(57)【要約】本発明によるジーンサイレンシング用ベクターは、プロモーターの下流にエンハンサー配列と、その下流にポティウィルス由来のコートタンパク質をコードする遺伝子とを有するベクターであり、宿主植物において特定の標的遺伝子のジーンサイレンシングを生じさせるために該標的遺伝子を、コートタンパク質をコードする遺伝子の周辺に挿入して使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターの下流にエンハンサー配列と、その下流にポティウィルス由来のコートタンパク質をコードする遺伝子とを有する組換えベクターを含んでなり、宿主植物において特定の標的遺伝子のジーンサイレンシングを生じさせるために、該標的遺伝子あるいは該標的遺伝子と相同性のある遺伝子をコートタンパク質の上流あるいは下流に挿入して使用されるジーンサイレンシング用ベクター。
【請求項２】
プロモーターの下流にキュウリモザイクウィルスのＲＮＡ４におけるリーダー配列と、その下流にジャガイモＹウィルスえそ系統（ＰＶＹ−Ｔ）のコートタンパク質（ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰ）をコードする遺伝子とを有する組換えベクターを含んでなり、宿主植物において特定の標的遺伝子のジーンサイレンシングを生じさせるために、該標的遺伝子あるいは該標的遺伝子と相同性のある遺伝子をジャガイモＹウィルスえそ系統（ＰＶＹ−Ｔ）のコートタンパク質の上流あるいは下流に挿入して使用されるジーンサイレンシング用ベクター。
【請求項３】
前記標的遺伝子の発現をより強く抑制するために、請求項１に記載のコートタンパク質を複数連結してなるジーンサイレンシング用ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のジーンサイレンシング用ベクターを宿主植物に形質転換することにより、前記宿主植物における前記標的遺伝子の発現を抑制することを含むジーンサイレンシング方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記標的遺伝子の発現を数％〜１００％の範囲で抑制する方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の方法であって、前記遺伝子の発現抑制が、前記形質転換された宿主の当代だけでなく、その自殖後代においても安定に維持される方法。
【請求項７】
請求項４または５に記載の方法であって、更に、前記形質転換された宿主を他の宿主と交雑することを含み、この交雑で得られた雑種世代においても前記標的遺伝子の発現抑制が安定に維持される方法。
【請求項８】
請求項４〜７の何れか１項に記載の方法であって、前記宿主細胞がＰＶＹ罹病性植物であるときには、前記形質転換された宿主はＰＶＹに対して免疫性および抵抗性となり、同時にその抵抗性の程度に応じて前記標的遺伝子の発現が抑制される方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はジーンサイレンシングを生じさせるために使用できるウィルスベクターおよび該ベクターを用いたジーンサイレンシング方法に関する。より詳細に言えば、ジーンサイレンシングの発生確率が高く、かつメンデルの法則に従った遺伝をするウィルス誘導型ジーンサイレンス方法に関するものである。
背景技術
特定の標的遺伝子の発現を抑制することは、遺伝子機能の解析を目的とした研究的側面のみならず、植物の品種改良のための手段としても有望な手法である。そのための手段として、標的遺伝子とは逆向きの塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを細胞に導入して、標的遺伝子の翻訳を阻害するアンチセンス法が知られている。しかし、アンチセンス法では、タンパク質の産生を完全に抑制することが困難であるという問題があった。
上記アンチセンス法の問題を解決するために、近年、ジーンサイレンシングの研究が活発になっている。ジーンサイレンシングは、遺伝子の転写レベルで作用するもの（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＴＧＳ）と、転写後に作用するもの（Ｐｏｓｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＰＴＧＳ）とに分類されるが、その何れにおいても、殆どの場合に１００％の範囲に近い内在性遺伝子発現の抑制がしばしば起きる点でアンチセンス法とは異なっている。最近はＰＴＧＳに関する研究報告が多く、転写されたｍＲＮＡが急速に分解される現象が哺乳動物、植物および微生物で報告されている（ＳＣＩＥＮＣＥ  ｖｏｌ．２８８，１３７０−１３７２，ＮＡＴＵＲＥ  ｖｏｌ．４０４，８０４−８０８等）。ＰＴＧＳのメカニズムは現在も不明であるが、この事象は植物バイオの分野においてコ・サプレッション（Ｃｏ−Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）として知られている。
しかし、コ・サプレッションではＰＴＧＳが起こる確率が低く、あるいは組織の一部のみでしか誘導されないということがたびたび起きるという問題が指摘されている。
また、ＰＴＧＳを効率的に誘導するためにウィルスベクターを用いるウィルス誘導型ジーンサイレンシング（ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）が知られている。しかし、ＶＩＧＳは、ウィルスそのものをベクターとしていることとジーンサイレンスが遺伝しないという問題が指摘されている。
本願発明の発明者等は、先に特開平６−１３３７８３号において、ジャガイモＹウィルスえそ系統（ＰＶＹ−Ｔ）に対する耐性を付与するためのベクターを開示した。その後の研究により、このベクターをジーンサイレンシングに使用できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、宿主における特定の標的遺伝子の発現を抑制するジーンサイレンシング用ベクターおよびジーンサイレンシング方法を提供するものである。
発明の開示
本発明によるジーンサイレンシング用ベクターは、プロモーターの下流にエンハンサー配列と、その下流にポティウィルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）由来のコートタンパク質（以下「ＣＰ」ということもある）をコードする遺伝子とを有する組換えベクターであって、ＣＰをコードする遺伝子の上流あるいは下流に、宿主植物においてジーンサイレンシングを生じさせるべき特定の標的遺伝子あるいは該標的遺伝子と相同な遺伝子配列をセンス方向に挿入したことを特徴とするものである。
また本発明によるジーンサイレンシング方法は、前記ベクターに前記標的遺伝子を挿入して得られた遺伝子構築物により宿主植物を形質転換することで、前記宿主植物における前記標的遺伝子の発現を抑制することからなる。
本発明のジーンサイレンシング用ベクターあるいは本発明のジーンサイレンシング方法は、
（１）標的遺伝子数が１コピーであっても、ジーンサイレンシングの発生確率が高い。
（２）当代で標的遺伝子の発現が多様なレベルで調整（数％〜１００％の範囲で抑制）された個体を得ることができる。
（３）ジーンサイレンシングが後代にも遺伝する。
（４）メンデルの法則に基づいて遺伝するため、固定品種との交配により数％〜１００％の範囲で標的遺伝子の発現が抑制される品種を容易に得ることができる。
という予期しない効果をもたらした。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、ジャガイモを、ジャガイモＹウィルスえそ系統に対して抵抗性にするために開発されたＧＳ−ＰＶＹベクター（特開平６−１３３７８３号）のＰＶＹ−Ｔコートタンパク質の周辺にセンス方向に組み込まれた遺伝子のジーンサイレンスが誘導されることに注目し、プロモーターの下流に存在するエンハンサーをコードする遺伝子とウィルス由来のコートタンパク質をコードする遺伝子がＰＴＧＳに強く関与していることを見出した。
ＧＳ−ＰＶＹベクターは、プロモーターの下流にキュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）のＲＮＡ４におけるリーダー配列と、その下流にジャガイモＹウィルスえそ系統（ＰＶＹ−Ｔ）のコートタンパク質をコードする遺伝子とを有する組換えベクターである。
本発明のジーンサイレンシング用ベクターで用いられるプロモーターは、特に限定されるものではなく、ウィルス由来のコートタンパク質の転写を開始できるものであればよい。たとえば、３５Ｓプロモーター、ＰＡＬプロモーター、ＰＡＬ  ＢＯＸプロモーター等が利用できる。
ＣＭＶにおけるＲＮＡ４のリーダー配列は、新田ら（１９８８）日本植物病理学会報５４：５１６−５２２に示されている。また、一般的に、植物ウィルスの構造タンパク質のリーダー配列が、タンパク質の発現を増強する作用をもっていることは良く知られている（Ｄ．Ｅ．Ｓｌｅａｔ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｓ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｔ．Ｍ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｄａｖｉｅｓ  ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５５−１１３）。
したがって、ＧＳ−ＰＶＹベクターのプロモーターの下流に配置されたＣＭＶのＲＮＡ４におけるリーダー配列は、本発明のジーンサイレンスベクターにおいては、これに限定されるものではなく、タンパク質発現の転写を活性化させるエンハンサー配列であればよく、たとえば、３５Ｓプロモーター中のエンハンサー（−９０〜−４４０の領域）やＴＭＶ−オメガ配列のようなエンハンサー配列が使用できる。
ウィルスのコートタンパク質は、グループ特異的なアミノ酸組成を持っており、他のウィルスグループとは配列の相同性が低い唯一のウィルス産物であることが知られている。ＰＶＹ−Ｔは、ポティウィルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）に属する植物ウィルスである。本発明のジーンサイレンスは、植物が本発明のジーンサイレンスベクター中のコートタンパク質とそのエンハンサーに対する防御に起因していると考えら得る。したがって、ＰＶＹ−Ｔと同一のグループに属し、相同性の高いポティウィルス由来のコートタンパク質、たとえばＰＶＡ，ＰＶＶ，ＰｒＬＶ，ＰｒＭｏＶ、ＴＥＶ，ＴＶＢＭＶ，ＴＶＭＶ，ＴＷＶ由来のコートタンパク質をコードする遺伝子配列を使用することも可能である。
また、ジーンサイレンスの効率を高めるため、コートタンパク質をコードする遺伝子配列はシングルではなく、複数の同種あるいは異種配列をタンデムに配置してもよい。
本発明のジーンサイレンス用ベクターは、入手可能な適切なベクターを基礎にして構築することができる。この基礎になるベクターは、上記プロモーターの他に宿主細胞内で機能する複製開始点を有し、また、ターミネータおよび薬剤耐性のような適当な選択マーカーを有することが好ましい。たとえば、入手可能な適切なベクターに、上記ＣＭＶのＲＮＡ４におけるリーダー配列およびＰＶＹ−ＴのＣＰをコードする配列を、常法により制限酵素を駆使して挿入することで容易に調製することができる。
本発明のジーンサイレンス方法は、前述のジーンサイレンス用ベクターのポティウィルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）由来のコートタンパク質をコードする遺伝子の上流あるいは下流にジーンサイレンシングの標的とする遺伝子（以下「標的遺伝子」という）あるいは該標的遺伝子と相同性のある遺伝子をセンス方向で組込んだベクターを用いて宿主植物を形質転換することを特徴とするものである。
本発明を適用してジーンサイレンシングを生じさせるべき宿主植物は、特に限定されない。適切な宿主には、例えばジャガイモ、タバコ等が含まれる。
本発明においては、ジーンサイレンシングの標的遺伝子、即ち、宿主において遺伝子発現を抑制すべき遺伝子を、ジーンサイレンシング用ベクターのポティウィルス由来ＣＰの上流あるいは下流に連結する。この標的遺伝子は特に限定されず、宿主の中に存在する如何なる遺伝子（内在性遺伝子）や外来性遺伝子であっても固定化しているものであってもよい。これらの遺伝子は全長をコードするものが望ましいが相同性を有するもの（たとえば、全長の一部分をコードするもの）を用いてもよい。相同性を有する遺伝子を用いる場合、相同性は高いものが望ましく、好ましくは７割以上、より好ましくは８割以上の相同性である。また、標的遺伝子数は１コピーでも十分発明の効果を得られるが、より確実にするため複数個、たとえばタンデム、としてもよい。このように、標的遺伝子を本発明のジーンサイレンシング用ベクターに組み込み、宿主植物を形質転換することにより、宿主における標的遺伝子の抑制を誘導することができる。
本発明において、宿主植物を形質転換する方法は特に限定されず、宿主植物の種類に応じて適切な方法を選択すればよい。宿主細胞が植物であるときには、まず、植物に対して強力な感染力を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、上記ジーンサイレンシング用ベクターに標的遺伝子を導入した遺伝子構築物で形質転換し、これを宿主植物に接種して感染させる方法が好ましいが、これに限定されるものではない。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換方法自体は公知であり、例えば凍結融解法（文献：Ｇ．Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ３，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ  ｐｐ．１−１９）により行うことができる。
本発明によれば、標的遺伝子のジーンサイレンシングが高い確率で誘導される。
また、本発明によれば、標的遺伝子の発現が多様なレベルで調整（数％〜１００％の範囲で抑制）された個体を得ることができる。
さらにまた、本発明によるジーンサイレンシング用ベクターを用いて誘導された標的遺伝子のジーンサイレンシングは、形質転換された当代だけでなく自殖後代でも遺伝することが認められ、標的遺伝子の発現を安定的且つ永続的に抑制することが可能である。
更にまた、誘導された標的遺伝子のジーンサイレンシングは、メンデルの法則に合致して遺伝するため自殖後代だけでなく、他の系統との交配によっても、標的遺伝子の発現を種々のレベルで抑制することができ、完全に（１００％）抑制することも可能である。その一例として、後述の実施例で示すように、Ｆ１の６０個体中の約３０個体（約５０％）がマーカー遺伝子として用いたＧＦＰ発現を完全に抑制し、残りの３０個体（約５０％）はＧＦＰ発現が低程度から中程度に発現を抑制される結果となり、ジーンサイレンシングの効果が示された。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を例示する目的で提供するものであり、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。
実施例１：  ＧＦＰ遺伝子をマーカーとした実験
（当代における外来性遺伝子の抑制）
＜材料および方法＞
Ｉ．ベクターの作製
（１）ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷベクターの構築：図１参照
植物発現ベクターｐＢＩ１２１（米国クローンテック社製）にＰＶＹ−Ｔ・ＣＰを組込んだベクターｐＢＩ１２１ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰ（特開平６−１３３７８３号）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断して、３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰおよびＮｏｓターミネータを含むＤＮＡ断片を得た。この断片をｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）の制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に導入して、ｐＵＣ１９−ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰを得た。このベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰおよびＮｏｓターミネータを含むＤＮＡ断片を回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端として、第一の平滑末端ＤＮＡ断片を得た。
一方、もう一つのｐＢＩ１２１ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした。この線形化されたｐＢＩ１２１  ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰに先に得られた平滑末端ＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより連結して、３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰおよびＮｏｓターミネータが二重タンデムで連結されたＰＶＹ−ＣＰＷを得た。
（２）ｐＹＳ４１５ベクターの構築：図２参照
次のようにして、特開平６−１３３７８３号のｐＢＩ１２１ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰベクターにＧＦＰ遺伝子が組込まれているｐＹＳ４１５ベクターを構築した。
先ず、ｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）に３５Ｓプロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびＮｏｓターミネータがクローニングされているｐＹＳ４０９を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。３５Ｓプロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびＮｏｓターミネータを含むＤＮＡ断片を回収し、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端ＤＮＡ断片を得た。次に、ｐＢＩ１２１ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して線形にした後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端のｐＢＩ１２１  ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰに、先に得られた平滑末端ＤＮＡ断片をＴ４リガーゼで連結することにより、ｐＢＩ１２１  ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰにおけるＮｏｓターミネータの下流に、３５Ｓプロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびＮｏｓターミネータが挿入されたベクターｐＹＳ４１５を得た。
（３）ｐＹＳ４１２ベクターの構築：図３参照
次のようにして、（１）で構築したＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷベクターにＧＦＰ遺伝子が組込まれているｐＹＳ４１２ベクターを構築した。
まず、（２）で述べたｐＹＳ４１５の場合と同様に、ｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）に３５Ｓプロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびＮｏｓターミネータがクローニングされているｐＹＳ４０９を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。３５Ｓプロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびＮｏｓターミネータを含むＤＮＡ断片を回収し、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端ＤＮＡ断片を得た。次に、（１）で得たＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端のＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷに、先に得られた平滑末端ＤＮＡ断片をＴ４リガーゼで連結することにより、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷにおける３‘Ｎｏｓターミネータの下流に、３５Ｓプロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびＮｏｓターミネータが挿入されたベクターｐＹＳ４１２を得た。
ＩＩ．アグロバクテリウム・ツメファシエンスへの形質転換
上記で構築された植物形質転換用ベクターｐＹＳ４１５およびｐＹＳ４１２を、それぞれ別々に、凍結融解法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌種ＬＢＡ４４０４（ホックマン等、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３；１７９−１８０，１９８３）に導入して形質転換を行った。続いて、カナマイシン耐性で選抜することにより、ｐＹＳ４１５またはｐＹＳ４１２の何れかがアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌種ＬＢＡ４４０４に導入された目的のコロニーを得た。
ＩＩＩ．タバコへの形質転換
温室内で１．５ヶ月栽培したタバコ品種（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１）の上位葉から採取したタバコの葉を、７０％エチルアルコールおよび１％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌し、滅菌水で洗浄した後、直径約６ｍｍの葉片ディスクを調製した。この葉片と、上記のようにして本発明のベクターで形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンス約１０８細胞とを、ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇの無機塩類および３０ｇ／Ｌのスクロースからなる液体培地中において４８時間共存培養を行った。
その後、葉片をセフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌを含む滅菌水で洗浄し、細菌を洗い落とした後、ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇの無機塩類、インドール酢酸０．３ｍｇ／Ｌ、２ｉｐ  １０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌおよび寒天０．９％を含む茎葉分化培地に置床した。約１ヶ月の後、カナマイシン耐性を示す茎葉をＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇの無機塩類、３０ｇ／Ｌのスクロース、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌおよび寒天０．９％を含む発根培地に置床した。培養約１ヶ月後、発根した形質転換体を閉鎖系温室内で栽培した。上記の手法は、小鞠等（Ｔｈｅｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７７，５４７−５５２、１９８９）の方法に従って行った。
ＩＶ．形質転換体の分析
（１）ＧＦＰ遺伝子の発現
ＧＦＰ遺伝子の発現は、形質転換体が発する蛍光を検出することにより分析した。蛍光測定にはＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸを用い、浜松ホトニクス社製の画像解析システム（ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ）を用いて解析した。
＜結果＞
（１）ＧＦＰ遺伝子のジーンサシレンシング
上記方法により、上記のベクター構築物ｐＹＳ４１５で形質転換された形質転換タバコについてＧＦＰの蛍光を測定したところ、ＧＦＰの緑色蛍光を強く発現する個体から全く緑色蛍光が認められない形質転換タバコが選られた。更に、ＰＶＹ−Ｔウィルスを接種したところ、緑色蛍光が認められない形質転換タバコのみから、ＰＶＹ−Ｔの病徴を示さない個体（免疫個体）が選られた。ＧＦＰ発現とＰＶＹ−Ｔ抵抗性との関係を下記の表１に示す。この結果から明らかなように、ＰＶＹ−Ｔに抵抗性を示す形質転換タバコはＧＦＰの発現がジーンサイレンシングにより抑制されている。これにより、本発明のベクターは、導入されたＧＦＰ遺伝子の発現を高頻度で抑制することが示された。
2003097841.tif 000002
なお、形質転換タバコのＰＶＹ−Ｔ抵抗性については、特開平６−１３３７８３号の段落番号〔００２７〕に記載の検定法に準じて調査した。即ち、タバコＢｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ４号またはＢｕｒｌｅｙ  ２１にＰＶＹ−Ｔの精製ウィルス粒子を接種し、２週間後、壊疽症状を確認した後に感染葉をサンプリングし、生重に対して２〜１０倍のＰＢＳ−Ｔバッファー（リン酸バッファー０．０２Ｍ）で希釈後、ホモジナイズし、その磨砕液を各々の形質転換体に接種した。供試する形質転換体は４寸釘で鉢上げ後、２１℃前後に調整された閉鎖系温室で栽培し、鉢上げ２〜３週間後に人工接種を行った。人工接種は、供試植物の上位葉から中位葉の５枚の葉に対して、６００メッシュのカーボランダムと所定濃度のウィルス磨砕液を混合したものを塗布することによって行った。接種後、経時的（１週間〜２カ月）に壊疽病徴の有無を調査し、更にＥＬＩＳＡでウィルス粒子の有無を調べることにより、抵抗性の程度を検定した。
実施例２：  ＧＦＰ遺伝子をマーカーとした実験
（他種との交雑による内在性遺伝子の抑制）
実施例１において、ジーンサイレンシングによりＰＶＹ−Ｔに対して抵抗性を示し、且つＧＦＰの発現が完全に抑制されている形質転換タバコ（ＧＢＳ１８、ＧＢＳ１９）を選抜した。これらの形質転換タバコを自殖させた後、自殖後代（Ｒ１）から、ＰＶＹ−Ｔに抵抗性で且つＧＦＰの発現が抑制されたもの（ＧＢＳ１８−１３、ＧＢＳ１９−７、ＧＢＳ２０−９）を選抜した。但し、ＧＢＳ１９系統は初期にジーンサイレンシングが誘導されるのに対して、ＧＢＳ１８およびＧＢＳ２０系統はエイジが進むに伴ってジーンサイレンシングが誘導される系統である。
次に、上記で選抜されたＧＢＳ１８−１３およびＧＢＳ１９−７と、タバコ（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１）にＧＦＰ遺伝子を導入してＧＦＰが高発現するように固定化した形質転換タバコ（ＧＦＰ−７−１１）とを交雑させた。選られたＦ１種子を、定法により７０％エタノール（数秒）および１％次亜塩素酸ナトリウム（５分）で表面殺菌し、滅菌水で洗浄した後、ＬｉｍｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ培地上に播種し、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｆｘを用いてＧＦＰの緑色蛍光を経時的に測定した。栽培条件は下記の通りである。
光条件：３０００〜５０００  Ｌｕｘの白色蛍光灯下で２４時間照明
培養温度：２３℃〜２５℃
なお、タバコの自殖種子とＦ１雑種種子の採種方法は次の通りである。タバコの自殖種子は、花粉の混入を防ぐために紙袋で花序部を覆うことにより容易に得られる。また、Ｆ１雑種種子を得るためには、目的の個体と交雑する前に他からの花粉が混入しないように注意しながら除雄し、開裂したばかりの葯の花粉を雌しべの柱頭に付着させた後、上袋で花序部を覆うことにより得られる。通常、開花後４〜５週間でサクが褐変し、種子が登熟する。遺伝子組換えタバコについては、２０℃〜２５℃で制御された完全閉鎖系温室で栽培し、タバコの自殖種子とＦ１雑種種子を採種した。
その結果、ＧＦＰが高発現する固定化した形質転換タバコ（黄色）と非形質転換タバコ（赤色）とのＦ１雑種（ＧＦＰ７−１１×ＳＲ１ｃｏｎｔ．）では、全てＧＦＰの発現（オレンジ色）が認められた。これに対して、ＧＢＳ１８−１３、ＧＢＳ１９−７及びＧＢＳ２０−９との交雑では、Ｆ１の６０個体のうち約３０個体（約５０％）においてＧＦＰの発現が完全に抑制され（赤色）、残りの３０個体（５０％）では、ＧＦＰの発現が低程度から中程度に抑制される結果が（オレンジ色〜赤色）得られた。更に、ＰＶＹ−Ｔの抵抗性を調べた結果、ＧＦＰ発現が完全に抑制された個体（赤色個体）は全て、ＰＶＹ−Ｔに対する抵抗性を示した。無菌播種８日目で、ＧＢＳ１９−７×ＧＦＰ７−１１（Ｆ１）の約半数はＧＦＰの発現が完全に抑制され（赤色化）、ＧＢＳ１８−１３およびＧＢＳ２０−９の自殖後代と同様に、エイジが進むに連れてジーンサイレンシングが誘導される結果となった。
以上の結果から、ＧＳ−ＰＶＹベクターによってタバコに誘導されたジーンサイレンシング効果は、自殖後代（Ｒ１）でも維持され、またこれを他のタバコ種と交雑して得られたＦ１世代にも受継がれることが明らかになった。
実施例３：  ＧＵＳ遺伝子をマーカーとした実験
＜材料および方法＞
Ｉ．ベクターの作製：
次のようにして、（１）で構築したＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷベクターにβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子が組込まれているｐＹＳ４３６ベクターを構築した。
先ず、ｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）に３５Ｓプロモーター、ＧＵＳ遺伝子およびＮｏｓターミネータがクローニングされているｐＢＩ２２１を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。３５Ｓプロモーター、ＧＵＳ遺伝子およびＮｏｓターミネータを含むＤＮＡ断片を回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とすることにより、平滑末端ＤＮＡ断片を得た。次に、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して線形化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化されたＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷに、上記で得た平滑末端ＤＮＡ断片をＴ４リガーゼで連結することにより、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷにおける３‘Ｎｏｓターミネータの下流に３５Ｓプロモーター、ＧＵＳ遺伝子およびＮｏｓターミネータが挿入されたベクターｐＹＳ４３６を得た（図４参照）。
ＩＩ．アグロバクテリウム・ツメファシエンスへの形質転換
上記で構築された植物形質転換用ベクターｐＹＳ４３６を、実施例１の場合と同様にして、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌種ＬＢＡ４４０４（ホックマン等、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３；１７９−１８０、１９８３）に導入して形質転換を行った。続いて、カナマイシン耐性で選抜することにより、ｐＹＳ４３６がアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌種ＬＢＡ４４０４に導入された目的のコロニーを得た。
ＩＩＩ．タバコへの形質転換
上記で得たベクターｐＹＳ４３６を、実施例１の場合と同様にして、温室内で１．５ヶ月栽培したタバコ品種（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１）の葉片に形質転換した。
ＩＶ．形質転換体の分析
（１）ＧＵＳ遺伝子の発現
先ず、ベクターｐＹＳ４３６によりＧＵＳ遺伝子を導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＬＢＡ４４０４）におけるＧＵＳ遺伝子の発現を調べた。対照として、ＧＵＳ遺伝子を有するベクターｐＢＩ１２１（米国クローンテック社製）を導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＬＢＡ４４０４）を用いた。その結果、ｐＹＳ４３６を導入したアグロバクテリウムおよびｐＢＩ１２１を導入したアグロバクテリウムは何れも青色を呈し、アグロバクテリウムにおいてはｐＹＳ４３６およびｐＢＩ１２１の両者共ＧＵＳ遺伝子を発現していることが明らかになった。
次に、上記アグロバクテリウムを用いてｐＹＳ４３６およびｐＢＩ１２１を導入した形質転換タバコについて、ＧＵＳ遺伝子の発現を調べた。その結果、対照であるｐＢＩ１２１を導入した形質転換タバコの葉片は青色を呈するのに対して、ｐＹＳ４３６を導入した形質転換タバコは青色を呈さなかった。これらの結果を下記の表２に纏めた。
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以上の結果から、ｐＹＳ４３６を導入した形質転換タバコでは、ＧＵＳ遺伝子の発現がジーンサイレンシングにより抑制されていることが明らかになった。
実施例４：  エンドウＺｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ転写因子ＰｓＤｏｆ１をマーカーとした実験（内在性転写因子の抑制）
＜材料および方法＞
Ｉ．ベクターの作製：
まず、実施例１の（１）で構築したＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷベクターに３５Ｓプロモーター、エンドウＺｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ転写因子ＰｓＤｏｆ１およびＮｏｓターミネータが組込まれているｐＹＳ４６５ベクターを構築した。
ＰｓＤｏｆ１の組み込まれたｐＧＥＸ−５Ｘ−１（文献名Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９（４），２５１−２６０（２００２）を制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＰｓＤｏｆ１遺伝子を含む断片を回収し、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端ＤＮＡ断片を得た。
次にｐＣａＭＣＮ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＳａｌＩで切断しＣＡＴ遺伝子を取り除き、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、これに先に得られたＰｓＤｏｆ１遺伝子断片をＴ４リガーゼで連結してＰｓＤｏｆ１遺伝子断片の上流に３５Ｓプロモーター、下流にＮｏｓターミネータの連結したベクターｐＣａＭＣＮ−ＰｓＤｏｆ１を得た。
ついで、ｐＣａＭＣＮ−ＰｓＤｏｆ１をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＰｓＤｏｆ１遺伝子断片の上流に３５Ｓプロモーター、下流にＮｏｓターミネータが連結された遺伝子断片を回収し、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端ＤＮＡ断片を得た。
次にＧＵＳ遺伝子の連結されたｐＢＩ１０１．２（東洋紡）をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＧＵＳ遺伝子を除去し、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端したものに先に得たＰｓＤｏｆ１遺伝子断片の上流に３５Ｓプロモーター、下流にＮｏｓターミネータが連結された遺伝子断片をＴ４リガーゼで連結したベクターｐＢＩ１０１．２−ＰｓＤｏｆ１を得た。
ついで、ｐＢＩ１０１．２−ＰｓＤｏｆ１をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＰｓＤｏｆ１遺伝子断片の上流に３５Ｓプロモーター、下流にＮｏｓターミネータが連結された遺伝子断片を回収し、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端ＤＮＡ断片を得た。
次に、実施例１の（１）で得たＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端のＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷに、先に得られた平滑末端ＤＮＡ断片をＴ４リガーゼで連結することにより、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷにおける３‘Ｎｏｓターミネータの下流に、３５Ｓプロモーター、ＰｓＤｏｆ１遺伝子およびＮｏｓターミネータが挿入されたベクターｐＹＳ４６５を得た。
さらに、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷベクターにＰＡＬプロモーター、エンドウＺｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ転写因子ＰｓＤｏｆ１およびＮｏｓターミネータが組込まれているｐＹＳ４６６ベクターを構築した（図５Ａおよび図５Ｂ参照）。
ＢＯＸ  ５リピータープロモーターとＣＡＴ遺伝子が組み込まれたｐＵＣ１８（特開２０００−２４５４６３号）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で切断し、ＰＡＬプロモーターＤＮＡ断片を回収した。
次にｐＢＩ１０１．２−ＰｓＤｏｆ１をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨ１で切断して３５Ｓプロモーターを削除し、これに先に得たＰＡＬプロモーターをＴ４リガーゼで連結し、ｐＢＩ１０１．２−ＰＡＬ−ＰｓＤｏｆ１ベクターを得た。さらにｐＢＩ１０１．２−ＰＡＬ−ＰｓＤｏｆ１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＰＡＬプロモーター、ＰｓＤｏｆ１遺伝子およびＮｏｓターミネータを含む断片を回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。
次に、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端のＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷに、先に得られた平滑末端ＤＮＡ断片をＴ４リガーゼで連結することにより、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷにおける３‘Ｎｏｓターミネータの下流に、ＰＡＬプロモーター、ＰｓＤｏｆ１遺伝子およびＮｏｓターミネータが挿入されたベクターｐＹＳ４６６を得た（図６参照）。
ＩＩ．アグロバクテリウム・ツメファシエンスへの形質転換
上記で構築された植物形質転換用ベクターｐＹＳ４６５およびｐＹＳ４６６を、実施例１の場合と同様にして、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌種ＬＢＡ４４０４（ホックマン等、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３；１７９−１８０、１９８３）に導入して形質転換を行った。続いて、カナマイシン耐性で選抜することにより、ｐＹＳ４６５、ｐＹＳ４６６がアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌種ＬＢＡ４４０４に導入された目的のコロニーを得た。
ＩＩＩ．タバコへの形質転換
上記で得たベクターｐＹＳ４６５、ｐＹＳ４６６を実施例１の場合と同様にして、温室内で１．５ヶ月栽培したタバコ品種（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１）の葉片に形質転換した。
ＩＶ．形質転換体の分析
（１）転写因子遺伝子のジーンサイレンス
ベクターｐＹＳ４６５あるいはｐＹＳ４６６で形質転換されたタバコの形態上変化を観察したところ、ｐＹＳ４６５形質転換体は、初期成育が遅れる傾向が見られた。一方、ｐＹＳ４６６形質転換体は、葉の表面にしわが形成されたものや葉全体が縮む等の葉の形態異常が起きていた。このことは転写因子ＰｓＤｏｆ１と相同性のある転写因子のジーンサイレンスがおきた結果によるものと考察される。
以上詳述したように、本発明によれば、宿主において特定の標的遺伝子のジーンサイレンシングを実現できる等、顕著な効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＶＹ−Ｔ・ＣＰＷベクターの構築を示す図である。
図２は、ｐＹＳ４１５ベクターの構築を示す図である。
図３は、ｐＹＳ４１２ベクターの構築を示す図である。
図４は、ｐＹＳ４３６ベクターの構築を示す図である。
図５Ａおよび図５Ｂは、ｐＹＳ４６５ベクターの構築を示す図である。
図６は、ｐＹＳ４６６ベクターの構築を示す図である。
これらの図において、図中の略号は次の通りである：ＮＰＴ＝ネイマイシンホスホトランスフェレース、ＢＲ＝右ボーダー、ＢＬ＝左ボーダー、３５ｓ−ｐｒｏ＝カリフラワーモザイクウイルス３５ｓプロモーター、ＮＯＳ−ｔｅｒ＝ノパリン合成酵素のターミネーター、Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子、ＰＶＹ−ＣＰ＝ＰＶＹ−Ｔのコートタンパク質遺伝子、ＧＦＰ＝ＧＦＰ遺伝子、ＧＵＳ＝βグルクロニダーゼ遺伝子、ＰｓＤｏｆ１＝エンドウＺｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ転写因子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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