(57)【要約】本発明は、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の新規選択方法に関する。本発明は、ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させて当該試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性を測定し、一方、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させて当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定し、両者の転写抑制活性を比較することにより、強い免疫抑制活性を示しながら、血小板減少の副作用が少ない化合物を簡便に選択する方法を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）及び（２）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）免疫抑制活性を有する化合物を選択する、
（２）（１）で選択した化合物から、さらにＧＡＴＡ−１転写抑制活性の少ない化合物を選択する、
【請求項２】
以下の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）被験化合物の免疫抑制活性を測定する、
（２）被験化合物のＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定する、
（３）（１）で求めた免疫抑制活性と（２）で求めたＧＡＴＡ−１転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する、
【請求項３】
以下の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性を測定する、
（２）試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定する、
（３）（１）で求めたＩＬ−２転写抑制活性と（２）で求めたＧＡＴＡ−１転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する、
【請求項４】
以下の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性を測定する、
（２）ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定する、
（３）（１）で求めたＩＬ−２転写抑制活性と（２）で求めたＧＡＴＡ−１転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する、
【請求項５】
請求項４において、ＩＬ−２転写抑制活性として（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値を測定し、ＧＡＴＡ−１転写抑制活性として（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）値を測定し、両者を比較することによる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値が５以上の化合物を選択することによる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
【請求項７】
ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子が、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御領域とレポーター遺伝子から構成されるものである請求項４−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子が、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子の転写開始点上流の−３７６９から−３１３３の領域配列及び転写開始点近傍の−７８９から＋３０の領域配列を含むものである請求項４−７に記載の方法。
【請求項９】
ＩＬ−２レポーター遺伝子がヒトＩＬ−２遺伝子の転写制御領域とレポーター遺伝子から構成されるものである請求項４−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ−２レポーター遺伝子が、ヒトＩＬ−２遺伝子の転写開始点近傍の−３７８から＋５４の領域配列を含むものである請求項４−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入する試験用細胞がヒト巨核球系列の細胞株である請求項４−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入する試験用細胞がＰｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ及びＡｎｔｉ  ＣＤ２８  ａｎｔｉｂｏｄｙで刺激されたヒトＴ細胞由来の細胞株であり、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入する試験用細胞がヒト巨核球系列の細胞株である請求項４−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ヒトＴ細胞由来の細胞株がＪｕｒｋａｔ細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト巨核球系列の細胞株がＨＥＬ細胞である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト巨核球系列の細胞株がＨＥＬ細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子である請求項４−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
被験物質がＨＤＡＣ阻害剤であるところの請求項１−１６のいずれかに記載の選択方法。
【請求項１８】
ＧＡＴＡ−１蛋白の発現量を測定することによる、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
【請求項１９】
次の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）ＩＬ−２蛋白の発現量を測定する、
（２）ＧＡＴＡ−１蛋白の発現量を測定する、
（３）両者の発現量を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する
【請求項２０】
以下の（１）（２）で構成される血小板減少作用の少ない免疫抑制剤選択の為の測定用キット。
（１）ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（２）巨核球細胞系列の試験用細胞
【請求項２１】
以下の（１）から（４）で構成される血小板減少作用の少ない免疫抑制剤選択の為の測定用キット。
（１）ＩＬ−２レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（２）ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（３）Ｔ細胞系列の試験用細胞、
（４）巨核球細胞系列の試験用細胞
【請求項２２】
請求項１７記載の方法により選択された血小板減少作用が少ないＨＤＡＣ阻害剤。
【請求項２３】
請求項１−１６のいずれかに記載の選択方法により選択された血小板減少作用の少ない免疫抑制剤。
【請求項２４】
請求項２２に記載のＨＤＡＣ阻害剤を有効成分として含む、炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療の為の免疫抑制剤。
【請求項２５】
請求項２３に記載の免疫抑制剤を有効成分として含む炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療剤。
【請求項２６】
請求項２２に記載のＨＤＡＣ阻害剤を有効成分として含む血小板減少作用が少ない免疫抑制剤を投与することによる、炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の免疫抑制剤を有効成分として含む血小板減少作用が少ない免疫抑制剤を投与することによる炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療方法。
【請求項２８】
炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療剤製造の為の請求項２２に記載のＨＤＡＣ阻害剤の使用。
【請求項２９】
炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療剤製造の為の請求項２３に記載の免疫抑制剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の新規選択方法に関する。
【背景技術】  今日、臓器移植後の急性拒絶反応を抑制する為に臨床現場で広く用いられている主要な免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ，ＣｓＡ）及びタクロリムス（ＦＫ５０６）は、それぞれに特異的なイミュノフィリン（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎｓ：例えばＣｓＡの場合にはｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ，ＦＫ５０６の場合は、ＦＫＢＰ１２）との結合を通じて、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインホスファターゼであるカルシニューリンの活性を阻害する。その結果、ＮＦ−ＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ）の脱リン酸化反応が阻害されることによって、ＮＦ−ＡＴの核内移行が阻害され、ＩＬ−２遺伝子の転写活性が抑制されることが知られている。このような作用メカニズムの研究から、活性化されたＴ細胞においてＩＬ−２遺伝子の転写レベルでの発現が特異的に抑制されることが、臓器移植片の拒絶を抑制し、様々な自己免疫疾患等への治療効果を示す上で、極めて重要であることが明らかになっている。
ところで、ヒストンの脱アセチル化を触媒する一群のヒストン脱アセチル化酵素（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，以下ＨＤＡＣと称す）は、細胞核内で、ヒストンアセチル化酵素と競合的に働き、クロマチン構造の変換を通じて、様々な遺伝子の発現レベルを制御していることが知られている。これまでの精力的なスクリーニングからＨＤＡＣ阻害活性を示す化合物が数多く得られているが、それらの中には顕著なＩＬ−２の産生阻害活性を示す化合物が含まれおり（Ｉ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４９，４５３−４５７）、シクロスポリンＡやタクロリムスを補完する免疫抑制剤の候補として注目されている。実際、このようにして選択された化合物の中にはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において優れた免疫抑制作用を示すものが見出されている。例えば、ＷＯ００／０８０４８に開示されているように、ＦＲ２２５４９７は、その強力な免疫抑制作用によって、臓器移植片拒絶（ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ），自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）の治療剤や予防剤として優れた効果を示すことが見出されているが、それに加えて、遺伝子発現の異常によって発症すると考えられている他の数多くの疾患の治療剤や予防剤としての有用性も示唆されている。それらの疾患の中には、例えば、炎症性疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ），糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ），糖尿病性合併症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），ホモ接合型サラセミア（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ），繊維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ），肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ），急性前骨髄球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ，ＡＰＬ），原虫感染症（ｐｒｏｔｏｚｏａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ），癌（ｔｕｍｏｒ）などが含まれる。しかしながら、このような有用性にもかかわらず、これらのＨＤＡＣ阻害活性を示す化合物の多くは、生体に投与した場合に、重篤な血小板減少の副作用を生じやすいという問題点があり、実際の治療薬としての利用を困難にしていた。
免疫抑制活性を示すＨＤＡＣ阻害剤の多くが血小板減少の副作用を生じやすい原因については、現在のところ、まだ十分に解明されているわけではない。しかしながら、本発明者らは、鋭意研究する中で、ＨＤＡＣ活性を阻害する化合物の多くがＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦ−１，ＮＦ−Ｅ１，あるいはＥｒｙｆ  １とも呼ばれている）遺伝子の転写活性をも阻害していることを見出した。
ＧＡＴＡ−１は、造血系遺伝子の転写制御領域に特徴的に存在する（Ａ／Ｔ）ＧＡＴＡ（Ａ／Ｇ）コンセンサス配列を認識するＤＮＡ結合蛋白質である。このＧＡＴＡモチーフ配列は、各種グロビン遺伝子のエンハンサー領域，β−グロビン遺伝子のローカス制御領域（ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ，ＬＣＲｓ），Ｔ細胞受容体α−鎖，δ−鎖遺伝子のエンハンサー領域などの様々な制御領域やプロモータで見出されている。また、ＧＡＴＡ−１  ｍＲＮＡは、成熟赤血球細胞・マスト細胞・巨核球などで高発現しており、多機能性前駆細胞や若齢マウスの精巣にもわずかに発現が見られる。
ＧＡＴＡ−１蛋白質には、Ｃ４型Ｚｎフィンガー領域（Ｃ４−ｔｙｐｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ）が２個所存在する。これらのうち特にＮ−末端側に存在するＺｎフィンガーは、Ｆｏｇ−１（Ｆｒｉｅｎｄ  ｏｆ  ＧＡＴＡ−１）などの転写共役因子との相互作用を通して、赤血球や巨核球の成熟に必須の機能を担っていることが知られている。例えば、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子はＸ染色体上に存在しているが、Ｘ染色体に連関した遺伝性の造血不全性貧血患者や血小板減少症患者の一部には、このＺｎフィンガーに対応する部位にＶ２０５Ｍ変異やＤ２１８Ｇ変異が見られることが報告されている（Ｋ．Ｅ．Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４，２６６−２７０：Ｋ．Ｆｒｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８，８５−９２）。Ｆｏｇ−１は、それ自身９個所のＺｎフィンガーを有しており、おそらくこれらを介して、プロモーター領域に結合したＧＡＴＡ−１と他の核内因子との結合を媒介する役割を担っていると推定される。
ＧＡＴＡ−１遺伝子自身のプロモーターについては、これまでに、ＩＥプロモーター及びＩＴプロモーターの少なくとも２種類が見出されている。それに応じて、この遺伝子の第１エクソンも２種類存在する。このうち、精巣のＳｅｒｔｏｌｉ細胞ではＩＴプロモーターが特異的に働き、造血系細胞では、主としてＩＥプロモーターが働いていると言われている。しかしながら、ＩＴプロモーターは、Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓの分化段階にも働くと報告されており（Ａ．Ｍ．Ｖａｎｎｕｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １８０，３９０−４０１）、上記２種類のプロモーターが生体内でどのように使い分けられているかについて、その詳細はまだ十分に解明されている訳ではない。
造血系細胞での転写制御には、その転写開始点から上流約０．７ｋｂまでの範囲内に存在すると予想されるＩＥプロモーター配列が重要と考えられる。この領域には、ＧＡＴＡモチーフやＣＡＣＣモチーフに一致する配列が含まれているが、内部に存在する制御配列の詳細については、ヒト配列そのものを直接用いた解析が、あまり報告されていない為、まだ不明の部分が多い。しかし、この領域単独では微弱な転写活性を示すのみであり、少なくとも巨核球系細胞での発現には、さらに上流約３．８ｋｂから３．５ｋｂ付近に存在する約３１７塩基対のＨＳＩ領域（ＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性領域）が必要であると考えられている（Ｐ．Ｖｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，２７９９−２８１１：Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０，７１３−７２３）。このＨＳＩ領域には、ＧＡＴＡモチーフ配列とＥ−ｂｏｘモチーフ配列が近接したＧＡＴＡ−Ｅ−ｂｏｘモチーフが存在しており、ＧＡＴＡ−１，ＧＡＴＡ−２などのＧＡＴＡ因子がＳＣＬ／ｔａｌ−１，Ｅ２Ａ（ＴＣＦ３，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３），ＬＭＯ−２（ＬＩＭ  ｏｎｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）やＬｄｂ−１（ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎ  ｂａｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１）などの核内蛋白質と複合体を形成して相互作用している可能性が示唆される。ＨＳＩ領域の配列の中には、ヒトとマウスの間で、かなりよく保存された領域が存在する。
ＧＡＴＡ−１遺伝子を通常の方法でノックアウトしたマウスは、１次造血細胞の形成障害から胚発生の段階で致死的となる（Ｙ．Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１２３５５−１２３５８）。一方、巨核球系列のＧＡＴＡ−１遺伝子発現だけを選択的にノックアウトさせたマウスを作製することは可能であり、このようなマウスにおいては、血小板数が激減し、巨核球系細胞の正常な成熟も見られないことが判明している（Ｒ．Ａ．Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６，３９６５−３９７３）。
【発明の開示】
これまでに、ＨＤＡＣ阻害活性を示す化合物は、生体に投与した場合に優れた免疫抑制作用を示す化合物が数多く知られているが、それらの化合物は、同時に重篤な血小板減少作用も示す為に、臨床への応用が難しく、必ずしも満足できるものではなかった。従って、これらの候補化合物の中から、さらに血小板減少作用を示さない化合物のみをイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でスクリーニングする為の優れた方法を提供することが強く求められており、本発明はこのような課題の解決をその目的とするものである。
これまでの研究から、ＧＡＴＡ−１遺伝子産物が、赤血球系や巨核球系の細胞分化や成熟に重要な役割を果たしていることは、すでに判明している（Ｘ．Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）：ＣＭＬＳ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆ  Ｓｃｉ．５８，２００８−２０１７）。しかしながら、巨核球系列の細胞分化や成熟には、ＧＡＴＡ−１以外にも他の多くの因子の関与が示唆されており、ＨＤＡＣ阻害剤の多くで見られる血小板減少作用がＧＡＴＡ−１そのものの機能阻害を介したものであるかどうかについては、今までのところ、まったく不明であった。本発明者等の今回の研究は、様々なＨＤＡＣ阻害剤の作用を比較検討することによって、それら薬剤の投与によって生じる血小板減少作用が、ＧＡＴＡ−１遺伝子の転写抑制によってもたらされるものであることを初めて明らかにしたものである。ＨＤＡＣ阻害剤の多くで見られる血小板減少作用の原因を探る為に、本発明者らは、巨核球で発現している遺伝子の中から、ＨＤＡＣ阻害薬でＧＡＴＡ−１と同様のパターンで転写が抑制されるヒト由来の遺伝子をＧｅｎｅＣｈｉｐ商標登録（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて選別してグループ化し、それらの遺伝子群に共通な転写因子の探索を行なった。そして、ＧＡＴＡ−１遺伝子と同様のパターンによってＨＤＡＣ阻害薬により転写抑制される遺伝子４５種類の中から、さらに、血球分化に関わる機能を有すると想定される転写因子の候補遺伝子あるいは巨核球マーカー遺伝子と想定される候補遺伝子１０遺伝子を得た。次に、これらの各遺伝子の転写制御領域とＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御領域において共通に存在する転写因子の結合配列がないかどうか詳細に調べてみたところ、ＧＡＴＡ−１自身が認識する応答配列（ＧＡＴＡ配列）以外にＳＴＡＴ３、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＳＦ１が認識する応答配列がほぼ共通して存在することが明らかになった。しかしながら、上記のＧＡＴＡ−１以外の各転写因子が認識する応答配列で制御されるレポーター遺伝子発現系を構築して、ＨＤＡＣ阻害薬の効果を調べてみたところ、いずれの場合も、レポーター遺伝子の転写はＨＤＡＣ阻害薬により抑制されないことが判明した。
さらに、本発明者は、ＧＡＴＡ−１遺伝子プロモーター内に存在しているＧＡＴＡ配列内に変異を導入してＧＡＴＡ−１自身が認識する応答配列を消失させたプロモーターを人工的に構築し、レポーター遺伝子発現系に組み込んで細胞に導入し調べてみたところ、レポーター遺伝子の転写は、少なくとも３種類のＨＤＡＣ阻害薬を添加しても、抑制されないことが判明した。これらの結果は、ＨＤＡＣ阻害薬によるＧＡＴＡ−１遺伝子の発現抑制は、ＧＡＴＡ−１遺伝子プロモーター内のＧＡＴＡ配列を介した転写因子による転写活性化機能が阻害されることにより生じていることを示している。すなわち、ＧＡＴＡ−１因子そのものは、ＧＡＴＡ配列を介した転写活性化機能を有しているので、これらの結果は、ＨＤＡＣ阻害薬がＧＡＴＡ−１因子による転写活性化機能を阻害することにより、血小板減少の副作用を生じている可能性を強く示唆している。
ところで、本発明者らは、数多くの免疫抑制作用を示すＨＤＡＣ阻害剤について、ラット心移植モデルでの有効用量について鋭意研究する中で、ラット心移植モデルでの免疫抑制剤としての有効性が、ＩＬ−２遺伝子の発現抑制と深く関わっていることに思い至り、この事実を確認する為に、ＩＬ−２遺伝子の転写制御領域を用いたレポーターアッセイ系の構築を行った。このレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物（ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を、活性化したＴ細胞由来の細胞株に導入して、様々な被験化合物を添加した際のレポータ活性の変化を測定し比較した。この結果、ラット心移植モデルでの免疫抑制剤としての有効性が、ＩＬ−２転写抑制作用とよく相関することを見出した。
さらに、本発明者らは、上述のように数多くのＨＤＡＣ阻害剤の重篤な副作用である血小板減少作用については、ＧＡＴＡ−１遺伝子そのものの発現抑制が深く関わっていることに思い至り、この事実を確認する為に、ＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御領域を用いたレポーターアッセイ系の構築を行った。これらのレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を、巨核球系列由来の細胞株に導入し、これに様々な被験化合物を添加した際のレポータ活性の変化を測定し比較した。その結果、血小板抑制作用の強い化合物ほどＧＡＴＡ−１遺伝子の転写を強く抑制する傾向にあることを見出した。
そこで、本発明者は、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定することによる、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法を見出した。
さらに、本発明者は、上記の２種類の細胞を用いたレポーターアッセイ系を併用することにより、強力なＩＬ−２転写抑制活性を示し、なおかつＧＡＴＡ−１転写抑制活性の弱い化合物を選択することにより、免疫抑制活性を示し、血小板減少作用の副作用が少ない化合物を迅速に選択する為の方法を発明した。
本発明は、ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させて当該試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性を測定し、一方、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させて当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定し、両者の転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する方法に関する。
さらに、本発明は、ＩＬ−２蛋白の発現量を測定し、ＧＡＴＡ−１蛋白の発現量を測定し、両者の発現量を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する方法に関する。
さらに、本発明は、ＩＬ−２レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、Ｔ細胞系列の試験用細胞、巨核球細胞系列の試験用細胞で構成される血小板減少作用の少ない免疫抑制剤選択の為の測定用キットに関する。
さらに、本発明は、ＩＬ−２転写抑制活性として（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値を測定し、ＧＡＴＡ−１転写抑制活性として（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）値を測定し、その両者を比較して、（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値が５以上を示すものを選択することにより得られた化合物を有効成分として含む炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療剤に関する。
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
《１》以下の（１）及び（２）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）免疫抑制活性を有する化合物を選択する、
（２）（１）で選択した化合物から、さらにＧＡＴＡ−１転写抑制活性の少ない化合物を選択する、
《２》以下の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）被験化合物の免疫抑制活性を測定する、
（２）被験化合物のＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定する、
（３）（１）で求めた免疫抑制活性と（２）で求めたＧＡＴＡ−１転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する、
《３》以下の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性を測定する、
（２）試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定する、
（３）（１）で求めたＩＬ−２転写抑制活性と（２）で求めたＧＡＴＡ−１転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する、
《４》以下の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性を測定する、
（２）ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させ、当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定する、
（３）（１）で求めたＩＬ−２転写抑制活性と（２）で求めたＧＡＴＡ−１転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する、
《５》  《４》において、ＩＬ−２転写抑制活性として（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値を測定し、ＧＡＴＡ−１転写抑制活性として（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）値を測定し、両者を比較することによる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
《６》  《５》において、（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値が５以上の化合物を選択することによる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
《７》  ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子が、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御領域とレポーター遺伝子から構成されるものである《４》−《６》のいずれかに記載の方法。
《８》  ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子が、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子の転写開始点上流の−３７６９から−３１３３の領域配列及び転写開始点近傍の−７８９から＋３０の領域配列を含むものである《４》−《７》に記載の方法。
《９》  ＩＬ−２レポーター遺伝子がヒトＩＬ−２遺伝子の転写制御領域とレポーター遺伝子から構成されるものである《４》−《８》のいずれかに記載の方法。
《１０》  ＩＬ−２レポーター遺伝子が、ヒトＩＬ−２遺伝子の転写開始点近傍の−３７８から＋５４の領域配列を含むものである《４》−《９》のいずれかに記載の方法。
《１１》  ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入する試験用細胞がヒト巨核球系列の細胞株である《４》−《１０》のいずれかに記載の方法。
《１２》  ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入する試験用細胞がＰｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ及びＡｎｔｉ  ＣＤ２８  ａｎｔｉｂｏｄｙで刺激されたヒトＴ細胞由来の細胞株であり、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入する試験用細胞がヒト巨核球系列の細胞株である《４》−《１１》のいずれかに記載の方法。
《１３》  ヒトＴ細胞由来の細胞株がＪｕｒｋａｔ細胞である請求項１２に記載の方法。
《１４》  ヒト巨核球系列の細胞株がＨＥＬ細胞である《１１》に記載の方法。
《１５》  ヒト巨核球系列の細胞株がＨＥＬ細胞である《１２》に記載の方法。
《１６》  レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子である《４》−《１５》のいずれかに記載の方法。
《１７》  被験物質がＨＤＡＣ阻害剤であるところの《１》−《１６》のいずれかに記載の選択方法。
《１８》  ＧＡＴＡ−１蛋白の発現量を測定することによる、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
《１９》  次の（１）から（３）からなる血小板減少作用の少ない免疫抑制剤の選択方法。
（１）ＩＬ−２蛋白の発現量を測定する、
（２）ＧＡＴＡ−１蛋白の発現量を測定する、
（３）両者の発現量を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する、
《２０》  以下の（１）（２）で構成される血小板減少作用の少ない免疫抑制剤選択の為の測定用キット。
（１）ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（２）巨核球細胞系列の試験用細胞
《２１》  以下の（１）から（４）で構成される血小板減少作用の少ない免疫抑制剤選択の為の測定用キット。
（１）ＩＬ−２レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（２）ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（３）Ｔ細胞系列の試験用細胞、
（４）巨核球細胞系列の試験用細胞
《２２》  《１７》記載の方法により選択された血小板減少作用が少ないＨＤＡＣ阻害剤。
《２３》  《１》−《１６》のいずれかに記載の選択方法により選択された血小板減少作用の少ない免疫抑制剤。
《２４》  《２２》に記載のＨＤＡＣ阻害剤を有効成分として含む、炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療の為の免疫抑制剤。
《２５》  《２３》に記載の免疫抑制剤を有効成分として含む炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療剤。
《２６》  《２２》に記載のＨＤＡＣ阻害剤を有効成分として含む血小板減少作用が少ない免疫抑制剤を投与することによる、炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療方法。
《２７》  《２３》に記載の免疫抑制剤を有効成分として含む血小板減少作用が少ない免疫抑制剤を投与することによる炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療方法。
《２８》  炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療剤製造の為の《２２》に記載のＨＤＡＣ阻害剤の使用。
《２９》  炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療剤製造の為の《２３》に記載の免疫抑制剤の使用。
以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明は、ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させて当該試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性を測定し、一方、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞を被験物質と共存させて当該試験用細胞におけるＧＡＴＡ−１転写抑制活性を測定し、両者の転写抑制活性を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する方法に関する。
上記発明の『ＩＬ−２レポーター遺伝子』とは、ＩＬ−２遺伝子の転写制御領域とレポーター遺伝子とを人工的に連結させたＤＮＡ構築物（ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を言う。ＩＬ−２遺伝子の転写制御領域としては、例えば、ヒトＩＬ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｘ００６９５，Ｌｏｃｕｓ  ｃｏｄｅ：ＨＳＩＬ０５）の転写開始点付近とその上流領域を含む配列が用いられる。本発明の目的に必須な転写制御領域の範囲としては、単に転写活性を保持しているのみならず、活性型Ｔ細胞における天然のＩＬ−２遺伝子の転写制御様式を実質的に反映したものであることが望ましい。実際に、ヒトＩＬ−２遺伝子に関しては、転写開始点の上流側に位置する約２７５塩基対の領域が存在すれば、ヒトＴ−リンパ芽球由来の細胞株であるＪｕｒｋａｔ（ＪＣＲＢ００６２，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）において、天然のＩＬ−２遺伝子の転写制御様式を実質的に反映したプロモーターとして機能することが報告されている（Ｄ．Ｂ．Ｄｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５，３９５−４０７）。これまでの研究から、この領域には、ＮＦ−ＡＴ，ＯＣＴ−１（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１），ＮＦ−κＢ，ＡＰ−１，ＣＤ２８ＲＣ（ＣＤ２８  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ），ＺＥＢ（ＴＣＦ８，ＮＩＬ−２−Ａ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛋白の結合部位が配置していることがわかっている。従って、そのような蛋白の結合に必須な領域を含んだものであれば、ＩＬ−２レポーター遺伝子の構築に用いる領域としては、どのような長さの配列でもかまわないが、たとえば、配列表９に記載の４３４塩基対の領域（上記ＧｅｎＢａｎｋ配列において、主要な転写開始点を＋１とした場合の−３７８から＋５４に相当する領域）を用いることができる。
ヒトに対して効果的な免疫抑制剤のスクリーニング系を構成する為には、ヒト由来のＩＬ−２遺伝子の転写制御領域を用いることが望ましい。また、マウスやラットなどの動物モデルで有効な化合物をスクリーニングする為には、上記ヒト配列に換えて、それぞれの動物由来のＩＬ−２遺伝子の転写制御領域を用いれば良く、そのようなＤＮＡ構築物は、通常の実験技術を有する当業者によって、容易に構築可能である。
また、上記発明の『ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子』とは、ＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御領域とレポーター遺伝子とを人工的に連結させたＤＮＡ構築物を言う。ＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御領域としては、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ１９６９７１）のＩＥプロモーター領域及びその上流約３．５ｋｂ付近に離れて存在するＨＳＩ領域（ＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性領域）の両方を含むＤＮＡ断片が用いられる。本発明の目的に必須な転写制御領域の範囲としては、単に転写活性を保持しているのみならず、巨核球系細胞における天然のＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御様式を実質的に反映したものであることが望ましい。
先述のように、ＧＡＴＡ−１遺伝子のプロモーターについては、ＩＥプロモーター及びＩＴプロモーターの少なくとも２種類が存在することが知られている。このうち、ＨＤＡＣ阻害剤による血小板減少作用との関連においては、巨核球系細胞における転写制御と密接に関連していることが判明しているＩＥプロモーターの機能が重要と推定され、今回の発明ではその制御領域を利用している。
ＩＥプロモーターによる転写制御には、転写開始点のすぐ上流約０．７ｋｂ内に存在する配列とさらに上流に存在するＨＳＩ領域（ＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性領域）の両方が重要である。ＨＳＩ領域の５’側には、２個のＣＡＣＣ  ｓｉｔｅが存在し、それから約５０塩基対離れて、ＧＡＴＡ結合部位（ＧＡＴＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）とＥ−ｂｏｘモチーフが約１０塩基対離れて隣り合っている。このうちのＧＡＴＡ結合部位を壊すような変異を導入すると、赤血球や巨核球特異的な発現が見られなくなることが知られている（Ｐ．Ｖｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，２７９９−２８１１）。また、このＧＡＴＡ−Ｅ−ｂｏｘモチーフのさらに３’側には、特徴的なパリンドローム配列であるＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧ配列及び、ＧＣに富む領域が存在する。ＧＣに富む領域の中には、転写因子のＥＴＳの結合部位に見られるＧＧＡＡ配列が存在する。これらの配列を含むＧＡＴＡ−１ＨＳＩ領域のうち、５’側のＣＡＣＣ  ｓｉｔｅを欠損させても、赤血球や巨核球特異的な発現が見られるが、ＧＡＴＡ−Ｅ−ｂｏｘ  ｍｏｔｉｆまで欠損させると、発現は消失する。３’側については、最大でもＥ−ｂｏｘの下流約２５０塩基対までを含めば、エンハンサーとして機能することが報告されている。従って、以上のような必須の配列部位をすべて含んでいるならば、実際にはどのような長さの配列でもかまわないが、たとえば、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子のＩＥプロモーターによる転写開始点近傍（−７８９から＋３０：転写開始点を＋１とする）８１９塩基対を含む領域と転写開始点上流のＨＩＳ領域として６３７塩基対（−３７６９から−３１３３）を含む領域を人工的に連結させたものを用いることができる。
ＧＡＴＡ−Ｅ−ｂｏｘ  ｍｏｔｉｆ等の必須な配列部位については、通常の組換えＤＮＡ実験の手法により、それらの必須配列を複数個タンデムに重複させた人工的なＤＮＡ構築物を作製することが可能である。このような人工的構築物を天然の配列と入れ換えて用いることにより、当該転写制御領域の転写誘導活性を増強させることができる場合がある。
また、様々なＨＤＡＣ阻害剤のＧＡＴＡ−１転写抑制活性とマウスやラットなどの動物モデルでの血小板減少作用との相関を確認する為には、上記ヒト配列に換えて、動物由来のＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御領域を用いて、同様のＤＮＡ構築物を作製すればよく、そのようなＤＮＡ構築物の作製は、通常の実験技術を有する当業者によって、容易に実施可能である。
本発明に用いられる『レポーター遺伝子』とは、遺伝子発現の目印となる特異的蛋白質をコードする構造遺伝子領域と下流の非翻訳領域（３’−ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）から構成され、構造遺伝子上流側に本来存在する転写制御領域をすべて欠失したものを言う。遺伝子発現の目印となる特異的蛋白質をコードする構造遺伝子領域については、外来遺伝子断片と人工的に連結させて細胞に導入することにより、当該外来遺伝子断片に含まれる転写制御領域からの遺伝子発現をそのレポーター遺伝子がコードする目印となる蛋白質の機能から容易に測定可能なものであれば、どのようなものでもかまわない。より好ましくは、当該目印となる蛋白質は、通常の哺乳類細胞中で安定的に存在し、同様の活性を示す内在的な蛋白質が当該細胞中に存在しないか、仮に存在しても容易に区別して測定可能なものであることが望ましい。また、より好ましくは、当該目印となる蛋白質をコードするｍＲＮＡは、細胞内で安定的に存在するものであることが望ましい。また、当該目印となる蛋白質の基質は、活性を測定するに際して、新たに添加する必要がないものであるか、あるいは添加を必要とするも、細胞内に容易に十分量取り込まれ得るものであることが望ましい。また、これらによって構成される測定系は、広範囲の直線性と高感度性を兼ね備えたものであることが望ましい。ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）由来のルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）由来のルシフェラーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ，Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、増強型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、β−グルクロニダーゼ（β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ）遺伝子などを用いることが可能である。より好ましくは、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を用いればよい。ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子については、改良型のルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ＋）を用いることにより、測定系の検出感度を上げることができる。構造遺伝子下流の非翻訳領域については、例えばＳＶ４０ウイルスゲノム後期遺伝子由来の配列を用いることができる。
上述のＩＬ−２レポーター遺伝子及びＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子は、それぞれクローニングベクターに連結し、大腸菌を宿主として増幅させる。その際のクローニングベクターとしては、大腸菌で増幅可能な複製開始点と選択マーカーをもったものであれば、特に限定されないが、例えばアンピシリン耐性マーカーと改良型のルシフェラーゼ構造遺伝子（ｌｕｃ＋）をコードしたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などを用いれば、上述のＤＮＡ構築物を容易に作製できる。その後、増幅したベクターを動物細胞に一過的に導入して、レポーター活性を測定すればよい。
ＩＬ−２レポーター遺伝子やＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を動物細胞へ導入する方法としては、通常のりん酸カルシウム法・リポソーム法・リポフェクチン法やエレクトロポーレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法，電気穿孔法）などのいずれかによる形質転換方法を用いればよく、特に限定されない。より好ましくは、エレクトロポーレーション法を用いればよい。
免疫抑制活性を示す化合物を選択する為の系としてＩＬ−２レポーター遺伝子を導入する『試験用細胞』については、その宿主細胞としてＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＣＲＢ００６２，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を用いることができるが、Ｔ細胞由来の細胞株であれば、他の細胞株を用いることも可能である。ところで、シクロスポリンＡ，タクロリムス等の免疫抑制剤の作用メカニズムの研究から、活性化されたＴ細胞においてＩＬ−２の発現が抑制されることが、これらの薬剤による臓器移植後の急性拒絶反応の抑制効果と強く相関することが知られている。従って、被験物質の免疫抑制作用をＩＬ−２レポーター遺伝子を用いて評価する系を構成するに際しては、試験用細胞としては、休止時ではなく活性化時のヒトＴ細胞の状態を実質的に反映した細胞を用いることが必要である。Ｔ細胞では、標的細胞上のＣＤ４／ＣＤ８と抗原ペプチドを提示したＭＨＣ複合体を認識するＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介する第１シグナルと、標的細胞上のＣＤ８０またはＣＤ８６を認識するＣＤ２８を介する第２シグナルの２種類が知られており、Ｔ細胞が活性化されている為には、上記２種類のシグナルの両方を生じるような刺激が同時に与えられているか、あるいはそれらをバイパスする刺激が与えられている必要がある。第１シグナルによって生じる非特異的なＴ細胞の活性化には、一群の蛋白質のリン酸化や細胞内カルシウム濃度の上昇を伴うことが知られているが、その効果は、経験上、１２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅなどのフォルボールエステルやイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）を添加することによって代替され得る。さらにこれに加えて、上記第２シグナルへの刺激として、Ａｎｔｉ  ＣＤ２８  ａｎｔｉｂｏｄｙが用いられうる。従って、本発明に用いられる活性化された試験用細胞は、上記の宿主細胞を、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ及びＡｎｔｉ  ＣＤ２８  ａｎｔｉｂｏｄｙで同時に刺激することによって得ることができる。
同様に、血小板減少作用の少ない化合物を選択するに際しては、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入する『試験用細胞』としては、巨核球系列の細胞の状態を実質的に反映した細胞株を宿主細胞に用いる必要がある。巨核球系列の細胞株であれば、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のＨＥＬ細胞（ＪＣＲＢ００６２，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を用いることができる。
上記本発明の『被験物質』とは、本発明の方法による測定系にかけられる候補物質であれば、特に限定されず、低分子有機化合物、低分子無機化合物、蛋白質や核酸を含む高分子化合物、糖類等のあらゆる化合物を含み、またそれらの混合液、天然物や合成品、動植物や菌類、藻類、微生物からの抽出液のすべてを含む。
上記本発明の『試験用細胞を被験物質と共存』させる方法としては、エレクトロポーレーション法により試験用細胞にＩＬ−２レポーター遺伝子またはＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入する前か後に、その培養液に被験物質を添加すれば良い。より好ましくは、ＩＬ−２レポーター遺伝子またはＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入して約１−２４時間、より好ましくは約３−１２時間後に、その培養液に被験物質を添加して、さらに１−２４時間、より好ましくは、８−１２時間程度培養すれば良い。
上記本発明の『ＩＬ−２転写抑制活性』は、上記のＩＬ−２レポーター遺伝子を導入した試験用細胞において、被験物質を共存させない場合のレポーター遺伝子産物の活性を測定して基準とし、被験物質を共存させた場合のレポーター遺伝子産物の活性と比較することにより求めることができる。レポーター遺伝子産物が十分安定な蛋白質である場合には、この遺伝子産物の活性は、ＩＬ−２遺伝子転写活性にほぼ比例することが期待される。
同様にして、上記本発明の『ＧＡＴＡ−１転写抑制活性』は、上記のＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞において、被験物質を共存させない場合のレポーター遺伝子産物の活性を測定して基準とし、被験物質を共存させた場合のレポーター遺伝子産物の活性と比較することにより求めることができる。
以上述べた方法により、ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入した試験用細胞（例えばＪａｒｋａｔ細胞）とＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を導入した試験用細胞（例えばＨＥＬ細胞）のそれぞれを構築することができる。そして、これらの細胞のそれぞれを様々な被験物質と共存させ、試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性とＧＡＴＡ−１転写抑制活性の強さを、それぞれのレポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定することが可能になる。血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する為には、そのような試験用細胞系においてＩＬ−２の発現を特異的に抑えるがＧＡＴＡ−１の発現を抑制しない物質を選択すればよい。
実際に臨床でより有効な化合物をスクリーニングする為には、それぞれの被検物質の血小板減少作用を、該被検物質の免疫抑制作用の強さとの兼ね合いで評価することが望ましく、すなわち、該被検物質を生体に投与した際にある一定の免疫抑制作用を示す有効用量において、どの程度の血小板減少作用を生じるかが評価の基準となる。これは、より具体的には、以下のように計算される。すなわち、上述の２組のレポーター遺伝子発現系を用いて、それぞれのルシフェラーゼ発現量を定量する。その際、本発明の『ＩＬ−２  ＩＣ５０値』は、被検物質を全く添加していない場合のＩＬ−２レポーター遺伝子の発現量を１００％とし、当該ＩＬ−２レポーター遺伝子の発現量を５０％抑制する被検物質の添加濃度を示しており、薬物用量作用曲線から容易に算出される。この値は、生体において、ある一定の免疫抑制作用を示す有効用量、すなわち例えば免疫抑制作用を示す最小有効用量に相関すると予想される。同様にして、本発明の『ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０値』は、被検物質を全く添加していない場合のＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子の発現量を１００％とし、当該ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子の発現量を５０％抑制する被検物質の添加濃度を示しており、薬物用量作用曲線から容易に算出される。このようにして算出されたＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０値をＩＬ−２  ＩＣ５０値で除した値（（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値）を求めると、この（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値は、それぞれの被検物質を、ある一定の強さの免疫抑制作用を示す用量だけ生体に投与した際に、該用量の該被検物質が示す血小板減少作用の程度に相関すると予想される。すなわち、この（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値は、例えば、それぞれの被検物質を生体に投与した際に免疫抑制作用が見られる最小有効用量における血小板減少作用の強度に相関すると予想される。実際に、レポーターアッセイのデータを基にして、上述のようにして求めた各被検物質の（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値は、それぞれの被検物質をラット心移植モデルに投与した際に免疫抑制活性が見られる最小有効用量での血小板減少率と良く相関することが確かめられている。そして、（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値が、例えば５以上の化合物では、当該ラット心移植モデルにおいて免疫抑制効果を示す最小有効用量を投与した場合の血小板減少率が３０％以下に抑えられることが判明している。
ところで、上記のように、『ＧＡＴＡ−１転写抑制活性』と『ＩＬ−２転写抑制活性』は、それぞれ人工的に構築したＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子あるいはＩＬ−２レポーター遺伝子を細胞に導入して、レポーター遺伝子産物の活性を指標として求めることが望ましいが、前述の転写制御領域をすべて含んだＧＡＴＡ−１遺伝子やＩＬ−２遺伝子をそのまま細胞に導入してＲＴ−ＰＣＲ法やＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ等の方法によりＧＡＴＡ−１ｍＲＮＡやＩＬ−２ｍＲＮＡを定量することにより、その転写活性を測定することも可能である。また、使用する細胞系によっては、細胞に内在する本来のＧＡＴＡ−１遺伝子やＩＬ−２遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲやＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ等の方法によって直接モニターすることによっても、可能な場合がある。通常の実験技術を有する当業者ならば、そのような方法を適宜工夫してアッセイ系を構成することは容易である。
また、本発明は、ＩＬ−２蛋白の発現量を測定し、ＧＡＴＡ−１蛋白の発現量を測定し、両者の発現量を比較することにより、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤を選択する方法に関する。
上記発明の『ＩＬ−２蛋白の発現量』は、ＩＬ−２レポーター遺伝子を導入しない前記試験用細胞の抽出液を被検物質で処理し、ＩＬ−２蛋白の発現量を、抗ＩＬ−２抗体及び、標識化された２次抗体を用いて測定することができる。その手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅ．Ｅｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を利用することができ、当業者であれば、容易に実施可能である。上記手法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。
上記２次抗体を標識するにあたり使用される標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
同様の手法により、上記発明の『ＧＡＴＡ−１蛋白の発現量』は、抗ＧＡＴＡ−１抗体及び、標識化された２次抗体を用いて測定することができる。
また、本発明は、ＩＬ−２レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、Ｔ細胞系列の試験用細胞、巨核球細胞系列の試験用細胞で構成される血小板減少作用の少ない免疫抑制剤選択の為の測定用キットに関する。
上記発明の『血小板減少作用の少ない免疫抑制剤選択の為の測定用キット』は、ＩＬ−２レポーター遺伝子とＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子のそれぞれを導入した試験用細胞を被験物質と共存させ、試験用細胞におけるＩＬ−２転写抑制活性とＧＡＴＡ−１転写抑制活性の強さを、ＩＬ−２レポーター遺伝子とＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子の発現を指標として検出し、測定することができればよい。具体的には、以下の（１）から（４）によって構成することができる。
（１）Ｌ−２レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（２）ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物、
（３）Ｔ細胞系列の試験用細胞、より好ましくは、Ｊｕｒｋａｔ細胞
（４）巨核球細胞系列の試験用細胞、より好ましくは、ＨＥＬ細胞
上記発明の『ＤＮＡ構築物』とは、上述のＩＬ−２レポーター遺伝子またはＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子を含むＤＮＡで、クローニングベクターに組込まれたものでも、組込まれないものでもよく、また環状でも線状でもかまわない。
また、本発明は、ＩＬ−２転写抑制活性として（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値を測定し、ＧＡＴＡ−１転写抑制活性として（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）値を測定し、その両者を比較して、（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値が５以上を示すものを選択することにより得られた化合物を有効成分として含む炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，臓器移植片拒絶，自己免疫疾患，癌の治療方法及び治療剤に関する。
前述の評価方法に基づいて、ＩＬ−２転写抑制活性として（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値を測定し、ＧＡＴＡ−１転写抑制活性として（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）値を測定し、その両者を比較して、（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）／（ＩＬ−２  ＩＣ５０）値が５以上を示すものを選択することにより得られた化合物は、血小板減少作用の少ない免疫抑制剤として臓器移植片拒絶，自己免疫疾患の治療や予防に有用である。そして、遺伝子発現の異常によって発症すると思われる以下のような疾患の治療や予防に有用である。
炎症性疾患，糖尿病，糖尿病性合併症，ホモ接合型サラセミア，繊維症，肝硬変，急性前骨髄球性白血病，原虫感染症，癌
本発明においてこれらを医薬品として用いる場合には、それ自体として医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、験濁剤等、製剤に用いられる公知のものと適宜組み合わせた医薬製剤の形態、例えば固体、半固体または液体（例えば錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、坐薬、クリーム剤、軟膏剤、エアロゾル剤、散剤、液剤、乳剤、懸濁剤など）で用いることができる。
患者への投与は、鼻、眼、外部（局所）、直腸、肺（鼻または口内注入）、経口または非経口（皮下、静脈および筋肉内を含む）投与または吸入に適している。注射剤の投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の公知の方法により行なうことができる。
本発明の治療剤の投与量は、所望の治療効果を生じるに足りる量であればよい。当該化合物の治療有効量は、例えば非経口投与による場合には、通常は、１日当たり約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１６ｍｇを投与することが好ましい。有効な１回投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１ｍｇの範囲、好ましくは０．０１〜０．１６ｍｇの範囲内で選択される。しかしながら、上記の投与量は、処置すべき各個の患者の体重、年齢及び病状、並びに、用いる投与方法等により変わるものである。通常の実験手法を有する当業者であれば、動物実験等のデータを基にして、より適切な投与量を適宜選択することが可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、血中の血小板数（ｎ＝５）が、ＨＤＡＣ阻害薬化合物Ｂの投与量に依存して減少することを示した図面である。
図２は、脾臓内の巨核球数（ｎ＝５）が、ＨＤＡＣ阻害薬化合物Ｂの投与量に依存して増加することを示した図面である。
図３は、ＧＰＩＩｂを内部標準として測定した脾臓内の単位巨核球あたりのＧＡＴＡ−１の発現量（ｎ＝５）が、ＨＤＡＣ阻害薬化合物Ｂの投与量に依存して抑制されることを示した図面である。
図４は、プラスミッドｐＧＬ３  ＩＬ−２  Ｐｒｏ４３のマップを示す。
図５は、プラスミッドｐＧＬ３−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒのマップを示す。
図６は、プラスミッドｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒのマップを示す。
図７は、ＩＬ−２レポーター遺伝子におけるルシフェラーゼ活性が、化合物Ｄ濃度依存的に阻害されることを示した図面である。
図８は、ＩＬ−２レポーター遺伝子アッセイ系における細胞増殖が、化合物Ｄ濃度非依存的であることを示した図面である。
図９は、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子におけるルシフェラーゼ活性が、化合物Ｄ濃度依存的に阻害されることを示した図面である。
図１０は、ＧＡＴＡ−１レポーター遺伝子アッセイ系における細胞増殖が、化合物Ｄ濃度非依存的であることを示した図面である。
図１１は、ＨＤＡＣ阻害剤によるラットでの免疫抑制作用及び血小板減少作用と細胞レベルでのＩＬ−２びＧＡＴＡ−１転写抑制作用に対する相関を示す。
図１２は、２種類のＨＤＡＣ阻害薬（それぞれ２種類の濃度）がＧＡＴＡ−１遺伝子の転写に及ぼす効果のパターンを示した図面である。
図１３は、２種類のＨＤＡＣ阻害薬（それぞれ２種類の濃度）が１２，６２６種類の遺伝子より選ばれた４５種類の遺伝子の転写に及ぼす効果のパターンを示しており、これらの遺伝子のＨＤＡＣ阻害薬による転写抑制のパターンがＧＡＴＡ−１遺伝子の場合と類似していることを示している。
図１４（ａ）は、Ｃ／ＥＢＰβ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄで用いられたＣ／ＥＢＰβの結合配列を示している。
図１４（ｂ）は、ＨＳＥ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄで用いられたＨＳＦ１（またはＨＳＦ２）の結合配列を示している。
図１４（ｃ）は、ｐＳＴＡＴ３  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄで用いられたＳＴＡＴ３の結合配列を示している。
図１５は、ＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）の配列を示す。変異導入箇所は、大文字で表わされている。
図１６は、ＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）領域の配列を示す。変異導入箇所は、大文字で表わされている。
【発明を実施するための最良の形態】  以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されない。また本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例１  ＨＤＡＣ阻害薬投与による血小板減少作用の確認
８週齢の雄性ＬｅｗｉｓラットにＨＤＡＣ阻害薬化合物Ｂを７日間経口投与した。群構成は投与量０，３．２ｍｇ／ｋｇ，および１０ｍｇ／ｋｇの３群とし、１群５例のラットを供した。最終投与の３時間後に採血して、血小板数を測定した。
図１に、このようにして測定された各群の血小板数を示す。化合物Ｂの投与量に依存して血小板数の減少が認められることが示された。
次に、採血後のラットから脾臓をサンプリングし、その下縁部の一部を巨核球数のカウント用に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて固定し、パラフィン切片を常法により作製し、ＨＥ染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を施した。各個体について１切片上の巨核球数を、対物１０倍のレンズを用いて明視野下にてカウントし、その数を切片の面積で除算したものを脾臓内の巨核球数とした。
図２に、このようにしてカウントされた巨核球数の群平均を示す。化合物Ｂの投与量依存的に脾臓内の巨核球数が増加することが示された。
実施例２  ＨＤＡＣ阻害薬を投与したラット脾臓におけるＧＡＴＡ−１  ｍＲＮＡの定量
実施例１でサンプリングした脾臓の残りをすべて凍結後、ＲＮｅａｓｙ（ＲＮＡ抽出キット）をもちいてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、これを鋳型として、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ法にてｃＤＮＡを合成した。続いてこのｃＤＮＡを鋳型としてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ＳＹＢＲ法）によりＧＡＴＡ−１のｃＤＮＡを増幅させ、その増殖曲線によりＧＡＴＡ−１のｍＲＮＡ量を定量した。
巨核球１個あたりのＧＡＴＡ−１の転写量を正確に定量する為に、巨核球で特異的に発現し、ＨＤＡＣ阻害薬の投与によっても、巨核球１個あたりでの発現量にあまり変動をきたさない遺伝子をｍＲＮＡ定量の内部標準として用いる必要がある。そこで、巨核球系の培養細胞であるＨＥＬ細胞におけるＨＤＡＣ阻害薬による遺伝子発現の変動をＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて解析し、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ（ＧＰＩＩｂ）を内部標準として選択した。
図３にそのＧＰＩＩｂを内部標準として測定したＧＡＴＡ−１の発現量を示した。ＨＤＡＣ阻害薬化合物Ｂの投与量に依存してＧＡＴＡ−１の転写抑制が認められた。
以上の実験結果から、ＨＤＡＣ阻害薬投与によって血小板減少が認めらたラットにおいて、巨核球でのＧＡＴＡ−１の転写抑制が見られることが判明した。
実施例３  ＩＬ−２  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用のレポーター遺伝子プラスミッドの構築
ヒトＩＬ−２遺伝子転写開始点近傍の−６７４〜＋５４の領域（ＩＬ−２遺伝子の主要な転写開始点を＋１とする）をカバーするＤＮＡ断片を、ヒトＴ細胞由来のＪｕｒｋａｔ細胞より単離したＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法により取得した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を、配列表の配列番号１及び２に示す。これらプライマーは遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋに記載されたヒトＩＬ−２遺伝子配列（Ｌｏｃｕｓ  ｃｏｄｅ：ＨＳＩＬ０５，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｘ００６９５）に基づいて設計され、その末端には、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用ベクターに挿入するための制限酵素認識部位が付加された。すなわち、増幅ＤＮＡ断片のプロモーター上流側にはＮｈｅ  Ｉ認識部位、プロモーター下流側にＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識部位が形成されるように設計された。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ４（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に挿入し、得られたプラスミッドから挿入領域の塩基配列を確認した。その結果、上記のＧｅｎＢａｎｋに記載されたＩＬ−２遺伝子のプロモーター配列と比較して、３ヶ所の塩基置換、１ヶ所の２塩基挿入及び１ヶ所の１塩基挿入部位を除いて、一致することが確認された。その７３１塩基対からなる全塩基配列を、配列番号８に示す。このようにして得られたプラスミッドをＮｈｅ  Ｉ認識部位及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識部位で切断して、さらに得られた断片を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用ベクターｐＧＬ３  ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＮｈｅ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入した。これにより、ヒトＩＬ−２遺伝子の転写開始点近傍の−６７４〜＋５４の領域７２８塩基対に相当する７３１塩基対のＤＮＡ配列をホタルルシフェラーゼ遺伝子上流に有するプラスミッドｐＧＬ３  ＩＬ−２  Ｐｒｏを得た。
次に、ｐＧＬ３  ＩＬ−２  Ｐｒｏを鋳型にして、ヒトＩＬ−２遺伝子の転写開始点近傍の−３７８〜＋５４の領域をカバーするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法により取得した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を、配列表の配列番号３及び２に示す。配列番号３のプライマーは前述のｐＧＬ３  ＩＬ−２  Ｐｒｏに挿入されているＤＮＡ配列を元に設計された。プライマーの末端には、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用ベクターに挿入するための、制限酵素認識部位が付加されており、増幅ＤＮＡ断片においてプロモーター上流側にＮｈｅ  Ｉ認識部位、プロモーター下流側にＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識部位を有するように設計されている。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ４に挿入し、得られたプラスミッドを用いて、その挿入領域の塩基配列を確認した。この挿入領域は、ＧｅｎＢａｎｋのＬｏｃｕｓ  ｃｏｄｅ：ＨＳＩＬ０５に記載されたＩＬ−２のプロモーター配列の−３７８〜＋５４の領域と比較すると、２ヶ所の塩基置換部位と１ヶ所の２塩基挿入部位を除いて、他は一致した。４３４塩基対からなるその全塩基配列を配列番号９に示す。このようにして得られたプラスミッドをＮｈｅ  Ｉ認識部位及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識部位で切断し、得られた断片を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用ベクターｐＧＬ３  ｂａｓｉｃのＮｈｅ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入した。これにより、ヒトＩＬ−２遺伝子転写開始点近傍−３７８〜＋５４の４３２塩基対に相当する４３４塩基対のプロモーター配列をホタルルシフェラーゼ遺伝子上流に有するプラスミッドｐＧＬ３  ＩＬ−２  Ｐｒｏ４３を得た（図４）。
実施例４  ＧＡＴＡ−１  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用のレポーター遺伝子プラスミッドの構築
ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子転写開始点近傍の−７８９〜＋３０の領域、８１９塩基対断片を、ヒトＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法により取得した。ＰＣＲには、配列表の配列番号４及び５に示したプライマーを用いた。これらプライマーは遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１９６９７１に記載されたヒトＧＡＴＡ−１遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用ベクターに挿入するための制限酵素認識部位を付加して、増幅ＤＮＡ断片のプロモーター上流側にＢｇｌ  ＩＩ認識部位、プロモーター下流側にＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識部位が形成されるようにした。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ４に挿入した。得られたプラスミッドを用いて、挿入領域の塩基配列を確認したところ、ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１９６９７１に記載されたＧＡＴＡ−１のプロモーター配列と完全に一致していた。その全塩基配列を配列番号１０に示す。さらに、得られたプラスミッドをＮｈｅ  Ｉ認識部位及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識部位で切断した。得られた断片を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用ベクターｐＧＬ３  ｂａｓｉｃのＮｈｅ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入した。これにより、ＧＡＴＡ−１遺伝子のプロモーター領域−７８９〜＋３０の８１９塩基対の配列をホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に有するプラスミッドｐＧＬ３−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒを得た（図５）。
次に、ヒトＧＡＴＡ−１遺伝子転写開始点上流−３７６９〜−３１３３の領域、６３７塩基対断片を、ヒト染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法により取得した。ＰＣＲには、配列表の配列番号６及び７に示したプライマーを用いた。これらプライマーは遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１９６９７１に記載されたヒトＧＡＴＡ−１遺伝子配列に従って設計され、プライマー末端には、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ用ベクターに挿入するための制限酵素認識部位が付加されて、増幅ＤＮＡ断片のプロモーター上流側にＫｐｎ  Ｉ認識部位、プロモーター下流側にＮｈｅ  Ｉ認識部位が形成されるようにした。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ４に挿入し、得られたプラスミッドを用いて、挿入領域の塩基配列を確認したところ、ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１９６９７１に記載されたＧＡＴＡ−１遺伝子の転写開始点上流配列と完全に一致していた。６３７塩基対からなるその全塩基配列を配列番号１１に示す。このようにして得られたプラスミッドをＫｐｎ  Ｉ認識部位及びＮｈｅ  Ｉ認識部位で切断し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＧＬ３−ＩＥ  ＰｒｏｍｏｔｅｒのＫｐｎ  Ｉ−Ｎｈｅ  Ｉ部位に挿入した。これにより、ＧＡＴＡ−１遺伝子の転写開始点上流−３７６９〜−３１３３の領域の６３７塩基対、及び−７８９〜＋３０の８１９塩基対の配列をホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に有するプラスミッドｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒを得た（図６）。
実施例５  ＩＬ−２転写抑制作用を有するＨＤＡＣ阻害剤のスクリーニング系の構築
実施例３で得られた１μｇのｐＧＬ３  ＩＬ−２  Ｐｒｏ４３と６μｇの任意のキャリヤープラスミッドを混和し、エレクトロポレーション法（電圧３００Ｖ、電荷９７５μＦ、４００μＬ）により、１ｘ１０７  ｃｅｌｌｓのＪｕｒｋａｔ細胞を形質転換した。形質転換後、２．５ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０（１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０）を加え、５０μＬ／ｗｅｌｌの割合で、９６−ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅに分注した。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で１２時間培養後、終濃度の４倍濃度の化合物Ｄ（ＨＤＡＣ阻害剤）を含む１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、更にＰｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ，ＳＩＧＭＡ）、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ）、Ａｎｔｉ  ＣＤ２８  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０で混合した液２５μＬ／ｗｅｌｌずつ加え（終濃度それぞれ５０ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞を刺激した。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で１２時間培養後、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のマニュアルに従い、細胞内のルシフェラーゼ活性を、マルチラベルカウンター（１４２０  ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ  ＣＯＵＮＴＥＲ  ＡＲＶＯ  ＳＸ，ＷＡＬＬＡＣ）により測定した。その結果、ＰＭＡ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、Ａｎｔｉ  ＣＤ２８  ａｎｔｉｂｏｄｙによるＪａｒｋａｔ細胞へに刺激に応答して、ｐＧＬ３  ＩＬ−２  Ｐｒｏ４３からルシフェラーゼが誘導されることがわかった（図７）。更に、誘導されるルシフェラーゼの発現量は、化合物Ｄにより用量依存的に抑制されることがわかった（図７）。また、化合物Ｄによるルシフェラーゼの発現量の抑制が、化合物Ｄによって細胞が何らかの障害を受けた結果ではないことは、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を用いて確認した（図８）。以上の結果から、本アッセイ系が、ＩＬ−２転写抑制作用を有するＨＤＡＣ阻害剤のスクリーニングに使用可能なことがわかった。
実施例６  ＧＡＴＡ−１転写抑制作用を有するＨＤＡＣ阻害剤化合物Ｄのスクリーニング系の構築
実施例２で得られた１５μｇのｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒを用いて、エレクトロポレーション法（電圧１７５０Ｖ、電荷１０μＦ、３６５μＬ）により、８．７５ｘ１０６  ｃｅｌｌｓのＨＥＬ細胞（ＪＣＲＢ００６２、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を形質転換した。形質転換後、２ｍＬの１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０を加え、５０μＬ／ｗｅｌｌの割合で、９６−ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅに分注した。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で３時間培養後、終濃度の２倍濃度のＨＤＡＣ阻害剤化合物Ｄを含む１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で８時間培養後、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のマニュアルに従い、細胞内のルシフェラーゼ活性を、マルチラベルカウンターにより測定した。その結果、ｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  ＰｒｏｍｏｔｅｒからＧＡＴＡ−１のプロモーターに依存したルシフェラーゼが誘導され、更に、誘導されるルシフェラーゼの発現量は、化合物Ｄにより用量依存的に抑制されることがわかった（図９）。また、化合物Ｄによるルシフェラーゼの発現量の抑制が、化合物Ｄによって細胞が何らかの障害を受けた結果ではないことは、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を用いて確認した（図１０）。以上の結果から、本アッセイ系が、ＧＡＴＡ−１転写抑制作用を有するＨＤＡＣ阻害剤のスクリーニングに使用可能なことがわかった。
実施例７  免疫抑制作用を有するＨＤＡＣ阻害剤のラット心移植の最小有効用量における血小板減少率の確認
被験物質としてランダムに選んだＨＤＡＣ阻害剤９化合物（表１及び表２に示す）について、ＡＣＩラットをドナー（Ｄｏｎｏｒ）、Ｌｅｗｉｓラットをレシピエント（Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）とした頸部への異所性心移植（Ｃｕｆｆ法）モデルにおいて評価した。各化合物は１０％ＨＣＯ−６０（Ｐｏｌｙｏｘｙｌ  ６０  Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  Ｃａｓｔｏｒ  Ｏｉｌ）／Ｗａｔｅｒを溶媒として経口にて、或いは１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅを溶媒として皮下にて、移植当日から１日１回・１４日間連日投与した。心拍動の停止を拒絶と判断し、その前日までを生着日数とした。尚、対照群（溶媒投与群）の生着日数の中央値が５日であることから、８日以上の中央値をもって有効と判断し、それぞれの最小有効用量を求めた。【０００１】  次に、それぞれ求めた最小有効用量の薬剤量を、正常Ｌｅｗｉｓラットに薬効試験と同一の投与経路にて１日１回計７回投与した。最終投与日翌田こ採血し、各個体の血小板数を測定し、各群（ｎ＝４）の平均値から対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する減少率（％）を求めた。
表１及び表２に、このようにして求めた各種ＨＤＡＣ阻害剤のラット心移植モデルにおける最小有効用量と血小板減少率を示す。最小有効用量と判断される用量を下線太字で示した。
【表１】
2004007758.tif 000002
【表２】
2004007758.tif 000003
【実施例８】    免疫作用を有しかつ血小板減少作用の少ないＨＤＡＣ阻害剤を選択する方法
被験物質として表３に示す化合物を使用し、実施例３に示したＩＬ−２転写抑制作用を有するＨＤＡＣ阻害剤のスクリーニング方法を用いてアッセイを行い、被験物質を添加していない場合のルシフェラーゼの発現量を１００％とした場合の薬物用量作用曲線から、ルシフェラーゼの発現量を５０％抑制する薬物濃度を、薬物によるＩＬ−２の転写抑制に対するＩＣ５０値（ＩＬ−２  ＩＣ５０）として算出した（表３）。次に、被験物質として表１に示す化合物を使用し、実施例４に示したＧＡＴＡ−１転写抑制作用を有するＨＤＡＣ阻害剤のスクリーニング方法を用いてアッセイを行い、被験物質を添加していない場合のルシフェラーゼの発現量を１００％とした場合の薬物用量作用曲線から、ルシフェラーゼの発現量を５０％抑制する薬物濃度を、薬物によるＧＡＴＡ−１の転写抑制に対するＩＣ５０値（ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０）として算出した（表３）。更に、ＧＡＴＡ−１  ＩＣ５０をＩＬ−２  ＩＣ５０で除した値を、Ｇ／Ｉ比として求めた（表３）。実施例５で得られた被験物質のラット心移植の最小有効用量での血小板減少率と、本実施例で得られたＧ／Ｉ比をプロットしたところ（図１１）、良好な相関が得られた。そして、Ｇ／Ｉ比が、５以上の化合物では、ラット心移植モデルにおいて免疫抑制効果を示す最小有効用量で、血小板減少率が３０％以下に抑えられていることがわかった。以上の結果から、本アッセイ系が、免疫作用を有しかつ血小板減少作用を起こしにくいＨＤＡＣ阻害剤をスクリーニングするのに適した方法であることが確認された。
【表３】
2004007758.tif 000004
【実施例９】ＨＤＡＣ阻害剤による血小板減少作用に関与する転写因子のＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を用いた探索
巨核球で発現している遺伝子の中から、ＨＤＡＣ阻害薬でＧＡＴＡ−１と同様のパターンで転写が抑制される遺伝子をＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて選別してグループ化し、それらの遺伝子群に共通な転写因子を探索した。
ヒト巨核球系培養細胞ＨＥＬ細胞を血小板減少作用が見られる２種類のＨＤＡＣ阻害薬（５００ｎＭ及び１５００ｎＭの化合物Ａ，１００ｎＭ及び３００ｎＭの化合物Ｄ）で８時間処理し、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡ合成し、さらにＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｅｉｌｄ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて蛍光標識のｃＲＮＡを合成した。得られた蛍光標識のｃＲＮＡをプローブとし、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて１２，６２６種類の遺伝子についてその発現パターンを調べた。
ＧＡＴＡ−１遺伝子の転写に及ぼす上記２種類のＨＤＡＣ阻害薬の効果は、図１２のパターンを示した。遺伝子発現解析ツールＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）による発現パターンの比較解析の結果、このＧＡＴＡ−１遺伝子と同様のパターンによってＨＤＡＣ阻害薬により転写抑制される遺伝子が、４５種類見出された（図１３）。これらの遺伝子の中から、さらに、血球分化に関わる機能を有すると想定される転写因子の候補遺伝子あるいは巨核球マーカー遺伝子と想定される候補遺伝子を絞り込み、以下の１０遺伝子を得た。
ＳＣＬ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６３５８９：Ｐ．Ｄ．Ａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０（１２），６４２６−６４３５）
ＮＦ−Ｅ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｓ７７７６３：Ｃ．Ｐｉｓｃｈｅｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（８），３５１１−３５１５）
ＥＫＬＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ６５４０４：Ｊ．Ｈ．ｖａｎ  Ｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３９（３），３９３−３９５）
Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０７７４３：Ｍ．Ｔｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３３（６１７２），４７０−４７３）
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６２４２４：Ｔ．Ｋ．Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４（６），１０５７−１０６８）
ＬＭ０２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６１１１８：Ｂ．Ｒｏｙｅｒ−Ｐｏｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６（１０），１８８７−１８９３）
ＰＵ．１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５２０５６：Ｄ．Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５（５），６６３−６６８）
Ｆｌｉ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ９８８３３：Ｄ．Ｋ．Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．３（１０），７０５−７１３）
ＡＭＬ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄ４３９６８：Ｈ．Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８（２３），１０４３１−１０４３４）
ＴＣＦ１１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ２４１２３：Ｊ．Ｙ．Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２３），１１３７１−１１３７５）
次に、ヒトゲノムの配列情報（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  Ｌｉｎｋ）より上記の各遺伝子転写開始部位上流２ｋｂの配列情報をダウンロードし、転写制御領域予測支援システムＴＲＡＮＳＦＡＣ（Ｅ．Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８，３１６−３１９，ＴＲＡＮＳＦＡＣ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．）に基づき、転写因子データベース（Ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ＴＲＡＮＳＦＡＣ商標登録Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ６．３，ＢＩＯＢＡＳＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ／Ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｄａｔｅｎｂａｎｋｅｎ  ＧｍｂＨ）を検索して、ヒト由来の各ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列に共通して存在する転写因子結合配列を調べた。その際、ＨＤＡＣ阻害薬にて発現抑制を受けた上記の各遺伝子の転写開始点上流２ｋｂ以内の転写制御領域において、大半の遺伝子に共通して存在する転写因子結合配列のうち、さらに、ＧＡＴＡ−１遺伝子ＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ及びＨＳＩ領域のいずれにおいても共通して存在する配列を中心に絞り込んだ。その結果、ＨＤＡＣ阻害剤による上記各遺伝子の発現抑制に関与する転写因子の候補として以下の▲１▼から▲４▼の４種類を見出した。
▲１▼  ＳＴＡＴ３：ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３（ａｃｕｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）
▲２▼Ｃ／ＥＢＰβ：ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ），ｂｅｔａ
▲３▼  ＨＳＦ１（又はＨＳＦ２）：ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １（又はｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２）
▲４▼  ＧＡＴＡ−１：ＧＡＴＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １
【実施例１０】ＳＴＡＴ３、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＳＦ１が認識する応答配列を有するレポーター遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ベクターの構築
ＨＤＡＣ阻害薬によるＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御に関与する転写因子候補であるＳＴＡＴ３、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＳＦ１およびＧＡＴＡ−１の４種類のうち、ＳＴＡＴ３、Ｃ／ＥＢＰβおよびＨＳＦ１（またはＨＳＦ２）の３種類の転写因子に関して、各転写因子が認識する応答配列を有するレポーター遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ベクターを構築した。
（Ｃ／ＥＢＰβ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）
これまでに報告されているＣ／ＥＢＰβが認識するコンセンサス配列（Ｍ．Ｒｏｓａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６７，１６５４−１６６２，ＣＣＡＡＴ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  β（Ｃ／ＥＢＰβ）Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＣＣＲ５  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｃ／ＥＢＰβ  ａｎｄ  ＣＣＲ５  ｉｎ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ＨＩＶ−１−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．）（Ｓ．Ｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１，３８９１−３８９６，ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｆａｍｉｌｙ．）を５個連結した以下の配列で示されるＣＥＢＰ−１１及びＣＥＢＰ−１２を設計し、それらの合成ＤＮＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を得た。
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上記２種の合成ＤＮＡを混合してアニーリングすることにより、図１４（ａ）に示されるＣ／ＥＢＰβ結合配列の断片を得た。この断片を、ＴＡ最小プロモーター（ＴＡ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有するｐＴＡ−Ｌｕｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマルチクローニングサイトＭｌｕＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＣ／ＥＢＰβ−ＴＡ−Ｌｕｃを得た。一方、ｐＴＡＬ−Ｌｕｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ処理してＴＡＬプロモーター配列及びホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ）Ｎ末端側領域をコードする約０．７ｋｂ断片を得た。この断片を、ｐＣ／ＥＢＰβ−ＴＡ−ＬｕｃをＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ処理して得られた約４．２ｋｂ断片と連結させることにより、Ｃ／ＥＢＰβ結合配列の下流にＴＡＬプロモーター配列及びホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＣ／ＥＢＰβ  レポータープラスミッドであるｐＣ／ＥＢＰβ−ＴＡＬ−Ｌｕｃを得た。
（ＨＳＥ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）
ｐＨＳＥ−ＴＡＬ−Ｌｕｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）で用いられているＨＳＥ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列に従い、以下の配列で示されるＨＳＥ−１１及びＨＳＥ−１２を設計し、それらの合成ＤＮＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を得た。
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上記２種の合成ＤＮＡを混合してアニーリングすることにより、図１４（ｂ）に示されるＨＳＥ配列の断片を得た。この断片を、ｐＴＡ−Ｌｕｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＭｌｕＩ／ＸｈｏＩ処理して得られた約４．９ｋｂ断片と連結させることにより、ｐＨＳＥ−ＴＡ−Ｌｕｃを得た。一方、ｐＴＡＬ−Ｌｕｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ処理してＴＡＬプロモーター配列及びホタルルシフェラーゼ遺伝子Ｎ末端側領域をコードする約０．７ｋｂ断片を得た。この断片を、ｐＨＳＥ−ＴＡ−ＬｕｃをＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ処理して得られた約４．２ｋｂ断片と連結させることにより、ＨＳＥ配列の下流にＴＡＬプロモーター配列及びホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＨＳＦ１レポータープラスミッドであるｐＨＳＥ−ＴＡＬ−Ｌｕｃを得た。
（ｐＳＴＡＴ３  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）
ｐＴＡＬ−Ｌｕｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ処理してＴＡＬプロモーター配列及びホタルルシフェラーゼ遺伝子Ｎ末端側領域をコードする約０．７ｋｂ断片を得た。この断片を、ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ処理して得られた約４．２ｋｂ断片と連結させることにより、図１４（ｃ）に示されるＳＴＡＴ３結合配列の下流にＴＡＬプロモーター配列及びホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＳＴＡＴ３レポータープラスミッドであるｐＳＴＡＴ３−ＴＡＬ−Ｌｕｃを得た。
【実施例１１】ＨＤＡＣ阻害薬のＳＴＡＴ３、Ｃ／ＥＢＰβおよびＨＳＦ１転写活性に対する作用
実施例１０で得られた１５μｇのｐＣ／ＥＢＰβ−ＴＡＬ−Ｌｕｃ、ｐＨＳＥ−ＴＡＬ−Ｌｕｃ、ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃのそれぞれを用いて、エレクトロポレーション法（電圧１７５０Ｖ、電荷１０μＦ、３６５μＬ）により、８．７５ｘ１０６  ｃｅｌｌｓのＨＥＬ細胞を形質転換した。形質転換後、２ｍＬの１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０に懸濁し、５０μＬ／ｗｅｌｌの割合で、９６−ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅに分注した。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で３時間培養後、終濃度の２倍濃度のＨＤＡＣ阻害薬化合物Ｄを含む１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で８時間培養後、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のマニュアルに従い、細胞内のルシフェラーゼ活性を、マルチラベルカウンターにより測定した。その結果、ｐＣ／ＥＢＰβ−ＴＡＬ−Ｌｕｃ、ｐＨＳＥ−ＴＡＬ−Ｌｕｃ、ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−ＬｕｃからそれぞれＣ／ＥＢＰβ、ＨＳＦ１およびＳＴＡＴ３の転写活性に依存したルシフェラーゼが誘導された。これらのルシフェラーゼの活性の誘導は、化合物Ｄにより抑制を受けなかった（表４）。以上の結果から、ＨＤＡＣ阻害薬によるＧＡＴＡ−１転写抑制作用はＣ／ＥＢＰβ、ＨＳＦ１（またはＨＳＦ２）およびＳＴＡＴ３の転写活性化阻害によるものではないことが明らかとなった。
【表４】
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【実施例１２】ＧＡＴＡ−１プロモーター内のＧＡＴＡ−１認識部位全てに変異を導入した変異プロモーターを有するレポーター遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ベクターの構築
ＧＡＴＡ−１プロモーター内にはＧＡＴＡ−１自身が認識する応答配列（ＧＡＴＡ配列）が存在している。ＨＤＡＣ阻害薬によるＧＡＴＡ−１遺伝子の転写制御がこのＧＡＴＡ配列を介した転写制御系と関連するかどうかを調べる目的で、ＧＡＴＡ配列内に変異を導入してＧＡＴＡ−１自身が認識する応答配列を消失させたプロモーターを人工的に構築し、レポーター遺伝子と連結させたベクターの構築を行なった。
即ち、ＧＡＴＡ−１遺伝子ＩＥプロモーター領域のＧＡＴＡ配列５箇所に変異を導入したＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）約０．８４ｋｂを、ＰＣＲ法を利用して人工的に構築した。その際、実施例４で得られたｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  ＤＮＡを１度目のＰＣＲにおけるテンプレートとし用い、当該ｐｒｏｍｏｔｅｒ領域の両端及び各変異導入配列に対応した合成プライマーを用いて、領域端または各変異導入箇所で挟まれる断片を増幅させた。このようにして得られたＰＣＲ後の生成物を混合して再度のＰＣＲ反応のテンプレートとして用い、合成プライマーの種類を絞り込むことによって、より長い領域を増幅させた。さらに、このようなＰＣＲを繰り返すことによって、領域両端に対応した合成プライマー対によりＩＥプロモーター領域全域に相当するＰＣＲ断片を得たので、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ挿入し、塩基配列を決定して設計どうりに変異が導入されていることを確認した。図１５にそのようにして確認されたＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）の配列を示す。変異導入部分は下線で示されており、両末端には、それぞれＢｇｌ  ＩＩ  ｓｉｔｅ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ  ｓｉｔｅが導入されている。このＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）全域を含むＢｇｌ  ＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片をｐＧＬ３のＢｇｌ  ＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｓｉｔｅ間に挿入して、ｐＧＬ３−ＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）を得た。
また、同様のＰＣＲを用いる手法によって、ＧＡＴＡ−１遺伝子ＨＳＩ領域のＧＡＴＡ配列２箇所に変異を導入したＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）領域約０．６５ｋｂを、実施例４で得られたｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  ＤＮＡを１度目のＰＣＲにおけるテンプレートとして人工的に構築した。得られたＰＣＲ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ挿入し、塩基配列を決定して変異導入を確認した。図１６にそのようにして確認されたＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）領域の配列を示す。変異導入部分は下線で示されており、両末端には、それぞれＭｌｕ  Ｉ  ｓｉｔｅ及びＢｇｌ  ＩＩ  ｓｉｔｅが導入されている。このＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）領域全域を含むＭｌｕ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ断片をｐＴＡＬ−ＬｕｃのＭｌｕ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ  ｓｉｔｅ間に挿入して、ｐＴＡＬ−ＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）−Ｌｕｃを得た。さらに、ｐＴＡＬ−ＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）−ＬｕｃのＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）領域全域を含むＫｐｎ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ断片をｐＧＬ３−ＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）のＫｐｎ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ間へ挿入して、ＩＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）全域とＨＳＩ（ｍｕｔａｎｔ）領域全域を含むｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）を得た。
【実施例１３】ＨＤＡＣ阻害薬のＧＡＴＡ−１転写活性に対する作用
実施例４で得られた１５μｇのｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒおよび実施例１２で得られたｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）を用いて、エレクトロポレーション法（電圧１，７５０Ｖ、電荷１０μＦ、３６５μＬ）により、８．７５ｘ１０６  ｃｅｌｌｓのＨＥＬ細胞を形質転換した。形質転換後、２ｍＬの１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０に縣濁し、５０μＬ／ｗｅｌｌの割合で、９６−ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅに分注した。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で３時間培養後、終濃度の２倍濃度のＨＤＡＣ阻害薬化合物Ａ、Ｃ、Ｄを含む１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度条件下で８時間培養後、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のマニュアルに従い、細胞内のルシフェラーゼ活性を、マルチラベルカウンターにより測定した。その結果、ｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  ＰｒｏｍｏｔｅｒおよびｐＧＬ３−ＨＳＩ−ＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｍｕｔａｎｔ）それぞれからＧＡＴＡ−１プロモーターに依存したルシフェラーゼが誘導されたが、変異プロモーターから誘導されるルシフェラーゼの活性は野生型に比べて低いものであった。また、変異プロモーターから誘導されるルシフェラーゼの活性は野生型の場合と異なり、化合物Ａ、Ｃ、Ｄにより抑制を受けなかった（表５）。
以上の結果は、ＨＤＡＣ阻害薬である化合物Ａ、Ｃ、Ｄは、ＧＡＴＡ−１プロモーター上のＧＡＴＡ配列を介する転写制御系の機能を抑制することによりその転写活性化機能を阻害していることを示している。ＧＡＴＡ配列は、ＧＡＴＡ−１自身によって認識されることが知られており、この事実は、化合物Ａ、Ｃ、ＤがＧＡＴＡ−１因子そのものの転写活性化機能を阻害している可能性を示唆している。
【表５】
2004007758.tif 000008
【産業上の利用の可能性】
本発明の方法によれば、２種類の細胞を用いたレポーターアッセイ系を併用することにより、強力なＩＬ−２転写抑制活性を示し、同時にＧＡＴＡ−１転写抑制活性の弱い化合物を迅速にスクリーニングすることが可能である。また、ＨＤＡＣ阻害剤からＧＡＴＡ−１転写抑制活性の弱い化合物を迅速にスクリーニングすることも可能である。このような方法で選択された化合物は、免疫抑制剤として、従来より高い確率で血小板減少の副作用を示さない安全性の高い創薬キャンディデイトとなることが期待されるので、本発明の方法は、新薬創出の為の研究に極めて有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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