(57)【要約】本発明は、室温流通が可能であって粘度が低く注入しやすく、且つ長期に亘って関節腔内に滞留し鎮痛効果を示すような実用的なヒアルロン酸製剤に適した安全なヒアルロン酸ベースの素材を提供する。より具体的には、本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ、ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ、ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ、ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ、ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ及びＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡから選択されるブロックポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物を提供する。本発明のヒアルロン酸修飾物は、室温流通が可能であり且つ粘度が低く取り扱いやすいにもかかわらず、生体内に注入後その粘弾性を急増させることが可能であり、今までにない実用的なヒアルロン酸製剤の主成分として、関節疾患の処置、外科手術の補助、組織の修復等に非常に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー及びポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマーから選択されるブロックポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物。
【請求項２】
前記ブロックポリマーが、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー又はポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマーである請求項１記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項３】
前記ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に結合している請求項１又は２に記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項４】
前記ブロックポリマーが、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に結合している請求項１又は２に記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項５】
前記ブロックポリマーが、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル基に結合している請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項６】
生理食塩水中及び／又はリン酸生理食塩水中における前記ヒアルロン酸修飾物の相転移温度が、前記ヒアルロン酸修飾物１０．０％ｗ／ｖ以下の濃度で、２０℃以上３５℃以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項７】
前記ブロックポリマーの重量平均分子量が１２００ダルトン以上であることあることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項８】
前記ブロックポリマーの、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩への導入率が、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩中のグルクロン酸当たり８モル％以上であることあることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項９】
前記ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が１５０万ダルトン以下であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物を主成分とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患の処置製剤。
【請求項１２】
前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である請求項１１記載の関節疾患の処置製剤。
【請求項１３】
注射用製剤である請求項１１又は１２に記載の関節疾患の処置製剤。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物の有効量を患者に投与することを含む、関節疾患の処置方法。
【請求項１５】
前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である請求項１４記載の関節疾患の処置方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤。
【請求項１７】
前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である請求項１６に記載の外科手術補助又は処置剤。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む外科手術方法。
【請求項１９】
前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である請求項１８に記載の外科手術方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物を主成分とする組織修復剤。
【請求項２１】
柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Ｍｏｈｓ’）化学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復することに用いられる請求項２０に記載の組織修復剤。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む組織修復方法。
【請求項２３】
柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Ｍｏｈｓ’）化学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復する請求項２２に記載の外科手術方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なヒアルロン酸修飾物、それを主成分とする関節疾患の処置製剤、及びそれを用いた関節疾患の処置方法に関する。また、本発明は、そのヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術用補助剤又は処置剤、及びそれを用いた外科手術方法にも関する。さらに、本発明は、そのヒアルロン酸修飾物を主成分とする組織修復剤、及びそれを用いた組織修復方法にも関する。
背景技術
これまでの約４０年間、多くの関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症等の関節疾患処置方法が提案されてきた。現在、自家細胞移植による関節軟骨再生法も試みられているが、数度の手術を必要とし、簡便さに欠け、患者の負担が大きい。人工関節を用いる場合においては、生体適合性や耐久性の問題がある。これらの問題を解決する薬物による治療方法が長らく望まれている。
こうした状況の中、現在、医療の現場において、ヒアルロン酸を関節腔内に直接注入する治療法が広く用いられている（例えば、アルツ（商品名）、製造  生化学工業株式会社、販売  科研製薬株式会社）。ヒアルロン酸は関節液の主成分の１つであり、その粘弾性効果や炎症抑制効果により関節において鎮痛効果を発揮する。一般に、変形性関節症、慢性関節リウマチ等の関節症患者の関節液中において、ヒアルロン酸濃度、分子量が正常関節液に対し低下していることが知られており、このことが関節液の潤滑作用、ショックアブソーバー作用の低下に起因する疼痛症状の発生につながると考えられている。唯、ヒアルロン酸の関節腔内からのクリアランスは早く、その滞留時間を延長する目的で高分子量（１９０万ダルトン程度）のヒアルロン酸を用いる事も試みられている（スベニール（商品名）：製造  アベンティスファーマ株式会社、販売  中外製薬株式会社）が、高分子量であるが故に低温流通が必要であり、また高粘度であるため注入圧が高くなる傾向がある。関節腔内における貯留は、５日間程度（薬理と治療、２２（Ｓ−３）、Ｓ７７９（１９９４））、鎮痛効果の持続も１週間程度であり、患者のコンプライアンス低減のためにも更なる効果の持続が求められている。
一方、部分的に化学的な架橋を架ける事で滞留時間を延長することも試みられている（例えば、Ｓｙｎｖｉｓｋ（商品名）、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ社（日本公開特許公報  特開平４−２６１６６４号（米国特許第５３９９３５１号、欧州特許第４６６３００号）；Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商品名）、Ｑ−ＭＥＤ社（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，  ２４，  １３１７−１３２５（１９９８））等）が、架橋剤による炎症誘発等の問題が懸念される。また、ヒアルロン酸間の水素結合等による物理架橋を利用したゲル素材の報告も有るが（国際公開公報  ＷＯ００／２７４０５号）、水溶液にすると架橋の崩壊が始まるため、現在用いられているヒアルロン酸製剤のような取り扱いやすい液剤（注射剤）での流通は難しい。
一方、温度応答性高分子として、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酸化物等が知られている。生体に安全性の高い温度応答性高分子としては、医薬品に用いる素材として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可されているポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ：商品名  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）が知られている（認可グレードはＦ６８及びＦ１２７）。また、その類似のポリマーとしてポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ：商品名  ＰｌｕｒｏｎｉｃＲ）が知られている。これらポリマー単独でも温度を上昇させることで粘度上昇、ゲル化することが報告されている（Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，  ３１，  １９７−２２１（１９９８））が、そのためには１６％ｗ／ｖ以上という高濃度が必要であり、安全性、薬物担持率の上で不利である。
また、疎水部にＰＰＯの代わりにポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体を用いた、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ：商品名  Ｒｅｇｅｌ）又はポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ：商品名  Ｒｅｇｅｌ）、或いは、疎水部にＰＰＯの代わりにポリ乳酸重合体を用いた、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ）又はポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡ）も同様の温度応答性機能を持つことが知られている（国際公開公報  ＷＯ９９／１８１４２号）。
また、このような温度応答性高分子と親水性高分子を組み合わせた、一般的な熱可逆性ハイドロゲル材料の報告も有る（日本公開特許公報  特開平５−２６２８８２号、特開平９−２２７３２９号、特開平１１−１６９７０３号、国際公開公報  ＷＯ９５／１５１５２号）が、ヒアルロン酸とＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ、ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ、ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ、ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ、ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ又はＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡを組み合わせた例は示されておらず、更にこれらは外用剤・香粧品等を目的としたもので、関節腔内等の体内への注入を目的としたものでもない。ポリアクリル酸とＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯをグラフトした温度応答性高分子（国際公開公報  ＷＯ９７／２４４３０号（米国特許第５７０９８１５号）、ヒアルロン酸にポリＮ−イソプロピルアクリルアミドをグラフトした高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌ．，  ２，  ８５６−８６３（２００１））も報告されているが、ポリアクリル酸、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドは、変異原性のあるモノマーの残存等、安全性に問題がある。また、ヒアルロン酸とＰｌｕｒｏｎｉｃを結合させた素材（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｖｏｌ．８０，Ｉｓｓｕｅｓ１−３，ｐ６９−７７（２００２年４月２３日））についても報告されているが、その素材自身の医薬用途については開示も示唆もされていない。なおこの文献に記載の素材の分子量は１２６００であるため、生体排泄しにくいものであり、医薬用途には不適当である。
上述した如く、室温流通が可能であって粘度が低く注入しやすく、且つ長期に亘って関節腔内に滞留し鎮痛効果を示すような実用的なヒアルロン酸製剤に適した安全なヒアルロン酸ベースの素材は現在のところ存在していない。
また、ヒアルロン酸製剤は眼科手術の補助剤等の用途（商品名：Ｈｅａｌｏｎ）、組織修復剤としての用途等も知られているが、室温流通が可能であって粘度が低く注入しやすく、手術中に適度な粘度を有する外科手術用補助剤または処置剤は未だ知られていない。
発明の開示
本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー及びポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマーから選択されるブロックポリマーを結合させることにより上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー及びポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマーから選択されるブロックポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物に関する。
また、本発明は、前記ブロックポリマーが、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー又はポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマーである前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
また、本発明は前記ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に結合している前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
また、本発明は、前記ブロックポリマーが、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に結合している前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
また、本発明は、前記ブロックポリマーが、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル基に結合している前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
また、本発明は、生理食塩水中及び／又はリン酸生理食塩水中における前記ヒアルロン酸修飾物の相転移温度が、前記ヒアルロン酸修飾物１０．０％ｗ／ｖ以下の濃度で、２０℃以上３５℃以下であることを特徴とする前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
また、本発明は、前記ブロックポリマーの重量平均分子量が１２００ダルトン以上であることあることを特徴とする前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
また、本発明は、前記ブロックポリマーの、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩への導入率が、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩中のグルクロン酸当たり８モル％以上であることあることを特徴とする前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
また、本発明は、前記ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が１５０万ダルトン以下であることを特徴とする前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。
さらに、本発明は、ヒアルロン酸修飾物を主成分とする医薬組成物にも関する。
また、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患の処置製剤にも関する。
また、本発明は、前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患の処置製剤にも関する。
また、本発明は、注射用製剤である前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患処置製剤にも関する。
また、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物の有効量を患者に投与することからなる、関節疾患の処置方法にも関する。
さらに、本発明は、前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である、前記ヒアルロン酸修飾物の有効量を患者に投与することからなる、関節疾患の処置方法にも関する。
更に、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤にも関する。
また、本発明は、前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤にも関する。
また、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む外科手術方法にも関する。
また、本発明は、前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である、前記ヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む外科手術方法にも関する。
さらに、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする組織修復剤にも関する。
また、本発明は、柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Ｍｏｈｓ’）化学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復することに用いられる、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする組織修復剤にも関する。
さらに、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む組織修復方法にも関する。
また、本発明は、柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Ｍｏｈｓ’）化学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復する、前記ヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む組織修復方法にも関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明のヒアルロン酸修飾物は、ヒアルロン酸（ＨＡとも略す）及び／又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー又はポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマーから選択されるブロックポリマーとが結合したものである。ここで、ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖で、次のような基本構造を有する。
2003087019.tif 000002
（式中、ｎは、特に限定されないが、例えば、１００〜１０，０００の整数である）
本発明のヒアルロン酸修飾物は、生体内（例えば関節腔内等）に注入した際、体温で相転移し、相転移に伴う疎水結合による物理的架橋によってその粘弾性を急増させる。即ち、本発明のヒアルロン酸修飾物は、相転移温度以下においては、架橋のかかったゲル状態ではなく流動性のあるゾル状態である。
この目的のために、本発明のヒアルロン酸修飾物においては、前記ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に結合していることが望ましい。尚、ここで「ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と結合している」とは、通常雰囲気下・２０℃以下の状態において、得られたヒアルロン酸修飾物の流動性が保たれている（得られたヒアルロン酸修飾物がゾル状態である）結合状態を指す。更に、原料のヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と得られたヒアルロン酸修飾物とを比較した際、その粘度に顕著な差が見られない結合状態であることが好ましい。また、前掲の「大部分」とは、前述の結合状態を満足する割合であれば特に限定されないが、具体的には、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と結合しているブロックポリマーの量が、結合している全ブロックポリマーの量に対して７０％ｗ／ｗ以上である状態を指し、好ましくは８５％ｗ／ｗ以上である状態を指し、特に好ましくは９５％ｗ／ｗ以上である状態を指す。尚、何れの場合においても、ブロックポリマーの両末端がヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に導入されている率は、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩中のグルクロン酸当たり５モル％以下であり、好ましくは３モル％以下であり、特に好ましくは１モル％以下である。当然のことながら、本発明ヒアルロン酸修飾物は、前記ブロックポリマーが、その片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に結合しているヒアルロン酸修飾物のみで構成されていてもよい。
片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と結合しているブロックポリマーの量の結合している全ブロックポリマーの量に対する率、並びにブロックポリマーの両末端がヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に導入されている率を定量する方法としては、プロトンＮＭＲで得られるブロックポリマーの導入量と、ブロックポリマーを結合させる前段階におけるヒドラジド化もしくはアミノ化されたヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩中の、ヒドラジド（ＨＺ）基又はアミノ基の実際の減少量との比較から求めることができる。例えばブロックポリマーを結合させる前段階においてヒドラジド化されたヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩を用いる場合、アジピン酸ジヒドラジドでヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）のプロトンＮＭＲから得られるフリーなヒドラジド基由来のピーク（２．２〜２．３ｐｐｍ）は、ブロックポリマーの導入率に比例して減少するはずであるから、このピークとヒアルロン酸由来のピーク（２．１ｐｐｍ）の比を実測する（Ｘ）。一方で、ブロックポリマーの導入が１００％片末端であると仮定して、ブロックポリマー導入率から比例的に計算されるフリーなヒドラジド基由来のピークの、ヒアルロン酸由来のピークに対する比を計算する（Ｙ）。この実測値の比が理論値の比より小さくなった割合が両末端で結合したブロックポリマーの割合になる。グルクロン酸に対するブロックポリマーの導入率をＺ％、ＨＡ−ＨＺのヒドラジド基導入率をＨ％とすると、片末端のみでヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と結合しているブロックポリマーの量の結合している全ブロックポリマーの量に対する率（％）は、（１−（Ｈ−Ｚ）／Ｚ（１−Ｘ／Ｙ））×１００で表される。また同様に両末端がヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩に導入されている率（％）は、グルクロン酸当たり、（Ｈ−Ｚ）×（１−Ｘ／Ｙ）で表される。
また、生理食塩水中及び／又はリン酸生理食塩水中における本発明のヒアルロン酸修飾物の相転移温度が、本発明のヒアルロン酸修飾物１０．０％ｗ／ｖ以下の濃度で、２０℃以上３５℃以下であることが望ましい。尚、ここでいう相転移温度とは、ヒアルロン酸修飾物の粘度の温度変化をコーン−プレート型粘度計等の粘度計で測定した際、粘度の変化がその最大変化量の１０％に達した温度をいう。従ってこの相転移は、本発明の目的に合致する範囲で、所謂ゾル−ゲル転移であってもよいし、ゾル状態からより粘度の高いゾル状態への転移であってもよい。
本発明に用いられるヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩は、粘度を注入しやすい程度に抑え、且つ室温流通を可能とするため、重量平均分子量で１５０万ダルトン以下であるものを用いることが好ましい。重量平均分子量の下限値については特に限定されないが、重量平均分子量が下がるに伴い、温度上昇に伴う粘度上昇を達成する為により高いヒアルロン酸濃度が必要となってくるため、１万ダルトン以上であることが好ましい。ここで、ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の測定方法については、光散乱法等、各種の公知の方法を利用することができる。尚、このようなヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、或いは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社等から）入手することも可能である。
また、ここでヒアルロン酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができる。この中で、特に好ましい塩は、医薬品として繁用されているナトリウム塩である。
本発明に用いられるポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ）、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ）及びポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡ）から選択されるブロックポリマーは、前述した如く本発明のヒアルロン酸修飾物の相転移温度が２０℃以上３５℃以下となるように、１．０％ｗ／ｖの生理食塩水中及び／又は１．０％ｗ／ｖのリン酸生理食塩水中におけるそれらポリマーの低温臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を調整したものを用いる。具体的には、１．０％ｗ／ｖの生理食塩水中及び／又は１．０％ｗ／ｖのリン酸生理食塩水中（好ましくは１．０％ｗ／ｖのリン酸生理食塩水中）において、前記ブロックポリマーのＬＣＳＴが１５℃以上４０℃以下であるものを用いればよい。ここでいうＬＣＳＴとは、前記の溶液中に溶解させたブロックポリマーの５００ｎｍにおける吸光度を温度変化させながら測定した際、その吸光度変化が最大変化量の１０％に達した温度をいう。また、上記相転移温度の範囲内で異なるＬＣＳＴを持つ複数の前記ブロックポリマーを組み合わせて使用してもよいが、好ましくは１種のブロックポリマーを使用するのがよい。
本発明に用いられるポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ）、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ）及びポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡ）から選択されるブロックポリマーは、これに限定されるものではないが、一般的には次のような基本構造を有する。
（１）ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯトリブロックポリマー
2003087019.tif 000003
（２）ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯトリブロックポリマー
2003087019.tif 000004
（３）ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯトリブロックポリマー又はＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯトリブロックポリマー
2003087019.tif 000005
（４）ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡトリブロックポリマー又はＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡトリブロックポリマー
2003087019.tif 000006
ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯトリブロックポリマー及びＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯトリブロックポリマーにおいては、疎水性のＰＰＯブロックと親水性のＰＥＯブロックの比率は、これに限定されないが、例えば、９０〜１０％ｗ／ｗ：１０〜９０％ｗ／ｗが好ましい。ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯトリブロックポリマー、ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡトリブロックポリマー、ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯトリブロックポリマー及びＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡトリブロックポリマーにおいて、疎水性のＰＬＧＡ又はＰＬＡブロックと親水性のＰＥＯブロックの比率は、これに限定されないが、例えば、５１〜８３％ｗ／ｗ：１７〜４９％ｗ／ｗが好ましい。また、ＰＬＧＡ又はＰＬＡブロックにおいて、ラクテート含量は、好ましくは３０〜１００モル％、より好ましくは５０〜１００モル％であり、グリコレート含量は、好ましくは０〜７０％、より好ましくは０〜５０％である。
また、本発明のヒアルロン酸修飾物が充分な架橋強度を発現できるためには、前記ブロックポリマーの重量平均分子量は１２００ダルトン以上であることが好ましい。さらに、生分解後の体内からの排泄性を考慮すると、ブロックポリマーとしてＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ又はＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯを用いる場合は、その重量平均分子量は１２００ダルトン以上１万ダルトン以下であることがより好ましい。ブロックポリマーとしてＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ、ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ、ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ又はＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡを用いる場合は、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ自体は生分解性であるので、ＰＥＯ成分の重量平均分子量が１万ダルトン以下であることがより好ましい。尚、ここでいうＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ、ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ、ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ又はＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡ、或いはＰＥＯの重量平均分子量とは、ポリエチレンオキサイドを標準物質に用い、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）で測定した際の重量平均分子量をいう。
尚、このようなＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯは商品名  Ｐｌｕｒｏｎｉｃとして、またＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは商品名  ＰｌｕｒｏｎｉｃＲとしてそれぞれ市販されており、例えばＢＡＳＦ武田ビタミン株式会社、旭電化工業株式会社等から入手することが可能である。それらの合成方法は、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ＳｕｒｆａｃｅｓＡ、９６、１−４６（１９９５）等に記載されている。また、ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ及びＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡは商品名  Ｒｅｇｅｌとして市販されており、例えばＭａｃｒｏＭｅｄ社、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社等から入手することが可能である。それらの合成方法は、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．、６１、１８８−１９６（２００２）、ＷＯ９９／１８１４２号公報等に記載されている。
ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩にブロックポリマーを結合させる方法としては特に制限されないが、例えば、ヒドラジド化（国際公開公報  ＷＯ９５／１５１６８号（米国特許第５６１６５６８号、米国特許第５６５２３４７号、米国特許第５８７４４１７号）等）或いはジアミン化合物をカルボジイミド等のカップリング剤で結合、アミノ化したヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と片末端の水酸基を、４−ニトロフェニルクロロフォルメイト化（国際公開公報  ＷＯ９５／２４４３０（米国特許第６４８６２１３号））或いはジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドからなる架橋剤をＤＭＳＯ中でピリジン等の塩基性有機溶媒下で反応させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド化した前記ブロックポリマーを反応させる方法、或いは、４−ニトロフェニルクロロフォルメイト化した後ジアミン、あるいはジヒドラジドと反応させ、アミノ基あるいはヒドラジド基を片末端に修飾した前記ブロックポリマーとヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル基をカルボジイミド等のカップリング剤を用いて結合させる方法等が挙げられる。
なお、参考のために示すと、上記ヒアルロン酸又はその塩とブロックポリマーの片末端の水酸基との結合は、次のスキーム（１）〜（４）のように模示することができる。但し、これはポリマー同士の反応を説明のために単に摸示したに過ぎず、本発明の結合方法はこれに何ら制限されるものではない。例えば、下記スキーム中、ヒアルロン酸を、ＨＡ−ＣＯＯＨとして示したが、ヒアルロン酸中のカルボキシ基は基本構造の繰返し単位の数（前記ｎ）だけ存在する。
スキーム（１）
2003087019.tif 000007
（式中、ＨＡ−ＣＯＯＨはヒアルロン酸を示し；そして、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２はジヒドラジドまたはジアミンを示す〔Ｒ＝ＮＨ−ＣＯ−Ａ−ＣＯ−ＮＨの場合にジヒドラジド〕）
スキーム（２）
2003087019.tif 000008
（式中、ＨＯ−ＴＢＰ−ＯＨは前記の各種トリブロックポリマーを示し；Ｐｈはフェニルを示し；Ｈ２Ｎ−Ｒ″−ＮＨ２はジヒドラジドまたはジアミンを示す
〔Ｒ″＝ＮＨ−ＣＯ−Ａ−ＣＯ−ＮＨの場合にジヒドラジド〕；そして、その他の略号は上記と同様である。）
スキーム（３）
2003087019.tif 000009
（式中、略号は上記と同様である。）
スキーム（４）
2003087019.tif 000010
（式中、略号は上記と同様である。）
上記スキームに示した反応の反応条件は、国際公開公報  ＷＯ９５／１５１６８号、国際公開公報  ＷＯ９５／２４４３０等の記載を参照して決定することができる。例えば、スキーム（１）では、ヒアルロン酸（１）を、ジヒドラジド（２）とジシクロヘキシルカルボジイミド、ジメチルアミノプロピルカルボジイミドなどのジカルボジイミドの存在下反応させ、末端アミノ化ヒアルロン酸（３）を得る。通常、この反応は、水及び／又は水溶性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール類、ジオール類）中、０〜１００℃、好ましくは１０℃〜４０℃の温度で、０．５〜４８時間行う。スキーム（２）では、トリブロックポリマー（４）と４−ニトロフェニルクロロホルメート（５）を、塩化メチルなどのハロゲン化炭化水素溶媒中、トリエチルアミン等の塩基の存在下、０〜４０℃で０．５〜２４時間反応させて４−ニトロフェニルホルメート化トリブロックポリマー（６）を得る。この化合物（６）は、末端アミノ化ヒアルロン酸（３）と、水及び／又は水溶性溶媒中で、０℃〜４０℃で、０．５〜４８時間反応させて、目的とするトリブロックポリマー結合ヒアルロン酸（９）を得る。一方、化合物（６）とジアミン（７）とを、ハロゲン化炭化水素溶媒中、０〜４０℃で、０．５〜４８時間反応させて末端アミノ化トリブロックポリマー（８）を得る。この化合物（８）を、ヒアルロン酸（１）と反応させて、目的とするトリブロックポリマー結合ヒアルロン酸（１２）を得る（スキーム（４））。なお、スキーム（３）では、トリブロックポリマー（４）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１０）とを反応させて、ＮＨＳ活性化トリブロックポリマー（１１）を得、これを末端アミノ化ヒアルロン酸（３）と反応させて、目的とするトリブロックポリマー結合ヒアルロン酸（１２）を得る。なお、上記反応において、ブロックポリマーのうち、大部分が片末端の水酸基のみに活性化官能基が導入されたブロックポリマーを得ることは、各原料の仕込量を調整することによって、容易に行うことができる。例えば、活性化官能基の反応時の仕込み量をブロックポリマーの末端官能基と等モル以下として反応させれば、片末端のみ活性化されたブロックポリマーを主成分として得ることができる。さらに、活性化官能基の反応時の仕込み量を減らせば、活性化されていないブロックポリマーの割合は増すが、片末端のみが活性化されたブロックポリマーの割合も増す。
本発明において使用されるジアミン、ジヒドラジドは特に限定されないが、例えばジアミンとしては、ジアミノエタン、ジアミノプロパン、等のジアミノアルカン類、Ｎ−リジル−ジアミノエタン、Ｎ，Ｎ’−ジリジル−ジアミノエタン等のモノ、またはジ（リジル）ジアミノアルカン類、アミノ基を２つ以上もつペプチド等が挙げられる。ジヒドラジドとしては、コハク酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドリジド、スベリック酸ジヒドラジド、オキサリック酸ジヒドラジド、マロニック酸ジヒドラジド等が挙げられる。ＰＬＧＡやＰＰＯ等の疎水部を末端に持つものは水中でのヒアルロン酸もしくはその誘導体へのグラフト反応性が低くなるため、ヒアルロン酸もしくはその誘導体をトリブチルアンモニウム塩にすることでＤＭＳＯ等の極性有機溶媒に可溶とし、極性有機溶媒中で上記の反応を行うと良い。また、上記においてヒドラジド化を経由する場合は、本発明のヒアルロン酸修飾物中に残存する未反応のヒドラジド基を無水コハク酸等と反応させ、フリーのヒドラジド基をなくしておくことが生体への適用上好ましい。
前記ブロックポリマーのヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩への導入率については、相転移に伴う充分な粘度の変化を得る為、ヒアルロン酸中のグルクロン酸当たり、８モル％以上であることが好ましい。尚、前記ブロックポリマーのヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩への導入率はプロトンＮＭＲ法で、ヒアルロン酸由来のプロトン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ）と前記ブロックポリマー由来のプロトンの面積比から算出すればよい。
このようにして得られた本発明のヒアルロン酸修飾物は、高分子量のヒアルロン酸を用いていないため、室温流通が可能である。また、相転移温度を２０℃以上３５℃以下に調整することにより、室温においては粘度が低く取り扱いやすい（注射等により注入しやすい）一方、生体内（例えば関節腔内）に注入した際、相転移温度まで温められることによって粘弾性が急増する。
本発明のヒアルロン酸修飾物は、生体内（例えば関節腔内）に注入した際、長期に亘って生体内に滞留することが好ましい。ここでいう長期とは、従来のヒアルロン酸製剤では達成できなかった期間、即ち１週間以上をいい、好ましくは２週間以上である。尚、このような生体内（例えば関節腔内）における滞留期間を測定するには、例えば、放射性ラベル化して標識化したヒアルロン酸を用いる方法（薬理と治療、２２、３２５−３５０、１９９４）、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光ラベル化して標識化したヒアルロン酸を用いる方法等の従来のヒアルロン酸製剤で試みられている方法、或いは、ヒアルロニダーゼでヒアルロン酸部分を分解し、前記ブロックポリマーをＧＰＣで定量する方法、あるいは、投与後の関節幅の経時的減少を直接測定する方法等を用いて測定すればよい。
上述したように、本発明のヒアルロン酸修飾物は、室温流通が可能であって粘度が低く注入しやすく、且つ長期（２週間以上）に渡って関節腔内に滞留可能であり、また高い安全性が予想されるため、今までにない実用的なヒアルロン酸製剤の主成分として、関節疾患の処置に非常に有用である。
尚、ここでいう「関節疾患」とは、関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症、肩関節周囲炎等の疾患をいう。「処置」とは、前記関節疾患の治療、予防、病態の進展抑制（悪化の防止や現状維持）等のための処置をいう。
また、本発明のヒアルロン酸修飾物は、上述したような特性を利用して、外科手術に用いる補助又は処置剤、薬物徐放用担体、再生医療、組織工学に用いられる細胞増殖用マトリックスなどへの応用も可能である。例えば、本発明のヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤は、例えば、眼科手術または内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）に用いることができる（ＷＯ０２／０５６９１４号公報等参照）。さらに、本発明のヒアルロン酸修飾物は、柔組織の損傷を強化し修復する用途にも応用することができる（特開平１０−３２４７０１号公報参照）。例えば、本発明のヒアルロン酸修飾物は、柔組織の損傷たとえばざ瘡の傷跡、外科手術後の萎縮性不整、モース（Ｍｏｈｓ’）化学外科損傷、口びるおよび老令のしわの裂傷傷跡のような損傷、あるいはしわ自体を修復するのに安全に使用することができる。
本発明のヒアルロン酸修飾物は、その有効量に、適宜、製薬上許容しうる担体、賦型剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、香料、着色剤を加えて医薬組成物として用いることができる。本発明の医薬組成物は、例えば、注射剤、溶液剤、経皮吸収剤、軟膏、ローション、カプセル剤等に製剤化することができる。製剤中のヒアルロン酸修飾物の含有量は、例えば、製剤全体に対して、０．０１〜９９．９％ｗ／ｗ、好ましくは、０．１〜７０％ｗ／ｗである。
本発明のヒアルロン酸修飾物を関節疾患処置製剤あるいは外科手術補助又は処置剤として製剤化するに際しては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水やリン酸生理食塩水等に所望の濃度に溶解させ、注射用製剤として製剤化することができる。この際、必要に応じて、酸又は塩基を加えることにより、溶液を所望のｐＨに調製してもよい。また、ナトリウム塩、カリウム塩等の１価の金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩等の２価の金属塩等の無機塩等を加えることにより、溶液を所望の塩濃度に調製してもよい。更に、所望に応じて、安定化剤等が加えられていてもよい。このようにして調製された、本発明のヒアルロン酸修飾物を溶解させた溶液を、ディスポーザブル注射筒等の注射器に予め充填させた形で流通させてもよい。
本発明のヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患処置製剤を注射用製剤として投与するに際しては、本発明のヒアルロン酸修飾物が０．０１％〜５０％ｗ／ｖの溶液濃度、好ましくは０．０５％〜２０％ｗ／ｖの溶液濃度、特に好ましくは０．５％〜１０％ｗ／ｖの溶液濃度のものを、１回あたり１〜３ｍＬを患者に投与すればよい。但し、この投与量は、医師の指示、対象となる患者、又は疾患や疾患の重篤度、或いは原料となるヒアルロン酸の分子量等により、それぞれ最適な投与量に適宜増減してもよい。
本発明のヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤を注射剤として用いる場合は、本発明のヒアルロン酸修飾物が０．０１％〜５０％ｗ／ｖの溶液濃度、好ましくは０．０５％〜２０％ｗ／ｖの溶液濃度、特に好ましくは０．５％〜１０％ｗ／ｖの溶液濃度のものを、必要量手術の対象部位に適用すればよい。例えば、このような製剤を、径が２０〜２２Ｇで、注射針のチューブの有効長が１０００〜２５００ｍｍの注射針を有する内視鏡用注射針を用いて、手術の対象部位に適用し、胃や腸などの粘膜組織の切除に利用することができる。例えば、ポリープや癌などの切除予定の粘膜下層に、内視鏡用注射針を介して上記製剤を注入して切除予定部位を隆起させ、その隆起部分をスネアやニードルナイル等で切除する。なお、上記製剤を眼科手術補助剤として用いる場合は、例えば、白内障手術において、上記製剤を、手術スペース（前房深度と呼ばれる）の維持や角膜内皮などを物理的侵襲から保護するために注入する。例えば、混濁した水晶体核を除去したのち、上記製剤を注入することにより、前房深度を十分に維持しつつ、眼内レンズを挿入することができる。
なお、本発明の組織修復剤は、例えば、上記のような組成を有する注射用製剤、溶液剤、経皮吸収剤、軟膏又はローションのような製剤として組織の修復が必要な部位に適用することができる。
実  施  例
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実施例においては、ＮＭＲスペクトルは核磁気共鳴装置  ＪＮＭ−ＥＣＡ５００（日本電子株式会社製）を用いて測定した。
〔実施例１〕
（実施例１−１）
（１）ニトロフェニルフォルメイト化したＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ（ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣ）の合成
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−６２Ｄ（商品名）（分子量２３６０ダルトン、ＬＣＳＴ２８℃、ＢＡＳＦ武田ビタミン株式会社製）８ｍｍｏｌ、４−Ｎ−ニトロフェニルクロロフォルメイト（東京化成株式会社製）１０ｍｍｏｌを１００ｍＬの塩化メチレン（Ｓｉｇｍａ社）に溶かし、１０ｍｍｏｌのトリエチルアミンを加え室温で１２時間反応させた後、エーテルで洗浄後エバポレータで濃縮し、ニトロフェニルフォルメイト化したＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ（ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣ）１７．２ｇを得た。
（２）ヒドラジド（ＨＺ）基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
分子量５．８×１０５ダルトンのヒアルロン酸（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）１００ｍｇを０．２５％濃度で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調製した。１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：５：４０モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド（ＨＺ）基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）８５ｍｇを得た。
得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の６８％がＨＺ化されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、ＨＺ：Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ、１．７ｐｐｍ、２．４ｐｐｍ）。
（３）ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成
前記（２）で得られたＨＡ−ＨＺ  １０ｍｇを１０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ＰＢ、ｐＨ８．０）に溶かし、同じく前記（１）で得られたＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣを、ＨＺ：ＮＰＣ＝１：２０モル比になるよう添加し、４℃で１日間反応させた。ｐＨを１１にして過剰のＮＰＣを加水分解した後、４℃で水に対して透析（スペクトラポア７、ＭＷＣＯ：３００ｋダルトン）することで精製、エバポレーションで濃縮した。標題のヒアルロン酸にポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）を結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。
得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の１３モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
また、このヒアルロン酸修飾物の４％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でゲル化した。
（実施例１−２）
（１）ＨＺが導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
分子量１．９×１０５ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）１００ｍｇを０．５％濃度で蒸留水に溶解したほかは前述の実施例１−１の（２）と同様の方法で、標題のＨＺが導入されたＨＡ（ＨＡ−ＨＺ）８３ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の６４％がＨＺ化されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、ＨＺ：Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ、１．７ｐｐｍ、２．４ｐｐｍ）。
（２）ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成
前記（１）で得られたＨＡ−ＨＺ  １０ｍｇを１０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ＰＢ、ｐＨ８．０）に溶かし、実施例１−１の（１）と同様の方法で得られたＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣを、ＨＺ：ＮＰＣ＝１：２０モル比になるよう添加し、４℃で１日間反応させた。ｐＨを１１にして過剰のＮＰＣを加水分解させた後、４℃で水に対して透析（スペクトラポア７、ＭＷＣＯ：３００ｋダルトン）することで精製、エバポレーションで濃縮した。標題のヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。
得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の３０モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
また、このヒアルロン酸修飾物の６％ｖ／ｖ酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でゲル化した。
（実施例１−３）
（１）ＨＺが導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
分子量２．５×１０４ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）１００ｍｇを１％濃度で蒸留水に溶解したほかは前述の実施例１−１の（２）と同様の方法で、標題のＨＺが導入されたＨＡ（ＨＡ−ＨＺ）８８ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の６５％がＨＺ化されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、ＨＺ：Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ、１．７ｐｐｍ、２．４ｐｐｍ）。
（２）ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成
前記（１）で得られたＨＡ−ＨＺ  １０ｍｇを１０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ＰＢ、ｐＨ８．０）に溶かし、実施例１−１の（１）と同様の方法で得られたＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣを、ＨＺ：ＮＰＣ＝１：２０モル比になるよう添加し、４℃で１日間反応させた。ｐＨを１１にして過剰のＮＰＣを加水分解させた後、４℃で水に対して透析（スペクトラポア７、ＭＷＣＯ：５０ｋダルトン）、さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に対して透析し、再度水に置換した後凍結乾燥、標題のヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。
このヒアルロン酸修飾物の１０％ｖ／ｖ酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でゲル化した。
〔実施例２〕
（実施例２−１）
（１）ニトロフェニルフォルメイト化したＰｌｕｒｏｎｉｃＬ９２（ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ９２−ＮＰＣ）の合成
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ９２（商品名）（分子量３６５０ダルトン、ＬＣＳＴ１７℃、ＢＡＳＦ武田ビタミン株式会社製）を用いるほかは、実施例１−１の（１）と同様の方法で、ニトロフェニルフォルメイト化したＰｌｕｒｏｎｉｃＬ９２（ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ９２−ＮＰＣ）２７．３ｇを得た。
（２）ヒアルロン酸にＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成
実施例１−１の（２）で得られたＨＡ−ＨＺを用い、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣの代わりに前記（１）で得られたＰｌｕｒｏｎｉｃＬ９２−ＮＰＣを用いるほかは、実施例１−１の（３）と同様の方法で、標題のヒアルロン酸にポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）を結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の２７モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の２％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でゲル化した。
（実施例２−２）
実施例１−２の（１）で得られたＨＡ−ＨＺを用いるほかは、実施例２−１の（２）と同様の方法で、標題のヒアルロン酸にＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の２９モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の４％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でゲル化した。
（実施例２−３）
実施例１−３の（１）で得られたＨＡ−ＨＺを用いるほかは、実施例２−１の（２）と同様の方法で、標題のヒアルロン酸にＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。
このヒアルロン酸修飾物の１０％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でゲル化した。
（実施例２−４）
（１）ヒドラジド（ＨＺ）基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
分子量１．５×１０６ダルトンのヒアルロン酸（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）１００ｍｇを０．１％濃度で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調製した。１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：５：４０モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド（ＨＺ）基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）８８ｍｇを得た。
得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の６１％がＨＺ化されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、ＨＺ：Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ、１．７ｐｐｍ、２．４ｐｐｍ）。
（２）ヒアルロン酸にＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成
実施例２−４の（１）で得られたＨＡ−ＨＺを用いるほかは、実施例２−１の（２）と同様の方法で、標題のヒアルロン酸にＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。４℃で水に対して透析（スペクトラポア７、ＭＷＣＯ：３００ｋダルトン）することで精製、エバポレーションで濃縮した。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の９モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の１％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でゲル化した。
〔比較例１〕
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−３１（商品名）（分子量１１００ダルトン、ＬＣＳＴ３９℃、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例１−１と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の１．４モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の２％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃で白濁化したが、顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。
〔比較例２〕
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−３１（商品名）（分子量１１００ダルトン、ＬＣＳＴ３９℃、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例１−２と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の０．５モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の４％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃で白濁化したが、顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。
〔比較例３〕
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−３１（商品名）（分子量１１００ダルトン、ＬＣＳＴ３９℃、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例１−３と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の２．０モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の１０％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃で白濁化したが、顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。
〔比較例４〕
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−６４（商品名）（分子量２９００ダルトン、ＬＣＳＴ５４℃、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例１−１と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の１１モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の２％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でも液体、５５℃でゲル化した。
〔比較例５〕
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−６４（商品名）（分子量２９００ダルトン、ＬＣＳＴ５４℃、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例１−２と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の１５モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の４％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でも液体、５４℃でゲル化した。
〔比較例６〕
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−６４（商品名）（分子量２９００ダルトン、ＬＣＳＴ５４℃、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例１−３と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の１９モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の１０％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でも液体、５５℃でゲル化した。
〔比較例７〕
実施例１−１で、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣを、ＨＺ：ＮＰＣ＝１：２モル比になるよう添加するほかは、実施例１−１と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。
得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の７．０モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の２％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でも顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。
〔比較例８〕
実施例１−２で、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６２Ｄ−ＮＰＣを、ＨＺ：ＮＰＣ＝１：２モル比になるよう添加するほかは、実施例１−２と同様の方法で、ヒアルロン酸にＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。
得られたＨＡ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ中のＰｌｕｒｏｎｉｃ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の５．８モル％にＰｌｕｒｏｎｉｃが導入されていた（ＨＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅ、２．１ｐｐｍ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ：ＰｒｏｐｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅのＭｅｔｈｙｌ、１．２ｐｐｍ）。
このヒアルロン酸修飾物の４％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液は、２５℃で液体、３６℃でも顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。
［試験例１  粘度の温度応答性］
実施例２−４の１％ｖ／ｖリン酸生理食塩性溶液の粘度の温度依存性をＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＲＥ１１０Ｒ  ｓｙｓｔｅｍ（東機産業会社製）を用いて、コーン／プレート型、せん断速度１．０（ｓｅｃ−１）で測定した。３７℃での粘度は室温の１００倍以上となった。その結果を図１３に示す。
［試験例２  関節腔内滞留性］
エーテル麻酔にかけたラットの下肢の毛を剃り、２６Ｇ注射針付シリンジにて関節腔内および皮下に実施例２−４で調製したサンプルを投与した。投与後のラットの膝関節幅をノギスにて経時的に測定し、投与前の膝関節幅からの膨張度を投与サンプルの滞留性の指標とした。関節幅は、ラットの関節幅を３回測定し平均値を各時点の代表値とした。投与後７２時間でも生理食塩水投与の３倍の関節幅を維持していた。その結果を図１４に示す。
産業上の利用可能性
ヒアルロン酸及び／又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＧＡ−ＰＥＯ）、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸−ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ＰＥＯ−ＰＬＡ−ＰＥＯ）及びポリ乳酸−ポリエチレンオキサイド−ポリ乳酸ブロックポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡ）から選択されるブロックポリマーとが結合した本発明のヒアルロン酸修飾物は、室温流通が可能であり且つ粘度が低く取り扱いやすいにもかかわらず、生体内（例えば関節腔内）に注入後その粘弾性を急増させることが可能である。従って、本発明のヒアルロン酸修飾物は、今までにない実用的なヒアルロン酸製剤の主成分として、関節疾患の処置に非常に有用である。また、本発明のヒアルロン酸修飾物を主成分とする製剤は、眼科手術、内視鏡的粘膜切除術などの外科手術用補助剤又は処置剤としても有効に用いられる。さらに、本発明のヒアルロン酸修飾物は、その特性を利用して、薬物徐放用担体などへの応用も期待できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１−１で得られた本発明ヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図２は、実施例１−２で得られた本発明ヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図３は、実施例２−１で得られた本発明ヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図４は、実施例２−２で得られた本発明ヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図５は、比較例１で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図６は、比較例２で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図７は、比較例３で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図８は、比較例４で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図９は、比較例５で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図１０は、比較例６で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図１１は、比較例７で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図１２は、比較例８で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトンＮＭＲチャートである。
図１３は、試験例１で得られた実施例２−４のヒアルロン酸修飾物の粘度の温度応答性である。
図１４は、試験例１で得られた実施例２−４のヒアルロン酸修飾物投与後の関節幅の経時変化である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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