【事件の表示】
　特許第６４９６９８０号発明「免疫測定方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。
【結　論】
　特許第６４９６９８０号の特許請求の範囲を訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項〔１−８〕について訂正することを認める。
　特許第６４９６９８０号の請求項１、２、４、６ないし８に係る特許を維持する。
　特許第６４９６９８０号の請求項３及び５に係る特許についての特許異議の申立てを却下する。
【理　由】
第１　手続の経緯
　特許第６４９６９８０号の請求項１〜８に係る特許についての出願は、平成２６年３月２７日（優先権主張　平成２５年３月２９日　日本国）の出願であって、平成３１年３月２２日にその特許権の設定登録がされ、その後、その特許について、令和元年１０月３日に特許異議申立人　萩山　弘文（以下、「申立人」という。）により特許異議の申立てがされ、同年１２月５日付けで取消理由が通知され、その指定期間内である令和２年２月１２日に意見書の提出及び訂正の請求があり、令和２年２月１４日付けでその訂正の請求を申立人に通知し、期間を指定して意見書を提出する機会を設けたが、異議申立人からは何ら応答がなかったものである。そして、同年５月１２日付けで取消理由通知書（決定の予告）により取消理由が通知され、同年７月１３日に意見書の提出及び訂正の請求があったものである。
第２　訂正の適否
１　訂正の内容（下線は、訂正箇所を示す。）
（１）訂正事項１
　特許請求の範囲の請求項１に「検体中の抗原又は抗体との免疫反応を１２〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が存在する液相中で起こし、次いで、固相上で測定を行うことを特徴とする」と記載されているのを、「検体中の抗原又は抗体との免疫反応を
、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５
０．００５〜１０重量％の濃度で
あらかじめブロッキング剤を添加した
　また、請求項１に係る発明を引用する請求項２、４、６、７及び８も同様に訂正する。
（２）訂正事項２
　特許請求の範囲の請求項２に「工程（１）：測定対象物質を含有する試料と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であってリガンドで修飾された抗体（一次抗体）を含む溶液と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であって酵素で標識された抗体（二次抗体）を含む溶液とを混合し、１２〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が存在する液相中で、免疫反応により前記一次抗体、前記測定対象物質および前記二次抗体のサンドイッチ複合体をつくる。工程（２）：前記サンドイッチ複合体を含む溶液を、あらかじめ前記リガンドと結合可能な物質を固相化した担体に触れさせて、前記複合体を前記固相化担体上の抗体に結合させる。」と記載されているのを、「工程（１）：測定対象物質を含有する試料と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であってリガンドで修飾された抗体（一次抗体）を含む溶液と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であって酵素で標識された抗体（二次抗体）を含む溶液とを混合し、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５
０．００５〜１０重量％の濃度で
であって、あらかじめブロッキング剤を添加した固相担体
　また、請求項２に係る発明を引用する請求項４、６及び８も同様に訂正する。
（３）訂正事項３
　特許請求の範囲の請求項３を削除する。
（４）訂正事項４
　特許請求の範囲の請求項４に「請求項１〜請求項３のいずれかに記載の方法」と記載されているのを、「請求項１
又は２
（５）訂正事項５
　特許請求の範囲の請求項５を削除する。
（６）訂正事項６
　特許請求の範囲の請求項６に「請求項１〜請求項５のいずれかに記載の方法」と記載されているのを、「請求項１
、２、又は４
（７）訂正事項７
　特許請求の範囲の請求項７に「請求項１〜請求項６のいずれかに記載の方法」と記載されているのを、「請求項１
、２、４、又は６
（６）訂正事項８
　特許請求の範囲の請求項８に「前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。」と記載されているのを、「前記非イオン性界面活性剤が、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル、
、及び
、２、４、６、又は７
　なお、訂正前の請求項１〜８について、請求項２〜８はそれぞれ請求項１を直接又は間接的に引用しているから、訂正前において一群の請求項に該当するものである。
　したがって、上記訂正の請求は、一群の請求項ごとにされたものである。
２　訂正の目的の適否、新規事項の有無、特許請求の範囲の拡張・変更の存否
（１）訂正事項１及び２について
　訂正事項１に係る請求項１についての訂正及び訂正事項２に係る請求項２についての訂正は、いずれも、「非イオン性界面活性剤」が「ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する」ものであり、「非イオン性界面活性剤」の濃度が「０．００５〜１０重量％の濃度」であり、「固相」が「あらかじめブロッキング剤を添加した」ものである旨の限定をしたものであるから特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、本件明細書の発明の詳細な説明に、「ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する、非イオン性界面活性剤」は、表１〜６において本件発明の効果が確認された非イオン性界面活性剤として記載され、また、
「【００３９】
本発明によれば、液相中において検体中の抗原又は抗体と免疫反応を起こし、あらかじめブロッキング剤を添加した固相上で測定する際に、反応系由来の物質による非特異的な反応を減少させることによりブランクを下げることができる。更に免疫反応が促進されるため、Ｓ／Ｎ比が高くなり、これにより測定感度が向上する。・・・」
「【００７７】
０．００５〜１０重量％の範囲において、ブランクが低く、高いＳ／Ｎ値を示した。」
と記載されていることから、これらの訂正は、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
（２）訂正事項３及び５について
　訂正事項３及び５に係る訂正は、いずれも特許請求の範囲の請求項３及び５を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。そして、これらの訂正が、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
（３）訂正事項４、６及び７について
　訂正事項４、６及び７は、上記訂正事項３及び５において、請求項３及び５が削除されたことに伴い、訂正事項４は、請求項１〜３において、訂正事項６は、請求項１〜５おいて、訂正事項７は、請求項１〜６において択一的に記載されていた引用請求項の一つ（当該請求項３及び５）を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
（４）訂正事項８について
　訂正事項８は、「前記非イオン性界面活性剤」を、「ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である」ものから、「前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である」ものにすることにより、「非イオン性界面活性剤」をポリオキシエチレンアルキルエーテルの一種である「ポリオキシエチレンラウリルエーテル」と、「ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテル」の三種より選択されるものである旨限定し、さらに請求項３及び５が削除されたことに伴い、「請求項１、２、４、６、又は７のいずれかに記載の方法」と、請求項１〜７において、択一的に記載されていた引用請求項の一つ（当該請求項３及び５）を削除するものであるあるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、「ポリオキシエチレンラウリルエーテル」がポリオキシエチレンアルキルエーテルの下位概念であることは、本件明細書の発明の詳細な説明に、
「【００３１】
そのような化合物として、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（具体的には、エマルゲン１０８（ＨＬＢ１２．１）、エマルゲン１０９Ｐ（ＨＬＢ１３．６）、エマルゲン１２０（ＨＬＢ１５．３）、エマルゲン１２３Ｐ（ＨＬＢ１６．９）、エマルゲン１３０Ｋ（ＨＬＢ１８．１）、エマルゲン１４７（ＨＬＢ１６．３）、エマルゲン１５０（ＨＬＢ１８．４）（以上ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、エマルゲン２２０（ＨＬＢ１４．２）（ポリオキシエチレンセチルエーテル）、エマルゲン３２０Ｐ（ＨＬＢ１３．９）、エマルゲン３５０（ＨＬＢ１７．８）（以上ポリオキシエチレンステアリルエーテル）、エマルゲン４２０（ＨＬＢ１３．６）、エマルゲン４３０（ＨＬＢ１６．２）（以上ポリオキシエチレンオレイルエーテル）（以上花王製、「エマルゲン」は登録商標）など）、・・・などが挙げられる。
・・・」
と記載されていることから、訂正事項８が、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
３　小括
　したがって、上記の訂正請求による訂正事項１〜８は、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に掲げる事項を目的とするものであり、かつ、同条第９項で準用する同法第１２６条第５項及び第６項の規定に適合する。
　よって、特許請求の範囲を、訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項〔１−８〕について訂正することを認める。
第３　訂正後の請求項１−８に係る発明
　本件訂正請求により訂正された請求項１−８に係る発明（以下「本件発明１−８」という。）は、訂正特許請求の範囲の請求項１−８に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。
「　　【請求項１】
　検体中の抗原又は抗体との免疫反応を、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が０．００５〜１０重量％の濃度で存在する液相中で起こし、次いで、あらかじめブロッキング剤を添加した固相上で測定を行うことを特徴とする、検体中の抗原又は抗体の測定におけるブランク値の低減方法であって、検体中の抗原又は抗体の測定がアデノウイルス抗原の免疫測定を含む、方法。
　　【請求項２】
　請求項１に記載の方法であって、以下の工程（１）〜（４）に従って実行される、測定対象物質の測定におけるブランク値の低減方法。
工程（１）：測定対象物質を含有する試料と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であってリガンドで修飾された抗体（一次抗体）を含む溶液と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であって酵素で標識された抗体（二次抗体）を含む溶液とを混合し、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が０．００５〜１０重量％の濃度で存在する液相中で、免疫反応により前記一次抗体、前記測定対象物質および前記二次抗体のサンドイッチ複合体をつくる。
工程（２）：前記サンドイッチ複合体を含む溶液を、あらかじめ前記リガンドと結合可能な物質を固相化した担体であって、あらかじめブロッキング剤を添加した固相化担体に触れさせて、前記複合体を前記固相化担体上の抗体に結合させる。
工程（３）：前記固相化担体を洗浄液で洗浄することにより、前記固相化担体上の抗体に結合していない一次抗体および二次抗体を除去する。
工程（４）：前記固相化担体に前記酵素の基質を含む液を添加し、前記固相化担体上で酵素による基質の化学変化量をモニタリングすることにより測定を行う。
　　【請求項３】
　（削除）
　　【請求項４】
　前記非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が１６〜１９である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
　　【請求項５】
　（削除）
　　【請求項６】
　前記液相中の非イオン性界面活性剤の濃度が０．２〜５重量％である、請求項１、２又は４のいずれかに記載の方法。
　　【請求項７】
　検体が体液又は組織抽出液である、請求項１、２、４又は６のいずれかに記載の方法。
　　【請求項８】
　前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１、２、４、６又は７のいずれかに記載の方法。」
第４　取消理由の概要
　訂正前の請求項１−８に係る特許に対して、当審が令和２年５月１２日付けの取消理由通知（決定の予告）において特許権者に通知した取消理由の要旨は、次のとおりである。
　請求項１に係る発明は、引用文献１に記載された発明及び甲５号証に記載された技術事項に基づいて、請求項２−８に係る特許は、引用文献１に記載された発明、甲５号証及び引用文献２に記載された技術事項に基づいて、本件特許出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、請求項１−８に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、取り消されるべきものである。
引用文献１：特開２００８−１２２３７２号公報（甲９号証）
引用文献２：特開２０１２−２２０３５７号公報（甲１号証）
甲５号証：特開２００６−０４７２５５号公報
第５　取消理由通知書（決定の予告）に記載した取消理由について
１　引用文献及び各甲号証に記載された事項
（１）　引用文献１について
ア　引用文献１に記載された事項
　引用文献１には、以下の事項が記載されている。（下線は、当審にて付した。以下同様である。）
（引１ａ）「【００２９】
　以下に、本発明の方法についてより具体的な手順の一例を示し、本発明を説明する。
（１）ウイルスや細菌等に感染した疑いがある患者の咽頭、鼻腔あるいは直腸等から綿棒等の検体採取器具を用いて直接採取した検体試料を、後述するような検体浮遊液に浮遊させる。あるいは患者から採取した鼻腔吸引液、尿、便等の被分析対象物から綿棒等の検体採取器具を用いて採取した検体試料を、後述するような検体浮遊液に浮遊させる。
（２）この浮遊液を、ろ過フィルターを備えた検体試料用ろ過チューブ中に入れてろ過する。
（３）このろ過液を、メンブレンを備えたアッセイ装置中の被検出物に特異的に結合して被検出物を捕捉する捕捉試薬が結合したメンブレンに滴下等により添加して、被検出物をメンブレン上に捕捉させる。この際、ろ過液をサンプル滴下パッドに滴下することにより、毛細管現象により被検出物がメンブレンに流れていく。
（４）前記
メンブレン上に、被検出物に特異的に結合する検出試薬である標識物質を滴下等により添加し、捕捉試薬／被検出物／標識物質の複合体を形成させ
標識物質はあらかじめアッセイ装置に組み込んでおいて
場合、検体試料を含む浮遊液をアッセイ装置に添加することにより、該浮遊液がアッセイ装置上を流れ、検出試薬を含むパッド部分に到達すると、検出試薬が前記浮遊液に溶解し、被検体とともにメンブレンに到達し、メンブレンの捕捉試薬との間で複合体を形成する。
（５）前記
複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中の被検出物の有無を測定する
（引１ｂ）「【００５１】
　本発明の検査方法により分析するための検体は、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、肺胞洗浄液、便懸濁液、血漿、血清、尿、唾液、羊水、髄液、膿、臓器抽出液、各種組織抽出液等の生体試料、食品抽出液、培養上清、上水、下水、湖水、河川水、海水、土壌抽出液、汚泥抽出液を用いることができるがこれらに限定されない。この中でも、特に生体試料を検体とした場合に有用であり、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液又は便懸濁液を検体とした場合に極めて有用である。生体試料はヒト由来であっても、非ヒト動物由来であってもよい。」
（引１ｃ）「【００５４】
　検体浮遊液には、通常、塩及びpHを一定に維持するための緩衝剤が含まれる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液等を使用することができ、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等が挙げられる。さらに
検体浮遊液には
非特異反応を減じる目的で界面活性剤を含有させ
界面活性剤としては、Triton X-100（商品名）：ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル、Tween 20：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Tween 80：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Nonidet P-40：ノニデット　P-40、ZWITTERGENT 3-14：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト、CHAPS：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等あるいはこれらを２種類以上混合したものを用いることができる
【００５５】
　
検体浮遊液には
非特異反応を減じる目的でウシ血清アルブミン、イムノグロブリン、カゼイン等のタンパク質、ウサギやマウス等の血清等を含有させることも可能である。
【００５６】
　また、例えば、被検出物が細菌のように細胞壁を有し、かつ標識物質や捕捉物質の被検出物への結合部位が細菌の内部にある場合には、検体浮遊液中に検体を浮遊させただけでは結合部位が容易に外部に露出せず、検出・定量ができないことがある。その際にはNaOH等のアルカリ等の添加、中和、又は熱処理等の前処理が必要な場合もある。
　上記のような工夫によっても偽陽性の発生を減じることができるが、完全に防ぐことはできない。
【００５７】
（検出試薬）
　本明細書において、検出試薬とは、被検出物に特異的に結合し、被検出物と複合体を形成しうるものである。また、標識物質とは、被検出物と複合体を形成した後に何らかの手段で検出可能なように標識された検出試薬を意味する。例えば、被検出物がウイルス等の抗原物質である場合には、そのウイルスに対する抗体であって、酵素等で標識化された抗体が挙げられる。このように酵素で標識された場合には、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成する該酵素の基質を添加することにより、複合体の検出を行うことができる。標識化される前の検出試薬としては、捕捉試薬について述べたものと同じものが挙げられる。また、
標識は、酵素、
が挙げられる。
【００５８】
　酵素標識を用いる場合には、使用される酵素としては例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素が挙げられる。
　
標識物質の標識として酵素標識を用いた場合には、通常その酵素に対する基質であって、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成するものを添加する。
（引１ｄ）「【００６６】
［実施例１］ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる鼻腔吸引液中のインフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出１
１．モノクローナル抗体の作製
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスNP（Nucleoprotein；核蛋白）モノクローナル抗体（マウス）の作製
　精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al.,Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（P3×63）と融合した。」
（引１ｅ）「【００９２】
（２）メンブレンアッセイ法による検出
　鼻腔吸引液１検体より調製した検体試料の入った６本のチューブの先端に６．で作製した各種の試料ろ過フィルターをそれぞれ２個ずつ装着した。検体採取に用いた綿棒の種類と試料ろ過フィルターの種類の組み合わせを表３に示した。
【００９３】
　
検体試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後、
ンフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸し
10分後、アッセイ装置を観察し、
ｈの位置（コントロールライン）に発色が認められた場合を有効とし、ｅの位置に標識に用いた着色ラテックスの色調の発色
が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性
いずれの位置にも発色が認められない場合は陰性と判定した。またｈの位置に発色が認められない場合を無効とし
　試験の結果を表３に示す。」
（引１ｆ）「【０１１６】
［実施例５］　
ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる咽頭拭い液中のアデノウイルスの検出
１．モノクローナル抗体の作製
（１）アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体（マウス）
　
ヒトアデノウイルスのヘキソン蛋白のアミノ酸配列の一部を合成したポリペプチド
【０１１７】
　得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、アデノウイルスヘキソン蛋白抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。
【０１１８】
　取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー（アマシャム社製）を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、
２種類の精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体を得た
【０１１９】
２．標識抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体（標識物質）の作製
（１）ラテックス粒子標識抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の調製
　
抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち１種類を
緩衝液で希釈し
青色ポリスチレンラテックス粒子
と
混合し、反応させ
洗浄後、最終浮遊液
中に浮遊し、超音波分散装置
にかけ、ラテックス粒子を分散させ
【０１２０】
３．ラテックス粒子標識抗体の乾燥化
（１）ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの作製
　２．で
作製したラテックス粒子標識抗体を
セルロース不織布全面に噴霧し
乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製し
【０１２１】
４．メンブレン固相用抗体の調製
（１）固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の調製
　上記１．（１）で作製した
精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液
に透析し、透析後に
ろ過を行い、
固相液で希釈して固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を調製し
【０１２２】
５．アデノウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
　アデノウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置は、図１及び図２に示すものと同様の構成のものを用いた。
　
メンブレンは、
ニトロセルロースメンブレン
シート
を用い
その長軸側の一端
から６mm離れたｅの位置に固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を
線状に塗布し、22mm離れたｈの位置に抗マウスIgG抗体を
線状に塗布した
塗布後、
乾燥し
【０１２３】
　次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（BioDot社製）を接着した（図２のｉ）。
【０１２４】
　次に、上記３（２）で作製した
ラテックス粒子標識抗体乾燥パッド
メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２mm重なる様に配置して貼り付け
セルロースろ紙
をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッド
とし
【０１２５】
　次に、幅30mm×長さ10cmの
セルロースろ紙
をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッド
とし
【０１２６】
　次にサンプル滴下パッドの上流端の幅５mmを除いて、上面全面を透明プラスチックラミネート（Adhesive Research社）で被覆した（図２のｊ）。
【０１２７】
　最後に長軸方向に沿って、５mmずつ切断し、図１及び図２に示す
メンブレンアッセイ装置を作製し
【０１２８】
６．試料ろ過フィルターの作製
　実施例１及び２で作製した試料ろ過フィルターのうちＡ、Ｃ及びＤを用いた。
【０１２９】
７．アデノウイルスの検出
（１）検体の採取と検体試料の調製
　臨床的にアデノウイルス感染が疑われる患者から頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（検体採取部分の水分吸収量90μL；microRheologics社）を用いて咽頭拭い液を４本採取した。まず、そのうち１本を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いてFujimoto等の方法（Single-tube multiplex PCR for rapid and sensitive diagnosis ofsubgenus B and other subgenera adenovirus in clinical samples. Microbiology andImmunology. 44. 821-826, 2000）を用いたPCR法により検体中にアデノウイルス遺伝子が存在するかを確認した。その結果より、採取した咽頭拭い液中から
アデノウイルス遺伝子が検出された
患者から採取した咽頭拭い液を
チューブ内に分注した検体浮遊液（20mM MES緩衝液（pH6.0）、１（W/V）％ TritonX-100、５（W/V）％　アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)％ウシ血清アルブミン）0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製し
【０１３０】
（２）メンブレンアッセイ法による検出
　１人の
患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入った
チューブの先端に
ろ過フィルターを
装着し、実施例１と同じ方法で試験を実施し
　試験の結果を表９に示す。
10分後、アッセイ装置を観察し、
ｈの位置（コントロールライン）に青色の発色が認められた場合を有効とし、ｅの位置に青色の発色が認められた場合にアデノウイルス陽性と判定した。またｈの位置に発色が認められない場合を無効とし
【０１３１】
【表９】
【０１３２】
結果の説明
アデノウイルス陽性：PCRにてアデノウイルス遺伝子が検出された検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にアデノウイルス陽性と判定された場合
陰性：PCRにてアデノウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際に陰性と判定された場合
非特異：試験した際にPCRにて検体からアデノウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にアデノウイルス陽性であると判定された場合
無効：メンブレンアッセイ法にてｈの位置に発色が認められなかった場合
【０１３３】
　簡易メンブレンアッセイにおいて咽頭拭い液から調製した検体試料を、焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターでろ過することにより、目詰まりによる無効や偽陽性を防ぐことが判明した。」
イ　引用文献１に記載された発明
（ア）上記（引１ａ）より、引用文献１には、「本発明の方法についてより具体的な手順の一例」として、
「メンブレン上に、被検出物に特異的に結合する検出試薬である標識物質を滴下等により添加し、捕捉試薬／被検出物／標識物質の複合体を形成させ、
　標識物質をあらかじめアッセイ装置に組み込んでおく場合、検体試料を含む浮遊液をアッセイ装置に添加することにより、該浮遊液がアッセイ装置上を流れ、検出試薬を含むパッド部分に到達すると、検出試薬が前記浮遊液に溶解し、被検体とともにメンブレンに到達し、メンブレンの捕捉試薬との間で複合体を形成し、
　複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中の被検出物の有無を測定する手順」
が記載されている。
（イ）上記（引１ｄ）及び（引１ｅ）には、実施例１の「ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる鼻腔吸引液中のインフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出１」の検出方法として、「検体試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後」、「インフルエンザ及びRSウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸し」「10分後、アッセイ装置を観察し」、「ｈの位置（コントロールライン）に発色が認められた場合を有効とし、ｅの位置に標識に用いた着色ラテックスの色調の発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性」、「いずれの位置にも発色が認められない場合は陰性と判定し」、「ｈの位置に発色が認められない場合を無効と」する検出方法が記載されている。
（ウ）上記（引１ｆ）には、「ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる咽頭拭い液中のアデノウイルスの検出」方法として、以下の方法が記載されている。
「ヒトアデノウイルスのヘキソン蛋白のアミノ酸配列の一部を合成したポリペプチドから、２種類の精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体を作成し、
　抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち１種類を緩衝液で希釈し、青色ポリスチレンラテックス粒子と混合し、反応させ、洗浄後、最終浮遊液中に浮遊し、超音波分散装置にかけ、ラテックス粒子を分散させ、
　作製されたラテックス粒子標識抗体をセルロース不織布全面に噴霧し、乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製し、
　標識に用いなかった精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を、固相液に透析し、透析後にろ過を行い、固相液で希釈して固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を調製し、
　メンブレンは、ニトロセルロースメンブレンシートを用い、その長軸側の一端から６mm離れたｅの位置に固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を線状に塗布し、22mm離れたｈの位置に抗マウスIgG抗体を線状に塗布し、塗布後、乾燥し、
　ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを幅15mm×長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２mm重なる様に配置して貼り付け、さらに幅23mm×長さ10cmのセルロースろ紙をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッドとし、
　幅30mm×長さ10cmのセルロースろ紙をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッドとして
　メンブレンアッセイ装置を作製し、
　アデノウイルス遺伝子が検出された患者から採取した咽頭拭い液をチューブ内に分注した検体浮遊液（20mM MES緩衝液（pH6.0）、１（W/V）％ TritonX-100、５（W/V）％　アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)％ウシ血清アルブミン）0.3mL中にそれぞれ浮遊させ、検体試料を調製し、
　患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入ったチューブの先端にろ過フィルターを装着し、実施例１と同じ方法で試験を実施し、
　10分後、アッセイ装置を観察し、ｈの位置（コントロールライン）に青色の発色が認められた場合を有効とし、ｅの位置に青色の発色が認められた場合にアデノウイルス陽性と判定し、
　またｈの位置に発色が認められない場合を無効とする
　ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる咽頭拭い液中のアデノウイルスの検出方法」
（エ）上記（イ）に記載された実施例１の「ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる鼻腔吸引液中のインフルエンザウイルス及びRSウイルスの検出１」の検出方法を踏まえると、上記ｃの「患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入ったチューブの先端にろ過フィルターを装着し、実施例１と同じ方法で試験を実施」することは、「患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入ったチューブの先端にろ過フィルターを装着し、検体試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後、前記メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸して試験を実施」することであるといえる。
　また、上記（ウ）の「メンブレンアッセイ装置」は、「ラテックス粒子を分散させ」た「抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体」である「ラテックス粒子標識抗体」を含有する「セルロース不織布」である「ラテックス粒子標識抗体乾燥パッド」が、「メンブレンの上面に」「貼り付け」られたものであることから、上記（ア）の「本発明の方法についてより具体的な手順の一例」の「標識物質をあらかじめアッセイ装置に組み込んでおく場合」に相当する。この場合、上記（ア）の手順が、「検体試料を含む浮遊液をアッセイ装置に添加することにより、該浮遊液がアッセイ装置上を流れ、検出試薬を含むパッド部分に到達すると、検出試薬が前記浮遊液に溶解し、被検体とともにメンブレンに到達し、メンブレンの捕捉試薬との間で複合体を形成」するものであることを踏まえると、上記「前記メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を液に浸して試験を実施」することは、「サンプル滴下パッド側」に「検体試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液」を滴下することにより、「検体試料」中の、「TritonX-100」を含む「検体浮遊液」が「メンブレンアッセイ装置」上を流れ、「検出試薬」である「ラテックス粒子標識抗体」を含む「ラテックス粒子標識抗体乾燥パッド」に到達すると、「ラテックス粒子標識抗体」が「検体浮遊液」に溶解し、「被検体」である「アデノウイルス」とともに「メンブレン」に到達し、「メンブレンの捕捉試薬」である「固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体」との間で複合体を形成することであるといえる。そして、上記（ア）における手順は、「メンブレン上に、被検出物に特異的に結合する検出試薬である標識物質を滴下等により添加し、捕捉試薬／被検出物／標識物質の複合体を形成させ」ることから、「検出試薬」である「ラテックス粒子標識抗体」／「被検出物」である「アデノウイルス」／「捕捉試薬」である「固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体」の複合体形成は、「TritonX-100」を含む「検体浮遊液」中で起こることも明らかである。
（オ）上記（ウ）の検出方法は、「ｅの位置に青色の発色が認められた場合にアデノウイルス陽性と判定し」ており、上記（ア）における手順に、「複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中の被検出物の有無を測定する」と記載されていることから、上記（ウ）の検出方法における「アデノウイルス」の検出は、「ｅの位置に」「複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中の」「アデノウイルス」「の有無を測定する」ことにより検出しているといえる。
（カ）以上のことから、引用文献１には、以下の発明（以下「引用発明」という。）が記載されている。
「ヒトアデノウイルスのヘキソン蛋白のアミノ酸配列の一部を合成したポリペプチドから、２種類の精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体を作成し、
　抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち１種類を緩衝液で希釈し、青色ポリスチレンラテックス粒子と混合し、反応させ、洗浄後、最終浮遊液中に浮遊し、超音波分散装置にかけ、ラテックス粒子を分散させ、
　作製されたラテックス粒子標識抗体をセルロース不織布全面に噴霧し、乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製し、
　標識に用いなかった精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を、固相液に透析し、透析後にろ過を行い、固相液で希釈して固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を調製し、
　メンブレンは、ニトロセルロースメンブレンシートを用い、その長軸側の一端から６mm離れたｅの位置に固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を線状に塗布し、22mm離れたｈの位置に抗マウスIgG抗体を線状に塗布し、塗布後、乾燥し、
　ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを幅15mm×長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２mm重なる様に配置して貼り付け、さらに幅23mm×長さ10cmのセルロースろ紙をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッドとし、
　幅30mm×長さ10cmのセルロースろ紙をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッドとして
　メンブレンアッセイ装置を作製し、
　アデノウイルス遺伝子が検出された患者から採取した咽頭拭い液をチューブ内に分注した検体浮遊液（20mM MES緩衝液（pH6.0）、１（W/V）％ TritonX-100、５（W/V）％　アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)％ウシ血清アルブミン）0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製し、
　患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入ったチューブの先端にろ過フィルターを装着し、検体試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液をチューブに集めた後、
　サンプル滴下パッド側に検体試料全量をろ過用ノズルに通過させてろ過したろ過液を滴下することにより、検体試料中の、TritonX-100を含む検体浮遊液がメンブレンアッセイ装置上を流れ、ラテックス粒子標識抗体を含むラテックス粒子標識抗体乾燥パッドに到達すると、ラテックス粒子標識抗体が検体浮遊液に溶解し、アデノウイルスとともにメンブレンに到達し、固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体との間で複合体を形成し、
　ラテックス粒子標識抗体／アデノウイルス／固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の複合体の形成は、TritonX-100を含む検体浮遊液中で起こり、
　10分後、アッセイ装置を観察し、
　ｅの位置に複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中のアデノウイルスの有無を測定する
　ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる咽頭拭い液中のアデノウイルスの検出方法」
（２）引用文献２
　引用文献２には、以下の事項が記載されている。
（引２ａ）「【００２０】
　糞便に由来する検体を、ｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた、Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液、Ａｌａ−ＨＣｌ緩衝液またはＳｅｒ−ＨＣｌ緩衝液で懸濁する工程においては、前処理した検体の目的成分を測定する際における非特異的発光の防止効果を上げるために、また、当該測定において免疫学的反応を使用する場合は免疫反応の感度を上げるために、界面活性剤を含んでもよい。
　界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、
非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃなどが挙げられる
　界面活性剤は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい。
【００２１】
　糞便に由来する検体を、ｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた、Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液、Ａｌａ−ＨＣｌ緩衝液またはＳｅｒ−ＨＣｌ緩衝液で懸濁する工程においては、
前処理した検体の目的成分を測定する際において免疫学的反応を使用する場合は、前記検体を懸濁する際に、抗原が該懸濁液を入れる容器の表面へ吸着することを防止するために、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んでも良い。
　
これらの試薬は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい
（引２ｂ）「【００２９】
　当該実施形態における検体前処理方法については、上記で詳しく説明したとおりである。
　また、当該実施形態における目的成分測定方法としては、特に限定されないが、例えば、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む酵素免疫測定法が例示できる。この測定法は、特開２００１−２３５４７１号公報（特許文献１）などで公知である。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（引２ｃ）「【００３３】
　（実施例）
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（実験１）ビオチン標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）１　ｍｇとビオチンアミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２５℃で４時間反応させ、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ−４（ミリポア社製）を用いて分画し、第１抗体液を調製した。
（実験２）ＡＬＰ標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）０．１　ｍｇをＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　-　ＳＨ（同人化学社製）を用いて、第２抗体液を調製した。
（実験３）ロタウイルス抗原測定の実施
　
症状から明らかにロタウイルス感染症である人より糞便を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のロタウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社　商品名ＢＤ　Ｒｏｔａ／Ａｄｅｎｏ　エグザマンＴＭ　スティック）でロタウイルス感染症陽性であることを確認できた糞便を使用し（５２例）、ロタウイルス抗原を測定した。検体抽出液としては、０．１５重量％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ナカライテスク社製）、０．１重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク社製）、１重量％　ＢＳＡを含む溶液を用い、糞便を前記検体抽出液に懸濁したものを検体とした。
（３）甲５号証
ア　甲５号証に記載された事項
　甲５号証（特開２００６−０４７２５５号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲５ａ）「【００１９】
　前記界面活性剤としては非イオン界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トウィーン系界面活性剤）およびポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（トリトン系界面活性剤）が挙げられ、最も典型的にはTween20およびTritonX-100が例示される。なお、かかる界面活性剤を特異的結合対形成物質同士の反応（例えば、抗原抗体反応、相補的核酸同士の反応など）の反応液に存在させると、ブランク値を低下させる効果を示す。さらに、固相に結合した特異的結合対の一方の物質と遊離の他方の物質による反応の前あるいは後の固液分離（洗浄等）を行なう際に、かかる界面活性剤を存在させることによってもブランク値を低下させることができる。」
（甲５ｂ）「【００２１】
　かかる本発明安定化剤は、後述の本発明ブロッキング剤としても使用することが可能であり、かかる使用を行うと、
特異的結合対形成物質を安定化させる働きを奏する非特異的吸着のブロッキング剤とすることができ、極めて有用である。
（２）本発明ブロッキング剤
　本発明ブロッキング剤は、植物由来のポリペプチドを有効成分とする、特異的結合対形成物質を用いる測定における非特異的吸着のブロッキング剤である。ここで
「ブロッキング剤」とは、特異的結合対形成物質を固着させた固相（又は担体）に対し、特異的結合対形成物質を用いて測定されるべき物質が非特異的に結合して、目的物質の測定が正確に行えなくなることを防ぐ作用を有する物質を意味する。
【００２２】
　本発明ブロッキング剤における、「植物」、「植物由来のポリペプチド」、「分解」は、上記本発明安定化剤と同様である。
【００２３】
　
本発明ブロッキング剤は、特異的結合対形成物質を用いる測定において、固相（又は担体）に特異的結合対形成物質（特異的結合タンパク質、抗体、抗原又は核酸など、特に抗体が好ましい）を固着させた後、検体中の特異的結合物質と複合体を形成する物質が固相に対して非特異的に結合するのを防止するために固相に固着させて使用される
また、本発明のブロッキング剤と特異的結合対形成物質とを含む特異的結合対形成物質を用いる測定のための組成物としては、例えば、特異的結合対形成物質、特に、抗体、抗原又は核酸が固着された固相の該特異的結合対形成物質が結合していない部分に、本発明のブロッキング剤を固着又は被覆させて、該特異的結合対形成物質が該部分に非特異的に結合することを防止できるようにしたものが挙げられる。
更に、上記組成物としては、例えば、本発明のブロッキング剤と、前記抗体、抗原又は核酸に免疫学的測定、核酸プローブ又は核酸チップに使用される標識物質が結合した複合体とを含む組成物であってもよい。
【００２４】
　本発明ブロッキング剤を、例えばプレートに固着させる場合には、以下の方法に従って行うことができる。すなわち、抗体などを固着させたプレートを、例えば、PBSなどで数回程度洗浄し、その後、0.1〜10%(w/v)で本発明ブロッキング剤を含むPBSなどをプレートに分注した後、10分〜24時間、2〜40℃条件下でインキュベートする。そして、インキュベート後に溶液を除去し、数回PBS（Tween20等の非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい）等で洗浄する。かかる操作により本発明ブロッキング剤が固着したプレートを調製することが可能である。かかる抗体などを固着させたプレートは、本発明ブロッキング剤でインキュベートし、溶液を捨てた後、そのまま乾燥させて抗体と特異的に結合する抗原等の測定用のキットの構成要素としてキットに加えることが可能であり、固相への非特異的結合を防止できるだけでなく、抗体の品質保持期限を大幅に延ばすことが可能となるため極めて有用である。この様なキットには、更に上述の本発明安定化剤を構成要素として加えることも可能である。」
（甲５ｃ）「【実施例１】
【００２５】
　本発明安定化剤の酵素標識抗体に対する安定化作用の検討
１）方法
（１）酵素標識抗体溶液の調製及び保存
　表1に記載の
試験物質（安定化剤）を0.15mol/l塩化ナトリウム、0.05%Tween20及び防腐剤として0.05%プロクリン300を含む50mmol/l トリス塩酸緩衝液（Tris-HCl：pH7.3〜7.7）（以下、T-TBSと記載する）で、所定の濃度に調整した後、0.22μmフィルターで濾過した溶液を試験物質溶液とした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG抗体（以下、HRP-抗マウスIgG抗体と記載）（Jackson社製）を上記試験物質溶液で10000倍希釈した溶液を
用い
（２）酵素標識抗体の活性測定方法
(i)固相化ヤギ抗マウスIgG抗体プレートの作成
　
ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson社製）をリン酸緩衝生理食塩水〔pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、PBS(-)と記載する〕で、20μg/mLに希釈し、この溶液50μLずつをヌンクイムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク社製）の各ウェルに加え、4℃で14〜18時間保存することにより、均一にコーティングし
ウェルのヤギ抗マウスIgG抗体でコーティングされていない部分をブロッキングするためのブロッキング物質として，2%ウシ血清アルブミン（BSA）（生化学工業株式会社製）及び防腐剤として0.05%プロクリン300を含むPBS(-)溶液を加え、室温で2時間静置した。静置後、このプレートを洗浄液（T-TBS）で4回洗浄して、所望する固相化抗マウスIgG抗体プレートを得た。
(ii)酵素標識抗体の活性測定方法
　上記洗浄後、上記(i)において作成した
固相化ヤギ抗マウスIgG抗体プレートの各ウェルに、1%BSAを含むT-TBS（以下、反応液と記載する）を100μL ずつ加え、続いて、所定の各ウェルに反応液で100ng/mLに調製したマウスIgGを20μLあるいはブランクとして反応液のみを20μL加え、37℃で60分間静置して抗原抗体反応を行った
【００２６】
　この反応終了後、T-TBSで各ウェルを4回洗浄した後、上記（１）で調製した試験物質（安定化剤）を含む各HRP-抗マウスIgG抗体溶液を各ウェルに100μL加え、これを37℃で60分間静置して反応させた。
【００２７】
　反応終了後、このプレートをT-TBSで4回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン（TMB）溶液（モス社製）を100μL 加え、37℃で30分間反応させ、発色させた。プレートに1N-HClを100μL 加えて反応を停止させ、TMBの分解による着色液の波長450nmの吸光度（対照波長630nm）をウェルリーダー（商標名）SK-603（生化学工業株式会社販売）で測定した。
【００２８】
　HRP-抗マウスIgGの反応性は、マウスIgG100ng/mLにおける吸光度からブランクにおける吸光度を減算した吸光度差（以下、吸光度差と記載する）で評価した。HRP-抗マウスIgGの安定性は、各試験物質ともに、試験溶液調製当日（day0）における吸光度差に対する各試験日における吸光度差の百分率（残存活性、%）で示した。対照品であるBSAでの残存活性の-10%を許容範囲とし、それ以上の残存活性を有する物質をBSAと同等以上の安定化効果ありと評価した。結果を表1に示した。なお、BSAは生化学工業株式会社販売、ゼラチン、脱脂粉乳はナカライテスク社販売、カゼインは和光純薬工業株式会社販売を使用し、ダイズ（大豆）タンパク質分解物、コムギ（小麦）タンパク質分解物、ジャガイモタンパク質分解物及びトウモロコシタンパク質分解物は、それぞれ、前記の２）ダイズタンパク質ペプトン、３）ダイズタンパク質酵素分解物、４）ダイズタンパク質酸分解物、５）コムギタンパク質加水分解物、６）コムギタンパク質加水分解物誘導体、７）ジャガイモタンパク質加水分解物、８）トウモロコシタンパク質加水分解物を使用した。
【００２９】
　２）結果
　37℃、12日間保存において、HRP-抗マウスIgG抗体の残存活性は、無添加では4%、BSA添加では68%であった。BSA以外によく使用される動物性タンパクについては、カゼインが69%と良好であったが、ゼラチンは14％、脱脂粉乳は17%と不良であった。」
イ　甲５号証に記載された技術事項
　上記（甲５ｃ）より、甲５号証には、以下の技術事項（以下「技術事項５」という。）が記載されている。
「試験物質（安定化剤）を0.15mol/l塩化ナトリウム、0.05%Tween20及び防腐剤として0.05%プロクリン300を含む50mmol/lトリス塩酸緩衝液（Tris-HCl：pH7.3〜7.7）（以下、T-TBSと記載する）で、所定の濃度に調整した後、0.22μmフィルターで濾過した溶液を試験物質溶液とした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG抗体（以下、HRP-抗マウスIgG抗体と記載）（Jackson社製）を上記試験物質溶液で10000倍希釈した溶液を用い、
　ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson社製）をリン酸緩衝生理食塩水〔pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、PBS(-)と記載する〕で、20μg/mLに希釈し、この溶液50μLずつをヌンクイムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク社製）の各ウェルに加え、4℃で14〜18時間保存することにより、均一にコーティングし、
　ウェルのヤギ抗マウスIgG抗体でコーティングされていない部分をブロッキングするためのブロッキング物質として，2%ウシ血清アルブミン（BSA）（生化学工業株式会社製）及び防腐剤として0.05%プロクリン300を含むPBS(-)溶液を加え、室温で2時間静置し、
　静置後、このプレートを洗浄液（T-TBS）で4回洗浄して、所望する固相化抗マウスIgG抗体プレートを得、
　固相化ヤギ抗マウスIgG抗体プレートの各ウェルに、1%BSAを含むT-TBS（以下、反応液と記載する）を100μL ずつ加え、続いて、所定の各ウェルに反応液で100ng/mLに調製したマウスIgGを20μLあるいはブランクとして反応液のみを20μL加え、37℃で60分間静置して抗原抗体反応を行う方法」
２　当審の判断
（１）本件発明１について
ア　対比
　本件発明１と引用発明とを対比する。
（ア）引用発明の「アデノウイルス」は、本件発明１の「検体中の抗原」に相当する。また、本件明細書の発明の詳細な説明の段落【００３０】及び【００３１】によれば、「TritonX-100」は、ＨＬＢ値が１３．５の非イオン性界面活性剤である。そして、引用発明の「検体浮遊液」に含有させた界面活性剤である「TritonX-100」の濃度は「１（W/V）％」である。また、引用発明の「ラテックス粒子標識抗体／アデノウイルス／固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の複合体の形成」は、免疫反応により起こるものであって、該形成は「TritonX-100を含む検体浮遊液中で起こ」るものである。
　そうすると、引用発明の「ラテックス粒子標識抗体／アデノウイルス／固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の複合体の形成は」、濃度が「１（W/V）％」の「TritonX-100を含む検体浮遊液中で起こ」ることと、本件発明１の「検体中の抗原又は抗体との免疫反応を、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が０．００５〜１０重量％の濃度で存在する液相中で起こ」すこととは、「検体中の抗原又は抗体との免疫反応を」、「１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が０．００５〜１０重量％の濃度で存在する液相中で起こ」すことで共通する。
（イ）　引用発明は「検体浮遊液」に「1.0(W/V)％ウシ血清アルブミン」を含有させており、引用文献１には「検体浮遊液にはその他、非特異反応を減じる目的でウシ血清アルブミン、イムノグロブリン、カゼイン等のタンパク質、ウサギやマウス等の血清等を含有させることも可能である。」と記載されていることから、「検体浮遊液」に含有させた「1.0(W/V)％ウシ血清アルブミン」は、本件発明の「ブロッキング剤」に相当するものであるといえる。また、引用発明は、「10分後、アッセイ装置を観察し、ｅの位置に複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中のアデノウイルスの有無を測定する」ものであって、「ｅの位置」には、「固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体」が「線状に塗布」されているものである。
　すると、引用発明の「検体浮遊液」に「1.0(W/V)％ウシ血清アルブミン」を含有させ、「10分後、アッセイ装置を観察し、ｅの位置に複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中のアデノウイルスの有無を測定する」ことと、本件発明１の「次いで、あらかじめブロッキング剤を添加した固相上で測定を行うこと」とは、「次いで、ブロッキング剤とともに固相上で測定を行うこと」で共通する。
（ウ）引用発明の「ラテックス粒子標識抗体／アデノウイルス／固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の複合体」を形成し「10分後、アッセイ装置を観察し、ｅの位置に複合体中の標識物質により、複合体の存在を検出することにより、検体試料中のアデノウイルスの有無を測定する」ことは、本件発明１の「アデノウイルス抗原の免疫測定」に相当し、引用発明と本件発明１とは、「検体中の抗原又は抗体の測定がアデノウイルス抗原の免疫測定を含む」点で一致する。
（エ）以上のことから、本件発明１と引用発明とは、次の一致点及び相違点を有する。
（一致点）「検体中の抗原又は抗体との免疫反応を、１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が０．００５〜１０重量％の濃度で存在する液相中で起こし、次いで、ブロッキング剤とともに固相上で測定を行う方法であって、検体中の抗原又は抗体の測定がアデノウイルス抗原の免疫測定を含む、方法。
（相違点１）非イオン性界面活性剤及びブロッキング剤が、本件発明１は、非イオン性界面活性剤が、「ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される」ものであって、ブロッキング剤が、「固相上」に「あらかじめ」「添加」されたものであるのに対し、引用発明は、非イオン性界面活性剤が、「TritonX-100」であって、ブロッキング剤が、「検体浮遊液」に含有させたものである点。
（相違点２）本件発明が「検体中の抗原又は抗体の測定におけるブランク値の低減方法」であるのに対し、引用発明はそのような特定がない点。
イ　判断
　上記相違点１について検討する。
　技術事項５の「固相化抗マウスIgG抗体プレート」及び「2%ウシ血清アルブミン（BSA）」は、それぞれ、本件発明１の「固相」及び「ブロッキング剤」に相当する。そして、技術事項５は、「ブロッキング物質として，2%ウシ血清アルブミン（BSA）（生化学工業株式会社製）及び防腐剤として0.05%プロクリン300を含むPBS(-)溶液を加え、室温で2時間静置し、静置後、このプレートを洗浄液（T-TBS）で4回洗浄して、所望する固相化抗マウスIgG抗体プレートを得」ているから、技術事項５の「ブロッキング物質として」の「2%ウシ血清アルブミン（BSA）」は、「固相化抗マウスIgG抗体プレート」上にあらかじめ添加されているといえる。また、技術事項５は、「固相化ヤギ抗マウスIgG抗体プレートの各ウェルに、1%BSAを含むT-TBS（以下、反応液と記載する）を100μLずつ加え、続いて、所定の各ウェルに反応液で100ng/mLに調製したマウスIgGを20μLあるいはブランクとして反応液のみを20μL加え」、「37℃で60分間静置して抗原抗体反応を行う」から、技術事項５の「抗原抗体反応」は、「固相化抗マウスIgG抗体プレート」上で行うものである。
　すると、技術事項5の「抗原抗体反応」は、あらかじめ「ブロッキング物質として」の「2%ウシ血清アルブミン（BSA）」を添加した「固相化抗マウスIgG抗体プレート」上で行うものであるといえるから、技術事項５は、本件発明１の「あらかじめブロッキング剤を添加した固相上で測定を行うこと」を含んでいるといえる。
　しかしながら、技術事項５の非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トウィーン系界面活性剤）である「Tween20」であって、甲５号証の発明の詳細な説明中には、「Tween20」以外にはポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（トリトン系界面活性剤）であるTritonX-100が例示されているだけであり、非イオン性界面活性剤として、「ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される」ものについては記載されていない。
　そうすると、技術事項５は、上記相違点１に係る構成を有していないといえる。
　また、引用文献２において使用される非イオン性界面活性剤は、技術事項５と同様に、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トウィーン系界面活性剤）である「Tween20」及び「Tween20」以外にはポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（トリトン系界面活性剤）であるTritonX-100、Ｐｌｕｒｏｎｉｃが例示されているだけであって、これらは、「ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される」ものではない。そして、本件発明において「ブロッキング剤」として例示されている「ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）」を使用しているが、該「ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）」は、前処理液や検体抽出液等に添加されるものであって、あらかじめ固相上に添加されたものではない。
　そうすると、引用文献２にも、上記相違点１に係る構成が記載されているとはいえない。
　したがって、上記相違点１に係る構成は、技術事項５であるとも、引用文献２に記載された技術事項であるともいえないから、本件発明１は、相違点２について検討するまでもなく、引用発明、技術事項５及び引用文献２に記載された技術事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
（２）本件発明２、４及び６〜８について
　本件発明２、４及び６〜８は、本件発明１に対して、さらに技術的事項を追加したものである。よって、上記（１）に示した理由と同様の理由により、本件発明２、４及び６〜８は、引用発明、引用文献２及び甲５号証に記載された技術事項に基づいて当業者が容易になし得るものではない。
ウ　小括
　以上のとおり、本件発明１、２、４及び６〜８は、引用発明、技術事項５及び引用文献２に記載された技術事項に基づいて当業者が容易になし得るものではない。
第６　取消理由通知（決定の予告）において採用しなかった特許異議申立理由について
１　取消理由通知において採用しなかった特許異議申立理由
　申立人は、特許異議申立書において、訂正前の特許請求の範囲に関し、請求項１〜８に係る発明は、甲１号証に記載された発明及び甲２〜１２号証に記載された技術事項に基づいて、当業者が容易に想到できる旨、また、請求項１〜８に係る発明は、発明の詳細な説明に記載された発明ではない旨主張する。
２　進歩性について
（１）各甲号証の記載
ア　甲１号証、甲５号証及び甲９号証
　甲１号証及び甲９号証は、それぞれ、当審の取消理由通知書（決定の予告）に記載した取消理由の引用文献２及び引用文献１で有り、各甲号証の記載事項等は、上記第４の２（２）ア〜ウで指摘したとおりである。
イ　甲２号証に記載された事項
　甲２号証（特開２０１０−１０１６７３号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲２ａ）「【実施例１】
【００３２】
（１）精製抗Biotin-（AC5）2-OSuポリクローナル抗体の作製
　２３．３ｍｇ／ｍＬのKLH(CALBIOCHEM社製) １００μＬに２８ｍｇ／ｍＬのBiotin-（AC5）2-OSu(同仁化学社製)(以下、長鎖ビオチンと表記する。）を４０μＬ添加し２５℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い未標識のビオチンを除去し、長鎖ビオチン標識KLHを得た。
　得られた長鎖ビオチン標識KLHを２．０ｍｇ／ｍＬの濃度でヤギに１週間ごとに計４回免疫を行った。最終免疫実施日の１週間後に全採血を行い、抗血清を得た。
　得られた抗血清はProtein Gカラム及びKLH結合アフィニテイーカラムを用いて精製を行
い、精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体を得た。
【００３３】
（２）精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体固定化クロマトグラフィー媒体の作製
　ニトロセルロースから成る、幅が１６ｍｍの膜担体（ミリポア社製：ＨＦ１２０）に、塗布機（BioDot社製）を用いて、実施例１（１）で作製した精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体をリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で３ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈後塗布し、５０℃で１時間乾燥させた。その後、一晩室温で乾燥させた。
【００３４】
（３）Biotin-OSu標識タンパク質の作製
　０．１５ＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと略すこともある）に溶解した１．０ｍｇ／ｍＬのヤケヒョウヒダニ抽出物（ＬＳＬ社製）　１ｍＬに対して、ＰＢＳに溶解した２８ｍｇ／ｍＬのBiotin-OSu (同仁化学社製)(以下、短鎖ビオチンと表記する)を２０μＬ添加し２５℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い未標識のビオチンを除去し、短鎖ビオチン標識ヤケヒョウヒダニ抽出物を得た。
【００３５】
（４）標識物質溶液の作製
　金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：　平均粒子径４０　ｎｍ）０．５ｍＬに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈したマウス由来の抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。次いで、１０重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬ加え、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。上清を除去した後、１重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．１ｍＬを加え、標識物質溶液とした。
【００３６】
（５）イムノクロマトグラフィー用試験片の作製
　上記作製した短鎖ビオチン標識タンパク質及び標識物質溶液の各々を幅が１６ｍｍのグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、短鎖ビオチン標識タンパク質保持部材及び標識保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製したクロマトグラフィー媒体、短鎖ビオチン標識タンパク質保持部材、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料、不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。
【００３７】
（６）測定
　上記作製したイムノクロマトグラフィー用試験片を用いて、以下の方法で陰性検体及び陽性検体中のヤケヒョウヒダニに対する特異ＩｇＥ抗体を測定した。
　０．３％のTritonX-100、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）から成る展開溶媒を作製した。陰性検体（０．１５ＩＵ／ｍＬ）、陽性検体（２．２４ＩＵ／ｍＬ）を試料とし、各試料２０μＬをイムノクロマトグラフィー用試験片のサンプルパッド上に載せ、次いで展開溶媒を８０μＬ載せて展開させ、１５分後にイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製）を用いて判定部位の発色強度を数値化した。陰性検体及び陽性検体の発色値よりＳ／Ｎ比を求めた。
　図１に結果を示す。」
ウ　甲３号証に記載された事項
　甲３号証（特開平０６−０６６７９８号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲３ａ）「【００１９】本発明の特徴は、上記免疫反応を行なう際に、１２〜１９のＨＬＢ値を有する非イオン界面活性剤を１．５〜６ w/w％の濃度となるように抗原−抗体反応系に存在させる点にある。
【００２０】非イオン界面活性剤としては、ＨＬＢ値が１２〜１９であれば特に限定されないが、好ましくは、ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤及び多価アルコール系非イオン界面活性剤からなる群から選ばれる化合物が挙げられる。
【００２１】たとえば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（具体的には、ノニオンＮＳ−２０８．５、ノニオンＮＳ−２２０、及びノニオンＮＳ−２７０（日本油脂製）など）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（具体的には、ノニオンＥ−２１５（日本油脂製）など）、ポリオキシエチレンモノステアレート（具体的には、ノニオンＳ−１５．４、及びノニオンＳ−４０（日本油脂製）など）、並びにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（具体的には、ツウィーン２０など）、等である。
【００２２】本発明で使用する非イオン界面活性剤の免疫反応系への添加量は、１．５〜６w/w％であるが、好ましくは、２〜５ w/w％である。
【００２３】添加量が１．５ w/w％未満においては、免疫反応容器の汚染を防止し、かつ免疫反応を促進させる効果が得られない。また、６ w/w％を越えると、かえって非特異反応によるブランク値の上昇をきたすことになる。」
（甲３ｂ）「【００２８】
実施例１
各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原の酵素免疫測定法により調べた。
【００２９】免疫反応用緩衝液（１％牛血清アルブミン含有リン酸生理食塩水）およびペルオキシダーゼ標識ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗体を免疫反応用緩衝液で希釈した酵素標識抗体液に、各種界面活性剤を３ w/w％になるように添加した。
【００３０】測定操作は以下のように行った。
【００３１】
サンドイッチ法によるＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原の酵素免疫測定法
反応用トレイにＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗体が結合した直径６．２５mmのポリスチレンビーズを入れ、これに０ｕ／ml，２．５ｕ／mlおよび１００ｕ／mlの標準抗原溶液を５０μｌ採取し、免疫反応用緩衝液を２００μｌ加え、３７℃で２時間の免疫反応を行った。１mlの生理食塩水で３回ビーズを洗浄し、次いで免疫反応用緩衝液と同一の界面活性剤を含有する酵素標識抗体液２５０μｌを加えて室温で１時間反応した。さらに、ビーズを１mlの生理食塩水で３回洗浄したのち別の試験管に移し、２．８７ｍＭ　２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）および０．０１４％過酸化水素を含む発色液３００μｌを加えて室温で１時間反応した。その後、０．１４mMアジ化ナトリウムを含む反応停止液を２ml加えて精製水を対照に４２０nmの吸光度を測定した。
【００３２】測定は５回の多重測定で行い、吸光度の平均値、変動係数（ＣＶ）および０ｕ／mlの場合の吸光度に対する２．５ｕ／mlの場合の吸光度の比（ＳＮ比）を求め比較した。
【００３３】対照として界面活性剤無添加および免疫反応促進効果の知られるポリオキシエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加した系でも同様の測定を行った。
【００３４】結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】表１から明らかなごとく、１２から１９のＨＬＢ値を有する非イオン界面活性剤を添加することによって、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原濃度が０ｕ／mlの場合の発色は低くなり、２．５および１００ｕ／mlの場合の発色は高くなっており、変動係数も小さくなった。またＳＮ比も対照に比べ大きくなった。
【００３７】このことは免疫反応を促進しながらバックグラウンドは下がり、低値における免疫反応の測定感度及び測定精度は向上したことを示している。
【００３８】
実施例２
界面活性剤濃度の影響をサンドイッチ法によるＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原の酵素免疫測定法により調べた。
【００３９】界面活性剤としてポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＨＬＢ値１８．７）およびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＨＬＢ値１６．７）を用い、実施例１と同一の免疫反応用緩衝液および酵素標識抗体液に０．１から８．０ w/w％になるように添加して実施例１と同様の測定操作で測定した。
【００４０】測定は５回の多重測定で行い、吸光度の平均値、変動係数（ＣＶ）を求め比較した。
【００４１】対照として界面活性剤無添加及びポリオキシエチレングリコール２００００を添加した系でも同様の測定を行った。
【００４２】結果を表２に示す。
【００４３】低濃度の界面活性剤添加ではバックグラウンドを下げる効果も免疫反応の促進効果も十分でなく、高濃度では逆にバックグラウンドが高くなることが判った。１．５から６．０ w/w％の添加で良好な効果が得られた。
【００４４】
【表２】
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　」
エ　甲４号証に記載された事項
　甲４号証（特開昭５８−１８７８６２号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲４ａ）「本発明に用いられる合成界面活性剤としては、非イオン，アニオン，カチオンおよび両性界面活性剤があげられる。
非イオン界面活性剤としては、（ポリ）オキシアルキレン系非イオン界面活性剤（アルキロールアミド，ポリオキシアルキレンアルキルまたはアルキルアリールエーテル，ポリオキシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンポリオール，ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル，ポリオキシアルキレンアルキルアミンなど），および多価アルコール系非イオン界面活性剤（多価アルコール脂肪酸エステルなど）があげられる。具体的には下記のとおりである。」
（甲４ｂ）「実施例１
各種界面活性剤を免疫反応媒体に加え，サンドウィッチ法によるインシュリンの酵素免疫法を行ないその効果を調べた。
免疫反応媒体として，免疫反応用緩衝液（０．８５％ＮａＣｌ，０．１％牛血清アルブミン，含有リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．３）に界面活性剤を添加した，下記４種類の免疫反応媒体を調製した。
免疫反応媒体Ａ；０．１％ポリオキシエチレン（付加モル数１０）オクチルフェニルエーテル含有免疫反応用緩衝液
免疫反応媒体Ｂ；０．１％ポリオキシエチレン（付加モル数２０）ソルビタンラウリン酸エステル含有免疫反応用緩衝液
免疫反応媒体Ｃ；０．１％ポリオキシエチレン（付加モル数４）ラウリルエーテル硫酸エステルトリエタノールアミン塩含有免疫反応用緩衝液
免疫反応媒体Ｄ；０．１％ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド含有免疫反応用緩衝液
サンドウィッチ法によるインシュリンの酵素免疫測定法：上記の免疫反応媒体（Ａ〜Ｄ）０．４５ｍｌにインシュリン含有液（インシュリン濃度０μＵ／ｍｌ，１０μＵ／ｍｌ，３２０μＵ／ｍｌの３種類）５０μｌを加え，更にガラスビーズ−抗インシュリン抗体結合物（φ６．６ｍｍ）を１ケ加えて，３７℃で１時間振とうし免疫反応を行なった。（各インシュリン濃度について，１０回多重測定を行なう。）振とう終了後，脱イオン水にてガラスビーズを２回洗浄し，次いで各免疫反応媒体（Ａ〜Ｄ）で希釈した抗インシュリン抗体−ペルオキシダーゼ複合体０．５ｍｌを加えて，３７℃で１時間振とうし免疫反応を行なった。反応終了後，ガラスビーズを脱イオン水で２回洗浄し，次いでガラスビーズに結合したペルオキシダーゼ活性を過酸化水素−Ｏフェニレンジアミン系の発色剤を用いて４９２ｎｍの吸光度にて測定した。各濃度のインシュリン含有液の１０回の多重測定値の平均，変動係数及びゼロ比（０μＵ／ｍｌの測定値に対する１０μＵ／ｍｌの測定値の比）を比較した。
結果を表−１に示す。なお，界面活性剤無添加の免疫反応媒体の系を対照として示す。
表−１から明らかな如く，免疫反応媒体Ａ〜Ｄの様に，界面活性剤を免疫反応系に添加することによって，各インシュリン濃度での変動係数が小さくなり，またゼロ比も無添加の対照に比べて大きくなった。このことは低濃度領域での測定感度，測定精度が向上したことを示している。」
オ　甲６号証に記載された事項
　甲６号証（特開２００５−２９１７８３号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲６ａ）「【０００９】
　本発明の検体浮遊液調製用媒体組成物を用いて検体浮遊液を調製し、免疫測定法に供すると、測定時の疑似反応の要因となる患者検体由来成分の非特異的な吸着やバックグラウンドの発生を抑えることができ、非特異的反応に起因する疑似陽性反応を有意に防止するすることができる。」
（甲６ｂ）「【００１２】
　上記イオン性界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、組成物全体の重量に対し0.01〜10w/v％の範囲であり、好ましくは0.5〜5w/v%である。
【００１３】
　本発明の組成物は、上記イオン性界面活性剤に加え、さらに非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。非イオン性界面活性剤としては、HLB値が１０以上、さらに好ましくはHLB値が１３以上のポリオキシエチレン系界面活性剤を好ましく用いることができる。HLB値の上限は特にないが、通常、HLB値は、２０以下である。ポリオキシエチレン系界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができ、より具体的には、ポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（商品名「Triton」シリーズ）、特にTriton X-100(商品名、HLB値13.5)、Nonidet P-40（商品名、HLB値13.1）、TritonX-102（商品名、HLB14.6）、TritonX-165（商品名、HLB15.8）、TritonX-405（商品名、HLB17.9）、ポリオキシエチレンp-t-ノニルフェニルエーテル（商品名「TritonN」シリーズ）、特にTritonN-101（商品名、HLB13.5）、TritonN-111（商品名、HLB13.8）、TritonN-150（商品名、HLB15.0）等を挙げることができる。非イオン性界面活性剤は、単独でも２種以上を混合して用いることもできる。
【００１４】
　上記した非イオン性界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、組成物全体の重量に対し0.01〜10w/v％の範囲であり、好ましくは0.5〜5w/v%である。」
（甲６ｃ）「【００１８】
　本発明の組成物は、上記した成分に加え、従来の検体浮遊液調製用媒体組成物と同様、緩衝剤を含有することが好ましい。緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤等を挙げることができる。また、さらに他の成分として、従来の検体浮遊液調製用媒体組成物と同様、ウシ血清アルブミン(BSA)等のタンパク質成分（含有量は通常0.01w/v%〜10w/v%）、変性剤（例えば、尿素、グアニジン塩酸、チオシアン酸塩等、含有量は通常0.01M〜8M）、高分子ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロースなどの可溶性セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等）、塩基性化合物（例えば、スペルミン、スペルミジン、硫酸プロタミン等、含有量は通常0.01w/v%〜3w/v%）等を任意的に含んでいてもよい。」
カ　甲７号証に記載された事項
　甲７号証（特開２００５−２９１７８０号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲７ａ）「【０００９】
　本発明の検体浮遊液調製用媒体組成物を用いて検体浮遊液を調製し、免疫測定法に供すると、測定時の疑似反応の要因となる患者検体由来成分の非特異的な吸着やバックグラウンドの発生を抑えることができ、非特異的反応に起因する疑似陽性反応を有意に防止するすることができる。」
（甲７ｂ）「【００１４】
　非イオン性界面活性剤としては、HLB値が１０以上、さらに好ましくはHLB値が１３以上のポリオキシエチレン系界面活性剤を好ましく用いることができる。HLB値の上限は特にないが、通常、HLB値は、２０以下である。ポリオキシエチレン系界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができ、より具体的には、ポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（商品名「Triton」シリーズ）、特にTriton X-100(商品名、HLB値13.5)、Nonidet P-40(商品名、HLB値13.1)、TritonX-102（商品名、HLB14.6）、TritonX-165（商品名、HLB15.8）、TritonX-405（商品名、HLB17.9）、ポリオキシエチレンp-t-ノニルフェニルエーテル（商品名「TritonN」シリーズ）、特にTritonN-101（商品名、HLB13.5）、TritonN-111（商品名、HLB13.8）、TritonN-150（商品名、HLB15.0）等を挙げることができる。非イオン性界面活性剤は、単独でも２種以上を混合して用いることもできる。」
（甲７ｃ）「【００１６】
　上記した非イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤は、いずれか一方のみを配合してもよいし、両者を配合してもよい。非イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤含有量は、特に限定されないが、組成物全体の重量に対しそれぞれ0.01〜10w/v％の範囲であり、好ましくは0.5〜5w/v%である。
【００１７】
　本発明の組成物の溶媒は、従来の検体浮遊液調製用媒体組成物と同様、通常、水である。
【００１８】
　本発明の組成物は、上記した成分に加え、従来の検体浮遊液調製用媒体組成物と同様、緩衝剤を含有することが好ましい。緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤等を挙げることができる。また、さらに他の成分として、従来の検体浮遊液調製用媒体組成物と同様、ウシ血清アルブミン(BSA)等のタンパク質成分（含有量は通常0.01w/v%〜10w/v%）、変性剤（例えば、尿素、グアニジン塩酸、チオシアン酸塩等、含有量は通常0.01M〜8M）、高分子ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロースなどの可溶性セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等）、塩基性化合物（例えば、スペルミン、スペルミジン、硫酸プロタミン等、含有量は通常0.01w/v%〜3w/v%）等を任意的に含んでいてもよい。」
キ　甲８号証に記載された事項
　甲８号証（特開平０２−２８７２５７号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲８ａ）「本発明で使用し得る非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルアルコールエーテル、ポリオキシエチレンモノステアレート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどのポリオキシエチレン誘導体が挙げられ、親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値１１〜１７のものが特に好ましい。代表的な例としては、ＨＬＢ値が１６．７であるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を挙げることができる。
非イオン性界面活性剤の使用量は、用いる非イオン性界面活性剤の種類によって多少異なるが、反応系に対して、０．０１〜１重量％、特に０．１〜１重量％が好ましい。但し、過剰の界面活性剤は抗体とＧ−ＣＳＦの結合をかえって阻害することとなり、また非特異的な発色を強めるので、非イオン性界面活性剤は１重量％以下で使用することが望ましい。」
（甲８ｂ）「ペルオキシダーゼ標識−Ｆａｂ′を用いたヒトＧ−ＣＳＦの測定
（１）１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中での測定１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）でヒトＧ−ＣＳＦを希釈して調製した標準液（緩衝液系標準液）を実施例３で製造したマイクロタイタープレートにそれぞれ１ウェルあたり５０μｌずつ分注した。４℃で１２時間放置後、反応液を除去し、ＰＢＳで５回洗浄した。実施例２で調製したペルオキシダーゼ標識−Ｆａｂ′を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で２時間放置後、液を捨て、ＰＢＳで５回洗浄した。０．４ｍｇ／ｍｌ　Ｏ−フェニレンジアミン−０．００６％過酸化水素水を含む０．１％クエン酸緩衝液ｐＨ５．２を各ウェルに１００μｌ分注後、室温で１０分間反応させた。１Ｎ　ＨＣｌ５０μｌを加えて反応を停止させ、６００ｎｍを対照に４９２ｎｍの吸光度を測定した。
４９２ｎｍの吸光度を縦軸に、ヒトＧ−ＣＳＦの濃度を横軸に取り、片対数グラフを用いて標準曲線を作成した（第１図参照）。」
（甲８ｃ）「（３）非イオン性界面活性剤を添加した健常人の血漿中での測定
血漿中に種々の非イオン性界面活性剤を添加し、血漿中の干渉物質の影響を出来る限り小さくする条件についての検討を行なった。健常人血漿標準液に非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０（ＰＯＬＹ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＷＡＲＲＩＮＧＴＯＮ，ＰＡ社製）、Ｔｗｅｅｎ８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ＨＬＢ＝１１．０、純正化学（株）社製）、Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレンラウリルアルコールエーテル、ＨＬＢ＝１６．９、ナカライテスク（株）社製）を１０％（Ｖ／Ｖ）添加し、実施例４（１）と同様に測定した。結果を第３図に示す。血漿に非イオン性界面活性剤を添加すると緩衝液系標準液における検量線とよく一致するようになることが分る。なお、非イオン性界面活性剤の添加量の検討として、種々の濃度のＴｗｅｅｎ２０を血漿体積に対し１０％（Ｖ／Ｖ）添加し、実施例４（１）の方法で測定した。血漿中のＴｗｅｅｎ２０の濃度を上げていくと、測定結果は、次第に緩衝液系標準液における検量線に近付いていき、０．１〜１％Ｔｗｅｅｎ２０の添加条件で最もよい結果が得られた（第４図参照）。１重量％より多量のＴｗｅｅｎ２０の添加は非特異的反応を起こしたり、抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体との結合を阻害するので好ましくなかった。また、非イオン性界面活性剤の至適濃度は、各非イオン性界面活性剤ごとに異なっていた。」
ク　甲１０号証に記載された事項
　甲１０号証（特開２００９−０３６７８１号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲１０ａ）「【００５８】
　検体浮遊液には、通常、塩及びpHを一定に維持するための緩衝剤が含まれる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液等を使用することができ、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等が挙げられる。さらに検体浮遊液には特異的な凝集反応を阻害しない範囲で非特異反応を減じる目的で界面活性剤を含有させることが可能である。界面活性剤としては、Triton X-100（商品名）：ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル、Tween 20：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Tween 80：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Nonidet P-40：ノニデット　P-40、ZWITTERGENT 3-14：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト、CHAPS：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等あるいはこれらを２種類以上混合したものを用いることができる。
【００５９】
　検体浮遊液にはその他、非特異反応を減じる目的でウシ血清アルブミン、イムノグロブリン、カゼイン等のタンパク質、ウサギやマウス等の血清等を含有させることも可能である。」
（甲１０ｂ）「【０１２３】
［実施例５］　ラテラルフロー式イムノクロマトアッセイによる咽頭拭い液中のアデノウイルスの検出
１．モノクローナル抗体の作製
（１）アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体（マウス）
　ヒトアデノウイルスのヘキソン蛋白のアミノ酸配列の一部を合成したポリペプチドを免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al.,Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（P3×63）と融合した。
【０１２４】
　得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、アデノウイルスヘキソン蛋白抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。
【０１２５】
　取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー（アマシャム社製）を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、２種類の精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白モノクローナル抗体を得た。
【０１２６】
２．標識抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体（標識物質）の作製
（１）ラテックス粒子標識抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の調製
　抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち１種類を50mMMES（2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate；同仁化学社）緩衝液（pH6.0）溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(W/V)％青色ポリスチレンラテックス粒子（粒径0.45μm、表面官能基はカルボキシル基、官能基密度65Å2/COOH基；Magsphere社）と液量比40：１になるように混合し、反応させた。次に、１(W/V)％のEDAC（N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidehydrochloride；Sigma社）を最終濃度0.1％になるように添加した後、２時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液（5mM Tris, 0.04(W/V)% BSA（ウシ血清アルブミン）, 0.4Mトレハロース,0.2(V/V)% TritonX-100）20mL中に浮遊し、超音波分散装置（オリンパス社）にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
【０１２７】
３．ラテックス粒子標識抗体の乾燥化
（１）ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの作製
　２．で作製したラテックス粒子標識抗体を陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社）を用いて８μL/cmの塗布量でリール状に巻いた幅15mmのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、50℃の温風を１分間吹きつけて乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製した。
【０１２８】
４．メンブレン固相用抗体の調製
（１）固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体の調製
　上記１．（１）で作製した精製抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液（10mM Tris-HCl(pH7.5)）に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=4.0になるように固相液で希釈して固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を調製した。
【０１２９】
５．アデノウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
　アデノウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置は、図１及び図２に示すものと同様の構成のものを用いた。
【０１３０】
　メンブレンは、幅３cm×長さ10cmのニトロセルロースメンブレン（孔径12μm；ワットマン社製）シート（白色）を用いた（図１及び図２のｄ）。その長軸側の一端（この端を上流端、反対側を下流端とする）から６mm離れたｅの位置に固相用抗アデノウイルスヘキソン蛋白抗体を１μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布し、22mm離れたｈの位置に抗マウスIgG抗体をO.D.280nm=1.0に希釈し、１μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置（BioJet;BioDot社）を用いて線状に塗布した。ｆとgの位置には何も塗布しなかった。塗布後、45℃の温風を10分間吹き付けて乾燥した。
【０１３１】
　次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（BioDot社製）を接着した（図２のｉ）。
【０１３２】
　次に、上記３（２）で作製したラテックス粒子標識抗体乾燥パッド（図１及び図２のｂ）を幅15mm×長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２mm重なる様に配置して貼り付け、さらに幅23mm×長さ10cmのセルロースろ紙（ワットマン社）をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッド（図１及び図２のａ）とした。
【０１３３】
　次に、幅30mm×長さ10cmのセルロースろ紙（ワットマン社）をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッド（図１及び図２のｃ）とした。
【０１３４】
　次にサンプル滴下パッドの上流端の幅５mmを除いて、上面全面を透明プラスチックラミネート（Adhesive Research社）で被覆した（図２のｊ）。
【０１３５】
　最後に長軸方向に沿って、５mmずつ切断し、図１及び図２に示すメンブレンアッセイ装置を作製した。
【０１３６】
６．試料ろ過フィルターの作製
　実施例１及び２で作製した試料ろ過フィルターのうちＡ、Ｃ及びＤを用いた。
【０１３７】
７．アデノウイルスの検出
（１）検体の採取と検体試料の調製
　臨床的にアデノウイルス感染が疑われる患者から頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（検体採取部分の水分吸収量90μL；microRheologics社）を用いて咽頭拭い液を４本採取した。まず、そのうち１本を2mLのウイルス分離用培地に浮遊し、この浮遊液を用いてFujimoto等の方法（Single-tube multiplex PCR for rapid and sensitive diagnosis ofsubgenus B and other subgenera adenovirus in clinical samples. Microbiology andImmunology. 44. 821-826, 2000）を用いたPCR法により検体中にアデノウイルス遺伝子が存在するかを確認した。その結果より、採取した咽頭拭い液中からアデノウイルス遺伝子が検出された患者を５人及びアデノウイルス遺伝子が検出されなかった患者を５人選び出し、その患者から採取した咽頭拭い液を図６に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液（20mM MES緩衝液（pH6.0）、１（W/V）％ TritonX-100、５（W/V）％　アルギニン塩酸塩、1.0(W/V)％ウシ血清アルブミン）0.3mL中にそれぞれ浮遊し、検体試料を調製した。
【０１３８】
（２）メンブレンアッセイ法による検出
　１人の患者より採取した咽頭拭い液より調製した検体試料の入った３本のチューブの先端に２．で作製したＡ、Ｃ及びＤの各種試料ろ過フィルターをそれぞれ１個ずつ装着し、実施例１と同じ方法で試験を実施した。
【０１３９】
　試験の結果を表９に示す。10分後、アッセイ装置を観察し、図１あるいは図２のｈの位置（コントロールライン）に青色の発色が認められた場合を有効とし、ｅの位置に青色の発色が認められた場合にアデノウイルス陽性と判定した。またｈの位置に発色が認められない場合を無効とした。
【０１４０】
【表９】
【０１４１】
結果の説明
アデノウイルス陽性：PCRにてアデノウイルス遺伝子が検出された検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にアデノウイルス陽性と判定された場合
陰性：PCRにてアデノウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際に陰性と判定された場合
非特異：試験した際にPCRにて検体からアデノウイルス遺伝子が検出されなかった検体から調製された検体試料を用いてメンブレンアッセイ法にて試験した際にアデノウイルス陽性であると判定された場合
無効：メンブレンアッセイ法にてｈの位置に発色が認められなかった場合
【０１４２】
　簡易メンブレンアッセイにおいて咽頭拭い液から調製した検体試料を、焼結フィルターを含む試料ろ過フィルターでろ過することにより、目詰まりによる無効や偽陽性を防ぐことが判明した。」
ケ　甲１１号証に記載された事項
　甲１１号証（特開平１１−１５３６０１号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲１１ａ）「【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記のような免疫クロマトグラフィー装置において、判定部の固定相抗体以外の部分の着色（バックグラウンド）及び検出物質が存在しない場合での固定化相の発色（ブランク）は、検出時のＳＮ比を下げるばかりでなく、誤動作の原因にもなりうる。バックグラウンド着色の原因は、可視化された移動相抗体と多孔質担体との疎水的な結合である。また、ブランク発色の原因は、負電荷を帯びた移動相抗体と正電荷を帯びた固定相抗体との電気的相互作用である。」
（甲１１ｂ）「【００１８】本発明の免疫クロマトグラフィー装置は、抗原がhCG、LH（黄体形成ホルモン）、またはCRP（Ｃ反応性タンパク質）のいずれかである場合に特に有効である。本発明に用いる界面活性剤としては、アルキルフェノールエーテル系の非イオン界面活性剤が用いられる。トリトン系界面活性剤、なかでもトリトン（Triton）X-100の名で販売されているものが好ましい。アンモニウム塩としては、テトラメチルアンモニウム塩、例えば塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウムなどが好ましい。添加剤含浸部におけるｐＨ緩衝剤の担持量は、担体の試料導入部にあらかじめ定めた体積の試料を添加したとき、判定部における試料のｐＨが８．０〜８．５の範囲になる量であることが好ましい。ｐＨ緩衝剤は、ホウ酸、２−（Ｎ−モルフォリノ)エタンスルフォン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびリン酸からなる群より選ばれたものが好ましい。」
（甲１１ｃ）「【００２０】
【実施例】以下、本発明の実施例を詳細に説明する。
《実施例１》
［各部材の作製方法］
（１）判定部のブロッキング剤及び洗浄剤の作製方法
蒸留水１Ｌにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下Trisで表す）を０．１ｍｏｌ（１２．１１ｇ）加えて攪拌した後、１ＮのＨＣｌによりｐＨ８．２に調整し、ニトロセルロースの洗浄剤とした。また、前記の洗浄剤にスキムミルクを１０ｇ加えて攪拌し、ニトロセルロースのブロッキング剤とした。
【００２１】（２）判定部の抗体固定化方法
ニトロセルロースのシート（ミリポア社製：HFM SPHF04020）を大きさ０．９ｃｍ×１．２ｃｍに裁断した厚さ約２２０μｍ（支持体を含む）のシートを担体とした。このシートの上に、試料導入部側から０．５ｃｍ、吸液部側から０．７ｃｍの箇所に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンに対する抗hCGβ抗体（α-hCGβ）のリン酸緩衝溶液（以下PBS溶液で表す）（５ｍｇ／ｍＬ）を塗布し、４０℃で８時間遮光状態で乾燥した。乾燥後、シートを上記のブロッキング剤に、ブロッキング剤が３０シートあたり７０ｍＬの割合となるよう浸潤し、３０℃で３０分間シェイカーにてブロッキングした。ブロッキング後、上記の洗浄剤（７０ｍＬ／３０シート）により３０℃で３０分間洗浄する操作を３回繰り返した後、デシケータ内にて一晩乾燥した。
（３）添加剤含浸部の作製方法
蒸留水１ＬにTrisを１ｍｏｌ（１２１．１ｇ）加えて攪拌した後、１ＮのＨＣｌによりｐＨ８．２に調整した。これに塩化テトラメチルアンモニウム（以下TMAで表す）１ｍｏｌ（１０９．６ｇ）とトリトン系界面活性剤Triton X-100（以下Tritonで表す）の１０％水溶液１０ｍＬを加えて攪拌し、ｐＨ８．２のTris(1M)-TMA(1M)-Triton(0.1%)溶液を作製した。これをガラス繊維濾紙を大きさ０．９ｃｍ×６．０ｃｍに裁断したものに０．３６ｍＬ含浸した後、凍結乾燥した。」
コ　甲１２号証に記載された事項
　甲１２号証（戸田新細菌学　改訂３３版、２００７年５月７日、南山堂、７４２〜７４５頁）には、以下の事項が記載されている。
（甲１２ａ）「表VII−３−３にアデノウイルスによる感染症の種類と原因となる主な血清型を示す。飛沫、接触、目の分泌物、糞便を介して感染が広がる。」（７４４頁右欄３−６行）
（甲１２ｂ）「喉頭ぬぐい液、うがい液。結膜ぬぐい液、糞便、尿の沈渣、陰部の分泌物などを病状に応じて採取し、ウイルスの分離培養や抗原、ＤＮＡの検出を行う。」（７４５頁左欄１０−１３行）
（甲１２ｃ）「早期診断法として、ＥＬＩＳＡにより糞便や気道分泌物中のウイルス抗原を検出する方法や、患者から採取した細胞を免疫蛍光染色する方法がある。」（７４５頁右欄４−６行）
（２）当審の判断
　甲１号証に記載された発明は、そもそも、アデノウイルス抗原の免疫測定に関するものでないことから、主引例としての適格性を欠いたものである。そして、本件発明１と甲１号証（引用文献２）に記載された発明とを対比すると、アデノウイルス抗原の免疫測定について記載されていないことに加えて、上記第５の２（１）イで検討したとおり、甲１号証には、上記第５の２（１）アで検討した上記相違点１に係る構成が記載されていないから、上記相違点１が相違点となる。そして、上記相違点１は、上記第５の２（１）ア及びイで検討したとおり、甲５号証及び取消理由における引用文献１である甲９号証に記載されていない。
　また、甲１１号証には、「判定部の抗体固定化方法」として、「前記の洗浄剤にスキムミルクを１０ｇ加えて攪拌し、ニトロセルロースのブロッキング剤とし」、「ニトロセルロースのシート（ミリポア社製：HFM SPHF04020）を大きさ０．９ｃｍ×１．２ｃｍに裁断した厚さ約２２０μｍ（支持体を含む）のシートを担体とし」、「このシートの上に、試料導入部側から０．５ｃｍ、吸液部側から０．７ｃｍの箇所に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンに対する抗hCGβ抗体（α-hCGβ）のリン酸緩衝溶液（以下PBS溶液で表す）（５ｍｇ／ｍＬ）を塗布し、４０℃で８時間遮光状態で乾燥し」、「乾燥後、シートを上記のブロッキング剤に、ブロッキング剤が３０シートあたり７０ｍＬの割合となるよう浸潤し、３０℃で３０分間シェイカーにてブロッキングした」旨記載されており（上記（甲１１ｃ）参照）、該記載より甲１１号証には、本件発明１の「あらかじめブロッキング剤を添加した固相上で測定を行うこと」に相当する構成が記載されているといえるから、甲１１号証には、上記相違点１に係る構成のうち、ブロッキング剤が、「固相上」に「あらかじめ」「添加」されたものである点が記載されているといえる。
　しかしながら、甲１１号証の非イオン性界面活性剤は、TritonX-100であって、これは、「ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の」「非イオン性界面活性剤」ではない。
　そうすると甲１１号証には、上記相違点１に係る構成が記載されているとはいえない。
　また、甲２〜８、１０及び１２号証には、ブロッキング剤が、「固相上」に「あらかじめ」「添加」されたものである点が記載されていないから、上記相違点１に係る構成が記載されているとはいえない。
　したがって、本件発明１、２、４及び６〜８は、甲１号証に記載された発明及び甲２〜１２号証に記載された技術事項に基づいて、当業者が容易に想到できるものであるとはいえないから、申立人のかかる主張は、採用することができない。
３　サポート要件について
　申立人は、訂正前の請求項１に係る発明に関し、本件明細書の発明の詳細な説明の実施例２において、ブロッキング剤を添加しないものは、非イオン性界面活性剤によるブランク低減効果が顕著に見られるとはいえず、また、Ｓ／Ｎ比も向上しているとはいえないことから、ブロッキング剤を添加しないものは、本件発明の課題を解決できるものであるとはいえない点、及び、実施例６において、ＨＬＢ値が本件発明１で限定されている１２〜２０の範囲内の界面活性剤であるＨＬＢ値１８．１のポリオキシエチレン（４１）ラウリルエーテル（花王製、エマルゲン１３０Ｋ）を用いた場合、その添加量が０．００５〜１０重量％となるよう前処理液に添加したものは、ブランクが低く、高いＳ／Ｎ値を示しているが、１５重量％及び２０重量％となるよう前処理液に添加したものは、界面活性剤なしのものと比べてもブランクが低いとはいえず、また、Ｓ／Ｎ値も高いとはいえないから、ＨＬＢ値１８．１のポリオキシエチレン（４１）ラウリルエーテル（花王製、エマルゲン１３０Ｋ）を１５重量％及び２０重量％となるよう前処理液に添加したものは、本件発明の課題を解決できるものであるとはいえない点から、訂正前の請求項１に係る発明は、本件発明の課題を解決できないものを含んでおり、発明の詳細な説明において発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものであるといえるから、発明の詳細な説明に記載したものであるとはいえない旨主張しているが、本件発明１は、訂正により、「検体中の抗原又は抗体との免疫反応を、・・・１２．５〜２０のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤が
０．００５〜１０重量％の濃度で
あらかじめブロッキング剤を添加した
　そして、本件発明１を引用する本件発明２、４及び６〜８に関しても同様に、上記理由は解消した。
第７　むすび
　以上のとおり、請求項１、２、４及び６〜８に係る発明は、取消理由通知書（決定の予告）に記載した取消理由又は特許異議申立書に記載された特許異議申立理由によっては、本件請求項１、２、４及び６〜８に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１、２、４及び６〜８に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　そして、請求項３及び５に係る特許は、上記のとおり、訂正により削除された。これにより、申立人による特許異議の申立てについて、請求項３及び５に係る申立ては、申立ての対象が存在しないものとなったため、特許法第１２０条の８第１項で準用する同法第１３５条の規定により却下する。
【異議決定日】
令和２年８月２６日（２０２０．８．２６）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　検体中の抗原又は抗体との免疫反応を
、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５
０．００５〜１０重量％の濃度で
あらかじめブロッキング剤を添加した
　【請求項２】
　請求項１に記載の方法であって、以下の工程（１）〜（４）に従って実行される、測定対象物質の測定におけるブランク値の低減方法。
工程（１）：測定対象物質を含有する試料と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であってリガンドで修飾された抗体（一次抗体）を含む溶液と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であって酵素で標識された抗体（二次抗体）を含む溶液とを混合し、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ、ピログルタミン酸エステル、ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１８）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン（３０）ノニルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の１２．５
０．００５〜１０重量％の濃度で
工程（２）：前記サンドイッチ複合体を含む溶液を、あらかじめ前記リガンドと結合可能な物質を固相化した担体
であって、あらかじめブロッキング剤を添加した固相化担体
工程（３）：前記固相化担体を洗浄液で洗浄することにより、前記固相化担体上の抗体に結合していない一次抗体および二次抗体を除去する。
工程（４）：前記固相化担体に前記酵素の基質を含む液を添加し、前記固相化担体上で酵素による基質の化学変化量をモニタリングすることにより測定を行う。
　【請求項３】
　
（削除）
　【請求項４】
　前記非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が１６〜１９である、請求項１
又は２
　【請求項５】
　
（削除）
　【請求項６】
　前記液相中の非イオン性界面活性剤の濃度が０．２〜５重量％である、請求項１
、２、又は４
　【請求項７】
　検体が体液又は組織抽出液である、請求項１
、２、４、又は６
　【請求項８】
　前記非イオン性界面活性剤が、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル
、及
、２、４、６、又は７