(57)【要約】図１に示すように、本実施形態の血液処理方法は、血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程Ｓｔ１と、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程Ｓｔ２とを含む。ここで溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
2003083479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
上記血液検体試料と上記溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である血液処理方法。
【請求項２】
請求項１に記載の血液処理方法において、
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存している、血液処理方法。
【請求項３】
請求項１に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤である、血液処理方法。
【請求項４】
請求項３に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、無機塩である、血液処理方法。
【請求項５】
請求項４に記載の血液処理方法において、
上記混合試料中における上記無機塩の濃度は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、血液処理方法。
【請求項６】
赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）と、
上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程（ｃ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であるヘモグロビン類測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）では、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する方法として、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法、比色スライド法、および電極法スライド法のうちのいずれか１つが用いられる、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項８】
請求項６に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）において、少なくとも２種類のヘモグロビンを測定する、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項９】
請求項８に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記少なくとも２種類のヘモグロビンは、ヘモグロビンとＨｂＡ１ｃとの組み合わせである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項１０】
請求項６に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記ヘモグロビン類は、糖化ヘモグロビンである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項１１】
基材と、
赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤とを備え、
上記溶血剤は、赤血球を含む血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されている、血液処理デバイス。
【請求項１２】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
上記血液検体試料の添加部を有する基材と、
赤血球膜を破壊するための溶血剤と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを備え、
上記溶血剤は、血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されており、
上記溶血剤、上記検出物質、および上記固定化物質はそれぞれ、固体で基材上に担持され、
上記基材の上記血液検体試料の添加部に近い方から順に、上記溶血剤と、上記検出物質と、上記固定化物質とが配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１３】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
基板と、
上記基板上に設けられた上記血液検体試料の添加部と、
上記基板上に設けられ、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤を含み、上記血液検体試料の溶血を制御するための溶血層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質を含み、上記ヘモグロビン類を標識するための標識層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化試薬を含み、上記ヘモグロビン類を検出するための検出層とを備え、
上記血液検体試料は、上記溶血層と、上記標識層と、上記検出層との間を移動できる、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去するための層をさらに備える、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１５】
請求項１３に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記溶血層、上記標識層、および上記検出層は、単一の層に配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、赤血球膜を破壊するための血液処理方法およびヘモグロビン類の測定に関する。
背景技術
現在、臨床検査分野において、ポイント・オブ・ケア・テスト（以下ＰＯＣＴと略する）が注目されている。ＰＯＣＴとは、医療現場での臨床検査を示し、検体採取から結果が出るまでの時間が最も重要視される検査の総称を示す。従って、一般に、臨床検査分野においては、操作の簡便性、迅速な判定、および低価格が、求められている。これは、血液中成分の測定にも当てはまる。
血液は、細胞成分と液体成分とに大きく分けられる。細胞成分には、赤血球、白血球、および血小板が含まれる。液体成分は、血漿が含まれる。
血液検体試料において、赤血球と全血との容積比（以後、ヘマトクリット値またはＨｔ値と称する）が重要なファクターの一つである。Ｈｔ値は、貧血の程度に応じて変化するため、貧血の程度を知るための尺度となる。また、Ｈｔ値は、血液検体試料の物性（粘度等）が測定に影響を与え得るため、他の測定値の補正を行なう必要性についての尺度となる。
赤血球は、約１．１×１０１０個で１ｍｌの体積を占め、１個あたりの容積は約９０μｍ３である。赤血球の最大成分である水は、１００ｍｌの赤血球中で約６３ｇを占める。赤血球に約３４ｇ含まれる残りの大部分は、ヘモグロビン類とみなすことができる。Ｈｔ値が４５％の場合、血液１Ｌ中のヘモグロビン類の量は約１５０ｇになる。すなわち、ヘモグロビン類は、血液中に１５０ｇ／ｌの濃度で存在しており、生体において最も量の多いタンパク質である。
ヒトヘモグロビン（以後Ｈｂとする）は、α鎖および非α鎖（β、γ、δ鎖）のグロビンがヘムと結合し、会合している四量体である。健常人のＨｂには、ＨｂＡ（α２β２）が約９０％、ＨｂＡ２（α２δ２）が約３％、ＨｂＦ（α２γ２）が約１％、およびＨｂＡ１（糖が結合したＨｂＡ）が数％それぞれ存在する。なお、上記ＨｂＡ１には、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、およびＨｂＡ１ｃが含まれる。
従来から、上記Ｈｂの組成比を検査することは、臨床化学的に重要なものとされている。例えば、上記ＨｂＦの測定値が、基準範囲０．３〜１．３％以外の異常値を示す場合、遺伝性高ＨｂＦ症、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病などの疑いがもたれる。また、上記ＨｂＡ２の測定値が、基準範囲２〜３．５％以外の異常値を示す場合、不安定Ｈｂ症もしくは悪性貧血の疑いがもたれる。
さらに、近年は三大成人病の一つである糖尿病が問題になっている。そこで、糖尿病患者の１〜３ヶ月間の比較的長期間の血糖コントロールのための目安として、ＨｂＡ１もしくはＨｂＡ１ｃが検査項目として注目されている。ＨｂＡ１ｃの測定装置が開発されている。
ヘモグロビン類は、例えば、等電点電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、ラテックス免疫凝集法などを用いて測定されている。
血液検体試料の他の測定対象物と異なり、ヘモグロビン類は、赤血球の中に存在しているため、測定を行なうためには溶血を生じさせる必要がある。「溶血」とは、赤血球膜が破れ、ヘモグロビン類が、赤血球の外に排出される現象をいう。より詳細には、赤血球の大きさは、赤血球膜に対する浸透圧によって影響される。赤血球は、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が高い塩溶液中では、赤血球が収縮する。一方、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が低い塩溶液中では、赤血球が膨張する。このような赤血球の収縮および膨張の過程において、赤血球膜が破れると、ヘモグロビン類が赤血球の外に排出される。血液が完全に溶血された場合、Ｈｔ値４５％の場合、ヘモグロビン濃度は、約１５０ｇ／Ｌである。
解決課題
ヘモグロビン類の測定の結果は、全ヘモグロビン量に対する割合で示される。このため、測定対象のヘモグロビン類の量だけでなく、全ヘモグロビン量をも測定する必要がある。上述のように、全ヘモグロビン量は、個人差があるものの、通常、血液中に約１５０ｇ／Ｌの濃度で存在する。この濃度は、ヘモグロビン類の測定にとって不都合な、非常に高い濃度である。ヘモグロビン類は、長波長側に吸収波長を有する赤い色素をもっているので、高濃度であれば、ヘモグロビン類の測定が妨害されやすい。
例えば、免疫クロマトグラフィーによってヘモグロビン類の測定を行なう場合、免疫反応の１つの特性として生じる抗原過剰量領域での測定値の低下が、誤作動の原因となる。また、多量のヘモグロビン類による血液検体試料の粘度の増加によって、免疫クロマトグラフィーデバイスの固相マトリックスでの血液検体試料の展開速度が遅くなったり、全く展開しなくなるなどの不具合も生じる。従って、例えば、特開平３−４６５６６号公報に開示されているように、ヘモグロビン類を正確に測定するためには、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が必要である。つまり、ヘモグロビン類を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、血液処理方法、血液処理デバイス、ヘモグロビン類測定方法およびヘモグロビン類測定デバイスに関し、特に、ヘモグロビン類に代表される赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことが可能な方法およびデバイスを提供することを目的とする。
発明の開示
本発明の血液処理方法は、赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、上記血液検体試料と上記溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）とを含み、上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
従来の方法では、ヘモグロビン類に代表される赤血球中の成分を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。しかしながら、本発明の血液処理方法を用いれば、赤血球中の成分を測定する際に、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が不要となる。従って、本発明の血液処理方法によれば、赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことができる。
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存していることが好ましい。
上記溶血剤は、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤である構成としてもよい。
上記溶血剤は、無機塩である構成としてもよい。
上記混合試料中における上記無機塩の濃度は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましい。
本発明のヘモグロビン類測定方法は、赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）と、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程（ｃ）とを含み、上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
従来の方法では、ヘモグロビン類を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。しかしながら、本発明のヘモグロビン類測定方法を用いれば、ヘモグロビン類を測定する際に、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が不要となる。従って、本発明のヘモグロビン類測定方法によれば、ヘモグロビン類の測定を、より簡単に行なうことができる。
上記工程（ｃ）では、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する方法として、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法、比色スライド法、および電極法スライド法のうちのいずれか１つが用いられる構成としてもよい。
上記工程（ｃ）において、少なくとも２種類のヘモグロビンを測定する構成としてもよい。
上記少なくとも２種類のヘモグロビンは、ヘモグロビンとＨｂＡ１ｃとの組み合わせである構成としてもよい。
上記ヘモグロビン類は、糖化ヘモグロビンである構成としてもよい。
本発明の血液処理デバイスは、基材と、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤とを備え、上記溶血剤は、赤血球を含む血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されている。
本発明の血液処理デバイスによれば、赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことができる。
本発明のヘモグロビン類測定デバイスは、赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、上記血液検体試料の添加部を有する基材と、赤血球膜を破壊するための溶血剤と、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質と、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを備え、上記溶血剤は、血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されており、上記溶血剤、上記検出物質、および上記固定化物質はそれぞれ、固体で基材上に担持され、上記基材の上記血液検体試料の添加部に近い方から順に、上記溶血剤と、上記検出物質と、上記固定化物質とが配置されている。
本発明のヘモグロビン類測定デバイスによれば、ヘモグロビン類の測定を、より簡単に行なうことができる。
本発明の別のヘモグロビン類測定デバイスは、赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、基板と、上記基板上に設けられた上記血液検体試料の添加部と、上記基板上に設けられ、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤を含み、上記血液検体試料の溶血を制御するための溶血層と、上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質を含み、上記ヘモグロビン類を標識するための標識層と、上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化試薬を含み、上記ヘモグロビン類を検出するための検出層とを備え、上記血液検体試料は、上記溶血層と、上記標識層と、上記検出層との間を移動できる。
本発明のヘモグロビン類測定デバイスによれば、ヘモグロビン類の測定を、より簡単に行なうことができる。
上記血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去するための層をさらに備える構成としてもよい。
上記溶血層、上記標識層、および上記検出層は、単一の層に配置されている構成としてもよい。
最良の実施形態
以下に、本発明の実施形態を図を参照しながら説明する。
（実施形態１）
本実施形態では、本発明の血液処理方法を図を参照しながら説明する。図１は、本発明の血液処理方法のフローチャートである。
図１に示すように、本実施形態の血液処理方法は、血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程Ｓｔ１と、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程Ｓｔ２とを含む。ここで溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
「血液検体試料」は、ヒトを含む被験体から、通常の採血法（例えば、静脈注射またはランセットにより）によって採取された血液、または測定以前に保存されていた血液である。
溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であるものが用いられる。例えば、凍結乾燥などによってほぼ水分を含まないように粉末状に調製されていることが好ましい。
また、本実施形態の血液処理方法は、ヘモグロビン類の測定に好適に用いられる。つまり、本発明のヘモグロビン類測定方法は、図１に示されている、血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程Ｓｔ１と、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程Ｓｔ２とに加えて、さらに、混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程を含む。ここで溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
上述の本実施形態の血液処理方法によって混合試料中の血漿に含まれるヘモグロビン類は、当業者に周知の方法によって定量的に測定され得る。
図１に示すように、工程Ｓｔ２において、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製すると、血液検体試料中の赤血球の赤血球膜が破れ、赤血球中の成分（代表的にはヘモグロビン類）が、赤血球の外に排出される（すなわち、溶血が生じる）。従って、赤血球中の成分（代表的にはヘモグロビン類）を測定することが可能となる。
上述のように、ヘモグロビン類に代表される赤血球中の成分を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。しかしながら、本実施形態の血液処理方法を用いれば、赤血球中の成分を測定する際に、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が不要となる。従って、本実施形態の血液処理方法によれば、赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことができる。
免疫学的な方法でヘモグロビン類を測定する場合、完全溶血を行なうと非常に高い濃度であるため、抗原過剰領域に入り、測定感度を低下させる可能性もある。従って、工程Ｓｔ２において、混合試料中に血球成分が残存している状態、すなわち血液検体試料を部分的に溶血することが好ましい。
「血液検体試料を部分的に溶血する」とは、完全溶血未満の体積の赤血球を溶血することを意味する。例えば、Ｈｔ値４５％の血液１Ｌの場合、体積４５０ｍｌ未満の赤血球を溶血することを意味する。これに対して、「完全溶血」とは、実質的に全赤血球体積の赤血球を溶血することをいう。例えば、Ｈｔ値４５％の血液１Ｌの場合、体積約４５０ｍｌ赤血球を溶血することをいう。「血液検体試料を部分的に溶血するように制御する」ことによって、試料中の一部の赤血球の膜が破壊され、その中のヘモグロビン類を溶出させることができる。このとき、血漿中のヘモグロビン類の濃度は、完全溶血の場合よりも低い濃度である。例えば、Ｈｔ値４５％の血液１Ｌで体積１ｍｌ相当の赤血球を溶血させた場合、血漿５５０ｍｌに、ヘモグロビン類０．３４ｇおよび水０．６３ｇが溶出される。従って、血漿水５５０．６３ｍｌ中にヘモグロビン類が０．３４ｇ溶解されることになるため、ヘモグロビン類濃度は０．６２ｇ／Ｌとなる。完全に溶血したときの全ヘモグロビン濃度は１５０ｇ／Ｌである。本実施形態の血液処理方法では、緩衝液などを必要とすることなく、溶血することのみで、完全溶血に比較して約２５０倍希釈に相当する効果が得られる。
背景技術の欄で述べたように、Ｈｔ値は全血に対する赤血球の容積比である。このため、Ｈｔ値により、赤血球の量、および全ヘモグロビン量が理解され得る。なお、Ｈｔ値は、毛細管法およびＷｉｎｔｒｏｂｅ法を含む周知の方法によって決定される。Ｈｔ値は、毛細管法で決定される場合、成人では、男性３６〜４８％、女性３４〜４３％であり得る。幼児では、新生児（臍帯血）４４〜６４％、３ヶ月３２から４４％、１歳児３６〜４４％、１０〜１２歳３７〜４４％であり得る（Ｄａｃｉｅらによる；臨床検査法提要、改訂３１版、金原出版株式会社を参照のこと）。よって、被験体の性別および年齢を考慮して、ヘモグロビン測定に関してＨｔ値は設定される。
全ヘモグロビン濃度は、Ｈｔ値などに個人差があるが、ほとんどの人が、１００ｍｇ／ｍｌより多いＨｂを有する（男性：約１３０〜１７０ｍｇ／ｍｌ、女性：約１２０〜１５０ｍｇ／ｍｌ）。従来の測定機器によって、希釈操作を行なうことなく、１００ｍｇ／ｍｌを超える濃度のＨｂを測定することはできない。従って、「部分溶血」によるＨｂ濃度は、１００ｍｇ／ｍｌ以下の濃度であることが好ましい。
溶血の制御は、例えば、溶血剤の量を変えることにより行なうことができる。例えば、１．５ｍｇもしくは７．５ｍｇの塩化カリウムに血液１．５ｍｌを添加した場合、全ヘモグロビン濃度は、前者は約６．０ｇ／Ｌ、後者は約２５ｇ／Ｌとなる。このように、溶血剤の量が大きくなれば、溶血の割合も大きくなる。そこで、血漿中の最適ヘモグロビン濃度（最適な溶血率）を達成する溶血剤の量の決定を簡単に述べる。
まず、血液検体試料を任意の量の溶血剤で溶血させ、分離作業により上清液を取り出す。次に、上清液中のヘモグロビン濃度を測定する。続いて、溶血剤の添加量とヘモグロビン濃度との関係を決定する。最後に、血漿中の最適なヘモグロビン濃度となる溶血剤の添加量を上記関係に基づいて決定する。
詳細には、後述する実施例２に記載の手順とほぼ同等の手順を行なうことによって、溶血剤の量とヘモグロビン濃度との関係図を得ることにより行なわれる。
血漿中の最適ヘモグロビン濃度（最適な溶血率）は、その測定方法に依存するので、添加される溶血剤の量もまた測定方法に依存する。なお、本明細書中において、溶血率は図２に示す式で表されるものとする。
Ｈｔ値が４０〜５０％の場合、ヘモグロビン類の測定方法が吸光法である場合、溶血剤は、溶血率が０．０１〜１％（ヘモグロビン濃度０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ）になるような量で添加されることが好ましく、測定方法が免疫クロマトグラフィー法である場合、溶血率が０．０００１〜０．１％（ヘモグロビン濃度０．１〜１０ｍｇ／ｄｌ）になるような量で添加されることが好ましい。
吸光法で測定される場合、Ｈｂの最大モル吸光係数が約１０５Ｍ−１であるため、溶血剤の添加量は、ヘモグロビン濃度が０．１〜１ｍｇ／ｍｌ（吸光度が約０．１〜２になる濃度）になる量が好ましい。
免疫クロマトグラフィー法で測定される場合、溶血剤の添加量は、その免疫クロマトグラフィー法で使用されている抗体の性能（結合親和力など）に依存するヘモグロビン濃度に基づく。
例えば、溶血剤として塩化カリウムを使用する場合、一般に、血液検体試料の全容量に対する溶血剤の添加割合（濃度）は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）（本明細書中では、（ｗ／ｖ）の単位は、ｇ／ｍｌであるものとする。）の範囲内であることが好ましい。特に、血液検体試料の全容量に対する溶血剤の添加割合（濃度）は、吸光法の場合、０．０５〜１％（ｗ／ｖ）の範囲内であり、免疫クロマトグラフィー法の場合、クロマトデバイスの大きさ、あるいはクロマトデバイスに担持される固定化抗体、標識抗体の試薬量などある程度依存するが、０．０５〜３％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましい。特に、５ｍｍ×１０ｃｍのクロマトデバイスの場合、０．１〜１％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましい。
他の塩を用いる場合も、塩化カリウムの場合の濃度と同等になるような濃度で添加すればよい。また、例えば、ラウリル酸ナトリウムなどの界面活性剤、もしくは、抗赤血球抗体のような、赤血球膜に直接働きかける薬剤もまた使用することができる。この場合も同様に、上述の全ヘモグロビン濃度の測定方法を利用して、血漿中の最適ヘモグロビン濃度を達成するために必要な溶血剤の量を決定した後、決定された量の溶血剤を用いて、血液検体試料を部分的に溶血させればよい。
一旦、血漿中の最適ヘモグロビン濃度を達成するために必要な溶血剤の量が決定されれば、この量の溶血剤が、血液検体試料を部分的に溶血するように制御するために使用される。次いで、血液検体試料中の全ヘモグロビン濃度の測定のために、現在、臨床検査で用いられる任意のヘモグロビン定量法が使用される。このようなヘモグロビン定量法としては、例えば、シアンメトヘモグロビン法、酸化ヘモグロビン法、およびＳＬＳ−ヘモグロビン法が挙げられる（例えば、臨床検査法提要、改訂３１版、金原出版株式会社を参照のこと）。上述したヘモグロビン定量法で用いられる専用の体外診断薬は、市販されている。
本実施形態の血液処理方法およびヘモグロビン類測定方法によれば、ヘモグロビン類を測定する際に、従来必要とされていた溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作を省略して、測定に適切なヘモグロビン濃度を簡単に実現することができる。
本実施形態では、溶血剤として、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤が使用される。赤血球は、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が高い塩溶液中では、赤血球が収縮する。一方、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が低い塩溶液中では、赤血球が膨張する。このような赤血球の収縮および膨張によって赤血球膜が破れ、ヘモグロビン類が赤血球の外に排出される。例えば、無機塩（例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、もしくはフッ化ナトリウムなど）が挙げられる。特に、塩化カリウムが好ましい。上述したように、溶血は、赤血球が、生理的条件である０．９％ＮａＣｌ以外の環境下に置かれた場合におこる。従って、上記薬剤は、血液中の塩濃度がこのような条件下（すなわち、０．９％ＮａＣｌまたはこれと等価な塩類濃度を除く濃度）に置かれ、かつ所望の量のヘモグロビンが血漿中に溶出するような濃度または量で、血液検体試料に添加される。例えば、血液量５０μｌに対して２５０μｇの塩化カリウムを用いると、溶血率は約２％となる。
なお、溶血剤は、固体で用いる。溶血剤として、所望量の溶血性試薬を含む溶液を準備し、その溶液を凍結乾燥することによって準備されたものを用いてもよい。また、例えば、まず所望量の溶血性試薬を含む溶液に基材（メンブレンなど）を含浸し、次いで凍結乾燥することによって、基材上に担持されたものを用いてもよい。
血液検体試料は、ヘモグロビン類の測定が開始される前に、溶血剤で処理される。あるいは、血液検体試料が、ヘモグロビン類の測定と同時に、溶血剤で処理される。いずれにしても、溶血により溶出されたヘモグロビン類が、以下に詳述するような、当該分野で使用され得る手段または技術によって測定される。このような方法を実施する形態として、溶血剤が溶液状態である場合、溶血剤は、血液検体試料中のヘモグロビン類の測定の前に血液検体試料に添加され得る。溶血剤が固体で基材に担持される場合、血液検体試料が、基材に導入された後に測定手段に供せられ得るか、またはこのような基材が測定手段に供せられる際に、試料が基材に導入され得る。
測定されるヘモグロビン類としては、Ｈｂ、ＨｂＡ（α２β２）、ＨｂＡ２（α２δ２）、ＨｂＦ（α２γ２）、およびＨｂＡ１（ＨｂＡと糖との結合体）、ならびにＨｂＡ１がさらに分類された、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、およびＨｂＡ１ｃが挙げられる。ここで、Ｈｂとは、上述したヘモグロビン類を含む全ヘモグロビンを意味する。ＨｂＡ１ならびにこのＨｂＡ１がさらに分類された、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、およびＨｂＡ１ｃは、グリコヘモグロビンまたは「糖化ヘモグロビン」と称され、同じ一次構造を有するが、β鎖のＮ末端バリンのアミノ基が、糖もしくはその誘導体でブロックされている。本明細書中で使用される用語「糖化ヘモグロビン」は、ＨｂＡ１ならびにこのＨｂＡ１がさらに分類された、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、およびＨｂＡ１ｃを包含する。特に、ＨｂＡ１ｃは、グルコースが非酵素的に結合した糖化ヘモグロビンである。
Ｈｂの組成比を検査することは、臨床化学的に重要である。臨床的意義のために、上述のようにして処理された血液検体試料中の少なくとも２種のヘモグロビン類を測定することもできる。
特に本実施形態では部分的な溶血を制御することによって、血液検体試料中のＨｂ（全ヘモグロビン）濃度が低濃度に抑えられる。このため、測定されたヘモグロビン類の濃度は絶対値ではない。つまり、ＨｂＡ、ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＡと糖が結合したＨｂＡ１、ＨｂＡ１がさらに分類されたＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、およびＨｂＡ１ｃなどの測定値は、全Ｈｂ量に対する割合で表される。そして、これらの全Ｈｂ量に対する割合は、溶血率によって変化しないので、本発明の測定対象に十分になり得る。また、ヘモグロビン濃度の絶対値は、溶血率と相関関係にあるので、測定値から逆算することも可能である。
糖化ヘモグロビン（特に、ＨｂＡ１もしくはＨｂＡ１ｃ）は、糖尿病患者の血糖管理の指標として、より詳細には、糖尿病患者の長期（主に１〜３ヶ月間）の血糖コントロールの指標として注目されている。例えば、ＨｂＡ１は、正常な場合、Ｈｂ（全ヘモグロビン）の７〜８％であり、ＨｂＡ１ｃは、正常な場合、Ｈｂ（全ヘモグロビン）の６％以下（例えば、４．７〜５．７％）である。しかし、これらの糖化ヘモグロビンは、糖尿病患者では増加する。例えば、ＨｂＡ１ｃの場合、Ｈｂの２０％にも及ぶ。従って、本実施形態の測定方法を、糖化ヘモグロビンを測定することによって、糖尿病の診断、治療などに好適に利用できる。また、本発明の測定方法によって、Ｈｂ（全ヘモグロビン）およびＨｂＡ１ｃを測定することも可能である。
また、本実施形態の測定法法によれば、ＨｂＦを、Ｈｂに対する割合として測定することもできる。Ｈｂに対するＨｂＦの割合は、正常成人の場合、０．３〜１．３％である。Ｈｂに対するＨｂＦの割合は、通常、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症、慢性骨髄性白血病、ファンコニー貧血、赤白血病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、不応性貧血、妊娠、胞状奇胎、サラセミア（β、δβ）、不安定ヘモグロビン症で、まれに再生不良性貧血、白血病、多血症（赤血球増加症）、骨髄線維症、悪性腫瘍、甲状腺中毒症で、この基準範囲より増加する。従って、本実施形態の測定方法を、上記疾病の診断に利用することもできる。
さらに、本実施形態の測定法法によれば、ＨｂＡ２を、Ｈｂに対する割合として測定することもできる。Ｈｂに対するＨｂＡ２の割合は、正常人の場合、２〜３．５％である。Ｈｂに対するＨｂＡ２の割合は、βサラセミア、不安定ヘモグロビン症、鎌形赤血球貧血ヘテロ型、巨赤芽球性貧血、甲状腺機能亢進症で、基準範囲より増加し、一方、α−、δ−、δβ−サラセミア、遺伝性高胎児血色素症、鉄欠乏性貧血、鉄芽球性貧血で、基準範囲より減少する。従って、本実施形態の測定方法を、上記疾病の診断に利用することもできる。
上述したＨｂ組成成分は、等電点が異なるので、イオン交換クロマトグラフィーによって定量的に分画され得る。イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣＹＰＲＥＳＳ社より入手可能なカラム（商品名ＰｏｌｙＣＡＴＡＴＭ）を用いて実施され得るが、このカラムと同様の分画能を有する限り市販により入手可能ないずれのカラムも使用することができる。上述したＨｂ組成成分はまた、これらの成分を個々に認識することができる抗体を用いて、免疫学的方法を用いて測定され得る。免疫学的方法としては、例えば、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集免疫法などが挙げられる。
全ヘモグロビンの濃度は、上述したように、現在、臨床検査で用いられる任意のヘモグロビン定量法を使用することが可能である。このようなヘモグロビン定量法としては、例えば、シアンメトヘモグロビン法、酸化ヘモグロビン法、およびＳＬＳ−ヘモグロビン法が挙げられる（例えば、臨床検査法提要、改訂３１版、金原出版株式会社を参照のこと）。上述したヘモグロビン定量法で用いられる専用の体外診断薬は、市販により入手可能である。
また、ヘモグロビン類の測定は、ドライケミストリーによる測定方法によって行なわれる。「ドライケミストリーによる測定方法」とは、試薬が乾燥状態で担持される固相マトリックスに液状の試料を添加（通常、点着による）して、このマトリックス上で試薬と反応させ、そしてこの反応を検出することにより、試料中の被検物質を測定する方法を指す。ドライケミストリーによる測定方法は、迅速で、簡単で、かつ精度よい測定方法であるため、日常の臨床検査で好都合に使用される。ドライケミストリーによる測定方法としては、例えば、免疫クロマトグラフィー方法、免疫コンセントレーション方法、固相酵素免疫測定方法のような免疫学的方法、比色スライド方法、および電極法スライド方法が挙げられる。ドライケミストリーに関しては、例えば、「臨床病理、ドライケミストリー・簡易検査の新たなる展開（日本臨床病理学会編集、平成９年１１月発行）」に開示されている。
（実施形態２）
本実施形態では、上記実施形態１で述べた血液処理方法およびヘモグロビン類測定方法に用いることができる血液処理デバイスを、図を参照しながら説明する。図３（ａ）および図３（ｂ）は、本実施形態の血液処理デバイスを示す図である。
図３（ａ）に示すように、本実施形態の血液処理デバイス１０ａは、血液検体試料が供される基材１１と、基材１１に担持された、血液検体試料を部分的に溶血する量の溶血剤（不図示）とを備える。なお、溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。溶血剤は、まず溶液状態で基材に添加され、次いで凍結乾燥されて、基材に乾燥状態で担持されている。好ましくは、溶血剤は、基材において血液検体試料が接触可能な領域に、乾燥状態で担持される。
血液検体試料が供される基材１１としては、血液検体試料を点着させるためのような平板形態（不溶性の単層基材（例えば、セラライザー（Ａｍｅｓ）、試験紙、免疫クロマトグラフィー（プラスチックカード型）など）または多層基材（例えば、エクタケム（Ｋｏｄａｋ）、ドライケム（富士）など））から、試料液体を入れる容器形態（例えば、バイアル、試験管、アンプル、シノテスト、遠心ローター、ピッコロなど）まで種々であり得る。本実施形態のデバイスにおいて用いられ得る基材はまた、ペーパータオル（例えば、リードクッキングペーパー（登録商標）のようなパルプ不織布）、メッシュ布帛（例えば、ガーゼ綿布帛）、およびガラス繊維濾紙のような、液体を吸収して保持することが可能な材料を用いて作製される。
ヘモグロビン類を測定するための手段としては、イオン交換クロマトグラフィーもしくは免疫学的方法（例えば、ラテックス免疫凝集法）に基づく測定手段が挙げられる。
また、図３（ａ）に示す血液処理デバイス１０ａに代えて、図３（ｂ）に示す血液処理デバイス１０ｂを用いることができる。血液処理デバイス１０ｂで使用される基材１１は、側面および底面（不図示）とを有し、開口部１３を備える、測定手段の使用に適したセル１２となっている。この場合、溶血剤がセルにおいて血液検体試料が接触可能な領域（例えば、セル１２内の底部および側面の表面など（これらは、測定される血液検体試料容積に応じて適宜選択される））に、乾燥状態で担持される。血液処理デバイス１０ｂは、溶血剤が担持されたセル１２内に血液検体試料を投入した後に測定手段に導入されてもよく、血液処理デバイス１０ｂのセル１２が測定手段に導入される際に、血液検体試料をセル１２内に投入してもよい。また、血液検体試料を、バッチ式またはフロー式でセル内に導入してもよい。
背景技術の欄で述べたように、ヘモグロビン類を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。
特に、従来ではＨｂＡ１ｃの測定のために、イオン交換クロマトグラフィー、およびラテックス免疫凝集法の測定原理に基づいた自動化機器が用いられている。血液中に約１５０ｇ／ｌのような全ヘモグロビン量は、上記従来の自動化機器で測定するには極めて高い濃度である。従って、一般的に、上記自動化機器には、血液検体試料を完全溶血する段階、完全溶血された試料を最適な測定結果が得られる濃度まで希釈する段階、および希釈された試料を上記測定原理に基づいて測定する段階が、厳密に設定されている。代表的なＨｂＡ１ｃ専用測定機器としては、東ソー製のＡ１ｃ２．２およびバイエル製のＤＬＳ２０００が挙げられる。前者は、イオン交換クロマトグラフィー原理に基づき、後者はラテックス免疫凝集阻止法に基づく。これらの機器における血液検体試料の処理方法は、完全溶血段階および希釈段階が自動化されている点で共通している。上記のような自動化機器は、臨床検査分野において多く使用されているが、様々な操作を自動化しているために、機器が大規模で、且つ、高価である。
このように、ヘモグロビン類の測定において、上述したような処理操作が装置に組み込まれている自動化された装置を用いる場合、高コストとなる、あるいは、このような装置を用いない場合、多段階操作により検査が煩雑になる。さらに、免疫学的な方法でヘモグロビン類を測定する場合、完全溶血を行なうと非常に高い濃度であるため、抗原過剰領域に入り、測定感度が低下することがある。
しかしながら、本実施形態の血液処理デバイス１０ａを用いれば、基材１１に、血液検体試料を供し、測定手段に設置するだけで、迅速に赤血球内の成分の測定が開始できる。また、本実施形態の血液処理デバイス１０ｂを用いれば、セル１２内に血液検体試料を投入し、セル１２を測定手段に設置するだけで、迅速に赤血球内の成分の測定が開始できる。
（実施形態３）
本実施形態では、血液検体試料中のヘモグロビン類をドライケミストリーによる測定方法によって測定するためのデバイス（以下、ヘモグロビン類測定デバイスと称する）を説明する。ヘモグロビン類測定デバイスは、血液検体試料を部分的に溶血する量の溶血剤と、ヘモグロビン類と特異的に結合する溶出可能な検出物質と、ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを含む。
ここで使用される「部分的に溶血できる量の溶血剤」は、上記実施形態１に述べた通りである。
上記検出物質は、測定対象のヘモグロビン類に特異的に結合する、標識に結合された物質である。このような標識は、当該技術分野で公知であり、例えば、金コロイド、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２４Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。このような標識はまた、測定対象のヘモグロビン類に対する抗体に結合されて、検出物質を形成し得る。測定対象のヘモグロビン類に結合する限り、いかなる抗体も使用することができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体が好ましい。
固定化物質は、測定対象のヘモグロビン類に特異的に結合する任意の物質である。このような物質としては、免疫学的方法を使用する場合、測定対象のヘモグロビン類に対するモノクローナル抗体である。上記の検出物質で使用された抗体とは別のエピトープに対して反応するモノクローナル抗体であることが好ましい。
本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスでは、溶血剤、検出物質、および固定化物質が、デバイスの血液検体試料の添加部位に近い方から順に、乾燥状態で担持されている。
従って、本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスによると、デバイスに添加された血液検体試料が、溶血剤、検出物質、および固定化物質が担持された層の間を移動しながら、溶血によるヘモグロビンの溶出から溶出されたヘモグロビンの検出まで行うことができる。
本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスでは、溶血剤は、例えば、基材への担持のために、層に含浸された後、凍結乾燥される。溶血剤は、添加された血液との接触により反応するので、血液が添加される部位を予め決定することなく測定可能なように基材の全体にわたって含まれていることが好ましい。勿論この場合も、基材全体に含まれる溶血剤の量は、溶出されたヘモグロビン類の血漿中の濃度が、完全溶血に比較して低い濃度となる量である。
溶出されたヘモグロビン類を含む血液検体試料は、検出物質が担持された層に移動すると、この層に担持された検出物質が溶出し、溶出されたヘモグロビン類は、この溶出された検出物質と特異的に反応する。従って、検出物質は、デバイスが使用されない状態では乾燥状態で担持されて固相を形成するが、溶液に遭遇したときにその溶液中に溶出され得るように、層に担持され得る。例えば、このような層への担持のために、検出物質は、層に含浸された後、凍結乾燥され得る。
検出物質と結合されたヘモグロビン類は、基材（固相マトリックス）に担持された固定化物質に結合される。固相マトリックスにおける検出物質、ヘモグロビン類、および固定化物質のサンドイッチ特異反応を検出することにより、血液検体試料中のヘモグロビン類の量が測定される。検出の場となる固相マトリックスは、通常の免疫アッセイなどで使用され得るマトリックス材料（例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリスチレンなど）であり得る。この固相マトリックスはまた、フィルム、試験紙および試験片であり得る。
ドライケミストリーによる測定方法に基づくヘモグロビン類測定デバイスは、単層方式または多層方式であり得る。単層方式または多層方式のいずれにしても、血液検体試料の添加部位に近い方を上流とすると、上流から下流に向って、溶血剤、検出物質、および固定化物質の順に担持される。
単層方式では、図４に示すように、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層（本明細書中、以下、溶血層とも称する）、検出物質によりヘモグロビン類を標識する層（本明細書中、以下、標識層とも称する）、および固定化試薬に結合されたヘモグロビン類を検出する層（本明細書中、以下、検出層とも称する）が、単一（同一）の層に配置される。単層方式では、溶血剤、検出物質、および固定化物質が、血液検体試料が添加される部分Ａ側から順に、ヘモグロビン類の検出の場となり得る基材（固相マトリックス）４１上に担持されている。固相マトリックス４１は、通常の免疫アッセイなどで使用され得るマトリックス材料（例えば、ニトロセルロースメンブレン）であり得る。この固相マトリックスはまた、フィルム、試験紙、および試験片であり得る。
このような配置により、添加された血液検体試料は、固相マトリックス上を展開する過程において、まず最初に溶血剤と接触して血液を部分溶血する。次に、部分溶血による血漿水中のヘモグロビンと溶出可能な検出物質とが特異的に結合される。続いて、ヘモグロビン類−検出物質の複合体と固定化試薬とが特異的に結合され、検出物質−ヘモグロビン類−固定化物質を生じる。
多層方式では、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層、検出物質によりヘモグロビン類を標識する層、および固定化試薬に結合されたヘモグロビン類を検出する層がそれぞれ独立した別個の層として存在しており、これらの層は、その間を血液検体試料が移動できるような形態で積層されている。多層方式では、溶血剤、検出物質、および固定化物質がそれぞれ別個の層に担持され、それらの層が、血液検体試料が添加される側から順に積層されている。溶血剤が担持される層は、表面に添加された液体を、その反対側の表面に浸透させる材料からなる。例えば、パルプ不織布、メッシュ布帛（例えば、ガーゼ綿布帛）、およびガラス繊維濾紙のような材料を用いて、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層が作製される。溶血剤は、例えば、溶血剤の溶液をこれらの層に含浸させ、次いで凍結乾燥されることにより、層に担持される。検出物質もまた、表面に添加された液体を、その反対側の表面に浸透させる材料からなる層に担持され得る。検出物質もまた、例えば、検出物質の溶液をこれらの層に含浸させ、次いで凍結乾燥されることにより、層に担持される。固定化物質は、ヘモグロビン類の検出の場となり得る固相マトリックス上に担持され得る。このような固相マトリックスとしては、ニトロセルロースメンブレンが挙げられる。固定化は、通常の免疫学的アッセイで使用される固定化の手順によって行なわれ得る。これらの層は、血液検体試料がこれらの層の間を移動可能となるように、接触して配置され得る。このような配置により、添加された血液検体試料は、これらの層間を移動する過程において、まず、溶血剤と接触して血液を部分溶血する。次に、部分溶血による血漿水中のヘモグロビンと溶出可能な検出物質とが特異的に結合される。続いて、ヘモグロビン類−検出物質の複合体と固定化試薬とが特異的に結合され、検出物質−ヘモグロビン類−固定化物質を生じ得る。
本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスはまた、血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去する層を備え得る。この赤血球残留物を除去する層は、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層と同じであり得る。あるいは、本デバイスにおいて、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層とは別に、赤血球残留物を除去する層が設けられ得る。例えば、パルプ不織布、メッシュ布帛（例えば、ガーゼ綿布帛）、およびガラス繊維濾紙のような材料からなる層が使用され得る。本層は、ドライケミストリーによるヘモグロビン類の測定に不要であり得る赤血球膜残骸を含む血漿溶液を吸収し得る。従って、本明細書中では、本層を「吸収層」とも称する。
本実施形態の多層式のヘモグロビン類測定デバイスの一例を、図５に示す。図５は、本実施形態の多層式のヘモグロビン類測定デバイスを表す断面図である。基板（２１）（基板は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）であり得る）の上に、抗体（２３）が固定化された抗体固定化メンブレン（２２）を、続いてこの上に標識抗体凍結乾燥担持層（２４）を、そして続いてこの上に溶血剤担持層（２５）を積層し得る。ここで、図２に示すように、溶血剤担持層（２５）、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）は、すぐ下にある層と部分的に重なるように配置され得る。この重なりによって、血液検体試料は各層間を移動し、従って、溶血、標識抗体結合、および固定化抗体結合を生じる。抗体固定化メンブレン（２２）の剥き出しの領域（すなわち、溶血剤担持層（２５）および標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない領域）に、ヘモグロビン類に特異的な抗体が固着しており、この領域にて、血液検体試料中のヘモグロビン類の反応が検出され得る。また、吸収層（２６）が、抗体固定化メンブレン（２２）における、血液検体試料の添加側と反対側（すなわち、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない側）の領域に重なるように積層され得る。吸収層は、反応検出領域に存在する、検出に不要であり得る赤血球膜残骸を含む血漿溶液を吸収し、反応の検出を補助し得る。さらに、溶血剤担持層（２５）、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）の３つの層の重なり領域から反応検出領域までが、添加された試料による湿潤の乾燥を防ぐため、または試料の測定を妨害し得る物質の混入を避けるために、不透過性のシート（２７）で被覆され得る。このような不透過性シートとしては、セロハンが挙げられる。溶血剤担持層（２５）の重なり部分以外は、不透過性シートで被覆され得ない。この非被覆部分に、血液検体試料が、添加され得る。不透過性シート（２７）は、抗体固定化メンブレン（２２）と吸収層（２６）との重なり領域および抗体固定化メンブレン（２２）との重なりのない吸収層（２６）の少なくとも一部分をも被覆し得る。このような被覆により、抗体固定化メンブレン（２２）から吸収層（２６）への吸収が妨害されない。
以上に示すように、血球中の成分を測定する際に、血液検体試料を部分的に溶血させることにより、従来必要であった希釈段階を除くことができる。手動の場合、本願発明の方法を用いることにより、希釈操作を省くことが可能である。またこれまで希釈段階を自動化していた場合も、自動化機器から自動希釈段階を省くことができ、機器の小型化およびコストの低減につながる。
従って、本発明により、ヘモグロビン類等の血球中の成分の測定をより容易にすることができる血液処理方法、ヘモグロビン類測定方法、血液処理デバイスおよびヘモグロビン類測定デバイスが提供される。本発明によれば、ヘモグロビン類を、簡便かつ迅速に、測定することができる。
実施例
次に、本発明の実施例をＨｂＡ１ｃの測定例に基づいて説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
（実施例１：吸光法における溶血剤の添加量の適切な範囲）
塩化カリウム１．５、７．５、１５、７５、および１５０ｍｇのそれぞれに、全血検体試料（ＨｂＡ１ｃ値４．８％）１．５ｍｌを添加（すなわち、それぞれ塩化カリウム０．１％、０．５％、１％、５％、および１０％；これらの割合は、重量／体積である）し、混濁し、次いで遠心分離し、上清液１．０ｍｌを取り出した。これらの各上清液について、３５０〜８００ｎｍにおける光透過率を調べた結果を図６に示す。例えば、５００ｎｍでは、溶血剤（ここではＫＣｌ）の添加量は、０．１〜０．５％程度が適切であり、７００ｎｍでは、０．１〜１０％程度が適切であることを示すものである。
（実施例２：溶血剤の量と、Ｈｂ濃度およびＨｂＡ１ｃ値との関係）
塩化カリウム１．５、７．５、１５、７５、または１５０ｍｇに、全血検体試料（ＨｂＡ１ｃ値４．８％）１．５ｍｌを添加（すなわち、それぞれ塩化カリウム０．１％、０．５％、１％、５％、または１０％；これらの割合は、重量／体積である）し、混濁し、次いで遠心分離し、上清液１．０ｍｌを取り出した。この上清液に存在しているＨｂ濃度をＳＬＳ−ヘモグロビン法により測定した。ＳＬＳ−ヘモグロビン法について記述する。ＳＬＳ−ヘモグロビン法を、専用試薬として、和光純薬から市販されているヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて行った。ヘモグロビンの発色原液である０．６７ｍＭラウリル酸ナトリウム５．０ｍｌに対して、ヘモグロビン標準液（１、５、１０、５０、１００、または１５０ｇ／Ｌ）０．０２ｍｌを加え、よく混合し、次いで室温で約３分間放置し、ヘモグロビンコントロール溶液を作製した。これらコントロール溶液を、５４０ｎｍの波長で吸光度を測定した。得られた値を用いて、ヘモグロビン濃度についての吸光度（５４０ｎｍ）の検量線を作成した。次に、種々の溶血率で処理しておいた試料において、上述の上清液の０．０２ｍｌを用いて、同様にして吸光度を測定した。検量線を用いて、各ヘモグロビン濃度を算出した。
一方、ＨｂＡ１ｃ値を専用ＨＰＬＣ（Ａ１ｃ２．２、東ソー製）を用いて測定した。溶血処理しておいた試料を試験管に入れ、この装置にセットし、自動的に測定した。ここで得られたＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの割合（％）に相当する。
以上の結果を図７に示す。図７中、下方の横軸に、添加した塩化カリウムの濃度（％）を示し、左の縦軸に、Ｈｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示し、そして右の縦軸に、ＨｂＡ１ｃ値（％）を示す。また、図７中の黒丸は、Ｈｂ濃度の結果を示し、そして白丸は、ＨｂＡ１ｃ値の結果を示す。
図７は、ＫＣｌ濃度に依存して、溶血によるＨｂ濃度が高くなっていることを示している。さらに、溶血剤の量に依存して、Ｈｂ濃度が変化したが、ＨｂＡ１ｃ値は変化しないことを示す。従って、全ヘモグロビンに対するヘモグロビン類の割合（％）の測定の際に、完全溶血の必要性がないこと、従って、希釈段階の必要性がなくなることが示唆された。
（実施例３：免疫クロマトグラフィー法を用いたＨｂＡ１ｃの測定）
（２．１．Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ１ｃ測定用デバイスの作製）
本実施例において、ＨｂＡ１ｃの測定に使用し得るデバイスを作製した。このデバイスは、図５に示すように、溶血剤による溶血、抗体との反応、およびこの反応の検出が別個の層で行なわれる多層式である。図５は、本発明の多層式デバイスの一例の断面図である。まず、各層の作製について、以下に説明する。
＜金コロイド標識抗体凍結乾燥固定化物（２４）＞
三角フラスコに蒸留水１９８ｍｌおよび１％塩化金酸水溶液２ｍｌを入れ、得られた混合水溶液を沸騰させ、沸騰した水溶液に１％クエン酸三ナトリウム水溶液４ｍｌを、すばやく添加した。添加後、混合水溶液の色が赤紫色になるのを確認してから、沸騰した状態で１５分間放置した。その後、三角フラスコを取り出し、室温に放置することにより自然冷却し、金コロイド液を得た。得られた金コロイド液に０．２Ｍ炭酸カリウム水溶液を加えてｐＨ８．９に調整した。この金コロイド液に対して１．５５ｍｇ／ｍｌの独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８８号の細胞株より産生した抗Ｈｂモノクローナル抗体の溶液を１．６ｍＬ添加して、３分間攪拌させた。さらに、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液（ｐＨ８．９）を２０ｍｌ添加し、さらに３分間攪拌させた。その後、未標識の抗体およびＢＳＡを取り除くために、遠心分離し、上清液をアスピレーターにて除去した。洗浄を行うために、１％ウシ血清アルブミン−生理食塩水（ＢＳＡ・ＰＢＳ）溶液を用いて再懸濁させ、再度、遠心分離し、上清液をアスピレーターにより除去した。こうして得られた金コロイド標識抗Ｈｂモノクローナル抗体１％ＢＳＡ・ＰＢＳ懸濁液を０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、凝集塊を除去した。この後、ガラス繊維濾紙に金コロイド標識抗Ｈｂ抗体２１懸濁液を含浸させ、液体窒素を用いて凍結させ、凍結乾燥機で２４時間放置することにより凍結乾燥固定化物を作製した。
＜Ｈｂ測定用／抗体固定化メンブレン（２２）＞
ニトロセルロース性メンブランに独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８９号の細胞株より産生した抗Ｈｂモノクローナル抗体の溶液（ＰＢＳ）を固定化した。固定化後、スキムミルクでブロッキングを行った。引き続き、固定化された抗体を、０．１Ｍトリス（ｐＨ  ８．２）で２回洗浄し、乾燥させた。
＜ＨｂＡ１ｃ測定用／抗体固定化メンブレン（２２）＞
ニトロセルロース性メンブランに独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３６号の細胞株より産生した抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体の溶液を固定化した。固定化後、スキムミルクでブロッキングを行った。引き続き、固定化された抗体を、０．１Ｍトリス（ｐＨ  ８．２）で２回洗浄し、乾燥させた。
＜溶血剤担持固相（２５）＞
リードクッキングペーパー（登録商標）（ライオン社より販売）に、全試料容量に対して０．５％（ｗ／ｖ）のＫＣｌを含浸させ、凍結乾燥させた。
＜Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ１ｃ測定用デバイスの構築＞
上記で作製した金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層、Ｈｂ測定用抗体固定化メンブレンもしくはＨｂＡ１ｃ測定用抗体固定化メンブレン、および溶血剤担持層を用いて、図５に示すように、Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ１ｃ測定用デバイスを構築した。以下に、このデバイスの構築を説明する。
基板（２１）（ポリエチレンテレフタレート：松本製作所製）の上に、抗体（２３）が固定化された抗体固定化メンブレン（２２）を、続いてこの上に金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）を、そして続いてこの上に溶血剤担持層（２５）を積層した。ここで、図５に示すように、溶血剤担持層（２５）、金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）は、すぐ下にある層と重なるように配置した。抗体固定化メンブレン（２２）では、剥き出しの領域（すなわち、溶血剤担持層（２５）および金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない領域）にヘモグロビン類に特異的な抗体が固着させた、この領域を、血液検体試料中のヘモグロビン類の反応を検出するための領域とした。また、抗体固定化メンブレン（２２）における、血液検体試料の添加側と反対側（すなわち、金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない側）の領域に重なるように、ガラス繊維濾紙吸収層（２６）を積層した。さらに、溶血剤担持層（２５）、金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）の３つの層の重なり領域から反応検出領域を、不透過性シート（２７）（セロハン）で被覆した。溶血剤担持層（２５）の重なり部分以外は曝露させた。この曝露部分は、血液検体試料を点着する領域である。不透過性シート（２７）は、抗体固定化メンブレン（２２）とガラス繊維濾紙吸収層（２６）との重なり領域および抗体固定化メンブレン（２２）との重なりのないガラス繊維濾紙吸収層（２６）の一部分をも被覆した。これは、抗体固定化メンブレン（２２）からガラス繊維濾紙吸収層（２６）への吸収を妨害しないためである。
＜Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ１ｃ測定用デバイスを用いるヘモグロビン類の測定＞
０、０．０５、０．１、０．５、０．７、１．０、３．０％（ｗ／ｖ）のＫＣｌを担持している溶血剤担持層を含むそれぞれのデバイスに対して、１６０μｌの血液を点着し、５分後、６１０ｎｍにおける反射吸光度を測定した。その結果を図８に示す。
図８より、０．１から１．０％（ｗ／ｖ）ＫＣｌにおいて呈色強度を示していることにより、ＫＣｌ量が最適な範囲は０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）であることがわかる。このデバイスでは、半値となる０．５％（ｗ／ｖ）ＫＣｌが好ましく、上記＜溶血剤担持固相（２５）＞の欄で述べたように、本実施例では、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＣｌを溶血剤担持固相（２５）に担持させ、ＨｂＡ１ｃの測定を試みた。
まず、Ｈｂ標準液またはＨｂＡ１ｃ標準液を用いて希釈系列を作成した。この希釈系列１６０μＬをデバイスに点着し、５分後、６１０ｎｍにおける反射吸光度を測定し、検量線を作成した。Ｈｂ測定用デバイスの検量線を図９に、そしてＨｂＡ１ｃ測定用デバイスの検量線を図１０に示す。図９中、横軸にＨｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、そして縦軸に６１０ｎｍにおける反射吸光度の値を示す。また、図９中の黒丸は、各希釈系列におけるＨｂ濃度の吸光度の結果を示す。図１０中、横軸にＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、そして縦軸に６１０ｎｍにおける反射吸光度の値を示す。また、図１０中の黒丸は、各希釈系列におけるＨｂＡ１ｃ濃度の吸光度の結果を示す。
次に、４．０、５．４、または１０．４％ＨｂＡ１ｃを含む血液検体試料１６０μｌをデバイスに点着し、５分後、反射吸光度を測定した。この結果を図１１に示す。図１１中、横軸にＨｂＡ１ｃ値（％）を示し、左の縦軸にＨｂに対する反射吸光度を示し、右の縦軸にＨｂＡ１ｃに対する反射吸光度を示す。また、図１１中の黒丸は、Ｈｂ濃度の結果を示し、そして白丸は、ＨｂＡ１ｃ値の結果を示す。図１１の結果の各吸光度値を、図９および図１０からそれぞれ得られる検量線から回帰して、Ｈｂ濃度およびＨｂＡ１ｃ濃度を求めた（図１２）。図１２中、横軸に６１０ｎｍでの反射吸光度を示し、左の縦軸に換算により算出されたＨｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示し、そして右の縦軸に換算により算出されたＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示す。また、図１２中の黒丸は、Ｈｂ濃度の結果を示し、そして白丸は、ＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｇ／ｄｌ）の結果を示す。上記のいずれの血液検体試料においてもＨｂ濃度は、ほぼ同じであった。このことにより、上記のいずれの血液検体試料においても、同程度に溶血されていることが分かる。デバイスでの測定により得られたＨｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）およびＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を用いて、各ＨｂＡ１ｃ値の試料のＨｂＡ１ｃ値（％）を決定した（ＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｇ／ｄｌ）／Ｈｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）×１００で算出した）。この結果、ＨｂＡ１ｃ値４．０％の検体は３．９％、ＨｂＡ１ｃ値５．４％の検体は５．７％、ＨｂＡ１ｃ値１０．４％の検体は１１．２％とそれぞれ算出された。このことから、血液検体試料を部分的に溶血するように制御することによって、ヘモグロビン類を測定できることが確認された。
以上の結果から、希釈段階をいれずに、１段階で簡易に測定できるデバイスを作製することができた。
本発明によれば、ヘモグロビン類を、簡便且つ迅速に測定することができる。
産業上の利用可能性
本発明は、栄養管理および医療診断の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の血液処理方法のフローチャートである。
図２は、溶血率を表す式を示す図である。
図３（ａ）および図３（ｂ）は、本実施形態の血液処理デバイスを示す図である。
図４は、本発明の単層式のヘモグロビン類測定デバイスの一例を示す図である。
図５は、本発明の多層式のヘモグロビン類測定デバイスの一例を示す断面図である。
図６は、本発明の一実施例におけるＫＣｌの濃度（溶血剤の添加量）と光透過率を表す図である。
図７は、本発明の一実施例におけるＫＣｌの濃度（溶血剤の添加量）とＨｂ濃度およびＨｂＡ１ｃとの関係を表す図である。
図８は、本発明の一実施例におけるＫＣｌ量の濃度（溶血剤の添加量）と６１０ｎｍにおける反射吸光度との関係を表す図である。
図９は、本発明の一実施例におけるＨｂ測定用デバイスの検量線を示す図である。
図１０は、本発明の一実施例におけるＨｂＡ１ｃ測定用デバイスの検量線を示す図である。
図１１は、本発明の一実施例におけるデバイスで４．０％ＨｂＡ１ｃ、５．４％ＨｂＡ１ｃ、１０．４％ＨｂＡ１ｃを測定したときの結果を示す図である。
図１２は、本発明の一実施例におけるデバイスによる４．０％ＨｂＡ１ｃ、５．４％ＨｂＡ１ｃ、１０．４％ＨｂＡ１ｃの測定値から、検量線を用いて濃度換算した結果を示す図である。
【図１】
2003083479.tif 000003
【図２】
2003083479.tif 000004
【図３】
2003083479.tif 000005
【図４】
2003083479.tif 000006
【図５】
2003083479.tif 000007
【図６】
2003083479.tif 000008
【図７】
2003083479.tif 000009
【図８】
2003083479.tif 000010
【図９】
2003083479.tif 000011
【図１０】
2003083479.tif 000012
【図１１】
2003083479.tif 000013
【図１２】
2003083479.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月29日(2003.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（補正後）赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
上記血液検体試料と上記溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であり、
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存している、血液処理方法。
【請求項２】
削除
【請求項３】
請求項１に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤である、血液処理方法。
【請求項４】
請求項３に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、無機塩である、血液処理方法。
【請求項５】
請求項４に記載の血液処理方法において、
上記混合試料中における上記無機塩の濃度は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、血液処理方法。
【請求項６】
（補正後）赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）と、
上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程（ｃ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であり、
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存している、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）では、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する方法として、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法、比色スライド法、および電極法スライド法のうちのいずれか１つが用いられる、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項８】
請求項６に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）において、少なくとも２種類のヘモグロビンを測定する、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項９】
請求項８に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記少なくとも２種類のヘモグロビンは、ヘモグロビンとＨｂＡ１ｃとの組み合わせである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項１０】
請求項６に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記ヘモグロビン類は、糖化ヘモグロビンである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項１１】
基材と、
赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤とを備え、
上記溶血剤は、赤血球を含む血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されている、血液処理デバイス。
【請求項１２】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
上記血液検体試料の添加部を有する基材と、
赤血球膜を破壊するための溶血剤と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを備え、
上記溶血剤は、血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されており、
上記溶血剤、上記検出物質、および上記固定化物質はそれぞれ、固体で基材上に担持され、
上記基材の上記血液検体試料の添加部に近い方から順に、上記溶血剤と、上記検出物質と、上記固定化物質とが配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１３】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
基板と、
上記基板上に設けられた上記血液検体試料の添加部と、
上記基板上に設けられ、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤を含み、上記血液検体試料の溶血を制御するための溶血層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質を含み、上記ヘモグロビン類を標識するための標識層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化試薬を含み、上記ヘモグロビン類を検出するための検出層とを備え、
上記血液検体試料は、上記溶血層と、上記標識層と、上記検出層との間を移動できる、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去するための層をさらに備える、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１５】
請求項１３に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記溶血層、上記標識層、および上記検出層は、単一の層に配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月27日(2003.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
上記血液検体試料と上記溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であり、
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存している、血液処理方法。
【請求項２】
請求項１に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤である、血液処理方法。
【請求項３】
請求項２に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、無機塩である、血液処理方法。
【請求項４】
請求項３に記載の血液処理方法において、
上記混合試料中における上記無機塩の濃度は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、血液処理方法。
【請求項５】
赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）と、
上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程（ｃ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であり、
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存している、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）では、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する方法として、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法、比色スライド法、および電極法スライド法のうちのいずれか１つが用いられる、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項７】
請求項５に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）において、少なくとも２種類のヘモグロビンを測定する、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項８】
請求項７に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記少なくとも２種類のヘモグロビンは、ヘモグロビンとＨｂＡ１ｃとの組み合わせである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項９】
請求項５に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記ヘモグロビン類は、糖化ヘモグロビンである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項１０】
基材と、
赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤とを備え、
上記溶血剤は、赤血球を含む血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されている、血液処理デバイス。
【請求項１１】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
上記血液検体試料の添加部を有する基材と、
赤血球膜を破壊するための溶血剤と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを備え、
上記溶血剤は、血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されており、
上記溶血剤、上記検出物質、および上記固定化物質はそれぞれ、固体で基材上に担持され、
上記基材の上記血液検体試料の添加部に近い方から順に、上記溶血剤と、上記検出物質と、上記固定化物質とが配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１２】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
基板と、
上記基板上に設けられた上記血液検体試料の添加部と、
上記基板上に設けられ、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤を含み、上記血液検体試料の溶血を制御するための溶血層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質を含み、上記ヘモグロビン類を標識するための標識層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化試薬を含み、上記ヘモグロビン類を検出するための検出層とを備え、
上記血液検体試料は、上記溶血層と、上記標識層と、上記検出層との間を移動できる、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去するための層をさらに備える、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１４】
請求項１２に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記溶血層、上記標識層、および上記検出層は、単一の層に配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球膜を破壊するための血液処理方法およびヘモグロビン類の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査分野において、ポイント・オブ・ケア・テスト（以下ＰＯＣＴと略する）が注目されている。ＰＯＣＴとは、医療現場での臨床検査を示し、検体採取から結果が出るまでの時間が最も重要視される検査の総称を示す。従って、一般に、臨床検査分野においては、操作の簡便性、迅速な判定、および低価格が、求められている。これは、血液中成分の測定にも当てはまる。
【０００３】
血液は、細胞成分と液体成分とに大きく分けられる。細胞成分には、赤血球、白血球、および血小板が含まれる。液体成分は、血漿が含まれる。
【０００４】
血液検体試料において、赤血球と全血との容積比（以後、ヘマトクリット値またはＨｔ値と称する）が重要なファクターの一つである。Ｈｔ値は、貧血の程度に応じて変化するため、貧血の程度を知るための尺度となる。また、Ｈｔ値は、血液検体試料の物性（粘度等）が測定に影響を与え得るため、他の測定値の補正を行なう必要性についての尺度となる。
【０００５】
赤血球は、約１．１×１０10個で１ｍｌの体積を占め、１個あたりの容積は約９０μｍ3である。赤血球の最大成分である水は、１００ｍｌの赤血球中で約６３ｇを占める。赤血球に約３４ｇ含まれる残りの大部分は、ヘモグロビン類とみなすことができる。Ｈｔ値が４５％の場合、血液１Ｌ中のヘモグロビン類の量は約１５０ｇになる。すなわち、ヘモグロビン類は、血液中に１５０ｇ／ｌの濃度で存在しており、生体において最も量の多いタンパク質である。
【０００６】
ヒトヘモグロビン（以後Ｈｂとする）は、α鎖および非α鎖（β、γ、δ鎖）のグロビンがヘムと結合し、会合している四量体である。健常人のＨｂには、ＨｂＡ（α2β2）が約９０％、ＨｂＡ2（α2δ2）が約３％、ＨｂＦ（α2γ2）が約１％、およびＨｂＡ1（糖が結合したＨｂＡ）が数％それぞれ存在する。なお、上記ＨｂＡ1には、ＨｂＡ1a、ＨｂＡ1b、およびＨｂＡ1cが含まれる。
【０００７】
従来から、上記Ｈｂの組成比を検査することは、臨床化学的に重要なものとされている。例えば、上記ＨｂＦの測定値が、基準範囲０．３〜１．３％以外の異常値を示す場合、遺伝性高ＨｂＦ症、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病などの疑いがもたれる。また、上記ＨｂＡ2の測定値が、基準範囲２〜３．５％以外の異常値を示す場合、不安定Ｈｂ症もしくは悪性貧血の疑いがもたれる。
【０００８】
さらに、近年は三大成人病の一つである糖尿病が問題になっている。そこで、糖尿病患者の１〜３ヶ月間の比較的長期間の血糖コントロールのための目安として、ＨｂＡ1もしくはＨｂＡ1cが検査項目として注目されている。ＨｂＡ1cの測定装置が開発されている。
【０００９】
ヘモグロビン類は、例えば、等電点電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、ラテックス免疫凝集法などを用いて測定されている。
【００１０】
血液検体試料の他の測定対象物と異なり、ヘモグロビン類は、赤血球の中に存在しているため、測定を行なうためには溶血を生じさせる必要がある。「溶血」とは、赤血球膜が破れ、ヘモグロビン類が、赤血球の外に排出される現象をいう。より詳細には、赤血球の大きさは、赤血球膜に対する浸透圧によって影響される。赤血球は、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が高い塩溶液中では、赤血球が収縮する。一方、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が低い塩溶液中では、赤血球が膨張する。このような赤血球の収縮および膨張の過程において、赤血球膜が破れると、ヘモグロビン類が赤血球の外に排出される。血液が完全に溶血された場合、Ｈｔ値４５％の場合、ヘモグロビン濃度は、約１５０ｇ／Ｌである。
【特許文献１】特開平３−４６５６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ヘモグロビン類の測定の結果は、全ヘモグロビン量に対する割合で示される。このため、測定対象のヘモグロビン類の量だけでなく、全ヘモグロビン量をも測定する必要がある。上述のように、全ヘモグロビン量は、個人差があるものの、通常、血液中に約１５０ｇ／Ｌの濃度で存在する。この濃度は、ヘモグロビン類の測定にとって不都合な、非常に高い濃度である。ヘモグロビン類は、長波長側に吸収波長を有する赤い色素をもっているので、高濃度であれば、ヘモグロビン類の測定が妨害されやすい。
【００１２】
例えば、免疫クロマトグラフィーによってヘモグロビン類の測定を行なう場合、免疫反応の１つの特性として生じる抗原過剰量領域での測定値の低下が、誤作動の原因となる。また、多量のヘモグロビン類による血液検体試料の粘度の増加によって、免疫クロマトグラフィーデバイスの固相マトリックスでの血液検体試料の展開速度が遅くなったり、全く展開しなくなるなどの不具合も生じる。従って、例えば、特開平３−４６５６６号公報に開示されているように、ヘモグロビン類を正確に測定するためには、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が必要である。つまり、ヘモグロビン類を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。
【００１３】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、血液処理方法、血液処理デバイス、ヘモグロビン類測定方法およびヘモグロビン類測定デバイスに関し、特に、ヘモグロビン類に代表される赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことが可能な方法およびデバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の血液処理方法は、赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、上記血液検体試料と上記溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）とを含み、上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
【００１５】
従来の方法では、ヘモグロビン類に代表される赤血球中の成分を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。しかしながら、本発明の血液処理方法を用いれば、赤血球中の成分を測定する際に、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が不要となる。従って、本発明の血液処理方法によれば、赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことができる。
【００１６】
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存していることが好ましい。
【００１７】
上記溶血剤は、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤である構成としてもよい。
【００１８】
上記溶血剤は、無機塩である構成としてもよい。
【００１９】
上記混合試料中における上記無機塩の濃度は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましい。
【００２０】
本発明のヘモグロビン類測定方法は、赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）と、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程（ｃ）とを含み、上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
【００２１】
従来の方法では、ヘモグロビン類を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。しかしながら、本発明のヘモグロビン類測定方法を用いれば、ヘモグロビン類を測定する際に、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が不要となる。従って、本発明のヘモグロビン類測定方法によれば、ヘモグロビン類の測定を、より簡単に行なうことができる。
【００２２】
上記工程（ｃ）では、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する方法として、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法、比色スライド法、および電極法スライド法のうちのいずれか１つが用いられる構成としてもよい。
【００２３】
上記工程（ｃ）において、少なくとも２種類のヘモグロビンを測定する構成としてもよい。
【００２４】
上記少なくとも２種類のヘモグロビンは、ヘモグロビンとＨｂＡ１ｃとの組み合わせである構成としてもよい。
【００２５】
上記ヘモグロビン類は、糖化ヘモグロビンである構成としてもよい。
【００２６】
本発明の血液処理デバイスは、基材と、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤とを備え、上記溶血剤は、赤血球を含む血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されている。
【００２７】
本発明の血液処理デバイスによれば、赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことができる。
【００２８】
本発明のヘモグロビン類測定デバイスは、赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、上記血液検体試料の添加部を有する基材と、赤血球膜を破壊するための溶血剤と、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質と、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを備え、上記溶血剤は、血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されており、上記溶血剤、上記検出物質、および上記固定化物質はそれぞれ、固体で基材上に担持され、上記基材の上記血液検体試料の添加部に近い方から順に、上記溶血剤と、上記検出物質と、上記固定化物質とが配置されている。
【００２９】
本発明のヘモグロビン類測定デバイスによれば、ヘモグロビン類の測定を、より簡単に行なうことができる。
【００３０】
本発明の別のヘモグロビン類測定デバイスは、赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、基板と、上記基板上に設けられた上記血液検体試料の添加部と、上記基板上に設けられ、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤を含み、上記血液検体試料の溶血を制御するための溶血層と、上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質を含み、上記ヘモグロビン類を標識するための標識層と、上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化試薬を含み、上記ヘモグロビン類を検出するための検出層とを備え、上記血液検体試料は、上記溶血層と、上記標識層と、上記検出層との間を移動できる。
【００３１】
本発明のヘモグロビン類測定デバイスによれば、ヘモグロビン類の測定を、より簡単に行なうことができる。
【００３２】
上記血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去するための層をさらに備える構成としてもよい。
【００３３】
上記溶血層、上記標識層、および上記検出層は、単一の層に配置されている構成としてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下に、本発明の実施形態を図を参照しながら説明する。
【００３５】
（実施形態１）
本実施形態では、本発明の血液処理方法を図を参照しながら説明する。図１は、本発明の血液処理方法のフローチャートである。
【００３６】
図１に示すように、本実施形態の血液処理方法は、血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程Ｓｔ１と、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程Ｓｔ２とを含む。ここで溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
【００３７】
「血液検体試料」は、ヒトを含む被験体から、通常の採血法（例えば、静脈注射またはランセットにより）によって採取された血液、または測定以前に保存されていた血液である。
【００３８】
溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であるものが用いられる。例えば、凍結乾燥などによってほぼ水分を含まないように粉末状に調製されていることが好ましい。
【００３９】
また、本実施形態の血液処理方法は、ヘモグロビン類の測定に好適に用いられる。つまり、本発明のヘモグロビン類測定方法は、図１に示されている、血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程Ｓｔ１と、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程Ｓｔ２とに加えて、さらに、混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程を含む。ここで溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。
【００４０】
上述の本実施形態の血液処理方法によって混合試料中の血漿に含まれるヘモグロビン類は、当業者に周知の方法によって定量的に測定され得る。
【００４１】
図１に示すように、工程Ｓｔ２において、血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製すると、血液検体試料中の赤血球の赤血球膜が破れ、赤血球中の成分（代表的にはヘモグロビン類）が、赤血球の外に排出される（すなわち、溶血が生じる）。従って、赤血球中の成分（代表的にはヘモグロビン類）を測定することが可能となる。
【００４２】
上述のように、ヘモグロビン類に代表される赤血球中の成分を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。しかしながら、本実施形態の血液処理方法を用いれば、赤血球中の成分を測定する際に、溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作が不要となる。従って、本実施形態の血液処理方法によれば、赤血球中の成分の測定を、より簡単に行なうことができる。
【００４３】
免疫学的な方法でヘモグロビン類を測定する場合、完全溶血を行なうと非常に高い濃度であるため、抗原過剰領域に入り、測定感度を低下させる可能性もある。従って、工程Ｓｔ２において、混合試料中に血球成分が残存している状態、すなわち血液検体試料を部分的に溶血することが好ましい。
【００４４】
「血液検体試料を部分的に溶血する」とは、完全溶血未満の体積の赤血球を溶血することを意味する。例えば、Ｈｔ値４５％の血液１Ｌの場合、体積４５０ｍｌ未満の赤血球を溶血することを意味する。これに対して、「完全溶血」とは、実質的に全赤血球体積の赤血球を溶血することをいう。例えば、Ｈｔ値４５％の血液１Ｌの場合、体積約４５０ｍｌ赤血球を溶血することをいう。「血液検体試料を部分的に溶血するように制御する」ことによって、試料中の一部の赤血球の膜が破壊され、その中のヘモグロビン類を溶出させることができる。このとき、血漿中のヘモグロビン類の濃度は、完全溶血の場合よりも低い濃度である。例えば、Ｈｔ値４５％の血液１Ｌで体積１ｍｌ相当の赤血球を溶血させた場合、血漿５５０ｍｌに、ヘモグロビン類０．３４ｇおよび水０．６３ｇが溶出される。従って、血漿水５５０．６３ｍｌ中にヘモグロビン類が０．３４ｇ溶解されることになるため、ヘモグロビン類濃度は０．６２ｇ／Ｌとなる。完全に溶血したときの全ヘモグロビン濃度は１５０ｇ／Ｌである。本実施形態の血液処理方法では、緩衝液などを必要とすることなく、溶血することのみで、完全溶血に比較して約２５０倍希釈に相当する効果が得られる。
【００４５】
背景技術の欄で述べたように、Ｈｔ値は全血に対する赤血球の容積比である。このため、Ｈｔ値により、赤血球の量、および全ヘモグロビン量が理解され得る。なお、Ｈｔ値は、毛細管法およびＷｉｎｔｒｏｂｅ法を含む周知の方法によって決定される。Ｈｔ値は、毛細管法で決定される場合、成人では、男性３６〜４８％、女性３４〜４３％であり得る。幼児では、新生児（臍帯血）４４〜６４％、３ヶ月３２から４４％、１歳児３６〜４４％、１０〜１２歳３７〜４４％であり得る（Ｄａｃｉｅらによる；臨床検査法提要、改訂３１版、金原出版株式会社を参照のこと）。よって、被験体の性別および年齢を考慮して、ヘモグロビン測定に関してＨｔ値は設定される。
【００４６】
全ヘモグロビン濃度は、Ｈｔ値などに個人差があるが、ほとんどの人が、１００ｍｇ／ｍｌより多いＨｂを有する（男性：約１３０〜１７０ｍｇ／ｍｌ、女性：約１２０〜１５０ｍｇ／ｍｌ）。従来の測定機器によって、希釈操作を行なうことなく、１００ｍｇ／ｍｌを超える濃度のＨｂを測定することはできない。従って、「部分溶血」によるＨｂ濃度は、１００ｍｇ／ｍｌ以下の濃度であることが好ましい。
【００４７】
溶血の制御は、例えば、溶血剤の量を変えることにより行なうことができる。例えば、１．５ｍｇもしくは７．５ｍｇの塩化カリウムに血液１．５ｍｌを添加した場合、全ヘモグロビン濃度は、前者は約６．０ｇ／Ｌ、後者は約２５ｇ／Ｌとなる。このように、溶血剤の量が大きくなれば、溶血の割合も大きくなる。そこで、血漿中の最適ヘモグロビン濃度（最適な溶血率）を達成する溶血剤の量の決定を簡単に述べる。
【００４８】
まず、血液検体試料を任意の量の溶血剤で溶血させ、分離作業により上清液を取り出す。次に、上清液中のヘモグロビン濃度を測定する。続いて、溶血剤の添加量とヘモグロビン濃度との関係を決定する。最後に、血漿中の最適なヘモグロビン濃度となる溶血剤の添加量を上記関係に基づいて決定する。
【００４９】
詳細には、後述する実施例２に記載の手順とほぼ同等の手順を行なうことによって、溶血剤の量とヘモグロビン濃度との関係図を得ることにより行なわれる。
【００５０】
血漿中の最適ヘモグロビン濃度（最適な溶血率）は、その測定方法に依存するので、添加される溶血剤の量もまた測定方法に依存する。なお、本明細書中において、溶血率は図２に示す式で表されるものとする。
【００５１】
Ｈｔ値が４０〜５０％の場合、ヘモグロビン類の測定方法が吸光法である場合、溶血剤は、溶血率が０．０１〜１％（ヘモグロビン濃度０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ）になるような量で添加されることが好ましく、測定方法が免疫クロマトグラフィー法である場合、溶血率が０．０００１〜０．１％（ヘモグロビン濃度０．１〜１０ｍｇ／ｄｌ）になるような量で添加されることが好ましい。
【００５２】
吸光法で測定される場合、Ｈｂの最大モル吸光係数が約１０5Ｍ-1であるため、溶血剤の添加量は、ヘモグロビン濃度が０．１〜１ｍｇ／ｍｌ（吸光度が約０．１〜２になる濃度）になる量が好ましい。
【００５３】
免疫クロマトグラフィー法で測定される場合、溶血剤の添加量は、その免疫クロマトグラフィー法で使用されている抗体の性能（結合親和力など）に依存するヘモグロビン濃度に基づく。
【００５４】
例えば、溶血剤として塩化カリウムを使用する場合、一般に、血液検体試料の全容量に対する溶血剤の添加割合（濃度）は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）（本明細書中では、（ｗ／ｖ）の単位は、ｇ／ｍｌであるものとする。）の範囲内であることが好ましい。特に、血液検体試料の全容量に対する溶血剤の添加割合（濃度）は、吸光法の場合、０．０５〜１％（ｗ／ｖ）の範囲内であり、免疫クロマトグラフィー法の場合、クロマトデバイスの大きさ、あるいはクロマトデバイスに担持される固定化抗体、標識抗体の試薬量などある程度依存するが、０．０５〜３％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましい。特に、５ｍｍ×１０ｃｍのクロマトデバイスの場合、０．１〜１％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましい。
【００５５】
他の塩を用いる場合も、塩化カリウムの場合の濃度と同等になるような濃度で添加すればよい。また、例えば、ラウリル酸ナトリウムなどの界面活性剤、もしくは、抗赤血球抗体のような、赤血球膜に直接働きかける薬剤もまた使用することができる。この場合も同様に、上述の全ヘモグロビン濃度の測定方法を利用して、血漿中の最適ヘモグロビン濃度を達成するために必要な溶血剤の量を決定した後、決定された量の溶血剤を用いて、血液検体試料を部分的に溶血させればよい。
【００５６】
一旦、血漿中の最適ヘモグロビン濃度を達成するために必要な溶血剤の量が決定されれば、この量の溶血剤が、血液検体試料を部分的に溶血するように制御するために使用される。次いで、血液検体試料中の全ヘモグロビン濃度の測定のために、現在、臨床検査で用いられる任意のヘモグロビン定量法が使用される。このようなヘモグロビン定量法としては、例えば、シアンメトへモグロビン法、酸化ヘモグロビン法、およびＳＬＳ−ヘモグロビン法が挙げられる（例えば、臨床検査法提要、改訂３１版、金原出版株式会社を参照のこと）。上述したヘモグロビン定量法で用いられる専用の体外診断薬は、市販されている。
【００５７】
本実施形態の血液処理方法およびヘモグロビン類測定方法によれば、ヘモグロビン類を測定する際に、従来必要とされていた溶血操作の後に血液検体試料を希釈するための多くの操作を省略して、測定に適切なヘモグロビン濃度を簡単に実現することができる。
【００５８】
本実施形態では、溶血剤として、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤が使用される。赤血球は、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が高い塩溶液中では、赤血球が収縮する。一方、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりも塩濃度が低い塩溶液中では、赤血球が膨張する。このような赤血球の収縮および膨張によって赤血球膜が破れ、ヘモグロビン類が赤血球の外に排出される。例えば、無機塩（例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、もしくはフッ化ナトリウムなど）が挙げられる。特に、塩化カリウムが好ましい。上述したように、溶血は、赤血球が、生理的条件である０．９％ＮａＣｌ以外の環境下に置かれた場合におこる。従って、上記薬剤は、血液中の塩濃度がこのような条件下（すなわち、０．９％ＮａＣｌまたはこれと等価な塩類濃度を除く濃度）に置かれ、かつ所望の量のヘモグロビンが血漿中に溶出するような濃度または量で、血液検体試料に添加される。例えば、血液量５０μｌに対して２５０μｇの塩化カリウムを用いると、溶血率は約２％となる。
【００５９】
なお、溶血剤は、固体で用いる。溶血剤として、所望量の溶血性試薬を含む溶液を準備し、その溶液を凍結乾燥することによって準備されたものを用いてもよい。また、例えば、まず所望量の溶血性試薬を含む溶液に基材（メンブレンなど）を含浸し、次いで凍結乾燥することによって、基材上に担持されたものを用いてもよい。
【００６０】
血液検体試料は、ヘモグロビン類の測定が開始される前に、溶血剤で処理される。あるいは、血液検体試料が、ヘモグロビン類の測定と同時に、溶血剤で処理される。いずれにしても、溶血により溶出されたヘモグロビン類が、以下に詳述するような、当該分野で使用され得る手段または技術によって測定される。このような方法を実施する形態として、溶血剤が溶液状態である場合、溶血剤は、血液検体試料中のヘモグロビン類の測定の前に血液検体試料に添加され得る。溶血剤が固体で基材に担持される場合、血液検体試料が、基材に導入された後に測定手段に供せられ得るか、またはこのような基材が測定手段に供せられる際に、試料が基材に導入され得る。
【００６１】
測定されるヘモグロビン類としては、Ｈｂ、ＨｂＡ（α2β2）、ＨｂＡ2（α2δ2）、ＨｂＦ（α2γ2）、およびＨｂＡ1（ＨｂＡと糖との結合体）、ならびにＨｂＡ1がさらに分類された、ＨｂＡ1a、ＨｂＡ1b、およびＨｂＡ1cが挙げられる。ここで、Ｈｂとは、上述したヘモグロビン類を含む全ヘモグロビンを意味する。ＨｂＡ1ならびにこのＨｂＡ1がさらに分類された、ＨｂＡ1a、ＨｂＡ1b、およびＨｂＡ1cは、グリコヘモグロビンまたは「糖化ヘモグロビン」と称され、同じ一次構造を有するが、β鎖のＮ末端バリンのアミノ基が、糖もしくはその誘導体でブロックされている。本明細書中で使用される用語「糖化ヘモグロビン」は、ＨｂＡ1ならびにこのＨｂＡ1がさらに分類された、ＨｂＡ1a、ＨｂＡ1b、およびＨｂＡ1cを包含する。特に、ＨｂＡ1cは、グルコースが非酵素的に結合した糖化ヘモグロビンである。
【００６２】
Ｈｂの組成比を検査することは、臨床化学的に重要である。臨床的意義のために、上述のようにして処理された血液検体試料中の少なくとも２種のヘモグロビン類を測定することもできる。
【００６３】
特に本実施形態では部分的な溶血を制御することによって、血液検体試料中のＨｂ（全ヘモグロビン）濃度が低濃度に抑えられる。このため、測定されたヘモグロビン類の濃度は絶対値ではない。つまり、ＨｂＡ、ＨｂＡ2、ＨｂＦ、ＨｂＡと糖が結合したＨｂＡ1、ＨｂＡ1がさらに分類されたＨｂＡ1a、ＨｂＡ1b、およびＨｂＡ1cなどの測定値は、全Ｈｂ量に対する割合で表される。そして、これらの全Ｈｂ量に対する割合は、溶血率によって変化しないので、本発明の測定対象に十分になり得る。また、ヘモグロビン濃度の絶対値は、溶血率と相関関係にあるので、測定値から逆算することも可能である。
【００６４】
糖化ヘモグロビン（特に、ＨｂＡ1もしくはＨｂＡ1c）は、糖尿病患者の血糖管理の指標として、より詳細には、糖尿病患者の長期（主に１〜３ヶ月間）の血糖コントロールの指標として注目されている。例えば、ＨｂＡ1は、正常な場合、Ｈｂ（全ヘモグロビン）の７〜８％であり、ＨｂＡ1cは、正常な場合、Ｈｂ（全ヘモグロビン）の６％以下（例えば、４．７〜５．７％）である。しかし、これらの糖化ヘモグロビンは、糖尿病患者では増加する。例えば、ＨｂＡ1cの場合、Ｈｂの２０％にも及ぶ。従って、本実施形態の測定方法を、糖化ヘモグロビンを測定することによって、糖尿病の診断、治療などに好適に利用できる。また、本発明の測定方法によって、Ｈｂ（全ヘモグロビン）およびＨｂＡ1cを測定することも可能である。
【００６５】
また、本実施形態の測定法法によれば、ＨｂＦを、Ｈｂに対する割合として測定することもできる。Ｈｂに対するＨｂＦの割合は、正常成人の場合、０．３〜１．３％である。Ｈｂに対するＨｂＦの割合は、通常、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症、慢性骨髄性白血病、ファンコニー貧血、赤白血病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、不応性貧血、妊娠、胞状奇胎、サラセミア（β、δβ）、不安定ヘモグロビン症で、まれに再生不良性貧血、白血病、多血症（赤血球増加症）、骨髄線維症、悪性腫瘍、甲状腺中毒症で、この基準範囲より増加する。従って、本実施形態の測定方法を、上記疾病の診断に利用することもできる。
【００６６】
さらに、本実施形態の測定法法によれば、ＨｂＡ2を、Ｈｂに対する割合として測定することもできる。Ｈｂに対するＨｂＡ2の割合は、正常人の場合、２〜３．５％である。Ｈｂに対するＨｂＡ2の割合は、βサラセミア、不安定ヘモグロビン症、鎌形赤血球貧血ヘテロ型、巨赤芽球性貧血、甲状腺機能亢進症で、基準範囲より増加し、一方、α−、δ−、δβ−サラセミア、遺伝性高胎児血色素症、鉄欠乏性貧血、鉄芽球性貧血で、基準範囲より減少する。従って、本実施形態の測定方法を、上記疾病の診断に利用することもできる。
【００６７】
上述したＨｂ組成成分は、等電点が異なるので、イオン交換クロマトグラフィーによって定量的に分画され得る。イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣＹＰＲＥＳＳ社より入手可能なカラム（商品名ＰｏｌｙＣＡＴＡTM）を用いて実施され得るが、このカラムと同様の分画能を有する限り市販により入手可能ないずれのカラムも使用することができる。上述したＨｂ組成成分はまた、これらの成分を個々に認識することができる抗体を用いて、免疫学的方法を用いて測定され得る。免疫学的方法としては、例えば、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集免疫法などが挙げられる。
【００６８】
全ヘモグロビンの濃度は、上述したように、現在、臨床検査で用いられる任意のヘモグロビン定量法を使用することが可能である。このようなヘモグロビン定量法としては、例えば、シアンメトへモグロビン法、酸化ヘモグロビン法、およびＳＬＳ−ヘモグロビン法が挙げられる（例えば、臨床検査法提要、改訂３１版、金原出版株式会社を参照のこと）。上述したヘモグロビン定量法で用いられる専用の体外診断薬は、市販により入手可能である。
【００６９】
また、ヘモグロビン類の測定は、ドライケミストリーによる測定方法によって行なわれる。「ドライケミストリーによる測定方法」とは、試薬が乾燥状態で担持される固相マトリックスに液状の試料を添加（通常、点着による）して、このマトリックス上で試薬と反応させ、そしてこの反応を検出することにより、試料中の被検物質を測定する方法を指す。ドライケミストリーによる測定方法は、迅速で、簡単で、かつ精度よい測定方法であるため、日常の臨床検査で好都合に使用される。ドライケミストリーによる測定方法としては、例えば、免疫クロマトグラフィー方法、免疫コンセントレーション方法、固相酵素免疫測定方法のような免疫学的方法、比色スライド方法、および電極法スライド方法が挙げられる。ドライケミストリーに関しては、例えば、「臨床病理、ドライケミストリー・簡易検査の新たなる展開（日本臨床病理学会編集、平成９年１１月発行）」に開示されている。
【００７０】
（実施形態２）
本実施形態では、上記実施形態１で述べた血液処理方法およびヘモグロビン類測定方法に用いることができる血液処理デバイスを、図を参照しながら説明する。図３（ａ）および図３（ｂ）は、本実施形態の血液処理デバイスを示す図である。
【００７１】
図３（ａ）に示すように、本実施形態の血液処理デバイス１０ａは、血液検体試料が供される基材１１と、基材１１に担持された、血液検体試料を部分的に溶血する量の溶血剤（不図示）とを備える。なお、溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤である。溶血剤は、まず溶液状態で基材に添加され、次いで凍結乾燥されて、基材に乾燥状態で担持されている。好ましくは、溶血剤は、基材において血液検体試料が接触可能な領域に、乾燥状態で担持される。
【００７２】
血液検体試料が供される基材１１としては、血液検体試料を点着させるためのような平板形態（不溶性の単層基材（例えば、セラライザー（Ａｍｅｓ）、試験紙、免疫クロマトグラフィー（プラスチックカード型）など）または多層基材（例えば、エクタケム（Ｋｏｄａｋ）、ドライケム（富士）など））から、試料液体を入れる容器形態（例えば、バイアル、試験管、アンプル、シノテスト、遠心ローター、ピッコロなど）まで種々であり得る。本実施形態のデバイスにおいて用いられ得る基材はまた、ペーパータオル（例えば、リードクッキングペーパー（登録商標）のようなパルプ不織布）、メッシュ布帛（例えば、ガーゼ綿布帛）、およびガラス繊維濾紙のような、液体を吸収して保持することが可能な材料を用いて作製される。
【００７３】
ヘモグロビン類を測定するための手段としては、イオン交換クロマトグラフィーもしくは免疫学的方法（例えば、ラテックス免疫凝集法）に基づく測定手段が挙げられる。
【００７４】
また、図３（ａ）に示す血液処理デバイス１０ａに代えて、図３（ｂ）に示す血液処理デバイス１０ｂを用いることができる。血液処理デバイス１０ｂで使用される基材１１は、側面および底面（不図示）とを有し、開口部１３を備える、測定手段の使用に適したセル１２となっている。この場合、溶血剤がセルにおいて血液検体試料が接触可能な領域（例えば、セル１２内の底部および側面の表面など（これらは、測定される血液検体試料容積に応じて適宜選択される））に、乾燥状態で担持される。血液処理デバイス１０ｂは、溶血剤が担持されたセル１２内に血液検体試料を投入した後に測定手段に導入されてもよく、血液処理デバイス１０ｂのセル１２が測定手段に導入される際に、血液検体試料をセル１２内に投入してもよい。また、血液検体試料を、バッチ式またはフロー式でセル内に導入してもよい。
【００７５】
背景技術の欄で述べたように、ヘモグロビン類を測定するためには、血液検体試料を処理するための多くの操作が必要である。
【００７６】
特に、従来ではＨｂＡ1cの測定のために、イオン交換クロマトグラフィー、およびラテックス免疫凝集法の測定原理に基づいた自動化機器が用いられている。血液中に約１５０ｇ／ｌのような全ヘモグロビン量は、上記従来の自動化機器で測定するには極めて高い濃度である。従って、一般的に、上記自動化機器には、血液検体試料を完全溶血する段階、完全溶血された試料を最適な測定結果が得られる濃度まで希釈する段階、および希釈された試料を上記測定原理に基づいて測定する段階が、厳密に設定されている。代表的なＨｂＡ1c専用測定機器としては、東ソー製のＡ１ｃ２．２およびバイエル製のＤＬＳ２０００が挙げられる。前者は、イオン交換クロマトグラフィー原理に基づき、後者はラテックス免疫凝集阻止法に基づく。これらの機器における血液検体試料の処理方法は、完全溶血段階および希釈段階が自動化されている点で共通している。上記のような自動化機器は、臨床検査分野において多く使用されているが、様々な操作を自動化しているために、機器が大規模で、且つ、高価である。
【００７７】
このように、ヘモグロビン類の測定において、上述したような処理操作が装置に組み込まれている自動化された装置を用いる場合、高コストとなる、あるいは、このような装置を用いない場合、多段階操作により検査が煩雑になる。さらに、免疫学的な方法でヘモグロビン類を測定する場合、完全溶血を行なうと非常に高い濃度であるため、抗原過剰領域に入り、測定感度が低下することがある。
【００７８】
しかしながら、本実施形態の血液処理デバイス１０ａを用いれば、基材１１に、血液検体試料を供し、測定手段に設置するだけで、迅速に赤血球内の成分の測定が開始できる。また、本実施形態の血液処理デバイス１０ｂを用いれば、セル１２内に血液検体試料を投入し、セル１２を測定手段に設置するだけで、迅速に赤血球内の成分の測定が開始できる。
【００７９】
（実施形態３）
本実施形態では、血液検体試料中のヘモグロビン類をドライケミストリーによる測定方法によって測定するためのデバイス（以下、ヘモグロビン類測定デバイスと称する）を説明する。ヘモグロビン類測定デバイスは、血液検体試料を部分的に溶血する量の溶血剤と、ヘモグロビン類と特異的に結合する溶出可能な検出物質と、ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを含む。
【００８０】
ここで使用される「部分的に溶血できる量の溶血剤」は、上記実施形態１に述べた通りである。
【００８１】
上記検出物質は、測定対象のヘモグロビン類に特異的に結合する、標識に結合された物質である。このような標識は、当該技術分野で公知であり、例えば、金コロイド、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位体（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（９9mＴｃ））、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。このような標識はまた、測定対象のヘモグロビン類に対する抗体に結合されて、検出物質を形成し得る。測定対象のヘモグロビン類に結合する限り、いかなる抗体も使用することができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体が好ましい。
【００８２】
固定化物質は、測定対象のヘモグロビン類に特異的に結合する任意の物質である。このような物質としては、免疫学的方法を使用する場合、測定対象のヘモグロビン類に対するモノクローナル抗体である。上記の検出物質で使用された抗体とは別のエピトープに対して反応するモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００８３】
本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスでは、溶血剤、検出物質、および固定化物質が、デバイスの血液検体試料の添加部位に近い方から順に、乾燥状態で担持されている。
【００８４】
従って、本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスによると、デバイスに添加された血液検体試料が、溶血剤、検出物質、および固定化物質が担持された層の間を移動しながら、溶血によるヘモグロビンの溶出から溶出されたヘモグロビンの検出まで行うことができる。
【００８５】
本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスでは、溶血剤は、例えば、基材への担持のために、層に含浸された後、凍結乾燥される。溶血剤は、添加された血液との接触により反応するので、血液が添加される部位を予め決定することなく測定可能なように基材の全体にわたって含まれていることが好ましい。勿論この場合も、基材全体に含まれる溶血剤の量は、溶出されたヘモグロビン類の血漿中の濃度が、完全溶血に比較して低い濃度となる量である。
【００８６】
溶出されたヘモグロビン類を含む血液検体試料は、検出物質が担持された層に移動すると、この層に担持された検出物質が溶出し、溶出されたヘモグロビン類は、この溶出された検出物質と特異的に反応する。従って、検出物質は、デバイスが使用されない状態では乾燥状態で担持されて固相を形成するが、溶液に遭遇したときにその溶液中に溶出され得るように、層に担持され得る。例えば、このような層への担持のために、検出物質は、層に含浸された後、凍結乾燥され得る。
【００８７】
検出物質と結合されたヘモグロビン類は、基材（固相マトリックス）に担持された固定化物質に結合される。固相マトリックスにおける検出物質、ヘモグロビン類、および固定化物質のサンドイッチ特異反応を検出することにより、血液検体試料中のヘモグロビン類の量が測定される。検出の場となる固相マトリックスは、通常の免疫アッセイなどで使用され得るマトリックス材料（例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリスチレンなど）であり得る。この固相マトリックスはまた、フィルム、試験紙および試験片であり得る。
【００８８】
ドライケミストリーによる測定方法に基づくヘモグロビン類測定デバイスは、単層方式または多層方式であり得る。単層方式または多層方式のいずれにしても、血液検体試料の添加部位に近い方を上流とすると、上流から下流に向って、溶血剤、検出物質、および固定化物質の順に担持される。
【００８９】
単層方式では、図４に示すように、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層（本明細書中、以下、溶血層とも称する）、検出物質によりヘモグロビン類を標識する層（本明細書中、以下、標識層とも称する）、および固定化試薬に結合されたヘモグロビン類を検出する層（本明細書中、以下、検出層とも称する）が、単一（同一）の層に配置される。単層方式では、溶血剤、検出物質、および固定化物質が、血液検体試料が添加される部分Ａ側から順に、ヘモグロビン類の検出の場となり得る基材（固相マトリックス）４１上に担持されている。固相マトリックス４１は、通常の免疫アッセイなどで使用され得るマトリックス材料（例えば、ニトロセルロースメンブレン）であり得る。この固相マトリックスはまた、フィルム、試験紙、および試験片であり得る。
【００９０】
このような配置により、添加された血液検体試料は、固相マトリックス上を展開する過程において、まず最初に溶血剤と接触して血液を部分溶血する。次に、部分溶血による血漿水中のヘモグロビンと溶出可能な検出物質とが特異的に結合される。続いて、ヘモグロビン類−検出物質の複合体と固定化試薬とが特異的に結合され、検出物質−ヘモグロビン類−固定化物質を生じる。
【００９１】
多層方式では、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層、検出物質によりヘモグロビン類を標識する層、および固定化試薬に結合されたヘモグロビン類を検出する層がそれぞれ独立した別個の層として存在しており、これらの層は、その間を血液検体試料が移動できるような形態で積層されている。多層方式では、溶血剤、検出物質、および固定化物質がそれぞれ別個の層に担持され、それらの層が、血液検体試料が添加される側から順に積層されている。溶血剤が担持される層は、表面に添加された液体を、その反対側の表面に浸透させる材料からなる。例えば、パルプ不織布、メッシュ布帛（例えば、ガーゼ綿布帛）、およびガラス繊維濾紙のような材料を用いて、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層が作製される。溶血剤は、例えば、溶血剤の溶液をこれらの層に含浸させ、次いで凍結乾燥されることにより、層に担持される。検出物質もまた、表面に添加された液体を、その反対側の表面に浸透させる材料からなる層に担持され得る。検出物質もまた、例えば、検出物質の溶液をこれらの層に含浸させ、次いで凍結乾燥されることにより、層に担持される。固定化物質は、ヘモグロビン類の検出の場となり得る固相マトリックス上に担持され得る。このような固相マトリックスとしては、ニトロセルロースメンブレンが挙げられる。固定化は、通常の免疫学的アッセイで使用される固定化の手順によって行なわれ得る。これらの層は、血液検体試料がこれらの層の間を移動可能となるように、接触して配置され得る。このような配置により、添加された血液検体試料は、これらの層間を移動する過程において、まず、溶血剤と接触して血液を部分溶血する。次に、部分溶血による血漿水中のヘモグロビンと溶出可能な検出物質とが特異的に結合される。続いて、ヘモグロビン類−検出物質の複合体と固定化試薬とが特異的に結合され、検出物質−ヘモグロビン類−固定化物質を生じ得る。
【００９２】
本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスはまた、血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去する層を備え得る。この赤血球残留物を除去する層は、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層と同じであり得る。あるいは、本デバイスにおいて、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層とは別に、赤血球残留物を除去する層が設けられ得る。例えば、パルプ不織布、メッシュ布帛（例えば、ガーゼ綿布帛）、およびガラス繊維濾紙のような材料からなる層が使用され得る。本層は、ドライケミストリーによるヘモグロビン類の測定に不要であり得る赤血球膜残骸を含む血漿溶液を吸収し得る。従って、本明細書中では、本層を「吸収層」とも称する。
【００９３】
本実施形態の多層式のヘモグロビン類測定デバイスの一例を、図５に示す。図５は、本実施形態の多層式のヘモグロビン類測定デバイスを表す断面図である。基板（２１）（基板は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）であり得る）の上に、抗体（２３）が固定化された抗体固定化メンブレン（２２）を、続いてこの上に標識抗体凍結乾燥担持層（２４）を、そして続いてこの上に溶血剤担持層（２５）を積層し得る。ここで、図２に示すように、溶血剤担持層（２５）、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）は、すぐ下にある層と部分的に重なるように配置され得る。この重なりによって、血液検体試料は各層間を移動し、従って、溶血、標識抗体結合、および固定化抗体結合を生じる。抗体固定化メンブレン（２２）の剥き出しの領域（すなわち、溶血剤担持層（２５）および標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない領域）に、ヘモグロビン類に特異的な抗体が固着しており、この領域にて、血液検体試料中のヘモグロビン類の反応が検出され得る。また、吸収層（２６）が、抗体固定化メンブレン（２２）における、血液検体試料の添加側と反対側（すなわち、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない側）の領域に重なるように積層され得る。吸収層は、反応検出領域に存在する、検出に不要であり得る赤血球膜残骸を含む血漿溶液を吸収し、反応の検出を補助し得る。さらに、溶血剤担持層（２５）、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）の３つの層の重なり領域から反応検出領域までが、添加された試料による湿潤の乾燥を防ぐため、または試料の測定を妨害し得る物質の混入を避けるために、不透過性のシート（２７）で被覆され得る。このような不透過性シートとしては、セロハンが挙げられる。溶血剤担持層（２５）の重なり部分以外は、不透過性シートで被覆され得ない。この非被覆部分に、血液検体試料が、添加され得る。不透過性シート（２７）は、抗体固定化メンブレン（２２）と吸収層（２６）との重なり領域および抗体固定化メンブレン（２２）との重なりのない吸収層（２６）の少なくとも一部分をも被覆し得る。このような被覆により、抗体固定化メンブレン（２２）から吸収層（２６）への吸収が妨害されない。
以上に示すように、血球中の成分を測定する際に、血液検体試料を部分的に溶血させることにより、従来必要であった希釈段階を除くことができる。手動の場合、本願発明の方法を用いることにより、希釈操作を省くことが可能である。またこれまで希釈段階を自動化していた場合も、自動化機器から自動希釈段階を省くことができ、機器の小型化およびコストの低減につながる。
【００９４】
従って、本発明により、ヘモグロビン類等の血球中の成分の測定をより容易にすることができる血液処理方法、ヘモグロビン類測定方法、血液処理デバイスおよびヘモグロビン類測定デバイスが提供される。本発明によれば、ヘモグロビン類を、簡便かつ迅速に、測定することができる。
【実施例】
【００９５】
次に、本発明の実施例をＨｂＡ1cの測定例に基づいて説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００９６】
（実施例１：吸光法における溶血剤の添加量の適切な範囲）
塩化カリウム１．５、７．５、１５、７５、および１５０ｍｇのそれぞれに、全血検体試料（ＨｂＡ１ｃ値４．８％）１．５ｍｌを添加（すなわち、それぞれ塩化カリウム０．１％、０．５％、１％、５％、および１０％；これらの割合は、重量／体積である）し、混濁し、次いで遠心分離し、上清液１．０ｍｌを取り出した。これらの各上清液について、３５０〜８００ｎｍにおける光透過率を調べた結果を図６に示す。例えば、５００ｎｍでは、溶血剤（ここではＫＣｌ）の添加量は、０．１〜０．５％程度が適切であり、７００ｎｍでは、０．１〜１０％程度が適切であることを示すものである。
【００９７】
（実施例２：溶血剤の量と、Ｈｂ濃度およびＨｂＡ1c値との関係）
塩化カリウム１．５、７．５、１５、７５、または１５０ｍｇに、全血検体試料（ＨｂＡ１ｃ値４．８％）１．５ｍｌを添加（すなわち、それぞれ塩化カリウム０．１％、０．５％、１％、５％、または１０％；これらの割合は、重量／体積である）し、混濁し、次いで遠心分離し、上清液１．０ｍｌを取り出した。この上清液に存在しているＨｂ濃度をＳＬＳ−ヘモグロビン法により測定した。ＳＬＳ−ヘモグロビン法について記述する。ＳＬＳ−ヘモグロビン法を、専用試薬として、和光純薬から市販されているヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて行った。ヘモグロビンの発色原液である０．６７ｍＭラウリル酸ナトリウム５．０ｍｌに対して、ヘモグロビン標準液（１、５、１０、５０、１００、または１５０ｇ／Ｌ）０．０２ｍｌを加え、よく混合し、次いで室温で約３分間放置し、ヘモグロビンコントロール溶液を作製した。これらコントロール溶液を、５４０ｎｍの波長で吸光度を測定した。得られた値を用いて、ヘモグロビン濃度についての吸光度（５４０ｎｍ）の検量線を作成した。次に、種々の溶血率で処理しておいた試料において、上述の上清液の０．０２ｍｌを用いて、同様にして吸光度を測定した。検量線を用いて、各ヘモグロビン濃度を算出した。
【００９８】
一方、ＨｂＡ1c値を専用ＨＰＬＣ（Ａ１ｃ２．２、東ソー製）を用いて測定した。溶血処理しておいた試料を試験管に入れ、この装置にセットし、自動的に測定した。ここで得られたＨｂＡ1c値は、全ヘモグロビンに対するＨｂＡ1cの割合（％）に相当する。
【００９９】
以上の結果を図７に示す。図７中、下方の横軸に、添加した塩化カリウムの濃度（％）を示し、左の縦軸に、Ｈｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示し、そして右の縦軸に、ＨｂＡ1c値（％）を示す。また、図７中の黒丸は、Ｈｂ濃度の結果を示し、そして白丸は、ＨｂＡ1c値の結果を示す。
【０１００】
図７は、ＫＣｌ濃度に依存して、溶血によるＨｂ濃度が高くなっていることを示している。さらに、溶血剤の量に依存して、Ｈｂ濃度が変化したが、ＨｂＡ1c値は変化しないことを示す。従って、全ヘモグロビンに対するヘモグロビン類の割合（％）の測定の際に、完全溶血の必要性がないこと、従って、希釈段階の必要性がなくなることが示唆された。
【０１０１】
（実施例３：免疫クロマトグラフィー法を用いたＨｂＡ１ｃの測定）
（２．１．Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ１ｃ測定用デバイスの作製）
本実施例において、ＨｂＡ１ｃの測定に使用し得るデバイスを作製した。このデバイスは、図５に示すように、溶血剤による溶血、抗体との反応、およびこの反応の検出が別個の層で行なわれる多層式である。図５は、本発明の多層式デバイスの一例の断面図である。まず、各層の作製について、以下に説明する。
【０１０２】
＜金コロイド標識抗体凍結乾燥固定化物（２４）＞
三角フラスコに蒸留水１９８ｍｌおよび１％塩化金酸水溶液２ｍｌを入れ、得られた混合水溶液を沸騰させ、沸騰した水溶液に１％クエン酸三ナトリウム水溶液４ｍｌを、すばやく添加した。添加後、混合水溶液の色が赤紫色になるのを確認してから、沸騰した状態で１５分間放置した。その後、三角フラスコを取り出し、室温に放置することにより自然冷却し、金コロイド液を得た。得られた金コロイド液に０．２Ｍ炭酸カリウム水溶液を加えてｐＨ８．９に調整した。この金コロイド液に対して１．５５ｍｇ／ｍｌの独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８８号の細胞株より産生した抗Ｈｂモノクローナル抗体の溶液を１．６ｍｌ添加して、３分間攪拌させた。さらに、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液（ｐＨ８．９）を２０ｍｌ添加し、さらに３分間攪拌させた。その後、未標識の抗体およびＢＳＡを取り除くために、遠心分離し、上清液をアスピレーターにて除去した。洗浄を行うために、１％ウシ血清アルブミン−生理食塩水（ＢＳＡ・ＰＢＳ）溶液を用いて再懸濁させ、再度、遠心分離し、上清液をアスピレーターにより除去した。こうして得られた金コロイド標識抗Ｈｂモノクローナル抗体１％ＢＳＡ・ＰＢＳ懸濁液を０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、凝集塊を除去した。この後、ガラス繊維濾紙に金コロイド標識抗Ｈｂ抗体２１懸濁液を含浸させ、液体窒素を用いて凍結させ、凍結乾燥機で２４時間放置することにより凍結乾燥固定化物を作製した。
【０１０３】
＜Ｈｂ測定用／抗体固定化メンブレン（２２）＞
ニトロセルロース性メンブランに独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８９号の細胞株より産生した抗Ｈｂモノクローナル抗体の溶液（ＰＢＳ）を固定化した。固定化後、スキムミルクでブロッキングを行った。引き続き、固定化された抗体を、０．１Ｍトリス（ｐＨ  ８．２）で２回洗浄し、乾燥させた。
【０１０４】
＜ＨｂＡ1c測定用／抗体固定化メンブレン（２２）＞
ニトロセルロース性メンブランに独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３６号の細胞株より産生した抗ＨｂＡ１ｃモノクロ−ナル抗体の溶液を固定化した。固定化後、スキムミルクでブロッキングを行った。引き続き、固定化された抗体を、０．１Ｍトリス（ｐＨ  ８．２）で２回洗浄し、乾燥させた。
【０１０５】
＜溶血剤担持固相（２５）＞
リードクッキングペーパー（登録商標）（ライオン社より販売）に、全試料容量に対して０．５％（ｗ／ｖ）のＫＣｌを含浸させ、凍結乾燥させた。
【０１０６】
＜Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ1c測定用デバイスの構築＞
上記で作製した金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層、Ｈｂ測定用抗体固定化メンブレンもしくはＨｂＡ1c測定用抗体固定化メンブレン、および溶血剤担持層を用いて、図５に示すように、Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ1c測定用デバイスを構築した。以下に、このデバイスの構築を説明する。
【０１０７】
基板（２１）（ポリエチレンテレフタレート：松本製作所製）の上に、抗体（２３）が固定化された抗体固定化メンブレン（２２）を、続いてこの上に金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）を、そして続いてこの上に溶血剤担持層（２５）を積層した。ここで、図５に示すように、溶血剤担持層（２５）、金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）は、すぐ下にある層と重なるように配置した。抗体固定化メンブレン（２２）では、剥き出しの領域（すなわち、溶血剤担持層（２５）および金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない領域）にヘモグロビン類に特異的な抗体が固着させた、この領域を、血液検体試料中のヘモグロビン類の反応を検出するための領域とした。また、抗体固定化メンブレン（２２）における、血液検体試料の添加側と反対側（すなわち、金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない側）の領域に重なるように、ガラス繊維濾紙吸収層（２６）を積層した。さらに、溶血剤担持層（２５）、金コロイド標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）の３つの層の重なり領域から反応検出領域を、不透過性シート（２７）（セロハン）で被覆した。溶血剤担持層（２５）の重なり部分以外は曝露させた。この曝露部分は、血液検体試料を点着する領域である。不透過性シート（２７）は、抗体固定化メンブレン（２２）とガラス繊維濾紙吸収層（２６）との重なり領域および抗体固定化メンブレン（２２）との重なりのないガラス繊維濾紙吸収層（２６）の一部分をも被覆した。これは、抗体固定化メンブレン（２２）からガラス繊維濾紙吸収層（２６）への吸収を妨害しないためである。
【０１０８】
＜Ｈｂ測定用デバイスおよびＨｂＡ1c測定用デバイスを用いるヘモグロビン類の測定＞
０、０．０５、０．１、０．５、０．７、１．０、３．０％（ｗ／ｖ）のＫＣｌを担持している溶血剤担持層を含むそれぞれのデバイスに対して、１６０μｌの血液を点着し、５分後、６１０ｎｍにおける反射吸光度を測定した。その結果を図８に示す。
【０１０９】
図８より、０．１から１．０％（ｗ／ｖ）ＫＣｌにおいて呈色強度を示していることにより、ＫＣｌ量が最適な範囲は０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）であることがわかる。このデバイスでは、半値となる０．５％（ｗ／ｖ）ＫＣｌが好ましく、上記＜溶血剤担持固相（２５）＞の欄で述べたように、本実施例では、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＣｌを溶血剤担持固相（２５）に担持させ、ＨｂＡ1cの測定を試みた。
【０１１０】
まず、Ｈｂ標準液またはＨｂＡ1c標準液を用いて希釈系列を作成した。この希釈系列１６０μＬをデバイスに点着し、５分後、６１０ｎｍにおける反射吸光度を測定し、検量線を作成した。Ｈｂ測定用デバイスの検量線を図９に、そしてＨｂＡ1c測定用デバイスの検量線を図１０に示す。図９中、横軸にＨｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、そして縦軸に６１０ｎｍにおける反射吸光度の値を示す。また、図９中の黒丸は、各希釈系列におけるＨｂ濃度の吸光度の結果を示す。図１０中、横軸にＨｂＡ1c濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、そして縦軸に６１０ｎｍにおける反射吸光度の値を示す。また、図１０中の黒丸は、各希釈系列におけるＨｂＡ1c濃度の吸光度の結果を示す。
【０１１１】
次に、４．０、５．４、または１０．４％ＨｂＡ1cを含む血液検体試料１６０μｌをデバイスに点着し、５分後、反射吸光度を測定した。この結果を図１１に示す。図１１中、横軸にＨｂＡ1c値（％）を示し、左の縦軸にＨｂに対する反射吸光度を示し、右の縦軸にＨｂＡ1cに対する反射吸光度を示す。また、図１１中の黒丸は、Ｈｂ濃度の結果を示し、そして白丸は、ＨｂＡ1c値の結果を示す。図１１の結果の各吸光度値を、図９および図１０からそれぞれ得られる検量線から回帰して、Ｈｂ濃度およびＨｂＡ1c濃度を求めた（図１２）。図１２中、横軸に６１０ｎｍでの反射吸光度を示し、左の縦軸に換算により算出されたＨｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示し、そして右の縦軸に換算により算出されたＨｂＡ1c濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示す。また、図１２中の黒丸は、Ｈｂ濃度の結果を示し、そして白丸は、ＨｂＡ1c濃度（ｍｇ／ｄｌ）の結果を示す。上記のいずれの血液検体試料においてもＨｂ濃度は、ほぼ同じであった。このことにより、上記のいずれの血液検体試料においても、同程度に溶血されていることが分かる。デバイスでの測定により得られたＨｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）およびＨｂＡ1c濃度（ｍｇ／ｄｌ）を用いて、各ＨｂＡ1c値の試料のＨｂＡ1c値（％）を決定した（ＨｂＡ1c濃度（ｍｇ／ｄｌ）／Ｈｂ濃度（ｍｇ／ｄｌ）×１００で算出した）。この結果、ＨｂＡ1c値４．０％の検体は３．９％、ＨｂＡ1c値５．４％の検体は５．７％、ＨｂＡ1c値１０．４％の検体は１１．２％とそれぞれ算出された。このことから、血液検体試料を部分的に溶血するように制御することによって、ヘモグロビン類を測定できることが確認された。
【０１１２】
以上の結果から、希釈段階をいれずに、１段階で簡易に測定できるデバイスを作製することができた。
【０１１３】
本発明によれば、ヘモグロビン類を、簡便且つ迅速に測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、栄養管理および医療診断の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】  図１は、本発明の血液処理方法のフローチャートである。
【図２】  図２は、溶血率を表す式を示す図である。
【図３】  図３（ａ）および図３（ｂ）は、本実施形態の血液処理デバイスを示す図である。
【図４】  図４は、本発明の単層式のヘモグロビン類測定デバイスの一例を示す図である。
【図５】  図５は、本発明の多層式のヘモグロビン類測定デバイスの一例を示す断面図である。
【図６】  図６は、本発明の一実施例におけるＫＣｌの濃度（溶血剤の添加量）と光透過率を表す図である。
【図７】  図７は、本発明の一実施例におけるＫＣｌの濃度（溶血剤の添加量）とＨｂ濃度およびＨｂＡ１ｃとの関係を表す図である。
【図８】  図８は、本発明の一実施例におけるＫＣｌ量の濃度（溶血剤の添加量）と６１０ｎｍにおける反射吸光度との関係を表す図である。
【図９】  図９は、本発明の一実施例におけるＨｂ測定用デバイスの検量線を示す図である。
【図１０】  図１０は、本発明の一実施例におけるＨｂＡ1c測定用デバイスの検量線を示す図である。
【図１１】  図１１は、本発明の一実施例におけるデバイスで４．０％ＨｂＡ1c、５．４％ＨｂＡ1c、１０．４％ＨｂＡ1cを測定したときの結果を示す図である。
【図１２】  図１２は、本発明の一実施例におけるデバイスによる４．０％ＨｂＡ1c、５．４％ＨｂＡ1c、１０．４％ＨｂＡ1cの測定値から、検量線を用いて濃度換算した結果を示す図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2003083479.tif 000015
【図２】
2003083479.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2003083479.tif 000023
【図１０】
2003083479.tif 000024
【図１１】
2003083479.tif 000025
【図１２】
2003083479.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月8日(2003.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
上記血液検体試料と上記溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であり、
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存している、血液処理方法。
【請求項２】
請求項１に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、赤血球膜に対する浸透圧を変化させる薬剤である、血液処理方法。
【請求項３】
請求項２に記載の血液処理方法において、
上記溶血剤は、無機塩である、血液処理方法。
【請求項４】
請求項３に記載の血液処理方法において、
上記混合試料中における上記無機塩の濃度は、０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、血液処理方法。
【請求項５】
赤血球を含む血液検体試料と、溶血剤とを用意する工程（ａ）と、
血液検体試料と溶血剤とを混合することによって混合試料を調製する工程（ｂ）と、
上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する工程（ｃ）とを含み、
上記溶血剤は、固体である、赤血球膜を破壊する薬剤であり、
上記工程（ｂ）において、上記混合試料中に血球成分が残存している、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）では、上記混合試料中の血漿中に含まれるヘモグロビン類を測定する方法として、免疫クロマトグラフィー法、免疫コンセントレーション法、固相酵素免疫測定法、比色スライド法、および電極法スライド法のうちのいずれか１つが用いられる、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項７】
請求項５に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記工程（ｃ）において、少なくとも２種類のヘモグロビンを測定する、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項８】
請求項７に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記少なくとも２種類のヘモグロビンは、ヘモグロビンとＨｂＡ１ｃとの組み合わせである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項９】
請求項５に記載のヘモグロビン類測定方法において、
上記ヘモグロビン類は、糖化ヘモグロビンである、ヘモグロビン類測定方法。
【請求項１０】
基材と、
赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤とを備え、
上記溶血剤は、赤血球を含む血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されている、血液処理デバイス。
【請求項１１】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
上記血液検体試料の添加部を有する基材と、
赤血球膜を破壊するための溶血剤と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する検出物質と、
上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化物質とを備え、
上記溶血剤は、血液検体試料と上記溶血剤との混合試料が形成されるときに、上記混合試料中に血球成分が残存するような量が上記基材上に担持されており、
上記溶血剤、上記検出物質、および上記固定化物質はそれぞれ、固体で基材上に担持され、
上記基材の上記血液検体試料の添加部に近い方から順に、上記溶血剤と、上記検出物質と、上記固定化物質とが配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１２】
赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、
基板と、
上記基板上に設けられた上記血液検体試料の添加部と、
上記基板上に設けられ、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤を含み、上記血液検体試料の溶血を制御するための溶血層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する、標識された検出物質を含む標識層と、
上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化試薬を含み、上記ヘモグロビン類を検出するための検出層とを備え、
上記血液検体試料は、上記溶血層と、上記標識層と、上記検出層との間を移動できる、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去するための層をさらに備える、ヘモグロビン類測定デバイス。
【請求項１４】
請求項１２に記載のヘモグロビン類測定デバイスにおいて、
上記溶血層、上記標識層、および上記検出層は、単一の層に配置されている、ヘモグロビン類測定デバイス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明の別のヘモグロビン類測定デバイスは、赤血球を含む血液検体試料中のヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類測定デバイスであって、基板と、上記基板上に設けられた上記血液検体試料の添加部と、上記基板上に設けられ、赤血球膜を破壊するための固体の溶血剤を含み、上記血液検体試料の溶血を制御するための溶血層と、上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する、標識された検出物質を含む標識層と、上記基板上に設けられ、上記ヘモグロビン類と特異的に結合する固定化試薬を含み、上記ヘモグロビン類を検出するための検出層とを備え、上記血液検体試料は、上記溶血層と、上記標識層と、上記検出層との間を移動できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
本実施形態のヘモグロビン類測定デバイスはまた、血液検体試料が溶血された後の赤血球残留物を除去する層を備え得る。この赤血球残留物を除去する層は、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層と同じであり得る。あるいは、本デバイスにおいて、溶血剤により血液検体試料の溶血を制御する層とは別に、赤血球残留物を除去する層が設けられ得る。例えば、パルプ不織布、メッシュ布帛（例えば、ガーゼ綿布帛）、およびガラス繊維濾紙のような材料からなる層が使用され得る。本層は、ドライケミストリーによるヘモグロビン類の測定に不要であり得る赤血球膜残骸を含む血漿溶液を吸収し得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本実施形態の多層式のヘモグロビン類測定デバイスの一例を、図５に示す。図５は、本実施形態の多層式のヘモグロビン類測定デバイスを表す断面図である。基板（２１）（基板は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）であり得る）の上に、抗体（２３）が固定化された抗体固定化メンブレン（２２）を、続いてこの上に標識抗体凍結乾燥担持層（２４）を、そして続いてこの上に溶血剤担持層（２５）を積層し得る。ここで、図２に示すように、溶血剤担持層（２５）、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）は、すぐ下にある層と部分的に重なるように配置され得る。この重なりによって、血液検体試料は各層間を移動し、従って、溶血、標識抗体結合、および固定化抗体結合を生じる。抗体固定化メンブレン（２２）の剥き出しの領域（すなわち、溶血剤担持層（２５）および標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない領域）に、ヘモグロビン類に特異的な抗体が固着しており、この領域にて、血液検体試料中のヘモグロビン類の反応が検出され得る。また、吸収層（２６）が、抗体固定化メンブレン（２２）における、血液検体試料の添加側と反対側（すなわち、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）が重なっていない側）の領域に重なるように積層され得る。吸収層は、反応検出領域に存在する、検出に不要であり得る血漿溶液を吸収し、反応の検出を補助し得る。さらに、溶血剤担持層（２５）、標識抗体凍結乾燥担持層（２４）、および抗体固定化メンブレン（２２）の３つの層の重なり領域から反応検出領域までが、添加された試料による湿潤の乾燥を防ぐため、または試料の測定を妨害し得る物質の混入を避けるために、不透過性のシート（２７）で被覆され得る。このような不透過性シートとしては、セロハンが挙げられる。溶血剤担持層（２５）の重なり部分以外は、不透過性シートで被覆され得ない。この非被覆部分に、血液検体試料が、添加され得る。不透過性シート（２７）は、抗体固定化メンブレン（２２）と吸収層（２６）との重なり領域および抗体固定化メンブレン（２２）との重なりのない吸収層（２６）の少なくとも一部分をも被覆し得る。このような被覆により、抗体固定化メンブレン（２２）から吸収層（２６）への吸収が妨害されない。
以上に示すように、血球中の成分を測定する際に、血液検体試料を部分的に溶血させることにより、従来必要であった希釈段階を除くことができる。手動の場合、本願発明の方法を用いることにより、希釈操作を省くことが可能である。またこれまで希釈段階を自動化していた場合も、自動化機器から自動希釈段階を省くことができ、機器の小型化およびコストの低減につながる。
【国際調査報告】
2003083479.tif 000027
2003083479.tif 000028
2003083479.tif 000029
2003083479.tif 000030
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