(57)【要約】外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換えＢＣＧワクチンであって、ポリヌクレオチドの各コドンの第３番目塩基がアミノ酸の種類を変化させることなくＧまたはＣに置換された改変型ポリヌクレオチドである。この組換えＢＣＧワクチンは、抗原性タンパク質の発現量に優れ、その結果として通常のＢＣＧワクチンと同程度の使用量によっても、標的とする感染症や癌等に対して十分な免疫応答を誘導することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換えＢＣＧワクチンであって、前記ポリヌクレオチドの各コドンの第３番目塩基がアミノ酸の種類を変化させることなくＧまたはＣに置換された改変型ポリヌクレオチドである組換えＢＣＧワクチン。
【請求項２】
改変型ポリヌクレオチドの各コドンの全塩基が、アミノ酸の種類を変化させることなくＧまたはＣを多く含むように置換されている請求項１の組換えＢＣＧワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、組換えＢＣＧワクチンに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、少ない用量で外来性抗原タンパク質に対する十分な免疫応答を誘導することのできる組換えＢＣＧワクチンに関するものである。
【背景技術】  牛型結核菌弱毒ＢＣＧ株（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ。以下「ＢＣＧ」と記載する）は、その安全性から、最も一般的な生バクテリアワクチンとして知られている。
一方、この十数年来の遺伝子組換え技術の開発、向上に伴い、ウイルスや細菌などの微生物に外来性の抗原性タンパク質を発現させるように改変して、様々な感染症や癌の予防および治療に対するワクチンベクターとして応用しようという研究が盛んに行われて来ている。ＢＣＧについても、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）やサル免疫免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を標的とする組換えＢＣＧワクチンが報告されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４９６８−４９７８，２０００；Ｊ．Ｖｉｒｏｏｌ．７１：２３０３−２３０９，１９９７；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２８３−２８８，１９８９）。
ＢＣＧ株は、その安全性と供給が容易であるという点において優れた組換えワクチンの候補である。しかしながら、従来の組換えＢＣＧワクチンの場合には、標的となる感染症や癌等に対する免疫誘導能の点においては必ずしも十分なものではなかった。例えば、ＨＩＶ−１を標的とする組換えＢＣＧワクチンを用いてモルモットに免疫誘導を行った場合には、通常のＢＣＧワクチンのヒトへの使用量（０．０５−０．１ｍｇ）の１０〜１００倍の量を投与する必要がある（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ．９２：１０６９８−１０６９７，１９９５）。
一方、組換えワクチンにおいて、外来抗原タンパク質に高い免疫原性を与える手段として、コドンの最適化が試みられている。すなわち、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオリシン（ｌｏｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ）０（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５５９４−５５９９，１９９８）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９１−１１００１，２００；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５，２０００）、Ｅｎｖ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７−１５０３，１９９８）、破傷風毒素（Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：８１０−８１５，２０００）、ヒトパピローマウイルスのＬ１タンパク質（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：９２０１−９２０９，２００１）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のメロゾイト表面タンパク質１（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７２５０−７２５３，２００１）などのコドン最適化が報告されている。しかしながら、これらのコドン最適化は、各抗原タンパク質のアミノ酸コドンをヒト化したものである。また、組換えワクチンもＤＮＡワクチン（ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ）であり、ＢＣＧ株等の他の組換えベクターを主成分とするワクチンにおいては、コドン最適化の効果は全く報告されていない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、抗原性タンパク質の発現量に優れ、その結果として通常のＢＣＧワクチンと同程度の使用量によっても、標的とする感染症や癌等に対して十分な免疫応答を誘導することのできる組換えＢＣＧワクチンを提供することを課題としている。
【発明の開示】
この出願の発明は、前記の課題を解決するための発明として、外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換えＢＣＧワクチンであって、前記ポリヌクレオチドの各コドンの第３番目塩基がアミノ酸の種類を変化させることなくＧまたはＣに置換された改変型ポリヌクレオチドである組換えＢＣＧワクチンを提供する。
この組換えＢＣＧワクチンにおいては、改変型ポリヌクレオチドの各コドンの全塩基が、アミノ酸の種類を変化させることなくＧまたはＣを多く含むように置換されていることを好ましい態様の一つとしている。
なおこの発明において、「ポリヌクレオチド」とはプリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が結合した分子を意味する。また、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮｅＷ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｐＮＬ４−３由来のｐ２４遺伝子のヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸配列、およびマイコバクテリアの最適コドンをもつ合成ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４遺伝子のヌクレオチド配列である。ｐＵＣ−ｈｓｐＫベクターへのクローニングのため、このＤＮＡフラグメントの５’および３’末端にＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ認識部位を付加した。星印はｐＮＬ４−３  ｐ２４遺伝子との同一配列を示す。
図２は、発現ベクターｐＳＯ−ｐ２４ＭｕおよびｐＳＯ−ｐ２４ＷＴの構造を示した模式図である。（Ａ）はＨＩＶ−１  ｐ２４の発現ユニットの模式図である。それぞれの矢印および黒四角はは、ｈｓｐ６０プロモーターおよびターミネーターの転写方向を示している。灰色、黒色、および白のバーは、各々マイコバクテリアのＤＮＡフラグメント、改変型ｐ２４遺伝子、およびｐ２４遺伝子のＰＣＲフラグメントを示す。（Ｂ）は発現ベクターｐＳＯ−ｐ２４Ｍｕおよび−ｐ２４Ｗｔの詳細である。Ｏｒｉ−ＭおよびＫｍｒは、各々マイコバクテリアの複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子を示す。
図３は、ｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔのｐ２４発現レベルおよび増殖速度を比較した結果である。（Ａ）は、抗ｐ２４モノクローナル抗体（Ｖ１０７）に反応するタンパク質をウェスタンブロットによって可視化した。レーン１はｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔの溶解産物、レーン２はｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕの溶解産物、レーン３はｐＳＯ２４６を含むｒＢＣＧの溶解産物（ネガティブコントロール）である。（Ｂ）はｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−２４Ｗｔの全細胞溶解物におけるｐ２４濃度の比較である。１ｍｌの各培養物からｒＢＣＧ細胞を定期的に回収し、超音波処理し、市販のｐ２４抗原ＥＩＡにより試験した。黒および白四角はそれぞれｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕおよび−ｐ２４Ｗｔを示す。データは異なるクローンの平均値±ｓ．ｄ．を示す。（Ｃ）は組換え体クローンにおける増殖速度の動性である。１ｍｌの各培養物を定期的に回収し、４７０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．を測定し、以下に示したとおりに吸光度から細胞密度を計算した；
密度（μｇ／ｍｌ）＝４７０ｎｍの吸光度×１４１２．３＋７３．０６３
密度からｃｆｕを変換し、プロットした。黒四角、白四角、白丸はそれぞれ、ｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ、−ｐ２４Ｗｔ、およびｐＳＯ２４６を示す。データは異なるクローンの平均値±ｓ．ｄ．を示す。
図４は、ｒＢＣＧｓで免疫化したマウスにおける細胞性および体液性免疫反応である。（Ａ）はＧａｇｐ２４重複ペプチドに対するリンパ球増殖である。増殖活性は刺激指数（ＳＩ）で示した。黒および白カラムはそれぞれｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕおよび−ｐ２４Ｗｔで免疫したマウスのＳＩ値を示す。データは各マウス群の平均ＳＩ値＋ｓ．ｄ．を示す。星印は統計的有意差（★はｐ＜０．０２、★★はｐ＜０．００２）を示す。（Ｂ）はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞の測定。黒、白および灰色カラムはそれぞれｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ、−ｐ２４ＷｔおよびｐＳＯ２４６で免疫したマウスのＳＦＣ数を示す。データは各マウス群のＳＦＣｓ／１０６細胞の平均数＋ｓ．ｄ．を示す。星印は統計的有意差（★はｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔ免疫マウスに対するｐ＜０．０５）を示す。（Ｃ）は各ｒＢＣＧで免疫したマウスの血漿中における抗ｐ２４特異的抗体および抗ＰＰＤ特異的ＩｇＧ抗体。黒、白および灰色カラムはそれぞれｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ、−ｐ２４ＷｔおよびｐＳＯ２４６で免疫したマウスのｌｏｇ２の逆数力価である。力価は終点ＥＬＩＳＡにほって決定した。データは各マウス群の平均力価＋ｓ．ｄ．を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  この発明の組換えＢＣＧワクチンは、外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換えＢＣＧを有効成分とする。そして、外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、コードする抗原性タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の種類を変化させないという条件で、各アミノ酸残基をコードするコドンの第３番目塩基がＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）に置換された改変型ポリヌクレオチドであることを特徴としている。
コドンの置換は、具体的には表１に示したとおりである（「至適コドン」の欄）。すなわち、例えばグリシン（Ｇｌｙ）をコードするコドンは、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡおよびＧＧＧの４種類であるが、上記の基準に合致するＧｌｙコドンはＧＧＣまたはＧＧＧである。従って、任意の抗原性タンパク質のアミン酸配列におけるＧｌｙコドンがＧＧＴまたはＧＧＡである場合には、第３番目のＴ（チミン）またはＡ（アデニン）は、ＣまたはＧに置換される。
2004016280.tif 000002
この発明においては、各コドンの全ての塩基はさらに、それがコードするアミノ酸残基の種類を変化させない条件で、ＧまたはＣを多く含むように置換されていることを好ましい態様としている。このような置換は、具体的には、ロイシン（Ｌｅｕ）およびアルギニン（Ａｒｇ）に適用される。すなわち、表１に示した至適コドンのうち、Ｌｅｕコドンとしては、Ｔを２個含むコドン（ＴＴＧ）よりも、ＣＴＣまたはＣＴＧが好ましく選択される。また、Ａｒｇコドンとしては、Ａを含むコドン（ＡＧＧ）よりも、ＣＧＣまたはＣＧＧが好ましく選択される。
以上のとおりのコドン置換は、以下の知見に基づいている。すなわち、ＢＣＧゲノムはＧ＋Ｃ含量の高いＤＮＡから成り、コドンの３番目の位置はＧＣペアを強く好むことが知られている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：９２０１−９２０９，２００１；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２８３−２８８，１９８９）。また、ＢＣＧ遺伝子についての集積された情報（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２，２０００）から、ＡｒｇのＡＧＡコドンおよびＬｃｕのＴＴＡコドンの使用頻度は極めて低いこと（全コドンの０．９％および１．６％）も知られている。一方、例えば、ＨＩＶ−１はコドンの３番目の位置にＡＴペアを好むことが知られている。すなわち、ＨＩＶ−１  ｐ２４遺伝子のコード配列においては、１１個のＡｒｇコドンのうち９個がＡＧＡを用い、また１８個のＬｅｕコドンのうち６個がＴＴＡを用いている。コドン使用頻度の好みは、単細胞生物では対応するアミノアシルｔＲＮＡ量と相関関係があることが一般的に知られている（Ｎａｔｕｒｅ３２５：７２８−７３０，１９８７；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２：１３−３４，１９８５）が、ＨＩＶ−１  ｐ２４遺伝子において好まれるＡｒｇコドン（ＡＧＡ）およびＬｅｕコドン（ＴＴＡ）用のアミノアシルｔＲＮＡ量はＢＣＧ細胞においては極めて低いと考えられる。
従って、この発明においては、ＢＣＧ細胞において特に好まれるコドン使用頻度（すなわち、コドンの第３番目塩基がＧまたはＣ、さらにはＧまたはＣをできるだけ多く含むコドン）に合致した塩基配列となるように、外来性の抗原性ポリヌクレオチドを置換するようにしている。
各コドンに対応した好ましい塩基置換をポリヌクレオチドに導入するには、公知のＫｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４：３６７，１９８７）や、ミューテーション・キット等を使用する方法、あるいは変異導入型のＰＣＲ法などを採用することができる。
ＢＣＧ株は、結核の予防接種等に使用されている公知のものを対象とすることができる。また、ＢＣＧ株に導入する発現ベクターは、従来の組換えＢＣＧワクチンの作成に使用されているような、ＢＣＧ用ベクター（例えばプラスミドｐＳＯ２４６等）を使用することができる。このベクターのクローニングサイトに、外来性（すなわち、ＢＣＧ以外）の任意の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって発現ベクターを構築することができる。なお、以下の記載では、外来性の抗原性タンパク質を「外来ポリペプチド」、これをコードするポリヌクレオチドを「外来ポリヌクレオチド」と記載することがある。また、外来ポリヌクレオチドには、ＢＣＧ株由来の任意のプロモーターおよびターミネーター配列（例えばＢＣＧ株由来の熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ６０）のプロモーターおよびターミネーター配列）等を連結することによって、外来ポリペプチドを良好に発現させるようにする。
外来ポリヌクレオチドは、ＢＣＧ株以外の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ断片）であり、外来ポリペプチドは生体内で抗原抗体反応を惹起するものであれば如何なるものであってもよい。具体的にはヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇａｇ前駆体ｐ５５またはｐ２４タンパク質、ｅｎｖタンパク質ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｐｏｌ前駆体タンパク質、ｎｅｆタンパク質、ｔａｔタンパク質等を対象とすることができる。また、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来の同様の抗原性ポリペプチドを使用することもできる。あるいは、その他の病原体（他の病原性ウイルスや細菌）、もしくは癌細胞の抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用いることもできる。
外来ポリヌクレオチドの取得方法としては、外来ポリペプチドをコードするゲノム遺伝子またはそのｃＤＮＡがクローン化されたプラスミドからその実質的な配列であるポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切り出すか、適当な配列のプライマーを用いたｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）により増幅すればよい。クローン化されていない場合は、その遺伝子を持つ細菌、動物のゲノムＤＮＡをウイルスの場合はウイルスが感染した動物細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、上記ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅することにより得ることができる。
このようにして構築した発現ベクターを、塩化カルシウム法や電気穿孔法等の公知に方法でＢＣＧ株に導入し、形質転換菌の外来ポリペプチドの発現をウエスタンブロットや公知の免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ法等）によって確認することによって、この発明の組換えＢＣＧを作成することができる。
このようにして作成した組換えＢＣＧを、通常のＢＣＧワクチンと同様の液状担体に懸濁することによって、組換えＢＣＧワクチンを作成することができる。
【実施例】  以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
１．材料および方法
１．１．試薬
組換えＤＮＡのための全ての酵素および大腸菌ＨＢ１０１コンピテント細胞は、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（東京、日本）より購入した。野性型ＨＩＶ−１  ｐ２４遺伝子増幅用のプライマーは、ＥＳＰＥＣ  Ｏｌｉｇｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（筑波、日本）から入手した。抗ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４モノクローナル抗体Ｖ１０７は、Ｄｒ．Ｉｋｕｔａ（大阪大学）より提供された。ウェスタン免疫ブロット分析のためのペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より購入した。
１．２．ｐ２４発現ベクターの構築およびＢＣＧの形質転換
遺伝子操作は、大腸菌ＨＢ１０１コンピテント細胞を用いて行った。マイコバクテリア株は、ＢＣＧ  Ｔｏｋｙｏワクチン株を使用した。組換えＢＣＧ（ｒＢＣＧ）の培養のための培地は、アルブミンデキストロース複合体を含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９  ブロス（７Ｈ９−ＡＤＣ；ＢＢＬ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｏｃｋｅｙｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用した。
ＢＣＧのｈｓｐ６０遺伝子をコードするＤＮＡフラグメント（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：１４６６−７５，１９８７）を、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ−ＳａｌＩ部位へクローニングした（ｐＵＣ−ｈｓｐ６０）。マルチクローニングサイトおよびｈｓｐ６０遺伝子のターミネーター領域に相当する合成ＤＮＡフラグメントをｐＵＣ−ｈｓｐ６０のＭｕｎＩ−ＫｐｎＩ部位にクローニングし、次いでＥｃｏＲＩ部位にＫｐｎＩリンカーを挿入し、ｐＵＣ−ｈｓｐＫベクターを構築した。サブタイプＢウイルスのｇａｇ  ｐ２４遺伝子は、ｐＮＬ４−３プラスミド（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９：２８４−２９１，１９８６）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマーは以下を使用した。
2004016280.tif 000003
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このＰＣＲ産物（野生型ｐ２４遺伝子）を、ｐＵＣ−ｈｓｐＫのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ部位に翻訳枠を一致させてクローニングし、ｐＵＣ−ｈｓｐＫ−ｐ２４Ｗｔを構築した。
一方、ｐ２４遺伝子の全塩基配列が、ＢＣＧにおける至適コドンとなるように、公知の合成法を用いて合成ＤＮＡ断片を作成し、この合成ＤＮＡ断片（改変型ｐ２４遺伝子）をｐＵＣ−ｈｓｐＫベクターの前記と同一部位にクローニングした（ｐＵＣ−ｈｓｐＫ−ｐ２４Ｍｕ）。ｐＮＬ４−３由来の野性型ｐ２４配列と改変型ｐ２４配列は図１に示したとおりである。これらの組換えベクターをＫｐｎＩによって消化し、ｐ２４発現ユニットを含む小フラグメント（ｈｐｓ−ｐ２４Ｗｔおよびｈｐｓ−ｐ２４Ｍｕ、図２Ａ）を、安定な大腸菌−マイコバクテリアシャトルベクターであるｐＳＯ２４６（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３５：２３７−２４３，１９９６）のＫｐｎＩ部位にサブクローニングし、発現ベクターｐＳＯ−ｐ２４ＷｔおよびｐＳＯ−ｐ２４Ｍｕをそれぞれ構築した。発現ベクター構築の概略は図２Ｂに示したとおりである。これらの発現ベクターおよびｐＳＯ２４６を、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６９８７−６９９１，１９８８）の記載に従ってＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてＢＣＧに形質導入し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有のＯＡＤＣ強化剤（ＢＢＬ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天プレート上で形質転換体を選択した。その結果、ｐＳＯ−ｐ２４Ｗｔ、ｐＳＯ−ｐ２４ＭｕおよびｐＳＯ２４６をそれぞれ含む組換えクローンｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔ、ｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６を得た。
１．３．ウェスタンブロット分析
ｒＢＣＧの形質転換体を、７Ｈ１０−ＡＤＣブロス中で２週間増殖させた。培地の一部を定期的に収集し、超音波処理し、Ｍｕｌｔｉ  Ｇｅｌ  ４／２０（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．、東京、日本）を用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動に供した。分画したタンパク質をニトロセルロースフィルター上にエレクトロブロットし、Ｖ１０７モノクローナル抗体（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２４４５−２４５０，１９９２）と反応させ、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧと反応させた後、ＮＢＴ（ニトロ  ブルー  テトラゾリウム  クロライド）／ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  フォスフェート、トルイジン塩）基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて可視化した。
１．４．ｒＢＣＧｓにおけるＧａｇ  ｐ２４抗原量の測定
ｒＢＣＧの形質転換体を、７Ｈ９−ＡＤＣブロス中で２週間増殖させた。培地の一部を定期的に収集し、超音波処理した。細胞抽出物中のｐ２４抗原濃度は、市販の原ＥＩＡ（ＨＩＶＡＧ−１ＭＣ，Ａｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって決定した。ｐ２４タンパク質の発現は、菌の１０８コロニー形成ユニット（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ：ｃｆｕ）当たりのｐ２４タンパク質濃度として表した。
１．５．モルモットにおける遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応
Ｈａｒｔｌｅｙ系雌モルモット（体重約３５０ｇ）に、ｒＢＣＧ（０．１−５ｍｇ／０．１ｍｌ生理食塩水）を皮下投与して免疫した（ｎ＝３）。ＤＴＨ皮膚反応を調べるため、１００μｌの生理食塩水あたり０．１μｇの精製ツベルクリンタンパク質誘導体（ＰＰＤ）、１０μｇまたは１μｇの組換えＨＩＶＩＩＩＢ  Ｇａｇ  ｐ２４タンパク質（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を、ｒＢＣＧ免疫化モルモットに各々皮内注射した。ネガティブコントロールには生理食塩水を用いた。２４時間後、皮膚反応を測定した。
１．６．マウスと免疫化
６−８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．（横浜、日本）から購入した。マウスは実験に使用する前に  １週間以上、動物実験施設に馴化させ、日本感染症研究所のガイドラインに従ってＳＰＦ条件下の施設内で飼育した。実験は、バイオセーフティーに関する研究所のコミッティーの承認および国際保健機構（ＷＨＯ）の規定に基づいたバイオセーフティーレベル２の基で実施した。
１．７．単一細胞懸濁液の調製
皮内接種の１０週後に全てのマウスを屠殺し、細胞濾過フィルター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を介して脾臓からの単一細胞を単離した。溶血の後、細胞を完全培地（ＣＭ；１０％熱不活性化ＦＣＳ、５．５×１０−５  Ｍβ−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁した。
１．８．リンパ球増殖試験
単一細胞懸濁液を、ＣＭ中で２×１０６細胞／ｍｌに調整した。等量の細胞懸濁液と  ＣＭまたはＨＩＶ−ＨＸＢ２  Ｇａｇ重複ペプチド（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）を５０μｌ／ｍｌ濃度で含むＣＭとを混合し、培地または２５μｇ／ｍｌのペプチド含有培地の細胞終濃度を１×１０６細胞／ｍｌとした。使用した重複ペプチドは、Ｇａｇ  ｐ２４領域をカバーする  ｐ１１（ＬＥＲＦＡＶＮＰＧＬＬＥＴＳＥ：配列番号４）からＰ３５（ＮＩＱＧＱＭＶＨＱＡＩＳＰＲＴ：配列番号５）までであり、５個のペプチド毎にプールしたもの、または全てプールしたものを刺激に使用した。ペプチド有りまたは無しの細胞懸濁液は、丸底９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に３重に添加し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿した環境下で４８時間インキュベートした。回収の６時間前、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを添加し、ガラスファイバーフィルター（ＧＦ／Ｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で回収し、次いで液体シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）により細胞内に取り込まれた［３Ｈ］−チミジン量をカウントした。
１．９．ＥＬＩＳＰＯＴ検定
ＨＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２４およびＰＰＤに特異的なＩＮＦγ分泌細胞を、マウス  ＩＦＮ−γ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＭｏｄｕｌｅとＥＬＩＳＰＯＴ  Ｂｌｕｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって検定した。すなわち、脾臓からの単一細胞懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのＧａｇ重複ペプチド（ｐ１１−３５）、５μｇ／ｍｌの組換えｐ２４タンパク質、または２．５μｇ／ｍｌのツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）が存在する、または存在しないＣＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２、加湿した環境下で４８時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗い、ＣＭ中に再懸濁した。検出用の９６穴ニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ  ＨＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を捕捉抗体でコート（４℃、一晩）し、ＰＢＳで洗浄後、ＣＭで３時間ブロッキングして、１００μｌの刺激細胞を様々な濃度で各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿した環境下で１６時間インキュベートした。次いで、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄し、検出抗体と共にインキュベートした。４℃一晩のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、アルカリフォスファターゼを結合したストレプトアビジンと共に室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄の後、プレートにＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質を加えて室温で可視化した。次いで、プレートを水で洗浄し、乾燥させ、スポット形成細胞（ｓｐｏｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；ＳＦＣｓ）を定量化した。ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてウェルを画像化し、ＳＦＣｓを計測した。ＳＦＣは、不明瞭な縁を持った暗青色のスポットとして規定した（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８７５−８８４，２００２）。有意レベルを決定するため、各刺激に対するＳＦＣの平均値および標準偏差値を用いてベースラインとした。この平均および２倍の標準偏差に対応する棄却値を次に決定した。もし、ＳＦＣ数が無刺激サンプルの棄却値を超えた場合には反応をポジティブと見なした。
１．１０．ＥＬＩＳＡ
血液を１０，０００ｇで５分間遠心して血漿を得た。全てのサンプルは使用まで−８０℃で貯蔵した。ＰＰＤおよびｐ２４に特異的な血漿中ＩｇＧの力価は終点ＥＬＩＳＡによって決定した。９６穴マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ；Ｎｕｎｃ  Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、重炭酸緩衝液（３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３，０．０２％ＮａＮ３，ｐＨ９．６）を用い１μｇ／ｍｌのｒｐ２４またはＰＰＤを、４℃にて一晩コートした。ＰＢＳ−１％ＢＳＡを用いて、４℃で一晩にわたってウェルをブロックした後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄した。ＰＢＳ−１％ＢＳＡを用いて１／２４で希釈を始め、２倍段階希釈した希釈物を、抗原コートしたウェルに１００μｌ／ｗｅｌｌの量加えた。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）と共にインキュベートした。３７℃で２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、テトラメチル−ベンジジン基質（ＴＭＢ＋；ＤａＫｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ａ／Ｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて１５分間暗所室温で可視化した。反応は、１Ｍ  ＨＣｌ，０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させた。終点の力価は、最高希釈のｌｏｇ２の逆数として算出した。これは、ネガティブコントロールの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）より上でかつ、吸光度０．１００以上のＯＤ４５０をもたらす。
２．結果
２．１．ＨＩＶ−１遺伝子のマイコバクテリアコドン最適化とその発現ベクターの構築
合成した改変型ｐ２４遺伝子を、図１に示したように設計した。合成ｐ２４遺伝子のコード領域における全Ｇ＋Ｃ含有量は６７．４％であり、ｐＮＬ４−３由来の野性型ｐ２４遺伝子の４３．４％よりも高い。これらの二つの遺伝子は最初にｐＵＣ−ｈｓｐＫベクターにクローニングし（図２Ａ）、次いでｐＳＯ２６４にサブクローニングした（図２Ｂ）。ｈｓｐ６０プロモーターを有する各発現ベクターは、ＢＣＧ  Ｔｏｋｙｏワクチン株に導入し、マイコバクテリア最適コドン使用頻度を有するｐ２４遺伝子を含むｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕと、野性型コドン使用頻度を有するｐ２４遺伝子を含むｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔをそれぞれ選択した。
２．２．コドン最適化ＨＩＶ遺伝子の挿入によるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＩＶ遺伝子発現の有意な増大
２種類のＢＣＧ−ＨＩＶ組換え体のＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４遺伝子発現レベルを比較するため、培養ｒＢＣＧの増殖曲線の動性を調べ、さらにｐ２４抗原タンパク質の検出によってＨＩＶ抗原の産生能を調べた（図３）。２週間の培養時点において、ｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕおよび−ｐ２４Ｗｔのそれぞれの溶解物における組換えｐ２４タンパク質はウェスタンブロット分析により同じく約２４ｋＤａの単一バンドとして検出された。ｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕのｐ２４抗原の発現レベル（菌体１０８ｃｆｕ当たり１７５．０±２５．１ｎｇ）はｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔのそれ（菌体１０８ｃｆｕ当たり４．７±０．３ｎｇ）よりも３７．０倍増加した（図３Ｂ）。ｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔの増殖曲線は、対照のｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６形質転換体と比較して正常であり、細胞培養の２１日目にピークに達した（図３Ｃ）。このことは、ｐ２４抗原の生産は培養ｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕの増殖率に相関することを示唆している。このように、コドンを最適化したＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２４遺伝子を挿入したＢＣＧ形質転換体は、菌体１０８ｃｆｕ当たりほぼ２００ｎｇのｐ２４抗原、またはコドン最適化ｒＢＣＧ−ＨＩＶの１ｍｇ当たり２００ｎｇのｐ２４抗原を産生することが可能である。
２．３．モルモットにおけるＤＴＨ反応
免疫応答に対する改変型ｐ２４の発現の効果を評価するため、まずモルモットにおけるＤＴＨ皮膚反応を調べた。以前の報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１０６９３−１０６９７，１９９５）では、Ｖ３エピトープに特異的なＤＴＨ反応を検出するためには、５ｍｇを接種することが必要であった。一方、改変型ｐ２４を産生するｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕを用いた場合には、表２に示したように、０．１ｍｇ量の接種によって、５ｍｇのｒＢＣＧ−Ｖ３Ｊ１接種の場合と同様のｐ２４に対する著しいＤＴＨ反応を検出することができた。なお、ｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔでそれぞれ免疫化されたモルモットの間には、何ら異なる反応性は観察されなかった。
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２．４．ウイルス特異的な免疫反応のコドン最適化ｒＢＣＧの低投与量による誘導
コドン最適化遺伝子を伴うＢＣＧ形質転換体の低投与量免疫化の可能性を検討した。３０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを各群１０匹づつ３群に分け、各群の５匹づつに０．０１および０．１ｍｇのｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ、ｒＢＣＧ−ｐ２４ＷｔおよびｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６をそれぞれ皮下（ｉ．ｄ．）投与した。５匹以上のマウスには生理食塩水のみを投与し、正常な健康コントロールとした。投与後１０週の時点で、免疫化動物のリンパ球増殖と、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ分泌細胞数を調べた。これを３回繰り返し、それらの結果を集計した。
リンパ球増殖反応において、ｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ免疫化マウスでは、プールされたペプチド＃２（ｐ１６−２０）およびプールされたトータルｐ２４ペプチド＃１−５（ｐ１１−３５）によって有意な活性（刺激指数は５．０４および４．０２）が得られた。０．１ｍｇのｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ免疫化では、プール＃２およびプール＃１−５に対するリンパ球増殖反応はそれぞれ１０．０８および８．０５に増加した。一方、０．０１ｍｇおよび０．１ｍｇのｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔ免疫化マウスではウイルス特異的な有意増加は何ら検出されなかった（図４Ａ）。このようなｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕとｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔ間におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖反応の違いは、プール＃２およびプール＃１−５について統計的に有意であった（それぞれｐ＝０．０１０２およびｐ＝０．００１４）。また、ｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６免疫化マウスでは如何なる増殖活性も検出されなかった。
さらに、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってｐ２４特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞を測定した。０．１ｍｇのｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔ免疫化マウスにおいて、プールされたｐ２４ペプチド（プール＃１−５）および組換えｐ２４特異的ＳＣＦｓが検出されたが、同量のｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６免疫化マウスでは検出されなかった（図４Ｂ）。ｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ免疫化マウスでのこれらの反応は、ペプチド刺激では３７５±２０２ＳＦＣ／１０６脾臓細胞であり、組換えｐ２４刺激では４８３±１３８  ＳＦＣ／１０６脾臓細胞であり、ｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔでの反応（それぞれ９３±２５および２２７±１２０ＳＦＣ／１０６脾臓細胞）と比較してはるかに大であった。このようなｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕとｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔ間の違いはまた、ペプチドおよび組換えｐ２４について統計的に有意であった（それぞれｐ＝０．０３３およびｐ＝０．０３１）。なお、ＰＰＤ特異的なＳＦＣｓは試験した全てのマウスにおいて高度に検出された（６７０±１８０ＳＦＣ／１０６脾臓細胞）。
０．１ｍｇのｒＢＣＧ−ｐ２４Ｍｕ、ｒＢＣＧ−ｐ２４ＷｔおよびｒＢＣＧ−ｐＳＯ２４６で免疫化した全てのマウスから得た血清について、組換えｐ２４およびＰＰＤに対する終点抗体ＥＬＩＳＡを用いて、投与後１０週時点でのｐ２４抗原特異的抗体の産生を調べた（図４Ｃ）。ｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔで免疫化された動物では、ｒｐ２４に対する抗体産生は一般的に低く、ｒＢＣＧ−ｐ２４ＭｕおよびｒＢＣＧ−ｐ２４Ｗｔで免疫化されたマウス血清における抗ｐ２４抗体力価はそれぞれ２８および２６．７５であった。さらに、ＰＰＤ特異的抗体は、免疫化動物で似たように検出され、力価は約２１０であった。以上のとおり、ウイルス特異的な細胞性免疫が初期の免疫反応において有意に誘導されたが、その抗体反応は低かった。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、抗原性タンパク質の発現量に優れ、その結果として通常のＢＣＧワクチンと同程度の使用量によっても、標的とする感染症や癌等に対して十分な免疫応答を誘導することのできる組換えＢＣＧワクチンが提供される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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