(57)【要約】血管狭窄を処置および予防するための手段を提供する。本発明は、血管平滑筋特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域を所定の遺伝子の上流に組み込んだことを特徴とする成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクター、およびそれを含有する、血管狭窄を処置および予防するための医薬組成物およびそのための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管平滑筋特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域を、所定の遺伝子の上流に組み込んだことを特徴とする成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクター。
【請求項２】
該転写開始制御領域が配列番号１に示される塩基配列を含む領域である、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項３】
該転写開始制御領域が配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターを含む領域である、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項４】
該転写開始制御領域が配列番号３に示される塩基配列を含む領域である、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項５】
該転写開始制御領域が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ当該遺伝子の転写開始制御活性と同等の活性を有する塩基配列を含む領域である、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項６】
単純ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項７】
リボヌクレオチドリダクターゼをコードするＤＮＡおよび／またはチミジンキナーゼをコードするＤＮＡを欠失している、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項８】
所定の遺伝子が、ウイルス複製関連遺伝子である、請求項１から７までのいずれか記載のベクター。
【請求項９】
ウイルス複製関連遺伝子が、ウイルスの複製開始に必須な転写因子をコードする遺伝子、ＩＣＰ４である、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか記載のベクターを含む、血管狭窄を処置および予防するための医薬組成物。
【請求項１１】
血管狭窄が動脈硬化性病変に由来する、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
血管狭窄が臓器移植に由来する、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
血管平滑筋特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域を、所定の遺伝子の上流に組み込んだことを特徴とする成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクターの有効量を生体に導入し、発現複製させることを特徴とする、血管狭窄を処置および予防するための方法。
【請求項１４】
血管狭窄が動脈硬化性病変に由来する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
血管狭窄が臓器移植に由来する、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血管平滑筋特異的に遺伝子を発現し自己複製する、成体では正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクターおよび該ベクターの血管狭窄を処置および予防するうえでの利用に関し、詳細には血管平滑筋特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域を所定の遺伝子の上流に組み込んだことを特徴とする成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクター、およびそれを含有する、血管狭窄を処置および予防するための医薬組成物およびそのための方法に関する。
背景技術
動脈硬化性病変、ことに頚動脈、冠動脈等の主幹動脈の狭窄性病変は、本邦でも大きな問題となりつつある。これら病変に対して、最近血管内手術法の進歩に伴い、ｂａｌｌｏｏｎ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙによる治療法が確立されつつある。しかしながら、この血管内手術により一度は狭窄が是正されても、３０−５０％の頻度で再狭窄をきたし、本治療法の大きな問題となっている。
また、最近話題となっている各種臓器移植は今後急速に需要が高まることが予想される。臓器の生着自体は免疫抑制剤によりコントロール良好となってきているが、移植臓器と患者の血管吻合部の狭窄が問題として残り、移植臓器の機能不全やその脱落の原因となる。例えば心臓移植後の狭心症、心筋梗塞等は克服すべき問題点である。これら動脈硬化および臓器移植後の血管狭窄の主病態は血管平滑筋の増殖性変化にあり、この病態の治療法を開発することは大きな関心事である。
血管再狭窄の治療として、各種薬剤や抗体等、さまざまなアプローチが行われているが、有効な治療法は未だ確立されていない。米国では、ｃ−ｍｙｃアンチセンスとＥ２Ｆデコイを用いた細胞増殖抑制療法による臨床試験が行われているが、これらのアプローチは細胞特異性を持たない。また、いろいろな遺伝子導入用ベクターを用いた遺伝子治療が試みられているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入効率の低さが問題となり、良好な治療効果は得られていない。
本発明者らは複製可能型遺伝子組み換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターを用いた悪性腫瘍に対する遺伝子治療の研究を続けている。ＨＳＶ  ＤＮＡの複製極初期に発現し、自己遺伝子の複製に必須なＩＣＰ４に着目し、ＩＣＰ４遺伝子を組織特異的な遺伝子プロモーターの下流に接続し、ＩＣＰ４欠損変異型ＨＳＶに導入することにより特定の細胞特異的な組換えＨＳＶを作成している。Ｍａｒｔｕｚａと本発明者の一人である宮武らは１９９８年３月に発行の米国特許第５７２８３７９号（「腫瘍あるいは細胞特異的単純ヘルペスウイルスの複製」）を取得している。
増殖期の細胞を破壊する複製可能型ＨＳＶベクターを用いた悪性脳腫瘍への臨床試験が米国、英国で行われているが、同ベクターを血管障害、臓器移植に応用する試みは未だ為されていない。この研究はウイルスベクターを単なる遺伝子導入の担体として用いる従来の遺伝子治療とは全く異なり、目的とする組織もしくは細胞にわずかでも本ウイルスが感染すれば、その感染が周辺の細胞に波及し破壊するという点が全く独創的なポイントである。しかし、増殖期の細胞をすべて破壊するウイルスベクターでは、動脈硬化の主病態である血管平滑筋の増殖のみならず、血管内皮をも障害する可能性が残り、この問題を解決するためには増殖期の血管平滑筋のみで複製破壊を行うベクターの開発が必要である。
発明の開示
そこで、本発明者らは平滑筋に特異的に発現する蛋白であるカルポニンに着目し、カルポニンのプロモーターを利用し、平滑筋の表現形を有し、増殖する細胞を破壊するＨＳＶベクターを開発し、平滑筋肉腫である腫瘍に対する遺伝子治療の効果、安全性を確認し報告している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３９６９−７７，２００１、特願２００１−１４３９９９）。
本発明においては、この細胞、組織特異的なＨＳＶベクターを用いて、動脈硬化性病変の治療に当たることが目的の一つである。
一方、臓器移植に伴う移植血管の狭窄性病変も問題であり、その病態がホスト由来の血管平滑筋の増殖に有ることが最近、Ｓｈｉｍｉｚｕ等により明らかにされ、狭窄の主体である新生内膜に多数のカルポニン陽性血管平滑筋由来細胞の増殖を認めた（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．７：７３８−４１，２００１）。よって、この病態の治療にも本ウイルスが応用できると考えられる。
すなわち本発明は、
（１）血管平滑筋特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域を、所定の遺伝子の上流に組み込んだことを特徴とする成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクター、具体的には該転写開始制御領域が、配列番号１に示される塩基配列を含む領域、配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターを含む領域または配列番号３に示される塩基配列を含む領域である本発明のウイルスベクター、または該転写開始制御領域が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ当該遺伝子の転写開始制御活性と同等の活性を有する塩基配列を含む領域である本発明のウイルスベクター、または；
該転写開始制御領域の上流にエンハンサー、好ましくは４Ｆ２エンハンサーが組み込まれている本発明のウイルスベクター、または；
該発現複製ウイルスベクターが単純ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである本発明のウイルスベクター、または；
該発現複製ウイルスベクターが、リボヌクレオチドリダクターゼ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードするＤＮＡおよび／またはチミジンキナーゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）をコードするＤＮＡを欠失している本発明のウイルスベクター、または；
該所定の遺伝子がウイルス複製関連遺伝子、具体的にはウイルスの複製開始に必須な転写因子をコードする遺伝子ＩＣＰ４である本発明のウイルスベクター、または；
所定の遺伝子のさらに下流に、アポトーシス関連遺伝子が連結され、前記転写開始制御領域とエンハンサーの制御下に発現することを特徴とする本発明のウイルスベクター、または該所定の遺伝子のさらに下流に、血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡが連結され、前記転写開始制御領域とエンハンサーの制御下に発現することを特徴とする本発明のウイルスベクター；あるいは
（２）上記本発明のウイルスベクターを含む、血管狭窄を処置および予防するための医薬組成物、好ましくは該血管狭窄が動脈硬化性病変または臓器移植に由来する本発明の医薬組成物；あるいは
（３）上記本発明のウイルスベクターの有効量を生体に導入し、発現複製させることを特徴とする、血管狭窄を処置および予防するための方法、好ましくは該血管狭窄が動脈硬化性病変または臓器移植に由来する本発明の方法；
に関する。
発明を実施するための最良の形態
（１）血管平滑筋特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域を、所定の遺伝子の上流に組み込んだことを特徴とする成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクター
本発明において、「血管平滑筋特異的に発現する遺伝子」としては、平滑筋に特異的に発現するカルポニン遺伝子、ヒトＳＭ２２α遺伝子（ヒトＳＭ２２α遺伝子では−４８０から−２６までの配列；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｄ８４３４２−Ｄ８４３４４）、増殖期の平滑筋に発現するＳｍｅｍｂ−ミオシンなどを挙げることができる。
ヒト由来の肉腫の腫瘍細胞に平滑筋の分化マーカーとされるカルポニン遺伝子が発現していることが見い出されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７９，２４５−２５０，１９９８、Ｓａｒｃｏｍａ  ３，１０７−１１３，１９９９、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８２，６７８−６８６，１９９９）。その後、骨・軟部肉腫に加えて消化管ストローマ腫瘍（ＧＩＳＴ）や唾液腺肉腫、繊維肉腫、悪性神経鞘腫など２０種類近い間葉系細胞由来のヒト悪性腫瘍で、カルポニン遺伝子が異常発現していることが国内外で相次いで報告されている。上記カルポニン（ｈ１またはｂａｓｉｃ）は、Ｘ線結晶構造と、インビトロおよびインビボの機能解析により、アクチン分子のＣ末端に結合して、アクチン・ミオシンの滑り運動を抑制することが明らかにされている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９，１５０−１５７，２０００、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２９，８１１−８２４，２０００）。カルポニン遺伝子は、成体では、平滑筋細胞に選択的に発現し、血管分化のマーカーと考えられている（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７５，４８７−５１７，１９９５）。
ＳＭ２２α遺伝子は平滑筋での特異的発現が知られており、そのプロモーター領域もクローニングされている（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１００６−１０１４，１９９７，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：１５７−１６７，１９９７）。
増殖期の平滑筋に発現するＳｍｅｍｂ−ミオシンはＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：１１１８−１１２４，１９９６に記載されている。
本発明において、「転写開始制御領域」とは、上記遺伝子の転写開始制御領域であり、プロモーターとして知られている領域を意味する。この転写開始制御領域は対応する構造遺伝子の一部を含んでいてもよい。
この具体例としては、カルポニン遺伝子の場合、ヒトカルポニン遺伝子のプロモーターの−２６０から−２１９までの配列番号１に示される塩基配列を含む領域、好ましくは配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーター、より好ましくは配列番号３に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターとその構造遺伝子の一部を含む領域を例示することができる。また、転写開始制御領域として、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ血管平滑筋特異的に発現する遺伝子の転写開始制御活性と同等の活性を有する塩基配列が挙げられる。
このような変異を有する塩基配列は当業者ならば、容易に調製することができる。また、該遺伝子の転写開始制御活性と同等の活性とは該遺伝子の転写開始を制御できる活性であれば、該遺伝子のプロモーターと同じ活性を有する必要はなく、転写開始制御活性は当業者ならば、通常の手法により測定することができる。このような変異を有する配列としては、マウス、ラットおよびブタ由来のカルポニンプロモーターなど、ヒトのそれに相同な領域を含む領域を例示することができる。
上記の他、増殖平滑筋細胞を攻撃の標的にする場合は、ＳＭ２２α遺伝子のプロモーター領域、具体的にはヒトＳＭ２２α遺伝子では−４８０から−２６までの配列；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃  Ｄ８４３４２−Ｄ８４３４４、マウスやラットまたはその他の哺乳動物由来のＳＭ２２α遺伝子プロモーターに相同な領域を、また内皮細胞を標的にする場合は、Ｆｌｋ−１遺伝子のプロモーター領域を用いることができる。これらの場合にも、一部構造遺伝子を含む領域を転写開始制御領域とすることもできる。
上記転写開始制御領域の上流に、転写を活性化するエンハンサーを連結することが好ましく、かかるエンハンサーとしてはアデノウイルス初期遺伝子のエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列のエンハンサー、ヒストンＨ２Ａ遺伝子エンハンサー、免疫グロブリンエンハンサー、インスリン遺伝子エンハンサー、ｃ−ｆｏｓ遺伝子エンハンサー、Ｔ細胞抗原受容体遺伝子エンハンサー、筋型クレアチンキナーゼ遺伝子エンハンサー、ヒト４Ｆ２重鎖（ヘビーチェイン）配列エンハンサー等を例示できる。転写開始制御領域がカルポニン遺伝子のプロモーターの−２６０から＋７３までの配列を含む領域の場合、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質である４Ｆ２ヘビーチェイン遺伝子のエンハンサーであるヒト４Ｆ２重鎖転写エンハンサー（配列番号４）等の４Ｆ２エンハンサーが転写効率を著しく高め得る点で好ましい。
本発明の、成体において正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクターの作製に用いられる所定の遺伝子とは、血管の狭窄または再狭窄を引き起こす血管平滑筋増殖を停止させ、あるいは該増殖に由来する細胞または組織を傷害または破壊する因子をコードする遺伝子を意味する。かかる因子遺伝子としては、用いるウイルスの複製開始または維持に必要な遺伝子を利用することができ、例えばアデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＩＣＰ６（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９８８  Ｓｅｐ；１６６（１）：４１−５１．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９８８Ａｕｇ；６２（８）：２９７０−７．）などのウイルス複製関連遺伝子を挙げることができる。特にヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードする遺伝子であるＩＣＰ４（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５６：５５８−５７０，１９８５）を好適に例示することができる。また、これら遺伝子としては、転写開始制御領域の下流に位置する本来の構造遺伝子の一部または全部と上記所定の遺伝子がインフレームで結合したものでもよく、例えば、カルポニンタンパク質のＮ末側の一部とＩＣＰ４タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを具体的に挙げることができる。
また、別の血管の狭窄または再狭窄を引き起こす血管平滑筋増殖を停止させ、あるいは該増殖に由来する細胞または組織を傷害または破壊する因子の遺伝子としては、アポトーシス関連遺伝子としてＢｃｌ−ｘｓ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｃｌ−Ｇｓ／Ｂｒａ、Ｂｃｌ−ＧＬ、Ｂｃｌ−Ｒａｍｂｏ、Ｈｒｋ／ＤＰ５、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ／Ｂｌｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、ＢｉｍＬ，Ｓ，ＥＬ／ＢｏｄＬ，Ｍ，Ｓ、Ｎｏｘａ／ＡＰＲ、Ｐｕｍａ等のアポトーシス促進遺伝子を、または血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡとしてアンジオスタチン、エンドスタチン、ＦＬＫ１、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２などのタンパク質をコードするＤＮＡを、それぞれ具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクターとして、所定の遺伝子のさらに下流に、先に説明したアポトーシス関連遺伝子や血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡなどが１または２以上連結され、前記転写開始制御領域とエンハンサーの制御下に発現することができる細胞特異的発現複製ウイルスベクターを用いることができる。
本発明の成体では正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ウイルスベクターの作製に用いられるベクターの骨格としては、平滑筋細胞、特に血管平滑筋に感染しまたは遺伝子を導入し発現できるベクターが好ましい。ウイルスベクターとしては、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）等のウイルスベクターが好ましく、中でも、ＨＳＶベクターとアデノウイルスベクター、特に条件付き複製可能型ＨＳＶベクター、または条件付き複製可能型アデノウイルスベクターが、遺伝子発現の高効率性、増殖細胞特異性細胞傷害活性などの点で好ましい。上記条件付き複製可能型ＨＳＶベクターとして、例えば、リボヌクレオチドリダクターゼをコードするＤＮＡやチミジンキナーゼをコードするＤＮＡやこれらを共に欠失しているベクターを用いることにより、本発明の成体正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ベクターを好適に作製することができる。
「成体正常細胞に作用しない」における「成体」とは幼小児期をのぞいた個体を意味し、総じて成人を意味する。
（２）上記本発明のウイルスベクターを含む、血管狭窄を処置および予防するための医薬組成物、および該ベクターの有効量を生体に導入し、発現複製させることを特徴とする、血管狭窄を処置および予防するための方法
本発明において、血管狭窄とは新生内膜の肥厚に起因する血管の内腔狭窄を意味し、それが動脈硬化性病変または臓器移植のいずれに由来するかは問わない。
また、本発明において、血管狭窄には血管の血管内手術後の再狭窄も含まれる。
本発明の医薬組成物により血管狭窄が予防されれば、移植臓器の機能不全やその脱落が予防され、また例えば心臓移植後の狭心症、心筋梗塞等なども予防することができる。
本発明ウイルスベクターを血管狭窄の処置および予防に適用する際には、以下の方法が適用され得る。
本発明における成体では正常細胞に作用しない血管平滑筋特異的発現複製ウイルスベクターを、生体細胞組織、好ましくは血管狭窄が生じている血管から注入し発現複製させる。
本発明のウイルスベクターを実際に医薬として作用させる導入、注入は治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により行う。例えば、血管内（静脈もしくは動脈）に投与することができる。剤型としては例えば、液剤等の形態をとりうるが、一般には有効成分である本発明ウイルスベクターを含有する注射剤等とし、必要に応じて当業界に周知の担体を加えてもよい。
製剤中の本発明ウイルスベクターの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、ウイルス量として１０９−１０１０ｐｆｕ／ｍｌ（ＰＦＵ：ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）の濃度で０．１ｍｌ程度の投与量になると予想される。
以上のような本発明ウイルスベクターの投与により、血管狭窄が起こっている、または起ころうとしている部位において所望遺伝子の発現または本発明ウイルスベクターの感染、複製が生じ、狭窄を退縮あるいは消失させる。このようにして、血管狭窄または血管再狭窄の処置または予防が達成される。
以下、調製例および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
調製例
Ｉ．使用細胞
ヒト平滑筋肉腫細胞株ＳＫ−ＬＭＳ−１（ＨＴＢ−８８）、ヒト骨肉腫細胞株ＨＯＳ（ＣＲＬ−１５４３）、ＭＮＮＧ−ＨＯＳ（ＣＲＬ−１５４７）、およびベロ細胞（ＣＣＬ−８１）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｕｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。
ヒト平滑筋肉腫細胞株ＳＫＮ（ＲＣＢ０５１３）およびヒト骨肉腫細胞株ＯＳＴ（ＲＣＢ０４５４）は、理研ジーンバンク（ＲＩＫＥＮ  ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ）から購入した。
ヒト滑膜肉腫およびデスモイド細胞株は、各腫瘍患者から切除した腫瘍サンプルから樹立した。滑膜肉腫の診断は文献（Ｓａｒｃｏｍａ  ３，１０７−１１３，１９９９）に記載のようにＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の発現を確認することにより行った。
初期培養されたヒトメサンギウム細胞（ＨＭＣ；弘前大学医学部の山部博士より供与；Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１２，４３８−４４２，１９９７）をヒト胎児の腎臓（妊娠１６および１８週）から調製し（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ＬｅｉｄｅｎのＤｒ．Ｍ．Ｒ．Ｄａｈａによって樹立されたもの）、４〜６回継代培養したものを以下の実施例に用いた。
ヒト臍帯静脈内皮細胞株ＨＵＶＥＣ（Ｔ２００−０５）は、東洋紡バイオケミカルから購入した。
ＩＣＰ４遺伝子を導入したベロ細胞、Ｅ５細胞（ベロ細胞にＩＣＰ４遺伝子をトランスフェクションしたもの））、Ｎ．Ｄｅｌｕｃａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）から供与されたものを用いた。）
ＩＩ．培養方法
ＳＫ−ＬＭＳ−１は１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したイーグルＭＥＭで培養した。ＨＯＳ、ＭＮＮＧ−ＨＯＳ、ＯＳＴ、ベロおよびＥ５細胞は、ＤＭＥＭで培養した。ＳＫＮ細胞は、Ｆ１２培地で培養した。滑膜肉腫細胞およびデスモイド腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ヒトメサンギウム細胞は１ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコースを添加したＤＭＥＭで培養した。全ての培地には、最終濃度で１０％，１５％（ＳＫＮの場合）または２０％（滑膜肉腫細胞およびデスモイドの場合）の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンがそれぞれ含まれている。ＨＵＶＥＣは、製造者の指示に従った培地で培養した。
上記全ての細胞は、加湿された５％のＣＯ２条件下で３７℃にて培養した。
ＩＩＩ．検定方法
化学ルミネッセンス（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）は、製造者のプロトコルに従って結合抗体を視覚化した。
ＩＶ．ウイルス
それぞれＥ５細胞またはベロ細胞に低多重度で感染させることにより生成した、ＨＳＶのＩＣＰ４欠損変異体ｄ１２０（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６，５５８−５７０，１９８５）およびＨＳＶのＩＣＰ６（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）欠損変異体ｈｒＲ３は、Ｎ．ＤｅｌｕｃａまたはＳ．Ｗｅｌｌｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ）からそれぞれ供与されたものを用いた。
実施例中、統計学的分析として、無対のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを使って、統計的差異を確認した。差異はｐ＜０．０５で、統計的に有意であると考えた。
調製例１
ヒトカルポニンプロモーターの発現制御領域の同定
Ｉ．ＲＮＡの調製とＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎｅ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社製）を用いて培養した細胞（ＯＳＴ、ＳＫ−ＬＭＳ−１、滑膜細胞肉腫（Ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ））から抽出し、文献（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７９，２４５−２５０，１９９８）記載の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲ増幅の条件としては、９４℃で４０秒間変性させ、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で９０秒間伸長反応させるというサイクルを３０回繰返し行った。ヒトカルポニンプライマーとしては、５’−ｇａｇｔｇｔｇｃａｇａｃｇｇａａｃｔｔｃａｇｃｃ−３’［フォーワードプライマー１（ＦＰ１）；ｎｔ＃１０−３３ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ１７４０８；配列番号５］と５’−ｇｔｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｇｇｇｔｃ−３’［リバースプライマー１（ＲＰ１）；ｎｔ＃６６０−６８０；配列番号６］を、コントロールとしてのＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のプライマーとしては、５’−ｃｃｃａｔｃａｃｃａｔｃｔｔｃｃａｇｇａ−３’［フォーワードプライマー２（ＦＰ２）；ｎｔ＃３４２−３６０；配列番号７］と５’−ｔｔｇｔｃａｔａｃｃａｇｇａａａｔｇａｇｃ−３’［リバースプライマー２（ＲＰ２）；ｎｔ＃１０５２−１０７０；配列番号８］を用いて、それぞれ６７１ｂｐと７３１ｂｐのＤＮＡを増幅させた。
ＩＩ．ヒトカルポニンプロモーターの単離
文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，１８−２１．１９９６）記載の方法に従い、ヒトゲノムλＥＭＢＬ３ファージライブラリーを上記増幅した６７１ｂｐおよび７３１ｂｐのＤＮＡを用いてスクリーニングし、ヒトカルポニン遺伝子の５’上流側を含むゲノムクローンを単離した。ＰＣＲ法で増幅することにより、５’側が欠失した断片であるｐ−１１５９Ｌｕｃ、ｐ−３８５Ｌｕｃ、ｐ−３４３Ｌｕｃ、ｐ−３１０Ｌｕｃ、ｐ−２９９Ｌｕｃ、ｐ−２８８Ｌｕｃ、ｐ−２６０Ｌｕｃ、ｐ−２３９Ｌｕｃ、ｐ−２１９Ｌｕｃ、ｐ−２０１Ｌｕｃ、ｐ−１７６Ｌｕｃ、ｐ−１５３Ｌｕｃを作製した。次いで、それぞれの断片を、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のルシフェラーゼ遺伝子の５’側に位置する多重クローニング部位にサブクローニングした。
上記番号は、以後＋１と表示されるＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に位置するＤＮＡ断片の５’末端を示している。欠失したこれらの断片は＋７３の位置まで伸びる共通の３’末端を有している。ＤＱＳ−２０００Ｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を製造者のプロトコールに従って使用し、該クローン断片のヌクレオチド配列を決定し、その配列は文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，１８−２１，１９９６）に記載の配列（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＭＢＬ  ｄａｔａｂａｓｅ；ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８５６１１）と同一であることを確認した。
ＩＩＩ．ヒトカルポニンプロモーターの発現制御領域の同定
ヒトカルポニンの発現を制御する最小のプロモーター領域を同定するため、上記ＩＩにて作製した５’部分が欠失している各種カルポニンプロモータールシフェラーゼ構築物をもつプラスミドを、ヒト骨肉腫細胞株ＭＮＮＧ−ＨＯＳおよびＨＯＳ、ならびにメサンギウム細胞株ＨＭＣにトランスフェクトした。
トランスフェクションする２４時間前に、あらかじめ培養した細胞を分割し、プレート上に播いた。製造者のプロトコルに従い１ウェル当たり、１．２μｇのプロモータープラスミドと、０．３μｇのｐＣＡＧＧＳ／β−ｇａｌ関連プラスミドと、３．７５μｌのＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）とを６ウエルディッシュに注入し、細胞（５×１０４）をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、１００μｌ／ウエルの細胞溶解緩衝液（ＰｉｃａＧｅｎｅＴＭルシフェラーゼ分析システム、Ｔｏｙｏ  Ｉｎｋ社製）中で細胞を回収した。４℃で１２０００ｇ×５分間の遠心分離を行った後、上清（２０μｌまたは３０μｌ）をルシフェラーゼアッセイおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイにそれぞれ使用した。ルシフェラーゼ活性はＢＬＲ−２０１  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ａｌｏｋａ社製）を用いて測定した。β−ガラクトシダーゼアッセイは、文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２２，１５７−１６７，１９９７）記載の方法に準じてβ−ガラクトシダーゼ酵素分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行った。再現性を確認するため、全実験は最低三回繰り返した。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することによりトランスフェクション効率を決定し、その値に応じて、ルシフェラーゼ活性（光ユニット）を補正した。ＳＶ４０エンハンサーおよびＳＶ４０プロモーターを含むｐＳＶ２−Ｌｕｃ遺伝子の発現を比較することにより、種々の細胞株のトランスフェクション効率を評価した。データは、ｐＳＶ２−Ｌｕｃの値に対してノーマライズした吸光度±Ｓ．Ｅ．を１００％を１として相対比を表示している。
メサンギウム細胞株ＨＭＣは、平滑筋様表現型に特徴的な成長パターン（山と谷）を安定的に示し、α−平滑筋アクチンおよびＳＭ２２αといった平滑筋に特異的な遺伝子を発現している。トランスフェクトした３つの細胞株の中でカルポニン遺伝子の発現が最も高かったのは、ＨＭＣだった（図１）。以前の報告にもあるように（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７９，２４５−２５０，１９９８）、カルポニンは、ヒト骨肉腫細胞株ＨＯＳにおいて中程度の発現を示すが、ＭＮＮＧ−ＨＯＳでは全く発現していなかった（図１）。
ｐ−２８８Ｌｕｃ断片とｐ−２６０Ｌｕｃ断片をｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローンして作製したプラスミドｐ−２８８Ｌｕｃとｐ−２６０ＬｕｃのＨＯＳおよびＨＭＣ細胞への一時的トランスフェクションアッセイ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の結果、両者のルシフェラーゼの活性がｐ−１１５９Ｌｕｃをトランスフェクションした場合よりも、ＨＯＳ細胞においては４倍、ＨＭＣ細胞においては６倍に増大した。これは、カルポニンプロモーター領域の−１１５９から−２８８の間に発現抑制領域があることを示している。カルポニンｍＲＮＡの発現とプロモーター領域−３８５から−２６０の転写活性との間にはかなりの相関関係があった。−２６０から−２１９まで、塩基をさらに除去するに従い、ＨＯＳ細胞とＨＭＣ細胞において、共にプロモーター活性が大きく減少した。さらにカルポニン遺伝子プロモーター領域の５’部分の広い範囲が除去された構築物（ｐ−２０１Ｌｕｃ、ｐ−１７６Ｌｕｃおよびｐ−１５３Ｌｕｃ）をトランスフェクションした場合は、ｐ−２１９Ｌｕｃを用いた場合とルシフェラーゼ活性が同程度であった。これらの結果により、−２６０から−２１９の配列は、ＨＯＳ細胞とＨＭＣ細胞の両方におけるカルポニン遺伝子転写の正の発現制御領域であることがわかる。
上記カルポニン遺伝子プロモーターの−２６０から−２１９の領域は、−２５８のＳｏｘ（ＡＡＣＡＡＴ）および−２５０のＧＡＴＡ−１（ＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣ）のコンセンサス結合配列に似たいくつかの配列モチーフを含んでいる。ｐ−２６０Ｌｕｃからカルポニン遺伝子プロモーターの−２６０から−２３９の部分を除去すると、転写活性が５０％減少する。ＳｏｘおよびＧＡＴＡ−１の推定結合部位と−２３９の下流領域が発現制御機能を示すかを調べるため、プラスミドｐ−２６０Ｌｕｃの−２５５／−２５４（ＡＡからＧＧ）、−２４６／−２４４（−２４６ではＡからＧ、−２４４ではＣからＴ）、−２３２／−２３１（ＣＣからＴＴ）の置換をした３つの変異体を作製し、そのプラスミドのトランスフェクトを行った。ＨＭＣ細胞におけるトランスフェクション実験では、上記３つの変異体は、ｐ−２６０Ｌｕｃ活性がそれぞれ７３±０．２％、７６±０．２％、３９±０．１％だった。これらの結果により、カルポニンプロモーターの転写活性には、−２６０から−２１９までの全体の配列が必要であることがわかった。
ＩＶ．ヒト軟部組織腫瘍および骨腫瘍細胞でのカルポニン遺伝子発現による転写レベルでの調節
ヒト軟部組織腫瘍および骨腫瘍細胞において、カルポニンの発現とカルポニンプロモーターの転写活性との間の相関関係の存在についてさらに検討するため、カルポニンが発現している、または発現していない各種ヒト細胞株（図２参照）に、ｐ−２６０Ｌｕｃあるいは、ｐ−２６０Ｌｕｃの上流にヒト４Ｆ２重鎖転写エンハンサー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９，２５８８−２５９７，１９８９）が挿入された構築物（ｐ４Ｆ２−２６０Ｌｕｃ）をトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、カルポニンｍＲＮＡの発現が、滑膜肉腫細胞および平滑筋肉腫細胞ＳＫ−ＬＭＳ−１で認められた。これに対し、骨肉腫細胞ＯＳＴでのカルポニンｍＲＮＡの発現は、ごくわずかだった（図２）。図２に示されるように、ｐ−２６０Ｌｕｃおよびｐ４Ｆ２−２６０Ｌｕｃの転写活性は測定したすべての細胞において、カルポニンｍＲＮＡの転写物の発現レベルと相関関係があった。これらの実験結果は、ヒト軟部組織腫瘍および骨腫瘍細胞におけるカルポニン遺伝子の発現が、翻訳開始点の上流２６０ｂｐの配列により、転写レベルで制御されている可能性を示している。
上記のように、カルポニンプロモーターの上流に４Ｆ２エンハンサーを挿入したところ、カルポニン陽性の滑膜肉腫細胞およびＳＫ−ＬＭＳ−１細胞において、ｐ−２６０Ｌｕｃの転写活性が３倍から５倍に増大した。そのため、以下の実験では、ヒト軟部組織腫瘍および骨腫瘍細胞におけるＨＳＶのＩＣＰ４遺伝子の発現の調節には、４Ｆ２エンハンサー／−２６０カルポニンプロモーター配列を使用した。
実施例１
組換えＨＳＶベクターの調製
上記調製例１の知見に基づき、カルポニン陽性細胞および増殖細胞中で選択的に複製するＨＳＶベクターを構築するため、４Ｆ２エンハンサー／−２６０カルポニンプロモーター／ＩＣＰ４（ｐＴＫΔ−ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４）を含むＤＮＡ断片を、ＨＳＶのＩＣＰ４欠損変異体ｄ１２０（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６，５５８−５７０，１９８５）のＴＫ遺伝子座（ＵＬ２３）に挿入し、ｄ１２．ＣＡＬＰを作製した。なお、プラスミドｐＴＫΔ−ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４は、大腸菌由来のＬａｃＺを挿入したＩＣＰ４タンパク質とβ−ガラクトシダーゼを発現する二つのキメラ導入遺伝子を含んでいる（図３Ａ）。
ｄ１２．ＣＡＬＰの具体的作製手法は次の通りである。
ＩＣＰ４のコード領域を含むｐＧＨ１０８（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６，５５８−５７０，１９８５）由来の４．１ｋｂの平滑末端ＳａｌＩ−ＭｓｅＩ断片（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＨａｙｗａｒｄ博士より提供）を、ｐＡＭＰ１ベクター（ｐＵＣ系のｐｌａｓｍｉｄ）にクローニングした３３３ｂｐヒトカルポニンプロモーター（−２６０〜＋７３）の下流の平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、次いでこのベクターのＳｍａＩサイトにヒト４Ｆ２重鎖転写エンハンサー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９，２５８８−２５９７，１９８９）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＬｅｉｄｅｎ氏より提供）の４４４ｂｐのＮｏｔＩ断片をサブクローンした。得られたｐＡＭＰ１／ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４ベクターをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩとを用いて二重消化させることにより得られた４．７ｋｂ断片を、ｐＴＫΔＬ組換えベクターのＸｂａＩ平滑末端サイトにサブクローンした。ｐＴＫΔＬ組換えベクターは、０．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ領域が欠失したＴＫコード配列、大腸菌（Ｅｓｃｈａｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＬａｃＺ、ＴＫ配列の上流（ＴＫの＋５３）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５１２４−５１３２，１９９７）、およびＳＶ４０由来ポリＡシグナルから構成されている（ｐＴＫΔＬ組換えベクターはＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより発売されているｐＨＳＶ１０６よりＪ  Ｖｉｒｏｌ．７１（Ｎｏ．７）：５１２４−５１３２，１９９７を参照して調製）。製造者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社）を使用し、上記プラスミドをＳａｌＩサイトで線状化したｐＴＫΔ−ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４とｄ１２０ＤＮＡとを、Ｅ５細胞に同時トランスフェクションした。ガンシクロビア（１μ／ｍｌ）の存在下、単一のプラークとして同定された組換えウイルスベクターｄ１２．ＣＡＬＰを、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）アガロースオーバーレイで青色に染色し、単離を行うという方法で、プラーク精製を三回行った。ＤＮＡを精製した後、制限酵素で分解し、サザンブロット、およびＰＣＲ分析によりその組換えを確認した。
１０〜２０個の１５０ｃｍ２／ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｌａｓｋｓ（ＩＷＡＫＩ  ＣＬＡＳＳ社製）中のＥ５細胞に感染させ、４８時間後に剥離した細胞を回収することにより、ウイルス感染細胞懸濁液を調製した。
次いで、ウイルス回収のため、４℃で５分間、４００×ｇで遠心分離を行って感染Ｅ５細胞を収集し、１０ｍｌの冷ウイルス緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に懸濁した。超音波処理（１分間を６回）を組み合わせた凍結処理と解凍処理を三回行い、上記細胞を溶解した。４℃で５分間、１５００×ｇで遠心分離を行ったあと、その上清に対してさらに４℃で４５分間、１５０００×ｇで遠心分離を行った。その結果得られたペレットを冷ウイルス緩衝液に懸濁し、Ｅ５細胞におけるプラークアッセイにより精製したｄ１２．ＣＡＬＰの力価を測定した。
実施例２
カルポニン陽性細胞における組換えＨＳＶベクターのインビトロでの選択的複製Ｉ．インビトロでの細胞崩壊分析
カルポニン発現ヒト細胞株またはカルポニン非発現ヒト細胞株を使用し、ｄ１２．ＣＡＬＰのウイルス複製の選択性を評価した（図３Ｂ：ＲＴ−ＰＣＲの結果）。
上記作製した細胞株（図３Ｃ参照）に、感染多重度０．００１のｄ１２．ＣＡＬＰまたはＩＣＰ６欠損変異体ｈｒＲ３を４８時間感染させた。ウイルス複製は、プラーク形成を指標として評価した（図３Ｃ）。ｈｒＲ３による感染はポジティブ対照である。カルポニン陽性の滑膜肉腫細胞、ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞、およびＨＯＳ細胞では、ｄ１２．ＣＡＬＰはｈｒＲ３と同様の細胞変性効果を示した。これに対して、カルポニン陰性のＳＫＮ細胞、ＯＳＴ細胞、ＭＮＮＧ−ＨＯＳ細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞では、ｄ１２．ＣＡＬＰによる明らかな細胞溶解は認められなかった。もっとも緩慢な増殖速度を示したデスモイド細胞はＳＫ−ＬＭＳ−１細胞と同じレベルでカルポニンのｍＲＮＡを発現しているが、ｄ１２．ＣＡＬＰによる明らかなプラーク形成は認められなかった。以上の結果は、ｄ１２．ＣＡＬＰによる細胞変性効果が、カルポニン発現と細胞増殖速度の両方に依存していることを示している。
図４Ａおよび４Ｂからわかるように、ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞および滑膜肉腫細胞にｄ１２．ＣＡＬＰを低感染多重度（ＭＯＩ：０．００１）で感染させた場合、感染の９６時間後には、１０ｃｍディッシュ中の培養物の完全な腫瘍崩壊が生じる。滑膜肉腫細胞の崩壊が細胞から細胞へと拡大していくことも確認できた（図４Ａ）。感染したＳＫ−ＬＭＳ−１細胞の中には、溶解前に多核化したものも見られた（図４Ｂ、矢印部分）。
ＩＩ．インビトロでのウイルス複製分析
１％の熱不活性ＦＢＳ／ＰＢＳ中、感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１〜０．００１ｐｆｕ／ｃｅｌｌで６ウエル組織培養プレート中のＳＫ−ＬＭＳ−１細胞またはＯＳＴ細胞のサブコンフルエント単層にウイルスを感染させた。かかる感染細胞を３７℃で１時間インキュベートし、その後、１％のＦＢＳと１１．３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．社製）を含む前記培地で培養した。感染の４８時間後、プラーク／ウエルの数を計測した。ウイルス複製分析のために、１２ウエル組織培養プレート中のＳＫ−ＬＭＳ−１細胞またはＯＳＴ細胞の単層培養（２×１０５細胞／ｗｅｌｌ）に、１％のＦＢＳ／ＰＢＳ中にて、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１となるようにｄ１２．ＣＡＬＰを感染させた。接種したウイルスを１時間後に取り除き、上記細胞を前記培地でインキュベートした。所定の時間（１２時間、２４時間、４８時間）に、１００μｌのウイルス緩衝液を用いて感染細胞をウエルから剥がした。細胞溶解物（１μｌ）を１０−３、１０−４および１０−５に希釈し、その後Ｅ５細胞におけるウイルスの力価をシングルステップグロースアッセイで評価した。
ｄ１２．ＣＡＬＰは、カルポニン陽性ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞中で複製したが、ｄ１２．ＣＡＬＰの力価は感染の４８時間後のカルポニン陰性ＯＳＴ細胞中ではＳＫ−ＬＭＳ−１細胞に比べて１／１０６から１／１０７程度に減少した（図５Ａ）。
ＩＣＰ４発現のイムノブロット分析は文献（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７９，２４５−２５０，１９９８）記載の方法と同様に行った。ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞およびＯＳＴ細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１となるようにｄ１２．ＣＡＬＰまたはウイルスバッファーのみをそれぞれ感染させ、２２時間培養したのち回収した。同量のタンパク質を９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に移した。５％のスキムミルク（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、膜を室温で２時間ブロッキングし、その後、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のＩＣＰ４タンパク質に対するモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．１１０１、Ｇｏｏｄｗｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（希釈率１：５００）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。
感染２２時間後の細胞抽出物のイムノブロット分析を行った結果、ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞ではＩＣＰ４タンパク質が発現しているが、ＯＳＴ細胞ではＩＣＰ４タンパク質が発現していないことがわかった。これはウイルス複製分析結果と一致していた（図５Ｂ）。これに対し、ｄ１２０ウイルスベクターは、ＳＫ−ＬＭＳ−１およびＯＳＴの培養物において子孫ウイルスの産生はまったく見られなかった。
実施例３
組換えＨＳＶベクターによるヒト平滑筋肉腫異種移植片の処理
治療におけるｄ１２．ＣＡＬＰの効果をインビボで評価するため、平滑筋肉腫異種移植片としてＳＫ−ＬＭＳ−１細胞あるいは骨肉腫移植片としてＯＳＴ細胞を、６週齢の雌の無胸腺症ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）（日本ＳＬＣ社製）の体側部に皮下注射し、腫瘍を定着させた。腫瘍は、ヌードマウス内で直径６から７ｍｍ程度に成長した。１×１０７ｐｆｕのｄ１２．ＣＡＬＰを含む５０μｌ（１腫瘍塊あたり）のウイルス懸濁液、あるいは同量のウイルス緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）を、３０ゲージの針を用いてそれぞれ腫瘍内に注入した。９日後に、全く同じ処理を繰り返した。注入後所定の時間に腫瘍を測定し、式［０．５３×長さ×幅の２乗］を用いて腫瘍容積を計算した。なお、処理前には、腫瘍の容積（それぞれ１３８±２０と１３９±２８ｍｍ３、ｎ＝５）においても、免疫反応性カルポニンの発現レベルにおいても、ｄ１２．ＣＡＬＰで処理した腫瘍と対照腫瘍との間には有意な差は見られなかった。
ｄ１２．ＣＡＬＰの感染は、ＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍の成長抑制とは関連性を示したが、カルポニン陰性ＯＳＴ腫瘍の成長抑制とは関連性がなかった（図６Ａ）。これに対し、ＳＫ−ＬＭＳ−１異種移植片のウイルスバッファーのみでの処理は、処理後８９日目までに、進行性腫瘍の成長と全ての動物の死（ｎ＝５）が確認でき、進行性腫瘍の成長と動物の死に関連があることがわかった（図６Ｂ）。最初のｄ１２．ＣＡＬＰ感染から５週間後には、５匹中４匹のマウスにおいて、腫瘍が完全に退縮しているのが確認できた（図７）。１匹のマウスでは腫瘍が再成長していた。そこでかかるマウスの再発した腫瘍をｄ１２．ＣＡＬＰで再処理したところ、腫瘍の成長が安定的に抑制された。
Ｘ−ｇａｌを用いた組織化学的分析のため、１×１０７ｐｆｕ／腫瘍容積１００ｍｍ３のｄ１２．ＣＡＬＰを一回投与した後、所定の日数で、腫瘍があるマウスを絶命させた。皮下腫瘍を取り出し、２％のパラホルムアルデヒド、０．５％のグルタルアルデヒドを用いて、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳで、４℃で一晩固定した。続いて、Ｘ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）、５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ６）、５ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ６）および１ｍＭのＭｇＣｌ２をＰＢＳ中に含む基質溶液に、該腫瘍を３７℃で３時間浸し、その後、３％のＤＭＳＯを含むＰＢＳで洗浄した。
Ｘ−ｇａｌを使った組織化学的染色法では、ＴＫ遺伝子座へＬａｃＺを挿入することによるβ−ガラクトシダーゼの発現は、ｄ１２．ＣＡＬＰで処理したＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍細胞（図８Ａおよび８Ｂ）において確認されたが、対照腫瘍細胞では確認することができなかった。これにより、インビボにおいてｄ１２．ＣＡＬＰウイルスが拡散する領域が同定された。８日目には壊死が目立つようになり、この領域においてはＬａｃＺの発現が欠乏していた（図８Ａ、矢印）。倍率を上げると、インビトロの細胞変性分析で観察されたように、青く染色された腫瘍細胞のなかに多核化したものが見られ（図８Ｃ、矢印）、それらはＳＫ−ＬＭＳ−１細胞の典型的な形態学的外見を失っていた。しかし、図８Ｄに示されるように、ウイルス感染マウスにおいて、正常血管を取り巻く平滑筋細胞のＬａｃＺ発現は陰性であった。血管平滑筋がカルポニンを発現しても増殖しない細胞集団である。ＬａｃＺ発現が陰性であるということはウイルスの複製を認めないことを意味し、本発明における「成体正常細胞に作用しない」という安全性が確認されたことを示している。
感染させたウイルスの分布をＰＣＲにより調べるため、感染腫瘍あるいは非感染腫瘍、並びに脳、肺、肝臓、腎臓、心臓、小腸および子宮あるいは精巣の新鮮な組織から、ＤＮＡを調製した。ＰＣＲ増幅の条件としては、９４℃で４０秒間変性させ、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で９０秒間伸長反応させるというサイクルを３０回繰返し行った。ＩＣＰ６（リボヌクレオチド  リダクターゼ）プライマーとしては、５’−ｇａｃａｇｃｃａｔａｔｃｃｔｇａｇｃ−３’［フォーワードプライマー３（ＦＰ３）；配列番号９］と５’−ａｃｔｃａｃａｇａｔｃｇｔｔｇａｃｇａｃｃｇ−３’［リバースプライマー３（ＲＰ３）；配列番号１０］を、グリコプロテインＥのプライマーとしては、５’−ｇａｇａｔｇｃｇａａｔａｔａｃｇａａｔ−３’［フォーワードプライマー４（ＦＰ４）；配列番号１１］と５’−ｇｔｇｇｇｔｇｇｇｃｔｃｇｇｃｃａａａｔ−３’［リバースプライマー４（ＲＰ４）；配列番号１２］を、大腸菌のＬａｃＺのプライマーとしては、５’−ｇｃｇｔｔａｃｃｃａａｃｔｔａａｔｃｇ−’［フォーワードプライマー５（ＦＰ５）；配列番号１３］と５’−ｔｇｔｇａｇｃｇａｇｔａａｃａａｃｃ−３’［リバースプライマー５（ＲＰ５）；配列番号１４］を、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＡＰＤＨ）のプライマーとしては、５’−ｃｃｃａｔｃａｃｃａｔｃｔｔｃｃａｇｇａ−３’［フォーワードプライマー６（ＦＰ６）；配列番号１５］と５’−ｔｔｇｔｃａｔａｃｃａｇｇａａａｔｇｇｃ−３’［リバースプライマー６（ＲＰ６）；配列番号１６］を用いて、それぞれ２２１ｂｐと３２０ｂｐ、３２０ｂｐ、７３１ｂｐのＤＮＡを増幅させた（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３８３２−３８４１，２０００）。
ｄ１２．ＣＡＬＰを腫瘍内に投与した後８日目に調製した脳、肺、肝臓、腎臓、心臓、小腸または子宮のＤＮＡ中には、ｄ１２．ＣＡＬＰに特異的なＬａｃＺ配列は確認できなかった。大動脈や胃腸の平滑筋を含む器官において、組織学的にウイルス複製とＬａｃＺ発現は生じていなかった。ここでも本ウイルスの安全性が確認された。
実施例４
腫瘍における組換えＨＳＶベクターの拡散
複製したｄ１２．ＣＡＬＰが、血管を経由して離れた場所にある腫瘍細胞を標的とすることができるか否かを評価するために、６週齢の雄のヌードマウスの両側背部皮下に、ＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍塊を生着させ、ウイルスを一方の腫瘍内に注入した。即ち、右脇腹におけるＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍塊にｄ１２．ＣＡＬＰを腫瘍内接種し、左脇腹におけるＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍塊におけるウイルスの分布を調べてみた。図９Ａに示されるように、２０日目に接種部位と同様に反対側の脇腹で腫瘍細胞においてβ−ガラクトシダーゼの発現が確認できた。組織学的には、右脇腹における腫瘍と左脇腹における腫瘍の双方において、広範囲にわたり腫瘍壊死が見られたが、図９Ｂに示されるように、正常血管を取り巻くカルポニン陽性平滑筋細胞ではｄ１２．ＣＡＬＰによる効果が見られなかった。ＴＫ遺伝子座に挿入された、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＩＣＰ６）、糖タンパク質Ｅ、または大腸菌由来のＬａｃＺに対するプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、両脇腹の腫瘍組織ではｄ１２．ＣＡＬＰ由来のウイルスＤＮＡが拡散するが、脳や精巣の腫瘍組織には拡散しないことがわかった（図９Ｃ）。
実施例５
実施例１により作成したｄ１２．ＣＡＬＰの血管内膜肥厚抑制効果を示すために、以下の実験を行った。
以下のように、Ｗｉｓｔｅｒラット頚動脈７本にバルーン傷害を作成した：
右総頚動脈、内頚動脈、外頚動脈を遮断後、外頚動脈に小切開を置き、２ＦのＦｏｇａｒｔｙカテーテルを総頚動脈へ進めた。これに６００μＬの空気を注入することでバルーンを膨張させ、総頚動脈を６回擦過した。
５日後、このうち４本に、２．５×１０７ｐｆｕのｄ１２．ＣＡＬＰを含むリン酸緩衝生理食塩水１００μＬを注入して感染させた。対照として、残り３本にリン酸緩衝生理食塩水１００μＬを注入した。傷害作成の１４日後に、ラットを犠牲にし、組織切片を作成した。
ｄ１２．ＣＡＬＰ処置血管４本中３本では、対照と比較して、顕著な血管内腔狭窄の抑制が観察された（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。ｄ１２．ＣＡＬＰ処置群のいずれにも血栓の付着は見られなかった（ｈｒＲ３を使用した予備実験では高率に血栓形成が認められた）。
以下に実験の統計学的データを示す。
2003083122.tif 000002
両処置群の分散分析における有意差  ｐ＝０．００５５
処置された血管に関して、その断面の新生内膜／中膜平滑筋層面積比が小さいほど、内膜肥厚の抑制効果が優れていることを示している。
ｄ１２．ＣＡＬＰ感染血管４本中、血管内膜肥厚抑制効果が示された３本では、中膜平滑筋細胞に変性が認められたが、残りの１本では組織学的変化が観察されなかった。このことから、内膜肥厚抑制効果が観察されなかったこのｄ１２．ＣＡＬＰ処置血管では、操作的失敗により感染自体が成立していなかったものと考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明は、治療遺伝子を導入するのではなく、標的となる細胞群を次々と破壊し感染が波及する、複製可能型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターを用いた、全くあたらしいものであり、Ｓｔｒｏｋｅ  ３０：２４３１−２４３９，１９９９に示しているようにその治療効果は画期的と言える。その細胞障害性を、目的とする細胞のみに限局する技法は、本発明者らが開発し、世界的にも他に例がないものである。本発明によれば、我が国でも年間１０万人を越える血管再狭窄の患者に適応され、経カテーテル的に血管内にウイルス投与が可能であり、従って巨額の医療費の削減に繋がる。また、臓器移植時の一大問題を解決し、患者を死への恐怖より解放できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１：  カルポニン遺伝子プロモーターの５’欠失変異体をトランスフェクションした場合の転写活性の結果を示す図である。
図２：  カルポニン陽性腫瘍細胞におけるヒトカルポニン発現制御領域の転写レベルでのエンハンサーの効果を示す図である。
図３：  ｄ１２．ＣＡＬＰの構造とインビトロでの細胞変性アッセイの結果を示す図である。
図４：  インビトロにおけるｄ１２．ＣＡＬＰによる腫瘍細胞への傷害効果を示す図である。
図５：  インビトロにおいてのカルポニン陽性細胞におけるｄ１２．ＣＡＬＰの選択的傷害活性を示す図である。
図６：  インビボにおけるｄ１２．ＣＡＬＰの腫瘍形成抑制効果を示す図である。
図７：  ｄ１２．ＣＡＬＰ処理したヌードマウスにおけるＳＫ−ＬＭＳ−１異種移植片の完全退縮を示す図である。
図８：  インビボにおけるｄ１２．ＣＡＬＰの複製を示す図である。
図９：  インビボにおいて、ｄ１２．ＣＡＬＰが感染部位から離れた部位に拡散および複製することを示す図である。
図１０：  インビボにおけるｄ１２．ＣＡＬＰの血管内膜肥厚抑制効果を示す図である。図１０Ａはｄ１２．ＣＡＬＰ処置群ラットおよび対照群ラット各３個体由来の血管の断面を表す。図１０Ｂはｄ１２．ＣＡＬＰ処置群ラット２個体および対照群ラット１個体由来の血管の断面（高倍率）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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