(57)【要約】本発明の人工細胞外マトリックスは、熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させた、熱安定化魚類由来コラーゲンを含有する。本発明の人工細胞外マトリックスは、適度な生体内安定性と組織修復を高度に活性化させる機能を有し、熱変性コラーゲンを付与する必要のないものである。また、魚類由来コラーゲンを用いているので、病原体を有する危険性が少ない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させた、熱安定化魚類由来コラーゲンを含有する人工細胞外マトリックス。
【請求項２】
熱変性率が２０〜９０％である魚類由来コラーゲンを含有する、人工細胞外マトリックス。
【請求項３】
前記魚類由来コラーゲンが、架橋処理を施したものである、請求項１又は２に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項４】
前記魚類由来コラーゲンが、紫外線を照射して架橋処理したものである、請求項３に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項５】
人工皮膚のマトリックスとして使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項６】
スポンジ状である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項７】
支持層と積層されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項８】
自家又は他家細胞が播種培養されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項９】
魚類由来コラーゲンを含有する溶液を成型する工程を含む人工細胞外マトリック製造方法であって、
熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させる工程を含むことを特徴とする、人工細胞外マトリックス製造方法。
【請求項１０】
前記魚類由来コラーゲンに架橋処理を施すことにより熱安定性を向上させる、請求項９に記載の人工細胞外マトリックス製造方法。
【請求項１１】
紫外線を照射することにより、前記魚類由来コラーゲンに架橋処理を施す、請求項１０に記載の人工細胞外マトリックス製造方法。
【請求項１２】
支持層と積層する工程を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックス製造方法。
【請求項１３】
動物において臓器又は組織を再生するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックスの使用。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックスを臓器又は組織の欠損部に移植することからなる、動物において臓器又は組織を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、人工細胞外マトリックス及びその製造方法に関するものである。更に詳細には、適度な生体内安定性と組織修復を高度に活性化させる機能を有するとともに、熱変性コラーゲンを付与する必要がなく、更に病原体を有する危険性の少ない、人工細胞外マトリックス及びその製造方法に関するものである。
背景技術
外傷や疾病により、臓器又は組織が損傷を受け又は欠損したような場合に、それらの機能を回復すべく、それらを再生させることは極めて重要な課題である。このような、臓器又は組織を再生させる医療は再生医療と呼ばれ、今日において研究開発が盛んに行われている。
再生医療にはいくつかのアプローチが知られている。第一に、患者の体外において臓器又は組織を構築した後、構築された臓器又は組織を体内に戻す方法、第二に、臓器又は組織が欠損した部位に臓器又は組織の再生の足場を提供して積極的な臓器又は組織の再生を図る方法である。
いずれの方法においても、臓器又は組織再生の足場となる人工的に作成された細胞外マトリックスが必要となる。このような人工細胞外マトリックスには組織修復を促進する効果が要求されている。これについて、皮膚における再生医療の場合について説明する。
既知のように、皮膚は、表皮、真皮及び皮下組織からなる三層構造からなり、熱傷等により真皮の全てが破壊された場合、皮膚を再生することができず、皮膚はケロイド状となってしまう。そこで、このような破壊された創面を修復するには、現在のところ植皮が優れた手段として行われている。しかし、植皮は自家植皮が好ましいが、皮膚欠損部が広範囲にわたる場合等においては植皮することが困難となる。このような場合、一卵性双生児の場合は、一方からの皮膚を植皮することが行われるが、一卵性双生児でない場合は実施することが困難である。
このような問題を解決するため、植皮の代用として、皮膚欠損部に人工細胞外マトリックスを移植し、治癒の促進を図る試みがなされている。このような人工細胞外マトリックスは、一般的に人工皮膚と呼ばれている。人工皮膚としては、例えばコラーゲンシート、キチン不織布等の天然高分子を用いた人工皮膚が実用化されている。
しかしながら、上記人工皮膚は生分解性が良好であるため、自家組織に置換される前に消失してしまう場合や、過度の架橋処理によって体内に異物として残留する場合がある。また、組織修復の活性化という点からも不十分なものであった。
そこで、適度な生体内安定性を付与しつつ組織修復活性化能を向上させた人工皮膚が開発されている。このような人工皮膚としては、例えば特公平６−１８５８３号公報に、繊維化コラーゲン及び変性コラーゲン（ゼラチン）からなる人工細胞外マトリックスに脱水熱架橋による架橋処理を施した創傷接触層を有する人工皮膚が開示されている。該公報に開示された人工皮膚は、適度な生体内安定性が付与されたものであるが、組織修復の活性化においては、未だ不十分なものである。また、該公報に開示された人工皮膚においては、熱変性温度の高い哺乳類由来のコラーゲンに架橋処理を施しているため、生体内温度ではほとんど熱変性を起こさない。このため、線維芽細胞の接着や遊走を促進する機能を有していると言われている熱変性コラーゲン（ゼラチン）を別途混入させるか、または上記コラーゲンに熱を加えることにより一部を変性させる必要があった。
上述の問題点は、人工肝臓等の体内埋め込み型人工臓器を構築する際に用いられる人工細胞外マトリックスについても同様である。すなわち、欠損した臓器に自家細胞が侵入して臓器が再建されるためには、人工細胞外マトリックスの形態を保持し続ける必要があり、自家細胞の侵入、さらには組織再生を促進させることが重要である。
また、人工細胞外マトリックスに、各種の細胞を播種培養した後、体外で臓器や組織を構築して用いる場合にも、上述のような性質が要求される。このような技術として、例えば特開平１１−４７２５８号公報には、ゼラチン及びコラーゲンの混合物に紫外線を照射して架橋を施した医用基材が開示されている。しかしながら、該公報に開示された医用基材においても、哺乳類由来のコラーゲンを用いており、そのコラーゲンに架橋処理を施しているため、熱変性コラーゲン（ゼラチン）を別途混入させる必要があった。また、自家細胞の侵入や組織再生を促進させるという観点からは未だ不十分なものである。更に、コラーゲンの供給源としては、主に牛や豚が用いられている。牛や豚は家畜として流通しているが故に病原体が伝播すると供給が停止するという問題があり、また、牛や豚のコラーゲンを用いて製造された医用基材を人間に用いた場合に、人間が病原体に感染する可能性がある。
従って、本発明の目的は、適度な生体内安定性と組織修復を高度に活性化させる機能を有するとともに、熱変性コラーゲンを付与する必要がなく、更に病原体を有する危険性の少ない、人工細胞外マトリックスを提供することにある。更に、本発明の目的は、上述のような人工細胞外マトリックスの製造方法等を提供することにある。
発明の開示
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させることにより、上記目的を達成し得る人工細胞外マトリックスが得られるという知見を得、本発明を完成した。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させた、熱安定化魚類由来コラーゲンを含有する人工細胞外マトリックスを提供するものである。
本明細書において「熱安定性」とは、コラーゲンを３７℃の温度で湿潤状態に静置した場合の、コラーゲンの熱変性の起こり難さを意味する。湿潤状態にあるコラーゲンを加熱すると、コラーゲンは分子量１００，０００程度のポリペプチド鎖３本からなるコラーゲンの三重螺旋構造がほぐれ、それぞれのポリペプチド鎖がランダムコイル状のゼラチンとなる。このような構造変化を起こす温度は一般に変性温度と呼ばれており、コラーゲンの由来する生物の生活環境温度に対応すると言われている。恒温動物である哺乳類や鳥類の場合、コラーゲンの変性温度は、それらの体温である３７℃前後である。北洋などの水温の低い海域に生育する魚類の場合は、コラーゲンの変性温度は１０〜２０℃と恒温動物に比べて大幅に低くなる。
また、本発明は、熱変性率が２０〜９０％である魚類由来コラーゲンを含有する、人工細胞外マトリックスを提供するものである。
本発明の人工細胞外マトリックス製造方法は、魚類由来コラーゲンを含有する溶液を成型する工程を含む人工細胞外マトリック製造方法であって、
熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させる工程を含むことを特徴とする。
本発明は、動物において臓器又は組織を再生するために上記本発明の人工細胞外マトリックスの使用することを含む。
また、本発明の動物において臓器又は組織を再生する方法は、上記本発明の人工細胞外マトリックスを臓器又は組織の欠損部に移植することからなる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の人工細胞外マトリックスについて説明する。
本発明の人工細胞外マトリックスは、熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させた、熱安定化魚類由来コラーゲンを含有する。
本発明の人工細胞外マトリックスを製造するために用いられるコラーゲンの由来の魚類としては、その種について特に限定されるものではない。本発明において用いられるコラーゲンは、その性質が重要であり、魚類の種については重要ではない。しかし、希少な種を用いたのでは、コラーゲンの安定供給が困難となるので好ましくない。また、水産化加工工程において発生する大量の魚皮が水産廃棄物として処理されているという現状に鑑みて、これらの廃棄物を新たな資源として有効利用できるという観点から、水産廃棄物系の魚皮を用いることが好ましい。
本発明の人工細胞外マトリックスを製造するために用いられるコラーゲンは、魚類由来のものであれば特に制限なく用いることができるが、収量や熱安定性の観点から、魚皮から得られるＩ型コラーゲン又はＩ型コラーゲンを主成分とする各型コラーゲンの混合物が好ましく用いられる。なお、用いるコラーゲンの熱安定化処理を施す前の熱安定性が高すぎると、本発明の効果を十分に得ることができない場合がある。具体的には、旋光度の温度変化を測定することにより得られる熱変性温度（Ｋｉｍｕｒａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０（１２），２０９２−２０９４  １９９６に記載の方法により測定）が、生体内温度である３７℃より低いことが必要である。なお、熱変性温度は３５℃以下であることが好ましく、３０℃以下であることが更に好ましく、２５℃以下であることが更に好ましく、２０℃以下であることが最も好ましい。
本発明の人工細胞外マトリックスに含まれる魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させる方法に特に制限はないが、例えば各種の化学的架橋法及び物理的架橋法が挙げられる。これらの方法については後述する。
本発明における「魚類由来コラーゲンの熱安定性」は熱変性率として求めることができる。熱変性率とは、魚類由来コラーゲンを十分な容量のリン酸緩衝液（３７℃）中に７２時間浸漬し、溶出したゼラチン濃度から定量することにより求めることができる。
具体的には、下記の操作により熱変性率（％）を測定することができる。
人工細胞外マトリックスを、五酸化リン入りデシケーター中に入れ、室温で３日間真空乾燥し、真空乾燥後の人工細胞外マトリックス約２０ｍｇを精秤して試料とした。正確に重量を測った試料を２０ｍｌのリン酸緩衝液中に浸漬し、３７℃の温度の恒温室中に７２時間静置した。なお、試料の蒸発を防止するため、容器には栓をして容器を密閉した。
７２時間静置した後、容器内のリン酸緩衝液をポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、変性率測定用試料とした。
これとは別に、コラーゲン水溶液を６０℃で１時間加熱して、熱変性コラーゲン（ゼラチン）水溶液を作成し、このゼラチン水溶液について２３０ｎｍの吸光度を測定し、ゼラチン濃度を変えた水溶液を作成して検量線を作成した。
上記のようにして得た変性率測定用試料について２３０ｎｍの吸光度を測定し、検量線からゼラチン濃度を求め、ゼラチン濃度と試料重量から熱変性率（％）を算出した。なお、検量線が直線になる範囲はゼラチン濃度が０．３ｍｇ／ｍｌ程度までであるので、コラーゲンの溶け出しが多く、熱変性率測定用試料中のゼラチン濃度が検量線から外れる場合には、変性率測定用試料を希釈して測定し、希釈率からゼラチン濃度を逆算して熱変性率を算出した。
本発明の人工細胞外マトリックスは、熱変性率が２０〜９０％、好ましくは２０〜８０％、更に好ましくは２０〜７０％である魚類由来コラーゲンを含有している。魚類由来コラーゲンの熱変性率が２０％未満であると線維芽細胞の接着、遊走、増殖の活性化の観点から好ましくない場合があり、一方、熱変性率が９０％を越えると、人工細胞外マトリックスとしての形状保持が困難となる場合があるので、熱変性率が上記範囲内の魚類由来コラーゲンを用いることが好ましい。
なお、魚類由来コラーゲンには、本発明の効果を損なわない範囲で、コラーゲンの物理化学的性質を変化させるべく公知の化学修飾を施されていてもよい。このような化学修飾としては、例えばメチル化、スクシニル化、アセチル化等が挙げられる。また、既知の如く、コラーゲン分子には、その両末端にテロペプチドと呼ばれる螺旋構造を有しないペプチド構造が存在している。このテロペプチド内には１２〜２７個のアミノ酸残基が存在し、コラーゲンの抗原性はこの部分によって発現すると言われている。そのため、本発明の人工細胞外マトリックスを得るにもこのテロペプチド部分を除去することが好ましい。テロペプチド部分の除去は、ペプシン等のタンパク質分解酵素を用いることにより実施することができる。
本発明の人工細胞外マトリックスには、本発明の効果を損なわない範囲で、他の天然高分子や細胞増殖因子を加えてもよい。該天然高分子としては、例えばアルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン等が挙げられる。また、該細胞増殖因子としては、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。
本発明の人工細胞外マトリックスは、スポンジ状の多孔構造であることが好ましい。このような人工細胞外マトリックスの厚み及び形状は適用される患部の状態によって変化するが、厚みは０．３〜３０ｍｍ程度であり、形状は薄板状、板状、棒状、球状、紡錘状又は両側凸レンズ状等に成型することが好ましい。また、スポンジの空孔サイズについては、適用される患部の状態によって適宜変更可能であり、製造時のコラーゲン溶液の濃度、凍結時の温度等により制御することができる。
本発明の人工細胞外マトリックスは、支持層と積層されていてもよい。支持層とは、人工細胞外マトリックスに強度、水分透過性、細菌防止性等を付与するために積層されるシート状材料のことを意味する。このような目的で人工細胞外マトリックスを支持層と積層することは公知の技術であり、本発明の人工細胞外マトリックスにおいても公知の材料を使用することが可能である。このような材料としては、例えばナイロン、シリコン等の合成高分子、絹、木綿、キチン、キトサン等の天然高分子から製造されている膜、編物及び不織布等が挙げられる。このような支持層は人工細胞外マトリックスの形状が平面である場合には、その片面に積層することが好ましく、塊状の場合は、その表面に積層することが好ましい。
本発明の人工細胞外マトリックスの製造方法については後述する。
本発明の人工細胞外マトリックスは、以下のように用いることができる
体外において、臓器又は組織を構築し、構築された臓器又は組織を体内の臓器は組織の欠損部に移植する。具体的には、移植する前に人工細胞外マトリックスに自家又は他家細胞を播種培養し、ある程度の臓器又は組織の回復を行う方法である。播種培養を行う細胞種としては、本発明の人工細胞外マトリックスが適用される臓器又は組織に元来含まれる細胞種を適宜選択して用いることができる。例えば、本発明の人工細胞外マトリックスを皮膚に適用する場合は、播種培養として線維芽細胞が用いられ、肝臓に適用する場合は肝細胞が用いられる。
本発明の人工細胞外マトリックスに自家又は他家細胞を播種する場合、自家又は他家細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２程度になるように播種することが好ましい。このように自家又は他家細胞を播種した人工細胞外マトリックスを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて１〜２週間程度培養した後に使用する。
また、本発明の人工細胞外マトリックスは、体内の臓器又は組織の欠損部において再生の足場を提供するために用いられる。この場合は、上記のように播種培養を行わず、本発明の人工細胞外マトリックスを直接、体内の臓器又は組織の欠損部に移植する。移植する欠損部位の形状に応じて、本発明の人工細胞外マトリックスは適宜成型して用いる。
上記のように本発明の人工細胞外マトリックスを、臓器又は組織の欠損部に移植することにより、動物において臓器又は組織を再生することができる。
また、本発明の人工細胞外マトリックスは、各種細胞が侵入する足場として、又は各種細胞培養の単体として用いることができる。すなわち、いわゆる人工臓器のマトリックスとして用いることができる。本発明の人工細胞外マトリックスが含有する、熱安定性が向上したコラーゲンの特徴を活用するという観点から、皮膚、軟骨、骨、血管、角膜、肝臓等の人工臓器のマトリックスとして好ましく用いられる。更に好ましくは皮膚、軟骨、骨等の人工臓器のマトリックスとして用いられる。最も好ましくは人工皮膚のマトリックスとして用いることである。
次いで、本発明の人工細胞外マトリックス製造方法について説明する。
本発明の人工細胞外マトリックス製造方法は、魚類由来コラーゲンを含有する溶液を成型する工程を含み、熱変性温度が３７℃未満である魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させる工程を含むことを特徴とする。
本発明の人工細胞外マトリックス製造方法において用いられる魚類由来コラーゲンについては、上述の本発明の人工細胞外マトリックスにおいて説明したものと同様のものが用いられる。本発明の人工細胞外マトリックス製造方法において用いられる魚類由来コラーゲンは、その熱変性温度が３７℃未満のものである。熱変性温度は３５℃以下であることが好ましく、３０℃以下であることが更に好ましく、２５℃以下であることが更に好ましく、２０℃以下であることが最も好ましい。
本発明の人工細胞外マトリックス製造方法においては、魚類由来コラーゲンを含有する溶液を成型する工程を含む。魚類由来コラーゲンを含有する溶液を成型する方法については、コラーゲン含有溶液を成型する方法として従来公知の方法を特に制限なく用いることができる。例えば以下の▲１▼〜▲５▼の方法が挙げられる。
▲１▼型に流し込んだ魚類由来コラーゲン溶液を風乾又は凍結乾燥する方法。
▲２▼型に流し込んだ魚類由来コラーゲン溶液を公知の方法によりゲル化させた後に風乾又は凍結乾燥する方法。
▲３▼型に流し込んだ魚類由来コラーゲン溶液が各種細胞を含有する状態でゲル化させる方法（Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ，１（２），１５０−１６１，１９８８に記載の方法）。
▲４▼魚類コラーゲン溶液を公知の方法により繊維状に加工した後にシート状に成型する方法。
▲５▼型に流し込んだ魚類由来コラーゲン溶液又はダイから押し出した魚類由来コラーゲン溶液を凝固相中で固化させる方法。
線維芽細胞の良好な侵入を達成するために、上記の中でも▲１▼、▲２▼及び▲５▼の成型方法が好ましく、特に▲１▼の成型方法が好ましい。
なお、用いる魚類由来コラーゲン含有溶液においては、魚類由来コラーゲン濃度は０．１〜２．０質量％程度であることが好ましい。溶媒としては、ｐＨ＝１〜７の範囲の溶媒であれば特に制限なく用いることができ、例えば、水及び希酢酸等の各種有機酸、無機酸水溶液を用いることができる。
上記魚類由来コラーゲンを含有する溶液には、本発明の効果を損なわない範囲で、他の天然高分子や細胞増殖因子を加えてもよい。該天然高分子としては、例えばアルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン等が挙げられる。また、該細胞増殖因子としては、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。
また、人工細胞外マトリックスをスポンジ状のものとして得るには、魚類由来コラーゲンを含有する溶液に、ホモジナイザー等を用いて溶液中に気泡を加えてから成型してもよい。
本発明の人工細胞外マトリックス製造方法において魚類由来コラーゲンの熱安定性を向上させる方法としては、例えば各種の化学的架橋法及び物理的架橋法等の架橋処理が挙げられる。魚類由来コラーゲンに架橋処理を施すことにより、熱安定性を向上させることができる。
上記化学的架橋法としては、例えばアルデヒド系架橋剤、エチレングリコールジグリシジルエーテル、イソシアネート系架橋剤等を使用した公知の方法が挙げられる。また、上記物理的架橋法としては、例えば紫外線架橋法、γ線架橋法、脱水熱架橋法等が挙げられる。上記化学的架橋法は、架橋後に架橋剤が残留して細胞毒性を示したり生分解性が悪くなり生体内に異物として残留する場合があるため、そのような問題の少ない物理的架橋法によることが好ましい。物理的架橋法のうちでも、架橋操作の簡便性の観点から特に紫外線架橋が好ましく用いられる。
本発明の人工細胞外マトリックス製造方法において、熱安定性の向上は魚類由来コラーゲンを成型する前に実施してもよく、また成型した後に実施してもよい。
成型前に熱安定性を向上させる場合、魚類由来コラーゲン含有溶液に上記架橋剤を加えることによって実施することができる。また、物理的架橋法の場合には、魚類由来コラーゲン含有溶液を撹拌しながら、又は静置したままで紫外線等を照射すればよい。成型後に熱安定性を向上させる場合は、物理的架橋法による場合は、人工細胞外マトリックスがフィルム状の場合、両面から紫外線等を照射することが好ましい。また、塊状等の場合には全ての面に均一の照射されるようにする。紫外線を照射することにより、魚類由来コラーゲンに架橋処理を施して熱安定性を向上させる場合、用いられる紫外線の波長は２５０〜２７０ｎｍ程度でよく、紫外線の強度は０．１〜１．０ｍＷ／ｃｍ２程度でよい。
本発明の人工細胞外マトリックス製造方法においては、人工細胞外マトリックスを支持層と積層してもよい。支持層とは、上述したように、人工細胞外マトリックスに強度、水分透過性、細菌防止性等を付与するために積層されるシート状材料のことを意味する。このような支持層に用いられる材料としては上述したものが挙げられる。人工細胞外マトリックスを支持層と積層する方法としては、支持層に魚類由来コラーゲン含有溶液を流し込んだ後に風乾し、凍結乾燥又はゲル化を行う方法、成型後の人工細胞外マトリックスに支持層を貼り合わせる方法等が挙げられる。後者の方法においては、各種接着剤を用いて貼り合わせてもよいし、支持層又は人工細胞外マトリックスの接着面に魚類由来コラーゲン含有溶液を塗布して支持層を接着させた後に乾燥して固着させてもよい。
実施例
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
メタノール及びクロロホルムにより脱脂した鮭（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  Ｋｅｔａ）の皮を１３０ｇ準備し、この皮を３リットルの０．５Ｍ酢酸溶液に浸漬し、４℃の温度に３日間静置し、コラーゲンを抽出した。次いで、膨潤した鮭皮をガーゼによりろ過して除去し、ろ液を１０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、鮭皮の破片等を沈殿させて除去した。
遠心分離して得られた上清にペプシンを３０ｍｇ加え、４℃の温度で撹拌しながら、上清に含まれるコラーゲンのペプシン処理を２日間行った。ペプシン処理を行った後、５％塩化ナトリウム溶液にて２４時間塩析し、１０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を捨て、コラーゲン残渣を集めた。集めたコラーゲン残渣に０．５Ｍ酢酸溶液を注ぎ、４℃の温度２日間撹拌しながら、コラーゲンを溶解し、コラーゲン溶液を得た。塩析、遠心分離、コラーゲンの溶解操作を２度繰り返して行った。得られたコラーゲン溶液（０．５Ｍ酢酸溶液に溶解）を１００，０００ｇ、４℃で１時間、超遠心機を用いて遠心分離を行い、微細な不純物を除去した。超遠心分離して得られた上清を透析膜に入れ、脱イオン水にて透析を行い、完全中性化したコラーゲン溶液を得、このコラーゲン溶液を凍結乾燥した。得られたコラーゲンの熱変性温度は１９℃である。
上述のようにして得られたコラーゲンの凍結乾燥物を、ｐＨ３．０の希塩酸に０．５質量％の濃度になるように加え、４℃の温度で３日間撹拌しながら溶解し、コラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液をプラスチック製の型に、乾燥した後に厚みが約０．５ｃｍになるように流し込み、液体窒素を用いて凍結した後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥されたコラーゲンスポンジ（厚み０．５ｃｍ）を五酸化リン入りデシケーター中に入れ、室温で３日間真空乾燥した。
【０００１】
真空乾燥を行ったコラーゲンスポンジを、２５４ｎｍの波長の紫外線ランプの下に、紫外線強度が０．６５ｍＷ／ｃｍ２になるように９時間静置し、コラーゲンの紫外線架橋処理を施し、コラーゲンの熱安定性を向上させ、本発明の人工細胞外マトリックスを得た。
次いで、以下の方法により人工細胞外マトリックスに含有されるコラーゲンの熱安定性を測定した。
人工細胞外マトリックスを、五酸化リン入りデシケーター中に入れ、室温で３日間真空乾燥し、真空乾燥後の人工細胞外マトリックス約２０ｍｇを精秤して試料とした。正確に重量を測った試料を２０ｍｌのリン酸緩衝液中に浸漬し、３７℃の温度の恒温室中に７２時間静置した。なお、試料の蒸発を防止するため、容器には栓をして容器を密閉した。
７２時間静置した後、容器内のリン酸緩衝液をポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、変性率測定用試料とした。
これとは別に、コラーゲン水溶液を６０℃で１時間加熱して、熱変性コラーゲン（ゼラチン）水溶液を作成し、このゼラチン水溶液について２３０ｎｍの吸光度を測定し、ゼラチン濃度を代えた水溶液を作成して検量線を作成した。
上記のようにして得た熱変性率測定用試料を２倍希釈して２３０ｎｍの吸光度を測定し、検量線から得られたゼラチン濃度を２倍して実際のゼラチン濃度を求め、ゼラチン濃度と試料重量から熱変性率（％）を算出した。
実施例１で得られた人工細胞外マトリックスの熱変性率は５２％であった。
次いで、得られた人工細胞マトリックスの皮下移植試験を以下のようにして行った。
検体としてＢａｌｂ／ｃマウス（雌）を用いた。マウスをエーテルで麻酔した後、脱毛フォームで背部を剃毛し、背部正中に約１ｃｍの切開を加え、皮筋下の疎生結合織内にポケットを作製した。このポケットに、上述のようにして得られた人工細胞外マトリックスを移植し、ナイロン糸で皮膚縫合を行った。移植して１４日経過後に、人工細胞外マトリックスの生検を行い、１０％中性緩衝ホルマリン溶液中に浸漬し、一昼夜放置し固定した後、病理組織検査を行った。病理組織染色としては、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ・Ｅ）染色、マッソン−トリクローム染色、抗ＣＤ３１染色を行った。結果を図１に示す。
図１に示すように、スポンジの血管増生と線維芽細胞、リンパ球や組織球がめだつ、いわゆる肉芽組織が形成されていた。また、抗ＣＤ３１染色によって染色された内皮成分と管腔形成が認められた。
比較例１
紫外線架橋処理を行わなかった以外は、実施例１と同様に操作を行い、人工細胞外マトリックスを得た。得られた人工細胞外マトリックスについて、実施例１と同様に熱変性率を求めたところ、１００％であった。熱変性率が１００％ということは、皮下移植試験に供した場合、３日目には完全に熱変性を受け、人工細胞外マトリックスが組織中に溶けだしてしまうことを意味する。
上述のようにして得られた人工細胞外マトリックスについて、実施例１と同様に皮下移植試験を行った。移植して７日経過後には、移植された人工細胞外マトリックスが完全に消滅していた。
比較例２
テルモ株式会社製「テルダーミス皮膚欠損用グラフト」を用いて、実施例１と同様に熱変性率を求め、皮下移植試験を行った。なお、テルダーミス皮膚欠損用グラフトはウシ（ほ乳類）由来のコラーゲンを原料として用いており、脱水熱架橋を施したものであり、更に熱変性コラーゲンが添加されているものである。本試料をｐＨ＝３．０の希塩酸に浸漬した後、１００℃の温度で１０分間加熱して試料を完全に溶解し、熱変性率の測定と同様の方法で試料に含まれるコラーゲン及び熱変性コラーゲン量を求めたところ９３％であった。残りの７％は無機塩類等と考えられる。そこで、試料重量の９３％に対して熱変性率を求めたところ、熱変性率は１５％であった。
皮下移植試験についても、実施例１と同様に行ったが、比較例２においては、テルダーミス皮膚欠損用グラフトに積層されているシリコンシートを除去して用いた。結果を図２に示す。図２から明らかなように、移植して１４日経過後に、血管増生は認められず、明らかに細胞成分に乏しいものであった。
実施例１、比較例１及び比較例２の所見について、下記表１にまとめた。
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以上詳述した通り、本発明の人工細胞外マトリックスは、適度な生体内安定性と組織修復を高度に活性化させる機能を有するとともに、熱変性コラーゲンを付与する必要がない。また、魚類由来のコラーゲンを用いているので、病原体を有する危険性のないものである。
また、本発明の人工細胞外マトリックス製造方法は、上述のような人工細胞外マトリックスを容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の人工細胞外マトリックスを用いて皮下移植試験を行った結果を示す写真である。
図２は、従来の人工細胞外マトリックスを用いて皮下移植試験を行った結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月22日(2004.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
熱変性率が２０〜９０％である熱安定化魚類由来コラーゲンを含有する人工細胞外マトリックスであって、
上記熱安定化魚類由来コラーゲンが、紫外線を照射して架橋処理したものである、人工細胞外マトリックス。
【請求項１６】
人工皮膚のマトリックスとして使用される、請求項１５に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項１７】
スポンジ状である、請求項１５又は１６に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項１８】
支持層と積層されている、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項１９】
自家又は他家細胞が播種培養されている、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックス。
【請求項２０】
魚類由来コラーゲンを含有する溶液を成型する工程を含む人工細胞外マトリックス製造方法であって、
魚類コラーゲンに紫外線を照射して架橋処理し、熱変性率を２０〜９０％とし、熱安定化魚類由来コラーゲンを得る工程；及び
熱安定化魚類由来コラーゲンを含有する溶液を成型する工程を含む、人工細胞外マトリックス製造方法。
【請求項２１】
支持層と積層する工程を含む、請求項２０に記載の人工細胞外マトリックス製造方法。
【請求項２２】
動物において臓器又は組織を再生するための請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックスの使用。
【請求項２３】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の人工細胞外マトリックスを臓器又は組織の欠損部に移植することからなる、動物において臓器又は組織を再生する方法。
【国際調査報告】
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