(57)【要約】本発明は、グレリン、グレリン類似体、非ペプチド性化合物及びこれらの製薬的に受容される塩からなる群から選択されるグレリン受容体作動性物質を有効成分として含有することを特徴とする、心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤を提供する。本発明の製剤は、心筋細胞死を伴った心疾患及び心臓バイパス手術などの心臓手術によって生じる心筋細胞死を伴う心臓の状態において、心筋細胞に直接作用し細胞死（ネクローシス及びアポトーシス）を抑制し、心筋梗塞、心肥大及び心筋炎などの重度の心疾患においても残存心筋細胞の死を迅速に抑制することができ、それによって、心不全への移行を防止することができるという優れた即効性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グレリン、グレリン類似体、非ペプチド性化合物及びこれらの製薬的に受容される塩からなる群から選択されるグレリン受容体作動性物質を有効成分として含有することを特徴とする、心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤。
【請求項２】
グレリン受容体作動性物質がグレリン、グレリン類似体、またはこれらの製薬的に受容される塩である、請求項１に記載の心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤。
【請求項３】
グレリン受容体作動性物質がグレリンまたはその製薬的に受容される塩である、請求項２に記載の心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤。
【請求項４】
心筋細胞死を伴う状態を予防または治療そのような予防又は治療を必要とする哺乳動物に、そのような疾患の予防又は治療に有効な量のグレリン、グレリン類似体、非ペプチド性化合物及びこれらの製薬的に受容される塩からなる群から選択されるグレリン受容体作動性物質を投与することを含む方法。
【請求項５】
グレリン受容体作動性物質がグレリン、グレリン類似体、またはこれらの製薬的に受容される塩である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
グレリン受容体作動性物質がグレリンまたはその製薬的に受容される塩である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、グレリン、グレリン類似体、非ペプチド性化合物及びこれらの製薬的に受容される塩からなる群から選択されるグレリン受容体作動性物質を有効成分として含有することを特徴とする、心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤に関する。
【背景技術】  成長ホルモン遊離促進物質（以下Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ、ＧＨＳと略すこともある）は視床下部あるいは下垂体に存在するＧＨＳ受容体を介して、下垂体から成長ホルモン（以下Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＧＨと略す）の遊離を促進する一連の物質の総称である。ＧＨＳにはＧＨＳ受容体の生体内リガンドであるグレリンに加えて合成ペプチド性ＧＨＳや非ペプチド性ＧＨＳなどが含まれるが、古くからＧＨ分泌ホルモンとして知られるＧＨＲＨはＧＨＳには含まれない。
成長ホルモン（ＧＨ）の長期投与により拡張型心筋症患者の心機能を高め、心不全治療に一定の効果を示した研究がある（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３４：８０９−８１４（１９９６））。
この研究が基になってＧＨＳを心疾患モデルに適用する研究がなされた。
非ペプチド性ＧＨＳのＣＰ−４２４３９１がペーシング誘発心不全ブタモデル（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：３０８−３１３（２００１））、ＧＨＳ受容体の内因性リガンドであるグレリンが冠結紮心不全ラットで（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１４３０−１４３５（２００１））、ともに長期投与により循環改善作用を示す。この作用はＧＨ依存的であり、ＧＨ分泌とそれによって増加したＩＧＦ−１に基づく作用機序が考えられている。
一方、ペプチド性ＧＨＳであるヘキサレリンはラットへの長期投与で心臓に虚血抵抗性をもたらすことが報告された（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３４：２０１−２０７（１９９７））。この報告者らはさらに、非ペプチド性ＧＨＳには、ＧＨ分泌促進作用はあるにもかかわらず、心臓で虚血抵抗性の効果がないことも結論づけている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：４０２４−４０３１（１９９９））。実際、ペプチド性ＧＨＳ特有な作用であるこれらの作用は、ＧＨ分泌とは無関係な作用であるが（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３４：２０１−２０７（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：４０２４−４０３１（１９９９））、長期投与によって獲得される遅延性のものであることがわかった（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ  ４２：１２９−１３６（２０００）））。
このペプチド性ＧＨＳの作用点は、ヘキサレリン結合タンパク質と呼ばれるものであることが、当業者の研究から示唆されている。ＧＨＳには、ラット摘出心臓において灌流圧を上げるものと上げないものがあり、灌流圧を上げるヘキサレリンの標識体が心臓に結合することから、ヘキサレリン結合タンパク質は発見された（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８５：７９６−８０２（１９９９））。ヘキサレリンはペプチド性ＧＨＳを意味するＧＨ分泌ペプチド（以下ＧＨ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＲＰと略す）であることから、このタンパク質をＧＨＲＰ受容体と呼ぶこともある。このタンパク質にはＧＨＲＰ−２も結合することが示されているがグレリンは結合しない（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８５：３８０３−３８０７（２０００））。さらに、このタンパク質は、２回膜貫通型構造をしたＢ型スカベンジャー受容体のＣＤ３６であることがわかり（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９０：８４４−８４９（２００２））、脳下垂体等に発現している７回膜貫通型構造を有するＧＨＳ受容体とは全く異なる構造をしている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：９７４−９７７（１９９６））。
以上のように、ペプチド性ＧＨＳあるいは非ペプチド性ＧＨＳを長期投与することによって、心臓に対する上記のような作用を示すことが報告されている。
また、ペプチド性ＧＨＳの心臓直接的心保護作用が報告された（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  １４：１１３−１１９（２００１））。ヘキサレリンは培養心筋細胞（Ｈ９ｃ２）においてドキソルビシン誘発性細胞死を抑制し、その媒介受容体としてヘキサレリン結合タンパク質であると考察している。このタンパク質に非ペプチド性ＧＨＳであるＭＫ−０６７７は結合しなかったことから、この作用はペプチド性ＧＨＳ固有の作用であると結論付けている。
従って、ヘキサレリン結合タンパク質に結合するペプチド性ＧＨＳのみが心筋直接的な保護作用を有すると当業者は考えてきた。
【発明の開示】
本発明は、心筋細胞死の抑制に関する受容体およびその活性物質を新たに見出すことにより、その新たな作用機序に基づく心筋細胞保護剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、ＧＨＳの心筋細胞への作用について鋭意検討した結果、上記の事実に反して、ヘキサレリン結合タンパク質に結合しないグレリン及びグレリン受容体作動性の非ペプチド性ＧＨＳも心筋細胞死を抑制する作用を有することを見出し、心筋細胞死抑制の媒介受容体はグレリン受容体であることを発見した。したがって、グレリン受容体作動性であれば、ヘキサレリン結合タンパク質に結合しなくても心筋細胞死抑制作用を有するという発見に基づき本発明を完成した。
本発明の態様によると、グレリン、グレリン類似体、非ペプチド性化合物及びこれらの製薬的に受容される塩からなる群から選択されるグレリン受容体作動性物質を有効成分として含有することを特徴とする、心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤（以下「本発明の製剤」または「本願製剤」という）を提供する。
本発明の他の態様によると、グレリン受容体作動性物質がグレリン、グレリン類似体、またはこれらの製薬的に受容される塩である、上記心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤を提供する。
本発明の他の態様によると、グレリン受容体作動性物質がグレリンまたはその製薬的に受容される塩である、上記心筋細胞死を伴う状態の予防または治療剤を提供する。
本発明の他の態様によると、心筋細胞死を伴う状態を予防または治療そのような予防又は治療を必要とする哺乳動物（ヒトを含む）に、そのような疾患の予防又は治療に有効な量のグレリン、グレリン類似体、非ペプチド性化合物及びこれらの製薬的に受容される塩からなる群から選択されるグレリン受容体作動性物質を投与することを含む方法を提供する。
本発明の他の態様によると、グレリン受容体作動性物質がグレリン、グレリン類似体、またはこれらの製薬的に受容される塩である、上記方法を提供する。
本発明の他の態様によると、グレリン受容体作動性物質がグレリンまたはその製薬的に受容される塩である、上記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｈ９ｃ２細胞における虚血／低酸素処置後のアポトーシスに対するＭＫ−０６７７、ヘキサレリン、ＩＧＦ−１およびグレリンの作用を、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を指標に示す。実験は２度行われた（実験１及び実験２）。各値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表す。＊、＊＊：溶媒に対してｐ＜０．０５、０．０１で有意差ありを示す。
図２は、Ｈ９ｃ２細胞における虚血／低酸素処置後の細胞死に対するＭＫ−０６７７、ヘキサレリン、ＩＧＦ−１およびグレリンの作用を、遊離細胞数を指標に示す。実験は２度行われた（実験１及び実験２）。各値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表す。＊、＊＊：溶媒に対してｐ＜０．０５、０．０１で有意差ありを示す。
図３は、Ｈ９ｃ２細胞におけるＤＯＸ誘発アポトーシスに対するヘキサレリン、ＭＫ−０６７７、ＮＮ−７０３およびＣＰ４２４，３９１の作用を、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を指標に示す。各値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表す。＊、＊＊：溶媒に対してｐ＜０．０５、０．０１で有意差ありを示す。
図４は、Ｈ９ｃ２細胞におけるＤＯＸ誘発アポトーシスに対するＳ−３８８５５、グレリン、デスオクタノイルグレリン（デス−Ｏ−グレリン）、ＩＧＦ−１、ＧＨＲＨおよびＧＨの作用を、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を指標に示す。各値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表す。＊＊：溶媒に対してｐ＜０．０１で有意差ありを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書でいう「グレリン受容体」とは、グレリンが特異的に結合し、シグナル伝達能を有する機能的な受容体である。本受容体は下垂体（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：１９６８−１９７１（２００２）），Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．２４：ＲＣ７−９（２００１））や心臓で存在が確認され（Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３４：１４３−１４９（２００１））、下垂体においては成長ホルモンの分泌促進を媒介する（Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：６５６−６６０（１９９９））。
本明細書でいう「グレリン受容体作動性」とは、グレリン受容体に対して特異的に結合し、細胞内にシグナルを伝達するものを言い、下垂体においては成長ホルモンの分泌を促進する活性を言い、例えばグレリンおよびＭＫ−０６７７はグレリン受容体作動性を有する化合物、すなわち本発明でいう「成長ホルモン分泌促進物質」であり、デス−Ｏ−グレリンはグレリン受容体作動性を有さない化合物である。
本明細書でいう「ヘキサレリン結合タンパク質」とは、２回膜貫通型構造を有するＢ型スカベンジャー受容体のＣＤ３６（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９０：８４４−８４９（２００２））である。
本明細書でいう「ヘキサレリン結合タンパク質に結合しない」とは、ヘキサレリン結合タンパク質に対してバインディングアッセイ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  １４：１１３−１１９（２００１））で結合を示さないことを言い、例えばヘキサレリン結合タンパク質に結合しない化合物にはグレリンが挙げられる。
以下に、本願製剤を詳細に説明する。
本明細書でいう、「グレリン」とは、下記表に記載された化学構造で示される、オクタノイル基をもっていることを特徴とする２８個のアミノ酸を有するペプチドである。「グレリン類似体」には、グレリン受容体作動性を有し、分子中にそのオクタノイル基を有し、２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているものも包含される。さらに、これらの各種誘導体〔例えば、ペプチド構成アミノ酸が置換された誘導体（アミノ酸間に基、例えば、アルキレンが挿入されたものも包含する）及びエステル誘導体〕も包含される。
ペプチド中のアミノ酸残基やアミノ酸誘導体残基の由来（例えば、ヒト、ラットの細胞より分離、精製したもの、合成品、半合成品、遺伝子工学により得られたものなど）などについては、特に制限がない。
２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているもの例としては、下記のものがあげられる。
グレリンのアミノ酸が１個欠損した例としては、１４番目のＧｌｎ残基が欠除した、ｄｅｓ−Ｇｌｎ１４−グレリンなどが代表的である。
さらに、本発明のグレリン類似体には、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３，４３７０−４３７６に記載された下記のようなものも包含される。
例えば、グレリン２８個のアミノ酸のうち、Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸（好ましくは、Ｎ末端４個のアミノ酸）を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているペプチド及びその誘導体であって、グレリン受容体作動性を有するものがあげられる。
Ｎ末端から３番目のアミノ酸の側鎖の例としてはグレリンの側鎖であるオクタノイル以外のアシル基及びアルキル基（これらの炭素数は６〜１８が好ましい）があげられる。
具体的には、下記のものがあげられる：
−ＣＨ２（ＣＨ２）９ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）６ＣＨ３、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＯ−（ＣＨ２）９ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）１４ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）６ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＣＯＰｈ、
下記式：
2004014412.tif 000002
Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているグレリン類似体の具体的な例としては、第３７回ペプチド討論会（２０００年１０月１８日〜２０日）で報告された化合物：ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯ−Ｓｅｒ（オクチル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２があげられる。
2004014412.tif 000003
本明細書でいう、「非ペプチド性化合物」とは、タンパク質を構成する２０種のＬ−アミノ酸及びそのＤ体であるアミノ酸の２量体以上がペプチド結合で結合している構造部分を含まない化合物をいう。
非ペプチド性成長ホルモン分泌促進物質の具体例としては、グレリン受容体作動性を有する限りこれらに限定されるものではないが、Ｓ−４２８７５、Ｓ−３８８５５、Ｓ−３７５５５、Ｓ−３９１００、イブタモレリン［例えば、イブタモレリンメシレート（ＭＫ−０６７７）］、カプロモレリン（ＣＰ−４２４３９１）、ＮＮＣ−２６０７２２、ＮＮＣ−２６０３２３、Ｌ−１６３６６１、Ｌ−１６３５４０、Ｌ−１６８７２１、ＬＹ−４２６４１０、ＬＹ−４４４７１１、Ｌ−６９２，４２９、Ｌ−６９２，５８５、Ｌ−７００，６５３、Ｌ−２５２，５６４、Ｌ−１６２，７５２、Ｌ−１６４，０８０、Ｇ−７２０３、Ｇ−７０３９、Ｇ−７０５２、Ｇ−７２２０、タビモレリン（ＮＮ−７０３）、ＳＭ−１３０６８６、Ｌ−７３９９４３、ＣＰ−３３６１５６、ＣＰ−４６４７０９またはそれらの塩、エステルなどが挙げられる。これらの塩の例は、下記に記載されるが、好ましい例としては、塩酸塩があげられる。
上記化合物の代表的なものは、以下の表に詳細を記載する。
2004014412.tif 000004
2004014412.tif 000005
2004014412.tif 000006
2004014412.tif 000007
2004014412.tif 000008
2004014412.tif 000009
2004014412.tif 000010
2004014412.tif 000011
2004014412.tif 000012
本明細書でいう、「心筋細胞死を伴う状態」とは、例えば、心筋梗塞、その治療に行われるバイパス手術やＰＴＣＡによる再灌流障害、冠微小循環障害、心筋炎（アルコール性、ウイルス性など）、拡張型心筋症、心臓移植、不整脈、心不全さらには、化学療法剤による薬剤性心筋障害等が上げられるが、これに限定されるものではない。
本願製剤は、心筋細胞に直接作用し細胞死（ネクローシス及びアポトーシス、特にアポトーシス）を抑制することができるという優れた即効性を有する。したがって、心筋梗塞、心肥大及び心筋炎などの重度の心疾患においても残存心筋細胞の死を迅速に抑制することができる。例えば、心筋梗塞後に生じる、梗塞拡大及び心室の拡張を予防することができるので、心筋梗塞後に生じうる心不全、再発性心筋梗塞及び／又は死亡を防止することができる。
「製薬的に受容される塩」としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸との塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
本発明の製剤において、有効成分を２種以上組み合わせて用いてもよい。
本発明に用いられるグレリン、グレリン類似体、グレリン受容体作動性である非ペプチド性化合物及びこれらの製薬的に受容される塩は、公知の製剤技術により、単独でまたは薬理学的に許容しうる担体、添加剤等とともに、通常の経口型製剤及び非経口型製剤、例えば、液剤（注射剤、点鼻剤、シロップ剤、ドライシロップ剤など）、錠剤、トローチ剤、カプセル剤（硬、軟、マイクロカプセル等）、散剤、細粒剤、顆粒剤、軟膏剤、坐剤等などに製剤可能であり、また、ドラッグデリバリーシステム（例えば、徐放剤等）などの剤型にも製剤可能である。
本願の製剤に用いることができる担体、添加剤等としては以下のような通常医薬品の調剤に使用されるものがあげられる：例えば生理食塩液、水（常水、蒸留水、精製水、注射用水など）、リンゲル液等の水性溶剤、例えば、油性溶剤（植物油など）、水溶性溶剤（プロピレングリコール、マクロゴール、エタノール、グリセリンなど）等の非水性溶剤、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、マイクロクリスタリンワックス、サラシミツロウ、流動パラフィン、白色ワセリン等の基剤、例えば蔗糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、ぶどう糖、セルロース、タルク、燐酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、蔗糖、デンプン等の結合剤、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、炭酸水素ナトリウム、燐酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、例えばクエン酸、メントール、グリシン、ソルビトール、オレンジ末等の矯味剤、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、クロロブタノール、四級アンモニウム塩（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）等の保存剤及び防腐剤、例えばアルブミン、ゼラチン、ソルビトール、マンニトール等の安定剤、例えばメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁化剤、例えばグリセリン、ソルビトール等の可塑剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース等の分散剤、例えば塩酸等の溶解補助剤、例えばモノステアリン酸ナトリウム等の乳化剤、例えば塩化ナトリウム等の電解質並びに例えば糖アルコール類、糖類及びアルコール類等の非電解質の浸透圧調整剤、着香剤等。
本発明において、グレリン受容体作動性物質の好ましい投与量は、０．０１μｇ／ｋｇ／日〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、０．１μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
投与方法は、静脈内投与、経鼻投与、皮下投与、筋肉内投与（心筋を含む）、経口投与などがあげられる。静脈内投与では、単回（ｂｏｌｕｓ）投与のみ、持続（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）投与のみ、あるいは単回投与直後から持続投与、のいずれかの投与方法で行われる。
以下に試験例を示して具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例
（１）試験物質および試薬
１）試験物質
グレリン（ラット型、ペプチド研究所）、デスオクタノイルグレリン（デス−Ｏ−グレリン）（合成品）、ヘキサレリン（ＰＥＮＩＮＳＵＬＡ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）、ＧＨ（ラット型、和光純薬）、ＧＨＲＨ（ＢＡＣＨＥＭ）、ＩＧＦ−Ｉ（ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ）、非ペプチド性ＧＨＳとして、Ｓ−３８８５５（合成品）、ＭＫ−０６７７（合成品）、ＮＮ−７０３（合成品）、ＣＰ４２４，３９１（合成品）を用いた。
Ｓ−３８８５５、ＭＫ−０６７７、ＮＮ−７０３及びＣＰ４２４，３９１は、ジメチルスルホキシド（ナカライテスク）に１０ｍＭになるように溶解後、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）を含む日局注射用水（大塚製薬）で所定の濃度に希釈して使用した。また、グレリン、デスオクタノイルグレリン（デス−Ｏ−グレリン）、ＧＨ、ＧＨＲＨ及びＩＧＦ−Ｉは、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン／日局注射用水に溶解し、所定の濃度に希釈して使用した。
２）試薬
試験には、以下の試薬を使用した。ＤＭＥＭ培地、ウシ胎児血清、トリプシン−ＥＤＴＡ、以上ＧＩＢＣＯ社製。ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）。ドキソルビシン（和光純薬社製）。ＤＡＢ溶液（シンプルステインＤＡＢ溶液）、ニチレイ社製。ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）。その他の試薬、ナカライテスク社製。
（２）細胞培養
Ｈ９ｃ２細胞は、大日本製薬より購入し、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳという）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２−９５％空気の培養インキュベーター内で培養した。
（３）試験方法
１）虚血／低酸素誘発細胞死
心臓の虚血−再灌流障害においては、心筋細胞のアポトーシスとネクローシスによる細胞死が誘発されることが知られている（Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８２，３０Ｋ−４１Ｋ（１９９８）参照）。したがって、虚血／低酸素による誘発細胞死を、Ｂｒａｒらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，８５０８−８５１４（２０００））を一部改変した方法により生じさせた。すなわち、前培養したＨ９ｃ２細胞を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて１．５×１０４細胞／ｃｍ２になるように４８ウエル培養プレートに播種し、培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２−９５％空気）内で２４時間培養した。虚血／低酸素状態は、Ｅｓｕｍｉ（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０，Ｈ１７４３−５２（１９９１））の虚血緩衝液（ＩＳＢ）処置および低酸素培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２−９５％Ｎ２通気）内で４時間培養することによって作った。ＩＳＢの組成は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＫＣｌ、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２、４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ  デオキシグルコース、２０ｍＭ乳酸ナトリウム（ｐＨ６．２）である。虚血／低酸素処置後、ＩＳＢを血清不含ＤＭＥＭに交換し、通常の培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２−９５％空気）に戻し培養した。培養２時間後、細胞はＰＢＳで１回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで固定しアポトーシス細胞数測定まで冷蔵庫内で保存した。また、虚血／低酸素処置後、２０時間培養した細胞を死細胞数測定用に用いた。試験化合物は、虚血／低酸素処置と同時に処置した。陰性対照の溶媒（ジメチルスルホキシド）も同様に添加した。
２）ドキソルビシン誘発細胞死
ドキソルビシン（以下、ＤＯＸと略す）は細胞内でフリーラジカルを生成させることで、心筋細胞のアポトーシスとネクローシスによる細胞死を誘発することが知られている（Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８７４，１５６−１６８（１９９９）参照）。したがってＤＯＸ誘発細胞死を、Ｋａｎｇらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１３６９０−１３６９８（２０００））を改変した方法によって生じさせた。前培養したＨ９ｃ２細胞を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて１．５×１０４細胞／ｃｍ２になるように２４ウエル培養プレートに播種し、培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２−９５％空気）内で培養した。２４時間培養後、ＤＯＸを最終濃度１μＭになるように添加し細胞死を誘発した。ＤＯＸ添加５時間後、細胞はＰＢＳで１回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、アポトーシス細胞数測定まで冷蔵庫内で保存した。試験化合物は、ＤＯＸ添加４時間前に処置した。陰性対照の溶媒（ジメチルスルホキシド）も同様に添加した。
３）アポトーシス細胞数の測定
アポトーシス細胞の検出は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡ断片化検出法として知られるＴＵＮＥＬ法（ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出キット）にて行った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞数の測定は、顕微鏡下、１００倍視野（ｈｉｇｈ  ｐｏｗｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｉｅｌｄ，ＨＰＦ）に存在するＴＵＮＥＬ陽性細胞を１ウエル当たりに５ＨＰＦをカウントした（この５視野は、全面積の約３０％（２４ウエルプレート）または約６０％（４８ウエルプレート）を占める）。１ＨＰＦ当たりの平均値を算出し、アポトーシス細胞数とした。
４）死細胞数の測定
培地中の遊離細胞を死細胞とし、顕微鏡下で観察し１ウエル当たり５ＨＰＦ（１ＨＰＦはウエルの中心を含む）をカウントした。１ＨＰＦ当たりの平均値を算出し、死細胞数とした。尚、本測定法は、血球計算板を用いて測定した遊離細胞数と有意な相関（相関係数：ｒ＝０．９０２、有意差危険率：ｐ＝０．００００３、ｎ＝１２）を示すことを確かめている。
５）データの表示及び統計解析
各データは、１群３ウエルの平均値±標準偏差で表した（図１〜４）。図中、試験化合物濃度は、ＩＧＦ−Ｉ及びＧＨを除き対数モル濃度で表した。
結果
（１）虚血／低酸素誘発細胞死に対する作用
Ｈ９ｃ２細胞の虚血／低酸素処置後、２時間でのアポトーシス細胞に対する作用を、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を指標に検討した。本試験系における虚血緩衝液中の酸素分圧は、約７０ｍｍＨｇであり通常の培養条件の約１／２であった。通常の培養条件下で培養した無処置群においてＴＵＮＥＬ陽性細胞はほとんど認められなかったのに対して、虚血／低酸素処置における溶媒群のＴＵＮＥＬ陽性細胞数は、２１．３±１．９細胞／ＨＰＦ（実験１）、２０．９±１．２細胞／ＨＰＦ（実験２）であった。
ＭＫ−０６７７（１μＭ）はヘキサレリン（１μＭ）およびＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍＬ）と同様に、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数の有意な低下作用を示した（実験１、図１）。グレリン（１μＭ）もまたＭＫ−０６７７（１μＭ）と同様にＴＵＮＥＬ陽性細胞数の有意な低下作用を示した（実験２、図１）。
次に、虚血／低酸素処置後、２４時間での死細胞数に対する作用を、遊離細胞数を指標に評価した。その結果、ヘキサレリンおよびＩＧＦ−１と同様に、ＭＫ−０６７７およびグレリンは有意な遊離細胞数の低下作用を示した（図２）。したがって、ヘキサレリン結合タンパク質に結合しない非ペプチドＧＨＳおよびグレリンにも心筋細胞アポトーシス抑制作用が明らかとなった。
（２）ＤＯＸ誘発細胞死に対する作用
Ｈ９ｃ２細胞のＤＯＸによるアポトーシスに対する作用を検討した。
ＤＯＸ非処置群では、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は全く観察されなかったのに対して、陰性対照のＤＯＸ（１μＭ）処置５時間後のＴＵＮＥＬ陽性細胞数は、１３．１±０．１細胞／ＨＰＦであった。
アポトーシスに対するＧＨＳの効果を検討した結果、ヘキサレリン、ＭＫ−０６７７、ＮＮ−７０３、ＣＰ４２４，３９１、グレリン及びＳ−３８８５５（それぞれ１μＭ）は、いずれもＴＵＮＥＬ陽性細胞数の有意な低下作用を示した（図３及び４）。また、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍＬ）も同様に有意な低下作用を示したが、デスオクタノイルグレリン（デス−Ｏ−グレリン）（１μＭ）、ＧＨＲＨ（１μＭ）及びＧＨ（１０μｇ／ｍＬ）ではその作用は認められなかった（図４）。
以上のように、グレリンおよび非ペプチド性ＧＨＳは虚血／低酸素誘発細胞死に加え、ＤＯＸ誘発細胞死をも抑制した。しかし、グレリン受容体作動性でないデスオクタノイルグレリン、ＧＨＲＨやＧＨは抑制しなかった。したがって、グレリン作動性であれば、ヘキサレリン結合タンパク質に結合しなくても、心筋細胞死抑制作用を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明の薬剤は、心筋細胞死を伴った心疾患及び心臓バイパス手術などの心臓手術によって生じる心筋細胞死を伴う心臓の状態において、心筋細胞に直接作用し細胞死（ネクローシス及びアポトーシス）を抑制し、心筋梗塞、心肥大及び心筋炎などの重度の心疾患においても残存心筋細胞の死を迅速に抑制することができ、それによって、心不全への移行を防止することができるという優れた即効性を有する。
【図１】
2004014412.tif 000013
【図２】
2004014412.tif 000014
【図３】
2004014412.tif 000015
【図４】
2004014412.tif 000016
【国際調査報告】
2004014412.tif 000017
2004014412.tif 000018
2004014412.tif 000019
2004014412.tif 000020
2004014412.tif 000021
2004014412.tif 000022