(57)【要約】自己免疫疾患を発症する非ヒト動物を用いて、該動物とヒトとでアミノ酸配列相同性の高いタンパク質に対する抗体を作製する方法。特に自己免疫疾患を発症するＭＲＬ／ｌｐｒマウスを用いたグリピカン３（ＧＰＣ３）に対する抗体を作製する方法。
2004022754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を発症する非ヒト動物をグリピカンタンパク質で免疫することを含むグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
【請求項２】
自己抗体産生非ヒト動物をグリピカンタンパク質で免疫することを含むグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
【請求項３】
自己免疫疾患を発症する非ヒト動物又は自己抗体産生非ヒト動物が、Ｆａｓ機能欠損非ヒト動物である請求項１または２に記載のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
【請求項４】
非ヒト動物がマウスである請求項３記載のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
【請求項５】
マウスがＭＲＬ／ｌｐｒマウスである請求項４記載のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
【請求項６】
グリピカンタンパク質がグリピカン３である請求項１から５のいずれか１項に記載のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
【請求項７】
Ｆａｓ機能欠損非ヒト動物を抗原で免疫することを特徴とする抗体の作製方法
【請求項８】
非ヒト動物がマウスである請求項７記載の抗体の作製方法。
【請求項９】
マウスがＭＲＬ／ｌｐｒマウスである請求項８記載の抗体の作製方法。
【請求項１０】
抗原となるタンパク質が、ヒトとマウスで高いアミノ酸配列の相同性を有している、請求項７から９のいずれか１項記載の抗体の作製方法。
【請求項１１】
アミノ酸配列の相同性が９０％以上である、請求項１０記載の抗体の作製方法。
【請求項１２】
アミノ酸配列の相同性が９４％以上である請求項１１記載の抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、自己免疫疾患非ヒト動物を用いた抗体の作製法に関する。本発明は、具体的には、自己免疫疾患を発症する非ヒト動物を用いて、該動物とヒトとでアミノ酸配列相同性の高いタンパク質に対する抗体を作製する方法に関する。本発明の対象とするタンパク質としてはグリピカン３（ＧＰＣ３）が挙げられる。
【背景技術】  ヒト由来タンパク質に対する抗体は、病気の診断、治療等広い分野で利用されている。ヒト由来タンパク質に対する抗体を得る最も簡便な方法は、ヒト由来タンパク質を非ヒト動物に抗原として投与することである。該ヒト由来タンパク質は、非ヒト動物に非自己と認識され免疫反応が生じ該動物において抗体産生が誘発される。該非ヒト動物がもともと有している自己タンパク質は免疫寛容により非自己とは認識されないので免疫反応を引き起こすことはなく該タンパク質に対する抗体も産生されることはない。
抗原となるタンパク質は５、６残基のアミノ酸からなるエピトープ（抗原決定基）を有し、エピトープが抗原を投与した動物中で認識され該エピトープに対して抗体が産生される。エピトープの形成はタンパク質の立体構造の影響も受ける。
タンパク質の中には、進化の過程でアミノ酸配列が保存され異種動物間でアミノ酸配列の相同性の高いものがある。異種動物間でアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質は立体構造も類似しているので、エピトープ構造も保存される。従って、異なる動物種間でアミノ酸配列の相同性の高いタンパク質において、ある種由来のタンパク質を別の動物種に投与しても非自己と認識されないので、抗体も産生されず、容易に抗体をえることはできない。
ヒトとマウス等の非ヒト動物間でアミノ酸配列相同性の高いタンパク質は多数あるが、例えばグリピカンファミリーに属するタンパク質が挙げられる。
グリピカンファミリーは、細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンの新しいファミリー報告されている。現在までのところ、グリピカンファミリーのメンバーとして、５種類のグリピカン（グリピカン１、グリピカン２、グリピカン３、グリピカン４およびグリピカン５）が存在することが報告されている。このファミリーのメンバーは、均一なサイズ（約６０ｋＤａ）のコアタンパク質を持ち、特異的でよく保持されたシステインの配列を共有しており、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより細胞膜に結合している。このうちグリピカン３（ＧＰＣ３）は、発生における細胞分裂やそのパターンの制御に深く関わっていることが知られており、またＧＰＣ３遺伝子が肝癌細胞において高発現しており、ＧＰＣ３遺伝子が癌マーカーとして利用できる可能性があることが知られている。このような特徴を有するＧＰＣ３に対する抗体が得られれば、癌の診断、研究に有用であると思われる。
しかし、ＧＰＣ３はマウスとヒトでアミノ酸レベルで９４％という極めて高い相同性を示すことから、前述のような理由で通常のＢａｌｂ／ｃマウス等への免疫では異物として認識されにくく抗体を得難い可能性がある。従って、ＧＰＣ３を始めとしたヒトと非ヒト動物の間でアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質について、抗体を容易に効率的に作製する系が望まれていた。
【発明の開示】
本発明は、自己免疫疾患を発症する動物を用いてヒトとマウス等の非ヒト動物間でアミノ酸配列相同性の高いタンパク質に対する抗体を作製する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、ヒトとマウスでアミノ酸配列相同性が高いＧＰＣ３タンパク質に対する抗体を、自己免疫疾患を発症するマウスを用いて作成する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、ヒトと非ヒト動物間でアミノ酸配列相同性が高いタンパク質であって、ヒト由来の該タンパク質を非ヒト動物に投与しても抗体を産生しにくいタンパク質であっても、自己に対して免疫反応が生じる自己免疫疾患を発症している非ヒト動物に投与したならば、該非ヒト動物内で前記タンパク質に対する抗体が産生され得るであろうと考え鋭意検討を行った。例えば、自己免疫疾患モデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスは自己抗体を産生することが知られている（Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＭＲＬ／ｌｐｒ  ｌｉｐｕｓ  ｍｉｃｅ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９８９  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ３５−４０、Ｈｉｄｄｅｎ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ．Ｃｏｈｅｎ  ＰＬ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８５  Ｊｕｎｌ；１６１（６）：１５８７−９２、Ｌｐｒ  ａｎｄ  ｇｌｄ：ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｏｈｅｎ  ＰＬ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１；９：２４３−６９、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｇｐ７０  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ＭＲＬ／ｌｐｒ  Ｌｕｐｕｓ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｇｐ７０  Ｄｅｐｏｓｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｎｏｎ−Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｍｉｃｅ．Ｎｏｂｕｔａｄａ  Ｔａｂａｔａ，Ｊ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍａｙ  ２０００；Ｖｏｌ  ７４：９：４１１６−２６）。従って、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス等の自己免疫疾患モデルマウスを用いれば、マウスと他の種でアミノ酸配列の相同性の低いタンパク質抗原はもちろんのこと、マウス由来の抗原やＧＰＣ３のようにマウスとヒトでアミノ酸レベルで非常に高い相同性を有するタンパク質抗原に対しても効率良く抗体を作製できる可能性があると考えた。
本発明者らは、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを用いた抗体作製の有用性を検証する目的でヒトＧＰＣ３を免疫原としてＭＲＬ／ｌｐｒマウスとＢａｌｂ／ｃマウスへの免疫、抗体作製を行なった。その結果、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスではＢａｌｂ／ｃマウスに比較してＯＤ値の高い陽性ウェルが約４０倍多く得られること、アイソタイプもバラエティーに富んでいること、抗体の抗原親和性も約１００倍高いことを見出した。従って、マウスと他の種でタンパク質相同性の低い抗原はもちろんのこと、ＧＰＣ３のようにマウスとヒトでアミノ酸レベルで非常に高い相同性を有する抗原に対する抗体を取得するために、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに免疫して抗体を作製することは非常に有効であることが判明し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は
（１）  自己免疫疾患を発症する非ヒト動物をグリピカンタンパク質で免疫することを含むグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
（２）  自己抗体産生非ヒト動物をグリピカンタンパク質で免疫することを含むグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
（３）  自己免疫疾患を発症する非ヒト動物又は自己抗体産生非ヒト動物が、Ｆａｓ機能欠損非ヒト動物である（１）または（２）のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
（４）  非ヒト動物がマウスである（３）のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
（５）  マウスがＭＲＬ／ｌｐｒマウスである（４）のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
（６）  グリピカンタンパク質がグリピカン３である（１）から（５）のいずれかのグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
（７）  Ｆａｓ機能欠損非ヒト動物を抗原で免疫することを特徴とする抗体の作製方法、
（８）  非ヒト動物がマウスである（７）の抗体の作製方法、
（９）  マウスがＭＲＬ／ｌｐｒマウスである（８）の抗体の作製方法、
（１０）  抗原となるタンパク質が、ヒトとマウスで高いアミノ酸配列の相同性を有している、（７）から（９）のいずれかの抗体の作製方法、
（１１）  アミノ酸配列の相同性が９０％以上である、（１０）の抗体の作製方法、および
（１２）  アミノ酸配列の相同性が９４％以上である（１１）の抗体の作製方法である
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において自己免疫疾患とは、自己抗体によってひき起こされる疾患のことをいう。自己抗体によってひき起こされる疾患は、自己抗体単独でひき起こされる疾患のみでなく、自己抗体と対応抗原との複合体物などの自己抗体と他の物質の複合体によってひき起こされる疾患も含まれる。又、自己抗体の病因性が明らかな疾患のみでなく、自己抗体の存在が病変の成立と密接に関係している疾患も含まれる。自己免疫疾患の具体的な例としては、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、などを挙げることができる。本発明の自己免疫疾患を発症する非ヒト動物は、自己免疫疾患の１つ以上を発症していればよく、自己免疫疾患の種類は特に限定されない。
又、本発明の抗体作製方法において、免疫に用いる非ヒト動物は、自己免疫疾患を発症している非ヒト動物だけでなく、正常非ヒト動物と比較して自己抗体を過剰に産生する非ヒト動物を用いることも可能である。
さらに、通常は自己抗体を産生しない正常非ヒト動物（例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスなど）に、ＬＰＳやデキストランサルフェートなどのポリクローナルＢセルアクチベーターを投与するなどして、自己抗体を産生する状態にした非ヒト動物を用いることも可能である。
自己免疫疾患を発症する非ヒト動物又は自己抗体を産生する非ヒト動物の好ましい例として、免疫調節機構に異常のある非ヒト動物、例えばＦａｓ遺伝子に変異が入りＦａｓ機能が欠損している非ヒト動物を挙げることができる。ＦａｓはＮＧＦ／ＴＮＦレセプターファミリーに属する細胞膜貫通型タンパク質で、アポトーシス誘導シグナルを伝達する受容体分子である。通常、自己抗原に反応するＢ細胞が自己抗原に特異的なＴ細胞に遭遇するとＴ細胞表面のＦａｓリガンドがＢ細胞表面のＦａｓ（ＣＤ９５）に結合し、自己抗原反応Ｂ細胞にアポトーシスが誘導されるが、Ｆａｓに変異がある場合にはこのメカニズムが働かないため、自己抗原に反応し自己抗体を産生するＢ細胞が生き残るようになり、自己抗体を過剰に産生するようになる。
又、Ｆａｓ機能欠損非ヒト動物以外に、例えば、Ｆａｓリガンド遺伝子に変異が入ったＦａｓリガンド欠損非ヒト動物を用いることもできる。
Ｆａｓ機能欠損非ヒト動物の具体的な例としては、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスなどを挙げることができる。Ｆａｓ遺伝子が突然変異したｌｐｒマウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）は一般的に異常なＴ細胞の蓄積と全身性エリテマトーデス様の自己免疫疾患を発症する。
Ｆａｓリガンド欠損非ヒト動物の具体的な例としては、ＭＲＬ／ｇｌｄマウスなどを挙げることができる。
Ｆａｓ機能欠損マウスやＦａｓリガンド欠損マウスなどは市販されているので、当業者は容易にそれらを入手することが可能である。
上記Ｆａｓ又はＦａｓリガンド欠損非ヒト動物以外にも、例えば、突然変異常染色体劣性遺伝子ｌｐｒ（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）やｇｌｄなどを入れたマウス（例えば、正常マウスやＭＲＬ／Ｍｐ−＋／＋マウス（ＭＲＬ／ｎマウス）にｌｐｒを加えたマウスなど）、ＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウス、ＢＸＳＢ／ＭｐＪマウス、Ｂ／ＷＦ１マウス、ＢＸＳＢマウス、ＳＬ／Ｎｉマウスなどを用いることができる。
又、ジーンターゲッティング法などを用いて、例えば以下の方法により、ＦａｓやＦａｓリガンドの発現を人為的に抑制したマウスを作製することも可能である。
まず、マウスからＦａｓ（又はＦａｓリガンド）遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡを単離し、このＤＮＡ断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。その後、該ターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスＥＳ細胞株に導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることにより、Ｆａｓ（又はＦａｓリガンド）遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、該マウスを交配させることにより、Ｆａｓ（又はＦａｓリガンド）遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを得ることができる。
本発明の非ヒト動物としては、例えば、サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス、ウサギなどを挙げることができるが、好ましくはラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類であり、特に好ましいのはマウスである。
本発明においては、いかなるタンパク質も抗原として用いることができるが、抗原となるタンパク質が、該抗原タンパク質に対応する免疫非ヒト動物のホモログタンパク質とアミノ酸配列レベルで高い相同性を有していることが好ましい。
高い相同性を有するとは、アミノ酸配列において少なくとも６５％以上の相同性を有していることを意味し、好ましくは７５％以上の相同性を有し、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、特に好ましくは９４％以上の相同性を有する。タンパク質の相同性を決定するための配列の最適アラインメントは様々なアルゴリズムを使って実施することができ、例えば、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０のアルゴリズム、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法、およびこれらのアルゴリズムのコンピューター実行プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなど）がある。配列アラインメントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（開示されたデフォルト設定を用いる）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて実施することもできる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立生物技術情報センター；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／）から利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、最初にデータベース配列中の長さＷの短いワードとアラインメントしたときに、一致するかまたは任意の正値の閾値スコアＴを満たすクエリー配列中の同じ長さの短いワードを確認することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる。最初の近傍ワードヒットはより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシーズとして機能する。ワードヒットを、それぞれの配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加しうる限り両方向に伸長させる。それぞれの方向のワードヒットの伸長は、次のパラメーターが適合したときに停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ落ちた；１以上の負スコアの残基アラインメントが蓄積して、累積スコアがゼロ以下になった；またはいずれの配列も末端に到達した。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、両鎖の核酸比較に対して、デフォルトとしてワードの長さ（Ｗ）＝１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）アラインメント（Ｂ）＝５０、期待値（Ｅ）＝１０（他の実施形態において���１または０．１または０．０１または０．００１または０．０００１に変えてもよい；０．１より遥かに高いＥ値は機能的に類似した配列を同定し得ないが、短い類似性領域に対してはより低い有意度、０．１と１０の間のＥ値を用いてヒットを判定するのが有用である）、Ｍ＝５、Ｎ＝４を使用しうる。タンパク質の比較に関しては、ＢＬＡＳＴＰを次のデフォルトを用いて使用しうる：Ｇ＝１１（ギャップを空けるコスト）；Ｅ＝１（ギャップを拡げるコスト）；Ｅ＝１０（期待値、この設定では、規定したアラインメントスコアＳと等しいかより優れたスコアをもつ１０ヒットが、検索対象と同じサイズのデータベース中で偶然に起こると期待される；Ｅ値を増加または減少して検索のストリンジェンシーを変えることができる）；およびＷ＝３（ワードサイズ、デフォルトはＢＬＡＳＴＮに対して１１、その他のｂｌａｓｔプログラムに対して３）。
ＢＬＯＳＵＭマトリックスはアラインメントの各位置に対する確率スコアを割当てるが、その割当は、関連タンパク質内のコンセンサスブロック間の置換が起こる頻度が分かっているのでその頻度に基づく。ＢＬＯＳＵＭ６２（ギャップ存在コスト＝１１；残基ギャップ当たりコスト＝１；λ比＝０．８５）置換マトリックスをＢＬＡＳＴ２．０のデフォルトで使う。様々な他のマトリックスを、ＢＬＯＳＭ６２の代わりに使ってもよく、例えばＰＡＭ３０（９，１，０．８７）；ＰＡＭ７０（１０，１，０．８７）、ＢＬＯＳＵＭ８０（１０，１，０．８７）、ＢＬＯＳＵＭ６２（１１，１，０．８２）およびＢＬＯＳＵＭ４５（１４，２，０．８７）が挙げられる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使う２つの配列間の統計的類似性の１つの基準は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間に一致が偶然起り得る確率を示す。本発明の他の実施形態においては、試験配列と比較して最小和確率が約１より低い、好ましくは約０．１より低い、さらに好ましくは０．０１より低い、そして最も好ましくは約０．００１より低い場合には、実質的に同一であると考えられる。
相同性の高いタンパク質の例としては、グリピカンファミリーを挙げることができる。グリピカンファミリーは、グリピカン１、グリピカン２、グリピカン３、グリピカン４、グリピカン５などから構成される（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．５２，（Ｍａｒｃｈ  １９９８）ｐｐ．１４５−１５２）。グリピカンファミリーの中でも、特にグリピカン３タンパク質が好ましい。
抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が望ましい。
感作抗原による動物の免疫は、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
抗原で免疫する動物として、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを選択した時もこれらのミエローマ細胞のいずれも用いることができる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては、ＧＰＣ３のＮ端ペプチドまたはその断片をスクリーニング用抗原として用いればよい。さらに、本発明の方法により得られた抗体を基に、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの人為的に改変した遺伝子組換え型抗体や、抗体断片、抗体修飾物などを作製することが可能である。
又、本発明の方法により得られたハイブリドーマから、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入すれば、組換え型抗体を作製することができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
抗体遺伝子は発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体は既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡなどと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、本発明の方法により得られた非ヒト動物由来抗体（例えばマウス抗体）のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、非ヒト動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、非ヒト動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用である。
本発明の方法により得られた抗体から、抗体の断片又はその修飾物を作製することも可能である。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
抗体の修飾物として、細胞障害性物質（化学療法剤、放射性物質、細胞由来トキシンなど）や標識物質（蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質など）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。このような抗体修飾物は、本発明の方法により得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明の方法により得られた抗体を基に、二重特異性抗体（ｈｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製することも可能である。二重特異性抗体の例として、同一抗原分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体、一方の抗原結合部位が抗原を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等の他の物質を認識する二重特異性抗体、一方の抗原結合部位が第一の抗原を認識し、他方の抗原結合部位が第一の抗原とは異なる第二の抗原を認識する二重特異性抗体、などを挙げることができる。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクターｌａ（ＨＥＦｌａ）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦｌａプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリポシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を得ることが可能である。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒトＧＰＣ３とマウスＧＰＣ３アミノ酸配列の比較を示す図である。
図２は、ハイブリドーマの１次スクリーニングの度数分布表を示す図である。
図３は、得られた４７クローンのモノクローナル抗体のアイソタイプの内分けを示す図である。
図４は、ＢＩＡｃｏｒｅによる抗ＧＰＣ３抗体の速度論的解析結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】    以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本願明細書記載の実施例において、以下の材料を用いた。
材料
可溶型ＧＰＣ３、可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質の発現ベクターとして、ｐＣＡＧＧＳにＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだｐＣＸＮＤ２、ｐＣＸＮＤ３を用いた。
ＤＸＢ１１はＡＴＣＣより購入した細胞を用い、培養には５％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １００９９−１４１，ＬＯＴ＃  Ａ０２７５２４２）／Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ（＋））（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １２５７１−０７１）／１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １５１４０−１２２）を用いた。ＤＸＢ１１を用いた発現株の選抜には、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １０１３１−０２７）／５％  ＦＢＳ／αＭＥＭ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １２５６１−０５６）（αＭＥＭ（−））／ＰＳあるいは同培地に終濃度２５ｎＭとなるようにＭＴＸを加えたものを用いた。
得られたハイブリドーマは１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０／１  ｘ  ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃  Ｈ−０２６２）／０．５  ｘ  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  ＣＡＴ＃  １０８８９４７）で培養した。
方法
〔可溶型ヒトＧＰＣ３の作製〕
ヒトＧＰＣ３をコードする全長ｃＤＮＡは、大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２より常法により調製したｌｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とし、上流プライマー（５’−ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＧＣＧ  Ｔ−３’（配列番号１））、下流プライマー（５’−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  Ｃ−３’（配列番号２））を用いたＰＣＲ反応により増幅した。この完全長ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを用い、可溶型ＧＰＣ３  ｃＤＮＡ発現プラスミドＤＮＡを構築した。Ｃ末端側の疎水領域（５６４−５８０アミノ酸）を除くように設計した下流プライマー（５’−ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  Ｃ−３’（配列番号３））とＥｃｏＲＩ認識配列、Ｋｏｚａｋ配列を加えた上流プライマー（５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  Ｃ−３’（配列番号４））を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片（１７１１ｂｐ）をｐＣＸＮＤ２−Ｆｌａｇにクローニングした。作製された発現プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０７０９−０１）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーにより溶出した。次に、Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃Ａ−２２２０）を用いてアフィニティー精製を行った。溶出は２００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドにより行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃４３０４）による濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−１０８８−０１）によるゲルろ過を行いＦＬＡＧペプチドを除去した。最後にＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを用いて濃縮し、同時にＴｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳ（５００ｍＭのＮａＣｌを含む）で溶出を行うことによりバッファー置換を行った。
〔可溶型ヒトＧＰＣ３コア蛋白質の作製〕
上記野生型ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡをテンプレートとし、アッセンブリーＰＣＲ法によって４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させたｃＤＮＡを作製した。この際、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されるようにプライマーを設計し、得られたｃＤＮＡをｐＣＸＮＤ３ベクターにクローニングした。作製された発現プラスミドＤＮＡをＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０５１０−０１）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファーにより溶出した。次に、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０５７５−０１）を用いてアフィニティー精製を行った。１０〜１５０ｍＭのイミダゾールでグラジエント溶出を行った。最後にＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて濃縮し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファーにより溶出した。
〔抗ＧＰＣ３抗体の作製〕
ヒトＧＰＣ３とマウスＧＰＣ３はアミノ酸レベルで９４％という非常に高い相同性を示す。ヒトＧＰＣ３とマウスＧＰＣ３アミノ酸配列の比較を図１に示す。図１の配列中黒三角で示した部分は、Ｎ結合グルコシル化部位の可能性のある部位であり、米印で示した部位は、グリコサミノグリカンが結合する可能性のある部位である。従って、通常のマウスへの免疫では抗体を取得し難いことが予想された。しかし、自己免疫疾患モデルマウスとして知られるＭＲＬ／ｌｐｒマウスは種々の自己抗体を産生することから、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに免疫することで、マウスと他の種で蛋白相同性の低い抗原はもちろんのこと、ＧＰＣ３のようにヒトとマウスで相同性の高い抗原に対しても抗体を作製できる可能性がある。そこで、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを用いた抗体作製の有用性を確かめる目的で、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスとＢａｌｂ／ｃマウスへの免疫による抗体作製の比較検討を行なった。
免疫及びハイブリドーマ作製
免疫原としてヘパラン硫酸付加可溶型ＧＰＣ３蛋白を用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、６週齢、日本チャールズリバー）５匹及びＭＲＬ／ｌｐｒマウス（オス、７週齢、日本チャールズリバー）７匹に定法に従い免疫を行なった。すなわち、初回免疫には免疫蛋白質を１００μｇ／匹となるように調製し、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント（Ｈ３７Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３−６０）ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２３１１３１））を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与し、２週間後に５０μｇ／匹となるように調製したものをＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２６３９１０））でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計５回行い、最終免疫については５０μｇ／匹となるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。１μｇ／ｍｌの可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質を１００μｌ／ウェルでコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＧＰＣ３に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｎｏ．２およびＭＲＬ／ｌｐｒ  Ｎｏ．６マウス１匹ずつに最終免疫を施し、定法に従い、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞を混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック、ｃａｔ＃７８３  ６４１）により細胞融合を行った。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓由来単核細胞はＢａｌｂ／ｃマウスのそれよりも数が多いため、Ｂａｌｂ／ｃ由来のハイブリドーマは９６穴培養プレート１０枚に、ＭＲＬ／ｌｐｒ由来のハイブリドーマは２０枚に播種した。フュージョン翌日よりＨＡＴ培地で選択を開始し、フュージョン後１０日目及び１４日目に培養上清を回収しＥＬＩＳＡスクリーニングを行なった。ＥＬＩＳＡスクリーニングは前述の抗体価測定と同様に１μｇ／ｍｌの可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質を１００μｌ／ウェルでコートしたイムノプレートを用いて行なった。
スクリーニング
一般的にＩｇＧ３、ＩｇＭは補体との結合活性が強くＣＤＣ活性を誘導し得るアイソタイプとして知られている。抗ＧＰＣ３抗体のように癌治療を目的とした場合、１次スクリーニング時にＩｇＧ３、ＩｇＭを取りこぼすことなくスクリーニングができることは非常に有用である。そこで、２次抗体を変えることでＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂのみならずＩｇＧ３、ＩｇＭもとりこぼさず拾う２段階の方法でスクリーニングを行なった。すなわち、一段階目は、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識−抗マウスＩｇＧ（ｒ）抗体（ＺＹＭＥＤ社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．６２−６６２２）を用いて発色させることでＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを取得し、次に、プレートを十分ｗａｓｈした後、二段階目はビオチン標識した抗ＩｇＧ３抗体（ＭＯＮＯＳＡＮ社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．ＭＯＮ５０５６Ｂ）及びホースラディッシュペルキシダーゼ標識した抗ＩｇＭ抗体（ＺＹＭＥＤ社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．６２−６８２０）で再度発色させることで選択的にＩｇＧ３及びＩｇＭを取得する方法でスクリーニングを行なった。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｎｏ．２）、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Ｎｏ．６）、各一匹ずつについてフュージョンを行い、ＧＰＣ３コア蛋白質を抗原としたＥＬＩＳＡスクリーニングにより陽性ウェルを選択した。陽性ウエルは２４ウェルプレートに拡大した後、限界希釈法（１陽性ウェルにつき９６ウェル１プレートに播きこむ）によりクローニングを行った。
抗体精製
抗体の精製は得られた培養上清から、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂについてはＰｒｏｔｅｉｎＧカラムＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＣＡＴ＃１７−０４０４−０１）を用いて、ＩｇＭについてはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌを用いて精製を行った。具体的に、ＩｇＧ精製はＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃１７−０４０４−０１）を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出は中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに行い直ちに中和した。抗体画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。
一方、ＩｇＭ精製はＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃２０５１０）を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５））で溶出した。溶出後はＩｇＧと同様の操作を行い４℃で保管した。
〔抗ＧＰＣ３抗体のアイソタイプ解析〕
抗グリピカン３抗体のアイソタイピングは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃  ３７５０２）を用い、方法は添付のマニュアルに従った。
〔ＢＩＡＣＯＲＥによる抗ＧＰＣ３抗体の速度論的解析〕
可溶型ＧＰＣ３コア蛋白チップの作製
ゲルろ過にて可溶型ＧＰＣ３コア蛋白を１０ｍＭ  Ｎａ  Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．０）にバッファー置換した。バッファー置換した可溶型ＧＰＣ３コア蛋白約１０μｇを用いて、アミンカップリングキット（ＢＩＡＣＯＲＥ社製  ＢＲ−１０００−５０）に記載された方法にて、センサーチップＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ社製  ＢＲ−１０００−１４）にアミンカップリングした。この操作にて約３０００ＲＵの可溶型ＧＰＣ３コア蛋白がＣＭ５チップ上に固定化された。
抗ＧＰＣ３抗体の速度論的解析
ＢＩＡＣＯＲＥ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製  ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）を用いて以下の速度論的解析を行った。各抗ＧＰＣ３抗体をＨＢＳ−ＥＰバッファーにて希釈して、１．２５、２．５、５、１０、２０μｇ／ｍｌになるように調製した。ランニングバッファーにＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＢＩＡＣＯＲＥ社製ＢＲ−１００１−８８）を用いて、流速２０μｌ／ｍｉｎにて各濃度の抗体４０μｌをインジェクトした。抗体をインジェクト中の２分間を結合相とし、その後ランニングバッファーに切り換え、２分間を解離相とした。解離相終了後、１０μｌの１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．２）、及び５μｌの０．０５％  ＳＤＳを連続してインジェクトすることにより、センサーチップを再生した。
この操作により得られたセンサーグラムを重ね書きし、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ｖｅｒ．３．０）にて結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、解離定数（ＫＤ）、最大結合量（Ｒｍａｘ）を算出した。
結果
〔リコンビナントＧＰＣ３の作製〕
抗ＧＰＣ３抗体作製のための材料として、Ｃ末端側の疎水性領域を欠損させた可溶型ＧＰＣ３蛋白質を作製した。ＣＨＯ細胞に可溶型ＧＰＣ３発現プラスミドＤＮＡを導入し定常発現株を構築した。培養上清をインイオン交換カラムで粗精製、濃縮した後、Ｃ末端側に付加したＦｌａｇタグを利用したアフィニティー精製を行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、５０〜３００ｋＤａのスメアなバンドと、約４０ｋＤａのバンドが得られた。ＧＰＣ３は６９ｋＤａのＣ末端にヘパラン硫酸付加配列を有するプロテオグリカンである。スメアなバンドはヘパラン硫酸修飾を受けたＧＰＣ３であると考えられた。約４０ｋＤａのバンドはアミノ酸シークエンスの結果、ＧＰＣ３のＮ末端側断片を起点としており、ＧＰＣ３は何らかの切断を受けていることが予想された。
ハイブリドーマのスクリーニングにおいてヘパラン硫酸に対する抗体を排除するため、ヘパラン硫酸付加シグナル配列である４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させた可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質を作製した。同様にＣＨＯ高発現株を構築し、培養上清よりＨｉｓタグを利用したアフィニティー精製を行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、７０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａの３つのバンドが得られた。アミノ酸シークエンスの結果、３０ｋＤａのバンドはＧＰＣ３のＣ末端側断片であることが判明し、ＧＰＣ３は３５８番目のアルギニンと３５９番目のセリンの間で何らかの酵素的な切断を受けていることが示された。ヘパラン硫酸付加型ＧＰＣ３でこの３０ｋＤａのバンドが見られなかったのは、ヘパラン硫酸が付加しているためスメアなバンドになっていたためと思われる。ＧＰＣ３が特定のアミノ酸配列で酵素的な切断を受けることは新しい知見であり、生物学的意義に関しては明らかにされていない。
〔抗ＧＰＣ３抗体の作製〕
ハイブリドーマ法により抗ＧＰＣ３抗体を作製した。免疫原としては、精製ヘパラン硫酸付加可溶型ＧＰＣ３を用いた。血清中のＧＰＣ３に対する抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞の細胞融合を行った。Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｎｏ．２）、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Ｎｏ．６）、各一匹ずつについてフュージョンを行い、ＧＰＣ３コア蛋白質を抗原としたＥＬＩＳＡスクリーニングによりＢａｌｂ／ｃマウス、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス合わせて１８０個の陽性ウェルを選択した。その結果、ＯＤ値０．２以上を示すクローン数はＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来が６５２ウエル、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来が１６ウエルであり、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの方がＢａｌｂ／ｃマウスよりもＯＤ値の高い（０．２以上）クローンが約４０倍も多く得られた。ＭＲＬ／ｌｐｒマウス間での一次スクリーニング結果の比較を、度数（頻度）分布表として図２に示す。
一次スクリーニング後、１８０の陽性ウェルを２４ウェルプレートに拡大した後、限界希釈法（１陽性ウェルにつき９６ウェル１プレートに播きこむ）によりクローニングを行った。最終的に、抗体を安定に産性する４７クローンを樹立した。
〔抗ＧＰＣ３抗体のアイソタイプ解析〕
樹立した抗グリピカン３抗体４７クローンについてアイソタイプ解析をしたところ、Ｂａｌｂ／ｃ由来の抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの３タイプのみであるのに対し、ＭＲＬ／ｌｐｒ由来の抗体にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３という全てのＩｇＧサブクラスとさらにＩｇＭも含まれていた。樹立した４７クローンについてのアイソタイプの内分を図３に示す。
以上のことから、Ｂａｌｂ／ｃマウスよりもＭＲＬ／ｌｐｒマウスを用いることでバラエティーに富んだアイソタイプを取得できることが明らかとなりその有用性が示された。さらに、ＩｇＧ３及びＩｇＭなど一般的に出現頻度の低いアイソタイプも取得できることから、ＣＤＣ活性を有する抗体取得を目的とした場合にもＭＲＬ／ｌｐｒマウスを用いた抗体作製が有用であることが示された。
〔ＢＩＡＣＯＲＥによる抗ＧＰＣ３抗体の速度論的解析〕
Ｂａｌｂ／ｃマウス由来１０クローン、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来２８クローンの精製抗体を用いてＢＩＡＣＯＲＥによる速度論的解析を行なった。速度論的解析結果を図４に示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来抗体に比べてＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来抗体の方が親和性の高い抗体がより多く含まれていた。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来抗体では最も親和性の高いものでの解離定数が１０−８Ｍオーダーであるのに対し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来抗体には１０−１０Ｍオーダーの解離定数を持つ高親和性抗体が４種類（ＩｇＧ１タイプとＩｇＧ２ｂタイプがそれぞれ２種類）含まれていた。以上のように、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスからの方がＢａｌｂ／ｃマウスよりも約１００倍親和性の高い抗体が得られたことから、ＭＲｌ／ｌｐｒマウスを用いた抗体作製の有用性が示された。
考察および結論
ＧＰＣ３はマウスとヒトでアミノ酸レベルで９４％という極めて高い相同性を示すことから通常のＢａｌｂ／ｃマウス等への免疫では抗体を得難い可能性がある。一方、自己免疫疾患モデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスはＦａｓリガンドの機能が欠損していることから自己抗体産生Ｂ細胞のアポプトーシスが誘導されず免疫寛容を打破する機構が働いているものと思われる。従って、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス等の自己免疫疾患モデルマウスを用いれば、マウスと他の種で蛋白相同性の低い抗原はもちろんのこと、マウス抗原やＧＰＣ３のようにマウスとヒトでアミノ酸レベルで非常に高い相同性を有する抗原に対しても効率良く抗体を作製できる可能性がある。
今回の検討により、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスではＢａｌｂ／ｃマウスに比較してＯＤ値の高い陽性ウェルが約４０倍得られること、アイソタイプもバラエティーに富んでいること、抗体の抗原親和性も約１００倍高いことを見出した。
産業上の有用性
以上の結果から、マウスと他の種で蛋白相同性の低い抗原はもちろんのこと、マウス抗原やＧＰＣ３のようにマウスとヒトでアミノ酸レベルで非常に高い相同性を有する抗原に対する抗体を取得するために、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに免疫して抗体を作製することは非常に有効であると考えられる。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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