(57)【要約】安定供給が可能であり、移植の際の適合性が問題にならない骨幹細胞が開示されている。本発明の骨幹細胞は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離される。この骨肝細胞は、骨欠損部等における骨形成に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト羊膜間葉細胞層から分離された骨幹細胞。
【請求項２】
ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞を含む骨細胞形成用細胞。
【請求項３】
ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞を、骨細胞分化用培地で培養することを含む骨細胞の取得方法。
【請求項４】
ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞を、骨欠損部に移植することを含む、骨形成方法。
【請求項５】
ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞の、骨形成のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒト羊膜から分離された、新規な骨幹細胞に関する。本発明の細胞は、これを移植することにより、骨の修復等に有用である。
【背景技術】  従来より、外傷や骨腫瘍の除去等により骨の修復が必要な場合には、患者本人の大腿骨等の自家骨を採取し、これを移植することが行われている。しかしながら、この方法は、患者の負担が大変大きい。一方、再生医学や組織工学の分野では、骨細胞に分化し得る幹細胞（骨幹細胞）を移植することにより骨の修復を行うことが研究されている。従来より、骨幹細胞は、骨髄中や脂肪細胞層中に見出されている。しかしながら、これらは安定供給に難がある。また、これらの骨幹細胞を移植する場合には、拒絶反応を防止するために適合性を調べる必要があり、適合性のない患者に対しては移植ができないという問題がある。
【発明の開示】
本発明の目的は、安定供給が可能であり、移植の際の適合性が問題にならない骨幹細胞を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒト羊膜の間葉細胞層に骨幹細胞が存在することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離された骨幹細胞を提供する。また、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞を含む骨細胞形成用細胞を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞を、骨細胞分化用培地で培養することを含む骨細胞の取得方法を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞を、骨欠損部に移植することを含む、骨形成方法を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞の、骨形成のための使用を提供する。
本発明により、ヒト羊膜間葉細胞層中に存在する骨幹細胞が初めて提供された。本発明の骨幹細胞は、羊膜由来であるので、安定供給が可能であり、移植の際の適合性が問題にならない。
【発明を実施するための最良の形態】  上記の通り、本発明の細胞は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されるものである。間葉細胞層は、絨毛膜層と羊膜上皮細胞層との間に位置する。羊膜は、胎児由来の組織であるが、母体由来の胎盤に付着した状態で採取することができ、しかも、子宮内壁の全体を被覆する大きな組織であるので、大量に採取することができる。さらに、胎盤やそれに付着している羊膜は、医療廃棄物として処理されるものであるので、採取に倫理上の問題も生じない。
本発明の細胞は、ヒト羊膜の羊膜上皮細胞層＋間葉細胞層を絨毛膜層から剥離し、これをトリプシン処理して羊膜上皮細胞を除去し、蛋白分解酵素処理することにより分離することができる。ここで、蛋白分解酵素処理の好ましい例としては、パパイン、コラゲナーゼ、中性プロテアーゼ（ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ））及びＤＮａｓｅ混合液で処理することを挙げることができるが（下記実施例参照）、これに限定されるものではない。なお、蛋白分解酵素処理することにより分離される細胞には、骨幹細胞以外の細胞も含まれる。一方、細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体（ＳＢ−１０）は骨細胞に分化する前に発現し、骨細胞に分化後に消失する（Ｂｒｕｄｅｒ  ＳＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ  １３：６５５，１９９８）。そこでＳＢ−１０を用いたフローサイトメトリーシステム（自動細胞解析分離装置）を用いることにより、骨幹細胞の分離、培養が可能である。なお、本発明においては、アルカリフォスファターゼを発現する細胞を骨細胞であると判断する。このような判断は、この分野において認められているものである（Ｊａｉｓｗａｌ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６４：２９５，１９９７；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３，１９９９）。
本発明の骨幹細胞の骨細胞への分化に用いられる骨細胞分化用培地としては、公知の骨細胞分化用培地を採用することができる。このような骨細胞分化用培地の好ましい例としては、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロールリン酸、０．２５ｍＭアスコルビン酸塩（ａｓｃｏｒｂａｔｅ）及び１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中に含有する培地（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３，１９９９）を挙げることができる。培養条件は、特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃で２〜４週間程度培養することが好ましい。また、培養は、５％ＣＯ２ガス雰囲気下で行うことが好ましい。
なお、上記本発明の細胞を一次培養又は継代培養をして得られる培養細胞であって、アルカリフォスファターゼを発現する細胞に分化可能な細胞も本発明の範囲に含まれる。
本発明の細胞はヒト羊膜由来であり、羊膜は胎児由来であり、免疫寛容を示す。すなわち免疫組織染色ではＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  Ｉには陽性反応を呈し、ＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩの染色性はない。またＦａｓ  ｌｉｇａｎｄ陽性細胞が存在している。最近、羊膜組織が拒絶反応を惹起しにくい理由は、ＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  Ｉｂ（ＨＬＡ−Ｇ）の発現とＦａｓ  ｌｉｇａｎｄ陽性細胞の存在が拒絶抑制に貢献していると考えられている（眼科４２：２５７−２６９，２０００）。従って、ＨＬＡの適合性を問題にすることなく移植することが可能である。
本発明の細胞は、そのまま、あるいは、アルカリフォスファターゼを発現する骨細胞にまで分化させた後、移植することにより骨の修復や再構成に用いることができる。移植する部位は、特に限定されないが、通常、骨の修復や再構成が望まれる、外傷や骨腫瘍の除去等に起因する骨欠損部である。移植は、公知の骨幹細胞移植と同様に行うことができる。移植する細胞の数は、骨欠損部の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０３〜１０７個程度が適当である。
【実施例】  以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】１．  細胞の分離及び培養
インフォームドコンセントを得た妊婦の出産後の胎盤より、羊膜上皮細胞層＋間葉細胞層を絨毛膜層から剥離して分離した。０．１２５％トリプシン溶液＋１．３ｍＭ  ＥＤＴＡで３７℃で１５分間処理した。これを４回繰り返し、トリプシン溶液を遠心して細胞を集め、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗った（トリプシン処理分画（比較例１））。消化されなかった組織塊をリン酸緩衝液で洗った後、混合酵素（０．０１％パパイン、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ、０．０１％ＤＮａｓｅ、０．１％中性プロテアーゼ）で３７℃、１時間振盪処理を行った。１０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、沈渣をＰＢＳに浮遊させた。２０μｍフィルターに通してから、ＰＢＳで３回洗浄した（混合酵素処理分画）。
得られた混合酵素処理分画細胞を、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロールリン酸、０．２５ｍＭアスコルビン酸塩（ａｓｃｏｒｂａｔｅ）及び１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３，１９９９）中、培養皿上で５％ＣＯ２ガス雰囲気下中で３７℃で培養した。培地は３〜４日後に交換した。
２１日間培養後、市販のアルカリフォスファターゼ検出用キット（Ｓｉｇｍａ  ｋｉｔ  ８５、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、組織学的にアルカリフォスファターゼの生産を調べた。アルカリフォスファターゼの組織学的検出は、市販のキットの添付文書通りに行った。
その結果、アルカリフォスファターゼが明瞭に検出された。これにより、本発明の細胞が、骨細胞に分化可能な骨幹細胞であることが確認された。
【国際調査報告】
2004018658.tif 000002
2004018658.tif 000003
2004018658.tif 000004
2004018658.tif 000005