(57)【要約】下記性質を有するグルタミン酸受容体タンパク質とこれに結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを探索する：（Ａ）タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有する、（Ｂ）タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも約３１６又は３２７アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。
2003035873.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記性質を有するグルタミン酸受容体タンパク質：
（Ａ）タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有する、
（Ｂ）タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも約３１６又は３２７アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。
【請求項２】
ラットの小腸及び大腸において発現していることを特徴とする請求項１記載のグルタミン酸受容体タンパク質。
【請求項３】
配列番号７に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号１２〜５８４で表されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のグルタミン酸受容体タンパク質。
【請求項４】
１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含み、かつ、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得る請求項３記載のグルタミン酸受容体タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質をコードし、かつ、タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質を発現しないＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞を培地で培養し、同グルタミン酸受容体タンパク質を生成させることを特徴とする、グルタミン酸受容体タンパク質又はそれを保持する細胞の製造法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストの探索方法。
【請求項１０】
前記グルタミン酸受容体タンパク質を、請求項６記載の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記グルタミン酸受容体タンパク質を、請求項６記載の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
枝術分野
本発明は、新規グルタミン酸受容体とその利用に関し、詳しくは、グルタミン酸受容体とそれをコードするＤＮＡ、ならびにそれらを利用して同受容体に結合するリガンドをスクリーニングする方法、及び受容体結合試験等に関する。
背景技術
グルタミン酸は、中枢神経系において主要な興奮性神経伝達物質であり、その制御異常は、記憶障害、虚血性脳障害、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン氏病、及びハンチントン舞踏病等の進行性脳障害などの病態形成に寄与していると広く考えられている（Ｍｅｌｄｒｕｍ，Ｂ．Ｓ，，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９４  Ｎｏｖ；４４（１１  Ｓｕｐｐｌ  ８）：Ｓ１４−２３；Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００１，Ｊｕｎ  １５；６９（４）：３６９−８１）。そのため、グルタミン酸受容体に関する多くの研究が脳神経系を通じてこれまでなされ、多くの受容体（イオン型受容体３種類、代謝型受容体８種類）が中枢神経系で発見され、上記疾患に対する治療薬の開発を目指して、今日もその受容体特異的な作用薬の開発が精力的になされている（詳しくはＢａｒｎａｒｄ，Ｅ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９７，Ｍａｙ；１８（５）：１４１−８；Ｓｃｈｏｅｐｐ，Ｄ．Ｄ．，Ｃｏｎｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１９９３  Ｊａｎ；１４（１）：１３−２０を参照）。
一方、中枢神経系以外でのグルタミン酸受容体に関する研究は少ない。グルタミン酸は、体内のエネルギー源、不要となったアンモニアのトラップ源としての役割も兼ねており、血漿中に常に数十マイクロモルオーダー以上存在することが知られている。中枢神経系においては、血液脳関門の存在により、細胞外グルタミン酸濃度はナノモル以下である。そのため、上記中枢神経系で発見されたグルタミン酸受容体のグルタミン酸に対する親和性は、ナノモルオーダーからマイクロモルオーダーであり、グルタミン酸が神経終末より放出された時にのみ、作用することができる。尚且つ、グルタミン酸受容体は不活性化あるいはタキフィラキシーを起こしやすいため、中枢神経系においてはグリア細胞が特異的トランスポーターを介して常にグルタミン酸を取りこんで、細胞外濃度を下げている。一方、血液脳関門で守られない中枢神経系以外の場所では、仮にそのようなグルタミン酸受容体が発現していても、常にグルタミン酸受容体が刺激されている状態となり、実際には不活化されており機能していないものと考えられていた。
しかし、２００１年、Ｃｈａｕｄｈａｒｉ，Ｎ．，Ｌａｎｄｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｒｏｐｅｒ，Ｓ．Ｄ．らは、ラット味蕾細胞から、うま味受容体として低親和性グルタミン酸受容体を発見した（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００，Ｆｅｂ；３（２）：１１３−９）。このうま味受容体は、ラット脳型代謝型グルタミン酸受容体のサブタイプであるタイプ４型（ｍＧｌｕＲ４）（Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９２，Ｊａｎ；８（１）：１６９−７９；Ｆｌｏｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆｅｂ；３４（２）：１４９−５５）とホスト遺伝子を同じとし、スプライシング変異により、脳型ｍＧｌｕＲ４の細胞外ドメインを一部欠損した味蕾型ｍＧｌｕＲ４であった。
今日我々は、末梢性グルタミン酸受容体の生理機能を示唆する幾つかの知見を有している（Ｂｅｒｋ，Ｍ．，Ｐｌｅｉｎ，Ｈ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００１，Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２４（３）：１２９−３２；Ｋａｒｉｍ，Ｆ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１，Ｊｕｎ  １；２１（１１）：３７７１−９；Ｂｅｒｋ，Ｍ．，Ｐｌｅｉｎ，Ｈ．，Ｂｅｌｓｈａｍ，Ｂ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０００；６６（２５）：２４２７−３２；Ｃａｒｌｔｏｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９９，Ｆｅｂ  ２７；８２０（１−２）：６３−７０；Ｈａｘｈｉｕ．Ｍ．Ａ．，Ｅｒｏｋｗｕ，Ｂ．，Ｄｒｅｓｈａｊ，Ｉ．Ａ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．１９９７，Ｄｅｃ  １１；６７（３）：１９２−９；Ｉｎａｇａｋｉ，Ｎ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５，Ｍａｙ；９（８）：６８６−９１；Ｅｒｄｏ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９１，Ｎｏｖ；１２（１１）：４２６−９；Ａａｓ，Ｐ．，Ｔａｎｓｏ，Ｒ．，Ｆｏｎｎｕｍ，Ｆ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８９，Ｍａｙ  ２；１６４（１）：９３−１０２；Ｓａｉｄ，Ｓ．Ｉ．，Ｄｅｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１，Ｊｕｌ；２２（７）：３４４−５；Ｓｋｅｒｒｙ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｅｎｅｖｅｒ，Ｐ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１，Ａｐｒ；２２（４）：１７４−８１）。
ところで、ヒトを含めた哺乳動物が正常に成長（ｇｒｏｗｔｈ）し、正常な生活（健康）を維持するためには、必要な時期に必要な量の栄養素を経口より摂取し、不必要なものは排泄する必要がある。それを実際に行っているのが、口腔、胃、小腸、大腸からなる一本の管である消化管であり、消化吸収プロセスは腸管内在神経叢と外在脳神経系により管理されている。必要な栄養素の摂取判断は、意識に上る経路（味覚）と、意識に上らない自律的な経路（内臓感覚）の脳内における統合により行われる。塩味（ナトリウム、カリウムなど）はミネラルのマーカーとして体液浸透圧の保持等に、甘味（グルコース）は炭水化物のマーカーとしてエネルギー補給に、うま味（グルタミン酸ナトリウム）はタンパク質源のマーカーとしてエネルギー・体蛋白補給、苦味は有害物質のマーカーとしての意味があると考えられている。即ち、味を頼りに、必要な栄養素は摂取される。そして、必要量を十分摂取したかどうかは、胃および小腸、及び肝臓−門脈系に存在する栄養素センサーを介して迷走神経求心路を活性化し、延髄孤束核へ入力され一連の脳内プロセスを得ることによって、満足感（ｓａｔｉｅｔｙ）として判断される（Ｂｒａｙ，Ｇ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．，２０００；５９：３７３−８４；Ｂｒａｙ，Ｇ．Ａ．，Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１９８９：７３：２９）。そして、迷走神経遠心路を通じて、消化吸収調節（消化酵素分泌、消化管運動など）が行われると考えられているが、その詳細なメカニズムは不明である。そして、最終的に満足感が得られると、摂食行動は終了する。万が一、生体とって有害なもの（毒物）を摂取した場合は、液性および神経性応答を介して、嘔吐、下痢により体外へ排出すると考えられているが、その場合も不明な点が多い。
一方、消化管における栄養素認識（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｅ）機構に関する生理学的検討は古くから行われており、消化管内には内容物を知覚するセンサーが存在すると想定されている（詳しくは、Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，１９８３；９：１９９−２０６；Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｌｕｃｃｈｉｎｉ，Ｓ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，１９９２；４１：１５−８を参照）。これら消化管センサーとしては、グルコースセンサー（Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）１９７８，２８２，４８５−５０６）、温度センサー（Ｅｌ  Ｏｕａｚｚａｎｉ，Ｔ．，Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９７９；１５；３４：４１９−３４）、浸透圧センサー（Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，１９８６；１６：１５９−７０）、ｐＨセンサー、アミノ酸センサー（Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９８５；６５：２１１−３７）、圧センサー（Ｂａｒｂｅｒ，Ｗ．Ｄ．，Ｂｕｒｋｓ，Ｔ．Ｆ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１９８７；１６：５２１−４）が挙げられる。
特に、グルタミン酸を認識するセンサーとしては、新島らが、主として胃、小腸を支配している迷走神経胃枝及び腹腔枝の神経活動を電気的に捉える手法を用いて、グルタミン酸の消化管内投与時に神経興奮が起こることを見出し、迷走神経終末にグルタミン酸認識機構が存在すると仮定し、グルタミン酸センサーとしてその存在を示唆した（Ｎｉｉｊｉｍａ，Ａ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，１９９１；４９：１０２５−８）。
発明の開示
上述のように、グルタミン酸受容体及び消化管センサーについて多くの研究がなされているが、今日まで、グルタミン酸センサーの実体は不明であり、研究の進展は見られていない。グルタミン酸センサーを含んだ消化管粘膜上における栄養素認識に必要な受容機構（受容体、トランスポーター等）が単離されていないことが、この分野の研究の進展を妨げている。本発明者らは、グルタミン酸消化管センサーの実体が解明されれば、下記に挙げる栄養素認識機構の調節を目的とした薬剤等の開発が可能であると考えた。
即ち、栄養素認識機構は、満足感（ｓａｔａｉｅｔｙ）あるいは飽きにも重要な役割を果たし、過食による体調不全、および偏食による摂取栄養素の偏りを是正する。この消化管における栄養素認識が正常に行われなくなると、当然ながら、消化吸収の全体のプロセスが乱れ、過食、偏食、食欲不振、消化不良、下痢、便秘等が引き起こされることが考えられる。より医学的には、心因性過食症、拒食症及び肥満症、胃酸分泌異常、消化管血流異常、消化酵素分泌異常等による消化性潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍）、ストレス性潰瘍、薬物性（ＮＳＡＩＤｓ等）急性潰瘍、虚血性潰瘍（虚血性大腸炎）、インシュリン分泌異常又は消化管ホルモン分泌異常による糖尿病、運動性機能異常による胃もたれ、むかつき、便秘、下痢、過敏性腸症候群などの要因として考えられる。
また、近年、肥満者の急増は社会現象化し、問題となっている。これらの人は基礎代謝が低下した人が多く、また過食傾向にあると言われ、これらの人の食べたいという欲求を如何にコントロールするかは社会的関心が非常に大きい。無理なダイエットを試みる人も多いが、多くの場合、失敗に終わっている。消化管における栄養素認識機構を是正し、食事による満足感を如何に正常に得るかは、これらの人にとっても非常に重要である。
本発明は、上記観点からなされたものであり、消化管グルタミン酸センサーの実体を明らかにし、それを利用した技術を提供することを課題とする。
本発明者らは、代謝型グルタミン酸受容体（４型）の細胞内ドメインを認識する抗体を用いた免疫組織学的手法により、消化管内における受容体分布を検討した。その結果、小腸・大腸粘膜層には代謝型グルタミン酸４型受容体（ＧｌｕＲ４）陽性細胞が存在することを見い出した。小腸・大腸では粘液産生細胞（杯細胞：ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）がｍＧｌｕＲ４陽性であった。そして、小腸・大腸サンプルから新規なグルタミン酸受容体と思われるｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。このグルタミン酸受容体は、これまで実態が不明であった、消化管グルタミン酸センサーである可能性が高く、本受容体ｃＤＮＡ、精製受容体及び本受容体発現細胞は、消化管グルタミン酸センサーの機能調節剤のスクリーニングに有用であると考えられる。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、その要旨は以下のとおりである。
（１）下記性質を有するグルタミン酸受容体タンパク質：
（Ａ）タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有する、
（Ｂ）タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも約３１６又は３２７アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。
（２）ラットの小腸及び大腸において発現していることを特徴とする（１）のグルタミン酸受容体タンパク質。
（３）配列番号７に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号１２〜５８４で表されるアミノ酸配列を有する（１）のグルタミン酸受容体タンパク質。
（４）１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含み、かつ、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得る（３）のグルタミン酸受容体タンパク質。
（５）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質をコードし、かつ、タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質を発現しないＤＮＡ。
（６）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞。
（７）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞を培地で培養し、同グルタミン酸受容体タンパク質を生成させ、前記細胞より前記グルタミン酸受容体タンパク質を採取することを特徴とする、グルタミン酸受容体タンパク質の製造法。
（８）請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索方法。
（９）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストの探索方法。
（１０）前記グルタミン酸受容体タンパク質を、（６）の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる（８）の方法。
（１１）前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する（１０）の方法。
（１２）前記グルタミン酸受容体タンパク質を、（６）の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる（９）の方法。
（１３）前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する（１２）の方法。
（１４）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質に特異的に結合する抗体。
（１５）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のグルタミン酸受容体タンパク質は、典型的には、配列表の配列番号７のアミノ酸配列においてアミノ酸番号１２〜５８４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。本タンパク質をコードするラットｃＤＮＡの塩基配列のオープンリーディング領域を配列番号６に示す。この配列の５’末端領域には、開始コドンの可能性のあるメチオニンコドンが２個（塩基番号１〜３、３４〜３６）見出された。Ｎ末端側のメチオニンコドンが開始コドンである可能性が高いが、２番目のメチオニンコドンが開始コドンである可能性もある。いずれにしても、配列番号６に示す塩基配列の上流に適当なプロモーターを連結し、適当な細胞で発現させれば、活性のあるグルタミン酸受容体を産生させることができる。
配列番号７のアミノ酸配列を、脳型代謝型グルタミン酸４型受容体（ｍＧｌｕＲ４）と比較したところ、Ｃ末端側（配列番号７中、アミノ酸番号１５〜５８４）は一致していたが、ｍＧｌｕＲ４に比べてＮ末端側は３００アミノ酸残基以上短かった。後述するように、本発明のグルタミン酸受容体タンパク質は、ｍＧｌｕＲ４と共通の遺伝子に由来するスプライシング変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であると考えられた。以下、本発明のグルタミン酸受容体タンパク質を、本明細書ではｍＧｌｕＲ４変異体と呼ぶことがある。
図１に、ｍＧｌｕＲ４及びｍＧｌｕＲ４変異体の構造を示す。ｍＧｌｕＲ４は、細胞内ドメインと、７つの膜貫通ドメインと、細胞外ドメインからなっている。ｍＧｌｕＲ４変異体も、ｍＧｌｕＲ４と細胞内ドメインと７つの膜貫通ドメインを有しており、ｍＧｌｕＲ４のそれらと同一の配列を有している。一方、細胞外ドメインは、ｍＧｌｕＲ４変異体は１番目のメチオニンコドンが開始コドンであるとすると３１６アミノ酸残基、２番目のメチオニンコドンが開始コドンであるとすると３２７アミノ酸残基、ｍＧｌｕＲ４よりも短い。
すなわち、本発明のｍＧｌｕＲ４変異体は、タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有し、タイプ４型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも約３１６又は３２７アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。
前記ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするｃＤＮＡ配列を、ｍＧｌｕＲ４  ｍＲＮＡ配列（Ｏ’Ｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１１：４１，１９９３）と比較したところ、これらは共通の遺伝子に由来することが示唆された。すなわち、ｍＧｌｕＲ４変異体の生成は、ｍＧｌｕＲ４遺伝子中の第２のエクソンが選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）により脱落し、フレームシフトが生じるため、第１エクソン中に終止コドンが出現し、さらにその下流に新たに開始コドンが生じた結果であると推定される。
本発明のｍＧｌｕＲ４変異体は、ラット由来のものでもよいし、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得るという性質を持つ限り、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウサギといった哺乳類や鳥類、魚類その他いかなる動物由来のｍＧｌｕＲ４変異体でもよい。ｍＧｌｕＲ４変異体を医薬組成物の成分として用いる場合には、哺乳類由来のものが好ましい。
本発明のｍＧｌｕＲ４変異体は、配列番号７に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号１２〜５８４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質に加えて、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得るという性質を持つ限り、配列番号７に示すアミノ酸配列において１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するものであってもよい。
ここで、「複数」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、配列番号７に示すアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上となるような数が挙げられる。より具体的には、２〜１１５個、好ましくは、２〜５８個、より好ましくは２〜３０個である。
尚、本発明のグルタミン酸受容体は、精製又は単離された形態であってもよいが、活性を必要とする場合は、適当な細胞で発現され、同細胞の膜に局在化した形態、又は、ｍＧｌｕＲ４変異体が発現した細胞から調製される膜画分に含まれる形態であることが好ましい。したがって、本発明のグルタミン酸受容体には、このようなｍＧｌｕＲ４変異体を発現している細胞又は同細胞から調製された膜画分も含まれる。
ｍＧｌｕＲ４変異体は、例えば、ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡを適当な宿主細胞に導入し、発現させることによって取得することができる。前記ＤＮＡとしては、マウス等の哺乳類細胞の染色体から単離したｍＧｌｕＲ４変異体をコードする遺伝子又はｃＤＮＡが挙げられる。尚、染色体遺伝子を用いる場合は、ｍＧｌｕＲ４変異体を生成させるように、転写後のスプライシング等のプロセスを調節する必要があると考えられるため、ｃＤＮＡを用いることが好ましい。
ｍＧｌｕＲ４変異体ｃＤＮＡは、ラット等の哺乳動物の小腸又は大腸から調製したＲＮＡを鋳型とし、例えば配列番号１〜５に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ｍＧｌｕＲ４変異体ｃＤＮＡを増幅することによって、クローニングすることができる。また、本発明により、ｍＧｌｕＲ４変異体の構造、特にＮ末端領域の特徴的な構造が明らかになったので、それらの構造に基づいて、ｍＧｌｕＲ４変異体ｃＤＮＡのクローニング及び同定は容易に行うことができる。こうして得られるｍＧｌｕＲ４変異体ｃＤＮＡのオープンリーディング領域塩基配列が、配列番号６に示した配列である。
ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡとしては、配列番号６に示す塩基配列以外にも、この塩基配列を有するＤＮＡ又は同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ましくは７５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡを導入する細胞としては、ｍＧｌｕＲ４変異体の活性を必要とする場合は、動物細胞、昆虫細胞又は酵母が好ましく、動物細胞が特に好ましい。例えば、ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを導入し、一時的な機能発現が可能と考えられる細胞として、アフリカツメガエル卵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞、ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）細胞、Ｓｆ−９  ｉｎｓｅｃｔ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＯＣＡ−２細胞等が挙げられる。また、ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込み、ｍＧｌｕＲ４変異体を永久的に発現させる場合には、上記の細胞のうち、アフリカツメガエル卵母細胞以外の細胞が挙げられる。
一方、ｍＧｌｕＲ４変異体を、ｍＧｌｕＲ４変異体に特異的に結合する抗体を作製するための免疫源として用いる場合のように、生理活性を必要としない場合には、ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡを導入する細胞は、ｍＧｌｕＲ４変異体を活性のある形態で発現しない細胞であってもよい。そのような細胞としては、エシェリヒア・コリをはじめとする異種蛋白質生産に通常用いられている微生物細胞を用いることができる。
ｍＧｌｕＲ４変異体を宿主細胞中で産生させるためには、宿主細胞に適したプロモーターおよびエンハンサー等の発現調節配列に、ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡを連結する。また、ｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡは、必要に応じて、プロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含んでいてもよい。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。
細胞へのＤＮＡの導入等の操作に必要な技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）等に記載されている。
上記のようにして得られるｍＧｌｕＲ４変異体をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞を培地で培養し、ｍＧｌｕＲ４変異体を生成させることにより、ｍＧｌｕＲ４変異体及びｍＧｌｕＲ４変異体を保持する細胞を製造することができる。
活性なｍＧｌｕＲ４変異体、すなわちグルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得るｍＧｌｕＲ４変異体は、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索等に利用することができる。例えば、ｍＧｌｕＲ４変異体と、ｍＧｌｕＲ４変異体に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーター（以下、これらを「リガンド」と総称することがある）を探索することができる。アロステリックモジュレーターは、ｍＧｌｕＲ４変異体とグルタミン酸との結合部位以外の部位に結合し、アゴニスト又はアンタゴニストと同様の機能を示す。
また、グルタミン酸のアゴニストは、ｍＧｌｕＲ４変異体と被検物質とを反応させ、該反応を検出することによっても、探索することができる。
活性なｍＧｌｕＲ４変異体としては、ｍＧｌｕＲ４変異体を発現している細胞、又は同細胞から調製される膜画分が挙げられる。このような膜画分は、例えば、上記のように細胞に活性なｍＧｌｕＲ４変異体を発現させ、そして、細胞を超音波などで破砕後、密度勾配遠心法で膜分画を集めることにより調製することができる。
また、前記ｍＧｌｕＲ４変異体に結合する物質として、グルタミン酸もしくはグルタミン酸アゴニスト、又はｍＧｌｕＲ４に結合する公知のリガンド（Ｌ−ＡＰ４、ＣＰＰＧ、ＭＡＰ−４等）等が挙げられる。ｍＧｌｕＲ４変異体の活性を調節する物質としては、細胞内カルシウム濃度に影響を与える薬剤（カルシウムチャンネルおよびナトリウムチャンネルオープナー、Ｎａ／Ｋポンプ阻害剤、Ｎａ／Ｃａ交換系作用剤、Ｃａ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロテインキナーゼＣ作用剤）、細胞内ｃＡＭＰ濃度に影響を与える薬剤（フォスフォジエステラーゼ作用剤、アデニレートシクラーゼ作用剤）、細胞内ｃＧＭＰ濃度に影響を与える薬剤（ｃＧＭＰ依存性フォスフォジエステラーゼ作用剤、グアニレートシクラーゼ作用剤）等が挙げられる。
ｍＧｌｕＲ４変異体と、これに結合する物質との反応の阻害又は促進は、ｍＧｌｕＲ４変異体にグルタミン酸等のリガンドが結合することによって発生するセカンドメッセンジャーを検出することによって、検出することができる。また、セカンドメッセンジャーを検出する代わりに、既知のリガンドを標識したものを用い、標識リガンドとｍＧｌｕＲ４変異体との結合を測定することによっても、前記反応の阻害又は促進を検出することができる。
また、ｍＧｌｕＲ４変異体とグルタミン酸のアゴニストとの反応は、ｍＧｌｕＲ４変異体とグルタミン酸のアゴニストとの結合により発生するセカンドメッセンジャーを検出することによって、検出することができる。
ｍＧｌｕＲ４変異体は、細胞内ドメインは脳型及び味蕾型ｍＧｌｕＲ４と同一であり、脳型及び味蕾型ｍＧｌｕＲ４の細胞内シグナル伝達機序は同じであるから、ｍＧｌｕＲ４変異体も同様であると予想される。したがって、前記セカンドメッセンジャーは、Ｇｉ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＧＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を活性化しアデニレートシクラーゼを抑制することに伴う、細胞内ｃＡＭＰ産生の抑制である。また、シグナル伝達におけるｃＡＭＰの下流には、ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ調節を介した遺伝子発現調節によるものと、細胞質・膜蛋白の燐酸化による急性期の機能調節がある。したがって、ｃＡＭＰの細胞内蓄積量変化の計測、細胞内Ｃａ−ＡＴＰａｓｅ活性調節を介する細胞内カルシウム濃度変化の測定、チャンネル機能変化の測定等によって、セカンドメッセンジャーを検出することができる。
以下に、ｍＧｌｕＲ４変異体を用いたリガンド探索の具体的な方法を例示する。
（１）アフリカツメガエル卵母細胞に、ｍＧｌｕＲ４変異体ｃＲＮＡと、ＣＦＴＲ（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ｃＲＮＡを共発現させ、２電極ボルテージクランプ法により、ＣＦＴＲに由来するクロライド電流の増強或いは減弱を指標に、ｍＧｌｕＲ４変異体に作用するリガンド検索を行う（Ｕｅｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  １９９３；１（３）：２３３−４１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９２  Ｍａｒ；２６２（３  ｐｔ  １）：Ｃ７８３−８）。尚、ＣＦＴＲは嚢胞性肺繊維症の疾患原因遺伝子産物であり、細胞内のｃＡＭＰにより活性が調節されるクロライドチャンネルである。
（２）ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞とリガンド候補化合物とを一定期間共存させた後、発現細胞の細胞内ｃＡＭＰ量を用いて計測し、ｃＡＭＰの増加または減少によりリガンド検索を行う（Ｃｈａｕｄｈａｒｉ  Ｎ，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０００  Ｆｅｂ；３（２）：１１３−９；Ｆｌｏｒ  ＰＪ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９９５  Ｆｅｂ；３４（２）：１４９−５５）。ｃＡＭＰ量は、市販のアッセイキットを用いて測定することができる。
（３）ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞又は同細胞から調製した膜画分に、リガンド候補化合物、及びｍＧｌｕＲ４に作用する既知のリガンド（例えばグルタミン酸、Ｌ−ＡＰ４、ＣＰＰＧ、ＭＡＰ−４等）を一定期間作用させ、ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞の細胞膜又は膜画分に結合した既知リガンドの量を測定することにより、リガンド検索を行う（Ｎａｐｌｅｓ  ＭＡ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００１；４０（２）：１７０−７；Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｃ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｊａｎ；３６（１）：２１−３０；Ｈ．Ｉ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｓ．Ｊ．Ｅｎｎａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｋｕｈａｒ  ｅｄｓ，１９５８，Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。既知リガンドの量は、それらの物質の一部を放射活性ラベルし、細胞膜又は膜画分に結合する放射活性の量により、測定することができる。
（４）ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞に、あらかじめカルシウム感受性色素（例えばＦｕｒａ−２、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３等）を導入し、リガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞を一定期間接触させたときの蛍光強度比（細胞内カルシウム濃度）変化を指標として、リガンド検索を行う。あるいは、ｍＧｌｕＲ４変異体アゴニストと、リガンド候補化合物と、カルシウム感受性色素を導入したｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞とを一定期間接触させたときの蛍光強度比（細胞内カルシウム濃度）変化により、リガンド検索を行う。
（５）ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞に、あらかじめｃＡＭＰ感受性蛍光蛋白質（例えばＦＩＣＲｈＲ等）を導入し、リガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞を一定期間接触させたときの蛍光強度比（細胞内ｃＡＭＰ濃度）変化を指標として、リガンド検索を行う（Ａｄａｍｓ  ＳＲ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１  Ｆｅｂ  ２１；３４９（６３１１）：６９４−７）。
（６）リガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞を一定期間接触させたとき、あるいは、ｍＧｌｕＲ４変異体作動薬とリガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞を一定期間接触させたときのプロトン産生量をサイトセンサーにより測定し、プロトン産生量を指標としてリガンド検索を行う（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ＨＭ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２  Ｓｅｐ  ２５；２５７（５０７８）：１９０６−１２）。
上記のようにして検索されるグルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを有効成分として含む医薬組成物は、グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬として使用することができる。セカンドメッセンジャーを調節することによって、グルタミン酸受容体異常に起因する疾患、病態を改善、予防することができる。
グルタミン酸受容体異常に起因する迷走神経制御異常としては、求心路異常（栄養素認識障害）と遠心路異常がある。求心路異常に起因する疾患又は病態としては、過食症、拒食症及び肥満症等が挙げられる。また、遠心路異常に起因するものとしては、胃酸分泌異常、消化管血流異常、消化酵素分泌異常等による消化性潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍）、ストレス性潰瘍、薬物性（ＮＳＡＩＤｓ等）急性潰瘍、虚血性潰瘍（虚血性大腸炎）、インシュリン分泌異常又は消化管ホルモン分泌異常による糖尿病、過食症、拒食症、肥満症、及び、運動性機能異常による胃もたれ、むかつき、便秘、下痢、過敏性腸症候群などが挙げられる。
ｍＧｌｕＲ４変異体を免疫源として用いることにより、ｍＧｌｕＲ４変異体に特異的に結合する抗体を作製することができる。特に、ｍＧｌｕＲ４変異体はＮ末端が新規なアミノ酸配列を有しているので、この部分をエピトープとする抗体、特にモノクローナル抗体は、ｍＧｌｕＲ４変異体に結合し、他のグルタミン酸受容体には結合しないと予想される。ｍＧｌｕＲ４変異体に特異的な抗体は、ｍＧｌｕＲ４変異体特異的な免疫染色等に用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  ラット腸組織からの新規な代謝型グルタミン酸受容体ｃＤＮＡのクローニング
ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（ＣＲＪ）の小腸及び大腸試料由来の全ＲＮＡを鋳型として、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）及びＳＭＡＲＴ（Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｔ  ５’ｅｎｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて逆転写を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＬＡ  ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いた５’−ＲＡＣＥ及びそれに続くｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによって、ラットｍＧｌｕＲ４の５’末端フラグメントを増幅した。
遺伝子特異的プライマー（Ｒ−ｍＧｌｕＲ４：５’−ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＣＴ−３’（配列番号１），Ｒ２−ｍＧｌｕＲ４：５’−ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＡＣ−３’（配列番号２））は、脳型ｍＲＮＡ配列（Ｏ’Ｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１１：４１，１９９３）に基づいて合成した。
ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｋｉｔからのプライマー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ：Ｌｏｎｇ  ５’−ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ−３’（配列番号３），Ｓｈｏｒｔ  ５’−ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃ−３’（配列番号４），及びＮｅｓｔｅｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴ−３’（配列番号５））は、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行うために用いた。
約３０ｎｇのラットｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーＲ−ｍＧｌｕＲ４及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘを用いて、１０μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ，２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ及び０．２５  ｕｎｉｔｓのＬａ  Ｔａｑ酵素中で、増幅した。
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用いて、９４℃２０秒、５０℃１分、及び６８℃３分を４０サイクル行った後、６８℃１０分の伸長を行った。
得られた反応産物は、Ｒ２−ｍＧｌｕＲ４及びＮｅｓｔｅｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒを用いて、上記と同じ条件で再度増幅し、３００ｂｐの断片が得られた。
増幅産物は、アガロース電気泳動によって分離し、ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、二重プロモーター（Ｄｕａｌ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を持つｐＣＲ−ＩＩ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。
上記フラグメントについて、ＡＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３７００（ＡＢＩ社）を用いて塩基配列を解析したところ、大腸から０１０４１１−７０及び０１０４１１−６６、０１０５２８−３、小腸から０１０５２８−３７と名付けられたクローンが同定された。これらは同一の塩基配列を含んでいた。
上記各クローンから決定された塩基配列を、配列番号６に示す。また、この塩基配列に含まれるオープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列を配列番号７に示す。この塩基配列を脳のｍＧｌｕＲ４  ｍＲＮＡ配列（Ｏ’Ｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１１：４１，１９９３）と比較したところ、配列番号６の塩基配列では、１７２４位のシトシンは１８８０位のアデニンに直接結合しており（塩基の位置は、ｍＧｌｕＲ４  ｍＲＮＡを基準とする）、１５５ｂｐのフラグメントが抜け落ちていた。１７２４位のシトシンの上流領域におけるフレームシフトにより、１６８４位又は１７１７位から始まる開始コドンによりコードされるメチオニンをＮ末端とする新規なペプチド（配列番号８）が翻訳され、このペプチドはグルタミン酸受容体の細胞外ドメインに位置する３４３位のグリシンに結合すると考えられた。残りの配列は、脳型受容体と同一の配列であった。尚、配列番号６及び配列番号７には、１６８４位から始まるコドンを開始コドンとして示した。２つのメチオニンコドンのいずれが開始コドンであるかは不明であるが、いずれにしても、オープンリーディングフレームと周辺配列を細胞に導入して発現させれば、生体中で発現している発現産物と同じ発現産物が得られると予想される。
上記オープンリーディングフレームがコードするタンパク質は、配列番号７に示すアミノ酸配列の１番目のメチオニンがＮ末端であるとした場合、分子量は約８８ｋＤである。Ｎ末端の１４アミノ酸は、ｍＧｌｕＲ４  ｍＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列には存在しない配列である。
以上のことから、得られたクローンは、新規な細胞外ドメインを有するｍＧｌｕＲ４のスプライシング変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であることが示された。
実施例２  免疫染色手法によるグルタミン酸受容体局在の同定
＜１＞ラット小腸及び大腸の切片標本の作製
ラット（Ｗｉｓｔａｒ系、雄、１０〜１５週齢）をエーテル麻酔下で心臓右心耳を切開して放血し、その後すぐ小腸および大腸を採材した。小腸は胃幽門より約５センチの部分、大腸は回盲開口部より約７センチ肛門側の部分を採材した。消化物が多量に腸内に残っている場合は、生理食塩水で腸管を洗浄した。
切り出した腸管は切り開き、コルクボードに針で貼り付け、４％パラホルムアルデヒド（４℃）で一昼夜振蕩し、浸漬固定した。その後２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ−ＰＢＳに３〜４日浸漬して凍結保護（Ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）した後、Ｔｉｓｓｕｅ−ＴｅｋＲ（ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に包埋し、クリオスタットで５−７μｍに薄切した。切片は室温にて乾燥させた後、各種染色に用いるまで４℃で保存した。
＜２＞抗代謝型グルタミン酸受容体抗体による免疫染色
切片の免疫染色は、Ｄｒｅｎｇｋ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．７８：１０９−１１２，２０００、及びＭｉａｍｐａｍｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．７７：１４０−１５１，１９９９に記載の方法に準じて行った。切片はまずＰＢＳで洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼによる反応を阻止するために、３％過酸化水素・メタノールで１５分処理した。次に、切片をＰＢＳで洗浄した後、１０％正常馬血清を含む１％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を用いて１時間ブロッキングを行った。再びＰＢＳで洗った後、１％正常馬血清を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した一次抗体（表１）を４℃で２晩反応させた。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した２次抗体（表１）を室温で１時間反応を行った。最後にＶｅｃｔｏｒｓｔａｉｎ  ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いてＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）反応を行い、０．０２５％ジアミノベンチジン−０．２５％塩化ニッケル−０．０１％Ｈ２Ｏ２で発色させた。反応終了後、切片をＰＢＳで洗い、エタノール・キシレンで脱水、封入の後、顕微鏡にて観察した。一次抗体を用いないものをネガティブコントロールとした。使用した一次抗体、二次抗体の種類及び希釈倍率を、表１に示す。
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＜３＞アルシアンブルー・ＰＡＳ染色
切片は流水で洗い、３％酢酸に親和させた後に、アルシアンブルー液（ｐＨ２．５、和光）で３０〜４０分反応させた。次に流水で洗浄し、１％過ヨウ素酸溶液に１０分間浸した後、シッフ試薬（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（和光）で８〜１０分ほど反応させた。これによりムチンを染色し、腸管の杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を同定した。切片を再び流水で洗浄した後、最後にマイヤーのヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（和光）で核染色し、色出しした後に、脱水・封入を行った。
＜４＞結果
免疫染色の結果を図２に示す。小腸（図２Ａ）および大腸（図２Ｂ）では抗ｍＧｌｕＲ４により杯細胞が染色された。杯細胞には、ｍＧｌｕＲ４受容体は発現していないと一般的に考えられている。したがって、ｍＧｌｕＲ４変異体は、杯細胞に発現していると考えられ、機能的には粘液分泌との関連が示唆された。
実施例３  新規ｍＧｌｕＲ４変異体の機能の推定
ラット（Ｗｉｓｔａｒ系、雄、８〜１０週齢：日本チャールズリバー）を１８時間絶食後、ウレタン麻酔（１ｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）下に開腹し、実態顕微鏡下で迷走神経腹腔枝を５ｍｍ前後剥離した。迷走神経束を切断後、小型オペ台（８×６ｍｍ）上に迷走神経束をのせて、周囲の脂肪及び結合組織を注意深く剥離し、その臓器側末端繊維を記録用のプラチナ製双極電極に載せ、流動パラフィン・ワセリン（１：１）混合液で周囲組織と絶縁した。また、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、味の素株式会社製）の投与ルートとして、経口で胃内および十二指腸起始部にシリコンチューブを留置した。
神経活動電位は、微小電位増幅器（ＷＰＩ社製ＤＡＭ−８０）により１００００倍に増幅し、ベッセルフィルター（４−ｐｏｌｅ，Ｈｉｇｈ  Ｃｕｔ  １０Ｈｚ，Ｌｏｗ  Ｃｕｔ  １ＫＨｚ）によりノイズを低減させた後、Ａ／Ｄ変換（Ｐｏｗｅｒｌａｂ  ４ｓｐ，ＡＤＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）後、コンピュータに取り込んだ（ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｒａｔｅ  ３ＫＨｚ，ｉＢｏｏｋ）。同時に、増幅信号をオシロスコープでモニタしながらウィンドー・ディスクリミネータ（ダイヤメディカル社製ＤＳＥ−４３５）によりノイズ成分と神経信号成分を分離し、スパイックカウンタ（Ｓｐｉｋｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ダイヤメディカル社製ＤＳＥ−３３５Ｐ）で５秒積算後、チャートレコーダ（日本光電製ＷＴ−４６５Ｇ）で記録した。スパイク波形の解析は、ＳＨＥソフトウエア（ＡＤＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いた。
結果を図３に示す。十二指腸内にＭＳＧ  １５０ｍＭを投与した時の迷走神経腹腔枝の求心活動は亢進した。迷走神経求心路は内臓感覚、特に、胃および腸からの栄養情報を延髄孤束核に送り込み、満足感、不快感などの食後感覚、及び迷走神経遠心路調節による消化調節を行うシグナル伝導路と考えられている。したがって、ＭＳＧの消化管内投与により迷走神経求心路活動が亢進したことは、ＭＳＧがそのシグナル発生要因であり、消化管内腔に発現しているｍＧｌｕＲ４変異体が、そのシグナル発生を仲介している可能性を示している。
寒施例４  新規ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞の作製
＜１＞新規ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞の作製
新規ｍＧｌｕＲ４変異体の全長ｃＤＮＡを、再度ＰＦＵポリメラーゼ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。その後、Ｅｃｈｏクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて常法に従いｐＵｎｉ−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯにクローニング後、プラスミド融合法によってｐｃＤＮＡ３．１Ｅに組み込んだ。
作製したベクター（ｐｃＤＮＡ３．１Ｅ）は、ｐｏｌｙＦｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬株式会社）に導入した。４８時間後、培養液（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）、１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンを含有；ナカライテスク）中にネオマイシン（６００μｇ／ｍＬ）を添加し、２、３週間培養を継続して、遺伝子導入細胞の選別を行った。選別したＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ法により新規ｍＧｌｕＲ１変異体のｍＲＮＡの発現を確認後、機能評価に必要な細胞数にまで増殖させた。
＜２＞ｃＡＭＰ測定によるｍＧｌｕＲ４変異体遺伝子の機能測定
上記で得た変異体発現細胞は、プレート（２４−ｗｅｌｌ）に２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように分注し、２０時間培養後、ｃＡＭＰ機能測定に用いた。各プレートはＤｕｌｂｅｃｏ’ｓリン酸緩衝液でよく洗浄し、２０分間インキュベーションを行った。その後、各薬剤で１０分間、３７℃で刺激を行った。刺激後速やかに氷冷した２．５％ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＣＡ）で３０分処理し、ＫＯＨで中和後、遠心上清を得た（１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ，４℃）。上清液中のｃＡＭＰ含量は、ｃＡＭＰ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて一般的な酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）により定量した。
その結果、ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞中のｃＡＭＰ量は、フォスフォジエステラーゼ阻害剤（ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌ−ｘａｎｔｈｉｎｅ；ＩＢＭＸ；１００μＭ）およびアデニルシクラーゼ活性化剤（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ；１０μＭ）処置により、約９倍上昇した。本条件下において、グルタミン酸（１ｍＭ）および食塩（１ｍＭ）の作用を比較したところ、ｃＡＭＰ量は食塩添加群（コントロール）では１５１９  ｆｍｏｌｅ（ｎ＝３）であり、グルタミン酸添加群では１２３５  ｆｍｏｌｅ（ｎ＝３）であった。よって、ｍＧｌｕＲ４変異体発現細胞中のｃＡＭＰ蓄積量は、グルタミン酸添加により約１９％減少することが判明した。本実験結果より、新規ｍＧｌｕＲ４変異体は、ミリモルオーダーのグルタミン酸と反応し、ｃＡＭＰを介するシグナルトランスダクション系を変動させることが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規な代謝型グルタミン酸受容体が提供される。本グルタミン酸受容体は、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索に用いることができる。また、小腸、大腸等の消化管における代謝異常による疾患、症状を改善する医薬として用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｍＧｌｕＲ４及びｍＧｌｕＲ４変異体の構造の概要を示す図である。
図２は、抗ｍＧｌｕＲ４抗体による免疫染色の結果を示す写真である。（Ａ）小腸。（Ｂ）大腸。
図３は、迷走神経腹腔枝求心性神経活動に対するＬ−グルタミン酸の作用を示す図である。横軸は時間。縦軸は神経活動を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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