(57)【要約】本発明によれば、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物を用いるＮ−アセチルノイラミン酸の製造法において、該微生物としてＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を用いる安価で効率的なＮ−アセチルノイラミン酸の製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を培地に培養し、該培地中にＮ−アセチルノイラミン酸を蓄積生成させ、該培地中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、およびＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体が、Ｎ−アセチルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンである請求項２記載の製造法。
【請求項４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ａ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｂのいずれか一方、または両方の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ａの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｂの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項６】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項７】
［１］Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、［２］Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、および［３］ホスホエノールピルビン酸を生産する能力から選ばれる１または２つの能力を有する微生物Ｃ、［１］〜［３］から選ばれる能力のうち該微生物Ｃが有していない能力の全部を有する微生物Ｄのいずれか一方または両方の微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｃの培養物または該培養物の処理物および該微生物Ｄの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｅ、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｆ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｇのうち、１以上の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｅの培養物または該培養物の処理物、該微生物Ｆの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｇの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項９】
ホスホエノールピルビン酸の生産に必要な炭素源が、グルコースまたはフラクトースであることを特徴とする、請求項６〜８記載の製造法。
【請求項１０】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物が、シアル酸アルドラーゼ活性が喪失または野生株より低下している微生物である請求項１〜９記載の製造法。
【請求項１１】
微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である請求項１〜１０記載の製造法。
【請求項１２】
エシェリヒア属に属する微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下しているエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）株である請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１〜１２記載の製造法。
【請求項１４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下しているエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）株。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を用いたＮ−アセチルノイラミン酸の製造法に関する。
背景技術
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法としては、抽出法、分解法、酵素を用いた方法、および微生物を用いた方法等が知られている。
抽出法としては、ウミツバメの巣などから抽出する方法［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，５６，４２３（１９７７）］等が知られている。
分解法としては、大腸菌などが生産するＮ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるコロミン酸を分解する方法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８２，１４２５（１９７７）］等が知られている。
酵素を利用した方法としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルマンノサミンを用いる方法［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，６４８１（１９８８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，７１５９（１９８８）］、アルカリ条件下でＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンを用いる方法［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，３９３（１９９７）、米国特許第５，６６５，５７４号］、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを用いる方法［Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，３０，８２７（１９９１）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３０６，５７５（１９９８）］、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、ホスホエノールピルビン酸およびＮ−アセチルマンノサミンを用いる方法［特開平１０−４９６１、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７，６９７（１９９７）］等が知られている。
微生物を用いる方法としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物を利用した方法（特開２００１−１３６９８２）が知られている。
しかしながら、微生物を利用した方法以外の上記のＮ−アセチルノイラミン酸の製造法はいずれも操作が煩雑であったり、高価な原料を必要としたり、原料からの転換効率が不十分である。
微生物を利用した方法についても、更なるＮ−アセチルノイラミン酸の安価で効率的な製造法の開発が望まれている。
発明の開示
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の安価でより効率的な製造法を提供することを目的とする。
本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）  Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を培地に培養し、該培地中にＮ−アセチルノイラミン酸を蓄積生成させ、該培地中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
（２）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、およびＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
（３）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体が、Ｎ−アセチルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンである上記（２）の製造法。
（４）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
（５）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ａ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｂのいずれか一方、または両方の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ａの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｂの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
（６）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
（７）  ［１］Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、［２］Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、および［３］ホスホエノールピルビン酸を生産する能力から選ばれる１または２つの能力を有する微生物Ｃ、［１］〜［３］から選ばれる能力のうち該微生物Ｃが有していない能力の全部を有する微生物Ｄのいずれか一方または両方の微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｃの培養物または該培養物の処理物および該微生物Ｄの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
（８）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｅ、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｆ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｇのうち、１以上の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｅの培養物または該培養物の処理物、該微生物Ｆの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｇの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
（９）  ホスホエノールピルビン酸の生産に必要な炭素源が、グルコースまたはフラクトースであることを特徴とする、上記（６）〜（８）の製造法。
（１０）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物が、シアル酸アルドラーゼ活性が喪失または野生株より低下している微生物である上記（１）〜（９）の製造法。
（１１）  微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１）〜（１０）の製造法。
（１２）  エシェリヒア属に属する微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下しているエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）株である上記（１１）の製造法。
（１３）  培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（１）〜（１２）の製造法。
（１４）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下しているエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）株。
本発明の製造法に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されず、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物より取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物より取得することもできる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよいが、例えば該微生物としては、微生物の細胞表層等に存在する糖鎖の構成成分にＮ−アセチルノイラミン酸を含むことが知られている微生物［例えばＡｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｙｓｉｏｌ．，３５，１３５−２４６（１９９３）］をあげることができる。該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
本発明の製造法に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸の生合成に関わる酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した微生物が好ましい。
具体的には、遺伝子組換え手法によりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子などから選ばれる遺伝子のうち、１以上の遺伝子の発現が増強された微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子としては、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，３１２（１９９５）］、ナイセリア・メニンギティディス由来の遺伝子［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４，１４１（１９９４）］、キャンピロバクター・ジェジュニ由来の遺伝子［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，１１２０（２０００）］等をあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子としては、ブタ由来のａｇｅ遺伝子（ＵＳＰ５，７９５，７６７）、シネコシスティス属に属する微生物由来のｓｌｒ１９７５（ＷＯ  ００／４７７３０）等をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した微生物としては、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体的にはエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＹＰ１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８３、特開２００１−１３６９８２）などをあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼの活性を遺伝子組換え技術により増強した微生物としては、ブタ由来のａｇｅ遺伝子、またはシネコシスティス属に属する微生物由来のｓｌｒ１９７５遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体的にはエシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＥＰＩ１［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１６２９４（１９９６）］、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＹＰ１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８２、特開２００１−１３６９８２）などをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、通常用いられる変異誘起処理を親株に施した後、Ｎ−アセチルノイラミン酸を単一の炭素源あるいは窒素源とした寒天平板培地上に塗布し、生育できない株、または該変異誘起処理に供した親株と比較して生育が遅延する株を選択することにより取得することができる。親株としては、野生型株およびＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下している変異株などをあげることができる。
本発明において、野生型株とは、自然集団中でその微生物が属する種において、最も高頻度にみられる型の微生物のことをいい、親株とは、上記変異誘起処理で得られるＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物に対して、その変異誘起処理に供した株、または遺伝子組換え技術などを用いた形質転換に供した株のことをいう。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の具体的な取得方法としては、親株である微生物に通常の変異誘起処理方法（ア・ショート・コース・イン・バクテリアル・ジェネティクス）、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理などを行い、得られた細胞を緩衝液で適当に希釈し、Ｎ−アセチルノイラミン酸を単一の炭素源あるいは窒素源とした寒天平板培地上に塗布し、該変異誘起処理に供した親株と比較して生育が遅延するあるいは生育できない株を、目的とする変異株として選択する方法をあげることができる。
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、公知の染色体上での相同組換えを利用した変異の導入または遺伝子破壊法（モレキュラー・クローニング第３版あるいはア・ショート・コース・イン・バクテリアル・ジェネティクス）により取得することができる。公知のＮ−アセチルノイラミン酸分解酵素としては、シアル酸アルドラーゼが知られており、該酵素をコードする遺伝子も同定されている。
大腸菌のシアル酸アルドラーゼとしては、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡとしては配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡが知られている。
染色体上での相同組換えを利用した変異の導入または遺伝子破壊法により、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得する具体的な方法としては、λファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現する微生物を利用する方法をあげることができる［Ｇｅｎｅ，２４６，３２１−３２０（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７，６６４０−６６４５（２０００）］。
例えば、微生物として大腸菌を用いる場合、Ｒｅｄ組換え系を発現している大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＭ２２株［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０，２０６３（１９９８）］、またはＫＭ２２株が保有するλＲｅｄ組換え系に関与する遺伝子で形質転換または形質導入された大腸菌を、
（１）薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（２）大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、および
（３）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
などを用いて形質転換することにより、シアル酸アルドラーゼ活性を喪失した大腸菌を取得することができる。
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。微生物に大腸菌を用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に屈する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）］、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）］等をあげることができる。
上記直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは５００ｂｐ〜５ｋｂｐ程度が好ましく、５００ｂｐ〜２ｋｂｐ程度がより好ましく、１ｋｂｐ程度がさらに好ましい。
上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
上記（１）〜（３）の直鎖ＤＮＡを用いて、シアル酸アルドラーゼ活性を喪失した大腸菌を取得する具体的な方法としては、
方法１：上記（１）の直鎖ＤＮＡを大腸菌に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法、
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（２）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除する方法、および
方法３：
［１］上記（３）の直鎖ＤＮＡを大腸菌に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡの両端の外側に位置するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法
などをあげることができる。
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
上記方法２および３は、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法である。
上記したＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性を喪失した微生物を取得法は、染色体ＤＮＡ上のシアル酸分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を完全に除去する方法であるが、上記方法で用いられる上記（１）、（３）の直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡの代わりに、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側および３’末端側のＤＮＡを含むＤＮＡを、その両端に有する直鎖ＤＮＡを用いることによっても、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性を喪失した大腸菌を取得することができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下した微生物の例としては、エシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１株があげられる。エシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１株は、平成１４年２月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８として寄託されている。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよいが、例えば、Ｎ−アセチルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産することができる微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体としては、微生物が有する酵素活性によりＮ−アセチルノイラミン酸に変換される前駆体であればいずれでもよく、好ましくはＮ−アセチルマンノサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産することができる微生物としては、例えばＮ−アセチルノイラミン合成酵素活性およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性のいずれか一方、または両方が強い微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素活性およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性のいずれか一方、または両方が強い微生物は、遺伝子組換え技術によりそれら酵素のいずれか一方、または両方の活性を増強した微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素活性およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性のいずれか一方、または両方が強い微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子のいずれか一方または両方を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることがでる。また該微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子とＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を別々に含有する２つの組換え体ＤＮＡを有する微生物であってもよい。
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡとしては、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８［エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＹＰ１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８３、特開２００１−１３６９８２）より調製］、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１［エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＥＰＩ１［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１６２９４（１９９６）より調製］、またはｐＹＰ１６［ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８２、特開２００１−１３６９８２）などより調製］をあげることができる。
上記したＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
また、上記したＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）などを親株に用い、上記したＮ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡおよびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡの一方、または両方の組換え体ＤＮＡを導入することによってもＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。  該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性が変異手法または遺伝子組換え技術などにより増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入して得られる微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物としては、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＹＰ１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８３）などをあげることができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性が増強されたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＹＰ１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８３）などを親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）などを親株として用い、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８を導入することによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することもできる。
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク貿を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、好ましくはＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性が変異手法および遺伝子組換え技術などにより増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入して得られる微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物としては、具体的にはエシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＥＰＩ１、およびエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＹＰ１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８２）などをあげることができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性が増強されたエシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＥＰＩ１またはエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＹＰ１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８２）などを親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）などを親株として用い、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１、またはｐＹＰ１６を導入することによりＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することもできる。
本発明に用いられるホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物は、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、好ましくはホスホエノールピルビン酸を生産する能力が変異手法および遺伝子組換え技術などにより増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、具体的には、エシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２株［Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，２１６４（１９９４）］などをあげることができる。
本発明に用いられるホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強されたエシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２株などを親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性が増強された微生物が好ましい。
具体的には、遺伝子組換え技術などによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができる。
該微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を同一の組換え体ＤＮＡに含む微生物であってもよい。
該微生物として、より具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１またはｐＹＰ１６を導入して得られる微生物などをあげることができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１またはｐＹＰ１６を宿主微生物に導入して得られる微生物などをあげることができる。
上記方法により得られるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリＮＡＮ８−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９０８）などを親株として用い、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１またはｐＹＰ１６を導入することによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することもできる。
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物が好ましい。
具体的には、遺伝子組換え技術などにより、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有し、かつ変異手法または遺伝子組換え技術などによりホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、より具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２株に、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１またはｐＹＰ１６を導入して得られる微生物などをあげることができる。
上記方法により得られるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を取得することができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、上記したホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２株に、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１またはｐＹＰ１６を導入して得られる微生物などをあげることができる。
上記方法により得られるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物が好ましい。
具体的には、遺伝子組換え技術などによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有し、かつ変異手法または遺伝子組換え技術などによりホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、より具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２株に、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８を導入して得られる微生物などをあげることができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定さない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、上記したホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２株に、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８を導入して得られる微生物などをあげることができる。
上記したＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物が好ましい。
具体的には、遺伝子組換え技術などによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有し、かつ変異手法または遺伝子組換え技術などによりホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を同一の組換え体ＤＮＡに含み、かつホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であってもよい。
該微生物として、より具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２株に、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＹＰ１８、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるｐＥＰＩ１またはｐＹＰ１６を導入して得られる微生物などをあげることができる。
上記方法により得られるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
本発明の製造法において、遺伝子組換え微生物を利用する場合、プラスミドＤＮＡの単離、精製、組換え体ＤＮＡの作製、該組換え体ＤＮＡを用いた形質転換、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）等の遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法（モレキュラー・クローニング第３版あるいはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）に準じて行うことができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造に関与するＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ等のタンパク質を組換え手法により、微生物で発現させるためには、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した微生物に導入することにより達成することができる。
微生物としては、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記微生物において自立複製可能ないしは染色体ＤＮＡ中への組込が可能で、該タンパク質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
微生物として細菌等の原核生物を用いる場合には、Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＧＨＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の製造法に用いられる組換え体ＤＮＡにおいて、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、プレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
本発明の製造法に用いられる微生物の培養は、以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。
本発明の製造法に用いられる微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸および有機酸のアンモニウム塩、およびペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリン、テトラサイクリンやクロラムフェニコール等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記した培養方法により、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を培地に培養し、該培地中にＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該培地中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することによりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法としては、
（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、およびＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（２）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（３）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ａ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｂのいずれか一方、または両方の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ａの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｂの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（４）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（５）［１］Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、［２］Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、および［３］ホスホエノールピルビン酸を生産する能力から選ばれる１または２つの能力を有する微生物Ｃ、［１］〜［３］から選ばれる能力のうち該微生物Ｃが有していない能力の全部を有する微生物Ｄのいずれか一方または両方の微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｃの培養物または該培養物の処理物および該微生物Ｄの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、および
（６）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｅ、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｆ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｇのうち、１以上の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｅの培養物または該培養物の処理物、該微生物Ｆの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｇの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
をあげることができる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体のタンパク質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において、酵素源として用いる微生物の培養物または該培養物の処理物の量は、単一の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いるときは該単一の微生物の培養物または該培養物の処理物の活性として、また複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いるときは該複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を合わせた活性として、３７℃で１分間に１μｍｏｌのＮ−アセチルノイラミン酸を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは  Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において用いられる各微生物の量は、用いる各微生物について、湿菌体として１〜３００ｇ／ｌである。
本発明で用いられるＮ−アセチルマンノサミンあるいはＮ−アセチルグルコサミンなどのＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体は、通常１〜３００ｇ／ｌの濃度で用いられる。
ホスホエノールピルビン酸の生産に必要な炭素源としては、ホスホエノールピルビン酸に代謝される炭素源であればいずれも用いることができるが、好ましくはグルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物等をあげることができ、より好ましくはグルコースやフラクトースなどをあげることができる。これらの炭素源は、一括して添加してもよいし、分割あるいは連続的に添加することもでき、通常１０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いられる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成反応において、必要に応じて塩化マグネシウム、塩化マンガン等を添加することができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃の条件で１〜９６時間行う。
水性媒体中に生成したＮ−アセチルノイラミン酸の定量は公知の方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）］に準じて行うことができる。
培養物中または水性媒体中に生成したＮ−アセチルノイラミン酸の採取は、イオン交換樹脂などを用いる通常の方法［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，３９３（１９９７）］に準じて行うことができる
本発明を実施するための最良の形態
実施例１  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素およびＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ発現株の造成
０．２μｇのｐＹＰ１８（特開２０００−１３６９８２）を制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ社製）によりエシェリヒア・コリ由来のＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次に０．１μｇのｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］を制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．１ｋｂおよび４．２ｋｂの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／ｌバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌ寒天）に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子発現プラスミドであるｐＬＴ１を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
次に０．２μｇのｐＹＰ１６（特開２０００−１３６９８２）を制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットを用いてシネコシスティス属に属する微生物由来のＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次に０．１μｇのｐＴｒＳ３２を制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．２ｋｂおよび４．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子発現プラスミドであるｐＮＥ１２を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
配列番号１および配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ｐＬＴプラスミドＤＮＡを鋳型として以下の方法によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、０．１μｇのｐＬＴプラスミドＤＮＡ、各０．５μｍｏｌ／ｌの上記プライマーＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、各２００μｍｏｌ／ｌのｄｅｏｘｙ  ＮＴＰを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で３分間を１工程とする反応を３０回繰り返すことにより行い、約１．１ｋｂのＰＣＲ産物を取得した。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを該反応液に添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］に溶解した。５μｌの該溶解液を用い、該ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いてＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
０．２μｇのｐＮＥ１２を制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．１ｋｂおよび５．４ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーからプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼを発現するプラスミドであるｐＬＴ４を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）
実施例２Ｎ−アセチルノイラミン酸分解活性低下株の取得
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＮＯＯ７４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２５）を、３０ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／ｌバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム）が入った３００ｍｌ容の三角フラスコに植菌し、２８℃で５時間振盪培養した。培養液を４℃で３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して対数増殖期の細胞を回収した。該細胞をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン０．１ｍｇ／ｍｌを含有するＴＭ緩衝液［６．１ｇ／ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５．８ｇ／ｌマレイン酸、０．１ｇ／ｌ硫酸マグネシウム・七水和物、１ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、０．５ｇ／ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０］に懸濁し、３７℃で３０分間変異処理を行った。変異処理を行った細胞を遠心分離により集めて洗浄した後、滅菌水に懸濁した。該懸濁液を１．５％の寒天を含有するＭ９最少培地［３ｇ／ｌグルコース、６ｇ／ｌリン酸水素二ナトリウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／ｌ塩化アンモニウム、０．２４ｇ／ｌ硫酸マグネシウム・七水和物、４ｍｇ／ｌビタミンＢ１］および該寒天含有Ｍ９最小培地に含まれるグルコースの代わりに０．７５ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸を含む培地からなる平板培地上に塗布し、３７℃で２日間培養し、グルコースを含む培地で良好に生育し、Ｎ−アセチルノイラミン酸を含む培地で生育が遅延または生育できない株を選択し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＡＮ８−７１株を取得した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＮＯＯ７４株およびＮＡＮ８−７１株を３０ｍｌのＭ９最少培地が入った３００ｍｌ容の三角フラスコに植菌し、３７℃で７時間振盪培養した。培養液を４℃で１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して菌体を回収した。
１２０ｇ／ｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＮＯＯ７４株またはＮＡＮ８−７１株の湿菌体、２０ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸、４ｇ／ｌのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／ｌのキシレンからなる０．１ｍｌの反応液を用いて、３２℃で２時間、振盪下で反応を行った。反応生成物をＨＰＬＣにて分析した結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸の残存率は、親株のＨＮＯＯ７４株が８５％であるのに対して、ＮＡＮ８−７１株では９８％であった。
実施例３  Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
実施例１で得られたプラスミドｐＬＴ４を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＡＮ８−７１株を形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養することによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＡＮ８−７１／ｐＬＴ４株を取得した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＡＮ８−７１／ｐＬＴ４株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１５０ｍｌのＬＢ培地の入った１Ｌ容のバッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。次に１５０ｍｌの該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ＬのＭ９培地［５ｇ／ｌグルコース、６ｇ／ｌリン酸水素二ナトリウム、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／ｌ塩化アンモニウム、２．４ｇ／ｌ硫酸マグネシウム・七水和物、１０ｍｇ／ｌ硫酸マンガン・一水和物、２００ｍｇ／ｌ硫酸鉄・七水和物、８ｍｇ／ｌビタミンＢ１、５ｇ／ｌペプトン（極東製薬社製）］が入った５Ｌ容の培養槽に接種し、６００ｒｐｍ、通気量３Ｌ／分の条件で３０℃で６．５時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて培養液のｐＨを７．０に維持した。培養終了後、培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
２００ｇ／ｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＡＮ８−７１／ｐＬＴ４株湿菌体、９０ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミン、５０ｇ／ｌのグルコース、４ｇ／ｌのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／ｌのキシレンからなる３０ｍｌの反応液を２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）しながら、３２℃で２４時間反応を行った。反応中、２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてグルコースを添加した。
反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣにて分析し、反応液中に３５ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。同様の培養および反応をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＮＯＯ７４／ｐＬＴ４株湿菌体を用いて行った場合のＮ−アセチルノイラミン酸の蓄積量は１２ｇ／ｌであった。
産業上の利用可能性
本発明により、Ｎ−アセチルノイラミン酸を効率的に製造することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図はＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＬＴ４の造成工程を示す。
また、図中の符号の意味は、以下に示す通りである。
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ＰＬ：ＰＬプロモーター
Ｐｔｒｐ×２：トリプトファンタンデムプロモーター
ｎｅｕＢ：Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子
ｓｌｒ１９７５：Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子
【図１】
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【国際調査報告】
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