(57)【要約】植物体からプロアントシアニジンを抽出し、得られた抽出物と所定量のキチン、キトサン、またはそれらの誘導体とを接触させ、非吸着物を回収することによって、生理活性の高いＯＰＣを多く含むプロアントシアニジン含有物を容易に得ることができる。さらに、このプロアントシアニジン含有物を合成樹脂系吸着剤で処理することによって、ＯＰＣ含量が極めて高いプロアントシアニジン含有物を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）植物体から抽出または圧搾により抽出物または搾汁を得る工程；および（ｂ）該抽出物または搾汁を、該抽出物または搾汁中のポリフェノール含有量に対して乾燥重量で２〜１０倍量のキチン、キトサン、またはそれらの誘導体と接触させ、非吸着物を回収する工程を包含する、プロアントシアニジン含有物の製造方法。
【請求項２】
前記抽出が、熱水抽出である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた非吸着物と合成樹脂系吸着剤とを接触させる工程を包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴメリック・プロアントシアニジンおよびカテキン類を含有するプロアントシアニジン含有物であって、該プロアントシアニジン含有物中に乾燥重量換算でオリゴメリック・プロアントシアニジンを３０重量％以上、そしてカテキン類を５〜１５重量％の割合で含有する、プロアントシアニジン含有物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生理活性の高いＯＰＣを多く含むプロアントシアニジン含有物を、効率よく製造する方法に関する。
背景技術
プロアントシアニジンは、各種植物中に存在する重合または縮合したタンニンであり、フラバン−３−オールまたはフラバン−３，４−ジオールを構成単位として縮合または重合（以下、縮重合という）により、結合した化合物群である。これらは、酸処理によりシアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジンなどのアントシアニジンを生成することから、その名称が与えられている。
プロアントシアニジンの中でも、重合度が低いプロアントシアニジンが好適に用いられている。重合度が２〜３０の縮重合体（２〜３０量体）が好ましく、重合度が２〜１０の縮重合体（２〜１０量体）がより好ましく、重合度が２〜４の縮重合体（２〜４量体）がさらに好ましく用いられる。
本明細書では、プロアントシアニジンの縮重合体のうち、フラバン−３−オールおよび／またはフラバン−３，４−ジオールを構成単位とする重合度が２〜４の縮重合体を、ＯＰＣ（オリゴメリック・プロアントシアニジン；ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）という。
プロアントシアニジンは、ポリフェノール類の一種で、植物が作り出す強力な抗酸化物質であり、植物の葉、樹皮、果物の皮もしくは種の部分に集中的に含まれている。プロアントシアニジン、特にＯＰＣは、具体的には、ブドウの種、松の樹皮、ピーナッツの皮、イチョウ葉、ニセアカシアの果実、コケモモの果実などに含まれている。また、西アフリカのコーラナッツ、ペルーのラタニアの根、日本の緑茶にも、ＯＰＣが含まれることが知られている。ＯＰＣは、ヒトの体内では、生成することのできない物質である。
さらにＯＰＣは、抗酸化作用のほか、口腔内のバクテリア増殖を抑制してプラーク（歯こう）を減少させる効果；血管の弾力性を回復させる効果；血液中でのリポタンパク質が活性酸素によりダメージを受けるのを防止して、損傷した脂肪が血管の内壁に凝集し、コレステロールが付着することを防止する効果；活性酸素によって分解されたビタミンＥを再生させる効果；ビタミンＥの増強剤としての効果などを有することが知られている。
さらに、フラバン−３−オールおよび／またはフラバン−３，４−ジオールの重合体であるタンニン、ならびにキチン、キトサン、およびこれらの誘導体は、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌、腸チフス菌、コレラ菌などに対する抗菌作用や殺菌作用が顕著である。特にほとんどの抗生物質が効かないために話題となったＭＲＳＡ（メチシリン耐性ブドウ球菌）にも効果があることが報告されている。
プロアントシアニジンは、一般的には植物体からの抽出によって得られる。抽出に用いる溶媒としては、水；メタノール、エタノール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチルなどの有機溶媒；またはこれらの混合物が挙げられる（特開平１１−８０１４８号公報）。しかし、単に溶媒による抽出のみでは、プロアントシアニジンの回収量は低く、純度も低い。したがって、健康食品、化粧品および医薬品原料として使用するためには、純度を上げるためのさらなる濃縮、精製などの工程が必要であり、コストおよび時間がかかる。
特開平５−２７９２６４号公報および特開平６−５６６８９号公報には、プロアントシアニジンを含むポリフェノール類を回収する方法が記載されている。この方法では、ポリフェノール類をキチンに吸着させ、ポリフェノール類が吸着したキチンをポリフェノール製品として利用する。しかし、吸着されたポリフェノール類は、重合度の高いポリフェノール類であり、上記生理活性が高い２〜４量体のＯＰＣの含有量は極めて低く、そのため抗酸化作用などの生理活性が低い。
特開平４−１９０７７４号公報、特開平１０−２１８７６９号公報、特開２００１−１３１０２７号公報、およびＥｂｅｒｈａｒｄ  Ｓｃｈｏｌｚら，Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｋｒａｍｅｒｉａ  ｔｒｉａｎｄｒａ  Ｒｏｏｔ，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，５５（１９８９），３７９−３８４頁には、植物体からＯＰＣを抽出する方法および／またはＯＰＣを合成する方法が記載されている。しかし、抽出方法においては、ＯＰＣを得るために、植物体の抽出液を合成樹脂系吸着剤に吸着・溶出させ、得られた画分を回収する工程、さらにこの工程を繰り返す工程が必要であり、効率的ではない。合成方法についても、工程数が多く、コストおよび時間もかかるなどの問題がある。
発明の開示
本発明者らは、有用な生理活性を有するＯＰＣ含量の多いプロアントシアニジン含有物を効率よく得る方法について、鋭意検討した。その結果、植物体からプロアントシアニジンを抽出し、得られた抽出物と所定量のキチン、キトサン、またはこれらの誘導体とを接触させ、非吸着物を回収することによって、生理活性の高いＯＰＣを多く含むプロアントシアニジン含有物が効率良く得られることを見出した。このプロアントシアニジン含有物を、さらに合成樹脂系吸着剤で処理することによって、よりＯＰＣ含量の高いプロアントシアニジン含有物が得られることを見出して本発明を完成させた。
本発明は、プロアントシアニジン含有物の製造方法を提供し、この方法は、（ａ）植物体から抽出または圧搾により抽出物または搾汁を得る工程；および
（ｂ）該抽出物または搾汁を、該抽出物または搾汁中のポリフェノール含有量に対して乾燥重量で２〜１０倍量のキチン、キトサン、またはそれらの誘導体と接触させ、非吸着物を回収する工程を包含する。
好ましい実施態様においては、上記抽出は、熱水抽出である。
さらに好ましい実施態様においては、さらに（ｃ）上記工程（ｂ）で得られる非吸着物と合成樹脂系吸着剤とを接触させる工程を包含する。
本発明はまた、オリゴメリック・プロアントシアニジンおよびカテキン類を含有するプロアントシアニジン含有物を提供し、これは、該プロアントシアニジン含有物中に乾燥重量換算でオリゴメリック・プロアントシアニジンを３０重量％以上、そしてカテキン類を５〜１５重量％の割合で含有する。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられる植物体は、プロアントシアニジンを含有する植物体であり、その種類には特に制限はない。プロアントシアニジンを多く含む杉、檜、松などの樹皮；ブドウ、ブルーベリー、イチゴ、アボガド、ニセアカシア、コケモモ、エルダーベリーの果実、果皮、もしくは種子；大麦；小麦；大豆；黒大豆；カカオ；小豆；トチの実の殻；ピーナッツの薄皮；イチョウ葉；茶葉および茶抽出液；モロコシキビ；リンゴ果実；クマザサ；フコイダン；ヤーコン葉；コーラナッツ（例えば、西アフリカのコーラナッツ）；ラタニア（例えば、ペルーのラタニア）の根；などが挙げられる。これらの中で、特に松樹皮、ブドウ種子および果皮、ピーナッツの薄皮などが好適に用いられる。
以下、本発明のプロアントシアニジン含有物の製造方法について説明する。まず、植物体からプロアントシアニジンを抽出し、あるいは植物体から搾汁を得る。抽出を行う場合には、抽出効率の点から、好ましくは植物体を適当な大きさに破砕し、体積当たりの表面積を大きくする。破砕方法は、特に限定されない。例えば、カッター、スライサーなどで処理した破砕物；ミキサー、ジューサー、ブレンダー、マスコロイダーなどで処理した粉砕物などでもよい。破砕物または粉砕物の大きさは、０．１〜１０ｃｍ、好ましくは０．１〜５ｃｍの細片である。破砕効率を上げるために、破砕時に水、あるいはエタノール、メタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒を加えてもよい。
抽出溶媒としては、水または有機溶媒が用いられる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、および１，１，２−トリクロロエテンが挙げられる。さらに、水−有機溶媒の混合溶媒も好ましく用いられる。これらの有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。なお、製造時の廃液処理の観点から、水が好適に用いられる。
植物体に添加する抽出溶媒の量は、目的とするプロアントシアニジン濃度および抽出効率を考慮して設定し得る。例えば、水を抽出溶媒として使用する場合、植物体：水の比が重量比で１：５〜１：５０、好ましくは１：１０〜１：２０である。水および／または有機溶媒を添加して破砕した場合は、破砕に使用した量を考慮し、添加する抽出溶媒の量を調整すればよい。
抽出温度は、抽出効率を高めるためには高い方が好ましい。水を用いる場合、５０〜１２０℃、好ましくは７０〜１００℃の熱水で抽出する。植物体に熱水を加えてもよく、植物体に水を加えた後、加熱してもよい。抽出時間は、一般的には１０分〜２４時間であるが、抽出温度により適宜決定され得る。
また、有機溶媒を用いた抽出方法として、加温抽出または超臨界流体抽出法による抽出を行ってもよい。有機溶媒を用いた加温抽出法としては、植物体に加温した溶媒を加える方法、または植物体に溶媒を添加して加温する方法が用いられる。例えば、粉砕した植物体に対して、水：エタノールの比が、重量比で１：１である水−エタノール混合溶媒を抽出溶媒として５倍量使用して、７０〜７５℃で還流させながら、３時間攪拌する方法が挙げられる。なお、有機溶媒を使用する場合の抽出温度は、その有機溶媒の沸点以下に設定する必要がある。
超臨界流体抽出法は、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて目的成分を抽出する方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが用いられ、二酸化炭素が好ましく用いられる。超臨界流体抽出法は、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程および目的成分と超臨界流体とを分離する分離工程からなる。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、または吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。
また、エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、超臨界流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、またはケトン類を２〜２０Ｗ／Ｖ％程度添加し、得られた抽出流体で超臨界流体抽出を行うことによって、ＯＰＣ、カテキン類（後述）などの目的とする被抽出物の抽出流体に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させ、プロアントシアニジンの効率的な抽出を可能にする。
抽出には、例えば、回分式、半連続式、または連続式などのいずれの抽出装置を用いてもよい。
植物体から搾汁を得る場合には、植物体を直接圧搾し、あるいは適宜切断または破砕した後に圧搾する。この方法は、水分含量の高い植物体を使用する場合に好適に採用される。例えば、ブドウ果実の場合には、圧搾によりプロアントシアニジンを含む搾汁が得られる。植物体を破砕して得られる植物体由来の固形分を含む植物体破砕物（例えば、上記ブドウ果実破砕物）もまた搾汁と同様に用いられ、本明細書中では、この植物体由来の固形分を含む植物体破砕物も搾汁に包含される。
次に、得られた抽出物または搾汁（以下、抽出物等という）と所定量のキチン、キトサン、またはそれらの誘導体（以下、キチン、キトサン、およびこれらの誘導体のうちの少なくとも１種をキチン類という）とを接触させる。
以下、この工程を接触工程という。
接触工程に用いられるキチン類の形状は、粉末のままでもよいし、繊維、フィブリル、フィルム、多孔体、マイクロビーズなどの成形体でもよい。あるいは、樹脂等の担体と結合してもよい。
所定量のキチン類とは、抽出物等中のポリフェノール含有量に対して、乾燥重量で２〜１０倍量、好ましくは３〜８倍量、より好ましくは４〜７倍量のキチン類をいう。なお、キチン類が樹脂などの担体と結合している場合は、担体部分の重量を除いた重量をキチン類の重量とする。
抽出物等中のポリフェノール含有量は、例えば、抽出液の一部（１〜５ｍＬ程度）を分取し、温風乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、減圧濃縮などにより粉末化し、抽出物等の粉末（以下、抽出物粉末という）の重量を測定した後、この抽出物粉末中のポリフェノール含有率（％）をＦｏｌｉｎ法などにより測定することによって算出することができる。
Ｆｏｌｉｎ法による抽出物粉末中のポリフェノール含有率（％）の測定は、例えば、以下のように行われる。まず、カテキンをポリフェノールの標準物質として精製水に溶解し、０．００５〜０．０５重量／容量％の範囲内で段階的に標準検体を調製する。次いで、上記抽出物粉末を０．０１〜０．０５重量／容量％の範囲内で適宜精製水に溶解し、検体を調製する。標準検体および検体をそれぞれＦｏｌｉｎ試薬（１００ｍＬ中にタングステン酸ナトリウム２．５ｇ、リンモリブデン酸０．５ｇ、および８５重量％リン酸溶液１．２５ｍＬを含有する水溶液）と等量混合し、３分間攪拌した後、１０重量／容量％炭酸ナトリウム溶液３ｍＬを加え、１時間放置する。放置後、遠心分離によって上清を回収して、この上清の７３０ｎｍにおける吸光度を測定する。各濃度の標準検体の吸光度から検量線を作成し、この検量線を用いて検体中に含まれるポリフェノール濃度を得る。得られたポリフェノール濃度および検体濃度から抽出物粉末中のポリフェノール含有率（％）を算出することができる。
接触工程においては、抽出物等とキチン類とが接触すれば、接触はいかなる方法で行ってもよい。例えば、簡易な方法としては、合成樹脂担体にキチンを結合させたキチン樹脂をカラムに充填し、抽出液を通過させるカラム法、キチン類を抽出物等に加え、一定時間後、キチン類を除去するバッチ法などが挙げられる。なお、抽出物等に有機溶媒が含まれる場合は、キチン類が有機溶媒に溶解しない程度に抽出物等を希釈するか、有機溶媒を除去しておく必要がある。
カラム法は、カラムの詰まりなどを考慮して、抽出物等に含まれる不溶物をあらかじめ除去することが好ましい。不溶物を除去する方法としては、当業者が通常用いる方法、例えば、濾過や遠心分離などが挙げられる。処理時間の点から、濾過が好適に用いられる。濾過は、好ましくは５０〜１００℃で行われ得る。高温ほど、より多くのプロアントシアニジンを回収することができ、好ましくは５０℃以上、より好ましくは７０℃以上で行われる。濾過により除去された不溶物を、さらに７０℃以上の熱水または加温溶媒で洗浄することによって、より多くのプロアントシアニジンを回収することができる。
不溶物を除去した後、キチン類への吸着効率を考慮して、得られた抽出物等を冷却することが好ましい。好ましくは抽出物等を４〜３０℃になるまで冷却する。冷却としては、放冷による自然冷却；水、氷、あるいは冷凍庫や冷蔵庫などの冷却装置を用いた強制冷却などが挙げられる。
冷却後、キチン類を充填したカラムに抽出物等を通液する。例えば、カニ由来のキチンを用いて、松樹皮からプロアントシアニジン含有物を得る場合、松樹皮の熱水抽出物中のポリフェノール含有量を測定した後、該ポリフェノールの含有量に対して乾燥重量で２〜１０倍量、より好ましくは３〜８倍量のキチンを充填したカラムに松樹皮抽出物を通液する。その後、カラムをカラム容量の約２〜３倍量の水で洗浄し、得られたカラム通過液および洗浄液を回収することによって、プロアントシアニジン含有物を得ることができる。ここで、プロアントシアニジン含有物とは、その後、当業者が通常用いる方法によって得られる濃縮物、希釈物、粉末なども含む。
バッチ法におけるキチン類による処理は、例えば、松樹皮の熱水抽出物中のポリフェノールの乾燥重量に対して、キチン類を乾燥重量で２〜１０倍量、好ましくは３〜８倍量添加して、攪拌しながら１〜３時間行うことが好ましい。
処理後、キチン類を濾過または遠心分離により、除去することで、プロアントシアニジン含有物を得ることができる。
上記接触工程を経ることによりＯＰＣ含量の多いプロアントシアニジン含有物（以下、プロアントシアニジン含有物Ｉという）を容易に得ることができる。プロアントシアニジン含有物Ｉは、乾燥重量換算でＯＰＣ（オリゴメリック・プロアントシアニジン）を３０〜９０重量％、より好ましくは４０重量％〜７０重量％含有する。
得られたプロアントシアニジン含有物Ｉは、さらに、乾燥重量換算でカテキン類を好ましくは５〜１５重量％、より好ましくは１０〜１５重量％含有し得る。カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）類は、単独では水溶性が乏しく、その生理活性が低いが、ＯＰＣは、カテキン類と共存すると、カテキン類の水溶性を増加させると同時に、カテキン類の作用を活性化する性質を有する。したがって、ＯＰＣとカテキン類とを含有するプロアントシアニジン含有物Ｉは、特に有用である。
カテキン類とは、ポリヒドロキシフラバン−３−オールの総称である。カテキン類としては、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレートなどが挙げられる。さらに、天然物由来のアフゼレキン、ならびに（＋）−カテキンまたはガロカテキンの３−ガロイル誘導体も含む。
カテキン類の作用としては、発癌抑制作用、動脈硬化予防作用、脂肪代謝異常の抑制作用、血圧上昇抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗アレルギー作用、抗ウイルス作用、抗菌作用、虫歯予防作用、口臭防止作用、腸内細菌叢正常化効果、活性酸素やフリーラジカルの消去作用、抗酸化作用、血糖の上昇を抑制する抗糖尿病効果などが挙げられる。
得られたプロアントシアニジン含有物Ｉは、さらに合成樹脂系吸着剤で処理することにより、糖類や有機酸などの夾雑物が除去され、さらに精製される。すなわち、プロアントシアニジン含有物Ｉを合成樹脂系吸着剤と接触させて、プロアントシアニジンを合成樹脂系吸着剤に吸着させた後、所定の溶媒で溶出することにより、ＯＰＣ含量が極めて高いプロアントシアニジン含有物（以下、プロアントシアニジン含有物ＩＩという）を得ることができる。
上記精製に用いられる合成樹脂系吸着剤としては、有機系樹脂、イオン交換樹脂、シリカゲル、逆相シリカゲルなどが挙げられる。
有機系樹脂としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂などの芳香族系樹脂、アクリル酸系メタクリル樹脂、アクリロニトリル脂肪族系樹脂などが使用できる。好ましくは、芳香族系樹脂である。芳香族樹脂としては、疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、無置換基型の芳香族系樹脂、無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂が挙げられ、無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂がより好適である。これらの樹脂は、多孔性であることが好ましい。このような合成樹脂は市販されており、例えば、次のものが挙げられる：アクリル酸系メタクリル樹脂としては、ダイアイオン（登録商標）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ（以上、三菱化学株式会社製）；芳香族系樹脂としては、ＳＰ−９００（三菱化学株式会社製）、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−２０００（以上、株式会社オルガノ製）；疎水性置換基を有する芳香族系樹脂としては、ダイアイオン（登録商標）ＳＰ−２０５、ＳＰ−２０６、ＳＰ−２０７、ＨＰ−２ＭＧ、ＥＸ−００２１（以上、三菱化学株式会社製）、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−８（以上、株式会社オルガノ製）；無置換基型の芳香族系樹脂としては、ダイアイオン（登録商標）ＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０（以上、三菱化学株式会社製）；無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂としては、ＳＰ−８２５、ＳＰ−８００、ＳＰ−８５０、ＳＰ−８７５（以上、三菱化学株式会社製）；架橋デキストランの誘導体としては、セファデックス（登録商標）ＬＨ２０、ＬＨ６０（以上、ファルマシアバイオテク株式会社製）など。中でもダイアイオンＨＰ−２０またはセファデックスＬＨ２０が好ましい。
イオン交換樹脂としては、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂のいずれも使用できる。市販されている陽イオン交換樹脂としては、例えば、官能基としてスルホン酸塩基を有する樹脂である、アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４０００、ＣＧ−５０００、ＣＧ−６０００、ＣＧ−８０００、ＩＲ−１１６、ＩＲ−１１８、ＩＲ−１２０Ｂ、ＩＲ−１２２、ＩＲ−１２４、ＸＴ−１００７、ＸＴ−１００９、ＸＴ−１００２（以上、株式会社オルガノ製）などが挙げられる。弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、官能基として４級アミンを有する樹脂である、ＯＰＴＩＰＯＲＥ−ＸＵＳ４０２８５．００、ＯＰＴＩＰＯＲＥ−ＸＵＳ  ４０３９０．００（以上、ダウケミカル株式会社製）などが挙げられる。イオン交換樹脂を用いる際の溶出溶媒は、水が好ましく、カラム温度は５０〜１２０℃、カラム内は常圧または加圧された状態であることが好ましい。
合成樹脂系吸着剤の量は、溶媒の種類、合成樹脂系吸着剤の種類等によって適宜設定すればよい。例えば、プロアントシアニジン含有物Ｉの乾燥重量に対して、０．０１〜５倍重量の合成樹脂系吸着剤を使用することが好ましい。
プロアントシアニジン含有物Ｉを合成樹脂系吸着剤を用いて精製するには、例えば、まず、合成樹脂系吸着剤をカラムに充填し、そのカラムにプロアントシアニジン含有物Ｉを通液し、次いで合成樹脂系吸着剤の重量に対し、５倍から１０倍の重量の水を通液させる。これにより、不純物である糖類および有機酸が除去される。その後、適切な溶媒によりプロアントシアニジンを溶出する。溶媒としては、水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。好ましくは水とエタノールとの混合溶媒が用いられる。水とエタノールとの混合比は、用いる合成樹脂系吸着剤によって異なるが、例えば、ダイアイオンＨＰ−２０の場合、水：エタノールの比が体積比で１：１〜４：１である。このようにして、ＯＰＣ含量が極めて高いプロアントシアニジン含有物ＩＩが得られる。
上記精製工程を経ることにより得られるプロアントシアニジン含有物ＩＩは、乾燥重量換算で、ＯＰＣを８０重量％以上、好ましくは９５重量％以上含有し得る。このプロアントシアニジン含有物ＩＩは、ＯＰＣを極めて多く含有するが、カテキン類はほとんど含有しない。
上記精製工程を経ることにより得られたプロアントシアニジン含有物ＩＩを用いて、カテキン類を５〜１５重量％含有するプロアントシアニジン含有物Ｉとすることもできる。例えば、プロアントシアニジン含有物ＩＩに純度の高いカテキン類を添加することによって得られ得る。
上記方法によって製造されるプロアントシアニジン含有物ＩまたはＩＩは、濃縮して食品素材とすることもできる。濃縮には、膜濃縮、加熱濃縮、真空（減圧）濃縮、凍結濃縮などの種々の方法が用いられる。
さらに必要に応じて、これらのプロアントシアニジン含有物ＩまたはＩＩを殺菌処理して保存する。殺菌は、気流殺菌、高圧殺菌、加熱殺菌などの当業者が用いる方法により行われる。
また、これらのプロアントシアニジン含有物ＩまたはＩＩは、殺菌後、濃縮、乾燥、粉末化してもよい。乾燥には、当業者が通常用いる方法によって行われる。中でも、凍結乾燥、真空乾燥、および噴霧乾燥が好ましく用いられる。
このようにして得られたプロアントシアニジン含有物ＩまたはＩＩは、食品、化粧品、医薬品の原料として使用することができる。
得られたプロアントシアニジン含有物ＩまたはＩＩは、ドリンク剤およびゲル化した飲食物などとしても利用できる。さらに、プロアントシアニジン含有物は、そのまま飲食に供するだけでなく、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、顆粒、錠剤などの形態に成形することもできる。例えば、ローヤルゼリー、ビタミン類、プロテイン、カルシウム、キトサン、レシチン、カフェインなどと混合し、さらに糖液および調味料により味が整えられる。さらにこれらは、ハードカプセルおよびソフトカプセルなどのカプセル剤、丸剤、またはティーバッグ状などにされる。これらは、これらの形状または好みに応じて、そのまま食してもよく、あるいは水、湯、牛乳などに溶いて飲んでもよい。またティーバッグ状などの場合、成分を浸出させてから飲んでもよい。
実施例
以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、この実施例は本発明を制限するものではない。実施例に示す単位（Ｖ／Ｖ）は（容量／容量）を、（Ｗ／Ｗ）は（重量／重量）を示す。
（実施例１）
松樹皮３００ｇに精製水２．４Ｌを加え、ブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ  Ｂｌｅｎｄｅｒ）で破砕した後、１００℃で１０分間加熱した。次いで、直ちに濾過し、濾過後の不溶物を精製水６００ｍＬで洗浄し、濾液と洗浄液を合わせて３Ｌの抽出液を得た。
この抽出液の一部（５ｍＬ）を減圧濃縮し、得られた抽出物粉末の重量を測定した（４０ｍｇ）。次いで、Ｆｏｌｉｎ法にて抽出物粉末中のポリフェノール含有率を測定したところ、１５．７８重量％であった。したがって、この抽出液１ｍＬの乾燥重量は８ｍｇであり、抽出液中のポリフェノール含有量は１．２６ｍｇであることがわかった。
上記抽出液４００ｍＬ（抽出物粉末重量３．２ｇおよびポリフェノール含有量０．５ｇ）を２５℃まで放冷し、ポリフェノール含有量の３倍量相当（１．５ｇ）のキチン（ナカライテスク株式会社製）を充填したカラムに通液した。次いで、このカラムを精製水４０ｍＬで洗浄し、通過液と洗浄液とを合わせて、４４０ｍＬのプロアントシアニジン含有液Ｉａを得た。
プロアントシアニジン含有液Ｉａの半量（２２０ｍＬ）を減圧濃縮し、得られた乾燥粉末の重量を測定した。乾燥粉末の重量は５７４ｍｇであり、プロアントシアニジン含有液Ｉａ全量の乾燥重量が１１４８ｍｇであることがわかった。
次に、プロアントシアニジン含有液Ｉａ中のＯＰＣおよびカテキンの乾燥重量換算での含有率および含有量を測定するために以下の操作を行った。
上記のようにして得られたプロアントシアニジン含有液Ｉａの乾燥粉末を、ＯＰＣを含む成分と、カテキン類を含む成分と、ポリマーなどを含むその他の成分（以下、その他の成分という）とに、以下のようにして分離した。まず、水で膨潤させたセファデックスＬＨ−２０（ファルマシアバイオテク株式会社製）２５ｍＬを１５×３００ｍＬのカラムに充填し、２５ｍＬのエタノールで洗浄した。１００ｍｇの上記乾燥粉末を２ｍＬのエタノールに溶解し、これをカラムに通液して吸着させた後、１００〜８０％（Ｖ／Ｖ）エタノール−水混合溶媒でグラジエント溶出し、１０ｍＬずつ分取した。分取すると同時に、２〜４量体のＯＰＣの標品（２量体：プロアントシアニジンＢ−２（Ｒｆ値：０．６）、３量体：プロアントシアニジンＣ−１（Ｒｆ値：０．４）、および４量体：シンナムタンニンＡ２（Ｒｆ値：０．２））を指標として、各画分中のＯＰＣをシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により検出した。
ＴＬＣの展開条件および検出方法は下記の通りである。
ＴＬＣ：シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  ＆  ＣＯ．，Ｉｎｃ．製）
展開溶媒：ベンゼン／蟻酸エチル／蟻酸（２／７／１）
検出試薬：硫酸およびアニスアルデヒド硫酸
サンプル量：各１０μＬ
ＴＬＣでの検出によりＯＰＣが含まれることを確認した溶出画分を合わせて、ＯＰＣ画分を得た。
次いで、ＯＰＣが検出されなくなった時点で、１００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）水−アセトン混合溶媒を通液し、カラムに吸着した残りの成分を溶出させた。
次いで、ＯＰＣ画分以外の画分について、カテキンを指標として、ＴＬＣを行い（Ｒｆ値：０．８）、カテキン類を含む画分とその他の成分の画分とに分離した。ＴＬＣの展開条件および検出方法は上記と同様に行った。
カテキン類を含む画分については、さらに、以下のようにカテキン類とカテキン類以外の成分とに分離した。まず、カテキン類を含む画分を凍結乾燥し、得られた粉末を３ｍＬの水に溶解し、これを水で膨潤させた２０ｍＬのＭＣＩゲル（三菱化学株式会社製）を１５×３００ｍＬのカラムに充填したカラムに通液して吸着させた。このカラムを水で洗浄した後、１０〜１００％（Ｖ／Ｖ）エタノール−水混合溶媒でグラジエント溶出し、１０ｍＬずつ分取した。溶出終了後、カテキンを指標として、各画分中のカテキン類をＴＬＣにより検出し、カテキン類画分とカテキン類以外の成分の画分とに分離した。
上記のようにして得たＯＰＣ画分、カテキン類画分、カテキン類以外の成分の画分、およびその他の成分の画分をそれぞれ凍結乾燥により粉末化し、乾燥重量を測定した。
得られたＯＰＣは、上記プロアントシアニジン含有液Ｉａの乾燥粉末１００ｍｇに対して３０．２ｍｇであった。すなわち、プロアントシアニジン含有液Ｉａ中のＯＰＣの含有率は、乾燥重量換算で３０．２重量％であり、プロアントシアニジン含有液Ｉａ全量中にＯＰＣを３４７ｍｇ含有することがわかった。
得られたカテキン類は１０．１ｍｇであった。すなわち、プロアントシアニジン含有液Ｉａ中のカテキン類の含有率は、乾燥重量換算で１０．１重量％であり、プロアントシアニジン含有液Ｉａ全量中にカテキン類を１１６ｍｇ含有することがわかった。なお、ＯＰＣ画分、カテキン類画分、カテキン類以外の成分の画分、およびその他の成分の画分の総和は、プロアントシアニジン含有液Ｉａの乾燥粉末１００ｍｇに対して９９．２ｍｇであり、ほぼ全量回収されていた。
表１に、プロアントシアニジン含有液Ｉａの乾燥重量、ならびにＯＰＣおよびカテキン類の乾燥重量換算での含有率および含有量を示す。
（実施例２および３）
カラムに充填したキチンの量を、抽出液中のポリフェノール乾燥重量のそれぞれ５倍量相当の２．５ｇおよび７倍相当量の３．５ｇとしたこと以外は、実施例１と同様にして、それぞれ４４０ｍＬのプロアントシアニジン含有液ＩｂおよびＩｃを得た。プロアントシアニジン含有液ＩｂおよびＩｃの各半量２２０ｍＬを減圧濃縮し、得られた各乾燥粉末の重量を測定し、それぞれのプロアントシアニジン含有液ＩｂおよびＩｃ全量の乾燥重量に換算した。プロアントシアニジン含有液Ｉｂの乾燥重量は１０２４ｍｇであり、プロアントシアニジン含有液Ｉｃの乾燥重量は６３２ｍｇであった。次にプロアントシアニジン含有液ＩｂおよびＩｃをそれぞれ１００ｍｇを用いて、実施例１と同様にＯＰＣおよびカテキン類の乾燥重量換算での含有率および含有量を求めた。結果を表１に併せて示す。なお、得られた画分の乾燥重量の総和は、プロアントシアニジン含有液ＩｂおよびＩｃの乾燥粉末各１００ｍｇに対してそれぞれ９８．９ｍｇおよび９９．５ｍｇであり、いずれもほぼ全量回収されていた。
（実施例４）
実施例２で得られたプロアントシアニジン含有液Ｉｂの半量２２０ｍＬを用いて、さらに精製を行った。まず、プロアントシアニジン含有液Ｉｂを５ｇの芳香族系合成樹脂（ダイアイオンＨＰ−２０：三菱化学株式会社製）を充填したカラムに通液し、プロアントシアニジンをカラムに吸着させた。このカラムを２０ｍＬの精製水で洗浄し、次いでカラムを２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）のエタノール−水混合溶媒でグラジエント溶出し、４０ｍＬのプロアントシアニジン含有液ＩＩｂを得た。
このプロアントシアニジン含有液ＩＩｂを減圧濃縮して得られた乾燥粉末の重量は１４３ｍｇであり、プロアントシアニジン含有液ＩＩｂ全量の乾燥重量に換算すると２８６ｍｇであることがわかった。実施例１と同様に、プロアントシアニジン含有液ＩＩｂの乾燥粉末１００ｍｇ用いて、ＯＰＣおよびカテキン類の乾燥重量換算での含有率および含有量を求めた。結果を表１に併せて示す。
（比較例１および２）
カラムに充填したキチンの量を、抽出液中のポリフェノール乾燥重量のそれぞれ１倍量相当の０．５ｇおよび１３倍相当量の６．５ｇとしたこと以外は、実施例１と同様にして、４４０ｍＬのプロアントシアニジン含有液ＩｄおよびＩｅを得た。プロアントシアニジン含有液ＩｄおよびＩｅの各半量２２０ｍＬを減圧濃縮し、得られた各乾燥粉末の重量を測定し、それぞれのプロアントシアニジン含有液ＩｄおよびＩｅ全量の乾燥重量に換算した。プロアントシアニジン含有液Ｉｄの乾燥重量は２２８８ｍｇであり、プロアントシアニジン含有液Ｉｅの乾燥重量は４７２ｍｇであった。次にプロアントシアニジン含有液ＩｄおよびＩｅの乾燥粉末をそれぞれ１００ｍｇを用いて、実施例１と同様にＯＰＣおよびカテキン類の乾燥重量換算での含有率および含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。なお、得られた画分の乾燥重量の総和は、プロアントシアニジン含有液ＩｄおよびＩｅの乾燥粉末各１００ｍｇに対してそれぞれ９９．３ｍｇおよび９８．８ｍｇであり、いずれもほぼ全量回収されていた。
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表１からわかるように、抽出液中のポリフェノール含有量に対して３〜７倍量のキチンで処理して得られたプロアントシアニジン含有液Ｉａ〜Ｉｃは、乾燥重量換算でＯＰＣを３０重量％以上含有している。これらのＯＰＣ含有量は、抽出物粉末中に含まれるポリフェノール（１５．７８重量％）の約２倍に相当する。特にプロアントシアニジン含有液ＩｂおよびＩｃは、乾燥重量換算でＯＰＣを４０重量％以上も含有している。一方、抽出液中のポリフェノール乾燥重量に対して１あるいは１３倍量のキチンで処理して得られるプロアントシアニジン含有液ＩｄおよびＩｅでは、乾燥重量換算でＯＰＣをそれぞれ１７．２重量％および１０．５重量％含有し、これらは３〜７倍量のキチンで処理した場合よりも低かった。これらのことから、植物体抽出物等を所定量のキチンで処理することによって、プロアントシアニジン、特にＯＰＣを高い割合で含むプロアントシアニジン含有物が得られることを示す。
また、プロアントシアニジン含有液Ｉａ〜Ｉｃが、乾燥重量換算でカテキン類を１０．１〜１４．８重量％含有しているのに対して、プロアントシアニジン含有液ＩｄおよびＩｅに含まれるカテキン類はそれぞれ７．３重量％および３．８重量％であった。このことは、植物体抽出物等を所定量のキチンで処理することによって、ＯＰＣだけでなく、さらにカテキン類も高い割合で含むプロアントシアニジン含有物が得られることを示す。
さらに、プロアントシアニジン含有液ＩＩｂは、乾燥重量換算でＯＰＣを８０重量％以上含有していた。このように、ＯＰＣを極めて高い割合で含むプロアントシアニジン含有物が、抽出液を２種類のカラムを通す工程のみで容易に得られることがわかった。
（実施例５）
松樹皮１００ｇに１Ｌの精製水を加え、破砕し、１００℃で１０分間加熱した。次いで、直ちに濾過し、濾過後の不溶物を精製水２００ｍＬで洗浄し、濾液と洗浄液とを合わせて１．２Ｌの抽出液を得た。この抽出液の一部（５ｍＬ）を減圧濃縮し、得られた抽出物粉末の重量を測定した（３９ｍｇ）。さらに、抽出物粉末中のポリフェノール含有率をＦｏｌｉｎ法を用いて測定したところ、１５．５５重量％であった。抽出液全量中のポリフェノール含有量は１．４６ｇであった。
次いで、上記抽出物粉末を残りの抽出液に加え、湯で全量１．２Ｌに調整した後、２５℃まで放冷し、ポリフェノール含有量に対して乾燥重量で約７倍量のキチン１０ｇを加え、３時間攪拌を行った。攪拌後、濾過し、１．２Ｌのプロアントシアニジン含有液Ｉｆを得た。
次いで、このプロアントシアニジン含有液Ｉｆを減圧濃縮し、３．３６ｇのプロアントシアニジン含有液Ｉｆの乾燥粉末を得た。１００ｍｇのプロアントシアニジン含有液Ｉｆの乾燥粉末を用いて、実施例１と同様にＯＰＣおよびカテキン類の含有率を測定したところ、乾燥重量換算でＯＰＣを４０重量％以上およびカテキン類を１２．１重量％含有することがわかった。さらに、３．２６ｇのプロアントシアニジン含有液Ｉｆの乾燥粉末を２Ｌのメタノールに溶解し、実施例１と同様に５０ｇのダイアイオンＨＰ２０を充填したカラムへ通液し、プロアントシアニジンを吸着させた。このカラムを精製水で洗浄した後、カラムを２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）エタノール−水混合溶媒でグラジエント溶出し、４００ｍＬのプロアントシアニジン含有液ＩＩｆを得た。このプロアントシアニジン含有液ＩＩｆを減圧濃縮し、２．０５ｇのプロアントシアニジン含有液ＩＩｆの乾燥粉末を得た。プロアントシアニジン含有液ＩＩｆ中のＯＰＣの含有率を実施例１と同様に測定したところ、乾燥重量換算でＯＰＣを８０重量％以上含有していることがわかった。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、生理活性の高いＯＰＣを高い割合で含有するプロアントシアニジン含有物を容易に得ることができる。このＯＰＣ含量が高いプロアントシアニジン含有物は、カテキン類も含有する。そのため、ＯＰＣがカテキン類の作用を活性化させるという相乗効果を有する。このプロアントシアニジン含有物を、単に合成樹脂系吸着剤で処理することによって、ＯＰＣ含量が極めて高いプロアントシアニジン含有物を提供することができる。このＯＰＣ含量が極めて高いプロアントシアニジン含有物は、ほとんどカテキン類を含有しないため、より精製されたＯＰＣとして利用し得る。これらのプロアントシアニジン含有物は、血管増強、高血圧、冷え性などの改善に効果があり、食品、化粧品、医薬品の製造原料として非常に有用である。
【国際調査報告】
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