(57)【要約】転写単位を形成する翻訳領域を予測した後に翻訳開始コドンを同定していく工程を含む遺伝子構造同定方法；既に同定された複数の翻訳領域の塩基配列中で逆相補的配列を有するコドンとの出現頻度の差が大きいコドンのペアを複数選別し、各ペアで出現頻度が高い方のコドンを多くもつ翻訳領域を真の翻訳領域と判定する工程を含む遺伝子構造同定方法；翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧＣ含量が所定値以下であるものを偽と判定する工程を含む、塩基配列のＧＣ含量が５０％を越える遺伝子構造同定方法、それらの実行プログラム、そのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、さらにそのプログラムを利用したコンピュータに基づく遺伝子構造同定システム。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｇ）の工程：
（ａ）原核生物の塩基配列（塩基配列とはＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列をいう）情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のオープン・リーディング・フレーム（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ；以下、ＯＲＦと略記する）を与える仮の翻訳開始コドンを設定する；
（ｂ）工程（ａ）で得られた任意の隣り合い、かつ同じ鎖にある２つのＯＲＦを下流からＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂとしたとき、ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定する〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数である〕；
（ｃ）工程（ｂ）においてＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定された場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中に翻訳開始コドンの候補があるときに、その候補をＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンと同定し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることによりＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する；
（ｄ）工程（ｃ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか調べる〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕；
（ｅ）工程（ｄ）で該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるとき、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する；
（ｆ）工程（ｂ）で一つの転写単位を形成する可能性があると判定されなかったＯＲＦ−Ａまたは工程（ｅ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕；
（ｇ）工程（ｃ）、（ｅ）または（ｆ）の同定結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定し遺伝子構造を同定する；
工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項２】
工程（ｅ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「ｍＲＮＡとリボソームとの結合状態を表わすスコア（以下、リボソーム結合スコア、という）」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ３を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い翻訳開始コドンを真の翻訳開始コドンと同定し、さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることにより、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する工程である請求の範囲第１項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕。
【請求項３】
工程（ｆ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「リボソーム結合スコア」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ１を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳コドンを真の翻訳コドンと同定し、閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を設定し、該閾値を越えたときにＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを段階的に同定する工程である請求の範囲第１項または第２項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｖ１は請求の範囲第２項のＶ３よりも大きい７〜１４の整数である〕。
【請求項４】
「リボソーム結合スコア」を算出する際に、翻訳開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引いて該スコアを求めることを特徴とする請求の範囲第２項または第３項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、ＰＧは１〜４の整数で、ＰＴは２〜６の整数である〕。
【請求項５】
請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された転写単位Ｐ、翻訳領域Ａ、転写単位Ｑおよび翻訳領域Ｂにおいて、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複する場合、さらに下記（ｈ）〜（ｊ）の工程：
（ｈ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと同じ鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｉ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｊ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複するときに、転写単位または翻訳領域の長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定する；
工程を含む遺伝子構造同定方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を繰り返して用いることを特徴とする遺伝子構造同定方法。
【請求項７】
下記（ｋ）と（ｌ）の工程：
（ｋ）すでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個の翻訳領域において、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別する；
（ｌ）「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより該翻訳領域Ａの真偽を判定する〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数である〕；
工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項８】
「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する方法である請求の範囲第７項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項９】
すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列をもとに、下記（ｍ）〜（ｐ）の工程：
（ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べる；
（ｎ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000071
としたとき、下式（２）によりｙｉを、そして、下式（３）によりｙｉ＋３２を求める；
2003035863.tif 000072
2003035863.tif 000073
（ｏ）ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、工程（ｍ）で並べた６４種類のコドンを並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（４）により求める
2003035863.tif 000074
［ここで、
2003035863.tif 000075
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする］；
（ｐ）工程（ｏ）で算出した翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域と判定し、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域とする；
工程を含む請求の範囲第７項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．８〜１．８の値である〕。
【請求項１０】
原核生物の翻訳領域または該領域と推定される翻訳領域Ａが、相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、下記（ｑ）と（ｒ）の工程：
（ｑ）該翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と該翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、該翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｒ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、請求の範囲第７項〜第９項いずれか一項記載の方法により該翻訳領域Ａと該翻訳領域Ｂの真偽を判定する；
を含む原核生物の遺伝子構造同定方法〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
【請求項１１】
転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域にした後に、請求の範囲第７項〜第１０項のいずれか一項記載の方法を適用することを特徴とする遺伝子構造同定方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法により同定した翻訳領域または転写単位の真偽を請求の範囲第７項〜第１１項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて判定する遺伝子構造同定方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一項に記載した遺伝子構造同定方法を用いて同定されたコードするポリペプチドの長さがＬＦアミノ酸以上である翻訳領域の塩基配列をもとに、コードするポリペプチドの長さがＬＭアミノ酸以上の翻訳領域の真偽を、請求の範囲第７項〜第１２項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて判定する遺伝子構造同定方法〔ここで、ＬＦは１００以上の正の整数であり、ＬＭは２０以上の正の整数である〕。
【請求項１４】
原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、該塩基配列内の翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域を「偽の翻訳領域」と判定することを特徴とする原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項１５】
計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる請求の範囲第１４項記載の遺伝子構造同定方法
2003035863.tif 000076
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000077
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕。
【請求項１６】
原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、該塩基配列内の翻訳領域の５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域の翻訳開始コドンを「偽の翻訳開始コドン」と判定し、該偽と判定した翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索する原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項１７】
計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる請求の範囲第１６項記載の遺伝子構造同定方法
2003035863.tif 000078
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000079
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕。
【請求項１８】
請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法と請求の範囲第１４項〜第１７項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いる、塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越える原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１項〜第１８項のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法と、「コーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域の真偽を判定する方法」を用いる原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項２０】
「コーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域を真偽を判定する方法」が、すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列をもとに、Ｔ個の翻訳領域において「出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより、該翻訳領域Ａの真偽を判定する方法である、請求の範囲第１９項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【請求項２１】
「出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する方法である請求の範囲第２０項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【請求項２２】
下記（ｓ）〜（ｕ）の工程：
（ｓ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000080
としたとき、下式（６）によりｙｉを求める；
2003035863.tif 000081
（ｔ）ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域と推定される翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（７）により求める
2003035863.tif 000082
［ここで、
2003035863.tif 000083
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする］；
（ｕ）工程（ｔ）で算出した該翻訳領域ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該翻訳領域Ａを真の翻訳領域と判定し、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽の翻訳領域と判定する；
工程を含む、請求の範囲第２０項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜１．８の値とする〕。
【請求項２３】
原核生物の翻訳領域または該領域と推定される翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、下記（ｖ）および（ｗ）：
（ｖ）該翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｗ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、請求の範囲第１８項〜第２２項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法により、該翻訳領域Ａと該翻訳領域Ｂの真偽を判定する；
工程を含む遺伝子構造同定方法〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
【請求項２４】
転写単位を構成する翻訳領域の終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域にした後に、請求の範囲第１８項〜第２３項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を適用することを特徴とする遺伝子構造同定方法。
【請求項２５】
（ａ）入力装置により入力された原核生物の塩基配列データから、該塩基配列中の翻訳終止コドンを検索し、得られた全ての翻訳終止コドンについて、最長のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を与える仮の翻訳開始コドンを検索し、上記翻訳終止コドンと仮の翻訳開始コドンの組み合わせをＯＲＦ候補とし、これらのコドンの上記塩基配列上の位置を、メモリに格納し、
（ｂ）メモリから、同じ鎖にある隣り合う２つのＯＲＦ候補を呼び出し、下流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ａとする）の仮の翻訳開始コドンと、上流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ｂとする）の翻訳終止コドンの位置と距離を調べ、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数〕にあるとき、この隣接する２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定してステップ（ｃ）に移り、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンとＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの位置と距離が上記条件を満たさない場合は、この隣接する２つのＯＲＦの組（ＯＲＦ−Ａ，ＯＲＦ−Ｂ）は一つの転写単位を形成しないと判定してステップ（ｆ）に移り、
（ｃ）ステップ（ｂ）で、２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定したものについて、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中から、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補を検索し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、
翻訳開始コドン候補が１つの場合、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
翻訳開始コドン候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位の最も高いものを選択し、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｄ）ステップ（ｃ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか検索し、
該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるときはステップ（ｅ）に移り、該候補がないときはステップ（ｆ）に移り、
（ｅ）ステップ（ｄ）で検索したＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補について、上記塩基配列データを呼び出して、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域の存在の有無を調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｆ）ステップ（ｂ）で一つの転写単位を形成しないと判定されたＯＲＦ−Ａまたは処理（ｅ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、上記塩基配列データを呼び出して、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを検索し、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｇ）以上のステップを、メモリに格納された全てのＯＲＦについて処理済みとなるまで繰り返し、
メモリに格納されたステップ（ｃ）、（ｅ）または（ｆ）ステップでの転写単位及び翻訳領域の同定結果を出力装置により出力する処理
をコンピューターに実行させるためのプログラム。
【請求項２６】
上記ステップ（ｅ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ３〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕を保持し、閾値Ｖ３を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い候補を選択し、
さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として該優先度が高い候補を選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむものである請求の範囲第２５項記載のプログラム。
【請求項２７】
上記ステップ（ｆ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ１を保持し、閾値Ｖ１を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンを、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を段階的に設定し、該閾値を越える上記ｍＲＮＡ配列を段階的に検索して、リボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、同定結果をメモリに書きこむものである請求の範囲第２５項または第２６項記載のプログラム〔ここで、Ｖ１は請求の範囲第２項のＶ３よりも大きい７〜１４の整数である〕。
【請求項２８】
上記「リボソーム結合スコア」を算出する際に、翻訳開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引いて該スコアを求めることを特徴とする請求の範囲第２６項または第２７項記載のプログラム〔ここで、ＰＧは１〜４の整数で、ＰＴは２〜６の整数である〕。
【請求項２９】
請求の範囲第２５項乃至第２８項記載のプログラムにおいて、上記ステップ（ｇ）の後、メモリに格納された転写単位及び翻訳領域のデータを呼び出し、さらに
（ｈ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと同じ鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定し；
（ｉ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定し；
（ｊ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複するときに、転写単位または翻訳領域の長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定し；
上記判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
【請求項３０】
（ｋ）入力手段により入力されたすでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個の翻訳領域の中で、使用されているコドンの種類とその数を調べ、この中で、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別して、メモリに格納し；
（ｌ）入力手段により入力された翻訳領域と推定される翻訳領域Ａのデータから、該翻訳領域Ａでの上記選択されたコドンの出現頻度を計測し、
上記「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより、該翻訳領域Ａの真偽を判定し〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数である〕；
上記判定結果を出力装置が表示する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
【請求項３１】
処理（ｌ）が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用いて「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較し、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する処理を行なうものである、請求の範囲第３０項記載のプログラム。
【請求項３２】
（ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納し、
（ｎ）すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列を入力し、ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000084
としたとき、下式（２）によりｙｉを、そして下式（３）によりｙｉ＋３２を求める；
2003035863.tif 000085
（ｏ）メモリから、ステップ（ｍ）で得られたコドンテーブルを呼び出し、テーブル中の各コドンのｙｉおよびｙｉ＋３２を対応付け、ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、テーブル中のコドンの配列を並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（４）により求める
2003035863.tif 000086
［ここで、
2003035863.tif 000087
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする］；
（ｐ）上記処理により求めた、翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域と判定し、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域と判定する処理
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．８〜１．８の値である〕をコンピューターに行なわせるための、請求の範囲第３０項記載のプログラム。
【請求項３３】
入力装置により入力された、原核生物の翻訳領域について、該翻訳領域同士の重複および内包の有無を調べ、翻訳領域または該領域と推定される翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、
（ｑ）上記塩基配列データを呼び出し、該翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と該翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、該翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｒ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、請求の範囲第３０項〜第３２項のいずれか一項記載の処理により該翻訳領域Ａと該翻訳領域Ｂの真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕
処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
【請求項３４】
すでに同定された翻訳領域のデータに代えて、このデータから、転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域に書き換える処理を行なった後、上記（ｋ）、（ｌ）の処理を行なわせることを特徴とする、請求の範囲第３３項記載のプログラム。
【請求項３５】
請求の範囲第２５項〜第３５項においてメモリに格納された同定ずみの翻訳領域および転写単位について、翻訳領域および転写単位の真偽を請求の範囲第３０項〜第３４項のいずれか一項記載の処理を用いて判定させるプログラム。
【請求項３６】
請求の範囲第２５項〜第３５項のいずれか一項に記載の処理により真の翻訳領域と同定された翻訳領域のデータをメモリから呼び出し、各翻訳領域がコードするポリペプチドの長さを計算し、ポリペプチドの長さがＬＦアミノ酸以上である翻訳領域の塩基配列をもとに、コードするポリペプチドの長さがＬＭアミノ酸以上の翻訳領域の真偽を、請求の範囲第７項〜第１２項のいずれか一項記載の処理を用いて判定する処理を行なうプログラム〔ここで、ＬＦは１００以上の正の整数であり、ＬＭは２０以上の正の整数である〕。
【請求項３７】
入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物の翻訳領域のデータから、上記翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を所定の計算式を用いて算出し、この算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域を「偽の翻訳領域」と判定し、判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
【請求項３８】
計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる請求の範囲第３７項記載のプログラム
2003035863.tif 000088
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000089
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕。
【請求項３９】
入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物の翻訳領域のデータから、上記翻訳領域の５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を、所定の計算式を用いて算出し、
算出された含量が一定値を下回るとき、該翻訳領域の翻訳開始コドンを「偽の翻訳開始コドン」と判定し、判定結果を出力装置により出力すると共に、
入力装置により入力された、上記翻訳領域の塩基配列データを呼び出し、該偽と判定した翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索する処理をコンピューターに行なわせるプログラム。
【請求項４０】
計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値：
2003035863.tif 000090
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000091
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕
および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる請求の範囲第３９項記載のプログラム。
【請求項４１】
請求の範囲第２５項乃至第４０項に記載された処理に基づいて同定された原核生物のＴ個の翻訳領域において出現頻度の高いｍ種類のコドンと、出現頻度の低いｍ種類のコドンを選択し、メモリに格納し、
Ｔ個の翻訳領域とは別の入力された未同定の翻訳領域のデータから、「Ｔ個の翻訳領域において出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「Ｔ個の翻訳領域において出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを計測し、両者を比較することにより該翻訳領域Ａの真偽を判定する処理を行ない、判定結果を出力装置により出力させる処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【請求項４２】
「出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する方法である請求の範囲第４１項記載のプログラム〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【請求項４３】
（ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納する；
（ｓ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000092
としたとき、下式（６）によりｙｉを求める；
2003035863.tif 000093
（ｔ）メモリのコドンテーブルを呼び出し、ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域と推定される翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（７）により求める
2003035863.tif 000094
［ここで、
2003035863.tif 000095
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする］；
（ｕ）ステップ（ｔ）で算出した該翻訳領域ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該翻訳領域Ａを真の翻訳領域と判定し、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽の翻訳領域と判定し、判定結果を出力装置により出力する
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜１．８の値とする〕処理をコンピューターに行なわせるための請求の範囲第４１項記載のプログラム。
【請求項４４】
原核生物の翻訳領域または翻訳領域と推定される翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される鎖の翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、
（ｖ）翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定し、
（ｗ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、請求の範囲第４１項〜第４３項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法により該翻訳領域Ａと該翻訳領域Ｂの真偽を判定し〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕、
判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
【請求項４５】
すでに同定された翻訳領域のデータに代えて、このデータから、転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域に書き換える処理を行なった後、請求の範囲第４１項〜第４４項のいずれか一項記載の処理を行なわせるプログラム。
【請求項４６】
請求の範囲第２５項乃至第４５項のいずれか１項記載のプログラムを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体。
【請求項４７】
（ｉ）塩基配列データを入力するための入力手段、（ｉｉ）入力されたデータを用いて、請求の範囲第２５項乃至第４５項のいずれかに記載のプログラムを実行する手段、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）により得られた結果を出力するための出力装置とを備えた、遺伝子構造同定システム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、原核生物の塩基配列（塩基配列とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列をいう）をもとにした遺伝子構造同定方法、その実行プログラム、そのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、さらにその記録媒体を利用したコンピュータに基づく遺伝子構造同定システムに関する。
背景技術
様々な微生物や微生物が生産する酵素が広い産業分野で利用されており、これら微生物の改良や新しい酵素の発見は重要な課題である。１９８０年代後半の自動蛍光シークエンサーの開発を契機に生物の塩基配列情報の解読が加速され、ゲノム研究は大きく発展している。１９９５年に初めて細菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）の全ゲノム配列が決定された後、現在では約５０種類の微生物の全ゲノム配列が決定されている。さらに現在ゲノム配列が決定中の微生物は約２００種類あり、まもなく２５０種類を越える微生物のゲノム配列が明らかになる。このように微生物バイオテクノロジー分野はポストゲノム時代に突入した。このように膨大な遺伝情報を活用して研究開発を推進する上で、膨大な微生物のゲノム情報を高精度にしかも迅速に解析する技術の開発は重要な研究開発の課題となっている。
ゲノム情報の解読の第１ステップは、決定された塩基配列情報から遺伝子構造を同定することである。遺伝子構造、特に翻訳領域（Ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＣＤＳ）（以下、遺伝子翻訳領域を単に翻訳領域という。）の位置を同定できれば、アミノ酸配列を予測できるので、遺伝子産物の機能予測を行うことが可能になる。またポリシストロンのような転写単位の構造を予測できれば、同一転写単位上にある遺伝子群の発現調節機構が予測できる。このように、塩基配列情報から遺伝子構造を予測する方法は、基本的かつ重要な技術であり、これまでにも様々な方法が開発されている。コンピュータを用いて塩基配列情報から遺伝子構造を予測した場合、「正しい」すなわち「真」の集団の総数をＮＴ、コンピュータによって予測した総数をＮＳ、およびコンピュータによって予測したものが「正しい」すなわち「真」のものと一致した数をＮＴＰとした場合に、ＮＴＰ／ＮＴを感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）といい、またＮＴＰ／ＮＳを特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）というが、感度と特異性の両方が１に近づくほど、プログラムの性能が優れていると判断される。したがって、感度と特異性の両方で優れた性能を示すプログラムを開発することは重要な課題である。
原核生物の翻訳領域の特徴をマルコフモデルなどの確率過程を利用して抽出し、この抽出した特徴を利用して翻訳領域を同定する手法、例えばＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，Ｊ．：Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１７，１２３−１３３（１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，Ａ．Ｖ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，１１０７−１１１５（１９９８）、Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，３９１１−３９２０（１９９９）〕およびＧｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．５４４−５４８（１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，ｐ．４６３６−４６４１（１９９９）〕などのプログラムが開発されている。この中でＧｌｉｍｍｅｒが世界で最も広く使われているプログラムである。また相同性解析に基づいて翻訳領域を同定するプログラムＣＲＩＴＩＣＡ〔Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．＆  Ｌｏｓｅｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．Ｖｏｌ．１６，ｐ．５１２−５２４（１９９９）〕やリボソーム結合配列の存在とコドン使用頻度分析に基づいて翻訳領域を同定するＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．２９４１−２９４７（１９９８）〕というプログラムも開発されている。しかしながら、これらプログラムの翻訳領域同定精度は十分には高くなく、さらにより高精度の翻訳領域同定技術の開発が望まれている。またごく最近、翻訳開始コドンの同定精度を高めることにより翻訳領域を高精度に同定するプログラムＧｅｎＭａｒｋＳ〔Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．，Ｌｏｍｓａｄｚｅ，Ａ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２９，２６０７−２６１８（２００１）〕も開発された。このプログラムは、上述のＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍと組み合わせることにより、８種類の微生物ゲノムからの翻訳領域同定において、感度が０．９６９以上で、特異性が０．８６５以上の精度を有している。しかしながら、特異性という精度においてはさらに精度が優れているプログラムが必要であるとともに、単独のプログラムで感度と特異性ともに精度が優れたプログラムを開発することは重要な課題である。
これまで様々な実験手法により最も詳細に解析された生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ−１２株であるが、大腸菌ゲノムを解析した米国の研究グループと日本の研究グループは、それぞれＣＤＳの総数は４２８９個と４３５９個であると発表している。この大腸菌ゲノムを、最もよく使われているＣＤＳ同定プログラムＧｌｉｍｍｅｒを用いて解析した場合、４２８９個のＣＤＳのうち約４１５８個の翻訳領域を見つけることができるが、一方Ｇｌｉｍｍｅｒが予測したＣＤＳの総数は５０２６個であり、４２８９個の数字とは大きくかけ離れている〔Ｄｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，ｐ．４６３６−４６４１（１９９９）〕。実際の微生物のゲノム配列の注釈付け（「アノテーション」と呼ぶ）の過程でも、これらＣＤＳ同定プログラムを利用して仮同定した翻訳領域について長い時間をかけて吟味しながら、遺伝子の構造を同定する作業を行っているのが現実である。このアノテーションの工程では、より精度が高く、アノテーションの作業時間を短縮できる技術の開発が強く要望されている。
このように、これまでの原核生物用の翻訳領域同定プログラムに関しては、翻訳領域の判別精度が不十分である上、翻訳開始コドン（以下、開始コドンと略記する）の位置を予測する精度が低いために、翻訳領域の同定精度が実用上不十分であるという問題点があった。また、既存のプログラムでは、ポリシストロンの転写単位の構造を予測できないという問題点があった。さらに、これまでの翻訳領域同定プログラムを用いた場合、相同性解析法などを用いて正しい翻訳領域を予め同定しておき、その翻訳領域の情報をもとに予測する方法を用いているので、翻訳領域同定プログラムを動かす前に前処理工程が必要であった。このため、作業が煩雑になるとともに、翻訳領域同定に要する時間が長くなるという問題点があった。また、これまで開発された翻訳領域同定プログラムの多くは、Ｇ残基とＣ残基の含量（以下、「ＧＣ含量」と略記する）が高い塩基配列から翻訳領域を予測する場合、翻訳領域の同定精度が悪くなるという問題点があった。前述のＧｅｎＭａｒｋＳとＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍの２つのプログラムを組み合わせる方法でも、ＧＣ含量が高い（例えば６５％以上）微生物ゲノムから高精度に翻訳領域が同定できることが示されていない。
これらの問題点をより具体的に示すために、原核生物の遺伝子の構造について図１と図２を使って説明を加える（図１と図２を参照）。原核生物の遺伝子の基本構造は、図１に示すように、ｍＲＮＡの合成を開始するプロモーター、ｍＲＮＡとリボソームとの結合と翻訳開始に関与するリボソーム結合部位、開始コドン、翻訳終止コドン（以下、終止コドンと略記する）、およびｍＲＮＡの合成を終結するターミネーターから成る。なお、開始コドンとしては、ＡＵＧコドンが最も最適であり、次にＧＵＧコドンが使われる。ＵＵＧコドンもまれに使われる。ごくまれにＣＵＧコドンなども使われると報告されている。
以下、開始コドンや翻訳領域の同定はＤＮＡ配列をもとに行うことが多いので、本明細書では、特に断らない限り、開始コドン、終止コドンの配列およびリボソームとｍＲＮＡの結合に関わる配列はＲＮＡ配列でだけでなく、適宜ＤＮＡ配列としても表現することにする。リボソーム結合部位はシャイン・ダルガーノ配列（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列；以下、ＳＤ配列と略記する）とも呼ばれ、一般に１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有する。特に、頻度が高く出現するＳＤ配列はＡＧＧＡＧＧまたはＡＡＧＧＡＧＧ（以下、この配列を「コンセンサスＳＤ配列」と略記する）、またはこの「コンセンサスＳＤ配列」に類似した配列である。このような配列は遺伝子の様々な部位に出現するが、開始コドンの上流の領域にＳＤ配列が高頻度に出現することがわかっている。本明細書では、「開始コドンの上流の位置」を明示するために、コンセンサスＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧまたはＡＡＧＧＡＧＧ）の中のＡＧＧＡ（または位置的にＡＧＧＡと一致する配列）と開始コドンの間の距離（以下、ＳＤ−ＡＴＧ間の距離と略記する）を以下の説明の中に加えることにする。なお、このＳＤ−ＡＴＧ間の距離は遺伝子の翻訳開始効率に大きく影響を与えることが知られている〔Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：ＤＮＡ  Ｖｏｌ．２，ｐ．１２５−１３１（１９８２）、Ｉｔｏｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：ＤＮＡ  Ｖｏｌ．２，ｐ．１５７−１６５（１９８２）〕。
次に、図２に示すように、蛋白質をコードする可能性がある翻訳の読取り枠（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ；以下、「ＯＲＦ」と略記する）が多数出現するが、本明細書の中では、蛋白質をコードする可能性がある翻訳の読取り枠を「ＯＲＦ」と呼び、ＯＲＦの中で、蛋白質が実際に翻訳される翻訳領域を「ＣＤＳ（Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ぶことにする。また個々の任意のＯＲＦ、ＣＤＳ、翻訳領域、転写単位に関しては、それぞれに数字または記号を付けて、ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂ、ＣＤＳ−１、ＣＤＳ−Ａ、ＣＤＳ−Ｂ、翻訳領域Ａ、翻訳領域Ｂ、転写単位Ｐ、転写単位Ｑなどと標記することにする。本明細書の中では、ＯＲＦは多くの場合、最長の長さのＯＲＦを意味するものとする。本明細書においては、図２に示すように、上側のＤＮＡ鎖すなわち右方向に翻訳される遺伝子が並んでいるＤＮＡ鎖をプラス鎖と呼び、一方、下側のＤＮＡ鎖をマイナス鎖と呼ぶことにする。
多くの場合、図２に示すように、ＣＤＳ（真の蛋白質をコードしている領域）はＯＲＦと同一であるか、またはＯＲＦのうちの一部の領域である。また開始コドンの候補も多数存在し、真の開始コドンの同定は容易でない。また原核生物の遺伝子の場合、複数のＣＤＳが同一のｍＲＮＡ上に存在し、しかも個々のＣＤＳすなわちシストロンが接近し、連結している構造をとることがある。この転写単位の構造を「ポリシストロン性ｍＲＮＡ」というが、このポリシストロンの転写単位構造を情報科学的に予測することは困難であり、効率よく転写単位を予測し、その結果を出力できる翻訳同定プログラムは開発されていない。また、ＣＤＳまたは転写単位が他のＣＤＳまたは転写単位と重複、あるいは他のＣＤＳまたは転写単位を含んでいる（本明細書では「内包する」または「内包関係にある」と表現する）場合は、各々のＣＤＳまたは転写単位の真偽を判定する必要もある。
以上のように、塩基配列情報が与えられた場合、「ＣＤＳの候補が多数存在する」、「開始コドンの候補が多数存在する」、および「２つ以上のＣＤＳの候補が重なり合う」というような理由により、正しいＣＤＳを同定することは困難であるという問題点があった。
発明の開示
本発明は上記問題点を解決するため、ポリシストロンの転写単位の構造の予測を可能とすること、開始コドンの位置の同定精度を高めること、予備情報を不要とすること、およびＧＣ含量が高い塩基配列に対応することに主眼をおき、精度の向上した遺伝子構造同定方法の開発を課題としてなされた。本発明の目的は、これらの課題を解決した原核生物の遺伝子構造同定方法、その実行プログラム、そのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、さらにその記録媒体を利用したコンピュータに基づく遺伝子構造同定システムを提供することである。
本発明でいう遺伝子構造同定方法とは翻訳領域、翻訳開始コドンの位置、翻訳終止コドンの位置、および転写単位のうちの一つ以上を同定する方法をいう。
本発明者は、「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」を主に考案し、この方法をコンピュータに実行させるプログラムを作成し、実行することにより本課題を解決できることを見い出した。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（６）で示される「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」である。
（１）下記（ａ）〜（ｇ）の工程：
（ａ）原核生物の塩基配列（塩基配列とはＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列をいう）情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のオープン・リーディング・フレーム（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ；以下、ＯＲＦと略記する）を与える仮の翻訳開始コドンを設定する；
（ｂ）工程（ａ）で得られた任意の隣り合い、かつ同じ鎖にある２つのＯＲＦを下流からＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂとしたとき、ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定する〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数である〕；
（ｃ）工程（ｂ）においてＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定された場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中に翻訳開始コドンの候補があるときに、その候補をＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンと同定し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることによりＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する；
（ｄ）工程（ｃ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか調べる〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕；
（ｅ）工程（ｄ）で該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるとき、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する；
（ｆ）工程（ｂ）で一つの転写単位を形成する可能性があると判定されなかったＯＲＦ−Ａまたは工程（ｅ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕；
（ｇ）工程（ｃ）、（ｅ）または（ｆ）の同定結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定し遺伝子構造を同定する；
工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法。
（２）工程（ｅ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（ｉ）ＧとＣの対合は＋４を与える
（ｉｉ）ＡとＵの対合は＋２を与える
（ｉｉｉ）ＧとＵの対合は＋１を与える
（ｉｖ）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「ｍＲＮＡとリボソームとの結合状態を表わすスコア（以下、リボソーム結合スコア、という）」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ３を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い翻訳開始コドンを真の翻訳開始コドンと同定し、さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることにより、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する工程である（１）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕。
（３）工程（ｆ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（ｉ）ＧとＣの対合は＋４を与える
（ｉｉ）ＡとＵの対合は＋２を与える
（ｉｉｉ）ＧとＵの対合は＋１を与える
（ｉｖ）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「リボソーム結合スコア」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ１を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳コドンを真の翻訳コドンと同定し、閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を設定し、該閾値を越えたときにＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを段階的に同定する工程である（１）または（２）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｖ１は（２）項のＶ３よりも大きい７〜１４の整数である〕。
（４）「リボソーム結合スコア」を算出する際に、翻訳開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引いて該スコアを求めることを特徴とする（２）または（３）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、ＰＧは１〜４の整数で、ＰＴは２〜６の整数である〕。
（５）（１）〜（４）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された転写単位Ｐ、翻訳領域Ａ、転写単位Ｑおよび翻訳領域Ｂにおいて、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複する場合、さらに下記（ｈ）〜（ｊ）の工程：
（ｈ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと同じ鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｉ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｊ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複するときに、転写単位または翻訳領域の長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定する；
工程を含む遺伝子構造同定方法。
（６）（１）〜（５）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を繰り返して用いることを特徴とする遺伝子構造同定方法。
また本発明は、下記（７）〜（１１）で示される「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」である。
（７）下記（ｋ）と（ｌ）の工程：
（ｋ）すでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個の翻訳領域において、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別する；
（ｌ）「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより該翻訳領域Ａの真偽を判定する〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数である〕；
工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法。
（８）「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する方法である（７）項記載の遺伝子構造同定方法。
（９）すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列をもとに下記（ｍ）〜（ｐ）の工程：
（ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べる；
（ｎ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000002
としたとき、下式（２）によりｙｉを、そして下式（３）によりｙｉ＋３２を求める；
2003035863.tif 000003
（ｏ）ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、工程（ｍ）で並べた６４種類のコドンを並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（４）により求める
2003035863.tif 000004
［ここで、
2003035863.tif 000005
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする］；
（ｐ）工程（ｏ）で算出した翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域と判定し、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域と判定する；
工程を含む（７）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．８〜１．８の値である〕。
（１０）原核生物の翻訳領域または該領域と推定される翻訳領域Ａが、相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、下記（ｑ）と（ｒ）の工程：
（ｑ）翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と該翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、該翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｒ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、（７）〜（９）いずれか一項記載の方法により該翻訳領域Ａと該翻訳領域Ｂの真偽を判定する；
工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
（１１）転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域にした後に、（７）〜（１０）のいずれか一項記載の方法を適用することを特徴とする遺伝子構造同定方法。
また本発明は、「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」と「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を組み合わせて原核生物の翻訳領域を同定する精度を高めた下記（１２）で示される。
（１２）（１）〜（６）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法により同定した翻訳領域または転写単位の真偽を（７）〜（１１）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて判定する遺伝子構造同定方法。
また本発明は下記（１３）で示される。
（１３）（１）〜（１２）のいずれか一項に記載した遺伝子構造同定方法を用いて同定されたコードするポリペプチドの長さがＬＦアミノ酸以上である翻訳領域の塩基配列をもとに、コードするポリペプチドの長さがＬＭアミノ酸以上の翻訳領域の真偽を、（７）〜（１２）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて判定する遺伝子構造同定方法〔ここで、ＬＦは１００以上の正の整数であり、ＬＭは２０以上の正の整数である〕。
また本発明は下記（１４）〜（１８）で示される「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」である。
（１４）原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、該塩基配列内の翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域を「偽の翻訳領域」と判定することを特徴とする原核生物の遺伝子構造同定方法。
（１５）計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる（１４）項記載の遺伝子構造同定方法
2003035863.tif 000006
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000007
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕。
（１６）原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、該塩基配列内の翻訳領域の５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域の翻訳開始コドンを「偽の翻訳開始コドン」と判定し、該偽と判定した翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索する原核生物の遺伝子構造同定方法。
（１７）計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる（１６）項記載の遺伝子構造同定方法
2003035863.tif 000008
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000009
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕。
（１８）（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法と（１４）〜（１７）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いる、塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越える原核生物の遺伝子構造同定方法。
また本発明は下記（１９）〜（２４）で示される。
（１９）（１）〜（１８）のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法と、「コーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域の真偽を判定する方法」を用いる原核生物の遺伝子構造同定方法。
（２０）「コーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域を真偽を判定する方法」が、すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列をもとに、Ｔ個の翻訳領域において「出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより該翻訳領域Ａの真偽を判定する方法である、（１９）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
（２１）「出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する方法である（２０）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
（２２）下記（ｓ）〜（ｕ）の工程：
（ｓ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000010
としたとき、下式（６）によりｙｉを求める；
2003035863.tif 000011
（ｔ）ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（７）により求める
2003035863.tif 000012
［ここで、
2003035863.tif 000013
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする］；
（ｕ）工程（ｔ）で算出した該翻訳領域ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該翻訳領域Ａを真の翻訳領域と判定し、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽の翻訳領域と判定する；
工程を含む、（２０）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜１．８の値とする〕。
（２３）原核生物の翻訳領域または該領域と推定される翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、下記（ｖ）および（ｗ）：
（ｖ）該翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｗ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、（１８）〜（２２）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法により該翻訳領域Ａと該翻訳領域Ｂの真偽を判定する；
工程を含む遺伝子構造同定方法〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
（２４）転写単位を構成する翻訳領域の終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域にした後に、（１８）〜（２３）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を適用することを特徴とする遺伝子構造同定方法。
さらに本発明は下記（２５）〜（４５）で示される。
（２５）  （ａ）入力装置により入力された原核生物の塩基配列データから、該塩基配列中の翻訳終止コドンを検索し、得られた全ての翻訳終止コドンについて、最長のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を与える仮の翻訳開始コドンを検索し、上記翻訳終止コドンと仮の翻訳開始コドンの組み合わせをＯＲＦ候補とし、これらのコドンの上記塩基配列上の位置を、メモリに格納し、
（ｂ）メモリから、同じ鎖にある隣り合う２つのＯＲＦ候補を呼び出し、下流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ａとする）の仮の翻訳開始コドンと、上流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ｂとする）の翻訳終止コドンの位置と距離を調べ、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数である〕にあるとき、この隣接する２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定してステップ（ｃ）に移り、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンとＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの位置と距離が上記条件を満たさない場合は、この隣接する２つのＯＲＦの組（ＯＲＦ−Ａ，ＯＲＦ−Ｂ）は一つの転写単位を形成しないと判定してステップ（ｆ）に移り、
（ｃ）ステップ（ｂ）で、２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定したものについて、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中から、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補を検索し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、
翻訳開始コドン候補が１つの場合、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
翻訳開始コドン候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位の最も高いものを選択し、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｄ）ステップ（ｃ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか検索し、
該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるときはステップ（ｅ）に移り、該候補がないときはステップ（ｆ）に移り、
（ｅ）ステップ（ｄ）で検索したＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補について、上記塩基配列データを呼び出して、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域の存在の有無を調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｆ）ステップ（ｂ）で一つの転写単位を形成しないと判定されたＯＲＦ−Ａまたは処理（ｅ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、上記塩基配列データを呼び出して、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを検索し、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｇ）以上のステップを、メモリに格納された全てのＯＲＦについて処理済みとなるまで繰り返し、
メモリに格納されたステップ（ｃ）、（ｅ）または（ｆ）ステップでの転写単位及び翻訳領域の同定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに実行させるためのプログラム。
（２６）  上記ステップ（ｅ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ３〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕を保持し、閾値Ｖ３を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い候補を選択し、
さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として該優先度が高い候補を選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむものである（２５）項記載のプログラム。
（２７）  上記ステップ（ｆ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える。
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える。
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える。
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える。
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ１を保持し、閾値Ｖ１を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンを、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を段階的に設定し、該閾値を越える上記ｍＲＮＡ配列を段階的に検索して、リボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、同定結果をメモリに書きこむものである（２５）または（２６）項記載のプログラム〔ここで、Ｖ１は（２）のＶ３よりも大きい７〜１４の整数である〕。
（２８）  上記「リボソーム結合スコア」を算出する際に、翻訳開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引いて該スコアを求めることを特徴とする（２６）または（２７）項記載のプログラム〔ここで、ＰＧは１〜４の整数で、ＰＴは２〜６の整数である〕。
（２９）  （２５）〜（２８）項記載のプログラムにおいて、上記ステップ（ｇ）の後、メモリに格納された転写単位及び翻訳領域のデータを呼び出し、さらに
（ｈ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと同じ鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定し；
（ｉ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定し；
（ｊ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複するときに、転写単位または翻訳領域の長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽の翻訳領域」と判定し；
上記判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
（３０）  （ｋ）入力手段により入力されたすでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個の翻訳領域の中で、使用されているコドンの種類とその数を調べ、この中で、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別して、メモリに格納し；
（ｌ）入力手段により入力された翻訳領域と推定される翻訳領域データから、該翻訳領域Ａでの上記選択されたコドンの出現頻度を計測し、
上記「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより、該翻訳領域Ａの真偽を判定し〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数である〕；
上記判定結果を出力装置が表示する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
（３１）  処理（ｌ）が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用いて「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較し、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する処理を行なうものである、（３０）項記載のプログラム。
（３２）  （ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納し；
（ｎ）すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列を入力し、ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000014
としたとき、下式（２）によりｙｉを、そして下式（３）によりｙｉ＋３２を求める；
2003035863.tif 000015
（ｏ）メモリから、ステップ（ｍ）で得られたコドンテーブルを呼び出し、テーブル中の各コドンのｙｉおよびｙｉ＋３２を対応付け、ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、テーブル中のコドンの配列を並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（４）により求める
2003035863.tif 000016
［ここで、
2003035863.tif 000017
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする］；
（ｐ）上記処理により求めた、翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域と判定し、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域と判定する処理〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．８〜１．８の値である〕をコンピューターに行なわせるための、（３０）項記載のプログラム。
（３３）  入力装置により入力された、原核生物の翻訳領域について、該翻訳領域同士の重複および内包の有無を調べ、翻訳領域または該領域と推定される翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、
（ｑ）上記塩基配列データを呼び出し、該翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と該翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定する；
（ｒ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、（３０）〜（３２）のいずれか一項記載の処理により翻訳領域Ａと翻訳領域Ｂの真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕
処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
（３４）  すでに同定された翻訳領域のデータに代えて、このデータから、転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域に書き換える処理を行なった後、上記（ｋ）、（ｌ）の処理を行なわせることを特徴とする、（３３）項記載のプログラム。
（３５）  （２５）〜（３５）項においてメモリに格納された同定ずみの翻訳領域および転写単位について、翻訳領域および転写単位の真偽を（３０）〜（３４）のいずれか一項記載の処理を用いて判定させるプログラム。
（３６）  （２５）〜（３５）のいずれか一項に記載の処理により真の翻訳領域と同定された翻訳領域のデータをメモリから呼び出し、各翻訳領域がコードするポリペプチドの長さを計算し、ポリペプチドの長さがＬＦアミノ酸以上である翻訳領域の塩基配列をもとに、コードするポリペプチドの長さがＬＭアミノ酸以上の翻訳領域の真偽を、（７）〜（１２）のいずれか一項記載の処理を用いて判定する処理を行なうプログラム〔ここで、ＬＦは１００以上の正の整数であり、ＬＭは２０以上の正の整数である〕。
（３７）  入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物の翻訳領域のデータから、上記翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を所定の計算式を用いて算出し、この算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域を「偽の翻訳領域」と判定し、判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
（３８）  計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる（３７）項記載のプログラム
2003035863.tif 000018
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000019
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕。
（３９）  入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物の翻訳領域のデータから、上記翻訳領域の５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を、所定の計算式を用いて算出し、
算出された含量が一定値を下回るとき、該翻訳領域の翻訳開始コドンを「偽の翻訳開始コドン」と判定し、判定結果を出力装置により出力すると共に、
入力装置により入力された、上記翻訳領域の塩基配列データを呼び出し、該偽と判定した翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索する処理をコンピューターに行なわせるプログラム。
（４０）  計算式として下式（５）、算出された含量として下記ＧＣｉの値：
2003035863.tif 000020
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒは１，２または３である）の塩基がｂ（ｂは１，２，３または４である）のとき、
2003035863.tif 000021
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす〕
および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いる（３９）項記載のプログラム。
（４１）  （２５）〜（４０）のいずれか一項に記載された処理に基づいて同定された原核生物のＴ個の翻訳領域において出現頻度の高いｍ種類のコドンと、出現頻度の低いｍ種類のコドンを選択し、メモリに格納し、
Ｔ個の翻訳領域とは別の入力された未同定の翻訳領域のデータから、「Ｔ個の翻訳領域において出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「Ｔ個の翻訳領域において出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを計測し、両者を比較することにより該翻訳領域Ａの真偽を判定する処理を行ない、判定結果を出力装置により出力させる処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
（４２）  「出現頻度の高いｍ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽の翻訳領域」と判定する方法である（４１）記載のプログラム〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
（４３）  （ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納する；
（ｓ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000022
としたとき、下式（６）によりｙｉを求める；
2003035863.tif 000023
（ｔ）メモリのコドンテーブルを呼び出し、ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域と推定される翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（７）により求める
2003035863.tif 000024
［ここで、
2003035863.tif 000025
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする］；
（ｕ）ステップ（ｔ）で算出した該翻訳領域ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該翻訳領域Ａを真の翻訳領域と判定し、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽の翻訳領域と判定し、判定結果を出力装置により出力する
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜１．８の値とする〕処理をコンピューターに行なわせるための（４１）項記載のプログラム。
（４４）  原核生物の翻訳領域または該領域と推定される翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する翻訳領域と推定される翻訳領域Ｂと重複し、かつ該翻訳領域Ｂが該翻訳領域Ａによって内包される場合、
（ｖ）翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、翻訳領域Ｂを「偽の翻訳領域」と判定し、
（ｗ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、（４１）〜（４３）のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法により該翻訳領域Ａと該翻訳領域Ｂの真偽を判定し〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕、
判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせるためのプログラム。
（４５）  すでに同定された翻訳領域のデータに代えて、このデータから、転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域に書き換える処理を行なった後、（４１）〜（４４）のいずれか一項記載の処理を行なわせるプログラム。
（４６）  （２５）〜（４５）のいずれか一項記載のプログラムを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体。
（４７）  （ｉ）塩基配列データを入力するための入力手段、（ｉｉ）入力されたデータを用いて、（２５）〜（４５）のいずれか一項に記載のプログラムを実行する手段、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）により得られた結果を出力するための出力装置とを備えた、遺伝子構造同定システム。
発明を実施するための最良の形態
本発明の遺伝子構造同定方法の実施は、コンピューターを用いた方法に限られるものではないが、大量の塩基配列データを高速で処理することが可能であるという点から、コンピューターを用いて実施することが好ましい。
図１２に本発明の遺伝子構造同定方法を好ましく実施するためのハードウェア構成図を示したものであり、基本的に、入力装置１、記憶装置２、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３、出力装置４からなり、バス線５に接続されている。
ＣＰＵ３は、プログラムを実行して、配列の検索、各種指標の計算、比較、記憶又は出力すべきデータの指示などを行なうものである。
入力装置１は、解析すべき塩基配列データを入力したり、各種の処理を実行するための指示コマンドなどを入力するための装置である。
記憶装置２とは、入力情報及び計算結果を記憶するメモリ、およびそれにアクセスしうるメモリアクセス手段をいい、主に、外部記憶手段６、データ記憶手段７、プログラムファイル８などからなる。
外部記憶手段６は、解析すべき塩基配列のデータが格納されたフロッピーディスク、光磁気ディスク、ハードディスクおよびメモリーなどの記録媒体である。
データ記憶手段７（以下、単にメモリともいう）には、本発明の遺伝子構造同定方法を実施するための各種処理で得られるデータを記憶するためのものである。そして、本発明の遺伝子構造同定方法により、同定され、あるいは真偽が判定された、ＯＲＦ、ＣＤＳ、転写単位のデータも記憶される。
プログラムファイル８には、本発明の方法を実行するためのプログラム、後述するランク関数表などが記憶されている。
出力装置４は、本発明の遺伝子構造同定方法により、同定され、あるいは真偽が判定された、ＯＲＦ、ＣＤＳ、転写単位の同定または判定結果を出力するものであり、ディスプレイ、プリンタ、記録媒体などが用いられる。すなわち、翻訳開始ドンおよび終止コドンの位置、並びに個々の転写単位に含まれるＣＤＳに関する情報は、ディスプレイへの表示、プリンタへの出力による印刷、または記録媒体への記録により、出力することができる。
さらに、本発明の実施のためのハードウェアにおいては、通信ネットワーク９に接続されて、該ネットワークを介して外部の塩基配列データベースを電送し、外部記憶手段に格納することができるようになっていることが好ましい。
１．転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法
本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」は開始コドンの位置とポリシストロンの転写単位の構造を高精度に予測する方法を用いる高精度な原核生物の遺伝子構造同定方法であり、これによりポリシストロンの転写単位の構造も同定できる。この遺伝子構造同定方法においては、開始コドンの位置の同定、ＣＤＳの同定およびポリシストロンの転写単位の構造の同定は互いに密接に関連している。すなわち、ある翻訳領域ＣＤＳ−Ａの開始コドンの位置の同定に関しては、ＣＤＳ−Ａが他の翻訳領域ＣＤＳ−Ｂとポリシストロンの転写単位を形成するかどうか調べて、該転写単位を形成する可能性のあるときには、ＣＤＳ−Ｂの終止コドンと開始コドンの候補との位置関係を調べて、開始コドンの真偽を判定している。さらに、ｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のリボソーム結合配列との対合状態を数値化することにより、開始コドンの位置を同定するとともに、ＣＤＳの真偽を判定している。
図１２に示した構成の装置を用いて、本発明の実施態様における遺伝子構造同定法を実施する場合の全体処理フロー図を図１３に示す。
図１３において、Ｓ１１では、入力装置により解析すべき原核生物の塩基情報が入力される。
本発明の方法において、塩基配列データは、キーボードから直接入力する、インターネットなどを介して電送されるデータを読み込む、あるいはフロッピーディスク、光磁気ディスク、ハードディスクおよびメモリーなどの記録媒体（外部記憶ファイル）上に記録されたデータを読み込むことにより、コンピュータに入することができる。
Ｓ１２において、ＣＰＵは、Ｓ１１で入力した塩基配列データから、終止コドンを検索し、該終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを検索し、終止コドンと仮の開始コドンの組をＯＲＦ候補としてメモリに格納する。
Ｓ１３では、ＣＰＵは、メモリから、同じ鎖にある隣り合う２つのＯＲＦを呼び出し、下流側の翻訳開始コドンと、上流側の翻訳終止コドンの位置関係を調べ、一つの転写単位を形成する可能性を判定する。
Ｓ１４では、Ｓ１３で一つの転写単位の可能性のあるものについては、その下流側の翻訳開始コドンの周囲の領域から、再度翻訳コドン候補を検索し、上流側の翻訳終止コドンとの位置関係に基づいて、あらかじめ定めた優先順位に基づいて下流側の翻訳開始コドンを同定し、同定した転写単位とＣＤＳをメモリに格納する。それ以外のものについては、上記仮の翻訳開始コドンの周囲から、再度翻訳コドン候補を検索し、その中からその上流の適当な位置にリボソーム結合領域を有するものを選択して、翻訳開始コドンを同定し、同定したＣＤＳをメモリに格納する。
Ｓ１７では、メモリに格納した、同定ずみの転写単位・ＣＤＳのデータを出力装置により出力する。
出力の際には、開始コドンの位置は、プラス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置、およびマイナス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置で表わすことができる。終止コドンの位置は、プラス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置、およびマイナス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置で表わすことができる。
図１３に示す遺伝子構造同定方法について、さらに、図３のフローチャートを用いて詳述する。
図３の工程（ａ）は図１３のＳ１２に対応するものである。
本発明で取り扱うことができる塩基配列の情報は、原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列の情報である。塩基配列としては、１本鎖と２本鎖いずれも扱うことができるが、２本鎖の場合には、どちらか一方の鎖の塩基配列の情報を取り扱う。２本鎖のプラス鎖の塩基配列情報を最初に扱った後、マイナス鎖の塩基配列情報を扱ってもよい。ＲＮＡの塩基配列を扱う場合には、Ｕ残基をＴ残基に置換して用いることが好ましい。１００塩基対程度の塩基配列だけでなく、１００万塩基対以上のゲノムＤＮＡの塩基配列に関しても、ＣＤＳを予測することができる。
原核生物の塩基配列としては、４６３９２２１  ｂｐの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ０００９６）、４２１４８１４  ｂｐの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＬ００９１２６）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のリボソームオペロンを含むＤＮＡ断片の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ０００４０８およびＡＥ０００４７２、ＤＮＡ断片の長さはそれぞれ１０９４４  ｂｐおよび１４６５９  ｂｐ）などが挙げられる。塩基配列は、相同性検索プログラムやｔＲＮＡ予測プログラムｔＲＮＡ−Ｓｃａｎなどを用いて前もってＲＮＡ遺伝子領域を予測し、予測された領域の塩基をｘなどで置換して、ＣＤＳの同定から除外することができる。
工程（ａ）では、この入力装置により入力された原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを検索し、該終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
最長のＯＲＦとは、５’末端から数えてｉ番目の終止コドンと（ｉ＋１）番目の終止コドンに着目したとき、ｉ番目の終止コドンから３’方向に向かって最初に出現するＡＴＧコドン、ＧＴＧコドン、またはＴＴＧコドン（これを仮の開始コドンとする）から（ｉ＋１）番目の終止コドンに至るまでの領域である〔ここで、ｉは１以上の整数〕。終止コドンとしては、ＴＡＡコドン、ＴＡＧコドン、ＴＧＡコドンを用いることができる。
ついで、終止コドンと仮の翻訳開始コドンの組（仮のＯＲＦ）を、終止コドンの位置に基づき５’末端から３’末端の方向にしたがって配列し、終止コドン、仮の開始コドンの上記塩基配上の位置とともに、メモリに格納する。
なお、本発明において、開始コドンとしては特にことわりのない限りＡＴＧ、ＧＴＧ、およびＴＴＧを用いる。
工程（ｂ）は、図１３のＳ１３に対応する処理であり、ＣＰＵがポリシストロンの転写単位の予測を行う。複数のＣＤＳすなわちシストロンがポリシストロンを形成するとき、同一のリボソーム結合部位を利用してこれらのシストロン（ＣＤＳ）の翻訳が行われる場合が多い。すなわち、隣り合っているＣＤＳ同士は翻訳の共役が起こる場合がある。あるＣＤＳ−Ａとその上流にあるＣＤＳ−Ｂの間で翻訳の共役が起こりうる条件としては、少なくともＣＤＳ−Ａを含む最長のＯＲＦの仮の開始コドンがＣＤＳ−Ｂの終止コドンの上流にある、または該終止コドンの下流の近い位置に存在することが必要である。より好ましくは、ＣＤＳ−Ａの開始コドンが、ＣＤＳ−Ｂの終止コドンの上流にあるか、または該終止コドンの下流ＤＳ塩基（ＤＳは２０〜１００の整数である）以内にあるときに、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂとの間で翻訳の共役が起こる、すなわちポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定できる。従って、本工程におけるＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂについては、ＯＲＦ−Ａの仮の開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの上流にあるか（Ｓ３０２）、または該終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき（Ｓ３０３）、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂがポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定してメモリに格納し、これに該当しない場合は、この隣接する２つのＯＲＦの組（ＯＲＦ−Ａ，ＯＲＦ−Ｂ）は一つの転写単位を形成しないと判定する。
つづいて、ＯＲＦ−Ａの開始コドンを同定する工程［図１３のＳ１４、工程（ｃ）〜（ｆ）］について説明する。
一般に、原核生物の遺伝子の発現において、リボソームがＯＲＦ−Ｂの翻訳を終えたとき、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍にＯＲＦ−Ａの開始コドンが存在するときに、該開始コドンの上流にリボソーム結合配列がなくても、ＯＲＦ−Ａの翻訳が起こりうる。従って、このＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍に開始コドンが存在するときは、該開始コドンをＣＤＳ−Ａの開始コドンと同定できる。本発明の工程（ｃ）においては、メモリに格納した隣り合う２つのＯＲＦ候補を呼び出し、ＯＲＦ−Ａの翻訳が起こりうるＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍」として、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かってＤＢ塩基以内（ここで、ＤＢは１０〜２０の整数とする）および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内（ここで、ＵＢは３〜１５の整数とする）の領域で開始コドンを検索することが好ましい。さらに好ましくは、図４に示す場合のように、ＤＢが１４で、ＵＢが１１である領域で検索する（Ｓ３０４）。
なお、このＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍」において検索する開始コドンはＡＴＧおよびＧＴＧに限定することが好ましい。これは好適なリボソーム結合配列が存在しないときに、ＴＴＧコドンから翻訳が開始されにくいという予測による。
ここで得られた翻訳開始コドン候補が１つの場合、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむ（Ｓ３１２）。
一方、Ｓ３０４の検索において、翻訳開始コドン候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位の最も高いものを選択する。
工程（ｃ）で開始コドンが同定できなかった場合、さらに工程（ｄ）として、ＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」にＯＲＦ−Ａの翻訳が起こりうる開始コドンの候補があるかどうか調べる（Ｓ３０５）。本発明において、ＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」とは、該終止コドンの第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域であり、かつ該「終止コドンの近傍」を除いた領域であることが望ましい〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数とする〕。
ここで単一の翻訳開始コドンを同定できた場合は、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむ。
なお、上記（ｃ）及び（ｄ）の工程でＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が複数得られた場合は、ＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分けた後、３つの領域すなわち「該近傍」、「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の優先度に従い、該優先度が高い翻訳開始コドンを真の翻訳開始コドンと同定することができる。さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標としてあらかじめ定めた優先順位に従い、該優先順位が最も高い開始コドンをＯＲＦ−Ａの真の開始コドンと同定することができる。
図４は、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン付近に存在する翻訳開始コドンの優先順位付けを「ランク関数」として表示した例を示している。図４においては、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かって１４塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かって１１塩基以内の領域を「ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍」に設定した例を示している。優先順位の決め方は、一般的には上記３つの領域について優先順位を設け、さらにＯＲＦ−Ｂの終止コドンに近いほど優先順位が高いというルールを採用することができる。
本発明において「距離を指標として優先順位を決める」とは、このルールを採用することであるが、好ましくは、図４に示すように、ＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補のＯＲＦ−Ｂの終止コドンとの位置関係を表わす値（本明細書では、「ランク関数」と名付けた）を用いることにより、開始コドンの優先順位を決めることができる。「ランク関数」の値は図４に示したが、小さい数ほど優先順位が高いことを意味する。「ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍」、「該近傍の下流域」および「該近傍の上流域」のそれぞれの領域において、ＯＲＦ−Ａの開始コドンがＯＲＦ−Ｂの終止コドンに近いほど、ランク関数は小さい値をとる。
具体的には、図４において、最も優先順位の高い「ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍」は、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かって１４塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かって１１塩基以内の領域であり、この領域のランク関数は、図４に示したように１〜８の値をとる。
前述のようにＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」にＯＲＦ−Ａの開始コドンが存在する場合に翻訳が起こりうる。ただし、ＯＲＦ−Ａの開始コドンがＯＲＦ−Ｂの終止コドンから離れているので、通常は効率のよい翻訳開始が起こるために、ＯＲＦ−Ａの開始コドンの上流にはリボソーム結合配列が存在することが望ましい。すなわち、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補が翻訳開始コドンと同定されるためには、該候補の上流の配列にリボソームとｍＲＮＡが結合することが可能であるリボソーム結合配列が存在することが望ましい。
リボソーム結合配列を調べる方法としては、リボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを、該候補から上流に向かって１〜３０塩基離れた領域にあるｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列との対合状態を数値化（Ｓ３０６）することにより求めた後、そのスコアがある閾値を越えたときには、該開始コドンの候補をＯＲＦ−Ａの開始コドンと同定する（Ｓ３０７）方法などが挙げられる。
１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列については、多くの細菌および古細菌が、３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’または３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’という配列を有している。従って、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列がわかっていない原核細胞の翻訳領域の開始コドンを同定する場合には、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列として３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’または３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’を用いることが望ましい。もしくは、その配列の周囲の配列（通常１〜３塩基）を含めた６〜１３塩基の配列をｍＲＮＡ結合配列として用いることもできる。さらに１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列がわかっている原核細胞の翻訳領域の開始コドンを同定する場合には、該ｒＲＮＡの３’末端配列を用いることもできる。
効率のよい翻訳開始が起こるには、このｍＲＮＡ結合配列との結合に関与するＳＤ配列と呼ばれる配列が開始コドンの上流の翻訳開始に適切な位置に存在する必要がある。そこで、開始コドンから上流に向かって１〜３０塩基離れた領域に、１６Ｓ  ＲＮＡのｍＲＮＡ結合配列と対合しうる配列があるかどうかを調べる。
具体的には、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’と該開始コドンの上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列との対合状態、または１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’と該開始コドンの上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列との対合状態を数値化してリボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを算出する方法により調べる。リボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアの算出法としては、翻訳領域の開始コドンから上流に向かって１〜３０塩基離れた領域にあるｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列の間の塩基の対合を数値化する方法ならいかなる方法も用いることができる。該方法としては、例えば核酸の対合物の解離温度の規則を利用する方法、核酸の対合物の結合状態を表わす自由エネルギーの値〔Ｓｃｈｕｒｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２１，４０１９−４０２３（１９９３）〕を用いる方法、またはウエイトマトリックス法を利用したリボソーム結合部位の検索法〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，２９４１−２９４７（１９９８）〕などをあげることができる。
上記方法を用いてリボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを求めたとき、各々の方法で設定される一定の閾値を越えたスコアを示す配列がリボソーム結合配列であると同定することができる。
以下、リボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを、核酸の対合物の解離温度の規則を利用して算出する方法について説明する。
ＤＮＡとオリゴヌクレオチドとの対合物の解離温度を算出する場合、ＧとＣの対合を４℃、ＡとＴとの対合を２℃、ＧとＴとの対合を１℃として計算することがよく行われるが、核酸の対合物の解離温度の規則を利用する方法においても同じ算出法を適用することができる。たとえば、ＧとＣの対合を＋４、ＡとＵとの対合を＋２、ＧとＵとの対合を＋１とし、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列と開始コドンの上流の塩基配列の間の対合をもとにスコア（以下、該スコアを「リボソーム結合スコア」と略記する）を求める。さらに、対合が観察された塩基のとなりの塩基で対合が起こらない場合、ペナルティーを与えることも望ましい。ペナルティースコアとしては、たとえば−１が挙げられる。従って核酸の対合物の解離温度の規則を利用するスコアの算出法として
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
の４つの規則に従って数値化する方法を用いる。通常、「リボソーム結合スコア」は、ＳＤ配列と開始コドンの間の距離が５〜１２塩基対である８通りの距離について算出し、最大値を求めた後、ＣＤＳの真偽の判定に用いることが望ましい。
ｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列との対合状態がよいほど、翻訳開始効率が高いことが知られているので、リボソーム結合スコアの値が大きいほど、翻訳開始の効率が高いと予想できる。したがって、開始コドンの位置はリボソーム結合スコアの値の大きさで同定することが可能である。開始コドンの同定法として、各開始コドンに対してリボソーム結合スコアの値を求めて、ある閾値Ｖ１を越えるときに開始コドンとして選別する方法を用いることができる。ＳＤ配列がＡＧＧＡあるいはＡＧＧのときに効率のよい翻訳開始が起こることが知られており、これらの配列のリボソーム結合スコアはそれぞれ１１および９である。このような知見から、リボソーム結合スコアの計算に核酸の対合物の解離温度の規則を利用する場合、閾値Ｖ１は７〜１４の整数に設定する。多くのＣＤＳの開始コドンは、最長のＯＲＦの５’末端領域に存在することが知られている。したがって、リボソーム結合スコアの算出は、最長のＯＲＦの５’末端から検索してＮ個（Ｎは５〜１０の整数）の開始コドンの候補に対して行えばよい。しかも５’末端に近い開始コドンの候補ほど真の開始コドンである確率が高いので、リボソーム結合スコアと閾値Ｖ１との比較は、５’末端に近い開始コドンの候補から順番に行い、最初に該スコアが閾値Ｖ１を越えた開始コドンの候補を開始コドンとして同定することができる。しかしながら、ＳＤ配列がＡＡＧまたはＧＧでも翻訳開始が起こるとされているので、閾値Ｖ１を用いたときに開始コドンが同定できない場合、Ｖ１より小さい値を持つ複数の閾値を用いて再度開始コドンを段階的に同定することが望ましい。
ただし、前述の工程（ｄ）において、ＯＲＦ−Ｂの「翻訳終止コドンの近傍」の周囲の領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補がある場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳を終えたリボソームはＯＲＦ−Ａの翻訳開始を行いやすいので、開始コドンの選別に用いる上述の閾値はＶ１より小さい値Ｖ３でよい。Ｖ３の値としては、４〜１２の整数が好ましい。
一般に、開始コドンとしては、ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧの順番で翻訳開始の効率が高いと考えられる。したがって、開始コドンの塩基の違いを反映させて、リボソーム結合スコアを補正することが好ましい。この補正の手段としては、たとえば、リボソーム結合スコアを算出する際に、開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引くことができる。リボソーム結合配列を求める計算に核酸の対合物の解離温度の規則を利用した方法を用いた場合はＰＧとしては１〜４の整数を、ＰＴとしては２〜６の整数を用いることができるが、より好ましくは、ＰＧとしては２、ＰＴとしては４を用いることができる。
図５に、リボソーム結合スコアの算出の方法の一例をフローチャートとして示した。
まず、すでに検索された開始コドン候補（ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ）のうちの一つを選択し（Ｓ５０１）、まずＳＤ−開始コドンの距離ｄを１２と設定する（Ｓ５０２）。これは、対合状態を調べる開始コドン候補の上流の、上流１７塩基目から１０塩基目までの領域の８塩基について、スコアを計算する設定であることを意味する。
Ｓ５０３では、Ｓ５０２の設定に従い、まずｄ＝１２でスコアを計算する。すなわち、対合状態を調べる開始コドンの上流の、上流１７塩基目から１０塩基目までの領域の８塩基について、所定の方式でスコアを計算し、さらにＳ５０４で、開始コドンがＧＵＧまたはＵＵＧであるとき、Ｓ５０５でペナルティスコアを与える。
ついで、Ｓ５０３からＳ５０５の処理を、ｄの設定を１ずつ減らして繰り返し、開始コドン候補の上流１６塩基目から９塩基目までの領域（ｄ＝１１）についてのスコア、開始コドン候補の上流１５塩基目から８塩基目までの領域（ｄ＝１０）についてのスコア、開始コドン候補の上流１４塩基目から７塩基目までの領域（ｄ＝９）についてのスコア、開始コドン候補の上流１３塩基目から６塩基目までの領域（ｄ＝８）についてのスコア、開始コドン候補の上流１２塩基目から５塩基目までの領域（ｄ＝７）についてのスコア、開始コドン候補の上流１１塩基目から４塩基目までの領域（ｄ＝６）についてのスコア、開始コドン候補の上流１０塩基目から３塩基目までの領域（ｄ＝５）についてのスコアを求め、この中の最大値を上記開始コドン候補のリボソーム結合スコアとする。
ついで、すべての開始コドン候補について、Ｓ５０１〜Ｓ５０６の処理を繰り返し、すべての開始コドン候補のリボソーム結合スコアを求める。
リボソーム結合スコアの算出の具体例を挙げると、図６に示すように、大腸菌のトリプトファンオペロンの先頭のｔｒｐＬ遺伝子のリボソーム結合スコアは１２と算出される。
こうして求めたリボソーム結合スコアは、上述の如く、ある閾値Ｖ１を越えるものを開始コドンとして選別するために用いることができる。
こうして選別されたコドンを翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむ。
工程（ｂ）でポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されなかったＯＲＦ−Ａまたは工程（ｅ）で開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについては、工程（ｆ）で最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めた最長のＯＲＦの５’端側の領域にある開始コドンの候補から開始コドンとしての真偽を調べる。その理由は、正しい開始コドンの上流に、次の開始コドンと終止コドンが出現する確率を予測した場合、終止コドンが出現せずに、複数のＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧコドンが出現する確率は低くなるからである。したがって、通常５’末端側からＮ個〔Ｎは５〜２０の整数〕までの開始コドンの候補のリボソーム結合スコアを上述した方法などにより求め（Ｓ３０９）該スコアを閾値Ｖ１（閾値Ｖ１は、閾値Ｖ３よりも大きい値である）と比較し、最初に該スコアが閾値Ｖ１を越えた開始コドンの候補を開始コドンとして同定する（Ｓ３１０）ことができる。しかしながら、ＳＤ配列がＡＡＧまたはＧＧでも翻訳開始が起こるとされているので、閾値Ｖ１を用いたときに開始コドンが同定できない場合、Ｖ１より小さい値を持つ複数の閾値を用いて再度開始コドンを段階的に同定する（Ｓ３１１）ことが望ましい。より好ましくは、閾値Ｖ１に加えて、Ｖ１より小さい閾値Ｖ２およびＶ２より小さい閾値Ｖ３を用いることができる。この場合、Ｖ２の値としては５〜１３の整数を、そしてＶ３の値としては４〜１２の整数を用いることが好ましい。
こうして、選択した該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、同定結果をメモリに書きこむ（Ｓ３１２）。
ここで、Ｖ１より小さい値を持つ複数の閾値でリボソーム結合部位の存在を調べ、翻訳開始コドンが同定できないときは、ＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域を含むものとしないことが好ましい（Ｓ３１３）。
工程（ｇ）では工程（ｃ）、（ｅ）または（ｆ）の同定結果から、開始コドンおよび終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定し遺伝子構造を同定する（Ｓ３１２）。
開始コドンおよび終止コドンの位置、並びに個々の転写単位に含まれるＣＤＳに関する情報は、コンピュータを用いて本方法を実施したときは、ディスプレイへの表示、プリンタへの出力による印刷、または記録媒体への記録により、出力することができる。開始コドンの位置は、プラス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置、およびマイナス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置で表わすことができる。終止コドンの位置は、プラス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置、およびマイナス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置で表わすことができる。
転写単位の構造に関しては、同定した転写単位がモノシストロンであるか、ポリシストロンであるか、表示する必要がある。また、ポリシストロンの場合には、先頭のＣＤＳ、最後尾のＣＤＳ、および先頭のＣＤＳと最後尾のＣＤＳに挟まれた内部に存在するＣＤＳを区別して情報を出力することが望ましい。転写単位の構造の情報に関する出力法の好適な例としては、モノシストロンのＣＤＳに対して「１」というラベルを与え、また先頭のＣＤＳ、最後尾のＣＤＳ、および先頭のＣＤＳと最後尾のＣＤＳに挟まれた内部に存在するＣＤＳに対しては、それぞれ「２」、「４」、「３」というラベルを与えることができる。
上に示した「転写単位構造に着目した翻訳領域同定法」以外に、この変法を用いて遺伝子の構造を同定することもできる。その変法は、下記（ａ１）〜（ｇ３）の工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法である。
（ａ１）原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
（ａ２）工程（ａ１）で得られたＯＲＦから、該ＯＲＦの長さ（翻訳終止コドンの第１文字目の位置と翻訳開始コドンの第１文字目の位置の差）がＬ０塩基以上のものを選んだ後、選んだＫ個のＯＲＦに対してその翻訳終止コドンの位置で５’末端側から順番に、第１番目ＯＲＦ、第２番目ＯＲＦ、・・・第Ｋ番目ＯＲＦと名付ける〔ここでＬ０は３０から９００までの整数、およびＫは２以上の整数〕。
（ｂ１）工程（ａ２）で得られた第Ｉ番目ＯＲＦの仮の翻訳開始コドンが、第１番目ＯＲＦから第（Ｉ−１）番目ＯＲＦまでのＯＲＦの中で工程（ｇ３）において「真の翻訳領域」と判定された翻訳領域を含む第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき、第Ｉ番目ＯＲＦと第Ｊ番目ＯＲＦがポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定する〔ここで、Ｉは１からＫまでの整数、ＪはＩより小さい正の整数、ＤＳは２０〜１００の整数〕。
（ｃ１）工程（ｂ１）において第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された第Ｊ番目ＯＲＦの中で、Ｊの値が最も小さいＯＲＦを選んだ後、第Ｊ番目ＯＲＦの「翻訳終止コドンの近傍」すなわち「該終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域」の中に翻訳開始コドンの候補があるときに、その候補を第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンと同定する〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕。ここで、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、各候補と第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンとの距離を指標として短い方から優先順位を決めることにより第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定する。
（ｄ１）工程（ｃ１）で第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、第Ｊ番目ＯＲＦの「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」内の翻訳の再開始が可能な位置に第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンの候補があるかどうか調べる。
（ｅ１）工程（ｄ１）で該領域内に第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンの候補があるときに、該候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該翻訳開始コドンの上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則、
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「ｍＲＮＡとリボソームとの結合状態を表わすスコア（リボソーム結合スコア）」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ３を越えるときは該候補を第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンと同定する。ここで、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、第Ｊ番目ＯＲＦの「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順で翻訳開始の優先度を決め、さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときは第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンとの距離を指標として短い方から優先順位を決めることにより、候補を段階的に選定し、閾値Ｖ３を超えるものを第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンと同定する。
（ｅ２）工程（ｄ１）または工程（ｅ１）で第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定できなかった場合、工程（ｃ１）に戻り、工程（ｂ１）において第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された第Ｊ番目ＯＲＦの中で、Ｊの値が次に小さいＯＲＦを選んだ後、工程（ｃ１）から（ｅ１）までの工程により第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定する操作を、第Ｉ番目ＯＲＦの長さがＬ０アミノ酸未満になるまで繰り返す〔ここでＬ０は工程（ａ２）で示したＬ０と同じ値〕。
（ｆ１）工程（ｂ１）でポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されなかった第Ｉ番目ＯＲＦ、または工程（ｃ１）から（ｅ２）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦについて、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補について工程（ｅ１）と同じようにして「リボソーム結合スコア」を求め、該スコアが閾値Ｖ１を超えるものをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンと同定する。さらに閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を設定し、この設定した閾値を越えたときにＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを段階的に同定する〔ここで、Ｖ１は工程（ｅ２）のＶ３よりも大きい７から１４までの整数、Ｎは５〜２０の整数である〕。
（ｇ１）工程（ｃ１）から（ｆ１）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦは「偽のＯＲＦ」と判定する。
（ｇ２）工程（ｃ１）、（ｄ１）、（ｅ１）または（ｆ１）で翻訳領域の翻訳開始コドンが同定された第Ｉ番目ＯＲＦは「真のＯＲＦ」を含むと判定し、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域および転写単位を確定して遺伝子構造を同定する。
（ｇ３）第１番目ＯＲＦから第Ｋ番目ＯＲＦまでのＫ個のすべてのＯＲＦについて工程（ｇ１）および工程（ｇ２）の方法により翻訳領域の「真」「偽」を判定し、「真」と判定されたすべての翻訳領域の翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定して遺伝子構造を同定する〔ここでＫは２以上の整数〕。
以下に、上述の「転写単位構造に着目した翻訳領域同定法」の変法を、コンピューターで行なう方法について、図７および図８のフローチャートを参照しながら詳述する。
まず工程（ａ１）において、入力装置により入力された原核生物の塩基配列情報から、ＣＰＵは翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する（Ｓ７０１）。翻訳終止コドン、翻訳開始コドン、最長ＯＲＦの定義は、上記と同義である。
工程（ａ２）において、工程（ａ１）で得られた複数のＯＲＦのうち、短いＯＲＦは真の翻訳領域でない可能性が高いので、ＣＰＵは各ＯＲＦの長さを計算し、一定の長さ以上のＯＲＦを選別する。選別に用いるＯＲＦの長さとしては３０〜９００塩基を用いることができるが、３０〜６００塩基が好ましい。このようにして選別したＯＲＦについては、以下の工程での操作を簡便にするために、各ＯＲＦの終止コドンの位置をもとに５’末端側から順番に、第１番目ＯＲＦ、第２番目ＯＲＦ、・・・第Ｋ番目ＯＲＦと名付けることが好ましい〔ここでＫは２以上の整数〕。これらのデータをメモリに格納する（Ｓ７０２）。
工程（ｂ１）においては、ＣＰＵは工程（ａ２）で得られた第Ｉ番目ＯＲＦの仮の翻訳開始コドンが、第１番目ＯＲＦから第（Ｉ−１）番目ＯＲＦまでのＯＲＦの中で第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンの上流にあるか（Ｓ７０４）、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき（Ｓ７０５）、第Ｉ番目ＯＲＦと第Ｊ番目ＯＲＦがポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定する（Ｓ７０６）〔ここで、Ｉは１からＫまでの整数、ＪはＩより小さい正の整数、ＤＳは２０〜１００の整数〕。第Ｊ番目ＯＲＦが工程（ｇ３）により「偽のＯＲＦ」と判定されたＯＲＦである場合もあるので、その場合は、ＣＰＵは第Ｊ番目ＯＲＦは第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンを形成しないと判断する（Ｓ７０３）。第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンを形成する可能性がある第Ｉ番目ＯＲＦの上流のＯＲＦは複数個得られた場合には、その複数個のＯＲＦを選び出し、番号が小さい順に並び替えて整理して、メモリに格納することが望ましい。
工程（ｃ１）は前述の工程（ｃ）と同じである（Ｓ７０８）。
工程（ｄ１）は前述の工程（ｄ）と同じである（Ｓ７０９）
工程（ｅ１）は前述の工程（ｅ）と同じである（Ｓ８０１，Ｓ８０２）。さらに、本工程においては、同定された開始コドンの位置から算出される翻訳領域の長さが非常に短い場合は「偽の翻訳領域」と判定し、棄却することが好ましい。その判定に用いる長さは前述の工程（ａ２）で用いた長さを用いることが好ましい。
工程（ｅ２）においては、工程（ｄ１）または工程（ｅ１）で第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定できなかった場合、工程（ｃ１）に戻り、ＣＰＵは第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性がある他のＯＲＦを検索する。すなわち工程（ｃ１）において第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された第Ｊ番目ＯＲＦの中で、Ｊの値が次に小さいＯＲＦを選んだ後（Ｓ８０３，Ｓ８０４）、ＣＰＵは工程（ｃ１）から（ｅ１）までの工程により第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定する操作を行う。工程（ｃ１）から（ｅ１）までの繰り返しは、第Ｉ番目ＯＲＦの長さが短くなった時点で中止することが望ましい。その長さは前述の工程（ａ２）で用いた長さを用いることが好ましい。
工程（ｆ１）においては、工程（ｂ１）でポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されなかった第Ｉ番目ＯＲＦ、または工程（ｃ１）から（ｅ２）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦについて、ＣＰＵが「リボソーム結合スコア」を求めることにより、翻訳開始コドンを検索するが、その方法は前述の工程（ｆ）と同じである（Ｓ８０５〜Ｓ８０８）。
工程（ｇ１）においては、ＣＰＵが工程（ｃ１）から（ｆ１）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦは「偽のＯＲＦ」と判定する（Ｓ８０９）。
工程（ｇ２）においては、工程（ｃ１）、（ｄ１）、（ｅ１）または（ｆ１）で翻訳領域の翻訳開始コドンが同定された第Ｉ番目ＯＲＦは「真」の翻訳領域を含むと判定するが（Ｓ８１０）、翻訳開始コドンの位置の確定により翻訳終止コドンの位置と翻訳領域が確定するとともに、工程（ｂ１）〜工程（ｅ２）において第Ｉ番目ＯＲＦがその上流のＯＲＦとポリシストロンを形成する可能性が示されているときは、第Ｉ番目ＯＲＦはポリシストロン形成に参加する遺伝子であると確定できる。
工程（ｇ３）においては、ＣＰＵが、第１番目ＯＲＦから第Ｋ番目ＯＲＦまでのＫ個のすべてのＯＲＦについて工程（ｇ１）および工程（ｇ２）の方法により翻訳領域の「真」「偽」を判定し、「真の翻訳領域」と判定されたすべての翻訳領域の翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定することにより、遺伝子構造を同定することができる〔ここでＫは２以上の整数〕。最後に、得られた同定結果を、出力装置により出力する（Ｓ８１１）。
上述の遺伝子構造同定方法を用いて、原核細胞のＤＮＡのプラス鎖マイナス鎖からＣＤＳの候補を選別するとともに転写単位の構造を予測した後、次の方法により互いに重複するＣＤＳまた転写単位の真偽を判定することによりＣＤＳの同定精度を高めることができる。すなわち、選別した複数のＣＤＳと転写単位の位置関係を調べた後、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと同じ鎖上に存在する別の転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定することができる。また、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと相補的な鎖上に存在する別の転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定することができる。転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａが相補的な鎖上に存在する別の転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂと重複するときに、転写単位またはＣＤＳの長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定することができる。
さらに、プラス鎖のＣＤＳまたは転写単位とマイナス鎖のＣＤＳまたは転写単位が重複してはいるが、互いに内包関係にない場合には、双方の長さを比較し、短い方を「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」とすることによってもＣＤＳまたは転写単位の同定精度を向上させることができる。
同じ鎖上のとなり合う２個の翻訳領域が、上流の翻訳領域の３’末端側の一部と下流の翻訳領域の５’末端側の一部が重なり合うことがあることが知られているので、翻訳領域同士の重複を調べ、このような重複が観察されたときには、双方の翻訳領域を真の翻訳領域としてよい。なお、通常その重なりの長さは長さが小さい方の翻訳領域の１０％以下であることが好ましい。またプラス鎖の翻訳領域とマイナス鎖の翻訳領域が、それぞれの３’末端側の一部同士が重なり合う場合があることも知られているので、翻訳領域同士の重複を調べ、このような重複が観察されたときには、双方の翻訳領域を「真の翻訳領域」と判定してよい。なお、通常その重なりの長さは長さが小さい方の翻訳領域の１０％以下であることが好ましい。
図９に、互いに重複するＣＤＳまた転写単位の真偽を判定するための上記方法の一例をフローチャートとして示した。
図９において、Ｓ９０１では、入力装置により、塩基配列、構造データが入力される。サイズの大きいＤＮＡ（１０００塩基対以上のＤＮＡの塩基配列）から多数のＣＤＳを同定するときは、個々のＯＲＦに対して上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」などを繰り返して使用することによりＣＤＳを選別する。
Ｓ９０２では、プラス鎖とマイナス鎖の各々について、転写ユニットとを、５’末端から３’末端の順に番号付けして整列し、メモリに格納する。
Ｓ９０３〜Ｓ９０８では、メモリからまず、プラス鎖とマイナス鎖の各１の転写ユニットを呼び出し、転写単位Ｐと相補的な鎖上に存在する別の転写単位Ｑが、転写単位Ｐの中に内包される場合に、「偽の転写単位」と判定し、この操作をすべての組み合わせについて処理済みとなるまで繰り返す。
ついで、Ｓ９０９では、プラス鎖とマイナス鎖の各々から、同定した転写単位とを、５’末端から３’末端の順に番号付けして整列し、メモリに格納する。
Ｓ９１０〜Ｓ９１６では、メモリからまず、プラス鎖とマイナス鎖の各１のＣＤＳを呼び出し、ＣＤＳ−Ａが相補的な鎖上に存在する別のＣＤＳ−Ｂと重複するときに、転写単位またはＣＤＳの長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定し、この操作をすべての組み合わせについて処理済みとなるまで繰り返す。
最後に、Ｓ９０９で得られた転写単位の同定結果と、Ｓ９１６で得られたＣＤＳの同定結果を、出力装置により出力する。
図９に示すように、まずプラス鎖から各ＯＲＦについて開始コドンの同定を行うとともに、ＣＤＳとしての真偽を判定し、「真のＣＤＳ」であると判定されたＣＤＳが出現した場合、上述の方法により該ＣＤＳが同じ鎖上にある別のＣＤＳを内包するかどうか調べることにより、ＣＤＳの同定精度を高めることができる。なお、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」を用いた場合、ＣＤＳだけでなく、転写単位の構造も同定できる。同様にして、マイナス鎖からもＣＤＳと転写単位の構造を同定した後、上述の方法により各転写単位が相補鎖上にある別の転写単位を内包するかどうか調べることにより、他の転写単位によって内包された転写単位を「偽の転写単位」と判定することにより転写単位の同定精度を高めることができる。
近年多数の微生物の全ゲノム配列が決定され、その数も年々増加している。このように、原核生物の塩基配列からのＣＤＳの同定については、全ゲノム配列からＣＤＳを同定する必要性が高まってきている。したがって、サイズの大きいＤＮＡ（１，０００塩基対以上のＤＮＡ）の塩基配列から多数のＣＤＳを同定するときは、個々のＯＲＦに対して上述の遺伝子構造同定方法を繰り返して使用することによりＣＤＳを選別する、あるいはＣＤＳとしての真偽を判定することが好ましい。遺伝子構造同定方法を繰り返して用いる方法としては、同じ鎖上から選別されたＯＲＦを終止コドンの位置で並べ替えた後、５’末端側のＯＲＦから順番に開始コドンの存在を調べ、またＣＤＳとしての真偽を判定する方法が挙げられる。その一例を図１０に示した。
図１０において、Ｓ１００１では、入力装置により解析すべき塩基配列を入力する。
Ｓ１００２、Ｓ１００３においては、上記Ｓ７０１、Ｓ７０２と同様の処理をＣＰＵが行なう。
Ｓ１００４、Ｓ１００５においては、ＣＰＵが上記Ｓ７０３〜Ｓ７０９及びＳ８０１〜Ｓ８１１と同様の処理を行ない、同定結果をメモリに格納するとともに、真のＣＤＳと判定されたＣＤＳについては、その同定精度をあげるため、以下の判定処理にうつる。
Ｓ１００６〜１０１１では、ＣＰＵは、上流のＣＤＳとの重複の有無と長さ、内包を調べ、重複度が高い場合、短い方のＣＤＳを偽と判定し、上流のＣＤＳを内包する場合は、その上流のＣＤＳを偽と判定する。
この処理を、Ｓ１００２におけるすべてのＯＲＦについて処理済みとなるまで繰り返し、判定結果をメモリに格納し、最後に得られた判定結果を、出力装置により出力する（Ｓ１０１３）。
図１０に示す方法によれば、まずプラス鎖から各ＯＲＦについて開始コドンの同定を行うとともに、ＣＤＳとしての真偽を判定し、真のＣＤＳであると判定されたＣＤＳが出現した場合、上述の方法により該ＣＤＳが同じ鎖上にある別のＣＤＳを内包するかどうか調べることにより、ＣＤＳの同定精度を高めることができる。同様にして、マイナス鎖からもＣＤＳを同定した後、上述の方法により各ＣＤＳまたは転写単位が相補鎖上にある別のＣＤＳまたは転写単位を内包するかどうか調べることにより、他のＣＤＳまたは転写単位によって内包されたＣＤＳまたは転写単位は「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」と判定することによりＣＤＳの同定精度を高めることができる。
２．シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法
通常、原核細胞のＣＤＳの相補鎖に重複する「偽のＣＤＳ」が存在することが多く、この「偽のＣＤＳ」の存在がＣＤＳの同定精度の向上を困難にさせている。この相補鎖に出現する「偽のＣＤＳ」のことを「遺伝子の影（ｇｅｎｅ  ｓｈａｄｏｗ）」と呼ぶことが多い。これまで開発されたＣＤＳの同定方法では、個々の原核生物の「真」のＣＤＳに特徴的な塩基配列の組成やコドンの使用頻度に着目し、この「遺伝子の影」を判別しているので、正しいＣＤＳを別の方法によって知る必要がある。
ところが、以下に述べるように、本発明では、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」などの方法を用いて同定したＯＲＦの情報をもとに、「遺伝子の影」を判別するための計算式を用いてＣＤＳの真偽を調べることにより、事前に正しいＣＤＳの情報がなくてもＣＤＳの同定精度を向上させることができることを見い出した。すなわち、まず上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」などを用いて同定した複数個のＣＤＳの情報に基づいて、「真のＣＤＳ」と判定されたＣＤＳ内のコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンが該ＣＤＳに出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ通り選別した後、「出現頻度の高いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式（以下、「シャドー判別関数（ｓｈａｄｏｗ−ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」と呼ぶ）を用いてＣＤＳ−Ａの真偽を判定することにより、ＣＤＳの同定精度を向上させることができる〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数〕。
以下、本方法を「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」と略称する。
本発明のシャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法は、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」により同定されたＣＤＳに限定されず、周知のいかなる方法で同定されたＣＤＳについても適用することができる。例えば、ＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，Ｊ．：Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１７，１２３−１３３（１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，Ａ．Ｖ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，１１０７−１１１５（１９９８）、Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，３９１１−３９２０（１９９９）〕、Ｇｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．５４４−５４８（１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，ｐ．４６３６−４６４１（１９９９）〕、ＣＲＩＴＩＣＡ〔Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．＆  Ｌｏｓｅｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．Ｖｏｌ．１６，ｐ．５１２−５２４（１９９９）〕、ＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．２９４１−２９４７（１９９８）〕、またはＧｅｎＭａｒｋＳ〔Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．，Ｌｏｍｓａｄｚｅ，Ａ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２９，２６０７−２６１８（２００１）〕などの、従来より知られた翻訳領域を同定する方法によって同定されたＣＤＳについて、本発明の「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を適用して、その同定精度を高めることができるが、これらに限定されるものではない。
「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」は、
（ｋ）入力手段により入力されたすでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個の翻訳領域の中で、使用されているコドンの種類とその数を調べ、この中で、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別して、メモリに格納し；
（ｌ）入力手段により入力された翻訳領域と推定される翻訳領域Ａのデータから、該翻訳領域Ａでの上記選択されたコドンの出現頻度を計測し、
上記「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより、該翻訳領域Ａの真偽を判定し〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数である〕；
上記判定結果を出力装置が表示する処理をコンピューターに行なわせることにより、実施することができる。
上で述べた「出現頻度の高いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式である「シャドー判別関数」としては、前者のコドンの出現個数と後者のコドンの出現個数との比を含む計算式ならいかなるものも用いることができる。「シャドー判別関数」の式の好適な例としては、前者のコドンの出現個数を「Ｈ」および後者のコドンの出現個数を「Ｌ」とした場合、Ｈ／Ｌ、Ｌ／Ｈ、（Ｈ／Ｌ＋１）、（Ｌ／Ｈ＋１）、１／（Ｈ／Ｌ＋１）、１／（Ｌ／Ｈ＋１）、２Ｈ／（Ｈ＋Ｌ）などが挙げられる。これらの計算式の中で、「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽のＣＤＳ」と判定することにより、ＣＤＳの同定精度を向上させることができる〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数〕。
以下に、本方法の具体的な「シャドー判別関数」の式の一例について説明する。まず、６４種類のコドンを
2003035863.tif 000026
の順で並べたとき、ｉ番目（ｉは３２以下）のコドンの３塩基は（ｉ＋３２）番目のコドンの３塩基の相補的配列を有する。ｉ番目のコドンの３塩基が真のＣＤＳに出現する頻度が高く、（ｉ＋３２）番目のコドンに相当する３塩基が真のＣＤＳに出現する頻度が低いと、ｉ番目のコドンの３塩基が反対鎖の塩基配列に出現する頻度が低く、（ｉ＋３２）番目のコドンに相当する３塩基が反対鎖の塩基配列に出現する頻度が高くなる。このことから、真のＣＤＳに出現するコドンを分析したとき、ｉ番目のコドンの３塩基の出現頻度と（ｉ＋３２）番目のコドンの３塩基の出現頻度の差を求め、その差の値が大きければ大きいほど、ｉ番目のコドンは真のＣＤＳに出現しやすく、また（ｉ＋３２）番目のコドンは真のＣＤＳの反対鎖の塩基配列に出現しやすくなる。
すなわち、真のＣＤＳとしてＴ個のＣＤＳを選別し、選別したｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000027
としたとき、上記の差ｙｉおよびｙｉ＋３２は次の式で表せる。
2003035863.tif 000028
次に、ｙｉとｙｉ＋３２（ｉは３２以下の正の整数）の値を計算し、その値が大きい順番に、上述の６４種類のコドンを並べ替える。ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選んだとき、ｎ番目のＣＤＳのシャドー判別関数（以下、Ｓｄと略記する）の値は次の式で表せる。
2003035863.tif 000029
ここで、
2003035863.tif 000030
が０のときは、Ｓｄｎの値は１とする。
次のようにして、このシャドー判別関数Ｓｄの値をもとに、あるＯＲＦのＳｄの値を予め定めた閾値（例えば１．０）を越えるときに、「真」のＣＤＳと判定できる。また、２つのＣＤＳが重複する、または内包関係にあるときには、各ＣＤＳのＳｄ値を算出し、それらの値を比較することにより、ＣＤＳの真偽を判定できる。ＣＤＳでなく、転写単位の真偽を判定するときには、転写単位を構成するＣＤＳの全コドンをもとに、Ｓｄ値を算出した後、そのＳｄ値により転写単位の真偽を判定することができる。
上記方法は、図１４に示すように、
（ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納し（Ｓ１４０１）；
（ｎ）すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列を入力し、ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000031
としたとき、下式（２）によりｙｉを、そして下式（３）によりｙｉ＋３２を求める（Ｓ１４０２）；
2003035863.tif 000032
（ｏ）メモリから、ステップ（ｍ）で得られたコドンテーブルを呼び出し、テーブル中の各コドンのｙｉおよびｙｉ＋３２を対応付け、ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、テーブル中のコドンの配列を並べ替えた（Ｓ１４０３）後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（４）により求める（Ｓ１４０４）
2003035863.tif 000033
［ここで、
2003035863.tif 000034
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする］；
（ｐ）上記処理により求めた、翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域とし、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域と判定し（Ｓ１４０５）〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．８〜１．８の値である。〕；
上記判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせることにより実施することができる。
２つのＣＤＳまたは転写単位の真偽の判定におけるシャドー判別関数Ｓｄの利用例としては、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」より、長いＣＤＳ（ＣＤＳがコードするポリペプチドの長さがＬアミノ酸以上で、Ｌは１００以上の正の整数）を同定した後に、これらＣＤＳの配列情報から上述のシャドー判別関数Ｓｄの値を求め、該Ｓｄ値を閾値としてＣＤＳの真偽を判定することによりＣＤＳの同定精度を高めることができる。この方法において、ＣＤＳの同定法としては、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」以外の方法を用いてもよい。
プラス鎖のＣＤＳまたは転写単位とマイナス鎖のＣＤＳまたは転写単位が重複する、または内包関係にあるときに、双方の長さに大きな違いがある場合には、ＣＤＳまたは転写単位の長さが短い方を「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」と判定してよい。しかし、長さの違いが大きくない場合には、上述の方法、特にそれぞれのＣＤＳまたは転写単位のシャドー判別関数の値を求めて比較することにより、ＣＤＳまたは転写単位の真偽を判定することができる。より好ましくは、ＣＤＳ−Ａのまたは転写単位Ａの長さＬＡ（塩基対）とＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂ長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、ＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂを「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」と判定することができる〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数〕。さらに、ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、「シャドー判別関数」を用いる上記方法によりＣＤＳ−Ａまたは転写単位ＡとＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂの真偽を判定することができる〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数〕。
このＣＤＳ−Ａまたは転写単位ＡとＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂの真偽を判定する方法は、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」により同定されたＣＤＳに限定されず、周知のいかなる方法で同定されたＣＤＳまたは転写単位についても適用することができる。例えば、ＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，Ｊ．：Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１７，１２３−１３３（１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，Ａ．Ｖ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，１１０７−１１１５（１９９８）、Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，３９１１−３９２０（１９９９）〕、Ｇｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．５４４−５４８（１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，ｐ．４６３６−４６４１（１９９９）〕、ＣＲＩＴＩＣＡ〔Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．＆  Ｌｏｓｅｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．Ｖｏｌ．１６，ｐ．５１２−５２４（１９９９）〕、ＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．２９４１−２９４７（１９９８）〕、またはＧｅｎＭａｒｋＳ〔Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．，Ｌｏｍｓａｄｚｅ，Ａ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２９，２６０７−２６１８（２００１）〕などの、従来より知られた方法によって同定されたＣＤＳまたは転写単位について、上記のＣＤＳ−Ａまたは転写単位ＡとＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂの真偽を判定する方法を適用して、その真偽を判定することができるが、これらに限定されるものではない。
図１０で示した方法において、互いに重複するＣＤＳまた転写単位の真偽を判定する処理は、上記「シャドー判別関数」を用いて判定することができる。
上述のように、近年多数の微生物の全ゲノム配列からＣＤＳを迅速にかつ高精度に同定する必要性が高まってきている。以下に、原核生物の全ゲノム配列からＣＤＳを同定する際に、上記のシャドー判別関数Ｓｄの値を利用して、ＣＤＳの同定精度を高める方法の例について詳述する。
サイズの大きいＤＮＡ（１０００塩基対以上のＤＮＡの塩基配列）から多数のＣＤＳを同定するときは、個々のＯＲＦに対して上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」などを繰り返して使用することによりＣＤＳを選別する。
図９に示すように、まずプラス鎖から各ＯＲＦについて開始コドンの同定を行うとともに、ＣＤＳとしての真偽を判定し、「真のＣＤＳ」であると判定されたＣＤＳが出現した場合、上述の方法により該ＣＤＳが同じ鎖上にある別のＣＤＳを内包するかどうか調べることにより、ＣＤＳの同定精度を高めることができる。なお、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」を用いた場合、ＣＤＳだけでなく、転写単位の構造も同定できる。同様にして、マイナス鎖からもＣＤＳと転写単位の構造を同定した後、上述の方法により各転写単位が相補鎖上にある別の転写単位を内包するかどうか調べることにより、他の転写単位によって内包された転写単位を「偽の転写単位」と判定することにより転写単位およびＣＤＳの同定精度を高めることができる。このようにして同定したＣＤＳの情報をもとに、「真のＣＤＳ」と判定されたＣＤＳ内のコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンが該ＣＤＳに出現頻度が低い」という２種類のコドンの組み合わせをｋ通り（ｋは５〜２０の整数）選別する。このようにして選別した「出現頻度の高いｋ種類のコドン」と「出現頻度の低いｋ種類のコドン」をもとに、上述の方法により、各ＣＤＳのシャドー判別関数Ｓｄの値を求めることができる。
次に、再び、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」を用いてプラス鎖およびマイナス鎖からＣＤＳと転写単位の構造を同定する。
図１１に示すように、プラス鎖から選別したＵＰ１個の転写単位とマイナス鎖から選別したＵＭ１個の転写単位について、上述のシャドー判別関数Ｓｄの値を利用することにより、転写単位の真偽を判定し、転写単位およびＣＤＳの同定精度を高めることができる。
上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」とは別の方法によりＣＤＳを同定した場合には、となり合う２つのＣＤＳの距離、すなわち上流のＣＤＳの終止コドンと下流のＣＤＳの開始コドンの距離がＤＣ塩基対（ＤＣは３０〜１２０の整数）であるときにポリシストロンを形成すると判定することにより転写単位を形成することができる。
このようにして形成した転写単位について、上述のシャドー判別関数Ｓｄの値を利用することにより、転写単位の真偽を判定し、転写単位およびＣＤＳの同定精度を高めることができる。
図１１において、Ｓ１１０１では、入力装置により解析すべき塩基配列データを入力する。
Ｓ１１０２では、プラス鎖とマイナス鎖の転写単位を選別し、終止コドンの位置を基準に５’末端から３’順に整列し、メモリに格納する。転写単位の選別・整列は、上記いかなる方法でもよい。
ついで、ＣＰＵは、Ｓ１１０２で格納されたプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を５’末端側から順に１つずつ呼び出し、互いに内包しているかを調べ（Ｓ１１０３，Ｓ１１０６）、内包する場合は、２つの転写単位の長さを比較し（Ｓ１１０４，１１０７）、一方が他方のＰ１％以下であれば、各々のシャドー判別関数を計算、比較し（Ｓ１１０５、Ｓ１１０８）、シャドー判別関数の小さい方を偽とする。
この操作をＳ１１０２でメモリに格納された転写単位について行ない、その結果、偽としなかったプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を選別し、終止コドンの位置を基準に５’末端から３’順に整列し、メモリに格納する（Ｓ１１０９）。
ついで、ＣＰＵは、Ｓ１１０９でメモリに格納されたプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を５’末端側から順に１つずつ呼び出し、各５”末端側と３”末端側が重複しているかを調べ（Ｓ１１１０，Ｓ１１１３）、重複する場合は、２つの転写単位の長さを比較し（Ｓ１１１１，１１１４）、一方が他方のＰ１％以下であれば、各々のシャドー判別関数を計算、比較し（Ｓ１１１２、Ｓ１１１５）、シャドー判別関数の小さい方を偽とする。
この操作をＳ１１０９でメモリに格納された転写単位について行ない、その結果、偽としなかったプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を選別し、この結果を出力装置により出力する（Ｓ１１１６）。
３．コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法
ＧＣ含量が高い原核生物の塩基配列からＣＤＳを同定する場合、長いＯＲＦが多数存在するために、ＣＤＳを高精度に同定することは困難である。本発明では、ＧＣ含量が５０％を越える原核生物のＣＤＳの特徴として、該ＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目の塩基のＧＣ含量が高いことを見い出し、この特徴をＣＤＳの同定精度を向上させるために利用した「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」を考案した。すなわち、該ＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて該含量を算出した後、該含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳを「偽のＣＤＳ」と判定することにより、原核生物のＣＤＳを同定する精度を高める方法である。塩基配列のＧＣ含量の値が５０％以上のとき本方法が適用できるが、６０％以上であることが望ましい。本方法の計算式としては、該ＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式ならどのような計算式でも用いることができ、該計算式の好適な例としては、「該ＣＤＳ内の全コドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の総数を全コドンの塩基数で割った式」、「該総数を全コドンのＧ残基とＣ残基の総数で割った式」、または「該総数を全コドンの第２文字目のＧ残基とＣ残基の総数で割った式」を用いることができる。より好ましくは、該計算式の値が塩基配列のＧＣ含量に影響を受けにくい計算式を用いる。「該ＣＤＳ内の全コドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の総数を全コドンのＧ残基とＣ残基の塩基の総数で割った式」としては、下式（５）により算出されるｉ番目のＣＤＳに対するＧＣｉ（以下、「ＧＣ関数」またはＧＣと略記する）の値を用いることができる。
2003035863.tif 000035
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ＝１，２，３）の塩基がｂ（ｂ＝１，２，３，４）のとき、
2003035863.tif 000036
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なおｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（終止コドンを除く）を表わす。
ＧＣ含量が５０％のＣＤＳの「ＧＣ関数」の値を求めた場合、平均２／３（０．６６６６６）になる。すなわち「ＧＣ関数」の値は、２／３を中心に分散した値になる。ここで、ＧＣ含量が６０％越えるＣＤＳの「ＧＣ関数」の値は、ほとんどのＣＤＳについて２／３を越えることがわかった。したがって、上記の「ＧＣ関数」を用いてＣＤＳの真偽を判別する場合、一定値としては、０．６〜０．７５の範囲に入る数値を用いることが好ましい。
本発明の「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、上述の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」により同定されたＣＤＳに限定されず、周知のいかなる方法で同定されたＣＤＳについても適用することができる。例えば、ＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，Ｊ．：Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１７，１２３−１３３（１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，Ａ．Ｖ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，１１０７−１１１５（１９９８）、Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，３９１１−３９２０（１９９９）〕、Ｇｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．５４４−５４８（１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２７，ｐ．４６３６−４６４１（１９９９）〕、ＣＲＩＴＩＣＡ〔Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．＆  Ｌｏｓｅｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．Ｖｏｌ．１６，ｐ．５１２−５２４（１９９９）〕、ＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２６，ｐ．２９４１−２９４７（１９９８）〕、またはＧｅｎＭａｒｋＳ〔Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｊ．，Ｌｏｍｓａｄｚｅ，Ａ．＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｍ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２９，２６０７−２６１８（２００１）〕などの、従来より知られた翻訳領域を同定する方法によって同定されたＣＤＳについて、本発明の「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」を適用して、その同定精度を高めることができるが、これらに限定されるものではない。
上記「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、図１５に示すように、入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物のすでに選択された翻訳領域のデータ（Ｓ１５０１）から、上記翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を所定の計算式を用いて算出し（Ｓ１５０２）、この算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域を「偽の翻訳領域」と判定し（Ｓ１５０３）、判定結果を出力装置により出力する処理を、コンピューターに行なわせることにより実施することができる。
ＣＤＳを同定するときに、偽の開始コドンを選択することにより、ＣＤＳの同定精度が下がる場合がある。真のＣＤＳの開始コドンの上流のコドンを開始コドンとして選別した場合、真のＣＤＳの５’末端に偽のＣＤＳが連結した形になっている。そこで、該ＣＤＳの５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて該含量を算出した後、該含量が一定値を下回るときには、５’末端側の領域が真のＣＤＳの一部でない可能性が高い。このような場合は、この開始コドンから下流に向かって翻訳開始コドンを再検索することにより、開始コドンの同定精度を高めることができる。この開始コドンを再検索する方法としてはいかなる方法をも用いることができる。例えば、開始コドンの上流にリボソーム結合配列が存在することを指標として開始コドンを同定する方法、あるいは本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」の中で用いられる開始コドンを同定する方法が挙げられる。該ＣＤＳの５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式としては、上述の計算式を用いることができる。また５’末端側の領域としては３０〜３００塩基対の長さの領域が好ましい。
上記方法は、入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物のすでに選択された翻訳領域のデータから、上記翻訳領域の５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を、所定の計算式を用いて算出し、算出された含量が一定値を下回るとき、該翻訳領域の翻訳開始コドン「偽の翻訳開始コドン」と判定し、判定結果を出力装置により出力すると共に、入力装置により入力された、上記翻訳領域の塩基配列データを呼び出し、該偽翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索する処理をコンピューターに行なわせることにより実施することができる。
上記の「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、他のＣＤＳ同定法と組み合わせて用いることができる。好ましくは、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」および「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を用いて、原核生物のＣＤＳを同定する精度を高めることができる。
原核細胞のＣＤＳを同定するときに、２つの公知の遺伝子構造同定方法を組み合わせてもＣＤＳ同定精度が向上しないこともあるが、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」または「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」のいずれかの方法は、多くの場合真のＣＤＳの塩基配列の出現頻度およびコドン使用頻度ならびにマルコフモデルおよび隠れマルコフモデルなどの確率過程のモデルを用いて算出した「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳ同定精度を向上させることができる。
前記の「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」の一例としては、すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列をもとに、Ｔ個のＣＤＳにおいて「出現頻度の高いｍ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式を用いて該ＣＤＳ−Ａの真偽を判定する方法を挙げることができるが、コーディング・ポテンシャルを表わす計算式なら、いかなる計算式を用いることもできる〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数〕。
前記の計算式の例として、「出現頻度が高いｍ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式として、「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」が挙げられるが、この逆数の一例である「Ｃｄ値」は下記で表される。
2003035863.tif 000037
ここで、
2003035863.tif 000038
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする。
上記の「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」の一例は、
（ｍ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納する；
（ｓ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000039
としたとき、下式（６）によりｙｉを求める；
2003035863.tif 000040
（ｔ）メモリのコドンテーブルを呼び出し、ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（７）により求める
2003035863.tif 000041
［ここで、
2003035863.tif 000042
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする］；
（ｕ）ステップ（ｔ）で算出した翻訳領域ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域とし、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽の翻訳領域とし、判定結果を出力装置により出力する〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜１．８の値とする〕
処理をコンピューターに行なわせることにより実施することができる。
原核生物のＣＤＳ−Ａが相補鎖のＣＤＳ−Ｂと重複し、かつＣＤＳ−ＢがＣＤＳ−Ａによって内包される場合に、上述の方法を用いて同じ原核生物の別のＣＤＳを同定するときに、下記（ｑ）と（ｒ）の工程を含む方法を用いてＣＤＳの「真偽」を判定してもよい。
（ｑ）ＣＤＳ−Ａの長さＬＡ（塩基対）とＣＤＳ−Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、ＣＤＳ−Ｂを「偽のＣＤＳ」と判定する、および
（ｒ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、「出現頻度が高いｍ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数と出現頻度が低いｍ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数の比較を可能にする計算式として前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」または「上述のＣｄ値」を用いる上述の方法によりＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数〕。
前記の方法を用いて転写単位の真偽を判定する場合に、各転写単位を構成するＣＤＳの終止コドンを除いたＣＤＳを連結して、一つのＣＤＳにした後に、前記の方法を適用することもできる。
本発明で開示した「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」または「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、コンピュータを用いることにより高速に実行することができる。このためには、本発明の方法の各手順をコンピュータに指示するプログラムを作成する必要がある。本プログラムは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＢＡＳＩＣ、ＪＡＶＡなどのプログラミング言語を用いて作成することができる。本プログラムは、ＵＮＩＸ、ＬＩＮＵＸ、Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＭａｃＯＳなどのオペレーティング・システム上で実行させることができる。
上記プログラムを実行させるために使用するコンピュータとしては、コンピュータとしての機能を有するものであればいずれも使用することができるが、計算速度の速いものが好ましい。具体例としては、ソニー社製のパーソナルコンピュータＰＣＧ−ＸＲ９Ｆ／Ｋ、松下電器産業株式会社のパーソナルコンピュータＬｅｔ’ｓ  ｎｏｔｅ  ＣＦ−Ａ７７Ｊ８１およびサン・マイクロシステムズ社製のワークステーションＳＵＮ  Ｕｌｔｒａ８０等を挙げることができる。本発明で開示した各方法または各工程は同一のコンピュータを用いて行う必要はない。すなわち、本発明で述べたある工程または方法で得られた結果を別のコンピュータに出力し、該コンピュータで次工程または別の方法の処理を行ってもよい。
本発明で開示した「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」または「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」の手順をコンピュータに実行させるプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を利用することにより、各方法を自動化することができる。該記録媒体は本発明の記録媒体である。
「コンピューターで読み取り可能な記録媒体」とは、コンピューターによって直接読みとられ、アクセスされうる任意の記録媒体をいう。このような記録媒体としては、フロッピーディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−ＲＷ等の光学記憶媒体、ＲＡＭやＲＯＭ等の電気記憶媒体、およびこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えばＭＯ等の磁気／光学記憶媒体）を挙げることができるが、これらに限定されない。
上記本発明のコンピューターで読みとり可能な記録媒体を利用した、コンピューターに基づく遺伝子構造同定システムは本発明のシステムである。
「コンピューターに基づく遺伝子構造同定システム」とは、本発明のコンピューターで読みとり可能な本発明の記録媒体に記録された情報を分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段より構成されたものをいう。
以下に本発明の実施例を示す。
下記の実施例に示した手順をコンピュータに指示するためのプログラムを、プログラム言語Ｐｅｒｌバージョン５．００５を用いて作成し、オペレーティングシステムＷｉｎｄｏｗｓ  ２０００上で実行した。コンピュータとしてはソニー社製「ＶＡＩＯ  ＰＣＧ−ＸＲ９Ｆ／Ｋ」を用いた。
実施例１  大腸菌Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からの遺伝子構造の同定
図７および図８のフローチャートに示した手順に従って、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片のプラス鎖およびマイナス鎖の配列からＣＤＳ（真のＯＲＦということもある）を同定した。その詳細を下記に述べる。
（１）コンピュータへの塩基配列の入力
米国の生命情報の管理機関であるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩと略記する）のＧｅｎＢａｎｋからインターネット経由で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列（アクセション番号はＡＥ０００１１１で、配列の長さは１０５９６塩基対）を取得し、ハードディスク上に保存した。
（２）最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンの同定
ＡＥ０００１１１で示されたＤＮＡ断片のプラス鎖に存在する終止コドンＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡを検索した。検索された各終止コドンについて最も長いＯＲＦを与える仮の開始コドン（ＡＴＧ、ＧＴＧ、およびＴＴＧのいずれか）を同定した後、長さが２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦを選別した。該選別により４個のＯＲＦが検出された。終止コドンの位置に基づき、各ＯＲＦは終止コドンの位置で、５’末端側から順番に、ＯＲＦ−Ｄ１からＯＲＦ−Ｄ４までの番号を付けた。
同様にして、マイナス鎖に関して終止コドンの検索および仮の開始コドンを同定した結果、３個のＯＲＦが選別された。長さが２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするを選別し、終止コドンの位置に基づき、マイナス鎖の３‘末端側から順番に、ＯＲＦ−Ｃ１からＯＲＦ−Ｃ３までの番号を付けた。
（３）リボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索の方法
ＯＲＦ−Ｄ１は上流にＯＲＦが存在しなかったため、以下の方法によって算出したリボソーム結合スコアをもとに開始コドンの同定を行った。
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のゲノム配列のデータ解析から、大腸菌Ｋ−１２株の１６Ｓ  ＲＮＡの３’末端の配列は、３’−ＡＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’であることが確認された。次に、図５に示した手順に従って、この配列のうち、３’−ＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’と開始コドンの上流８塩基の配列との対合状態を調べ、
ＧとＣの対合：＋４、
ＡとＵの対合：＋２、
ＧとＵの対合：＋１、
対合が観察された塩基の次の塩基で対合が見られない場合：−１、
開始コドンがＧＴＧの場合：−２、
開始コドンがＴＴＧの場合：−４、
とし、これらの数値を足し合わせたものをリボソーム結合スコア（Ｓ）とした。ただし、３’−ＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’の最後の塩基Ａが関与する対合に関してはスコアを与えなかった。
対合状態を調べる開始コドンの上流の８塩基は、上流１７塩基目から１０塩基目までの領域から、上流１０基目から３塩基目までの領域の８通りの配列を用いた。この８通りの配列（以下，上流に存在する配列から順にＵ−１〜Ｕ−８と名付ける）についてリボソーム結合スコアを求めて、最大値を与えるものを選んだ。
もし同じ最大値を与える配列が２つ以上存在した場合には、Ｕ−４、Ｕ−５、Ｕ−６を優先し、次にＵ−７、Ｕ−８を優先した。
このリボソーム結合スコアの算出方法を用いて、各ＯＲＦの５’末端の開始コドンの候補から順番に最大１０個の開始コドンの候補（ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧ）についてリボソーム結合スコア（Ｓ）を算出した。
各ＯＲＦの５’末端から順番に、１番目から５番目までの５個の開始コドンの候補についてリボソーム結合スコア（Ｓ）を閾値Ｖ１（Ｖ１＝９．０とする）と比較し、この閾値を越えた場合（Ｓ＞Ｖ１）、その開始コドン候補を真の開始コドン候補として選別した。Ｖ１を越えるリボソーム結合スコアがない場合には、閾値Ｖ２（Ｖ２＝７．０）を越える（Ｓ＞Ｖ２）開始コドンの候補が存在するときには、その開始コドンの候補を真の開始コドン候補として選別した。
いずれの閾値を越える開始コドンの候補がない場合には、５’末端から数えて６番目から１０番目の５個の開始コドン候補のリボソーム結合スコアを求めた後、第一番目の開始コドンから順番に各開始コドンのリボソーム結合スコアを調べて、その値が閾値Ｖ３（Ｖ３＝６．０）以上であった場合には、その値を与えた開始コドンの候補を開始コドンとして選別した。
すべての開始コドンの候補のリボソーム結合スコアが閾値Ｖ３を下回る場合には（Ｓ＜Ｖ３）、選別すべき開始コドンの候補が存在しなかった場合には、そのＯＲＦを「偽のＣＤＳ」とした。
その結果、ＯＲＦ−Ｄ１の真の開始コドン候補は３３７番目の塩基であった。
（４）ポリシストロンの転写単位を形成する可能性があるＯＲＦの検索
上記（３）で選別されたＯＲＦ−Ｄ１の真の開始コドン候補に基づくＯＲＦを利用し、下流に存在するＯＲＦがポリシストロンを形成する可能性があるか調べた。
上記（３）で選別されたＯＲＦ−Ｄ１の真のＯＲＦ候補と判定されたＯＲＦについて、その終止コドンの下流６０塩基以内にＯＲＦ−Ｄ２の仮の開始コドンが存在していたため、ＯＲＦ−Ｄ２はＯＲＦ−Ｄ１とポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定した。
同様に、ＯＲＦ−Ｄ３もＯＲＦ−Ｄ２とポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された。しかし、ＯＲＦ−Ｄ４とポリシストロンの転写単位を形成する可能性は見られなかった。
（５）ポリシストロンの転写単位を形成する可能性があるＯＲＦの開始コドンの同定
上記（４）により、ＯＲＦ−Ｄ１〜Ｄ３はポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されたので、以下に述べる「図４に示した開始コドンの優先順位の規則」（これを「ランク関数」と呼び、値は１以上の整数を持つ）に従って、真の開始コドンを同定した。
ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの「近傍」は、図４の中のランク関数が１から８までの値を取る領域とした。この領域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補（ＡＴＧまたはＧＴＧ）が存在するときには、上記の方法で求めたリボソーム結合スコアがいかなる値でも「開始コドン」として同定した。なお、この「近傍」の領域のみ、開始コドンの候補として、ＡＴＧかＧＴＧに限定した。
ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在しないときには、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍の下流域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補（ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧ）が存在するかどうかを調べた。ポリシストロンを形成する条件としてＯＲＦ−Ｂの終止コドンとＯＲＦ−Ａの開始コドンの間の距離を６０塩基以内としたので、ランク関数の値が９〜２３までの値を取る領域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在するときには、ランク関数値が小さい順に、上の（３）で述べた方法を用いて各開始コドンの候補のリボソーム結合スコアを算出し、該スコアが閾値Ｖ３（６．０）以上であった場合に、その候補を開始コドンとして選別した。
ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍にも、さらにその近傍の下流域にも、ＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在しないときには、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍の上流域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補（ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧ）が存在するかどうかを調べた。その近傍の下流域は、ランク関数の値が２４〜ＲＤＮまでの値を取る領域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在するときには、ランク関数値が小さい順に、上の（３）で述べた方法を用いて各開始コドンの候補のリボソーム結合スコアを算出し、該スコアが閾値Ｖ３（６．０）以上であった場合に、その開始コドンの候補を開始コドンとして選別した。なお、ＯＲＦ−Ａのアミノ酸数の１０％以下の値に一番近い整数値を求めて、これに２３を足したをＲＤＮの値としたが、その値が５３を越える場合には、ＲＤＮ、の値を５３とした。
その結果、ＯＲＦ−Ｄ２の真の開始コドン候補の位置は２８０１番目の塩基、ＯＲＦ−Ｄ３の真の開始コドン候補の位置は３７３４番目の塩基であった。
（６）上記の工程で同定できなかったＯＲＦの開始コドンの同定
ポリシストロンの転写単位を形成する可能性がないと判定されたＯＲＦ−Ｄ４については、以下のようにして、真の開始コドンを同定した。
上述の（３）の方法を用いて、真の開始コドン候補を同定するとともに、ＯＲＦ−Ａが真のＯＲＦであるかどうかを判定した。同定した真の開始コドン候補の位置とＯＲＦ−Ａの上流にあるすべてのＯＲＦの終止コドンの位置を比較して、ＯＲＦ−Ａが上流のＯＲＦと重複するかどうか調べた。ＯＲＦ−ＡがあるＯＲＦ−Ｂと重複することがわかった場合には、その重複領域の長さが９０塩基対以上であるか、ＯＲＦ−Ｂの長さの１０％以上であるかどうかを調べた。
重複領域の長さが９０塩基対以上、またはＯＲＦ−Ｂの長さの１０％以上である場合には、そのＯＲＦ−Ａを「偽のＯＲＦ」と判定した。また、重複領域の長さが９０塩基対以下あるいはＯＲＦ−Ｂの長さの１０％以下である場合には、ＯＲＦ−Ａを「真のＯＲＦの候補」として選別した。
その結果、ＯＲＦ−Ｄ４の真の開始コドン候補は８１７５番目の塩基であった。
（７）同じ鎖で内包されるＯＲＦの消去
上述の工程で、ＯＲＦ−Ａが「真のＯＲＦの候補」として選別された場合には、そのＯＲＦ−Ａの上流にあるすべての「真のＯＲＦの候補」について、そのＯＲＦ−Ａの開始コドンと終止コドンの間に内包されるかどうか調べ、内包されるＯＲＦはすべて「偽のＯＲＦ」と判定した。
上述の工程により、ＯＲＦ−Ｄ１からＯＲＦ−Ｄ４までの４個のＯＲＦはすべて「真のＯＲＦの候補」と判定された。
（８）マイナス鎖上のＯＲＦの候補の選別
上述のプラス鎖上の「真のＯＲＦの候補」の選別と全く同じ手順で、マイナス鎖上の「真のＯＲＦの候補」を同定した。その結果、ＯＲＦ−Ｃ１〜ＯＲＦ−Ｃ３の３個のＯＲＦはすべて「真のＯＲＦの候補」と判定された。
即ち、ＯＲＦ−Ｃ１の真の開始コドン候補は４１６２番目の塩基、ＯＲＦ−Ｃ２の真の開始コドン候補は６４５９番目の塩基、ＯＲＦ−Ｃ３の真の開始コドン候補は７９５９番目の塩基であった。該結果より、ＯＲＦ−Ｃ１はＯＲＦ−Ｃ２とポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された。
（９）プラス鎖とマイナス鎖の転写単位の比較
個々の真のＯＲＦ（ＣＤＳ）について、該ＣＤＳの開始コドンとその上流のＣＤＳの終止コドンの距離が９０塩基対以内のときは、双方のＣＤＳは同一転写単位上に存在すると判定した。
このようにして転写単位の構造を、プラス鎖およびマイナス鎖について調べた結果、プラス鎖の転写単位の数は２個（その内１個はポリシストロンの転写単位）で、マイナス鎖の転写単位の数は２個（その内１個はポリシストロンの転写単位）であることがわかった。
個々の転写単位の先頭のＣＤＳの開始コドンの位置と最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置を求めて、プラス鎖の転写単位とマイナス鎖の転写単位の間で重複領域があるかどうか調べた。
マイナス鎖で同定されたＯＲＦ−Ｃ１はプラス鎖で同定されたＯＲＦ−Ｄ３と重複領域が存在したため、以下の方法で転写単位の真偽の判定を行った。なお転写単位の長さは、「先頭のＣＤＳの開始コドンの位置」と「最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置」の差とした。
プラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑを内包する場合、マイナス鎖の転写単位Ｑを「偽の転写単位」とした。次に、プラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑに内包される場合、転写単位Ｐを「偽の転写単位」とした。
また、転写単位Ｐと転写単位Ｑが重複しているが、転写単位Ｐが転写単位Ｑを内包していないし、また転写単位Ｑが転写単位Ｐを内包していない場合には、転写単位ＰとＱの長さを比較して、長さが短い方を「偽の転写単位」とした。
最終的に、転写単位Ｐと転写単位Ｑの真偽を判定できなかった場合には、いずれの転写単位も真の転写単位とした。
このような転写単位の真偽の判定方法を用いた結果、マイナス鎖のモノシストロンの転写単位ＯＲＦ−Ｃ１（４１６２塩基から３５１２塩基までの領域）は、「偽の転写単位」と判定された（表１参照）。
（１０）同定されたＣＤＳに関する情報の出力
上記の工程により同定されたＣＤＳに関する情報をハードディスク上にファイルとして出力した。出力された情報を表１に示した。
2003035863.tif 000043
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されているアクセション番号ＡＥ０００１１１の配列に対して付与されたアノテーション情報と表１の情報を比較した結果、２００アミノ酸以上のＣＤＳの数はともに６個であること、および同定された６個のＣＤＳはすべて一致していることがわかった。ＯＲＦ−Ｄ４を除く５個のＣＤＳの開始コドンの位置はＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報と一致していることがわかった。さらに、本発明では、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報にはない転写単位に関する構造情報も得られることが示された。
なお、表中、転写単位に関する構造情報としては、モノシストロンのＣＤＳに対して「１」というラベルを与え、また先頭のＣＤＳ、最後尾のＣＤＳ、および先頭のＣＤＳと最後尾のＣＤＳに挟まれた内部に存在するＣＤＳに対しては、それぞれ「２」、「４」、「３」というラベルを与えている。
実施例２  大腸菌Ｋ−１２株のトリプトファン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からのＣＤＳの同定
実施例１に記載の方法に準じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のトリプトファン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列より、ＣＤＳを同定した。
（１）コンピュータへの塩基配列の入力
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからインターネット経由で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株の全ゲノム配列（アクセッション番号はＵ０００９６で、配列の長さは４６３９２２１塩基対）を取得し、ハードディスク上に保存した。さらに、この配列から、トリプトファン・オペロンを含む１３１４００１塩基〜１３２１０２１塩基の配列を抜き出した。
（２）ＣＤＳと開始コドンの同定
上記（１）の配列のプラス鎖およびマイナス鎖より、実施例１（２）に記載の方法に準じて、長さが２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
プラス鎖からはＯＲＦを同定できなかったが、マイナス鎖からは合計５個のＯＲＦを同定した。各ＯＲＦは終止コドンの位置で、マイナス鎖の３’末端側から順番に、ＯＲＦ−Ｃ１１からＯＲＦ−Ｃ１５までの番号を付けた。
実施例１（４）に記載の方法に準じて、マイナス鎖のＯＲＦ候補に関して、ポリシストロンの転写単位を形成する可能性があるＯＲＦを検索するとともに、実施例１（３）〜（６）に記載の各ＯＲＦのリボソーム結合スコアの算出と真の開始コドンの同定方法に準じて、５個のＯＲＦ（ＯＲＦ−Ｃ１１〜ＯＲＦ−Ｃ１５）の真偽の判定および開始コドンの同定を行った。さらに、実施例１（８）に記載の方法に準じて、同じ鎖で内包されるＣＤＳの消去について検討を加えた。
その結果、マイナス鎖から５個のＣＤＳと１個の転写単位を同定した
（３）同定されたＣＤＳに関する結果の出力とその結果の評価
最終的に同定されたＣＤＳに関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。その結果を表２に示した。
2003035863.tif 000044
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のゲノム配列（アクセッション番号Ｕ０００９６）に対して付与されたアノテーション情報と表２の情報を比較した結果、トリプトファンオペロン領域の２００アミノ酸以上のＣＤＳの数はともに５個であること、および同定された５個のＣＤＳはＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと完全に一致していることがわかった。これら５個のＣＤＳの開始コドンの位置はＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報と一致していることがわかった。さらに、本発明では、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報にはない転写単位に関する構造情報も得られることが示された。
実施例３  大腸菌Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からＣＤＳの同定
実施例１に記載の方法に準じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列より、長さが２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
（１）コンピュータへの塩基配列の入力
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからインターネット経由で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列（アクセッション番号はＡＥ０００４０８で、配列の長さは１４６５９塩基対）を取得し、ハードディスク上に保存した。
（２）ＣＤＳと開始コドンの同定
上記（１）の配列より、実施例１（２）に記載の方法に準じて終止コドンおよび仮の開始コドンを同定した。
プラス鎖からは６個のＯＲＦを、およびマイナス鎖からは５個のＯＲＦを同定した。各ＯＲＦは終止コドンの位置で、プラス鎖の５’末端側から順番にＯＲＦ−Ｄ２１からＯＲＦ−Ｃ２６までの番号を付けるとともに、マイナス鎖の３’末端側から順番にＯＲＦ−Ｃ２１からＯＲＦ−Ｃ２５までの番号を付けた。
実施例１（４）に記載の方法に準じて、プラス鎖およびマイナス鎖のＯＲＦ候補に関して、ポリシストロンの転写単位を形成する可能性があるＯＲＦを検索するとともに、実施例１（３）〜（６）に記載の各ＯＲＦのリボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索の方法に準じて、１１個のＯＲＦの真偽の判定および開始コドンの同定を行った。さらに、実施例１（７）、（８）に記載の方法に準じて、同じ鎖で内包されるＣＤＳの消去検討を加えた。
その結果、プラス鎖から６個のＣＤＳと５個の転写単位を同定し、またマイナス鎖から５個のＣＤＳと４個の転写単位を同定した。
さらに、実施例１（９）に記載の方法に準じて、選別されたプラス鎖とマイナス鎖の転写単位の間での重複を調べて、真のＯＲＦ候補の真偽の判定を行った。
その結果、ＯＲＦ−Ｄ２１、ＯＲＦ−Ｄ２２、ＯＲＦ−Ｄ２４、ＯＲＦ−Ｄ２５、ＯＲＦ−Ｄ２６、ＯＲＦ−Ｃ２１およびＯＲＦ−Ｃ２２の７個のＣＤＳは真、ＯＲＦ−Ｄ２３、ＯＲＦ−Ｃ２３、ＯＲＦ−Ｃ２４およびＯＲＦ−Ｃ２５の４個のＣＤＳは偽と判定された。
（３）同定されたＣＤＳに関する結果の出力とその結果の評価
最終的に同定された７個の真のＣＤＳと４個の偽のＣＤＳに関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。その結果を表３に示した。
2003035863.tif 000045
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されているアクセッション番号ＡＥ０００４０８の配列に対して付与されたアノテーション情報と表３の情報を比較した結果、本発明の方法で同定されたリボソーム蛋白質オペロン領域の２００アミノ酸以上のＣＤＳの数は７個であり、一方ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳの数は５個であった。同定された７個のＣＤＳのうちＧｅｎＢａｎｋのアノテーション情報と一致しているＣＤＳは、ＯＲＦ−Ｃ２１およびＯＲＦ−Ｃ２２の２個であった。これら２個のＣＤＳの開始コドンの位置はＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報と一致していることがわかった。さらに、本発明では、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報にはない転写単位に関する構造情報も得られることが示された。
実施例４  大腸菌Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（１）
実施例１記載の方法に準じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
（１）コンピュータへの塩基配列の入力
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからインターネット経由で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列（アクセッション番号はＡＥ０００４０８で、配列の長さは１４６５９塩基対）を取得し、ハードディスク上に保存した。
（２）３４アミノ酸以上のＣＤＳと開始コドンの同定
上記（１）の配列より、実施例１（２）に記載の方法に準じて、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの終止コドンおよび仮の開始コドンを同定した。
プラス鎖からは５３個のＯＲＦを、およびマイナス鎖からは３８個のＯＲＦを同定した。各ＯＲＦは終止コドンの位置で、プラス鎖の５’末端側から順番にＯＲＦ−Ｄ１０１〜ＯＲＦ−Ｄ１５３、マイナス鎖の３’末端側から順番にＯＲＦ−Ｃ１０１〜ＯＲＦ−Ｃ１３８までの番号を付けた。
実施例１（４）に記載の方法に準じて、プラス鎖およびマイナス鎖のＯＲＦ候補に関して、ポリシストロンの転写単位を形成する可能性があるＯＲＦを検索するとともに、実施例１（３）〜（６）に記載の各ＯＲＦのリボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索の方法を用いて、９１個のＯＲＦの真偽の判定および開始コドンの同定を行った。さらに、実施例１（７）、（８）に記載の方法に準じて、同じ鎖で内包されるＣＤＳの消去について検討を加えた。その結果、プラス鎖から２２個のＣＤＳと１３個の転写単位を同定し、またマイナス鎖から２３個のＣＤＳと２個の転写単位を同定した。さらに、実施例１（９）に記載の方法に準じて、選別されたプラス鎖とマイナス鎖の転写単位の間での重複を調べて、ＣＤＳの候補の真偽の判定を行った。
その結果、マイナス鎖の２３個のＣＤＳは真、プラス鎖の２２個のＣＤＳは偽と判定された。
（３）同定されたＣＤＳに関する結果の出力とその結果の評価
最終的に同定された真のＯＲＦ（ＣＤＳ）に関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。その結果を表４に示した。
2003035863.tif 000046
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されているアクセッション番号ＡＥ０００４０８の配列に対して付与されたアノテーション情報と表４の情報を比較した結果、リボソーム蛋白質オペロン領域の３４アミノ酸以上のＣＤＳの数はともに２３個であること、および同定された２３個のＣＤＳはすべて一致していることがわかった。これら２３個のＣＤＳの開始コドンの位置はＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報と一致していることがわかった。さらに、本発明では、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報にはない転写単位に関する構造情報も得られることが示された。
実施例５  大腸菌Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（１）
実施例４記載の方法による３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定の精度をさらに向上させるために、同定された２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの情報に基づいた解析手順を追加し、以下のように高精度で３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
（１）３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの検索
実施例４に記載の方法に準じて、大腸菌Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列（アクセション番号はＡＥ０００１１１で、配列の長さは１０５９６塩基対）から、プラス鎖上の３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦを検索した。
その結果、プラス鎖から４７個のＯＲＦが、またマイナス鎖から５１個のＯＲＦが得られた。これらＯＲＦについて、実施例４に記載の方法に準じて、開始コドンの位置を同定するとともに、真のＯＲＦ候補を選別した。
ただし、ＯＲＦの長さが１８０塩基対未満であり、かつ開始コドンがＴＴＧであるＯＲＦはＣＤＳとして選別しなかった。
（２）シャドー判別関数によるＣＤＳの真偽の判定
上記（１）で選別された各真のＯＲＦ候補について、下記に述べるシャドー判別関数の値より各ＯＲＦの真偽を判定した
実施例１で同定した、大腸菌Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列に存在する、２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするの６個のＣＤＳのコドン出現頻度を求めた。
工程（１）で同定した２００アミノ酸以上の６個のＣＤＳのコドン出現頻度をもとに、下記に示す方法に従って、「真のＣＤＳ」と判定されたＣＤＳ内のコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンが該ＣＤＳに出現頻度が低い」というコドンの組み合わせを１３通り選んだ後、シャドー判別関数の値を求めた。
即ち、６４種類のコドンを
2003035863.tif 000047
の順に並べ、１番目のコドンはＴＴＡ、２番目のコドンはＣＴＡのように各コドンに番号をふった。下式に従ってｙｉおよびｙｉ＋３２の値（ｉは３２以下の正の整数）を計算し、その値が大きい順番に、上述の６４種類のコドンを並べ替え、各コドンに順番に番号をふった。
2003035863.tif 000048
または
2003035863.tif 000049
〔ここで、ｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000050
とする。〕
続いて、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位１３個のコドンとｙｉまたはｙｉ＋３２の値が小さい下位１３個のコドンを選び、真のＯＲＦ候補であるＯＲＦ−Ａにおけるシャドー判別関数ＳｄＡの値を下式によって求めた。
2003035863.tif 000051
ただし、
2003035863.tif 000052
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする。
このようにして求めたＳｄＡをもとに、次の条件を満たすときに、ＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと判断した。すなわち、１００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが０．９以上」、６０アミノ酸以上かつ９９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが１．０以上」、３４アミノ酸以上かつ５９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが１．０以上」のときに該ＯＲＦを真のＯＲＦ（ＣＤＳ）と判定した。
（３）同じ鎖上の２つのＯＲＦが重複するときのＣＤＳの選別
上記工程により選別された同じ鎖上の２つのＯＲＦが重複するときには、次のようにしてＣＤＳを選別した。
真のＯＲＦ候補であるＯＲＦ−Ａの５’末端側が、該ＯＲＦの上流に存在するＯＲＦ−Ｂの３’末端側と重複することがわかった場合には以下の方法でこれらＯＲＦの真偽を判定した。
ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが重複している領域の長さが９０塩基対以下、ＯＲＦ−Ａの長さＬＡの１０％以下、かつＯＲＦ−Ｂの長さＬＢの１０％以下であるとき、双方のＯＲＦを真のＣＤＳとして選別した。
重複している領域の長さが上記条件を満たさないときは、以下の方法でこれらＯＲＦの真偽を判定した。
ＬＡがＬＢより大きく、かつ下式（９）を満たすときには、ＯＲＦ−ＡをＣＤＳとして選別した。
2003035863.tif 000053
ＬＡがＬＢより小さく、かつ下式（１０）を満たすときには、ＯＲＦ−ＢをＣＤＳとして選別した。
2003035863.tif 000054
ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂの長さの関係が式（９）と式（１０）を満たさないときには、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂのシャドー判別関数の値の大きさによってＣＤＳの真偽を判定した。
上述の工程で、あるＯＲＦが「真のＯＲＦの候補」として選別された場合には、そのＯＲＦの上流にあるすべての「真のＯＲＦの候補」について、そのＯＲＦの開始コドンと終止コドンの間に内包されるかどうか調べて、内包されるＯＲＦはすべて「偽のＯＲＦ」と判定した。
以上の方法で判定した結果、プラス鎖に存在する４７個のＯＲＦの内１５個が、マイナス鎖に存在する５１個のＯＲＦの内１６個がＣＤＳとして選別された。
（４）プラス鎖とマイナス鎖の転写単位の比較
上記において、真のＯＲＦとして選別されたＣＤＳの開始コドンとその上流のＣＤＳの終止コドンの距離が９０塩基対以内のときは、双方のＣＤＳは同一転写単位に存在すると判定し、転写単位の構造を調べた。
その結果、プラス鎖の転写単位の数は６個で、マイナス鎖の転写単位の数は９個であることがわかった。
続いて、個々の転写単位の先頭のＣＤＳの開始コドンの位置と最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置を求めて、プラス鎖の転写単位とマイナス鎖の転写単位の間で重複領域があるかどうか調べた。プラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑを内包する場合、またはプラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑに内包される場合は、次のようにして、転写単位の真偽を判定した。なお転写単位の長さは、「先頭のＣＤＳの開始コドンの位置」と「最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置」の差とし、転写単位Ｐと転写単位Ｑの長さをそれぞれＬＰ、ＬＱとした。
ＬＰがＬＱより大きく、かつ下式（１１）を満たすときには、転写単位Ｐを真の転写単位とし、転写単位Ｑを偽の転写単位とした。
2003035863.tif 000055
ＬＰがＬＱより小さく、かつ下式（１２）を満たすときには、転写単位Ｐを偽の転写単位とし、転写単位Ｑを真の転写単位とした。
2003035863.tif 000056
転写単位Ｐと転写単位Ｑの長さの関係が式（１１）と式（１２）を満たさないときには、転写単位Ｐと転写単位Ｑを構成しているすべてのＣＤＳを連結した後、この連結した翻訳領域に関して、実施例５の（２）に述べた方法に従ってシャドー判別関数の値を算出し、その値が大きい方を真の転写単位と判定した。
（５）プラス鎖とマイナス鎖のＣＤＳの比較およびプラス鎖とマイナス鎖のＣＤＳが５’末端側で重複しているときの処理
上記で選別された転写単位を構成するＣＤＳについて、（４）に記載した方法により、内包関係にある２つのＣＤＳの真偽を判定した。
判定後、真のＣＤＳとして選別されたＣＤＳについて、プラス鎖のＣＤＳ（ＣＤＳ−Ａとする）とマイナス鎖のＣＤＳ（ＣＤＳ−Ｂとする）が５’末端側で重複しているかどうか調べた。
重複が認められた２つのＣＤＳ（ＣＤＳ−ＡおよびＣＤＳ−Ｂ）の真偽を以下の手順に従って判定した。
ＣＤＳ−Ａの開始コドンの次のコドンから下流に向かって、実施例１（３）で述べた方法を用いて、新しい開始コドンの同定を試みた。同様にして、ＣＤＳ−Ｂの開始コドンの次のコドンから下流に向かって、実施例１（３）で述べた方法を用いて、新しい開始コドンの同定を試みた。新しい開始コドンが同定された場合、前の開始コドンも含めて、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂが重複しない開始コドンの組み合わせが存在するか調べた。元の開始コドンおよび新しく同定された開始コドンの位置を比較して、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの重複が回避できるときには、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの両方を真のＣＤＳと判定した。ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの重複が回避できないときには、以下の方法で、ＣＤＳの真偽を判定した。
ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの長さをそれぞれＬＡ、ＬＢとし、ＬＡがＬＢより大きく、かつ下式（９）を満たすときには、ＣＤＳ−Ｂを「偽のＣＤＳ」とした。
2003035863.tif 000057
ＬＡがＬＢより小さく、かつ下式（１０）を満たすときには、ＣＤＳ−Ａを「偽のＣＤＳ」とした。
2003035863.tif 000058
上述のいずれの方法でもＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの真偽が判定できない場合には、上述と同じ方法によりそれぞれのＣＤＳのシャドー判別関数の値を比較することにより、ＣＤＳの真偽を判定した。
（６）プラス鎖とマイナス鎖のＣＤＳが３’末端側で重複しているときの処理
プラス鎖のＣＤＳ−Ａとマイナス鎖のＣＤＳ−Ｂがそれぞれ３’末端側で重複しているが、ＣＤＳ−ＡがＣＤＳ−Ｂを内包していないし、またＣＤＳ−ＢがＣＤＳ−Ａを内包していない場合には、上述の（５）の工程で述べた方法と同様の方法を用いて、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの真偽を判定した。
まず、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂが重複している領域の長さがそれぞれのＣＤＳの２０％未満である場合には、双方のＣＤＳを真のＣＤＳとして判定した。その重複領域の長さが片方のＣＤＳの２０％以上であるが、もう一方のＣＤＳの長さの２０％未満である場合には、前者のＣＤＳを偽のＣＤＳと判定した。これらの条件でのＣＤＳの真偽が判定できないときは、上述の式（９）と式（１０）を用いる方法によりＣＤＳの真偽を判定した。
上記処理により、プラス鎖からは７個の真のＯＲＦ（ＣＤＳ）を、およびマイナス鎖からは５個のＣＤＳを同定した。各ＯＲＦは終止コドンの位置で、プラス鎖の５’末端側から順番にＯＲＦ−Ｄ２０１からＯＲＦ−Ｄ２０７までの番号を付けるとともに、マイナス鎖の３’末端側から順番にＯＲＦ−Ｃ２０１からＯＲＦ−Ｃ２０５までの番号を付けた。
（７）同定されたＣＤＳに関する結果の出力とその結果の評価
上述の処理を加えることにより、プラス鎖からは７個のＯＲＦを、およびマイナス鎖からは５個のＯＲＦを同定した。各ＯＲＦは終止コドンの位置で、プラス鎖の５’末端側から順番にＯＲＦ−Ｄ２０１からＯＲＦ−Ｄ２０７までの番号を付けるとともに、マイナス鎖の３’末端側から順番にＯＲＦ−Ｃ２０１からＯＲＦ−Ｃ２０５までの番号を付けた。最終的に同定された１２個のＣＤＳに関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。その結果を表５に示した。
2003035863.tif 000059
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されているアクセッション番号ＡＥ０００１１１の配列に対して付与されたアノテーション情報と表５の情報を比較した結果、本発明の方法で同定された３４アミノ酸以上のＣＤＳの数は１２個であり、一方ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳの数は９個であった。同定された１２個のＣＤＳのうちＧｅｎＢａｎｋのアノテーション情報と一致しているＣＤＳは、ＯＲＦ−Ｄ２０１、ＯＲＦ−Ｄ２０２、ＯＲＦ−Ｄ２０３、ＯＲＦ−Ｄ２０６、ＯＲＦ−Ｄ２０７、ＯＲＦ−Ｃ２０２、ＯＲＦ−Ｃ２０３、およびＯＲＦ−Ｃ２０５の８個であった。これら８個のＣＤＳの開始コドンの位置がＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報と一致しているものは６個であった。さらに、本発明では、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報にはない転写単位に関する構造情報も得られることが示された。
本実施例の結果から、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」に、本発明の「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を組み合わせることにより、ＣＤＳ同定精度が向上することが示された。
実施例６  大腸菌Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（２）
実施例５に記載の方法に準じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のリボソーム蛋白質・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列（アクセッション番号はＡＥ０００４０８で、配列の長さは１４６５９塩基対）から、２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを高精度で同定した後、同定したＣＤＳの情報に基づき、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」の手順を実施することにより、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
その結果、実施例４に示した結果と同一の結果が得られた。
実施例７  大腸菌Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（２）
本実施例において「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」と「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」との組み合わせた、実施例５に記載の方法に、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳの同定精度が向上することを示す。コーディング・ポテンシャルの指標として、以下に示す、真のＣＤＳに出現しやすいコドンの出現度数と出現しにくいコドンの出現度数をもとにした計算式（以下、「コード関数」またはＣｄと略記する）により得られた値を用いた。
（１）「コード関数」の値の算出方法によるＯＲＦの真偽の判定
すでに同定されたＴ個の翻訳領域のうち、ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
2003035863.tif 000060
としたとき、下式（６）によりｙｉを求めた。
2003035863.tif 000061
次に、ｙＩの大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、特定のＯＲＦ（ＯＲＦ−Ａとする）のＣｄＡの値は下式（７）により求めた。
2003035863.tif 000062
ただし、
2003035863.tif 000063
が０のときは、Ｃｄｎの値は１とする。
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｔとｊはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０までの整数とする。〕
本実施例では、ｍを１５とした。
このようにして求めたＣｄＡをもとに、次の条件を満たすときに、ＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと判断した。
すなわち、１００アミノ酸以上ＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．０以上」のとき、６０アミノ酸以上、かつ９９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．１以上」とき、３４アミノ酸以上かつ、５９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．４以上」のときに該ＯＲＦを真のＣＤＳと判定した。
「シャドー判別関数」の値が得られている場合には、ＯＲＦ−Ａの「シャドー判別関数」の値ＳｄＡと「コード関数」の値ＣｄＡの積の値（ＳｄＡ×ＣｄＡ）をもとに、ＣＤＳの真偽を判別した。
すなわち、１００アミノ酸以上のＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが１．１以上」のときに該ＯＲＦを真のＣＤＳを含むものと判定した。６０アミノ酸以上、かつ９９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが１．４以上」ときに該ＯＲＦを真のＣＤＳを含むものと判定した。３４アミノ酸以上かつ、５９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが１．６以上」のときに該ＯＲＦを真のＣＤＳを含むものと判定した。
（２）スレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定
「シャドー判別関数」の値を用いる工程以外は、実施例５に記載した方法に準じ、大腸菌Ｋ−１２株のスレオニン・オペロンを含むＤＮＡ断片の配列（アクセション番号はＡＥ０００１１１で、配列の長さは１０５９６塩基対）のプラス鎖とマイナス鎖から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定することを試みた。
本実施例では、実施例５の「シャドー判別関数」を用いる工程においては、「シャドー判別関数」の値に基づく判定法に加えて、上の（１）に示した「コード関数」の値に基づく判定法と「シャドー判別関数」と「コード関数」の積の値に基づく判定法により、ＣＤＳの真偽を判定した。
上述のようにしてＣＤＳの選別を行った結果、最終的にプラス鎖から６個のＣＤＳ（ＯＲＦ−Ｄ３０１〜ＯＲＦ−Ｄ３０６）とマイナス鎖から３個のＣＤＳ（ＯＲＦ−Ｃ３０１〜ＯＲＦ−Ｃ３０３）が同定された。
（３）同定されたＣＤＳに関する結果の出力とその結果の評価
最終的に同定された９個のＣＤＳに関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。その結果を表６に示した。
2003035863.tif 000064
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されているアクセション番号ＡＥ０００１１１の配列に対して付与されたアノテーション情報と表６の情報を比較した結果、３４アミノ酸以上のＣＤＳの数はともに９個であること、および同定された９個のＣＤＳはすべて一致していることがわかった。これら９個のＣＤＳの開始コドンの位置はＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報と一致していることがわかった。さらに、本発明では、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアノテーション情報にはない転写単位に関する構造情報も得られることが示された。
実施例５の結果と本実施例の結果の比較から、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」と「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」との組み合わせ方法に加えて、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳ同定精度が向上することが示された。
実施例８  大腸菌Ｋ−１２株の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（１）
実施例１および５に記載の方法に準じ、すなわち「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の全ゲノム配列から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
（１）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定
実施例１に記載の方法に準じ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株の全ゲノム配列（アクセッション番号はＵ０００９６で、配列の長さは４６３９２２１塩基対）のプラス鎖とマイナス鎖から、３４アミノ酸以上のポリベプチドをコードするＣＤＳをそれぞれ２６７９個と２６６１個ずつ同定した。さらに、同定した合計５３４０個のＣＤＳの終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した結果、５３４０個のＣＤＳの内、３３９１個のＣＤＳの終止コドンがＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していることがわかった。なお、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株の３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの数は４２７４個であった。
以上の結果より、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のアノテーション情報を正解とし、かつ大腸菌Ｋ−１２株の全ＣＤＳの数（４２８９個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．７９０であり、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は０．６３５であった。
実施例９  大腸菌Ｋ−１２株の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（２）
実施例６に記載の方法に準じ、すなわち「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」と「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を組み合わせて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の全ゲノム配列から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
実施例１に記載の方法に準じ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株の全ゲノム配列（アクセッション番号はＵ０００９６で、配列の長さは４６３９２２１塩基対）のプラス鎖とマイナス鎖から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳをそれぞれ２６０７個と２６４８個ずつ同定した。
同定した合計５２５５個のＣＤＳの終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した結果、５２５５個のＣＤＳの内、４１４９個のＣＤＳの終止コドンがＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していることがわかった。
以上の結果より、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のアノテーション情報を正解とし、かつ大腸菌Ｋ−１２株の全ＣＤＳの数（４２８９個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．９６７であり、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は０．７９０であった。
実施例８の結果と本実施例の結果の比較から、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」に、本発明の「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を組み合わせることにより、ＣＤＳ同定精度が向上することが示された。
実施例１０  大腸菌Ｋ−１２株の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（３）
「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」、および、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」の一つである「コード関数を用いたＣＤＳ同定精度向上法」を組み合わせた、実施例７に記載の方法に準じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の全ゲノム配列から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
その結果、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株の全ゲノム配列（アクセッション番号はＵ０００９６で、配列の長さは４６３９２２１塩基対）のプラス鎖から２１８５個、マイナス鎖から２２８１個同定した。
同定した合計４４６６個のＣＤＳの終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した結果、４４６６個のＣＤＳの内、４１６３個のＣＤＳの終止コドンはＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していることがわかった。
以上の結果より、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のアノテーション情報を正解とし、かつ大腸菌Ｋ−１２株の全ＣＤＳの数（４２８９個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．９７１であり、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は０．９３２であった。
実施例９の結果と本実施例の結果の比較から、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」と「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」との組み合わせ方法に加えて、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳの同定精度が向上することが示された。
なお、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株の３４アミノ酸以上のＣＤＳの中で、本実施例で選別されなかった１１２個のＣＤＳは、
2003035863.tif 000065
であった。
（２）大腸菌Ｋ−１２株の既知遺伝子に関する評価
大腸菌は実験科学的によく解析されている生物の一種である。既に解析が行われていると考えられる下記のＣＤＳについて、本発明の方法で解析した結果と比較した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｒｐｌ」、「ｒｐｓ」、「ｒｐｍ」が付くものをリボソーム蛋白質として、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報から検索し、計５５個のＣＤＳを選択した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｄｎａ」が付くものをＤＮＡ合成・複製に関わる遺伝子として検索し、計１１個のＣＤＳを選択した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｒｅｃ」が付くものをＤＮＡ組換え・修復に関わる遺伝子として検索し、計１３個のＣＤＳを選択した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｐｙｒ」または「ｐｕｒ」が付くものをピリミジンとプリンの塩基の生合成に関わる遺伝子として検索し、計２３個のＣＤＳを選択した。
さらに、著名なアミノ酸生合成系のオペロンを構成する遺伝子として、ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤおよびｔｒｐＥの８個のＣＤＳを選択した。
これら合計１１０個の大腸菌の既知遺伝子に関して、本実施例で同定した３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするの４４６６個のＣＤＳを比較した結果、既知遺伝子１１０個のうち、本発明の方法によって同定できなかったＣＤＳは、ｒｐｍＨとｐｙｒＬだけであった。
本発明の方法によって同定できた１０８個の既知遺伝子の開始コドンの位置をＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている大腸菌Ｋ−１２株のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した。
その結果、１０８個のうち、ｒｐｌＹ、ｒｐｓＢ、ｄｎａＫ、ｄｎａＱ、ｄｎａＢ、ｒｅｃＱおよびｐｙｒＦを除く１０１個のＣＤＳの開始コドンの位置がＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアノテーション情報と一致した。
以上、本発明の方法を用いることにより、微生物のゲノム配列から高精度にＣＤＳと開始コドンを同定できることが示された。
実施例１１  枯草菌の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（１）
「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」および「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を組み合わせた、実施例５に記載の方法に準じて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株）の全ゲノム配列から、２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを高精度で同定した後に、同定したＣＤＳの情報に基づき、追加の手順を実施することにより、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを高精度に同定した。
（１）各ＯＲＦのリボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索の方法
実施例１（３）記載の方法に準じて、枯草菌の各ＯＲＦのリボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索を行った。
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されたデータ解析より得られた、枯草菌の１６Ｓ  リボソームＲＮＡの３’末端の配列３’−ＵＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’のうち、３’−ＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’情報を利用し、大腸菌Ｋ−１２株からのＣＤＳの同定の方法に準じて、真の開始コドンとＣＤＳの同定を行った。
（２）２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定
実施例１（２）〜（９）に記載の方法に準じ、２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株）の全ゲノム配列（アクセッション番号はＡＬ００９１２６で、配列の長さは４２１４８１４塩基対）のプラス鎖から１２５５個、マイナス鎖から１３４８個同定した。
（３）３４アミノ酸以上のＣＤＳと開始コドンの同定
実施例５の（２）に記載の方法に準じ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株）の全ゲノム配列（アクセッション番号はＡＬ００９１２６で、配列の長さは４２１４８１４塩基対）のプラス鎖とマイナス鎖から３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦを検索した。
その結果、プラス鎖から５３２５個、マイナス鎖から５５３２個のＯＲＦを同定した。上記で同定した２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードする２６０３個のＣＤＳの情報をもとに、実施例５に記載の方法に準じ、ＣＤＳの真偽を判定し、開始コドンの同定を行った結果、プラス鎖から２３５０個、マイナス鎖から２６０２個のＣＤＳが同定された。
（４）同定されたＣＤＳに関する結果の出力とその結果の評価
最終的に同定された４９５２個のＣＤＳに関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。
出力された各ＣＤＳの終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている枯草菌のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した結果、４９５２個のＣＤＳの内、４０１１個のＣＤＳの終止コドンはＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していた。
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている枯草菌のアノテーション情報を正解とし、かつ枯草菌の全ＣＤＳの数（４１００個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．９７８であり、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は０．８１０であった。
実施例１２  枯草菌の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（２）
「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」、および「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」の一つである「コード関数を用いたＣＤＳ同定精度向上法」を組み合わせた、実施例７に記載の方法に準じて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株）の全ゲノム配列から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
（１）枯草菌の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のＣＤＳと開始コドンの同定
実施例７に記載の方法に準じて、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株）の全ゲノム配列（アクセッション番号はＡＬ００９１２６で、配列の長さは４２１４８１４塩基対）のプラス鎖から２１４９個、マイナス鎖から２３９５個同定した。
同定した合計４５４４個のＣＤＳの終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている枯草菌のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した結果、４５４４個のＣＤＳの内、４００７個のＣＤＳの終止コドンはＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していた。
以上の結果より、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている枯草菌のアノテーション情報を正解とし、かつ枯草菌の全ＣＤＳの数（４１００個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．９７７であり、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は０．８８１であった。
実施例１１の結果と本実施例の結果の比較から、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」と「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」との組み合わせ方法に加えて、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳ同定精度が向上することが示された。
なお、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている枯草菌の３４アミノ酸以上のＣＤＳの中で、本実施例で選別されなかった８７個のＣＤＳは、
2003035863.tif 000066
であった。
（２）枯草菌の既知遺伝子に関する評価
枯草菌は実験科学的によく解析されている生物の一種である。既に解析が行われていると考えられる下記のＣＤＳについて、本発明の方法で解析した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｒｐｌ」、「ｒｐｓ」、「ｒｐｍ」が付くものをリボソーム蛋白質として、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている枯草菌のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報から検索し、計５２個のＣＤＳを選択した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｄｎａ」が付くものをＤＮＡ合成・複製に関わる遺伝子として検索し、計１１個のＣＤＳを選択した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｄｎａ」が付くものをＤＮＡ合成・複製にかかわる遺伝子として検索し、計１１個のＣＤＳを選択した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｒｅｃ」が付くものをＤＮＡ組換え・修復に関わる遺伝子として検索し、計５個のＣＤＳを選択した。
遺伝子名の最初の３文字が「ｐｙｒ」または「ｐｕｒ」が付くものをピリミジンとプリンの塩基の生合成に関わる遺伝子として検索し、合計２４個のＣＤＳを選択した。
著名なアミノ酸生合成系の遺伝子として、ｔｈｒＳ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｔｈｒＺ、ｔｒｐＡ、ｔｐｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥおよびｔｒｐＦの９個のＣＤＳを選択した。
これら合計１０２個の枯草菌の既知遺伝子に関して、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードする、本発明の方法で同定した４００７個のＯＲＦの結果について検討した。
その結果、上記既知遺伝子１０２個のうち１０２個とも同定できた。続いて、本発明の方法によって同定できた１０２個の既知遺伝子の開始コドンの位置をＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている枯草菌のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した。
その結果、１０２個中、８２個のＣＤＳの開始コドンの位置が一致していた。
実施例１３  緑膿菌ゲノムの全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（１）
全ゲノム配列が解明された微生物の中で、全ゲノム配列のＧＣ含量が６０％以上であり、最も遺伝学的および生化学的に解析が進んでいる微生物は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。そこで、本実施例では、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１株）の全ゲノム配列から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
実施例５に記載の方法に準じて、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１株）の全ゲノム配列から、２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを高精度で同定した後、同定したＣＤＳの情報に基づき、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」の手順を実施することにより、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを高精度に同定した。
（１）各ＯＲＦのリボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索
実施例１（３）に記載の方法に準じ、緑膿菌の各ＯＲＦのリボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索を行った。
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されたデータ解析より得られた緑膿菌の１６Ｓ  リボソームＲＮＡの３’末端配列３’−ＡＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’のうち、３’−ＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’情報を利用し、大腸菌Ｋ−１２株からのＣＤＳの同定に準じて、真の開始コドンとＣＤＳの同定を行った。
（２）２００アミノ酸以上のＣＤＳの同定
実施例１（２）〜（９）に記載の方法および上述の開始コドンの同定方法を用いて、２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを、ＧＣ含量６６．５６％緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１株）の全ゲノム配列（アクセッション番号はＡＥ００４０９１で、配列の長さは６２６４４０３塩基対）のプラス鎖から２０６９個、マイナス鎖から１６４４個同定した。
（３）３４アミノ酸以上のＣＤＳと開始コドンの同定
実施例５（２）に記載の方法に準じ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１株）の全ゲノム配列（アクセッション番号はＡＥ００４０９１で、配列の長さは６２６４４０３塩基対）のプラス鎖とマイナス鎖から３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦを検索した。
ただし、実施例５（２）で述べた「シャドー判別関数」の値ＳｄＡに基づくＣＤＳの真偽の判定に用いる閾値は以下のように変更した。すなわち、１００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが１．０以上」のときに、６０アミノ酸以上、かつ９９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが１．１以上」のときに、３４アミノ酸以上かつ、５９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが１．１以上」のときに該ＯＲＦを真のＯＲＦ（ＣＤＳ）と判定した。
この条件のもとＯＲＦを検索した結果、プラス鎖からは８５１９個のＯＲＦ、マイナス鎖からは８３０７個のＯＲＦを同定した。
上記で同定した２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードする３７１３個のＣＤＳの情報をもとに、実施例５に記載の方法に準じてＣＤＳの真偽を判定し、開始コドンの同定を行った。
その結果、プラス鎖から３０６２個、マイナス鎖から３１６６個のＣＤＳが同定された。
（４）同定されたＣＤＳに関する結果の出力とその結果の評価
最終的に同定された６２２８個のＣＤＳに関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。
出力された各ＣＤＳの終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている緑膿菌のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した結果、６２２８個のうち５０１８個のＣＤＳの終止コドンはＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していた。
ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている緑膿菌のアノテーション情報を正解とし、かつ緑膿菌の全ＣＤＳの数（５５６５個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．９０２であり、特異性（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）は０．８０６であった。
実施例１４  緑膿菌ゲノムの全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（２）
本実施例において、「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」および「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を組み合わせた実施例１３に記載の方法に、「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目したＣＤＳ同定精度向上法」を組み合わせることにより、更にＣＤＳの同定精度が向上することを示す。
（１）コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法
ＣＤＳ内のコドンの第１文字目と第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量をコドン内の塩基のＧＣ含量とし、下式（５）のＧＣｉの値（以下、「ＧＣ関数」の値と略記する）として算出した。
2003035863.tif 000067
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ＝１，２，３）の塩基がｂ（ｂ＝１，２，３，４）のとき、
2003035863.tif 000068
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なおｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（終止コドンを除く）を表す。〕
（２）緑膿菌ゲノムの全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のＣＤＳの同定
上記の「ＧＣ関数」の値を、「開始コドンの再検索」と「ＣＤＳの真偽の判定」に用いた。
「開始コドンの再検索」に関しては（実施例１（３）または（６）の記載に準拠した方法によりポリシストロンの転写単位を形成する可能性がないと判定されたときに「ＧＣ関数」の値を利用した。
具体的には、選別された１５０アミノ酸以上のポリペプチドをコードする真のＯＲＦ候補の５’末端側６０アミノ酸の領域の「ＧＣ関数」の値を求め、この値が２／３以下のときには、同定された開始コドンの次のコドンから３’側に向かって開始コドンを再検索した。「開始コドンの再検索」は最大２回繰り返した。「ＣＤＳの真偽の判定」については、選別したＣＤＳの「ＧＣ関数」の値を求め、この値が２／３以下のときには、「偽のＣＤＳ」と判定した。
これらの手順を実施例１３に記載の方法に組み入れ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１株）の全ゲノム配列（アクセッション番号はＡＥ００４０９１で、配列の長さは６２６４４０３塩基対）のプラス鎖とマイナス鎖から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
このようにしてＣＤＳの選別を行った結果、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳをプラス鎖から２８９６個、マイナス鎖から３２９０個同定した。
同定した合計６１８６個のＣＤＳの各終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている緑膿菌のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した。
その結果、５３００個のＣＤＳの終止コドンはＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していた。
以上の結果より、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている緑膿菌のアノテーション情報を正解とし、かつ緑膿菌の全ＣＤＳの数（５５６５個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．９５２であり、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が０．８５７であった。
実施例１３の結果と本実施例の結果の比較から、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」と「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」との組み合わせ方法に加えて、「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳ同定精度が向上することが示された。
実施例１５  緑膿菌ゲノムの全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定（３）
「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」、「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」、および「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」の一つである「コード関数を用いたＣＤＳ同定精度向上法」を組み合わせた実施例１４に記載の方法に準じて、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１株）の全ゲノム配列から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを同定した。
（１）緑膿菌の全ゲノム配列からの３４アミノ酸以上のＣＤＳと開始コドンの同定
ＣＤＳ選別のためのシャドー判別関数の閾値を変更する以外は、実施例７に記載の方法に準じて、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１株）の全ゲノム配列（アクセッション番号はＡＥ００４０９１で、配列の長さは６２６４４０３塩基対）から、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳの同定を行った。
ＣＤＳ選別のためのシャドー判別関数の閾値は次のように設定した。
上式実施例７により求めた「コード関数」ＣｄＡの値をもとに、次の条件を満たすときに、ＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと判断した。すなわち、１００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．５以上」のときに、６０アミノ酸以上、かつ９９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．５以上」ときに、３４アミノ酸以上かつ、５９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．６以上」のときに該ＯＲＦを真のＯＲＦ（ＣＤＳ）と判定した。
さらに、「シャドー判別関数」の値が得られている場合には、ＯＲＦ−Ａの「シャドー判別関数」の値ＳｄＡと「コード関数」の値ＣｄＡがの積の値（ＳｄＡ×ＣｄＡ）をもとに、ＣＤＳの真偽を判別することができる。すなわち、１００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが１．８以上」のときに、６０アミノ酸以上、かつ９９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが２．０以上」のときに、３４アミノ酸以上かつ、５９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが２．１以上」のときに該ＯＲＦを真のＯＲＦ（ＣＤＳ）と判定した。
上記条件でＣＤＳの選別を行った結果、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＣＤＳを、プラス鎖から２７１６個、マイナス鎖から２８５９個同定した。
同定した合計５５７５個の各ＣＤＳの終止コドンの位置を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている緑膿菌のゲノム配列に対して付与されたアノテーション情報と比較した。
その結果、５５７５個のＣＤＳの内、５２９９個のＣＤＳの終止コドンはＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＤＳと一致していた。
以上の結果より、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている緑膿菌のアノテーション情報を正解とし、かつ緑膿菌Ｋ−１２株の全ＣＤＳの数（５５６５個）を分母としたときの同定精度に関して、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は０．９５２であり、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は０．９５０であった。
実施例１４の結果と本実施例の結果の比較から、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」および「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」の組み合わせ方法に加えて、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳ同定精度が向上することが示された。
なお、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている緑膿菌の３４アミノ酸以上のＣＤＳの中で、本実施例で選別されなかった２６２個のＣＤＳは、
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であった。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、精度の向上した遺伝子構造同定が可能である。
特に、本発明の方法によれば、ポリシストロンの転写単位の構造の予測が可能であり、開始コドンの位置の同定精度を高めることができ、予備情報が不要であり、ＧＣ含量が高い塩基配列に対応する遺伝子構造同定が可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、原核生物の遺伝子の構造を示した図である。本明細書では、図中のリボソーム結合配列の中で高頻度で出現する配列ＡＧＧＡと開始コドンの間の距離をＳＤ配列と開始コドンの間の距離と定義した。
図２は、原核生物の転写単位の構造を示した図である。図中に示すように、真のＣＤＳの反対鎖に「遺伝子の影」という偽のＣＤＳが多数出現することがＣＤＳの同定精度を下げる原因となっている。ＯＲＦは「白抜きのボックス」または「白抜きと灰色のボックスを合わせた領域」で示し、ＣＤＳは灰色のボックスで示すことにした。また、ＳＤ配列は黒の小ボックスで、開始コドンの候補（通常ＡＴＧ、ＧＴＧ，ＴＴＧ）は黒の三角で、および終止コドンは黒丸（●）で示した。
遺伝子の構造の定義（図１参照）
プロモーター、ＣＤＳ、ＳＤ、開始コドン、終止コドン、ターミネーターシストロン、オペロンの定義
ＣＤＳ、ＳＤ，開始コドン、終止コドン、オペロンが同定できれば、プロモーターとターミネーターの存在場所は推測できると説明する。
プラス鎖とマイナス鎖の定義
本明細書でのＯＲＦの定義：途中に終止コドンが出てこない読み取り枠。開始コドンから終止コドンを持ち、内部に終止コドンが出てこないＣＤＳの候補
本明細書でのＣＤＳの定義：蛋白質が翻訳される可能性が高いＣＤＳ
ＣＤＳの位置が合ってても、開始コドンの位置が正確に同定できていない場合があることを指摘する。
図３は、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」のアルゴリズムのフローチャートを示した図である。
図４は、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」において、２つの翻訳領域がオペロンを形成するときの開始コドンの位置の優先順位を決めるためのランク関数の値を示した図である。図中のＲＵＰの値は、（ＲＵＰ−２）の３倍の値が予め設定したポリシストロンを形成するための終止コドンと開始コドンの距離を越えず、かつ１０より大きい整数である。ＲＤＮは、予め設定された値（例えば３０）を越えない（ＲＵＰ＋２）以上の整数である。
図５は、翻訳領域Ａ（ＣＤＳ−Ａ）の「リボソーム結合スコア」の算出の手順をフローチャートとして示した図である。
図６は、大腸菌ｔｒｐＬ遺伝子のＳＤ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列の間の対合状態を示した図である。
図７は、本発明の「転写単位構造に着目したＣＤＳ同定法」の変法のアルゴリズムのフローチャートを示した図であり、図８に続く。
図８は、図７の続きで、本発明の「転写単位構造に着目したＣＤＳ同定法」の変法のアルゴリズムのフローチャートを示した図である。
図９は、本発明の「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」を用いてプラス鎖とマイナス鎖の塩基配列から複数個のＣＤＳおよび転写単位を同定した後、重複する転写単位の真偽を判定するための手順をフローチャートとして示した図である。
図１０は、「転写単位構造に着目した遺伝子構造同定方法」を繰り返して用いることにより複数のＣＤＳを同定する方法の一例をフローチャートとして示した図である。図中のＸ１（％）通常５〜２０の値をとる。
図１１は、シャドー判別関数を用いて翻訳領域Ａ（ＣＤＳ−Ａ）の真偽を判定することにより、ＣＤＳの同定精度を向上させるための手順をフローチャートとして示した図である。図中のＰ１（％）は通常５〜２０の値をとる。
図１２は、本発明の方法を好ましく実施するためのハードウェア構成図である。
図１３は、本発明の遺伝子構造同定法の一実施態様の全体処理フロー図である。
図１４は、本発明の遺伝子構造同定法の一実施態様の全体処理フロー図である。
図１５は、本発明の遺伝子構造同定法の一実施態様の全体処理フロー図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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