(57)【要約】ＭＫＫ７と結合してこれを直接リン酸化する蛋白質ＰＡＫ４およびＪＩＫを見出し、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合およびＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の少なくとも１つを阻害することを特徴とするＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化阻害剤およびリン酸化阻害方法、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止剤および／または治療剤並びに防止方法および／または治療方法を提供した。さらにＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物の同定方法および該同定方法で得られた化合物を提供した。また、上記化合物および上記阻害剤のうち少なくとも１種を有効量含有してなる医薬組成物を提供した。
2004002532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害剤；
ｉ）ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害、
ｉｉｉ）ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
および
ｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害。
【請求項２】
下記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害方法；
ｉ）ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害、
ｉｉｉ）ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
および
ｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害。
【請求項３】
下記ｉ）から（ｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止剤および／または治療剤；
ｉ）ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害、
ｉｉｉ）ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
および
ｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害。
【請求項４】
下記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、神経変性疾患の防止剤および／または治療剤；
ｉ）ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害、
ｉｉｉ）ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
および
ｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害。
【請求項５】
下記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止方法および／または治療方法；
ｉ）ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害、
ｉｉｉ）ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
および
ｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害。
【請求項６】
下記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、神経変性疾患の防止方法および／または治療方法；
ｉ）ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害、
ｉｉｉ）ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害、
および
ｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害。
【請求項７】
ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＰＡＫ４とＭＫＫ７とが結合する条件下で、ＰＡＫ４および／またはＭＫＫ７を被検化合物と接触させ、次いで、ＰＡＫ４とＭＫＫ７との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＡＫ４とＭＫＫ７との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項８】
ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＪＩＫとＭＫＫ７とが結合する条件下で、ＪＩＫおよび／またはＭＫＫ７を被検化合物と接触させ、次いで、ＪＩＫとＭＫＫ７との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＪＩＫとＭＫＫ７との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項９】
ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）によるＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＰＡＫ４および／またはＭＫＫ７と被検化合物を接触させ、ＭＫＫ７のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害するか否かを決定する同定方法。
【請求項１０】
ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）によるＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＪＩＫおよび／またはＭＫＫ７と被検化合物を接触させ、ＭＫＫ７のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害するか否かを決定する同定方法。
【請求項１１】
請求の範囲第７項から第１０項のいずれか１項に記載の方法によって得られた化合物。
【請求項１２】
ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合を阻害する化合物。
【請求項１３】
ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合を阻害する化合物。
【請求項１４】
ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）によるＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）のリン酸化を阻害する化合物。
【請求項１５】
ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）によるＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）のリン酸化を阻害する化合物。
【請求項１６】
ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害剤。
【請求項１７】
ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）とＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の結合阻害剤。
【請求項１８】
ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）によるＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）のリン酸化阻害剤。
【請求項１９】
ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）によるＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）のリン酸化阻害剤。
【請求項２０】
請求の範囲第１１項から第１５項に記載の化合物および請求の範囲第１６項から第１９項に記載の阻害剤の少なくとも１種以上を有効量含有してなる医薬組成物。
【請求項２１】
請求の範囲第１１項から第１５項に記載の化合物および請求の範囲第１６項から第１９項に記載の阻害剤の少なくとも１種以上を有効量含有してなる、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２２】
請求の範囲第１１項から第１５項に記載の化合物および請求の範囲第１６項から第１９項に記載の阻害剤の少なくとも１種以上を有効量含有してなる、神経変性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２３】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、Ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ｐｉｃｋ病、ファミリアル  ブリティッシュ  デメンチア（ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病、ゲルストマン−ストランスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｎｓｓｌｅｒ）症候群、狂牛病（ウシ海綿状脳症）（ＢＳＥ）、またはニューロセルピン（ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ）封入体を伴う家族性痴呆症である請求の範囲第５項若しくは第２２項に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項２４】
請求の範囲第１１項から第１５項に記載の化合物および請求の範囲第１６項から第１９項に記載の阻害剤の少なくとも１種以上を使用することを特徴とする、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項２５】
請求の範囲第１１項から第１５項に記載の化合物および請求の範囲第１６項から第１９項に記載の阻害剤の少なくとも１種以上を使用することを特徴とする、神経変性疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項２６】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、Ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ｐｉｃｋ病、ファミリアル  ブリティッシュ  デメンチア（ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病、ゲルストマン−ストランスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｎｓｓｌｅｒ）症候群、狂牛病（ウシ海綿状脳症）（ＢＳＥ）、またはニューロセルピン（ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ）封入体を伴う家族性痴呆症である請求の範囲第６項若しくは第２５項に記載の防止方法および／または治療方法。
【請求項２７】
ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチド、ＪＩＫをコードするポリヌクレオチド、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよびＪＩＫをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つと、ＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）、ＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドおよびＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つとを含んでなる試薬キット。
【請求項２８】
請求の範囲第７項から第１０項のいずれか１項に記載の同定方法に用いる試薬キットであって、ｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ；ＪＩＫ）、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチド、ＪＩＫをコードするポリヌクレオチド、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよびＪＩＫをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つと、ＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）、ＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドおよびＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つとを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）の活性化を阻害することを特徴とするｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の改善、並びに神経変性疾患の改善に関する。より詳しくは、ＭＫＫ７とｐ２１活性化キナーゼ４（ＰＡＫ４）の相互作用および／またはＭＫＫ７とＪＮＫ／ＳＡＰＫ−インヒビトリーキナーゼ（ＪＩＫ）の相互作用を阻害すること、すなわち、ＰＡＫ４がＭＫＫ７に結合して直接ＭＫＫ７をリン酸化することにより引き起こされるＭＫＫ７の活性化および／またはＪＩＫがＭＫＫ７に結合して直接ＭＫＫ７をリン酸化することにより引き起こされるＭＫＫ７の活性化を阻害することを特徴とするＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害剤および阻害方法に関する。また、かかる特徴を有するＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止剤および／または阻害剤並びに防止方法および／または阻害方法、さらに神経変性の防止剤および／または阻害剤並びに防止方法および／または阻害方法に関する。さらに、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物の同定方法および該同定方法で得られた化合物に関する。
【背景技術】  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（以下、ＪＮＫと略称する。）は、ＭＡＰキナーゼ（以下、ＭＡＰＫと略称する。）ファミリーに属する蛋白質リン酸化酵素である。哺乳類では３つのＪＮＫ遺伝子（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３）が見出されている。これらのうちＪＮＫ３は脳神経系などに特異的に発現している。
ＪＮＫ３は、古典的ＭＡＰＫとは異なり、増殖刺激ではほとんど活性化しない。ＪＮＫ３の活性化は、細胞に対するストレス（ＤＮＡ損傷、紫外線、熱、高浸透圧、小胞体ストレス、活性酸素など。）や炎症性サイトカイン〔腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）など。〕により引き起こされる。活性化されたＪＮＫは、細胞質から核内へ移行し、ｃ−Ｊｕｎなどの転写因子のリン酸化を介して標的遺伝子の発現を制御すると考えられている。
ＪＮＫの活性化は、各種ストレス刺激により引き起こされるアポトーシスに関与している。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）除去による神経細胞死においてＪＮＫが活性化すること（非特許文献１）、ＮＧＦ除去による神経細胞死がｃ−Ｊｕｎのドミナントネガティブ変異体（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ）の発現により抑制されることが報告されている（非特許文献２）。さらに、ＪＮＫ３のノックアウトマウスでは、カイニン酸投与による興奮性神経死が抑制されることが報告されている（非特許文献３）。これらから、ＪＮＫ３の活性化が神経細胞死に関与していることが示唆されている。
ＪＮＫを活性化させるＭＡＰＫキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫと略称する。）として、ＭＫＫ４とＭＫＫ７が知られている。ＭＫＫ７は、ＭＡＰＫＫ７、ＭＡＰ２Ｋ７、ＪＮＫＫ２とも呼ばれ、ＪＮＫを特異的にリン酸化して活性化させる（非特許文献４および５）。一方、ＭＫＫ４は、ＪＮＫをリン酸化して活性化させるだけではなく、同じくＭＡＰＫファミリーの一員であるＥＲＫ２やｐ３８もリン酸化して活性化させる。ＭＫＫ４遺伝子を破壊した胚性幹細胞（ＥＳ細胞）においても浸透圧刺激または紫外線によるＪＮＫ活性化が認められることから（非特許文献６）、ＭＫＫ７は、ＭＫＫ４と独立してＪＮＫの活性化に働いていると考えられている。
ＪＮＫの活性化はまた、低分子量ＧＴＰ蛋白質の１つであるｃｄｃ４２からのシグナルによって引き起こされる（非特許文献７）。ｃｄｃ４２に結合してそのシグナルを伝達するキナーゼとして、ｐ２１活性化キナーゼ（ｐ２１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ；ＰＡＫ）が知られている。実際、ＰＡＫファミリーの一員であるＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３またはＰＡＫ４の過剰発現により、ＪＮＫのシグナル伝達経路が活性化することが報告されている（それぞれ非特許文献８、９、７および１０）。しかし、ＰＡＫとＪＮＫ活性化との間の詳細なシグナル伝達経路の機構、例えば直接的なのかあるいは間接的なのかについては明らかにされていない。
ｃｄｃ４２が神経細胞死に関与していることを示唆する知見がいくつか報告されている。例えば、神経細胞への活性化型ｃｄｃ４２の強制発現は神経細胞死を誘導し、また、ｃｄｃ４２のドミナントネガティブ変異体はＮＧＦ除去による神経細胞死を抑制する（非特許文献１１）。また、活性化型ｃｄｃ４２により、ＪＮＫと同様、ＭＫＫ７も活性化することが報告されている（非特許文献１２）。よって、ｃｄｃ４２からＭＫＫ７を介してＪＮＫへと伝わるシグナル伝達経路が神経細胞死に関与している可能性が考えられる。
ＪＮＫ３活性化の原因となる各種ストレスの１つとして、小胞体ストレス（以下、ＥＲストレスと略称する。）が挙げられる。ＥＲストレスは、各種刺激（グルコース枯渇、カルシウム濃度恒常性の変化、活性酸素など。）により、小胞体（以下、ＥＲと略称することもある。）における蛋白質のフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）の過程に異常が起こり、ＥＲ内に異常蛋白質が蓄積することにより生じる。ＥＲストレスが生じると、小胞体内分子シャペロンの発現が誘導され（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＵＰＲ）、フォールディング異常（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）の解消へと向かう。この過程においてＥＲストレスのセンサー蛋白質として働いているものとして、ＩＲＥ１が知られている（非特許文献１３）。
ＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化の過程に、ＩＲＥ１およびＴＲＡＦ２が関与していることが報告されている（非特許文献１４および１５）。すなわち、ＩＲＥ１破壊細胞株ではＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化が抑制され、また、ＩＲＥ１の過剰発現によりＪＮＫが活性化する。さらに、ＩＲＥ１はＴＲＡＦ２と結合し、また、ＴＲＡＦ２のドミナントネガティブ変異体はＩＲＥ１によるＪＮＫの活性化を阻害する。
ＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化の過程に関与する蛋白質として、その他にＪＩＫ（ＤＰＫとも呼ぶ。）が知られている。ＪＩＫは、ＩＲＥ１およびＴＲＡＦ２と結合し、ＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化に関与していると考えられている。例えば、ＪＩＫの過剰発現はＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化を増強し、ＪＩＫの活性部位欠失変異体はＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化を抑制する（非特許文献１５）。
ＪＩＫは、イーストＳｔｅ２０ｐ蛋白質のヒト相同体であるＳＴＥ２０に関連したセリン／スレオニンキナーゼ（ＳＴＥ２０−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）の一つである。ＪＩＫについては上記作用の他に、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）刺激によるＪＮＫ活性化を阻害し、その際ＪＩＫ自身の活性も抑制される（非特許文献１６）こと、また、ＪＩＫの過剰発現がＪＮＫの活性化を引き起こす（非特許文献１７）ことが報告されている。
一方、ＥＲストレスの過剰負荷により、アポトーシスが誘導されることが知られている。虚血またはポリグルタミンやアミロイドβ（以下、Ａβと略称する。）などの異常蛋白質の蓄積は、ＥＲストレスを生じさせると考えられることから、ＥＲストレスの負荷による神経細胞死と神経変性疾患との関わりが指摘されている。
ＥＲストレスの負荷によるアポトーシスが、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７の各々のドミナントネガティブ変異体により抑制されたことから（非特許文献１８）、ＥＲストレスの負荷によるアポトーシス誘導に、ＭＫＫ４またはＭＫＫ７を介したＪＮＫ活性化が関与している可能性がある。
以下に、本明細書で引用した文献を列記する。
特許文献１：国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報。
非特許文献１：Ｅｉｌｅｒｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９８）１８：１７１３−１７２４。
非特許文献２：Ｈａｍ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ（１９９５）１４：９２７−９３９。
非特許文献３：Ｙａｎｇ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８９：８６５−８７０。
非特許文献４：Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９７）１６：７０４５−７０５３。
非特許文献５：Ｆｏｌｔｚ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：９３４４−９３５１。
非特許文献６：Ｙａｎｇ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９７）９４：３００４−３００９。
非特許文献７：Ｂａｇｒｏｄｉａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２７９９５−２７９９８。
非特許文献８：Ｂｒｏｗｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）６：５９８−６０５。
非特許文献９：Ｆｒｏｓｔ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）１６：３７０７−３７１３。
非特許文献１０：Ａｂｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８）１７：６５２７−６５４０。
非特許文献１１：Ｂａｚｅｎｅｔ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９８）９５：３９８４−３９８９。
非特許文献１２：Ｆｏｌｔｚ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：９３４４−９３５１。
非特許文献１３：Ｕｒａｎｏ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．（２０００）１１３：３６９７−３７０２。
非特許文献１４：Ｕｒａｎｏ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：６６４−６６６。
非特許文献１５：Ｙｏｎｅｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：１３９３５−１３９４０。
非特許文献１６：Ｔａｓｓｉ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：３３２８７−３３２９５。
非特許文献１７：Ｚｈａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２７４：８７２−８７９。
非特許文献１８：Ｚｈａｎｇ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１）２８９：７１８−７２４。
非特許文献１９：細胞工学、２００１年、第２０巻、第１１号、特集：神経変性疾患の発症メカニズムと治療への展望。
【発明の開示】
このような現状を鑑みると、各種ストレスによるＪＮＫ活性化機構のいずれかの段階を阻害することは、ＪＮＫの活性化によって引き起こされるアポトーシスに基づく疾患、具体的には神経変性疾患などの解明並びに防止および／または治療を可能にすると考えられる。その一例として、ＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質を見出して、ＭＫＫ７の活性化を阻害することはＪＮＫの活性化を阻害することとなる。
本発明者らは、ＭＫＫ７がＰＡＫ４またはＪＩＫと相互作用することをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測して、実験的に証明し、該相互作用の結果、ＰＡＫ４またはＪＩＫによりＭＫＫ７がリン酸化されてＪＮＫ３シグナル伝達経路を活性化することを見出して、本発明を完成した。
本発明の一態様は、下記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害剤に関する；
ｉ）ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合阻害、
ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害、
ｉｉｉ）ＪＩＫとＭＫＫ７の結合阻害、
および
ｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害。
また本発明の一態様は、前記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、神経変性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
また本発明の一態様は、前記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、神経変性疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＰＡＫ４とＭＫＫ７とが結合する条件下で、ＰＡＫ４および／またはＭＫＫ７を被検化合物と接触させ、次いで、ＰＡＫ４とＭＫＫ７との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＡＫ４とＭＫＫ７との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
また本発明の一態様は、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＪＩＫとＭＫＫ７とが結合する条件下で、ＪＩＫおよび／またはＭＫＫ７を被検化合物と接触させ、次いで、ＪＩＫとＭＫＫ７との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＪＩＫとＭＫＫ７との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
さらに本発明の一態様は、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＰＡＫ４および／またはＭＫＫ７と被検化合物を接触させ、ＭＫＫ７のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害するか否かを決定する同定方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＪＩＫおよび／またはＭＫＫ７と被検化合物を接触させ、ＭＫＫ７のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害するか否かを決定する同定方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの同定方法によって得られた化合物に関する。
さらに本発明の一態様は、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合を阻害する化合物に関する。
また本発明の一態様は、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物に関する。
さらに本発明の一態様は、ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合阻害剤に関する。
また本発明の一態様は、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合阻害剤に関する。
さらに本発明の一態様は、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化阻害剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化阻害剤に関する。
また本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも１種以上を有効量含有してなる医薬組成物に関する。
さらに本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも１種以上を有効量含有してなる、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも１種以上を有効量含有してなる、神経変性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
また本発明の一態様は、神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、Ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ｐｉｃｋ病、ファミリアルブリティッシュ  デメンチア（ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病、ゲルストマン−ストランスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｎｓｓｌｅｒ）症候群、狂牛病（ウシ海綿状脳症）（ＢＳＥ）、またはニューロセルピン（ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ）封入体を伴う家族性痴呆症である前記神経変性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
さらに本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも１種以上を使用することを特徴とする、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも１種以上を使用することを特徴とする、神経変性疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
また本発明の一態様は、神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、Ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ｐｉｃｋ病、ファミリアルブリティッシュ  デメンチア（ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病、ゲルストマン−ストランスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｎｓｓｌｅｒ）症候群、狂牛病（ウシ海綿状脳症）（ＢＳＥ）、またはニューロセルピン（ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ）封入体を伴う家族性痴呆症である前記神経変性疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに本発明の一態様は、ＰＡＫ４、ＪＩＫ、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチド、ＪＩＫをコードするポリヌクレオチド、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよびＪＩＫをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つと、ＭＫＫ７、ＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドおよびＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つとを含んでなる試薬キットに関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記同定方法に用いる試薬キットであって、ＰＡＫ４、ＪＩＫ、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチド、ＪＩＫをコードするポリヌクレオチド、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよびＪＩＫをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つと、ＭＫＫ７、ＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドおよびＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つとを含んでなる試薬キットに関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＭＫＫ７とＰＡＫ４との相互作用をインシリコで予測した結果を示す。ＭＫＫ７とＰＡＫ４のローカルアライメントを行い、高いスコアを示した領域を表示した。上の配列および下の配列はそれぞれ、ＭＫＫ７の部分配列およびＰＡＫ４の部分配列である。
第２図は、ＰＡＫ４がインビトロでＭＫＫ７をリン酸化したことを示す。ＧＳＴ−ＭＫＫ７はＦＬＡＧ−ＰＡＫ４存在下でリン酸化された（レーン４）が、ＦＬＡＧ−ＰＡＫ４非存在下（レーン３）ではリン酸化されなかった。一方、ＧＳＴはＦＬＡＧ−ＰＡＫ４存在下（レーン２）でも非存在下（レーン１）でもリン酸化されなかった。図の左側に示した数値は分子量を示す。
第３図は、ＰＡＫ４とＭＫＫ７が細胞内で結合したことを示す。図中の下段は、免疫沈降試験（ＩＰ）において、ＨＡ−ＭＫＫ７とＦＬＡＧ−ＰＡＫ４とを共発現させた細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）（レーン２）ではＨＡ−ＭＫＫ７とＦＬＡＧ−ＰＡＫ４を含む免疫共沈降物が検出されたが、ＨＡ−ＭＫＫ７のみを発現させた細胞の細胞溶解物（レーン１）においてはかかる免疫共沈降物が検出されなかったことを示す。また、上段および中段はそれぞれ、各細胞溶解物におけるＦＬＡＧ−ＰＡＫ４およびＨＡ−ＭＫＫ７の発現を確認した結果を示す。免疫共沈降物の検出および発現の確認はウエスタンブロット法（ＷＢ）で行った。
第４図は、ＰＡＫ４の一過性発現によりＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化がＰＡＫ４の発現量に依存して増強されたことを示す。図中の下段は、キナーゼアッセイ（ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）において、ＨＡ−ＰＡＫ４とＦＬＡＧ−ＪＮＫ３とを共発現させた細胞の細胞溶解物（レーン２−４）によりＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）がリン酸化されたが、ＦＬＡＧ−ＪＮＫ３のみ発現させた細胞の細胞溶解物（レーン１）ではＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）はリン酸化されなかったことを示す。レーン２、レーン３およびレーン４はそれぞれ、ＨＡ−ＰＡＫ４発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＰＡＫ４）を０．１μｇ、０．５μｇ、および２．０μｇトランスフェクションした結果を示す。また、上段および中段はそれぞれ、ＦＬＡＧ−ＪＮＫ３およびＨＡ−ＰＡＫ４の発現を確認した結果を示す。発現の確認はウエスタンブロット法（ＷＢ）で行った。
第５図は、ＭＫＫ７とＪＩＫとの相互作用をインシリコで予測した結果を示す。ＭＫＫ７とＪＩＫのローカルアライメントを行い、高いスコアを示した領域を表示した。上の配列および下の配列はそれぞれ、ＭＫＫ７の部分配列およびＪＩＫの部分配列である。
第６図は、ＪＩＫがインビトロでＭＫＫ７をリン酸化したことを示す。ＧＳＴ−ＭＫＫ７はＨＡ−ＪＩＫ存在下でリン酸化された（レーン２）が、ＨＡ−ＪＩＫ非存在下（レーン１）ではリン酸化されなかった。一方、ＧＳＴはＨＡ−ＪＩＫ存在下（レーン３）でリン酸化されなかった。図の左側に示した数値は分子量を示す。
第７図は、ＪＩＫとＭＫＫ７が細胞内で結合したことを示す。図中の下段は、免疫沈降試験（ＩＰ）において、ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７とＨＡ−ＪＩＫとを共発現させた細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）（レーン２）ではＦＬＡＧ−ＭＫＫ７とＨＡ−ＪＩＫを含む免疫共沈降物が検出されたが、ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７のみを発現させた細胞の細胞溶解物（レーン１）においてはかかる免疫共沈降物が検出されなかったことを示す。また、上段および中段はそれぞれ、各細胞溶解物におけるＨＡ−ＪＩＫおよびＦＬＡＧ−ＭＫＫ７の発現を確認した結果を示す。免疫共沈降物の検出および発現の確認はウエスタンブロット法（ＷＢ）で行った。
第８図は、ＪＩＫの一過性発現によりＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化が増強されたことを示す。ＨＡ−ＪＩＫおよびＦＬＡＧ−ＪＮＫ３のいずれも非発現の細胞の細胞溶解物（レーン１）並びにＦＬＡＧ−ＪＮＫ３のみ発現させた細胞の細胞溶解物（レーン２）ではＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）がほとんどリン酸化されなかったのに対し、ＨＡ−ＪＩＫとＦＬＡＧ−ＪＮＫ３を共発現させた細胞の細胞溶解物（レーン３）ではＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）のリン酸化が認められた。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第２００２−１９０９０９号および同第２００２−１９０９１０号からの優先権を請求するものである。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物などの資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
本発明においては、ＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質を国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報（特許文献１）記載の方法に従って予測し、その結果２つの蛋白質を見出した。これら蛋白質は、ｐ２１活性化キナーゼ４（以下、ＰＡＫ４と略称する。）およびＳＴＥ２０に関連したセリン／スレオニンキナーゼの一つであるＪＩＫである。そして、実験的に、ＰＡＫ４およびＪＩＫがそれぞれＭＫＫ７と結合すること、さらにＰＡＫ４およびＪＩＫがそれぞれ直接ＭＫＫ７をリン酸化することを初めて見出した。また、ＰＡＫ４またはＪＩＫの発現により、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（以下、ＪＮＫ３と略称する。）が活性化されてｃ−Ｊｕｎがリン酸化されることを明らかにした。これらから、ＰＡＫ４およびＪＩＫがそれぞれＭＫＫ７を直接リン酸化することによりＪＮＫ３シグナル伝達経路が活性化されることが判明した。
本明細書においてＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質とは、ＭＫＫ７と特異的に作用し合う蛋白質、具体的には例えばその機能の１つとして特異的にＭＫＫ７と結合する蛋白質を意味する。より具体的には、その機能の１つとしてＭＫＫ７をリン酸化し得る蛋白質を意味する。本明細書においてはアミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
ＰＡＫ４についてはこれまでに、低分子量ＧＴＰ蛋白質の１つであるｃｄｃ４２により活性化されること（非特許文献１０）が知られている。また、活性化型ｃｄｃ４２が神経細胞死を誘導すること（非特許文献１１）、および活性化型ｃｄｃ４２またはＰＡＫ４がＪＮＫシグナル伝達経路を活性化することが報告されている（非特許文献７および１０）。
本発明において明らかにした知見およびこれら公知の知見から、ｃｄｃ４２がＰＡＫ４を活性化し、活性化されたＰＡＫ４がＭＫＫ７に結合して直接リン酸化してこれを活性化させ、その結果ＪＮＫ３が活性化してｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、最終的に何らかの生理機能が発現するというシグナル伝達経路が存在すると考えた。該生理機能としては、例えばアポトーシスの誘導など、より具体的には神経細胞死の誘導などが例示できる。このことから、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合および／またはＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害することにより、ＪＮＫ３の活性化によるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を阻害することができ、ひいては神経細胞死を阻害することが可能である。さらに、ＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化により引き起こされる疾患、例えばｃｄｃ４２が介在するＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化に基づく疾患の防止および／または治療が可能である。
ＪＩＫは、ＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化に関与していると考えられている。例えば、ＪＩＫの過剰発現がＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化を増強すること、またＪＩＫの活性部位欠失変異体がＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化を抑制したことが報告されている（非特許文献１５）。
本発明において明らかにした知見およびこれら公知の知見から、ＥＲストレスの負荷による生理機能の発現には、ＥＲストレスの負荷によりＪＩＫが活性化され、活性化されたＪＩＫがＭＫＫ７に結合して直接リン酸化してこれを活性化させ、その結果ＪＮＫ３が活性化してｃ−Ｊｕｎをリン酸化するというシグナル伝達経路が存在していると考えた。該生理機能としては、例えばアポトーシスの誘導など、より具体的には神経細胞死の誘導などが例示できる。このことから、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合および／またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害することにより、ＪＮＫ３の活性化によるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を阻害することができ、ひいては神経細胞死を阻害することが可能である。さらに、ＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化により引き起こされる疾患、例えばｃｄｃ４２が介在するＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化に基づく疾患の防止および／または治療が可能である。
ＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化によって引き起こされる疾患としては、例えばアポトーシスに基づく疾患、具体的には、神経変性疾患などが挙げられる。神経変性疾患としては、次に挙げる例に限定されるものではないが、ポリグルタミン病（例えばハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症など）、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、Ｌｅｗｙ小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ｐｉｃｋ病、ファミリアル  ブリティッシュ  デメンチア（ｆａｍｉｌｉａｌＢｒｉｔｉｓｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病、ゲルストマン−ストランスラー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｎｓｓｌｅｒ）症候群、狂牛病（ウシ海綿状脳症）（ＢＳＥ）、およびニューロセルピン（ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ）封入体を伴う家族性痴呆症などを挙げることができる（非特許文献１９）。またこの他に、ＥＲストレスの負荷が関与している虚血や再灌流による神経細胞死の防止および／または治療が可能である。
本発明においては、下記ｉ）からｉｖ）のうちの少なくとも１つを特徴とする、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害剤、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害方法、さらにはＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎのリン酸化に基づく疾患、例えば神経変性疾患などの防止剤および／または治療剤並びに防止方法および／または治療方法を提供可能である；ｉ）ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合阻害；ｉｉ）ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害；ｉｉｉ）ＪＩＫとＭＫＫ７の結合阻害；およびｉｖ）ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸の阻害。
本発明においては、上記知見に基づいて、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合および／またはＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物、あるいはＪＩＫとＭＫＫ７の結合および／またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を提供する。該同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。化合物の同定に使用するＰＡＫ４、ＪＩＫおよびＭＫＫ７は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＰＡＫ４またはＪＩＫとＭＫＫ７との結合およびこれら蛋白質の機能、例えばキナーゼ活性が阻害されなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やペプチドなどを直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識化したものであってもよい。あるいは、化学修飾物質により標識化したものであってもよい。好ましくは、それらの基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質やペプチドなどとしては、例えばグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇなどのタグペプチド類、マルトース結合蛋白質、および免疫グロブリンのＦｃ断片などが挙げられる。また、標識化に用いる化学修飾物質としては、グリーン蛍光蛋白質、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）などの蛍光物質類、ビオチン、あるいは放射性同位元素などを例示できる。標識化するとき、これら蛋白質やペプチドなどは単独で付加してもよいし複数を組み合わせて付加することもできる。これら標識化に用いた蛋白質またはペプチドなどの物質自体、またはその機能を測定することにより、例えばＰＡＫ４若しくはＪＩＫとＭＫＫ７との結合を検出することが可能になる。被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＰＡＫ４、ＪＩＫおよびＭＫＫ７の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物などが挙げられる。
例えば、ＰＡＫ４とＭＫＫ７との結合を可能にする条件を選択し、該条件下でＰＡＫ４、ＭＫＫ７および被検化合物を接触させ、次いで、ＰＡＫ４とＭＫＫ７との結合を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在、またはその変化を検出することにより、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物を同定可能である。例えばＰＡＫとＭＫＫ７との結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが、被検化合物をＰＡＫ４およびＭＫＫ７と接触させたときに消失あるいは低減するなどの変化を示した場合、当該被検化合物はＰＡＫとＭＫＫ７との結合を阻害するものであると判定できる。かかる同定方法において、被検化合物をＰＡＫ４および／またはＭＫＫ７と予め接触させ、その後にＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合反応を行うことも可能である。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体など、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子など、または検出用のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇなど、公知のものが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知のものである。
具体的には、例えばＰＡＫ４またはＭＫＫ７の一方を固相化し、他方をシグナルで標識化して用いて結合反応を行い、標識シグナルを定量的に測定するといった当業者に知られた一般的なインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における結合実験系に、被検化合物を加えて評価することにより、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物を得ることができる。
あるいは、ＰＡＫ４によりＭＫＫ７がリン酸化される条件を選択し、該条件下でＰＡＫ４およびＭＫＫ７と被検化合物とを接触させ、ＭＫＫ７のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物を同定できる。例えばＰＡＫによるＭＫＫ７のリン酸化により生じるシグナルまたは該リン酸化のマーカーが、被検化合物をＰＡＫ４およびＭＫＫ７と接触させたときに消失あるいは低減するなどの変化を示した場合、当該被検化合物はＰＡＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害するものであると判定できる。かかる同定方法において、被検化合物をＰＡＫ４および／またはＭＫＫ７と予め接触させ、その後にＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化反応を行うことも可能である。蛋白質リン酸化試験およびリン酸化蛋白質の定量は、自体公知の方法により実施可能である。簡便には、例えば後述する実施例に記載したようにＰＡＫ４とＭＫＫ７とを放射性同位体（３２Ｐ）で標識したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下でインビトロで反応させ、反応後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質の分離を行い、得られた蛋白質のバンドを染色して検出し、リン酸化されたＭＫＫ７に相当するバンドの放射活性を測定することにより蛋白質リン酸化試験およびリン酸化蛋白質の定量を実施できる。
または、ＰＡＫ４およびＭＫＫ７を共発現させた細胞を用い、該細胞と被検化合物とを接触させ、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合またはＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合および／またはＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物を同定できる。
上記細胞を使用した同定方法は、上記インビトロでの同定方法と組み合わせて使用できる。当該インビトロの同定方法により得られたＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合および／またはＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物を、細胞を使用した上記同定方法で再度試験することにより、有用な化合物をさらに選択し得る。
上記同定方法において、ＰＡＫ４の代わりにＪＩＫを用いることにより同様に、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合および／またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物を同定可能である。
本発明にかかる同定方法においては、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合を阻害する化合物、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物、およびＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物を得ることができる。これら化合物もまた、本発明の範囲に包含される。これら化合物は、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合阻害剤、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化の阻害剤、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合阻害剤、またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の阻害剤として利用可能である。このような化合物としては、両蛋白質が相互作用する部位、例えば結合部位のアミノ酸配列からなるペプチドまたはオリゴペプチドを例示できる。このようなペプチドまたはオリゴペプチドは、ＰＡＫ４またはＭＫＫ７のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法によって合成し、上記同定方法においてＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合、またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害するか否かを試験することにより同定可能である。また、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合を阻害し得る抗体またはＪＩＫとＭＫＫ７の結合を阻害し得る抗体も上記化合物の１つとして例示できる。かかる抗体は、ＰＡＫ４、ＪＩＫまたはＭＫＫ７に対する抗体を作成し、得られた抗体からＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合またはＪＩＫとＭＫＫ７の結合を阻害し得るものを選択することにより取得可能である。抗体の作製は、抗原として例えば、ＰＡＫ４、ＪＩＫおよびＭＫＫ７の各蛋白質自体、またはＰＡＫ４とＭＫＫ７若しくはＪＩＫとＭＫＫ７が相互作用する部位のアミノ酸配列を含むペプチド若しくはオリゴペプチドを用いて、自体公知の抗体作製法により行うことができる。
上記選別された化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸化阻害剤は、さらに生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化、またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害することに基づく医薬の有効成分として有用である。ＰＡＫ４およびＪＩＫはいずれも、ＭＫＫ７に結合すると直接ＭＫＫ７をリン酸化してこれを活性化し、その結果ＪＮＫ３が活性化してｃ−Ｊｕｎがリン酸化される。従って、上記化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸化阻害剤は、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく医薬、例えばアポトーシスに基づく疾患、具体的には神経変性疾患などに対する医薬の有効成分として用いることができる。
本発明に係る医薬は、上記選別された化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸化阻害剤のうちの少なくとも１つを有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体または賦形剤を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。
必要な用量範囲は、上記化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸化阻害剤の有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．１μｇないし１００μｇの範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜４回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
処方は投与形態に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られたものを用いればよい。また、処方するときには、これらを単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、ｃ−Ｊｕｎリン酸化阻害剤または神経変性疾患の防止剤および／または治療剤などの有効成分を配合してもよい。
投与形態は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与形態を選択する。例えば、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などに投与することもできる。腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜投与若しくは経皮投与を用いることもできる。局所的な投与においては、膏薬、パスタ、ゲルなどの形態での投与であってもよい。
製剤化にあたっては、その投与形態あるいは有効成分の物性に応じて適切な製剤用添加物を用いることができ、常法に従って製剤化することができる。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法が利用できる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコールなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振盪、超音波処理および遠心分離した後、上清を濾過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油、ＭＣＴなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿を濾過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
本発明は、試薬キットであって、ＰＡＫ４、ＪＩＫ、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチド、ＪＩＫをコードするポリヌクレオチド、ＰＡＫ４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよびＪＩＫをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つと、ＭＫＫ７、ＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドおよびＭＫＫ７をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも１つとを含んでなる試薬を提供する。本発明にかかる試薬キットは、上記同定方法に使用することができる。ＪＩＫ、ＰＡＫ４およびＭＫＫ７は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または当該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＪＩＫまたはＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合およびこれら蛋白質の機能、例えばキナーゼ活性が阻害されなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やペプチドなどを直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識化したものであってもよい。あるいは、化学修飾物質により標識化したものであってもよい。好ましくは、それらの基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質やペプチドなどとしては、例えばグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇなどのタグペプチド類、マルトース結合蛋白質、および免疫グロブリンのＦｃ断片などが挙げられる。また、標識化に用いる化学修飾物質としては、グリーン蛍光蛋白質、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリンなどの蛍光物質類、ビオチン、あるいは放射性同位元素などを例示できる。標識化するとき、これら蛋白質やペプチドなどは単独で付加してもよいし複数を組み合わせて付加することもできる。ＰＡＫ４、ＪＩＫまたはＭＫＫ７のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。ＰＡＫ４、ＪＩＫまたはＭＫＫ７のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターＤＮＡ、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。これらは試薬であるとき、ＰＡＫ４またはＪＩＫとＭＫＫ７の結合やＰＡＫ４またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、バッファー、並びに塩など、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【実施例】  以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１（ＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＭＫＫ７のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＭＫＫ７との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＭＫＫ７と相互作用すると予測した。
解析の結果、ＭＫＫ７由来の７アミノ酸残基または６アミノ酸残基からなるオリゴペプチドＤＶＷＳＬＧＩ（配列番号１）およびＰＰＡＲＰＲ（配列番号２）と相同性あるオリゴペプチドＤＩＷＳＬＧＩ（配列番号３）およびＰＰＡＲＡＲ（配列番号４）が、ＰＡＫ４のアミノ酸配列中に存在することが分かった。第１図に、ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントの結果を示した。この結果から、ＰＡＫ４はＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質であると予測された。
実施例２（ＰＡＫ４によるＭＫＫ７リン酸化の解析）
ＰＡＫ４によるＭＫＫ７の相互作用を実験的に確認するために、免疫複合体リン酸化法を用いたインビトロにおけるリン酸化試験を実施した。
＜材料＞
ＰＡＫ４発現プラスミドを次のように構築した。まず、ヒトＰＡＫ４ｃＤＮＡを、ヒト脳由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組込んだ。そのとき、５´側にＦＬＡＧ−ｔａｇコード配列またはＨＡ−ｔａｇコード配列を挿入し、動物細胞用Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＰＡＫ４発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＡＫ４）および動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＰＡＫ４発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＰＡＫ４）をそれぞれ構築した。
試験には、下記組成からなる各バッファーを用いた。
細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），１ｍＭ  エチレングリコールビス四酢酸（ＥＧＴＡ），１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２．５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム（Ｎａ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），１ｍＭ  β−グリセロホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社。
キナーゼバッファー（Ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５ｍＭ  β−グリセロホスフェート，２ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社。
ＳＤＳ  サンプルバッファー（ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）：４％  ＳＤＳ，１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，２０％  グリセロール，０．０１％  ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ），１０％  β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）。
＜方法＞
細胞数５×１０５のＨＥＫ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下φ６０ｍｍのシャーレ中で一晩培養した後、５μｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＡＫ４を、１５μｌのＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用い、同様にトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（−）〔ＰＢＳ（−）〕で洗浄して回収し、５００μｌの細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で１０分間放置した。ついで４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）とした。次に、５００μｌの細胞溶解物に、アガロースに結合した正常マウスＩｇＧ（Ａｇａｒｏｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ社）２０μｌを加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に２０μｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｆｆｉｎｉｔｙｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて２時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにこのビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで２回、５００μｌのキナーゼバッファーで２回洗浄した。次に、ビーズに１μｇの基質と１０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を含む２５μｌのキナーゼバッファーを加え、３０℃にて３０分間リン酸化反応を行った。反応後、２５μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間煮沸後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社）を用いたオートラジオグラフィーによりリン酸化蛋白質を検出した。なお、基質は、ＧＳＴ−ＭＫＫ７の不活性体（ｕｎａｃｔｉｖｅ  ＧＳＴ−ＭＫＫ７、Ｕｐｓｔａｔｅ社）、または、陰性コントロールとしてＧＳＴをそれぞれ使用した。
＜結果＞
第２図に示したように、ＰＡＫ４によるＧＳＴ−ＭＫＫ７のリン酸化が認められた。また、このリン酸化はＰＡＫ４非存在では認められなかったことから、ＧＳＴ−ＭＫＫ７のリン酸化は自己リン酸化ではなく、ＰＡＫ４によるものであることが明らかとなった。なお、陰性コントロール用の基質として用いたＧＳＴでは、リン酸化は認められなかった。
実施例３（ＭＫＫ７とＰＡＫ４の結合解析）
ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合を実験的に確認するために、細胞内共発現／免疫共沈降法による結合試験を実施した。
＜材料＞
ＰＡＫ４発現プラスミドは、実施例２で構築したものを用いた。
ＭＫＫ７発現プラスミドは次のように構築した。まず、ヒトＭＫＫ７ｃＤＮＡを、ヒト骨格筋由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＲＴ−ＰＣＲにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組込んだ。その際、５´側にＨＡ−ｔａｇコード配列を挿入し、動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＭＫＫ７発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＭＫＫ７を構築した。
試験に用いた各バッファーの組成は、実施例２に記載のものと同じである。
＜方法＞
細胞数４×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下φ６０ｍｍシャーレ中で一晩培養した後、２μｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＡＫ４を２μｇのｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＭＫＫ７と共に、ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用い、同様にトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を氷冷したＰＢＳ（−）で洗浄して回収し、５００μｌの細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で１０分間放置した。ついで、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、５００μｌの細胞溶解物に２０μｌのＡｇａｒｏｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に２０μｌのａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて一晩転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収した。ビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで３回、次いで５００μｌのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した後、２０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間加熱後、上清を５−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ＨＡ抗体（Ｙ−１１、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を用いたウェスタンブロット法により結合蛋白質を検出した。なお、検出はＥＣＬウエスタンブロッティング検出キット（ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。
＜結果＞
第３図に示したように、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＦＬＡＧ−ＰＡＫ４の免疫沈降を実施した結果、ＦＬＡＧ−ＰＡＫ４とＨＡ−ＭＫＫ７とを共発現させた細胞においてはＨＡ−ＭＫＫ７の共沈降が認められた。一方、ＦＬＡＧ−ＰＡＫ４非発現細胞ではＨＡ−ＭＫＫ７の共沈降は認められなかったことから、この共沈降はアガロースビーズへの非特異的結合ではなく、ＦＬＡＧ−ＰＡＫ４とＨＡ−ＭＫＫ７の結合を示すものであることが明らかとなった。これらから、ＰＡＫ４とＭＫＫ７が細胞内で結合することが判明した。
実施例４（ＰＡＫ４によるＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化）
ＰＡＫ４によるＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化を実験的に確認するために、インビトロにおけるＪＮＫ３リン酸化試験を、免疫複合体リン酸化法を用いて実施した。
＜材料＞
ＰＡＫ４発現プラスミドは、実施例２で構築したものを用いた。
ＪＮＫ３発現プラスミドは次のように構築した。まず、ヒトＪＮＫ３ｃＤＮＡを、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからＲＴ−ＰＣＲにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組込んだ。その際、５´側にＦＬＡＧ−ｔａｇコード配列を挿入し、動物細胞用Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＪＮＫ３発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＪＮＫ３を構築した。
また、ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）（ｃ−ＪｕｎのＮ末端７９アミノ酸領域であり、ＪＮＫによるリン酸化部位を含む）を、Ｎ末端にＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を付加した融合蛋白質〔以下、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）〕として大腸菌にて発現後、グルタチオン  セファロース  ４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、使用した。
試験に用いた各溶液の組成は、実施例２に記載のものと同じである。
＜方法＞
細胞数６×１０５のＨＥＫ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下φ６０ｍｍのシャーレ中で一晩培養した後、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＪＮＫ３（２μｇ）とｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＰＡＫ４（０、０．１、０．５、または２μｇ）を１２μｌのＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。なお、ＤＮＡの総量はｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用いて全て４μｇに調整した。２日間培養後、細胞を氷冷したＰＢＳ（−）で洗浄して回収後、５００μｌの細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で１０分間放置した。ついで、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、５００μｌの細胞溶解物に２０μｌのＡｇａｒｏｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に２０μｌのａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて２時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで２回、５００μｌのキナーゼバッファーで２回洗浄した。次に、ビーズに基質として２μｇのＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）と１０μＭ  ＡＴＰおよび５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を含む２５μｌのキナーゼバッファーを加え、３０℃にて３０分間リン酸化反応を行った。反応後、２５μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃にて５分間処理後、上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社）を用いたオートラジオグラフィーによりリン酸化されたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を検出した。なお、各蛋白質の発現は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）または抗ＨＡ抗体（Ｙ−１１、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を用いたウェスタンブロット法により確認した。
＜結果＞
第４図に示すように、ＨＡ−ＰＡＫ４とＦＬＡＧ−ＪＮＫ３を共発現させた細胞の溶解物を用いたキナーゼアッセイにおいて、ＨＡ−ＰＡＫ４の発現量に依存して、リン酸化ｃ−Ｊｕｎが増加した。すなわち、ＨＡ−ＰＡＫ４の発現により、ＪＮＫ３のｃ−Ｊｕｎリン酸化活性が上昇することが明らかになった。ＦＬＡＧ−ＪＮＫ３の発現量には大きな変動がないことから、ＪＮＫ３活性の上昇はＨＡ−ＰＡＫ４の発現によるものと考えられる。
実施例２、３および４で得られた結果から、ＰＡＫ４がＭＫＫ７に結合してこれを直接リン酸化することにより、ＪＮＫ３が活性化されてｃ−Ｊｕｎがリン酸化されること、すなわちＪＮＫ３シグナル伝達経路が活性化されることが判明した。
実施例５（ＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質を、実施例１と同様の方法で予測した。その結果、ＭＫＫ７由来の６アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、ＷＳＬＧＩＳ（配列番号５）およびＬＥＡＫＬＫ（配列番号６）、と相同性のあるオリゴペプチド、ＷＳＬＧＩＴ（配列番号７）およびＬＥＮＫＬＫ（配列番号８）が、ＪＩＫのアミノ酸配列中に存在することが分かった。第５図に、ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントの結果を示した。この結果から、ＪＩＫはＭＫＫ７と相互作用する機能を有する蛋白質であると予測された。
実施例６（ＪＩＫによるＭＫＫ７リン酸化の解析）
ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を実験的に確認するために、免疫複合体リン酸化法を用いたインビトロにおけるリン酸化試験を実施した。
＜材料＞
ＪＩＫ発現プラスミドを次のように構築した。まず、ヒトＪＩＫ  ｃＤＮＡを、ヒト腎臓由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＲＴ−ＰＣＲにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組込んだ。そのとき、５´側にＨＡ−ｔａｇコード配列を挿入し、動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＪＩＫ発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＪＩＫを構築した。なお、クローニングしたＪＩＫ  ｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の蛋白質データベースに開示されたアクセッション番号ＸＰ＿０４５００６（登録遺伝子名：ＪＩＫ）のものと同一である。
試験に用いた各バッファーの組成は、実施例２に記載のものと同じである。
＜方法＞
細胞数４×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下φ６０ｍｍのシャーレ中で一晩培養した後、５μｇのｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＪＩＫを、１５μｌのＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用い、同様にトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を氷冷したＰＢＳ（−）で洗浄して回収し、５００μｌの細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で１０分間放置した。ついで４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、５００μｌの細胞溶解物に、Ａｇａｒｏｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）２０μｌを加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に２０μｌの抗ＨＡアフィニティーマトリックス（ａｎｔｉ−ＨＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ、Ｒｏｃｈｅ社）を加え、４℃にて２時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにこのビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで２回、５００μｌのキナーゼバッファーで２回洗浄した。次に、ビーズに１μｇの基質と１０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を含む２５μｌのキナーゼバッファーを加え、３０℃にて３０分間リン酸化反応を行った。反応後、２５μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間煮沸後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社）を用いたオートラジオグラフィーによりリン酸化蛋白質を検出した。なお、基質は、ＧＳＴ−ＭＫＫ７の不活性体（ｕｎａｃｔｉｖｅ  ＧＳＴ−ＭＫＫ７、Ｕｐｓｔａｔｅ社）、または、陰性コントロールとしてＧＳＴをそれぞれ使用した。
＜結果＞
第６図に示したように、ＪＩＫによるＧＳＴ−ＭＫＫ７のリン酸化が認められた。また、このリン酸化はＪＩＫ非存在下では認められなかったことから、ＧＳＴ−ＭＫＫ７のリン酸化は自己リン酸化ではなく、ＪＩＫによるものであることが明らかとなった。なお、陰性コントロール用の基質として用いたＧＳＴでは、リン酸化は認められなかった。
実施例７（ＭＫＫ７とＪＩＫの結合解析）
ＪＩＫとＭＫＫ７の結合を実験的に確認するために、細胞内共発現／免疫共沈降法による結合試験を実施した。
＜材料＞
ＪＩＫ発現プラスミドは、実施例６で構築したものを用いた。
ＭＫＫ７発現プラスミドは次のように構築した。まず、ヒトＭＫＫ７ｃＤＮＡを、ヒト骨格筋由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＲＴ−ＰＣＲにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組込んだ。その際、５´側にＦＬＡＧ−ｔａｇコード配列を挿入し、動物細胞用Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＭＫＫ７発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７を構築した。
試験に用いた各バッファーの組成は、実施例２に記載のものと同じである。
＜方法＞
細胞数４×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下φ６０ｍｍシャーレ中で一晩培養した後、２μｇのｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＪＩＫを２μｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７と共に、ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用いて、同様にトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を氷冷したＰＢＳ（−）で洗浄して回収し、５００μｌの細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で１０分間放置した。ついで４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、５００μｌの細胞溶解物に２０μｌのＡｇａｒｏｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に２０μｌのａｎｔｉ−ＨＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社）を加え、４℃にて一晩転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収した。ビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで３回、次いで５００μｌのＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した後、２０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間加熱後、上清を５−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いたウェスタンブロット法により結合蛋白質を検出した。なお、検出はＥＣＬウエスタンブロッティング検出キットを使用した。
＜結果＞
第７図に示したように、抗ＨＡ抗体を用いてＨＡ−ＪＩＫの免疫沈降を実施した結果、ＨＡ−ＪＩＫとＦＬＡＧ−ＭＫＫ７とを共発現させた細胞においては、ＦＬＡＧ−ＭＫＫ７の共沈降が認められた。一方、ＨＡ−ＪＩＫ非発現細胞ではＦＬＡＧ−ＭＫＫ７の共沈降は認められなかったことから、この共沈降はアガロースビーズへの非特異的結合ではなく、ＨＡ−ＪＩＫとＦＬＡＧ−ＭＫＫ７の結合を示すものであることが明らかとなった。これらから、ＪＩＫとＭＫＫ７が細胞内で結合することが判明した。
実施例８（ＪＩＫによるＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化）
ＪＩＫによるＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化を実験的に確認するために、インビトロにおけるＪＮＫ３リン酸化試験を、免疫複合体リン酸化法を用いて実施した。
＜材料＞
ＪＮＫ３発現プラスミドは、実施例４で構築したものを用いた。
ＪＩＫ発現プラスミドは、実施例６で構築したものを用いた。
ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）は実施例４と同様に調製した。
試験に用いた各バッファーの組成は、実施例２に記載のものと同じである。
＜方法＞
細胞数４×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下φ６０ｍｍのシャーレ中で一晩培養した後、２μｇのｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＪＩＫを、２μｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＪＮＫ３と共に、ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用いて同様にトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を氷冷したＰＢＳ（−）で洗浄して回収後、５００μｌの細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で１０分間放置した。ついで４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、５００μｌの細胞溶解物に２０μｌのＡｇａｒｏｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に２０μｌのａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、４℃にて２時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで２回、５００μｌのキナーゼバッファーで２回洗浄した。次に、ビーズに基質として２μｇのＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）と１０μＭ  ＡＴＰおよび５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を含む２５μｌのキナーゼバッファーを加え、３０℃にて３０分間リン酸化反応を行った。反応後、２５μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃にて５分間処理後、上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社）を用いたオートラジオグラフィーによりリン酸化されたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を検出した。
＜結果＞
第８図に示すように、ＨＡ−ＪＩＫとＦＬＡＧ−ＪＮＫ３を共発現させた細胞の溶解物を用いたキナーゼアッセイにおいて、ＦＬＡＧ−ＪＮＫ３のみを発現させた細胞の溶解物と比較してリン酸化ｃ−Ｊｕｎが増加した。すなわち、ＨＡ−ＪＩＫの発現により、ＪＮＫ３のｃ−Ｊｕｎリン酸化活性が上昇することが明らかになった。
実施例６、７および８で得られた結果から、ＪＩＫがＭＫＫ７に結合してこれを直接リン酸化することにより、ＪＮＫ３が活性化されてｃ−Ｊｕｎがリン酸化されること、すなわちＪＮＫ３シグナル伝達経路が活性化されることが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明においては、ＰＡＫ４およびＪＩＫがそれぞれＭＫＫ７と結合すること、さらに、ＰＡＫ４およびＪＩＫのいずれもＭＫＫ７を直接リン酸化すること、その結果ＪＮＫ３シグナル伝達経路が活性されることを初めて見出した。
ＰＡＫ４がＪＮＫシグナル伝達経路を活性化することは従来知られていたが、その機構は不明であった。ＰＡＫ４はｃｄｃ４２によって活性化されるが、ｃｄｃ４２の活性化はＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を介して神経細胞死を引き起こす。よって、ＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化による神経細胞死において、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化が関与していると考えられる。
ＪＩＫがＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ活性化に関与していることは今までに報告されているが、その機構は不明であった。ＥＲストレスはＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を介して、神経細胞死を引き起こす。よって、ＥＲストレスの負荷によるＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化による神経細胞死において、ＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化が関与していると考えられる。
したがって、ＰＡＫ４またはＪＩＫとＭＫＫ７の結合、あるいはＰＡＫ４またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害することにより、ＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化によって引き起こされるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を阻害することができ、ひいては神経細胞死を阻害することができる。
ＰＡＫ４およびＪＩＫがいずれもＭＫＫ７を直接的にリン酸化することから、これらは異なった経路でＭＫＫ７をリン酸化することによりＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化に関与していると考えられる。よって、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化およびＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の両方を阻害することにより、どちらか一方によるＭＫＫのリン酸化を阻害するよりも、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化の阻害においてより高い効果が得られると考える。
本発明はこのように、ＪＮＫ３シグナル伝達経路の活性化によって引き起こされる疾患、例えば神経細胞死に基づく疾患、具体的には、神経変性疾患の予防・治療のために、また、神経変性疾患やＪＮＫシグナル伝達機構の研究のために、非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：ＰＡＫ４の部分配列（配列番号３）と高い相同性を有する、ＭＫＫ７の部分配列。
配列番号２：ＰＡＫ４の部分配列（配列番号４）と高い相同性を有する、ＭＫＫ７の部分配列。
配列番号３：ＭＫＫ７の部分配列（配列番号１）と高い相同性を有する、ＰＡＫ４の部分配列。
配列番号４：ＭＫＫ７の部分配列（配列番号２）と高い相同性を有する、ＰＡＫ４の部分配列。
配列番号５：ＪＩＫの部分配列（配列番号７）と高い相同性を有する、ＭＫＫ７の部分配列。
配列番号６：ＪＩＫの部分配列（配列番号８）と高い相同性を有する、ＭＫＫ７の部分配列。
配列番号７：ＭＫＫ７の部分配列（配列番号５）と高い相同性を有する、ＪＩＫの部分配列。
配列番号８：ＭＫＫ７の部分配列（配列番号６）と高い相同性を有する、ＪＩＫの部分配列。
配列番号９：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号１０：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号１１：ＭＫＫ７、ＰＡＫ４およびＪＩＫの配列において一致する部分配列。
配列番号１２：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号１３：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号１４：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号１５：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号１６：ＭＫＫ７とＰＡＫ４の配列において一致する部分配列。
配列番号１７：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号１８：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号１９：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号２０：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号２１：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号２２：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号２３：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号２４：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号２５：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号２６：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号２７：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号２８：ＭＫＫ７とＰＡＫ４とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＡＫ４の部分配列。
配列番号２９：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号３０：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号３１：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号３２：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号３３：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号３４：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号３５：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号３６：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号３７：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号３８：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号３９：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号４０：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号４１：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号４２：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号４３：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号４４：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
配列番号４５：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＭＫＫ７の部分配列。
配列番号４６：ＭＫＫ７とＪＩＫとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＩＫの部分配列。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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