(57)【要約】天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有するモノクローナル抗体や、該モノクローナル抗体が特異的に認識する天疱瘡自己免疫疾患治療薬として有用なペプチド等を提供するものである。自己抗原モデルマウスを用いて作製された尋常性天疱瘡モデルマウスの脾細胞中には抗マウスＤｓｇ３抗体産生細胞が存在することから、かかるモデルマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞をポリエチレングリコールにて細胞融合し、ハイブリドーマを作製し、Ｄｓｇ３に対するモノクローナル抗体を作製し、その中から、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有するモノクローナル抗体をスクリーニングし、その可変領域（重鎖・軽鎖）の塩基配列及びアミノ酸配列を決定し、その特異的エピトープ部分を確定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有することを特徴とする天疱瘡モノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒト及びマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）３に特異的に結合し、ヒトとマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）１とは交叉反応性を示さないことを特徴とする天疱瘡モノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列中の複数の特定のアミノ酸残基を特異的に認識することを特徴とする請求項１又は２記載の天疱瘡モノクローナル抗体。
【請求項４】
複数の特定のアミノ酸残基が、配列番号１又は２の３番目のバリン、７番目のリジン、８番目のプロリンの少なくとも１つと、５９番目のアスパラギン酸であることを特徴とする請求項３記載の天疱瘡モノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＨ鎖として機能するＨ鎖、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＬ鎖として機能するＬ鎖を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体の可変領域からなる抗原結合部位を含むことを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを投与することにより、天疱瘡病変が誘導されたことを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患モデル動物。
【請求項８】
請求項７記載の天疱瘡自己免疫疾患モデル動物に被検物質を投与し、該モデル動物における天疱瘡自己免疫疾患の病変の程度及び／又は血清中の抗体価を評価することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体又は請求項６記載の抗体フラグメントと、被検物質とを接触させ、抗体価及び／又は天疱瘡自己免疫疾患の病変の程度を評価することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
配列番号１〜５のいずれか記載のモノクローナル抗体により特異的に認識されるエピトープを含むことを特徴とするペプチド。
【請求項１１】
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列中の複数の特定のアミノ酸残基を含むペプチドであって、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する天疱瘡モノクローナル抗体が特異的に認識することを特徴とするペプチド。
【請求項１２】
複数の特定のアミノ酸残基が、配列番号１又は２の３番目のバリン、７番目のリジン、８番目のプロリンの少なくとも１つと、５９番目のアスパラギン酸であることを特徴とする請求項１１記載のペプチド。
【請求項１３】
天疱瘡モノクローナル抗体が、ヒト及びマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）３に特異的に結合し、ヒトとマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）１とは交叉反応性を示さないモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１又は１２記載のペプチド。
【請求項１４】
天疱瘡モノクローナル抗体が、配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＨ鎖として機能するＨ鎖、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＬ鎖として機能するＬ鎖を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患の診断薬。
【請求項１６】
請求項１０〜１４のいずれか記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患の予防・治療薬。
【請求項１７】
請求項１０〜１４のいずれか記載のペプチドを有効成分として使用することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患の予防・治療方法。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する天疱瘡モノクローナル抗体や、天疱瘡自己免疫疾患治療薬として有用な前記天疱瘡モノクローナル抗体が特異的に認識するペプチド等に関する。
背景技術
尋常性天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ；ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の自己免疫水疱形成疾患であり、組織学的には表皮内の水疱形成により特徴付けられ、免疫病理学的にはケラチノサイトの細胞表面に対するＩｇＧ自己抗体により特徴付けられる（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ．Ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｉ．Ｍ．Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｚ．Ｅｉｓｅｎ，Ｋ．Ｗｏｌｆｆ，Ｋ．Ｆ．Ａｕｓｔｅｎ，Ｌ．Ａ．Ｇｏｌｄｅｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｉ．Ｋａｔｚ，ａｎｄ  Ｔ．Ｂ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，ｅｄｓ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，６５４−６６６（１９９８））。臨床的には、尋常性天疱瘡患者は、広範な弛緩性の水疱及びびらんを示す。これらは、あらゆる重層扁平上皮に生じうる。適当な治療を行わなければ、広範囲の皮膚に生じた病巣が体液の漏出又は二次的な細菌感染を引き起こすため、尋常性天疱瘡は致命的となることもある。コルチコステロイドの全身投与及び免疫抑制療法を用いることにより、天疱瘡の予後は改善されているが、治療の合併症による死亡のため、死亡率は依然としてかなり高い。
尋常性天疱瘡の標的抗原は、最初、ケラチノサイト抽出物の免疫沈降により、１３０ｋＤの糖タンパク質として同定された（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０，２８１−２８８，１９８２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４，３１３−３２０，１９８４）。その後、尋常性天疱瘡抗原に特異的なアフィニティ精製自己抗体を用いて、ヒト・ケラチノサイト発現ライブラリーを免疫スクリーニングすることにより、尋常性天疱瘡抗原のｃＤＮＡが単離された（Ｃｅｌｌ，６７，８６９−８７７，１９９１）。塩基配列の解析により、尋常性天疱瘡抗原は、細胞間接着分子のカドヘリン・スーパー遺伝子ファミリーに属することが示された。尋常性天疱瘡抗原は、デスモソームの膜タンパク質であり（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２２，４０９−４１５，１９９３）、デスモグレイン３（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ３；Ｄｓｇ３）と名付けられた（Ａｄｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１，３１９−３５２，１９９６）。
Ｄｓｇ３タンパク質に対するＩｇＧ自己抗体が尋常性天疱瘡の病因的役割を示す証拠は多数存在する。第一に、経時的な疾患の活性が、血中抗体力価と相関していることが、間接蛍光抗体法（Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８４，７−１３，１９７１）又はＥＬＩＳＡ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，２０１０−２０１７，１９９７、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４０，３５１−３５７，１９９９）により報告されている。第二に、尋常性天疱瘡を患う母親の新生児は、胎盤を介して移行した母親由来のＩｇＧのために一時的に疾患を有する（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ７８，１１０２−１１０５，１９８６）。母親由来のＩｇＧが異化されるにつれ、症状は軽快する。第三に、尋常性天疱瘡患者由来のＩｇＧは、組織培養された皮膚において、補体又は炎症細胞なしに水疱形成を誘導することができる（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６７，２５４−２６０，１９７６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７，２５９−２７２，１９８３）。第四に、患者の血清由来のＩｇＧを新生マウスに受動移入すると、典型的な組織学的所見を伴う表皮内水疱形成が起こる（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０６，１１８９−１１９６，１９８２）。第五に、患者の血清を、細胞外ドメインからなる組換えＤｓｇ３タンパク質（ｒＤｓｇ３）を用いて免疫吸収除去すると、血清の病原性が除去され、新生マウスにおける水疱形成が阻害される（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，５９−６７，１９９４）。最後に、ｒＤｓｇ３でアフィニティ精製された抗体は、抗原性を有し、新生仔マウスにおいて尋常性天疱瘡の組織学的所見を伴う水疱を形成させる（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，９１９−９２６，１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２，７７５−７８２，１９９８）。これらの研究から、尋常性天疱瘡は、特に自己抗体生成後の過程に関しては、最もよく特徴が決定された自己免疫疾患の一つとなっている。従って、尋常性天疱瘡は、現在では、自己抗体産出又は自己寛容の破壊の細胞メカニズムを研究するため、また、疾患特異的な治療法を開発するための、臓器特異的自己免疫疾患の良い疾患モデルとされている。
本発明者らは、マウス体内において病原性抗体が産生されないのは、Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己寛容のためであるとの仮説の下、遺伝子ターゲティング技術により作製したＤｓｇ３欠損マウスは発生段階で免疫系がＤｓｇ３タンパク質に曝されず、Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己寛容を獲得していないとの知見に基づき、尋常性天疱瘡の表現型を示すマウス（ＰＶモデルマウス）の作製方法を開発した（特願平１１−９１４０８号及び特願２００１−１５６１２６号）。すなわち、Ｄｓｇ３遺伝子が欠損しているマウスを、組換えＤｓｇ３タンパク質（ｒＤｓｇ３タンパク質）で免疫し、該免疫されたマウスから脾細胞を調製し、該調製した脾細胞をＤｓｇ３タンパク質を有するマウスに移植し、Ｄｓｇ３タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞の活性化により、尋常性天疱瘡の表現型を示すマウスを作製する方法（特願平１１−９１４０８号）や、ナイーブなＤｓｇ３遺伝子が欠損しているマウスから調製した脾細胞を５×１０７細胞／匹に調整し、Ｄｓｇ３タンパク質を有するマウスに移植し、Ｄｓｇ３タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞の活性化により、尋常性天疱瘡の表現型を示すマウスを作製する方法（特願２００１−１５６１２６号）である。
前記のように、尋常性天疱瘡は細胞間接着分子であるＤｓｇ３に対する自己免疫性の水疱形成疾患であり、その発症に関与する病原性を有する自己抗体はポリクローナルで、その個々の自己抗体の病原性については不明である。上記本発明者らが開発したＰＶモデルマウスは、病原性を有する抗Ｄｓｇ３抗体によりその表現型を誘導している。そこで抗Ｄｓｇ３モノクローナルな抗体を作製し、個々のモノクローナル抗体における病原性を解析することにより、尋常性天疱瘡の分子レベルでの発症機序の解明、抗原特異的な抗体除去療法の開発に有用であると考えられるが、現在まで、尋常性天疱瘡病変を誘導できるような病原性を有するモノクローナル抗体は報告されていない。本発明の課題は、尋常性天疱瘡の分子レベルでの発症機序の解明、抗原特異的な抗体除去療法の開発に有用であると考えられる天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有するモノクローナル抗体や、該モノクローナル抗体が特異的に認識する天疱瘡自己免疫疾患治療薬として有用であると考えられるペプチド等を提供することにある。
発明の開示
病原性を有する自己抗体の産生誘導はその自己抗原に対する免疫寛容が存在し困難であった。しかし、自己抗原モデルマウスを用いて作製されたＰＶ（尋常性天疱瘡）モデルマウスの脾細胞中には抗マウスＤｓｇ３抗体産生細胞が存在する。そこで本発明者らは、上記モデルマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にて細胞融合し、ハイブリドーマを作製し、Ｄｓｇ３に対するモノクローナル抗体の作製を行い、数多く作製したこれらのモノクローナル抗体の中から、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有するモノクローナル抗体をスクリーニングし、その可変領域（重鎖・軽鎖）の塩基配列及びアミノ酸配列を決定し、その特異的エピトープ部分を確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有することを特徴とする天疱瘡モノクローナル抗体（請求項１）や、ヒト及びマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）３に特異的に結合し、ヒトとマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）１とは交叉反応性を示さないことを特徴とする天疱瘡モノクローナル抗体（請求項２）や、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列中の複数の特定のアミノ酸残基を特異的に認識することを特徴とする請求項１又は２記載の天疱瘡モノクローナル抗体（請求項３）や、複数の特定のアミノ酸残基が、配列番号１又は２の３番目のバリン、７番目のリジン、８番目のプロリンの少なくとも１つと、５９番目のアスパラギン酸であることを特徴とする請求項３記載の天疱瘡モノクローナル抗体（請求項４）や、配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＨ鎖として機能するＨ鎖、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＬ鎖として機能するＬ鎖を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体（請求項５）や、請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体の可変領域からなる抗原結合部位を含むことを特徴とする抗体フラグメント（請求項６）に関する。
また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを投与することにより、天疱瘡病変が誘導されたことを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患モデル動物（請求項７）や、請求項７記載の天疱瘡自己免疫疾患モデル動物に被検物質を投与し、該モデル動物における天疱瘡自己免疫疾患の病変の程度及び／又は血清中の抗体価を評価することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患治療薬のスクリーニング方法（請求項８）や、請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体又は請求項６記載の抗体フラグメントと、被検物質とを接触させ、抗体価及び／又は天疱瘡自己免疫疾患の病変の程度を評価することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患治療薬のスクリーニング方法（請求項９）や、配列番号１〜５のいずれか記載のモノクローナル抗体により特異的に認識されるエピトープを含むことを特徴とするペプチド（請求項１０）や、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列中の複数の特定のアミノ酸残基を含むペプチドであって、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する天疱瘡モノクローナル抗体が特異的に認識することを特徴とするペプチド（請求項１１）や、複数の特定のアミノ酸残基が、配列番号１又は２の３番目のバリン、７番目のリジン、８番目のプロリンの少なくとも１つと、５９番目のアスパラギン酸であることを特徴とする請求項１１記載のペプチド（請求項１２）や、天疱瘡モノクローナル抗体が、ヒト及びマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）３に特異的に結合し、ヒトとマウスのデスモグレイン（Ｄｓｇ）１とは交叉反応性を示さないモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１又は１２記載のペプチド（請求項１３）や、天疱瘡モノクローナル抗体が、配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＨ鎖として機能するＨ鎖、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＬ鎖として機能するＬ鎖を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載のペプチド（請求項１４）や、請求項１０〜１４のいずれか記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患の診断薬（請求項１５）や、請求項１０〜１４のいずれか記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患の予防・治療薬（請求項１６）や、請求項１０〜１４のいずれか記載のペプチドを有効成分として使用することを特徴とする天疱瘡自己免疫疾患の予防・治療方法（請求項１７）や、請求項１〜５のいずれか記載の天疱瘡モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株（請求項１８）に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の天疱瘡モノクローナル抗体としては、尋常性天疱瘡等の天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有するモノクローナル抗体やヒト及びマウスのＤｓｇ３に特異的に結合し、ヒトとマウスのＤｓｇ１とは交叉反応性を示さないモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではなく、ここで、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性とは、被毛の脱毛、体重減少、病理組織学的に基底層直上の水疱形成等の病変を誘導することが可能な病的活性をいう。上記天疱瘡モノクローナル抗体としては、ヒト及びマウスのＤｓｇ３に特異的に結合し、ヒトとマウスのＤｓｇ１とは交叉反応性を示さず、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体や、マウスのＤｓｇ３に特異的に結合し、マウスのＤｓｇ１とは交叉反応性を示さず、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体や、ヒトのＤｓｇ３に特異的に結合し、ヒトのＤｓｇ１とは交叉反応性を示さず、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体が好ましく、また、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列中の複数の特定のアミノ酸残基、例えば、配列番号１又は２の３番目のバリン、７番目のリジン、８番目のプロリンの少なくとも１つと、５９番目のアスパラギン酸、を特異的に認識する天疱瘡モノクローナル抗体や、配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＨ鎖として機能するＨ鎖、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＬ鎖として機能するＬ鎖を有する抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体を好適に例示することができ、より具体的には、実施例においてＡＫ２３と表記されているアイソタイプＩｇＧ１κのモノクローナル抗体を挙げることができるが、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体や１本鎖抗体であってもよい。
上記本発明の天疱瘡モノクローナル抗体の製造方法としては、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２，１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法における慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）にＤｓｇ３タンパク質に対する抗体を産生させる方法を挙げることができるが、この場合、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用することが好ましい。また、配列番号３で示されるＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡや、配列番号５で示されるＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、例えば、公知のヒト化抗体の作製方法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３−３２７，１９８８；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８８；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４，７７３−７８３，１９９１；Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，１２４−１３４，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１８１−４１８５，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，１１４９−１１５４，１９９２；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，１−６，１９９３）に準じて、組換えＤＮＡ技術により、本発明の天疱瘡モノクローナル抗体やヒト化天疱瘡モノクローナル抗体を作製することもできる。
本発明の抗体フラグメントとしては、上記本発明の天疱瘡モノクローナル抗体の可変領域からなる抗原結合部位を含む抗体フラグメントであれば特に制限されるものではなく、かかる抗体フラグメントとしては、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ′）２や、Ｆ（ａｂ′）２を還元して得られるＦａｂ′や、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂなどを例示することができる。上記天疱瘡モノクローナル抗体の可変領域としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＨ鎖として機能するＨ鎖可変領域や、配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＬ鎖として機能するＬ鎖可変領域を具体的に例示することができる。このように、抗体の抗原結合部位を含む一次構造がわかると三次構造を予測することができ、抗体エピトープ部の窪みを塞ぐ物質の分子モデルを構築することが可能になる。本発明の抗体フラグメントは、配列番号３で示されるＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡや、配列番号５で示されるＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、あるいは、配列番号４で示されるＨ鎖可変領域や、配列番号６で示されるＬ鎖可変領域のアミノ酸配列情報に基づいて、常法により作製することができる。
本発明の天疱瘡モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株としては、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有するモノクローナル抗体を産生することができる細胞株であれば特に制限されるものではなく、かかる天疱瘡モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、ＰＶモデルマウスに内在するＤｓｇ３タンパク質に対する抗体を産生する動物（好ましくはヒト以外）の脾細胞と当該動物由来の骨髄腫細胞とを、常法により細胞融合させ、ＨＡＴ培地で選択したハイブリドーマの中から、該ハイブリドーマが分泌するモノクローナル抗体が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド標識化物に対して特異的に免疫反応することができるものをスクリーニングすること等により作出することができる。また、かかる天疱瘡モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株を、インビボ又はインビトロで常法により培養することにより本発明の天疱瘡モノクローナルモノクローナル抗体を生産することができ、例えば、インビボ系においては、マウス又はラット等の齧歯目動物、好ましくはハイブリドーマと由来を同じくする齧歯目動物の腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより、天疱瘡モノクローナル抗体を得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
本発明の天疱瘡自己免疫疾患モデル動物としては、本発明の天疱瘡モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを投与することにより、天疱瘡病変が誘導されたマウス等の非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、例えば、天疱瘡モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に注入すると、ハイブリドーマにより産生される天疱瘡モノクローナル抗体により、マウス等の非ヒト動物には、エピトープ特異的に天疱瘡病変が誘導されることになる。かかる天疱瘡病変が誘導された天疱瘡自己免疫疾患モデル動物に被検物質を投与し、該モデル動物における被毛の脱毛、体重減少、病理組織学的に基底層直上の水疱形成等の天疱瘡自己免疫疾患の病変の程度を対照と比較評価することにより、あるいはモデル動物における血清中の抗体価を免疫沈降法やＥＬＩＳＡ等により測定し、対照と比較評価することにより、天疱瘡自己免疫疾患治療薬のスクリーニングをすることができる。上記投与方法としては、特に制限されるものではないが、静注や経口投与を挙げることができる。
本発明の天疱瘡自己免疫疾患治療薬のスクリーニング方法としては、上記天疱瘡自己免疫疾患モデル動物を用いる方法の他に、本発明の天疱瘡モノクローナル抗体又は本発明の抗体フラグメントと被検物質とを接触させ、インビボ及び／又はインビトロにおける抗体価を対照と比較評価する方法や、天疱瘡自己免疫疾患の病変の程度を対照と比較評価する方法を挙げることができ、インビボにおける評価方法としては、あらかじめ抗体又は抗体フラグメントを被検物質と接触させたものをマウス等の非ヒト動物に投与するか、あるいは抗体又は抗体フラグメントと被検物質を順不同でマウス等の非ヒト動物に投与して生体内で接触させた後、血清中の抗体価を免疫沈降法やＥＬＩＳＡにより測定する方法や、天疱瘡自己免疫疾患の病変の程度を対照と比較評価する方法を挙げることができ、インビトロにおける評価方法としては、抗体又は抗体フラグメントと被検物質とをインビトロで接触させた後、免疫沈降法やＥＬＩＳＡにより抗体価を測定し、対照と比較評価する方法を挙げることができる。
本発明のペプチドとしては、前記本発明のモノクローナル抗体により特異的に認識されるエピトープを含むペプチドであれば特に制限されるものではなく、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列中の複数の特定のアミノ酸残基、例えば、配列番号１又は２の３番目のバリン、７番目のリジン、８番目のプロリンの少なくとも１つと、５９番目のアスパラギン酸、を含むペプチドであって、天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する天疱瘡モノクローナル抗体、好ましくはヒト及びマウスのＤｓｇ３に特異的に結合し、ヒトとマウスのＤｓｇ１とは交叉反応性を示さないモノクローナル抗体や、配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＨ鎖として機能するＨ鎖、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこの配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、抗ヒトＤｓｇ３モノクローナルＦａｂ抗体のＬ鎖として機能するＬ鎖を有するモノクローナル抗体が特異的に認識するペプチドの他、Ｄｓｇ３を特異的に認識する抗体とＤｓｇ３分子上のエピトープとの関係がＤｓｇ１にも基本的に共通することから、Ｄｓｇ１の上記Ｄｓｇ３のエピトープに相当するペプチドを挙げることができ、かかる本発明のペプチドは、通常、合成ペプチドであり、これらペプチドは、そのアミノ酸配列情報や、該ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、常法により作製することができる。これら本発明のペプチドの中でも、天疱瘡自己免疫疾患の病態を顕著に改善しうる治療薬として有用なペプチドが特に好ましい。
上記本発明のペプチドは、前記ＡＫ２３等の天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する天疱瘡モノクローナル抗体のエピトープと考えられることから、本発明のペプチドを有効成分として含有するものは、天疱瘡自己免疫疾患の診断薬や、天疱瘡自己免疫疾患治療薬・予防薬として有用である。かかる本発明のペプチドエピトープを用いて、単一エピトープに対する抗体価を測定できるようなｓｉｎｇｌｅ  ｅｐｔｏｐｅ  ＥＬＩＳＡを構築できれば、病勢に対する絶対評価ができるＥＬＩＳＡスコアを得ることができ、重症度判定等の天疱瘡自己免疫疾患の診断に大きく役立つことになる。また、このエピトープに対する自己抗体を特異的に除く、あるいはその抗体を産生するＢ細胞を特異的に除去することにより、重症型の天疱瘡に対する有効な治療法の開発が期待される。上記本発明の天疱瘡自己免疫疾患予防・治療薬には、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
また、本発明のペプチドを、天疱瘡自己免疫疾患予防・治療用の機能性食品素材又は食品の有効成分とすることもできる。かかる食品素材又は食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、チーズ、バター等の乳製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例Ａ［方法と材料］
Ａ−１（ｒＤｓｇ３抗原蛋白の作製とＥＬＩＳＡ）
文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，２０１０−２０１７，１９９７）記載のとおりに作製したバキュロウィルスベクター、ｐＥＶｍｏｄ−Ｄｓｇ３−Ｈｉｓ及びｐＥＶｍｏｄ−Ｄｓｇ１−Ｈｉｓ、並びにｐＥＶｍｏｄ−ｍｏｕｓｅＤｓｇ３−Ｈｉｓ及びｐＥＶｍｏｄ−ｍｏｕｓｅＤｓｇ１−Ｈｉｓを用いた。これら組換えバキュロウィルスを昆虫細胞Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に感染させ、組換え蛋白ヒトＤｓｇ３−Ｈｉｓ及びＤｓｇ１−Ｈｉｓ、並びに組換え蛋白マウスＤｓｇ３−Ｈｉｓ及びＤｓｇ１−Ｈｉｓを培養液中よりそれぞれ回収した。また、これら組換え蛋白の精製はＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて行った。これら精製された組換え蛋白をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）プレートにそれぞれコートし、抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を各ウェルに５０μｌずつ入れ、文献（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０５，６２５−６３１，２０００）記載のとおりにＥＬＩＳＡ法を実施した。抗体価が中等度のＰＶモデルマウス１血清を陽性コントロール、正常マウス血清の１血清を陰性コントロールとして選択した。波長４５０ｎｍにて吸光度を測定し（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｋｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、次式で計算しＩｎｄｅｘ表示した。
Ｉｎｄｅｘ＝｛ＯＤ（検体）−ＯＤ（陰性コントロール）｝／｛ＯＤ（陽性コントロール）−ＯＤ（陰性コントロール）｝×１００
Ａ−２（培養マウス角化細胞ＰＡＭ２１２を用いた  Ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）
培養マウス角化細胞ＰＡＭ２１２（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅｒｃｈ，４０，４６９４−４７０３，１９８０）を８ウェルのＣｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＳＡ）にて培養した。培養液を３０倍希釈したＰＶモデルマウス血清あるいはハイブリドーマ培養上清に置換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３０分間培養した。氷上にてＰＢＳで洗浄（３回）後、１００％メタノールを加え−２０℃で２０分間固定した。ＰＢＳで洗浄（３回）後、１００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、室温で３０分反応後ＰＢＳで洗浄（３回）し、蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００、ＮＩＫＯＮ  Ｃｏｒｐ．Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）にて検鏡した。
Ａ−３（ＰＶモデルマウスの作製）
Ｄｓｇ３ノックアウト（−／−）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｎｅ，ＵＳＡ）は１２９／ＳＶ（Ｈ−２ｂ）とＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ−２ｂ）の遺伝子背景を有するマウスを使用した。レシピエントマウスとして用いたＲａｇ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ）２−／−マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＵＳＡ）（Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：ＲＡＧ−２  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋ  ｍａｔｕｒｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｗｉｎｇ  ｔｏ  ｉｎａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｉｔｉａｔｅ  Ｖ（Ｄ）Ｊ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ，６８：８５５−８６７，１９９２．）はＢ６．ＳＪＬ−ｐｔｐｒｃに１０代戻し交配したマウスを使用した。Ｄｓｇ３−／−マウスの免疫は初回、組換えマウスＤｓｇ３−Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｏｕｓｅ）と完全フロイントアジュバントを皮下に注射した。初回免疫より７、１４日後に組換えマウスＤｓｇ３−Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｏｕｓｅ）と不完全フロイントアジュバントを腹腔内に注射した。さらに２１日後とマウス脾細胞移植４日前に組換えマウスＤｓｇ３−Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｏｕｓｅ）単独を腹腔内に注射し免疫した。Ｄｓｇ３−／−マウス脾細胞１×１０７をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）５００μｌ中に懸濁し、Ｒａｇ２−／−マウス尾静脈より静注した。脾細胞移植３０日後に肉眼的な被毛の脱毛と血清学的にレシピエントマウス血清を採取し、マウスＤｓｇ３−Ｈｉｓを抗原としたＥＬＩＳＡ法と  Ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇにて抗マウスＤｓｇ３抗体産生を確認した。
Ａ−４（モノクローナル抗体の作製）
肉眼的な表現型及び抗Ｄｓｇ３抗体を有するＰＶモデルマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞株Ｐ３を１：５に調整し、ポリエチレングリコール４０００を用いて細胞融合を行った。細胞融合終了後、プレート当たり１×１０７の細胞をＨＡＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）培地−１０％ＨＣＦ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ．）中に懸濁し９６ウェル平底プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。３７℃、５％ＣＯ２培養器中で１０〜１４日間培養した。コロニー陽性のウェルより培養上清５０μｌを採取し、マウスＤｓｇ３を用いたＥＬＩＳＡにて１次スクリーニングを実施した。１次スクリーニング陽性のハイブリドーマを、培養マウス角化細胞ＰＡＭ２１２を用いたｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇにて２次スクリーニングを行った。陽性クローンを２４ウェルプレート中でＨＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）培地−５％ＨＣＦにて培養した。最終的に培養液をＲＰＭＩ１６４０培地−１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）にて培養した。それらのハイブリドーマを９６ウェルプレート（Ｃｏａｓｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）にウェル当たり１細胞に調整し、３７℃、５％ＣＯ２培養器中で培養した。１０〜１４日後、コロニー陽性のウェルの培養上清をマウスＤｓｇ３を用いたＥＬＩＳＡとｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇにてスクリーニングし、計３回のクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。アイソタイプはマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｉｓｏ  Ｓｔｏｒｉｐ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。
Ａ−５（間接蛍光抗体法）
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス口蓋粘膜、肝臓及びヒト皮膚をＯＣＴコンパウンド（ＳＡＫＵＲＡ、ＵＳＡ）で包埋後、凍結し５μｍ厚で薄切し基質を作製した。各ハイブリドーマ培養上清を室温で１時間反応後、ＰＢＳで洗浄（３回）し、１００希釈ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を室温にて６０分反応後、ＰＢＳにて洗浄（３回）し、蛍光顕微鏡にて検鏡した。
Ａ−６（免疫沈降法と免疫ブロット法）
各モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上清２００μｌとマウスＤｓｇ３−Ｈｉｓ２０μｇを混合し、振盪しながら室温で１時間反応させた。次にプロテインＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を１０μｌ加え４℃で１晩反応させた。反応後遠心し、沈殿に５０μｌのＳＤＳを加え２分間煮沸した。各サンプルを７．５％電気泳動用均一ゲルプレート（マルチゲル７．５：Ｄａｉｉｓｈｉ  ｐｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて泳動後ＰＶＤＦ膜に転写しブロッキングした。次に１００倍希釈した抗６×ヒスチジン抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を室温で１時間反応させた後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）にて洗浄（３回）し、次いで１０００倍希釈アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を室温で１時間反応させた後ＴＢＳにて洗浄（３回）し、発色させた。
Ａ−７（モノクローナル抗体の精製）
ＲＰＭＩ１６４０培養液中でハイブリドーマを大量培養し、培養上清を以下のごとくプロテインＡカラムにて濃縮精製した。培養上清に３ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を加えて遠心した後、０．４５μｍのフィルターにて濾過した。組換えプロテインＡ５ｍｌ（ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を充填したカラムにて抗体を結合させ、３ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）にてカラムを洗浄し、１ＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０）にて抽出した。抽出後、脱塩カラム  ＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にて緩衝液をＰＢＳに交換し、蛋白濃度はＯＤ２８０（１．４ＯＤ＝１ｍｇ／ｍｌ）で測定した。
Ａ−８（落葉状天疱瘡患者血清の濃縮）
臨床的、病理組織学的に落葉状天疱瘡（ＰＦ：Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｆｏｌｉａｃｅｕｓ）の特徴を有し、血清学的に間接蛍光抗体法及びＥＬＩＳＡ法にてＰＦと診断された１患者血清を選択した。患者血清は４０％飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ：Ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ）にて蛋白を沈殿させ、遠心後沈殿をＰＢＳに溶解し１００倍量のＰＢＳにて緩衝液を交換した（３回）。さらにＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）にて１０倍濃度（２０ｍｇ／ｍｌ）に濃縮した。
Ａ−９（モノクローナル抗体の病原性の確認）
モノクローナル抗体の病原性の確認は、新生仔マウスへの抗体の移入と、Ｒａｇ２−／−免疫不全マウスへのハイブリドーマの接種により行った。まず、モノクローナル抗体と同時に移入したＰＦ患者血清（２０ｍｇ／ｍｌ）は、５μｌ、１０μｌ、２０μｌを単独で移入し、肉眼的、病理組織学的に水疱の形成が認められない量を決定した。同様にＥＴＡ（Ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ）を用いて（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６，１２７５−１２７７，２０００）、それ単独では病変を誘導しない程度の量を決定した。新生仔マウスへの移入は、モノクローナル抗体単独（３０〜３００μｇ／１５０μｌ／ｍｏｕｓｅ）とモノクローナル抗体と病変を誘導しない量のＰＦ患者血清（１ｍｇ／５μｌ／ｍｏｕｓｅ）の同時移入（計１５０μｌ／ｍｏｕｓｅ）と、モノクローナル抗体とそれ単独では病変を誘導しない程度のＥＴＡ（計１５０μｌ／ｍｏｕｓｅ）の３種類の組み合わせで実施した。１５０μｌの注射液を生後２４時間以内のＩＣＲ（Ｓａｎｋｙｏ  ｌａｂｏ  ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、体重１．６〜１．８ｇの新生仔マウスの肩胛骨間にインスリン用シリンジポンプを用いて皮下注射した。注射後１８〜２４時間で断頭し組織を採取した。皮膚と頭部の切片は１０％ＰＢＳ緩衝ホルマリンで病理組織検査用に固定した。病理組織学的には、採取した１匹のマウスあたり作製した病理切片数と切片中の水疱形成数（断端部、連続部）をカウントした。免疫不全マウスを用いた病原性の確認はＲａｇ２−／−マウスを用いて行った。生後４週齢以上のＲａｇ２−／−マウス腹腔内に５００μｌのプリスタン（２，６，１０，１４−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ、Ｗａｋｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を注射し、１週間後に１×１０７以上のハイブリドーマを接種した。接種後７〜１０日で肉眼的な被毛の脱毛、免疫組織学的に直接蛍光抗体法にて口蓋粘膜、足底部皮膚での抗体の沈着、および病理組織学的に口蓋部での水疱形成の有無を検討した。
Ａ−１０（直接蛍光抗体法）
新生仔マウス皮膚、頭部組織切片をＯＣＴコンパウンドにて包埋し、凍結後５ｕｍ厚で薄切片を作製した。１００倍希釈、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を室温にて６０分反応後、ＰＢＳにて洗浄（３回）し、蛍光顕微鏡にて検鏡した。
Ａ−１１（Ｄｓｇ１とＤｓｇ３とのドメインスワップ分子の作製）
モノクローナル抗体のＤｓｇ３分子上におけるエピトープを解析するために、Ｄｓｇ１あるいはＤｓｇ３の細胞外領域を、それぞれ相当するＤｓｇ３あるいはＤｓｇ１領域に置換する方法で、ヒトＤｓｇ３とヒトＤｓｇ１とのドメインスワップ分子を８種類作製した。そのうち、５種類のドメインスワップ分子はＮ末端領域にＤｓｇ３のフラグメントを有するもの（Ｄｓｇ３１−８８／Ｄｓｇ１８９−４９６、Ｄｓｇ３１−６３／Ｄｓｇ１６３−４９６、Ｄｓｇ３１−３４／Ｄｓｇ１３５−４９６、Ｄｓｇ３１−２６／Ｄｓｇ１２６−４９６、Ｄｓｇ３１−１０／Ｄｓｇ１１１−４９６）で、３種類はＮ末端領域にＤｓｇ１のフラグメントを有するもの（Ｄｓｇ１１−８７／Ｄｓｇ３８７−５６６、Ｄｓｇ１１−６４／Ｄｓｇ３６５−５６６、Ｄｓｇ１１−２４／Ｄｓｇ３２５−５６６）である。Ｄｓｇ１及びＤｓｇ３の多様な領域に対するｃＤＮＡを、ｐＥＶｍｏｄ−ＰＶＩｇ（ジェンバンクアクセッション番号Ｍ７６４８２）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，５９，１９９４）及びｐＫＳ−Ｄｓｇ１（ジェンバンクアクセッション番号Ｘ５６６５４）をそれぞれ鋳型として使用し、表１記載のプライマー（配列番号７〜２８に示される塩基配列をそれぞれ有するプライマー１〜２２）を用いてＰＣＲにより増幅した。天疱瘡自己抗体エピトープを小さくするため、Ｃ末端にＨｉｓタグを含む８種類のドメインスワップキメラ構造物をそれぞれ構築した（図４）。
残基１−８７、１−６４／１−２４、８９−４９６／６３−４９６／２６−４９６／３５−４９６、１１−４９６からなるＤｓｇ１断片のＰＣＲ産物をそれぞれＢｇｌＩＩ／ＡａｔＩＩ、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｅＩ、ＡａｔＩＩ／ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ／ＳａｌＩ、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで分解した。残基１−８８、１−６３／１−１０、１−３４／１−２６、８７−５６６／６５−５６６／２５−５６６からなるＤｓｇ３断片のＰＣＲ産物をそれぞれＢｇｌＩＩ／ＡａｔＩＩ、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｅＩ、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ、ＡａｔＩＩ／ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ／ＸｈｏＩで分解した。その結果得られた産物をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで分解し、発現ベクターｐＥＶｍｏｄ−Ｈｉｓ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，２０１０，１９９７）に結紮した（Ｄｓｇ３１−８８／Ｄｓｇ１８９−４９６、Ｄｓｇ３１−６３／Ｄｓｇ１６３−４９６、Ｄｓｇ３１−２６／Ｄｓｇ１２６−４９６、Ｄｓｇ１１−８７／Ｄｓｇ３８７−５６６、Ｄｓｇ１１−６４／Ｄｓｇ３６５−５６６、Ｄｓｇ１１−２４／Ｄｓｇ３２５−５６６）。また、得られた産物を発現ベクターｐＱＥ  ｖｅｃｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結紮した（Ｄｓｇ３１−３４／Ｄｓｇ１３５−４９６、Ｄｓｇ３１−１０／Ｄｓｇ１１１−４９６）。これら発現ベクターに導入されたはドメインスワップキメラ構造物をバキュロウィルス発現系にて分泌型蛋白として発現させ、ドメインスワップ分子を作製した。
2003020769.tif 000002
Ａ−１２（点変異分子の作製）
また、ＡＫ２３のエピトープを更に詳細に解析するためにＤｓｇ３とＤｓｇ１のアミノ酸末端１？８７領域におけるアミノ酸を置換した点変異分子を１４種類作製した。そのうち１０種類の点変異分子はＤｓｇ３分子中のＤｓｇ３特異的なアミノ酸をＤｓｇ１特異的なアミノ酸に置換したもの（Ｄｓｇ３−Ｍ１、Ｄｓｇ３−Ｍ２、Ｄｓｇ３−Ｍ３、Ｄｓｇ３−Ｍ４、Ｄｓｇ３−Ｍ５、Ｄｓｇ３−Ｍ６、Ｄｓｇ３−Ｍ７、Ｄｓｇ３−Ｍ８、Ｄｓｇ３−Ｍ１−２、Ｄｓｇ３−Ｍ１−２−３）で、４種類はＤｓｇ１分子中のＤｓｇ１特異的なアミノ酸をＤｓｇ３特異的なアミノ酸に置換したもの（Ｄｓｇ１−Ｍ１−２、Ｄｓｇ１−Ｍ１−２−３、Ｄｓｇ１−Ｍ７、Ｄｓｇ１−Ｍ７−８）である（図５）。また、点変異を導入するため、上記Ｄｓｇ３−Ｍ１〜Ｍ６の６種類については、ユニーク制限サイト除去法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００，８１，１９９２）及びＰＣＲに基づくメガプライマー法（Ｂａｒｉｋ，Ｓ．Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｉｎ  ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．１５，Ｂ．Ａ，Ｗｈｉｔｅ，ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ｐ２７７，１９９３）にしたがって、位置指定変異処理を行った。また、残りの８種類については、ツーステップＰＣＲ法（Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７，５３９−５４２，１９９６）により位置指定変異処理を行った。
これらの処理のために、表２に示される２６個の変異プライマー（配列番号２９〜５４に示される塩基配列をそれぞれ有するプライマー２３〜４８を作製した。Ｄｓｇ３−Ｍ１〜Ｍ６の６種類については、変異原プライマー（５’−ＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧ−３’；配列番号５５及びＤｓｇ３の細胞外ドメインをコードするプラスミド鋳型（ｐＥＶｍｏｄ−Ｄｓｇ３−Ｈｉｓ）を用いて、変異を内包したメガプライマーを初回のＰＣＲで作製した。この処理により、ａｍｐｒ遺伝子中のユニークなＳｃａＩ制限サイト（ＡＡＴＡＣＴ）を除去した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００，８１，１９９２）。２回目のＰＣＲで、全プラスミドを増幅するためにかかるメガプライマーを同一のプラスミド鋳型とともに用いた。ＤｐｎＩ分解後、かかるＰＣＲ産物を変換に用いた。すべての変異体を配列決定にかけ、変異の存在を確認するとともに他の変異が導入されていないことを確かめた。上記各ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで分解し、発現ベクターｐＥＶｍｏｄ−Ｈｉｓに結紮した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，２０１０，１９９７）。また、残りの８種類については、Ｄｓｇ１断片のＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで分解し、Ｄｓｇ３断片のＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩで分解し、発現ベクターｐＱＥ  ｖｅｃｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結紮した。これら発現ベクターに導入された点変異ＤＮＡ構造物をバキュロウィルス発現系にて分泌型蛋白として発現させ、点変異分子を作製した。
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実施例Ｂ（結果）
Ｂ−１（モノクローナル抗体の反応性）
進行中の病気を抱えているＰＶモデルマウスは、ケラチノサイトの細胞間接着の欠失を誘導でき、結果として疱疹をもたらす循環抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体を有している。本発明者らは、このＰＶモデルマウスを、抗Ｄｓｇ３ＩｇＧモノクローナル抗体を開発するための供給源として使用した。本発明者らは、これらのマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞を作製した。まずこれらハイブリドーマ細胞について、バキュロウィルス発現系により得られた組換え型Ｄｓｇ３を用いてＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行い、陽性のクローンについて、マウスのケラチノサイトＰＡＭ２１２細胞（図１ａ、ｂ、ｃ）を用いた生存ケラチノサイト染色により、さらにスクリーニングを行った。二度目のスクリーニングで、ケラチノサイト細胞表面の未変性（ｎａｔｉｖｅ）Ｄｓｇ３にインビボで結合可能な抗体を選別し、８個の別個のクローンを単離した（表３）。これらのモノクローナル抗体のアイソタイプはすべてＨ鎖についてはＩｇＧ１であり、Ｌ鎖についてはκであった。
モノクローナル抗体の抗原特異性の検討は、組換えＤｓｇ蛋白を抗原として用いたＥＬＩＳＡ法と、マウス各臓器を基質として用いた間接蛍光抗体法及び培養マウス角化細胞ＰＡＭ２１２を用いたＬｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇにて行った。間接免疫蛍光法により、これらの抗体はすべて、硬口蓋や皮膚といった重層扁平上皮細胞表面には反応したが、肝臓や腸といった単層上皮には反応しなかった。また、これらモノクローナル抗体の染色パターンは、ＰＶモデルマウスの血清又はＰＶ患者の血清の染色パターンと区別できなかった。いくつかのモノクローナル抗体（ＡＫ１、１５、１８、１９、２０及び２３）は、ヒト皮膚又は粘膜と交差反応した。これらの抗体は、ＤｓＧ３が発現するヒト上皮の下層及び粘膜の全層を染色した（図１ｄ、ｅ、ｆ）。ＥＬＩＳＡにより、マウスＤｓｇ１と交差反応したＡＫ１を除いたすべての抗体が、マウスＤｓｇ３の組換え型細胞外ドメインとのみ反応した。免疫蛍光法でヒト組織に交差反応性を示したものも、ＥＬＩＳＡによって組換え型ヒトＤｓｇ３と反応した。上記表３にはＩｇＧ１κであった８クローンについての特徴が示されている。表３中、ＩＩＦ（間接蛍光抗体法）とＥＬＩＳＡにおける（＋）は陽性を、（−）は陰性をそれぞれ示し、Ｃａ依存性は、マウスＤｓｇ３に対するモノクローナル抗体の反応性をＥＤＴＡ処理又は未処理で行い、ＥＤＴＡにより反応性が欠失したものを（＋）で表し、また、エピトープについては、ＡＫ７、ＡＫ９、ＡＫ１５、ＡＫ１８及びＡＫ２０のエピトープはマウスＤｓｇ３のアミノ酸残基により示され、ＡＫ１９及びＡＫ２０はヒトＤｓｇ３のアミノ酸残基により示されている。
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表３からわかるように、マウス、ヒトの基質を用いた間接蛍光抗体法では、すべてのクローンはＤｓｇ３に特異的で、ＡＫ７とＡＫ９はマウスＤｓｇ３に特異的であった。各種の組み換えＤｓｇ蛋白を抗原として用いた上記ＥＬＩＳＡ法による検討では、ＡＫ１は、すべてのＤｓｇ（ヒトとマウスのＤｓｇ３及びＤｓｇ１）に反応が認められた。また、ＡＫ７及びＡＫ９は、マウスＤｓｇ３にのみ反応が認められた。ＡＫ１５、ＡＫ１８、ＡＫ１９、ＡＫ２０及びＡＫ２３は、マウスとヒトのＤｓｇ３に交叉反応性を有するクローンであった。その中のＡＫ２０は、ヒトＤｓｇ３に対する反応性は低かったが、ＡＫ２３はヒトＤｓｇ３に対する反応性は非常に高かった。培養マウス角化細胞（ケラチノサイト）を用いたｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇではすべてのクローンがインビボでＤｓｇ３に反応性を有するクローンであった。また、ＡＫ１９及びＡＫ２３のみがカルシウム感受性を有するクローンであった。新生マウスを用いた病原性の確認ではＡＫ１９とＡＫ２３で水疱の形成が確認された。ハイブリドーマのＲａｇ２−／−マウスでの腹水形成による病原性の確認では、ＡＫ２３のみで水疱の形成が確認された。以上の結果より、作製されたモノクローナル抗体の認識するエピトープは単一ではないことが示された。
Ｂ−２（新生マウスにおけるモノクローナル抗体の病原性）
新生仔マウスへのモノクローナル抗体の移入による病原性の確認は、全てのモノクローナル抗体を用いて行った。まず、各モノクローナル抗体を単独で移入した新生仔マウスの皮膚における肉眼的な水疱形成と顕微鏡的な微小水疱形成をヘマトキシリン・エオジン染色標本にて観察した。その結果すべのモノクローナル抗体において肉眼的な水疱形成は認められなかった。次に、顕微鏡的な微小水疱の形成を検討した。検討項目として１検体中の組織切片数と切片中における断端部と連続部（両断端部を結ぶ連続部位）に認められた基底層直上の水疱形成数をカウントした。その結果ＡＫ２３を移入したマウスでは総切片数１５に対して微小水疱形成数は、断端部６、連続部４、総数１０であった。ＡＫ１９を移入したマウスでは総切片数３７に対して微小水疱形成数は、断端部６、連続部７、総数１３であった。ＡＫ２０などその他のモノクローナル抗体を移入したマウスは総切片数１８に対して微小水疱形成は、断片部、連続部ともに認められなかった。ＡＫ１９、ＡＫ２０及びＡＫ２３を用いた場合の結果を表４に示す。
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上記の所見より、もっとも病原性が強いと思われるＡＫ２３及びＡＫ１９を中心にさらに受動伝達アッセイを行った（図２）。新生仔マウスへのＡＫ１９（図２ａ）及びＡＫ２３（図２ｂ）の単独移入では肉眼的に明らかな水疱の形成は認められなかったが、顕微鏡下、病理組織学的にはヘマトキシリンエオジン染色でＰＶに特徴的な基底層直上の微小水疱がＡＫ１９（図２ｃ）及びＡＫ２３（図２ｄ）共に認められた。肉眼的水疱形成が認められない理由として、皮膚においてはＤｓｇ１が共発現しているためにＡＫ２３やＡＫ１９によるＤｓｇ３の接着機能障害をＤｓｇ１の接着機能が代償しているためと考え、それ自身では明かな水疱形成を誘導しない微量の抗Ｄｓｇ１抗体（ＰＦ患者血清）を同時に注射したところ、新生仔マウスに広範囲な肉眼的水疱形成がＡＫ１９（図２ｅ）及びＡＫ２３（図２ｆ）共に認められ、病理組織学的にもＰＶに特徴的な基底層直上での水疱形成が認められた。さらに、黄色ブドウ球菌が産生するＥＴＡがＤｓｇ１を特異的に分解する事実を利用し、それ自身では明かな水疱形成を誘導しない微量のＥＴＡを同時に注射したところ、肉眼的に広範囲な水疱をＡＫ１９（図２ｇ）及びＡＫ２３（図２ｈ）共に形成し、病理組織学的にもＰＶに特徴的な基底層直上の水疱形成を認めた。免疫組織学的には直接蛍光抗体法ですべての組み合わせにおいて基底層直上の表皮角化細胞表面への抗体の沈着が認められた。
Ｂ−３（免疫不全マウスへのハイブリドーマの移植）
新生マウス皮膚を用いた実験では、前述したように、マウス皮膚にＤｓｇ１が共発現しており、そのＤｓｇ１の接着機能を特異的に障害するためにＰＦ患者血清やＥＴＡを同時に移入して病原性を確認する必要性があった。そこで、モノクローナル抗体単独使用による病原性を確認するために、８クローンのハイブリドーマを免疫不全マウスの腹腔にそれぞれ接種した後に腹水化させ、その表現型の変化を観察した。抗体が病原性を有すれば口腔粘膜などで水疱が形成されると考えられた（図３）。その結果、ＡＫ２３産生性ハイブリドーマを接種したＲａｇ２−／−マウスでは、口の回り（図３ａ）、目の回り（図３ｂ）及び背中（図３ｃ）に被毛の脱毛が認められ、７日目から９日目に、目視可能な腹水症の発生が観察される前に急死した。ＡＫ１９産生性ハイブリドーマを接種したＲａｇ２−／−マウスでは、明らかに腹水が形成（図３ｄ）されているにもかかわらず、被毛の脱毛のような表現型は観察されなかった。直接蛍光抗体法では、硬口蓋粘膜のＤｓｇ３の分布に一致した部位の角化細胞表面へのＩｇＧの沈着がＡＫ２３（図３ｅ）及びＡＫ１９（図３ｆ）共に認められたが、病理組織学的なケラチノサイト細胞間の接着性の減少はＡＫ２３産生性ハイブリドーマを接種したＲａｇ２−／−マウス（図３ｇ；硬口蓋、ｈ；皮膚、テロゲン毛クラブ）でのみ観察された。以上の肉眼的、病理組織学的な変化はＤｓｇ３−／−マウスと同様の所見であった。しかし、ＡＫ２０、ＡＫ１９をはじめとして、ＡＫ２３以外のモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマを腹腔内に接種したマウスでは、免疫組織学的には足底部皮膚、硬口蓋粘膜にＡＫ２３と同様のＩｇＧの沈着が認められた。ところが、十分な腹水の貯留が認められたのにもかかわらず、肉眼的に被毛の脱毛、体重減少、病理組織学的に基底層直上の水疱形成は認められなかった（表５）。以上の結果よりＡＫ２３は単独で天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有する抗体であることが確認された。
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ＡＫ２３等のモノクローナル抗体（ＡＫ）の病原活性を、受動伝達及び腹水形成の観点からさらに生後４週齢以上の成体マウスについても検討した。その解析結果のまとめを表６に示す。モノクローナル抗体を単独、モノクローナル抗体とＰＦＩｇＧとの組合せ（ＡＫ＋ＰＦＩｇＧ）又はモノクローナル抗体とＥＴＡとの組合せ（ＡＫ＋ＥＴＡ）を成体マウスに注入し、１８〜２４時間後に肉眼的及び微小水泡が形成されているか観察を行った結果、肉眼的水泡が認められた成体マウスにはＰＶの典型的な組織学上の所見が認められた。また、生後４週齢以上のＲａｇ２−／−マウス腹腔内にハイブリドーマを接種したところ、ＡＫ２３産生ハイブリドーマ接種群では接種後７〜１０日で肉眼的な被毛の脱毛と腹水の形成が認められた。ＡＫ１５、ＡＫ１９及びＡＫ２０でのマウスの抗体価は、ＡＫ２３でのマウスの抗体価の４倍以上であり、水疱形成誘導能が低い理由が不充分な抗体産生量によるという可能性が否定された。以上のことから、ＡＫ１、ＡＫ７、ＡＫ９、ＡＫ１５、ＡＫ１８、ＡＫ１９及びＡＫ２０は、成体マウスにおけるケラチノサイトの細胞間接着の欠損を誘導し、腹水を形成する能力がないことを示している。ＡＫ２３は、受動伝達及び腹水形成の２つの分析において、典型的なＰＶ表現型で水疱形成を生起したが、ＡＫ１９は、受動伝達分析においてのみ、ＰＶ水疱形成を生起したに過ぎなかった。その他のモノクローナル抗体は、いずれの分析においても病原性を示さなかった。
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Ｂ−４（免疫沈降法によるモノクローナル抗体の抗原特異性の検討）
モノクローナル抗体の認識するＤｓｇ３上のエピトープを解析するために、バキュロウィルス発現系により得られた、Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ１の細胞外領域全長を含む分子及びドメインスワップ分子（Ｄｓｇ３のアミノ酸残基２５？５６６、６５？５６６，８７？５６６，１？８８、１？６３、１？３４、１？２６，１？１０とその欠失領域をＤｓｇ１で置換した８種類のドメインスワッピング分子、Ｄｓｇ１１−２４／Ｄｓｇ３２５−５６６、Ｄｓｇ１１−６４／Ｄｓｇ３６５−５６６、Ｄｓｇ１１−８７／Ｄｓｇ３８５−５６６、Ｄｓｇ３１−８８／Ｄｓｇ１８９−４９６、Ｄｓｇ３１−６３／Ｄｓｇ１６３−４９６、Ｄｓｇ３１−３４／Ｄｓｇ１３５−４９６、Ｄｓｇ３１−２６／Ｄｓｇ１２６−４９６、Ｄｓｇ３１−１０／Ｄｓｇ１１１−４９６）を作製し、免疫沈降法による検討を行った。結果を図４に示す。図４には、Ｄｓｇ３及びＤｓｇ１の全細胞外領域（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ；ＥＣ１−ＥＣ５）を有するＤｓｇ３−Ｈｉｓ及びＤｓｇ１−Ｈｉｓの模式図が示され、Ｃ末端領域のＨｉｓ−ｔａｇはＮｉ−ＮＴＡカラムを用いた蛋白の精製のために用いられたものである。
図４からわかるように、ＡＫ２３、ＡＫ２０、ＡＫ１９のいずれもＤｓｇ３の全細胞外領域を有するＤｓｇ３−Ｈｉｓに対しては反応性が認められたが、Ｄｓｇ１の全細胞外領域を有するＤｓｇ１−Ｈｉｓに対する反応は認められなかった。この結果より上記モノクローナル抗体ＡＫ２３、ＡＫ２０、ＡＫ１９はＤｓｇ３を特異的に認識する抗体であることが確認された。また、ＡＫ２３はＤｓｇ３１−８８／Ｄｓｇ１８９−４９６及びＤｓｇ３１−６３／Ｄｓｇ１６３−４９６分子のみに反応性を有し、ＡＫ２３の認識するエピトープはＤｓｇ３の細胞外領域のＮ末端より１〜６３アミノ酸領域に存在し、ＡＫ２０とＡＫ１９の認識するエピトープはＤｓｇ３の細胞外領域のＮ末端より８７〜５６６アミノ酸領域、すなわちＤｓｇ３アミノ酸残基８７よりもＣ末端側に存在することが確認された。
デスモゾームカドヘリンであるＤｓｇ３とＤｓｇ１は、そのアミノ酸配列の相同性が高いことが知られている。図６には、Ｄｓｇ３とＤｓｇ１のＥＣ１領域におけるアミノ酸配列が、左側をＮ末端、右側をＣ末端として、比較して示されている。上記ＡＫ２３のエピトープを更に詳細に検討するために、Ｄｓｇ３とＤｓｇ１の細胞外領域のアミノ酸１？８７におけるＤｓｇ１、Ｄｓｇ３特異的なアミノ酸のみを点変異導入した点変異分子を用いて免疫沈降法を行った。結果を図５に示す。図５からわかるように、ＡＫ２３はＤｓｇ３特異的なアミノ酸２５−５６領域及び７０−８４領域をＤｓｇ１特異的なアミノ酸に置換した点変異Ｄｓｇ３分子（Ｄｓｇ３−Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ１−２、Ｍ１−２−３）との反応性を保持し、また、Ｄｓｇ１特異的なアミノ酸２５？５６領域をＤｓｇ３特異的なアミノ酸に置換した点変異分子（Ｄｓｇ１−Ｍ１−２、Ｍ１−２−３）との反応性を失った。これらの結果よりＡＫ２３のエピトープはＤｓｇ３のアミノ酸１−８７領域中の２５−５６以外の領域に存在すると考えられた。
そこで、Ｄｓｇ３のＮ末端の領域に注目し、アミノ酸、Ｖ３、Ｋ７、Ｐ８のみをＤｓｇ１特異的なアミノ酸に置換した点変異分子Ｄｓｇ３−Ｍ７を用いたところ、その反応性が消失した。また、Ｄｓｇ１特異的なＩ３、Ａ７、Ａ８をＤｓｇ３特異的なアミノ酸配列に置換したＤｓｇ１−Ｍ７においては、ＡＫ２３は反応性を獲得することはなかった。これらの結果から、Ｄｓｇ３のアミノ酸Ｖ３、Ｋ７、Ｐ８はＡＫ２３のエピトープに必要ではあるが充分ではないものと考えられた。そこでさらに、Ｄｓｇ１−Ｍ７にＤｓｇ３特異的なアミノ酸Ｄ５９を加えたＤｓｇ１−Ｍ７−８を作製したところ、ＡＫ２３は反応性を獲得した。以上の結果からＡＫ２３の主要なエピトープはＤｓｇ３分子上のアミノ酸Ｖ３、Ｋ７、Ｐ８の少なくとも１つと、Ｄ５９にて構成されているものと考えられた。なお、Ｄｓｇ３特異的なアミノ酸Ｄ５９をＤｓｇ１特異的なアミノ酸Ｅ５９に変えたＤｓｇ３−Ｍ８を用いたところ、その反応性が維持されていた。このことは、Ｄｓｇ３特異的なアミノ酸Ｄ５９は、Ｄｓｇ３分子上のアミノ酸Ｖ３、Ｋ７、Ｐ８の少なくとも１つに依存的に反応性を消失するものと考えられる。
ＡＫ２３等のモノクローナル抗体のエピトープを特徴づけるため、まず、かかる抗体のＤｓｇ３への結合がカルシウム依存性であるかを調べてみた。組換えマウスＤｓｇ３−Ｈｉｓを、ＥＤＴＡを使用又は使用せずに処理し、ＡＫ抗体と共に免疫沈降を行なった。ＥＤＴＡ処理により、ＡＫ１９及びＡＫ２３抗体の反応性はなくなったが、他のＡＫ抗体については反応がなくならなかった（表３、図７ａ）。マウスＤｓｇでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートをＥＤＴＡで処理したところ、同様に、ＡＫ１９及びＡＫ２３は結合しなくなり、他のＡＫ抗体の結合には著しい影響は見られなかった。従って、ＡＫ１９及びＡＫ２３はカルシウム依存性のエピトープを認識し、他のＡＫ抗体はカルシウム非依存性のエピトープを認識すると言える。次に、前述したＡＫ２３、ＡＫ１９等のＤｓｇ３に対する反応性を免疫ブロット法にて検討した。その結果、ＡＫ１９等は分子量の異なる２種類の蛋白に対する反応が認められた。これに対してＡＫ２３ではＡＫ１９等で認められた分子量が小さい蛋白と同様の１本のバンドのみが認められた（図７ｂ）。バキュロウィルス発現型により得られた組み換えＤｓｇ３蛋白はその培養上清中にプロ配列を有する不活性型のＤｓｇ３蛋白とプロ配列が切断された活性型のＤｓｇ３蛋白が存在する。ＡＫ１９のみが認識した分子量が大きい蛋白はプロ配列を有する、不活性型のＤｓｇ３蛋白と思われる。これと比較してＡＫ２３は分子量が小さい蛋白分子のみを認識した。これらの所見はＡＫ２３が、プロ配列が除去されたいわゆる活性型のＤｓｇ３蛋白のみを認識していることを示している。プロ配列は蛋白合成過程において分子同士が接着して凝集するのを防ぐために存在していることを考えると、ＡＫ２３は、Ｄｓｇ３の接着機能上重要な部位を認識していることが考えられ、前述のエピトープマップの結果と合致するものである。
最近、カドヘリン（Ｃ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の全細胞外領域の３次元構造が、結晶解析により明らかにされた（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，１３０８−１３１３，２００２）。カドヘリン分子はＮ末端のＥＣ１の領域で接着し合い、その接着面を構成するアミノ酸配列が明らかにされた。その報告においてＣ−ｃａｄｈｅｒｉｎの接着面は、そのＮ末端領域のアミノ酸１−８、２０、２３−２７、５９より構成されていることが確認された。これらの情報を今回ＡＫ２３のエピトープの結果と考え合わせると、Ｖ３、Ｋ７、Ｐ８、Ｄ５９は、結果的にそのＣ−ｃａｄｈｅｒｉｎの接着面を構成するアミノ酸１？８、５９（図５の斜線ボックス参照）上に存在することがわかった。これらのことは、ＡＫ２３がＤｓｇ３分子機能上最も重要なカドヘリン接着面に結合し、その細胞間接着機能を直接障害することにより水疱を形成することを裏付けている。
かかる強い病原性を有するモノクローナル抗体ＡＫ２３の可変領域（重鎖、軽鎖）の塩基配列を常法により決定した。ＡＫ２３の可変領域（重鎖、軽鎖）の塩基配列及びそのアミノ酸配列を図８に示す。
産業上の利用可能性
本発明によると、尋常性天疱瘡の分子レベルでの発症機序の解明、抗原特異的な抗体除去療法の開発に有用であると考えられる天疱瘡病変を誘導することが可能な病的活性を有するモノクローナル抗体や、該モノクローナル抗体が特異的に認識する天疱瘡自己免疫疾患治療薬として有用であると考えられるペプチド等を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体の間接蛍光抗体法とＬｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇの結果を示す写真である。
第２は、本発明の抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体を新生仔マウスへ単独移入したときの結果を示す写真である。
第３図は、本発明の抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体ＡＫ２３産生性のハイブリドーマを免疫不全マウスへ接種したときの結果を示す写真である。
第４図は、Ｄｓｇドメインスワップ分子の構造と、このスワップ分子と本発明の抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体との反応性を免疫沈降法により調べた結果を示す図である。
第５図は、Ｄｓｇ点変異分子の構造と、この点変異分子と本発明の抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体との反応性を免疫沈降法により調べた結果を示す図である。
第６図は、Ｄｓｇ３とＤｓｇ１のＥＣ１領域におけるアミノ酸配列の比較を示す図である。
第７図は、免疫沈降法による、本発明の抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体と抗原Ｄｓｇ３との反応結果を示す写真である。
第８図は、本発明の抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体ＡＫ２３の可変領域（重鎖・軽鎖）の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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