(57)【要約】微生物を検出同定する特異的プローブ及びそれを用いた検出及び／又は同定方法の提供。  アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、アシネトバクター・カルコアセチカス、ヘモフィルス・インフルエンザ等の医療及び食品等の分野において有害な１又は複数の微生物を検出同定するためのプローブであって、同定すべき微生物の１６ＳｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及び／又はＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブ。また、前記プローブの１種以上を用いる、微生物の検出及び／又は同定方法。
2003106676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シトロバクター・フレンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ベイヨネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）、プロビデンシア・スチュアーティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、ナイセリア・ゴノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・ワルネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブセラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクアチウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｕｍ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐ���ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・カセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、サルモネラ・パラチフィＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ）、クレブセラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、モラキセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）から選択される１又は複数の微生物を検出及び／又は同定するためのプローブであって、検出及び／又は同定すべき微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及び／又はＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの各塩基配列又はその相補配列からなるプローブ。
【請求項２】
配列番号１〜１５２で示される塩基配列またはその相補配列から選ばれる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
配列番号１、２又は３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４】
配列番号４、５又は６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、アシネトバクター・カルコアセチカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５】
配列番号７、８又は９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ヘモフィルス・インフルエンザを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項６】
配列番号１０、１１又は１２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ステノトロフォモナス・マルトフィリアを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項７】
配列番号１３、１４又は１５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、プロテウス・ミラビリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項８】
配列番号１６、１７又１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項９】
配列番号１９、２０又は２１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、シュードモナス・エルギノサを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１０】
配列番号２２、２３又は２４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、シトロバクター・フレンディを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１１】
配列番号２５、２６又は２７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ベイヨネラ・パルブーラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１２】
配列番号２８、２９又は３０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、プロビデンシア・スチュアーティを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１３】
配列番号３１、３２又は３３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ナイセリア・ゴノローエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１４】
配列番号３４、３５又は３６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・アガラクチエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１５】
配列番号３７、３８又は３９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、モルガネラ・モルガニを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１６】
配列番号４０、４１又は４２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、バクテロイデス・フラジリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１７】
配列番号４３、４４又は４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ホミニスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１８】
配列番号４６、４７又は４８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ワルネリを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項１９】
配列番号４９、５０又は５１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ヘモリティカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２０】
配列番号５２、２３又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロバクター・クロアカを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２１】
配列番号５４、５５又は５６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロバクター・アエロゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２２】
配列番号５７、５８又は５９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・エピデルミディスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２３】
配列番号６０、６１又は６２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・コンステラータスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２４】
配列番号６３、２３又は６４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、セラチア・マルセッセンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２５】
配列番号６５、６６又は６７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・アンギノサスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２６】
配列番号６８、６９又は７０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エシェリシア・コリを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２７】
配列番号５４、７１又は７２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クレブセラ・ニューモニエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２８】
配列番号７３、７４又は７５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・フェカリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項２９】
配列番号７６、７７又は７８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・フェシウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３０】
配列番号７９、８０又は８１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・サングイスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３１】
配列番号８２、８３又は１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ミティスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３２】
配列番号６０、８４又は６７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・インターメディウスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３３】
配列番号８５、８６又は８７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、リステリア・モノサイトゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３４】
配列番号８８、８９又は９０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クロストリジウム・パーフリンゲンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３５】
配列番号９１、９２又は９３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、コリネバクテリウム・アクアチウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３６】
配列番号９４、９５又は１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・オラリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３７】
配列番号９６、９７又は９８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・アウレウスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３８】
配列番号９９、１００又は１０１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ナイセリア・メニンギチディスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項３９】
配列番号１０２、１０３又は１０４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、カンピロバクター・フェタスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４０】
配列番号１０５、１０６又は１０７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・ガリナルムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４１】
配列番号１０８、１０６又は１０９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・カセリフラバスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４２】
配列番号１１０、１１１又は１１２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エロモナス・ハイドロフィラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４３】
配列番号１１３、１１４又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、サルモネラ・パラチフィＡを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４４】
配列番号１１５、１１４又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、サルモネラ・チフィを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４５】
配列番号１１６、１１７又は１１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・エクイシミリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４６】
配列番号１１９、１２０又は１２１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・カニスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４７】
配列番号５２、２３又は１２２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クレブセラ・オキシトカを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４８】
配列番号４６、１２３又は１２４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・サプロフィティカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項４９】
配列番号１２５、１２６又は１２７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、パスツレラ・ムルトシダを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５０】
配列番号１２８、１２９又は１３０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エイケネラ・コロデンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５１】
配列番号１３１、１３２又は１３３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５２】
配列番号１３４、１３５又は１３６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、モラキセラ・カタラリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５３】
配列番号１３７、１３８又は１３９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、レジオネラ・ニューモフィラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５４】
配列番号１４０、１４１又は１４２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５５】
配列番号１４３、１４４又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・アビウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５６】
配列番号１４６、１４７又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・イントラセルラレを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５７】
配列番号１４８、１４９又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・カンサシを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５８】
配列番号１５０、１５１又は１５２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・ゴルドネを検出及び／又は同定するためのプローブ。
【請求項５９】
複数の微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における相同性検索によって、それぞれの微生物におけるＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域を特定し、該Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３領域の塩基配列において２種以上の微生物間で比較してミスマッチ部位を決定し、該ミスマッチ部位を含み、かつ塩基長が２０〜１００ｂｐの領域を決定することを含む、プローブの設計方法。
【請求項６０】
請求項１又は２に記載のプローブの１種以上を用いることを特徴とする、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、アシネトバクター・カルコアセチカス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、プロテウス・ミラビリス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、シュードモナス・エルギノサ、シトロバクター・フレンディ、ベイヨネラ・パルブーラ、プロビデンシア・スチュアーティ、ナイセリア・ゴノローエ、ストレプトコッカス・アガラクチエ、モルガネラ・モルガニ、バクテロイデス・フラジリス、スタフィロコッカス・ホミニス、スタフィロコッカス・ワルネリ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、エンテロバクター・クロアカ、エンテロバクター・アエロゲネス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ストレプトコッカス・コンステラータス、セラチア・マルセッセンス、ストレプトコッカス・アンギノサス、エシェリシア・コリ、クレブセラ・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・インターメディウス、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリネバクテリウム・アクアチウム、ストレプトコッカス・オラリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・メニンギチディス、カンピロバクター・フェタス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・カセリフラバス、エロモナス・ハイドロフィラ、サルモネラ・パラチフィＡ、サルモネラ・チフィ、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコッカス・カニス、クレブセラ・オキシトカ、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、パスツレラ・ムルトシダ、エイケネラ・コロデンス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、モラキセラ・カタラリス、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・ゴルドネから選択される１又は複数の微生物の検出及び／又は同定方法。
【請求項６１】
微生物由来の塩基配列とプローブの塩基配列間でミスマッチが４個以上ある場合にハイブリダイズしないストリンジェンシー条件を用いて両配列をハイブリダイズさせることを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
同定すべき微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列とのミスマッチが３個以下である塩基配列を有する２種以上の微生物を検出し、該２種以上の微生物と異なる微生物のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの１種以上を用い、該２種以上の微生物のうち１種の微生物をさらに同定することを含む、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項６３】
以下の工程：（ａ）同定すべき微生物から核酸を調製する工程、（ｂ）該核酸を請求項１又は２に記載のプローブとハイブリダイズさせる工程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイズの有無を検出し、各プローブに対するその検出シグナルパターンを特定する工程、（ｄ）工程（ｃ）において得られた検出シグナルパターンと、予め特定しておいた微生物の検出シグナルパターンとを比較して同定すべき微生物の種類を特定する工程、からなる請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項６４】
配列番号１５３及び１５４で示されるプライマーを用いて標的配列を含むヌクレオチドを増幅した後にプローブとハイブリダイズさせる、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
標的配列を含むヌクレオチドの増幅の際に、蛍光物質を用いて標識を行う、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
ＤＮＡチップ上で検出する、請求項６０〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、微生物、特に医療及び食品等の分野において有害な細菌を検出、同定する特異的なプローブ及びそれを用いた検出及び／又は同定方法に関する。
背景技術
表１に記載した細菌の検出は、種々の医学、公衆衛生に関して重要であり、検出方法については次の２つの方法が知られている。
2003106676.tif 000003
2003106676.tif 000004
第１の方法としては、検体材料の患者糞便・血液及び食品等から、基本的には血液寒天培地、マッコンキー培地（便の場合、ＳＳ寒天培地等）、各種確認培地、診断用免疫血清を用いて微生物の同定を行う方法がある。しかしながらこの方法は、同定に時間がかかってしまうという問題がある。
第２の方法としては、迅速に検査を行うことができるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法と呼ばれる方法が開発され実用化されている。このＰＣＲ法では細菌を同定するプローブとして１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を使用することが知られている。このようなリボソームの塩基配列を使用した細菌同定用プローブ及び同定方法は、例えば特許第３１１６３５３号、特許第３１３５９０９号、特許第３０３００３４号、特願２００２−１７３５６号、特開２００２−３４５７８号などに開示されている。
しかしながら、これらの出願には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子の５’末端に由来の４００〜５００塩基の領域が系統学的に保存された属の近縁の種間を識別するために有効な領域であり、それらの領域の一部の塩基配列を有するプローブを調製してある特定の微生物を検出、同定することは報告されてはいるが、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列のうち、微生物間の保存性が低く、特定の種に対して特異性が高いＶ１、Ｖ２及びＶ３領域は個々に特定されておらず、その領域の塩基配列からプローブを調製し、本願発明の表１に示す微生物を効率よく特異的に検出、同定する方法については全く報告されていない。
発明の開示
従って、本発明は、医療及び食品等の分野において有害な微生物を、１６Ｓ  ｒＲＮＡの特定の種に対して特異性が高いＶ１、Ｖ２及びＶ３領域の塩基配列に基づいて、迅速かつ確実に微生物を検出及び／又は同定するプローブ及びそのプローブを用いた検出及び／又は同定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列のうち、特に種に対して特異性が高い特定のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域の塩基配列に着目し、医療及び食品等の分野において有害な細菌を特異的に検出及び／又は同定し得るプローブを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の１〜６６を提供する。
（１）  アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シトロバクター・フレンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ベイヨネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）、プロビデンシア・スチュアーティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、ナイセリア・ゴノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・ワルネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブセラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクアチウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｕｍ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（��ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・カセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、サルモネラ・パラチフィＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ）、クレブセラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、モラキセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）から選択される１又は複数の微生物を検出及び／又は同定するためのプローブであって、検出及び／又は同定すべき微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及び／又はＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの各塩基配列又はその相補配列からなるプローブ。
（２）  配列番号１〜１５２で示される塩基配列またはその相補配列から選ばれる、（１）に記載のプローブ。
（３）  配列番号１、２又は３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４）  配列番号４、５又は６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、アシネトバクター・カルコアセチカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５）  配列番号７、８又は９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ヘモフィルス・インフルエンザを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（６）  配列番号１０、１１又は１２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ステノトロフォモナス・マルトフィリアを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（７）  配列番号１３、１４又は１５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、プロテウス・ミラビリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（８）  配列番号１６、１７又１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（９）  配列番号１９、２０又は２１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、シュードモナス・エルギノサを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１０）  配列番号２２、２３又は２４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、シトロバクター・フレンディを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１１）  配列番号２５、２６又は２７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ベイヨネラ・パルブーラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１２）  配列番号２８、２９又は３０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、プロビデンシア・スチュアーティを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１３）  配列番号３１、３２又は３３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ナイセリア・ゴノローエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１４）  配列番号３４、３５又は３６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・アガラクチエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１５）  配列番号３７、３８又は３９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、モルガネラ・モルガニを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１６）  配列番号４０、４１又は４２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、バクテロイデス・フラジリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１７）  配列番号４３、４４又は４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ホミニスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１８）  配列番号４６、４７又は４８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ワルネリを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（１９）  配列番号４９、５０又は５１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・ヘモリティカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２０）  配列番号５２、２３又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロバクター・クロアカを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２１）  配列番号５４、５５又は５６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロバクター・アエロゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２２）  配列番号５７、５８又は５９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・エピデルミディスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２３）  配列番号６０、６１又は６２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・コンステラータスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２４）  配列番号６３、２３又は６４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、セラチア・マルセッセンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２５）  配列番号６５、６６又は６７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・アンギノサスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２６）  配列番号６８、６９又は７０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エシェリシア・コリを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２７）  配列番号５４、７１又は７２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クレブセラ・ニューモニエを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２８）  配列番号７３、７４又は７５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・フェカリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（２９）  配列番号７６、７７又は７８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・フェシウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３０）  配列番号７９、８０又は８１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・サングイスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３１）  配列番号８２、８３又は１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ミティスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３２）  配列番号６０、８４又は６７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・インターメディウスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３３）  配列番号８５、８６又は８７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、リステリア・モノサイトゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３４）  配列番号８８、８９又は９０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クロストリジウム・パーフリゲンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３５）  配列番号９１、９２又は９３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、コリネバクテリウム・アクアチウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３６）  配列番号９４、９５又は１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・オラリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３７）  配列番号９６、９７又は９８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・アウレウスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３８）  配列番号９９、１００又は１０１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ナイセリア・メニンギチディスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（３９）  配列番号１０２、１０３又は１０４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、カンピロバクター・フェタスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４０）  配列番号１０５、１０６又は１０７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・ガリナルムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４１）  配列番号１０８、１０６又は１０９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エンテロコッカス・カセリフラバスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４２）  配列番号１１０、１１１又は１１２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エロモナス・ハイドロフィラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４３）  配列番号１１３、１１４又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、サルモネラ・パラチフィＡを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４４）  配列番号１１５、１１４又は５３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、サルモネラ・チフィを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４５）  配列番号１１６、１１７又は１１８に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・エクイシミリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４６）  配列番号１１９、１２０又は１２１に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・カニスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４７）  配列番号５２、２３又は１２２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、クレブセラ・オキシトカを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４８）  配列番号４６、１２３又は１２４に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、スタフィロコッカス・サプロフィティカスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（４９）  配列番号１２５、１２６又は１２７に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、パスツレラ・ムルトシダを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５０）  配列番号１２８、１２９又は１３０に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、エイケネラ・コロデンスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５１）  配列番号１３１、１３２又は１３３に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５２）  配列番号１３４、１３５又は１３６に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、モラキセラ・カタラリスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５３）  配列番号１３７、１３８又は１３９に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、レジオネラ・ニューモフィラを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５４）  配列番号１４０、１４１又は１４２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５５）  配列番号１４３、１４４又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・アビウムを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５６）  配列番号１４６、１４７又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・イントラセルラレを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５７）  配列番号１４８、１４９又は１４５に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・カンサシを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５８）  配列番号１５０、１５１又は１５２に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、マイコバクテリウム・ゴルドネを検出及び／又は同定するためのプローブ。
（５９）  複数の微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における相同性検索によって、それぞれの微生物におけるＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域を特定し、該Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３領域の塩基配列において２種以上の微生物間で比較してミスマッチ部位を決定し、該ミスマッチ部位を含み、かつ塩基長が２０〜１００ｂｐの領域を決定することを含む、プローブの設計方法。
（６０）  （１）又は（２）に記載のプローブの１種以上を用いることを特徴とする、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、アシネトバクター・カルコアセチカス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、プロテウス・ミラビリス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、シュードモナス・エルギノサ、シトロバクター・フレンディ、ベイヨネラ・パルブーラ、プロビデンシア・スチュアーティ、ナイセリア・ゴノローエ、ストレプトコッカス・アガラクチエ、モルガネラ・モルガニ、バクテロイデス・フラジリス、スタフィロコッカス・ホミニス、スタフィロコッカス・ワルネリ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、エンテロバクター・クロアカ、エンテロバクター・アエロゲネス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ストレプトコッカス・コンステラータス、セラチア・マルセッセンス、ストレプトコッカス・アンギノサス、エシェリシア・コリ、クレブセラ・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・インターメディウス、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリネバクテリウム・アクアチウム、ストレプトコッカス・オラリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・メニンギチディス、カンピロバクター・フェタス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・カセリフラバス、エロモナス・ハイドロフィラ、サルモネラ・パラチフィＡ、サルモネラ・チフィ、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコッカス・カニス、クレブセラ・オキシトカ、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、パスツレラ・ムルトシダ、エイケネラ・コロデンス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、モラキセラ・カタラリス、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・ゴルドネから選択される１又は複数の微生物の検出及び／又は同定方法。
（６１）  微生物由来の塩基配列とプローブの塩基配列間でミスマッチが４個以上ある場合にハイブリダイズしないストリンジェンシー条件を用いて両配列をハイブリダイズさせることを含む、（６０）に記載の方法。
（６２）  同定すべき微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列とのミスマッチが３個以下である塩基配列を有する２種以上の微生物を検出し、該２種以上の微生物と異なる微生物のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの１種以上を用い、該２種以上の微生物のうち１種の微生物をさらに同定することを含む、（６０）又は（６１）に記載の方法。
（６３）  以下の工程：（ａ）同定すべき微生物から核酸を調製する工程、（ｂ）該核酸を請求項１又は２に記載のプローブとハイブリダイズさせる工程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイズの有無を検出し、各プローブに対するその検出シグナルパターンを特定する工程、（ｄ）工程（ｃ）において得られた検出シグナルパターンと、予め特定しておいた微生物の検出シグナルパターンとを比較して同定すべき微生物の種類を特定する工程、からなる（６０）又は（６１）に記載の方法。
（６４）  配列番号１５３及び１５４で示されるプライマーを用いて標的配列を含むヌクレオチドを増幅した後にプローブとハイブリダイズさせる、（６０）〜（６３）のいずれかに記載の方法。
（６５）  標的配列を含むヌクレオチドの増幅の際に、蛍光物質を用いて標識を行う、（６０）〜（６４）のいずれかに記載の方法。
（６６）  ＤＮＡチップ上で検出する、（６０）〜（６５）のいずれかに記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００２−１７４５６４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号１５３は合成ＤＮＡである。
配列番号１５４は合成ＤＮＡである。
発明を実施するための形態
本発明の微生物検出同定用のプローブ及びそれを用いた検出及び／又は同定方法についてさらに詳細に説明する。
本発明の第１の態様は、前述の表１に示す微生物から選択される１または複数の微生物を検出及び／又は同定するためのプローブであって、検出及び／又は同定すべき微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブである。
本発明においてプローブとは、核酸の相補的な配列が互いに特異的に結合する性質を利用して、ＤＮＡやＲＮＡ断片の中から特定の断片を検出し得るオリゴヌクレオチドＤＮＡやＲＮＡであり、特に、微生物由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは１６Ｓ  ｒＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列を有する標的核酸と特異的に結合するオリゴヌクレオチド配列である。
本発明の各微生物を検出及び／又は同定し得るプローブは、各微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域について検出同定対象の２種以上の微生物間でマルチプルアライメントを行ってミスマッチ部位を決定し、特に各微生物に対して特異性が高い領域を決定して当該プローブを作製することができる（図１参照）。本明細書において、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３領域とは、各微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの５’領域遺伝子配列（約５００ｂｐ）のうち、保存性の低い３つの領域であって、Ｖ１領域は５’末端からおおよそ第５０〜第１２０番目の塩基の領域であり、Ｖ２領域はおおよそ第１５０〜第２６０番目の塩基の領域であり、Ｖ３領域はおおよそ第４２０〜第５２０番目の塩基の領域である。
これらのＶ１〜Ｖ３領域から作製し得る検出同定用プローブは、検出、同定感度の点から検出同定すべき微生物間においてミスマッチが多い領域を用いるのが適当であり、ミスマッチは４ヶ所以上存在するのが好ましい。また、同定方法における検出感度、コスト等を考慮すると、プローブの塩基配列は２０〜１００ｂｐが好ましく、特に３０〜８０ｂｐが好ましい。なお、これらのプローブは、対応する各々の領域に応じて、ｖ１プローブ、ｖ２プローブ、ｖ３プローブと称する。
これらのプローブは、表１に示す微生物が特異的に検出、同定出来る限り、一部が修飾され、又はその塩基配列に欠失、置換又は付加が存在していてもよい。
具体的には、表１に記載した微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における相同性検索によってそれぞれの微生物におけるＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域を特定し、該Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３領域において２種以上の微生物の塩基配列を比較してミスマッチ部位を決定する。その結果を基にして、該ミスマッチ部位を含み、かつ塩基長が２０〜１００ｂｐのプローブを作製する。ミスマッチ部位はプローブの中央付近になるように設計するのが好ましい。表１に示す微生物のうち、その微生物自身のＶ１〜Ｖ３領域の塩基配列とその微生物以外の微生物由来のｖ１〜ｖ３プローブの塩基配列の間に最小ミスマッチ数が４個以上ある微生物は、プローブを単独で用いることによって検出、同定可能な微生物である。また、最小ミスマッチ数が３個以下の微生物は、複数のプローブによる検出結果を総合的に判断することによって検出、同定可能な微生物である。
各微生物に対する検出同定用プローブのＩＤとその配列番号を表２及び表３に示す。
2003106676.tif 000005
2003106676.tif 000006
表２は、単独で微生物の同定が可能なプローブを、表３は、組み合わせて同定が可能なプローブの例を示す。
例えば、表２からわかるように、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスを単独で特異的に検出同定し得るプローブは、配列番号２に示される塩基配列を有する０１  ｖ２プローブ及び配列番号３に示される塩基配列を有する０１  ｖ３プローブ、またはそれぞれの相補配列を有するプローブであり、アシネトバクター・カルコアセティカスを単独で特異的に検出同定し得るプローブは、配列番号４に示される塩基配列を有する０２  ｖ１プローブ、配列番号５に示される塩基配列を有する０２  ｖ２プローブ、配列番号６に示される塩基配列を有する０２  ｖ３プローブ、またはそれぞれの相補配列を有するプローブである。
また、表３には、他の微生物との１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が類似しているため、単独プローブによる検出・同定が困難な微生物を示してある。これら微生物の場合には、該当微生物の検出用に設計されたプローブだけでなく、他の微生物の検出用に設計されたプローブによるハイブリダイゼーションパターンを利用して、個々の微生物の検出同定を行う。例えば、表４に示されるように、ストレプトコッカス・ニューモニエを検出するための配列番号１６〜１８のプローブ０６  ｖ１〜ｖ３はいずれも、Ｖ１〜Ｖ３領域で他の微生物との間で最小のミスマッチ数が３塩基以内であるため、単独でストレプトコッカス・ニューモニエの検出・同定が困難である。そこで、配列番号１６〜１８のプローブ０６  ｖ１〜ｖ３だけでなく、配列番号８２、８３、１８のプローブ２９  ｖ１〜ｖ３および、配列番号９４、９５、１８のプローブ３４  ｖ１〜ｖ３、またはそれぞれの相補配列を有するプローブの検出結果を組み合わせて利用することで、検出・同定を行う。
これらのプローブは、天然由来のものであっても、化学合成等の常法によるものであってもよく、化学合成は、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザーを用いてホスホロアミダイト法により合成できる。また、公知のリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスファイト法等を用いることもできる。
本発明の第２の態様は、表１に示す微生物から選択される１または複数の微生物の検出及び／又は同定方法であって、検出同定すべき微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの１以上を用いることを特徴とする方法である。
すなわち、具体的には、本発明の検出同定方法は、微生物又はそれ由来の核酸を含む被検体に上記プローブを接触させてハイブリダイゼーションを行い、標識を指標にして表１の微生物を検出、同定する方法である。
微生物又はそれ由来の核酸を含む被検体は、核酸が微量である場合には、表１に示す微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む塩基配列を増幅させることができるプライマーを用いて増幅させる。なお、プライマーとは、核酸の合成反応にあたりポリヌクレオチド鎖が伸長していく出発点として働くポリヌクレオチドであり、本発明におけるフォワードプライマーは、Ｖ１領域より上流の各微生物間において保存性の高い領域であるおおよそ１から７０番目の塩基に存在する領域から設計するのが好ましく、リバースプライマーは、Ｖ３領域より下流の各微生物間において保存性の高い領域であるおおよそ４５０から６２０番目の塩基に存在する領域から設計するのが好ましい。また、そのサイズは、１５〜３５ｍｅｒが好ましく、特に１８〜３０ｍｅｒが好ましい。例えば、一例として、フォワードプライマーとしては、おおよそ第１から第７０番目の塩基に位置する、以下の配列番号１５３に示される２７Ｆプライマー、リバースプライマーとしては、おおよそ第４５０から第６２０番目の塩基に位置する、以下の配列番号１５４に示される５２５Ｒを用いることができる。これらのプライマーは天然由来のものであっても、常法により化学合成されたものであってもよい。化学合成は、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザーを用いてホスホロアミダイト法により合成できる。また、公知のリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスファイト法等を用いることもできる。
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微生物又はそれ由来の核酸を含む被検体は、予め以下のような常法により調製し、上記のプライマーを用いたＰＣＲ増幅に供する。例えば、サンプルから遠心分離法やメンブランフィルター等を用いて捕集された微生物に溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等の公知の処理方法を用いて核酸を抽出する。このうち、抽出の効率や純度、操作性の点などから、溶菌酵素を加える方法を用いるのが好ましい。なお、本発明において、核酸にはＲＮＡ、ＤＮＡが含まれる。また、本発明では、核酸が数分子から数十分子以上存在すればＰＣＲは達成され得る。サンプルとしては、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジェネート等の臨床検査材料、及び、食品材料等が挙げられる。
次に、抽出した核酸を鋳型とし、上記のプライマーを用いてＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０（１９８５））を実施する。本発明においては、上記プライマー（配列番号１５３及び１５４）を用いることによって、微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の５’末端からおおよそ第２７〜第５２５番目の塩基及びその近傍の配列を増幅させることが好ましい。ＰＣＲ法の反応条件や反応溶液は公知の情報に基づいて任意に設定することができる。例えば、熱変性：９０〜９５℃で１〜３０秒、アニーリング：３７〜６５℃で０〜３０秒、伸長反応：５０〜７５℃で１０〜６０秒、これを１サイクルとして３０〜５０サイクル行って増幅するのが好ましい。ＰＣＲ法の増幅結果は、必要に応じ、反応を終えた溶液をそのままアガロールゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチドの存在、及びその長さを確認することができる。
増幅された微生物の核酸は、上記の本発明のプローブを用いたハイブリダイゼーションに用いることができる。本発明において、ハイブリダイゼーションとは、特定の条件下において、相補的な配列を有する２つの１本鎖の塩基配列が結合して、２本鎖を形成することを意味する。また、特定の条件とは、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーな条件を意味し、特に、本発明では、微生物由来の塩基配列と本発明のプローブの塩基配列間でミスマッチが４個以上ある場合にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェンシーな条件は、実施されるハイブリダイゼーションの条件によって異なるが、当業者であればハイブリダイゼーションのプロトコルに基づいて、温度、塩濃度、活性剤濃度等の溶媒組成等の条件を適宜設定することができる。一例としては、５０ｍｅｒのプローブとのハイブリダイゼーションの場合、５５℃、０．５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで実施することができる。なお、目的に応じ、ストリンジェンシーを高くすることによって、ミスマッチ数が３個以上、２個以上、又は１個以上でハイブリダイズすることができないように設定することが可能である。また、ストリンジェンシーを低くすることによって、ミスマッチが５個以下、６個以下等でもハイブリダイズできるように設定することもできる。
ハイブリダイズの可否は、上記のように調製した微生物から抽出し、増幅した核酸を予めフルオロセインイソチオシアネートやテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質やハプテン等で標識し、プローブを前記の標識化した核酸とハイブリダイズさせた後、蛍光色素等の標識を測定することによって確認することができる。標識化は、例えば、ニックトランスレーション法、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法や５’側の末端が蛍光物質またはハプテン等で標識された標識化プライマーを用いて核酸増幅を行うことにより得ることができる。
本発明の検出同定方法には、単独のプローブの使用によって、表２に示す特定の微生物を検出、同定する方法が含まれる。例えば、同定すべき微生物自身のＶ１〜Ｖ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列と、その微生物以外の微生物由来の塩基配列との間に最小ミスマッチ数が４個以上存在する前記プローブを使用することによって、微生物を検出するとともに同定することができる（表２及び表４を参照）。
また、本発明の方法には、本発明の複数のプローブによる検出結果を総合的に判断することによって、表３に示す特定の微生物を検出し、さらに同定する方法も含まれる。具体的には、第１ステップとして、同定すべき微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列とのミスマッチが３個以下である塩基配列を有する２種以上の微生物を検出し、第２ステップとして、該２種以上の微生物と異なる微生物のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域内の２０〜１００ｂｐの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの１種以上を用い、該２種以上の微生物のうち１種の微生物をさらに同定する方法である。
例えば、一例を表６１に示している（実施例３参照）。ＩＤ  ０６微生物（ストレプトコッカス・ニューモニエ）の０６  ｖ１〜ｖ３プローブとＩＤ  ２９微生物（ストレプトコッカス・ミティス）に対応する塩基配列とはミスマッチが３個以下であるので、０６  ｖ１〜ｖ３プローブを用いて検出される微生物は、ＩＤ  ０６微生物とＩＤ  ２９微生物のいずれであるかまでは同定できない。しかしながら、第２ステップとして、ＩＤ  ３４微生物（ストレプトコッカス・オラリス）由来の３４  ｖ１〜ｖ３プローブを用いて検出方法を行うと、ＩＤ  ０６微生物は３４  ｖ３プローブとのみハイブリダイズしてシグナルが検出され、ＩＤ  ２９微生物は３４  ｖ２及びｖ３プローブとそれぞれハイブリダイズしてシグナルが検出される。従って、０６  ｖ１〜ｖ３プローブを用いて検出された微生物は、さらにＩＤ  ３４微生物（ストレプトコッカス・オラリス）由来の３４  ｖ１〜ｖ３プローブを用いた検出を行うことによって、ＩＤ  ０６微生物であるかＩＤ  ２９微生物であるかを同定することができる。
なお、臨床や食品衛生の分野において、検出すべき微生物が試料中に存在する可能性があるか否かをいち早く確認することが必要であり、微生物の同定まで行う必要がない場合、また、同時に検出され得る複数の微生物が近縁の種であり、それら複数の微生物に対する治療方法などの対処方法がすでに明らかである場合には、上記の第１ステップを実施するだけでよい。
また、本発明の方法には、（ａ）同定すべき微生物から核酸を調製する工程、（ｂ）該核酸を本発明のプローブとハイブリダイズさせる工程、（ｃ）工程（ｂ）におけるハイブリダイズの有無を検出し、各プローブに対するその検出シグナルパターンを特定する工程、（ｄ）工程（ｃ）において得られた検出シグナルパターンと、予め特定しておいた、表１に示す微生物の検出シグナルパターンとを比較して同定すべき微生物の種類を特定する工程からなる方法も含まれる。この場合、検出シグナルパターンをコンピュータ処理等によって解析することによって、微生物の検出、同定効率を一層高めることができる。また、この検出シグナルパターンによる方法は、ＤＮＡチップ上で実施することによって、より迅速に、効果的に行うことができる。
ＤＮＡチップ上での検出同定方法としては、具体的には、以下のように実施することができる。本発明のプローブを、例えば、ガラス、シリコン等の支持体上の各位置（スポット）に共有結合等により固定化する。その支持体上に、上記のようにして得られた標識化核酸を含む溶液をかけると、各スポット内のプローブの塩基配列に相補的な塩基配列を有する試料中の微生物由来核酸の塩基配列がハイブリダイズして二本鎖を形成し、支持体上に残る。ハイブリダイゼーションした結合体の標識又はハイブリダイゼーションしなかった標識を測定することによって、被検体中の微生物を検出同定することができる。
実施例
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］  微生物同定用プローブの調製と同定チップの作製
（プローブ調製用微生物）
本発明のプローブを調製するために、表１に示す微生物を標準菌株として用いた。なお、微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ株）、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源部門（財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の微生物株分譲業務を引継ぎ、微生物の分譲を行っている）（ＩＦＯ株）、東京大学医科学研究所（ＩＩＤ株）等から入手可能である。
（微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ５’領域遺伝子配列（約５００ｂｐ）のＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域の決定とプローブとして利用可能な塩基配列の決定とプローブの調製）
表１に示す微生物のＶ１、Ｖ２、Ｖ３領域は、１６Ｓ  ｒＲＮＡをシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）で解読した塩基配列についてマルチプルアライメント（日立ソフトＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ）を実行し、決定した。更に、ブラストと呼ばれるアルゴリズム（日立ソフトＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ）を用いて、それらの領域においてミスマッチ部位を特定した。該ミスマッチ部位が中央付近にくるようにプローブの塩基配列を設計した。
表４に、それぞれの微生物について設計されたｖ１〜ｖ３プローブについて、各プローブが由来する微生物以外の微生物のＶ１〜Ｖ３領域の配列とハイブリダイズさせることを想定した場合のミスマッチ塩基数の中で最小となる数値（最小ミスマッチ数）を示す。ｖ１〜ｖ３プローブのいずれかにおいて最小ミスマッチ数が４以上であれば、単独のプローブによってその微生物が検出・同定可能である。ｖ１〜ｖ３プローブのいずれにおいても最小ミスマッチ数が３以下であるばあいには単独のプローブによって検出・同定ができないが、後述するように本発明の方法によって検出・同定できる。なお、表４中、ｎｏｎｅとは、有意な相同性のある配列がなかったということを表す。
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（ＤＮＡチップの作製）
表１に示す微生物の各ｖ１〜ｖ３プローブを合成し、ＨＰＬＣ精製の後凍結乾燥した状態で保存した。これらを２０μＭに調整し、マイクロアレイスポッティングソリューション（ジェネティックス社）と１：１で混合した。全てのサンプルをスポッター（日立ソフト社  ＳＰＢＩＯ）にて２×４ブロックにスポットし、レプリカを含め合計４×４ブロックとした。それぞれのブロックの４端にはポジティブコントロールをスポットした。スポッターで使用するピンは、ステンレス・スチールピン１５０μｍとした。スポットした後、０．２％  ＳＤＳ溶液・水・沸騰水に入れ、スライドウォッシャー（バイオフィールド社）にてチップを洗浄し、以下の実験に用いた。
［実施例２］  微生物同定プローブを用いた微生物の同定方法
（微生物ＤＮＡ抽出溶液の調製）
表１に示す微生物をＬＢ培地寒天培地（酵母エキス５ｇ、トリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．４）で培養した後、集菌した。３００μｌの１％  Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ），６０Ｕｎｉｔ  Ｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ），６００Ｕｎｉｔ  Ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（和光純薬）を含むＣｅｌｌ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（溶菌酵素液）を加え懸濁し、３７℃で２時間加温した。次に、６００ｍＵ／μｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を３０μｌ加え、７０℃で１０分間加温した。
この溶液に５Ｍグアニジン塩酸−１００ｍＭトリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）を３３０μｌ加え、１０分間混合した。その後、ＴＥ飽和フェノール：クロロホルム液（１：１）６００μｌを加えて懸濁した後、微量高速遠心分離機を用い１５，０００ｒｐｍ  １０分間２５℃で遠心分離した。上層を６００μｌ分取し、６０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１８００μｌの９９．５％エタノールを加え混和し、−８０℃で１０分間放置後、８，０００ｒｐｍ１５分間４℃で遠心分離した。７０％冷エタノールでリンスした後、沈殿を乾燥させ、滅菌蒸留水１００μｌを加えて十分に溶解した。この溶液をＰＣＲに供した。
（ＰＣＲによるターゲットＤＮＡの増幅）
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用し、５０μｌの反応液量で行った。反応液５０μｌ中には、１μｌの鋳型ＤＮＡ（上記微生物ＤＮＡ抽出溶液）、５μｌの１０Ｘバッファー（Ｚ−Ｔａｑ用）、０．７５ｕｎｉｔｓ  Ｚ−Ｔａｑ（宝酒造）、６ｎｍｏｌｅ  ｄＮＴＰｓ、フォワードプライマー２７Ｆ（配列番号１５３）、リバースプライマー５２５Ｒ（配列番号１５４）各６ｐｍｏｌｅが含まれる。
ＰＣＲの条件は、９８℃で２分の後、９８℃で１秒、６０℃で９０秒を１サイクルとし、３５サイクル反応させ、微生物中のターゲット遺伝子のＰＣＲ増幅産物を得た。反応終了後、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ５０  Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）によるスピンカラム法により基質を除去後、凍結乾燥により濃縮乾固させ、１０μｌの滅菌超純水にて溶解し、ターゲットＤＮＡ溶液とした。
（ＰＣＲ増幅産物の標識）
Ｎｉｃｋ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、上記のターゲットＤＮＡをＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋＴＭＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識した。標識反応液２０μｌ中には、１μｇの上記ターゲットＤＮＡ溶液、３．５μｌＥｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ、０．０４ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０４ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．０４ｍＭ  ｄＧＴＰ、２μｌ  １０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ、０．１ｍＭ  ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋＴＭＣｙ５−ｄＵＴＰが含まれる。反応条件は、１５℃、２時間で行った。反応後、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ５０  Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）によるスピンカラム法で精製した。精製した反応物を凍結乾燥し、１０μｌ滅菌超純水に溶解した。
（ハイブリダイゼーション）
２μｌの上記標識ターゲットＤＮＡを加えて、最終濃度が５０％ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ、２％ＳＤＳ、１％ＢＳＡとなるようにハイブリダイゼーション溶液を調整した。この溶液１５μｌを９８℃、２分間ディネイチャーさせた。
実施例１で作製した微生物同定チップ上に滴下し、２４ｘ２５ｍｍハイブリカバースライド（ビーエム機器社）を乗せ、５５℃の恒温槽で２時間反応させた。反応後、細菌同定チップを２ｘ  ｓｓｃ溶液に浸し、ハイブリカバースライドを滑り落とした。さらに、２ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液へ移し、５分間洗浄後、０．２ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで５分間洗浄した。さらに０．５ｘ  ＳＳＣで１分間洗浄した。
微生物同定チップを２０００ｒｐｍ、１分間遠心乾燥した後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ４０００（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）で常温、室温の元、シグナル検出した。なお、シグナルの強度をより明確に判断するために、検出されたシグナルを日立ソフトＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ａｒｒａｙによって数値化し、輝度値とした。
表５には、微生物ＩＤ  ０１のアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドを微生物同定チップに調製された各微生物のｖ１プローブ、ｖ２プローブ及びｖ３プローブとハイブリダイズさせ、シグナルの輝度値が高かった上位１０種類のプローブを各領域毎に示した。表５中、プローブＩＤは、表１に示す微生物ＩＤの番号とｖ１〜ｖ３領域を組み合わせて示している。
例えば、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１領域の結果をみると、プローブ０１  ｖ１の輝度値が著しく高いので、プローブ０１  ｖ１は被検体中にアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスが存在する可能性があることを検出することができる。ただし、この場合、プローブ０１  ｖ１以外にプローブ０３  ｖ１が類似の輝度値を示すので、プローブ０１  ｖ１の単独使用による同定はできない。これは、プローブ０１  ｖ１の塩基配列が他の微生物由来の塩基配列に対してミスマッチ塩基数が３個以下であるため、類似のプローブ０１  ｖ１と相同性の高い塩基配列を有する他の微生物ともハイブリダイズしてしまうからである（表１を参照）。従って、プローブ０１  ｖ１によって検出された微生物がいずれの微生物であるかを詳細に同定する必要がある場合には、さらなる同定ステップを行う必要がある。
一方、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ２領域の結果をみると、プローブ０１  ｖ２の輝度値のオーダーが他のプローブに比べて著しく高いので、プローブ０１  ｖ２を用いて被検体中のアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの存在を検出、同定することができる。
また、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ３領域の結果をみると、プローブ０１  ｖ３の輝度値のオーダーが他のプローブに比べて著しく高いので、プローブ０１  ｖ３を用いて被検体中のアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスの存在を検出、同定することができる。
また、Ｖ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域のプローブの組合せから総合的に判断して、ｖ１プローブにおいて比較的シグナル強度の高いプローブは０３  ｖ１および０１  ｖ１であり、ｖ２プローブにおいて比較的シグナル強度の高いプローブは０１  ｖ２であり、ｖ３プローブにおいて比較的シグナル強度の強いプローブは０１  ｖ３であることから、対象微生物は、全ての領域に共通して強いシグナル強度が検出されたアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスであると検出・同定することができる。
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表６は、アシネトバクター・カルコアセチカス（微生物ＩＤ  ０２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表６の結果から、アシネトバクター・カルコアセチカスは、プローブ０２  ｖ１、０２  ｖ２、０２  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは０２  ｖ１、ｖ２プローブでは０２  ｖ２、ｖ３プローブでは０２  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたアシネトバクター・カルコアセチカスであると検出・同定することができる。
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表７は、ヘモフィルス・インフルエンザ（微生物ＩＤ  ０３）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表７の結果から、ヘモフィルス・インフルエンザは、プローブ０３  ｖ２、０３  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは０３  ｖ１、０１  ｖ１、ｖ２プローブでは０３  ｖ２、ｖ３プローブでは０３  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたヘモフィルス・インフルエンザであると検出・同定することができる。
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表８は、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（微生物ＩＤ  ０４）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表８の結果から、ステノトロフォモナス・マルトフィリアは、プローブ０４  ｖ１、０４  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは０４  ｖ１、ｖ２プローブでは０４  ｖ２、０２  ｖ２、ｖ３プローブでは０４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたステノトロフォモナス・マルトフィリアであると検出・同定することができる。
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表９は、プロテウス・ミラビリス（微生物ＩＤ  ０５）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表９の結果から、プロテウス・ミラビリスは、プローブ０５  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは０５  ｖ１、０１  ｖ１、ｖ２プローブでは０５  ｖ２、ｖ３プローブでは０５  ｖ３、４５  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたプロテウス・ミラビリスであると検出・同定することができる。
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表１０は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ０６）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１０の結果から、ストレプトコッカス・ニューモニエは、プローブ０６  ｖ１〜０６  ｖ３の単独使用により同定はできなかった。しかしながら、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは０６  ｖ１、２９  ｖ１、ｖ２プローブでは０６  ｖ２、２９  ｖ２、ｖ３プローブでは０６＿２９＿３４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・ニューモニエであると検出・同定することができる。
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表１１は、シュードモナス・エルギノサ（微生物ＩＤ  ０７）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１１の結果から、シュードモナス・エルギノサは、プローブ０７  ｖ１、０７  ｖ２、０７  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは０７  ｖ１、ｖ２プローブでは０７  ｖ２、ｖ３プローブでは０７  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたシュードモナス・エルギノサであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000016
表１２は、シトロバクター・フレンディ（微生物ＩＤ  ０８）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１２の結果から、シトロバクター・フレンディは、プローブ０８  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは０８  ｖ１、１８＿４５  ｖ１、ｖ２プローブでは４１＿４２  ｖ２、０８＿１８＿２２＿４５  ｖ２、２４  ｖ２、１９  ｖ２、ｖ３プローブでは０８  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたシトロバクター・フレンディであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000017
表１３は、ベイヨネラ・パルブーラ（微生物ＩＤ  ０９）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１３の結果から、ベイヨネラ・パルブーラは、プローブ０９  ｖ１、０９  ｖ２、０９  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは０９  ｖ１、ｖ２プローブでは０９  ｖ２、ｖ３プローブでは０９  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたベイヨネラ・パルブーラであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000018
表１４は、プロビデンシア・スチュアーティ（微生物ＩＤ  １０）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１４の結果から、プロビデンシア・スチュアーティは、プローブ１０  ｖ１、１０  ｖ２、１０  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは１０  ｖ１、１３＿ｖ１、ｖ２プローブでは１０  ｖ２、ｖ３プローブでは１０  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたプロビデンシア・スチュアーティであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000019
表１５は、ナイセリア・ゴノローエ（微生物ＩＤ  １１）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１５の結果から、ナイセリア・ゴノローエは、プローブ１１  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは１１  ｖ１、３６  ｖ１、ｖ２プローブでは１１  ｖ２、３６  ｖ２、ｖ３プローブでは１１  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたナイセリア・ゴノローエであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000020
表１６は、ストレプトコッカス・アガラクチエ（微生物ＩＤ  １２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１６の結果から、ストレプトコッカス・アガラクチエは、プローブ１２  ｖ１、１２  ｖ２、１２  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは１２  ｖ１、ｖ２プローブでは１２  ｖ２、ｖ３プローブでは１２  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・アガラクチエであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000021
表１７は、モルガネラ・モルガニ（微生物ＩＤ  １３）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１７の結果から、モルガネラ・モルガニは、プローブ１３  ｖ２、１３  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは１３  ｖ１、１０  ｖ１、ｖ２プローブでは１３  ｖ２、ｖ３プローブでは１３  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたモルガネラ・モルガニであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000022
表１８は、バクテロイデス・フラジリス（微生物ＩＤ  １４）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１８の結果から、バクテロイデス・フラジリスは、プローブ１４  ｖ１、１４  ｖ２、１４  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは１４  ｖ１、ｖ２プローブでは１４  ｖ２、ｖ３プローブでは１４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたバクテロイデス・フラジリスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000023
表１９は、スタフィロコッカス・ホミニス（微生物ＩＤ  １５）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表１９の結果から、スタフィロコッカス・ホミニスは、プローブ１５  ｖ１〜１５  ｖ３の単独使用により検出、同定できることができなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは１６＿４６  ｖ１、１５  ｖ１、１７  ｖ１、ｖ２プローブでは１５  ｖ２、１６  ｖ２、ｖ３プローブでは１５  ｖ３、１６  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたスタフィロコッカス・ホミニスもしくはスタフィロコッカス・ワルネリの存在が示唆された。
2003106676.tif 000024
表２０は、スタフィロコッカス・ワルネリ（微生物ＩＤ  １６）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２０の結果から、スタフィロコッカス・ワルネリは、プローブ１６  ｖ１〜１６  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは１６＿４６  ｖ１、１５  ｖ１、１７  ｖ１、ｖ２プローブでは１６  ｖ２、３５  ｖ２、ｖ３プローブでは１６  ｖ３、３５  ｖ３、１５  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたスタフィロコッカス・ワルネリの検出・同定が可能であった。
2003106676.tif 000025
表２１は、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（微生物ＩＤ  １７）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２１の結果から、スタフィロコッカス・ヘモリティカスは、プローブ１７  ｖ１〜１７  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは１７  ｖ１、１５  ｖ１、１６＿４６  ｖ１、ｖ２プローブでは１７  ｖ２、１５  ｖ２、ｖ３プローブでは１７  ｖ３、２０  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたスタフィロコッカス・ヘモリティカスであると検出・同定することができた。
2003106676.tif 000026
表２２は、エンテロバクター・クロアカ（微生物ＩＤ  １８）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２２の結果から、エンテロバクター・クロアカは、プローブ１８  ｖ１、１８  ｖ２、１８  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せを総合的に考えた場合、ｖ１プローブでは１８＿４５  ｖ１、ｖ２プローブでは０８＿１８＿２２＿４５  ｖ２、４１＿４２  ｖ２、２４  ｖ２、ｖ３プローブでは１８＿４１＿４２  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエンテロバクター・クロアカであると検出・同定することができた。
2003106676.tif 000027
表２３は、エンテロバクター・アエロゲネス（微生物ＩＤ  １９）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２３の結果から、エンテロバクター・アエロゲネスは、プローブ１９  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは１９＿２５  ｖ１、ｖ２プローブでは１９  ｖ２、０８＿１８＿２２＿４５  ｖ２、ｖ３プローブでは１９  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエンテロバクター・アエロゲネスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000028
表２４は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（微生物ＩＤ  ２０）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２４の結果から、スタフィロコッカス・エピデルミディスは、プローブ２０  ｖ１、２０  ｖ２、２０  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは２０  ｖ１、１５  ｖ１、ｖ２プローブでは２０  ｖ２、３５  ｖ２、１７  ｖ２、ｖ３プローブでは２０  ｖ３、４６  ｖ３、１７  ｖ３、１６  ｖ３、１５  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたスタフィロコッカス・エピデルミディスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000029
表２５は、ストレプトコッカス・コンステラータス（微生物ＩＤ  ２１）の１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２５の結果から、ストレプトコッカス・コンステラータスは、プローブ２１  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは２１＿３０  ｖ１、ｖ２プローブでは３０  ｖ２、２１  ｖ２、ｖ３プローブでは２１  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・コンステラータスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000030
表２６は、セラチア・マルセッセンス（微生物ＩＤ  ２２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２６の結果から、セラチア・マルセッセンスは、プローブ２２  ｖ１、２２  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは２２  ｖ１、ｖ２プローブでは０８＿１８＿２２＿４５  ｖ２、ｖ３プローブでは２２  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたセラチア・マルセッセンスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000031
表２７は、ストレプトコッカス・アンギノサス（微生物ＩＤ  ２３）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２７の結果から、ストレプトコッカス・アンギノサスは、プローブ２３  ｖ１、２３  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは２３  ｖ１、ｖ２プローブでは２３  ｖ２、ｖ３プローブでは２３＿３０  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・アンギノサスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000032
表２８は、エシェリシア・コリ（微生物ＩＤ  ２４）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２８の結果から、エシェリシア・コリは、プローブ２４  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは２４  ｖ１、４１  ｖ１、ｖ２プローブでは０８＿１８＿２２＿４５  ｖ２、２４  ｖ２、４１＿４２  ｖ２、ｖ３プローブでは２４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエシェリシア・コリであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000033
表２９は、クレブセラ・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ２５）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表２９の結果から、クレブセラ・ニューモニエは、プローブ２５  ｖ１、２５  ｖ２、２５  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せを総合的に判断すると、ｖ１プローブでは１９＿２５  ｖ１、１８＿４５  ｖ１、ｖ２プローブでは２５  ｖ２、１９  ｖ２、ｖ３プローブでは２５  ｖ３、４５  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたクレブセラ・ニューモニエであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000034
表３０は、エンテロコッカス・フェカリス（微生物ＩＤ  ２６）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３０の結果から、エンテロコッカス・フェカリスは、プローブ２６  ｖ１、２６  ｖ２、２６  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは２６  ｖ１、ｖ２プローブでは２６  ｖ２、ｖ３プローブでは２６  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエンテロコッカス・フェカリスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000035
表３１は、エンテロコッカス・フェシウム（微生物ＩＤ  ２７）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３１の結果から、エンテロコッカス・フェシウムは、プローブ２７  ｖ１、２７  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは２７  ｖ１、ｖ２プローブでは２７  ｖ２、ｖ３プローブでは２７  ｖ３、３９  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエンテロコッカス・フェシウムであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000036
表３２は、ストレプトコッカス・サングイス（微生物ＩＤ  ２８）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３２の結果から、ストレプトコッカス・サングイスは、プローブ２８  ｖ１、２８  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブで２８  ｖ１、ｖ２プローブでは２８  ｖ２、ｖ３プローブでは２８  ｖ３、０６＿２９＿３４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・サングイスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000037
表３３は、ストレプトコッカス・ミティス（微生物ＩＤ  ２９）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３３の結果から、ストレプトコッカス・ミティスは、プローブ２９  ｖ１、２９  ｖ２、２９  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは２９  ｖ１、２８  ｖ１、ｖ２プローブでは２９  ｖ２、０６  ｖ２、ｖ３プローブでは０６＿２９＿３４  ｖ３、２８  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・ミティスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000038
表３４は、ストレプトコッカス・インターメディウス（微生物ＩＤ  ３０）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３４の結果から、ストレプトコッカス・インターメディウスは、プローブ３０  ｖ１、３０  ｖ２、３０  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは２１＿３０  ｖ１、ｖ２プローブでは３０  ｖ２、２１  ｖ２、ｖ３プローブでは２３＿３０  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・インターメディウスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000039
表３５は、リステリア・モノサイトゲネス（微生物ＩＤ  ３１）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３５の結果から、リステリア・モノサイトゲネスは、プローブ３１  ｖ１、３１  ｖ２、３１  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは３１  ｖ１、ｖ２プローブでは３１  ｖ２、ｖ３プローブでは３１  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたリステリア・モノサイトゲネスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000040
表３６は、クロストリジウム・パーフリンゲンス（微生物ＩＤ  ３２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３６の結果から、クロストリジウム・パーフリンゲンスは、プローブ３２  ｖ１、３２  ｖ２、３２  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは３２  ｖ１、ｖ２プローブでは３２  ｖ２、ｖ３プローブでは３２  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたクロストリジウム・パーフリンゲンスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000041
表３７は、コリネバクテリウム・アクアチウム（微生物ＩＤ  ３３）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３７の結果から、コリネバクテリウム・アクアチウムは、プローブ３３  ｖ１、３３  ｖ２、３３  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは３３  ｖ１、ｖ２プローブでは３３  ｖ２、ｖ３プローブでは３３  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたコリネバクテリウム・アクアチウムであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000042
表３８は、ストレプトコッカス・オラリス（微生物ＩＤ  ３４）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３８の結果から、ストレプトコッカス・オラリスは、プローブ３４  ｖ１の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは３４  ｖ１、ｖ２プローブでは３４  ｖ２、２９  ｖ２、ｖ３プローブでは０６＿２９＿３４  ｖ３、２８  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・オラリスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000043
表３９は、スタフィロコッカス・アウレウス（微生物ＩＤ  ３５）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表３９の結果から、スタフィロコッカス・アウレウスは、プローブ３５  ｖ１の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは３５  ｖ１、ｖ２プローブでは３５  ｖ２、２０  ｖ２、ｖ３プローブでは３５  ｖ３、１６  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたスタフィロコッカス・アウレウスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000044
表４０は、ナイセリア・メニンギチディス（微生物ＩＤ  ３６）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４０の結果から、ナイセリア・メニンギチディスは、プローブ３６  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは３６  ｖ１、１１  ｖ１、ｖ２プローブでは３６  ｖ２、１１  ｖ２、ｖ３プローブでは３６  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたナイセリア・メニンギチディスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000045
表４１は、カンピロバクター・フェタス（微生物ＩＤ  ３７）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４１の結果から、カンピロバクター・フェタスは、プローブ３７  ｖ１、３７  ｖ２、３７  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは３７  ｖ１、ｖ２プローブでは３７  ｖ２、ｖ３プローブでは３７  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたカンピロバクター・フェタスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000046
表４２は、エンテロコッカス・ガリナルム（微生物ＩＤ  ３８）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４２の結果から、エンテロコッカス・ガリナルムは、プローブ３８  ｖ１、３８  ｖ２、３８  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは３８  ｖ１、３９  ｖ１、ｖ２プローブでは３８＿３９  ｖ２、ｖ３プローブでは３８  ｖ３、３９  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエンテロコッカス・ガリナルムもしくはエンテロコッカス・カセリフラバスの存在が検出可能であった。
2003106676.tif 000047
表４３は、エンテロコッカス・カセリフラバス（微生物ＩＤ  ３９）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４３の結果から、エンテロコッカス・カセリフラバスは、プローブ３９  ｖ１、３９  ｖ２、３９  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは３９  ｖ１、３８  ｖ１、ｖ２プローブでは３８＿３９  ｖ２、ｖ３プローブでは３９  ｖ３、３８  ｖ３、２７  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエンテロコッカス・カセリフラバスもしくはエンテロコッカス・ガリナルムの存在が検出できる。
2003106676.tif 000048
表４４は、エロモナス・ハイドロフィラ（微生物ＩＤ  ４０）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４４の結果から、エロモナス・ハイドロフィラは、プローブ４０  ｖ１、４０  ｖ２、４０  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは４０  ｖ１、ｖ２プローブでは４０  ｖ２、ｖ３プローブでは４０  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエロモナス・ハイドロフィラであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000049
表４５は、サルモネラ・パラチフィＡ（微生物ＩＤ  ４１）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４５の結果から、サルモネラ・パラチフィＡは、プローブ４１  ｖ１、４１  ｖ２、４１  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは４１  ｖ１、４２  ｖ１、ｖ２プローブでは４１＿４２  ｖ２、０８＿１８＿２２＿４５＿ｖ２、ｖ３プローブでは１８＿４１＿４２  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたサルモネラ・パラチフィＡもしくはサルモネラ・チフィの存在が検出可能であった。
2003106676.tif 000050
表４６は、サルモネラ・チフィ（微生物ＩＤ  ４２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４６の結果から、サルモネラ・チフィは、プローブ４２  ｖ１、４２  ｖ２、４２  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは４１  ｖ１、４２  ｖ１、ｖ２プローブでは４１＿４２  ｖ２、０８＿１８＿２２＿４５  ｖ２、ｖ３プローブでは１８＿４１＿４２  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたサルモネラ・チフィもしくはサルモネラ・パラチフィＡの存在が検出可能であった。
2003106676.tif 000051
表４７は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（微生物ＩＤ  ４３）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４７の結果から、ストレプトコッカス・エクイシミリスは、プローブ４３  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは４３  ｖ１、４９  ｖ１、４４  ｖ１、ｖ２プローブでは４３  ｖ２、ｖ３プローブでは４３  ｖ３、４９  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・エクイシミリスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000052
表４８は、ストレプトコッカス・カニス（微生物ＩＤ  ４４）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４８の結果から、ストレプトコッカス・カニスは、プローブ４４  ｖ１、４４  ｖ２、４４  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは４４  ｖ１、ｖ２プローブでは４４  ｖ２、ｖ３プローブでは４４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・カニスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000053
表４９は、クレブセラ・オキシトカ（微生物ＩＤ  ４５）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表４９の結果から、クレブセラ・オキシトカは、プローブ４５  ｖ１、４５  ｖ２、４５  ｖ３の単独使用により同定はできなかったが、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断すると、ｖ１プローブでは１８＿４５  ｖ１、１９＿２５  ｖ１、ｖ２プローブでは４１＿４２  ｖ２、０８＿１８＿２２＿４５  ｖ２、ｖ３プローブでは４５  ｖ３、０５  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたクレブセラ・オキシトカであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000054
表５０は、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（微生物ＩＤ  ４６）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５０の結果から、スタフィロコッカス・サプロフィティカスは、プローブ４６  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは１６＿４６  ｖ１、１７  ｖ１、１５  ｖ１、ｖ２プローブでは４６  ｖ２、ｖ３プローブでは４６  ｖ３、１５  ｖ３、２０  ｖ３、１６  ｖ３、１７  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたスタフィロコッカス・サプロフィティカスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000055
表５１は、パスツレラ・ムルトシダ（微生物ＩＤ  ４７）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５１の結果から、パスツレラ・ムルトシダは、プローブ４７  ｖ２、４７  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは４７  ｖ１、０１  ｖ１、ｖ２プローブでは４７  ｖ２、ｖ３プローブでは４７  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたパスツレラ・ムルトシダであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000056
表５２は、エイケネラ・コロデンス（微生物ＩＤ  ４８）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５２の結果から、エイケネラ・コロデンスは、プローブ４８  ｖ１、４８  ｖ２、４８  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは４８  ｖ１、ｖ２プローブでは４８  ｖ２、ｖ３プローブでは４８  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたエイケネラ・コロデンスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000057
表５３は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（微生物ＩＤ  ４９）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５３の結果から、ストレプトコッカス・ピオゲネスは、プローブ４９  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは４９  ｖ１、４３  ｖ１、ｖ２プローブでは４９  ｖ２、ｖ３プローブでは４９  ｖ３、４３  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス・ピオゲネスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000058
表５４は、モラキセラ・カタラリス（微生物ＩＤ  ５０）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５４の結果から、モラキセラ・カタラリスは、プローブ５０  ｖ１、５０  ｖ２、５０  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せを総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは５０  ｖ１、ｖ２プローブでは５０  ｖ２、ｖ３プローブでは５０  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたモラキセラ・カタラリスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000059
表５５は、レジオネラ・ニューモフィラ（微生物ＩＤ  ５１）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５５の結果から、レジオネラ・ニューモフィラは、プローブ５１  ｖ１、５１  ｖ２、５１  ｖ３の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは５１  ｖ１、ｖ２プローブでは５１  ｖ２、ｖ３プローブでは５１  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたレジオネラ・ニューモフィラであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000060
表５６は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（微生物ＩＤ  ５２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５６の結果から、マイコバクテリウム・ツベルクロシスは、プローブ５２  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは５２  ｖ１、５５  ｖ１、ｖ２プローブでは５２  ｖ２、ｖ３プローブでは５２＿５５  ｖ３、５３＿５４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたマイコバクテリウム・ツベルクロシスであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000061
表５７は、マイコバクテリウム・アビウム（微生物ＩＤ  ５３）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５７の結果から、マイコバクテリウム・アビウムは、プローブ５３  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは５３  ｖ１、５４  ｖ１、ｖ２プローブでは５３  ｖ２、ｖ３プローブでは５６  ｖ３、５３＿５４  ｖ３、５２＿５５  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたマイコバクテリウム・アビウムであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000062
表５８は、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（微生物ＩＤ  ５４）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５８の結果から、マイコバクテリウム・イントラセルラレは、プローブ５４  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは５４  ｖ１、５３  ｖ１、ｖ２プローブでは５４  ｖ２、ｖ３プローブでは５６  ｖ３、５３＿５４ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたマイコバクテリウム・イントラセルラレであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000063
表５９は、マイコバクテリウム・カンサシ（微生物ＩＤ  ５５）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表５９の結果から、マイコバクテリウム・カンサシは、プローブ５５  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは５５  ｖ１、５２  ｖ１、ｖ２プローブでは５５  ｖ２、ｖ３プローブでは５２＿５５  ｖ３、５６  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたマイコバクテリウム・カンサシであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000064
表６０は、マイコバクテリウム・ゴルドネ（微生物ＩＤ  ５６）の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１〜Ｖ３領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさせた結果を示す。表６０の結果から、マイコバクテリウム・ゴルドネは、プローブ５６  ｖ１、５６  ｖ２の単独使用により検出、同定できることが明らかである。また、ｖ１、ｖ２、ｖ３プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、ｖ１プローブでは５６  ｖ１、ｖ２プローブでは５６  ｖ２、ｖ３プローブでは５６  ｖ３、５３＿５４  ｖ３が比較的強いシグナル強度をもつため、各領域で高い強度が検出されたマイコバクテリウム・ゴルドネであると検出・同定することができる。
2003106676.tif 000065
［実施例３］  複数のプローブによるシグナル結果に基づく微生物の同定方法
上記表３に記載された微生物由来のｖ１、ｖ２及びｖ３プローブは、いずれもその塩基配列と他の微生物由来の塩基配列とのミスマッチが３個以下であるため、他の微生物由来の塩基配列とクロスハイブリダイゼーションを起こしやすく、単独のプローブによって検出、同定することが困難であった。このため、上記表３に記載された微生物については、その検出シグナルの傾向からグループ分けを行い、それら微生物由来のｖ１、ｖ２及びｖ３プローブを用いたハイブリダイゼーションの検出シグナルの結果を総合的に検討し、その微生物がいずれの属種であるかを同定した。
例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ０６）、ストレプトコッカス・ミティス（微生物ＩＤ  ２９）及びストレプトコッカス・オラリス（微生物ＩＤ  ３４）は同属の菌であるため相同性が高く、互いの区別が困難であり、特にストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ミティスは単独プローブによる区別が不可能であった。そこでこれらをグループＡとしてまとめ、被検体がこれら３種のいずれかであると判定された場合、各々に対応する３種のｖ１〜ｖ３プローブを用いた更なる同定作業を行った。そして、ストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ０６）、ストレプトコッカス・ミティス（微生物ＩＤ  ２９）及びストレプトコッカス・オラリス（微生物ＩＤ  ３４）の３種類の微生物について、検出シグナルの結果を各微生物の各プローブについて表６１のようにまとめた。
2003106676.tif 000066
表６１から明らかなように、グループＡの各微生物は各プローブに対して独自の検出シグナルパターンを有する。すなわち、ストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ０６）は、３４  ｖ１及びｖ２プローブのシグナル強度が弱く、他の０６  ｖ１〜ｖ３プローブ、２９  ｖ１〜ｖ３プローブ、３４  ｖ３プローブではシグナル強度が強いので、これらのスポットにおける発色の程度を総合的に判断することによって、被検体がストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ０６）であるか否かを同定することができた。また、同様に、ストレプトコッカス・ミティス（微生物ＩＤ  ２９）及びストレプトコッカス・オラリス（微生物ＩＤ  ３４）についても、０６  ｖ１〜ｖ３、２９  ｖ１〜ｖ３、３４  ｖ１〜ｖ３のプローブに対して特有のシグナル強度呈示パターンを有するので、これらのプローブのスポットにおける発色の程度を総合的に判断することによって、被検体がストレプトコッカス・ミティス（微生物ＩＤ  ２９）あるいはストレプトコッカス・オラリス（微生物ＩＤ  ３４）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ０６）であるか否かを同定することができた。
同様に、スタフィロコッカス・ホミニス（微生物ＩＤ  １５）、スタフィロコッカス・ワルネリ（微生物ＩＤ  １６）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（微生物ＩＤ  １７）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（微生物ＩＤ  ２０）、スタフィロコッカス・アウレウス（微生物ＩＤ  ３５）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（微生物ＩＤ  ４６）は同属であるために１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の類似性が高く、互いの区別が困難であり、特に、スタフィロコッカス・ホミニス、ストレプトコッカス・ワルネリ、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカス・エピデルミディスは、単独プローブによる区別が不可能であった。そのため、これら微生物をグループＢとして、各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパターンを検討した。その結果を表６２に示す。その結果、各微生物の有する独自の検出シグナルパターンに基づいて、微生物を同定することができることがわかった。
2003106676.tif 000067
同様に、シトロバクター・フレンディ（微生物ＩＤ  ０８）、エンテロバクター・クロアカ（微生物ＩＤ  １８）、エンテロバクター・アエロゲネス（微生物ＩＤ  １９）、セラチア・マルセッセンス（微生物ＩＤ  ２２）、エシェリシア・コリ（微生物ＩＤ  ２４）、クレブセラ・ニューモニエ（微生物ＩＤ  ２５）、サルモネラ・パラチフィＡ（微生物ＩＤ  ４１）、サルモネラ・チフィ（微生物ＩＤ  ４２）、クレブセラ・オキシトカ（微生物ＩＤ  ４５）は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の類似性が高く、互いの区別が困難であり、特にエンテロバクター・クロアカ、クレブセラ・ニューモニエ、サルモネラ・パラチフィＡ、サルモネラ・チフィ、クレブセラ・オキシトカは単独プローブによる区別が不可能であった。そのため、これら微生物をグループＣとして、各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパターンを検討した。その結果を表６３に示す。その結果、各微生物の有する独自の検出シグナルパターンに基づいて、微生物を同定することができることがわかった。ただし、このうち、サルモネラ・パラチフィＡ、サルモネラ・チフィの場合はいずれかの微生物が存在することを検出可能であった。
2003106676.tif 000068
同様に、エンテロコッカス・フェシウム（微生物ＩＤ  ２７）、ストレプトコッカス・サングイス（微生物ＩＤ  ２８）、エンテロコッカス・ガリナルム（微生物ＩＤ  ３８）、エンテロコッカス・カセリフラバス（微生物ＩＤ  ３９）は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の類似性が高く、互いの区別が困難であり、特に、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・カセリフラバスは区別が不可能であった。そのため、これら微生物をグループＤとして、各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパターンを検討した。その結果を表６４に示す。その結果、各微生物の有する独自の検出シグナルパターンに基づいて、微生物を同定することができることがわかった。ただし、このうち、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・カセリフラバスの場合はいずれかの微生物であることが検出可能であった。
2003106676.tif 000069
同様に、ストレプトコッカス・コンステラータス（微生物ＩＤ  ２１）、ストレプトコッカス・アンギノサス（微生物ＩＤ  ２３）、ストレプトコッカス・インターメディウス（微生物ＩＤ  ３０）は同属であり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の類似性が高く、互いの区別が困難であり、特にストレプトコッカス・インターメディウスは単独プローブによる区別が不可能であった。そのため、これら微生物をグループＥとして、各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパターンを検討した。その結果を表６５に示す。その結果、各微生物の有する独自の検出シグナルパターンに基づいて、微生物を同定することができることがわかった。
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以上のように、本発明のプローブを用いることによって表１に示す微生物を検出及び／又は同定することが可能となった。また、その検出シグナルパターンが明らかになったので、その検出シグナルパターンをコンピュータ等の記憶分析媒体に予め登録させることによって、被検体の微生物を迅速に確実に検出、同定することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明の微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列のうち、特に特異性が高いＶ１、Ｖ２及びＶ３領域の塩基配列から設計したプローブを用い、被検体である微生物から抽出した核酸を鋳型としてＰＣＲ法によって増幅を行い、得られた増幅産物を解析することにより、医療及び食品等の分野において有害な細菌を特異的にかつ迅速に検出、同定することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列中のＶ１、Ｖ２及びＶ３領域を示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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