(57)【要約】免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することによって、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で大量に増殖させる。さらに、このようにして増殖させたヒト肝細胞を用いて前記の操作を繰り返すことによって、大量のヒト肝細胞を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することにより、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させることを特徴とするヒト肝細胞増殖方法。
【請求項２】
ヒト補体の攻撃から防御させた状態が、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも１回、補体抑制剤を投与すること；
（ｂ）免疫不全肝障害マウスとして、免疫不全肝障害マウスとｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ／ＣＤ５５）トランスジェニックマウスを交配して得られた子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方である請求項１のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項３】
免疫不全肝障害マウスが、遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスである請求項１または２のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項４】
子孫マウスが、ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスである請求項３のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項５】
ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスに、肝細胞増殖阻害物質を投与した後、ヒト肝細胞を移植する請求項４のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項６】
ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与する請求項１から５のいずれかのヒト肝細胞増殖方法。
【請求項７】
免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、増殖性ヒト肝細胞である請求項１のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項８】
増殖性ヒト肝細胞が、コロニーを形成しながら増殖するヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞である請求項７のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）が産生するモノクローナル抗体である請求項８のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項１０】
以下のステップ（１）〜（３）：
（１）免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することによって、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させるステップ；
（２）マウス肝臓から増殖したヒト肝細胞を単離するステップ；および
（３）単離したヒト肝細胞を、免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを５０日以上飼育するステップ、
からなり、ステップ（２）および（３）を１回以上繰り返すことを特徴とするヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１１】
ステップ（１）および／または（３）におけるヒト補体の攻撃から防御させた状態が、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも１回、補体抑制剤を投与すること；
（ｂ）免疫不全肝障害マウスとして、免疫不全肝障害マウスとｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ／ＣＤ５５）トランスジェニックマウスを交配して得られた子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方である請求項１０のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１２】
ステップ（１）および／または（３）において、免疫不全肝障害マウスが、遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスである請求項１０または１１のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１３】
子孫マウスが、ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスである請求項１２のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１４】
ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスに肝細胞増殖阻害物質を投与した後、ヒト肝細胞を移植する請求項１３のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１５】
ステップ（１）および／または（３）において、ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与する請求項１０から１４のいずれかのヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１６】
ステップ（１）および／または（３）において免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、増殖性ヒト肝細胞である請求項１０のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１７】
増殖性ヒト肝細胞が、コロニーを形成しながら増殖するヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞である請求項１６のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１８】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）が産生するモノクローナル抗体である請求項１７のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１９】
ステップ（２）において、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する；および
（ｂ）非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、実質的にヒト肝細胞のみを単離する請求項１０のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項２０】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生するモノクローナル抗体である請求項１９のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項２１】
請求項１から９のいずれかのヒト肝細胞増殖方法、または請求項１０から２０のいずれかのヒト肝細胞大量増殖方法によって増殖させたヒト肝細胞を肝臓内に有するキメラマウス。
【請求項２２】
増殖したヒト肝細胞が、肝臓内の細胞の７０％以上を占めている請求項２１のキメラマウス。
【請求項２３】
ヒト型Ｐ４５０活性を有する請求項２１または２２のキメラマウス。
【請求項２４】
請求項２１、２２または２３のキメラマウスの肝臓からヒト肝細胞を単離することを特徴とするヒト肝細胞取得方法。
【請求項２５】
以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する；および
（ｂ）非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、実質的にヒト肝細胞のみを単離する請求項２４のヒト肝細胞取得方法。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生するモノクローナル抗体である請求項２５の取得方法。
【請求項２７】
請求項２４から２６のいずれかの方法によって取得されたヒト肝細胞。
【請求項２８】
請求項２７のヒト肝細胞を含む細胞キット。
【請求項２９】
請求項２７のヒト肝細胞を充填したハイブリッド型人工肝臓。
【請求項３０】
非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項３１】
Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生する請求項３０のモノクローナル抗体。
【請求項３２】
Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）。
【請求項３３】
請求項２１、２２または２３のキメラマウスに候補物質を全身投与し、候補物質の薬物動態または毒性を試験する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、マウス体内でヒト肝細胞を増殖させる方法、肝臓内にヒト肝細胞を有するキメラマウス、キメラマウスからのヒト肝細胞の取得方法と、これによって取得されたヒト肝細胞に関するものである。このようにしてキメラマウスから得られたヒト肝細胞は、肝細胞キットや体外型人工肝臓の材料となる。
背景技術
肝臓は５００種類以上もの多種多様な特異機能を有する。肝臓の主な機能として、血漿蛋白質の合成分泌、糖新生やグリコーゲン代謝による血糖調節、脂質合成、尿素合成、胆汁合成分泌、解毒などが挙げられる。
体内に取り込まれた物質の多くは肝臓で代謝される。医薬品開発の領域では、医薬品候補物質が肝臓でどのような代謝を受け、肝臓やその他の臓器や組織にどのような影響を与えるかは必須のデータである。さらに、これまで多くの化学物質が合成され環境へも放出されている。これらの物質が個々に、あるいは複合して人体にどのような影響をおよぼすかを解明することは、社会的にも非常に重要であり、このような化学物質の人体への影響評価にも肝機能に対する毒性試験が必要とされている。
医薬品候補物質をはじめとする化学物質の安全性試験や薬物代謝試験には、現在のところ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等が使われている。特に医薬品開発ではヒトを対象とする第一相試験へ入る前に、動物を用いた毒性試験・安全性試験が義務づけられているが、これには多大な時間と労力を必要とし、投資額も莫大なものとなる。
しかしながら、これらの動物実験で得られるデータがそのままヒトに適応される保証はない。事実、動物実験では毒性の認められなかった物質がヒトに対して毒性を示す例は多く、また逆の場合もあり得る。したがって、これまで多くの医薬品候補物質がヒトを対象とする第一相試験に入ってから開発中止となったり、また、動物実験では毒性が強いために臨床試験に入る前に開発中止となった物質においても、実際にはヒトには毒性が認められないケースも多く存在しているものと予想される。
このことは、ヒトの肝臓における代謝機能とマウスやラットの肝臓における代謝機能の違いが起因していると考えられている。最近では、ヒト肝細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝試験や毒性試験が行われるようになった。ところが、移植に用いられなかった脳死患者の肝臓や腫瘍摘出などによる切除肝から得られるヒト肝細胞の量は需要をはるかに下回っている。したがって、ヒト肝細胞の増殖技術の開発は医薬品開発において必要とされている。
また、大量のヒト肝細胞の必要性は、体外型人工肝臓においても同様である。人工肝臓は、人工的に肝臓機能を代行するための医療装置であり、吸着、透析、濾過等の物理化学的原理に基づく人工的な作用と、摘出肝や肝組織の潅流による生物学的作用を組み合わせたハイブリッド型の人工肝臓の開発が精力的に進められている。この人工肝臓の開発に当たっては、物理化学的機能を向上させるための膜や回路の性能向上とともに、ヒトへの適用が可能な大量の肝細胞の供給が不可欠とされている。
しかしながら、ヒトの肝細胞については、これまで成熟個体から単離した初代細胞を継代的に培養することは不可能であるとされてきた。すなわち、接着依存性の成熟肝細胞は、その継代操作のために培養基質から剥離する際に大きく損傷し、また培養基質に再接着させることも困難なためである。これに対し、この出願の発明者らは、ヒト肝臓から分離した正常肝細胞からクローン性増殖能を有する小型肝細胞を単離し、この小型肝細胞を初代培養し、さらにこの培養肝細胞を継代培養して肝細胞を増殖させる方法を発明し、特許を取得している（特開平０８−１１２０９２号公報；日本特許第３２６６７６６号；米国特許第６，００４，８１０号、特開平１０−１７９１４８号公報：日本特許第３２１１９４１号、特開平７−２７４９５１公報；日本特許第３１５７９８４号、特開平９−３１３１７２号公報；日本特許第３０１４３２２号）。
この特許発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで肝細胞を増殖させて大量のヒト肝細胞を得るための新しい手段を提供するものであるが、長期間の継代培養中に幾つかの肝機能が低下してしまうという問題点を有していた。このため、例えば肝機能を維持するための薬剤のスクリーニング系として、あるいは長期間の継代培養後も保存されている特定の機能について薬剤の毒性や薬効を試験する系としては有用であるが、ヒト肝機能代替としての肝細胞として、またはハイブリット型人工肝臓の材料としては不十分な点も存在する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝細胞の増殖における以上のとおりの問題点を解消するための手段として、動物個体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でヒト肝細胞を増殖させる方法が提案されている。
例えば、Ｈｅｃｋｅｌらは、アルブミンウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス（ｕＰＡ−Ｔｇマウス）を作製している。このマウスにおいては、アルブミンのエンハンサーとプロモーターにウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）遺伝子が接続してあるため、肝臓特異的にｕＰＡ蛋白が合成される（Ｈｅｃｋｅｌ  ＪＬ，Ｓａｎｄｇｒｅｎ  ＥＰ，Ｄｅｇｅｎ  ＪＬ，Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ＲＤ，ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｅｒ  ＲＬ．Ｎｅｏｎａｔａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ６２：４４７−４５６，１９９０）。肝細胞はｕＰＡ蛋白による傷害で、肉眼的には白色を呈し、出血や肝不全により死亡する個体もみられる。このマウスの脾臓よりｌａｃＺトランスジェニックマウスの正常肝細胞を移植すると、肝臓に生着・増殖し、最終的にはドナー肝細胞で置き換わることが知られている（Ｒｈｉｍ  ＪＡ，Ｓａｎｄｇｒｅｎ  ＥＰ，Ｄｅｇｅｎ  ＪＬ，Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ＲＤ，ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ＲＬ．Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１１４９−１１５２，１９９４）。さらにＲｈｉｍらは、ｕＰＡ−Ｔｇマウスと胸腺を生まれつき欠損しているためＴ細胞の機能を持たないＮＵＤＥマウスを掛け合わせ、ｕＰＡ−Ｔｇ／ＮＵＤＥマウスを作製した。ｕＰＡ−Ｔｇ／ＮＵＤＥマウスにラットの肝細胞を移植することにより、ラット肝細胞を持つマウスを作製した（Ｒｈｉｍ  ＪＡ，Ｓａｎｄｇｒｅｎ  ＥＰ，Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ＲＤ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ＲＬ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４９４２−４９４６，１９９５）。しかし、このマウスを用いたヒト肝細胞を持つキメラマウスの報告はない。
Ｄａｎｄｒｉらは、ｕＰＡ−Ｔｇマウスと免疫不全の性質を持つノックアウトマウスＲａｇ２マウスを掛け合わせ、ｕＰＡ−Ｔｇ／Ｒａｇ２マウスを作製した。ｕＰＡ−Ｔｇ（＋／−）／Ｒａｇ２マウスの肝臓へヒトの肝臓から採取したヒト肝細胞を移植し、マウス肝臓の１５％が置き換わったことを示した。彼らはこのマウスへのＢ型肝炎ウィルスの感染に成功している（Ｄａｎｄｒｉ  Ｍ，Ｂｕｒｄａ  ＭＲ，Ｔｏｒｏｋ  Ｂ，Ｐｏｌｌｏｋ  ＪＭ，Ｉｗａｎｓｋａ  Ａ，Ｓｏｍｍｅｒ  Ｇ，Ｒｏｇｉｅｒｓ  Ｘ，Ｒｏｇｌｅｒ  ＣＥ，Ｇｕｐｔａ  Ｓ，Ｗｉｌｌ  Ｈ，Ｇｒｅｔｅｎ  Ｈ，ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｊ．Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３：９８１−９８８，２００１）。
また、この出願の発明者らは、先に特許出願した発明（特開２００２−４５０８７号公報）において、免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスとｕＰＡ−Ｔｇマウスとを掛け合わせたｕＰＡ−Ｔｇ／ＳＣＩＤマウスにヒト肝細胞を移植し、この移植肝細胞が実質的にマウスの肝機能を担っているキメラマウスを開示している。この先願発明のキメラマウスは、ｕＰＡ遺伝子の発現によってマウス肝細胞が機能不全となっているため、その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれている。このため、移植したヒト肝細胞の個体内機能を正しく評価することができ、被検物質の毒性や薬効を判定するための実験動物個体としては極めて有用である。しかしながら、この先願発明のキメラマウスの場合には、ヒト肝細胞の移植から５０日以上は生存することができず、また成長の過程で正常化したマウス肝細胞が増殖するため、移植ヒト肝細胞の増殖効率は低く、ヒト肝細胞の置換率は約５０％程度にとどまっていた。
このことはまた、最近のＭｅｒｃｅｒらの報告（Ｍｅｒｃｅｒ  ＤＦ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＤＥ，Ｅｌｉｉｏｔｔ  ＪＦ，Ｄｏｕｇｌｕｓ  ＤＦ，Ｈａｏ  Ｃ，Ｒｉｃｎｆｒｅｔ  Ａ，Ａｄｄｉｓｏｎ  ＷＲ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＫＰ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  ＴＡ，Ｌａｋｅｙ  ＪＲＴ，Ｔｙｒｒｅｌｌ  ＤＬＪ  ａｎｄ  Ｋｅｔｅｍａｎ  ＮＭ．Ｈｅｐａｔｉｔｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒｓ．Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：９２７−９３３，２００１）によっても裏付けられている。Ｍｅｒｃｅｒらは、この出願の発明者らと同様にしてｕＰＡ−Ｔｇ／ＳＣＩＤを作製し、凍結保存したヒト肝細胞を融解して移植した結果、マウス血清中に２ｍｇ／ｍｌ未満のヒトアルブミンが検出され（血液中に換算すると約１ｍｇ／ｍｌ未満）、肝臓の約５０％がヒト肝細胞で置き換わったことを報告している。
以上のとおり、免疫不全肝障害マウス（ｕＰＡ−Ｔｇ／ＳＣＩＤマウス）にヒト肝細胞を移植してキメラマウスを作製することは、そのキメラマウス自体に有用性（例えば、ヒト肝細胞に対する毒性や薬効のｉｎ  ｖｉｖｏ試験等）は存在するものの、マウス個体内で移植肝細胞を大量に増殖させるための手段としては、不十分であった。
また、ヒト肝細胞を移植したキメラマウスは長期間生存することができず、また成長の過程でマウス肝細胞が増殖してしまうため、ヒト肝細胞に対する毒性や薬効のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系としてもその利用対象が限定されていた。
この出願の発明は、ヒト肝細胞の増殖方法として、マウス体内でヒト肝細胞を十分に増殖させるための改良された方法を提供することを課題としている。
また、長期間生存することによって、マウス体内で増殖したヒト肝細胞を分離回収する方法を提供することも課題としている。
さらに、分離したヒト肝細胞を複数のマウスに移植してマウス体内で増殖させることにより一定の規格のヒト肝細胞を体内に持つキメラマウスを大量に得ること、そのマウスから分離した一定規格のヒト肝細胞を大量に得る方法を提供することも課題としている。
さらには、分離したヒト肝細胞の利用方法を提供することを課題としている。
またさらに、この出願は、前記の各発明を実施するために有用なモノクローナル抗体や、そのモノクローナル抗体を産生する新規ハイブリドーマ細胞株を提供することを課題としてもいる。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することにより、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させることを特徴とするヒト肝細胞増殖方法を提供する。
この第１発明の方法においては、ヒト補体の攻撃から防御させた状態が、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも１回、補体抑制剤を投与すること；
（ｂ）免疫不全肝障害マウスとして、免疫不全肝障害マウスとｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ／ＣＤ５５）トランスジェニックマウスを交配して得られた子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方であることを好ましい態様としている。
またこの第１発明の方法においては、免疫不全肝障害マウスが、遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスであることを好ましい態様としている。さらに、この子孫マウスがヘミ接合体免疫不全肝障害マウスであること、そしてこのヘミ接合体免疫不全肝障害マウスに肝細胞増殖阻害物質を投与した後、ヒト肝細胞を移植することをそれぞれ好ましい態様としてもいる。
さらにこの第１発明およびその好ましい前記態様においては、ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与することを別の好ましい態様としている。
この第１発明の方法においては、また、免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、増殖性ヒト肝細胞であること、その増殖性ヒト肝細胞が、増殖性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞であること、そしてモノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）が産生するモノクローナル抗体であることをそれぞれ好ましい態様としている。
この出願は、第２の発明として、以下のステップ（１）〜（３）：
（１）免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することによって、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させるステップ；
（２）マウス肝臓から増殖したヒト肝細胞を単離するステップ；および
（３）単離したヒト肝細胞を、免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを５０日以上飼育するステップ、
からなり、ステップ（２）および（３）を１回以上繰り返すことを特徴とするヒト肝細胞大量増殖方法を提供する。
この第２発明の方法においては、ステップ（１）および／または（３）におけるヒト補体の攻撃から防御させた状態が、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも１回、補体抑制剤を投与すること；
（ｂ）免疫不全肝障害マウスとして、免疫不全肝障害マウスとｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ／ＣＤ５５）トランスジェニックマウスを交配して得られた子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方であることを好ましい態様としている。
またこの第２発明の方法においては、前記ステップ（１）および／または（３）において、免疫不全肝障害マウスが、遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスであること、子孫マウスがヘミ接合体免疫不全肝障害マウスであること、そして、このヘミ接合体免疫不全肝障害マウスに肝細胞増殖阻害物質を投与した後、ヒト肝細胞を移植することをそれぞれ好ましい態様としている。
さらにこの第２発明および前記の好ましい態様においては、前記ステップ（１）および／または（３）において、ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与することを別の好ましい態様としてもいる。
またさらに、この第２発明の方法においては、前記ステップ（１）および／または（３）において免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、増殖性ヒト肝細胞であること、増殖性ヒト肝細胞がコロニーを形成しながら増殖するヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞であること、そしてモノクローナル抗体がＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）が産生するモノクローナル抗体であることをそれぞれ好ましい態様としている。
この第２発明の方法においては、さらに、前記ステップ（２）において、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する；および
（ｂ）非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、実質的にヒト肝細胞のみを単離することを好ましい態様としている。そして、この態様においては、モノクローナル抗体がＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生するモノクローナル抗体であることをさらに好ましい態様としている。
この出願は、第３の発明として、前記の第１発明または第２発明の方法によって増殖させたヒト肝細胞を肝臓内に有するキメラマウスを提供する。
この第３発明のキメラマウスは、増殖したヒト肝細胞が肝臓内の細胞の７０％以上を占めていること、および／またはヒト型Ｐ４５０活性を有することを好ましい態様としている。
この出願はさらに、第４の発明として、前記第３発明のキメラマウスの肝臓からヒト肝細胞を単離することを特徴とするヒト肝細胞取得方法を提供する。
第４発明の方法においては、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する；および
（ｂ）非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、実質的にヒト肝細胞のみを単離することを好ましい態様としている。そしてこの態様においては、モノクローナル抗体がＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生するモノクローナル抗体であることをさらに好ましい態様としている。
この出願は、第５の発明として、前記第４発明の方法によって取得されたヒト肝細胞を提供する。
さらにこの出願は、第６の発明として、前記第５発明のヒト肝細胞を含む細胞キットを提供する。
さらにまた、この出願は、第７の発明として、前記第５発明のヒト肝細胞を充填したハイブリッド型人工肝臓を提供する。
さらにまた、この出願は、第８の発明として、非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。この第８発明の一例は、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生するモノクローナル抗体である。
この出願はまたさらに、第９の発明として、前記第３発明のキメラマウスに候補物質を全身投与し、候補物質の薬物動態または毒性を試験する方法を提供する。
以上の各発明における態様や用語、概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
発明を実施するための最良の形態
第１発明のヒト肝細胞増殖方法は、ヒト肝細胞を免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でこのレシピエントマウスを飼育することにより、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させることを特徴とする。
前記のＭｅｒｃｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：９２７−９３３，２００１）は免疫不全肝障害マウス（ｕＰＡ−Ｔｇ／ＳＣＩＤマウス）を作製し、凍結保存したヒト肝細胞を融解してマウスに移植した結果、肝臓の５０％程度がヒト肝細胞で置き換わったことを報告している。しかしながら、Ｍｅｒｃｅｒらの作製したヒト肝細胞移植マウスは、移植したヒト肝細胞の高い置換率が達成できていない。
第１発明の方法は、移植したヒト肝細胞が作る補体がマウス本体を攻撃することを防止することによって、ヒト肝細胞移植マウスを５０日以上も生存させることを可能としている。そして、このように５０日以上もマウスを生存させることによって、マウス肝臓の細胞を、７０％以上ヒト肝細胞に置換させることを可能とするものである。
ヒト補体の攻撃からレシピエントマウスを防御するための第１の具体的手段は、「補正抑制剤」をレシピエントマウスに投与することである。補体抑制剤としては、ｎａｆａｍｏｓｔａｔ  ｍｅｓｉｌａｔｅ（フサンＲ；鳥居製薬）、ｇａｂｅｘａｔｅ  ｍｅｓｉｌａｔｅ（ＦＯＹＲ；小野製薬）、ｃｏｍｏｓｔａｔ  ｍｅｓｉｌａｔｅ（フオイパンＲ；小野製薬）、ｃｏｂｒａｖｅｎｏｍ  ｆａｃｔｏｒ（コブラ毒）等を用いることができる。なお、これらの補体抑制剤は、細胞移植や臓器移植の際に使用される薬剤である。ただし、通常の移植術においては、補体抑制剤は、レシピエントの肝臓が産生する補体が移植細胞や移植臓器を攻撃することを防ぐために使用される。一方、この発明においては、レシピエントマウスは肝障害のために自らは補体を産生しないと考えられるため、補体抑制剤は、移植したヒト肝細胞が産生する補体がレシピエントマウスを攻撃することを防ぐために使用される。
ヒト補体の攻撃からレシピエントマウスを防御するための第２の具体的手段は、レシピエントマウスとして、免疫不全肝障害マウスとｈｕｍａｎ  ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ｈＤＡＦ／ＣＤ５５）トランスジェニックマウスとの交配により得られた子孫マウスを使用することである。ｈＤＡＦ／ＣＤ５５トランスジェニックマウスは、腎臓、心臓、肺、肝臓等の内皮細胞表面においてｈＤＡＦを高発現しており、ヒト補体に対する耐性能を有することが報告されている（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｈ，Ｔａｋａｈａｇｉ  Ｙ，Ｙｏｓｈｉｔａｔｓｕ  Ｍ，Ｍｉｙａｇａｗａ  Ｓ，Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｔｏｙｏｍｕｒａ  Ｋ，Ｓｈｉｇｅｈｉｓａ  Ｔ，Ｓｈｉｒａｋｕｒａ  Ｒ，ａｎｄ  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｔ．Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＭＣＰ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＡＦ（ＣＤ５５）ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１：５８３−５９７，１９９９／２０００；ｖａｎ  Ｄｅｎｄｅｒｅｎ  ＢＪＷ，Ｐｅａｒｓｅ  ＭＪ，Ｋａｔｅｒｅｌｏｓ  Ｍ，Ｎｏｔｔｌｅ  ＭＢ，Ｄｕ  Ｚ−Ｔ，Ａｍｉｎｉａｎ  Ａ，Ａｄａｍ  ＷＲ，Ｓｈｅｎｏｙ−Ｓｃａｒｉａ  Ａ，Ｌｕｂｌｉｎ  ＤＭ，Ｓｈｉｎｋｅｌ  ＴＡ，ａｎｄ  Ｄ’Ａｐｉｃｅ  ＡＪＦ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＤ５５）ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｔｔａｃｋ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６１：５８２−５８８，１９９６）。従って、このｈＤＡＦ／ＣＤ５５トランスジェニックマウスと免疫不全肝障害マウスとの子孫動物であるレシピエントマウスは、移植ヒト肝細胞の産生するヒト補体に対して高い耐性能を有している。ｈＤＡＦ／ＣＤ５５トランスジェニックマウスは、前記の文献（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１：５８３−５９７，１９９９／２０００およびＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６１：５８２−５８８，１９９６）に従い、例えば広く様々な組織、器官で発現しているｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＣＰ）やＨ２Ｋ（ｂ）（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ）のプロモーター制御下でｈＤＡＦが発現するように構築したベクターを用いて、公知のトランスジェニックマウス作製法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０）により作製することができる。
第１発明のヒト肝細胞増殖方法に使用する「免疫不全肝障害マウス」は、マウス本来の肝細胞が障害を受けている「肝障害マウス」であり、かつ、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない「免疫不全マウス」である。従って、免疫不全肝障害マウスは、肝障害誘発処置と免疫不全処置とを同一マウス個体に施すことによって作製することができる。肝障害誘発処置は、例えば公知の肝障害誘発物質（例えば、四塩化炭素、Ｄ−ガラクトサミン、２−アセチルアミノフルオレン、ピロロジンアルカロイドなど）による処理、あるいは外科的な肝切除等である。また、免疫不全処置としては、免疫抑制剤の投与や胸腺摘出等である。
ただし、この第１発明の方法では、遺伝的な肝障害形質を有するマウスと遺伝的に免疫不全であるマウスとを交配し、その子孫個体として得られた免疫不全肝障害マウスを使用することを好ましい態様としている。遺伝的肝障害マウスとしては、前記Ｒｈｉｍら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，１１４９（１９９４））が作成したｕＰＡ−Ｔｇマウスを例示することができる。あるいは肝障害を生じさせる遺伝子（例えば、ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ遺伝子等）を用い、公知のトランスジェニック法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０）によりトランスジェニック免疫不全肝障害マウスを作成することもできる。また、肝機能を担う遺伝子（例えば、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子等）を公知のジーンターゲティング法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，１９８９）によってノックアウトすることによっても、遺伝的な肝障害を有するマウスを得ることができる。一方、遺伝的な免疫不全マウスとしては、ＳＣＩＤマウス、ＮＵＤＥマウス、ＲＡＧ２ノックアウトマウス等の公知のマウスを使用することができる。以下、このようにして得られたマウスを「遺伝的免疫不全肝障害マウス」と記載する。
遺伝的免疫不全肝障害マウスは、肝障害遺伝子がホモ接合体であるマウスを用いることが好ましい。このようなホモ接合体マウスは正常な肝細胞がほとんど増殖しないため、ヒト肝細胞の増殖をマウス肝細胞が妨げることがない。ただし、このようなホモ接合体マウスは、ヘミ接合体同士を掛け合わせた場合、確率的に１／４の割合でしか得ることができない。
一方、肝障害遺伝子がヘミ接合体である遺伝的免疫不全肝障害マウス（「ヘミ接合体免疫不全肝障害マウス」）は、ヘミ接合体同士を掛け合わせた場合、またはヘミ接合体とＳＣＩＤマウスを掛け合わせた場合１／２の確立で得ることができるため、第１発明の低コストでの実施が可能となる。しかし、ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスは、２倍体染色体の一方の遺伝子が正常であるため、肝障害遺伝子の欠失により正常肝細胞がコロニーを形成しながら増殖して生後７週頃にはマウス肝臓を正常なマウス肝細胞が占めるようなる。このため、一般的には、ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスはヒト肝細胞を増殖させるためのレシピエントマウスとして適さない。そこでこの第１発明の好ましい態様として、ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスにヒト肝細胞を移植する前に、肝細胞特異的に増殖を阻害する物質を投与し、正常化したマウス肝細胞が増殖してコロニーを形成することを予防する。肝細胞増殖阻害物質としては、たとえばｐｙｒｒｏｌｉｚｉｄｉｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄの一種であるｒｅｔｒｏｒｓｉｎｅ、ｌａｓｉｏｃａｒｐｉｎｅ、ｓｅｎｅｃｉｐｈｙｌｌｉｎｅ、ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ、ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｎｅ等を例示することができる。
第１発明の方法において、移植に用いるヒト肝細胞は、正常なヒト肝組織から常法によって単離したものを用いることができる。この第１発明の方法においては、特にｉｎ  ｖｉｖｏで活発な増殖能を有する増殖性肝細胞を使用することを好ましい態様としている。なおこの発明において、「増殖性ヒト肝細胞」とは、培養条件下（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、単一細胞種の集団としてのコロニーを形成し、そのコロニーを増大させるように増殖するヒト肝細胞を意味する。また、その増殖は、コロニー構成細胞が単一種であるという点において「クローン性増殖」という場合もある。さらに、このような細胞は、継代培養によって細胞数をさらに増加することができる細胞である。
このような増殖性ヒト肝細胞は、一例として、この出願の発明者らが発明したヒト小型肝細胞を用いることができる。すなわち、この出願の発明者は、ラットあるいはヒトの肝臓に増殖能の高い小型肝細胞が含まれることを見いだし、すでに特許出願している（特開平０８−１１２０９２号公報；日本特許第３２６６７６６号；米国特許第６，００４，８１０号、特開平１０−１７９１４８号公報：日本特許第３２１１９４１号、特開平７−２７４９５１公報；日本特許第３１５７９８４号、特開平９−３１３１７２号公報；日本特許第３０１４３２２号）。また、関連の論文も発表している（Ｃｈｉｓｅ  Ｔａｔｅｎｏ，ａｎｄ  Ｋａｔｓｕｔｏｓｈｉ  Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ：Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｂｏｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １４９：１５９３−１６０５，１９９６．Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｈｉｎｏ，Ｃｈｉｓｅ  Ｔａｔｅｎｏ，Ｈａｊｉｍｅ  Ｓａｔｏ，Ｃｈｉｈｉｒｏ  Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｓｈｉｇｅｒｕ  Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ  Ｋｏｈａｓｈｉ，Ａｋｉｏ  Ａｒａｔａｎｉ，Ｔｏｓｈｉｍａｓａ  Ａｓａｈａｒａ，Ｋｉｙｏｈｉｋｏ  Ｄｏｈｉ，ａｎｄ  Ｋａｔｓｕｔｏｓｈｉ  Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ：Ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｓｈｏｗ  ａ  ｈｉｇｈ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２５６：１８４−１９１，１９９９．Ｃｈｉｓｅ  Ｔａｔｅｎｏ，Ｋａｏｒｉ  Ｔａｋａｉ−Ｋａｊｉｈａｒａ，Ｃｈｉｈｉｒｏ  Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｈａｊｉｍｅ  Ｓａｔｏ，ａｎｄ  Ｋａｔｓｕｔｏｓｈｉ  Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３１：６５−７４，２０００．Ｓｈｉｇｅｒｕ  Ｋａｔａｙａｍａ，Ｃｈｉｓｅ  Ｔａｔｅｎｏ，Ｔｏｓｈｉｍａｓａ  Ａｓａｈａｒａ，ａｎｄ  Ｋａｔｓｕｔｏｓｈｉ  Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ：Ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５８：９７−１０５，２００１．）。このヒト小型肝細胞は、その優れた増殖能によって、レシピエントの体内で急速に増殖し、正常な肝機能を発揮しうるヒト肝細胞集団を短時間で形成することができる。
このような小型肝細胞の採取は、前記の先願発明に記載されているような遠心分離を用いた方法の他、エルトリエーターやＦＡＣＳ等の細胞分画装置によっても採取することができる。さらには、コロニーを形成しながら増殖する肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって採取することもできる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させたヒト肝細胞、凍結保存肝細胞、テロメラーゼ遺伝子等の導入により不死化させた肝細胞、これらの肝細胞と非実質細胞を混合させたものでも可能である。
増殖性ヒト肝細胞の別の例は、増殖性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体（実施例６）によって認識されたヒト肝細胞である。このようなモノクローナル抗体が認識する増殖性ヒト肝細胞は、抗体への標識に応じて、公知のＥＩＡ、ＲＩＡ、蛍光抗体法等により高純度で得ることができる。具体的には、例えば、ヒト肝臓から分離した肝細胞集団に、酵素、放射性同位体、磁気ビーズ、または蛍光色素等で標識したモノクローナル抗体を接触させ、標識シグナルを発する細胞を単離することによって行うことができる。標識として使用する酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、標識シグナルの検出は、酵素を用いる場合には酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
以上のとおりのヒト肝細胞、とくに増殖性ヒト肝細胞を免疫不全肝障害マウスに移植するには、実施例に示したように、マウスの脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、直接門脈から移植することも可能である。移植するヒト肝細胞の数は、１〜１００００個程度とすることができる。
さらにこの第１発明の方法では、ヒト肝細胞を移植したマウスに、抗マウスＦａｓ抗体を投与することを好ましい態様の一つとしている。抗マウスＦａｓ抗体は、マウス肝細胞のＦａｓ抗原に反応し、アポトーシスを誘導する作用を持つ。ヒト肝細胞を移植したマウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与することにより、マウスの肝細胞はアポトーシスを起こし、死滅する。この抗体はヒト肝細胞には影響を与えないため、移植したヒト肝細胞のみが選択的に増殖することができる。この方法により、マウス肝臓におけるヒト肝細胞による置換率をさらに上昇させることが可能となる。
次に、第２発明のヒト肝細胞大量増殖方法について説明する。
第２発明の方法は、以下のステップ（１）〜（３）を行うことを特徴とする。ステップ（１）：第１発明の方法と同様にしてヒト肝細胞をマウス肝臓内で増殖させる。
ステップ（２）：マウス肝臓内で増殖したヒト肝細胞を単離する。
ステップ（３）：単離したヒト肝細胞を、免疫不全肝障害マウスにそれぞれ移植し、第１発明の方法と同様にしてヒト肝細胞を増殖させる。
そして、この第２発明の方法は、前記ステップ（２）および（３）を１回以上繰り返す。すなわち、ステップ（１）において１匹のマウスに移植したヒト肝細胞は、そのマウス肝臓内で約１００倍まで増加する。従って、ステップ（２）において増殖ヒト肝細胞が全て回収されれば、ステップ（３）においては、原理的には、１００匹のマウスにヒト肝細胞を移植することができ、最終的には、最初に移植したヒト肝細胞の１００×１００倍のヒト肝細胞を回収することができる。さらに、ステップ（２）および（３）を２回繰り返すことによって、最初に移植したヒト肝細胞の１００×１００×１００倍のヒト肝細胞を回収することができる。
この第２発明の方法では、ステップ（１）および／またはステップ（３）を前記の第１発明方法またはその好ましい態様方法と同一にして行うことができる。ここで、「および／または」とは、前記第１発明方法における１つの要件を、ステップ（１）でのみ行ってもよく、ステップ（３）でのみ行ってもよく、あるいはステップ（１）および（３）の両方で行ってもよいことを意味する。例えば、ステップ（１）では、前記のモノクローナル抗体（第８発明）によって認識されたヒト増殖性肝細胞をマウスに移植し、ステップ（３）では回収されたヒト肝細胞の全てを移植用として使用するようにしてもよい。前記第１発明における各要件は、ヒト肝細胞を増殖させたマウス個体、またはマウスから回収したヒト肝細胞の用途等に応じて、適宜に選択して行うことができる。
第２発明のステップ（２）は、ステップ（１）［ステップ（２）および（３）を繰り返す場合は、その直前のステップ］において増殖させたヒト肝細胞をマウス肝臓から単離するステップである。分離方法は様々な方法（例えば、コラゲナーゼ灌流法等）を採用することができるが、以下の方法（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方を行うことが好ましい。
方法（ａ）：
マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理することによって、実質的にヒト肝細胞のみを回収する。コラゲナーゼの細胞毒性は、マウス肝細胞に対する方がヒト肝細胞に対するより高いため、コラゲナーゼによる消化時間を調節することにより、マウス肝細胞にダメージを与え、ヒト肝細胞のみを分取することもできる。コラゲナーゼ処理の時間は、ヒト肝細胞とマウス肝細胞との割合によっても異なるが、例えば、ヒト肝細胞が７０％以上の場合は、８〜２０分間程度の処理を行えばよい。
方法（ｂ）：
非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体（第８発明）によって認識された細胞を単離することによって、純度の高いヒト肝細胞を回収する。このようなモノクローナル抗体としては、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７５１）が産生するモノクローナル抗体を例示することができる。
この出願の第３発明は、前記の第１発明または第２発明の方法によって増殖させたヒト肝細胞を肝臓内に有する「キメラマウス」である。このキメラマウスは、好ましくはヒト肝細胞の移植から５０日以上、さらに好ましくは７０日以上生存したマウスである。またこのキメラマウスは、マウス肝臓の７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９８％以上がヒト肝細胞で占められているマウスである。またさらに、このキメラマウスは、ヒトのシトクロムＰ４５０活性を有するマウスである。すなわち、ヒト型Ｐ４５０はＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４等、数十種類の分子種が存在するが、この発明のキメラマウスは、これらのヒト型Ｐ４５０をそれぞれヒト肝細胞と実質的に同程度に発現していることを特徴の一つとしている。シトクロムＰ４５０は肝臓における外来性化学物質の代謝等に関与するタンパク質であり、ヒト型Ｐ４５０を発現するマウス肝臓は、ヒト肝臓と実質的に同様にして化学物質等を代謝する。従って、この第３発明のキメラマウスは、例えば薬剤の薬効や毒性がヒト肝細胞に及ぼす影響を試験する方法（第９発明）を可能とする。なお、このようなキメラマウスの利用は、この出願の発明者らによる先願発明（特開２００２−４５０８７号公報：キメラ動物）を参照することができる。また、第２発明の大量増殖方法によって増殖させたヒト肝細胞を肝臓内に有するキメラマウスの集団は、同一のヒト由来の肝細胞をそれぞれに有するキメラマウスの集団であり、大規模な試験を実質的に均一な条件で行うことを可能にする。
この出願の第４発明は、前記第３発明のキメラマウスからヒト肝細胞を単離する方法である。この方法は、前記第２発明のステップ（２）と同様にして行うことができる。
この出願の第５発明は、前記第４発明の方法によってキメラマウスの肝臓から単離したヒト肝細胞である。このヒト肝細胞は、マウス個体内で増殖したことによって、実質的にヒト肝臓組織の正常肝細胞と同一の肝機能を有している。従って、この第５発明のヒト肝細胞によって、薬物代謝試験や安全性試験などに用いることができるヒト肝細胞キット（第６発明）や、ハイブリッド型人工肝臓（第７発明）が提供される。さらに、ハイブリッド型人工肝臓に使用するモジュール（ヒト肝細胞を充填したモジュール）を使用して、ヒト肝細胞が生産する有用物質を回収することできる。
肝細胞キットは、細胞の種類や用途に応じて各種のもの公知であり、当業者であれば、第５発明のヒト肝細胞と公知の細胞キットの構成を採用することによって、第６発明の細胞キットを容易に作製することができる。また、モジュールやハイブリッド型人工臓器の構成も公知であり、当業者であれば第７発明の人工肝臓等を容易に作製することができる。
この出願は、さらに第８の発明として、非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。
このモノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”Ｊａｍｅｓ  Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）に従い、例えば以下の様な手順で作製することができる。
１：ハイブリドーマ細胞の作製
継代培養したヒト正常肝細胞を含む免疫原を用いて哺乳動物を免疫し、必要に応じて適宜に追加免疫して動物を充分に感化する。次いでこの動物から抗体産生細胞（リンパ細胞または脾臓細胞）を摘出し、これとミエローマ（骨髄種）細胞株との融合細胞を得る。そして、これらの融合細胞株から、目的とするモノクローナル抗体を産生する細胞を選択し、培養することによって、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。以下、各工程を詳しく説明する。
ａ）免疫原の調製
正常肝組織からコラゲナーゼで分離したヒト肝細胞を継代培養し、免疫原とする。ヒト肝細胞は、４回以上、好ましくは６回以上の継代が可能な、例えば１５歳以下のヒト肝組織から分離したものを使用することが好ましい。
ｂ）動物の免疫
被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等である。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点からは、マウスまたはラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＲ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＲＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではｌｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週齢は５〜１２週齢が好ましい。
動物の免疫は、免疫原である継代ヒト肝細胞を、１０４〜１０８個程度、動物の皮内または腹腔内に投与することによって行うことができる。免疫原の投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数１〜６回、複数回の場合は投与間隔１〜２週間が好ましい。
ｃ）細胞融合
上記の投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
次いで、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ，ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、アミノプテリン存在下で生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞および融合細胞をＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
ｄ）ハイブリドーマのスクリーニング
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光抗体法等により行うことができる。
このようなスクリーニングによって、非ヒト肝細胞とは結合せず、ヒト肝細胞のみと特異的に結合するモノクローナル抗体をそれぞれに産生するハイブリドーマ細胞群が得られる。
なお、スクリーニング後のハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。この出願は、このようなハイブリドーマ細胞の具体例として、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）を提供する。
２：モノクローナル抗体の取得および精製
上記１で作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法で培養することによって、非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞のみと特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
培養は、例えば、前記のクローニング法で使用した同じ組成の培地中で培養してもよく、あるいはモノクローナル抗体を大量に産生するためには、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取してもよい。
このようにして得たモノクローナル抗体は、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
この出願は、モノクローナル抗体の具体例として、前記のハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６）が産生するモノクローナル抗体を提供する。
この第８発明のモノクローナル抗体は、前記第２発明および第４発明の方法において、マウス肝臓からヒト肝細胞のみを分離するために使用することができる。また、この第８発明のモノクローナル抗体は、非ヒト肝細胞は認識しないため、マウス以外の非ヒト動物の体内でヒト肝細胞を増殖させた場合、あるいは非ヒト肝細胞とヒト肝細胞を混合培養した場合に、ヒト肝細胞を単離、精製するために使用することができる。
なお、この出願の発明で使用する「増殖性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体」も、スクリーニング工程において目的抗体を産生するハイブリドーマを選択することを除き、前記と同一の方法で作成することができる（実施例６参照）。この出願は、そのようなモノクローナル抗体の具体例として、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）が産生するモノクローナル抗体を提供する。
実施例
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１
ヒト肝細胞を増殖させたキメラマウスの作成
免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、肝臓内でヒト肝細胞を増殖させたキメラマウスを作製した。作成の材料、方法、および各種試験の結果は以下のとおりであった。
１  材料
（ａ）アルブミンウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベータートランスジェニックマウス
（ｕＰＡ−Ｔｇ）：Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（Ａｌｂ１Ｐｌａｕ）１４４Ｂｒｉ（ｂ）スキッドマウス（Ｓｃｉｄ）：Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ  Ｓｃｉｄｊｃｌ
（ｃ）ｎａｆａｍｏｓｔａｔ  ｍｅｓｉｌａｔｅ
（ｄ）ｒｅｔｒｏｒｓｉｎｅレトロルシン
（ｅ）ヒト肝細胞
なお、マウス（ａ）は  Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、マウス（ｂ）は日本クレアよりそれぞれ購入した。薬品（ｃ）は鳥居製薬社製（商品名：フサン）、（ｄ）はＳＩＧＭＡ社製を購入した。
また、細胞（ｅ）は以下のとおりに調製した。肝切除術を行う患者にインフォームドコンセントを実施し、承諾を得た後に切除肝より正常肝臓組織を得て、ＵＷ液で灌流し、４℃で運搬した。正常肝臓組織からコラゲナーゼ処理により肝臓分散液を得た。低速遠心分離法（５０ｇ、２分）で沈殿と上澄みに分離し、それぞれに含まれる細胞（上澄み：小型肝細胞、沈殿：肝実質細胞）を培地で洗浄後、肝細胞数をカウントした。凍結保存する場合は、凍結保存液（クラボウ製）を加え、プログラムフリーザーを用いて凍結した。液体窒素に保存してある沈殿または上澄みの肝細胞を３７℃の恒温水槽で融解し、細胞数をカウントした。４ｘ１０７個／ｍｌになるように、移植直前に培地で調整した。
２  方法と結果
２．１  免疫不全肝障害マウスの作製
ｕＰＡ−Ｔｇマウス（ｈｅｍｉｚｙｇｏｔｅ，＋／−）とＳＣＩＤマウス（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ，＋／−）を掛け合せ、両方の形質を持つマウスＴｇ（＋／−）／ＳＣＩＤ（＋／−）を３５．２％の確率で得た。Ｔｇ（＋／−）とＴｇ（−／−）の識別は、Ｔｇ遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムＰＣＲ法により行った。また、ＳＣＩＤ（＋／−）とＳＣＩＤ（−／−）の識別は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により行った。
次に、得られたＴｇ（＋／−）／ＳＣＩＤ（＋／−）を  ＳＣＩＤ（＋／＋）と戻し交配させ、Ｔｇ（＋／−）／ＳＣＩＤ（＋／＋）を得た。その結果、Ｔｇ（＋／−）は３７．９％出現し、ＳＣＩＤ（＋／＋）は５２．８％出現した。Ｔｇ（＋／−）／ＳＣＩＤ（＋／＋）同士を交配させ、目的のＴｇ（＋／−）／ＳＣＩＤ（＋／＋）およびＴｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤ（＋／＋）を得た。
なお、ｕＰＡ遺伝子のホモとヘテロの識別は以下の方法で行った。
生後８〜１０日目のマウスの尾を約５ｍｍ切断し、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの濃度および純度を吸光度計を用いて測定した。ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ２５μｌ，ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ  １μｌ，ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ  １μｌ，Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ  １μｌにＤＮＡと蒸留水を加え、全量を５０μｌに調整し、定量性ＰＣＲを行った（ＡＢＩ７７００，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。プライマーおよびＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅはｕＰＡ遺伝子導入のためのベクターに含まれるヒト成長ホルモンのコード配列を対象として以下のとおりに設計した。
2003080821.tif 000002
またとコントロールとして、マウスＧ３ＰＤＨを対象とする以下のプライマーおよびＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅを用いた。
2003080821.tif 000003
ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分変性の後、９５℃で１５秒変性と６０℃で１分伸長を５０サイクル行った。ヒト成長ホルモンのコード配列の増幅断片の量を、内部コントロールのマウスＧ３ＰＤＨコード配列の増幅断片量で割った相対値により、ゲノムＤＮＡ中の導入遺伝子の量を比較した。標準曲線はサンプルの中のヘテロかホモのマウスのゲノムの希釈系列を用いた。標準に用いたマウスの値を１とし、そのマウスがヘテロだった場合は、ヘテロが１に近い数値を示し、ホモは２に近い数値を示す。標準に用いたマウスがホモだった場合は、ホモが１に近い数値を示し、ヘテロは０．５に近い数値を示す。解剖時の肉眼所見により、この方法による正答率は約９０％と推定している。
２．２  ｕＰＡ−Ｔｇ／ＳＣＩＤマウスへのヒト肝細胞の移植
生後１４〜４８日目のＴｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤ（＋／＋）マウスをエーテルで麻酔し、脇腹を約５ｍｍ切開し、脾頭より４−８×１０７個／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を１０−１２．５μｌずつ（４−１０×１０５個）注入した後、止血した。腹腔に止血剤ｅ−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ）を０．０２ｇ／ｍｌの濃度で４０μｌずつ投与し、脾臓を腹腔に戻し縫合した。Ｔｇマウスの肝細胞で作られたｕＰＡは細胞外へ分泌されるため、血中のｕＰＡ濃度が高い。ｕＰＡは、蛋白質分解やｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎからｐｌａｓｍｉｎへの活性化を触媒したり、ｆｉｂｒｉｎ  ｃｌｏｔを分解する働きがある。このため、生後、多くのマウスが、腸管や腹腔内で出血をおこし生後４日以内に死に至るといわれている。手術時の出血による死亡を避けるため、ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒおよびｐｌａｓｍｉｎの作用を阻止し止血作用の効果を有するｅ−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄを投与した。
掛け合わせに用いたＳＣＩＤ／Ｃ．Ｂ−１７マウスは、Ｔ細胞Ｂ細胞は持たないが、ＮＫ細胞を持つことが知られている。そこで、移植したヒト肝細胞がマウスのＮＫ細胞に攻撃されないように、ＮＫ活性を阻害するａｓｉａｌｏ  ＧＭ１抗体を移植前日と移植翌日に腹腔内に投与した。生後４週で離乳させ、生後５週から雌雄を別ケージで飼育した。
２．３  マウス血中におけるヒトアルブミンのモニタリング
ヒト肝細胞移植後１週間目より、週１回または２回ずつマウスの尾より血液を１０μｌ採血し、ヒトアルブミン濃度をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて測定した。
ヒト肝細胞を移植した１９匹のＴｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウス中１１匹のマウス血中でヒトアルブミンが増加し（図１）、高いもので、８ｍｇ／ｍｌ以上に達し、この値はマウス血中アルブミンの６２％に相当した。
また、ヒト肝細胞の低速遠心分離による上澄み中の細胞（小型肝細胞）と沈殿中の細胞（肝実質細胞）をそれぞれ移植した場合の血中ヒトアルブミン濃度を比較したところ、肝実質細胞移植マウスよりも小型肝細胞移植マウスの方がアルブミン濃度の上昇を示した（図２）。
２．４  ヒト肝細胞により産生されるヒト補体および補体抑制剤の投与
血中ヒトアルブミンが３ｍｇ／ｍｌを越えたマウスが急速に状態が悪くなり死亡するケースが見られた（図１）。死亡動物には肺の出血が観察され、ヒト肝細胞による補体産生による影響が認められた。マウス肝臓組織中のヒト肝細胞をヒト補体Ｃ３に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、ヒト肝細胞にＣ３の存在が確認された。そこで、ヒトアルブミン濃度が高くなったマウスに２ｍｇ／ｍｌ濃度の補体抑制剤（フサン）２００μｌを投与した。投与頻度は２日に１回から開始した。体重の変化を毎日観察し、体重減少が見られたら、投与頻度や濃度を増加していった（図３）。その結果、血中ヒトアルブミン濃度が２ｍｇ／ｍｌを越えたマウスには補体抑制剤（フサン）を隔日、４ｍｇ／ｍｌを越えたマウスには毎日、さらに６ｍｇ／ｍｌを越えたマウスには１日２回投与することとした（図３）。この処理により、血中ヒトアルブミン濃度が３ｍｇ／ｍｌを越えてもマウスが長期間生存でき、高いもので８ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミンを検出できるようになった（図１）。
さらに、補体抑制剤（フサン）を投与しないキメラマウスと、投与したキメラマウスのそれぞれの血中ヒト補体（ｈＣ３ａ）をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、補体投与キメラマウスのｈＣ３ａ濃度は、非投与キメラマウスに比較して低いことが確認された（図４）。
２．５  ビタミンＣおよびＳＣＩＤマウス血清の投与
ヒト肝細胞はビタミンＣを合成できないため、ヒト肝細胞で置換された肝臓を持つマウスはビタミンＣ欠乏症となる可能性が考えられた。そのため、ヒト肝細胞を移植したマウスにはａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅを１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした飲料水を与えた（日本クレア、アスコルビン酸合成能欠如ラットの飼育方法を参考にした）。
また、ヒト肝細胞を移植したＴｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスはＴｇ（＋／−）／ＳＣＩＤマウスに比べて体重増加が遅く毛並みも悪い。マウス肝臓中のヒト肝細胞が合成する蛋白や酵素などがマウスの成長や体の維持に不十分である可能性が考えられたので、ＳＣＩＤマウス血清を５０μｌずつ週に１回皮下に投与した。ＳＣＩＤマウス血清を投与したものと投与していないＴｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスの体重増加量を比較したところ、投与したマウスの方が上回った。
２．６  マウス肝臓の肉眼的病理検査および組織学的病理検査
マウスをエーテル麻酔下で採血し、血清中アルブミンおよびＧＰＴ値を測定した。肝臓と脾臓を摘出し、重量測定、写真撮影後に凍結切片ブロック、パラフィン切片ブロック用にサンプリングし、残りのサンプルからマイクロゾーム画分を抽出した。ヒトアルブミン濃度が高くなるに従って、血清アルブミン量の増加およびＧＰＴ値の低下が認められた（図５）。
ヒトアルブミンが高値のマウスでは、肝臓全体が桃色を呈し、１部にＴｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤの特徴である白色部位が残っているマウスも見られた。また、１部が赤色を呈した肝臓も見られ、その部位はｕＰＡ導入遺伝子の欠損により正常化したマウスの肝細胞と考えられた。
肝臓のそれぞれの葉の凍結切片を作製し、ヒト特異的ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８／１８抗体（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ，Ｏｈｉｏ）を反応させた後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ＤＡＫＯ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ＴＭ（ＤＡＫＯ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，ＣＡ）で染色した。それぞれの葉について、切片面積あたりのｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８／１８陽性部位の割合を算出した（図６、７）。ヒトアルブミン分泌量が多いマウスでは、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８／１８陽性肝細胞の面積の割合が高かった。陽性細胞が８０％を越えているマウスも観察された。
２．７  マイクロゾームにおけるＰ４５０分子種の解析
マウスから採取したマイクロゾーム画分におけるＰ４５０分子種の発現を、Ｐ４５０の分子種に対する抗体（第一化学薬品株式会社、東京）を用いてウェスタンブロット分析により検出した。その結果、ヒトアルブミンが高かったマウスにおいて、Ｐ４５０のヒト特異的な分子種であるＣＹＰ２Ｃ９の発現が認められた（図８）。
さらに、マウスから採取したマイクロゾーム画分におけるＣＹＰ２Ｃ９の活性を調べるため、マイクロゾームにＤｉｃｌｏｆｅｎａｃを添加し、Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎの測定を行った。その結果、ｕＰＡ（−／−）ＳＣＩＤマウスにはＤｉｃｌｏｆｅｎａｃ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ活性はほとんど認められず、補体抑制剤投与による誘導も認められなかった。一方、ヒト肝細胞を移植したキメラマウスにおいては、ヒト細胞への置換率が高くなるほど高いＤｉｃｌｏｆｅｎａｃ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ活性が認められ、置換率８９％のキメラマウスでは、ドナー（ヒト）のマイクロゾームにおけるそれを上回る活性が認められた（図９）。
２．８  キメラマウス肝臓におけるＰ４５０各分子種のｍＲＮＡ発現と、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎによる誘導
キメラマウス肝臓よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。６種類のヒト型Ｐ４５０分子種（ＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４）のそれぞれの遺伝子ｃＤＮＡに対するプライマーを合成し、ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＡＢＩ社）を用いて、それぞれのｍＲＮＡ発現量を定量した。その結果、置換率０％のコントロールマウスがヒト型Ｐ４５０をほとんど発現しないのに対し、キメラマウス肝臓においては全てのヒト型Ｐ４５０分子種が発現しており、それらの発現パターンはドナー（ヒト）の発現パターンと近似していた（図１０）。
さらに、キメラマウス３匹にＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ（５０μｇ／ｋｇｂ．ｗ．）を４日間腹腔内投与し、５日目に肝臓を採取し、前記と同様にして６種類のヒト型Ｐ４５０のそれぞれの発現を定量した。ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎはヒトのＣＹＰ３Ａ４発現のみを誘導することが公知である。その結果、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎを投与したキメラマウスの肝臓において、非投与マウスに比べ約５．７倍ものヒト型ＣＹＰ３Ａ４発現が確認された（図１０）。
実施例２
キメラマウスからのヒト肝細胞の分離と、
モノクローナル抗体によるヒト肝細胞純化
実施例１で作成したキメラマウスからコラゲナーゼ灌流法により肝細胞を分離した。コラゲナーゼの濃度は０．０５％、処理時間は９分とした。肝細胞には、ヒト肝細胞とマウス肝細胞が混入していると考えられるが、マウス肝細胞の方がヒト肝細胞に比べて、コラゲナーゼによる毒性が高いため、分離した肝細胞の多く（約８０％）はヒト肝細胞により占められていた。
さらに、ヒト肝細胞の純度を上げるため、マウス肝細胞は認識せずに、ヒト肝細胞の表面を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体（実施例６で作成したハイブリドーマ  Ｋ８２１６が産生するモノクローナル抗体）を用いてヒト肝細胞のみを分離した。コラゲナーゼ灌流により分離したヒト肝細胞の占める割合が約８０％であったマウスの肝細胞に上記抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ抗体を反応させ、ＦＡＣＳを用いてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ抗体に反応した細胞を分離した。その結果、ヒト肝細胞の純度が９５％以上となった。
実施例３
キメラマウスから単離したヒト肝細胞のｕＰＡ−Ｔｇ／ＳＣＩＤマウスへの再移植
実施例２で単離した肝細胞を、実施例１と同様にして別のｕＰＡ−Ｔｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスに移植し、飼育した。その結果、マウス血中においてヒトアルブミン量の増加が見られた（図１１）。
実施例４
ｕＰＡ導入遺伝子の欠失による正常化マウス肝細胞の増殖抑制
ｕＰＡ−Ｔｇ（＋／−）／ＳＣＩＤマウスおよびｕＰＡ−Ｔｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスに、ｒｅｔｒｏｒｓｉｎｅ３０または６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。その結果、ｕＰＡ−Ｔｇ（＋／−）／ＳＣＩＤマウスにおけるｕＰＡ導入遺伝子の欠失（ｕＰＡ−Ｔｇ（−／−）／ＳＣＩＤ）による正常化肝細胞のコロニーが減少した（図１２）。
次いで、ｒｅｔｒｏｒｓｉｎｅを６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与したｕＰＡ−Ｔｇ（＋／−）／ＳＣＩＤマウスおよびｕＰＡ−Ｔｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスに実施例１と同様にしてヒト肝細胞を移植し、キメラマウスを作成した。その結果、ｕＰＡ−Ｔｇ（＋／−）／ＳＣＩＤマウスをレシピエントするキメラマウスにおいても、ｕＰＡ−Ｔｇ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウス由来のキメラマウスと同程度に血中ヒトアルブミン濃度が増加した。
実施例５
ヒト肝細胞キメラマウスへの抗マウスＦａｓ抗体投与
実施例１で作製したキメラマウスの１匹について、ヒト肝細胞移植から１００日経過した時点で、マウス肝細胞のＦａｓ抗原に反応してマウス肝細胞のアポトーシスを誘導する抗マウスＦａｓ抗体（０．２μｇ／ｇ  ｂ．ｗ．）を１週間間隔で２回腹腔内投与した。
結果は図１３に示したとおりである。このキメラマウスは、ヒト肝細胞移植から約８０日以降、血中のヒトアルブミン濃度が減少傾向を示したが、抗マウスＦａｓ抗体の投与により、血中ヒトアルブミン濃度を著しく上昇させた。
以上の結果、この発明の方法においては、ヒト肝細胞移植後のキメラマウスに抗Ｆａｓ抗体を投与することが、ヒト肝細胞の増殖および／または活性化に有効であることが確認された。
実施例６
ヒト増殖性肝細胞を認識するモノクローナル抗体の作製
１．ヒト肝細胞の培養
ヒト肝臓組織よりコラゲナーゼ灌流法により、細胞分散液を得た。細胞分散液を低速遠心分離（５０ｇ、２分）し、その沈殿画分を牛胎児血清、ヒト血清、ＥＧＦ、ニコチンアミド、活性持続型ビタミンＣを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を用い、マイトマイシンＣ処理したＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞と混合培養した。Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞は１０日毎に添加した。培養７日目頃よりヒト肝細胞のコロニーが観察された。コンフルエントに増殖した肝細胞をＥＤＴＡ／Ｔｒｙｐｓｉｎを用いて継代した。継代は、子供の肝細胞では６−９回継代でき、６０才以上の患者の肝細胞は３−４回しか継代できなかった（図１４）。もっとも高い増殖能を示した子供（１２才）の肝細胞を抗原として用いた（図１５）。
２．動物の免疫
上記方法により、３−５回継代培養した子供（１２才）の肝細胞を培養皿上で増やした。コンフルエントに増殖した細胞（約１×１０７個）を、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）で洗浄した後、ＰＢＳを取り除き、セルスクレーパーで掻き取って回収し、ＰＢＳ約１ｍｌに懸濁した。これを６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与した。さらに２０日後または３０日後に、同様の方法で免疫を行った。
３．細胞融合
２回の免疫後、抗体価の上昇がみられたため、３回目の免疫（ｂｏｏｓｔ）の７２時間後、１匹の免疫動物より脾臓を摘出、脾臓細胞を採取した。この脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（細胞名ＮＳ−１）を細胞融合し、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３７２ｗｅｌｌ播種、培養した。
４．ハイブリドーマのスクリーニング
１次スクリーニング（ＥＬＩＳＡ、組織染色）：
得られた融合細胞の培養上清の抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡにより測定した。測定は以下の方法により実施した。抗原として用いた継代培養肝細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、培養後ＰＢＳで洗浄、乾燥させ−８０℃で保存しておいたものに、培養上清を反応させた。次に酵素標識の抗マウスＩｇＧまたは抗マウスＩｇＭ抗体を反応させ、基質を加えて発色させ、その吸光度を測定した。その結果、融合細胞３７２サンプルの吸光度の平均は０．１４９（ＳＤ：０．０９９）で、このうち吸光度０．２０以上（８１サンプル、約２０％）のサンプルを陽性とした。また目視において、吸光度０．１５以上でも発色が確認されたことから、０．１５〜０．２０のサンプル（４６サンプル）については、組織染色を行い反応性を確認した。その中から、興味深い染色パターンを示した１３サンプルについてのみ陽性サンプルとした。選択した陽性サンプル、９４サンプルをスケールアップしてさらに培養し、培養上清を回収後、細胞を凍結保存した。
５．２次スクリーニング（ＥＬＩＳＡ、組織染色）：
１次スクリーニングで選んだ９４サンプルから、スケールアップ後の培養上清の抗原に対する反応性を１次スクリーニングと同様のＥＬＩＳＡにより測定し、陽性サンプル、８８サンプルを選んだ。さらに、これらのサンプルの、組織における反応性を組織染色により調べた。そのなかから、肝細胞の細胞膜や、門脈域の肝細胞に特異的に反応するハイブリドーマを含むサンプル、または、そこからクローニングによって得られたクローンの培養上清について、分離直後のヒト肝細胞への反応性を調べた。
組織において門脈域の肝細胞膜が染まるハイブリドーマ培養上清（Ｎｏ．２３）（図１６）について、分離直後の肝細胞表面における反応性を、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて解析した。成人男性（４６才および４９才）の肝臓からコラゲナーゼ灌流、低速遠心により得られた細胞を、このサンプルの培養上清で４℃、３０分処理し、次にＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を４℃、３０分処理することにより、ＦＡＣＳでの検出を可能にした。その結果、肝細胞集団の一部（１〜２％）の細胞がこのサンプルに反応した（図１７）。そこで、これらの細胞集団をＲ２、反応しなかった細胞集団をＲ３として分取し、培養した。また分取前の肝細胞も同様に培養した。その結果、分取前の肝細胞では、前述したように、培養７日目頃より、コロニー形成が観察された。一方、Ｒ３画分においては、コロニーを形成する細胞は観察されなかったが、Ｎｏ．２３に反応したＲ２画分において、多くのコロニーが観察された（図１８）。また、継代培養ヒト肝細胞への反応性をＦＡＣＳにより調べたところ、約８０％の細胞が陽性であった（図１９）。すなわち、継代培養ヒト肝細胞のうち培養過程で分化した細胞は認識せず、増殖性肝細胞のみを認識していると考えられた。このことから、Ｎｏ．２３には、コロニーを形成する細胞を特異的に認識するハイブリドーマが含まれている可能性が示唆された。Ｎｏ．２３サンプルからクローニングにより得られたクローンについても分離直後の肝細胞表面における反応性をＦＡＣＳを用いて解析した。その結果、同様の反応性を示すクローンが３クローン得られた。これらの中から、１クローン（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３）を２００２年３月６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに特許微生物として寄託し（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７５２）、さらに２００３年３月２０日付で国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）。
６．モノクローナル抗体の作製
前記のハイブリドーマ（Ｋ８２２３株）細胞を培養することによって、さらに、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取することにより、増殖性ヒト肝細胞と特異的に結合するモノクローナル抗体を得た。
実施例７
ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体の作製
非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞のみを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、実施例６の１次スクリーニングで選択した９４サンプルのうちＥＬＩＳＡにおいて陽性であった８８サンプルからヒト肝臓組織における組織染色により選択した。肝細胞の細胞膜が部域に関係なく一様に染まるハイブリドーマ培養上清３サンプルについて、培養ヒト肝細胞や分離直後のヒト肝細胞および非ヒト動物（マウス、ラット）肝細胞の細胞表面への反応性をＦＡＣＳを用いて解析した。成人男性（４６才または６８才）の肝臓からコラゲナーゼ灌流、低速遠心により得られた細胞を、選択した３サンプルの培養上清で４℃、３０分処理し、次にＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を４℃、３０分処理することにより、ＦＡＣＳでの検出を可能にした。ＦＡＣＳによるスクリーニングの結果、ヒトの肝細胞のみに反応し、マウスおよびラット肝細胞には反応しないハイブリドーマ（クローニング前）を１サンプル選択した。これより得られたモノクローンのハイブリドーマ培養上清、２クローンも同様の反応性を示した（図２０）。選択したハイブリドーマ培養上清での組織染色ではヒト肝組織の毛細胆管と思われる部位が染まり、その染色性において部域差は認められなかった。またマウスおよびラット肝組織はこのハイブリドーマ培養上清に対していずれも陰性であった。以上の結果より、非ヒト動物の肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識する抗−ヒト肝細胞モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られた。このハイブリドーマＫ８２１６株を２００２年３月６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに特許生物として寄託し（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７５１）、さらに２００３年３月２０日付で国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）。
このＫ８２１６株から実施例６と同様の方法で、モノクローナル抗体を得た。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ヒト肝細胞を、その機能を保持した状態で大量に増殖させることが可能となる。また、肝臓内の細胞の多くがヒト肝細胞に置換したキメラマウスが提供される。このキメラマウスやヒト肝細胞を用いた化合物の薬物代謝試験や安全性試験が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、補体抑制剤のヒトアルブミン濃度への効果を試験した結果である。
図２は、ヒト肝実質細胞と小型肝細胞をそれぞれ移植したマウスの血中アルブミン濃度を測定した結果である。
図３は、補体抑制剤のマウス体重に対する効果を試験した結果である。
図４は、キメラマウスに補体抑制剤を投与した時と投与していない時のヒト補体（ｈＣ３ａ）濃度の比較である。
図５は、マウス血中ヒトアルブミン濃度とヒト肝細胞による置換率および肝機能の相関を示したグラフである。
図６は、ヒト特異的サイトケラチン８／１８抗体による免疫染色像である。
図７は、ヒト特異的サイトケラチン８／１８抗体による免疫染色の拡大像である。
図８は、ヒト肝細胞を移植したマウス肝臓マイクロゾームにおけるヒト特異的ＣＹＰ２ＣＰのウェスタンブロット分析の結果である。
図９は、マウスまたはドナー肝臓のマイクロゾームにおけるＤｉｃｌｏｆｅｎａｃの代謝活性を示したグラフである。
図１０は、様々なヒト肝細胞置換率のキメラマウス肝臓、およびＲｉｆａｍｐｉｃｉｎを投与したキメラマウス肝臓における６種類のヒト型Ｐ４５０分子種の発現量を示したグラフである。
図１１は、ヒト肝細胞を再移植したマウス血中ヒトアルブミン濃度を試験した結果である。
図１２は、ｕＰＡ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスへのＲｅｔｒｏｒｓｉｎｅ投与の効果を試験した結果である。
図１３は、ヒト肝細胞キメラマウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与したマウス血中のヒトアルブミン濃度を試験した結果である。
図１４は、様々な年令の患者から採取した肝細胞を培養した時の増殖曲線である。
図１５は、モノクローナル抗体を作るために抗原として用いた培養ヒト肝細胞の位相差顕微鏡像である。
図１６は、ハイブリドーマ培養上清（Ｋ８２２３）の、ヒト肝細胞における反応性を蛍光抗体染色により観察した像である。
図１７は、ハイブリドーマ培養上清（Ｎｏ．２３）の、分離直後のヒト肝細胞表面における反応性をＦＡＣＳにより解析した結果である。
図１８は、ハイブリドーマ培養上清（Ｎｏ．２３）に反応した細胞集団（Ｒ２）と反応しなかった細胞集団（Ｒ３）を分取し、培養した時の位相差顕微鏡像である。
図１９は、ハイブリドーマ培養上清（Ｎｏ．２３）の、継代培養ヒト肝細胞表面における反応性をＦＡＣＳにより解析した結果である。
図２０は、ハイブリドーマ培養上清（Ｋ８２１６）の、分離直後のヒト、マウス、ラット肝細胞表面における反応性をＦＡＣＳにより解析した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１８】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月25日(2004.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させる方法において、ヒト肝細胞移植マウスを、移植ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態で飼育することを特徴とするヒト肝細胞増殖方法。
【請求項２】
ヒト補体の攻撃から防御させた状態が、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも１回、補体抑制剤を投与すること；
（ｂ）免疫不全肝障害マウスとして、免疫不全肝障害マウスとｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ／ＣＤ５５）トランスジェニックマウスを交配して得られた子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方である請求項１のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項３】
免疫不全肝障害マウスが、遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスである請求項１または２のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項４】
子孫マウスが、ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスである請求項３のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項５】
ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスに、肝細胞増殖阻害物質を投与した後、ヒト肝細胞を移植する請求項４のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項６】
ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与する請求項１から５のいずれかのヒト肝細胞増殖方法。
【請求項７】
免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、増殖性ヒト肝細胞である請求項１のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項８】
増殖性ヒト肝細胞が、コロニーを形成しながら増殖するヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞である請求項７のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）が産生するモノクローナル抗体である請求項８のヒト肝細胞増殖方法。
【請求項１０】
以下のステップ（１）〜（３）：
（１）免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させるステップ；
（２）増殖したヒト肝細胞をマウス肝臓から単離するステップ；および
（３）単離したヒト肝細胞を、免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植し、ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを５０日以上飼育するステップ、
からなり、ステップ（２）および（３）を１回以上繰り返すことによってヒト肝細胞を大量に増殖させる方法であって、ヒト肝細胞移植マウスを、移植ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態で飼育することを特徴とするヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１１】
ステップ（１）および／または（３）におけるヒト補体の攻撃から防御させた状態が、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも１回、補体抑制剤を投与すること；
（ｂ）免疫不全肝障害マウスとして、免疫不全肝障害マウスとｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ／ＣＤ５５）トランスジェニックマウスを交配して得られた子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方である請求項１０のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１２】
ステップ（１）および／または（３）において、免疫不全肝障害マウスが、遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスである請求項１０または１１のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１３】
子孫マウスが、ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスである請求項１２のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１４】
ヘミ接合体免疫不全肝障害マウスに肝細胞増殖阻害物質を投与した後、ヒト肝細胞を移植する請求項１３のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１５】
ステップ（１）および／または（３）において、ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与する請求項１０から１４のいずれかのヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１６】
ステップ（１）および／または（３）において免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、増殖性ヒト肝細胞である請求項１０のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１７】
増殖性ヒト肝細胞が、コロニーを形成しながら増殖するヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞である請求項１６のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１８】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３４）が産生するモノクローナル抗体である請求項１７のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項１９】
ステップ（２）において、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する；および
（ｂ）非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、実質的にヒト肝細胞のみを単離する請求項１０のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項２０】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生するモノクローナル抗体である請求項１９のヒト肝細胞大量増殖方法。
【請求項２１】
請求項１から９のいずれかのヒト肝細胞増殖方法、または請求項１０から２０のいずれかのヒト肝細胞大量増殖方法によって増殖させたヒト肝細胞を肝臓内に有するキメラマウスであって、増殖したヒト肝細胞が、肝臓内の細胞の７０％以上を占め、６０日以上生存することを特徴とするキメラマウス。
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
ヒト型Ｐ４５０活性を有する請求項２１または２２のキメラマウス。
【請求項２４】
請求項２１、２２または２３のキメラマウスの肝臓からヒト肝細胞を単離することを特徴とするヒト肝細胞取得方法。
【請求項２５】
以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する；および
（ｂ）非ヒト肝細胞は認識せず、ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、実質的にヒト肝細胞のみを単離する請求項２４のヒト肝細胞取得方法。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生するモノクローナル抗体である請求項２５の取得方法。
【請求項２７】
請求項２４から２６のいずれかの方法によって取得されたヒト肝細胞。
【請求項２８】
請求項２７のヒト肝細胞を含む細胞キット。
【請求項２９】
請求項２７のヒト肝細胞を充填したハイブリッド型人工肝臓。
【請求項３０】
マウス肝臓内で増殖したヒト肝細胞を認識し、該マウス肝細胞は認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項３１】
Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）が産生する請求項３０のモノクローナル抗体。
【請求項３２】
Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋ８２１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３３）。
【請求項３３】
請求項２１、２２または２３のキメラマウスに候補物質を全身投与し、候補物質の薬物動態または毒性を試験する方法。
【国際調査報告】
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