(57)【要約】本発明は、ヘマグルチニン活性を低下させた薬剤または遺伝子運搬組成物を提供する。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に化合物を付加させることにより、該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性を低下させた薬剤または遺伝子運搬組成物を製造することに成功した。例えば本発明の一態様において提供されるウイルスベクターは、赤血球凝集活性および溶血活性が有意に低下しており、血中でのベクターの安定性が顕著に上昇した。本発明により提供される薬剤または遺伝子運搬組成物は、生体内への薬剤または遺伝子の導入に好適に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む、薬剤または遺伝子運搬組成物であって、（ａ）該蛋白質に化合物が付加されており、（ｂ）該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性が低下しており、（ｃ）該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する、組成物。
【請求項２】
さらに（ｄ）該化合物が付加されていない場合に比べ赤血球に対する溶血活性が低下している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該組成物が、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスの感染性ウイルス粒子を含む組成物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
該組成物が、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスの不活化ウイルスまたは該ウイルスのエンベロープの部分を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルス科ウイルスである、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
該パラミクソウイルス科ウイルスが、センダイウイルスである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
該蛋白質に付加されている化合物が分子量１，８００以上である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
該蛋白質に付加されている化合物が分子量４，５００以上である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
該蛋白質に付加されている化合物が分子量１６，０００以上である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
該蛋白質に付加されている化合物がポリエチレングリコールである、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
該蛋白質が、さらにポリエチレンイミンと共に複合体を形成している、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
該蛋白質が、細胞に結合する化合物と共に複合体を形成している、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
該細胞に結合する化合物が、該蛋白質に付加されている化合物と結合している、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該蛋白質に付加されている化合物が、該蛋白質に結合する抗体またはその断片である、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
該細胞に結合する化合物が、細胞表面の受容体のリガンドである、請求項１２から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
該リガンドが葉酸である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、細胞に結合する化合物が結合している抗体またはその断片。
【請求項１８】
抗体またはその断片がＦ（ａｂ’）２である、請求項１７に記載の抗体またはその断片。
【請求項１９】
細胞に結合する化合物が細胞表面の受容体のリガンドである、請求項１７または１８に記載の抗体またはその断片。
【請求項２０】
該リガンドが葉酸である、請求項１９に記載の抗体またはその断片。
【請求項２１】
（ａ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、細胞に結合する化合物が結合している抗体またはその断片、および（ｂ）該エンベロープ蛋白質を含む薬剤または遺伝子運搬組成物、を含む薬剤または遺伝子運搬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープ蛋白質を修飾することにより、ヘマグルチニン活性を低減させた、細胞内への薬物または遺伝子運搬体に関する。
背景技術
センダイウイルス（ＳｅＶ）のエンベロープ蛋白質はヘマグルチニン（ＨＮ）とフュージョン（Ｆ）の２種類から構成される。ＳｅＶはＨＮ蛋白質が細胞表面のシアル酸に結合した後、Ｆ蛋白による融合により、細胞質内へ直接、短時間に、かつ高効率で感染することが可能である。また、シアル酸はほとんどの細胞表面に存在するため、広範囲の細胞への感染が可能である。このような、優れた感染特性を有するＳｅＶは遺伝子治療を目的に、種々の遺伝子を搭載した組替えＳｅＶベクターとしての開発や（Ｓｈｉｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１，８，１０４３−１０５０）、そのエンベロープ蛋白質を含むリポソーム内水相に遺伝子や種々の薬物を封入した、薬物送達システムとしての研究も進められている（Ｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，４０４，１６４−１６８；Ｉｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１９９８，６，１４４−１４７）。
このように、ＳｅＶベクターは多くの利点を有しているが、その広範な感染性は本ベクターの欠点にもなる。ＳｅＶベクターはシアル酸を大量に含む赤血球とも融合して、強い溶血活性を引き起こすことから安全性の面で改善が望まれる。また、赤血球と融合することは、標的とする細胞に必要な量の薬物を送達できないことを意味しており、血液中で極めて不安定であると言える。そのため、生体内への投与方法は、一時的に血流を止める、あるいは還流法などによる血液を介さずに行う方法か、血液成分の影響の少ない部位への局所投与に限定されることが予測される。
このような安全性、安定性にかかわる問題を解決するにはＨＮ蛋白質のヘマグルチニン活性を消失または低減して、赤血球との結合を少なくすることが必要である。しかし、ヘマグルチニン活性の消失は、薬物を導入する標的細胞への結合を低下することにもなり、効率が著しく低下することが容易に推測されるので工夫が必要となる。
これまでに、ＳｅＶのＨＮ蛋白をジチオスレイトール（ＤＴＴ）により特異的に還元して、ヘマグルチニン活性を消失させる方法を利用した研究が多数報告されているが、そのほとんどは赤血球への溶血活性を指標にした研究である。例えば、ＴｏｍａｓｈｉらはＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８２，１４３，（２），２５２−２５６において、ＳｅＶをＤＴＴで還元して、そのヘマグルチニン活性を消失させた。そのときに形成されるＨＮ蛋白分子中のＳＨ基に新たに、赤血球を認識する抗体分子を導入することで、再度赤血球への結合能を補い、溶血活性を再び示すことを報告するのみに留まっている。しかも、その融合活性は著しく低下しており、この方法の発展性には疑問が残る。また、Ｇｉｔｍａｎらは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８５，２４，２７６２−２７６８において、ＳｅＶのエンベロープへの化学的な修飾について報告している。ヘマグルチニン活性を消失させることに成功しているが、融合能も同時に完全に消失しており、融合能を付与するには新たに修飾していないエンベロープ蛋白を組み込み、ヘマグルチニン活性を再度もたらす必要があると報告している。
細胞を標的とした研究もいくつか報告はされている。例として、ＢａｇａｉらはＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，６７，（６），３３１２−３３１８において、ＨＮを還元したＳｅＶを界面活性剤で可溶化を行った後、Ｆ蛋白のみからなる微粒子を再構成させて、Ｆ蛋白の糖鎖特異的な感染を目指した薬物送達システムを提唱している。また、Ｒａｍａｎｉらも、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，４０４，１６４−１６８にて、同様のシステムでインビトロにおける遺伝子導入の結果を報告している。この方法論では、確かにヘマグルチニン活性を消失した上で、標的とする細胞のみに融合させることは可能であるが、ＨＮ蛋白と同時にＦ蛋白も少なからず還元を受けることや再構成の過程でエンベロープ蛋白が完全に粒子に組み込まれず（Ｐｏｎｉｍａｓｋｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，２６９，３９１−４０３）、再び得られる運搬体の融合能は低下するために、投与量が多くなることが改善すべき点として挙げられる。また、調製において、ウイルスを大量に必要とすることや界面活性剤の除去が煩雑であること、さらに、再構成される粒子の不均一性など調製方法の面からも改良の余地は大きい。
このように、これまでに、ヘマグルチニン活性を著しく低減させ、かつ細胞への薬剤送達能を維持した、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープ蛋白をベースとした薬物送達システムは知られていない。
発明の開示
本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルス粒子中のエンベロープ蛋白を修飾することで、ヘマグルチニン活性のみを大きく低減させて、細胞内への薬物または遺伝子導入能は維持した運搬体を提供することを課題とする。
薬物や製剤の開発において、望まない作用を軽減させ、目的とする機能を引き出す方法論として、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）は重要な技術である。本発明者らは、ＤＤＳ技術の一つである化学修飾をマイナス鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープに対して適用することで、赤血球に対する作用を低下させ、細胞への導入能を維持しうることを考えた。そのためには、ヘマグルチニン活性を担うエンベロープ蛋白への選択的修飾を行い、その活性を低減させるとともに、融合に重要なエンベロープ蛋白への影響は可能な限り小さくするのが望ましい。
本発明者らは鋭意検討した結果、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子修飾が赤血球凝集反応を低減させるのに有効であることを見出した。例えばセンダイウイルス（ＳｅＶ）のエンベロープ蛋白に存在するアミノ基に対して活性化ＰＥＧを共有結合させて得られるＰＥＧ修飾ＳｅＶベクター（図１）は、ＰＥＧの反応量に応じて赤血球凝集反応（ＨＡＵ）が著しく低下することが明らかとなった。ＨＡＵの低下に伴い、標的細胞への感染性も同様に低下することが懸念されたが、修飾ベクターの細胞への遺伝子導入能の低下はＨＡＵの低下度合いに比べて小さく、十分な能力を維持していることを認めた（表１および２）。このとき、ＰＥＧの分子量が大きいほど、細胞への遺伝子導入能を高くすることができることを明らかにした。また、ＰＥＧ修飾ベクターの調製方法も、非常に短時間で容易であった。
ＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターの構成蛋白の電気泳動パターンから、ＨＮ蛋白量の大幅な減少と、それに代わる新たな高分子の出現を認めた。一方、Ｆ蛋白の減少は小さいことから、ＨＮ蛋白が優先的にＰＥＧ修飾され、Ｆ蛋白への結合よりも優位に起こることが示唆された。このことがＨＡＵを大きく低下しつつ、融合能を維持する要因となっていると推測された（図４、１５、および１６）。
ＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターはＨＡＵの低下を反映して、ラット血液に対する溶血活性が著しく低下しており、安全性の面で非常に優れたベクターであることが示された（図２）。また、ＳｅＶベクターは血液と接触するとその遺伝子導入能が著しく低下したが、修飾ベクターでは血液処理後も遺伝子導入能を十分に維持していた（図３および２０）。このことは、修飾による赤血球との結合を低下させる効果に加えて、補体などの血液中に存在するベクターの活性を不安定化すると考えられる因子に対しての安定化効果も同時に付与できることを示す結果であった。さらに、ＰＥＧ修飾ベクターが中和抗体存在下においても、実に安定に遺伝子導入可能であったことから（図５および１７）、様々な生体成分に対する安定化効果も付与されていると考えられた。
さらに、ＰＥＧ修飾ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ投与の効果を調べたところ、複数回投与においてＰＥＧ修飾ベクターの遺伝子導入効率は未修飾ベクターに比べ明らかに高く、生体内において高い遺伝子導入能を持つことが確認された（図１９）。
このように、ＰＥＧ修飾の条件を適当に選ぶことにより、赤血球とのインタラクションのみを低減させ、細胞へ高い導入能を維持しうることを見出した。
さらに、本発明者らはヘマグルチニン活性を担うエンベロープ蛋白に選択的に結合する物質の一つとして、ＨＮ蛋白に対する精製モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が活性を低下させることから（Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９８２，１４１，４０９−４２０）、その利用についても検討を行った。ＭＡｂで処理したセンダイウイルスベクターは赤血球凝集反応を全く示さず、そのヘマグルチニン活性は完全にブロックされて、細胞への遺伝子導入も認められなかった。そこで、新たに、ＭＡｂ分子に標的細胞へ結合するリガンド分子を導入したところ、このリガンド結合ＭＡｂで処理したセンダイウイルス（図５）は、赤血球凝集反応や溶血活性は示さなかったにもかかわらず（図７、１０、および１１）、リガンドが結合しうる標的細胞に対しては遺伝子を高効率に導入し得た（図８および９）。標的細胞以外には遺伝子導入ができなかったことや、過剰の競合物質存在下で遺伝子導入能が消失したことから（表４）、修飾ベクターのヘマグルチニン活性が完全に消失しているにもかかわらず、標的とする細胞にのみ高効率で遺伝子導入が可能となることを裏付ける結果を得た。
組み込むリガンド分子をターゲットとする細胞に高発現しているレセプターに応じた分子に変更することで、種々の細胞に対して導入可能なシステムになると考えられる。
また、このシステムは、使用直前に混和することで容易に調製できるため、非常に使いやすいシステムであることも特徴としてあげられる。
このような技術はＳｅＶのエンベロープ構成蛋白から再構成した微粒子製剤にも適用できる。この場合、先述したようなＨＮ蛋白を還元する必要はなくなると考えられる。ＳｅＶを還元せずにそのまま可溶化を行い、必要な薬物を封入した微粒子を再構成させた後、この技術を適用すれば、還元によるＦ蛋白への影響を与えることなく、より融合能の高い運搬体が形成されると考えられる。
本発明は、ヘマグルチニン活性が低減した薬剤または遺伝子運搬組成物に関し、より具体的には、
（１）マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む、薬剤または遺伝子運搬組成物であって、（ａ）該蛋白質に化合物が付加されており、（ｂ）該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性が低下しており、（ｃ）該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する、組成物、
（２）さらに（ｄ）該化合物が付加されていない場合に比べ赤血球に対する溶血活性が低下している、（１）に記載の組成物、
（３）該組成物が、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスの感染性ウイルス粒子を含む組成物である、（１）または（２）に記載の組成物、
（４）該組成物が、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスの不活化ウイルスまたは該ウイルスのエンベロープの部分を含む、（１）または（２）に記載の組成物、
（５）該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルス科ウイルスである、（１）から（４）のいずれかに記載の組成物、
（６）該パラミクソウイルス科ウイルスが、センダイウイルスである、（５）に記載の組成物、
（７）該蛋白質に付加されている化合物が分子量１，８００以上である、（１）から（６）のいずれかに記載の組成物、
（８）該蛋白質に付加されている化合物が分子量４，５００以上である、（７）に記載の組成物、
（９）該蛋白質に付加されている化合物が分子量１６，０００以上である、（８）に記載の組成物、
（１０）該蛋白質に付加されている化合物がポリエチレングリコールである、（１）から（９）のいずれかに記載の組成物、
（１１）該蛋白質が、さらにポリエチレンイミンと共に複合体を形成している、（１）から（１０）のいずれかに記載の組成物、
（１２）該蛋白質が、細胞に結合する化合物と共に複合体を形成している、（１）から（１１）のいずれかに記載の組成物、
（１３）該細胞に結合する化合物が、該蛋白質に付加されている化合物と結合している、（１２）に記載の組成物、
（１４）該蛋白質に付加されている化合物が、該蛋白質に結合する抗体またはその断片である、（１２）または（１３）に記載の組成物、
（１５）該細胞に結合する化合物が、細胞表面の受容体のリガンドである、（１２）から（１４）のいずれかに記載の組成物、
（１６）該リガンドが葉酸である、（１５）に記載の組成物、
（１７）マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、細胞に結合する化合物が結合している抗体またはその断片、
（１８）抗体またはその断片がＦ（ａｂ’）２である、（１７）に記載の抗体またはその断片、
（１９）細胞に結合する化合物が細胞表面の受容体のリガンドである、（１７）または（１８）に記載の抗体またはその断片、
（２０）該リガンドが葉酸である、（１９）に記載の抗体またはその断片、
（２１）（ａ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、細胞に結合する化合物が結合している抗体またはその断片、および（ｂ）該エンベロープ蛋白質を含む薬剤または遺伝子運搬組成物、を含む薬剤または遺伝子運搬キット、を提供するものである。
本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む薬剤または遺伝子運搬組成物であって、（ａ）該蛋白質に化合物が付加されており、（ｂ）該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性が低下しており、（ｃ）該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する組成物を提供する。本発明の組成物は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む複合体である。このような複合体は、例えば感染性ウイルス粒子であってもよいし、不活化したマイナス鎖ＲＮＡウイルス、または例えば再構成リポソームなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスの破砕物のエンベロープ成分を含む複合体であってもよい。
感染性ウイルス粒子は、細胞への感染を介して該細胞内にウイルスに含まれる薬物または遺伝子を細胞内に運搬する。特にウイルスゲノムに外来遺伝子を組み込むことにより、感染性ウイルス粒子が感染した細胞内においてウイルスゲノムから該遺伝子を発現させることができる。感染性ウイルスは、複製能を有する（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ウイルスであってもよく、あるいは複製能を有さない（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）ウイルスであってもよい。複製能を有するウイルスとは、該ウイルスが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、細胞内において該ウイルスのゲノムＲＮＡを、このゲノムＲＮＡの転写および複製に必要なウイルス蛋白質の共存下で転写させることにより再構成させることができる。組み換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（国際公開番号  ＷＯ９７／１６５３９；国際公開番号  ＷＯ９７／１６５３８；国際公開番号  ＷＯ００／７００５５；国際公開番号  ＷＯ００／７００７０；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９６６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターをＤＮＡから再構成させることができる。
外来遺伝子を含む組換えウイルスベクターは、ウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とする細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、また天然型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。あるいは、天然型蛋白質の欠失型や人工的な蛋白質などであってもよい。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、ウイルスベクターの鋳型となるＤＮＡ（ウイルスベクターＤＮＡ）に対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入し、これを転写させてウイルスの再構成を行う。ウイルスベクターＤＮＡに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウイルスベクターＤＮＡにおいては、転写終結（Ｅ）配列と転写開始（Ｓ）配列との間などに、６の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，１９９３，ｐ．４８２２−４８３０）。パラミクソウイルス等においては、外来遺伝子は、ウイルスの各蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（例えばＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質のＯＲＦ）の前および／または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜Ｅ−Ｉ−Ｓ配列（転写開始配列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入し、各遺伝子の間にＥ−Ｉ−Ｓ配列のユニットが配置されるようにする。
回収したウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法は濾過、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
不活化したウイルスまたは破砕ウイルスの再構成生成物は、細胞に薬物または遺伝子を導入するためのトランスフェクション試薬として用いられる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスの不活化は、例えばＵＶ照射により行うことができる。また、ＨＶＪ（Ｈｅｍｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）−リポソームなど、不活化ウイルスを用いたリポソームの製造方法は、例えば震盪と超音波により調製することができる（「ライフサイエンスにおけるリポソーム／実験マニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京（１９９２）ｐｐ．２８２〜２８７参照）。また不活性化したセンダイウイルス粒子、またはリポソーム及び核酸を混合した組成物（膜融合リポソーム）が報告されている（金田安史：ＢＩＯＴＨＥＲＡＰＹ，８，１２６５（１９９４））。あるいは破砕ウイルスの再構成は、例えば、ウイルス可溶化物からリポソームを再構成させ、いわゆるビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）を調製することにより実施できる（Ｂａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５２，１５−２５）。具体的には、マイナス鎖ＲＮＡウイルスをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの界面活性剤で可溶化した後、不溶性のＲＮＰを遠心除去する。エンベロープおよびエンベロープ蛋白質を含む可溶化液から界面活性剤を除くことにより粒子を再構成させ、ビロソームを調製することができる。ビロソームは粒子径を均一化するために、遠心分離（例えば１２０００ｒｐｍ，１０分）により粒子サイズが揃ったビロソームを分離して回収することができる。
感染性ウイルス粒子を含む組成物においては、その感染性ウイルス粒子は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであってもよく、あるいはマイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を持つ別のウイルスであってもよい。異種ウイルスのエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化されたウイルスはよく知られている（国際公開番号  ＷＯ０１／９２５０８）。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスを調製するには、例えば、マイナス鎖ＲＮＡウイルスの不活化ウイルスまたは該ウイルスのエンベロープ蛋白質を持つビロソームなどを調製し、これを他のウイルスに融合させることにより製造することができる。あるいは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を発現する発現ベクターを、他のウイルスのパッケージング細胞で発現させることにより製造することができる。該他のウイルスとしては、例えばレトロウイルスが挙げられ、具体的にはモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ；ＭｏＭＬＶ）およびマウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ；ＭＳＣＶ）などを含むオンコウイルス亜科（Ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）に属するレトロウイルス（本発明においてオンコウイルスと呼ぶ）、およびヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）（例えばＨＩＶ１またはＨＩＶ２）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディ・ビスナウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などを含むレンチウイルス亜科（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）に属するレトロウイルス（本発明においてレンチウイルスと呼ぶ）が挙げられる。ＨＩＶ−１としては、全てのメジャー（Ｍ）サブタイプ（ＡからＪを含む）、Ｎおよびｏｕｔｌｉｅｒ（Ｏ）が含まれる（Ｈｕ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  １９９６；２７５：２１０−２１６；Ｚｈｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，５；３９１（６６６７）：５９４−７；Ｓｉｍｏｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９８，４（９）：１０３２−７）。ＳＩＶ単離株としては、ＳＩＶａｇｍ、ＳＩＶｃｐｚ、ＳＩＶｍａｃ、ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｎｍ、ＳＩＶｓｙｋ等が例示できる。また、スプーマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）に由来するレトロウイルスなどであってもよく、例えばフォーミーウイルス（Ｆｏａｍｙｖｉｒｕｓ）が含まれる（ＤＥ４３１８３８７；ＷＯ９６０７７４９；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９５）２１０，１，１６７−１７８；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０，１，２１７−２２）。フォーミーウイルスに由来するウイルスベクターは、ヒト細胞への外来遺伝子導入、特に遺伝子治療および組換えワクチンの投与などに利用され得る。
シュードタイプウイルスベクターは、例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に加えて、該ウイルスの他のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。例えば、パラミクソウイルスのＨＮおよびＦ蛋白を持つシュードタイプウイルスベクターで、ＨＮ蛋白質に化合物が付加されたベクターを含む組成物は、本発明に含まれる。またマイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を含むウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができ、例えばこのような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質などが挙げられる。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇｐ８５蛋白質、ＥＢウイルスのｇｐ３５０、ｇｐ２２０蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）４０７０Ａ株由来のエンベロープ蛋白質を用いることができる。また、ＭｕＭＬＶ  １０Ａ１由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばｐＣＬ−１０Ａ１（Ｉｍｇｅｎｅｘ）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））。エコトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）由来のエンベロープ蛋白質を用いることができる。水疱性口内炎ウイルスＧ蛋白（ＶＳＶ−Ｇ）としては、例えばＩｎｄｉａｎａ血清型株（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：５１９−５２８（１９８１））由来の蛋白を用いることができる。これら以外にも、所望の株由来の蛋白質を用いることができる。
本発明においてマイナス鎖ＲＮＡウイルスとは、マイナス鎖（ウイルス遺伝子をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のＲＮＡをゲノムとして含むウイルスであって、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有するウイルスを言う。マイナス鎖ＲＮＡはネガティブ鎖とも呼ばれる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のインフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）の水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
本発明においてヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質は、好ましくは一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスエンベロープ蛋白質である。一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスは非分節型（ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスとも言われ、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＴｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ属等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，およびＰｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。ヘマグルチニン活性を持つエンベロープ蛋白質としては、具体的には、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質、オルソミクソウイルスのＨＡ蛋白質、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質、ブニヤウイルスのＧ１蛋白質、ラブドウイルスのＧ蛋白質、フィロウイルスのＶＰ１蛋白質などが挙げられる。
本発明においてヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質は、さらに好ましくはパラミクソウイルスのウイルスエンベロープ蛋白質である。「パラミクソウイルス」とは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスを指す。パラミクソウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）属、モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属、およびルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属、およびメタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属が含まれ、具体的にはセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。パラミクソウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質は、具体的にはＨＮ蛋白質が挙げられる（Ｈ蛋白質とも言われる）。本発明においてヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質は、さらに好ましくはパラミクソウイルス属、モルビリウイルス属、およびルブラウイルス属を含むパラミクソウイルス亜科のウイルスであり、さらに好ましくはパラミクソウイルス属ウイルスのウイルスエンベロープ蛋白質である。ヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質は、最も好ましくはセンダイウイルスのＨＮ蛋白質である。各ウイルスは、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などが含まれる。例えばＺ株由来のセンダイウイルスのＨＮ蛋白質を好適に用いることができる。センダイウイルスのＨＮ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１などに記載されている。
また、ウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質として、オルトミクソウイルス科ウイルスのＨＡ蛋白質を用いることも好ましい。例えば、インフルエンザウイルスのエンベロープ蛋白発現プラスミドを用いて製造されたシュードタイプウイルスは、ヒト細胞を含めた広い哺乳動物細胞に感染可能である。インフルエンザウイルスエンベロープには所望の単離株由来のものが用いられ得る。インフルエンザウイルスのｂｕｄｄｉｎｇにおいては、ノイラミニダーゼがシアル酸との結合を切断する役割を担っている。このため、ＨＡシュードタイプウイルスの作製においては、ＨＡに化合物を付加した前、中、または後の時期にノイラミニダーゼで処理することで感染性ウイルスを得ることができる。あるいは、ノイラミニダーゼ活性を有する蛋白質を共存させたウイルスベクターを作製することによって、自動的にシアル酸との結合を切断させることができる。この場合、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質などの、ノイラミニダーゼ活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質を用いることが特に好適である。このように本発明は、オルトミクソウイルス科ウイルスのＨＡとパラミクソウイルス科ウイルスのＨＮ蛋白質の両方でシュードタイプ化されたウイルスベクターで、これらのいずれかまたは両方に化合物が付加されており、ヘマグルチニン活性が低下したウイルスを含む組成物を提供する。
ウイルスエンベロープ蛋白質は、野生型ウイルスが持つインタクトな蛋白質であってもよいし、天然または人為的に変異が導入されていてもよい。例えば、これらのエンベロープ蛋白質において細胞表面の抗原分子となりうる抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用して抗原提示能を弱めた蛋白質を用いてウイルスを作成することも可能である。また、病原性ウイルス等における弱毒株由来のエンベロープ蛋白質などを用いることもできる。
例えば、ヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質や、他のエンベロープ蛋白質の細胞質側領域を欠失、置換、および／または付加により改変した蛋白質を用いて、より高い遺伝子導入能を有するベクターを製造することが可能である。本発明は、天然に存在するヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質の細胞質側領域の一部または全部が、置換、欠失、および／または付加により改変された蛋白質を含むウイルスであって、ヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質に化合物が付加されているベクターを含む組成物に関する。具体的には、例えばパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質の細胞質側領域を欠失させたり、他の膜蛋白質（例えばレンチウイルスを含むレトロウイルスのエンベロープ蛋白質）の細胞質側領域で置換または付加した改変蛋白質は、感染効率の高いシュードタイプレトロウイルスベクターを製造するために好適に用いられる。
本発明においてヘマグルチニン活性とは、ヘマグルチネーション（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ，ＨＡ）を起こす活性、すなわち赤血球を凝集させる活性を言う。ヘマグルチニン活性は公知の方法により試験することができる（国立予防衛生研究所学友会編，改訂二版  ウイルス実験学  総論，ｐｐ．２１４−２２５，丸善株式会社）。赤血球としては、例えばニワトリ（ヒヨコおよび成鶏を含む）、ガチョウ、ラット、モルモット、アカゲザル、ミドリザル、またはヒトなどの赤血球が用いられ得る。反応温度は、０℃、４℃、室温、または３７℃など、蛋白質により適した条件で行う。具体的には、ヘマグルチニン活性の測定は、例えば「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆ａｍｐ；Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）により実施することができる。
本発明の組成物は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に化合物が付加されており、これにより該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性が低下している。本発明において活性の低下は有意に低下していればよく例えば統計学的に有意（例えば有意水準５％またはそれより有意）に低下している場合が含まれる。また活性が完全に欠失（または検出限界未満）している場合も含まれる。本発明の組成物は、該化合物が付加されていない場合の対照組成物と比べ、ヘマグルチニン活性が好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、より好ましくは１／５以下、より好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／２０以下、より好ましくは１／５０以下、より好ましくは１／１００以下、より好ましくは１／２００以下、より好ましくは１／５００以下、より好ましくは１／１０００以下に低下している。これに対して本発明の組成物が持つ薬剤または遺伝子を細胞へ導入する能力は、該ヘマグルチニン活性の低下に比べて高く維持されている。すなわち、本発明の組成物が持つ薬剤または遺伝子を細胞へ導入する能力は、化合物が付加されていない対照組成物の場合と比べ低下の度合いが、該ヘマグルチニン活性の低下の度合いに比べて少ないか、より好ましくは低下していないか上昇している。
また本発明の組成物は、好ましくは溶血活性も有意に低下している。溶血活性は、血液に被検組成物を添加し静置後、遠心して血球成分を除き、溶出したヘモグロビンを吸光度測定により測定して検出することができる（実施例参照）。本発明の組成物は、該化合物が付加されていない場合の対照組成物と比べ、溶血活性が好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、より好ましくは１／５以下、より好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／２０以下、より好ましくは１／５０以下に低下している。
本発明の組成物は、ヘマグルチニン活性が低下しており、好ましい態様においては溶血活性も低下しているが、薬剤または遺伝子を細胞に導入する能力を保持している。例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルス、あるいは該ウイルスのエンベロープ成分を含む組成物においては、該組成物は標的細胞との細胞膜融合能を有しており、これにより薬剤または遺伝子を標的細胞に送達される。細胞膜融合能とは、本発明の組成物に含まれる複合体（運搬体）が細胞膜に吸着した後、該複合体の持つ融合活性により、細胞内にその構成成分が組み込まれる能力を言う。この活性は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープに含まれる、細胞融合を起こすエンベロープ蛋白質であるフュージョン（Ｆ）蛋白質の働きによる。本発明の組成物に含まれる細胞膜には、化合物が付加されたヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に加え、好ましくはマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＦ蛋白質も含んでいる
細胞との融合能は、例えば、１．赤血球の溶血を指標として検出する。２．膜に蛍光物質を組み込んでおき、融合による膜の流動により蛍光物質が希釈され蛍光強度の変化が起きることを利用して検出する。あるいは３．内水層に薬物を封入したリポソームを細胞膜のモデルとして、その漏出を指標として検出する、などの方法により検出することができる。
また、上記のようにレトロウイルスなど他のウイルスにおけるシュードタイプウイルスとして本発明の組成物を調製する場合は、それぞれのウイルスのエンベロープ蛋白質により、ウイルス内の薬剤または遺伝子が細胞に導入される能力が保持されている。薬物または遺伝子の細胞への導入能力は、細胞内に導入されたこれらの薬剤または遺伝子を検出することにより確認することができる。薬剤であれば、例えば標識された薬剤の細胞内への取り込みを検出したり、あるいは生理活性物質を取り込ませ、これによる細胞の形質の変化を検出することによって検出することができる。遺伝子であれば、細胞内における該遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタンブロット等の方法によりＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルで検出することができる。また、生理活性蛋白質をコードする遺伝子を取り込ませ、該蛋白質による細胞の形質の変化を検出することによって検出することができる。
また本発明の組成物は、好ましくは血中安定性が有意に上昇している。血中安定性の上昇とは、本発明の組成物が血中に置かれたときに、薬剤または遺伝子の運搬能力の低下の度合いが小さくなることを言う。運搬能力の低下が少ないほど血中安定性は高い。血中安定性の上昇は、本発明の組成物を血液と共にインキュベートし、その後の該組成物の薬剤または遺伝子の運搬を測定し、化合物が付加されていない場合の対照組成物と比べることにより知ることができる（実施例参照）。運搬能力は、例えば薬剤であればその薬剤の活性の大きさであってよく、遺伝子でればその遺伝子の発現レベルであってよい。遺伝子の発現は、例えば転写産物（ｍＲＮＡ）または翻訳産物（蛋白質）を直接または間接に検出することにより決定することができる。生理活性を持つ蛋白質の検出は、その蛋白質の活性の測定により行うことができる。本発明の組成物は、該化合物が付加されていない場合の対照組成物の運搬能力の低下の度合いと比べ、薬剤または遺伝子の運搬能力の低下の度合いが好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、より好ましくは１／５以下、より好ましくは１／１０以下に縮小している。本発明の組成物は、ヘマグルチニン活性に対する薬剤または遺伝子運搬能力が、未修飾の対照組成物に比べ上昇していることが好ましい。
本発明においてヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に化合物が付加されているとは、該蛋白質と該化合物とが結合していることを言う。結合は共有結合または非共有結合であってよい。非共有結合としては、例えば水素結合、配位結合、イオン結合、疎水相互作用（疎水結合）、および分子間力（ファンデルワールス力）などが挙げられる。該蛋白質と該化合物は、もともとは分離して存在していたが、結合により該化合物が該蛋白質に付加されたものであってよい。ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質への化合物の付加は、例えば架橋による共有結合形成により行うことができる。架橋は、所望の官能基を介して形成させることができる。官能基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、フェノール基等が挙げられるが、これらに制限されない。共有結合の例としてエステル結合、エーテル結合、アミノ結合、アミド結合、スルフィド結合、イミノ結合、ジスルフィド結合等が挙げられる。該蛋白質と該化合物は、好ましくは非ペプチド結合で結合されている。共有結合法としては、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、およびアルキル化法などが挙げられる。
本発明の薬剤または遺伝子運搬組成物の製造は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に化合物を接触させる工程、および該蛋白質と該化合物を結合させる工程を含む方法により実施することができる。化合物は、該エンベロープ蛋白質のエンベロープ外側にあたる領域に結合させる。このためには、特に、該蛋白質に化合物を接触させる工程を、該蛋白質を含むウイルス粒子に該化合物を接触させることにより行うことが好ましい。これにより、ヘマグルチニン活性に関与する該蛋白質のウイルス表面に露出した領域に特異的に化合物を付加することができる。特に本発明において、ウイルス表面にヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に加え、他のエンベロープ蛋白質が存在する場合でも、化合物の架橋によりヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に優先的に化合物が付加され、有意にヘマグルチニン活性が低下することが判明した。従って、例えば通常通りの方法で生産された、化合物が付加されていないウイルスに化合物を添加し、該化合物を該ウイルスに付加する工程を実施することにより、簡単にヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に化合物が付加されたウイルスを製造することができる。
ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に付加する化合物としては、該蛋白質のヘマグルチニン活性を有意に阻害する限り制限されない。好ましくは有意な生物毒性を持たず、蛋白質に付加された後は化学的に安定な化合物であることが好ましい。また、非抗原性または抗原性が低いことが好ましい。また、付加する化合物は水溶性であることが好ましい。ヘマグルチニン活性を有効に阻害するためには、化合物の分子量は好ましくは１，６００（ダルトン；Ｄａ）以上、より好ましくは１，８００以上、より好ましくは１，９００以上、より好ましくは２，０００以上である。特に、分子量が２，８００以上、より好ましくは３，８００以上、より好ましくは４，３００以上、より好ましくは４，５００以上、より好ましくは５，０００以上の化合物である。また分子量が１２，０００以上、より好ましくは１４，０００以上、より好ましくは１５，０００以上、より好ましくは１６，０００以上、より好ましくは１８，０００以上、より好ましくは２０，０００以上の化合物は、ヘマグルチニン活性を特に顕著に阻害することができる。
付加する化合物としては各種のポリマーであってよく、例えば有機化合物重合体が挙げられる。付加する化合物は分子量にばらつきがあってもよく、その場合、本明細書で言う付加する化合物の分子量とは平均分子量である。分子量分散（ＭＷ／Ｍｎ）は小さい方が好ましく、例えば５以下、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、より好ましくは１．６以下、より好ましくは１．４以下である。
具体的には、天然高分子として、例えば、抗体、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、レクチン、ヘパリンなどの蛋白質またはその断片、あるいは、デキストラン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸などの多糖類、さらには脂質を用いることができる。また、合成高分子として、ポリ乳酸、ポリリジン、ポリスチレン、ピラン重合体、ポリグルタミン酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、スチレン−マレイン酸共重合体、リジン−グルタミン酸共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、フィコールなどを用いることができる。
付加する化合物としては、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，″Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ″，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ″，ＡＣＳ  Ｂｏｏｋｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９７）。ＰＥＧは水溶性で毒性が低いまたはないため好適に用いられる。ＰＥＧとは、下記の構造を有する化合物を言う。
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−          ［化合物１］
（ここでｎは２以上の自然数）
例えば代表的なＰＥＧとしては、以下の構造からなる化合物が挙げられる。
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ    ［化合物２］
（ここでｎは２以上の自然数）
ＰＥＧは所望の修飾体が含まれ、例えば上記構造の末端はヒドロキシル基等から置換されていてもよい。例えば主鎖の一端のヒドロキシル基が置換されたモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）は、本発明において好適に用いられる。ＰＥＧは直鎖状であってもよく、あるいは分枝を持つＰＥＧであってもよい。例えば１、２、３、またはそれ以上の側鎖を有するＰＥＧを用いることができる。側鎖はエチレングリコール構造を有していてよい。ＰＥＧは各種の分子量のものが入手可能であり、例えばＰＥＧ２０００（平均分子量２０００）、ＰＥＧ３０００（平均分子量３０００）、ＰＥＧ４０００（平均分子量４０００）、ＰＥＧ５０００（平均分子量５０００）、ＰＥＧ８０００（平均分子量８０００）、ＰＥＧ１００００（平均分子量１００００）、またはＰＥＧ２００００（平均分子量２００００）などを好適に用いることができる。架橋のための官能基を持つＰＥＧを用いて、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質にこのＰＥＧを付加することができる。
例えば、末端に一級アミノ基を有するＰＥＧは、アシル化試薬で架橋することが可能である（Ｂｕｃｋｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７；Ｅｉｄｅｌｍａｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９）：Ｃ１０９４；Ｐｉｌｌａｉ，Ｖ．Ｎ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４５：５３６４）。あるいは、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）活性化エステル、活性化カルボン酸およびアルデヒドなどを利用してより簡便に架橋させることができる。具体的には、ＰＥＧカルボン酸のＮＨＳエステル、としては例えばＰＥＧ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、ＰＥＧ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＰＥＧ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、およびＰＥＧ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｂｕｔａｎｏａｔｅなどが挙げられる（Ｏｌｓｏｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ  Ｅｄｓ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ  １７０−１８１，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ａ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，６７２，６６２）。また、ＰＥＧのｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ誘導体は、蛋白質のアミノ基と安定なウレタン結合を形成する（Ｄｏｌｅｎｃｅ，Ｅｒｉｃ  Ｋ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，６５０，２３４）。また、アルデヒド基を末端に有するＰＥＧを用いることもできる。アルデヒド基はＮＨＳエステルよりも穏やかな条件でアミンに反応させることができる。たとえばＰＥＧ−Ｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅなどを好適に用いることができる（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１；Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏｌａｆ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，８２４，７８４；Ｗｉｒｔｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９：１３３）。またＰＥＧのＭａｌｅｉｍｉｄｅ誘導体はチオール基に架橋することができる（Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．＆  Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３；Ｋｏｇａｎ，Ｔ．Ｐ．（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍ．２２，２４１７）。ＰＥＧのｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ＮＨＳ誘導体、ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ−ＮＨＳ誘導体、ｔｒｅｓｙｌａｔｅ誘導体、ｅｐｏｘｉｄｅ誘導体、ｃａｒｂｏｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ誘導体、およびＰＮＰ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ誘導体などを用いることもできる。特に、ＰＥＧ  ＴｒｅｓｙｌａｔｅおよびＰＥＧ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅを好適に用いることができる。
化合物の結合は、例えばヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を含むウイルス粒子を１ｍｇ蛋白／ｍｌ程度の濃度で調製し、付加したい化合物を０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜５０ｍｇ程度添加して結合させることができる。例えば、ウイルス１ｍｇ蛋白に対して、ｐＨ８．５の緩衝液中で、ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋを１〜５ｍｇを反応させることにより、また、ＳＰＡ−ＰＥＧ２０Ｋを１０〜２０ｍｇ程度反応させることによりヘマグルチニン活性が有意に低下し、細胞への薬剤または遺伝子導入能を維持させることができる。蛋白質への化合物の付加は、反応に用いる化合物の量などの反応条件により変化し得るが、ヘマグルチニン活性が有意に低下し、細胞への薬剤または遺伝子導入能は維持されるように適宜調整される。
例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスに化合物を付加する場合、その化合物とウイルスとの量比は、化合物をモル数、ウイルス量をタンパク量とした場合に１〜１０μｍｏｌ／ｍｇ蛋白質（化合物／ウイルス比）、より好ましくは２〜８μｍｏｌ／ｍｇ蛋白質、より好ましくは３〜８μｍｏｌ／ｍｇ蛋白質、例えば約４μｍｏｌ／ｍｇ蛋白質とすることができる。
薬剤または遺伝子を細胞に導入する能力を失わせないために、付加する化合物の分子量は好ましくは１００，０００以下、より好ましくは８０，０００以下、より好ましくは６０，０００以下、より好ましくは５０，０００以下である。特に分子量が４０，０００以下、より好ましくは３５，０００以下、より好ましくは３０，０００以下、より好ましくは２５，０００以下、より好ましくは２０，０００以下の化合物は該導入能力を維持しヘマグルチニン活性を特異的に低下させるのに好適である。
実施例２８に示すように、ヘマグルチニン蛋白質を修飾した場合に薬剤または遺伝子の導入能力は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの脂肪族ポリアミンによりさらに修飾することにより顕著に改善できることが明らかとなった。ＰＥＩとは、下記の構造を有する化合物を言う。
−（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ−        ［化合物３］
（ここでｎは２以上の自然数）
例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰＥＧ修飾物にＰＥＩを付加することにより、遺伝子導入能を有意に上昇させることができる。この場合、ＰＥＩとウイルスとの量比は、化合物を重量、ウイルス量をタンパク量とした場合に０．００１〜１（化合物／ウイルス比）、より好ましくは０．０１〜０．２、より好ましくは０．０１〜０．１とすることができる。ＰＥＩの平均分子量は例えば２５ｋＤａ〜７５０ｋＤａのものを好適に用いることができるが、これに限定されない。
また、本発明において、ヘマグルチニン蛋白質への化合物の付加により薬剤または遺伝子の導入効率が低下または喪失する場合でも、この蛋白質を含む複合体に、細胞に結合する活性を有する化合物を付加することにより導入効率を維持できることが判明した。これにより、エンベロープ蛋白質に付加する化合物の分子量は制限されずに、本発明の薬剤または遺伝子運搬組成物を調製することが可能となった。本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む、薬剤または遺伝子運搬組成物であって、（ａ）該蛋白質に化合物が付加されており、（ｂ）該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性が低下しており、（ｃ）該蛋白質が細胞に結合する活性を有する化合物と共に形成した複合体を含み、（ｄ）該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する、組成物を提供する。ヘマグルチニン活性を阻害して、遺伝子の導入を阻害する化合物を結合した場合も、その化合物にさらにリガンドを組み入れることで、ヘマグルチニン活性を阻害して、遺伝子導入は維持することができる。リガンドとは、細胞表面の受容体に結合し受容体の機能を活性化する化合物である。例えば、抗体のＦ（ａｂ’）２断片（分子量約５０ｋＤａ）を用いた場合、結合量を少なく調節すれば、ヘマグルチニン活性の残存に応じたウイルスベクターの遺伝子導入能を維持することができるが、細胞に結合する活性を有するリガンド（葉酸）を抗体に結合することにより、ヘマグルチニン活性を完全に阻害した場合でも、ベクターの遺伝子導入能を劇的に向上させることが可能である（実施例参照）。
細胞に結合する活性を有する化合物が、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質と共に複合体を形成しているとは、該化合物と該蛋白質が、共有結合または非共有結合により直接または間接（例えば他の化合物を介して）に結合していることを言う。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。例えば、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質と細胞に結合する活性を有する化合物とを有する細胞膜を含む組成物などであってよい。細胞に結合する活性を有する化合物は複合体の表面に露出していることが必要であり、例えば該複合体がウイルス粒子であれば、該蛋白質と該化合物がウイルスエンベロープ表面に存在しているものであってよく、該複合体がリポソームであれば、該リポソーム表面に該蛋白質と該化合物が存在しているものであってよい。細胞に結合する活性を有する化合物を該複合体に結合させるには、例えば該化合物を該複合体に含まれる所望のエンベロープ蛋白質に架橋したり、あるいは好ましくはヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に架橋させることができる。架橋は、上記と同様に所望の官能基を利用して形成させることができる。あるいは、該化合物が蛋白質であれば、膜蛋白質としてエンベロープに発現させたり、該複合体に含まれるエンベロープ蛋白質との融合蛋白質として発現させることができる。好ましい態様においては、細胞に結合する活性を有する化合物は、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に付加されている化合物と共有結合または非共有結合により直接結合しているか、あるいは同一の化合物である。本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む、ヘマグルチニン活性が低下した薬剤または遺伝子運搬組成物の製造方法であって、（ａ）該蛋白質に化合物を接触させる工程、および（ｂ）該蛋白質と該化合物を結合させる工程を含む方法であり、（ｉ）該化合物に、細胞に結合する活性を有する化合物を付加する工程をさらに含む方法に関する。工程（ｉ）は、工程（ａ）の前に行ってもよく、あるいは工程（ａ）または（ｂ）と同時あるいは（ａ）と（ｂ）の間、または工程（ｂ）の後に行ってもよい。好ましくは工程（ｉ）は工程（ａ）の前に行われる。あるいは、予め工程（ｉ）が行われた化合物をマイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に付加してもよい。
細胞に結合する活性を有する化合物としては、細胞表面に結合し、それにより本発明の組成物の薬剤または遺伝子導入を助ける働きを有する限り、所望のものを用いることができる。そのような化合物としては、例えば細胞表面蛋白質に結合する化合物、または細胞表面の糖鎖に結合する化合物などを用いることができる。具体的には、例えばウイルスのエンベロープ蛋白質、あるいは天然または合成のリガンド、ホルモン、または細胞接着因子などが挙げられ、具体的には葉酸、トランスフェリン、エリスロポエチン、抗体、レクチン、ガラクトース、マンノースなどを例示することができる。
中でも、本発明において葉酸は、本発明の組成物に含まれる複合体の薬剤・遺伝子導入能を維持させるのに極めて有効であることが判明した。本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む、薬剤または遺伝子運搬組成物であって、（ａ）該蛋白質に化合物が付加されており、（ｂ）該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性が低下しており、（ｃ）該蛋白質が葉酸と共に形成した複合体を含み、（ｄ）該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する、組成物を提供する。特に、該蛋白質に付加されている化合物に葉酸が直接結合していることが好ましい。
細胞に結合する活性を有する化合物を用いて本発明の組成物を製造する際に、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に付加する化合物として特に好ましいのは該蛋白質に結合する抗体である。本発明の組成物は、好ましい態様として、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片が結合している該蛋白質を含む組成物であって、該蛋白質が、細胞に結合する活性を有する化合物と共に複合体を形成している組成物が挙げられる。すなわち本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む、薬剤または遺伝子運搬組成物であって、（ａ）該蛋白質に、該蛋白質に結合する抗体またはその断片が結合しており、（ｂ）該化合物が付加されていない場合に比べヘマグルチニン活性が低下しており、（ｃ）該蛋白質が細胞に結合する活性を有する化合物と共に形成した複合体を含み、（ｄ）該薬剤または遺伝子を標的とする細胞へ導入する能力を有する、組成物に関する。特に、細胞に結合する活性を有する化合物が、該抗体またはその断片と直接結合していることがより好ましい。
本発明において抗体にはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。ポリクローナル抗体は、例えばヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質またはそれらの部分ペプチドを調製し、これを抗原にウサギ、ヤギ、ヒツジなどを免疫してポリクローナル抗体を作製する。抗原ペプチドとしては、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質の細胞外ドメインまたはその断片を用いることができる。抗原ペプチドは、適宜他のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンやアルブミンなどのキャリア蛋白質に結合させて免疫することができる。モノクローナル抗体は、免疫したマウスやラットの脾細胞を用い、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることにより作製することができる。抗体の作製は、公知の方法に従って行うことができる（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｐ．ａｎｄ  Ｄｅａｎ，Ｃ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２２７），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）。ポリクローナル抗体は血清から、モノクローナル抗体ではハイブリドーマ培養上清またはハイブリドーマを接種した動物の腹水から硫安分画、プロテインＧセファロースカラム、抗原を固定したアフィニティーカラムなどの一般的な生化学的手法で抗体を精製することができる。本発明において用いられる抗体は、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質のエンベロープ外側の領域（細胞外領域）に結合する抗体を用いることができ、好ましくはモノクローナル抗体、さらに好ましくは実施例１２に記載のＨＮ−１（Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９８２，１４１，４０９−４２０）である。本発明の抗体は、ヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質（抗原蛋白質）に結合する限り、その抗体断片であってもよい。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ（ｔ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、抗体可変領域断片（Ｆｖ）、単鎖可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ；ｓｃＦｖ）、またはそれらの修飾物が含まれる。Ｆａｂは抗体Ｈ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖およびＬ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖からなる複合体である。これらのポリペプチドは互いに結合し１つの抗原結合部位（１価）を形成する。Ｆａｂは、典型的にはイムノグロブリンをパパインで消化することにより得られるが、これと同等の構造を有するものも本発明においてＦａｂと称す。具体的には、ＦａｂはイムノグロブリンＬ鎖と、Ｈ鎖可変領域（Ｖｈ）およびＣＨ１を含むポリペプチド鎖とが結合した二量体蛋白質が含まれる。Ｆａｂ’（イムノグロブリンをペプシン消化後、Ｈ鎖間のジスルフィド結合を切断して得��れる）、およびＦａｂ（ｔ）（イムノグロブリンのトリプシン消化で得られる）なども、Ｆａｂと同等の構造を有する。またＦ（ａｂ’）２とは、抗体の定常領域を欠失する抗体またはそれと同等の形態の蛋白質複合体を言い、具体的には抗体Ｈ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖およびＬ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖からなる複合体を２つ有する蛋白質複合体を言う。Ｆ（ａｂ’）２は抗原結合部が２つある二価抗体であり、典型的には抗体をｐＨ４付近でペプシンにより消化して得られ、Ｈ鎖のヒンジ領域を有しているが、他のプロテアーゼまたは薬剤により切断されたもの、あるいは人工的に設計したものであってよい。ｓｃＦｖとは、抗体Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域が一本のポリペプチド鎖に含まれているポリペプチドを言う。Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域は適当な長さのスペーサーを介して連結されており、互いに結合して抗原結合部を形成する。このような抗体断片は、例えば「日本生化学会編  新生化学実験講座１２  分子免疫学ＩＩＩ  １８５−１９５ページ（東京化学同人）」および／または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）」の記載に従って作製することができる。抗体断片は、例えば抗体をペプシン、パパイン、トリプシン等の蛋白質分解酵素で消化することにより得ることができる。あるいは可変領域のアミノ酸配列を解析し、組み換え蛋白質として発現させ調製することが可能である。また抗体には、ヒト型抗体もしくはヒト抗体なども含まれる。抗体は、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
本発明においては、特に抗体の可変領域（抗原結合領域）を含む断片をヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に付加することが好ましい。このような断片としては、抗体のＨ鎖および／またはＬ鎖の可変領域を含む所望の断片を用いることができるが、例えば上記のようにＦａｂ、Ｆａｂ（ｔ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはそれらの修飾物を挙げることができる。
本発明において細胞に導入する薬剤は所望の化合物であってよく、例えば天然化合物、合成化合物、無機または有機化合物、低分子または高分子化合物などが挙げられる。また遺伝子は所望の核酸であってよく、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸およびその誘導体が挙げられる。核酸としては、環状および直鎖状の１本鎖もしくは２本鎖のデオキシリボ核酸であっても、リボ核酸であってもよい。核酸の誘導体としては、例えば、ホスフォロチオエート、ホスフォロジチオエート等が例示される。本発明の組成物で運搬する薬剤または遺伝子としては、具体的には、例えば、アンチセンス核酸（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，１０，９１−９７，１９９５）、デコイ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７，１２４０３−１２４０６，１９９４）、リボザイム（Ｔｈｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，１０，９１−９７，１９９５）、三重鎖ＤＮＡ（細胞工学、１３巻、Ｎｏ．４、２７７−２８５、１９９４）、プラスミドＤＮＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２１，３１７−３２７，１９９３）、ＲＮＡベクター、および、これらとキャリアー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８９，７９３４−７９３８，１９９２）または、蛋白（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６（６），３３６１−３３６４，１９９１）との複合体、あるいは、抗癌剤、抗ウイルス剤、トキシン（ジフテリアトキシン；Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１１９２，２５３−２６２，１９９４／リシン；Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１０７０，２４６−２５２，１９９１）、酵素（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，２８０−２８４，１９９４）、あるいはその他の所望の生理活性物質を用いることができる。所望の遺伝子をゲノム核酸中に挿入し、組み換えウイルスから該遺伝子を発現させることもできる。
本発明の組成物は、生体への直接投与（インビボ）および間接投与（エクスビボ）において使用することができる。また、生体外細胞において投与（インビトロ）することができる。インビボでの適用においては、投与ルートは薬剤または遺伝子が標的細胞または組織に到達する限り所望の投与経路で投与されてよい。有効成分の性質に応じて、例えば経口的、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。また、全身的または局所的に投与され得る。インビトロ（エクスビボを含む）での適用においては、本発明の組成物は標的細胞に接触するように添加される。例えば細胞培養液に添加される。本発明の組成物は特に血中での安定性に優れていることから、静脈注射等の血中投与に用いられる注射剤などとして有用である。
本発明の方法により製造されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む複合体は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、該複合体と共に投与することが可能であり、複合体による薬剤または遺伝子の細胞への導入を有意に阻害しない材料である。このような担体または媒体としてな、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などと適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。また本発明の組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。また、リポソームの膜安定化剤（例えばコレステロール等のステロール類）を含んでいてもよい。また、抗酸化剤（例えばトコフェロールまたはビタミンＥなど）を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。また本発明の組成物は溶液、凍結乾燥物、またはエアロゾルの形態の組成物であってよい。凍結乾燥物の場合は安定化剤としてソルビトール、シュークロース、アミノ酸及び各種蛋白質等を含んでいてもよい。マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
本発明の組成物の投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入する薬剤または遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。マイナス鎖ＲＮＡウイルスの感染性ウイルスを含む組成物であれば、投与量は好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０９ＣＩＵ〜２×１０１０ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。
本発明の組成物の投与の対象となる生物としては特に制限はない。例えば、ニワトリ、ウズラ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類、哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。本発明の方法をインビトロ（エクスビボを含む）で用いる場合は、適用個体としては、例えばヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類などが挙げられる。本発明の方法をインビボで用いる場合は、適用個体としては特に非ヒト哺乳動物および鳥類などが挙げられる。
また本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、細胞に結合する化合物が結合している抗体またはその断片に関する。このような抗体またはその断片は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスまたはその処理物に添加することにより該蛋白質に結合し、これによりヘマグルチニン活性を低下させるが、細胞に結合する化合物により細胞への接着を助ける働きが維持される。従って、このような抗体またはその断片は、本発明の薬剤または遺伝子運搬組成物の製造に極めて有用である。抗体またはその断片は、上記のように抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖の可変領域を含む所望の断片等であってよい。具体的には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ（ｔ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。特に、Ｆ（ａｂ’）２は好適に用いられる。細胞に結合する化合物としては、特に細胞表面の受容体のリガンドが好ましく、例えば葉酸トランスフェリン、エリスロポエチン、抗体、レクチン、ガラクトース、マンノースなどを例示することができる。
本発明の抗体またはその断片は、薬学的に許容される担体と共に組成物とすることができる。このような担体としては、例えば水、アルコール、グリセロール、塩、蛋白質、ゼラチン、公知のｐＨ緩衝剤、安定剤、懸濁剤、保存剤などが挙げられる。
また本発明は、（ａ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に結合する抗体またはその断片であって、細胞に結合する化合物が結合している抗体またはその断片、および（ｂ）該エンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む薬剤または遺伝子運搬組成物を含むキットに関する。該エンベロープ蛋白質を有する細胞膜を含む薬剤または遺伝子運搬組成物としては、例えば感染性ウイルス粒子、あるいは不活化ウイルスまたは該ウイルスのエンベロープを含むリポソームなどが挙げられる。感染性ウイルス粒子は例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスであってもよく、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質を含む他のウイルスであってもよい。これらに上記抗体またはその断片を添加することにより、該エンベロープ蛋白質に抗体またはその断片が結合し、ヘマグルチニン活性が低下した薬剤または遺伝子運搬組成物を調製することができる。例えば生体内投与において血中安定性を高めたい場合など、目的に合わせて適宜ヘマグルチニン活性を制御することが可能となる。これらは使用直前に混和することで容易に調製できるため、非常に使いやすいシステムとなる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  ＮＬＳ−ＬａｃＺ遺伝子搭載ＳｅＶベクターの調製と精製
核移行シグナル付きＬａｃＺ遺伝子（ＮＬＳ−ＬａｃＺ）を搭載したＮＬＳ−ＬａｃＺ／ＳｅＶは既報の方法により作製した（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，１，５６９−５７９；Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７８，２８１３−２８２０）。このベクターを鶏有性卵（１０日卵）に接種して、３５．３℃にて３日間培養後、しょう尿液を回収した。４，０００ｒｐｍ、１５分の遠心後、上清を１０，０００ｒｐｍ、１時間遠心してベクターを沈殿させた。ＰＢＳに再懸濁後、蔗糖密度勾配（３０／５０％）に重層し、２５，０００ｒｐｍ、１時間遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ，ローターＳＷ２８）。蔗糖界面のベクターを回収、遠心沈殿後、ＰＢＳに再懸濁して精製ベクターのストック（以下ＳｅＶベクターと表記）を調製した。ベクターの蛋白濃度は、等容の２％ＳＤＳ溶液で可溶化したものを検体として用い、ＢＳＡを標品として、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）にて測定した。赤血球凝集活性（ＨＡＵ）は以下のように求めた。ベクターを９６ｗｅｌｌ丸底プレート（旭テクノグラス）内でＰＢＳで順次２倍希釈を行った（各５０μｌ）。各ｗｅｌｌにＰＢＳで洗浄した１％ニワトリ赤血球液を５０μｌずつ加え、４℃で１時間静置後に判定を行った。ＨＡＵは血球凝集を引き起こすベクターの最大希釈倍数で表した。また、ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・ユニット）の算出は、ＳｅＶ  １ＨＡＵ＝約１０６ｐｆｕの関係を用いた。精製ベクターは１ｍｇ蛋白／ｍｌ＝４０９６〜５１２０ＨＡＵ／ｍｌ＝約５×１０９ｐｆｕ／ｍｌであった。
［実施例２］  ＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例１のＳｅＶベクターのストックをＰＢＳで２ｍｇ蛋白／ｍｌに希釈した。この溶液０．５ｍｌに０．５Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）を０．５ｍｌ加えて、１ｍｇ蛋白／ｍｌのｐＨ８．５溶液を調製した。トレシル活性化ＰＥＧ試薬（ＴＰＥＧ、分子量５０００：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）１ｍｇを上記溶液に攪拌しながら少量ずつ加え、室温で９０分反応を行った（図１）。反応終了後、反応液を氷冷ＰＢＳ  １４ｍｌで希釈して、１５，０００ｒｐｍ、１時間の遠心（Ｂｅｃｋｍａｎ、ローターＳＷ２８．１）によりベクターを回収し、０．８ｍｌのＰＢＳに再懸濁してＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターを得た。修飾ベクターの蛋白濃度およびＨＡＵは実施例１と同様に求めた。
［実施例３］  ＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターによるインビトロ遺伝子発現
実施例１のＳｅＶベクターのストックをＰＢＳで希釈して、１×１０５ｐｆｕ／ｍｌとした。実施例２のＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターは未修飾ベクターと蛋白濃度を揃えることでウイルス粒子数を同一にした。実験前日にＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部癌由来）を１２ｗｅｌｌプレート（住友ベークライト）に１ｗｅｌｌあたり５×１０４細胞数（１０％非働化ウシ胎児血清（以下ＦＣＳ）添加ＭＥＭ培地１ｍｌ／ｗｅｌｌ）でシードした。培地を０．５ｍｌに減らし、上記ベクター希釈液を５０μｌ／ｗｅｌｌで加え（ＳｅＶベクター換算で５×１０３ｐｆｕ／ｗｅｌｌ、ｍｏｉ＝０．１）、３７℃、５％ＣＯ２で感染を行った。１時間後にベクターを除き、培地で２回洗浄後、新たに２ｍｌの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。ＬａｃＺ遺伝子発現の測定は、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  ＰｌｕｓＴＭ（Ｔｒｏｐｉｘ社）のプロトコールに従って行った。細胞蛋白の測定はＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ社）に従った。結果は細胞蛋白あたりのｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ（ＲＬＵ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で表した。
表１にＴＰＥＧ−ＳｅＶベクターのＨＡＵと遺伝子発現量を示す。同一蛋白濃度、即ち同一ウイルス粒子数で、ＴＰＥＧ−ＳｅＶベクターはＳｅＶベクターに比べて２，０００分の１以下のＨＡＵであった。一方、同一粒子数でのＨｅＬａ細胞における遺伝子発現は約５０％維持していた。このように、細胞への遺伝子導入能を極端に損なうことなく、ＨＡＵのみを著しく減少したベクターを調製することが可能となった。
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［実施例４］  溶血活性試験
ＳＤ系ラット（オス）をエーテル麻酔下、頚静脈よりヘパリン処理シリンジで採取した新鮮血液を実験に供した。実施例１のＳｅＶベクターおよび実施例２のＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターをＰＢＳで希釈して、１から１０００μｇ蛋白／ｍｌの溶液を調製した。ベクター希釈液５０μｌと３７℃に保温したラット血液５０μｌを混和し、１５分間インキュベーションを行った。４℃で氷冷後、血漿を遠心分離した。血漿中に放出されたヘモグロビン量を５７０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ５７０）により測定した。なお、ベクター溶液の代わりにＰＢＳを用いたときを陰性対照、蒸留水を陽性対照（１００％溶血）として、以下の計算式よりベクターの溶血活性を算出した。
溶血活性（％）＝｛（ベクター溶液のＯＤ５７０）−（ＰＢＳでのＯＤ５７０）｝／｛（蒸留水のＯＤ５７０）−（ＰＢＳでのＯＤ５７０）｝×１００
図２に示すように、ＳｅＶベクターはベクター濃度に依存した強い溶血活性を示した。一方、ＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターの溶血活性は非常に低いことがわかった。ＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクター１０００μｇの溶血活性はＳｅＶベクター５μｇに相当することから、安全性が約２００倍向上していると考えられた。
［実施例５］  ラット血液中での安定性試験
実施例１のＳｅＶベクターをＰＢＳで希釈して、１×１０８ｐｆｕ／ｍｌとした。実施例２のＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターはウイルス蛋白濃度が同じになるようにＰＢＳで希釈した。ベクター希釈液２５０μｌに、ＳＤ系ラット（オス）の新鮮血液２５０μｌを混和して、３７℃でインキュベーションを行った。所定の時間経過後に、血液を８０μｌサンプリングして、４℃で遠心分離を行い血漿を回収した。血漿１０μｌをＰＢＳで５０倍に希釈した溶液５０μｌを用いて、実施例３記載の方法に準じて、ＨｅＬａ細胞におけるＬａｃＺ遺伝子発現を調べた。
図３に示すように、ＳｅＶベクターは血液処理直後から著しく不安定化され、１５分の処理で血液未処理に比べて１０００分の１にまで遺伝子発現能は低下した。一方、ＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターでは、血液中での安定性が改善されており、未修飾ベクターに比べて著しく高い遺伝子発現能を維持していた。
［実施例６］  ＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例１のＳｅＶベクターのストック溶液をＰＢＳで希釈して２ｍｇ蛋白／ｍｌに調製した。この溶液を０．５Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）で２倍希釈して、１ｍｇ蛋白／ｍｌ溶液を調製した。分子量２０００のスクシニミジル・プロピオン酸誘導体ＰＥＧ試薬（ＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）１、２または４ｍｇを上記溶液に攪拌しながら少量ずつ加え、室温で３０分反応を行った（図１）。反応終了後、反応液を氷冷ＰＢＳ  １４ｍｌで希釈を行い、１３，０００ｒｐｍ、１時間の遠心（Ｂｅｃｋｍａｎ、ローターＳＷ２８．１）によりベクターを回収し、０．８ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、ＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋ修飾ＳｅＶベクターを得た（表２、検体番号１〜３）。修飾ベクターの蛋白濃度は実施例１と同様に求めた。
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［実施例７］  ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例６のＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋを分子量５０００のＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）に変更して、ＰＥＧ反応量を１、２．５、５または１０ｍｇで同様に反応・精製を行い、ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶを得た（表２、検体番号４〜７）。
［実施例８］  ＳＰＡ−ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例６のＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋを分子量２０，０００のＳＰＡ−ＰＥＧ２０Ｋ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）に変更して、ＰＥＧ反応量を１０、２０または４０ｍｇで同様に反応・精製を行い、ＳＰＡ−ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＳｅＶを得た（表２、検体番号８〜１０）。
図４にＳＰＡ−ＰＥＧ２０Ｋ修飾ベクターをＳＤＳ−電気泳動を行い、銀染色により各構成蛋白を染色した結果を示す。ＰＥＧ反応量の増大に伴って、ＨＮ蛋白に由来するバンドが減少し、代りに高分子量画分にバンドが出現した。これは、ＰＥＧが結合したＨＮ蛋白が高分子化されたものと推測された。一方、Ｆ蛋白のバンドの減少は少なかった。このことから、ＳｅＶエンベロープへのＰＥＧ修飾では、ＨＮとＦの２種の蛋白のうちＨＮへの修飾が主となることがわかった。
［実施例９］  ＳＰＡ−ＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターのＨＡＵ活性とインビトロ遺伝子発現
実施例１のＳｅＶベクターおよび実施例６、７および８に記載のＰＥＧ修飾ＳｅＶベクター（検体番号１から１０）について、実施例１に記載の方法でＨＡＵ活性を測定した。さらに、ＨｅＬａ細胞におけるＬａｃＺ遺伝子発現を、感染ｍｏｉを０．５、感染後の培養日数を２日間に変更した以外は実施例３記載の方法に従って測定した。
表２にＨＡＵとＬａｃＺ発現の結果を示す。ＰＥＧの反応量の増加に伴い、得られる修飾体のＨＡＵは低下した。ＬａｃＺ遺伝子発現はＳｅＶベクターに比べると低下するが、ＰＥＧ反応量を表に示したように制限することにより、発現能の低下を抑えたままＨＡＵを大幅に低下させることができた。このように、修飾条件を選ぶことで、十分な発現能を有する修飾ベクターが得られることがわかった。
［実施例１０］  血球存在下でのＳＰＡ−ＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターによるインビトロ遺伝子発現
実施例３と同様に、ＨｅＬａ細胞を準備した。実験直前に培養液を除き、代りに１×１０９個／ｍｌに調製したＰＢＳ洗浄ニワトリ赤血球を３００μｌ添加した。対照群は赤血球液の代りにＰＢＳを用いた。実施例１のＳｅＶベクターまたは表２に記載のＰＥＧ修飾ＳｅＶベクター（検体番号１、２、４、５、６、８および９）を５０μｌ加え、３７℃で５分の極短時間での感染を行った。ベクター添加量は表２を基に、同じ発現効率となるように調整した。実施例３に準じて、細胞を処理し、４８時間後におけるＬａｃＺ遺伝子発現を測定した。
表３に赤血球存在下での各検体の遺伝子発現量を示す。結果は、赤血球非存在下での発現量を１００とした相対比で示した。ＳｅＶベクターでは赤血球の存在により、遺伝子発現量は約２０％にまで低下した。一方、ＰＥＧ修飾検体はＨＡＵ活性の低下に伴って、赤血球とのインタラクションが低減するので、その結果、赤血球存在下でも高い遺伝子導入を示した。これらの結果は、ＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターは、臨床の場において、血液を介しての短時間での遺伝子導入の可能性を示唆するものである。
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［実施例１１］  中和抗体存在下でのＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターによる遺伝子導入
（１）ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例１に準じてＮＬＳ−ＬａｃＺ／ＳｅＶベクターを調製・精製を行い、ストックを調製した。このベクターに対して、ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ（５ｍｇ）を実施例７に記載の方法に準じて反応を行い、ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターを調製した。ベクターのＬＬＣＭＫ２細胞に対するタイターは以下のように求めた。実験前日にＬＬＣＭＫ２細胞を６ｗｅｌｌプレート（住友ベークライト）に１ｗｅｌｌあたり１×１０６細胞数（１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地２ｍｌ／ｗｅｌｌ）でシードした。ベクターを１％ＦＣＳ含有ＰＢＳで１ｍｇ蛋白／ｍｌに希釈して、さらに１０倍希釈系列を調製した。前記細胞の培地を除去し、希釈ベクター溶液を１ｗｅｌｌあたり１ｍＬを添加して、３７℃、５％ＣＯ２で１時間感染を行った。ベクター溶液を除去した後、培地で洗浄、新たな培地をｗｅｌｌあたり２ｍｌ加えて、さらに３７℃、５％ＣＯ２で培養を続けた。２日後に培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、ＬａｃＺ遺伝子を発現している細胞をβ−Ｇａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＸ−ｇａｌ染色を行った。ｘ２００倍の視野における感染細胞数をｗｅｌｌ内の任意の１０個所で計数し、その平均値と視野の面積からｗｅｌｌ全体でのタイターを次式により求めた。
ＬａｃＺ感染タイター（ＣＩＵ／ｍＬ）＝（感染細胞数）×８５４．８６５×（希釈倍数）
その結果、ＳｅＶベクターおよびＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶのタイターはそれぞれ、１．４×１０１０ＣＩＵ／ｍｌおよび２．７×１０９ＣＩＵ／ｍｌであった。
（２）中和抗体存在下での遺伝子導入
実施例１１−（１）記載のＳｅＶベクターおよびＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターをＰＢＳで希釈して、１×１０７ＣＩＵ／ｍｌに調製した。ベクター溶液３０μｌに、ＳｅＶをウサギに免疫して調製した抗ＳｅＶ抗血清（５６℃、１時間処理）の１０、１００および１０００倍希釈血清またはＰＢＳ  ３０μｌを添加して、室温で１時間処理した。実験前日にＬＬＣＭＫ２細胞を１２ｗｅｌｌプレート（住友ベークライト）に１ｗｅｌｌあたり２×１０５細胞数（１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地１ｍｌ／ｗｅｌｌ）でシードした。培地を０．５ｍｌに減らし、前記抗血清処理ベクター溶液４０μｌをウエルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で１時間感染を行った。以下、実施例１１−（１）同様に２日後のＬａｃＺ遺伝子発現をＸ−ｇａｌ染色で評価した。
図５に示すように、ＳｅＶベクターは抗血清の存在により、遺伝子導入効率が著しく低下した。一方、ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターは抗血清存在下でも十分な遺伝子導入能を維持できた。
［実施例１２］  抗ＨＮモノクローナル抗体、ＨＮ−１の調製および精製
抗ＨＮモノクローナル抗体、ＨＮ−１を産生するハイブリドーマ細胞（Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９８２，１４１，４０９−４２０）をＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で３７℃、５％ＣＯ２で継代培養を続け、２×１０５細胞数／ｍｌの細胞浮遊液１０００ｍｌを調製した。さらに、２週間培養を続けた後、３，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により得た上清を０．４５μｍのフィルターで濾過を行った。モノクローナル抗体の精製はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムクロマトグラフィーにより行った。培養上清を２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した５ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ファルマシア）にペリスターポンプ（Ｐ−１ポンプ：ファルマシア）を用いて流速４．２ｍｌ／分で添加して、抗体をカラムに結合させた。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）で抗体を溶出した。溶出液を１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で中和後、限外濾過（セントリプラス−２０、分子量カット３０，０００：アミコン）で濃縮した。ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（ファルマシア）でＰＢＳにバッファー交換した後、再度限外濾過で濃縮して、ＨＮ−１のＰＢＳ溶液１６０μｌを得た。蛋白濃度をウシ・ガンマグロブリンを標品として、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）により求めた結果、３７．６ｍｇ／ｍｌであった。
［実施例１３］  抗ＨＮモノクローナル抗体、ＨＮ−１のＦ（ａｂ’）２フラグメント化
実施例１２の精製モノクローナル抗体ＨＮ−１を０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈して２ｍｇ蛋白／ｍｌに調製した。蛋白溶液２．３５ｍｌに０．１ｍｇ／ｍｌに調製したペプシン（Ｓｉｇｍａ社）の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を２．３５ｍｌ添加して、３７℃で２１時間反応を行った。１Ｎ水酸化ナトリウム７００μｌで中和した後、ＰＢＳを加えて全量２５ｍｌとした。この溶液をＰＢＳで平衡化した１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ファルマシア）に負荷し、未反応の抗体を吸着させた。カラムを素通りした画分を回収し、実施例１２に準じて限外濾過により濃縮した。濃縮液をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックス７５カラム（ファルマシア）を用いたゲル濾過法により精製した。限外濾過により濃縮し、ＨＮ−１のＦ（ａｂ’）２フラグメント（以下ＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２）のＰＢＳ溶液を３００μｌ回収した。実施例１２同様に蛋白濃度測定を行った結果、４．０８ｍｇ／ｍｌのＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２を得た。
［実施例１４］  ＮＨＳ法による葉酸結合モノクローナル抗体の調製
（１）ＮＨＳ活性化葉酸の合成
合成はＲｏｂｅｒｔらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｆｅｂ．４，２６９（５），３１９８−３２０４，１９９４）に準じて行った。即ち、葉酸（Ｓｉｇｍａ社）をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、５０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。２５０μｌのトリエチルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ社）、４７０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（東京化成）、および２６０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ社）を順に加え、室温、暗所で一晩攪拌した。析出した副反応物を濾過により除去し、濾過液を２５０ｍｌのジエチルエーテルに攪拌しながら滴下した。析出した黄色沈殿をエーテル洗浄を繰り返し、減圧乾燥して、ＮＨＳ活性化葉酸を得た。
（２）葉酸結合ＨＮ−１の調製
実施例１２の方法に準じて精製したＨＮ−１の２．０ｍｇ蛋白／ｍｌ  ＰＢＳ溶液１００μｌと０．５Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μｌを混和したものを反応溶液とした。実施例１４−（１）記載のＮＨＳ活性化葉酸のＤＭＳＯ溶液（５ｍｇまたは１０ｍｇ／ｍｌ）２．５μｌを滴下して、室温、暗所１時間反応を行った。室温、暗所で１時間反応を行った後に、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラムで未反応の葉酸を除去し、蛋白画分を回収した。限外濾過法で濃縮して、葉酸結合ＨＮ−１を得た。蛋白濃度は実施例１２に準じて測定した。
（３）葉酸結合ＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２の調製
実施例１４−（２）のＨＮ−１をＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２溶液に、ＮＨＳ活性化葉酸の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに変更して、同様に反応、精製を行い葉酸結合ＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２を得た。
［実施例１５］  葉酸結合モノクローナル抗体修飾ＳｅＶベクターのＨＡ活性
実施例１記載のＮＬＳ−ＬａｃＺ／ＳｅＶをＰＢＳで１×１０８ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、９６ウエル丸底プレートに５０μｌずつ分注した。実施例１２の方法に準じて精製したＨＮ−１、実施例１３のＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２、および実施例１４に記載した葉酸結合ＨＮ−１ならびに葉酸結合ＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２をＰＢＳで希釈して１から１００μｇ蛋白／ｍｌに調製した。抗体希釈液５０μｌをベクターと混和して、室温で３０分静置して、修飾ベクターを調製した（図６）。その後、実施例１の方法に従って、ＨＡＵを測定した。
図７にＨＡＵの測定結果を示す。いずれの修飾体も抗体添加量の増加に伴って、ＨＡＵが低下し、１０μｇ／ｍｌ以上の抗体濃度では検出限界以下となった。また、葉酸の結合によるＨＡＵの阻害活性の極端な低下は認められなかった。これらのことから、赤血球とのインタラクションを著しく低減させた、葉酸結合抗体修飾ＳｅＶベクターの調製が可能となった。
［実施例１６］  葉酸結合モノクローナル抗体修飾ＳｅＶベクターの溶血活性
実施例１記載のＮＬＳ−ＬａｃＺ／ＳｅＶをＰＢＳで１×１０９ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、９６ウエル丸底プレートに５０μｌずつ分注した。実施例１２の方法に準じて精製したＨＮ−１、および実施例１４に記載した葉酸結合ＨＮ−１をＰＢＳで１００μｇ蛋白／ｍｌに希釈した。抗体希釈液またはＰＢＳ  ５０μｌをベクターと混和して、室温で３０分静置して、修飾ベクターを調製した。溶血活性は、実施例４記載の方法のラット血液を１×１０９細胞数／ｍＬのニワトリ赤血球ＰＢＳ溶液に、インキュベート時間を３０分に変更した以外は同様に行い、溶血活性を調べた。
図８に溶血活性の測定結果を示す。ＨＮ−１および葉酸結合ＨＮ−１で修飾したＳｅＶベクターの溶血活性は非常に小さかった。ＳｅＶベクターの溶血活性と比較すると、１／１００濃度のＳｅＶベクターよりも低い溶血活性であった。
［実施例１７］  葉酸結合モノクローナル抗体修飾ＳｅＶベクターのインビトロ遺伝子導入試験
実施例１５の、ＳｅＶベクターを１×１０７ｐｆｕ／ｍｌに、抗体濃度を１０μｇ／ｍｌに変更して修飾ベクターを調製した。実験前日にＫＢ細胞（ヒト鼻咽腔ガン由来）を１２ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり２×１０５細胞数（１０％ＦＣＳ添加、葉酸不含ＲＰＭＩ１６４０培地：Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、１ｍｌ／ｗｅｌｌ）でシードした。実験１時間前に培地を０．５ｍｌの葉酸不含ＲＰＭＩ１６４０培地または同培地に１ｍＭの葉酸を添加した培地に交換して使用した。上記ベクター液を２０μｌ／ｗｅｌｌで加え、３７℃、５％ＣＯ２で感染を行った。３時間後にベクターを除き、培地で２回洗浄後、新たにウエルあたり２ｍｌの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。ＬａｃＺ遺伝子発現の測定は実施例３に準じて行った。
図９にＫＢ細胞におけるＬａｃＺ遺伝子発現の結果を示す。ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターの遺伝子発現は、未修飾のＳｅＶベクターの１００分の１以下となり、ＨＡＵの消失に伴う遺伝子導入の低下を認めた。一方、葉酸結合ＨＮ−１については、葉酸非結合に比べ有意な遺伝子発現の増加を認め、未修飾ＳｅＶベクターの約１５％の遺伝子導入を示した。過剰の葉酸が培地中に存在したときに、葉酸結合ＨＮ−１において遺伝子導入に阻害が認められたことから、葉酸結合ＨＮ−１による遺伝子導入は、リガンドとして結合した葉酸がＫＢ細胞の葉酸レセプターに結合し、その後Ｆ蛋白による融合により起こったと推測された。
図１０に抗体分子がＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２のときの比較を行った。ＨＮ−１同様にＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２においても、葉酸結合のときにのみ高い遺伝子導入を示した。
［実施例１８］  ＥＤＣ法による葉酸結合ＨＮ−１の調製と修飾体の評価
（１）ＥＤＣ法による葉酸結合ＨＮ−１の調製
Ｌｅａｍｏｎらの報告の方法に従って調製した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，２６７，（３５），２４９６６−２４９７１）。即ち、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した、１０ｍｇ／ｍｌの葉酸（Ｓｉｇｍａ社）溶液１ｍｌに２１．７ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ：Ｓｉｇｍａ社）のＤＭＳＯ溶液１ｍｌを加え、室温、暗所で３０分静置した。ＰＢＳで１ｍｇ蛋白／ｍｌに調製した実施例１２のＨＮ−１溶液３００μｌに前記の葉酸−ＥＤＣ溶液１６．６μｌを攪拌しながら滴下した。室温、暗所で１時間反応を行った後に、実施例１４−（２）と同様にして葉酸結合ＨＮ−１を得た。
（２）葉酸結合ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターのＨＡ活性
実施例１５の葉酸結合ＨＮ−１を実施例１８−（１）記載のものに変更して修飾ベクターを調製し、ＨＡＵを測定した。
図１１に示すように、ＥＤＣ法で調製した葉酸結合ＨＮ−１についても同様に、ＳｅＶベクターを修飾することでそのＨＡＵを消失させる効果があった。
（３）葉酸結合ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターによる遺伝子発現
実施例１のＳｅＶベクターの１×１０７ｐｆｕ／ｍｌ溶液と、実施例１２のＨＮ−１ならびに実施例１８−（１）記載の葉酸結合ＨＮ−１の１００μｇ／ｍｌ溶液を用いて修飾ベクターを調製した。実施例１６のＫＢ細胞に加えて、Ａ５４９細胞（ヒト肺カルシノーマ）を使用して、同様に感染実験を行った。
表４に葉酸レセプターを高発現しているＫＢ細胞と、レセプターがほとんどないＡ５４９細胞（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７，８，６７３−６７９）の遺伝子発現の比較を行った。葉酸結合ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターはＫＢ細胞の、過剰葉酸非存在下でのみ高い遺伝子導入を示したことから、ＨＮ蛋白のヘマグルチニン活性に置き換えた葉酸リガンドが葉酸レセプターへの結合を担うことにより特異的に遺伝子導入をすることがわかった。
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［実施例１９］  ＧＦＰ搭載ＳｅＶベクターの調製と精製
ＧＦＰ遺伝子を搭載したＳｅＶ／ＧＦＰは既報の方法により作製した（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，１，５６９−５７９；Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７８，２８１３−２８２０）。このベクターを鶏有精卵（１０日卵）に接種して、３５．３℃にて３日間培養後、しょう尿液を回収した。４℃，３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎの遠心後、上清を４℃，３５０００ｇ，１ｈ遠心してベクターを沈殿させた。ＰＢＳに再懸濁後、再度４℃，３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎの遠心をし、上清を４℃，３５０００ｇ，１ｈ遠心してベクターを沈殿させた。ＰＢＳに再懸濁して精製ベクターのストック（以下ＳｅＶベクターと表記）を調製した。ベクターの蛋白濃度は、等容の３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液で可溶化したものを検体として用い、ＢＳＡを標品として、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社）にて測定した。精製ベクターは約１ｍｇ蛋白／ｍｌであった。
［実施例２０］  ＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例１９のＳｅＶベクターのストック０．５ｍｌに０．５ｍｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加え、０．５ｍｇ蛋白／ｍｌのｐＨ８．５溶液を調製した。分子量２０００のスクシニミジル・プロピオン酸誘導体ＰＥＧ試薬（ＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）を０、２、４、６、８、１０ｍｇを上記溶液に攪拌しながら少量ずつ加え、室温で１時間反応を行った。反応終了後、反応液を４℃，１５０００ｒｐｍ，１ｈ遠心後、沈殿を氷冷ＰＢＳに懸濁し、再度４℃，１５０００ｒｐｍ，１ｈ遠心によりベクターを回収し、０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、ＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋ修飾ＳｅＶベクターを得た。修飾ベクターの蛋白濃度は実施例１９と同様に求めた。
［実施例２１］  ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例２０のＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋを分子量５０００のＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）に変更してＰＥＧ反応量を０、５、１０、１５、２０、２５ｍｇで同様に反応・精製を行い、ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶを得た。修飾ベクターの蛋白濃度は実施例１９と同様に求めた。
［実施例２２］  ＰＥＧ２ＮＨＳ−１０Ｋ修飾ＳｅＶベクターの調製
実施例２０のＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋを分子量１００００のＰＥＧ２ＮＨＳ−１０Ｋ（２本鎖、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）に変更してＰＥＧ反応量を０、１０、２０、３０、４０、５０ｍｇで同様に反応・精製を行い、ＰＥＧ２ＮＨＳ−１０Ｋ修飾ＳｅＶを得た。修飾ベクターの蛋白濃度は実施例１９と同様に求めた。
［実施例２３］  ＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターの赤血球凝集活性（ＨＡＵ）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性（ＣＩＵ）
実施例２０、２１、２２に記載したＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターについて赤血球凝集活性（ＨＡＵ）及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性（ＣＩＵ）を調べた。図１２、１３および１４に示したように、上記３種類ＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターのＨＡＵ及びＣＩＵを測定したところ、何れもＰＥＧ反応量の増加によってＨＡＵとＣＩＵが低下する傾向が見られた。分子量が大きいほど、反応量の増加によるＨＡＵとＣＩＵの低減幅が小さい。また、ＨＡＵとＣＩＵの相関を考察したところ、適量のＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾した場合、未修飾と比べて１ＨＡＵあたりのＣＩＵが約７−８倍高かった。これはＰＥＧ修飾によって感染性を維持しつつ、赤血球凝集を低減し、血中安定性を向上できる可能性を示すと考えられる。
ＨＡＵは以下のように求めた。ベクターを９６ｗｅｌｌ丸底プレート（旭テクノグラス社）内でＰＢＳで順次２倍希釈を行った（５０μｌ）。各ｗｅｌｌにＰＢＳで洗浄した１％ニワトリ赤血球液を５０μｌずつ加え、４℃で１時間静置後に判定を行った。ＨＡＵは赤血球凝集を引き起こすベクターの最大希釈倍数で表した。
ＣＩＵは以下のように求めた。ベクターをＰＢＳ／１％ＢＳＡで順次１０倍希釈を行い、２４−ｗｅｌｌでコンフルエントになったＬＬＣ−ＭＫ２細胞へ１０μｌ／ｗｅｌｌ感染させ、２日後、ｗｅｌｌあたりのＧＦＰ発現細胞数を数えて算出した。
［実施例２４］  ＰＥＧ修飾の確認
実施例２０、２１、２２に記載したＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターを０．５μｇ／ｌａｎｅを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図１５に示したように、ゲルを銀染色してウイルスベクターの組成蛋白を分析したところ、エンベロープ蛋白であるＦとＨＮに由来するバンドがＰＥＧ反応量の増大に伴って減少し、代わりに高分子量画分にバンドが出現した。ＨＮ蛋白と比べてＦ蛋白量の減少が少なかったことから、比較的にＨＮ蛋白がＦ蛋白より多く修飾されたことが考えられる。また、図１６に示したように、ウェスタンブロッティングでウサギ由来の抗Ｆ１ポリクローナル抗体とマウス由来抗ＨＮモノクローナル抗体を用いてＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターのエンベロープ蛋白であるＦとＨＮ蛋白を分析したところ、銀染色と同じような結果が得られた。
［実施例２５］  中和抗体存在下でのＰＥＧ２−ＮＨＳ１０Ｋ修飾ＳｅＶベクターによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子導入
実施例２２に準じてＰＥＧ反応量を０、１５、２０、２５ｍｇで同様に反応・精製を行い、ＰＥＧ２−ＮＨＳ１０Ｋ修飾ＳｅＶを得た。修飾ベクターの蛋白濃度は実施例１９と同様に求めた。ベクター溶液をＰＢＳ／１％ＢＳＡで希釈し、０．０１μｇ／μｌに調製した。ベクター溶液３５μｌに、ＳｅＶをウサギに免疫して調製した抗ＳｅＶ抗血清（５６℃、１時間処理）の１０、１００及び１０００倍希釈血清またはＰＢＳ／１％ＢＳＡ  ３５μｌを添加して、室温で１時間処理した。２４−ｗｅｌｌにコンフルエントになったＬＬＣ−ＭＫ２細胞へ上記抗血清処理ベクター溶液をｗｅｌｌあたり２０μｌ加え、感染を行った。感染後３日目のＧＦＰ発現は蛍光顕微鏡で写真を撮影し、また蛍光プレートリーダを用いて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで測定したＧＦＰ蛍光強度で定量的に評価した。
図１７に示したように、未修飾のＳｅＶベクターは抗体濃度の増加によって感染効率が低下する傾向が見られたが、ＰＥＧ２−ＮＨＳ１０Ｋの修飾によって、その低下が押さえられ、どの抗体濃度でも未修飾と比べて感染効率が高く、最大約７０％の感染効率の改善が見られた。
［実施例２６］  ＰＥＧ２−ＮＨＳ１０Ｋ修飾ＳｅＶベクターによるｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入
実施例２５にＰＥＧ反応量を０ｍｇで調製した未修飾ＳｅＶコントロールと２０ｍｇで調製したＰＥＧ修飾ＳｅＶを用いてマウスへの繰り返し投与を行った。図１８および１９に示したように、実験群は５グループに分け、１回目でＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ搭載ＳｅＶを点鼻投与して抗ＳｅＶ抗体を作らせ、２週間後にグループＢではＧＦＰ搭載の未修飾ＳｅＶコントロール、グループＣでは、ＰＥＧ修飾ＳｅＶを用いて２回目投与を行った。グループＡは未処置コントロール、ＤとＥは１回のみ投与のコントロールとした。１回目投与の前、投与後１週間、２週間の時点でマウスから採血し、市販のＥＬＩＳＡキット（プレザイム「生研」デンカ生研株式会社）を用いて抗ＳｅＶ抗体価を測定した。１回目投与をしたグループＢ、Ｃのマウスでは抗ＳｅＶ抗体価の上昇が見られた。この抗体価が十分上がった２週間目に２回目の投与を行い、２日後マウスを解剖し、肺でのＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡で観察し、写真を撮影した。
図１９の蛍光写真で示したように、１回目の投与では、広い範囲にわたってＳｅＶの感染が見られ、未修飾とＰＥＧ修飾したベクターの間に大きな差は見られなかった。２回目の投与では、未修飾の場合、ＧＦＰ発現が全体像からほとんど見えず、拡大しても肺表面の一部にまばらにしか観察できなかった。一方、ＰＥＧ修飾した場合、１回目と比べれば少なかったが、ＧＦＰ発現細胞は未修飾と比べて多く、より広い範囲に観察された。特に拡大した写真に見られるようなＧＦＰ発現細胞のコロニーが観察された。
［実施例２７］  ＰＥＧ修飾によるＳｅＶの４℃保存条件での感染性維持効果
実施例２０のＳＰＡ−ＰＥＧ２Ｋを分子量２００００のＰＥＧ２ＮＨＳ−２０Ｋ（２本鎖、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）に変更してＰＥＧ反応量を１０、２０、４０ｍｇで、分子量４００００のＰＥＧ２ＮＨＳ−４０Ｋ（２本鎖、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）に変更してＰＥＧ反応量を２０、４０、８０ｍｇで、同様に反応・精製を行い、ＰＥＧ２ＮＨＳ−２０Ｋ修飾ＳｅＶとＰＥＧ２ＮＨＳ−４０Ｋ修飾ＳｅＶを得た。修飾ベクターの蛋白濃度は実施例１９と同様に求めた。
実施例５で用いた方法で、４℃で８日と２０日保存した上記ＰＥＧ修飾ＳｅＶと未処置ＳｅＶのＣＩＵを測定した。図２０に示したように、未処置ＳｅＶコントロールは４℃で２週間保存した後、タイターが３分の１に低下したが、適量の高分子量の２本鎖ＰＥＧで修飾したものは最大８０％近い感染効率を維持した。
［実施例２８］  ＰＥＩ修飾によるＰＥＧ修飾ＳｅＶの感染効率の改善
実施例２１にＰＥＧ反応量を０、５、１０、１５ｍｇで調製したものを分子量７５００００のｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ，ＳＩＧＭＡ社）を用いてＰＥＩ：ＳｅＶ重量比０、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２で修飾し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞への感染効率を測定した（測定方法は実施例２３を参照）。図２１に示したように、一定量のＰＥＩ添加では、ＰＥＧ修飾したＳｅＶの感染効率を約１０倍増加する効果があった。ＰＥＧ修飾量が多いほどＰＥＩの感染効率の改善効果があった。分子量２５０００のＰＥＩ（ＳＩＧＭＡ社）でも同様な結果が得られた。
産業上の利用の可能性
薬物治療または遺伝子治療において薬物（特に高分子化合物）や核酸等の生理活性物質を、目的とする細胞または細胞内組織に到達させるシステム、すなわちドラッグデリバリーシステム（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；以下単にＤＤＳと言う）は重要な技術分野である。ＤＤＳはウイルスベクターを用いて、あるいは人工的なまたは半人工的な輸送担体（キャリアー）に、所望の生理活性物質を封入または担持させた組成物を投与することにより実施することができるが、本発明によりこの両方においてヘマグルチニン活性を低下させ、血中での安定性および遺伝子導入効率を向上させることが可能となった。例えばウイルスベクターを用いたＤＤＳでは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターあるいは該ウイルスのヘマグルチニン活性を持つエンベロープ遺伝子でシュード化したウイルスベクターなどに本発明を適用すれば、ヘマグルチニン活性を特異的に低下させたウイルスベクターを製造することができる。また人工的にリポソーム等を調製する場合においても、本発明を適用することによりヘマグルチニン活性を低下させることができる。本発明を用いて製造されるＤＤＳのための組成物は、生体内への適用に極めて優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳｅＶベクターのエンベロープ蛋白（ＨＮおよびＦ蛋白）へのＴＰＥＧおよびＳＰＡ−ＰＥＧ修飾試薬によるＰＥＧ修飾を模式的に示す図である。
図２は、ＳｅＶベクターおよびＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターによるラット血液に対する溶血活性を、３７℃、１５分の条件で測定した結果を示す図である。
図３は、ＳｅＶベクターおよびＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターのラット血液中での安定性を調べた結果を示す図である。３７℃で１、１５および３０分処理した後に、血漿を分離して、ＨｅＬａ細胞に感染を行い、２４時間後のＬａｃＺ遺伝子発現を定量した結果である。結果は３例の平均値±標準偏差で表した。
図４は、ＳｅＶベクターおよびＴＰＥＧ修飾ＳｅＶベクターをＳＤＳ電気泳動を行い、銀染色法により染色した結果を示す写真である。ＨＮ蛋白とＦ蛋白の泳動位置を矢印で示す。０はＳｅＶベクターを、８から１０は表２の検体番号８から１０に相当する。
図５は、ＳｅＶベクターおよびＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ修飾ＳｅＶベクターをウサギ抗ＳｅＶ抗血清存在下（１０、１００および１０００倍希釈血清）でＬＬＣＭＫ２細胞に遺伝子導入後のＬａｃＺ発現をＸ−ｇａｌ染色法により評価した結果を示す写真である。
図６は、ＳｅＶベクターに葉酸結合型抗ＨＮモノクローナル抗体で、ＨＮ蛋白への選択的修飾を行う模式図である。
図７は、ＨＮ−１、ＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２およびそのＮＨＳ法により調製した葉酸結合型抗体で修飾したＳｅＶベクターのＨＡＵを示す図である。横軸は抗体濃度、縦軸は赤血球凝集活性のｌｏｇ表記（ｌｏｇ２（ＨＡＵ））を表す。
図８は、ＳｅＶベクター、ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターおよび葉酸結合ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターのニワトリ赤血球に対する溶血活性を調べた結果を示す図である。ＳｅＶベクターは１×１０７、１×１０８および１×１０９ｐｆｕ／ｍＬで、修飾ベクターはいずれも１×１０９ｐｆｕ／ｍＬのＳｅＶベクターを１００μｇ／ｍＬの抗体で修飾したベクターでの結果を示す。図の縦軸は、遊離したヘモグロビン量を５７０ｎｍにおける吸光度で示した。
図９は、ＳｅＶベクター、ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターおよび葉酸結合ＨＮ−１修飾ＳｅＶベクターをＫＢ細胞に感染を行い、２日後にＬａｃＺ遺伝子発現を調べた結果を示す図である。過剰葉酸存在条件とは、感染実験において、培養液中に１ｍＭの葉酸を添加して行った系を示す。結果は３例の平均値±標準誤差で示した。
図１０は、ＨＮ−１またはＨＮ−１／Ｆ（ａｂ’）２およびその葉酸結合体でＳｅＶベクターを修飾して、ＫＢ細胞に感染したときの、感染２日後のＬａｃＺ遺伝子発現を調べた結果を示す図である。３例の平均値±標準誤差で示した。
図１１は、ＳｅＶベクターをＨＮ−１またはＥＤＣ法で調製した葉酸結合ＨＮ−１で抗体量を変えて修飾したベクターのＨＡＵの変化を示す図である。横軸は抗体濃度、縦軸は赤血球凝集活性のｌｏｇ表記（ｌｏｇ２（ＨＡＵ））を表す。
図１２は、ＰＦＧ修飾したＳｅＶのタイター変化を示す図である。ＰＥＧ反応量を変えてＳｅＶを修飾し、修飾ＳｅＶベクターの相対感染効率を調べた。
図１３は、ＰＦＧ修飾したＳｅＶのＨＡ活性変化を示す図である。ＰＥＧ反応量を変えてＳｅＶを修飾し、修飾ＳｅＶベクターのＨＡ活性を調べた。
図１４は、ＰＦＧ修飾したＳｅＶの感染性とＨＡ活性の相関を示す図である。ＰＥＧ修飾により、ＨＡ活性に対する感染性は上昇し得ることが分かる。
図１５は、銀染色によりＰＦＧ修飾したＳｅＶの組成蛋白を分析した結果を示す写真である。エンベロープ蛋白であるＦとＨＮに由来するバンドがＰＥＧ反応量の増大に伴って減少し、代わりに高分子量画分にバンドが出現した。
図１６は、ウェスタンブロッティングによりＰＦＧ修飾したＳｅＶの組成蛋白を分析した結果を示す写真である。
図１７は、ＰＥＧ修飾したＳｅＶの中和抗体への抵抗性を示す図および写真である。修飾ＳｅＶの総粒子数（総蛋白量）を一定にした条件で比較した。
図１８は、ＰＥＧ１０Ｋ修飾ＳｅＶのｉｎ  ｖｉｖｏ評価を示す図である。修飾ＳｅＶの投与スケジュールおよび投与条件、および抗ＳｅＶ抗体価の変化が示されている。
図１９は、ＰＥＧ１０Ｋ修飾ＳｅＶのｉｎ  ｖｉｖｏ評価を示す写真である。図１８に示した修飾ＳｅＶのｉｎ  ｖｉｖｏ投与における、肺での導入遺伝子の発現を示す。
図２０は、ＰＥＧ修飾ＳｅＶの４℃保存条件での感染性の維持効果を示す図である。
図２１は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ７５０Ｋ）の修飾効果を示す図である。ＰＥＩは、ＰＥＧ修飾ＳｅＶの感染性を上昇させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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