(57)【要約】哺乳動物由来の間葉系細胞を起源細胞として、例えば膵β細胞形成剤の存在下に該細胞を培養し、得られる膵β細胞を該細胞で特異的に発現する遺伝子を選択マーカーとして選択、分離することを特徴とする間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法、該方法によって得られる膵β細胞を有効成分とする耐糖異常疾患の治療剤、該方法に利用するサイトカインなどの膵β細胞形成剤、間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られる膵β細胞形成促進物質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の間葉系細胞を以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１つの工程に付すことを特徴とする、間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法：
ａ）哺乳動物の検体から得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を増殖させる工程、
ｂ）哺乳動物の検体から得られる間葉系細胞または工程ａ）で得られる間葉系細胞から、細胞膜抗原に結合性を有する抗体を用いて膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を選択して分離する工程、
ｃ）工程ａ）またはｂ）で得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を、該細胞が接触可能なように接着分子／細胞外基質をコートした反応容器中で培養する工程、
ｄ）工程ａ）、ｂ）またはｃ）で得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を膵β細胞形成剤と接触させて培養する工程、および
ｅ）工程ｃ）またはｄ）で得られる膵β細胞を、膵β細胞で特異的に発現する遺伝子を選択マーカーとして選択して分離する工程。
【請求項２】
間葉系細胞が、骨髄、筋肉、膵臓、肝臓、小腸、大腸、腎臓、皮下組織、子宮内膜、血液、臍帯血又は胎盤から得られる、請求項１に記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
【請求項３】
工程ｂ）における間葉系細胞の選択が、ＣＤ１４０陽性抗体を用いて行われる請求項１または２に記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
【請求項４】
工程ｅ）における膵β細胞に特異的に発現する遺伝子が、インスリンである請求項１から３のいずれかに記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
【請求項５】
工程ｄ）における膵β細胞形成剤が、サイトカイン、生理活性物質、転写因子および接着分子／細胞外基質からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１から４のいずれかに記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
【請求項６】
サイトカインが、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／ＦＧＦ−２、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、ガストリン、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、パラサイロイド・ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン、プラセンタル・ラクトジェン（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｌａｃｔｏｇｅｎ）、グルカゴン様ペプチド  １（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＫＧＦ（ｋａｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
【請求項７】
生理活性物質が、ニコチンアミド、ベータセルリン、アクチビンＡ、プロゲストロン、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｃｉｎｅ）およびセレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
【請求項８】
転写因子が、ＰＴＦ１ａ／ＰＴＦ−Ｐ４８、Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１、Ｂｅｔａ２／ｎｅｕｒｏＤ、ｎｇｎ３、ＰＡＸ−６、ＰＡＸ−４、Ｈｌｘｂ−９、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４αからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
【請求項９】
接着分子／細胞外基質が、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、アガロース、フィブロネクチンおよびオルニチンからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
【請求項１０】
サイトカイン、生理活性物質、転写因子および接着分子／細胞外基質からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する、請求項１から９のいずれかに記載の方法に用いられる膵β細胞形成剤。
【請求項１１】
サイトカインが、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／ＦＧＦ−２、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、ガストリン、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、パラサイロイド・ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン、プラセンタル・ラクトジェン（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｌａｃｔｏｇｅｎ）、グルカゴン様ペプチド１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＫＧＦからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１０に記載の膵β細胞形成剤。
【請求項１２】
生理活性物質が、ニコチンアミド、ベータセルリン、アクチビンＡ、プロゲストロン、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｃｉｎｅ）およびセレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１０に記載の膵β細胞形成剤。
【請求項１３】
転写因子が、ＰＴＦ１ａ／ＰＴＦ−Ｐ４８、Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１、Ｂｅｔａ２／ｎｅｕｒｏＤ、ｎｇｎ３、ＰＡＸ−６、ＰＡＸ−４、Ｈｌｘｂ−９、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４αからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１０に記載の膵β細胞形成剤。
【請求項１４】
接着分子／細胞外基質が、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、アガロース、フィブロネクチンおよびオルニチンからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１０に記載の膵β細胞形成剤。
【請求項１５】
候補物質の存在下に請求項１に記載の方法に従って間葉系細胞から膵β細胞を形成させ、候補物質の非存在下に形成される膵β細胞と対比して、膵β細胞の形成を促進させる作用を奏する候補物質を選択することを特徴とする、間葉系細胞からのβ細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
間葉系細胞が、骨髄、筋肉、膵臓、肝臓、小腸、大腸、腎臓、皮下組織、子宮内膜、血液、臍帯血又は胎盤から得られる、請求項１５に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
工程ｂ）における間葉系細胞の選択が、ＣＤ１４０陽性抗体を用いて行われる請求項１５または１６に記載の間葉系細胞からのβ細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
工程ｅ）における膵β細胞に特異的に発現する遺伝子が、インスリンである請求項１５から１７のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
工程ｄ）における膵β細胞形成剤が、サイトカイン、生理活性物質、転写因子および接着分子／細胞外基質からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１５から１８のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
サイトカインが、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／ＦＧＦ−２、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、ガストリン、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、パラサイロイド・ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン、プラセンタル・ラクトジェン（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｌａｃｔｏｇｅｎ）、グルカゴン様ペプチド１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＫＧＦからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
生理活性物質が、ニコチンアミド、ベータセルリン、アクチビンＡ、プロゲストロン、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｃｉｎｅ）およびセレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項２２】
転写因子が、ＰＴＦ１ａ／ＰＴＦ−Ｐ４８、Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１、Ｂｅｔａ２／ｎｅｕｒｏＤ、ｎｇｎ３、ＰＡＸ−６、ＰＡＸ−４、Ｈｌｘｂ−９、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４αからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
接着分子／細胞外基質が、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、アガロース、フィブロネクチンおよびオルニチンからなる群から選ばれる少なくともひとつである、請求項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項２４】
候補物質が培養組成物である請求項１５から２３のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２５】
請求項１５から２４のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質のスクリーニング方法によって得られる、間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する活性を有する物質。
【請求項２６】
請求項１から９のいずれかに記載の方法によって得られる膵β細胞の有効量を患者に投与する、耐糖能異常に基づく疾患を有する患者の疾患を治療する方法。
【請求項２７】
請求項１から９のいずれかに記載の方法によって得られる膵β細胞を有効成分として含有する、耐糖能異常に基づく疾患の治療剤。
【請求項２８】
培養皿に単層培養された間葉系細胞上に、インスリン分泌細胞に分化されうる細胞を播き、共培養してインスリン分泌細胞に分化する方法。
【請求項２９】
インスリン分泌細胞に分化されうる細胞が、胚性幹細胞、膵幹細胞、小腸上皮幹細胞、肝臓由来幹細胞及び羊膜細胞からなる群から選ばれる１種である、請求項２８に記載の共培養してインスリン分泌細胞に分化する方法。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本発明は、間葉系細胞から膵β細胞を形成させる方法に関する。また本発明は、間葉系細胞から膵β細胞を形成させる膵β細胞形成剤に関する。さらに本発明は、間葉系細胞からの膵β細胞形成を促進させる候補物質のスクリーニング方法に関する。加えて本発明は、間葉系細胞から膵β細胞を形成させる方法によって得られる膵β細胞を利用する耐糖能異常疾患の治療方法および治療剤に関する。
背  景  技  術
膵β細胞は、胎児期ではインスリンを産生しながら活発に細胞分裂を行っているが、炎症、出生後の加齢（老化）などに伴い次第に変性壊死する。従って、これらの患者などの生体内に残存する膵β細胞数は少なく、これが血糖インスリン値の低下や耐糖能異常を招く。
かかる炎症などによる膵β細胞の変性壊死に伴われる耐糖能異常疾患は、これまでインスリン投与の増強などの対症療法を中心に治療が行われてきた。これに対して、膵β細胞移植は、重症耐糖能異常疾患に対する根本的な治療法と考えられるが、臓器提供者の不足、脳死判定の難しさ、拒絶反応、医療費の高騰などの問題から、一般的な医療に普及するには至っていない。実際、糖尿病などの耐糖能異常に基づく疾患は、腎障害、神経障害、網膜障害、虚血性心疾患、高血圧などの重大なリスクファクターであり、失われた膵β細胞を再生することができれば、医療福祉の大きな前進につながると考えられる。
現在までに、膵β細胞の性質を保存した細胞株としては、ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ細胞およびＲＩＮ細胞が知られている〔Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６（１０），１６６３（１９９７）〕。しかしながら、これらの細胞の移植によると腫瘍が形成されるため、これらの細胞は細胞移植に適さない問題がある。このような背景のもと、膵β細胞を再構築するために以下の３つの方法が考えられた。
１つ目の方法は、膵β細胞以外の細胞を膵β細胞に変換する方法である。この方法は、例えば肝細胞にＰｄｘ−１／ＩＰＦ−１を導入するとβ細胞様細胞に変換されることから類推された［Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，６（５）：５６８，２００１］。
２つ目の方法は、膵β細胞に再び分裂能を付与する方法である。これは、胎児期にβ細胞が分裂する現象および切除膵においてβ細胞が分裂する現象に基づいている。
３つ目の方法は、未分化な幹細胞から膵β細胞を誘導する方法である。すでに、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から膵β細胞を誘導できることが知られている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：１３８９−１３９３，２００１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４９：１５７−１６２，２０００；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０：１６９１−１６９７，２００１］。しかるに、このＥＳ細胞は、これを生体に移植するとカルシノーマを形成する欠点があり、また抗原性などの問題が存在する。また、成人の膵ラ氏島に存在する幹細胞から膵β細胞を誘導する方法も知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０：５２１−５３３，２００１］。
上記のようなＥＳ細胞を現実の医療に応用するためには、少なくとも膵β細胞前駆細胞あるいは膵β細胞を純粋に精製する技術が不可欠である。抗原性の問題はクローン化の技術により解決できる可能性が示唆されるが、煩雑な操作を必要とすることから、一般的な医療への応用は容易ではない。
未分化な細胞である膵β細胞前駆細胞を取得して移植に用いる方法も考えられ、動物を用いた実験では膵β細胞として有効に機能することが報告されている〔Ｒａｍｉｙａ，Ｖ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６（３），２７８（２０００）；Ｓｏｒｉａ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４９（２），１５７（２０００）〕。該報告は患者自身から骨髄液を取得して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞培養および薬剤処理を行った後、膵β細胞の障害部位に移植する細胞治療が現実的な医療として可能になることを示唆している。
成体骨髄には、造血系幹細胞および血管幹細胞以外に、間葉系幹細胞が存在し、該間葉系幹細胞からは骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、靱帯細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、肝臓ｏｖａｌ細胞が分化誘導できることが報告されている［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１１６８−１１７０（１９９９）］。
生体内の組織から目的の細胞を取得する方法としては、目的細胞に特有の各種表面抗原を認識する抗体を用いる方法が知られている。上記細胞特有の表面抗原については、現在、以下の知見が得られている。即ち、例えば未熟な造血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＨＬＡ−ＤＲ−／ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）＋の特性を有しており、該造血幹細胞が分化するに従い、ＣＤ３８が発現し、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）が消失する［蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１３，２０５６−２０６２（２０００）］。血管内皮細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２、Ｅ−セレクチンなどのマーカーを発現しており［分子心血管病，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．３，２９４−３０２（２０００）］、骨髄の間葉系幹細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４０などのマーカーを発現している［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１１６８−１１７０（１９９９）］。しかしながら、膵β細胞を誘導できる間葉系幹細胞に関して、上記のような特有の表面マーカーは現在尚明らかにされていない。
発  明  の  開  示
以上のように、糖尿病などの耐糖能異常疾患の治療をより安全かつ確実に行い得る技術、特に、安全に移植可能な膵β細胞の確立乃至膵β細胞の再生技術、これらに付随する膵β細胞の増殖、分化の制御技術、該制御のためのサイトカイン乃至転写因子の解明、同定などが、当業界で望まれている。
本発明者は、上記のように当業界で望まれている耐糖能異常疾患の治療に有効な新しい技術を提供することを目的として鋭意研究を重ねる過程において、以下の知見を得た。
すなわち、マウス骨髄由来の間葉系細胞を１細胞レベルにまず分離して、膵β細胞形成能を有する細胞株を複数取得した。次に、得られた細胞株を、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現するレトロウイルスベクターを用いて標識し、１つの細胞を蛍光顕微鏡下で追跡することによって、該間葉系細胞が、膵β細胞および神経細胞の少なくとも２種の異なる細胞に分化誘導できる多分化能（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）を有する幹細胞であることを見出した。さらに、該幹細胞が、確率的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）に膵β細胞および神経細胞の系列に分化することを見出すと共に、この分化に関与する分化誘導剤（膵β細胞形成剤）としての転写因子、液性因子およびマトリックスを明らかにした。次に、移植実験により、上記間葉系細胞が骨、軟骨、脂肪、心筋、骨格筋、神経および血管になることを確認した。これらの結果から、本発明者は、上記間葉系細胞が、今まで知られていた骨髄に存在する造血系組織にのみ分化する造血幹細胞および骨格筋、脂肪細胞、骨などの沿軸中胚葉系組織にのみ分化する間葉系幹細胞とは異なって、外胚葉系、中胚葉系および内胚葉系の３胚葉のすべてに分化できる全能性を有していることを見出した。
また、本発明者は、上記間葉系細胞について、造血系細胞の表面抗原であるＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、Ｓｃａ−１、Ｌｙ６ｃおよびＬｙ６ｇを認識する抗体、血管内皮細胞の表面抗原であるＦｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１０５およびＣＤ１４４を認識する抗体、間葉系細胞の表面抗原であるＣＤ１４０を認識する抗体、インテグリンの表面抗原であるＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９およびＣＤ４１を認識する抗体、マトリックス受容体であるＣＤ５４、ＣＤ１０２、ＣＤ１０６およびＣＤ４４を認識する抗体などを用いて、表面抗原の発現を解析した結果、該間葉系細胞は今までに知られていない新しい発現形態を示す膵β細胞に分化し得る細胞であることを見出した。本発明は、これらの知見を基礎として完成されたものである。
即ち、本発明は、以下の項１−項２９を提供する。
項１．哺乳動物由来の間葉系細胞を以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１つの工程に付すことを特徴とする、間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法：
ａ）哺乳動物の検体から得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を増殖させる工程、
ｂ）哺乳動物の検体から得られる間葉系細胞または工程ａ）で得られる間葉系細胞から、細胞膜抗原に結合性を有する抗体を用いて膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を選択して分離する工程、
ｃ）工程ａ）またはｂ）で得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を、該細胞が接触可能なように接着分子／細胞外基質をコートした反応容器中で培養する工程、
ｄ）工程ａ）、ｂ）またはｃ）で得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を膵β細胞形成剤と接触させて培養する工程、および
ｅ）工程ｃ）またはｄ）で得られる膵β細胞を、膵β細胞で特異的に発現する遺伝子を選択マーカーとして選択して分離する工程。
項２．間葉系細胞が、骨髄、筋肉、膵臓、肝臓、小腸、大腸、腎臓、皮下組織、子宮内膜、血液、臍帯血又は胎盤から得られる、項１に記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
項３．工程ｂ）における間葉系細胞の選択が、ＣＤ１４０陽性抗体を用いて行われる項１または２に記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
項４．工程ｅ）における膵β細胞に特異的に発現する遺伝子が、インスリンである項１から３のいずれかに記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
項５．工程ｄ）における膵β細胞形成剤が、サイトカイン、生理活性物質、転写因子および接着分子／細胞外基質からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１から４のいずれかに記載の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法。
項６．サイトカインが、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／ＦＧＦ−２、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、ガストリン、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、パラサイロイド・ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン、プラセンタル・ラクトジェン（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｌａｃｔｏｇｅｎ）、グルカゴン様ペプチド１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＫＧＦ（ｋａｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
項７．生理活性物質が、ニコチンアミド、ベータセルリン、アクチビンＡ、プロゲストロン、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｃｉｎｅ）およびセレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
項８．転写因子が、ＰＴＦ１ａ／ＰＴＦ−Ｐ４８、Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１、Ｂｅｔａ２／ｎｅｕｒｏＤ、ｎｇｎ３、ＰＡＸ−６、ＰＡＸ−４、Ｈｌｘｂ−９、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４αからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
項９．接着分子／細胞外基質が、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、アガロース、フィブロネクチンおよびオルニチンからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項５に記載の間葉系細胞を膵β細胞に形成させる方法。
項１０．サイトカイン、生理活性物質、転写因子および接着分子／細胞外基質からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する、項１から９のいずれかに記載の方法に用いられる膵β細胞形成剤。
項１１．サイトカインが、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／ＦＧＦ−２、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、ガストリン、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、パラサイロイド・ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン、プラセンタル・ラクトジェン（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｌａｃｔｏｇｅｎ）、グルカゴン様ペプチド１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＫＧＦからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１０に記載の膵β細胞形成剤。
項１２．生理活性物質が、ニコチンアミド、ベータセルリン、アクチビンＡ、プロゲストロン、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｃｉｎｅ）およびセレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１０に記載の膵β細胞形成剤。
項１３．転写因子が、ＰＴＦ１ａ／ＰＴＦ−Ｐ４８、Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１、Ｂｅｔａ２／ｎｅｕｒｏＤ、ｎｇｎ３、ＰＡＸ−６、ＰＡＸ−４、Ｈｌｘｂ−９、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４αからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１０に記載の膵β細胞形成剤。
項１４．接着分子／細胞外基質が、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、アガロース、フィブロネクチンおよびオルニチンからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１０に記載の膵β細胞形成剤。
項１５．候補物質の存在下に項１に記載の方法に従って間葉系細胞から膵β細胞を形成させ、候補物質の非存在下に形成される膵β細胞と対比して、膵β細胞の形成を促進させる作用を奏する候補物質を選択することを特徴とする、間葉系細胞からのβ細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項１６．間葉系細胞が、骨髄、筋肉、膵臓、肝臓、小腸、大腸、腎臓、皮下組織、子宮内膜、血液、臍帯血又は胎盤から得られる、項１５に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項１７．工程ｂ）における間葉系細胞の選択が、ＣＤ１４０陽性抗体を用いて行われる項１５または１６に記載の間葉系細胞からのβ細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項１８．工程ｅ）における膵β細胞に特異的に発現する遺伝子が、インスリンである項１５から１７のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項１９．工程ｄ）における膵β細胞形成剤が、サイトカイン、生理活性物質、転写因子および接着分子／細胞外基質からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１５から１８のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項２０．サイトカインが、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／ＦＧＦ−２、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、ガストリン、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、パラサイロイド・ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン、プラセンタル・ラクトジェン（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｌａｃｔｏｇｅｎ）、グルカゴン様ペプチド１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＫＧＦからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項２１．生理活性物質が、ニコチンアミド、ベータセルリン、アクチビンＡ、プロゲストロン、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｃｉｎｅ）およびセレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）からなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項２２．転写因子が、ＰＴＦ１ａ／ＰＴＦ−Ｐ４８、Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１、Ｂｅｔａ２／ｎｅｕｒｏＤ、ｎｇｎ３、ＰＡＸ−６、ＰＡＸ−４、Ｈｌｘｂ−９、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４αからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項２３．接着分子／細胞外基質が、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、アガロース、フィブロネクチンおよびオルニチンからなる群から選ばれる少なくともひとつである、項１９に記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質をスクリーニングする方法。
項２４．候補物質が培養組成物である項１５から２３のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質のスクリーニング方法。
項２５．項１５から２４のいずれかに記載の間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する候補物質のスクリーニング方法によって得られる、間葉系細胞からの膵β細胞の形成を促進する活性を有する物質。
項２６．項１から９のいずれかに記載の方法によって得られる膵β細胞の有効量を患者に投与する、耐糖能異常に基づく疾患を有する患者の疾患を治療する方法。
項２７．項１から９のいずれかに記載の方法によって得られる膵β細胞を有効成分として含有する、耐糖能異常に基づく疾患の治療剤。
項２８．培養皿に単層培養された間葉系細胞上に、インスリン分泌細胞に分化されうる細胞を播き、共培養してインスリン分泌細胞に分化する方法。
項２９．インスリン分泌細胞に分化されうる細胞が、胚性幹細胞、膵幹細胞、小腸上皮幹細胞、肝臓由来幹細胞及び羊膜細胞からなる群から選ばれる１種である、項２８に記載の共培養してインスリン分泌細胞に分化する方法。
本発明の間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法は、前述した通り、哺乳動物由来の間葉系細胞（膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を含む）を起源として、基本的には、該細胞を膵β細胞に分化させた後（工程ｃまたはｄ）、得られる膵β細胞を分離（採取）する（工程ｅ）ことにより実施できる。
上記において起源とする間葉系細胞は、これを一般的方法に従い増殖させることができ（工程ａ）、また該細胞より膵β細胞に分化する能力を有する所望の間葉系細胞を選択、分離することができる（工程ｂ）。
かくして得られる膵β細胞への分化能を有する細胞は、接着分子／細胞外基質（膵β形成剤）をコートした反応容器中で培養する（工程ｃ）かまたは膵β細胞形成剤と接触させて培養（膵β細胞形成剤を含む培地で培養）する（工程ｄ）ことによって目的とする膵β細胞に分化誘導される。
本発明方法の好ましい一実施態様によれば、哺乳動物の検体から得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を増殖させ（工程ａ）、工程ａで得られる間葉系細胞から、細胞膜抗原に結合性を有する抗体を用いて膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を選択して分離し（工程ｂ）、工程ｂで得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を、該細胞が接触可能なように接着分子／細胞外基質をコートした反応容器中で培養し（工程ｃ）、工程ｃで得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を膵β細胞形成剤と接触させて培養し（工程ｄ）、工程ｄで得られる膵β細胞を、該膵β細胞で特異的に発現する遺伝子を選択マーカーとして選択して分離する（工程ｅ）。
本発明方法の他の好ましい一実施態様によれば、哺乳動物の検体から得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を増殖させ（工程ａ）、次いで得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を、該細胞が接触可能なように接着分子／細胞外基質をコートした反応容器中で培養する（工程ｃ）。
また、本発明方法の他の好ましい一実施態様は、哺乳動物の検体から得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞を増殖させ（工程ａ）、次いで得られる膵β細胞に分化し得る間葉系細胞またはこれを含む細胞を膵β細胞形成剤と接触させて培養する（工程ｄ）。
上記膵β細胞の形成（分化誘導）は、特に好ましくは、工程ｃおよびこれに引き続く工程ｄの採用によって行われる。
本発明方法において、哺乳動物由来の間葉系細胞（膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞を含む）は、例えば骨髄、筋肉、膵臓、肝臓、小腸、大腸、腎臓、皮下組織、子宮内膜、血液、臍帯血などの生体組織または胎盤から単離することができ、好ましくは骨髄または臍帯血から単離される。
上記間葉系細胞は、多分化能幹細胞であり、膵β細胞に分化する能力の他にも各種細胞（生体組織の全細胞）に分化する能力を潜在的に有している。
本発明方法に好ましく利用できる膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞は、細胞表面マーカーの発現型解析の結果、ＣＤ１４０陽性であることが確認された。該ＣＤ１４０陽性細胞には、更にＣＤ３４陽性およびＣＤ１１７陽性である細胞、およびＣＤ３４陰性およびＣＤ１１７陽性である細胞が含まれる。これらの内でも特に好ましい細胞としては、
（１）ＣＤ３４陽性、ＣＤ１１７陽性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ９０陰性、Ｆｌｋ−１陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陰性、ＣＤ１４４陽性、ＣＤ１４０陽性、ＣＤ４９ｂ陰性、ＣＤ４９ｄ陰性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ５４陰性、ＣＤ１０２陰性、ＣＤ１０６陰性およびＣＤ４４陽性である細胞；
（２）ＣＤ３４陽性、ＣＤ１１７陽性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ９０陰性、Ｆｌｋ−１陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陰性、ＣＤ１４４陰性、ＣＤ１４０陽性、ＣＤ４９ｂ陰性、ＣＤ４９ｄ陰性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ５４陰性、ＣＤ１０２陰性、ＣＤ１０６陰性およびＣＤ４４陽性である細胞；
（３）ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陽性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ９０陰性、Ｆｌｋ−１陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陰性、ＣＤ１４４陽性、ＣＤ１４０陽性、ＣＤ４９ｂ陰性、ＣＤ４９ｄ陰性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ５４陰性、ＣＤ１０２陰性、ＣＤ１０６陰性およびＣＤ４４陽性である細胞；並びに
（４）ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陽性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ９０陰性、Ｆｌｋ−１陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陰性、ＣＤ１４４陰性、ＣＤ１４０陽性、ＣＤ４９ｂ陰性、ＣＤ４９ｄ陰性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ５４陰性、ＣＤ１０２陰性、ＣＤ１０６陰性およびＣＤ４４陽性である細胞を挙げることができる。
上記間葉系細胞の起源とする生体組織などとしては、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物に由来するものが挙げられる。ヒトの治療用途には特にヒト由来のものが好ましい。
以下、起源動物由来間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法（膵β細胞の単離方法）を、各工程乃至操作毎に順次詳述する。
１．膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞の起源動物からの分離
膵β細胞への分化能を有する細胞は、前記した各種の生体組織または臍帯血から単離することができる。以下、生体組織としてヒト骨髄から膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞を例にとり、その単離方法を具体的に述べる。
（１）骨髄由来間葉系細胞の単離
胸骨または腸骨に骨髄穿刺を行う。骨髄穿刺針の内筒を抜き、ヘパリンを入れた注射器を装着して必要量の骨髄液を速やかに吸引する。平均的には１０ｍｌ−２０ｍｌの骨髄液を吸引する。取得した骨髄液を１，０００×ｇで遠心分離して骨髄由来間葉系細胞を回収後、該骨髄由来間葉系細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄する。本ステップを２回繰り返した後、細胞培養用培地に再浮遊させて骨髄由来間葉系細胞液を得る。
該骨髄由来間葉系細胞液から膵β細胞への分化能を有する骨髄間葉系細胞（骨髄間質細胞）を単離する方法としては、上記で調製した細胞液中に混在する他の細胞、例えば血球系細胞、造血幹細胞、血管幹細胞などを除去する一般的な方法に従うことができる。その例としては、例えば、Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３（１９９９）に記載された方法を採用できる。該方法は、具体的には、まず骨髄由来間葉系細胞液を密度１．０７３ｇ／ｍｌのｐｅｒｃｏｌｌに重層した後、１，１００×ｇで３０分間遠心分離して界面の細胞を回収することにより単離する。該骨髄由来間葉系細胞液に１０×ＰＢＳを加えて９／１０に希釈したｐｅｒｃｏｌｌを同容量加えて混合した後、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、密度１．０７５−１．０６０ｇ／ｍｌの画分を回収して、膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞を含む骨髄由来間葉系細胞混合物を取得する。
上記方法に従い取得した膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞を含む骨髄由来間葉系細胞混合物を、９６穴の培養プレートの各穴に１細胞のみが注入されるように希釈し、１細胞由来のクローンを多数調製した後、以下に記載する膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞から所望の膵β細胞を誘導する方法を利用してクローンを処理し、インスリンを産生する細胞が出現するクローンを選択することにより、目的とする膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞を得る。
ラットやマウスなどから膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞を取得する方法は、特に限定されないが、例えば以下の手順に従うことができる。即ち、ラットまたはマウスを頚椎脱臼により致死させ、消毒した後、大腿骨の皮膚なちびに大腿四頭筋を切除する。膝関節部分にハサミを入れて関節をはずし、大腿骨背面の筋肉を除去する。股関節部分にハサミを入れて関節を外し、大腿骨を取り出す。大腿骨に付着している筋肉をハサミでできるだけ除去した後、大腿骨の両端をハサミで切断する。骨の太さに応じた適当なサイズの針を２．５ｍｌの注射器に装着し、１０％のＦＢＳ（牛胎仔血清）を含むα−ＭＥＭ（α−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＥＭ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＥＭ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）などの細胞培養用培地の約１．５ｍｌを注射器に充填した後、注射針の先端を大腿骨の膝関節側の断端に差し込む。注射器内の培養液を骨髄内に注入して、股関節側の断端から骨髄由来間葉系細胞を押し出す。得られる骨髄由来間葉系細胞をピペッテイングにより培養液中に浮遊させる。かくして得られる骨髄液から、前述したヒト骨髄液からの骨髄由来間葉系細胞の単離方法と同様にして、膵β細胞への分化能を有するラットまたはマウス由来の骨髄由来間葉系細胞を単離することができる。
（２）骨髄以外の組織からの膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞の単離
骨髄以外の組織から、後述する１２．に記載の抗体を用いた分離方法により、膵β細胞への分化能を有する細胞を取得することができる。
骨髄以外の組織としては、好ましくは臍帯血があげられる。この臍帯血からの膵β細胞への分化能を有する細胞の単離は、具体的には以下の方法に従うことができる。
即ち、まず臍帯から臍帯血を分取し、直ちに５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌの終濃度になるようにヘパリンを加える。よく混合した後、遠心分離して臍帯血から細胞を分取し、１０％のＦＢＳを含むα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭなどの細胞培養用培地に再浮遊させる。得られた細胞液から後述する抗体を利用して、膵β細胞への分化能を有する細胞を分離することができる。
２．膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞の培養
膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞の培養は、適当な培地中で行われる。該培地としては、通常公知（例えば、組織培養の技術基礎編  第三版、朝倉書店、１９９６年参照）の組成を有する細胞培養用培地を用いることができる。培養条件としては、細胞が培養可能ないかなる条件でもよい。一般に、培養温度は３３−３７℃が好ましい。培養は、好ましくは、５−１０％の二酸化炭素ガスを満たしたインキュベーター内で実施される。
膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着させて増殖させるのが好ましい。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加えて細胞を浮遊させる。浮遊した細胞を、ＰＢＳもしくは細胞培養用培地で洗浄後、細胞培養用培地で５−２０倍に希釈し、新しい培養皿に添加して、さらに継代培養する。
３．膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞から膵β細胞の形成
上記２に示す膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞の培養によって、該間葉系細胞の増殖と共に、該間葉系細胞の分化による膵β細胞の形成が行われる。
膵β細胞への分化能を有する細胞からの膵β細胞の形成は、より好ましくは、膵β細胞形成剤として、（１）胎児の膵β細胞発生領域で発現している因子または胎児の膵β細胞発生段階において膵β細胞への分化に働く因子、および／または（２）膵β細胞への分化能を有する細胞の培養上清または該細胞から分化した膵β細胞の培養上清を利用して実施することができる。また、前記（２）において、膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞と共に支持細胞或いはインスリン分泌細胞に分化されうる細胞を共培養して同様に実施することができる。
上記（１）として記載の胎児の膵β細胞発生領域で発現している因子または胎児の膵β細胞発生段階において膵β細胞への分化に働く因子としては、サイトカイン、接着分子／細胞外基質、生理活性物質、転写因子などをあげることができる。これらの膵β細胞形成剤は、一般には、膵β細胞への分化能を有する細胞の培養系内にこれらの適量を添加存在させることによって利用される。その添加量は、膵β細胞形成剤の種類に応じて適宜決定でき、特に限定的ではないが、一般には、約１−４００ｎｇ／ｍｌ培養液の範囲とすることができる。
サイトカインとしては、膵β細胞への分化能を有する細胞に、膵β細胞の発生段階で膵β細胞への分化を促進する作用を有するものであればいかなるサイトカインでもよい。好ましいサイトカインの具体例としては、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＡＴＵＲＥ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬ．６，ＮＵＭＢＥＲ  ３，ＭＡＲＣＨ  ２０００，２７８−２８２，Ｖ．Ｋ．Ｒａｍｉｙａ，ｅｔ  ａｌ．；ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４８，１９９９，１０１３−１０１９，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，；ＥＤＮＯＣＲＩＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１３７，ＮＯ．９，３９６９−３９７６，Ｈｉｒｏｓａｔｏ  Ｍａｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，；ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬ．２７５，ＮＯ．２，１４  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００；１２２６−１２３２，Ａｄｏｌｆｏ  Ｇａｒｃｉａ−Ｏｃａｎａ，ｅｔ  ａｌ．，など参照）、線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ），ＦＧＦ−２（ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．２８４，１８，ＪＵＮＥ  １９９９，１９９８−２００３，Ｊｏｏｎｉｌ  Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，；ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．４０８，１４  ＤＥＣＥＭＢＥＲ  ２０００，８６４−８６８，Ａｌａｎ  Ｗ．Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．など参照），ＦＧＦ−１（ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．２８４，１８，ＪＵＮＥ  １９９９，１９９８−２００３，Ｊｏｏｎｉｌ  Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．４０８，１４  ＤＥＣＥＭＢＥＲ  ２０００，８６４−８６８，Ａｌａｎ  Ｗ．Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．など参照））、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬ．２７２，ＮＯ．４６，１４  ＮＯＶＥＭＢＥＲ，１９９７，２９１３７−２９１４３，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｋａｎｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．参照）、ＥＧＦ（ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，ＶＯＬ．１１２，１９９１，８５５−８６１，Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｎｏｇａｗａ  ａｎｄ  Ｙｕ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ；ＮＡＴＵＲＥ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬ．６，ＮＵＭＢＥＲ  ３，ＭＡＲＣＨ  ２０００，２７８−２８２，Ｖ．Ｋ．Ｒａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．など参照）、ガストリン、ＴＧＦ−β１（ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，ＶＯＬ．１２０，１９９４，３４５１−３４６２，Ｓａｎｖｉｔｏ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．参照）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１など）、パラサイロイド・ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ，ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬ．２７１，ＮＯ．２，１２  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９６，１２００−１２０８，Ｒｕｐａｎｇｉ  Ｃ．Ｖａｓａｖａｄａ  ｅｔ  ａｌ．参照）、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プロラクチン、プラセンタル・ラクトジェン（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ    ｌａｃｔｏｇｅｎ，ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬ．２７５，ＮＯ．２０，１９  Ｍａｙ  ２０００，１５３９９−１５４０６，Ｒｕｐａｎｇｉ  Ｃ．Ｖａｓａｖａｄａ  ｅｔ  ａｌ．参照）、グルカゴン様ペプチド１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４９，ＭＡＹ  ２０００，７４１−７４８，Ｄｏｒｉｓ  Ａ．Ｓｔｏｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．；ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．５０，ＡＰＲＩＬ  ２００１，７８５−７９６，Ｈｏｎｇｘｉａｎｇ  Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌなど参照）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４（ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４８，ＤＥＣＥＭＢＥＲ，１９９９，２２７０−２２７６，Ｇａｎｇ  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．；ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４９，ＭＡＹ  ２０００，７４１−７４８，Ｄｏｒｉｓ  Ａ．Ｓｔｏｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．など参照）、ＫＧＦ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ケラチン細胞増殖因子、ＰＮＡＳ，ＶＯＬ．９７，ＮＯ．１４，５  ＪＵＬＹ  ２０００，７９９９−８００４，Ｓｕｓａｎ  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．；ＡＭ．Ｊ．ＰＡＴＨＯＬ．，ＶＯＬ．１４５，１９９４，８０−８５，Ｙｉ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．など参照）、ＴＧＡα（ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，ＶＯＬ．１１２，１９９１，８５５−８６１，Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｎｏｇａｗａ  ａｎｄ  Ｙｕ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ）などを挙げることができる。
また、膵β細胞への分化を抑制するサイトカインに対する阻害剤を用いることにより、膵β細胞への分化能を有する細胞に、膵β細胞の発生段階で膵β細胞への分化を促進することも可能である。このような抑制するサイトカインとしては、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）などを例示でき、その阻害剤としては、例えば該サイトカインを中和する抗体、低分子化合物などが挙げられる。
接着分子／細胞外基質としては、膵β細胞の発生段階で膵β細胞発生領域で発現している各種の接着分子／細胞外基質を利用することができる。その具体例としては、例えばゼラチン、ラミニン（ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４９，ＪＵＮＥ  ２０００，９３６−９４４，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．Ｃｒｉｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．；ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４８，ＡＰＲＩＬ  １９９９，７２２−７３０，Ｆａｎｇ−Ｘｕ  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ａｎａｔ．ＶＯＬ．１９３，１９９８，１−２１，Ｍｏｎｉｑｕｅ  Ａｕｍａｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｎｅｉｌ  Ｓｍｙｔｈ）、コラーゲン（ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４５，ＡＵＧＵＳＴ  １９９６，１１０８−１１１４，Ｊｕｌｉｅ  Ｋｅｒｒ−Ｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．；ＣＥＬＬ  ＴＩＳＳＵＥ  ＲＥＳ，ＶＯＬ．２７７，１９９４，１１５−１２１，Ｄｅｉｊｎｅｎ  ＪＨ  ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴ  Ｍｅｔｈｏｄ，ＶＯＬ．８，１９８３，３１−３６，Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．）、アガロース、フィブロネクチン、オルニチンなどの細胞外マトリックス蛋白質などを挙げることができる。例えば、ラミニンを利用する場合、該ラミニンでコートした培養皿で膵β細胞への分化能を有する細胞を培養すればよく、これによって該細胞の膵β細胞への分化を促進することができる。
生理活性物質としては、ニコチンアミド（ＮＡＴＵＲＥ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬ．６，ＮＵＭＢＥＲ  ３，ＭＡＲＣＨ  ２０００，２７８−２８２，Ｖ．Ｋ．Ｒａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ，；ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ，ＶＯＬ．６８，ＮＯ．１１，１５  ＤＥＣＥＭＢＥＲ  １９９９，１６７４−１６８３，Ｔｉｍｏ  Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．参照）、ベータセルリン（ＢＥＴＡＣＥＬＬＵＬＩＮ，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４８，ＦＥＢＲＵＡＲＹ  １９９９，３０４−３０９，Ｈｉｒｏｓａｔｏ  Ｍａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．参照）、アクチビンＡ、プロゲストロン、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｃｉｎｅ）、セレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、Ｂ２７−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  Ｎｕｅｒｏｂａｓａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｅｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＯＬ．３５，１９９３，５６７−５７６，Ｇ．Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）などの、膵β細胞の発生段階で膵β細胞への分化を促進する作用を奏し得るものを挙げることができる。例えばニコチンアミドは、１−１０ｍＭの濃度で用いられる。他のものも、同様に所望の分化促進作用を奏し得る濃度で利用することができる。
転写因子としては、ＰＴＦ１ａ／ＰＴＦ−Ｐ４８（ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，ＶＯＬ．３２，ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ  ２００２，１２８−１３４）、Ｉｓｌ−１（ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．３８５，１６  ＪＡＮＵＡＲＹ  １９９７，２５７−２６０，Ｕｌｆ  Ａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１（ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．３７１，１３  ＯＣＴＯＢＥＲ  １９９４，６０６−６０９，Ｊｏｏｒｇｅｎ  Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，ＶＯＬ．１５，ＪＡＮＵＡＲＹ  １９９７，１０６−１１０，Ｄｏｒｉｓ  Ａ．Ｓｔｏｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．；ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．４０８，１４  ＤＥＣＥＭＢＥＲ  ２０００，８６４−８６８，Ａｌａｎ  Ｗ．Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｅｔａ２／ｎｅｕｒｏＤ（ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＶＯＬ．１１，１９９７，２３２３−２３３４，Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｊ．Ｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．），ｎｇｎ３（ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，ＶＯＬ．１２７，３５３３−３５４２，２０００，Ｖａｌｅｉｒｅ  Ｍ．Ｓｃｈｗｉｔｚｇｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．），ＰＡＸ−６（ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．３８７，２２  ＭＡＹ  １９９７，４０６−４０９，Ｌｕｃ  Ｓｔ−Ｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．），ＰＡＸ−４（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１９，ＮＯ．１２，ＤＥＣＥＭＢＥＲ  １９９９，８２８１−８２９１，Ｙｏｓｈｉｏ  Ｆｕｊｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１９，ＮＯ．１２，ＤＥＣＥＭＢＥＲ  １９９９，８２７２−８２８０，Ｓｔｕａｒｔ  Ｂ．Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．），Ｈｌｘｂ−９（ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，ＶＯＬ．２３，ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ  １９９９，６７−７０，Ｈａｏ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．；ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，ＶＯＬ．２３，ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ  １９９９，７１−７５，Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎｋｘ２．２（ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，ＶＯＬ．１２５，２２１３−２２２１，１９９８，Ｌ．Ｓｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎｋｘ６．１（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，ＶＯＬ．４６，１９９８，７０７−７１５，Ｏｓｔｅｒ  Ａ．Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ＨＮＦ１α，ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４α（ＮＡＴＵＲＥ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２，ＤＥＣＥＭＢＥＲ  ２０００，８７９−８８７，Ｃｈｉａ−Ｎｉｎｇ  Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ６などを挙げることができる。
上述した転写因子は、該因子をコードするＤＮＡを膵β細胞への分化能を有する細胞中に導入して、発現させることにより、膵β細胞への分化を誘導させることができる。かかる転写因子をコードするＤＮＡの細胞への導入および発現方法は、常法に従うことができる。
また、膵β細胞から取得した細胞外基質も、膵β細胞形成剤として利用することができる。該細胞外基質は、膵β細胞への分化能を有する細胞の培養上清または該細胞から分化した膵β細胞の培養上清中に存在していることから、これらの培養上清の利用によっても膵β細胞への分化能を有する細胞から膵β細胞を誘導することができる。
例えば、膵β細胞由来細胞外基質は、これをコートした細胞培養用培養皿にて所望細胞を培養するか、これを生成する膵β細胞と所望細胞とを共培養するか、或いはこれを含む培養上清を培養培地に添加して所望細胞を培養することによって、膵β細胞への分化能を有する細胞を膵β細胞に分化誘導させることができる。
また、後記４．に示す方法で得られる膵β細胞分化誘導因子も膵β細胞形成剤として利用することができ、この利用によっても、膵β細胞への分化能を有する細胞を膵β細胞に分化誘導することができる。
また、膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞を支持細胞と共培養して膵β細胞に分化誘導することもできる。ここで、支持細胞とは、予め培養皿に単層培養された細胞上に、所望細胞を播種して膵β細胞へ分化誘導する場合、予め培養皿に単層培養する細胞を意味する。支持細胞としては、例えば、膵ランゲルハンス島を構成するα、β、δ、ＰＰ細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ細胞）、あるいは膵β細胞由来細胞株、又はｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ由来細胞株などのインスリン分泌能を有する細胞を例示できる。支持細胞の培養は前記２．に記載の膵β細胞への分化能を有する細胞の培養と同様に実施できる。
具体的には、予め培養皿に単層培養された支持細胞上に、膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞を播種して、共培養することができる。さらに、上記膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞と共に支持細胞を共培養する際に、培養皿に単層培養された支持細胞を、パラホルムアルデヒド、エタノール、１０％中性緩衝ホルマリン液などの固定液で固定した後に、膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞と共培養することもできる。
また、上記共培養において、支持細胞に換えて、インスリン分泌細胞に分化されうる細胞を用いることもできる。インスリン分泌細胞に分化されうる細胞としては、胚性幹細胞、膵幹細胞、小腸上皮幹細胞、肝臓由来幹細胞および羊膜細胞が例示することができる。
また、培養皿に単層培養された間葉系細胞上に、インスリン分泌細胞に分化されうる細胞を播き、共培養してインスリン分泌細胞に分化する方法を行うこともできる。インスリン分泌細胞に分化されうる細胞としては、胚性幹細胞、膵幹細胞、小腸上皮幹細胞、肝臓由来幹細胞及び羊膜細胞があげられる。
４．膵β細胞分化誘導因子の取得
膵β細胞分化誘導因子の取得方法としては、インスリンを産生する細胞の培養上清に、各種プロテアーゼ阻害剤を添加して、透析、塩析、クロマトグラフィーなどを組み合わせた操作を実施することにより取得することができる。
さらに該膵β細胞分化誘導因子の遺伝子は、マイクロシーケンサーを用いて、上記膵β細胞分化誘導因子の部分アミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列に基づき設計したＤＮＡプローブを用いて、該細胞より作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。
かくして得られる膵β細胞分化誘導因子は、その利用によって、膵β細胞への分化能を有する細胞を膵β細胞に分化誘導することができる。例えば、これを、膵β細胞への分化能を有する細胞の培養用培地に添加して膵β細胞への分化能を有する細胞を培養することによって、所望の膵β細胞を得ることができる。培養条件は、前記２．に記載した通りである。培地への添加量は、通常、約１−４００ｎｇ／ｍｌ培地の範囲から適宜選択することができる。
５．膵β細胞を含む膵β細胞再生薬または糖尿病などの耐糖能異常に基づく疾患の治療薬
本発明方法に従い分化誘導された膵β細胞或いはその前駆細胞は、膵β細胞再生薬また耐糖能異常に基づく疾患、例えば耐糖能異常に起因する疾患、例えば、糖尿病またはそれに準するＩｍｐａｉｒｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅなどの各種疾患の治療薬として有用である。
膵β細胞再生薬および耐糖能異常疾患治療剤は、膵β細胞またはその前駆細胞（膵β細胞への分化能を有する細胞）を高純度で含むものであればよく、また、これを適用すべき患者の膵β細胞の障害部位ならび大きさに応じて、該細胞を増殖させたもの、好ましくは、膵β細胞への分化能を有する細胞から分化させたインスリン産生能を持つβ細胞様細胞を含むものが用いられる。
この膵β細胞再生薬の有効成分とする本発明細胞は、例えば患者の骨髄液中から前記１−（１）に示す密度勾配遠心分離法、後記８．に示す膵β細胞への分化能を有する細胞を特異的に認識する抗体を用いたパニング法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１（８），２７９７−２８００（１９８８）］もしくはＦＡＣＳ法［Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（３），２７５−２８３（１９９８）］、または膵β細胞への分化能を有する細胞に特異的な遺伝子のプロモーターを用いたレポーター系を構築する方法により、製造および精製することができる。
また該薬剤の有効成分とする細胞には、後記６．に示す膵β細胞形成剤を用いて、該膵β細胞への分化能を有する細胞を膵β細胞へ分化誘導させた細胞、高齢者の骨髄から取得した骨髄由来間葉系細胞に、後記１１．に示す不死化方法を適用して、細胞分裂能を賦活させた膵β細胞への分化能を有する細胞も含まれる。
本発明膵β細胞再生薬および耐糖能異常疾患治療剤は、通常、処置を必要とする患者に約１０５−１０８細胞／ｋｇ体重、好ましくは約１０６−１０７細胞／ｋｇ体重の範囲で投与することができる。投与経路は、特に制限されないが、好ましくは、門脈注射により障害部位に輸送する方法を挙げることができる。
６．膵β細胞形成剤
本発明の膵β細胞形成剤は、胎児の膵β細胞発生領域で発現している因子あるいは胎児の膵β細胞発生段階で膵β細胞への分化に働く因子および膵β細胞分化誘導因子の少なくとも一種を有効成分として含有しており、その利用によって膵β細胞への分化能を有する細胞を膵β細胞へ分化誘導させることができる。
該膵β細胞形成剤としては、前記３．に詳述した、サイトカイン、接着分子／細胞外基質、生理活性物質、転写因子などをあげることができる。
また、前記２．２．に示された膵ランゲルハンス島を構成するα、β、δ、ＰＰ細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ細胞）、あるいは膵β細胞由来細胞株、又はｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ由来細胞株などのインスリン分泌能を有する細胞などの支持細胞や胚性幹細胞、膵幹細胞、小腸上皮幹細胞、肝臓由来幹細胞および羊膜細胞などのインスリン分泌細胞に分化されうる細胞も膵β細胞形成剤として利用することができる。
これらは、一般には１−４００ｎｇ／ｍｌ程度の範囲で用いることができる。好ましくは、サイトカインは、１０−４０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。生理活性物質としてのニコチンアミドは、例えば１０−３Ｍの濃度で用いられる。接着分子／細胞外基質は、例えばラミニンの場合は、これでコートした培養皿を利用して、該培養皿で膵β細胞への分化能を有する細胞を培養することにより膵β細胞への分化を促進することができる。
また、本発明の膵β細胞形成剤には、前記４に記載の膵β細胞分化誘導因子または該膵β細胞分化誘導因子の遺伝子を含むものも包含される。以下、これらにつき詳述する。
（１）膵β細胞分化誘導因子をコードする遺伝子を含む膵β細胞形成剤
膵β細胞分化誘導因子をコードする遺伝子を有効成分として含む膵β細胞形成剤について詳述する。
まず、膵β細胞分化誘導因子の遺伝子ＤＮＡ断片あるいは全長ｃＤＮＡをウイルスベクタープラスミド内のプロモーターの下流に挿入して、組換えウイルスベクタープラスミドを造成する。ここでウィルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなど、公知の各種のものを利用できる。
次いで、該組換えウイルスベクタープラスミドを、該ウイルスベクタープラスミドに適合したパッケージング細胞に導入する。ここでパッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクタープラスミドの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものも用いることができる。例えば該パッケージング細胞としては、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。
パッケージング細胞で補給する蛋白質としてはレトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの蛋白質、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなどの蛋白質、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂなどの蛋白質、アデノ随伴ウィルスベクターの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質を用いることができる。
ウイルスベクタープラスミドとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、ＭＯＤＹ疾患の原因遺伝子に対する野生型遺伝子を膵β細胞で転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。その具体例としては、例えばＭＦＧ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７（１９９５）］、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，３５８７−３５９６（１９９０）］、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８１５０−８１５７（１９９８）］、ｐＡｄｅｘ１［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３８１６−３８２１（１９９５）］などのウイルスベクタープラスミドを挙げることができる。
プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーが上記プロモーターと共に用い得る。また、インスリン遺伝子のような膵β細胞特異的な遺伝子のプロモーターの利用によれば、膵β細胞で特異的に目的の遺伝子を発現させることができる。
上記組換えウイルスベクタープラスミドを上記パッケージング細胞に導入する方法（組換えウイルスベクターの生産方法）としては、例えば、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などを挙げることができる。
かくして得られる組換えウイルスベクターは、これを遺伝子治療剤に用いる基剤と共に調合して、膵β細胞形成剤とすることができる。その調合は文献記載の方法［Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）］に従うことができる。遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればいかなるものでも用いることができる。例えば、蒸留水、塩化ナトリウム、塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などがあげられる。また常法に従い、これらの基剤と共に、助剤として例えば浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油などの植物油またはレシチン、非イオン界面活性剤などの界面活性剤などを用いて、溶液、懸濁液、分散液としての注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。かくして得られる膵β細胞形成剤は、これが液体の場合はそのままで、固体の場合は治療の直前に必要により滅菌処理をした上記基剤に溶解して、遺伝子治療に使用することができる。該膵β細胞形成剤は、カテーテルなどを用いて局所的に投与する方法などによって遺伝子治療に実用することができる。
上述した組換えウイルスベクターを試験管内で膵β細胞への分化能を有する細胞に感染させて得られる感染細胞を上述した膵β細胞形成剤として患者に投与することによっても、本発明遺伝子治療を実施することができる。また、上述した組換えウィルスベクターを患者の患部に直接投与することによっても、所望の遺伝子治療を実施することができる。
（２）蛋白質を有効成分とする膵β細胞形成剤
以下、膵β細胞分化誘導因子を有効成分とする膵β細胞形成剤について詳述する。
膵β細胞分化誘導因子の完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ断片または完全長ｃＤＮＡを発現ベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、該蛋白質の組換発現ベクターを造成する。該組換発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞内に導入する。
宿主細胞としては、目的とするＤＮＡを発現できるものは全て用いることができる。例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などに属する細菌、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属などに属する酵母や動物細胞、昆虫細胞などを用いることができる。
宿主細胞の具体例としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などをあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、膵β細胞分化誘導因子の遺伝子ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌を宿主細胞として用いる場合は、膵β細胞分化誘導因子の組換え発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、膵β細胞分化誘導因子をコードするＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換え発現ベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０［特開昭５８−１１０６００］、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳＰ４６８６１９１、ＵＳＰ４９３９０９４、ＵＳＰ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］などを例示することができる。
発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６−１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌やファージなどに由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター［Ｇｅｎｅ，４４，２９（１９８６）］、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
膵β細胞分化誘導因子をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように置換することにより、目的とする蛋白質の生産率を向上させることができる。
膵β細胞分化誘導因子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
組換えベクターの導入方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法などをあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などを例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーターなどをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）］などを挙げることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＣＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐＣＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０などを例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞などを用いることができる。
組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］などを用いることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル［Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント［Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１−３８（１９８７−１９９７）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）］などに記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して、昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを挙げることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）などを用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などを挙げることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング  第２版［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されている方法などに準じて、分泌生産、融合蛋白質発現などを行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
膵β細胞分化誘導因子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に膵β細胞分化誘導因子を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、膵β細胞分化誘導因子を製造することができる。
膵β細胞分化誘導因子を産生する形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機物などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの宿主が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５−４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間−７日間とすることができる。培養中、ｐＨは３．０−９．０に保持するのがよい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行い得る。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−膵β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清などを添加した培地などを用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６−８、３０−４０℃、５％ＣＯ２存在下の条件下で１−７日間行うことができる。培養中、必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］などを用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６−７、２５−３０℃の条件下で、１−５日間行うことができる。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
上述の形質転換体の培養物から、膵β細胞分化誘導因子を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。例えば、膵β細胞分化誘導因子が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁させた後、超音波破砕機などにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離して得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、例えば、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などの樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）などの樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどの樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、細胞を回収後、破砕し、遠心分離することにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、希釈あるいは透析により、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得る。
膵β細胞分化誘導因子またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から、該蛋白質またはその糖鎖付加体などの誘導体を回収することができる。例えば、培養物から遠心分離などの手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、上記各方法により発現させた蛋白質は、そのアミノ酸配列に基づいて、別個にＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って製造することができる。また、米国Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社製、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、米国Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、米国Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社製、米国ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製、島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して合成することもできる。
膵β細胞への分化を誘導できる蛋白質は、前記６−（１）と同様にして膵β細胞形成剤として実用できる。
７．先天性遺伝子疾患の治療への利用
糖尿病などの耐糖能異常に基づく疾患の中には、単一遺伝子の変異により、本来膵β細胞の分化または維持に必要な蛋白質の一部が欠損するために耐糖能異常となる一群がある。このような疾患の代表例にはＭＯＤＹ（ｍａｔｕｒｉｔｙ  ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｕｎｇ）が含まれる。この疾患は、ミオシン、トロポニン、トロポミオシン、電位依存性Ｎａチャンネル、Ｋチャンネル、フィブリン、エラステイン、ミトコンドリア、ジストロフィンなどの遺伝子異常が原因であることが知られている。
上記疾患患者を治療する方法としては、疾患患者より膵β細胞への分化能を有する細胞を取得し、該細胞に正常な遺伝子を導入したのち、膵β細胞に移植する方法があげられる。正常な遺伝子は、前記６−（１）に記載した遺伝子治療用ベクターに挿入した後、膵β細胞への分化能を有する細胞に導入することができる。
８．膵β細胞への分化能を有する細胞特異的な表面抗原を認識する抗体
以下、本発明膵β細胞への分化能を有する細胞が発現している表面抗原を認識する抗体について詳述する。
本発明膵β細胞への分化能を有する細胞で特異的に発現している表面抗原を認識する抗体は、耐糖能異常による疾患の細胞治療を実施する上で必要な膵β細胞への分化能を有する細胞の純度検定や精製に用いることができる。
該抗体を取得する方法としては、本発明の膵β細胞への分化能を有する細胞３−５×１０５細胞／匹あるいは該細胞から調製した細胞膜画分１−１０ｍｇ／匹程度を抗原として、ウサギ、ヤギ、３−２０週齢ラット、マウス、ハムスターなどの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）または水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチンなど］とともに投与する。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１−２週間おきに３−１０回行う。各投与後、３−７日目に眼底静脈叢より採血し、得られる血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ法：医学書院刊、１９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］などで調べる。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物を、血清または抗体産生細胞の供給源とする。
ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製できる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞、特に脾細胞が好適に用いられる。
骨髄腫細胞としては、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）株［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）株［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）株［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）株［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）株［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などのマウス由来の株化細胞が好適に用いられる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。即ち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地）に懸濁した後、７−１４日間培養する。培養後、培養上清の一部を採り酵素免疫測定法などにより抗原に反応し抗原を含まない蛋白質には反応しない細胞を選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿や、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラム、ゲル濾過カラムなどを用いるクロマトグラフィーなどを、単独または組み合わせて行う方法があげられる。
上記方法で取得した該膵β細胞への分化能を有する細胞で発現している表面抗原を認識する抗体を用いて、検体細胞に対する反応性と、造血系幹細胞、神経系幹細胞などの対照となる細胞に対する反応性とを比較することで、検体細胞が上記表面抗原を発現しているかどうかを容易に検定することができる。
９．膵β細胞への分化能を有する細胞で発現している表面抗原および該表面抗原をコードする遺伝子の取得
膵β細胞への分化能を有する細胞で特異的に発現している表面抗原遺伝子の取得方法としては、二つの異なる由来のサンプル間で異なる発現形態を取る遺伝子を取得する方法であるサブトラクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５７３８−５７４２（１９８８）］や、Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５６４０−５６４８（１９９４）］による方法をあげることができる。
まず、膵β細胞への分化能を有する細胞より作製したｃＤＮＡライブラリーを、造血系幹細胞や神経系幹細胞などの膵β細胞への分化能を有する細胞以外の対照細胞より取得したｍＲＮＡを用いてサブトラクションを行う。膵β細胞への分化能を有する細胞特異的な遺伝子を濃縮した差分化ｃＤＮＡライブラリーを調製した後、該差分化ｃＤＮＡライブラリーの挿入ｃＤＮＡ配列を５’末端側よりランダムに塩基配列解析を行い、分泌シグナル配列を持つものだけを選択する（ランダム配列解析）。このようにして得られたｃＤＮＡの全長塩基配列を決定することにより、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質が分泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
上記の方法において、ランダム配列解折の代わりに、シグナルシーケンストラップ法も用いることもできる［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，６００−６０３（１９９３）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４８７−４９０（１９９９）］。シグナルシーケンストラップ法とは、分泌シグナル配列をもつ遺伝子を選択的にスクリーニングする方法である。
効率よく特異的な表面抗原を取得するためには、シグナルシーケンストラップライブラリーをサブトラクションが行い得るベクターを用いて作製し、膵β細胞への分化能を有する細胞から作製したシグナルシーケンストラップライブラリーを造血系幹細胞や神経系幹細胞などの対照となる細胞より取得したｍＲＮＡを用いてサブトラクションを行う方法が望ましい。このようにして取得された分泌シグナル配列を含むＤＮＡ断片は全長ｃＤＮＡをクローン化するためのプローブとして用いることができる。
全長ｃＤＮＡはその全長塩基配列を解析することで、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質が分泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
ランダム配列解析あるいはシグナルシーケンストラップ法を用いた場合でも、得られたクローンが膜蛋白質をコードする場合は、塩基配列から類推されるアミノ酸配列に基づき合成ペプチドを作製し、該合成ペプチドを抗原として上記方法により特異的な抗体を取得することができる。
また、膜蛋白質の場合は、受容体をコードしているものがある。このような受容体は膵β細胞への分化能を有する細胞の特異的な増殖または膵β細胞への分化の調節に働いている可能性があり、当該受容体のリガンドの探索に用いることができる。分泌蛋白質の場合は、直接膵β細胞への分化能を有する細胞を増殖あるいは分化させるために用いることができる。
１０．膵β細胞の形成を促進する候補物質のスクリーニング
本発明は、膵β細胞の形成（分化誘導）を促進する活性を有する候補物質のスクリーニング方法をも提供する。該スクリーニング方法は、膵β細胞への分化能を有する間葉系細胞を無血清培地中で培養させる際に、候補物質を培養系内に添加存在させ、その存在が膵β細胞の形成を促進するか否か、即ち分化誘導される膵β細胞レベルを調べることにより実施できる。
候補物質としては、各種サイトカイン、増殖因子などの分泌蛋白質、細胞接着分子／細胞外基質などの膜結合蛋白質、組織抽出液、合成ペプチド、合成化合物、微生物培養液などを挙げることができる。
膵β細胞乃至その前駆細胞の増殖能力はコロニー形成能やＢｒｄＵの取り込みなどで調べることができる。
コロニー形成能は、本発明の膵β細胞への分化能を有する細胞を低密度で播種することにより調べることができる。
ＢｒｄＵの取り込みは、ＢｒｄＵを特異的に認識する抗体を用いた免疫染色により調べることができる。
膵β細胞への分化を評価する方法としては、細胞のインスリン産生を指標とする方法、細胞内に導入したレポーター遺伝子の発現を指標とする方法などがあげられる。
レポーター遺伝子の発現を指標とする方法は、膵β細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝子とを組み込んだベクターＤＮＡを膵β細胞への分化能を有する細胞に導入し、該細胞を用いてレポーター遺伝子の発現を調べる方法である。
レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ（Ｇｌｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ、ベーターガラクトシダーゼをコードする遺伝子などがあげられる。
膵β細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーターとしては、インスリンがあげられる。
１１．膵β細胞への分化能を有する細胞の不死化
糖尿病などの耐糖能異常に基づく疾患などの耐糖能異常に基づく疾患の患者、特に高齢者に対して本発明の治療薬を投与する場合、本発明の膵β細胞への分化能を有する細胞をガン化させずに細胞分裂の回数を増やすことが望ましい。
細胞をガン化させずに細胞分裂の回数を増やす方法としては、テロメラーゼを本発明の膵β細胞への分化能を有する細胞に発現させる方法をあげることができる。
テロメラーゼを本発明の膵β細胞への分化能を有する細胞に発現させる方法としては、テロメラーゼの触媒サブユニットであるＴＥＲＴ遺伝子をレトロウイルスベクターに導入し、該ベクターを膵β細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、膵β細胞への分化能を有する細胞に内在するＴＥＲＴ遺伝子を誘導発現させる因子を膵β細胞への分化能を有する細胞に投与する方法、ＴＥＲＴ遺伝子を誘導発現させる因子をコードするＤＮＡを含むベクターを膵β細胞への分化能を有する細胞に導入する方法などをあげることができる。
上述のＴＥＲＴ遺伝子を誘導発現させる因子は、ＴＥＲＴ遺伝子プロモーターとＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼあるいはベーターガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子とを組み込んだベクターＤＮＡを膵β細胞への分化能を有する細胞に導入することにより、ＴＥＲＴ遺伝子を誘導発現させる因子を選別することができる。
１２．膵β細胞への分化能を有する細胞を抗体を用いて分離する方法
生体内から取り出した各種組織から目的の表面抗原を発現している細胞を取得する方法としては、ソーテイング機能を有したフローサイトメーターを用いる方法、磁気ビーズを用いる方法があげられる。
フローサイトメーターのソーテイングの方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などがあげられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ１４−２３、秀潤社、１９９９年）。どちらの方法も、細胞の表面に発現している分子に結合した抗体から発せられる蛍光強度を電気信号に変換することにより抗原の発現量を定量することができる。また、使用する蛍光の種類を組み合わせることで、複数の表面抗原を利用して分離することも可能である。蛍光としては、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＴＲ（ＴｅｘａｓＲｅｄ）、Ｃｙ３、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、Ｒｅｄ６１３、Ｒｅｄ６７０、ＰｅｒＣＰ、ＴＲＩ−Ｃｏｌｏｒ、ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄなどがあげられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ．３−１３、秀潤社、１９９９年）。
染色方法としては、生体内から取り出した各種組織、具体的には骨髄または臍帯血から、遠心分離などの方法で細胞を分離した後、直接抗体で染色する方法、一度適当な培地中で培養・増殖を行った後に抗体で染色する方法があげられる。
細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的の細胞サンプルを混合し、氷上で３０分間−１時間インキュベートする。一次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後フローサイトメーターで分離を行う。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞とを混合し、再び氷上で３０分間−１時間インキュベートする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメーターで分離する。
磁気ビーズを用いる方法では、目的の表面抗原を発現している細胞を大量に分離することができる。分離の純度は上述のフローサイトメーターを用いる方法には及ばないが、精製を繰り返すことにより、十分高い細胞純度を確保することができる。
細胞に一次抗体を反応させた後、細胞と反応しなかった一次抗体を除去し、一次抗体と特異的に結合する磁気ビーズを結合させた二次抗体を結合させる。残存する二次抗体を洗浄除去した細胞は磁石を設置したスタンドで分離することができる。これらの操作に必要な材料および装置はＤＹＮＡＬ社から入手することができる。
磁気ビーズを用いる方法は、細胞サンプル中より不要な細胞を除去するのにも同様に利用することができる。不要な細胞をより効率的に除去するにはＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）より販売されているＳｔｅｍＳｅｐ法を用いることができる。
上述の方法で用いられる抗体としては、前記８．で取得した抗体または造血系細胞の表面抗原であるＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、Ｓｃａ−１、Ｌｙ６ｃ、Ｌｙ６ｇを認識する抗体、血管内皮細胞の表面抗原であるＦｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４を認識する抗体、間葉系細胞の表面抗原であるＣＤ１４０を認識する抗体、インテグリンの表面抗原であるＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９、ＣＤ４１を認識する抗体、マトリックス受容体であるＣＤ５４、ＣＤ１０２、ＣＤ１０６、ＣＤ４４を認識する抗体があげられる。これらの抗体を組み合わせることで、より高い純度で目的の細胞を取得することができる。
具体的には、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陽性、ＣＤ１４４陰性細胞およびＣＤ１４０陽性の性質を有する細胞を取得するには、ヒト骨髄由来間葉系細胞からＣＤ３４陽性細胞とＣＤ１４４陽性細胞を上述した免疫磁気ビーズの方法などを利用して除去した後、ＣＤ１１７陽性およびＣＤ１４０陽性の細胞画分を分取することで目的の細胞を分離することができる。
１３．膵β細胞特異的遺伝子のプロモーターレポーターベクターを用いた膵β細胞前駆細胞の分離
膵β細胞への分化能を有する細胞から誘導した膵β細胞または膵β細胞の前駆細胞を効率的に分離するために、発光オワンクラゲの緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）を遺伝子導入のためのレポーター遺伝子の指票として用いることができる。
具体的には、膵β細胞で特異的に発現している遺伝子または前記９．で取得した膵β細胞への分化能を有する細胞で特異的に発現している遺伝子のプロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子をつないだベクターを作製し、膵β細胞への分化能を有する細胞に導入する。このようなレポーターベクターを導入された細胞を薬剤耐性などの指標で分離後、膵β細胞へと分化誘導する。分化誘導した細胞はＧＦＰを発現し、蛍光を発生する。蛍光を発生した膵β細胞ならびに膵β細胞前駆細胞はフローサイトメーターを用いて容易に分離することができる（フローサイトメーター自由自在、ｐ．４４−５２、秀潤社、１９９９年）。
膵β細胞で特異的に発現している遺伝子のプロモーターとしてはインスリン、ｐａｘなどを用いることができる。
ベクターとしては、上述した動物細胞用のプラスミドベクター、アデノウイルスベクターなどを用いることができる。
１４．Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いた膵β細胞への分化能を有する細胞の分離
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２はＤＮＡ結合色素であり、生きたままの細胞を染色することができる。骨髄由来間葉系細胞の大多数は激しく分裂しているため、非常に明るく染色されるが、未熟な細胞ほど暗く染まる。このことは、細胞が未熟なほど、ＡＢＣ（ＡＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）トランスポーターによる色素排除能力が大きいことを示す文献の記載（中内啓光、蛋白質核酸酵素、Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１３，２０５６−２０６２，２０００）から支持される。従って、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて供試細胞を染色して、染色されない（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を取り込まない）細胞を分離することによって、本発明の膵β細胞への分化能を有する細胞を単離することができる。
具体的には、例えば、骨髄由来間葉系細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した後、ＦＡＣＳを用いてＵＶレーザーをあてて短波長と長波長の２重染色解析を行うことによって、骨髄中からＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で暗く染まる細胞を分離することができる。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を取り込まない未熟な細胞は、Ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎとして、分画することができる［Ｇｏｏｄｅｌｌ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３，１７９７−１８０６（１９９６），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ／ｇｏｏｄｅｌｌ／ｎｅｗ＿ｓｉｔｅ／ｉｎｄｅｘ２．ｈｔｍｌ参照］。
以上詳述したとおり、本発明によれば、膵β細胞の破壊ならびに変性に伴う糖尿病などの耐糖能異常に基づく疾患などの耐糖能異常に基づく疾患の治療ならびに治療薬の探索に有効な間葉系細胞およびこれに由来する膵β細胞が提供される。また本発明によれば、該細胞の膵β細胞への分化に有用なサイトカイン、転写因子、生理活性物質、接着分子／細胞外基質などの膵β細胞形成剤およびこれらの利用法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をより詳しく説明するため実施例を挙げるが、本発明は之等に限定されない。
実施例１：マウス骨髄からの膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞の取得と培養
５週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス１０匹を、エーテルを用いて麻酔後、頸椎脱臼により致死させた。マウスを半側臥位にして、７０％エタノールを十分かけ消毒した。
次に、大腿骨周辺の皮膚を広範囲にわたり切開し、大腿骨全面の大腿四頭筋をはさみで切除した。股関節の部分にはさみを入れ、関節をはずし、さらに大腿骨背面の筋肉を切除した。股関節の部分にはさみをいれ、関節をはずし、大腿骨を取り出した。大腿骨に付着している筋肉をはさみで切除し、大腿骨全体を露出させた。大腿骨の両端をはさみで切断後、テルモ製２３Ｇの針を装着した２．５ｍｌ注射器に２０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地を約１．５ｍｌ入れ、注射針の先端を大腿骨の膝関節側の断端に差し込み、試験管の中に培養液を吹き出すことで、骨髄由来間葉系細胞を押し出した。
取得した細胞を、２０％ＦＣＳ、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン、２５０ｎｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび８５ｍｇ／ｍｌアムフォテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）を含有するＩＭＤＭ培地中、３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて培養した。継代を続けることで、細胞は間葉系細胞へと均一化し、造血系の細胞は消失した。
約４ヶ月間、上記条件で培養を行い、不死化した細胞を選択した後、希釈により１９２種類の独立した単一細胞由来の細胞株を取得した。これらの細胞株のうち、膵β細胞への分化能を有する骨髄由来間葉系細胞の一つを、「ＫＵＳＡ／Ａ１」と命名した。以後、骨髄由来間葉系細胞ＫＵＳＡ／Ａ１は、特に指定しない限り、１０％ＦＣＳ、１００ｍｇ／ｍｌペニシリンおよび２５０ｎｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中、３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて培養した。
実施例２：ＫＵＳＡ／Ａ１細胞の表面抗原の解析
骨髄中から効率的に膵β細胞形成能を有する細胞を単離、精製するために、ＫＵＳＡ／Ａ１の表面抗原の解析を行った。
解析に用いたのは、血管内皮細胞の表面抗原として知られているＣＤ１０５、Ｆｌｋ−１、ＣＤ３１およびＣＤ１４４、造血系細胞の表面抗原として知られているＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、Ｌｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ−１）、Ｌｙ６ｃおよびＬｙ６ｇ、間葉系細胞の表面抗原として知られているＣＤ１４０、インテグリンＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄおよびＣＤ２９、マトリックス受容体ＣＤ５４、ＣＤ１０２、ＣＤ１０６およびＣＤ４４の２０種類である。
まずＫＵＳＡ／Ａ１細胞の各１×１０４個を９６ウェルＵ字プレートにそれぞれ分注した。公知の方法［酵素抗体法：学際企画刊（１９８５）］でビオチン標識した抗マウスＣＤ１０５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．４）に加え各ウェルに添加し、氷中で３０分間反応させた。コントロール抗体としては、ラットＩｇＧ２ａ、κ精製抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いた。緩衝液で２回洗浄後、ストレプトアビジン−ＰＥ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）を２０μｌ加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、緩衝液で３回洗浄し、最終的に５００μｌに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定し、抗体の添加により蛍光強度が増加するか否かで抗体の発現の有無を調べた。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ１０５陰性であることが確認された。
Ｆｌｋ−１抗原の発現についても、上記と同様の方法によりビオチン化した抗マウスＦｌｋ−１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−２８１８１Ｄ）を用いて抗体反応をおこない、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＦｌｋ−１陰性であることが確認された。
ＣＤ３１抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識された抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０１９５４Ｄ）を用いて抗体反応をおこない、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ３１陰性であることが確認された。
ＣＤ１４４抗原の発現については、ビオチン化した抗マウスＣＤ１４４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−２８０９１Ｄ）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ１４４陰性細胞であることが確認された。
ＣＤ３４抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識された抗マウスＣＤ３４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０９４３４Ｄ）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ３４陰性であることが確認された。
ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識された抗マウスＣＤ１１７抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０１９０４Ｄ）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ１１７陰性であることが確認された。
ＣＤ１４抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０９４７４）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ１４陽性であることが確認され、ＢＭＳＣ細胞はＣＤ１４陰性であることが確認された。
ＣＤ４５抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ４５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０１１１４）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ４５陰性であることが確認された。
ＣＤ９０抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ９０抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−２２２１４）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ９０陰性であることが確認された。
Ｌｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ−１）抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＬｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ−１）抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０１１６４Ａ）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＬｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ−１）陽性であることが確認された。
Ｌｙ６ｃ抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＬｙ６ｃ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０１１５２）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＬｙ６ｃ陽性であることが確認された。
Ｌｙ６ｇ抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＬｙ６ｇ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０１２１４）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＬｙ６ｇ陰性であることが確認された。
ＣＤ１４０抗原の発現については、ビオチン化した抗マウスＣＤ１４０抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−２８０１１Ａ）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ１４０陽性であることが確認された。
ＣＤ４９ｂ抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ４９ｂ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０９７９４）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ４９ｂ陽性であることが確認された。
ＣＤ４９ｄ抗原の発現については、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ４９ｄ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製；ＰＭ−０１２７４）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＣＤ４９ｄ陰性であることが確認された。
実施例３：骨髄由来間葉系細胞から膵β細胞への分化の誘導（その１）
実施例１で得られたＫＵＳＡ／Ａ１細胞を、トリプシン処理して、６ウエルディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に細胞密度がなるべく低密度となるようにしながら移乗させた。
この細胞を、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地および１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地のそれぞれで、３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて、１２日間培養した。
無血清培地および血清含有培地を用いた各ウエルのそれぞれ一つずつに、ｂＦＧＦ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，Ｒ＆Ｄ社製）を最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。以後、特別に指定しない限り、同様の条件で、培地を２日ごとに交換しながら細胞培養を行った。
１２日間の培養のあと、全てのウエルについて培地を捨て、ＰＢＳを用いてウエルごと細胞を３度繰り返し洗浄した。洗浄後、全てのウエルに新たにＰＢＳを２ｍｌ加え、２時間、３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて培養した。
２時間の培養後、ＰＢＳを廃棄し、新たに２５．０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭを２ｍｌ加え、さらに２時間、３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて培養した。
グルコース添加後、２時間で培養を終え、次いで、各ウエルの上清をピペットを用いて約２ｍｌずつチューブ（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ）に収集した。
これらの各上清サンプルについて、ＥＬＩＳＡ法（インスリン測定キット、ＭＯＲＩＮＡＧＡ社製）のを用いて、インスリン濃度を計測した。
その結果、ｂＦＧＦおよびインスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地で培養した細胞の上清については、２２３ｐｇ／ｍｌのインスリンを検出した。一方、ｂＦＧＦおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養した細胞の上清については、インスリンは、検出されなかった（測定感度以下、即ち３９ｐｇ／ｍＬ以下であった）。
さらに、ｂＦＧＦを含まず、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地で培養した細胞の上清については、５１．９ｐｇ／ｍｌでインスリンが検出された。これに対して、ｂＦＧＦを含まず１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養した細胞の上清については、インスリンは検出されなかった（測定感度以下）。
コントロールとして、ウエルの洗浄に用いたＰＢＳおよび洗浄後にウエルに加えるのに用いた２５．０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭについても、同様の方法を用いてインスリン濃度を測定したが、これらのインスリン濃度は、測定感度以下であった。
実施例４：骨髄由来間葉系細胞から膵β細胞への分化の誘導（その２）
ピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドベクターｐＣＡＧＩＰｕｒｏに、配列表の配列番号１に示すＰａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １遺伝子（Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１）を組み込んだプラスミドベクターｐＣＡＧＩＰｕｒｏ  ｐｄｘを、コンピテントな大腸菌に取り込ませて形質転換させ、ＧＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを調整した。
実施例１で得られたＫＵＳＡ／Ａ１にＦｕＧＥＮＥ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、リポフェクション法により転写因子であるＰｄｘ−１／ＩＰＦ−１をトランスフェクションし、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンと１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したインスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地で３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて１週間培養した。培地は２日毎に交換しながら細胞培養を行った。ＫＵＳＡ／Ａ１から膵β細胞への分化誘導プロトコールを図１Ａに示す。
１週間の培養のあと、全てのディッシュの培養液を捨て、ＰＢＳを用いてディッシュ毎細胞を３回繰り返し洗浄し、洗浄後、上清採取に用いる培養液、即ち、２５．０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ培養液、２．５ｍＭグルコースを含有するＫｒｅｂ’ｓリンゲル液（ＫＲＳ）、または５．５ｍＭあるいは５５．５ｍＭグルコースを含有するＨａｎｋ’ｓ液を、６ｃｍおよび１０ｃｍディッシュにそれぞれ２ｍｌおよび４ｍｌ加えて１時間、３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて培養した。１時間の培養の後、１ｍｌの培養液を採取しインスリン濃度を測定した。上清採取手順を図１Ｂに示す。
その結果、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地に含まれるインスリンは１５１−２６８ｐｇ／ｍｌであった。上清採取に用いたＤＭＥＭ培養液、Ｋｒｅｂ’ｓリンゲル液、Ｈａｎｋ’ｓ液は全て測定感度以下（３９ｐｇ／ｍｌ以下）であったが、ｂＦＧＦを添加したインスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地で培養した細胞の上清には、上清採取に用いたいずれの培養液上清中にもインスリンを認め、最高値は２２００ｐｇ／ｍｌであった。結果を表１に示す。
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Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１をトランスフェクションし、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンと１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したインスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地で３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて１週間培養したＫＵＳＡ／Ａ１からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いてＲＮＡを取得した。次に、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＲＮＡからｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作製した。次に作製したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを基質としてｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉおよびｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩについてｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉおよびｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩの増幅には表２に示す塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。ＲＴ−ＰＣＲの条件および使用したプライマーを表２に示す。
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その結果、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１をトランスフェクションし、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したインスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地で１週間培養したＫＵＳＡ／Ａ１にｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉ（１９７ｂｐ）およびｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩ（２９２ｂｐ）の発現を認めた（レーン２）。１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養したＫＵＳＡ／Ａ１（レーン３）、鋳型ＤＮＡの代わりに滅菌蒸留水を加えた陰性対照（レーン４）、外側ＰＣＲの生成物の代わりに滅菌蒸留水を加えた陰性対照（レーン５）にｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉおよびｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩの発現は認めなかった。レーン１はマーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を用いた。結果を図２Ａ及びＢに示す。
ＰＣＲの結果認められたバンドからＰＣＲ生成物を抽出して塩基配列を決定した。決定された塩基配列をＮＣＢＩ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴで検索した結果、それぞれｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉおよびｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩの塩基配列の一部と１００％一致していた。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、膵β細胞の破壊ならびに変性に伴う糖尿病などの耐糖能異常に基づく疾患の治療ならびに治療薬の探索に有効な間葉系細胞およびこれに由来する膵β細胞が提供される。また本発明によれば、該細胞の膵β細胞への分化に有用なサイトカイン、転写因子、生理活性物質、接着分子／細胞外基質などの膵β細胞形成剤およびこれらの利用法が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１Ａは、マウス骨髄由来間葉系細胞（ＫＵＳＡ／Ａ１）から膵β細胞への分化誘導の手順を示した図面である。ＫＵＳＡ／Ａ１にＰｄｘ−１／ＩＰＦ−１をトランスフェクションし、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンと１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加した無血清ＤＭＥＭ培地で培養を行い、その後上清を採取した。
図１Ｂは、上清を採取する手順と、上清採取に用いた培養液を示した図面である。１週間の培養のあと、全てのディッシュの培養液を捨て、ＰＢＳを用いてディッシュ毎細胞を３回繰り返し洗浄し、洗浄後、上清採取に用いる培養液、即ち、２５．０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ培養液、２．５ｍＭグルコースを含有するＫｒｅｂ’ｓリンゲル液（ＫＲＳ）、または５．５ｍＭあるいは５５．５ｍＭグルコースを含有するＨａｎｋ’ｓ液を加えて１時間、３３℃下に５％ＣＯ２濃度のインキュベーターを用いて培養した後、１ｍｌの培養液を採取しインスリン濃度を測定した。
図２Ａ及びＢは、Ｐｄｘ−１／ＩＰＦ−１をトランスフェクションし、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したインスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシンおよびセレニウムを含む無血清ＤＭＥＭ培地で１週間培養したＫＵＳＡ／Ａ１におけるｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉ（１９７ｂｐ）及びｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩ（２９２ｂｐ）の発現を調べた結果を示す図面を示す。該ＫＵＳＡ／Ａ１において、ｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉ（１９７ｂｐ）及びｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩ（２９２ｂｐ）の発現が認められた（レーン２）。１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養したＫＵＳＡ／Ａ１（レーン３）、鋳型ＤＮＡの代わりに滅菌蒸留水を加えた陰性対照（レーン４）、外側ＰＣＲの生成物の代わりに滅菌蒸留水を加えた陰性対照（レーン５）においては、ｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉおよびｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩの発現は認めなかった。レーン１はマーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を示す。
図３Ａ及びＢは、ＰＣＲの結果認められたバンドからＰＣＲ生成物を抽出して塩基配列を決定した結果を示す。決定された塩基配列をＮＣＢＩ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴで検索した結果、それぞれｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｉおよびｍｏｕｓｅ  ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩの塩基配列の一部と１００％一致していた。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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