(57)【要約】本発明は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）と上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の複合体の結晶およびＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の結晶、それらの構造座標、該構造座標を用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、ＥＧＦＲ変異体・ＥＧＦ変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるＥＧＦＲ変異体・ＥＧＦ変異体、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてエピトープを設計する方法、抗ＥＧＦＲ抗体・抗ＥＧＦ抗体の製造方法および該方法により得られる抗体、ＥＧＦＲ二量体化部位を形成する領域を含むポリペプチドまたはその塩などに関する。
2003066677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶であり、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体が以下の（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有する結晶。
（Ａ）ＥＧＦとＥＧＦＲが１：１で結合している；
（Ｂ）ＥＧＦ結合ＥＧＦＲが二量体を形成している
【請求項２】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶であって、単位格子定数がａ＝２２０．２±１．５Å、ｂ＝２２０．２±１．５Åおよびｃ＝１１３．１±１．５Åであることを特徴とする結晶。
【請求項３】
結晶化可能なＥＧＦＲの製造方法であり、以下の工程：
（Ａ）Ｌｅｃ８細胞を用いてＥＧＦＲを産生する工程；および
（Ｂ）グリコシダーゼを用いてＥＧＦＲを脱グリコシル化する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により製造される結晶化可能なＥＧＦＲ。
【請求項５】
ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の結晶の製造方法であり、以下の工程：
（Ａ）結晶化可能なＥＧＦＲを製造する工程；および
（Ｂ）ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質を接触させる工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
ＥＧＦＲ活性調節物質がＥＧＦである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の構造座標を決定する方法であり、以下の工程：
（Ａ）ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の結晶を製造する工程；および
（Ｂ）（Ａ）により得られた結晶を用いたＸ線結晶構造解析によりＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の構造座標を取得する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
ＥＧＦＲ活性調節物質がＥＧＦである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の結晶を用いたＸ線結晶構造解析により得られるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標。
【請求項１０】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いることを特徴とする、ＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＥＧＦＲ活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階：
（１）被験物質の立体構造を構造座標化する段階；ならびに
（２）（１）の構造座標および以下の（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかに記載のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
（Ａ）以下の（Ａ−１）または（Ａ−２）のいずれかから選ばれる第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ａ−１）少なくともＥＧＦのＬｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ６９およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ａ−２）少なくともＥＧＦのＬｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ６９およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＭｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２およびＣｙｓ３３、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｇｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｇｌｕ３５、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｇｌｕ９０およびＴｙｒ１０１に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｂ）以下の（Ｂ−１）または（Ｂ−２）のいずれかから選ばれる第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｂ−１）少なくともＥＧＦのＬｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０およびＡｓｐ３５５に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｂ−２）少なくともＥＧＦのＬｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０およびＡｓｐ３５５に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｈｉｓ１６、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９およびＧｌｕ４０、ならびにＥＧＦＲのＴｈｒ１０、Ａｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｇｌｎ３８４およびＨｉｓ４０９に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｃ）以下の（Ｃ−１）または（Ｃ−２）のいずれかから選ばれる第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｃ−１）少なくともＥＧＦのＡｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｃ−２）少なくともＥＧＦのＡｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＧｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｓｐ４６およびＬｙｓ４８、ならびにＥＧＦＲのＡｒｇ２９、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｇｌｎ４０８、Ｇｌｎ４１１、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｄ）（Ａ）に記載の第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（Ｂ）に記載の第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｅ）（Ｂ）に記載の第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（Ｃ）に記載の第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｆ）（Ａ）に記載の第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（Ｃ）に記載の第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｇ）（Ａ）に記載の第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位、（Ｂ）に記載の第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（Ｃ）に記載の第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｈ）以下の（Ｈ−１）〜（Ｈ−３）のいずれかから選ばれるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｈ−１）少なくともＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ａｓｐ４６およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＰｈｅ３５７、Ｌｙｓ１３、Ａｓｐ３５５、Ａｒｇ２９、Ｌｅｕ３８２、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（Ｈ−２）ＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ｈｉｓ１６、Ｍｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｌｅｕ２６、Ｌｙｓ２８、Ａｌａ３０、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｖａｌ３５、Ｔｙｒ３７、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｒｇ４５、Ａｓｐ４６、Ｌｅｕ４７、Ｌｙｓ４８およびＴｒｐ４９、ならびにＥＧＦＲのＡｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｌｅｕ１４、Ｔｈｒ１５、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ａｓｐ２２、Ａｒｇ２９、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｌｅｕ６９、Ｔｙｒ８９、Ｇｌｕ９０、Ｌｅｕ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｌｅｕ３４８、Ｐｒｏ３４９、Ｖａｌ３５０、Ａｓｐ３５５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｔｈｒ３５８、Ｌｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｇｌｎ４０８、Ｈｉｓ４０９、Ｇｌｎ４１１、Ｐｈｅ４１２、Ａｌａ４１５、Ｖａｌ４１７、Ｉｌｅ４３８およびＬｙｓ４６５に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標；
（Ｈ−３）ＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ｈｉｓ１６、Ｍｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｌｅｕ２６、Ｌｙｓ２８、Ａｌａ３０、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｖａｌ３５、Ｔｙｒ３７、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｒｇ４５、Ａｓｐ４６、Ｌｅｕ４７、Ｌｙｓ４８およびＴｒｐ４９、ならびにＥＧＦＲのＡｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｌｅｕ１４、Ｔｈｒ１５、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ａｓｐ２２、Ａｒｇ２９、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｌｅｕ６９、Ｔｙｒ８９、Ｇｌｕ９０、Ｌｅｕ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｌｅｕ３４８、Ｐｒｏ３４９、Ｖａｌ３５０、Ａｓｐ３５５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｔｈｒ３５８、Ｌｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｇｌｎ４０８、Ｈｉｓ４０９、Ｇｌｎ４１１、Ｐｈｅ４１２、Ａｌａ４１５、Ｖａｌ４１７、Ｉｌｅ４３８およびＬｙｓ４６５に相当するアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階：
（１）被験物質の立体構造を構造座標化する段階；ならびに
（２）（１）の構造座標および以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階；
を含むことを特徴とする方法；
（Ａ）少なくとも二量体を形成している第一のＥＧＦＲのＴｈｒ２４９、Ｔｙｒ２４６およびＧｌｎ２５２、ならびに第二のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｃｙｓ２８３およびＡｌａ２８６に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（Ｂ）少なくとも二量体を形成している第一のＥＧＦＲのＴｈｒ２４９、Ｔｙｒ２４６およびＧｌｎ２５２、ならびに第二のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｃｙｓ２８３およびＡｌａ２８６に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつ両方のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｇｌｎ１９４、Ｐｒｏ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｌｙｓ２２９、Ｐｈｅ２３０、Ｔｈｒ２３９、Ｐｒｏ２４２、Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ２５１、Ｇｌｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｓｅｒ２６２、Ｐｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５、Ｈｉｓ２８０、Ｓｅｒ２８２、Ｃｙｓ２８３、Ｖａｌ２８４、Ａｒｇ２８５、Ａｌａ２８６およびＬｙｓ３０３に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（Ｃ）二量体を形成している両方のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｇｌｎ１９４、Ｐｒｏ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｌｙｓ２２９、Ｐｈｅ２３０、Ｔｈｒ２３９、Ｐｒｏ２４２、Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ２５１、Ｇｌｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｓｅｒ２６２、Ｐｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５、Ｈｉｓ２８０、Ｓｅｒ２８２、Ｃｙｓ２８３、Ｖａｌ２８４、Ａｒｇ２８５、Ａｌａ２８６およびＬｙｓ３０３に相当するアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（Ｄ）二量体を形成している両方のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｇｌｎ１９４、Ｐｒｏ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｌｙｓ２２９、Ｐｈｅ２３０、Ｔｈｒ２３９、Ｐｒｏ２４２、Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ２５Ｌ  Ｇｌｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｓｅｒ２６２、Ｐｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５、Ｈｉｓ２８０、Ｓｅｒ２８２、Ｃｙｓ２８３、Ｖａｌ２８４、Ａｒｇ２８５、Ａｌａ２８６およびＬｙｓ３０３に相当するアミノ酸残基ならびにその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標；
（Ｅ）少なくともＥＧＦＲのＡｒｇ４０５およびＧｌｕ２９３に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦＲのＡｒｇ２８５、Ａｒｇ２７３、Ａｓｐ２５４およびＧｌｙ４５８に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標。
【請求項１３】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体におけるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；および
（２）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
ＥＧＦＲ活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する段階；
（２）（１）により同定されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いてＥＧＦＲ活性調節物質をスクリーニングする段階；および
（３）（２）により得られたＥＧＦＲ活性調節物質を生化学的アッセイに供し、ＥＧＦＲ活性調節作用について評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
ＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法であって、以下の段階：
（１）被験物質の立体構造を構造座標化する段階；および
（２）（１）の構造座標と以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のファルマコフォアを同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
（Ａ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６２３、Ｙ座標６．２５９、Ｚ座標０．８５３に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標−１２．６５６、Ｙ座標３．３６３、Ｚ座標−２．９３４に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球３：Ｘ座標−１１．５７６、Ｙ座標９．５４６、Ｚ座標−２．１３５に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−１３．８６、Ｙ座標８．５３２、Ｚ座標−３．７９２に中心を有する半径２．０Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
（Ｂ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６６９、Ｙ座標−１．６３０、Ｚ座標−１．２００に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球２：Ｘ座標−４．５４７、Ｙ座標６．３０４、Ｚ座標４．０６０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−０．８４２、Ｙ座標２．９３８、Ｚ座標０．１６９に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
（Ｃ）以下の４つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標４．５２７、Ｙ座標６．１１９、Ｚ座標−０．７２５に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標０．４５９、Ｙ座標−１．８６１、Ｚ座標１．４１０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−６．５３４、Ｙ座標３．４９６、Ｚ座標−０．２４７に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．０４５、Ｙ座標１．６１７、Ｚ座標１．５３８に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球４：Ｘ座標−１１．０２４、Ｙ座標２．６６７、Ｚ座標０．１２８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｄ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．４１６、Ｙ座標７．５４２、Ｚ座標−２．１８４に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．１８５、Ｙ座標６．５８７、Ｚ座標−２．８２７に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標−１６．１１９、Ｙ座標９．３２６、Ｚ座標−０．３４１に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−１４．８４６、Ｙ座標５．８０６、Ｚ座標−１．６７６に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｅ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標６．５９５、Ｙ座標−０．９９６、Ｚ座標−１．６６３に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標７．６２５、Ｙ座標１．４８２、Ｚ座標−０．３２２に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標１．８５８、Ｙ座標１．０４６、Ｚ座標１．３７０に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標２．０５１、Ｙ座標２．６２６、Ｚ座標−１．１７２に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球３：Ｘ座標−１．９３６、Ｙ座標０．０２１、Ｚ座標−３．２７８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域
【請求項１６】
ＥＧＦＲ活性調節物質の設計方法であって、以下の段階：
（１）以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のファルマコフォアの各特性球に対応する官能基を有する各フラグメント群を作成する段階；および
（２）（１）で作成した各フラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物を設計する段階；
を含むことを特徴とする方法。
（Ａ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６２３、Ｙ座標６．２５９、Ｚ座標０．８５３に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標−１２．６５６、Ｙ座標３．３６３、Ｚ座標−２．９３４に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球３：Ｘ座標−１１．５７６、Ｙ座標９．５４６、Ｚ座標−２．１３５に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−１３．８６、Ｙ座標８．５３２、Ｚ座標−３．７９２に中心を有する半径２．０Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
（Ｂ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６６９、Ｙ座標−１．６３０、Ｚ座標−１．２００に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球２：Ｘ座標−４．５４７、Ｙ座標６．３０４、Ｚ座標４．０６０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−０．８４２、Ｙ座標２．９３８、Ｚ座標０．１６９に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
（Ｃ）以下の４つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標４．５２７、Ｙ座標６．１１９、Ｚ座標−０．７２５に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標０．４５９、Ｙ座標−１．８６１、Ｚ座標１．４１０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−６．５３４、Ｙ座標３．４９６、Ｚ座標−０．２４７に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．０４５、Ｙ座標１．６１７、Ｚ座標１．５３８に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球４：Ｘ座標−１１．０２４、Ｙ座標２．６６７、Ｚ座標０．１２８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｄ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．４１６、Ｙ座標７．５４２、Ｚ座標−２．１８４に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．１８５、Ｙ座標６．５８７、Ｚ座標−２．８２７に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標−１６．１１９、Ｙ座標９．３２６、Ｚ座標−０．３４１に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−１４．８４６、Ｙ座標５．８０６、Ｚ座標−１．６７６に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｅ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標６．５９５、Ｙ座標−０．９９６、Ｚ座標−１．６６３に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標７．６２５、Ｙ座標１．４８２、Ｚ座標−０．３２２に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標１．８５８、Ｙ座標１．０４６、Ｚ座標１．３７０に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標２．０５１、Ｙ座標２．６２６、Ｚ座標−１．１７２に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球３：Ｘ座標−１．９３６、Ｙ座標０．０２１、Ｚ座標−３．２７８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域
【請求項１７】
ＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアの設計方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の３次元構造を解析し、ＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアとして使用し得る部分構造を特定する段階；および
（２）該部分構造を特性球に変換し、ファルマコフォアを発生させる段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
ＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する段階；
（２）（１）により同定されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いてＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階；
（３）（２）により得られたファルマコフォアを用いてＥＧＦＲ活性調節物質をスクリーニングする段階；および
（４）（３）により得られたＥＧＦＲ活性調節物質を生化学的アッセイに供し、ＥＧＦＲ活性調節作用について評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
ＥＧＦＲ活性調節物質の設計方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する段階；
（２）（１）により同定されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いてＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階；
（３）（２）により得られたファルマコフォアを用いて化合物を設計する段階；および
（４）（３）により得られた化合物を生化学的アッセイに供し、ＥＧＦＲ活性調節作用について評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のファルマコフォアに適合する構造を有するＥＧＦＲアンタゴニスト。
（Ａ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６２３、Ｙ座標６．２５９、Ｚ座標０．８５３に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標−１２．６５６、Ｙ座標３．３６３、Ｚ座標−２．９３４に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球３：Ｘ座標−１１．５７６、Ｙ座標９．５４６、Ｚ座標−２．１３５に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−１３．８６、Ｙ座標８．５３２、Ｚ座標−３．７９２に中心を有する半径２．０Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
（Ｂ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６６９、Ｙ座標−１．６３０、Ｚ座標−１．２００に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球２：Ｘ座標−４．５４７、Ｙ座標６．３０４、Ｚ座標４．０６０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−０．８４２、Ｙ座標２．９３８、Ｚ座標０．１６９に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
（Ｃ）以下の４つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標４．５２７、Ｙ座標６．１１９、Ｚ座標−０．７２５に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標０．４５９、Ｙ座標−１．８６１、Ｚ座標１．４１０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−６．５３４、Ｙ座標３．４９６、Ｚ座標−０．２４７に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．０４５、Ｙ座標１．６１７、Ｚ座標１．５３８に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球４：Ｘ座標−１１．０２４、Ｙ座標２．６６７、Ｚ座標０．１２８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｄ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．４１６、Ｙ座標７．５４２、Ｚ座標−２．１８４に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．１８５、Ｙ座標６．５８７、Ｚ座標−２．８２７に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標−１６．１１９、Ｙ座標９．３２６、Ｚ座標−０．３４１に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−１４．８４６、Ｙ座標５．８０６、Ｚ座標−１．６７６に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｅ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標６．５９５、Ｙ座標−０．９９６、Ｚ座標−１．６６３に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標７．６２５、Ｙ座標１．４８２、Ｚ座標−０．３２２に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標１．８５８、Ｙ座標１．０４６、Ｚ座標１．３７０に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標２．０５１、Ｙ座標２．６２６、Ｚ座標−１．１７２に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球３：Ｘ座標−１．９３６、Ｙ座標０．０２１、Ｚ座標−３．２７８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域
【請求項２１】
ＥＧＦＲの活性を阻害する方法であって、ＥＧＦＲと、以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のファルマコフォアに適合する構造を有するＥＧＦＲアンタゴニストを接触させることを特徴とする方法。
（Ａ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６２３、Ｙ座標６．２５９、Ｚ座標０．８５３に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標−１２．６５６、Ｙ座標３．３６３、Ｚ座標−２．９３４に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球３：Ｘ座標−１１．５７６、Ｙ座標９．５４６、Ｚ座標−２．１３５に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−１３．８６、Ｙ座標８．５３２、Ｚ座標−３．７９２に中心を有する半径２．０Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
（Ｂ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．６６９、Ｙ座標−１．６３０、Ｚ座標−１．２００に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
特性球２：Ｘ座標−４．５４７、Ｙ座標６．３０４、Ｚ座標４．０６０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−０．８４２、Ｙ座標２．９３８、Ｚ座標０．１６９に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
（Ｃ）以下の４つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標４．５２７、Ｙ座標６．１１９、Ｚ座標−０．７２５に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球２：Ｘ座標０．４５９、Ｙ座標−１．８６１、Ｚ座標１．４１０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−６．５３４、Ｙ座標３．４９６、Ｚ座標−０．２４７に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．０４５、Ｙ座標１．６１７、Ｚ座標１．５３８に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球４：Ｘ座標−１１．０２４、Ｙ座標２．６６７、Ｚ座標０．１２８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｄ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標−５．４１６、Ｙ座標７．５４２、Ｚ座標−２．１８４に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．１８５、Ｙ座標６．５８７、Ｚ座標−２．８２７に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標−１６．１１９、Ｙ座標９．３２６、Ｚ座標−０．３４１に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域；
特性球３：Ｘ座標−１４．８４６、Ｙ座標５．８０６、Ｚ座標−１．６７６に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域；
（Ｅ）以下の３つの特性球により定義されるファルマコフォア；
特性球１：Ｘ座標６．５９５、Ｙ座標−０．９９６、Ｚ座標−１．６６３に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標７．６２５、Ｙ座標１．４８２、Ｚ座標−０．３２２に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域；
特性球２：Ｘ座標１．８５８、Ｙ座標１．０４６、Ｚ座標１．３７０に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標２．０５１、Ｙ座標２．６２６、Ｚ座標−１．１７２に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域；
特性球３：Ｘ座標−１．９３６、Ｙ座標０．０２１、Ｚ座標−３．２７８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域
【請求項２２】
ＥＧＦＲ変異体を設計する方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；
（２）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階；および
（３）変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
ＥＧＦＲ変異体を製造する方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いてＥＧＦＲ変異体を設計する段階；
（２）変異蛋白質を調製する段階；および
（３）変異蛋白質を生化学的アッセイに供し所望の活性を有することを確認する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の製造方法により得られるＥＧＦＲ変異体。
【請求項２５】
ＥＧＦＲ二量体化部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦＲ変異体。
【請求項２６】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ相互作用部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦＲ変異体。
【請求項２７】
ＥＧＦＲ二量体化部位およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ相互作用部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦＲ変異体。
【請求項２８】
ＥＧＦ変異体を設計する方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；
（２）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階；および
（３）変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
ＥＧＦ変異体を製造する方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いてＥＧＦ変異体を設計する段階；
（２）変異蛋白質を調製する段階；および
（３）変異蛋白質を生化学的アッセイに供し所望の活性を有することを確認する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の製造方法により得られるＥＧＦ変異体。
【請求項３１】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ相互作用部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦ変異体。
【請求項３２】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて、分子置換法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法。
【請求項３３】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて、ホモロジーモデリング法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法。
【請求項３４】
請求項３２または請求項３３に記載の方法により得られる蛋白質または蛋白質複合体の構造座標。
【請求項３５】
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてエピトープを設計する方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；および
（２）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりエピトープとなり得る部分を特定する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
抗ＥＧＦＲ抗体の製造方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いてエピトープを設計する段階；
（２）設計したエピトープを含む抗原を調製する段階；および
（３）設計したエピトープを認識する抗体を調製する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の製造方法により得られる抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項３８】
抗ＥＧＦ抗体の製造方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いてエピトープを設計する段階；
（２）設計したエピトープを含む抗原を調製する段階；および
（３）設計したエピトープを認識する抗体を調製する段階；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の製造方法により得られる抗ＥＧＦ抗体。
【請求項４０】
ＥＧＦＲ二量体化部位を形成する領域の全部または一部のアミノ酸残基を含むポリペプチドまたはその塩。
【請求項４１】
ＥＧＦＲ二量体化部位を形成する領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２４０番目〜第２６７番目からなる領域の全部または一部である請求項４０記載のポリペプチドまたはその塩。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、上皮増殖因子（以下、ＥＧＦまたはＥＧＦリガンドと呼ぶ場合がある）と上皮増殖因子受容体（以下、ＥＧＦＲ、ＥＧＦ受容体またはＥＧＦレセプターと呼ぶ場合がある）の複合体の結晶およびＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の結晶、Ｘ線結晶構造解析に供することが可能なＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質（特にＥＧＦ）の複合体の結晶化方法、その結晶を構造解析することによって得られるＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質（特にＥＧＦ）の複合体の構造座標、該構造座標を用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体におけるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の同定方法、ＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアの設計方法、ＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、ファルマコフォアに適合するＥＧＦＲアンタゴニスト、ＥＧＦＲアンタゴニストを用いたＥＧＦＲ活性の阻害方法、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦＲ変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるＥＧＦＲ変異体、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦ変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるＥＧＦ変異体、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて未知の構造の蛋白質の構造座標を取得する方法および該方法により得られる構造座標、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてエピトープを設計する方法、抗ＥＧＦＲ抗体の製造方法および該方法により得られる抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦ抗体の製造方法および該方法により得られる抗ＥＧＦ抗体、ＥＧＦＲ二量体化部位を形成する領域を含むポリペプチドまたはその塩などに関する。
背景技術
上皮増殖因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーの１つのメンバーであり、細胞増殖、成熟および分化の調節に関与することが知られている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｇ．＆  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，７７０９−７７１２（１９９０））。
上皮増殖因子（ＥＧＦ）のＥＧＦＲ細胞外ドメインとの結合は受容体の二量体化を誘導するものと考えられ、この二量体化は２つの受容体の細胞質チロシンキナーゼドメインを接近させ、それにより細胞内ドメインの内因性チロシンキナーゼ受容体を活性化し、続いて多数の下流シグナル経路を活性化すると考えられている（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  １０３，２１１−２２５（２０００））。この活性化機序の他、最近、ＥＧＦにより活性化されたＥＧＦＲの一部分が核に転移して、転写因子として機能することにより、高度な増殖活性に必要な遺伝子を活性化することが証明された（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３，８０２−８０８（２００１））。一方、チロシンのリン酸化に伴う自発性オリゴマー化は、細胞外ドメインの一部分または大部分を欠損する発癌性突然変異体について報告されている（Ｈａｌｅｙ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４，２７３−２８３（１９８９）；Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２９２７−２９３５（１９９７））。細胞外ドメインはまた、リガンド依存的自発性オリゴマー化の抑制に重要な役割を果たす可能性がある。
ＥＧＦＲの３つの相同体として、ヒトにおいてＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４が同定されている。多数の研究によって、ＥＧＦリガンドが、ホモ二量体化に加えてＥＧＦＲファミリーのメンバーの異なるペアで組み合わせたヘテロオリゴマー化も誘導することが証明されている（Ｏｌａｙｉｏｙｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．１９，３１５９−３１６７（２０００））。
ヒトＥＧＦの単量体立体構造に関しては高分解能ＮＭＲを用いた解析が行われてきている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２７，２７１−２８２）。この結果、２つのヘリカル断片（Ｌｅｕ８−Ｔｙｒ１３、Ｌｅｕ４７−Ｇｌｕ５１）が見つかり、１つ目はジスルフィド架橋（Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ２０、Ｃｙｓ１４−Ｃｙｈ３１）を経た主要β−シートを形成し、２つ目は蛋白質のＣ末端におけるタイプＩＩターンを形成することが報告されている。このヘリックスは疎水面上のＬｅｕ４７、Ｔｒｐ５０、Ｔｒｐ４９およびＬｅｕ５２と、親水面上のＬｙｓ４８およびＧｌｕ５１との両親媒性の特徴を示していると報告されている。このヘリックスは保存された残基であるＴｙｒ３７の周辺の疎水性コア（Ｖａｌ３４、Ａｒｇ４５、Ｔｒｐ５０）の形成に関与していると考えられている。近年、ＥＧＦの二量体化に関してＮＭＲを用いた解析結果の報告もなされている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００１）２７６，３４９１３−３４９１７）。この結果、３つのジスルフィド架橋（Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ２０、Ｃｙｓ１４−Ｃｙｓ３１、Ｃｙｓ３３−Ｃｙｓ４２）が確認され、Ｎドメイン（１−３２番残基）とＣドメイン（３３−５３番残基）から成っていることが明らかとなった。Ｎドメインは不規則なＮ末端ペプチドセグメント（１−１２番残基）を有し、逆平行なβ−シート（１９−２３および２８−３２番残基）を有することが報告されている。また、Ｃドメインは短い逆平行β−シート（３６−３８および４４−４６番残基）を含み、そしてＣ末端セグメント（４８−５３番残基）を含むことが報告されている。
また、Ａｒｇ４１とＬｅｕ４７に対する変異化の研究が行われ、その結果ＥＧＦとそのレセプターとの結合に際し、これら残基が不可欠であり、リシンによるアルギニンの置換も許容されない事が知られている。（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（１９８９）９，４０８３−４０８６；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６１，３９２−３９６；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２７１，４７−５０；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０，８８９１−８８９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８９）８６，９８３６−９８４０）。これは、ＥＧＦのアルギニン側鎖（グアニジノ基）がＥＧＦＲとの特異的な相互作用に関与していることを示す。その他に、ポイントミューテーションによる研究で、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｌｅｕ２６、Ａｌａ３０、Ａｓｎ３２に対してアミノ酸改変体を作製し、これを用いて実験検討が加えられた結果から各残基はＥＧＦＲと直接的な相互作用をするアミノ酸である可能性が示唆されている。しかしながら、ポイントミューテーション実験において相互作用に重要なアミノ酸残基の推定がなされつつあるものの、そのアミノ酸側鎖の活性コンフォメーションや、ＥＧＦＲとの相互作用の形式、ＥＧＦＲアミノ酸側鎖の活性コンフォメーションが不明であるため、産業応用に必要な情報は、未だもたらされていない状況であった。
ＥＧＦＲに関しては結晶構造を解明する努力はされているものの、未だ達成されておらず（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９０）２６５，２２０８２−２２０８５；Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ（１９９８）５４，９９９−１００１）、ホモロジーモデリングにより立体構造がモデリングされているのみである（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００１）１５５０，１４４−１５２）。この報告ではインスリンレセプターとリンパ細胞タンパク−チロシンキナーゼをテンプレートとして用い、ＥＧＦＲのモデル構造を構築している。またＩＧＦ−１Ｒ（インシュリン様増殖因子−１受容体）をテンプレートとして用いている報告もある（Ｊｏｒｉｓｓｅｎ  Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０００，９（２）１３１０−３２４；ＷＯ９９／６２９５５）。
ポイントミューテーション実験では、Ｇｌｕ３６７、Ｇｌｙ４４１、Ｇｌｕ４７２をＬｙｓに変異化し、Ｇｌｕ３６７ＬｙｓおよびＧｌｕ４７２Ｌｙｓ変異化ではリガンドとの結合に影響を及ぼさないことが明らかとなった。一方でＧｌｙ４４１Ｌｙｓでの変異化はＥＧＦとのアフィニティーをかなり減少させたことが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０，８９３０−８９３９）。
現在、ＥＧＦＲを標的とした医薬品候補化合物の開発が進行中である（Ｄｒｕｇｓ  ２０００；Ｖｏｌ．６０  Ｓｕｐｐｌ．１：１５−２３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１；Ｖｏｌ．７：２９５８−２９７０）。またＥＧＦＲの細胞内ドメインのキナーゼ活性を抑制する低分子阻害剤も数多く報告されている（Ｄｒｕｇｓ  ２０００；Ｖｏｌ．６０  Ｓｕｐｐｌ．１：２５−３２）。しかしながら、低分子化合物において、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合することで、選択的に活性化を促進する薬物、もしくはこれを選択的に阻害する薬物は医薬品として未だ上市されるまでには至っていない。一般に、抗体や組換えタンパク製剤に比較して低分子化合物のアゴニストやアンタゴニストのほうが、多くのケースで経口投与可能となるため、医薬品として有用である。従って、多くの疾患においてタンパク製剤の低分子化が試みられているが、通常はその開発に試行錯誤が加わるため多大な費用と時間がかかり、その結果として、患者にとって有用な薬の開発に、長期間・高コストを要するのが常である。また、細胞内キナーゼドメインを標的としたアンタゴニストは、細胞膜を透過させる必要があるのでその骨格に制限がかかり、かつ過剰な投与量を必要とすることが予測される。加えてＥＧＦＲキナーゼドメインの実験的な立体構造（結晶構造やＮＭＲ構造）は存在せず、選択性を付与する上で多くの試行錯誤的な誘導合成が必要となる。更にＡＴＰ結合領域に作用するアンタゴニストの場合、多くのケースでＡＴＰ様の化学的性質を有する薬理作用団を分子内に含むために、化合物の性質として核酸類似物質となることが多く、将来的な副作用が懸念される可能性もある。
発明の開示
かかる状況下においてＥＧＦとＥＧＦＲの相互作用を阻止する低分子化合物、またはＥＧＦＲ細胞外ドメインに選択的に結合・活性化し、ＥＧＦシグナルを伝える低分子化合物を見出すために、ＥＧＦとＥＧＦＲの相互作用部位をミミックする技術が切望されてきた。分子設計的手法によりＥＧＦＲアゴニストやアンタゴニストあるいは、アゴニスト・アンタゴニスト抗体を構築・設計することで、従来に比較してはるかに合理的にＥＧＦ／ＥＧＦＲに対する選択的医薬品を作製可能となる。このような構造情報に基づく分子設計や構造情報に基づくコンピュータスクリーニングには、ＥＧＦ／ＥＧＦＲの複合体の実験構造とその解析結果が非常に重要な意味を持つ。
しかし上述のように、ＥＧＦリガンドに関してはＮＭＲ構造で単量体もしくはホモダイマーの構造が取得されているが、ＥＧＦＲとの結合時のアミノ酸側鎖や、主鎖の活性コンフォメーションは知られていないうえ、ＥＧＦＲに至っては、モデリングによりリガンドが結合していない状態でのＥＧＦＲ構造が予測されていたに過ぎなかった。さらに、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造については全く未知であった。リガンドと結合していない状況でのレセプター構造と単体のリガンド構造からでは、両者が結合し、活性化したときの活性コンフォメーションを推測することは不可能であった。従って、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体結晶構造とその相互作用部位の解析から得られるファルマコフォアの特定や、分子設計的手法の発明は、これまで切望の極みであった。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、優れたＥＧＦＲアゴニストまたはアンタゴニストの提供を目的として鋭意研究した結果、Ｘ線結晶構造解析においてその立体構造を特定可能なＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶化手法の確立に成功し、この結晶を用いて、多くの研究者が試みたがこれまで誰もなしえなかった複合体構造の座標を明らかにした。さらにその解析を通じて、ＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体におけるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の同定方法、ＥＧＦＲ活性調節物質（特にＥＧＦ）のファルマコフォアの設計方法、ＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法および設計方法、ファルマコフォアに適合するＥＧＦＲアンタゴニスト、ＥＧＦＲアンタゴニストを用いたＥＧＦＲ活性の阻害方法、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦＲ変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるＥＧＦＲ変異体、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦ変異体の設計方法および製造方法、ならびに該製造方法により得られるＥＧＦ変異体、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて未知の構造の蛋白質の構造座標を取得する方法および該方法により得られる構造座標、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてエピトープを設計する方法、抗ＥＧＦＲ抗体の製造方法および該方法により得られる抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦ抗体の製造方法および該方法により得られる抗ＥＧＦ抗体、ＥＧＦＲ二量体化部位を形成する領域を含むポリペプチドまたはその塩などを提供することで本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．結晶およびその製造方法
本発明はＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶を提供する。該結晶はＥＧＦとＥＧＦＲが１：１で結合しており、かつＥＧＦ結合ＥＧＦＲ（ＥＧＦが結合した状態のＥＧＦＲ）が二量体を形成しているＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体を含むことを特徴とする。より詳細には、ＥＧＦ結合ＥＧＦＲはＥＧＦを介さずに受容体同士の結合によって二量体化している。ＥＧＦ結合ＥＧＦＲは、図１ａに示すように、ＥＧＦＲのドメインＩＩ、より詳細には配列番号１に示すヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の２４０〜２６７番目のアミノ酸からなる領域を介して二量体化している。また、ＥＧＦはＥＧＦＲのドメインＩおよびＩＩＩと相互作用している。ＥＧＦＲのドメインＩおよびＩＩＩはＥＧＦを挟み込むかたちで二量体化部位の反対側へと湾曲している。このような特徴を有するＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶であれば、本発明の範囲内に含まれる。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体におけるＥＧＦとＥＧＦＲとの相互作用部位を「ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位」、ＥＧＦ結合ＥＧＦＲが相互作用して二量体化している部位を「二量体化部位」または「ＥＧＦＲ二量体化部位」と呼ぶ。また、ＥＧＦ／ＥＧＦＲと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド／受容体複合体についても同様に、リガンドと受容体との相互作用部位を「リガンド／受容体結合部位」、リガンド結合受容体が相互作用して二量体化している部位を「二量体化部位」または「受容体二量体化部位」と呼ぶ。
本発明に用いるＥＧＦおよびＥＧＦＲは哺乳動物、好ましくはマウス、ヒト、特に好ましくはヒト由来のものである。ＥＧＦおよびＥＧＦＲのアミノ酸配列は公知である。ヒトＥＧＦ（成熟ペプチド）はアクセッション番号ＡＡＡ７２１７３（配列番号２）としてＮＣＢＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。マウスＥＧＦはアクセッション番号ＮＰ＿０３４２４３としてＮＣＢＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。ラットＥＧＦはアクセッション番号ＮＰ＿０３６９７４としてＮＣＢＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。ヒトＥＧＦＲはアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９（配列番号１５）としてＮＣＢＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。マウスＥＧＦＲはアクセッション番号ＣＡＡ５５５８７としてＮＣＢＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。ラットＥＧＦＲはアクセッション番号ＡＡＦ１４００８としてＮＣＢＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。上記以外の種のＥＧＦおよびＥＧＦＲについても公知のデータベースより配列情報を取得することが可能である。
またその機能が保持されることを条件として、天然のアミノ酸配列に対して１個以上、好ましくは１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、Ｎ末端および／またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも包含される。通常、このような一次構造上の僅かな差異は全体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると考えられる。ヒトＥＧＦＲの全長アミノ酸配列を配列番号１５に示す。配列番号１５に示されるアミノ酸配列の１〜２４番目のアミノ酸からなる領域はシグナル配列として除去されるので、天然の成熟ヒトＥＧＦＲは配列番号１５に示されるアミノ酸配列の２５〜１２１０番目のアミノ酸で構成される。
ＥＧＦＲとしてはＥＧＦＲの細胞外ドメインを用いることが好ましい。ＥＧＦＲは細胞膜を一回貫通した構造をしており、Ｎ端より、細胞外ドメイン、膜貫通領域、チロシンキナーゼ領域と自己リン酸化部位を有する細胞内ドメインから構成されている。さらに、細胞外ドメインは４つのドメイン（Ｎ端よりドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ、ドメインＩＶと呼ぶ、またはそれぞれ、Ｌ１、Ｓ１、Ｌ２、Ｓ２ドメインとも呼ばれる）から構成されている（Ｂａｊａｊ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９１６，２２０−２２６（１９８７））。ヒトＥＧＦＲのドメインＩは、成熟ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列の１〜１６５番目のアミノ酸、ドメインＩＩは１６６〜３１２番目のアミノ酸、ドメインＩＩＩは３１３〜５１２番目のアミノ酸、ドメインＩＶは５１３〜６１９番目のアミノ酸から構成される。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体形成には、ＥＧＦＲのドメインＩ、ドメインＩＩおよびドメインＩＩＩが関与していることが本発明により明らかになった。よって、ＥＧＦＲとしては、少なくともドメインＩ、ドメインＩＩおよびドメインＩＩＩを含む細胞外ドメインを使用することが好ましい。
１−１  蛋白質精製
本発明において結晶構造解析に使用するＥＧＦの採取源は特に限定されず、ブタ、ラット、雄牛などの肝臓、脾臓または腎臓を用いることができる。また、摘出されたヒト肝臓などから採取することもできる。上記採取源をホモジナイズし、可溶化成分を数種類のカラムクロマトグラフにより精製することにより、ＥＧＦを採取する。さらに、遺伝子工学的手法を用いて、ＥＧＦをコードする遺伝子を細菌や動物細胞等により発現させて大量生産することも可能である。例えば、ＥＧＦ遺伝子が組み込まれた組換えＤＮＡを、ＥＧＦ遣伝子が発現し得るように大腸菌、酵母、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの宿主中に導入して形質転換体を得、その形質転換体を培養することによりＥＧＦを得ることができる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、ＥＧＦ遺伝子を含む組換えＤＮＡが細胞中で自律複製可能であることが必要である。また、転写プロモーター、リボゾームＲＮＡ結合領域としてのＳＤ配列等が連結されていてもよい。転写ターミネーターなどを適宜挿入することもできる。宿主への組換えベクターの導入は、市販のキットを使用する方法等により容易に導入することができる。
ＥＧＦは、上記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体自体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。培養方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えばＣＨＯ細胞を宿主とした場合、通常の動物細胞に使用される培地中で、５％ＣＯ２条件下、３７℃で培養する。培養の際、必要に応じてウシ血清、抗生物質を培地に添加して行ってもよい。
培養後、ＥＧＦが菌体内または細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体または細胞を破砕することにより目的のＥＧＦを採取する。その後、前記培養物から各種クロマトグラフ等を用いてＥＧＦを単離精製し調製試料とする。
ＥＧＦＲについても、ＥＧＦの単離精製法に準じて得ることができる。なお、市販の遺伝子組換え型ＥＧＦまたはＥＧＦＲを使用することも可能である。
ＥＧＦとＥＧＦＲとの複合体を調製するには、精製したＥＧＦＲの溶液に精製ＥＧＦを溶解すればよい。二量体は、ＥＧＦとＥＧＦＲとを混合した反応系においてＥＧＦとＥＧＦＲとの複合体同士が結合することにより調製される。
本発明の結晶調製に用いるのに好適なＥＧＦＲのアミノ酸配列を配列番号１に、ＥＧＦのアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号１のアミノ酸配列の１〜６１９番目のアミノ酸からなる領域は、天然の成熟ヒトＥＧＦＲの１〜６１９番目のアミノ酸からなる領域（配列番号１５に示されるアミノ酸配列の２５〜６４３に該当）に相当する。配列番号１のアミノ酸配列の６２０〜６３３番目のアミノ酸配列からなる領域は精製のためのＦＬＡＧタグを含む領域である。但し、これらのアミノ酸配列に限定されるものではなく、上記アミノ酸配列において１個以上（例えば２個〜１０個）のアミノ酸に欠失、置換または付加等の変異が生じ、かつ、ＥＧＦＲ活性またはＥＧＦ活性を有するものも、本発明に使用することができる。ＥＧＦＲ活性とは、少なくともＥＧＦと結合できること、より好ましくはＥＧＦと結合し、かつそれにより二量体化することを意味し、ＥＧＦ活性とは、少なくともＥＧＦＲと結合できること、より好ましくはＥＧＦＲと結合し、かつそれによりＥＧＦＲの二量体化を引き起こすことを意味する。たとえば、配列番号１５に示されるアミノ酸配列の２５〜６４３番目のアミノ酸からなる領域に対して、Ｎ端および／またはＣ端に１アミノ酸以上伸長したアミノ酸配列を有するＥＧＦＲのアミノ酸配列を使用することが可能である。
なお、上記アミノ酸の変異は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発法により変異させることができ、そのためのキットを使用することができる（例えばＭｕｔａｎ−Ｇ、Ｍｕｔａｎ−Ｋ（いずれも宝酒造社）など）。
本発明はまた、結晶化可能なＥＧＦＲの製造方法を提供する。当該製造方法は、
（Ａ）Ｌｅｃ８細胞を用いてＥＧＦＲ蛋白質を産生する工程；および
（Ｂ）グリコシダーゼを用いてＥＧＦＲを脱グリコシル化する工程；
を含むことを特徴とする。さらに（Ｃ）ＥＧＦＲ蛋白質を塩析により粗精製する工程を含むことができる。本発明者らは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインには１０本のＮ型糖鎖が結合しており、そのうち一本はグリコシダーゼ処理では除去しにくい糖鎖であることを明らかにした。この知見に基づき末端シアル酸およびガラクトース残基欠損型Ｎ−結合オリゴ糖を有する蛋白質を産生する細胞であるＬｅｃ８細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７３７）を用いることが結晶化可能なＥＧＦＲを製造する上で有効であることを見出した。また、Ｌｅｃ８細胞を用いて産生したＥＧＦＲ蛋白質を精製する際に、塩析を用いて粗精製することが有効であることを見出した。塩析としては硫安沈殿を用いることが好ましい。グリコシダーゼの具体例としては、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＨを挙げることができる。本発明は、上記製造方法により製造される結晶化可能なＥＧＦＲも提供するものである。当該ＥＧＦＲは、少なくともＥＧＦに結合する活性を保持していることを特徴とする。少なくともＥＧＦに結合する活性を保持している限りにおいては、ＥＧＦＲとしては、天然のアミノ酸配列に対して１個以上、好ましくは１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、Ｎ末端および／またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも包含される。また、本発明の結晶化可能なＥＧＦＲは、それを用いて得られる結晶（ＥＧＦＲ単独の結晶でもＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の結晶でもよい）がＸ線結晶構造解析に供した際に少なくとも１０Å以下の分解能、好ましくは４．０Å以下の分解能、更に好ましくは３．５Å以下の分解能を与えるだけの品質を有していることが好ましい。
上記方法により製造されたＥＧＦＲは、本発明においてＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体またはＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体を結晶化する方法において用いることができ、このＥＧＦＲを使用することにより、結晶を容易に得ることが可能となる。
１−２  蛋白質の結晶の調製
次いで、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶を調製する。蛋白質を結晶化する方法としては、蒸気拡散法、バッチ法、透析法などの一般的な蛋白質結晶手法を用いることができる。また、蛋白質の結晶化においては、蛋白質濃度、塩濃度、ｐＨ、沈殿剤の種類、温度等の物理的および化学的因子の決定が重要であり、これらの因子の決定については当業者に一般的に知られている。従って、複数のパラメーター（例えば沈殿剤、ｐＨおよび塩濃度）を能率よく調べるために、フェーズダイアグラムを作成しておくことが好ましい。一旦結晶が析出した後は、さらにパラメーターを細かく変えて最良の結晶が出現する条件を精密化する。
（１）「蒸気拡散法」とは、沈澱剤を含む蛋白質溶液の液滴を、より高濃度の沈澱剤を含む緩衝液（外液）の入った容器中に置き、密封後静置する方法である。液滴の置き方によって、ハンギングドロップ法およびシッティングドロップ法があるが、本発明ではいずれの方法も採用することが可能である。ハンギングドロップ法は、蛋白質溶液の小さな液滴をカバーグラス上に配置し、カバーグラスを溶液溜め（リザーバー）上で反転させ、密封する方法である。一方、シッティングドロップ法は、リザーバー内部に適切な液滴台を設置し、蛋白質溶液の小滴を液滴台上に配置し、カバーグラス等でリザーバーを密封する方法である。この場合、リザーバー中の溶液には沈澱剤を含有させ、また沈澱剤は蛋白質小滴中にも少量含有させることが好ましい。
蒸気拡散法で使用する沈澱剤溶液は、当業者であれば適切なものを任意に調製することができる。例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の成分を含有するように調製する。
（ａ）沈殿剤：分子量４００〜２０００、０〜５０重量％の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または硫酸アンモニウムや、ＭＰＤ（メチルペンタンジオール）など
（ｂ）添加塩：０．１〜０．３Ｍの濃度のＮａＣｌ、塩化リチウム、塩化マグネシウムなど
（ｃ）緩衝剤：リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、トリス−ＨＣｌなど
なお、成分としては上記に限られるわけではなく、当業者が通常使用する成分を適宜使用し得る。
（２）「バッチ法」とは、蛋白質溶液に沈澱剤溶液を少しずつ加え、わずかに濁ったところで不溶物を遠心分離して除去し、上清を小さな試験管に入れて密封した後に静置する方法である。
（３）「透析法」とは、蛋白質溶液を沈澱剤の入った緩衝液（外液）に対して、半透膜を用いて透析する方法である。
蛋白質の結晶化においては、複合体または二量体を保ったままの条件で結晶化することが必須である。本発明においては、ＥＧＦおよびＥＧＦＲが溶解している溶液（蛋白質溶液）に、沈殿剤を添加してＥＧＦ／ＥＧＦＲの結晶を析出させることができる。上記蛋白質溶液の溶媒としては、水または緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、例えば０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、約０．１Ｍ  ＮａＣｌ等が使用可能である。「添加して」とは、蛋白質溶液と緩衝剤溶液を接触させることも含む。例えば、以下の条件に限定するものではないが、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の場合、蒸気拡散法を用い、ｐＨ＝７．０〜９．０、蛋白質濃度３〜１５ｍｇ／ｍｌ、温度２０℃の条件下で、沈殿剤としてポリエチレングリコールを用いた場合に、Ｘ線結晶解析に適した結晶を得ることができる。本発明の結晶製造方法は、ＥＧＦＲの精製過程において糖鎖処理をする工程を含むことが好ましい。
またさらに本発明は、ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の結晶の製造方法を提供する。当該製造方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：（Ａ）結晶化可能なＥＧＦＲを製造する工程；および（Ｂ）ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質を接触させる工程。ＥＧＦＲ活性調節物質の代表例としてはＥＧＦが挙げられるが、これに限定されるものではなく、後述するＥＧＦＲアゴニストまたはＥＧＦＲアンタゴニストであれば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物のいずれでもよい。ＥＧＦＲ活性調節物質は、当技術分野で公知の手法により調製することができる。当該結晶の製造方法は、さらに（Ｃ）ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体を結晶化する工程；を含むことができ、上述した蒸気拡散法、バッチ法、透析法などの一般的な蛋白質結晶化手法を採用して当該複合体を結晶化させることができる。
（Ｃ）の工程はさらに、（Ｃ−１）ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質を含有する溶液と沈殿剤を含有する溶液を接触させる工程；（Ｃ−２）結晶を生成させる工程；および（Ｃ−３）結晶を単離する工程；を含み得る。ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質を含有する溶液と沈殿剤を含有する溶液を接触させる工程は、例えば、透析膜を介した接触、ハンギングドロップ法におけるシールされた空間を介する接触、溶液同士の混合などにより行うことができる。結晶を生成させる工程は、ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質を含有する溶液における蛋白質および沈殿剤の濃度の緩やかな上昇による蛋白質の過飽和状態を生じさせることにより実現される。またこの工程は、蛋白質溶液に種結晶を導入することによっても実現され得る。
１−３  結晶のＸ線結晶回折
蛋白質の３次元構造を明らかにする手法として最も一般的に行われているものは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。すなわち、蛋白質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線を当て、得られたＸ線の回折像をもとに、蛋白質の３次元構造を明らかにしていくものである。本発明はＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の構造座標を決定する方法を提供する。当該方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
（Ａ）ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の結晶を製造する工程；および
（Ｂ）（Ａ）により得られた結晶を用いたＸ線結晶構造解析によりＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体の構造座標を取得する工程
（Ａ）の工程は上記「１−２」において説明したとおりである。（Ｂ）の工程はさらに、（ｂ−１）（Ａ）により得られた結晶にＸ線を照射し回折データを取得する工程；（ｂ−２）（ｂ−１）により得られた回折データの解析により複合体の電子密度図を取得する工程；および（ｂ−３）（ｂ−２）により得られた電子密度図の解析により複合体の構造座標を取得する工程；を含み得る。複合体結晶の構造解析は、実験室のＸ線回折計または大型放射光施設（ＥＳＲＦ、ＡＰＳ、ＳＰｒｉｎｇ−８、ＰＦ、ＡＬＳ、ＣＨＥＳＳ、ＳＲＳ、ＬＬＮＬ、ＳＳＲＬ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎなど）を用いて、振動写真法やラウエ法によってイメージングプレートまたはＣＣＤカメラなどの２次元検出器を用いて回折データの収集を行い、該データより複合体の３次元構造をＸ線結晶構造解析により明らかにすることができる。具体的には、Ｘ線回折実験により収集された回折イメージをデータ処理ソフトウエアで処理することで、個々の回折斑点の指数と積分によって得られた回折強度を算出できる。これらの回折斑点の回折強度と位相情報を用いて逆フーリエ変換を行うことで３次元空間の電子密度を導くのであるが、回折実験では電子密度の計算に必要な各回折斑点の位相の情報を測定することは原理的に不可能である。そこで電子密度を得るために、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）またはそれらの改変法によって、失われた情報である位相を推定する。こうして得られた電子密度図に合わせて、３次元モデルをグラフィックスワークステーション上で稼動するソフトウエアを用いて構築する。このモデル構築の後、最小二乗法、最尤法、Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ法などによる構造の精密化を行うことで最終的な複合体の３次元構造を得る。
ＭＡＤ法においては放射光を使って、入射Ｘ線波長を変えて結晶の回折データを測定する。ＭＡＤ法に使うことのできる放射光は、例えば大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８構造生物学ビームラインＩ（ＢＬ４１ＸＵ）により発生させることができる。
蛋白質結晶はＸ線照射により損傷を受け、回折能が劣化する場合が多いため、低温測定により高分解能のＸ線回折を行うことが好ましい。低温測定とは、結晶を急激に−１７３℃程度に冷却凍結して、その状態で回折データを収集する方法である。一般に、蛋白質結晶の凍結には、凍結による結晶の崩壊を防ぐ目的で、グリセロールなどの保護剤を含む溶液で処理するなどの工夫がなされる。凍結結晶は、例えば保護剤を添加した保存液に浸漬した結晶を、液体窒素に直接浸漬して瞬時に凍結させることにより調製することができる。
本発明では、ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質の複合体、例えばＥＧＦとＥＧＦＲとの複合体が結合した二量体の結晶を、適切なＸ線源を用いてＸ線回折する。
Ｘ線回折データは、複合体の３次元構造を詳細に解析できるように、少なくとも１０Å以下の分解能、好ましくは４．０Å以下、更に好ましくは３．５Å以下の分解能に回折する結晶で収集する。
本発明者は、ＥＧＦとＥＧＦＲとの複合体結晶の構造を、Ｘ線による結晶構造解析技術を用いて解析した。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦと、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲとの複合体の結晶は、晶系Ｐ３１２１に属するものであり、単位格子としてａ軸、ｂ軸およびｃ軸の方向にａ＝２２０．２±１．５Å、ｂ＝２２０．２±１．５Åおよびｃ＝１１３．１±１．５Åの大きさを有する。すなわち、本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶は、単位格子定数がａ＝２２０．２±１．５Å、ｂ＝２２０．２±１．５Åおよびｃ＝１１３．１±１．５Åであることを特徴とする。更に、その複合体の結晶を用いたＸ線回折による結晶構造解析の手法により、ＥＧＦとＥＧＦＲとの複合体の３次元構造座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）が得られる。得られた構造座標を、当業者において一般的に用いられている蛋白質の３次元の構造座標の表記方法に従って表したものを表１および表２に示す。表１は３．５Åの分解能で決定された構造座標であり、表２は３．３Åの分解能で決定された構造座標である。
表１および表２のデータは、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）のフォーマットに準じて記載されているものである。ＰＤＢフォーマットは、蛋白質分子を構成するそれぞれの原子の座標等を記載したものであり、生体高分子の座標を扱う際の標準的形式の一つである。表１または表２に記載の記号または数字において、最も左側の列（第１列目）に記載の「ＡＴＯＭ」は、原子座標の原子一つ一つを意味する。表２における「ＨＥＴＡＴＭ」も同様だが、その行に記載された原子はアミノ酸に属する原子ではない（例；ＮＡＧや水分子）ことを意味する。「ＴＥＲ」はペプチド鎖のＣ末端であることを意味する。その右側の列（第２列目）の数字は原子の通し番号（１〜８７６７または１〜８８９６）であり、その右側の列（第３列目）に記載のアルファベットは原子の種類を意味する（下記参照）。
Ｃ：アミノ酸残基の炭素原子
Ｎ：アミノ酸残基の窒素原子
Ｏ：アミノ酸残基の酸素原子
Ｓ：アミノ酸残基の硫黄原子
ここで、上記原子の右側に併記したアルファベット（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ等）は、その原子の位置関係を示すものであり、例えばＣＡ、ＣＢ、ＮＥ、ＮＺ、ＯＥ、ＳＧ等のように記載する。
さらに、上記原子の種類を示すアルファベットの右側の列（第４列目）に記載したアルファベットは、この原子が属するアミノ酸残基を意味し、３文字表記されている（例えば「ＧＬＵ」「ＬＹＳ」「ＶＡＬ」等）。但し、原子の通し番号８６１４番以降の「ＮＡＧ」はＮ−アセチルグルコサミンを意味する。「ＴＩＰ」は水分子を意味する。さらにその右側の列（第５列目）のアルファベット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）は、蛋白質鎖の識別記号であり、それぞれＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２を表す。さらにその右側の列（第６列目）に記載の数字はアミノ酸残基のＮ末端からの番号を意味する。ＥＧＦＲのアミノ酸残基の番号は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対応している。ＥＧＦのアミノ酸残基の番号は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対応している。さらに、この数字の右側の列（第７列目）から第９列目までは、順にＸ座標（ａ座標）（オングストローム単位）、Ｙ座標（ｂ座標）（オングストローム単位）、Ｚ座標（ｃ座標）（オングストローム単位）を示す。さらにその右側の列（第１０列目）から最も右側の列（第１２列目）に向かって、順に占有率（「１．００」等）、等方性温度因子（例えば表１の原子の通し番号１番では１２０．７３、２番では１３１．３５）、原子番号または原子記号（６：Ｃ、７：Ｎ、８：Ｏ、１６：Ｓ、等）を意味する。
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２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標
本発明はＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標、具体的には、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶であって，ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体が以下の（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有する結晶を用いたＸ線結晶構造解析により得られるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を提供する。
（Ａ）ＥＧＦとＥＧＦＲが１：１で結合している
（Ｂ）ＥＧＦ結合ＥＧＦＲが二量体を形成している
本発明において「構造座標」とは、結晶形態における蛋白質の原子に含まれる電子によるＸ線の回折により得られる個々の回折点の回折強度を数値化し、解析することによって導かれる数学的座標であって、上記蛋白質の原子の位置を３次元座標として表したものを意味する。すなわち構造座標とは、実質的には化学構造を構成する分子（原子）間の各距離によって定まる空間配置を意味する。この空間配置をコンピューター上で情報として処理する場合には、相対的な配置をある座標系における特定座標として数値情報化する（座標化という）が、これはコンピューター処理を行うにあたり便宜上必要な処理であって、構造座標の本質は、先に示した通り各分子（原子）間相互の距離によって定まる配置であって、コンピューター処理時に一時的に特定される座標値ではないと理解されるべきである。また、本明細書中において原子座標とは、物質（蛋白質、アミノ酸など）を構成する個々の原子についての座標を意味する。
本発明者は、ＥＧＦリガンドの結合が受容体の二量体化と活性化を誘導するという機構を解明するために、ＥＧＦと複合体を形成したＥＧＦＲの細胞外ドメインを結晶化し、Ｘ線結晶学により解析した。そして、ヒトＥＧＦと複合体を形成したヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインのうち、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの結晶構造を３．５Å分解能および３．３Å分解能で解析することに成功した。解析結果によれば、２つの受容体（ＥＧＦＲ）がそれぞれリガンド（ＥＧＦ）と複合体を形成していることが判明した。その複合体は、各リガンドが各受容体のドメインＩとＩＩＩの表面の間に捕捉される形態をとっている。また、二量体は、各受容体のドメインＩＩから突き出した２つのループ間の相互作用により形成され、安定化している。上記二量体の形成は、ＥＧＦ誘導型受容体二量体化の構造的機構を示すものである。
以下に、本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶構造解析の経緯と解析結果の詳細な検討から導き出される事項を説明する。
２−１  構造決定
本発明において、ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインは、末端シアル酸およびガラクトース残基を欠損しＮ結合オリゴ糖を有する蛋白質を産生するチャイニーズハムスター卵巣Ｌｅｃ８細胞において発現させ、精製した。得られた蛋白質をエンドグリコシダーゼＤおよびＨで消化して脱グリコシル化し、そしてヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）と共に結晶化した。本発明者はまた、Ｌｅｃ８細胞からセレノメチオニン置換型組換え蛋白質を発現させ、精製し、脱グリコシル化してネイティブ結晶として結晶化した。全ての回折データはＳＰｒｉｎｇ−８で収集した。これにより、ネイティブ結晶構造を、ＭＡＤ法および分子置換解析法により３．５Åに決定した（図１ａおよび１ｂ）。得られた電子密度図は、複合体のモデル構築（図１ｃ）に十分に使用可能であった。構造精密化の最終段階の後で、ＲｃｒｙｓｔおよびＲｆｒｅｅはそれぞれ２８％および３４％となった。これは、７５％という比較的大きな溶媒含量と、複合体を構成するアミノ酸残基のうちの１８％に対応する比較的大きな欠損領域に起因するものである。データ収集および構造精密化の統計値を表３に示す。
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２−２  全体の構造
本発明では、ＥＧＦＲ／ＥＧＦ複合体の二量体を３．５Åにおいて結晶構造決定することによって、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位およびＥＧＦＲ二量体化部位の原子構造が明らかとなった。結晶の非対称単位における二量体は、ＥＧＦが結合したＥＧＦＲを２つ含むものである。リガンド／受容体相互作用領域（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）は、ＥＧＦＲのドメインＩにおいて１箇所、ドメインＩＩＩにおいて２箇所の部位からなる。ＥＧＦが受容体のドメインＩおよびＩＩＩと広範囲に相互作用する溝は、ＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩにより形成されており、ＥＧＦともう一つの受容体との間に相互作用は全くない。二量体構造は、受容体／受容体相互作用により安定化されている。まず、ＥＧＦがＥＧＦＲと結合し、その結果ＥＧＦＲのドメインＩおよびＩＩＩがＥＧＦ側に湾曲してそのポケット内にＥＧＦを収めている。そして、湾曲部の外側同士が背を向けるようにしてドメインＩＩ（Ｓ１ドメインともいう）を介して結合して二量体を形成し、ＥＧＦＲは互いに剣のつばを向き合せた形態をとっている。従って、２つのＥＧＦは直接接触しておらず、その距離は７９Å離れている。
ドメインＩおよびＩＩＩは繰り返しβシートの右巻き構造からなり、その主鎖は、リガンドが付加していないＩＧＦ−１Ｒ（インシュリン様増殖因子−１受容体）のＬ１およびＬ２ドメインと個々に類似し、対応する各ドメインのＣα原子の平均二乗偏差の平方根（ＲＭＳＤ値）がそれぞれドメインＩについて２．１Å、ドメインＩＩＩについて４．０Åである。リガンドが付加していないＩＧＦ−１Ｒの構造との比較によって、本発明における複合体のドメインＩＩ〜ＩＩＩ間の配向は、Ｓ１〜Ｌ２間の配向に対して明らかに相違することが明らかとなった。そして、ＥＧＦＲ／ＥＧＦ複合体の二量体構造は、ＥＧＦＲとＥＧＦが結合したことにより受容体のドメインＩＩ（Ｓ１ドメイン）からループが突き出し、この突き出たループによって、各複合体同士が結合することが分かった。この結合様式は、従来のＥＧＦＲの細胞外ドメインのモデリング構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０００，９，３１０−３２４）には示されておらず、本発明において初めて見出された知見であり、新規な構造的特徴を示すものである。この二量体化に必要なループ領域は、蛋白質のアミノ酸配列アライメントからＥＧＦＲファミリーに特異的であり、インシュリン受容体ファミリーでは欠損していることがわかった。ドメインＩＩは、ＩＧＦ−１ＲのＳ１と類似した折りたたみ様式を示す。ＥＧＦＲ／ＥＧＦ複合体における湾曲の外側（ＥＧＦを結合している領域とは反対側）に位置するＣｙｓ２４０とＣｙｓ２６７との間のループと、ＩＧＦ−１Ｒ分子の内側に位置するＣｙｓ２５２とＣｙｓ２７３との間のループとは異なるもののそれ以外の対応するＣα原子の平均二乗偏差の平方根が３．２Åである。ドメインＩＩＩのＣ末端残基（Ｖａｌ４８１）は互いに７７Å離れており、二量体のドメインＩＶが存在しない場合には細胞質ドメインが互いに接近できないと考えられる。
なお、本明細書においてアミノ酸（３文字表記）に併記した数字は、ＥＧＦＲを説明している場合はＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）に対応するアミノ酸番号を示す。ＥＧＦを説明している場合はＥＧＦのアミノ酸配列（配列番号２）に対応するアミノ酸番号を示す。ＩＧＦ−１Ｒを説明している場合はＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸配列（配列番号３）に対応するアミノ酸番号を示す。
２−３  リガンド−受容体相互作用
ＥＧＦは、ＥＧＦＲの３つの部位と相互作用し、これはドメインＩにおける部位１（Ｓｉｔｅ  １）、ドメインＩＩＩにおける部位２（Ｓｉｔｅ  ２）および部位３（Ｓｉｔｅ  ３）からなる（図２ａ）。これらのリガンドと受容体との相互作用領域は広範囲にわたっており、その接触面積は、ドメインＩでは約７２０Å２、ドメインＩＩＩでは７３０Å２におよび、疎水性相互作用が支配している。部位１におけるＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９およびＬｅｕ９８側鎖、ならびにＥＧＦのＢ−ループにおけるＭｅｔ２１、Ｉｌｅ２３およびＬｅｕ２６側鎖は疎水性環境を形成している（図２ｂ）。部位２におけるＶａｌ３５０およびＰｈｅ３５７側鎖、ならびにＥＧＦにおけるＴｙｒ１３およびＬｅｕ１５側鎖は疎水性環境を形成している（図３ａ）。部位３におけるＰｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８側鎖、ならびにＥＧＦにおけるＬｅｕ４７側鎖は疎水性環境を形成している（図３ｂ）。上記特性を有するアミノ酸残基はＥＧＦファミリーメンバーにおいて保存されており、このことは、受容体とリガンドとの上記相互作用領域が、他のＥＧＦＲファミリーメンバーの保存されている相互作用部位に存在する可能性があることを示唆している。
リガンドのアミノ酸配列を部位特異的突然変異誘発法により置換することによって、受容体結合における上記疎水性残基のＴｙｒ１３、Ｍｅｔ２１、Ｉｌｅ２３およびＬｅｕ２６の重要性が示唆されている（Ｔａｄａｋｉ，Ｄ．Ｋ．＆Ｎｉｙｏｇｉ，Ｓ．Ｋ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１０１１４−１０１１９（１９９３）；Ｃａｍｐｉｏｎ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，９９８８−９９９３（１９９０）；Ｋｏｉｄｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１２０，２５７−２６１（１９９２））。
突然変異誘発法によりＥＧＦのＩｌｅ２３をＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐなどに置換した実験から、ＥＧＦにおけるＩｌｅ２３は、受容体との強い結合に必要であり、その結合部位はイソロイシン残基の大きさとちょうど良いことがわかっている。このことは、ＥＧＦＲドメインＩにおけるＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５およびＬｅｕ６９の側鎖が形成するＥＧＦＩｌｅ２３結合領域が、結晶構造のイソロイシン側鎖とほぼ相補的であることと十分に一致する。
同様に、突然変異誘発法によりＥＧＦのＴｙｒ１３をＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ  Ａｌａなどに置換してレセプターへの結合の実験を行った結果、Ｔｙｒ１３が最適な大きさであることが示唆されているが、このことは、ドメインＩＩＩにおけるＰｈｅ３５７側鎖とＨｉｓ１０、Ｔｙｒ２９およびＡｒｇ４１側鎖が形成するＴｙｒ１３結合領域が、結晶構造のチロシン側鎖と相補的であることと十分に一致する。結晶構造において、部位１におけるＧｌｕ９０側鎖はリガンドに由来するＬｙｓ２８側鎖と塩橋を形成し、また部位２におけるＡｓｐ３５５側鎖はリガンドに由来するＡｒｇ４１側鎖と塩橋を形成する。突然変異誘発および生化学研究によって、ＥＧＦにおけるＡｒｇ４１のグアニジウム基が受容体との結合にとって重要な決定因子であることが示されている（Ｅｎｇｌｅｒ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２２７４−２２８１（１９９２））。このことは、上記側鎖がリガンドに由来するＴｙｒ１３側鎖および受容体に由来するＰｈｅ３５７側鎖と接近して疎水環境を形成しているという結晶構造の結果とよく一致する。突然変異誘発法によってＥＧＦのＬｙｓ２８をＬｅｕに変異させてレセプターへの結合実験を行った結果、当該ロイシンへの置換が受容体結合にほとんど影響を及ぼさない結果が得られている。この結果は、結晶構造とは明らかに一致しないものであり、２８番の位置におけるイオン性相互作用（Ｃａｍｐｉｏｎ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，９９８８−９９９３（１９９０））は必ずしも必要ないことを示している。
いくつかの水素結合によってさらにリガンドと受容体との相互作用領域が強化されている。部位１におけるＧｌｎ１６側鎖は、リガンドに由来するＡｓｎ３２側鎖と水素結合を形成している。突然変異誘発法によってＥＧＦのＡｓｎ３２をＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐなどに置換した結果、ＥＧＦにおけるＡｓｎ３２が受容体との強い結合に必要であることが示唆されている（Ｋｏｉｄｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０２，３９−４２（１９９２））。部位３におけるＧｌｎ３８４側鎖は、リガンドにおけるＧｌｎ４３およびＡｒｇ４５の主鎖原子と水素結合を形成している。
キメラＥＧＦ／ヒレグリンペプチドの研究（Ｂａｒｂａｃｃｉ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，９５８５−９５８９（１９９５））から、ヒレグリンのＮ末端にある５残基が、ヒレグリン受容体（ＥｒｂＢ−４）との結合に特に重要であることがわかっている。しかしながら、結晶構造においてＮ末端領域に相互作用は認められておらず、このことは、リガンドの結合部位の違いによって受容体の結合部位が異なり、またこの違いがＥＧＦＲファミリーメンバーにおけるリガンド−受容体特異性を付与している可能性があることを示唆している。ＥＧＦファミリーメンバーにおいて保存されていない特性を有するアミノ酸との特異的な相互作用は、結晶構造においてはＥＧＦのＡｓｎ３２以外に認められない。ＥＧＦとリガンド結合部位を共有するＴＧＦ−αの対応する位置はＶａｌに置換されており、このことは、Ａｓｎ３２がＥＧＦＲにリガンド特異性を付与するものではないことを示唆している。ＥＧＦのＮ末端は、残基Ｔｙｒ１０１およびＬｙｓ３３６と架橋し得ることが示されている。ＥＧＦのＮ末端領域（ディスオーダーしているため構造は見えない）とＥＧＦＲとの相互作用は結晶構造に認められないが、結晶構造におけるそれらのＥＧＦ構造のＮ末端であるＧｌｕ５のＣαとの推定距離はそれぞれ１６Åおよび３９Åである。
このことは、ＥＧＦのＮ末端はＴｙｒ１０１とは架橋可能であるが、Ｌｙｓ３３６とは架橋不可能であることを示している。また、安定なＥＧＦ結合ＥＧＦＲの二量体は、その形成過程において複数の中間状態を経る可能性があり、その中間状態では、ＥＧＦが結晶構造では説明されない受容体の異なるいくつかの部位でＥＧＦＲと結合することも考えられる。ドメインＩにおける残基１０−１７、８５−９４および１０１−１０７、ならびにドメインＩＩＩにおける残基３１６−３２５、３５３−３６２および４０４−４１３は、繰り返しβシートの右巻き構造から形成される円筒部分の外側にループアウトしているようである。上記ループのうちループ１０−１７および３５３−３６２はＥＧＦ結合に関与しており、これは、リガンド競合モノクローナル抗体（ＬＡ２２）（Ｗｕ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１７４６９−１７４７５（１９８９））に対するエピトープ（残基３５１−３６４）の大部分を包含するループ３５３−３６２と一致するものである。
以上の説明の中でＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造解析の結果からＥＧＦ／ＥＧＦＲ相互作用に関与していることが示されたアミノ酸残基は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例である。
２−４  受容体−受容体相互作用
二量体における２つのＥＧＦＲ分子間の相互作用は、ほぼドメインＩＩに限定される（図４ａ〜ｃ）。この相互作用領域の全体的な接触面積は、約１２７０Å２である。特に、Ｃｙｓ２４０とＣｙｓ２６７との間のループが受容体の二量体化に関与している。ダイマー間の相互作用は２回回転対称となっている。Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８およびＴｙｒ２５１側鎖は、他の受容体に由来するＰｈｅ２３０、Ｐｈｅ２６３、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５およびＡｒｇ２８５側鎖と共に疎水性環境を形成し、これはＴｙ２７５とＡｒｇ２８５側鎖の間の水素結合により達成される。
Ｇｌｎ２５２側鎖は、主鎖の窒素およびＡｌａ２８６のカルボニル酸素と水素結合を形成している。Ｔｙｒ２４６側鎖と他の受容体のＣｙｓ２８３の主鎖酸素との水素結合によって、相互作用領域が強化されている。上記アミノ酸残基の大部分の特性がＥＧＦＲファミリーメンバーにおいて保存されており、このことは、各受容体のループ間における相互作用領域が、他のＥＧＦＲファミリーメンバーの保存されている二量体化部位に存在する可能性があることを示唆している。本明細書に開示する結晶構造では各ドメインＩＩ間の上記相互作用の他に、ドメインＩＩにおける１つのアミノ酸残基と他の受容体のドメインＩにおける１つのアミノ酸残基との唯一の相互作用も観察される。詳細に説明すると、二量体化ループから突き出たＴｈｒ２４９側鎖は、他の受容体のドメインＩに由来するＡｓｎ８６側鎖と水素結合を形成している。
以上の説明の中でＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造解析の結果から二量体化に関与していることが示されたアミノ酸残基は、ＥＧＦＲ二量体化部位において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例である。
２−５  リガンド誘導型受容体二量体化の機構
最初に、シグナル伝達に関与する受容体活性化機構を理解する必要がある。ＥＧＦＲは、膜を横切るシグナル伝達に関する多数の研究において代表的な標的の１つとなっている。過去四半世紀の間に、ＥＧＦＲの活性化機構に関する生化学および物理生物学データが徐々に蓄積された。ＥＧＦとＥＧＦＲ細胞外ドメインとの結合は、安定な二量体の形成を誘導すると考えられていたが、二量体化の様式（ＥＧＦを介して二量体化しているのか、受容体側で二量体化しているのか）は不明であった（Ｌｅｍｍｏｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．１６，２８１−２９４（１９９７））。本発明者は、この安定な二量体ＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体の構造を初めて明らかにした。
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶構造とリガンドが付加していないＩＧＦ−１Ｒ結晶構造との比較に基づいて、本発明者はＥＧＦ誘導型受容体二量体化の機構を推定した。結晶構造は、受容体の二量体化はＥＧＦが関与する相互作用により媒介されていないが、２つのＥＧＦＲそれぞれのドメインＩＩ間の直接的な相互作用により媒介されており、ＥＧＦの受容体への結合によって、受容体−受容体相互作用部位を露出するコンホメーション変化がもたらされることを示している。ＥＧＦＲファミリーに特異的なループ領域の１つは、ＥＧＦＲのＣｙｓ２４０とＣｙｓ２６７との間に位置する。二量体化部位として機能するというこのループの重要な役割は、本発明の結晶構造から初めて明らかとなった。
本発明者は、リガンドが付加されていないＩＧＦ−１Ｒとの比較によって、リガンドのＥＧＦＲ細胞外ドメインとの結合が、推定ヒンジ領域（Ｌｙｓ３０３〜Ｌｙｓ３１１）のドメイン間の配向の変化を誘導し、ドメインＩＩＩをドメインＩＩに接近させる可能性があることを推測した（図５ａ）。本発明者は、Ｇｌｕ２９３側鎖が、未結合ＥＧＦＲ単量体におけるドメインＩＩのＡｒｇ２８５側鎖と塩橋を形成する可能性があると仮定する。この仮定は、未結合ＩＧＦ−１Ｒ構造との比較によって合理的に得られたものである。リガンドが未結合のＩＧＦ−１Ｒでは、対応する位置にあるＲ２８３側鎖がＳ１ドメインにおけるＧｌｕ２７６側鎖と塩橋を形成している（図５ｂ）。リガンド依存的コンホメーション変化により、Ｇｌｕ２９３側鎖の届く範囲内にドメインＩＩＩのＡｒｇ４０５側鎖が接近し、続いてこれらの側鎖間に塩橋が形成される。相互作用パートナーと離れたＡｒｇ２８５側鎖は、Ｔｙｒ２７５側鎖と相互作用すると考えられる。結果として、疎水性環境はＰｈｅ２６３、Ｔｙｒ２７５およびＡｒｇ２８５側鎖と共に形成され、そこでは、他の受容体のドメインＩＩから突き出したＴｙｒ２５１側鎖は結晶構造で示すように疎水性接触をする（図５ｃ）。本発明者は、受容体のリガンド誘導型コンホメーション変化が、上記相互作用および他の未同定の構造変化を制御するものと推測する。
本発明者は、以下に、他の潜在的な構造変化について考察する。二量体化ループがドメインＩＩから突き出た形ではなく、受容体の活性化前にループ自体にくるみ込まれると仮定すると、リガンド依存的レセプター活性化はより効果的に起こるだろう。この目的のため、本発明者は、Ａｒｇ２７３側鎖が未結合ＥＧＦＲ単量体のドメインＩＩにおけるＡｓｐ２５４側鎖と塩橋を形成すると試行的に仮定して、以下のようなモデルを提案する（図５ｃ）。
受容体のＥＧＦ依存性コンホメーション変化により、Ａｒｇ２７３の届く範囲内にドメインＩＩＩのＧｌｙ４５８の主鎖が接近し、続いてＧｌｙ４５８の主鎖酸素とＡｒｇ２７３に由来する側鎖との間で水素結合が形成される。Ａｓｐ２５４側鎖はいずれの相互作用からも解放されて、Ａｓｐ２５４を包含する二量体化ループはドメインＩＩから突き出た形となり、それにより他の受容体それぞれの二量体化ループ間における相互作用が可能となる。
ＥＧＦＲの細胞外ドメインの二量体化によって、２つの受容体の細胞質チロシンキナーゼドメインが接近して存在し、その結果、エリスロポエチン受容体（Ｒｅｍｙ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３，９９０−９９３（１９９９））と同様に、細胞内ドメインにおいて内在性チロシンキナーゼ受容体が活性化される。
２−６  まとめ
本発明者は、ＥＧＦＲ／ＥＧＦ複合体の二量体構造を３．５Åおよび３．３ÅにおけるＸ線回折データに基づいて初めて解明した。本発明の結晶構造は、二量体における受容体の各ドメインＩＩから突き出した２つのループのみが主な二量体化部位であるという新規な構造的特徴を示すものである。本発明の結晶構造は、リガンド誘導型ＥＧＦＲ活性化を原子レベルで説明する情報を初めて提供するだけではなく、ＥＧＦＲファミリーのアンタゴニストまたは活性化阻害剤を例えば新規抗腫瘍剤として開発するために、重要な情報を提供するものである。
従来技術で得られているＥＧＦ結晶構造およびＥＧＦＲモデリング構造を、本発明で得られたＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体結晶構造の座標と比較解析すれば、そのアミノ酸主鎖の流れや、側鎖配座が、ドラッグデザインなどの産業応用に活用する際には、十分な精度を有さないことが判然とする。
２００１年に明らかとされたＥＧＦ結晶構造１ＪＬ９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６  ｐｐ．３４９１３（２００１））とＥＧＦＲ／ＥＧＦ複合体構造を比較すると、Ｃｙｓ６−Ｌｅｕ４７の主鎖でスーパーインポーズ（最小２乗法による重ね合わせ）した場合、１ＪＬ９Ａ鎖で１．５オングストローム、１ＪＬ９Ｂ鎖では、２．９オングストロームもＲＭＳＤ（ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）値（平均二乗偏差の平方根）に差があった。ＥＧＦ活性を発揮するのに重要な側鎖を含めてスーパーインポーズを行った際には、更に構造のずれは拡大し、Ａ鎖で３．５オングストローム、Ｂ鎖とでは、４．２オングストロームもＲＭＳＤ値に差があった。従来技術のＥＧＦ構造は、ＥＧＦＲと結合していない状態での構造を反映したものであるに過ぎず、薬理活性を発揮するＥＧＦＲとの複合体中で観察される活性コンフォメーションを提供するには十分な情報ではないことが判明した。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ共結晶構造中のＥＧＦの活性コンフォメーションと従来技術で提示されているフリーの状態でのＥＧＦのコンフォメーションがかくのごとく異なるのは、ＥＧＦが、ＥＧＦＲと結合することによって、そのコンフォメーションや側鎖の向きが、ＥＧＦ活性を発揮する上で変化することに他ならない。この変化した構造こそが活性コンフォメーションであり、これが提供されることによって、医薬品の創出や開発に有用なものとなる。従って、ＥＧＦ／ＥＧＦＲの活性コンフォメーションが、本発明で明らかにされたことは、非常に進歩性があると考えられる。
ＥＧＦＲの蛋白質立体構造の先行技術に至っては、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造が知られていなかっただけではなく、モデリング構造で単量体のＥＧＦＲ構造が予測されていたに過ぎなかった。従来は、インシュリン様増殖因子−１受容体のリガンド結合部位が、リガンドの結合していない状況下において結晶化され構造が特定されていたが、この構造では、リガンドが結合した際の活性コンフォメーションを予測することができないため、学術的解析や、分子設計を行う際に十分な情報を提供することが困難であった。特に、ＥＧＦＲの活性コンフォメーションはダイナミックに変化を起こすため、リガンドが結合していない構造で、その活性コンフォメーションを推測することが不可能である。ホモロジーモデリング法においてテンプレートの構造は、モデリングを行う際の標的蛋白質（ＥＧＦＲ単量体）モデル構造のコンフォメーションを規定するので、リガンド非結合時のＩＧＦ−１Ｒの構造をテンプレートにＥＧＦＲのモデリングを行えば、リガンド非結合時のＩＧＦ−１Ｒと同様のコンフォメーションのＥＧＦＲモデルが得られる。ＥＧＦＲのモデリング構造のテンプレートとなったインシュリン様増殖因子−１レセプター単量体結晶構造と、本発明によって明らかにされたＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体のＥＧＦＲ構造とを比較すれば、視覚的解析においてさえ、リガンドが結合していない構造からでは活性コンフォメーションのモデリングは極めて困難であることが理解できる（図８参照）。
本発明の複合体共結晶構造が与える構造座標は、ＥＧＦＲ活性調節物質（すなわちアゴニストやアンタゴニスト）のファルマコフォア抽出、複合体構造座標の全部または一部を用いたコンピュータスクリーニング、ＥＧＦＲアゴニストやアンタゴニストの分子設計（活性上昇、選択性付与など）、産業上有用なＥＧＦまたはＥＧＦＲの変異体設計およびスクリーニング、ＥＧＦ中和抗体・アゴニスト抗体の作製、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結晶構造を利用した分子置換法、インシュリンレセプター等ＥＧＦＲと同様のフォールドを有すると考えられる蛋白質のモデリングとその構造の活用（コンピュータスクリーニング、分子設計、抗体設計、改変体設計、分子置換法など）などにおいて有用であり、本発明はこれらに使用可能なＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を提供するものである。
より詳細には、本発明は下記（ａ）〜（ｚｃ）の構造座標を提供する：
（ａ）表１に示される構造座標の全部または一部；
（ｂ）表１に示される構造座標により特定されるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標；
（ｃ）表１に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｄ）表１に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｅ）以下の（ｅ−１）〜（ｅ−４）のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるＥＧＦＲの一部の構造座標；
（ｅ−１）表１に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩに相当する部分の構造座標；
（ｅ−２）表１に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｅ−３）表１に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｅ−４）（ｅ−１）〜（ｅ−３）のいずれかにより特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｆ）表１に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７８８７により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｇ）表１に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７８８７により特定されるＥＧＦＲのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｈ）以下の（ｈ−１）〜（ｈ−４）のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるＥＧＦＲの一部の構造座標；
（ｈ−１）表１に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７８８７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩに相当する部分の構造座標；
（ｈ−２）表１に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７８８７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｈ−３）表１に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７８８７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｈ−４）（ｈ−１）〜（ｈ−３）のいずれかにより特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｉ）表１に示される構造座標の原子の通し番号７８８８から８２５０により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｊ）表１に示される構造座標の原子の通し番号７８８８から８２５０により特定されるＥＧＦのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｋ）表１に示される構造座標の原子の通し番号８２５１から８６１３により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｌ）表１に示される構造座標の原子の通し番号８２５１から８６１３により特定されるＥＧＦのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｍ）表２に示される構造座標の全部または一部；
（ｎ）表２に示される構造座標により特定されるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標；
（ｏ）表２に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｐ）表２に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｑ）以下の（ｑ−１）〜（ｑ−４）のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるＥＧＦＲの一部の構造座標；
（ｑ−１）表２に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩに相当する部分の構造座標；
（ｑ−２）表２に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｑ−３）表２に示される構造座標の原子の通し番号１から３９５７により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｑ−４）（ｑ−１）〜（ｑ−３）のいずれかにより特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｒ）表２に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７９０５により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｓ）表２に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７９０５により特定されるＥＧＦＲのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲの構造座標；
（ｔ）以下の（ｔ−１）〜（ｔ−４）のいずれかに記載の構造座標のうち少なくとも一つを含んでなるＥＧＦＲの一部の構造座標；
（ｔ−１）表２に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７９０５により特定されるＥＧＦＲのドメインＩに相当する部分の構造座標；
（ｔ−２）表２に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７９０５により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｔ−３）表２に示される構造座標の原子の通し番号３９５８から７９０５により特定されるＥＧＦＲのドメインＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｔ−４）（ｔ−１）〜（ｔ−３）のいずれかにより特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに相当する部分の構造座標；
（ｕ）表２に示される構造座標の原子の通し番号７９０６から８２９１により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｖ）表２に示される構造座標の原子の通し番号７９０６から８２９１により特定されるＥＧＦのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｗ）表２に示される構造座標の原子の通し番号８２９２から８６７７により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｘ）表２に示される構造座標の原子の通し番号８２９２から８６７７により特定されるＥＧＦのα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦの構造座標；
（ｙａ）以下の（ｙａ−１）〜（ｙａ−８）のいずれかから選ばれる第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−１）少なくともＥＧＦのＬｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ６９およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−２）少なくともＥＧＦのＬｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ６９およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＭｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２およびＣｙｓ３３、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｇｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｇｌｕ３５、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｇｌｕ９０およびＴｙｒ１０１に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−３）少なくともＥＧＦのＬｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ６９およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＭｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２およびＣｙｓ３３、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｇｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｇｌｕ３５、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｇｌｕ９０およびＴｙｒ１０１に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−４）少なくともＥＧＦのＬｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ６９およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＭｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２およびＣｙｓ３３、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｇｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｇｌｕ３５、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｇｌｕ９０およびＴｙｒ１０１に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基およびその近傍アミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−５）少なくともＥＧＦのＩｌｅ２３、Ｌｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９、Ｇｌｕ９０およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−６）少なくともＥＧＦのＩｌｅ２３、Ｌｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９、Ｇｌｕ９０およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＭｅｔ２１、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２およびＣｙｓ３３、ならびにＥＧＦＲのＧｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｇｌｕ３５、Ａｌａ６８およびＴｙｒ１０１に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−７）少なくともＥＧＦのＩｌｅ２３、Ｌｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９、Ｇｌｕ９０およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＭｅｔ２１、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２およびＣｙｓ３３、ならびにＥＧＦＲのＧｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｇｌｕ３５、Ａｌａ６８およびＴｙｒ１０１に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙａ−８）少なくともＥＧＦのＩｌｅ２３、Ｌｅｕ２６およびＬｙｓ２８、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９、Ｇｌｕ９０およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＭｅｔ２１、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２およびＣｙｓ３３、ならびにＥＧＦＲのＧｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｇｌｕ３５、Ａｌａ６８およびＴｙｒ１０１に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ）以下の（ｙｂ−１）〜（ｙｂ−８）のいずれかから選ばれる第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−１）少なくともＥＧＦのＬｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０およびＡｓｐ３５５に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−２）少なくともＥＧＦのＬｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０およびＡｓｐ３５５に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｈｉｓ１６、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９およびＧｌｕ４０、ならびにＥＧＦＲのＴｈｒ１０、Ａｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｇｌｎ３８４およびＨｉｓ４０９に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−３）少なくともＥＧＦのＬｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０およびＡｓｐ３５５に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｈｉｓ１６、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９およびＧｌｕ４０、ならびにＥＧＦＲのＴｈｒ１０、Ａｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｇｌｎ３８４およびＨｉｓ４０９に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−４）少なくともＥＧＦのＬｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０およびＡｓｐ３５５に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｈｉｓ１６、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９およびＧｌｕ４０、ならびにＥＧＦＲのＴｈｒ１０、Ａｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｇｌｎ３８４およびＨｉｓ４０９に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−５）少なくともＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０、Ａｓｐ３５５およびＰｈｅ３５７に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−６）少なくともＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０、Ａｓｐ３５５およびＰｈｅ３５７に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｈｉｓ１６、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９およびＧｌｕ４０、ならびにＥＧＦＲのＴｈｒ１０、Ａｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２５、Ｓｅｒ３５６、Ｇｌｎ３８４およびＨｉｓ４０９に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−７）少なくともＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０、Ａｓｐ３５５およびＰｈｅ３５７に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｈｉｓ１６、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９およびＧｌｕ４０、ならびにＥＧＦＲのＴｈｒ１０、Ａｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２５、Ｓｅｒ３５６、Ｇｌｎ３８４およびＨｉｓ４０９に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｂ−８）少なくともＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５およびＡｒｇ４１、ならびにＥＧＦＲのＶａｌ３５０、Ａｓｐ３５５およびＰｈｅ３５７に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｈｉｓ１６、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９およびＧｌｕ４０、ならびにＥＧＦＲのＴｈｒ１０、Ａｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２５、Ｓｅｒ３５６、Ｇｌｎ３８４およびＨｉｓ４０９に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ）以下の（ｙｃ−１）〜（ｙｃ−８）のいずれかから選ばれる第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−１）少なくともＥＧＦのＡｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−２）少なくともＥＧＦのＡｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＧｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｓｐ４６およびＬｙｓ４８、ならびにＥＧＦＲのＡｒｇ２９、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｇｌｎ４０８、Ｇｌｎ４１１、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−３）少なくともＥＧＦのＡｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＧｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｓｐ４６およびＬｙｓ４８、ならびにＥＧＦＲのＡｒｇ２９、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｇｌｎ４０８、Ｇｌｎ４１１、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−４）少なくともＥＧＦのＡｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＧｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｓｐ４６およびＬｙｓ４８、ならびにＥＧＦＲのＡｒｇ２９、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｇｌｎ４０８、Ｇｌｎ４１１、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−５）少なくともＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−６）少なくともＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＴｙｒ４４、Ａｓｐ４６およびＬｙｓ４８、ならびにＥＧＦＲのＡｒｇ２９、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｇｌｎ４０８、Ｇｌｎ４１１、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−７）少なくともＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＴｙｒ４４、Ａｓｐ４６およびＬｙｓ４８、ならびにＥＧＦＲのＡｒｇ２９、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｇｌｎ４０８、Ｇｌｎ４１１、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｃ−８）少なくともＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦのＴｙｒ４４、Ａｓｐ４６およびＬｙｓ４８、ならびにＥＧＦＲのＡｒｇ２９、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｇｌｎ４０８、Ｇｌｎ４１１、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基およびその近傍のアミノ残残基の原子座標からなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｄ）（ｙａ）に記載の第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（ｙｂ）に記載の第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｅ）（ｙｂ）に記載の第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（ｙｃ）に記載の第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｆ）（ｙａ）に記載の第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（ｙｃ）に記載の第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｇ）（ｙａ）に記載の第一のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位、（ｙｂ）に記載の第二のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および（ｙｃ）に記載の第三のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｈ）以下の（ｙｈ−１）〜（ｙｈ−３）のいずれかから選ばれるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｈ−１）少なくともＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ａｓｐ４６およびＬｅｕ４７、ならびにＥＧＦＲのＰｈｅ３５７、Ｌｙｓ１３、Ａｓｐ３５５、Ａｒｇ２９、Ｌｅｕ３８２、Ａｌａ４１５およびＶａｌ４１７に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｈ−２）ＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ｈｉｓ１６、Ｍｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｌｅｕ２６、Ｌｙｓ２８、Ａｌａ３０、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｖａｌ３５、Ｔｙｒ３７、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｒｇ４５、Ａｓｐ４６、Ｌｅｕ４７、Ｌｙｓ４８およびＴｒｐ４９、ならびにＥＧＦＲのＡｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｌｅｕ１４、Ｔｈｒ１５、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ａｓｐ２２、Ａｒｇ２９、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｌｅｕ６９、Ｔｙｒ８９、Ｇｌｕ９０、Ｌｅｕ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｌｅｕ３４８、Ｐｒｏ３４９、Ｖａｌ３５０、Ａｓｐ３５５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｔｈｒ３５８、Ｌｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｇｌｎ４０８、Ｈｉｓ４０９、Ｇｌｎ４１１、Ｐｈｅ４１２、Ａｌａ４１５、Ｖａｌ４１７、Ｉｌｅ４３８およびＬｙｓ４６５に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標；
（ｙｈ−３）ＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ｈｉｓ１６、Ｍｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｌｅｕ２６、Ｌｙｓ２８、Ａｌａ３０、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｖａｌ３５、Ｔｙｒ３７、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｒｇ４５、Ａｓｐ４６、Ｌｅｕ４７、Ｌｙｓ４８およびＴｒｐ４９、ならびにＥＧＦＲのＡｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｌｅｕ１４、Ｔｈｒ１５、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ａｓｐ２２、Ａｒｇ２９、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｌｅｕ６９、Ｔｙｒ８９、Ｇｌｕ９０、Ｌｅｕ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｌｅｕ３４８、Ｐｒｏ３４９、Ｖａｌ３５０、Ａｓｐ３５５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｔｈｒ３５８、Ｌｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｇｌｎ４０８、Ｈｉｓ４０９、Ｇｌｎ４１１、Ｐｈｅ４１２、Ａｌａ４１５、Ｖａｌ４１７、Ｉｌｅ４３８およびＬｙｓ４６５に相当するアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標；
（ｙｉ）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標；
（ｙｊ）少なくとも二量体を形成している第一のＥＧＦＲのＴｈｒ２４９、Ｔｙｒ２４６およびＧｌｎ２５２、ならびに第二のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｃｙｓ２８３およびＡｌａ２８６に相当するアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（ｙｋ）少なくとも二量体を形成している第一のＥＧＦＲのＴｈｒ２４９、Ｔｙｒ２４６およびＧｌｎ２５２、ならびに第二のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｃｙｓ２８３およびＡｌａ２８６に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつ両方のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｇｌｎ１９４、Ｐｒｏ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｌｙｓ２２９、Ｐｈｅ２３０、Ｔｈｒ２３９、Ｐｒｏ２４２、Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ２５１、Ｇｌｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｓｅｒ２６２、Ｐｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５、Ｈｉｓ２８０、Ｓｅｒ２８２、Ｃｙｓ２８３、Ｖａｌ２８４、Ａｒｇ２８５、Ａｌａ２８６およびＬｙｓ３０３に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（ｙｌ）二量体を形成している両方のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｇｌｎ１９４、Ｐｒｏ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｌｙｓ２２９、Ｐｈｅ２３０、Ｔｈｒ２３９、Ｐｒｏ２４２、Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ２５１、Ｇｌｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｓｅｒ２６２、Ｐｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５、Ｈｉｓ２８０、Ｓｅｒ２８２、Ｃｙｓ２８３、Ｖａｌ２８４、Ａｒｇ２８５、Ａｌａ２８６およびＬｙｓ３０３に相当するアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（ｙｍ）二量体を形成している両方のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｇｌｎ１９４、Ｐｒｏ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｌｙｓ２２９、Ｐｈｅ２３０、Ｔｈｒ２３９、Ｐｒｏ２４２、Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ２５１、Ｇｌｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｓｅｒ２６２、Ｐｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５、Ｈｉｓ２８０、Ｓｅｒ２８２、Ｃｙｓ２８３、Ｖａｌ２８４、Ａｒｇ２８５、Ａｌａ２８６およびＬｙｓ３０３に相当するアミノ酸残基ならびにその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標；
（ｙｎ）少なくともＥＧＦＲのＡｒｇ４０５およびＧｌｕ２９３に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦＲのＡｒｇ２８５、Ａｒｇ２７３、Ａｓｐ２５４およびＧｌｙ４５８に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標を含んでなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（ｙｏ）少なくともＥＧＦＲのＡｒｇ４０５およびＧｌｕ２９３に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦＲのＡｒｇ２８５、Ａｒｇ２７３、Ａｓｐ２５４およびＧｌｙ４５８に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の原子座標からなるＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（ｙｐ）少なくともＥＧＦＲのＡｒｇ４０５およびＧｌｕ２９３に相当するアミノ酸残基の原子座標を含み、かつＥＧＦＲのＡｒｇ２８５、Ａｒｇ２７３、Ａｓｐ２５４およびＧｌｙ４５８に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基ならびにその近傍のアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標；
（ｙｑ）ＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標；
（ｚａ）（ｙａ）〜（ｙｉ）のいずれかに記載のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるリガンド／受容体結合部位の構造座標；
（ｚｂ）（ｙｊ）〜（ｙｑ）のいずれかに記載のＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定される受容体二量体化部位の構造座標；
（ｚｃ）（ａ）〜（ｚｂ）のいずれかに記載の構造座標を含んでなるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体またはその構造ホモログの構造座標
上記構造座標の説明において、α炭素とはアミノ酸のα位の炭素原子を意味し、Ｃαと表記することもある。蛋白質の立体構造は強固に固定されたものでなく、ある程度の揺らぎを持っている。蛋白質全体の構造として主鎖の位置のずれ、すなわちα炭素の平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であれば、実質的に同等の構造を有するものと考えることができるが、好ましくは１．５Å以下、より好ましくは１．０Å以下である。また、受容体二量体化部位やリガンド／受容体結合部位の構造の場合には、主鎖原子の平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下であれば、機能的に同等の構造を有するものと考えることができるが、好ましくは１．０Å以下、より好ましくは０．７Å以下、更に好ましくは０．５Å以下である。
上記（ａ）または（ｍ）における「一部」とは、表１または表２の構造座標の内、任意の１以上の原子座標からなる構造座標を意味する。例えば、表１または表２の構造座標はＥＧＦを２分子、ＥＧＦＲを２分子含むものであるが、その中のＥＧＦ１分子に相当する部分、ＥＧＦＲ１分子に相当する部分は「一部」の適当な例である。また、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の座標、ＥＧＦＲ二量体化部位の座標も「一部」の適当な例である。好ましくは、最小限としてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位、またはＥＧＦＲ二量体化部位の原子座標を含む構造座標のことである。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位、またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を含む限り、それらに加えて表１または表２中の任意の１以上の原子座標を含んでもよい。別の「一部」の適当な例としては、ＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかに相当する部分が挙げられる。「一部」のより具体的な例は、（ｂ）〜（ｌ）、（ｏ）〜（ｘ）および（ｙａ）〜（ｙｑ）の構造座標に示されている。
ＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標は、例えば二量体を形成している両方のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｇｌｎ１９４、Ｐｒｏ２０４、Ｓｅｒ２０５、Ｌｙｓ２２９、Ｐｈｅ２３０、Ｔｈｒ２３９、Ｐｒｏ２４２、Ｔｙｒ２４６、Ｐｒｏ２４８、Ｔｈｒ２４９、Ｔｙｒ２５１、Ｇｌｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｓｅｒ２６２、Ｐｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５、Ｈｉｓ２８０、Ｓｅｒ２８２、Ｃｙｓ２８３、Ｖａｌ２８４、Ａｒｇ２８５、Ａｌａ２８６、Ｌｙｓ３０３に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標が適当な例である。二量体を形成している片方のＥＧＦＲの上記アミノ酸の原子座標からなる構造座標でもよい。また、少なくとも、二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸を含む限りここにあげたアミノ酸の一部分でも、ここに上げたアミノ酸以外に１以上のアミノ酸を含んでもよい。「〜に相当する」とは、示されたアミノ酸番号が、ＥＧＦＲのアミノ酸残基に関しては配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応し、ＥＧＦのアミノ酸残基については配列番号２に示されるアミノ酸配列に対応していることを意味する。
二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例としては、二量体を形成しているＥＧＦＲの第一のＥＧＦＲのＴｈｒ２４９、Ｔｙｒ２４６、Ｇｌｎ２５２と第二のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｃｙｓ２８３、Ａｌａ２８６が挙げられる。しかし、二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸は相互作用領域の解析の方法により差異を生ずることがあるので、上記に限定されるものではない。好適な例としては、二量体化部位を構成するアミノ酸は、少なくとも二量体を形成している第一のＥＧＦＲのＴｈｒ２４９、Ｔｙｒ２４６、Ｇｌｎ２５２、ならびに第二のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｃｙｓ２８３、Ａｌａ２８６に相当するアミノ酸残基を含んでいる限りにおいては任意の１以上のアミノ酸を含んでもよい、と定義される。その好適な具体例は、（ｙｋ）〜（ｙｍ）の構造座標に挙げられている。また、二量体化における直接的な相互作用には関与していないが、リガンド依存的コンフォメーション変化が起こるときにスイッチのようにアミノ酸相互作用の切り替えに関与している残基（Ｇｌｕ２９３、Ａｒｇ２８５、Ａｒｇ４０５、Ａｒｇ２７３、Ａｓｐ２５４、Ｇｌｙ４５８）もまた二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸であるといえる。このようなアミノ酸残基からなる二量体化部位の例は、（ｙｎ）〜（ｙｐ）の構造座標に挙げられている。また「近傍のアミノ酸残基」とは５Å以内、好ましくは３Å以内にあることを言う。（ｚｂ）における「受容体二量体化部位」とは、ＥＧＦＲ二量体化部位のことを含むが、それに限定されるものではない。二量体化部位のように、蛋白質の機能を発揮する上で重要な部位は、ファミリー間や種差を越えて構造的に高度に保存されている場合がある。よって、ＥＧＦ／ＥＧＦＲと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド／受容体複合体は、本発明のＥＧＦＲ二量体化部位と同等の構造を有するものと考えられる。よって本発明はＥＧＦ／ＥＧＦＲと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド／受容体複合体の受容体二量体化部位の座標も提供するものである。このようなリガンド／受容体複合体の例としては、ＥｒｂＢファミリーに属する受容体が挙げられる。
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位の構造座標は、例えば以下の（Ａ）および（Ｂ）：
（Ａ）ＥＧＦのＨｉｓ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ｈｉｓ１６、Ｍｅｔ２１  Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２５、Ｌｅｕ２６、Ｌｙｓ２８、Ａｌａ３０、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３、Ｖａｌ３５、Ｔｙｒ３７、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｔｙｒ４４、Ａｒｇ４５、Ａｓｐ４６、Ｌｅｕ４７、Ｌｙｓ４８、Ｔｒｐ４９と、
（Ｂ）ＥＧＦＲのＡｓｎ１２、Ｌｙｓ１３、Ｌｅｕ１４、Ｔｈｒ１５、Ｇｌｎ１６、Ｌｅｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ａｓｐ２２、Ａｒｇ２９、Ｔｙｒ４５、Ａｌａ６８、Ｌｅｕ６９、Ｔｙｒ８９、Ｇｌｕ９０、Ｌｅｕ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ３２５、Ｈｉｓ３４６、Ｌｅｕ３４８、Ｐｒｏ３４９、Ｖａｌ３５０、Ａｓｐ３５５、Ｓｅｒ３５６、Ｐｈｅ３５７、Ｔｈｒ３５８、Ｌｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｇｌｎ４０８、Ｈｉｓ４０９，Ｇｌｎ４１１、Ｐｈｅ４１２、Ａｌａ４１５、Ｖａｌ４１７、Ｉｌｅ４３８、Ｌｙｓ４６５に相当するアミノ酸残基の原子座標からなる構造座標が適当な例である。また、少なくとも、ＥＧＦとＥＧＦＲの結合において重要な相互作用を形成しているアミノ酸を含む限りここに挙げたアミノ酸の一部分でも、ここに挙げたアミノ酸以外に１以上のアミノ酸を含んでもよい。また、アミノ酸以外にも、糖鎖や水分子が相互作用に重要な役割を果たしている場合もあるので、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体または結合部位の構造座標には糖鎖や水分子の原子座標を適宜含ませることも可能である。
ＥＧＦとＥＧＦＲの結合において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例としては、図９に示されるようにＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｇｌｕ４０、Ａｒｇ４１、Ａｓｐ４６、Ｌｅｕ４７と、ＥＧＦＲのＰｈｅ３５７、Ｌｙｓ１３、Ａｓｐ３５５、Ａｒｇ２９、Ｌｅｕ３８２、Ａｌａ４１５、Ｖａｌ４１７が挙げられる。しかし、ＥＧＦとＥＧＦＲの結合において重要な相互作用を形成しているアミノ酸は相互作用領域の解析の方法により差異を生ずることがあるので、上記アミノ酸に限定されるものではない。好適な例としては、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ相互作用部位を構成するアミノ酸は、（ｙａ−１）、（ｙｂ−１）または（ｙｃ−１）のいずれかの構造座標に挙げられているＥＧＦおよびＥＧＦＲのアミノ酸残基のセットを含んでいる限りにおいては任意の１以上のアミノ酸を含んでもよい、と定義される。その好適な具体例は、（ｙａ）〜（ｙｈ）の構造座標に挙げられている。
また「近傍のアミノ酸残基」とは、５Å以内、好ましくは３Å以内にあるアミノ酸残基を言う。（ｚａ）における「リガンド／受容体結合部位」とは、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位のことを含むが、それに限定されるものではない。リガンド／受容体結合部位のように、蛋白質の機能を発揮する上で重要な部位は、ファミリー間や種差を越えて構造的に高度に保存されている場合がある。よって、ＥＧＦ／ＥＧＦＲと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド／受容体複合体は、本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位と同等の構造を有するものと考えられる。よって本発明はＥＧＦ／ＥＧＦＲと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド／受容体複合体のリガンド／受容体結合部位の座標も提供するものである。このようなリガンド／受容体複合体の例としては、ＥｒｂＢファミリーに属する受容体が挙げられる。
（ｚｃ）における「構造ホモログ」とは、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体と構造的に類似しているリガンド／受容体複合体のことである。構造的に類似しているとは、少なくとも受容体二量体化部位および／またはリガンド／受容体結合部位の構造に類似性があることをいう。類似性があるとは、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体のペプチド鎖のα炭素の原子座標に対して、平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定される構造を有することを意味する。構造ホモログの例としては、ＥＧＦ／ＥＧＦＲと同様のメカニズムで複合体を形成するリガンド／受容体複合体であり、ＥｒｂＢファミリーに属する受容体が挙げられる。
（ｙａ）〜（ｙｑ）のアミノ酸残基により特定されるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標は、アミノ酸の座標として表１または表２に示される座標を参照可能であるが、これらに限定されるものではない。例えば、表１または表２に示される構造座標により特定されるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体のα炭素に対して、平均二乗偏差の平方根が２．０Å以下であるα炭素の原子座標を有する構造座標により特定されるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標も参照の対象となり得る。また、以下の（１）〜（４）に記載の特徴のうち少なくとも一つを満たすＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標も参照の対象となり得る：
（１）ＥＧＦのＩｌｅ２３、Ｌｅｕ２６およびＬｙｓ２８に相当するアミノ酸残基に対してＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９、Ｇｌｕ９０およびＬｅｕ９８に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する；
（２）ＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５およびＡｒｇ４１に相当するアミノ酸残基に対してＥＧＦＲのＶａｌ３５０、Ａｓｐ３５５およびＰｈｅ３５７に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する；
（３）ＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５およびＬｅｕ４７に相当するアミノ酸残基に対してＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２およびＩｌｅ４３８に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する；
（４）二量体を形成している第一のＥＧＦＲのＴｈｒ２４９、Ｔｙｒ２４６およびＧｌｎ２５２に相当するアミノ酸残基に対して第二のＥＧＦＲのＡｓｎ８６、Ｃｙｓ２８３およびＡｌａ２８６に相当するアミノ酸残基が相互作用可能な距離に存在する。
ここで、相互作用可能な距離とは５Å以内、好ましくは３Å以内である。
また、蛋白質の立体構造はその構造を構成する原子の相対的な空間配置により定義されるものであり、構造座標化は立体構造をコンピューター等で扱う上で必要な便宜的処理である。したがって、当業者であれば明らかなように、（ａ）〜（ｚｃ）の構造座標を回転および／もしくは並進操作して得られる構造座標も、操作前の構造座標と全く同一の立体構造を表すものである。
さらに、本発明は上述の構造座標（ａ）〜（ｚｃ）のいずれかを格納（記録）したコンピューター読み取り可能な記憶媒体（記録媒体）を提供する。コンピューター読み取り可能な記憶媒体としては、格納した構造座標をコンピューター上の各種プログラム（例えば構造座標を利用するプログラム）上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどの半永久的な記憶媒体でも良い。
本発明の構造座標および構造座標を格納した記憶媒体は、ＥＧＦＲの活性調節作用を有する化合物（本明細書中「ＥＧＦＲ活性調節物質」ともいう）のスクリーニングまたは設計に使用することができ、有用である。さらに本発明は、上述の構造座標（ａ）〜（ｚ）のいずれかにより特徴付けられる立体構造を有するＥＧＦ／ＥＧＦＲまたはＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体を提供するものである。
３．構造情報を用いたスクリーニングまたは設計方法
本発明であるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニングまたは設計方法は、以下の段階：
（ａ）被験物質の立体構造を構造座標化する段階；ならびに
（ｂ）（ａ）の構造座標およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標の全部または一部を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階；
を含むことを特徴とする。すなわち、本発明の方法は、上記のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標と任意の被験物質の立体構造を表す構造座標とをコンピューター上で適合させ、その適合状態を、例えば経験的スコアリング関数を指標とすることで数値化して、該被験物質のＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦに対する結合能を評価する方法である。ここでＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標としては、該構造座標の全体、およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位、ＥＧＦＲ二量体化部位などの一部を利用することができる。
本発明の方法は、スクリーニングまたは設計されたＥＧＦＲ活性調節物質を生化学的アッセイに供し、ＥＧＦＲ活性調節作用について評価する段階を更に含めることができる。
本明細書においてＥＧＦＲ活性調節物質とは、ＥＧＦＲアゴニストまたはＥＧＦＲアンタゴニストのことである。ＥＧＦＲアゴニストとは、少なくともＥＧＦＲと結合する活性を有し、好ましくはその結合によりＥＧＦＲの二量体化を引き起こす活性を有する物質のことである。ＥＧＦＲアンタゴニストとは、ＥＧＦとＥＧＦＲの結合を阻害する活性および／またはＥＧＦＲの二量体化を阻害する活性を有する物質のことである。ＥＧＦに結合することでＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害する物質もまた、ＥＧＦＲアンタゴニストに含まれる。ＥＧＦに結合することでＥＧＦとＥＧＦＲの結合を促進または安定化させ、ＥＧＦＲの二量体化を引き起こす活性を有する物質はＥＧＦＲアゴニストに含まれる。ＥＧＦＲアゴニストの好ましい例はＥＧＦである。
ＥＧＦＲ活性調節物質のＥＧＦＲの二量体化を引き起こす活性または阻害する活性（すなわち、ＥＧＦＲ活性調節作用）は、ＥＧＦＲの二量体化の成否を直接観察することで確認できるほか、二量体化によって生じるシグナル伝達の過程や結果（例：ＥＧＦＲの細胞内領域のリン酸化、細胞増殖）の成否を検出する方法によっても確認できる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
３−１  ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位およびＥＧＦＲ二量体化部位の同定方法
本発明は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体におけるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する方法であって、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いることを特徴とする方法を提供する。
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標の全ての情報が本発明において有用であるが、その中でも特に重要な情報の抽出を図ることによって、その産業応用の可能性が大きく広がる。本発明の結晶構造座標を解析することによって、ＥＧＦがＥＧＦＲと相互作用するアミノ酸残基（ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位）とＥＧＦＲの二量体化において相互作用するアミノ酸残基（ＥＧＦＲ二量体化部位）を特定することが可能となった。また、既存の分子設計ソフトウエア（トライポス社ＳＹＢＹＬ，アクセルリス社ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ等）によって複合体分子の座標を視覚的に表示させ、相互作用に関わるアミノ酸残基を抽出することで、特に産業応用に重要な性質や情報を抽出することも可能である。
すなわち、当該方法は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階；を含み得る。さらに、コンピュータ上でＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の３次元構造を視覚的に表示させる段階を含んでもよい。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階は、目視および／またはコンピュータプログラムによる解析により実現され得る。
本発明によるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶から得られる構造座標を、分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューターまたはそのコンピューターの記憶媒体に入力することで、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の３次元的な化学的相互作用の様式を詳細に表現することが可能になる。コンピューターの記憶媒体としては、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の結晶から得られる構造座標をコンピューターの該プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどの半永久的な記憶媒体でも良い。蛋白質分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムは多数市販されているが、これらプログラムは、一般に、分子の３次元構造座標の入力手段、該座標をコンピューター画面に視覚的に表現する手段、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定する手段、該座標の追加修正を行う手段などを提供する。更に、分子の座標を元に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算する手段を提供することができるように作成されたプログラムを用いることも可能である。アクセルリス社から市販されているコンピューター・プログラムであるＩｎｓｉｇｈｔＩＩやＱＵＡＮＴＡは、該目的に好適なプログラムの例であるが、本発明はこれらのプログラムに限定されるものではない。また、該プログラムは、通常シリコングラフィクス社やサンマイクロシステムズ社などから供給されているワークステーションと呼ばれるコンピューターに導入されて使用されるが、これらに限定されるものではない。構造座標としては、「２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標」の項で説明された（ａ）〜（ｘ）の構造座標を用いることが可能である。
目視および／またはコンピュータプログラムによりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階とは、蛋白質分子間の接触面を目視／またはコンピュータプログラムにより解析し、蛋白質間相互作用に関わっているアミノ酸残基を特定する段階である。このとき、アミノ酸残基間の相互作用の距離、強さ、種類等を考慮して、相互作用に関わるアミノ酸を特定する。たとえば、複合体結晶構造において、ＥＧＦの各アミノ酸残基から、数オングストローム以内の距離に存在するＥＧＦＲのアミノ酸残基を抽出すれば、直接的な相互作用を有しているＥＧＦＲ上のアミノ酸残基を抽出可能であるし、逆にＥＧＦＲの各アミノ酸残基から数オングストローム以内の距離に存在するＥＧＦ中のアミノ酸残基を抽出すれば、直接的な相互作用を有しているＥＧＦ上のアミノ酸残基を特定できる。更に、二量体を形成する互いのＥＧＦＲ間の距離が数オングストローム以内の距離に存在するＥＧＦＲ中のアミノ酸残基を抽出すれば、ＥＧＦＲの二量体化に重要なアミノ酸残基の特定が可能となる。
例えば、ＥＧＦＲから、３オングストローム以内の距離にあるＥＧＦのアミノ酸残基は、ＥＧＦＲとの直接的結合に重要なアミノ酸残基である。逆にＥＧＦから３オングストローム以内の距離にあるＥＧＦＲ中のアミノ酸残基はＥＧＦ分子との直接的相互作用に重要なアミノ酸残基である。また、ＥＧＦＲと二量体化するＥＧＦＲ間の距離において３オングストローム以内のＥＧＦＲ中のアミノ酸残基は、ＥＧＦＲを二量体化させるために重要なＥＧＦＲのアミノ酸残基である。
相互作用の種類としては、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などがある。また、単に距離により相互作用を特定するだけではなくアミノ酸側鎖同士の配向も考慮して相互作用を特定することが好ましい。相互作用の強さは、距離、相互作用の種類、側鎖の配向、さらには水分子の存在などにより影響される。コンピュータプログラムにより解析する場合は、アミノ酸残基間の距離を計算するプログラム、相互作用を形成していると推定される２つのアミノ酸残基の種類から相互作用の種類を特定するプログラムなどを用いることが可能である。しかし近接した距離に、相互作用可能な複数のアミノ酸残基が存在する場合、どの残基のいかなる相互作用が蛋白質間相互作用に重要であるかを計算のみで導き出すのは難しい場合がある。よって、最終的には目視によりアミノ酸残基間の相互作用の距離、強さ、種類等を総合的に考慮して、相互作用に関わるアミノ酸を特定することが好ましい。
以下に相互作用の距離を主体としてＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体結晶構造解析から特定された相互作用解析に有用なアミノ酸残基を示す。
（ｉ）ＥＧＦＲとの結合部位を構成するＥＧＦ中のアミノ酸残基の例
Ｈｉｓ１０，Ａｓｐ１１，Ｔｙｒ１３，Ｌｅｕ１５，Ｈｉｓ１６，Ｍｅｔ２１，Ｉｌｅ２３，Ａｌａ２５，Ｌｅｕ２６，Ｌｙｓ２８，Ａｌａ３０，Ｃｙｓ３１，Ａｓｎ３２，Ｃｙｓ３３，Ｖａｌ３５，Ｔｙｒ３７，Ｉｌｅ３８，Ｇｌｙ３９，Ｇｌｕ４０，Ａｒｇ４１，Ｇｌｎ４３，Ｔｙｒ４４，Ａｒｇ４５，Ａｓｐ４６，Ｌｅｕ４７，Ｌｙｓ４８，Ｔｒｐ４９
（ｉｉ）ＥＧＦとの結合部位を構成するＥＧＦＲ中のアミノ酸残基の例
Ａｓｎ１２，Ｌｙｓ１３，Ｌｅｕ１４，Ｔｈｒ１５，Ｇｌｎ１６，Ｌｅｕ１７，Ｇｌｙ１８，Ａｓｐ２２，Ａｒｇ２９，Ｔｙｒ４５，Ａｌａ６８，Ｌｅｕ６９，Ｔｙｒ８９，Ｇｌｕ９０，Ｌｅｕ９８，Ｓｅｒ９９，Ｔｙｒ１０１，Ｌｅｕ３２５，Ｈｉｓ３４６，Ｌｅｕ３４８，Ｐｒｏ３４９，Ｖａｌ３５０，Ａｓｐ３５５，Ｓｅｒ３５６，Ｐｈｅ３５７，Ｔｈｒ３５８，Ｌｅｕ３８２，Ｇｌｎ３８４，Ｇｌｎ４０８，Ｈｉｓ４０９，Ｇｌｎ４１１，Ｐｈｅ４１２，Ａｌａ４１５，Ｖａｌ４１７，Ｉｌｅ４３８，Ｌｙｓ４６５
（ｉｉｉ）ＥＧＦＲの二量体化部位を形成するＥＧＦＲ中のアミノ酸残基の例Ａｓｎ８６，Ｇｌｎ１９４，Ｐｒｏ２０４，Ｓｅｒ２０５，Ｌｙｓ２２９，Ｐｈｅ２３０，Ｔｈｒ２３９，Ｐｒｏ２４２，Ｔｙｒ２４６，Ｐｒｏ２４８，Ｔｈｒ２４９，Ｔｙｒ２５１，Ｇｌｎ２５２，Ｍｅｔ２５３，Ｓｅｒ２６２，Ｐｈｅ２６３，Ｇｌｙ２６４，Ａｌａ２６５、Ｔｙｒ２７５，Ｈｉｓ２８０，Ｓｅｒ２８２，Ｃｙｓ２８３，Ｖａｌ２８４，Ａｒｇ２８５，Ａｌａ２８６，Ｌｙｓ３０３
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位およびＥＧＦＲ二量体化部位は上記の例に限定されない。
相互作用領域を上述のように、ＥＧＦから３オングストローム以内の距離にあるＥＧＦＲ中のアミノ酸残基、のように定義することもできるし、相互作用の種類と強さに着目して相互作用に重要なアミノ酸のみをＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位と定義することもできる。すなわち相互作用領域の解析の方法により差異を生ずることがあるが、依然として本発明に係るスクリーニング方法を実施可能であれば、そのような相互作用も本発明の範囲内に含まれる。アミノ酸残基間の相互作用の距離だけでなく、相互作用の種類や側鎖の配向を考慮して相互作用に重要なアミノ酸を抽出した例が、図９、図１０、実施例６および前述の「２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲの構造座標」の項で説明されている。
３−２  ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位および二量体化部位の同定
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体におけるＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する方法であって、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いることを特徴とする方法を用いることにより、本発明はさらに以下の方法を提供するものである：
・ＥＧＦＲ活性調節物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する段階；
（２）（１）により同定されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いてＥＧＦＲ活性調節候補物質をスクリーニングする段階；および
（３）（２）により得られたＥＧＦＲ活性調節物質を生化学的アッセイに供し、ＥＧＦＲ活性調節作用について評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
・ＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する段階；
（２）（１）により同定されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いてＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階；
（３）（２）により得られたファルマコフォアを用いてＥＧＦＲ活性調節物質をスクリーニングする段階；および
（４）（３）により得られたＥＧＦＲ活性調節物質を生化学的アッセイに供し、ＥＧＦＲ活性調節作用について評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
・ＥＧＦＲ活性調節物質の設計方法であって、以下の段階：
（１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を同定する段階；
（２）（１）により同定されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いてＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを設計する段階；
（３）（２）により得られたファルマコフォアを用いて化合物を設計する段階；および
（４）（３）により得られた化合物を生化学的アッセイに供し、ＥＧＦＲ活性調節作用について評価する段階；
を含むことを特徴とする方法。
これらの方法については以下に詳細に説明する。
３−３  ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたスクリーニング方法
本発明に係るＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法は、以下の段階：
（ａ）被験物質の立体構造を構造座標化する段階；ならびに
（ｂ）（ａ）の構造座標およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標の全部または一部を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階；
を含むことを特徴とする。すなわち、かかる方法は、上記のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標と任意の被験物質の立体構造を表す構造座標とをコンピューター上で適合させ、その適合状態を、例えば経験的スコアリング関数を指標とすることで数値化して、該被験物質のＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦに対する結合能を評価する方法である。
上述のように、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて、ＥＧＦ／ＥＧＦＲの結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の形状を指定し、そこに結合可能な化合物を、ＤＯＣＫ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｐｈａｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｋｕｎｔｚ／ｄｏｃｋ．ｈｔｍｌ）、ＡｕｔｏＤｏｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｏｌｓｏｎ−ｗｅｂ／ｄｏｃｋ／ａｕｔｏｄｏｃｋ／）、Ｌｕｄｉ、Ｌｉｇａｎｄ  ｆｉｔなどの市販パッケージソフトを使用してコンピュータスクリーニングを行うことが可能である。例えば、ＥＧＦＲ中のアミノ酸残基で、ＥＧＦと相互作用可能なＡｓｎ１２，Ｌｙｓ１３，Ｌｅｕ１４，Ｔｈｒ１５，Ｇｌｎ１６，Ｌｅｕ１７，Ｇｌｙ１８，Ａｓｐ２２，Ａｒｇ２９，Ｔｙｒ４５，Ａｌａ６８，Ｌｅｕ６９，Ｔｙｒ８９，Ｇｌｕ９０，Ｌｅｕ９８，Ｓｅｒ９９，Ｔｙｒ１０１，Ｌｅｕ３２５，Ｈｉｓ３４６，Ｌｅｕ３４８，Ｐｒｏ３４９，Ｖａｌ３５０，Ａｓｐ３５５，Ｓｅｒ３５６，Ｐｈｅ３５７，Ｔｈｒ３５８，Ｌｅｕ３８２，Ｇｌｎ３８４，Ｇｌｎ４０８，Ｈｉｓ４０９，Ｇｌｎ４１１，Ｐｈｅ４１２，Ａｌａ４１５，Ｖａｌ４１７，Ｉｌｅ４３８，Ｌｙｓ４６５のアミノ酸残基は、ＥＧＦＲ活性調節物質（アゴニストまたはアンタゴニスト）が結合し得るポケットや、クレーブを提供するので、この場を足がかりに、コンピュータスクリーニングを行うことが可能となる。
被験物質の構造座標およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標の全部または一部を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階は、上述のような市販パッケージソフトウェアと、該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実施可能である。当該コンピュータシステムは、例えば、化合物の構造式を格納する記憶手段、化合物の立体構造を構造座標化する手段、化合物の構造座標を格納する記憶手段、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を格納する記憶手段、評価結果を格納する記憶手段、各記憶手段の内容を表示させる手段、キーボード等の入力手段、ディスプレイ等の表示手段、中央処理装置等の、目的のソフトウエアを作動させるのに必要な各種手段を適宜含むものである。
本明細書においては、解析用ソフトウェアとしてＤＯＣＫを用いた具体例を示すが、コンピュータ上で蛋白質にリガンドをドッキングさせる操作が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えばＦｌｅｘＸ（トライポス社）、ＬｉｇａｎｄＦｉｔ（アクセルリス社）、Ｌｕｄｉ（アクセルリス社）等を用いてもよい。
まず、ＳＰＨＧＥＮプログラムを用いてＥＧＦＲ活性調節物質（アゴニストまたはアンタゴニスト）が結合し得ると考えられるポケットおよびクレーブの周囲に対してスフェアと呼ばれる仮想の球体を配置する。この球体は、リガンドをドッキングさせる際のアンカー（錨）として機能する。なお、スフェアの発生部位は特定のポケット、クレーブに限定することも可能であるし、複数の部位に発生させることもできる。発生したスフェアの数が多い際には、近接するスフェアを手動で除去することも可能である。
次に、ＧＲＩＤプログラムを用いてＥＧＦとＥＧＦＲが相互作用を起こしている部分とその周囲に対してグリッド（格子）を発生させ、指定された範囲の受容体残基における電子的および立体的な環境を、各グリッド上のスカラー値として表現する。なお、各グリッドの値を算出するためにＡＭＢＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｅｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ａｍｂｅｒ／ａｍｂｅｒ．ｈｔｍｌ）等の力場を利用するが、他の力場を使用してもよく、必ずしもＡＭＢＥＲに限定するものではない。また、蛋白質側の形状によっては、グリッド情報を改変し、化合物のドッキングがより現実に近い形で表現されるように調節することも可能である。
次に、化合物データベースに対して検索を行う。ＤＯＣＫプログラムを用いて、ポケットおよびクレーブの周囲に存在するスフェアの近傍に位置し、かつ、グリッド上の立体的要素または電子的要素と反発しないような３次元配座を取るような化合物を探索する。この際、ドッキングされた化合物の３次元配座は、ＤＯＣＫプログラムに内蔵された配座発生機能により最適化されるが、最終的に適切なドッキングが行われたかどうかは、ドッキング時のスコア、目視等によって経験的な判断を加味して総合的に判断し、決定する。このようにして適切なドッキングが行われていると判断された一連のヒット化合物群は、ＥＧＦＲ活性調節物質（アゴニストまたはアンタゴニスト）と一定の確率でなり得る。
以上の方法は、創薬開発の効率化を推進する。すなわち、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の相互作用部位の性質および形状に適合する構造座標配置を予測し、これを埋めることの可能な構造を有する化合物を計算により選択することで、多数の化合物からＥＧＦＲに特異的な活性制御物質を効率的に選択することが可能となる。
ＥＧＦＲに対する活性調節作用の有無を確認しようとする候補物質（被験物質）は、公知または新規いずれであっても差し支えなく、その構造、由来、物性等にも特に制限はない。天然化合物、合成化合物、高分子化合物、低分子化合物、ペプチド、核酸類似物のいずれでもよい。将来的に医薬開発を行う上では低分子化合物であることが好ましく、例えばＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＡＣＤ）（ＭＤＬ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）、ＣＭＣ（Ｃｏｎｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ＭＤＤＲ（ＭＤＬ  Ｄｒｕｇ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｒｔ）等に登録されている化合物情報は有益である。
この様な低分子化合物の立体構造を座標化するプログラムとしては、ＣＯＲＩＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｃｈｅｍｉｅ．ｕｎｉ−ｅｒｌａｎｇｅｎ．ｄｅ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｃｏｒｉｎａ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、Ｃｏｎｃｏｒｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ／ｓｃｉＴｅｃｈ／ｉｎＳｉｌｉｃｏＤｉｓｃ／ｃｈｅｍＩｎｆｏ／ｃｏｎｃｏｒｄ．ｈｔｍｌ）、あるいはＣｏｎｖｅｒｔｅｒ等が利用可能である。この様にして座標化した低分子化合物とＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体との結合は、分子ドッキングパッケージＤＯＣＫ等を使用して自動的に行わせることも可能であるし、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ等の分子表示ソフトウエアを用いて対話的に行うことも可能である。その際、これらのプログラムを用いて適合状態を評価する際の指標としては、結合体全体の自由エネルギー計算値、経験的スコアリング関数、形の相補性の評価などを任意に選んで使用することができる。この指標により、結合の良否を客観的に評価することが可能となる。
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法において、構造座標としては、「３−１」の項に記載の方法で同定したＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いることができる。
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標の例としては、「２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標」の項で説明された、それぞれ（ｙａ）〜（ｙｈ）、（ｙｊ）〜（ｙｐ）の構造座標が挙げられる。また、後述するホモロジーモデリング法や分子置換法によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて取得したリガンド／受容体複合体の構造座標を用いることにより、該受容体アゴニスト・アンタゴニストのスクリーニングを同様の方法で行うことが可能である。
３−４  ファルマコフォアを用いたＥＧＦ活性調節物質のスクリーニング方法・設計方法
ファルマコフォアとは、標的蛋白質に結合するために必要とされる、化合物上の物理化学的特徴である。ファルマコフォアは、化合物の構造上の物理化学的特徴を特性球として表し、特性球間の相対距離を決定することで定義することができるし、特定の官能基間の相対距離を決定することで定義することも可能である。その他、当業者が通常用い得る手法を任意に使用してファルマコフォアを定義可能であり、前述の方法に限定されるものではない。
特性球は、疎水性、帯電性、水素結合を形成し得る能力、などの種々の物理化学的性質を保持した空間的領域を意味する。例えば、ファルマコフォア構築プログラムであるＣａｔａｌｙｓｔ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）においては、「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ（さらに、Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｐｉｄを分類することもできる）」、「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  Ｄｏｎｏｒ」、「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ（さらに、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ＡｒｏｍａｔｉｃとＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｌｉｐｈａｔｉｃを分類することもできる）」、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｈａｒｇｅ」、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｌｏｎｉｚａｂｌｅ」、「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｈａｒｇｅ」、「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ」、「Ｒｉｎｇ  Ａｒｏｍａｔｉｃ」の８種類の特性球が示されているが、該プログラムのユーザーが新たな定義を加えることも可能であり、上記の構成要素以外を利用することも可能である。すなわち、疎水性領域、水素結合受容体領域、陽イオン領域、環状芳香族性領域、等を物理化学的性質として規定し、これら該物理化学的性質を有するÅ半径の球状の領域として、特性球を表すことができる。各特性球に適合する原子や官能基の例は、例えばＣａｔａｌｙｓｔなどのプログラムに付属のマニュアルに定義されている（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４．５，１９９９）。
換言すれば、本発明のＥＧＦＲ活性調節物質は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の蛋白質間相互作用部位（リガンド−受容体相互作用領域、受容体−受容体相互作用領域を含む）に選択的に適合可能な、一定の物理化学的性質を有する特性球相互の構造座標を満足させる化学構造で表される物質として規定される。
ＥＧＦ／ＥＧＦＲの共結晶構造情報を解析することで、既に記述したアミノ酸残基の立体的配置や構造水の三次元的な配置が与える性質をファルマコフォアとして規定することにより、ＥＧＦＲ活性調節物質（アゴニストやアンタゴニスト）をコンピュータによってスクリーニングが可能となる。また、複合体を形成する上で、分子間に存在する水分子（構造水）も、複合体形成に役割を果たすことがあり、これを介した蛋白質間の相互作用は、グラフィックス観察などによって特定される。更に、相互作用可能なアミノ酸残基や水分子のうち、特に、疎水的な相互作用・イオン結合・水素結合を形成している部位やアミノ酸残基、更には、複合体構造のＥＧＦやＥＧＦＲの活性コンフォメーションが与える分子形状（ポケットや、クレーブ）を解析することで、分子設計や、コンピュータスクリーニングに必要なファルマコフォアを提示することが可能となる。ファルマコフォアの構築に有用なＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の相互作用の例は、図９および図１０に示す。これらの図に示されるアミノ酸残基は、それぞれＥＧＦとＥＧＦＲの結合やＥＧＦＲの二量体化において重要な相互作用を形成しているアミノ酸の例でもある。
３−４−１  ファルマコフォアの設計方法
本発明は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いることを特徴とする、ファルマコフォアの設計方法を提供する。ここでいうファルマコフォアとは、ＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを意味する。ファルマコフォアの設計方法は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標により表される３次元構造を（目視および／または適切なコンピュータプログラムにより）解析し、ファルマコフォアとして使用し得る部分構造（アミノ酸残基、構造水、ポケット、クレーブ等）を特定する工程；および、該部分構造を特性球に変換し、ファルマコフォアを発生させる工程を含み得る。ファルマコフォアとして使用し得る部分構造を特定する工程は、「３−１」に説明した手段に準ずる。部分構造を特性球に変換し、ファルマコフォアを発生させる工程は、Ｃａｔａｌｙｓｔなどの市販のソフトウエアと該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実施可能である。
特性球の３次元空間上における相対的な位置関係を設定することによって、Ｃａｔａｌｙｓｔ上の検索式（ファルマコフォア）が構築可能である。なお、規定の方法は、座標（ｘ，ｙ，ｚ）による規定でも、各点を結ぶ直線距離の集合による規定であっても構わない。また、実際に受容体と相互作用可能な距離、計算上の誤差等を考慮にいれると、各々の化学的機能の距離関係は必ずしも厳密である必要はない。Ｃａｔａｌｙｓｔでは各化学的機能の位置は、各点を中心とした半径１．５〜２．０Åの球内、あるいは、各点を結ぶ直線距離±３〜４Åの範囲によって定義されるのが一般的であるが、この数値は適宜変更することもできる。
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたファルマコフォアの設計方法において、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標としては、「３−１」に記載の方法で同定したＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標を用いることができる。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位の構造座標の例としては、「２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標」の項で説明された、それぞれ（ｙａ）〜（ｙｈ）、（ｙｊ）〜（ｙｐ）の構造座標が挙げられる。また、後述するホモロジーモデリング法や分子置換法によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて取得したリガンド／受容体複合体の構造座標を用いることにより、該受容体アゴニスト・アンタゴニストのスクリーニングに有用なファルマコフォアの設計を同様の方法で行うことが可能である。
またファルマコフォアは、前述のコンピューターを用いたスクリーニング方法や実験的スクリーニング方法で得られたＥＧＦＲ活性調節作用を示す化合物を基に、これら化合物に共通して存在する化合物に共通する構造上の特徴を特性球として表し、特性球間の相対距離を決定することで定義することができるし、特定の官能基間の相対距離を決定することで定義することも可能である。
また、化合物により蛋白質に結合する部位が異なると、全ての化合物に共通する物理化学的性質が存在しない場合がある。この場合は、化合物を適切にクラスタリングした後、各クラスター内で共通する物理化学的性質を決定する必要がある。
本発明者は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を利用して、ＥＧＦＲ活性調節物質ののファルマコフォアを設計することに成功した。具体的なファルマコフォアは、実施例５および実施例６に開示されている。
３−４−２  ファルマコフォアを用いたスクリーニング方法
本発明はファルマコフォアを用いたＥＧＦＲ活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。特定されたファルマコフォアを用いて、ＥＧＦＲアゴニストやアンタゴニストを見出すことが可能となる。ここでは、解析用ソフトウェアとしてＣａｔａｌｙｓｔ（アクセルリス社）を使用した例を示すが、リガンドからの化学的機能の抽出および抽出した化学的機能と類似した空間配置を取り得る化合物の検索が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えばＳｙｂｙｌ（トライポス社）のモジュールであるＵｎｉｔｙ等を用いてもよい。この際、化合物のクラスタリングが必要であれば、Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）等のプログラムを使用することが可能である。
設計したファルマコフォアを用いて、あらかじめ準備したコンピュータスクリーニング用の化合物構造データベースを対象としてスクリーニングを実施する。ファルマコフォアの情報とある化合物の立体構造の空間配置とを比較し、該化合物がファルマコフォアの性質を満足させるものであるかどうかを計算により決定する。コンピュータスクリーニングの利点として、検索対象が理論上考え得る全ての化合物の部分集合であることが挙げられる。通常は、自社で保有する化合物のデータベース、市販化合物データベース、例えばＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＭＤＬ社）や各化合物販売会社・代理店が作成したデータベース、もしくはバーチャルコンビナトリアル合成手法等を用いて発生させた仮想化合物のデータベース、天然物由来の化合物データベース、医薬品データベース等をコンピュータ検索用に変換して用いる。
上記コンピュータスクリーニングによりヒットした化合物群はＥＧＦＲのファルマコフォアに結合する可能性を有する化合物であるため、ＥＧＦＲのアゴニストまたはアンタゴニスト（ＥＧＦＲ活性調節物質）となり得る可能性が、一定の確率で発生する。
ファルマコフォアを用いたスクリーニング方法は、（１）被験物質の立体構造を構造座標化する段階、および（２）（１）の構造座標とファルマコフォアを規定する特性球の構造座標とを同一座標系上で重ね合わせ、両者の適合状態を評価する段階、を含み得る。ここでファルマコフォアとは、「３−４−１」において設計されたＥＧＦＲ活性調節物質のファルマコフォアを指す。このとき、（１）の構造座標がファルマコフォアにおける少なくとも３点以上の特性球の相対配置および特性を満足させることが望ましい。これらの工程は上述した市販のソフトウェアおよび当該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実行可能である。
また、検索式でヒットした化合物群をデータベース化し、引き続き蛋白質構造を市販のドッキングソフトウエアに適用することによってヒット率を増すこともできる。
また、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体に対して結合する化合物は、ＤＯＣＫ等を用いてコンピュータスクリーニングする際に有効なフィルターとして使用することができるし、各ファルマコフォアに対して適合するフラグメントを配置した後に各フラグメントを適当な官能基で結合させて化合物を構築するＤｅ  Ｎｏｖｏ設計的使用も可能である。
３−４−３  ファルマコフォアを用いた設計方法
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いることでＥＧＦＲ活性調節物質（アゴニスト・アンタゴニスト）の分子設計（活性上昇、選択性付与など）も可能となる。
スクリーニングでヒットした化合物や、その誘導体の結合モデルを構築することで、得られた化合物の誘導最適化に活用することが可能となる。例えば、スクリーニングによって得られたＥＧＦＲアゴニストやアンタゴニストを、ＥＧＦまたはＥＧＦＲとコンピュータによってドッキングモデル構造を予測することも可能である。このモデル構造は、化合物と近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強させるような誘導方向性を見出す上で、また、活性には影響を与えずに、代謝、毒性などの改善を進める上で適当な方向性を提示しうるため、非常に有用である。加えて、薬理試験や代謝試験における種差の考察や、副作用軽減を目的として標的蛋白質に対する選択性を向上させるための誘導合成を支援する上で最も有用な情報を提供する。
ファルマコフォアを用いたＥＧＦＲ活性調節物質の設計方法は、（１）ファルマコフォアの各特性球に対応する官能基を有する各フラグメント群を作成する段階；および（２）（１）で作成した各フラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物を設計する段階；を含み得る。さらに、（３）設計した化合物の構造座標とＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標またはファルマコフォアを同一座標系上で重ね合わせて両者の適合状態を評価する段階；（４）化合物の１つ以上のフラグメントを、近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強もしくは減弱させる性質を有するフラグメントに置換する段階；ならびに（５）（３）および（４）を反復する段階；を含んでもよい。
（１）の工程は、ファルマコフォアの各特性球に対応する官能基を有するフラグメント群を作成する工程である。本発明においてフラグメントとは、化合物の部分構造を意味する。例えば、一つのファルマコフォアの特性球に相当する官能基を有するフラグメントを収集し、フラグメント群とする。また別のファルマコフォアの特性球に相当する官能基を有するフラグメントを収集し、フラグメント群とする。このようにして、各条件に相当する官能基を有する各フラグメント群を作成する。この時複数のファルマコフォアを満たす官能基を有するフラグメント、もしくはファルマコフォアを満たす官能基ともう一つのファルマコフォアを満たす官能基を同時に有するフラグメントを収集してもよい。フラグメントの収集の仕方は特に限定するものではない。例えば、ＥＧＦＲ活性調節物質からフラグメントを収集してもよい。収集した一つのフラグメントに置換基をつける、炭素鎖を伸張もしくは縮減する、原子を置換する等の操作により、新たなフラグメントを作成してもよい。このときには、既知のＥＧＦＲ活性調節物質を改善するようなフラグメントの作成がより有用である。例えば、ＥＧＦＲとＥＧＦＲ活性調節物質との間に存在する水分子（構造水）もまた、両者の複合体形成に役割を果たすことがあり、これを介したＥＧＦＲ−ＥＧＦＲ活性調節物質間の相互作用は、グラフィックス観察などによって特定できる。更に、相互作用可能なアミノ酸残基や水分子のうち、特に、疎水的な相互作用・イオン結合・水素結合を形成している部位やアミノ酸残基、更には、複合体構造のＥＧＦＲ活性調節物質の活性コンフォメーションが与える分子形状を解析することよって観察できる。このようにして、既知ＥＧＦＲ活性調節物質と近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強させるような誘導の方向性を見出したり、または、活性には影響を与えずに、代謝、毒性などの薬理学的な改善を進める上で適当な方向性を提示するための新たなフラグメントの創作が可能である。
次に、上述のように作成したフラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物をモデル構築する。例えば、紙上において、段階（１）で決定した各フラグメント群より一つずつ選択された各フラグメントを結合させて、化合物をモデル構築してもよい。好ましくはコンピューターソフトウェアを用いて化合物をモデル構築する。用いるソフトウェアは、化合物の構造を構築可能なソフトウェアであればいずれのソフトウェアを用いてもよく、例えばＬｕｄｉ（アクセルリス社）またはＳｙｂｙｌ（トライポス社）のモジュールであるＣｏｍｂｉＬｉｂＭａｋｅｒ等を用いることができる。
フラグメントを結合させるとは、フラグメント同志を直接結合させること、およびフラグメントの間にリンカーを用いることによりリンカーを介して両者を結合させることが含まれる。使用するリンカーは特に限定されず、例えば、直鎖もしくは側鎖を有する炭化水素の基、前記炭化水素の基がヘテロ化合物で置換された基等が挙げられる。
また、ＥＧＦまたはＥＧＦＲ中の連続した配列中に存在する相互作用に関わるアミノ酸残基を有するペプチドを設計することによって、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結晶構造情報に基づき、低分子化合物にミミックすることも可能である。例えば、ＥＧＦのＣｙｓ３３−Ｔｒｐ４９（ＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷ：配列番号１０）、ＥＧＦＲのドメインＩ領域におけるＳｅｒ１１−Ａｓｎ３２（ＳＮＫＬＴＱＬＧＴＦＥＤＨＦＬＳＬＱＲＭＦＮ：配列番号１１）、ドメインＩＩ領域におけるＰｒｏ２４１−Ｔｈｒ２６６（ＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫＹＳＦＧＡＴ：配列番号１２）、あるいはドメインＩＩＩ領域におけるＬｅｕ３４５−Ｌｅｕ３６３（ＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬ：配列番号１３）の部分配列は、活性調節作用、例えばアゴニスト活性やアンタゴニスト活性を発揮し得るため、この配列をペプチドミミックし低分子化することで、薬剤として最適化することもできる。
「３−１」〜「３−４」に説明した方法は、単独で用いるのみでなく、組み合わせたり反復して用いることが可能である。例えばＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いた化合物のスクリーニングを行った後、ヒット化合物をさらにファルマコフォアを用いたスクリーニング方法に供することができる。複数の手法を組み合わせたり反復することにより、より確からしいＥＧＦＲ活性調節物質を同定することが可能となる。
３−５  生化学的アッセイによる評価
上述に説明したＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いたＥＧＦＲ活性調節物質の設計またはスクリーニング方法、ファルマコフォアを用いたＥＧＦＲ活性調節物質の設計またはスクリーニング方法は、コンピュータ上での迅速なスクリーニングを可能とするが、コンピューターを利用したスクリーニングにより選択された化合物群は、期待される活性を有する確率が高くはなるが、全ての化合物が活性を有するとは限らないため、多くの化合物を実験的に（生化学的アッセイを用いて）評価することが望ましい。すなわち、構造情報・ファルマコフォアを用いたスクリーニング・設計方法は、生化学的アッセイに供する段階を含まない場合、ＥＧＦＲ活性調節「候補」物質をスクリーニングする方法であると言える。
したがって、コンピュータースクリーニングの結果から実験的に評価する化合物を選択する際には、評価の結果期待される活性化合物数を考慮の上、実際に実験的に評価を行う化合物数を決定する必要がある。
一般的に、コンピュータースクリーニングを行うプログラムには評価システムが含まれるが、評価システムは、対応するプログラムのアルゴリズムに合わせた独自の手法が多い。評価システムとして各化合物の活性値が得られる場合は、その値を基準として実験的評価に供する化合物を選択することが可能であるが、活性値ではなく経験的な数値しか得られない評価システムも数多く存在する。一方で、コンピュータースクリーニングの目的が、実験的評価に供する化合物数を絞り込むことと考えると、評価システムにより順位付けられた化合物を、上位から実験に供することが可能な数だけ選択することも有意義である。例えばコンピュータースクリーニングにより選択された化合物が期待する活性を有する確率を５％〜３０％と考えた場合、１０化合物の活性制御物質を得るためには約３０〜２００の候補化合物を選択すれば良いし、５０化合物の活性制御物質を得るためには約１６０〜１０００の候補化合物を選択すれば良い。この際、最終的に得られる活性制御化合物に多様性を持たせることを目的として、評価の上位化合物を構造・物性等の類似度によりクラスタリングした後、各クラスターから実験的評価に供する化合物数を選択することも有意義である。
すなわち、コンピューター上でスクリーニングし選別したＥＧＦＲ活性調節（候補）物質を、更にＥＧＦＲを発現する細胞またはＥＧＦＲを用いた生化学的アッセイに供することにより、より効果的にＥＧＦＲ活性調節物質を選別することが可能になる。生化学的アッセイを用いるに際して、被験物質がＥＧＦＲ活性調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系に該化合物を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性に差があるかどうかを調べればよい。活性調節作用を有するとは、蛋白質の活性の測定値が、被験化合物添加群と、被験化合物無添加群との間で差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
阻害（抑制）率または増強（促進）率（％）＝（無添加群の測定値−被験化合物添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値×１００
ここで、阻害・増強のどちらの作用であるかについておよび測定値については、蛋白質の活性を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が以下に示す生化学的アッセイ例６に示す方法の場合には、吸光度を用いることができ、被験物質添加群の測定値＜被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質はＥＧＦＲアンタゴニストであり、被験物質添加群の測定値＞被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質はＥＧＦＲアゴニストであるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることができる。
以下に生化学的アッセイの例を示すが、これらに限定されるものではない。
（生化学的アッセイ例１）ＥＧＦレセプターバインディングアッセイ
Ａ４３１（ヒト扁平上皮癌）細胞などで代表されるＥＧＦレセプター高発現細胞あるいは可溶型ＥＧＦレセプターをプレートに固相化する。ユーロピウム標識したＥＧＦおよび被験物質を各ウェルに添加し一定時間インキュベートする。インキュベート後プレートを洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強試薬を添加した後に時間分解蛍光を測定する。被験物質のかわりにＤＭＳＯを添加したウェルの蛍光カウントをコントロールとし、これよりも低いカウントを示す被験物質をＥＧＦ結合阻害物質としてスクリーニングすることができる。
同様にＲＩ等で標識したＥＧＦを用いてレセプターバインディングアッセイを行なう事も可能である。
（生化学的アッセイ例２）ＥＬＩＳＡアッセイ
Ａ４３１細胞を含めたＥＧＦレセプター高発現細胞あるいは可溶型ＥＧＦレセプターをプレートに固相化する。ＥＧＦおよび被験物質を各ウェルに添加し、一定時間インキュベートする。インキュベート後プレートを洗浄した後にＨＲＰ標識した抗ＥＧＦ抗体を添加し、さらにインキュベートする。再び洗浄を行い、基質溶液を加えることにより酵素反応を開始する。一定時間後に反応を停止した後に吸光度を測定する。被験物質のかわりにＤＭＳＯを添加したウェルの吸光度をコントロールとし、これよりも低いカウントを示す被験物質をＥＧＦ結合阻害物質としてスクリーニングすることができる。
（生化学的アッセイ例３）ＢＩＡＣＯＲＥを用いた結合試験
センサーチップ上に可溶型ＥＧＦレセプターを固相化し、被験物質をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）マイクロ流路系を介してチップ上に送液する。表面プラズモン共鳴によりセンサーチップ表面の質量変化を検出することにより、ＥＧＦレセプターに特異的に結合する被験物質をスクリーニングすることができる。
（生化学的アッセイ例４）ＥＧＦレセプターリン酸化試験（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法）
Ａ４３１細胞を含めたＥＧＦレセプター高発現細胞をプレートに播種する。ＥＧＦおよび被験物質を各ウェルに添加し、一定時間インキュベートする。インキュベート後、細胞をＬａｅｍｌｌｉ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｌｌｉ，Ｕ．Ｋ．，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５）を用いて溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて蛋白質を分離後、メンブランにブロッティングする。チロシンリン酸化されたＥＧＦレセプターは、抗リン酸化ＥＧＦ受容体抗体およびＨＲＰなどで標識された２次抗体と適切な基質溶液を用いて発光させ、Ｘ線フィルム上等で検出する。被験物質のかわりにＤＭＳＯを添加した細胞におけるリン酸化レセプターの量（検出されたバンドの濃さ）をコントロールとし、これよりも薄いバンドを示す被験物質をＥＧＦ受容体活性化阻害薬としてスクリーニングすることができる。
またコントロールよりも濃いバンドを示す被験物質をＥＧＦ受容体活性化薬としてスクリーニングすることも可能である。
（生化学的アッセイ例５）レポータージーンアッセイ
ｃ−ｆｏｓやｃ−ｍｙｃなどＥＧＦ刺激によって転写誘導される遺伝子のプロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミドを構築する。これをＡ４３１細胞などで代表されるＥＧＦレセプター発現細胞にトランスフェクトし、ＥＧＦ刺激により一過性または恒常的にレポータージーンを発現する組替え細胞を作製する。本組替え細胞に対してＥＧＦおよび被験物質を添加し、一定時間後のルシフェラーゼ活性を測定する。被験物質のかわりにＤＭＳＯを添加したウェルのルシフェラーゼ活性をコントロールとし、これよりも低いルシフェラーゼ活性を示す被験物質をＥＧＦ受容体活性化阻害薬としてスクリーニングすることができる。
またコントロールよりも高いルシフェラーゼ活性を示す被験物質をＥＧＦ受容体活性化薬としてスクリーニングすることも可能である。
（生化学的アッセイ例６）細胞増殖アッセイ
Ａ４３１細胞およびＳｉＨａ細胞（ヒト扁平上皮癌）などに代表されるＥＧＦ依存的増殖を示す細胞をプレートに播種する。ＥＧＦおよび被験物質を添加し、数日後の生細胞数をＭＴＴ法等により定量する。被験物質のかわりにＤＭＳＯを添加したウェルの吸光度をコントロールとし、これよりも低い吸光度を示す被験物質をＥＧＦ受容体活性化阻害薬としてスクリーニングすることができる。またコントロールよりも高い吸光度を示す被験物質をＥＧＦ受容体活性化薬としてスクリーニングすることも可能である。
ＥＧＦの効果および作用は細胞膜に存在するＥＧＦ受容体を介して惹起されることが明らかになっており、ＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させる化合物はＥＧＦと同等の生理活性および薬理活性を有することが期待される。ＥＧＦ受容体活性化薬の生物活性（薬効試験）の評価例を以下に示す。
（試験例１）腫瘍移植モデルマウスに対する作用
Ｃｏｌｏｎ−２６（マウス結腸腺癌）またはＡ４３１細胞をＢＡＬＢ／ｃ系雌マウス腹部皮下に移植し、一定期間後に癌の大きさ、すなわち腫瘍の長径（ａ  ｍｍ）および短径（ｂ  ｍｍ）を測定して下式により癌重量を算出する。
癌重量（ｍｇ）＝ａｂ２／２
（これらの癌腫瘤は一般に回転楕円体の形状をとるため、回転楕円体の体積計算の公式を導入する。また、ガン細胞の比重を約１として体積＝重量とする。）
被験物質投与直前に癌重量を測定した後、各々の群に被験物質を投与し、移植癌細胞の経時的重量変化を測定する。本発明により得られるＥＧＦ受容体活性化薬は癌重量を増加または減少させる。
（試験例２）急性肝障害モデルマウスに対する作用
ｄｄＹ系雄マウスに被験物質を投与し，３０分後に３ｖｏｌ％四塩化炭素を皮下注射する。そして、この時より２４時間後に眼窩静脈叢より採血して、血清を調製する。この血清を希釈し、ＧＯＴおよびＧＰＴ値を測定する。本発明により得られるＥＧＦ受容体活性化薬はＧＯＴおよびＧＰＴ値の上昇を抑制する。
（試験例３）胃潰瘍モデルラットに対する作用
ＳＤ系雄ラットを実験開始２４時間前より絶食させ、麻酔下において正中線より切開し、胃を切り開く。胃壁の外側と内側とをリング付きピンセットで挟み、内側に６０ｖｏｌ％酢酸を滴下する。一定時間後にこれを除去した後に縫合し、その後の食餌は自由摂取とする。翌日より被験物質の投与を開始し、粘膜層の厚さの変化を経時的に測定する。本発明により得られるＥＧＦ受容体活性化薬は粘膜層の厚さを増加させる。
（試験例４）肉芽形成に対する作用
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットの背部皮下に麻酔下において被験物質を吸収させたペーパーディスクを移植し、形成された肉芽組織の乾燥重量、蛋白質含量、ＤＮＡ含量および／またはハイドロキシプロリン含量の変化を経時的に測定する。本発明により得られるＥＧＦ受容体活性化薬は乾燥重量、蛋白質含量、ＤＮＡ含量および／またはハイドロキシプロリン含量を増大させる。
（試験例５）パーキンソン病モデルラットに対する作用
ＳＤ系雌ラットの片側の黒質線条体ドーパミン経路に６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ  ＨＢｒを投与してパーキンソン病モデルラットを作成する。ここに胎生１４日齢のラット胎児から得られた中脳腹側および被験物質を線条体に移植し、ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅを投与したときの運動性の変化を経時的に観察する。本発明により得られるＥＧＦ受容体活性化薬はａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ投与時の運動性を低下させる。
また、ＥＧＦ受容体活性化阻害薬の生物活性は、例えば以下の各種方法により確認できる。
（試験例６）腫瘍移植モデルマウスに対する作用
試験例１と同様の手順で行う。ただし、被験物質とともにＥＧＦを投与し、ＥＧＦのみを投与した群との生物活性を比較する。本発明により得られるＥＧＦ活性化阻害薬はＥＧＦのみを投与した場合に観察される癌重量の変化を阻害する。（試験例７）卵巣摘出ラットに対する作用
ＳＤ系雌ラットから卵巣を摘出した後、被験物質を投与する。一定期間後に両大腿骨を摘出し、骨梁に含まれるカルシウムおよびハイドロキシプロリンの量を測定する。本発明により得られるＥＧＦ受容体活性化阻害薬はカルシウムおよびハイドロキシプロリン含量の低下を抑制する。
さらに、ＥＧＦ受容体選択的薬物送達剤の生物活性は、例えば以下の方法により確認できる。
（試験例８）腫瘍移植モデルマウスに対する作用
試験例１と同様の手順で行う。ただし、被験物質とともに適切な殺細胞物質を投与し、殺細胞物質のみを投与した群との生物活性を比較する。本発明により得られるＥＧＦ受容体選択的薬物送達剤は殺細胞物質のみを投与した場合に観察される癌重量増加抑制作用を増強させる。
これまでにＥＧＦの生理活性および薬理活性として報告されているものには、以下のものがある。
１）正常細胞および腫瘍細胞増殖の促進［Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，１２，３９４（１９６５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１，５１５（１９７８）］または抑制［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，７７６１（１９８４）］
２）損傷を受けた器官の自己再生の促進［Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．，５５，９５（１９７７）］
３）胃酸分泌抑制作用［Ｇｕｔ，２３，９５１（１９８２）］・消化管粘膜保護作用：［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１３，Ｓ１０３（１９９１）］
４）創傷治癒促進作用［Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，３３，１６４（１９８２）］・角膜修正作用［Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，４０，４７（１９８５）］
５）神経保護作用［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｓｃｉ．，３７，１（１９９３）］・神経細胞の分化・増殖作用［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２，４５６５（１９９２），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，２６４９（１９９６）］
６）カルシウム遊離促進作用［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０７，２７０（１９８０）］
ＥＧＦ受容体に結合してこれを活性化させる物質（アゴニスト）は、１）腫瘍細胞の増殖調節剤、望ましくは抗腫瘍剤、あるいは細胞の賦活化・新陳代謝の促進剤および化粧品類、望ましくは脱毛剤、２）損傷を受けた器官の再生促進剤、望ましくは肝機能障害の治療剤、３）消化管機能障害改善薬、望ましくは胃酸分泌抑制剤・消化管粘膜保護剤・抗潰瘍剤、４）創傷治療促進剤望ましくは糖尿病・創傷・火傷等による皮膚潰瘍・角膜損傷の治療剤、５）神経細胞の再生・保護剤、望ましくは抗パーキンソン病薬として用いることができる。
また、ＥＧＦ受容体に結合して活性化を阻害する物質（アンタゴニスト）は、１）正常細胞および腫瘍細胞の増殖調節剤、望ましくは抗腫瘍剤、乾癬治療剤および喘息を含む慢性閉塞性肺疾患治療剤、２）骨吸収抑制剤、望ましくは骨粗鬆症の予防・治療薬として用いることができる。
さらに、ＥＧＦ受容体に結合する化合物はＥＧＦ受容体を有する細胞への選択的薬物送達剤、望ましくは腫瘍細胞への殺細胞物質の選択的薬物送達剤として用いることができる。
本発明はまた、上述に説明したＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いたＥＧＦＲ活性調節物質の設計またはスクリーニング方法、ファルマコフォアを用いたＥＧＦＲ活性調節物質の設計またはスクリーニング方法により同定または設計されたＥＧＦＲ活性調節物質を提供するものである。
３−６  ＥＧＦＲアゴニストまたはＥＧＦＲアンタゴニスト
本発明はまた、具体的な特性球により定義されるファルマコフォアに適合する構造を有するＥＧＦＲアゴニストまたはＥＧＦＲアンタゴニストを提供する。ファルマコフォアに適合する構造を有するとは、このようなＥＧＦＲアゴニストまたはＥＧＦＲアンタゴニストを立体構造化した際の構造座標がファルマコフォアにおける少なくとも３点以上の特性球の相対配置および特性を満足させることを意味する。各特性球に適合する原子や官能基の例は、例えばＣａｔａｌｙｓｔなどのプログラムに付属のマニュアルに定義されている（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４．５，１９９９）。具体的な特性球を有するファルマコフォアは実施例５および実施例６に開示されているがこれらに限定されるものではなく、本発明のファルマコフォアの設計方法により得られるファルマコフォアも含まれる。
３−７  ＥＧＦＲの活性を調節する方法
本発明はまた、ＥＧＦＲの活性を調節する方法であって、ＥＧＦＲと、具体的な特性球により定義されるファルマコフォアに適合する構造を有するＥＧＦＲ活性調節物質を接触させることを特徴とする方法を提供する。当該方法はさらに、ＥＧＦＲの活性が調節されたことを確認する工程を含みうる。ＥＧＦＲの活性が調節されたことを確認する工程は、ＥＧＦＲの活性化の結果生起することが知られている事象（例、ＥＧＦＲ細胞内ドメインのリン酸化、細胞増殖等）のうち少なくとも一つについて阻害または促進が起こったことを検出することにより実現され得る。
４．構造情報を用いたＥＧＦ変異体およびＥＧＦＲ変異体の作製
本発明は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いることを特徴とする、ＥＧＦＲ変異体を設計する方法、またはＥＧＦ変異体を設計する方法を提供する。また、本発明は、当該設計方法を用いたＥＧＦＲ変異体またはＥＧＦ変異体の製造方法および当該製造方法により得られるＥＧＦＲ変異体またはＥＧＦ変異体を提供する。
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いることにより、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ間の相互作用部位や二量体化部位の観察を行って、ＥＧＦまたはＥＧＦＲ中のアミノ酸残基にポイントミューテーションを目的に応じて導入することが可能となる。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いることを特徴とする、ＥＧＦＲ変異体を設計する方法、またはＥＧＦ変異体を設計する方法は、以下の工程を含み得る：ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階；および変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階。
さらに、コンピュータ上でＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の３次元構造を視覚的に表示させる段階を含んでもよく、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階および変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階は、目視および／またはコンピュータプログラムによる解析により実現され得る。
当該設計方法を用いたＥＧＦＲ変異体またはＥＧＦ変異体の製造方法は、以下の工程を含み得る：ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いてＥＧＦＲ変異体またはＥＧＦ変異体を設計する段階；変異蛋白質を調製する段階；および変異蛋白質を生化学的アッセイに供し所望の活性を有することを確認する段階。
例えば、ＥＧＦ活性を増強させたＥＧＦ変異体を設計することも可能となる。単なる組み換えＥＧＦに比較して、創傷などの薬剤として低容量で投与可能となるなどのメリットがある。
すなわち、アゴニスト（作用薬）としての活性を持つＥＧＦ変異体を設計するには、ＥＧＦＲとの直接的な相互作用に関与するＥＧＦのアミノ酸残基およびその近傍領域において、相互作用上において対応しているＥＧＦＲ側の領域中にあるアミノ酸残基とより強く結合するように変異を導入する。ここに「その近傍領域」とは、該アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などに関与する領域、具体的にはおよそ５Å以内にある領域をいう。更に、これ以外の部位に変異を導入することによりアゴニストとしての活性を持つ変異体ＥＧＦを設計する場合においても、そのような設計方法は、本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲に含まれる。
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；コンピュータ上でＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の３次元構造を視覚的に表示させる段階；およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位またはＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基を特定する段階の詳細は、上述の「３−１」に説明されている。変異を導入するアミノ酸残基を特定する段階において、考慮されるべき非共有結合の相互作用は、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などがあり、これらを総合的に考慮して最終的な変異体の設計を行うことができる。例えば、ＥＧＦＲ側のグルタミン酸、アスパラギン酸といった側鎖部分に負の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖近傍には、近接するＥＧＦのアミノ酸残基においてリジン、アルギニン、ヒスチジンといった正の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖が配置されるように、また、その逆にＥＧＦＲ側にリジン、アルギニン、ヒスチジンといった側鎖部分に正の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖近傍には、近接するＥＧＦのアミノ酸残基においてグルタミン酸、アスパラギン酸といった負の電荷を持つアミノ酸残基の側鎖が配置されるように変異させる。また、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンといった側鎖部分が疎水性の高いアミノ酸残基が主に集まって相互作用している部分においては、ＥＧＦにおいてセリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンといった親水性のアミノ酸残基やアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった荷電しているアミノ酸残基が存在している箇所を見つけだし、該アミノ酸残基を疎水性のアミノ酸残基で置き換え、疎水性相互作用が強まるようにする。また、水素結合をする主鎖部分やセリン、チロシンなどのアミノ酸残基の側鎖部分には、新たな水素結合ができるように、対応するアミノ酸残基を変異させる。以上の変異においては、アミノ酸残基の側鎖や主鎖部分において、ファンデルワールス相互作用ができるだけ大きく、しかも各原子間で立体的な障害が生じないように注意する必要がある。更には、変異により新たな空隙部分ができないように、また既に空隙部分が存在する領域においては、その空隙部分をできるだけ充填するような変異を考慮することも必要である。このように、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などやその他の因子を、コンピューター画面上で視覚的または／および適当なコンピュータプログラムを用いて総合的に考慮して、最終的な変異体の設計を行うことができる。
例えばＥＧＦのＭｅｔ２１は、結晶構造の解析結果から、ある程度の確からしさでデルタ炭素以上の炭素を有する水素結合可能なアミノ酸残基に置換可能である。特にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎへの置換によって、Ｔｙｒ４５の側鎖の水酸基、Ｇｌｎ１６の側鎖Ｌｅｕ１４の主鎖カルボニルとの水素結合能が付与される可能性があり、ＥＧＦＲへの結合活性上昇、ＥＧＦ物性改善等を期待することができる。逆に、Ｃγまでしかないアミノ酸側鎖に置換すると活性を損なう可能性も考えられる（Ｔｈｒ，Ｓｅｒなど）。更にＧｌｎ４３は、ある程度の確からしさでＬｅｕ、Ｉｌｅなどの疎水性残基に置換することも可能である。これは、ＥＧＦＲの相互作用可能な残基がＬｅｕであることから推測される。
また、アンタゴニスト（拮抗薬）としての活性を持つＥＧＦ変異体を設計するには、ＥＧＦＲとの直接的な相互作用に関与するＥＧＦのアミノ酸残基およびその近傍領域において変異を導入する。ついで、該変異体ＥＧＦがＥＧＦＲへ結合することによって、３次元空間における本来のＥＧＦとＥＧＦＲの２分子の相対的な位置が保たれなくなるような変異体、または該変異体ＥＧＦとＥＧＦＲとが相互作用ができなくなり、その結果、天然型のＥＧＦに対してアンタゴニストとしての活性を持つような変異体を選択する。または、ＥＧＦＲに結合はするものの、ＥＧＦＲの構造変化を引き起こさないような変異体も有用である。ＥＧＦＲとの直接的な相互作用に関与する以外の部位に変異を導入することにより、アンタゴニストとしての活性を持つ変異体ＥＧＦを設計する場合においても、そのような設計方法は本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲である。
また、ＥＧＦＲの二量体化に関与するアミノ酸残基に、相互作用を困難にするような変異を導入することで、ＥＧＦとは結合するが、二量体化を行わない変異ＥＧＦＲを設計することも可能となる。可溶型変異ＥＧＦＲとすれば、ＥＧＦ中和抗体同様に、ＥＧＦＲアンタゴニスト活性を発揮することで、癌や乾癬などの治療効果を発揮することが期待される。例えばＧｌｎ２５２はＡｌａ２８６の主鎖と、Ｔｙｒ２４６はＣｙｓ２８３の主鎖と、Ａｓｎ８６はＴｈｒ２４９の側鎖とそれぞれ水素結合をして二量体を安定化させているので、これらのアミノ酸残基側鎖を水素結合を形成できないアミノ酸に置換することで、二量体化を行わずにＥＧＦをトラップする能力を有する分子を構築することも可能となる。
「変異体」とは、もとの蛋白質のアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも１つ以上、例えば１個または数個（１〜１０個）が置換、付加もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。「非天然アミノ酸」とは、蛋白質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。
本発明の変異体設計方法に用いる構造座標は、表１または表２に示される構造座標、また、これを元にしてコンピューターを用いた計算などにより新たに作成した構造ホモログの構造座標でもよいし、更にはこれらの座標より、一部を抜き出したものでもよい。人に用いる医薬品として設計する場合においては、ヒト由来の蛋白質の構造座標を用いる方がより望ましい。
本発明により設計された変異体は、多くの方法によって調製され得る。例えば本発明を元にして、変異が有効であると同定された部位において、対応するアミノ酸残基をコードしている該オリゴヌクレオチドの部位を、変異体に相当するオリゴヌクレオチドを化学的に合成して、配列に特異的なオリゴヌクレオチド切断酵素（制限酵素）を用いて天然型のオリゴヌクレオチドの部分と入れ替えることで、本発明を元にして設計された該変異体をコードするＤＮＡを得ることができる。得られた変異体ＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることで前述のような変異体を得ることができる。
さらに、本発明の設計方法により設計され、調製された変異体について、生化学的アッセイにより所望の活性を有するかどうかを確認することが好ましい。用い得るアッセイ系に特に限定はないが、既述（３−５）の生化学的アッセイ例を使用することが可能である。すなわち、本発明の構造座標を利用して変異を導入すべきアミノ酸残基を決定し、遺伝子工学的手法を用いて変異蛋白質を作成し、該変異蛋白質を生化学的アッセイに供し、所望の活性を有するかどうかについて評価をすればよい。所望の活性の具体的な例としては、ＥＧＦついては、ＥＧＦＲ結合能および／またはＥＧＦＲ二量体化誘導能を増強あるいは減弱させること、ＥＧＦＲについては、ＥＧＦ結合能および／または二量体化能を増強あるいは減弱させることが挙げられる。
以上のように、今まで３次元構造上の理論的な支持がない状態で試行錯誤で行われていた変異体の作製を、本発明の構造座標の使用により、３次元空間内の理論的な解析に基づいて行うことが可能になる。
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたＥＧＦ変異体またはＥＧＦＲ変異体の設計方法において、構造座標としては、「２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標」の項で説明された構造座標を用いることが可能である。また、後述するホモロジーモデリング法や分子置換法によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて取得したリガンド／受容体複合体の構造座標を用いることにより、該リガンドの変異体または該受容体の変異体の設計を同様の方法で行うことが可能である。
本発明は、上述のＥＧＦ変異体またはＥＧＦＲ変異体の設計・製造方法により得られる変異体を提供する。
さらに本発明は、具体的な変異体の例として、以下の（Ａ）〜（Ｄ）に示す変異体を提供する：
（Ａ）ＥＧＦＲ二量体化部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ｂ）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ｃ）ＥＧＦＲ二量体化部位およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ｄ）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位にアミノ酸変異を有するＥＧＦ変異体。
（Ａ）の好ましい態様としては以下の（Ａ−１）〜（Ａ−３）が挙げられる：
（Ａ−１）ＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ａ−２）ＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、ＥＧＦＲ二量体化能が減弱した活性を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ａ−３）ＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、ＥＧＦＲ二量体化能が増強した活性を有するＥＧＦＲ変異体。
（Ｂ）の好ましい態様としては以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）が挙げられる：
（Ｂ−１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ｂ−２）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、ＥＧＦ結合能が減弱した活性を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ｂ−３）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、ＥＧＦ結合能が増強した活性を有するＥＧＦＲ変異体。
（Ｃ）の好ましい態様としては以下の（Ｃ−１）〜（Ｃ−２）が挙げられる：
（Ｃ−１）ＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するＥＧＦＲ変異体；
（Ｃ−２）ＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、ＥＧＦ結合能が増強しかつＥＧＦＲ二量体化能が減弱した活性を有するＥＧＦＲ変異体。
実施例９に示されるように、ＥＧＦとＥＧＦＲはいわゆる「ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｔ」によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合とＥＧＦＲ二量体化を行うものと考えられる。よって、ＥＧＦＲ二量体化部位に変異を有する変異体がＥＧＦ結合能に変化を生じる可能性があり、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位に変異を有するＥＧＦＲ変異体がＥＧＦＲ二量体化能に変化を生じる可能性もある。よって、ＥＧＦＲ変異体については、上述のほかに、ＥＧＦ結合能が増強した活性、ＥＧＦ結合能が減弱した活性、ＥＧＦＲ二量体化能が増強した活性、ＥＧＦＲ二量体化能が減弱した活性、ＥＧＦ結合能が増強しかつＥＧＦＲ二量体化能が増強した活性、ＥＧＦ結合能が減弱しかつＥＧＦＲ二量体化能が減弱した活性、ＥＧＦ結合能が増強しかつＥＧＦＲ二量体化能が減弱した活性、ＥＧＦ結合能が減弱しかつＥＧＦＲ二量体化能が増強した活性、のいずれかより所望の活性を有するＥＧＦＲ変異体とすることが可能である。
（Ｄ）の好ましい態様としては以下の（Ｄ−１）〜（Ｄ−３）が挙げられる：
（Ｄ−１）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有するＥＧＦ変異体；
（Ｄ−２）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、ＥＧＦＲ結合能が減弱した活性を有するＥＧＦ変異体；
（Ｄ−３）ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基に変異を有し、ＥＧＦＲ結合能が増強した活性を有するＥＧＦ変異体。
本項の変異体のＥＧＦＲ二量体化部位を構成するアミノ酸残基・ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位を構成するアミノ酸残基の定義は、「２．ＥＦＧ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標」の項の説明に準ずる。二量体化部位を構成するとは、二量体化において重要な相互作用を形成していると換言できる。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合部位についても同様である。
「減弱した活性」とは、変異を有さない天然のアミノ酸配列の蛋白質の活性に対して、変異を有する蛋白質の活性が、例えば０．８倍以下、好ましくは０．５倍以下、更に好ましくは０．３倍以下であることを意味する。「増強した活性」とは、変異を有さない天然のアミノ酸配列の蛋白質の活性に対して、変異を有する蛋白質の活性が、例えば１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、更に好ましくは２．０倍以上であることを意味する。蛋白質の活性は、当業者が通常使用し得る方法を用いて測定可能であり、例としては「３．構造座標を用いたスクリーニングまたは設計方法」の項の「３−５」の項で説明した生化学的アッセイ、実施例７〜９に記載の方法が挙げられる。
５．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いた分子置換法
本発明は、ＥＦＧ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用い、分子置換法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法を提供する。より詳細には、未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体を結晶化する工程；該結晶化された未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体からＸ線回折像を生成する工程；および、表１または表２に記載の構造座標の少なくとも一部をＸ線回折像に適用して、その構造が未知である未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体の少なくとも一部の３次元電子密度マップを生成する工程を含み得る。分子置換法は、Ｘ線結晶構造解析において位相問題を解決するための手段であり、構造未知の蛋白質または蛋白質複合体のネイティブ結晶（重金属原子を含有しない結晶）のＸ線回折像が得られているとき、既に構造が決定されている蛋白質または蛋白質複合体の構造情報を利用することで、重原子同型置換法を用いることなく迅速に構造未知蛋白質または蛋白質複合体の構造座標を決定し得る方法である（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，（１９７６）．ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ，第４４３−４６４頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ．）。
本発明による、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標またはその一部は、ＥＧＦおよびＥＧＦＲの全部または一部を含んでいる結晶、ＥＧＦもしくはＥＧＦＲと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ他の蛋白質から得られた結晶、またはＥＧＦもしくはＥＧＦＲと構造上類似性を有すると予想される他の蛋白質から得られた結晶などのＸ線結晶構造解析において使用されうる。分子置換法を行う際には、例えばＣＮＸ（アクセルリス社）やＡＭＯＲＥ（ＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ４．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０，６７０−６７３（１９９４））のプログラム群の１つ）などのプログラムを利用できるが、その他のプログラムを用いてもよい。
本発明のＥＧＦとＥＧＦＲの複合体の構造座標を用いて分子置換法を適用するべき結晶としては、ＥＧＦとＥＧＦＲの全部または一部を含んでいる結晶、ＥＧＦまたはＥＧＦＲと有意な相同性を有するアミノ酸配列を持つ他の蛋白質の結晶、ＥＧＦまたはＥＧＦＲと構造上類似性を有すると予想される他の蛋白質の結晶、ＥＧＦＲと結合する化合物（例えばアゴニストやアンタゴニスト）とＥＧＦＲとの複合体の結晶、ＥＧＦと結合する化合物（例えばアンタゴニスト）とＥＧＦとの複合体の結晶、ＥＧＦとアミノ酸残基において有意な相同性を有する蛋白質の結晶、ＥＧＦＲとアミノ酸残基において有意な相同性を有する蛋白質の結晶が挙げられ、ＥＧＦの変異体の結晶、ＥＧＦＲの変異体の結晶、また更にそれらの複合体（リガンド−受容体複合体、蛋白質−化合物複合体を含む）の結晶にも適応しうる。ここで有意な相同性とは、一般に、比較するアミノ酸配列間において２０％以上、好ましくは３０％以上のアミノ酸が一致している場合をさす。分子置換法の適用については、実際に目的の結晶のＸ線回折像から計算された構造因子に分子置換法を適用し、有意な解が得られることにより、判断されうる。すなわち、上記以外の未知物質の結晶においても、本発明によるＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標の全部または一部を用いて分子置換法により構造解析する方法は、有意な解が得られる場合においては本発明の範囲に含まれる。
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いた分子置換法において、構造座標としては、「２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標」の項で説明された構造座標を用いることが可能である。また、後述するホモロジーモデリング法によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて取得した蛋白質または蛋白質複合体の構造座標を用いることも可能である。
本発明の分子置換法により新たに得られた蛋白質または蛋白質複合体の構造座標も本発明の範囲内のものである。
６．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いたホモロジーモデリング法
本発明は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてホモロジーモデリング法により未知の構造の蛋白質または蛋白質複合体についての構造座標を取得する方法を提供する。
ホモロジーモデリングとは、構造未知の蛋白質（ターゲット）の構造を、類似の配列をもつ構造既知の蛋白質（テンプレート）をもとに予測する手法をいう。ホモロジーモデリングでは、まず、構造データベースから類似の配列を探し、アラインメントを確定する。次に、アラインメントしたテンプレートの配列から、対応する部分の構造を選び出して予測構造を構築する。
ホモロジーモデリングには、フラグメントに基づく方法と制約条件に基づく方法の２つがある。フラグメントに基づく方法は、構造既知の蛋白質から得られるフラグメントを集めてモデリングするもので、フラグメントの平均構造を利用し、構造が保存していない部分では、ループモデリングなど他の手法を用いる。制約条件に基づく方法は、構造上の特徴を制約条件（α炭素間の距離、主鎖・側鎖の二面角など）で表し、これを満たすようモデリングするというものである。制約条件を評価関数で表し、最小化を行う。使用されるプログラムとしてはＲｏｃｋｆｅｌｌｅｒ大学ＳａｌｉのＭＯＤＥＬＬＥＲが代表的であるがこれに限定されるものではない。
ホモロジーモデリングは、既知の蛋白質と２０％程度、より好ましくは３０％以上のホモロジーがないと適用できないという制約があるが、他のアプローチに比べ、大きな蛋白質にも適用することができ、また、データベースの内容を直接的に利用するので、構造データベースが充実すればするほど、予測精度が向上する、という利点がある。テンプレートの選択とアラインメントは、構造予測の精度に大きな影響を及ぼす。
本発明に係るＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いたホモロジーモデリング法は、モデリングをしたい構造未知の蛋白質のアミノ酸配列とモデリングのテンプレートとなる蛋白質のアミノ酸配列を用意する工程；双方のアミノ酸配列のアライメントを行う工程；テンプレート蛋白質の構造情報を鋳型としてターゲット蛋白質を座標化する工程；および得られたモデル構造に理論上の問題がないかを検証する工程のうち一部または全部を含む。
産業応用可能な精度を有するＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造が明らかとなり、この情報を解析してドラッグデザインすることが可能となれば、非常に有用であるが、ＥＧＦ／ＥＧＦＲの複合体結晶構造は、ＥＧＦＲアゴニストやアンタゴニストのドラッグデザインに有用なだけではない。複合体の結晶構造を利用することで、ＥＧＦＲとの相同性から、その立体構造フォールドが同じであると推測されるすべてのレセプター、例えばインシュリンレセプター、インシュリン様増殖因子−１レセプター、ＥｒｂＢ２，３，４等のリガンド結合状態におけるレセプターのコンフォメーションを高い精度で立体構造予測することを可能とすることをも意味する。本発明によって、ＥＧＦ／ＥＧＦＲの共結晶構造が得られたことで、ＥＧＦＲはリガンド結合によってダイナミックなコンフォメーション変化をおこしていることが判明し、先行技術を大きく上回って、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ様のフォールドを有する蛋白質の構造予測に有用な情報を得ることが可能となった。例えば、ＥＧＦＲの構造を用いて、一般的なホモロジーモデリングを実施することによりインシュリンレセプターのインシュリン結合時の活性コンフォメーションを精度高く予測することが可能となるし、インシュリンとの結合部位を特定し、それに相補的な分子を設計することで、低分子のインシュリン様活性を有する低分子化合物を提示することも可能である。経口投与可能なインシュリン様化合物は切望されており、この技術を用いることで、試行錯誤を行って探索するよりもはるかに合理的な情報を提供可能となる。同様に、ＥＧＦＲ様フォールドを有する蛋白質すべてにおいて、その活性コンフォメーションの予測が可能となるため、有用な学術的解析や、医薬品創製（抗がん剤など）を目的とした解析が本発明によって可能となる。
上述したターゲット蛋白質アミノ酸配列とテンプレート蛋白質のアミノ酸配列情報とを比較する段階、ドメインを構成する部分配列を特定する段階、テンプレート蛋白質の構造情報を鋳型としてターゲット蛋白質を座標化する段階、得られたモデル構造に理論上の問題がないかを検証する段階、および相互作用部位を構成しているアミノ酸残基を特定する段階のそれぞれに必要とされる情報やプログラムは、一般に開放されているデータベースあるいは市販化されている各種プログラムを用いて得ることができる。ドメインの特定に必要な公知の蛋白質情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＰＤＢデータベース（Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．２３５−２４２（２０００），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）など、公開データベースから入手可能である。また、アミノ酸配列比較には、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．，３６，ｐｐ．２９０−３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，ｐｐ．４０３−１０（１９９０））、マルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，ｐｐ．４６７３−４６８０（１９９４））、その他入手可能ないずれのプログラムを用いてもよい。ドメイン検索には、モチーフデータベースであるＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）、またはＰｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｆａｍ／；Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，ａｎｄ  Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，２８，ｐｐ．４０５−４２０（１９９７））などが利用可能であり、検索プログラムとしては、隠れマルコフモデルを用いた相同性検索プログラムであるＨＭＭＥＲ（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．，重み行列を用いた膜貫通予測プログラムｔｍａｐ（Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｂ，Ａｒｇｏｓ  Ｐ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２３７，ｐｐ．１８２−９２（１９９４））等が挙げられる。また、蛋白質モデリングプログラムとしては、ＦＡＭＳ（Ｏｇａｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．Ｍｏｄｅｌ．，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２５８−２７２（２０００））、Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、蛋白質構造評価プログラムとしては、Ｐｒｏｆｉｌｅｓ−３Ｄ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、グラフィックス表示プログラムとしては、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｓｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等を使用することが可能である。これらのデータベースまたはプログラムはその性質上内容が改良され、あるいは将来的に新たなプログラム等が開発されることもあり得るが、本発明の実施に必要な機能を有している限り利用可能であり、上記の例に限定されるものではない。
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたホモロジーモデリング法において、構造座標としては、「２．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標」の項で説明された構造座標を用いることが可能である。また、前述の分子置換法によりＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて取得した蛋白質または蛋白質複合体の構造座標を用いることも可能である。
本発明のホモロジーモデリング法により新たに得られた蛋白質または蛋白質複合体の構造座標も本発明の範囲内に含まれる。
以下にＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いたホモロジーモデリングの具体的方法を説明する。ヒトインシュリンレセプター、インシュリン様増殖因子−１レセプター、ＥｒｂＢ２，３，４等のＥＧＦＲと同じフォールドを有するレセプターのアミノ酸配列を既存のアミノ酸配列ＤＢから抽出する。この配列を、ＥＧＦＲとアミノ酸配列で配列アライメントを行う。配列アライメントプログラムまたはマルチプルアライメントプログラムとしてはＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴ，Ｃｌｕｓｔａｌｗなどを使用できる。次に、本発明で規定されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ共結晶構造やその部分構造を鋳型として、既存のパッケージソフトウエア（アクセルリス社Ｈｏｍｏｌｏｇｙ，北里大学ＦＡＭＳ等）を用いることによって常法に従い、ホモロジーモデリングを行うことが可能である。初期構造に対してＤｉｓｃｏｖｅｒやＣｈａｒｍ，Ａｍｂｅｒなどの力場を用いて分子最適化計算を行い、極小化後、リガンド結合時のインシュリンレセプター、インシュリン様増殖因子−１レセプター、ＥｒｂＢ２，３，４等のＥＧＦＲと同じフォールドを有するレセプターの極めて精度高いと考えられる予測構造を構築することに成功した。例としてヒトＥｒｂＢ２のモデリング構造を図１２に示す。得られた各蛋白質のモデリング構造からリガンドとの結合に重要なアミノ酸残基を決定したので、これを図１１に提示する。この構造は、アゴニストやアンタゴニストのファルマコフォア抽出、コンピュータスクリーニング、アゴニストやアンタゴニストの分子設計（活性上昇、選択性付与など）、産業上有用な改変体の設計、中和抗体・アゴニスト抗体の作製、分子置換法による新規結晶構造解析、その他変異体の解析などに有用である。これによって規定されるファルマコフォアによって、医薬品のスクリーニングや、開発に利用できる。
また、スクリーニングでヒットした化合物や、その誘導体の結合モデルを構築することで、得られた化合物の誘導最適化に活用することも可能となる。
７．ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いたエピトープの設計方法と抗体の作製
本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いることにより、抗体のエピトープの設計が合理的に行える。これにより中和抗体やアゴニスト抗体を合理的に効率よく作製することが可能となる。例えば、本発明の複合体構造を観察した結果、ＥＧＦのＣｙｓ３３−Ｔｒｐ４９（ＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷ：配列番号１０）は、ヒトＥＧＦ中和抗体を作製する上で非常に有用な配列であるし、ＥＧＦＲのドメインＩ領域におけるＳｅｒ１１−Ａｓｎ３２（ＳＮＫＬＴＱＬＧＴＦＥＤＨＦＬＳＬＱＲＭＦＮ：配列番号１１）、ドメインＩＩ領域におけるＰｒｏ２４１−Ｔｈｒ２６６（ＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫＹＳＦＧＡＴ：配列番号１２）またはドメインＩＩＩ領域におけるＬｅｕ３４５−Ｌｅｕ３６３（ＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬ：配列番号１３）は中和抗体またはアゴニスト抗体を作製する上で非常に有用であることが明らかとなった。
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いることを特徴とする、エピトープの設計方法は、以下の工程を含み得る：ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標をコンピュータに入力する段階；およびＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりエピトープとなり得る部分を特定する段階。さらに、コンピュータ上でＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の３次元構造を視覚的に表示させる段階を含んでもよい。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造の解析によりエピトープとなり得る部分を特定する段階は、目視および／またはコンピュータプログラムによる解析により実現され得る。また、当該設計方法を用いた抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＥＧＦ抗体の製造方法は、以下の工程を含み得る：ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いてエピトープを設計する段階；および設計したエピトープを含む抗原を調製する段階；設計したエピトープを認識する抗体を調製する段階。
エピトープを設計するにあたっては、本発明のＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を、分子の３次元構造をグラフィカルに表示可能なコンピュータプログラムに導入する。ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の３次元構造を視覚的に観察し、または適当なコンピュータプログラムを用いて、エピトープとなりうる部分を特定する。エピトープとなりうる部分としては、分子の表面に露出されている部分、または溶媒（例えば水分子）と接触可能な部分が好ましい。また、複合体形成時には蛋白−蛋白相互作用部位を形成しているが、単量体時には分子の表面に露出されている部分または溶媒（例えば水分子）と接触可能な部分をエピトープとすれば、複合体形成を妨げるような中和抗体を設計することが可能である。一方で、リガンド−受容体結合部位を架橋するような抗体または二量体形成部位を架橋するような抗体は、アゴニスト抗体として機能するものと予想される。さらに、アゴニスト活性や中和活性を有さない抗体を設計するために、ＥＧＦとＥＧＦＲの結合および二量体化に影響を与えないエピトープを設計することも可能である。
エピトープとなりうる部分を特定した後は、該エピトープのアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、該ペプチドを抗原として定法に従い抗体を作製する。あるいは、蛋白質の全部または一部を抗原として抗体を作製したのち、所望のエピトープを認識する抗体を選別することにより取得してもよい。
抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、特異性が高い点でモノクローナル抗体が好ましい。
上記モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマから所望のエピトープを特異的に認識する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
動物の免疫に抗原として用いるペプチドとしては、組換えＤＮＡ法または化学合成により調製したペプチドが好ましい。モノクローナル抗体の作製は、当分野では周知である。簡単に説明すると、抗原用ペプチドをアジュバントとともに哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与して免疫する。免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で免疫する。最終免疫後、抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等）を採集する。次に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１等が好適に使用される。
細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で融合促進剤の存在下に接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等を使用することができる。また、電気刺激を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。
すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。
抗体の評価にあたっては、所望のエピトープを特異的に認識するかどうかに加えて、中和活性またはアゴニスト活性を有するかどうかを生化学的アッセイにより評価することが好ましい。用いる生化学的アッセイに制限はないが、例えば前述の生化学的アッセイ例を用いることが可能である。
本発明のエピトープの設計方法は、ＥＧＦおよびＥＧＦＲのほか、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いたホモロジーモデリング法により構造決定された蛋白質または蛋白質複合体、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いた分子置換法により構造決定された蛋白質または蛋白質複合体についても適用できる。また、本発明のエピトープの設計方法を利用して作製された抗体についても本発明の範囲内のものである。
８．ペプチド断片
本発明は、ＥＧＦＲ二量体化部位を形成する領域の全部または一部のアミノ酸残基を含むペプチド（ポリペプチド）またはその塩を提供する。複合体のＥＧＦＲ同士が結合して二量体を形成する領域（ＥＧＦＲ二量体化部位）は、例えば、ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１に示すアミノ酸配列）のうち第２４０番目〜第２６７番目（配列番号１４）からなる領域であり、この領域の全部または一部のアミノ酸残基を含む。
さらに、本発明は、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合部位を形成する領域の全部または一部のアミノ酸残基を含むペプチドまたはその塩も提供する。
ＥＧＦのＣｙｓ３３−Ｔｒｐ４９（配列番号１０）は、ヒトＥＧＦ中和抗体を作製する上で非常に有用な配列であり、ＥＧＦＲのドメインＩ領域におけるＳｅｒ１１−Ａｓｎ３２（配列番号１１）、ドメインＩＩ領域におけるＰｒｏ２４１−Ｔｈｒ２６６（配列番号１２）またはドメインＩＩＩ領域におけるＬｅｕ３４５−Ｌｅｕ３６３（配列番号１３）なども、本発明のペプチドに含まれる。
本発明のペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の常法手段によって合成することができる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法および液相合成法のいずれをも適用することができる。
すなわち、本発明のペプチドを構成し得るアミノ酸同士を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドが合成される。縮合方法や保護基の脱離としては、公知のいずれの手法を用いてもよい（例えば泉屋信夫他，ペプチド合成の基礎と実験，丸善（１９７５）等）。反応後は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドを精製することができる。但し、本発明においては、市販の自動ペプチド合成装置（例えば株式会社島津製作所の多種品同時固相法自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８）を使用して合成することもできる。
本発明のペプチドの塩は、生理学的に許容される酸付加塩または塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、リジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。塩は、塩酸などの適切な酸、または水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。
また、本発明のペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここで、エステルにおけるＲとしては、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素６〜１２のアリール基、炭素数７〜１２のアラルキル基などが挙げられる。
さらに、本発明のペプチドには、Ｎ末端のアラニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖ペプチドなどの複合ペプチド等も含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕ＥＧＦおよびＥＧＦＲの発現
（１）ＥＧＦＲの発現
以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、標準的ＰＣＲプロトコルにより発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｓＥＧＦＲ（配列番号１のアミノ酸１−６１９）を作製した。
フォワードプライマー（制限酵素切断部位およびＡＴＧ開始コドンを含む）
2003066677.tif 000265
リバースプライマー（トロンビン切断部位、ＦＬＡＧエピトープ、ＴＡＧストップコドン、制限酵素部位を含む）
2003066677.tif 000266
ＰＣＲは、鋳型として全長ヒトＥＧＦＲをコードするＤＮＡを含有するｐｃＤＮＡ−ＥＧＦＲとＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）を用い、（９４℃で３０秒、５５℃で１５秒、７５℃で１分）×２５サイクルの反応を行った。
増幅させたＤＮＡを哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐｃＤＮＡ−ｓＥＧＦＲを作製した。キット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の説明書に従ってリポフェクトアミン法によりベクタープラスミドをＬｅｃ８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３７）にトランスフェクトした。なお、Ｌｅｃ８細胞は、末端シアル酸およびガラクトース残基欠損型Ｎ−結合オリゴ糖を有する蛋白質を産生する細胞である。０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で安定なトランスフェクタントを選別し、独立したコロニーを単離した。そして、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて得られた細胞がＥＧＦＲを発現することを確認した。
（２）ＥＧＦＲの精製
１０％ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２０ｍｇ／ｌプロリンを添加したダルベッコ改変イーグル培地／Ｈａｍ′ｓ  Ｆ−１２培地（１：１）（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いてＬｅｃ８トランスフェクタントを維持した（３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター）。ＥＧＦＲを大量生産するために、１％ウシ血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２０ｍｇ／ｌプロリンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中にＬｅｃ８トランスフェクタントをまき、さらに３〜４日増殖させた。その後、培養上清を回収して１５００ｒｐｍで１５分遠心した。残りのフラスコから細胞を掻きとって回収し、別のフラスコに移して拡大培養を行った。全体のプロセスは、細胞を３箇月維持する間繰り返した。培養上清を回収し、ＥＤＴＡおよびＰＭＳＦをそれぞれ終濃度０．４ｍＭになるように加え、４℃で硫酸アンモニウム沈殿により血清グロブリンを除いたのち（培地１０００ｍＬあたり硫酸アンモニウム２８０ｇ添加）、更に培地１０００ｍＬあたり硫酸アンモニウム２８０ｇを添加することでＥＧＦＲを沈殿させた。ペレットを０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．１）（バッファーＡ）中に溶解して透析した。得られたＥＧＦＲ含有サンプルは、−８０℃で保存し、次のステップは４℃で行った。次に、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東ソー）、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東ソー）およびＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を直列に連結し、バッファーＡで平衡化したカラムにサンプルをロードした。切り離したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅカラムから、バッファーＡ中の０．０２−０．６Ｍ  ＮａＣｌ直線グラジエントにより蛋白質を溶出させた。溶出物を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ添加のバッファーＡで平衡化した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）カラムに一晩循環させることにより通した。カラムに結合した蛋白質を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ３．５）で回収し、すぐに中和した。得られたサンプルをＵＫ−１０メンブレン（東ソー）で濃縮し、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．０２Ｍ  ＮａＣｌ（バッファーＢ）で透析した後、バッファーＢで平衡化したＭｏｎｏ−Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。蛋白質は、バッファーＢ中０．０２−０．２Ｍ  ＮａＣｌの直線グラジエントで溶出した。得られたＥＧＦＲは、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、以下のようにして酵素的に脱グリコシル化した。０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．３）中の０．４ｕｎｉｔ／ｍｌのエンドグリコシダーゼＤ（生化学工業）および１ｕｎｉｔ／ｍｌのエンドグリコシダーゼＨ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、２８０ｎｍでの消光係数（０．６５）で決定した２ｍｇ／ｍｌ  ＥＧＦＲをインキュベートした（窒素またはアルゴンガス雰囲気中、３７℃で５０時間）。反応混合物をバッファーＢで１０倍に希釈した後、脱グリコシル化ＥＧＦＲ（ｄＥＧＦＲ）を、Ｍｏｎｏ−Ｑカラムにより精製した（前記Ｍｏｎｏ−Ｑカラムの操作と同様に行った）。
メチオニンの代わりにセレノメチオニンを有するＥＧＦＲを発現させるため、５０ｍｌのメチオニンの代わりの新鮮なセレノメチオニン、１％透析済仔ウシ血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび４０ｍｇ／ｌプロリンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＳｅＭｅｔ培地）を調製した。セレノメチオニン化ＥＧＦＲを産生させるため、上述と同様に細胞を集密的濃度になるまで増殖させ、続いて培地をＳｅＭｅｔ培地に交換した。１２〜２４時間のプレインキュベーション後、細胞を新鮮なＳｅＭｅｔ培地中で２〜３日間培養し、その後培地を回収した。上述した天然ｄＥＧＦＲの精製と同じ方法でセレノメチオニン化ｄＥＧＦＲを精製した。
（３）結果
ＥＧＦＲの細胞外ドメインは、既に、Ａ４３１癌細胞系、ＥＧＦＲを発現する組換え昆虫細胞系、またはＥＧＦＲを発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞から調整培地で精製されている。結晶化のために、本発明者は、組換えＬｅｃ８細胞から産生されたＥＧＦＲの細胞外ドメインを単離するための精製方法を開発した。
まず、硫酸アンモニウム分画により血清蛋白質等の混入物質の大部分を取り除いた。次に、ＦＬＡＧタグのアフィニティークロマトグラフィーにより残りの混入物質を取り除き、アニオン交換クロマトグラフィーによりサンプルの不均質性を低減させた。脱グリコシル化していない精製蛋白質を用いて小さな結晶を成長させたが、Ｘ線回折像は得られなかった。さらに分子表面の非均質性を低減させるために、精製蛋白質を、エンドグリコシダーゼＨおよびＤを用いて強力に脱グリコシル化し、続いてアニオン交換クロマトグラフィーを行って酵素と消化されたグリカンを除去した。その結果、脱グリコシル化蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断したところ、予想通り約７４ｋＤａのサイズにシフトした（図６）。ＦＬＡＧタグはトロンビンを用いて消化することができないため、ＦＬＡＧタグを付したｄＥＧＦＲを結晶化および他の実験に使用した。ｄＥＧＦＲの収量は、回収した培地３．５１あたり約１ｍｇであった。
〔実施例２〕ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の二量体の結晶化
（１）結晶化
結晶化用のｄＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体を以下の通り調製した。精製ｄＥＧＦＲ溶液を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０を使用して、２８０ｎｍにおける吸光係数（０．７９）を用いて測定した濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるまで濃縮した。等モル量の組換えｈＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ−Ｔｅｃｈ）を逆相ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥し、ｄＥＧＦＲ溶液に溶解した。結晶化は、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、３μｌの１１ｍｇ／ｍｌ複合体および３μｌのリザーバ緩衝液（１５％  ＰＥＧ４０００、１％  ＰＥＧ６０００、０．０７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、０．０７５Ｍ酢酸ナトリウム、および０．２Ｍ塩化ナトリウム）で開始して、３週間かけて２０℃で成長させた。マクロシーディング法を利用することで、結晶を１×０．２×０．２ｍｍまたはそれ以上に再現良く成長させた。本発明者は、ＸＡＦＳスペクトル測定および回折データセットの収集を大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８のＢＬ４１ＸＵで行った。なお、測定は、抗凍結剤（１８％  ＰＥＧ４０００、１．２％  ＰＥＧ６０００、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、０．０９Ｍ酢酸ナトリウム、０．２４Ｍ塩化ナトリウム、１６％トレハロースおよび１１％  ＰＥＧ４００）存在下、１００Ｋで行った。
（２）化学的架橋実験
野生型ＥＧＦＲと同様に、ＥＧＦ誘導型ｄＥＧＦＲ二量体化に関して試験するため、本発明者は化学的架橋により分析を行った（図６）。
０．８ｍｇ／ｍｌ  ｄＥＧＦＲを、０．０５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に溶解した０．０７ｍｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦおよび１ｍＭビス（スルホスクシンイミジル）基質（ＢＳ３，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）架橋剤と共にインキュベートした。反応混合物を６０分間放置した後、０．０１ｍＭグリシンを用いて架橋反応をクエンチした。架橋生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
その結果、ＥＧＦの存在下において、単一の高分子量種（二量体サイズ１５０ｋＤに相当する）が形成された。ＥＧＦの不在下では、上記のような高分子量種は検出されなかった。この結果は、ｄＥＧＦＲがＥＧＦに応答して二量体を形成したことを示している。
（３）結果（ネイティブ結晶の結晶化およびデータ収集）
結晶化条件をスクリーニングするためにスパースマトリクス法を適用した。ハンギングドロップ蒸気拡散法により、１１ｍｇ／ｍｌの等モル量のｈＥＧＦと複合体化させた受容体を用いて２０℃にてＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔ  ＩおよびＩＩ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用した。その結果、最も有望な条件（Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔ  ＩのＮｏ．２２）を、回折能を有する結晶を成長させるための条件として改善した。結晶化条件の精密化の結果、この結晶は通常は約４週間で最終的なサイズに成長した（図７）。結晶は、１°という高いモザイク度で約３．５Åまで回折した。結晶の質を改善するため、結晶を抗凍結剤に浸漬し、段階的に０℃まで冷却して氷上で静置したところ、モザイク度が約０．５°まで低減した。ネイティブ結晶は、溶媒含量が７５％であり、ａ＝ｂ＝２２０．２Åおよびｃ＝１１３．１Åで空間群Ｐ３ｌ２１に属するものである。
〔実施例３〕ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の二量体の構造解析
（１）方法
天然およびセレノメチオニン化結晶は、それぞれａ＝ｂ＝２２０．２Åおよびｃ＝１１３．１Åならびにａ＝ｂ＝２２１．２Åおよびｃ＝１１４．２Åで空間群Ｐ３ｌ２１に属するものである。非対称単位には、７５％の溶媒含量で１つの２：２複合体を含有する。結晶を、回収用緩衝液（リザーバ緩衝液の１．２倍の濃度）から、回収用緩衝液に１６％トレハロースおよび１１％ＰＥＧ４００を添加した抗凍結剤に移す際には注意深く段階的に移し替えた。液体窒素による凍結保存の前に、結晶を徐々に４℃に冷却し、２日間氷上に静置した。この処理によって結晶のモザイク度が減少した。回折データセットは、凍結保存結晶からＳＰｒｉｎｇ−８を用いてビームラインＢＬ４１ＸＵで１００Ｋにて収集した。データ処理にはプログラムＨＫＬを使用した。
尺度補正を行ったピーク波長におけるセレノメチオニン化結晶のデータセットを用いて、プログラムＤＲＥＡＲで正規化構造因子を計算し、プログラムＳｎＢをセレニウム原子の位置決定に使用した。これにより、非対称単位において予測される２０個の原子のうち１３個の一致するピークを選択した。重原子位置の精密化および初期位相の計算にはプログラムＭＬＰＨＡＲＥを使用し、溶媒平滑化にはプログラムＲＥＳＯＬＶＥを使用した。さらに、プログラムＤＭによって非結晶学的な平均化およびさらなる溶媒平滑化を行った。本発明者はこの時点で、４．０Å分解能で得られた電子密度を用いて主鎖をトレースした。モデル構築にはプログラム０を使用した。続いて、３．５Åまで位相拡張を行い、ＭＡＤ法で決定したモデルを探索モデルとしてプログラムＡＭＯＲＥを用いた分子置換解析法を行い、３．５Åまでのデータを用いて、ネイティブ結晶構造を決定した。当該構造を表１に示す。さらに、３．３Åまでのデータを用いることで、３．３Åの分解能でもネイティブ結晶構造を決定した。当該構造を表２に示す。上記モデルは、電子密度から構築し、プログラムＣＮＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｌ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｃｌ／ａｐｐｌｉ／ａｐｐｌｉ＿ｍａｎｕａｌ／ｃｎｓ＿ｍａｎｕａｌ／ｍａｉｎ／ｔｅｘｔ．ｈｔｍｌ）を用いて、剛体精密化、エネルギー最小化、制限付き温度因子精密化、およびシミュレーテッドアニーリング法による構造精密化を行った。さらにプログラムＳＩＧＭＡＡおよびプログラムＲＥＳＯＬＶＥを用いて、モデルバイアスが少なくなるように電子密度の修正を行った。電子密度図の質は、反復的なモデル構築およびデンシティーモディフィケーションによって改善された。最終的な構造精密化の後に、プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫによるラマチャンドランプロット解析では、表１に示される結晶構造における９５．９％、表２に示される結晶構造における９５．５％の残基が、最も好ましい領域とそれに加えて許容される領域に存在することを示した。プログラムＳＩＧＭＡＡおよびＰＲＯＣＨＥＣＫは、ＣＣＰ４（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｎａｇａｏｋａｕｔ．ａｃ．ｊｐ／〜ｓａｋａｍｏｔｏ／ｃｃｐ４）によりサポートされている。
表１に示される結晶構造においては、二量体における一方の受容体分子のアミノ酸残基１−２および５１３〜Ｃ末端、ならびにもう一方の受容体分子のアミノ酸残基１−４および５１３〜Ｃ末端は不規則であり、この領域は電子密度図ではほとんど特定されなかった。両方のリガンド分子における残基１−４および５０−５３の電子密度は分散している。表１の結晶構造は、１１０８個のアミノ酸と１１個の炭化水素残基を含有する。表２に示される結晶構造においては、二量体における一方の受容体分子のアミノ酸残基１、１５８−１６２、１６９−１７０、１７９−１８０、３０２−３０８および５１３〜Ｃ末端、ならびにもう一方の受容体分子のアミノ酸残基１−２、１５８−１６０、１７９、３０５−３０９および５１３〜Ｃ末端は不規則であった。両方のリガンド分子における残基１−４および５０−５３の電子密度は分散している。表２の結晶構造は、９９６個のアミノ酸、１０個の炭化水素残基および７９個の水分子を含有する。
（２）結果（セレノメチオニン化ｄＥＧＦＲ）
浸漬法によるネイティブ結晶から重原子誘導体のスクリーニングおよび、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを有するｄＥＧＦＲの発現、精製、結晶化の双方を検討した。本発明者は、浸漬法により可能性のある重原子誘導体は同定できなかったが、セレノメチオニン化結晶をネイティブ結晶と同じ方法で得た。セレノメチオニン化結晶は、溶媒含量が７５％で、ａ＝ｂ＝２２１．２Åおよびｃ＝１１４．２Åで空間群Ｐ３ｌ２１に属するものであり、４．０Åまで回折した。
〔実施例４〕ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体構造座標を用いたホモロジーモデリング
（１）モデル構造の作成
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに登録されているＥｒｂＢ２（ＥＢＲ２  ＨＵＭＡＮ）のアミノ配列情報を元に、全自動モデリングシステムＦＡＭＳ（Ｏｇａｔａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．Ｍｏｄｅｌ．，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２５８−２７２（２０００））を用いて、ＥｒｂＢ２のモデル構造を構造座標として構築した。このとき、ＦＡＭＳが主鎖構造の構築に用いる立体構造座標として、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体結晶構造解析によって得られた構造座標を使用した。また、側鎖構造の構築に用いるデータベースは、ＦＡＭＳオリジナルのものを使用した。この結果、配列番号５に示すアミノ酸配列の２４〜５４１番目のアミノ酸残基部分の構造座標を得た。
モデル構造の構造座標を決定した後、さらに分子設計支援ソフトウエアパッケージＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のモジュールであるＰｒｏｆｉｌｅｓ−３Ｄ等の蛋白質立体構造評価プログラムを用いて、構築された座標に理論上の問題がないことを検証した。このモデル構造を図１２に示す。
ＥｒｂＢ３（配列番号６）、ＥｒｂＢ４（配列番号７）、インシュリン様増殖因子−１受容体（配列番号３）、インシュリン受容体（配列番号４）についても同様の手法でモデリングを行い、モデル構造を得た。
（２）リガンド結合部位の予測
モデリング構造とＥＧＦＲ立体構造を、構造保存領域（ＳＣＲ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）でスーパーインポーズし、初期構造構築に使用したアライメント表と対比しながら、ＥＧＦＲにおけるＥＧＦと相互作用するアミノ酸と、立体的座標としてほぼ同じ位置に存在するモデリング構造中のアミノ酸残基を抽出した。これを、相互作用するアミノ酸残基とした。結果を図１１に示す。
〔実施例５〕ファルマコフォアの作成
複合体情報から抽出したアミノ酸残基の情報を利用すれば、ファルマコフォアの１例は次のように規定できる。ファルマコフォア形成に特に有用であると考えられる相互作用として以下の相互作用を例示する（表４）。
2003066677.tif 000267
この相互作用部位は、極めて隣接している上に、３点の相互作用部位を有し、しかも、ドメインＩとドメインＩＩＩの両ドメインと相互作用可能な部位である。従って、ＥＧＦＲアンタゴニストを探索できるだけでなく、アゴニストをも探索可能なファルマコフォアとして規定できる可能性が高い。具体的なファルマコフォアの例としては、Ａｒｇ４５、Ａｓｐ４６、Ｌｅｕ４７のトリペプタイドが、ＥＧＦＲ結合時に取っている活性コンフォメーションによって規定される。
次に、ＥＧＦの構造をＣａｔａｌｙｓｔなどの市販のバーチャルスクリーニング用のソフトパッケージに読み込み、相互作用している原子もしくは官能基を、Ｃａｔａｌｙｓｔのファンクションマッピング機能を用いて、以下の表５に示すような、適切な特性球に変換しファルマコフォアを発生させた。
2003066677.tif 000268
当該ファルマコフォアは、以下の３つの特性球の座標により規定される。
特性球１；Ｘ座標−５．６２３、Ｙ座標６．２５９、Ｚ座標０．８５３に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域、
特性球２；Ｘ座標−１２．６５６、Ｙ座標３．３６３、Ｚ座標−２．９３４に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域、
特性球３；Ｘ座標−１１．５７６、Ｙ座標９．５４６、Ｚ座標−２．１３５に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−１３．８６、Ｙ座標８．５３２、Ｚ座標−３．７９２に中心を有する半径２．０Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域。
当該ファルマコフォアを図１３に示す。
〔実施例６〕ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標・ファルマコフォアを用いたスクリーニング方法
（１）ＤＯＣＫを利用したｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
（１−１）検索サイトの特定
ＥＧＦ／ＥＧＦＲ共結晶構造解析結果から得られた表１の構造座標を、ソフトウエアＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて三次元構造を視覚的に表示させた。ＥＧＦ（リガンド）、ＥＧＦＲ（受容体）のｃｏｎｏｌｌｙ  ｓｕｒｆａｃｅ図を図１４に示す。
図１４を観察した結果、ＥＧＦ上で凸状に突出している残基のうち、図中丸印で示す残基は、ＥＧＦＲ上のポケットに対応していることが分かった。この部分は、有力なリガンド結合サイト候補と考えられる。
そこで、上記情報を元に、ＥＧＦＲ上の３つの部位（サイト１，サイト２，サイト３）をリガンド結合サイトと仮定し、各サイトと相互作用すると考えられるＥＧＦアミノ酸残基上の主要な原子位置にＤＯＣＫ  ＳＰＨＥＲＥを設定した。ドッキングスタディに用いたサイトを表６に示す。
2003066677.tif 000269
（１−２）化合物データベースの構築
検索対象となる化合物データベースは、ＡＣＤ（Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ；ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に登録されている化合物情報を用いた。まず、ＡＣＤ化合物情報をｓｄファイル形式でｅｘｐｏｒｔし、塩の除去、ＣＯＲＩＮＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ＧｍｂＨ）による化合物構造の３次元化、ＤＯＣＫ付属のアクセサリーによるｍｏｌ２ファイルへの変換および電荷割付け等の処理を施し、ＤＯＣＫ用化合物データベースを作成した（１７０，８５５化合物）。更に、上記手法により構築した化合物データベースを酸性官能基を含む化合物群（ａｃｄ＿ａ：１９，２７０化合物）と含まない化合物群（ａｃｄ＿ｂ：１５１，５８５化合物）に分割し、それぞれ独立に解析を実施することにした。  （注：ＤＯＣＫはしばしば、酸性官能基のスコアリングを不当に高く見積もる傾向があるため、今回の検討では上記のような処理を行い、独立して解析を行った。）
（１−３）ドッキングスタディ実施
各サイトに関して、（１−２）で作成した化合物データベースに対しＤＯＣＫ４．０．１を実行した。ドッキングはリガンド配座を計算時に発生させる方式（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ）で行った。
得られた結果をドッキングスコア（リガンド−蛋白の結合エネルギーを評価するための関数、ドッキングスコアが低いほど蛋白質と良くフィットしている）の低い順にソートし、上位５０００化合物を抽出した。このうち、重要残基に近接した立体配座を有する化合物を自作スクリプト（ＥＧＦＲの重要残基−リガンド間の距離を計算するスクリプト）により抽出の後（表７中▲１▼）、目視によって、各重要残基と適切な相互作用が起こり得る立体配座を有する化合物を選出した（表７中▲２▼）。更に、医薬品として相応しくない構造を有する化合物や、活性測定時に擬陽性を示す可能性が高い化合物（色素類など）を除去し、最終的なヒット化合物を得た（表７中▲３▼）（ａ）はａｃｄ＿ａ、（ｂ）はａｃｄ＿ｂを意味する。
2003066677.tif 000270
（１−４）ドッキングスタディヒット化合物のクラスター解析
（１−３）により選出したヒット化合物には、互いに構造（骨格）が類似している化合物群が含まれている。これらの化合物群は、互いにドッキングスコアやドッキングモードまで類似している可能性が高く、単純にドッキングスコアの上位順からアッセイ候補化合物を選択すると、構造多様性に乏しいセットとなる恐れが高い。
構造多様性が乏しいと、安全性・ＡＤＭＥ（吸収・分布・代謝・排泄）プロファイルまで類似してしまう可能性が高いが、現状の技術では安全性・ＡＤＭＥプロファイルのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測は困難であり、このようなセットをアッセイ候補化合物とした場合、医薬品開発時にしばしば発生する、予期せぬ副作用によるドロップアウトのリスクに対応できない可能性が高い。
そこで、（１−３）のヒット化合物それぞれに対して、構造類似性に着目したクラスター解析を実施し、幾つかの構造類似グループに分類することで、構造多様性を確保することが可能となる（下表８，９参照）。生化学的アッセイには各グループの代表化合物を１化合物選出して供すればよい。
なお、各ヒットにおける、最適分割グループ数の決定には、ｏｐｔｃｌｕｓ（Ｂａｒｎａｒｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．）を用い、クラスター解析にはＤａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｉｎｃ．）を用いた。
2003066677.tif 000271
2003066677.tif 000272
（２）ＤＯＣＫ、ＡＵＴＯＤＯＣＫを利用したｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
（２−１）低分子化合物ライブラリ
低分子化合物データベースＡＣＤから、１エントリ複数分子を含むものは１分子ごとに分割した上で重複を除いたライブラリを作成した（計３０７４８１分子）。次いで、「Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ５」に基づいた絞込みを行った。ここで用いた絞込み条件は以下のとおりである。
１）分子量  １００以上、５００以下
２）計算ＬＯＧＰ値（ｏ／ｗ）（ＸＬＯＧＰ−１アルゴリズム使用）５以下
３）アクセプター原子数（化合物中に含まれるＮの数とＯの数）  １０以下
４）ドナー原子数（化合物中に含まれるＮＨの数とＯＨの数）５以下
更にドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
１）回転可能な単結合数が２１以上のもの
２）ラジカルを含むもの
３）Ｈ，Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｆ，Ｓ，Ｐ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ以外の元素を含むもの
この絞込み操作の結果、２２２０９６分子からなる低分子化合物セットを得た。
（２−２）結合部位予測
（２−２−１）ドメイン定義
ＥＧＦＲのチェーンＡを３つのドメイン（ドメインＩ：Ｇｌｕ２□Ｌｙｓ１６５、ドメインＩＩ：Ｃｙｓ１６６□Ｖａｌ３１２、ドメインＩＩＩ：Ｃｙｓ３１３□Ｖａｌ５１２）に分割した。ドメインＩおよびＩＩＩにはＥＧＦとＥＧＦＲとの相互作用面が、ドメインＩＩにはＥＧＦＲを２量体化するための相互作用面が含まれる。
（２−２−２）サイト定義
ＥＧＦとＥＧＦＲは３つのサイトで分子間相互作用を形成している。ＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｇｌｎ１６、Ｇｌｙ１８、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９、Ｇｌｕ９０、Ｌｅｕ９８とＥＧＦのＭｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ｌｅｕ２６、Ｌｙｓ２８、Ｃｙｓ３１、Ａｓｎ３２、Ｃｙｓ３３によって形成される相互作用面をサイト１、ＥＧＦＲのＶａｌ３５０、Ａｓｐ３５５、Ｐｈｅ３５７、ＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ａｒｇ４１によって形成される相互作用面をサイト２、ＥＧＦＲのＬｅｕ３８２、Ｇｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２、Ｉｌｅ４３８、ＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５、Ｌｅｕ４７によって形成される相互作用面をサイト３と定義する。サイト１はドメインＩに、サイト２および３はドメインＩＩＩに含まれる。ここでは、それぞれのサイトについてその分子間相互作用を阻害する低分子化合物をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングにより探索する。
（２−２−３）結合部位予測
ドッキングプログラムスイートＤｏｃｋに含まれるプログラムＳｐｈｇｅｎを用いて、上記３つのサイトそれぞれについて結合部位予測を行った。
Ｓｐｈｇｅｎは、分子表面にその幾何学的形状に応じた半径を持つ球体（スフィア）を生成する。複数の重なり合うスフィアは１つのクラスタにまとめられ、最終的には相互に独立した複数のクラスタが生成される。これらクラスタによって占められる領域が予測された結合部位となる。この計算はＳｐｈｇｅｎのデフォルトの設定値を用いて行った。
サイト１については、このサイト近傍のクラスタのうち、ＥＧＦＲのＬｅｕ１４、Ｔｙｒ４５、Ｌｅｕ６９、Ｌｅｕ９８およびＥＧＦのＭｅｔ２１、Ｉｌｅ２３、Ｌｅｕ２６から構成される疎水性環境、ならびにＥＧＦＲ側残基Ｇｌｕ９０とＥＧＦ側残基Ｌｙｓ２８を繋ぐソルトブリッジに近接するものを選択した。このクラスタに含まれるスフィアのうち、疎水性ポケットおよびその周辺部に配置されたもの以外を削除するような整形を行ったものをサイト１の予測結合部位として選択した。
サイト２については近傍のクラスタに含まれるスフィアのうち、分子間相互作用を形成しているＥＧＦＲのＶａｌ３５０、Ａｓｐ３５５、Ｐｈｅ３５７、ＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ａｒｇ４１からスフィアの中心までの距離が４Å以内にあるものを選択した。
サイト３についても同様に、近傍のクラスタに含まれるスフィアのうち、分子間相互作用を形成しているＥＧＦＲのＧｌｎ３８４、Ｐｈｅ４１２、Ｉｌｅ４３８、ＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５、Ｌｅｕ４７からスフィアの中心までの距離が４．４Å以内にあるものを選択した。
（２−３）ドッキングシミュレーション条件
ソフトウェアＤｏｃｋ４．０を用いて、（２−２）で定義した結合部位それぞれに対して、（２−１）で作成したライブラリに含まれる２２２０９６分子の低分子化合物すべてについてドッキングシミュレーションを行った（１次スクリーニング）。計算精度を高めるため、Ｄｏｃｋ設定パラメータのうち、以下のパラメータをデフォルト値から変更した。
ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ＿ｐｅｒ＿ｃｙｃｌｅ＝３０（デフォルト２５）
ｍａｘｉｍｕｍ＿ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｓ＝１０００（デフォルト５００）
サイト１については上位１０３４７分子、サイト２については上位１６９２９分子、サイト３については上位１０５００分子について、ＡｕｔｏＤｏｃｋ３．０．５を用いてより詳細なドッキングを行った（２次スクリーニング）。ここでも、計算精度を高めるため、以下のパラメータを変更した。
ｇａ＿ｎｕｍ＿ｅｖａｌｓ＝１５０００００（デフォルト２５００００）
（２−４）ドッキングシミュレーション結果
ＡｕｔｏＤｏｃｋによる２次スクリーニングの結果得られた低分子化合物のドッキング構造について、サイト１についてはＥＧＦのＩｌｅ２３、Ｌｅｕ２６、Ｌｙｓ２８、サイト２についてはＥＧＦのＴｙｒ１３、Ｌｅｕ１５、Ａｒｇ４１、サイト３についてはＥＧＦのＧｌｎ４３、Ａｒｇ４５、Ｌｅｕ４７、およびそれぞれのサイトにおいて１次スクリーニングで用いたスフィアの中心からの距離を計算した。最短距離が４Å以上離れている化合物は、注目している結合サイトからはずれた位置に結合することが予想されるため除外した。次いで、低分子化合物を、ＡｕｔｏＤｏｃｋのスコアの順にソートし、サイト１については上位２５００分子、サイト２については上位８０８分子、サイト３については上位８７９分子を蛋白質と結合するリガンド候補化合物とした。次いで、これらの化合物を、蛋白質との相互作用様式に基づいて分類した。ここでは、蛋白質と化合物の重原子（水素以外の原子）間の距離を計算し、化合物と４Å以内で接している残基のうち、静電相互作用している残基を「重要相互作用残基」、それ以外の残基を「相互作用残基」とし、蛋白質の１次配列上で、「相互作用残基」および「重要相互作用残基」の出現パターンが類似している化合物を１つのクラスタに分類した。ＥＧＦと相互作用しているＥＧＦＲの残基と相互作用する化合物の方が阻害活性が高いと期待される。従って、サイト１についてはクラスタ２（３１９化合物）、サイト２についてはクラスタ２（１８８化合物）、サイト３については、クラスタ５、６、１２を除くクラスタ（８７１化合物）に含まれる化合物は阻害活性が高いと考えられた。
（２−５）ドッキングスタディヒット化合物のクラスター解析
（１−４）に準じた方法によって、（２−４）におけるヒット化合物に対してクラスター解析を行った。結果を表１０に示す。
2003066677.tif 000273
（３）Ｃａｔａｌｙｓｔを利用したｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
（３−１）検索サイトの特定（Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓの作成）
共結晶構造解析結果から得られた表１の構造座標を、ソフトウエアＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて三次元構造を視覚的に表示させ、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ相互作用部位を目視により観察した結果から、重要と考えられる薬理作用団パターンを、リガンドであるＥＧＦから抽出した。以下に抽出し、検索に利用した薬理作用団仮説を示す。なお、形状を考慮に入れたＣａｔａｌｙｓｔ仮説は最低３点の薬理作用団が要求されるため、「疎水性ポケットに配置し、かつ、もう２点以上の相互作用部位を有する」薬理作用団パターンから仮説を作成した。特性球の設定は、抽出した部分構造をＣａｔａｌｙｓｔなどの市販のバーチャルスクリーニング用のソフトパッケージに読み込み、相互作用している原子もしくは官能基を、Ｃａｔａｌｙｓｔのファンクションマッピング機能を用いて、適切な特性球に変換しファルマコフォアを発生させた。さらに、抽出した薬理作用団抽出に利用したＥＧＦの部分構造を、対応する薬理作用団にフィットさせ、Ｃａｔａｌｙｓｔの「Ｃｏｎｖｅｒｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｏ  Ｓｈａｐｅ」機能によってこのＥＧＦ部分構造を分子形状仮説（Ｓｈａｐｅ）に変換し、この仮説を元の薬理作用団と結合することによって、３次元分子形状の類似性が加味された薬理作用団仮説を構築した。
なお、分子形状の発生は、デフォルトの方法で実施した。また、残基同士が一次構造上大きく離れている場合（Ｌｅｕ１５とＡｒｇ４１など）は、それぞれの残基の最も近い部分で擬似的に結合を発生させた後に形状構築を行った。
（ａ）Ｌｅｕ２６，Ａｓｐ２７，Ｌｙｓ２８（ｓｉｔｅ１）
特性球１（Ｌｅｕ２６側鎖）；Ｘ座標−５．６６９、Ｙ座標−１．６３０、Ｚ座標−１．２００に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域、
特性球２（Ａｓｐ２７側鎖のカルボキシル基）；Ｘ座標−４．５４７、Ｙ座標６．３０４、Ｚ座標４．０６０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域、
特性球３（Ｌｙｓ２８側鎖のアミノ基）；Ｘ座標−０．８４２、Ｙ座標２．９３８、Ｚ座標０．１６９に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域。
（ｂ）Ｉｌｅ３８，Ｇｌｙ３９，Ｇｌｕ４０，Ａｒｇ４１（ｓｉｔｅ２）
特性球１（Ａｒｇ４１側鎖のグアニジル基）；Ｘ座標４．５２７、Ｙ座標６．１１９、Ｚ座標−０．７２５に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域、
特性球２（Ｇｌｕ４０側鎖のカルボキシル基）；Ｘ座標０．４５９、Ｙ座標−１．８６１、Ｚ座標１．４１０に中心を有する半径１．５Åの陰イオン性領域、
特性球３（Ｇｌｙ３９主鎖のＮＨ基）；Ｘ座標−６．５３４、Ｙ座標３．４９６、Ｚ座標−０．２４７に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．０４５、Ｙ座標１．６１７、Ｚ座標１．５３８に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域、
特性球４（Ｉｌｅ３８側鎖）；Ｘ座標−１１．０２４、Ｙ座標２．６６７、Ｚ座標０．１２８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域。
（ｃ）Ｌｅｕ１５，Ａｒｇ４１，Ｔｙｒ４４（ｓｉｔｅ２）
特性球１（Ｔｙｒ４４側鎖）；Ｘ座標−５．４１６、Ｙ座標７．５４２、Ｚ座標−２．１８４に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標−８．１８５、Ｙ座標６．５８７、Ｚ座標−２．８２７に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域、
特性球２（Ａｒｇ４１側鎖のグアニジル基）；Ｘ座標−１６．１１９、Ｙ座標９．３２６、Ｚ座標−０．３４１に中心を有する半径１．５Åの陽イオン性領域、
特性球３（Ｌｅｕ１５側鎖）；Ｘ座標−１４．８４６、Ｙ座標５．８０６、Ｚ座標−１．６７６に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域。
（ｄ）Ｔｙｒ４４，Ａｒｇ４５，Ｌｅｕ４７（ｓｉｔｅ３）
特性球１（Ｔｙｒ４４側鎖）；Ｘ座標６．５９５、Ｙ座標−０．９９６、Ｚ座標−１．６６３に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標７．６２５、Ｙ座標１．４８２、Ｚ座標−０．３２２に中心を有する半径１．５Åの芳香族性領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される芳香族性領域、
特性球２（Ａｒｇ４５主鎖のＮＨ）；Ｘ座標１．８５８、Ｙ座標１．０４６、Ｚ座標１．３７０に中心を有する半径１．５Åの水素結合供与体領域Ｒ（ルート）を開始点とし、Ｘ座標２．０５１、Ｙ座標２．６２６、Ｚ座標−１．１７２に中心を有する半径１．７Åの水素結合供与体領域Ｔ（ターミナル）を終点とするベクトルにより定義される水素結合供与体領域、
特性球３（Ｌｅｕ４７側鎖）；Ｘ座標−１．９３６、Ｙ座標０．０２１、Ｚ座標−３．２７８に中心を有する半径１．５Åの疎水性領域。
ここで、ルートはベクトルの開始点と、ターミナルはベクトルの終点とそれぞれ定義される。芳香属性領域における環の平面は、ＲからＴへのベクトルを垂線としてもつ平面として定義される。（ａ）〜（ｄ）に示される特性球の配置をグラフィクス化したものを、それぞれ図１５〜図１８に示す。
（３−２）化合物データベースの構築
検索対象となる化合物データベースは、ＡＣＤ（Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ；ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に登録されている化合物情報を用いた。まず、ＡＣＤ化合物情報をｓｄファイル形式でｅｘｐｏｒｔし、専用のデータベース形式に変換する（ｃａｔＤＢモジュール，Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）ことにより、Ｃａｔａｌｙｓｔ用データベース（２３１，７７７化合物）の構築を行った。
（３−３）Ｃａｔａｌｙｓｔ実行
（３−２）で構築した化合物データベースに対し、（３−１）で示した４個（ａ〜ｄ）のファルマコフォア（薬理作用団）および実施例５で作成したファルマコフォア（ｅと呼ぶ）に合致する化合物を、Ｃａｔａｌｙｓｔ４．６（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を用いて検索した（表１１中▲１▼）。検索の結果、それぞれの薬理作用団に含まれる全ての仮説球にマッチする化合物が選出された。更に、医薬品として相応しくない構造を有する化合物や、活性測定時に擬陽性を示す可能性が高い化合物（色素類など）を除去し、最終的なヒット化合物を得た（表１１中▲２▼）
2003066677.tif 000274
〔実施例７〕ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合阻害アッセイ
（１）Ｅｕｒｏｐｉｕｍラベルリガンドの作製
ＥＧＦ／ＥＧＦＲの複合体結晶構造を解析したところ、リガンド（ＥＧＦ）のＮ末端部位であるＡｓｎがＥＧＦＲとの直接的相互作用には大きく関与していないと判断されたため、Ｎ末端をユーロピウム（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ）キレート化合物（ＤＥＬＦＩＡ  Ｅｕ−Ｎ１，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で化学修飾する事とした。ユーロピウム標識ＥＧＦは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓに合成委託し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．８）に４８μｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解したユーロピウム標識ＥＧＦ（以下、Ｅｕ−ＥＧＦと表記）を１．５ｍｇ得た。
（２）Ａ４３１細胞を用いたＥＧＦ結合試験および抗体による結合阻害
Ａ４３１細胞（ヒト扁平上皮癌細胞，ＡＴＣＣより購入）は、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）に非働化ＦＢＳ（ＪＲＨ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）およびＡｍｐｈｏｔｅｌｉｃｉｎＢ（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ最終濃度１０ｖｏｌ％、５０Ｕ／ｍＬ−５０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬとなるように添加した培地（以下培地と表記）を用いて継代培養したものを使用した。培地に懸濁したＡ４３１細胞を１０，０００ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロタイタープレート（黒色、ＣＯＳＴＡＲ）に播種した後、これをＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で一晩前培養した。ウェル内の培地を完全に除去した後、１３８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、７５μｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡおよび０．２ｖｏｌ％ＢＳＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８、以下Ｂｕｆｆｅｒと表記）で１回洗浄し、Ｂｕｆｆｅｒを４９μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次いでＤＭＳＯを１μＬ／ｗｅｌｌで添加し、Ｂｕｆｆｅｒにて各種濃度に希釈したＥｕ−ＥＧＦを５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で１時間インキュベートし、氷冷したＢｕｆｆｅｒを用いて２００μＬ／ｗｅｌｌで５回洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温でさらに３０分間インキュベートした後、プレートリーダー（ＡＲＶＯ−ｓｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて時間分解蛍光を測定した。励起波長および測定波長はそれぞれ３４０ｎｍ、６１５ｎｍを使用した。
実験の結果、Ｅｕ−ＥＧＦの濃度依存的に蛍光の増加が認められ、最終濃度３０ｎｍｏｌ／Ｌ以上においてほぼ結合の飽和が認められた（図１９）。なお、非特異結合はＥｕ−ＥＧＦの添加前に非標識ＥＧＦを最終濃度５０μｍｏｌ／Ｌとなるよう加えたウェルにおける蛍光値で示され、特異結合は各リガンド濃度において測定値から非特異結合の測定値を差し引く事により算出した。なお、遊離リガンド濃度および特異結合の値をもとにＳｃａｔｃｈａｒｄ  ｐｌｏｔを作成したところ、近似直線の傾きからＫｄ＝２．２ｎｍｏｌ／Ｌと算出された。また上記試験系において各種濃度に調製した抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ａｂ−３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）を添加し、Ｅｕ−ＥＧＦを最終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように添加したところ、抗体濃度依存的に蛍光が減少し、抗体によるＥＧＦ結合阻害が確認された（図２０）。以上の結果から、本アッセイ系を用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ結合阻害物質のスクリーニングが可能であると考えられた。
（３）コンピュータースクリーングによって選抜した化合物群のスクリーニング  実施例６の２）のサイト１のグループの代表化合物、実施例６の２）のサイト２のグループの代表化合物および実施例６の１）のサイト３のグループの代表化合物を本アッセイに供した。培地に懸濁したＡ４３１細胞を１０，０００ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう９６穴マイクロタイタープレート（黒色、ＣＯＳＴＡＲ）に播種した後、これをＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で一晩前培養した。ウェル内の培地を完全に除去した後、Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、次いでＢｕｆｆｅｒを４９μＬ／ｗｅｌｌで添加した。検体（被験化合物）は３−８ｍｇを秤量し、これにＤＭＳＯを添加し、検体濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。検体を１μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で５分間インキュベートした後にＢｕｆｆｅｒにて最終濃度５ｎｍｏｌ／Ｌとなるように希釈したＥｕ−ＥＧＦを５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で１時間インキュベートし、氷冷したＢｕｆｆｅｒを用いて２００μＬ／ｗｅｌｌで５回洗浄後、ＤＥＬＦＩＡ増強試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で３０分間インキュベートした後、プレートリーダー（ＡＲＶＯ−ｓｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて時間分解蛍光を測定した。励起波長および測定波長はそれぞれ３４０ｎｍ、６１５ｎｍを使用した。アッセイは二連にて行ない、測定値の平均を用いてデータ処理した。なおデータ処理はＤＭＳＯおよびスクリーニング検体添加群の測定値から非特異結合の測定値を差し引き、ＤＭＳＯ添加群の特異的リガンド結合を１００％、非特異結合を０％とした時の検体添加群における特異的リガンド結合率（％）を算出し、これを１００から減ずることにより阻害活性（％）を算出した。さらに、以下の方法により擬陽性検体を除いた。すなわちＢｕｆｆｅｒでＤＭＳＯおよび各検体を希釈し、Ａ４３１細胞と室温で１時間インキュベートした後に５回洗浄を行い、Ｅｕ−ＥＧＦおよびＤＥＬＦＩＡ増強試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加、室温で３０分間インキュベートした後、プレートリーダー（ＡＲＶＯ−ｓｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて時間分解蛍光を測定した。ＤＭＳＯ添加群の測定値と比較して明らかに蛍光が減少している化合物群を擬陽性検体として除き、それ以外の化合物群を活性検体とした。活性検体については検体最終濃度１，３，１０，３０μｇ／ｍＬとなるように添加し、阻害活性を算出した後に非線形最小二乗法によりＩＣ５０値を算出した。
（４）結果
サイト１の代表化合物からは、ＩＣ５０＝８．０μｇ／ｍＬを示す化合物１０−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−プロピル］−２−トリフルオロメチル−１０Ｈ−フェノチアジン二塩酸塩（ＳＩＧＭＡより購入、カタログ番号Ｔ８５１６）が得られた。サイト２の代表化合物からは、ＩＣ５０＝１３．０μｇ／ｍＬを示す化合物８−ヘキシルスルファニル−３−メチル−７−プロピル−３，７−ジヒドロ−プリン−２，６−ジオン（ＳＡＬＯＲより購入、カタログ番号Ｒ３３，６８３−１）が得られた。サイト３の代表化合物からは、ＩＣ５０＝２３．８μｇ／ｍＬを示す化合物２−［２−（３−エチル−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−２−オキソ−エチルスルファニル］−ニコチン酸（ＭＡＹＢＲＩＤＧＥより購入、カタログ番号ＲＨ００８６６）が得られた。
〔実施例８〕ＥＧＦＲリン酸化を指標としたＥＧＦＲアゴニスト活性／アンタゴニスト活性の評価
ＥＧＦＲはリガンドが結合し活性化すると、細胞内領域がリン酸化される。このリン酸化はリン酸化受容体特異的抗体により検出可能である。Ａ４３１細胞を１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）を用いて５％ＣＯ２，３７℃の環境下にて１日間培養（ＢＮＲ−１１０Ｍ，エスペック社製）した後、血清を除いた培地にてさらに１日間培養した。アゴニスト活性測定を行う場合は、検体を１０μｇ／ｍＬの濃度で含んだ培地を添加して１０分間放置した。また、アンタゴニスト活性測定を行う場合は検体を１０または１００μｇ／ｍＬの濃度で含んだ培地を添加して２０分間放置した後、終濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社製）を添加し、さらに１０分間放置した。また、コントロールとしてＥＧＦ処理のみを行った細胞および未処理の細胞を用意した。培地を除去し、冷却したリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ，Ｓｉｇｍａ社製）にて細胞を洗浄した後、熱した細胞溶解バッファー（２０％グリセロール（和光純薬製），２％ＳＤＳ（シグマ社製），５％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（シグマ社製），０．０２５ｍｇ／ｍＬ  Ｂｒｏｍｏ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ（シグマ社製）を含む１２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス（和光純薬製）−塩酸（和光純薬製）緩衝液（ｐＨ６．８））を添加して細胞溶解液を得た。得られた細胞溶解液を７．５％のポリアクリルアミドゲル（ｅ−パジェル、アトー社製）にアプライし、トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（バイオ・ラッド社製）を用いてゲル１枚あたり３０ｍＡの条件で電気泳動により分離（ＡＥ−６４００、アトー社製）した後，セミドライ式ブロッティング装置（ＡＥ−６６７５、アトー社製）を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（クリアブロットメンブレン−Ｐ、アトー社製）に２００ｍＡ、１時間の条件で転写した。ＰＶＤＦ膜を５％のスキムミルク（和光純薬製）を含むＰＢＳで室温、１時間の条件でブロッキングした後、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（バイオ・ラッド社製）を含むＰＢＳにて１０００倍希釈した活性化ＥＧＦ受容体に対する一次抗体（抗ヒト活性化ＥＧＦＲ抗体・マウスＩｇＧ１：ＢＤトランスダクション・ラボラトリーズ社製）および西洋わさび過酸化酵素によって標識された二次抗体（抗マウス  イムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体／パーオキシダーゼ標識：ダコ社製）と３７℃で１時間ずつ反応させ、化学発光法（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてＥＧＦの作用によって活性化されたＥＧＦ受容体を発光・蛍光撮影出力装置（ＡＥ−６９６２Ｎ、ＡＴＴＯ社製）を利用して検出した。１０μｇ／ｍＬの１０−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−プロピル］−２−トリフルオロメチル−１０Ｈ−フェノチアジン二塩酸塩、１０μｇ／ｍＬの８−ヘキシルスルファニル−３−メチル−７−プロピル−３，７−ジヒドロ−プリン−２，６−ジオンおよび１００μｇ／ｍＬの２−［２−（３−エチル−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−２−オキソ−エチルスルファニル］−ニコチン酸はＥＧＦ��よるＡ４３１細胞のＥＧＦ受容体活性化を阻害した（図２１）。
〔実施例９〕ＥＧＦＲ変異体の作製
（１）方法
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ登録商標部位特異的突然変異誘発キットを製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従って用いることにより、部位特異的突然変異誘発法を行った。ＥＧＦＲ配列中の突然変異は、ＤＮＡ配列解析により確認した。ＣＨＯ細胞は、１０％仔ウシ血清を添加した最少必須培地α中で培養し、ＦｕＧＥＮＥ６法を製造業者（Ｒｏｃｈｅ）の推奨に従って用いて、野生型又は変異型受容体を含む発現ベクターでトランスフェクトした。続いて、一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を２４時間にわたり培養し、このＣＨＯ細胞は、特記しない限り、２４時間にわたり飢餓状態に付すか飢餓状態にしないで次の分析に用い、続いてヒトＥＧＦで５分間刺激した。
一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＥＧＦＲの発現及び下流のＥＲＫの活性化は、Ｋｉｍら（Ｋｉｍ，Ｊ．−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：２３２３−２３２９，２００２）に従って測定した。また、抗ＥＧＦＲポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン−ｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼＥ１０モノクローナル抗体、及び抗ＭＡＰキナーゼポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてイムノブロット分析を行った。
続いて、野生型及びＥＲＫ活性化欠損突然変異体について、一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上におけるＥＧＦＲの発現を、以下に記載する２つの異なる方法により確認した。第１の方法では、細胞表層タンパク質をビオチン化し、Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙら（Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：６８４５−６８５７，１９９９）に記載の方法に従ってビオチン化ＥＧＦＲを検出した。第２の方法では、一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞の細胞表層ＥＧＦＲを抗ＥＧＦＲ  ５２８モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で標識し、続いてＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を製造業者の指示に従って用いて分析した。
ＥＧＦにより誘導された自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を検出するために、一過性トランスフェクト細胞を１２時間培養し、血清不含培地中で３時間にわたり飢餓状態にした。ＥＧＦＲ自己リン酸化は、既に報告されているＳａｔｏらの方法により調べた（Ｓａｔｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１２７：６５−７２，２０００）。ＥＧＦ結合アッセイに関しては、一過性トランスフェクト細胞をフィブロネクチン被覆２４ウエルプレート中で２４時間維持し、その後血清不含培地中で２４時間にわたり飢餓状態にした。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２ｎＭ  １２５Ｉ標識ＥＧＦと共に１時間インキュベートした。１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳを用いて３回洗浄することにより遊離１２５Ｉ標識ＥＧＦを除去した。続いて細胞を０．５ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ中に溶解し、放射活性をγカウンターを用いて測定した。
（２）結果
ＥＧＦＲの相互作用領域残基（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）に突然変異誘発を行い、全長ＥＧＦＲの活性化に対する作用を検討した。最初に、ＣＨＯ細胞において発現されたＥＧＦＲの下流シグナル伝達経路を調べるために、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ；ＥＲＫ）のＥＧＦ依存性リン酸化をアッセイした（図２２Ａ）。疎水性受容体の二量体化相互作用領域は、一方の受容体のＴｙｒ２５１が、もう一方の受容体のＡｒｇ２８５と水素結合しており、またＰｈｅ２６３と疎水性相互作用している。Ａｒｇ２８５をＴｈｒで置換する（Ｒ２８５Ｙ）ことによってほとんど影響はないが、Ａｒｇ２８５をＳｅｒで置換した（Ｒ２８５Ｓ）場合には、生物活性が低減した（図２２Ａ）。
Ｔｙｒ２５１またはＰｈｅ２６３のＡｌａへの置換は活性にほとんど影響を与えないが、Ｒ２８５Ｓ突然変異とＹ２５１ＡまたはＦ２６３Ａとを組み合わせた場合にはほぼ完全な活性の消失を引き起こした。Ｒ２８５Ｓ突然変異とＹ２５１ＡまたはＦ２６３Ａとを組み合わせた変異体は、ビオチン化分析（図２２Ｂ）及びＦＡＣＳ解析（データは示さない）のいずれの分析においても、野生型ＥＧＦＲとほぼ同程度に細胞表面上に発現されることが確認された。これらの非シグナル伝達形態はまた、ＥＧＦＲ自己リン酸化能を示さない（図２２Ｃ）。結果として、結晶構造において見出された受容体二量体化相互作用領域を突然変異誘発法により確証することができた。２つの二量体化相互作用領域の突然変異体は、［１２５Ｉ］ＥＧＦ結合アッセイにおいてＥＧＦに対して非常に低いアフィニティーを示している（図２２Ｄ）。このことは、高いアフィニティーによるＥＧＦの結合がＥＧＦＲの二量体化と関連していることを示唆している。
さらに、ＥＧＦＲのドメインＩＩとドメインＩＩＩとの間の細胞内相互作用もまた突然変異誘発法を利用して試験した。このドメイン間相互作用領域においては、ドメインＩＩのＧｌｕ２９３とドメインＩＩＩのＡｒｇ４０５とが互いに塩橋を形成している。Ａｒｇ４０５のＧｌｕによる置換によって、ＥＧＦ依存性ＥＲＫリン酸化、自己リン酸化、及び高アフィニティーによるＥＧＦ結合が破壊されていることが示された（図２２）。従って、ドメイン間相互作用は、受容体の活性化に重要である。
産業上の利用可能性
本発明により、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の二量体の結晶構造およびその立体構造が提供される。本発明の複合体共結晶構造が与える構造座標は、ＥＧＦＲアゴニストやアンタゴニストのファルマコフォア抽出、複合体構造座標の全部または一部を用いたコンピュータスクリーニング、ＥＧＦＲアゴニストやアンタゴニストの分子設計（活性上昇、選択性付与など）、産業上有用なＥＧＦまたはＥＧＦＲ変異体設計、ＥＧＦ中和抗体・アゴニスト抗体の作製、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ結晶構造を利用した分子置換法、インシュリンレセプター等ＥＧＦＲと同様のフォールドを有すると考えられる蛋白質のモデリングとその構造の活用（コンピュータスクリーニング、分子設計、抗体設計、改変体設計、分子置換法など）などにおいて有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１ａ〜ｃは、ＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体の二量体の結晶構造および３．５□分解能で作成した電子密度図の一部を示す図である。図１ａは、二回垂直軸方向に向けられたリボンダイアグラムである。ドメインＩＶの大部分は不規則である。図１ｂは、図１ａの上面図である。二回軸を中心に示す。図１ｃは、ドメインＩの一部分の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図の立体図である。
図２ａおよびｂは、ＥＧＦＲとＥＧＦとの相互作用を示す図である。図２ａは、ＥＧＦＲおよびＥＧＦのリボン図上に種々の相互作用部位をマッピングした。相互作用領域における３つの結合部位を示す。図２ｂは、部位１における相互作用領域の立体図である。相互作用する残基の側鎖のみを示す。波線は水素結合または塩橋を表す。
図３ａおよびｂは、ＥＧＦＲとＥＧＦとの相互作用を示す図である（図２ａおよびｂの続き）。図３ａは、部位２における相互作用領域の立体図である。図３ｂは、部位３における相互作用領域の立体図である。
図４ａ〜ｃは、二量体の相互作用領域における各受容体間の相互作用を示す。図４ａは、相互作用領域における結合領域の概要である。相互作用する残基の側鎖のみを示す。図４ｂは、相互作用領域の立体図である。波線は水素結合または塩橋を表す。図４ｃは、図４ａにおいて矢印で示す、異なる方向から見た相互作用領域の立体図である。
図５ａ〜ｃは、ＥＧＦ誘導型受容体二量体化の可能性のあるモデルを示す。図５ａは、リガンド付加ＥＧＦＲのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩと、非リガンド付加ＩＧＦ−１ＲのＬ１、Ｓ１およびＬ２ドメインとの全体的な折りたたみの比較である。図５ｂは、非リガンド付加ＥＧＦＲの単量体の推定構造である。リガンド誘導型活性化に関与する可能性のある残基の側鎖のみを示す。図５ｃは、二量体ＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体の構造を示す。図５ｂで示す側鎖のみを示す。
図６は、脱グリコシル化ＥＧＦＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび化学的架橋によるＥＧＦ−誘導型二量体化の分析を示す写真である。
Ａ：精製ｄＥＧＦＲ（２ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．８）中でエンドグリコシダーゼＨ（１Ｕ／ｍｌ）およびＤ（０．４Ｕ／ｍｌ）と共に３７℃にてインキュベートした。消化の０時間後（レーン１）、２４時間後（レーン２）、４８時間後（レーン３）、９６時間後（レーン４）および１２０時間後（レーン５）に採取し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで消化産物を分析した。また、エンドグリコシダーゼ未添加（レーン６）またはｄＥＧＦＲ未添加の反応混合物を１２０時間インキュベートした。
Ｂ：精製ｄＥＧＦＲ（０．８ｍｇ／ｍｌ）を０．０５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．５）中でＥＧＦを添加して（レーン１）または添加しないで（レーン２）インキュベートし、続いて化学架橋剤ＢＳ３（１ｍＭ）と共にインキュベートした。
図７は、ｄＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体結晶の顕微鏡写真を示す。結晶の寸法は約１．０×０．２×０．２ｍｍである。
図８は、ヒトインシュリン様増殖因子−１受容体単量体（ＰＤＢ−ＩＤ：１ＩＧＲ）の立体構造とＥＧＦ結合時のＥＧＦＲの立体構造の比較の図である。
図９は、ファルマコフォアの構築に利用可能なＥＧＦとＥＧＦＲの結合部位のアミノ酸残基の例を表す図である。
図１０は、ファルマコフォアの構築に利用可能なＥＧＦＲ二量体化部位のアミノ酸残基の例を表す図である。
図１１は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてホモロジーモデリング法により作成したＥｒｂＢファミリー、インシュリン受容体（ＩＲ）インシュリン様増殖因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のモデル構造より推定したリガンド結合部位を示す図である。
図１２は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いてホモロジーモデリング法により作成したヒトＥｒｂＢ２のモデリング構造を示す図である。濃いグレーの部分は、推定リガンド結合部を表す。
図１３は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例を表す図である。
図１４は、ＥＧＦおよびＥＧＦＲ（受容体）のｃｏｎｏｌｌｙ  ｓｕｒｆａｃｅ図を表す写真である。
図１５は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例（仮説ａ）を表す図である。
図１６は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例（仮説ｂ）を表す図である。
図１７は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例（仮説ｃ）を表す図である。
図１８は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ複合体の構造座標を用いて構築したファルマコフォアの一例（仮説ｄ）を表す図である。
図１９は、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲに対するユーロピウム標識ＥＧＦの結合の飽和曲線を表す図である。
図２０は、ＥＧＦＲ（Ａ４３１細胞）／ユーロピウム標識ＥＧＦ（１０ｎＭ）結合に対する、ＥＧＦＲ抗体（Ａｂ−３）による結合阻害を表す図である。
図２１は、被験化合物のＥＧＦＲリン酸化阻害活性を表す写真である。レーン１は分子量マーカーである。レーン２はＥＧＦ非添加のサンプル、レーン３はＥＧＦ添加のサンプル、レーン４はＥＧＦおよび２−［２−（３−エチル−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−２−オキソ−エチルスルファニル］−ニコチン酸（１００μｇ／ｍＬ）添加のサンプル、レーン５はＥＧＦおよび１０−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−プロピル］−２−トリフルオロメチル−１０Ｈ−フェノチアジン二塩酸塩（１０μｇ／ｍＬ）添加のサンプル、レーン６はＥＧＦおよび８−ヘキシルスルファニル−３−メチル−７−プロピル−３，７−ジヒドロ−プリン−２，６−ジオン（１０μｇ／ｍＬ）添加のサンプルを泳動したものである。
図２２は、変異型ＥＧＦＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲ活性化を示す写真である。
Ａ：ＥＧＦ誘導性ＥＲＫリン酸化を示す。
Ｂ：変異型ＥＧＦＲの細胞表面発現を示す。
Ｃ：ＥＧＦＲのＥＧＦ誘導性自己リン酸化を示す。
Ｄ：変異型ＥＧＦＲを発現する細胞に対する１２５Ｉ標識ヒトＥＧＦ（２ｎＭ）の結合を示す。ＳＤ（ｎ＝３）は誤差のバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）として示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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