(57)【要約】ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株由来ＧＤＨのβサブユニットのＮ末端シグナル配列領域の塩基配列からデザインしたプライマーを用いたインバースＰＣＲにより、βサブユニットをコードするＤＮＡ断片を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素βサブユニットとして機能し得るタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素βサブユニットとして機能し得るタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ。
【請求項４】
さらに配列番号１５の塩基番号１２１〜１８７からなる塩基配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ又は請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素βサブユニットを産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素βサブユニットの製造方法。
【請求項８】
さらにブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素αサブユニット及びγサブユニットをコードする塩基配列を含む請求項３又は４に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のＤＮＡ又は請求項９に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、グルコース脱水素酵素のβサブユニットを構成するチトクロームＣ、それをコードするＤＮＡ、及びそれらの利用に関する。グルコース脱水素酵素は、酵素電極を用いたグルコースセンサ等に有用である。
背景技術
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われている。その中でも特にバイオセンサの１つであるグルコースセンサは、主に医療分野で測定方法やその方法を利用した装置の開発が盛んに行われている。例えばグルコースセンサは、１９６２年にＣｌａｒｋとＬｙｏｎｓによってグルコースオキシダーゼと酸素電極を組み合わせたバイオセンサーの報告（Ｌ．ｃ．Ｃｌａｒｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｌｙｏｎａｓ，Ｃ．”Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ．”Ａｎｎ，ｎ．ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：２０−４５）が最初にされて以来、約４０年ほどの歴史を有している。
このように、グルコースセンサに、酵素としてグルコースオキシダーゼが採用されてからの歴史は長い。なぜならグルコースオキシダーゼは、グルコースに対する基質特異性が高く、熱安定性に優れており、更に酵素の量産化が可能であり、生産コストが他の酵素と比べて安価である、からである。基質特異性が高いということは、酵素がグルコース以外の糖とは反応しないため、測定値に誤差を生じることなく、正確な測定が行なえるという利点に通じる。また、熱安定性に優れているということは、酵素が熱により変性し酵素活性が失活するという問題を防止することができ、長期間正確な測定が行えるという利点に通じる。
しかし、グルコースオキシダーゼは、上記の様なメリットを有している反面、例えば溶存酸素の影響を受け、測定結果に影響があるという問題も有している。
一方、グルコースオキシダーゼ以外には、グルコース脱水素酵素（以下、「グルコースデヒドロゲナーゼ」又は「ＧＤＨ」ともいう）を利用したグルコースセンサの開発も行われてきた。そして、酵素も、微生物から発見されている。例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）及びクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１９）が知られている。
前者のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）は、β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ（Ｐ）＋→Ｄ−δ−グルコノラクトン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋の反応を触媒する酵素であり、後者のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１９）は、Ｄ−グルコース＋ＮＡＤＰ＋→Ｄ−δ−グルコノラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋の反応を触媒する酵素であり、前述した微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、既に市販もされている。
これらグルコースデヒドロゲナーゼは、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けないという利点を有する。このことは、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、測定結果に誤差を及ぼさずに正確に測定することができるという利点に通じる。
しかし、従来に見られるグルコースデヒドロゲナーゼは、溶存酸素の影響を受けない一方、熱安定性が悪く、基質特異性がグルコースオキシダーゼよりも劣るという問題点を有しており、センサに採用される酵素として、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼの両欠点を補う酵素の提供が望まれていた。
尚、本発明者は  Ｓｏｄｅ，Ｋ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９，８２−８５．や、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｏｄｅ，Ｋ．，（１９９９）Ａｐｐｌｉ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃ．７７−７９／０３２５や、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｏｄｅ，Ｋ．，（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃ  Ｌｅｔｔ．２１，１９９−２０２において、温泉近くの土壌より採取した試料を用い、ＧＤＨについての研究結果を報告している。この試料中の微生物が産出するＧＤＨは補酵素結合型であり、すでに至適反応温度、熱安定性、基質特異性などの酵素学的性質が明らかとなっている（前記文献）。本酵素は高い耐熱性を持つ触媒サブユニット（αサブユニット）、電子伝達サブユニット（βサブユニット）、機能不明のγサブユニットから構成されているヘテロオリゴマー酵素であり、活性のピークを４５℃と７５℃に持つ。また、γ、αサブユニット遺伝子はクローニングされており、上記微生物がブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）に属すること、及びβサブユニットのＮ末端アミノ酸配列も明らかにされている（猪瀬  健、東京農工大学修士論文（２００１年））。しかし、βサブユニット遺伝子の構造は未だ報告されていない。
発明の開示
本発明は、ブルクホルデリア属微生物のＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡ、及びその利用法を提供することを課題とする。
本発明者は、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨに関する研究をさらに進め、ＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素βサブユニットとして機能し得るタンパク質。
（２）以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素βサブユニットとして機能し得るタンパク質。
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ。
（４）さらに配列番号１５の塩基番号１２１〜１８７からなる塩基配列を含む（３）に記載のＤＮＡ。
（５）（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（６）（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡ又は（５）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（７）（６）に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素βサブユニットを産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素βサブユニットの製造方法。
（８）さらにブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素αサブユニット及びγサブユニットをコードする塩基配列を含む（３）又は（４）に記載のＤＮＡ。
（９）（８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１０）（８）に記載のＤＮＡ又は（９）に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（１１）（１０）に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素複合体の製造方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡを検索し、単離した。同菌株は、２０００年９月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号第ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０６として寄託されている。本明細書において、ＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡを、本発明のＤＮＡ、「βサブユニット構造遺伝子」又は単に「βサブユニット遺伝子」ということがある。
本発明者らは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株が産生するＧＤＨは、αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットを含む多量体タンパク質であることを確認している。本発明のタンパク質は、これらのサブユニットのうち、βサブユニットである。ＧＤＨの分光光度解析により、酸化型ＧＤＨの吸収波長はグルコノバクターＳｐ．、アセトバクターｓｐ．のデヒドロゲナーゼチトクローム複合体でできているアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの吸収波長と類似しており、熱処理によりこの吸収は失われる。このことと、下記に示すβサブユニットの有無によるＧＤＨの至適反応温度の相違から、βサブユニットはチトクロームＣからなっていることが示唆された。
以下に、上記ＧＤＨの理化学的性質を示す。
▲１▼作用：
グルコースの脱水素反応を触媒する。
▲２▼還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約４３ｋＤａを示すサブユニットからなる。
▲３▼ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤａを示す。
▲４▼至適反応温度：
４５℃付近  （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
また、αサブユニット単独では、以下の理化学的性質を示す。
▲１▼’グルコース脱水素酵素活性を有する。
▲２▼’還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａを示す。
▲３▼’至適反応温度：
７５℃付近  （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
βサブユニットは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の培養物から、ＧＤＨ活性を指標としてＧＤＨ複合体を精製することにより、他のサブユニットとともに取得することができる。ＧＤＨ活性は、公知のＧＤＨの活性測定と同様の方法で測定することができる。具体的には、例えば次のようにして測定することができる。５９４μＭの１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え、３７℃でインキュベートする。分光光度計を用いてＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化を追跡し、当該吸光度の減少速度を酵素反応速度とする。
また、本発明によりβサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１５）が明らかにされたので、この塩基配列を有するＤＮＡ又は同ＤＮＡがコードするアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡを適当な宿主で発現させることによってもβサブユニットを製造することができる。配列番号１５のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号１６に、示す。タンパク質から決定したβサブユニットのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１６のアミノ酸番号２３〜３８と一致していた。したがって、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号１５及び１６において、第１番目のアミノ酸残基はＶａｌと記載されているが、Ｍｅｔである可能性が高く、また、翻訳後に脱落している可能性がある。
上記アミノ酸配列についてＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行ったところ、ラルストニア・ソアナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のオキシドレダクターゼ脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと６５％、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）由来のソルビトール脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと４８％、エルビニア・シプリペディイ（Ｅｒｉｗｉｎｉａ  ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ）由来のグルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットと４４％、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）由来２−ケト−グルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットと塩基配列レベルで５５．７％、アミノ酸レベルで４６．４％と、全体にわたって高い相同性を示していた。またこれらのシトクロームｃのアミノ酸配列中には、ヘム結合モチーフ（配列番号１８）配列が保存されていた。これらのことから、本発明のβサブユニットがチトクロームＣであることが示された。
本発明のβサブユニットは、ＧＤＨのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、ＧＤＨのβサブユニットとして機能するとは、ＧＤＨの酵素活性を損なわずにチトクロームＣとして機能することをいう。
本発明のＤＮＡは、上記βサブユニットをコードするＤＮＡであり、例えばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株から取得することができる。本発明のＤＮＡは、本発明を完成する過程においては、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから単離された。本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するプライマーを用い、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、取得することができる。また、本発明によりその塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかとなったので、これらの配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、ブルクホルデリア・セパシアの他の菌株からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
本発明のＤＮＡは、配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものの他、このアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＧＤＨβサユニットとして機能するタンパク質をコードするものであってもよい。
本発明のＤＮＡとしては、具体的には、配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また本発明のＤＮＡは、配列番号１５又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件としては、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
本発明のＤＮＡ又は同ＤＮＡを含む組換えベクターを保持する形質転換体を培養して、同ＤＮＡの発現産物としてＧＤＨβサブユニットを産生させ、これを菌体又は培養液から採取することにより、ＧＤＨβサブユニットを製造することができる。その際、本発明のＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡは、さらにαサブユニットをコードするＤＮＡ、又はさらにγサブユニットをコードするＤＮＡとともに発現させることによって、ＧＤＨ複合体を製造することができる。γサブユニット及びαサブユニットを連続してコードするＤＮＡ断片は、配列番号１８及び１９に示す塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲによって、取得することができる。
ＧＤＨβサブユニット又はＧＤＨ複合体を産生させる微生物としては、大腸菌をはじめとする腸内細菌群、シュードモナス属やグルコノバクター属などのグラム陰性細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌をはじめとするグラム陽性細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
本発明のＤＮＡのクローニング又は発現に使用するベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るプラスミド又はファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。エシェリヒア・コリ用のベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔあるいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示される。一旦本発明のＤＮＡのクローニングに使用したベクターより、発現等に適した他の組換えベクターへの移入は、本発明のＤＮＡを保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法により同ＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる微生物の形質転換は、例えばエシェリヒア属細菌ではカルシウム処理によるコンピテントセル法、バチルス属細菌ではプロトプラスト法、酵母ではＫＵ法やＫＵＲ法、糸状菌ではマイクロマニュピレーション法等の方法によって行うことができる。また、エレクトロポレーション法も広く用いることができる。
宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカー等を指標とすればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培養温度は菌が生育し、本発明のタンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、本発明のタンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
培養物中の本発明のタンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、本発明のタンパク質が培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、本発明のタンパク質を含有する溶液と微生物菌体と分離した後に利用される。本発明のタンパク質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加して本発明のタンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。
上記のようにして得られたタンパク質含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製を行うことにより、精製された本発明のタンパク質を得ることができる。
カラムクロマイトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましいが、αサブユニット又はγサブユニットが含まれていてもよい。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。
本発明のβサブユニット及びαサブユニット、もしくは必要に応じてさらにγサブユニットからなるＧＤＨ複合体、又はそれを保持する形質転換体は、グルコースセンサの酵素電極として用いることができる。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のグルコース脱水素酵素をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の酵素を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコースの濃度を計算することができる。
また、本発明のβサブユニットを含むＧＤＨ複合体は、グルコース等の糖類アッセイキットの構成要素とすることができる。典型的には、キットは、ＧＤＨ複合体に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作成のためのグルコースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
参考例１  ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株ＧＤＨ  αサブユニットをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株からの染色体ＤＮＡの調製
ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をＴＬ液体倍地（ポリペプトン  １０ｇ、酵母抽出液  １ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ２ｇ、グルコース  ５ｇ；１Ｌ、ｐＨ  ７．２）を用いて、３４℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。この菌体を１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
＜２＞ＧＤＨαサブユニットのＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例２と同様にして精製したＧＤＨを凍結乾燥によって濃縮後、１２．５％ポリアクリルアミドを用いたＳＤＳ−電気泳動法を用いて展開し、αサブユニットを分離した。こうして得られたαサブユニットをポリビニリデンフルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。その結果、本酵素には配列番号３のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２〜１２からなる１１残基から構成されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
＜３＞αサブユニットをコードする遺伝子のクローニング
＜１＞で調製したＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで限定分解した。これをＣＩＡＰ（仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ）処理した。一方、コスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（ストラジーン社から入手）をＢａｍＨＩ処理し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩにα−１５株由来の染色体ＤＮＡ断片をＳａｕ３ＡＩで限定分解して得られたＤＮＡ断片を組み込んだ。得られた組換えＤＮＡでエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲ（ストラジーン社から入手）を形質転換した。形質転換体はＳｕｐｅｒＣｏｓＩ上の抗生物質耐性であるネオマイシン耐性およびアンピシリン耐性にしたがって１０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地から選抜した。得られた形質転換体をＬＢ液体培地で培養した。これらの形質転換菌体を集菌後、ＧＤＨ活性測定試薬に懸濁し、グルコースに対する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜した。その結果、１株のグルコース脱水素酵素活性を示すクローンが得られた。
＜４＞サブクローニング
＜３＞で得られたαサブユニットをコードする遺伝子を含むコスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＩから、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。同コスミドから挿入遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩにより切り出した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、それらの断片をＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８に組み込んだ。各挿入断片を含むプラスミドｐＵＣ１８でエシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養し、それぞれの細胞のＧＤＨ活性を＜３＞と同様に調べた。その結果、一つの形質転換体にＧＤＨ活性を示す株が得られた。この形質転換体からプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、約８．８ｋｂｐの挿入断片が確認された。本プラスミドをｐＫＳ１と命名した。
＜５＞塩基配列の決定
ｐＫＳ１の挿入ＤＮＡ断片について、制限酵素解析及び常法に従い塩基配列を決定した。その結果、本挿入ＤＮＡ断片中に、＜２＞で明かとなったαサブユニットのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が確認され、この配列を含むオープンリーディングフレームが見つかった。決定した塩基配列および同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列は、配列番号１および３に示す通りである。尚、後述するように、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２３８６以降の塩基配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードしており、β−サブユニットをコードしていると推定された。
参考例２  組換え大腸菌によるＧＤＨ  αサブユニットの生産
αサブユニットの塩基配列が決定されたことにより、前記αサブユニットの構造遺伝子を用いてベクターを作製し、更に前記ベクターにより形質転換体の製造を行った。
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
ＫＳ１株由来のゲノム断片をテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応には次の１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
（フォワード）
2003091430.tif 000002
（リバース）
2003091430.tif 000003
ＰＣＲにより増幅された遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ（ＳＩＧＭＡ社）のクローニング部位であるＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αと命名した。
前記プラスミドｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αでエッシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。
さらにｐＫＳ１挿入断片について、αサブユニットの上流に関してオープンリーディングフレームを検索したところ、新たに配列番号２に記載される１６８アミノ酸残基から構成されるポリペプチドをコードする５０７塩基から構成される構造遺伝子（配列番号１中塩基番号２５８〜７６１）が見出された。この構造遺伝子は、γサブユニットをコードしていると考えられた。
αサブユニットのコード領域の上流に、γサブユニットをコードする領域の存在が明らかになったことから、γサブユニットとαサブユニットが連続するポリシストロン構造の遺伝子を含む組換えベクターを作製し、同ベクターを導入した形質転換体を構築した。
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
γサブユニットの構造遺伝子およびαサブユニットの構造遺伝子が連続するＫＳ１株由来のゲノム断片をテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応には次の１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
（フォワード）
2003091430.tif 000004
（リバース）
2003091430.tif 000005
このＰＣＲにより増幅された遺伝子の５’末端をＮｃｏＩ、３’末端をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のクローニング部位である、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αと命名した。
前記プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αにより、エシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。
前記ｐＫＳ１、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／α、ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αのそれぞれのプラスミドによって形質転換したエシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を用いてαサブユニットの生産を行った。各形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌した。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０分）により膜画分（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。
参考例３  ＧＤＨ活性の確認
先ず前記各膜分画を用いてＧＤＨ活性の確認を行った。具体的には５９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により、目視判定を行った。結果は以下のとおりである。＋の数は、青色から無色への変化の程度を表す。
ｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αによる形質転換体培養膜分画      ＋
ｐＫＳ１による形質転換体培養膜分画                    ＋＋
ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αによる形質転換体培養膜分画      ＋＋＋
αサブユニットのみを組みこんだｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αによる形質転換体培養膜分画のＧＤＨ活性が最も低く、効率良くベクターを構築したｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αによる形質転換体培養膜分画が最も高いＧＤＨ活性を示した。
αサブユニットの構造遺伝子のみによるベクターを用いた形質転換体でもαサブユニットは発現されるが、更にγサブユニットの構造遺伝子をαサブユニットの構造遺伝子と合わせたベクターを用いることにより、効率良くαサブユニットを得ることができた。
本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコースをアッセイした。本発明のグルコース脱水素酵素（αサブユニット）を、各種濃度のグルコースで酵素活性を測定した。ＧＤＨ活性の測定は５９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の中で行った。酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え３７℃でインキュベートした時のＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。本発明のＧＤＨを用いて、０．０１〜１．０ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
実施例１  ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットの検索
Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅのブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株ゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）を用いて、ＫＳ１株由来ＧＤＨのβサブユニット遺伝子を検索した。すでに明らかにされているＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットのＮ末端配列（配列番号９）を参考に、アセトバクターＳｐ．、グルコノバクターｓｐ．由来のアルコール脱水素酵素（Ｔａｍａｋｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０８８（２）：２９２−３００（１９９１）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，３０４−３１０（１９９２）、Ｔａｋｅｍｕｒａ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７５，６８５７−６６（１９９３）、Ｋｏｎｄｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６３，１１３１−８（１９９７））、エルビニアｓｐ．、シュードモナスｓｐ．由来のグルコン酸脱水素酵素（Ｙｕｍ  ＤＹ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９，６５６６−７２，（１９９７）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，８５，１１７３−８１（１９７９））、グルコノバイターｓｐ．由来のソルビトール脱水素酵素（Ｃｈｏｉ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２５，４５−５０（１９９５））、エルビニアｓｐ．、パントエアｓｐ．由来の２−ケトグルコン酸脱水素酵素（Ｐｕｊｏｌ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８２，２２３０−７，（２０００））のシトクロームｃサブユニットとホモロジーの高いアミノ酸配列（配列番号１０）をデザインした。
上記アミノ酸配列を指標として、前記ブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株のデーターベースからＢＬＡＳＴを用いてホモロジーの高いアミノ酸配列をコードしている遺伝子配列を検索した。つぎに、得られた５つの配列に対して、ＫＳ１株ＧＤＨαサブユニットのＣ末端配列とのホモロジーを検索した結果、２つの遺伝子断片から翻訳されるアミノ酸配列が高いホモロジー（＞９０％）を示した。各遺伝子断片は２００〜５００ｂｐと短かったので、これらの配列に対して相同性の高い配列を、Ｂｌａｓｔを用いてブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株のゲノムデーターベースから検索し、各断片をつなぎ合わせた。その結果、３１１０ｂｐの断片を得た。得られた塩基配列にはＧＤＨのＣ末端と思われるＯＲＦと１２７５ｂｐからなるシトクロームｃ構造遺伝子と思われるＯＲＦが存在した（配列番号１１）。同ＯＲＦがコードするアミノ酸配列を配列番号１２に示す。得られたＪ２３１５株の塩基配列と既にクローニングされているＫＳ１株αサブユニット塩基配列を比較した結果、αサブユニット下流にはＪ２３１５株シトクロームｃのシグナルペプチドをコードする塩基配列に相同性の高い塩基配列が含まれていた。
以上のことから、参考例１で得られたブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のクローニング断片中の三番目のＯＲＦ（配列番号１の塩基番号２３８６以降）は、β−サブユニットをコードしていると推定された。また、精製されたβ−サブユニットのＮ末端におけるアミノ酸配列と、配列番号１中の塩基番号２４５２〜２４６６の塩基配列によって翻訳される５アミノ酸残基が一致したことからも、前記ＯＲＦはβサブユニットをコードしていると考えられた。
＜２＞インバースＰＣＲ法を用いたβサブユニット構造遺伝子の増幅
（１）菌体の培養及びゲノムの抽出
ＫＳ１株を５ｍｌの完全培地（０．５％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、０．３％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  ＮａＣｌ）を用いて３７℃で一晩振とう培養した。得られた菌体からＧｅｎｎｏｍｉｃＰｒｅｐＴＭＣｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてゲノムを抽出した。方法は付属のマニュアルに従った。得られたゲノムに対してフェノール／クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿させた後、精製水に溶解した。
（２）ゲノム断片の環状化
ＫＳ１株より抽出したゲノムを、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、エタノール沈殿によってゲノム断片を回収した。制限酵素消化したゲノム１μｇをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて１６℃で一晩ライゲーション反応を行った。
（３）ＰＣＲ
ＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットのＮ末端シグナル配列領域の塩基配列からデザインしたフォワードプライマー（ＥＦ１配列番号１３）５０ｐｍｏｌ，リバースプライマー（ＥＲ１配列番号１４）５０ｐｍｏｌ（プライマーはいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に依託合成）、ＬＡＴａｑ（宝バイオ（株））０．５ｍｌ、ｄＮＴＰ溶液８μｌ，１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌに精製水を全量５０μｌとなるように加え、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−８０１（ＡＳＴＥＣ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応は、以下の条件で行った。９４℃  ５分、９８℃  ２０秒、６２℃  ３０秒を３０サイクルの後、７２℃  ６分、７２℃  １０分。
ＳｍａＩで制限酵素消化したゲノムをテンプレートとした場合において、約２．１ｋｂｐの大きさの断片がアガロース電気泳動で確認された。
＜３＞ＰＣＲ増幅断片のシークエンシング
（１）ＴＡクローニング
前記のインバースＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、バンドを切り出し、Ｇｅｎｅ  ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ＫＩＴ（Ｂｉｏ１０１  ｉｎｃ．）を用いて精製した。この断片を、ｐＧＥＭＲ−Ｔ  ａｎｄ  ｐＧＥＭＲ−Ｔ  ＥＡＳＹ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒにライゲーションした。ライゲーションを行ったベクターでエシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ  ４０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ  ０．１μＭを含むＬ寒天培地を用いて一晩培養した。出現したコロニーから白色のコロニーを選択し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ培地で一晩培養して、菌体からプラスドをアルカリ法により抽出した。
（２）シークエンスサンプルの調製
得られたプラスミドをＲＮａｓｅ処理し、これに０．６倍量の２０％  ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加え、氷上に１時間放置した。その後１５０００ｒ．ｐ．ｍ、４℃で１５分間遠心分離し、ペレットを得た。これを７０％エタノールで洗浄し、ペレットを真空乾燥させた。これを精製水に溶解した。
（３）ＤＮＡ塩基配列の解析
（２）で得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｚｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ  Ａｐｐｌｉｓｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。ベクターのマルチクローニングサイトからＭ１３プライマーを用いて挿入断片の一部の配列を決定した結果、これまでに解析されているβサブユニットＮ末端を含む塩基配列が確認された。この配列を手がかりにプライマーを順次作製して用い、挿入断片の塩基配列を決定した。結果を配列番号１５に示す。また、この塩基配列に含まれるＯＲＦがコードするアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
βサブユニットは、全部で４２５個のアミノ酸残基から構成されており、すでに得られているＮ末端アミノ酸配列と比較して、そのうち２２残基はシグナルペプチドであると考えらる。アミノ酸配列から計算される分子量は４５，２７６Ｄａであり、シグナルペプチドを除いた分子量４２，７３１Ｄａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求められたＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットの分子量４３ｋＤａとほぼ同等の値であった。βサブユニットのアミノ酸配列中には、シトクロームｃにおいてヘムとの結合モチーフ（配列番号１８）が３ヶ所に確認された。このＯＲＦはαサブユニット構造遺伝子のＯＲＦのすぐ下流に位置し、開始コドンの上流にＳＤ配列と思われる配列が存在した。
得られたアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行ったところ、ラルストニア・ソアナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のオキシドレダクターゼ脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと６５％、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）由来のソルビトール脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと４８％、エルビニア・シプリペディイ（Ｅｒｉｗｉｎｉａ  ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ）由来のグルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットと４４％、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）由来２−ケト−グルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットとアミノ酸レベルて４６．４％と、全体にわたって高い相同性を示していた。またこれらのシトクロームｃのアミノ酸配列中には、ヘム結合モチーフ（配列番号１８）配列が保存されていた。
尚、ＫＳ１株のＧＤＨβサブユニット構造遺伝子は、Ｊ２３１５株のＧＤＨβサブユニット構造遺伝子と、塩基配列レベルで９２．０％、アミノ酸レベルで９２．２％の相同性を有している。
産業上の利用の可能性
本発明により、ブルクホルデリア属微生物のＧＤＨβサブユニット及びそれをコードするＤＮＡが提供される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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