(57)【要約】ＤＮＡを含む液滴の精確な搬送と、その液滴の温度を的確に制御し、プライマーを作用させることにより、個々の液滴を個別に制御できる静電搬送によるＰＣＲ方法、また、迅速、かつ容易に判別を行うことができる静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法、及びそれらの装置を提供する。生体試料（ＤＮＡとプライマーを含む液滴）（９）を化学的に不活性な液層（８）中に用意し、前記生体試料（９）を静電搬送用電極（２）を有する静電搬送用電極板（１）により静電搬送し、前記静電搬送用電極板（１）の所定の部位で前記生体試料（９）を加熱する温度制御を行い、ＰＣＲを行う。
2003057875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生体試料を化学的に不活性な液層中に用意し、
（ｂ）前記生体試料を静電搬送用電極を有する静電搬送用電極板により静電搬送し、
（ｃ）前記静電搬送用電極板の所定の部位で温度制御を行い、ＰＣＲを行うことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項２】
請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料がＤＮＡ及びプライマーを含む液滴であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項３】
請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料がＤＮＡを含む液滴とプライマーを含む液滴であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項４】
請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電極をマトリックス状に配置し、前記生体試料を２次元的に操作することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項５】
請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記通電加熱用電極へ電圧を印加し、前記液滴を通電加熱することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項６】
請求項５記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電圧として高周波交流電圧を用いることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項７】
請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記化学的に不活性な液層を恒温ヒータにより第１の温度に保つことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項８】
請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料の加熱を多段階に行うことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項９】
請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電極及び加熱領域をカスケードに配置して、時間間隔をとって同時に生体試料の処理を行うことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項１０】
（ａ）表面に撥水性の膜を有する電極を有する静電搬送用電極板と、
（ｂ）生体試料を前記静電搬送用電極板により静電搬送する手段と、
（ｃ）前記静電搬送用電極板の所定の部位で前記生体試料の温度制御を行う手段とを具備することを特徴とするＰＣＲ装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記電極はマトリックス状に配置した電極であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１２】
請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記化学的に不活性な液層を恒温状態に加熱するシート状のヒータ層を具備することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１３】
請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記生体試料を加熱する手段は、前記液滴に対する電圧を印加する通電加熱用電極板であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１４】
請求項１３記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記電圧は高周波交流電圧であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１５】
請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記生体試料を加熱する手段は、長尺状のヒータ層であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１６】
（ａ）ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を化学的に不活性な液層中に用意し、
（ｂ）前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を、電極を有する静電搬送用電極板により静電搬送し、
（ｃ）前記静電搬送用電極板の第１の部位で前記ＤＮＡを加熱して熱変性を行い、
（ｄ）前記ＤＮＡに作用するプライマーをアニーリングし、
（ｅ）該アニーリングされたＤＮＡを伸長させることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項１７】
（ａ）表面に撥水性の膜を有する電極を有する静電搬送用電極板と、
（ｂ）ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を有する化学的に不活性な液層と、
（ｃ）前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を所定の部位で加熱する手段とを備え、
（ｅ）前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を前記静電搬送用電極板により静電搬送する手段と、
（ｅ）前記静電搬送用電極板の第１の部位で前記ＤＮＡを加熱して熱変性を行う手段と、
（ｆ）前記ＤＮＡに作用するプライマーをアニーリングする手段と、
（ｇ）前記アニーリングされたＤＮＡを伸長させる手段とを具備することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１８】
請求項１７記載のＰＣＲ装置において、前記電極はマトリックス状電極であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１９】
請求項１又は１６記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料の位置を検出し、その位置を制御することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項２０】
請求項１０又は１７記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、コンピュータと、該コンピュータに接続される撮像装置と、前記コンピュータに接続されるコントローラとを有し、前記生体試料の移動の様子を、前記撮像装置により監視し、その監視結果に基づいて、前記コンピュータからの操作により、前記コントローラによる調整を行うことにより、前記生体試料の位置の制御を行う手段を具備することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項２１】
静電搬送電極基板を化学的に不活性な液体で覆い、そこに既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴をアレイ状に配置しておき、続いて未知の一本鎖ＤＮＡ液滴サンプルを含む液滴を静電気により移動させ、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と結合させハイブリダイゼーションを行い、両者が一致したときには前記蛍光試薬がインターカレートされ、しかも合致の状況に応じて蛍光強度変化が現れることを利用して、ハイブリダイゼーション状況を判別することを特徴とする静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２２】
（ａ）化学的に不活性な液層を満たした静電搬送電極基板と、
（ｂ）該静電搬送電極基板上にアレイ状に配置される、既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と、
（ｃ）前記静電搬送電極基板の電極の駆動により移動される未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴と、
（ｄ）前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴に前記未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴とを作用させて、そのハイブリダイゼーション状況を判別する手段とを具備することを特徴とする静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、静電搬送によるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）方法、静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法及びそれらの装置に関するものである。
背景技術
従来、このような技術分野の文献として、例えば、以下のようなものがある。
（１）「分子生物学イラストレイテッド」  編集  田村隆明  山本雅  羊土社発行  ｐｐ．１６８−１８０
（２）「バイオ実験イラストレイテッド」  著者  中山広樹  秀潤社発行  ｐｐ．１４−４６
（３）「分子生物学プロトコール」  編集  小池克郎  関谷剛男  近藤寿人  南江堂発行  ｐｐ．２１７−２２４
昨今、バイオの技術分野において、簡便で、的確に操作を行うことができるポスト・ゲノム・アプリケーション（Ｐｏｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に用いる試験用のデバイスが要請されている。
第１図に示すように、二重螺旋ＤＮＡを形成する水素結合は、高温やアルカリ条件下で壊れ、ＤＮＡは変性して一本鎖となる。相補的な塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡやＲＮＡは、適当な条件下でアニールして二重鎖となる。これをハイブリダイゼーションと呼ぶ。
核酸を合成、分解、修飾する酵素には、特異性などの性質が異なる実に多くの種類がある。そこで、それぞれの特性を生かして多くの遺伝子工学の技術が生み出されている。例えば、制限酵素法は２０年以上前から現在まで組換えＤＮＡ技術の中心的存在である。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅に広く用いられている。
まず、そのＰＣＲ法について説明する。
ＰＣＲ法は、ごく微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域を短時間で数万倍にも増殖することができる技術である。
このＰＣＲ法の原理は、第２図に示すように、（１）鋳型ＤＮＡの熱変性、（２）鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）酎熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長の３つのステップを数１０回繰り返すことである〔近年、上記（２）と（３）を同時に行う、つまり、２ステップで行うことも多い〕。ＰＣＲ法は現在広範囲に応用されている。
ここで、より詳細にＰＣＲ法の工程を示すと、第３図のようになる。
鋳型ＤＮＡの熱変性（１）、鋳型ＤＮＡのプライマーのアニーリング（２）、鋳型ＤＮＡの伸長（３）を行う一サイクル後に、同様に、鋳型ＤＮＡの熱変性（４）、鋳型ＤＮＡのプライマーのアニーリング（５）、鋳型ＤＮＡの伸長（６）を行い、その二サイクルの後に、同様に、鋳型ＤＮＡの熱変性（７）、鋳型ＤＮＡのプライマーのアニーリング（８）、鋳型ＤＮＡの伸長（９）を行う三サイクル（１０）後、順次、四サイクル目〔熱変性・アニーリング・伸長（１１）〕、五サイクル目の熱変性・アニーリング・伸長を繰り返す。
その場合のＰＣＲ法の標準的な温度と時間は例えば第４図のようになる。
第４図に示すように、室温に設定された状態から、９４℃に加熱して約１分間熱変性を行い、次に、５０〜６０℃にして約１分間アニーリングを行い、次に、７２℃にして約１分間伸長反応を行わせる。このサイクルを順次繰り返す。
このように、ＰＣＲ工程では、複数工程の温度制御を的確に行う必要がある。
また、従来のハイブリダイゼーション方法では、主に、ＤＮＡチップ中で、既知の一本鎖ＤＮＡと未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを混合させて、その反応を見ることにより、ハイブリダイゼーション状況を判別するようにしている。
発明の開示
しかしながら、ＰＣＲの工程においては、上述したような、迅速、かつ適切な位置決め及び温度制御を行う必要があるにもかかわらず、特別なマイクロチャンネル、マイクロバルブ、マイクロポンプなどの微小流体素子が必要なため、その操作が複雑になり、円滑な操作に難があった。
このような状況から、簡便な操作によりＰＣＲ反応を起こさせる、ＰＣＲの実験用デバイスが求められている。
また、従来のＤＮＡチップでは、サンプルとの接触面積が小さいため検出感度が低いという問題があり、接触面積を増やすために、微小なビーズ表面にｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）等を修飾するなどの方法も考えられている。また、ハイブリダイゼーション方法は手作業が主であり、煩雑であるとともに、的確でなく、時間を要するものであった。
本発明は、上記状況に鑑みて、ＤＮＡを含む液滴の精確な搬送と、その液滴の温度を的確に制御し、プライマーを作用させることにより、個々の液滴を個別に制御できる静電搬送によるＰＣＲ方法、また、迅速、かつ容易に判別を行うことができる静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法、及びそれらの装置を提供することを目的とする。
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕静電搬送によるＰＣＲ方法において、生体試料を化学的に不活性な液層中に用意し、前記生体試料を静電搬送用電極を有する静電搬送用電極板により静電搬送し、前記静電搬送用電極板の所定の部位で温度制御を行い、ＰＣＲを行うことを特徴とする。
〔２〕上記〔１〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料がＤＮＡ及びプライマーを含む液滴であることを特徴とする。
〔３〕上記〔１〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料がＤＮＡを含む液滴とプライマーを含む液滴であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
〔４〕上記〔１〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電極をマトリックス状に配置し、前記生体試料を２次元的に操作することを特徴とする。
〔５〕上記〔１〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記通電加熱用電極へ電圧を印加し、前記液滴を通電加熱することを特徴とする。
〔６〕上記〔５〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電圧として高周波交流電圧を用いることを特徴とする。
〔７〕上記〔１〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記化学的に不活性な液層を恒温ヒータにより第１の温度に保つことを特徴とする。
〔８〕上記〔１〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料の加熱を多段階に行うことを特徴とする。
〔９〕上記〔１〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電極及び加熱領域をカスケードに配置して、時間間隔をとって同時に生体試料の処理を行うことを特徴とする。
〔１０〕静電搬送によるＰＣＲ装置において、表面に撥水性の膜を有する電極を有する静電搬送用電極板と、生体試料を前記静電搬送用電極板により静電搬送する手段と、前記静電搬送用電極板の所定の部位で前記生体試料の温度制御を行う手段とを具備することを特徴とする。
〔１１〕上記〔１０〕記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記電極はマトリックス状に配置した電極であることを特徴とする。
〔１２〕上記〔１０〕記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記化学的に不活性な液層を恒温状態に加熱するシート状のヒータ層を具備することを特徴とする。
〔１３〕上記〔１０〕記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記生体試料を加熱する手段は、前記液滴に対する電圧を印加する通電加熱用電極板であることを特徴とする。
〔１４〕上記〔１３〕記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記電圧は高周波交流電圧であることを特徴とする。
〔１５〕上記〔１０〕記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記生体試料を加熱する手段は、長尺状のヒータ層であることを特徴とする。
〔１６〕静電搬送によるＰＣＲ方法において、ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を化学的に不活性な液層中に用意し、前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を、電極を有する静電搬送用電極板により静電搬送し、前記静電搬送用電極板の第１の部位で前記ＤＮＡを加熱して熱変性を行い、前記ＤＮＡに作用するプライマーをアニーリングし、このアニーリングされたＤＮＡを伸長させることを特徴とする。
〔１７〕静電搬送によるＰＣＲ装置において、表面に撥水性の膜を有する電極を有する静電搬送用電極板と、ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を有する化学的に不活性な液層と、前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を所定の部位で加熱する手段とを備え、前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を前記静電搬送用電極板により静電搬送する手段と、前記静電搬送用電極板の第１の部位で前記ＤＮＡを加熱して熱変性を行う手段と、前記ＤＮＡに作用するプライマーをアニーリングする手段と、前記アニーリングされたＤＮＡを伸長させる手段とを具備することを特徴とする。
〔１８〕上記〔１７〕記載のＰＣＲ装置において、前記電極はマトリックス状電極であることを特徴とする。
〔１９〕上記〔１〕又は〔１６〕記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料の位置を検出し、その位置を制御することを特徴とする。
〔２０〕上記〔１０〕又は〔１７〕記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、コンピュータと、このコンピュータに接続される撮像装置と、前記コンピュータに接続されるコントローラとを有し、前記生体試料の移動の様子を、前記撮像装置により監視し、その監視結果に基づいて、前記コンピュータからの操作により、前記コントローラによる調整を行うことにより、前記生体試料の位置の制御を行う手段を具備することを特徴とする。
〔２１〕静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法において、静電搬送電極基板を化学的に不活性な液体で覆い、そこに既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴をアレイ状に配置しておき、続いて未知の一本鎖ＤＮＡ液滴サンプルを含む液滴を静電気により移動させ、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と結合させハイブリダイゼーションを行い、両者が一致したときには前記蛍光試薬がインターカレートされ、しかも合致の状況に応じて蛍光強度変化が現れることを利用して、ハイブリダイゼーション状況を判別することを特徴とする。
〔２２〕静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置において、化学的に不活性な液層を満たした静電搬送電極基板と、この静電搬送電極基板上にアレイ状に配置される、既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と、前記静電搬送電極基板の電極の駆動により移動される未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴と、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴に前記未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴とを作用させて、そのハイブリダイゼーション状況を判別する手段とを具備することを特徴とする。
なお、本発明においては、既知の一本鎖ＤＮＡにはｃＤＮＡを含むものと定義する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
第５図は本発明の第１実施例を示す静電搬送によるＰＣＲ装置（ＰＣＲのためのチップ）の模式図、第６図はその静電搬送用電極板と生体試料としてのＤＮＡとプライマーを含む液滴の搬送の模式図（加熱手段は図示なし）、第７図はそのＰＣＲ装置の全体構成を示す模式図、第８図はそのＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図、第９図は液滴の加熱装置の模式図である。
これらの図において、１はマトリックス状に配置された静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板、３はその電極板１上に積層される通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板、５は第１の加熱領域、６は第２の加熱領域、７は第３の加熱領域、８は化学的に不活性な液層、９は生体試料であり、ここでは、ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴である。１１は液槽（セル）、１２はＤＳＰコントローラ、１３はプログラマブル電源、１４はパソコン、１５はビデオカメラである。
このように構成したので、例えば、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を化学的に不活性な液層８中に用意し、この生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９の熱変性、アニーリング、伸長の工程を繰り返す。ここでは、マトリックス状に配置された静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１を配置し、その上に、表面に通電加熱用電極４が配置される通電加熱用電極板３を積層したものを用いる。その通電加熱用電極板３上に生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を化学的に不活性な液層８内に有する液槽（セル）１１を構成する。なお、第８図においては、最下層に液槽（セル）１１の雰囲気の温度制御を行う恒温ヒータとしてのヒータ層１６を配置している。
なお、静電搬送用電極（ドット電極）２を２次元に配置した静電搬送用電極板の上方に生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を置き、静電搬送用電極（ドット電極）２の電圧をパソコン１４に接続されるＤＳＰコントローラ１２で制御することにより、２次元に任意の方向に生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９をハンドリングすることができる。
生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９が移動する原理は、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９の表面がプラスまたはマイナスに帯電しているため、静電搬送用電極（ドット電極）２との間に吸引力または反発力が生じるからである。さらに、静電搬送用電極（ドット電極）２に印加する電圧を進行波型にすることで、静電搬送用電極（ドット電極）２に生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９へ推進力を与えることができる。また、静電搬送用電極（ドット電極）２を２次元的に配置したので、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を平面上で任意の方向に移動させることができる。
その生体試料の移動の様子は、例えば、パソコン（コンピュータ）１４に接続されるビデオカメラ（撮像装置）１５により監視し、その監視結果に基づいて、パソコン１４からの操作により、ＤＳＰコントローラ１２及びプログラマブル電源１３の調整を行うことにより、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９の位置の制御を行うことができる。
なお、その静電搬送用電極（ドット電極）２は、Ｘ，Ｙ軸に平行なライン状であっても、それぞれの交点だけが電極として働くドット状でも良い。
そこで、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９は、静電搬送用電極板１の静電搬送用電極（ドット電極）２に印加される電圧により搬送される。その搬送途上に、第１の加熱領域５を配置して、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を活性化（熱変性）することができる。なお、微小液滴の静電搬送自体については、既に、特願２００１−２３８６２５として、本願発明者によって提案されている。
このようにして、第５図に示すように、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を静電搬送用電極（ドット電極）２に印加される電圧により搬送して、第１の加熱領域５で約９２℃〜９７℃で短時間（秒のオーダー）加熱して熱変性する〔ステップ（１），第３図参照〕。
次いで、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を第２の加熱領域６に搬送して約５０℃〜７２℃で短時間（秒のオーダー）加熱し、プライマー９Ｂのアニーリングを行うことができる〔ステップ（２）〕。
次に、そのアニーリング後に、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を第３の加熱領域７に静電搬送用電極（ドット電極）２に印加される電圧により搬送して、そこで、約７２℃で短時間（秒のオーダー）加熱して、ＤＮＡ９Ａの伸長を行わせる〔ステップ（３）〕。このような工程を２５回くらい繰り返し、ＰＣＲを実施することができる。すなわち、伸長工程〔ステップ（３）〕の次には、その下流に移動させて、再び、加熱領域５で約９２℃〜９７℃で短時間加熱して熱変性し〔ステップ（４）〕、その後、加熱領域６に移動させて、そこで、アニーリングを行い〔（ステップ（５）〕、その後、加熱領域７に移動させて、伸長を行わせる〔ステップ（６）〕。更に、熱変性工程〔ステップ（７）〕へ進み、次の工程を実施する。このような工程を所定サイクル実施してＰＣＲを行う。なお、上述したように、実際にはこの工程を２５回くらい繰り返す。また、上記したステップ（１）〜ステップ（７）の態様はこれに限定されるものではなく、種々の変形が可能である。
この実施例における生体試料の加熱装置は、第８図及び第９図に示すように、通電加熱用電極板３上の通電加熱用電極４に加熱すべき生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を静電搬送用電極（ドット電極）２で位置決めした上で、静電搬送用電極（ドット電極）２に高周波交流電圧を印加することで、直接生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を加熱することにより、上記したように、熱変性工程、アニーリング工程及び伸長工程を実施する。
また、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９の加熱装置は、第１０図に示すようなものを用いてもよい。すなわち、熱絶縁性基板１７の表面に配置される長尺状のヒータ層１８に電源が接続されて通電されることにより、長尺状のヒータ層１８が加熱され、静電搬送用電極２を有する静電搬送用電極板１によって搬送され、その長尺状のヒータ層１８上に位置決めされた生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を加熱し、熱変性、アニーリング、伸長を実施することもできる。
なお、液滴自体の製造方法については、既に、特願２００１−２３８６２４として、本願発明者によって提案されている。
第１１図は本発明の更なるＰＣＲの態様を示す模式図である。
このＰＣＲの態様を示すと、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９の流れに沿って電極および加熱領域をカスケードに配置して、それぞれのＰＣＲのサイクルを時間間隔をとって同時に処理できるようにする。
このように構成すると、生体試料（ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴）９を次々に供給することにより、同時に大量のＰＣＲを流れ作業で効率的に実施することができる。
第１２図は本発明の第２実施例を示す静電搬送によるＰＣＲ装置（ＰＣＲのためのチップ）の模式図、第１３図はその静電搬送用電極板と生体試料としてのＤＮＡを含む液滴とプライマーを含む液滴の搬送の模式図（加熱手段は図示なし）、第１４図はそのＰＣＲ装置の全体構成を示す模式図である。なお、第１実施例と同様の部分については同じ符号を付してそれらの説明は省略する。
第１２図〜第１４図において、２１は生体試料（ＤＮＡを含む液滴）、２２はプライマーを含む液滴である。
このように構成したので、例えば、生体試料（ＤＮＡを含む液滴）２１を化学的に不活性な液層８中に用意し、これにプライマーを含む液滴２２を作用させて、熱変性、アニーリング、伸長の工程を繰り返す。ここでは、マトリックス状に配置された静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１を配置し、その上に表面に通電加熱用電極４が配置される通電加熱用電極板３を積層する。その通電加熱用電極板３上に生体試料（ＤＮＡを含む液滴）２１を有する化学的に不活性な液層８とプライマーを含む液滴２２を有する液槽（セル）１１を構成する。
そこで、生体試料（ＤＮＡを含む液滴）２１は、静電搬送用電極板１の静電搬送用電極（ドット電極）２に印加される電圧により搬送される。その搬送途上に、第１の加熱領域５を配置して、生体試料（ＤＮＡを含む液滴）２１を活性化（熱変性）することができる。
一方、プライマーを含む液滴２２も静電搬送用電極板１の静電搬送用電極（ドット電極）２に印加される電圧により搬送されるため、生体試料（ＤＮＡを含む液滴）２１にプライマーを含む液滴２２を衝突させて作用させることができる。
このようにして、生体試料（ＤＮＡを含む液滴）２１に作用したプライマーを含む液滴２２を静電搬送用電極（ドット電極）２に印加される電圧により搬送して、第２の加熱領域６で加熱して、プライマーを含む液滴２２のアニーリングを行うことができる。
次に、そのアニーリング後に、第３の加熱領域７に静電搬送用電極（ドット電極）２に印加される電圧により搬送して、そこで、ＤＮＡの伸長を行わせ、ＰＣＲを実施することができる。なお、実際には、この工程を２５回くらい繰り返す。
この実施例における液滴の加熱装置は、第８図〜第１０図に示すものを用いることができる。
以下、本発明のＰＣＲ装置の各種の液槽（セル）の構造の実施例について説明する。
第１５図は本発明の第３実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
この実施例においては、生体試料（ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴）９を有する化学的に不活性な液層８の下部には底板２３のみを配置し、上部に通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３と、静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１と、最上部に恒温用のヒータ層１６を積層するように配置する。
第１６図は本発明の第４実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
この実施例においては、生体試料（ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴）９を有する化学的に不活性な液層８の下部には最下層に静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１を配置し、その上に通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３を積層する。上部には恒温用のヒータ層１６のみ配置するようにしている。
第１７図は本発明の第５実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
この実施例においては、生体試料（ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴）９を有する化学的に不活性な液層８の下部には恒温用のヒータ層１６のみ配置する。上部には、通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３と、静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１とを積層するように配置する。
第１８図は本発明の第６実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
この実施例においては、生体試料（ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴）９を有する化学的に不活性な液層８の下部にはその最下層に恒温用のヒータ層１６を配置し、その上に静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１とを積層するように配置する。上部には通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３のみを配置する。
第１９図は本発明の第７実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
この実施例においては、生体試料（ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴）９を有する化学的に不活性な液層８の下部には通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３のみを配置する。上部には最下部に静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１を配置し、その上に恒温用のヒータ層１６を積層するように配置する。
第２０図は本発明の第８実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
この実施例においては、生体試料（ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴）９を有する化学的に不活性な液層８の下部には静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１のみを配置する。上部には最下層には通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３を配置し、その上に恒温用のヒータ層１６を積層するように配置する。
第２１図は本発明の第９実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
この実施例においては、生体試料（ＤＮＡ９Ａ及びプライマー９Ｂを含む液滴）９を有する化学的に不活性な液層８の下部にはその最下層に恒温用のヒータ層１６を配置し、その上に通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３を積置するように配置する。上部には静電搬送用電極（ドット電極）２を有する静電搬送用電極板１のみを配置する。
上記した実施例の通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３に代えて、長尺状のヒータ層を液滴の移動方向に直交する方向に配置するようにしてもよいことは、第１０図に示したが、このような長尺状のヒータ層１８は、図示しないが、第１５図〜第２１図に示される通電加熱用電極４を有する通電加熱用電極板３に代替して配置することができる。
また、上記静電搬送用電極板にはマトリックス状に配置された静電搬送用電極（ドット電極）を形成したものについて説明したが、線状の電極としてもよい。
さらに、２次元的操作でなく、１次元的操作を行うようにしてもよい。
このように、本発明によれば、ＰＣＲ反応を起こさせる、ＰＣＲのための実験用チップ装置（「Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ」デバイス）を提供することができる。すなわち、マトリックス状に電極を配置し、更に化学的に不活性な液層を満たした反応場であるチップを準備し、生体試料であるＤＮＡを含む複数の微小液滴と複数のプライマーを含む液滴とを導入し、前記電極への電圧印加またはヒータ層への通電によりＤＮＡとプライマーとを含む液滴を静電気力で任意に移動・衝突させ、同時にまたは時系列的にも加熱により反応させるＰＣＲ方法及びそのためのＰＣＲ装置（チップ装置）を提供することができる。
なお、前記電極への電圧印加は液滴の昇温にも活用できる。このＰＣＲは、ポンプやチャネルが不要な上、微量な試薬量で、複数種類のＤＮＡを同一チップ上で同時に増幅することができる。
本発明は、上記したように、不活性な液体中にある生体試料としてのＤＮＡサンプルの液滴を複数種類のプライマーを含む液滴と結合させて、ＰＣＲを行うチップを開発することであり、これにより、複数種類のＤＮＡを同一のチップ上で同時に増幅させることができる。
上記のように構成したので、本発明は、以下のような効果を奏することができる。
▲１▼  化学的に不活性な液層中にある微小液滴を用いているためサンプル、試薬が微小量で済む。
▲２▼  液滴を静電気力で搬送するため、電極上を平面的に移動、停止させることができる。したがって、特別なマイクロチャンネル、マイクロバルブ、マイクロポンプなどの微小流体素子が不要である。
▲３▼  基板上で同時に複数の化学反応を行わせることができる。
▲４▼  加熱法としては、微小液滴の導電性を利用した通電加熱を採用することにより、所定の部位で適切な温度に加熱することができる。
▲５▼  また、加熱法としては、微小液滴を長尺状のヒータで加熱することにより、その加熱装置の簡素化と価格の低減を図ることができる。
▲６▼  チップ上のセルの温度は恒温ヒータにより所定の温度に設定することができる。
▲７▼  上記したように、液滴の位置と温度をシャープに制御することができ、簡便で、かつ的確な操作を実行させることができる。
次に、本発明の更なる他の実施例について説明する。
この実施例では、液体を満たした静電搬送基板上に、既知の一本鎖ＤＮＡを保持し、未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを静電気により移動・反応させ、発光状況からハイブリダイゼーション状況を判定する静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法およびその装置を提供する。
第２２図は本発明の他の実施例を示す静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置の模式図である。
この図において、１０１は静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置、１０２は静電搬送用電極基板、１０３は静電搬送用電極、１０４は液層、１０５は未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴、１０６は塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴（ＤＮＡ１１，ＤＮＡ１２，…，ＤＮＡ４１，ＤＮＡ４２，…）、１０７は電圧制御機器であり、この電圧制御機器１０７は静電搬送用電極基板１０２の全般にわたる静電搬送用電極１０３に接続されている。
そこで、塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴１０６を静電搬送用電極基板１０２上にアレイ状に配置する。そして、未知の一本鎖ＤＮＡを含む液滴１０５を静電搬送により移動させて、塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴１０６と合体させる。
合体により、蛍光が発生するメカニズムを第２３図に示す。第２３図（ａ）は塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡの一本鎖を示し、第２３図（ｂ）は未知の一本鎖ＤＮＡと塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡが完全に一致した場合、第２３図（ｃ）は一部のみ合致した場合、第２３図（ｄ）は全く合致しなかった場合を示している。
第２３図に示すように、未知の一本鎖ＤＮＡと塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡとの塩基配列が完全に合致した場合〔第２３図（ｂ）〕だけ、蛍光が強く発せられる。
本発明は、液体中にある一本鎖ＤＮＡを含む液滴を静電気により移動・反応させて、遺伝子の存在を判別するＤＮＡチップの機能を有する。
ＤＮＡとは反応しない液体中に既知の各種一本鎖ＤＮＡおよび蛍光試薬が入った液滴をアレイ状に配置する。続いて、液体中に配置された未知の一本鎖ＤＮＡの液滴を静電気により移動させて、既知一本鎖ＤＮＡを含む液滴と結合させて、ハイブリダイゼーションを行う。既知の一本鎖ＤＮＡとサンプルが一致すれば、すべてハイブリダイゼーションするため、蛍光試薬がインターカレートされて蛍光を発する。もし、一致しない場合は、第２３図（ｄ）に示すように、蛍光試薬がインターカレートされないため蛍光を発しない。
一般に遺伝子の塩基配列はプライマ（塩基対２０ｂａｓｅ前後）で決定されるため、一本鎖ＤＮＡとして塩基対２０ｂａｓｅを用いることにより、サンプル中に一本鎖ＤＮＡによって決定される塩基配列を持つ遺伝子が含まれるかどうかの判別が出来る（一般のＤＮＡチップも同じ）。
本発明によれば、実験に用いるサンプルを液滴化して用いるため、サンプル量は極微量で済む。また、ハイブリダイゼーションに要する時間も極僅かであるため、現行のＤＮＡチップによる判別法に比べて優れた特徴がある。
第２４図は左より蛍光試薬のみ、蛍光試薬と合致しない一本鎖ＤＮＡ、蛍光試薬と一部のみ合致するＤＮＡ、蛍光試薬と完全に合致するＤＮＡとの結合状態における蛍光強度を示す。
この図に示すように、完全に配列が一致した場合のみ強い蛍光が生じることが分かる。また、一部のみ合致した場合には僅かな蛍光が生じる。ここで、基本となるＤＮＡ配列は、２０ｂａｓｅで、配列はＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＧＴである。一部のみ合致とは１０ｂａｓｅだけ合致していることを示す。
第２５図は第２４図におけるハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置の模式図である。
この図において、１１０は基台、１１１は静電搬送用電極基板、１１２は液層、１１３はＤＮＡを含む液滴、１１５は下部より紫外線を照射する紫外線光源、１１６はカメラ（撮像装置）である。
第２６図は本発明の更なる他の実施例を示すハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置を示す図である。
この図において、１２０は基台、１２１は静電搬送用電極基板、１２２は液層、１２３はＤＮＡを含む液滴、１２４はガラスカバー、１２５は斜め上方より紫外線を照射する紫外線光源、１２６はカメラ（撮像装置）である。なお、ガラスカバー１２４は不用の場合もある。
このようにして、液層中のＤＮＡを含む液滴のハイブリダイゼーション状況をカメラ（撮像装置）によって撮像することができる。
なお、本発明に関する基礎技術として、本発明者らは不活性な液体中にある液体微小粒子のハンドリングに関する特許を出願している（特許願２００１−４８０９６および特許願２００１−２３８６２４、「液体微粒子のハンドリング方法およびその装置」）。
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
（Ａ）生体試料としてのＤＮＡを含む液滴の精確な搬送と、その液滴の温度を的確に制御し、プライマーを作用させる、簡便で、的確な操作を行うことができる。
（Ｂ）生体試料としてのＤＮＡを含む液滴を静電気力で搬送するため、電極上を平面的に移動、停止させることができる。したがって、特別なマイクロチャンネル、マイクロバルブ、マイクロポンプなどの微小流体素子が不要である。
（Ｃ）基板上で同時に複数の化学反応を行わせることができ、加熱法としては、微小液滴の導電性を利用した通電加熱を採用することにより、所定の部位で適切な温度に加熱することができる。
（Ｄ）チップ上のセルの温度は恒温ヒータにより所定の温度に設定することができる。
（Ｅ）生体試料の流れに沿って電極および加熱領域をカスケードに配置して、それぞれのＰＣＲのサイクルを時間間隔をとって同時に処理することにより、同時に大量のＰＣＲを流れ作業で効率的に実施することができる。
（Ｆ）生体試料の位置を的確に検出し、その位置を制御することができる。
（Ｇ）ハイブリダイゼーションの判別を迅速、かつ容易に行うことができる。
（Ｈ）実験に用いるサンプルを液滴化して用いるため、サンプル量は極微量で済む。また、ハイブリダイゼーションに要する時間も極僅かであるため、現行のＤＮＡチップによる判別法に比べて優れた特徴がある。
産業上の利用可能性
本発明は、静電搬送によるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）装置、静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置として好適であり、簡便なチップを用いたバイオ試料の試験装置などに広範に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、二重螺旋ＤＮＡの変性と再生の模式図である。
第２図は、ＰＣＲの原理を示す模式図である。
第３図は、ＰＣＲのフローを示す図である。
第４図は、ＰＣＲの温度と時間のプロファイル図である。
第５図は、本発明の第１実施例を示す静電搬送によるＰＣＲ装置（ＰＣＲのためのチップ）の模式図である。
第６図は、本発明の第１実施例を示す静電搬送用電極板と生体試料としてのＤＮＡとプライマーを含む液滴の搬送の模式図（加熱手段は図示なし）である。
第７図は、本発明の第１実施例を示すＰＣＲ装置の全体構成を示す模式図である。
第８図は、本発明の第１実施例を示すＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第９図は、本発明の第１実施例を示す液滴の加熱装置の模式図である。
第１０図は、本発明の第１実施例を示す生体試料の加熱装置の変形例を示す図である。
第１１図は、本発明のＰＣＲの一態様を示す模式図である。
第１２図は、本発明の第２実施例を示す静電搬送によるＰＣＲ装置の模式図である。
第１３図は、本発明の第２実施例を示す静電搬送用電極板と生体試料としてのＤＮＡを含む液滴とプライマーを含む液滴の搬送の模式図（加熱手段は図示なし）である。
第１４図は、本発明の第２実施例を示すＰＣＲ装置の全体構成を示す模式図である。
第１５図は、本発明の第３実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第１６図は、本発明の第４実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第１７図は、本発明の第５実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第１８図は、本発明の第６実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第１９図は、本発明の第７実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第２０図は、本発明の第８実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第２１図は、本発明の第９実施例のＰＣＲ装置の液槽（セル）の断面図である。
第２２図は、本発明の他の実施例を示す静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置の模式図である。
第２３図は、蛍光が発生するメカニズムを示す模式図である。
第２４図は、本発明の他の実施例を示す静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置による蛍光強度を示す図である。
第２５図は、第２４図におけるハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置の模式図である。
第２６図は、本発明の更なる他の実施例を示すハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置を示す図である。
【図１】
2003057875.tif 000003
【図２】
2003057875.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2003057875.tif 000009
【図８】
2003057875.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2003057875.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
2003057875.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
2003057875.tif 000017
【図１６】
2003057875.tif 000018
【図１７】
2003057875.tif 000019
【図１８】
2003057875.tif 000020
【図１９】
2003057875.tif 000021
【図２０】
2003057875.tif 000022
【図２１】
2003057875.tif 000023
【図２２】
2003057875.tif 000024
【図２３】
2003057875.tif 000025
【図２４】
2003057875.tif 000026
【図２５】
2003057875.tif 000027
【図２６】
2003057875.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月11日(2003.9.11)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】（ａ）ポリメラーゼを含む生体試料液滴を化学的に不活性な液層中に用意し、
（ｂ）前記生体試料液滴を静電搬送用電極を有する静電搬送用電極板により静電搬送し、
（ｃ）前記静電搬送用電極板の所定の部位で温度制御を行い、ＰＣＲを行うことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項２】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料液滴がＤＮＡ及びプライマーを含む液滴であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項３】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料液滴がＤＮＡを含む液滴とプライマーを含む液滴であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項４】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電極をマトリックス状に配置し、前記生体試料液滴を２次元的に操作することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項５】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記通電加熱用電極へ電圧を印加し、前記生体試料液滴を通電加熱することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項６】請求項５記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電圧として高周波交流電圧を用いることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項７】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記化学的に不活性な液層を恒温ヒータにより第１の温度に保つことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項８】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料液滴の加熱を多段階に行うことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項９】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記電極及び加熱領域をカスケードに配置して、時間間隔をとって同時に生体試料液滴の処理を行うことを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項１０】（ａ）ポリメラーゼを含む生体試料液滴を有する化学的に不活性な液層と、
（ｂ）前記化学的に不活性な液層で覆われる、表面に撥水性の膜を有する電極を有する静電搬送用電極板と、
（ｃ）前記生体試料液滴を前記静電搬送用電極板により静電搬送する手段と、
（ｄ）前記静電搬送用電極板の所定の部位で前記生体試料液滴の温度制御を行う手段とを具備することを特徴とするＰＣＲ装置。
【請求項１１】請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記電極はマトリックス状に配置した電極であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１２】請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記化学的に不活性な液層を恒温状態に加熱するシート状のヒータ層を具備することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１３】請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記生体試料液滴を加熱する手段は、前記生体試料液滴に対する電圧を印加する通電加熱用電極板であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１４】請求項１３記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記電圧は高周波交流電圧であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１５】請求項１０記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、前記生体試料液滴を加熱する手段は、長尺状のヒータ層であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１６】（ａ）ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を化学的に不活性な液層中に用意し、
（ｂ）前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を、電極を有する静電搬送用電極板により静電搬送し、
（ｃ）前記静電搬送用電極板の第１の部位で前記ＤＮＡを加熱して熱変性を行い、
（ｄ）前記ＤＮＡに作用するプライマーをアニーリングし、
（ｅ）該アニーリングされたＤＮＡを伸長させることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項１７】（ａ）表面に撥水性の膜を有する電極を有する静電搬送用電極板と、
（ｂ）ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を有する化学的に不活性な液層と、
（ｃ）前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を所定の部位で加熱する手段とを備え、
（ｅ）前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴を前記静電搬送用電極板により静電搬送する手段と、
（ｅ）前記静電搬送用電極板の第１の部位で前記ＤＮＡを加熱して熱変性を行う手段と、
（ｆ）前記ＤＮＡに作用するプライマーをアニーリングする手段と、
（ｇ）前記アニーリングされたＤＮＡを伸長させる手段とを具備することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１８】請求項１７記載のＰＣＲ装置において、前記電極はマトリックス状電極であることを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項１９】請求項１記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記生体試料液滴の位置を検出し、その位置を制御することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。
【請求項２０】請求項１０又は１７記載の静電搬送によるＰＣＲ装置において、コンピュータと、該コンピュータに接続される撮像装置と、前記コンピュータに接続されるコントローラとを有し、前記生体試料液滴の移動の様子を、前記撮像装置により監視し、その監視結果に基づいて、前記コンピュータからの操作により、前記コントローラによる調整を行うことにより、前記生体試料液滴の位置の制御を行う手段を具備することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ装置。
【請求項２１】静電搬送電極基板を化学的に不活性な液体で覆い、そこに既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴をアレイ状に配置しておき、続いて未知の一本鎖ＤＮＡ液滴サンプルを含む液滴を静電気により移動させ、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と結合させハイブリダイゼーションを行い、両者が一致したときには前記蛍光試薬がインターカレートされ、しかも合致の状況に応じて蛍光強度変化が現れることを利用して、ハイブリダイゼーション状況を判別することを特徴とする静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２２】（ａ）化学的に不活性な液層を満たした静電搬送電極基板と、
（ｂ）該静電搬送電極基板上にアレイ状に配置される、既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と、
（ｃ）前記静電搬送電極基板の電極の駆動により移動される未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴と、
（ｄ）前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴に前記未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴とを作用させて、そのハイブリダイゼーション状況を判別する手段とを具備することを特徴とする静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置。
【請求項２３】請求項１６記載の静電搬送によるＰＣＲ方法において、前記ＤＮＡ及びプライマーを含む液滴の位置を検出し、その位置を制御することを特徴とする静電搬送によるＰＣＲ方法。




【国際調査報告】
2003057875.tif 000029
2003057875.tif 000030
2003057875.tif 000031