(57)【要約】ＤＮＡ組換え修復酵素であるＲａｄ５２タンパク質の結晶を作製し、それを用いてＸ線結晶構造解析を行い三次元立体構造を決定する。このようにして得られたＲａｄ５２タンパク質複合体の三次元立体構造は、種々の変異体酵素や該酵素複合体への結合化合物のスクリーニングに利用できる。本発明の方法によりスクリーニングした変異体Ｒａｄ５２タンパク質複合体や該複合体に結合してそのＤＮＡ組換え修復能を調節する化合物は、ＤＮＡ損傷により引き起こされる病気の診断や治療、生体内でのＲａｄ５２によるＤＮＡ組換え修復能の検出に使用することができるほか、Ｒａｄ５２をターゲットとした創薬や生体内での相同的組換えによる特異的な部位への遺伝子導入などに利用することができる。
2003040361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１位から１９２位までのアミノ酸配列を含むポリペプチド断片であって、５５位、６５位、６９位、７０位、１５３位及び１６９位のアミノ酸残基がＤＮＡ結合部位を形成することを特徴とするポリペプチド断片。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチド断片において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つＤＮＡ結合能を有するポリペプチド断片。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質が集合したＤＮＡ組換え修復酵素複合体であって、該複合体が１１量体の環状構造を形成することを特徴とするＤＮＡ組換え修復酵素複合体：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ組換え修復能を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から２１２位までからなるタンパク質が集合した変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体であって、該複合体が１１量体の環状構造を形成することを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体。
【請求項５】
前記複合体が、明細書の表１に示す原子座標により実質的に規定される立体構造を有することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体。
【請求項６】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から２１２位までからなるタンパク質が集合した１１量体の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶であって、空間群Ｐ４３２１２を有する変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶。
【請求項７】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から２１２位までからなるタンパク質が集合した１１量体の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶であって、格子定数ａ＝ｂ＝１４５．６Å、ｃ＝２４７．５Åを有する変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶。
【請求項８】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、７８位のメチオニンがセレノメチオニンに置換されていることを特徴とする請求項６又は７記載の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶。
【請求項９】
ＤＮＡ組換え修復酵素複合体、又はその変異体の結晶の製造方法であって、
３〜４ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ組換え修復酵素タンパク質又はその変異体と一本鎖ＤＮＡとを１４：１〜１１：１のモル比で混合した溶液を、１０〜２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリエチレングリコールモノメチルエステル（ＰＥＧＭＭＥ）と０．０５〜０．２Ｍの硫酸アンモニウムを含有し、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液を用いて蒸気拡散法により結晶化する方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ組換え修復酵素複合体、又はその変異体の立体構造を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ組換え修復能を有するタンパク質の結晶を生成する工程、
（ｂ）該結晶を用いて重原子同型置換法又は多波長異常散乱法によりＸ線回折データを取得する工程、及び
（ｃ）該Ｘ線回折データに基づいて三次元構造座標を決定する工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ組換え修復酵素複合体の立体構造の決定方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ組換え修復酵素複合体を規定した原子座標を内部に配置したメモリと、該メモリと電気的に連絡しＤＮＡ組換え修復酵素複合体を表す三次元立体構造を有するモデルを生成し、又は該複合体の配座エネルギーを計算するプロセスを含むプロセッサと、を含むコンピュータシステム。
【請求項１２】
ＤＮＡ組換え修復能が調節された変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ組換え修復酵素複合体を表す三次元立体構造を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）該三次元立体構造モデルに基づいて、該ＤＮＡ組換え修復能に影響を及ぼす部位を特定する工程、
（ｃ）該特定された部位に変異を導入して変異体酵素を製造する工程、及び
（ｄ）該変異体酵素の活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法。
【請求項１３】
前記三次元立体構造モデルが明細書の表１に示す原子座標により実質的に規定されることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ組換え修復能が、ＤＮＡ結合活性、相同的対合活性、又は多量体形成活性であることを特徴とする請求の範囲第１２項又は第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ組換え修復能が調節された変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法であって、
（ａ）明細書の表１に示す原子座標により実質的に規定されたＤＮＡ組換え修復酵素複合体の表面電荷の計算によりＤＮＡ結合領域を特定する工程、
（ｂ）該特定されたＤＮＡ結合領域中に存在する塩基性及び疎水性アミノ酸残基を選択する工程、
（ｃ）該選択されたアミノ酸残基又はその近傍領域のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は化学的修飾を行って変異体酵素を作製する工程、及び
（ｄ）該変異体酵素のＤＮＡ結合活性、及び／又は相同的対合活性を測定する工程、を含むことを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法。
【請求項１６】
前記工程（ｂ）において選択されたアミノ酸残基が、配列番号１に示すアミノ酸配列の５５位のアルギニン、６５位のチロシン、６９位のヒスチジン、７０位のアルギニン、１５３位のアルギニン及び１６９位のリジンから選択される１又は２以上のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１５記載の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１２項〜第１６項何れか記載の方法により変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する工程と、該変異体ＤＮＡ組換え修復酵素をコードする組換えＤＮＡを用いて該変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を発現させる工程とを含むことを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素の製造方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１２項〜第１６項何れか記載の方法により得られるＤＮＡ組換え修復能が調節された変異体ＤＮＡ組換え修復酵素。
【請求項１９】
請求の範囲第１項〜第５項何れか記載のポリペプチド断片又は複合体を用いて、これに結合する化合物を設計又は選択する、ＤＮＡ組換え修復酵素の修復能を調節し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１項〜第５項何れか記載のポリペプチド断片又は複合体の立体構造座標データを記憶させたコンピュータを用いて、これに結合する化合物を設計又は選択する、ＤＮＡ組換え修復酵素の修復能を調節し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記設計又は選択された化合物と、ＤＮＡ組換え修復酵素とを接触させて該化合物がＤＮＡ組換え修復酵素に結合するか否かを判定することを更に含む、請求の範囲第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１９項〜第２１項に記載の方法により得られることを特徴とするＤＮＡ組換え修復酵素の活性を調節する化合物。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ組換え修復能を調節する化合物が天然物化合物又は合成化合物であることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の化合物。
【請求項２４】
実質的に、シス−６−［４−（４−アルキルフェニル）−５−メチルチアゾール−２−イルカルバモイル］−３，４−ジメチル−３−シクロヘキセンカルボン酸又はその塩（ここで、アルキル基は炭素数１〜１０の直鎖又は分枝を有するアルキル基を意味する。）からなるＤＮＡ組換え修復酵素の阻害剤。
【請求項２５】
実質的に、３−［４−（４−アルキルフェニル）−５−メチルチアゾール−２−イルカルバモイル］−７−オキサビシクロ［２，２，１］ヘプタン−２−カルボン酸又はその塩（ここで、アルキル基は炭素数１〜１０の直鎖又は分枝を有するアルキル基を意味する。）からなるＤＮＡ組換え修復酵素の阻害剤。
【請求項２６】
ＤＮＡ組換え修復能を調節する化合物を含有する医薬組成物の製造方法であって、請求の範囲第１９項〜第２１項に記載の方法により得られた化合物を製薬的に許容される担体と混合する工程を含むことを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＤＮＡ組換え修復酵素の結晶化、該結晶を用いたＸ線結晶構造解析によるＤＮＡ組換え修復酵素の三次元構造の決定、及びその使用に関し、特に、その立体構造に基づく、変異体酵素の設計及び同定、並びに該酵素への結合化合物の合理的なスクリーニング方法等に関する。
背景技術
染色体ＤＮＡの損傷からゲノムの完全性を維持するためには、二本鎖ＤＮＡの切断等を修復する能力が必要である。この二本鎖ＤＮＡの切断は、放射線照射、ＤＮＡを損傷させる薬剤の投与や複製の誤りだけでなく、減数分裂、酵母の接合因子の切り替え及び抗体遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊ組換え等の際に働く酵素によっても引き起こされることが知られている。このような染色体ＤＮＡの損傷を修復するために、細胞は相同的組換えや非相同的ＤＮＡ末端の結合能力を獲得してきた。相同的組換えは、染色体ＤＮＡ中でのＤＮＡ塩基配列の保存に重要な役割を果たしている。相同的組換え反応において、相同染色体又は姉妹染色分体の何れかとの塩基配列の相同性を探索する段階、すなわち相同的対合段階は不可欠である。従って、相同的対合を促進する酵素を同定することは、相同的組換え反応を理解する上での最も重要な課題の一つである。
大腸菌においては、ＲｅｃＡ及びＲｅｃＴという２つの相同的対合酵素が報告されている。ＲｅｃＡとＲｅｃＴはアミノ酸配列の相同性はなく、異なった組換え修復経路、すなわち、ＲｅｃＡはＲｅｃＢＣＤ及びＲｅｃＦ経路、ＲｅｃＴはＲｅｃＥ経路における相同的対合反応を触媒する。真核生物においては、２つのＲｅｃＡ相同物であるＲａｄ５１及びＤｍｃ１が同定され、これらは共に相同的対合を促進する。Ｒａｄ５１非依存的な組換え経路が同定されているにもかかわらず、ＲｅｃＴと相同性の高いタンパク質は、真核生物では見出されていない。電子顕微鏡による観察では、ＲｅｃＴは７量体又は８量体の環状を形成することが示された。興味深いことに、酵母Ｒａｄ５２タンパク質（以下「ＳｃＲａｄ５２」という。）及びヒトＲａｄ５２タンパク質（以下「ＨｓＲａｄ５２」という。）もまたＲｅｃＴと同様な環状構造を形成する。Ｓｔａｓｉａｋらは、電子顕微鏡を用いた解析により、ＨｓＲａｄ５２が７量体の環状構造を示すことを報告している（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０，（２０００）ｐ．３３７−３４０）。
ＲＡＤ５２遺伝子は、酵母、ニワトリ、マウス及びヒトを含む真核生物において同定されている。Ｒａｄ５１依存的組換え経路におけるＲａｄ５２の役割は、生体内及び試験管内の両方において詳細に検討されている。ＳｃＲａｄ５２とＨｓＲａｄ５２は共に一本鎖ＤＮＡに結合し、相補的な一本鎖ＤＮＡ同士のアニーリングを促進する。さらに、ＳｃＲａｄ５２とＨｓＲａｄ５２は酵母やヒトのＲａｄ５１タンパク質を伴なって、環状一本鎖ＤＮＡと直鎖状二本鎖ＤＮＡとの接合分子形成を促進することが報告されている。従って、Ｒａｄ５２タンパク質は、一本鎖ＤＮＡと結合し、組換え部位にＲａｄ５１を誘導する仲介役のタンパク質であることが提案されている。このような、Ｒａｄ５１依存的な組換え経路に加え、Ｒａｄ５１非依存的組換え経路におけるＲａｄ５２の役割についても研究されているが、その詳細な分子的機構、特に、相同的対合段階におけるＤＮＡとの結合様式を初めとする本酵素の触媒機構については十分に理解されていない。
特表２００１−５０２５４５号公報によれば、真核Ｒａｄ５２タンパク質と核酸との複合体、及びその複合体を使用する相同的組換えに関与する生理活性物質のスクリーニング方法等が開示されている。しかしながら上記公報に開示された方法では真核Ｒａｄ５２タンパク質を組換えＤＮＡ技術により発現後に精製又は単離しなければならず、真核生物細胞内のＲａｄ５２による相同的組換え能を直接測定することは難しい。また、相同的組換え能の測定操作が煩雑なため、この複合体を用いて数多くの化合物をスクリーニングすることは極めて非効率的である。
ところで、現在では、ある種のガンやその他の遺伝的な病気が、染色体ＤＮＡの異常によって引き起こされることが知られている。例えば、ヒトでは多くの発ガン遺伝子が同定され、現在までに明らかにされたほとんどの発ガン遺伝子は、正常な細胞内の遺伝子（プロトオンコジーン）における変異、しばしば点突然変異によって、その発現タンパク質中のアミノ酸置換がおこることが知られている。この変異した発現タンパク質は、細胞をガン化させるための異常な生物学的機能を発揮する。
例えば、Ｒａｓという発ガン遺伝子は最もよく研究されたものの一つである。Ｒａｓタンパク質中の特定のアミノ酸残基の置換により、Ｒａｓタンパク質が活性化されて細胞の異常な増殖を刺激することにより細胞をガン化することが知られている。
一方、他の重要な発ガン遺伝子は、細胞内のｐ５３というタンパク質をコードしている。このｐ５３というタンパク質は発ガンを抑制する遺伝子であると考えられ、突然変異によってｐ５３が不活性化されると細胞がガン化することが明らかとなった。従って、正常なｐ５３タンパク質を発現する遺伝子をガン細胞に導入することによって、ガンを治療するという試みも行われている（米国特許第６０１７５２４号明細書）。
このように、染色体ＤＮＡの損傷とこれによるＤＮＡへの突然変異の導入は発ガン遺伝子の活性化やガン抑制遺伝子の不活性化などを通じて細胞のガン化と密接に関連していることから、ＤＮＡ組換え修復によりゲノムの完全性を維持し、ゲノム情報を安定に伝達することはガンの予防や治療に役立つ可能性がある。すなわち、ＤＮＡ組換え修復酵素活性が著しく低下している細胞においては、その活性を高めることによって染色体ＤＮＡの損傷を修復し、発ガンを抑制することができると考えられる。
一方、ＤＮＡ組換え修復酵素の活性を抑制することは、抗癌療法、特に放射線療法又は化学療法の増強になる可能性がある。電離放射線及び放射線作用薬物が通常、ＤＮＡに損傷を与えることによって癌細胞を処理するために使用されることから、ＤＮＡ組換え修復酵素の活性を阻害するような化合物を投与することが、上記放射線療法や化学療法剤に対する癌細胞の感受性を増強することが示唆される（特表２００１−５０８８６８号公報参照）。更に、染色体ＤＮＡの相同的組換えは、遺伝子療法におけるウイルスＤＮＡ等の組み込みにも関与していることから、ＤＮＡ組換え修復能を調節することによって外来遺伝子を染色体ＤＮＡの特定の位置に導入する効率を高め、遺伝子療法の究極的な使用を高めるために使用されうる。
このように、ＤＮＡ組換え修復機構の役割とその応用は極めて重要であるにもかかわらず、上述したように細胞内には種々のＤＮＡ組換え修復酵素が存在することから、Ｒａｄ５２特異的なＤＮＡ組換え能を測定したり、その生理的な役割を明らかにすることが難しい。また、ＤＮＡの相同的組換え修復反応におけるＲａｄ５２の構造と機能の関係は未だ明らかではない。
本発明は、上記課題を解決すべく、ＤＮＡ組換え修復酵素の一つであるＲａｄ５２タンパク質の単結晶を取得し、Ｘ線結晶構造解析によりその立体構造を明らかにしてその構造とＤＮＡ組換え修復能の発現機構との関係を明らかにすることを目的とする。
本発明はまた、Ｒａｄ５２の立体構造に基づいて、ＤＮＡ組換え修復能に影響を与える構造上の特徴を特定し、該酵素活性の増強や抑制又は安定化などの種々の調節を行った変異体酵素の設計を行うことを目的とする。
さらに、本発明はＲａｄ５２に結合することによってＤＮＡ組換え修復能を調節し得る化合物のスクリーニング方法及びこのような方法を用いて得られる阻害剤や活性化剤を提供すること等を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、Ｒａｄ５２タンパク質のＮ末端領域がＤＮＡとの結合や相同的対合活性の発現に必須であることに着目し、本酵素が多量体複合体を形成してその機能を発揮するために必要かつ十分なＮ末端領域の探索を行い、更にそのタンパク質の結晶化及び該結晶を用いたＸ線結晶構造解析を行った。その結果、本発明者らは、Ｒａｄ５２タンパク質のＮ末端領域が、１１量体の環状構造を形成すること、及びその環状構造の周囲においてＤＮＡと結合し得ることを初めて明らかにし本発明を完成した。
即ち、本発明は、ＤＮＡ組換え修復酵素であるＲａｄ５２タンパク質の結晶、その製造方法、それを用いた三次元立体構造の解析、及びそのようにして得られた三次元立体構造を用いて、種々の変異体酵素や該酵素複合体への結合化合物のスクリーニング方法等に関し、より具体的には、
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１位から１９２位までのアミノ酸配列を含むポリペプチド断片であって、５５位、６５位、６９位、７０位、１５３位、１６９位のアミノ酸残基がＤＮＡ結合部位を形成することを特徴とするポリペプチド断片。
（２）（１）に記載のポリペプチド断片において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つＤＮＡ結合能を有するポリペプチド断片。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質が集合したＤＮＡ組換え修復酵素複合体であって、該複合体が１１量体の環状構造を形成することを特徴とするＤＮＡ組換え修復酵素複合体：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ組換え修復活性を有するタンパク質。
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から２１２位までからなるタンパク質が集合した変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体であって、該複合体が１１量体の環状構造を形成することを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体。
（５）前記複合体が、表１に示す原子座標により実質的に規定される立体構造を有することを特徴とする（４）の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体。
（６）配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から２１２位までからなるタンパク質が集合した１１量体の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶であって、空間群Ｐ４３２１２を有する変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶。
（７）配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から２１２位までからなるタンパク質が集合した１１量体の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶であって、格子定数ａ＝ｂ＝１４５．６Å、ｃ＝２４７．５Åを有する変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶。
（８）配列番号１に示すアミノ酸配列において、７８位のメチオニンがセレノメチオニンに置換されていることを特徴とする（６）又は（７）の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶。
（９）ＤＮＡ組換え修復酵素複合体、又はその変異体の結晶の製造方法であって、３〜４ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ組換え修復酵素タンパク質又はその変異体と一本鎖ＤＮＡとを１４：１〜１１：１のモル比で混合した溶液を、１０〜２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリエチレングリコールモノメチルエステル（ＰＥＧＭＭＥ）と０．０５〜０．２Ｍの硫酸アンモニウムを含有し、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液を用いて蒸気拡散法により結晶化する方法。
（１０）ＤＮＡ組換え修復酵素複合体、又はその変異体の立体構造を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ組換え修復能を有するタンパク質の結晶を生成する工程、
（ｂ）該結晶を用いて重原子同型置換法又は多波長異常散乱法によりＸ線回折データを取得する工程、及び
（ｃ）該Ｘ線回折データに基づいて三次元構造座標を決定する工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ組換え修復酵素複合体の立体構造の決定方法。
（１１）ＤＮＡ組換え修復酵素複合体を規定した原子座標を内部に配置したメモリと、該メモリと電気的に連絡しＤＮＡ組換え修復酵素複合体の少なくとも一部分を表す三次元立体構造を有するモデルを生成し、又は該複合体の配座エネルギーを計算するプロセスを含むプロセッサと、を含むコンピュータシステム。
（１２）ＤＮＡ組換え修復能が調節された変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ組換え修復酵素複合体を表す三次元立体構造を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）該三次元立体構造モデルに基づいて、該ＤＮＡ組換え修復能に影響を及ぼす部位を特定する工程、
（ｃ）該特定された部位に変異を導入して変異体酵素を製造する工程、及び
（ｄ）該変異体酵素の活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法。
（１３）前記三次元立体構造モデルが表１に示す原子座標により実質的に規定されることを特徴とする（１２）の方法。
（１４）前記ＤＮＡ組換え修復能が、ＤＮＡ結合活性、相同的対合活性、又は多量体形成活性であることを特徴とする（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）ＤＮＡ組換え修復能が調節された変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法であって、
（ａ）表１に示す原子座標により実質的に規定されたＤＮＡ組換え修復酵素複合体の少なくとも一部分の表面電荷の計算によりＤＮＡ結合領域を特定する工程、
（ｂ）該特定されたＤＮＡ結合領域中に存在する塩基性及び疎水性アミノ酸残基を選択する工程、
（ｃ）該選択されたアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は化学的修飾を行って変異体酵素を作製する工程、及び
（ｄ）該変異体酵素のＤＮＡ結合活性、及び／又は相同的対合活性を測定する工程、を含むことを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法。
（１６）前記工程（ｂ）において選択されたアミノ酸残基が、配列番号１に示すアミノ酸配列の５５位のアルギニン、６５位のチロシン、６９位のヒスチジン、７０位のアルギニン、１５３位のアルギニン及び１６９位のリジンから選択される１又は２以上のアミノ酸残基であることを特徴とする（１５）の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する方法。
（１７）（１２）〜（１６）何れか記載の方法により変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を同定する工程と、該変異体ＤＮＡ組換え修復酵素をコードする組換えＤＮＡを用いて該変異体ＤＮＡ組換え修復酵素を発現させる工程とを含むことを特徴とする変異体ＤＮＡ組換え修復酵素の製造方法。
（１８）（１２）〜（１６）何れかの方法により得られることを特徴とするＤＮＡ組換え修復能が調節された変異体ＤＮＡ組換え修復酵素。
（１９）（１）〜（５）の何れかに記載のポリペプチド断片又は複合体を用いて、これに結合する化合物を設計又は選択する、ＤＮＡ組換え修復酵素の修復能を調節し得る化合物のスクリーニング方法。
（２０）（１）〜（５）の何れかに記載のポリペプチド断片又は複合体の立体構造座標データを記憶させたコンピュータを用いて、これに結合する化合物を設計又は選択する、ＤＮＡ組換え修復酵素の修復能を調節し得る化合物のスクリーニング方法。
（２１）前記設計又は選択された化合物と、ＤＮＡ組換え修復酵素とを接触させて該化合物がＤＮＡ組換え修復酵素に結合するか否かを判定することを更に含む（２０）の方法。
（２２）（１９）〜（２１）の何れかに記載の方法により得られることを特徴とするＤＮＡ組換え修復酵素の活性を調節する化合物。
（２３）前記ＤＮＡ組換え修復能を調節する化合物が天然物化合物又は合成化合物であることを特徴とする（２２）の化合物。
（２４）ＤＮＡ組換え修復能を調節する化合物を含有する医薬組成物の製造方法であって、（１９）〜（２１）の何れかに記載の方法により得られた化合物を製薬的に許容される担体と混合する工程を含むことを特徴とする医薬組成物の製造方法、に関する。
発明の実施の形態
本発明において、「ＤＮＡ組換え修復能」とは、染色体ＤＮＡの損傷を受けた部分等を認識し、相同的組換えによってＤＮＡ分子間の相同的な塩基配列の認識、切断、再結合を行う能力をいう。相同的組換え反応は非常に複雑であるため、その反応機構の詳細については明らかではないが、上述したように真核生物においては、Ｒａｄ５１依存的経路と、非依存的経路の２つの経路が存在すると考えられ、これら２つの相同的組換え反応を介したＤＮＡ修復能のことを「ＤＮＡ組換え修復能」という。
「ＤＮＡ組換え修復酵素」とは、上記ＤＮＡ組換え修復能を有する酵素をいい、その例としては、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨｓＲａｄ５２が挙げられる。ＨｓＲａｄ５２は、ヒト由来の４１８個のアミノ酸残基からなるタンパク質であって、そのｃＤＮＡ塩基配列も明らかとなっている（例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０５２３４７）。真核生物のＲＡＤ５２遺伝子は、ニワトリ、マウス、酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で見つかっており、これらのｃＤＮＡ塩基配列から得られたＲａｄ５２タンパク質の１次構造を比較すると、Ｎ末端領域、特に、ＨｓＲａｄ５２ではＮ末端から１７７位までの領域で約７０％の相同性を有することが知られている（Ｍｕｒｉｓ，ＤＦ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３１５，２９５−３０５）。
従って、本発明における「ＤＮＡ組換え修復酵素」とは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨｓＲａｄ５２、又は真核生物におけるその相同物をいう。
本発明において、ＤＮＡ組換え修復酵素の「変異体」とは、配列番号１に示したアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも１つ以上欠失、付加、挿入若しくは置換、又は修飾されたアミノ酸配列を有し、もとの酵素の活性の少なくとも一部を保持する改変された酵素をいう。ここで、「活性の少なくとも一部」とは、代表的には、もとの酵素の少なくとも１０％の比活性、好ましくはもとの酵素の少なくとも５０％の比活性をいうが、所望によって、１０％未満の比活性をいう場合もある。
本発明者らによるこれまでの研究によれば、ＨｓＲａｄ５２タンパク質の限定分解や、Ｃ末端領域を欠失させた変異体酵素の解析から、ＨｓＲａｄ５２のＮ末端側に、ＨｓＲａｄ５２の相同的対合活性を担うコアドメインが存在することが明らかになっている。Ｎ末端から２３７位のアミノ酸までからなるポリペプチドＨｓＲａｄ５２１−２３７は、プロテネースＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）による限定分解に対して耐性を示し、この変異体酵素ＨｓＲａｄ５２１−２３７は、Ｄ−ループ形成反応の解析において、野生型酵素とほぼ同程度の相同的対合活性を有するため、ＨｓＲａｄ５２のＮ末端から２３７位のアミノ酸までのＮ末端領域が相同的対合活性を担うと考えられる。更に、このＮ末端領域は野生型ＨｓＲａｄ５２と同様の多量体高次構造を形成し、及びＤＮＡ結合活性も有することが明らかになった。これらのことから、ＨｓＲａｄ５２タンパク質は、Ｃ末端側の一部を欠失しても野生型ＨｓＲａｄ５２タンパク質と同様の複合体を形成してＤＮＡ組換え修復能を有し、相同的組換え機構におけるＨｓＲａｄ５２タンパク質の構造と機能の関係を解明するために十分役立つものと考えられる。これらのＣ末端側の一部を欠失した変異体ＨｓＲａｄ５２タンパク質として具体的には種々のものが利用できるが、例えば、ＨｓＲａｄ５２１−２３７のＣ末端から５アミノ酸残基ずつを欠失させた複数の欠失変異体、即ち、ＨｓＲａｄ５２１−２３２、ＨｓＲａｄ５２１−２２７、ＨｓＲａｄ５２１−２２２、ＨｓＲａｄ５２１−２１７、ＨｓＲａｄ５２１−２１２、ＨｓＲａｄ５２１−２０７、ＨｓＲａｄ５２１−２０２、ＨｓＲａｄ５２１−１９７、ＨｓＲａｄ５２１−１９２及びＨｓＲａｄ５２１−１８７などが挙げられる。これらの中で、Ｎ末端より少なくとも１９２位までのアミノ酸配列を有する変異体酵素はＤＮＡ組換え修復酵素としての活性を保持しており、最も結晶化しやすい変異体酵素を選択してＸ線結晶構造解析に用いるタンパク質の結晶を作製することができる。
（ＤＮＡ組換え修復酵素複合体結晶の調製）
タンパク質の立体構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基に、該タンパク質の立体構造を明らかにしていくものである（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ，ｐ．１−５６５，（１９７６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加し、または溶媒量を蒸発等によって減少させる等の操作によって、タンパク質が溶液状態から非溶液状態になる場合において、ある特定の条件において結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度、塩濃度、水素イオン濃度（ｐＨ）、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子が関与している。更には、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法、透析法、蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ，ｐ．５９−８２，（１９７６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。例えば、蒸気拡散法は、気相を通じて拡散によって揮発性の溶媒や沈殿剤が移動するようなしくみである。タンパク質溶液が沈殿剤溶液とのあいだで蒸気拡散することにより、タンパク質濃度と沈殿剤濃度が共に高まって過飽和の領域で結晶化が起こる。タンパク質溶液の液滴をどうつくるかによって、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法等の方法がある。このようにＸ線結晶解析に適したタンパク質の結晶を得るには、それぞれのタンパク質において、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における種々の因子や結晶化法を最適化する検討が必要になる。特に高純度のタンパク質の調製は結晶化を成功させるための重要な因子である。このために、クローン化した遺伝子を効率的な発現系で発現させることにより迅速かつ均一なタンパク質を調製することができる。
本発明のＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶は、以下のようにして調製される。ＨｓＲａｄ５２タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は既に公知であり、組換えＤＮＡ技術を用いて細菌や動物細胞等の種々の宿主において容易に発現させることができる。
本発明の一つの実施形態において、組換え大腸菌を用いた系によりＨｓＲａｄ５２タンパク質を大量発現させることができる。組換え大腸菌において異種遺伝子を大量に発現させるための種々のプラスミドベクター等が市販されている。例えば、強力なＴ７ファージプロモーターの下流に発現させたい遺伝子を導入し、宿主大腸菌により供給されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）等を用いることができる。このシステムでは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は宿主大腸菌染色体に組み込まれており、ｌａｃＵＶ５プロモーター下流にあるためＩＰＴＧ添加による誘導で発現をコントロールすることができる。また、ＨｓＲａｄ５２タンパク質のＮ末端側やＣ末端側に種々のタグ配列を導入しておくことによって、金属キレート樹脂（ヒスチジンタグ）や抗体（Ｔ７タグ、ＣＢＤタグ等）等を使って簡単に精製することができる。精製された融合タンパク質は、エンテロキナーゼやトロンビン等のプロテアーゼを用いて更にＨｓＲａｄ５２タンパク質部分のみを回収することが可能である。
また、ＨｓＲａｄ５２タンパク質を発現する組換え大腸菌を、重金属原子であるセレンを含有したセレノメチオニンあるいはセレノシステインを含む培地で生育、培養することによりＨｓＲａｄ５２タンパク質中のメチオニンあるいはシステイン残基がセレノメチオニン又はセレノシステインに置換された変異体酵素が取得される。
更に結晶化に適するように、これらのタンパク質を高純度に精製する。精製法としては、カラムクロマトグラフィー（アフィニティー、疎水、イオン交換、ゲルろ過等）、塩析、遠心分離、電気泳動等、当業者においてタンパク質を精製する方法として一般的に行われている方法を単独で又は組み合わせて用いることができる。
次いで、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶を調製する。ＨｓＲａｄ５２タンパク質が細胞内において形成する多量体複合体の状態を保ったままの条件で結晶化することが必須である。例えば、蒸気拡散法を用い、ｐＨ＝６〜８、タンパク質濃度３〜４ｍｇ／ｍｌ、温度２０℃の条件下で、沈殿剤として１０〜２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリエチレングリコールモノメチルエステル（ＰＥＧＭＭＥ）と０．０５〜０．２Ｍの硫酸アンモニウムを用いた場合にＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶が得られる。ＨｓＲａｄ５２タンパク質が集合して多量体複合体の形成を促進するために、ＨｓＲａｄ５２タンパク質と一本鎖ＤＮＡとを１４：１〜１１：１のモル比であらかじめ混合しておくことが好ましい。
上記セレン含有培地で培養することによる重金属原子のタンパク質中への導入方法の他に、天然型のタンパク質結晶を、金、白金、イリジウム、オスミウム、水銀、鉛、ウラン、サマリウム等を含む金属塩又は有機金属化合物の溶液に浸漬することによっても重原子誘導体結晶を作製することができ、重原子同型置換法及び多波長異常分散法を適用する場合に利用される。
配列番号１に示したアミノ酸配列の１位から２１２位までを有するＨｓＲａｄ５２１−２１２の複合体の結晶は、正方晶系の空間群Ｐ４３２１２に属するもので、単位格子としてａ軸、ｂ軸の方向に１４５．６Å、ｃ軸の方向に２４７．５Åの大きさを有する。
（ＤＮＡ組換え修復酵素複合体のＸ線結晶解析）
このようにして得たＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶の構造を当業者に知られたＸ線結晶構造解析技術を用いて解析する。類縁タンパク質の立体構造が未知であり、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能な本発明のような立体構造決定においては、重原子置換法又は多波長異常分散法（ＭＡＤ法）が適用され得る。本発明の一つの実施態様に於いて、Ｘ線結晶解析は、ＭＡＤ法であり、これに用いられるＸ線は、シンクロトロン放射光から得られる０．３〜３．０Åの波長である。ＭＡＤ法は、入射Ｘ線エネルギー近傍の吸収端をもつ重原子同型置換結晶から、複数の波長によるＸ線回折データを得る方法である。Ｘ線と該重原子の電子殻との共鳴でＸ線の散乱に差を生じ、これによってタンパク質の構造解析での位相問題を解決することができる。この方法の原理はすでに古くから知られていたが、波長可変であるシンクロトロン放射光の出現によって始めてタンパク質の構造決定に使用されるようになり、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎらがこの方法によって初めてタンパク質の構造解析に成功した（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４，７７−８８，１９８８及び、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５，１６６５−１６７２，１９９０参照）。
シンクロトロン放射光とは、蓄積リングに打ち込まれた電子を磁場によって加速して得られる放射光であり、通常のＸ線発生装置よりも極めて強いエネルギーを有する。理研播磨研究所の第三世代大型放射光設備ＳＰｒｉｎｇ−８（８ＧｅＶ）等が使用可能である。
測定した回折画像データは、プログラムＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）又は同様な画像処理プログラムを用いて、反射強度データに処理される。天然型結晶の反射強度データ、複数波長での重原子置換結晶の反射強度データから、差パターソン図を利用して結晶中のタンパク質に結合した重原子の位置を求めた後、プログラムＰＨＡＳＥＳ若しくはＣＣＰ４又は同様の回折データ解析プログラムを用いて重原子位置パラメータを精密化することにより初期位相が決定される。決定された初期位相は、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ）又は同様な位相改良プログラム（電子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法に従って、信頼性の高い位相へと改良される。
ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の立体構造モデルは、プログラムＯにより３次元グラフィックス上に表示した電子密度図から、以下の手順で構築し得る。まず、特徴的なアミノ酸配列を有する複数の領域を電子密度図上で探し出す。次に、見出した領域を起点にしてアミノ酸配列を参照しながら、電子密度に適合するアミノ酸残基の部分構造をプログラムＯを用いて三次元グラフィックス上で構築する。
順次この作業を繰り返すことにより、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体のすべてのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、複合体全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密化プログラムであるＸＰＬＯＲの精密化プロトコルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化される。精密化の進行状況や分子モデルのチェックは、以下の指標により確認することができる。信頼度因子（Ｒ因子）は、回折強度測定で得られた結晶構造因子の絶対値と分子モデルから計算した結晶構造因子の絶対値の一致度を示す尺度であり、精密化が正常に進行すると小さな値となる。また、タンパク質の主鎖の二面角を計算しそれらをプロットしてそれらの値が許容される領域にあるかどうかを確認する方法（ラマチャンドランプロット）も用いられる。
このようにして本発明であるＤＮＡ組換え修復酵素複合体の３次元原子座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）が初めて得られる。得られた原子座標を当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクのテキスト形式に従って表１に示す。なお、得られた原子座標はプロテイン・データ・バンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）が運営）に受け入れコードＰＤＢ  ＩＤ：１ＫＮ０として登録されている。表１は本明細書の特許請求の範囲において参照される。
2003040361.tif 000003
2003040361.tif 000004
2003040361.tif 000005
2003040361.tif 000006
2003040361.tif 000007
2003040361.tif 000008
2003040361.tif 000009
2003040361.tif 000010
2003040361.tif 000011
2003040361.tif 000012
2003040361.tif 000013
2003040361.tif 000014
2003040361.tif 000015
2003040361.tif 000016
2003040361.tif 000017
2003040361.tif 000018
2003040361.tif 000019
2003040361.tif 000020
2003040361.tif 000021
2003040361.tif 000022
2003040361.tif 000023
2003040361.tif 000024
2003040361.tif 000025
2003040361.tif 000026
2003040361.tif 000027
2003040361.tif 000028
2003040361.tif 000029
2003040361.tif 000030
2003040361.tif 000031
2003040361.tif 000032
2003040361.tif 000033
2003040361.tif 000034
2003040361.tif 000035
2003040361.tif 000036
2003040361.tif 000037
2003040361.tif 000038
2003040361.tif 000039
2003040361.tif 000040
2003040361.tif 000041
2003040361.tif 000042
2003040361.tif 000043
2003040361.tif 000044
2003040361.tif 000045
2003040361.tif 000046
2003040361.tif 000047
2003040361.tif 000048
2003040361.tif 000049
2003040361.tif 000050
2003040361.tif 000051
2003040361.tif 000052
2003040361.tif 000053
2003040361.tif 000054
2003040361.tif 000055
2003040361.tif 000056
2003040361.tif 000057
2003040361.tif 000058
2003040361.tif 000059
2003040361.tif 000060
2003040361.tif 000061
2003040361.tif 000062
2003040361.tif 000063
2003040361.tif 000064
2003040361.tif 000065
2003040361.tif 000066
2003040361.tif 000067
2003040361.tif 000068
2003040361.tif 000069
2003040361.tif 000070
2003040361.tif 000071
2003040361.tif 000072
2003040361.tif 000073
2003040361.tif 000074
2003040361.tif 000075
2003040361.tif 000076
2003040361.tif 000077
2003040361.tif 000078
2003040361.tif 000079
2003040361.tif 000080
2003040361.tif 000081
2003040361.tif 000082
2003040361.tif 000083
2003040361.tif 000084
2003040361.tif 000085
2003040361.tif 000086
2003040361.tif 000087
2003040361.tif 000088
2003040361.tif 000089
2003040361.tif 000090
2003040361.tif 000091
2003040361.tif 000092
2003040361.tif 000093
2003040361.tif 000094
2003040361.tif 000095
2003040361.tif 000096
2003040361.tif 000097
2003040361.tif 000098
2003040361.tif 000099
2003040361.tif 000100
2003040361.tif 000101
2003040361.tif 000102
2003040361.tif 000103
2003040361.tif 000104
2003040361.tif 000105
2003040361.tif 000106
2003040361.tif 000107
2003040361.tif 000108
2003040361.tif 000109
2003040361.tif 000110
2003040361.tif 000111
2003040361.tif 000112
2003040361.tif 000113
2003040361.tif 000114
2003040361.tif 000115
2003040361.tif 000116
2003040361.tif 000117
2003040361.tif 000118
2003040361.tif 000119
2003040361.tif 000120
2003040361.tif 000121
2003040361.tif 000122
2003040361.tif 000123
2003040361.tif 000124
2003040361.tif 000125
2003040361.tif 000126
2003040361.tif 000127
2003040361.tif 000128
2003040361.tif 000129
2003040361.tif 000130
2003040361.tif 000131
2003040361.tif 000132
2003040361.tif 000133
2003040361.tif 000134
2003040361.tif 000135
2003040361.tif 000136
2003040361.tif 000137
2003040361.tif 000138
2003040361.tif 000139
2003040361.tif 000140
2003040361.tif 000141
2003040361.tif 000142
2003040361.tif 000143
2003040361.tif 000144
2003040361.tif 000145
2003040361.tif 000146
2003040361.tif 000147
2003040361.tif 000148
2003040361.tif 000149
2003040361.tif 000150
2003040361.tif 000151
2003040361.tif 000152
2003040361.tif 000153
2003040361.tif 000154
2003040361.tif 000155
2003040361.tif 000156
2003040361.tif 000157
2003040361.tif 000158
2003040361.tif 000159
2003040361.tif 000160
2003040361.tif 000161
2003040361.tif 000162
2003040361.tif 000163
2003040361.tif 000164
2003040361.tif 000165
2003040361.tif 000166
2003040361.tif 000167
2003040361.tif 000168
2003040361.tif 000169
2003040361.tif 000170
2003040361.tif 000171
2003040361.tif 000172
2003040361.tif 000173
2003040361.tif 000174
2003040361.tif 000175
2003040361.tif 000176
2003040361.tif 000177
2003040361.tif 000178
2003040361.tif 000179
2003040361.tif 000180
2003040361.tif 000181
2003040361.tif 000182
2003040361.tif 000183
2003040361.tif 000184
2003040361.tif 000185
2003040361.tif 000186
2003040361.tif 000187
2003040361.tif 000188
2003040361.tif 000189
2003040361.tif 000190
2003040361.tif 000191
2003040361.tif 000192
2003040361.tif 000193
2003040361.tif 000194
2003040361.tif 000195
2003040361.tif 000196
2003040361.tif 000197
2003040361.tif 000198
2003040361.tif 000199
2003040361.tif 000200
2003040361.tif 000201
2003040361.tif 000202
2003040361.tif 000203
2003040361.tif 000204
2003040361.tif 000205
2003040361.tif 000206
2003040361.tif 000207
2003040361.tif 000208
2003040361.tif 000209
2003040361.tif 000210
2003040361.tif 000211
2003040361.tif 000212
2003040361.tif 000213
2003040361.tif 000214
2003040361.tif 000215
2003040361.tif 000216
2003040361.tif 000217
2003040361.tif 000218
2003040361.tif 000219
2003040361.tif 000220
2003040361.tif 000221
2003040361.tif 000222
2003040361.tif 000223
2003040361.tif 000224
2003040361.tif 000225
2003040361.tif 000226
2003040361.tif 000227
2003040361.tif 000228
2003040361.tif 000229
2003040361.tif 000230
2003040361.tif 000231
2003040361.tif 000232
2003040361.tif 000233
2003040361.tif 000234
2003040361.tif 000235
2003040361.tif 000236
2003040361.tif 000237
2003040361.tif 000238
2003040361.tif 000239
2003040361.tif 000240
2003040361.tif 000241
2003040361.tif 000242
2003040361.tif 000243
2003040361.tif 000244
2003040361.tif 000245
2003040361.tif 000246
2003040361.tif 000247
2003040361.tif 000248
2003040361.tif 000249
2003040361.tif 000250
2003040361.tif 000251
2003040361.tif 000252
2003040361.tif 000253
2003040361.tif 000254
2003040361.tif 000255
2003040361.tif 000256
2003040361.tif 000257
2003040361.tif 000258
2003040361.tif 000259
2003040361.tif 000260
2003040361.tif 000261
2003040361.tif 000262
2003040361.tif 000263
2003040361.tif 000264
2003040361.tif 000265
2003040361.tif 000266
2003040361.tif 000267
2003040361.tif 000268
2003040361.tif 000269
2003040361.tif 000270
2003040361.tif 000271
2003040361.tif 000272
2003040361.tif 000273
2003040361.tif 000274
2003040361.tif 000275
2003040361.tif 000276
2003040361.tif 000277
2003040361.tif 000278
2003040361.tif 000279
2003040361.tif 000280
2003040361.tif 000281
2003040361.tif 000282
2003040361.tif 000283
2003040361.tif 000284
2003040361.tif 000285
2003040361.tif 000286
2003040361.tif 000287
2003040361.tif 000288
2003040361.tif 000289
2003040361.tif 000290
2003040361.tif 000291
2003040361.tif 000292
2003040361.tif 000293
2003040361.tif 000294
2003040361.tif 000295
2003040361.tif 000296
2003040361.tif 000297
2003040361.tif 000298
2003040361.tif 000299
2003040361.tif 000300
2003040361.tif 000301
2003040361.tif 000302
2003040361.tif 000303
2003040361.tif 000304
2003040361.tif 000305
2003040361.tif 000306
なお、上記原子座標は、結晶内における単位格子の原点を３次元空間における原点として表記している。本発明の原子座標をコンピュータによる計算に用いる場合などにおいて、各原子の相対的な配置を変化させずに、３次元空間内で並進、回転、対称などの数学的な移動操作を施した結果として得られる新たな原子座標も本発明の範囲である。
（ＨｓＲａｄ５２タンパク質複合体の立体構造モデルを表示するコンピュータシステム）
本発明によるＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶から得られる原子座標を、分子の３次元構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の３次元的な構造を詳細に表現することが可能になる。
コンピュータの記憶媒体としては、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の原子座標をコンピュータの該プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フレキシブルディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープ等の半永久的な記憶媒体でも良い。
上記メモリ又は記憶媒体と電気的に連絡するプロセッサによってＤＮＡ組換え修復酵素複合体の少なくとも一部を表す三次元立体構造モデルが生成される。このようなプロセッサ（プログラム）としては、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６，７６５−７８４）或は、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．４，１８７−２１７）等が利用できる。
更に、これらの分子モデルを生成するステップに続いて、該複合体の配座エネルギーを計算してエネルギーを最小化するプログラムとしては、上記ＣＨＡＲＭＭやＡＭＢＥＲ等が用いられる。
図１は、このようにして２．８Åの分解能で得られたＤＮＡ組換え修復酵素複合体ＨｓＲａｄ５２１−２１２複合体の立体構造をリボンモデルで示したものである。図１より明らかなように、ＨｓＲａｄ５２１−２１２の複合体の結晶は、２１２アミノ酸残基の単量体タンパク質が集合して環状構造を形成していることが分かった。Ｃ末端側の残りのアミノ酸残基は、複合体の形成には直接関与しないと考えられることから、生体内における完全長のＨｓＲａｄ５２についても１１量体の複合体を形成していると考えられ、本発明に含まれる。複合体を構成する単量体の立体構造は図２に示した。２１２アミノ酸残基の単量体タンパク質は５つのαヘリックスと５つのβシート構造を有している。
（ＤＮＡ組換え酵素複合体の立体構造の使用）
本発明によるＤＮＡ組換え修復酵素複合体の結晶から得られる原子座標を、分子の立体構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はその記録媒体に入力して、視覚的検討及び／又は配座エネルギー計算をすることで、所望の特性の改変、例えば触媒活性の向上、タンパク質の安定性の向上等の性質を持つ変異体ＤＮＡ組換え修復酵素の３次元空間における論理的設計が初めて可能になる。
代表的な変異体ＤＮＡ組換え修復酵素の設計方法の一つは、コンピュータ又はその記憶媒体に本発明によるＤＮＡ組換え修復酵素複合体の３次元原子座標を入力し、適当なプログラムを用いてコンピュータ画面上にタンパク質の３次構造を表示し、視覚的な検討によって行う方法である。
ＤＮＡ組換え修復機構の最も重要な段階である相同的対合段階は、図１に示したＤＮＡ組換え修復酵素複合体の立体構造から、環状構造の周囲でＤＮＡと結合する状態が視覚的に推測できる。次に、例えばＤＮＡ組換え修復酵素複合体の表面電荷を計算することにより該複合体表面でＤＮＡと結合するアミノ酸残基を予測することができる。ＤＮＡ分子はその表面のリン酸ジエステル結合に由来する負電荷を有することから、これと結合するアミノ酸残基は、塩基性又は疎水性アミノ酸残基である可能性が高く、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の表面電荷を計算することによってこれらを特定することが可能となる。特定された各アミノ酸残基を、部位特異的なアミノ酸置換などの方法により１つずつアラニンに変換し、ＤＮＡとの結合活性を評価するアラニンスキャニング法等によりＤＮＡ結合部位の解析を行うことができる。このような解析の結果、ＤＮＡとの結合に重要と推測されるアミノ酸残基又はその近傍領域のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換又は化学修飾等を行って変異体酵素を作製することができる。ここに「その近傍領域」とは、該アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデアワールス相互作用、水素結合などに関与する領域、具体的にはおよそ５Å以内にある領域をいう。
図３は、このような方法により推定されたＤＮＡ結合領域を立体構造モデルにより表したものである。図３（ａ）は、ＨｓＲａｄ５２単量体タンパク質中の推定ＤＮＡ結合部位を示したものである。５５位のアルギニン（Ｒ５５）から７０位のアルギニン（Ｒ７０）近傍のループ領域と１５３位のアルギニン、１６９位のリジンの近傍領域は、同一分子内において立体構造上近接しており（図３（ａ））、また隣接する分子の間でも互いに近接している（図３（ｂ））ことが分かる。上記塩基性アミノ酸の何れかをアラニンに置換した変異体Ｒａｄ５２は、ゲルシフトアッセイによるＤＮＡ結合活性を失っていることから、これらの領域がＤＮＡとの結合に関与していることが確認される。図３（ｃ）は、このようなＨｓＲａｄ５２複合体の環状構造の表面でＤＮＡと相互作用する様子を模式的に示したものである。従って、図１又は図３（ｃ）に示したＨｓＲａｄ５２１−２１２の複合体において、リングの外側に突き出している上記ローブ領域でＤＮＡと結合していることが分かった。本発明は、例えば１位から少なくとも１９２位までのアミノ酸配列からなる、ＤＮＡ組換え修復能を有するポリペプチド断片であって、上記ＤＮＡ結合部位を形成するようなポリペプチド断片をも含む。
また、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体とＤＮＡとの結合をコンピュータによる配座エネルギー計算により推定して、変異体酵素の設計を行うこともできる。一般に、タンパク質の立体構造が与えられると、その配座エネルギー（ポテンシャルエネルギー）を計算することができると考えられ、このようなエネルギー計算システムとしてＥＣＥＰＰやＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのプログラムが広く用いられている。配座エネルギーを構成する因子としては結合ポテンシャル、静電ポテンシャル、ファンデアワールスポテンシャル、水素結合ポテンシャル等が存在する。配座エネルギーが計算されると、特定のアミノ酸残基を置換等した場合立体構造も推定することができ、これらの変異体酵素複合体がＤＮＡと結合するための最適化された構造を解析し、推定することも可能となる。
本発明により設計された変異体は、多くの方法によって調製され得る。例えば、本発明の変異体をコードするＤＮＡを部位特異的変異導入法やＰＣＲ、化学合成等の当業者において公知の方法により又はこれらを組み合わせて調製することができる。これらの変異体酵素をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、該発現ベクターを更に適当な細胞に導入して得られた形質転換体を培養し、変異体酵素を発現させることが可能である。
発現ベクターとしては宿主細胞内で増殖することができるものであれば種々のベクターが使用でき、例えば、宿主が大腸菌の場合、高転写活性をもち誘導が可能なｔａｃ、λＰＬ、Ｔ７などのプロモーター／オペレーター系をもったプラスミドベクターが用いられる。具体的にはｔａｃプロモーターをもつものとしてｐＫＫ２３３−３（Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｏｌｙ，Ａ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６９２９）、及びｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７，３１−４０）等や、Ｔ７プロモーターをもつものとしてｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５６，ｐ．１２５−３５）等がある。宿主がパン酵母の場合には、大腸菌と両方で使用できるシャトルベクターｐＡＭ８２（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，１）等がある。宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）等が用いられる。一方、宿主が動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ，ヒトＨｅＬａ細胞等の場合、ｐＭＳＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等のベクターが用いられる。
本発明が提供するＤＮＡ組換え修復酵素複合体の原子座標のすべて又は一部を、分子の立体構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はその記憶媒体に入力することで、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体と結合し、ＤＮＡ組換え修復能を調節する化合物を同定、検索、評価又は設計することが可能となる。化合物は、天然物化合物、合成化合物の何れでもよく、高分子化合物、低分子化合物の何れでも良い。
このような方法は、まず候補化合物とＤＮＡ組換え修復酵素複合体とをコンピュータモデルにより表示し、視覚的観察によりＤＮＡ組換え修復酵素複合体の特定の部位に良く適合する形状又は化学構造をもつ候補化合物（リード化合物）を見つけ出す段階が含まれる。分子モデルを作成、表示するためには、前記ＱＵＡＮＴＡやＳＹＢＹＬ等のプログラムが利用できる。更に、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の特定の部位との親和性、反発力、及び立体的障害等を推定するための種々のコンピュータプログラムが使用できる。これらのプログラムの例としては、例えば、生体高分子についてエネルギー的に好適な結合部位を決定するためのＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．，（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐ．８４９−８５７）、機能的結合部位を探索するためのＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，ｐ．２９−３４）、あるいは高分子とリガンドとの相互作用を幾何学的に解析し、自動的にドッキングさせるＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２）、及びＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１，２６９−２８８）等が挙げられる。このようなプログラムを用いた計算により、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体表面の特定の領域であって、例えば一本鎖又は二本鎖ＤＮＡとエネルギー的に安定に結合し得る領域を推定し、この領域と立体的に相補的な候補化合物を示唆することができる。
これらの候補化合物（リード化合物）が見つけ出されると、続いて、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体の立体構造を表示したコンピュータ画面上で候補化合物との立体的な相互作用を視覚的に検討し、更に最適化することができる。前述したＱＵＡＮＴＡやＳＹＢＹＬ等のプログラムを用いて候補化合物を最適化するためのモデルを構築することができる。これらの他に、分子モデリングの最適化のために有用な種々のプログラムが利用でき、例えば、ＣＡＶＥＡＴ（Ｌａｕｒｉ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．，Ｊ．（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．８，５１−６６）やＨＯＯＫ（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９，１９９−２２１）等が挙げられる。
更に、上記のプログラムの他にＤＮＡ組換え修復酵素複合体の立体構造から直接（ｄｅ  ｎｏｖｏ）、自動的に候補化合物を構築し、その構造を出力することも可能である。これらのためには、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．Ｊ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ．）やＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７，８９８５）等のプログラムも利用できる。
このようにして設計又は選択された化合物は、さらにＤＮＡ組換え修復酵素と接触させて該化合物がＤＮＡ組換え修復酵素に結合するか否かを判定することができる。上記候補化合物は一般的に用いられている化学合成の手法を用いて合成するか、又は天然化合物から得られる。該候補化合物がＤＮＡ組換え修復酵素と結合するか否かは種々の方法により判定することができ、例えば、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡとの結合、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡとの三元複合体（ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成、並びにＤ−ループ形成等をゲルシフトアッセイにより判定する。これらの反応は、基本的にはＤＮＡ組換え修復酵素が第１の一本鎖ＤＮＡと結合し、これと相補的な塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡとアニーリングする反応に基づく。このようにして形成された複合体はゲル電気泳動の手法を用いて放射性標識等の種々の検出手段で検出することができる。
あるいは、上記化合物とＤＮＡ組換え修復酵素との相互作用を、ＮＭＲや質量分析法等を用いて分光学的に検出することもできる。一般的に、ＮＭＲシグナルは分子の局所的環境変化（リガンドとの結合、構造変化など）を敏感に反映するから、リガンドと相互作用するタンパク質を混合してＮＭＲスペクトルを測定した場合、リガンドシグナルのブロード化や消失、化学シフト値の変化などが確認される。反対に、リガンドと結合した状態のタンパク質の構造を特異的に検出することもできる。１５Ｎで均一にラベルしたタンパク質を用いた１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを利用すれば、タンパク質のＮＭＲシグナルのみを観測することができる。
以上の手法によって得られたＤＮＡ組換え修復能を調節する化合物は、Ｒａｄ５２に特異的なＤＮＡ組換え修復反応の阻害剤、又は活性化剤であり得る。この阻害剤はＲａｄ５２特異的な活性の測定に用いることができ、例えば、細胞抽出液などの試料と混合してＲａｄ５２の相同的組換え活性を完全に阻害した後、ＤＮＡ組換え修復能を測定し、該阻害剤を除去した条件で測定したＤＮＡ組換え修復能との差からＲａｄ５２に特異的なＤＮＡ組換え修復能を算出することができる。
また、この阻害剤をガンの治療薬、例えば、放射線療法や化学療法剤の増強剤として用いる場合には、一般に製薬的に許容される担体と混合することによって、医薬組成物を調製することができる。医薬組成物用担体としては、特に制限はなく、例えば，乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルアルコール、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖，酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エアステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース，卵黄、界面活性剤、単シロップ、クエン酸、蒸留水、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等があり、目的とする製剤、例えば、注射薬や錠剤等の形態に応じて、本発明の方法によって同定された阻害剤と混合して使用される。
実施例
以下に本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
（実施例１）ＨｓＲａｄ５２の限定分解
公知の方法（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６，３５２０１−８）により調製した５μｌのＨｓＲａｄ５２タンパク質（１〜３ｍｇ／ｍｌ）を５μｌのプロテネースＫ（３０μｇ／ｍｌ）と混合し、２５℃で４〜６時間保温した。プロテネースＫ溶液はｐＨ７．５の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で希釈した。反応混合液を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、タンパク質のバンドをｓｅｍｉ−ｗｅｔ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてＰＶＤＦ膜にトランスファーした。タンパク質分解物のバンドは、クーマシーブリリアントブルー溶液で染色し、続いてメタノールで脱色して視覚的に検出した。タンパク質のバンドを含むＰＶＤＦ膜の一部からタンパク質を溶出しＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。質量分析法により分子量測定するために、ＨｓＲａｄ５２の限定分解物を含む反応混合物に、１μｌの２Ｎ  ＨＣｌを添加してプロテネースＫによる分解反応を停止し、反応混合液を水で１００倍希釈して質量分析装置で測定した。これらの結果、ＨｓＲａｄ５２は、Ｎ末端から２３７番目までの領域ＨｓＲａｄ５２１−２３７がプロテネースＫによる限定分解に対して抵抗性であることが分かった。
（実施例２）ＨｓＲａｄ５２１−２３７の欠失による解析
ＨｓＲａｄ５２１−２３７のＣ末端から５アミノ酸残基ずつを欠失させた複数の欠失変異体、即ち、ＨｓＲａｄ５２１−２３２、ＨｓＲａｄ５２１−２２７、ＨｓＲａｄ５２１−２２２、ＨｓＲａｄ５２１−２１７、ＨｓＲａｄ５２１−２１２、ＨｓＲａｄ５２１−２０７、ＨｓＲａｄ５２１−２０２、ＨｓＲａｄ５２１−１９７、ＨｓＲａｄ５２１−１９２及びＨｓＲａｄ５２１−１８７について、結晶化と生化学的実験の両方を組み合わせて行った。ＨｓＲａｄ５２１−１９２及びこれより大きな欠失変異体は、ＨｓＲａｄ５２１−２３７と全く同じＤＮＡ結合活性を有していた。これらすべての欠失変異体の中で、ＨｓＲａｄ５２１−２１２がスクリーニングキット（クリスタルスクリーン１及び２、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた系で最も多くの結晶が得られた。従って、これらの結果より、ＨｓＲａｄ５２１−２１２が構造解析に最も適していると判断した。
（実施例３）ＨｓＲａｄ５２１−２１２の精製
ＨｓＲａｄ５２１−２１２は、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースによるアフィニティー吸着、６個のヒスチジンタグ配列の除去、及びヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィーによる３段階の精製を行った。ＨｓＲａｄ５２１−２１２をコードするＤＮＡをＴ７ポリメラーゼによる発現ベクターｐＥＴ１５−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローン化した。ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質は、ＣＧＧコドンを認識するｔＲＮＡＡｒｇ３、及びＡＧＡ／ＡＧＧコドンを認識するＲＮＡＡｒｇ４と共に大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を用いて大量発現させた。発現プラスミドが上記ｔＲＮＡ遺伝子を含まない場合は、ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質の発現量は極めて少なかった。通常、ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質は１Ｌの培養液から精製した。組換え大腸菌は３０℃で培養し、対数増殖期（ＯＤ６００＝０．６）に、最終濃度で１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えてタンパク質の発現を誘導した。その後、４〜６時間培養して菌体を集め、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．８Ｍ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール及びプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含む緩衝液Ａ（ｐＨ７．８）中、氷冷下で超音波により細胞を破砕した。菌体を集めた後のすべての操作は４℃で行った。菌体破砕物を２７，７００ｇで２０分間遠心分離し、得られた上清と４ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ社）とをバッチ法により、１時間緩やかに混合した。ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質を結合したＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズをＥｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．８Ｍ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロールを含む緩衝液Ｂ（ｐＨ７．８）をカラム容量の３０倍量用い、約０．３ｍｌ／分の流量で洗浄した。ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質は、５０ｍＭから３００ｍＭへのイミダゾール溶液の直線的濃度勾配をカラム容量の３０倍量で行い溶出した。約０．１５Ｍのイミダゾール濃度で溶出されたピーク画分を回収し、１ｍｇのＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質あたり２単位（２ｕｎｉｔｓ）のトロンビンプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を加えて６個のヒスチジンを含むタグ配列を除去した。反応溶液は直ちに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び１０％グリセロールを含む緩衝液Ｃ（ｐＨ７．５）に対して１２時間以上透析した。６個のヒスチジンを含むタグ配列を除去した後、ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質を、４ｍｌのヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に負荷し、カラム容量の２０倍量の緩衝液Ｃでカラムを洗浄し、タンパク質を、カラム容量の２０倍量の０．２Ｍから１ＭへのＫＣｌ濃度の直線的勾配により溶出した。ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質は、約０．３ＭのＫＣｌ濃度で鋭いピークで溶出された。１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度のＨｓＲａｄ５２１���２１２タンパク質のピーク画分は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、０．２Ｍ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び５０％グリセロールを含む緩衝液Ｄ（ｐＨ７．０）に対して透析し、−２０℃にて保存した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のプロテインアッセイキットを用い、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を標準物質として測定した。このようにして精製したＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質をＤＮＡ結合活性や相同的対合活性の測定等の種々の酵素活性の測定に用いた。
（実施例４）結晶化のためのタンパク質の精製
ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質を結晶化するために、上記と同様の方法にて大腸菌で大量発現させ、透析に用いる最終の緩衝液のみを変更して精製した。すなわち、ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質を、発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）で大量発現し、ヒスチジンタグ配列を有するＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、続いてトロンビンプロテアーゼでヒスチジンタグ配列を除去した後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。ヘパリンセファロースカラムから溶出したピーク画分を、１０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、０．２Ｍ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、セントリコン−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて３−４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＨｓＲａｄ５２１−２１２結晶の生長を促進するために、ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質を８塩基の一本鎖ＤＮＡ（ＧＴＴＧＧＴＴＧ，１．５〜２ｍＭ）と１４：１〜１１：１のモル比で氷冷下で混合し、４℃で一晩保温した。次の日、ハンギングドロップ法により、２０℃でＨｓＲａｄ５２１−２１２の結晶を生長させた。最初の液滴は、１２％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０００モノメチルエーテル（ＭＭＥ）、８０ｍＭ硫酸アンモニウム、２０ｍＭベタイン一水素化物（ｂｅｔａｉｎｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）又は尿素、及び４０ｍＭカコジル酸ナトリウムを含むｐＨ６．２の溶液１μｌと、ＨｓＲａｄ５２１−２１２及び一本鎖ＤＮＡの混合物２μｌとを混合して調製した。リザーバー溶液は、１５％ＰＥＧ５０００ＭＭＥ、０．１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭカコジル酸ナトリウムを含むｐＨ６．２の溶液とした。典型的な例として、結晶は１２時間から１日経過後に出現し、３日以内に最大の大きさ（０．１ｍｍ  ｘ  ０．２ｍｍ  ｘ  ０．３ｍｍ）に達した。
（実施例５）データ収集
ＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質の結晶は、非対称単位の一つの１１量体ＨｓＲａｄ５２１−２１２環を含み、２．８Å分解能以上の回折データが得られた。データ収集に先立って、水で３倍に希釈したリザーバー溶液で結晶を処理した。その後、１５％エチレングリコール、５％ＰＥＧ５０００ＭＭＥ、３３ｍＭ硫酸アンモニウム及び１７ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．２）を含む溶液に対して透析し、続いて３０％エチレングリコール以外は同じ組成の溶液に更に透析して凍結防止を行った。ＨｓＲａｄ５２１−２１２結晶は窒素ガスの流れの中で瞬間的に凍結した。
天然型及びセレノメチオニン置換体結晶の両方のデータセットを、理研播磨研究所の８ＧｅＶの大型放射光施設（ＳＰｒｉｎｇ−８）のビームラインＩ（ＢＬ４５ＸＵ）で収集した。回折データはデータ処理プログラムＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで処理した。
（実施例６）立体構造の決定と精密化
立体構造を決定するために、３種類の異なる結晶（１つは天然型であり、他の２つはセレノメチオニンによる重原子置換体である。）から得られた３つのデータセットを用いた。ＨｓＲａｄ５２１−２１２単量体タンパク質は４つのメチオニン残基を含むが、４つのセレニウム原子のうち１つだけ（７８位のメチオニン残基）がＳｎＢプログラムを用いた直接法によって見出され、続いて位相決定に用いられた。セレニウム原子の位置は、ＳＨＡＲＰプログラムにより更に精密化され、初期位相は３．５Å分解能で計算された。初期マップはＤＭによって溶媒平坦化された。２つのセレノメチオニンのデータから計算された位相は組み合わされ、天然型のデータを用いて２．８Åまで拡張された。プログラムＯによるモデル構築の反復とプログラムＸＰＬＯＲによる精密化プロトコルに従って、完全な主鎖の明確化が可能になるまで立体構造の精密化を行った。この段階までのすべての精密化は、３００のＮＣＳ拘束の重みを含んだ。最小化とグループＢ因子の精密化による最終的な精密化によって、ＮＣＳの重みは段階的に３００〜５０に減少した。ＨｓＲａｄ５２１−２１２１１量体の１５，８４１残基と８２個の水分子を含む最終モデルのＲ値は２３．５％（自由Ｒ値としては２８．５％）であった。最終構造のラマチャンドランプロットは、最適領域に８８．６％の残基が、付加的な許容領域に１１．４％の残基が存在した。立体構造のグラフィック表示はプログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴ及びＳＰＯＣＫを用いて行った。
（実施例７）ＨｓＲａｄ５２への部位特異的変異導入
表１並びに図１及び図２に示したＨｓＲａｄ５２１−２１２の立体構造から、１１量体の環状構造の周囲でＤＮＡと結合する可能性のある塩基性アミノ酸残基を選択し、これらをそれぞれアラニン残基に置換した点突然変異体ＨｓＲａｄ５２１−２１２を作製した。選択されたアミノ酸残基は、５５位のアルギニン、６５位のチロシン、６９位のヒスチジン、７０位のアルギニン、１５３位のアルギニン及び１６９位のリジンであり、これらをそれぞれアラニンに置換した変異体を、Ｒ５５Ａ、Ｙ６５Ａ、Ｈ６９Ａ、Ｒ７０Ａ、Ｒ１５３Ａ及びＫ１６９Ａと表す。部位特異的変異導入は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、その使用方法説明書に従って行った。
このようにして作製した６種類の点突然変異体ＨｓＲａｄ５２１−２１２の一本鎖及び二本鎖ＤＮＡとの結合活性をゲルシフトアッセイ法により検出した。この方法に用いた基質ＤＮＡは以下のようにして調製した。二本鎖ＤＮＡのｐＧｓａｔ４は、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にヒトαサテライト由来の１９８ｂｐのＤＮＡ断片を挿入して調製した。この３．２ｋｂのプラスミドＤＮＡは、不可逆的な変性を回避するために宿主大腸菌をアルカリ変性することなく、サルコシルを用いた緩和な溶菌方法によって調製した。一本鎖ＤＮＡとしては、配列番号２に示した、ＨＰＬＣ精製された５０塩基のオリゴヌクレオチドをＲｏｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。
配列番号２：ＳＡＴ−１（５０ｍｅｒ  ５’−ＡＴＴＴＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡ−３’）。このオリゴヌクレオチドの５’末端を［γ３２Ｐ］ＡＴＰの存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて放射性標識し、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ−１０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により精製した。
ゲルシフトアッセイは最終濃度で５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、０．２５〜２μＭの変異体ＨｓＲａｄ５２１−２１２を含む反応溶液を用いた。一本鎖ＤＮＡとの結合活性を測定するためには、上記反応溶液９μｌに３２Ｐ標識されたＳＡＴ−１一本鎖ＤＮＡ１μＭ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を１μｌ添加し、３７℃で５分間保温した。その後、１μｌの１２％グリセルアルデヒド溶液を添加してＨｓＲａｄ５２と一本鎖ＤＮＡとを固定した。２０分間保温後、６倍容量の電気泳動用染色溶液を添加し、この反応溶液を用いて、０．５ｘＴＢＥバッファー、３．３Ｖ／ｃｍ、室温にて１％アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーにより検出した。遊離の一本鎖ＤＮＡ量は富士写真社製ＢＡＳ２５００イメージアナライザーにて定量した。その結果を図４（ａ）に示す。ＨｓＲａｄ５２と結合していない一本鎖ＤＮＡはゲルの先端部分に残存するが、タンパク質濃度が上昇するに従って一本鎖ＤＮＡと結合し高分子側にシフトすることが分かる。野生型ＨｓＲａｄ５２１−２１２と比較してすべての点突然変異体の一本鎖ＤＮＡとの結合活性は低下し、特に、Ｒ５５Ａ、Ｙ６５Ａ、Ｈ６９Ａ、Ｒ７０Ａの変異体はほとんど一本鎖ＤＮＡとの結合活性を失っていた。このことから、５５位のアルギニンから７０位のチロシン残基近傍の領域はＤＮＡ結合領域であることが示唆される。
次に、二本鎖ＤＮＡとの結合活性を測定するためには、上記と同様の反応溶液９μｌに、１５μＭのｐＧｓａｔ４二本鎖ＤＮＡ１μｌを添加して５分間反応を行い、ＨｓＲａｄ５２と二本鎖ＤＮＡとの固定化を行わないこと以外は上記と同様にして１％アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドで染色して検出した。遊離の二本鎖ＤＮＡ量はＭａｃＢＡＳソフトウエアにて定量した。その結果を図４（ｂ）に示す。ＨｓＲａｄ５２と結合していない二本鎖ＤＮＡはゲルの先端部分に残存するが、タンパク質濃度の上昇に伴なって二本鎖ＤＮＡとの結合が起こり、高分子側にシフトすることが分かる。野生型ＨｓＲａｄ５２１−２１２と比較してすべての点突然変異体はほとんど二本鎖ＤＮＡとの結合活性を失っていた。このことから、５５位のアルギニンから７０位のチロシン残基、及びこれと近接している１５３位のアルギニン、１６９位のリジン近傍の領域がＤＮＡ結合領域であることが示唆される。
さらに本発明者らは同様の方法を用いてＨｓＲａｄ５２のＤＮＡ結合部位についてより詳細に解析を行った。その結果は、Ｋａｇａｗａ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０，３５９−３７１，Ａｕｇｕｓｔ，２００２に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。上記刊行物のＦｉｇ．５のＡは一本鎖ＤＮＡとの結合を、Ｂは二本鎖ＤＮＡとの結合を、Ｃ〜Ｆはこれらを図示したものであり、ＧはＨｓＲａｄ５２と、一本鎖ＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡとの三元複合体の形成を、Ｈは一本鎖ＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡとのＤ−ループ形成を検出したものである。これらを参照すると明らかなように、５５位のアルギニン、６５位のチロシン、１５２位のリジン、１５３位のアルギニン、１５６位のアルギニンはすべてＤＮＡとの結合に必要であり、この中で５５位のアルギニンと１５２位のリジンは一本鎖ＤＮＡとの結合に必要であり、６５位のチロシン、１５３位のアルギニン、及び１５６位のアルギニンは一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの両方との結合に必要であった。
（実施例８）ＨｓＲａｄ５２のＤＮＡ結合領域に結合する化合物のインシリコスクリーニング
〈データベース最適化〉
低分子化合物データベースの対照データベースとしては、ＳＰＥＣＳ社から提供されている低分子化合物カタログデータベースを用いた。１エントリーに複数分子含むものは１分子ごとに分割した上で、重複を除いたライブラリをスクリーニングの母集団（１５２３２３分子）とした。次に、”Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ５”に基づき、上記低分子化合物データベースについてのターゲット非依存最適化を行った。ここで用いた絞込条件は以下の通りである。
１．分子量１００以上５００以下
２．計算ＬｏｇＰ値（ｏ／ｗ）５以下（ＸＬＯＧＰ−１アルゴリズム使用）、
３．水素結合アクセプター原子数（低分子化合物に含まれるＮとＯの数）１０以下
４．水素結合ドナー原子数（低分子化合物に含まれるＮＨとＯＨの数）５以下
更にドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
１．回転可能な単結合数が２１以上のもの
２．ラジカルを含むもの
３．Ｈ，Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｆ，Ｓ，Ｐ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ以外の元素を含むもの。
絞込み後の分子数は１０３７７３となった。
〈結合部位予測〉
ＨｓＲａｄ５２１−２１２の中で一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの双方との結合に本質的に関わっていると推察される残基群（配列番号１に示したアミノ酸配列において５５位のアルギニン、６５位のチロシン、１５２位のリジン、１５３位のアルギニン、及び１５６位のアルギニン）からなる溝を結合部位とした。
〈スクリーニング〉
（１）１次スクリーニング
Ｄｏｃｋ４．０を用いて、上記結合サイトについて、先に最適化を行った低分子化合物ライブラリー全体に対してドッキングを行った。この時、Ｄｏｃｋのエネルギースコア（ｅｎｅｒｇｙ  ｓｃｏｒｅ）に基づいて低分子化合物をランク付けした。
（２）２次スクリーニング
１次スクリーニングの結果得られた上位１００００分子とデータベース内に含まれるその類似化合物（Ｓｙｂｙｌ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｔ  ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ０．８以上）１７８分子について、ＡｕｔｏＤｏｃｋ３．０．５を用いて詳細なドッキングを行った。その後、ドッキングの際に使用したスフィアーから４Å以内にある化合物に絞込み、更に計算が異常終了した分子を除去した。この結果、最終的に９９８９分子についてドッキング構造を得た。得られた化合物のうち、上述の結合部位との結合性が高い上位１０００化合物をリガンド候補化合物とした。このリガンド候補化合物のΔＧ（結合自由エネルギー変化）は、−９．４３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であった。
（実施例９）ＮＭＲによるＨｓＲａｄ５２結合化合物のスクリーニング
実施例８で得られたリガンド候補化合物の中から、ＡｕｔｏＤｏｃｋによる結合自由エネルギー変化（ΔＧ）及び溶解度などを考慮して選択した一つの候補化合物をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、４５５．７μＭに調整した。実施例３で調製したＨｓＲａｄ５２１−２１２タンパク質は緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｄ１１（ｐＨ７．５）／２００ｍＭ  ＫＣｌとなるように重水に溶解したもの）を用いて１５２μＭの濃度に溶解した。これらを用いて、リガンド候補化合物単独と、そこにＨｓＲａｄ５２タンパク質を１：１の比で加えたもの、との２種類の試料を用意した。
2003040361.tif 000307
リガンド候補化合物の終濃度は２１．７μＭとなる。
2003040361.tif 000308
リガンド候補化合物及びＨｓＲａｄ５２タンパク質の終濃度はそれぞれ２１．７μＭとなる。
上記それぞれの試料について１次元１Ｈ−ＮＭＲを測定し、ＨｓＲａｄ５２タンパク質を添加する前後でスペクトルに変化があるかどうか観察した。その結果、リガンド候補化合物として、試料ＩＤ：ＡＫ９６８−４１１７０１３１、化合物名称：ｃｉｓ−６−［４−（４−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ］−３，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘ−３−ｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（化合物Ａ、−１１．７１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を用いた場合のＮＭＲスペクトルを図５〜７に示した。図５は化合物Ａ単独のＮＭＲスペクトル、図６は化合物ＡとＨｓＲａｄ５２タンパク質を混合した場合のＮＭＲスペクトルである。図６ではタンパク質と混合したことによるベースラインに若干の上昇が認められるが、化合物Ａに由来する７．５ｐｐｍ付近の２本のシグナルが明らかに消失していることが分かる。この領域を拡大したチャートを図７に示す。図７（ａ）は化合物Ａ単独、図７（ｂ）はＨｓＲａｄ５２タンパク質と混合したもの、図７（ｃ）は（ａ）と（ｂ）の両者を比較したものである。これらの結果より、ＨｓＲａｄ５２との相互作用により化合物Ａのベンゼン環の４個の水素に由来するシグナルが消失していることが認められ、該化合物がＨｓＲａｄ５２に結合していることが示唆された。
一方、図８〜１０はリガンド候補化合物として、試料ＩＤ：ＡＫ９６８−４１０２５３１５、化合物名称：３，４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−６−［Ｎ’−（９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｅ−９−ｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘ−３−ｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（化合物ａ、−１３．３３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を用いて同様の実験を行った結果を示す。図８は化合物ａ単独、図９は化合物ａとＨｓＲａｄ５２タンパク質との混合溶液のＮＭＲスペクトルである、図１０は、７．５ｐｐｍ付近のシグナルを拡大して比較したものである。これらの図から明らかなように化合物ａはＨｓＲａｄ５２との混合によってもＮＭＲシグナルに変化はなく、ＨｓＲａｄ５２タンパク質に結合しないと推測される。
なお、上記すべてのＮＭＲスペクトルは、重水素中、２９８ＫでＢｒｕｋｅｒＤＲＸ５００ＮＭＲ分光計を用いて行った。
このような方法を用いて、実施例８で得られた複数のリガンド候補化合物を種々の濃度に調整してＮＭＲスペクトルを測定し、ＨｓＲａｄ５２と相互作用が検出された化合物を以下の表４に示した。なお、化合物Ａの結合力を１として、ＮＭＲスペクトルのシグナル強度から相対的に計算した結合力の強さを相対結合力として示した。
2003040361.tif 000309
表４の結果より、ＨｓＲａｄ５２と相互作用する化合物は、以下の一般式（Ｉ）に示す構造を有すると考えられる。
2003040361.tif 000310
但し、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分枝を有するアルキル基、Ｒ２及びＲ３は独立していて、水素原子又はメチル基等の低級アルキル基、Ｒ４及びＲ５は互いに連結されて５員環又は６員環を形成する、置換基を有していてもよいアルキル基又はアルケニル基である。
更に具体的には、シス−６−［４−（４−アルキルフェニル）−５−メチルチアゾール−２−イルカルバモイル］−３，４−ジメチル−３−シクロヘキセンカルボン酸（ここで、アルキル基は炭素数１〜１０の直鎖又は分枝を有するアルキル基を意味する。）、及び３−［４−（４−アルキルフェニル）−５−メチルチアゾール−２−イルカルバモイル］−７−オキサビシクロ［２，２，１］ヘプタン−２−カルボン酸（ここで、アルキル基は炭素数１〜１０の直鎖又は分枝を有するアルキル基を意味する。）である。これらの化合物は塩の形態（ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等）であってもよい。また、これらの化合物は、光学活性体又はラセミ体であってもよい。
（実施例１０）ゲルシフトアッセイ法によるリガンド候補化合物のＨｓＲａｄ５２との結合活性の測定
実施例９でＨｓＲａｄ５２との結合が示唆されたリガンド候補化合物ＡＫ９６８−４１１７０１３１（化合物Ａ）が、実際にＨｓＲａｄ５２と結合するかどうかを確認するために、実施例７と同様の方法によりＨｓＲａｄ５２とＳＡＴ−１一本鎖ＤＮＡ（配列番号２、５０ｍｅｒ）との結合を指標として、化合物Ａによる結合阻害活性を測定した。終濃度で５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％グリセロール、及び１μＭのＨｓＲａｄ５２１−２１２、を含む溶液に、一塩基当たり１μＭとなるように３２Ｐ標識ＳＡＴ−１一本鎖ＤＮＡと、種々の濃度の化合物Ａとを混合して３７℃で６分間保温した。その後、０．２％グルタルアルデヒドで２０分間固定した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーにより可視化した。その結果を図１１に示した。図１１で、レーン１は一本鎖ＤＮＡのみを、レーン２は一本鎖ＤＮＡと化合物Ａとの混合物を、レーン３は一本鎖ＤＮＡとＨｓＲａｄ５２１−２１２との混合物を試料としたものである。レーン４〜７は、一本鎖ＤＮＡとＨｓＲａｄ５２１−２１２との混合物にそれぞれ０．１、１、１０、及び１００μＭとなるように化合物Ａを添加したものである。図１１から明らかなように、ＨｓＲａｄ５２１−２１２を添加すると一本鎖ＤＮＡとの複合体が高分子側にシフトするが、化合物Ａの濃度が増加するに従って（レーン４〜７）その複合体の量が減少していること、すなわち一本鎖ＤＮＡとＨｓＲａｄ５２１−２１２との複合体の形成が阻害されていることが分かる。従って、インシリコスクリーニング（実施例８）及びＮＭＲによるスクリーニング（実施例９）で予想されたとおり、リガンド候補化合物ＡＫ９６８−４１１７０１３１（化合物Ａ）は、ＨｓＲａｄ５２のＤＮＡ結合部位に結合していることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＤＮＡ組換え修復酵素複合体又はその変異体の立体構造モデルが提供される。本酵素複合体の立体構造は、相同的組換えによるＤＮＡの修復機構を理解する上で極めて有用である。本酵素の反応機構を理解することによって、ＤＮＡ修復反応を介した癌の予防や治療への応用が可能となる。癌の予防や治療のための手段として、ＤＮＡ組換え修復活性の向上した変異体酵素の設計や本酵素と結合し得る化合物のスクリーニング等を行うことができる。これらの方法によって得られた化合物は生体内でのＲａｄ５２特異的なＤＮＡ組換え修復能を測定して、ＤＮＡ損傷により引き起こされる病気の診断に使用することができるほか、Ｒａｄ５２をターゲットとした創薬や生体内での相同的組換えによる特異的な部位への遺伝子導入などの幅広い応用が期待される。
【配列表】
2003040361.tif 000311
2003040361.tif 000312
2003040361.tif 000313
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト由来の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素であるＨｓＲａｄ５２１−２１２複合体の立体構造をリボンモデルであらわした図である。図１（ａ）及び（ｂ）は、ＨｓＲａｄ５２１−２１２の１１量体の構造を異なる方向から見たものである。
図２は、ヒト由来の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素であるＨｓＲａｄ５２１−２１２単量体の立体構造をリボンモデルであらわしたものである。図２（ａ）及び（ｂ）は、ＨｓＲａｄ５２１−２１２の単量体の構造を異なる方向から見たものである。
図３は、ヒト由来の変異体ＤＮＡ組換え修復酵素であるＨｓＲａｄ５２１−２１２のＤＮＡとの結合部位及び結合様式を示したものである。図３（ａ）は、ＨｓＲａｄ５２１−２１２単量体の中のＤＮＡ結合部位を示したステレオ図であり、図３（ｂ）は、複合体を形成するＨｓＲａｄ５２１−２１２のうちの隣接する２分子間におけるＤＮＡ結合部位を示したステレオ図であり、図３（ｃ）は１１量体のＨｓＲａｄ５２１−２１２複合体とＤＮＡとの結合様式を示したモデル図である。
図４は、野生型及び各種変異体ＨｓＲａｄ５２１−２１２のＤＮＡ結合活性をゲルシフト法により測定した結果を示したものである。図４（ａ）は一本鎖ＤＮＡとの結合活性をオートラジオグラフィーにより検出した結果を示したものであり、図４（ｂ）は、二本鎖ＤＮＡとの結合活性をエチジウムブロミド染色により検出した結果を示したものである。同一タンパク質についての５つのレーンは、タンパク質濃度を順に上昇させて濃度依存性を調べたものである。
図５は、リガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１１７０１３１（化合物Ａ）のプロトンＮＭＲスペクトルである。
図６は、リガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１１７０１３１（化合物Ａ）とＨｓＲａｄ５２１−２１２との混合物（１：１）のプロトンＮＭＲスペクトルである。
図７は、リガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１１７０１３１（化合物Ａ）及びリガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１１７０１３１（化合物Ａ）とＨｓＲａｄ５２１−２１２との混合物（１：１）のプロトンＮＭＲスペクトルの７．５ｐｐｍ付近のシグナルを比較したものである。
図８は、リガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１０２５３１５（化合物ａ）のプロトンＮＭＲスペクトルである。
図９は、リガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１０２５３１５（化合物ａ）とＨｓＲａｄ５２１−２１２との混合物（１：１）のプロトンＮＭＲスペクトルである。
図１０は、リガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１０２５３１５（化合物ａ）及びリガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１０２５３１５（化合物ａ）とＨｓＲａｄ５２１−２１２との混合物（１：１）のプロトンＮＭＲスペクトルの７．５ｐｐｍ付近のシグナルを比較したものである。
図１１は、リガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１１７０１３１（化合物Ａ）が、ＨｓＲａｄ５２と一本鎖ＤＮＡとの結合を阻害することを示すゲルシフトアッセイの結果である。
【図１（ａ）】
2003040361.tif 000314
【図１（ｂ）】
2003040361.tif 000315
【図２（ａ）】
2003040361.tif 000316
【図２（ｂ）】
2003040361.tif 000317
【図３（ａ）】
2003040361.tif 000318
【図３（ｂ）】
2003040361.tif 000319
【図３（ｃ）】
2003040361.tif 000320
【図４（ａ）】
2003040361.tif 000321
【図４（ｂ）】
2003040361.tif 000322
【図５】
2003040361.tif 000323
【図６】
2003040361.tif 000324
【図７（ａ）】
2003040361.tif 000325
【図７（ｂ）】
2003040361.tif 000326
【図７（ｃ）】
2003040361.tif 000327
【図８】
2003040361.tif 000328
【図９】
2003040361.tif 000329
【図１０（ａ）】
2003040361.tif 000330
【図１０（ｂ）】
2003040361.tif 000331
【図１０（ｃ）】
2003040361.tif 000332
【図１１】
2003040361.tif 000333
【国際調査報告】
2003040361.tif 000334
2003040361.tif 000335
2003040361.tif 000336
2003040361.tif 000337
2003040361.tif 000338
2003040361.tif 000339
2003040361.tif 000340