(57)【要約】本発明の目的はＡＭＰＡ拮抗剤であるキノキサリンジオン誘導体の新規な結晶に関する。本発明により、あらゆる湿度条件でも安定な医薬品の製造原料が提供できる。
2003087091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
［７−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−６−ニトロ−２，３−ジオキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−１（２Ｈ）−イル］酢酸フリー体無水物のα結晶。
【請求項２】
粉末Ｘ線回折図において、回折角９．１°、１９．４°、２２．５°、２３．３°、２３．９°、２５．７°、２６．２°にピークを認める請求の範囲１記載のα結晶。
【請求項３】
図１に示す粉末Ｘ線回折図と同一の回折角のところに回折ピークを認める請求の範囲２記載のα結晶。
【請求項４】
熱分析（ＴＧ−ＤＳＣ）で、３４１℃付近で発熱を伴いながら分解することを示す請求の範囲３記載のα結晶。
【請求項５】
請求項１乃至３記載の化合物Ａフリー体無水物のα結晶を有効成分として含有するＡＭＰＡ受容体拮抗剤。
【請求項６】
脳梗塞治療剤である請求項３記載の医薬。
【請求項７】
治療有効量の請求の範囲１乃至３記載のα結晶を有する脳梗塞治療用医薬の製造のための使用。
【請求項８】
患者に治療有効量の請求の範囲１乃至３記載のα結晶を投与することからなる脳梗塞治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、湿度に対し優れた安定性を有する新規な［７−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−６−ニトロ−２，３−ジオキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−１（２Ｈ）−イル］酢酸（以下、化合物Ａという）フリー体無水物のα結晶（以下、化合物（Ｉ）という）、該化合物（Ｉ）を有効成分とするＡＭＰＡ受容体拮抗剤、特に脳梗塞治療剤に関する。
背景技術
［７−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−６−ニトロ−２，３−ジオキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−１（２Ｈ）−イル］酢酸（化合物Ａ）の互変異性体、その塩、その水和物またはその溶媒和物は、ＡＭＰＡ受容体に対して高い親和性を有しており、強いカイニン酸神経細胞毒性阻害作用およびＤＢＡ／２マウスにおける聴原性けいれん抑制作用を示し、これらの作用に基づきハンチングトン舞踏病、パーキンソン氏病、癲癇、アルツハイマー病、老人性痴呆症の予防又は治療の為の向精神薬として、又は脳虚血、酸素欠乏、一時的な心停止時の細胞死、低血糖および痙攣後の神経変性あるいは精神および運動機能不全症等の予防又は治療の為の抗虚血薬として特に有用であり、溶解度も優れていることが報告されている（特許文献１）。
特許文献１には、一連のテトラヒドロキノキサリンジオン誘導体は、結晶多形を形成することができることの一般的事項が記載されており［特許文献１第（５）頁右欄第１６〜１９行］、またその実施例１によれば化合物Ａ・１塩酸塩・１．２水和物の結晶を得たこと、その結晶の元素分析値によれば該結晶が１．２モルの水分を有すること［同第（９）頁右欄下から第２１行〜同第（１０）頁右欄第５行、特に同第（１０）頁左欄第３９〜５０行］、その実施例２３によれば化合物Ａ・１塩酸塩・１水和物の結晶を得たこと［同第（１８）頁右欄第２７行〜同第（１９）頁右欄第２５行、特に同第（１９）頁左欄第１６〜２５行］、さらにその実施例２４によれば化合物Ａの結晶を得たこと、その結晶の元素分析値によれば該結晶が０．２モルの水分を有すること［同第（１９）頁左欄第２６行〜４１行、特に同第３０〜４１行］が、それぞれ記載されている。
一方、特許文献２の実施例には、化合物Ａのフリー体の１水和物の改良製法が開示されている。
また、化合物Ａの１水和物は、水溶性が高く、局所脳虚血モデルに於いて優れた脳梗塞体積の縮小効果を示すことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
しかしながら、特許文献１の実施例２４は、化合物Ａのフリー体の無水物と水和物との混合物である可能性が示唆されるが、フリー体無水物が具体的に存在すること、更には結晶多形が存在することについて、上記特許文献、非特許文献には何ら開示がない。
また、特許文献１の実施例２４の分析データについても、本発明のα結晶の存在を示唆するデータは得られていない。
【特許文献１】
特許第２８６５８７８号
【特許文献２】
特開２０００−２８１６７６号
【非特許文献１】
Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ２２，Ｐａｒｔ  ２，６０４．２，１９９６
【非特許文献２】
Ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７６  Ｓｕｐｐｌ．Ｉ，Ｐ−３６２，Ｐ−３６９，Ｐ−３７２，１９９８
発明が解決しようとする課題
このような技術水準下、本発明者らは、化合物Ａにつき検討した結果、特許文献２の製法によれば、通常、化合物Ａのフリー体がその１水和物として得られるが、該１水和物はその保存の状態により不純物が増加するため、安定性を担保するには冷蔵保存が必要であり、医薬品の製造原体としてはなお工業的に不十分であることを知見した。
従って、本発明の目的とするところは、薬理学的活性、製剤学的性質において優れた化合物Ａの医薬品製造原体として供しうる安定な結晶を提供することである。
課題を解決するための手段
かかる状況下、本発明者らは化合物Ａの医薬品原体として供しうる安定な結晶につきさらに鋭意検討した結果、化合物Ａのフリー体には無水物が存在すること、そのフリー体の無水物にはα型（化合物（Ｉ））及びβ型（化合物（ＩＩ））の二種類の結晶多形が存在すること、そのβ結晶は湿度に対して不安定であり、医薬品原体として供するには適さないことを見出した。湿度に対しても安定な結晶につきさらに検討を進めた結果、前記化合物（Ｉ）が湿度に対しても優れた安定性を有すること見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。
即ち、［７−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−６−ニトロ−２，３−ジオキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−１（２Ｈ）−イル］酢酸（化合物Ａ）フリー体無水物のα結晶。
好ましくは、粉末Ｘ線回折図において、回折角９．１°、１９．４°、２２．５°、２３．３°、２３．９°、２５．７°、２６．２°にピークを認める前記のα結晶。
更に好ましくは、図１に示す粉末Ｘ線回折図と同一の回折角のところに回折ピークを認める前記α結晶。
最も好ましくは、図１に示す粉末Ｘ線回折図と同一の回折角のところに回折ピークを認め、且つ熱分析（ＴＧ−ＤＳＣ）で、３４１℃付近で発熱を伴いながら分解することを示す前記α結晶。
更に本発明の別の態様として、前記化合物Ａフリー体無水物のα結晶を有効成分として含有するＡＭＰＡ受容体拮抗剤、好ましくは脳梗塞治療剤である医薬に関する。
又は、治療有効量の前記化合物Ａフリー体無水物のα結晶を有する脳梗塞治療用医薬の製造のための使用に関する。
或いは、患者に治療有効量の前記化合物Ａフリー体無水物のα結晶を投与することからなる脳梗塞治療のための方法に関する。
発明の実施の形態
本発明について更に説明すると、次の通りである。
本発明の化合物（Ｉ）、即ち［７−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−６−ニトロ−２，３−ジオキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−１（２Ｈ）−イル］酢酸フリー体無水物のα結晶は、好ましくは、Ｃｕ−Ｋα線を使用した粉末Ｘ線回折図において、回折角９．１°、１９．４°、２２．５°、２３．３°、２３．９°、２５．７°、２６．２°にピークを認める化合物である。
なお、回折角は、通例２θ±０．２°の範囲で一致するものを意味する。また、ピークとは主要なピークを意味し、これらの回折角以外に中程度以下のピークを認めるものも含まれる。
より好ましくは、図１に示す粉末Ｘ線回折図と同一の回折角のところに回折ピークを認める化合物である。
更に好ましくは、図１に示す粉末Ｘ線回折図と同一の回折角のところに回折ピークを認め、同一の相対強度を有する化合物である。
もっとも好ましくは、図１に示す粉末Ｘ線回折図と同一の回折角のところに回折ピークを認め、熱分析（ＴＧ−ＤＳＣ）は、３４１℃付近で発熱を伴いながら分解することを示す化合物である。
ここで、粉末Ｘ線回折は好ましくはＣｕ−Ｋα線を使用して行うが、データの性質上、結晶の同一性認定においては、結晶格子間隔や全体的なパターンが重要であり、相対強度は結晶成長の方向、粒子の大きさ、測定条件によって多少変わりうるものであるから、厳密に解されるべきではない。
本発明の化合物（Ｉ）は、例えば、化合物Ａ一水和物を温水に添加し、遮光条件下で撹拌し、得られた結晶を濾過し、乾燥することにより製造することが出来る。
原料として使用される化合物Ａ一水和物は、上記文献に記載の製造法、或いは、前記の特許文献２記載の製法により製造することが出来る。
本発明の化合物（Ｉ）は、脳梗塞治療剤、好ましくは脳梗塞急性期治療剤として有用である。
脳梗塞治療とは、脳梗塞急性期における梗塞巣の進展防止効果、脳梗塞に伴う機能不全或いは自覚症状を改善する効果、及び／又は慢性期の精神症状やけいれん発作の発現の抑制を意味する。更に、脳梗塞発作の再発予防も含まれる。
脳梗塞急性期とは、発症後４８時間以内をいう。
また、投与前のＣＴ所見により、脳梗塞の程度は、梗塞巣の大きさ、梗塞巣の広がり（穿通枝、皮質枝）、梗塞側（左、右、両側）、梗塞領域（前大脳動脈領域、中大脳動脈領域、後大脳動脈領域、分水嶺領域、脳幹、小脳、その他）及び浮腫の程度によって分類できる。
脳梗塞に伴う機能不全とは、脳梗塞急性期に発現する神経症候、日常生活動作障害、運動麻痺等を意味する。
これらの症状は、神経学的チェック（意識レベルの評価、瞳孔対称性と光反応、運動失調、間代性筋収縮等の症状）や、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒａｎｋｉｎ  Ｓｃａｌｅ，Ｂａｒｔｈｅｌ  Ｉｎｄｅｘ，ＮＩＨＳＳ，及びＧｌａｓｇｏｗ  Ｓｃａｌｅを用いた神経機能と障害の程度の指標によって表すことができる。
具体的には、下記の項目の臨床症状を観察し、数値化する。
意識障害
自覚症状（頭痛・頭重感、めまい、四肢のしびれ感等）
精神症候（呼名・挨拶への反応、見当識、意欲、知識、計算力、声の調子、態度、自発動作、自発発語、注意等）
神経症候（失語、失行、失認、構音障害、嚥下障害、運動麻痺側の筋力、感覚障害等）
日常動作障害（寝返り、坐位保持、起立、歩行、着脱衣、食事、排尿・排便等）
神経症状とは、上記神経症候に挙げられた１つ又は２つ以上の項目について障害が認められる状態をいう。
慢性期の精神症状とは、脳梗塞発症後３週間以降に発現する精神症状を意味し、具体的には自発性低下（意欲低下）、記憶障害、不安感、うつ状態、不機嫌、焦燥感、妄想、感情易刺激性、攻撃的行為、精神興奮、徘徊、せん妄等の症状である。
本発明の化合物（Ｉ）は、主に非経口投与、具体的には、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、髄腔内投与、硬膜外、関節内、及び局所投与、あるいは可能で有れば経口投与等、種々の投与形態で投与可能である。
非経口投与のための製剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物はさらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ラクトース）、溶解補助剤（例えば、メグルミン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。好ましくは凍結乾燥製剤である。
本発明の化合物（Ｉ）の投与量は症状、投与対象の年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常成人１日当り１００〜２０００ｍｇ、好ましくは１日当り９００ｍｇ程度である。成人１日当り１００〜２０００ｍｇを、１回で、あるいは２〜４回に分けて投与してもよい。静脈内投与や、持続的静脈内投与の場合には、一日当たり１時間から２４時間で投与しても良い。
上記に示すとおり、投与量は種々の状態によって決められる。有効である場合は、上記の範囲よりも少ない投与量を用いることができる。
実施例
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
１）化合物Ａ無水物の製造
約５０℃の温水５００ｍＬ中に、化合物Ａの一水和物  約１０ｇを加え、遮光条件下、パドルで２日間撹拌（２００ｒｐｍ）後、吸引濾過し、残渣を８０℃で３日間減圧乾燥して、濃黄色の結晶性の粉末（化合物（Ｉ））を得た。また、化合物Ａの一水和物を１０５℃で１時間乾燥し、淡黄色の結晶性の粉末（化合物（ＩＩ））を得た。
２）結晶形の確認
１）で得た調製品について、粉末Ｘ線回折及び熱分析測定を行った。なお、化合物（ＩＩ）は、測定直前までシリカゲルデシケーター中に保存し、測定のためのサンプリングも出来るだけ乾燥した条件下で行った。
その結果、以下に示すように、それぞれ、α型無水物結晶（化合物（Ｉ））及びβ型無水物結晶（化合物（ＩＩ））であることが確認された。
（１）α型無水物結晶（化合物（Ｉ））
α型無水物結晶（化合物（Ｉ））は濃黄色の結晶性の粉末であり、前記に示すとおり、Ｃｕ−Ｋα線を使用した粉末Ｘ線回折図において、回折角９．１°、１９．４°、２２．５°、２３．３°、２３．９°、２５．７°、２６．２°付近にピークを認める化合物である。
また、本発明の化合物（Ｉ）の熱分析（ＴＧ−ＤＳＣ）は、３４１℃付近で発熱を伴いながら分解することを示す。
化合物（Ｉ）の粉末Ｘ線回折図を図１に示す。
測定条件：装置；マックサイエンス製  ＭＸＰ１８ＴＡＨＦ２２型粉末Ｘ線回折装置  対陰極；Ｃｕ  管電圧；４０ＫＶ  管電流；４０ｍＡ  走査速度；３．０°／ｍｉｎ
また、図２にＴＧ−ＤＳＣ熱分析結果を示す。
測定条件：ＴＧ装置；ティーエイインストルメンツ製２９５０型熱重量装置  試料量；約８ｍｇ  雰囲気ガスの種類；窒素、雰囲気ガスの総流量；１００ｍｌ／ｍｉｎ  昇温速度；１０℃／ｍｉｎ、ＤＳＣ装置；ティーエイインストルメンツ製２９１０型示差走査熱量分析装置  試料量；約５ｍｇ  基準物質；空容器  試料容器；アルミニウム開放  雰囲気ガスの種類；窒素  雰囲気ガスの流量；５０ｍｌ／ｍｉｎ  昇温速度；１０℃／ｍｉｎ
（２）β型無水物結晶（化合物（ＩＩ））
β型無水物結晶（化合物（ＩＩ））は、淡黄色の結晶性の粉末であり、Ｃｕ−Ｋα線を使用した粉末Ｘ線回折図において、回折角１０．５°、１８．８°、２１．２°、２３．５°、２６．７°、２９．５°付近にピークを認める化合物である。
また、化合物（ＩＩ）の熱分析（ＴＧ−ＤＳＣ）は、３２０℃付近で発熱を伴いながら分解することが確認された。
図３に化合物（ＩＩ）の粉末Ｘ線スペクトル図を示す。
測定条件：装置；マックサイエンス製  ＭＸＰ１８ＴＡＨＦ２２型粉末Ｘ線回折装置  対陰極；Ｃｕ  管電圧；４０ＫＶ  管電流；４０ｍＡ  走査速度；３．０°／ｍｉｎ
また、図４にＴＧ−ＤＳＣ熱重量分析結果を示す。
測定条件：ＴＧ装置；ティーエイインストルメンツ製２９５０型熱重量装置  試料量；約７ｍｇ  雰囲気ガスの種類；窒素、雰囲気ガスの総流量１００ｍｌ／ｍｉｎ  昇温速度；１０℃／ｍｉｎ、ＤＳＣ装置；ティーエイインストルメンツ製２９１０型示差走査熱量分析装置  試料量；約６ｍｇ  基準物質；空容器  試料容器；アルミニウム開放  雰囲気ガスの種類；窒素  雰囲気ガスの流量；５０ｍｌ／ｍｉｎ  昇温速度；１０℃／ｍｉｎ
３）吸湿性試験
化合物Ａ無水物の化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）のそれぞれ約１ｇを質量既知の秤量瓶（７個）に秤取し、正確に質量を求めた後、２５℃で以下の条件に保存し、経時的に質量変化を測定した。
ここで、ＲＨは相対湿度を示す。
2003087091.tif 000003
その結果を表２−１及び表２−２に示す。
2003087091.tif 000004
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以上の結果より、化合物（Ｉ）については、何れの相対湿度条件下でもほとんど吸湿性を示さず安定であった（表１−１）。一方、化合物（ＩＩ）については、吸湿性が強く、少なくとも３３％ＲＨ条件以上において、１日で、１モル相当の水を吸湿することが判明した（表２−２）。
従って、化合物（Ｉ）は、低湿度から高湿度の何れの条件でも安定であることから、温度や湿度を管理するための特殊な容器や保存形態等を必要とせず、医薬品の製造原体として有用である。
実施例２（凍結乾燥製剤の製造）
メグルミン３３．３ｇを注射用水４００ｍｌに溶解させ、これに化合物（Ｉ）１０ｇを加えて攪拌溶解させた。この液に、注射用水１４００ｍｌを加え、更にマンニトール４０ｇを溶解させた後、注射用水を加えて２０００ｍｌとした。この液を常法により除菌ろ過した後、３０ｍｌ容量のバイアルに１５ｍｌ充填し、常法により凍結乾燥して本発明に用いられる化合物（Ｉ）の凍結乾燥製剤を得た。
実験例
本発明化合物の薬理効果はつぎの様にして確認できる。
１）［３Ｈ］−ＡＭＰＡ結合阻害活性の測定：
約４５ｎＭの［３Ｈ］−ＡＭＰＡ［２−アミノ−３−（３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾール）プロピオニックアシッド］と約３００ｍｇのラット大脳膜標本および試験化合物を含有した全量０．５ｍｌの反応液を氷水中で４５分間反応させる。ＡＭＰＡ受容体へ結合した［３Ｈ］−ＡＭＰＡ量の測定は濾過法で行う。特異的結合量は全結合量のうち１０μＭキスカル酸によって置換された部分とする。試験化合物の評価は、特異的結合に及ぼす結合阻害率を求める。
２）カイニン酸神経細胞毒性阻害活性の測定：
本発明化合物のカイニン酸神経細胞毒性に対する阻害作用をラット胎児海馬神経細胞初代培養形を用いて検討する。
▲１▼培養条件
胎生１８−２０日目のラット脳より海馬を切り出し、パパインとＤＮａｓｅｌで酵素処理し、細胞を分散する。１０％血清を含むＭＥＭにて細胞を浮遊し、予めｐｏｌｙ−Ｉ−ｌｙｓｉｎｅで処理した４８ｗｅｌｌのプレート上に４×１０５ｃｅｌｌ／ｃｍ２の濃度で播種し、２４時間後無血清培地に交換する。培地交換は、２回／週の割合で行う。６日以上培養した細胞を以下の実験に供する。
▲２▼カイニン酸神経細胞毒性阻害
神経細胞毒性は、細胞死により培養液中に遊離される乳酸脱水素酵素の活性値で表す。３００μＭのカイニン酸を含む無血清培地に２４時間曝霧したものを対照として、各化合物をそれぞれ３００μＭのカイニン酸と同時に２４時間神経細胞に作用させ、カイニン酸による神経細胞死に対する各化合物の阻害作用を評価する。
３）脳梗塞抑制作用（ＭＣＡ永久閉塞モデル）
既報（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｒ．２７６，８４−９２，１９９６）に従い、Ｆｉｓｃｈｅｒ−３４４系ラットの左ＭＣＡを永久閉塞し、その５分後より化合物を無麻酔・無拘束下で２４時間静脈内持続投与した。投与終了後断頭、脳を摘出し、２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）染色を施し、梗塞体積を測定する。
発明の効果
本発明によれば、物理化学的に安定な新規な結晶形である化合物（Ｉ）が提供される。本発明の化合物（Ｉ）は、低湿度から高湿度の何れの条件でも安定であることから、医薬品の製造原体として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１  化合物（Ｉ）の粉末Ｘ線回折図
図２  化合物（Ｉ）のＴＧ−ＤＳＣ曲線
図３  化合物（ＩＩ）の粉末Ｘ線回折図
図４  化合物（ＩＩ）のＴＧ−ＤＳＣ曲線
【図１】
2003087091.tif 000006
【図２】
2003087091.tif 000007
【図３】
2003087091.tif 000008
【図４】
2003087091.tif 000009
【国際調査報告】
2003087091.tif 000010
2003087091.tif 000011
2003087091.tif 000012
2003087091.tif 000013