(57)【要約】神経細胞のアポトーシスを抑制または促進する物質、そのスクリーニング法、ならびにアポトーシスに関連した疾病の診断および治療方法およびキットを提供する。詳細には、ＣＧＩ−９４蛋白質の機能あるいはＣＧＩ−９４蛋白質とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制または促進し、アポトーシスを抑制または促進する物質を提供する。さらに本発明は、アポトーシスを抑制する物質としてのｐ１８ＴＦＰ蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ、該蛋白質またはＤＮＡを含むアポトーシス関連疾病治療用組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを抑制する物質。
【請求項２】
ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する物質。
【請求項３】
下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示すＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の塩基番号１４０〜６０１の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に対して６０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す蛋白質：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１５３からなる蛋白質であって、ＣＧＩ−９４と相互作用して、あるいはＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、ＣＧＩ−９４と相互作用して、あるいはＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する蛋白質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項４記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３または５記載のＤＮＡに相補的なＲＮＡ。
【請求項７】
ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを促進する物質。
【請求項８】
ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進してアポトーシスを促進する物質。
【請求項９】
試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４発現細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４発現細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
請求項９の方法により見出される、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質。
【請求項１２】
請求項１０の方法により見出される、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質。
【請求項１３】
試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯを発現する細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯを発現する細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求項１３の方法により見出される、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質。
【請求項１６】
ｐ１８ＴＦＰ蛋白質である請求項１２または１５に記載の物質。
【請求項１７】
請求項１４の方法により見出される、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質。
【請求項１８】
ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを抑制する物質を含むアポトーシス関連疾病の治療用医薬組成物。
【請求項１９】
ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する物質を含むアポトーシスに関連した疾病の治療用医薬組成物。
【請求項２０】
該物質がＰ１８ＴＦＰ蛋白質またはｐ１８ＴＦＰ  ＤＮＡである請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを促進する物質を含む細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療用医薬組成物。
【請求項２２】
ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進してアポトーシスを促進する物質を含む、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療用医薬組成物。
【請求項２３】
細胞中あるいは組織中のＣＧＩ−９４遺伝子またはＣＧＩ−９４蛋白質の発現レベルを調べることを特徴とする、アポトーシスに関連した疾病の診断方法。
【請求項２４】
細胞中あるいは組織中のＣＧＩ−９４遺伝子またはＣＧＩ−９４蛋白質の発現レベルを調べることを特徴とする、アポトーシスに関連した疾病の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、アポトーシスを抑制または促進する物質、そのスクリーニング、ならびにアポトーシスに関連した疾病の診断および治療に関する。より詳細には、本発明は、アポトーシスに関与するＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯと相互作用し、アポトーシスを惹起するＣＧＩ−９４と直接あるいはＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を通してアポトーシスを抑制或いは促進する物質に関し、詳細には、アポトーシスを抑制する蛋白質ｐ１８ＴＦＰおよびそれをコードする遺伝子に関する。さらにそれらの発現の変化によって影響を受ける細胞或いは組織の診断への応用に関する。
背景技術
細胞のアポトーシスは細胞の分化誘導など成長期にみられる生理学的な変化（Ｂｒｉ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２６，２３９（１９７２））だけでなく、その異常はアルツハイマー病（Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８９，３５（１９９５），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５２，７３（１９９７））などの神経変性疾患、癌その他（Ｂｒｉ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２６，２３９（１９７２））の病的過程においても認められる現象である。とくに、異常なアポトーシスの亢進（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，５３５（１９８９），Ｃｅｌｌ  ９７，３９５（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ  ３９９，２６３（１９９９））或いは抑制（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５０，５５（１９９１））は生体の正常な統合的機能維持を失わせ、重篤なる疾病を招来させることになる。近年、アポトーシスに関与する蛋白質ならびにそれらの生理学的ならびに病理学的メカニズムに関する研究（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０，１（１９９６），Ｃｅｌｌ  ８７，１７１（１９９６）），Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，７７３（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，１１２２（１９９７），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，１８（２００２））は分子生物学的研究の進展により飛躍的な進歩をとげつつある。しかし、その詳細なメカニズムについては、まだ不明な部分が多い。このアポトーシスのメカニズムを明らかにして、アポトーシスを制御することは、アルツハイマー病や癌をはじめとして種々の疾病の医学的治療の上で、非常に有益なことは言うまでもなく、治療上のターゲット（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７，１４５６（１９９５），Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３８，８３９（１９９５），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０，３５（１９９９））となっている。
発明が解決しようとする課題
本発明の発明者らは、遺伝子ＣＧＩ−９４の発現がアルツハイマー病初期患者脳の海馬において抑制されていることを見出した（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，７９（２００２））。しかし、この遺伝子によって産生される蛋白質の生理学的並びに病理学的な役割については現在、全く不明である（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０，７０３（２０００））。そこで、本発明発明者らはこの蛋白質（ＣＧＩ−９４）の機能を明らかにするため、鋭意研究を重ね、Ｃ末端に蛍光蛋白のＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を融合させた蛋白質（ＣＧＩ−９４−ＣＴ−ＧＦＰ）をＰＣ１２、細胞に発現させ、神経栄養因子（ＮＧＦ；Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）で分化誘導を行った。その結果、ＣＧＩ−９４−ＧＦＰを発現させた細胞ではＮＧＦ添加１２０時間後において、神経突起伸長が抑制され、アポトーシスが認められた。さらに２週間後、全細胞が死滅することが明らかにされた。一方、非発現細胞においてはＮＧＦ添加によって神経突起の伸長と生存が観察された。このように、ＣＧＩ−９４は神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを惹起するものと考えられる。ＣＧＩ−９４のアルツハイマー病初期脳での発現の抑制と、細胞死促進作用は一見矛盾するような事象であるが、おそらく初期アルツハイマー脳ではアポトーシス抑制機能が働いているためと考えられる。
さらに本発明発明者らは、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，９５７８（１９９１））として記載された方法を応用し、このＣＧＩ−９４と相互作用する蛋白質を検索した結果、細胞のアポトーシスに関与する蛋白質であるＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯがＣＧＩ−９４と強い相互作用を示す事を明らかにした。Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯはアポトーシスに際してミトコンドリアからチトクロームｃとともに細胞内に遊離され、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ２あるいはｓｕｒｖｉｖｉｎなどのアポトーシス抑制蛋白質（ＩＡＰｓ；Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の作用を阻害し、さらにｃａｓｐａｓｅ−３活性を促進することによってチトクロームＣの下流でアポトーシスを促進することが報告（Ｃｅｌｌ  １０２，３３（２０００），Ｃｅｌｌ  １０２，４３（２０００），Ｎａｔｕｒｅ  ４０６  ４０６，８５５（２０００））されている。したがって、ＣＧＩ−９４はこのＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯと相互作用をすることによってＮＧＦで分化誘導されたＰＣ１２細胞において神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを惹起したと考えられる。
以上の事実から、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質は神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを抑制するものであり、細胞、特に神経細胞のアポトーシスに関連する疾病、例えばアルツハイマー病の神経細胞死を抑制し、その進行を抑制すると考えられる。また、ＣＧＩ−９４の機能を促進する物質はアポトーシスを促進するものであり、特に細胞のアポトーシスを速やかに亢進させ、特に、細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば癌や自己免疫疾患などの治療に有効と考えられる。
さらに、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質は神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを抑制するものであり、神経細胞のアポトーシスに関連する疾病、例えばアルツハイマー病の神経細胞死を抑制し、その進行を抑制すると考えられる。また、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質はアポトーシスを促進するものであり、細胞のアポトーシスを速やかに亢進させ、特に、細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば癌や自己免疫疾患などの治療に有効と考えられる。
課題を解決するための手段
したがって、本発明は、
（１）ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを抑制する物質、
（２）ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する物質、
（３）下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示すＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の塩基番号１４０〜６０１の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に対して６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（４）下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示す蛋白質：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１５３からなる蛋白質であって、ＣＧＩ−９４と相互作用して、あるいはＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、ＣＧＩ−９４と相互作用して、あるいはＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する蛋白質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有する蛋白質、
（５）上記（４）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（６）上記（３）または（５）に記載のＤＮＡに相補的なＲＮＡ、
（７）ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを促進する物質、
（８）ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進してアポトーシスを促進する物質、
（９）試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４発現細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質をスクリーニングする方法、
（１０）試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４発現細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質をスクリーニングする方法、
（１１）上記（９）の方法により見出される、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質、
（１２）上記（１０）の方法により見出される、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質、
（１３）試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯを発現する細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質をスクリーニングする方法、
（１４）試験物質存在下かつ分化誘導因子存在下においてＣＧＩ−９４およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯを発現する細胞の神経突起伸長またはアポトーシスを調べることを特徴とする、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質をスクリーニングする方法、
（１５）上記（１３）の方法により見出される、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質、
（１６）ｐ１８ＴＦＰ蛋白質である上記（１２）または（１５）に記載の物質、
（１７）上記（１４）の方法により見出される、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質、
（１８）ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを抑制する物質を含むアポトーシス関連疾病の治療用医薬組成物、
（１９）ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制してアポトーシスを抑制する物質を含むアポトーシスに関連した疾病の治療用医薬組成物、
（２０）該物質がＰ１８ＴＦＰ蛋白質またはｐ１８ＴＦＰ  ＤＮＡである上記（１８）または（１９）に記載の医薬組成物、
（２１）ＣＧＩ−９４と相互作用してアポトーシスを促進する物質を含む細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療用医薬組成物、
（２２）ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進してアポトーシスを促進する物質を含む、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療用医薬組成物、
（２３）細胞中あるいは組織中のＣＧＩ−９４遺伝子またはＣＧＩ−９４蛋白質の発現レベルを調べることを特徴とする、アポトーシスに関連した疾病の診断方法、ならびに
（２４）細胞中あるいは組織中のＣＧＩ−９４遺伝子またはＣＧＩ−９４蛋白質の発現レベルを調べることを特徴とする、アポトーシスに関連した疾病の診断用キット
を提供する。
発明の実施の形態
本発明は、１の態様において、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質に関するものである。上述のごとく、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質は、細胞のアポトーシス、特に神経細胞における神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを抑制するものであり、細胞、特に神経細胞のアポトーシスに関連する脳内神経変性疾病、例えば、アルツハイマー病、ダウン症やその他の痴呆症のほか、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性疾患、パーキンソン氏病などの予防および／または治療に有用である。ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質は下記スクリーニングにより得られるものであってもよい。ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質としては、いずれの種類の分子であってもよく、例えば、蛋白質、ペプチド、その他の低分子有機化合物などの小型分子が挙げられる。
さらに本発明は、もう１つの態様において、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質のスクリーニング方法にも関する。ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質のスクリーニング方法の例としては、ＣＧＩ−９４蛋白質をコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、それを用いて細胞、好ましくは神経細胞を形質転換し、次いで、試験物質存在下において分化誘導因子（例えばＮＧＦ）を作用させて細胞を培養し、神経細胞の場合には神経突起伸長およびアポトーシスについてアッセイし、試験物質不存在下および／または分化誘導因子不存在下での結果（すなわち、対照系）と比較する方法がある。ＣＧＩ−９４発現細胞は一定濃度の分化誘導因子の存在下においても、神経突起の伸長が抑制され（神経細胞の場合）、アポトーシスが観察される。一方、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質が存在すると、細胞の神経突起は成長し（神経細胞の場合）アポトーシスが回避される。そのような場合、試験物質はＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制し、アポトーシスを抑制する可能性がある。アポトーシスが起こったかどうかを判定するには、顕微鏡観察を用いるのが一般的である。アポトーシスが起こると、例えば、細胞収縮、空胞化、表面平滑化、および細胞ならびに核の断片化等が観察される。ＣＧＩ−９４遺伝子を挿入して神経細胞の形質転換に使用するベクターとしては、文献に記載された種々のベクターあるいは種々の市販ベクターを用いることができ、例えば、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（登録商標）、あるいはＬＮＣＸ２などのウイルスベクター等がある。形質転換法としては、リン酸カルシウム法、Ｓｕｐｅｒ  Ｆｅｃｔｏｒ試薬による方法、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ試薬などを用いたｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ法等が知られている。スクリーニングに使用する細胞としてはいずれの細胞でもよいが、神経細胞が好ましく、好ましい神経細胞の例としては、ＰＣ１２細胞、ＮＢ２ａ、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、Ｂ１０４、ＳＨＳＹ−５Ｙ、初代培養神経細胞等が挙げられる。細胞培養の条件は個々の細胞に応じて決定され、当業者の知識の範囲内であるか、あるいは容易に決定できるものである。ＣＧＩ−９４遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＧＩ−９４蛋白質のアミノ酸配列は公知である（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，７９（２００１））。ＣＧＩ−９４蛋白質の発現を容易にチェックできるように、発現されるＣＧＩ−９４蛋白質に検出可能なタグを付しておくことが望ましい。検出可能なタグとしては、緑色蛍光蛋白、赤色蛍光蛋白、ｍｙｃ等があり、特に緑色蛍光蛋白との融合物が簡便で感度の高いものとして推奨される。
本発明者は上記スクリーニングを用いて、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質として、ｐ１８ＴＦＰ蛋白質およびそれをコードするＤＮＡを見出した。
したがって、本発明の１の態様において、配列番号：１に記載の塩基配列の塩基番号１４０〜６０１の塩基配列を含む新規ＤＮＡが提供される。このＤＮＡは、配列番号：２（アミノ酸１〜１５３）で示される本発明の新規蛋白質ｐ１８ＴＦＰをコードするものである。したがって、ｐ１８ＴＦＰ蛋白質は、典型的には、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含む。
配列番号：１に記載の塩基配列の塩基番号１４０〜６０１の塩基配列を含むＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、配列番号：１に記載の塩基配列の塩基番号１４０〜６０１の塩基配列を含むＤＮＡと同様の構造、機能等を有していると考えられることから本発明に包含される。ストリンジェントな条件とは、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔおよび０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイダイズさせる条件が例示される。また、本発明は、配列番号：１に記載の塩基配列の塩基番号１４０〜６０１の塩基配列を含むＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡにも関する。このようなＤＮＡにはヒトのｐ１８ＴＦＰ  ＤＮＡも包含される。上記のＤＮＡ／遺伝子をまとめてｐ１８ＴＦＰ  ＤＮＡ／遺伝子ということがある。
本発明はもう１の態様において、配列番号：２のアミノ酸配列（アミノ酸１〜１５３）からなる新規ラットｐ１８ＴＦＰ蛋白質およびその変異蛋白質を提供する。上記のごとく、典型的には、本蛋白質は配列番号：２で示されるアミノ酸配列１〜１５３からなる蛋白質であるが、配列番号：２のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であってもよい。また、配列番号：２のアミノ酸配列（アミノ酸１〜１５３）に対して少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有する変異蛋白質であってもよく、かかる蛋白質にはヒトのｐ１８ＴＦＰも包含される。ただし、かかる変異蛋白質もまた、配列番号：２で示されるアミノ酸配列（アミノ酸１〜１５３）からなる新規ｐ１８ＴＦＰと実質的に同じ活性、すなわちアポトーシス抑制活性を有している。本明細書において、本発明のｐ１８ＴＦＰ蛋白質および実質的に同じ活性を有する変異蛋白質をまとめてｐ１８ＴＦＰ、あるいはｐ１８ＴＦＰ蛋白質と称することがある。
さらに本発明は、１の態様において上記ｐ１８ＴＦＰおよびその変異蛋白質をコードするＤＮＡに関する。本発明はもう１つの態様において、上記ｐ１８ＴＦＰ  ＤＮＡに相補的なＲＮＡ、ならびに上記ｐ１８ＴＦＰおよびその変異蛋白質をコードするＤＮＡに相補的なＲＮＡにも関する。
また本発明は、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質を対象に投与することを特徴とする、細胞、好ましくは神経細胞のアポトーシスに関連する疾病の治療方法に関する。さらに、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質、例えば、ｐ１８ＴＦＰ蛋白質および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する、細胞、好ましくは神経細胞のアポトーシスに関連する疾病を治療するための医薬組成物にも関する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。また、ｐ１８ＴＦＰ蛋白質をコードするＤＮＡを対象の細胞に投与してｐ１８ＴＦＰ蛋白質を発現させ、ＣＧＩ−９４の機能を抑制することによる、遺伝子治療によるアポトーシスの治療方法も本発明により提供される。
さらに本発明は、もう１つの態様において、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質に関するものである。上述のごとく、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質は細胞のアポトーシスを意図的に引き起こすことができるので、アポトーシス系の確立、アポトーシス機構の研究、アポトーシスに関連した種々の研究、細胞、特に神経細胞のアポトーシスに関連した疾病、例えばアルツハイマー病の研究、例えば発症機構の解明等に有用である。また、ＣＧＩ−９４の機能を促進する物質はアポトーシスを促進するものであり、特に細胞のアポトーシスを速やかに亢進させて疾病、特に、細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば癌や自己免疫疾患などの治療に有効と考えられる。ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質は下記スクリーニングにより得られるものであってもよい。ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質としては、いずれの種類の分子であってもよく、例えば、蛋白質、ペプチド、その他の低分子有機化合物などの小型分子が挙げられる。
さらに本発明は、もう１つの態様において、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質のスクリーニング方法にも関する。ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質のスクリーニング方法の例としては、ＣＧＩ−９４蛋白質をコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、それを用いて神経細胞を形質転換し、次いで、試験物質存在下において分化誘導因子を作用させて細胞を培養し、神経突起伸長およびアポトーシスについてアッセイし、試験物質不存在下での結果と比較する方法がある。ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質のスクリーニングに用いるよりも高い濃度の分化誘導因子の存在下において神経突起を伸長させている神経細胞またはアポトーシスを起こしていない細胞に試験物質を添加して、その神経突起成長が抑制され（神経細胞の場合）あるいはアポトーシスが観察される場合には、試験物質はＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進、アポトーシスを促進する可能性がある。ＣＧＩ−９４遺伝子を挿入して神経細胞の形質転換に使用するベクターとしては、文献に記載された種々のベクターあるいは種々の市販ベクターを用いることができ、例えば、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（登録商標）、あるいはＬＮＣＸ２などのウイルスベクター等がある。形質転換法としては、リン酸カルシウム法、Ｓｕｐｅｒ  Ｆｅｃｔｏｒ試薬による方法、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ試薬などを用いたｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ法等が知られている。スクリーニングに使用する細胞としてはいずれの細胞でもよいが、神経細胞が好ましく、好ましい神経細胞の例としては、ＰＣ１２細胞、ＮＢ２ａ、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、Ｂ１０４、ＳＨＳＹ−５Ｙ、初代培養神経細胞等が挙げられる。細胞培養の条件は個々の細胞に応じて決定され、当業者の知識の範囲内であるか、あるいは容易に決定できるものである。ＣＧＩ−９４遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＧＩ−９４蛋白質のアミノ酸配列は公知である（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，７９（２００２））。ＣＧＩ−９４蛋白質の発現を容易にチェックできるように、発現されるＣＧＩ−９４蛋白質に検出可能なタグを付しておくことが望ましい。検出可能なタグとしては、緑色蛍光蛋白、赤色蛍光蛋白、ｍｙｃ等があり、特に緑色蛍光蛋白との融合物が簡便で感度の高いものとして推奨される。
本発明は、さらなる態様において、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質に関するものである。さらに本発明は、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質のスクリーニング方法にも関する。ＣＧＩ−９４の機能を抑制する物質のスクリーニング方法の例としては、ＣＧＩ−９４蛋白質をコードする遺伝子およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯをコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、それらを用いて神経細胞を形質転換し、次いで、試験物質存在下において分化誘導因子を作用させて細胞を培養し、神経突起伸長およびアポトーシスについてアッセイし、試験物質不存在下での結果と比較する方法がある。ＣＧＩ−９４およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質を発現する細胞は一定濃度の分化誘導因子の存在下においても、神経突起の伸長が抑制され（神経細胞の場合）、アポトーシスが観察される。一方、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質との相互作用を抑制する物質が存在すると、細胞の神経突起は成長し（神経細胞の場合）アポトーシスが回避される。そのような場合、試験物質はＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質との相互作用を抑制し、アポトーシスを抑制する可能性がある。ＣＧＩ−９４およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ遺伝子を挿入して神経細胞の形質転換に使用するベクター、形質転換法、ならびに使用細胞は上掲のものと同様のものが使用できる。細胞培養の条件は個々の細胞に応じて決定され、当業者の知識の範囲内であるか、あるいは容易に決定できるものである。ＣＧＩ−９４遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＧＩ−９４蛋白質のアミノ酸配列は公知であり（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，７９（２００２））、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ遺伝子のヌクレオチド配列およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質のアミノ酸配列も公知である（Ｃｅｌｌ  １０２，３３（２０００）；Ｃｅｌｌ  １０２，４３（２０００））。ＣＧＩ−９４蛋白質またはＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質の発現を容易にチェックできるように、発現されるＣＧＩ−９４蛋白質またはＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質に検出可能なタグを付しておくことが望ましい。検出可能なタグとしては、緑色蛍光蛋白、赤色蛍光蛋白、ｍｙｃ等があり、特に緑色蛍光蛋白との融合物が簡便で感度の高いものとして推奨される。
上述のごとく、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質は、神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを抑制するものであり、神経細胞のアポトーシスに関連する脳内神経変性疾病、例えば、アルツハイマー病、ダウン症状やその他の痴呆症の他、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性疾患、パーキンソン氏病などの予防および／または治療に有用である。ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質は上記スクリーニングにより得られるものであってもよい。ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質としては、いずれの種類の分子であってもよく、例えば、蛋白質、ペプチド、その他の低分子有機化合物などの小型分子が挙げられる。
本発明者は上記スクリーニングを用いて、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質として、ｐ１８ＴＦＰ蛋白質およびそれをコードするＤＮＡを見出した。
本発明は、さらにもう１つの態様において、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質、例えば、ｐ１８ＴＦＰ蛋白質を対象に投与することを特徴とする神経細胞のアポトーシスに関連する疾病の治療方法に関する。さらに、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する、神経細胞のアポトーシスに関連する疾病を治療するための医薬組成物にも関する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。また、ｐ１８ＴＦＰ蛋白質をコードするＤＮＡを対象の細胞に投与してｐ１８ＴＦＰ蛋白質を発現させ、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制することによる、遺伝子治療によるアポトーシスの治療方法も本発明により提供される。
さらに本発明は、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質に関するものである。さらに本発明は、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質のスクリーニング方法にも関する。ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質のスクリーニング方法の例としては、ＣＧＩ−９４蛋白質およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質をコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、それを用いて神経細胞を形質転換し、次いで、試験物質存在下において分化誘導因子を作用させて細胞を培養し、神経突起伸長およびアポトーシスについてアッセイし、試験物質不存在下での結果と比較する方法がある。ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質との相互作用を抑制する物質のスクリーニングに用いるよりも高い濃度の分化誘導因子の存在下において神経突起を伸長させている神経細胞またはアポトーシスを起こしていない細胞に試験物質を添加して、その神経突起成長が抑制され（神経細胞の場合）あるいはアポトーシスが観察される場合には、試験物質はＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質との相互作用を促進し、アポトーシスを促進する可能性がある。ＣＧＩ−９４およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ遺伝子を挿入して神経細胞の形質転換に使用するベクター、形質転換法、ならびに使用細胞は上掲のものと同様のものが使用できる。細胞培養の条件は個々の細胞に応じて決定され、当業者の知識の範囲内であるか、あるいは容易に決定できるものである。ＣＧＩ−９４遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＧＩ−９４蛋白質のアミノ酸配列は公知であり（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，７９（２００２））、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ遺伝子のヌレオチド配列およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質のアミノ酸配列も公知である（Ｃｅｌｌ  １０２，３３（２０００）；Ｃｅｌｌ  １０２，４３（２０００））。ＣＧＩ−９４蛋白質またはＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質の発現を容易にチェックできるように、発現されるＣＧＩ−９４蛋白質またはＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白質に検出可能なタグを付しておくことが望ましい。検出可能なタグとしては、緑色蛍光蛋白、赤色蛍光蛋白、ｍｙｃ等があり、特に緑色蛍光蛋白との融合物が簡便で感度の高いものとして推奨される。
上述のごとく、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質は、神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを促進するものであり、アポトーシス系の確立、アポトーシスに関連した種々の研究、神経細胞のアポトーシスに関連した疾病、例えばアルツハイマー病の神経細胞死などの機構解明等に有用である。また、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質はアポトーシスを促進するものであり、細胞のアポトーシスを速やかに亢進させ、特に、細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば癌や自己免疫疾患などの治療に有効と考えられる。ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質は上記スクリーニングにより得られるものであってもよい。ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質としては、いずれの種類の分子であってもよく、例えば、蛋白質、ペプチド、その他の低分子有機化合物などの小型分子が挙げられる。
また本発明は、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質を対象に投与することを特徴とする、細胞、特に細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば、癌や自己免疫疾患などの治療方法に関する。さらに、ＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する、細胞、特に細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば、癌や自己免疫疾患を治療するための医薬組成物にも関する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。
本発明は、さらにもう１つの態様において、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質を対象に投与することを特徴とする、細胞、特に細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば、癌や自己免疫疾患などの治療方法に関する。さらに、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する、細胞、特に細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば、癌や自己免疫疾患を治療するための医薬組成物にも関する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。
さらに本発明は、細胞や組織中のＣＧＩ−９４遺伝子またはＣＧＩ−９４蛋白質の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞、特に神経細胞のアポトーシスを調べる方法、ならびにかかるアポトーシスに関連した疾病の診断方法にも関する。対象から得られた試料細胞や組織中のＣＧＩ−９４遺伝子を例えばｍＲＮＡレベルで検出してもよく、試料細胞中のＣＧＩ−９４蛋白質を検出してもよい。このような検出は当業者によく知られている手段、例えば、ＣＧＩ−９４遺伝子の相補的なプローブ（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）を用いるハイブリダイゼーション法あるいはＣＧＩ−９４蛋白質に対するモノクローナル抗体（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）との結合を用いて行うことができる。上記の場合には、標識のシグナル強度を調べることによりＣＧＩ−９４遺伝子の発現強度あるいはＣＧＩ−９４蛋白質量を測定することができる。
また本発明は、細胞や組織中のＣＧＩ−９４遺伝子またはＣＧＩ−９４蛋白質の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞、特に神経細胞のアポトーシスを調べるためのキット、ならびにかかるアポトーシスに関連した疾病の診断用キットにも関する。キットの成分としては、例えば、ＣＧＩ−９４遺伝子の相補的なプローブ（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）および／またはＣＧＩ−９４蛋白質に対するモノクローナル抗体（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）が含まれる。通常には、取り扱い説明書をキットに添付する。
実施例１：ＣＧＩ−９４の作用およびＣＧＩ−９４と相互作用する蛋白質のスクリーニング
Ａ．実験方法
１．ＧａｔｅｗａｙＴＭ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＰｒｏＱＵＥＳＴＴＭ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ
イースト株にはＭａＶ２０３を使用した。ヒトＣＧＩ−９４はｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ登録商標からＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを有するｐＤＥＳＴＴＭ３２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンした。また、ＰｒｏＱｕｅｓｔＴＭ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をもつ活性化ドメイン発現ベクターとしてｐＥＸＰＡＤ５０２を使用した。選択はＨＩＳ３，ＵＲＡ３及びｌａｃＺの３種のレポーター遺伝子を使用した。それぞれの遺伝子はイースト遺伝子内の異なる場所に安定的に組み込まれており、ＵＲＡ３，ＨＩＳ３及びｌａｃＺのプロモーター領域はＧＡＬ４結合部位を除いて異なる。標準的ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍに較べて、このＰｒｏＱＵＥＳＴＴＭ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍでは３つの独立した転写がそれぞれ別個の染色体で起こるので偽陽性反応は少ないとされる。ＨＩＳ３及びＵＲＡ３レポーター遺伝子の誘導はｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ依存性に起こり、それぞれｈｉｓｔｉｄｉｎｅあるいはｕｒａｃｉｌを含まないプレートでも細胞が成長するので判別が可能である。一方、ＬａｃＺ遺伝子の誘導ではＸ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）法で青色に変色する。さらに、ＵＲＡ３の誘導は５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ（５ＦＯＡ）から５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌへの変化による毒性のため、細胞はｕｒａｃｉｌを含まない培養液中では成長するが、５ＦＯＡを含む培養液中では成長が阻害される。したがって、この系では４つの表現系すなわち、Ｈｉｓ（３ＡＴ登録商標）、β−ｇａｌ、Ｕｒａ＋及び５ＦＯＡＳによって本当の相互作用を示す蛋白質を探索することができ、偽り陽性反応を除くことができる。また、ＡＲＳ／ＣＥＮ）ベクターを使うことによって、発現レベルと毒性を下げる事ができる。陽性のクローンは再形質転換によって確認される。相互作用をする蛋白質を含む場合、イースト細胞はＤＢ−ヒトＣＧＩ−９４及びＡＤ−Ｙ（Ｙとして例えばＳｍａｃ）と結合する。ＤＢ−ヒトＣＧＩ−９４及びＡＤ−Ｙ（Ｙとして例えばＳｍａｃ）を含むイースト株由来のプラスミドＤＮＡはエレクトロポレーション法で大腸菌に導入し、ＡＤ−Ｙ（Ｙとして例えばＳｍａｃ）を含む形質転換体はアンピシリンで、また、ＤＢ−ヒトＣＧＩ−９４はゲンタマイシンで選択される。これらの大腸菌のプラスミドＤＮＡ  ＡＤ−Ｙ（Ｙとして例えばＳｍａｃ）はｐＤＢＬｅｕあるいはＤＢ−ヒトＣＧＩ−９４と一緒にＭａＶ２０３へ導入されるが、ＤＢ−ヒトＣＧＩ−９４によるレポーター遺伝子の誘導が真の陽性反応となる。
２．遺伝子導入
ＣＧＩ−９４のＣ末端にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を結合させた蛋白質の遺伝子（ＣＧＩ−９４−ＣＴ−ＧＦＰ）を一過性にＰＣ１２細胞に発現させるため、ＧＦＰ発現ベクターあるいはそれを含まないプラスミドをＳｕｐｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ遺伝子導入試薬（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）を使用し、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２（１／１）／Ｎ２培養液中で３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気中で培養した。ＣＧＩ−９４−ＣＴ−ＧＦＰ発現細胞の生存は遺伝子導入４８時間後に蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０）を用いて観察した。さらに遺伝子導入２４時間後、ＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１２０時間後に再び蛍光顕微鏡で細胞の神経突起の伸長と細胞の生存を観察した。
３．細胞培養
ＰＣ１２細胞はＮ２−用栄養剤と１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）／Ｆ１２（１／１）中で３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気中で培養した。
上記方法以外にも、当業者は別の方法により実験を行うことができる。また、上で説明しなかった種々の実験操作も当業者にとって常套的なものである。
Ｂ．実験結果
１．ＣＧＩ−９４はＮＧＦによって分化誘導されたＰＣ１２細胞において、神経突起伸長の抑制ならびにアポトーシスを惹起した。
ＣＧＩ−９４の神経細胞における機能を明らかにする目的で、ＰＣ１２細胞にＣＧＩ−９４−ＧＦＰを発現させた。その結果、同発現細胞ではＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）添加１２０時間後において、図１ｂに示すように神経突起伸長の抑制ならびにＮＧＦの存在にもかかわらずアポトーシスがみられ、２週間後には全ての細胞が死滅した。一方、同遺伝子を発現していない細胞（蛍光なし）では明らかに突起の伸長が促進され、生存した。図１ａは発現４８時間後のＮＧＦ非添加の細胞を示す。同細胞ではＮＧＦは添加していないので神経突起伸長はみられなかった。
２．ＣＧＩ−９４と相互作用する蛋白質をＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍを用いてスクリーニング（方法は上記のとおり）した結果、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯと強い相互作用をすることが見出された。
実施例２：ｐ１８ＴＦＰ遺伝子のクローニングおよびｐ１８ＴＦＰ蛋白質のアミノ酸配列
Ａ．実験方法
１．ＲＴ−ＰＣＲ
ｐ１８ＴＦＰ  ｃＤＮＡはラット脳ｃＤＮＡライブラリー（ｐＡＰ３ｎｅｏ，ＴａＫａＲａ、大津、滋賀県、日本）を用いた５’−ＲＡＣＥ−ＲＴ−ＰＣＲ法により探索し見出した。ｍＲＮＡ発現分析とｐ１８ＴＦＰの単離にＲＴ−ＰＣＲ法を応用した。全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ登録商標試薬プロトコール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に従って調整した。すなわち、クロロホルムでｍＲＮＡを抽出後、等量のイソプロピルアルコールを添加して沈殿させ７５％のエタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない水に溶解後、分光光度計で吸光度（２６０ｎｍ）を測定した。各サンプル中の全ＲＮＡ（０．２μｇ／μｌ）はまず、ｃＤＮＡに逆転写（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−ｐｒｉｍｅｄ−ＳＭＡＲＴＴＭ−ｃＤＮＡ合成（クロンテック、東京、日本）；
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，ＮＹ，ＵＳＡ））した後、ＰＣＲ反応（反応液量；２５μｌ）をラットｃＤＮＡ／ｐ１８ＴＦＰ特異的プライマーとして単離のため、まず第一に１）センス：５’−ｇｃｇ  ｔａａ  ｔａｃ  ｇａｃ  ｔｃａ  ｃｔａ  ｔａｇ  ｇｇａ  ａｔｔ  ｃｇａ  ｃｇｔ−３’（配列番号：３），アンチセンス：５’−ｃｇｃ  ｇａｃ  ｇｔａ  ｃｇａ  ｔｔｔ  ａａａ  ｔｔａ  ａｃｃ  ｃｔｃ  ａｃｔ  ａａａ−３’（配列番号：４）、次いで２）センス：５’−ｇｔｇ  ｃｇｔ  ｔｇｔ  ｃｃｔ  ｃｇｃ  ｔａａ  ｇｇａ  ｃｃｔ  ｇａａ  ｃｇａ  ａａｃ  ｇｃｇ  ａｔｃ  ｔｔｇ  ａａａ３’（配列番号：５），アンチセンス：５’−ａａｇ  ｔｔｃ  ｔｇｔ  ｇｃｔ  ｔｔａ  ｇｔｔ  ｃａａ  ａｃａ  ａｃｔ  ｇａｔ  ａａｃ  ａｃｔ  ｃｔａ  ａａｃ  ａａｇ−３’（配列番号：６），３）ＯＲＦのサブクローニングでは、センス：５’−ａｔｇ  ｇｃａ  ｇｔｃ  ｃｃａ  ｇｇｔ  ｔｇｃ  ａａｃ  ａａｇ  ｇａｃ  ａａｔ  ｇｔｃ  ｃ−３’（配列番号：７）、アンチセンス：５’−ｔｔａ  ｃｔｔ  ｔｔｔ  ｇｇｔ  ｇａｃ  ｔｔｃ  ａｇａ  ａｃｇ  ｇｔｔ  ａｇｇ  ｇｇａ  ａｇａ  ａ−３’（配列番号：８）を用いた。各ｃＤＮＡ増幅に用いた反応繰り返し回数はＥｌｏｎｇａｓｅＴＭ酵素混合プロトコールに従って直線範囲で行なった。増幅ステップの変性時間は９４℃で０．５分間、アニーリングは特異的プライマーと共に６５℃で５０秒間行い、さらに伸長は６８℃で１〜２分間行った（ＡｎｎＴ：６５℃／２４サイクル）。恒常的に発現しているリボゾーム蛋白Ｓ１２ｃＤＮＡのＰＣＲ反応（ＡｎｎＴ：６０℃／１６サイクル）は導入したＲＮＡの測定に使用した。ＲＮＡサンプルを使った逆転写なし、あるいはＲＮＡなしのコントロールはＤＮＡの混入がないことを証明するために使用した。ＰＣＲ反応の解析は１．５％アガロースゲルで電気泳動法で分析した。
２．ｐ１８ＴＦＰ  ｃＤＮＡ配列ならびにアミノ酸分析
ｐ１８ＴＦＰ  ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は重複のないＧｅｎＢａｎｋＣＤＳトランスレーションに対するＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）Ｂｌａｓｔｐ  ２．０プログラム（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５、３３８９（１９９７））とＵｎｉｇｅｎｅデータベース（ＮＣＢＩ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，２２８９（１９９７））に加えて、ＰＤＢ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲおよびＰＲＦを使って行なった。相同性の検索はＢｌａｓｔとＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）アルゴリズムとＢｅｓｔＦｉｔ（Ｅｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  １０．０，ＧＣＧ）を使って行った。アミノ酸配列のモチーフ探索はＰＲＯＳＩＴＥ  Ｐｒｏｆｉｌｅ−、ＢＬＯＣＫＳ、ＰｒｏＤｏｍ−、ＰＲＩＮＴＳ−、Ｐｆａｍ−およびＰＳＯＲＴＩＩ−プログラムを使って行った（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，２６０（１９９９），Ｉｎｔｅｌｌｉｇ．Ｓｙｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４，１０９（１９９６），Ｉｎｔｅｌｌｉｇ．Ｓｙｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５，１４７（１９９７））。リン酸化部位はＮｅｔＰｈｏｓ  ２．０（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４，１３５１（１９９９））を使って、さらにその他の分析はＥｘＰＡＳｙ−ｗｗｗサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）の他、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ及びアミノ酸組成サーチ（ＡＡＣｏｍｐＩｄｅｎｔ）：ｈｔｔｐ：／／ｋｒ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ａａｃｏｍｐ／を使って行った。
３．細胞培養
ＰＣ１２細胞（例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７２１）の培養はＮ２含有１０％牛胎児血清（ＦＣＳ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）で、またＣＨＯ細胞はＤ−ＭＥＭに１０％ＦＣＳを加えて、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件で培養を行った。
４．細胞への遺伝子導入
ｐ１８ＴＦＰ  ｃＤＮＡはｐＣＧＩ−９４とラット脳ｃＤＮＡライブラリーをラットＰＣ１２細胞に一緒に遺伝子導入して見出した。細胞は一過性にＳｕｐｅｒＦｅｃｔｏｒ遺伝子導入試薬（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使い、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ／（Ｆ１２（１：１）／Ｎ２）培地で３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件で培養して行なった。
Ｂ．実験結果
１．ｐ１８ＴＦＰの単離
ｐＣＧＩ−９４とラット脳ｃＤＮＡライブラリーを共遺伝子導入した後、ｐ１８ＴＦＰはｄｅａｔｈ  ｔｒａｐ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ法（Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１７（１９９７））を用いて、生存細胞から生存に関する遺伝子を培養６日後にＲＴ−ＰＣＲ法によって見出し、ｐ１８ＴＦＰと命名した。また、この遺伝子によりコードされる細胞死抑制蛋白をｐ１８ＴＦＰと命名した。
２．ｐ１８ＴＦＰの特徴
図２ａにｐ１８ＴＦＰのｃＤＮＡ塩基配列（２２４０ヌクレオチド（ｎｔ）、ＯＲＦはｎｔ１４０からｎｔ６０１まで）と図２ｂに１５３個のアミノ酸（分子量：１８ｋＤａ）からなるそのアミノ酸配列を示す。ｐ１８ＴＦＰのアミノ酸配列にはＣ２ＨＣ−Ｚｎ−フィンガーモチーフと二連核局在シグナル（ＮＬＳ）配列モチーフを有することから転写因子蛋白ファミリーとしての性格が示された。
本発明によれば、アポトーシスを抑制または促進する物質、そのスクリーニング、ならびにアポトーシスに関連した疾病の診断および治療方法およびキットが提供される。より詳細には、本発明によれば、アポトーシスを引き起こすＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質、それらのスクリーニング方法、それらを含有するアポトーシス関連疾病治療用医薬組成物、アポトーシスに関連疾病の治療方法、ならびにかかる疾病の診断方法およびキットが提供される。詳細には、アポトーシスを引き起こすＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を抑制する物質として、あるいはＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を抑制する物質としてｐ１８ＴＦＰ蛋白質が見出された。また、アポトーシスを引き起こすＣＧＩ−９４と相互作用してその機能を促進する物質、ＣＧＩ−９４とＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯとの相互作用を促進する物質、それらのスクリーニング方法も提供され、これらの物質はアポトーシス機構、アルツハイマー病等のアポトーシス関連疾病の発症機構等の解明に役立つ。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はＣＧＩ−ＧＦＰ融合蛋白をＰＣ１２細胞に発現した蛍光顕微鏡写真を示す。図１ａはＣＧＩ−ＧＦＰを一過性に発現し４８時間後の像でＰＣ１２細胞はいずれも生存しているが、ＮＧＦは添加していないため神経突起の伸長は蛍光顕微鏡下で認められていない。
図１ｂでは発現２４時間後にＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加してさらに１２０時間後において、同蛋白質を発現していない細胞では神経突起が伸長しているが、同蛋白質を発現する細胞（矢印）では神経突起の伸長が抑制されアポトーシスが蛍光顕微鏡下で認められた。
図２ａはアポトーシス抑制蛋白質ｐ１８ＴＦＰのＯＲＦのｃＤＮＡ配列を示す図である（配列番号：１も参照）。図２ｂはアポトーシス抑制蛋白質ｐ１８ＴＦＰのアミノ酸配列を示す図である（配列番号：２も参照）。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【国際調査報告】
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