(57)【要約】脳下垂体ホルモンの関わる特定の疾患、特には糖尿病又は糖尿病性網膜症治療薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を開示する。前記ポリペプチドは脳下垂体で産生されるホルモンの調節に関わる新規なＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ又はその前駆体である。また、前記ポリペプチドを用いた糖尿病又は糖尿病性網膜症治療薬のスクリーニング方法並びに該スクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする糖尿病治療用医薬組成物及び糖尿病性網膜症治療用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第１８６番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｃ）記載のアミノ酸配列を含む（１）記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１８６番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第１８６番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列。
【請求項３】
下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）から選択されるポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｅ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択されるポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１〜第３９２番のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｃ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示すポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲１乃至請求の範囲４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求の範囲５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求の範囲６に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項８】
ｉ）請求の範囲４に記載のポリペプチド又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチドと、ｉｉ）前記ポリペプチドにより切断可能な基質と、ｉｉｉ）試験化合物とを接触させる工程、
前記基質の切断を分析する工程、及び
前記基質を切断する活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、試験化合物が前記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求の範囲８に記載の方法により、糖尿病治療薬及び／又は糖尿病性網膜症治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求の範囲８又は請求の範囲９に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、糖尿病治療用医薬組成物及び／又は糖尿病性網膜症治療用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なセリンプロテアーゼの前駆体または成熟体であるポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターでトランスフェクトされた細胞及び前記プロテアーゼ成熟体を使用する糖尿病治療に有用な薬物のスクリーニング法に関するものである。
背景技術
これまでに数百種類のプロテアーゼが報告されている。これらのプロテアーゼの中には、単に蛋白やペプチドの消化を行う分子の他に、ペプチド鎖の切断を介して蛋白質の成熟や生理活性の発現、代謝の調節、情報の発現や伝達など生命現象に直結した重要な役割に関与している分子が多数あることが知られている。そのため、古くより、プロテアーゼ阻害剤の医薬品応用が進められてきた。
ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼはセリンプロテアーゼのうち、Ｎ末端側に膜貫通領域、細胞外のＣ末端側にプロテアーゼドメインを有する分子種であり（非特許文献１参照）、心房性ナトリウム利尿因子前駆体（ｐｒｏＡＮＰ）から成熟体への変換を制御するコリン（Ｃｏｒｉｎ）（非特許文献２参照）、トリプシノーゲンをトリプシンに変換するエンテロペプチダーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（非特許文献３参照）など、重要な生理作用を調節する役割を担う分子が同ファミリーに分類される。また、これらのＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼの多くは比較的限局した特徴ある組織分布を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性のある配列に関しては種々の報告がある（特許文献１−６参照）が、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと１００％同一の配列は知られていなかった。前記報告には本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性のある配列の特定用途、すなわち糖尿病治療の記載がない、あるいは、実験的裏付けもなく前記相同配列の機能を調整する物質の用途として多数の疾患の治療が列挙されているのみであり、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの生理機能に関する具体的な情報はなかった。
一方、脳下垂体は種々のホルモンの生産、分泌を担う内分泌器官である。ホルモンは生体のホメオスタシスの維持や機能の発現などを担う分子であり、ホルモンのプロセシング、分泌や分解、その発現制御に係わる分子の分解を制御することにより、標的としたホルモンの作用を修飾することができ、その結果、該ホルモンの係わる特定の疾患の治療に繋がることが期待できる。脳下垂体から分泌されるホルモンの中で、少なくとも成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）には、その血中濃度と糖尿病の発症、進行度に関連性があることが示されている（非特許文献４参照）。ＧＨの生理作用としてはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）を介する成長促進作用と、そのものによる直接作用とがあり、種々の代謝作用に関与することが知られている。ＧＨ産生はソマトスタチンにより抑制され、ＧＨ自身やＩＧＦ−Ｉによりネガティブフィードバックを受けて抑制される。また、ＧＨは血糖値による制御を受けて分泌され糖代謝へ関与するが、低血糖ではＧＨ分泌は促進され、高血糖ではＧＨ分泌は抑制される。糖尿病患者においては、ＧＨ過剰分泌をきたしていると考えられる血中ＧＨ濃度の慢性的高値例が多数報告されている。一方、ＧＨの慢性的な過分泌状態にある末端肥大症患者においては高率で耐糖能低下を合併することが知られており、ＧＨ分泌を正常化する治療により耐糖能が改善することから、ＧＨは糖尿病誘発性に働くホルモンとして位置付けられている。これらのことからＧＨの過剰分泌の抑制は糖尿病治療に繋がると考えられる（以上、ＧＨに関する知見は非特許文献５参照）。上述のように、ＧＨはその下垂体からの分泌がＩＧＦ−Ｉにより負に制御されることから、ＩＧＦ−Ｉを臨床応用する試みがなされている。しかしながら、糖尿病治療において一定の治療効果が得られているものの、機能が多岐に渡るＩＧＦ−Ｉを全身投与することに起因する副作用が報告されている（非特許文献６参照）。したがって、脳下垂体で産生される成長ホルモンの調節に関わる新規な創薬標的分子の発見が待望されていた。
ソマトスタチンはそのアナログの試験的投与により糖尿病性網膜症を改善することが知られている（非特許文献７参照）。また、網膜におけるソマトスタチンの免疫組織化学的解析の結果、ソマトスタチンの免疫陽性細胞は内顆粒細胞層および視神経節細胞層で検出されることが報告されている（非特許文献８参照）。さらに糖尿病性網膜症を発症した糖尿病患者においては健常者に比べて硝子体液中のソマトスタチン様物質の免疫反応性が低下することが報告されている（非特許文献９参照）。したがってソマトスタチンの安定化は糖尿病性網膜症を改善することが期待されていた。
（特許文献１）
国際公開第０１／５５４４１号パンフレット
（特許文献２）
国際公開第０２／００８６０号パンフレット
（特許文献３）
国際公開第０１／３６６４５号パンフレット
（特許文献４）
国際公開第０１／５５３１４号パンフレット
（特許文献５）
国際公開第０１／５５３０１号パンフレット
（特許文献６）
国際公開第０１／７５０６７号パンフレット
（非特許文献１）
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、２００１年、第２７６巻、ｐ．８５７−８６０
（非特許文献２）
「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッドステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」（米国）、２００１年、第９７巻、ｐ．８５２５−８５２９
（非特許文献３）
「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（米国）、１９９５年、第３４巻、ｐ．４５６２−４５６８
（非特許文献４）
「日本臨床」、５５巻・１９９７年増刊号、ｐ１５５−１６３
（非特許文献５）
「日本臨床」、５６巻、１９９８年増刊号、ｐ．９７−１０２
（非特許文献６）
「ホルモンと臨床」、１９９８年、第４６巻  第２号、ｐ．７３−８１
（非特許文献７）
「ホルモン  アンド  メタボリック  リサーチ（Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２００１年、３３巻，ｐ．２９５−２９９
（非特許文献８）
「マイクロスコピー  リサーチ  アンド  テクニック（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」，２０００年、５０巻，ｐ．１０３−１１１
（非特許文献９）
「ダイアベート  ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ）」，２００２年、２５巻，ｐ．２２８２−２２８６
発明の開示
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ヒト及びマウスの新規なＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ遺伝子全長配列、全長ＯＲＦを決定し、全長遺伝子及び組換え体蛋白質を取得した。次いで、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記プロテアーゼの細胞外領域であることを明らかにした。更に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチドが十分なプロテアーゼ活性を有することを見出した。加えて、活性型酵素を得る為に前記プロテアーゼの全長領域及び細胞外領域を用いることができることを見出した。また、前記プロテアーゼは脳下垂体、眼を含む領域に限局して発現することを確認した。前記プロテアーゼがソマトスタチン及びプロラクチン放出ペプチドを切断し成長ホルモンを切断しなかったことから、前記プロテアーゼは脳下垂体において糖尿病の増悪に関与することが報告されている成長ホルモンの分泌量を増加させることを明らかにした。
これらの結果、糖尿病治療薬の検索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、糖尿病治療薬及び糖尿病性網膜症治療薬をスクリーニングする方法、並びに、糖尿病治療用医薬組成物及び糖尿病性網膜症治療用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）下記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチド
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第１８６番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、
（２）下記（ａ）〜（ｃ）記載のアミノ酸配列を含む（１）記載のポリペプチド
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１８６番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第１８６番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列、
（３）下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）から選択されるポリペプチド
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４）下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択されるポリペプチド
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示すポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示すポリペプチド、
（５）（１）乃至（４）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（６）（５）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（７）（６）に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
（８）ｉ）（４）に記載のポリペプチド又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチドと、ｉｉ）前記ポリペプチドにより切断可能な基質と、ｉｉｉ）試験化合物とを接触させる工程、
前記基質の切断を分析する工程、及び
前記基質を切断する活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、試験化合物が前記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法、
（９）（８）に記載の方法により、糖尿病治療薬及び／又は糖尿病性網膜症治療薬をスクリーニングする方法、
（１０）（８）又は（９）に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、糖尿病治療用医薬組成物及び／又は糖尿病性網膜症治療用医薬組成物の製造方法、
に関する。
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性のある種々の配列が報告（ＷＯ０１／５５４４１、ＷＯ０２／００８６０、ＷＯ０１／３６６４５、ＷＯ０１／５５３１４、ＷＯ０２／６４５３（本願優先日後に公開））されているが、いずれの報告においても本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性のある配列が糖尿病に関与するとの記載はない。ＷＯ０１／５５３０１には本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性のある配列が示され、該配列の機能を調整する物質の用途として多数の疾患の治療が列挙された中に糖尿病治療が含まれるが、該配列が糖尿病に関与するとの裏付けの実施例及び記載はない。ＷＯ０１／７５０６７には、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドのうちプロテアーゼ活性を有する領域（セリンプロテアーゼ領域）と１００％一致する配列を含む配列が記載されている。しかしながら、これらの配列からなるポリペプチド及びポリヌクレオチドは現実に取得しておらず、プロテアーゼ活性を有することも明らかにされておらず、特定の用途も記載されていない。
即ち、脳下垂体及び眼を含む限局した領域に発現し、ソマトスタチン及びプロラクチン放出ペプチドの分解により成長ホルモンを増加させる活性を有するプロテアーゼである本発明のプロテアーゼは本発明者らが初めて見出したものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「前駆体」は「酵素前駆体」を示しており、これ自体では不活性型であるが、活性化（プロセッシング）を受けて活性型酵素となる蛋白質を表す。「成熟体」は、活性化を受けて活性型となった酵素である蛋白質を表す。「プロテアーゼ活性」は、ペプチド結合の加水分解を触媒する活性であり、活性型酵素（成熟体）の示す酵素活性を表す。
本発明のポリペプチドには、成熟体であるポリペプチド（１）〜（４）と、前駆体であるポリペプチド（５）〜（１６）が含まれる。
すなわち、本発明のポリペプチドには、成熟体であるポリペプチド
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド１８７／４１８」と称することがある）；
（２）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド１６１／３９２」と称することがある）；
（３）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示すポリペプチド（以下、「ポリペプチド１６１／３９２の機能的等価改変体」と称することがある）；
（４）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド（以下、「ポリペプチド１６１／３９２の相同ポリペプチド」と称することがある）
が含まれる。
本発明のポリペプチドには、前駆体であるポリペプチド
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（７）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド４５／４１８」と称することがある）；
（９）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド４６／３９２」と称することがある）（以下、（５）乃至（９）をあわせて「本発明の前駆体」と称することがある）；
（１０）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド；
（１１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド；
（１２）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド；
（１３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第４５番〜第１８６番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド；
（１４）配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド（以下、（１０）乃至（１４）を「本発明の前駆体の機能的等価改変体」と称する）；
（１５）ポリペプチド１８７／４１８を含み、かつ、
配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはポリペプチド４５／４１８のアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド；
及び
（１６）配列番号１７で表されるアミノ酸配列又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第４６番〜第３９２番のアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド（以下、（１５）乃至（１６）を「本発明の前駆体の相同ポリペプチド」と称する）
が含まれる。
「ポリペプチド１８７／４１８の機能的等価改変体」、「ポリペプチド１６１／３９２の機能的等価改変体」および「本発明の前駆体の機能的等価改変体」を総称して「本発明の機能的等価改変体」と称するが、「本発明の機能的等価改変体」としては、各本発明の機能的等価改変体のうち、脳下垂体を含む限局された組織に発現されるポリペプチドが好ましい。
「本発明の前駆体の相同ポリペプチド」及び「ポリペプチド１６１／３９２の相同ポリペプチド」を、以下、「本発明の相同ポリペプチド」と称する。「本発明の相同ポリペプチド」である限り、特に限定されるものではないが、該相同性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むことができ、また、各相同ポリペプチドのうち、脳下垂体を含む限局された組織に発現されるポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用いて得られた値を意味する。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、
「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、
「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」を、
それぞれ使用する。
本発明の機能的等価改変体の起源はヒト又はマウスに限定されない。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ポリペプチド４５／４１８のヒトにおける変異体、配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはポリペプチド４６／３９２のマウスにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト又はマウス以外の生物（例えば、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト又はマウス由来の変異体、あるいはヒト又はマウス以外の生物由来の機能的等価改変体）又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２番〜第４１８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ポリペプチド４５／４１８、配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６１番〜第３９２番のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはポリペプチド４６／３９２を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
以上、本発明のポリペプチドについて説明したが、「ポリペプチド１８７／４１８」「ポリペプチド１６１／３９２」、「本発明の前駆体」、「本発明の機能的等価改変体」、及び「本発明の相同ポリペプチド」を総称して、以下、「本発明のポリペプチド」と称する。「本発明のポリペプチド」のうち、成熟体であるポリペプチドを「本発明のプロテアーゼ」と総称する。また、「本発明のポリペプチド」のうち、配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ヒトＮＳＰ蛋白質」または「ヒトＮＳＰ」と称する。配列番号１７で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「マウスＮＳＰ蛋白質」または「マウスＮＳＰ」と称する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはヒトＮＳＰ蛋白質全長ＯＲＦであり、ポリペプチド４５／４１８は細胞外領域であり、いずれも酵素の前駆体に関するものである。また、ポリペプチド１８７／４１８はセリンプロテアーゼ領域であると推定される。配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはマウスＮＳＰ蛋白質全長ＯＲＦであり、ポリペプチド４６／３９２は細胞外領域であり、いずれも酵素の前駆体に関するものである。また、ポリペプチド１６１／３９２はセリンプロテアーゼ領域であると推定される。後述の実施例に示すように配列番号２に記載の酵素前駆体は、自己触媒的にＮ末端領域をプロセッシングし、成熟体（活性型酵素）となった結果、酵素活性が発現することが明らかとなっている。また同様に、細胞外領域（ポリペプチド４５／４１８）も活性型酵素を得る為に用いることができる。セリンプロテアーゼ領域と推定されるポリペプチド１８７／４１８は、酵素活性が観察されたことから、該領域を有すれば酵素活性を示すことが確認された。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列における第４番〜第１２５７番の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第１３３番〜第１２５７番の塩基からなる配列、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第５５９番〜第１２５７番の塩基からなるポリヌクレオチド、配列番号１６で表される塩基配列、配列番号１６で表される塩基配列における第１３６番〜第１１７９番の塩基からなる配列、あるいは、配列表の配列番号１６で表される塩基配列における第４８１番〜第１１７９番の塩基からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号１で表される塩基配列における第１３３番〜第１２５７番の塩基からなる前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド４５／４１８を、配列番号１で表される塩基配列における第５５９番〜第１２５７番の塩基からなる前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド１８７／４１８をコードする。配列番号１で表される塩基配列における第４番〜第１２５７番の塩基からなる前記ポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２番〜第４１８番からなるポリペプチドをコードする。配列番号１で表される塩基配列からなる前記ポリヌクレオチドは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。配列番号１６で表される塩基配列における第１３６番〜第１１７９番の塩基からなる前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド４６／３９２を、配列番号１で表される塩基配列における第４８１番〜第１１７９番の塩基からなる前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド１６１／３９２をコードする。また、配列番号１６で表される塩基配列からなる前記ポリヌクレオチドは配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。
本発明のポリヌクレオチドは、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ポリペプチド４５／４１８、ポリペプチド１８７／４１８、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ポリペプチド４６／３９２、またはポリペプチド１６１／３９２の遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列における第１３３番〜第１２５７番の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第５５９番〜第１２５７番の塩基からなる配列、配列番号１６で表される塩基配列、配列番号１６で表される塩基配列における第１３６番〜第１１７９番の塩基からなる配列または配列番号１で表される塩基配列における第４８１番〜第１１７９番の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に従って実施することが可能である。
例えば、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列における第４番〜第１２５７番の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第１３３番〜第１２５７番の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第５５９番〜第１２５７番の塩基からなる配列、配列番号１６で表される塩基配列、配列番号１６で表される塩基配列における第１３６番〜第１１７９番の塩基からなる配列または配列番号１６で表される塩基配列における第４８１番〜第１１７９番の塩基からなる配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリヌクレオチドを取得できる。そのポリヌクレオチドを適当な発現系（例えば、実施例６に記載の方法）を用いて発現させる、あるいは更に精製する（例えば、実施例７に記載の方法）ことにより本発明のポリペプチドが得られる。例えば、実施例８に記載の方法により、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドがプロセッシングを受けて生成した成熟体がプロテアーゼ活性を示すことを確認できる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドまたは該ポリペプチドがプロセッシングを受けて生成した成熟体が、例えば、実施例８に記載の方法により、プロテアーゼ活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、本発明の機能的等価改変体には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２番から第４１８番からなるポリペプチド、ポリペプチド４５／４１８、ポリペプチド１８７／４１８を含むポリペプチド、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ポリペプチド４６／３９２、またはポリペプチド１６１／３９２を含むポリペプチド、例えば、Ｎ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、プロテアーゼ活性を示すか、あるいは、プロセッシングを受けた後にプロテアーゼ活性を示す限り含まれる。
前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のポリペプチドには、本発明の前駆体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させることにより得られる、活性化に伴う切断を受けたポリペプチドもプロテアーゼ活性を示す限り含まれる。好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８６番目と第１８７番目のアミノ酸であるセリンプロテアーゼの活性化配列の間が切断されて生成したセリンプロテアーゼ活性を有する、Ｎ末端が第１８７番目のアミノ酸であるポリペプチド又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列における第１６０番目と第１６１番目のアミノ酸であるセリンプロテアーゼの活性化配列の間が切断されて生成したセリンプロテアーゼ活性を有する、Ｎ末端が第１６１番目のアミノ酸であるポリペプチド（すなわち、ポリペプチド１８７／４１８又はポリペプチド１６１／３９２であると推定される）である。
本明細書において、あるポリペプチドが「プロテアーゼ活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、蛍光標識された合成ペプチド、例えばＭＣＡ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）でＣ末端を標識された合成ペプチドを用いて酵素切断活性を検出することにより確認することができ（Ｙａｓｕｏｋａ，Ｓ，ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１６，３００−３０８，１９９７）、より好ましくは、実施例８に記載の方法により確認することができる。また、生理活性物質であるソマトスタチン、プロラクチン放出ペプチドを用いて例えば実施例１０に記載の方法により酵素切断活性を検出し確認することができる。生理活性物質を用いた切断活性の検出が最も好ましい。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されていると同様に実施できる。ただし、上記特許出願明細書における「本発明の新規蛋白」を本発明のポリペプチド、「本発明の遺伝子」を本発明のポリヌクレオチドと読み替える。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞あるいは組織、例えば、ヒト又はマウスの脳下垂体からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例３又は１１に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。より具体的には、化学合成法によって製造したヌクレオチド断片を結合することによっても製造できる。また、各ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡ合成機（例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ベックマン社）、あるいは、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）など）を用いて合成することができる。
本発明の発現ベクター、形質転換細胞、ポリペプチドの製造方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例３〜６に記載のように本発明のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１またはサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（インビトロジェン社）に組み込むことにより、所望のポリペプチドの発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターを市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ロシュ社）を用いてヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により本発明のポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
上記により、形質転換細胞に生産される本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認及び精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８（１９９６）。
＜本発明のスクリーニング方法＞
本発明のプロテアーゼ又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８７番〜第４１８番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド（以下、「本発明のスクリーニングに用いるポリペプチド」）を用いて、本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドとしては、後述の実施例１及び１３に示すように脳下垂体で発現している蛋白質であり、かつ実施例８に示すようにプロテアーゼ活性を有するものが望ましい。実施例１０に示すように本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドの１つである、ポリペプチド４５／４１８をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより得られる活性化に伴う切断を受けたポリペプチドはソマトスタチン及びプロラクチン放出ホルモンを切断することがわかった。ソマトスタチンは視床下部から分泌され、脳下垂体からの成長ホルモンの分泌を抑制する制御因子である。また、プロラクチン放出ホルモンはソマトスタチンの脳下垂体における分泌を促進して成長ホルモンの血中レベルを下げることが報告されている（Ｉｉｊｉｍａ，Ｎ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２，３２３９−３２４３，２００１）。本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドがソマトスタチン及びプロラクチン放出ペプチドを切断したことから、本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドを用いてその阻害剤をスクリーニングすることにより、内在性のソマトスタチン量を増加させ成長ホルモン等の分泌抑制を介して糖尿病を改善する物質が得られる。
本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドとしては、実施例８に示すようにプロテアーゼ活性を有するものであり、後述の実施例１２及び１３に示すように眼で発現している蛋白質が好ましい。実施例１０に示すように、本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドの１つである、ポリペプチド４５／４１８をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより得られる活性化に伴う切断を受けたポリペプチドはソマトスタチン及びプロラクチン放出ホルモンを切断することがわかっている。ソマトスタチンのアナログは試験的投与により糖尿病性網膜症を改善することが知られている（Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，２９５−２９９，２００１）。また、網膜におけるソマトスタチンの免疫組織化学的解析の結果、ソマトスタチンの免疫陽性細胞はＮＳＰの免疫陽性細胞が検出された視神経節細胞層およびその隣接する内顆粒細胞層で検出されることが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．ら、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５０，１０３−１１１，２０００）。さらに糖尿病性網膜症を発症した糖尿病患者においては健常者に比べて硝子体液中のソマトスタチン様物質の免疫反応性が低下することが報告されている（Ｓｉｍｏ，Ｒ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２５，２２８２−２２８６，２００２）。これらのことから、本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドの阻害剤はＮＳＰ陽性細胞の近傍で産生されるソマトスタチンの分解を抑制し、内在性のソマトスタチンを安定化することにより、ソマトスタチンアナログと同様の糖尿病性網膜症治療効果を示すと期待できる。従って、本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドを用いてその阻害剤をスクリーニングすることにより、糖尿病性網膜症を改善する物質が得られる。
本発明のスクリーニング法は、特に限定されるものではないが、本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドによる蛍光標識された合成ペプチド、例えばＭＣＡ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）でＣ末端を標識された合成ペプチドの酵素切断活性を検出することにより確認することができ（Ｙａｓｕｏｋａ，Ｓ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１６，３００−３０８，１９９７）、より好ましくは、実施例８に記載の方法により実施することができる。
たとえば実施例８及び９に記載の条件で、ＩＣ５０＝１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０＝１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０＝０．１μＭ以下の物質をプロテアーゼ阻害活性を有する物質として、選択することができる。また、このようにプロテアーゼ阻害活性を有する物質を選択することによって糖尿病治療薬または糖尿病性網膜症治療薬を得ることができる。
本発明のスクリーニング法で使用する試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５））によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
＜本発明の糖尿病治療用医薬組成物又は糖尿病性網膜症治療用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、糖尿病治療用医薬組成物又は糖尿病性網膜症治療用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
実施例
以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、遺伝子操作技術に関しては公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）新規ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ遺伝子ＮＳＰの部分配列の取得
配列番号３（配列番号１の６０７番から６３３番の配列）と配列番号４（配列番号１の１１２４番から１１５０番の相補配列）のオリゴＤＮＡを合成し、クロンテック社のポリＡ＋ＲＮＡよりスーパースクリプトＩＩ（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ）（インビトロジェン社）を用いｃＤＮＡに転換することにより作製した自家製のヒト各組織由来のｃＤＮＡパネルを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３６回のＰＣＲ反応を行った。この反応により、脳下垂体、子宮を含む組織に選択的に５４４ｂｐのＤＮＡ断片が生成した。このＤＮＡ断片の配列を直接ジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００  ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）で解析し、配列番号１の６０７番から１１５０番の配列を得た。
（実施例２）ＮＳＰの全長ＯＲＦ配列の決定
クロンテック社のヒト子宮の鋳型ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、ｃＤＮＡ末端増幅ＰＣＲ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、ＲＡＣＥ）を繰り返すことにより、５’側および３’側の塩基配列を解読し、実施例１で取得した配列の全長のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）配列を決定した。この遺伝子をＮＳＰと名付けた。該遺伝子の全長塩基配列を配列番号１に、推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。ＮＳＰのＯＲＦは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番から第４１８番まで、あるいは該配列における第２番から第４１８番までの４１７または４１８アミノ酸からなる新規蛋白質をコードしており、ホモロジー検索の結果、そのドメイン構造はＮ末から、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、プロ領域、プロテアーゼ活性化配列、セリンプロテアーゼドメイン、Ｃ末端配列であり、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼファミリーに属する分子であった。
（実施例３）ＮＳＰ全長ＯＲＦのクローニングと蛋白質発現プラスミドの構築
配列番号５（配列番号２の１番から３０番の配列５’末端に制限酵素Ｘｂａ  Ｉ認識配列が付加された配列）と配列番号６（配列番号２の１２２５番から１２５４番の相補配列５’末端に制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ認識配列が付加された配列）で示されるオリゴＤＮＡをプライマーとし、ヒト子宮の鋳型ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社）、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６５℃３０秒、７２℃１分３０秒のサイクルを４０回、続いて７２℃７分のＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物（約１．３Ｋｂｐ）をフェノールクロロホルム処理し、エタノール沈殿処理し、精製水に溶解した。このＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで切断し、ｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧ（ＷＯ  ０１／３４７８５実施例３）のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ部位に挿入して、全長蛋白質発現プラスミドｐＣＥＰ−ＮＳＰ−ＦＬＡＧを完成した。
（実施例４）ＮＳＰ細胞外領域蛋白質発現プラスミドの構築
配列番号２の４５番から４１８番にコードされるポリペプチドをＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧを付加した蛋白質として発現するためのプラスミドは以下のように構築した。
まず、配列番号１の１３３番から１２５７番の遺伝子をＰＣＲにより取得した。詳しくは、配列番号７（配列番号１の１３３番から１６２番の配列５’末端に制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ認識配列が付加された配列）と配列番号８（配列番号１の１２２５番から１２５７番の相補配列５’末端に制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ認識配列が付加された配列）で示されるオリゴＤＮＡプライマー、鋳型としてｐＣＥＰ−ＮＳＰ−ＦＬＡＧ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６５℃３０秒、７２℃１分３０秒のサイクルを２５回、続いて７２℃７分の反応を行った。こうして生成したＤＮＡ断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングして配列を確認した。ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ部位で目的のＤＮＡ断片を切り出し、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧベクターのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入しｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒとした。なお、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ部位にＷＯ０１／３４７８５の（実施例７−１）記載の方法に従い、配列番号１０と配列番号１１から成る２重鎖オリゴＤＮＡを挿入したプラスミドである。
（実施例５）ＮＳＰのセリンプロテアーゼドメインおよびＣ末端配列発現プラスミドの構築
配列番号２の１８７番から４１８番にコードされるポリペプチドをＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧを付加した蛋白質として発現するためのプラスミドは以下のように構築した。
まず、配列番号１の５５９番から１２５７番の遺伝子をＰＣＲにより取得した。詳しくは、配列番号９（配列番号１の５５９番から５８８番の配列５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が付加された配列）と配列番号８で示されるオリゴＤＮＡプライマー、鋳型としてｐＣＥＰ−ＮＳＰ−ＦＬＡＧ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２５回、続いて７２℃７分の反応を行った。こうして生成したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧベクターのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入しｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤとした。
（実施例６）ＮＳＰ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤの動物細胞株での発現
実施例３−５において作製した発現プラスミドをトランスフェクション試薬
（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ロシュ社）を用いて添付指示書に従いＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）に導入した。プラスミド導入後１２−１６時間で培地を無血清に置換した後、さらに４８−６０時間培養を継続し、培養上清を回収した。培養上清中に目的蛋白が存在することを末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；シグマ社）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、上記培養上清をＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社）に電気泳動（還元条件）後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にブロックエース（大日本製薬社）を添加してブロッキングした後、ビオチン化マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２；シグマ社）、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシア社）を順次反応させた。反応後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマシャムファルマシア社）を用いて該蛋白の発現を確認した。ｐＣＥＰ−ＮＳＰ−ＦＬＡＧを導入した場合、培養上清に分子量２６．９±０．５ｋＤのバンドが検出されたが細胞溶解液には予想分子量４７ｋＤの全長タンパク質はほとんど検出されなかった。このことからＮＳＰ遺伝子産物はセリンプロテアーゼファミリーに保存されたプロ領域とセリンプロテアーゼドメインの間にある活性化配列で切断されて成熟体として培養上清中に分泌されると示唆される。一方、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒを導入した場合には、培養上清中に分子量４１．６±０．６ｋＤ、４０．０±０．５ｋＤ、２１．３±１．０ｋＤ、および２０．０±１．０ｋＤのバンドが検出された。またｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤを導入した場合では培養上清中に分子量２７．９±０．５ｋＤのバンドが検出された。ｐＣＥＰ−ＮＳＰ−ＦＬＡＧを導入した場合に比較してｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤを導入した場合に得られた物質の分子量がやや大きいのは、発現させるためにｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤに付加したシグナル配列が残っているためと考えられた。
（実施例７）ＮＳＰ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤの精製
上述のようにＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にて発現させた蛋白質にＦＬＡＧタグが付加されていることを利用して、以下の方法でアフィニィティ精製を行った。すなわち実施例６において回収した培養上清をカラムに詰めたＦＬＡＧ抗体結合レジン（Ｍ２−ａｇａｒｏｓｅ）（シグマ社）にアプライし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（以下、ＴＢＳという）で洗浄した後、０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で、溶出、分画し、この溶液に直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和した。ｐＣＥＰ−ＮＳＰ−ＦＬＡＧを導入した場合、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒを導入した場合、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤを導入した場合に得られた精製標品をそれぞれＮＳＰ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤと称する。溶出した精製標品は、還元条件下、非還元条件下において電気泳動した後、実施例６に示したＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングおよび銀染色キット（和光純薬社）によって検出した。ＮＳＰ−ＦＬＡＧにはＣ末端にＦＬＡＧタグが付加され、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒおよびｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤにはＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されている。この結果ＮＳＰ−ＦＬＡＧを発現させた場合、還元条件では分子量２６．９±１．０ｋＤのバンドが抗ＦＬＡＧ抗体および銀染色でともに検出され、非還元条件下では分子量２６．９±１．０ｋＤ付近にスメアなバンドが検出された。一方、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒを発現させた場合は非還元条件下では分子量４１．６±０．６ｋＤ、４０．０±０．５ｋＤ、２１．３±１．０ｋＤ、および２０．０±１．０ｋＤのバンドが抗ＦＬＡＧ抗体および銀染色でともに検出され、還元条件下ではさらに分子量２６．４±０．５ｋＤのバンドが銀染色で検出されたが、抗ＦＬＡＧ抗体では検出されなかった。また、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤを発現させた場合は、還元条件、非還元条件いずれの場合でも分子量２７．９±０．５ｋＤのバンドが抗ＦＬＡＧ抗体および銀染色でともに検出された。ＮＳＰ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒのバンドパターンが大きく異なるのは、ＮＳＰ−ＦＬＡＧはＣ末端にタグが付加されているためにプロセッシング後の成熟体が精製されているのに対して、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒはＮ末端にタグが付加されているために精製後に自己消化によるプロセッシングが起きているためと考えられる。更に、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したＮＳＰ細胞外領域の精製蛋白の抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット（還元条件）と還元・非還元条件下での銀染色パターンを比較すると抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットでは検出されない分子量２６．４±０．５ｋＤのバンドが還元条件下での銀染色では検出されることから、これはＦＬＡＧタグがついていないＣ末端側のセリンプロテアーゼ���メインをふくむポリペプチドであると考えられる。一方、４１．６±０．６ｋＤおよび４０．０±０．５ｋＤのバンドは非還元条件と比較して還元条件で減少することから、還元条件下で分子量２６．４±０．５ｋＤの部分が解離していると推測される。これらのことからＮＳＰは少なくとも２箇所以上で自己消化により切断されて成熟体になると考えられる。セリンプロテアーゼが活性化するときに切断されることが知られている活性化部位（小出武比古、医学の歩み、１９８，１１−１６、２００１）がＮＳＰにも存在する（配列２で示した１８６番アルギニンと１８７番イソロイシン）ことからこの間で切断され、さらにそのＮ端側で少なくとも１箇所切断されると考えられる。また、既知のＩＩ型セリンプロテアーゼＨＡＴ（Ｙａｍａｏｋａ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１１８９５−１１９０１，１９９８），Ｄｅｓｃ１（Ｌａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４，２３７−２４３，２００１），ｈｅｐｓｉｎ（Ｌｅｙｔｕｓ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１０６７−１０７４，１９８８）とのアミノ酸配列の比較から、ジスルフィド結合を形成すると推定されているシステイン残基がＮＳＰでも保存されている（Ｃｙｓ１７５、２１２、２２８、２９２、３３７，３５３，３６４，３９３）ことから約２６ｋＤのセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドとＮ端側のポリペプチドがジスルフィド結合を形成していると推測される。（他のプロテアーゼとの比較からＣｙｓ１７５と２９２の間でジスルフィド結合が形成されていると予想される。）
（実施例８）合成ペプチドを用いた酵素活性の検出
ＭＣＡ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）でＣ末端を標識された合成ペプチドを用いて酵素的切断活性を検出する方法は特に断りの無い限り、論文報告された方法（Ｙａｓｕｏｋａ，Ｓ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１６，３００−３０８，１９９７）に従った。すなわち、ＭＣＡでＣ末端を標識された合成ペプチド（ペプチド研究所）を基質として、９６穴プレートに終濃度１００μＭとなるようにＴＢＳ中に基質を希釈した。この基質溶液に実施例７に示した方法で精製した酵素標品を１０−５０μｌ添加し密閉した後、３７℃で３０分−２時間インキュベートした。その後合成ペプチドから酵素により切断されて遊離したＡＭＣ（７−Ａｍｉｎｏ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）の蛍光を蛍光測定プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ、ＳＬＴ社）で励起波長３９０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍにて測定した。この結果、組換え体ＮＳＰ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ＳｅｒＰＤはいずれも合成ペプチドＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡの切断活性を示した。
（実施例９）既知プロテアーゼ阻害剤による酵素活性の阻害
実施例８で示した酵素活性検出法を用いて、反応液に既知プロテアーゼ阻害剤を添加した場合の酵素活性の阻害効果を調べた。基質としてＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、酵素標品として実施例７のように精製したＮＳＰ細胞外領域の組換え体を用い、各種既知プロテアーゼ阻害剤存在下あるいは非存在下における酵素活性を比較した。ＮＳＰの酵素活性は終濃度１ｍＭ  Ｎ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅで約４０％、１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）で約１５％、１０μＭ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎで約１０％阻害された。一方、ＮＳＰの酵素活性は終濃度０．６６ＴＩＵ（ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｕｎｉｔ）（シグマ社）ａｐｒｏｔｉｎｉｎでは全く阻害されず既知のトリプシン様セリンプロテアーゼとは阻害剤への感受性が異なっていることから、配列のみならず、この点においてもＮＳＰ成熟体は新しいセリンプロテアーゼであると考えられた。
実施例８、９に記載の方法でＮＳＰ成熟体阻害剤のスクリーニングが可能であることがわかった。
（実施例１０）ＮＳＰ成熟体による生理活性物質の切断
ＮＳＰ成熟体の生理活性ペプチド切断活性を以下の方法で検討した。すなわち、オキシトシン、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ１−１４）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、メラニン凝集ホルモン（Ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン放出ペプチド（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ３１）、アドレノコルチコトロピックホルモン、脳下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド３８、インスリン、インスリン様成長因子−１、黄体形成ホルモン放出ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、バソプレッシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ブラジキニン、エンケファリン及びＡｐｅｌｉｎ（すべてペプチド研究所）を終濃度４−４０μＭとなるようにそれぞれＴＢＳ中に希釈した。これらの基質溶液に実施例７に示した方法で精製したｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒの酵素標品または酵素を含まない９ｍＭ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）／０．９０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を３μｌ添加し密閉した後、３７℃で一晩インキュベートした。酵素標品添加または無添加の基質溶液をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（島津製作所）を用いて解析し比較したところ、ソマトスタチン、プロラクチン放出ペプチド３１の場合のみＮＳＰ成熟体による切断に伴う分離パターンの変化が観察された。ＮＳＰ成熟体による切断部位を決定するためにソマトスタチンならびにプロラクチン放出ペプチド３１の分解産物をＨＰＬＣはナノスペース（資生堂）、ＭＳはＬＣＱ（サーモクエスト社）、カラムはカプセルパック（Ｃ１８ＵＧ１２０、１ｘ１５０ｍｍ；資生堂）を用いてマス（ＭＳ）スペクトル測定を行い、検出されたペプチド断片のＭＳ／ＭＳスペクトルをマニュアルもしくはＳｅｑｕｅｓｔソフト（サーモクエスト社）を用いて解析した。この結果ソマトスタチンの切断部位は配列番号１２の第９番目Ｋと第１０番目Ｔの間、すなわちＡＧＣＫＮＦＦＷＫ／ＴＦＴＳＣと考えられた。プロラクチン放出ペプチドの切断部位は配列番号１３の第５番目Ｒと第６番目Ｈの間、すなわちＳＲＴＨＲ／ＨＳＭＥＩＲＴＰＤＩＮＰＡＷＹＡＳＲＧＩＲＰＶＧＲＦと考えられた。またＮＳＰ成熟体による成長ホルモンの切断を検討した。成長ホルモン（バイオジェネシス社）、２００ｎｇと実施例７に示した方法で精製したｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＮＳＰ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒの酵素標品または酵素を含まない９ｍＭ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）／０．９０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液５μｌを混合し密閉した後、３７℃で一晩インキュベートした。この反応液を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、実施例６と同様の方法でウエスタンブロットを行い、バンドパターンを解析した。１次抗体として抗成長ホルモンモノクローナル抗体（ネオマーカーズ社）を、２次抗体としてパーオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（���マシャム社）を用いて検出した。この結果、ＮＳＰ成熟体によって成長ホルモンは切断されなかった。
ソマトスタチンは視床下部から分泌され、脳下垂体からの成長ホルモンの分泌を抑制する制御因子である。また、プロラクチン放出ホルモンはソマトスタチンの脳下垂体における分泌を促進して成長ホルモンの血中レベルを下げることが報告されている（Ｉｉｊｉｍａ，Ｎ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２，３２３９−３２４３，２００１）。ＮＳＰがソマトスタチン及びプロラクチン放出ペプチドを切断し、成長ホルモンを切断しなかったことからＮＳＰ成熟体は脳下垂体において成長ホルモンの分泌量を増加させる方向に作用すると考えられる。すなわち、ＮＳＰ成熟体を用いてその阻害剤をスクリーニングすることにより、内在性のソマトスタチン量を増加させ成長ホルモン等の分泌抑制を介して糖尿病を改善する物質が得られると考えられた。
（実施例１１）マウスＮＳＰの全長ＯＲＦ配列の決定
配列番号１４と配列番号１５で示したプライマーを作製し、胎齢１７日目のマウス胚のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９４℃５分の後、９８℃１０秒、６５℃２０秒、７２℃２分のサイクルを４０回、続いて７２℃７分のＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物（約１．２Ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社）を用いて精製し、精製水に溶解した。このＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断したｐＺＥｒＯ−２ベクター（インビトロジェン社）に挿入した。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号１６に示した。同配列は１１７９塩基のＯＲＦ（配列番号１６）を持っている。ＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３９２アミノ酸）を配列番号１７に示した。
得られたマウスＮＳＰとヒトＮＳＰとの相同性は塩基配列で比較して７９．７％、アミノ酸配列で比較して６９．７％であった。ヒトＮＳＰのセリンプロテアーゼドメイン（配列番号１の５５９番から１２５７番にコードされ、配列番号２の１８７番から４１８番で示されるアミノ酸配列からなるドメイン）とマウスＮＳＰのセリンプロテアーゼドメイン（配列番号１６の４８１番から１１７９番にコードされ、配列番号１７の１６１番から３９２番で示されるアミノ酸配列からなるドメイン）における相同性は塩基配列で比較して８４％、アミノ酸配列で比較して７６．８％であった。マウスＮＳＰはヒトＮＳＰと高い相同性を示したことから、マウスＮＳＰはヒトＮＳＰと同等の機能を持つ蛋白質であることが推察される。
（実施例１２）眼におけるヒト及びマウスＮＳＰの発現
眼におけるヒトＮＳＰの検出はヒト網膜由来ｃＤＮＡ（バイオチェイン社）を鋳型として実施例１と同様のＰＣＲ法で行い、５４４ｂｐのＤＮＡ断片の生成を確認した。マウスＮＳＰの検出はセリンプロテアーゼドメインをコードする領域内に配列番号１８と１９で示したプライマーを作製しマウス眼由来ｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型としＤＮＡポリメラーゼを含有する蛍光試薬（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、アプライドバイオシステムズ社）を用いて、９５℃１０分の後、９４℃１５秒、５９℃１分のサイクルを４５回のＰＣＲ反応および経時的な増幅産物の検出をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。この増幅産物（配列番号１２の７６２−８３３番）をアガロースゲル電気泳動後ゲル抽出により精製し、増幅された７２ｂｐの塩基配列を解読することによりマウスＮＳＰが特異的に増幅されていることを確認した。
ＮＳＰ成熟体は生理活性ペプチドであるソマトスタチンを切断する活性を有することを実施例１０において見出した。ソマトスタチンアナログは糖尿病性網膜症を改善することが知られている（Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，２９５−２９９，２００１）。これらの知見より、ＮＳＰ成熟体のプロテアーゼ活性を測定する方法（実施例８）は糖尿病性網膜症治療薬をスクリーニングする方法として利用でき、ＮＳＰ成熟体を阻害する物質は内因性ソマトスタチン量を増加させ糖尿病性網膜症に効果を示すと考えられる。
（実施例１３）脳下垂体、眼におけるＮＳＰの免疫組織化学的検出
抗ＮＳＰ抗体の作製および精製は、抗ペプチド抗体作製法（竹縄ら編、分子生物学研究のためのタンパク実験法、バイオマニュアルシリーズ７、実験医学別冊、羊土社、７７−８６、１９９４）に従い、以下のように行った。抗原ペプチドとして配列番号２０で示されるペプチド（配列番号２の２３８番目から２５２番目のアミノ酸配列で示されるＮＳＰの部分ペプチドにシステイン残基を付加したペプチド）を合成し、ウシサイクログロブリンをキャリア蛋白質として結合させ、油性アジュバントを混合してエマルジョンを作製し、ウサギの皮内または皮下に２−３週間おきに８回にわたって接種することによりＮＳＰ蛋白質に対する抗血清を作製した。抗原ペプチドを結合したアフィニティカラムを用いてこの抗血清を精製し、抗ＮＳＰポリクローナル特異抗体を得た。この精製抗体を用いて以下に示すＮＳＰの免疫組織化学的検出を行った。
マウスを頚椎脱臼後４％パラホルムアルデヒドで還流固定した後、脳下垂体および眼を摘出した。湿組織をアルコール系列に順次浸漬することにより脱水し、透徹、パラフィン包埋後、薄切組織切片を作製した。この切片に抗ＮＳＰ抗体または正常ウサギ抗体を一次抗体として反応させ免疫組織染色キット（ベクター社）を用いて内在性ＮＳＰの免疫陽性細胞を特異的に検出した。この結果、脳下垂体においてＮＳＰ免疫陽性細胞は中間部（中葉）に検出され、前葉においても弱く検出された。眼においてＮＳＰ免疫陽性細胞は主に網膜の視神経節細胞層で検出され、視神経節細胞が染色されていると考えられる。一方、正常ウサギ抗体を一次抗体とした場合いずれの組織切片においてもバックグラウンドの染色はほとんど検出されなかった。さらにヒト脳下垂体および眼におけるＮＳＰの検出を上記と同様の方法で行った。この結果、ヒト脳下垂体においてＮＳＰ免疫陽性細胞は中間部および前葉に強く検出された。ヒト眼においては網膜にＮＳＰ免疫陽性細胞が存在し視神経節細胞層などに高発現していることが確認された。また糖尿病罹患者由来の脳下垂体、眼の組織切片においても正常組織と同様の部位にＮＳＰ免疫陽性細胞の存在が検出された。これらの結果よりＮＳＰはヒト、マウスいずれにおいても脳下垂体前葉および中間部、眼の網膜に高度に局在するセリンプロテアーゼであると言える。
ところで、ＮＳＰの基質の一つであるソマトスタチンのアナログは試験的投与により糖尿病性網膜症を改善することが知られている（Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，２９５−２９９，２００１）。網膜におけるソマトスタチンの免疫組織化学的解析の結果、ソマトスタチンの免疫陽性細胞はＮＳＰの免疫陽性細胞が検出された視神経節細胞層およびその隣接する内顆粒細胞層で検出されることが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．ら、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５０，１０３−１１１，２０００）。さらに糖尿病性網膜症を発症した糖尿病患者においては健常者に比べて硝子体液中のソマトスタチン様物質の免疫反応性が低下することが報告されている（Ｓｉｍｏ，Ｒ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２５，２２８２−２２８６，２００２）。すなわち、ＮＳＰ阻害剤には実施例１０で示した糖尿病治療効果に加え、ＮＳＰ陽性細胞の近傍で産生されるソマトスタチンの分解を抑制し、内在性のソマトスタチンを安定化することにより、ソマトスタチンアナログと同様の糖尿病性網膜症治療効果を期待できる。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドは脳下垂体、眼を含む組織に局所的に発現するプロテアーゼまたはその前駆体である。本発明の前駆体は本発明のプロテアーゼを得るために有用である。本発明のプロテアーゼはソマトスタチン切断活性を有することから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び細胞は、糖尿病治療薬のスクリーニング及び／又は糖尿病性網膜症治療薬のスクリーニングに有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号５〜１１の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号２０は人工的に合成した抗原用のペプチドである。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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