(57)【要約】この発明は、ハンチントン病遺伝子産物の転写に関連するタンパク質因子として、配列番号２および配列番号４のそれぞれのアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製されたハンチントン病遺伝子転写因子を提供する。またこの発明は、この転写因子をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらの発明は、ＨＤにおける病変異型ハンチンチンの生成を人為的に制御する治療技術の開発や、ＨＤの選択的な神経細胞死に対する治療法、治療薬の開発に有用である。
2003044197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製されたハンチントン病遺伝子転写因子。
【請求項２】
ハンチントン病遺伝子転写調節領域に存在する配列番号７の塩基配列のうち、第１４４−１５０番目配列、第１６４−１７０番目配列および第１８４−１９０番目配列の少なくとも一つを認識する請求項１のハンチントン病遺伝子転写因子。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製されたハンチントン病遺伝子転写因子。
【請求項４】
ハンチントン病遺伝子転写調節領域に存在する配列番号７の塩基配列のうち、第１４４−１５０番目配列、第１６４−１７０番目配列および第１８４−１９０番目配列の少なくとも一つを認識する請求項３のハンチントン病遺伝子転写因子。
【請求項５】
請求項１のハンチントン病遺伝子転写因子をコードする、単離精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１の塩基配列を有する請求項５のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３のハンチントン病遺伝子転写因子をコードする、単離精製されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号３の塩基配列を有する請求項７のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項５または６のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、１０塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項７または８のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、１０塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項５または６のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項１２】
請求項７または８のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１１の組換えベクターによる形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１２の組換えベクターによる形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１のハンチントン病遺伝子転写因子に対する抗体。
【請求項１６】
請求項３のハンチントン病遺伝子転写因子に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、ハンチントン病遺伝子の転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ハンチントン病遺伝子の遺伝子産物の転写に関与し、ハンチントン病の発病等に重要な役割を果たすハンチントン病遺伝子の転写因子と、この因子を利用するための各種遺伝子材料に関するものである。
背景技術
ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＨＤ）は、常染色体優性遺伝を示す神経変性疾患の一つである。このＨＤ発症の本態は、ＨＤ病原因遺伝子（ＨＤ遺伝子）の第１エクソン内に存在するＣＡＧリピート配列の特異的な増大に伴いＨＤ遺伝子がコードする機能不明なタンパク質ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）のＮ末端側に存在するグルタミン残基が異常伸長してポリグルタミン配列を形成することに起因すると考えられている。またＨＤ遺伝子は様々な組織で発現しているにも関わらず、選択的な神経細胞の変性脱落を示すことも知られている。
神経細胞死の選択性の重要な要因として、原因遺伝子の発現制御が考えられる。事実、マウスモデルの研究は、変異型ハンチンチン発現量の抑制が疾患症状を改善する可能性を示唆している（Ｃｅｌｌ  １０１：５７−６６，２０００）。
前記のとおり、ＨＤ遺伝子の発現制御機構を解明することがＨＤの新しい治療法や治療薬の開発にとって重要かつ不可欠であると考えられる。しかしながら、ヒトＨＤ遺伝子について、その転写に関与する分子（転写因子）は未だ見出されていない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ヒトＨＤ遺伝子の転写因子を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、このＨＤ転写因子をコードするポリヌクレオチドや抗体等を提供することを課題としてもいる。
発明の開示
この発明は、第１の態様として、配列番号２および配列番号４のそれぞれのアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製されたハンチントン病遺伝子転写因子を提供する。この第１の態様において、ハンチントン病遺伝子転写因子は、ハンチントン病遺伝子転写調節領域に存在する配列番号７の塩基配列のうち、第１４４−１５０番目配列、第１６４−１７０番目配列および第１８４−１９０番目配列の少なくとも一つを認識することを特徴の一つとしている。
この発明は、第２の態様として、前記のそれぞれのハンチントン病遺伝子転写因子をコードする、単離精製されたポリヌクレオチドを提供する。
この第２態様における具体的な態様は、配列番号１および配列番号３のそれぞれの塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
この発明は、第３の態様として、前記のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、１０塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
この発明は、第４の態様として、前記のポリヌクレオチドを保有する組換えベクターを提供する。
この発明は、第５の態様として、前記の組換えベクターによる形質転換細胞を提供する。
この発明は、第６の態様として、前記のハンチントン病遺伝子転写因子に対する抗体を提供する。
なお、この発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安として１００ｂｐ以上の断片をポリヌクレオチド、１００ｂｐ未満の断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。
発明を実施するための最良の形態
この発明の第１の態様は、配列番号２および配列番号４のそれぞれのアミノ酸配列を有することを特徴とするＨＤ遺伝子転写因子［以下、「ＨＤ／ＴＦ」と記載することがある］である。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＤ遺伝子転写因子（ＨＤ／ＴＦ−１）と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＤ遺伝子転写因子（ＨＤ／ＴＦ−２）である。
この発明の転写因子ＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２は、ＨＤ遺伝子の転写の開始に関与する機能（転写開始因子）、転写産物の伸長を正または負に調節する機能（転写伸長因子）、および転写調節に関与する機能（転写調節因子）のうち、少なくとも１つの機能を有するタンパク質である。なお、ＨＤ遺伝子は公知（Ｃｅｌｌ７２：９７１−９８３，１９９３；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５：７０７−７１５，１９９５；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ３４０２０）である。配列番号７は、この公知のＨＤ遺伝子の一部ゲノム配列である。ＨＤ遺伝子の転写は配列番号７の第２１９番目ｇあるいは第２２９番目ｃから開始し、第３６４−３６６番目のａｔｇコドンからタンパク質がコードされている。この発明の転写因子ＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２は、ＨＤ遺伝子の転写調節領域中の第１４４−１５０番目配列、第１６４−１７０番目配列および第１８４−１９０番目配列に存在する「ｇｃｃｇｇｃｇ」配列を認識する（すなわち、この発明の転写因子はこのｇｃｃｇｇｃｇに結合する）。しかもこの３箇所のｇｃｃｇｇｃｇ配列はそれぞれ１３塩基配列を介して連続的に存在するという特徴を有している。従って、この発明の転写因子ＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２は、この特徴的なｇｃｃｇｇｃｇ配列に結合するタンパク質として定義することもできる。
この発明のＨＤ遺伝子転写因子は、ＨＤにおける病変異型ハンチンチンの生成を人為的に制御する治療技術の開発や、ＨＤの選択的な神経細胞死に対する治療法、治療薬の開発に有用である。具体的には、この転写因子に拮抗的または促進的に作用する低分子化合物をスクリーニングすることによって、新たな治療薬の開発が期待される。また、このこれらの転写因子またはその一部断片（ペプチド）は、抗体作製の抗原としても使用される。なお、低分子化合物のスクリーニング等においては、前記のｇｃｃｇｇｃｇ配列を含む配列（例えば精製ポリヌクレオチドや精製オリゴヌクレオチド等）を利用することもできる。
この発明の転写因子ＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２は、それぞれ、ヒトの細胞から単離する方法、配列番号２および４のアミノ酸配列に基づき化学合成によってポリペプチドを調製する方法等によって得ることができる。また、この発明の形質転換細胞から単離・精製する方法によって大量に生産することができる。すなわち、形質転換体細胞を培養し、その培養物から、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって単離、精製することによりＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２をそれぞれ大量に得ることができる。なお、このような遺伝子工学的手法によって得られたＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２には、それぞれ他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明のＨＤ遺伝子転写因子の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
また、この第１態様の転写因子には、配列番号２および４における一部連続配列からなるペプチド（５アミノ酸残基以上）もその範囲に含まれる。このようなペプチドは、例えばこの発明の転写因子に対する抗体作製のための抗原として使用できる。
この発明の第２の態様は、前記２種類のＨＤ遺伝子転写因子をそれぞれコードするポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、ＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２をそれぞれコードするゲノム遺伝子ＤＮＡ、ゲノム遺伝子から転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ（配列番号１および３）が含まれる。また、配列番号１および３のポリヌクレオチドは、その１本鎖形態とその相補鎖、およびそれらが対合した２本鎖形態が含まれる。
ＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２をそれぞれコードするゲノム遺伝子ＤＮＡは、例えば、配列番号１および３の塩基配列またはその一部配列からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
また、ｃＤＮＡは、ヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成することができる。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でもよい。ｃＤＮＡは、公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，１６１−１７０，１９８２；Ｊ．Ｇｅｎｅ２５，２６３−２６９，１９８３；Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０，１９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。これらのｃＤＮＡは、例えばＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２の遺伝子工学的な製造に使用することができる。
この発明の第３の態様は、前記第２態様のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、１０塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、具体的には、前記のポリヌクレオチドをスクリーニングする場合等に使用するオリゴヌクレオチドプローブ、または前記のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅する際に使用するオリゴヌクレオチドプライマー等である。
オリゴヌクレオチドプローブは、前記のゲノム遺伝子または前記ポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片である。例えば、配列番号１または３の塩基配列における連続１０〜９９塩基のＤＮＡ断片等である。ここで、ストリンジェント条件とは、前記の遺伝子またはポリヌクレオチドプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許Ｎｏ．６，１００，０３７等に詳しく規定されている。
また、オリゴヌクレオチドプライマーは、前記の遺伝子やポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するための少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットである。このようなプライマーセットは、配列番号１または３の塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
この発明の第４の態様は、前記第２態様のポリヌクレオチドを保有する組換えベクターである。このベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２を遺伝子工学的に生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、前記のゲノム遺伝子ＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することができる。
この発明の第５の態様は、前記の組換えベクターによる形質転換細胞である。例えば、前記の組換えベクターを用いてＨＤ／ＴＦ−１やＨＤ／ＴＦ−２を遺伝子工学的に製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
この発明の第６の態様は、前記のＨＤ遺伝子転写因子に対する抗体である。この抗体は、ＨＤ遺伝子転写因子を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、ＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２のそれぞれのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、前記のＨＤ／ＴＦ−１およびＨＤ／ＴＦ−２またはそれらのペプチドを抗原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエローマと融合させてハイブリドーマを作製すれば、モノクローナル抗体を産生することができる。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例
実施例１
ＨＤ遺伝子転写因子の単離
ＨＤ遺伝子の転写因子を単離するため、ＨＤ遺伝子の−３６４〜＋１５８領域（プロモーター領域、転写開始点、ＣＡＧリピート配列を含む：図１参照）をＰＣＲ増幅し、ｐＨＩＳｉまたはｐＨＩＳｉ−１のＳｍａＩサイトに挿入してレポーターコンストラクトを構築した。このレポーターコンストラクトを用いた酵母のＯｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍにより、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＨｕｍａｎ  Ｔｅｓｔｉｓ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ）をスクリーニングした。その結果、３つの陽性ｃＤＮＡクローン２、８および１１が同定された。
なお、Ｏｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ全ての手続は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従った。
次に、各クローンの結合領域を決定するために、ＨＤ遺伝子の−３６４〜＋１５８領域をさらに次の４つの領域に分けたレポーターコンストラクト；−３６４〜−２１３（Ｒ１）、−２３０〜−１１３（Ｒ２）、−１３１〜＋５１（Ｒ３）および＋２９〜＋１５８（Ｒ４）を作成し（図１参照）、酵母のＯｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて解析を行った。図２に示したように、３つの陽性クローンのうち、クローン２および８が、ＨＤ遺伝子転写調節領域であるＲ２領域への結合活性を示すことが確認された。すなわち、ｃＤＮＡクローン２（約１．３ｋｂ）およびｃＤＮＡクローン８（約１．８ｋｂ）の発現産物が、ＨＤ遺伝子転写因子であることが明らかとなった。
これらのｃＤＮＡクローン２および８は、それぞれベクターｐＡＣＴ２のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入されていた。
実施例２
クローン２およびクローン８の発現解析
実施例１で単離したｃＤＮＡクローン２およびｃＤＮＡクローン８のヒト組織における発現をノーザンブロットにより解析した。ノーザンブロッティングは、ＴＯＹＯＢＯ社のＧｅｎｅ  ＨｙｎｔｅｒＴＭｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｍＲＮＡ  ｂｌｏｔ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ）を用いて行った。プローブＤＮＡはｃＤＮＡクローン２および８を含むｐＡＣＴ２ののＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイト断片を放射性同位元素で標識したものを使用した。１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＨｅｒｒｉｎｇ  ｔｅｓｔｉｓ  ＤＮＡを含む１．１×Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．５５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｏｈｏｓｐｈａｔｅ−１．１ｍＭ  ＥＤＴＡ−７．７％ＳＤＳ）中でメンブレンとプローブＤＮＡとを６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。メンブレンの洗浄は、２×ＳＳＣ、室温、５分間２回、引き続き２×ＳＳＣ−１％ＳＤＳ、６５℃、３０分間１回の条件で行った。その後、Ｘ線フィルムへの露光を行うことでシグナルを得た。
その結果、図３に示したとおり、ｃＤＮＡクローン２および８にそれぞれ対応するヒト遺伝子は、前全身的な発現パターンを示すことが確認された。また、ｃＤＮＡクローン２のｍＲＮＡサイズは約１．８ｋｂ、ｃＤＮＡクローン８のｍＲＮＡは約５．５ｋｂであることも判明した。
実施例３
完全長ｃＤＮＡの取得
実施例１で得られたｃＤＮＡクローン２および８は、実施例２の結果により判明したｍＲＮＡよりもサイズが小さいため、以下の方法により、それぞれの完全長ｃＤＮＡを単離した。
すなわち、クローン２については、ヒト精巣由来のｍＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＨｕｍａｎ  Ｔｅｓｔｉｓ  ｍＲＮＡ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成し、ｃＤＮＡクローン２を含む組換えベクターｐＡＣＴ２のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイト断片を放射性同位元素で標識したものをプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。なお、ｃＤＮＡライブラリーの作製は、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔを用い、そのプロトコールに従って行った。
その結果、サイズの異なる２つのｃＤＮＡが得られた。１つはＤＮＡサイズが約１．５ｋｂ（ｃＤＮＡクローン２Ｍ）であり、もう一方はＤＮＡサイズが１．８ｋｂ（ｃＤＮＡクローン２Ｌ）であることから、ｃＤＮＡクローン２Ｌが完全長ｃＤＮＡであることが判明した。そして、このｃＤＮＡクローン２Ｌの発現産物をＨＤ遺伝子転写因子ＨＤ／ＴＦ−１とした。
一方、クローン８については、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングからは完全長ｃＤＮＡが得られなかったため、５’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法によって５’領域をカバーするｃＤＮＡを取得した。鋳型ｍＲＮＡは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＨｕｍａｎ  Ｔｅｓｔｉｓ  ｍＲＮＡを用い、ＰＣＲプライマーは配列番号５（ｃＤＮＡクローン８の３６８ｎｔ〜３９３ｎｔ領域）および配列番号６（ｃＤＮＡクローン８の３１２ｎｔ〜３３３ｎｔ領域）の合成オリゴヌクレオチドを使用した。なお、この５’ＲＡＣＥ法は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、そのプロトコールに準じて行った。
その結果、実施例１で取得した５’領域断片は既に開始コドン（メチオニン）を含む翻訳領域を完全にコードしていることが明らかとなった。クローン８のｃＤＮＡサイズとｍＲＮＡサイズの違いは、３’非翻訳領域の長さの違いによるものであると判断された。ｃＤＮＡクローン８がコードするタンパク質をＨＤ遺伝子転写因子ＨＤ／ＴＦ−２とした。
実施例４
組換え発現ベクターの構築
ｃＤＮＡクローン２Ｌの翻訳領域（配列番号２のアミノ酸位置１〜３８７に対応）、ｃＤＮＡクローン８の翻訳領域（配列番号４のアミノ酸位置１〜５１３に対応）をそれぞれＰＣＲ増幅し、発現ベクターｐＥＧＦＰ−ＮおよびｐＥＧＦＰ−ＣのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイト、発現ベクターｐＧＥＸ−５Ｘ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）およびｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイト、発現ベクターｐＢｓＣＡＧ−２のＮｈｅＩ−ＮｓｔＩサイト（ｃＤＮＡクローン２Ｌ）およびＮｈｅＩサイト（ｃＤＮＡクローン８）へ導入して、組換え発現ベクターを構築した。また、ｃＤＮＡクローン２Ｌのアミノ酸位置１〜１０５、１０６〜３２１、３２２〜３８７にそれぞれ対応するＤＮＡ断片、ｃＤＮＡクローン８のアミノ酸位置１〜１６８、１６９〜４３７、４３８〜５１３にそれぞれ対応するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、発現ベクターｐＧＥＸ−５のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに導入して組換え発現ベクターを構築した。構築した組換えベクターは以下のとおりである。
ベクター１：ｐＥＧＦＰ−Ｎ／２Ｌ（１−３８７）
ベクター２：ｐＥＧＦＰ−Ｎ／８（１−５１３）
ベクター３：ｐＥＧＦＰ−Ｃ／２Ｌ（１−３８７）
ベクター４：ｐＥＧＦＰ−Ｃ／８（１−５１３）
ベクター５：ｐＧＥＸ−５Ｘ／２Ｌ（１−３８７）
ベクター６：ｐＧＥＸ−５Ｘ／８（１−５１３）
ベクター７：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）／２Ｌ（１−３８７）
ベクター８：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）８（１−５１３）
ベクター９：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／２Ｌ（１−３８７）
ベクター１０：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／８（１−５１３）
ベクター１１：ｐＢｓＣＡＧ−２／２Ｌ（１−３８７）
ベクター１２：ｐＢｓＣＡＧ−２／８（１−５１３）
ベクター１３：ｐＧＥＸ−５／２Ｌ（１−１０５）
ベクター１４：ｐＧＥＸ−５／２Ｌ（１０６−３２１）
ベクター１５：ｐＧＥＸ−５／２Ｌ（３２２−３８７）
ベクター１６：ｐＧＥＸ−５／８（１−１６８）
ベクター１７：ｐＧＥＸ−５／８（１６９−４３７）
ベクター１８：ｐＧＥＸ−５／８（４３８−５１３）
実施例５
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ結合解析
実施例３で取得されたクローン２Ｌおよびクローン８のそれぞれの遺伝子産物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系においてＤＮＡ結合能を有するかをゲルシフトアッセイ法により解析した。プローブは、実施例１で使用したＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４断片を放射性同位元素で標識したＤＮＡ断片を使用した。また、ターゲットタンパク質は、実施例４で構築したベクター５が発現するクローン２Ｌ遺伝子産物（ＨＤ／ＴＦ−１）とＧＳＴとの融合タンパク質、およびベクター６が発現するクローン８遺伝子産物（ＨＤ／ＴＦ−２）とＧＳＴとの融合タンパク質を使用した。
すなわち、融合タンパク質５０ｎｇ〜２００ｎｇ、２μｇ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）を含む反応溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）−５０ｍＭ  ＫＣｌ−１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−１ｍＭ  ＤＤＴ）中で室温５分間インキュベーションを行った後、３２Ｐで標識したプローブＤＮＡを０．１ｎｇ反応溶液に加え、室温で２０分間、結合反応を行った。反応終了後、反応溶液を４％ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ）に供した。電気泳動の終了したゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに露光してシグナルを検出した。
また、競合活性の試験は、実施例４で構築したベクター５および６がそれぞれ発現する融合タンパク質１００ｎｇを使用し、次の条件を除き、前記の結合活性試験と同一に行った。すなわち、室温５分間のインキュベーション時に、１０ｎｇ（プローブＤＮＡの１００倍量）の非標識ＤＮＡを競合ＤＮＡとして加えた後、３２Ｐで標識したプローブＤＮＡを０．１ｎｇ反応溶液に加え、室温で２０分間、結合反応を行った。また、プローブＤＮＡはＲ２およびＲ３断片を使用した。
結合活性の試験結果は、図４Ａおよび図５Ａに示したとおりであり、クローン２Ｌ遺伝子産物（ＨＤ／ＴＦ−１）およびクローン８遺伝子産物（ＨＤ／ＴＦ−２）とＧＳＴとの融合タンパク質は、標識したＲ２プローブとＲ３プローブとに対して結合活性を示した。
また、競合活性の試験結果は図４Ｂおよび図５Ｂに示したとおりであり、融合タンパク質の結合はＲ２領域に対して特異的であり、Ｒ３領域には非特異的であることが確認された。
実施例６
ドメイン機能解析
実施例５の結果から、クローン２Ｌ遺伝子産物（ＨＤ／ＴＦ−１）およびクローン８遺伝子産物（ＨＤ／ＴＦ−２）がＨＤ遺伝子のＲ２領域に対して特異的に結合することが確認されたことから、次に、クローン２Ｌ遺伝子産物のどの領域がＨＤ遺伝子との結合に関与しているのかを解析した。
すなわち、実施例４で構築したベクター１３、１４、１５がそれぞれ発現する融合タンパク質を用い、実施例５と同様の結合活性試験を行った。プローブＤＮＡは標識Ｒ２断片を用いた。
結果は図６に示したとおりであり、クローン２Ｌ遺伝子産物のＣ末端領域がＲ２プローブＤＮＡとの結合活性を示したことから、この領域がＨＤ遺伝子転写調節領域に対する結合領域であることが明らかとなった。
次にこのＣ末領域がＨＤ遺伝子転写調節領域のどのような配列を認識するのかを解析した。すなわち、実施例４で構築したベクター１５が発現する融合タンパク質、およびクローン２Ｌ遺伝子産物のＣ末領域と高い相同性を示すクローン８遺伝子産物のＣ末領域をコードする様に構築したベクター１８が発現する融合タンパク質１０ｎｇ〜４００ｎｇをそれぞれ用い、実施例５と同様の結合反応を行った。ただし、プローブＤＮＡは標識Ｒ１＋Ｒ２断片（−３６４〜−１１３）を用いた。その後、これら反応溶液中に１０×ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液（１５ｕｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ，５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１／１０量加えて、２５℃で１分間酵素消化反応を行った。ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｓｔｏｐ溶液（１．６Ｍ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，９５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．８％ＳＤＳ，０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｃａｌｆ  ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡ）を加えて反応を停止させ、ＤＮＡ断片の精製を行った。精製ＤＮＡをローディングダイ（８０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８），０．０２５％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，０．０２５％ｘｙｌｅｎｅｃｙａｎｏｌ）に溶解し、８Ｍ  ｕｒｅａ−８％ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌを用いての電気泳動による分離を行った。
結果は、図７に示したとおりであり、クローン２Ｌおよびクローン８遺伝子産物のＣ末領域（ＤＮＡ結合ドメイン）が、ＨＤ遺伝子転写調節領域中の７ｂｐのｇｃｃｇｇｃｇ配列を認識したこと、およびこの配列が１３ｂｐのスペーサー配列を挟んで３ヶ所に位置することから、これら領域がＨＤ遺伝子転写調節領域における新規シスエレメントを構成していることが確認された。
実施例７
細胞内局所解析
実施例４で構築したベクター１〜４をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に細胞を４％パラホルムアルデヒド固定し、顕微鏡下で蛍光を観察した。
その結果、クローン２Ｌ遺伝子産物とＧＦＰとの融合タンパク質は核内への局在を示すものも観察されたが、クローン８のそれは細胞質にのみ発現が観察された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、ＨＤ遺伝子の転写因子が提供される。この転写因子によって、ＨＤにおける病変異型ハンチンチンの生成を人為的に制御する治療技術の開発や、ＨＤの選択的な神経細胞死に対する治療法、治療薬の開発が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＤ遺伝子転写因子をコードするｃＤＮＡクローンのＯｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍによる分離に使用したＨＤ遺伝子の構成と、プローブＤＮＡの領域を示す模式図である。
図２は、Ｏｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍによって単離された３つのクローンの各レポーターコンストラクトを持つ株における結合活性を試験した結果である。
図３は、クローン２Ｌ  ｍＲＮＡおよびクローン８ｍＲＮＡのヒト組織における発現を調べたノーザンブロッティング分析の結果である。レーン１：心臓、２：脳、３：肝臓、４：膵臓、５：胎盤、６：肺、７：胃、８：空腸、９：回腸、１０：大腸、１１：直腸、１２：筋、１３：子宮、１４：膀胱、１５：腎臓、１６：脾臓、１７：子宮頚、１８：卵巣、１９：精巣、２０：前立腺。
図４Ａはクローン２Ｌ遺伝子産物とＨＤ遺伝子断片との結合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果であり、Ｂは競合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果である。
図５Ａはクローン８遺伝子産物とＨＤ遺伝子断片との結合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果であり、Ｂは競合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果である。
図６は、ＨＤ遺伝子に対するクローン２Ｌ遺伝子産物の結合領域を調べたゲルシフトアッセイの結果（右の泳動像）と、この試験に用いたＧＳＴ融合タンパク質の構成を示した模式図（左）である。
図７は、クローン２Ｌおよびクローン８遺伝子産物のＣ末領域を用いて、両産物が認識するＨＤ遺伝子転写調節領域中のＤＮＡ配列を調べたＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント解析の結果（左：全体の泳動像、右：拡大像）、並びにこの試験に用いたＨＤ遺伝子転写調節領域中のＤＮＡ断片の位置の模式図とプロテクトされたコア配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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