(57)【要約】ミトコンドリア病と総称される一群の疾患の予防、改善、治療等に有効で新規な薬剤を提供する。Ｌ−アラニン等アラニンを前記目的とする薬剤の有効成分として使用する。ミトコンドリア病の予防、改善及び／又は治療方法や、アラニンのミトコンドリア病用薬剤の製造への使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニンを有効成分として含有することを特徴とするミトコンドリア病用薬剤。
【請求項２】
アラニンがＬ−アラニンである請求の範囲１記載の薬剤。
【請求項３】
ミトコンドリア病の予防、改善及び／又は治療剤である請求の範囲１又は２記載の薬剤。
【請求項４】
ＭＥＬＡＳ、Ｌｅｉｇｈ脳症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＭＮＧＩＥ、慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）、ＭＥＲＲＦ症候群、レーバー病及び糖尿病の何れか用である請求の範囲１又は２記載の薬剤。
【請求項５】
投与量が一日当たり１０〜１０００ｍｇ／ｋｇである請求の範囲１〜４何れか記載の薬剤。
【請求項６】
投与量が一日当たり１００〜５００ｍｇ／ｋｇである請求の範囲５記載の薬剤。
【請求項７】
剤型が錠剤、顆粒剤、散剤、及び注射剤の何れかの形態にある請求の範囲１〜６何れか記載の薬剤。
【請求項８】
アラニンを生体内に摂取又は投与することを特徴とするミトコンドリア病の予防、改善及び／又は治療方法。
【請求項９】
当該摂取又は投与する形態が請求の範囲１〜７何れか記載の薬剤の形態にある請求の範囲８記載の方法。
【請求項１０】
アラニンのミトコンドリア病用薬剤の製造への使用。
【請求項１１】
当該薬剤の製造への使用形態が請求の範囲１〜７何れか記載の薬剤の形態にある請求の範囲１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ミトコンドリア病を予防、改善、治療等するための薬剤、即ちミトコンドリア病用薬剤（予防、改善、治療剤等の医薬品）に関する。更に、本発明はミトコンドリア病の予防、改善及び／又は治療方法や、Ｌ−アラニン等アラニンのミトコンドリア病用薬剤の製造への使用等にも関する。ミトコンドリア病とは、ミトコンドリアの機能異常により発症する一群の病態の総称である。本発明のミトコンドリア病用薬剤は、アミノ酸の一種であるＬ−アラニン等アラニンを有効成分として含有するものである。
背景技術
ミトコンドリア病は、ミトコンドリアの機能障害に起因する一群の疾患の総称である。ミトコンドリアは細胞内でエネルギー産生の機能を担っており、この機能が損なわれた場合には、種々の疾患を誘発することが知られている。それ等の疾患を例示すると、ＭＥＬＡＳ、Ｌｅｉｇｈ脳症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＭＮＧＩＥ、慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）、ＭＥＲＲＦ症候群、レーバー病等が挙げられる。上記の疾患は、ミトコンドリアに存在する各種の代謝酵素の機能異常に由来すると考えられ、その病因は対応する遺伝子の変異にあると推定される。
ミトコンドリア病は、例えばミトコンドリアＤＮＡの異常（欠失、点変異、重複）、ミトコンドリア酵素若しくは複合高分子量ミトコンドリア成分をコード付けする細胞ＤＮＡの異常、有害物質や医薬品により引き起こされる後天性のような種々の機序による変性疾患である。これ等の理由によりミトコンドリア関連遺伝子が損傷を受けると種々の生化学的異常が生じる。即ち、基質の転送障害によるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症やカルニチン欠乏症、基質の利用障害によるピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーセ複合体欠損症、β酸化の障害、ＴＣＡ回路の障害によるフマラーゼ欠損症、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損症、酸化的リン酸化共役の障害によるＬｕｆｔ病、電子伝達系酵素の障害による複合体Ｉ欠損症、複合体ＩＩ欠損症、複合体ＩＩＩ欠損症、複合体ＩＶ（シトクロームｃオキシダーゼ）欠損症、複合体Ｖ（ＡＴＰ合成酵素）欠損症等である。これ等の病因の本態はミトコンドリアのエネルギー代謝障害なので、治療法としては、病気の原因となる遺伝子の治療、酵素を補充する方法、障害酵素の基質制限や中毒物質の無毒化、或いは不足物質の補充等が考えられる。具体的な治療薬としては、補酵素Ｑ１０、ビタミン類、シトクローム製剤、コハク酸、ジクロロ酢酸、カルニチン、ＡＴＰ製剤等があるが、現在のところ、決め手となる治療薬、治療法は無いと言うのが現状である。
発明の開示
１．発明が解決しようとする課題
本発明が解決しようとする課題は、ミトコンドリア病と総称される一群の疾患の予防、改善、治療等に有効で新規な薬剤を提供することにある。
２．課題を解決するための手段
本発明者等は前記課題を解決すべく、先ず従来技術について調査、検討を行った。
シトクロームｃとビタミンＢ１、Ｂ２の合剤であるカルジオクラム中のシトクロームｃについては、牛の心筋から作られているので、アナフィラキシーショックを起こす可能性がある。また、本剤はシトクロームｃ酸化酵素の基質補充を期待されたものであるが、本酵素の残存活性が低いと有効性が低い。チトレスト等経口用シトクローム製剤もあるが経口投与では十分量がミトコンドリア内に移行できない可能性がある。これに対して、アラニンはこれ等の問題点を解決できる可能性が高いものと期待して、Ｌ−アラニンの投与を試みたところ、シトクロームｃオキシダーゼのｍＲＮＡ発現が上昇することが確かめられた。更に、シトクロームｃオキシダーゼ自身が活性化されるため本酵素の残存活性が低い患者でも有効性が期待できる。また、アラニンの経口投与によっても本酵素の活性化が期待でき、アナフィラキシーの危険性も無い。
また、ジクロロ酢酸はピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を高めることによりＴＣＡ回路を活性化するが、投与量が多い場合は意識障害等の副作用がある。これに対して、アラニンはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及び２−オキソグルタル酸キャリア、フマル酸ヒドラターゼのｍＲＮＡ発現を上昇させることにより、ＴＣＡ回路が活性化するが、副作用の危険は無い。
次に、ＡＴＰ製剤は細胞内のＡＴＰを補充する目的で使われるが、ＡＴＰは分解し易いためその効果は不明である。これに対して、アラニンはＡＴＰ合成酵素のｍＲＮＡ発現が上昇することによりＡＴＰ合成酵素の活性を促進しＡＴＰ量が増強される。細胞内でＡＴＰが作られるためより効果的であることが期待できる。
一方、コハク酸は複合体ＩＩの基質であるが、投与によりミトコンドリア内に十分に到達するかどうかは不明である。これに対して、アラニンの投与により、ＴＣＡ回路のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及び２−オキソグルタル酸キャリアのｍＲＮＡ発現が上昇する。このことにより、ＴＣＡ回路のイソクエン酸デヒドロゲナーゼが活性化し、２−オキソグルタル酸からのコハク酸生成を促進することができる。細胞内でコハク酸が作られるためより効果的であることが期待できる。
本発明者等は、以上の調査、検討の結果に基いて、アミノ酸の一つであるＬ−アラニン等アラニンがミトコンドリアの重要な生理機能であるＴＣＡ回路、電子伝達系を活性化し、それに基づきミトコンドリア病の病態が予防、改善、治療等されることを見出し、この知見に基き本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は、Ｌ−アラニン等アラニンを有効成分として含有することに特徴を有するミトコンドリア病の予防、改善、治療等のために使用する薬剤（以下、「ミトコンドリア病用薬剤」とも称する。）に存する。
本発明において使用するアラニンの立体構造には特に制限は無い。Ｌ−体やＤ−体を使用することができるが、簡便にはＬ−アラニンを使用することができる。
前記ミトコンドリア病として、ＭＥＬＡＳ、Ｌｅｉｇｈ脳症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＭＮＧＩＥ、慢性進行性外眼筋麻痺慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）、ＭＥＲＲＦ症候群、レーバー病及び糖尿病の何れかの病態を挙げることができる。
本発明の薬剤の有効成分、アラニンの投与量については、好ましくは一日当たり１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１００〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、更に好ましくは２００〜４００ｍｇ／ｋｇ程度を、この薬剤を求める生体内に投与することができる。
本発明の薬剤の剤型については、特に制限は無いが、錠剤、顆粒剤、散剤、注射剤等を好ましいものとして挙げることができる。
本発明は、別の形態として、Ｌ−アラニン等アラニンを生体内に摂取又は投与することに特徴を有するミトコンドリア病の予防、改善及び／又は治療方法に存する。当該摂取又は投与する形態については、前記本発明のミトコンドリア病用薬剤の各種形態を採用することができる。
本発明は、更に別の形態として、Ｌ−アラニン等アラニンのミトコンドリア病用薬剤の製造への使用にも存する。当該薬剤製造への使用形態（製造後の使用形態）については、前記本発明のミトコンドリア病用薬剤の各種形態を採用することができる。
発明の実施の形態
以下に、本発明の実施の形態について説明する。
本発明はＬ−アラニン等アラニンを有効成分として使用する薬剤であるが、動物、特にヒトの体内、即ち生体内に投与して、ミトコンドリア病を予防、改善、治療等するための薬剤である。
アラニン、特にＬ−アラニンの生体内への投与によりミトコンドリア病に対して下記のような改善の作用が考えられる。
１．  Ｌ−アラニンの投与により、ＴＣＡ回路のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及び２−オキソグルタル酸キャリア、フマル酸ヒドラターゼのｍＲＮＡ発現が上昇する。このことにより、ＴＣＡ回路が活性化し、ＡＴＰ合成を促進する。即ち、ＭＥＬＡＳ，ＭＥＲＲＦ症候群、Ｌｅｉｇｈ脳症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レーバー病、慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）、糖尿病、ＭＮＧＩＥのＡＴＰ合成に障害のあるミトコンドリア病を改善する。
２．  Ｌ−アラニンの投与により、ＴＣＡ回路のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及び２−オキソグルタル酸キャリアのｍＲＮＡ発現が上昇する。このことにより、ＴＣＡ回路のイソクエン酸デヒドロゲナーゼが活性化し、２−オキソグルタル酸からのコハク酸生成を促進することができる。即ち、電子伝達系の複合体ＩＩ基質であるコハク酸を供給することにより、複合体Ｉが欠損或いは活性低下したミトコンドリア病、特に慢性進行性外眼筋麻痺、Ｌｅｉｇｈ脳症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レーバー病等、において、複合体ＩＩからＡＴＰ産生を補い、病態を改善する。
３．  Ｌ−アラニンの投与により、電子伝達系のシトクロームｃオキシダーゼのｍＲＮＡ発現が上昇する。即ち、シトクロームｃオキシダーゼが活性化され、シトクロームｃオキシダーゼ活性がびまん性に低下したＬｅｉｇｈ脳症、Ｋｅａｒｎｓ−Ｓａｙｒｅ症候群において、Ｌ−アラニンはシトクロームｃオキシダーゼの活性上昇を促し、病態を改善する。
４．  Ｌ−アラニンの投与により、電子伝達系のＡＴＰ合成酵素のｍＲＮＡ発現が上昇する。即ち、ＡＴＰ合成酵素の活性を促進する。その結果、ミトコンドリア機能低下やＡＴＰ産生低下によるインスリン分泌障害が原因となる糖尿病において、Ｌ−アラニンはＡＴＰ合成を促進し、インスリン分泌を回復する。また、ＡＴＰ合成に障害のあるミトコンドリア病であるＭＥＬＡＳ，ＭＥＲＲＦ症候群、Ｌｅｉｇｈ脳症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レーバー病、慢性進行性外眼筋麻痺、ＭＮＧＩＥにおいて、Ｌ−アラニンはＡＴＰ合成を促進し、病態を改善する。
本発明では、ミトコンドリア病の動物モデルが確立されていないことから、ミトコンドリア機能の低下が報告されている肝障害の動物モデルである７０％部分肝切除ラットを用いてアラニン、特にＬ−アラニンの有効性を確認することができた（後述実施例参照。）。
本発明の薬剤の剤型や投与形態については特に制限は無い。従って、経口投与、非経口投与（静脈内投与等、腹腔内投与、経皮的投与、吸入投与、点滴投与等）等各種の投与形態が採用可能であり、例えば剤型として錠剤、顆粒剤、散剤、注射剤等の形態を採用することができる。
本発明の薬剤の投与量については、ミトコンドリア病の種類（病態）、症状の程度、製剤の形態（剤型）等に応じて適当に選択される。有効成分のアラニン、例えばＬ−アラニンを経口投与する場合の投与量については、Ｌ−アラニンを患者に対して１日当たり好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ程度、より好ましくは、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、更に好ましくは２００〜４００ｍｇ／ｋｇ程度使用することができる。重篤な場合には更に増量することもできる。投与の回数、時期については、数日に１回でも、又は１日１回でも可能であるが、通常は１日当たり数回、例えば２〜４回に分けて、持続的に投与することもできる。
一方、非経口投与する場合には、上記経口投与する場合の投与量に比べて十〜二十分の一程度の投与量を基準に選択、投与することができる。
前記投与量の算定は、本発明の薬剤中に含まれるＬ−アラニン等アラニンについての投与量の範囲に対するもので、この薬剤が投与される動物、特に患者にこれとは別のルートで必要により供給される飲食品、栄養剤、他の医薬品等由来のアラニン、特にＬ−アラニンの量は前記投与量の算定には含まれていない。従って、本発明の薬剤とは別の目的で、この薬剤を投与されるミトコンドリア病患者等が、例えば日常の食生活等においてＬ−アラニンを別途摂取することは当然のことながらできる。
その他、前記製剤中に、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質（補助剤等として）を含むこともできる。製剤用物質は製剤の剤型により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を挙げることができる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、及び溶剤、例えば滅菌水及び一価又は多価アルコール、例えばグリセロールを挙げることができる。
これ等様々な医薬製剤の形態として、例えば適当な固形又は液状の製剤形態、例えば顆粒、粉剤、被覆錠剤、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、乳濁液、滴下剤、注射用溶液、活性物質の放出を延長する製剤等を挙げることができる。
以上に例示した製剤形態にある本発明の薬剤には、薬効を奏するに有効な量の前記成分のアラニンを含有すべきことは当然のことであり、前記投与量等を参考にして有効成分を薬剤中に配合することができる。
前記の通り、本発明は、別の形態として、Ｌ−アラニン等アラニンを生体内に摂取又は投与することに特徴を有するミトコンドリア病の予防、改善及び／又は治療方法や、更に別の形態として、Ｌ−アラニン等アラニンのミトコンドリア病用薬剤の製造への使用にも存する。
これ等の発明については、特にその摂取又は投与形態、或いはその使用形態を含めて、何れも前記本発明のミトコンドリア病用薬剤についての説明や、後述の実施例等に基づいて、また必要により従来技術を参考にすることにより、容易に実施をすることができる。
好適な実施の形態
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）  ミトコンドリアＡＴＰ産生関連タンパク質の遺伝子発現
Ｆ３４４／ＤｖＣｒｊ（Ｆｉｓｃｈｅｒ）系雄性ラット（６週齢、体重１２０ｇ）を６日間、飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母）と水を供与して予備飼育した後、体重が等しくなるように２群に分けた。Ｈｉｇｇｉｎｓ−Ａｎｄｅｒｓｏｎの方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，１９３１，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．１２：１８６−１９１参照。）に従い、７０％（左葉、中間葉）部分肝切除を施術した。部分肝切除後１８及び２１時間に２ｇ／１０ｍｌ／ｋｇ  ＢＷのＬ−アラニンを０．３％カルボキシメチルセルロース水溶液で経口投与し（１群）、コントロールとして０．３％カルボキシメチルセルロースのみを経口投与した（２群）。解剖は、部分肝切除後２４時間に実施した。麻酔下で放血屠殺した後に肝臓を摘出、秤量した後、凍結保存してＴａｑｍａｎ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡの発現測定に供した。
ラット肝臓１ｇに対し、１０ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を加え、ホモジナイズした。得られたホモジネートを遠心し、上清を回収した。この上清にＩＳＯＧＥＮ１ｍｌにつき２００μｌのクロロホルムを添加し、軽く撹拌した。室温に２分静置後、１５０００回転、４℃で１０分間遠心分離し、水層を回収した。水層にそれと等容量の２−プロパノールを加え、室温に５分静置後、１５０００回転、４℃で１５分間遠心分離した。上清を捨て、沈澱したペレットに７０％エタノールを加え、１５０００回転、４℃で１５分間遠心分離し、ペレットを回収した。ペレットを室温で５分間乾燥させ、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水を添加し、ペレットを溶解させた。
Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲに用いるテンプレートのｃＤＮＡ合成については、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を使用し、実施した。全ＲＮＡ  ５００ｎｇ、０．５μｇ／μｌ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌをＤＥＰＣ処理水に溶解し、全量を１０μｌとした。６５℃で５分間反応後、氷冷し、１０×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｔｏｒ  １μｌを加えて混合した後、４２℃、２分間保温し、逆転写酵素ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＲＴ  １μｌ（５０ｕｎｉｔｓ）を添加した。４２℃、５０分間、更に７０℃、１５分間反応させた。
ミトコンドリアのＴＣＡ回路及び電子伝達系のＡＴＰ産生に関与するタンパク質についてプライマーを設計した。設計には外部データベースＰｒｉｍｅｒ３を用いた。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）
表１に、遺伝子の種類とそのＵｎｉｇｅｎｅ  ＮＯ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｕｎｉｇｅｎｅ）、プライマーの塩基配列を示す（配列表配列番号１〜２６参照。）。
2003068215.tif 000002
下記表２に示す組成の反応液をＴａｑｍａｎ用ＰＣＲチューブ内で混合し、ＡＢＩ７７００  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＤｅｔｅｃｔｏｒにおいてＰＣＲ反応を行った。反応条件は以下の通り行った。
反応条件：
５０℃２分→９５℃１０分→（９５℃１５秒→６０℃１分）を４０サイクル行った。
2003068215.tif 000003
Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ反応は全て２連で行い、閾値を超えるサイクル数ＣＴを算出した。ＣＴ＝３０の時の発現量を１と定義し、次式から相対発現量を求めた。
相対発現量＝２（３０−ＣＴ  ｓａｍｐｌｅ）
更に、β−Ａｃｔｉｎの相対発現量を１０００としたときの各遺伝子の発現量の相対値を求めた。
遺伝子発現解析の結果を図１に示す。図１から明らかな如く、Ｌ−アラニンの投与により、肝臓のミトコンドリアのＴＣＡ回路及び電子伝達系のＡＴＰ産生に関与するタンパク質のｍＲＮＡが非投与群に比べて有意に上昇した。従って、Ｌ−アラニンは肝臓のミトコンドリアのエネルギー産生を改善する効果を有することが分かった。
（実施例２）ミトコンドリア膜電位の定量
ＳＤ（ＩＧＳ）ラット♂８週齢をエーテル麻酔下にて放血屠殺後、肝臓を摘出し、１ｘＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ；２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）ｐＨ７．５，２ｍＭ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，７０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸））で２回洗った。約１００ｍｇにカットして重さを量り５ｍｌチューブへ、更に細かくカットした。
１０倍量の１ｘＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（２ｍｇ／ｍｌアルブミン含有）を入れ、低速氷中でホモジナイズ（１５秒）し、ホモジネートをエッペンドルフチューブに移して６００ｇで４℃５分間遠心した。上清を新しいチューブに移して１１０００ｇで４℃１０分遠心し、上清を取り除き、１０倍量の１ｘＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁した。６００ｇで４℃５分遠心から１１０００ｇで４℃１０分遠心までをもう１度行い、上清を取り除き、４０μｌのｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，２５０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ  ＡＴＰ，０．０８ｍＭ  ＡＤＰ（アデノシン−５’−二リン酸），５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（コハク酸ナトリウム），２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４，１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁した。これをミトコンドリア懸濁液とし、以下の実験に用いた。蛋白定量によりミトコンドリア懸濁液１ｍｇ／ｍｌに調整し、１９０μｌのａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＡＴＰ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ）にミトコンドリア懸濁液を２μｌ（２μｇ）混和し、各濃度のＬ−アラニンを添加した。ＪＣ−１（１μｇ／ｍｌ）を２μｌ加え、室温で７分放置した後、蛍光強度測定した。（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝４９０ｎｍ，Ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５９０ｎｍ）結果を図２に示した。その結果、Ｌ−アラニンの添加濃度依存的にＪＣ−１の蛍光強度が増加した。これは、即ちミトコンドリアの電子伝達系が活性化し膜電位が上昇しているものと考えられる。
以上の結果から、Ｌ−アラニンがミトコンドリア病用薬剤の有効成分として期待できる。
（実施例３）ＣＯＸ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ）活性の測定
実施例２と同様にミトコンドリア懸濁液を準備し０．１ｍｇ／ｍｌに調整した。９５０μｌのａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ−７．０，１２０ｍＭ  ＫＣｌ）にミトコンドリアを２５μｌ（２．５μｇ）混和し、各濃度のＬ−アラニンを添加した。１０ｍｇ／ｍｌのヒドロキシ亜硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｉｔｅ）で還元したシトクロームｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ；０．２２ｍＭ）を５０μｌ添加して転倒混和し反応開始し、直ちに吸光光度計で吸光度（５５０ｎｎ）を連続１分間測定し吸光度の減少を記録した。結果を図３に示した。Ｌ−アラニンは２．５ｍＭから濃度依存的にＣＯＸ活性を増強させる作用があることが明らかとなった。実施例２のＬ−アラニンによるミトコンドリア膜活性化の一因にＣＯＸ活性の活性化が関与していることが示唆された。
以上の結果から、アラニン、特にＬ−アラニンのミトコンドリア病用薬剤の有効成分としての使用が期待される。
発明の効果
本発明により、ミトコンドリア病に対して有効な治療剤等薬剤を提供することができる。また、本発明のミトコンドリア病用薬剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く、副作用が殆ど無いので、ミトコンドリア病用の医薬品として極めて有用である。
更に、本発明によりミトコンドリア病の予防、改善及び／又は治療方法や、Ｌ−アラニン等アラニンのミトコンドリア病用薬剤の製造への使用も提供することができる。
従って、本発明は医薬品、食品、医療等の分野で広く実施することができ、故に産業上極めて有用である。
【配列表】
2003068215.tif 000004
2003068215.tif 000005
2003068215.tif 000006
2003068215.tif 000007
2003068215.tif 000008
2003068215.tif 000009
2003068215.tif 000010
2003068215.tif 000011
【図面の簡単な説明】
［図１］
図１は実施例１において、遺伝子発現解析の結果（ミトコンドリアＡＴＰ産生関連タンパク質の遺伝子発現）を図示したものである。
□：２群（コントロール群）；■：１群（Ａｌａ投与群）。
［図２］
図２は実施例２において、ミトコンドリア膜電位を定量した結果；ミトコンドリア膜電位に対するＬ−アラニンの影響（ＪＣ−１）を示したものである。
［図３］
図３は実施例３において、ＣＯＸ活性を測定した結果；ＣＯＸ活性に及ぼすＬ−アラニンの影響を示したものである。
【図１】
2003068215.tif 000012
【図２】
2003068215.tif 000013
【図３】
2003068215.tif 000014
【国際調査報告】
2003068215.tif 000015
2003068215.tif 000016
2003068215.tif 000017
2003068215.tif 000018