(57)【要約】藻類において外来有用遺伝子を効率よく発現させ、藻類の遺伝子工学的育種に有用なプロモーター、イントロン、ターミネーター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるＤＮＡであって、かつ、藻類においてプロモーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
【請求項２】
下記（ｄ）〜（ｆ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類における遺伝子の転写効率を上昇させる活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｄ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるＤＮＡであって、かつ、藻類においてプロモーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ
の下流に隣接して、もしくは１〜１００００塩基のＤＮＡ断片を介した位置に、下記（ｄ）〜（ｆ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類における遺伝子の転写効率を上昇させる活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｄ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ
を有し、かつ、藻類においてプロモーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号３の８７−１３６７番目の塩基配列である請求項３記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
下記（ｇ）〜（ｉ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類においてターミネーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｇ）配列表の配列番号１１に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｈ）（ｇ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｉ）（ｇ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
【請求項６】
（１）下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるＤＮＡであって、かつ、藻類においてプロモーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ；
（２）下記（ｄ）〜（ｆ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類における遺伝子の転写効率を上昇させる活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｄ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ；
（３）下記（ｇ）〜（ｉ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類においてターミネーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｇ）配列表の配列番号１１に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｈ）（ｇ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｉ）（ｇ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ
のいずれかに所望の遺伝子が発現可能な状態で連結されていることを特徴とする、組換えＤＮＡ。
【請求項７】
（１）のＤＮＡの下流に隣接して、もしくは１〜１００００塩基のＤＮＡ断片を介した位置に（２）のＤＮＡを有する単離されたＤＮＡに所望の遺伝子が発現可能な状態で連結されていることを特徴とする請求項６記載の組換えＤＮＡ。
【請求項８】
配列表の配列番号３の８７−１３６７番目の塩基配列を示す単離されたＤＮＡに所望の遺伝子が発現可能な状態で連結されていることを特徴とする請求項７記載の組換えＤＮＡ。
【請求項９】
所望の遺伝子が、タンパク質をコードする核酸、アンチセンス核酸をコードする核酸、デコイをコードする核酸およびリボザイムをコードする核酸からなる群より選択される核酸であることを特徴とする、請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
（１）下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるＤＮＡであって、かつ、藻類においてプロモーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ；
（２）下記（ｄ）〜（ｆ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類における遺伝子の転写効率を上昇させる活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｄ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ；
（３）下記（ｇ）〜（ｉ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類においてターミネーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｇ）配列表の配列番号１１に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｈ）（ｇ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｉ）（ｇ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ
のいずれかに記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１１】
（１）のＤＮＡの下流に隣接して、もしくは１〜１００００塩基のＤＮＡ断片を介した位置に（２）のＤＮＡを有する単離されたＤＮＡを含有する請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
配列表の配列番号３の８７−１３６７番目の塩基配列を示す単離されたＤＮＡを含有する請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターであることを特徴とする、請求項１０記載のベクター。
【請求項１４】
請求項６〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡが導入された、もしくは請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された藻類。
【請求項１５】
下記の（ｊ）〜（ｌ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、エロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｊ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｋ）（ｊ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｌ）（ｊ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
【請求項１６】
下記の（ｍ）〜（ｏ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、エロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする、単離されたＤＮＡ：
（ｍ）配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｎ）（ｍ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｏ）（ｍ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有し、かつ、エロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた海藻の育種や海藻の細胞を用いた工業生産に用いるための遺伝子発現用のプロモーター、ベクターに関する。
背景技術
従来、産業上有用な海藻を得るためには、海藻の収集や選抜に頼ってきた。また、交配育種法によって海藻をさらに有用なものに改変する試みも行われているが、交配選抜するには、その培養、栽培が長期におよび、また非常に手間がかかり、十分な成果は挙げられていない。
陸上植物においては、遺伝子組換えによる植物の改変が頻繁に行われ、成果があがってきている。しかしながら、海洋の大型藻類においては、遺伝子組換えによる改変はおろか、遺伝子を導入し発現させることすら成功した例は知られてない。
生体内で遺伝子を発現させる場合、その宿主に適したプロモーターが必須である。即ち、藻類で遺伝子を発現させる場合、藻類で働くプロモーターが必須である。しかしながら、現在まで、藻類に由来するプロモーターは全く知られておらず、藻類における遺伝子の発現は不可能であった。
発明の目的
本発明の目的は、上記従来技術を鑑みて行われたものであり、藻類において外来有用遺伝子を効率よく発現させ、藻類の遺伝子工学的育種に有用なプロモーター、イントロン、ターミネーターを提供するものである。
発明の概要
本発明者らは、鋭意研究した結果、広く食用に供されているスサビノリの遺伝子を解析し、２種類のエロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＦ）遺伝子が生活環の全てのステージにおいて高発現していることを見出し、該遺伝子の５’上流領域を単離し、プロモーター活性を有することを見出した。さらに、本発明者らは、現在まで未知であった１種類のＥＦ遺伝子のゲノムの配列をも明らかにし、該配列中にイントロン配列、ターミネーター配列を見出し、これらの配列が導入遺伝子の発現効率を上昇させる活性を有することを明らかにし、本発明を完成させた。
即ち、本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるＤＮＡであって、かつ、藻類においてプロモーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡに関する：
（ａ）配列表の配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
本発明の第２の発明は、下記（ｄ）〜（ｆ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類における遺伝子の転写効率を上昇させる活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡに関する：
（ｄ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の単離されたＤＮＡの下流に隣接して、もしくは１〜１００００塩基のＤＮＡ断片を介した位置に、本発明の第２の発明のＤＮＡを有し、かつ、藻類においてプロモーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡに関する。本発明の第３の発明において、単離されたＤＮＡとしては、配列表の配列番号３の８７−１３６７番目の塩基配列が例示される。
本発明の第４の発明は、下記（ｇ）〜（ｉ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、藻類においてターミネーター活性を示すことを特徴とする、単離されたＤＮＡに関する：
（ｇ）配列表の配列番号１１に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｈ）（ｇ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｉ）（ｇ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
本発明の第５の発明は、本発明の第１〜４の発明のいずれかのＤＮＡに所望の遺伝子が発現可能な状態で連結されていることを特徴とする、組換えＤＮＡに関する。本発明の第５の発明において、所望の遺伝子としては、例えばタンパク質をコードする核酸、アンチセンス核酸をコードする核酸、デコイをコードする核酸およびリボザイムをコードする核酸が例示される。
本発明の第６の発明は、本発明の第１〜５の発明のＤＮＡを含有するベクターに関する。本発明の第６の発明において、ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイルスベクターが例示される。
本発明の第７の発明は、本発明の第５の発明のＤＮＡが導入された、もしくは本発明の第６の発明のベクターで形質転換された藻類に関する。
本発明の第８の発明は、下記の（ｊ）〜（ｌ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、エロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする、単離されたＤＮＡに関する：
（ｊ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｋ）（ｊ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｌ）（ｊ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
本発明の第９の発明は、下記の（ｍ）〜（ｏ）に記載のＤＮＡから選択され、かつ、エロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする、単離されたＤＮＡに関する：
（ｍ）配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、
（ｎ）（ｍ）のＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、
（ｏ）（ｍ）のＤＮＡに、１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡ。
本発明のプロモーター活性を示すＤＮＡ、転写効率を上昇させる活性を示すＤＮＡ、および／またはターミネーター活性を示すＤＮＡを用いることにより、海藻の遺伝子組換え用のベクターが提供され、さらには、海藻の遺伝子組換えによって、海藻の育種の道を切り開くと同時に、その結果、新規な産業上有用な海藻を提供することができる。
また本発明は、海藻由来のエロンゲーションファクター活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的製造を可能とするものである。
発明の詳細な説明
以下に本発明について詳細に説明する。
本明細書でいう「プロモーター」とは、遺伝子の転写、即ちＤＮＡを鋳型としたｍＲＮＡの合成を開始させる機能を有するＤＮＡを意味する。本発明のプロモーターは前記機能に限定されるものではなく、転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあって、ＲＮＡポリメラーゼに正確な位置から転写を開始させる機能を担うＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類似の領域や発現調節のために必要な他の領域を含んでいても良い。
本明細書で言う「プロモーター活性」とは、プロモーターの下流に発現可能な状態で所望の遺伝子を連結し、宿主（藻類）に導入した際、宿主内または宿主外において所望の遺伝子の遺伝子産物を生産する能力および機能を有することを示す。
一般的に、プロモーターの下流に、定量が容易に行なえるタンパク質をコードする遺伝子（レポーター遺伝子）を発現可能な状態で連結させ、宿主に導入し、これらタンパク質の発現量を測定することでプロモーターの有無や強弱をプロモーターの活性として表わす。このように、プロモーターの下流に発現可能な状態で所望の遺伝子の発現が確認された場合、そのプロモーターは導入した宿主において活性を有することになる。
本明細書で言う「イントロン」とは、遺伝子またはその転写物の内部にあって、その遺伝子から作られる最終ＲＮＡ産物に含まれない配列を言う。
イントロンはアミノ酸配列情報を持たない塩基配列であるが、外来遺伝子を宿主に導入する際、イントロン配列を含む導入遺伝子を用いることにより、転写効率が高まり、導入遺伝子にコードされた目的のタンパク質が高生産される例がある。例えば、高等植物において知られている〔タナカ  Ａ．（Ｔａｎａｋａ  Ａ．）ら；ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第１８巻、第２３号、第６７６７〜６７７０頁（１９９０年）〕。
転写効率は、例えば転写されたＲＮＡ量をノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の公知の方法で測定することで調べることが出来る。
本発明で言う「ターミネーター」とは、ＲＮＡの転写を終結させる活性を有するものを指す。ターミネーターは、例えば転写されたＲＮＡのサイズをノザンハイブリダイゼーション法等の公知の方法で測定することでその存在を調べることが出来る。
本発明で言う「藻類」には特に限定はなく、例えばスサビノリ等の紅藻、コンブ、ワカメ、ヒジキ等の褐藻、アオノリ等の緑藻等、任意の真核生物に属する藻類が挙げられる。
本発明で言う「所望の遺伝子」には特に限定はなく、例えば藻類において発現可能なタンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、デコイをコードする核酸、リボザイムをコードする核酸等が挙げられる。
また、本発明に開示されたプロモーター活性を有するＤＮＡ、転写効率を上昇させる活性を有するＤＮＡ、ターミネーター活性を有するＤＮＡと本来は機能的に連結されていない「異種の遺伝子」を本発明に使用することができる。
藻類において発現可能なタンパク質をコードする核酸としては、例えば藻類由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定にされるものではなく、藻類において発現可能であれば、細菌類；酵母類；放線菌類；糸状菌類；子嚢菌類；担子菌類等の微生物由来、植物由来、動物由来、またはウイルス由来の核酸も、本明細書で言う所望の遺伝子に含まれる。前記タンパク質をコードする核酸としては、酵素、レセプター、サイトカイン類、成長因子、遺伝子発現やその制御に関連する因子類、構造タンパク質等をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ（以下、プロモーターと記載する）は、藻類においてプロモーター活性を有するものであり、例えば、スサビノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ  Ｕｅｄａ）由来ＥＦ１−ａｌｐｈａＡ２遺伝子のプロモーター、例えば、配列表の配列番号３に示される塩基配列において、８７〜８５９番目の塩基配列、すなわち配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部を含むＤＮＡが挙げられる。即ち、本発明のプロモーターは、藻類においてプロモーター活性を有する範囲において、配列表の配列番号９に示される塩基配列中のいかなるＤＮＡであってもよい。
また、これらのＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、藻類においてプロモーター活性を有するものも、本発明のプロモーターに含まれる。ハイブリダイゼーションは公知の方法、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーパー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．）に記載の方法により実施することが出来る。上記の厳密な条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸３ナトリウム二水和物、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト（Ｄｅｎ  ｈａｒｄｔ’ｓ）、１００ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件が挙げられる。
さらに、これらのＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡであって、かつ、藻類においてプロモーター活性を有するＤＮＡも本発明のプロモーターに含まれる。
本発明のプロモーターの下流に所望の遺伝子を発現可能な状態で連結した組換えＤＮＡを藻類に導入することにより、藻類において所望の遺伝子を発現させることができる。このことは、藻類の遺伝子工学的育種、藻類を宿主とした有用物質の生産等を可能とするものである。
本発明の藻類における転写効率を上昇させる活性を有するＤＮＡは、例えば、スサビノリ由来ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２遺伝子のイントロン、例えば、配列表の配列番号３に示される塩基配列において、８７８〜１３３１番目の塩基配列、すなわち配列表の配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部を含むものが挙げられる。即ち、前記の本発明のＤＮＡは、藻類において転写効率を上昇させる活性を有する範囲において、配列表の配列番号１０に示される塩基配列中のいかなるＤＮＡであってもよい。
また、これらのＤＮＡ断片またはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、藻類における転写効率を上昇させる活性を有するものも、本発明のＤＮＡに含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、前記のものが挙げられる。
さらに、これらのＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡであって、かつ、藻類における転写効率を上昇させる活性を示すＤＮＡも本発明の転写効率を上昇させる活性を有するＤＮＡに含まれる。
上記した本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡと所望の遺伝子を発現可能な状態で連結した組換えＤＮＡに、さらに本発明の藻類における転写効率を上昇させる活性を有するＤＮＡを適当な位置に挿入することにより、転写効率を上昇させることが出来る。ここで、適当な位置としては、例えばプロモーター活性を有するＤＮＡの下流に隣接する、もしくは１〜１００００塩基のＤＮＡ断片を介した位置が例示される。
本発明のターミネーター活性を有するＤＮＡ（以下、ターミネーターと記載する）は、藻類においてターミネーター活性を有するものであり、例えば、スサビノリ由来ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２遺伝子のターミネーター、例えば、配列表の配列番号３に示される塩基配列において、２７１８〜３７６４番目の塩基配列、すなわち配列表の配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部を含むものが挙げられる。即ち、本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号１１に示される塩基配列中のいかなるＤＮＡであってもよい。
また、これらのＤＮＡ断片またはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、藻類においてターミネーター活性を有するものも、本発明のターミネーターに含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、前記のものが挙げられる。
さらに、これらのＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡであって、かつ、藻類においてターミネーター活性を有するＤＮＡも本発明のターミネーターに含まれる。
上記した本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡと所望の遺伝子を発現可能な状態で連結した組換えＤＮＡの下流に、さらに本発明のターミネーター活性を有する断片を連結することにより、所望の遺伝子の発現効率を上昇させることが出来る。また、所望により、さらに本発明の藻類における遺伝子の転写効率を上昇させる活性を示すＤＮＡを導入することにより、さらに所望の遺伝子の発現効率を上昇させることできる。
本発明のエロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、ＥＦ遺伝子と記載する）としては、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、あるいは配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその一部をコードするＤＮＡが挙げられる。好適な本発明のＥＦ遺伝子の例としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列の７９〜１４２５番目の塩基配列を有するＤＮＡ、配列表の配列番号２に示される塩基配列の６５〜１４０１番目の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、配列表の配列番号３に示される塩基配列の１３６８〜２７１４番目の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。さらに、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列中のいかなるポリペプチドをコードするＤＮＡであっても良い。
また、これらのＤＮＡ断片またはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ＥＦ活性を有するポリペプチドをコードするものも、本発明のＤＮＡに含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、前記のものが挙げられる。
さらに、これらのＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡであって、かつ、ＥＦ活性を有するポリペプチドをコードするものも本発明のＥＦ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに含まれる。
これらのＤＮＡまたはその相補鎖と厳密な条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加を有するＤＮＡとしては、上記したＤＮＡと例えば９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％を超える相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
なおＥＦ活性は、例えば、シャラク  Ｖ．  Ｆ．（Ｓｈａｌａｋ  Ｖ．  Ｆ．）ら；ウクラインスキー  ビオヒミチュスキー  ジュルナル（Ｕｋｒ．  Ｂｉｏｋｈｉｍ．  Ｚｈ．）、第６９巻、第１０４〜１０９頁（１９９７年）に記載の方法で測定することができる。
本発明のプロモーターと、藻類における転写効率を上昇させる活性を有するＤＮＡ、あるいはターミネーター活性を有するＤＮＡをそれぞれ単独でもしくは組合わせて所望の遺伝子を発現可能な状態で連結した組換えＤＮＡは、ベクターを介してあるいはベクターを介さずに藻類に導入することができる。ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイルスベクターが好適に使用される。
ＤＮＡが導入される藻類の形態に特に限定はなく、糸状体、胞子、葉状体、培養細胞、プロトプラスト等、任意の形態の藻類を用いることが出来る。
藻類へのＤＮＡの導入方法に特に限定はなく、公知の方法、例えばパーティクルガンによる導入方法が使用される。
本発明のプロモーターは、例えば、スサビノリより、以下のようにして単離することが出来る。
スサビノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ  Ｕｅｄａ）は、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）原始紅藻亜綱（Ｐｒｏｔｏｆｌｏｒｉｄｅｏｐｈｙｃｉｄａｅ）ウシケノリ目（Ｂａｎｇｉａｌｅｓ）ウシケノリ科（Ｂａｎｇｉａｃｅａｅ）に属する海藻であり、北海道西部、南部、本州北部、および朝鮮半島などに自生している。
このスサビノリは広く食用に供されている海藻であり、盛んに養殖されており、広く市販されている。本発明の目的には、海中で自生しているものを採取したもの、養殖されているもの、あるいは市販されているもののいずれも使用することが出来る。また、公知の方法〔クワノ  Ｋ．（Ｋｕｗａｎｏ  Ｋ）．ら；プラント  サイエンス（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．）、第１１６巻、第１集、第１１７〜１２４頁（１９９６年）〕によって株化されたものも同様に本発明の目的に使用される。
＜プロモーターを単離するための候補遺伝子の選定＞
外来遺伝子を高発現させるための遺伝子発現プロモーターを発見するためには、宿主海藻において高発現している遺伝子を知り、そのゲノム配列を単離し、その構造を解析する必要がある。
スサビノリのＥＳＴ配列（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）は、かずさＤＮＡ研究所のホームページ〔ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｅｎ／ｐｌａｎｔ／ｐｏｒｐｈｙｒａ／ＥＳＴ／〕にて公開されている。
この配列情報をもとにＥＳＴクラスタリング解析（ＥＳＴ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を、例えばＰＡＲＡＣＥＬ  ＣＬＵＳＴＥＲＩＮＧ  ＰＡＣＫＡＧＥソフトウエア（パラセル社製）を用いて行なう。クラスタリング解析の結果、同一クラスタに属するＥＳＴ配列の数が多いものが、高発現している可能性のある遺伝子と考えられるので、それらの遺伝子のプロモーターを単離するための配列の候補とすることが出来る。
例えば、その中の２つの遺伝子〔Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ１遺伝子およびＰｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２遺伝子（本明細書では以下それぞれＡ１遺伝子、Ａ２遺伝子と呼ぶ）〕を選び、本発明のプロモーターを単離するための材料とすることが出来る。
上記候補遺伝子のｃＤＮＡのクローニングは、上記クラスタリング解析において選定された候補遺伝子が属するクラスタに含まれるＥＳＴ配列、アセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）してできたコンセンサス配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはそれらの一部をプローブとして行なうことが出来る。例えば、Ａ１遺伝子に属するＥＳＴ配列をアセンブルしてできたコンセンサス配列からプライマーを設計し、このプライマーを使用したＰＣＲで増幅したＡ１遺伝子断片をプローブとして用いて行なうことが出来る。
このようにして、本発明において単離された新規候補遺伝子のｃＤＮＡの一例が配列表の配列番号１に示されるＡ１遺伝子のｃＤＮＡである。
＜海藻のすべての生活環で高発現している遺伝子か否かの確認＞
候補遺伝子が海藻のすべての生活環で高発現している遺伝子か否かの確認は、海藻の生活環のさまざまなステージにおけるｍＲＮＡの発現量を、候補遺伝子のＤＮＡ配列をプローブに用いたノーザンハイブリダイゼーションで測定することにより調べることができる。
海藻の組織から全ＲＮＡを抽出するには、公知の方法、例えば、グアニジンチオシアネート法やフェノール／クロロホルム法などが用いられる。このように抽出された全ＲＮＡを、目的のｍＲＮＡの発現量を測定するために使用することが出来る。
例えば、海藻スサビノリの生活環ステージのうち、
（１）単胞子未形成ステージ、
（２）単胞子形成ステージ、
（３）単胞子形成後の栄養成長配偶体ステージ、
（４）糸状体ステージ、
からそれぞれ改変フェノール／クロロホルム法を用いて、全ＲＮＡを抽出して、アガロースゲル電気泳動を行った後、候補遺伝子のＤＮＡをプローブにしてノザンハイブリダイゼーションを行うことができる。
また、別の方法としてＲＴ−ＰＣＲによっても発現様式を解析することができる。この場合、特異的なプライマーを設計することにより、より厳密にファミリー遺伝子と区別した解析が可能である。
例えば、候補遺伝子のｃＤＮＡの非翻訳領域にプライマーと翻訳領域内のプライマーを用いて、上記の各ステージから、例えば、グアニジンチオシアネート法を用いて抽出した全ＲＮＡを鋳型にして、ＴａＫａＲａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）等を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、各ステージにおける遺伝子の発現量を測定することができる。
このようにして、各ステージの海藻で高発現している遺伝子を探し出すことができる。
＜プロモーターを含有する領域のクローニング＞
上記のようにして選択された各ステージで高発現している遺伝子のプロモーターを含有する領域は、例えば、ゲノムライブラリーより該遺伝子のゲノムＤＮＡをスクリーニングすることにより単離することが出来る。
海藻で高発現する遺伝子のプロモーターのクローニングは、ゲノムライブラリーを用いたプラークハイブリダイゼーション法、ゲノムＤＮＡと既知の配列をもとに未知の配列を増幅するＰＣＲ法などがあるが、これらに限定されるわけではない。
本発明において単離された、配列表の配列番号３に示される新規なｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２遺伝子を含むゲノムＤＮＡ断片は、各ステージで高発現している遺伝子の一例である。このＡ２遺伝子（配列番号３）と配列番号１のｃＤＮＡおよびクラスタリング解析したＥＳＴ配列を比較すること、転写因子検索、コード領域検索、イントロン・エキソン検索をすることにより、この配列には、プロモーター配列、イントロン配列、ターミネーター配列が含まれることがわかった。
即ち、配列表の配列番号３に示される塩基配列は、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２遺伝子のゲノムの全長をカバーする配列であり、該配列中の１３６８〜２７１７番目の塩基配列がＡ２ポリペプチドをコードする配列（終止コドンを含む）、８７８〜１３３１番目の塩基配列が第１イントロン配列、１〜８５９番目の塩基配列がプロモーター配列、２７１８〜３７６４番目の塩基配列がターミネーター配列である。
また、この配列番号３で表される塩基配列と配列番号１のｃＤＮＡおよびクラスタリング解析したＥＳＴ配列を比較することにより、Ａ２遺伝子のｃＤＮＡ配列が明らかとなった。該配列を配列表の配列番号２に示す。該配列中、配列表の配列番号３の塩基配列に含有されている領域がＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２遺伝子のエキソン領域である。
本発明で単離された上記のプロモーターは、藻類においてプロモーター活性を有するＤＮＡであり、所望の遺伝子を藻類において発現させるために使用することが出来る。また、該配列に厳密な条件下でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡ、該配列にプロモーター活性を失わない範囲で塩基の置換、欠失、挿入、付加がなされたＤＮＡも上記目的のために使用することが出来る。
本発明で単離された上記のターミネーターは、藻類においてターミネーター活性を有するＤＮＡであり、所望の遺伝子を藻類において発現させる際、その発現効率を上昇させる目的で使用することが出来る。また、該配列に厳密な条件下でハイブリダイズし、ターミネーター活性を有するＤＮＡ、該配列にターミネーター活性を失わない範囲で塩基の置換、欠失、挿入、付加がなされたＤＮＡも上記目的のために使用することが出来る。
高等植物では、イントロン配列を含む導入遺伝子を使うことにより転写効率が高まり導入遺伝子の目的タンパクが高生産される例が知られている。本発明で単離された上記第１イントロンは、所望の遺伝子を藻類において発現させる際、その転写効率を上昇させる目的で使用することが出来る。また、前記の転写効率上昇活性を有するものであれば、該配列に厳密な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、該配列に塩基の置換、欠失、挿入、付加がなされたＤＮＡも上記目的のために使用することが出来る。
本発明で単離された上記エキソン領域は、藻類の新規なエロンゲーション  ファクター（ＥＦ）であるＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２ポリペプチドをコードする配列である。該配列はＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２ポリペプチドの遺伝子工学的生産に使用でき、また、さらに新規なＥＦ遺伝子のスクリーニング、特に藻類由来の新規ＥＦ遺伝子のスクリーニングのプローブ、プライマーとして使用できる。
本願明細書に開示された本発明のＤＮＡは、上記のようにして単離することが出来る。また本明細書に開示された配列情報をもとに化学的に合成することも出来る。
本発明で、藻類においてプロモーター活性を有するＤＮＡが初めて単離されたことにより、現在まで全く不可能であった、藻類での所望の遺伝子の人為的な発現が初めて可能となった。さらに、藻類由来のターミネーター活性を有するＤＮＡ、イントロンが初めて単離されたことにより、藻類での所望の遺伝子の発現の効率を高めることも可能となった。このことは、藻類における有用物質の遺伝子工学的生産を可能とするのみならず、従来、甚だ効率の悪い交配法に頼るしかなかった藻類の育種を、遺伝子工学的に効率よく行なうことをも可能にするものである。
本発明で、藻類由来の新規エロンゲーションファクター遺伝子が初めて単離されたことにより、現在まで採取あるいは培養した藻類からしか取得することが出来なかった藻類由来のエロンゲーションファクターを遺伝子工学的に生産することが可能となった。
実施例
以下に実施例をもって本発明を示すが、本発明はこれらの実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１  スサビノリの各ステージからのｍＲＮＡの調製
１．材料
クワノ  Ｋ．（Ｋｕｗａｎｏ  Ｋ．）ら〔プラント  サイエンス（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．）、第１１６巻、第１集、第１１７〜１２４頁（１９９６年）〕により確立された、スサビノリの純系株である、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ  Ｕｅｄａ  ＴＵ−１株の葉状体の配偶子および糸状の胞子体を用いた。
２．培養条件
葉状体の配偶子は１５℃、１０時間明期〔光量８０μＥ／（ｍ２・ｓ）；白色蛍光灯〕、１４時間暗期のもと、ＥＳＬ培地〔３．５％（ｗ／ｖ）ＳＥＡＬＩＦＥ  ｐｏｗｅｒ（マリン  テック（Ｍａｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈ）社製）、１％（ｖ／ｖ）ＥＳＳ２］の入ったガラス製の１リットル容枝付き平底フラスコ（パイレックス（ＰＹＲＥＸ）社製）中で通気（フィルター濾過滅菌した空気、０．１２リットル／ｍｉｎ）し、還流浮遊状態で培養した。
糸状の胞子体は２５℃、２４時間明期〔光量１７μＥ／（ｍ２・ｓ）；白色蛍光灯〕のもと、ＥＳＬ培地の入ったガラス製の５００ｍｌ容三角フラスコ中で静置培養した。
３．全ＲＮＡ抽出
スサビノリＴＵ−１株の各ステージの全ＲＮＡは、単胞子が未形成で葉長１〜２ｍｍの葉状の配偶体、単胞子の放出の誘導を３０分間かけた葉長２ｍｍの葉状の配偶体、葉長１〜２ｃｍの葉状の配偶体、および糸状の胞子体からそれぞれ抽出した。
全ＲＮＡの抽出は、アプト  Ｋ．Ｅ．（Ａｐｔ  Ｋ．Ｅ．）らのフェノール／クロロホルム法を一部改変して行った〔モレキュラー  アンド  ジェネラル  ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第２４６巻、第４号、第４５５〜４６４頁（１９９５年）〕。
藻体から全ＲＮＡを抽出する手順を以下に示す。
培養した藻体の水分を紙タオルで除いた後、重量を測定した。１．２ｇの藻体を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて破砕し、液体窒素で予冷した薬さじを用いて、１６．８ｍｌの抽出バッファー〔１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）〕を入れた５０ｍｌ容の遠沈管に移した。これを振盪機（ＮＲ−１、タイテック（ＴＡＩＴＥＣ）社製）を用いて１１０ｒｐｍ／ｍｉｎ、室温で１５分間混合した後、等量のクロロホルムを加えて攪拌した。
この混合液を遠心して上層を集め、ここに１／３量のエタノールを一滴ずつゆっくりと加え混合した。これを遠心して沈澱（主に多糖類が含まれている。）を除去した後、上清に等量のクロロホルムを加えて攪拌した。これを遠心して上清を集めた。この操作を上清の色が抜けるまで繰り返した。
上清を回収し、上清の１／２量の９Ｍ  ＬｉＣｌと上清の１／１００量のβ−メルカプトエタノールを加え混合し、−２０℃で一晩静置した。生じた沈澱を遠心分離により回収し、沈澱を５０μｌのＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水に溶かして、等量のフェノール／クロロホルム（１：１）による抽出を行なった。この抽出操作を中間層がなくなるまで繰り返した。
上層を回収し、上層の１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを加え混合した。生じた沈澱を遠心分離により回収し、７５％エタノールでリンスした後、風乾した。
沈澱物を９０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶かし、これに１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）を加えて混合した後、５分間室温で保持した。これに０．２ｍｌのクロロホルムを加えて攪拌した後、２〜３分間室温で保持した。
これを遠心分離し、得られた上清に０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、生じた沈澱を遠心分離により回収した。沈澱を７５％エタノールでリンスした後、風乾し、４００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶かした。
さらに、残存している多糖類を除くため、２００μｌの高塩沈澱溶液（１．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．８Ｍ  クエン酸３ナトリウム二水和物、ｐＨ未調整）ならびに２００μｌのイソプロパノールを加え、遠心した。得られた沈澱を７５％エタノールでリンスした後、風乾し、１００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶かした。
このようにして抽出された全ＲＮＡの濃度および純度は、分光光度計（ＵＶ−２２００，島津製作所製）により測定した。また、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、全ＲＮＡが分解されていないことを確認した。
ｍＲＮＡは、上記の方法で抽出された全ＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ｓｕｐｅｒ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を用いて分離した。操作手順は付属の説明書に従った。
実施例２  スサビノリＥＳＴ配列のクラスタリング解析
解析に用いるスサビノリＥＳＴ配列は、かずさＤＮＡ研究所のホームページ〔ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｅｎ／ｐｌａｎｔ／ｐｏｒｐｈｙｒａ／ＥＳＴ／〕よりダウンロードした。ダウンロードしたスサビノリＥＳＴ配列の全１０１５４配列について、パラセル社のＰＡＲＡＣＥＬ  ＣＬＵＳＴＥＲＩＮＧ  ＰＡＣＫＡＧＥを用いて、配列のクラスタリングを行った。
その結果、８２４３個の配列が１１４０のクラスタに分類された。また、どのクラスタにも属さない配列が１９１１個あった。
以下の表１〜４に、各クラスタに属する配列の数が多い上位５０位のクラスタＩＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＤ）をリスト化したものを示す。同一のクラスタに属する配列の数（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔ）が多いほど高発現の遺伝子と考えられる。
さらに、各クラスタに属する配列をアセンブルしてできたコンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）のコンセンサス配列をＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）〔ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏ／〕のヌクレオチドデータベース（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄｕｎｔな核酸のデータベース）に対して、ＢＬＡＳＴプログラム〔アルトシュル  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら；ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、第１７号、第３３８９〜３４０２頁（１９９７年）〕にて、ホモロジー検索を行った。
その結果のうち、各クラスタのコンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）がもっとも高いスコアでヒットしたコンティグＩＤ（ｃｏｎｔｉｇ  ＩＤ）、配列の数（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔ）およびヒットしたＧｅｎＢａｎｋ登録番号（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ）を、表１〜４のＣｏｎｔｉｇ  ＩＤ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｕｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏの欄に番号（Ｎｏ）とともに示す。また、その時のスコア（Ｓｃｏｒｅ）とＥ値（Ｅ  ｖａｌｕｅ）を、表１〜４のＳｃｏｒｅ、Ｅ  ｖａｌｕｅの欄に示す。
2003072775.tif 000002
2003072775.tif 000003
2003072775.tif 000004
2003072775.tif 000005
以下の表５〜８に、ヒットした各ＧｅｎＢａｎｋ登録（アクセッション）番号（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ）のタイトルをＨｉｔ  ｎａｍｅの欄に示す。
2003072775.tif 000006
2003072775.tif 000007
2003072775.tif 000008
2003072775.tif 000009
ヒットした遺伝子タイトルに対して、ゲノム配列やその断片のクローン等ではなく、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであるヒット、あるいはＰｏｒｐｈｙｒａの語を含むヒットを検索したところ、スサビノリの近縁の遺伝子が見出された。
さらに、高発現している遺伝子のある配列を探索したところ、上記５０のクラスタ中、スサビノリの近縁のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列として、クラスタＩＤ１３番（表１および表５のＮｏ２）、クラスタＩＤ９番（表３および表７のＮｏ３２）の２種類が見出された。
見出された２種類のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列のうち、クラスタＩＤ１３番は１８Ｓ  ｒＲＮＡとホモロジーが高いものであった。一方、クラスタＩＤ９番のコンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）１のコンセンサス配列はホモロジー検索の結果、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）Ｕ０８８４４のＰｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ（ｔｅｆ−ｃ）  ｍＲＮＡにヒットし、本発明のための候補として最も適しているものの１つと考えられた。
また、クラスタＩＤ９番のコンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）１のアセンブル結果を見ると、ミスマッチがあり、２つのグループに分かれること、特に５’末端の非翻訳領域の配列が明らかに異なることが判明した。
これより、この２つのグループをそれぞれ、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ１、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ  Ａ２と命名した（以下、それぞれＡ１遺伝子、Ａ２遺伝子と呼ぶ）。
実施例３  Ａ１遺伝子の全長ｃＤＮＡクローニング、シークエンシング、および配列解析
１．材料
ｃＤＮＡクローニングの材料として、クワノ  Ｋ．（Ｋｕｗａｎｏ  Ｋ）．ら〔プラント  サイエンス（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．）、第１１６巻、第１集、第１１７〜１２４頁（１９９６年）〕により確立された、スサビノリＴＵ−１株の葉状の配偶体単藻培養株を用いた。
２．培養条件
スサビノリＴＵ−１株は、１５℃、１０時間明期〔光量８０μＥ／（ｍ２・ｓ）；白色蛍光灯〕、１４時間暗期の短日条件で培養した。ＥＳＬ培地が入った１リットル容の枝付き平底フラスコ（パイレックス（ＰＹＲＥＸ）社製）中で通気（ポアサイズ０．２μｍのフィルター（アドバンテック（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製）でろ過滅菌した空気、０．２５リットル／ｍｉｎ）し、還流浮遊状態で培養した。培地は７日ごとに交換した。
３．ＲＮＡ抽出
スサビノリＴＵ−１株の葉状配偶体単藻培養株の１．２ｇの藻体より、実施例１と同様の方法で全ＲＮＡを抽出した。
４．ｃＤＮＡライブラリースクリーニングのためのプローブ作製
スサビノリＴＵ−１株のＤＮＡ抽出をキタデ（Ｋｉｔａｄｅ）ら〔ジャーナルオブ  フィコロジー（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．）、第３２巻、第４９６〜４９８頁（１９９６年）〕による方法に従って行った。
このＤＮＡを鋳型とし、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）と２種類のプライマー〔ＰＹＥＦ１（配列番号７）およびＰＹＥＦＲ１（配列番号５）〕を用いてＰＣＲを行った。これらのプライマーは、実施例２のＥＳＴのクラスタリングの結果をもとに設計したものであり、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ遺伝子におけるモチーフを含む、保存性の高い配列を増幅するプライマーである。ＰＣＲは９４℃で２分間の予温後、９４℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし、このサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
得られたＰＣＲ産物（約１７０ｂｐ）を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。目的のバンドを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（バイオ１０１（Ｂｉｏ１０１）社製）を用いてゲルから回収し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ＫｉｔＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてＴＡクローニング用ベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）に連結した。これを常法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編、モレキュラー  クローニング，ア  ラボラトリー  マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ〔コールド  スプリング  ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）社、１９８９年刊〕）によりコンピテント細胞大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地で培養することによって大腸菌の形質転換体のコロニーを得た。
その後、形質転換されたコロニーを無作為に選び、該コロニーが保持するプラスミド中のインサートの長さを、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター内の配列を有するＴ７プロモータープライマー（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）、Ｍ４プライマー（宝酒造社製）によるＰＣＲ増幅産物を電気泳動することによって確認し、目的の長さのＤＮＡ断片を持つ大腸菌のコロニーを選定した。
選定した大腸菌の形質転換体のコロニーを液体培養した後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）を用いてプラスミド抽出を行った。
このプラスミドを鋳型とし、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を用いたサイクルシークエンシング法にて塩基配列の決定を行なった。サイクルシークエンシング反応は、９６℃で２分間の予温後、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間を１サイクルとし、このサイクルを２５回繰り返すことによって行なった。
得られた反応産物を、簡易型のエタノール沈澱を利用した方法により精製した後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）により塩基配列を決定した。プラスミド抽出および塩基配列決定の手順は付属の説明書に従った。
塩基配列を決定した後、得られた配列が目的の配列であることを確かめるため、ＮＣＢＩが公開しているＢＬＡＳＴプログラム〔アルトシュル  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら；ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、第１７号、第３３８９〜３４０２頁（１９９７年）〕を用いて、核酸配列データベースに対し相同性検索を行った。検索の結果、得られた配列は、クラスタリング、アッセブリングから予測したＡ１遺伝子の配列に最も強くマッチすることが明らかとなった。
このようにして配列が決定されたプラスミドを鋳型とし、プライマーＰＹＥＦ１（配列番号７）およびＰＹＥＦＲ１（配列番号５）を用い、上述した条件で再度ＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を用いてジゴキシゲニンで標識した。標識反応後、未反応の基質を除くため標識した産物をＱｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  ＣｏｌｕｍｎｓＴＭ  Ｇ−５０（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を用いて精製し、スクリーニング用のプローブとした。標識および精製の手順は付属の説明書に従った。
５．ｃＤＮＡライブラリーの作製
ｃＤＮＡライブラリーの作製に使用したｃＤＮＡは、実施例３−４で調製したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡからＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製）を用いて合成した。ｃＤＮＡ合成の際に用いる逆転写酵素には、ＥＦＬＣｐｕｒｅＴＭ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製）を用い、反応温度は４４℃で行った。
合成されたｃＤＮＡはλＺＡＰＩＩベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）に連結し、連結反応産物はＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）を用いてパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）した。以下、このパッケージングして得られたファージ液をｃＤＮＡライブラリーとして使用した。
６．一次スクリーニング
上記のパッケージングして得られたファージ液をＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）付属の説明書に従い、１プレートにつきプラーク数が約１×１０５となるように、あらかじめボトムプレートを作製、保温しておいた２４×２４ｃｍ角型シャーレ（ＭＳ−１２４５０、住友ベークライト（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）社製）にまいた。常法に従い、プレートに生じたファージプラークをニトロセルロースメンブレン（ＮＩＴＲＯＰＬＵＳ  ２０００、フナコシ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ）社製）に写しとった。
このメンブレンをアルカリ変性液（０．９Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に２〜５分間、次に中和液（１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に２〜５分間浸した。次いで、このメンブレンを６×ＳＳＣで洗い、乾燥させた後、乾熱滅菌機（ＳＰ−６５０、アドバンテク（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製）にて８０℃で２時間加熱した。
このメンブレンを、終濃度１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液〔５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、４．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、６×ＳＳＣ〕中で６５℃、２時間インキュベートすることでプレハイブリダイゼーションを行った。
次に、メンブレンを、終濃度１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡならびに熱変性させ１本鎖にした実施例３−４で調製したプローブを終濃度１０ｎｇ／ｍｌで含むハイブリダイゼーション溶液中で６０℃で一晩（１２時間以上）インキュベートすることでハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを、洗浄溶液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で室温、５分間保持し、結合していないプローブ、ハイブリダイゼーション溶液などを洗い落とした。この洗浄を２回繰り返した。
次に、メンブレンを、あらかじめ６０℃に保温しておいた洗浄溶液（０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で６０℃、２０分間保持し、非特異的結合をしているプローブを解離させた。この洗浄を２回繰り返した。
次いで、メンブレンを、あらかじめ６０℃に保温しておいた洗浄溶液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で６０℃、２０分間保持し、非特異的結合をしているプローブを解離させた。この洗浄を２回繰り返した。
ジゴキシゲニンの検出は、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）付属の説明書に従い、発色反応で行った。検出結果の確認は、写真用ライトボックス（ＬＩＧＨＴ  ＢＯＸ  ＮＥＷ  ５０００  ＩＮＶＥＲＴＥＲ，フジ写真フィルム株式会社（Ｆｕｊｉ  Ｃｏｌｏｒ）製）を用いて行った。以上の手順で一次スクリーニングを行った。
７．二次スクリーニング
上記の一次スクリーニングで陽性となったファージを回収し、ライブラリーの増幅を真壁〔真壁和裕；バイオ実験イラストレイテッド（４）  苦労なしのクローニング  秀潤社（１９９７年）〕の方法に従って行った。
二次スクリーニングは、増幅されたファージ液を、１プレートにつきプラーク数が５０〜１００となるように、あらかじめボトムプレートを作製、保温しておいた９ｃｍシャーレ（高さ１．５ｃｍ、直径９ｃｍ）にまき、得られたプラークについて二次スクリーニングを行なった。二次スクリーニングの操作は、一次スクリーニングと同様の条件で行った。
上記の方法に従って、葉状配偶体に由来するｃＤＮＡライブラリーを作成し、一次スクリーニングを行ない、分離された陽性クローンにつき、増幅を行った。増幅されたファージ液より得られたプラーク約１×１０５をスクリーニングすることによって、５個の陽性クローンが分離された。二次スクリーニングで陽性と判断されたプラークについては、ベクター配列に特異的な２種類のプライマー〔Ｔ３プロモータープライマー（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）およびＴ７プロモータープライマー（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）〕を用いてＰＣＲを行い、増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動に供することにより挿入断片の長さを確認した。
ファージベクター中の挿入断片のプラスミドベクターへのサブクローニングは、ｉｎ  ｖｉｖｏエキシジョンにより行った。操作手順はＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）付属の説明書に従った。
ｉｎ  ｖｉｖｏエキシジョンによって得られたコロニーを無作為に選び、上述のプライマー対（Ｔ３プロモータープライマーおよびＴ７プロモータープライマー）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動に供することにより挿入断片の長さを確認した。
８．塩基配列の解析
最も長いｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを大腸菌に導入し、得られた形質転換体を液体培養した後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）を用いてプラスミドを抽出し、このプラスミドを用いて挿入ｃＤＮＡ領域の塩基配列をプライマーウォーキング法により決定した。
決定されたｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に示す。全長１６４４ｂｐのｃＤＮＡ配列中に１３５０ｂｐの長さの読み取り枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）が見いだされ（塩基番号７９〜１４２８）（終止コドンを含む）、このＯＲＦは、４４９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。該ＯＲＦにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に示す。該ＯＲＦにコードされるタンパク質の予測される分子量は４９．４ｋＤａであり、等電点は９．１８である。
開始コドンを含む塩基番号７６〜８２の領域にコザック規則〔Ｋｏｚａｋ  Ｍ．；Ｃｅｌｌ，第４４巻，第２８３頁〜第２９２頁（１９８６年）〕と似た配列（ＡＴＣＡＴＧＧ）が見られた。
一方、ｃＤＮＡ配列中にポリ（Ａ）配列付加信号（ＡＡＴＡＡＡ）およびポリ（Ａ）尾部は見つからなかったが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＣＹＣ１遺伝子において報告されている、ポリ（Ａ）付加配列（ＴＡＣＡＴＡ）〔プラウフット  Ｎ．（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  Ｎ．）；セル（Ｃｅｌｌ）、第６４巻、第４号、第６７１〜６７４頁（１９９１年）〕に似た配列（ＴＡＣＴＡＴＴ）が塩基番号１５７９〜１５８５の領域に見られた。
得られた配列がＥＦ−１αをコードする遺伝子であることを確かめるため、相同性検索ならびにモチーフ検索を行った。
相同性検索にはＮＣＢＩが公開しているＢＬＡＳＴ  ２．０  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＢＬＡＳＴ  ＳＥＡＲＣＨのＢＬＡＳＴＸ２．０．１０プログラム〔アルトシュル  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら；ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、第１７号、第３３８９〜３４０２頁（１９９７年）〕を用いて行った。
モチーフ検索は、ＩｎｔｅｒＰｒｏ〔ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／〕が公開しているプログラム  ＩｎｔｅｒＰｒｏ  Ｒｅｌｅａｓｅ４．０〔アプヴァイラー  Ｒ．（Ａｐｗｅｉｌｅｒ  Ｒ．）ら；ジャーナル  オブ  バイオサイエンシズ（Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．）、第２６巻、第２号、第２７７〜２８４頁（２００１年）〕を用いて、ＰＲＯＳＩＴＥのモチーフデータベース〔ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｐｒｏｓｉｔｅ／〕に対して検索を行った。
ＢＬＡＳＴＸ（核酸の配列をアミノ酸の配列のデータベースに対して検索する）プログラムによる相同性検索の結果、一番初めに的中したのは類似性の評点が８８７のＰｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａのＥＦ−１α  ｔｅｆ−ｃであった。Ｅ値（Ｅ  ｖａｌｕｅ）（対象データベースと同じ大きさの任意の配列ライブラリーを無作為に検索したときに、類似性の評点以上の評点を持つものが的中する個数の期待値）は、有意に低い数値を示したので、偶然に的中したのではなく、本実施例で決定された上記配列はＰｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ由来ＥＦ−１α  ｔｅｆ−ｃと類似する配列であることは明らかである。
ＩｎｔｅｒＰｒｏによるアミノ酸のモチーフ検索の結果は、次のとおりであった。
ＰＲＯＳＩＴＥのデータベースに対して、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１４から２１の領域（ＧＨＶＤＳＧＫＳ）に、ＡＴＰ／ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ  Ａ（Ｐ−ｌｏｏｐ）〔ＰＲＯＳＩＴＥ登録番号（ＰＲＯＳＩＴＥ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）ＰＳ０００１７〕が、また、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１から７６の領域（ＤＫＬＫＡＥＲＥＲＧＩＴＩＤＩＡ）に、ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ〔ＰＲＯＳＩＴＥ登録番号（ＰＲＯＳＩＴＥ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）ＰＳ００３０１〕が見つかった。
このことより、本実施例で得られたＤＮＡ断片はｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒとして機能するアミノ酸をコードする新規のＤＮＡ断片と考えられる。
実施例４  スサビノリのライフサイクルの各ステージにおけるＡ１遺伝子およびＡ２遺伝子の発現様式のＲＴ−ＰＣＲによる解析
１．Ａ１遺伝子
（１）プライマー合成
Ａ１遺伝子の発現様式を調べるためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして、プライマーＰＹＥＦＲＴ１（配列番号４）およびプライマーＰＹＥＦＲ１（配列番号５）を合成した。
プライマーＰＹＥＦＲＴ１の配列は、実施例３で明らかにされた配列番号１で示されるＡ１遺伝子の５’末端非翻訳領域の配列を、実施例２でクラスタリングしたＥＳＴ配列のうちＡ２遺伝子のグループに属し、最も５’末端非翻訳領域の配列が長い配列ＡＶ４３５９８２とを比較し、明らかに配列が異なる領域を選択し、設定した配列である。
即ち、プライマーＰＹＥＦＲＴ１の配列は、配列番号１で示されるＡ１遺伝子の５’末端非翻訳領域中の配列で、かつＡ２遺伝子の５’末端非翻訳領域の配列とホモロジーを持たない配列である。
また、プライマーＰＹＥＦＲＴ１の配列は、実施例２でクラスタリングしたＥＳＴ配列のうち、Ａ２遺伝子のグループに属する配列とも、共通にホモロジーの高い、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ（ｔｅｆ−ｃ）ｍＲＮＡ中の配列である。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
スサビノリＴＵ−１株の各ステージの全ＲＮＡは、単胞子が未形成で葉長１〜２ｍｍの葉状の配偶体、単胞子の放出の誘導を３０分間かけた葉長２ｍｍの葉状の配偶体、葉長１〜２ｃｍの葉状の配偶体、そして糸状の胞子体から、実施例１と同様の方法でそれぞれ抽出した。
得られたそれぞれ２００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡからＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応は、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）をプライマーとして用いて５３℃で行った。操作手順は付属の説明書に従った。
得られた５ｎｇのｃＤＮＡを鋳型とし、Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（和光純薬社製）と２種の合成プライマー〔ＰＹＥＦＲＴ１（配列番号４）およびＰＹＥＦＲ１（配列番号５）〕を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃で２分間の予温後、９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を１サイクルとし、このサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間反応させる条件で行った。
ネガティブコントロールとして、逆転写反応を行なわない各ステージのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ鋳型として上述と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
アガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。
図１において、逆転写反応を行ったサンプルのアガロース電気泳動の結果を図１（Ａ）に、逆転写反応を行わなかったサンプル（ネガティブコントロール）のアガロース電気泳動の結果を図１（Ｂ）に、それぞれ示す。
図１（Ａ）、（Ｂ）それぞれにおいて、
Ｍは１００ｂｐラダーマーカー（宝酒造社製）、
レーン１は単胞子未形成葉状配偶体（大きさ：１〜２ｍｍ）から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
レーン２は単胞子形成葉状配偶体（大きさ：２ｍｍ）から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
レーン３は葉状配偶体（大きさ：１〜２ｃｍ）から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
レーン４は糸状胞子体から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
である。
いずれのステージにおいても３９１ｂｐの増幅産物が確認され、Ａ１遺伝子はスサビノリのライフサイクルのどのステージにおいても強く発現していると考えられた。
２．Ａ２遺伝子
（１）プライマー合成
Ａ２遺伝子の発現様式を調べるためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして、プライマーＰＹＥＦＲＴ４（配列番号６）を以下のようにして設計した。
プライマーＰＹＥＦＲＴ４の配列は、前記したＡ２遺伝子のグループに属し、最も５’末端非翻訳領域の配列が長い配列ＡＶ４３５９８２を、実施例３で明らかにされた配列番号１で示されるＡ１遺伝子の５’末端非翻訳領域の配列と比較し、明らかに配列が異なる領域を選択し、設定した。
即ち、プライマーＰＹＥＦＲＴ４の配列は、Ａ２遺伝子の５’末端非翻訳領域中の配列で、かつＡ１遺伝子の５’末端非翻訳領域の配列とホモロジーを持たない配列である。
このプライマーＰＹＥＦＲＴ４と、上述のプライマーＰＹＥＦＲ１（配列番号５）とを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
スサビノリＴＵ−１株の各ステージの全ＲＮＡは、単胞子が未形成で葉長１〜２ｍｍの葉状の配偶体、単胞子の放出の誘導を３０分間かけた葉長２ｍｍの葉状の配偶体、葉長１〜２ｃｍの葉状の配偶体、そして糸状の胞子体から、実施例１と同様の方法でそれぞれ抽出した。
得られたそれぞれ２００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡからＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応は、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）をプライマーとして用いて５３℃で行った。操作手順は付属の説明書に従った。
得られた５ｎｇのｃＤＮＡを鋳型とし、Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（和光純薬社製）と２種の合成プライマーＰＹＥＦＲＴ４（配列番号６）とＰＹＥＦＲ１（配列番号５）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃で２分間の予温後、９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を１サイクルとし、このサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間反応させる条件で行った。
ネガティブコントロールとして、逆転写反応を行なわない各ステージのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ鋳型として上述と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
アガロースゲル電気泳動の結果を図２に示す。
図２において、逆転写反応を行ったサンプルのアガロース電気泳動の結果を図２（Ａ）に、逆転写反応を行わなかったサンプル（ネガティブコントロール）のアガロース電気泳動の結果を図２（Ｂ）に、それぞれ示す。
図２（Ａ）、（Ｂ）それぞれにおいて、
Ｍは１００ｂｐラダーマーカー（宝酒造社製）、
レーン１は単胞子未形成葉状配偶体（大きさ：１〜２ｍｍ）から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
レーン２は単胞子形成葉状配偶体（大きさ：２ｍｍ）から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
レーン３は葉状配偶体（大きさ：１〜２ｃｍ）から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
レーン４は糸状胞子体から調製したｍＲＮＡを鋳型とした場合、
である。
いずれのステージにおいても３６９ｂｐの増幅産物が確認され、Ａ２遺伝子はスサビノリのライフサイクルのどのステージにおいても強く発現していると考えられた。
実施例５  ゲノムライブラリーからのＡ２遺伝子の単離、配列決定とプロモーター配列の単離
１．ゲノムＤＮＡの調製
スサビノリＴＵ−１株のゲノムＤＮＡの抽出は、Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏ  Ｐｕｒｅ，Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｇａｌ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔｓ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製）を用いて、キットに付属の説明書の方法を一部改変して行った。
葉状体ステージの藻体からゲノムＤＮＡを抽出する場合の手順を以下に示す。
培養した葉状体ステージの藻体の水分を紙タオルで除いた後，重量を測定した。２．５ｇの藻体を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて破砕し、液体窒素で予冷した薬さじを用いて、１１．５ｍｌの上記キットに添付のＲｅａｇｅｎｔ１緩衝液を入れた５０ｍｌ容の遠沈管に移し、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で３０分間保持した。これに３．７５ｍｌの上記キットに添付のＲｅａｇｅｎｔ２を加え、均一になるまで攪拌した後、６５℃で途中３回引き上げてよく混ぜながら１０分間保持した。これを氷中で２０分間保持した後、２ｍｌのクロロホルムを加え、−２０℃で２０分間保持した。これに５００μｌのＮｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｎ（アマシャム  ファルマシア  バイオシステムズ社製）を加えて、室温で１０分間混合した。
これを遠心した後、上層を回収し、ここに終濃度３．２ｇ／３ｍｌとなるよう塩化セシウムを加えて溶解した後、さらに１／１０量のエチジウムブロマイド（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、超遠心チューブ（１２ＰＡシールチューブ、日立製作所（ＨＩＴＡＣＨＩ）製）に分注し、５０，０００ｒｐｍ、１５℃で２０時間、日立超遠心機６５Ｐ（日立製作所（ＨＩＴＡＣＨＩ）製）にて遠心分離した。
遠心分離後、超遠心チューブに紫外光を当てながら注射針（２２Ｇ×１、テルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）社製）を装着したシリンジ（テルモシリンジ２．５ｍｌ、テルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）社製）を用いてＤＮＡ層を抜き取った。抜き取ったＤＮＡ層に等量のイソブタノールを加えて攪拌、遠心した後、下層を回収した（イソブタノール処理）。エチジウムブロマイドの色が確認できなくなるまでイソブタノール処理を繰り返した（２〜３回繰り返す）。
回収した下層を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ７  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、スペクトラム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）社製）に入れ、１リットルのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に対して室温で一晩透析を行なった。透析後、１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを加え混合し、生じた沈澱を遠心分離により回収し、７５％エタノールでリンスした後、風乾した。
こうして得られた沈澱物を１００μｌのＴＥバッファーに溶かした。抽出されたゲノムＤＮＡの濃度および純度は、分光光度計（Ｇｅｎｅ  Ｑｕａｎｔ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製）により測定した。また、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ゲノムＤＮＡが分解されていないことを確認した。
２．プローブの作成
実施例２での解析から、プロモーターの単離候補のＡ１遺伝子、Ａ２遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）Ｕ０８８４４のＰｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ（ｔｅｆ−ｃ）ｍＲＮＡとホモロジーが高いことがわかっていた。
これを基に、Ａ１、Ａ２両方の遺伝子のゲノム配列を単離できるように、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＦ１−ａｌｐｈａ遺伝子におけるモチーフを含む保存性の高い配列を検索した。そして、該モチーフを挟むようにフォワードプライマー  ＰＹＥＦ１（配列番号７）およびリバースプライマー  ＰＹＥＦＲ１（配列番号５）を設計した。
両プライマーとＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社製）を用い、スサビノリＴＵ−１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社製）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲは９５℃で１０分間の予温後、９４℃で１分間、５２℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし、このサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間反応させる条件で行った。ＰＣＲ産物を２．０％シーケムＧＴＧ（宝酒造社製）アガロースゲルで電気泳動し、目的のＤＮＡ断片（約１７０ｂｐ）をゲルから切り出して回収し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ（バイオ１０１（Ｂｉｏ１０１）社製）を用いてＤＮＡを精製した。このＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いてＴＡクローニング用ベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）へ連結した。約１６時間のライゲーション反応後、得られたライゲーション産物にて大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、該形質転換ＪＭ１０９をアンピシリン添加ＬＢ寒天培地にて培養し、コロニーを形成させた。
コロニーが保持するプラスミド中のインサートを、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター中の配列を有するＴ７プロモータープライマー（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）およびＭ４プライマー（宝酒造社製）を用いたコロニーＰＣＲによって確認し、目的のＤＮＡ断片を持つプラスミドを保持する大腸菌のコロニーを選定した。
選定した大腸菌からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）を用いてプラスミドを抽出、精製した。操作手順は該キットの説明書に従った。このプラスミドを鋳型にし、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社製）、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社製）を使用し、ジデオキシ法を用いたサイクルシークエンス法によって塩基配列の決定を行った。操作手順は該キットの説明書に従った。
このようにして塩基配列が決定されたプラスミドをＰＣＲ  ＤＩＧ  ラベリングキット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を用いて標識し、ゲノムライブラリーのスクリーニングを行うためのプローブを作製した。操作手順は該キットの説明書に従った。標識反応後、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  ＣｏｌｕｍｎｓＴＭ  Ｇ−５０（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を用いて余分な基質を除き、精製標識産物を得た。該精製標識産物をスクリーニング用のプローブとした。
３．ゲノムライブラリーの作製
実施例５−１で抽出したゲノムＤＮＡをλＤＡＳＨＩＩ／ＢａｍＨＩ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）を用いてλＤＡＳＨＩＩベクターに連結し、ゲノムライブラリーを作製した。操作手順は該キットに付属の説明書に従った。連結反応産物はＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）を用いてＰａｃｋａｇｉｎｇし、得られたファージ液を、該ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔに付属の説明書に従い、１プレートのプラーク数が１×１０４となるように、あらかじめボトムプレートを作製、保温しておいた９０×２０ｍｍ滅菌シャーレ（ＳＨ−２０、イワキ（Ｉｗａｋｉ）社製）にまいた。
４．一次スクリーニング
プレートに生じたファージプラークを、常法に従ってニトロセルロースメンブレン（ＮＩＴＲＯＰＬＵＳ２０００、フナコシ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ）社製）に写しとった。
メンブレンをアルカリ変性液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ）に５分間、次に中和液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に５分間浸した。メンブレンを６×ＳＳＣで洗い、乾燥させた後、乾熱滅菌器（ＳＰ−６５０、アドバンテク（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製）にて、８０℃で２時間加熱した。
このメンブレンを、終濃度１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液〔５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５０ｍＭ  チャーチ  リン酸緩衝液（Ｃｈｕｒｃｈ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ  ７．０）、１０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）、７％ＳＤＳ、０．１％Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム〕中で６５℃、２時間インキュベートすることによりプレハイブリダイゼーションを行った。
次に、メンブレンを、一本鎖に熱変成させたプローブを添加した終濃度１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液で５０℃で一晩インキュベートすることによりハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを洗浄溶液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で室温、５分間保持し、結合していないプローブ、ハイブリダイゼーション溶液などを洗い落とした。この洗浄を２回繰り返した。
次に、あらかじめ加温しておいた洗浄溶液２（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で６８℃、１５分間保持し、非特異的結合をしているプローブを解離させた。この洗浄を２回繰り返した。
ジゴキシゲニンの検出は，ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）付属の説明書に従い、発色反応で行った。
５．二次スクリーニング
上記の一次スクリーニングにて陽性となったファージを回収し、常法に従ってファージ液を調製し、二次スクリーニングを行なった。
二次スクリーニングは、ファージ液を１プレートにつきプラーク数が５０〜１００となるように、あらかじめボトムプレートを作製、保温しておいた９０×２０ｍｍ滅菌シャーレにまいた。他は一次スクリーニングと同様に行った。
その結果、２つの陽性クローン、Ｎｏ．２０およびＮｏ．４７が得られた。これらの陽性と判断されたプラークについては、杉浦の方法〔杉浦昌弘：クローニングとシークエンス、農村文化社、東京、第１５２頁〜第１５６頁（１９８９年）〕に従って、λファージの増幅とλファージＤＮＡの抽出を行なった。
６．λファージＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
二次スクリーニングの結果得られた陽性クローンＮｏ．２０、Ｎｏ．４７につき、ゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションを行なった。
サザンハイブリダイゼーションは、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編、モレキュラー  クローニング，ア  ラボラトリー  マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第９章、第３１〜５８頁〔コールド  スプリング  ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）社、１９８９年刊］に記載の方法に準じて行った。
すなわち、陽性クローンのＮｏ．２０およびＮｏ．４７より抽出したＤＮＡを種々の制限酵素にて切断を行なった後、１％アガロースゲル電気泳動に供し、泳動後、ゲルをアルカリ変性、中和し、常法に従い、ＤＮＡをナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）、アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製）に一晩かけてブロッティングした。ブロッティング後、メンブレンに紫外線トランスイルミネーターにて紫外線（２５４ｎｍ）を５分間照射し、ＤＮＡをメンブレンに固定した。
このメンブレンを、２０ｍｌのＤＩＧ−Ｅａｓｙ−Ｈｙｂ．Ｇｒａｎｕｌｅｓ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）中で４２℃、２時間インキュベートすることにより、プレハイブリダイゼーションを行った。
次に、メンブレンを４ｍｌの上述のハイブリダイゼーション溶液ならびに一本鎖に熱変成させたプローブとともに４２℃で一晩インキュベートすることによりハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを洗浄溶液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で室温、５分間保持し、結合していないプローブ、ハイブリダイゼーション溶液などを洗い落とした。この洗浄を２回繰り返した。
次いで、あらかじめ６８℃に加温しておいた洗浄溶液２（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で６８℃、１５分間保持し、非特異的結合をしているプローブを解離させた。この洗浄を２回繰り返した。
メンブレンは、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を用いて処理して発光させ、乾燥させた後、Ｘ線フイルム（コダック（Ｋｏｄａｋ）社製）を入れたカセット内で３０秒感光させ、オートラジオグラフィーをとった。
この結果を図３に示した。
図３において、ＭはｐＨＹマーカー（宝酒造社製）、
レーン１はＨｉｎｄＩＩＩ、
レーン２はＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ、
レーン３はＸｂａＩ、
レーン４はＸｂａＩおよびＳａｌＩ、
レーン５はＳａｌＩ、
レーン６はＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ、
レーン７はＥｃｏＲＩ、
にて、クローンＮｏ．２０またはクローンＮｏ．４７をそれぞれ制限酵素処理したものである。
また、各レーンのａがクローンＮｏ．２０、ｂがクローンＮｏ．４７である。
その結果、クローンＮｏ．２０に関しては約４ｋｂｐの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩの２重消化断片に、クローンＮｏ．４７に関しては約５．５ｋｂｐの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片に遺伝子およびその上流域が存在する可能性が高いと考えられた。
そこで、クローンＮｏ．２０のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで完全消化した後、１％アガロースゲル電気泳動し、約４ｋｂｐのサイズのバンドをアガロースゲルから切り出し回収した。
また、クローンＮｏ．４７のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化した後、１％アガロースゲル電気泳動し、約５．５ｋｂｐのサイズのバンドをアガロースゲルから切り出し回収した。
回収したそれぞれＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡（ＴｏＹｏＢｏ）社製）にＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いてライゲーションした。約３０分のライゲーション後、得られたライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、該形質転換ＪＭ１０９をアンピシリン添加ＬＢ寒天培地にて培養し、コロニーを形成させた。
コロニーが保持するプラスミド中のインサートを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター中の配列を有するＲＶプライマー（宝酒造社製）およびＭ４プライマー（宝酒造社製）でコロニーＰＣＲを行うことによって確認し、目的のＤＮＡ断片を持つ大腸菌のコロニーを選定した。選定された大腸菌からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）を用いて、プラスミドを抽出、精製した。操作手順は該キットの説明書に従った。調製したプラスミドは、それぞれｐＥＦ２０、ｐＥＦ４７と命名した。
プラスミドｐＥＦ２０、ｐＥＦ４７をそれぞれ用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＦ２０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＦ４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６０）と命名、表示した。これは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１、中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成１４年（２００２年）１２月１８日（原寄託日）よりＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６０として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８５［国際寄託への移管請求日：平成１５年（２００３年）１月２９日］として寄託されている。
これらのプラスミドｐＥＦ２０、ｐＥＦ４７を鋳型とし、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社製）、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社製）を使用し、ジデオキシ法を用いたサイクルシークエンス法によって塩基配列の決定を行った。操作手順は，該キットの説明書に従った。
その結果、クローンＮｏ．２０ファージＤＮＡには、Ａ２遺伝子の翻訳開始点から１７３ｂｐ以降が含まれていることが分かった。即ち、ゲノムＤＮＡの上流の配列が含まれていない為、プロモーター配列は含まれていないと言える。
一方、クローンＮｏ．４７ファージＤＮＡには、Ａ２遺伝子の翻訳開始点から約１．３ｋｂ上流までの配列が含まれていた。該配列を、配列表の配列番号３に示す。
また、決定したクローンＮｏ．４７の塩基配列、即ち配列番号３と、配列番号１のｃＤＮＡおよびクラスタリング解析したＥＳＴ配列を比較し、転写因子検索、コード領域検索、イントロン・エキソン検索を行なったところ、クローンＮｏ．４７の配列には、プロモーター配列、イントロン配列、ターミネーター配列が含まれることが明らかとなった。
即ち、全長３７６４ｂｐのＤＮＡ配列中、塩基番号８７〜８５９の配列が５’隣接領域（５’ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）、塩基番号８６０〜８７７番目の配列が第１エキソン、塩基番号８７８〜１３３１番目の配列が第１イントロン、塩基番号１３３２〜２９６１番目の配列が第２エキソン、塩基番号２９６２〜３７６４番目の配列が３’隣接領域（３’ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）であることが明らかになった。また、５’隣接領域がプロモーター配列、３’隣接領域がターミネーター配列であることが明らかになった。
開始コドンを含む塩基番号１３６５〜１３７１の領域にコザック規則〔Ｋｏｚａｋ  Ｍ．；Ｃｅｌｌ，第４４巻，第２８３頁〜第２９２頁（１９８６年）〕と似た配列（ＡＴＣＡＴＧＧ）が見られた。一方、高等植物の核遺伝子のポリ（Ａ）配列付加信号ＣＡＹＴＧ〔ジョシ  Ｃ．Ｐ．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，第１５巻，第９６２７〜９６４０頁（１９８７年）〕が塩基番号２９５１〜２９６５の領域に見られ（ＣＡＴＴＧ）、また他のポリ（Ａ）配列付加信号ＡＡＴＡＡＡに類似の配列ＡＡＴＡＧＡが塩基番号２８９７〜２９０２の領域に見られた。
また、上記の検索から、配列番号３の配列中の塩基番号８６０〜８７７、１３３２〜２９６１の配列がＡ２遺伝子のｃＤＮＡ配列であることが明らかとなった。該配列を配列表の配列番号２に示す。該配列中、塩基番号６５〜１４０４番目の配列がＡ２ポリペプチドをコードする配列（終止コドンを含む）である。該配列がコードする４９９アミノ酸からなるポリペプチドのアミノ酸配列は、Ａ１遺伝子のＯＲＦがコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）と同一であった。このことより、本実施例で得られたＤＮＡ断片もまたエロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）として機能するアミノ酸をコードするＤＮＡ断片と考えられる。
実施例６  プロモーター配列の活性の確認
（１）プロモーター活性測定用のプラスミドの作製
β−グルクロニダーゼ遺伝子の一過性発現におけるＧＵＳ活性をみることによりプロモーター活性を測定できるように、以下のプロモーター活性測定用プラスミドベクターを構築した。
比較コントロールのプラスミドベクターはｐＢＩ２２１（クロンテック社製）とし、このベクターの３５Ｓプロモーター部分（ＨｉｎｄＩＩＩサイトからＸｂａＩサイトまでの断片）をｐＥＦ４７のＨｉｎｄＩＩＩサイトからＥＦ−１α  Ａ２遺伝子のイントロンを含まない転写開始直前までのプロモーター配列（配列表の配列番号９の配列）と入れ替えることにより、プロモーター配列にβ−グルクロニダーゼ遺伝子を連結したベクターを作製した。つまり、配列番号９の配列は、ｐＥＦ４７プラスミドを鋳型にＭ１３  ＲＶプライマー（タカラバイオ製）と５’側にＸｂａＩサイトを持つように合成した配列表の配列番号１２に記載のＥＦ４７Ｘ２プライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより得られた約０．８ｋｂｐのフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで完全消化し、約０．８ｋｂｐのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により切り出して精製し、入手した。このＤＮＡ断片をｐＢＩ２２１から同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで完全消化し３５Ｓプロモーター部分をのぞいたベクター断片にライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換した。このプラスミドは、ｐ４７ＧＵＳ−ＩＬと命名し、ｐ４７ＧＵＳ−ＩＬで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐ４７ＧＵＳ−ＩＬと命名した。このｐ４７ＧＵＳ−ＩＬは、ＰＣＲおよび塩基配列解析によりＨｉｎｄＩＩＩサイトから転写開始直前までのプロモーター配列（配列表の配列番号９の配列）をもつことを確認した。
比較コントロールのプラスミドベクターｐＢＩ２２１の３５Ｓプロモーター部分（ＨｉｎｄＩＩＩサイトからＸｂａＩサイトまでの断片）を、上記のプロモーター配列＋第１エキソン＋第１イントロン＋第２エキソンのＡＴＧ直前までの配列（配列番号３の８７〜１３６７番目の配列）と入れ替えることにより、プロモーター配列（配列表の配列番号９の配列）とその下流に第１イントロン（配列表の配列番号１０）を含む配列に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を連結したベクターを作製した。つまり、上記のプロモーター配列＋第１エキソン＋第１イントロン＋第２エキソンのＡＴＧ直前までの配列（配列番号３の８７〜１３６７番目の配列）は、ｐＥＦ４７プラスミドを鋳型にＭ１３  ＲＶプライマー（タカラバイオ製）と５’側にＸｂａＩサイトを持つように合成した配列表の配列番号１３に記載のＥＦ４７Ｘプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより得られた約１．３ｋｂｐのフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで完全消化し、約１．３ｋｂｐのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により切り出して精製し、入手した。このＤＮＡ断片をｐＢＩ２２１から同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで完全消化し３５Ｓプロモーター部分を除いたベクター断片にライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換した。このプラスミドは、ｐ４７ＧＵＳと命名し、ｐ４７ＧＵＳで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐ４７ＧＵＳと命名した。このｐ４７ＧＵＳは、ＰＣＲおよび塩基配列解析により配列番号３の８７〜１３６７番目の配列をもつことを確認した。
（２）プロモーター活性の確認
パーティクルガンによりｐＢＩ２２１、ｐ４７ＧＵＳ−ＩＬ、ｐ４７ＧＵＳベクターのスサビノリＴＵ−１株への導入を行い、β−グルクロニダーゼ遺伝子の一過性発現におけるＧＵＳ活性を組織化学的アッセイにより細胞内に蓄積される青色のインジゴチン色素の有無を正立顕微鏡で観察することにより、プロモーター活性を測定した。
ベクターを細胞に導入するための金粒子にＤＮＡをコーティングする手順を以下に示した。金粒子６０ｍｇを微量遠心チューブ（１．５ｍｌ容量）に測り取った。これに１ｍｌの新しく調製された７０％エタノールを加え試験管ミキサー（ＶＯＲＴＥＸ  ＧＥＮＩＥ  ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて５分間撹拌を行い、１５分間室温に放置した。卓上遠心機（チビタン、ミリポア）で５秒間遠心し、上清を除いた。これに１ｍｌの滅菌水を加え試験管ミキサーで１分間撹拌した後、１分間静置して金粒子を沈殿させ、卓上遠心機で２秒間遠心した後、上清を除いた。これを３回繰り返した。これに金粒子の終濃度が６０ｍｇ／ｍｌとなるように５０％グリセロールを加えた。５０％グリセロール中の金粒子（６０ｍｇ／ｍｌ）の再懸濁と凝集の破壊のために、試験管ミキサーで５分間激しく撹拌した。この溶液５０μｌ（金粒子が約３ｍｇ相当含まれる）を微量遠心チューブ（１．５ｍｌ容量）に測り取り、激しく試験管ミキサーで撹拌しながら１０μｌのＤＮＡ（１μｇ／μｌ）と５０μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ２と２０μｌの０．１Ｍ  スペルミジンを加え、さらに３分間撹拌した。１分間静置して金粒子を沈ませた後、卓上遠心機で２秒間遠心し上清を除いた。ペレットを崩さないように１４０μｌの７０％エタノールを加え、上清を除き、次にペレットを崩さないように１４０μｌの１００％エタノールを加え、上清を除いた。これに４８μｌの１００％エタノールを加え混合した。１回の導入には８μｌを使用した。
スサビノリのＴＵ−１株の葉状の配偶体単藻培養株（以下スサビノリＴＵ−１株とする）を、１５℃、１０時間明期（光量８０  μＥ／ｍ２／ｓ；白色蛍光灯）・１４時間暗期の短日条件で、ＥＳＬ培地が入った容量２  Ｌの簡易式培養容器（藤森工業）中で通気（ポアサイズ０．２  μｍのフィルターでろ過滅菌した空気、０．２５  ｌ／ｍｉｎ）し、還流浮遊状態で培養した。培地は７日ごとに交換した。葉状の配偶体を約２ｃｍ２の大きさに切断し、ＥＳＬ培地で広げながら４分の１のＧｌａｓｓ  Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｅ（ＧＦ／Ｃ：４７ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ）上に貼り付けた。これをブフナー漏斗（適合ろ紙７０ｍｍ用、ＭＴ）にろ紙（９０ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ）を載せて、ＥＳＬ培地で湿らせた上に載せ、ろ過びんと吸引機を用いて吸引し、余分の水分を除きつつ吸着させた。これをＥＳＬ寒天培地上に置き、パーティクルガン（ＧＩＥ−ＩＩＩ、タナカ）でＤＮＡをコーティングした金粒子の導入を行った。パーティクルガンの操作手順は、付属の説明書に従った。打込み条件は、発射口と試料との距離は７〜９ｃｍ、発射時の圧力は０．５〜６．０ｋｇｆ／ｃｍ２の範囲で設定し、発射時間は０．０１５秒で打込みを行い、１条件ごとに試料３つ準備しそれぞれに導入を行った。
導入を行った後の試料は、Ｇｌａｓｓ  Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｅから剥がし取り、導入したベクター別に発射口と試料との距離の条件ごとに集め、簡易式培養容器で１５℃、１４時間明期・１０時間暗期の長日条件で２日間培養した。その後、固定液〔２％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、０．１Ｍ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ  ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５Ｍ  Ｄ−ソルビトール〕で１時間固定し、洗浄液〔０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ  Ｄ−ソルビトール〕で３回洗浄した。これを細胞・組識全体が浸るようにＸ−Ｇｌｕｃ  溶液〔２ｍＭ  Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．５ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、１．５Ｍ  Ｄ−ソルビトール、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を加え、適当な容器に入れ密封した後、３７℃インキュベータ（ＭＩＲ−２５３、三洋）中で一晩インキュベートした。β−グルクロニダーゼ活性（ＧＵＳ活性）は細胞内に蓄積される青色のインジゴチン色素の有無を正立顕微鏡で観察することにより確認し、これをプロモーター活性とした。
その結果、ｐＢＩ２２１ベクターを導入した試料について発射口と試料との距離が９ｃｍの条件の中で２つＧＵＳ活性が確認された。同様にｐ４７ＧＵＳ−ＩＬベクターについては、発射口と試料との距離が８ｃｍと９ｃｍの条件でそれぞれ１つの合計２つＧＵＳ活性が確認された。したがって、このベクターのプロモーター（配列表の配列番号９）がプロモーター活性があることが確認された。
ｐ４７ＧＵＳベクターについては、発射口と試料との距離が７ｃｍの条件で１つ、８ｃｍと９ｃｍでそれぞれ３つの合計７つのＧＵＳ活性が確認された。
また、ＧＵＳ活性が見られた試料について、細胞の色素を脱色したところ、発射口と試料の距離が９ｃｍでｐ４７ＧＵＳベクターを一過性に導入した１２の圧力条件（０．５〜６．０Ｋｇ／ｃｍ２）の１つが、約１週間経過しても青色のインジゴチン色素の蓄積が残っていた（図４）。図４において、Ａは脱色前、Ｂは脱色７日後の結果を示す。したがって、このベクターのプロモーター（配列表の配列番号９）はその下流に第１イントロン（配列表の配列番号１０）を含むことにより効率よく遺伝子発現が可能でありかつ非常に高い発現の誘導が可能と考えられた。
産業上の利用の可能性
本発明により、藻類に由来するプロモーターが初めて提供され、該プロモーターを利用した藻類における遺伝子発現が可能となった。さらに、本発明により、藻類に由来するターミネーター、イントロンが初めて提供され、これらを利用して藻類における遺伝子発現効率の向上が可能となった。即ち、本発明は、藻類における有用物質の遺伝子工学的生産を可能とするのみならず、藻類の遺伝子工学的育種を可能とするものである。
また、本発明により、藻類に由来する新規エロンゲーションファクターの遺伝子が提供され、該遺伝子を利用して藻類に由来するエロンゲーションファクターの遺伝子工学的生産が可能となった。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１：Ａ１遺伝子のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図２：Ａ２遺伝子のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図３：クローンＮｏ．２０およびクローンＮｏ．４７のサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラムの結果を示す図である。
図４：ｐ４７ＧＵＳベクターを導入した細胞における、１週間後のインジゴチン色素の蓄積を示す図である。Ａ：脱色前；Ｂ：脱色７日後。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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