(57)【要約】ヒアルロン酸のエステル誘導体の保存安定性と、関節治療剤の注射時の刺激性や疼痛の回避をできるヒアルロン酸エステル誘導体を含む分離型医療材料を提供する。  ｐＨ４．５〜６．５に緩衝されたヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液の（Ａ）液と、該（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液とが分離された状態で保持されている分離型医療材料。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ４．５〜６．５に緩衝されたヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液の（Ａ）液と、該（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液とからなり、（Ａ）液と（Ｂ）液とは投与時には混合して投与されるが、投与前は分離された状態で保持されていることを特徴とする分離型医療材料。
【請求項２】
（Ａ）液のヒアルロン酸エステル誘導体が、自己架橋ヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１に記載の分離型医療材料。
【請求項３】
（Ａ）液のヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液のヒアルロン酸エステル誘導体の濃度が１〜２０質量％の範囲であることを特徴とする請求項１又は２に記載の分離型医療材料。
【請求項４】
（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液が、ヒアルロン酸を溶解した水溶液であることを特徴とする請求項１、２、又は３に記載の分離型医療材料。
【請求項５】
更に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分離型医療材料。
【請求項６】
ｐＨ４．５〜６．５に緩衝されたヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液の（Ａ）液に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤が溶解又は分散していることを特徴とする請求項５に記載の分離型医療材料。
【請求項７】
（Ａ）液のヒアルロン酸エステル誘導体中に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤が溶解又は分散していることを特徴とする請求項５又は６に記載の分離型医療材料。
【請求項８】
（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤が溶解又は分散していることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の分離型医療材料。
【請求項９】
医薬的に受容し得る潤滑剤がリン脂質であることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の分離型医療材料。
【請求項１０】
シリンジに（Ａ）液と（Ｂ）液とが分離した状態で充填された関節注入型医療材料であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の分離型医療材料。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの分離型医療材料を構成する（Ａ）液と（Ｂ）液とを、投与直前に混合した混合液を患者の関節に注入して投与することを特徴とする関節疾患用医療材料の投与方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体適合性のヒアルロン酸のエステル誘導体を用いた関節症治療用注入剤に関するものである。
【背景技術】  ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさか、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖球菌の培養物からも精製物が調製されている。
天然産のヒアルロン酸は、分子量について多分散性であるが、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植または注入した場合であっても優れた生体適合性を示すことが知られている。
関節液は、生体関節において関節軟骨へ栄養を供給するとともに、他に類を見ない優れた潤滑機能とショックアブソーバー機能を有し、その優れた粘弾性機能は関節液中の主成分の一つであるヒアルロン酸に大きく支配されている。ヒアルロン酸の分子量は数百万〜１千万もの高分子量であることが知られている。
一般に、変形性関節症、慢性関節リウマチ等の各種関節症患者の関節液中のヒアルロン酸濃度及び分子量の分析結果から、関節症患者の関節液は正常関節液に比較し、濃度、分子量において低下傾向が認められており、このことが関節液の潤滑作用、関節軟骨表面保護作用の低下に起因する運動機能障害や疼痛症状の発生に密接な関係があるものと考えられている。
これら関節疾患のうち変形性膝関節症に有効な手段として、ヒアルロン酸溶液を疾患関節部位へ注入する方法が採用されてきており、その膝関節治療剤の例としては、アルツ（生化学工業社製、平均分子量９０万）、Ｈｙａｌｇａｎ（Ｆｉｄｉａ社製、平均分子量＜５０万）や、高分子量の方が一層の効巣が期待できるとの考えのもとに本発明者らが開発した、慢性関節リウマチにも適応するスベニール（アベンティスファーマ社／中外製薬社／電気化学工業社製、平均分子量１９０万）が挙げられる。
また、ヒアルロン酸を化学的に架橋することで高分子化し粘弾性を改良した、架橋ヒアルロン酸ゲルを含有するＳｙｎｖｉｓｃ（ジェンザイム社製）が開発されている。この架橋ヒアルロン酸ゲルは架橋剤ジビニルスルホンでヒアルロン酸を化学的に架橋したヒアルロン酸ゲルでハイランと呼ばれる。ハイラン及びハイランを架橋したゲルの生成法は、米国特許第４，７１３，４４８号に詳細に記載されている。ヒアルロン酸をベースとする単一及び混合ゲルは、米国特許第４，５８２，８６５号及び同第４，６０５，６９１号に記載されている。
これら関節製剤を用いた治療は、患者の関節に直接、１週間毎に３〜５回の注射を行う必要があり、患者及び医者の負担の面から注射回数の低減が望まれている。
自己架橋ヒアルロン酸を含む関節治療剤に関する技術もＷＯ９７／４９４１２に記載されている。ヒアルロン酸を架橋することによる粘弾性的な性質の制御と、関節内での滞留性を目的としている。自己架橋ヒアルロン酸とヒアルロン酸の水溶液を均一に混合することによって、粘弾性を制御する技術が開示されている。自己架橋ヒアルロン酸が関節腔内で加水分解することにより、天然のヒアルロン酸の容器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ）となり得ることも概念的に示されている。
関節液のｐＨは約７．３〜７．６である。（日本生化学学会編、生化学ハンドブックＩ、東京化学同人、１９７９年、ｐ１５６９）関節腔内に注射される関節治療剤のｐＨが、関節液のｐＨと大幅に異なった場合、刺激性や疼痛の原因となることが指摘されている。このため、アルツやスベニールのｐＨは７．４を中心とした範囲に調整されている。
医療機関での投薬調整時の負担軽減、細菌汚染や異物混入の防止等を目的とし、関節治療剤についても、バイアル製剤からプレフィルシリンジの様なキット製剤に、販売形態が大きく変化してきた。バイアル製剤から、特に高粘度のヒアルロン酸製剤を注射筒に吸引する時間は長く、吸引した量のバラツキも大きい。キット製剤では、医療機関での投薬調整の負担を軽減するとともに、設定液量を容易に、より均一に注入することができ、医療上有益な剤形であることが示されている。
本発明者らは、ヒアルロン酸のエステル誘導体、特に自己架橋ヒアルロン酸の性質を鋭意検討する過程で該エステル誘導体が中性領域では十分な安定性を持たないことを見出した。生体に投与するような医療材料は、生理的条件である中性領域になるように製剤化されるが、このような条件で医療材料としてヒアルロン酸のエステル誘導体を適応した場合には、流通過程等での長期保存に耐えられない可能性が考えられた。
そこで、特にこのようなヒアルロン酸のエステル誘導体から成る医療材料の製剤化に当たり、ヒアルロン酸のエステル誘導体が中性ｐＨ領域で不安定となるといった問題を解決するために、該エステル誘導体を安定に提供する方法を鋭意検討してきた。その結果、該エステル誘導体がｐＨ４．５〜６．５の弱酸性領域条件下で安定性が高まることを見出した。そして、ヒアルロン酸のエステル誘導体を成分とする医療材料を提供する場合に、弱酸性のヒアルロン酸のエステル誘導体の分散水溶液とその中和剤溶液、中和剤溶液中にヒアルロン酸が溶解している場合も含めて、両者を異なったｐＨ条件になるように、分離された状態で充填しておき、治療時に混合して注入でき、最終的には生理的な中性ｐＨ条件で投与できるような製剤を考案し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
本発明は、以下の構成を要旨とする。
（１）ｐＨ４．５〜６．５に緩衝されたヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液の（Ａ）液と、該（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液とからなり、（Ａ）液と（Ｂ）液とは投与時には混合して投与されるが、投与前は分離された状態で保持されていることを特徴とする分離型医療材料。
（２）（Ａ）液のヒアルロン酸エステル誘導体が、自己架橋ヒアルロン酸であることを特徴とする（１）記載の分離型医療材料。
（３）（Ａ）液のヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液のヒアルロン酸エステル誘導体の濃度が１〜２０質量％の範囲であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の分離型医療材料。
（４）（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液が、ヒアルロン酸を溶解した水溶液であることを特徴とする（１）、（２）又は（３）に記載の分離型医療材料。
（５）更に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤を含有することを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の分離型医療材料。
（６）ｐＨ４．５〜６．５に緩衝されたヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液の（Ａ）液に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤が溶解又は分散していることを特徴とする（５）に記載の分離型医療材料。
（７）（Ａ）液のヒアルロン酸エステル誘導体中に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤が溶解又は分散していることを特徴とする（５）又は（６）に記載の分離型医療材料。
（８）（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液に、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤が溶解又は分散していることを特徴とする（５）〜（７）に記載の分離型医療材料。
（９）医薬的に受容し得る潤滑剤がリン脂質であることを特徴とする（５）〜（８）のいずれかに記載の分離型医療材料。
（１０）シリンジに（Ａ）液と（Ｂ）液液とが分離した状態で充填された関節注入型医療材料であることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載の分離型医療材料。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかの分離型医療材料を構成する（Ａ）液と（Ｂ）液とを、投与直前に混合した混合液を患者の関節に注入して投与することを特徴とする関節疾患用医療材料の投与方法。
【図面の簡単な説明】  図１：本発明の分離型医療材料の一実施例の態様である、プレフィルシリンジに充填されたサンプルの概略図である。
【符号の説明】
１      ：  先端部密封用部品
２      ：  ラバーストッパー
３      ：  シリンダー
４      ：  プランジャー・ロッド
（Ａ）  ：  ゲル懸濁液
（Ｂ）  ：  ヒアルロン酸溶液
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は、約１×１０５〜約１×１０７ダルトンの範囲内のものが好ましい。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから加水分解処理等をして得た低分子量のものでも同様に好ましく使用できる。
尚、本発明でいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
ヒアルロン酸のエステル誘導体、及びその製造方法としては、一部またはすべてのカルボキシ基が、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族（ａｒｙｌａｌｉｐヒアルロン酸ｔｉｃ）、環状脂肪族、複素環式系列のアルコールでエステル化されたヒアルロン酸エステルがＥＰ  ０２１６４５３  Ｂ１に開示される。また、一部またはすべてのカルボキシ基が同一の多糖鎖または他の多糖鎖のアルコール基でエステル化された、自己架橋ヒアルロン酸エステルがＥＰ  ０３４１７４５  Ｂ１に開示される。また、一部またはすべてのカルボキシ基が脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、環状脂肪族、複素環式系列のポリアルコールでエステル化され、スペーサー鎖によって架橋を生じたヒアルロン酸の架橋化合物がＥＰ  ０２６５１１６  Ｂ１に開示される。また、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の部分的または全体的エステルとの、コハク酸ヘミエステルがＷＯ９５／２５７５１に開示される。また、ヒアルロン酸の水溶液を酸性に調整し、該水溶液を凍結し、次いで解凍することを少なくとも１回行うことによって生成する自己架橋ヒアルロン酸ゲルがＷＯ９９／１０３８５に開示される。また、凍結を行わずとも５質量％以上の濃度になるようにヒアルロン酸と酸性溶液を混合・該共存状態を保持することで生成する自己架橋ヒアルロン酸がＷＯ０１／５７０９３に開示される。ヒアルロン酸をエステル誘導体化することにより、ヒアルロン酸の水溶液と比較して、生体内での滞留性が向上することが開示されている。
ヒアルロン酸のエステル誘導体を関節治療剤に使用する場合、粘弾性的な性質の制御が目的なら、エステル架橋したヒアルロン酸のエステル誘導体が好ましい。多価アルコールとヒアルロン酸のカルボキシル基のエステル、多価カルボン酸とヒアルロン酸の水酸基とのエステル、ヒアルロン酸のカルボキシル基と水酸基間がエステル結合した自己架橋ヒアルロン酸が好ましい。エステル結合が関節腔内で加水分解することにより、天然のヒアルロン酸の容器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ）とすることを目的とする場合でも、低エステル化度で生体内の滞留性を大きく変化することができるエステル架橋したヒアルロン酸が好ましい。
自己架橋ヒアルロン酸の安全性は、自己架橋ヒアルロン酸の分解により放出される天然のヒアルロン酸が生理学的代謝経路により代謝されるので、別の架橋反応により製造されたエステル架橋ヒアルロン酸より良好である可能性がある。
ヒアルロン酸のエステル誘導体を関節治療剤に使用するとき、天然のヒアルロン酸の容器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ）とすることを目的とする場合、放出されるヒアルロン酸自体の分子量が大きい方が好ましい。ヒアルロン酸の関節腔内からの代謝（移動）が、ヒアルロン酸自体の分子量に大きく左右されることが知られている（Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  １４３、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９８９、ｐ２６５）。
放出されるヒアルロン酸の分子量が約３０万以下の場合、放出されたヒアルロン酸は速やかに関節腔内から代謝（移動）するため、関節治療の効果は大きく減じる可能性がある。
ヒアルロン酸のエステル誘導体を関節治療剤に使用する場合、注射針を通して関節腔内に注入するため、ヒアルロン酸のエステル誘導体は生理的に受容可能な媒質に分散した懸濁液にする必要がある。懸濁液は、ヒアルロン酸のエステル誘導体をその製造工程、精製工程のいづれかの段階で、ミキサーやホモジナイザーのような破砕機を用いて破砕することにより調整できる。ヒアルロン酸のエステル誘導体の分散粒子径は、関節治療剤の物理化学的な性質や効果を制御するため任意に調整することができる。ヒアルロン酸のエステル誘導体を、生理的に受容可能な媒質に分散した後、ホモジナイザーで処理すれば、０．０５ｍｍ〜２．０ｍｍの分散粒子径に容易に調整できる。
エステル架橋ヒアルロン酸は、生理的に受容可能な媒質中で膨潤してゲルになる。ゲルの平衡膨潤倍率は、エステル架橋ヒアルロン酸の架橋度によって任意に調整することができる。例えば、平衡膨潤倍率が１００倍の場合、生理的に受容可能な媒質中のヒアルロン酸濃度は１．０質量％になる。平衡膨潤倍率が１０倍の場合、生理的に受容可能な媒質中のヒアルロン酸濃度は１０質量％になる。エステル架橋ヒアルロン酸を関節治療剤に使用するとき、天然のヒアルロン酸の容器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ）とすることを目的とする場合、生理的に受容可能な媒質中のヒアルロン酸濃度が高い方が、関節腔内へ注入する容量を一定にした場合、関節腔内に注入するヒアルロン酸量を大きくできるため、大きな治療効果が期待できる。
市販されている膝関節治療剤、例えばアルツやスベニールなどのヒアルロン酸水溶液のヒアルロン酸濃度は１．０質量％である。生理的に受容可能な媒質中に分散されたエステル架橋ヒアルロン酸の濃度が１質量％より小さい場合、市販品以上の大きな治療効果は望めない。またヒアルロン酸分子自体が水に対して大きな親和性を有するため、生理的に受容可能な媒質中にエステル架橋ヒアルロン酸を分散した場合、そのヒアルロン酸濃度を２０質量％よりも大きくすることは、分散液の流動性を著しく損なうため実用的ではない。
本発明において、ｐＨ４．５〜６．５に緩衝されたヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液の（Ａ）液と、（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液は、最終的に（Ａ）液と（Ｂ）液を混合したとき、生理的に受容な水性媒質である。生理的に受容とは、関節治療剤が関節腔内に注入されたとき、水性媒質自身が好ましくない作用もしくは副作用、例えば、組織の膨潤または収縮、炎症等の原因とならないことを意味する。生理的に受容な水性媒質は、通常アルカリもしくはアルカリ土類金属の塩化物、硫酸塩、リン酸塩または重炭酸塩のような無機塩類、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化マグネシウム、及び対応するカリウム、カルシウム塩、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウムのような有機酸の塩、またはグルコース、マンノース、多価アルコールのような中性有機物質、例えばグリセリン、マンニトール等から選択される１つ以上の低分子量物質の水溶液である。低分子量成分の種類と量は、最終的に（Ａ）液と（Ｂ）液を混合したとき、生理的に受容な浸透圧、ｐＨ、イオン含量になることを考慮して選択されるべきである。
ｐＨ４．５〜６．５に緩衝されたヒアルロン酸エステル誘導体を含む水溶液の（Ａ）液の緩衝成分は、指定のｐＨに緩衝できる生理的に受容な成分から任意に選択できる。例えば、酢酸−酢酸ナトリウム、乳酸−乳酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウムのような有機酸塩が好適である。ヒアルロン酸自体もカルボキシル基を有する高分子電解質であり、ヒアルロン酸自体が有する緩衝性も有効に利用できる。
（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液の緩衝成分は、医薬品添加物として使用が認められている物質から、最終的に（Ａ）液と（Ｂ）液を混合したとき、生理的に受容な浸透圧、ｐＨ、イオン含量になることを考慮して、任意に選択することができる。例えば、（Ａ）液の緩衝成分が酢酸−酢酸ナトリウムの場合、（Ｂ）液の緩衝成分として水酸化ナトリウムを選択すると、最終的に（Ａ）液と（Ｂ）液を混合したとき、酢酸ナトリウムが生成する。
（Ａ）液と混合したときのｐＨを６．８〜７．８の範囲内にする緩衝能を有する水溶液の（Ｂ）液がヒアルロン酸を溶解した水溶液である場合、ヒアルロン酸自体が不安定な物質であることも考慮する必要がある。ヒアルロン酸はナトリウム塩の形で製剤化して適用されているが、ヒアルロン酸ナトリウムさえも水溶液の状態においては安定性に欠けている。また、ヒアルロン酸は分子量が大きくなるほど安定性が悪くなるという性質を有する。ヒアルロン酸ナトリウムの溶液は、ｐＨによってその安定性が左右され、中性付近においては比較的安定なものである。そのため、この場合、（Ｂ）液自体のｐＨも８．０以下にし、緩衝成分の濃度によって緩衝能を調整することが望ましい。ｐＨを８．０以下に調整する緩衝成分としては、例えば、リン酸緩衝成分、ホウ酸緩衝成分、炭酸緩衝成分、有機物系緩衝成分を使用することができる。溶解するヒアルロン酸の濃度は、関節治療剤としての有効性から０．５〜２．０質量％の範囲にすることが望ましい。
（Ａ）液と、ヒアルロン酸を溶解した場合は（Ｂ）液にも、ヒアルロン酸自体の安定性を向上させることができる安定剤を添加することができる。ヒアルロン酸自体の安定性を向上させる安定剤は、例えば、特開平８−１０４６４２号、特開平１０−２１２３０３号、特開平１１−３０２１９７号に開示されている。
安定剤自体がｐＨの制限を受けないことから、例えば、ヨウ素含有の還元剤やイオウ含有の還元剤は好適である。また、ヒアルロン酸自体の安定性が、鉄などの重金属イオンに大きく左右される場合があることから、リン酸などの金属の不活性剤を添加することも有効である。
次に本発明の分離型医療材料についての実際の保存形態について述べる。
（Ａ）液と（Ｂ）液を分離して保存する実際の形態において、（Ａ）液はヒアルロン酸のエステル誘導体を破砕後に特定の水性媒質に分散させた懸濁液として容器に充填される。（Ｂ）液は、（Ａ）液と保存中に混合しないように、別の容器又は同一容器内の別の区画に充填される。一般的に、医薬品・医療材料として製品を提供する場合には、シリンジに充填して供する。例えば、二液分離型のプレフィルシリンジなどが目的に合致しており、このような保存容器によって（Ａ）液と（Ｂ）液を別々に封入するのが好ましい。ここで、通液用のシリンジの突起部分の位置、ゴム栓位置などは、（Ａ）液と（Ｂ）液の封入量や容積比に応じて最適の位置に調整されるものである。（Ａ）液と（Ｂ）液の混合性を向上させる目的で、スタティックミキサー等を装着した容器を使用することができる。
スタティックミキサーは二液分離型のプレフィルシリンジのシリンジ先端にも、（Ａ）液と（Ｂ）液を別々のシリンジに充填し、２つのシリンジの先端の混合部分にも装着することができる。
本発明の関節治療用に用いる医療材料には、医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤を含有することができる。医薬品としては、麻酔剤、抗生物質、ステロイド性及び非ステロイド性の抗炎症剤、ソマトスタチン等のホルモンタイプの抗炎症剤、上皮親和性のビタミン、ＩＬ−１及びＩＬ−６等のサイトカイン、サイトカイン受容体、ＦＧＦ等の増殖因子、抗リウマチ剤、抗アレルギー剤、免疫抑制剤等の適当な医薬的に活性な薬剤を添加することができる。
潤滑剤としては、リン脂質が好適である。本発明に用いられるリン脂質は、動物組織から抽出したものでも、また人工的に合成して製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。リン脂質は、好ましくはフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン及びそれらの誘導体を含む。特に好ましくは、α−ジパルミトイルフォスファチジルコリン（α−ＤＰＰＣ）である。このα−ＤＰＰＣはＬ体、Ｄ体、あるいはラセミ（ＤＬ）体混合物でもよい。
本発明に用いられるリン脂質の濃度は、１〜２００ｍｇ／ｍｌが好ましい。リン脂質の濃度が１ｍｇ／ｍｌ未満では、関節用医薬品としては効果が低く、２００ｍｇ／ｍｌを越えるとリン脂質の凝集が大きくなり保存の面で難があり、取り扱いが難しくなるため好ましくない。リン脂質は、両親媒性物質なのでヒアルロン酸溶液中での安定性などの目的のためリポソーム化しても良いが、特にリポソーム化せず懸濁させるだけでもよい。
本発明の関節治療用に用いる医療材料に添加する医薬品又は医薬的に受容し得る潤滑剤は、医薬品や潤滑剤の物理化学的な性質や添加する目的に応じて、（Ａ）液または（Ｂ）液のいずれかに添加すること、また両液に添加することは任意である。また同様に、（Ａ）液中のヒアルロン酸のエステル誘導体の分散粒子内に添加するか、分散媒質中に添加するか、またその両者に添加するかも任意である。例えば、添加する医薬品の関節腔内での濃度を一定に保つように、すなわちＤＤＳ効果を持つように製剤設計する場合は、ヒアルロン酸のエステル誘導体の分散粒子内に所望の医薬品や潤滑剤を添加することが望ましい。
本発明の分離型医療材料として提供される形態は、シリンジに充填された関節注入型医療材料が挙げられる。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  凍結・解凍法によるヒアルロン酸ゲルの製造例
ヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製：分子量２×１０６ダルトン）を蒸留水に溶解し、１質量％のヒアルロン酸の水溶液を調製した。この水溶液のｐＨを、１ｍｏｌ／ｌ塩酸（和光純薬）でｐＨ１．５に調整する。ヒアルロン酸の酸性水溶液１５ｍｌを３０ｍｌのガラスビンに入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。そして６５時間放置した後、２５℃で解凍した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。
このゲルを、１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に何度か浸漬させ、ゲルを完全に中和する。次に得られたスポンジ状のヒアルロン酸ゲルをミキサーにより破砕し、ゲル破砕懸濁液を得た。これを、３，０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離し、ゲル分を分離して、これに新しい緩衝液を加える操作を５回以上繰り返し、ゲル溶媒を５ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝生理食塩水に置換した。
以上の方法により、酸性凍結・解凍法で製造されたヒアルロン酸ゲル懸濁液が得られた。
酸混合法によるヒアルロン酸ゲルの製造例
ヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製、分子量２×１０６ダルトン）の粉末を５ｇ量り取り、これに氷冷しておいた１５ｍｌの１Ｎ硝酸（和光純薬）を添加した。両者をビーカー内で十分に混合した後、ビニール袋に入れた状態で４℃の冷蔵庫に入れ、６５時間放置した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。これを、１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に何度か浸漬させ、ゲルを完全に中和した。次に得られたスポンジ状のヒアルロン酸ゲルをミキサーにより破砕し、ゲル破砕懸濁液を得た。これを、３，０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離し、ゲル分を分離して、これに新しい緩衝液を加える操作を５回以上繰り返し、ゲル溶媒を５ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝生理食塩水に置換した。以上の方法により、酸混合法で製造されたヒアルロン酸ゲル懸濁液が得られた。
以上の方法で製造したヒアルロン酸ゲルのｐＨ安定性を、以下の加速試験で評価した。評価には、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７の酢酸緩衝生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水に懸濁された１質量％のヒアルロン酸濃度になるように調節したゲル懸濁液を用いた。
ゲル懸濁液１０ｍｌを１５ｍｌのプラスチックチューブに入れ、これを６０℃の温浴上で放置し、２時間おきにサンプリングを行った。サンプリングした液は、まず１２，０００ｒｐｍ、５分の遠心でゲル分を除き、その後０．２２μのフィルターでろ過して完全にゲルを除去した。これについてＧＰＣ分析と比色分析を行い、ヒアルロン酸濃度を求めた。この上清中のヒアルロン酸濃度は、ゲルが溶解した濃度であるために、初期濃度との比から残存するゲルの割合と溶解したゲルの割合が求められる（両者の和は１００％に相当する）。以上の方法により、各サンプリング時間における残存するゲルの割合を調べた。結果を表１に示す。
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表１に示すように、溶解後２５時間ではｐＨ７に調整したゲル懸濁液のゲル残存率が７５％であるのに対して、ｐＨ６に調整したゲル懸濁液では８４％が、そしてｐＨ４に調整したゲル懸濁液では８８％が残存していた。更に、ｐＨ５では９５％ものゲルが残存しており、有意にｐＨ５付近の低ｐＨ側でのゲルの保存安定性があることがわかった。
【実施例２】  ヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製：分子量２×１０６ダルトン）を蒸留水に溶解し、１質量％のヒアルロン酸の水溶液を調製した。この水溶液のｐＨを、１ｍｏｌ／ｌ塩酸（和光純薬）でｐＨ１．５に調整する。ヒアルロン酸の酸性水溶液１００ｍｌを２００ｍｌのガラスビンに入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。そして１４日間放置した後、２５℃で解凍した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。
これを、１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に何度か浸漬させ、ゲルを完全に中和する。次に得られたスポンジ状のヒアルロン酸ゲルをミキサーにより破砕し、ゲル破砕懸濁液を得た。これを、３，０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離しゲル分を分離した。ゲル分に１リットルの蒸留水を加え、撹拌下で洗浄した。ゲル分の遠心分離と洗浄を５回繰り返して、中和剤のリン酸緩衝成分を完全に除去した。生理的食塩水に５質量％のヒアルロン酸濃度とし、そのｐＨを塩酸を加えて５．０に調整し、（Ａ）液とした。０．０１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を調製し、（Ｂ）液とした。
上記ｐＨ５．０に調整した  （Ａ）液１０ｍｌに、上記（Ｂ）液１．６ｍｌを加えて良く混合した。混合された水溶液のｐＨは７．４だった。
【実施例３】  ヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製：分子量２×１０６ダルトン）を２０ｍＭのリン酸緩衝液でｐＨを８．０に緩衝した生理的食塩水に溶解し、（Ｂ）液とした。実施例２で調製した（Ａ）液２．０ｍｌに、上記で調製した（Ｂ）液８．０ｍｌを加えて良く混合した。混合された水溶液のｐＨは７．４だった。
【実施例４】  ヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製：分子量２×１０６ダルトン）を２０ｍＭのホウ酸緩衝液でｐＨを８．０に緩衝した生理的食塩水に溶解し、（Ｂ）液とした。実施例２で調製した（Ａ）液２．０ｍｌに、上記で調製した（Ｂ）液８．０ｍｌを加えて良く混合した。混合された水溶液のｐＨは７．４だった。
【実施例５】  凍結・解凍法によるヒアルロン酸ゲルを含む分離型医療材料の製造例
ヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製、分子量２×１０６ダルトン）を蒸留水に溶解し、１質量％のヒアルロン酸の水溶液を調製した。この水溶液のｐＨを、１ｍｏｌ／ｌ塩酸（和光純薬）でｐＨ１．５に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液１５ｍｌを３０ｍｌのガラスビンに入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。
そして６５時間放置した後、２５℃で解凍し、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。これを、１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に何度か浸漬させ、ゲルを完全に中和した。
次に、得られたスポンジ状のヒアルロン酸ゲルをカップミキサー（１２，０００ｒｐｍ、２分）により破砕し、ゲル破砕懸濁液を得た。これを、３，０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離し、ゲル分を分離した。そして、これに新しい緩衝液を加える操作を５回以上繰り返し、ゲル溶媒をｐＨ５の５ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝生理食塩水に置換した。
２質量％濃度になるように酢酸緩衝生理食塩水に懸濁したヒアルロン酸ゲル懸濁液（ｐＨ５．０）の（Ａ）液と、１質量％濃度になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に溶解したヒアルロン酸（電気化学工業社製）溶液の（Ｂ）液とを、（Ａ）：（Ｂ）＝２：８になるようにトップ社のプレフィルシリンジ（Ｇタイプ）に別々に充填した。すなわち、図１に示すように（Ａ）液のヒアルロン酸ゲル懸濁液を注射口側のコンパートメント（Ａ）に０．６ｍｌ充填し、（Ｂ）液のヒアルロン酸溶液をプランジャー側のコンパートメント（Ｂ）に２．４ｍｌ充填した。
【実施例６】  酸混合法によるヒアルロン酸ゲルを含む分離型医療材料の製造例
ヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製、分子量２×１０６ダルトン）の粉末を５ｇ量り取り、これに氷冷しておいた１５ｍｌの１ｍｏｌ／ｌ硝酸（和光純薬）を添加した。両者をビーカー内で十分に混合した後、ビニール袋に入れた状態で４℃の冷蔵庫に入れ、６５時間放置した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。これを、１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に何度か浸漬させ、ゲルを完全に中和した。
次に、得られたスポンジ状のヒアルロン酸ゲルをカップミキサー（１２，０００ｒｐｍ、２分）により破砕し、ゲル破砕懸濁液を得た。これを、３，０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離し、ゲル分を分離した。そして、これに新しい緩衝液を加える操作を５回以上繰り返し、ゲル溶媒をｐＨ５の５ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝生理食塩水に置換した。
２質量％濃度になるように酢酸緩衝生理食塩水に懸濁したヒアルロン酸ゲル懸濁液（ｐＨ５．０）の（Ａ）液と、１質量％濃度になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に溶解したヒアルロン酸（電気化学工業社製）溶液の（Ｂ）液とを、（Ａ）：（Ｂ）＝２：８になるようにトップ社のプレフィルシリンジ（Ｇタイプ）に別々に充填した。すなわち、図１に示すように（Ａ）液のヒアルロン酸ゲル懸濁液を注射口側のコンパートメント（Ａ）に０．６ｍｌ充填し、（Ｂ）液のヒアルロン酸溶液をプランジャー側のコンパートメント（Ｂ）に２．４ｍｌ充填した。
比較例１
非分離型のヒアルロン酸とヒアルロン酸ゲルの混合医療材料の調製
２質量％濃度になるように酢酸緩衝生理食塩水に懸濁したヒアルロン酸ゲル懸濁液（ｐＨ５．０）の（Ａ）液と、１質量％濃度になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に溶解したヒアルロン酸（電気化学工業社製）溶液の（Ｂ）液とを、（Ａ）：（Ｂ）＝２：８になるように混合後にテルモ社のシリンジ（ＳＳ−０２Ｓ２１３８）に注入した。
【実施例７】  ヒアルロン酸製剤中のヒアルロン酸ゲル安定性
実施例２と比較例１で調製した複数のシリンジを６０℃の恒温槽に保存した。これを各時間で取り出し、サンプリングを行った。サンプリングした液は、まず１２，０００ｒｐｍ、５分の遠心でゲル分を除き、その後０．２２μフィルターでろ過して完全にゲルを除去した。これについてＧＰＣ分析と比色分析を行い、ヒアルロン酸濃度を求めた。この上清中のヒアルロン酸濃度は、ゲルが溶解した濃度分だけ増加しているために、初期濃度との比から残存するゲルの割合と溶解したゲルの割合が求められる（両者の和は１００％に相当する）。以上の方法により、各サンプリング時間における残存するゲルの割合を調べた。結果を表２に示す。
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表２に示すとおり、６０℃に保存した時間が２５時間後では、均一に混合された比較例１では、ゲルが開始時の６４％しか残存していなかったのに対して、実施例１の分離させた状態でのゲル残存率は開始時の９４％と有意に高かった。これより、分離して保存することでゲルの安定性を高めることがわかった。
【実施例８】  ヒアルロン酸製剤の生体内での貯留性
膝関節製剤としての有効性を評価するために、実施例５で作成したヒアルロン酸ゲルとヒアルロン酸溶液の分離型医療材料のウサギ膝関節内貯留性試験を行った。試験は次の手順で行った。３ヶ月齢のウサギ（Ｋｂｓ：ＮＺＷ雄）の左膝に０．２５ｍｌのヒアルロン酸ゲルとヒアルロン酸溶液の混合液（ヒアルロン酸ゲル懸濁液：ヒアルロン酸溶液＝２：８）を投与した。投与１日及び３日後に、動物をペントバルビタールナトリウムの耳介静脈内投与による麻酔後、放血致死させた。その後投与した方の脚を切断し膝関節を背面より切開して、腔内を生理食塩水で洗いだし、膝関節腔内貯留液を回収した。また、投与しない方の脚についても同様の回収を行った。得られた関節腔内貯留液はｐＨをアルカリ側に調整して残存するヒアルロン酸ゲルを完全に分解させた後、ＧＰＣ分析により全ヒアルロン酸量を定量した。そして、投与を行っていない方の膝から回収した貯留液のヒアルロン酸量でバックグラウンド補正をして、投与後１日および３日後のヒアルロン酸の回収率を得た。
その結果、投与してから１日経過後のヒアルロン酸の回収率は、８０％であり、投与してから３日経過後のヒアルロン酸の回収率は、５０％であった。
従って、投与してから１日経過後と３日経過後で、それぞれ関節腔に投与したヒアルロン酸が残存していることがわかり、関節製剤としての有用性が示された。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、弱酸性のヒアルロン酸のエステル誘導体の分散水溶液とその中和剤水溶液、中和剤水溶液中にヒアルロン酸が溶解している場合も含めて、両者が異なったｐＨ条件になるように、分離された状態で保持しておくことで、保存安定性に優れた状態とすることができる。
分離された状態で保持しておき、治療する投与時に混合することで、最終的には生理的な中性ｐＨ条件で投与できるような製剤を提供することができる。
本発明により、ヒアルロン酸のエステル誘導体の保存安定性と関節治療剤の注射時の刺激性や疼痛の回避を両立することができ、ヒアルロン酸のエステル誘導体を関節治療剤として提供することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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