(57)【要約】本発明は、コンフォメーション病の治療及び／又は予防剤を提供する。本発明の課題は、神経保護作用を有する神経ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコンフォメーション病の治療及び／又は予防剤である。
2003051387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経保護作用を有する神経ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコンフォメーション病の治療及び／又は予防剤。
【請求項２】
神経ペプチドが、下記式（Ｉ）：
2003051387.tif 000075
（式中、Ａは、Ａｌａ又はＧｌｙ；Ｂは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｃは、Ａｓｎ又はＳｅｒ；Ｄは、Ｔｈｒ又はＳｅｒ；Ｅは、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；Ｆ及びＪは、それぞれＬｙｓ又はＡｒｇを示し、ＩはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＧｌｎを示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはＡｒｇ；Ｇは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はｎＬｅｕ；Ｋは、Ａｓｎ又はＡｌａ；Ｌは、Ｓｅｒ又はＡｌａ；Ｍは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｎは、−ＮＨ２又はＡｓｎ−ＮＨ２を示す。）
で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
神経ペプチドが、下記式（ＩＩ）：
2003051387.tif 000076
（式中、Ａは、Ａｌａ又はＧｌｙ；Ｂは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｃは、Ａｓｎ又はＳｅｒ；Ｄは、Ｔｈｒ又はＳｅｒ；Ｅは、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；Ｆ及びＪは、それぞれＬｙｓ又はＡｒｇを示し、ＩはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＧｌｎを示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはＡｒｇ；Ｇは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はｎＬｅｕ；Ｋは、Ａｓｎ又はＡｌａ；Ｌは、Ｓｅｒ又はＡｌａ；Ｍは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｐは、Ａｓｎ又は化学結合；Ｑは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ又は化学結合；Ｒは、−ＯＨ又は−ＮＨ２を示す。）
で示されるペプチドである、請求項１に記載の剤。
【請求項４】
神経ペプチドが、下記式（ＩＩＩ）：
2003051387.tif 000077
（式中、Ａは、Ａｌａ又はＧｌｙ；Ｂは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｃは、Ａｓｎ又はＳｅｒ；Ｄは、Ｔｈｒ又はＳｅｒ；Ｅは、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；Ｆ、Ｊ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔは、それぞれＬｙｓ又はＡｒｇを示し、ＩはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＧｌｎを示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはＡｒｇ；Ｇは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はｎＬｅｕ；Ｋは、Ａｓｎ又はＡｌａ；Ｌは、Ｓｅｒ又はＡｌａ；Ｍは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｎは、化学結合又はＡｓｎ；Ｕは−ＯＨ又は−ＮＨ２を示す。）
で示されるペプチドである、請求項１に記載の剤。
【請求項５】
コンフォメーション病が、プリオンタンパク質、ポリグルタミン酸、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、β−アミロイド、ＳＯＤ１、Ｔａｕ、Ａｂｒｉ、又はｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎの蓄積によって発病する疾患である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の剤。
【請求項６】
コンフォメーション病が、ヤコブ病、狂牛病（牛海綿状脳症）、ゲルストマン・ストロイスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ）症候群、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、パーキンソン病、ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上皮性麻痺、皮質基底核変性症、Ｐｉｃｋ病、ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ又は家族性痴呆症である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の剤を含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、神経保護作用を有する神経ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコンフォメーション病の治療及び／又は予防剤、並びに該剤を含んでなる医薬組成物に関する。
背景技術
Ｈａｒｒｉｓにより提唱された「腺性下垂体は、視床下部で産生され門脈を介して下垂体前葉に運ばれる体液性因子によりコントロールされる」という仮説に基づき、過去３０年の間に甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、成長ホルモン分泌抑制ホルモン（ソマトスタチン）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＨ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＨ）といった視床下部ホルモンが同定されてきた。これらの物質は神経伝達物質や神経機能調節因子として作用する神経ペプチドであり、視床下部からの放出後、下垂体に作用し、各種刺激に応じたホルモンの分泌の促進や抑制を行う。しかし、上記物質ですべての神経ペプチドが同定されたかどうかは議論のあるところである。そこで有村らは、従来の神経ペプチドに対する分離・同定の戦略を変え、分離のための指標として下垂体前葉細胞中の細胞内情報伝達系（特に、ＣＲＨ、ＧＲＨによるＧＨ、ＡＣＴＨの分泌に重要であるｃＡＭＰ系）の活性化を指標とし、視床下部から新たな神経ペプチドの分離を試み、最終的にそれを同定した（Ｍｉｙａｔａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９８９），１６４，５６７−５７４）。そして、このペプチドは下垂体のアデニル酸シクラーゼ（ａｄｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ）の活性化を指標として分離されたことから、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、以下、ＰＡＣＡＰと称する）と名付けられた。
また、ＰＡＣＡＰよりも先に天然より見出された神経ペプチドとして血管作働性腸管ペプチド（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下、ＶＩＰと称する）がある。ＶＩＰは腸管から分泌される神経ペプチドの一種であり、消化管平滑筋弛緩の作用を有し、また、ＰＡＣＡＰのＮ末端側からの２７個のアミノ酸配列はＶＩＰと極めて類似した構造を有している。ＶＩＰとＰＡＣＡＰは、ペプチドの長さ、シーケンス及びＣ末端がアミド化されているという点でセクレチン、グルカゴン等と共通点が多いことから、一般にグルカゴン−セクレチンファミリーに属している。
一方、神経系における疾患は、かつてはそのメカニズムに不明のものが多く、特に神経変性疾患の病態については謎が多く存在していた。今日では、神経変性疾患は「原因不明の代謝障害によって、疾患毎にきまった種類の神経細胞群が進行性の変性・脱落を生じる結果、様々な神経・精神症状を呈する一群の疾患」として定義されている。この中には、アルツハイマー病やパーキンソン病など極めて頻度が高く殆どが弧発性であるもの、また、ポリグルタミン病のように個々の疾患としては比較的稀であるが様々な病型が存在し、そのすべてが遺伝性を示すものなど、実に多様な疾患が含まれている。しかしながら、近年、神経変性疾患は、当該疾患の原因遺伝子産物である特定のタンパク質のフォールディングに異常を生じ、主としてβシート構造をとる不溶性蓄積物を形成していく過程で新たな異常機能を獲得し、細胞死を招来するのではないかとの展望が急速に開けている。その結果、タンパク質の高次構造の変化によって生じた特定のタンパク質に着目したコンフォメーション病の概念が急速に浸透し始めた。これらコンフォメーション病の特徴としては、脳内に蓄積する特定のタンパク質がその発症に必要不可欠とされている。例えば、ヤコブ病・狂牛病（牛海綿状脳症）・Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ症候群ではプリオンタンパク質、球脊髄性筋萎縮症・ハンチントン病・脊髄小脳失調症・歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症ではポリグルタミン、パーキンソン病・ｌｅｗｙ小体型痴呆症・多系統萎縮症ではα−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、アルツハイマー病・ダウン症ではβ−アミロイド、家族性筋萎縮性側索硬化症ではＳＯＤ１、ＦＴＤＰ−１７・進行性核上皮性麻痺・皮質基底核変性症・Ｐｉｃｋ病ではＴａｕ、ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａではＡｂｒｉ、家族性痴呆症ではｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎなどが現在原因物質として提唱されている［細胞工学（２００１）２０，１４７５］。
これらのコンフォメーション病については、原因物質及びその作用機序が徐々に解明されつつあり、目下、治療及び／又は予防効果のある医薬品の速やかな開発が望まれているところである。しかしながら、現在のところ、これらコンフォメーション病に対する有効かつ効果的な医薬品については報告が少なく、また、上記神経ペプチドを用いたコンフォメーション病に対する治療及び／又は予防のための医薬品については未だ報告されていない。
発明の開示
従って、本発明は、神経保護作用を有する神経ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコンフォメーション病の治療及び／又は予防剤、並びに該剤を含んでなる医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、コンフォメーション病を発症しうる特定のタンパク質に対して神経保護作用を有する神経ペプチドを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）を提供する。
（１）神経保護作用を有する神経ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコンフォメーション病の治療及び／又は予防剤。
（２）神経ペプチドが、下記式（Ｉ）：
2003051387.tif 000003
（式中、Ａは、Ａｌａ又はＧｌｙ；Ｂは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｃは、Ａｓｎ又はＳｅｒ；Ｄは、Ｔｈｒ又はＳｅｒ；Ｅは、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；Ｆ及びＪは、それぞれＬｙｓ又はＡｒｇを示し、ＩはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＧｌｎを示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはＡｒｇ；Ｇは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はｎＬｅｕ；Ｋは、Ａｓｎ又はＡｌａ；Ｌは、Ｓｅｒ又はＡｌａ；Ｍは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｎは、−ＮＨ２又はＡｓｎ−ＮＨ２を示す。）
で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドである、（１）に記載の剤。
（３）神経ペプチドが、下記式（ＩＩ）：
2003051387.tif 000004
（式中、Ａは、Ａｌａ又はＧｌｙ；Ｂは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｃは、Ａｓｎ又はＳｅｒ；Ｄは、Ｔｈｒ又はＳｅｒ；Ｅは、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；Ｆ及びＪは、それぞれＬｙｓ又はＡｒｇを示し、ＩはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＧｌｎを示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはＡｒｇ；Ｇは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はｎＬｅｕ；Ｋは、Ａｓｎ又はＡｌａ；Ｌは、Ｓｅｒ又はＡｌａ；Ｍは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｐは、Ａｓｎ又は化学結合；Ｑは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ又は化学結合；Ｒは、−ＯＨ又は−ＮＨ２を示す。）
で示されるペプチドである、（１）に記載の剤。
（４）神経ペプチドが、下記式（ＩＩＩ）：
2003051387.tif 000005
（式中、Ａは、Ａｌａ又はＧｌｙ；Ｂは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｃは、Ａｓｎ又はＳｅｒ；Ｄは、Ｔｈｒ又はＳｅｒ；Ｅは、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；Ｆ、Ｊ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔは、それぞれＬｙｓ又はＡｒｇを示し、ＩはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＧｌｎを示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはＡｒｇ；Ｇは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はｎＬｅｕ；Ｋは、Ａｓｎ又はＡｌａ；Ｌは、Ｓｅｒ又はＡｌａ；Ｍは、Ｉｌｅ又はＶａｌ；Ｎは、化学結合又はＡｓｎ；Ｕは−ＯＨ又は−ＮＨ２を示す。）
で示されるペプチドである、（１）に記載の剤。
（５）コンフォメーション病が、プリオンタンパク質、ポリグルタミン酸、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、β−アミロイド、ＳＯＤ１、Ｔａｕ、Ａｂｒｉ、又はｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎの蓄積によって発病する疾患である、（１）〜（４）のいずれかに記載の剤。
（６）コンフォメーション病が、ヤコブ病、狂牛病（牛海綿状脳症）、ゲルストマン・ストロイスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ）症候群、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、パーキンソン病、ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上皮性麻痺、皮質基底核変性症、Ｐｉｃｋ病、ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ又は家族性痴呆症である、（１）〜（５）のいずれかに記載の剤。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の剤を含んでなる医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００１−３８６６９９号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号１：ＸａａはＡｌａ又はＧｌｙを表す（存在位置：４）
配列番号１：ＸａａはＩｌｅ又はＶａｌを表す（存在位置：５）
配列番号１：ＸａａはＡｓｎ又はＳｅｒを表す（存在位置：９）
配列番号１：ＸａａはＴｈｒ又はＳｅｒを表す（存在位置：１１）
配列番号１：ＸａａはＬｅｕ又はＴｙｒを表す（存在位置：１３）
配列番号１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：１５）
配列番号１：ＸａａはＭｅｔ又はＬｅｕ又はｎＬｅｕを表す（存在位置：１７）
配列番号１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇ又はＧｌｎを表す（存在位置：２０）
配列番号１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：２１）
配列番号１：ＸａａはＡｓｎ又はＡｌａを表す（存在位置：２４）
配列番号１：ＸａａはＳｅｒ又はＡｌａを表す（存在位置：２５）
配列番号１：ＸａａはＩｌｅ又はＶａｌを表す（存在位置：２６）
配列番号１０：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：２）
配列番号１０：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：３）
配列番号１０：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：５）
配列番号１０：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：７）
配列番号１０：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：９）
配列番号１０：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：１１）
配列番号１１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：３）
配列番号１１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：４）
配列番号１１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：６）
配列番号１１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：８）
配列番号１１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：１０）
配列番号１１：ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇを表す（存在位置：１２）
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の神経保護作用を有する神経ペプチドは、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端に、Ａｓｎまたは配列番号２〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列が付加したアミノ酸配列からなるペプチドである。
2003051387.tif 000006
2003051387.tif 000007
上記ペプチドのＮ末端のアミノ基には、極性物質又は非極性物質を結合させて分子の極性を変化させたり、ポリエチレングリコール、グルコサミノグリカン（ヒアルロン酸等）の高分子を結合させて酵素耐性を持たせたり、該アミノ酸をリポソーム基質に結合させてリポソームに封入する、あるいは脂質膜表面に固定することもできる。
また、上記ペプチドのＣ末端は、−ＯＨ、−ＮＨ２のいずれでもよい。
具体的には、ＰＡＣＡＰ３８（ペプチド１：配列番号１２）、ＰＡＣＡＰ２７（ペプチド２：配列番号１３）、ＶＩＰ（ペプチド３：配列番号１４）、ＰＡＣＡＰの誘導体であるＡｒｇ−ＰＡＣＡＰ３８（ペプチド４；配列番号１５）、ＰＡＣＡＰ−ｌｉｋｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ペプチド５；配列番号１６）、Ａｒｇ−ＰＡＣＡＰ２７（ペプチド６；配列番号１７）、［Ａ４，Ｖ５］−ＰＡＣＡＰ２７（ペプチド７；配列番号１８）及び［Ａ４，Ｖ５，Ｎ９］−ＰＡＣＡＰ２７（ペプチド８；配列番号１９）、ＶＩＰの誘導体である［Ｇ４，Ｉ５］−ＶＩＰ（ペプチド９；配列番号２０）及び［Ｇ４，Ｉ５，Ｓ９］−ＶＩＰ（ペプチド１０；配列番号２１）、ＶＩＰの高塩基性誘導体であるＶＩＰ高塩基性誘導体Ａ（ペプチド１１；配列番号２２）、ＶＩＰ高塩基性誘導体Ｂ（ペプチド１２；配列番号２３）、ＶＩＰ高塩基性誘導体Ｃ（ペプチド１３；配列番号２４）及びＶＩＰ高塩基性誘導体Ｄ（ペプチド１４；配列番号２５）、ＰＡＣＡＰ２７の高塩基性誘導体であるＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ａ（ペプチド１５；配列番号２６）、ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｂ（ペプチド１６；配列番号２７）及びＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｃ（ペプチド１７；配列番号２８）、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ高塩基性キメラペプチド（ペプチド１８；配列番号２９）、ＰＡＣＡＰ  ｓｈｏｒｔｆｏｒｍ（ペプチド１９、２６〜３８；配列番号３０、３７〜４９）、ＶＩＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ペプチド２０、２２〜２５；配列番号３１、３３〜３６）、ＰＡＣＡＰ誘導体ＰＡＣＡＰ−ｌｉｋｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ｓｔｉｎｇｒａｙ−ＰＡＣＡＰ）（ペプチド２１；配列番号３２）、及びアセチル化ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｃ（ペプチド３９；配列番号１７のアセチル化誘導体）がある。
本発明のコンフォメーション病の治療及び／又は予防に用いることができる神経保護作用を有する神経ペプチドは、公知のペプチド合成の常法に従って合成できる。例えば、「ザ．ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻（１９６６年）［Ｓｃｈｒｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｈｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．］、あるいは「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）］の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（Ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＮＳｕ）法など、各種の方法により合成することができる。これらの方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。
本発明におけるペプチド合成は、上記のような一般的なポリペプチドの合成法、例えば、末端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステップワイズ法、または数個のフラグメントに分けてカップリングさせていく方法によって行われる。
例えば、ステップワイズ法による固相合成は、具体的には、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ．Ｒ．Ｂ．）の方法［Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９−２１５９（１９６３）］に従い、以下のようにして行うことができる。まず、Ｃ末端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキシル基によって不溶性樹脂に結合させ、その後、該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性アミノ基に、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従って、アミノ基を保護したアミノ酸の反応性カルボキシル基を縮合反応により順次結合させる。このようにして一段階ずつ全配列を合成した後、ペプチドを不溶性樹脂からはずす。
上記の固相合成において用いられる不溶性樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するものであればいずれをも使用できる。例えば、クロロメチル樹脂、オキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）、ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂などが挙げられる。
また、α−アミノ基の保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）を使用する場合は、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂など、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって樹脂から脱離できるものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）を使用する場合には、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）など、フッ化水素などによって樹脂から脱離できるものがよい。
樹脂１ｇ当りのペプチド濃度は０．５ｍｍｏｌｅ以下とすることが好ましい。
上記の方法においては、アミノ酸のペプチド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護基の脱離、並びにアミノ酸のペプチド結合に関与するカルボキシル基の活性化が必要である。
アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフイノチオイルなどの基が挙げられる。
また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有するもの、例えば、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＳｅｒは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。官能基の保護は、下記のような保護基を通常用いられている方法で上記アミノ酸に結合させ、反応終了後、該保護基は脱離される。
Ｈｉｓのイミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙げられる。
Ｓｅｒ及びＴｈｒの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができるが、この保護は必須ではない。エステル化に適する基としては、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルなどのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。
Ｔｙｒの水酸基の保護基としては、例えば、ベンジル（Ｂｚｌ）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、ジクロロベンジル（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、アセチル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
Ｌｙｓのアミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ジクロロベンジル（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
Ａｒｇのグアニジノ基の保護基としては、例えば、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）基などが挙げられる。
Ａｓｐのカルボキシル基の保護は、例えば、ベンジルアルコール、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、シクロヘキシル（ｃＨｅｘ）などによるエステル化により行われる。
その他のアミノ酸の保護基として、Ｔｒｐのインドリル基の保護基としては、例えば、ホルミル、カルボベンゾキシル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。
Ｍｅｔのチオメチル基の保護基としては、予めメチルスルホキシドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は必須ではない。
一方、カルボキシル基の活性化は、従来公知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公知のものから適宜選択しえる。例えば、カルボキル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）などを形成させることにより行う。
上記の固相における反応性アミノ基と反応性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用できるものであればいずれでもよい。例えば、無水または含水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）などを単独で、あるいは２種以上の混合溶媒として使用することができる。
また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボキシイミド（ＤＣＣ）、カルボジイミダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Ｂｏｐ試薬）などの存在下に行うこともできる。
得られたペプチドは、通常の方法に従い脱塩、精製することができる。例えば、ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０、セファデックスＧ−２５などの分配クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
上記のようにして得られた精製ペプチドは、各種の酸を用いて、所望により薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、塩酸塩、リン酸塩などにすることが出来る。
上記のようにして調製したペプチド及びその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する剤は、コンフォメーション病を招来しうる特定のタンパク質に対する神経保護作用を有する。ここで、コンフォメーション病を発症しうる特定のタンパク質とは、遺伝子の異常によってタンパク質のフォールディングに異常が生じ、本来のタンパク質がとりうる立体配座（コンフォーメーション）と相違し、β−シート構造をとることによって不溶性蓄積物となるタンパク質を意味する。また、コンフォメーション病とは、前記の特定のタンパク質が蓄積することによって神経細胞の細胞死が生じ、進行性痴呆、ミオクローヌス、運動失調、構音障害等を特徴とする症状が引き起こされた疾病を意味する。具体的な特定のタンパク質とそれに起因するコンフォメーション病としては、プリオンタンパク質によるヤコブ病・狂牛病（牛海綿状脳症）・ゲルストマン・ストロイスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ）症候群、ポリグルタミンによる球脊髄性筋萎縮症・ハンチントン病・脊髄小脳失調症・歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎによるパーキンソン病・ｌｅｗｙ小体型痴呆症・多系統萎縮症、β−アミロイドによるアルツハイマー病・ダウン症、ＳＯＤ１による家族性筋萎縮性側索硬化症、ＴａｕによるＦＴＤＰ−１７・進行性核上皮性麻痺・皮質基底核変性症・Ｐｉｃｋ病、Ａｂｒｉによるｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎによる家族性痴呆症などが挙げられる。また、神経保護作用とは、上記のようなコンフォメーション病を発症しうる特定のタンパク質による神経細胞の細胞死を阻害し、神経細胞の役割を維持することができる作用を意味する。このコンフォメーション病が生じる過程においてはアポトーシスによる細胞死を引き起こすと言われており、実際にアポトーシスに深く関与しているカスパーゼ系への作用が報告されている［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）６５，４５−５３］。例えば、この作用については、毒性タンパク質に対する神経保護作用を有する被検物質の存在下で試験対象の細胞にプリオンなどの毒性タンパク質を添加し刺激した後、細胞死のマーカー物質、カスパーゼ活性の検出を行い、被検物質を存在させなかったコントロールにおけるカスパーゼ活性値と比較する。コントロールの値よりも低い場合に、特定のタンパク質に対して神経保護作用有りと判断することができる。また上記の試験においてカスパーゼ活性を検出するかわりに生細胞数の比較をすることによっても同様の判断が可能である。
本発明のペプチド及び誘導体は神経保護作用を有するが、ＰＡＣＡＰ及びＶＩＰに比べてそれぞれの誘導体にはさらなる強力な活性と臨床的に望ましい補助的な効果が認められる。例えば、Ａｒｇ−ＰＡＣＡＰ３８やＡｒｇ−ＰＡＣＡＰ２７をはじめとする塩基性アミノ酸置換誘導体群は生体内におけるペプチダーゼに対して極めて強い耐性を有しており、このことはＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）２４９−２５２に明記されている。一般的にペプチド・タンパク質は生体内において速やかに代謝されるようになっているが、この代謝課程を担う重要物質の一つがペプチダーゼである。したがってこのペプチダーゼに対する耐性は生体内での本塩基性アミノ酸置換誘導体群の作用時間延長をもたらし、慢性的な疾病であるコンフォメーション病に対して極めて有効である。この結果は投与回数の低減とそれに伴う薬価の低下をもたらし、医療経済学的に考慮しても顕著な効果であると考えられる。さらに、Ｎ末端を変化させた誘導体群は、ＰＡＣＡＰが有する一過性の気管支平滑筋収縮作用を示さず、臨床的に使用した場合に想定される対象患者の幅を広くすることが可能である。以上の補助的な効果を有する誘導体は、ＰＡＣＡＰ及びＶＩＰに比べて優れた神経保護作用を示しており、特に、ＰＡＣＡＰ誘導体ではＡｒｇ−ＰＡＣＡＰ３８（ペプチド４；配列番号１６）、Ａｒｇ−ＰＡＣＡＰ２７（ペプチド６；配列番号１８）、ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ａ（ペプチド１５：配列番号２６）、ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｂ（ペプチド１６：配列番号２７）、ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｃ（ペプチド１７：配列番号２８）、ＶＩＰ誘導体では［Ｇ４，Ｉ５，Ｓ９］−ＶＩＰ（ペプチド１０；配列番号２２）においてその作用が顕著である。
本発明のペプチド及びその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する剤は、ダウン症、パーキンソン病、ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、ヤコブ病、狂牛病（牛海綿状脳症）、アルツハイマー病、ゲルストマン・ストロイスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ）症候群、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上皮性麻痺、皮質基底核変性症、Ｐｉｃｋ病、ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、家族性痴呆症等のコンフォメーション病の治療及び予防に有効である。
本発明のペプチド及びその塩を上記疾患の患者の治療に使用する場合には、そのまま投与することができる。
さらに、本発明のペプチド及びその塩と、公知の方法により薬学的に許容される種々の担体及びその他の成分とを混合し、液状、固体状の中枢神経系に作用させる非経口、経口、エアゾル、経肺、経皮、経鼻又は眼球投与のための医薬組成物としても利用することができる。例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤などとして、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、脳室内ポンプによって脳を直接的な標的にすることもできる。
本発明の医薬組成物に用いられる薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質があげられる。例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが用いられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤などの添加物を用いることもできる。賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが用いられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが用いられる。結合剤としては、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが用いられる。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
本発明のペプチド及びその塩の投与量は、使用（検査）目的、被験者の年齢、体重、投与方法などにより適宜決定されるが、例えば、ヒトを含む哺乳動物に静脈内投与を行う場合、ペプチド量として一回あたり、０．１〜１００μｇを使用することが好ましい。
実施例
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］（ペプチドの合成）
下記のアミノ酸配列を有するＰＡＣＡＰ３８、ＰＡＣＡＰ２７、ＶＩＰ（ペプチド１〜３）及びこれらより誘導されるペプチド誘導体（ペプチド４〜３９）をそれぞれ通常のペプチド固相合成法に従い合成した。なお、特に指定がない限り、各ペプチドのＮ末端は−Ｈ、Ｃ末端は−ＮＨ２である。
（１）ペプチド１：ＰＡＣＡＰ３８
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（２）ペプチド２：ＰＡＣＡＰ２７
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（３）ペプチド３：ＶＩＰ
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（４）ペプチド４：ＰＡＣＡＰ誘導体Ａｒｇ−ＰＡＣＡＰ３８
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（５）ペプチド５：ＰＡＣＡＰ誘導体ＰＡＣＡＰ−ｌｉｋｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ｓｔａｒｇａｚｅｒ−ＰＡＣＡＰ）
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（６）ペプチド６：ＰＡＣＡＰ誘導体Ａｒｇ−ＰＡＣＡＰ２７
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（７）ペプチド７：ＰＡＣＡＰ誘導体［Ａ４，Ｖ５］−ＰＡＣＡＰ２７
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（８）ペプチド８：ＰＡＣＡＰ誘導体［Ａ４，Ｖ５，Ｎ９］−ＰＡＣＡＰ２７
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（９）ペプチド９：ＶＩＰ誘導体［Ｇ４，Ｉ５］−ＶＩＰ
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（１０）ペプチド１０：ＶＩＰ誘導体［Ｇ４，Ｉ５，Ｓ９］−ＶＩＰ
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（１１）ペプチド１１：ＶＩＰ高塩基性誘導体Ａ
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（１２）ペプチド１２：ＶＩＰ高塩基性誘導体Ｂ
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（１３）ペプチド１３：ＶＩＰ高塩基性誘導体Ｃ
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（１４）ペプチド１４：ＶＩＰ高塩基性誘導体Ｄ
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（１５）ペプチド１５：ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ａ
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（１６）ペプチド１６：ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｂ
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（１７）ペプチド１７：ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｃ
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（１８）ペプチド１８：ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ高塩基性キメラペプチド
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（１９）ペプチド１９：ＰＡＣＡＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ
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（２０）ペプチド２０：ＶＩＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ
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（２１）ペプチド２１：ＰＡＣＡＰ誘導体ＰＡＣＡＰ−ｌｉｋｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ｓｔｉｎｇｒａｙ−ＰＡＣＡＰ）
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（２２）ペプチド２２：ＶＩＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ＶＩＰ２４）
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（２３）ペプチド２３：ＶＩＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ＶＩＰ２５）
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（２４）ペプチド２４：ＶＩＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ＶＩＰ２６）
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（２５）ペプチド２５：ＶＩＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ＶＩＰ２７）
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（２６）ペプチド２６：ＰＡＣＡＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ２４）
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（２７）ペプチド２７：ＰＡＣＡＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ２５）
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（２８）ペプチド２８：ＰＡＣＡＰ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ２６）
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（２９）ペプチド２９：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ２８）
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（３０）ペプチド３０：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ２９）
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（３１）ペプチド３１：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３０）
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（３２）ペプチド３２：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３１）
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（３３）ペプチド３３：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３２）
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（３４）ペプチド３４：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３３）
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（３５）ペプチド３５：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３４）
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（３６）ペプチド３６：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３５）
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（３７）ペプチド３７：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３６）
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（３８）ペプチド３８：ＰＡＣＡＰ  ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ（ＰＡＣＡＰ３７）
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（３９）ペプチド３９：Ａｃｅｔｙｌ−ＰＡＣＡＰ２７高塩基性誘導体Ｃ
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［実施例２］異常プリオン（１０６−１２６）による細胞死の検討
正常プリオンは既に構造変換により異常体のプリオンに変換されることが確認されているので（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，（２０００）ｖｏｌ．７５，２５３６−２５４５）、脳・神経系研究におけるモデル系として用いられているラットの副腎髄質褐色細胞腫由来細胞、ＰＣ１２細胞を使用してフォールディング異常タンパク質のプリオン（１０６−１２６）による細胞死を検討した。５％ウマ血清及び５％新生仔ウシ血清含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて、ＰＣ１２細胞を５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの環境下で３７℃に保って培養した。トリプシンにてＰＣ１２細胞を培養フラスコからはがした後、９６ｗｅｌｌ培養プレートにて前記細胞を培養した（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。このＰＣ１２培養細胞にプリオン（１０６−１２６）（アメリカンペプタイドカンパニー社製）を添加し、その影響を確認した。プリオン（１０６−１２６）は、約５ｍｇ／ｍＬの濃度で約７２時間前処理を行い、凝集体（βシート構造に変化したフィブリル体）へと変換させた。細胞死は、細胞から培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ放出量検出にてモニタリングした。その結果を図１に示す。細胞死は異常プリオン（１０６−１２６）濃度依存的に起こることが明瞭に示された。
［実施例３］ＰＡＣＡＰ及びＶＩＰの異常プリオン（１０６−１２６）に対する神経保護作用
実施例２と同様に培養したＰＣ１２細胞に異常プリオン（１０６−１２６）５０μＭと様々な濃度の神経ペプチド（ＰＡＣＡＰ及びＶＩＰ）を添加し、ＷＳＴ−８法によって細胞数を算出し、異常プリオン（１０６−１２６）に対する神経保護作用の程度を数値化した。その結果を図２に示す。ＰＡＣＡＰは極めて低い濃度においてもある程度の神経保護作用を示すことが確認された。一方、ＶＩＰもＰＡＣＡＰに比べて高い濃度において神経保護作用を示した。また、この神経保護効果は、１０−９Ｍの神経ペプチド１〜２１すべてにおいて認められた。
［実施例４］β−アミロイドによる細胞死の検討
実施例２と同様に培養したＰＣ１２細胞にβ−アミロイド（β−アミロイド１−４２、アメリカンペプタイドカンパニー社）（１０−３Ｍ）を添加し、４８時間培養し、生じる細胞死について検討した。β−アミロイドは約５ｍｇ／ｍＬの濃度で約２４時間前処理を行い、凝集体（フィブリル体）へと変換させた。細胞死については、細胞の膜状に常在し細胞死に伴う細胞膜の破壊によって外部へと放出される乳酸デヒドロゲナーゼを検出することによってモニタリングした。培地は３種類、すなわち、５％ウマ血清及び５％新生仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ、０．２５％ウマ血清及び０．２５％新生仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ、そして０．２μＭインシュリン含有無血清ＤＭＥＭを用意し、β−アミロイドによる細胞死を検討した。その結果を図３示す。０．２μＭインシュリン含有無血清及び０．２５％ウマ血清及び０．２５％新生仔ウシ血清含有ＤＭＥＭにおいては、コントロール対照群（β−アミロイド無添加群）と比して有意にβ−アミロイドによる細胞死が確認された。一方、ＤＭＥＭ５％ウマ血清及び５％新生仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ中でのＰＣ１２培養細胞は、４８時間後においてもβ−アミロイドによる細胞死は確認されなかった。このことから、血清中成分が何らかの神経保護に関与している可能性が示唆された。なお、以上の結果から、以降の実施例においては、０．２μＭインシュリン含有無血清ＤＭＥＭを用いることにした。
［実施例５］神経ペプチドＰＡＣＡＰ２７によるβ−アミロイドに対する神経保護作用
実施例４と同様にＰＣ１２細胞を培養してβ−アミロイドを添加し、その際に神経ペプチドＰＡＣＡＰ２７を共存させてβ−アミロイドによる細胞死に対する神経保護作用について確認した。細胞死は細胞から培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ放出量検出にてモニタリングした。結果を図４に示す。β−アミロイドの存在下では経時的に細胞が死んでいく様が確認できた。また、２４時間の培養ではそれほど細胞が死なず、ある程度の時間が経過してから細胞が死んでいくことから、β−アミロイドによる細胞死はアポトーシス誘導に起因している可能性が示唆された。一方、神経ペプチドＰＡＣＡＰ２７を添加した細胞群では、その細胞死が非常に強力に抑制されており、ほぼコントロールと同値であった。このことからＰＡＣＡＰ類は極めて強力な神経保護作用をβ−アミロイドに対して示すことが明らかとなった。
［実施例６］各種神経ペプチド類によるアミロイドに対する神経保護作用
実施例５と同様の試験を行い、ＰＡＣＡＰ関連神経ペプチド（ペプチド１、２、４、５、７、８、１５、１６、１７、１９、２１、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８及び３９）とＶＩＰ関連神経ペプチド（ペプチド３、９、１０、１１、１２、１３、１４、１８、２０、２２、２３、２４及び２５）のβ−アミロイドによる細胞死に対する神経保護作用について確認した。すなわち、培養したＰＣ１２細胞にアミロイド（５０μＭ）と各種ＰＡＣＡＰ関連神経ペプチド、ＶＩＰ関連神経ペプチドを各々添加し、ＷＳＴ−８法によって生細胞数を算出し、アミロイドに対する各種ペプチドの神経保護作用について比較検討を行った。神経ペプチドが神経保護作用を有していたならば、神経ペプチド無添加の場合の生細胞数と明確な違いを認めることが出来る。各種神経ペプチドを添加したＰＣ１２細胞において、神経ペプチド無添加群よりも細胞生存率が高い（Ｐ＜０．０５）場合を神経保護作用ありと判定した。その結果を表１及び表２に示す。
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［実施例６］神経ペプチドＰＡＣＡＰ２７、ＶＩＰ、ｈｕｍａｎｉｎ、細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体による神経保護作用
実施例５と同様にＰＣ１２細胞を培養してβ−アミロイドを添加し、その際に神経ペプチドＰＡＣＡＰ２７、ＶＩＰ、ｈｕｍａｎｉｎ、細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体を各々共存させてβ−アミロイドによる細胞死に対するそれらの影響を確認した。細胞死については、ＷＳＴ−８法による細胞数評価を行い、細胞の生存率を算出することによって検討した。その結果を図５に示す。β−アミロイド存在下では約７割の細胞が死滅した。一方、ｃＡＭＰ誘導体であるｄｉｂｕｔｙｒｙｌ−ｃＡＭＰを共存させた場合には極めて強力に細胞死が抑制され、神経保護作用が確認された。また、ＰＡＣＡＰ２７（１０−９Ｍ）も強力な神経保護作用を明瞭に示した。ＰＡＣＡＰ類はｃＡＭＰの上昇を介して作用を示すことが知られているが、この結果は神経ペプチドのβ−アミロイドに対する神経保護作用もｃＡＭＰを介したものである可能性を示唆している。さらに、ＰＡＣＡＰ２７の類似化合物であるＶＩＰもＰＡＣＡＰ２７よりも効果は弱いがβ−アミロイドによる神経保護作用を示した。また、最近発見されたヒト由来神経保護物質であるｈｕｍａｎｉｎ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００１）９８（１１）６３３６−６３４１）についても神経保護作用を検討したが、やはりＰＡＣＡＰ２７よりも効果は弱いものの神経保護作用を示した。
［実施例７］神経ペプチド類の濃度と神経保護作用の関係
実施例５と同様にＰＣ１２細胞を培養してβ−アミロイドを添加し、その際に様々な濃度の神経ペプチド類を共存させて神経保護作用と濃度の関係について精査を行った。ＷＳＴ−８法によって細胞数を算出し、β−アミロイドによる細胞死をどの程度減弱できたか数値化した。その結果を図６に示す。神経ペプチドＰＡＣＡＰは極めて低い濃度においても神経保護作用を示し、その効果は１０−９〜１０−１３Ｍにおいて最も強力であった。また、ＶＩＰも比較的高濃度において強い神経保護作用を示した。このことから、ＰＡＣＡＰはＶＩＰと比して少なくとも一万倍は強力である神経保護作用を有することが明瞭に示された。
［実施例８］β−アミロイドによるカスパーゼ−３活性化作用と神経ペプチドによるその抑制効果
実施例４とほぼ同様に処理したＰＣ１２細胞を２４ｗｅｌｌプレートにて培養し（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、１０−５Ｍのβ−アミロイドを添加し、その際にｃＡＭＰ誘導体（１０−４Ｍ）と神経ペプチドＰＡＣＡＰ（１０−９Ｍ）を各々添加してアポトーシス関連酵素であるカスパーゼ−３の活性化作用を検討した。カスパーゼ−３の活性化作用は、カスパーゼ−３特異基質であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを用いて行った。その結果を図７に示す。β−アミロイドの添加によってカスパーゼ−３の活性は向上するが、ｃＡＭＰ誘導体の添加によってこの作用は著しく減弱化された。また、神経ペプチドＰＡＣＡＰの添加によっても完全ではないが約５０％の抑制効果を示した。この結果によって、神経ペプチドのカスパーゼ系への作用がβ−アミロイドに対する神経保護作用に大きく関与している可能性が示唆された。ただし、この抑制作用は完全ではなかったことを考慮すれば、他の作用機序も関与している可能性が考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明の剤及び医薬組成物は、神経保護作用を有し、コンフォメーション病の治療及び／又は予防に有効である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、異常プリオンの細胞死に及ぼす影響を示す図である。
図２は、神経ペプチドの異常プリオンに対する神経保護作用の程度を示す図である。図中、●はＰＡＣＡＰを示し、▲はＶＩＰを示す。
図３は、β−アミロイドの細胞死に及ぼす影響を示す図である。図中、□は５％ウマ血清及び５％新生仔ウシ血清含有ＤＭＥＭを示し、斜線付きの□は０．２５％ウマ血清及び０．２５％新生仔ウシ血清含有ＤＭＥＭを示し、■は０．２μＭインシュリン含有無血清ＤＭＥＭを示す。
図４は、神経ペプチドのβ−アミロイドに対する神経保護作用の程度を示す図である。図中、□はコントロールを示し、■はβ−アミロイド１０−５Ｍを示し、●はＰＡＣＡＰ２７  １０−９Ｍを示し、＃はＰ＜０．０５、＃＃はＰ＜０．０１であることを示す。
図５は、神経ペプチドＰＡＣＡＰ２７、ＶＩＰ、ｈｕｍａｎｉｎ、細胞透過性ｃＡＭＰ誘導体による神経保護作用を示す図である。図中、＃はＰ＜０．０５、＃＃はＰ＜０．０１（コントロールに対して）、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１（β−アミロイド処理群に対して）であることを示す。
図６は、神経ペプチド類の濃度と神経保護作用との関係を示す図である。図中、●はＰＡＣＡＰを示し、▲はＶＩＰを示す。
図７は、β−アミロイドによるカスパーゼ−３活性化作用と神経ペプチドによるその抑制効果を示す図である。図中、＃はＰ＜０．０１（コントロールに対して）、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１（β−アミロイド処理群に対して）であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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