(57)【要約】本発明は、ＨＣＣの新規かつ有用な免疫治療法を提供すると共に、臨床的に有用な肝細胞癌の診断剤を提供する。具体的には、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であり、かつＨＣＣ反応性のＣＴＬを調製することができる、ＧＰＣ３由来の配列番号５〜１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。また、ＧＰＣ３に対する抗体を含む、肝細胞癌の診断剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５〜１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号５〜１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、請求項２または３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドとＨＬＡ分子とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
【請求項７】
ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ２４である、請求項６に記載のエキソソーム。
【請求項８】
ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ＊２４０２である、請求項７に記載のエキソソーム。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１０】
グリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）タンパク質または請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドを含むその部分ペプチドをコードする遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１３】
ＨＬＡ分子と請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
【請求項１４】
請求項９または１０に記載の方法によって誘導される、請求項１３に記載の抗原提示細胞。
【請求項１５】
ＧＰＣ３に対する抗体を含む、肝細胞癌（ＨＣＣ）の診断剤。
【請求項１６】
サンプルとＧＰＣ３に対する抗体を接触させることを含む、ＨＣＣの診断方法。
【請求項１７】
更にサンプル中のＧＰＣ３を定量することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＰＣ３に対する抗体を含む、ＨＣＣの診断のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌ワクチンとして有効な新規ペプチド、当該ペプチドを含む腫瘍の治療及び予防のための医薬、並びに肝細胞癌の新規な診断剤に関する。
【背景技術】  原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界中で最も一般的な悪性疾患の一つである。Ｂ型及びＣ型肝炎の世界的な流行により、アジアや欧州諸国におけるＨＣＣの発生率は急激に上昇しており（Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｄ．Ｆ．及びＳｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５３，１２５３−１２５７（１９９９））、ＨＣＣ感染から発病までの長い潜在期間を考慮すると今後５０年にわたってこの傾向が続くものと予想される。病状の進んだＨＣＣの予後は芳しくなく、新たな治療戦略が緊急に必要とされている。
一方、近年の分子生物学及び腫瘍免疫学の進展により、腫瘍応答性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される腫瘍抗原及び抗原性のあるペプチドをコードする多数の遺伝子が同定されてきており、抗原特異的腫瘍免疫療法の可能性が高まってきている（Ｂｏｏｎ，Ｔ．及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，７２５−７２９（１９９６）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８８，１６３５−１６４４（１９９６））。
α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）は、正常組織では胎生期にのみ発現するが、多くのＨＣＣにおいて発現が再活性化されることが報告されている（Ｆｕｊｉｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６２，５７−６３（２００２））。またマウス及びヒトのＴ細胞レパートリーは、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されたＡＦＰ由来ペプチドエピトープを認識できる（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３１３４−３１４２；Ｊｒ  Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｃ．Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３０６４−３０６７（１９９９）；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｈ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，５３００−５３０８（２００１））。胎児の発達段階においてこの癌胎児性タンパク質に対して高い血漿レベルで曝されているにも関わらず、成熟Ｔ細胞はＡＦＰに対して完全な免疫寛容（トレランス）を獲得することはなく、ＡＦＰ特異的なＴ細胞が末梢血中に検出される。すなわち、癌胎児性タンパク質は免疫治療の標的となり得る。また、ＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩ（Ｆｕｊｉｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６２，５７−６３（２００２））はＨＣＣの周知の腫瘍マーカーである。
更に、研究者が遺伝子−発現プロファイルに関する包括的なデータを得ることを可能とするｃＤＮＡマイクロアレイ技術が急速に発展している。いくつかの研究によって、この技術が新規癌関連遺伝子の同定及び分子レベルにおけるヒト癌の分類に有用であることが証明されている（Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，５３１−５３７（１９９９）；Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，５０３−５１１（２０００）；Ｏｎｏ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，５００７−５０１１（２０００）；Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｏ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，３５４４−３５４９（２００１）；Ｋｉｈａｒａ，Ｃ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，６４７４−６４７９（２００１））。本発明者等は先に、２３，０４０種の遺伝子を含むゲノムワイドのｃＤＮＡマイクロアレイの使用によって、ＨＣＣの発生の際に発現が変化する遺伝子の同定を報告した。そして２０種の原発性ＨＣＣにおけるこれらの遺伝子の発現プロファイルを検討した（Ｏｋａｂｅ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，２１２９−２１３７（２００１））。
１９９６年、Ｐｉｌｉａらは、グリピカンファミリーのメンバーの１種をコードするグリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）遺伝子が、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｇｏｌａｂｉ−Ｂｅｈｍｅｌ症候群（ＳＧＢＳ）患者において変異していることを報告した（Ｐｉｌｉａ，Ｇ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２，２４１−２４７（１９９６））。ＳＧＢＳは出生前後の過成長、及び女性キャリアにおける非常に軽い表現型から男性乳児の致死的症状までの幅広い臨床症状によって特徴付けられるＸ連鎖遺伝性疾患である（Ｎｅｒｉ，Ｇ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．７９，２７９−２８３（１９９８））。ＳＧＢＳの臨床的特徴としては、特徴的な顔貌（ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆａｃｉａｌ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）、口蓋裂、合指、多指、副乳、嚢胞性及び異形成腎、先天性心欠陥等が挙げられる（Ｂｅｈｍｅｌ，Ａ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７，４０９−４１３（１９８４）；Ｇａｒｇａｎｔａ，Ｃ．Ｌ．及びＢｏｄｕｒｔｈａ，Ｊ．Ｎ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４４，１２９−１３５（１９９２）；Ｇｏｌａｂｉ，Ｍ．及びＲｏｓｅｎ，Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１７，３４５−３５８（１９８４）；Ｇｕｒｒｉｅｒｉ，Ｆ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４４，１３６−１３７（１９９２））。ＧＰＣ３変異のほとんどは点突然変異または幾つかのエクソンを含む小さな遺伝子の欠失であると報告されている（Ｈｕｇｈｅｓ−Ｂｅｎｚｉｅ，Ｒ．Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．６６，２２７−２３４（１９９６）；Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３４，４８０−４８３（１９９７）；Ｖｅｕｇｅｌｅｒｓ．Ｍ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９，１３２１−１３２８（２０００）；Ｘｕａｎ，Ｊ．Ｙ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３６，５７−５８（１９９９））。また、患者の表現型と変異の位置に相関性がないことから、ＳＧＢＳは機能的ＧＰＣ３タンパク質の欠損と、家系内及び家系間の表現型の差を生み出す他の遺伝的要因によって引き起こされる可能性が挙げられており（Ｈｕｇｈｅｓ−Ｂｅｎｚｉｅ，Ｒ．Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．６６，２２７−２３４（１９９６））、ＧＰＣ３欠損マウスの研究からも、この仮説に対する支持が得られている（Ｃａｎｏ−Ｇａｕｃｉ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４６，２５５−２６４（１９９９））。これらのマウスはＳＧＢＳ患者に見られる、過成長、嚢胞性及び異形成腎を含む異常のいくつかを有している。
癌に特異的に過剰発現し、種々の正常組織においては発現レベルが無視できる抗原は、免疫療法において理想的な標的である可能性がある。こうした場合、ＣＴＬは抗原を過剰発現する癌に対してのみ細胞傷害性を示し、正常な組織には副作用を示さないと期待できる。ノーザンブロット解析を用いた研究から、ＧＰＣ３  ｍＲＮＡはＨＣＣ、胎盤、胎児肝臓、胎児肺、胎児腎臓で過剰発現していることが報告されている（Ｚｈｕ，Ｚ．Ｗ．ら，Ｇｕｔ  ４８，５５８−５６４（２００１）；Ｈｓｕ．Ｈ．Ｃ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，５１７９−５１８４（１９９７）；Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２１３，４３１−４３９（１９９８））。
また、ＧＰＣ３には細胞増殖の阻害作用があり、ある種の腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得るため（Ｄｕｅｎａｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４１，１４０７−１４１４（１９９８）；Ｃａｎｏ−Ｇａｕｃｉ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４６，２５５−２６４（１９９９））、ＧＰＣ３発現が種々の起源の腫瘍において発現が抑制されているという報告がある。Ｌｉｎらは、ＧＰＣ３は正常な卵巣で発現しているが、ある種の卵巣癌細胞系においては検出できないことを示した（Ｌｉｎ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，８０７−８１０（１９９９））。ＧＰＣ３発現が見られない全てのケースにおいて、コード領域における変異はなく、ＧＰＣ３プロモーターが過度にメチル化されており、また脱メチル化剤で処理することによってＧＰＣ３発現は回復した。更に、ＧＰＣ３の異所性発現は数種の卵巣癌細胞系においてコロニー形成活性を阻害することが報告されている。ＧＰＣ３と癌を関連付ける他のデータとしては、正常なラット中皮細胞と中皮腫細胞株との間のディファレンシャルｍＲＮＡディスプレイ研究から得られたものがある（Ｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，４１０−４１６（２０００））。この研究において、ＧＰＣ３は腫瘍細胞株において絶えず発現が抑制されていることが見出された。更に、同様の発現抑制は原発性ラット中皮腫及びヒトの中皮腫由来の細胞株においても見られている。卵巣癌と同様に、ＧＰＣ３コード配列中に変異は見出されていないが、ほとんどの細胞株でＧＰＣ３プロモーター領域に異常なメチル化が見られている。報告されているように（Ｄｕｅｎａｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４１，１４０７−１４１４（１９９８））、中皮腫細胞株におけるＧＰＣ３の異所性発現はコロニー形成活性を阻害することが示された。更に最近、Ｘｉａｎｇらは、ＧＰＣ３がヒトの乳癌においても発現していないことを報告した（Ｘｉａｎｇ，Ｙ．Ｙ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０，７４０８−７４１２（２００１））。これらのデータから、ＧＰＣ３がこれらの癌における細胞増殖の負の調節因子として作用し得ることが示唆される。すなわち、ＧＰＣ３の発現は成人のＧＰＣ３陽性組織から生じる癌における腫瘍の進行の間に低下し、この低下が悪性の表現型の発生において何らかの役割を果たしているように思われる。
反対に、ＨＣＣの場合、腫瘍は胎児においてのみＧＰＣ３を発現する肝臓組織から生じ、ＧＰＣ３発現は悪性への形質転換において再び現れる傾向がある。ＧＰＣ３の再発現がこれらの腫瘍の進行において重要であるか否かは明らかでない。ここ数年の間に、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）が線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びＷｎｔ等のヘパリン結合性成長因子の最適な活性の発現に必要であることが明らかとなった（Ｙａｙｏｎ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ  ６４，８４１−８４８（１９９１）；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ  ８３，３５７−３６０（１９９５））。グリピカンはＧＰＩアンカー型細胞表面ＨＳＰＧのファミリーであり、腫瘍形成とＧＰＣ３の発現レベルの関係におけるこの組織特異的な差異は、ＧＰＣ３が各組織ごとに異なった方法で成長と生存因子を調節しているためではないかと推測される。ＧＰＣ３は少なくともこれらの臓器において癌胎児性タンパク質として働いているように思われる。一般に、癌胎児性タンパク質は腫瘍の進行において重要な役割を持つとはされていないが、腫瘍マーカーまたは免疫治療の標的として使用されてきた（Ｃｏｇｇｉｎ，Ｊ．Ｈ．Ｊｒ．，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ５，３７−５５（１９９２）；Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｈ．及びＨａｋｏｍｏｒｉ  Ｓ．−Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，６５１７−６５２１（１９８５））。ＧＰＣ３の癌胎児性挙動が臨床的用途に利用し得るか否か、このグリピカンの再発現がＨＣＣの進行において重要であるか否かは、更に研究の余地がある。
ＨＣＣの治療法は様々なものがあるにも関わらず、他の癌に比べて予後が悪く、難治性癌のひとつになっている。ＨＣＣのベースに肝硬変があり、もともとの患者の肝機能が悪いことや、１個の癌を治療してもまた別の場所から癌が発生するという性質もその理由である。早急かつ新たな治療戦略が要求されている。ＨＣＣに特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発できれば、自己の正常臓器に障害を及ぼすことなく、癌だけを有効に排除する治療法になる可能性がある。また、どんな末期の癌患者でも、肝機能が悪すぎて他の治療が行えない患者にでも使用できる治療法になり得る。また、現在日本ではＨＣＣ予備群であるＣ型肝炎感染者が２００万人以上いるといわれている。これらの感染者のＨＣＣの予防に対してもこのような免疫療法は使用できる可能性がある。ＨＣＣの腫瘍マーカーとしてＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩが知られているが、患者によっては検出されない場合や、良性肝疾患である肝硬変や慢性肝炎の患者で偽陽性となる場合があり、特に早期のＨＣＣの診断は難しいとされている。ＨＣＣの早期診断のためにも他に有用な腫瘍マーカーが必要である。
【発明の開示】
本発明者等は、ｃＤＮＡマイクロアレイ解釈データに基づいて、ヒト肝細胞癌において特異的に過剰発現している新規な癌胎児性タンパク質としてグリピカン３（ＧＰＣ３）を同定し、免疫治療のための標的抗原の潜在的な候補となり得る新規なペプチドを見出した。次いで本発明者等はＨＣＣ患者血清中に可溶性ＧＰＣ３タンパク質を検出し、ＧＰＣ３はＨＣＣの新たな腫瘍マーカーとなり得ることを明らかにした。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１８）を提供する。
（１）  配列番号５〜１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（２）  配列番号５〜１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
（３）  Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、上記（２）に記載のペプチド。
（４）  Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、上記（２）または（３）に記載のペプチド。
（５）  上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
（６）  上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ分子とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
（７）  ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ２４である、上記（６）に記載のエキソソーム。
（８）  ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ＊２４０２である、上記（７）に記載のエキソソーム。
（９）  上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１０）  グリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）タンパク質または上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを含むその部分ペプチドをコードする遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１１）  上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
（１２）  上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
（１３）  ＨＬＡ分子と上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
（１４）  上記（９）または（１０）に記載の方法によって誘導される、上記（１３）に記載の抗原提示細胞。
（１５）  ＧＰＣ３に対する抗体を含む、肝細胞癌（ＨＣＣ）の診断剤。
（１６）  サンプルとＧＰＣ３に対する抗体を接触させることを含む、ＨＣＣの診断方法。
（１７）  更にサンプル中のＧＰＣ３を定量することを含む、上記（１６）に記載の方法。
（１８）  ＧＰＣ３に対する抗体を含む、ＨＣＣの診断のためのキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−２４５８３１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、成人組織におけるＧＰＣ３  ｍＲＮＡのＨＣＣ特異的発現を示す。
２０例のＨＣＣ及び種々の正常組織におけるヒトＧＰＣ３  ｍＲＮＡの発現の相対比（ＲＲ）を示す。ＨＣＣにおけるＲＲは各症例における腫瘍：非腫瘍の強度比を示す。正常組織におけるＲＲは正常各組織：正常肝臓の強度比を示す。
図２は、ヒトＨＣＣ細胞株においてＲＴ−ＰＣＲによって検出されたＧＰＣ３及びβ−アクチン（対照）のｍＲＮＡの発現を示す。
レーン１：ＨｅｐＧ２、レーン２：Ｈｅｐ３Ｂ、レーン３：ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、レーン４：ＳＫ−Ｈｅｐ−１、レーン５：ＨｕＨ−７
図３は、ＧＰＣ３ペプチド（ペプチド（ｐｅｐ）１〜１２：配列番号５〜１６）で刺激し、更に増殖させたＰＢＭＣを、６時間の５１Ｃｒ放出アッセイを用いてＣＴＬ活性について調べた結果の一部を示す。縦軸の値は３回のアッセイの平均値に基づいて計算した特異的細胞溶解率（％）を示す。ＨＣＣ細胞株としてＨＬＡ−Ａ２４＋ＧＰＣ３＋＋＋のＨｅｐＧ２、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＧＰＣ３−のＳＫ−Ｈｅｐ−１、ＨＬＡ−Ａ２４−ＧＰＣ３＋＋＋のＨｅｐ３Ｂ及びＨｕＨ−７を用い、患者１に対してペプチド１、３、７、または１２で誘導したＣＴＬ、患者２に対してペプチド５、６、１０、または１１で誘導したＣＴＬ、患者３に対してペプチド２または１２で誘導したＣＴＬ、患者４に対してペプチド１、２、３、４、７、または１０で誘導したＣＴＬ、患者５に対してペプチド１、３、４、１１、または１２で誘導したＣＴＬ、患者６に対してペプチド６または９で誘導したＣＴＬ、患者７に対してペプチド４、５、６、８、９、１１、または１２で誘導したＣＴＬ、患者８に対してペプチド５、７、または１０で誘導したＣＴＬの結果を示す。尚、横軸はＥｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ比（Ｅ／Ｔ比）、すなわち癌細胞数に対するＣＴＬ数の比を示す。
図４は、ウエスタンブロットを用いてＨｅｐＧ２の培養上清におけるＧＰＣ３タンパク質の存在を示す。
レーン１、３、５、及び７：６、１２、２４、及び４８時間の培養後のＨｅｐＧ２細胞１×１０５個の溶解物
レーン２、４、６、及び８：６、１２、２４、及び４８時間の培養後のＨｅｐＧ２培養上清２０μｌ
図５は、３種類のＨＣＣ細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２、Ｈｅｐ  ３ＢおよびＳＫ−Ｈｅｐ−１）の培養上清中に分泌されるＧＰＣ３タンパク質のＥＬＩＳＡによる定量の結果を示す。ＨｅｐＧ２細胞１×１０５個の２４時間培養後の培養上清１ｍｌ中のＧＰＣ３タンパク質の濃度を１Ｕ／ｍｌと定義した。
図６は、ウエスタンブロットによるＨＣＣ患者血清中の可溶性ＧＰＣ３タンパク質の検出を示す。
図７は、ＨＣＣ患者２８名及び健康なドナー（ＨＤ）５４名の血清中のＧＰＣ３タンパク質のＥＬＩＳＡによる定量の結果を示す。１．７１は、５４名のＨＤ由来の血清中のＧＰＣ３タンパク質の平均値＋３ＳＤとして規定される、血清中の可溶性ＧＰＣ３タンパク質の正常上限の値である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者等は、Ｏｋａｂｅ，Ｈ．ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，２１２９−２１３７（２００１））に記載の方法を用い、ｃＤＮＡマイクロアレイに基づいてヒト肝細胞癌において特異的に過剰発現している新規な癌胎児性タンパク質としてグリピカン３（ＧＰＣ３）を同定した。血清中のＧＰＣ３を検出した結果では、肝細胞癌以外の癌、例えば胃、食道、肺、乳房、すい臓、胆管、結腸等の癌ではＧＰＣ３は陰性であり、また、肝硬変、慢性肝炎等の良性の肝疾患においても陰性であることを確認した。更に本発明者等は、肝細胞癌の外科的治療後の患者において、術後の血清中ＧＰＣ３が陰性になることも確認した。
ヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋのタンパク質データベースにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ  ００４４７５として登録されており、当業者であれば容易に入手することができる。本発明者等は次に、種々のタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞上に提示される場合に、９個のアミノ酸からなるペプチド（ノナペプチド）に分解されてから提示されることを考慮し、日本人全体の６０％を占めるＨＬＡ−Ａ２４に対する結合モチーフを有するＧＰＣ３由来の９個のアミノ酸または１０個のアミノ酸からなる部分ペプチドを合成した。
ＨＬＡ−Ａ２４に対する結合モチーフを有するペプチドの選択は、例えば（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，３９１３，１９９４；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７，１９９４）に記載の方法に基づいて行うことができる。ＨＬＡ−Ａ２４以外のＨＬＡの型についても同様にペプチドを選択することが可能である。あるいはまた、最近インターネット上で利用可能となっているソフトウェア、例えばＰａｒｋｅｒ  Ｋ．Ｃ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，１９９４に記載されているもの等を用いて、種々のペプチドとＨＬＡ分子（ＨＬＡ抗原と呼ばれることもある）との結合親和性をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで計算することもできる。尚、ＨＬＡ分子との結合親和性は、例えば上記のソフトウエアを利用できるＢＩＭＡＳ：ＨＬＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／（Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，１９９４）、あるいはＮｕｋａｙａ，Ｉ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，１９９９等に記載の方法を用いて推定することができる。
９−ｍｅｒ及び１０−ｍｅｒペプチドは、得られたＧＰＣ３タンパク質の全アミノ酸配列に基づいて、任意の位置からのペプチドを合成して得ることができる。ペプチドの合成は、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。通常用いられる合成方法は、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成、丸善（株）、１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店、１９９１等の文献や、国際公開ＷＯ９９／６７２８８号等の公報に記載されている。ＨＬＡ分子とペプチドとの実際の結合は、ＴＡＰ欠損Ｔ２あるいはＲＭＡ−Ｓ細胞株に当該ＨＬＡ遺伝子を発現させたトランスフェクタントとペプチドをインキュベートし、細胞表面に発現するＨＬＡクラスＩ分子をフローサイトメーターで定量して測定することができる（例えばＩｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００２  Ａｕｇ  １，８３（１）：２１−３０；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４４：２３３−２４１，１９９６；Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３２１−３２５，１９９０を参照のこと）。
ＨＬＡ分子としては、日本人の多く（６０％）が保有しているＡ２４型を用いることが有効な結果を得るために好ましく、更に好ましくはＡ＊２４０２等のサブタイプである。しかしながら、臨床においては、治療を必要とする患者のＨＬＡ分子の型を予め調べることにより、これとの結合親和性、あるいは抗原提示による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能の高いペプチドを適宜選択することができる。更に、結合親和性及びＣＴＬ誘導能の高いペプチドを得るために、天然に存在するＧＰＣ３部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて１個または２個のアミノ酸の置換または付加を行うこともできる。天然において提示されるペプチド以外にも、既にＨＬＡ分子に結合して提示されるペプチドの配列の規則性が知られているので（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，３９１３，１９９４；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．４１：１７８，１９９５；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７，１９９４）、得られたペプチドに対してこれらの規則性に基づいた改変を行っても良い。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４結合親和性の高いものはペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンに置換したり、Ｃ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したペプチドも好適に使用することができる。
しかしながら、ペプチドの配列が他の機能を有する内在性または外来性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一となる場合には、自己免疫疾患等の副作用が生じたり、あるいは特定の物質に対するアレルギー症状を引き起こしたりする可能性があるため、利用可能なデータベースを用いてホモロジー検索を行い、他のタンパク質のアミノ酸配列と一致することを避けるのが好ましい。更に、ホモロジー検索において、アミノ酸が１個または２個異なるペプチドも存在しないことが明らかであれば、ＨＬＡ分子との結合親和性及び／またはＣＴＬ誘導能を高めるための上記アミノ酸配列の改変もこのような問題を生じるおそれがない。
上記のようにしてＨＬＡ分子との結合親和性の高いペプチドは、癌ワクチンとして有効である可能性が高いことが予想されるが、高い結合親和性を有することを指標として選択した候補ペプチドについて、実際にＣＴＬ誘導能を有するか否かを検討することが必要である。ＣＴＬ誘導能の確認は、例えばＨＬＡ分子を有する抗原提示細胞（例えばＢ−リンパ球、マクロファージ、樹状細胞）、具体的にはヒト末梢血単核細胞由来の樹状細胞等を誘導し、ペプチドで刺激した後にＣＤ８陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定する。あるいはまた、Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら（Ｅｕｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，８２６−８３６（２００２））に記載の方法に基づいてＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができる。更に、反応系として、ヒトＨＬＡ分子を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ａｕｇ．；６１（８）：７６４−７９  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｂｏｏｋｓ，Ｌｉｎｋｏｕｔ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ＨＬＡ  Ａ＊０２０１／ＤＲ１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｔ（Ｈ）ｒｅｓｐｏｎｓｅ．，ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ  Ｌ．，Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ．，Ｌｏｎｇｍａｔｅ  Ｊ．，Ａｕｇｅ  Ｃ．，Ｌｏｗ  Ｌ．，Ｐｒｉｍｕｓ  Ｊ．，Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＪ．に記載のもの）を用いることもできる。細胞傷害活性は、例えば標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識し、標的細胞から遊離した放射活性から計算することができる。あるいはまた、ペプチドを負荷した抗原提示細胞の存在下でＣＴＬが産生・放出したＩＦＮ−γ及び抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体によって培地上に可視化されるスポットを測定することによって観察することもできる。
上記のようにしてペプチドのＣＴＬ誘導能を検討した結果、以下の配列番号５〜１６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチドが特に高いＣＴＬ誘導能を有することが明らかとなった。
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本発明は更に、配列番号５〜１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。１個または２個のアミノ酸の置換または付加は、他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、ＣＴＬ誘導能を有し得る。特に、アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンへの置換は好適な例である。
上記の本発明のペプチドは、１種または２種以上の組み合わせとして、生体内でＣＴＬを誘導し得る癌ワクチンとして使用することができる。本発明のペプチドの投与により、抗原提示細胞のＨＬＡ分子に当該ペプチドが高密度に提示され、提示されたペプチドとＨＬＡ分子との複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導され、標的細胞となるべき肝細胞癌細胞に対する攻撃力が高まる。あるいは、被験者から樹状細胞を取り出して本発明のペプチドで刺激することにより、細胞表面に本発明のペプチドを負荷した抗原提示細胞が得られ、これを再度被験者に投与することで被験者においてＣＴＬを誘導し、標的細胞に対する攻撃力を高めることができる。
すなわち、本発明は、本発明のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療または腫瘍の増殖・転移等の予防のための医薬を提供するものである。尚、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、本発明のペプチドによる抗原提示細胞の刺激は、細胞に対して高濃度のペプチドを存在させることによって、当該細胞に予め負荷されているペプチドとの交換が生じ、容易に行われる。このため、ＨＬＡ分子との結合親和性はある程度以上高いことが必要とされる。
本発明の医薬は、本発明のペプチドを単独で直接投与しても良いが、通常用いられる製剤学的方法によって製剤化した医薬組成物として投与しても良い。その場合、本発明のペプチドの他に、通常医薬に用いられる担体、賦形剤等を適宜含むことができ、特に限定されるものではない。
本発明のペプチドを有効成分とする肝細胞癌の治療及び／または予防のための医薬は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントと共に投与したり、他の抗癌剤等の有効成分と共に投与したり、また粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが利用でき、全身投与、あるいは目的となる腫瘍の近傍に局所投与しても良い。本発明のペプチドの投与量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法等により適宜調整することができるが、通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。当業者であれば、適当な投与量を適宜選択することが可能である。
あるいはまた、本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面に提示している、エキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームの調製は、例えば特表平１１−５１０５０７号、及び特表２０００−５１２１６１号に詳細に記載されている方法を用いて行うことができるが、好ましくは治療及び／または予防の対象となる被験者から得た抗原提示細胞を用いて調製する。本発明のエキソソームは、上記本発明のペプチドと同様に癌ワクチンとして接種することができる。
ＨＬＡ分子としては、治療及び／または予防を必要とする被験者のＨＬＡ分子と同じ型のものであることが必要である。例えば、日本人の場合にはＨＬＡ−Ａ２４、特にＨＬＡ−Ａ＊２４０２とすると好適であることが多い。
本発明はまた、本発明のペプチドを用いた抗原提示細胞の誘導方法も提供する。樹状細胞を末梢血単球から誘導した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、抗原提示細胞を誘導することができる。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内で本発明のペプチドを負荷した抗原提示細胞が誘導される。あるいは、抗原提示細胞に本発明のペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで負荷した後に被験者にワクチンとして投与することもできる。
本発明はまた、ＧＰＣ３タンパク質または上記本発明のペプチドを含む、その部分ペプチドをコードする遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。導入する遺伝子はＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。導入の方法は当分野において通常行われるリポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法等の種々の方法を用いれば良く、特に限定するものではない。具体的には、例えばＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：５６７２，１９９６；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：５６０７，１９９８；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：４６５，１９９６；特表２０００−５０９２８１号に記載のようにして行うことができる。遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって、当該遺伝子は細胞中で転写、翻訳等の処理の後、得られたタンパク質がＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのプロセッシング及び提示経路を経て、部分ペプチドが提示される。
本発明は更に、上記本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内でＣＴＬが誘導され、肝細胞癌細胞を標的とした免疫力が増強される。あるいは、被験者由来の抗原提示細胞及びＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、ＣＴＬを誘導してから被験者にもどすｅｘ  ｖｉｖｏの治療方法にも用いることができる。
本発明は更に、本発明のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。本発明のペプチドを提示した抗原提示細胞による刺激に基づいて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキソソーム等を含む、他の医薬と共に抗腫瘍効果を目的として投与することができる。
本発明は更に、ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞を提供する。本発明のペプチド、あるいは本発明のペプチドを含むＧＰＣ３タンパク質、またはその部分ペプチドをコードする遺伝子との接触によって得られる当該抗原提示細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキソソーム、細胞傷害性Ｔ細胞等を含む、他の医薬と共にワクチンとして投与することができる。
本発明は更に、ＧＰＣ３に対する抗体を含む、肝細胞癌の診断剤を提供する。ＧＰＣ３に対する抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれでも良く、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ＧＰＣ３タンパク質はアミノ酸配列が前記のように公知であり、当該アミノ酸配列に基づいて通常のタンパク質発現技術を用いて製造でき、また市販のもの（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を利用することも可能である。市販のＧＰＣ３を用いる場合は、必要に応じてＳＤＳ−ｏｕｔＴＭ（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより購入）を用いてＳＤＳを除いて使用することが好ましい。またＧＰＣ３の部分ペプチドは、ＧＰＣ３のアミノ酸配列から適当な部分配列を選択し、通常のペプチド合成技術を用いて製造できる。
ポリクローナル抗体の調製は、まず、例えば、ウサギ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ニワトリ、サルなどの動物にＧＰＣ３タンパク質またはその部分ペプチドを感作抗原として投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。
一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、ＧＰＣ３タンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間継続する。次いで、目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。
また、本発明の抗体は、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生させても良い。例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。次に、形質転換させた宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。
モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製により行うことができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られずＧＰＣ３に結合する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。尚、本発明の目的のためには、抗体はＧＰＣ３のいかなるエピトープを認識するものであっても良い。
診断剤としての正確性のためには、抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ＧＰＣ３タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＥ  Ｈ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫グロブリン遺伝子をヒトと入れ換えたマウスにＧＰＣ３タンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
本発明の診断剤において、限定するものではないが、抗体は例えば１μｇ／ｍｌの濃度で用いることができる。診断剤には上記ＧＰＣ３に対する抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体等を適宜含有させることができる。
本発明は更に、サンプルとＧＰＣ３に対する抗体を接触させることを含む、肝細胞癌の診断方法を提供する。診断方法は、更にサンプル中のＧＰＣ３を定量することを含み得る。本発明において、サンプルは、ＨＣＣに罹患しているおそれのある被験者から得られる血清、唾液、尿等が挙げられるが、特に好ましくは血清である。サンプルと上記抗体との接触は、当分野において通常行われている方法に基づいて行えば良く、特に限定するものではない。診断は、例えばサンプルと上記抗体との接触の後、サンプル中に存在し得るＧＰＣ３と抗体との特異的結合を、蛍光物質や発光物質、酵素等で標識した二次抗体等を使用して定量的に検出することにより行うことができる。また、診断のための反応をウェル等の液相中で行っても良く、あるいはＧＰＣ３に対する抗体を固定した固相支持体上で行っても良い。この場合、ＨＣＣに罹患していない正常なサンプル、あるいはＨＣＣであることが判明しているサンプルを用いて予め作製した標準値と比較することによって、測定された値がＨＣＣ陽性であるか否かを判定することができる。また、診断の際には、多数のＨＣＣ患者と健常入の血清中ＧＰＣ３量を測定して、カットオフ値を設定することが好ましい。
本発明の診断方法は、ＨＣＣに罹患しているか否かの診断に用いることができる他、ＨＣＣに対する治療の効果を確認するために経時的に行うこともできる。
更に本発明は、ＧＰＣ３に対する抗体を含む、ＨＣＣの診断のためのキットを提供する。当該キットには、ＧＰＣ３に対する抗体の他、二次抗体、定量のための標準サンプル、バッファー等を含めることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  ＨＣＣで特異的に過剰発現するＧＰＣ３遺伝子の同定
ｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現のプロファイリングは先に報告したように行った（Ｏｋａｂｅ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，２１２９−２１３７（２００１））。肝切除術を行った２０名の患者から、原発性ＨＣＣ及び対応する非癌性肝臓組織を得た。そのうち１０例はＢ型肝炎表面抗原陽性、１０例はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）陽性であり、ＨＢＶ及びＨＣＶの双方に感染している例はなかった。ＨＢＶ陽性及びＨＣＶ陽性のもので、年齢、性別、分化の程度、血管の浸潤、腫瘍の段階に関して有意な差異はなかった。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＵｎｉＧｅｎｅデータベースから選択した２３，０４０種のｃＤＮＡを含む「ゲノムワイドの」ｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。ＨＣＣ及び対応する非癌性肝臓組織間での発現プロファイルを比較してＨＣＣにおいて特異的に過剰発現している遺伝子を探索し、その結果、ＨＣＣ患者に対する免疫治療の候補であり、おそらくは理想的な標的であり得るＧＰＣ３を同定した。２０例のＨＣＣ中１６例において、癌組織におけるＧＰＣ３  ｍＲＮＡの発現は非癌性組織における発現よりも５倍以上高かった（図１）。すなわち、ＧＰＣ３はほとんどのＨＣＣにおいて過剰発現しており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＨＣＶ感染とは関連していなかった。一方、ＧＰＣ３  ｍＲＮＡは胎盤、胎児肝臓、胎児肺、及び胎児腎臓において高発現しており、成人の正常組織のほとんどで発現が低かった（図１）。これらのＧＰＣ３に関するデータは、ノーザンブロッティング研究に基づいて公表されているものと一致した（Ｚｈｕ，Ｚ．Ｗ．ら，Ｇｕｔ  ４８，５５８−５６４（２００１）；Ｈｓｕ．Ｈ．Ｃ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，５１７９−５１８４（１９９７）；Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２１３，４３１−４３９（１９９８））。この結果から、ＧＰＣ３はα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）と同様に、ＨＣＣにおける新規な癌胎児性抗原であることが明らかとなった。
［実施例２］  ヒトＨＣＣ細胞系におけるＧＰＣ３  ｍＲＮＡ及びＨＬＡ−Ａ２４の発現
ＣＴＬアッセイのための標的ＨＣＣ細胞系を選択するために、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いたＧＰＣ３  ｍＲＮＡ発現、抗ＨＬＡクラスＩ（ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡ−Ａ２４（ＩｇＧ２）モノクローナル抗体（ＶＥＲＩＴＡＳ、東京）、及びＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）を用いた免疫染色及びフローサイトメトリーによるＨＬＡ−クラスＩ及び−Ａ２４の発現を検討した。ＨＣＣ細胞系であるＨｅｐ  Ｇ２、Ｈｅｐ  ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、及びＨｕＨ−７は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。またＳＫ−Ｈｅｐ−１は久留米大学のＫ．Ｉｔｏｈ博士よりご供与頂いた。
ＲＴ−ＰＣＲは公知の方法（例えばＮａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１，９３６−９４４（２００１））に従って行った。９３９ｂｐの断片を増幅するＧＰＣ３遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを設計し、これを用いて９４℃、５分の初期変性、及び５８℃のアニーリング温度での３０増幅サイクルからなるＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。用いたＧＰＣ３ＰＣＲプライマー配列は、
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対照であるβ−アクチンｍＲＮＡによる標準化の後、ＨＣＣ細胞系におけるＧＰＣ３  ｍＲＮＡの発現を比較した。
その結果、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＨｕＨ−７  ＨＣＣ細胞系においてＧＰＣ３  ｍＲＮＡの強い発現が示され、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞系において中程度の発現が示されたが、ＳＫ−Ｈｅｐ−１ではそのような発現は見られなかった（図２）。尚、ＨｅｐＧ２及びＳＫ−Ｈｅｐ−１はＨＬＡ−Ａ２４を発現したが、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕＨ−７は発現しなかった。
［実施例３］  末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の刺激による腫瘍応答性ＣＴＬの誘導
先行技術（Ｋｕｂｏ，Ｒ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，３９１３−３９２４（１９９４））に基づいて、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合することが予想されるＧＰＣ３由来ペプチドを探索し、１２種の異なるペプチドを合成して使用した（表１）。これらのペプチドは、Ｆｍｏｃ／ＰｙＢＯＰ法を用いて合成したものであり（後記参考例１〜１２を参照のこと）、ｂｉｏｌｏｇｉｃａ（東京）から購入した。ペプチドの純度は、ＨＰＬＣでいずれも９５％を越えることが確認された。
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インフォームドコンセントを得た後、熊本大学医学部外科学第二講座において治療中のＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＣＣ患者から血液サンプル３０ｍｌを得、先に報告したように（Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，８２６−８３６（２００２））、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ密度勾配遠心法によってＰＢＭＣを単離した。ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するｇｌｙｐｉｃａｎ−３由来のペプチド１２種（表１、Ｎｏ．１〜１２：配列番号５〜１６に対応）について、８名のＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＣＣ患者（Ｐｔ１〜８）から得たＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性で、かつ腫瘍応答性のＣＴＬを誘導する能力について検討した（図３、表１）。ＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導する方法は、先に報告した方法（Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，８２６−８３６（２００２））を用いた。ＣＴＬの表面表現型はＦＩＴＣ−コンジュゲート抗−ＣＤ３、−ＣＤ４、または−ＣＤ８モノクローナル抗体（ニチレイ、東京）を用いた直接免疫蛍光染色によって検討した。エフェクター細胞及びＨＬＡ拘束性を決定するために、培養開始時に各２０μｇ／ｍｌの抗−ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗−ＨＬＡ−Ａ２４（００４１ＨＡ、ＩｇＧ２ａ）、抗−ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗−ＨＬＡ−ＤＲ（Ｈ−ＤＲ−１、ＩｇＧ２ａ）、及び抗−ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／Ｉ、ＩｇＧ１）モノクローナル抗体を添加した。アイソタイプが合った対照として、抗−ＣＤ１３（ＭＣＳ−２、ＩｇＧ２ａ）及び抗−ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ１）モノクローナル抗体を使用した。３〜４週間後、これらのＣＴＬ株の数はＰＢＭＣの培養前の数と比較して約１０倍に増加した。次にこれらのＣＴＬ株のＨＣＣ細胞株に対する細胞傷害活性を６時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって検討した。結果を図３及び表１に示す。９６種中３３種（３４．４％）のＣＴＬ株が、ＨＬＡ−Ａ２４−ＧＰＣ３＋のＨｅｐ３Ｂ及びＨｕＨ−７、及びＨＬＡ−Ａ２４＋ＧＰＣ３−のＳＫ−Ｈｅｐ−１に対してよりも、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＧＰＣ３＋のＨｅｐＧ２に対して強い細胞傷害性を示した。この細胞傷害性はペプチド特異性を示し、抗−ＨＬＡ−クラスＩ、抗−ＣＤ８または抗−ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体によって阻害されることから、これらのＴ細胞応答がＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＤ８＋ＣＴＬによって担われていることが示される。各ペプチドまたは各患者におけるＣＴＬの誘導率を表１に示す。これらの結果から、ＧＰＣ３由来の１２種のペプチドの全てがＣＴＬ誘導能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＧＰＣ３由来ペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ株が８名のＨＣＣ患者の全員において誘導されたことが示される。
［実施例４］  ＨＣＣにおけるＧＰＣ３タンパク質の発現
４名のＨＣＣ患者から切除した肝臓組織周辺のＨＣＣ及び非癌性領域におけるＧＰＣ３のウエスタンブロッティング解析及び免疫組織化学分析を行った。
ウエスタンブロッティングは以下のように行った。サンプルを適量の溶解用バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム（和光純薬工業（株））、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤タブレット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））中で溶解した。溶解物の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）にトランスファーした。５％脱脂乳、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中でブロッキングした後、この膜を、ＧＰＣ３  ３０３−４６４のアミノ酸に対応する組換えタンパク質に対して作製された抗−ＧＰＣ３ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共にインキュベートし、ＰＢＳでよく洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗−ウサギＩｇ、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）２断片（ロバ由来）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｃｈａｍ）を使用して化学発光検出を行った。
免疫組織化学分析は、当分野において公知の方法に従って行った（Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１，９３６−９４４（２００１））。ＯＣＴ包埋用化合物に包埋した厚さ４μｍの組織サンプル切片を１：２００に希釈した抗−ＧＰＣ３抗体と共に染色した。陽性対照のために４５ｋＤａタグ付き融合タンパク質として大腸菌から産生されるＧＰＣ３  ３０３−４６４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）及び抗−ｇｌｙｐｉｃａｎ−３ウサギポリクローナル抗体のビオチン化のためにＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｍｉｎｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｆ−６３４７）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ）を使用した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を４℃で一晩、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中０．１μｇ／ウェルの抗−ヒトＧＰＣ３  ３０３−４６４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でコートした。次いで、４％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳを用い、室温で１時間、プレートをブロッキングした。陽性対照の標準サンプル及び培養上清をビオチン化抗−ＧＰＣ３抗体と共に添加し、室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルにＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジン（ＥＮＤＯＧＥＮ，Ｗｏｂｕｒｎ）を添加した。３０分のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（ＥＮＤＯＧＥＮ）を添加した。解析のためにＥＬＩＳＡリーダー（モデル５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を４０５ｎｍで用いた。
インフォームドコンセントを得た後、熊本大学医学部外科学第二講座において治療中のＨＣＣ患者から組織サンプルを得た。４種の腫瘍全てにおいて、ＧＰＣ３タンパク質の発現がＨＣＣ細胞において非癌性肝細胞と同程度に低いという同様の結果が得られた。従って、ＨＣＣ細胞中におけるＧＰＣ３  ｍＲＮＡ発現とＧＰＣ３タンパク質発現の間に矛盾が生じる。ＧＰＣ３はＧＰＩ−アンカー型膜タンパク質であり、分泌タンパク質である可能性が報告されている（Ｆｉｌｍｕｓ  Ｊ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１，１９Ｒ−２３Ｒ（２００１））。そこで、次に分泌されたＧＰＣ３タンパク質の検出を試みた。
［実施例５］  ＨＣＣ細胞株の培養上清及びＨＣＣ患者血清中における可溶性ＧＰＣ３タンパク質の検出
ＨｅｐＧ２の培養上清中に可溶性ＧＰＣ３タンパク質が存在するか否かを検討するために、所定の培養期間の後に回収したＨｅｐＧ２細胞溶解物及び培養上清についてウエスタンブロッティングを行った。無血清培地における６、１２、２４、及び４８時間の培養後に１×１０５個のＨｅｐＧ２細胞から調製した細胞溶解物は、同様の量の６０ｋＤａのＧＰＣ３タンパク質の存在を示した（図４のレーン１、３、５、及び７）。一方、６、１２、２４、及び４８時間の培養後のＨｅｐＧ２培養上清（１ｍｌ／ウェルの２０μｌ）では６０ｋＤａのＧＰＣ３タンパク質が漸増しており、ＧＰＣ３タンパク質がＨｅｐＧ２から培養上清中に分泌されたことを示した。
次いで、抗−ＧＰＣ３  ３０３−４６４抗体及びビオチン化抗−ＧＰＣ３抗体を用いて酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）による検出を行った。ＧＰＣ３  ３０３−４６４に対応する市販の組換えタンパク質を用い、ＥＬＩＳＡ系におけるＧＰＣ３の定量の精度を確認した。ＨｅｐＧ２培養上清の連続希釈を用い、ＯＤデータに基づいてＧＰＣ３タンパク質を定量する標準曲線を評価した。１×１０５個のＨｅｐＧ２細胞を２４時間培養した後の培養上清１ｍｌ中のＧＰＣ３タンパク質の濃度を１Ｕ／ｍｌと定義した。ＨｅｐＧ２培養上清中のＧＰＣ３タンパク質の量はＨｅｐ３Ｂよりはるかに多く、一方ＳＫ−Ｈｅｐ−１においては検出できなかった（図５）。
次に、ＨＣＣ患者血清中の可溶性ＧＰＣ３タンパク質の検出を行った（図６）。２８名のＨＣＣ患者から血液サンプルを採取し、医療記録から患者のプロファイルを集めてＵＩＣＣ  ＴＮＭ分類に基づいて臨床段階を決定した。患者７（Ｐｔ７、図６のレーン３）の血清２０μｌ中に６０ｋＤａのＧＰＣ３タンパク質のバンドが検出されたが、他の２名のＨＣＣ患者及び４名の健康なドナーの血清からは検出されなかった。次に２８名のＨＣＣ患者及び５４名の健康なドナー（ＨＤ）の血清中のＧＰＣ３タンパク質の量をＥＬＩＳＡによって評価した（図７）。５４名のＨＤ血清中のＧＰＣ３タンパク質の平均は０．７５Ｕ／ｍｌであり、標準偏差（ＳＤ）は０．３２であった。男女間で発現に差はなく、従って卵巣でのＧＰＣ３の弱い発現は、この系に関して無視できると考えられた。２８名のＨＣＣ患者の平均値は１．９８Ｕ／ｍｌであった。血清中のＧＰＣ３タンパク質の正常上限値を決定するために、５４名のＨＤ血清のＧＰＣ３タンパク質の平均＋３ＳＤとして１．７１を規定した。ＨＣＣ患者の３５．７％（１０／２８）、ＨＤの０％（０／５４）がＧＰＣ３タンパク質陽性（＞１．７１）であった。ＨＣＣ患者血清中のＧＰＣ３タンパク質の濃度は、ＨＤにおける濃度よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０００１）。患者４、５及び７についてＥＬＩＳＡで評価したＧＰＣ３の濃度は、図６に示すようにそれぞれ０．９４、１．７３、及び６９．４Ｕ／ｍｌであった（表２）。すなわち、ウエスタンブロッティングでは６９．４Ｕ／ｍｌのＧＰＣ３タンパク質は検出できるが、１．７３Ｕ／ｍｌのＧＰＣ３は検出できなかった。
表２の結果から明らかなように、１０名のＧＰＣ３−陽性患者のうち２名（患者６及び２５）はＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩの双方が陰性であり、その一方の患者（患者６）は比較的初期のＵＩＣＣステージＩＩとして分類された。すなわち、ＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩの双方が陰性の患者においてＧＰＣ３が陽性となる場合があることから、ＧＰＣ３はＨＣＣの新規な腫瘍マーカーとして有用であることが明らかとなった。
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［参考例１］  Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号５）の合成
開始レジンとしてＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎ（１００−２００ｍｅｓｈ）を用いて後記スケジュールＡに従って合成を開始し、工程５まで進んだ後、工程２へ戻ることでαアミノ基の脱保護、洗浄、カップリング、洗浄を繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次カップリングさせた結果、ペプチド結合樹脂を得た。ペプチドは工程６に示す試薬との反応によって樹脂から切り離され、冷メチルタートブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中にろ過され、沈殿させた。沈殿したペプチドは２回冷ＭＴＢＥで洗浄され、窒素下で凍結乾燥された。
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得られた粗ペプチドはＢｉｏＣａｄ  ６０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）により、粒子サイズ１０ミクロンのＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いて逆相ＨＰＬＣ法によって精製された。流速２０ｍｌ／ｍｉｎ，４５分で１０％Ｂから８０％Ｂ（溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ，溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡ／アセトニトリル）の直線濃度勾配で溶出し、溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターした。面積割合で９０％以上を占める主ピークの質量分析をＬａｓｅｒｍａｔ  ２０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｍａｔ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法で行なった結果、理論値［ＭＨ＋］１１０９．３に対し、実測値１１０９．９を得た。
［参考例２］  Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号６）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ＋］１１３１．３に対し、実測値１１３０．４を得た。
［参考例３］  Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号７）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ＋］１０３１．２に対し、実測値１０３２．３を得た。
［参考例４］  Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（配列番号８）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ−］１１２１．３に対し、実測値１１２２．１を得た。
［参考例５］Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ（配列番号９）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ−］１１０８．３に対し、実測値１１１１．４を得た。
［参考例６］  Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１０）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ＋］１１１４．３に対し、実測値１１１５．７を得た。
［参考例７］  Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号１１）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ−］１１０４．３に対し、実測値１１０５．３を得た。
［参考例８］  Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号１２）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ＋］１３７１．６に対し、実測値１３７０．７を得た。
［参考例９］  Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号１３）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ＋］１２１１．４に対し、実測値１２１３．４を得た。
［参考例１０］  Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ（配列番号１４）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ−］１２１６．４に対し、実測値１２１７．４を得た。
［参考例１１］  Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ（配列番号１５）の合成
［参考例１０］と同様にＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎ（１００−２００ｍｅｓｈ）を開始レジンとして用い、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ＋］１１９３．４に対し、実測値１１９６．８を得た。
［参考例１２］  Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（配列番号１６）の合成
［参考例１］と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ  Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎを用い、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを順次結合させた。
質量分析の結果、理論値［ＭＨ−］１１８３．５に対し、実測値１１８６．７を得た。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図３】
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【図３】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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