(57)【要約】本発明は、立体構造の解析に意味のあるドメインを形成するＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインを形成するタンパク質およびその構造情報などを提供することを目的とする。具体的に本発明は、（１）配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はその塩、（２）配列番号３、５、７、９のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はそれらの塩、（３）配列番号７に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜５個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が９２〜１０６であるタンパク質又はそれらの塩、（４）（１）、（２）又は（３）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（１）、（２）又は（３）に記載のタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質又はそれらの塩、それらの製造方法、それらをコードするポリヌクレオチド、それらのタンパク質に対する抗体、それらを用いるスクリーニング方法、それらの立体構造を用いたスクリーニング方法などを提供するものである。
2004016781.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はその塩。
【請求項２】
配列番号３、５、７のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はそれらの塩。
【請求項３】
配列番号５に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜５個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が９２〜１０６であるタンパク質又はそれらの塩。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、請求項１、２又は３に記載のタンパク質のいずれかと実質的に同一の細胞増殖抑制機能を有するタンパク質又はそれらの塩。
【請求項５】
請求項１〜請求項４に記載されたタンパク質のいずれか１つのタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２、４、６、８のいずれか一つに記載された塩基配列を含有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項５又は請求項６に記載のポリヌクレオチドで形質転換させた形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換体を培養し、タンパク質を生成させる工程を含む、請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質またはそれらの塩の製造方法。
【請求項１１】
無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質又はそれらの塩の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の抗体を用いた請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質を含むタンパク質又はそれらの塩の定量方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の定量方法を用いた、請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質を含むタンパク質またはそれらの塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質を細胞内で発現させる工程と、当該細胞内における遺伝子の発現状態を調べる工程と、を含む、請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質と関連する遺伝子を特定する方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で特定する工程とを含む請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記タンパク質の立体構造に関する情報が、立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載の立体構造情報のうちアミノ酸番号８〜９８番目のアミノ酸残基からなるタンパク質の立体構造情報である請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
立体構造座標表１に記載の立体構造情報のうち、（Ｖａｌ２６、Ｌｙｓ２７、Ｇｌｕ４７、Ａｒｇ６７、，Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ８６）のアミノ酸残基に相当する部分の情報を用いる請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１６〜請求項１８のいずれか一つに記載されたスクリーニング方法によって、特定された活性部位と相互作用する化合物を候補化合物として用意し、
請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載されたタンパク質と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載されたタンパク質またはそれらの塩及び／又は請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載されたタンパク質の立体構造のうちアミノ酸番号８〜９８番目のアミノ酸残基のタンパク質の立体構造情報に関する情報を用いて、請求項１〜４のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する構造未知タンパク質のホモロジーモデリングを行い、前記構造未知タンパク質の立体構造を推定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ドメインを形成するヒト由来のタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、そのタンパク質に対する抗体、それらを用いた活性化合物のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】  近年、ヒトゲノム計画に代表されるさまざまなモデル生物のゲノム塩基配列が次々に解読されている。これらのゲノム配列情報から抽出される遺伝子について、個々の遺伝子にコードされたタンパク質の立体構造を体系的に明らかにし、構造と機能の関係を明確にしようとする“構造ゲノム科学”が、新たな研究分野として急速に立ち上がり、世界各国で大規模なプロジェクトが進行している。
この構造ゲノム科学において、解析対象となるタンパク質数は１０万種類に及ぶとも見られており、その全立体構造の決定を目標とするのは現在の技術レベルでは未だ現実的ではない。
そこで、まず対象タンパク質を妥当な数に絞り、「代表的な構造」を選ぶことが必要である。網羅的な立体構造解析は、例えばａ）対象とするタンパク質のセットとして比較的小さいものに特定する、ｂ）超好熱性古細菌、高度好熱菌、マイコプラズマ等のゲノムサイズの小さい生物種を特定する、或いはｃ）シグナル伝達や遺伝子発現に関与するタンパク質、疾病関連遺伝子産物タンパク質等、生命現象を特定する等、様々な視点から解析対象を選定したプロジェクトが開始されている。
このような研究の流れにおいては、最初のステップとして、約１万種類とも推測されているファミリー（アミノ酸配列が約３０〜３５％の相同性を有するものをファミリーとして分類）のすべてについて代表的な立体構造を１つ以上決定することを１つの目標としている。ある代表的な立体構造（基本構造）があれば、同じファミリーに属する他のタンパク質の構造も、ホモロジーに基づくモデリングにより類推することが可能となる。
このプロジェクトの中で、機能ドメインの三次元構造のタイプ、又はトポロジー（基本構造：フォールド）に注目し、タンパク質の基本構造単位で機能との相関を解明しようとする研究が注目されている。
複数のドメインを有するタンパク質の場合、機能ドメインがモジュールのように組み合わさってできているため、あるドメインがさまざまなタンパク質のなかに違ったドメインとの組み合わせで現れることがしばしば見られる。また、一次配列上のホモロジーが検出されなくても同じ基本構造をもつことはめずらしくない。従って、基本構造の数はタンパク質のファミリーの数よりもかなり少ないはずであり、それぞれの基本構造が分子機能と関連付けられると期待される。この基本構造の数は、約１万〜２万種類と予測されており、このオーダーの解析対象であれば、全対象タンパク質の立体構造を決定することも十分可能になる。
このようにして得られるタンパク質の立体構造と機能に関する情報は、生体機能の解明に新たな知見を与え、医薬品等の開発（例えば、ラショナルドラックデザインやバーチャルスクリーニングによる開発）を飛躍的に発展させるものであり、産業界においても非常に有益である。
しかしながら、タンパク質の立体構造解析には、多くの時間と労力、費用を要するのが実情である。網羅的且つ体系的な構造解析を目指す構造ゲノム科学研究においては、構造解析のハイスループット化を図ることが重要な課題である。
タンパク質の立体構造解析には主にＮＭＲ法およびＸ線結晶構造解析法が使用されている。
タンパク質をＮＭＲを用いて立体構造解析を行うためには、サンプルの分子量は約２００００以下（アミノ酸残基で約２００個以下）であることが好ましい。Ｘ線解析によって立体構造解析を行う場合にも、結晶作成のためにタンパク質の性状に制限がある。
構造解析に適したタンパク質を得るためにタンパク質をランダムに分割すると、切断する部位がβシートやαヘリックス構造をとるアミノ酸配列中にあると、多くのタンパク質は生理的に意味のある構造が変形したり、ひも状になり構造を取らなかったり、あるいは凝集することになる。このように本来生体内でとる構造を有しないタンパク質の立体構造を解析しても意味がない。したがって、立体構造の解析に意味のあるドメインを形成するタンパク質を取得することが望まれる。
構造解析に適した、ドメインを有するタンパク質（以下、「ドメインを形成するタンパク質」という）を発現させるためには、ドメイン境界の位置に関する情報が必要である。一般に、このドメイン境界はアミノ酸配列の相同性などを手がかりにして予測される。このようにして予測されたドメイン領域のアミノ酸配列に基づいてタンパク質の発現を行っても実際に構造をとる（フォールドする）ドメインを形成するタンパク質が得られる確率は非常に低く、ドメイン発現が構造解析のボトルネックの１つとなっている。
本発明の対象であるＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインを形成するタンパク質についても、これまでは取得されておらず、またその構造情報も未知であり、これらを創薬等に利用することはできなかった。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたもので、下記のようなタンパク質、その製造方法、それをコードするポリヌクレオチド、そのタンパク質に対する抗体、それらを用いるスクリーニング方法などを提供する。
（１）配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はその塩。
（２）配列番号３、５、７のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はそれらの塩。
（３）配列番号５に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜５個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が９２〜１０６であるタンパク質又はそれらの塩。
（４）（１）、（２）又は（３）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（１）、（２）又は（３）に記載のタンパク質と実質的に同一の細胞増殖抑制機能を有するタンパク質又はそれらの塩。
（５）（１）〜（４）に記載されたタンパク質のいずれか１つのタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（６）配列番号２、４、６、８のいずれか一つに記載された塩基配列を含有する（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）（５）又は（６）に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（８）（５）又は（６）に記載のポリヌクレオチドで形質転換させた形質転換体。
（９）（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質に対する抗体。
（１０）（８）に記載の形質転換体を培養し、タンパク質を生成させる工程を含む、（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質またはそれらの塩の製造方法。
（１１）無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質又はそれらの塩の製造方法。
（１２）（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
（１３）（９）に記載の抗体を用いた（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質を含むタンパク質又はそれらの塩の定量方法。
（１４）（１３）に記載の定量方法を用いた、（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質を含むタンパク質またはそれらの塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
（１５）（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質を細胞内で発現させる工程と、当該細胞内における遺伝子の発現状態を調べる工程と、を含む、（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質と関連する遺伝子を特定する方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で特定する工程とを含む（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法。
（１７）前記タンパク質の立体構造に関する情報が、立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載の立体構造情報のうちアミノ酸番号８〜９８番目のアミノ酸残基からなるタンパク質の立体構造情報である（１６）に記載のスクリーニング方法
（１８）立体構造座標表１に記載の立体構造情報のうち、（Ｖａｌ２６、Ｌｙｓ２７、Ｇｌｕ４７、Ａｒｇ６７、Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ８６）のアミノ酸残基に相当する部分の情報を用いる（１７）に記載のスクリーニング方法。
（１９）（１６）〜（１８）のいずれか一つに記載されたスクリーニング方法によって、特定された活性部位と相互作用する化合物を候補化合物として用意し、（１）〜（４）のいずれか一つに記載されたタンパク質と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む（１）〜（４）のいずれか一つに記載されたタンパク質またはその塩及び／又は（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
（２０）立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載されたタンパク質の立体構造のうちアミノ酸番号８〜９８番目のアミノ酸残基のタンパク質の立体構造情報に関する情報を用いて、（１）〜（４）のいずれか一つに記載のタンパク質のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する構造未知タンパク質のホモロジーモデリングを行い、前記構造未知タンパク質の立体構造を推定する方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１〜４におけるＳＤＳゲル電気泳動図を示す。図１（ａ）は、実施例１のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図１（ｂ）は、実施例２のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図１（ｃ）は、実施例３のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図１（ｄ）は、実施例４のＳＤＳゲル電気泳動図を示す。
図２は、各比較例のＳＤＳゲル電気泳動図を示す。図２（ａ）は比較例１のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図２（ｂ）は比較例２のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図２（ｃ）は比較例３のＳＤＳゲル電気泳動図を示す。
図３は、配列番号１に記載されたタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す。図３（ａ）は、１次元核磁気共鳴スペクトルを表し、図３（ｂ）は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを表す。
図４は、配列番号３に記載されたタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す。図４（ａ）は、１次元核磁気共鳴スペクトルを表し、図４（ｂ）は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを表す。
図５は、配列番号５に記載されたタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す。図５（ａ）は、１次元核磁気共鳴スペクトルを表し、図５（ｂ）は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを表す。
図６は、配列番号７に記載されたタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す。図６（ａ）は、１次元核磁気共鳴スペクトルを表し、図６（ｂ）は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを表す。
図７は、２９３細胞、及びＨｅＬａ細胞を用いた生細胞数の測定結果を表す図である。
図８は、実施例９のウェスタンブロッティングの検出像を示す図面に変わる写真である。レーン１はＨｅＬａ細胞抽出液の上清のみ（対照）、レーン２はＨｅＬａ細胞にＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）とＦＬＡＧ配列を発現させたもの（対照）、レーン３は、ＨｅＬａ細胞にＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）とＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（４６４−５５４）にＦＬＡＧ配列を付加したものを発現させたもののレーンを示す。
【発明を実施するための最良の形態】（本発明のタンパク質）
本発明のタンパク質は、立体構造をもったドメインを形成するタンパク質である。本発明は、より具体的には、配列番号１、３、５、７のいずれか一つに記載されるＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質、又は配列番号５に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜５個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が９２〜１０６であるタンパク質（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に０〜１０個、Ｃ末端に０〜５個のアミノ酸残基を付加したタンパク質）に関する。
以下、本発明のタンパク質の機能などについて説明する。
ＣＡＰ−Ｇｌｙは、ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｇｌｙｃｉｎｅ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｍａｉｎの略であり、細胞内小器官や染色体を細胞内の微小管に結合する役割を果たすタンパク質を構成する。ＣＡＰ−Ｇｌｙドメインは、保存性の高い約４２残基からなるグリシンに富んだ領域を含む［Ｒｉｅｈｅｍａｎｎ  Ｋ．，Ｓｏｒｇ  Ｃ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｏｕｒ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８：８２−８３（１９９３）］。このドメインを含むタンパク質としては、細胞内小胞体と微小管を接続する中間径フィラメントに関連する１６０ｋＤａのタンパク質のレスチン（ｒｅｓｔｉｎ）（細胞質のリンカータンパク質１７０またはＣＬＩＰ−１７０とも呼ばれる）、脊椎動物のダイナクチン［１５０ｋＤａのダイニン関連ポリペプチド（ＤＡＰ）］、アクティベータＩの主要な成分であるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｇｌｕｅｄ複合体、有糸分裂期の微小管の形成・安定化および対合期における紡錘体融合に必要と考えられる酵母タンパク質ＢＩＫ１、酵母タンパク質ＮＩＰ１００（ＮＩＰ８０）、ヒトタンパク質ＣＫＡＰ１／ＴＦＣＢ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅタンパク質のａｌｐ１１、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのタンパク質と推定されるＦ５３Ｆ４．３などが知られている。
なお、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質と疾病との関連については、実施例によりＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインに細胞増殖抑制効果があることが示されたことと、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインがＩＫＫ−ガンマ（ｇａｍｍｍａ）と結合することが示されたことから、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインは癌関連疾患の原因遺伝子の一つであると予測できる。すなわち、実施例８では、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質は、ＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞）及び２９３細胞において増殖抑制効果を示し、実施例９ではＩＫＫ−ｇａｍｍａとの結合性を示した。ここでＩＫＫ−ｇａｍｍａは、転写調整因子ＮＦ−ｋＢと結合してＮＦ−ｋＢの転写促進機能を抑制する因子であり、またＮＦ−ｋＢは癌遺伝子ＲｅＩファミリーであるｐ５０とｐ６５によりヘテロ複合体を形成している。ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインは、ＩＫＫ−ｇａｍｍａと結合し、活増殖抑制能を示すことから、ＩＫＫ−ｇａｍｍａに結合してＮＦ−ｋＢの転写促進を抑制しているものと考えることができる。このようにＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインにより細胞は増殖抑制の制御をうけるため本発明のタンパク質は、癌抑制遺伝子産物としての機能を有している。癌抑制遺伝子に変異が起き増殖抑制活性が低下すると、癌が発病することはよく知られた事実である（田矢洋一ほか  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ用語ライブラリー  癌遺伝子・癌抑制遺伝子  ｐ１１３−１１５  羊土社  ２０００）。網膜芽細胞腫を引き起こすレチノブラストーマ遺伝子が有名である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８１，３２３−３３０  １９９５）。殊に、本発明に利用した遺伝子（ＫＩＡＡ０８４９）は、ヒトのターバン腫瘍症候群の原因遺伝子であることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５，１６０−１６５  ２０００）。ＫＩＡＡ０８４９の発現するタンパク質のどのドメインが疾病の原因であるかは未だ不明であるが、本発明で例示した、本発明のタンパク質の癌抑制遺伝子的な機能を考えると、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質が本疾病の原因であることが予測される。本発明のタンパク質は、少なくともターバン症候群に対する薬物のスクリーニングへの利用や、立体構造情報を利用しての薬物の最適化、および癌関連の疾患の予防、治療に有効に用いられ得る。
また、本発明は、配列番号１、３、５、７のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜５個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列において、１若しくは数個（１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号５に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜５個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれかと実質的に同一の機能を有するタンパク質またはその塩も提供する。
なお、「本発明のタンパク質と実質的に同一の細胞増殖抑制機能を有する」とは、本発明のタンパク質が有する細胞増殖抑制機能を有することを意味する。ここで、そのような分子機能としては、ＩＫＫ−ｇａｍｍａとの結合性のほか、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質が有する機能や活性が上げられる。
ＩＫＫ−ｇａｍｍａは、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｋａｐｐａＢの略であり、ＮＦ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ）−ｋＢに結合する。ＮＦ−ｋＢは、免疫グロブリンｋＬ鎖遺伝子のイントロンエンハンサーに結合する転写因子であり、ｐ５０とｐ６５との２種類のサブユニットからなるヘテロ２量体である。ここでｐ５０、ｐ６５はともに癌遺伝子Ｒｅｌに相同性を示し、Ｒｅｌファミリーに属する。その機能は、ＮＦ−ｋＢは当初Ｂ細胞に特異的でＢ細胞の分化に伴って発現する細胞特異的な遺伝子の発現を制御しているものと考えられた。その後、非Ｂ細胞にも同様の効果がみられた。また、ＮＦ−ｋＢは免疫グロブリン遺伝子の他にも様々な遺伝子の転写調節領域にも結合し、これらの遺伝子の転写を活性化する。非Ｂ細胞では、不活性型のＮＦ−ｋＢがＩＫＫ−ｇａｍｍａと結合し複合体を形成している。細胞外刺激によりＩＫＫ−ｇａｍｍａはリン酸化による不活性化を受け、その結果、ＮＦ−ｋＢが解離して各核内に移行して活性型となり、転写因子として働く。ＩＫＫ−ｇａｍｍａのサブユニットとしては、ＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、ｂｃｌ−３が知られている。
（タンパク質の配列）
本発明のタンパク質の配列決定に関しては、ｉ）公知のタンパク質配列情報に基づき、対象とする機能を有するドメイン領域を推定した後、ｉｉ）その推定ドメイン領域のアミノ酸配列を基本パターンとするドメイン候補配列パターンを用意し、ｉｉｉ）各配列パターン毎にタンパク質発現を行い、得られたドメインを形成するタンパク質の構造安定性評価により、良好な結果を示すものを目的ドメインとし、この目的ドメインのアミノ酸配列により各タンパク質を定義する。即ち、本発明のタンパク質は、全長タンパク質中のある一部分（目的とする機能を有する）を断片化してドメインを形成するタンパク質として発現させた時に、安定な構造を有するものを経験的に選別したものであり、ドメイン領域予測の段階では数１００のオーダーで存在するドメイン候補が、種々の要因により絞り込まれて実際は１０〜数１０のオーダーまで厳選される。従って、このように選別されたタンパク質を、立体構造解析に用いることにより、高精度で且つ信頼性に優れた構造解析を行うことが可能となる。
（ドメイン領域の推定）
全長タンパク質中のドメイン領域を推定する手法としては、バイオインフォーマティクスなどの情報科学的な手法や計算科学的な手法（特願２００１−３０９４３４号明細書参照）、ｄｅｌｅｔｅｄＤＮＡライブラリーとＧＦＰの組み合わせ（特開２００２−２６２８７３号公報参照）、プロテアーゼによる限定分解などの実験的な手法等、いずれも利用可能であり、特に限定されるものではなく、より精度の高い手法を用いることにより、ドメイン候補群から目的ドメインを選び出す作業効率が向上する。
（ドメイン候補配列パターンの作製）
上記ドメイン候補配列パターンは、上述のように推定されたドメイン領域を基準にしてドメイン境界の位置をＮ末端側又はＣ末端側に伸ばしたり縮めたりすることにより作製される。
例えば、推定ドメイン領域のＮ末端側のドメイン境界におけるアミノ酸残基の位置より、Ｎ末端側に数から数十残基分伸長させた、又はＣ末端側に数から数十残基分短縮したおよそ数十種類の境界を新たに設け、それらの境界をＮ末端とするドメイン候補配列パターンが用意される。同様に、推定ドメイン領域のＣ末端側のドメイン境界においても数種類のドメイン境界を選定し、各境界をＣ末端とするドメイン候補配列パターンが作製される。
（ドメイン境界の伸縮）
上記推定ドメイン領域のドメイン境界を伸縮させる方法としては、例えば上記ドメイン候補配列パターンに対応したｃＤＮＡを作成できるＰＣＲプライマーを個々に合成して、ＰＣＲにより作成する方法が挙げられ、特に特開２００３−９８８０号公報に示される２段階ＰＣＲ法が好適である。
（ドメイン候補配列パターンからの目的ドメインの抽出）
このようなドメイン候補配列パターンから実際に安定な立体構造を有する目的ドメインを選び出すためには、まず上述のようにして作製されたドメイン候補配列パターンのｃＤＮＡを用いてそれぞれタンパク合成を行う。
このドメイン候補配列パターンの発現系としては、特に限定されず、従来より公知の発現系がいずれも使用可能である。
次に、得られたタンパク質が実際に安定な立体構造をとっているかどうかを判定し、立体構造を有することが確認できたものを本発明におけるタンパク質として採用する。
このタンパク質の立体構造の安定性の指標としては、例えば合成されたドメインタンパク質が可溶性タンパク質としてＳＤＳゲル電気泳動等により検出され、かつ適当な分子量相当な均一なバンドとして検出されるかという生化学的指標や、Ｃ末端側に融合させたＧＦＰの蛍光強度、ＮＭＲスペクトル、ＣＤスペクトルなどの分光学的手法等が挙げられる。
従来のタンパク質の配列決定の過程では、例えば▲１▼上記タンパク質合成で、目的とするドメインを形成するタンパク質が発現しない、或いは▲２▼発現はしたものの、凝集を起こす、溶解度が低い等の問題があった。本発明者らは、このような問題点を克服し、本発明を完成させるに至った。
（安定な立体構造を有することの確認）
上記ＮＭＲスペクトルにおいてドメインを形成するタンパク質のフォールディングの判定を以下に示す。
１Ｄスペクトルにおいて、ドメインを形成するタンパク質がフォールドしていない場合はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなどのメチル基プロトンに由来するシグナルが０．８ｐｐｍ付近に観測される。しかしフォールドしている場合はメチル基プロトンの環境が変化し、シグナルが高磁場側（０．７ｐｐｍから−０．５ｐｐｍ付近）にシフトする。
１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣにおける判定は、クロスピーク収束度合いとシグナル強度の均一性の評価を目視により行うことが挙げられる。すなわち、クロスピークが密集した場合は、立体構造を形成していない状態とし、逆に分散した場合は安定な立体構造を形成している状態として立体構造の安定性の評価を行う。
（ベクター）
本発明の（組換え）ベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。簡便で効率が良いことから多くの場合、ベクターを用いて形質転換が行われる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明のポリヌクレオチドを導入した組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ６９，２１１０−２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７５，１９２９−１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３，１６３−１６８）等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
（抗体）
本発明のタンパク質を抗原として用いて、その抗原に対する抗体を調製することができる。
［本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製］
前記の抗原を用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、例えばアジュバントを用いて１００〜５００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなどの非ヒト哺乳動物）に投与することにより行われる。投与部位は静脈内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
［タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製］
上記抗原を用いて動物を免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うため、前記と同様アジュバント（市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を混合してもよい。
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。抗原の１回の投与量は、マウスの場合１匹当たり５０μｇである。投与部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、最低２〜３回行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
［細胞融合］
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株として、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えば、ミエローマ細胞の具体例としてはＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１５：１〜２５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在のもとで、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
［ハイブリドーマの選別及びクローニング］
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地を用いて培養し、生育する細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的に単クローン抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
［モノクローナル抗体の採取］
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地又はＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で３〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。
（本発明のタンパク質の製造）
本発明のタンパク質は、例えば、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。「本発明の形質転換体を培養する方法」は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、好ましくは、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、好ましくは無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。この精製工程の間又は後において、プロテアーゼ処理により精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。
（無細胞タンパク質合成系を用いるドメインを形成するタンパク質の製造方法）
本発明は、無細胞タンパク質合成系を用いる、配列番号１、３、５、７のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を有するドメインを形成するタンパク質、および配列番号５に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜５個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が９２〜１０６であるタンパク質の製造方法も提供する。
無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。「無細胞タンパク質合成系」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、及びＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む。無細胞タンパク質合成系は、系を容易に改変することができるため、目的のタンパク質に適した発現系を構築しやすいという利点がある。なお、無細胞タンパク質合成系の詳細については、特許公開２０００−１７５６９５号などに記載されている。
［細胞抽出液］
粗細胞抽出液は、細菌（例えば大腸菌等）、菌類（例えば出芽酵母等）、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核および原核生物細胞からの抽出液であってもよい（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
粗細胞抽出液はリボソーム、ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に必要な成分を含むことが好ましい。粗抽出液の調製は、例えばＰｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに記載の方法を使用できる。具体的には、フレンチプレッスによる破砕（Ｐｒａｔｔら、上掲）やグラスビーズを用いた破砕によって行うことができる。好ましい細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液である。Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌ＢＬ２１Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ株から既知の方法、例えばＰｒａｔｔら（上掲）の方法に従って調製できるし、あるいはＰｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを使用してもよい。細胞抽出液としては、主に大腸菌、小麦胚、ウサギ網赤血球由来のものが使用される。
［透析装置］
透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装置を用いることができる。小スケール反応用装置としては、例えばＤｉｓｐｏ  Ｄｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）やＳｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）が挙げられる。
また、大スケール反応用装置としては、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を例示できる。
［透析内液］
無細胞タンパク質合成系における透析内液（すなわち、タンパク質合成反応液）には、大腸菌Ｓ３０等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）およびｔＲＮＡ、などを含んでもよい。
その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、ＲＮアーゼ阻害剤、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。一方、透析外液（すなわち、タンパク質合成基質溶液）は、透析内液組成から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、塩類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。
［緩衝液］
緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はタンパク質を構成する２０種のアミノ酸である。また、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどの市販の酵素を使用できる。
透析膜の内部に上記透析内液を、一方その外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪拌（回転攪拌など）し、生成した目的タンパク質を、透析内液または外液から回収することができる。温度および攪拌速度などの反応条件は、タンパク質の種類に応じて任意の条件を使用できる。タンパク質の合成の場合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは３７℃であるが、高度好熱菌由来の菌体抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系では５０℃を超える温度でもよい。
また、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば１００〜２００ｒｐｍを使用できる。目的のタンパク質の生成を監視しながら、反応時間を適当に選択することができる。
上記無細胞タンパク質合成系の透析外液を、反応速度が低下した時点で新鮮なものと交換することが好ましい。また、透析膜の分子量限界が１００００ダルトンを超えるもの、好ましくは約５００００ダルトンおよびそれ以上のものを使用する場合には、タンパク質の生産量をさらに高めることができる。
［タンパク質の精製］
生成タンパク質の精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法は、タンパク質の性質に応じて従来公知のものを単独にまたは適宜組合わせて使用できる。例えば硫酸アンモニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げることができる。この精製工程の間又は後においてプロテアーゼ処理により、精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。生成タンパク質の同定および定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法としては、本発明のタンパク質またはその塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む前記タンパク質と相互作用を有する化合物のスクリーニング方法が挙げられる。ここで、「相互作用を有する」とは、化合物とタンパク質が結合して、そのタンパク質の分子機能及び／又は生理活性を抑制または増強すること、などをいう。このスクリーニング方法においては、そのタンパク質と候補物質を接触させて、そのタンパク質の分子機能または生理活性が変化するか否かを測定する。
［ＮＭＲを用いた相互作用物質探索］
相互作用物質探索にＮＭＲを用いる場合、候補物質の添加前後でのタンパク質のシグナル変化の有無により、相互作用の有無を判定することができる。すなわち、相互作用候補物質がタンパク質と相互作用する場合には、タンパク質の相互作用部位近傍に由来するＮＭＲシグナルの化学シフト値、線幅、個数等に変化が起きることが期待されるので、その変化を検出することで相互作用の有無を判定できる。特に１５Ｎで標識したタンパク質は調製が比較的容易であり、そこから得られる１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルは、分解能や感度が比較的高く、添加した相互作用候補物質由来のＮＭＲシグナルの影響を受けにくいため、その有用性は高い。
（定量方法）
本発明のタンパク質は、例えば本発明の抗体を用いることによっても定量することができる。抗体を用いたタンパク質の定量方法としては、例えば、サンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法、ネフメトリー法などが挙げられる。また、放射性同位体や酵素、蛍光物質などの標識物質を用いて検出することもできる。
（定量方法を用いたスクリーニング方法）
本発明の抗体は、本発明のタンパク質と特異的に結合するため、本発明の抗体を用いることで、本発明のタンパク質と相互作用する化合物のスクリーングなどに用いることができる。この際のスクリーニング方法としては、公知のスクリーニング方法を用いることができる。
なお、本発明の抗体を用いた、本発明のタンパク質の定量方法によれば、本発明のタンパク質が関与する疾患の予防・診断を行うことができる。
（立体構造解析）
タンパク質の立体構造は、ＮＭＲによる構造解析、Ｘ線構造解析などによって解析することができる。
（ＮＭＲ）
ＮＭＲに用いる試料としては、特に限定されるわけではないが、好ましくは、タンパク質中の１２Ｃ、または１４Ｎを１３Ｃ、１５Ｎ核で安定同位体標識した試料を用いる（多核多次元ＮＭＲ測定）。タンパク質を安定同位体標識する技術は慣用技術であり、例えば、Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．＆  Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，ｐ．１３９０−１３９９，１９９１等の文献に記載されている。特に、主鎖１５Ｎ均一安定同位体標識したタンパク質試料を用いた解析が容易であり好ましい。また、タンパク質の主鎖の骨格を、１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈのうち少なくとも２種類以上の同位体標識したものを使用してもよい（特表２００１−５１４２３９）。
好ましくは、ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトルの観測等による１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数の測定を行う。「ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトル」とは、準位相、反位相の２つのＨＳＱＣスペクトルを同時に観測し、両者のスペクトルの足しあわせをすることにより、シグナルのオーバーラップを防いで、効果的に１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数を読みとるための測定法である。
２種類以上のＮＭＲ法により化学シフト帰属が行われる。例えば、２次元ＮＭＲとしては２Ｄ、ＤＯＱ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＨＳＱＣ等、多次元ＮＭＲとしては、ＨＮＣＯ、ＨＣＡＣＯ、ＨＮＣＡ、ＨＣＡ（ＣＯ）Ｎ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＨＢ、ＣＢＣＡＮＨ、Ｈ（ＣＡ）ＮＨ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＡＮＨ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＡＣＯＮ、１５Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ等が公知技術として知られている。ＮＭＲの一般的手法は周知であり、例えば、「タンパク質のＮＭＲ」（共立出版、１９９６、荒田洋治）；「日本生化学会編  基礎生化学実験法  第３巻  タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」第１８章ＮＭＲによる立体構造解析（東京化学同人、２００１年２月）；伊藤隆ら、日本農薬学会誌２１，ｐ．４５０−４５９、１９９６；田中俊之、化学と工業  第４９巻  第２号  ｐ．１５５−１５８、１９９６等に詳述されている。
立体構造解析にＮＭＲを用いる場合、タンパク質の各プロトン間の核オーバーハウザー効果の大きさから各プロトン間の距離を見積もり、その距離情報に基づき立体構造を決定する方法が一般的である。化学シフト値、スカラーカップリング値、残余双極子カップリング値、水素結合等の情報を加えて立体構造を精密化することも可能である。
ＮＭＲデータから構造解析を行うための多くのプログラムが周知である。好ましくは、化学シフト帰属のためのものとして、ＮＭＲ  Ｐｉｐｅ、ＰＩＰＰ、Ｃａｐｐ、Ｆｅｌｉｘ、ＮＭＲ  Ｖｉｅｗ、ＸＥＡＳＹ、立体構造計算ソフトとしてＸ−ＰＬＯＲ、ＣＮＳ、ＤＹＡＮＡ、ＤＹＮＡＭＯ等を用いて構造解析を行う。
（Ｘ線結晶構造解析）
立体構造解析にＸ線結晶構造解析を用いる場合、結晶化させたタンパク質のＸ線回折像に基づき電子密度図を計算し、立体構造を決定する。すなわち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像をもとに、該蛋白質の３次元構造を明らかにしていくものである（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬ  ＬＯＧＲＡＰＨＹ，１−５６５頁，（１９７６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
（立体構造情報に基づくスクリーニング方法）
次に、本発明は、前記タンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で検索する工程とを含む、前記タンパク質またはその塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法をも提供する。
（インシリコ  スクリーニング）
分子の３次元構造に基づく薬物設計については、医薬品の開発・第７巻「分子設計」（廣川書店）をはじめとして数多くの総説がある。具体的には、第一にＦｌｅｘｉＤｏｃｋ、ＦｌｅｘＸ等のフレキシブルリガンドバインディングシミュレーションソフトウエアを用いて、Ｏｒａｃｌｅ等のリレーショナルデータベースに格納された低分子（分子量１０００以下）化合物のライブラリー（たとえば約１５００００種）をコンピュータでスクリーニングする。このライブラリー内の化学物質はＣＯＮＣＯＲＤ等のプログラムで３次元構造を指定し、活性部位にはめ込める物質を選択することができる。選ばれた物質の中からＩｎｓｉｇｈｔＩＩやＭＯＥ等のシミュレーションプログラムを用いて肉眼により更によく活性部位にあてはまる化合物を絞り込む。一連の過程で利用されるコンピュータソフトウエアは、いずれも以下のような市販のものである。
ＦｌｅｘｉＤｏｃｋ：  Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．ＦｌｅｘＸ：  Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．ＣＯＮＣＯＲＤ：  Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．Ｏｒａｃｌｅ：Ｏｒａｃｌｅ  Ｃｏｒｐ．Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．ＭＯＥ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．
他の方法は、未知の物質を含めた候補化合物のコンピュータによる設計である。この方法には、メチル、エチル等の化学基を活性部位に並べて適合するものを探す方法と、原子を活性部位にコンピュータプログラムを用いて並べていく方法とが知られている。
（ウエットスクリーニング）
本発明のタンパク質と相互作用する候補化合物の有力候補を選択するために、インシリコスクリーニングにより得られた候補化合物と本発明のタンパク質と接触させ、本発明のタンパク質の分子機能又は生理活性を測定する。候補化合物と本発明のタンパク質の立体構造データをもとに候補化合物を修飾し、より望ましい構造とする。
絞り込まれた化合物を合成し、実際に前記タンパク質と作用させ、スクリーニングする。前記タンパク質の活性を変化させた化合物を、更に動物実験によってインビトロでの活性や、体内動態、あるいは毒性等に関する試験を行う。
（相互作用する物質を含む医薬）
本発明のタンパク質と相互作用を有する物質は、そのタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療剤として用いることができる。そのような医薬は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
（配列の説明）
本明細書の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号１］
ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４−５５４））のアミノ酸配列を示す。
［配列番号２］
配列番号１のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
［配列番号３］
ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４５４−５５４））のアミノ酸配列を示す。
［配列番号４］
配列番号３のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
［配列番号５］
ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４５４−５５９））のアミノ酸配列（配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端にそれぞれアミノ酸残基ＮＴＡＰＶＱＥＳＰＰ、ＶＳＮＱＩが付加したアミノ酸配列）を示す。
［配列番号６］
配列番号５のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
［配列番号７］
ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４−５５９）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号８］
配列番号７のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
［配列番号９］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１０］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１１］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１２］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１３］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１４］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１５］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１６］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１７］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１８］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１９］
以下の実施例で用いられるプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号２０］
配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端に複数のアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列を示す。
［配列番号２１］
ＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号２２］
配列番号２１に示されるタンパク質のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【実施例】  以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
［実験例１］
（１）ドメイン領域の推定
ドメイン領域の推定を、以下の手順で行った。
まず、１）＜ＳＣＯＰ法＞問い合わせ配列について、タンパク質データベースＳＣＯＰ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．５５）に含まれる配列と相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法としてＢＬＡＳＴＰを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に、相同性があったと判断した。
２）＜ＰＦＡＭ法＞問い合わせ配列について、タンパク質モチーフデータベースＰＦＡＭ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．５）に含まれる配列プロファイルと相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法としてＨＭＭＥＲを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。
３）＜ＰｒｏＤｏｍ法＞問い合わせ配列について、タンパク質モチーフデータベースＰｒｏＤｏｍ（２０００年１月にＷｅｂより取得したバージョン）に含まれるコンセンサス配列のいずれかに対して相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法として、ＢＬＡＳＴＰを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。
４）＜ＮＲ法＞問い合わせ配列について、タンパク質配列データセット（ＮＣＢＩ−ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合、その相同性領域をグループとしてまとめ、ドメインとして予測した。
５）＜ＰＡＳＳ法＞問い合わせ配列について、タンパク質配列データセット（ＮＣＢＩ−ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、相同性が検出された頻度を計算した。頻度の高い部分を山、低い部分を谷として表示し、谷となっている部分でドメイン境界となるように、一つの山をドメインとして予測した。
６）＜Ｎｏ  Ｈｉｔ法＞以上１）から５）までの方法のいずれを用いてもドメインとして検出されなかった領域（残余領域）をドメインとして予測した。
７）＜差分ドメイン境界設定法＞上記６つのドメイン予測について、ヒット領域が重なっている場合の優先順位は１）を最優先として、以下２）、３）、４）、５）、６）の順序とし、ヒット領域が重なっているものの、ドメイン境界のずれが３０残基以上あり、かつ低い優先度での定義のほうがＮ末側あるいはＣ末側により長く存在している場合は、その差分の配列を別途ドメインとして予測した。
以上のいずれかの方法で推定されたドメイン領域のうち、Ｌｏｗ−Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ領域（複雑性の低い配列領域）を１箇所以上有するものや、全長３０残基に未満のものは、除外した。
ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質）のアミノ酸配列について上述のようにしてドメイン領域の推定を行い、ＮＲ法によりアミノ酸残基番号４９６−５３９の範囲をドメイン領域と推定した。このドメイン領域は、Ｌｏｗ−Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ領域（複雑性の低い配列領域）をもたず、全長も３０残基以上であるため、最終的にこの領域をバイオインフォーマティクスによるドメイン推定の結果とした。
（２）  コンストラクトの製造
このＫＩＡＡ０８４９タンパク質中のアミノ酸残基番号４９６番から５３９番までのアミノ酸配列を有するタンパク質（ここで、推定ドメインと称する。）について、後述の無細胞タンパク質合成系を用い、タンパク質合成反応を行った。その後、得られた試料について定法に従ってＳＤＳゲル電気泳動を行い、タンパク質の発現状態を調べた。
その結果、推定ドメインのアミノ酸配列情報からは、目的とするタンパク質の発現を行うことができなかった。
そこで、この推定ドメインのアミノ酸配列を基準にして、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質のアミノ酸配列に対し、該推定ドメインのドメイン境界の位置をＮ末端およびＣ末端においてそれぞれ数残基ずつ伸ばしたり縮めたりしたコンストラクトを系統的に作成した。
即ち、例えばＫＩＡＡ０８４９タンパク質のアミノ酸残基番号４９６番を基準とし、Ｎ末端側に１０残基ずつ伸縮させ、またＣ末端側に１０残基ずつ短縮させたパターンと、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質のアミノ酸残基番号５３９番を基準とし、Ｎ末端側に５残基ずつ短縮させ、またＣ末端側に５残基ずつ伸長させたパターンをそれぞれ用意した。
このようにして作成したコンストラクトを全て用いて、個々のパターンについてタンパク質発現を行い、その発現状態をＳＤＳゲル電気泳動にて評価した。
【実施例１】  本実施例では、上述のようにして作成したコンストラクトのうち、立体構造解析に用いて好適なＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインを有するＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４〜５５４）：（配列番号１）について検討した結果を説明する。
（１）発現ベクターの構築
▲１▼第１次ＰＣＲ
ＫＩＡＡ０８４９タンパク質をコードするｃＤＮＡ（ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０２０６５６．２）  がプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋にクローン化されたプラスミドを含む組換え大腸菌培養液を用いて、５’プライマー１（配列番号１４）、３’プライマー１（配列番号１５）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成は、表１に示す通りとし、プログラムは、通常のＰＣＲのプロトコルに従った。
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▲２▼第２次ＰＣＲ
次に、上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物と、Ｔ７プロモーター配列の下流にＨｉｓタグ配列を有する５’プライマー２（配列番号１７）とＴ７ターミネーター配列を有する３’プライマー２（配列番号１８）、及びユニバーサルプライマーＵ２（配列番号１９）とを用いて、第２次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成は、表２に示す通りとし、プログラムは上記第１次ＰＣＲと同様とした。
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この結果、Ｔ７プロモーターの制御下で、Ｈｉｓタグ配列とＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４〜５５４）との融合タンパク質を発現することのできる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅できた。
▲３▼クローン化
上記第２次ＰＣＲ反応により得られたＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡ−クローニングキット（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ）（インビトロジェン（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）社）により、ベクターｐＰＣＲ２．１（インビトロジェン社）にクローン化することにより、発現ベクターＰ０１１２１３−０３を構築した。
（２）ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４〜５５４）タンパク質の発現
▲１▼透析法を用いた無細胞タンパク質合成法による１５Ｎ標識ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインの合成
大腸菌Ｓ３０抽出液は、Ｚｕｂａｙら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉ．７，２６７−２８７，１９７３）の方法に従って、大腸菌ＢＬ２１コドン  プラス（ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ）株から調製した。
タンパク質合成反応は、表３に示す反応液組成の反応液３ｍｌ、および表４に示す透析外液組成の透析外液３０ｍｌのスケールで、液温を３０℃に維持しつつ一晩行った。
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▲２▼ＳＤＳゲル電気泳動による発現状態の判定
合成反応終了後、常法に従ってＳＤＳゲル電気泳動を行い、得られたタンパク質の発現状態を判定した。
その結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）から、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４〜５５４）（配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質）が発現していることが確認できた。なお、図１（ａ）において、第１レーンは精製時の目的フラクションを含むタンパク質、Ｍはマーカーレーンを表す。
【実施例２〜４】
以下に説明する実施例２〜４では、上述のようにして作成したコンストラクトのうち、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４５４〜５５４）（実施例２）、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４５４〜５５９）（実施例３）、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４〜５５９）（実施例４）について検討した。それらの結果を、以下に説明する。
実施例１における第１次ＰＣＲ、及び第２次ＰＣＲに用いた各種プライマーをそれぞれ表５に示すように代え、それ以外は実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、得られた直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡとしてタンパク質合成を行った。
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合成反応終了後、実施例１と同様にして、ＳＤＳゲル電気泳動による発現状態の判定を行った。
その結果を、図１（ｂ）〜図１（ｄ）示す。図１（ｂ）は、実施例２のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図１（ｃ）は、実施例３のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図１（ｄ）は、実施例４のＳＤＳゲル電気泳動図を示す。なお、図１（ｂ）〜図１（ｄ）において、第１レーンは精製時の目的フラクションを含むタンパク質、Ｍはマーカーレーンを表す。図１（ｂ）には、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４５４〜５５４）に対応する位置にバンドが見られる。このことから、実施例２において、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４５４〜５５４）が発現したことがわかる。また、図１（ｂ）と同様にして、図１（ｃ）から、実施例３において、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４５４〜５５９）が発現したことがわかる。さらに、図１（ｄ）から実施例４において、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４〜５５９）が発現したことがわかる。
［比較例１〜３］
上述のようにして作成したコンストラクトのうち、ＫＩＡＡ０８４９タンパク質のアミノ酸残基番号４７４番目から５３９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドａ（比較例１）、アミノ酸残基番号４５４番目から５３９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドｂ（比較例２）、及びアミノ酸残基番号４５４番目から５４９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドｃ（比較例３）について、上述の実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、得られた直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡとしてタンパク質合成を行った。この際、実施例１における第１次ＰＣＲに用いた各種プライマーとしては、本比較例に適したものとして設計したアミノ酸配列のものに代えた。
そして、得られた試料について、ＳＤＳゲル電気泳動により発現状態の判定を行った。図２に比較例におけるＳＤＳゲル電気泳動図を示す。図２（ａ）は比較例１のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図２（ｂ）は比較例２のＳＤＳゲル電気泳動図を示し、図２（ｃ）は比較例３のＳＤＳゲル電気泳動図を示す。なお、第１レーンは生成物全体を表し、第２レーンは上清、Ｍはマーカーレーンを表す。
図２（ａ）において、ポリペプチドａのアミノ酸配列から推定される分子量であるＭＷ＝１１．１ｋＤａの位置にバンドが現れていない。したがって、図２（ａ）から、比較例１においては、目的とするタンパク質が発現しなかったことがわかる。
また、図２（ｂ）においても、ポリペプチドｂのアミノ酸配列から推定される分子量である１３．１ｋＤａの位置にバンドが現れていない。したがって、図２（ｂ）から、比較例２においては、目的とするタンパク質が発現しなかったことがわかる。
次に図２（ｃ）においては、ポリペプチドｃのアミノ酸配列から推定される分子量である１４．２ｋＤａに対応する位置よりも、上側にバンドが現れた。したがって、図２（ｃ）から、比較例３では、目的とするタンパク質が良好な発現状態で得られていないことがわかる。
【実施例５】上記の実施例１〜４の各種目的タンパク質（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７に記載されたタンパク質）について、構造安定性を評価した。
（１）１５Ｎ標識ドメインの精製
まず、上記の実施例１〜４の各種目的タンパク質の精製を行った。
１５Ｎ標識ドメインタンパク質の精製には、ヒスチジンタグとニッケルの親和性を利用した。精製に関する操作を、４℃の温度環境の下で行った。合成反応終了後、３ｍｌの反応液を４．２ｍｌの洗浄緩衝液［５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／３００ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭイミダゾール］で希釈、回収し、１９６０×ｇ、５分間遠心して沈殿を取り除いた。次に、得た上清を０．８ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン社）に通して吸着させ、９．６ｍｌの洗浄緩衝液を通すことで夾雑物を除去した。最後に４ｍｌの溶出緩衝液［５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／３００ｍＭ塩化ナトリウム／５００ｍＭイミダゾール］を通すことで、サンプルを樹脂から遊離させた。以上の手順により、０．８８ｍｇの精製サンプルを得た。
（２）構造安定性評価のための試料調製
精製サンプルをＮＭＲ測定に適した溶媒にするために、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液に置換した。その後、サンプルを０．２５ｍｌ（サンプル濃度０．２８ｍＭ）になるまで濃縮した。以上の操作を、限外ろ過装置（ビバスピン２；ザルトリウス社）を用いて行った。最後に０．０３ｍｌの重水を濃縮したサンプルに添加して、構造安定性評価用試料とした。
（３）ＮＭＲ測定による構造安定性評価
ＮＭＲ測定用のサンプル管として、シゲミ社の対称型ミクロ試料管（５ｍｍプローブ用）を用いた。ＮＭＲ測定は、６００ＭＨｚのＮＭＲ装置（Ａｖａｎｃｅ６００；ブルカー社）で、温度２５℃のもとで行った。判定には、１Ｈの１次元スペクトル（以後１Ｄスペクトルと略記）、および１Ｈ−１５Ｎ２次元ＨＳＱＣスペクトル（以後１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルと略記）を用いた。その条件は下表６のとおりであった。ＮＭＲ測定結果を図３〜図６に示す。
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図３〜図６は、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７に記載されたタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す。なお、図３〜図６において、図（ａ）は、１次元核磁気共鳴スペクトルを表し、図（ｂ）は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを表す。
図３（ａ）〜図６（ａ）には、１次元核磁気共鳴スペクトルのメチル領域の高磁場側（０．７ｐｐｍから−０．５ｐｐｍ付近）に、高磁場シフトしたシグナルが認められた。また、図３（ｂ）〜図６（ｂ）には、１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルには、７ｐｐｍから９ｐｐｍにわたって分離したアミドプロトンのシグナルが認められた。
これらのシグナルの現れ方は、安定な立体構造を形成しているタンパク質に特徴的なシグナルの現れ方であることから、上記実施例１〜４で得られた各タンパク質は安定な立体構造を形成していると判定した。
以上のように、上記の実施例１〜４においては、全長ＫＩＡＡ０８４９タンパク質からコンピュータによりタンパク質の構造・機能を有する構成要素（ドメイン）のアミノ酸配列を予測して、予測した領域を基準として種々のコンストラクトを全て作成してタンパク質発現を行い、実際に取得したタンパク質をＳＤＳゲル電気泳動でその発現状態を確認した。さらに安定な立体構造を有するか否かをＮＭＲの測定結果に基づいて評価し、全てのタンパク質について優れた構造安定性を確認した。
したがって、本実施例により、実際に安定な立体構造をもつ（フォールドする）ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインのアミノ酸配列を正確に決定できたことが確認された。
また、このような分子量の小さい、ドメインを形成するタンパク質を用いることで、精度の高い立体構造解析を比較的容易に行うことが可能となった。
そこで、実施例１のＫＩＡＡ０８４９タンパク質（４６４〜５５４）：配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質を用いて、以下のようにして立体構造解析を行った。
【実施例６】ヒトターバン腫瘍症候群に関与するガン抑制遺伝子（ＫＩＡＡ０８４９）産物に含まれるＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質のＮＭＲによる構造決定
（１）１３Ｃ１５Ｎ標識ドメインの精製
全ての炭素核および窒素核をそれぞれ安定同位体である炭素１３、窒素１５により置換した配列番号２０に記載されたタンパク質を、上述の無細胞タンパク質発現系により作成した。配列番号２０に記載されたタンパク質は、配列番号１に記載されたタンパク質のＮ末端にＧＳＳＧＳＳＧ、Ｃ末端にＳＧＰＳＳＧで表されるアミノ酸残基を付加したものであり、これらの付加配列は立体構造には影響を与えないものである。したがって、配列番号２０に記載されたタンパク質の立体構造を解析すれば、配列番号１に記載された本発明のタンパク質の立体構造に関する情報を得ることができる。
得られた高純度標品を高速遠心機用の限外濾過膜付タンパク質濃縮器を用いて標品濃度がおよそ０．８ｍＭとなるまで濃縮した。その後、ＮＭＲ解析用標品緩衝液により濃縮液を１０倍に希釈した。この濃縮、希釈の操作を３回繰返し、標品精製用の緩衝液をＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全に置換した。用いたＮＭＲ解析用標品緩衝液の組成は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトールであり、ｐＨは６．０であった。ＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全置換された標品の最終的な標品濃度は、およそ０．８ｍＭであった。得られた標品を、外径５ｍｍのＮＭＲ測定用試料管に注入した後、２５℃にて２時間保存することにより安定化させた。
（２）ＮＭＲ測定
ＮＭＲ実験には、スイス・ブルカー社製ＤＲＸ６００およびＤＲＸ８００を使用した。全ての測定を２５℃の温度環境下で行った。主鎖シグナルの帰属を目的としたＮＭＲ実験として、二次元スペクトルは１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ、三次元スペクトルはＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨ、Ｈ（ＣＣＣＯ）ＮＨ、Ｃ（ＣＣＣＯ）ＮＨ、１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹを測定した。また、側鎖シグナルの帰属を目的としたＮＭＲ実験として、二次元スペクトルは１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ、三次元スペクトルは脂肪族系側鎖用ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、同ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、同１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ、芳香族系側鎖用ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、同１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹさらにＨＮＨＢ、ＨＮ（ＣＯ）ＨＢを測定した。
（３）測定データの解析
測定データを、アメリカ・シリコングラフィックス社製ワークステーションオクタン（Ｏｃｔａｎｅ）２、およびオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）３８００を用いてフーリエ変換計算を行い、各二次元および三次元スペクトルを得た。得られたスペクトルデータに基づいて、アミノ酸残基における主鎖シグナルとしてα位およびβ位の炭素核であるＣαとＣβ、カルボニル基の炭素核であるＣ’、α位およびβ位の水素核であるＨαとＨβ、アミド基の水素核であるＨＮ、アミド基の窒素核であるＮを連鎖的に帰属した。この手法は、まずＨＮ（ＣＯ）Ｃａ上で隣接残基のＣαシグナルの化学シフト値に一致するシグナルをＨＮＣＡ上で検索し、自身と隣接する残基のＣαシグナルの連鎖性を明らかにする。この操作を繰り返すことによりプロリン残基および何らかの原因でシグナルが観測できない場合を除く全てのＣαシグナルを連鎖的に帰属できる。同様の操作を行うことにより、Ｃ（ＣＣＣＯ）ＮＨ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨとＨＮＣＡＣＢによりＣβシグナル、Ｈ（ＣＣＣＯ）ＮＨ、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨと１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹによりＨα、Ｈβシグナル、さらにＨＮＣＯによりＣ’シグナルを帰属することで、より正確に帰属を行うことができる。さらに、得られた主鎖帰属情報および側鎖帰属用に測定したスペクトルデータを用いてγ、δ、ε、ζ、η位の炭素核、窒素核、水素核の帰属を行う。以上の操作によりほぼ全てのアミノ酸残基に対するシグナルの帰属データを得た。また、１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ上の１１４２個のシグナル、脂肪族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ上の２１５８個のシグナル、芳香族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ上の２０９個のシグナルから距離制限データを得た。主鎖帰属の際に得られたＣα、Ｃβ、Ｃ’、Ｈα、Ｈβ、ＨＮ、Ｎシグナルの化学シフト値から、ポリペプチド主鎖二面角であるφ角、およびψ角を高精度で予測するソフトウエアＴＡＬＯＳを用いて、４２残基に対するφ、ψ角データを得た。さらに、ＨＮＨＢおよびＨＮ（ＣＯ）ＨＢのシグナルパターンから３５残基における側鎖二面角であるχ角のデータを得た。これらシグナルの帰属データ、距離制限データ、φ、ψ、χ角度制限データを元に、タンパク質立体構造計算用ソフトウエアであるＣＮＳを用いてドメイン構造の計算を行った。得られた立体構造に基づいて、供した距離制限が満たされていないＮＯＥ群を比較検討しながら最適化を行った。これを繰返すことで最終的に全ての角度制限と２６６７個の距離制限を用いて計算し、エネルギー的に安定した立体構造２０個を得た。これら構造において二次構造を形成するアミノ酸残基部分の収斂度は、主鎖の原子団に対して０．２９Å、側鎖を含めた水素原子以外の全原子団に対しては０．７６Åであった。
（４）立体構造座標
得られた構造座標を以下の立体構造座標１〜２０に示す。
以下の立体構造座標データは、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）のフォーマットに準じて記載されているものである。１列目のＡＴＯＭはこの行が原子座標の行であることを示し、２列目は、その原子の順番を、３列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基等を、５列目は配列番号２０に対応したアミノ酸の番号を、６、７、８列目はその原子の座標（ａ軸、ｂ軸、ｃ軸方向の順番でÅ単位）を、９列目は、その原子の占有率（本発明においてはすべて１．００）を、１０列目はその原子の温度因子を示している。最終行は、この表の終わりの行であることを示している。
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このように、タンパク質全長からコンピュータによりタンパク質の構造・機能を有する構成要素（ドメイン）を予測して、予測した領域を中心にＮ端、Ｃ端へ伸ばしたりカットしたりしたコンストラクトを各種作成し、これらのタンパク質を発現させ、実際に取得したドメインタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥでその発現を確認した。さらに構造を有するか否かはＮＭＲを用いてＨＳＱＣ測定を行い個々のドメイン全てについて確認した。したがって、実際に構造をもつ（フォールドする）ドメインのタンパク質配列上の位置を正確に決定できたことが確認された。また、このような分子量の小さいドメインタンパク質を用いることで、容易に立体構造解析を行うことができるようになったことが確認された。
【実施例７】  上記の立体構造解析結果に基づいてインシリコスクリーニングを行い、リガンド候補の検索と、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様タンパク質のファルマコフォア（結合部位）を探索した。
（１）データベース最適化
低分子化合物データベースの対象データベースとしてＳＰＥＣＳ社から提供されている低分子化合物カタログデータベースを用いた。１エントリーに複数分子を含むものは１分子ごとに分割した上で、重複を除いたライブラリをスクリーニングの母集団として用いた。ここには１５２３２３分子含まれていた。
”Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ５”に基づき、低分子化合物データベースについてのターゲット非依存最適化を行った。ここで用いた絞り込み条件は、以下の通りであった。
１．分子量１００以上５００以下
２．計算ＬｏｇＰ値（ｏ／ｗ）５以下（ＸＬＯＧＰ−１アルゴリズム使用）
３．水素結合アクセプター原子数（低分子化合物に含まれるＮとＯの数）１０以下
４．水素結合ドナー原子数（低分子化合物に含まれるＮＨとＯＨの数）５以下
更にドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
１．回転可能な単結合数が２１以上のもの
２．ラジカルを含むもの
３．Ｈ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ以外の元素を含むもの
絞り込み後の候補化合物の個数は、１０３７７３であった。
（２）結合部位予測
▲１▼立体構造類似性検索
本発明におけるＣＡＰ−Ｇｌｙ様タンパク質ドメインはＳＨ３ドメインと構造類似性を持つことが立体構造類似性検索により示唆されたため、距離行列比較［Ｈｏｌｍ  Ｌ，Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３），２３３：１２３−１３８］を行い、１ＡＯＮ、１ＢＢＺ、１ＣＫＡ及び１ＧＢＱ（いずれもＰＤＢコード）との立体構造類似性検索を行なった。この立体構造類似性検索には立体構造座標表１を用いた。
▲２▼結合部位予測
多少のギャップはみられるが、Ｎ末端及びＣ末端側のフラグメントを除くと、ターゲットとＳＨ３ドメインとの間には構造類似性があることが示された。一方、ＳＨ３ドメインを含む構造は、共通する疎水性ポケット近傍でペプチドと結合している。このポケットは本発明におけるＣＡＰ−Ｇｌｙ様タンパク質ドメインとも共通しているため、この部位近傍をスクリーニング対象として選択した。
（３）スクリーニング
▲１▼一次スクリーニング
Ｄｏｃｋ４．０を用いて、結合サイトについて、先に最適化を行った低分子化合物ライブラリー全体に対してドッキングを行った。Ｄｏｃｋのエネルギースコア（ｅｎｅｒｇｙｓｃｏｒｅ）に基づいて低分子化合物をランク付けした。
▲２▼二次スクリーニング
１次スクリーニングの結果得られた上位１０６１９分子について、オートドック（ＡｕｔｏＤｏｃｋ）３．０．５を用いて、詳細なドッキングを行った。ドッキングの際に使用したスフィアーから４Å以内にある化合物への絞り込み、および計算が異状終了した分子を除去した結果、最終的に９９３８分子についてドッキング構造を得た。さらに得られた化合物のうち、ΔＧ（結合自由エネルギー変化）＝−６．８９、Ｋｄ＝約１μＭ以下を化合物選定の基準とし、この基準値より高い結合性を有する化合物１０００個をリガンド候補とした。
（４）ファーマコフォア定義における重要な残基の探索
ターゲットであるＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質の構造座標情報から、Ｄｏｃｋ付属のプログラムＳＰＨＧＥＮによりターゲット表面にスフィアーと呼ばれる球状のプローブを生成し、ＨＰＤ残基より４Å以内のものを選択することにより、ファーマコフォア定義における重要なアミノ酸（Ｖａｌ２６、Ｌｙｓ２７、Ｇｌｕ４７、Ａｒｇ６７、Ｌｙｓ８３、Ｓｅｒ８６）を求めた。
【実施例８】  細胞増殖の測定
（１）細胞培養
▲１▼ＨｅＬａ細胞
１０％のＩＣＮ社製細胞培養用ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））、２ｍＭのシグマ社製Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、及び１００μｇ／ｍｌのシグマ社製ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むシグマ社製ダルベッコＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地）を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとでＨｅＬａ細胞を培養した。
▲２▼２９３細胞
１０％のＩＣＮ社製細胞培養用ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））、２ｍＭのシグマ社製Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、０．１ｍＭのシグマ社製非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、１ｍＭのシグマ社製ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、及び１００μｇ／ｍｌのシグマ社製ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むシグマ社製ダルベッコＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地）を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとで２９３細胞を培養した。
（２）培養細胞への本発明のタンパク質の遺伝子導入
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＫＩＡＡ０８４９由来の遺伝子断片（アミノ酸４６４〜５５４相当）のｃＤＮＡ（配列番号２）をＰＣＲにより増幅した。増幅したｃＤＮＡ（配列番号２）を、クローンテック社の導入ベクター（ゲートウェイシステム）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩマルチクローニングサイトに導入し、サブクローニングした。その後、ライゲーション反応により導入部分を、真核生物の発現ベクターであるクローンテック社製ｐＤＥＳＴ２６に導入した。直径が６０ｍｍの皿に、１０５個のサブクローニングされた細胞を蒔いた。その後およそ２４時間インキュベートした。インビトロジェン社のリポフェクタミン（ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用い、公知のプロトコルに従って、細胞に遺伝子を一過的に導入した。また、対照として、ｐＤＥＳＴ２６のみを導入した細胞を調整した。
（３）細胞増殖の測定
細胞増殖の測定をするために、以下の対照実験を行った。まず、上記の２９３細胞、及びＨｅＬａ細胞それぞれに配列番号２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを導入したプラスミドｐＤＥＳＴ２６を導入したものと、導入しないもの（対照）を作成し、ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインによる細胞増殖への影響を調べた。遺伝子導入から２４時間後、接着細胞をトリプシン処理することにより剥離し、細胞を回収した。リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）中に再懸濁した。同じ体積の再懸濁した細胞と、０．４％のシグマ社製トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）とを結合させ、１０分間室温にてインキュベートした。着色しない生細胞の数を、サンリードグラス社製の標準的な血算盤（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で測定した。測定は独立に３回行い、その平均値と標準偏差（ＳＥ）を求めた。その結果を図７に示す。図７から、２９３細胞、及びＨｅＬａ細胞のいずれの場合においても、配列番号２で表されるｃＤＮＡを導入したものは、導入しないものに比べて生細胞の数が減少していることがわかる。
以上から、本発明のタンパク質を培養動物細胞内で発現させる事によって、細胞は増殖抑制性の制御をうけることがわかる。
【実施例９】ＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（４６４−５５４）とＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）との結合実験
以下では、本発明のドメインタンパク質が、ＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）と結合することを実験的に確かめた。
（１）１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿潤環境のもとでＨｅＬａ細胞を培養した。培養したＨｅＬａ細胞に、インビトロジェン社のリポフェクタミン（ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００試薬を用いてＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）のｃＤＮＡ（配列番号２２）とＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメイン（４６４−５５４）のｃＤＮＡ（配列番号２）とを導入し発現させた。なお、ＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）のＮ末端には、ｍｙｃタグが付されているが、本実験において特に影響はない。遺伝子導入から２４時間後に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。リシスバッファー（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）と阻害剤２００μｌを用いて細胞を回収し、細胞膜を破砕した。リシスバッファーは、３０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）と、１５０ｍＭのＮａＣｌと、５ｍＭのＥＤＴＡと、１％のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００とを含むものであった。また、阻害剤は、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１μｇ／ｍｌのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、１μｇ／ｍｌのペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、４０ｍＭのβ−グリセリンリン酸（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と１ｍＭのＰＭＳＦとを含むものであった。回収液を、４℃で１０分間放置した後、４℃で、３０分間遠心分離を行い、細胞抽出液の不要成分を沈殿させ上清を得た。遠心分離機の回転速度は、１５００ｒｐｍであった。遠心分離後の上清にシグマ社製のプロテインＧゲルを３０μｇ加え、４℃で３０分間静置した。その後、上清にシグマ社製アンチＦＬＡＧ−Ｍ２アフィニティゲルを１０μｇ加え、４℃で２時間静置した。静置後、０．５％のＴＢＳと５００μｌのトライトンＸ−１００とで３回洗浄を行った。その後、さらにＴＢＳで２回洗浄を行った。洗浄後、２０μｌのサンプルバッファで、細胞を溶出した。９８℃で５分間熱処理した。
試料をＳＤＳゲル電気泳動にかけ、分離した。なお、ゲルは、第一化学薬品株式会社製ＰＡＧミニ１０／２０を使用した。その後、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。転写条件は、８０ｍＡ、１時間であった。ＰＶＤＦ膜に１０００倍に希釈したファーミゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製マウス抗ＩＫＫ−ｇａｍｍａ抗体を１次抗体として用いて１時間反応させた。２次抗体として、１０００倍に希釈したアマシャム社製西洋わさびペルオキシターゼ（ＨＲＰ）が結合した完全マウスＩｇＧ抗体を１時間反応させた。
（２）対照として、培養したＨｅＬａ細胞に、ＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）のｃＤＮＡ（配列番号２２）と導入し、発現させたもの、及び培養したＨｅＬａ細胞に、何も遺伝子導入しないものも用意した。
（３）検出試薬として、アマシャムファルマシア社製イーシーエルプラス（ＥＣＬｐｌｕｓ）を用い、化学発光検出器として富士フィルム社製ＬＡＳ−１０００を用いてウェスタンブロッティングの検出像を得た。このようにして得られたウェスタンブロッティングの検出像を図８に示す。図８は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティゲルで精製後、ＰＶＤＦに転写し、ホースラディッシュペルオキシダーゼの基質分解による化学発光で検出したものである。図８において、レーン１はＨｅＬａ細胞のみのもののレーン（対照）、レーン２はＨｅＬａ細胞にＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）：配列番号２１とＦＬＡＧ配列を発現させたもののレーン（対照）、レーン３は、ＨｅＬａ細胞にＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）とＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（４６４−５５４）にＦＬＡＧ配列を付加したものを発現させたもののレーンを示す。レーン３では、化学発光によりＩＫＫ−ｇａｍｍａを検出した。これはＨｅＬａ細胞内で発現させたＣＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（４６４−５５４）とＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）とが結合し、複合体を形成していたため、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティゲル精製にもかかわらずＩＫＫ−ｇａｍｍａが複合体として残り、検出されたものと考えられる。この結果からＧＡＰ−Ｇｌｙ様ドメインタンパク質（４６４−５５４）とＩＫＫ−ｇａｍｍａ（１−４１９）とが結合していることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】  以上説明したように、本発明のドメインタンパク質は生理的に意味のある構造を有し、タンパク質の分子機能を有していることから、このドメインタンパク質は相互作用する生理活性物質のスクリーニングに用いることができる。また、本発明のドメインタンパク質の立体構造解析を行うことにより、該ドメインに作用する化合物をコンピュータ上で探索・設計できることとなった。
また、ウエット実験での化合物の探索においても、本発明のドメインタンパク質は特定の分子機能のみを有するタンパク質の最小カセットであり、余分なタンパク質構造の影響を受けることなく、効率よく活性化合物のスクリーニングができることとなった。
これらの結果により本ドメインタンパク質及び／又は本ドメインタンパク質を含んだ天然のタンパク質と相互作用する化合物をスクリーニングすることができる。
したがって、本発明によるドメインタンパク質を提供することで、タンパク質の構造−機能解析を基礎としたゲノム創薬を効果的に行うことができる。
さらに、本発明のタンパク質は、ターバン症候群に対する薬物のスクリーニングへの利用や、立体構造情報を利用しての薬物の最適化が可能である。すなわちＣＡＰ−Ｇｌｙ機能を有するドメインタンパク質と相互作用を有する化合物は、各種癌関連疾患の予防・治療に有効に用いられ得る。また、本発明のタンパク質は、ＩＫＫ−ｇａｍｍａタンパク質と結合することがわかった。ＩＫＫ−ｇａｍｍａタンパク質は、癌関連のタンパク質であるＮＦ−ｋＢと相互作用してＮＦ−ｋＢの転写促進機能を抑制している。したがって、本発明のタンパク質は、特にＮＦ−ｋＢが関連する癌関連の疾患の予防・治療に有効に用いられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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