(57)【要約】本発明は、形態ばかりでなく生理的に重要な機能をもつ含気腔の再生を目的とし、含気腔の表層を覆う粘膜組織再生の足場となる壁骨構造に類似した組成と構造を持つ含気腔壁再生用基材およびかかる再生用基材を用いた含気腔の再生方法を提供することにある。すなわち、本発明は、連続した三次元蜂巣構造を持ち、生体親和性を有することを特徴とする含気腔の再生用基材及びそれを用いた含気腔の再生方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続した三次元蜂巣構造を持ち、生体親和性を有することを特徴とする含気腔の再生用基材。
【請求項２】
気孔率が１〜９９％である、請求項１記載の含気腔の再生用基材。
【請求項３】
表面がコラーゲンで被覆された、請求項１又は２に記載の含気腔の再生用基材。
【請求項４】
含気腔の粘膜細胞を充填した、請求項１〜３のいずれか１項に記載の含気腔の再生用基材。
【請求項５】
間葉系幹細胞をさらに充填した、請求項４に記載の含気腔の再生用基材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の含気腔の再生用基材を対象組識に挿入、固定することを特徴とする含気腔の再生方法。
【請求項７】
再生すべき含気腔が鼻、副鼻腔、中耳腔、乳突蜂巣等の人体内の含気腔である、請求項６に記載の含気腔の再生方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、人体の生理的機能を有する含気腔の再生用基材およびその再生方法に関する。
背景技術
人体には含気腔が多数ある。とくに顔面、頭部には上顎洞をはじめとする副鼻腔や中耳腔などが左右対称性に存在し、顔貌や頭部の形態を左右する要素ともなっている。
これら含気腔の構造的特徴は、いずれも周囲が骨に囲まれ、その表面が薄い粘膜に覆われていることであり、これらの特徴が含気腔の重要な生理的機能と結びついている。
副鼻腔と中耳腔とでは機能の上でやや異なる点もあるが、含気腔のもつ主な生理的な機能は、ガス交換能と物質の分泌、老廃物の排泄などである。これらの機能が障害されると、副鼻腔炎や中耳炎などをはじめとする疾患を来たすこととなる。
これらの疾患に対する治療は、保存的治療（薬物治療）と外科的治療とに分けられ、前者は病的に傷害され変性に陥った含気腔内の粘膜を薬物によって正常な状態に回復することを目的としたもので、前者に反応しない難治性のものに対して後者が選択施行される。
しかし、乳幼児期から副鼻腔炎や中耳炎に繰り返し罹患した場合、本来の含気腔が十分な発達を遂げず、必要な生理的機能を不十分にしか有しない小さい含気腔が形成されることとなり、結果としてこれらの疾患から完治できないこととなる。
また、手術的に含気腔内の病巣除去を行った場合でも、生理的機能が回復されなければ、疾患の再発や別疾患の誘発の原因をつくることにもなる。一部の人々から副鼻腔炎や中耳炎は手術を行っても治らないと考えられているのはこのためである。つまり、従来技術には、生理的機能を有する含気腔の再生という発想、概念はなかった。
したがって、新たにこの含気腔を形成し、同時に生理的機能をも再生することにより、これらの疾患を完治する手段を提供することは価値がある。
発明の開示
本発明は、形態ばかりでなく生理的に重要な機能をもつ含気腔の再生を目的とし、含気腔の表層を覆う粘膜組織の再生の足場となる壁骨構造に類似した組成と構造を持つ含気腔壁の再生用基材およびかかる再生用基材を用いた含気腔の再生方法を提供することにある。
すなわち、本発明は、
１．連続した三次元蜂巣構造を持ち、生体親和性を有することを特徴とする含気腔の再生用基材；
２．気孔率が１〜９９％である、上記１記載の含気腔の再生用基材；
３．表面がコラーゲンで被覆された、上記１又は２に記載の含気腔の再生用基材；
４．含気腔の粘膜細胞を充填した、上記１〜３のいずれか１項に記載の含気腔の再生用基材；
５．さらに、間葉系幹細胞を充填した、上記４に記載の含気腔の再生用基材；
６．上記１〜５のいずれか１項に記載の含気腔の再生用基材を対象組識に挿入、固定することを特徴とする含気腔の再生方法；及び
７．再生すべき含気腔が鼻、副鼻腔、中耳腔、乳突蜂巣等の人体内の含気腔である、上記６に記載の含気腔の再生方法
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の再生用基材は、連続した三次元蜂巣構造を持ち、生体親和性を有することを特徴とする。ここで、三次元蜂巣構造とは、各蜂巣が独立した腔（閉塞した腔）をなさず、外部との交通がある構造を意味する。
本発明の含気腔の再生用基材は、三次元蜂巣構造を持ち、生体親和性を有する素材であれば特に限定されないが、ある程度の強度を有する素材が好ましい。
このような素材には、自家骨や多孔性のセラミックスがあり、多孔質セラミックスには、リン酸カルシウム系セラミックス（ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムなど）、アルミナセラミックス、バイオガラス等が含まれる。素材として好ましのは、自家骨、ハイドロキシアパタイト及びアルミナである。
本発明の再生用基材全体の構造は、基本的には三次元蜂巣構造をなすものであるが、再生させる含気腔の形態に応じてある程度、蜂巣構造の密度を変化させることができる。すなわち、副鼻腔などの再生には、元の形態に近づけるため出来る限り疎な構造の再生用基材を使用し、一方、乳突峰巣の再生の場合は、副鼻腔の場合よりも密な構造の再建基材を使用するのが望ましい。
本発明の再生用基材の気孔率は、１〜９９％、好ましくは３〜９５％、特に好ましくは６０〜９０％である。再生用基材の気孔率は、走査電子顕微鏡観察により測定することができる。
本発明の再生用基材は種々の形態を取り得るが、例えば、板状、立方体、直方体、円筒、ブロック、フィルムの形態であり得る。
本発明の再生用基材の表面は、含気腔の粘膜細胞が再建基材の表面を被覆しやすい足場を提供する目的で、コラーゲンで被覆するのが好ましい。被覆するコラーゲンとして、後述するような各種コラーゲンを使用することができる。コラーゲンによる被覆は、常法、例えば、コラーゲンの塩酸溶液に浸漬することによって行うことができる。コラーゲンの被覆量は、再生用基材に対して０．１〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％である。
本発明の再生用基材には、再生すべき含気腔の粘膜細胞を充填することが好ましい。充填すべき粘膜細胞は、含気腔の再生を要するヒトの中耳、鼻、ロ腔などから粘膜を採取し、細胞培養することよって得られる。得られた粘膜細胞を再生用基材に充填する。充填する粘膜細胞の数は、再生用基材１ｇ当たり数百〜数百万個、好ましくは数十万〜数百万個である。
本発明の再生用基材には、含気腔の粘膜細胞に加え、さらに、間葉系幹細胞を充填することが好ましい。粘膜細胞と間葉系幹細胞は、例えば、培養した粘膜細胞と選択培養した骨髄より採取した間棄系幹細胞とを、コラーゲン内で立体混合培養することによって得ることができる。このようにして得た粘膜細胞と間葉系幹細胞とを再生用基材に充填する。充填する粘膜細胞の数は上記と同様であり、充填する間葉系幹細胞の数は再生用基材１ｇ当たり数百〜数百万個、好ましくは数十万〜数百万個である。
本発明において、再生用基材被覆用及び細胞の培養用に使用するコラーゲンとしては、従来から用いられている各種のコラーゲン、例えば中性可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲンを使用することができるが、酵素、例えばペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、プロナーゼなどによって処理した酵素可溶化コラーゲンが好ましい。コラーゲン分子中の抗原基であるテロペプチドが確実に除去されて抗原性がほとんどなくなるからである。
これらコラーゲンの由来は特に限定されず、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、カンガルー、鳥、魚などの動物の皮、骨、軟骨、健、臓器などから抽出・精製して得られるＩ型コラーゲン、またはＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンの混合物を用いることができる。
本発明で使用する間葉系幹細胞としては、採取した骨髄を継代培養することによって造血系の細胞が除去されたものを使用することができる。
具体的には、骨髄提供先（免疫の問題から、患者自身が好ましい）の胸骨、腸骨、長管骨等から骨髄穿刺針を用いて採取した骨髄を、通常の細胞培養、例えば１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加したイーグル最小必須培養液（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ）にて培養増殖させる。培養ボトルを使用する場合、培養液を交換する過程で造血系の細胞は除去され、該培養ボトルの底に間葉系幹細胞が１週間程度で増えてくる。顕微鏡下、該培養ボトルを観察し、該培養ボトルの底に十分増殖した時点で、酵素（トリプシン）を用いてこの細胞をはがす。該採取した細胞浮遊液を通常の細胞計測器、例えばＭｅｔａｌｌｉｚｅｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にかけて細胞数を確認する。尚、中型培養ボトル（２６０ｍｌ）にて１０５〜１０７個程度の細胞を採取することができる。
本発明において、間葉系幹細胞の充填は、コラーゲンの塩酸溶液に上記のようにして準備された間葉系幹細胞（浮遊液）を所定の細胞数（例えば、１０５〜１０７個／ｍｌ−コラーゲン）となるよう混合し、これを再生用基材に充填することによって行うことができる。
本発明の含気腔の再生方法は、上記した含気腔の再生用基材のいずれかを再生すべき対象組識に挿入、固定することを特徴とする。
対象組識に挿入、固定する再生用基材の量は、再生すべき含気腔の大きさによってさまざまであるが、例えば数ｇ〜数百ｇ、好ましくは数ｇ〜数十ｇである。
再生基材の対象組識への挿入は、例えば、全身麻酔下又は局所麻酔下の手術により行うことができ、再生用基材の対象組識への固定は、例えば、縫合糸による固定又は外科用接着剤による固定により行うことができる。
本発明の再生方法の適用できる含気腔には、例えば、鼻、副鼻腔（上顎洞、篩骨洞、蝶形骨洞、前頭洞）、中耳腔、乳突蜂巣が含まれる。
実施例
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
１）再生用基材の調製
内部に直径数百μｍ〜３ｍｍ程度の連続した小穴のあいた３×３×２ｃｍのブロック状の外形を有し、異なる気孔率（５０％及び８０％）の２種のリン酸カルシウム系セラミックス（ハイドロキシアパタイト）を再生用基材とした。豚皮を酵素可溶化したコラーゲンの塩酸溶液（ｐＨ＝３、コラーゲン濃度＝１．０重量％、日本ハム社製）を用いて、ハイドロキシアパタイトをコラーゲンで被覆した。
２）粘膜細胞及び間葉系細胞の基材への充填及び粘膜細胞の培養
（粘膜細胞の培養）
犬の口腔粘膜を１×１ｃｍの大きさに切除して、その粘膜を培養液の入ったシャーレ上でメスにより細切し、粘膜細胞を分散させた。培養液はＭＥＭ培地に１０％ウシ胎児血清を加えたものを使用した。１週間後には、シャーレ底上に粘膜細胞が増殖した。これをトリプシンで剥がし、次いでこれを培養液で洗浄してトリプシンを除去し、遠心して細胞を濃縮した後、これをコラーゲンの塩酸溶液（ｐＨ＝３、コラーゲン濃度＝１．０重量％、日本ハム社製）を用いて細胞浮遊液とした。
（間葉系幹細胞の培養）
イヌの骨（大腿骨又は上腕骨）から骨髄穿刺針で骨髄穿刺液１ｍｌを採取し、これを培養液の入ったボトルに入れて培養した。培養液はＭＥＭ培地に１０％ウシ胎児血清を加えたものを使用した。培養液を３〜５日に一度づつ交換して、浮遊している血球系の細胞を除去した。２〜３週間後には、ボトルの底面に付着系の細胞（間葉系幹細胞）が広がった。これをトリプシンで剥がして、粘膜細胞の培養で行った操作と同様にして、細胞浮遊液とした。
（基材への細胞の充填）
粘膜細胞浮遊液（細胞１００万〜１０００万個／ｍｌ）を注射器に吸って、１８Ｇ程度の太い注射針で再生用基材の上から粘膜細胞浮遊液を滴下し、基材に浮遊液をまんべんなく染み込ませた。
別の再生用基材に、粘膜細胞浮遊液と間葉系幹細胞浮遊液を等量づつ混合したものを、上記と同様にして、まんべんなく染み込ませた。
この２種の再生用基材をそれぞれシャーレ上で基材全体が浸るほどの培養液中で３週間培養した。３週間後に取出して、ホルマリン固定して、病理切片を観察した。
３）結果
上記のようにして、犬の口腔粘膜より採取した粘膜細胞を培養し、再生用基材上をどのように粘膜が被覆するかを観察検討した。粘膜被覆率は、今回使用した再生用基材の気孔率の範囲ではさほど影響をうけなかった。間葉系幹細胞と粘膜細胞を同時に充填した再生用基材と、粘膜細胞のみを充填した再生用基材とでは、両者とも粘膜細胞で被覆されたが、前者の方が、病理組識の顕微鏡観察で表面細胞の数が明らかに多いことが確認され、良好な被覆率が得られた。
実施例２
１）再生用基材の調製
実施例１−１）及び１−２）と同様に、培養細胞（間葉系幹細胞と粘膜細胞を同時に使用したものと、粘膜細胞のみのもの）を充填して再生用基材を調製した。
２）再生用基材の挿入固定及び粘膜の被覆程度の観察
全身麻酔下に犬の前額部を横切開し、頭蓋骨の眉上部に１×２ｃｍ大の穴を左右にあけ、前頭洞を露出した。上記１）で調製した再生用基材を、同一の犬の左右の前頭洞内に挿入し、皮膚縫合した。穴の大きさと再生用基材の大きさはほぼ同じにした。約６カ月後に犬を屠殺して含気腔内の粘膜被覆の度合いを観察した。また屠殺するまでの６ケ月の間に２回レントゲン撮影を行い含気腔内の状態を観察した。
３）結果
いずれも粘膜細胞により被覆されたが、間葉系幹細胞と粘膜細胞を同時に充填した再生用基材の方が、粘膜細胞のみのものより良好な粘膜細胞被覆率が得られた。
産業上の利用可能性
単一腔とした側頭骨や副鼻腔、特に篩骨洞の表面に粘膜が形成されただけでは、ガス交換能としては不十分と考えられるが、本発明のように連続した三次元蜂巣構造を有する人工代替骨を利用して、副鼻腔や側頭骨内の空間全体に広がる網目状の粘膜蜂巣を構築できれば、その表面積を大きく拡張し、十分なガス交換能を得ることが出来き、より生理的に自然な中耳腔に近い構造が得られる。
したがって、本発明により、今まで難治性とされてきた慢性副鼻腔炎や慢性中耳炎、真珠腫、癒着性中耳炎などを治癒させることができる可能性があり、これらの治療が大きく変革されることとなる。
【国際調査報告】
2003039614.tif 000002
2003039614.tif 000003
2003039614.tif 000004
2003039614.tif 000005
2003039614.tif 000006