(57)【要約】免疫学的クロマトグラフ法の標識抗体に可視担体として金コロイド粒子またはブルーラテックス粒子などを用いる試験紙片上の、測定項目の定量に関係する複数の反応ラインの像を光学的に読み取った検体情報群と、測定項目固有の情報および試薬ロット固有情報である検量線情報群を磁気カードリーダなどにより取り出し、１検体ごとかつ１試験紙片ごと検量線を新しく計算しながら検体の濃度を定量する装置。この装置は、試験紙片上の反応ラインの像を読み取る光学系で複数個の測定項目の定量に関係する反応ラインの像をＣＣＤカメラ素子などで受光した検体情報群と予め磁気カードなどから得た検量線情報群の検量線近似式と補間式から検体ごと１試験紙片ごと内蔵の中央演算装置（ＣＰＵ）で濃度計算して、未知検体の濃度を定量する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的クロマトグラフ法の標識抗体に金コロイド粒子やブルーラテックス粒子などの可視担体を用いる試験紙片の複数の反応ライン方向と直角斜め上方に複数個の発光素子を配しかつ試験紙片上にレンズを一定間隔で配し、発光素子から試験紙片に照射された光を、その光軸上に置かれたレンズを経て結ばれた像の位置にＣＣＤカメラ素子などの撮像素子を配してなり、被検査試料をクロマトグラフ的に展開させたあと、出現した測定項目の定量に関係する２つ以上の反応ラインの濃さを試験紙片を動かすことなく読み取り、内蔵のＣＰＵでその測定項目の濃度を定量することが出来る免疫学的クロマトグラフ法を用いる試験紙片の読み取り定量装置。
【請求項２】
免疫学的クロマトグラフ法を用いる試験紙片の定量に必要な、測定項目名、反応ラインの既定濃度値の値、検量線の近似式や補間法の式、項目の正常値・異常値情報および測定試薬のロット情報などを読み取る磁気カードまたはＩＣカードなどの記憶媒体のデータを読み取る機構を備えた請求項１の免疫学的クロマトグラフ法を用いる試験紙片の読み取り定量装置。
【請求項３】
ＣＣＤカメラ素子などの撮像素子で読み取った試験紙片上の固有の画像データを検体情報群とし、請求項２の磁気カードやＩＣカードの情報を検量線情報群とし、試験紙片の測定ごと毎回これら２つの情報群より未知試料の濃度を定量することを特長とする請求項１の免疫学的クロマトグラフ法を用いる試験紙片の読み取り定量装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、ヒトや動物などの体液成分の測定に、免疫学的クロマトグラフの原理を使って被測定検体を展開させ、反応させそこに現れたラインやスポット及び色調の濃度を読み、定量する機器に関する。
背景技術
試験紙片の反射測光方法は既に尿や血液試料の測定に種々用いられている。血液試料の定量については、参考資料１および参考資料２などに詳しく紹介されている。
それらは、１種類または数種類の検査項目の測定を１度の操作で検査出来るように、１つの細長いプラスチック支持体に等間隔で１個または複数個貼り付けられた化学反応試薬を含浸させた吸収パット（濾紙片）を並べたものを使用している。すでに、これらの試験紙片や測定機器は、日常の尿試験紙に適用され住民健診や病院のスクリーニング検査として広く用いられている。この試験紙片は原則として１つの吸収パットが１つの固有の測定項目に限定されている。例えば糖・蛋白・ビリルビン・ヘモグロビン・ウロビリンのようなものが良く知られている。この試験紙片を読み取る方式では、試験紙片の各吸収パット部分を反射測光する光学系部分に順次移動させその濃度を読みとるかまたは試験紙片を固定しておいて光学系部分を移動して濃度を読み取る方法である。
免疫学的クロマトグラフ法による測定の特長は、超微量例えば数ｎｇの蛋白質などの濃度を免疫学的な特異性に基づいて測定できる事にある。この免疫学的クロマトグラフ法は一般的に酵素や金コロイド粒子やブルーラテックスを測定すべき項目に特異的な抗体に標識したものをクロマトグラフの展開方向の途中に乾燥状態で設置してある。そして、被検検体をクロマトの一端に注入することで、標識抗体が展開し、その途中測定項目に特異的な抗体が塗ってある固相抗体領域でそれぞれ捉えられることで、被検検体中の測定項目があるか無いかを定性的に判定する方法である。この方法は日本特公平７−４６１０７（参考資料３）に記載されており、広く使用されている。
この特許公報に記載されているように本測定法は、定量を目的にされておらず人の目で特定のラインがあるかないかを判定する方法であり定量に不向きとされていた。免疫学的クロマトグラフ法を使い定量目的に使用する方法として日本特願平１１−１４９６９２（参考資料４）にあるように試験紙片上のラインやスポットに係わる酵素標識抗体に３原色の色素を予め結合しておき、この３種類の色調をカラーで読み取り、結果をコンピュータ等で解析し定量したものもある。また、参考資料５に紹介されているように、バックグランドの影響を無くすため発光試薬のビオチンなどを標識した抗体を用いて免疫学的クロマトグラフ展開させた後、特定の発光光を測定して定量をしているものも存在する。
反射測光方式による尿試験紙の測定法では、１種類（１項目）の吸収パットの化学反応の色調を１種類の光学系による測光をしている。多項目の検査にはいくつもの専用項目パットを並べた試験紙片を、試験紙片の移動または光学系自体の移動で読み取っていた。化学反応の試薬においては、事前に既知濃度の各項目別吸収パットの色調や濃度が装置に記憶されており未知濃度の被検試料の色調と比較し、実際の濃度を計算していた。
また免疫学的クロマトグラフ法による測定方法においては、化学反応試薬と異なり超微量濃度の定量が目的であり前述の参考資料４（日本特願平１１−１４９６９２）に詳細に記してあるようにバックグランドの不安定さや被検検体中の他の物質例えば多量にある蛋白質が定量を阻害していた。そのバックグランドなどの妨害を除去する方法は、色調の異なる標識抗体を使用し出現したラインまたはバンドをフルカラーで読み取り、バックグランドに関係する色調を別にデータ処理して安定した定量が出来るようにしている。
または、参考資料５に示すように、測定対照項目には自然界にない発光物を標識した抗体を特異的に結合する方式を使用しバックグランドや妨害物質の影響を排除していた。
参考資料１  吉野二男・大沢久男編：臨床化学検査における分光測定法、ドライケミストリーにおける反射吸光光度分析、日本分光学会測定法シリーズ７、１９８４年、（株）学会出版センター
参考資料２  武田真一：ＰＯＣＴの新たなる展開〜ＣＡＲＥＬＡＢ（ケアラボ）〜、生物試料分析、Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４，２４５−２５２，２００１
参考資料３  日本特公平７−４６１０７
参考資料４  日本特願平１１−１４９６９２
参考資料５  高木  康、五味邦英、小林裕史：イムノクロマトグラフィ法を用いた心筋マーカの迅速測定法−Ｃａｒｄｉａｃ  ＲｅａｄｅｒによるミオグロビンとトレポニンＴ測定−、生物試料分析、Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４，２７０−２７５，２００１
発明の開示
本発明は、日本特願平１１−２９５７０８の試験紙片を用いる専用の読み取り定量装置を提供するものであり、標識抗体として、可視でかつ安価な金コロイドあるいはブルーラテックス粒子を担体として用い、固相部に予め測定項目と密接に関係ある例えば感度・濃度・検量線情報などの複数個の反応ラインが出現するよう構成されている試験紙片に、被検検体を塗布し免疫学的クロマトグラフで展開させ出現した複数個の反応ラインを光学的にかつ試験紙片を移動することなくそれぞれ読み取り、予め複数個の反応ラインに与えられている情報に従って被検検体のその項目の濃度を定量できるよう構成した測定装置であり、▲１▼試験紙片または光学系を移動することなく読み取る測定機器であること。▲２▼バックグランドの影響がなく、かつ安定的に読み取る方式であること。▲３▼安価な試薬で超微量の体液成分の測定ができかつ小型で安価な測定機器であること。▲４▼１台の機器で多数の項目の測定ができること。▲５▼免疫学的検査法特有のロット間差、日差間差、測定者間差が簡単に補正できること。などが解決しなければならない課題である。
超微量の体液成分を測定する場合、化学発色を原理とする測定法ではできず免疫学的測定法を利用する事が多い。その中では比較的安価な測定法として可視担体いわゆる金コロイドやブルーラテックス標識抗体を用いる免疫学的クロマトグラフ法による測定法が定着している。この方法による測定感度は、超微量の蛋白質例えば数ｎｇの濃度を特異的に測定できるが、この方法は、参考資料３に示すように定量を目的にされておらず人の目で特定のラインがあるかないかを判定する方法であり定量に不向きとされていた。この免疫学的クロマトグラフ法を定量目的に使用するためには参考資料４〜５のようにバックグランドの不安定さを無くす別の方法を利用しなければならなかった。
本発明により、定性試験紙片と見られていた上記免疫学的クロマトグラフ法が、日本特願平１１−２９５７０７に示す試験紙片を使うことで、定量用に使えるようになった。この日本特願平１１−２９５７０７に示す試験紙片には、１枚毎の試験紙片上に既定値の色調が現れる特別の反応ライン（コントロールライン）が１個または複数個設置されており、それらが試験紙片ごと定量計算に役立つよう構成されている。その試験紙片に被検検体を一定量所定の操作で添加し、反応済み試験紙片を作成し、反射型測定装置で読み取る。
図１に一般的な反射型測定装置で読み取った反応ラインの波形を示した。図２には本発明による反射型測定装置で読み取った波形を示した。
図１の波形は、ベースラインが鍋底型（湾曲）となっているが、図２では平坦になっている。図１と同じ波形が参考資料４の日本特願平１１−１４９６９２の図２０〜２２に記載されている。本発明の光学系で同じ試験紙片の波形を書かせると図２のようにベースラインは平坦となり、結局読み取った波形の高さがバックグランドの影響で異なることが防止できた。
本発明では、試験紙片については日本特願平１１−２９５７０７が示しているように試験紙片上へ抗原抗体反応の反応ラインに特定の既定値情報（コントロールライン）が設置されているので、試験紙片の測定ごと毎回その被検検体の濃度および特定のコントロールラインの濃度測定値などいわゆる検体情報群のデータと磁気カードなどの外部からの入力である検量線の近似式などの検量線情報群のデータに基づいて濃度計算が出来るように構成された。
検体情報群の測定では、ベースラインの平坦化の部分と試験紙片上のコントロールラインの既定値濃度の測定数値とから、バックグランドの影響を排除する事ができた。その１例として前立腺特異抗原（ＰＳＡ）について、図１に一般的な反射型測定装置で取ったデータおよび図２の本願発明の装置で取った同時再現性のデータをそれぞれ表１に示した。
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なお測定項目や正常値情報および試薬ロットごとの反応ラインの設定濃度やその検量線の近似式などは予め専用の磁気カードやＩＣカードに記載しており、そのカードを読むことにより測定項目の変更や試薬のロット変更および検量線の近似式の変更が簡単にできるようになされた（検量線情報群の一部）。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、図３の光学系を用いて図５の試験紙片の各反応ラインを読み取る検体情報群と磁気カードなどに記憶されている検量線の近似式及びコントロールラインの濃度値などの検量線情報群の２つから、試験紙片ごとかつ毎回の測定ごと検量線計算をし、プリントアウトする。この光学系の条件下では、図４に示すように、最大５個の反応ライン（４）が、光学系または試験紙片を移動させることなく直線ベースライン上にそれぞれの反応ラインの濃度に比例する波形が得られた。本発明は、標識抗体に高価な発光色素標識抗体や３原色色調を持った特別な標識抗体を使用せず、可視的で安価な金コロイドやブルーラテックス標識抗体を直接使用した試験紙片で作られている。
本発明の免疫学的クロマト試験紙片の読取装置は、特願平１１−２９５７０８に示されている試験紙片そのものに組み込まれている一定の色調が現れる１個または複数の特定のコントロールラインの色調を、被検検体特有の測定ラインと共に読み取り数値化した検体情報群と、磁気カードやＩＣカードに書き込まれている検量線近似式および試薬のロット情報および補間式などの検量線情報群から被検検体の濃度を計算して求めている。その装置の構成図を図７に示す。
実施例１
図３が本発明の光学系であり、レンズ（１）の焦点距離（ｆ）の２倍の位置（２ｆ）に試験紙片（２）およびＣＣＤカメラ素子（３）を置き、試験紙片のライン（４）方向に直角で斜上方６０度に複数個の発光素子アレイ（５）を配して構成させた。図３に示す光学系の発光素子（５）は中心波長が５２０〜５２５ｎｍ、光度０．４ｃｄの発光ダイオードを少なくとも２個以上使用し、その発光面と試験紙片の表面までの距離が光学系のレンズの焦点距離の半分以下であり、試験紙片の複数のライン（６）の中心が複数の発光素子の中心と一致させた。また受光素子としてＣＣＤカメラ素子３６４８画素の素子を使用した。受光素子としてはＣＣＤカメラ素子以外に撮像管も使用できる。
試験紙片（２）の標識抗体に抗ヒトＰＳＡ金コロイド標識抗体を使用するＰＳＡ測定法の実施例（図５）について説明する。
取り込むデータ数としては、試験紙片の分解能を上げるため２００〜１０００ポイントのデータを最低１０回〜５０回程取り込み、そのうち上限と下限のいくつかのデータを捨て残りのデータを平均して取り込み検体情報群とした。
検量線情報群として試験紙片のロット情報、主に項目情報と図５（ＰＳＡ試験紙片の外観図）に示す固相部の区分Ｂ（１３）、Ｄ（１４）の既定値（コントロールの値）・検量線の近似式▲１▼と補間式▲２▼・項目別ロット情報などを、測定前に内臓の磁気カードリーダで読み込む。
磁気カードに入れてある検量線情報群
１）Ｂ、Ｄラインの量
Ｂ区分（ロット固有）  ３．７ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ）−−−Ｃｃ
Ｄ区分（ロット固有）１１．５ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ）−−−Ｃｄ
２）検量線近似式
ｙ＝−０．１７３ｘ２＋１０．５１８ｘ＋１６３．９  −−−−  ▲１▼
Ｃ＝（Ｃｄ−Ｃｃ）（Ｐ−Ｐｃ）／（Ｐｄ−Ｐｃ）＋Ｃｃ  −−−−  ▲２▼
この磁気カードの内容である検量線情報群と測定データ（表２）いわゆる検体情報群を用いて装置に組み込まれたコンピュータにより、近似式▲１▼と補間式▲２▼を用いて計算を行ない定量値を算出しプリントアウトする。
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この２つの計算式から得られるデータは、例えば図２のベースライン上に細かく乗っているノイズの影響を受けていないのが特長である。何故ならば本願発明のデータ処理システムは▲２▼に示す補間法を使うので、ベースライン上のノイズは計算上除去されるからである。
図５の区分Ａ（１１）には金コロイド標識抗体が乾燥状態で塗布されており、固相部区分Ｂ（１３）、Ｃ（１２）、Ｄ（１４）の３つの反応ラインはそれぞれ特異抗血清が塗布されている。そのうち区分Ｂが低濃度ラインを、区分Ｄが高濃度ラインを指し、区分Ｃラインが被検検体の濃度を示すラインである。なおこの試験紙片の構成は、日本特願平１１−２９５７０７に詳しく記載されている。
次に、この試験紙片に被検検体１〜６を添加し測定した場合の結果の出し方について説明する。
表２には、被検検体１〜６の血清試料それぞれ１５０μＬ添加し反応後本機器で読み取った値（検体情報群）を示した。これと検量線情報群の検量線近似式▲１▼で２次方程式の解を求めさらに補間法の式▲２▼にて被検検体の濃度を算出した。
参考：補間法▲２▼−−−臨床化学検査における分光測定法、吉野二男・大沢久男編、（株）学会出版センター、式（３．１４）ｐ．１２０、１９８４（参考資料１に記載）
その結果を表３に示した。
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実施例２
図６は１枚の試験紙片上で２種類の測定項目が測定出来る試験紙片の読み取りの実施例を示した。心筋梗塞マーカのトレポニンＴとミオグロビンの２種類の定量が１枚の試験紙片により本願発明の定量装置で読み取り定量できた。この特長は１回の採血操作で２項目の検査が１度に出来る点にある。
標識抗体区分Ａ（１５）には、３種類の金コロイド標識抗体として抗ヒトトレポニン抗体、抗ヒトミオグロビン抗体、マウスＩｇＧを混合して乾燥状態で設置し、固相部の区分Ｂ（１６）、Ｃ（１７）、Ｄ（１８）、Ｅ（１９）にはそれぞれ抗マウスヤギ抗体、抗ヒトトレポニンＴ抗体、抗ヒトミオグロビン抗体、マウスヤギ抗体を設置した試験紙片に被検検体（血清）を１５０μＬ添加し反応後本測定装置で測定し実施例１と同様に計算して定量値を算出した。表４に測定結果を示した。
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この測定では、一度に２つの項目が測定できたが、反応ラインに他の項目を加える事で一度に３つの項目または４つの項目の検査が出来る。
実施例３
本発明の免疫学的クロマト法の試験紙片の読み取り定量装置で測定できる項目は、標識抗体と試験紙片上に塗布される抗体の種類を変えることで、免疫学的に抗体が作れる全てのものの定量が出きる。本実施例以外に例えばＣＲＰや尿中のアルブミン・ヘモグロビン・ＩｇＥなどの蛋白質や抗体、ＣＥＡ・αフェトプロテイン・ＣＡ１９−９等の癌関連物質、ＨＤＬコレステロール等の脂質、ＨｂｓＡｇ・ＨｂｓＡｂ・ヘリコバクターピロリ菌の抗原又は抗体・ＳｔｒｅｐｔＡなどの細菌の抗体、テオフイリンやジオキシン等の薬物、ＨＣＧ・ＬＨ等のホルモンなど色々な測定項目の試験紙片が出来るのでそれぞれの定量が簡単に出来る。
実施例４
試験紙片の標識抗体にブルーラテックスを使用した場合、照射すべき発光素子の最大中心波長を６３０ｎｍにすることで実施例１および２と同様に定量が出来た。
実施例５
実施例１は発光素子（５）を２個を使用した例であるが、発光素子は３個でも４個でも選択できる。
またレンズ（１）とＣＣＤカメラ素子（３）およびレンズと試験紙片上の距離は、実施例ではそれぞれ２ｆとしているが、ＣＣＤカメラ素子（３）の受光面に像が結べる状態であれば、これらの値を変える事は容易である。
また光学系の構成上、反射光を直接またはレンズやスリットを通しＣＣＤカメラ素子に像を結ぶ方法も採用可能である。またその過程に反射鏡を設置して像を結ぶ構成も同じ結果が得られる。
実施例６
実施例１、２には被検検体として血清や尿試料となっているが、全血試料を使用する方法も既にこの分野では論文などで知れ渡っている。それはいくつかのグラスフイルターおよびポリカーボネイトフイルターなどを組み合わせして多層フイルターとすることで、血球等の固形成分を溶血させず血清または血漿成分に区分出来る方法はドライケミストリー（下記参考資料）などの技術で明らかになっている。
参考資料：（川浪武美、田中哲男、大畑  淳、朝原卓二、宮坂勝之：Ｏｐｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ検査室でのドライケミストリー法の使用経験および試験紙法との比較検討、ＩＣＵとＣＣＵ、Ｖｏｌ１、Ｎｏ５、４６７〜４７３、１９８７
これらの技術を使用し検体試料として全血を、本試験紙片免疫学的クロマトグラフ法に適用することは、容易である。
実施例７
実施例１の光学系の発光素子の照射角度は６０度であったが、その角度は４０度でも６５度でも構わない。また発光素子と試験紙片の距離は実施例１に係わらず発光強度で決まるのでそれぞれ任意に選択出来る。また光源を光ファイバーなどのライトガイドを用いて照射することも出来る。
実施例８
実施例１では試験紙片１個の測定例を示しているが、試験紙片の測定部分に多数の試験紙片を自動的に交換する機構を取りつける事で、一度に多数の試験紙片の検査が出来る。その実施例を図８に示す。ここでは本発明の測定装置（２０）の試験紙片の設置部分（２１）に多検体自動搬送モジュール（２２）を設置した。
産業上の利用可能性
本発明の免疫学的クロマトグラフ試験紙片の読み取り定量装置は、近年定性試験用として常用されていた可視担体を用いる免疫学的クロマトグラフ法が、定量用に使用出きるようになった。従来、自動の免疫学的測定法は大型な装置であり、その操作も複雑であり価格も高く大学病院や大病院で主に使われていた。本発明では、小型で簡単な操作でかつ安価なため開業医や病院のベットサイドで簡単に測定出来るようになった。
さらに、全血でも測定できる事から、開業医の外来や緊急時のベットサイド検査として緊急測定項目や癌関連物質などが手軽に安価に測定出来るようになる。ベットサイド検査が出来ると言う事は、今まで開業医などで診察を受けても、尿検査や血液検査の検査結果は、その診察時には分からず、次の診察時しか診療に反映出来なかった。本発明の結果の活用で、診療の正確性を高めるほか再来院の回数を減らしかつ余分な検査を少なくする事で医療保険の赤字を減少させるなどの効果がある。
測定機器の点から言えば、標識抗体そのものが可視なので、クロマト展開させ本願発明の定量装置にかけるだけで定量出来る。酵素標識抗体を使うＥＬＩＳＡ法より反応系が１ないし２工程少なくなり、装置としての構造が簡単になり結果的に手の掌に載る程度の超小型で安価な装置の提供が出来るようになった。
【図面の簡単な説明】
図１  従来の読み取り波形
図２  本発明の読み取り波形
図３  光学系
図４  波形
図５  試験紙片（１項目の定量）
図６  試験紙片（２項目の定量）
図７  装置の構成図
図８  多検体搬送図
符号の説明
１  レンズ
２  試験紙片
３  受光素子（ＣＣＤカメラ素子）
４  反応ライン
５  発光素子
６  反応ラインの間隔
７  発光素子の間隔
８  カードリーダ
９  演算素子（ＣＰＵ）
１０プリンター
１１試験紙片上の区分Ａ
１２試験紙片上の区分Ｃ
１３試験紙片上の区分Ｂ
１４試験紙片上の区分Ｄ
１５試験紙片上の区分Ａ
１６試験紙片上の区分Ｂ
１７試験紙片上の区分Ｃ
１８試験紙片上の区分Ｄ
１９試験紙片上の区分Ｅ
２０測定装置
２１試験紙片の設置部分
２２多検体自動搬送モジュール
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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