(57)【要約】本発明は、蛋白質を定量または半定量するために使用され、かつ酸性ｐＨ指示薬を含む蛋白質測定用試験片に関する。この蛋白質測定用試験片は、蛋白質に対する発色感度を高めるための増感剤として、界面活性剤を含んでいる。酸性ｐＨ指示薬としては、たとえばトリフェニルメタン系指示薬が用いられる。本発明ではさらに、蛋白質測定用試験片の製造方法が提供される。この製造方法は、酸性ｐＨ指示薬および増感剤を含んだ含浸液を吸収性担体に含浸させた後に、これを乾燥させることにより蛋白質測定用試験片が製造される。増感剤としては、界面活性剤が使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を定量または半定量するために使用され、かつ酸性ｐＨ指示薬を含む蛋白質測定用試験片であって、
蛋白質に対する発色感度を高めるための増感剤として、界面活性剤を含んでいる、蛋白質測定用試験片。
【請求項２】
上記酸性ｐＨ指示薬は、トリフェニルメタン系指示薬である、請求項１に記載の蛋白質測定用試験片。
【請求項３】
上記トリフェニルメタン系指示薬は、下記化学式（１）で示されるテトラブロムフェノールブルーである、請求項２に記載の蛋白質測定用試験片。
2004015424.tif 000006
【請求項４】
上記増感剤として、カチオン系の界面活性剤を含んでいる、請求項１に記載の蛋白質測定用試験片。
【請求項５】
上記カチオン系の界面活性剤は、臭化ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、およびゼフィラミンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の蛋白質測定用試験片。
【請求項６】
上記増感剤として、ノニオン系の界面活性剤を含んでいる、請求項１に記載の蛋白質測定用試験片。
【請求項７】
上記ノニオン系の界面活性剤は、ポリエチレングリコールである、請求項６に記載の蛋白質測定用試験片。
【請求項８】
上記増感剤として、カチオン系の界面活性剤とノニオン系の界面活性剤とを組み合わせて使用する、請求項１に記載の蛋白質測定用試験片。
【請求項９】
上記カチオン系界面活性剤は臭化ベンジルトリメチルアンモニウムであり、上記ノニオン系の界面活性剤はポリエチレングリコールである、請求項８に記載の蛋白質測定用試験片。
【請求項１０】
蛋白質を定量または半定量するために使用される蛋白質測定用試験片を製造する方法であって、酸性ｐＨ指示薬および増感剤を含んだ含浸液を吸収性担体に含浸させた後に、これを乾燥させることにより蛋白質測定用試験片を製造する方法において、
上記増感剤として、界面活性剤を使用する、蛋白質測定用試験片の製造方法。
【請求項１１】
上記界面活性剤として、臭化ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、ゼフィラミン、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種を使用する、請求項１０に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
【請求項１２】
上記界面活性剤として、臭化ベンジルトリメチルアンモニウムおよびポリエチレングリコールを組み合わせて使用する、請求項１１に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
【請求項１３】
上記含浸液における上記界面活性剤の含有量は、０．０１〜５ｗｔ％に設定される、請求項１０に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
【請求項１４】
上記含浸液における上記界面活性剤の含有量は、０．０１〜１ｗｔ％に設定される、請求項１３に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
【請求項１５】
上記酸性ｐＨ指示薬として、下記化学式（２）で示されるテトラブロムフェノールブルーを使用する、請求項１０に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
2004015424.tif 000007
【請求項１６】
上記含浸液における上記酸性ｐＨ指示薬の濃度は、０．１〜５ｍＭに設定される、請求項１０に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
【請求項１７】
上記含浸液のｐＨは、上記酸性ｐＨ指示薬ｐＫａ以下に設定される、請求項１６に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
【請求項１８】
上記含浸液のｐＨは、２．０〜４．５に設定される、請求項１７に記載の蛋白質測定用試験片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、蛋白質含有試料（たとえば血液や尿などの体液、蛋白質含有飲料、工場廃水）中に存在する蛋白質を測定するための蛋白質測定用試験片およびその製造方法に関する。
【背景技術】  生体試料中の蛋白質を測定することは、病理学的診断において重要である。たとえば、肝臓機能が低下した場合には、血清アルブミンの量が減少する一方、腎炎、ネフローゼ症候群、結石、腫瘍等の腎・尿路疾患、循環系及び中枢神経系の疾患などの場合には、尿中の蛋白質の量が増加する。したがって、アルブミンなどの蛋白質を測定することは、これらの疾患の診断において重要な指針となり得るのである。
蛋白質測定の分野においては、蛋白質誤差指示薬を用いた簡便な測定方法が知られている。この測定方法では、蛋白質誤差指示薬として、たとえばテトラブロムフェノールブルー（ＴＢＰＢ）が用いられており、一例を挙げれば、ＴＢＰＢを用いた尿試験紙が一次スクリーニング用として広く用いられている。ＴＢＰＢは、蛋白質が存在すると、ｐＨ３付近でフェノール性ヒドロキシル基の解離が起こり、黄色から青色に変化するため、蛋白質を検出することができる。
しかしながら、ＴＢＰＢを指示薬として用いた試験紙は、臨床的に必要とされる１０〜２０ｍｇ／ｄＬの低濃度蛋白質に対する検出感度が不充分なため、蛋白質を正確に検出できない場合がある。たとえば、カラーチャートとの比較により行われる目視判定においては、陰性蛋白質と痕跡蛋白質の色が近いために区別が難しく判定が困難である。一方、尿試験紙の測定装置を用いる場合においても、ＴＢＰＢの感度が低いためにしばしば判定を誤る場合がある。
そのため、低濃度な蛋白質をより高感度に定量できる技術が望まれていた。
【発明の開示】
上述した課題を解決すべく本発明者が鋭意検討した結果、本発明者は、試験片に界面活性剤を含有させれば、低濃度の蛋白質を高感度で測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１の側面により提供される蛋白質測定用試験片は、蛋白質を定量または半定量するために使用され、かつ酸性ｐＨ指示薬を含む蛋白質測定用試験片であって、蛋白質に対する発色感度を高めるための増感剤として、界面活性剤を含んでいる。
本発明の第２の側面においては、蛋白質を定量または半定量するために使用される蛋白質測定用試験片を製造する方法であって、酸性ｐＨ指示薬および増感剤を含んだ含浸液を吸収性担体に含浸させた後に、これを乾燥させることにより蛋白質測定用試験片を製造する方法において、上記増感剤として、界面活性剤を使用する、蛋白質測定用試験片の製造方法が提供される。
本発明において使用することができる酸性ｐＨ指示薬としては、たとえばトリフェニルメタン系指示薬が挙げられる。トリフェニルメタン系指示薬としては、典型的には、下記化学式（１）で示されるものが挙げられる。
2004015424.tif 000002
化学式（１）において、Ｘ１はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基であり、Ｘ２およびＸ３は同一または異なるハロゲンである。
本発明においては、トリフェニルメタン系指示薬として、下記化学式（２）で示されるテトラブロムフェノールブルー（ＴＢＰＢ）を使用するのが好ましい。
2004015424.tif 000003
含浸液中の酸性ｐＨ指示薬（たとえばＴＢＰＢ）の濃度は、特に限定されないが、典型的には０．１〜５ｍＭ、好ましくは０．３〜０．１ｍＭとされる。
界面活性剤（増感剤）としては、カチオン系の界面活性剤を用いるのが好ましく、これに加えて、あるいはこれに代えてノニオン系の界面活性剤を使用してもよい。
カチオン系の界面活性剤としては、たとえば第４級アンモニウム塩を使用することができる。第４級アンモニウム塩としては、たとえばアルキルジメチルベンジルアンモニウム、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、ベンザルコニウム塩、およびイミダゾリウム塩が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、脂肪族アミン塩を使用することもできる。
ノニオン系の界面活性剤としては、エーテル型、エーテルエステル型、エステル型、および含窒素型のいずれをも使用することができる。
エーテル型の界面活性剤としては、たとえばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン２級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンステロールエーテル、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、アルキルフェノールホルマリン縮合物の酸化エチレン誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルが挙げられる。
エーテルエステル型の界面活性剤としては、たとえばポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルが挙げられる。
エステル型の界面活性剤としては、たとえばポリエチレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、およびショ糖脂肪酸エステルが挙げられる。
含窒素型の界面活性剤としては、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレンアルキルアミン、およびアルキルアミンオキサイドが挙げられる。
本発明におけるカチオン系の界面活性剤としては、典型的には、臭化ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、またはゼフィラミンが使用され、ノニオン系の界面活性剤としては、典型的には、ポリエチレングリコールが使用される。もちろん、複数種の界面活性剤を併用してもよく、その場合には、カチオン系の界面活性剤とノニオン系の界面活性剤とを組み合わせて使用するのが好ましい。典型的には、カチオン系界面活性剤である臭化ベンジルトリメチルアンモニウムと、ノニオン系の界面活性剤であるポリエチレングリコールを組み合わせて使用される。
含浸液中の増感剤（界面活性剤）の濃度は、特に限定されないが、典型的には０．０１〜５ｗｔ％、好ましくは０．０１〜１ｗｔ％とされる。
増感剤としては、界面活性剤に加えて、ポリカーボネートやポリビニルアルコールなどの高分子材料を使用してもよい。
含浸液のｐＨは、酸性ｐＨ指示薬のｐＫａ値よりもやや低い値に設定される。酸性ｐＨ指示薬としてＴＢＰＢを使用する場合には、含浸液のｐＨは２．０〜４．５とされ、好ましくは２．０〜３．５とされる。
緩衝剤としては、含浸液のｐＨ（たとえばｐＨ２．０〜４．５の範囲）において良好な緩衝能を有し、酸性ｐＨ指示薬と蛋白質との反応を阻害しないものであれば何れでもよい。緩衝剤としては、たとえばグリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、あるいは酒石酸緩衝液を用いることができる。含浸液中の緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、典型的には０．１〜１．５Ｍ、好ましくは０．３〜１Ｍである。
吸収性担体としては、蛋白質成分を含まない多孔性物質を使用することができ、たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。多孔性物質としては、たとえば紙状物、フォーム（発泡体）、織布状物、不織布状物、および編物状物が挙げられる。吸収性担体を形成するための材料としては、たとえば綿、麻、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ロックウール、ガラス繊維、シリカ繊維、カーボン繊維、ボロン繊維、ポリアミド、アラミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、レーヨン、ポリエステル、ナイロン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、およびポリオレフィンが挙げられる。これら吸収性担体の形状は、特に限定されないが、矩形、長矩形、円形あるいは楕円形が一般的である。
本発明の蛋白質測定用試験片は、そのままでも使用することができるが、非吸収体に接着させて使用することもできる。
非吸収体としては、たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。非吸収体を形成するための材料としては、たとえばポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、およびポリスチレンが挙げられる。
【実施例】
【実施例１】  本実施例では、アルブミン濃度が０．３ｍｇ／ｄＬ（陰性）または１５ｍｇ／ｄＬ（陽性）の尿を試験片に含浸させ、それぞれについて反射率を測定した。試験片は、含浸液を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製「３ＭＭＣｈｒ」）に含浸させた後にそれを乾燥させることにより形成した。含浸液としては、表１に示した基本組成に対して、増感剤としてカチオン系界面活性剤である臭化ベンジルトリメチルアンモニウムを０．２ｗｔ％添加したものを使用した。反射率は、色差計を用いて、測定波長を６３０ｎｍとして測定した。測定結果については、表２に示した。
【実施例２】  本実施例においては、含浸液として、表１の基本組成に対して、増感剤としてカチオン系界面活性剤である臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを０．０１ｗｔ％添加したものを用いた以外は、実施例１と同様にして反射率を測定した。その結果を表２に示した。
【実施例３】  本実施例においては、含浸液として、表１の基本組成に対して、増感剤としてカチオン系界面活性剤である臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを０．０１ｗｔ％添加したものを用いた以外は、実施例１と同様にして反射率を測定した。その結果を表２に示した。
【実施例４】  本実施例においては、含浸液として、表１の基本組成に対して、増感剤としてノニオン系界面活性剤であるポリエチレングルコールを０．５ｗｔ％添加したものを用いた以外は、実施例１と同様にして反射率を測定した。その結果を表２に示した。
【実施例５】  本実施例においては、含浸液として、表１の基本組成に対して、増感剤としてカチオン系界面活性剤である臭化ベンジルトリメチルアンモニウムを０．２ｗｔ％およびノニオン系界面活性剤であるポリエチレングリコールを０．５ｗｔ％を併用したものを用いた以外は、実施例１と同様にして反射率を測定した。その結果を表２に示した。
【実施例６】  本実施例においては、含浸液として、表１の基本組成に対して、増感剤としてカチオン系界面活性剤である臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを０．０１ｗｔ％およびノニオン系界面活性剤であるポリエチレングリコールを０．５ｗｔ％を併用したものを用いた以外は、実施例１と同様にして反射率を測定した。その結果を表２に示した。
【実施例７】  本実施例においては、含浸液として、表１の基本組成に対して、増感剤としてカチオン系界面活性剤であるゼフィラミンを０．０１ｗｔ％およびノニオン系界面活性剤であるポリエチレングリコールを０．５ｗｔ％を併用したものを用いた以外は、実施例１と同様にして反射率を測定した。その結果を表２に示した［比較例１］
本比較例においては、含浸液として基本組成のもの（界面活性剤（増感剤）を含まないもの）を用いた以外は、実施例１と同様にして反射率を測定した。その結果を表２に示した。
2004015424.tif 000004
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表２から明らかなように、アルブミン濃度が１５ｍｇ／ｄＬのときの反射率は、界面活性剤を含有させた場合には、界面活性剤を含有させない場合に比べて小さくなっている。そのため、陰性時（０．３ｍｇ／ｄＬ）と陽性時（１５ｍｇ／ｄＬ）との差分Δ（％）は、界面活性剤を含ませた場合には、界面活性剤を含ませない場合の２倍程度となっている。したがって、界面活性剤を含ませた場合には、アルブミンに対する感度が高くなり、アルブミン濃度が１０〜２０ｍｇ／ｄＬ程度の低濃度であっても、適切にアルブミンを検出できるといえる。とくに、カチオン系の界面活性剤を単独で、あるいはこれに加えてノニオン系の界面活性剤を併用した場合には、アルブミンの検出感度が高くなっている。この点からは、増感剤としては、カチオン系の界面活性剤を使用するのが好ましいといえる。
なお、各実施例における実験結果は尿サンプルに関するものであるが、本発明は尿に限らず、蛋白質を含んだ種々の試料、たとえば血液、蛋白質含有飲料、工場廃水における蛋白質を定量する場合にも適用することができる。
【国際調査報告】
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