(57)【要約】課題：抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン等の生理活性を有するタンパク質の溶液状態における会合体の生成を抑制し、タンパク質溶液製剤の安定性を向上させる方法を提供する。  解決手段：磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤の安定化方法及び磁力線発生装置を備えたタンパク質溶液製剤の収納容器。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤の安定化方法。
【請求項２】
磁束密度が１ミリテスラ以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が生理活性タンパク質である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
生理活性タンパク質が、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモンから選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
生理活性タンパク質が造血因子である請求項４記載の方法。
【請求項６】
造血因子がエリスロポエチン又は顆粒球コロニー刺激因子である請求項５記載の方法。
【請求項７】
生理活性タンパク質が抗体である請求項４記載の方法。
【請求項８】
タンパク質溶液製剤がプレフィルドシリンジである請求項１記載の方法。
【請求項９】
磁力線発生装置を備えたタンパク質溶液製剤の収納容器。
【請求項１０】
磁力線発生装置が磁石である請求項９記載の収納容器。
【請求項１１】
磁力線下にタンパク質含有溶液を保存することを含むタンパク質含有溶液の安定化方法。
【請求項１２】
タンパク質含有溶液がタンパク質製造バルク溶液である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
磁力線下に保存したタンパク質バルク製造溶液から調製した安定化タンパク質製剤。
【請求項１４】
安定化タンパク質製剤が溶液製剤である請求項１３記載の製剤。
【請求項１５】
安定化タンパク質製剤が凍結乾燥製剤である請求項１３記載の製剤。
【請求項１６】
磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤の会合体生成抑制方法。
【請求項１７】
タンパク質溶液製剤の安定化のための磁力線発生装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、タンパク質溶液製剤の安定化方法及びタンパク質溶液製剤の収納容器に関する。さらに詳しくは、磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することにより生理活性タンパク質製剤を安定化する方法及び磁力線発生装置を備えたタンパク質溶液製剤の収納容器に関する。本発明の方法及び収納容器は生理活性タンパク質の会合を抑制し、タンパク質溶液製剤の安定化に特に有用である。
【背景技術】  遺伝子組換え技術の発達によって、種々の生理活性タンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。これらの生理活性タンパク質の多くは水溶液中で会合することが知られており、これが製剤の安定性低下の主たる要因になっている。そこで、これらの製剤の安定性を確保するため、凍結乾燥製剤とするか、あるいは安定性を向上させるための各種添加剤を加えたタンパク質溶液製剤の形で提供されている。
たとえば、安定化剤としてヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質といった高分子類或いはポリオール類、アミノ酸及び界面活性剤等といった低分子類を添加することによる安定化効果が見出されている。しかしながら、タンパク質のような生体由来の高分子を安定化剤として添加することは、その安定化剤に由来するウイルス等のコンタミを除去するために非常に煩雑な工程を必要とするなどの問題があった。また、ウイルスの不活性化を目的として加熱処理を行うときに、熱ストレスによりさらに会合、凝集などの問題を生じることがあった。
そこで、添加する安定化剤をなるべく少なくし、かつ簡便な処理によりタンパク質分子の会合を抑制できるタンパク質溶液製剤の安定化方法が求められている。
本発明の目的は、抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン等の生理活性を有するタンパク質などの溶液状態における会合体の生成を抑制し、タンパク質溶液製剤の安定性を向上させる方法を提供することである。
【発明の開示】
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、意外にもタンパク質溶液製剤を磁力線下におくことにより二量体などの会合体の生成を顕著に抑制できることを発見して本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のものを提供する：
（１）磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤の安定化方法。
（２）磁束密度が１ミリテスラ以上である前記（１）記載の方法。
（３）タンパク質が生理活性タンパク質である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）生理活性タンパク質が、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモンから選択される前記（３）記載の方法。
（５）生理活性タンパク質が造血因子である前記（４）記載の方法。
（６）造血因子がエリスロポエチン又は顆粒球コロニー刺激因子である前記（５）記載の方法。
（７）生理活性タンパク質が抗体である前記（４）記載の方法。
（８）タンパク質溶液製剤がプレフィルドシリンジである前記（１）記載の安定化方法。
（９）磁力線発生装置を備えたタンパク質溶液製剤の収納容器。
（１０）磁力線発生装置が磁石である前記（９）記載の収納容器。
（１１）磁力線下にタンパク質含有溶液を保存することを含むタンパク質含有溶液の安定化方法。
（１２）タンパク質含有溶液がタンパク質製造バルク溶液である前記（１１）記載の方法。
（１３）磁力線下に保存したタンパク質バルク製造溶液から調製した安定化タンパク質製剤。
（１４）安定化タンパク質製剤が溶液製剤である前記（１３）記載の製剤。
（１５）安定化タンパク質製剤が凍結乾燥製剤である前記（１３）記載の製剤。
（１６）磁力線下にタンパク質溶液製剤を保存することを含むタンパク質溶液製剤の会合体生成抑制方法。
（１７）タンパク質溶液製剤の安定化のための磁力線発生装置の使用。
【図面の簡単な説明】  図１は、磁力線下におけるＥＰＯ注射製剤の加速試験を示す模式図である。
図２は、本発明の方法で溶液製剤を保存する１態様である。ａは側面図、ｂは上面図である。
図３は、本発明の方法で溶液製剤を保存する１態様の側面図である。
図４は、磁力線下にてＧ−ＣＳＦ溶液を保存する１態様である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明におけるタンパク質としては生理活性タンパク質が好ましいがこれに限定されない。本発明のタンパク質溶液は医薬品に限らず、食品、化粧品などに含有されるタンパク質の安定化が求められる全てのタンパク質含有溶液の安定化方法を提供する。生理活性タンパク質は、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモンを含むがこれに限定されない。具体的には、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体やヒト型化抗体等の免疫グロブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などを含むが、これらに限定されない。生理活性タンパク質の中でも、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン等の造血因子が好ましく、さらに好ましくはＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦである。また、生理活性タンパク質としては免疫グロブリンが好ましく、さらに好ましくはモノクローナル抗体、ヒト型化抗体である。
本発明の安定化方法に用いる生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法による生理活性タンパク質は、大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
生理活性タンパク質としては、例えば糖鎖を有するタンパク質が挙げられる。糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
例えば、生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
また、生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１４５８０を参照）、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１３３８８を参照）、ヒト型化抗組織因子抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９９−５１７４３を参照）なども本発明で使用する好ましい抗体である。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。
さらに、トランスジェニック動物等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
さらに、抗体にはＦａｂ，（Ｆａｂ’）２，Ｆｃ，Ｆｃ’，Ｆｄなどの抗体断片や、１価又は２価以上の一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）などの再構成したものも含む。
本発明では、生理活性タンパク質含有試料とは、生体由来タンパク質であるか、あるいは組換えタンパク質であるかを問わず、いかなるタンパク質を含む試料であってもよく、好ましくは、培養により得られた生理活性タンパク質を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。
生理活性タンパク質溶液製剤は、生理活性タンパク質の他に、所望によりさらに界面活性剤、アミノ酸などの安定化剤、希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。これらの成分を通常使用される緩衝液中に溶解して製造される。
生理活性タンパク質溶液製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチック又はガラス製のバイアル、アンプル、注射器のような規定容量の形状の容器、ならびに瓶のような大容量の形状の容器で供給される。本発明の安定化方法は、これらのいずれの容器形状の溶液製剤にも使用できる。好ましいのはプレフィルドシリンジの溶液製剤である。
その他には、バイアルも好ましく例示される。
本発明では、生理活性タンパク質の溶液製剤を磁力線下に保存する。磁力線の発生装置は磁石、半導体プロセスで製造される磁気ヘッド、微小コイルを配列して電気を流す、などが挙げられるが、これに限定されない。安価で簡便であることから、磁石を溶液製剤の容器の周囲に配置して保存するのが好ましい。本発明の実施の１態様を図１に示す。磁石の形態や配置方向については特に限定されないが、包装形態を考慮するとシート状の磁石が好ましい。また、磁力線の強さが磁石表面からの距離に依存すること、シリンジ内の薬液ができるだけ均一になるようにということを考えると、シリンジ縦軸方向に直交してＳＮを配置するのが好ましい（図２参照）。磁力線発生装置は収納する生理活性タンパク質溶液製剤が磁力線下におかれるように１又は複数配置する。図２に示すように、１つのシート状磁石上にシリンジを配置してもよいし、あるいは図３に示すように２つのシート状磁石の間にシリンジを配置してもよい。
あるいはまた、図４に示すように、シート状の磁石上にバイアルを配置してもよい。
生理活性タンパク質溶液製剤及び磁石の配置は、溶液製剤が磁力線下に保存されるものであれば何れの配置であってもよい。磁石の磁化の向きは、溶液製剤が磁力線下に保存されるものであれば何れの向きであってもよい。例えば図１では、磁石の上面をＮ極、下面をＳ極とすることもでき、上面をＳ極、下面をＮ極とすることもできる。図２及び４では、シリンジ又はバイアルに接する面をＮ極としてもよく、Ｓ極としてもよい。図３では、シリンジに接する２つの面の一方をＮ極、もう一方をＳ極とすることもでき、両方を同じ極にすることもできる。
磁束密度（磁力線の強度）は、１ミリテスラ以上、好ましくは１〜４５０ミリテスラ、さらに好ましくは１〜１５０ミリテスラである。
本発明はさらに、磁力線発生装置を備えた生理活性タンパク質溶液製剤の収納容器を提供する。本発明の収納容器の形状、材質は特に限定されないが、内部に上述した磁力線の発生装置並びに溶液製剤の収納部位を備えている。収納容器は収納ボックス、冷蔵庫、コンテナーなどであってよい。
本発明はさらに、磁力線下にタンパク質バルク溶液を保存することを含むタンパク質バルク溶液の安定化方法を提供する。また、磁力線下に保存したタンパク質バルク溶液から安定化タンパク質製剤を調製することができる。安定化タンパク質製剤は溶液製剤であっても、凍結乾燥製剤であってもよい。
本発明の方法で保存した生理活性タンパク質溶液製剤は長期保存後も会合体の生成を抑制することが確認された。例えば、非磁力線下で４０℃−２週間及び１ヵ月間加速したエリスロポエチン（ＥＰＯ）注射剤（７５０ＩＵ）について純度試験（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）及び定量試験（液体クロマトグラフ法）にて評価した結果、純度試験において二量体の増加を認め、定量試験においてＥＰＯ含量の低下が確認された。一方、約１００ミリテスラの磁力線下で４０℃−２週間及び１ヵ月間加速したＥＰＯ注射剤（７５０ＩＵ）につき、純度試験（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）及び定量試験（液体クロマトグラフ法）にて評価した結果、４０℃−１ヵ月加速品の純度試験において僅かな二量体の増加を認めたものの、その他はいずれの評価項目においても、未加速品と比べて変化を認めなかった。
本発明者らは特定の理論に拘束されるものではないが、本発明の作用機構を以下のように考えている。すなわち、一般的にタンパク質の会合化は、タンパク質分子の疎水性部位が、熱や容器表面への衝突等の何らかの影響によってタンパク質分子の立体構造の表面に出現し、疎水性部位が互いに結合し合うことにより起こると考えられている。従って、何らかの力で水溶液中のタンパク質を拘束できればタンパク質分子のランダムな衝突を抑制できると考えられる。本発明では、水溶液中のタンパク質分子が強磁場の下で規則的に配列することにより、分子が拘束され、ランダムな衝突が抑制され、その結果疎水性部位の結合による会合化が抑制されたものと考えられる。
従って、本発明の方法及び収納容器は、従来の安定化剤を添加して生理活性タンパク質製剤を安定化させるという発想とは全く異なる技術的思想に基づくものであり、簡便な方法で会合体の生成を抑制して長期保存が可能となる。本発明の方法及び収納容器を使用することにより、添加剤の使用量を少なくすることができる。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】実施例１：ＥＰＯ製剤における効果
１）試料
ＥＰＯ注射用製剤（７５０ＩＵ）（シリンジ製剤、ＥＰＯ濃度１５００ＩＵ／ｍＬ、容量０．５ｍＬ：中外製薬製）を用いた。
２）試験方法
ＥＰＯ注射用製剤（７５０ＩＵ）に磁石（約１００ミリテスラ）を取り付け（図１参照）、４０℃恒温槽に２週間及び１ヵ月間保存した後に、評価を行った。図１において、シート状磁石の上面をＮ極とし、下面をＳ極とした。
また、非磁力線下（＜１ミリテスラ）において４０℃−２週間及び１ヵ月間加速を行った試料及び未加速の試料を同時に評価し、未加速品に対するＥＰＯ含量の変化、二量体及びその他の類縁物質の含量変化を評価の指標とした。
３）評価方法
３−１）  純度試験  （ＳＤＳ−ゲル電気泳動法）
上述した各試料を試料溶液とする。試料溶液の６０μＬを正確に取り、非還元系Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ＊１を正確に２０μＬ加え、５０℃の温浴で１５分間加熱する。加熱後、ＢＰＢ溶液＊２を正確に４．０μＬ加え、泳動用試料とする。
泳動用試料および分子量マーカー＊３のそれぞれ７．５μＬにつき、次の条件で電気泳動法により試験を行い、ウェスタンブロット法により検出する。
３−１−１）  電気泳動法
泳動装置：ＴＥＦＣＯ社製電気泳動装置
泳動ゲル：スラブゲル〔グラジェント８％−１６％、１５Ｗｅｌｌ、厚さ１．５ｍｍ、ＴＥＦＣＯ製〕
泳動電流：２５ｍＡ／枚の一定電流
泳動時間：約１．５時間
泳動Ｂｕｆｆｅｒ：電気泳動用緩衝液＊４
３−１−２）  ウェスタンブロット法
泳動後、Ｔｒａｎｓｆｅｒ緩衝液＊５１０ｍＬにゲルを浸し、３０分間平衡化する。次いで、転写装置の陽電極側にＴｒａｎｓｆｅｒ緩衝液で浸したスポンジおよびろ紙１枚（ファーストトランスファーフィルターペーパー（２０ｃｍ×１０ｃｍ、ファルマシア製）を順にのせ、その上にあらかじめメタノールに約３０秒間浸し、更にＴｒａｎｓｆｅｒ緩衝液に５分間浸しておいたプロブロット膜＊６をのせる。更にその上にゲルを重ね、Ｔｒａｎｓｆｅｒ緩衝液に浸したろ紙１枚およびスポンジをのせ、膜側を陽電極、ゲル側を陰電極にセットする。次の条件により、プロブロット膜への転写を行い、転写後抗ＥＰＯウサギ血清を用いてプロブロット膜を発色させる。
転写温度：２５℃付近の一定温度
転写条件：電流６５±２ｍＡ、転写時間１２０分間
＊１  非還元系  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム７４．４８ｍｇ及びラウリル硫酸ナトリウム５．０ｇをＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液＊７５０ｍＬに溶かす。
＊２  ＢＰＢ溶液：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液０．６２５ｍＬ、濃グリセリン３．５ｍＬ及びブロムフェノールブルー溶液５ｍｇを混和する。４℃で冷蔵保存する。
＊３  分子量マーカー溶液：Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準溶液（バイオラッド製又はこれに相当するもの）〔Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（分子量：２０９００）、Ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、（同：２９１００）Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（同：３５５００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（同：５０６００）、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（同：８３０００）及びＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  Ｂ（同：１０１０００）を含む〕
＊４  電気泳動用緩衝液：トリスヒドロキシメチルアミノメタン３．０ｇ及びグリシン１４．４ｇを水６００ｍＬに加え、これにラウリル硫酸ナトリウム１．０ｇを加えて溶解した後、水を加えて１０００ｍＬとする。
＊５  Ｔｒａｎｓｆｅｒ緩衝液：トリスヒドロキシメチルアミノメタン６．０ｇ及びグリシン２８．８ｇを水６００ｍＬに加え、これにメタノール４００ｍＬを加えて溶解した後、水を加えて２０００ｍＬとする。
＊６  プロブロット膜：ポリビニリデンジフルオリドメンブランフィルター（８ｃｍ×８ｃｍ、アプライドバイオシステム製）又はこれに相当するもの。
＊７  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液：トリスヒドロキシメチルアミノメタン３．０ｇを水３０ｍＬに溶かし、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加えてｐＨ６．８に調整した後、水を加えて１００ｍＬとする。４℃で冷蔵保存する。
３−２）  定量法（液体クロマトグラフ法）
本品を試料溶液とし、ＥＰＯ標準品に０．０５％ポリソルベート２０水溶液を加えて１５００ＩＵ／ｍＬとしたものを標準溶液とする。
試料溶液及び標準溶液各１００μＬを正確に量り、次の条件で液体クロマトグラフ法により試験を行い、それぞれのＥＰＯのピーク面積ＡＴ及びＡＳを測定する。次式により本品のＥＰＯ含量（濃度：ｍｇ／ｍＬ）を求める。
2004019966.tif 000002
ＡＴ：試料溶液のＥＰＯのピーク面積
ＡＳ：標準溶液のＥＰＯのピーク面積
液体クロマトグラフの操作条件
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２１４ｎｍ）
カラム：内径５ｍｍ、長さ２５ｃｍのステンレス管にブチルシリル化した約５μｍのシリカゲルを充填する。（ＶＹＤＡＣ２１４ＴＰ５４、セパレーションズグループ製）
カラム温度：室温
移動相：次のＡ液及びＢ液を用い、２液の混合グラジェントを行う。
Ａ液：水・アセトニトリル・トリフルオロ酢酸混液（４００：１００：１）
Ｂ液：アセトニトリル・水・トリフルオロ酢酸混液（４００：１００：１）
グラジェント操作：Ｂ液濃度３５％でカラムを平衡化した後、試料溶液及び標準溶液を注入する。５分間Ｂ液濃度３５％に保った後、１５分間でＢ液濃度１００％になるように線形グラジェントを行う。その後、２分間これを保持する。
流量：ＥＰＯの保持時間が約１８分になるように調整する。
４）結果
４−１）  純度試験（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
磁力線下で４０℃−２週間及び１ヵ月間加速したＥＰＯ注射用製剤（７５０ＩＵ）につき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて評価した。
その結果、非磁力線下における４０℃−２週間加速品では二量体の増加が認められたのに対し、磁力線下における４０℃−２週間加速品では未加速品と比較して、変化は認められなかった。
また、４０℃−１ヵ月間加速品については、磁力線下及び非磁力線下ともに僅かな二量体の増加を認めたものの、目視による量的な多少については判断することは困難であった。
４−２）  定量法（液体クロマトグラフ法）
磁力線下で４０℃−２週間及び１ヵ月間加速したＥＰＯ注射用製剤（７５０ＩＵ）につき、液体クロマトグラム法にて評価した結果を表１及び表２に示す。
ＥＰＯ含量を未加速品と比較した場合、非磁力線下における４０℃−２週間加速品では含量低下を認め、残存率が９６％となった。また、非磁力線下における４０℃−１ヵ月間加速品では顕著な含量低下を認め、残存率が９３％となった。
一方、磁力線下４０℃−２週間加速品では含量の変化はほとんど認めず、４０℃−１ヵ月間加速品においても、残存率９７％となり、試験法の精度（併行精度Ｃ．Ｖ．＝１．６％）を考慮した時、何れの加速期間においても含量の変化は認められなかった。
2004019966.tif 000003
2004019966.tif 000004
2004019966.tif 000005
実施例２：Ｇ−ＣＳＦ溶液における効果
１）  試料調製
Ｇ−ＣＳＦ溶液（Ｇ−ＣＳＦ濃度  約０．５ｍｇ／ｍＬ）をディスポーサブルフィルターにてろ過し、５ｍＬガラスバイアルに１ｍＬずつ充填したものを被験試料とした。
２）  保存条件
被験試料を３０℃恒温槽内にて磁力線存在下（約１００ミリテスラ＊８）及び非磁力線下＊９に保存した（図４参照）。図４において、シート状磁石のバイアルと接する面をＮ極とし、反対の面をＳ極とした。
＊８  テスラ（Ｔ）：磁束密度単位、１テスラ＝１０，０００ガウス（Ｇ）
＊９  非磁力線下：自然界における磁束密度（通常１ミリテスラ未満）とした。
３）  評価方法
被験試料を３０℃恒温槽にて２週間保存後、ゲルろ過クロマトグラフ法（ｎ＝３）にてＧ−ＣＳＦ会合体含量を測定した。
４）  結果
３０℃２週間保存後のＧ−ＣＳＦ会合体含量を表３に示す。
2004019966.tif 000006
上記の結果の通り、磁力線にはＧ−ＣＳＦ溶液の保存時における会合体の生成を抑制する効果が認められた。
【図１】
2004019966.tif 000007
【図２】
2004019966.tif 000008
【図３】
2004019966.tif 000009
【図４】
2004019966.tif 000010
【国際調査報告】
2004019966.tif 000011
2004019966.tif 000012
2004019966.tif 000013
2004019966.tif 000014