(57)【要約】生理活性作用感受性細胞に希少糖を作用させて当該細胞の機能を変化させることを特徴とする希少糖の生理活性作用の利用方法。生理活性作用感受性細胞に取り込ませて当該細胞の機能を変化させる作用を有する希少糖を有効成分として配合した組成物。前記細胞はヒト細胞である。前記組成物は機能性食品、医薬品または化粧品である。前記希少糖はアルドースおよび／またはケトースに属する希少糖である。前記アルドースはＤ−アロースであり、前記細胞は、癌細胞増殖抑制作用感受性細胞および活性酸素の産生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれる。前記ケトースはＤ−プシコースであり、前記細胞は、ケモカイン分泌抑制作用感受性細胞、マイクログリアの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作用感受性細胞よりなる群より選ばれる。
2003097820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性作用感受性細胞に希少糖を作用させて当該細胞の機能を変化させることを特徴とする希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項２】
前記細胞がヒト細胞である請求項１の希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項３】
前記希少糖として希少糖を有効成分として配合した組成物を用いる請求項１または２の希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項４】
前記組成物が機能性食品、医薬品または化粧品である請求項３の希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項５】
前記希少糖がアルドースおよび／またはケトースに属する希少糖である請求項１ないし４のいずれかの希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項６】
前記アルドースがＤ−アロースである請求項５の希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項７】
前記細胞が、癌細胞増殖抑制作用感受性細胞および活性酸素の産生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれる請求項６の希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項８】
前記ケトースがＤ−プシコースである請求項５の希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項９】
前記細胞が、ケモカイン分泌抑制作用感受性細胞、マイクログリアの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作用感受性細胞よりなる群より選ばれる請求項８の希少糖の生理活性作用の利用方法。
【請求項１０】
生理活性作用感受性細胞に取り込ませて当該細胞の機能を変化させる作用を有する希少糖を有効成分として配合した組成物。
【請求項１１】
前記細胞がヒト細胞である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記希少糖がアルドースおよび／またはケトースに属する希少糖である請求項１０または１１の組成物。
【請求項１３】
前記アルドースがＤ−アロースである請求項１２の組成物。
【請求項１４】
前記細胞が、癌細胞増殖抑制作用感受性細胞および活性酸素の産生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれる請求項１３の組成物。
【請求項１５】
前記ケトースがＤ−プシコースである請求項１２の組成物。
【請求項１６】
前記細胞が、ケモカイン分泌抑制作用感受性細胞、マイクログリアの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作用感受性細胞よりなる群より選ばれる請求項１５の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が機能性食品、医薬品または化粧品である請求項１０ないし１６の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、希少糖の生理活性作用の利用方法、及び希少糖を有効成分として配合した組成物、特に機能性食品、医薬品または化粧品に関する。
背景技術
単糖はポリヒドロキシルアルデヒド構造を持つアルドース、ポリヒドロキシルケトン構造を持つケトース、およびそれらを還元して得られる糖アルコールに大別される。一方単糖は、自然界における存在量によっても分類される。即ち、希少糖は国際希少糖学会の定義によれば「自然界に希にしか存在しない糖」と定義されており、自然界における存在量が少ない単糖である。希少糖は、一般に有機化学的合成方法における合成反応においては収量の少ないものが多い。このため、希少糖は未知の性質のものが多く、Ｄ−アロースを含めたアルドヘキソース（六炭糖のアルドース）の希少糖においても未知の性質が多いというのが現状である。
このアルドヘキソースに属する希少糖としては、Ｄ−アロースの他にＤ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−タロース、Ｄ−アルトロース、Ｌ−マンノース、Ｌ−グルコース、Ｌ−ガラクトース等が例示される。また、Ｄ−プシコースを含めたケトヘキソース（六炭糖のケトース）の希少糖においても同様である。ケトヘキソースに属する希少糖としては、Ｄ−プシコース、Ｌ−プシコース、Ｄ−ソルボース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−タガトース、Ｌ−タガトース、Ｌ−フラクトース等が例示される。
ここで、従来、糖類と癌との関係については、例えば、特許文献１に記載されているように、癌の予防に有効である多糖類が知られている。また、オリゴ糖が整腸作用を持つことを利用して便秘を解消し大腸癌などになりにくい効果をもつことや、最近ではアガリスクなどの多糖体が癌抑制効果を持つことなどの報告、糖鎖と癌転移関連の報告もある。
一方、糖類の活性酸素に対する性質を利用したものでは、例えば、特許文献２に記載されているように、活性酸素を抑制する性質を有する多糖類を含有させた活性酸素抑制剤は知られている。
単糖類の中で、プシコースはケトヘキソース（六炭糖）である。このプシコースには光学異性体としてＤ体とＬ体とが有ることが知られている。ここで、Ｄ−プシコースは既知物質であるが自然界に希にしか存在しないので、国際希少糖学会の定義によれば「希少糖」と定義されているが、このＤ−プシコースは、近年、エピメラーゼの出現（例えば、特許文献３参照）により高価ではあるが、比較的入手が容易となった。そして、この公報に従えば、調製されたＤ−プシコースは、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化粧品・医薬品の原料・中間体などとして有効に利用できることが示唆されている。この公報によれば、この甘味料としては、飲食物、飼料、歯磨き、内服薬など経口摂取物の甘味付け嗜好性向上に利用できる旨記載されているが、可食配合物としての具体的な構成については開示されていない。Ｄ−プシコースの光学異性体であるＬ−プシコースについては、可食配合物として利用可能であることが、例えば、特許文献４で詳細に開示されている。
特許文献１  特開平５−１１２４５５号公報
特許文献２  特開平７−２８５８７１号公報
特許文献３  特開平６−１２５７７６号公報
特許文献４  特開昭５７−１２９６７１号公報
発明の開示
希少糖の生理活性に着目し、細胞を用いる実験によりその裏付けをすることは本発明者らによってはじめられた。２１世紀は生命科学の世紀とも言われており、現在、国際的にＤＮＡ研究、タンパク質研究が進められている。ポストゲノム研究における糖と言えば糖鎖研究が中心であるが、本発明者らは「単糖」に着目し、単糖に生理活性はないかという切り口で研究を進めている。本発明の背景としては、希少糖の生産に関する網羅的な研究が長年積み重ねられてき、近年になり一部の希少糖の大量生産技術が確立されたことが挙げられる。
本発明は、希少糖について、特にＤ−アロース、Ｄ−プシコースの生理活性作用の利用方法の提供及び希少糖の生理活性を活用した機能性食品、医薬品等の創生を目的とする。
本発明は、以下の（１）ないし（９）の希少糖の生理活性作用の利用方法を要旨としている。
（１）生理活性作用感受性細胞に希少糖を作用させて当該細胞の機能を変化させることを特徴とする希少糖の生理活性作用の利用方法。
（２）上記（１）の方法において、前記細胞がヒト細胞であることを特徴とする方法。
（３）上記（１）または（２）の方法において、前記希少糖として希少糖を有効成分として配合した組成物を用いることを特徴とする方法。
（４）上記（３）の方法において、前記組成物が機能性食品、医薬品または化粧品であることを特徴とする方法。
（５）上記（１）ないし（４）のいずれかの方法において、前記希少糖がアルドースおよび／またはケトースに属する希少糖であることを特徴とする方法。
（６）上記（５）の方法において、前記アルドースがＤ−アロースであることを特徴とする方法。
（７）上記（６）の方法において、前記細胞が、癌細胞増殖抑制作用感受性細胞および活性酸素の産生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれることを特徴とする方法。
（８）上記（５）の方法において、前記ケトースがＤ−プシコースであることを特徴とする方法。
（９）上記（８）の方法において、前記細胞が、ケモカイン分泌抑制作用感受性細胞、マイクログリアの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作用感受性細胞よりなる群より選ばれることを特徴とする方法。
本発明は、以下の（１０）ないし（１７）の希少糖を有効成分として配合した組成物を要旨としている。
（１０）生理活性作用感受性細胞に影響して当該細胞の機能を変化させる作用を有する希少糖を有効成分として配合した組成物。
（１１）上記（１０）の組成物において、前記細胞がヒト細胞であることを特徴とする組成物。
（１２）上記（１０）または（１１）の組成物において、前記希少糖がアルドースおよび／またはケトースに属する希少糖であることを特徴とする組成物。
（１３）上記（１２）の組成物において、前記アルドースがＤ−アロースであることを特徴とする組成物。
（１４）上記（１３）の組成物において、前記細胞が、癌細胞増殖抑制作用感受性細胞および活性酸素の産生抑制作用感受性細胞よりなる群より選ばれることを特徴とする組成物。
（１５）上記（１２）の組成物において、前記ケトースがＤ−プシコースであることを特徴とする組成物。
（１６）上記（１５）の組成物において、前記細胞が、ケモカイン分泌抑制作用感受性細胞、マイクログリアの遊走抑制作用感受性細胞および血糖降下作用感受性細胞よりなる群より選ばれることを特徴とする組成物。
（１７）上記（１０）ないし（１６）のいずれかの組成物において、前記組成物が機能性食品、医薬品または化粧品であることを特徴とする組成物。
発明を実施するための最良の形態
「希少糖」とは、自然界に微量にしか存在しない単糖と定義づけることができる。本発明においても前記定義に基づく希少糖であり、好ましくはアルドースであるＤ−アロース、またはケトースであるＤ−プシコースである。自然界に多量に存在する単糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースの７種類あり、それ以外の単糖は全て希少糖である。また、糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ−ソルビトールが比較的多いが、それ以外のものは量的には少ないので、これらも本発明に従う希少糖と定義される。これらの希少糖は、これまで入手が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
以下、これらの単糖の関係を一層容易に理解するために提案されたＩｚｕｍｏｒｉｎｇに基づき説明を加える。
図４１で示される生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、炭素数４から６の単糖全てをつないだ連携図がイズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）の全体図である。すなわち、図４１から理解できることは、単糖は、炭素数４、５、６全てがつながっているということである。全体図は、イズモリングＣ６の中でのつながりと、イズモリングＣ５の中でのつながりと、イズモリングＣ４の中でのつながりと、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６が全てつながっていることである。この考え方は重要である。炭素数を減少させるには主に発酵法を用いる。炭素数の異なる単糖全てをつなぐという大きな連携図であることも特徴である。また、利用価値がないということも理解することができる。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングは、図４１の下段および図４２に示すように、炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。これらの糖は、酸化還元酵素の反応、アルドース異性化酵素の反応、アルドース還元酵素の反応で変換できることは、本発明者らの研究を含めた研究で知られている。しかしながら、これまでの研究では上のグループ、真ん中のグループ、下のグループは酵素反応でつながっていなかった。つまり、上のグループに属しているＤ−グルコース（ブドウ糖）やＤ−フラクトースは自然界に多量に存在する糖であり安価であるが、これらから希少糖を合成することができなかった。ところが、本発明者らの研究の過程で、これを結ぶ酵素が発見された。それはガラクチトールからＤ−タガトースを合成する酵素を持つ菌の培養液中に、全く予期しなかったＤ−ソルボースが発見されたことに端を発する。その原因を調べた結果、この菌がＤ−タガトース３エピメラーゼ（ＤＴＥ）という酵素を産生していることを発見した。
図４１の下段および図４２に示すように、このＤＴＥはこれまで切れていたＤ−タガトースとＤ−ソルボースの間をつなぐ酵素であることがわかる。そしてさらに驚くことに、このＤＴＥは全てのケトースの３位をエピ化する酵素であり、これまで合成接続できなかったＤ−フラクトースとＤ−プシコース、Ｌ−ソルボースとＬ−タガトース、Ｄ−タガトースとＤ−ソルボース、Ｌ−プシコースとＬ−フラクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有するユニークな酵素であることが分かった。このＤＴＥの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）と名付けた。
この図４２をよく見てみると、左側にＬ型、右側にＤ型、真ん中にＤＬ型があり、しかもリングの中央（星印）を中心としてＬ型とＤ型が点対称になっていることもわかる。例えば、Ｄ−グルコースとＬ−グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）の価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、Ｄ−グルコースを出発点としてＬ−グルコースを生産しようと思えば、Ｄ−グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとＬ−グルコースが作れることを示している。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）を使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるＤ−ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。ＤＴＥの発見によって、Ｄ−グルコースからＤ−フラクトース、Ｄ−プシコースを製造し、さらにＤ−アロース、アリトール、Ｄ−タリトールを製造することができるようになった。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）の意義をまとめると、生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、すべての単糖が構造的に整理され（知識の構造化）、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。
炭素数が５つの単糖（ペントース）のイズモリングは、図４１の中段および図４３に示すように、炭素数６のイズモリングよりも小さいリングである。しかし、Ｃ６のイズモリングと同じようにアルドース８個、ケトース４個および糖アルコール４個全てを含むことに変わりは無く、全てが酵素反応で結ばれる。異なる点は、酸化還元反応、異性化反応のみでリング状に全てが連結できることである。一方、ＤＴＥを用いることによって、さらに効率のよい生産経路が設計できることがわかる。炭素数５のイズモリングの特徴は、特に図４３から明らかなように、炭素数６のイズモリングが点対象に全単糖が配置されているのに対し、左右が対象に配置されていることが大きな特徴である。これら全ペントースは、酵素反応により連結されていることから、炭素数６のイズモリングの場合と全く同様に、すべてのペントースが構造的に整理され（知識の構造化）、全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できる意義を持っている。
炭素数が４つの単糖（テトロース）のイズモリングは、図４１の上段に示すように、テトロースの構造上の特性のため、リングが完成しないという特徴がある。炭素数５のイズモリング上部半分の構造を持っている。このリングの場合も、炭素数５，６の場合と同様の酸化還元および異性化反応によって連結されている。ＤＴＥが炭素数４のケトースに反応しないため、ケトース間の反応は現在のところ存在しない。しかし、新規のエピメラーゼの存在が予測され、この研究は現在研究途上である。全体の配置は、炭素数５と同様に左右対称であり、アルドース４個、ケトース２個および糖アルコール３個全てを含んでいる。すなわち炭素数５，６のイズモリングと同様の意義が存在する。
イズモリングＣ６のＤ−グルコースは、イズモリングＣ５のＤ−アラビトールおよびイズモリングＣ４のエリスリトールとつながっている。この線は、発酵法によってＤ−グルコースからＤ−アラビトールおよびエリスリトールを生産できることを示している。すなわち、イズモリングＣ６，イズモリングＣ５およびイズモリングＣ４は連結されている。この連結は、炭素数の減少という主に発酵法による反応であり、このＤ−アラビトールおよびエリスリトールへの転換反応の二つ以外の発酵法によるイズモリングＣ６とイズモリングＣ５，Ｃ４との連結は可能である。例えばＤ−グルコースからＤ−リボースの生産も可能である。このように、３つのイズモリングにより全ての炭素数４，５，６の単糖（アルドース、ケトース、糖アルコール）が連結されたことで、それぞれの単糖が全単糖の中でその存在場所を明確に確認できる。
最も有名なキシリトールは、未利用資源の木質から生産できるＤ−キシロースを還元することで容易に生産できることを明確に確認できる。もしも特定の単糖が生物反応によって多量に得られた場合には、それを原料とした新たな単糖への変換の可能性が容易に見いだすことが可能である。すなわち、この全体像から全ての単糖の原料としての位置を確実につかむことができるため、有用な利用法を設計することができる。特に廃棄物や副産物から単糖が得られた場合の利用方法を容易に推定できるのである。希少糖の生産分野ばかりではなく、希少糖の持つ生理活性を探索する研究においても有効性を発揮する。例えば、ある希少糖に生理活性が判明したとき、図４１で示される連携図の存在位置を確認する。そして構造の近い希少糖に関しての生理活性との比較、あるいは、構造的に鏡像関係にある希少糖の生理活性を検討することで、生理活性の機構を分子の構造から類推する助けになるであろう。また、希少糖の生理機能を解析し、イズモリング上に性質を集積することにより、これまで単純な羅列的理解から、単糖全体を、「単糖の構造」、「単糖の生産法」、および「単糖の生理機能」を包括的に理解することに大いに利用できると期待される。
希少糖のうち、現在大量生産ができているＤ−アロースとＤ−プシコースという二つの希少糖について説明する。
本発明で用いられるＤ−アロース（Ｄ−アロヘキソース）は、アルドース（アルドヘキソース）に分類されるアロースのＤ体であり、融点が１７８℃の六炭糖（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）である。
そして、このＤ−アロースの製法としては、Ｄ−アロン酸ラクトンをナトリウムアマルガムで還元する方法による製法や、また、シェイクワット・ホセイン・ブイヤン等による「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」第８５巻、５３９乃至５４１頁（１９９８年）において記載されている、Ｌ−ラムノース・イソメラーゼを用いてＤ−プシコースから合成する製法がある。
さらに近年では、特開２００２−１７３９２号公報に記載されている。Ｄ−プシコースを含有する溶液にＤ−キシロース・イソメラーゼを作用させて、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生成する製法が発明されている。
本発明の例えば癌細胞増殖抑制物質に用いるＤ−アロースは、前記製法、或いはその他の製法のいずれによって得られたものでもよいが、前記特開２００２−１７３９２号公報に記載されている製法によれば、大量生産が期待されるため、より容易に入手することができるようになることが期待される。しかし、これまでの製造法は、Ｄ−アロースの分離回収に関して完全に満足できるものではなく、従って工業的製造をするには未だ不経済な作業を必要としている。Ｄ−アロースを分離回収することに関する従来技術の不利な点「最もエネルギーの必要な過程」を克服すること、すなわち、効率よく分離回収する方法を提供すること、ならびに、高純度Ｄ−アロースの製造に関して技術的に実行可能な連続的製造法を提供することを目的として、Ｄ−アロースの結晶化法による分別法とその大量生産への応用について別途出願中である（特願平２００３−９５８２８号）。当該高純度Ｄ−アロースの分離回収法は、Ｄ−プシコースの一部分をＤ−アロースに変換した酵素反応産物である例えば３５％Ｄ−プシコースと１５％Ｄ−アロースの混合溶液からＤ−アロースを回収するに際し、Ｄ−アロースのエタノールおよび／またはメタノールに難溶性の性質を利用してＤ−アロースを結晶化させ、該Ｄ−アロースの結晶を分離することを特徴とする。上記の方法において、Ｄ−プシコースを酵素反応でＤ−アロースに変換する際に用いる酵素は「Ｌ−ラムノースイソメラーゼ」が例示される。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは、上記１９９８年の文献で発表された公知酵素であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ由来の酵素を好ましいものとして例示される。菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  ＬＬ１７２ａは、上記文献に記載された公知菌であり、香川大学農学部生物資源食糧化学科の何森健研究室に保存されている。財団法人発酵研究所から同一のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉは得られる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  ＩＦＯ  ３７７３，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  ＩＦＯ  １３５９６が同一の活性を持っていると思われる。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物から容易に入手が可能であり、Ｌ−ラムノースが存在する培養条件の時に、誘導的に生産される。通常、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物を培養して得ることができる。例えば、Ｌ−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物をＬ−ラムノースを炭素源として培養すると、Ｌ−ラムノースが誘導剤となって菌体内に生産される。酵素を大量に構成的に産生する変異株を用いることは、Ｌ−ラムノースなどの高価な炭素源を必要としないので特に有利である。得られた培養菌体からＬ−ラムノースイソメラーゼを抽出したもの、または菌体そのものを用いる。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは、使用目的に応じて、必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、粗酵素であっても用いることができる。粗酵素の具体的例としては、上記のＬ−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物自体を、また、その培養物や部分精製した培養物を用いることができる。本発明では特定の固定化法による固定化酵素または固定化菌体の形態で用いることにより、送液圧力が低く安定で長期間連続使用可能なリアクターを構築することができる。
上記の高純度Ｄ−アロースを連続的に製造する方法によって、Ｄ−アロースの分離と同時に脱塩、脱イオン、そして濃縮、結晶化が行え、従来、すべて別々の工程で行っていた分離方法をワンステップに統合処理できる。したがって、短時間に大量の処理が可能である。
本発明で用いられるＤ−プシコースは、希少糖に属するケトヘキソースに分類されるプシコースのＤ体であり六炭糖（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）である。このようなＤ−プシコースは、自然界から抽出されたもの、化学的又はバイオ的な合成法により合成されたもの等を含めて、どのような手段により入手してもよい。比較的容易には、例えば、エピメラーゼを用いた手法（特開平６−１２５７７６号公報等参照）により調製されたものでもよい。得られたＤ−プシコース液は、必要により、例えば、除蛋白、脱色、脱塩などの方法で精製され、濃縮してシラップ状のＤ−プシコース製品を採取することができ、更に、カラムクロマトグラフィーで分画、精製することにより９９％以上の高純度の標品も容易に得ることができる。このようなＤ−プシコースは単糖としてそのまま利用できるほか、必要に応じて各種の誘導体として用いることも期待される。
本発明において、生理活性作用感受細胞とは希少糖を作用させて当該細胞の機能を変化させることができる細胞をいい、このような機能を備えた細胞であれば特に限定されない。希少糖は当該細胞に影響して当該細胞の機能を変化させる。希少糖の種類により生理活性作用が異なるが、細胞を用いた予備実験によりその作用を予測することができ、本実験により確認することができる。当該細胞としては、好ましくはヒト細胞であるが、ヒト以外の細胞をも包含する。細胞の形態は生体の臓器、培養細胞のどちらでもよい。
生理活性作用感受細胞に希少糖を影響して当該細胞の機能を変化させる作用を発揮させるためには、細胞に希少糖を作用させることにより行う。本発明に用いられる希少糖は水溶性であり、作用させる態様には制限はない。用途に応じて適宜な手段を採用して希少糖を作用させることができる。
希少糖を有効成分とする物質の形態で用いて、細胞に希少糖を作用させることが好ましい。希少糖として希少糖を有効成分として配合した物質はいかなる形態のものも包含する。
希少糖のうち、アルドースとしてイズモリングにおいてＤ−フラクトースから最も近いＤ−アロースを、ケトースとしてＤ−プシコースを２つの代表的な希少糖としてとりあげその生理活性について説明する。
まず第１に、Ｄ−アロースについての例を示す。
本発明者らは、アルドースである希少糖が活性酸素の産生を抑制する性質を有することを見いだした。本発明は、アルドースである希少糖を有効成分とする活性酸素産生抑制剤を提供することができる。
すなわち、Ｄ−アロースが臓器の虚血障害を保護するというデータがある。肝臓などの臓器の手術の際には、必ず血流を一時的に止める。その結果、臓器は虚血状態に陥る。手術終了後、再び血液を流すと、この時、白血球から活性酸素が多量に産生され、これが臓器障害を起こす一つの大きな原因と考えられている。本発明者らは、希少糖を用いてラットで９０分間というかなり長い時間肝臓を虚血にし、その後再還流して３ヶ月後の生存率を調べた。通常では３割くらいしか生存しないものが、虚血前にＤ−アロースを０．２ｇ／ｋｇ還流しておくと、生存率が約７割に増加した。これを実証するために白血球を用いて様々な希少糖および現在自然界に多量に存在する糖（ブドウ糖など）を用いて、白血球からの活性酸素の産生に対する効果を調べた。白血球から活性酸素を産生させておき様々な糖を加えると、Ｄ−アロースのみが非常に強い活性酸素の産生抑制効果を示した。これが臓器保護の一つの要因であると考えられる。
このような虚血に対する保護作用は小腸、あるいは、脳の神経細胞死にも有効であることがわかった。神経細胞は特に虚血に弱く、海馬の神経細胞は５分間の虚血でも死滅することがわかっている。ラットの脳を用いて５分間の虚血を起こすと、海馬の神経細胞の８割が死んでしまうが、虚血の前にＤ−アロースを含む溶液で還流しておくと５分間の虚血でも約７割の生存が確認された。Ｄ−プシコースではこの作用は認められなかった。
さらに、この虚血保護作用は、網膜の虚血の保護作用があること、皮弁の生着率が著しく向上すること、腎臓虚血保護作用があることを裏付け、脳神経細胞虚血保護作用がグルタミン酸分泌抑制によることがわかった。
本発明者らは、希少糖に属するアルドヘキソース（六炭糖）が癌細胞の増殖を抑制する性質を有することを見いだした。本発明は、希少糖に属するアルドヘキソースを有効成分とする癌細胞増殖抑制剤を提供することができる。すなわち、ヒトがん由来の株化細胞を用いたがん細胞の増殖に対する効果を調べた。後述する実施例に結果を示しているが、がん細胞はシャーレに撒いておき、十分な栄養と酸素を与えるとどんどん増殖する。ここにＤ−アロースを添加すると増殖を非常に強力に押えるという効果があることが分かった。この効果は肝臓がんや皮膚がんの細胞においても同様に認められた。Ｄ−アロースを有効成分とする癌細胞増殖抑制剤は、用法としては経口投与でもよく、また、静脈注射、動脈注射、リンパ管内注射および疾患部位への直接投与でもよい。また、癌細胞増殖抑制剤に有効成分として含有させるものはＤ−アロースに限定されず、癌細胞の増殖を抑制する効果（癌細胞増殖抑制効果）を有する他のアルドース希少糖も癌細胞増殖抑制剤の有効成分として含有させることができる。
さらにＤ−アロースの白血病細胞に対する影響について、ある種の白血病細胞の増殖を抑制することを確認し、細胞増殖の抑制は細胞周期のＧ２−Ｍ期を延長するというＤ−アロースの細胞周期への影響のメカニズムを解明した。
次に、ケトヘキソースの生理活性についての例を示す。
このような希少糖に属するケトヘキソースは糖代謝に影響を及ぼさず、ケモカイン抑制物質、マイクログリア遊走抑制物質、インスリン分泌促進物質又は癌細胞増殖抑制物質として経口摂取、腹腔内投与、静脈投与など種々の経路で使用することができる。また、病巣内或いは病巣周辺に非経口的に投与することもできる。この場合、希少糖に属するケトヘキソースは単独で、又は希少糖に属するケトヘキソースの作用に悪い影響を与えない添加物を添加したり、誘導体としたり、また、他の物質（薬理活性成分）と併用して用いることもできる。
以下、各用途に分けてこの発明の実施の形態を詳細に説明する。
本発明者等は希少糖に属するケトヘキソースがケモカインの分泌を抑制する性質を有することを見出した。これにより、希少糖に属するケトヘキソースを有効成分とするケモカイン分泌抑制剤又は物質を提供することができる。
動脈硬化症に起因する死亡は、死因の第一位である。動脈硬化症の危険因子としては、糖尿病、高脂血症、高血圧などが指摘されている。最近の報告によれば、これら危険因子と動脈硬化症発症の機序について、分子レベルでの解析が進んでいる。動脈硬化症発症の契機は、単球の血管壁への遊走およびｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒによるコレステロール蓄積とマクロファージの泡沫細胞化である。その進展には種々のサイトカインやケモカインの関与が示唆されている。特にケモカイン（細胞遊走を起こすサイトカイン）の一つであるＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）は動脈硬化巣の血管内皮細胞から分泌され単球の遊走に関係する因子であり、動脈硬化進展に重要な役割を演じている因子として注目されている。
ＭＣＰ−１又はＭＣＰ−１の受容体であるＣＣＲ２をノックアウトしたマウスにおいては動脈硬化が起こりにくく、ＭＣＰ−１が動脈硬化発症において中心的な役割を持っていることが明らかになった。
ＭＣＰ−１は、ＩＬ−１βやＴＮＦ−αという炎症性サイトカインにより刺激されて分泌される。こうしたサイトカインの産生を抑制する薬剤として、ｐｙｒａｚｏｌｏｔｒｉａｚｉｎ誘導体薬剤やｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）分泌誘発剤が知られており、臓器保存に使用されている。
炎症性サイトカイン・ケモカイン産生抑制剤としてコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム（薬効：副腎皮質ホルモン剤）も市販されている（例えば、ファルマシア社、富士製薬社、ユーシービージャパン社、沢井製薬社）。
一方、糖類又はその誘導体の動脈硬化治療剤としては、血中コレステロール濃度を低下させるヘキソースリン酸カルシウム（グルコースリン酸カルシウムなど）が特開昭６３−１９８６３０号公報で公表されている。
また、コラーゲンの合成を抑制するピラノピラノン化合物が特開平１０−３３０２６８号公報で公表されている。
しかしながら、希少糖に属するケトヘキソース及びその誘導体によるＭＣＰ−１分泌の抑制効果やこれを利用した動脈硬化抑制についてはまだ知られていない。
本発明により、希少糖に属するケトヘキソースのＭＣＰ−１分泌の抑制効果を確認することにより希少糖に属するケトヘキソースの動脈硬化における有用性及び臨床応用への可能性を裏付けることができる。以下の実施例では、第一に希少糖に属するケトヘキソースの一つとしてのＤ−プシコースによる血管内皮細胞からのＭＣＰ−１分泌に対する影響について検討する。また、血管内皮細胞からのＭＣＰ−１分泌を刺激するサイトカイン存在下におけるＤ−プシコースのＭＣＰ−１分泌抑制効果についても検討する。
これにより、希少糖に属するケトヘキソースはＭＣＰ−１の分泌を抑制することにより、単独で、又は他の物質（薬理活性成分）と併用して、動脈硬化症の予防又は治療に有効である可能性が示唆される。また、糖尿病、高脂血症、高血圧などの予防物質、治療物質として期待される。また、炎症性サイトカイン・ケモカイン産生抑制物質、副腎皮質ホルモン剤や抗炎症剤の代用物質としての利用が期待される。更に、臓器保存剤としての適用も期待される。
Ｄ−プシコースはインスリン分泌を促進する。インスリンを分泌するラットの膵臓β細胞株を用いた実験において、生理的な分泌物質であるＤ−グルコースの濃度を徐々に上げていくと、濃度に依存してインスリンの分泌が増えていく。Ｄ−グルコースの濃度をゼロにしておき、Ｄ−プシコースの濃度を上げていくと、Ｄ−グルコースと同じように濃度依存性にインスリンを分泌するという反応が見られた。また、Ｄ−グルコースを１１．２ｍＭ投与すると最大のインスリン分泌となるが、その状態でさらにＤ−プシコースを加えるとＤ−グルコースと等濃度くらいまで加えた時さらにインスリン分泌が促進され、Ｄ−グルコースでの最大分泌量とＤ−プシコースでの最大分泌量を足した量のインスリンが分泌された。
このように、希少糖が生理活性を持つということが次々と分かってきた。希少糖を細胞の外に投与した場合、（１）輸送体を通って細胞の中に入ってくる可能性、（２）受容体に結合する可能性、あるいは、（３）細胞内の代謝を希少糖が存在することで変える可能性、などが考えられる。それらいずれの経路でも、恐らく情報は核に伝わり核のＤＮＡの転写に変化が起こり、蛋白の発現に変化が生じ、その結果、細胞機能が変化するのではないかと考えている。Ｄ−プシコースのインスリン分泌の例を見ても、今まで知られているメカニズムと異なっている可能性が高い。希少糖の作用メカニズムについては、これまでほとんど行われておらず、そのような場合においてメカニズムを探るためには、希少糖を処理した細胞あるいは臓器での情報経路を網羅的に解析する手法を取らなければならないと考えている。
そこで、本発明者らはさらに研究をすすめて、インスリン分泌促進作用について、Ｄ−プシコースが血糖値を緩やかに押さえる作用を動物（ラット）で裏付け、Ｄ−プシコースが高血糖時の血糖降下とインスリン分泌促進作用があること、ならびに、Ｄ−プシコースにより蛋白質の糖化がほとんどおこらないことを確認した。
以上、医薬品としての応用を例に示したが、その他にも、Ｄ−プシコースでは動脈硬化の増悪因子であるケモカインＭＣＰ−１の血管内皮細胞からの分泌を抑制する効果に加え、肝臓での脂肪の合成を抑制する効果があることもわかっており動脈硬化予防作用などにつながる可能性がある。また血管新生に対する作用や免疫抑制作用など、さまざまな生理活性効果の可能性が出てきている。また、希少糖の用途としては医薬品以外の可能性については、食品、飲料、特に機能性食品（肥満予防など）、化粧品、飼料、農薬（植物成長調整剤、植物病害抵抗性増幅剤など）が例示される。
農薬の使用量を飛躍的に減少させる可能性のある、植物に対して病害抵抗性を増幅する作用の物質を提供することを目的として、本発明者らの別のグループは、希少糖による植物病害抵抗性増幅剤の発明を別途出願中である（特願平２００３−９５８２６号）。希少糖を、植物に対して病害抵抗性を増幅する作用の物質として用いる場合の利点は、（１）低濃度（１００μｇ／ｍｌ）の希少糖水溶液が、展着剤なしで、抵抗性遺伝子を迅速に起動し、（２）希少糖は自然界に微量しか存在しないが、「天然物」であるため、安全性の高い散布剤であることが期待され、（３）希少糖は病原菌に対する作用は強い殺菌作用ではないので、耐性菌の発生を考慮する必要がなく、（４）希少糖単独の剤としてのみならず、殺菌剤との混合商品等としての開発が期待される点が挙げられる。
食品、飲料または化粧品、あるいは飼料における配合量は特に制限されないが０．０１〜１０重量％程度が好ましい。医薬品の場合、カプセルや粉末、錠剤などとして経口投与することができ、水に溶けることから経口投与以外に静脈注射、筋肉注射などの投与方法を採用することが可能である。投与量は例えば糖尿病の症状の度合いや体重、年齢、性別などにより異なるものであり、使用に際して適当な量を症状に応じて決めることが望ましい。医薬品における配合量は特に制限はされないが、体重１ｋｇあたり、経口投与の場合０．０１〜２，０００ｍｇ、静脈注射投与の場合０．０１〜１，０００ｍｇ、筋肉注射投与の場合０．０１〜１，０００ｍｇ程度が好ましい。
また本発明の希少糖は食品素材に微量に存在し、安全性が高く、大量生産技術が開発されればコスト面でも利用価値は高いものである。なお急性経口毒性試験では５，０００ｍｇ／ｋｇ以上であった。
本発明の機能性食品は、特定の疾病などを予防（肥満予防）する健康食品、予防医薬品の分野の利用に適している。特定の疾病を予防する健康食品においては、必須成分である希少糖の他に、任意的成分として、通常食品に添加されるビタミン類、炭水化物、色素、香料など適宜配合することができる。食品は液状または固形の任意の形態で食することができる。ゼラチンなどで外包してカプセル化した軟カプセル剤として食することができる。カプセルは、例えば、原料ゼラチンに水を加えて溶解し、これに可塑剤（グリセリン、Ｄ−ソルビトールなど）を加えることにより調製したゼラチン皮膜でつくられる。
本発明の薬剤においては、有効成分である希少糖はそれ自体のみならずそれの薬剤として許容される塩として使用される。該薬剤は、希少糖を単独で製剤として用いることができるほか、製薬上使用できる担体もしくは希釈剤を加えた製剤組成物に加工したものを用いることもできる。このような製剤または薬剤組成物は、経口または非経口の経路で投与することができる。例えば、経口投与用の固体または流体（ゲルおよび液体）の製剤または薬剤組成物は、タブレット、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、顆粒もしくはゲル調製品の形態をとる。製剤または薬剤組成物の正確な投与量は、その目的とする使用形態および処置時間により変化するため、担当の医師または獣医が適当であると考える量になる。服用および投与用量は製剤形態によって適宜調整できる。錠剤などの経口固形製剤、経口液剤などとして１日服用量を１回ないし数回に分けて服用してもよい。また、例えばシロップやトローチ、チュアブル錠などの幼児頓服して、局所で作用させるとともに内服による全身性作用をも発揮させる製剤形態では１日服用量の１／２〜１／１０を１回量として配合し服用すればよく、この場合全服用量が１日量に満たなくてもよい。
逆に、製剤形態からみて無理な服用容量とならなければ１日服用量に相当する量を１回分として配合してもよい。製剤の調製にあたっては、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、コーティング剤、徐放化剤など、希釈剤や賦形剤を用いることができる。この他、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、吸着剤、香料、着色剤、矯味剤、抗酸化剤、保湿剤、遮光剤、光沢剤、帯電防止剤などを使用することができる。
本発明は、希少糖の抗炎症作用を利用する皮膚外用剤、すなわち治療薬、皮膚外用剤、化粧料等が知られている肌荒れ、荒れ性に対して改善・予防効果を有する皮膚外用剤を提供することができる。本発明の皮膚外用剤には、希少糖を必須成分とし、それ以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば水性成分、油性成分、粉末成分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、香料、色剤、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラバミル、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸、トラネキサム酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸クルコシド、アルブチン、コウジ酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。本発明の皮膚外用剤は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来の皮膚外用剤に用いられる形態であればいずれでもよく、剤型は特に問わない。
以下、本発明の詳細を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されない。
実施例１
（希少糖の培養細胞増殖に及ぼす影響）
以下の条件により、各種の希少糖を培養液中に５０ｍＭの濃度で添加して、各希少糖が株化癌細胞の増殖進行に及ぼす影響を調べた。
（１）添加対象細胞：肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）、子宮癌細胞（Ｈｅｌａ）、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）、皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）を、添加する対象細胞とした。
（２）添加した希少糖：Ｄ−アロースの他に、比較する他の糖として、グルコース、及びケトース希少糖のＤ−アルトロースを各添加対象細胞に添加した。また、コントロールとしては、Ｄ−フルクトースを採用した。
（３）実験方法：９６穴のマルチウェルプラスティックディッシュ（ウェル）に各添加対象細胞を３，０００〜５，０００個撒き、細胞種により５〜１０％のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を添加した媒体で４〜５日間培養した。Ｄ−アロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−アルトロースを、各々５０ｍＭの濃度で各添加対象細胞に添加した。コントロールとしてのＤ−フルクトースを、前記同様に５０ｍＭの濃度で添加した。細胞増殖に及ぼす影響を調べるため、２４時間毎に下記のＭＴＴ法により細胞数を確認した。
＜ＭＴＴ法＞
▲１▼試薬の調製：ＭＴＴ（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ）の所定量をオートクレープで滅菌したＰＢＳ（−）で溶解し、濾過滅菌しＭＴＴ溶液を得る。酸性溶液としては、ＳＤＳの所定量（２０ｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの５０ｍＬ及び水を加えて１００ｍＬとし、１Ｎの塩酸約２００ｍＬを加えてｐＨ４．７に調整する。室温で保存して使用前に３７℃とする。
▲２▼試験方法：細胞をＴＥＰで処理し、細胞浮遊液を調製する。その細胞浮遊液を所定数（３００〜５２０００細胞／ウェル）、各ウェルに分注する（９６ウェルプレート：培地０．１ｍＬ）。薬剤としての糖を所定量添加し、炭酸ガスインキュベーターで一昼夜前培養する。上述のＭＴＴ液０．５ｍｇ／ｍＬを添加し、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養後、培地を完全に取り除く。さらに、３７℃に保たれた室内で酸性溶液を０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、マイクロプレートミキサーに載せ、３７℃で２０分間振動させながら溶解させる（ｆｏｒｍａｚａｎを酸性溶液で溶解させる）。分光光度計を用いて、５７０〜６００ｎｍの波長で吸光度を測定する。着色物質（ｆｏｒｍａｚａｎ）酸性溶液で溶解させた後、そのままプレートリーダで吸光度を測定できる。
（４）実験結果：▲１▼肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）…肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）の細胞数の経時変化を図１に示す。図１により、Ｄ−アロースがＨｅｐＧ２細胞の増殖を強く抑制したことがわかる。Ｄ−アルトロースにも抑制作用が認められたが、Ｄ−アロースと比し癌細胞増殖抑制効果は弱いものであった。グルコースにはほとんど抑制効果が認められなかった。
▲２▼子宮癌細胞（Ｈｅｌａ）…子宮癌細胞（Ｈｅｌａ）の細胞数の経時変化を図２に示す。Ｄ−アロースはＨｅｌａ細胞の増殖を強く抑制したことがわかる。
▲３▼卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）…卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）の細胞数の経時変化を図３に示す。Ｄ−アロースはＯＶＣＡＲ３細胞の増殖を強く抑制したことがわかる。Ｄ−アルトロースにも抑制作用が認められたが、Ｄ−アロースと比し癌細胞増殖抑制効果は弱いものであった。グルコースは癌細胞の増殖に対して促進的に働いた。
▲４▼皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）…皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）の細胞数の経時変化を図４に示す。Ｄ−アロースはＨａＣａＴ細胞の増殖を強く抑制したことがわかる。他の希少糖ではＤ−アルトロースに中等度の抑制効果が認められたが、Ｄ−アロースと比し癌細胞増殖抑制効果は弱いものであった。図１〜図４より、Ｄ−アロースの癌細胞増殖抑制効果は、細胞種により強さが異なっていることがわかる。アルドース希少糖としてのＤ−アロースには癌細胞の増殖を抑制する効果があり、制癌剤としての有効利用が期待された。さらに、Ｄ−アロースと比しケトース希少糖のＤ−アルトロースの癌細胞増殖抑制効果は弱いものであったことから、Ｄ−アロースだけでなく他のアルドース希少糖も制癌剤としての有効利用が期待できる。
実施例２
（Ｄ−アロースの癌細胞増殖抑制効果の濃度依存性）
実施例２として、Ｄ−アロースの癌細胞増殖抑制効果の濃度依存性を調べた。
（１）実験方法：添加対象細胞として、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）を選択し、Ｄ−アロース濃度を１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭとして添加した。卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）の培養方法、細胞数の計測方法（ＭＴＴ法）等の実験条件は前記実施例１と同様である。
（２）実験結果：各濃度のＤ−アロースを添加した卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）の細胞数の経時変化を図５に示す。癌細胞増殖抑制効果は１０ｍＭで認められ始め、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭと次第に強くなった。すなわち、Ｄ−アロースの抑制効果には濃度依存性が認められた。抑制効果が見られる濃度は本実施例２の実験条件（１０％胎仔血清）では１０ｍＭであったが、この有効濃度は他の細胞においても同じであった。さらに、Ｄ−アロースを投与した細胞を顕微鏡で見ると、死んだ細胞はほとんどなく、このことはトリパンブルー色素排泄試験でも確かめられた。本実験結果からは、Ｄ−アロースは細胞増殖を抑制するものの、細胞を殺す働きはないと考えられる。
実施例３
（希少糖の血液系の癌細胞株の増殖への影響）
この実施例は、希少糖に属するアルドースを有効成分とする癌細胞増殖抑制物質に関する。各種の抗腫瘍薬・制ガン剤が知られているが、一般的にその副作用が問題となっている。また、現在では疾患の治療にターゲットを置いた薬剤より、むしろその予防にターゲットを置いた薬剤又は食品（機能性食品）に対する意識や期待が高まっている。糖と癌との関係では、オリゴ糖が整腸作用を持つことを利用して便秘を解消し大腸癌などになりにくい効果を有することや、最近ではアガリクスなどの多糖体が癌抑制効果を持つことなどの報告、糖鎖と癌転移などの関連の報告などはあるが、単糖そのものが癌細胞増殖抑制効果を持つことについてはほとんど報告がない。本実施例では、希少糖に属するアルドースやケトースの各種の株化癌細胞に対する増殖の影響を検討した。これにより、希少糖に属するアルドースが株化癌細胞の増殖抑制が確認された。糖代謝に影響を及ぼさない希少糖に属するアルドースが株化癌細胞の増殖を抑制させる効果が確認されたことは、副作用の少ない癌の治療剤、予防剤、増殖抑制剤として期待される。また、希少糖に属するアルドースは機能性食品としての付加価値が高まることが期待される。なお、希少糖に属するアルドースとしてはＤ−アロースが最も有効であった。
（１）目的：希少糖による細胞株の増殖抑制効果を比較検討する。
（２）方法：Ｍｙｅｌｏｉｄ（ＨＬ−６０，ＴＨＰ−１，ＫＧ−１）、Ｔ−ｃｅｌｌ（ＭＴ−２）、Ｂ−ｃｅｌｌ（Ｄａｕｄｉ，ＫＳ−１）の合計６株、希少糖３種（Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ，Ｄ−ａｌｔｒｏｓｅ，Ｄ−ａｌｌｏｓｅ）を使用した。培養液と各細胞を１×１０５個、計１ｍｌになるようにし、４日目と７日目の細胞数をコールターカウンターでカウントした。糖はそれぞれ０．０５、０．５、５、５０ｍＭで添加し、コントロールにはＤ−ｇｌｕｃｏｓｅを用いた。
培地；ＦＢＳ１０％添加ＲＰＭＩ１４６０
培養条件；３７℃，５％ＣＯ２
培養容器；ＦＡＬＣＯＮ，ＭＵＬＴＩＷＥＬＬ，１２ｗｅｌｌ
培養日数；７日間
糖濃度；０．０５、０．５、５、５０ｍＭ
（３）結果（図６〜図１１）：６株の細胞のうち、ＨＬ６０とＤａｕｄｉ細胞において効果が認められたが、他の細胞においては明らかな影響は認められなかった。
１）図６に示すように、ｐｓｉｃｏｓｅとａｌｌｏｓｅで抑制が見られたが、ａｌｔｒｏｓｅでは見られなかった。
▲１▼ａｌｌｏｓｅ；糖濃度が高くなる程、７日目の細胞増殖抑制は強くなる傾向にあった。０．０５ｍＭ；６２．６％，０．５ｍＭ；６７．７％，５ｍＭ；４１．５％，５０ｍＭ；３０．７％，（ｇｌｕｃｏｓｅを１００％とする）
▲２▼ｐｓｉｃｏｓｅ；細胞増殖抑制は、糖濃度には関わりなく、ほぼ一定であった。０．０５ｍＭ；８４．７％，０．５ｍＭ；８０．７％  ５ｍＭ；８４．２％，５０ｍＭ；９３．６％，（ｇｌｕｃｏｓｅを１００％とする）
２）図７に示すように、ａｌｌｏｓｅで抑制が見られたが、ｐｓｉｃｏｓｅとａｌｔｒｏｓｅでは認められなかった。
▲１▼ａｌｌｏｓｅ；糖濃度が大きくなる程、７日目の細胞増殖抑制は大きくなる傾向にあった。０．０５ｍＭ；８５．９％，０．５ｍＭ；８０．６％  ５ｍＭ；６２．２％，５０ｍＭ；３．９％，（ｇｌｕｃｏｓｅを１００％とする）
３）図８および図９に示すように、ａｌｌｏｓｅ  ５０ｍＭで細胞増殖抑制が見られたが、他の糖、濃度でははっきりとした抑制は見られなかった。
４）図１０および図１１に示すように、コントロールを含め、すべての糖および濃度で抑制が見られたため、糖そのものにこれら細胞にたいする非特異的な影響があることが想定された。
以上より、Ｄ−ａｌｌｏｓｅは、ＨＬ６０，Ｄａｕｄｉ，ＫＳ１，ＫＧ１の４種類の細胞において抑制効果が認められ、使用した希少糖の中で最も抑制効果が高かった。Ｄ−ａｌｌｏｓｅの効果には細胞の種類により差があることが確認された。
実施例４
（Ｄ−アロースの細胞周期に及ぼす影響）
（１）目的：様々な糖を試した中で、Ｄ−アロースのみがミリＭ濃度で癌細胞の増殖を抑えた。作用メカニズムは未だ不明だが、そのために、Ｄ−アロースが細胞周期に及ぼす影響を調べることとした。
（２）方法：フローサイトメーターによる解析を行った。使用した細胞は、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）細胞である。
１）細胞をトリプシンで処理し、細胞浮遊液を調製する。
２）直径１００ｍｍのｐｌａｓｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅに細胞を撒き、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養する（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）。
３）希少糖（Ｄ−アロース５０ｍＭ）を添加と無添加（ｃｏｎｔｒｏｌとしてＤ−グルコース）して、３日間培養する。
４）分離した細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄する。
５）遠心後ＰＢＳ（−）３ｍｌを加えピペッティングにより撹拌する。
６）７ｍｌ  １００％  ｅｔｈａｎｏｌを加える、４℃で、２ｈ固定する。
７）１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ遠心する。
８）Ｃｏｌｄ  ＰＢＳ（−）で２回洗浄する。
９）遠心後，ＲＮａｓｅ２００ｕｇ／ｍｌを加える、３７℃で３０分インキュベーションする。
１０）０．５ｍｌＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）を加える、１５分インキュベーションする。
１１）フローサイトメーターで測定する。
（３）結果：Ｄ−アロースを添加した細胞は細胞周期においてＧ２−Ｍ期の細胞の割合が２２．６％であり、コントロールでの細胞の割合１２．６％に比べて有意に多かった（図１２）。
（４）考察：１）希少糖はこれまでほとんど研究されていないため、その生理機能もほとんど知られていないのが現状である。そのなかＤ−アロースは癌細胞の増殖を抑制効果があることは、今まで全く知られていない新規な働きである。２）そのメカニズムについてはまだ明らかでないが、今回の解析によって、細胞周期Ｇ２期を遅延させる効果があることがわかった。
実施例５
（希少糖の白血球からの活性酸素の産生に対する影響）
以下の条件により、各種の希少糖の白血球からの活性酸素の産生に対する影響を調べた。ここでは白血球からの活性酸素産生に対する作用を、Ｌ０１２化学発光により調べた。
（１）添加対象白血球：ラット白血球（顆粒球）を用いた。
（２）添加した希少糖：アルドース希少糖としてのＤ−アロースの他に、比較する他の希少糖として、ケトース希少糖のＤ−プシコースとＤ−アルトロースを、ポリオールのＤ−タリトールを用いた。さらに、自然界に多量存在する糖としてＤ−グルコースとＤ−フラクトースを使用した。
（３）実験方法：▲１▼ラット白血球からの活性酸素産生の経時変化…ラット白血球（顆粒球）にｚｙｍｏｓａｎ粒子を添加することにより起こる活性酸素産生の時間経過を調べた。さらに、各希少糖の存在化における活性酸素産生の時間経過も調べた。
▲２▼活性酸素産生に希少糖が及ぼす影響…白血球からの活性酸素産生系に対して、さまざまな糖を添加して産生量を測定した。添加した糖の濃度はそれぞれ１０ｍＭを使用した。また、糖を添加しない条件下でも測定を行った。
▲３▼希少糖の活性酸素産生に対する作用…白血球においてｚｙｍｏｓａｎ添加し貧食が始まり活性酸素産生が始まった後にそれぞれ１０ｍＭの濃度の各希少糖を添加した。
▲４▼Ｄ−アロースの活性酸素産生抑制効果の濃度依存性…Ｄ−アロースの活性酸素産生抑制効果の濃度依存性を調べた。Ｄ−アロース濃度を０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭとして添加した。
（４）実験結果：▲１▼ラット白血球からの活性酸素産生の経時変化…ラット白血球（顆粒球）にｚｙｍｏｓａｎ粒子を添加することにより起こる活性酸素産生の時間経過を調べた結果を図１３に示す。活性酸素産生は、２〜３分で極大になりその後は随時減少することが判明した。また、この結果は、希少糖存在下でも変化しなかった。
▲２▼活性酸素産生に希少糖が及ぼす影響…各糖を添加して産生量を測定した結果を図１４に示す。活性酸素産生は、Ｄ−アロースのみにより抑制された（ｎ＝４）。グルコースをはじめ、他の希少糖（Ｄ−プシコース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−タリトール）では全く抑制が認められなかった。
▲３▼希少糖の活性酸素産生に対する作用…活性酸素産生が始まった後に希少糖を添加したときの実験結果を図１５に示す。白血球においてｚｙｍｏｓａｎ添加し貧食が始まり活性酸素産生が始まった後に希少糖を１０ｍＭの濃度添加した場合には、Ｄ−アロースにおいて抑制効果がみられた。本実施例５により、活性酸素の産生の時間的経過は希少糖の存在に拘わらず同じであることが判明した。また、調べた希少糖の中では、Ｄ−アロースに特異的に、活性酸素の産生を抑制する効果（活性酸素産生抑制効果）があることが判明した。
▲４▼Ｄ−アロースの各濃度における活性酸素抑制効果の実験結果を図１６に示す。この結果、この系においては５ｍＭでは作用が現れず、１０ｍＭになって初めて５０％以上の抑制効果が現れることが判明し、Ｄ−アロースの有効濃度は１０ｍＭ近辺にあることが判明した。また、本実施例１０および前記実施例５により、Ｄ−アロースには活性酸素の産生を抑制する作用があることが判明した。他のアルドースについてもこの作用があることも予想され、今後の課題として調べていかなければならない。
この活性酸素産生抑制効果は幅広い活性酸素が関連する病態・疾患に対して、有効であり、今後、治療薬、機能性食品、外用剤などとしての応用の可能性があると思われる。例えば、脳神経系疾患（一過性脳虚血発作、脳卒中、パーキンソン症候群、外傷性てんかん、脊髄損傷等）、心血管系病変（動脈硬化症、虚血性心筋傷害等）、呼吸器疾患（Ａｄｕｌｔｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＲＤＳ）、間質性肺炎、肺線維症、ウイルス性肺炎等）、消化器疾患（胃粘膜病変、肝の虚血・再循環障害、黄疸病態、膵炎等）、腎疾患（糸球体腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、尿毒症等）、糖尿病、癌、眼科疾患（網膜変性、未熟児網膜症、白内障、眼炎症、角膜疾患等）、皮膚疾患（アトピー性皮膚炎、しみ、そばかす、色素沈着、皮膚の老化等）、膠原病等のための治療薬への応用や、その他の用途としても臓器保存剤、各種臓器幹細胞保存剤、精子・卵子保存剤としても応用の可能性がある。また、本実施の形態では、アルドース希少糖として、Ｄ−アロースを用いているが、活性酸素産生抑制効果を有する他のアルドース希少糖も前記のような用途への応用の可能性がある。
実施例６
（網膜虚血・再還流障害に対する希少糖の効果）
（１）目的：一過性眼虚血モデル（ラット）に対してＤ−アロースの網膜に対する影響を検討する。
（２）方法：一過性眼虚血モデルは眼圧を１２０ｍｍＨｇ程度まで上昇させることにより作製した。４５分間の虚血を行い、その後再還流を行った。マイクロダイアリーシス法により虚血再還流時に放出されるグルタミン酸濃度を測定した。
（３）結果：図１７に示すように、Ｄ−アロースを虚血前に静脈内投与（２００ｍｇ／ｋｇ体重）することにより、虚血時のグルタミン酸濃度はコントロール（Ｄ−アロース非投与）に比べ抑制され、また再還流時には完全に抑制された。
（４）考察：網膜の虚血・再還流障害においては、海馬の神経細胞のそれと同様に、多量のグルタミン酸の放出による神経毒性があることが指摘されている。Ｄ−アロースがグルタミン酸の放出を抑制することはＤ−アロースが網膜神経保護効果を有する可能性を強く示唆している。
実施例７
（希少糖（Ｄ−アロース）の皮弁虚血再灌流障害軽減効果に関する実験）
（１）目的：本発明者らはこれまでの基礎研究で、島状皮弁の虚血再灌流後の皮弁壊死および乱走皮弁遠位部の壊死メカニズムの解明に取り組んできた。その結果、島状皮弁の虚血再灌流後の壊死および乱走皮弁遠位部の壊死に活性酸素が関与していることを明らかにした。また、島状皮弁の虚血再灌流後の壊死および乱走皮弁遠位部の壊死には、血腫や炎症により産生される活性酸素の関与することも示唆されている。本実施例７は、希少糖の活性酸素産生抑制作用の基礎的データを得ることを第一の目的とし、島状皮弁および乱走皮弁の壊死を効果的に予防するための臨床応用を第二の目的とする。さらに、遊離皮弁、切断肢の長期保存における保存液としての応用および血行再開後の再灌流障害予防法を開発することを第三の目的とする。（２）実験方法：１）ウイスター系ラット（♂、７〜８週、３００ｇ弱）にペントバルビタール（ネンブタール）を腹腔内投与して麻酔をする。２）バリカンで腹部全体を剃毛する。３）左大腿動静脈を血管茎とする３×５ｃｍの島状皮弁を左腹部に作成する。４）挙上した皮弁は、４−０ナイロン糸を用いて元の位置に縫合する５）薬剤（いずれも０．６ｍｌ）を右大腿静脈よりワンショットで静注する。投与する薬剤は、各種濃度のＤ−アロース、グルコース（０．２ｍｇ／ｇ）、生理食塩水。
６）薬剤を投与して１５分間待った後、血管茎を動静脈ともクランプする。クランプには、バスキュラークリップ（静脈用６０ｇ）を２個使用した。
７）レーザードップラー血流計を用いて、血行が完全に遮断されたことを確認する。
８）８時間後、クランプを外す。同様に、レーザードップラー血流計を用いて血行が再開したことを確認する。
９）１週間後に、皮弁の生死を判定する。
１０）デジタルカメラで撮影後コンピューターに取り込み、生着面積（％）を面積計算ソフトで計算する。
（３）実験群：下記の６群：各群いずれもｎ＝１５
１）Ｄ−アロース  ：１５０ｍｇ（０．５ｍｇ／ｇ）
２）Ｄ−アロース  ：６０ｍｇ（０．２ｍｇ／ｇ）
３）Ｄ−アロース  ：３０ｍｇ（０．１ｍｇ／ｇ）
４）Ｄ−アロース  ：１５ｍｇ（０．０５ｍｇ／ｇ）
５）Ｄ−グルコース：６０ｍｇ（０．２ｍｇ／ｇ）
６）生理食塩水（コントロール）
（４）結果（図１７〜２０）：生着面積（％）の全データを図１８に、分散分析（一元配置）の結果を図１９に、平均値と標準偏差を図２０に、多重比較検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ）の結果を図２１に示す。多重比較検定は、ｐ＜０．０５で有意差ありと判定した。
３０ｍｇ（０．１ｍｇ／ｇ）以上Ｄ−アロースを投与した１）２）３）の３群は、生食投与群６）に対してともに統計的有意差を認める。さらに、１）２）の２群はグルコース投与群５）に対しても統計的有意差を認める。しかし、Ｄ−アロースを１５ｍｇ（０．０５ｍｇ／ｇ）投与した４）は、生食投与群６）やグルコース投与群５）に対して統計的有意差を認めない。また、グルコース投与群５）は生食投与群６）に対して統計的有意差を認めない。したがって、Ｄ−アロースはＤ−グルコースと異なり皮弁生着面積の延長効果があり、その効果発現には３０ｍｇ（０．１ｍｇ／ｇ）以上の投与が必要であるといえる。
（５）考察：上記の実験によりＤ−アロースに皮弁虚血再灌流障害軽減効果があることが証明された。この機序がいかなる作用によるものなのかを検証する必要がある。われわれはＤ−アロースが抗酸化作用を持つのではないかと考えている。この証明のためには、各種酸化ストレスの指標を測定する必要がある。まず、皮弁組織中の過酸化脂質をＴＢＡ（チオバルビタール）法により経時的に測定すること、４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎｏｎｅａｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＮＥによる免疫染色から測定）や白血球数（ＨＥ標本から測定）などの他のパラメーターも測定することが必要がある。
作用機序の概要が分かることにより、どのタイミングで投与するのが最も効果的なのかを検討することが可能である。現在は皮弁挙上直後（皮弁の血管茎をクランプする１５分前）に経静脈的に全身投与しているが、血管茎のクランプを解除する直前に全身または局所投与してみる実験を続けるべきと考えている。また、至適投与量についても再検討し、至適投与量・最も効果的な投与方法（タイミング）が判明したところで、既存の抗酸化剤（ＳＯＤ、アロプリノールなど）と効果を比較してみることが必要であると考えている。今後の展望として、皮弁保護作用のある注射薬または軟膏の開発につながると考えている。効果的な皮弁壊死予防薬が開発されれば、皮弁による手術成績が飛躍的に向上する。また、切断肢の保存が可能になれば、緊急手術で再接着術を行う必要はなくなり、待機手術として定時に行うことができるようになる。
（６）参考文献：１）Ａｓｈｏｏｒｉ  Ｆ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｆｌａｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｌａｇｉｃ  ａｃｉｄ．Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ，９４：１０２７−１０３７，１９９４．
２）Ｕｍ  ＳＣ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎｏｎｅａｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ３−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｓｌａｎｄ  ｓｋｉｎ  ｆｌａｐｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ａｎｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ，４２：２９３−２９８，１９９９．
３）佐藤美樹，鈴木茂彦，宗内巌：皮弁虚血再灌流障害時における組織内Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９の発現変化．日本形成外科学会会誌，２２：４２８−４３３，２００２．
４）Ｙａｇｉ  Ｋ：Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｅｄ，１５：２１２−２１６，１９７６．
５）Ｏｈｋａｗａ  Ｈ，Ｏｈｉｓｈｉ  Ｓ，Ｙａｇｉ  Ｋ：Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｂｙ  ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，９５：３５１−３５８，１９７９．
実施例８
（ラット腎虚血再灌流障害に及ぼす希少糖の効果）
（１）目的：ショックや腎虚血を伴う手術時などで、急性腎不全は生命予後に悪影響を及ぼす重篤な合併症の一つである。そこで、今まで腎虚血性障害に対してはｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇや各種薬物の有効性が検討されている。今回はラット腎虚血再灌流障害モデルを使用して腎虚血性障害に及ぼす希少糖の効果を検討した。
（２）方法：
対象…体重３００ｇ前後の雄性ラット。
実験方法…ラットをネンブタールで麻酔後に腎虚血モデルを作製。
腎虚血…右腎摘出後、左腎血管を４５分間クランプすることで作製。
使用薬剤…Ｄ−アロース、Ｄ−プシコース（ともに４００ｍｇ／ｋｇ）腎虚血３０分前に静脈内投与する。
測定項目…障害性因子であるｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ（ＣＩＮＣ）−１  ｍＲＮＡ（再灌流２時間後）の発現に及ぼす影響。
（３）結果（図２２）：ノーザンブロッティグの結果を図２２に示す。再灌流２時間後のＣＩＮＣ−１ｍＲＮＡの発現量はアロース、プシコースともに減少しているように思われる。
（４）考察：本実施例８では、たった１回の予備実験の結果であるので、今後回数を重ねて、必要濃度などの効果の検討を行う必要がある。ＣＩＮＣ−１ｍＲＮＡの発現量だけでなく、ＣＩＮＣ−１蛋白に及ぼす影響も検討しなければならないと考えている。腎虚血性障害に対する希少糖の有効性が立証できれば、ショック、腎虚血を伴う手術時など新しい治療薬および輸液製剤の開発として有望であると考えている。
実施例９
（希少糖の脳虚血保護作用の研究）
（１）目的：一過性の脳虚血に伴い、海馬の神経細胞が死にいたることが知られている。この原因は明らかではないが、いくつかの可能性がある仮説が提案されており、現在、多くの研究者がこれらの仮説の証明を行っている。我々もこのモデルを用いて研究を行っているが、Ｄ−アロースの前投与によりこの細胞死が抑制されることを明らかにした。さらに、より詳細な投与量の決定や、作用機序の一部を明らかにした。
（２）方法：砂ネズミを用い、５分間の両側性の総頸動脈を閉塞する。１週間後にサクリファイスし、常法に従い、切片作成を行い、ヘマトキシリンエオジン染色を行う。顕微鏡下で海馬の神経細胞数をカウントし、残存率を計測した。正常コントロール群、虚血を与えたのみの群、２００ｍｇ／ｋｇのＤ−アロースまたはＤ−プシコースを虚血前に投与した群で実験を行った。虚血にともない細胞外に放出される大量のグルタミン酸が神経細胞に毒性を有することが知られている。これを明らかにするため、脳定位固定装置に砂ネズミを固定後、海馬にグルタミン酸オキシダーゼを溶解した液をマイクロダイアリシス用のプローブに還流し、海馬の神経細胞外のグルタミン酸濃度をリアルタイムで測定した。またＤ−アロースや２−デオキシグルコースの前投与を行い、虚血に伴うグルコースの代謝とＤ−アロースの作用機序の関連を明らかにした。
（３）結果：Ｄ−アロースは虚血に伴う神経細胞死を有意に抑制した。しかしＤ−プシコースではこの抑制効果は認められなかった（図２３）。虚血に伴い、海馬ではグルタミン酸は二相性に分泌される（図２４）。最初のピークは虚血に伴うもので、第二のピークは虚血終了後の過還流時に伴うものである。この過還流は１時間ほど持続し、この過還流時に神経細胞が障害を受けると考えられている。Ｄ−アロースの前投与により、１番目のピークは一部抑制されたが、その抑制は２５％程度であった。しかし２番目のピークはＤ−アロースの投与によって９０％前後に強く抑制された（図２４）。またこのような効果は非代謝性のＤ−グルコース関連物質である２−デオキシグルコース投与によっても同様の効果が観察された（図２５）。
（４）考察：Ｄ−グルコースは神経活動には必須のものであると同時に、過不足にともない細胞毒性をもたらすことはよく知られている。また虚血のような強いストレスが与えられ、かつ酸素の供給が断たれた場合は、強い細胞毒性を発揮する。おそらくこれは活性酸素の発生を伴う細胞障害であると考えられる。Ｄ−アロースはＤ−グルコース代謝に何らかの影響を与えて、神経細胞死を抑制するものと考えられる。これは非代謝性の２−デオキシグルコースの投与によっても同様な効果がもたらされたことから、証明された。一方、脳虚血におけるＤ−グルコース消費は神経細胞のみならず、星状グリア細胞でもおこっており、両者がＤ−グルコースを取り合うような可能性が示された。星状グリア細胞におけるＤ−グルコース消費は最終産物が、神経とは異なっており、嫌気的代謝系が働き、乳酸が放出されると報告されている。プレリミナリーデーターであるが、実際に虚血時における乳酸分泌が観察されていることから、Ｄ−アロースの作用部位の一部は星状グリア細胞ではないかと推測される。また、グルタミン酸放出の２番目のピークは活性酸素によってもたらされる可能性もある。
実施例１０
（ケトヘキソースによる動脈硬化増悪に関連するケモカインＭＣＰ−１の分泌抑制作用）
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を常法に従い培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）の条件下で細胞培養を行った。ＨＵＶＥＣｓを約７０％の濃度で９６穴培養ディッシュに分注し以下の実験に供した。
（実験１）
Ｄ−プシコース濃度を０ｍＭ、５．６ｍＭ、１１．２ｍＭにてＨＵＶＥＣｓの培養液に添加し、２４時間培養後、培養液中のＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ＆Ｄ）キットで測定し、結果を図２６に示した。
（実験２）
ＨＵＶＥＣｓに作用してＭＣＰ−１の分泌を刺激するサイトカイン、ＩＬ−１β（最大分泌刺激濃度１ｎｇ／ｍＬ）およびＴＮＦ−α（最大分泌刺激濃度１０ｎｇ／ｍＬ）で１時間ＨＵＶＥＣｓを前処理し、次にＤ−プシコースを０ｍＭ、５．６ｍＭ、１１．２ｍＭの濃度になるように添加し２４時間培養後の培養液中のＭＣＰ−１濃度をＥＬＩＳＡキットで測定し、結果を図２７に示した。図２６より、血管内皮細胞におけるＭＣＰ−１の基礎分泌に関して、Ｄ−プシコースは濃度依存的にＭＣＰ−１の分泌を抑制することが理解される。また、血管内皮細胞におけるＭＣＰ−１の分泌はサイトカイン（ＴＮＦ−α，ＩＬ−１β）によって刺激され、最大刺激濃度はそれぞれＩＬ−１βが最大分泌刺激濃度１ｎｇ／ｍＬであり、ＴＮＦ−αが最大分泌刺激濃度１０ｎｇ／ｍＬである。図２７より、血管内皮細胞をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激するとＭＣＰ−１が分泌され、その分泌は添加されたＤ−プシコースにより濃度依存的に抑制されることが理解される。
一般に、種々の血球成分に対する遊走活性を有するサイトカインであるケモカインの一つとしてのＭＣＰ−１は単球に対する遊走活性を有しており、生理的には炎症病巣における単球・マクロファージの集積に重要な役割を担っている。また、臨床的には動脈硬化巣の形成において血管内皮細胞の障害に引き続き、泡末細胞形成のための細胞成分の遊走に重要な役割を演じている。最近、動脈硬化巣の免疫染色で、動脈硬化病変におけるＭＣＰ−１の過剰発現が指摘されている。
以上の実験により、血管内皮細胞からのケモカインＭＣＰ−１の分泌が希少糖に属するケトヘキソースにより抑制されることが判明した。また動脈硬化巣におけるＭＣＰ−１の発現は種々のサイトカインにより刺激されており、特にＩＬ−１β，ＴＮＦ−αは重要な因子として位置付けられているが、以上の実験により、少なくともＩＬ−１βによるＭＣＰ−１の分泌刺激を希少糖に属するケトヘキソースが抑制することが示唆された。
ＭＣＰ−１は動脈硬化病変形成に重要な役割を演じることが指摘されており、希少糖に属するケトヘキソースのＭＣＰ−１分泌抑制効果は、動脈硬化の予防の観点からも重要であり、動脈硬化治療に有益な物質（例えば、動脈硬化治療物質や予防物質）への用途となり得ると考えられた。
これらの結果から、希少糖に属するケトヘキソースは、それ単独でＭＣＰ−１分泌を抑制する物質としての用途に利用できる。また、その誘導体や配糖体について検討すれば、ＭＣＰ−１分泌を抑制する物質ができる可能性が示唆される。またＭＣＰ−１は動脈硬化症のみならず、他の疾患発症に関与していることが指摘されている。例えば慢性関節リウマチにおける関節での炎症の惹起にＭＣＰ−１の関与が指摘されている。また喘息などの肺疾患においても単球の遊走および単球・マクロファージの活性化を介して疾患形成に関与している。このような局所の炎症、および単球・マクロファージが関与する疾患において希少糖に属するケトヘキソースは疾患の活動性を調節する可能性があり、幅広い疾患の治療薬としての応用が期待される。
実施例１１
（ケトヘキソースによるマイクログリア遊走抑制作用）
本実施例１１は、希少糖に属するケトヘキソースを有効成分とするマイクログリア遊走抑制物質に関する。生体内の臓器は長時間血流が途絶え虚血状態に陥ると壊死に陥る。虚血状態は、臓器の手術時に血流を一時遮断し術後に再開する場合に必ず生じる。また、臓器移植等で臓器を摘出保存し移植する場合も同様である。臓器保存法には、単純冷却法、持続灌流法、凍結法などがあるが現在もっとも臨床的に応用されているのは、単純冷却法である。これは臓器摘出時に保存液で灌流し、摘出後に同様の冷却した保存液に浸漬する方法である。現在ではＢｅｌｚｅｒらＷｉｓｃｏｎｓｉｎ大学外科のグループにより開発されたＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＵＷ）液により飛躍的に保存時間が延長され、主としてこれが使用されるようになった。しかし、保存終了後の血流再開時には、臓器に対して活性酸素、細胞外プロテアーゼおよびサイトカインなどによる障害性変化が出現する。これを抑制する目的で種々の薬剤（ｐｙｒａｚｏｌｏｔｒｉａｚｉｎ誘導体薬剤やｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）分泌誘発剤など）を灌流液に添加する方法が提唱されているが臨床的にまだ十分ではない（松本光司  Ｊ  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｈ第６８巻第３号、２００１年）。
そこで、本実施例１１では、希少糖に属するケトヘキソースのマイクログリア遊走抑制効果を確認することにより希少糖に属するケトヘキソースの脳臓器保存における有用性及び臨床応用への可能性について検討する。
以下の本実施例１１では、虚血で出現するマイクログリアの数に及ぼす希少糖に属するケトヘキソースの影響について検討する。これにより、希少糖に属するケトヘキソースはマイクログリアの出現数を減少させて脳臓器保存における有用性及び脳の治療への臨床的応用へ有効であることが示唆される。なお、希少糖に属するケトヘキソースとしては、Ｄ−プシコースを使用した。脳虚血モデルとして、体重７０ｇ程度の雄砂ネズミの両側総頚動脈を５分間結紮するモデルを使用する。このモデルでは、脳の海馬ＣＡ１領域の神経細胞が特異的に虚血性細胞死を起こす。
虚血を行わない対象（コントロール：Ｓｈａｍ）、虚血＋生理食塩水処理、虚血＋Ｄ−プシコース処理の各３例の各群に分けて比較検討した。
Ｄ−プシコース処理としては、生理食塩水中にＤ−プシコースを溶解させて濃度２００ｍｇ／ｍＬのＤ−プシコース溶液として、虚血前５分と虚血直後にそれぞれ、２００ｍｇ／ｋｇずつ、大腿静脈より虚血モデルに投与した。生理食塩水処理としては、Ｄ−プシコース溶液に代えて生理食塩水のみを同様に投与した。虚血後１週間して灌流固定し、２０μｍの凍結脳切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。
結果を図２８に示すが、炎症細胞であるマイクログリアの出現数がＤ−プシコースの添加により減少され、マクログリアの遊走がＤ−プシコースの投与によって確実に抑制されることが理解される。この虚血モデルでは、炎症細胞であるマイクログリアの遊走はＤ−プシコースの投与によって抑えられた。一過性脳虚血の際には、海馬の神経細胞死が起こり症状として記憶障害が伴うことが知られている。脳虚血による神経細胞死に関しては、薬剤や低体温療法などで一時的に虚血性神経細胞死を抑制した後でも、脳グリア細胞の一種であるマイクログリアがグルタミン酸や活性酸素を出して、治療後の慢性的な細胞死に関与するということが指摘されている。これにより、こうしたマイクログリアの動きを抑制することも、脳の虚血保護や移植時保存に関して有用であると言える。したがって、Ｄ−プシコースは薬剤や低体温療法など他の治療法との併用でその治療効果を上げることが期待される。
実施例１２
（ケトヘキソースの血糖降下に関連する作用）
本実施例１２は、希少糖に属するケトヘキソースを有効成分とする血糖降下作用物質に関する。糖尿病は耐糖能異常も含めると１０００万人を遙かに超える国民病となっている。糖尿病の本態はグルコースによる特異的なインスリン分泌不全であり、膵臓からのインスリン分泌が減弱した状態およびその作用不足のために発症する代謝疾患と考えられている。一般にインスリン分泌を促進する薬剤として、スルホニル尿素薬やフェニールアラニン誘導体などの糖尿病治療薬があるが、副作用などの種々の問題点がある。そこで本実施例１２では、希少糖に属するケトヘキソースの糖尿病における有用性および臨床応用の可能性について検討した。第一に希少糖に属するケトヘキソースによる膵β細胞からのインスリン分泌刺激能について、グルコースと比較して検討し、また、グルコースと希少糖に属するケトヘキソースの共存下における膵β細胞からのインスリン分泌動態について検討する。またグルコースは、食物が消化分解され腸から吸収されて供給されているので、グルコース吸収における希少糖に属するケトヘキソースの影響について腸管を用いて検討する。これにより、希少糖に属するケトヘキソースは、インスリンの分泌を促進する効果があり、特にグルコースと併用することにより加算的（追加的）にインスリンの分泌を促進させること、また、糖代謝に影響を及ぼさない希少糖に属するケトヘキソースがグルコースの吸収を抑制していることにより、希少糖に属するケトヘキソースの糖尿病の予防又は治療への有用性が示唆される。
インスリノーマ由来の膵β細胞株ＩＮＳ−１を常法に従い培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）の条件下で細胞培養を行った。ＩＮＳ−１細胞を約７０％の密度で９６穴培養ディッシュに分注し以下の実験に供した。希少糖に属するケトヘキソースとしては、Ｄ−プシコースを使用した。
（実験１）
培養液のグルコース濃度を２．８ｍＭ、５．６ｍＭ、１１．２ｍＭ、１６．７ｍＭにして２４時間培養後、培養液中のインスリン濃度をＥＬＩＳＡ（レビス  インスリンキット）で測定した。この結果、インスリノーマ由来の膵β細胞株ＩＮＳ−１細胞は培養液中のグルコース濃度に反応してインスリン分泌が刺激された。この分泌刺激はグルコース濃度１１．２ｍＭでプラトーに達した。
（実験２）
培養液のＤ−プシコース濃度を０ｍＭ、２．８ｍＭ、５．６ｍＭ、１１．２ｍＭ、１６．７ｍＭに変えた時の培養液中のインスリン濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定し結果を図２９に示した。この結果、膵β細胞株ＩＮＳ−１細胞を種々の濃度のＤ−プシコースで刺激すると、濃度依存的にインスリン分泌が認められた。この分泌刺激は、Ｄ−プシコース濃度１１．２ｍＭでプラトーに達した。
（実験３）
グルコースに基づくインスリン分泌がプラトーに達するグルコース濃度を１１．２ｍＭに固定し、更にＤ−プシコースを加えてプシコース濃度を２．８ｍＭ、５．６ｍＭ、１１．２ｍＭ、１６．７ｍＭと変化させて２４時間培養した。膵β細胞株ＩＮＳ−１細胞からのインスリン分泌の状況を検討し結果を図２９に併せて示した。この結果、グルコースに基づくインスリン分泌の最大刺激濃度に保ったにもかかわらず、Ｄ−プシコースの濃度を追加的に増加させると、培養液中へのインスリンの分泌がさらに加算的に刺激されたことが確認された。
（実験４）
グルコースの吸収に与えるＤ−プシコースの影響を調べるためにラットの腸管を用いてＤ−プシコースの吸収に及ぼす影響を解析した。グルコースの吸収はグルコースオキシダーゼ法による定量法により腸管粘膜を隔てて外部と内部の濃度を測定することで解析する。Ｄ−プシコースがグルコースと併存することでグルコースの吸収がどのように変化するかを測定する。またＤ−プシコースを長期間投与したラットの腸管を用いて、同様に糖の吸収系がどのように変化するかを解析する。
グルコースを含む緩衝液中に、図３０に示すように、ラット反転腸管を浸漬し、一定時間後に漿膜側の溶液をサンプリングしグルコース濃度を測定する。種々の濃度のＤ−プシコースを添加することによって、粘膜側から漿膜側へのグルコースの輸送に与えるＤ−プシコースの影響について検討し、結果を図３１に示した。
この結果、ラット反転腸管にグルコースと同濃度のＤ−プシコースを加えておくと、漿膜側のグルコース濃度の上昇が有意に抑制された。Ｄ−プシコースの添加が、グルコースの輸送系に影響を与えている可能性が示唆された。以上の結果より、希少糖に属するケトヘキソースは、膵β細胞からのインスリン分泌を刺激することが判明した。また最大のインスリン分泌刺激が得られるグルコース濃度下の細胞において、希少糖に属するケトヘキソースを追加的に添加することにより、さらなるインスリン分泌が観察された。一般に、糖尿病の本態はグルコースによる特異的なインスリン分泌不全であるが、グルコースに基づくインスリン分泌が不全である場合にも希少糖に属するケトヘキソースの作用により有効にインスリン分泌を促進させることができると期待される。これにより、希少糖に属するケトヘキソースの膵β細胞からのインスリン分泌刺激作用および高血糖状態における希少糖に属するケトヘキソースのインスリン分泌増強作用が判明され、希少糖に属するケトヘキソースは、今までにない新しい作用機序を有する物質として期待される。また、臨床的に高血糖が認められる糖尿病患者において希少糖に属するケトヘキソースがインスリン分泌を促進し、血糖値を改善することが期待される。また経腸管的に投与された希少糖に属するケトヘキソースがグルコースの吸収を抑制すること及び希少糖に属するケトヘキソースが糖代謝に影響を及ぼさないことは、糖尿病における食後過血糖を抑制する可能性があり、糖尿病における予防又は治療に有益な物質として期待される。さらに、希少糖に属するケトヘキソースには糖尿病およびその合併症とも関連が大きい動脈硬化の予防効果も認められ、糖尿病の主死因は動脈硬化性疾患であるので、動脈硬化抑制作用もある希少糖に属するケトヘキソースは血糖値の改善および動脈硬化症の予防という画期的な糖尿病治療薬として期待される。また、希少糖に属するケトヘキソースは、これらの治療効果や抗肥満等が期待される健康補助食品となり得ると期待される。
実施例１３
（希少糖投与によるラット血糖値に対する影響）
（１）目的：希少糖、特にＤ−プシコースの投与によってＤ−フラクトースの長期大量投与負荷で発生する高インスリン血症が抑制されることが報告されている。今回我々は希少糖の投与によって正常ラットの血糖値がどのように変動するかを調べた。
（２）方法：１）希少糖投与：ＳＤラットオス（体重３００ｇ前後）を２０−２４時間絶食後に実験に用いた。ラットにネンブタール（５８ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）を腹腔内投与し、麻酔下にて頚部を切開して経静脈にシリコンチューブを留置した。このチューブに１ｍｌシリンジを接続し、希少糖を投与した。
２）採血：頚静脈に挿入したシリコンチューブから１ｍｌシリンジを用いて採血を行った。採血は希少糖投与直前、５，１０，１５，２０，２５，３０，６０，１２０，１８０，２４０分後に行った。
３）血糖測定：採血した血液中の血糖値はアントセンスＩＩ（バイエルメディカル）によって決定した。
（３）結果：
１）麻酔下生理食塩水投与による血糖への影響（図３２）：まず、３匹のラットに生理食塩水（０．７ｍｌ）のみを静注して血糖値に対する麻酔等の影響を調べた。その結果、生理食塩水のみの投与では血糖値の大きな変化はみられなかった。
２）麻酔下Ｄ−グルコース投与による血糖値への影響（図３３）：Ｄ−グルコース（２００ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）を頚静脈より静注して注入前後の血糖値を測定した（Ｎ＝２）。血糖値はＤ−グルコース投与によって一過性に上昇し、６０分程度で正常値に近づいた。
３）Ｄ−プシコース投与による血糖値への影響（図３４）：ラットに麻酔下でＰｓｉｃｏｓｅ（２００ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）を静脈内投与して血糖値を測定した（Ｎ＝４）。そのうち２匹では血糖値が希少糖投与３０−６０分で減少し、徐々に回復をしたが、他の２匹では血糖低下ののちに初期値より上昇またはほとんど変化しなかった。
（４）考察：本実施例１３が用いた正常ラット麻酔下における実験系にてネンブタール麻酔や生理食塩水静脈内投与が血糖値やＤ−グルコース負荷に対して影響しないことが確認された。本実施例１３の実験では、ラットのうち半数はＤ−プシコースを投与することによって血糖値が投与後３０−６０分で低下し、その後ゆっくりとした回復が見られた。残りのラットは早期に血糖低下を起こしその後上昇するか、または徐々に血糖低下を示した。これらのことから個体差はあるが正常ラットでは希少糖（Ｄ−プシコース）により、軽度の血糖低下が起こることがわかった。今後、実験動物数を増やしてデータを解析する必要がある。また、高血糖ラットにおいての作用を検討する必要性がある。同時に行った、Ｄ−アロースの実験では、血糖低下は認められなかった。
実施例１４
（ケトースの高血糖状態改善効果）
（１）目的：糖尿病は耐糖能異常も含めると１０００千万人を遥かにこえる国民病となっている。糖尿病の本態はグルコースによる特異的なインスリン分泌不全である。そこで今回我々は、希少糖、特にケトースであるＤ−プシコースの糖尿病における有用性および臨床応用の可能性について検討した。現在までに、ケトースによる膵β細胞からのインスリン分泌刺激能について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討してきた。今回の検討は、無麻酔無拘束ラットをもちいてＤ−プシコースのインスリン分泌能および糖代謝に与える影響について検討をおこなう。本研究により、ケトースの膵β細胞からのインスリン分泌刺激作用および高血糖状態におけるケトースのインスリン分泌増強作用をｉｎ  ｖｉｖｏで検証するものである。以上のことより今後ケトースの糖尿病における予防／治療薬としての可能性を検討する目的である。
（２）方法：１）経静脈ブドウ糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）…８週令ＳＤラット雄を使用して頚静脈よりカテーテルを挿入してＩＶＧＴＴを施行する。希少糖３匹・グルコース３匹とする。
プロトコール１
０．５ｇ／ｋｇ（０．５ｇ／１０００ｇ＝５００ｍｇ／１０００ｇ＝０．５ｍｇ／ｇ）でＩＶする。
０．５ｇ／ｍｌ（０．５ｇ／１０００ｕｌ＝５００ｍｇ／１０００ｕｌ＝０．５ｍｇ／ｕｌ）の濃度の希少糖およびグルコースの溶液を調整する。溶液は２ｍｌ作成する。
２００ｇのラットであれば、２００ｕｌを静脈注射（ＩＶ）する。
２５０ｇであれば２５０ｕｌとなる。
ＩＶのあと生理食塩本を３００ｕｌ注入する。
血液サンプルは１５０ｕｌ採血する。
前処置として１６時間絶食とする。飲水は可。
採血時間は０、５、１０，１５，２０，２５，３０，４５，６０分の９ポイントとする。
２）高血糖時におけるプシコースの影響
８週令ＳＤラット雄を使用して頚静脈よりカテーテルを挿入して５０％グルコースを２０分間隔で注入し高血糖状態を作成し、プシコースおよびデオキシグルコースを使用しＩＶＧＴＴを施行する。希少糖１匹・デオキシグルコース１匹とする。
プロトコール２
０．５ｇ／ｋｇ（０．５ｇ／１０００ｇ＝５００ｍｇ／１０００ｇ＝０．５ｍｇ／ｇ）でＩＶする。
０．５ｇ／ｍｌ（０．５ｇ／１０００ｕｌ＝５００ｍｇ／１０００ｕｌ＝０．５ｍｇ／ｕｌ）の濃度の希少糖およびデオキシグルコースの溶液を調整する。溶液は２ｍｌ作成する。
２００ｇのラットであれば、２００ｕｌをＩＶする。
２５０ｇであれば２５０ｕｌとなる。
ＩＶのあと生理食塩水を３００ｕｌ注入する。
血液サンプルは１５０ｕｌ採血する。
採血時間は０、５、１０，１５，２０，２５，３０，４５，６０分の９ポイントとする。
（３）結果：ＩＶＧＴＴ…コントロールとしてブドウ糖を使用した。図３５に示すように、ブドウ糖を負荷すると血糖値の上昇をみとめた。プシコースを静脈内に投与しても血糖値の上昇を認めなかった。またＩＶＧＴＴに経時的に血中ｉｎｓｕｌｉｎを測定すると、ブドウ糖負荷群では血糖値の上昇に一致してｉｎｓｕｌｉｎの上昇を認めたが、プシコース投与群においては血糖値が上昇しなかったためかｉｎｓｕｌｉｎの分泌にも影響を与えなかった（図３６）。
正常の血糖レベルではプシコースはインスリン分泌を促進しないことが示唆されたので、次にブドウ糖を連続して投与し高血糖状態を作成したラットにおいてプシコースの影響を検討した。コントロールとしてデオキシグルコースを使用した。コントロールに比較して、プシコース投与群においては血糖値に低下が速やかであった。また経時的に測定したｉｎｓｕｌｉｎ濃度はコントロールに比較して分泌が増加していた（図３７）。
（４）考察：本実施例１４の検討においてｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＤ−プシコースは糖代謝に影響を及ぼさずに膵β細胞からのインスリン分泌を刺激することが判明した。またインスリン分泌作用に関しては、高血糖時にインスリン分泌作用を有するが、通常の血糖においてはインスリン分泌促進作用がほとんど認められず、低血糖の誘発は認められなかった。糖尿病の本態はグルコースによる特異的なインスリン分泌不全であるが、希少糖は、そのような状態においても有効にインスリン分泌を促進させることより、今までにない新しい作用機序を有する物質として期待される。臨床的に高血糖が認められる糖尿病患者においてＤ−プシコースがインスリン分泌を促進し、血糖値の改善が得られる可能性があり、糖尿病治療に有益な医薬品または健康補助食品となりえると考えられる。
実施例１５
（希少糖の蛋白質の糖化に対する効果）
（１）目的：糖尿病における持続的高血糖状態は，生体内での蛋白質の非酵素的糖付加反応（糖化）を促進する。この反応はアマドリ産物など（前期生成物）を経由して，やがて後期反応生成物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＡＧＥ）を形成し、酸化ストレスを増大させ、糖尿病における網膜症、腎障害などの血管合併症を進展させる。本実施例１５では，希少糖に高血糖下における糖化、酸化ストレス抑制効果があるか否かを検討する。
（２）方法：グリコアルブミン（ＧＡ）測定試薬（オリエンタル酵母社製）プロテアーゼＫによりアルブミンをアミノ酸断片にした後，ケトアミンオキシダーゼによりグリコリジンを測定する（図３８）。各種希少糖によるヒトアルブミンのグリケーションを検討した。試料の調整は，ＰＢＳにヒトアルブミン純品を３ｇ／ｄｌにして，それに各種希少糖をそれぞれ終濃度５５．５ｍＭになるように溶解した。調整した溶液を０．２５μｍのフィルターでろ過滅菌し，３７℃で７日間インキュベーションした。途中，正確に２４時間おきにＧＡ濃度（グリコリジン濃度）を測定した。さらに、アルブミン（終濃度３ｇ／ｄｌ）、グルコース（終濃度５５．５ｍＭ）溶液に各希少糖を終濃度５５．５ｍＭになるように添加し、同様に実験した。
（３）結果：１）最も糖化反応が顕著だったのはＤ−アロースであり，その糖化速度は約９０μｍｏｌ／ｄａｙであった。次に糖化反応が進んだのはＤ−グルコースとＤ−マンノースであり，約５０μｍｏｌ／ｄａｙであった。他の希少糖（Ｄ−プシコースなど）ではアルブミンのグリケーションは見られなかった（図３９）。
２）グルコース共存下での希少糖の糖化作用…次にアルブミン（終濃度３ｇ／ｄｌ）、Ｄ−グルコース（終濃度５５．５ｍＭ）溶液に各希少糖を終濃度５５．５ｍＭになるように添加し、グリコアルブミン濃度を測定した。その結果、Ｄ−アロースはＤ−グルコース存在下でも急速な糖化反応が見られた。その糖化速度は実験１の結果通りで、約１４０μｍｏｌ／ｄａｙ（Ｄ−グルコース＋Ｄ−アロースの糖化速度）であった。またＤ−マンノースでは約１００μｍｏｌ／ｄａｙであり，グルコースの糖化速度をプラスした糖化速度が得られた。一方、Ｄ−プシコースなどの各希少糖ではグリケーションの抑制効果は認められなかった（図４０）。
（４）考察：生体内ではタンパク質とグルコースなとが非酵素的に結合（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が起こっている。蛋白質のアミノ基とアルデヒド基の反応が初期反応において重要である。今回の検討結果でアルブミンのグリケーションが認められた糖類（Ｄ−アロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース）はいずれもアルドース類である。アルドースは糖化反応のみならず、アルドース還元酵素によるポリオール代謝への影響も考えられる。臨床検査では、糖尿病患者の血糖コントロールの指標としてＨｂＡ１ｃやグリコアルブミンなどが有用とされている。いずれも蛋白質のグルコースによる糖化反応生成物を測定している。糖化部位は、ヘモグロビンのグロビンβ鎖Ｎ末端のバリン、アルブミンの１９９，２８１，４３９，５２５番目のリジンと言われている。今回希少糖の糖化反応の検討に使用したアルブミンはヘモグロビンに比べて糖化部位が多いので、短い期間の実験でデータが得られた。
ヘモグロビンによる同様の検討を行うには問題点がある。糖化速度が遅いので、インキュベーション中に蛋白の変性が進みすぎてうまく測定できない。現在、市販ヘモグロビン粉末にて検討中である。
実施例１５の実験データで分かったようにＤ−プシコースはアルブミンの糖化を促進しない。他のＤ−フラクトースなどの糖も糖化は起こさなかったが、それらの糖は体内に代謝経路をもっており、多量に存在すると結果としてアルドースなどが増加することになる。今後の実験でＤ−プシコースのヒト体内代謝をあきらかにするべきだが、少なくともＤ−プシコースは多量に服用しても糖化反応などがもたらす合併症の進展を促進しない可能性がある。加えて、Ｄ−プシコースのインスリン分泌作用があることから有用な糖尿病患者への利用価値があると考えられる。一方、今回のアルブミンを使用した実験では希少糖に糖化抑制作用は認められなかった。しかし、今後さらに希少糖の濃度を変更して検討し、さらに酸化抑制効果を検討していきたい。
以上、本発明を実施例により説明した。ここで希少糖は常用の糖類とは反対に身体により同化されないか又はたとえ同化されてもその程度は僅かであること、また、希少糖の脂質代謝に及ぼす影響から体脂肪蓄積の抑制効果が期待されていることにより、希少糖は、本発明の開示により各種の医薬品への期待に加えて、機能性食品としての付加価値を高くすることが期待される。
産業上の利用可能性
本発明に従えば、希少糖、特にＤ−アロース、Ｄ−プシコースが細胞に取り込まれ又は作用されて当該細胞を変化させるので、希少糖が生理活性作用を有する物質として有効に利用されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明についてのＤ−アロースが、肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）に対する増殖抑制効果があることを示す図である。図２は、本発明についてのＤ−アロースが、子宮癌細胞（Ｈｅｌａ）に対する増殖抑制効果があることを示す図である。図３は、本発明についてのＤ−アロースが、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）に対する増殖抑制効果があることを示す図である。図４は、本発明についてのＤ−アロースが、皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）に対する増殖抑制効果があることを示す図である。図５は、本発明についてのＤ−アロースが、癌細胞増殖抑制に対する濃度依存性を有することを示す図である。
図６は、実施例３の希少糖によるＨＬ６０の増殖抑制効果を示す図面である。図７は、実施例３の希少糖によるＤａｕｄｉ細胞の増殖抑制効果を示す図面である。図８は、実施例３の希少糖によるＴＨＰ１の増殖抑制効果を示す図面である。図９は、実施例３の希少糖によるＫＳ１の増殖抑制効果を示す図面である。図１０は、実施例３の希少糖によるＭＴ２の増殖抑制効果を示す図面である。図１１は、実施例３の希少糖によるＫＧ１の増殖抑制効果を示す図面である。
図１２は、フローサイトメトリーによるＤ−アロースの細胞周期への影響を示す図面である。図１３は、白血球からの活性酸素産生の経時変化を示す図である。図１４は、本発明についてのＤ−アロースが、白血球の活性酸素の産生の抑制に効果があることを示す図である。図１５は、各糖が、白血球の活性酸素産生が始まった後での活性酸素抑制については効果がないことを示す図である。
図１６は、実施例９の本発明についてのＤ−アロースが、活性酸素産生抑制に対する濃度依存性を有することを示す図である。図１７は、網膜虚血・再環流障害に対するＤ−アロースの効果を示す図面である。図１８は、実施例７のＤ−アロースの皮弁虚血再環流障害軽減効果に関し、生着面積（％）の全データを示す表である。図１９は、実施例７のＤ−アロースの皮弁虚血再環流障害軽減効果に関し、分散分析（一元配置）を示す表である。図２０は、実施例７のＤ−アロースの皮弁虚血再環流障害軽減効果に関し、平均値と標準偏差を示す図である。図２１は、実施例７のＤ−アロースの皮弁虚血再環流障害軽減効果に関し、多重比較検定の結果を示す表である。
図２２は、実施例８のラット腎虚血再環流障害に及ぼす希少糖の効果に関し、ノーザンブロッティングの結果を示す図面に代わる写真である。図はＣＩＮＣ−１のｍＲＮＡの発現量を示すものである。標準としてＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを取り、これがほぼ一定であることを確認した（写真上）。その上で、ＣＩＮＣ−１のｍＲＮＡの発現量を比較した。左から、虚血前、虚血後、Ｄ−アロース投与後虚血、Ｄ−プシコース投与後虚血での腎臓を示す。ＣＩＮＣ−１  ｍＲＮＡは虚血前には全く発現していないが、虚血により発現し、Ｄ−アロースとＤ−プシコース投与により発現量が抑えられていた。
図２３は、実施例９の希少糖による海馬神経細胞死の抑制効果を示す図面である。図２４は、実施例９の脳虚血に伴う神経細胞外へのグルタミン酸の放出、およびアロースによる放出抑制効果を示す図面である。図２５は、実施例９の脳虚血に伴う神経細胞外へのグルタミン酸の放出、および２−デオキシグルコースによる放出抑制効果を示す図面である。
図２６は、実施例１０で、Ｄ−プシコースがＭＣＰ−１の分泌抑制効果があることを示す図である。図２７は、実施例１０で、Ｄ−プシコースがＭＣＰ−１の分泌を刺激するサイトカインに作用してＭＣＰ−１の分泌を抑制することを示す図である。
図２８は、実施例１１で、Ｄ−プシコースがマイクログリアの出現数に与える影響を示す図である。
図２９は、実施例１２で、Ｄ−プシコースがインスリンの分泌刺激効果に与える影響を示す図である。
図３０は、実施例１２で使用される反転腸管の実験例を説明する図である。図３１は、実施例１２で、Ｄ−プシコースが、ブドウ糖の吸収に与える影響を示す図である。図３２は、実施例１２で、希少糖投与によるラット血糖値に対する影響に関し、麻酔下生理食塩水投与による血糖への影響を示す図面である。
図３３は、実施例１３の希少糖投与によるラット血糖値に対する影響に関し、麻酔下Ｄ−グルコース投与による血糖への影響を示す図面である。図３４は、実施例１３の希少糖投与によるラット血糖値に対する影響に関し、Ｄ−プシコース投与による血糖への影響を示す図面である。
図３５は、実施例１４のケトースの高血糖状態改善効果に関し、ＩＶＧＴＴでの血中Ｄ−グルコース濃度への影響を示す図である。
図３６は、実施例１５のケトースの高血糖状態改善効果に関し、インスリンの分泌動態を示す図である。図３７は、実施例１５のケトースの高血糖状態改善効果に関し、高血糖時におけるＤ−プシコースの作用を示す図である。図３８は、実施例１５の希少糖に高血糖下における糖化抑制効果があるか否かの検討に関し、ＧＡ測定原理を説明する図である。図３９は、実施例１５の希少糖に高血糖下における糖化抑制効果があるか否かの検討に関し、希少糖によるグリケーションの検討を示す図である。図４０は、実施例１５の希少糖に高血糖下における糖化抑制効果があるか否かの検討に関し、グルコース共存下での希少糖によるグリケーションの検討を示す図である。
図４１は、イズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）連携図である。図４２は、図４１の下段のイズモリングＣ６の説明図である。図４３は、図４１の中断のイズモリングＣ５の説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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