(57)【要約】本発明は、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患、特に汎造血細胞減少症および／または造血機能低下を伴う疾患の治療薬として有用である、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を提供することを課題とする。本発明は、コフィリンを有効成分とする、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を提供することにより、上記課題を解決する。
2003057241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コフィリンを有効成分とする、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項２】
コフィリンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すアミノ酸配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるコフィリンのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するものである、請求項１に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項３】
コフィリンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すアミノ酸配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるコフィリンのアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するものである、請求項１に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項４】
コフィリンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すアミノ酸配列、あるいはコフィリンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）との間で少なくとも３０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する、請求項１に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項５】
コフィリンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す塩基配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるコフィリンの塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列によりコードされ、かつ造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するものである、請求項１に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項６】
コフィリンが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す塩基配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるコフィリンの塩基配列との間で少なくとも３０％の塩基配列相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡによりコードされ、かつ造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するものである、請求項１に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項７】
コフィリンが遺伝子組換えの手法により産生されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項８】
コフィリンが糖鎖を有する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項９】
他のサイトカインをさらに含有してなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項１０】
前記サイトカインが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子または白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ  ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）からなる群から選ばれた１または複数の組み合わせである、請求項９に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項１１】
前記他のサイトカインがＩＬ−３である、請求項９に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項１２】
前記他のサイトカインが、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）またはこれらの組み合わせである、請求項９に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項１３】
造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患の治療のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤
【請求項１４】
汎造血細胞減少および／または造血機能低下を伴う疾患の治療のための、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項１５】
再生医療に用いることができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を投与することを含む、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化を促進する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を投与することを含む、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患を治療する方法。
【請求項１８】
造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患が汎造血細胞減少および／または造血機能低下を伴う疾患である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を用いて、造血幹細胞を生体外で増殖させる方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を用いて、造血幹細胞を生体外で増殖させることによる再生医療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アクチン結合タンパク質の１種であるコフィリンまたはその類縁化合物を有効成分とする造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤とその新たな用途に関する。本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤は、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患、特に汎造血細胞減少症および／または造血機能低下を伴う疾患の治療薬として有用である。また、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を用いて造血幹細胞を生体外で増殖させる方法は、造血幹細胞移植や遺伝子治療にも有用であり、さらに再生医療にとって有用なものである。
従来の技術
生体における成熟・分化した末梢血球系の恒常性は、自己複製能を有する造血幹細胞、それから供給され分化の方向が決定づけられた造血前駆細胞および両者間の連続的な分化段階の細胞群と、さらにはそれら一連の細胞を取り巻く造血微小環境としての支持間質細胞との直接相互作用あるいは後者の分泌する液性造血調節因子との間接相互作用により調節されている。造血幹細胞から造血前駆細胞を経て、成熟した各種血球への増殖および／または分化には、多数のサイトカインの関与が明らかにされている。
遺伝子工学の進歩により、これらのサイトカインの遺伝子はクローニングされ、遺伝子組み換え技術により工業生産も可能となっている。遺伝子組み換え型造血因子としては、顆粒球−コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、以下「Ｇ−ＣＳＦ」という）およびマクロファージ−コロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、以下「Ｍ−ＣＳＦ」という）が放射線照射または化学療法などによる造血機能低下（好中球減少など）に対する治療薬として、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、以下「ＥＰＯ」という）が腎性貧血などの治療薬として臨床応用されている。しかし、これらの造血因子での治療は、一過性に成熟血球の回復をきたすに過ぎない。
そこで、根本的な造血機能の改善の治療手段として、自己あるいは同種造血幹細胞移植が行われている。最近では、末梢血造血幹細胞移植が急速に普及しつつあり、また、臍帯血造血幹細胞移植が注目されている。しかし、課題も多く、とくに造血幹細胞は非常に僅かな存在であるためドナーおよび／あるいはレシピエントの負担も大きい。そのため、造血幹細胞の体外増幅法の確立が必要である。また、現在効果的な治療法のない致死的な遺伝性疾患や、ある種の悪性腫瘍、エイズ患者に対して、欠失あるいは、変異遺伝子を相補する遺伝子治療が試みられている（大橋十也、実験医学、１２：３３３，１９９４）。
造血幹細胞は恒久的に生存し得ることから、このような遺伝子治療において、最適な標的細胞と考えられている。しかし、目的遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターを効率よくトランスフェクトあるいは感染させるには、通常静止期にある少数の造血幹細胞を細胞周期に入れ、増幅させることが必要である。造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖に関与していると考えられたステムセルファクター（ＳＣＦ；ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）やｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンドについて、増殖に対する有効性が検討された。
造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖にとって、ｃ−ｋｉｔ／ＳＣＦ系シグナルが重要なことが実験的研究により明らかにされ（Ｂｌｏｏｄ，７８：１−１９，１９９１；Ｂｌｏｏｄ，８１：２８４４−２８５３，１９９３；Ｂｌｏｏｄ，９０：４７６７−４７７８，１９９７）、ステムセルファクター（ＳＣＦ；ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）が造血幹細胞や造血前駆細胞に発現しているチロシンキナーゼ型受容体であるｃ−ｋｉｔのリガンドであることが示された（Ｃｅｌｌ，６３：１６７−１７４，１９９０；Ｃｅｌｌ，６３：１９５−２０１，１９９０；Ｃｅｌｌ，６３：２２５−２３３，１９９０）ことから、造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖に対するＳＣＦの効果が期待された。しかしながら、ヒト造血幹細胞や造血前駆細胞上のｃ−ｋｉｔの発現は弱く（Ｂｌｏｏｄ，８７；４１３６−４１４２，１９９６）、ＳＣＦ単独では増幅活性が低く、造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖にとって十分に有効ではない。
また、様々な組織に遺伝子発現が認められている受容体型チロシンキナーゼであるＦｌｋ−２／Ｆｌｔ−３は、血液細胞ではとくに未分化造血幹細胞に発現しており、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）は未分化造血細胞の増殖を刺激する因子として見出された（Ｌｙｍａｎ  ＳＤ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９８；５（３）：１９２−６）。しかしこの分子も、単独では増幅活性が低く、造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖にとって十分に有効ではない。
このように、ＳＣＦやＦＬを単独で使用しても造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖にとって十分には有効でないことから、造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖法としては種々のサイトカインとの組み合わせが理想的であると考えられており（Ｂｌｏｏｄ，８９：２６４４−２６５３，１９９７；Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３８［Ｓｕｐｐｌ．］：６４−６８，１９９６）、これらの分子とＴＰＯ（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、インターロイキン（ＩＬ−６）／可溶性インターロイキン６受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ  ＩＬ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）複合体あるいはＨｙｐｅｒ  ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）等との組み合わせが検討されている（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：８２２−８３２，２００１）。さらに、増幅活性の強い新たな因子の解明、取得が待たれている。
一方コフィリンは、分子量約１９０００のタンパク質であり、種々のシグナルに対しアクチンフィラメント（Ｆ−アクチン）に１：１のモル比で結合し、その結果、アクチンの物理的状態を調節して、アクチン系細胞骨格の再構築において主要な機能を果している、アクチン結合タンパク質（ａｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＢＰ）の一員である（実験医学、第１２巻、第４号：２４−２８，１９９４）。そしてコフィリンは、Ｇ−アクチンと結合しＧ−アクチン（アクチン単量体）を切断、脱重合することにより、形態変化、移動（運動）、分裂、分泌、食（飲）作用、各種シグナル伝達等の多くの細胞応答を制御していることが知られている（生化学、第７１巻、第２号：１０１−１１４，１９９９）。コフィリンは、細胞内でリン酸化型と脱リン酸化型が共存しており、アクチンに対する結合活性は、リン酸化によって抑制され、脱リン酸化により促進される。
近年、血小板に対するトロンビンによる刺激、甲状腺細胞に対する甲状腺刺激ホルモンによる刺激、耳下腺細胞に対するイソプレテレノールによる刺激、アストロサイトに対するジブチリルｃＡＭＰによる刺激など、さまざまな外的刺激に伴いコフィリンが脱リン酸化されることが分かってきた（Ｍｏｏｎ，Ａ．＆  Ｄｒｕｂｉｎ，Ｄ．Ｇ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．６，１４２３−１４３１）。さらに、好中球やＴ細胞の活性化にともなってコフィリンが脱リン酸化されるという報告もある。
一方、アクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の機能あるいはＡＢＰ機能の調節により、ある種の疾患治療法が提示されている。例えば、アクチン沈着が原因となる病態組織、臓器へのＡＢＰ投与による治療あるいは病態軽減法（特表平５−５０６０３号、特表平８−５１０９９８号）、コフィリンの脱リン酸化抑制剤によるアポトーシスモジュレーションを機序としたアポトーシス制御不全が関与する各種疾患治療薬（特開平１０−６７６６２号、特開平１０−８７４８４号）が挙げられる。
しかしながら、これらコフィリンおよびその類縁化合物が造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化に関与するとの報告はこれまでのところ存在しなかった。
本発明は、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患、特に汎造血細胞減少症および／または造血機能低下を伴う疾患の治療薬として有用である、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、造血幹細胞移植、遺伝子治療および再生医療にも有用である、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を投与することを含む、造血幹細胞の生体外増殖方法を提供することを課題とする。
発明の概要
本発明者は以前に、ヒト骨髄性白血病細胞株から、ＣＤ３４が陽性であり、かつＧＰ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＩｂ／ＩＩＩａが陰性であるという特徴を有する、新たな細胞株を樹立した（特開平６−２６９２８４）。本発明者らはこの細胞を、Ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌ  Ｓ６  ＳＢＭ３３２と命名し（以下「Ｓ６細胞」と称す）、１９９３年３月９日付けで日本国茨城県つくば市東１−１−１の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ  ＢＰ−４２２７として寄託した。ＣＤ３４は、造血幹細胞の分化に伴い消失する糖タンパク質でヒト造血幹細胞のマーカーであり、一方ＧＰ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＩｂ／ＩＩＩａは、血小板と巨核球に特異的に発現している血小板膜糖タンパク質で、巨核球の分化に伴い増強される分化抗原でありヒト巨核球のマーカーである。
Ｓ６細胞株は、血清添加条件でＣＤ３４陽性およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ陰性の表現型を保持したまま長期的に安定して培養でき、しかも１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）の添加培養によりＣＤ３４の発現が減弱し、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの発現が著しく増強し、これによってＳ６細胞株は巨核球系へ分化することがわかり、分化能を有することも明らかとなった。
本発明の発明者らのこれらの従来の実験結果に基づくさらなる研究において、Ｓ６細胞の無血清培養上清中にはマウス高増殖能コロニー形成細胞、ＨＰＰ−ＣＦＣ（ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ−ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の増幅を促進する因子の存在が認められた。従来からの知見およびこの研究結果から、Ｓ６細胞は造血幹細胞の性質を有し、造血幹細胞の増殖を促進し得る未知の因子（以下「Ｓ６因子」と称す）によりオートクリン増殖していることを見いだした。すなわち、Ｓ６因子は新規な、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖因子である可能性が示唆された。これに基づいてＳ６細胞の無タンパク質培養上清を精製し、ＨＰＰ−ＣＦＣ増幅能を有する因子の分離精製及び構造の決定、ないし該因子の遺伝子のクローニング及び遺伝子組み換え型因子のＨＰＰ−ＣＦＣ増幅能に関して鋭意研究を重ねた結果、意外にも該因子が低分子アクチン結合タンパク質であるコフィリンであることを見出した。
そして本発明の発明者らは、この知見から、アクチン結合タンパク質の一つであるコフィリンが造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化を促進することができる因子であることを見いだし、マウスのＨＰＰ−ＣＦＣ増幅を促進させ、しかも、ＨＰＰ−ＣＦＣ増幅能を有する既存のサイトカインよりも、その活性が著しく高いという知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、コフィリンを有効成分とし、場合により他のサイトカインをさらに含有する、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を提供する。
本発明はまた、上述した造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を投与することを含む、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化を促進する方法を提供する。
本発明はまた、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を用いて、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患、より具体的には汎造血細胞減少または造血機能低下、を治療する方法を提供する。
本発明はさらに、上述した造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を投与することを含む、造血幹細胞を生体外で増殖させる方法を提供する。
本発明はさらに、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の少なくとも１種を用いて造血幹細胞を生体外で増殖させ、増殖させた造血幹細胞を移植することによる再生医療方法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明におけるコフィリンの造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性は、ＨＰＰ−ＣＦＣの増幅促進活性（以下「ＨＰＰ−ＣＦＣ活性」と称す）を指標として、決定することができる。このＨＰＰ−ＣＦＣ（ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ−ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）は、増殖力が強く巨大コロニー形成能を有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏコロニー形成法で確認できる最も未熟な細胞であり、骨髄細胞を骨髄間質細胞上で５週間以上培養した後でもコロニー形成能を有する細胞として検出される長期培養開始細胞（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ、ＬＴＣ−ＩＣ）より一段階分化したものと考えられている。そして本発明においてＨＰＰ−ＣＦＣ活性という場合、被検物質がＨＰＰ−ＣＦＣに作用し、その増幅を促進する活性のことをいう。
ＨＰＰ−ＣＦＣ活性の測定は、たとえば、造血幹細胞を特異的に取得する目的でマウスに抗がん剤である５−フルオロウラシルを投与し、このマウスから得た骨髄細胞から、さらにＴ細胞、Ｂ細胞、顆粒球およびマクロファージのマーカー抗原を発現している細胞を除去した造血幹細胞画分に、サンプルおよび／またはサイトカインを添加して液体培養し、その培養液の一部をコロニーアッセイに供することにより形成される巨大なＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数を測定することにより行う。この測定法により、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の活性を測定することができる。
本発明において、コフィリンを用いて上述したＨＰＰ−ＣＦＣ活性測定を行ったところ、コフィリンは、このようなＨＰＰ−ＣＦＣに働いて、その増殖および／または分化を誘導する活性を発揮することがわかった。したがって、コフィリンは、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化の非常に初期段階にある細胞（すなわち多能性幹細胞）に機能し、その増殖および／または分化を促進する活性を有している。
本発明において「造血幹細胞」とは、赤血球、白血球、血小板などの全ての血液細胞に分化することができる、多能性幹細胞のことをいう。この細胞は、ＣＤ３４陽性であるが、他の細胞系譜マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｋｅｒ）は全て陰性な細胞である。例えば、本発明における「造血幹細胞」は、骨髄由来のＣＤ３４陽性細胞の他、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞に含まれている。
本発明において「造血前駆細胞」とは、造血幹細胞より分化段階が進み、それぞれの血液細胞系列の前駆細胞（単能性前駆細胞）へ分化する未分化前駆細胞のことをいう。例えば本発明における「造血前駆細胞」には、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球系前駆細胞である赤芽球バースト形成細胞（Ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ、ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球系前駆細胞（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ、ＣＦＵ−Ｍｋ）および骨髄系多能性幹細胞（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｍｉｘｅｄ、ＣＦＵ−Ｍｉｘ）などが含まれる。
本発明において造血幹細胞および／または造血前駆細胞の「分化」という用語は、造血幹細胞が造血前駆細胞へ、造血前駆細胞が単能性造血前駆細胞および／または特有の機能を有する細胞、すなわち赤血球、白血球、巨核球などの成熟細胞に転換することをいう。
したがって、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞増殖促進活性とは、上述した機能を有する造血幹細胞および／または造血前駆細胞を増殖させて、同様の機能を有する造血幹細胞および／または造血前駆細胞を増幅する活性のことをいう。また、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞分化促進活性とは、造血幹細胞および／または造血前駆細胞を分化させて、上述した機能を有する造血前駆細胞や単能性前駆細胞および／または成熟血液細胞（赤血球、白血球、巨核球）に転換する活性のことをいう。本発明においては、ＨＰＰ−ＣＰＣを造血幹細胞および／または造血前駆細胞と同義で使用する。
切断因子の一例であるコフィリンは、真核生物に普遍的に存在する分子量が１５−２１ｋＤａの低分子アクチン結合タンパク質であり、高等脊椎動物のコフィリンはいずれも１６６個のアミノ酸からなる。そして、そのアミノ酸配列は系統樹的に離れた種間でも全長にわたって３０％以上の相同性がある。たとえば、ヒトのコフィリンには筋型コフィリンと非筋型コフィリンとが存在するが、これらの相同性は７６．５％であることが知られている。したがって、本発明において特に限定なく「コフィリン」という場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有するコフィリンの他、その類縁化合物も含まれる。
本発明においてコフィリンの類縁化合物という場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるコフィリンのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるコフィリンのアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するもの；コフィリンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）との間で少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列からなるもの；であって、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するもの、が含まれる。本発明においてコフィリンの類縁化合物という場合には、また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるコフィリンの塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列によりコードされるもの；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるコフィリンの塩基配列との間で少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の塩基配列相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡによりコードされるもの；であって、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するもの、も含まれる。
ここにおいて、「１もしくは複数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のことをいう。また、タンパク質の場合、「欠失」、「置換」、「付加」は、コフィリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と同様に造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するように生じるもののことをいう。例えば、アミノ酸の「置換」の場合には、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換、例えばある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換、などの置換が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件とは、目的の塩基配列が、コフィリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をコードする塩基配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）もしくはこれと縮重の関係にある塩基配列との間で、特異的にハイブリダイズ可能である条件をいう。ハイブリダイズ条件は、温度、イオン濃度などの条件を考慮して決定されるが、一般的には温度が高いほど、またイオン濃度が低いほどストリンジェントな程度が高くなることが知られている。このようなストリンジェントな条件の設定は、当業者であれば、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１））の記載に基づいて行うことができる。これらのストリンジェントな条件の具体的な例としては、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。
本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列の配列相同性は、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の配列相同性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；および（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
本発明においてアミノ酸あるいは塩基配列の配列相同性解析には、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。具体的には、塩基配列解析の場合、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ）プログラムで、Ｑｕｅｒｙ塩基配列を入力して、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどの塩基配列データベースと照合することができる。また、アミノ酸配列解析の場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）プログラムで、Ｑｕｅｒｙアミノ酸配列を入力して、ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ、ＰＤＢ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲなどのアミノ酸配列データベースと照合することができる。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
このようなコフィリンおよびその類縁化合物は、天然のものを使用するほか、本発明の技術分野において既知の遺伝子工学的方法により製造することができるもの、たとえば部位特異的変異生成（Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、変異原処理やＰＣＲ増幅ミスを用いたランダム変異生成（Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、カセット導入変異生成（Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などにより製造されるもの、を用いることができる。すなわち、変異は自然に生じたものであっても、遺伝子工学的手法によって施したものであってもよい。たとえば、コフィリンについてはアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および遺伝子配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は既知であることから、これらの配列に基づいて、確立されている遺伝子工学的手法により産生することもできる。ここにおいて、遺伝子工学的手法としては、たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１））に記載されている方法を使用することができる。当業者は、慣用された方法により容易にこのような変異タンパク質を作製することができる。
コフィリンは生物種によりいくつかの異なる名称で呼ばれており、通常、それらはコフィリンファミリーと総称されている。本発明においては、これらのコフィリンファミリーに属する様々な生物種由来のものを含めて、コフィリンと総称する。したがって、コフィリンには、ヒト非筋型コフィリンやヒト筋型コフィリンなどを含むコフィリンと命名されているものの他、例えば、ブタのデストリン、ニワトリのアクチン脱重合因子（ＡＤＦ）、ウニ卵のデパクチン、酵母のＡｂｐ１、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａのアクトフォリン等およびこれらの類縁化合物が含まれる。
コフィリンの活性を有する物質の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤としての活性の種特異性は、マウス由来のコフィリンがヒト細胞に対して効果を発揮するなど、厳密な種特異性は有していない。従って、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の有効成分としては、コフィリンだけでなく、コフィリンと同様の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する限り、特定の種由来である必要はなく、たとえばウシ、ブタ、トリ、ヤギ、ヒツジなどの動物に由来するものであってもよい。しかし、ヒトに使用する場合には、ヒト由来のもの、すなわちヒト由来コフィリンあるいは当該コフィリンのヒト由来の類縁化合物を用いることが好ましい。
本発明の一態様においてはさらに、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤にはコフィリンまたはその類縁化合物以外に、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化を促進する働きを有する種々のサイトカインを１種類以上、補助的有効成分として含有させることもできる。
本発明において補助的有効成分として追加することができるサイトカインの例としては、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）等があるが、これらに限られるわけではない。また、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ  ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）を含有させることもできる。本発明において追加することができるサイトカインとしては、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）またはこれらのいずれかの組み合わせが好ましい。
これらのサイトカインを補助的有効成分として含有させると、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤としてのコフィリンの効果は相乗的に増加する。これらの添加量は特に限定しないが、例えば、ヒトコフィリンを１００とした場合にそれぞれ０．０００１〜２０００００重量％添加することができる。これらの補助的有効成分の添加量は上述の値に限定されるものでなく、症状、患者の年齢等により適宜決定することができる。これらのサイトカインは必ずしもコフィリンと同時に同じ剤形として投与しなくてもよく、たとえば、コフィリンを投与した後にサイトカインを投与することもできる。
本発明の一態様においては、上述した造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤に対して、コフィリン以外のＨＰＰ−ＣＦＣ活性を有する物質を、さらなる補助的有効成分として添加して使用してもよい。さらなる補助的有効成分としてのコフィリン以外のＨＰＰ−ＣＦＣ活性を有する物質とは、ＨＰＰ−ＣＦＣ由来コロニーの形成を促進することにより、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進作用を有する物質であって、コフィリン以外のもののことをいう。コフィリンとこれらのさらなる補助的有効成分とを同時に投与することにより、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進作用を相乗的に亢進することができる。このような物質にはＳＣＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ−３リガンド、ＴＰＯ、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体あるいはＨｙｐｅｒ  ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）などが含まれるが、これらのものには限定されない。
本発明のコフィリンを有効成分とする、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤は、体内に投与された際のその機能に基づいて、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化が十分でないために生じる疾患、より具体的には汎造血細胞減少および／または造血機能低下を伴う疾患、あるいは造血細胞減少あるいは造血機能障害を伴う疾患の治療および／または造血細胞減少あるいは造血機能障害を伴う治療法の改善に有効である。上記例としては、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、再生不良性貧血、悪性リンパ腫もしくは急性白血病等の癌、慢性肝障害、腎不全、手術時若しくは保存血の大量輸血患者、重症感染症、骨髄障害性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＳＴＥ、蛇咬症、溶血性尿毒症性症候群、脾機能亢進症、出血、Ｂａｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ’ｓ血小板無力症、尿毒症、抗血小板抗体、骨髄増殖性疾患等がある。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の投与は、限定するわけではないが、一般に非経口的に行われ、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内などの経路から投与することができる。本発明においては、静脈内投与することが好ましい。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の治療または改善薬としての使用量は、その使用方法、使用目的等により異なるが、例えば、ヒトコフィリンのタンパク質量として、注射投与して用いる場合には、例えば、１日量約０．００２μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、より好ましくは、１日量約０．２μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇである。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤は、液体あるいは固体として調製することができる。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を液体として調製する場合には、コフィリンを水性溶剤（例えば、蒸留水）、水溶性溶剤（例えば、生理食塩水、リンゲル液）、油性溶剤（例えば、ゴマ油、オリーブ油）等の溶剤に溶解して、慣用の方法により調製できる。さらに所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、グリシン）、等張化剤（例えば、ブドウ糖、転化糖）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、フェノール）、無痛化剤（例えば、ベンジルアルコール、塩酸プロカイン）等の添加剤を加えることもできる。また、該水溶液におけるｐＨは、約３〜８に、さらに好ましくは約５〜７に調整される。上記ｐＨ範囲に調整するためには、例えば希酸（例えば、希塩酸）や希アルカリ（例えば、希水酸化ナトリウム、希炭酸水素ナトリウム）等を添加することにより行える。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の製剤化にあたり、コフィリンを含有する液剤に、安定剤としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合すると、溶液状態でｐＨ３〜８を示すように調整することができる。このようにすると、保存中および凍結や凍結乾燥操作におけるコフィリンの活性低下が少なく、また凍結品においてはその再溶解時の溶状が透明であるので好ましい。ＨＳＡとしては、いかなるものでもよいが、本組成物を臨床応用するためには、非経口投与に用いる程度の品質のものが好ましい。例えば、健康人血漿を原料としてＣｏｈｎのエタノール分画第６法によって分画精製したものが用いられる。また、安定剤として、アセチルトリプトファンナトリウムや、カプリル酸ナトリウムを含むものであってもよい。ＨＳＡは、各成分を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌあたり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、特に、約０．５ｍｇ〜約２０ｍｇ含有させることが好ましい。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤の製剤化にあたっては、コフィリンを含有する液剤に、前記ＨＳＡに加えさらに、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、プロリン等のアミノ酸、特にモノアミノ脂肪酸アミノ酸、もしくは環状アミノ酸、ブドウ糖、マンノース等の単糖類、ソルビット、マンニット等の糖アルコール類、およびこれらの生理学的に許容される塩、ならびにこれらの誘導体からなるグループから選択される化合物の１種類または２種類以上を配合してもよい。上記配合剤は、例えば、コフィリンを水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌ当たり、単糖類または糖アルコール類の場合は約１０〜１００ｍｇ、アミノ酸の場合は約５〜５０ｍｇ配合することが好ましい。上記の製剤化にあたっては、水溶液を溶液状態でｐＨ約３〜８、好ましくはｐＨ約５〜７を示すように調整する。グルタミン酸等の酸性アミノ酸を配合する場合は該物質を上記所定量加えることにより、所定のｐＨに調整できる。あるいは、所望により、または上記酸性アミノ酸を配合しない場合は塩酸、リン酸等の鉱酸、もしくはコハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝剤で所定のｐＨに調整できる。
また、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を固体として調製する場合は、例えば、コフィリンを凍結することにより、あるいは凍結乾燥することにより調製することができる。特に、取り扱いや貯蔵の安定性の面から凍結乾燥することが好ましい。本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を凍結することにより調製するためには、水溶液として調製した造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を原料として用い、これを通常約−８０℃〜−２０℃で凍結することにより製造できる。該凍結組成物は約−８０℃〜２５℃、好ましくは約−８０℃〜１５℃、さらに好ましくは約−８０℃〜−１０℃で保管する。本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を凍結乾燥することにより調製するためには、例えば上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか、または、上記水溶液もしくは上記凍結組成物の融解により得られる水溶液を、所望により小分けし、上述のように凍結した後、常法により減圧乾燥することにより製造することができる。
本発明においては、場合により、固体（例えば、粉末状）のコフィリンに、希釈剤（例えば、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖）、賦形剤（例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、フェノール）、無痛化剤（ブドウ糖、ベンジルアルコール、塩酸プロカイン）等を混合することができる。
上述した固体の製剤を凍結乾燥することにより調製する場合には、さらにそれを用いて液剤を調製するために、用時適当な溶剤に溶解して使用することができる。より具体的には、上述した固体の製剤を、蒸留水もしくは生理食塩水等を用いて溶解し液剤として用いる。なお、所望により前記の単糖類、糖アルコール類、アミノ酸等を含有する、ｐＨ調整された溶解液で溶解した後に使用することもできる。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を液剤としてあるいは凍結により製造する場合は、例えば、コフィリンを含有する水溶液を濾過等により滅菌することが好ましい。液剤として製造する場合にはこの水溶液を使用することができ、凍結により製造する場合にはこの水溶液を凍結することができる。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を凍結乾燥により製造する場合は、例えば、コフィリンを含有する水溶液を濾過等により滅菌するか、この水溶液を濾過等により滅菌した後、無菌操作によりバイアル瓶等に分注小分けした後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。この場合、容器の空間部を真空にするか、窒素ガス置換することにより、該組成物の安定性を高めることができる。また、アミノ酸や単糖類あるいは糖アルコール類を含有する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場合には、その水溶液は除菌濾過し、無菌操作によりアンプル等に分注小分け後、常法により蒸気滅菌したものを用いることが好ましい。
本発明のコフィリンを有効成分とする、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤は、上述したような薬理学的効果を発揮する結果、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤はまた、再生医療において使用することもできる。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を再生医療において使用する場合には、本発明の増殖および／または分化促進剤を上述したように生体内に投与するか、または生体外で培養液中に添加する。本発明の増殖および／または分化促進剤を生体外で使用する場合には、例えば以下の方法により行うことができるが、これ以外にも当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。まず、被検体から当該技術分野において既知の方法を使用して造血幹細胞および／または造血前駆細胞を採取し、ついでこれを本発明の増殖および／または分化促進剤を含む培養液中で培養して増殖させることにより造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化を促進し、その後増殖および／または分化させた造血幹細胞および／または造血前駆細胞を再び被検体内へ移入する。
本発明の増殖および／または分化促進剤を生体外で使用する場合には、培養液中でのコフィリン濃度として１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２．５ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌとなるように、本発明の増殖および／または分化促進剤を培養液中に添加する。本発明の増殖および／または分化促進剤中には場合により、前述したようにサイトカインをさらに添加することができる。本発明において追加して添加するサイトカインとしては、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）またはこれらのいずれかの組み合わせが好ましい。
発明の実施の形態
（１）造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の測定法
造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖の測定法として、細胞系譜マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｋｅｒ）を発現した細胞を除去したマウス骨髄細胞とサンプルとを液体培養した後、その培養液中に存在する高増殖能コロニー形成細胞（Ｈｉｇｈ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｅｌｌ；ＨＰＰ−ＣＦＣ）数を測定する方法を用いる。ＨＰＰ−ＣＦＣを指標としたアッセイ系は広く造血幹細胞の研究に用いられている。たとえば、造血幹細胞に作用する幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）はＨＰＰ−ＣＦＣを指標にして精製される。
（２）造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の精製
造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の精製は、例えば、Ｓ６細胞の無タンパク質培養上清（６００Ｌ）および細胞を出発原料とし、分子量１００００のＵＦ膜により分離する限外ろ過濃縮（１８Ｌ）後、５０％硫安上清、フェニル−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）、ヘパリン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）、キレート−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）、ＭｏｎｏＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）、ゲルろ過などの各カラムクロマトグラフィーを順次組み合わせることにより行うことができる。タンパク質はＡ２８０ｎｍ、Ｌｏｗｒｙ法による定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認する。
（３）造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の構造決定
造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の構造決定には、タンパク質の限定分解で生じる複数のペプチド断片の分子量値、および、その衝突解離によって生じる分子量値によってタンパク質／核酸配列データベースを検索し、もとのタンパク質を同定する方法を用いる。この方法は、質量分析計や質量分析法の発展によりタンパク質やペプチドから、その分子量を高い精度で測定できるようになったこと、ゲノムプロジェクトなどにより大量のタンパク質／核酸配列データが蓄積されたこと、大量のデータを高速で処理するコンピュター技術が発展したことを技術的な背景としており、１０ｎｇ程度以上の微量の試料を簡単な操作で処理することで、未知のタンパク質を迅速かつ確実に同定できる利点を持っている。
（４）ＨＰＰ−ＣＦＣ活性の測定方法
ＨＰＰ−ＣＦＣ活性の測定は、造血幹細胞を特異的に取得する目的でマウスに抗がん剤である５−フルオロウラシルを投与したマウスから得た骨髄細胞から、さらにＴ細胞、Ｂ細胞、顆粒球およびマクロファージのマーカー抗原を発現している細胞を除去した造血幹細胞画分に、サンプルおよびサイトカインを添加して液体培養し、その培養液の一部をコロニーアッセイに供することにより形成される巨大なＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数を測定することにより行う。
本明細書において、塩基、アミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号または当該分野における慣用略号に基づく。
明細書の以下に、実施例を記載する。この実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
実施例
実施例１：造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の精製、同定
（１）ヒトＳ６細胞の調製
ヒトＳ６細胞を７５０ｃｍ２の培養面積を持つローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，４３０８５１）で培養した。すなわち、ローラーボトルあたり１×１０８細胞を植え、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を含むＦ−１２培地（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５００ｍｌを用いて、３７℃、０．５ｒｐｍで７２時間培養した。７２時間培養後、培養上清を遠心操作により取り除き、リン酸緩衝化塩類溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ、日水製薬）で３回洗浄した。洗浄後、遠心操作で上清を取り除いた細胞ペレットを−２０℃で凍結保存した。
（２）マウス骨髄細胞による造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の測定
造血幹細胞を特異的に取得する目的でマウスに抗がん剤である５−フルオロウラシル（ＫＹＯＷＡ  ＨＡＫＫＯ  ＫＯＧＹＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を投与したマウスから得た骨髄細胞から、さらにＴ細胞、Ｂ細胞、顆粒球およびマクロファージのマーカー抗原を発現している細胞を除去した造血幹細胞に、サンプルおよびサイトカインを添加して液体培養し、その培養液の一部をコロニーアッセイに供することにより形成される巨大なＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数を測定することにより、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の活性を測定した。以下、この測定法をＨＰＰ−ＣＦＣ活性測定法という。
具体的には、マウスＢＤＦ１（メス、１０〜１５週齢、日本チャールス・リバーより購入）に５−フルオロウラシル（１５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）（ＫＹＯＷＡ  ＨＡＫＫＯ  ＫＯＧＹＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を投与し、２日後に大腿骨から骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞をラット抗マウスＣＤ４抗体（ＣＡＬＴＡＧ）、ＣＤ８抗体（ＣＡＬＴＡＧ）、Ｂ２２０抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）、Ｇｒ−１抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）、Ｍａｃ−１抗体（ＣＡＬＴＡＧ）で標識した。これらラット抗体はすべてＩｇＧを使用した。次にヤギ抗ラットＩｇＧ抗体標識ダイナビーズ（ＤＹＮＡＬ）を反応させた後、マグネットを用いてダイナビーズと結合した細胞を除去することにより、系譜マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）陰性な骨髄細胞（Ｌｉｎ−ＢＭＣｓ）を得た。Ｌｉｎ−ＢＭＣｓを１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加αＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製した。この細胞浮遊液にマウスＩＬ−３（最終濃度、１０ｎｇ／ｍｌ）（ＩＮＴＥＲＧＥＮ）を添加後、この細胞浮遊液を２４穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウエルに１ｍｌづつ加えた。ついで、各ウエルにサンプルを添加後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下ＣＯ２インキュベーター内にて培養した。培養６日目及び１０日目に、各ウエル中の培養液を攪拌した後、そのうちの２００μｌを採取した。１５ｍｌの遠心管チューブに、この採取した培養液２００μｌとＦＣＳ１．５ｍｌ（最終濃度３０％）、ＢＳＡ０．５ｍｌ（最終濃度１％）（ＩＣＮ）、２−ＭＥ５０μｌ（最終濃度１×１０−４Ｍ）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）、αＭＥＭで作製した２．５％メチルセルロース２ｍｌ（最終濃度１％）（Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、各造血因子５０μｌ（マウスＩＬ−３（ＩＮＴＥＲＧＥＮ）、ＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ヒトＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、Ｇ−ＣＳＦ（ＣＨＵＧＡＩ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＯ．，ＬＴＤ．）、Ｍ−ＣＳＦ（株式会社ミドリ十字）：すべて最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、αＭＥＭ０．５ｍｌとを混和し全量が５ｍｌとなるようにした。その後、２０分間静置して泡を抜き、その１ｍｌを４枚の３５ｍｍ浮遊細胞培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。９ｃｍシャーレに２つの３５ｍｍディッシュを入れ、さらに蒸留水を入れたフタなし３５ｍｍディッシュ１個を入れて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下ＣＯ２インキュベーター内で１４日間培養した。直径２ｍｍ以上のコロニーをＨＰＰ−ＣＦＣとしてその数を測定した。
（３）造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の精製
ＰＢＳにて洗浄し凍結保存した湿重量２６９ｇのＳ６細胞に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）を加えて、４℃にて、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型テフロン（登録商標）ホモジナイザー（ＩＷＡＫＩ  ＧＬＡＳＳ  ＣＯ．，ＬＴＤ．）にて破砕した。細胞残渣を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）にて除去した上清について５０％飽和となるように硫酸アンモニウム（硫安）を添加した。その上清を２Ｍ硫安／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したフェニル−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）にかけ十分に洗浄した後、硫安濃度を１．５Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、０Ｍと段階的に下げることで各結合画分を溶出した。本因子、すなわち本明細書中で上述したＳ６因子、は主に１Ｍ硫安／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）画分に溶出されていることを、（２）に記載のＨＰＰ−ＣＦＣ活性測定法と同様な方法により確認した。
フェニル−セファロースで得られた活性画分を０．６Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）に対して充分透析した後、同バッファーで平衡化したヘパリン−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）にかけ洗浄後、２Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）で各結合画分を溶出した。このヘパリン溶出画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）で４倍希釈し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化した銅（Ｃｕ）キレート−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）に吸着させ、０．５Ｍと０．３Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）の２段階で洗浄する事によりバッファー置換を行った。
結合画分は０．１Ｍ  イミダゾール／０．３Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）により溶出させ、そのまま０．４Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化したＭｏｎｏ  Ｓイオン交換カラムにかけて流速０．７ｍｌ／分にて０．４〜２ＭのＮａＣｌグラジエント溶出を行い、溶出液には終濃度０．１％となるように界面活性剤ＣＨＡＰＳを添加して保存した。ＨＰＰ−ＣＦＣ活性はフラクション４７〜５０に認められたが、本画分中には目的とするＳ６因子とともに、塩基性−ＦＧＦが共存する事がＥＬＩＳＡで確認された。ここでＭｏｎｏ  Ｓ活性画分を前半画分（フラクション４７、４８）と後半画分（フラクション４９、５０）の２画分に分けて、ヘパリンカラムでのグラジエントクロマトにより塩基性−ＦＧＦとの分離を試みた。０．４Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）／０．１％ＣＨＡＰＳで平衡化したヘパリン−セファロースカラムにかけた後、流速０．７ｍｌ／分にて０．４〜４ＭのＮａＣｌグラジエント溶出を行った。
Ｍｏｎｏ  Ｓ活性前半画分からはフラクション３０〜３２に活性が認められたが、ここには塩基性−ＦＧＦが存在する事がＥＬＩＳＡにて確認され、本活性は塩基性−ＦＧＦ由来である事が明らかとなった。
一方、Ｍｏｎｏ  Ｓ後半画分はフラクション３０〜３２（塩基性−ＦＧＦ画分）以外に、ＥＬＩＳＡで塩基性−ＦＧＦが検出されないフラクション２２、２３にＨＰＰ−ＣＦＣ活性が認めらた。活性画分付近の各フラクションについて、ドーズアッセイおよび塩基性−ＦＧＦ  １ｎｇ／ｍｌ添加した系でのアッセイを行った。活性はフラクション２２、２３に容量依存的に認められ、液体培養６日目より１０日目の方が高いＨＰＰ−ＣＦＣコロニー形成促進活性を示した。また、塩基性−ＦＧＦ添加アッセイ系でもフラクション２２、２３に塩基性−ＦＧＦ単独でのフル活性を超えるＨＰＰ−ＣＦＣ活性が認められた。
さらに活性を再確認するためにヘパリンカラムでグラジエント勾配を変えて再クロマトを行った。０．３Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）／０．１％ＣＨＡＰＳで平衡化したヘパリン−セファロースカラムにかけた後、０．３〜２ＭのＮａＣｌとグラジエント勾配を緩くして溶出を行った。ＨＰＰ−ＣＦＣ活性はフラクション２５〜２７に認められ、本画分中には塩基性−ＦＧＦが存在しない事をＥＬＩＳＡ法で確認した。活性画分であるフラクション２６で容量依存的に活性が認められ、塩基性−ＦＧＦ添加アッセイ系でも塩基性−ＦＧＦ単独での完全な活性を超えるＨＰＰ−ＣＦＣ活性が認められた。また、活性画分中にはＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析（ゲル濃度：１０〜２０％グラジェント）により２０ｋＤａのバンドが認められた。
以上の各ステップにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析で２０ｋＤａのバンドを示す画分がＳ６細胞１２０Ｌから約０．４μｇ得られ、この画分はＨＰＰ−ＣＦＣ活性が確認されたことから、本画分で観察された２０ｋＤａバンドは造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質であることが明らかとなった。
（４）造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の性質
本発明における因子は下記の性質を有する。
１  分子量：約２０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析において２０ｋＤａ付近に１本のバンドとして検出され、還元、非還元条件による移動度の差はない。従って分子間ジスルフィド結合を有さない。
２  等電点：８．１±０．５
ＡＦＢ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）を使用した２次元電気泳動分析において、当該範囲にスポットとして検出される。
（５）造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質の構造決定
本因子について、以下の手順により、構造決定を試みた。
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ測定のためのサンプル調製
本因子と判断した２０ｋＤａバンドを含む精製画分を、１２．５％アクリルアミドゲルによりＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析後、０．１％ＣＢＢ／４０％ＭｅＯＨ／１％ＡｃＯＨで染色した。２０ｋＤａバンドを検出後、そのバンドを切り出し、４０％ＭｅＯＨ／１％ＡｃＯＨで脱色した。脱色したゲルを１０ｍＭ  ＤＴＴ／１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ８．７中で浸透し、５６℃、１時間インキュベート後、５５ｍＭヨードアセトアミドを添加し、暗室、４５分インキュベートすることにより、本因子の還元アルキル化を行った。過剰の還元剤やアルキル化剤をゲルから除去後、１５０ｎｇトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）／５ｍＭ  ＣａＣｌ２／５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加し、ゲル内トリプシン消化を、３７℃、１８時間行った。反応終了後、ペプチド断片混合物を抽出し、スピードバック（Ｓａｖａｎｔ）により乾燥させた。０．０５％ＴＦＡで溶解したペプチド断片混合物を、０．０５％ＴＦＡで平衡化したＰｏｒｏｓＲ２（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に供し、５０％ＭｅＯＨ／０．２％ＦＡで溶出させることにより脱塩した。脱塩したペプチド断片混合物を、質量分析（ＭＳ）およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定のためのサンプル（調製済ペプチド断片化合物）とした。陰性対照として、サンプルバッファーのみでＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析を行ったレーンのうち２０ｋＤａバンドが検出すると考えられる部位を切り出し、本因子の場合と同様に調製した。記述した以外の詳細の操作は、Ｗｉｌｍらの方法に従って行った（Ｗｉｌｍ，Ｍ．，Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．，Ｈｏｕｔｈａｅｖｅ，Ｔ．，Ｂｒｅｉｔ，Ｓ．，Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒｅｒ，Ｌ．，Ｆｏｔｓｉｓ，Ｔ．ａｎｄ  Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７９，４６６−４６９，１９９６）。
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ解析による構造決定
本因子の構造決定には四重極直交加速飛行時間型質量分析計のＱ−ＴＯＦ（マイクロマス社）を用い、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ測定を操作指示書に従って行った。まず調製済ペプチド断片混合物と陰性対照について、それぞれＭＳによりｍｚ１００〜１５００の範囲を測定した。ペプチドの指標となる多価分子イオンについて両者で比較し、調製済ペプチド断片混合物に有意に検出した２価分子イオンを３つ確認した（表１）。
2003057241.tif 000003
次にこれら３つの２価分子イオンを個別に選択して、ＭＳ／ＭＳを測定した。その結果、得られた主なプロダクトイオンの情報を基に、インターネット上に公開されているデータベース検索プログラムの１つ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｍｓｈｏｍｅ３．２．ｈｔｍ）を用いて検索したところ、低分子量アクチン調節タンパク質として周知のヒト非筋型コフィリン（ＡＣ：Ｐ２３５２８、ｐＩ  ８．２２、１６６ａａ）がヒットした。本因子は、ヒト非筋型コフィリンと、分子量、等電点など挙動が類似している。
しかしながら、このような解析のみから、本因子がヒト非筋型コフィリンであるということを確実に示すことは困難である。そこで、表１に記述した情報とヒト非筋型コフィリンの整合性をより厳密に調べるため、得られた情報から推測されるペプチド（表２）を合成し衝突解離スペクトルを測定することにより検証した。その結果、得られた情報全てが表１記載の情報と合致した。特筆すべき点として、得られた情報には表２に記載のＮ末端やＣ末端を含むペプチドに関する情報が含まれており、本因子のＮ末端とＣ末端がヒト非筋型コフィリンと同一であることが特定できた。以上のことから、本因子は、翻訳開始のメチオニンが除去され、それに続くアラニンがアセチル化し、それに続くセリンがリン酸化していない（アクチン調節という観点からは活性型の）ヒト非筋型コフィリンであると同定した（図１）。
2003057241.tif 000004
実施例２：コフィリンの調製
（１）ヒトＳ６細胞株由来のｃＤＮＡライブラリーの作製
無血清培地Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を入れたローラーボトルにて４日間培養したＳ６細胞（１．２×１０８細胞）より、ＦａｓｔＴｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて、３７μｇのＳ６細胞−ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡを調製した。その５μｇのＳ６細胞−ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡより、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）とＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）を用いて、ＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）制限酵素部位とＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）制限酵素部位を両側に持ったｃＤＮＡを調製した。
次に、ｃＤＮＡをλファージクローニングベクターλＥｘＣｅｌｌ  ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋ．Ｋ．）に挿入し、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。大腸菌ＮＭ５２２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を宿主としてプラーク数を寒天培地上で数えて力価を測定すると、１．３７×１０６ｐｆｕであった。更に、大腸菌ＮＭ５２２を宿主として、ライブラリー増幅を行い、６．９×１０１０ｐｆｕ／ｍｌのＳ６細胞ｃＤＮＡライブラリーを得た。Ｓ６細胞ｃＤＮＡライブラリーの平均挿入サイズは１．０ｋｂであった。
（２）ＰＣＲによるヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡの完全長クローニング
胎盤由来ヒト非筋型コフィリンのアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＡＣ：Ｄ００６８２、５０１ｂｐ）を基にそれぞれオリゴマーＳＫ０１３（図２の１〜２６に対応、プライマーＳＫ０１３：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＳＫ０１４（図２の４７６〜５０１に対応、プライマーＳＫ０１４：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を合成した：
2003057241.tif 000005
ヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡは、上記Ｓ６細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、プライマーＳＫ０１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびプライマーＳＫ０１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をプライマーとして、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（クロンテック社）を用い、ＰＣＲにより増幅した。この増幅産物を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、約５００塩基対のＤＮＡ断片を持つ陽性クローンを得た。陽性クローンについて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｔ（アプライドシステムズ社）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０（アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列解析を行った結果、５０１塩基対の非筋型コフィリンｃＤＮＡ完全長の取得を確認した。なお、胎盤由来ヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡの塩基配列と比較して、Ｓ６細胞由来のものは２塩基異なっていたが、いずれもアミノ酸の変異を伴っていなかった（図３）。
（３）ヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡの発現ベクターの作製
非筋型コフィリンｃＤＮＡクローンとｐＫＤＥＭＳＳベクター（Ｋｉｔａｎｏ  Ｋ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｙ，Ｎａｇａｈｉｒａ  Ｋ，Ｎａｓｕ  Ｔ，Ｉｚｕｍｉ  Ｒ，Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．４７，２１５−２２２，１９９５）由来ｐＤＥベクターを、ＥｃｏＲ  Ｉで消化後、アルカリホスファターゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）により脱リン酸化した。その後、非筋型コフィリンｃＤＮＡを含むＥｃｏＲ  Ｉ断片とｐＤＥベクターＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡを含むゲルを切り出し、ＣＯＮＣＥＲＴ  Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により精製した。ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用い、非筋型コフィリンｃＤＮＡ断片をｐＤＥベクターＤＮＡ断片に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を形質転換することにより、ヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡの発現ベクターを調製した。なお、発現ベクターに挿入されたヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡが発現用プロモーターに対して順方向であることは、制限酵素によって確認した。
（４）ヒト非筋型コフィリンのＣＯＳ−１細胞における発現
組換え型ヒト非筋型コフィリンを、以下の手順により、発現させ、その発現を確認した。
ヒト非筋型コフィリンのＣＯＳ−１細胞における発現
ヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡ発現ベクターを用いて、ヒト非筋型コフィリンを動物細胞で発現させ、発現したタンパク質にＨＰＰ−ＣＦＣ活性があるか否かを検討した。発現用動物細胞としてＣＯＳ−１細胞（理化学研究所から購入）を用い、リポフェクチン法によりヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションした。すなわち、直径１０ｃｍの培養用ディシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，４３０１６７）にＣＯＳ−１細胞を１×１０６細胞を植え込んだ。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（ＤＭＥＭ、ＮＩＳＳＵＩ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いた。翌日、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５ｍｌで細胞を１回リンスした後、５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地を加え、３７℃で２時間培養した。２時間培養後、ディシュ１枚あたり、実施例２（３）で作製した発現プラスミド１μｇおよびリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μｇの混液を加え、さらに、３７℃で５時間培養した。培養後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を５ｍｌ加え、合計１０ｍｌとし、５％ＣＯ２存在下、３７℃で７２時間培養した。７２時間培養後、遠心操作により培養上清を回収した。陰性対照として、ヒト非筋型コフィリンを挿入していないもとの発現ベクターを用い、同様に調製した。
分泌型の組換え型ヒト非筋型コフィリンの検出
培養上清についてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析したところ、ヒト非筋型コフィリンｃＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションした培養上清には、組換え型ヒト非筋型コフィリンと考えられる２０ｋＤａのバンドが有意に認められた。この２０ｋＤａのバンドは、ウエスタンブロット分析で、ラビット抗ヒト非筋型コフィリンペプチド（１３〜２２）ポリクローナル抗体（サイトスケルトルン社）と特異的に反応した。したがって、組換え型ヒト非筋型コフィリンを分泌していることが確認された。ウエスタンブロット分析およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析により、分泌型の組換え型ヒト非筋型コフィリンの発現量は、１ｍｌあたり２．５μｇであることを確認した。
分泌型の天然型ヒト非筋型コフィリンの検出
ヒト非筋型コフィリンを挿入していないもとの発現ベクター（ｐＤＥベクター）をトランスフェクションした培養上清を、１０％トリクロル酢酸により沈殿後、１００倍量用いて、同様にウエスタンブロット分析した場合、天然型ヒト非筋型コフィリンの微弱なバンドを検出した。以上のことから、従来細胞内にのみ存在していると考えられてきた非筋型コフィリンが、分泌型としてもわずかながら存在することも判明した。
実施例３：組換え型ヒト非筋型コフィリンの造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質としての活性確認
ＣＯＳ−１細胞で発現した分泌型の組換え型ヒト非筋型コフィリンが、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質であるか否かを評価するため、培養上清について、ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイを行った。
マウスＢＤＦ１（メス、１０〜１５週齢、日本チャールス・リバーより購入）に抗がん剤である５−フルオロウラシルを（１５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）（ＫＹＯＷＡ  ＨＡＫＫＯ  ＫＯＧＹＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を投与した後、２日後のマウスの大腿骨から、骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞をラット抗マウスＣＤ４抗体（ＣＡＬＴＡＧ）、ＣＤ８抗体（ＣＡＬＴＡＧ）、Ｂ２２０抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）、Ｇｒ−１抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）、Ｍａｃ−１抗体（ＣＡＬＴＡＧ）で標識した。これらラット抗体はすべてＩｇＧを使用した。次にヤギ抗ラットＩｇＧ抗体標識ダイナビーズ（ＤＹＮＡＬ）を反応させた後、マグネットを用いてダイナビーズと結合した細胞を除去することにより、系譜マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）陰性な骨髄細胞（Ｌｉｎ−ＢＭＣｓ）を得た。これを、造血幹細胞画分としてＨＰＰ−ＣＰＣアッセイに用いた。
得られた造血幹細胞画分を、１０％ＦＣＳ添加αＭＥＭ培地で２．５×１０４細胞／ｍｌに調製した。この細胞浮遊液にマウスＩＬ−３（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加後、２４ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のそれぞれのウェル中に１ｍｌずつまき、さらに各ウェルにサンプルである実施例２において調製した培養上清またはサイトカインを添加して液体培養し、その培養液の一部をコロニーアッセイに供することにより形成される巨大なＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数を測定することによりＨＰＰ−ＣＦＣ活性の測定を行う。
図４において、Ｃｏｆｉｌｉｎ１、２、３、４はそれぞれ、１０倍に濃縮したコフィリン培養上清の×１、×１０、×１００、×１０００倍希釈を示す。したがって、実施例２において分泌型の組換え型ヒト非筋型コフィリンの発現量が１ｍｌあたり２．５μｇであることから、αＭＥＭ培地に対して１／１０量の培養上清を添加した培養液中では、組換え型ヒトコフィリン濃度として、Ｃｏｆｉｌｉｎ１は２５００ｎｇ／ｍｌ、Ｃｏｆｉｌｉｎ２は２５０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｏｆｉｌｉｎ３は２５ｎｇ／ｍｌ、Ｃｏｆｉｌｉｎ４は２．５ｎｇ／ｍｌが含まれる。Ｃ１、Ｃ２は培養上清サンプルと同量のＰＢＳを添加したウェルである。ＳＣＦ１、５、１０はそれぞれ、培養液中に１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦが含まれることを示す。データは液体培養６日目と１０日目の各ウェルの培養液２００μｌ中のＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数を示す。Ｉｎｐｕｔは培養前の細胞浮遊液２００μｌ中のＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数を示す。
組換え型ヒト非筋型コフィリンは、陰性対照と比較して、液体培養６日目より１０日目で活性上昇傾向を示す本因子特有のＨＰＰ−ＣＦＣ活性を、有意に濃度依存的に示した（図４）。活性が認められた濃度はコフィリンとして２５ｎｇ／ｍｌ程度（図中Ｃｏｆｉｌｉｎ３と表記）で、ＳＣＦ  １ｎｇ／ｍｌ（図中ＳＣＦ１と表記）と同等であった。陰性対照の培養上清に分泌型の天然型ヒト非筋型コフィリンが確認されており、ＨＰＰ−ＣＦＣ活性に若干関与していることが示唆された（図４）。
以上の過程を経て、低分子量アクチン調節タンパク質として周知のヒト非筋型コフィリンが、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有する物質として作用することを見いだした。
実施例４：組換え型ヒト非筋型コフィリンのヒト造血幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３４陽性細胞）の増殖促進活性の検討
組換え型ヒト非筋型コフィリンが、ヒト造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進活性を有するか否かを、実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清をヒト造血幹細胞培養中に添加することにより検討した。
ヒト臍帯血にシリカゲル懸濁液を１０％（Ｖ／Ｖ）になるよう加え緩やかに攪拌し３７℃にて約１時間静置した。比重１．０７７のｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社）に重層後、１６００ｒｐｍで３０分間の比重遠心により単核球画分を得た。ついで、Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＡｕｔｏ−ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＣＤ３４陽性細胞を取得した。このようにして得られたＣＤ３４陽性細胞を、２０％ＦＣＳ（ＣＣＴ社）および１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）添加αＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）培地で１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、１２ｗｅｌｌ培養プレート（ファルコン社）に１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ加えた。
このように調製した培養プレート中に、ＳＣＦ＋ＦＬ群に対してはヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）およびヒトＦｌｔ−３リガンド（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３Ｌｉｇａｎｄ，ＦＬ）（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）を、ＳＣＦ＋ＦＬ＋コフィリン群に対してはヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）およびヒトＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）および実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清を１０倍濃縮し、その１００μｌを添加し、その後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。ＰＢＳ群（対照群）には、上述したＳＣＦ、ＦＬ、またはコフィリンの代わりに、同量のＰＢＳのみを添加した。培養３、５、７、９、１２および１４日目に、血球計算版を用いて顕微鏡下で細胞数を測定した。結果を、培養開始時の初期細胞数に対する増殖倍率により表し、それを図５に示した。
その結果、ヒト非筋型コフィリンは、ＳＣＦ＋ＦＬとの共存により、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を時間とともに増殖させ、ＳＣＦ＋ＦＬのみの添加の場合に比べて著しい増殖活性を示すことが明らかになった。具体的には、培養１４日目の時点で、初期細胞数の約９０倍まで増殖した（図５）。
実施例５：組換え型ヒト非筋型コフィリンのヒト造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および分化促進活性の検討
組換え型ヒト非筋型コフィリンが、ヒト造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するか否かを、実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清を用いて、各種コロニー形成能を指標として検討した。
まず、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を実施例４に記載したように２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、１２ｗｅｌｌ培養プレートに１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ加えた。実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清を１０倍濃縮し、その１００μｌ、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）および／またはヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）を種々の組み合わせで添加し７日間培養後、細胞数を測定した。細胞数の測定は、血球計算版を用いて顕微鏡下で行った。結果を、培養開始時の初期細胞数に対する増殖倍率により表し、それを図６Ａに示した。ここで、「Ｔ／Ｃ」群はヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）および上述のコフィリン含有培養上清を含有する条件；「Ｓ／Ｆ／Ｃ」群はヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）および上述のコフィリン含有培養上清を含有する条件；「Ｓ／Ｆ／Ｔ」群はヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）を含有する条件；「Ｓ／Ｆ」群はヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する条件；「Ｃ」群は上述のコフィリン含有培養上清を含有する条件；「Ｔ」群はヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）を含有する条件；のもとでそれぞれ培養したことを示す。
「ＰＢＳ」群はＰＢＳのみを添加した条件のもとで培養したことを示す。
その結果、ヒト非筋型コフィリンは、ＳＣＦおよびＦＬとの共存（すなわちＳ／Ｆ／Ｃ群）により、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を著しく増殖させ、Ｓ／Ｆ群の場合の約６倍、Ｓ／Ｆ／Ｔ群の場合の約２倍の増殖活性を示し、培養７日目では「Ｉｎｐｕｔ」（培養前の細胞懸濁液２００μｌ中のコロニー数）の約５８倍まで増殖した（図６Ａ）。
ついで、上述の（１）で７日間培養したヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞懸濁液の一部（１００μｌ）を採取し、メチルセルロース法によるコロニー形成アッセイに供した。
メチルセルロース法によるコロニー形成アッセイは以下の様に行う。すなわち、αＭＥＭを基礎培地とし、２．２％メチルセルロース（信越化学）、３０％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、５×１０−５Ｍ  ２ＭＥ（和光純薬）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；１０ｎｇ／ｍｌ、中外製薬）、エリスロポエチン（ＥＰＯ；２Ｕ／ｍｌ、麒麟麦酒）を添加した半固形培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２週間培養し、各種コロニーを形成させた。
各種コロニーのうち、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＣＦＵ−ＧＭ）コロニー、赤芽球系前駆細胞である赤芽球バースト形成細胞（Ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ、ＢＦＵ−Ｅ）コロニーおよび骨髄系多能性幹細胞（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｍｉｘｅｄ、ＣＦＵ−Ｍｉｘ）コロニーの同定およびコロニー数の測定を倒立顕微鏡下で視覚的観察に基づいて行った。小さめの細胞が密にまとまった顆粒球集塊と、より大きな細胞による粗なマクロファージ集塊からなる細胞集塊をＣＦＵ−ＧＭとして、また、ヘモグロビン合成により赤色を呈した細胞からなる大きな集塊をＢＦＵ−Ｅとして判別した。判別困難な集塊や典型的なコロニーの形態をなしていない集塊については、サイトスピン標本を作製後、メイギムザ染色により判定した。そして、ＣＦＵ−ＧＭは５０個以上の細胞集塊を、ＢＦＵ−Ｅは５００個以上の細胞集塊をそれぞれコロニーとして計測し、ＢＦＵ−Ｅと他の系統の細胞５０個以上を含むコロニーをＣＦＵ−Ｍｉｘコロニーとして計測した。結果を、培養開始時の初期細胞数に対する増殖倍率により表し、ＣＦＵ−ＧＭコロニー、ＢＦＵ−ＥコロニーおよびＣＦＵ−Ｍｉｘコロニーについての結果をそれぞれ図６Ｂ〜６Ｄに示した。
ヒト非筋型コフィリンとＳＣＦおよびＦＬとの共存により（すなわちＳ／Ｆ／Ｃ群）ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を増殖させた後にコロニー形成アッセイに供したところ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｍｉｘのコロニー数が「Ｉｎｐｕｔ」（培養前の細胞懸濁液２００μｌ中のコロニー数）のそれぞれ、約４倍、約６倍および約８倍まで増幅された（図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ）。とくに、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｍｉｘについては他のいずれのサイトカインの組み合わせよりも顕著にコロニー数を増幅させた。
実施例６：組換え型ヒト非筋型コフィリンのヒト巨核球系前駆細胞の増殖および分化促進活性の検討
組換え型ヒト非筋型コフィリンが、ヒト巨核球系前駆細胞の増殖および／または分化促進活性を有するか否かを、実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清を利用して、巨核球前駆細胞（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ、ＣＦＵ−Ｍｋ）のコロニー形成能を指標として検討した。
まず、実施例４に記載したようにヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、１２ｗｅｌｌ培養プレートに１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ加えた。実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清を１０倍濃縮し、その１００μｌ、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）を、実施例５に記載した組み合わせ、すなわちＴ／Ｃ群、Ｓ／Ｆ／Ｃ群、Ｓ／Ｆ／Ｔ群、Ｓ／Ｆ群、Ｃ群、およびＴ群の条件で添加し、７日間培養した。「ＰＢＳ」群はＰＢＳのみを添加した条件のもとで培養したことを示す。
ついで、７日間培養したヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞の懸濁液の一部を採取しＭｅｇａＣｕｌｔ−Ｃ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ＣＦＵ−Ｍｋコロニーを形成させ、巨核球の同定およびコロニー数を測定をした。すなわち、細胞懸濁液の一部（１００μｌ）をコラーゲンゲル（ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＴＰＯ含有）に加え攪拌後、培養用のスライドチャンバーに移して１２〜１４日間培養し、ＣＦＵ−Ｍｋコロニーを形成させた。スライド上の細胞をメタノール／アセトン溶液で固定後、抗ＧＰ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ヒト巨核球のマーカー）抗体による免疫染色およびエバンスブルーによる細胞核染色により巨核球を検出した。本実施例においては、顕微鏡下で観察した際に、２０個以上の巨核球からなる細胞集塊をＣＦＵ−Ｍｋコロニーとして計測した。結果を、培養開始時の初期細胞数に対する増殖倍率により表し、それを図７に示した。
ヒト非筋型コフィリンは、ＳＣＦおよびＦＬの共存によりヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を増殖させ、ついでコロニー形成アッセイに供したところ、ＣＦＵ−Ｍｋのコロニー数を「Ｉｎｐｕｔ」（培養前の細胞懸濁液２００μｌ中のコロニー数）の約４倍まで増幅させた（図７）。なお、他のサイトカインの組み合わせではほとんどＩｎｐｕｔと同程度の増幅であった。
実施例７：組換え型ヒト非筋型コフィリンのヒト巨核球胞体突起（Ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）形成活性の検討
組換え型ヒト非筋型コフィリンが、ヒト巨核球胞体突起（Ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）形成活性を有するか否かを、実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清を用いて、形態学的に検討した。
ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を、１％ＢＳＡ、ＧＩＢＣＯサプリメント（インシュリン１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン５．５μｇ／ｍｌ、エタノールアミン２ｍｇ／ｍｌ、亜セレン酸６．７ｍｇ／ｍｌ）添加αＭＥＭで５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製後、１２ｗｅｌｌ培養プレートの各ウェルに１ｍｌ加えた。ついで、実施例２において調製した組換え型ヒト非筋型コフィリン含有ＣＯＳ−１細胞培養上清を１０倍濃縮し、その１００μｌあるいはヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）を単独もしくは組み合わせて添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。培養７日目に各ｗｅｌｌの培地と同組成の培地を１ｍｌづつ添加し、培養を継続した。その後、経時的に顕微鏡下で観察し、巨核球胞体突起形成の有無を確認した。
ヒト非筋型コフィリンは、ＴＰＯとの共存によりヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を巨核球へ著しく分化増殖させ（図８）、培養２週間前後では成熟巨核球の一部に血小板放出の前段階を反映していると考えられている胞体突起が認められた（図９）。しかし、ヒト非筋型コフィリンの単独添加あるいはＴＰＯの単独添加では胞体突起形成はまったく認められなかった。
産業上の利用可能性
本発明は、コフィリンを有効成分とする、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または分化促進剤を提供することにより、幅広いセットの血液細胞の増殖および／または分化を促進することができるという効果を有する。このような効果により、汎造血細胞減少症および／または造血機能低下を伴う疾患の治療薬として有用であり、さらに再生医療の分野において効率よく血液系細胞の再生を図ることが可能になる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト非筋型コフィリン（ＡＣ：Ｐ２３５２８）の一次構造配列を示す図である。
図２は、ヒト胎盤非筋型コフィリン（ＡＣ：Ｄ００６８２）のｃＤＮＡの配列を示す図である。下線部分はプライマーとしてオリゴマー、プライマーＳＫ０１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびプライマーＳＫ０１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を合成した部位を示す。
図３は、ヒト胎盤由来（上段）とヒトＳ６細胞由来（下段）の非筋型コフィリンの塩基配列のアラインメントを示す。両者の比較から塩基１９８番および塩基４７１番が異なっているが、ともにサイレントミューテーションであることを示す。
図４は組換え型ヒト非筋型コフィリンを発現させたＣＯＳ−１細胞の培養上清について、ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイにより、造血幹細胞増幅作用を評価した結果を示す。
図５は、ヒト非筋型コフィリンが、ＳＣＦおよびＦＬとの共存により、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞に対して、ＳＣＦおよびＦＬのみの添加の場合と比べて、著しい増殖活性を有することを示す。
図６Ａは、ヒト非筋型コフィリンが、ＳＣＦ＋ＦＬとの共存により、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を著しく増殖させたことを示し、図６Ｂ〜Ｄは、ヒト非筋型コフィリン＋ＳＣＦ＋ＦＬの条件下でヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を増殖させた後にコロニー形成アッセイに供したところ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｍｉｘのコロニー数を顕著に増加させたことを示す。
図７は、ヒト非筋型コフィリン＋ＳＣＦ＋ＦＬの条件下でヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を増殖させた後にコロニー形成アッセイに供したところ、ＣＦＵ−Ｍｋのコロニー数を顕著に増加させたことを示す。
図８は、ヒト非筋型コフィリンが、ＳＣＦおよびＦＬとの共存により、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を巨核球に分化・増殖させることを示す、顕微鏡写真である。
図９は、ヒト非筋型コフィリンが、ＳＣＦおよびＦＬとの共存下でヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を２週間前後培養した際に、成熟巨核球の一部に胞体突起が認められたことを示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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