(57)【要約】活性酸素ラジカルの消去時に観察される微弱発光を利用し、穿刺具を用いて人体から微量採取した血液に、アルコール又は水にコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解してなる試薬又は濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした炭酸水素カリウムからなる試薬のいずれかと、濃度２％の過酸化水素水からなる試薬と、濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした没食子酸からなる試薬とからなるグループの中から選択した、一種または、複数種の試薬を用いた際に生じる微弱な発光を、ＣＣＤカメラを用いて把握し、輝度（Ｌｕｍｉｎａｎｃｅ）（単位：ｃｄ／ｍ２）の多寡として人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性酸素ラジカルからなる第一の試薬、
活性酸素ラジカルスカベンジャーからなる第二の試薬、
単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質からなる第三の試薬
の中のいずれか一種以上の試薬を、人体から採取した血液に添加した際に生じる微弱な発光現象を用いて、人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法であって、
第一の試薬と第三の試薬とを同時に用いて、血液中における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡を測定し、
第一の試薬と第二の試薬とを同時に用いて、血液中における、単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質の多寡を測定する
ことを特徴とする人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項２】
活性酸素ラジカルスカベンジャーからなる第二の試薬、
単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質からなる第三の試薬
の中のいずれか一種以上の試薬を、人体から採取した血液に添加した際に生じる微弱な発光現象を用いて、人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法であって、
第二の試薬と、第三の試薬とを、それぞれ単独で用いて、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分の、血液中における、多寡を測定する
ことを特徴とする人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項３】
活性酸素ラジカルからなる第一の試薬、
活性酸素ラジカルスカベンジャーからなる第二の試薬、
単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質からなる第三の試薬
の中のいずれか一種以上の試薬を、人体から採取した血液に添加した際に生じる微弱な発光現象を用いて、人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法であって、
第一の試薬と第三の試薬とを同時に用いて、血液中における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡を測定し、
第一の試薬と第二の試薬とを同時に用いて、単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質の、血液中における、多寡を測定し、
第二の試薬と、第三の試薬とを、それぞれ単独で用いて、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分の、血液中における、多寡を測定する
ことを特徴とする人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項４】
第二の試薬と、第三の試薬とを、それぞれ単独で用いて測定される、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分は、それぞれ、酸素（３Ｏ２）が、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けた過酸化水素（ＨＯＯＨ）の状態となり、これが活性酸素ラジカルスカベンジャーに結合、あるいは吸着している状態の物質、及び、これが単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質に結合、あるいは吸着している状態の物質であることを特徴とする請求項２又は３記載の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項５】
第一の試薬を、過酸化水素水、
第二の試薬を、飽和状態に溶解した没食子酸、
第三の試薬を、濃度２．５％のコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）、又は、飽和状態に溶解した炭酸水素カリウムとしたことを特徴とする請求項１、３、４のいずれか一項記載の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項６】
第二の試薬を、飽和状態に溶解した没食子酸、
第三の試薬を、濃度２．５％のコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）、又は、飽和状態に溶解した炭酸水素カリウムとしたことを特徴とする請求項２記載の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項７】
第一の試薬の過酸化水素水は、濃度２％の過酸化水素水であることを特徴とした請求項５記載の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項８】
第二の試薬の飽和状態に溶解した没食子酸は、濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした没食子酸であることを特徴とした請求項５又は６記載の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項９】
第三の試薬の濃度２．５％のコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）は、アルコール又は水にコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解したものであることを特徴とした請求項５又は６記載の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【請求項１０】
第三の試薬の飽和状態に溶解した炭酸水素カリウムは、濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした炭酸水素カリウムであることを特徴とした請求項５又は６記載の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、人体中における活性酸素ラジカル（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ）の状態を簡便に測定できる方法に関する。特に、活性酸素ラジカルが消失する際に生じる現象であって、微弱発光するかのように観察されるフォトン放出現象を利用して、人体中における活性酸素ラジカルの消去の状態及び、活性酸素ラジカル消去能の状態を測定する方法に関する。
背景技術
活性酸素ラジカルは、単に活性酸素あるいはフリーラジカルとも称され、不安定な不対電子を持つ反応性に富んだ原子や分子であり、更に１電子を取り込むか、あるいは逆に与えることにより安定性を保とうとするものである。一般には、スーパーオキサイド（・Ｏ２−）、ヒドロキシラジカル（ＨＯ＊）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（１Ｏ２）の４種が活性酸素ラジカルと呼ばれている。前記４種の他に、ヒドロペルオキシラジカル（ＨＯＯ＊）、ペルオキシラジカル（ＬＯＯ＊）、アルコキシラジカル（ＬＯ＊）なども広い意味で活性酸素種やラジカル種と呼ばれている。
活性酸素ラジカルからは、新たな活性酸素ラジカルが、二次的、三次的に産生される。そして、このようにして加速度的に増加する活性酸素ラジカルは、細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等を引き起こして多くの疾患に関与することが近年明らかにされている。
この活性酸素ラジカルを除去する、いわゆる活性酸素ラジカルスカベンジャー成分に関しては、各種のフラボノイド類及びこの関連成分（カテキン、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、ルチン、アントシアニン、ポリフェノール、他）やサポニン類など、食素材に由来する天然成分の研究が進められている。
本願の発明者は、活性酸素ラジカルの消失反応を簡便かつ精度高く分析できる方法の開発に取り組んできた。この方法は、活性酸素ラジカルの消失時に微弱発光するかのように観察されるフォトン放出の高感度測定に基づくものである。これは、本願の発明者が共同発明者となっている特許出願（日本  特開平９−２４１６３７号公報）中において紹介されている。
この日本  特開平９−２４１６３７号公報においても説明されているように、活性酸素ラジカルスカベンジャーには、活性酸素の消去と、活性酸素の発生という二面性が存在している。
これを式で説明すると下記のようになる。
2003038429.tif 000002
前記の式は、活性酸素ラジカルスカベンジャーが活性酸素ラジカルを消去するプロセスを説明するものである。ハイドロジェン（Ｈ＊）ドナーである活性酸素ラジカルスカベンジャーは、式の後半に示されるように、Ｏ＊、ＨＯＯＨ、ＨＯＯ＊、ＨＯ＊などの活性酸素ラジカル（前記の式ではＨＯＯＨ）に、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を行って活性酸素ラジカルの消去を行うものである。しかし、前記の式の前半にあるように、同時に、通常の酸素分子（３Ｏ２）に、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を行って、活性酸素を発生させるというプロセスにも関与しているのである。
また、日本  特開平９−２４１６３７号公報においても説明されているように、本願の発明者は、単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質（以下、本明細書に於いて、この物質を単に「メディエーター」ということがある。）が存在することを発見した。
すなわち、単独では自ら活性酸素ラジカルを処理する直接作業能力に乏しい、アルデヒドやアミノ酸、ウロン酸（酸性糖類）などのメディエーターが同時に存在している下で、前述した活性酸素ラジカルスカベンジャーによる活性酸素消去作用は、活性酸素ラジカルスカベンジャー単独の場合よりも優れていることが分かった。
そして、活性酸素ラジカルの消失反応において、活性酸素ラジカルスカベンジャーと、メディエーターとの組み合わせが存在することを解明した。更に、活性酸素ラジカルの消去時に微弱発光するかのように観察されるフォトン放出において、以下の関係式で示される法則が成立することを明らかにした。
［Ｐ］＝ｋ［Ｘ］［Ｙ］ｆ（Ｚ）
［Ｐ］：活性酸素ラジカルの消失時に微弱発光するかのように観察されるフォトン放出の強度。この強度が大きいほど、活性酸素ラジカルの消去が促進されている。この微弱発光は、ＣＣＤカメラによって可視的に捉ることが可能である。
ｋ：主として活性酸素ラジカルスカベンジャーと、メディエーターとの組み合わせによる活性酸素ラジカル処理能力を反映している定数。
［Ｘ］：活性酸素ラジカルの濃度。
［Ｙ］：活性酸素ラジカルスカベンジャーの濃度。
ｆ（Ｚ）：メディエーターの濃度。
すなわち、活性酸素ラジカルと、活性酸素ラジカルスカベンジャーとが並存している下において、被試験物質に微弱発光を認めることができれば、当該被試験物質は、メディエーターであると認めることができる。
また、活性酸素ラジカルと、メディエーターとが並存している下において、被試験物質に微弱発光を認めることができれば、当該被試験物質は、活性酸素ラジカルスカベンジャーであると認めることができる。
更に、活性酸素ラジカルスカベンジャーが存在している下において、被試験物質に微弱発光を認めることができれば、当該被試験物質は、活性酸素ラジカルとメディエーターとからなる物質であると認めることができる。
更に、メディエーターが存在している下において、被試験物質に微弱発光を認めることができれば、当該被試験物質は、活性酸素ラジカルと活性酸素ラジカルスカベンジャーとからなる物質であると認めることができる。
その後、本願発明者はさらに研究を進めた結果、人体内中において、活性酸素ラジカルは、以下の３つの形態で存在するものが、細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等による疾患の発生に影響を与えるものであることがわかった。
第一の形態は、通常、酸素と呼ばれる三重項酸素（３Ｏ２）が、以下の式に示すように、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けて生成された過酸化水素（ＨＯＯＨ）の形態である。
2003038429.tif 000003
第二の形態は、前記形態の過酸化水素（ＨＯＯＨ）が活性酸素ラジカルスカベンジャーに結合、あるいは吸着している状態の形態である。
すなわち、この形態のものは、メディエーターが存在している下において微弱発光を認めることができる、活性酸素ラジカルと活性酸素ラジカルスカベンジャーとからなる、活性酸素ラジカル由来の成分である。
第三の形態は、前記形態の過酸化水素（ＨＯＯＨ）が、単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質（メディエーター）に結合、あるいは吸着している状態の形態である。
すなわち、この形態のものは、活性酸素ラジカルスカベンジャーが存在している下において微弱発光を認めることができる、活性酸素ラジカルとメディエーターとからなる、活性酸素ラジカル由来の成分である。
そして、前記第二、第三の活性酸素ラジカル由来の形態のものは、この状態で、比較的安定状態にて人体中に存在していることがわかった。
なお、人体中には、前記形態の過酸化水素（ＨＯＯＨ）と、活性酸素ラジカルスカベンジャーと、メディエーターとが結合、あるいは吸着している状態の形態のものも存在するが、本願発明者の研究によれば、生体の損傷、加熱で発生する活性酸素ラジカルは、前記第二の形態と、前記第三の形態のものであった。
そこで、人体内における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡、メディエーターの多寡、前述した第二、第三の形態で存在している活性酸素ラジカル由来の成分の多寡を簡便に測定することができれば、活性酸素消去能力の多寡の把握、活性酸素ラジカル由来の成分の発生要因・発生因子を簡便に把握でき、活性酸素ラジカルによって引き起こされる細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等による疾患の治療に有効に活用することが可能である。
発明の開示
本発明は、以上の知見に鑑みて、人体内における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡、メディエーターの多寡、前述した第二、第三の形態で存在している活性酸素ラジカル由来の成分の多寡を簡便に測定できる、人体中における活性酸素ラジカルの消去の状態及び、活性酸素ラジカル消去能の状態を測定する方法を提供することを目的としている。
本願は、前記目的を、本願の発明者が共同発明者となっている日本  特開平９−２４１６３７号公報において紹介した、活性酸素ラジカルの消去時に観察される微弱発光を利用して達成したものである。
すなわち、この発明が提案する人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法は、活性酸素ラジカルからなる第一の試薬、活性酸素ラジカルスカベンジャーからなる第二の試薬、メディエーターからなる第三の試薬、の中のいずれか一種以上の試薬を、人体から採取した血液に添加した際に生じる微弱な発光現象を用いて、人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法であって、第一の試薬と第三の試薬とを同時に用いて、血液中における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡を測定し、第一の試薬と第二の試薬とを同時に用いて、血液中における、メディエーターの多寡を測定することを特徴とするものである。
また、他の方法は、活性酸素ラジカルスカベンジャーからなる第二の試薬、メディエーターからなる第三の試薬、の中のいずれか一種以上の試薬を、人体から採取した血液に添加した際に生じる微弱な発光現象を用いて、人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法であって、第二の試薬と、第三の試薬とを、それぞれ単独で用いて、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分の、血液中における、多寡を測定することを特徴とするものである。
更に他の方法は、活性酸素ラジカルからなる第一の試薬、活性酸素ラジカルスカベンジャーからなる第二の試薬、メディエーターからなる第三の試薬、の中のいずれか一種以上の試薬を、人体から採取した血液に添加した際に生じる微弱な発光現象を用いて、人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法であって、第一の試薬と第三の試薬とを同時に用いて、血液中における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡を測定し、第一の試薬と第二の試薬とを同時に用いて、血液中における、メディエーターの多寡を測定し、第二の試薬と、第三の試薬とを、それぞれ単独で用いて、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分の、血液中における多寡を測定することを特徴とするものである。
以上のいずれの人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法においても、活性酸素ラジカルスカベンジャー、メディエーター、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分など、測定すべき物質の多寡は、本願の発明者が共同発明者となっている日本  特開平９−２４１６３７号公報において紹介した、活性酸素ラジカルの消去時に観察される微弱発光を利用して測定することができる。すなわち、人体から微量採取した血液に、前記第一の試薬、第二の試薬、第三の試薬を単独で、あるいは組み合わせて用いた際に生じる微弱な発光を、ＣＣＤカメラ等を用いて把握することによって、輝度（Ｌｕｍｉｎａｎｃｅ）（単位：ｃｄ／ｍ２）の多寡として、前記測定すべき物質の多寡を把握することができる。
ここで、人体からの血液の微量な採取は、例えば、血糖値などを調べるキットに採用されている穿刺具などを用いて、検査を受ける者（被検査者）の手の親指の先、耳朶などから簡単に行うことができる。
なお、前記の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法において、第二の試薬を単独で用いて測定される、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分は、酸素（３Ｏ２）が、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けた過酸化水素（ＨＯＯＨ）の状態となり、これがメディエーターに結合、あるいは吸着している状態の物質である。この人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分は、生体の損傷、加熱で発生する活性酸素ラジカルである。
また、第三の試薬を単独で用いて測定される、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分は、酸素（３Ｏ２）が、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けた過酸化水素（ＨＯＯＨ）の状態となり、これが活性酸素ラジカルスカベンジャーに結合、あるいは吸着している状態の物質である。この人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分も、生体の損傷、加熱で発生する活性酸素ラジカルである。
すなわち、本発明によれば、生体の損傷、加熱で発生するものであって、比較的安定状態にて人体中に存在する活性酸素ラジカルの人体内における多寡を、人体から微量に採取した血液を用いるのみで、前記の微弱発光を利用して簡単に測定できるのである。
このようにして測定される前述した形態の活性酸素ラジカル由来の成分は、生体の損傷、加熱で発生する活性酸素ラジカルであり、これを簡便に測定できることによって、活性酸素ラジカル由来の成分の発生要因・発生因子を簡便に把握し、活性酸素ラジカルによって引き起こされる細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等による疾患の治療に有効に活用することができる。例えば、健康診断に用いるようにすることも考えられる。
なお、前記本発明の人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定する方法において、第一の試薬を、過酸化水素水、第二の試薬を、飽和状態に溶解した没食子酸、第三の試薬を、濃度２．５％のコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）、又は、飽和状態に溶解した炭酸水素カリウムとすることができる。
ここで、第一の試薬の過酸化水素水は、濃度２％の過酸化水素水とすれば測定能を向上させる上で効果的である。
また、第二の試薬の飽和状態に溶解した没食子酸は、濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした没食子酸とすれば測定能を向上させる上で効果的である。
没食子酸は、代表的な活性酸素ラジカルスカベンジャーとされているカテキン類の加水分解でＢ環部分が遊離したものである。
更に、第三の試薬の濃度２．５％のコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）は、アルコール（例えば、エチルアルコール）又は水に、にコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解したものとすれば測定能を向上させる上で効果的である。
また、もう一つの第三の試薬である飽和状態に溶解した炭酸水素カリウムは、濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした炭酸水素カリウムとすれば測定能を向上させる上で効果的である。
以上説明したように、この発明が提案する方法は、活性酸素ラジカルの消去時に観察される微弱発光を利用し、穿刺具を用いて人体から微量採取した血液に、アルコール又は水にコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解してなる試薬又は濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした炭酸水素カリウムからなる試薬のいずれかと、濃度２％の過酸化水素水からなる試薬と、濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした没食子酸からなる試薬とからなるグループの中から選択した、一種または、複数種の試薬を用いた際に生じる微弱な発光を、ＣＣＤカメラを用いて把握し、輝度（Ｌｕｍｉｎａｎｃｅ）（単位：ｃｄ／ｍ２）の多寡として人体中における活性酸素ラジカルの状態を測定するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好ましい実施形態を説明するが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々の態様に変更可能である。
（実施例１）
穿刺具により、被検査者の親指先から微量の血液を円形の紙片にとり、活性酸素ラジカルの消去時に観察される微弱発光をＣＣＤカメラ（感度：１０）を用いて測定した。
まず、第一の試薬（濃度２％の過酸化水素水）と、第二の試薬（濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした没食子酸）とを紙片上の血液に同時に添加して輝度を測定した。ＣＣＤカメラで１０分観察したところ、５００（ｃｄ／ｍ２）の発光を測定できた。このことから、被検査者の血液中のメディエーターの量が輝度５００（ｃｄ／ｍ２）に対応する量であることを確認できた。
次に、第一の試薬（濃度２％の過酸化水素水）と、第三の試薬（濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３））とを紙片上の血液に同時に添加して輝度を測定した。ＣＣＤカメラで１０分観察したところ、３０（ｃｄ／ｍ２）の発光を測定できた。このことから、被検査者の血液中の活性酸素ラジカルスカベンジャーの量が輝度３０（ｃｄ／ｍ２）に対応する量であることを確認できた。
穿刺具を用いて人体から微量に採取した血液に試薬を添加し、ＣＣＤカメラで発光現象を観察するという極めて簡単な方法でありながら、血液中におけるメディエーターの量、活性酸素ラジカルスカベンジャーの量を、初めて観察することができた。
これによって、本発明の方法によれば、活性酸素ラジカルの消去に大きな役割を果たす活性酸素ラジカルスカベンジャー、メディエーターの血液中における多寡を容易に把握して、被検査者の活性酸素消去能を把握することができる。
（実施例２）
実施例１において、第三の試薬として、エチルアルコールにコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解したものを採用した以外は同様にして、穿刺具を用いて被検査者の耳朶から微量に採取した血液について同じように測定したところ、以下の結果を得た。
第一の試薬（濃度２％の過酸化水素水）と、第二の試薬（濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした没食子酸）とを紙片上の血液に同時に添加し、ＣＣＤカメラで１０分観察したところ、１０００（ｃｄ／ｍ２）の発光を測定できた。
第一の試薬（濃度２％の過酸化水素水）と、第三の試薬（エチルアルコールにコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解したもの）とを紙片上の血液に同時に添加し、ＣＣＤカメラで１０分観察したところ、１００（ｃｄ／ｍ２）の発光を測定できた。
このことから、第三の試薬を、エチルアルコールにコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解したものにすれば、実施例１の場合に比較して３倍のスケールで活性酸素ラジカルスカベンジャーの量を測定することができることが明らかになった。そこで、かかる第一の試薬と、第三の試薬とを同時に用いることによって、活性酸素ラジカルスカベンジャー成分を含む食物を摂取した際の、人体中における活性酸素ラジカルスカベンジャーの量の変化を効果的に測定する用途に用いることが考えられる。
第二の試薬（濃度１０％のアセトアルデヒドに飽和に溶かした没食子酸）を単独で紙片上の血液に添加し、ＣＣＤカメラで１０分観察したところ、１００（ｃｄ／ｍ２）の発光を測定できた。このことから、被検査者の血液中の活性酸素ラジカル由来の成分、すなわち、酸素（３Ｏ２）が、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けた過酸化水素（ＨＯＯＨ）の状態となり、これがメディエーターに結合、あるいは吸着している状態の物質の量が輝度１００（ｃｄ／ｍ２）に対応する量であることを確認できた。
また、第三の試薬（エチルアルコールにコリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）を２．５％濃度に溶解したもの）を単独で紙片上の血液に添加し、ＣＣＤカメラで１０分観察したところ、１５（ｃｄ／ｍ２）の発光を測定できた。このことから、被検査者の血液中の活性酸素ラジカル由来の成分、すなわち、酸素（３Ｏ２）が、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けた過酸化水素（ＨＯＯＨ）の状態となり、これが活性酸素ラジカルスカベンジャーに結合、あるいは吸着している状態の物質の量が輝度１５（ｃｄ／ｍ２）に対応する量であることを確認できた。
このように第二の試薬、第三の試薬をそれぞれ単独で用いた際に測定できる、人体中において発生している活性酸素ラジカル由来の成分は、生体の損傷、加熱で発生する活性酸素ラジカルである。これらを、穿刺具を用いて人体から微量に採取した血液に試薬を添加し、ＣＣＤカメラで発光現象を観察するという極めて簡単な方法で、初めて観察することができた。
これによって、本発明の方法によれば、被検査者の人体中における活性酸素ラジカル由来の成分の多寡を、被検査者の耳朶や手の親指の先から微量採取した血液を用いて簡便に測定し、活性酸素ラジカル由来の成分の発生要因・発生因子を簡便に把握して、活性酸素ラジカルによって引き起こされる細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等による疾患の治療に有効に活用することができる。
例えば、本願の発明者の実験によれば、被検査者の血液中の、酸素（３Ｏ２）が、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けた過酸化水素（ＨＯＯＨ）の状態となり、これがメディエーターに結合、あるいは吸着している状態の物質の量が、２０分間のＣＣＤカメラ（感度：１０）による測定で、３０輝度に相当する場合、これは、ＤＮＡ損傷ラインである１ｍＭＨＯＯＨに相当するものであることが確認できている。そこで、本発明の方法において、第二の試薬を単独で用いた際に測定された数値（輝度）を、活性酸素ラジカルによって引き起こされる細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等による疾患の治療に有効に活用することができる。
同様に、被検査者の血液中の、酸素（３Ｏ２）が、２個の電子（ｅ−）の供与と、２個のプロトン（Ｈ＋）による還元を受けた過酸化水素（ＨＯＯＨ）の状態となり、これが活性酸素ラジカルスカベンジャーに結合、あるいは吸着している状態の物質の量をＣＣＤカメラによって測定したときの輝度と、ＤＮＡ損傷ラインとの関係を実験によって確認しておくことにより、本発明の方法において、第三の試薬を単独で用いた際に測定された数値（輝度）を、活性酸素ラジカルによって引き起こされる細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等による疾患の治療に有効に活用することができる。
産業上の利用の可能性
本願発明によれば、穿刺具採血によって簡単に人体から採取した微量な血液を用いて、人体内における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡、単独では自ら活性酸素ラジカルを消去する能力に乏しいが、活性酸素ラジカルスカベンジャーと共に存在することによって、活性酸素ラジカルを消去する作用を促進させる性質を有する物質（メディエーター）の多寡を、発光現象を利用して、簡便に、把握することができる。
本発明の測定方法は、被検査者の手の親指の先、あるいは耳朶などから穿刺具を用いて微量に採取した血液を用いて簡便に行うことができるので、健康診断などの用途に用いることが考えられる。
また、生体の損傷、加熱で発生して人体中に存在している活性酸素ラジカル由来の成分（過酸化水素（ＨＯＯＨ）の形態となった活性酸素ラジカルが、活性酸素ラジカルスカベンジャーに結合、あるいは吸着している状態のもの、及び、過酸化水素（ＨＯＯＨ）の形態となった活性酸素ラジカルが、メディエーターに結合、あるいは吸着している状態のもの）の多寡を、発光現象を利用して簡便に、把握することができる。
すなわち、人間の体調の目安を判断する基準となる体温を測定する体温計が存在するように、発光現象を利用した、いわば体光計のようにして、人体内における、活性酸素ラジカルスカベンジャーの多寡、メディエーターの多寡、活性酸素ラジカル由来の成分の多寡を簡便に測定することができる。
これによって、活性酸素消去能力の多寡の把握、活性酸素ラジカル由来の成分の発生要因・発生因子を簡便に把握でき、活性酸素ラジカルによって引き起こされる細胞やＤＮＡの損傷、脂質の過酸化等による疾患の治療に有効に活用することが可能になる。
【国際調査報告】
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