(57)【要約】反応液導入流路部、反応流路部並びに検出流路部がマイクロチャンネルとして基板上に順次に連通配設された分析チップにおいて、反応流路部マイクロチャンネルには、抗体を支持させたビーズ体の装入部とともに、このビーズ体の流れせき止め部とが設けられている酵素免疫分析チップを構成し、これを用いて流れせき止め部を越えて流れる酵素反応生成物を分析する。
2003062823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液導入流路部、反応流路部並びに検出流路部がマイクロチャンネルとして基板上に順次に連通配設された分析チップにおいて、反応流路部マイクロチャンネルには、抗体を支持させたビーズ体の装入部とともに、このビーズ体の流れせき止め部とが設けられていることを特徴とする酵素免疫分析チップ。
【請求項２】
抗体を支持させたビーズ体の流れせき止め部においては、反応流路部マイクロチャンネルの幅もしくは深さが、このビーズ体の流れをせき止めるに充分な狭さもしくは浅さであることを特徴とする請求項１の酵素免疫分析チップ。
【請求項３】
複数の並列配置された反応流路部マイクロチャンネルが、検出点の前方で一つの検出流路部マイクロチャンネルに各々連通されていることを特徴とする請求項１または２の酵素免疫分析チップ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかの分析チップによる酵素免疫分析方法であって、反応流路部マイクロチャンネル内での酵素を標識とする抗原抗体反応によって生成した酵素反応生成物を検出流路部マイクロチャンネルにおいて検出することを特徴とする分析チップによる酵素免疫分析方法。
【請求項５】
非接触で酵素反応生成物を検出することを特徴とする請求項４の酵素免疫分析方法。
【請求項６】
熱レンズ顕微鏡システムにより酵素反応生成物を検出することを特徴とする請求項５の酵素免疫分析方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、酵素免疫分析チップと酵素免疫分析方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、マイクロチップ上において、高い精度で効率的に酵素免疫分析を行うことのできる、新しいマイクロチップとこれを用いた分析方法に関するものである。
背景技術
従来より、免疫分析は医療や生化学などの分野で重要な分析方法のひとつであることが知られている。しかし酵素免疫分析方法（ＥＬＩＳＡ）など従来の方法では分析に一日以上の時間を要し、また操作が煩雑、試薬コストが高いという欠点がある。そこでこの出願の発明者らは、これまで一枚のガラスチップ等の基板上にμｍオーダーのマイクロチャンネル（微細溝）を形成したマイクロチップを使用することにより、その特性である短い拡散移動距離、大きな比界面積を利用して様々な化学システムを集積化してきたことの実績と知見を踏まえて、そのひとつとして免疫分析法のマイクロチップへの集積化を行ってきた。その結果の一つとして、金コロイドを標識としてポリスチレンビーズ表面を熱レンズ顕微鏡：ＴＬＭで測定する分析法がすでに開発されてきている。これにより分析時間の短縮、試薬の少量化を実現した。だが、この方法では、球体の微小表面を測定するため測定点毎のばらつきが大きく、ダイナミックレンジがせまく、測定に熟練が必要であるといった問題点があった。
この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の問題点を解消し、高い精度で効率よく免疫分析を行うことを可能とする、新しい免疫分析用マイクロチップとこれを用いた分析方法を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、上記の課題を解決するための方策として、ビーズ表面ではなく、比較的容易に測定できる液相を測定するシステムにすることで、上記問題点が解決できると着想し、酵素を標識として基質溶液を呈色させ測定する酵素免疫分析システムをマイクロチップ内に集積化することで、この出願の発明を完成した。
すなわち、この出願の発明は、第１には、反応液導入流路部、反応流路部並びに検出流路部がマイクロチャンネルとして基板上に順次に連通配設された分析チップにおいて、反応流路部マイクロチャンネルには、抗体を支持させたビーズ体の装入部とともに、このビーズ体の流れせき止め部とが設けられていることを特徴とする酵素免疫分析チップを提供する。
第２には、抗体を支持させたビーズ体の流れせき止め部においては、反応流路部マイクロチャンネルの幅もしくは深さが、このビーズ体の流れをせき止めるに充分な狭さもしくは浅さであることを特徴とする上記の酵素免疫分析チップを提供し、第３には、複数の並列配置された反応流路部マイクロチャンネルが、検出点の前方で一つの検出流路部マイクロチャンネルに各々連通されていることを特徴とする酵素免疫分析チップを提供する。
そして、この出願の発明は、第４には、上記第１ないし第３のいずれかの発明の分析チップによる酵素免疫分析方法であって、反応流路部マイクロチャンネル内での酵素を標識とする抗原抗体反応によって生成した酵素反応生成物を検出流路部マイクロチャンネルにおいて検定することを特徴とする分析チップによる酵素免疫分析方法を提供し、第５には、非接触で酵素反応生成物を検出することを特徴とする酵素免疫分析方法を、第６には、熱レンズ顕微鏡システムにより酵素反応生成物を検出することを特徴とする酵素免疫分析方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
まず、この出願の発明の酵素免疫分析チップにおいては、たとえば図１に模式的に示した例に沿って説明すると、ガラス、シリコン、樹脂等の基板（１）上に、反応液導入流路部（２）、反応流路部（３）並びに検出流路部（４）がマイクロチャンネル（微細溝）として順次に連通配設されたマイクロチップにおいて、反応流路部（３）マイクロチャンネルには、抗体を支持させたビーズ体（５）の装入部（３Ａ）とともに、このビーズ体（５）の下流域への流れ（移動）をせき止める流れせき止め部（３Ｂ）とが設けられている。
この図１の例では、流れせき止め部（３Ｂ）は、反応流路部（３）のマイクロチャンネルの深さ（Ｈ０）よりもその深さ（Ｈ）を浅くしてビーズ体（５）の流れをせき止めるようにしている。
流れせき止め部（３Ｂ）については、この例のようなマイクロチャンネルの深さ調整による方法だけでなく、マイクロチャンネルの幅（Ｗ）を狭くしてビーズ体（５）の流れをせき止める構造とする等の各種の方策が採用されてもよい。磁性ビーズ体を用い、外部磁場の印加手段の配置をもって流れせき止め部（３Ｂ）を構成するようにしてもよい。
たとえばマイクロチャンネルの構造の調整によって、深さ（Ｈ）や幅（Ｗ）でビーズ体をせき止めるには、ビーズ体の径（Ｄ）との関係が、マイクロチャンネル装入部（３Ａ）に装入されるビーズ体の装入量（体積）、その比重、そしてマイクロチャンネル内での液流速等を考慮して定められることになる。たとえば一般的目安としては、Ｈ＜Ｄ、Ｗ＜Ｄが考慮されるが、Ｈ＜（２／３）Ｄ、Ｗ＜（２／３）Ｄがより好ましく考慮される。
反応液導入流路部（２）、反応流路部（３）、そして検出流路部（４）ともに、従来と同様にリソグラフィーによるエッチング等の手段で形成することができる。深さ（Ｈ）や幅（Ｗ）の調整についても同様である。これら流路部マイクロチャンネルの通常の深さや幅については、目的や対象物の種類、そして反応に応じて定めることができ、たとえば、その幅については５００μｍ以下、深さは３００μｍ以下を一般的な目安とすることができる。
反応液導入流路部（２）の先端には導入溝穴部を、また検出流路部（４）の終端には排出用溝穴部を設けること等の従来より知られているマイクロチップへの集積化の手段が適宜に採用されてよい。基板（１）上へのカバープレートの積層等も同様である。
たとえば以上のようなこの出願の発明の分析チップを用いることにより、従来のようにビーズ表面を測定対象とせずに、酵素を標識として、流れせき止め部（３Ｂ）を越えて流れる基質溶液の反応による呈色等を測定対象とすることが可能になり、より高精度での簡便、効率的な酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）が可能となる。
なお、反応・分析時には、マイクロチャンネルやビーズ体の装入部に気泡が混入すると分析上好ましくない場合があることから、たとえばマイクロチャンネル上部のチップ表面に配置する透明カバー体やチップ基板に微少孔や微少排気路を設けることや、図１の平面Ｙ字型のマイクロチャンネル流路の一方に試料や試薬を供給する際に、他方のマイクロチャンネル流路にまでこれらが流れ込むように気泡の混入を抑えること等のことが、そして、そのための流路設計が考慮されることになる。ビーズ体の振動あるいは攪拌等によって気泡を取り除くこと等も考慮される。
また、定量分析のために一定量のビーズを導入することが必要な場合には、ビーズの個数を数えるのではなく、流路設計により体積、すなわち流路長さにより判定できるようにすることも考慮されている。
もちろん図１は、マイクロチップの基本構成を説明したものであって、これに限定されることはない。たとえば一枚の基板（１）上に、複数の反応流路部と複数の検出流路部が配設されていてもよいし、さらには、たとえば図２に例示したように、検出点を一点にし、一つの検出流路部（４）に、並列配置した複数の反応流路部（３）の各々が連通されるようにしてもよい。この場合には、同時に他種類の分析を行うことを目的とし、まず初めに各反応流路部（３）のチャネルに反応に必要な試薬溶液などを同時に導入して一斉に反応させた後、酵素反応基質溶液を各チャネルごとに順次導入して、反応生成物を合流部より下流で検出することができる。
各チャネルの分析結果を一カ所の検出点で測ることができ、検出器を複数準備したり、検出器もしくはチップを移動させたりする必要がないため、簡便で迅速な分析が可能となる。
免疫分析のための検出については非接触で、たとえば光学的に行うことなどが可能である。たとえば、この出願の発明者らが開発してきた熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ）システムを有効に用いることができる。
この出願の発明によって、標識物質に酵素を用い、抗体を支持させた樹脂のビーズ体をマイクロチャンネルに装入してその流れをせき止めることで、反応生成物を液相中で簡便に測定することが可能になる。
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
実  施  例
実施例１
３ｃｍ×７ｃｍの石英ガラス製基板に、図１に示したように、深さ（Ｈ０）１００μｍ、幅２５０μｍで、中央部のみをビーズをせき止めるために深さ（Ｈ）を１０μｍにしたせき止め部（３Ｂ）を設けた平面配置がＹ字型状のマイクロチャンネルを作製した。このマイクロチャンネル内に反応固相としてあらかじめヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）抗体を固定化した直径５０μｍ程度のポリスチレンビーズを導入し、チップ内でそのまま抗原抗体反応および洗浄操作などを行った。反応生成物の検出には、図１に示したような流路位置において、高感度な分析法である熱レンズ顕微鏡を用いた。
具体的には、濃度の異なるＩＦＮ−γを含む試料、ビオチン化ＩＦＮ−γ抗体、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を順番にポンプで流し反応させる。反応後前記Ｙ字のマイクロチャンネルの一方から４−ＡＡ（アミノアンチピリン）、他方からＴＯＯＳ、Ｈ２Ｏ２を流し、酵素と反応させる。反応により生じた５５０ｎｍに吸収極大波長を持つ生成物をせき止め部の下流で熱レンズ顕微鏡（励起光：ＹＡＧレーザー５３２ｎｍ、プローブ光学導体レーザー６７０ｎｍ）で測定した。
作製したマイクロチップ酵素免疫分析システムでＩＦＮ−γの分析を試みたところ、定量的な酵素反応生成物の信号が確認できた。さらに測定に十分な信号強度を得るため、試薬の濃度や流速、反応時間を変えて最適条件を求めた。抗原／抗体反応時は、流速１μｌ／ｍｉｎ、反応時間１５分以上、測定時は基質濃度１×１０−４Ｍ、流速０．１μｌ／ｍｉｎ以下で良好な信号が確認できた。この条件下で試料濃度に対する信号強度の検量線を作成した。バルクでの分析と比較して、分析時間は２日から９０分に減少し、検出限界は約８桁、マイクロチップ内で金コロイド標識した方法と比較して検出限界が約２桁向上した。
さらに温度と信号強度の関係を調べたところ、約５０℃で信号が最大となり、室温の約５倍の信号強度となった。温度を変化させ信号強度をあげることによりさらに検出限界が下がることが確認された。
実施例２
イボニシなどの海産巻き貝一個体中に微量に含まれる、内分泌攪乱物質の一種とされる性ホルモン１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌの定量を行った。
まず、数ｃｍ角のバイレックスガラス基板中に、深さ１００μｍ、幅２５０μｍで、中央部のみビーズをせき止めるために深さを１０μｍにしたせき止め部を設けたマイクロチャンネルを作製した。このチップに反応固相として直径１５−５０μｍ程度のポリスチレンビーズを導入し、ここに試料および各種試薬溶液を添加し、チップ内でそのまま抗原抗体反応および洗浄操作、酵素反応などを行った。生じた酵素反応生成物の検出には高感度な分析法である熱レンズ顕微鏡を用いた。
より具体的には、作製したチップのマイクロチャンネル内にあらかじめ抗１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ抗体を吸着させたビーズを導入した後、シリンジポンプを用いて１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌを含む試料と一定量のペルオキシダーゼ標識した１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌを混合した溶液を流し入れ、競合的に抗原抗体反応を行わせた。未反応物をバッファーで洗浄後、酵素基質（４−アミノアンチピリン、Ｎ−ヒドロキシスルフォプロピルアニリン誘導体、Ｈ２Ｏ２）を導入して酵素反応させ、そこで生成する発色物質を下流部で検出することにより定量を試みた。
その結果、図３に例示したように、１，０００ｐｇ／ｍＬまでの比較的低濃度の濃度範囲で検量線を作成することができた。アッセイに必要な試料体積が極めて少量であることとあわせると、小型の巻き貝一個体からの抽出液から測定するのに充分な感度を有していることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、より高精度に、簡便、かつ効率的な酵素免疫分析が可能とされる。
【図面の簡単な説明】
図１は、この出願の発明の分析チップの構成について模式的に例示した斜視図と要部縦断面図である。
図２は、マイクロチャンネルの配置の別の例を示した平面図である。
図３は、実施例２についての検量線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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