(57)【要約】宿主微生物、好ましくは非メバロン酸経路しか有しない微生物に、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを導入し発現させることにより、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物を作製する。該微生物を培養し、培養物中に大量に生成蓄積するメバロン酸を採取することにより、効率よくメバロン酸を製造できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルコエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）からメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを宿主微生物に導入することにより得られる、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にメバロン酸を生成蓄積させ、該培養物からメバロン酸を採取することを特徴とするメバロン酸の製造方法。
【請求項２】
宿主微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物が、メバロン酸経路を有しない微生物である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、およびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡからなる群より選ばれる１以上のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項８】
アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項９】
導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
ＤＮＡが、細菌、放線菌、古細菌および酵母からなる群より選ばれる１以上の微生物に由来するＤＮＡである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
ＤＮＡが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来するＤＮＡである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
導入されるＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる１以上のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＥ
（ｂ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＳ
（ｃ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｔｈｉＬ
（ｄ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｍｖａＡ
（ｅ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｈｍｃＣ
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｊ）配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
【請求項１４】
メバロン酸経路を有しない微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項１５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを発現ベクターを用いて宿主微生物に導入することにより得られる微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを宿主微生物に導入することにより得られる、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物。
【請求項１８】
宿主微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物が、メバロン酸経路を有しない微生物である、請求項１８に記載の微生物。
【請求項２０】
導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、およびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡからなる群より選ばれる１以上のＤＮＡである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２１】
アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼである、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２２】
アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２３】
ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２４】
アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２５】
導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２６】
導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２７】
ＤＮＡが、細菌、放線菌、古細菌および酵母よりなる群より選ばれる１以上の微生物に由来するＤＮＡである、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２８】
ＤＮＡが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来するＤＮＡである請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２９】
導入されるＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれる１以上のＤＮＡである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の微生物。
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＥ
（ｂ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＳ
（ｃ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｔｈｉＬ
（ｄ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｍｖａＡ
（ｅ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｈｍｃＣ
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｊ）配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
【請求項３０】
メバロン酸経路を有しない微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物である、請求項１９に記載の微生物。
【請求項３１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項３０に記載の微生物。
【請求項３２】
アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを発現ベクターを用いて宿主微生物に導入された微生物である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、メバロン酸を生成する能力を付与した組換え微生物、および該微生物を用いたメバロン酸の製造方法に関する。
背景技術
メバロン酸は、ライト等によって始めて単離された物質であり〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，５２７３，１９５６〕、生体内では、コレステロールを始めとする各種イソプレノイド化合物の構造の基本であるイソペンテニルピロリン酸の生合成中間体であることが知られている〔Ｈａｒｐｅｒ’ｓ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８３）〕。メバロン酸を経るイソペンテニルピロリン酸生合成経路はメバロン酸経路と呼ばれ、以下のような経路である。解糖などで生じるアセチルコエンザイムＡ（以下、アセチル−ＣｏＡと略す）を基質に、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの活性によりアセトアセチル−ＣｏＡへ転換し、更に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡと略す）シンターゼの活性によりＨＭＧ−ＣｏＡへ転換する、そしてＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性によりメバロン酸が生成する。メバロン酸はメバロネートキナーゼの活性により、メバロネート−５−リン酸に転換され、次にホスホメバロネートキナーゼの活性によりメバロネート−５−２リン酸へ転換し、最後にジホスホメバロネートデカルボキシラーゼの活性によりイソペンテニルピロリン酸が生成する。
なお、メバロン酸は酸型とラクトン型の２通りの構造を示すが、相互に変換することが公知である。
メバロン酸は、種々の微生物および植物等の成長促進剤として用いられ、また、ピレスノイド系農薬、ユビキノン（呼吸系補酵素）、ドリコール（多糖類の生合成必須因子）、および脂溶性ビタミン等の合成前駆体等に用いられる。また近年メバロン酸の皮膚に対する効果として、適度の湿潤感および柔軟性を付与できること（特開平０４−０９９７０７）や、老化防止作用を有すること（特開平１０−３３８６２６）が報告されていることから、化粧品の成分として用いられている。従来これらの研究には化学合成されたラセミ体が使用されており、天然型〔生体内に存在するＲ（＋）体〕のメバロン酸は入手し難いものであった。
天然型のメバロン酸の発酵法による製造は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ  ＮＲＲＬＹ−７０６９を用いた例が報告されているが〔ＵＳ３６１７４４７；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９６５（１９６８）〕、その収量は低く、７００〜１０００μｇ／ｍＬにとどまり、工業的な生産にはいたっていない。また近年同じ種であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ  ＩＦＯ０１０７〔Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８６，５８（１９８９）〕、ＡＤＫ８１０７、ＡＤＫ８１０８（特開平３−２１０１７４）を用いることで２０ｇ／Ｌ程度にまで生産性が向上している。しかし培養時間が２００時間と長く、対糖収率が低いため、工業的に有用な製造法とは言い難い。
発明の開示
工業生産に実施可能な効率の良いメバロン酸の製造方法が求められている。
イソペンテニルピロリン酸の生合成において、メバロン酸を経由する生合成経路（メバロン酸経路）に加え、メバロン酸を経由しない生合成経路（非メバロン酸経路）が微生物や植物に見出されている〔蛋白質  核酸  酵素，４２，２５９０（１９９７）〕。本発明者らは、非メバロン酸経路のみを持ちメバロン酸経路を持たない微生物はメバロン酸を代謝せず、非常に効率よくメバロン酸を製造できるとの仮定に基づき、鋭意検討し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（３２）を提供するものである。
（１）アセチルコエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）からメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを宿主微生物に導入することにより得られる、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にメバロン酸を生成蓄積させ、該培養物からメバロン酸を採取することを特徴とするメバロン酸の製造方法。
（２）宿主微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物である、（１）に記載の製造方法。
（３）アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物が、メバロン酸経路を有しない微生物である、（２）に記載の製造方法。
（４）導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、およびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡからなる群より選ばれる１以上のＤＮＡである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（５）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼである、（４）に記載の製造方法。
（６）アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである、（４）に記載の製造方法。
（７）ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである、（４）に記載の製造方法。
（８）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、（４）に記載の製造方法。
（９）導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１０）導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１１）ＤＮＡが、細菌、放線菌、古細菌および酵母からなる群より選ばれる１以上の微生物に由来するＤＮＡである、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１２）ＤＮＡが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来するＤＮＡである、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１３）導入されるＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる１以上のＤＮＡである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＥ
（ｂ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＳ
（ｃ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｔｈｉＬ
（ｄ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｍｖａＡ
（ｅ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｈｍｃＣ
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｊ）配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（１４）メバロン酸経路を有しない微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物である、（３）に記載の製造方法。
（１５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである（１４）に記載の製造方法。
（１６）アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを発現ベクターを用いて宿主微生物に導入することにより得られる微生物である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１７）アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを宿主微生物に導入することにより得られる、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物。
（１８）宿主微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物である、（１７）に記載の微生物。
（１９）アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物が、メバロン酸経路を有しない微生物である、（１８）に記載の微生物。
（２０）導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、およびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡからなる群より選ばれる１以上のＤＮＡである、（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の微生物。
（２１）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼである、（２０）に記載の微生物。
（２２）アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである、（２０）に記載の微生物。
（２３）ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである、（２０）に記載の微生物。
（２４）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフエラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、（２０）に記載の微生物。
（２５）導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡである、（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の微生物。
（２６）導入されるＤＮＡが、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡである、（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の微生物。
（２７）ＤＮＡが、細菌、放線菌、古細菌および酵母よりなる群より選ばれる１以上の微生物に由来するＤＮＡである、（１７）〜（２６）のいずれか１項に記載の微生物。
（２８）ＤＮＡが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来するＤＮＡである（１７）〜（２６）のいずれか１項に記載の微生物。
（２９）導入されるＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれる１以上のＤＮＡである、（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の微生物。
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＥ
（ｂ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＳ
（ｃ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｔｈｉＬ
（ｄ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｍｖａＡ
（ｅ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｈｍｃＣ
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｊ）配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（３０）メバロン酸経路を有しない微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物である、（１９）に記載の微生物。
（３１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである（３０）に記載の微生物。
（３２）アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡを発現ベクターを用いて宿主微生物に導入された微生物である、（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の微生物。
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物とは、メバロン酸経路上に変異を有し該能力を欠損した微生物および非メバロン酸経路しか有しない微生物である。
本明細書において、メバロン酸は、２種類存在する酸型とラクトン型の構造のいずれの構造のものでもよい。
メバロン酸経路上に変異を有し該能力を欠損した微生物においては、メバロン酸の代謝活性の弱い、あるいは該活性を有しない微生物が好ましい。
非メバロン酸経路しか有しない微生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属等に属する細菌をあげることができ、具体的にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｓｅｃｅｎｓｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３等をあげることができる。
本明細書において、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡは、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成できる生合成経路上に存在する酵素をコードするいかなるＤＮＡでもよい。該ＤＮＡとして、メバロン酸経路のうちのアセチル−ＣｏＡからメバロン酸の生成までの反応経路上の酵素（以下、メバロン酸生合成系酵素と称する）をコードするＤＮＡ等をあげることができる。
メバロン酸生合成系酵素としては、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を生成する活性を有する酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素をあげることができる。アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素としてはアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをあげることができる。アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素としてはＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをあげることができる。ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素としてはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをあげることができる。また１つの酵素蛋白質中にアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのうちの２つあるいは３つ全ての酵素活性を有する蛋白質、例えば１つの酵素でアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼとＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの両方の酵素活性を有するアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼも含まれる。
上記酵素をコードするＤＮＡとしては、上述のアセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物を宿主として発現させたときに、該微生物中でそれぞれのメバロン酸生合成系酵素として機能するものであれば、いかなる生物由来のものでもよく、また人工的な配列を有するものでもよい。宿主微生物におけるコドン使用頻度と類似したコドン使用頻度をもつ生物由来のＤＮＡあるいは、類似するように配列を改変したＤＮＡが好ましい。
以下、遺伝子工学的手法としては、断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と称する）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−２００１）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと称する）等に記載された方法を準用する。
［１］アセチル−ＣｏＡからメバロン酸への生合成に関与するＤＮＡの調製
（１）メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡの塩基配列情報の取得
メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡは公知の塩基配列情報を利用して（２）に後述する方法により調製することができる。各酵素をコードするＤＮＡの塩基配列情報はＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースを検索することにより取得できる。
本発明のメバロン酸を生合成する能力を有する微生物の作製に用いることができる、塩基配列情報が公知のメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡとしては、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＥおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＥおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｔｈｉＬ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｈｍｃＭおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｍｖａＣ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｈｍｇｓおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｈｍｇｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＭＴＨ５６２およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＭＴＨ７９２、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＭＪ０７０５およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＭＪ１５４６、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＰＡＢ２１０６およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＰＡＢ０９０６、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＰＨ１８０５およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＰＨ０６７７、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子Ｔａ０４０６およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子Ｔａ１４５５、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＴＶＮ１１６８およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＴＶＮ０１３０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＨＭＧ１およびＨＭＧ２等の微生物由来の遺伝子をあげることができる。
（２）メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡの調製
メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡは、（１）で見出された塩基配列が公知のメバロン酸生合成系酵素をコードする遺伝子を有するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属等の細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の放線菌、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属等の古細菌、Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ属等の酵母、具体的にはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等より調製することができる。
上記の微生物を、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該生物が効率的に増殖する培地を用いて、該微生物の生育に適した温度と通気条件のもとに培養する。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
該微生物の染色体ＤＮＡの塩基配列からメバロン酸生合成系酵素をコードする領域を含む領域を適当に選択する。選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ（フォワードプライマー）、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡ（リバースプライマー）をそれぞれＤＮＡ合成機により合成する。この２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲによりメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを増幅し単離することができる。ＰＣＲはモレキュラー・クローニング第３版、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に記載の方法に従って行うことができる。また、メバロン酸生合成系酵素をコードする領域の塩基配列を、宿主微生物の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該酵素の発現量をあげ、その結果としてメバロン酸の生産性を向上させることができる。例えば、開始コドンがＡＴＧでなくＧＴＧ、ＴＴＧまたはＣＴＧである場合は、開始コドンに相当する配列をＡＴＧに置換したフォワードプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、得られるメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡの開始コドンをＡＴＧに置換することができる。また、該宿主微生物での使用頻度が非常に少ないコドンについて、部位特異的変異導入法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８（１９８５）〕により、使用頻度の高いコドンに置換することができる。
必要に応じて、単離した断片を適当な大腸菌用のベクターに組み込み、ＤＮＡシークエンサーにより該断片の塩基配列を確認する。
［２］本発明の微生物の造成
本発明のメバロン酸を生合成する能力を有する微生物は、後述する宿主微生物に［１］で得られたメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを導入し発現させることにより、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を示す形質転換体として取得することができる。
メバロン酸経路を有しない宿主微生物の場合には、該微生物にアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの３種類のメバロン酸生合成系酵素を導入して発現させるか、またはアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの２種類のメバロン酸生合成系酵素を導入して発現させることにより、本発明のメバロン酸を生合成する能力を有する微生物を得ることができる。
宿主微生物が、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有しない微生物であり、しかもアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素、アセトアセチル−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸を生成する活性を有する酵素、あるいはこれらの活性のうちの２つの活性を１つの酵素蛋白質中に有する酵素を内因的に有している場合は、その酵素以外の酵素をコードするＤＮＡを導入して発現させることにより、宿主微生物にメバロン酸を生合成する能力を付与することができる。
宿主微生物が既にアセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する場合も、［１］で得られたメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを導入し発現させることにより、宿主微生物における該メバロン酸生合成系酵素が有する活性が強化され、その結果としてメバロン酸の生産性を向上させることができる。
（１）宿主微生物
宿主微生物としては、あらゆる微生物を用いることができるが、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸を生合成する能力を有する微生物、メバロン酸経路上に変異を有し該能力を欠損した微生物または非メバロン酸経路しか有しない微生物が好ましい。特に、非メバロン酸経路しか有しない微生物は、メバロン酸の代謝活性を有しないと考えられるので好ましい。
非メバロン酸経路しか有しない微生物としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属等に属する細菌、さらに具体的にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと略記する）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｓｅｃｅｎｓｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３等をあげることができる。
（２）メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを含むベクター
（ａ）発現ベクターの利用
上記［１］に記載の方法により取得したメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡから、必要に応じて、メバロン酸生合成系酵素をコードする領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え発現ベクターを作製する。
メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを挿入する発現ベクターとしては、（１）に記載の宿主微生物において自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを挿入するための制限酵素サイト、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。さらにプロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。また、形質転換体を容易に選択するため、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
発現ベクターとしては、ｐＫＫ２２３−３〔アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・バイオサイエンス社製）、ｐＥＴ−３ａ〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕、ｐＧＥＭＥＸ−１〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕、ｐＱＥ−３０〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＨＷ１５２０（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）、ｐＲＩ１０９（ＷＯ  ００／４４８８６）等のプラスミドを例示することができる。
プロモーターとしては、宿主微生物中でプロモーターの下流の遺伝子の転写を開始できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター等をあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列とメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡの開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したベクターを用いることが好ましい。［１］のメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを取得する際に、染色体ＤＮＡにおいてメバロン酸生合成系酵素をコードする領域およびその上流に存在する内因性のリボソーム結合配列を含む領域を増幅し、リボソーム結合配列として用いてもよい。
メバロン酸生合成系酵素の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡ（１つのプロモーターの下流に複数のメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを接続する場合は、最下流のメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡ）の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主微生物に２種類以上のメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを導入して発現させる場合は、各メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡについて、それぞれプロモーター、リボソーム結合配列、メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡ、転写終結配列からなるユニットを有するような構造のベクターを作製するか、１つのプロモーターの下流に、各メバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡについてリボソーム結合配列とメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡからなるユニットを順次接続し、最後のユニットの下流に転写終結配列が存在する構造を有するベクターを作製する。
以上のようにして作製されたメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターの例として、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＥを含むｐＭＶ１、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＥおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳを含むｐＭＶ２、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｔｈｉＬおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡを含むｐＭＶ４、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｔｈｉＬ、ｍｖａＡおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｈｍｃＭを含むｐＭＶ５をあげることができる。
（ｂ）内因性プロモーターによる発現
［１］のメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを取得する際に、染色体ＤＮＡにおいてメバロン酸生合成系酵素をコードする領域とともに、その上流に存在する内因性のリボソーム結合配列およびプロモーターを含む領域を増幅して取得した場合は、上記の発現ベクターを用いなくても、該ＤＮＡを宿主微生物に導入することにより、内因性のプロモーターからメバロン酸生合成系酵素を発現させることができる。導入のためには、宿主微生物で自律複製可能で、該ＤＮＡを挿入するための制限酵素サイトおよび形質転換体を容易に選択するための薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子を含むベクターに、該ＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製する。このようなＤＮＡを挿入するのに用いるベクターとしてはｐＢＲ３２２〔Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７７）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社製）等をあげることができる。
（３）宿主微生物へのメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを含むベクターの導入と形質転換体の取得
（２）で作製したメバロン酸生合成系酵素をコードするＤＮＡを含むベクターの宿主微生物への導入方法としては、（１）に記載した宿主微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。導入した宿主微生物を培養し、発現ベクター中の選択マーカーに基づく表現型の変化（薬剤に対する耐性等）に基づき、形質転換体を選択し、取得する。
以上のようにして造成されるメバロン酸を生合成する能力を有する組換え微生物として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅにアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの発現ベクターｐＭＶ２を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＶ２株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５５２にアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクダーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの発現ベクターｐＭＶ５を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＭＶ５株をあげることができる。
［３］メバロン酸の生産
（１）組換え微生物の培養
上記［２］記載の方法により得られた組換え微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、発酵に用いた菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また、プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、培養中に必要に応じて、該プロモーターに対するインデューサーを培地に添加してもよい。インデューサーとしては、例えば、ｌａｃプロモーターに対するイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、ｔｒｐプロモーターに対するインドールアクリル酸等があげられる。
培養は通常、振盪培養または通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア水等を用いて行う。
（２）培養物からのメバロン酸の採取
培養液から、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等、通常の有機化学で用いられる単離精製方法を用いて、メバロン酸を採取することができる。
採取されたメバロン酸は、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により構造の確認または定量をすることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］データベース上での遺伝子検索
アセチルコエンザイムＡアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡシンセターゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をクエリー（Ｑｕｅｒｙ）として、塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋに対してキーワード検索を行った。
その結果、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９２）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９２）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９４）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９８）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９６）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９６）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｔｈｉＬ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥ００６３８７）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｈｍｃＭ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥ００６３８８）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥ００６３８７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｍｖａＣ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００８８）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００８８）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００８８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００８６）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００８６）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｍｖａＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９０）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９０）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＢＢ０６８３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥ００１１６９）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＢＢ０６８５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥ００１１６９）等の細菌由来のこれらの酵素遺伝子の配列情報、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｈｍｇｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ０３７９０７）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｈｍｇｒ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ０３７９０７）等の放線菌由来のこれらの酵素遺伝子の配列情報、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＭＴＨ５６２（ＧｅｎＢ���ｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００９１６）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＭＴＨ７９２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００９１６）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＭＪ０７０５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００９０９）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＭＪ１５４６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００９０９）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＰＡＢ２１０６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００８６８）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＰＡＢ０９０６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００８６８）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクダーゼ遺伝子ＰＨ１８０５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００９６１）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＰＨ０６７７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿０００９６１）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子Ｔａ０４０６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ４４５０６４）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子Ｔａ１４５５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿００２５７８）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＴＶＮ１１６８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿００２６８９）およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ＴＶＮ０１３０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿００２６８９）等の古細菌由来のこれらの酵素遺伝子の配列情報、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ９６６１７）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ＨＭＧ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿００１１４５）およびＨＭＧ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＣ＿００１１４４）等の酵母由来のこれらの酵素遺伝子の配列情報、その他マウス、ヒト、シロイヌナズナ等の高等真核生物由来のこれらの酵素遺伝子の配列情報が得られた。
［実施例２］Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のメバロン酸生合成酵素遺伝子を発現する大腸菌株の造成
（１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｖａＥおよびｍｖａＳの断片の単離
実施例１で得られた配列情報のうち、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（以下、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓと略記する。）のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子ｍｖａＥおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子ｍｖａＳを含む配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２９００９２）を利用し、これらの遺伝子断片を以下のようにして取得した。配列番号１にＥ．ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＥ（以下、単にｍｖａＥと記載する）の塩基配列、配列番号２に該遺伝子がコードするアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列、配列番号３にＥ．ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＳ（以下、単にｍｖａＳと記載する）の塩基配列、配列番号４に該遺伝子がコードするＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列を示した。
まず、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １４５０８）をブレイン・ハートインフュージョン培地〔ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ；ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号５〜８に記載の配列をそれぞれ有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣ、プライマーＤと呼ぶ）を合成した。配列番号５の配列は、配列番号９の配列（ＭｖａＥを含むＥ． ｆａｅｃａｌｉｓの染色体ＤＮＡの部分配列）の１〜２４番目の配列について、ＭｖａＥの開始コドン（ｔｔｇ）をａｔｇに置換し、５’にＣｌａＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号６の配列は、配列番号９の配列の２３９５〜２４１８番目の配列と相補的な配列の５’に、ＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号７の配列は、配列番号１０の配列（ＭｖａＳを含むＥ． ｆａｅｃａｌｉｓの染色体ＤＮＡの部分配列）の１〜２０番目の配列の５’に、ＢｇｌＩＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号８の配列は、配列番号１０の配列の１１４４〜１１６６番目の配列と相補的な配列の５’に、ＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。
Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型とし、ｍｖａＥ断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢを、ｍｖａＳ断片の増幅にはプライマーＣおよびプライマーＤをそれぞれプライマーとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μＬ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ）各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＡおよびプライマーＢを用いたＰＣＲではｍｖａＥ断片に相当する約２．４ｋｂ、プライマーＣおよびプライマーＤを用いた反応ではｍｖａＳ断片に相当する約１．１ｋｂの断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。該ＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液それぞれ５μＬを用い、プライマーＡおよびプライマーＢで増幅したＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＣおよびプライマーＤで増幅したＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ｋｉｔ、ＢＩＯ  １０１社製）により、それぞれＭｖａＥを含む２．４ｋｂおよびＭｖａＳを含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
（２）ＭｖａＥを含む発現ベクターｐＭＶ１の構築
ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製可能〕０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
（１）で得られたＭｖａＥを含む２．４ｋｂ断片および４．６ｋｂの断片とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（ストラタジーン社製）をカルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ７．０）に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｍｖａＥを含むアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ発現ベクターであるｐＭＶ１を得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した。第１図に、以上の構築工程を示した。
（３）ＭｖａＥおよびＭｖａＳ各遺伝子断片を含む発現ベクターｐＭＶ２の構築  ｐＭＶ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより７ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これにブラントＤＮＡキット（宝酒造社製）によりＤＮＡ断片末端の脱リン酸化を施した。
該７ｋｂの断片およびＭｖａＳを含む１．１ｋｂの断片とライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を前述の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の方法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、ＭｖａＥおよびＭｖａＳをｔｒｐプロモーターから転写方向が順向きに挿入された構造を有する発現ベクターであるｐＭＶ２を得た。第２図に、以上の構築工程を示した。ｐＭＶ２はアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの発現ベクターである。ｐＭＶ２を含む該形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＶ２株と表記する。
［実施例３］Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＶ２株によるメバロン酸の生産
（１）試験管培養によるメバロン酸の生産
実施例２で得たＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＶ２株をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）８ｍＬの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＭ９Ｘ培地〔１６ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１４ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌクエン酸（無水）、５ｇ／Ｌペプトン（極東製）、２０ｇ／Ｌグルコース、０．８ｍｇ／ＬビタミンＢ１、２５ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、５０ｍｇ／Ｌ硫酸第一鉄七水和物、ｐＨ７．２に１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・七水和物、硫酸第一鉄七水和物は別個に蒸煮後添加〕８ｍＬの入った太型試験管に１％接種し３０℃で４８時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。コントロールとして、ベクターｐＴｒＳ３０を含む形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＴｒＳ３０株についても同様に培養し、培養上清を取得した。
各培養上清中の培養生成物をガスクロマトグラフィーを用いてＡｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７，１０１３（１９７３）に記載された方法に従って分析した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＶ２株の培養液中に３．９ｇ／Ｌのメバロン酸が生成蓄積していることを確認した。一方、ベクターｐＴｒＳ３０のみを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＴｒＳ３０株ではメバロン酸の生成は認められなかった。
（２）２Ｌジャーフャーメンターを用いたメバロン酸の生産
実施例２で得たＥ． ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＶ２株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地５０ｍＬの入った三角フラスコに接種し２８℃で１７時間培養した。
該培養液をＭ９ＸＡ培地〔７ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１ｇ／Ｌクエン酸（無水）、１ｇ／Ｌペプトン（極東製）、１０ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン七水和物、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｇ／ＬビタミンＢ１、２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、０．２ｇ／Ｌ硫酸第一鉄七水和物、ｐＨ７．２に１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム七水和物、硫酸第一鉄七水和物は別個に蒸煮後添加〕９５０ｍＬの入った２Ｌジャーファーメンターに１％接種した。培養中の培地ｐＨは１８％アンモニア水でｐＨ７．０に保持した。また９００ｒｐｍで攪拌し、かつ滅菌フィルターを介して除菌した圧縮空気を１．０ｖｖｍで通気した。培養温度は３０℃で実施した。初発添加糖切れ（２４時間後）後、滅菌６０％グルコース溶液を１時間あたり１０〜１３ｍＬの速度で供給した。
培養上清中の培養生成物をガスクロマトグラフィーを用いて分析し、培養５０時間後で培養液中に５０．２ｇ／Ｌのメバロン酸が生成蓄積していることを確認した。
［実施例４］Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のメバロン酸生合成酵素を発現する大腸菌株の造成
（１）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のｔｈｉＬ、ｍｖａＡおよびｈｍｃＭ各遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離
実施例１で得られた配列情報のうち、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（以下、Ｌ．ｌａｃｔｉｓと略記する。）のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｔｈｉＬおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｖａＡを含む配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥ００６３８７）、およびＬ．ｌａｃｔｉｓのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ遺伝子ｈｍｃＭを含む配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥ００６３８８）を利用し、これらの遺伝子断片を以下のようにして取得した。
配列番号１１にＬ．ｌａｃｔｉｓのｔｈｉＬ（以下、単にｔｈｉＬと記載する）の塩基配列、配列番号１２に該遺伝子がコードするアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、配列番号１３にＬ．ｌａｃｔｉｓのｍｖａＡ（以下、単にｍｖａＡと記載する）の塩基配列、配列番号１４に該遺伝子がコードするＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列、配列番号１５にＬ．ｌａｃｔｉｓのｈｍｃＭ（以下、単にｈｍｃＭと記載する）、配列番号１６に該遺伝子がコードするＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列を示した。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３６７５）をブレイン・ハート・インフュージョン培地（ディフコ社製）に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１７〜２０に記載の配列をそれぞれ有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦ、プライマーＧ、プライマーＨと呼ぶ）を合成した。
配列番号１７の配列は、配列番号２１の配列（ｔｈｉＬおよびＭｖａＡを含むＬ ｌａｃｔｉｓの染色体ＤＮＡの部分配列）の１〜２１番目の配列について、ｔｈｉＬの開始コドン（ｇｔｇ）をａｔｇに置換し、５’にＣｌａＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号１８の配列は、配列番号２１の配列の２４４４〜２４６４番目の配列と相補的な配列の５’に、ＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号１９の配列は、配列番号２２の配列（ｈｍｃＭを含むＬ ｌａｃｔｉｓの染色体ＤＮＡの部分配列）の１〜１７番目の配列の５’に、ＢｇｌＩＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号２０の配列は、配列番号２２の配列の１１５９〜１１７９番目の配列と相補的な配列の５’に、ＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型とし、ｔｈｉＬおよびｍｖａＡの増幅には上記のプライマーＥおよびプライマーＦを、ｈｍｃＭの増幅にはプライマーＧおよびプライマーＨをそれぞれプライマーとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ  ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μＬ、ｄＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＥおよびプライマーＦを用いたＰＣＲではｔｈｉＬおよびｍｖａＡを含む約２．５ｋｂ、プライマーＧおよびプライマーＨを用いたＰＣＲではｈｍｃＭを含む約１．２ｋｂの断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。該ＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μｌを用い、プライマーＥおよびプライマーＦで増幅したＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＧおよびプライマーＨで増幅したＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットによりそれぞれｔｈｉＬおよびｍｖａＡを含む２．５ｋｂおよびｈｍｃＭを含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
（２）ｔｈｉＬおよびｍｖａＡを含む発現ベクターｐＭＶ４の構築
（１）で得られたｔｈｉＬおよびｍｖａＡを含む２．５ｋｂ断片および実施例２（２）で得られるｐＴｒＳ３０のＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片（４．６ｋｂ）とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２株〔ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４７０００、Ｊ．Ｍ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕を前述の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｔｈｉＬおよびｍｖａＡを含む発現ベクターであるｐＭＶ４を得た。ｐＭＶ４はアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現ベクターである。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した。第３図に、以上の構築工程を示した。
（３）ｔｈｉＬ、ｍｖａＡおよびｈｍｃＭを含む発現ベクターｐＭＶ５の構築
ｐＭＶ４を制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。ブラントＤＮＡキット（宝酒造社製）により該断片の末端の脱リン酸化を施した。該７ｋｂの断片および（１）で得られたｈｍｃＭを含む１．２ｋｂの断片とライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２株を前述の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、ｔｈｉＬ、ｍｖａＡおよびｈｍｃＣをｔｒｐプロモーターから転写方向が順向きに挿入された構造を有する発現ベクターであるｐＭＶ５を得た。第４図に、以上の構築工程を示した。ｐＭＶ５はアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの発現ベクターである。ｐＭＶ５を含む該形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＭＶ５株と表記する。
［実施例５］Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＭＶ５株によるメバロン酸の生産
（１）試験管培養でのメバロン酸の生産
実施例４で得たＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＭＶ５株をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地８ｍＬの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＭ９Ｘ培地８ｍＬの入った太型試験管に１％接種し３０℃で４８時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。コントロールとして、ベクターｐＴｒＳ３０を含む形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＴｒＳ３０株についても同様に培養し、培養上清を取得した。
培養上清中の培養生成物をガスクロマトグラフィーを用いて前述の方法に従って分析し、培養液中に１．０ｇ／Ｌのメバロン酸が生成蓄積していることを確認した。一方、ベクターｐＴｒＳ３０のみを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＴｒＳ３０株ではメバロン酸の生成は認められなかった。
（２）２Ｌジャーフャーメンターを用いたメバロン酸の生産
実施例４で得たＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＭＶ５株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地５０ｍＬの入った三角フラスコに接種し２８℃で１７時間培養した。
該培養液をＭ９ＸＡ培地９５０ｍＬの入った２Ｌジャーファーメンターに１％接種した。培養中の培地ｐＨは１８％アンモニア水でｐＨ７．０に保持した。また９００ｒｐｍで攪拌し、かつ滅菌フィルターを介して除菌した圧縮空気を１．０ｖｖｍで通気した。培養温度は３０℃で実施した。初発添加糖切れ（２４時間後）後、滅菌６０％グルコース溶液を１時間あたり１０〜１３ｍＬの速度で供給した。
培養上清中の培養生成物をガスクロマトグラフィーを用いて分析し、培養５０時間後で培養液中に１５．３ｇ／Ｌのメバロン酸が生成蓄積していることを確認した。
産業上の利用可能性
本発明により、安価な原料より、効率的にメバロン酸を製造できる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−発明者：田畑和彦；橋本信一
配列番号５−プライマーＡ
配列番号６−プライマーＢ
配列番号７−プライマーＣ
配列番号８−プライマーＤ
配列番号１７−プライマーＥ
配列番号１８−プライマーＦ
配列番号１９−プライマーＧ
配列番号２０−プライマーＨ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  ｐＭＶ１の造成工程を示す。
第２図  ｐＭＶ２の造成工程を示す。
第３図  ｐＭＶ４の造成工程を示す。
第４図  ｐＭＶ５の造成工程を示す。
「符号の説明」
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｐｔｒｐ：ｔｒｐプロモーター
ｍｖａＥ：アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡレ
ダクターゼ遺伝子
ｍｖａＳ：ＨＭＧ−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子
ｔｈｉＬ：アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
ｍｖａＡ：ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子
ｈｍｃＭ：ＨＭＧ−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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