(57)【要約】（ｉ）（１）少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーター及びこのプロモーターにより制御可能な位置に存在する少なくとも１種の構造遺伝子を保持する試験細胞と被験物質とを接触させる工程と、（２）被験物質を接触させた試験細胞における前記構造遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞における前記構造遺伝子の発現量とを比較することにより、試験細胞における前記構造遺伝子の発現量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程とを含むＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。（ｉｉ）本発明者は、ＩＮＫ４ファミリーの一つであるｐ１９遺伝子のプロモーター領域及びコアプロモーター領域を始めて同定した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーター及びこのプロモーターにより制御可能な位置に存在する少なくとも１種の構造遺伝子を保持する試験細胞と被験物質とを接触させる工程と、
（２）被験物質を接触させた試験細胞における前記構造遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞における前記構造遺伝子の発現量とを比較することにより、試験細胞における前記構造遺伝子の発現量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程と
を含むＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
試験細胞が、いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターとこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを保持する細胞である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
工程（１）において、試験細胞に、被験物質の他にさらに、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させ得る阻害物質を接触させ、工程（２）において、阻害物質により低下したレポーター遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させる阻害物質が、１２−０−テトラデカノイルフォルボル−１３−アセテート、テレオシジン又はオカダ酸である請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
試験細胞が、少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子及びそのＩＮＫ４ファミリー遺伝子を制御可能な少なくとも１種のプロモーターを保持する細胞である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
工程（１）において、試験細胞に、被験物質の他にさらに、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させ得る阻害物質を接触させ、工程（２）において、阻害物質により低下したＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させる阻害物質が、１２−０−テトラデカノイルフォルボル−１３−アセテート、テレオシジン又はオカダ酸である請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
試験細胞が、少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子と該遺伝子を発現可能な少なくとも１種のプロモーターとを保持するとともに、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量が正常レベルより低下している細胞であり、工程（２）において、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
工程（１）において、試験細胞に接触させた物質を試験細胞内に導入する処理を行う請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
癌予防又は治療薬を選択するための請求項１に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬を選択するための請求項１に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
（１）いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに被験物質を接触させる工程と、
（３）プロモーターと結合した被験物質を検出する工程と
を含むＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
癌予防又は治療薬を選択するための請求項１３に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬を選択するための請求項１３に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
（１）いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに、被験物質の存在下で、ＤＮＡ結合タンパク質を接触させる工程と、
（２）被験物質の存在下と非存在下とで、ＤＮＡ結合タンパク質のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーターへの結合量を比較することより、ＤＮＡ結合タンパク質のＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターへの結合量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程と
を含むＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
癌予防又は治療薬を選択するための請求項１７に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬を選択するための請求項１７に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質。
【請求項２２】
請求項２１に記載の物質を有効成分として含む癌予防又は治療薬。
【請求項２３】
請求項２１に記載の物質を有効成分として含む、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬。
【請求項２４】
請求項２１に記載の物質を用いた癌の予防又は治療方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の物質を用いた再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療方法。
【請求項２６】
癌予防又は治療薬の製造のための請求項２１に記載の物質の使用。
【請求項２７】
再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬の製造のための請求項２１に記載の物質の使用。
【請求項２８】
いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターとこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター。
【請求項２９】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニングのための、請求項２８又は２９に記載のベクターの使用。
【請求項３１】
請求項２８又は２９に記載のベクターを保持する細胞。
【請求項３２】
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニングのための、請求項３１に記載の細胞の使用。
【請求項３３】
以下の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１における塩基番号３７８２〜３７９０の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｂ）配列番号１における塩基番号３７８２〜３７９０の塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列を含むＤＮＡ
【請求項３４】
以下の（ｃ）若しくは（ｄ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１における以下のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｄ）配列番号１における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列を含むＤＮＡ
塩基番号２９２３〜２９３１、２９４２〜２９４８、３１３５〜３１４４、３４００〜３４０６、３４４１〜３４５３、３４４６〜３４５７、３４９６〜３５０５、３５３７〜３５４６、３６００〜３６０９、３７４０〜３７５１、３７７６〜３７８４、３７８２〜３７９０の塩基配列
【請求項３５】
配列番号１における塩基番号１〜３５４９の塩基配列、塩基番号１〜３７３４の塩基配列、塩基番号３５５０〜３８１３の塩基配列及び塩基番号３７３５〜３８１３の塩基配列のうち少なくとも１の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
【請求項３６】
配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞周期の制御機能を有する癌抑制遺伝子であるヒトＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を調節する物質のスクリーニング方法、この方法により得られる物質、及び、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のうちの一つであるｐ１９遺伝子のプロモーターに関する。
背景技術
ｐ５３遺伝子は、ヒト癌において高頻度に変異が報告されている代表的な癌抑制遺伝子である。ｐ５３蛋白は、転写因子として標的遺伝子を転写レベルで活性化することにより癌の発症および進行を抑制できることが知られている。詳述すれば、ｐ５３タンパク質は、正常細胞の遺伝子に突然変異が生じて癌化に進み出すときに、Ｇ１後期で細胞周期を停止させて、その間にＤＮＡ修復を行い、さらに修復できない場合にはアポトーシスにより初期の癌細胞を死滅させると考えられている（交通医学５３（５／６），１７８−１８０，１９９９）。
ここで、ｐ５３に関連した細胞周期停止経路に関わる蛋白の一つとして、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）抑制因子であるＩＮＫ４ファミリータンパク質（ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９など）が知られている。ＩＮＫ４ファミリータンパク質は、それぞれがｃｄｋ４及びｃｄｋ６に直接結合することにより、重要な癌抑制遺伝子である網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）蛋白を脱リン酸化して活性型にする。ＲＢは、発癌を促進する転写因子であるＥ２Ｆと結合することによりＥ２Ｆを失活させる。Ｅ２Ｆは、細胞周期をＧ１期からＳ期に移行させる際に機能する遺伝子群のプロモーターに結合することによりこれらの遺伝子を活性化させ、細胞周期をＧ１期からＳ期に移行させる。
ＲＢが活性をもつ脱リン酸化型であれば、Ｇ１後期で細胞周期の進行が抑制されて細胞の無限増殖が抑えられる。一方、ｐ５３やＩＮＫ４ファミリータンパク質等の遺伝子に変異が生じて失活すると、ＲＢが不活性化型であるリン酸化型となってＥ２Ｆに結合できなくなるために、Ｅ２Ｆ依存性の遺伝子群が活性化し、細胞が無限に増殖する癌となる（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９，１１４９−１１６３、Ｎａｔｕｒｅ  ３７１，２５７−２６１、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，７０４−７０７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２６７２−２６８１）。
以上のことから、多くの癌において、ＩＮＫ４ファミリータンパク質を転写レベルで活性化すれば、癌細胞に対して選択的にｃｄｋ４及びｃｄｋ６を抑制することによりＲＢを活性化型にして、細胞周期停止を誘導し、癌を抑制することができる。従って、ＩＮＫ４ファミリータンパク質を転写レベルで活性化できる物質を見出すことができれば、癌治療及び予防に非常に有用である。
また、発癌には発癌プロモーターとなる物質が関与していることが知られている。癌抑制遺伝子であるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量がこのような発癌プロモーターにより低下している場合に、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を回復できる物質を見出すことができれば、癌治療及び予防に非常に有用である。
しかし、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を調節する物質を見出す方法は未だ報告されていない。
発明の開示
本発明の目的
本発明の目的は、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を調節する物質のスクリーニング方法、この方法により得られる物質、及び、ヒトｐ１９遺伝子のプロモーターを提供することである。
本発明により得られた知見
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
ｉ）癌抑制遺伝子であるＩＮＫ４ファミリー遺伝子及びＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターを保持する試験細胞に、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させる阻害物質（発癌プロモーター）及び被験物質を接触させ、阻害物質により低下したＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択することにより、発癌プロモーターによるＩＮＫ４ファミリー遺伝子を介した発癌を抑制できる物質を選択することができる。
ｉｉ）また、発癌プロモーターを用いるのに代えて、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量が正常レベルより低下している試験細胞を用い、この細胞に被験物質を接触させて、この細胞におけるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる物質を選択することによっても、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子を介した発癌を抑制できる物質を選択することができる。
ｉｉｉ）また、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーター及びこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子を保持する試験細胞に被験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を変化させる被験物質を選択することにより、簡便かつ高感度にＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現を調節する物質を選択することができる。ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現を増大させる物質は抗癌剤として使用でき、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現を抑制する物質は細胞増殖剤として使用できる。
ｉｖ）さらに、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターとこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子を保持する試験細胞に、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させる物質及び被験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択することにより、簡便かつ高感度にＩＮＫ４ファミリー遺伝子を介した発癌抑制物質を選択することができる。
ｖ）また、本発明者は、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の一つであるｐ１９遺伝子の部分断片を調製し、これらをプローブとしてヒト白血球ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトｐ１９遺伝子のプロモーター領域を単離することに成功した。また、このプロモーター領域の一連の欠失変異体を作製することにより、プロモーター活性に主に寄与する領域を見出した。
本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、以下のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法、この方法により得られる物質、及び、ｐ１９遺伝子のプロモーター等を提供する。
本発明の構成
１．  （１）少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーター及びこのプロモーターにより制御可能な位置に存在する少なくとも１種の構造遺伝子を保持する試験細胞と被験物質とを接触させる工程と、
（２）被験物質を接触させた試験細胞における前記構造遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞における前記構造遺伝子の発現量とを比較することにより、試験細胞における前記構造遺伝子の発現量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程と
を含むＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
２．  試験細胞が、いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターとこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを保持する細胞である項１に記載のスクリーニング方法。
３．  工程（１）において、試験細胞に、被験物質の他にさらに、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させ得る阻害物質を接触させ、工程（２）において、阻害物質により低下したレポーター遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する項２に記載のスクリーニング方法。
４．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させる阻害物質が、１２−０−テトラデカノイルフォルボル−１３−アセテート、テレオシジン又はオカダ酸である項３に記載のスクリーニング方法。
５．  試験細胞が、少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子及びそのＩＮＫ４ファミリー遺伝子を制御可能な少なくとも１種のプロモーターを保持する細胞である項１に記載のスクリーニング方法。
６．  工程（１）において、試験細胞に、被験物質の他にさらに、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させ得る阻害物質を接触させ、工程（２）において、阻害物質により低下したＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する項５に記載のスクリーニング方法。
７．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させる阻害物質が、１２−０−テトラデカノイルフォルボル−１３−アセテート、テレオシジン又はオカダ酸である項６に記載のスクリーニング方法。
８．  試験細胞が、少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子と該遺伝子を発現可能な少なくとも１種のプロモーターとを保持するとともに、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量が正常レベルより低下している細胞であり、工程（２）において、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する項１に記載のスクリーニング方法。
９．  工程（１）において、試験細胞に接触させた物質を試験細胞内に導入する処理を行う項１に記載のスクリーニング方法。
１０．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である項１に記載のスクリーニング方法。
１１．  癌予防又は治療薬を選択するための項１に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
１２．  再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬を選択するための項１に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
１３．  （１）いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに被験物質を接触させる工程と、
（２）プロモーターと結合した被験物質を検出する工程と
を含むＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
１４．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である項１３に記載のスクリーニング方法。
１５．  癌予防又は治療薬を選択するための項１３に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
１６．  再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬を選択するための項１３に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
１７．  （１）いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに、被験物質の存在下で、ＤＮＡ結合タンパク質を接触させる工程と、
（２）被験物質の存在下と非存在下とで、ＤＮＡ結合タンパク質のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーターへの結合量を比較することより、ＤＮＡ結合タンパク質のＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターへの結合量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程と
を含むＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
１８．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である項１７に記載のスクリーニング方法。
１９．  癌予防又は治療薬を選択するための項１７に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
２０．  再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬を選択するための項１７に記載のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法。
２１．  項１〜２０のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質。
２２．  項２１に記載の物質を有効成分として含む癌予防又は治療薬。
２３．  項２１に記載の物質を有効成分として含む、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬。
２４．  項２１に記載の物質を用いた癌の予防又は治療方法。
２５．  項２１に記載の物質を用いた再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療方法。
２６．  癌予防又は治療薬の製造のための項２１に記載の物質の使用。
２７．  再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞又は創傷の予防又は治療薬の製造のための項２１に記載の物質の使用。
２８．  いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターとこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター。
２９．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子が、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９からなる群より選ばれる遺伝子である項２８に記載のベクター。
３０．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニングのための、項２８又は２９に記載のベクターの使用。
３１．  請求項２８又は２９に記載のベクターを保持する細胞。
３２．  ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニングのための、項３１に記載の細胞の使用。
３３．  以下の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１における塩基番号３７８２〜３７９０の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｂ）配列番号１における塩基番号３７８２〜３７９０の塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列を含むＤＮＡ
３４．  以下の（ｃ）若しくは（ｄ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１における以下のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｄ）配列番号１における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列を含むＤＮＡ
塩基番号２９２３〜２９３１、２９４２〜２９４８、３１３５〜３１４４、３４００〜３４０６、３４４１〜３４５３、３４４６〜３４５７、３４９６〜３５０５、３５３７〜３５４６、３６００〜３６０９、３７４０〜３７５１、３７７６〜３７８４、３７８２〜３７９０の塩基配列
３５．  配列番号１における塩基番号１〜３５４９の塩基配列、塩基番号１〜３７３４の塩基配列、塩基番号３５５０〜３８１３の塩基配列及び塩基番号３７３５〜３８１３の塩基配列のうち少なくとも１の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
３６．  配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
本発明の効果
本発明によれば、癌抑制遺伝子として重要なＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を調節する物質をスクリーニングする方法が提供される。
詳述すれば、ＩＮＫ４ファミリータンパク質（代表的にはｐ１５、ｐ１６、ｐ１８、ｐ１９）遺伝子は、ＲＢの脱リン酸化を介して細胞周期停止を引き起こすことにより癌抑制に関与している。ＩＮＫ４ファミリータンパク質は、いずれが欠けても発癌を招くために、各タンパク質がＲＢの脱リン酸化を介して癌抑制に機能していると考えられる。
ここで、ｐ１６は報告されている癌の約５０％において失活している（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９８  Ｍａｒ；１６（３）：１１９７−２０６）。ｐ１６の失活は、タンパク質自体が失活している場合より、プロモーターの過剰メチル化等により発現量が極端に低下している場合が多いと考えられる。従って、ｐ１６プロモーターに直接または間接的に作用することによりｐ１６遺伝子を転写レベルで活性化できる物質は、癌の治療及び予防に非常に有効である。また、ｐ１６遺伝子を転写レベルで活性化できる物質は、動脈硬化、バルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄、リウマチ性疾患等の治療及び予防にも非常に有効である。また、ｐ１６プロモーターに直接または間接的に作用することによりｐ１６遺伝子を転写レベルで抑制できる物質は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療及び予防に非常に有効である。
一方、癌におけるｐ１９、ｐ１８又はｐ１５の失活は少ない（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９９  Ｓｅｐ２０；１８（３８）：５３１１−７）。特にｐ１９の失活は殆ど報告されていない。従って、ｐ１６が失活している場合に、ｐ１９、ｐ１８又はｐ１５（特にｐ１９）を転写レベルで活性化することにより過剰に発現させれば、ｐ１６の機能を代償させることができる。
また、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに作用する物質は、癌細胞に選択毒性を示す可能性が高い。すなわち、正常細胞ではサイクリン依存性キナーゼのレセプター部位がｐ１６で飽和しているために、ＩＮＫ４ファミリータンパク質遺伝子のプロモーターを活性化させるような物質を投与することによりその遺伝子を過剰発現させても、それ以上にサイクリン依存性キナーゼは抑制されない。一方、ｐ１６が失活している癌細胞では、サイクリン依存性キナーゼのレセプターがｐ１６で飽和されていなっため、ＩＮＫ４ファミリータンパク質の発現量を向上させることによりサイクリン依存性キナーゼを抑制することができる。この結果、ＩＮＫ４ファミリータンパク質遺伝子のプロモーターを活性化させる物質は、癌細胞に選択毒性を示す可能性が高い。
また、従来の遺伝子導入による癌治療等では、細胞への遺伝子導入効率が悪い、局所投与しなければならない、ウィルスベクターによる副作用が生じる可能性がある、生殖細胞に導入された場合には遺伝病を生む可能性がある等の難点があったが、プロモーター活性を調節することにより、目的遺伝子を転写レベルで調節できる物質を用いれば、これらの難点を解消することができる。特に、遠隔投与できること及び細胞への導入効率がよいことが大きなメリットである。
また本発明により、発癌プロモーターとして知られている１２−０−テトラデカノイルフォルボル−１３−アセテート（ＴＰＡ）がｐ１８プロモーターを特異的に阻害することによりｐ１８遺伝子の発現量を特異的に低下させることが明らかになった。すなわち、ｐ１８遺伝子が発癌プロモーターによる発癌に密接に関与している可能性が強く示唆された。このことから、ｐ１８プロモーターに作用してｐ１８遺伝子の発現量を増加させる物質を選択できる本発明のスクリーニング方法は、癌予防又は治療薬を効率よく選択できる方法である。また、イニシエーターの投与及び複数回の発癌プロモーターの投与により発癌が誘導されることから、ｐ１８遺伝子の発現量を増加させる物質を選択できる本発明のスクリーニング方法は、実際のヒト癌に対する予防薬を特に効果的に選択できる方法である。
また、本発明により、発癌プロモーターとして知られているＴＰＡにより低下させたｐ１８の発現量を、Ｒｏ３１−８４２５、ゲニステイン及びクルクミンが増大させることが明らかになった。Ｒｏ３１−８４２５はプロテインキナーゼＣの特異的抑制物質であるため（Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，１７，３８９−３９３，１９９１）、発癌抑制物質である可能性が高い。ゲニステインは優れた発癌予防剤であり、同時に抗癌剤でもある（Ｕｃｋｕｎ  Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，８８６−８９１，１９９５）。クルクミンは発癌予防剤として知られている（Ｈｕａｎｏ  Ｍ．Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８，５９４１−５９４６，１９９８，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１４，８５７−８６１，１９９３）。従って、これらの優れた発癌抑制剤や抗癌剤を選択できる本発明のスクリーニング方法は、効率よく発癌抑制剤や抗癌剤を選択できる有用な方法である。
また、本発明によれば、細胞自体の分化、増殖停止、アポトーシスを誘導することにより癌細胞を正常化させる又は死滅させる物質として注目されているヒストンデアセチラーゼ阻害剤として知られているトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）により、ｐ１５、ｐ１８、ｐ１９遺伝子の発現量が増加することが明らかになった。
一般に、ヌクレオソーム中のヒストンがアセチル化されると遺伝子の転写が促進され、脱アセチル化されると転写が抑制される。本発明において、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤により、ｐ１５、ｐ１８、ｐ１９遺伝子の発現量が増大すること、ひいてはヒストンデアセチラーゼによりｐ１５、ｐ１８、ｐ１９遺伝子の転写が抑制されることが見出された。このことから、ｐ１５、ｐ１８又はｐ１９遺伝子の発現量を増加させる物質を選択できる本発明のスクリーニング方法は、現在最も注目されている制癌剤であり、発癌予防剤でもあるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を選択できる方法である点でも、非常に有用な方法である。
さらに、本発明者は、ｐ１９プロモーター配列である配列番号１の塩基番号３７７６〜３７８４の領域（Ｓｐ１−１部位）又は塩基番号３７８２〜３７９０の領域（Ｓｐ１−２部位）を介して、ＴＳＡがｐ１９遺伝子の発現増大に関与していること、及び、Ｓｐ１−１部位又はＳｐ１−２部位には転写因子のＳｐ１及びＳｐ３が結合することをそれぞれ見出している。また、転写因子Ｓｐ１がヒストンデアセチラーゼ阻害剤と結合することが報告されている。これらのことから、ｐ１９については、ｐ１９プロモーターのＳｐ１−１部位又はＳｐ１−２部位にＳｐ１−ヒストンデアセチラーゼ複合体が結合し、ヒストンデアセチラーゼがｐ１９プロモーターのヌクレオソーム中のヒストンに作用することにより、通常はｐ１９遺伝子の発現を低いレベルに抑えていると考えられる。
本発明のスクリーニング方法は、殆どのヒト発癌に関与すると考えられている癌抑制遺伝子のＲＢの活性化物質を検索するものであるために、多くのヒト発癌の抑制に応用し得る。そのために、例えば、肝硬変から肝臓癌への進行を抑える肝臓癌予防薬のスクリーニング方法としても好適である。
また、本発明により癌抑制遺伝子であるヒトｐ１９遺伝子のプロモーターが提供された。これにより、ヒトｐ１９遺伝子のプロモーターの活性を調節し、ｐ１９遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングが初めて可能となった。
発明の詳細な記述
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法
（Ｉ−Ｉ）基本的構成
本発明のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法は、以下の工程（１）及び（２）を含む方法である。
（１）少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーター及びこのプロモーターにより制御可能な位置に存在する少なくとも１種の構造遺伝子を保持する試験細胞と被験物質とを接触させる工程
（２）被験物質を接触させた試験細胞における前記構造遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞における前記構造遺伝子の発現量とを比較することにより、試験細胞における前記構造遺伝子の発現量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程
ＩＮＫ４ファミリー
本発明においてＩＮＫ４ファミリーとは、サイクリン依存性キナーゼであるｃｄｋ４及びｃｄｋ６を特異的に阻害するタンパク質であり、かつ、３２アミノ酸からなるアンキリンモチーフと呼ばれる構造単位を４回又は５回繰り返した構造を有する。ＩＮＫ４ファミリーには、代表的には、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８及びｐ１９が含まれる。
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーター
ｐ１５遺伝子のプロモーターの塩基配列はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５  Ｎｏｖ１０；２７０（４５）：２６７５０−３に記載されており、ｐ１６遺伝子のプロモーターの塩基配列はＭｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ｍａｒ；１６（３）：８５９−６７に記載されておりｐ１８遺伝子のプロモーターの塩基配列は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９  Ｊｕｌ  ５；２５９（２）：３８４−９１及びＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８  Ｊｕｎ  ９；２４７（１）：１４６−５３に記載されている。
本発明のスクリーニング方法において、ｐ１５、ｐ１６及びｐ１８の「プロモーター」には、上記の各塩基配列からなるＤＮＡ、上記の塩基配列を含むＤＮＡ、上記の塩基配列のうちプロモーター活性に主に寄与する領域の塩基配列を含むＤＮＡ、及び、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ等が含まれる。
これらのＤＮＡは、化学合成法により作製することもできるが、上記文献に記載された塩基配列に基づき設計したプローブを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法、上記文献に記載された塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行う方法等によっても作製できる。
また、ｐ１９遺伝子のプロモーターは、後述する塩基配列を有する本発明のＤＮＡである。本発明のスクリーニング方法において、ｐ１９の「プロモーター」にも、後述する塩基配列からなるＤＮＡ、後述する塩基配列を含むＤＮＡ、後述する塩基配列のうちプロモーター活性に主に寄与する領域の塩基配列を含むＤＮＡ、及び、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ等が含まれる。
構造遺伝子
構造遺伝子としては、当該ＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーターに対応するＩＮＫ４ファミリー遺伝子、例えばｐ１５プロモーターに対してｐ１５遺伝子が挙げられる。また、レポーター遺伝子も使用できる。
被験物質
本発明のスクリーニング方法において、被験物質の種類は特に制限されない。例えばタンパク質、ペプチド、これらをコードするＤＮＡ、非ペプチド性物質（糖質、脂質など）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞の核抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、微生物の培養上清等を用いることができる。これらは自然界から単離されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。これらの物質の種類および分子量は特に制限されないが、細胞内への移行性を考慮すれば、低分子化合物であるのが好ましい。
判定
工程（２）においては、被験物質を接触させた試験細胞における構造遺伝子の発現量と、被験物質を接触させない試験細胞における構造遺伝子の発現量とを、それぞれ評価した後、両発現量を比較することができる。また、被験物質を接触させた試験細胞における構造遺伝子の発現量と、被験物質を接触させない試験細胞における構造遺伝子の発現量とを、直接比較することもできる。
（Ｉ−ＩＩ）第１のスクリーニング方法
第１のスクリーニング方法は、上記の本発明の基本のスクリーニング方法において、試験細胞として、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターとこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを保持する細胞を使用する方法である。
すなわち、以下の工程（１）及び（２）を含む方法である。
（１）いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターとこのプロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを保持する試験細胞と被験物質とを接触させる工程
（２）被験物質を接触させた試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程
レポーター遺伝子
本発明方法において使用するレポーター遺伝子は、その遺伝子の発現を定性的又は定量的に確認できる遺伝子をいう。
レポーター遺伝子としては、例えば公知のレポーター遺伝子を広く使用できる。このような公知のレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）のような、酵素であってその酵素による生成物の定量が可能な酵素、発光タンパク質、蛍光タンパク質、細胞外分泌タンパク質、着色タンパク質、細胞死を引き起こすタンパク質等が挙げられる。これらのうち、ルシフェラーゼ遺伝子は、高感度であること、活性の測定が容易であること等により好ましい。
これらは、内在性のプロモーター領域が欠損したレポータープラスミドまたは内在性のエンハンサーが欠損したレポータープラスミドとして市販されている。ルシフェラーゼプラスミドとしては、ｐＴ８１１ｕｃ、ｐＳｌｕｃ２、ｐＸＰ１／ｐＸＰ２（いずれも、Ｎｏｒｄｅｅｎ，１９８８）等が市販されている。
レポーター遺伝子の発現量を測定するにあたっては、前記のレポータータンパク質のうち、ＳＥＡＰおよびｈＧＨは分泌型タンパク質であるため細胞の培養上清のタンパク質発現量を定量すればよく、その他のレポータータンパク質は界面活性剤等を用いて溶解した細胞溶解物中のタンパク質発現量をこれらのタンパク質に応じた方法で測定すればよい。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、細胞溶解物について、ルシフェラーゼにより触媒されるルシフェリンの分解による蛍光をルミノメーターを用いて検出することにより定量することができる。また、細胞が発する蛍光をルミノメーターを用いて検出することもできる。
後述するように、レポーター遺伝子の発現量は、必ずしも正確に定量する必要はなく、目視等により大まかに定量する（定性的に確認する）こともできる。
これらのレポーターアッセイは、マニュアル作業でも行えるが、機械を用いて自動で行ういわゆるハイスループットスクリーニング（組織培養工学、Ｖｏｌ２３，Ｎｏ．１３，５２１−５２４，米国特許第５，６７０，１１３号）を用いることにより迅速かつ簡便に行うことができる。
試験細胞
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーター及びレポーター遺伝子を保持させる試験細胞としては、それには限定されないが、哺乳動物細胞又は昆虫細胞などを用いることができる。
哺乳動物細胞としては、例えばベロ細胞、ヒーラ細胞、ＣＶ１細胞、ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＨＯ細胞等の公知の細胞を使用できる。また、ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ８５）、大腸癌細胞株のＤＬＤ−１、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（国立医薬品食品衛生研究所細胞バンク、ＪＣＲＢ０１３４）、ヒト腎上皮細胞株２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５７３）、赤白血球病細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３）等の癌細胞を使用することもできる。継代培養が容易であり、正常細胞の多くの性質を有していることから、一次スクリーニングの段階では癌細胞を用いてもよい。
昆虫細胞としては、例えばＳｆ細胞、ＭＧ１細胞、Ｈｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞等の公知の細胞を使用できる。
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーター及びこれに発現可能に連結されたレポーター遺伝子は、試験細胞に一時的又は恒常的に導入することができるが、恒常的に導入することが好ましい。
接触・判定
試験細胞と被験物質との接触は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち、ベクターを保持する細胞は、その細胞に適した培地を用いて継代し、対数増殖期の状態になるように培養しておく。被験物質を接触させる際には、細胞を２０〜３０％程度コンフルエントになるように播き、２４時間程度培養する。次いで、被験物質を、その種類によって異なるが例えば５ｎＭ〜５０μＭ程度の濃度になるように細胞培養に添加する。次いで、３７℃程度で、１２〜４８時間程度インキュベートする。なお、被験物質によりプロモーターが活性化され、アポトーシスが誘導されてしまうのを防ぐために、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）阻害剤を添加してもよい。
この後、被験物質を接触させた試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量とをそれぞれ評価し、両発現量を比較する場合は、以下の方法で、評価及び判定すればよい。
レポーター遺伝子の発現量をレポーター遺伝子に応じた方法で測定することにより評価する。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、細胞を界面活性剤入り溶解剤で溶解し、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェリンの分解による発光をルミノメーターを用いて検出すればよい。
被験物質を用いることにより、ルシフェラーゼ活性が被験物質を接触させない対照の例えば７０％以下、好ましくは５０％以下になる場合には、プロモーターが抑制されたと判定すればよい。また、ルシフェラーゼ活性が対照の例えば１５０％以上、好ましくは２００％以上になる場合には、プロモーターが活性化されたと判定すればよい。
また、被験物質を接触させた試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現量とを、目視等により直接比較することにより、プロモーターが活性化又は抑制されることを定性的に確認することもできる。
この場合は、発現量の増大又は減少が目視等により確認された場合に、プロモーターが活性化又は抑制されたと判定すればよい。
この方法によると、細胞膜受容体などを介して間接的にＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターの活性に影響を与える物質の他、細胞内に取り込まれて直接本発明のプロモーターに結合する低分子化合物、細胞内に取り込まれて他の細胞内タンパク質に作用することにより間接的に本発明のプロモーターに作用する低分子化合物等が選択される。
（Ｉ−ＩＩＩ）第２のスクリーニング方法
第２の方法においては、上記第１のスクリーニング方法の工程（１）において、試験細胞に、被験物質に加えてＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量（第２の方法において実際に低下させるのはレポーター遺伝子の発現量）を低下させ得る阻害物質を接触させる。
阻害物質
阻害物質は、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させ得るものであればよく、公知の発癌プロモーターの中から選択することができる。
ｐ１８プロモーターの阻害物質として本発明者は、１２−０−テトラデカノイルフォルボル−１３−アセテート（ＴＰＡ）、テロシジンを見出しているが、他の候補物質として、テレオシジン、オカダ酸等が挙げられる。
接触・判定
試験細胞に接触させる阻害物質の濃度は、標的ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量（ここではレポーター遺伝子の発現量）を例えば３０〜５０％程度以上低下させる濃度とすればよい。
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量（ここではレポーター遺伝子の発現量）が、阻害物質を加えない場合の８０〜９０％程度以上、好ましくは９０〜１２０％程度以上にまで増加又は回復させる被験物質を、阻害物質によるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現阻害の回復物質として選択できる。
また、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量の増加又は回復が、目視等により定性的に確認された被験物質を、阻害物質によるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現阻害の回復物質として選択することもできる。
（Ｉ−ＩＶ）第３のスクリーニング方法
第３の方法においては、上記本発明のスクリーニング方法において、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子及びそのＩＮＫ４ファミリー遺伝子を制御可能なプロモーターを保持する試験細胞を用いる。すなわち、第３のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法は以下の工程を含む。
（１）少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子及びそのＩＮＫ４ファミリー遺伝子を制御可能な少なくとも１種のプロモーターを保持する試験細胞と被験物質とを接触させる工程
（２）被験物質を接触させた試験細胞における前記ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量と被験物質を接触させない試験細胞における前記ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量とを比較することにより、試験細胞における前記ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程
第３の方法においては、試験細胞として、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子及び当該ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターを保持する細胞をそのまま使用すればよい。試験細胞は、通常全てのＩＮＫ４ファミリー遺伝子及びそのプロモーターを保持する。
試験細胞としては、例えば上記本発明の第１の方法で説明した哺乳動物細胞を使用できる。取り扱いが容易である点で癌細胞が好ましい。
遺伝子発現量の測定方法
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量は、例えば対応するｍＲＮＡ量又はタンパク質量を公知の方法により測定することにより評価できる。すなわち、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子に対するプローブを用いたノーザンブロット又はＩＮＫ４ファミリータンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット等により測定することができる。
被験物質と試験細胞との接触方法及び判定基準は、上記第１の方法で説明した通りである。
また、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量は、必ずしも定量しなくてもよく、被験物質を接触させた場合と接触させない場合との差を、直接目視等により定性的に確認できた被験物質を選択することもできる。
この方法によると、細胞膜受容体などを介して間接的にＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターの活性に影響を与える物質の他、細胞内に取り込まれて直接本発明のプロモーターに結合する低分子化合物、細胞内に取り込まれて他の細胞内タンパク質に作用することにより間接的に本発明のプロモーターに作用する低分子化合物等が選択される。
（Ｉ−Ｖ）第４のスクリーニング方法
第４の方法では、第３の方法の工程（１）において、試験細胞に、被験物質に加えてＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させ得る阻害物質を接触させる。
阻害物質の種類、使用濃度、被験物質と試験細胞との接触方法、判定基準については、上述した第２の方法の場合と同様である。この方法によれば、阻害物質により低下したＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる被験物質が選択される。
第４の方法においては、阻害物質により発現量を低下させたそのＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加又は回復させる被験物質を選択してもよく、又は、発現量を低下させたＩＮＫ４ファミリー遺伝子とは異なるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加又は回復させる被験物質を選択してもよい。例えば、ｐ１８の発現量を低下させる阻害物質を使用した場合、ｐ１８の発現量を増加又は回復させる被験物質を選択すればよいが、例えばｐ１５の発現量を増加又は回復させる被験物質を選択してもよい。
（Ｉ−ＶＩ）第５のスクリーニング方法
本発明の第５の方法は、上記本発明の第３のスクリーニング方法において、試験細胞として、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量が正常レベルより低下している細胞を用いる方法である。
このような細胞は、例えばベロ細胞、ヒーラ細胞、ＣＶ１細胞、ナマルバ細胞等の公知の哺乳動物細胞を変異剤で処理すること等により得ることができる。これらの細胞は、試験細胞の少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量が変異処理しない場合の５０〜１０％程度に低下しているものであることが好ましい。
被験物質の接触方法及び判定方法は、第２の方法について説明した通りである。この方法によると、少なくとも１種のＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターの発現量を増加させる物質を選択できる。
（Ｉ−ＶＩＩ）第６のスクリーニング方法
本発明の第６のスクリーニング方法は、本発明の第１〜第５のスクリーニング方法の工程（１）において、試験細胞に被験物質あるいはさらに阻害物質を接触させ、さらにこれらの物質を試験細胞内に導入する方法である。
導入方法としては、遺伝子導入に通常用いられるリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法などを採用できる。これらの公知の方法により、試験細胞に被験物質などを一時的に導入した後、レポーター遺伝子又はＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を測定すればよい。
また、被験物質がタンパク質やペプチドである場合には、膜透過タンパク質との融合タンパク質とすることにより細胞内に導入することができる。
第６の方法により、直接プロモーターＤＮＡと結合する物質の他に、細胞内の内在性タンパク質等に作用して間接的にプロモーターＤＮＡの活性を調節する物質を得ることができる。
また、この方法の他の例としては、ワンハイブリッド法（ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ）法を例示できる。具体的には、プロモーターＤＮＡを挿入したレポータープラスミドを細胞に安定に導入し、次いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択することにより、プロモーターＤＮＡに結合するタンパク質等を選択する。この方法により、直接プロモーターＤＮＡと結合するタンパク質等の他に、細胞内の内在性タンパク質等に作用して間接的にプロモーターＤＮＡの活性を調節するタンパク質等を得ることができる。ワンハイブリッド法（Ｌｉ  Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  Ｉ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１８７０−１８７３、Ｗａｎｇ  Ｍ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  Ｒ．Ｒ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：１２１−１２６）は、例えば「Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）等の市販のキットを用いて行うことができる。
被験物質あるいはさらに阻害物質の接触方法及び判定基準は、第１〜５の方法の場合と同様である。
（Ｉ−ＶＩＩＩ）第７のスクリーニング方法
本発明の第７のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法は、以下の工程を含む方法である。
（１）いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに被験物質を接触させる工程
（２）プロモーターと結合した被験物質を検出する工程
この方法では、通常６ｂｐ以上、より好ましくは１８ｂｐ以上のプロモーターＤＮＡ断片を用いることができる。
この方法の１例としては、アフィニティー精製を例示できる。具体的には、プロモーターＤＮＡをビオチン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに結合させてＤＮＡアフィニティービーズを作製する。次いで、これを被験物質とインキュベートしてプロモーターＤＮＡと特異的に結合する被験物質を精製し、この構造を決定すればよい。
この方法において被験物質は、上記例示した被験物質をいずれも使用できる。特に、細胞の核抽出液は、通常、転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質が含まれていることから好ましい。タンパク質等の混合物を用いる場合には、直接プロモーターＤＮＡと結合する被験物質の他、ＤＮＡ結合活性は持たないがＤＮＡ結合タンパク質等と複合体を形成することによりプロモーターＤＮＡに間接的に結合するタンパク質等を選択することができる
また、この方法の他の例としては、被験物質がタンパク質等である場合には、サウスウェスタンブロットを例示できる。具体的には、タンパク質等の混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したものをフィルター膜に転写した後、プロモーターＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、このＤＮＡプローブと結合するタンパク質等を選択する。
サウスウェスタンブロットの他の具体例としては、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌でタンパク質等を発現させ、これらをフィルター膜に転写した後、プロモーターＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、該ＤＮＡプローブと結合するタンパク質等を発現するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単離する方法を例示できる。この方法によると、プロモーターＤＮＡに結合する活性を有するタンパク質等とともに、これをコードする遺伝子を得ることができる。
この方法のさらに他の例としては、被験物質がタンパク質等である場合には、ゲルシフト法を例示できる。具体的には、タンパク質等の混合物を、アイソトープなどにより標識したプロモーターＤＮＡプローブと混合し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質等とプロモーターＤＮＡとの複合体のバンドをゲルシフト法により検出する。この方法によると、プロモーターＤＮＡに直接結合するタンパク質等およびこのタンパク質等に結合することにより間接的にプロモーターＤＮＡに結合するタンパク質等の双方が得られる。
（Ｉ−ＩＸ）第８のスクリーニング方法
本発明の第８のＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質のスクリーニング方法は、以下の工程を含む方法である。
（１）いずれか一つのＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに、被験物質の存在下で、ＤＮＡ結合タンパク質を接触させる工程
（２）被験物質の存在下と非存在下とで、ＤＮＡ結合タンパク質のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーターへの結合量を比較することより、ＤＮＡ結合タンパク質のＩＮＫ４ファミリー遺伝子プのロモーターへの結合量に影響を及ぼす被験物質を選択する工程
この方法において被験物質は、上記例示した被験物質をいずれも使用できる。
ＤＮＡ結合タンパク質としては、コンピューターを用いた検索によりスクリーニングに使用するプロモーターＤＮＡ断片に結合することが予想されている転写因子等のタンパク質を用いることができる。
この方法の具体例としては、前記説明したゲルシフト法を例示できる。具体的には、被験物質の存在下または非存在下で、ＤＮＡ結合タンパク質と標識されたＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターＤＮＡプローブとを結合させ、ＤＮＡ結合タンパク質とこのプロモーターＤＮＡとの複合体のバンドの形成を促進または阻害する物質を選択する。これにより、プロモーターに直接結合はしないが、ＤＮＡ結合タンパク質のプロモーターへの結合を促進または抑制する物質を選択することができる。例えば、プロモーターに結合するタンパク質等が生体内でプロモーターの活性を阻害するような場合、このタンパク質等とプロモーターとの結合を阻害するような物質は、プロモーターの活性を促進できると考えられる。
また、この方法の他の例としては、以下の方法を例示できる。すなわち、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに結合することが予想されているＤＮＡ結合タンパク質にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを融合したタンパク質を精製して、この融合タンパク質を抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビチオン化したプロモーターＤＮＡを融合タンパク質と接触させ、融合タンパク質とプロモーターＤＮＡとの結合をストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼで検出する。プロモーターＤＮＡ添加の際、被験物質も添加し、融合タンパク質とプロモーターＤＮＡとの結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。
ＩＮＫ４ファミリー遺伝子プロモーターＤＮＡへのＤＮＡ結合タンパク質の結合量を、例えば３０％以上、好ましくは５０％以上促進又は低減させる化合物を、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量に影響を及ぼす物質として選択することができる。
また、このように被験物質の存在下での結合量及び非存在下での結合量をそれぞれ定量して両者を定量的に比較する方法の他、目視等により両結合量の差を定性的に直接比較して差がある被験物質を選択することもできる。
この方法によると、直接ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターに作用する物質およびＤＮＡ結合タンパク質に作用する物質の双方が得られる。例えば、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターＤＮＡに結合するタンパク質が生体内でＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターの活性を阻害する場合、このタンパク質とプロモーターＤＮＡとの結合を阻害するような化合物はＩＮＫ４ファミリー遺伝子のプロモーターの活性を促進できると考えられる。
（ＩＩ）スクリーニング方法により得られた物質
上記本発明のスクリーニング方法によりＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現調節物質が得られる。
得られた物質は、以下の形態で医薬として使用できる。すなわち、そのまま又は薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、潤沢剤等が含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製できる。この医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤）等に応じて経口投与又は非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、当業者であれば容易に定めることができる。
また、得られた物質がオリゴペプチド又はタンパク質である場合には、膜透過性タンパク質との融合タンパク質として投与することができる。これにより当該オリゴペプチド又はタンパク質を、膜透過性タンパク質の細胞膜透過機構を利用することにより細胞内に移行させることができる。また、当該オリゴペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡを、遺伝子治療用のウィルスベクターに組み込んで、目的細胞に導入することもできる。これらの場合も、投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、当業者であれば適宜選択することができる。
また、得られた物質がポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである場合には、前述した医薬組成物の形態で医薬として投与できる他、例えばリポソーム内に封入して送達するリポソームデリバリーシステム、マイクロインジェクション、直接注射法、遺伝子銃等を利用して細胞内に導入することもできる。これらの場合も、投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、当業者であれば適宜選択することができる。さらに、遺伝子治療用のウィルスベクター等に組み込んで、目的細胞に導入することもできる。
得られた物質がＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増大させるものである場合には、当該物質を有効成分とする医薬は、悪性腫瘍（癌）、動脈硬化、バルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄、リウマチ性疾患のような細胞増殖性疾患の治療又は予防薬として有用である。一方、得られた物質がＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を低下させるものである場合には、当該物質を有効成分とする医薬は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療又は予防薬として有用である。
（ＩＩＩ）ヒトｐ１９遺伝子のプロモーター
（ＩＩＩ−Ｉ）プロモーター領域の単離
本発明者は、ヒトｐ１９遺伝子のプロモーターＤＮＡを得るために、ヒトｐ１９塩基配列（日本ＤＮＡデータバンクＮｏ．ＡＦ０４４１７１）に基づき、二つのオリゴヌクレオチド５’ＡＧＣＴＣＧＴＡＧＴＡＡＧＧＧＣＣＡＡＴＧＡＡＴＧＴＴＣＴ３’（配列番号２）および５’ＡＣＡＡＡＣＴＣＧＣＴＡＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡ３’（配列番号３）を合成し、これらをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて、ヒト白血球ゲノムλＰＳライブラリーを鋳型としたＰＣＲを行い、ヒト白血球ゲノムλＰＳライブラリーをスクリーニングするためのプローブを増幅した。
この標識プローブを用いてヒト白血球ゲノムλＰＳライブラリーをスクリーニングし、ｐ１９プロモーターＤＮＡと考えられる約２０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。さらに、このＤＮＡ断片から約３．８ｋｂのＤＮＡ断片をｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０６−０４８３１）にサブクローニングし、その塩基配列を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ，ＰＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩ  ＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで決定した。
このＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。なお、この断片の３’末端に隣接して、ヒトｐ１９遺伝子のエクソン１およびイントロン１の一部が含まれており、これらの配列は、報告されているヒトｐ１９遺伝子の塩基配列（日本ＤＮＡデータバンクＮｏ．ＡＦ０４４１７１）と一致していた。
さらに、単離したＤＮＡがｐ１９プロモーターとしての活性を示すことを確認するために、前記の約３．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結したルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０６−０４８３１）を、ｐ１９プロモーター活性が高くかつ実際にｐ１９遺伝子の発現量が多いＪｕｒｋａｔ細胞（Ｄｒ．ＪＩ．Ｆｕｊｉｓａｗａ（関西医科大学）より供与）に遺伝子導入し、所定時間培養後のＪｕｒｋａｔ細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、前記プラスミドが導入されたＪｕｒｋａｔ細胞の溶解物はルシフェラーゼ活性を示し、前記の約３．８ｋｂのＤＮＡ断片は、プロモーター活性を有することが確認された。
すなわち、本発明のｐ１９遺伝子のプロモーターとして最も好ましいのは、配列表の配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡである。特に、配列表の配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡが好ましい。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中であれば６８℃で行う条件が挙げられ、５０％フォルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中であれば４２℃で行う条件が挙げられる。詳しくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第２巻に記載のサザンハイブリダイゼーションに用いられる条件が挙げられる。
なお、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡにおいて、１または２以上の塩基が置換、欠失、もしくは付加したＤＮＡは、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの公知の方法により作製できる。
本発明のプロモーターは、ヒトｐ１９遺伝子の塩基配列に基づき公知の方法で作製することができる。例えば、前述したように、ヒトｐ１９遺伝子の塩基配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ヒトゲノムライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法の他、ヒトゲノムライブラリーをＰＣＲの鋳型として用いて、ベクターＤＮＡに対応するセンスプライマーとｐ１９ＤＮＡの一部に対応するアンチセンスプライマーのオリゴヌクレオチドを合成し、これらを組み合わせてＰＣＲを行うことによっても得ることができる。
（ＩＩＩ−ＩＩ）プロモーター活性に主に寄与する領域
本発明のヒトｐ１９遺伝子のプロモーターは、少なくとも以下のａ）又はｂ）の塩基配列を含むか、又は、この塩基配列のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーター活性を有する塩基配列を含むものであってもよい。特に、以下のａ）又はｂ）の塩基配列からなるか、又は、この塩基配列のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーター活性を有する塩基配列からなることが好ましい。
ａ）配列表の配列番号１において、塩基番号１〜３５４９の塩基配列、塩基番号１〜３７３４の塩基配列、塩基番号３５５０〜３８１３の塩基配列又は塩基番号３７３５〜３８１３の塩基配列
これらの領域は、以下のようにして、プロモーター活性に寄与する領域であると結論付けられた。すなわち、ｐ１９遺伝子のプロモーター領域である配列番号１のＤＮＡが連結されたルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２について、市販のキットを用いて、プロモーター領域の一連の５’末端変異体を作製した。これらの変異体をＪｕｒｋａｔ細胞に一時的に遺伝子導入し、所定時間培養後のＪｕｒｋａｔ細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、配列番号１における塩基番号１〜３５４９の領域、塩基番号１〜３７３４の領域、又は、塩基番号３７３５〜３８１４の領域の欠失によりルシフェラーゼ活性が有意に減少した。このことから、塩基番号１〜３５４９の領域、塩基番号１〜３７３４の領域、塩基番号３５５０〜３８１３の領域又は塩基番号３７３５〜３８１３の領域に、プロモーター活性に必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が存在すると考えられる。
ｂ）配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列、又は、配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列とからなる塩基配列
塩基番号２９２３〜２９３１、２９４２〜２９４８、３１３５〜３１４４、３４００〜３４０６、３４４１〜３４５３、３４４６〜３４５７、３４９６〜３５０５、３５３７〜３５４６、３６００〜３６０９、３７４０〜３７５１、３７７６〜３７８４、３７８２〜３７９０の各塩基配列
これらの領域は、以下のようにして、プロモーター活性に必須な転写因子結合部位を含むと結論付けられた。すなわち、配列番号１の塩基配列について、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ  Ｖ２．２  ａｔ  ｔｈｅ  ＴＲＡＮＳＦＡＣ  ＷＷＷ  ｓｉｔｅを用いて、公知の転写因子との結合可能性をコンピューター検索により調べた。使用した公知の転写因子は、Ｓｐ１、ＡＰ−２、ＣＣＡＡＴ、ＳＲＹ、ＧＡＴＡ−３、Ｅ２Ｆなどである。検索の結果、上記の各ＤＮＡ領域がこれらのいずれかの転写因子と結合し得る領域であることが判明した。
また、これらのＤＮＡ領域に隣接する前後６塩基程度までのＤＮＡ領域も、転写因子との結合性に関与すると考えられる。すなわち、これらの塩基配列とこれに隣接する上流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ、これらの塩基配列とこれに隣接する下流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ、又は、これらの塩基配列とこれに隣接する上流側および下流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡも、転写因子との結合性可能性がある。「最大６塩基」には、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基または１塩基のいずれの場合も含まれる。
前記の転写因子との結合可能領域のうち、塩基番号３７８２〜３７９０で示されるＤＮＡ領域は、コアプロモーター領域と考えられる。これは、後述するように、この転写因子結合可能部位がｐ１９遺伝子の転写開始位置に最も近い転写因子結合可能部位であること、及び、ｐ１９プロモーターＤＮＡを連結したルシフェラーゼレポータープラスミドにおいて、この部位に位置指定突然変異を導入した場合には、ルシフェラーゼの発現量が有意に減少することから導かれる。
従って、本発明のｐ１９遺伝子のプロモーターとして前記ｂ）に列記したＤＮＡのうちでは、塩基番号３７８２〜３７９０の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、この塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡが、特に好ましい。さらに、塩基番号３７８２〜３７９０の塩基配列からなるＤＮＡ、又は、この塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列からなるＤＮＡがより好ましい。
（ＩＩＩ−ＩＩＩ）ヒトｐ１９遺伝子のプロモーターの有用性
本発明のプロモーターＤＮＡは、例えば、その生体内における変異によるｐ１９タンパク質の欠損あるいは発現異常症などの治療や予防に利用することができる。即ち、本発明のｐ１９プロモーターＤＮＡを有するｐ１９遺伝子を、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのベクターに挿入し、あるいはリポソームなどに封入して体細胞に導入することにより、正常な制御の下にｐ１９タンパク質を発現させることができ、これによりｐ１９タンパク質の欠損あるいは発現異常症などの改善を図ることができる。
また、本発明のプロモーターＤＮＡがある特異的な刺激により活性化または抑制されることが判明した場合、所望の遺伝子の上流に本発明のＤＮＡを挿入したベクターなどを作製して体細胞に導入し、その刺激を付加することにより、その所望の遺伝子を誘導的に発現誘導または発現抑制させることができる。例えば、所望の遺伝子として殺細胞遺伝子を用いれば、その特異的な刺激により、本発明のプロモーターＤＮＡが導入された細胞を選択的に死滅させることが可能である。このような本発明のプロモーターＤＮＡの利用は、殺傷したい細胞が存在する幅広い疾患（例えば、癌等）に適用可能である。
また、本発明のプロモーターＤＮＡと同じ塩基配列を有するＤＮＡは、細胞に存在するｐ１９プロモーターＤＮＡとこれらに結合しうるタンパク質（例えば、転写因子）との結合を拮抗阻害しうる。このためそのＤＮＡが、ｐ１９プロモーターＤＮＡのプロモーター活性を阻害するタンパク質とｐ１９プロモーターとの結合を拮抗阻害する場合には、この方法によりｐ１９プロモーター活性を促進することができ、逆にプロモーター活性を促進するタンパク質とｐ１９プロモーターとの結合を拮抗阻害する場合には、この方法によりｐ１９プロモーター活性を阻害することができる。
前述したように、ｐ１９タンパク質は細胞周期停止を引き起こす作用を有することから、ｐ１９プロモーターの活性の促進は、悪性腫瘍、動脈硬化またはバルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄のような細胞増殖性疾患の治療等に有用である。一方、ｐ１９プロモーターＤＮＡの活性の阻害は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療等に有効である。
また、本発明プロモーターＤＮＡは、前述したように、このＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子を用いること等により、このプロモーターの活性を調節する物質のスクリーニングに利用できる。すなわち、本発明のプロモーターＤＮＡは、このプロモーターＤＮＡに直接結合することにより又は細胞膜受容体や細胞内タンパク質に結合して間接的にこのプロモーターＤＮＡに作用することによりｐ１９遺伝子を転写レベルで調節できる物質をスクリーニングすることに使用できる。
ｐ１９遺伝子を転写レベルで活性化できる化合物は、悪性腫瘍、動脈硬化、バルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄、リウマチ性疾患などの細胞増殖性疾患の治療等に有用である。一方、ｐ１９遺伝子を転写レベルで抑制できる物質は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療などに有効である。
実施例
以下、本発明を実施例を示して説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
先ず、本発明のｐ１９遺伝子のプロモーター、そのプロモーター活性に必須な領域及び転写開始位置について説明し、次に、癌細胞を用いたＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を調節する物質のスクリーニング方法について説明する。
実施例１（使用細胞）
ヒトＴリンパ芽球細胞Ｊｕｒｋａｔ（Ｄｒ．ＪＩ．Ｆｕｊｉｓａｗａ（関西医科大学）より分与）を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日本、東京、ニッスイ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．０５９１８）に維持し、５％のＣＯ２を含む湿潤大気中で３７℃でインキュベートした。
実施例２（ヒトｐ１９遺伝子プロモーターＤＮＡのクローニング）
ヒトｐ１９遺伝子の塩基配列（日本ＤＮＡデータバンクＮｏ．ＡＦ０４４１７１）に基づき、二つのオリゴヌクレオチド（５’ＡＧＣＴＣＧＴＡＧＴＡＡＧＧＧＣＣＡＡＴＧＡＡＴＧＴＴＣＴ３’（配列番号２）および５’ＡＣＡＡＡＣＴＣＧＣＴＡＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡ３’（配列番号３））を合成し、これらをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて、ヒト白血球ゲノムライブラリーを鋳型としたＰＣＲを行い、ヒト白血球ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブを増幅した。
このプローブは、［γ−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ，Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ  Ｎｏ．９４５７８４）及びＢｃａ  ＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本、ＴＡＫＡＲＡ、Ｃｏｄｅ  ６０４６）を用いて標識した。標識条件は、Ｂｃａ  ＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの添付マニュアルに従った。ヒトｐ１９遺伝子の５’末端側領域を含むゲノミックＤＮＡ断片を得るために、このプローブを用いて、ヒト白血球ゲノム由来のλＰＳライブラリー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ、商品番号：ＯＢ−４９０１−００、フナコシカタログ）中のおよそ１×１０７ファージプラークをスクリーニングした。なお、スクリーニングはλＰＳライブラリーの添付マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションは５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハールト溶液と熱変性した魚の精子ＤＮＡ０．１μｇ／μｌを含む緩衝溶液中で５０℃で１６時間以上行った。一つの陽性ファージを３回スクリーニングすることにより精製した。
得られた陽性ファージプラークをλＰＳゲノムライブラリー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ、商品番号：ＯＢ−４９１０−１０、フナコシカタログ）の添付マニュアルに従って、プラスミドに転換後、ＤＮＡを増殖、精製した。具体的には、単一のコロニーをＬＢブロスの中で一晩増殖後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮのキット（ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（２５），Ｃａｔ．Ｎｏ．１２１６３，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って抽出、精製した。
ゲノミックＤＮＡ断片は制限酵素で処理し、サザンブロッティングにより分析した（ラボマニュアル遺伝子工学、第３版、松村正實編、ｐ７３−７６）。
実施例３（ヒトｐ１９プロモーターＤＮＡの塩基配列）
実施例２で取得した陽性ファージＤＮＡ由来の約３．８ｋｂのＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＶＢ２にサブクーロニングし、その配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ，ＰＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．９８０５０１０，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４３０３１５２）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで塩基配列を決定した。
また、この約３．８ｋｂのＤＮＡ断片の３’末端に隣接して、ヒトｐ１９遺伝子（日本ＤＮＡアータバンクＮｏ．ＡＦ０４４１７１）のエクソン１及びイントロン１の一部と一致する配列が存在した。このＤＮＡ断片の３８１４塩基の配列を配列表の配列番号１に示す。
実施例４（ヒトｐ１９プロモーターの転写開始部位）
転写開始部位を決定するために、ヒトｔｅｓｔｉｓ  ｃａｐ  ｓｉｔｅ  ｃＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｏｎ  Ｇｅｎｅ、戸山、東京）を用いたキャップサイトハンティング法を添付マニュアルに従い行った。すなわち、ｒ−ｏｌｉｇｏをキャップ構造を除去したヒトｔｅｓｔｉｓのｍＲＮＡの５’末端に連結し、連結されたｍＲＮＡをオリゴｄＴプライマーの存在下に逆転写により第１の標準ｃＤＮＡの合成に用いた。ｒ−ｏｌｉｇｏに相補的なセンスＤＮＡプライマー（１ＲＤＴ；５’ＧＡＴＧＣＴＡＧＣＴＧＣＧＡＧＴＣＡＡＧＴＣ３’）（配列番号４）及びｐ１９遺伝子に特異的なアンチセンスプライマー３（ＴＧＰ３；５’ＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＧＣＧ３’）（配列番号５）（日本ＤＮＡデータバンクＮｏ．ＮＭ＿００１８００）を用いて第１回目のＰＣＲを行った。第１回目のＰＣＲ産物を第２回目のＰＣＲにおける鋳型として用いた。第２回目のＰＣＲは、ｒ−ｏｌｉｇｏ（ＴＧＰ１；５’ＣＧＡＧＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＴＧＣ３’）（配列番号６）に相補的なセンスプライマー及びｐ１９遺伝子特異的なアンチセンスプライマー１（２ＲＤＴ；５’ＴＧＡＧＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＴＧＣ３’）（配列番号７）又はアンチセンスプライマー２（ＴＧＰ２；５’ＴＧＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣ３’）（配列番号８）を用いて行った。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動に供し、またＴＡベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０、Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングした後にＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて塩基配列を決定した。
第１回目のＰＣＲでは、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物は検出されなかった。第２回目のＰＣＲでは、ｒ−ｏｌｉｇｏに相補的なセンスプライマー２ＲＤＴとアンチセンスプライマーＴＧＰ１とを組み合わせた場合には約２２０塩基対の単一の増幅産物が検出されｒ−ｏｌｉｇｏに相補的なセンスプライマー２ＲＤＴとアンチセンスプライマーＴＧＰ２とを組み合わせた場合には約２５０塩基対の単一の増幅産物が検出された。このことから、ｐ１９遺伝子の転写開始位置が一つであることが分かった。電気泳動パターンを図１に示す。
また、この二つのＰＣＲ産物の塩基配列から、配列番号１の塩基番号３７９８のＧ残基がヒトｐ１９プロモーターにおける転写開始位置であることが分かった。
実施例５（転写因子結合部位の候補の検索）
ヒトｐ１９遺伝子の５’末端隣接領域（配列番号１に示す塩基配列）について、Ｍａｔ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  Ｖ２．２  ａｔ  ｔｈｅ  ＴＲＡＮＳＦＡＣ  ＷＷＷ  ｓｉｔｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４，２３８−２４１）を用いて、公知の転写因子との結合可能性をコンピューターを用いて検索した。検索に供した転写因子は、Ｓｐ１、ＡＰ−２、ＣＣＡＡＴ、ＳＲＹ、ＧＡＴＡ−３及びＥ２Ｆである。
この結果、公知の転写因子との結合可能性がある幾つかの塩基配列が見出された。これらの塩基配列は、配列表の配列番号１における塩基番号２９２３〜２９３１、２９４２〜２９４８、３１３５〜３１４４、３４００〜３４０６、３４４１〜３４５３、３４４６〜３４５７、３４９６〜３５０５、３５３７〜３５４６、３６００〜３６０９、３７４０〜３７５１、３７７６〜３７８４、３７８２〜３７９０で示される塩基配列である。これらの領域は、所定の物質が結合することにより、ｐ１９の転写を活性化または阻害することが予想される領域である。
なお、ｐ１９プロモーター領域の転写開始位置の周辺にはＴＡＴＡボックスは見出されなかった。
実施例６（プロモーター活性の確認およびプロモーター活性に主に寄与する領域の決定）
実施例６−１
実施例２で得られたヒトｐ１９プロモーター領域を含む約２０ｋｂのＤＮＡ断片から約３．８ｋｂ断片、すなわち配列番号１の塩基番号１〜３８１３の塩基配列からなるＤＮＡ断片をルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（日本，東京，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）内にサブクローニングした。このプラスミドをｐ１９（１／３８１３）と命名した。
また、ｐ１９（１／３８１３）について、本発明のプロモーター領域の二つの５’末端欠失変異体を「Ｍｕｎｇｂｅａｎｓ−Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ」、すなわち「Ｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｔａｋａｒａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて作製した。これらの変異体は、配列表の塩基番号３５５０〜３８１３を含むプラスミドｐ１９（３５５０／３８１３）及び塩基番号３７３５〜３８１３を含むプラスミドｐ１９（３７３５／３８１３）である。
これらのプラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞へと一時的に遺伝子導入した。また、対照としてｐ１９プロモーター領域を含まないルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２もＪｕｒｋａｔ細胞へと一時的に遺伝子導入した。
具体的には、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてＪｕｒｋａｔ細胞（１×１０６個）に遺伝子導入した。４８時間後の細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をＰｉｃａ  Ｇｅｎｅ発光ｋｉｔ（東洋インキ、東京、日本、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０９−０４３２１）のプロトコールに従って測定し、細胞溶解物中のタンパク量によって標準化した。タンパク量の測定は、ＤＣプロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０１１１）を用いて行った。各実験は、少なくとも２回づつ行い、ルシフェラーゼアッセイは、３回ずつ行った。また、スチューデンツＴ検定で有意差検定を行い、ｐ＜０．０５未満の場合に有意差ありとした。
結果を図２に示す。図２に示すように、略全長のｐ１９プロモーターを有するプラスミドｐ１９（１／３８１３）を導入した細胞は、極めて強いルシフェラーゼ活性を示し、この活性はｐＧＶＢ２のみ導入した細胞の約１０倍であった。このことから、配列表の配列番号１に示すＤＮＡがｐ１９遺伝子のプロモーター領域であることが確認された。
また、ｐ１９（１／３８１３）とｐ１９（３５５０／３８１３）との間に有意差が認められ、ｐ１９（１／３８１３）とｐ１９（３７３５／３８１３）との間にも有意差が認められた。また、ｐ１９（３７３５／３８１３）とｐＧＶＢ２との間に有意差が認められた。このことから、配列番号１において塩基番号１〜３５４９の塩基配列、塩基番号１〜３７３４の塩基配列、塩基番号３５５０〜３８１３の塩基配列及び塩基番号３７３５〜３８１３の塩基配列の間に、ｐ１９遺伝子のプロモーター活性に必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が含まれていると考えられる。
実施例６−２
次いで、実施例４のコンピューターによる検索から転写因子結合部位になり得ることが判明した部位のうち、転写開始位置に最も近い３つの部位（配列番号１の塩基番号３７４０〜３７５１の領域（ＡＰ−２サイト）、塩基番号３７７６〜３７８４の領域（Ｓｐ１−１サイト）及び３７８２〜３７９０の領域（Ｓｐ１−２サイト））に部位特異的突然変異導入を行った。
具体的には、配列番号１の塩基番号１〜３８１３の塩基配列を挿入したルシフェラーゼレポータープラスミドｐ１９（１／３８１３）に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、このキットの添付マニュアルに従って、以下のような置換変異を導入した。すなわち、配列番号１の塩基番号３７４０〜３７５１の５’ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴ３’（ＡＰ−２サイト：配列番号９）を５’ＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＴ３’（配列番号１０）に変異させたｐ１９ｍｕｔＡＰ−２、塩基番号３７７６〜３７８４の５’ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ３’（Ｓｐ１−１サイト：配列番号１１）を５’ＧＧＧＴＴＴＴＧＧ３’（配列番号１２）に変異させたｐ１９ｍｕｔＳｐ１−１、塩基番号３７８２〜３７９０の３’ＧＧＧＣＧＧＧＧ５’（Ｓｐ１−２サイト：配列番号１３）を３’ＧＧＡＴＧＧＧＴＡ３’（配列番号１４）に変異させたｐ１９ｍｕｔＳｐ１−２をそれぞれ作製した。
次いで、実施例６−１と同様にして、各変異レポータープラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞へと一時的に遺伝子導入し、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。
各変異体を導入した細胞のルシフェラーゼ活性を、変異させていないｐ１９（３７３５／３８１４）を導入した細胞及びｐＧＶＢ２を導入した各細胞のルシフェラーゼ活性とともに、図３に示す。図３の結果、ＡＰ−２を変異させたｐ１９ｍｕｔＡＰ−２およびＳｐ１−１を変異させたｐ１９ｍｕｔＳｐ１−１では、置換変異を導入していないｐ１９（３７３５／３８１３）との間に有意差は見出されなかった。これに対して、Ｓｐ１−２を変異させたｐ１９ｍｕｔＳｐ１−２では、置換変異を導入していないｐ１９（３７３５／３８１３）に比べてルシフェラーゼ活性が有意に低く、そのルシフェラーゼ活性はｐ１９プロモーター領域を全く含まないｐＧＶＢ２と略同じであった。
このことから、配列番号１の塩基配列において、プロモーター活性に寄与する領域である塩基番号３７３５〜３８１４の領域の中でも塩基番号３７８２〜３７９０のＳｐ１−２領域は、特にプロモーター活性に主に寄与する領域であり、転写因子結合部位またはエンハンサー部位が存在することが分かる。
実施例７（ＴＰＡによるｐ１８遺伝子の発現の阻害）
１２−０−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）がｐ１８遺伝子の発現量を低下させることをｐ１８タンパク質量及びｍＲＮＡ量を調べることにより確認した。
ヒト結腸腫瘍細胞ＨＣＴ１１６（ボルチモアのジョンスホプキンス医科大学  Ｄｒ．Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎから分与された）及びヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞２９３Ｔ（関西医科大学  Ｄｒ．ＪＩ．Ｆｕｊｉｓａｗａから分与）をそれぞれ１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン及び抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ（日水製薬社）中に維持し、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中でインキュベートした。
各培養細胞に、ＴＰＡ（ＨＣＴ１１６では３ｎＭ、２９３Ｔでは８ｎＭ）を添加し、３７℃でインキュベートした。１２、２４及び４８時間後に、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１％ＳＤＳ，１％  ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）中で溶解させた。細胞溶解液を遠心分離し、タンパク質濃度をＢＩＯ−ＲＡＤ  ＤＣプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて測定した。等量の細胞タンパク質を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。このメンブレンを、先ず一次抗体であるウサギ−抗ヒトｐ１８ＩＮＫ４ｃポリクローナル抗体（Ｎ−２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートし、次いで、２次抗体としてペルオキシダーゼが結合した抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）又は抗ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）とともにインキュベートした。２次抗体の添付マニュアルに従い、ＥＣＬ試薬を用いてシグナルを検出した。
２９３Ｔ細胞の結果を図４の（ａ）に示し、ＨＣＴ１１６細胞の結果を図４の（ｃ）に示す。図４（ａ）及び（ｃ）から、ＴＰＡは時間に依存してｐ１８タンパク質の発現量を低下させることが分かる。
また、ＴＰＡを接触させた後の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＳｅｐａｓｏｌ  ＲＮＡ分離キット（ナカライテスク社）を用いて単離した。４０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１％アガロースゲル電気泳動により分画し、ナイロンフィルターにトランスファーし、プローブを用いて検出した。ｐ１８ＩＮＫ４ｃのｃＤＮＡの一部をコードする０．６ｋｂＤＮＡ断片を、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＯ．ＮＭ＿００１２６２のデータに基づき５’−ＧＡＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＧＴＴＡＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＧＧＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧ−３’（配列番号１６）をプライマーとして用いて、ヒト脾臓ｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡ断片を放射標識し、ｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子のｍＲＮＡ検出のためのプローブとして用いた。
２９３Ｔ細胞の結果を図４の（ｅ）に示し、ＨＣＴ１１６細胞の結果を図４の（ｇ）に示す。図４（ｅ）及び（ｇ）から、ＴＰＡは時間に依存してｐ１８遺伝子のｍＲＮＡ量を低下させることが分かる。
実施例８（ＴＰＡによるｐ１８遺伝子の発現の阻害）
２９３Ｔの培養細胞にＴＰＡをそれぞれ２、４及び８ｎＭ添加して３７℃で４８時間インキュベートした。また、ＨＣＴ１１６の培養細胞にＴＰＡをそれぞれ０、１及び３ｎＭ添加して３７℃で２４時間インキュベートした。さらに、実施例７と同様にして、ｐ１８タンパク質量をウェスタンブロットにより評価した。
２９３Ｔ細胞の結果を図４の（ｂ）に示し、ＨＣＴ１１６細胞の結果を図４の（ｄ）に示す。図４（ｂ）及び（ｄ）から、ＴＰＡは用量に依存してｐ１８タンパク質の発現量を低下させることが分かる。
また、実施例７と同様にしてＴＰＡを接触させた後の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを分離し、ノーザンブロット解析によりｍＲＮＡ量を評価した。２９３Ｔ細胞の結果を図４の（ｆ）に示し、ＨＣＴ１１６細胞の結果を図４の（ｈ）に示す。図４（ｆ）及び（ｈ）から、ＴＰＡは用量に依存してｐ１８遺伝子のｍＲＮＡ量を低下させることが分かる。
実施例９
実施例７と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞に０ｎＭ又は３ｎＭのＴＰＡを接触させ、ｐ１５タンパク質、ｐ１６タンパク質、ｐ１９タンパク質、ｐ２１タンパク質、ｐ２７タンパク質、ＲＢの発現量をウェスタンブロットにより経時的に測定した。結果を図５に示す。図５から、ＴＰＡはこれらのタンパク質の発現量に影響を与えていないことが明らかである。このことから、ＴＰＡはｐ１８遺伝子の発現を特異的に阻害する物質であることが分かる。
実施例１０（ＴＰＡによるｐ１８プロモーターの抑制）
＜ヒトｐ１８遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の単離＞
ＴＰＡによるｐ１８遺伝子の発現抑制メカニズムを知るために、ヒトｐ１８遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域を連結したレポータープラスミドを導入した２９３Ｔ細胞を用いて、ＴＰＡの接触によるレポーター遺伝子の発現量を測定した。
ｐ１８ＩＮＫ４ｃ遺伝子のエキソン１の一部をコードする３２Ｐラベルされたプローブを用いてヒト白血球ゲノム由来のλＰＳ１ライブラリー（Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ）中の１×１０７ファージプラークをスクリーニングした。このプローブは、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ０４１２４９のデータに基づき、５’−ＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＡＡ−３’（配列番号１７）及び５’−ＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＧＡＧＡＧＴＣ−３’（配列番号１８）をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより得た。
得られた陽性ファージプラークを３回再スクリーニングした後、ファージＤＮＡを、クレーリコンビナーゼー発現細菌株中に導入することによりプラスミドＤＮＡに変換した。ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、サザンブロットにより解析した。
＜レポータープラスミドの構築＞
得られた陽性ファージＤＮＡ由来の約５．２ｋｂの断片をルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ社）にサブクローニングした。このプラスミドをｐ１８−ｌｕｃという。
＜ルシフェラーゼアッセイ＞
リン酸カルシウム法を用いて、ｐ１８−ｌｕｃをＨＣＴ１１６細胞及び２９３Ｔ細胞に一時的に導入した。ＨＣＴ１１６細胞及び２９３Ｔ細胞をそれぞれ１２ウェルプレートに、１．５×１０５又は２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル播種した。ＨＣＴ１１６細胞では２μｇのレポータープラスミドを用い、２９３Ｔ細胞では０．２μｇのレポータープラスミド及び１．８μｇのキャリアＤＮＡ（サケ精巣を超音波処理することにより得られたＤＮＡ；Ｓｉｇｍａ社）を用いた。
プラスミドが導入された後、２９３Ｔ細胞を、２、４及び８ｎＭのＴＰＡ（和光純薬社）を含むＤＭＥＭ培地で３７℃で４８時間インキュベートした。また、ＨＣＴ１１６細胞を、０、１及び３ｎＭのＴＰＡ（和光純薬社）を含むＤＭＥＭ培地で３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼレポータープラスミドシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼ量を測定した。以上の操作は３回づつ行い、ルシフェラーゼアッセイは３回づつ行った。
結果を図６に示す。ＴＰＡは用量に依存してルシフェラーゼ量を低下させている。このことから、ＴＰＡはｐ１８遺伝子のプロモーター活性を抑制していることが分かる。
実施例１１（ＴＰＡによるｐ１８遺伝子プロモーターの抑制機構）
ＴＰＡによるｐ１８遺伝子プロモーターの抑制のメカニズムを調べるために、実施例１０と同様にして、２９３Ｔ細胞に、８ｎＭのＴＰＡに加えて、強力で特異的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビターであるＲｏ３１−８４２５を２０ｎＭ又は１００ｎＭ接触させて、ルシフェラーゼ量に与えるＰＫＣインヒビターの影響を調べた。
結果を図７に示す。図７から明らかなように、ＴＰＡにより抑制されたルシフェラーゼ発現量はＲｏ３１−８４２５によりやや回復している。このことから、ＴＰＡによるｐ１８遺伝子プロモーターの阻害効果はＰＫＣパスウェイによるものであることが分かる。
実施例７〜１１の結果から、ＴＰＡは特異的にｐ１８遺伝子のプロモーターに作用してｐ１８遺伝子の発現量を低下させることが明らかとなった。このことから、ＴＰＡは、本発明のスクリーニング方法において、ｐ１８遺伝子の発現量を特異的に低下させる阻害物質として使用できることが判明した。
実施例１２（ＴＰＡによるｐ１８遺伝子プロモーターの抑制機構）
実施例１０と同様にして、２９３Ｔ細胞に８ｎＭのＴＰＡを接触させ、さらに２０又は１００ｎＭのＲｏ３１−８４２５を接触させることによるｐ１８タンパク質発現量の変化をウェスタンブロットにより調べた。
結果を図８に示す。図８から明らかなように、ＴＰＡ添加によるｐ１８タンパク質発現量の抑制は、Ｒｏ３１−８４２５の用量に依存して回復している。
実施例１３（ｐ１８遺伝子の発現量を増大させる物質のスクリーニング）
実施例１０と同様にして、２９３Ｔ細胞に８ｎＭのＴＰＡを接触させ、さらに１６μＭのクルクミン（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ）を接触させることによるｐ１８タンパク質発現量の変化をウェスタンブロット解析により調べた。
結果を図９に示す。図９から明らかなように、ＴＰＡ添加によるｐ１８タンパク質発現量の低下は、クルクミンの添加により回復している。このことから、クルクミンは、発癌プロモーターであるＴＰＡによるｐ１８発現量低下を回復させ得る物質であることが分かる。
実施例１４（ｐ１８遺伝子の発現量を増大させる物質のスクリーニング）
実施例１０と同様にして、２９３Ｔ細胞に８ｎＭのＴＰＡを接触させ、さらに２５μＭのゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｎ）を接触させることによるｐ１８タンパク質発現量の変化をウェスタンブロット解析により調べた。
結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、ＴＰＡ添加によるｐ１８タンパク質発現量の低下は、ゲニステインの添加により回復している。このことから、ゲニステインは、発癌プロモーターであるＴＰＡによるｐ１８発現量低下を回復させ得る物質であることが分かる。なお、ゲニステインはチロシンキナーゼを阻害する物質であることが知られている。このことから、ＰＫＣからｐ１８への経路の途中にチロシンキナーゼが関与している可能性が示唆された。
実施例１５（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスクリーニング）
＜ヒトｐ１５遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の単離＞
ｐ１５ＩＮＫ４ｃ遺伝子のエキソン１の一部をコードする３２Ｐラベルされたプローブを用いてヒト白血球ゲノム由来のλＰＳ１ライブラリー中のファージプラークをスクリーニングした。このプローブは、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｓ７５７５６のデータに基づき、５’−ＴＡＡＡＴＡＧＧＴＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＡ−３’（配列番号１９）及び５’−ＧＧＧＣＧＧＡＣＧＣＧＴＣＡＣＧＡＧＧＧ−３’（配列番号２０）をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより得た。
得られた陽性ファージプラークを３回再スクリーニングした後、ファージＤＮＡを、クレーリコンビナーゼ−発現細菌株中に導入することによりプラスミドＤＮＡに変換した。ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、サザンブロットにより解析した。
＜レポータープラスミドの構築＞
得られた陽性ファージＤＮＡ由来の約７．８ｋｈの断片をルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ社）にサブクローニングした。このプラスミドをｐ１５−ｌｕｃという。
＜ルシフェラーゼアッセイ＞
リン酸カルシウム法を用いて、ｐ１５−ｌｕｃをＨａＣａＴ細胞（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＤＫＦＺ）のＤｒ．Ｎｏｒｂｅｒｔ  Ｅ．Ｆｕｓｅｎｉｇから入手）に一時的に導入した。導入にあたっては、ＨａＣａＴ細胞を１２ウェルプレートに、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル播種し、２μｇのレポータープラスミドを用いた。
プラスミド導入後のＨａＣａＴ細胞を３７℃で２４時間培養した後、細胞を９０、１２０及び１８０ｎＭのＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ（ＴＳＡ）（Ｗａｋｏ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳから入手）を含むＤＭＥＭ培地で３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をＰｉｃａ  Ｇｅｎｅ発光ｋｉｔ（東洋インキ）のプロトコールに従って測定した。
結果を図１０に示す。ＴＳＡの用量に依存してルシフェラーゼ活性が増大している。このことから、ＴＳＡはｐ１５遺伝子のプロモーターに作用してルシフェラーゼ活性を増大させたことが分かる。さらに、本発明のスクリーニング方法により、細胞増殖抑制、分化誘導、アポトーシス誘導のような抗腫瘍効果を有するヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）を簡便かつ効率的に選択できることを可能とした。
実施例１６（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスクリーニング）
ＨａＣａＴ細胞をＤＭＥＭ培地中に維持し、５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートした。この培養細胞を、１０ｃｍ２のシャーレに４×１０５個になるように播種し、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で２４時間培養した後、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ（ＴＳＡ）をそれぞれ９０ｎＭ、１２０ｎＭ及び１８０ｎＭとなるように添加した。
ＴＳＡとともに２４時間インキュベートした後のＨａＣａＴ細胞について、実施例７と同様にして、ｐ１５タンパク質量をウェスタンブロットにより評価した。結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、ＴＳＡは用量に依存して、ｐ１５タンパク質量を増大させている。このことから、本発明のスクリーニング方法によりヒストンデアセチラーゼ阻害剤を選択できることが分かる。
実施例１７（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスクリーニング）
Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ培地中に維持し、５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートした。この培養細胞を、１０ｃｍ２のシャーレに２×１０６個になるように播種し、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で２４時間培養した後、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ（ＴＳＡ）をそれぞれ３０ｎＭ、６０ｎＭ、１２０ｎＭ及び２４０ｎＭとなるように添加した。
ＴＳＡとともに２４時間インキュベートした後のＪｕｒｋａｔ細胞について、実施例７と同様にして、ｐ１８及びｐ１９ｍＲＮＡ量をノーザンブロットにより評価した。結果を図１２に示す。図１２から明らかなように、ＴＳＡは１２０ｎＭまではｐ１８ｍＲＮＡ量を用量に依存して増大させている。ＢＡＳ２０００による定量解析ではＴＳＡ１２０ｎＭでｐ１８ｍＲＮＡ量は２．５倍に増大している。また、ＴＳＡはｐ１９ｍＲＮＡ量を用量に依存して増大させている。
このことから、本発明のスクリーニング方法によりヒストンデアセチラーゼ阻害剤を選択できることが分かる。
産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法によれば、癌抑制遺伝子として重要なＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を調節する物質を効率的に選択することができる。
従って、本発明方法により得られるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を増加させる物質は、癌、動脈硬化、バルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄、リウマチ性疾患などの治療又は予防薬として有用である。
また、本発明方法により得られるＩＮＫ４ファミリー遺伝子の発現量を抑制できる物質は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療又は予防薬として有用である。
本発明のｐ１９遺伝子のプロモーターは、体細胞に調節導入することにより、生体内におけるｐ１９プロモーター変異による疾患の治療又は予防に好適に利用できる。また本発明のｐ１９遺伝子のプロモーターは、生体内に投与することにより、結合によりプロモーター活性を阻害又は活性化するタンパク質がｐ１９プロモーターに結合するのを拮抗阻害できるため、ｐ１９遺伝子の発現を促進又は抑制でき、癌又は細胞増殖を必要とする疾患の治療に有用である。さらに本発明のｐ１９遺伝子プロモーターは、このプロモーター活性を調節する物質のスクリーニングに利用できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、キャップサイトハンティング法におけるＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す図である。
図２は、ｐ１９プロモーター領域の欠失変異によるルシフェラーゼの発現量の変化を示す図である。
図３は、ｐ１９プロモーター領域のＡＰ−２部位及び二つのＳｐ１部位の変異によるルシフェラーゼの発現量の変化を示す図である。
図４は、ＴＰＡがｐ１８のタンパク質量及びｍＲＮＡ量に及ぼす影響を示す図である。
図５は、ＴＰＡがｐ１５等のタンパク質量に及ぼす影響を示す図である。
図６は、ＴＰＡがｐ１８遺伝子のプロモーター活性に及ぼす影響を示す図である。
図７は、ＴＰＡにより抑制されたｐ１８遺伝子のプロモーター活性に及ぼすＰＫＣインヒビターの影響を示す図である。
図８は、ＴＰＡにより抑制されたｐ１８遺伝子のプロモーター活性に及ぼすＰＫＣインヒビターの影響を示す図である。
図９は、ＴＰＡにより抑制されたｐ１８遺伝子のプロモーター活性に及ぼすクルクミンの影響を示す図である。
図１０は、ＴＳＡがｐ１５遺伝子のプロモーター活性に及ぼす影響を示す図である。
図１１は、ＴＳＡがｐ１５タンパク質量に及ぼす影響を示す図である。
図１２は、ＴＳＡがｐ１８及びｐ１９のｍＲＮＡ量に及ぼす影響を示す図である。
図１３は、ＴＰＡにより抑制されたｐ１８遺伝子のプロモーター活性に及ぼすゲニステインの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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