(57)【要約】ドナーから得た末梢血から抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法の提供。Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血単核細胞（Ｇ−ＰＢＭＣ）、Ｇ−ＣＳＦを投与せずに採取した正常末梢血もしくは移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または臍帯血から採取した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）等の血液由来単核細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５場合によってはさらに他のサイトカインの存在下で培養することを含む、抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液由来の単核細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項２】
末梢血単核細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、請求項１記載の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項３】
Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血単核細胞（Ｇ−ＰＢＭＣ）、Ｇ−ＣＳＦを投与せずに採取した正常末梢血もしくは移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または臍帯血から採取した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、請求項１記載の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項４】
ＣＤ８＋細胞にＣＤ１４＋細胞を混合し、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項５】
細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５に加えて、ＩＬ−２１の存在下で培養する請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１５で刺激培養の際に同時に、または抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１５で刺激培養した後に、ＩＬ−２１を添加する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞がＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項８】
少なくとも抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５が存在する条件下での培養が５日以上行われる請求項１から７のいずれか１項に記載の抑制性ＮＫ細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法。
【請求項９】
少なくとも抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５が存在する条件下での培養が１０日以上行われる請求項８記載の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項１０】
培養前に比べ、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣ中のＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞が１０倍以上増幅される請求項１から９のいずれか１項に記載の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項１１】
培養前に比べ、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣ中のＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞が２０倍以上増幅される請求項１０記載の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の増幅方法により抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させたＧ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣより抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を単離することを含む、抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ドナーから得た末梢血から抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法に関する。
【背景技術】  ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上およびＴ細胞の抑制性ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）はＭＨＣクラスＩ分子への結合を通して細胞障害作用を負に調節することが報告されている（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．１１，２３７−２４４（１９９０）、Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５５，１０５−１１７（１９９７）、Ｂａｋｋｅｒ，Ａ．Ｂ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，５２３９−５２４５（１９９８））。
移植片対宿主病（ＧＶＤＨ）および移植片対白血病反応（ＧＶＬ）効果は同種幹細胞移植（ａｌｌｏ  ＳＣＴ）において最も重要な問題である。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で動員された末梢血単核球（Ｇ−ＰＢＭＣ）移植片は通常の骨髄移植片の少なくとも１０倍のＴ細胞を含んでいるが、同種末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）後の急性移植片対宿主病の発生と重篤度は同種骨髄で認められるものとほぼ同等である（Ｂｌａｉｓｅ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８，５３７−５４６（２０００）、Ｐｏｗｌｅｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５５，１２３１−１２３７（２０００）、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，３４４，１７５−１８１（２００１））。Ｇ−ＣＳＦ動員後のアフェレシス産物は多数のＣＤ１４陽性細胞を含んでおり、該ＣＤ１４＋細胞は用量依存的にドナーＴ細胞の増幅を抑制することが報告されている（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８９，１６２９−１６３４（１９９７）、Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９２，２１５−２２２（１９９８））。また、本発明者らはＣＤ４＋細胞中の共刺激性（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子ＣＤ２８反応性複合体の誘導はＧ−ＰＢＭＣ中のＣＤ１４＋細胞の存在により抑制されることを見出している（Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｌｏｄ  ９１，３４７−３５２（１９９８））。
ＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロダイマーはＨＬＡ−Ｅ  ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ  ＨＬＡ−Ｉ分子の受容体として作用する（Ｂｒａｕｄ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，７９５−７９９（１９９８））。細胞内部分に二つの特徴的なチロシン残基を有する免疫抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有するＮＫＧ２Ａは抑制性シグナルを伝達しうる。抑制性ＮＫＲを発現するＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）のＮＫ様活性およびＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）誘導性障害活性はＮＫＲによるクラスＩ認識により抑制される（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，４０３−４０５（１９９５）、Ｍｉｎｇａｒｉ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１２４３３−１２４３８（１９９６））。ＲｕｇｇｅｒｉらはＡＭＬ（急性骨髄性白血病）患者に対するＨＬＡハプロタイプ不一致移植において、ＧＶＨ方向にＮＫＲリガンド不適合が存在した場合には再発、拒絶、急性ＧＶＨＤも認められないという驚くほどの良好な臨床的結果を示した（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，１０９７−２１００（２００２））。そのデータは同種細胞上のＮＫＲリガンドの発現喪失は抑制性ＮＫＲ発現細胞の同種反応性をトリガーしうることを示す。
本発明者等は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＨＬＡ−Ｃの特異的受容体であるＣＤ１５８ｂの発現は慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）患者において増大することを示した。数人の患者においてＴ細胞におけるＣＤ１５８ｂの発現増大と臨床症状の改善には相関が認められた。また、Ｔ細胞上でのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの発現は予後の良好なｃＧＶＨＤ患者で予後の悪いｃＧＶＨＤ患者よりも高かった（Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０８，７７８−７８３（２０００）、Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２６，２８７−２９０（２０００）、Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１７，７５１−７５４，（２００２））。従って、ＮＫ細胞だけでなくＮＫＲ発現Ｔ細胞もａｌｌｏ  ＳＣＴ後のＧＶＨＤおよびＧＶＬ効果の調節に関与していると考えられた（Ｍｉｎｇａｒｉ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３，３２５−３２８（２０００））。
【発明の開示】
本発明は、レシピエント中でＧＶＬを引き起こすが、ＧＶＨＤを引き起こさない抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅する方法を提供し、白血病および腫瘍の治療に役立てることを課題とする。
本発明者らは、ドナーにＧ−ＣＳＦを投与して動員した末梢血（Ｇ−ＰＢＭＣ）由来の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞であるＣＤ９４発現細胞を抗ＣＤ３モノクローナル抗体およびＩＬ−１５と共に培養し増幅させると、培養白血病細胞および患者の白血病細胞に対する細胞障害作用を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、増幅したＣＤ９４発現細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植したＫ５６２白血病細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
（１）  血液由来の単核細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、抑制性ＮＫ細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法、
（２）  末梢血単核細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、（１）の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
（３）  Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血単核細胞（Ｇ−ＰＢＭＣ）、Ｇ−ＣＳＦを投与せずに採取した正常末梢血もしくは移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または臍帯血から採取した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、（１）の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
（４）  ＣＤ８＋細胞にＣＤ１４＋細胞を混合し、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
（５）  細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５に加えて、ＩＬ−２１の存在下で培養する（１）から（３）のいずれかの方法、
（６）  抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１５で刺激培養の際に同時に、または抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１５で刺激培養した後に、ＩＬ−２１を添加する、（５）の方法、
（７）  抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞がＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞である、（１）から（６）のいずれかの抑制性ＮＫ細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法、
（８）  少なくとも抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５が存在する条件下での培養が５日以上行われる（１）から（７）のいずれかの抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
（９）  少なくとも抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５が存在する条件下での培養が１０日以上行われる（８）の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
（１０）  培養前に比べ、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣ中のＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞が１０倍以上増幅される（１）から（９）のいずれかの抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
（１１）  培養前に比べ、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣ中のＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞が２０倍以上増幅される（１０）の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、および
（１２）  （１）から（１１）のいずれかの増幅方法により抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を増幅させたＧ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣより抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞を単離することを含む、抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞は、健常人である移植ドナーにＧ−ＣＳＦを投与して幹細胞を動員した末梢血単核細胞（Ｇ−ＰＢＭＣ）を採取し、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５、場合によってはさらに他のサイトカインと共に培養することにより増幅させることができる。ここで、幹細胞の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）とは末梢血中の造血幹細胞の数を増大させることをいい、「末梢化（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｚａｔｉｏｎ）」ともいう。また、用いる細胞はＧ−ＰＢＭＣに限定されず、ヒト血液から採取した血液由来の単核細胞ならばいずれも用いることができ、Ｇ−ＣＳＦを投与せずに採取した正常末梢血または移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ））等の末梢血単核細胞、あるいは臍帯血から採取した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ：Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を用いることもできる。ここで、正常末梢血とは移植を受けていないヒトから採取した末梢血をいい、移植患者末梢血とは、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞等の移植を受けたヒトから採取した末梢血をいう。
抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞は、表面にＣＤ９４あるいはＮＫＧ２Ａを発現しており、本発明の抑制性ＮＫ細胞受容体陽性細胞の増幅はＣＤ９４あるいはＮＫＧ２Ａ発現細胞が増幅したか否かで確認することができる。
ドナーの末梢血への幹細胞の動員は、ドナーにヒトＧ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）を投与することにより行う。この際、リコンビナントヒトＧ−ＣＳＦを投与すればよい。ヒトＧ−ＣＳＦは市販のものを用いることができる。投与は皮下注射により行えばよく、数日間、毎日ドナーの体重１ｋｇ当たり、約１０μｇのＧ−ＣＳＦを投与する。採取した末梢血は凍結により用時まで保存することができる。
Ｇ−ＣＳＦ投与後４日目あるいは５日目にＣＳ３０００などの血球分離装置を用いてドナーからＧ−ＰＢＭＣを採取する。
このようにして得たＧ−ＣＳＦで動員したドナー末梢血単核細胞（Ｇ−ＰＢＭＣ）または正常末梢血もしくは移植患者末梢血（ＰＢＭＣ）、あるいは臍帯血から採取した単核細胞（ＣＢＭＣ）を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５存在下、場合によってはさらに他のサイトカインの存在下で培養することにより、ＣＤ９４あるいはＮＫＧ２Ａ発現細胞を増幅させることができる。培養は通常の組織培養用フラスコ等を用いて行う。培養の際の培地は、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ等のヒト造血細胞の培養に用いられる培地を用いればよく、必要に応じてヒト血清、アルブミン等の補足物質を添加する。抗ＣＤ３抗体は、公知のマウスモノクローナル抗体作製法により作製したモノクローナル抗体を用いてもよいし、市販の抗体を用いてもよい。例えば、市販のものとしてＵＣＨＴ−１やＯＫＴ３がある。この際、抗ＣＤ３抗体は培養用容器に固相化して用いるのが望ましい。例えばあらかじめ適当な緩衝液で抗ＣＤ３抗体を０．１〜１．０μｇ／ｍＬの濃度に調整し、０．０５Ｌの培養容器に前記調製した抗ＣＤ３抗体５〜１０ｍＬを入れ、好ましくは４℃で１２〜２４時間インキュベートし、固相化する。抗ＣＤ３抗体を固相化した容器内でＩＬ−１５を添加した前記培地を用いてＧ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣを培養する。培養時のＧ−ＰＢＭＣの密度は０．５〜２．０×１０６／ｍＬ、好ましくは１×１０６／ｍＬである。ＩＬ−１５はリコンビナントヒトＩＬ−１５を用いればよく、市販のものを用いればよい。ＩＬ−１５の添加濃度は１〜１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬである。培養は、数日間、好ましくは３〜５日間、あるいは５日間以上、好ましくは１０日間以上３７℃で行う。
上述のように、培養工程において抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の他に他のサイトカインが存在していてもよい。抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５の他に添加し得るサイトカインは限定されず、塩基性繊維芽細胞成長因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、エリスロポエチン、ＣＳＦ−１（コロニー刺激因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、トロンボポエチン、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング増殖因子−α）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子）、エピレグリン、ニューレグリン１，２，３、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、インスリン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、ミッドカイン、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）、ベータグリカン、アクチビン、ＢＭＰ（骨形成因子）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ＩＦＮ−α／β（インターフェロン−α／β）、ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）、フィブロネクチン、ラミニン、カドヘリン、インテグリン、セレクチンなどを用いることができるが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−７が好ましく、このうちＩＬ−２１が特に好ましい。これらのサイトカインは、天然物でもリコンビナントのものでもよく、いずれも市販のものを用いることができる。添加するサイトカインの濃度は、１〜２５ｎｇ／ｍＬが好ましく、１２．５ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。他のサイトカインは、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５と同時に添加してもよいし、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５による刺激培養の後に添加してもよい。抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−１５および他のサイトカインを同時に添加して培養する場合は、数日間、好ましくは３〜５日間、あるいは５日間以上、好ましくは１０日間以上培養すればよい。抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５による刺激培養の後に添加する場合、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５により数日間、好ましくは３〜５日間、あるいは５日間以上、好ましくは１０日間以上刺激培養した後に他のサイトカインを追加添加してもよいし、培地を他のサイトカインを含む培地に交換してもよい。
ＣＤ９４あるいはＮＫＧ２Ａ発現細胞が増幅しているか否かは、蛍光標識抗ＣＤ９４抗体あるいはＮＫＧ２Ａ抗体で免疫蛍光染色を行い、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）またはフローサイトメトリーで解析することにより決定できる。Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣを本発明の抑制性ＮＫ受容体陽性細胞の増幅方法により増幅することにより、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣ中の１５％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上、特に好ましくは３０％以上の細胞がＣＤ９４＋細胞となり、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣ中の５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上の細胞がＮＫＧ２Ａ＋細胞となる。本発明の方法により増幅する前のＧ−ＰＢＭＣに比べ、ＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞は１０倍以上、好ましくは２０倍以上、特に好ましくは１００倍以上に増幅されている。
また、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣからＣＤ８＋細胞をＦＡＣＳまたは抗ＣＤ８抗体を結合させた免疫磁気ビーズを用いて、単離精製し抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５、場合によってはさらに他のサイトカインで刺激してもよい。この際抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１５による刺激のほか、ＣＤ１４＋細胞の存在が必要であり、Ｇ−ＰＢＭＣ等から別途ＣＤ１４＋細胞を単離精製して混合する。
本発明の方法によりドナーＧ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣ細胞から増幅したＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞は、セルソーターまたは抗ＣＤ９４抗体結合免疫磁気ビーズを用いて単離精製することができる。本発明は、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣからＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞を増幅し、該ＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞を単離精製することを含むＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞の製造方法をも包含する。
このようにして増幅したＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞は、表面にＨＬＡクラスＩ分子の発現がないか、発現量が低いか、またはＨＬＡクラスＩ分子が非適合である腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有する一方で、適合したＨＬＡクラスＩの発現量が高い正常細胞に対しては細胞障害活性を有さない。すなわち、ドナー由来のＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋増幅細胞を白血病や腫瘍患者に投与した場合、正常な細胞に対してＧＶＨＤをもたらさず白血病細胞および腫瘍細胞に対してのみ細胞障害活性を示し、例えば白血病患者においてはＧＶＬ（移植片対白血病）効果を、腫瘍患者においてはＧＶＴ（移植片対腫瘍）効果をもたらすので、本発明の方法により増幅したＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞を癌の治療に用いることができる。癌の種類は問わず、ＨＬＡクラスＩ分子の発現が低下した癌細胞ならばどんな癌細胞でも本発明の方法で増幅したＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞による治療の対象となる。
治療には、本発明の方法によりＧ−ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣから増幅したＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞を上記のように単離精製して用いるのが望ましい。単離精製したＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞を患者体重１ｋｇ当たり１０６〜１０８個患者に投与すればよい。投与は、例えば点滴静注により行う。細胞の投与によりＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞が、患者の白血病細胞または腫瘍細胞を障害し、治療効果を発揮することができる。
従って、本発明の方法により増幅したＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞を被検体に投与することを含む癌の治療方法も本発明に包含される。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−２３５６０１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ドナーｐｒｅ−ＧおよびドナーＧ−ＰＢＭＣからのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図２は、ドナーＧ−ＰＢＭＣからのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図３は、ドナーＧ−ＰＢＭＣより精製したＣＤ８＋細胞からのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図４は、ドナーＧ−ＰＢＭＣからのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の増幅倍率を示す図である。
図５は、ドナーＧ−ＰＢＭＣ由来のＣＤ９４発現細胞のＫ５６２細胞および自家ＰＨＡ芽球に対する細胞障害活性を示す図である。
図６は、ドナーＧ−ＰＢＭＣ由来のＣＤ９４発現細胞のＫ５６２細胞、自家ＰＨＡ芽球、ＣＭＬ−ＣＰ患者由来細胞およびＣＭＬ−ＢＣ患者由来細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図７は、Ｋ５６２細胞におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現を示す図である。
図８は、Ｋ５６２細胞におけるＨＬＡ−Ｅの発現を示す写真である。
図９は、ドナーＧ−ＰＢＭＣ由来のＣＤ９４発現細胞の処理Ｋ５６２細胞および非処理Ｋ５６２細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図１０は、ドナーＧ−ＰＢＭＣ由来のＣＤ９４発現細胞の処理Ｋ５６２細胞および非処理Ｋ５６２細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図１１は、Ｋ５６２細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでのＣＤ９４発現細胞投与の効果を示す写真である。
図１２は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでのＫ５６２細胞の増殖のＣＤ９４発現細胞による抑制を示す図である。
図１３は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでのＫ５６２細胞の増殖のＣＤ９４発現細胞による抑制を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例１】実施例１は、以下のようにして行った。
（ドナーおよびＧ−ＣＳＦ動員）
末梢血幹細胞ドナーにｒｈＧ−ＣＳＦ（キリンビール社）を４、５日間毎日一回１０μｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。白血球アフェレシスはｒｈＧ−ＣＳＦ投与の４日目から行い、原則としてＧ−ＰＢＭＣ検体は最初の白血球アフェレシスから得た。すべてのサンプルは同時に試験するために凍結保存した。
（フローサイトメーター分析のための免疫蛍光染色およびモノクローナル抗体の入手）
フィコエリトリン（ＰＥ）結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＨＰ−３Ｄ９（抗ＣＤ９４）はＡｎｃｅｌｌ社（米国）より、ｚ１９９（抗ＮＫＧ２Ａ）はＩｍｍｕｎｏｔｅｃ社（フランス）より、ＬｕｅＭ３（抗ＣＤ１４）はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（米国）より入手した。ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３、抗ＣＤ８ｍＡｂおよび抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  ｍＡｂは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（米国）から入手した。抗ＣＤ３ｍＡｂ  ＵＣＨＴ−１はＩｍｍｕｎｏｔｅｃ社よりＯＫＴ３はＯｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（米国）から入手した。細胞の蛍光強度はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。統計分析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
（ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ９４＋細胞の免疫磁気細胞ソーティング）精製ＣＤ１４＋細胞（フローサイトメーター分析によればＣＤ１４＋の割合が９５％を超える）、ＣＤ１４＋細胞除去分画（ＣＤ１４＋細胞の割合は、３％未満）、ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８＋の割合は９０％を超える）およびＣＤ９４＋細胞（ＣＤ９４＋の割合は９０％を超える）は磁気微粒子を用いた磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）により入手した。方法は、製造元（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）の指示書に従った。
（固相化抗ＣＤ３モノクローナル抗体の刺激によるＣＤ９４発現細胞の誘導）
抗ＣＤ３ｍＡｂでコーティングするために、２４ウェル平底プレートまたは組織培養フラスコを抗ＣＤ３モノクローナル抗体、ＵＣＨＴ１またはＯＫＴ３を添加して前培養した。実施例１の図２および図３に結果を示す実験においては、ＵＣＨＴ１を用い、他の実験においてはＯＫＴ３を用いた。コーティングは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中１μｇ／ｍＬの抗体濃度で４℃で１６時間行った。Ｇ−ＰＢＭＣ（１×１０６／ｍＬ）またはＧ−ＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋細胞（５００×１０３／ｍＬ）をこれらのプレート中で５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国）存在下または非存在下で３７℃で培養した。Ｇ−ＰＢＭＣ培養は２４ウェルプレートで０．４５μｍ微孔膜（ＦＡＬＣＯＮ）を用いるかまたは用いないで行った。Ｇ−ＰＢＭＣ由来の精製ＣＤ１４＋細胞（３００×１０３）は培養物に直接添加するかまたは前記膜を介して添加した。
（Ｇ−ＰＢＭＣからのＣＤ９４発現細胞の増幅）
５人の異なるドナー由来のＧ−ＰＢＭＣを固相化抗ＣＤ３ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を用いた条件で１０日間培養した。この際、培地はＲＰＭＩ１６４０を用い、３７℃で培養を行った。５日間の培養後、新鮮培地およびＩＬ−１５を添加し、細胞密度を１×１０６／ｍｌに調整した。
（１）  Ｇ−ＰＢＭＣ由来のＴ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現の誘導
上記の手法を用いてＧ−ＰＢＭＣ由来のＴ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの誘導を行った。
図１に抗ＣＤ３ｍＡｂとＩＬ−１５での７日間の刺激前および刺激後のＰＢＭＣ（それぞれｐｒｅ−Ｇ若しくはｐｒｅ−ＧＰＢＭＣおよびＧ−ＰＢＭＣと称する）中のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の割合を示した。白抜きのバーはｐｒｅ−Ｇの結果を、黒塗りのバーは、Ｇ−ＰＢＭＣの結果を示す。１、２および３はＣＤ９４＋／３＋の細胞の割合を、４、５および６はＣＤ９４＋／８＋
４＋／８＋の細胞の割合を、７、８および９はＮＫＧ２Ａ＋／ＣＤ３＋細胞の割合を、１０、１１および１２はＮＫＧ２Ａ＋／ＣＤ８＋細胞の割合を示す。図中１、４、７および１０は抗ＣＤ３ｍＡＢおよびＩＬ−１５による刺激前の結果を、３、６、９および１２は、抗ＣＤ３ｍＡＢおよびＩＬ−１５による刺激後の結果を、２、５、８および１１は抗ＣＤ３ｍＡＢのみで刺激した結果を示す。図に示すように、Ｇ−ＣＳＦの投与前および投与後に７名のドナーから得たＰＢＭＣ間でＴ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現に差はなかった。しかしながら、ＩＬ−１５の存在下または不存在下で固相化抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で７日間刺激したＧ−ＰＢＭＣから採取したＴ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡはｐｒｅＧ−ＰＢＭＣよりも高かった。
図２は、Ｇ−ＰＢＭＣ、ＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣ、ＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣに３×１０５の精製ＣＤ１４＋細胞を添加した場合およびＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣに膜を介して３×１０５の精製ＣＤ１４＋細胞を添加した場合の抗ＣＤ３ｍＡｂとＩＬ−１５での７日間の刺激前および刺激後のｐｒｅ−ＧとＧ−ＰＢＭＣ中のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の割合を示す。白抜きのバーが抗ＣＤ３ｍＡｂとＩＬ−１５による刺激前の結果を、黒塗りのバーが抗ＣＤ３ｍＡｂとＩＬ−１５による刺激後の結果を、斜め線のバーがＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣの結果を、チェックのバーがＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣに３×１０５の精製ＣＤ１４＋細胞を添加した場合の結果を、ドットが付されたバーはＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣに膜を介して３×１０５の精製ＣＤ１４＋細胞を添加した場合の結果を示す。グラフ上の９４＋／３＋、９４＋／８＋、ＮＫＧ２Ａ＋／３＋およびＮＫＧ２Ａ＋／８＋の意味は図１と同じである。図に示すように、ＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣに３×１０５の精製ＣＤ１４＋細胞を添加するとＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ発現を誘導した。この精製ＣＤ１４＋細胞の効果はＣＤ１４＋細胞とレスポンダー細胞との接触を膜を用いて阻止すると抑制された。これらの結果はＣＤ１４＋細胞がＴ細胞におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現の誘導に重要な役割を果たしており、この効果はＣＤ１４＋細胞とレスポンダー細胞の少なくとも部分的な接触を要することを示唆する。ＣＤ１４＋細胞はＧ−ＰＢＭＣ中のＴＣＲを介した第１のシグナルの伝達を妨げずに、ＣＤ２８／Ｂ７共刺激を抑制する（Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｌｏｄ  ９１，３４７−３５２（１９９８））。このＴＣＲの関与はＣＤ８＋Ｔ細胞上の抑制性ＮＫＲの誘導に重要な役割を果たすことが報告されている（Ｈｕａｒｄ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３，３２５−３２８（２０００））。
図３は、３×１０５の精製ＣＤ１４＋細胞を添加した場合およびＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣに膜を介して３×１０５の精製ＣＤ１４＋細胞を添加した場合の抗ＣＤ３ｍＡｂとＩＬ−１５での刺激前および刺激後のＧ−ＰＢＭＣ由来の精製ＣＤ８＋細胞中のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の割合をしめす。各バーの意味は図２と同じである。値は、ｐｒｅ−ＧおよびＧ−ＰＢＭＣ中のＣＤ９４またはＮＫＧ２Ａ発現細胞の割合（平均±ＳＤ）を示す。以下の条件間に有意の差が認められた。Ｐｒｅ−ＧおよびＧ−ＰＢＭＣ間の値、刺激前と刺激後の間、Ｇ−ＰＢＭＣとＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣの間、精製ＣＤ１４＋細胞を添加したＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣと精製ＣＤ１４＋細胞を添加しなかったＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣの間、膜を介してＣＤ１４＋細胞を添加したＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣおよび膜を介さないでＣＤ１４＋細胞を添加したＣＤ１４除去Ｇ−ＰＢＭＣの間、ならびにＧ−ＰＢＭＣから精製したＣＤ８＋細胞であって刺激前と刺激後の間、精製ＣＤ１４＋細胞を添加した精製ＣＤ８細胞と添加しないＣＤ８＋細胞の間、膜を介してＣＤ１４＋細胞を添加した精製ＣＤ８＋細胞と膜を介さないでＣＤ１４＋細胞を添加した精製ＣＤ８＋細胞の間。図１〜３に示すａはＰ＜０．０１、ｂはＰ＜０．０５、ｃはＰ＜０．１なる有意差を示している。図に示すように、固相化抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＩＬ−１５で刺激するとＧ−ＰＢＭＣ由来の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現の増大が認められた。３×１０５の精製ＣＤ１４細胞を精製ＣＤ８＋Ｔ細胞に添加するとこれらの精製ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現を誘導した。さらに、この精製ＣＤ１４＋細胞効果は膜により阻止される傾向を示した。ＩＬ−１５はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ誘導性サイトカインの一つとして知られている。従って、本実施例の結果はＩＬ−１５が固相化抗ＣＤ３ｍＡｂによるＴ細胞活性化の間Ｇ−ＰＢＭＣ由来の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞上の抑制性ＮＫＲの誘導に重要な役割を果たしていることを示している。
（２）Ｇ−ＰＢＭＣからのＣＤ９４発現細胞の増幅
図４は、５人の異なるドナー由来のＧ−ＰＢＭＣを用いた刺激前と比較した刺激５日後および１０日後のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の増幅倍率を示す。図に示すように、１０日間の培養後５人のドナーから得たＧ−ＰＢＭＣからＣＤ９４＋／８＋細胞およびＮＫＧ２Ａ＋／ＣＤ８＋細胞は刺激前と比較してそれぞれ２２．１〜４１０．０倍、１２１．７〜２３４８．２倍に増えた。
（Ｇ−ＰＢＭＣからのＣＤ９４発現細胞の増幅２  ＩＬ−１５およびＩＬ−２１による刺激）
上記の方法でＧ−ＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１５で刺激培養の際に同時に、または抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１５で４〜５日間刺激培養した後、ＩＬ−２１（ＳＩＧＭＡ）を１２．５ｎｇ／ｍｌ加えて培養することによりさらに効率良く抑制性ＮＫレセプターＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性細胞を増幅することができた。
ＣＤ９４発現は４０％以上、ＮＫＧ２Ａ発現は３０％以上となり、ＣＤ８陽性細胞におけるその増幅率はＣＤ９４で４００から１，４００倍、さらにＮＫＧ２Ａで５００から２，６００倍に達した（表１）。
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〔実施例２〕  Ｋ５６２白血病細胞および患者からの白血病細胞に対するドナーＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性
実施例２において細胞障害活性の評価およびＲＴ−ＰＣＲは以下のようにして行った。（４時間の５１Ｃｒリリースアッセイを用いた細胞障害活性の評価）
７〜１０日間の固相化抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＩＬ−１５による刺激後、ＣＤ９４発現細胞を磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）により精製した。８０％を超えるＣＤ９４発現細胞が、ＣＤ８を共発現していた。５１Ｃｒ標識ヒト白血病細胞株Ｋ５６２、ａｌｌｏ  ＳＣＴ前の患者白血病細胞および自家ＰＨＡ芽球（５×１０３）に対するＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性を試験した。Ｋ５６２細胞をＩＦＮ−γ（０．２μｇ／ｍＬ）と共に２日間培養した。ＨＬＡ−Ｃｗ３シグナルペプチド（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ；配列番号１）およびＢ１５ペプチド（ＶＴＡＰＲＴＶＬＬ；配列番号２）はＫＵＲＡＢＯ社（日本）が合成したものを用いた（純度９５％）。
（ＰＣＲ反応）
第１鎖ｃＤＮＡ合成は６０ｎｇＲＮＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＮＴＰ、２．５μＭランダム９マーおよび０．２５Ｕ／μＬ  ＡＭＶ逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ、日本）を用いて行った。次いで、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅をＨＬＡ−Ｅのエキソン４用のセンスプライマー５’−ＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＴＡＣＣＣＧ−３’（配列番号３）およびアンチセンスプライマー５’−ＧＴＧＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＴＣＡＴＧ−３’（配列番号４）を用いて行い、βアクチン用のセンスプライマー５’−ＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴ−３’（配列番号５）およびアンチセンスプライマー５’−ＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴ−３’（配列番号６）を内部標準として用いた。
ドナーＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性
図５は、ＣＤ９４発現細胞のＫ５６２細胞および自家ＰＨＡ芽球に対する細胞障害活性を示す。白抜きのバーは、Ｋ５６２細胞の結果を、黒塗りのバーはＰＨＡ芽球の結果を示す。図に示すように、標準的な４時間の５１Ｃｒリリースにより検出したＫ５６２に対するＧ−ＰＢＭＣ由来の精製ＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性は自家のＰＨＡ芽球に対するよりも常に高かった。
次いで、慢性相における同種ＳＣＴ前の骨髄細胞である患者由来の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞およびＣＭＬの急性転化（ＣＭＬ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｂｌａｓｔｉｃ  ｃｒｉｓｉｓ、ＣＭＬ−ＢＣ）の患者の白血病芽球に対するドナー由来のＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性を調べた。図６は、ドナーＧ−ＰＢＭＣから増幅したＣＤ９４発現細胞のＫ５６２細胞、患者白血病細胞および自家ＰＨＡ芽球に対する細胞障害活性を示す。白抜きのバーはＫ５６２細胞の結果を、斜め線のバーは患者の白血病細胞の結果を、チェックのバーは自家ＰＨＡ芽球の結果を示す。エフェクター／ターゲット比は５：１および１０：１であり、それぞれ２本一組のバーのうち、左が５：１で右が１０：１の結果を示す。図に示すように、ドナー由来のＣＤ９４発現細胞は患者の白血病細胞を攻撃したが、自家ＰＨＡ芽球は攻撃しなかった。Ｋ５６２細胞、ＣＭＬ−ＣＰおよびＣＭＬ−ＢＣの患者の白血病細胞、ＰＨＡ芽球１、ＰＨＡ芽球２ならびに健常人のＰＢＭＣを用いてＦＡＣＳで検出したＨＬＡクラスＩ分子の平均の蛍光はそれぞれ、２１．６、１０１．８、１０８．５、３９４．４、３４７．８および１７１．１であった。従って、ＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性は標的細胞上のＨＬＡクラスＩ分子の発現に逆比例していることがわかった。
次に、ＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性の特徴を調べた。図７にＫ５６２細胞をＩＦＮ−γ（０．２μｇ／ｍｌ）と共に、またはＩＦＮ−γなしに２日間培養した後に抗ＨＬＡクラスＩ  ｍＡｂおよびアイソタイプ対照マウスＩｇ  Ｇ１−ＦＩＴＣで染色した結果を示す。上図がＩＦＮ−γなしで、下図がＩＦＮ−γを添加して培養した結果である。ＨＬＡクラスＩ発現はＩＦＮ−γによりＫ５６２細胞上で誘導される。ＩＦＮ−γ処理Ｋ５６２上のＨＬＡクラスＩ分子の平均の蛍光は１０９．０であった。
図８は、Ｋ５６２細胞中のβ−アクチンおよびＨＬＡ−Ｅ  ｍＲＮＡをＩＦＮ−γと培養する前、培養１日後、および２日後にＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す。レーン１、２および３がβアクチンの結果を、レーン４、５および６がＨＬＡ−Ｅの結果を示し、レーン１および４がＩＦＮ−γとの培養前、レーン２および５がＩＦＮ−γとの培養１日後、レーン３および６がＩＦＮ−γとの培養２日後の結果を示す。このＲＴ−ＰＣＲ実験により、ＩＦＮ−γによりＫ５６２細胞におけるＨＬＡ−Ｅ  ｍＲＮＡが誘導されることが示された（Ｕｌｂｒｅｃｈｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，２９４５−２９５３（１９９２））。
図９は、未処理Ｋ５６２、ＩＦＮ−γ処理Ｋ５６２細胞、ＩＦＮ−γおよびＨＬＡ−Ｃｗ３ペプチド（０．３ｍＭ）処理Ｋ５６２細胞ならびに自家ＰＨＡ芽球に対するＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性を示す。それぞれ、◆、■、▲および●で表す。ＣＤ９４発現細胞のＩＦＮ−γ処理Ｋ５６２細胞に対する細胞障害活性は、未処理Ｋ５６２に対するものに比較して弱かった。さらに、ＨＬＡ−Ｃのシグナル配列でありＨＬＡ−ＥとともにＣＤ９４のリガンドとして複合体を作るＨＬＡ−Ｃｗ３ペプチド（０．３ｍＭ）は、ＣＤ９４発現細胞のこれらのＨＬＡクラスＩ発現Ｋ５６２細胞に対する細胞障害活性を抑制する（Ｂｏｒｒｅｇｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，８１３−８１８（１９９８））。しかし、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用しないと報告されているＢ１５ペプチドは、そのような抑制性効果を奏しなかった（Ｂ１５ペプチドに関する結果は図に示していない）。
図１０は、ＩＦＮ−γ処理Ｋ５６２細胞、ＨＬＡ−Ｃｗ３ペプチド（０．３ｍＭ）およびＩＦＮ−γ処理Ｋ５６２細胞ならびにＨＬＡ−Ｃｗ３ペプチド、抗ＮＫＧ２Ａ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）およびＩＦＮ−γ処理Ｋ５６２細胞に対するＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性を示す。それぞれ、◆、■および▲で示す。図に示すように、抗ＮＫＧ２Ａ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）はＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性に対するＨＬＡクラスＩ防護効果を解除した。従って、これらのＣＤ９４発現細胞はＨＬＡクラスＩ分子を有さないＫ５６２を攻撃し得、しかしこの障害活性はＫ５６２細胞におけるＨＬＡクラスＩ分子の発現およびＨＬＡクラスＩシグナルペプチドにより阻止された。
〔実施例３〕  ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＣＤ９４発現細胞によるＫ５６２白血病細胞増幅の抑制
５〜８週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはＣＬＥＡ社（日本）から入手した。飼育維持は無菌条件下でマイクロアイソレーターを用いて行った。Ｋ５６２細胞をＧ−ＰＢＭＣから増幅させた精製ＣＤ９４発現細胞とともにまたは単独で０．５ｍＬ  ＰＢＳに懸濁させ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇に皮下注射した。ＣＭＬ急性転化白血球細胞もＮＯＤ／ＳＣＩＤに移植しようと試みたが、Ｋ５６２細胞のようには腫瘍を形成しなかった。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＫ５６２細胞をＧ−ＰＢＭＣ由来の精製ＣＤ９４発現細胞と共に同時に皮下注射した。図１１は、注射後８週間でのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中でのＫ５６２細胞の増殖を示す。図１２及び図１３は、マウスにＫ５６２細胞を単独でまたはＣＤ９４発現細胞と皮下注射した場合の腫瘍の大きさを示す。図１２において、◆および▲は５×１０７のＫ５６２細胞のみを注射した場合、■は１×１０７のＣＤ９４発現細胞と共に注射した場合、●は、２．５×１０７のＣＤ９４発現細胞と共に注射した場合を示す。図１３において、◆および●は、２．５×１０７のＫ５６２細胞のみを注射した場合、■および△は、１×１０７ＣＤ９４発現細胞と共に注射した場合を示す。ＣＤ９４発現細胞はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＫ５６２細胞の増幅を細胞数依存的に、ＣＤ９４発現細胞：Ｋ５６２細胞比が１×１０７：２×１０７および２．５×１０７：５×１０７のとき完全に、同比が１×１０７：５×１０７のとき部分的に阻害した。
さらに、実施例１から３の結果から以下の事項がわかった。
本発明において、Ｇ−ＣＳＦで動員されたＰＢＭＣ（Ｇ−ＰＢＭＣ）中のＩＬ−１５と固相化抗ＣＤ３モノクローナル抗体で刺激したＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの増大した発現が示された。また、ＣＤ１４＋細胞が精製ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現の誘導に重要な役割を果たしていることが示された。従って、Ｇ−ＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は刺激後にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現できた。さらに、ドナーＧ−ＰＢＭＣからＣＤ９４発現細胞を約１００倍増幅させることができた。これらの増幅したドナーＣＤ９４発現細胞はＨＬＡクラスＩ分子を欠失しているＫ５６２白血病細胞とＨＬＡクラスＩ分子が健常人由来ＰＢＭＣおよび自家ＰＨＡ芽球に比較して減少している患者白血病細胞を攻撃するが、ＨＬＡクラスＩ分子の発現が非常に増大している自家ＰＨＡ芽球は攻撃しない。ｉｎ  ｖｉｖｏ分析でこれらのＣＤ９４発現細胞はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてＫ５６２細胞の増幅を阻止し得ることが示された。従って、ＣＤ９４抑制性ＮＫＲ発現細胞は移植片対白血病効果を活性化する。
部分的にＨＬＡが適合したＢＭＴ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、骨髄移植）はＣＤ１５８ｂ抑制性ＮＫＲを発現するドナー由来のＣＴＬを大きく増幅させ、ＧＶＨＤを抑制するがそれとは区別できるＧＶＬ反応は抑制しない（Ａｌｂｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８７，３９９３−４０００（１９９６））。抑制性ＮＫＲ陽性細胞はクラスＩ陰性標的細胞を攻撃するが同一のクラスＩ陽性細胞は攻撃しない（Ｍｉｎｇａｒｉ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１１７２−１１７７（１９９８））。また、ＧＶＬエフェクターは  ＮＫＲの非適合の原則に基づいてＨＬＡ非適合造血細胞移植において重要である（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９４，３３３−３３９（１９９９））。ＣＤ１５８ｂ抑制性ＮＫＲのトランスジェニック発現は、Ｈ−２非適合骨髄移植のｉｎ  ｖｉｖｏでの拒絶を抑制する（Ｃａｍｂｉａｇｇｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，８０８８−８０９２（１９９７））。混合リンパ球反応および抗ＣＤ３ｍＡｂにより活性化された細胞障害活性はＣＤ１５８ｂトランスジェニックマウスにおけるトランスジェニックＣＤ１５８ｂ分子の働きにより抑制され得る（Ｃａｍｂｉａｇｇｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９４，２３９６−２４０２（１９９９））。最近、Ｒｕｇｇｅｒｉらは、特にレシピエントのＡＰＣ（抗原提示細胞）に対するドナー対宿主ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞同種反応性が特に急性ＧＶＨＤを抑制することを示した（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，２０９７−２１００（２００２））。
予後の良好な慢性ＧＶＨＤ患者におけるＴ細胞上でのＣＤ１５８およびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの増大した発現について報告され、これらの抑制性のＮＫＲ発現細胞がＭＬＣの同種反応に対する抑制性効果を有することが示された（Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０８，７７８−７８３（２０００）、Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２６，２８７−２９０（２０００）、Ｔａｎａｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１７，７５１−７５４，（２００２））。従って、ａｌｌｏ  ＳＣＴ後の同種刺激の間のこれらの抑制性ＮＫＲ発現はＧＶＨＤおよびＧＶＬの調節に重要な役割を果たす。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現がＧ−ＰＢＭＣ由来のＣＤ１４＋細胞により誘導されるという本発明者らの知見はａｌｌｏ  ＰＢＳＣＴ後の急性ＧＶＨＤの予想外の低い発生および増大し得るＧＶＬ効果を説明し得る。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａリガンド、ＨＬＡ−ＥはほとんどのＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＧのシグナル配列由来のペプチドに特異的に結合しこれらのペプチドによりアップレギュレートされる（Ｂｒａｕｄ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，７９５−７９９（１９９８））。ＩＦＮ−γにより誘導されたＨＬＡクラスＩ分子発現Ｋ５６２細胞を用いてＣＤ９４発現細胞の細胞障害特性を調べた。ＨＬＡ−ＣシグナルペプチドはＣＤ９４発現細胞のＩＦＮ−γに誘導されＨＬＡクラスＩ分子を発現しているＫ５６２細胞に対する細胞障害活性を抑制することがわかった。また、抗ＮＫＧ２Ａ  ｍＡｂはＨＬＡクラスＩ分子に防護されたＫ５６２細胞に対するＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性を復活させる。しかし、これらのＣＤ９４発現細胞によるＨＬＡクラスＩ分子依存性細胞障害活性はａｌｌ  ｏｒ  ｎｏｔｈｉｎｇ様式では評価できなかった。これは、これらのＧ−ＰＢＭＣから増幅したＣＤ９４発現細胞がクローン化Ｔ細胞と同一ではなく、２６ＴＣＲ−Ｖβプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析が示すように、様々なＴＣＲ−Ｖベータファミリーを有することによる。抗ＮＫＧ２Ａ  ｍＡｂを用いても自家ＰＨＡ芽球に対するＣＤ９４発現細胞の細胞障害活性の復活はできなかった。これはＨＬＡクラスＩ分子の非常に増大した発現およびＣＤ９４発現細胞の細胞障害作用を刺激する他の異なる抗原の減少による。一方、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは種々の血液細胞および組織細胞で広いＨＬＡクラスＩ分子をモニターし得る。従って、ＣＤ９４発現細胞は種々のＨＬＡクラスＩタイプを有する多くの患者においてＧＶＨＤおよびＧＶＬを調節するのに役立つ。抑制性ＮＫＲ発現細胞の細胞障害特性はＧＶＨＤとＧＶＬ間の微妙なバランスを如何にして調節するかという問いかけを説く鍵になる。これらのドナーＧ−ＰＢＭＣからの増幅したＣＤ９４発現細胞はＧＶＨＤを促進せずに単純なドナーリンパ球注入の代わりにＧＶＬ効果を誘導するための同種細胞治療に役立つ。ドナーＧ−ＰＢＭＣは同種細胞治療のためのＣＤ９４＋あるいはＮＫＧ２Ａ＋細胞などの抑制性ＮＫＲ発現細胞の増幅のための供給源となると考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
実施例１に示すように、本発明の方法によりドナー由来のＧ−ＰＭＢＣ中で抑制性ＮＫ細胞受容体腸性細胞であるＣＤ９４発現細胞を著しく増幅することができる。ＣＤ９４発現細胞は、実施例２に示すようにＨＬＡクラスＩ分子が発現していないかまたは発現量が低い細胞に対して細胞障害活性を有し、実施例３に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの白血病および腫瘍治療に用いることができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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