(57)【要約】本発明は、生理活性蛋白質の生理活性を保持させた状態で噴霧乾燥し、高い効率でこれを生体分解性高分子物質中に封入せしめ、かつ初期放出の抑制と長期にわたる持続的な放出性を達成した徐放性注射用組成物の提供に関する。また本発明は、生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内分解性高分子物質のマトリックス中に、粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める生理活性蛋白質と糖類とからなる噴霧乾燥微粉末が、均一に分散された生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項２】
粒子径６μｍ以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、５０％以上とした請求項１記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項３】
糖類がマンニトールおよび／またはシクロデキストリン類である請求項２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項４】
シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである請求項３に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項５】
生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である請求項４に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項６】
生理活性蛋白質がインターフェロン類である請求項５記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項７】
インターフェロン類がインターフェロン−α−Ｃｏｎ１である請求項６記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項８】
組成物がマイクロスフェアーである請求項７に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項９】
マイクロスフェアーの平均粒子径を約２０−約２５０μｍとした請求項８に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１０】
糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約０．０１−約８０％（ｗ／ｗ）である請求項９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１１】
生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が約０．０１−約２０％（ｗ／ｗ）である請求項９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１２】
生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１３】
粒子径６μｍ以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、５０％以上とした請求項１２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１４】
糖類がマンニトールおよび／またはシクロデキストリン類である請求項１３に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１５】
シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである請求項１４に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１６】
生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である請求項１５に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１７】
生理活性蛋白質がインターフェロン類である請求項１６記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１８】
インターフェロン類がインターフェロン−α−Ｃｏｎ１である請求項１７記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項１９】
油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である請求項１８に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項２０】
油類がシリコン油である請求項１９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項２１】
組成物がマイクロスフェアーである請求項２０に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項２２】
マイクロスフェアーの平均粒子径を約２０−約２５０μｍとした請求項２１に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項２３】
糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約０．０１−約８０％（ｗ／ｗ）である請求項９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項２４】
生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が１０％（ｗ／ｗ）以下である請求項２２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
【請求項２５】
生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項２６】
粒子径６μｍ以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、５０％以上とした請求項２５に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項２７】
糖類がマンニトールおよび／またはシクロデキストリン類である請求項２６に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項２８】
シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである請求項２７に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項２９】
生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である請求項２８に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３０】
生理活性蛋白質がインターフェロン類である請求項２９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３１】
インターフェロン類がインターフェロン−α−Ｃｏｎ１である請求項３０記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３２】
油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である請求項３１に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３３】
油類がシリコン油である請求項３２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３４】
組成物がマイクロスフェアーである請求項３３に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３５】
マイクロスフェアーの平均粒子径を約２０−約２５０μｍとした請求項３４に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３６】
生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が１０％（ｗ／ｗ）以下である請求項３５に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【請求項３７】
糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約０．０１−約８０％（ｗ／ｗ）である請求項９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生理活性蛋白質を生体内分解性高分子物質に封入させた徐放性注射剤用組成物およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、生体内分解性高分子物質のマトリックス中に、生理活性蛋白質と糖類とからなる粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める噴霧乾燥微粉末が、均一に分散された生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物に関する。
背景技術
生理活性蛋白質のヒトへの投与は、幅広く行われているが、一般的に蛋白質は経口吸収性が低く、生体内での消失も速やかであるために、注射剤として頻回投与されているのが現状である。このような状況下生体内分解性高分子物質中に生理活性蛋白質を封入してマイクロスフェアーとする徐放化技術は、頻回投与の回避および治療効果の増強という観点から強く望まれている。また蛋白質は、熱、溶媒等により変性を受けることから、製造面での取扱いの困難さが指摘され、その回避方法が望まれている。しかし生理活性蛋白質を安定的に、かつ高い封入率でマイクロスフェアー中に封入し、さらに溶出試験開始後初期の急激な生理活性蛋白質の放出（以下初期バーストという）をおこさず、生産性、実施可能性を備えた徐放性マイクロスフェアーの技術は、これまでになかった。
生理活性蛋白質の生理活性を低下させないために、塩化メチレン等の有機溶媒による変性を回避する目的で、水溶性である蛋白質を粉末化して活性を保持しようとする試みが行われている。例えば特開平１１−３２２６３１号公報には、生理活性ポリペプチド水溶液に水混和性の有機溶媒及び／又はアンモニウム塩等の揮発性の塩類を添加し、凍結乾燥することでポリペプチドを粉末化し、ポリペプチドの製剤中への安定的な封入を達成し、その封入率、徐放性を改善した生理活性ポリペプチドの徐放性製剤が開示されている。さらに特開平１１−３０２１５６号公報には、ポリペプチドおよびポリエチレングリコールの混合水溶液を凍結乾燥し、ポリペプチドは溶解しえないが、ポリエチレングリコールと生体内分解性高分子物質が溶解する溶媒を用いることで、回収率が高く、変性を伴なわずに高純度のポリペプチド微粒子を調製し、その微粒子をマイクロスフェアー中に封入することが開示されている。これらの技術は、マイクロスフェアー調製の前段階での、ポリペプチドの微粒子化のための凍結乾燥技術に関するもので、噴霧乾燥の技術に関するものではない。
マイクロスフェアー調製の前段階で噴霧乾燥を用いた技術としては、特開平４−３６２３３号公報に開示されたものがある。当該技術は、ポリペプチドとゼラチン等の水溶性高分子との混合水溶液を噴霧乾燥、微小球化し、さらに生体内分解性高分子溶液で被覆することで、薬物の取り込み率を高め、初期バーストを抑制し、長期間の徐放性を達成した方法に関するものである。しかしながら、この方法においては、用いる水溶性高分子に依存して噴霧乾燥時の温度が高温になる場合があり、ポリペプチドの失活を招きかねないことが懸念される。
これまでマイクロスフェアー調製の前段階、その後の調製段階において、生理活性の保持と同時に初期放出制御、生理活性蛋白質の高い封入率、さらには長期にわたる持続的な放出性、生産性、実施可能性すべての点において充分な効果を示す技術は知られておらず、これらすべてを満足させるために更なる改善の余地が残されている。
したがって本発明の目的は、生理活性蛋白質の生理活性を保持した状態で噴霧乾燥により微粉末化し、高い封入率で生体内分解性高分子物質に内包させ、且つその際にも生理活性蛋白質の生理活性を保持し、更には初期放出の抑制と長期にわたる持続的な放出性を達成した生産性の高い、実施可能性を有した生理活性蛋白質含有徐放性注射製剤を提供することにある。
発明の開示
このような状況下、本発明者らは生理活性蛋白質の噴霧乾燥による微粉末化を種々検討したところ、糖類、特にマンニトールまたは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを担体として用いると生理活性蛋白質の変性をさせることなく、噴霧乾燥が可能であり、良好な粒子径を持つ微粉末が得られること、さらに得られた生理活性蛋白質の微粉末を、生体内分解性高分子物質からなる徐放基剤に油類中で内包させる方法を採用した際には、その生理活性は全く失われず、高い封入率、初期放出の抑制および長期にわたる持続的な薬物放出が達成されることを見出し本発明を完成するに至った。
本発明によれば、糖類を用いることで乾燥温度を高温とすることなく噴霧乾燥が可能となり、熱による生理活性蛋白質の変性や失活を回避し、粒子径を制御した蛋白質微粉末を調製することが極めて容易となる。また、生理活性を保持し、粒子径が充分に制御された蛋白質微粉末を用いることで、マイクロスフェアーに内包の生理活性蛋白質の生理活性を保持し、またマイクロスフェアーへの高い封入率、初期放出の抑制を達成することが可能となる。
すなわち本発明は、
１．生体内分解性高分子物質のマトリックス中に、粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める生理活性蛋白質と糖類とからなる噴霧乾燥微粉末が、均一に分散された生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
２．粒子径６μｍ以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、５０％以上とした上記１に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
３．糖類がマンニトールおよび／またはシクロデキストリン類である上記２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
４．シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである上記３に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
５．生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である上記４に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
６．生理活性蛋白質がインターフェロン類である上記５に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
７．インターフェロン類がインターフェロン−α−Ｃｏｎ１である上記６に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
８．組成物がマイクロスフェアーである上記７に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
９．マイクロスフェアーの平均粒子径を約２０−約２５０μｍとした上記８に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１０．糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約０．０１−約８０％（ｗ／ｗ）である上記９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１１．生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が約０．０１−約２０％（ｗ／ｗ）である上記９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１２．生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１３．粒子径６μｍ以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、５０％以上とした上記１２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１４．糖類がマンニトールおよび／またはシクロデキストリン類である上記１３に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１５．シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである上記１４に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１６．生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である上記１５に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１７．生理活性蛋白質がインターフェロン類である上記１６記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１８．インターフェロン類がインターフェロン−α−Ｃｏｎ１である上記１７記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
１９．油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である上記１８に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
２０．油類がシリコン油である上記１９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
２１．組成物がマイクロスフェアーである上記２０に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
２２．マイクロスフェアーの平均粒子径を約２０−約２５０μｍとした上記２１に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
２３．糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約０．０１−約８０％（ｗ／ｗ）である上記９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
２４．生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が１０％（ｗ／ｗ）以下である上記２２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
２５．生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径１０μｍ以下の粒子が９０％以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
２６．粒子径６μｍ以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、５０％以上とした上記２５に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
２７．糖類がマンニトールおよび／またはシクロデキストリン類である上記２６に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
２８．シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである上記２７に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
２９．生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である上記２８に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
３０．生理活性蛋白質がインターフェロン類である上記２９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
３１．インターフェロン類がインターフェロン−α−Ｃｏｎ１である上記３０記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
３２．油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である上記３１に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
３３．油類がシリコン油である上記３２に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
３４．組成物がマイクロスフェアーである上記３３に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
３５．マイクロスフェアーの平均粒子径を約２０−約２５０μｍとした上記３４に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
３６．生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が１０％（ｗ／ｗ）以下である上記３５に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
３７．糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約０．０１−約８０％（ｗ／ｗ）である上記９に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
に関する。
本発明でいう「マトリックス」とは、生体内分解性高分子の網目構造を示す。また「均一に分散された」とは生体内分解性高分子の網目構造中に生理活性蛋白質と糖類とからなる噴霧乾燥粉末が充分に分散されている状態を意味し、本発明組成物の放出を後述する放出試験法にて測定し、初期バーストを起こさない時、生理活性蛋白質が「均一に分散された」ことを間接的に知ることができる。
また本発明における「噴霧乾燥微粉末の粒子径」測定の意義は、生体内分解性高分子物質への内包が容易となり、初期放出の抑制と高い封入率を達成することが可能になるための粒子径を把握することであり、具体的には粒子径１０μｍ以下のものが９０％以上が好ましく、さらには、粒子径６μｍ以下のものが５０％以上であることが好ましい範囲である。このように粒子径の揃った微粉末を用いることで、以降の生体内分解性高分子物質への噴霧乾燥微粉末、すなわち生理活性蛋白質の内包が容易となり、初期放出の抑制と高い封入率を達成することが可能になる。
本発明でいう「マイクロスフェアー」とは、粒子径が数十μｍから数百μｍの球形粒子を意味し、具体的には約１０μｍから約３００μｍの球形粒子を意味し、好ましくは約２０μｍから約２５０μｍを意味する。
本発明でいう「生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし」とは、生理活性蛋白質と糖類とを主成分としているが、本発明の効果を損なわない範囲内において、他の賦形剤等の成分を含んでも良いことを意味する。また本発明でいう生理活性蛋白質の「生理活性の保持」とは具体的に、例えば下記に示す生理活性試験法で、生理活性蛋白質の力価を測定するとき、標品に対する試料の力価が約７０−約１２５％、好ましくは約８０−約１１５％であることを意味する。
さらに本発明の生理活性蛋白質を封入した徐放性注射剤用組成物において「初期放出の抑制」および「持続的な放出」とは、下記に示す放出試験法を行うとき、「初期放出の抑制」に関しては試験開始後３時間で約１０％以下であることを示し、「持続的な放出」に関しては、「徐放性」をも意味し、具体的には試験開始後１日乃至１ヶ月間程度、薬物の放出が続くことを意味する。
さらにまた本発明でいう生理活性蛋白質の「高い封入率」とは、例えば下記に示す封入率の測定法で測定したとき、約７０％以上、好ましくは約７５％以上、更に好ましくは約８０％以上の封入率を示すことを意味する。
また噴霧乾燥時の乾燥温度の「高温とすることなく」とは、例えばスプレードライヤーを機器として選択した際の送風出口温度の低い温度範囲を意味し、具体的には約０℃から約８０℃、好ましくは約１０℃から約６０℃、更に好ましくは約２０℃から約６０℃を意味する。
本発明で用いられる生理活性蛋白質としては、医薬活性成分として用いられる蛋白質であれば特に限定されない。かかる医薬活性成分としては、サイトカイン、成長因子、造血因子、ペプチドホルモン、酵素等が挙げられる。
具体的にサイトカインとしては、インターフェロン類（α型、β型、γ型等）、インターロイキン類（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３等）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等、成長因子としては、骨形成因子（ＢＭＰ−１、２、３、４等）、神経成長因子（ＮＧＦ−１、２等）、神経栄養因子（ＮＴＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１、２、３等）、線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、軟骨由来因子（ＣＤＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−α、−β等）等が挙げられる。
また造血因子としては、コロニー刺激因子類（Ｇ−、Ｍ−、ＧＭ−ＣＳＦ等）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、血小板増殖刺激因子等、ペプチドホルモンとしては、成長ホルモン（ＧＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、インスリン、グルカゴン、プロラクチン、カルシトニン、ナトリウム利尿ペプチド等、酵素としては、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、アスパラギナーゼ、カリクレイン、ストレプトキナーゼ、プロテインＣ、メタロプロテアーゼ類、第ＶＩＩＩおよびＩＸ因子、プルオキシダーゼ等が挙げられる。
本発明に好ましい生理活性蛋白質としては、インターフェロン類、骨形成因子、成長ホルモンであり、更に好ましくは、インターフェロン類、成長ホルモンであり、最も好ましくはインターフェロン類である。インターフェロン類には天然型、遺伝子組換え型の両者が含まれる。またその中でも遺伝子組換え型のインターフェロン−α−Ｃｏｎ１が特に好ましい。これら生理活性蛋白質は、１種または２種以上を組み合わせて用いても良い。また蛋白質ではない薬物、例えば抗ウイルス剤等との組み合わせも可能である。
また本発明における生理活性蛋白質としては、分子量約１，０００−２００，０００のものが用いられ、好ましくは約５，０００−７０，０００のものである。これらの生理活性蛋白質は、天然由来あるいは遺伝子組み換え技術等によって得られた改変体であってもよく、それらの修飾体（例えばポリエチレングリコールなどによる化学修飾体）であってもよい。またこれらは単量体として用いても、ホモまたはヘテロの多量体として用いてもよい。
本発明における糖類としては、環状及び（直鎖及び分岐鎖）の単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、あるいはそれらの誘導体（糖アルコール等も含む）等が挙げられ、その内、糖アルコールまたは環状オリゴ糖が好ましく、更にマンニトールまたはシクロデキストリン類（α型、β型、γ型、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）が好ましく、最も好ましくはマンニトールおよび２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが挙げられる。またこれらの糖類は１種または２種以上を組み合わせて用いても良い。
本発明における生体内分解性高分子物質とは、生体適合性を有するとともに、生理活性を持たず生体内で分解、消失する高分子を意味し、製薬学的に許容されるものであれば特に制限されない。例えばα−ヒドロキシカルボン酸類（乳酸、グリコール酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸類（クエン酸等）等のホモポリマーまたはコポリマー等が挙げられ、ポリ乳酸、乳酸グリコール酸共重合体が好ましく、乳酸グリコール酸共重合体が特に好ましい。また、これらの生体内分解性高分子物質は、１種または２種以上を組み合わせて用いても良い。
噴霧乾燥微粉末は実質的に生理活性蛋白質と糖類からなり、糖類に対する生理活性蛋白質の含有量は、約０．０１−約８０％（ｗ／ｗ）の範囲が好ましく、さらに約２−約５０％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約５−約２０％（ｗ／ｗ）である。活性蛋白質の含有量がこれらの範囲より低くなると、実質的な生理活性を示さなくなってしまい、これらの範囲より高くなると、糖類の安定性への寄与が得られなくなってしまう。
生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の含有量は、生理活性蛋白質の薬理効果および放出時間によって異なるが、約０．０１−約２０％（ｗ／ｗ）の範囲であり、好ましくは約０．１−約１０％（ｗ／ｗ）である。これらの範囲より低い場合には、放出時間が著しく遅くなってしまい、これら範囲より高い場合には、放出時間が早まる可能性がある。
本発明の噴霧乾燥微粉末は、例えば生理活性蛋白質と糖類の混合水溶液をノズルを用いて噴霧乾燥器の乾燥室内に噴霧し、水を揮発させることにより得ることができる。噴霧乾燥器の例としては、スプレードライヤーが挙げられる。噴霧乾燥時に使用するノズルとしては、例えば二流体ノズル、圧力ノズル、回転ディスク型等があり、生理活性蛋白質、糖類の選択に応じていずれも使用が可能である。
混合水溶液の調製の際は、生理活性蛋白質の水溶液に水溶性低分子物質を溶解させてもよいし、生理活性蛋白質水溶液と水溶性低分子物質の水溶液を混合させてもよい。また本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤、塩化ナトリウム等の浸透圧調整剤を添加してもよい。この際、混合水溶液における生理活性蛋白質の濃度は、生理活性蛋白質が溶解する範囲であれば特に限定されないが、約０．１−約２０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは約１−約１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１−約８ｍｇ／ｍｌである。また混合水溶液における糖類の濃度は、糖類が溶解し、さらに生理活性蛋白質が沈殿しない範囲であれば特に限定されないが、約１−約１５０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは約１０−約１００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約２０−約７０ｍｇ／ｍｌである。
噴霧乾燥の際の噴霧乾燥室の送風室の送風入り口温度は、約２０−約１５０℃の範囲であり、好ましくは約４０−約１２０℃、さらに好ましくは約５０−約１００℃である。また、送風出口温度は、約０−約８０℃の範囲であり、好ましくは約１０−約８０℃であり、さらに好ましくは約２０−約６０℃である。
生理活性蛋白質と糖類との噴霧乾燥微粉末を生体内分解性高分子物質に分散させる方法としては、噴霧乾燥微粉末と生体内分解性高分子物質の混合物に有機溶媒を添加させて生体内分解性高分子物質を溶解させて噴霧乾燥微粉末を分散させる方法、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に噴霧乾燥微粉末を分散させる方法、噴霧乾燥微粉末の有機溶媒分散液に生体内分解性高分子物質を溶解させる方法、噴霧乾燥微粉末の有機溶媒分散液と生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液を混合させる方法、のいずれの方法をも選択することができる。噴霧乾燥微粉末を生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させる際に、均一性を増すためにボルテックスミキサー、ホモジナイズ、超音波等の処理を行ってもよい。有機溶媒中の生体内分解性高分子物質の濃度は、約１０−約５００ｍｇ／ｍｌが好ましく、約５０−約２５０ｍｇ／ｍｌがより好ましい。
本発明で使用する有機溶媒としては、噴霧乾燥微粉末を溶解せずに生体内分解性高分子物質を溶解する揮発性のものであれば特に制限されない。有機溶媒の具体例としては、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン等が挙げられ、これらのうちアセトニトリル、塩化メチレンが好ましい。これらの有機溶媒は２種類以上を混合して用いてもよい。
また、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲において賦形剤等が添加されていてもよい。賦形剤としては、製薬学的に許容される塩類、界面活性剤、糖類、アミノ酸類、有機酸、その他水溶性物質等が挙げられ、その配合量は、生体内分解性高分子物質重量に対し、約０．１−約２０％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは約１−約１０％（ｗ／ｗ）である。これらの賦形剤は１種または２種類以上を添加することができる。
上記賦形剤のうち有機溶媒に溶解しないものは粉末として添加されるが、その際の賦形剤の平均粒子径は２０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がさらに好ましい。
具体的な塩類としては、Ｌ−グルタミン酸カリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カルバゾクロムスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、メタスルホ安息香酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化アルミニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、糖類としては、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、イノシトール、キシリトール、デキストラン、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース等が挙げられ、アミノ酸類としては、メチオニン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、グリシン、システイン、タウリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グルタミン酸、リジン等が挙げられ、その他水溶性物質としては、アスコルビン酸、人血清アルブミン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、ヘパリンナトリウム等が挙げられる。
また有機溶媒に溶解する賦形剤として、界面活性剤、有機酸類等を添加することもできる。具体的な界面活性剤としては、セスキオレイン酸ソルビタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、マクロゴール４００、マクロゴール４０００、マクロゴール６００等が挙げられ、有機酸類としては、オレイン酸、チオグリコール酸、乳酸等が挙げられる。
有機溶媒中の生体内分解性高分子物質を固化させる方法としては、例えば生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液を油類に加え、乳化することによりＯ／Ｏ型エマルションを調製し、得られたエマルションを液中乾燥する方法が挙げられる。油類としては、噴霧乾燥微粉末および生体内分解性高分子物質を溶解せず、生体内分解性高分子物質を溶解させる有機溶媒と混合しない油類であれば特に制限されないが、例えば、シリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油等が好ましく、その中でもシリコン油、鉱物油はより好ましく、特にシリコン油は最も好ましい。これらは２種類以上混合して用いても良い。
また油類の体積は、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液体積の１−１０００倍程度とすることが好ましく、特に１０−５００倍程度が好ましい。
油類中で有機溶媒を除去することで、生体内分解性高分子物質への内包が容易となり、高い封入率を達成するという利点を有する。
さらに油類には凝集防止剤を添加することもできる。凝集防止剤は油類中でのマイクロスフェアーの凝集を抑制するものであれば特に制限されないが、セスキオレイン酸ソルビタンが好ましい。
乳化操作時には、プロペラ式攪拌機、タービン型乳化機、超音波分散装置、高圧乳化機等適切な機器を用いることができる。
液中乾燥は、減圧法等の常法により実施することができ、例えばプロペラ式攪拌機でエマルションを約１０−約１０００ｒｐｍで攪拌しながら約０．１−約５０ｍｍ／Ｈｇとして有機溶媒の留去を行い、温度は０−約２５℃とし、約１０−約２０℃とすることがより好ましい。０．１−２０μｍのメッシュサイズのメッシュで油類を除去する。油類の除去の際に油類と混合する溶媒を添加することにより効率的に油類を除去することができる。例えばイソプロピルアルコール、エタノール等の添加である。また、必要であれば、さらに１ｍｍＨｇ以下に減圧することにより有機溶媒を留去してもよい。温度は０−約３０℃とすることが好ましく、約１５−約２５℃とすることがさらに好ましい。有機溶媒を完全に留去するためには、約２４−約６０時間の減圧処理が好ましく、約３６−約４８時間がより好ましい処理時間である。油類の除去は、油類が溶解し、生体内分解性高分子物質が溶解しない溶媒を添加することによっても実施することができる。具体的には、ｎ−ヘキサン、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール等の添加である。
必要であれば、１ｍｍＨｇ以下に約１−約２時間減圧することにより油類が溶解し、生体内分解性高分子物質が溶解しない溶媒の除去を実施する。このようにして得られたマイクロスフェアーを１００−５００μｍのメッシュサイズのメッシュ、好ましくは１５０−３００μｍのメッシュサイズのメッシュで篩過することにより粒子径の整ったマイクロスフェアーを得ることができる。また、必要であればこのようにして得られたマイクロスフェアーを加温することによりマイクロスフェアー中に残留した有機溶媒をさらに除去することができる。加温は減圧下で行っても良い。これら一連の操作を行うことで、平均粒子径約２０μｍ−約２５０μｍの注射剤に適したマイクロスフェアーを得ることが可能である。
次に本発明の徐放性注射用組成物の製造法を説明する。
本発明組成物を製造するには、生理活性蛋白質水溶液と糖類水溶液を混合し、スプレードライヤーを用いて噴霧乾燥微粉末を得る。別に生体内分解性高分子物質（例えば乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ））を適切な有機溶媒（例えばアセトニトリル）にて溶解後生理活性蛋白質／糖類噴霧乾燥微粉末を添加し、ポリトロンにて分散させる。噴霧乾燥微粉末分散生体内分解性高分子物質溶液を油中（例えばシリコン油）に投入し、４００回転で攪拌し、３０分間１０ｍｍＨｇ以下で溶媒を留去する。イソプロピルアルコール等を添加し、メッシュサイズ２０μｍのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、０．１ｍｍＨｇ以下で適切な時間処理する。ヘキサン洗浄にて油を除去した後、０．１ｍｍＨｇ以下で１時間処理することによりヘキサンを除去する。メッシュサイズ２５０μｍのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明組成物を得る。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
［粒子径測定法］
噴霧乾燥微粉末にアセトニトリルを添加し、ポリトロン（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ  ＧｍｂＨ）にて１０，０００回転、１分間処理することにより分散させた。分散液の一部あるいは全部をレーザー回折／散乱式粒度分布測定装置（ＨＯＲＩＢＡ、ＬＡ−９１０）にて測定した。
［生理活性試験法］
噴霧乾燥粉末中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を７％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する１／３０Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０に溶解後、０．２２μｍのフィルター（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にてろ過した。蛍光分光器（Ｆ−４５００：日立）にて蛍光強度（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１７ｎｍ）を測定することによりＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１の濃度を算出し、試料溶液とした。
マイクロスフェアー中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を含有するマイクロスフェアーにアセトンを添加することによりＰＬＧＡを溶解させ、遠心処理（２，０００ｒｐｍ、１０分間）後、上清を除去した。この操作を４回繰り返すことにより噴霧乾燥微粉末を回収した。回収された噴霧乾燥微粉末は上記の方法により試料溶液とした。
力価測定法
インターフェロン−α−Ｃｏｎ１の力価は、抗ウィルス活性を測定することにより実施した（参考文献：蛋白質・核酸・酵素、別冊２５、３５５−３６３、１９８１年）。細胞は、ヒト羊膜由来株細胞（ＦＬ細胞、ＡＴＣＣ番号  ＣＣＬ−６２（国立予防衛生研究所より分与された株又は同等品）およびシンドビスウィルス（国立予防衛生研究所より分与された株）を用いて行った。
［放出試験法］
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１含有ＰＬＧＡマイクロスフェアー５０ｍｇに１／３０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌを添加し、６０ストローク／ｍｉｎ、３７℃の水浴中でインキュベートした。所定時間後、上清の一部に等量の５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．１Ｎ水酸化ナトリウムを添加後、蛍光分光器（Ｆ−４５００：日立）にて蛍光強度（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１７ｎｍ）を測定することによりインターフェロン−α−Ｃｏｎ１の放出量を算出した。
［封入率の測定法］
ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１含有ＰＬＧＡマイクロスフェアー２０ｍｇにジメチルスルホキシド１０ｍｌを添加して溶解させた。５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．１Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌを添加後、蛍光分光器（Ｆ−４５００：日立）にて蛍光強度（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１７ｎｍ）を測定することによりインターフェロン−α−Ｃｏｎ１の封入率を算出した。
実施例１
［インターフェロン−α−Ｃｏｎ１のＦＩＴＣ標識化］
インターフェロン−α−Ｃｏｎ１水溶液（１９ｍｇ／ｍｌ）４０ｍｌにｐＨ９．５の炭酸緩衝液１５０ｍｌを添加し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ９．５に調製し、氷冷した。フルオレセインイソチオシアネート２５ｍｇを炭酸緩衝液に溶解後、氷冷したインターフェロン−α−Ｃｏｎ１水溶液に添加し、所定時間攪拌した。１Ｎ塩酸を添加してｐＨ７．０に調整後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いたゲル濾過によりＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１を精製した。インターフェロン−α−Ｃｏｎ１  １分子当たりに標識されたＦＩＴＣ分子数は約０．２であった。
［フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／マンニトール噴霧乾燥微粉末の製造］
ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１  ５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール５０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度９５−１０５℃、液体供給速度６ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度３５−４５℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径４．７μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９８．１％であった。
［ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／マンニトール噴霧乾燥微粉末封入ＰＬＧＡマイクロスフェアーの製造］
ＰＬＧＡ５００ｍｇをアセトニトリル２．５ｍｌにて溶解後ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／マンニトール噴霧乾燥微粉末１０ｍｇを添加し、ポリトロンにて１０，０００回転、１分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル５００ｍｌ中に投入し、４００回転で攪拌し、３０分間１０ｍｍＨｇ以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール５００ｍｌを添加し、メッシュサイズ２０μｍのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、０．１ｍｍＨｇ以下で３６時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、０．１ｍｍＨｇ以下で１時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ２５０μｍのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
実験例１
実施例１で調製したマイクロスフェアー中へのＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／マンニトール噴霧乾燥微粉末封入率は、上記封入率測定法により算出したところ９０％であった。またマイクロスフェアーからのＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１の放出性を上記放出試験法により測定したところ、初期３時間までの放出性は５％以下であった。また、放出は１ヶ月以上にわたり持続した。
したがって本発明のマンニトールを担体とした噴霧乾燥微粉末を用い、本発明の製造方法により調製したマイクロスフェアーにおいては、生理活性蛋白質が効率よく封入され、初期放出が抑制され、かつ長期にわたる持続的な放出性を達成したことが確認された。
実施例２
［ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末の製造］
ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１水溶液と２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、最終濃度がＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１  ５ｍｇ／ｍｌ、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン５０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度９５−１０５℃、液体供給速度６ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度３５−４５℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径４．０μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９９．４％であった。
［ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末封入ＰＬＧＡマイクロスフェアーの製造］
ＰＬＧＡ５００ｍｇをアセトニトリル２．５ｍｌにて溶解後ＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末１０ｍｇを添加し、ポリトロンにて１０，０００回転、１分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル５００ｍｌ中に投入し、４００回転で攪拌し、３０分間１０ｍｍＨｇ以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール５００ｍｌを添加し、メッシュサイズ２０μｍのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、０．１ｍｍＨｇ以下で３６時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、０．１ｍｍＨｇ以下で１時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ２５０μｍのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物を得た。
実験例２
実施例１で調製したＰＬＧＡマイクロスフェアー中へのＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末封入率を上記封入率測定法で測定したところ８５％であった。またＰＬＧＡマイクロスフェアーをｐＨ７．０のリン酸緩衝液に浸せきさせた際のＦＩＴＣ標識インターフェロン−α−Ｃｏｎ１の放出性を上記放出試験法により測定したところ、初期３時間までの放出性は１０％以下であった。また、放出性は３週間以上にわたり持続した。
したがって本発明の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを担体とした噴霧乾燥微粉末を用い、本発明の製造方法により調製したマイクロスフェアーにおいて、生理活性蛋白質が効率よく封入され、初期放出が抑制され、かつ長期にわたる持続的な放出性を達成したことが確認された。
実施例３
インターフェロン−α−Ｃｏｎ１水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がインターフェロン−α−Ｃｏｎ１  ０．５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール５０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４５−５５℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、送風出口温度は２３−２８℃であった。回収したインターフェロン−α−Ｃｏｎ１／マンニトール噴霧乾燥微粉末を用いて、実施例１と同様の製造方法にてインターフェロン−α−Ｃｏｎ１含有ＰＬＧＡマイクロスフェアーを調製した。
実験例３
［インターフェロン−α−Ｃｏｎ１含有ＰＬＧＡマイクロスフェアー製造工程中のインターフェロン−α−Ｃｏｎ１の安定性］
実施例３に示したインターフェロン−α−Ｃｏｎ１／マンニトール噴霧乾燥微粉末を封入したＰＬＧＡマイクロスフェアーを用い、インターフェロン−α−Ｃｏｎ１の製造工程中における安定性を評価した。ＦＬ細胞とシンドビスウイルスを用いた抗ウイルス活性測定を行った。インターフェロン−α−Ｃｏｎ１溶液の活性値と比較した際の、ＰＬＧＡマイクロスフェアーに封入されたインターフェロン−α−Ｃｏｎ１の活性は、１０３．５％であり、製造工程中に失活せずに安定性を保持していることが確認された。
比較例１
［コンセンサスインターフェロン／ポリエチレングリコール４０００噴霧乾燥微粉末の製造］
コンセンサスインターフェロン水溶液とポリエチレングリコール４０００水溶液を混合し、最終濃度がコンセンサスインターフェロン０．２ｍｇ／ｍｌ、ポリエチレングリコール４０００  ２０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４７−５２℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２６−３１℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。
［コンセンサスインターフェロン含有ＰＬＧＡマイクロスフェアー製造工程中のコンセンサスインターフェロンの安定性］
コンセンサスインターフェロン／ポリエチレングリコール４０００噴霧乾燥微粉末の製造工程中における安定性を評価するために、ＦＬ細胞とシンドビスウイルスを用いた抗ウイルス活性測定を行った。コンセンサスインターフェロン溶液の活性値と比較した際のコンセンサスインターフェロン／マンニトール噴霧乾燥微粉末の活性は、３１．２％を示し、製造工程中に失活していることが確認された。よって実施例との比較により、糖類によって製造工程中のコンセンサスインターフェロンの失活が回避されていることが確認された。
比較例２
［ＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロン／マンニトール凍結乾燥粉末の製造］
ＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロン水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロン３．９ｍｇ／ｍｌ、マンニトール５０ｍｇ／ｍｌとなるように調整し凍結乾燥した。凍結乾燥粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径６９．３μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は３．３％であった。
［ＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロン／マンニトール凍結乾燥粉末封入ＰＬＧＡマイクロスフェアーの製造］
ＰＬＧＡ５００ｍｇをアセトニトリル２．５ｍｌにて溶解後ＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロン／マンニトール凍結乾燥粉末１０ｍｇを添加し、ポリトロンにて１０，０００回転、１分間処理することにより分散させた。凍結乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル５００ｍｌ中に投入し、４００回転で攪拌し、３０分間１０ｍｍＨｇ以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール５００ｍｌを添加し、メッシュサイズ２０μｍのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、０．１ｍｍＨｇ以下で３６時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、０．１ｍｍＨｇ以下で１時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ２５０μｍのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
［ＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロン／マンニトール凍結乾燥粉末封入ＰＬＧＡマイクロスフェアーからの初期放出性評価］
マイクロスフェアー中へのＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロン／マンニトール凍結乾燥微粉末封入率は、上記封入率測定法により算出したところ１２２％であった。またマイクロスフェアーからのＦＩＴＣ標識コンセンサスインターフェロンの放出性を上記放出試験法により測定したところ、初期３時間までの放出性は６８％であった。
したがって本発明の噴霧乾燥微粉末を用いた生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物においては、生理活性蛋白質が効率よく封入され、初期放出が抑制され、かつ長期にわたる持続的な放出性を達成したのみならず、生理活性蛋白質の生理活性も保持していることが確認された。更に噴霧乾燥微粉末の粒子径が１０μｍ以下のものが９０％以上であれば、封入率、初期放出ともに良好なマイクロスフェアーが得られることが示された。
実施例４
［ＢＭＰ−２実験方法］
噴霧乾燥微粉末中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を希釈用緩衝液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０  グリシン緩衝液ｐＨ４．５で溶解し，マイクロローリー法を用いてＢＭＰ−２濃度を測定した．希釈用緩衝液で調製したＢＭＰ−２溶解液から１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変ＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）を用いてＢＭＰ−２濃度が約０．４８８−１３８０ｎｇ／ｍＬになるように希釈系列を作成し試料溶液とした．
マイクロスフェアー中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を含有するマイクロスフェアーにアセトンを添加することによりＰＬＧＡを溶解させ、遠心処理（２０００ｒｐｍ、１０分間）後上清を除去した。この操作を４回繰り返すことにより噴霧乾燥微粉末を回収した。
回収された噴霧乾燥微粉末は上記と同様の方法により試料溶液とした。
力価測定法
ＢＭＰ−２の力価はＢＭＰ−２濃度依存的に亢進する細胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定した（参考文献：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０巻、１９９２年  １３１８−１３２４ページ）。細胞は骨髄ストローマ細胞であるＷ２０細胞（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（現Ｗｙｅｔｈ社）より分与された細胞株）を用いた。
［ＢＭＰ−２／マンニトール噴霧乾燥微粉末の製造］
ＢＭＰ−２水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がＢＭＰ−２０．５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール５０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４８−５３℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２６−３１℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径４．９μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９７．９％であった。
実施例５
［ＢＭＰ−２／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ８０噴霧乾燥微粉末の製造］
ＢＭＰ−２水溶液とマンニトール／Ｔｗｅｅｎ８０水溶液を混合し、最終濃度がＢＭＰ−２  ０．５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール５０ｍｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ８０  １ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４８−５３℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２７−３２℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径６．２μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９０．２％であった。
実施例６
［ＢＭＰ−２／マンニトール／グリシン噴霧乾燥微粉末の製造］
ＢＭＰ−２水溶液とマンニトール／グリシン水溶液を混合し、最終濃度がＢＭＰ−２  ０．５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４５ｍｇ／ｍｌ、グリシン５ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４８−５３℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２６−３１℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径４．６μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９８．３％であった。
実施例７
［ＢＭＰ−２／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末の製造］
ＢＭＰ−２水溶液と２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、最終濃度がＢＭＰ−２  ０．５ｍｇ／ｍｌ、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン５０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４８−５３℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２６−３１℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径４．７μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９８．３％であった。
実施例８
［ＢＭＰ−２／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン／Ｔｗｅｅｎ８０噴霧乾燥微粉末の製造］
ＢＭＰ−２水溶液と２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、ＢＭＰ−２の最終濃度が、０．５ｍｇ／ｍＬ、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが５０ｍｇ／ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ８０が１ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４７−５２℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２６−３１℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径６．３μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９０．１％であった。
実施例９
［ＢＭＰ−２／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン／グリシン噴霧乾燥微粉末の製造］
ＢＭＰ−２水溶液と２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン／グリシン水溶液を混合し、ＢＭＰ−２の最終濃度が、０．５ｍｇ／ｍＬ、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが４５ｍｇ／ｍＬ、グリシンが５ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４８−５３℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２５−３０℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径５．８μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９７．２％であった。
実施例１０
［ＢＭＰ−２含有噴霧乾燥微粉末封入ＰＬＧＡマイクロスフェアーの製造］
ＰＬＧＡ５００ｍｇをアセトニトリル２．５ｍｌにて溶解後ＢＭＰ−２／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末１０ｍｇを添加し、ポリトロンにて１０，０００回転、１分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル５００ｍｌ中に投入し、４００回転で攪拌し、３０分間１０ｍｍＨｇ以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール５００ｍｌを添加し、メッシュサイズ２０μｍのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、０．１ｍｍＨｇ以下で３６時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、０．１ｍｍＨｇ以下で１時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ２５０μｍのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
実験例４
［ＢＭＰ−２含有噴霧乾燥微粉末及びＰＬＧＡマイクロスフェアー中のＢＭＰ−２の安定性］
ＢＭＰ−２含有噴霧乾燥微粉末及びＰＬＧＡマイクロスフェアーに封入されたＢＭＰ−２の製造工程中における安定性を評価するために、Ｗ２０細胞を用いた活性測定を行った。ＢＭＰ−２溶液の活性値と比較した際の、ＢＭＰ−２−マンニトール噴霧乾燥微粉末およびＢＭＰ−２−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末を用いた、ＰＬＧＡマイクロスフェアー封入ＢＭＰ−２の活性は、それぞれ１０５．７％、１０３．９％と高い活性を保持し、製造工程中に失活せずに安定性を保持していることが確認された。
実施例１１
［塩化リゾチーム実験方法］
噴霧乾燥微粉末中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を精製水で溶解し、マイクロローリー法を用いて塩化リゾチーム濃度を測定した、ｐＨ６．２リン酸緩衝液を用いてタンパク濃度が１μｇ／ｍＬになるように希釈し試料溶液とした．
マイクロスフェアー中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を含有するマイクロスフェアーにアセトンを添加することによりＰＬＧＡを溶解させ、遠心処理（２０００ｒｐｍ，１０分間）後上清を除去した。この操作を４回繰り返すことにより噴霧乾燥微粉末を回収した。
回収された噴霧乾燥微粉末は上記の方法により試料溶液とした。
力価測定
塩化リゾチームの力価は塩化リゾチームの濃度依存的に更新する基質溶解性を指標に測定した（参考文献：日本薬局方外医薬品規格，１９９７，Ｐ３５２−３５３）．基質はＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの乾燥菌体を用いた．
［塩化リゾチーム／マンニトール噴霧乾燥微粉末の製造］
塩化リゾチーム水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度が塩化リゾチーム５ｍｇ／ｍｌ、マンニトール５０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４８−５３℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２４−３０℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径４．９μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９６．６％であった。
実施例１２
［塩化リゾチーム／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末の製造］
塩化リゾチーム水溶液と２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、最終濃度が塩化リゾチーム１０ｍｇ／ｍＬ、マンニトール５０ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度４９−５０℃、液体供給速度３ｇ／ｍｉｎ、噴霧圧２ｋｇ／ｃｍ２、結果として送風出口温度２７−２９℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径５．８μｍ、１０μｍ以下の粒子が占める割合は９０．９％であった。
［塩化リゾチーム含有噴霧乾燥微粉末封入ＰＬＧＡマイクロスフェアーの製造］
ＰＬＧＡ５００ｍｇをアセトニトリル２．５ｍＬにて溶解後塩化リゾチーム含有噴霧乾燥微粉末１０ｍｇを添加し、ポリトロンにて１０，０００回転、１分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル５００ｍＬ中に投入し、４００回転で攪拌し、３０分間１０ｍｍＨｇ以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール５００ｍＬを添加し、メッシュサイズ２０μｍのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、０．１ｍｍＨｇ以下で３６時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、０．１ｍｍＨｇ以下で１時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ２５０μｍのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
実験例５
［塩化リゾチーム含有ＰＬＧＡマイクロスフェアー製造工程中の塩化リゾチームの安定性］
塩化リゾチーム溶液、塩化リゾチーム含有噴霧乾燥微粉末、ＰＬＧＡマイクロスフェアーに封入された塩化リゾチームの製造工程中における安定性を評価するために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの乾燥菌体を用いた活性測定を行った。塩化リゾチーム溶液の活性値と比較した際の塩化リゾチーム／マンニトール噴霧乾燥微粉末を用いたＰＬＧＡマイクロスフェアー中の塩化リゾチームの活性値は、９０．１％であり、塩化リゾチーム／２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末を用いたＰＬＧＡマイクロスフェアー中の塩化リゾチームの活性は９２．６％であった。いずれも９０％を下回らない活性を示し、製造工程中に失活せずに安定性を保持していることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、糖類を用いることで高温にすることなく噴霧乾燥が可能となり、熱による生理活性蛋白質の変性や失活を回避し、粒子径を制御した蛋白質微粉末を調製することが極めて容易となる。また、生理活性を保持し、粒子径が充分に制御された蛋白質微粉末を用いることで、生体内分解性高分子溶液中への均一な分散が可能となり、内包の生理活性蛋白質の生理活性を保持し、またマイクロスフェアーへの高い封入率、初期放出の抑制を達成することが可能となる。
よって本発明は、噴霧乾燥微粉末を高い封入率で徐放性マイクロスフェアー中に封入することを可能とするとともに、マイクロスフェアーからの初期放出の抑制および持続的な放出性を達成することを可能とし、一般的に生理活性の保持が製剤化の過程で困難とされる生理活性蛋白質の生産性の高い徐放性注射用組成物の提供を可能にしたものである。
【国際調査報告】
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