(57)【要約】蛋白質を可視化する技術を用い、アフリカツメガエル腎臓上皮培養細胞Ａ６において、ＧＦＰ融合全長及び変異型ＡＰＣを安定に発現する細胞株を得た。この細胞を用い、Ｃ末端領域を欠損した変異型ＡＰＣは細胞の重層化を誘導することを見出した。さらに、変異型ＡＰＣの発現細胞株によって重層化した細胞は、細胞間接着構造を保持しており、個体（マウス）におけるポリープ形成と類似した現象であることを確認した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の重層化を誘導し得る機能を有することを特徴とする変異型ＡＰＣタンパク質。
【請求項２】
ＡＰＣタンパク質の少なくとも以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸領域が欠損した、請求項１に記載の変異型ＡＰＣタンパク質。
（ａ）配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、２８２７位のアミノ酸以降のＣ末端側アミノ酸領域
（ｂ）配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、２１５９位のアミノ酸以降のＣ末端側アミノ酸領域
（ｃ）配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、８６０位のアミノ酸以降のＣ末端側アミノ酸領域
【請求項３】
アフリカツメガエル由来である、請求項１または２に記載の変異型ＡＰＣタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の変異型ＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したアミノ酸配列からなる、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の変異型ＡＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
人為的に発現させた請求項１〜４のいずれかに記載の変異型ＡＰＣタンパク質または請求項６に記載のベクターを有する細胞。
【請求項８】
哺乳動物由来である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
アフリカツメガエル由来である、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
樹立された細胞株である、請求項７〜９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、細胞の重層化阻害剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項７〜９のいずれかに記載の細胞と被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）上記細胞の重層化を検出する工程、
（ｃ）重層化を阻害する化合物を選択する工程
【請求項１２】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣ蛋白質をコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法。
（ａ）アフリカツメガエル由来の細胞に、被検ポリヌクレオチドを導入して変異型ＡＰＣ蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）上記細胞を培養する工程、
（ｃ）上記細胞の重層化を検出する工程、
（ｄ）上記細胞を重層化させるポリヌクレオチドを選択する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣタンパク質、および該タンパク質を発現する細胞に関する。
【背景技術】  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）遺伝子は、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）の原因遺伝子として同定された癌抑制遺伝子であるが、ＡＰＣ遺伝子の変異はＦＡＰに限らず非遺伝性の大腸腺腫や大腸癌の発生に関与していることが明らかにされている（Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．（１９９７）１３３２，Ｆ１２７−１４７）。ＦＡＰ患者では大腸に多数の良性ポリープを形成し、その中から悪性化した癌細胞が出現する。大腸癌は、多数の癌遺伝子や癌抑制遺伝子に多段階的に変異が起きて発症するが、ＡＰＣ遺伝子の変異は最も早期に発見されており、ＡＰＣ遺伝子の異常が大腸癌発症の原因と考えられている。
ＡＰＣタンパク質（以下、ＡＰＣ）は、２８４３アミノ酸からなる分子量約３１０ｋＤａの大きなタンパク質で、多数のタンパク質と結合する。これまでに、脱リン酸化酵素ＰＰ２Ａ  Ｂ５６サブユニット、ＡＰＣ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ（Ａｓｅｆ）、キネシンファミリーに属する微小管関連モータータンパク質ＫＡＰ３／ＫＩＦ３Ａ／ＫＩＦ３Ｂ複合体、Ｗｎｔシグナル伝達系構成因子であるβ−ｃａｔｎｅｉｎ／ＧＳＫ−３β／Ａｘｉｎ、細胞骨格成分である微小管、微小管結合タンパク質ＥＢ／ＲＰファミリー・タンパク質、細胞周期調節因子ｐ３４ｃｄｃ２リン酸化酵素、アポトーシス関連タンパク質Ｓｉａｈ−１、癌抑制遺伝子産物ｈＤＬＧと直接結合することが報告されている（ｆｏｒ  ｒｅｖｉｅｗ  ｓｅｅ  Ｂｉｅｎｚ，Ｍ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２）３（５），３２８−３３８．）。ＦＡＰ患者のポリープ及び大腸癌細胞では、ＡＰＣの対立遺伝子の両方に変異が生じており、途中で切断されてＣ末端領域を欠失した変異型ＡＰＣのみが発現されている。この変異型ＡＰＣが異常な機能を有することにより、細胞が癌化すると考えられている。
ＡＰＣはβ−ｃａｔｎｅｉｎ／ＧＳＫ−３β／Ａｘｉｎと複合体を形成してβ−ｃａｔｅｎｉｎの分解を促進し、その存在量を低く維持する機能があることが報告されている（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ，Ｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６２：１７３１−１７３４，Ｓｕ，Ｌ．Ｋ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６２：１７３４−１７３７）。β−ｃａｔｅｎｉｎが多量に存在すると、核に移行して転写因子と結合し細胞増殖を促進するため、当初、ＡＰＣはβ−ｃａｔｅｎｉｎの存在量を制御することで癌抑制タンパク質として機能していると考えられた。しかしながら、ＦＡＰモデルマウスを用いたポリープ形成過程の詳細な観察から、ｃｒｙｐｔで分化した上皮細胞がｖｉｌｌｕｓ先端方向に正常に移動できず、ｃｒｙｐｔ−ｖｉｌｌｕｓの境界域においてｖｉｌｌｕｓの内側に落ち込み本来とは異なる形態となることによってポリープを形成することが明らかにされた（Ｏｓｈｉｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９７）５７（９），１６４４−１６４９．）。さらに、ポリープ内では細胞増殖の促進は起こっておらず、上皮細胞としての細胞間接着構造を維持しつつ本来とは異なる形態をとることがポリープ形成の原因であることが明らかにされ、ＡＰＣが細胞形態や運動の制御に関与していると考えられるようになってきた。さらに、ＡＰＣが、アクチン細胞骨格の制御機能を持つＡｓｅｆ（Ｋａｗａｋｉ，Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８９（５４８２），１１９４−１１９７．）や、運動する細胞の先導端で微小管と結合することが見出され（Ｍｉｍｏｒｉ−Ｋｉｙｏｓｕｅ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０００）１４８（３），５０５−５１８．）、ＡＰＣが細胞骨格の制御に関わっている可能性が考えられ始めている。
正常及び変異型ＡＰＣの細胞形態や運動に関わる機能を明らかにし、ポリープ形成及び癌化の原因の解明が待望されていた。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、正常および変異型ＡＰＣの細胞形態や運動に関わる機能を明らかにすることにある。さらに本発明は、得られた知見を基に変異型ＡＰＣタンパク質の用途を提供することにある。
本発明者らは、ＡＰＣの機能を詳細に明らかにするために、自家蛍光タンパク質（ＧＦＰ；ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を標識した全長及び切断型ＡＰＣを上皮細胞に発現させた。融合タンパク質ｃＤＮＡを細胞に導入し、薬剤耐性を利用して融合タンパク質を安定的に発現する独立な（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）クローンを数株ずつ単離したところ、異なる構造の切断型ＡＰＣ発現細胞を発現するそれぞれのクローンにおいて共通して、細胞層の隆起が観察された。電子顕微鏡観察において、細胞間接着構造（ＡＪ、ＴＪ）は形成しているが、細胞間隙及び細胞−基質間隙が増加して細胞接着が弱化し、細胞が重層化していることが認められた。全長ＡＰＣを発現する細胞株では、細胞の重層化は起こらず、細胞接着はより強化された。免疫組織染色によって、重層化した細胞群は細胞間接着構造を保持していることが確認された。以上の結果より、変異型ＡＰＣは細胞の重層化を引き起こすことを見出し、本発明を完成するに至った。変異型ＡＰＣを発現する細胞は、細胞間接着構造を保持しているが細胞の重層化を引き起こすという現象は、本発明者らによって始めて見出された知見である。
本発明の変異型ＡＰＣは、正常上皮細胞の単層性を阻害し、細胞間接着を維持させながら細胞を重層させることから、本発明の変異型ＡＰＣを発現する細胞は、ポリープ形成現象のモデル細胞として有用である。さらに、本発明の変異型ＡＰＣを発現する細胞は、細胞の重層化を阻害する化合物のスクリーニングに利用することが可能である。
即ち本発明は、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣタンパク質、および該タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞の用途に関し、より具体的には、
〔１〕  細胞の重層化を誘導し得る機能を有することを特徴とする変異型ＡＰＣタンパク質、
〔２〕  ＡＰＣタンパク質の少なくとも以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸領域が欠損した、〔１〕に記載の変異型ＡＰＣタンパク質、
（ａ）配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、２８２７位のアミノ酸以降のＣ末端側アミノ酸領域
（ｂ）配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、２１５９位のアミノ酸以降のＣ末端側アミノ酸領域
（ｃ）配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、８６０位のアミノ酸以降のＣ末端側アミノ酸領域
〔３〕  アフリカツメガエル由来である、〔１〕または〔２〕に記載の変異型ＡＰＣタンパク質、
〔４〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の変異型ＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したアミノ酸配列からなる、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣタンパク質、
〔５〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の変異型ＡＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
〔６〕  〔５〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
〔７〕  人為的に発現させた〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の変異型ＡＰＣタンパク質または〔６〕に記載のベクターを有する細胞、
〔８〕  哺乳動物由来である、〔７〕に記載の細胞、
〔９〕  アフリカツメガエル由来である、〔７〕に記載の細胞、
〔１０〕  樹立された細胞株である、〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の細胞、
〔１１〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、細胞の重層化阻害剤の候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の細胞と被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）上記細胞の重層化を検出する工程、
（ｃ）重層化を阻害する化合物を選択する工程、
〔１２〕  以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣ蛋白質をコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法、
（ａ）アフリカツメガエル由来の細胞に、被検ポリヌクレオチドを導入して変異型ＡＰＣ蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）上記細胞を培養する工程、
（ｃ）上記細胞の重層化を検出する工程、
（ｄ）上記細胞を重層化させるポリヌクレオチドを選択する工程
を、提供するものである。
本発明は、変異型ＡＰＣタンパク質（本明細書においては「変異型ＡＰＣ」と略記する場合あり）を提供する。細胞において本発明の変異型ＡＰＣが発現することにより、細胞の重層化が誘導される。本発明の変異型ＡＰＣは、本発明者らによって細胞間接着を維持しながら細胞の重層化を誘因するタンパク質として特定されたものである。
本発明において「変異型」とは、正常ＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列において、単一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたタンパク質を指す。また、上記「変異」は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する保存的変異であってもよく、あるいは非保存的置換を伴う変異であってもよい。つまり、本発明の変異型ＡＰＣは、細胞の重層化を誘導し得る機能を有するものであれば、その変異の種類は特に制限されない。本発明における変異型ＡＰＣは、通常、人為的に作製（もしくは正常ＡＰＣを基に改変）、あるいは単離・精製されたものである。
また、ＡＰＣタンパク質は、これまでのところ種々の生物において見出されている。これらの正常ＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列は、公共のデータベースから容易に入手することができる。例えば、ヒトのＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号はＭ７４０８８であり、アフリカツメガエルのＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列はのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号はＵ６４４４２である。アフリカツメガエルのＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に記載する。
本発明の変異型ＡＰＣは、特定の種のＡＰＣの変異体に限定されない。本発明の変異型ＡＰＣの一例としては、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるアフリカツメガエルのＡＰＣタンパク質の変異体を挙げることができる。
本発明の好ましい態様においては、変異型ＡＰＣは、正常ＡＰＣの一部のアミノ酸領域が欠失されたタンパク質（切断型ＡＰＣタンパク質）である。
本発明の変異型ＡＰＣは、通常、Ｃ末端の３つのアミノ酸ＴＳＶ配列（ＤＬＧ結合領域）を欠失したものである。このＴＳＶ配列は、ＰＤＺタンパク質結合モチーフとされており、この領域でＰＤＺタンパク質の一つｈＤＬＧタンパク質と結合することが報告されている（Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）；２７２（５２６４）：１０２０−３）。また、本発明の変異型ＡＰＣは、少なくとも「ヘプタッド・リピート」及び「アルマジロ・リピート」を含むＮ末端アミノ酸領域を有することが好ましいが、本発明の変異型ＡＰＣは、これらのリピートを含むものに限定されない。
具体的には本発明の変異型ＡＰＣとして、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸領域が少なくとも欠損した構造を有するタンパク質を挙げることができる。
（ａ）Ｃ末端のＴＳＶ配列（ＤＬＧ結合領域）、より具体的には、配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、２８２７位のアミノ酸以降のＣ末側アミノ酸領域
（ｂ）Ｃ末端側の塩基性領域（ｂａｓｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）およびＴＳＶ配列、より具体的には、配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、２１５９位のアミノ酸以降のＣ末側アミノ酸領域
（ｃ）１５アミノ酸リピート（１５ａ．ａ．ｒｅｐｅａｔｓ）、２０アミノ酸リピート（２０ａ．ａ．ｒｅｐｅａｔｓ）、Ｃ末端側の塩基性領域（ｂａｓｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）およびＴＳＶ配列、より具体的には、配列番号：１に記載のＡＰＣタンパク質において、８６０位のアミノ酸以降のＣ末側アミノ酸領域
また、上記のタンパク質において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものであって、細胞の重層化を誘導し得る機能を有するタンパク質もまた、本発明に含まれる。このタンパク質を調製するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４）を利用して、上記変異型ＡＰＣをコードするＤＮＡ配列またはその一部をもとに同種または異種生物由来のＤＮＡ試料から、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから本発明のタンパク質を得ることは、通常行いうることである。このように単離されたタンパク質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、細胞の重層化を誘導し得る機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。
変異型ＡＰＣにおいて１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、通常、本発明の変異型ＡＰＣとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９５％以上、さらに好ましくは少なくとも９７％以上（例えば、９８〜９９％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明において、「細胞の重層化」とは、例えば、以下のような細胞の状態（形態）であるものと、記述することができるが、通常、正確に定義することは困難であるため、下記の状態に特に制限されるものではない。
（ａ）異なる細胞の核が高さ方向に複数重なって観察される。
（ｂ）細胞体が、細胞層から遊離せず、単層状態の細胞（例えば、Ａ６細胞）の平均的な高さ（２−４μｍ）よりも明らかに高い位置に存在する。
（ｃ）電子顕微鏡レベルでは明らかに細胞体や細胞核が高さ方向に複数存在して見られる領域は、光学顕微鏡レベル（位相差顕微鏡法）では細胞単層に”しわ”が寄りうねったように観察される。
本発明において、細胞の重層化を誘導し得るタンパク質であるか否かは、当業者においては公知の方法により判定することができる。例えば、対象となるタンパク質を発現する細胞について、位相差顕微鏡または蛍光抗体法によって、細胞が重層化されているか否かを容易に確認することができる。
本発明の変異型ＡＰＣは、例えば、正常ＡＰＣタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を基に、当業者においては、一般的に周知の方法（ＰＣＲ法等）を利用して作製することができる。例えば、上記の変異型ＡＰＣタンパク質の作製は、通常、該タンパク質をコードするＤＮＡを正常ＡＰＣのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により増幅し、該ＤＮＡを発現ベクターへクローニングすることよって実施することができる。正常ＡＰＣのｃＤＮＡは、当業者においては公知の方法、例えば、正常ＡＰＣを発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＡＰＣ  ｃＤＮＡの一部をプローブとするハイブリダイゼーションを行うことにより取得することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。
上記変異型ＡＰＣは、より具体的には、後述の実施例で示す方法により作製することができる。当業者においては、後述の実施例に示す方法を適宜改変して、正常ＡＰＣの任意のアミノ酸領域を有する変異型ＡＰＣを作製することが可能である。
また、本発明の変異型ＡＰＣは、正常ＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列）を改変することによって作製することができる。例えば、アミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５））等の周知の方法により正常ＡＰＣタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を改変し、塩基配列が改変されたＤＮＡを適当な細胞において発現させることにより行うことができる。タンパク質中のアミノ酸の変異は、自然界（天然）において生じることもあり、本発明のタンパク質には、細胞間接着を維持しながら細胞の重層化を誘導し得る機能を有する限り、単離された天然のＡＰＣタンパク質変異体も含まれるが、通常、本発明の変異型ＡＰＣは人為的に作出されたものである。
本発明の変異型ＡＰＣは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドは例えば、本発明の変異型ＡＰＣをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の変異体に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより調製（精製）することが可能である。
また、本発明の変異型ＡＰＣをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的の変異体以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
また、本発明の変異型ＡＰＣをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。該ポリヌクレオチドには、本発明の変異型ＡＰＣをコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡの転写産物であるＲＮＡが含まれる。
さらに本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、細胞において本発明の変異型ＡＰＣを発現させるため、あるいは、本発明の変異型ＡＰＣを生産させるために有用である。
上記ベクターは、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、適当な薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより選択できるような薬剤耐性遺伝子）を有するものであれば特に制限されない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とする場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等が挙げられる。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を有する以外に、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーター等を有することが望ましい。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）等が挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明の変異型ＡＰＣを発現させるためのベクターとして、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を有することが望ましく、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により選択できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。
また、動物の生体内で本発明の変異型ＡＰＣを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された細胞を提供する。本発明の好ましい態様においては、該細胞は、人為的に本発明の変異型ＡＰＣを発現させた細胞（例えば、変異型ＡＰＣを人為的に導入し発現させた細胞）である。本発明のベクターが導入される細胞は特に制限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞等を用いることが可能である。本発明の好ましい態様においては、該細胞は本発明の変異型ＡＰＣの発現により、細胞間接着を維持しながら細胞の重層化が見られることを特徴とする上皮細胞である。本発明の細胞は、より好ましくは、本発明の変異型ＡＰＣを安定的に発現する樹立された細胞株である。また本発明の細胞は、好ましくは動物由来の細胞であり、より好ましくはアフリカツメガエル由来の細胞（例えば、Ａ６細胞）である。
本発明の変異型ＡＰＣを発現する細胞は、実際のＡＰＣ変異によるポリープ形成細胞と類似していると考えられる。家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）患者の場合、初期段階において正常な細胞間接着を形成し、浸潤性を持たず、まだ悪性化していない良性のポリープを形成する。通常、このようなポリープが数百〜数千形成され、これを切除せずに放置しておくと、その中からＡＰＣ以外の遺伝子にも変異を生じることにより悪性化した細胞が出現し、この時点で癌化するものと考えられている。本発明の変異型ＡＰＣを発現する細胞は、ＡＰＣのみの変異を模倣した状態であると言え、ポリープ形成または癌化の原因解明のための研究材料として有用である。
また、本発明の細胞は、細胞の重層化を阻害する化合物のスクリーニングに有用である。本発明の変異型ＡＰＣを発現する細胞がアフリカツメガエル由来の細胞である場合には、該細胞は、室温、非二酸化炭素環境下で培養できる利点を有する。
本発明の細胞は、本発明の変異型ＡＰＣの製造や発現のための産生系として使用することができる。本発明の変異型ＡＰＣの製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション等の方法で行うことが可能である。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌等が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に本発明の変異型ＡＰＣをコードするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内で変異型ＡＰＣを産生させ、回収する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、本発明の変異型ＡＰＣをコードするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、本発明の変異型ＡＰＣを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、本発明の変異型ＡＰＣをコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から該変異型ＡＰＣを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、本発明の変異型ＡＰＣをコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より本発明の変異型ＡＰＣを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明の変異型ＡＰＣは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明には、これらの精製方法を用い、高度に精製された変異型ＡＰＣも含まれる。
一般的に、Ｗｎｔシグナル伝達系のアッセイとして、アフリカツメガエルの卵にＷｎｔシグナル因子のｍＲＮＡ、抗体等を微量注入してその後の発生に与える影響を調べる方法が広く用いられている（Ｇｌｏｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）４（５）：３５１−３５７）。ＡＰＣやＡＰＣ結合タンパク質であるβ−ｃａｔｅｎｉｎやａｘｉｎもこの手法が用いられ、オタマジャクシの頭が双頭になったり頭が正常形成されなかったりする現象により、Ｗｎｔシグナル伝達系における機能が議論されている。従って、この種の実験において本発明の精製された変異型ＡＰＣを利用することも可能である。
また本発明は、細胞の重層化阻害剤のための候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）本発明の変異型ＡＰＣを発現する細胞と被験化合物を接触させる工程、（ｂ）該細胞の重層化を検出する工程、および（ｃ）重層化を阻害する化合物を選択する工程を含む。
本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清等が挙げられる。
上記工程（ａ）の「接触」は通常、本発明の変異型ＡＰＣを発現する細胞の培養液へ、被検化合物を添加することにより実施することができるが、この方法に特に制限されない。
上記工程（ｂ）における「細胞の重層化の検出」は、当業者においては上述した方法（例えば、位相差顕微鏡を利用した方法等）により実施することができる。
上記工程（ｃ）においては、通常、細胞へ被検化合物を接触させない場合と比較して、細胞の重層化の程度が低下している場合、細胞の重層化は阻害されていると判定される。
多くの癌細胞において細胞の重層化が見られることから、細胞の重層化を阻害する化合物は、抗腫瘍活性を有することが期待される。従って、本発明の上記スクリーニング方法によって選択される化合物は、抗腫瘍活性を有することが期待できる。即ち、該化合物を有効成分として含有する細胞の重層化阻害剤は、抗腫瘍剤となり得る。
また、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養細胞のシステムにおいては、癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＲａｓやＳｒｃによる”繊維芽細胞”のトランスフォーメーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）アッセイが広く用いられていた。これは、細胞が足場依存性を失って増殖を続けるために、何処にも接着していない細胞が増加して光学顕微鏡で検出し得る”ｆｏｃｕｓ”を形成する現象を見るものである。ＲａｓやＳｒｃ、あるいはいくつかの癌遺伝子を上皮細胞に発現させると、ほとんどのケースで細胞間接着が失われ、さらに上皮の極性が失われて、繊維芽細胞・間充織細胞様の形態になることが知られている。本発明の細胞は、従来の細胞とは異なり、細胞間接着を維持したまま重層する細胞であることから、該細胞を利用した本発明の方法においては、従来の方法では取得するのが困難であった化合物（例えば、「上皮細胞の重層化」を特異的に阻害する化合物）のスクリーニングが可能となった。
多くの癌は上皮細胞由来であるのに関わらず、培養細胞を用いたアッセイ系は上述の繊維芽細胞を用いた”ｆｏｃｕｓ”形成アッセイが主なものであった。上皮細胞を用いたアッセイ系の開発は、多くの種類の癌細胞に対してより有効なスクリーニング系を提供する可能性がある。また、上皮細胞が単層を維持する機構を解明する材料としても有用である。
本発明には、上記スクリーニング方法によって取得される化合物、および該化合物を有効成分として含有する細胞の重層化阻害剤、あるいは抗腫瘍剤も含まれる。
本発明の上記薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが可能である。
また本発明は、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣをコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法に関する。該スクリーニング方法は、アフリカツメガエル由来の細胞に、被検ポリヌクレオチドを導入して変異型ＡＰＣ蛋白質を発現させる工程、上記細胞を培養する工程、上記細胞の重層化を検出する工程、および上記細胞を重層化するポリヌクレオチドを選択する工程、を含む。
本発明の好ましい態様においては、被検者のＡＰＣをコードするポリヌクレオチドを被検試料とすることにより、該ポリヌクレオチドがポリープの原因となるか否かについて検査することが可能である。通常、被検ポリヌクレオチドは、細胞において発現可能なように適当な発現ベクターへ組み込まれ、細胞へ導入される。当業者においては、適宜、発現ベクターを選択し、一般的な遺伝子工学技術を用いて、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築することができる。該発現ベクターの細胞への導入は、周知の方法、例えば、上述のエレクトロポレーション法、またはリポフェクション法等により、実施することができる。
上記スクリーニング方法に使用されるアフリカツメガエル由来の細胞としては、例えば、Ａ６細胞を示すことができる。また、細胞の重層化は、例えば、位相差顕微鏡を利用した方法により検出することができる。より具体的には、後述の実施例で示す方法によって細胞の形態を詳細に観察することにより、細胞の重層化の検出を行うことができる。本スクリーニング方法においては、被検ポリヌクレオチドを発現させた細胞において重層化が見られる場合に、該ポリヌクレオチドは細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣをコードしているものと判定される。
【図面の簡単な説明】  図１は、アフリカツメガエルＡＰＣタンパク質のドメイン構成図と、本発明に用いられたＧＦＰ融合全長及び変異型ＡＰＣを模式的に示す図である。
図２は、Ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａ６細胞、及び、ＧＦＰ−ｆＡＰＣ、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰを安定に発現するＡ６細胞株の位相差顕微鏡写真である。
図３は、変異型ＡＰＣを発現する細胞が重層化することを示す走査型電子顕微鏡写真である。
図４は、変異型ＡＰＣを発現する細胞が重層化することを示す透過型電子顕微鏡写真である。
図５は、変異型ＡＰＣを発現する細胞が重層化後も細胞が細胞間接着構造を形成していることを示す写真である。抗ＺＯ−１抗体でＴＪタンパク質ＺＯ−１を染色した。
図６は、非極性化状態のＡ６細胞における、微小管非存在下でのＧＦＰ−ｆＡＰＣ、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰｃ−ＧＦＰの局在をＤＬＧの局在と共に示した蛍光顕微鏡写真である。ＧＦＰ−ｆＡＰＣはストライプ状にＤＬＧと共局在するが（矢印）、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）は細胞質中に散在し（矢頭）ＤＬＧと共局在しない。
図７は、Ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａ６細胞およびＧＦＰ−ｆＡＰＣ、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰｃ−ＧＦＰ発現細胞の、撒き込み後一定時間後の細胞の面積を示すプロットである。左はｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ非存在下、右はｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ存在下で微小管を脱重合させた状態でアッセイした。
【発明を実施するための最良の形態】  以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例に使用する抗体および細胞は下記の通りである。抗ＺＯ−１モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ：Ｔ８−７５４）と抗ＤＬＧ抗体（ａｎｔｉ−ＰＳＤ−９５  Ｆａｍｉｌｙ，ｃｌｏｎｅ  Ｋ２８／８６．２）は、それぞれ三光純薬とｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。核酸を選択的に染色するＴＯＴＯ−３とアクチン・フィラメントを選択的に染色するローダミン・ファロイジンは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社から購入した。微小管を脱重合させる薬剤ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅはＳＩＧＭＡから購入した。Ａ６細胞（アフリカツメガエルＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ腎臓由来上皮細胞株）は、１０％ウシ胎児血清を含むＬｅｉｖｏｂｉｔｚ′ｓ  Ｌ−１５培養液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中にて、２３℃、非二酸化炭素環境中で増殖させた。実施例２に示す理由により、アフリカツメガエルの遺伝子と細胞を選択した。
［実施例１］  自家蛍光タンパク質ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）融合ＡＰＣの作成
ＡＰＣの機能を詳細に明らかにするために、常法を用いて、ＡＰＣの異なる部位を含むｃＤＮＡを自家蛍光タンパク質ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ｃＤＮＡを融合した発現ベクターを作成した（図１）。
アフリカツメガエルＡＰＣ遺伝子の配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｕ６４４４２）に報告されている。各々の発現ベクターは、以下の手順で作成された。
（ａ）ＧＦＰ−ｆＡＰＣ：  ＧＦＰを融合した全長ＡＰＣを発現するためのベクターである。全長ＡＰＣを含む発現ベクター、ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）／ＡＰＣ（１−８４９０）及びｐＱＢＩ２５／ＡＰＣ（１−８４８７）は、発明者らによって既に論文報告されている。ＧＦＰ−ｆＡＰＣ発現ベクターを構築するため、まず、ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）／ＡＰＣ（１−８４９０）からＸｂａＩを用いて切り出したＡＰＣの３’領域を含むｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ社）のＸｂａＩサイトに挿入した。次に、このベクターのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに、ｐＱＢＩ２５／ＡＰＣ（１−８４８７）からＳａｃＩＩとＢａｍＨＩによって切り出したｃＤＮＡを挿入した。最後に、このベクターのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに、ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）／ＡＰＣ（１−８４９０）からＢａｍＨＩとＮｏｔＩを用いて切り出したｃＤＮＡを挿入し、完全長ＡＰＣを含むベクターを構築した（ＡＰＣ／ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）。
（ｂ）ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）：ＡＰＣのＣ末端の３アミノ酸、ＴＳＶを欠失したＡＰＣを発現するベクターである。ＡＰＣの２０８９−２８２６アミノ酸をコードする遺伝子は、ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）／ＡＰＣ（１−８４９０）をテンプレートとし、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより作成した。
2004018677.tif 000002
このＰＣＲ産物はＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）ベクターのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した（ＡＰＣ（６４７５−８４７８）／ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）。このベクターをＰｖｕＩとＮｏｔＩで切断し、得られた断片を同酵素で切断したＡＰＣ／ｐＥＧＦＰ−Ｃ１に挿入した。
（ｃ）ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ：このタンパク質を発現するベクターは、既に発明者らによって論文報告されている。
（ｄ）ｎＡＰＣ−ＧＦＰ：ＡＰＣのＮ末端領域のみ（ｈｅｐｔａｄ領域とａｒｍａｆｉｌｌｏ領域を含む）を発現するためのベクターである。ＡＰＣのＮ末端の８５９アミノ酸をコードする遺伝子は、ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）／ＡＰＣ（１−８４９０）をテンプレートとし、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより作成した。
2004018677.tif 000003
このＰＣＲ産物はＭｌｕＩで切断し、ｐＧＦＰ（ＭｌｕＩ）ベクター（発明者らにより報告）のＭｌｕＩサイトに挿入した。
（ｅ）ｎ２ＡＰＣ−ＧＦＰ：ＡＰＣのＮ末端領域のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｈｅｐｔａｄ領域のみを発現するためのベクターである。ＡＰＣのＮ末端の２８４アミノ酸をコードする遺伝子は、ｐＧＦＰ−Ｃ（ＮｈｅＩ）／ＡＰＣ（１−８４９０）をテンプレートとし、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより作成した。
2004018677.tif 000004
2004018677.tif 000005
このＰＣＲ産物はＮｈｅＩで切断し、ｐＱＢＩ２５ベクターのＮｈｅＩサイトに挿入した。
（ｆ）ｍＡＰＣ−ＧＦＰ：ＡＰＣの中央領域のみを発現するためのベクターである。まず、以下のプライマーを用いてＰＣＲによりＡＰＣの８６０−１１２０アミノ酸をコードする遺伝子をを作成した。
2004018677.tif 000006
このＰＣＲ産物をＮｈｅＩとＸｂａＩで切断し、ｐＱＢＩ２５ベクターのＮｈｅＩサイトに挿入した。次に、このベクターをＥｃｏＲＩで切断し、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰからＥｃｏＲＩで切り出したＡＰＣの中央領域を含むフラグメントを挿入した。最後に、このベクターをＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで切断し、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰからＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで切り出したフラグメントを挿入した。
（ｇ）ＧＦＰ−ｃＡＰＣ：ＡＰＣのＣ末端領域のみを発現するためのベクターである。このタンパク質を発現するベクターは、既に発明者らによって論文報告されている（Ｍｉｍｏｒｉ−Ｋｉｙｏｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４８（３）：５０５−１８，２０００）。
［実施例２］  ｃＤＮＡのＡ６細胞への導入及びスクリーニング
実施例１で得られたベクターをＡ６細胞に導入して安定発現株の樹立を試みた。
多くの哺乳類由来培養細胞株において、ＡＰＣの発現は非常に困難であり、これまでに全長ＡＰＣをコンディショナルに発現する細胞についての報告（Ｍｏｒｉ  Ｐ．Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７９５０−４，１９９６）はあるものの、外来の全長及び切断型ＡＰＣを安定的に発現する細胞株の樹立は報告されていない。そこで、Ａ６細胞がＡＰＣの発現に適当であるかどうかを検討した。
まず、ｐＱＢＩ２５ベクター（ＱＢＩＯｇｅｎｅ社）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＧＦＰ単体をＡ６細胞に発現させる予備実験を行い、蛍光染色像を蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰが発現されることを確認した。さらに、ＧＦＰ以外の明瞭な蛍光シグナルを呈する細胞は、調べた限りにおいては存在しなかった。ｐＱＢＩ２５ベクター導入後４８〜７２時間後に０．６〜０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）存在下で培養を開始し、耐性クローンを選択したが、Ａ６細胞は容易に耐性クローンのコロニーを形成することが確認された。さらに、実施例１に示す発現ベクターを導入したところ、ＧＦＰの蛍光を発する細胞が増殖し得ることが確認された。これらの実験は、Ａ６細胞の通常の培養環境である、室温、非二酸化炭素環境中で行われた。これらの結果から、この細胞株がＧＦＰ融合ＡＰＣを発現する蛋白質の視覚的スクリーニングに適当であるということを確認した。
実施例１に示した各ｃＤＮＡは、上記と同様の条件で細胞に導入し、蛍光顕微鏡下でＧＦＰの蛍光を検出することによりスクリーニングを行った。各コンストラクトについて、安定的に発現する細胞株を樹立した。安定発現株樹立後、変異型ＡＰＣの発現状態はＧＦＰの蛍光によって細胞に何ら操作を加えずに容易にモニターすることが可能であり、また、変異型ＡＰＣの細胞内局在も細胞が生きた状態で検出することが可能である。
［実施例３］  ＧＦＰ融合全長及び切断型ＡＰＣ発現細胞の位相差顕微鏡法による形態観察
実施例２で得られたＧＦＰ融合全長及び切断型ＡＰＣ発現細胞の形態を、位相差顕微鏡法により観察し、ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａ６細胞のそれと比較した。細胞が広く伸展した状態で１００％コンフルエント密度でディシュに撒き、毎日培地を交換しながら５日以上、細胞が密になり上皮の構造に極性化するまで培養すると、ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａ６細胞とＧＦＰ−ｆＡＰＣ発現細胞は上皮の形態を持つ平坦な単層構造となるが、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰ発現細胞では、一定の頻度で細胞層が平坦ではなく隆起した領域が出現した（図２）。ｎ２ＡＰＣ−ＧＦＰ発現細胞でも同様の隆起した領域が観察されたが、全ての株ではなく、細胞内に存在するＧＦＰの蛍光強度が高い、即ち発現レベルが高い細胞に限られた。ｎ２ＡＰＣ−ＧＦＰによって細胞を隆起させるためには、細胞の蛍光強度から測定して、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰのおよそ１０倍の発現レベルが必要であった。
［実施例４］  ＧＦＰ融合全長及び切断型ＡＰＣ発現細胞の電子顕微鏡観察
実施例２で得られたＧＦＰ融合全長及び切断型ＡＰＣ発現細胞の形態を詳細に観察するため、電子顕微鏡観察を行った（図３）。各細胞を、リン酸緩衝液を用いて調整した１％グルタルアルデヒド水溶液中で固定し、常法により試料作成を行い、走査型電子顕微鏡法により細胞表面の構造を観察した。ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａ６細胞とＧＦＰ−ｆＡＰＣ発現細胞においては、細密充填された細胞の頂端膜が平坦に連なり、頂端膜上の微絨毛やｐｒｉｍａｌｙ  ｃｉｌｉａ構造の突出のみが観察された。それに対し、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰ発現細胞では、数個〜数１０個の細胞が隆起し、平坦な細胞単層でない領域の出現が観察された。
次に、１％グルタルアルデヒド水溶液中で固定した細胞を常法により超薄切片を作成、透過型電子顕微鏡法により細胞縦断面の観察を行った（図４）。ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａ６細胞ではある程度の細胞間隙が認められるが細胞が単層であるのに対し、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰ発現細胞では細胞間隙及び細胞−基質間隙が増加し、細胞の重層が明確に観察された。しかし、典型的な細胞間接着構造は保持されていることが確認された。つまり、変異型ＡＰＣ発現細胞は、電子顕微鏡像において、細胞頭頂領域に特徴的な細胞間接着構造であるタイト・ジャンクションとアドヘレンス・ジャンクションが観察されるのに関わらず、それより下の領域では細胞−細胞間隙が顕著で、また、細胞−基質間隙も顕著であった。それに反して、ＧＦＰ−ｆＡＰＣ発現細胞では、細胞−細胞間にも細胞−基質間にも間隙が全く見られず、細胞は単層に並列していた。これらの結果から、ＡＰＣは細胞間接着を強化する機能を持つが、変異型ＡＰＣはその機能を有せず、おそらくドミナント・ネガティブに働くことによって細胞−細胞間、細胞−基質間の両方の接着が弱くなっていることが明らかになった。
つまり、全長ＡＰＣは、細胞−細胞間、細胞−基質間接着を強化する機能を持つのに対し、Ｃ末端を欠失した変異型ＡＰＣではその機能が失われ、かつドミナント・ネガティブな効果を及ぼすことによって、細胞が基質からはがれ、重層化するものと考えられた。
ｎ２ＡＰＣ−ＧＦＰが細胞を重層化させるためになぜ高い発現レベルが必要であるのか（細胞重層化活性が低いか）はまだ不明であるが、以下の２つの可能性が考えられた。１）ＡＰＣはそのＮ末端のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ領域でホモダイマーを形成することが報告されているが（Ｊｏｓｌｙｎ  Ｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９３；９０（２３）：１１１０９−１３．）、細胞中ではｎ２ＰＡＣ−ＧＦＰは内在性全長ＡＰＣとほとんど共局在できず、ｎＡＰＣ−ＧＦＰはＡＰＣと強く共局在することから、細胞内で安定して複合体を形成するためにはａｒｍａｄｉｌｌｏリピート領域も必要であると考えられる。そのため、安定に内在性ＡＰＣと複合体形成できる変異体の方がドミナント・ネガティブ効果を発揮しやすい可能性。２）ａｒｍａｄｉｌｌｏリピート部位にはアクチン骨格を調節する因子であるＡｓｅｆが結合して細胞運動を促進することが報告されているため（Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｙ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８９（５４８２），１１９４−１１９７）、ドミナント・ネガティブ効果とＡｓｅｆによる細胞運動の亢進の相乗効果により細胞接着や形態が変化した可能性。
［実施例５］  ＧＦＰ融合全長及び切断型ＡＰＣ発現細胞の蛍光顕微鏡法による観察
実施例２で得られたＧＦＰ融合全長及び切断型ＡＰＣ発現細胞の細胞間接着構造を、抗ＺＯ−１抗体を用いて免疫染色を行い蛍光共焦点顕微鏡法により観察し、ｐａｒｅｎｔａｌ  Ａ６細胞のそれと比較した（図５）。ＺＯ−１は、上皮または内皮細胞層における細胞間接着装置の一つであるｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ（ＴＪ）の構成成分であり、正常な上皮の極性を持った細胞では、ＺＯ−１は細胞膜頂端部において細胞を取り巻く連続した周縁に分布する。Ａ６細胞とＧＦＰ−ｆＡＰＣ発現細胞では、ＺＯ−１は細胞周縁に連続して観察され、正常に上皮形態をとっていることが観察された。ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰ発現細胞では、重層していない領域の細胞で正常なＺＯ−１の染色が確認された上、重層した領域においても、ＺＯ−１の連続したストランドが観察された。この結果は、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰ発現細胞では細胞間接着（ＴＪ、ＡＪ）は維持された状態で重層していることを示す。
これらの知見は、変異型ＡＰＣは細胞の形態に影響を及ぼし、正常上皮細胞の単層性を阻害することが示された。細胞間接着（ＴＪ、ＡＪ）は維持しながら細胞が重層することから、モデルマウスにおけるポリープ形成現象に類似しており、モデル系として用いることができる。
［実施例６］  全長ＡＰＣと変異型ＡＰＣの細胞内局在
ＧＦＰ−ｆＡＰＣは、極性化し上皮細胞形態をとる  Ａ６細胞においてｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜とジャンクション領域に局在した。類似したコンストラクトであるｆＡＰＣ−ｍＧＦＰ（ＡＰＣ全長を含むがＧＦＰがＡＰＣの内部に挿入されている公表済みのコンストラクト）がＡ６細胞においてｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜に局在することは発明者らによって論文報告されている（Ｍｉｍｏｒｉ−Ｋｉｙｏｓｕｅ  Ｙ  ａｎｄ  Ｔｓｕｋｉｔａ  Ｓ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１５４（６）：１１０５−１１０９，２００１）。しかし、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｍＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎ２ＡＰＣ−ＧＦＰはｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜への局在が著しく阻害された。このことから、ＡＰＣはそのＣ末端のＰＤＺ結合モチーフ、ＴＳＶによりｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜とジャンクション領域に局在すると考えられる。ＡＰＣのＣ末端には、ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜とジャンクション領域に局在するＰＤＺタンパク質のひとつであるＤＬＧが結合することが報告されている（Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ  Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７２（５２６４）：１０２０−３）ことから、ＡＰＣはＤＬＧ等のＰＤＺタンパク質に依存してｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜とジャンクション領域に局在していると考えられる。
極性化して細胞−細胞間接着を形成したＡ６細胞において、ｎＡＰＣ−ＧＦＰはジャンクション領域への局在が検出されたが、ジャンクション領域のみならずｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜に局在し得る全長ＡＰＣとは異なる局在であり、ｎＡＰＣ−ＧＦＰはＡＰＣの結合タンパク質の一部のジャンクション局在タンパク質との結合のみを保持しているものと考えられる。
また、細胞密度が低く細胞−細胞間接着が形成されない状態で、微小管脱重合剤（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）を添加し微小管を完全に脱重合させると、微小管上に局在していたＧＦＰ−ｆＡＰＣはｂａｓａｌ側の細胞膜上に移行し、ストライプ状に分布しＤＬＧと共局在した（図６）。しかし、ＧＦＰ−ＡＰＣ（ΔＴＳＶ）、ΔｃＡＰＣ−ＧＦＰ、ｍＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎＡＰＣ−ＧＦＰ、ｎ２ＡＰＣ−ＧＦＰは細胞質中に散在し、ＧＦＰ−ｆＡＰＣようなストライプ状のパターンとＤＬＧとの共局在は観察されなかった。この結果から、ＡＰＣがｂａｓａｌ側の細胞膜に結合するためにはＡＰＣのＣ末端のＰＤＺ結合モチーフ、ＴＳＶに依存してＤＬＧ等のＰＤＺタンパク質に結合することが必要であることが明らかになった。
［実施例７］  全長ＡＰＣと変異型ＡＰＣの細胞伸展活性の解析
次に、全長ＡＰＣと変異型ＡＰＣの細胞運動に及ぼす影響を調べるため、細胞伸展アッセイを行った。トリプシン処理によりディッシュから回収したそれぞれの細胞株をカバーガラス上に撒き、１５、３０、６０、１２０分後にカバーガラスを取り出して固定し、細胞の形を可視化するためにローダミン・ファロイジンでアクチンを染色した。それぞれの試料を蛍光顕微鏡で撮影し、ローダミン・ファロイジンで染色された細胞領域の面積を測定し、個々の細胞の面積の平均を求めてプロットした（図７）。その結果、ｆＡＰＣ−ＧＦＰを発現する細胞においてのみ、細胞伸展が顕著に促進されていた。細胞伸展活性が微小管安定化によるものであるのかどうかを調べるために、次に、ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅを添加して微小管を脱重合された条件下で同様のアッセイを行ったが、やはりＧＦＰ−ｆＡＰＣ発現細胞のみで顕著な細胞伸展の促進が観察された。この結果から、ＡＰＣは微小管安定化すること以外にも細胞伸展活性を持つが、この活性にはＣ末端のＰＤＺ結合機能が重要であることが明らかになった。［実施例６］に示したＡＰＣの局在が示すように、ＡＰＣは、Ｃ末端のＰＤＺ結合モチーフを介してＤＬＧなどのＰＤＺタンパク質に結合してｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜に局在することから、正常ＡＰＣの機能にはＰＤＺタンパク質を介した細胞膜への局在が必要であると考えられる。変異型ＡＰＣは細胞膜に結合する機能を持たず正常な機能を発現することができず、さらにドミナント・ネガティブな効果を発揮すると考えられる。
これらの結果から、ＡＰＣはそのＣ末端でＰＤＺタンパク質に結合することにより細胞膜に局在し、細胞運動の制御や細胞形態の維持に寄与していると考えられる。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、細胞の重層化を誘導し得る変異型ＡＰＣタンパク質が提供された。該タンパク質を発現する細胞は、細胞の重層化を阻害する化合物のスクリーニングに有用である。また本発明者らによって、変異型ＡＰＣを発現する細胞は細胞間接着構造を保持しているが、細胞の重層化が見られることが、初めて明らかとなった。これらの知見により、ポリープ形成および癌化のメカニズムの解明が大いに期待される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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