(57)【要約】本発明は、骨格筋の間質に由来する多分化能幹細胞に関する。本発明の多分化能幹細胞は、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞への分化する能力を有し、組織や細胞の再生、心不全、肝不全、腎不全、白血病、神経変性疾患、関節炎、糖尿病、動脈硬化などの治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋の間質に由来する多分化能幹細胞。
【請求項２】
ｃ−ｍｅｔ陽性を示す請求項１記載の多分化能幹細胞。
【請求項３】
ＣＤ３４陽性を示す請求項１または２記載の多分化能幹細胞。
【請求項４】
Ｓｃａ１陽性を示す請求項１〜３のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
【請求項５】
ｍ−カドヘリン陰性を示す請求項１〜４のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
【請求項６】
ＣＤ４５陰性を示す請求項１〜５のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
【請求項７】
ＣＤ１４陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４９ｄ陰性、ＣＤ１１７陰性、ＦＬＫ−１陰性およびＣＤ１４４陰性を示す請求項１〜６のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
【請求項８】
ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性、ｍ−カドヘリン陰性およびＭｙｏＤ陰性を示す請求項１記載の多分化能幹細胞。
【請求項９】
少なくとも骨格筋細胞に分化する能力を有する多分化能幹細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
少なくとも骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞および脂肪細胞に分化する能力を有する多分化能幹細胞である請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
少なくとも骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、小腸上皮細胞、角膜細胞に分化する能力を有する多分化能幹細胞である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
骨格筋が哺乳動物由来のものである請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
哺乳動物がヒトおよびラットから選ばれるものである請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を含有することを特徴とする医薬。
【請求項１５】
医薬が、組織または細胞の再生薬である請求項１４記載の医薬。
【請求項１６】
医薬が、臓器不全の治療薬である請求項１４記載の医薬。
【請求項１７】
組織または細胞が、筋肉、心臓、血液、血管、骨、関節、膵臓、肝臓、神経系の組織または細胞である、請求項１５記載の医薬。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を特異的に認識する抗体。
【請求項１９】
請求項１８記載の抗体を用いることを特徴とする、ヒト骨格筋から請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を精製する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、該細胞を増殖させる物質をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、該細胞から、各種細胞への分化を誘導する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２２】
各種細胞が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、小腸上皮細胞、皮膚細胞および角膜細胞から選ばれる、請求項２１記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を不死化させる方法。
【請求項２４】
スフェアーを形成させることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞等への分化能を有する骨格筋間質に由来する幹細胞に関する。本発明はまた、該幹細胞を含有する組織または細胞の再生薬等の医薬および該細胞の利用方法に関する。
背景技術
筋肉中のサテライト細胞は、生誕後の筋肉の増殖、修復および維持に働く筋肉分化誘導能を有する特殊な細胞として知られている（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２１８；１１５−１２４，２０００）。マウスのサテライト細胞は、生誕時には筋肉繊維内のラミナ膜の内側に存在する核の約３０％を占めるが、２ヶ月後には約５％まで減少する（Ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［ＡＧ  Ｅｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆｒａｎｓｚｉｎｉ−Ａｍｓｔｒｏｎｇ，ｅｄｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ］ｐｐ９７−１１８，１９９４）。このようなサテライト細胞の減少は、生誕後の筋肉の成長を反映している（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，６，５７４−５８０，１９８３）。またサテライト細胞は成熟した大人の筋肉に存在し、ラミナ膜の内側に近接した位置で筋肉繊維と接触しているという特徴を有している（Ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［ＡＧ  Ｅｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆｒａｎｓｚｉｎｉ−Ａｍｓｔｒｏｎｇ，ｅｄｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ］ｐｐ９７−１１８，１９９４）。
マウスでは、２ヶ月をすぎるとサテライト細胞は細胞分裂を停止して休止期に入る。しかし、サテライト細胞は、伸び、運動、怪我、電気刺激などの様々な刺激を受けて活性化することが知られている（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，８，２１７−２２２，１９８５；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．，９，２９７−２９９，１９８８；Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，１７，６０８−６１３，１９９４；Ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［ＡＧ  Ｅｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆｒａｎｓｚｉｎｉ−Ａｍｓｔｒｏｎｇ，ｅｄｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ］ｐｐ９７−１１８，１９９４）。サテライト細胞の子孫である筋肉前駆細胞は複数回の細胞分裂を起した後に筋肉細胞に分化して隣接する筋肉繊維と融合する。一方、休止期のサテライト細胞そのものの数は変性と再生を繰り返しても変化しないことから、サテライト細胞は自己複製により一定の数に維持されている（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，６，５７４−５８０，１９８３；Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．３０，６３−７２，１９８５；Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．，１８０，４７１−４７８，１９８９）。従って、サテライト細胞は単分化能を有する幹細胞であり、その子孫である筋肉前駆細胞とは生物学的にも生化学的にも異なる性質を有している（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｈｕｍ．Ｄｉｓ．，３，２１０−２５６，１９９３；Ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［ＡＧ  Ｅｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆｒａｎｓｚｉｎｉ−Ａｍｓｔｒｏｎｇ，ｅｄｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ］ｐｐ９７−１１８，１９９４）。
以上のことからサテライト細胞は成体の筋肉中に存在し、将来筋肉となる筋肉前駆細胞を誘導する生理機能を有すると考えられる。
サテライト細胞に加えて最近、骨格筋内に多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有するｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ（ＳＰ細胞）という幹細胞が存在することが示された。ＳＰ細胞はヘキスト・ダイ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を排出するという性質を利用してＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）により分離できる（Ｎａｔｕｒｅ，４０１，３９０−３９４，１９９９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４４８２−１４４８６，１９９９）。組織から分離したＳＰ細胞を、放射線により骨髄を破壊したマウスに移植するとすべての主要な血液細胞へと分化することが示されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４４８２−１４４８６，１９９９）。さらに、骨髄ならびに筋肉より分離されたＳＰ細胞は、筋肉を再生する能力も有するという特徴を持つ。しかし、サテライト細胞になることができるのは筋肉由来のＳＰ細胞だけであった（Ｎａｔｕｒｅ，４０１，３９０−３９４，１９９９）。さらにＳＰ細胞は適当な培養条件におくことでデスミン陽性の筋肉に分化することも示された（Ｎａｔｕｒｅ，４０１，３９０−３９４，１９９９）。一方Ｐａｘ７遺伝子をノックアウトしたマウスでは、筋肉のサテライト細胞が完全に消失し、ＳＰ細胞が増加していることが見出された（Ｃｅｌｌ，１０２，７７７−７８６，２０００）。
この結果は、サテライト細胞とは異なる多能性幹細胞が骨格筋に存在することを示唆している。しかし、サテライト細胞とは異なる幹細胞が骨格筋のどこに存在し、どのような生理機能や分化能を有しているのかは明らかにされていない。
なお、サテライト細胞は、ｍ−カドヘリン陽性およびＣＤ３４陰性を示す細胞であることが知られており、また、骨格筋から分離されたＳＰ細胞は、ＣＤ３４陰性、Ｓｃａ−１陽性、ｃ−ｋｉｔ陰性およびＣＤ４５陰性を示す細胞（Ｎａｔｕｒｅ，４０１，３９０−３９４，１９９９）であることが知られている。
加齢や慢性疾患、怪我などを原因とする組織の障害や臓器不全は高齢化社会を迎えて、大きな問題となってきている。現在、組織や臓器の障害を薬物で治療する方法はなく、病気の進行に伴い患者は寝たきりや介護を必要な状態となる。一方、臓器移植もドナー不足に加え感染症や拒絶反応の問題がある。近年の成体幹細胞生物学の進展から、我々成体の様々な組織に体性幹細胞が存在することが示唆されている。また加齢に伴い、これら体性幹細胞が減少することが、高齢者の組織障害や臓器不全の根本的な原因として考えられるようになってきている。従って、失われた体性幹細胞を補充する治療は組織障害や臓器不全の治療に有効であると考えられている（細胞、３３、１０１−１０４，２００１）。
発明の開示
本発明は以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）  骨格筋の間質に由来する多分化能幹細胞。
（２）  ｃ−ｍｅｔ陽性を示す上記（１）記載の多分化能幹細胞。
（３）  ＣＤ３４陽性を示す上記（１）または（２）記載の多分化能幹細胞。
（４）  Ｓｃａ１陽性を示す上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
（５）  ｍ−カドヘリン陰性を示す上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
（６）  ＣＤ４５陰性を示す上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
（７）  ＣＤ１４陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４９ｄ陰性、ＣＤ１１７陰性、ＦＬＫ−１陰性およびＣＤ１４４陰性を示す上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の多分化能幹細胞。
（８）  ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性、ｍ−カドヘリン陰性およびＭｙｏＤ陰性を示す上記（１）記載の多分化能幹細胞。
（９）  少なくとも骨格筋細胞に分化する能力を有する多分化能幹細胞である上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の細胞。
（１０）  少なくとも骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞および脂肪細胞に分化する能力を有する多分化能幹細胞である上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の細胞。
（１１）  少なくとも骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、小腸上皮細胞、角膜細胞に分化する能力を有する多分化能幹細胞である上記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の細胞。
（１２）  骨格筋が哺乳動物由来のものである上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の細胞。
（１３）  哺乳動物がヒトおよびラットから選ばれるものである上記（１２）記載の細胞。
（１４）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を含有することを特徴とする医薬。
（１５）  医薬が、組織または細胞の再生薬である上記（１４）記載の医薬。
（１６）  医薬が、臓器不全の治療薬である上記（１４）記載の医薬。
（１７）  組織または細胞が、筋肉、心臓、血液、血管、骨、関節、膵臓、肝臓、神経系の組織または細胞である、上記（１５）記載の医薬。
（１８）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を特異的に認識する抗体。
（１９）  上記（１８）記載の抗体を用いることを特徴とする、ヒト骨格筋から上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を精製する方法。
（２０）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、該細胞を増殖させる物質をスクリーニングする方法。
（２１）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、該細胞から、各種細胞への分化を誘導する物質をスクリーニングする方法。
（２２）  各種細胞が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、小腸上皮細胞、皮膚細胞および角膜細胞から選ばれる、上記（２１）記載のスクリーニング方法。
（２３）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を不死化させる方法。
（２４）  スフェアーを形成させることを特徴とする、上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を分離する方法。
幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）とは、自己複製能力を有し、かつ二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいい、多分化能幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）ともいう。
多分化能幹細胞のうち、生体内のすべての細胞に分化する能力を有する細胞を多能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｌ）といい、さらに、個体を再構築する能力を有する細胞を全能性幹細胞（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）という。
幹細胞としては、胚盤胞から取得されるＥＳ細胞（胚性幹細胞）、組織中に存在する体性幹細胞ならびに生殖細胞に分化する生殖性幹細胞などがあげられる。体性幹細胞と生殖性幹細胞はさらに成体由来と胎児由来の二つに分類できる。人体を構成する細胞にはそれぞれ特有の寿命が存在するにもかかわらず、生涯にわたり組織や臓器の細胞数に大きな変化は起こらない。これは、死滅した細胞を補うために細胞の再生・新生が厳密な制御のもとに生涯にわたり行われているからである。このように、成体組織での細胞の再生・新生を行う働きを有する細胞が体性幹細胞（組織幹細胞）である。
本発明の多分化能幹細胞は新規の成体体性幹細胞に分類され、自己複製能と体性細胞に分化する能力を有する。体性細胞としては成体組織を構成する細胞であればいずれでもよいが、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、小腸上皮細胞、皮膚細胞、角膜細胞など、通常自己複製能を有さない細胞があげられる。
本発明の多分化能幹細胞としては、細胞表面抗原について以下の（１）〜（６）のいずれか１つまたは複数の性質を有する細胞ならびに（７）の性質を有する細胞があげられる。
（１）ｃ−ｍｅｔ陽性を示す。
（２）ＣＤ３４陽性を示す。
（３）Ｓｃａ１陽性を示す。
（４）ｍ−カドヘリン陰性を示す。
（５）ＣＤ４５陰性を示す。
（６）ＣＤ１４陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４９ｄ陰性、ＣＤ１１７陰性、ＦＬＫ−１陰性およびＣＤ１４４陰性を示す。
（７）ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性、ｍ−カドヘリン陰性およびＭｙｏＤ陰性を示す。
本発明の多分化能幹細胞は、骨格筋の間質に由来し、少なくとも骨格筋細胞に分化する能力を有する。すなわち本発明の多分化能幹細胞は、骨格筋細胞とそれ以外の細胞、好ましくは、少なくとも骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞および脂肪細胞、より好ましくは少なくとも骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、小腸上皮細胞、角膜細胞に分化する能力を有する。
本発明の多分化能幹細胞は骨格筋の間質に由来するが、該骨格筋としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物の骨格筋が用いられる。本発明の多分化能幹細胞をヒトの治療用途に用いる場合にはヒト由来であることが好ましい。
以下、本発明の多分化能幹細胞を分離・精製する方法を説明する。
１．骨格筋間質細胞を生体から分離する方法
ヒトの骨格筋より多分化能細胞を取得する方法としては、特に限定されないが、以下の方法で取得することができる。
細胞治療を必要とする患者の上腕二頭筋の外側頭や下腿の縫工筋などの筋肉を含む結合組識を切皮して摘出後、縫合する。取得した全筋ははさみあるいはメスを利用してミンチ状にした後、０．０６％コラゲナーゼおよび１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地にけん濁し、３７℃で２時間インキュベーションする。ミンチ状の筋肉より分離してきた細胞を回収後、遠心分離法により細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地にけん濁する。該けん濁液をまず半径４０μｍマイクロフィルターを通過させた後、半径２０μｍのマイクロフィルターを通すことによりヒト骨格筋間質細胞液を得ることができる。
ラットやマウスから多分化能幹細胞を取得する方法としては、特に限定されないが以下の手順で取得することができる。
ラットあるいはマウスを頚椎脱臼により致死させ、７０％エタノールで充分消毒した後、皮膚を切除して大腿四頭筋を取得する。大腿四頭筋ははさみあるいはメスを利用してミンチ状にした後、０．０６％コラゲナーゼおよび１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地にけん濁し、３７℃で２時間インキュベーションする。ミンチ状の筋肉より分離してきた細胞を回収後、遠心分離法により細胞を回収し１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地にけん濁する。該けん濁液をまず半径４０μｍマイクロフィルターを通過させた後、半径２０μｍのマイクロフィルターを通すことによりラットおよびマウス骨格筋間質細胞液を得ることができる。
２．多分化能幹細胞を取得する方法
上記１で得られた骨格筋間質細胞液から目的の表面抗原を発現している細胞を取得する方法としては、ソーテイング機能を有したフローサイトメーターを用いたＦＡＣＳ法［Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（３），２７５−２８３（１９９８）］、磁気ビーズを用いる方法、本発明の多分化能幹細胞を特異的に認識する抗体を用いたパニング法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１（８），２７９７−２８００（１９８８）］などがあげられる。また、大量な培養液などから本発明の多分化能間細胞を取得する方法としては、細胞の表面に発現している分子（以下、表面抗原と称する。）を特異的に認識する抗体を単独または組み合わせてカラムとして用いることにより、本発明の多分化能幹細胞を取得することもできる。
フローサイトメーターのソーテイングの方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などがあげられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ１４−２３、秀潤社、１９９９年）。どちらの方法も、細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光で標識し、標識された抗体と抗原との結合体の蛍光測定を行い、蛍光強度を電気信号に変換することにより細胞の抗原の発現量を定量することができる。また、使用する蛍光の種類を組み合わせることで、複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。蛍光としては、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＴＲ（ＴｅｘａｓＲｅｄ）、Ｃｙ３、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、Ｒｅｄ６１３、Ｒｅｄ６７０、ＰｅｒＣＰ、ＴＲＩ−Ｃｏｌｏｒ、ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄなどがあげられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ３−１３、秀潤社、１９９９年）。
フローサイトメーターを用いたＦＡＣＳ法としては、生体内から取り出した骨格筋組織から、上記１の方法に従い骨格筋間質溶液を集め、遠心分離などの方法で細胞を分離したのち、直接抗体で染色する方法と、一度適当な培地中で培養・増殖を行った後に抗体で染色する方法が利用できる。細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的の細胞サンプルを混合し、氷上で３０分間〜１時間、インキュベーションする。一次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後フローサイトメーターで分離を行う。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞とを混合し、再び氷上で３０分間〜１時間、インキュベーションする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメーターで分離を行う。
磁気ビーズを用いる方法では、目的の表面抗原を発現している細胞を大量に分離することができる。分離の純度は上述のフローサイトメーターを用いる方法には及ばないが、精製を繰り返すことにより、十分高い細胞純度を確保することができる。
具体的には、骨格筋間質溶液に一次抗体を反応させた後、未反応一次抗体を除去し、一次抗体と特異的に結合する磁気ビーズを結合させた二次抗体を結合させる。残存する二次抗体を洗浄除去した細胞は磁石を設置したスタンドで分離する。これらの操作に必要な材料および装置はＤＹＮＡＬ社から入手することができる。
磁気ビーズを用いる方法は、細胞サンプル中より不要な細胞を除去する場合にも同様に利用することができる。不要な細胞をより効率的に除去するにはＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）より販売されているＳｔｅｍＳｅｐを用いる方法を用いる。
各種表面抗原としては、造血系細胞の表面抗原、血管内皮細胞の表面抗原、間葉系細胞の表面抗原、インテグリンの表面抗原、マトリックス受容体、接着分子、サイトカイン受容体などがあげられる。
造血系細胞の表面抗原としては、ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、Ｓｃａ−１、Ｌｙ６ｃ、Ｌｙ６ｇなどがあげられ、血管内皮細胞の表面抗原としては、Ｆｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４などがあげられ、間葉系細胞の表面抗原としてはＣＤ１４０などがあげられ、インテグリンの表面抗原としてはＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９、ＣＤ４１などがあげられ、マトリックス受容体としてはＣＤ５４、ＣＤ１０２、ＣＤ１０６、ＣＤ４４などがあげられ、接着分子としてはｍ−カドヘリンなどがあげられ、サイトカイン受容体としてはｃ−ｍｅｔなどがあげられる。
上述した各種表面抗原を認識する抗体を単独あるいは組み合わせて用いることで、目的とする細胞を取得することができる。
例えば、ＣＤ３４陽性を示す細胞を取得するには、抗ＣＤ３４抗体を結合させたカラムに、上記１で調製した骨格筋間質溶液を通塔することにより、ＣＤ３４陽性を示す細胞を抗ＣＤ３４抗体と結合させる。通塔後、抗ＣＤ３４抗体からＣＤ３４陽性を示す細胞を溶離させることより、目的の細胞を分離することができる。
本発明の多分化能幹細胞を分離する方法として、以下に述べる培養法に従い、骨髄間質由来を細胞後、スフェアーを形成する細胞を分離する方法を用いることもできる。スフェアーとは培養上清中での細胞塊であり、顕微鏡下で接着性の細胞や単細胞で浮遊する細胞などと容易に識別することができる。
細胞の培養に用いる培地としては、通常公知（組織培養の技術基礎編  第三版、朝倉書店１９９６）の組成の細胞培養用培地を用いることができるが、好ましくは牛等の血清を５〜２０％添加した、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭあるいはＩＭＤＭ等の細胞培養用培地などが用いられる。
培養条件としては、細胞が培養可能であればいかなる条件でもよいが、培養温度は３３〜３７℃が好ましく、さらに５〜１０％の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器で培養することが好ましい。
培養は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着あるいは浮遊させて行うことが好ましい。細胞を接着して培養する場合には培養皿一面に細胞が増殖する頃、培地を除去して、トリプシンＥＤＴＡ溶液を加えることで細胞を浮遊させる。浮遊した細胞は、ＰＢＳあるいは該細胞培養用の培地で洗浄後、該細胞培養用の培地で５倍から２０倍希釈して新しい培養皿に添加することで、さらに継代培養することができる。
上記方法で取得された本発明の多分化能幹細胞は、上述した各種表面抗原に対する抗体を用いたＦＡＣＳ法により細胞の純度を検定することができる。
３．本発明の多分化能幹細胞の検定方法
本発明の多分化能幹細胞は、以下の方法で検定される。
上記２の方法で分離された本発明の多分化能幹細胞を、９６穴の培養プレートに１細胞／穴が注入されるように希釈して該細胞液を各穴に入れる。その後、細胞の培養を行い、分化誘導してくる細胞を以下の方法で解析することにより、本発明の多分化能幹細胞を検定することができる。
細胞の培養に用いる培地としては、通常公知（組織培養の技術基礎編  第三版、朝倉書店１９９６）の組成の細胞培養用培地を用いることができるが、好ましくは牛等の血清を５〜２０％添加した、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭあるいはＩＭＤＭ等の細胞培養用培地などが用いられる。
培養条件としては、細胞が培養可能であればいかなる条件でもよいが、培養温度は３３〜３７℃が好ましく、さらに５〜１０％の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器で培養することが好ましい。
培養は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着あるいは浮遊させて行うことが好ましい。細胞を接着して培養する場合には培養皿一面に細胞が増殖する頃、培地を除去して、トリプシンＥＤＴＡ溶液を加えることで細胞を浮遊させる。浮遊した細胞は、ＰＢＳあるいは該細胞培養用の培地で洗浄後、該細胞培養用の培地で５倍から２０倍希釈して新しい培養皿に添加することで、さらに継代培養することができる。
以上の方法で細胞を培養した結果、細胞が増殖すれば、該細胞は自己複製能を有していることになる。
また、多分化能を有しているかについては、培養した細胞からランダムに出現してくる分化した細胞を同定するか、細胞が増殖を停止して分化に進むように培養をコンフルエントにした後、分化した細胞を同定することにより、検定することができる。
分化した細胞の同定方法としては、分化した細胞のマーカーを認識する抗体またはＤＮＡ／ＲＮＡなどのプローブを用いる公知の方法（免疫染色・ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼイション、別冊実験医学、野地澄晴編集、羊土社）を用いることができる。
分化した細胞を識別するマーカーとしては以下のものがあげられる。
ニューロンを識別するマーカーとしては、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａｂ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔなどがあげられる。グリアを識別するマーカーとしては、ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎがあげられる。心筋を識別するマーカーとしては、Ｍｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉなどがあげられる。筋肉を識別するマーカーとしては、ＭｙｏＤなどがあげられる。脂肪細胞を識別するマーカーとしては、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ２、ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ、ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎなどがあげられる。血管内皮を識別するマーカーとしては、ｋｄｒ／ｆｌｋ１、Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒなどがあげられる。血液細胞を識別するマーカーとしては、ＣＤ４５があげられる。骨を識別するマーカーとしては、アルカリフォスファターゼがあげられる。軟骨を識別するマーカーとしては、タイプＩＩコラーゲンがあげられる。膵臓β細胞を識別するマーカーとしては、インシュリンがあげられる。肝細胞を識別するマーカーとしては、アルブミンがあげられる。
また本発明の多分化能幹細胞を検定する別の方法としては、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（ｎｏｎｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）マウスに、ＧＦＰなどのマーカーにより標識した本発明の多分化能幹細胞を移植し、上述した免疫染色あるいはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼイションにより分化誘導した細胞を解析する方法があげられる。
４．本発明の多分化能幹細胞を培養する方法
上記２の方法により分離した、多分化能幹細胞を培養するために用いる培地としては、通常公知（組織培養の技術基礎編  第三版、朝倉書店１９９６）の組成の細胞培養用培地を用いることができるが、好ましくは牛等の血清を５〜２０％添加した、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭあるいはＩＭＤＭ等の細胞培養用培地などが用いられる。培養条件は、細胞が培養可能であればいかなる条件でもよいが、培養温度は３３〜３７℃が好ましく、さらに５〜１０％の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器で培養することが好ましい。本発明の多分化能幹細胞は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着あるいは浮遊して増殖することが好ましい。細胞を接着して培養する場合には培養皿一面に細胞が増殖する頃、培地を除去して、トリプシンＥＤＴＡ溶液を加えることで細胞を浮遊させる。浮遊した細胞は、ＰＢＳあるいは該細胞培養用の培地で洗浄後、該細胞培養用の培地で５倍から２０倍希釈して新しい培養皿に添加することで、さらに継代培養することができる。
５．本発明の多分化能幹細胞を含む再生治療薬または細胞治療薬
本発明の多分化能幹細胞は、各種組識または細胞の再生または各種臓器不全の治療薬として用いることができる。
臓器不全としては、成体組織や細胞の破壊や変性を伴う疾患であれば特に限定されないが心不全、肝不全、腎不全、白血病、神経変性疾患、関節炎、糖尿病、動脈硬化などをあげることができる。
上記疾患による臓器の障害部位または障害の大きさに応じて、本発明の多分化能幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより分化・増殖させて、該細胞を臓器の障害部位へ移植することにより、各種臓器不全を治療することができる。または、臓器の障害部位へ本発明の多分化能幹細胞を直接移植させてもよい。
心不全の治療薬としては、本発明の多分化能幹細胞のなかでも心筋細胞への分化能を有する細胞を高純度に含んだ細胞があげられる。心筋細胞としては、心筋内皮細胞（Ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、クッション細胞（Ｃｕｓｈｉｏｎ  ｃｅｌｌ）、心室型心筋細胞、心房型心筋細胞、洞結節細胞などがあげられる。
本発明の多分化能幹細胞は、心臓の障害部位または障害の大きさに応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化・増殖させ、所望の心筋細胞を取得し、これを心臓障害部位へ移植することにより心不全の治療に用いることができる。または、心臓障害部位へ本発明の多分化能幹細胞を直接移植させてもよい。
腎不全の治療薬としては、本発明の多分化能幹細胞のなかでも腎ネフロンへの分化能を有する細胞を高純度に含んだ細胞があげられる。腎ネフロンとしては、メサンギウム細胞、ポドサイト、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞などがあげられる。
本発明の多分化能幹細胞は、腎臓の障害部位または大きさに応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化・増殖させ、所望の腎臓細胞を取得し、これを腎臓障害部位へ移植することにより腎不全の治療に用いることができる。または、腎臓障害部位へ本発明の多分化能幹細胞を直接移植させてもよい。
神経変性疾患の治療薬としては、本発明の多分化能幹細胞のなかでも神経系の細胞への分化能を有する細胞を高純度に含んだ細胞があげられる。神経系の細胞としては、好ましくはドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンなどの中枢神経系、末梢神経系の細胞などがあげられる。
本発明の多分化能幹細胞は、神経の障害部位または大きさに応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化・増殖させ、所望の神経系の細胞を取得し、これを神経の障害部位へ移植することにより神経変性疾患の治療に用いることができる。または、神経の障害部位へ本発明の多分化能幹細胞を直接移植させてもよい。
関節炎の治療薬としては、本発明の多分化能幹細胞のなかでも関節を形成する細胞への分化能を有する細胞を高純度に含んだ細胞があげられる。関節を形成する細胞としては、好ましくは軟骨細胞、骨、靭帯などがあげられる。
本発明の多分化能幹細胞は、関節炎部位または大きさに応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化・増殖させ、所望の関節を形成する細胞への分化能を有する細胞を取得し、これを関節の障害部位へ移植することにより関節炎の治療に用いることができる。
糖尿病の治療薬としては、本発明の多分化能幹細胞のなかでも膵臓内分泌細胞への分化能を有する細胞を高純度に含んだ細胞があげられる。膵臓内分泌細胞としては、β細胞、α細胞、δ細胞などがあげられる。
本発明の多分化能幹細胞は、疾患の重篤度に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化・増殖させ、所望の膵臓内分泌細胞への分化能を有する細胞を取得し、これを膵臓疾患部位へ移植することにより糖尿病の治療に用いることができる。または、膵臓疾患部位へ本発明の多分化能幹細胞を直接移植させてもよい。
動脈硬化の治療薬としては、本発明の多分化能幹細胞のなかでも血管細胞への分化能を有する細胞を高純度で含んだ細胞があげられる。血管細胞としては、血管内皮細胞や血管平滑筋などがあげられる。
本発明の多分化能幹細胞は、動脈硬化部位または大きさに応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化・増殖させることにより、所望の血管への分化能を有する細胞を取得し、これを動脈硬化部位に移植することにより動脈硬化の治療に用いることができる。または、動脈硬化の障害部位へ本発明の多分化能幹細胞を直接移植させてもよい。
白血病の治療薬としては、本発明の多分化能幹細胞のなかでも血液への分化能を有する細胞を高純度で含んだ細胞があげられる。血液としては、好ましくは、造血幹細胞から白血球、赤血球、血小板などがあげられる。
本発明の多分化能幹細胞は、必要量に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化・増殖させることにより、所望の血液への分化能を有する細胞を取得し、これを骨髄に移植することにより白血病の治療に用いることができる。または、骨髄へ直接本発明の多分化能幹細胞を直接移植させてもよい。
６．本発明の多分化能幹細胞を認識する抗体の取得
以下に、本発明の多分化能幹細胞を特異的に認識する抗体の製造方法について説明する。
本発明の多分化能幹細胞３〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／匹、あるいは該細胞から調製した細胞膜画分１〜１０ｍｇ／匹を抗原として、ウサギ、ヤギまたは３〜２０週令のラット、マウスもしくはハムスター等の非ヒトほ乳動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチンなど］とともに投与する。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］などで調べる。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物を、血清または抗体産生細胞の供給源とする。
ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒトほ乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞、特に脾細胞が好適に用いられる。
骨髄腫細胞としては、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）株［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）株［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）株［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）株［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）株［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］等、マウス由来の株化細胞が好適に用いられる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地）に懸濁したのち、７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まない蛋白質には反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
上記方法で取得した、本発明の多分化能幹細胞を特異的に認識する抗体を用いて、検体細胞が本発明の多分化能幹細胞に特異的な表面抗原を発現しているかどうかを容易に検定することができる。
７．本発明の多分化能幹細胞で発現している表面抗原および該表面抗原をコードする遺伝子の取得
本発明の多分化能幹細胞で特異的に発現している表面抗原遺伝子は、二つの異なる由来のサンプル間で異なる発現形態を取る遺伝子を取得する方法であるサブトラクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５７３８−５７４２（１９８８）］やＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５６４０−５６４８（１９９４）］による方法により、以下のようにして取得することができる。
まず、多分化能を有する骨格筋間質由来幹細胞より作製したｃＤＮＡライブラリーを、本発明の多分化能幹細胞以外の対照細胞より取得したｍＲＮＡを用いてサブトラクションを行う。本発明の多分化能幹細胞に特異的に発現している遺伝子を濃縮した差分化ｃＤＮＡライブラリーを調製した後、該差分化ｃＤＮＡライブラリーの挿入ｃＤＮＡ配列を５’末端側よりランダムに塩基配列解析を行い、分泌シグナル配列を持つものだけを選択する（ランダム配列解析）。このようにして得られた表面抗原をコードするｃＤＮＡの全長塩基配列を決定することにより、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質が分泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
上記の方法において、ランダム配列解析の代わりに、シグナルシーケンストラップ法も用いることもできる［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，６００−６０３（１９９３）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４８７−４９０（１９９９）］。シグナルシーケンストラップ法とは、分泌シグナル配列をもつ遺伝子を選択的にスクリーニングする方法である。
効率よく特異的な表面抗原を取得するためには、本発明の多分化能幹細胞由来のシグナルシーケンストラップライブラリーを作製する際にサブトラクションを行うことが可能なベクターを用いることが好ましい。
本発明の多分化能幹細胞から作製したシグナルシーケンストラップライブラリーを対照細胞より取得したｍＲＮＡを用いてサブトラクションを行い、分泌シグナル配列を含むＤＮＡ断片を取得する。このようにして取得された分泌シグナル配列を含むＤＮＡ断片は全長ｃＤＮＡをクローン化するためのプローブとして用いることができる。分泌シグナル配列を含むＤＮＡ断片をプローブとして、表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡを取得することができる。
表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡはその全長塩基配列を解析することにより、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質が分泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
ランダム配列解析あるいはシグナルシーケンストラップ法を用いた場合でも、得られたクローンが膜蛋白質をコードする場合は、塩基配列から類推されるアミノ酸配列に基づき合成ペプチドを作製し、該合成ペプチドを抗原として上記方法により特異的な抗体を取得することができる。
また、膜蛋白質の場合は、受容体であることもある。受容体の場合には、多分化能幹細胞の特異的な増殖、または様々な細胞への分化の調節に働いている可能性があり、当該受容体のリガンドの探索に用いることができる。分泌蛋白質の場合は、多分化能幹細胞を増殖あるいは分化させるために用いることができる。
８．多分化能幹細胞の増殖因子および各種細胞への分化誘導因子のスクリーニング方法
本発明の多分化能幹細胞の増殖因子および骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞などへの分化誘導因子のスクリーニング方法としては、本発明の多分化能幹細胞を無血清培地中で培養させる際に、検体となる種々の物質を添加させ、該細胞が増殖するか、または骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞などの細胞へ分化誘導されるかを測定することにより行うことができる。
検体となる物質としては、各種サイトカインや増殖因子などの分泌蛋白質、細胞接着分子などの膜結合蛋白質、組織抽出液、合成ペプチド、合成化合物、微生物培養液等などいかなるものでもよい。
該検体物質の細胞を増殖させる能力は、細胞のコロニー形成能やＢｒｄＵの取り込みを指標に測定することができる。
コロニー形成能は、本発明の多分化能幹細胞を低密度で播種することにより調べることができる。
ＢｒｄＵの取り込みは、ＢｒｄＵを特異的に認識する抗体を用いた免疫染色により調べることができる。
該検体物質の骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞などの細胞への分化させる能力は、各細胞特異的に発現するマーカーを指標とする方法、細胞内に導入したレポーター遺伝子の発現を指標とする方法などにより測定することができる。
各細胞特異的に発現するマーカーを指標とする方法としては、分化した細胞のマーカーを認識する抗体またはＤＮＡ／ＲＮＡなどのプローブを用いる公知の方法（免疫染色・ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼイション、別冊実験医学、野地澄晴編集、羊土社）があげられる
各細胞特異的に発現するマーカーとしては、次のものがあげられる。ニューロンを識別するマーカーとしては、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａｂ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔなどがあげられる。グリアを識別するマーカーとしては、ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎがあげられる。心筋を識別するマーカーとしては、Ｍｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉなどがあげられる。筋肉を識別するマーカーとしては、ＭｙｏＤなどがあげられる。脂肪細胞を識別するマーカーとしては、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ２、ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ、ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎなどがあげられる。血管内皮を識別するマーカーとしては、ｋｄｒ／ｆｌｋ１、Ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒなどがあげられる。血液細胞を識別するマーカーとしては、ＣＤ４５があげられる。骨を識別するマーカーとしては、アルカリフォスファターゼがあげられる。軟骨を識別するマーカーとしては、タイプＩＩコラーゲンがあげられる。膵臓β細胞を識別するマーカーとしては、インシュリンがあげられる。肝細胞を識別するマーカーとしては、アルブミンがあげられる。
レポーター遺伝子の発現を指標とする方法としては、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞などで特異的に発現する遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝子とを組み合わせたベクターＤＮＡを、本発明の多分化能幹細胞に導入したのち、該細胞を用いてレポーター遺伝子の発現を指標にする方法があげられる。
レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ（Ｇｌｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ、ベーターガラクトシダーゼなどがあげられる。
９．本発明の多分可能幹細胞の不死化方法
本発明の多分化能幹細胞を含有する医薬を患者に投与する場合、本発明の多分可能幹細胞をガン化させずに不死化させることが望ましい。
細胞をガン化させずに不死化させる方法としては、テロメラーゼを本発明の多分化能幹細胞に発現させる方法があげられる。
テロメラーゼを本発明の多分化能幹細胞に発現させる方法としては、テロメラーゼの触媒サブユニットであるＴＥＲＴ遺伝子、具体的には配列番号１９で表されるＤＮＡを、レトロウイルスベクターに導入し、該ベクターを多分化能幹細胞に導入する方法があげられる。
また、本発明の多分化能幹細胞に内在するＴＥＲＴ遺伝子を誘導発現させる因子を多分化能幹細胞を培養する培地内に投与することにより、またはＴＥＲＴ遺伝子を誘導発現させる因子をコードするＤＮＡを挿入したベクターを本発明の多分化能幹細胞へ導入することにより、テロメラーゼを本発明の多分化能幹細胞に発現させることができる。
ＴＥＲＴ遺伝子を誘導発現させる因子は、多分化能幹細胞を培養する培地内に直接投与することでテロメラーゼが発現していることを指標としてスクリーニングすることができる。また、ＴＥＲＴ遺伝子プロモーターとＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ、あるいはベーターガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子とを組み込んだベクターＤＮＡを多分化能幹細胞に導入することにより、スクリーニングすることができる。
以下に実施例をあげて、本発明を具体的に示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ラット骨格筋肉中の幹細胞の分析
筋肉中で新たな筋肉繊維を新生する細胞を明らかにするために、３週齢の雄のウイスターラットの足底筋を組織化学的手法で解析を行った。ラットは誕生後、２３±１℃、１２時間明１２時間暗の周期で飼育を行った。ラットは最終濃度が６０ｍｇ／ｋｇになるように塩化ペントバルビタールを注入することにより殺し、足底部位より筋肉を摘出した。摘出した筋肉は液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結し、以下の実験に用いるまで−８０℃で保存した。免疫組織染色に用いる筋肉組織の切片は、凍結筋肉標本を−２０℃に平衡化したのち、６つの断片に分断して全筋肉組織を解析できるようにした。切片は７μＭの厚さに調製し、一つの組織断片より１０から１８の切片を作製した。
免疫染色には、骨格筋マーカーに対する抗体である抗ｍｙｏｇｅｎｉｎ抗体（Ｄａｋｏ社製，Ｆ５Ｄ）、抗ＭｙｏＤ抗体（Ｄａｋｏ社製，ａｎｔｉ−ＭｙｏＤ１，５．８Ａ）、抗ミオシン重鎖抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製）、筋肉繊維を染色する抗体である抗ラミニン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、細胞接着分子に対する抗体である抗ｍ−カドヘリン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製，Ｎ−１９）、造血系細胞の表面抗原に対する抗体である抗ＣＤ３４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製，Ｃ−１８）をそれぞれ用いた。骨格筋は分化が進むにつれ、ｍｙｏｇｅｎｉｎ、ＭｙｏＤ、ミオシン重鎖、ラミニンの順で細胞表面に発現する。
また、免疫反応はビオチン・アビジンパーオキサイド反応を用いて視覚化した。
生後３週齢の雄のラットの足底筋中の筋芽細胞の解析を組織断片に各種抗体を用いた免疫染色により行った。その結果、組織断片で観察されたＭｙｏＤ陽性細胞の約７０％は基底ラミナの内側、すなわち筋繊維の内側に存在した。残りの３０％のＭｙｏＤ陽性細胞は小さな細胞質を持ち、筋繊維と筋繊維の間の間質領域に存在していた。ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞についても同様の細胞の存在が認められたが、その強度はＭｙｏＤ陽性細胞よりも小さかった。抗ｍｙｏｇｅｎｉｎ抗体は筋繊維の内側および間質中の細胞質の小さい細胞を染色した。一部の細胞ではｍｙｏｇｅｎｉｎとＭｙｏＤの両方を発現していた。
解析した切片中には発生段階で観察されるミオシン重鎖が陽性の小さな筋繊維が１つの背切片あたり、１５から２０検出された。これらのミオシン重鎖陽性細胞の核はｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性であり、ミオシン重鎖陽性細胞の膜はラミニン陽性であった。
以上の結果から、このような発生段階で観察されるミオシン重鎖が陽性の小さな筋繊維は新しく筋肉を形成する細胞と考えられる。
このような、筋肉を形成する細胞は、電子顕微鏡による解析でも観察された。  小さな筋繊維を持つラミニン陽性の細胞は間質領域の血管の近辺で観察され、新しい筋肉が生まれる位置と、上述の免疫染色でｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性およびＭｙｏＤ陽性細胞が観察される位置とが一致した。また、サテライト細胞も筋繊維内に観察された。
以上の観察結果は、成長中の筋肉の間質領域には新しい筋肉繊維を産み出す幹細胞が存在すること、およびサテライト細胞は筋肉繊維内に存在し、筋肉繊維を太くするのに働いていることを示している。
生後３週齢の雄ラットの足底筋中の筋芽細胞を、筋肉組織断片に抗ｍ−カドヘリン抗体と抗ラミニン抗体を用いた二重染色を行うことにより解析した。その結果、ｍ−カドヘリンはサテライト細胞が存在する筋繊維の内側に存在したが、間質ではｍ−カドヘリンは観察されなかった。ｍ−カドヘリン陽性細胞の一部の細胞表面はＭｙｏＤ陽性を示すが、その他の細胞表面はＭｙｏＤ陰性であった。ＣＤ３４陽性細胞は常に、筋繊維の外側の間質で観察された。ＣＤ３４陽性細胞の数は、１セクションあたり、３０から４０存在し、その数はＭｙｏＤ陽性細胞の数とほぼ同じであった。ＣＤ３４陽性細胞はＭｙｏＤを共発現していなかった。
以上の結果は、以前から知られているサテライト細胞が、ｍ−カドヘリン陽性、ＣＤ３４陰性であるのとは対照的に、本解析ではじめて明らかになった間質の幹細胞はｍ−カドヘリン陰性、ＣＤ３４陽性であることが明らかになった。
またサテライト細胞とは異なり、ＭｙｏＤを発現していないことから、本細胞は筋肉への分化の制限を受けていない多分化能の幹細胞であることが示された。
実施例２  マウス骨格筋間質からの幹細胞の分離
骨格筋の間質細胞を３週齢から４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの後脚の大腿部より摘出した。取得した筋肉片ははさみにより小さく切り分けミンチ状にした後、０．０６％のコラゲナーゼタイプＩＡ（シグマ社製）と１０％の牛胎児血清を含むＤｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地中で３７℃、２時間インキュベーションを行った。該処理により抽出された細胞をまず４０μｍのナイロン・メッシュでろ過したのち、２０μｍのナイロン・メッシュでろ過し、１１００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことで回収した。得られた該細胞は２０％の牛胎児血清を含むＤｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地中に浮遊させることで、骨格筋間質細胞液を取得した。
骨格筋間質細胞液より骨格筋の幹細胞を取得するために、抗体とフローサイトメトリー（ＦＡＣＳソーター）を利用して分離を行った。骨格筋間質細胞液に含まれる血球系の細胞を除去するために、抗ＣＤ３４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、ＲＡＭ３４）と抗ＣＤ４５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、３０−Ｆ１１）とを用いて、ＣＤ３４陽性・ＣＤ４５陰性画分（以後骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞と称する）と、ＣＤ３４陰性・ＣＤ４５陰性画分（以後骨格筋間質ＣＤ３４−／４５−細胞と称する）とを分離した。
骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞に関してはさらに、造血系細胞の表面抗原であるＣＤ１４を認識する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、ｒｍＣ５−３）、血管内皮細胞の表面抗原であるＣＤ３１を認識する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、ＭＥＣ１３．３）、血管内皮細胞の表面抗原であるＣＤ１４４を認識する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、１１Ｄ４．１）、血管内皮細胞の表面抗原であるＦＬＫ−１を認識する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、Ｌｙ−７３）、インテグリンの表面抗原であるＣＤ４９ｄを認識する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、Ｒ１−２）、いずれも造血幹細胞の表面抗原であるｃ−ｋｉｔを認識する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、２Ｂ８）、Ｓｃａ−１を認識する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｅｇｎ社製、Ｌｙ６Ａ／Ｅ）を用いて解析を行った。
その結果、骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞の９３．７＋／−１．３％がＳｃａ−１陽性であったが、他はすべて陰性であった。この結果は骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞には造血系前駆細胞や血管前駆細胞が含まれていないことを示した。
また骨格筋から分離されたｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ（ＳＰ細胞）はＣＤ３４陰性、Ｓｃａ−１陽性、ｃ−ｋｉｔ陰性、ＣＤ４５陰性であることが報告されていることから（Ｎａｔｕｒｅ，４０１，３９０−３９４，１９９９）、骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞はＳＰ細胞とは異なる新規の細胞であることが示された。
つぎに、取得した骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞よりＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｓｏｇｅｎ，Ｗａｋｏ社製）を用いて、ｍＲＮＡを分離し、ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により、ＭｙｏＤ、ｍｙｆ−５、ｍｙｆ−６、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、ｍ−カドヘリン、ｃ−ｍｅｔ、Ｐａｘ−７、Ｐａｘ−３、β−アクチンの発現について解析した。ＲＴ−ＰＣＲの解析には、以下の合成ＤＮＡプライマーを用いた；ＭｙｏＤ（配列番号１および２）、ｍｙｆ−５（配列番号３および４）、ｍｙｆ−６（配列番号５および６）、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（配列番号７および８）、ｍ−カドヘリン（配列番号９および１０）、ｃ−ｍｅｔ（配列番号１１および１２）、Ｐａｘ７（配列番号１３および１４）、Ｐａｘ３（配列番号１５および１６）、β−アクチン（配列番号１７および１８）。
ＲＴ−ＰＣＲの結果、骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−は内部コントロールのβ−アクチン以外ではｃ−ｍｅｔのみが陽性であり、他のマーカーにはすべて陰性であった。
この結果は骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−がＰａｘ７陽性のサテライト細胞とは異なる新規の幹細胞であることを示している。
実施例３  骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞の培養
実施例２により取得した骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞の分化能を解析するため、以下の方法で該細胞の培養を行った。骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞を１×１０４細胞／ｍｌの条件で完全なメチルセルロース培地ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＧＦＨ４  ４ｓ４Ｖ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ社製）で培養した。インキュベーターは３７℃、５％ＣＯ２、９５％Ｏ２で培養した。３日間の培養で骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞は均一な大きさの丸い形態をした細胞からなるコロニーを形成した。コロニー内の細胞数は経時的に増加し、その一部は培養皿から離れスフェアーを形成した。また別の一部の細胞は７日目から１０日目にかけて小さな筋肉様細胞へと分化を始め、自律的に動き始めた。また本細胞は抗ＭｙｏＤ抗体（Ｄａｋｏ社製、５．８Ａ）で染色されたことから骨格筋細胞と確認された。また骨格筋細胞以外にも血管内皮細胞様の細胞が検出され、この細胞はＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を取り込むことから血管内皮細胞と同定された。また、細胞内に油滴を持ちＯｉｌ  ｒｅｄで染色される脂肪細胞も検出された。以上の結果は、骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞が少なくとも骨格筋、血管内皮細胞、脂肪細胞に分化する能力を有した多分化能の幹細胞であることを示している。
実施例４  骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞の移植
骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞の生体内での機能を明らかにするために、まずＧＦＰトランスジェニックマウスより実施例２と同様の方法で骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞を分離した。次に、該ＧＦＰトランスジェニックマウス由来骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞をＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの頚骨筋の前方に移植した。６週間後、解剖して分析を行った結果、筋肉繊維ならびに血管内皮細胞にＧＦＰ蛋白の発現が観察された。この結果は、骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞が生体内で骨格筋と血管内皮細胞に分化できることを示している。
実施例５  ヒト骨格筋細胞からの骨格筋間質ＣＤ３４＋／４５−細胞の分離
患者よりインフォームドコンセントに基づき採取した全筋をはさみあるいはメスを用いてミンチ状にした後、コラゲナーゼタイプＩＡ（シグマ社製）を０．０６％、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にけん濁し、３７Ｃで２時間インキュベーションした。ミンチ状の筋肉より分離してきた細胞を回収後、遠心分離法により細胞を回収しＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）にけん濁した。該けん濁液をまず半径４０μｍマイクロフィルターを通過させた後、半径２０μｍのマイクロフィルターを通すことによりヒト骨格筋間質細胞液を得た。得られた細胞を実施例２と同様にして抗ＣＤ３４抗体と抗ＣＤ４５抗体を用いて細胞の分離を行った。その結果、全骨格筋間質細胞の７．５４％がＣＤ３４陽性およびＣＤ４５陰性であることが観察された。本結果はマウスでの知見がヒトにも応用できることを示している。
実施例６  マウス骨格筋間質由来ＣＤ３４−／４５−細胞中の幹細胞の培養
実施例２に記載の方法で取得した約１００００個のＣＤ３４−／４５−細胞をＣｏｌｌａｇｅｎＣｕｌｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ［ステムセル・テクノロジー社製（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）］にｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を追加した培養液を加えた３５ｍｍの培養皿で培養した。その結果、約１％強の細胞が単一な細胞によるコロニーを形成することが観察された。また、コロニーを形成した細胞は培養を継続することにより、抗ＣＤ３４抗体（ＲＡＭ３４，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）により染色され、ＣＤ３４＋／４５−細胞が出現することを示した。
さらに培養を継続することにより、骨格筋や脂肪細胞、血管内皮細胞への分化が観察された。骨格筋への分化は、抗ＭｙｏＤ抗体（５．８Ａ，Ｄａｋｏ社製）の染色で、血管内皮への分化は標識した低密度リポ蛋白（Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｓ社製）の細胞内への取込で、また脂肪細胞への分化はｏｉｌ−ｒｅｄ０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）染色により確認した。
以上の結果は、ＣＤ３４＋／４５−細胞がＣＤ３４−／４５−細胞に含まれる幹細胞から誘導されることを示している。また、ＣＤ３４−／４５−細胞中に存在するコロニー形成能を有する細胞が多分化能幹細胞であることを示している。
さらに、実施例１に示した方法に従い、骨髄の間質に存在する細胞を解析すると、ＣＤ３４陽性、ｍ−カドヘリン陰性およびＭｙｏＤ陰性の細胞に加えて、ＣＤ３４陰性、ｍ−カドヘリン陰性およびＭｙｏＤ陰性の細胞が観察された。以上のことから、ＣＤ３４−／４５−細胞中に存在するコロニー形成能を有する多分化能幹細胞は、ＣＤ３４陰性、ｍ−カドヘリン陰性およびＭｙｏＤ陰性の特徴を有すると考えられる。
実施例７  マウス骨格筋間質由来ＣＤ３４＋／４５−細胞の腎臓皮下への移植
実施例２に記載の方法で取得した約１００００個のＣＤ３４＋／４５−細胞をただちに同系統のマウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスの腎臓皮下へ移植した。移植６週間後に腎臓を摘出し、組織切片を作成して移植した細胞の着床および分化状態を確認した。
光学顕微鏡下で組織切片を観察した結果、移植した細胞の形態としては腎皮膜下に筋線維群および血管、さらにミエリン構造を有する神経軸策群が合わせて観察された。以上の結果は、ＣＤ３４＋／４５−細胞が筋線維、血管のみならず神経へも分化したことを示し、多分化能を有することを示している。
また、光学顕微鏡下で組織切片を観察した結果、腎皮膜下に観察された成熟型の筋線維にはサテライト細胞の存在も確認されたことから、ＣＤ３４＋／４５−細胞がサテライト細胞へも分化しうることが示された。
産業上の利用可能性
組織や細胞の再生等に有用な骨格筋の間質に由来する多分化能幹細胞を提供する。
「配列フリーテキスト」
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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