(57)【要約】１２６５種類のイネＥＳＴを貼り付けたＤＮＡマイクロチップを用いてエリシター処理初期に発現が誘導される遺伝子を探索した。その際、イネイモチ病菌細胞壁の主要成分の一つ、キチンのオリゴマー（Ｎ−アセチルキトオリゴ糖）をエリシターとして用いた。その結果、６種類の新規エリシター応答性ＥＳＴを同定した。これらのうち、２種類の遺伝子（ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子と命名）の産物は、転写因子と考えられているＧＲＡＳファミリーに特徴的なモチーフを備えており、イネでもジベレリンシグナル伝達制御因子以外にＧＲＡＳファミリーが存在することが初めて示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の植物のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
植物がイネである、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）請求項１または２に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンス核酸
（ｂ）請求項１または２に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）請求項１または２に記載のＤＮＡの発現を、共抑制により阻害効果を有する核酸
（ｄ）請求項１または２に記載のＤＮＡの発現を、ＲＮＡｉ効果により阻害効果を有する核酸
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ、請求項５に記載の核酸、または請求項６に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項９】
イネ由来である、請求項８に記載の形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ、請求項５に記載の核酸、または請求項６に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１３】
植物がイネである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物におけるエリシターおよびジベレリン応答遺伝子、並びに、その利用に関する。
背景技術
ＤｉＬａｕｒｅｎｚｉｏら（Ｌａｕｒｅｎｚｉｏ，Ｌ．，Ｄ．，Ｗｙｓｏｃｋａ−Ｄｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｍａｌａｍｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｐｙｓｈ，Ｌ．，Ｈｅｌａｒｉｕｔｔａ，Ｙ．，Ｆｒｅｓｈｏｕｒ，Ｇ．，Ｈａｈｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．Ｔｈｅ  ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｏｏｔ．Ｃｅｌｌ，１９９６，８６，４２３−４３３．）はクロモソームウォーキング法により、シロイヌナズナの根および茎の断面構造形成を司る遺伝子としてＳｃａｒｅｃｒｏｗを単離しその構造を明らかにした。この遺伝子はその構造からおそらく転写因子と推定された。その後アラビドプシスのＥＳＴにこれと構造上の類似性をもつ遺伝子が多数同定されＳｃａｒｅｃｒｏｗは遺伝子ファミリーを形成していることが明らかにされた（Ｐｙｓｈ，Ｌ．Ｄ．，Ｗｙｓｏｃｋａ−Ｄｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ，Ｃ．，Ｂｏｕｃｈｅｚ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．Ｔｈｅ  ＧＲＡＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ−ＬＩＫＥ  ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１９９９，１８，１１１−１１９．）。
これとは独立に、アラビドプシスにおいて植物ホルモンの一つ、ジベレリンのシグナルを負に制御する遺伝子が２種類（ＧＡＩ、ＲＧＡ）単離され、その推定アミノ酸配列のとりわけＣ末側約３分の２がＳｃａｒｅｃｒｏｗに有意な相同性を示すことが明らかとなった（Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｃａｒｏｌ，Ｐ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｋｉｎｇ，Ｋ．Ｅ．，Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｒｂｅｒｄ，Ｎ．Ｐ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９７，１１，３１９４−３２０５．Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｉａｍｐａｇｌｉｏ，Ｃ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｔ−Ｐ．Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＧＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８，１０，１５５−１６９．）。
似たようなジベレリンのシグナル制御因子はその後トウモロコシ、コムギ（Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｎ．Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．，Ｄｅｖｏｓ，Ｋ．Ｍ．，Ｆｌｉｎｔｈａｍ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｅａｌｅｓ，Ｊ．，Ｆｉｓｈ，Ｌ．Ｊ．，Ｗｏｒｌａｎｄ，Ａ．Ｊ．，Ｐｅｌｉｃａ，Ｆ．，Ｓｕｄｈａｋａｒ，Ｄ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，Ｓｎａｐｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｇａｌｅ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈａｒｂｅｒｄ，Ｎ．Ｐ．”Ｇｒｅｅｎ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９９，４００，２５６−２６１．）、イネ（Ｏｇａｗａ，Ｍ．，Ｋｕｓａｎｏ，Ｔ．，Ｋａｔｓｕｍｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｎｏ，Ｈ．Ｒｉｃｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ，ＯｓＧＡＩ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｕｃｌｅａｒ−ｌｏｉｃａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｌｅｖｅｌ．Ｇｅｎｅ，２０００，２４５，２１−２９．Ｉｋｅｄａ，Ａ．，Ｕｅｇｕｃｈｉ−Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｓｏｎｏｄａ，Ｙ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．，Ｋｏｓｈｉｏｋａ，Ｍ．，Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｊ．ｓｌｅｎｄｅｒ  ｒｉｃｅ，ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｕｔａｎｔ，ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＬＲ１  ｇｅｎｅ，ａｎ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ＧＡＩ／ＲＧＡ／ＲＨＴ／Ｄ８．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２００１，１３，９９９−１０１０．）で次々に単離され、構造的によく保存されていることが示された。また、トマトにおいては腋芽抑制遺伝子（Ｌａｔｅｒａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）の産物がＳｃａｒｅｃｒｏｗと同じファミリーに属することが報告された（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｔ．，Ｒｏｓｓｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｔｈｅｒｅｓ，Ｋ．Ｔｈｅ  Ｌａｔｅｒａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｌｓ）ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＨＩＩＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９９，９６，２９０−２９５．）。
Ｐｙｓｈらはアラビドプシスで見いだされたＧＡＩ、ＲＧＡ、Ｓｃａｒｅｃｒｏｗの頭文字をとってこれらの遺伝子ファミリーをＧＲＡＳと命名した（Ｐｙｓｈ，Ｌ．Ｄ．，Ｗｙｓｏｃｋａ−Ｄｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ，Ｃ．，Ｂｏｕｃｈｅｚ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．Ｔｈｅ  ＧＲＡＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ−ＬＩＫＥ  ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１９９９，１８，１１１−１１９．）。ＧＲＡＳファミリーのアミノ酸配列は、相同性の低いＮ末領域、ロイシンヘプタド構造，ＶＨＩＩＤ領域等によって特徴づけられる。このような構造は動物や微生物では知られておらず、植物に特有のものである。
ジベレリンシグナルの制御因子はＮ末付近まで相同性が高く、特にＤＥＬＬＡ配列はジベレリンのシグナルをキャッチする上で重要な働きをしていることがＧＡＩの遺伝学的研究から明らかにされている（Ｈｅｒｂａｒｄ，Ｎ．Ｐ．，Ｋｉｎｇ，Ｋ．，Ｅ．，Ｃａｒｏｌ，Ｐ．，Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｅｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｅ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９９８，２０，１００１−１００８．）。
Ｓｃａｒｅｃｒｏｗはそのアミノ酸配列中にロイシンジッパー型転写因子にみられる塩基性アミノ酸領域が含まれ、またＮ末２６７アミノ酸残基中４４％がグルタミン酸、セリン、スレオニン、プロリンである等のことから転写因子であろうと推定された（Ｌａｕｒｅｎｚｉｏ，Ｌ．，Ｄ．，Ｗｙｓｏｃｋａ−Ｄｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｍａｌａｍｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｐｙｓｈ，Ｌ．，Ｈｅｌａｒｉｕｔｔａ，Ｙ．，Ｆｒｅｓｈｏｕｒ，Ｇ．，Ｈａｈｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．Ｔｈｅ  ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｏｏｔ．Ｃｅｌｌ，１９９６，８６，４２３−４３３．）。
最近、ＲＧＡについてはＧＦＰ融合タンパク質を導入した組換え体において核に蛍光が局在することから、核に局在する転写因子であることが強く示唆された（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｉａｍｐａｇｌｉｏ，Ｃ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｔ−Ｐ．Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＧＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８，１０，１５５−１６９．）。
一方、イネイモチ病菌細胞壁の主要成分の一つ、キチンのオリゴマー（Ｎ−アセチルキトオリゴ糖）がイネ培養細胞に対して種々の防御反応を低濃度で誘導する、すなわち強力なエリシター（生体防御反応を誘導する物質）として作用することが見出された（Ｙａｍａｄａ，Ａ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｏ．，ａｎｄ  Ａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５７，４０５−４０９．）。その過程で、これまでも知られていた防御関連酵素遺伝子、ＰＡＬ、キチナーゼ、グルカナーゼが発現すること（Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｙａｚａｋｉ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｔａｋａｉ，Ｒ．，Ｙａｍａｄａ，Ｋ．，Ｓａｋａｎｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ，Ｎ−ａｃｅｔｈｙｌｃｈｉｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔ．，１９９８，１２，１１６７−１１７４．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ａ．，Ｈｉｂｉ，Ｔ．，Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，３９，９０７−９１４．）、これ以外により速いタイムコースでＥＬ２、ＥＬ３、ＥＬ５という３種の新規な初期遺伝子が発現することを見いだし（Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．，Ｋｕｃｈｉｔｓｕ，Ｋ．，Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｋｏｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｍｉｄｏｈ，Ｎ．，Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．Ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｓ  ｒａｐｉｄｌｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ，ａ  ｂｉｏｔｉｃ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９６，３７，５６３−５６７．Ｔａｋａｉ，Ｒ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｋ．，Ｋａｋｕ，Ｋ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｒｉｃｅ  ｇｅｎｅ，ＥＬ５，ｗｈｉｃｈ  ｓｈｏｗｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ＡＴＬ  ｆａｍｉｌｙ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，２００１，１６０，５７７−５８３．）、その構造、発現特性等を明らかにしてきた。
発明の開示
本発明の目的は、植物における新規なエリシター応答遺伝子を同定し、該遺伝子および該遺伝子が制御された植物を提供することにある。
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、エリシター応答においては、多数の遺伝子発現が変化していることが考えられることから、１２６５種類のイネＥＳＴを貼り付けたＤＮＡマイクロチップを用いてエリシター処理初期に発現が誘導される遺伝子を探索した。その際、イネイモチ病菌細胞壁の主要成分の一つ、キチンのオリゴマー（Ｎ−アセチルキトオリゴ糖）をエリシターとして用いた。その結果、２種類のＳｃａｒｅｃｒｏｗファミリーのｃＤＮＡを含む６種類の新規エリシター応答性ＥＳＴを同定した。これらのうち、２種類のＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子（ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子と命名）の産物は、ＧＲＡＳファミリーに特徴的なモチーフを備えており、イネでもジベレリンシグナル伝達制御因子以外にＧＲＡＳファミリーが存在することが初めて示された。これら２種類の遺伝子は興味あることに、イネ懸濁培養細胞においてオーキシン非存在下ではジベレリンに応答してその発現が短時間内に誘導された。ジベレリンはｅｎｔジベラン骨格をもつ化合物の総称であるが、これらの遺伝子発現誘導には活性型ジベレリンのみが有効であった。また、遺伝子発現に至るシグナル伝達過程ではタンパク質リン酸化、脱リン酸化が関与していることが示唆された。このようなジベレリンによる急激な遺伝子発現はイネ緑葉においても観察された。
エリシターは、植物において、種々の防御関連酵素遺伝子を誘導し、防御反応を引き起こすことが知られている。よって、エリシターによって誘導されるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子は、作物に病害抵抗性を付与するにあたり有用であることが期待される。また、ジベレリンは発芽や休眠等作物の重要形質を司るホルモンとして農業上利用されてきたがそれによって制御される転写因子は未報告であり、本遺伝子はジベレリンによる有用形質を調節した組み換え作物の作出においても有用であることが期待される。
即ち、本発明は、植物におけるエリシターおよびジベレリン応答遺伝子、並びに、その利用に関し、より具体的には、
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の植物のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ａ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
〔２〕  植物がイネである、〔１〕に記載のＤＮＡ、
〔３〕  〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
〔４〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、
〔５〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸、
（ａ）〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンス核酸、
（ｂ）〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、
（ｃ）〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの発現を、共抑制により阻害効果を有する核酸、
（ｄ）〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの発現を、ＲＮＡｉ効果により阻害効果を有する核酸、
〔６〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔５〕に記載の核酸を含むベクター、
〔７〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、〔５〕に記載の核酸、または〔６〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
〔８〕  〔７〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
〔９〕  イネ由来である、〔８〕に記載の形質転換植物体、
〔１０〕  〔８〕または〔９〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔１１〕  〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔１２〕  〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、〔５〕に記載の核酸、または〔６〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
〔１３〕  植物がイネである、〔１２〕に記載の方法、を提供するものである。
本発明者は、植物における２つの新規エリシター応答遺伝子を同定し、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子と命名した。また、これらの遺伝子が、ジベレリンに対しても応答性を示すことを明らかにした。
本発明は、植物のＣＩＧＲ１タンパク質またはＣＩＧＲ２タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明における上記植物としては、特に限定されず、例えば、穀類、野菜、および果樹等の有用農作物、観葉植物等の鑑賞用植物等が挙げられる。具体的には、該植物として、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ、キク、バラ、カーネーション、シクラメン等を例示することができる。
本発明の上記植物としては、好ましくはイネを挙げることができる。イネのＣＩＧＲ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、ＣＩＧＲ２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
イネ以外の植物における本発明のＤＮＡは、当業者においては、一般的に公知の方法により単離することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．、Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２３９，４８７．）を利用する方法が挙げられる。すなわち、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、また配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の植物から配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。こうして単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，２２６４−２２６８．、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３．）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９０，２１５，４０３．）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
また、本発明は、上記の植物のＣＩＧＲ１タンパク質およびＣＩＧＲ２タンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。このようなＤＮＡとしては、該タンパク質において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
上記のＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、上記ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．、Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７．）の他に、例えば、該ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆  Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）により変異を導入する方法が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異ＤＮＡも本発明に含まれる。
本発明のＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、上記の植物のＣＩＧＲ１タンパク質およびＣＩＧＲ２タンパク質をコードする遺伝子を有する植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、該タンパク質をコードするＤＮＡを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、上記の植物のＣＩＧＲ１タンパク質およびＣＩＧＲ２タンパク質をコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有する植物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
本発明のＤＮＡは、例えば、組み換えタンパク質の調製や、その発現制御により表現型が改変された形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、発現ベクターを変えることにより、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．＆  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５８−１６２．、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，１６６，５５７−５８０．）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することができる。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。このようにして作製される本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質もまた、本発明に含まれる。
得られた組み換えタンパク質を用いることにより、これに結合する抗体を調製することも可能である。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去した血清より調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明の抗体には、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれら抗体の断片が含まれる。
本発明のＤＮＡを発現する形質転換植物体を作製する場合には、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
また、本発明のＤＮＡの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のＤＮＡの発現抑制」には、遺伝子の転写の抑制、および／またはタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
本発明のＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡの好ましい態様としては、本発明のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンス核酸、本発明のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、ＲＮＡｉ効果または共抑制効果により本発明のＤＮＡの発現を抑制する核酸、および、本発明のＤＮＡの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等を例示することができる。本発明において「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンス核酸が植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ，ＪＲ．＆  Ｄａｖｉｓ，ＲＷ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９８６，８３，５３７２．）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンス核酸の発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ＡＲ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３３，８６６．）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．）。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンス核酸の長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
また、内在性遺伝子の発現の抑制は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８９，１７，７０５９．）。例えば、ＣＩＧＲ１遺伝子またはＣＩＧＲ２遺伝子のコード領域中には、標的となり得る部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１９９０，３，７３３．、Ｄｚｉａｎｏｔｔ，ＡＭ．＆  Ｂｕｊａｒｓｋｉ，ＪＪ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９８９，８６，４８２３．、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ，ＣＡ．＆  Ｃｅｃｈ，ＴＲ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，３８７５．、Ｔａｉｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，５１２５．）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９２，１８６，１２７１．）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉは植物においても効果を奏することが知られている（Ｃｈｕａｎｇ，ＣＦ．＆  Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，ＥＭ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０００，９７，４９８５．）。例えば、植物体におけるＣＩＧＲ１遺伝子またはＣＩＧＲ２遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、ＣＩＧＲ１遺伝子もしくはＣＩＧＲ２遺伝子、または、これらと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを目的の植物へ導入すればよい。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はＲＮＡｉの機構と重複していると考えられている。共抑制も植物において観察される（Ｓｍｙｔｈ，ＤＲ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，１９９７，７，Ｒ７９３．、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｒ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，１９９６，６，８１０．）。例えば、ＣＩＧＲ１遺伝子またはＣＩＧＲ２遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、ＣＩＧＲ１遺伝子もしくはＣＩＧＲ２遺伝子、または、これらと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子がコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子を、植物へ形質転換することによっても達成することができる。「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子」とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型タンパク賛の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことを指す。
また本発明は、上記ＤＮＡまたは核酸を含むベクター、該ベクターを保持する形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、および該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。
さらに、本発明は、上記の形質転換植物体の製造方法であって、本発明のＤＮＡまたは核酸、あるいは本発明のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法を提供する。
本発明のＤＮＡまたは核酸の植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法により実施することができる。
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９０，６７，３２５．）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のＤＮＡが位置し、さらに該ＤＮＡの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平２−７９９８３号公報）等を挙げることができる。
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
また、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
また、本発明のＤＮＡまたは核酸の導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
次いで、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９５，１００，１５０３−１５０７．）。例えばイネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．），１９９５，６６−７４．）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９２，１００，１５０３−１５０７．）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９，９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１９９４，６，２７１−２８２．）等、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来ＤＮＡまたは核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡまたは核酸の抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に準じて実施することができる。
再生させた植物体中に存在する本発明のＤＮＡよりなる外来遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型として増幅反応を行う。また、本発明の核酸がＤＮＡである場合には、該ＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明のＤＮＡに対応することを確認することが可能である。
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、実施例は、下記の材料および方法に従って実施した。
（１）イネ培養細胞；  イネ培養細胞は発芽イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ  Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）種子より１ＰＰＭの２，４Ｄ（オーキシン；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含むＮ６寒天培地上で誘導し、Ｎ６液体培地で以下のように継代した。週に一度生体積約１ｍｌ程度の細胞を１５０ｍｌのＮ６培地に植え継いだ。２週に一度２０−ｍｅｓｈの金網を通して細胞塊を小さくする操作を行った。ノーザンブロットのＲＮＡ抽出に供する細胞は裏ごししないで３０ｍｌの培地に植え継いだ細胞を４〜６日間振とう培養したものを用いた。
（２）ＲＮＡ抽出；  イネ培養細胞および緑葉からの全ＲＮＡ抽出はフェノールＳＤＳ法に従って行った。組織体積の約１０倍以上のフェノール（水で９０％程度飽和させたもの）およびこれと等量の抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０，１％  ＳＤＳ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ）存在下ポリトロンホモジェナイザーで組織を磨砕した。遠心分離によって得た水層を繰り返しフェノール抽出した後、０．６容のイソプロパノールを加えて攪拌し、全核酸を沈殿させた。これを水に溶かした後その０．２５容の１０Ｍ  ＬｉＣｌを加えて氷冷し高分子ＲＮＡを遠心分離によって回収した。これを７０％エタノールで洗浄したのち少量の水に溶解させてＲＮＡ標品とした。
（３）培養細胞および緑葉のジベレリン処理方法；  培養細胞をあらかじめ２，４Ｄを含まないＮ６培地で数回洗浄後同じ培地に懸濁し２５℃で２時間浸透した。ジベレリン（ＧＡ３：エタノール溶液）をそれぞれの終濃度になるように加えて所定時間振とう培養後ＲＮＡ抽出に供した。播種後３週間の日本晴植物体にジベレリンをスプレーで噴霧処理しタイムコースを追って３，４葉をサンプリングし、全ＲＮＡを抽出した。エリシター処理はイネ培養細胞に直接エリシター水溶液を投与することにより行った。
（４）ハイブリダイゼーション；  ノーザンハイブリダイゼーションのためのＲＮＡ変性はグリオキサル法によった。１０μｇの全ＲＮＡ（３．７μｌ）に２．７μｌのグリオキサル（終濃度１Ｍ）、１．６μｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、終濃度１０ｍＭ）、８μｌのジメチルスルフォキシド（終濃度５０％）を加えて５０℃で１時間保温したのち１．４％アガロース（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０）中で電気泳動した。泳動後ＲＮＡをナイロン膜（バイオダインＡ）にブロットし８０℃、２時間処理をしてＲＮＡを膜に固定した。ハイブリダイゼーションは５０％フォルムアミド、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，５ｘＳＳＰＥ（０．９ＭＮａＣｌ，５０ｍＭリン酸ナトリウム，５ｍＭＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）、５ｘデンハルト溶液（０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン）中で４２℃一昼夜行い、その後０．１ｘＳＳＣ（１５ｍＭＮａＣｌ，１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）で、室温で５分間３回、６５℃で３０分間、２回洗浄した後Ｘ線フィルムに露光した。
（５）ＤＮＡマイクロアレイ解析；  マイクロチップ（ｈｔｔｐ：／／ｃｄｎａ０１．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＲＭＯＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）はイネゲノムプロジェクトにより１２６５クローンのイネＥＳＴを用いて作成された。エリシター無処理および１５分処理した細胞より抽出したｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡをｃｙ５−ｄＣＴＰ存在下逆転写して一本鎖ｃＤＮＡプローブを作成し、その結果をアレイスキャナー（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒ  ＦＬＡ８０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ））を用いて解析した。
［実施例１］
イネＧＲＡＳファミリーのうち、ジベレリンシグナルリプレッサーと考えられる遺伝子（ＳＬＲ、ＯｓＧＡＩ）については最近報告された（Ｏｇａｗａ，Ｍ．，Ｋｕｓａｎｏ，Ｔ．，Ｋａｔｓｕｍｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｎｏ，Ｈ．Ｒｉｃｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ，ＯｓＧＡＩ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｕｃｌｅａｒ−ｌｏｉｃａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｌｅｖｅｌ．Ｇｅｎｅ，２０００，２４５，２１−２９．Ｉｋｅｄａ，Ａ．，Ｕｅｇｕｃｈｉ−Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｓｏｎｏｄａ，Ｙ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．，Ｋｏｓｈｉｏｋａ，Ｍ．，Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｊ．ｓｌｅｎｄｅｒ  ｒｉｃｅ，ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｕｔａｎｔ，ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＬＲ１  ｇｅｎｅ，ａｎ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ＧＡＩ／ＲＧＡ／ＲＨＴ／Ｄ８．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２００１，１３，９９０−１０１０．）。ＤＮＡマイクロアレイでエリシター処理１５分でシグナルが有意に増加した２つのＥＳＴ（ｃ７２４９５，ＡＵ０９４８６０）を農林水産ジーンバンクより入手して全塩基配列を解読し、両者の推定アミノ酸配列を既知のＧＲＡＳファミリー遺伝子と比較した（図１および図２）。両遺伝子はＶＨＩＩＤ領域を有し、Ｃ末側のアミノ酸配列はＳｃａｒｅｃｒｏｗおよびそのファミリーとの間でよく保存されていたが典型的なロイシンヘプタド構造は認められなかった。またジベレリンシグナルリプレッサーに特徴的なＤＥＬＬＡ配列は存在しなかった。以後、Ｃ７２４９５をＣＩＧＲ１遺伝子（塩基配列を配列番号：１、アミノ酸配列を配列番号：２に記す）、ＡＵ９４８６０をＣＩＧＲ２遺伝子（塩基配列を配列番号：３、アミノ酸配列を配列番号：４に記す）と命名した。ヌクレオチドレベルでの両者の相同性は５７％、アミノ酸配列レベルでの相同性は４０％であった。ゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果、両遺伝子はそれぞれ１コピー存在するものと考えられた（図３）。
図４は両遺伝子産物ならびにこれまでに構造が明らかになったＧＲＡＳファミリー遺伝子産物の推定分子進化系統を示す。ＣＩＧＲ２遺伝子はＣＩＧＲ１遺伝子よりもむしろアラビドプシスのＡｔＳＣＬ５に近縁であると考えられた。またジベレリンシグナルリプレッサーは一つのサブファミリーを形成し、イネＯｓＧＡＩ（ＳＬＲ）はＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子よりもトウモロコシやアラビドプシスのリプレッサーにより近縁であることが示唆された。
［実施例２］
ＧＲＡＳファミリー遺伝子産物は転写調節因子であると考えられているがそれらがどのような遺伝子発現の調節に関わっているかについての知見は得られていない。アラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗは典型的な核移行シグナルをもたないが、Ｎ末側にセリン、スレオニン、プロリン、グルタミンが多いこと等の理由から転写因子と推測された。アラビドプシスのジベレリンシグナルリプレッサーの一つ、ＧＡＩおよびそれと極めてよく似た遺伝子ＧＲＳには核移行シグナル様の配列が存在した（Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｃａｒｏｌ，Ｐ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｋｉｎｇ，Ｋ．Ｅ．，Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｒｂｅｒｄ，Ｎ．Ｐ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９７，１１，３１９４−３２０５．）。またもう一つのリプレッサーであるＲＧＡが、ＧＦＰとの融合タンパク質を用いた実験で核に局在することが示された（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｉａｍｐａｇｌｉｏ，Ｃ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｔ−Ｐ．Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＧＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８，１０，１５５−１６９．）。ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子についてその細胞内局在性を検討するためこれらの翻訳領域をＧＦＰにｉｎ  ｆｒａｍｅで連結したキメラプラスミドをパーティクルガン法によってタマネギ表皮細胞に導入し、融合タンパク質の挙動をＧＦＰの蛍光を指標として追跡したところ、ＣＩＧＲ２・ＧＦＰ融合タンパク質が細胞核に局在している像が観察された（図５）。またＧＦＰ単独ではそのような像は観察されなかったことから、ＣＩＧＲ２遺伝子産物は核に局在すると結論した。
［実施例３］
ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子はいずれもＤＮＡマイクロアレイ解析によってエリシター応答性遺伝子として同定された。そこでこれらの両遺伝子のエリシター応答性をノーザンブロットハイブリダイゼーション法によって解析した。両遺伝子ともキチン７量体処理５分後にそのｍＲＮＡ量の顕著な増加が観察されはじめ９０分に至るまで発現量は増加し続けた（図６ａ）。キチンオリゴマーのイネに対するエリシター活性はそのサイズに依存し、７または８量体がもっとも強い活性をもつこと、脱アセチル体であるキトサンオリゴマーは活性が極めて低いことがこれまでの研究により明らかになっている。そこで１〜７量体のキチンオリゴマーおよび４，７量体のキトサンオリゴマーを処理したときのこれら両遺伝子の発現誘導を調べた。両者ともキチンの７量体にもっとも強く応答し、キトサンのオリゴマーには有意な応答を示さなかった（図６ｂ）。
［実施例４］
芦刈ら（Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｙａｎｏ，Ｍ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，ａｎｄ  ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．Ｒｉｃｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｗａｒｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｄｗａｒｆ  １  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，１０２８４−１０２８９．）、藤澤ら（Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ａｓａｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｉｗａｓａｋｉ，Ｙ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｄｗａｒｆｉｓｍ，ｉｎ  ｒｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，７５７５−７５８０．）は独立に、イネわい性変異体ｄ１の原因遺伝子（Ｄ１）が３量体型Ｇタンパク質αサブユニットをコードしていることを見いだした。動物細胞においては３量体型Ｇタンパク質は７回膜貫通型受容体と共役して細胞外の情報を伝達する重要な役割をもつことが知られている（Ｎｅｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｔｏｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｏｒｇａｎｉｚｅｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ．１９９５，Ｃｅｌｌ  ５０，１０１１−１０１９．）。
一方、エリシターシグナルの伝達過程においてはこの阻害剤あるいは活性化剤を用いた研究からその関与が示唆されている（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ，Ｌ．，Ｈｅｉｎｓｙｅｉｎ，Ｐ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｕｒｓｔ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９２，２６７，２０１４０−２０１４７．）がこれらの阻害剤はその特異性が必ずしも明確でないなどの問題点が指摘されており（Ｅｐｈｒｉｔｉｋｈｉｎｅ，Ｇ．，Ｐｒａｄｉｅｒ，Ｊ．−Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｕｅｒｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ＧＴＰγＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３，３１，５７３−５８４．）、Ｄ１遺伝子産物の関与についても明確な結論は得られていない。
塚田らはｄ１系統の種子由来のカルスにおけるエリシター応答性諸反応を野生型と詳細に比較し、有意な差が認められないことを示した（Ｔｓｕｋａｄａ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．Ｒｉｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｈｉｔｉｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃｏｕｐｌｅ  ｔｏ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｄａｉｋｏｋｕ  ｄｗａｒｆ（ｄ１）ｍｕｔａｎｔｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  α−ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔｒｕｍ，２００２，１１６，３７３−３８２）。
予備的実験の結果からＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のｄ１系統におけるエリシター誘導も野生型と同じタイムコースをたどることを確認した。
一方、上口−田中ら（Ｕｅｇｕｃｈｉ−Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｍ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．Ｒｉｃｅ  ｄｗａｒｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｄ１，ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  α  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００，９７，１１６３８−１１６４３．）は発芽種子アリューロンにおけるαアミラーゼの誘導を指標として、ジベレリンのシグナル伝達にＤ１遺伝子が関与していることを示した。これより先にＳｃｈｕｍａｃｈｅｒら（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｔ．，Ｒｏｓｓｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｔｈｅｒｅｓ，Ｋ．Ｔｈｅ  Ｌａｔｅｒａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｌｓ）ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＨＩＩＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，２９０−２９５．）はトマトの腋芽抑制遺伝子の産物がＳｃａｒｅｃｒｏｗと同じ遺伝子ファミリーに属することを明らかにし、その形態形成における役割の考察においてこの遺伝子産物とジベレリンとの何らかの相互作用の可能性を指摘した。
そこでＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子についてそのジベレリン応答性を検討した。懸濁培養細胞に活性型ジベレリンの一つＧＡ３を処理し、タイムコースを追ってこれら両遺伝子の発現変化を解析したが、処理３時間後まで見る限りでは両遺伝子ともその発現量に有意な変化は認められなかった。培養細胞の培地には細胞の分裂能を維持するために植物によって代謝されにくいオーキシン、２，４Ｄが含まれている。これがジベレリンの作用を抑制している可能性が考えられたため、細胞を２，４Ｄを含まない培地であらかじめ洗浄した後、同じ培地中で２時間前培養し、ＧＡ３を処理したところ、処理１０分後をピークとする一過的な発現が観察された（図７）。
これまで、ジベレリンシグナル伝達の研究は穀物種子のアリューロン組織におけるαアミラーゼの誘導を指標とした解析が中心であり、培養細胞を用いた例は上記の結果が初めてである。そこでジベレリンによるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の培養細胞での発現を指標としてその応答性をさらに詳細に解析した。
図８はこれら両遺伝子の発現誘導に対するＧＡ３の濃度効果をみたものである。両遺伝子とも１０−６ＭのＧＡ３処理によってその発現が誘導されはじめ、１０−４Ｍでほぼ飽和に達した。Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙら（Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙ，Ｍ．，Ｏｖａｄｉｓ，Ｍ．，Ｉｔｚｈａｋｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．ＣＨＲＣ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２，２４７４７−２４７５０．）はキュウリ花弁色素体のカロチノイド結合タンパク質、ＣＨＲＣのジベレリンによる誘導には少なくとも１０−７ＭのＧＡ３が必要で、１０−４Ｍまでほぼ直線的に発現量が増大することを報告しており、材料、遺伝子が異なるがＧＡ３の有効濃度に関しては似たような結果となっている。
［実施例５］
ジベレリンはオーキシンやサイトカイニンと異なり、生理活性ではなくｅｎｔジベラン骨格をもつ化合物として定義されているため、その活性には大きな差がある。これまで述べてきたＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のＧＡ３による発現誘導がその生理活性に基づくものかそれともｅｎｔジベラン骨格自体にこの両遺伝子を誘導する活性があるのかを調べるために活性型（ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４）、不活性型（ＧＡ１３、ＧＡ１７）のジベレリン（Ｃｒｏｚｉｅｒ，Ａ．，Ｋｕｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｄｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｐｈａｒｉｓ，Ｒ．Ｐ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ２６  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ  ｉｎ  ｎｉｎｅ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ．Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ  １９７０，４８，８６７−８７７．）によるこれら両遺伝子の発現誘導を解析した。その結果、両遺伝子とも活性型ジベレリンによってのみその発現が誘導された（図９）。この結果はこれまでに述べてきたジベレリンによるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の発現誘導がジベレリンの受容体を介したシグナル伝達を介するものであることを強く示唆している。
［実施例６］
培養細胞はオーキシン存在下で脱分化状態にあると考えられており、葉緑体をもたないために従属栄養条件下で生育するなど、植物体とは組織学的、生理学的に大きく異なるものである。したがってこれまで述べてきたＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のジベレリンによる誘導現象は培養細胞における特殊な現象である可能性が否定できない。そこでイネ緑葉において両遺伝子がジベレリンにどのように応答するかを解析した。播種後３週間のイネの３，４葉にＧＡ３（５０μＭ）をスプレーしタイムコースを追って全ＲＮＡを抽出して両遺伝子の発現量変化を解析した。その結果両遺伝子ともスプレー後３０分をピークとする極めて迅速な一過的発現を示した（図１０）。したがって培養細胞における、ジベレリン受容体を介したシグナルは培養細胞特有のものではなく、イネ植物体においても機能していることが強く示唆された。
［実施例７］
Ｋｕｏら（Ｋｕｏ，Ａ．，Ｃａｐｐｅｌｌｕｔｉ，Ｓ．，Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｈ，Ｄ．Ｓ．Ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｂｌｏｃｋｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｇｅｓ，ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ａｌｅｕｒｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９６，８，２５９−２６９．）はコムギアリューロン層におけるαアミラーゼのジベレリンによる誘導がタンパク質脱リン酸化酵素阻害剤の一つであるオカダ酸によって特異的に阻害されることを見いだした。オカダ酸は動物のタンパク質脱リン酸化酵素のうちＰＰ１、ＰＰ２Ｂを阻害することが知られている。
一方タンパク質リン酸化酵素阻害剤であるスタウロスポリン、Ｋ−２５２−Ａはほとんど阻害しなかったことから、ジベレリンからαアミラーゼ遺伝子に至るシグナル伝達にはタンパク質リン酸化、特にタンパク質脱リン酸化酵素が重要な関与をしていると推測した。
一方、これまでの我々の結果ではエリシター応答性遺伝子の発現誘導はＫ−２５２−Ａの前処理によって強く阻害されることが明らかになっている（Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｙａｚａｋｉ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｔａｋａｉ，Ｒ．，Ｙａｍａｄａ，Ｋ．，Ｓａｋａｎｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ，Ｎ−ａｃｅｔｈｙｌｃｈｉｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔ．１９９８，１２，１１６７−１１７４．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ａ．，Ｈｉｂｉ，Ｔ．，Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，３９，９０７−９１４．）。
そこでイネ培養細胞におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のジベレリンおよびエリシターによる誘導における種々の阻害剤の影響を検討した。まずＫｕｏらの結果を参照してオカダ酸を前処理した細胞では両遺伝子のキチン７量体による誘導はほとんど阻害されなかったのに対してＧＡ３による誘導はほぼ完全に阻害された（図１１Ｂ）ことから、イネ培養細胞におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子へのジベレリンからのシグナル伝達にはタンパク質脱リン酸化酵素の関与が推定された。つぎにタンパク質リン酸化酵素阻害剤について検討した。受容体型チロシンキナーゼの阻害剤として知られるラベンダスチンＡはオカダ酸とほぼ同様の阻害を示し、キチン７量体による誘導をほとんど阻害しないのに対しＧＡ３による誘導をほぼ完全に阻害した（図１１Ｃ）。タンパク質セリン・スレオニンリン酸化酵素、タンパク質チロシンリン酸化酵素のいずれをも阻害するとされるＫ−２５２−Ａは両遺伝子のキチン７量体およびＧＡ３による誘導をほぼ完全に阻害した（図１１Ｄ）。
コムギアリューロン層におけるαアミラーゼのジベレリンによる誘導はオカダ酸によって阻害されるがＫ−２５２−Ａによっては阻害されないと報告されている（Ｋｕｏ，Ａ．，Ｃａｐｐｅｌｌｕｔｉ，Ｓ．，Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｈ，Ｄ．Ｓ．Ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｂｌｏｃｋｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｇｅｓ，ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ａｌｅｕｒｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９６，８，２５９−２６９．）。
図１１の結果は、培養細胞におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のジベレリン誘導においてもオカダ酸によって阻害されるタンパク質脱リン酸化酵素の関与のほかに、Ｋ−２５２−Ａ、ラベンダスチンＡによって阻害されるタンパク質リン酸化酵素の関与を示唆するものであり、アリューロン層におけるシグナル伝達との共通性、相違点が認められた。また、ジベレリンからのシグナル伝達はキチン７量体からのものとは質的に異なると考えられる。
Ｒｉｃｈａｒｄら（Ｄｏｎａｌｄ  Ｅ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊｉｎｒｏｎｇ  Ｐｅｎｇ，ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｐ．Ｈａｒｂｅｒｄ  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ｖｏｌ２２，ｐ５７３−５７７（２０００））は、ＧＲＡＳファミリーは後生動物に幅広く見いだされる転写因子、ＳＴＡＴに対応するものであるという仮説を提唱している。ＳＴＡＴではＣ末領域には動物の転写因子、ＳＴＡＴファミリーに共通したＳＨ２領域に類似した構造が見いだされる。ＳＨ２領域のＣ末端付近に動物のＳＴＡＴでもよく保存されリン酸化を受けることが知られているチロシン残基、およびこのリン酸化チロシンと静電的に相互作用するとされるアルギニン残基が保存されている。アミノ酸配列のＮ−末付近はＣ末側に比べると相同性が低くなっている。これはＧＲＡＳファミリーに一般的である。ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のヌクレオチドレベルでの相同性は５７％であった。一方、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果これら両遺伝子は１コピーずつ存在するものと推定された（図３）。イネのゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）で完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写した。これを３２Ｐで標識したＣＩＧＲ１、ＣＩＧＲ２でハイブリダイズしたところｃＤＮＡのマップと一致するパターンが得られた。
このことからｃＤＮＡの全長鎖はそれぞれ対応する遺伝子産物と特異的にハイブリダイズするものと考えられた。両遺伝子ともジベレリンシグナルの負の制御因子であるＧＡＩ／ＲＧＡサブファミリーに共通するＤＥＬＬＡ配列を有していない。
産業上の利用の可能性
本発明者によって、植物におけるエリシターおよびジベレリン応答植物遺伝子が提供された。エリシターは、植物において、種々の防御関連酵素遺伝子を誘導し、防御反応を引き起こすことが知られている。よって、エリシターによって誘導されるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子は、病害抵抗性が付与された組み換え作物において有用であることが大いに期待される。
【配列表】
2003054196.tif 000002
2003054196.tif 000003
2003054196.tif 000004
2003054196.tif 000005
2003054196.tif 000006
2003054196.tif 000007
2003054196.tif 000008
2003054196.tif 000009
2003054196.tif 000010
2003054196.tif 000011
2003054196.tif 000012
2003054196.tif 000013
2003054196.tif 000014
2003054196.tif 000015
2003054196.tif 000016
2003054196.tif 000017
2003054196.tif 000018
2003054196.tif 000019
2003054196.tif 000020
2003054196.tif 000021
2003054196.tif 000022
2003054196.tif 000023
2003054196.tif 000024
2003054196.tif 000025
2003054196.tif 000026
2003054196.tif 000027
2003054196.tif 000028
2003054196.tif 000029
2003054196.tif 000030
2003054196.tif 000031
2003054196.tif 000032
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子からコードされるアミノ酸配列とＧＲＡＳファミリーとの比較を示す図である。ＳＬＲ（ＯｓＧＡＩ）はイネジベレリンシグナルリプレッサー（配列番号：５）、Ｔｏｍａｔｏ  Ｌｓはトマト腋芽抑制因子（配列番号：６）を示す。４種類全てで保存されているアミノ酸を＊で、３種類で保存されているアミノ酸を・で示す。
図２は、図１の続きを示す図である。
図３は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。Ａは、ＣＩＧＲ１遺伝子を示す。Ｂは、ＣＩＧＲ２遺伝子を示す。
図４は、アミノ酸レベルでのＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の進化系統を示す図である。ＡｔＳＣＲはアラビドプシスＳｃａｒｅｃｒｏｗ、ＡｔＳＣＬｎはＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子、ＡｔＧＲＳはＡｔＧＡＩに類似の機能不明の遺伝子、ＡｔＧＲＡはアラビドプシスのジベレリンシグナルリプレッサー、ＡｔＧＡＩはアラビドプシスのジベレリンシグナルリプレッサー（ＧＲＡとの機能分担については不明）、ＯｓＳＬＲはイネのジベレリンシグナルリプレッサー、Ｔｏｍａｔｏ  Ｌｓはトマトの腋芽抑制因子、アラビドプシスの光シグナル伝達因子、ＡｔＳＣＬ２１はアラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子（機能不明）、ＣＩＧＲ２は本研究で報告したイネ遺伝子、ＡｔＳＣＬ１３はアラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子（機能不明）、ＡｔＳＣＬ５はアラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子（機能不明）、ＣＩＧＲ１は本研究で報告したイネ遺伝子を示す。
図５は、ＣＩＧＲ１およびＣＩＧＲ２遺伝子の核局在を示す写真である。３５Ｓ／ＣＩＧＲ１／ＧＦＰまたは３５Ｓ／ＣＩＧＲ２／ＧＦＰ融合遺伝子をパーティクルガン法でタマネギ表皮細胞に導入し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した。対照として３５Ｓ／ＧＦＰ融合遺伝子を用いた。ａは３５Ｓ／ＧＦＰ、ｂは３５Ｓ／ＣＩＧＲ１／ＧＦＰ、ｃは３５Ｓ／ＣＩＧＲ２／ＧＦＰを表す。
図６は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のキチンオリゴマーへの応答性を示す写真である。ａは、キチン７量体処理による発現のタイムコース（分）を示す。ｂは、キチンおよびキトサンオリゴマーの誘導活性を示す。
図７は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のＧＡ３応答に対する２，４Ｄの効果を示す写真である。時間は、ＧＡ３処理後の時間を示す。
図８は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の発現誘導に及ぼすＧＡ３の濃度効果を示す図および写真である。ａは、各濃度（単位はモル濃度）のＧＡ３を１０分間処理した後に抽出した全ＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション法による解析結果を示す写真である。ｂは、イメージアナライザーによるａのシグナルの定量結果を示す図である。四角がＣＩＧＲ１遺伝子、白抜き三角がＣＩＧＲ２遺伝子を示す。
図９は、ジベレリンの生理活性と遺伝子発現を示す図および写真である。イネ培養細胞に活性型（ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４）、不活性型（ＧＡ１３、ＧＡ１７）のジベレリンを１０分間処理し、全ＲＮＡを抽出した。ノーザンブロットハイブリダイゼーション法で解析した結果を写真で示す。
図１０は、ＧＡ３処理後のイネ緑葉におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の発現を示す写真である。イネ植物体にＧＡ３をスプレー処理し、タイムコースを追って３，４葉をサンプリングした。３，４葉より抽出した全ＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイゼーション法で解析した。
図１１は、エリシター応答とジベレリン応答に対するタンパク質リン酸化阻害剤の効果を示す写真である。（Ａ）エリシター応答のポジティブコントロール、（Ｂ）オカダ酸（１μＭ）、（Ｃ）ラベンダスチンＡ（３０μＭ）、（Ｄ）Ｋ−２５２−Ａ（２０μＭ）をキチン７量体（ＧＮ７）またはジベレリン（ＧＡ３）処理１０分前に投与した。
【図１】
2003054196.tif 000033
【図２】
2003054196.tif 000034
【図３】
2003054196.tif 000035
【図４】
2003054196.tif 000036
【図５】
2003054196.tif 000037
【図６】
2003054196.tif 000038
【図７】
2003054196.tif 000039
【図８】
2003054196.tif 000040
【図９】
2003054196.tif 000041
【図１０】
2003054196.tif 000042
【図１１】
2003054196.tif 000043
【国際調査報告】
2003054196.tif 000044
2003054196.tif 000045
2003054196.tif 000046
2003054196.tif 000047