(57)【要約】本発明の目的は、例えば大腸菌Ｏ−１５７などのベロ毒素産生菌が産生するベロ毒素の量を抑制することができる新規なベロ毒素産生抑制剤を提供することである。本発明によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むベロ毒素産生抑制剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むベロ毒素産生抑制剤。
【請求項２】
腸管出血性大腸菌によるベロ毒素産生を抑制するために使用する、請求項１に記載のベロ毒素産生抑制剤。
【請求項３】
腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７によるベロ毒素産生を抑制するために使用する、請求項１又は２に記載のベロ毒素産生抑制剤。
【請求項４】
ポリ乳酸中における反復単位である乳酸が実質的にＬ−乳酸から成る、請求項１から３の何れか１項に記載のベロ毒素産生抑制剤。
【請求項５】
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が、ラクチドを式（３）：Ｍｅ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）（式中、Ｍｅはアルカリ金属を示す。Ｒ１及びＲ２は各々独立に脂肪族基又は芳香族基を示す。）で表される化合物の存在下で重合させることにより製造されるポリ乳酸混合物である、請求項１から４の何れかに記載のベロ毒素産生抑制剤。
【請求項６】
Ｍｅがリチウムである、請求項５に記載のベロ毒素産生抑制剤。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２が各々独立に炭素数１から６のアルキル基である、請求項５又は６に記載のベロ毒素産生抑制剤。
【請求項８】
Ｍｅがリチウムであり、Ｒ１及びＲ２がイソプロピル基である、請求項５から７の何れかに記載のベロ毒素産生抑制剤。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載のベロ毒素産生抑制剤を含む、ベロ毒素産生抑制のための飲食品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ベロ毒素産生抑制剤に関する。より詳細には、本発明は、大腸菌Ｏ−１５７などのベロ毒素産生菌が産生するベロ毒素の量を抑制することができる医薬品、特定保健用食品又は健康食品等として用いることができるベロ毒素産生抑制剤に関する。
背景技術
１９９６年、腸管出血性大腸菌による食中毒が日本全国において発生し、腸管出血性大腸菌による溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）や脳症などの発症が社会問題となった。ベロ毒素産生菌の一種である腸管出血性大腸菌による食中毒にみられる下痢、血便、ＨＵＳおよび脳症は産生されるベロ毒素（ＶＴ）によるものであり、このベロ毒素が人体に重篤な症状を引き起こす。ベロ毒素にはＶＴ１とＶＴ２の２種類があるが、両者とも真核細胞のタンパク質合成を阻害する作用を有する。即ち、ベロ毒素は、細菌が感染した動物の腸管における上皮細胞へ入り、細胞内の２８ＳリボゾームＲＮＡの特定のアデニン残基とリボース残基の間のＮ−グリコシド結合を加水分解することによりその機能を破壊し、その細胞のタンパク質合成機能を止めて当該細胞を死に至らしめる。この結果、腸管上皮細胞が脱落し、下痢や出血が生じる。また、場合によっては、ベロ毒素が血管内に入って血管内皮細胞を攻撃し、これにより腎障害を引き起こして溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）などの重篤な疾患が生じる。
日本において大流行した腸管出血性大腸菌の８０％以上がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７であるが、この他にも腸管出血性大腸菌にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ−，０１１１：Ｈ−，０２６：Ｈ１１，０１２８：Ｈ２，０１：Ｈ２０，０１８：Ｈ−，０１１４：Ｈ１９，０１１５：Ｈ１０などを含む多種の大腸菌が見つかっている。また、ベロ毒素は大腸菌のみならず、細菌性赤痢、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）においても産生されることが知られている。
このようなベロ毒素産生菌が産生するベロ毒素による疾病の予防及び治療のために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７をはじめとするベロ毒素産生菌の検出方法、疾病発症の作用機作の解明、あるいは有効な治療方法についての研究が進みつつあるが、未だ発症を十分に抑制する方法は見出されておらず、有効な発症抑制方法の確立が望まれている。特に、ベロ毒素産生菌が産生するベロ毒素による疾病の発症は、免疫機能の低い乳幼児や老人に多いため、これら乳幼児や老人でも摂取しやすく、且つ副作用の少ない安全なベロ毒素産生抑制剤を提供することが望まれていた。
これまでの研究により、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリＬ−乳酸混合物は、抗悪性腫瘍剤として有用であることが報告されている（特開平９−２２７３８８号公報および特開平１０−１３０１５３号公報）。しかしながら、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物がベロ毒素の産生量に及ぼす効果については報告されていない。
発明の開示
本発明は、例えば大腸菌Ｏ−１５７などのベロ毒素産生菌が産生するベロ毒素の量を抑制することができる新規なベロ毒素産生抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、上記したベロ毒素産生抑制剤を利用したベロ毒素産生抑制用の飲食品を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決することを目的とした検討を行うために、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を無菌マウスに投与し、大腸菌Ｏ−１５７が産生するベロ毒素の量を測定した。その結果、上記ポリ乳酸混合物は、ベロ毒素の産生量を抑制し、Ｏ−１５７感染マウスの生存率を改善することが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むベロ毒素産生抑制剤が提供される。
好ましくは、本発明のベロ毒素産生抑制剤は、Ｏ−１５７などの腸管出血性大腸菌によるベロ毒素産生を抑制するために使用することができる。
好ましくは、ポリ乳酸中における反復単位である乳酸は実質的にＬ−乳酸から成る。
好ましくは、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、ラクチドを式（３）：Ｍｅ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）（式中、Ｍｅはアルカリ金属を示す。Ｒ１及びＲ２は各々独立に脂肪族基又は芳香族基を示す。）で表される化合物の存在下で重合させることにより製造されるポリ乳酸混合物である。
好ましくは、上記式でＭｅはリチウムである。好ましくは、上記式でＲ１及びＲ２は各々独立に炭素数１から６のアルキル基である。さらに好ましくは、上記式でＭｅはリチウムであり、Ｒ１及びＲ２はイソプロピル基である。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のベロ毒素産生抑制剤を含む、ベロ毒素産生抑制のための飲食品が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ベロ毒素産生抑制剤又はベロ毒素産生抑制のための飲食品の製造における、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の使用が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の有効量をヒトなどの哺乳動物に投与することを含む、ベロ毒素の産生を抑制するための方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明する。
本発明のベロ毒素産生抑制剤は、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を有効成分として含むものであり、例えば、大腸菌Ｏ−１５７等のベロ毒素産生菌が産生するベロ毒素の量を抑制するために使用することができる。本発明のベロ毒素産生抑制剤は、ベロ毒素産生菌の感染に起因する疾患の治療剤や予防剤として使用することができる。
本明細書で言うベロ毒素産生菌の種類は、特に限定されない。例えば、ベロ毒素を産生する大腸菌としては、Ｏ−１５７のほかの例として、Ｏ−１、Ｏ−１８、Ｏ−２６、Ｏ−６８、Ｏ−１１１、Ｏ−１１４、Ｏ−１１５、Ｏ−１１９、Ｏ−１２８、Ｏ−１３８、Ｏ−１４５などの血清型を示す菌が挙げられる。また、ベロ毒素を産生する赤痢菌（細菌性赤痢）の例としては、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）などが挙げられる。その他のベロ毒素産生菌としては、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）などが挙げられる。
これらの中でも大腸菌は健康人の腸内フローラを構成する１菌種であり、一部の特殊な病原因子産生能を獲得した大腸菌はヒトの腸管感染症を引き起こす。全国各地で腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）Ｏ−１５７：Ｈ７感染症の集団発生が多発した１９９６年以降、集団発生の件数は減少しているが、散発例は依然として続いている。ＥＨＥＣはアフリカミドリザルの腎細胞由来のベロ細胞に強い細胞毒性を示すベロ毒素を主要な病原因子として産生し、感染時には約５％の例で溶血性尿毒症症候群や稀に脳症を合併して重篤になる場合が多い。本発明のベロ毒素産生抑制剤は特に、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７によるベロ毒素の産生を抑制するために使用することができる。
本発明のベロ毒素産生抑制剤は、ベロ毒素産生菌によるベロ毒素の産生を抑制するのに効果的であり、当該菌に感染する前に予め摂取しておくこともできる。従って、本発明のベロ毒素産生抑制剤は、健康食品や医薬品として日頃から摂取しておくことも好ましい。
本発明のベロ毒素産生抑制剤及びベロ毒素産生抑制のための飲食品においては、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が有効成分として用いられる。
本明細書で言う「ポリ乳酸混合物」とは、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸が任意の割合で存在する混合物を意味する。即ち、「混合物」という用語は、縮合度３〜２０の何れかを有するポリ乳酸の混合物であることを意味すると同時に、環状および鎖状のポリ乳酸の混合物を含む概念としても用いられる。このような「ポリ乳酸混合物」は、本明細書中以下に述べるように、乳酸を脱水縮合し、適当な方法で精製することにより得ることができる。なお、本明細書では便宜上「ポリ乳酸混合物」という用語を用いたが、この中には一定の縮合度を有する環状のポリ乳酸または一定の縮合度を有する鎖状のポリ乳酸といった単一成分から成るポリ乳酸も含まれる。
縮合度とは、ポリ乳酸中における反復単位である乳酸単位の数を意味する。例えば、環状のポリ乳酸は下記の構造式を有することが推測されるが、式中のｎが縮合度を表す（即ち、ｎ＝３〜２０）。
2003105870.tif 000002
本明細書で単に「乳酸」と称する場合、この乳酸にはＬ−乳酸、Ｄ−乳酸またはこれらの任意の割合の混合物の全てが包含される。本発明においては好ましくは、乳酸は実質的にＬ−乳酸から成る。ここで言う「実質的に」とは、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率［即ち、（Ｌ−乳酸単位数／Ｌ−乳酸単位数＋Ｄ−乳酸単位数）×１００］が、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であることを意味する。なお、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率は、出発物質として使用する乳酸中に存在するＬ−乳酸とＤ−乳酸の比率に依存する。
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、特開平９−２２７３８８号公報、特開平１０−１３０１５３号公報、または特願平１１−３９８９４号明細書（これらの特許明細書に記載の内容は全て引用により本明細書の開示として含める。）などに記載の製造方法により得ることができる。
より具体的には、例えば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、下記の方法Ａにより得ることができる。
方法Ａ：
先ず、乳酸（好ましくは、実質的にＬ−乳酸から成る乳酸）を不活性雰囲気下で脱水縮合させる。不活性雰囲気としては、例えば、窒素ガス、アルゴンガスなどが挙げられるが、窒素ガスを用いるのが好ましい。
脱水縮合反応は、常圧〜１ｍｍＨｇ程度の減圧下、１１０〜２１０℃、好ましくは１３０〜１９０℃の温度で行われるが、段階的減圧および段階的昇温によって行うのが特に好ましい。反応時間は適宜設定できるが、例えば１〜２０時間反応を行うことができる。段階的減圧および段階的昇温を用いる場合には、反応時間を２以上から成る部分的な反応時間に分け、それぞれの部分において圧力と温度を設定して反応を行う。段階的減圧を用いる場合は、例えば、常圧→１５０ｍｍＨｇ→３ｍｍＨｇと減圧することができ、段階的昇温を用いる場合は、例えば、１４５℃→１５５℃→１８５℃と昇温することができる。実際には、これらを組み合わせて、例えば、１４５℃で常圧で３時間、１４５℃で１５０ｍｍＨｇで３時間、１５５℃で３ｍｍＨｇで３時間そして１８５℃で３ｍｍＨｇで１．５時間反応を行うことができる。
次いで、この脱水縮合反応により得られた反応混合物にエタノールおよびメタノールを加え、濾過して濾液を乾燥してエタノールおよびメタノール可溶分が得られる。即ち、本明細書で言う「エタノールおよびメタノール可溶分」とはエタノールとメタノールの混合液に可溶な画分を意味する。なお、エタノールおよびメタノール可溶分を得る際には、脱水縮合反応の反応混合物をエタノールおよびメタノールと混合するが、その際のエタノールとメタノールの比率は適宜設定することができ、例えばエタノール：メタノール＝１：９である。なお、反応混合物にエタノールとメタノールを添加する順番、方法などは限定されず、適宜選択することができ、例えば、脱水縮合反応の反応混合物に先ずエタノールを添加し、次いでメタノールを添加することができる。
上記で得られたエタノール・メタノール可溶分を逆相カラムクロマトグラフィー、特にオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムを用いたクロマトグラフィーに付し、まずｐＨ２〜３の２５〜５０重量％のアセトニトリル水溶液で溶離する画分を除去し、次いでｐＨ２〜３の９０重量％以上のアセトニトリル水溶液、好ましくは９９重量％以上のアセトニトリル水溶液で溶離してくる画分を採取すると、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が得られる。
上記のようにして得られた環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、水酸化ナトリウムなどのアルカリ物質で中和し、減圧乾燥後、常法により下記に述べるような所望の形態に製剤化することができる。
本発明で用いる縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を製造するための別法としては、例えば、特願平１１−２６５７１５号明細書に記載された方法（方法Ｂとする）または特願平１１−２６５７３２号明細書に記載された方法（方法Ｃとする）を挙げることができる（これらの特許明細書に記載の内容は全て引用により本明細書の開示として含める。）。以下、方法Ｂおよび方法Ｃについて具体的に説明する。
方法Ｂ：
この方法は、ラクチドをＲＹＬｉ（式中、Ｒは脂肪族基又は芳香族基を示し、Ｙは酸素原子又はイオウ原子を示す）で表されるリチウム化合物の存在下で重合させることによって環状乳酸オリゴマーを製造する方法である。重合反応を実施する場合、リチウム化合物（ＲＹＬｉ）の使用割合は、ラクチド１モル当たり、１〜０．１モル、好ましくは０．２〜０．３モルの割合である。反応温度は−１００〜０℃、好ましくは−７８〜−５０℃である。反応は、−７８〜−５０℃の温度で開始し、徐々に室温にまで昇温させるように実施するのが好ましい。反応は、好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。反応溶媒としては、テトラヒドロフラン等の環状エーテルの他、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン等を用いることができる。反応雰囲気としては、窒素ガスやアルゴン等の不活性ガス雰囲気が用いられる。反応圧力は特に制約されず、好ましくは常圧である。
なお、上記のようにして得られる乳酸オリゴマーの組成（即ち、環状乳酸オリゴマーと鎖状乳酸オリゴマーの混合比率）は、反応助剤として用いるリチウム化合物によって変動する。リチウム化合物として炭素数１〜３のアルキルアルコールのリチウム化合物（ＲＯＬｉ）（式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基）を用いる場合には、環状乳酸オリゴマーと鎖状オリゴマーとの混合物（環状乳酸オリゴマーの割合：８０〜８５重量％）が得られる。一方、リチウム化合物としてｔ−ブチルアルコール等の炭素数４以上のアルキルアルコールのリチウム化合物や、チオフェノール化合物を用いるときには、実質的に環状乳酸オリゴマーのみを選択的に得ることができる。
方法Ｃ：
この方法は、（ｉ）乳酸を３５０〜４００ｍｍＨｇの圧力条件で１２０〜１４０℃の範囲の温度に加熱し、脱水縮合反応させるとともに、ラクチドを留出させずに副生水のみを留出除去する第１加熱工程、
（ｉｉ）該第１加熱工程終了後、反応生成物を１５０〜１６０℃の温度に加熱し、該反応圧力を降圧速度０．５〜１ｍｍＨｇ／分で１５〜２０ｍｍＨｇまで降下させるとともに、その降圧に際し、ラクチドの留出を回避させながら副生水のみを留出除去し、該反応圧力が１５〜２０ｍｍＨｇに降下後、同圧力条件及び反応温度１５０〜１６０℃においてさらに反応を継続して鎖状乳酸オリゴマーを主成分とする脱水縮合物を生成させる第２加熱工程、
（ｉｉｉ）該第２加熱工程終了後、０．１〜３ｍｍＨｇの圧力条件で１５０〜１６０℃で加熱して該鎖状乳酸オリゴマーを環化させ、環状オリゴマーを生成させる第３加熱工程、
からなることを特徴とする方法である。
この方法では先ず、第１加熱工程において、減圧下において乳酸を加熱し、脱水縮合反応させる。この場合の反応時間は３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。この第１加熱下での反応は、その反応を円滑に進行させるために、乳酸の脱水縮合により生成する副生水を留去させるが、この場合、乳酸２分子の脱水縮合物であるラクチドが留去しないように実施する。このためには、反応圧力を減圧、好ましくは３００〜５００ｍｍＨｇ、より好ましくは３５０〜４００ｍｍＨｇに保持し、この圧力条件下において、１００〜１４０℃、好ましくは１３０〜１４０℃の範囲に加熱するのがよい。この第１加熱工程での反応により、主に、乳酸の３〜２３分子の脱水縮合物を主成分とする反応生成物が生じる。
上記第１加熱工程の終了後、第２加熱工程において、高められた平均重合度のオリゴマーが得られるように、前記第１加熱工程における反応温度よりも高められた温度、好ましくは１４５〜１８０℃、より好ましくは１５０〜１６０℃の温度に加熱するとともに、反応圧力を１０〜５０ｍｍＨｇ、好ましくは１５〜２０ｍｍＨｇの圧力に降下させてさらに脱水縮合反応を継続する。
この反応も、前記第１加熱工程の反応の場合と同様に、反応を円滑に進行させるために副生水を留去させるが、ラクチドが留去しない条件で実施する。反応圧力を前記範囲の圧力にまで降下させる速度（降圧速度）は、ラクチドの留出を回避し、且つ反応効率を高めるためには、０．２５〜５ｍｍＨｇ／分、好ましくは０．５〜１ｍｍＨｇ／分の範囲に保持することが通常は必要である。前記範囲より低い降圧速度では、その所定圧まで降圧させるのに必要な時間が長くなるため好ましくなく、一方、前記範囲より高い降圧速度では、ラクチドが副生水とともに留去するようになるので好ましくない。
反応圧力が所定圧力にまで降下後、この反応圧力において、さらに反応を継続する。この場合の加熱時間は、３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。
前記第２加熱工程での反応により、平均重合度が３〜３０、好ましくは３〜２３の乳酸オリゴマーが得られるが、この場合のオリゴマー中の環状オリゴマーの割合は、通常、７０〜８０重量％程度である。
上記第２加熱工程終了後、第３加熱工程において、反応圧力を０．２５〜５ｍｍＨｇ、好ましくは０．５〜１ｍｍＨｇに保持し、１４５〜１８０℃、好ましくは１５０〜１６０℃の温度でさらに反応を継続する。反応時間は３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。この場合に生じる副生水も留去させる。この場合、ラクチドの留去も回避させることが好ましいが、反応生成物にはラクチドは殆んど含まれないので、その降圧速度を格別遅くする必要はない。
前記第３加熱工程での反応により、平均重合度３〜３０、好ましくは３〜２３で、かつ環状オリゴマーの割合が９０重量％以上、好ましくは９９重量％以上の乳酸オリゴマーが生成される。
方法Ｄ：
本発明の特に好ましい態様では、ラクチドを式（３）：Ｍｅ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）（式中、Ｍｅはアルカリ金属を示す。Ｒ１及びＲ２は各々独立に脂肪族基又は芳香族基を示す。）で表される化合物の存在下で重合させることにより製造されるポリ乳酸混合物を使用する。以下、式（３）：Ｍｅ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）について説明する。
式（３）において、Ｍｅはアルカリ金属を示し。Ｒ１及びＲ２は各々独立に脂肪族基又は芳香族基を示す。
ここで脂肪族基としては、炭素数１から１２、好ましくは１から６の直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせの飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、オクチル、ドデシル等のアルキル基、シクロプロピル、シクロブチル、シクロオクチル、シクロドデシル等のシクロアルキル基が挙げられる。脂肪族基は二重結合または三重結合を有する不飽和の炭化水素基でもよい。
ここで芳香族基としては、炭素数は６〜３０、好ましくは６〜２０、より好ましくは６〜１２、さらに好ましくは６〜１０のアリール基及びアリールアルキル基が挙げられる。アリール基としては、フェニル、トリル、ナフチル等が挙げられ、アリールアルキル基としては、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等が挙げられる。
脂肪族基および芳香族基は１以上の置換基を有していてもよい。置換基の種類は特に限定されないが、例えば、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルキル基、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルケニル基、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルキニル基、アリール基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、カルボンアミド基、スルホンアミド基、カルバモイル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、Ｎ−アシルスルファモイル基、Ｎ−スルファモイルカルバモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、アミノ基、アンモニオ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルホ基、メルカプト基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ウレイド基、複素環基（例えば、窒素、酸素およびイオウ等を少なくとも１個以上含み、３ないし１２員環の単環、縮合環）、複素環オキシ基、複素環チオ基、アシル基、スルファモイルアミノ基、シリル基、ハロゲン原子などが挙げられる。上記においてアルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシの炭素数は一般的には１から１２であり、好ましくは１から６であり、アリールの炭素数は一般的には６から２０であり、好ましくは６から１０である。
式（３）おいて、Ｍｅはアルカリ金属を示す。アルカリ金属としては、例えば、Ｌｉ、Ｎａ又はＫが挙げられ、好ましくはＬｉである。
式（３）で表される化合物で不斉炭素を有するものは、各々（Ｒ）体、（Ｓ）体、（Ｒ），（Ｓ）体の何れでもよい。
式（３）で表されるアルカリ金属化合物の入手方法は特に限定されず、当業者であれば適宜入手できる。ジイソプロピルアミン等のジアルキルアミンとｎ−ブチルリチウム等のアルキル化アルカリ金属を反応させることによって得ることができる。より具体的には、この反応は、例えば、窒素雰囲気下などの反応に不活性な条件下において、ＴＨＦ等の不活性溶媒中にジアルキルアミンを含む溶液と、ヘキサン等の不活性溶媒中にアルキル化アルカリ金属を含む溶液とを混合して攪拌することで行うことができる。反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは−７８℃から室温である。反応時間は適宜設定できる。
ラクチドを式（３）の化合物の存在下で重合させる場合、式（３）の化合物（Ｍｅ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２））の使用量は、ラクチド１モル当たり好ましくは１〜０．１モルであり、より好ましくは０．２〜０．３モルである。
ラクチドの重合反応を行う際の反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは−１００℃〜室温であり、より好ましくは−７８℃〜室温である。
ラクチドの重合反応は、好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。反応溶媒は反応に不活性な溶媒であれば特に制限されないが、好ましくはテトラヒドロフラン等の環状エーテル、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン等を用いることができる。反応雰囲気としては、窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガス雰囲気を使用することができる。反応圧力は特に制約されず、好ましくは常圧である。
上記方法で得られる鎖状及び環状の乳酸オリゴマー混合物の組成は、反応助剤として用いる式（３）の化合物の種類や反応条件などによって変化するが、好ましくは、環状乳酸オリゴマーよりも鎖状乳酸オリゴマーの含有量が高い。
上記した方法によれば、下記式（１）又は（２）：
2003105870.tif 000003
（式中、ｍは１〜１８の整数を示し、ｎは１〜１８の整数を示す）
で表される鎖状及び環状の乳酸オリゴマー混合物が製造される。
なお、上記方法Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは本発明で用いるポリ乳酸混合物の製造方法の具体例の一部を示したものにすぎず、本発明においては他の方法で製造されたポリ乳酸混合物を用いることもできる。
本発明のベロ毒素産生抑制剤は、前記の必須成分に加えてさらに必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、医薬品類、医薬部外品類などの製剤に使用される成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができる。本発明のベロ毒素産生抑制剤は、単独の医薬品類として使用できる以外に、医薬品類や医薬部外品類などに配合して用いることもできる。
本発明のベロ毒素産生抑制剤の形態は特に限定されず、経口投与又は非経口投与用の製剤形態の中から目的に最も適した適宜の形態のものを選択することが可能である。
経口投与に適した製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、ドリンク剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、チュアブル剤などを挙げることができ、非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、注射剤（皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射など）、外用剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
経口投与に適当な液体製剤、例えば、溶液剤、乳剤、又はシロップ剤などは、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを用いて製造することができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などの固体製剤の製造には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いることができる。
非経口投与に適当な注射用又は点滴用の製剤は、好ましくは、受容者の血液と等張な滅菌水性媒体に有効成分である上記の物質を溶解又は懸濁状態で含んでいる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩水とブドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体などを用いて溶液を調製することができる。腸内投与のための製剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪、又は水素化カルボン酸などの担体を用いて調製することができ、座剤として提供される。また、噴霧剤の製造には、有効成分である上記の物質を微細な粒子として分散させることができ、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分の吸収を容易ならしめる担体を用いることができる。担体としては、具体的には、乳糖又はグリセリンなどが例示される。有効成分である物質及び使用する担体の性質に応じて、エアロゾル又はドライパウダーなどの形態の製剤が調製可能である。これらの非経口投与用製剤には、グリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種又は２種以上の飲食品を添加することもできる。
本発明のベロ毒素産生抑制剤の投与量及び投与回数は、投与の目的、投与形態、摂取者の年齢、体重又は性別などの条件などを含む種々の要因により適宜設定することができるが、一般的には、有効成分の投与量として一日当り１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜２０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｋｇである。上記投与量の製剤を一日１〜４回程度に分けて投与することが好ましい。
本発明のベロ毒素産生抑制剤の投与時期は特に限定されず、ベロ毒素産生菌の感染の前でも後でもよい。
本発明はさらに、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むベロ毒素産生抑制のための飲食品にも関する。即ち、本発明で用いる縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、上記したような単独の製剤の形態で使用するのみならず、飲食品の中に配合して用いることができる。
本発明のベロ毒素産生抑制剤のための飲食品は、ポリ乳酸混合物を分解させることなく配合し得るものであれば、その配合形態には特に制限はない。
本発明によるベロ毒素産生抑制剤のための飲食品の製品の具体例としては、清涼飲料、ドリンク剤、健康食品、特定保健用食品、機能性食品、機能活性型食品、栄養補助食品、サプレメント、飼料、飼料添加物などと一般に呼称される、飲料を含む健康食品または補助食品が挙げられる。
飲食品の具体例としては、例えば、チューインガム、チョコレート、キャンディー、錠菓、ゼリー、クッキー、ビスケット、ヨーグルト等の菓子類、アイスクリーム、氷菓等の冷菓類、茶、清涼飲料（ジュース、コーヒー、ココア等を含む）、栄養ドリンク剤、美容ドリンク剤等の飲料、パン、ハム、スープ、ジャム、スパゲティー、冷凍食品など任意の飲食品を挙げることができる。あるいは、本発明で用いるポリ乳酸混合物は調味料又は食品添加剤などに添加して用いることもできる。本発明のベロ毒素産生抑制のための飲食品を摂取することによりベロ毒素産生抑制効果が発揮され、実質的に有害な副作用を示さない安全な飲食品を提供することができる。
本発明のベロ毒素産生抑制剤のための飲食品は、ポリ乳酸混合物を、食品に使われる一般的な原料に直接混合、分散したのち、公知の方法により所望の形態に加工することによって得ることができる。
本発明のベロ毒素産生抑制剤のための飲食品はあらゆる形態の飲食品を包含するものであり、その種類は特に制限されず、上記したような各種飲食物、あるいは各種栄養組成物、例えば各種の経口又は経腸栄養剤や飲料等に、本発明のベロ毒素産生抑制剤剤を配合して飲食品として提供することができる。このような飲食品の組成としては、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の他に、蛋白質、脂質、糖質、ビタミン及び／又はミネラル類などを含めることができる。飲食品の形態は特に限定されず、摂取しやすい形態であれば、固形、粉末、液体、ゲル状、スラリー状等のいずれであってもよい。
飲食品中におけるポリ乳酸混合物の含有量は特には限定されないが、一般的には０．１〜２０重量％、より好ましくは０．１〜１０重量％程度である。
飲食品に含まれるポリ乳酸混合物の量は、本発明の目的とするベロ毒素産生抑制作用を発揮できる程度に含まれることが好ましく、好ましくは摂取される飲食物１食中に０．１ｇから１０ｇ程度、より好ましくは０．５ｇから３ｇ程度である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によっていかなる点においても限定されることはない。
実施例
製造例１：ポリ乳酸混合物（以下、ＣＰＬとも称する）の製造
製造例１の反応図を以下に示す。
2003105870.tif 000004
窒素雰囲気下、０℃でジイソプロピルアミン０．１０１ｇ（１ｍｍｏｌ）の５ｍＬ  ＴＨＦ溶液にｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍヘキサン溶液）０．６３ｍＬ（１ｍｍｏｌ）を加え、１０分間攪拌し、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）とした後、Ｌ−（−）−ラクチド０．５７７ｇ（４ｍｍｏｌ）の４ｍＬ  ＴＨＦ溶液を加え、１５分間攪拌し反応させた。この反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液２０ｍＬを加え、反応を処理し、さらに水１０ｍＬを加えた。ＴＨＦ（５０ｍＬ）で５回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムを濾別した後、有機溶媒を減圧濃縮し、粗生成物０．５３ｇを得た。得られた粗生成物にエーテル６ｍＬを加え、超音波洗浄器にて１０分間浸漬し、濾過し、融点１２５〜１２９℃の白色固体生成物０．３９ｇを得た。
得られた生成物の物性データを図１から図７に示す。図１から図７に示したＦＡＢＭＳ及びＮＭＲデータから、固体生成物中に３量体から２１量体の環状乳酸オリゴマーと３量体から２７量体の鎖状乳酸オリゴマーが存在することが確認された。
試験例１：
（材料および方法）
実験動物は５〜１２週齢の無菌ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（日本クレア）を用いた。ＣＰＬ群は０．１％のＣＰＬ（製造例１で製造したもの）を混入させた標準固形餌（ＣＥ−２）をあらかじめ高圧蒸気滅菌（１２１℃、１０分間）し、滅菌水道水とともに自由摂取させた。また、対照群は放射線滅菌（コバルト６０）した標準固形餌（ＣＥ−２）を滅菌水道水とともに自由摂取させた。実験に用いたすべてのマウスはビニール・アイソレーター内で飼育管理された。
ＥＨＥＣ（５．０×１０６ｃｆｕ／マウス）はＣＰＬの投与を開始してから７日目に胃ゾンデを用いて経口投与し、生死を観察した。
腸管付着阻止実験として、ＥＨＥＣを無菌マウスに感染させた後４日目に屠殺し、腸管各部位（十二指腸、空・回腸、大腸）を約４ｃｍの長さに切り、腸管を開き、内容物を十分にＰＢＳで洗浄した。腸管の水分を濾紙で吸い取り、重量を計測し、１０倍量のＰＢＳを加えてホモジナイズし、その０．１ｍｌを普通寒天培地上に塗抹して集落数を数えた。
また、大腸菌ベロドキシン検出用キット（デンカ生研）を用いて、盲腸内容物中に産生されたベロ毒素（ＶＴ１、ＶＴ２）、ＩｇＡキットを用いて、腸管に分泌されるＩｇＡを測定した。
（結果および考察）
（１）ＥＨＥＣ感染マウスの生存率に対するＣＰＬの効果
ＣＰＬ投与群および対照群における生死観察（生存率）の結果を図８に示す。１５日間の観察期間におけるＥＨＥＣ感染マウスの生存率は対照群２０％（２／１０）であったのに対し、ＣＰＬ投与群は８８．９％（１６／１８）であった。この結果より、ＣＰＬはＥＨＥＣに対して感染防御効果を示すことが示唆された。
（２）ＥＨＥＣの腸管付着に対するＣＰＬの効果
腸管各部位（十二指腸、空・回腸、結腸）における付着菌数および腸管に分泌されたＩｇＡは、ＣＰＬ投与群と対照群の間には差は認められなかった（図９および図１０）。この結果より、ＣＰＬは腸管粘膜付着阻止を示さないことが示唆された。
（３）ベロ毒素（ＶＴ１、ＶＴ２）に対するＣＰＬの効果
ＣＰＬ投与群および対照群の盲腸内容物中に産生されたベロ毒素（ＶＴ１、ＶＴ２）を測定した結果を図１１に示した。対照群におけるＶＴ１の希釈倍率は６４倍であったが、ＣＰＬ投与群の希釈倍率は３２倍であった。また、対照群におけるＶＴ２の希釈倍率は２５６倍であったが、ＣＰＬ投与群の希釈倍率は１２８倍であった。この結果から、ＣＰＬはベロ毒素（ＶＴ１、Ｔ２）量を抑制していることが実証された。以上の結果から、ＣＰＬ投与群の生存率が高い要因の一つとして、ＣＰＬがＥＨＥＣの産生するベロ毒素量を抑制していることが判明した。
産業上の利用の可能性
本発明のベロ毒素産生抑制剤は、ベロ毒素産生菌（例えば、Ｏ−１５７などの腸管出血性大腸菌）によるベロ毒素の産生を抑制するために使用することができる。また、本発明において有効成分として用いられるポリ乳酸混合物は、生体成分に由来する乳酸の低縮合体であることから、生体適合性が高く、副作用が少ない。
【図面の簡単な説明】
図１は、製造例１で得た生成物のｐｏｓｉｔｉｖｅモードＦＡＢＭＳスペクトルの全体図を示す。Ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  １０．００００〜１３０５．５９００
図２は、製造例１で得た生成物のｎｅｇａｔｉｖｅモードＦＡＢＭＳスペクトルの全体図を示す。Ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  １０．００００〜２０００．００００
図３は、製造例１で得た生成物のｎｅｇａｔｉｖｅモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  １０．００００〜５０１．９２６０
図４は、製造例１で得た生成物のｎｅｇａｔｉｖｅモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  ４９０．２９８０〜１００３．７７００
図５は、製造例１で得た生成物のｎｅｇａｔｉｖｅモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  ９９９．９５００〜１５０４．３４００
図６は、製造例１で得た生成物のｎｅｇａｔｉｖｅモードＦＡＢＭＳスペクトルの拡大図を示す。Ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  １４８４．５３００〜２０００．００００
図７は、製造例１で得た生成物のＮＭＲスペクトルの全体図を示す。
図８は、Ｏ−１５７感染マウスの生存率に及ぼすＣＰＬの効果を示すグラフである。
図９は、ＥＨＥＣの腸管粘膜付着に対するＣＰＬの効果を示す図である。
図１０は、分泌型ＩｇＡに対するＣＰＬの効果を示す図である。
図１１は、盲腸内容物中のベロ毒素（ＶＴ１、ＶＴ２）に対するＣＰＬの効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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