(57)【要約】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用によるＢＭＡＬ１のＪＮＫ３によるリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法、並びにＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を提供する。さらに、上記特徴を有するサーカディアンリズム障害の改善剤、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤および／または治療剤、上記同定方法により得られた化合物、該化合物からなるＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害剤、ＪＮＫ３の発現および／または機能の阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤リン酸化阻害剤、並びにこれらの１種を含有してなる医薬組成物を提供する。
2003063907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善剤。
【請求項２】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）の発現阻害剤および／または機能阻害剤を有効量含み、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善剤。
【請求項３】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法。
【請求項４】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）の発現阻害および／または機能阻害により、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法。
【請求項５】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項６】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項７】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１との相互作用を阻害する化合物の同定方法であって、化合物とＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１との相互作用を可能にする条件下で、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、次いで、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１との相互作用により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、化合物がＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害するかどうかを決定する同定方法。
【請求項８】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、ＢＭＡＬ１のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、化合物がＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害するかどうかを決定する同定方法。
【請求項９】
請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物。
【請求項１０】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物。
【請求項１１】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物。
【請求項１２】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤。
【請求項１３】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤。
【請求項１４】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１５】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３の発現を阻害することおよび／または機能を阻害することを特徴とする、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除方法。
【請求項１６】
下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなる医薬組成物：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１７】
下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなるサーカディアンリズム障害の改善剤：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１８】
下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなるサーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤および／または治療剤：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１９】
サーカディアンリズム障害が、睡眠−覚醒リズム障害および／または周期性・反復性障害である請求の範囲第５項若しくは第１８項に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項２０】
下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を使用することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法：
１）  請求の範囲７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項２１】
下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を使用することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項２２】
サーカディアンリズム障害が、睡眠−覚醒リズム障害および／または周期性・反復性障害である請求の範囲第６項若しくは第２１項に記載の防止方法および／または治療方法。
【請求項２３】
請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法に使用する試薬キットであって、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）および／若しくはＢＭＡＬ１、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドおよび／若しくはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチド、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／若しくはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用の結果、ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がリン酸化されることによるＢＭＡＬ１の機能抑制を阻害することを特徴とするサーカディアンリズム障害の改善に関する。
背景技術
サーカディアンリズムとは、約２４時間の周期を示すリズムであり、体内の諸生理機能の中でも睡眠−覚醒、摂食、飲水、体温、内分泌、代謝あるいは免疫機能などの種々の生理現象に認められる。このリズムを発現させる生体時計はあらゆる生物に備わっており、哺乳動物では脳視床下部の視交差上核に存在することが証明されている。
一般に、ヒトでは昼間に交感神経系が活発になり、血圧、脈拍および体温などが上昇し、内分泌系では副腎、甲状腺および生殖器のホルモン分泌が盛んになる。一方、免疫系のリンパ球やＴ細胞の生産は夜間に活発になる。このように内分泌や代謝などにリズムが存在するため、例えば薬の吸収速度や排泄時間にリズムが生じるので薬などの感受性にもリズムが現れる。従って、サーカディアンリズムの異常は、睡眠障害（非特許文献１）や精神科疾患（非特許文献２）、例えば冬期鬱病、周期的高血圧あるいは不規則排卵周期など、様々な疾患を引き起こす。また、インスリン分泌の周期性と糖尿病の関連が報告されている（非特許文献３）。一方、この時間機構を人為的に操作すれば、上記疾患の治療のみならず、東西飛行による時差症候群（非特許文献４）の解除あるいは家畜の排卵や分娩時刻の調節が可能である。また、投薬時間に関して薬効を最大に、副作用を最小にすることも可能である。
近年、サーカディアンリズムについての遺伝子研究が盛んに行われており、哺乳動物において生体時計関連遺伝子、例えばＣｌｏｃｋ、Ｂｍａｌ１（Ｍｏｐ３）、Ｐｅｒｉｏｄ（Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３）、Ｔｉｍｅ（Ｔｉｍ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ（Ｃｒｙ１／Ｃｒｙ２）およびカゼインキナーゼＩεなどの遺伝子が見出されている（非特許文献５および非特許文献６）。さらに、これら遺伝子の欠損マウスなどを実験モデルに使用してサーカディアンリズム機構の解明が試みられ、その結果、該機構において上記遺伝子の転写フィードバックループが存在することが明らかになった。すなわち、ＢＭＡＬ１蛋白質とＣＬＯＣＫ蛋白質とがヘテロダイマーを形成し、該ヘテロダイマーは生体時計関連遺伝子であるＰｅｒ１とＰｅｒ２のプロモーターに存在するＥ−ｂｏｘ（ＣＡＣ  ＧＴＧ）に結合してこれらの転写を促進する。その結果、産生されたＰＥＲ１とＰＥＲ２が常時生産されているＰＥＲ３と結合して核内へと移行する。核内でＰＥＲはさらにＴＩＭやＣＲＹなどの蛋白質と結合し、ＢＭＡＬやＣＬＯＣＫの転写を抑制する（非特許文献７）。その結果、ＢＭＡＬやＣＬＯＣＫが減少し、Ｐｅｒ１とＰｅｒ２の転写は抑制される。この抑制によってＰＥＲ１とＰＥＲ２の生産が減少し、これはＢＭＡＬとＣＬＯＣＫの抑制を解除する。このようなフィードバックループによって、サーカディアンリズムが成立していると考えられている。
一方、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（以下、ＪＮＫと略称する）は、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーの１つである。ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、細胞増殖や分化を制御する細胞内シグナル伝達経路上で主要な経路にあると考えられており、癌遺伝子産物であるＲａｓ蛋白質やＲａｆ−１蛋白質の下流で細胞の増殖や分化の調節に働いている。ＭＡＰＫは、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）（ＭＥＫＫ）によりＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）（ＭＥＫ）（ＭＫＫ）がリン酸化されて活性化され、活性化型ＭＥＫによりＭＡＰＫがリン酸化されるというカスケードで活性化される。ＪＮＫも、近縁の酵素からなる上記同様のカスケードにより活性化される。例えば、ＪＮＫの１つであるＪＮＫ３は、ＭＥＫＫ１によりリン酸化されて活性化されたＭＫＫ４／ＭＫＫ７によりリン酸化されるというカスケードで活性化される。現在、ＪＮＫは、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３の３種が報告されている。この内、ＪＮＫ３は脳神経系などに特異的に発現する蛋白質であり、低酸素状態などのショック的状況で発現して脳機能に障害を与えることが知られている。従って、ＪＮＫ３が相互作用する蛋白質を見出して、該蛋白質の機能を制御することは、ＪＮＫ３およびＪＮＫ３が相互作用する蛋白質に起因する疾患の解明並びに防止および／または治療に有用である。
以下に、本背景技術の説明に引用した文献を列記する。
非特許文献１：「医薬雑誌」、１９９９年、第１２２巻、第２号、ｐ．４５８−４６２。
非特許文献２：カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｆ．）、「モレキュラー  メディシン（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ）」、１９９９年、第３６巻、ｐ．１１６１−１１６５。
非特許文献３：「神経精神薬理」、１９９６年、第１８巻、第１０号、ｐ．７０３−７１０。
非特許文献４：「臨床検査」、２００１年、第４５巻、第６号、ｐ．６３６−６３９。
非特許文献５：キングら（Ｋｉｎｇ  Ｄ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．）、「アニュアル  レヴュー  オブ  ニューロサイエンス（ＡＮＮＵＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ  ＯＦ  ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ）」、２０００年、第２３巻、ｐ．７１３−７４２。非特許文献６：モーリーンら（Ｍａｕｒｅｅｎ  Ｋ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．）、「セル（Ｃｅｌｌ）」、２０００年、第１０３巻、ｐ．１００９−１０１７。
非特許文献７：リーら（Ｌｅｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．）、「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、１９９９年、第１９巻、ｐ．５３１６−５３２５。
発明の開示
本発明においては、ＪＮＫ３と相互作用する蛋白質を見出し、ＪＮＫ３と該蛋白質の相互作用により生じる該蛋白質の機能変化に起因する疾患を制御する手段を提供すべく種々の検討を重ねた。その結果、ＪＮＫ３がサーカディアンリズムに関与する転写因子の１つであるＢＭＡＬ１と相互作用することをインシリコで予測して実験的に証明した。さらに、該相互作用の結果、ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がリン酸化されてＢＭＡＬ１の機能が抑制されることを見出して、本発明を完成した。
すなわち本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善剤である。
また、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）の発現阻害剤および／または機能阻害剤を有効量含み、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善剤である。
さらに、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）の発現阻害および／または機能阻害により、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法である。
また、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤および／または治療剤である。
さらに、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１との相互作用を阻害する化合物の同定方法であって、化合物とＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１との相互作用を可能にする条件下で、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、次いで、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１との相互作用により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、化合物がＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害するかどうかを決定する同定方法である。
また、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、ＢＭＡＬ１のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、化合物がＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害するかどうかを決定する同定方法である。
さらに、本発明の一態様は、前記同定方法によって得られた化合物である。
さらにまた、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物である。
また、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物である。
さらに、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤である。
さらにまた、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤である。
また、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤である。
さらに、本発明の一態様は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３の発現を阻害することおよび／または機能を阻害することを特徴とする、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなる医薬組成物である：
１）  前記同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
また、本発明の一態様は、下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなるサーカディアンリズム障害の改善剤である：
１）  前記同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
さらに、本発明の一態様は、下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなるサーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤および／または治療剤である：
１）  前記同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
さらにまた、本発明の一態様は、サーカディアンリズム障害が、睡眠−覚醒リズム障害および／または周期性・反復性障害である前記防止剤および／または治療剤である。
また、本発明の一態様は、下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を使用することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法である：
１）  前記同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
さらに、本発明の一態様は、下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を使用することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法である：
１）  前記同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
さらにまた、本発明の一態様は、サーカディアンリズム障害が、睡眠−覚醒リズム障害および／または周期性・反復性障害である前記防止方法および／または治療方法である。
また、本発明の一態様は、前記同定方法に使用する試薬キットであって、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）および／若しくはＢＭＡＬ１、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドおよび／若しくはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチド、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／若しくはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キットである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００２−０２２８５７号からの優先権を請求するものである。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物などの資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
（ＢＭＡＬ１のＪＮＫ３との相互作用および活性化型ＪＮＫ３によるリン酸化）
本発明においては、ＪＮＫ３と相互作用する蛋白質を国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報記載の方法に従って予測し、その結果該蛋白質がＢＭＡＬ１であることを見出した。さらに、実験により、活性化型ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がリン酸化されること、およびＢＭＡＬ１のリン酸化によりＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとからなる複合体（以下、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体と表記することもある）の転写活性が抑制されることを見出した。
ＢＭＡＬ１はＭＡＰＫのひとつであるＭＡＰＫ１によりリン酸化されて機能抑制を受けることが報告されている〔サナダら（Ｓａｎａｄａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．２６７−２７１〕。しかし、ＪＮＫ３のＢＭＡＬ１リン酸化活性はＭＡＰＫ１より強く特異性が高いことが本発明において明らかになった。さらに、ＭＡＰＫ１およびＪＮＫ３双方の活性化に関わる因子であるＭＥＫＫ１の活性化によるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性抑制が、ＪＮＫ３活性にドミナントネガティブ作用を示すことが知られているペプチド（ＪＩＰ−１の部分ペプチドなど）によってほぼ完全に解除された。これらから、ＢＭＡＬ１のリン酸化による機能抑制作用はＭＡＰＫ１よりもＪＮＫ３の方がより特異的かつ強力であることが本発明において明らかになった。
（ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用阻害またはＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害による、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤・治療剤および防止方法・治療方法）
ＢＭＡＬ１はサーカディアンリズム調節に関わる転写因子である。ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性が低下するとサーカディアンリズム調節因子であるＰｅｒおよびＣｒｙの発現が低下すること〔ゲカキスら（Ｇｅｋａｋｉｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．）「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９８年、第２８０巻、ｐ．１５６４−１５６９〕、並びにＰｅｒおよびＣｒｙの発現が低下するとサーカディアンリズム障害が生じること（非特許文献６）が知られている。
一方で、ＭＡＰＫカスケードはサーカディアンリズムのリセットに関与していることが報告されている〔明石  真ら、「細胞工学」、２００１年、第２０巻、ｐ．８２２−８２７；岡野  俊行ら、「細胞工学」、２００１年、第２０巻、ｐ．８３７−８４２〕。ここで、「サーカディアンリズムのリセット」とは、生体の内因性リズム機構を光や温度といった外的環境因子により外的時間に同調させることをいう。具体的には、ヒトでは、内因性リズム機構は２５時間であり、実際の１日より長い周期を有するが、光を浴びることなどにより、２４時間の外的時間に同調されている。
これらの報告および本発明において明らかになった知見から、ＭＡＰＫによりサーカディアンリズムが調節されているところに、ストレスなどによってＪＮＫ３が活性化されると、ＭＡＰＫよりも特異的かつ強力なＢＭＡＬ１のリン酸化反応が起こり、その結果、サーカディアンリズム調節因子の極度転写抑制などに起因するサーカディアンリズム障害が起こると発明者らは考えている。
すなわち、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することにより、サーカディアンリズム障害を改善することが可能である。
従って本発明において、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法および該障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法、並びにサーカディアンリズム障害の改善剤および該障害に起因する当該疾患の防止剤および／または治療剤が提供可能である。
サーカディアンリズム障害に起因する疾患は、次に挙げる例に限定されるものではないが、例えば、睡眠−覚醒リズム障害や周期性・反復性障害などが挙げられる。睡眠−覚醒リズム障害としては、睡眠相後退症候群や非２４時間型睡眠などが挙げられる。周期性・反復性障害としては、内因性躁鬱病、季節性感情障害、周期性緊張症、周期性高血圧症、周期性潰瘍、不規則排卵周期、およびインスリン分泌の周期性異常に起因する糖尿病などが挙げられる。
また、脳血管型痴呆やアルツハイマー型痴呆における夜間徘徊などもサーカディアンリズム障害が関与すると考えられている。その他、ストレス、慢性疲労、感染症抵抗減弱および時差症候群などもサーカディアンリズム障害により起こり得る。さらに、投薬時の薬効や副作用の出方に関してもサーカディアンリズム障害が関与する場合があると発明者らは考えている。
（ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用またはＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法）
本発明においては、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用、例えばＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を提供する。該同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。化合物の同定に使用するＪＮＫ３およびＢＭＡＬ１は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製したものであってもよい。また、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用および両蛋白質の機能が阻害されなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やペプチド、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧなどの免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇまたはＦＬＡＧ−ｔａｇなどが、直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に付加されたものであってもよい。これら蛋白質やペプチドの付加は、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＪＮＫ３およびＢＭＡＬ１の立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物などが挙げられる。
例えば、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物との相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下でＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、次いで、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物を同定可能である。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的性質または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的性質または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）および放射性同位体など、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など、または検出用のタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇなど、公知のものが利用できる。これらのシグナルまたはマーカーの検出方法は、当業者には周知のものである。
具体的には、例えば、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、ＢＭＡＬ１のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物を同定できる。このとき、ＪＮＫ３は活性化型であることが好ましい。ＪＮＫ３が不活性型であるときは、ＪＮＫ３を活性化する酵素であってＢＭＡＬ１をリン酸化しない酵素をＪＮＫ３と共に使用することも可能である。ＢＭＡＬ１のリン酸化の検出は、自体公知の蛋白質のリン酸化試験およびリン酸化蛋白質の定量方法を利用して実施可能である。簡便には、例えば、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で反応させ、反応後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質の分離を行ない、ついで蛋白質のバンドを染色して検出し、リン酸化されたＢＭＡＬ１に相当するバンドの放射活性を測定することにより定量が可能である。上記反応を化合物の存在下または非存在下で行ない、得られた結果を比較することにより、当該化合物がＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害するか決定することができる。
あるいは、ＪＮＫ３およびＢＭＡＬ１を発現させた細胞を用い、該細胞と化合物とを接触させ、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物を同定できる。ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用は、例えばＢＭＡＬ１のリン酸化を測定することにより検出できる。または、該細胞にＣＬＯＣＫを共発現させ、さらにＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性を検出するためのレポーター遺伝子を導入して該レポーター活性を測定することにより検出可能である。本発明の実施例ではレポーター遺伝子としてＳＶ４０プロモーター上流にＥ−ｂｏｘを３個挿入したホタルルシフェラーゼレポータープラスミドを使用したが、これに限定されず、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性を検出できるものであれば適宜使用可能である。
細胞を使用したこのような同定方法は、上記のようなインビトロでの同定方法と組み合わせて使用できる。インビトロの同定方法により得られた、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物を、細胞を使用した同定方法で再度試験することにより、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化および該リン酸化によるＢＭＡＬ１の機能抑制を細胞内で阻害する化合物をさらに選択することができる。
（ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用阻害剤またはＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害剤および医薬組成物）
上記同定方法で得られた化合物は、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用阻害剤、例えばＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害剤として利用可能である。このような化合物としては、両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドまたはオリゴペプチドを例示することができる。このようなペプチドまたはオリゴペプチドは、ＪＮＫ３またはＢＭＡＬ１のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法によって合成し、上記同定方法においてＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害するか否かを試験することによって同定可能である。また、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１との相互作用を阻害する抗体も上記化合物の１つとして例示できる。該抗体は、例えば両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドまたはオリゴペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。
あるいは、ＪＮＫ３の発現および／または機能を阻害する化合物も、結果的にＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害し得るため、本発明の範囲に含まれる。ＪＮＫ３の発現を阻害する化合物の同定は、蛋白質の発現阻害剤を得るための自体公知のスクリーニング系を用いて実施可能である。ＪＮＫ３の発現を阻害する化合物は、ＪＮＫ３遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが例示できる。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ３遺伝子の発現系を用いて、ＪＮＫ３遺伝子の塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドから、ＪＮＫ３遺伝子の発現を特異的に阻害するものを選択することにより得られる。また、ＪＮＫ３の機能を阻害する化合物は、ＪＮＫ３を用いてその機能、例えばリン酸化酵素活性やＢＭＡＬ１との相互作用を阻害する物質を、上記同定方法などを用いて選択することにより得られる。かかる化合物の具体例は、ＪＩＰ１やＪＳＡＰ１などのＪＮＫ結合ドメイン（Ｊｕｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ；以下、ＪＢＤと略称する）部分ペプチドなどを挙げることができる。ＪＩＰ１やＪＳＡＰ１はＪＮＫカスケードのスキャッホールド蛋白質として知られており、そのＪＢＤ部分ペプチドが、ＪＮＫ３活性にドミナントネガティブ作用を示すことが知られている。ＪＢＤ部分ペプチドが、ＭＡＰＫ１およびＪＮＫ３双方の活性化に関わる因子であるＭＥＫＫ１活性化によるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性抑制をほぼ完全に解除することを本発明において明らかにした。上記の如きＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性抑制の解除剤も、本発明の範囲に含まれる。
かくして選別された化合物、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用阻害剤、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害剤、またはＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性抑制解除剤は、単独でまたは複数組み合わせて使用することにより、サーカディアンリズム障害の改善剤および改善方法に使用できる。また、これら化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤は試薬として使用できる。該試薬は、例えばサーカディアンリズムおよびその障害の研究に有用である。
上記選別された化合物、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用阻害剤、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害剤、またはＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性抑制解除剤は、さらに生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、医薬組成物として調製可能である。これらの化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤は、それぞれ単独で使用することもできるし、複数を組み合わせて使用することも可能である。
ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１とが相互作用し、ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がリン酸化されるとサーカディアンリズム障害が起きると考えられるため、上記医薬組成物は、サーカディアンリズム障害の改善に有用である。さらに、本発明に係る医薬組成物は、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止および／または治療に使用することができる。サーカディアンリズム障害に起因する疾患は、次に挙げる例に限定されるものではないが、例えば、睡眠−覚醒リズム障害や周期性・反復性障害などが挙げられる。睡眠−覚醒リズム障害としては、睡眠相後退症候群や非２４時間型睡眠などが挙げられる。周期性・反復性障害としては、内因性躁鬱病、季節性感情障害、周期性緊張症、周期性高血圧症、周期性潰瘍、不規則排卵周期、およびインスリン分泌の周期性異常に起因する糖尿病などが挙げられる。また、脳血管型痴呆やアルツハイマー型痴呆における夜間徘徊などもサーカディアンリズム障害が関与すると考えられる。その他、ストレス、慢性疲労、感染症抵抗減弱および時差症候群などもサーカディアンリズム障害により起こり得る。従って、これらの疾患に対しても本医薬組成物を使用可能である。さらに、投薬時の薬効や副作用の出方に関してもサーカディアンリズム障害が関与することがあるので、本医薬組成物を別の医薬と共にあるいは別途使用して、該別の医薬の薬効を高めることおよび／または副作用を減弱させることも可能である。
本発明に係るＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用阻害剤、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害剤、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性抑制解除剤、サーカディアンリズムの改善剤、および医薬組成物の処方は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量の上記化合物、阻害剤、転写活性抑制解除剤、改善剤、および／または医薬組成物、さらに医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、次に挙げる例に限らないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの混合物が挙げられる。処方は投与経路に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られている。これら阻害剤、転写活性抑制解除剤、改善剤、および／または医薬組成物は、単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と一緒に使用してもよい。
本発明に係るＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用阻害剤、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化阻害剤、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性抑制解除剤、サーカディアンリズムの改善剤、および医薬組成物の投与形態は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様は、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜投与若しくは経皮投与を用いることもできる。局所的な投与においては、膏薬、パスタ、ゲルなどの形態での投与であってもよい。
必要な用量範囲は、上記阻害剤、転写活性抑制解除剤、改善剤、および医薬組成物の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断による。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。
製剤化にあたっては、例えばペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、または化合物など各対象の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、またはシクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法が利用できる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロースおよびマンニトールなどの賦形剤、澱粉およびアルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレートおよびタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトールおよびフラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油およびオリーブ油などの植物油並びにＭＣＴなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトールおよび果糖など）が例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
（試薬キット）
本発明は、ＪＮＫ３およびＢＭＡＬ１、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドおよびＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチド、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよびＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キットを提供する。当該試薬キットは、上記同定方法に使用できる。ＪＮＫ３およびＢＭＡＬ１は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または当該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製したものであってもよい。また、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用および両蛋白質の機能が阻害されなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やペプチド、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧなどの免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇまたはＦＬＡＧ−ｔａｇなどが、直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に付加されたものであってもよい。ＪＮＫ３またはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。ＪＮＫ３またはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターＤＮＡ、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。当該試薬キットはさらに、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１との相互作用、例えばＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化、あるいはＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１の機能抑制を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーやバッファーなど、上記同定方法に必要な物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
実施例
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ＪＮＫ３と相互作用する蛋白質のインシリコでの探索）
ＪＮＫ３と相互作用する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の予測方法に従って予測した。まず、ＪＮＫ３のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索した。ついで、得られた蛋白質とＪＮＫ３との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＪＮＫ３と相互作用すると予測した。ローカルアライメントのスコアの判定基準は、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の方法と同様に２５．０以上とした。また、ＪＮＫ３は脳神経系に特異的に発現する蛋白質であり、低酸素状態などのショック的状況で発現して脳機能に障害を与えることが分かっているので、ＪＮＫ３と相互作用する蛋白質の候補は、脳で発現し重要な機能を持っている既知の蛋白質に絞った。
この結果、ＪＮＫ３由来の６アミノ酸残基からなるオリゴペプチドＫＶＩＥＱＬ（配列番号２）と相同性あるペプチドＫＶＫＥＱＬ（配列番号３）が、サーカディアンリズムに関連する蛋白質ＢＭＡＬ１のアミノ酸配列中に存在することが分かった。また、ＢＭＡＬ１と相同な蛋白質ＢＭＡＬ２のアミノ酸配列中にもオリゴペプチドＫＶＫＥＱＬ（配列番号３）が存在することが分かった。第１図および第２図に、それぞれＪＮＫ３とＢＭＡＬ１およびＪＮＫ３とＢＭＡＬ２とのローカルアライメントの結果を示した。ローカルアライメントにおいて２５．０以上のスコアを示すフラグメントは、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１との間で７個、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２との間で４個見出された。この結果から、ＪＮＫ３はＢＭＡＬ２よりもＢＭＡＬ１に強く相互作用する蛋白質であると予測した。
（ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用およびＢＭＡＬ１リン酸化の解析）
ＢＭＡＬ１がＪＮＫ３の基質となるかどうかについて実験的に確認するために、活性化型ＪＮＫ３を用いてインビトロでリン酸化試験を実施した。
＜材料＞
活性化型ヒトＪＮＫ３は、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）付加蛋白質（Ｈｉｓ−ＪＮＫ３）としてＳｆ９細胞にて発現後、プロボンドレジン（Ｐｒｏｂｏｎｄ  Ｒｅｓｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で精製して使用した。すなわち、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により得たヒトＪＮＫ３（ＪＮＫ３α１）ｃＤＮＡを、ｐＦＡＳＴＢＡＣ  ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入後、添付の説明書に従い、Ｈｉｓ−ＪＮＫ３発現用組換えバキュロウイルスを作成した。次に、作成した組換えウイルスをＳｆ９細胞に感染させた後、感染細胞を溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）〔２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１％  ＮＰ−４０／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／２．５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム（Ｎａ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／１ｍＭ  β−グリセロリン酸（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／１ｍＭ  ベンズアミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ）／１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）／プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）〕で可溶化し、遠心処理により上清を回収した。上清をＰｒｏｂｏｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）カラムに添加し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１ｍＭ  ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ／１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）で洗浄した後、０−０．２Ｍイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含むバッファーＡの直線勾配（ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶出により目的蛋白質を得た。Ｈｉｓ−ＪＮＫ３を含むフラクションは、使用時まで−８０℃で保存した。
ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）（ｃ−ＪｕｎのＮ末端７９アミノ酸領域であり、ＪＮＫによるリン酸化部位を含む）は、Ｎ末端ＧＳＴ融合蛋白質〔以下、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）〕として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にて発現後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、ＪＮＫ３のリン酸化酵素活性を測定するための陽性コントロールとして使用した。
ヒトＢＭＡＬ１は、Ｎ末端ＧＳＴ融合蛋白質（以下、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１）として大腸菌にて発現後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製して使用した。すなわち、まず、Ｃ末端Ｖ５／Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ヒトＢＭＡＬ１発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１−ＢＭＡＬ１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からＰＣＲにより増幅したＢＭＡＬ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域をｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）に挿入し、大腸菌用ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１発現ベクターであるｐＧＥＸ−ＢＭＡＬ１を構築した。次に、ｐＧＥＸ−ＢＭＡＬ１を保持する大腸菌ＢＬ２１株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む４００ｍｌのプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．３ｍＭとなるように添加し、さらに２５℃にて６時間培養後、菌体を回収した。この菌体を４０ｍｌの１％  サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）／１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む４０ｍｌのＴＧＥＤＳバッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０％  グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）〕に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。次に、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を終濃度１．０％となるように加え、氷上１５分間静置した後、２０，０００ｇで３０分間の遠心処理を行ない、上清を回収した。上清にあらかじめＴＧＥＤＳバッファーで平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを２ｍｌ加え、４℃にて１．５時間転倒混和することにより目的蛋白質をレジンに吸着させた。レジンを１０倍量のＴＧＥＤＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３回洗浄した後、カラムに詰め、１０ｍＭ  グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を含むＴＧＥＤＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で目的蛋白質を溶出させた。なお、溶出液は０．５ｍｌずつ分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより目的蛋白質を含むフラクションを確認後、そのフラクションを回収した。回収した溶出液はＴＧＥＤＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１晩透析後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。その後、使用時まで−８０℃で保存した。
＜方法＞
インビトロ  リン酸化実験（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）は、１μｇの上記各ＧＳＴ融合蛋白質〔ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）またはＧＳＴ〕と活性化型ＪＮＫ３（７０ｎｇ）を、５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ社）を含む２０μｌのカイネーションバッファー（ｋｉｎａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／５ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／２ｍＭ  ＤＴＴ／０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１０μＭ  ＡＴＰ）中にて、３０℃で３０分間インキュベーションすることにより行った。反応後、２０μｌの２×ＳＤＳ  サンプルバッファー〔４％  ＳＤＳ／１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８／２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．０１％  ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）／１０％  β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）〕を加え、１００℃で５分間処理した後、５％−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した。次いで、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社）を用いたオートラジオグラフィーによりリン酸化蛋白質を検出した。また、用いた各ＧＳＴ融合蛋白質（１μｇ）を５％−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行うことにより、目的蛋白質の移動度を確認した。なお、ＢＭＡＬ１のリン酸化反応におけるＪＮＫ３用量依存性を検討するため、反応系に加える活性化型ＪＮＫ３を０ｎｇ、１４ｎｇ、２８ｎｇおよび７０ｎｇとし、同様の方法でリン酸化蛋白質を検出した。また、ＢＭＡＬ１のリン酸化反応におけるＪＮＫ３特異性を検討するために、ＪＮＫ３の代わりに、ヒトＪＮＫ１（１４３μＵ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ヒトＪＮＫ２（１６７μＵ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）またはマウスＥＲＫ２（２．７ｍＵ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を反応系に加え、同様の方法でリン酸化蛋白質を検出した。なお、ＥＲＫ２の活性を確認するための基質としては、１μｇのミエリン塩基性蛋白質（Ｍｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＭＢＰと略称する）（Ｓｉｇｍａ社）を使用した。
＜結果＞
ＪＮＫ３は陽性コントロールとして用いたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）をリン酸化したが、ＧＳＴはリン酸化しなかった（第３図Ｂ）。このことから、本実施例で用いた実験系がＪＮＫ３の活性を測定する上で妥当であることが確認できた。この実験系において、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１のリン酸化が認められた（第３図Ｂ）。ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１は、第４図に示したように、ＪＮＫ３の用量依存的にリン酸化された。このことから、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１のリン酸化は自己リン酸化ではなくＪＮＫ３によるものであることが明らかになった。また、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１は、ＪＮＫ３によってリン酸化されたが、ＪＮＫファミリーの１員であるＪＮＫ１およびＪＮＫ２並びにＭＡＰＫファミリーの１つであるＥＲＫ２のいずれによってもほとんどリン酸化されなかった（第５図）。このことから、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１はＪＮＫ３特異的にリン酸化されることが明らかになった。
実験例１
（ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ依存的転写の抑制）
ＢＭＡＬ１は、ＣＬＯＣＫとヘテロダイマーを形成し、体内時計関連遺伝子であるＰｅｒ遺伝子の５´上流域に存在するＥ−ｂｏｘ（５´−ＣＡＣＧＴＧ−３´）に結合することによりＰｅｒ遺伝子発現を調節する転写因子であることが知られている〔ゲカキスら（Ｇｅｋａｋｉｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．）「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９８年、第２８０巻、ｐ．１５６４−１５６９〕。そこで、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１との細胞内での相互作用を解析するために、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーの転写活性化能がＪＮＫ３の活性化により変化するかどうかについてレポーターアッセイを用いて検討した。このとき、ＪＮＫ３は、ＭＥＫＫ１によりリン酸化されて活性化されたＭＫＫ４／ＭＫＫ７によってリン酸化されるというカスケードで活性化することが知られているので、活性化型ＭＥＫＫ１または活性化型ＭＫＫ７の共発現によるＪＮＫ３の活性化によって、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の活性（転写活性化能）が変動するかどうかを解析した。
＜材料＞
動物細胞用ヒトＣＬＯＣＫ発現プラスミド（ｐＣＩ−ＣＬＯＣＫ）は、ヒトＣＬＯＣＫのＯＲＦ領域を含むｃＤＮＡクローンであるＨＧ０１０１５（ＫＩＡＡ０３３４、かずさＤＮＡ研究所より分与）を鋳型としてＰＣＲにより増幅したヒトＣＬＯＣＫのＯＲＦ領域を、動物細胞用発現ベクターであるｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へ挿入することにより構築した。なお、ＯＲＦ領域にＰＣＲによるエラーが無いことは、ビッグダイ  ターミネーター  サイクル  シーケンシング  キット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）およびＡＢＩ  ３１００  ジェネティック  アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（共にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により確認した。
ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性検出用レポータープラスミド（ｐＧＬ３Ｐ−Ｍ３４×３）の構築は、ホゲネシュ（Ｈｏｇｅｎｅｓｃｈ）らの報告〔「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＡＣＡＤＥＭＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ  ＯＦ  ＡＭＥＲＩＣＡ）」、１９９８年、第９５巻、ｐ．５４７４；「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ）」、２０００年、第２０巻：ＲＣ８３、ｐ．１〕を参考にして行った。すなわち、Ｅ−ｂｏｘを３個含むＭ３４×３配列（５´−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＡＣＣ−３´；下線はＥ−ｂｏｘを示す）（配列番号４）を、ＳＶ４０プロモーターおよびその下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＧＬ３Ｐのプロモーター上流部に挿入することにより構築した。まず、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ認識配列が３箇所含まれるＭ３４×３ＤＮＡ断片は、合成オリゴＤＮＡ  Ｍ３４×３−Ｓ（５´−ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＡＣＡ  ＣＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＣＧＴ  ＧＡＣ  Ｃ−３´）（配列番号５）とＭ３４×３−Ａ（５´−ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＣＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＧＴＣＣ−３´）（配列番号６）をＳＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中にて１００℃で２分、次いで７０℃で１時間加温後、徐々に室温に戻すことによりアニールさせて作成した（ｄｓＭ３４×３）。作成したｄｓＭ３４×３の５´末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）によりリン酸化した後、ルシフェラーゼレポータープラスミドであるｐＧＬ３−プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＧＬ３Ｐ−Ｍ３４×３を構築した。なお、Ｍ３４×３配列が正方向に挿入されていることはシーケンシングにより確認した。
ＢＭＡＬ１発現プラスミドおよびＣＬＯＣＫ発現プラスミドは、それぞれｐｃＤＮＡ３．１−ＢＭＡＬ１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｃ末Ｖ５／Ｈｉｓ−ｔａｇ付加、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびｐＣＩ−ＣＬＯＣＫ〔ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）型、上記参照〕を使用した。ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の活性検出用のレポータープラスミドは、ＳＶ４０プロモーターの上流にＥ−ｂｏｘを３個挿入したホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼレポータープラスミドであるｐＧＬ３Ｐ−Ｍ３４×３（上記参照）を使用した。
活性化型ＭＥＫＫ１発現プラスミドはｐＦＣ−ＭＥＫＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した。
活性化型ＭＫＫ７発現プラスミドであるＳＲα−ＭＫＫ７−ＤＥＤは、ＭＫＫ７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ；アクセッション番号ＡＢ００５６５４）の変異体（配列番号１：ＭＫＫ７遺伝子コード領域の第８５９−８６０番目の塩基ＴＣがＧＡに、第８７１−８７３番目の塩基ＡＣＡがＧＡＧに、第８７７−８７９番目の塩基ＡＧＴがＧＡＣに変異したもの）を通常の哺乳類用発現ベクターに挿入して作成した。
ＪＩＰ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＮＫ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）の哺乳動物細胞発現プラスミドであるＪＢＤ−ＪＩＰ１は、文献〔ディッケンスら（Ｄｉｃｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９７年、第２７７巻、ｐ．６９３−６９６〕に記載の方法に従って作成した。
ＪＳＡＰ１のＪＮＫ結合ドメインの哺乳動物細胞発現プラスミドであるＪＢＤ−ＪＳＡＰ１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＥｃｈｏクローニングシステムを利用して作成した。まず、目的の遺伝子であるＪＳＡＰ−１ｂのＪＢＤを、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯに挿入し、次いでａｄａｐｔｅｄ  ｖｅｃｔｏｒとしてｐｃＤＮＡ３．１−Ｅを使用して組換えにより哺乳動物細胞発現ベクターを構築した。
上記プラスミドをトランスフェクションするために、ＪＮＫ３／２９３細胞を使用した。該細胞は、２９３ＥｃＲ細胞（エクジソンレセプター発現２９３細胞）にＦｌａｇ−ＪＮＫ３／ｐｃＤＮＡ３．１を導入した安定発現細胞である。ただし、発現されたＪＮＫ３は活性化されておらず、不活性型である。
＜方法＞
トランスフェクションおよびレポーターアッセイは、次のように行った。細胞数３×１０５のＪＮＫ３／２９３ＥｃＲ細胞を６ウエルプレートに播種し、１晩培養後、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてトランスフェクションを行った。プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１−ＢＭＡＬ１／Ｖ５−Ｈｉｓ（３００ｎｇ）、ｐＣＩ−ＣＬＯＣＫ（４００ｎｇ）、ｐＧＬ３Ｐ−Ｍ３４×３（１０ｎｇ）、ｐＦＣ−ＭＥＫＫ（０．１−２．０ｎｇ）またはＳＲα−ＭＫＫ７−ＤＥＤ（２０−３００ｎｇ）および内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としてレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発現プラスミドであるｐｈＲＬ−ＣＭＶ（０．１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。また、ＤＮＡの総量は１．０μｇとなるようにｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調整した。ＪＮＫに対するドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）効果について検討するためには、ｐＦＣ−ＭＥＫＫ（０．５ｎｇ）とＪＢＤ−ＪＩＰ１またはＪＢＤ−ＪＳＡＰ１（共に５０−３００ｎｇ）を用いた。４８時間培養後、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。なお、測定値は、レニラルシフェラーゼ活性により補正した。各実験は、独立してデュプリケート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）にて３回実施し、結果は標準誤差をつけて示した。
＜結果＞
ＪＮＫ３／２９３ＥｃＲ細胞において、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫの両蛋白質存在下でのみ転写活性の増加が認められたことから、本実験例で用いたアッセイ系の妥当性が確認できた（第６図）。また、この転写活性の増加は、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ認識配列を含まないレポータープラスミド（ｐＧＬ３Ｐ）を用いた場合は認められなかった（第６図）。図中、ルシフェラーゼ活性は、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫ非存在下でのｐＧＬ３Ｐ−Ｍ３４×３由来のルシフェラーゼ活性を１とした場合の相対値で示した。
この実験系において、活性化型ＭＥＫＫ１または活性化型ＭＫＫ７発現プラスミドを共発現させてＪＮＫ３を活性化すると、当該発現プラスミドの用量依存的にＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の活性の抑制が認められた（第７図および第８図）。図中、ルシフェラーゼ活性は、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫ存在、活性化型ＭＥＫＫ１非存在下でのルシフェラーゼ活性を１００とした場合の相対値で示した。
ＭＥＫＫ１はＥＲＫおよびｐ３８のカスケードにも関与することが報告されているので、上記活性化型ＭＥＫＫ１共発現によるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の活性の抑制がＪＮＫ３を介しているものなのかどうかについて、ＪＮＫカスケードのスキャッホールド蛋白質として知られているＪＩＰ１およびＪＳＡＰ１を用いて更に検討した。これらの蛋白質のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）部分のみをＪＮＫと共発現させると、ＪＮＫの機能にドミナントネガティブに作用することが報告されている〔ディッケンスら（Ｄｉｃｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９７年、第２７７巻、ｐ．６９３−６９６；イトウら（Ｉｔｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、１９９９年、第１９巻、ｐ．７５３９〕。そこで、ＪＩＰ１またはＪＳＡＰ１のＪＢＤの共発現による影響を検討した結果、活性化型ＭＥＫＫ１共発現によるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の活性の抑制が、ＪＩＰ１またはＪＳＡＰ１のＪＢＤの発現により阻害されることが明らかになった（第９図Ａおよび第９図Ｂ）。すなわち、活性化型ＭＥＫＫ１共発現によるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の活性の抑制は、ＭＥＫＫ１によって活性化されたＪＮＫ３が介するものであることが判明した。
以上の結果から、活性化型ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がリン酸化されること、さらにその結果ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体の転写活性化能が抑制されることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明においては、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１とが相互作用すること、さらに活性化型ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がリン酸化されてその機能が抑制されることを初めて見出した。ＢＭＡＬ１は、ＣＬＯＣＫ蛋白質とヘテロダイマーを形成し、体内時計関連遺伝子であるＰｅｒ遺伝子の５´上流域に存在するＥ−ｂｏｘ（５´−ＣＡＣＧＴＧ−３´）に結合することによりＰｅｒ遺伝子発現を調節する転写因子であって、サーカディアンリズムに関与する。従って、ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がリン酸化されてその機能が抑制されると、サーカディアンリズム障害が生じる。すなわち、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害すれば、サーカディアンリズム障害を改善することができる。
これらのことから本発明は、サーカディアンリズム障害の改善方法および該障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法、並びにサーカディアンリズム障害の改善剤および該障害に起因する当該疾患の防止剤および／または治療剤を提供可能である。
サーカディアンリズム障害に起因する疾患は、次に挙げる例に限定されるものではないが、例えば、睡眠−覚醒リズム障害や周期性・反復性障害などが挙げられる。唾眠−覚醒リズム障害としては、睡眠相後退症候群や非２４時間型睡眠などが挙げられる。周期性・反復性障害としては、内因性躁鬱病、季節性感情障害、周期性緊張症、周期性高血圧症、周期性潰瘍、不規則排卵周期、およびインスリン分泌の周期性異常に起因する糖尿病などが挙げられる。
また、脳血管型痴呆やアルツハイマー型痴呆における夜間徘徊などもサーカディアンリズム障害が関与すると考えられている。その他、ストレス、慢性疲労、感染症抵抗減弱および時差症候群などもサーカディアンリズム障害により起こり得る。さらに、投薬時の薬効や副作用の出方に関してもサーカディアンリズム障害が関与する場合があると考えられる。
このように本発明は、サーカディアンリズム障害の改善、該障害に起因する疾患の防止および／または治療、およびサーカディアンリズム障害の研究のために非常に有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号２：ＢＭＡＬ１の部分ペプチド（配列番号３）と相同性の高いＪＮＫ３の部分ペプチド。
配列番号３：ＪＮＫ３の部分ペプチド（配列番号２）と相同性の高いＢＭＡＬ１の部分ペプチド。
配列番号４：３つのＥ−ｂｏｘを有する設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：３つのＥ−ｂｏｘを有する二重鎖ＤＮＡを構築するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：３つのＥ−ｂｏｘを有する二重鎖ＤＮＡを構築するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号８：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ１の部分オリゴペプチド。
配列番号９：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号１０：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１１：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号１２：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１３：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号１４：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１５：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号１６：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１７：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号１８：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１９：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号２０：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２１：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号２２：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ２の部分オリゴペプチド。
配列番号２３：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号２４：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ２の部分オリゴペプチド。
配列番号２５：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号２６：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ２の部分オリゴペプチド。
配列番号２７：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＪＮＫ３の部分オリゴペプチド。
配列番号２８：ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＢＭＡＬ２の部分オリゴペプチド。
【配列表】
2003063907.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用をインシリコで予測した結果を示す。ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１のローカルアライメントを行ない、高いスコアを示した領域を表示した。上列および下列は、それぞれＪＮＫ３に存在する配列およびＢＭＡＬ１に存在する配列である。
第２図は、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２の相互作用をインシリコで予測した結果を示す。ＪＮＫ３とＢＭＡＬ２のローカルアライメントを行ない、高いスコアを示した領域を表示した。上列および下列は、それぞれＪＮＫ３に存在する配列およびＢＭＡＬ２に存在する配列である。
第３図Ａは、精製した各グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質〔レーン１：ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１、レーン２：ＧＳＴ、レーン３：ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）〕を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後にクマシーブリリアントブルー染色により検出した結果を示す（矢頭）。レーンＭは分子量マーカーである。
第３図Ｂは、ＪＮＫ３によりＢＭＡＬ１がインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でリン酸化されたことを示す。ＪＮＫ３により、ＧＳＴ−ＢＭＡＬ１（レーン２）またはＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）（レーン３）がリン酸されたが、ＧＳＴ（レーン１）はリン酸化されなかった。矢頭はリン酸化されたＧＳＴ−ＢＭＡＬ１またはリン酸化されたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を示す。図の左側に示した数値は分子量マーカーの分子量である。
第４図は、ＢＭＡＬ１がＪＮＫ３により、ＪＮＫ３の用量依存的にリン酸化されたことを示す。レーン１、レーン２、レーン３およびレーン４はそれぞれ、ＪＮＫ３を無添加、１４ｎｇ添加、２８ｎｇ添加および７０ｎｇ添加したときのＢＭＡＬ１のリン酸化を示す。矢頭はリン酸化されたＧＳＴ−ＢＭＡＬ１を示す。図の左側に示した数値は分子量マーカーの分子量である。
第５図は、ＢＭＡＬ１がＪＮＫ３によりリン酸化されたが、ＥＲＫ２、ＪＮＫ１またはＪＮＫ２によってはリン酸化されなかったことを示す。リン酸化反応は、基質としてＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）（レーン１−４）、ＧＳＴ（レーン５−８）、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）（レーン９−１２）およびＧＳＴ−ＢＭＡＬ１（レーン１３−１６）を用い、キナーゼとしてＪＮＫ３（レーン１、５、９、１３）、ＥＲＫ２（レーン２、６、１０、１４）、ＪＮＫ２（レーン３、７、１１、１５）またはＪＮＫ１（レーン４、８、１２、１６）を用いて行った。矢頭はリン酸化された各蛋白質を示す。図の左側に示した数値は分子量マーカーの分子量である。
第６図は、レポーターアッセイにおいて、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫの両蛋白質を発現させたときに転写活性が認められたことを示す。転写活性は、ルシフェラーゼ活性を検出することにより測定した。
第７図は、活性化型ＭＥＫＫ１を発現させてＪＮＫ３を活性化したとき、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫの共発現により生じた転写活性が抑制されたことを示す。転写活性は、レポーターアッセイにおいて、ルシフェラーゼ活性を検出することにより測定した。
第８図は、活性化型ＭＫＫ７を発現させてＪＮＫ３を活性化したとき、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫの共発現により生じた転写活性が抑制されたことを示す。転写活性は、レポーターアッセイにおいて、ルシフェラーゼ活性を検出することにより測定した。
第９図Ａは、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫの共発現により生じた転写活性の、活性化型ＭＥＫＫ１によるＪＮＫ３活性化による抑制が、ＪＮＫ３の作用をＪＩＰ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）の共発現により抑制すると、観察されなくなったことを示す。
第９図Ｂは、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫの共発現により生じた転写活性の、活性化型ＭＥＫＫ１によるＪＮＫ３活性化による抑制が、ＪＮＫ３の作用をＪＳＡＰ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）の共発現により抑制すると、観察されなくなったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月30日(2004.1.30)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善剤。
【請求項２】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）の発現阻害剤および／または機能阻害剤を有効量含み、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善剤。
【請求項３】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法。
【請求項４】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）の発現阻害および／または機能阻害により、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法。
【請求項５】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項６】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項７】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１との相互作用を阻害する化合物の同定方法であって、化合物とＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１との相互作用を可能にする条件下で、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、次いで、ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１との相互作用により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、化合物がＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害するかどうかを決定する同定方法。
【請求項８】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＪＮＫ３および／またはＢＭＡＬ１と化合物とを接触させ、ＢＭＡＬ１のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、化合物がＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害するかどうかを決定する同定方法。
【請求項９】請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物。
【請求項１０】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物。
【請求項１１】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物。
【請求項１２】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤。
【請求項１３】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤。
【請求項１４】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１５】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３の発現を阻害することおよび／または機能を阻害することを特徴とする、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除方法。
【請求項１６】下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなる医薬組成物：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１７】下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなるサーカディアンリズム障害の改善剤：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１８】下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含有してなるサーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止剤および／または治療剤：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項１９】サーカディアンリズム障害が、睡眠−覚醒リズム障害および／または周期性・反復性障害である請求の範囲第５項若しくは第１８項に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項２０】下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を使用することを特徴とする、サーカディアンリズム障害の改善方法：
１）  請求の範囲７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項２１】下記の化合物、阻害剤および転写活性抑制解除剤からなる群から選択される少なくとも１つ以上を使用することを特徴とする、サーカディアンリズム障害に起因する疾患の防止方法および／または治療方法：
１）  請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法によって得られた化合物、
２）  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）とＢＭＡＬ１の相互作用を阻害する化合物、
３）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害する化合物、
４）  ＪＮＫ３とＢＭＡＬ１の相互作用の阻害剤、
５）  ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化の阻害剤、
および
６）  ＪＮＫ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤からなる、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。
【請求項２２】サーカディアンリズム障害が、睡眠−覚醒リズム障害および／または周期性・反復性障害である請求の範囲第６項若しくは第２１項に記載の防止方法および／または治療方法。
【請求項２３】請求の範囲第７項または第８項に記載の同定方法に使用する試薬キットであって、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３（ＪＮＫ３）および／若しくはＢＭＡＬ１、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドおよび／若しくはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチド、またはＪＮＫ３をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／若しくはＢＭＡＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キット。
【請求項２４】ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ３の発現阻害剤および／または機能阻害剤を有効量含み、ＪＮＫ３によるＢＭＡＬ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、ＢＭＡＬ１およびＣＬＯＣＫからなる複合体の転写活性抑制解除剤。




【国際調査報告】
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