(57)【要約】本発明は、ヒト、ラット、マウスの幹細胞由来神経生存因子ポリペプチド（ＳＤＮＳＦ）、その製造方法、ＳＤＮＳＦをコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、ＳＤＮＳＦの抗体、ＳＤＮＳＦまたは抗体を含有する薬学的組成物、ＳＤＮＳＦを測定する方法、ＳＤＮＳＦを測定する試薬およびＳＤＮＳＦを用いたスクリーニング方法に関する。本発明のポリペプチドは、神経細胞の生存に有効であり、脳梗塞や脳出血、脊髄損傷などによる中枢神経の損傷の治療に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋な形である配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモローグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモローグ。
【請求項２】
配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなる請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１、２、５、６、９または１０で示される塩基配列を有する請求の範囲第３項記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント。
【請求項５】
請求の範囲第３項または第４項記載のｃＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
【請求項６】
請求の範囲第５項記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを発現させるための条件下で請求の範囲第６項記載の宿主細胞を培養することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドまたは請求の範囲第８項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１０】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドまたは請求の範囲第８項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有することを特徴とする神経変性が係わる疾患の治療に有効な薬学的組成物。
【請求項１１】
神経変性が係わる疾患が中枢神経の損傷である請求の範囲第１０項記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドの測定方法。
【請求項１３】
請求の範囲第８項記載の抗体を用いることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドの免疫化学的測定方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１２項または第１３項記載の方法を用いることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを検出する試薬。
【請求項１５】
請求の範囲第１２項または第１３項記載の方法を用いることを特徴とする腫瘍を検査する試薬。
【請求項１６】
腫瘍が脳腫瘍である請求の範囲第１４項記載の試薬。
【請求項１７】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを用いることを特徴とする該ポリペプチドに対するアンタゴニストまたはアゴニストとしての活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを有効成分とする中枢神経損傷治療剤。
【請求項１９】
中枢神経損傷が脳梗塞による中枢神経損傷である請求の範囲第１９項記載の試薬。
【請求項２０】
中枢神経損傷が脳出血による中枢神経損傷である請求の範囲第１９項記載の試薬。
【請求項２１】
中枢神経損傷が脊髄損傷による中枢神経損傷である請求の範囲第１９項記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はヒト、ラット、マウスの幹細胞由来神経生存因子（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ−Ｎｅｕｒｏｎ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｆａｃｔｏｒ、以下、ＳＤＮＳＦと省略する。）に関する。
さらに詳しく言えば、ヒト、ラット、マウスのＳＤＮＳＦ、それらの製造方法、ＳＤＮＳＦをコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、ＳＤＮＳＦの抗体、ＳＤＮＳＦまたは抗体を含有する薬学的組成物、ＳＤＮＳＦを測定する方法、ＳＤＮＳＦを測定する試薬およびＳＤＮＳＦを用いたスクリーニング方法に関する。
背景技術
成体脳では新しいニューロンは生まれないというのが長い間の定説であり、脳梗塞や脳出血、脊髄損傷などによる中枢神経の損傷、パーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患などでは、神経細胞の細胞死により運動機能が失われ、いったん失われた機能の回復は難しいとされていた。しかし近年、ヒトやサルなどの高等哺乳動物の成体脳（海馬、大脳皮質連合野、側脳室）でもニューロンが新生することが見出され、これらの領域で新しく生まれるニューロンが神経幹細胞から発生することも示された。また、神経幹細胞が高齢者の脳内にも存在し、神経細胞に分化しうることも証明された。これらのことは、脳の再生治療が細胞を移植する細胞治療に限定されず、タンパク質医薬、薬物あるいは遺伝子治療などの方法により直接内在性の幹細胞を活性化する治療が可能であることを示唆している。
従来、ある特定のポリペプチドまたはそれをコードするｃＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、次いでポリペプチドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングするという方法、あるいはその生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的に用いられてきた。しかし、生体内生理活性ポリペプチドは、多様な生物活性を有している場合が多いので、あるひとつの活性を指標にして遺伝子をクローニングした結果、それが既知のポリペプチドと同一であることが後になって判明するという事例が増えている。また、微量しか産生されなかったり、特別な生理条件でのみ発現する因子も多く、そのことが単離、精製および生物活性の確認を困難なものとしている。
発明の開示
本発明者らは、中枢神経の損傷または神経変性に係わる疾患の治療、診断、脳腫瘍の診断あるいは研究上有益な新規な因子（ポリペプチド）、特に分泌シグナルを有する分泌蛋白質および膜蛋白質に着目してそれを見出すべく、鋭意検討を行った。その結果、神経幹細胞に係わる新規なペプチド分子を単離し、上記のような再生治療に使用すること、および神経細胞の特異的マーカーとなることを見出した。
本発明者らは、これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のクローニングを研究してきた。そして、増殖分化因子（例えば、各種サイトカイン等）のような分泌蛋白質やそのレセプターのような膜蛋白質（以下、これらをまとめて分泌蛋白質等と呼ぶ。）の大部分がそのＮ末端にシグナルペプチドと呼ばれる配列を有していることに着目して、シグナルペプチドをコードする遺伝子を効率的かつ選択的にクローニングする方法を鋭意検討した。その結果、動物細胞を用いて、シグナルペプチドの有無を簡単に検索できる方法（シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ）法）を見出した（日本国特許第２，８７９，３０３号参照）。さらに同じ概念のもとに、酵母を用いてさらに大量かつ簡便にシグナルペプチドをコードする遺伝子を単離する方法（酵母ＳＳＴ法）も開発された（米国特許第５，５３６，６３７号）。
本方法を用いて、成体ラット海馬由来神経幹細胞が産生している新規な分泌蛋白質、およびそれをコードするｃＤＮＡを同定することに成功し、その情報を基に全長ｃＤＮＡを成体ラット海馬由来神経幹細胞より見出した。
本ポリペプチドが、後に詳述するように、脳の一部のニューロン（海馬神経初代培養細胞および海馬由来幹細胞）に対し、生存支持活性を持つことを確認し、本発明を完成した。本ポリペプチドは、機能が特定された有用な因子である。
本発明が提供するｃＤＮＡ配列は、配列番号１または２で示されるラットＳＤＮＳＦクローンとして同定され、成体ラット海馬由来神経幹細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーより、酵母ＳＳＴ法を使用して得た情報をもとに単離された。配列番号１で示されるラットＳＤＮＳＦクローンは分泌蛋白質（ここではラットＳＤＮＳＦ蛋白として表される。）をコードする完全なｃＤＮＡ配列を含む全長鎖ｃＤＮＡである。
本発明が提供するｃＤＮＡ配列は、配列番号５または６で示されるヒトＳＤＮＳＦクローンとして同定され、成体ラット海馬由来神経幹細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーより、酵母ＳＳＴ法を使用して得た情報をもとに単離された。配列番号５で示されるヒトＳＤＮＳＦクローンは分泌蛋白質（ここではヒトＳＤＮＳＦ蛋白として表される。）をコードする完全なｃＤＮＡ配列を含む全長鎖ｃＤＮＡである。
本発明が提供する配列番号９または１０で示されるｃＤＮＡ配列は、マウスＳＤＮＳＦクローンとして同定され、成体ラット海馬由来神経幹細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーより、酵母ＳＳＴ法を使用して得た情報をもとに単離された。配列番号９で示されるマウスＳＤＮＳＦクローンは分泌蛋白質（ここではマウスＳＤＮＳＦ蛋白として表される。）をコードする完全なｃＤＮＡ配列を含む全長鎖ｃＤＮＡである。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対してＧｅｎＢａｎｋおよびＮＣＢＩを用いたＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡおよびＵＮＩＧＥＮＥなどにより、またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＰ、Ｆｌｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔなどにより検索をした結果、本発明ポリペプチドであるラットＳＤＮＳＦおよびそれらをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。このことから、本発明のポリペプチドは、新規の分泌蛋白質であることが判明した。
また、本発明者らは脳の一部のニューロンの生存支持活性を持つこと、分泌蛋白でありながらＥＦハンドモチーフを持ち、細胞外または分泌経路のオルガネラのカルシウムで調節を受けるサイトカインである可能性があること、および既知のいずれのニューロトロフィンとも相同性を有さないことから、既知のニューロトロフィン遺伝子欠損マウス解析からそれらへの依存性が知られている交感神経、知覚神経、脊髄運動神経核の神経、基底核コリン作動性神経以外のニューロンの形成や生存を支持するサイトカインである可能性と同時に、これまで原因不明であった神経変性疾患の病因解明および治療につながるものと考えられる。
本発明は、
１．実質的に純粋な形である配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモローグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモローグ、
２．配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなる前記第１項記載のポリペプチド、
３．前記第１項または第２項記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、
４．配列番号１、２、５、６、９または１０で示される塩基配列を有する前記第３項記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント、
５．前記第３項または第４項記載のｃＤＮＡからなる複製または発現ベクター、
６．前記第５項記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
７．前記第１項または第２項記載のポリペプチドを発現させるための条件下で前記第６項記載の宿主細胞を培養することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法、
８．前記第１項または第２項記載のポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、
９．前記第１項または第２項記載のポリペプチドまたは前記第８項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有することを特徴とする薬学的組成物、
１０．前記第１項または第２項記載のポリペプチドまたは前記第８項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有することを特徴とする神経変性が係わる疾患の治療に有効な薬学的組成物、
１１．神経変性が係わる疾患が、脳梗塞や脳出血、脊髄損傷などによる中枢神経の損傷である前記第１０項記載の薬学的組成物、
１２．前記第１項または第２項記載のポリペプチドの測定方法、
１３．前記第８項記載の抗体を用いることを特徴とする前記第１項または第２項記載のポリペプチドの免疫化学的測定方法、
１４．前記第１２項または第１３項記載の方法を用いることを特徴とする前記第１項または第２項記載のポリペプチドを検出する試薬、
１５．前記第１２項または第１３項記載の方法を用いることを特徴とする腫瘍を検査する試薬、
１６．腫瘍が脳腫瘍である前記第１４項記載の試薬、
１７．前記第１項または第２項記載のポリペプチドを用いることを特徴とする該ポリペプチドに対するアンタゴニストまたはアゴニストとしての活性を有する化合物をスクリーニングする方法、
１８．前記第１項または第２項記載のポリペプチドを有効成分とする中枢神経損傷治療剤、
１９．中枢神経損傷が脳梗塞による中枢神経損傷である前記第１９項記載の試薬、
２０．中枢神経損傷が脳出血による中枢神経損傷である前記第１９項記載の試薬、および
２１．中枢神経損傷が脊髄損傷による中枢神経損傷である前記第１９項記載の試薬に関する。
詳細な説明
実質的に純粋な形である配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９８または９９％が配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを意味する。
配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０、８０または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記載される。
さらに、配列番号４、８または１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
配列番号１、２、５、６、９または１０で示される塩基配列からなるｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０、８０または１００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発明のｃＤＮＡとして記載される。
配列番号１、２、５、６、９または１２で示される塩基配列からなるｃＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。
本発明のＳＤＮＳＦ蛋白は、脳腫瘍のうち未分化なニューロブラストーマとグリオブラストーマ細胞株から大量に分泌されるが、分化したグリオーマからは分泌されないことと、血中や髄液中に分泌されるニューロブラストーマとグリオブラストーマ脳腫瘍マーカーは無いので、ＳＤＮＳＦ蛋白が、血中で検出可能な初の未分化脳腫瘍マーカーとすることができる。
さらに、本発明には、本発明のｃＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ｃＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、例えばｃＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、宿主細胞の形質転換に用いることができる。
さらに、本発明には、配列番号１、２、５、６、９また１０で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームからなるｃＤＮＡを含む本発明のｃＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。培養は、本発明のポリペプチドが発現し、宿主細胞より製造される条件下で行われることが好ましい。
本発明のｃＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮＡを製造することもできる。このようなアンチセンスＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。
本発明は、本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体をも含む。さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法をも含む。モノクローナル抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原として用い、通常のハイブリドーマの技術により製造することができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。
本発明には、本発明のポリペプチド、その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
（Ａ）前記１の本発明のポリペプチドとしては、配列番号４、８または１２で示されたアミノ酸配列からなるもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号４中、生物活性の発現に必須な部分だけからなる成熟ポリペプチド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、および上記本発明のポリペプチドに他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
（Ｂ）前記３で特定される本発明のｃＤＮＡには、（Ａ）の配列番号４、８または１２で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（Ｃ）配列番号２、６または１０で特定されるｃＤＮＡは、（Ｂ）で示されるｃＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
（Ｄ）配列番号１、５または９で示されるｃＤＮＡは、（Ｃ）で特定されるｃＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
配列番号１、５または９で示される塩基配列からなるｃＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行われる。
はじめに酵母ＳＳＴ法（米国特許第５，５３６，６３７号に記載）の概要について説明する。
サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母がショ糖またはラフィノースをエネルギー源や炭素源として利用するためにはインベルターゼを培地中に分泌しなければならない（インベルターゼはラフィノースをショ糖とメリビオースに、ショ糖をフルクトースとグルコースに分解する酵素である。）。また数多くの既知の哺乳類のシグナルペプチドは酵母のインベルターゼを分泌させうることが知られている。
これらの知見から、酵母のインベルターゼの分泌を可能にする新規のシグナルペプチドを哺乳類のｃＤＮＡライブラリーからラフィノース培地上での酵母の生育を指標にスクリーニングする方法として本方法は開発された。
翻訳開始点ＡＴＧを削除した非分泌型のインベルターゼ遺伝子ＳＵＣ２（ＧＥＮＢＡＮＫ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｖ０１３１１）を酵母の発現ベクターに組み込んで酵母ＳＳＴ用ベクターｐＳＵＣ２を作製した。発現ベクターには、ＡＡＨ５プラスミド（Ｇａｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１，１９２−２０１，１９８３）由来の発現用プロモーター（ＡＤＨプロモーター）およびターミネーター（ＡＤＨターミネーター）が組み込まれ、酵母複製起点としては２μ  ｏｒｉ、酵母選択マーカーにはＴＲＰ１、大腸菌複製起点としてはＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、大腸菌薬剤耐性マーカーにはアンピシリン耐性遺伝子がそれぞれ組み込まれている。そのＳＵＣ２遺伝子の上流に哺乳類のｃＤＮＡを組み込んで、酵母ＳＳＴ  ｃＤＮＡライブラリーを調製した。このライブラリーを分泌型インベルターゼを欠損している酵母に形質転換した。
組み込まれた哺乳類ｃＤＮＡがシグナルペプチドをコードしている場合、酵母で発現されたインベルターゼに対しても分泌作用をもつと考えられ、その結果ラフィノース培地上での生育が可能となる。そこで出現したコロニーから酵母を培養してプラスミドを調製し、インサートｃＤＮＡの塩基配列を決定することによって、新規シグナルペプチドの検索を迅速かつ容易にした。
酵母ＳＳＴ  ｃＤＮＡライブラリーの作製は、
工程（１）：対象となる細胞よりｍＲＮＡを単離し、特定の制限酵素（酵素Ｉ）サイトを連結したランダムプライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、
工程（２）：酵素Ｉとは異なる特定の制限酵素（酵素ＩＩ）サイトを含むアダプターを連結して、酵素Ｉで消化した後、適当なサイズで分画し、
工程（３）：酵母発現ベクター内のシグナルペプチドを削除したインベルターゼ遺伝子の上流に得られたｃＤＮＡ断片を連結し、形質転換する工程よりなる。
各工程を詳しく説明すると、工程（１）では、対象となる哺乳類の臓器や細胞株などより、必要により適当な刺激剤で刺激した後、公知の方法（以下、公知の方法は特に記載がなければＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．より発刊）に記載の方法に従って行われる。）に従ってｍＲＮＡの単離が行われる。
対象となる組織としては、マウス胎児心臓が挙げられる。ランダムプライマーを用いる二本鎖ｃＤＮＡの合成は公知の方法により行われる。
アダプターに連結される制限酵素（酵素Ｉ）サイトと次の工程（２）で用いられる制限酵素（酵素ＩＩ）サイトは、互いに異なるものであれば何を用いてもよい。好ましくは、酵素ＩとしてＸｈｏＩ、酵素ＩＩとしてはＥｃｏＲＩが用いられる。
工程（２）ではＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、酵素ＩＩアダプターを連結した後、酵素Ｉで消化し、アガロース電気泳動（ＡＧＥ）により３００〜８００ｂｐのｃＤＮＡを分画する。酵素ＩＩは、前記したように酵素Ｉと異なるものなら何でもよい。
工程（３）は、酵母発現用プラスミドベクターに連結されたシグナルペプチドを削除したインベルターゼの遺伝子の上流に（２）で得られたｃＤＮＡ断片を組み込んで大腸菌に形質転換する工程である。ここで酵母発現用プラスミドベクターとしては、種々のものが知られているが、例えば、大腸菌内でも機能するＹＥｐ２４などが用いられるが、好適には前述したプラスミドｐＳＵＣ２が用いられる。
形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、好ましくはＤＨ１０Ｂのコンピテントセルである。また形質転換方法は公知の方法のいずれを用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法により行われる。形質転換体は公知の方法により培養され、酵母ＳＳＴ用のｃＤＮＡライブラリーが得られる。
このｃＤＮＡライブラリーでは、すべてのクローンｃＤＮＡ断片が導入されているわけではないし、またすべてが未知の（新規の）シグナルペプチドをコードする遺伝子断片とは限らない。そこで、次に該ライブラリーから未知のシグナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニングする必要がある。
遺伝子をもたない酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えばＹＴ４５５株など）またはインベルターゼ遺伝子を人為的に欠損させた株（公知の方法に従い作製可能）に、該ｃＤＮＡライブラリーを導入し、シグナルペプチドをコードする配列を有する断片のスクリーニングを行なう。酵母の形質転換は公知の方法、例えば酢酸リチウム法によって行われる。形質転換体を選択培地で生育後、ラフィノースを炭素源とする培地に移し、生育可能なコロニーを選択し、プラスミドを回収する。ラフィノースを炭素源として酵母が生育したということは、ライブラリー中に何らかの分泌蛋白質のシグナルペプチドが組み込まれていたことを示している。
次に、単離した陽性クローンについて、塩基配列を決定し、未知の蛋白質をコードすることが明らかになったｃＤＮＡについては、それをプローブとして全長クローンを単離し、全長の塩基配列を決定することができる。これらの操作は、当業者にとってすべて公知の方法で行われる。
配列番号１、５または９で示される塩基配列が、一部、好ましくは全てが確定されると哺乳類に存在する本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡもしくは本発明蛋白質のホモローグおよびサブセットをコードするｃＤＮＡを得ることができる。適当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それを用いて、哺乳類由来のｃＤＮＡライブラリーあるいはｍＲＮＡからＰＣＲ法により、あるいは適当な塩基配列の断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、他の哺乳類ｃＤＮＡライブラリーあるいは該ゲノムライブラリーから、他の哺乳類型の当該蛋白質をコードするｃＤＮＡを得ることができる。
このようにして得られたｃＤＮＡが、ＳＳＴで得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列（またはその相同配列）を含んでいるならばシグナルペプチドをコードしていることになるので、該ｃＤＮＡが全長、またはほぼ全長であることは明らかである。
（シグナルペプチドは例外なく蛋白質のＮ末端に存在することから、ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの５’末端にコードされている。）
さらに公知の方法に従い、該ｃＤＮＡをプローブとしてノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）解析によって全長の確認をしてもよい。ハイブリダイズしたバンドから得られるｍＲＮＡのサイズと該ｃＤＮＡのサイズを比較し、ほぼ同じであれば該ｃＤＮＡはほぼ全長であると考えられる。
本発明は、開示されたタンパクの全長型並びに成熟型の両方を提供する。それらのタンパクの全長型は、配列番号４、８または１２で示される塩基配列の翻訳されるアミノ酸配列で同定される。それらの成熟タンパクは、適当な哺乳類の細胞あるいはその他の宿主細胞で開示された配列番号１、５または９で示される全長ＤＮＡを適当な哺乳類の細胞あるいはその他の宿主細胞で発現させることによって得られる。成熟型のタンパクの配列は、全長型のアミノ酸配列より予測可能である。
配列番号１、２、５、６、９または１０で示される塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、これをプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のｃＤＮＡを得ることができる。さらに、本ｃＤＮＡを含有するベクターｃＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とするｃＤＮＡを必要量得ることができる。
本発明のポリペプチドを取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟蛋白部分をコードするｃＤＮＡの５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。
次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産することもできる。
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号１、２、５、６、９または１０で示される塩基配列を適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば，サルＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、分泌蛋白である本発明の蛋白は、その細胞上清中に目的とするポリペプチドとして発現される。さらに、その他のポリペプチド、例えば抗体の定常領域（Ｆｃ  ｐｏｒｔｉｏｎ）をコードするｃＤＮＡ断片と連結することによって、フュージョン・プロテイン（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産することもできる。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドおよびそれをコードするｃＤＮＡは、一つあるいはそれ以上の効果あるいは生物活性（以下に列挙するアッセイに関連するものを含む。）を示すことが考えられる。
本発明の蛋白に関して記述される効果あるいは生物活性は、その蛋白の投与あるいは使用により、あるいは、その蛋白をコードするｃＤＮＡの投与あるいは使用（例えば、遺伝子療法（再生医療を含む。）やｃＤＮＡ導入に適したベクター）により提供される。
本発明のポリペプチドが、脳の一部のニューロン（海馬神経初代培養細胞および海馬由来幹細胞）の生存維持活性を有していることから、神経変性が関わる疾患（脳梗塞や脳出血、脊髄損傷などによる中枢神経の損傷）の治療に有用である。
また、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行え、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて公知の方法により作製することができる。
また、該ポリペプチドを用いることにより、例えば、アフィニティーカラムを作製して、本ポリペプチドと結合する既知または未知の蛋白（リガンド）の同定、精製あるいはその遺伝子クローニングを行うことができる。
また、該ポリペプチドを用いて、例えば、ウエスト−ウエスタン法により、または該ｃＤＮＡ（好ましくは該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）を用いて、例えば、酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法により該ポリペプチドと相互作用する分子の同定、遺伝子クローニングを行うこともできる。
さらに、本ポリペプチドを用いることによって、本ポリペプチドレセプターアゴニスト、アンタゴニストおよび受容体−シグナル伝達分子間の阻害剤等のスクリーニングを行うこともできる。
スクリーニングは、例えば、以下の方法により行なうことが出来る。すなわち、
（ａ）本発明のポリペプチド、スクリーニングすべき化合物、及び細胞を含む反応混合物を、細胞が該ペプチドにより正常に刺激される条件下に一緒にし（該反応混合物は細胞が増殖するに従い細胞中に導入される標識および該ペプチドの機能を効果的に観察させるための該ペプチド以外のペプチドを含む）；ついで、
（ｂ）細胞の増殖の程度を測定して、該化合物が有効なアンタゴニストまたはアゴニストであるかどうかを決定する。
本発明のｃＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によって、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療等）に利用できる。
また、本発明のｃＤＮＡをプローブとしてジェノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを分離できる。
前記の疾患に適応するために、本発明のポリペプチド、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体は通常、全身的または局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投与である。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一人あたり、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。
もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。
このような固体組成物においては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アスパラギン酸等）を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、また２以上の層で被膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第２，８６８，６９１号および同第３，０９５，３５５号明細書に詳しく記載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等が挙げられる。
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいてもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明のＳＤＮＳＦに関する実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１：ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製
成体ラット海馬由来神経幹細胞をクローン化したＰＺ５細胞よりＴＲＩｚｏｌｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃより購入）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＯｌｉｇｏｔｅｘｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（商品名、Ｒｏｃｈｅより購入）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
実施例２：酵母ＳＳＴ  ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型にＸｈｏＩ部位を連結した９ｍｅｒ
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をプライマーとして、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃより購入）を用いて２本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。ＥｃｏＲＩアダプター（ＧＩＢＣＯＥＲＬより購入）をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（商品名、宝酒造（株）より購入。以後、ｃＤＮＡの連結はすべて本キットを使用した。）を用いて連結した後、ＸｈｏＩで消化し、アガロース電気泳動で４００〜８００ｂｐのｃＤＮＡを切り出して分画し、ｐＳｕｃ２ｔ７ｌｏｒｉ（米国特許５，５３６，６３７号参照）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に連結し、大腸菌ＤＨ１０株にエレクトロポレーション法で形質転換して酵母ＳＳＴ用のｃＤＮＡライブラリーを得た。
実施例３：ＳＳＴによるスクリーニングおよびＳＳＴ陽性クローンの塩基配列の決定
このｃＤＮＡライブラリーのプラスミドを調製し、酢酸リチウム法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３．７．１を参照）により酵母ＹＴＫ１２株を形質転換し、トリプトファン（Ｔｒｐ）不含の酵母形質転換体の選択培地（ＣＭＯ−Ｔｒｐ培地）のプレート上にまいた。３０℃で４８時間インキュベートした後、Ａｃｃｕｔｒａｎ  Ｒｅｐｌｉｃａ  Ｐｌａｔｅｒ（商品名、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌより購入）を用いて得られたコロニー（形質転換体）のレプリカををラフィノースを炭素源とするＹＲＰプレートにとり、３０℃で１４日間インキュベートした。  ３日目以降、出現してきた各々のコロニーを一つずつ再度ＹＰＲプレートにストリークして、３０℃で４８時間インキュベーション後、シングルコロニーをＹＰＤ培地に植菌し、さらに、３０℃で４８時間インキュベーションした後、プラスミドを調製した。続いて、ｐＳＵＣ２のクローニングサイトの両端の配列の２種類のプライマー（センス鎖はビオチン化プライマー）を用いて公知の方法に従ってＰＣＲを行い、インサートｃＤＮＡを増幅した後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商品名、ＤＹＮＡＬより購入）を用いてビオチン化１本鎖ｃＤＮＡを精製し、塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定はＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．より購入）を用いた蛍光ダイターミネーターサイクルシークエンス法で反応を行い、自動ＤＮＡシークエンサー３７３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）で読み取りを行った（以下の塩基配列決定もすべて本方法で行った）。
得られた塩基配列および推定されるアミノ酸配列についてデータベースとの相同性検索を行い、ＳＤＮＳＦと名付けられたクローンがデータベースに登録されていない新規のｃＤＮＡであることが明らかとなった。そこで、このＳＤＮＳＦクローンの断片ｃＤＮＡ（以後、ＳＤＮＳＦ  ＳＳＴ断片ｃＤＮＡと呼ぶ）について全長ｃＤＮＡのクローニングを試みた。また、推定されるアミノ酸配列を既知のシグナルペプチドと比較することによりＳＤＮＳＦ  ＳＳＴ断片ｃＤＮＡが機能的かつ構造的にもシグナルペプチドを有することを確認した。
実施例４：全長ｃＤＮＡのクローニングおよび塩基配列の決定
ＰＺ５ｃＤＮＡライブラリーより得られた１００万プラークをナイロンメンブレンにトランスファーした。３２Ｐ標識したラットＳＤＮＳＦ  ＳＳＴ断片ｃＤＮＡをプローブとして、公知の方法に従いハイブリダイゼーションを行い、多数の陽性クローンを得た。その中の１クローンを単離して、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してプラスミドを調製した。初めに５’側の塩基配列を決定してラットＳＤＮＳＦ  ＳＳＴ断片ｃＤＮＡの塩基配列が存在することを確認した後、全塩基配列を決定し、配列番号１に示す配列を得た。さらにオープンリーディングフレームを決定し、配列番号２に示すアミノ酸翻訳領域および配列番号４に示す推定アミノ酸配列を得た。
ＮＣＢＩデータベース検索の結果、本発明のポリペプチド（ラットＳＤＮＳＦポリペプチドと呼ぶ）およびコードする核酸配列と一致する配列はなかった。さらに、ラットＳＤＮＳＦポリペプチドは膜貫通領域を持たないことも明らかとなり、本発明のラットＳＤＮＳＦポリペプチドは新規の分泌蛋白質であることが判明した。
モチーフ検索の結果から、ＳＤＮＳＦはシグナルペプチドと下流に２つのＥＦハンドモチーフ（カルシウム結合モチーフ）を有することが判明した（第１図）。ＥＦハンドモチーフはカルシウム分泌蛋白であるｃａｌｍｏｄｕｌｉｎのＥＦハンドモチーフと共通の配列を有している（第２図）。ＥＦハンドモチーフは分泌蛋白ではあまりみられない構造ではあるが、同様の構造を有する蛋白としてはＢＭ−４０とその関連蛋白が報告されている。ＢＭ−４０においてはＥＦハンドモチーフが分泌小胞内のカルシウム濃度に応じて蛋白質高次構造の変化に寄与し、分泌効率に関与しているのではないかとされている（文献１：Ｂｕｓｃｈ  Ｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＥＦ−ｈａｎｄｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ＢＭ−４０．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（３３），２５５０８−１５（２０００））。
実施例５：ヒトおよびマウスＳＤＮＳＦ遺伝子の塩基配列の決定
他の哺乳類のＥＳＴｓおよびＵＮＩＧＥＮＥ  ＤＮＡデータベースの相同性検索の結果、本発明者らはラットＳＤＮＳＦと相同するヒトおよびマウスＥＳＴ配列を見い出した。
そこで、本発明者らは、その配列情報を用いて、常法によりヒトおよびマウスＳＤＮＳＦの全長遺伝子を単離し、全塩基配列を決定した。その結果、配列番号５および９に示す塩基配列を得た。さらにオープンリーディングフレームを決定し、配列番号８および１２に示す推定アミノ酸配列を得た。以上のことから、該ヒトクローンおよびマウスクローンは全長であること、およびラットＳＤＮＳＦに対してアミノ酸レベルで、それぞれ８７％、９０％一致していることが判明した。
このヒトＳＤＮＳＦおよびマウスＳＤＮＳＦについても核酸配列データベースおよびアミノ酸配列データベースを検索したが、ラットＳＤＮＳＦと同様に一致する配列はなかった。このことから、本発明のポリペプチドも、新規の分泌蛋白質であることが判明した。
実施例６：哺乳類以外の動物との相同性検索
線虫、およびショウジョウバエの遺伝子データベース検索の結果から線虫の仮想的な蛋白質として報告されているＦ５５Ａ１１．１あるいはショウジョウバエの遺伝子産物として報告されているＣＧ１２８１７と２０−３０％のアミノ酸が一致する相同性を有することが確認された。このことから、種間の保存が保たれていると考えられた。
実施例７：抗ＳＤＮＳＦ蛋白ポリクローナル抗体の作製
固相法により合成し、キーホール  リムペット  ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）コンジュゲートした３種類のラットＳＤＮＳＦポリペプチドの部分ペプチド
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を免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後血清を採取した。得られた血清を各々免疫原としたペプチド断片を結合させたアフィニティーカラムにより抗ＳＤＮＳＦ蛋白ポリクローナル抗体を精製した。
実施例８：ＳＤＮＳＦの分泌経路の検討
ラットＳＤＮＳＦのアミノ基末端にＦＬＡＧ構造を付加したＳＤＮＳＦ合成蛋白（ＦＬＡＧ−ＳＤＮＳＦ）およびカルボキシル基末端にＦＬＡＧ−６Ｈｉｓ構造を付加したＳＤＮＳＦ合成蛋白（ＳＤＮＳＦ−ＣＦＬＡＧ−６Ｈｉｓ）を２９３Ｔ細胞に強制発現させた。それぞれの培養上清中にＳＤＮＳＦ合成蛋白が分泌されていることを抗ＳＤＮＳＦ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）法により確認した（第３図）。
実施例９：ラットＳＤＮＳＦの発現部位の同定
成体ラット脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、骨格筋、胸腺の組織よりＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃより購入）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＯｌｉｇｏｔｅｘｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（商品名、Ｒｏｃｈｅより購入）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
それぞれのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをホルムアルデヒドゲル電気泳動し、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ．ａｌ．，１９８９［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ］）の方法に従い、ブロッティングを行った。ゲル精製を行った、３２ＰラベルｃＤＮＡフラグメントをプローブとして、検出を行ったところ、第４図に示すように全ての臓器で発現が認められた。
ラット胎児の全身および脳、出生後７日までの脳の組織および神経系の初代培養細胞および細胞株よりＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃより購入）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現量を調べた。第５図に示すように、培養幹細胞、神経初代培養細胞、神経幹細胞にＳＤＮＳＦの発現が認められた。また、ヒト神経膠芽種細胞ＵＧ２５１およびマウス神経芽細胞Ｎ１８ではＳＤＮＳＦの発現を認めたが、グリア初代培養細胞およびラットグリオーマ細胞Ｃ６では発現を認めなかった。また、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）法によって、ヒト神経膠芽種細胞ＵＧ２５１およびマウス神経芽細胞Ｎ１８でＳＤＮＳＦタンパク質の発現が確認された（第６図）。
実施例１０：ＳＤＮＳＦの神経細胞および幹細胞生存支持活性の測定
ＳＤＮＳＦの発現部位より、神経細胞および幹細胞に対する機能を調べた。
Ｈｉｓ構造を利用しＮｉ−ＮＴＡ法により精製した合成ＳＤＮＳＦ蛋白（ＳＤＮＳＦ−ＦＬＡＧ−６Ｈｉｓ）をラット海馬神経初代培養細胞およびラット海馬由来幹細胞の培養上清に加えて、それぞれの培養条件下における培養４日目の生存細胞数をＷＳＴ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ法を用いて検討したところ、第７図に示すように神経初代細胞においてはＳＤＮＳＦ１００ｎｇ／ｍｌの濃度において無添加群と比較して細胞生存に有効であった。また、神経幹細胞においてもＳＤＮＳＦ添加群において無添加群と比較して生存細胞数が多い傾向が認められた。また、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子２）を除いた培地でのラット海馬由来幹細胞の５日目での生存活性は、ＳＤＮＳＦ添加濃度に依存して増強した（第８図および第９図）。
実施例１１：ＳＤＮＳＦの神経幹細胞の自己再生および分化に対する効果の測定
ラット海馬由来幹細胞をＳＤＮＳＦ存在／ＦＧＦ−２欠如培地で５日間培養後、さらに、非コート培養ディッシュ中にてＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）添加培地で６日間培養した後の神経肝細胞のニューロスフェア（神経細胞塊）を計数した。また、神経細胞の分化マーカーであるＴｕｊ−１陽性細胞を計測した。第１０図および第１１図に示すように、ＳＤＮＳＦ添加神経幹細胞は、無添加群（Ｃｔｒｌ）と比較して有意なニューロスフェアの増加を呈した。さらに、そのうちの分化した神経細胞の割合は、無添加群（Ｃｔｒｌ）と比較して有意な増加を示した。これらの結果から、ＳＤＮＳＦは、ＦＧＦ−２と同様に神経幹細胞の自己再生能を維持し、神経細胞やグリア細胞への分化を促進する活性を有すると考えられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図（Ａ）はヒト、マウスおよびラットＳＤＮＳＦのアミノ酸配列の相同性アライメントを示し、（Ｂ）はシグナルペプチドの下流に２つのＥＦハンドモチーフ（カルシウム結合モチーフ）を有することを示す。
第２図は、ＳＤＮＳＦのＥＦハンドモチーフがカルシウム分泌蛋白であるカルモデュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のＥＦハンドモチーフと共通の配列を有していることを示す。
第３図は、培養上清中にＳＤＮＳＦ合成蛋白が分泌されていることを抗ＳＤＮＳＦ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）法により確認した様子を示す。
第４図は、ゲル精製を行った、３２ＰラベルｃＤＮＡフラグメントをプローブとして、検出を行った様子を示す。
第５図は、神経初代培養細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ）、神経膠星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、神経幹細胞（胎児神経幹細胞（ｅｍｂｒｙｏ  ＮＳＣ）、未分化成人神経幹細胞（ａｄｕｌｔ  ＮＳＣ  ｕｎｄｉｆｆ）、分化成人神経幹細胞（ａｄｕｌｔ  ＮＳＣ  ｄｉｆｆ））、ラットグリオーマ細胞Ｃ６、マウス神経芽細胞Ｎ１８、ヒト神経膠芽種細胞ＵＧ２５１でのＳＤＮＳＦｍＲＮＡの発現を示す。
第６図は、初代神経膠星状細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、神経初代培養細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ）、成人神経幹細胞（ａｄｕｌｔ  ＮＳＣ）、マウス神経芽細胞Ｎ１８、ヒト神経膠芽種細胞ＵＧ２５１でのＳＤＮＳＦタンパク質の発現を示す。
第７図（Ａ）（Ｂ）は、神経初代細胞（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎ）および神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）におけるＳＤＮＳＦ添加による細胞生存活性に対する効果を示す。
第８図は、ＳＤＮＳＦの添加が、濃度依存的に神経初代細胞の生存活性に有効であることを示す（＊は、ＳＤＮＳＦ非添加群に対する統計的有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。）。
第９図は、ＦＧＦ−２非存在下で培養した神経幹細胞の生存活性に対するＳＤＮＳＦの効果を示す（＊は、無添加群（Ｃｔｒｌ）に対する統計的有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。）。
第１０図は、ＦＧＦ−２非存在下で培養した神経幹細胞のニューロスフェア（神経細胞塊）を計数することによる神経幹細胞の自己再生能に対するＳＤＮＳＦの効果を示す（＊は、無添加群（Ｃｔｒｌ）に対する統計的有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。）。
第１１図は、ＦＧＦ−２非存在下で培養した神経幹細胞のニューロスフェア（神経細胞塊）の神経細胞への分化能に対するＳＤＮＳＦの効果を示す（＊は、ＳＤＮＳＦ添加群、ＦＧＦ−２添加群および無添加群（Ｃｔｒｌ）間それぞれの統計的有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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