(57)【要約】本発明は、生体適合性に優れ、グラフト収縮が抑制された組織又は臓器再建用基材を提供することを目的とする。本発明は、脱細胞化組織マトリックスと細胞成長因子とを含む、組織又は臓器の再建用基材に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱細胞化組織マトリックスと細胞成長因子とを含む、組織又は臓器の再建用基材。
【請求項２】
細胞成長因子がｂＦＧＦである請求項１に記載の再建用基材。
【請求項３】
脱細胞化組織マトリックスが膀胱由来である請求項１又は請求項２に記載の再建用基材。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の再建用基材の製造方法であって、脱細胞化組織マトリックスに細胞成長因子溶液を含浸又は添加することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体組織又は臓器の再建用基材、すなわち、周辺組織からの細胞の侵入を誘導し、生体組織又は臓器を再生して修復するような再生用基材、より特定的には、脱細胞化組織マトリックスと細胞成長因子とを含む、組織又は臓器の再建用基材に関する。
背景技術
生体組織又は臓器の損傷又は欠損部を再生修復する試みが生体組織工学である。この試みの中で、種々の細胞の増殖分化のための足場材料が研究開発されている。
これまでにも、合成物質による足場が作られているが、改善すべき問題も多い。そこで、生体由来材料からの足場材料の作製が考えられ、試みられている。これまでに、様々な生体組織又は臓器を使い、組織又は臓器への免疫拒絶反応を抑制することを目的として脱細胞化処理を行い、細胞外マトリックスのみを回収し、それを足場として利用する試みがある。これらの生体由来足場材料は合成足場材料に比べて力学特性、体液保存性などに優れている。しかしながら、生体内で用いたとき、足場が収縮するという欠点があった。これを解決する方法として細胞を入れる方法がある。ところが、この方法では、細胞の単離、播種などが煩雑であり、別の方法が望まれる。
そこで、細胞の代わりに足場材料への細胞の侵入を体内で促進することで、足場の収縮を抑制する方法として、細胞成長因子を入れることを考えた。この点が本発明のポイントである。もちろん、場合によっては、各種の細胞と細胞成長因子とを組み合わせて、脱細胞化組識マトリックスに入れ、用いることも可能である。
グラフト収縮の一つの原因は、平滑筋などの組織又は臓器の再生が悪いことであり、細胞成長因子を入れ、脱細胞化組織マトリックスからそれらの因子が徐放化されることで、上記の組織又は臓器の再生が促進されると考えられる。
例えば、膀胱再建手術を考えた場合には、先天性疾患による膀胱機能障害や、癌により膀胱を切除した場合に膀胱拡大手術が必要である。通常は消化管をもってパッチ修復を行うが、腸管から尿の再吸収、破裂、発癌などの問題は多く、膀胱そのものの再生が理想的である。
各種人工材料を用いたパッチ修復による膀胱再建の歴史は１９６０年代にさかのぼり、実に多様な材料が動物実験から臨床治験まで使用されてきた。しかし、非吸収性の材料は異物反応、結石形成などのために尿路への使用には適せず、一方、吸収性高分子や各種生物由来材料ではグラフト上への良好な再生を認める一方で、グラフト面積そのものの収縮のために不十分な機能付加しかもたらすことができなかった。その後、消化管を利用した膀胱再建術の進歩があったが、上に述べた長期的な問題点が明らかになるとともに、膀胱再建は再び注目を浴びつつある。
１９９０年代に入り、小腸粘膜下組織（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｓｕｂｍｕｃｏｓａ：ＳＩＳ）と、脱細胞化膀胱マトリックス（ｂｌａｄｄｅｒ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）の二つの生物材料について、動物実験で優れた修復性が報告され膀胱再建の新たな材料として期待されたものの、大欠損の修復においてはやはり上に述べたグラフト収縮のためにいずれも十分な機能付加をもたらさないことが判明した。ただ、この二つの生物材料は米国ではすでに尿道再建などには日常的に臨床で使用されており、特にＳＩＳはＣＯＯＫ社の商品として流通している。
一方、別のグループは体外で大量培養した自己膀胱細胞をグラフト上に播種して膀胱修復を行うことでグラフトの収縮が抑制しうることを報告し、現在臨床治験に入っている。自家細胞移植の有用性はこの研究により証明されたが、その一方でこのように複雑な操作と多額の医療費を必要とする医療が広く世界に受け入れられていくにはクリアーすべき問題が多い。
何らかの方法で膀胱そのものの優れた修復能を十分に引き出すことができれば、細胞移植のような複雑な方法をとらなくとも十分な膀胱の再生をもたらしうる可能性はあり、そのような治療法の開発が現在の課題である。
発明の開示
本発明は、これら問題点を解決した、すなわち、膀胱のみならず、他の様々な生体組織又は臓器の再建にも使用でき、生体適合性に優れ、グラフト収縮をもたらさず、操作が簡便であり、経済的にも低廉な、組織修復能を引き出す組織又は臓器再建用基材を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、本発明を完成した。
本発明は、脱細胞化組織マトリックスと細胞成長因子とを含むことを特徴とする、生体組織又は臓器の再生を誘導し、生体組織又は臓器を再生して修復する機能を持つ生体組織又は臓器の再建用基材である。
本発明における脱細胞化組織マトリックスとは、生体組織又は臓器の細胞成分の大部分が除去されており、多孔性の細胞外マトリックスが残存しているものをいい、あらゆる生体組織又は臓器から脱細胞処理を施して作製したもの全てを含む。
脱細胞化組織マトリックスを得ることができる組織又は臓器としては、生体組織又は臓器であれば特に制限はないが、たとえば、食道、膀胱、尿道、小腸、肝臓、肺、骨格筋、平滑筋、心筋、腎臓、骨、軟骨、皮膚、毛髪、脳、神経、筋肉、血管、膵臓、網膜、角膜、横隔膜、心膜、漿膜、羊膜、腱、靭帯、大腸、十二指腸、気管、精輸管、卵管、尿管及びリンパ管などが挙げられる。好ましくは、膀胱、小腸及び食道などであり、特に好ましくは膀胱である。
本発明における細胞成長因子には、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ａＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩなど一般に細胞成長因子（細胞増殖因子）と呼ばれているもの、あるいはインターロイキン、サイトカイン、生理活性ペプチド類及びケモカイン類などが含まれるが、好ましくはｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＣＴＧＦ及びＰＤＧＦであり、特に好ましくはｂＦＧＦである。また、これら成長因子は、単独でも、２種類以上の組み合わせでも、使用することができる。具体的には、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ／ＨＧＦなどの組み合わせが考えられる。
本発明に使用できるｂＦＧＦは、脳下垂体、脳、網膜、黄体、副腎などの臓器より抽出されたもの、組換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学的手法で製造されたもの、さらに、これらの修飾体であって線維芽細胞成長因子として作用し得るものを含む。ｂＦＧＦの修飾体としては、上記の抽出又は遺伝子工学的手法で得られたｂＦＧＦのアミノ酸配列においてアミノ酸が付加、置換又は欠失したものを挙げることができる。本発明において使用できるｂＦＧＦとして、好ましくは、たとえば、ＷＯ８７／０１７２８、ＷＯ８９／０４８３２、特に前者に記載されたものが挙げられる。
本発明の組織又は臓器再建用基材における細胞成長因子の量は、脱細胞化組織マトリックスや細胞成長因子の種類、再建すべき組織もしくは臓器の種類、病変部位、病変の程度、患者の状態などによって異なるが、たとえば、脱細胞化組織マトリックス１ｇ中に、１，０００〜１００，０００μｇ、好ましくは５，０００〜５０，０００μｇ、より好ましくは２，０００〜３０，０００μｇである。
本発明における再建すべき組織又は臓器としては、生体組織又は臓器であれば特に限定されないが、たとえば食道、膀胱、尿道、小腸、肝臓、肺、骨格筋、平滑筋、心筋、腎臓、骨、軟骨、皮膚、毛髪、脳、神経、筋肉、血管、膵臓、網膜、角膜、横隔膜、心膜、漿膜、羊膜、腱、靭帯、大腸、十二指腸、気管、精輸管、卵管、尿管及びリンパ管などが挙げられ、好ましくは、膀胱、小腸、尿道であり、特に好ましくは膀胱である。
本発明の組織又は臓器再建用基材において、脱細胞化組織マトリックスを得るための組織又は臓器と再建すべき組織又は臓器は同一でも、異なっていても良いが、両方の組織又は臓器が同一であることが好ましい場合もある。
発明を実施するための最良の形態
本発明の組織又は臓器再建用基材は、脱細胞化組織マトリックスに細胞成長因子を含有させることにより製造することができる。
脱細胞化組織マトリックスは、前記したような組織又は臓器から常法、たとえばＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤処理又はそれ以外の公知の処理、例えば、繰り返し凍結融解、浸透圧変化などにより細胞を破壊する方法にしたがって調製することができる。脱細胞化組織マトリックスは、凍結乾燥して保存し、その後に使用することもできる。
細胞成長因子を脱細胞化組織マトリックスに含有させる方法としては、細胞成長因子を脱細胞化組織マトリックスに均一に分布させることができる方法であれば特に限定されず、たとえば、脱細胞化組織マトリックスに細胞成長因子溶液を含浸する方法、脱細胞化組織マトリックスを凍結乾燥し、これに細胞成長因子溶液を含浸又は添加する方法を例示できる。
本発明の組織又は臓器再建用基材は、たとえば先天性疾患による組織機能障害がある場合、癌などにより組織又は臓器を切除した場合、糖尿病などの合併症により創傷治癒力が劣っている場合又は周辺組織の感染などにより創傷治癒力が劣っている場合などに、その組織又は臓器の再建に効果的に使用することができる。
本発明の再建用基材による組織又は臓器の再建は、たとえば、再建用基材をグラフトとして用い、再建すべき組織又は臓器をパッチ修復することにより行うことができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明を限定するものではない。
実施例１：ラット膀胱からの脱細胞化組織マトリックスの作製とその形態学的評価
（方法）
２５０〜３００ｇのラットの膀胱を摘出し、周囲組織を切除した後に下記の方法で脱細胞化を行った。
１）１０ｍＭ  ＰＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム溶液を加え、３７℃で６時間、震盪した。
２）０．１Ｍ  ＰＢＳを加え、室温にて数分間洗浄した。
３）１Ｍ  ＮａＣｌ＋２０００Ｋｕｎｉｔｚ  ｕｎｉｔｓ  ＤＮａｓｅ  Ｉを加え、３７℃で６時間震盪した。
４）４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ水溶液を加え、３７℃で６時間震盪した。
５）７０％エタノールを加え、１時間洗浄した。これを３回繰り返した。
６）蒸留水を加え、１時間洗浄した。これを３回繰り返した。
得られた脱細胞化組織マトリックスを、１０％ホルマリンで固定後、ＨＥ染色標本を作製し、光学顕微鏡で形態を記録した。又、別の標本を２．５％グルタルアルデヒド水溶液で固定、脱水、ｔ−ブチルアルコールで置換後、凍結乾燥し、白金蒸着でコートした後、走査型電子顕微鏡で観察記録した。
（結果）図１の（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、得られた脱細胞化組織マトリックスでは、膀胱の細胞成分の大部分が除去されており、細胞外マトリックスの多孔性の組織が残存していた。
実施例２：凍結乾燥した脱細胞化組織マトリックスの水溶液含浸による細胞成長因子の結合方法及び水溶液中での結合状態の評価
（方法）
上記方法で作製したマトリックスを、蒸留水内で、−８０℃で１２時間凍結後、真空ポンプを用いて、４８時間凍結乾燥した。これにｂＦＧＦ水溶液を含浸し、３７℃で１時間静置することで、細胞成長因子を含有する脱細胞化組織マトリックスを作製した。これとは別に、凍結乾燥前のマトリックスにｂＦＧＦ水溶液を含浸させた。
１２５Ｉで放射ラベル化した１００〜２００μＭの塩基性線維芽細胞成長因子（以下ｂＦＧＦと略す）水溶液を、ラットのマトリックス１個分（乾燥重量１０〜１２ｍｇ）あたり２０μｌずつ含浸して、細胞成長因子を含有する脱細胞化組織マトリックスを得（図２）、これを１ｍｌのＰＢＳ内又は尿中にて３７℃で震盪し、一定時間後の溶液内の放射活性をガンマカウンター定量し、ｂＦＧＦとマトリックスとの相互作用を評価した。
（結果）
脱細胞化組織マトリックスに含浸させたｂＦＧＦは、凍結乾燥前後にかかわらず、最初の２４時間に一定量が脱着し、以後はプラートに達した（図３）。凍結乾燥したマトリックスでは、乾燥前のマトリックスを使用した場合よりも放出が抑制されていた。また、尿中での放出は、ＰＢＳ内よりもさらに低かった。
（考察）
この方法により、一定量のｂＦＧＦをマトリックスに付着させることが可能である。また、このマトリックスを尿道の再建に使用しても、尿中に大量に失われることはないと考えられた。
実施例３：細胞成長因子の生体内での減衰とマトリックスの分解の相関の評価
（方法）
ｂＦＧＦの生体内での放出実験：上で述べたのと同様の方法で作製した放射ラベル化した細胞成長因子を含有するマトリックスを、６週令のメスｄｄＹマウスの背部皮下に埋入し、以後、経時的にこれを犠牲死させて、マトリックス及び周辺組織の残存放射活性を測定して、ｂＦＧＦの残留を検討した。
マトリックスの分解実験：Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いて１２５Ｉで放射ラベル化した脱細胞化組織マトリックスを上記と同様の方法で、マウス皮下に埋入し、生体内での分解速度を調べた。
（結果）
ｂＦＧＦは、埋入後６週間に渡り、徐々に減衰していった。また、マトリックスの分解もこれと同様の経過を取った（図４）。
脱細胞化組織マトリックスに結合したｂＦＧＦは、マトリックスの分解とともに、生体内から消失していくと考えられる。
実施例４：生体内での、細胞成長因子活性の残存の評価
（方法）
ラット膀胱からの脱細胞化組織マトリックス５ｍｇに５μｇのｂＦＧＦを含む水溶液又はＰＢＳ１０μｌを、上記と同様の方法で含浸し、一群はそのまま上記と同様の方法でマウス皮下に埋入し、残りの二群はディフージョンチャンバー内に封入して上記と同様の方法で、マウス皮下に埋入した。これを、７又は１４日後に取り出した後に、マトリックスのみを別のマウスの皮下に再埋入した。いずれの群もマトリックス埋入（又は再埋入）７日後に、マウスを犠牲死させて、マトリックスの周囲２ｃｍ四方の皮下組織を採取し、組織重量などを評価した。
（結果）
ｂＦＧＦを含浸させたマトリックスでは、２週間以上に渡って、マトリックス周囲での肉芽形成を認めた（図５）。
（考察）
マトリックスに結合したｂＦＧＦの活性は生体内に埋入しても保たれていると考えられた。
実施例５：ｂＦＧＦを含有させたラット膀胱からの脱細胞化組織マトリックスによる膀胱パッチ修復手術、使用ｂＦＧＦ濃度とマトリックスグラフト上での膀胱再生像、パッチサイズの関係の検討。
（方法）
ラットの膀胱を脱細胞化処理し、そこから膀胱頂部２／３に当たる部分を取り出し、様々な濃度のｂＦＧＦを含有させた脱細胞化組織マトリックスを作製した。別の１０週齢のメスＷｉｓｔａｒラットに、キシラジン−ケタミン麻酔を施し、下腹部を正中切開して膀胱を露出し、膀胱の頂部側２／３を切除し、上記脱細胞化組織マトリックスをグラフトとして用い、この欠損部分をパッチ修復した。
膀胱とグラフトとの縫合は、８−０の吸収糸を用い、連続縫合し、４隅を７−０ナイロン糸でマーキングした。修復終了後に、尿道よりチューブを入れて生理食塩水を注入してリークのないことを確認し、同時に充満時のグラフトサイズをマーキング糸の長短径として記録した。
０，５，２５，１００μｇのｂＦＧＦを含む脱細胞化組織マトリックスについて、各９匹のグループを作製し、術後４週目に４匹を、１２週目に５匹を評価した。各々をＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ群とした。また、コントロールとして膀胱２／３切除後にそのまま縫合閉鎖したグループを６匹作製し、４，１２週後に各３匹づつを評価した。
ウレタン（９００ｍｇ／ｋｇ，ｓｃ）麻酔下に下腹部を切開して膀胱を露出し、尿道から３Ｆｒのポリエチレンチューブを留置した。チューブの端にＴ字管を連結し、一方は圧トランスデューサーに、他方は注入ポンプに接続した。創部より膀胱を圧排して空虚としてから、注入ルートより６．０ｍｌ／ｈｒの速度で生理食塩水を注入して膀胱内圧の測定を行い、尿道留置チューブ周囲からの注入液のリークをもって最大膀胱容量とした。検査は一個体につき５回連続して行い、中間値３回分の平均値をその個体の膀胱容量とした。
検査終了後にラットを犠牲死させ、膀胱を空虚な状態としてから、膀胱容量と同等量の１０％ホルマリン又はＫｒｅｂｓ液を注入後、外尿道口をクランプし、マーキング糸の間の距離を測定した。グラフト面積は長径×短径／２で定義した。
各群において４週目の全てと１２週目の３匹づつについて、組織をホルマリン固定後、写真を撮影し、脱水、パラフィン包埋、ＨＥ染色を施行した。
（結果）
４週目の時点で、いずれの群においても上皮の再生は完了していた。粘膜下層では、ｂＦＧＦの濃度が高いほどグラフト内に浸潤する間葉系細胞の量が多かった（図６〜７）。またこの時点において、ｂＦＧＦの濃度に依存してグラフト面積の収縮が抑制されていた（図８）。
１２週目の時点では、各群において平滑筋層の形成が認められた（図９）。
発明の効果
本発明の組織又は臓器再建用基材は、膀胱再建のパッチ修復のような組織又は臓器の再建において使用でき、生体適合性に優れ、グラフト修復をもたらさず、簡便で経済的にも低廉な方法で組織修復能を引き出すことができる。
本発明の組織又は臓器再建用基材は、細胞増殖因子を徐放し組織から基材への細胞の侵入を促進させることで、従来の生体由来足場材料では得られないグラフトの収縮を抑制する効果を有する。しかも、本発明の方法は、従来の生体由来足場材料に細胞を入れる方法より、簡便性に優れている。
【図面の簡単な説明】
図１は、ラット膀胱からの脱細胞化組織マトリックスの図（Ａ）及びそのＨＥ染色結果（Ｂ）である。
図２は、ラット膀胱からの脱細胞化組織マトリックスの調製及びこれに細胞成長因子を含有させる工程における、脱細胞化処理前のラット膀胱（１）、ラット膀胱からの脱細胞化組織マトリックス（２）、凍結乾燥後の脱細胞化組織マトリックス（３）及び細胞成長因子水溶液に含浸後の脱細胞化組織マトリックス（４）である。
図３は、水溶液（ＰＢＳ）中における、細胞成長因子を含有させた脱細胞化組織マトリックスからの細胞成長因子の放出を示すグラフである。
図４は、マウス皮下における、脱細胞化組織マトリックスの分解、及び脱細胞化組織マトリックスに含有させた細胞成長因子の減衰を示すグラフである。
図５は、生体内に一定期間埋入した細胞成長因子を含有させた脱細胞化組織マトリックスのマウス皮下への埋め直し後７日目の肉芽形成能を示すグラフ（上部）と肉眼像を示す図（下部）である。
図６は、術後４週後のＡ群、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群のラットのグラフト上での膀胱組織のＨＥ染色結果（それぞれ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ））である。
図７は、術後４週間後のＡ群、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群のラットの膀胱（それぞれ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ））である。矢印で囲まれた領域がグラフト部位である。
図８は、術後４週間後のＡ群、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群のラットのグラフト面積を示すグラフである。
図９は、術後１２週間後のＡ群、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群のラットのグラフト上での膀胱組織のＨＥ染色結果（それぞれ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ））である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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