(57)【要約】ＭｎＳＯＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡを有するノックイン非ヒト動物を開示する。また、前記ノックイン非ヒト動物と、特定の組織でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物とを交配して得られる、前記特定組織におけるマンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現が抑制又は欠損したノックアウト非ヒト動物、及び前記ノックアウト非ヒト動物を更に交配して得られる、前記特定組織に特異的にマンガンスーパーオキシドジスムターゼが欠損した非ヒト動物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡを有する、ノックイン非ヒト動物。
【請求項２】
エクソンがエクソン３である、請求項１に記載のノックイン非ヒト動物。
【請求項３】
２つのリコンビナーゼ認識配列の間に、更にマーカー遺伝子を含む、請求項１又は２に記載のノックイン非ヒト動物。
【請求項４】
マーカー遺伝子がｎｅｏ耐性遺伝子である、請求項３に記載のノックイン非ヒト動物。
【請求項５】
リコンビナーゼ認識配列がｌｏｘｐ配列である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のノックイン非ヒト動物。
【請求項６】
非ヒト動物がマウスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のノックイン非ヒト動物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のノックイン非ヒト動物と、特定の組織でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物とを交配して得られる、前記特定組織におけるマンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現が抑制又は欠損したノックアウト非ヒト動物。
【請求項８】
請求項７に記載のノックアウト非ヒト動物を、請求項１〜６のいずれか一項に記載のノックイン非ヒト動物又は請求項７に記載のノックアウト非ヒト動物と交配して得られる、前記特定組織に特異的にマンガンスーパーオキシドジスムターゼが欠損したノックアウト非ヒト動物。
【請求項９】
リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項７又は８に記載のノックアウト非ヒト動物。
【請求項１０】
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この発明は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；以下、「ＭｎＳＯＤ」と称する）遺伝子の１つのエクソンをリコンビナーゼ認識配列（例えば、ｌｏｘｐ配列）で挟んだＤＮＡを有するノックイン非ヒト動物（例えば、ノックインマウス）に関し、更に、このノックイン非ヒト動物と、特定の組織でリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）を発現するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）とを交配して得られる組織特異的ノックアウト非ヒト動物（特には、その特定の組織に特異的にＭｎＳＯＤが欠損したマウス）に関する。
【背景技術】  生物は年齢が進むにつれ老化が進行するが、この老化の原因として活性酸素説が提唱されている。活性酸素蓄積の疾患の例である、脳若しくは心臓の虚血後再潅流における組織の損傷、パーキンソン病、神経変性疾患、又は動脈硬化などでは、活性酸素の関与が報告されている。
活性酸素は、ミトコンドリアにおける内呼吸の副産物である。このミトコンドリアの活性酸素であるスーパーオキサイドを、ＭｎＳＯＤが過酸化水素に変換する。この酵素の生体内における役割、活性酸素の影響、又は疾患の原因究明を目的として、組織特異的ＭｎＳＯＤ遺伝子欠損による活性酸素蓄積モデルマウスを作製して、活性酸素蓄積による疾患の発症のメカニズムの解明が試みられてきた。
例えば、ＭｎＳＯＤのエクソン３を欠損させたマウスが、拡張性心筋症、神経変性、又はミトンコンドリア呼吸鎖酵素の活性低下を示すことが明らかにされたが、このマウスは新生児期に死亡した［Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１１，３７６−３８１（１９９５）］。また、ＭｎＳＯＤノックアウトマウスが顕著な貧血症や大脳基底核のニューロンの変性を示し、７日以上生きたマウスがミトコンドリアの損傷を示すことが明らかにされたが、最長で１０日しか生きなかった［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９７８２−９７８７（１９９６）］。
【発明の開示】
現在遺伝子組み換えマウスの常法の一つである遺伝子ターゲティング法を用いたモデルマウスの作製は広く一般的に行われている［Ｎａｔｕｒｅ，１９８８  Ｎｏｖ  ２４；３３６（６１９７）］。具体的にはターゲティングベクターを作成後、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）において相同組み換えをおこさせることにより、遺伝子組み換えマウスを作製する。
バクテリオファージＰ１由来のリコンビナーゼであるＣｒｅタンパク質は、３４塩基対のｌｏｘｐ配列を認識し、ｌｏｘｐ配列の間にはさまれた配列を切り取る。この性質を用いて、本発明においては、例えば、ＭｎＳＯＤ遺伝子のエクソン３の上流及び下流にｌｏｘｐ配列を挿入したｆｌｏｘ動物を遺伝子ターゲティング法にて作製することができる。このマウスを臓器特異的にＣｒｅタンパク質を過剰に発現するトランスジェニックマウスと交配することにより臓器特異的にＭｎＳＯＤ遺伝子が欠損するようなコンディショナルノックアウトマウスを作製することができる。
従来、活性酸素の臓器別の影響をモデル化することは困難であった。全身性にＭｎＳＯＤを欠損したモデルマウスは報告されていたが、新生児期に死亡するために長期的な活性酸素の影響を評価することは不可能であった。更に各々の臓器の活性酸素の感受性や発生量を評価することは困難であり、臓器によっては活性酸素の感受性が低いにもかかわらず、全身性の変化の結果として変性が起こる可能性が既存のモデルマウスでは否定することができない。このことより既存のモデルマウスを用いて、各臓器の加齢現象を評価することはかなり困難であり、老化により罹患率が上昇し、臓器で特異的な変化を起こす罹患（例えば、パーキンソン病又は動脈硬化等）の解析は不可能であった。
従って、本発明の課題は、長期に生存して組織特異的にＭｎＳＯＤ遺伝子が抑制又は欠損（特には欠損）するノックアウト非ヒト動物（例えば、ノックアウトマウス）、及びその作成に利用可能なノックイン非ヒト動物（好ましくはノックインマウス）を提供することにある。前記ノックアウトマウスは、成体組織又は正常老化過程におけるＭｎＳＯＤ遺伝子欠損による活性酸素の影響を調べることを可能とするモデルマウスである。
本発明において、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステムを利用することにより、組織特異的なＭｎＳＯＤ欠損マウス、及びその作成に利用可能なノックインマウスを提供することに成功した。このノックインマウスは、通常はＭｎＳＯＤの発現量が野生型と変わらない表現型であるが、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させると遺伝子がノックアウトされるモデルマウスである。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現はＣｒｅリコンビナーゼ過剰発現トランスジェニックマウスと交配させることにより可能となる。更に組織特異的にＣｒｅリコンビナーゼを過剰発現するようなトランスジェニックマウスと交配することにより、ＭｎＳＯＤ遺伝子が組織特異的にノックアウトされるようなコンディショナルノックアウトマウスを用いることにより、全身性のノックアウトマウスでは困難であった成体組織での解析が可能となる。
従って、本発明は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡを有するノックイン非ヒト動物に関する。
本発明の好適態様によれば、前記エクソンがエクソン３である。また、本発明の別の好適態様によれば、前記の２つのリコンビナーゼ認識配列の間に、更にマーカー遺伝子（より好ましくはｎｅｏ耐性遺伝子）を含む。本発明の更に別の好適態様によれば、前記リコンビナーゼ認識配列がｌｏｘｐ配列である。本発明の更に別の好適態様によれば、前記非ヒト動物がマウスである。
また、本発明は、前記ノックイン非ヒト動物と、特定の組織でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物とを交配して得られる、前記特定組織におけるマンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現が抑制又は欠損したノックアウト非ヒト動物に関する。
更に、本発明は、前記ノックアウト非ヒト動物を、前記ノックイン非ヒト動物又は前記ノックアウト非ヒト動物と交配して得られる、前記特定組織に特異的にマンガンスーパーオキシドジスムターゼが欠損したノックアウト非ヒト動物に関する。
本発明の好適態様によれば、前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである。
更に、本発明は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡに関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＭｎＳＯＤ遺伝子のエクソン３を２つのｌｏｘｐ配列で挟んだノックインマウスを作製する様子を示す図である。１段目は５個のエクソンを含むＭｎＳＯＤ遺伝子を表し、２段目はターゲティングコンストラクトを示し、３段目は相同組み換えをおこさせたアリルを示す。黒い四角はエクソンを示し、Ｅｘ３はＭｎＳＯＤ遺伝子のエクソン３を示す。白い四角はそれぞれ、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）とチミジンカイネース遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）を示し、白い三角はｌｏｘｐ配列を示す。黒い矢印は各ＰＣＲで用いたプライマーを示す。制限酵素は下記略号で表す：Ｅ，ＥｃｏＲＩ；Ｘ，ＸｂａＩ；ＲＶ，ＥｃｏＲＶ；Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ，ＮｄｅＩ
図２は、実施例１の相同組み換えを起こした細胞のサザンブロットを示す図である。左図は、ＭｎＳＯＤ  ｆｌｏｘマウスから産まれてきた産仔のＤＮＡのサザンブロットを示し、右図は、ＰＣＲ法による遺伝子型の区別を示す。「ｗｔ」及び「ｗｉｌｄ」は野生型アリルを意味し、「ｌｏｘ」はｌｏｘｐアリルを意味する。また、「３’ｐｒｏｂｅ」及び「Ｎｅｏｒ  ｐｒｏｂｅ」は、それぞれ、図３に示す「３’ｐｒｏｂｅ」及び「Ｎｅｏｒ  ｐｒｏｂｅ」を用いた結果であることを示す。
図３は、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスの作製を示す図である（実施例２）。上段は相同組み換えをおこさせたアリルを表し（ｌｏｘｐアリル）、下段はＣｒｅリコンビナーゼによる組み換えを表し（ｄｅｌアリル）、エクソン３が消失している。黒色の四角はサザンブロット法で用いたプローブである。
図４は、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスのサザンブロットを示す図である。「ｅｘｏｎ４  ｐｒｏｂｅ」及び「Ｎｅｏｒ  ｐｒｏｂｅ」は、それぞれ、図３に示す「ｅｘｏｎ４  ｐｒｏｂｅ」び「Ｎｅｏｒ  ｐｒｏｂｅ」を用いた結果であることを示す。
図５は、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスのウエスタンブロット解析を示す図である。
図６は、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスのＳＯＤ活性の測定を示す図である。
図７は、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスの組織（ＨＥ染色）を示す図である。ｄｅｌ／ｄｅｌは肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスを示し、ｌｏｘ／ｌｏｘはコントロールを示す。
図８は、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスの過酸化脂質（ＭＤＡ及び４−ＨＡＥ）量を示す図である。ｄｅｌ／ｄｅｌは肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスを示し、ｌｏｘ／ｌｏｘはコントロールを示す。
【発明を実施するための最良の形態】（１）本発明のノックイン非ヒト動物
本発明のノックイン非ヒト動物は、ＭｎＳＯＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡを有する。
前記非ヒト動物としては、例えば、ヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、又はイルカ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生類（例えば、カエル）、又は爬虫類などを挙げることができる。
ＭｎＳＯＤ遺伝子の塩基配列は、種々の非ヒト動物において既に公知である。例えば、マウスでは、図１に示すように、５個のエクソン（エクソン１〜５）からなることが知られている。本発明のノックイン非ヒト動物は、ＭｎＳＯＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソン（好ましくは１つのエクソン）を、所望によりその隣接するイントロンと共に、含むことができる。本発明において用いることのできるエクソンは、そのエクソンが欠損することによりＭｎＳＯＤとしての機能が欠損するエクソンである限り、特に限定されるものではないが、例えば、マウスでは、エクソン３が好ましい。
本発明においては、リコンビナーゼ及びその認識配列の組み合わせを利用する。リコンビナーゼは、ＤＮＡ分子内に存在する２つの特異的な短い相同領域（すなわち、リコンビナーゼ認識配列）を認識してＤＮＡの組み換え（部位特異的組み換え）を行う酵素である。このようなリコンビナーゼ及びその認識配列の組み合わせとしては、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステム又はＦＬＰ−ＦＲＴシステム等を挙げることができる。従って、本発明のノックイン非ヒト動物におけるリコンビナーゼ認識配列としては、例えば、ｌｏｘｐ配列又はＦＲＴ配列等を用いることができる。
本発明のノックイン非ヒト動物は、２つのリコンビナーゼ認識配列の間に、更にマーカー遺伝子（好ましくは薬剤耐性遺伝子）を含むことができる。前記マーカー遺伝子としては、所望のＤＮＡをノックイン非ヒト動物に導入する際に薬剤耐性として機能することのできるタンパク質をコードする遺伝子である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子又はＨＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子などを挙げることができる。
本発明のノックイン非ヒト動物は、以下の製造方法に限定されるものではないが、例えば、ＭｎＳＯＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡ（好ましくは、ＭｎＳＯＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域とマーカー遺伝子とを、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡ）を適当なベクター上で構築することによりターゲッティングベクターを作製した後、そのターゲッティングベクターを用いて胚性幹細胞（ＥＳ細胞）において相同組み換えをおこさせることにより、取得することができる。得られた非ヒト動物が所望のＤＮＡを有しているか否かは、例えば、サザンブロット法により確認することができる。
本発明のノックイン非ヒト動物には、ＭｎＳＯＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む領域を２つのリコンビナーゼ認識配列で挟んだＤＮＡを、相同染色体のいずれ一方のみに有するヘテロ接合体と、相同染色体の両方に有するホモ接合体とが含まれる。
（２）本発明のノックアウト非ヒト動物
本発明のノックアウト非ヒト動物には、特定組織に特異的にＭｎＳＯＤが欠損したノックアウト非ヒト動物と、特定組織におけるＭｎＳＯＤの発現が抑制されたノックアウト非ヒト動物とが含まれる。なお、本明細書における「欠損」とは、実質的にＭｎＳＯＤが存在しないことを意味し、「抑制」とは、ＭｎＳＯＤの発現量が野生型よりも低い（好ましくは野生型の５０％以下であり、より好ましくは野生型の３０％以下であり、更に好ましくは２０％以下である）ことを意味する。
本発明のノックアウト非ヒト動物は、例えば、本発明のノックイン非ヒト動物と、特定の組織でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物とを交配することにより得ることができる。
前記リコンビナーゼとしては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦＬＰリコンビナーゼ等を挙げることができる。
例えば、特定の組織でＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスとしては、例えば、Ｓｙｎ−Ｃｒｅ（シナプシンプロモーターにより中枢神経細胞で発現する）、Ｎｅｓ−Ｃｒｅ（ネスチンプロモーターにより中枢及び末梢神経で発現する）、Ｔｅｋ−Ｃｒｅ（Ｔｉｅ２プロモーターにより血管内皮細胞で発現する）、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ（マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーターにより乳腺細胞で発現する）、ＰＲＭ−Ｃｒｅ（プロタミンプロモーターにより雄性性腺で発現する）、ＧＺＭＢ−Ｃｒｅ（グランザイムプロモーターによりＴ細胞で発現する）、Ａｌｂ−Ｃｒｅ（アルブミンプロモーターにより肝臓で発現する）、Ｉｎｓ２−Ｃｒｅ（インスリン２プロモーターにより膵臓で発現する）、Ｃｏｌｌ  Ｉ−Ｃｒｅ（２型コラーゲンプロモーターにより軟骨細胞で発現する）（以上、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６００  Ｍａｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ  ０４６０９，ＵＳＡより入手可能）、ＰＢ−Ｃｒｅ（プロバシンプロモーターにより前立腺で発現する）、ＭｙＨＣ−Ｃｒｅ（ミオシン重鎖プロモーターにより心筋で発現する）（以上、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｎｅ  Ｂａｙｌｏｒ  Ｐｌａｚａ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ  ７７０３０，ＵＳＡより入手可能）、ＴＨ−Ｃｒｅ（チロシンハイドロキシレースプロモーターによりドーパミン作動ニューロンで発現する。福島県立医科大学  生体情報伝達研究所  生体機能部門より入手可能）、又はＫ１４−Ｃｒｅ（ケラチン１４プロモーターにより表皮で発現する。Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉ．Ｇ．Ｂ．Ｍ．Ｃ．ＣＮＲＳ−ＩＮＳＥＲＭ−ＵＰＬ，ＢＰ  １６３，６７４０４  ＩＬＬＫＩＲＣＨ  ＣＥＤＥＸ  Ｃ．Ｕ．ＳＴＲＡＳＢＯＵＲＧ，Ｆｒａｎｃｅより入手可能）等を挙げることができる。
本発明のノックイン非ヒト動物と、特定の組織でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物とを交配すると、リコンビナーゼが発現する組織では、図３に示すように、２つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれた領域（すなわち、ＭｎＳＯＤ遺伝子のエクソンを含む領域）がリコンビナーゼにより切り出されるが、リコンビナーゼが発現しない組織では、前記切り出しは起こらない。従って、前記交配により得られる本発明のノックアウト非ヒト動物では、リコンビナーゼが発現する組織でのみ特異的にＭｎＳＯＤの欠損又は発現抑制が起こり、それ以外の組織では野生型と変わらないＭｎＳＯＤ発現を示す。
ここで、リコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物として、ＭｎＳＯＤ遺伝子に関して野生型である非ヒト動物を使用すると、特定組織におけるＭｎＳＯＤの発現が抑制された本発明のノックアウト非ヒト動物（ヘテロ接合体）を得ることができる。一方、リコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物として、ＭｎＳＯＤ遺伝子欠損のトランスジェニック非ヒト動物を使用すると、特定組織に特異的にＭｎＳＯＤが欠損した本発明のノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
次に、本発明のノックイン非ヒト動物と特定の組織でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物とを交配して得られた本発明のノックアウト非ヒト動物を、本発明のノックイン非ヒト動物と交配することにより、特定組織に特異的にＭｎＳＯＤが欠損した本発明のノックアウト非ヒト動物（ホモ接合体）を得ることができる。あるいは、本発明のノックイン非ヒト動物と特定の組織でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物とを交配して得られた本発明のノックアウト非ヒト動物を、同様にして得られた本発明のノックアウト非ヒト動物と交配することによっても、特定組織に特異的にＭｎＳＯＤが欠損した本発明のノックアウト非ヒト動物（ホモ接合体）を得ることができる。
交配により得られた非ヒト動物が、ＭｎＳＯＤ遺伝子のエクソンを欠損しているか否かは、例えば、サザンブロット法により確認することができる。また、特定組織においてＭｎＳＯＤが欠損しているか否かは、例えば、ウエスタンブロット法により確認することができる。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】  本実施例では、ＭｎＳＯＤ遺伝子のエクソン３を２つのｌｏｘｐ配列で挟んだノックインマウスを作製した。その様子を図１に示す。
ＭｎＳＯＤのマウスｃＤＮＡをプローブとして、１２９／Ｓｖ系統マウスの染色体ライブラリー（λＦＩＸＩＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）からＭｎＳＯＤの５個のエクソンを含む約１４ｋｂの染色体遺伝子をｐＢＳＫＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にクローニングした。
単離したＭｎＳＯＤゲノム遺伝子を鋳型にして、ＮｏｔＩ認識配列を含むセンスプライマー（ＮｏｔＩ  ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；配列番号１）及びＳａｌＩ認識配列を含むアンチセンスプライマー（ＳａｌＩ  ａｎｃｈｏｒｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；配列番号２）のプライマーセットを用いて、５’側の１．３ｋｂのゲノム遺伝子断片をＰＣＲ法にて増幅させ、ｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（Ｂ）プラスミド（オリエンタル酵母社製）にクローニングした。
単離したＭｎＳＯＤゲノム遺伝子を鋳型にして、ＸｈｏＩ認識配列を含むセンスプライマー（ＸｈｏＩ  ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；配列番号３）及びＳａｌＩ認識配列を含むアンチセンスプライマー（ＳａｌＩ  ａｎｃｈｏｒｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；配列番号４）のプライマーセットを用いて、３’側の約６ｋｂのゲノム遺伝子断片を増幅させた。ＳａｌＩ部位とＸｈｏＩ部位において、先に得られた５’側のゲノム遺伝子を含むｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（Ｂ）プラスミドにクローニングした。
一方、ｌｏｘｐ配列を両脇に配置したネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＭＣｎｅｏ−ｌｏｘｐベクター［大阪大学の八木教授より供与；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６（１９９８）６７９−６８０］を用いて、ｐＢＳＫＩＩベクターへｌｏｘｐ配列を両脇に配置したネオマイシン耐性遺伝子をＸｈｏＩ／ＳａｌＩ部位に挿入し、Ｎｅｏｒ／ＢＳＫベクターを作製した。更にＮｅｏｒ／ＢＳＫベクターに３番目のｌｏｘｐ配列を挿入したＮｅｏｒ−ｌｏｘｐ／ＢＳＫベクターを作製した。
単離したＭｎＳＯＤゲノム遺伝子を鋳型にして、ＳａｌＩ認識配列を含むセンスプライマー（ＳａｌＩ  ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；配列番号５）及びＳａｌＩ認識配列を含むアンチセンスプライマー（ＳａｌＩ  ａｎｃｈｏｒｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；配列番号６）のプライマーセットを用いて、エクソン３を取り囲むゲノム遺伝子断片を増幅させ、この断片をＮｅｏｒ−ｌｏｘｐ／ＢＳＫベクターのＳａｌＩ部位に挿入した。制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩを用いてエクソン３とネオマイシン耐性遺伝子を含む断片を取り出し、平滑末端にしてから、先に得られた５’側及び３’側のゲノム遺伝子を含むｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（Ｂ）ベクターにクローニングした。作製したベクターから制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩを用いてターゲティングコンストラクトを取り出し、ＰＩＣ１９Ｒ／ＭＣＩ−ＴＫベクター［ユタ大学のＣａｐｅｃｃｈｉ博士より供与；Ｎａｔｕｒｅ，３３６（１９８８）３４８−３５２又はＳｃｉｅｎｃｅ，３０１（２００３）３６３−３６７］にクローニングし、ノックインコンストラクトを作製した（図１、ターゲティングベクター）。
制限酵素ＮｏｔＩで切断し、直線化したターゲティングコンストラクトをエレクトロポレーション法でＥＳ細胞に導入した。
Ｇ４１８を含む培地中から、相同組み換えを起こしている細胞を、以下のようにして、サザンブロット法で確認した。
出生直後の産仔から得られた各ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、３’プローブ（３’ｐｒｏｂｅ）を用いると、野生型マウス（ｗｔ／ｗｔ）は２４ｋｂの断片が、ＭｎＳＯＤ  ｆｌｏｘマウスのホモ接合体マウス（ｌｏｘ／ｌｏｘ）は８．１ｋｂの断片が検出された（図２左上）。また、Ｎｅｏｒプローブ（Ｎｅｏｒ  ｐｒｏｂｅ）を用い、制限酵素ＸｂａＩによる消化では、ホモ接合体マウス（ｌｏｘ／ｌｏｘ）とヘテロ接合体マウス（ｗｔ／ｌｏｘ又はｌｏｘ／ｗｔ）は６．３  ｋｂの断片が検出され、野生型（ｗｔ／ｗｔ）は検出されなかった（図２左下）。
更にキメラマウスを作製し、生殖系列に入ったかどうかもサザンブロット法にて確認した。図１に示すプライマーＰ１（配列番号７）、Ｐ２（配列番号８）、及びＰ４（配列番号９）を用いて子の尾から抽出したＤＮＡを用い、ＰＣＲを実施した。野生型アリル（ｗｔ／ｗｔ）は５００ｂｐ、変異アリル（ｗｔ／ｌｏｘ、ｌｏｘ／ｗｔ、又はｌｏｘ／ｌｏｘ）は３５８ｂｐのバンドを検出した（図２右）。
【実施例２】  本実施例では、肝細胞で特異的にＭｎＳＯＤが欠損するモデルマウスを作製し、その解析を行った。
肝細胞でＣｒｅリコンビナーゼを発現するラットアルブミンプロモーター（Ａｌｂ）−Ｃｒｅ［ｒａｔ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｌｂ）−Ｃｒｅ］トランスジェニックマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６００  Ｍａｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ  ０４６０９，ＵＳＡより入手）と、実施例１で得られたＭｎＳＯＤ  ｆｌｏｘマウスとを交配した。その様子を図３に示す。
その結果、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスに致死性は認められず、外見上も野生型と比較して差異は認められなかった。
肝臓から得られたＤＮＡを用い、組み換えの効率を調べるため、サザンブロット法を実施した（図４）。
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化においては、エクソン４プローブ（ｅｘｏｎ４  ｐｒｏｂｅ）により、ＭｎＳＯＤ  ｆｌｏｘアリル（ｌｏｘ／ｌｏｘ）では６．０ｋｂのＤＮＡ断片を、ＭｎＳＯＤ欠損アリル（ｄｅｌ／ｄｅｌ）では４．０ｋｂのＤＮＡ断片を検出した。
制限酵素ＥｃｏＲＶ消化においては、エクソン４プローブにより、ＭｎＳＯＤ  ｆｌｏｘアリルでは８．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ＭｎＳＯＤ欠損アリルは６．８ｋｂのＤＮＡ断片を検出した。それぞれ一部Ｃｒｅによる組み換えが行われていないＤＮＡ断片が少量検出されている。Ｎｅｏｒプローブを用いると、ＭｎＳＯＤ  ｆｌｏｘアリルのホモ及びヘテロマウスから得られたＤＮＡでは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ又はＥｃｏＲＶでそれぞれ６．１ｋｂ又は６．８ｋｂの断片が検出され、野生型はまったく検出されなかった。ＭｎＳＯＤ欠損アリルについては、エクソン４プローブと同様に、一部検出された。
これらの結果から、大部分のＭｎＳＯＤ遺伝子のエクソン３が期待通りに欠損するような遺伝子組み換えが行われたことが確認された。
一方、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスの脳、心臓、肝臓、又は腎臓から抽出したサンプルに対してウエスタンブロット法を実施した。その結果、肝臓のみＭｎＳＯＤが欠損しており、他の臓器では差が無いことが確認された（図５）。
次に、肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスとコントロールマウスの肝臓をサンプルにＳＯＤの活性を測定した（図６）。Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ活性に明らかな差はなかった（図６左）が、ＭｎＳＯＤについてはコントロールと比較して活性は７０％減少していた（図６右）。
【実施例３】  ＭｎＳＯＤ欠損マウスはＭｎＳＯＤ欠損の影響により肝臓に脂肪やグリコーゲンが蓄積しているという報告がある。そのため、本実施例では、実施例２で作製した肝臓特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスについて、同様にＨＥ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）染色、ＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）染色、及びオイルレッドＯ（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）染色を行った。その結果、グリコーゲンの蓄積の程度に明らかな差異は認められなかった（図７）。
また、野生型より臓器に対する活性酸素の暴露が多いのではないかと予想し、過酸化脂質［マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）及び４−ヒドロキシアルケナール類（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｌｋｅｎａｌｓ；４−ＨＡＥ）］の量を測定したが、これもコントロールのマウスと明らかな差は認められなかった（図８）。
以上の結果より、既存のＭｎＳＯＤ欠損マウスに認められた肝臓での変化は、肝臓自体でなく、全身の欠損によるものであることが示唆された。
【産業上の利用可能性】  遺伝子操作により各臓器別に活性酸素の防御機構の破綻を観察し、活性酸素の生体に対する影響を観察することが可能なモデルマウスの作成に成功した。本発明により得られる組織特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスは、既存のＭｎＳＯＤ欠損マウスと異なり、組織特異的にＭｎＳＯＤの活性が欠損するため、新生児期の致死性を回避することが可能となる。このモデルマウスを用いることにより、既存のマウスでは不可能であった臓器別に老化、加齢現象を観察することが可能になった。また各臓器における活性酸素の感受性の程度が解析可能となり、臓器別に老化に対する感受性が評価できるようになった。
このモデルマウスは、老化により罹患率が上昇する臓器で特異的な変化を起こす罹患（パーキンソン病、動脈硬化等）の解析には不可欠のモデルである。更にその疾患の臓器特異的な薬剤、例えば、脳の老化を予防するような薬剤を開発するためにこれらのモデルマウスが必須である。更に開発された薬剤の効果を検定する際にも貴重なアッセイシステムを提供するものである。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１〜６の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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