(57)【要約】多孔性担体からなる免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいて、該多孔性担体がその下流に分析対象物質を検出すための捕捉試薬が固定されている検出領域（１）、その上流に展開試薬を受領する展開液受容領域（２）を含み、また両領域の間に分析対象物と親和性を有する標識化試薬を含む試薬領域（３）と検体から測定を阻害する物質を分離する分離領域（４）を含む免疫クロマトグラフィーテストストリップを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の分析対象物を定性または定量するための、多孔性担体を有する免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいて、該多孔性担体がその下流に分析対象物質を検出すための捕捉試薬が固定されている検出領域（１）、その上流に展開試薬を受領する展開液受容領域（２）を含み、また両領域の間に分析対象物と親和性を有する標識化試薬を含む試薬領域（３）と検体から測定を阻害する物質を分離する分離領域（４）を含む、ことを特徴とする免疫クロマトグラフィーテストストリップ。
【請求項２】
前記検体から測定を阻害する物質を分離する分離領域（４）が、当該ストリップから分岐した構造を有し、分岐点以外の部分において当該ストリップと直接接触しない、請求項１記載のテストストリップ。
【請求項３】
前記捕捉試薬が分析対象物と特異的に結合する性質のものである請求項１又は２記載のテストストリップ。
【請求項４】
前記多孔性担体が、ニトロセルロース、ナイロン、セルロース、ガラスファイバーいずれかを含む、請求項１〜３いずれか１項記載の免疫クロマトグラフィーテストストリップ。
【請求項５】
前記検体が血液である、請求項１〜４いずれか１項記載の免疫クロマトグラフィーテストストリップ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は免疫診断の分野、特に免疫クロマトグラフィーを用いた微量検体の簡便かつ正確なテストストリップに関する。
背景技術
免疫クロマトグラフィーを利用したストリップ形式のテストストリップは、試料を適用するだけで分析結果を得ることが出きるため、その簡便性、迅速性から臨床検査の分野や一般家庭などで幅広く利用されている。特に商業的には妊娠検査薬に代表されるように、免疫クロマトグラフィーを利用したストリップを不透湿性固体材料でケーシングした装置がその主流をなしている。このような一般家庭での使用を念頭に置いたテストストリップでは、尿を試料に使うため試料の量の制限を考慮する必要はない。
しかしながら、臨床検査の分野では尿を試料とすることが稀であり、多くは全血、血清、血漿、髄液、組織抽出液等を試料とする。これらを試料とする場合は、本質的には尿を試料とするテストストリップと何ら変わるところはないが、全血を試料とする場合は、いくつかの問題が懸念される。例えば赤血球が存在すると、光の散乱及び吸収が起こり結果反射光又は透過光を測定するアッセイ法を妨害するおそれがある。
また、全血試料は、色素または他の可視試験を実質的に干渉する深赤色を有するため、赤血球やヘモグロビンおよびその他の測定阻害物質は、血液検体が特定の分析物について分析される前に、血球分離膜などをテストストリップ内に組み込むことにより、血漿または血清から分離する必要がある。また、その他の試料を用いる場合でも測定阻害物質を含むことが多いことから、正確な測定を行うためにはそれらの物質を分離する必要がある。
全血試料から血漿を分離する機能を持つ血球分離膜については、多くの先行文献がある。特許第２，９４０，９９０号では、血球凝集素を組み込んだ親水性焼結多孔性マトリックスをもちいた血球分離膜を試験ストリップなどのテストストリップの成分として使用可能であることを開示している。また、特公平７−８５０８３号公報ではポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルで被膜されたガラス繊維を含むことを特徴とする器具が示されている。特表平７−５０４７４７号公報では赤血球に対する抗体を含有するマトリックスをデバイスに適用する方法を記載している。
これらの方法は全血から血球を分離する能力では優れた方法である。しかし、免疫クロマトグラフィーを利用したテストストリップでは全血の量が問題となる。免疫クロマトグラフィーを利用したテストストリップに組み込んだ場合、完全に反応を終わらせるためには少なくとも５０μＬ程度の血漿成分、全血量として１００μＬ程度の血液検体が必要となり、ある程度の血液量を確保するために採血管、注射用シリンジを用いた採血が必要となってくることから家庭用などには不向きである。
使用する全血等の試料の量を少なくするため展開溶液を用いる方法もあるが、同一ストリップ上で血球等測定阻害物質の分離工程並びに展開行程が連続して行われるため、分離膜でトラップした血球が流出してしまうことから判定に影響を及ぼすことが懸念される。また、分離したテストストリップのサイズを小さくする方法もあるが、操作性や結果の観察のしやすさの点から、このテストストリップの小型化が適切であるとは限らない。
これらの方法を改善する方法として、特開２０００−３２１２７８号公報では、全血試料を非多孔性受液部材に適用し、順次試薬を吸収しながら検出部で分析対象物を検出する方法を提示している。この方法は全血試料が、テストストリップの末端から吸収されていくため、血球分離能が優れており、より少量の全血試料で反応が終了すると考えられる。
しかしながら、この方法によっても、テストストリップの他の構成、結合パッドや橋かけパッド等の大きさに依存して、ある程度の血漿試料の量が必要となってくるため、全血の量を少なくするには限界があった。
このため、微量検体でも簡便かつ正確な測定が可能なテストストリップが望まれていた。
発明の開示
本発明は、微量の検体で測定可能な、免疫クロマトグラフィーを利用した簡便で正確なテストストリップを提供することを目的とする。
本発明者は、上記の課題を解決するため鋭意検討を行った結果、本発明の免疫クロマトグラフィーテストストリップが微量の検体で正確な測定が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、  検体中の分析対象物を定性または定量するための、多孔性担体を有する免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいて、該多孔性担体がその下流に分析対象物質を検出すための捕捉試薬が固定されている検出領域（１）、その上流に展開試薬を受領する展開液受容領域（２）を含み、また両領域の間に分析対象物と親和性を有する標識化試薬を含む試薬領域（３）と、検体から測定を阻害する物質を分離する分離領域（４）を含む、ことを特徴とする免疫クロマトグラフィーテストストリップを提供するものである。
発明の実施の形態
図１に本発明の代表的な形態の一例を示す。（１）は分析対象物質を検出すための捕捉試薬が固定されている検出領域、（２）は展開試薬を受領する展開液受容領域、（３）は分析対象物と親和性を有する標識化試薬を含む試薬領域、そして（４）は検体から測定を阻害する物質を分離する分離領域、をそれぞれ示しており、（３）と（４）の位置関係は前後してもよい。以下、これに従い説明するが、本発明はこの形態に限定されるものではない。
本発明の免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいては、繊維質の材料からなる展開液受容領域（２）から展開液が毛管現象により移動し、その下流区域に位置する試薬領域（４）に展開液が到達すると、分析対象物と親和性を有する標識化試薬が溶解されて展開液とともにさらに下流へ展開する。その下流側に検体から測定を阻害する物質を分離する分離領域（４）との接点（５）があり、該分離領域で精製された検体と、上流から展開されてきた標識化試薬を含む展開液がここで合流し、分析対象物と標識化試薬が複合体を形成しながら捕捉試薬が固定されている検出領域（１）に達する。
検体中に分析対象物が存在すれば、補足試薬に分析対象物と標識化試薬との複合体が捕獲され、任意のシグナルとして観察される。
尚、これらの各領域は同じ多孔性のマトリックス上にあっても良く、また別のマトリックス上に存在し、試薬や検体が移動可能なように接触していても良い。
テストストリップに用いられる多孔性担体は、展開液や試薬、分析対象物等が毛管現象によって上流から下流領域に流動し得るもであれば特に制限されないが、好ましきは、ガラス繊維、セルロース類（濾紙、ニトロセルロース等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック類、ナイロン等が挙げられる。更に好ましくはニトロセルロース、ナイロン、セルロース及びガラス繊維等である。
検体から測定を阻害する物質を分離する手段としては、検体によって異なるが、任意のフィルターや樹脂および血球凝集剤等を使用できる。例えば検体が血液の場合は、ガラス繊維膜等の血球分離膜等あるいは抗体やレクチン、糖アルコール等の血球凝集剤を用いることができる。
この分離領域（４）は、テストスリップから分岐した構造を有し、分岐点（５）以外の部分は当該スリップと直接接触しないようにされる。その方法としては、例えば測定に影響を与えないフィルム等の不透湿性の材料を用いて、分離領域の前記分岐点以外の部分、またはストリップの分離領域に対応する部分（６）を、被覆することができる。
本発明に用いられる標識化試薬は任意の標識試薬で標識された分析対象物と親和性を有するものをいい、例えば、標識された抗体、抗原、及びハプテン等を用いることができる。
また、標識法としては、直接標識や間接標識（アルカリ性フォスファターゼ等の酵素類等、ビオチン標識）等があり、基質などを必要としない直接標識が好ましい。直接標識としては、例えば、プラチナ、金、銀および銅などの金属、ヨウ化銀、臭化銀、水酸化銀、酸化鉄、水酸化鉄または水和酸化鉄、水酸化アルミニウムまたは水和酸化アルミニウム、水酸化クロムまたは水和水酸化クロム、硫酸銅、硫酸水銀、硫酸バリウム二酸化チタンなどの金属化合物よりなる群から選ばれたものが挙げられ、好ましくは金コロイド粒子を用いて調製することができる。
本発明に用いられる検出領域に固定化された捕捉試薬としては、分析対象物と特異的に結合する抗体、抗原、ハプテン、アビジン、レセプター等が挙げられる。
本発明に用いられる使用可能な検体としては、例えば血液、尿、唾液及び粘液等が挙げられるが、血液が特に好ましく、測定対象成分としては、例えばタンパク、ウイルス抗原、腫瘍マーカー、炎症マーカー、ホルモンあるいは薬物等が挙げられる。
本発明に用いられる免疫学的特異的結合アッセイとしては、競合結合アッセイ法、サンドイッチアッセイ法（ビオチン化抗体とアビジンとの結合を用いたサンドイッチ法を含む）が挙げられ、いずれも適用可能であるが特にサンドイッチアッセイ法が好ましい。
また本発明は、特別な熟練を必要としないことから、簡便かつ正確なテストストリップとして臨床現場から家庭用まで幅広く応用が可能である。
実施例
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．
検出領域の膜の作製
イムノダイン膜ＡＢＣに抗ＨＣＧ抗体をディスペンサーにてライン状に塗布、乾燥後カゼイン溶液でブロッキングし、ＰＢＳ溶液で洗浄した後、２５℃にて乾燥した。最終的に５ｍｍｘ２５ｍｍのストリップに切断した。
金コロイド標識化試薬の作製
金コロイド溶液はＢＢＩ社のｇｏｌｄ−ｓｏｌ  Ｇ４０を使用し、プロトコールに従って、抗ＨＣＧ抗体を標識化した。金コロイド標識試薬をディスペンサーでコンジュゲートパッド上に塗布し、凍結乾燥した。最終的に５ｍｍｘ５ｍｍのパッドとした。
テストストリップの作製
セルロース膜を５ｍｍｘ１０ｍｍ幅に切断し、血漿成分と標識化試薬の混合領域とした。コンジュゲートパッドを５ｍｍｘ１０ｍｍに切断し、展開液受容部とした。粘着剤の塗布されたポリエチレンフイルム上に検出領域をもつイムノダイン膜を貼りつけ、その一端にセルロース膜、金コロイド標識化試薬を含有するパッド、および展開液受容部を順次貼りつけて一枚のストリップとした。さらにセルロース膜と金コロイド標識化試薬を含有するパッドの接点部分に血球分離膜であるＨｅｍａｓｅｐ（５ｍｍｘ１０ｍｍ）の一端を接触させ、この接触部分を、粘着剤を塗布したフイルムにより貼り合わせた。血球分離膜の上記接触部分以外の部分と展開試薬受領領域とが接触しないように、前記展開液受容部の一部の表面を粘着剤の塗布された不透過性フィルムで覆った。
全血試料にＨＣＧが１００ＩＵ／Ｌとなるように加え、上記のようにして作製したテストストリップの血球分離領域に１０μＬ添加した。５分後、展開液１００μＬを展開液受容部に加え、検出領域に達するように、下方向に１５分展開させた後、検出領域中の発色したラインを５２０ｎｍの反射光により測定した。一方、展開液受容部に血球分離膜をもちいた一般的なテストストリップを作製し対照として使用した。対照品では全血試料１０μＬを添加した場合と全血検体１０μＬを加えた後、展開液１００μＬを加える方法で測定した。
本発明のテストストリップによる測定結果と対照品による測定結果の比較を表１に示す。
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表−１の結果から、極少量の全血１０μＬの試料を免疫クロマトグラフィーを利用したテストストリップで分析する場合、一般的なテストストリップでは液量の不足から展開が十分に起こらず、分析が不可能であることが明白である。また、全血試料を滴下した後、同じ部位に展開液を加えると、液量は十分に足りるが、血球分離が十分に行われず、血球が検出領域にもれ出てくる現象が認められ、検出が出来なくなることが示された。
本発明のように全血検体の滴下部位と展開液受容部位とを明確に区分することで、少量の全血試料を用いた分析物の測定が可能となることが証明された。
産業上の利用可能性
本発明の免疫クロマトグラフィーテストストリップは、簡便かつ正確な測定が可能であることから、臨床現場から家庭用まで幅広く応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明免疫クロマトグラフィーテストストリップの一形態を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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