(57)【要約】ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖Ｆｃ領域を有する抗体分子からなる組成物、該組成物を生産する細胞またはトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する医薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する細胞。
【請求項２】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる酵素である、請求項３に記載の細胞。
（ａ）ＧＭＤ（ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）；
（ｂ）Ｆｘ（ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）；
（ｃ）ＧＦＰＰ（ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）。
【請求項５】
ＧＭＤが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ＧＭＤが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質。
【請求項７】
Ｆｘが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
Ｆｘが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質。
【請求項９】
ＧＦＰＰが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
ＧＦＰＰが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質。
【請求項１１】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα−１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求項３に記載の細胞。
【請求項１２】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項１１に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項１１に記載の細胞。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１４】
酵素の活性が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群から選ばれる手法により低下または欠失した、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法。
【請求項１５】
少なくともＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１６】
細胞が、下記の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）サルＣＯＳ細胞；
（ｇ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｈ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｉ）胚性幹細胞；
（ｊ）受精卵細胞。
【請求項１７】
ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する、該抗体分子をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項１８】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項１７に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項１９】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下するように、ゲノムが改変された請求項１７または１８に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項２０】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の遺伝子またはＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子がノックアウトされた請求項１７または１８に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項２１】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる酵素である、請求項１９または２０に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）ＧＭＤ（ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）；
（ｂ）Ｆｘ（ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）；
（ｃ）ＧＦＰＰ（ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）。
【請求項２２】
ＧＭＤが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
Ｆｘが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２４】
ＧＦＰＰが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２５】
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα−１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求項１９または２０に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項２６】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項２５に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２７】
トランスジェニック非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル及びウサギからなる群から選ばれる動物である、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項２８】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項２９】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項１〜１６および２８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３０】
抗体分子の軽鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３が配列番号５、６、７、および／または重鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３が配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列を含む請求項１〜１６、２８および２９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３１】
抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２、および／または重鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む請求項１〜１６、２８、２９および３０のいずれかに１項に記載の細胞。
【請求項３２】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項３３】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項１７〜２７および３２のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項３４】
抗体分子の軽鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号５、６、７、および／または重鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列を含む請求項１７〜２７、３２および３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項３５】
抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２、および／または重鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む請求項１７〜２７、３２、３３および３４のいずれかに１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項３６】
請求項１〜１６、２８〜３１のいずれか１項に記載の細胞により生産された抗体組成物。
【請求項３７】
請求項１７〜２７、３２〜３５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を飼育し、飼育した動物あるいは植物により生産された抗体組成物。
【請求項３８】
ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物。
【請求項３９】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項３８に記載の抗体組成物。
【請求項４０】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求項３８項に記載の抗体組成物。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項４１】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項４２】
抗体分子の軽鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号５、６、７、および／または重鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列を含む請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項４３】
抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２、および／または重鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む請求項３８〜４２のいずれかに１項に記載の抗体組成物。
【請求項４４】
請求項１〜１６、２８〜３１のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に請求項３６、３８〜４３のいずれか１項に記載の抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から該抗体組成物を採取する工程を含む、該抗体組成物を製造する方法。
【請求項４５】
請求項１７〜２７、３２〜３５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を飼育し、飼育した動物あるいは植物から組織あるいは体液を取得し、取得した組織あるいは体液から請求項３６、３８〜４３のいずれか１項に記載の抗体組成物を採取する工程を含む、該抗体組成物を製造する方法。
【請求項４６】
請求項３６〜４３いずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項４７】
請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有するＣＤ２０関連疾患の治療薬。
【請求項４８】
ＣＤ２０関連疾患が、癌または免疫疾患である請求項４７記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫などのＣＤ２０陽性細胞が関与する疾患の治療に有用な抗体組成物、抗体組成物を製造するための細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法に関する。
背景技術
抗体は、高い結合活性、結合特異性及び血中での高い安定性を有することから、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療への応用が試みられてきた［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２．１（１９９５）］。また、遺伝子組換え技術を利用して、ヒト以外の動物の抗体からヒト型キメラ抗体或いはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体の様なヒト化抗体を作製することが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体である。ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト抗体のＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＣＤＲと置換した抗体である。
哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１（１９９５）］。ヒトＩｇＧクラスの抗体は、更にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類のサブクラスに分類されている。ＩｇＧクラスの抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）については、これまでに多数の研究が行われ、ヒトＩｇＧクラスでは、ＩｇＧ１サブクラスの抗体が最も高いＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有していることが報告されている［ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）］。実際に、ＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＤ２０キメラ抗体をサルに投与した場合に検出されるＣＤ２０陽性Ｂ細胞の除去が、ＩｇＧ４サブクラスを用いた場合には検出されないことも報告されている［バイオケミカル・ソサイエティ・トランスアクション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．），２５，７０５（１９９７）］。以上の観点から、市販の治療用抗体のうち、その効果発現に高いエフェクター機能を必要とする抗腫瘍ヒト化抗体の殆どはヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。
ＣＤ２０はＢｐ３５とも呼ばれる約３５ｋＤａのポリペプチドであり、モノクローナル抗体によってヒトＢリンパ球特異抗原Ｂ１として同定された［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２５，１６７８（１９８０）］。４回膜貫通型分子で、カルシウムチャンネルとして機能し、Ｂ細胞の活性化や増殖、分化に関与していると考えられている［イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ），１５，４５０（１９９４）］。ＣＤ２０の発現はプレＢ細胞から成熟Ｂ細胞までに限られており、未分化細胞や、形質細胞には発現していない。また、９０％以上のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫に発現していること、抗体が結合しても細胞内に移行しないことなどの特徴も持っており、早くから抗ＣＤ２０抗体によるＢ細胞リンパ腫の治療が試みられてきた［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），６９，５８４（１９８７）］。しかしながら、当初用いられていたのはマウスモノクローナル抗体であり、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（ＨＡＭＡ；Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）が誘導されること、エフェクター機能を欠くことなどから、その治療効果は限られたものであった。したがって、遺伝子組換え技術を用いて、マウス抗体とヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体とのキメラ抗体作製が検討された［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１３９，３５２１（１９８７）、ＷＯ８８／０４９３６］。更に、マウスモノクローナル抗体２Ｂ８を用いて作製されたヒトＩｇＧ１サブクラスのキメラ抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８は、サルを用いた検討により生体内においてもＣＤ２０陽性細胞を除去する活性を有することが確認され［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），８３，４３５（１９９４）、ＷＯ９４／１１０２６］、臨床試験を経て、米国においてＲｉｔｕｘａｎＴＭ（ＩＤＥＣ社／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂとも呼ばれるが、以下、ＲｉｔｕｘａｎＴＭと表記する）として１９９７年１１月に上市された。
ＲｉｔｕｘａｎＴＭの米国における第ＩＩＩ相試験は、小リンパ球性及び濾胞性リンパ腫１６６例に対して、３７５ｍｇ／ｍ２／週の４週投与で行われ、奏効率は４８％（完全寛解６％、部分寛解４２％）であった［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１６，２８２５（１９９８）］。ＲｉｔｕｘａｎＴＭの作用機序としては、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性に加え、ＣＤ２０をクロスリンクさせることにより細胞にアポトーシスを誘導させる活性などが考えられている［カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），１１，５４１（１９９９）］。ＣＤＣ活性に関しては、標的となるＢリンパ腫細胞によってその感受性が異なることから、その制御に関与していると考えられる補体阻害分子ＣＤ５５やＣＤ５９の機能を阻害することで、ＲｉｔｕｘａｎＴＭの治療効果を高められる可能性が議論されてきた［カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），１１，５４１（１９９９）］。しかし、患者由来の腫瘍細胞でのそれらの阻害分子の発現や、インビトロにおけるＣＤＣ活性の感受性が、臨床における成績と必ずしも相関しないことも報告されてきている［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９８，１３５２（２００１）］。また、マウスにヒトＢリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞を移植したモデルを用いた検討において、抗体レセプター（以下、抗体レセプターをＦｃγＲと表記する）を介したＡＤＣＣ活性が抗腫瘍効果に重要であることが示された［ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），６，４４３（２０００）］。
ＲｉｔｕｘａｎＴＭと化学療法（ＣＨＯＰ；Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）との併用が検討されてきており、第ＩＩ相試験において低悪性度および濾胞性リンパ腫４０例に対して奏効率９５％（完全寛解５５％、部分寛解４５％）と報告されているものの、ＣＨＯＰに起因する副作用が見られた［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，２６８（１９９９）］。また、他の治療用抗ＣＤ２０抗体として、放射性同位元素標識抗体であるＺｅｖａｌｉｎ（ＩＤＥＣ社）、Ｂｅｘｘａｒ（Ｃｏｒｉｘａ社）などが開発されているが、どちらもマウス抗体であることと、放射性同位元素が用いられていることから、強い毒性による副作用が懸念される。
ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の発現には、抗体Ｆｃ領域と、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在する抗体レセプター及び各種補体成分との結合が必要であり、その結合については、抗体のヒンジ領域及びＣ領域の第２番目のドメイン（以下、Ｃγ２ドメインと表記する）内のいくつかのアミノ酸残基の重要性が示唆されている［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），２３，１０９８（１９９３）、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），８６，３１９（１９９５）、ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）］。ＲｉｔｕｘａｎＴＭに関しても、Ｃγ２ドメインのアミノ酸置換体を用いた検討により、主にＣＤＣ活性に重要なアミノ酸が同定されてきている［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６４，４１７８（２０００）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６６，２５７１（２００１）］。
また、Ｃγ２ドメインに結合している糖鎖の重要性［ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７）］が示唆されている。糖鎖に関しては、ボイド（Ｂｏｙｄ）らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と表記する）或いはマウスミエローマＮＳＯ細胞（以下、ＮＳＯ細胞と表記する）で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）を各種糖分解酵素で処理し、糖鎖のＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性に対する影響を検討した結果、非還元末端のシアル酸の除去は、両活性に影響を与えないが、更にガラクトース残基を除去することでＣＤＣ活性のみが影響を受け、約５０％程度活性が低下すること、糖鎖の完全な除去は、両活性を消失させることを報告した［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３２，１３１１（１９９５）］。また、ライフリー（Ｌｉｆｅｌｙ）らは、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞或いはラットミエローマＹＯ細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）の糖鎖の分析及びＡＤＣＣ活性を測定した結果、ＹＯ細胞由来のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈが最も高いＡＤＣＣ活性を示し、その活性にはバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃとも表記する）が重要であることを示唆した［グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）：ＷＯ９９／５４３４２］。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしており、糖鎖の構造を変えることでより高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能であることを示している。しかし、実際には糖鎖の構造は多様かつ複雑であり、エフェクター機能に真に重要な構造を特定できたとは言い難い。
糖鎖の修飾に係わる酵素の遺伝子を宿主細胞に導入して生産物の糖鎖構造を改変した例としては、ラットのβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加されたタンパク質の製造が可能であることが報告されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８（１９８９）］。
また、ヒトのβ−ガラクトシド−２−α−フコシルトランスフェラーゼをマウスＬ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−）の発現が確認されている［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８，（１９９１）］。さらに、ユマナ（Ｕｍａｎａ）らは、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加が抗体のＡＤＣＣ活性に重要であるとの知見に基づき、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を発現させたＣＨＯ細胞を作製し親株との比較を行っている。親株のＣＨＯ細胞ではＧｎＴＩＩＩの発現が観察されておらず［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５９，１３３７０，（１９８４）］、作製したＧｎＴＩＩＩ発現ＣＨＯ細胞を用いて発現させた抗体は親株で発現させた抗体と比べて高いＡＤＣＣ活性を有していることを確認している［ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），１７，１７６（１９９９）：ＷＯ９９／５４３４２］。またこの際、ユマナ（Ｕｍａｎａ）らは、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の遺伝子を導入したＣＨＯ細胞も作製しており、ＧｎＴＩＩＩまたはＧｎＴＶの過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すことを報告している。ＲｉｔｕｘａｎＴＭに関しては、ＧｎＴＩＩＩを導入したＣＨＯ細胞を用いて作製した抗体は親株で発現させた抗体と比べて高いＡＤＣＣ活性を示すことが報告されているが、その活性差は１０−２０倍程度である［バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７４，２８８（２００１）］。
発明の開示
エフェクター機能の増強された抗ＣＤ２０抗体は治療効果が増大し、投与量の減少による患者の負担の軽減が期待される。また、化学療法や放射性同位元素標識抗体などとの併用の必要性が無くなることによる副作用の低減なども期待される。本発明の目的は、エフェクター機能が増強された抗ＣＤ２０抗体を生産する細胞、およびエフェクター機能が増強された抗ＣＤ２０抗体組成物、該抗体組成物の製造方法、該抗体組成物を含有する医薬等を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（４８）に関する。
（１）  ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する細胞。
（２）  フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、上記（１）に記載の細胞。
（３）  細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した上記（１）または（２）に記載の細胞。
（４）  細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる酵素である、上記（３）に記載の細胞。
（ａ）ＧＭＤ（ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）；
（ｂ）Ｆｘ（ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）；
（ｃ）ＧＦＰＰ（ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）。
（５）  ＧＭＤが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（６）  ＧＭＤが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質。
（７）  Ｆｘが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（８）  Ｆｘが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質。
（９）  ＧＦＰＰが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１０）  ＧＦＰＰが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質。
（１１）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα−１，６−フコシルトランスフェラーゼである、上記（３）に記載の細胞。
（１２）  α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（１１）に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１３）  α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、上記（１１）に記載の細胞。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（１４）  酵素の活性が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群から選ばれる手法により低下または欠失した、上記（３）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法。
（１５）  少なくともＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である上記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の細胞。
（１６）  細胞が、下記の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である、上記（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）サルＣＯＳ細胞；
（ｇ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｈ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｉ）胚性幹細胞；
（ｊ）受精卵細胞。
（１７）  ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する、該抗体分子をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（１８）  フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、上記（１７）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（１９）  細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下するように、ゲノムが改変された上記（１７）または（１８）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（２０）  細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の遺伝子またはＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子がノックアウトされた上記（１７）または（１８）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（２１）  細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる酵素である、上記（１９）または（２０）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）ＧＭＤ（ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）；
（ｂ）Ｆｘ（ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）；
（ｃ）ＧＦＰＰ（ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）。
（２２）  ＧＭＤが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（２１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２３）  Ｆｘが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（２１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２４）  ＧＦＰＰが、以下の（ａ）または（ｂ）であるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（２１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２５）  Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα−１，６−フコシルトランスフェラーゼである、上記（１９）または（２０）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（２６）  α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（２５）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２７）  トランスジェニック非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル及びウサギからなる群から選ばれる動物である、上記（１７）〜（２６）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（２８）  抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、上記（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（２９）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、上記（１）〜（１６）および（２８）のいずれか１項に記載の細胞。
（３０）  抗体分子の軽鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３が配列番号５、６、７、および／または重鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３が配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列を含む上記（１）〜（１６）、（２８）および（２９）のいずれか１項に記載の細胞。
（３１）  抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２、および／または重鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む上記（１）〜（１６）、（２８）、（２９）および（３０）のいずれかに１項に記載の細胞。
（３２）  抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、上記（１７）〜（２７）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（３３）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、上記（１７）〜（２７）および（３２）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（３４）  抗体分子の軽鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号５、６、７、および／または重鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列を含む上記（１７）〜（２７）、（３２）および（３３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（３５）  抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２、および／または重鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む上記（１７）〜（２７）、（３２）、（３３）および（３４）のいずれかに１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（３６）  上記（１）〜（１６）、（２８）〜（３１）のいずれか１項に記載の細胞により生産された抗体組成物。
（３７）  上記（１７）〜（２７）、（３２）〜（３５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を飼育し、飼育した動物あるいは植物により生産された抗体組成物。
（３８）  ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物。
（３９）  フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、上記（３８）に記載の抗体組成物。
（４０）  抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、上記（３８）項に記載の抗体組成物。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（４１）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、上記（３８）〜（４０）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（４２）  抗体分子の軽鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号５、６、７、および／または重鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列を含む上記（３８）〜（４１）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（４３）  抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２、および／または重鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む上記（３８）〜（４２）のいずれかに１項に記載の抗体組成物。
（４４）  上記（１）〜（１６）、（２８）〜（３１）のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に上記（３６）、（３８）〜（４３）のいずれか１項に記載の抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から該抗体組成物を採取する工程を含む、該抗体組成物を製造する方法。
（４５）  上記（１７）〜（２７）、（３２）〜（３５）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を飼育し、飼育した動物あるいは植物から組織あるいは体液を取得し、取得した組織あるいは体液から上記（３６）、（３８）〜（４３）のいずれか１項に記載の抗体組成物を採取する工程を含む、該抗体組成物を製造する方法。
（４６）  上記（３６）〜（４３）のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
（４７）  上記（３６）〜（４３）のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有するＣＤ２０関連疾患の治療薬。
（４８）  ＣＤ２０関連疾患が、癌または免疫疾患である上記（４７）記載の治療薬。
本発明の細胞としては、ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する細胞であればいかなる細胞も包含される。
本発明において、ＣＤ２０は、Ｂ１やＢｐ３５とも呼ばれている約３５ｋＤａの細胞表面膜タンパク質で、配列番号４記載のアミノ酸配列で表されたタンパク質または配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＤ２０と実質的に同一の性質を有するものであればいかなるものも包含される。
本発明において配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＤ２０活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入および／または付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、用いられる蛋白質が、ＣＤ２０活性を有するためには、それぞれ配列番号４で表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する。
本発明において、抗体分子のＦｃ領域に結合する糖鎖としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が挙げられ、そのＮ−グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）糖鎖を挙げることができる。
抗体分子のＦｃ領域には、後述するＮ−グリコシド結合糖鎖がそれぞれ１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、下記構造式（Ｉ）で示されるいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。したがって、Ｆｃ領域に結合した糖鎖構造の観点から物質の同一性を判断することができる。
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本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物（以下、本発明の抗体組成物と称する）とは、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する糖鎖から構成されていてもよい。
本発明において、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖は、該フコースの１位が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。例えば、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
本発明の抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、好ましくは２０％以上、より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３０％以上、特に好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上があげられ、これらの糖鎖の割合を有する抗体組成物は、高いＡＤＣＣ活性を有する。
抗体濃度が低下すれば、それに伴ってＡＤＣＣ活性が低下するが、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上の場合、抗体濃度が低くても高いＡＤＣＣ活性を獲得することができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３―糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することによっても決定することができる。
また、本発明の細胞としては、本発明の組成物を生産し、かつ細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した細胞が包含される。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に係わる酵素としては、細胞内ＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素を包含する。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースは、ｄｅ  ｎｏｖｏの合成経路あるいはＳａｌｖａｇｅ合成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素はすべて細胞内ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素に包含される。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのｄｅ  ｎｏｖｏの合成経路に関与する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ；以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＤＰ−ケト−デオキシマンノース  ３，５−エピメラーゼ，４−リダクターゼ；以下、Ｆｘと表記する）などがあげられる。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのＳａｌｖａｇｅ合成経路に関与する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ；以下、ＧＦＰＰと表記する）、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅ（フコキナーゼ）などがあげられる。
本発明において、ＧＭＤとしては、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、（ａ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｃ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質
（ｅ）配列番号６１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、ＧＭＤのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号４１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、Ｆｘとしては、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、（ａ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｃ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質
（ｅ）配列番号６２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、Ｆｘのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号４８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４８で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ＧＦＰＰとしては下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｃ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質
（ｅ）配列番号６３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、ＧＦＰＰのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号５１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号５１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼやα−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。  また、上述のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明において、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｅ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｆ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｇ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｈ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｉ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｊ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
等があげられる。
また、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１または２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１または２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１、２、４８、５１または４１で表される塩基配列からなるＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、２、４８、５１または４１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号２３、２４、６１、６２または６３で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性、ＧＭＤ活性、Ｆｘ活性またはＧＦＰＰ活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号１、２、４１、４８または５１で表される塩基配列を有するＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、用いられる蛋白質が、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性、ＧＭＤ活性、Ｆｘ活性またはＧＦＰＰ活性を有するためには、それぞれ配列番号２３、２４、６１、６２または６３で表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する。
また、本発明の細胞、すなわち、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した細胞を取得する方法としては、目的とする酵素活性を低下させることができる手法であれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素活性を低下または欠失させる手法としては、
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
本発明の抗体組成物を生産させる宿主細胞としては、抗ＣＤ２０抗体分子を発現できる宿主細胞すなわち抗ＣＤ２０抗体分子をコードする遺伝子を組み込んだ宿主細胞であればいかなる細胞も包含する。その例として、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられる。これらの細胞としては、後述１に記載のものがあげられ、特に、動物細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などが好ましい。具体的には、本発明の抗ＣＤ２０抗体の遺伝子を組み込んだラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞形質転換クローンＫＭ３０６５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３４）があげられる。
本発明のヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫としては、ＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する、該抗体分子をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫であればいかなるものも包含される。具体的には、マウスＥＳ細胞へＣＤ２０に特異的に結合する抗体の遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることにより該抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。また、動物の受精卵にＣＤ２０に特異的に結合する抗体の遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることによって該抗体産生トランスジェニック動物を作製することもできる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル又はウサギ等があげられる。
本発明において、抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含されるが、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質などがあげられる。
抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいう。抗体としては動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマとしては、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相補性決定領域（以下、相補性決定領域をＣＤＲとも称す）移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はＶ領域、重鎖はＨ鎖としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
抗体の断片とは、上記抗体のＦｃ領域を含んだ断片を意味する。抗体の断片としては、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域を含む融合タンパク質としては、抗体のＦｃ領域を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどのタンパク質とを融合させた物質を包含する。
本発明の抗体分子としては、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体分子であればいかなるものでもよいが、好ましくは軽鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号５、６、７、および／または重鎖可変領域の相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３がそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体分子、より好ましくは軽鎖可変領域が配列番号１２、および／または重鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体分子などがあげられる。
本発明の医薬としては、上述した本発明の抗体組成物、すなわち抗ＣＤ２０抗体分子の組成物を有効成分として包含する医薬があげられる。
ＣＤ２０関連疾患としては、Ｂ細胞リンパ腫などの癌、炎症性疾患、自己免疫疾患などの免疫疾患などがあげられる。
本発明において、ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を傷害する活性を意味する［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ  ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．  本発明の抗体組成物を生産する細胞の作製
本発明の細胞は、以下に述べる手法により、本発明の抗体組成物を生産するために用いる宿主細胞を作製し、該宿主細胞に後述３に述べる方法により、抗ＣＤ２０抗体をコードする遺伝子を導入することにより、作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド法（以下、ＲＤＯ法と表記する）、ＲＮＡインターフェイス法（以下、ＲＮＡｉ法と表記する）、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明の細胞を作製するための宿主細胞の作製
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
本発明の細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述３に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、下記に記載の方法があげられる。
ＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のごとくヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片ＤＮＡをプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することもできる。
取得した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号４８、５１または４１に記載の塩基配列があげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１または２に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号５７または６０に記載の塩基配列があげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号３に記載の塩基配列があげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（ｂ）相同組換え法による本発明細胞の作製のために用いる宿主細胞の作製
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する。
ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載のグノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号５７または６０に記載の塩基配列があげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号３に記載の塩基配列があげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
（ｃ）ＲＤＯ方法による本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、導入した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述１の（５）に記載の細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述４または後述５に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｄ）ＲＮＡｉ法による本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述３に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載された「ＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．），２，７０（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
これらの酵素は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、ＧＭＤを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
大腸菌由来のＧＭＤの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（１３３番目のトレオニン、１３５番目のグルタミン酸、１５７番目のチロシン、１６１番目のリシン）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，２，２０００）。すなわち、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。一方、ＧＭＤの補酵素ＮＡＤＰや基質であるＧＤＰ−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、ＧＭＤの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。大腸菌由来のＧＭＤの結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ（配列番号４１）では、１５５番目のトレオニン、１５７番目のグルタミン酸、１７９番目のチロシン、１８３番目のリシンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述３に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（３）酵素についての突然変異を導入する手法
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
方法としては、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、本項の１の（５）に記載の方法があげられる。
（４）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。（５）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
具体的には、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地で１日〜２週間、好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、本発明のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
２．本発明のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明の抗体分子の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が制御されるようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的として、前記１を用いて作製した本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、植物カルス細胞より、例えば以下のように作製することができる。
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、前記１．に記載の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
具体的は、染色体上の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成する。作製した胚性幹細胞（例えば、該変異クローン）を用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、前記１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下した本発明の受精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルス又は細胞に、前記１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下した本発明のカルスを作製することができる。
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシン及びサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下したトランスジェニック植物を作製することができる。
３．抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
本発明の抗ＣＤ２０抗体分子の全長ｃＤＮＡを調製し、該抗体分子をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した細胞を選択するか、または前述１に示された種々の人為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、前記１．の（１）の（ａ）に記載のＤＮＡの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマー等を用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合タンパク質などを挙げることができる。
以下に、本発明の抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物の製造方法について記すが、他の抗体組成物を当該方法と同様にして取得することもできる。
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，１０３５（２０００）］、ｐＥＥ１８［ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ），１７，５５９（１９９８）］などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。  ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｂｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］によりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
さらに、抗体可変領域のアミノ酸配列または該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いて製造することができる。
アミノ酸配列が公知である場合には、アミノ酸配列を、コドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも４〜６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（７）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）及び（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体組成物を製造することができる。
すでに宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、後述１に記載した方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、本発明の抗体組成物を製造することができる。
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合活性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
５．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖タンパク質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
６．抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
抗体組成物は、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。本発明の抗体組成物は、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上であり、高いＡＤＣＣ活性を示す特徴を有している。このような抗体組成物は、上記５に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｃａｕｄａｔｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  Ｂａｌｋ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｌｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ  ｐｏｍｉｆｅｒａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）があげられる。
Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）を挙げることができる。
７．本発明の抗体分子の利用
本発明の抗体組成物はＣＤ２０に特異的に結合し、高い抗体依存性細胞傷害活性を有するため、癌をはじめとする各種ＣＤ２０発現細胞関連疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍は癌細胞が増殖し、例えばＢ細胞性リンパ腫においては特定のＢ細胞が、異常増殖する。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体は、殺細胞効果により抗原を発現している癌細胞を傷害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分であり、化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７（１９９８）］、本発明の抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもなる。
本発明の抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない
発明を実施するための最良の形態
実施例１．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の作製
１．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの作製
（１）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＬ鎖Ｖ領域（以下ＶＬと表記する）のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号１１に記載）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＬの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、および２０の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行ない、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で２時間反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第１図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌを得た。
（２）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＨ鎖Ｖ領域（以下ＶＨと表記する）のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号１３に記載）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＨの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、および３０の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行い、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４９ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。
この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第２図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを得た。  次に、１４番目のアミノ酸残基をＡｌａからＰｒｏへ置換するために、配列番号３１で示した合成ＤＮＡを設計し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により、以下の様に塩基の置換を行った。上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ上記の変異導入用プライマー（配列番号３１、ＧＥＮＳＥＴ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを２５サイクル行なった。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。また、同様に、上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ  塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ７  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ  ＭＵＴ  Ｂ１  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）］のＰＣＲ反応を行った。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。続いて、上記で得られた０．４４ｋｂのＰＣＲ産物と０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を０．５μＬずつ４７．５μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造社製）、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９０℃にて１０分間加熱した後、６０分間かけて３７℃まで冷却した後、３７℃で１５分間保持することによってＤＮＡをアニーリングさせた。２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を添加して７２℃にて３分間反応させた後、１０ｐｍｏｌずつのＴ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とＴ７  ＢｃａＢＥＳＴ  ���ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）を添加して反応液を５０μＬとし、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行った。該反応液２５μＬをＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した後、半量を１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位の制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）１μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位のＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲ産物由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。
こうして目的の塩基配列を有する第２図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを得た。
（３）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５，２０００）と実施例１の１項（１）および（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８ＬおよびｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを用いて抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＣＤ２０キメラ抗体と表記する）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを以下の様にして構築した。
実施例１の１項（１）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４１ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．７５ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌ由来ＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、第３図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌを得た。
次に、実施例１の１項（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの２μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌの３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．１６ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて、添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した。
得られたプラスミドを用い、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を同社のＤＮＡシークエンサー３７７を用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされている第３図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐが得られたことを確認した。
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）ラットミエローマＹＢ／０細胞を用いた生産細胞の作製
上記実施例１の１項（３）で得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを用いて抗ＣＤ２０キメラ抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍｌのＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）培地（牛胎児血清（ＦＣＳ）を５％添加）に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌになる様に添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、培養上清中のヒトＩｇＧ抗体の産生量を実施例１の２項（２）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中にヒトＩｇＧ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する：ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになる様に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中のヒトＩｇＧ抗体の産生量を実施例１の２項（２）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中にヒトＩｇＧ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ培地で増殖可能かつ、抗ＣＤ２０キメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗ＣＤ２０キメラ抗体を発現するクローンＫＭ３０６５を取得した。尚、ＷＯ００／６１７３９の実施例８に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し、用いた。
このようにして得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体を生産する形質転換クローンＫＭ３０６５は平成１３年１２月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３４として寄託されている。
（２）培養上清中のヒトＩｇＧ抗体濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）で希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＡＭＰＣ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μＬ／ｍｌで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
３．抗ＣＤ２０キメラ抗体の培養上清からの精製
実施例１の２項（１）で得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ３０６５をＭＴＸを２００ｎＭ、Ｄａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬製）を５％の濃度で含むＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に１×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍｌ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５を精製した。得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５の約３μｇを、公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従って電気泳動し、分子量及び精製度を調べた。その結果、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５は、非還元条件下は約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）であり、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの蛋白質の大きさは、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、ＲｉｔｕｘａｎＴＭの泳動パターンともほぼ一致することから、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。
実施例２．抗ＣＤ２０キメラ抗体の活性評価
１．抗ＣＤ２０キメラ抗体のＣＤ２０発現細胞に対する結合活性（蛍光抗体法）
上記実施例１の３項で得られた精製ＣＤ２０キメラ抗体の結合活性をフローサイトメトリーを用いた蛍光抗体法によって評価した。ＣＤ２０陽性細胞であるヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を２×１０５個ずつ、９６ウェルＵ字プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に分注した。抗ＣＤ２０キメラ抗体をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて希釈した抗体溶液（濃度０．０３９〜４０μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルとして加え、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液にて２００μＬ／ウェルで２回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（コールター社製）をＦＡＣＳ用緩衝液を用いて１００倍希釈したものを５０μＬ／ウェル加えた。遮光し氷中で３０分間反応させた後、２００μＬ／ウェルで３回洗浄し、最終的に５００μＬに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。その結果を第４図に示した。ＫＭ３０６５、ＲｉｔｕｘａｎＴＭともに抗体濃度依存的に蛍光強度の増加が認められ、ほぼ同等の結合活性を示すことが確認された。また、ＣＤ２０陰性細胞であるヒトＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１１９）に対する結合活性を抗体濃度を４０μｇ／ｍＬとして同様の方法により検討した。その結果を第５図に示した。ＫＭ３０６５、ＲｉｔｕｘａｎＴＭともに結合せず、ＫＭ３０６５はＣＤ２０特異的に結合することが示唆された。
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例１の３項で得られた精製抗ＣＤ２０キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で培養したヒトＢリンパ球培養細胞株ＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８８８５）あるいはＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９６）、Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を遠心分離操作及び懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地（ＦＣＳを５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地によって、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体を各最終濃度０．３〜３０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
2003055993.tif 000003
第６図には３種類の細胞株を標的とした結果を示した。第６図ＡはＲａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を、第６図ＢはＲａｍｏｓ細胞を（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９６）、第６図ＣはＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８８８５）を標的とした結果である。第６図に示したように、ＫＭ３０６５はいずれの抗体濃度においてもＲｉｔｕｘａｎＴＭよりも高いＡＤＣＣ活性を示し、最高細胞傷害活性値も高かった。
実施例３．抗ＣＤ２０キメラ抗体の糖鎖解析
実施例１の３項で精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体の糖鎖解析を行った。ＫＭ３０６５及びＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒドラジン分解を行い、糖鎖をタンパク質から切断した［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３（１９８２）］。減圧留去することによってヒドラジンを除去した後、酢酸アンモニウム水溶液と無水酢酸加えてＮ−アセチル化を行った。凍結乾燥後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５，１９７，１９８４］。蛍光標識した糖鎖群（以下、ＰＡ化糖鎖群と表記する）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ  １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
第７図は、抗ＣＤ２０キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。第７図ＡにＫＭ３０６５、第７図ＢにＲｉｔｕｘａｎＴＭの溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。緩衝液Ａとして１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、緩衝液Ｂとして１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）＋０．５％１−ブタノールを用い、以下のグラジエントで分析した。
2003055993.tif 000004
2003055993.tif 000005
2003055993.tif 000006
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ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。第７図において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの１位にフコースの６位がα結合しない糖鎖群（以下、α−１，６−フコースを持たない糖鎖群またはα−１，６−フコースが結合し
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合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの１位にフコースの６位がα結合した
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ークが占める面積の合計のうち▲５▼〜▲８▼のピークが占める面積の合計から算出した。
その結果、ＲｉｔｕｘａｎＴＭのα−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量は６％、α−１，６−フコース結合糖鎖含量は９４％であった。ＫＭ３０６５のα−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量は９６％、α−１，６−フコース結合糖鎖含量は４％であった。以上の結果から、ＫＭ３０６５はα−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量の割合が多いことがわかった。
実施例４．ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子の取得
（１）ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）ｃＤＮＡ配列の取得
ＷＯ００／６１７３９の実施例８（１）において培養２日目のチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より調製した一本鎖ｃＤＮＡより、以下の手順でチャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡを取得した（第８図）。
まず、マウスＦＵＴ８のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ，ＡＢＯ２５１９８）より、５’側非翻訳領域に特異的なフォワードプライマー（配列番号２１に示す）および３’側非翻訳領域に特異的なリバースプライマー（配列番号２２に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、前述のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ｃＤＮＡ  １μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、４％ＤＭＳＯ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記特異的プライマー（配列番号２１および配列番号２２）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約２Ｋｂを精製した。このＤＮＡ断片４μｌを、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従ってプラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちｃＤＮＡが組み込まれた８クローンから、公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、全ての挿入ｃＤＮＡが、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のＯＲＦ全長を含む配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、本プラスミドをＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１と称す。決定したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１の翻訳部分（オープンリーディングフレーム：ＯＲＦ）は、塩基配列１００〜１８２７であり、終止コドンを除く塩基番号１００〜１８２４に対応するアミノ酸配列を配列番号２３に示す。
（２）ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）ゲノム配列の取得
本項（１）で取得したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ＯＲＦ全長ｃＤＮＡ断片をプローブとして用い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来λ−ファージゲノムライブラリー（ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ社製）よりモレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載の公知のゲノムスクリーニングの方法に従いＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ゲノムクローンを取得した。次に、取得したゲノムクローンを各種制限酵素を用いて消化後、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ｃＤＮＡの開始コドンを含むＡｆａＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片（約２８０ｂｐ）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、陽性を示した制限酵素断片のうちＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片（約２．５Ｋｂ）およびＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片（約６．５Ｋｂ）を選択してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）へ各々挿入した。
取得した各ゲノム断片の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片はＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含む上流イントロン約２．５Ｋｂの配列を、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片はＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含む下流イントロン約６．５Ｋｂの配列を各々コードすることを確認した。以下、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を含むプラスミドをｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片を含むプラスミドをｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４と称す。決定したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域の塩基配列（約９．０Ｋｂ）を配列番号３に示す。
実施例５．α−１，６−フコース転移酵素遺伝子を破壊したＣＨＯ細胞の作製
ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子エクソン２を含むゲノム領域を欠失したＣＨＯ細胞を作製し、該細胞が生産する抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
１．チャイニーズハムスターα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築
（１）プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏの構築
以下の手順でプラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏを構築した（第９図）。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、特開平１１−３１４５１２に記載のプラスミドｐｌｏｘＰ  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．０ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．５μｌ、プラスミドｐｌｏｘＰ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約２．０Ｋｂ）０．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐｌｏｘＰＰｕｒｏと称す。
（２）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１の構築
実施例４（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１を構築した（第１０図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ２．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２由来のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．５μｌ、プラスミドＬＩＴＭＵＳ２８由来のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（約２．８Ｋｂ）０．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１と称す。
（３）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２の構築
本項（２）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２を構築した（第１１図）。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１  ２．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏ  １．０μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＨｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１由来のＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏ由来のＨｐａＩ−ＫｐｎＩ断片（約３．５Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２と称す。
（４）プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築
実施例４（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３を構築した（第１２図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４  ２．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｐａＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用い、添付の説明書に従ってＤＮＡ末端の平滑化を行った。フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行ってＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４由来のＨｐａＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．５Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３９由来のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約２．８Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３と称す。
（５）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築
実施例４（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３を構築した（第１３図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４  ２．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．０ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１．８Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３．０Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３と称す。
（６）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４の構築
本項（４）および（５）で得たプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３およびｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４を構築した（第１４図）。
プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３  １．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．６ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３  １．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３５μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．５μｌを添加し、６５℃で３０分間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
上記で得たプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．１Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約４．８Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４と称す。
（７）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５の構築
本項（３）および（６）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２およびｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５を構築した（第１５図）。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて２５℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３０μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．０μｌを添加し、６５℃で１時間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて２５℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約５．２ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．０Ｋｂ）０．５μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．２Ｋｂ）４．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で１５時間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５と称す。
（８）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築
本項（７）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを構築した（第１６図）。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ジフテリアトキシン発現ユニットを含む約１．２ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３０μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．０μｌを添加し、６５℃で１時間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ由来のＲｓｒＩＩ−ＲｓｒＩＩ断片（約１．２Ｋｂ）１．０μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５由来のＲｓｒＩＩ−ＲｓｒＩＩ断片（約１０．４Ｋｂ）１．０μｌ、滅菌水３．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏと称す。該プラスミドはＣＨＯ細胞のＦＵＴ８遺伝子ノックアウト細胞を作製するためのターゲッティングベクターとして用いられる。
実施例６．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
１．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株の取得
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地［ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を１倍濃度含むＩＭＤＭ培地］にて接着培養用フラスコ７５ｃｍ２（グライナー社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。５ｍｌのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、ダルベッコＰＢＳで希釈した０．０５％トリプシン（インビトロジェン社製）を１．５ｍｌ添加して３７℃にて５分間放置し、細胞を培養器底面から剥離させた。剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心操作により回収し、１×１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、未添加又は０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤であるＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎ（以下、ＭＮＮＧと表記、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、培養上清を除き、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地に懸濁後、接着培養用９６穴プレート（岩城硝子社製）に１０００細胞／ウエルの密度で播種した。各ウエルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍｌのレンズマメ凝集素（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのヒイロチャワンタケ凝集素（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ；以下、ＡＡＬと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのインゲンマメ凝集素（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、Ｌ−ＰＨＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したコロニーをレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株として取得した。取得したそれぞれのレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株については、ＬＣＡ耐性株をＣＨＯ−ＬＣＡ株、ＡＡＬ耐性株をＣＨＯ−ＡＡＬ株、Ｌ−ＰＨＡ耐性株をＣＨＯ−ＰＨＡ株と名付けた。取得したこれら株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、ＣＨＯ−ＬＣＡ株はＡＡＬに対しても耐性であり、ＣＨＯ−ＡＡＬ株はＬＣＡに対しても耐性であることが分かった。さらに、ＣＨＯ−ＬＣＡ株及びＣＨＯ−ＡＡＬ株は、ＬＣＡやＡＡＬが認識する糖鎖構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位とフコースの１位がα結合で付加された糖鎖構造を認識するレクチンに対しても耐性を示した。具体的には、終濃度１ｍｇ／ｍｌのエンドウマメ凝集素（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＰＳＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地でもＣＨＯ−ＬＣＡ株及びＣＨＯ−ＡＡＬ株は耐性を示し生存することが分かった。また、アルキル化剤ＭＮＮＧ無添加の場合でも、上述の処理を施す細胞数を増やすことでレクチン耐性株を取得した。
２．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体生産細胞の作製
上記１で得られたＬＣＡレクチン耐性株に、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、増殖の認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させた。具体的には、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。
３．抗体発現細胞株の培養及び抗体の精製
上記２．で得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体を高生産するＬＣＡレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４形質転換細胞をＲ９２−３−１株と名付けた。Ｒ９２−３−１株は、平成１４年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７６として寄託されている。
Ｒ９２−３−１株を、２００ｎＭ  ＭＴＸ濃度のＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）でコンフルエントになるまで培養し、ダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）で洗浄後、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１（ＪＲＨ社製）に培地交換した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養して培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、抗ＣＤ２０キメラ抗体を精製した。得られた抗体は、Ｒ９２−３−１抗体と名付けた。
実施例７．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産する抗ＣＤ２０キメラ抗体の精製と活性評価
１．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗体の結合活性の評価（蛍光抗体法）
上記実施例６の３項で得られたＲ９２−３−１抗体のＣＤ２０発現細胞株Ｒａｊｉ細胞に対する結合活性を、実施例２の１項に示した蛍光抗体法にしたがって検討し、通常のＣＨＯ細胞由来である市販抗体ＲｉｔｕｘａｎＴＭの活性と比較した。第１７図に示したように、Ｒ９２−３−１抗体、ＲｉｔｕｘａｎＴＭともに抗体濃度依存的に蛍光強度の増加が認められ、ほぼ同様の結合活性を示すことが確認された。
２．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性の評価（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例６の３項で得られたＲ９２−３−１抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を評価するため、実施例２の２項に示した方法に準じて、ＡＤＣＣ活性を測定した。なお、エフェクター細胞とターゲット細胞であるＲａｊｉ細胞との比は２５：１、最終抗体濃度は０．００１〜１０μｇ／ｍＬとし、全量２００μＬになるように添加して反応させた。その結果を第１８図に示した。
ＬＣＡレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来Ｒ９２−３−１抗体はＲｉｔｕｘａｎＴＭよりも高いＡＤＣＣ活性を示していた。
３．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来抗体の糖鎖解析
上記実施例６の３項において得られたＲ９２−３−１抗体の糖鎖解析を実施例３に示した方法にしたがって行った。第１９図にその結果を示した。第１９図で示されたピーク▲１▼〜▲８▼の糖鎖構造は、第７図で示されたピーク▲１▼〜▲８▼の糖鎖構造と同一である。
2003055993.tif 000011
占める面積の合計のうち▲５▼〜▲８▼のピークが占める面積の合計から算出した。
その結果、Ｒ９２−３−１抗体のα−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量は３３％、α−１，６−フコース結合糖鎖含量は６７％であり、実施例３で糖鎖分析を行ったＲｉｔｕｘａｎＴＭと比較すると、ＬＣＡレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で生産した抗体はα−１，６−フコースが結合しない糖鎖含量が多かった。
実施例８．ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子の取得
１．ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列の決定
（１）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子のｃＤＮＡ取得（５’及び３’末端配列を除く部分ｃＤＮＡの取得）
ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０４２３７７）をクエリーとして、げっ歯類由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡを公的データベース（ＢＬＡＳＴ）を用いて検索した結果、３種類のマウスＥＳＴ配列が得られた（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＥ９８６８５６、ＢＦ１５８９８８、ＢＥ２８４７８５）。これらＥＳＴ配列を連結させることにより、推定されるマウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列を決定した。
このマウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より、配列番号３２で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマー、配列番号３３で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒのプライマー、配列番号３４で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマー、配列番号３５で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、配列番号３６で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。
続いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内にて継代後４日間培養した。培養後、Ｒｎｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、各１×１０７細胞より添付の使用説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って各ＲＮＡ５μｇより２０μｌの反応液中にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
該ＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡを増幅するために以下の方法でＰＣＲを行なった。ＣＨＯ細胞由来一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの合成ＤＮＡプライマー２種類］を調製した。なお、合成ＤＮＡプライマーには配列番号３２と配列番号３３、配列番号３４と配列番号３３、配列番号３２と配列番号３５、配列番号３２と配列番号３６の組み合わせを用いた。該反応液をＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
このＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画した結果、配列番号３２と配列番号３３の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１．２ｋｂｐ、配列番号３３と配列番号３４の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１．１ｋｂｐ、配列番号３２と配列番号３５の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約３５０ｂｐ、配列番号３２と配列番号３６の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。これらＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド２２−８（配列番号３２と配列番号３３の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）、２３−３（配列番号３４と配列番号３３の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）、３１−５（配列番号３２と配列番号３５の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を有する）、３４−２（配列番号３２と配列番号３６の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）を得た。これらプラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した（５’末端側の開始メチオニンより下流２８塩基の配列、及び３’末端側の終了コドンより上流２７塩基の配列は合成オリゴＤＮＡ配列由来のため、マウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列である）。
さらに、プラスミド２２−８と３４−２に含まれるＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡを組み合わせたプラスミドを作製するため、以下の工程を行った。１μｇのプラスミド２２−８を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。２μｇのプラスミド３４−２を制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片を、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で末端を脱リン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドＣＨＯ−ＧＭＤを得た（第２０図）。
（２）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの５’末端配列の決定
ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの５’末端側非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）領域の塩基配列より配列番号３７で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、及びＣＨＯ由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より配列番号３８で示される塩基配列を有する３２ｍｅｒのプライマーを作製し、ｃＤＮＡを増幅するために以下の方法でＰＣＲを行なった。ＣＨＯ細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３７と配列番号３８の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間のサイクルを２０サイクル行なった後、さらに９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを１８サイクル行なった。該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付の説明書に従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド５’ＧＭＤを得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用い、該プラスミドに含まれるＣＨＯ由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの開始メチオニンより下流２８塩基の配列を決定した。
（３）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの３’末端配列の決定
ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの３’末端ｃＤＮＡ配列を得るため、以下の方法でＲＡＣＥ法を行なった。ＣＨＯ細胞由来ＲＮＡより、３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製をＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、添付の説明書に従って行なった。ただし、逆転写酵素にはＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。
続いて、上記３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡ  １μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３９で示す２４ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマー［本項（１）で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より作製］、１倍濃度のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液より１μｌを取り、Ｔｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）で２０倍希釈した水溶液１μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号４０で示す２５ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマー［本項（１）で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より作製］、０．５μＭのＮｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約７００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド３’ＧＭＤを得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用い、該プラスミドに含まれるＣＨＯ由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの終止コドンより上流２７塩基の配列、及び３’側のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ領域４１５ｂｐの塩基配列を決定した。
以上、本項（１）、（２）、（３）より決定したＣＨＯ由来ＧＭＤ遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号４１、それに対応するアミノ酸配列を配列番号６１に示す。
２．ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＧＭＤ遺伝子を含むゲノム配列の決定
実施例８の１項で決定したマウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より、配列番号５６で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、以下の方法でＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡを取得した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地［ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地］に３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌ／ウェルずつ分注した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内でコンフルエントになるまで培養したのち、該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３（１９７６）］に従ってゲノムＤＮＡを調製し、ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ）１５０μｌに一晩溶解した。
上記で取得したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３５と配列番号５６の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約１００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｅｘ３を得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用いて該プラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号５７に示す。
次に、実施例８の１項で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より、配列番号５８で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマー、及び配列番号５９で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４由来ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号５８と配列番号５９の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約２００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｅｘ４を得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用いて該プラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号６０に示す。
実施例９．ＣＨＯ細胞由来の糖鎖合成に係わる各種酵素遺伝子の取得
１．ＣＨＯ細胞のＦｘ  ｃＤＮＡ配列の決定
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全ＲＮＡの抽出
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、培養２日目に１×１０７個を回収後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により添付の説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来一本鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製した全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた全ＲＮＡ３μｌに対しＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＧＦＰＰおよびＦｘのクローニングには該反応液の５０倍希釈水溶液を使用した。使用するまで−８０℃で保管した。
（３）チャイニーズハムスターＦｘのｃＤＮＡ部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターＦｘのｃＤＮＡ部分断片を取得した。まず公的データーベースに登録されているヒトＦｘのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  登録番号Ｕ５８７６６）およびマウスのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  登録番号Ｍ３０１２７）に共通の塩基配列に対して特異的なプライマー（配列番号４２および配列番号４３に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号４２および配列番号４３）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分間、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片３０ｌｂｐをＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した（以下、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いた）。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αをコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）、６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）により形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），７，１５１３（１９７９）］（以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いた）に従って、プラスミドＤＮＡを単離し、Ｆｘ  ｃＤＮＡ部分断片が組み込まれた２クローンを得た。各々ｐＣＲＦＸクローン８、ｐＣＲＦＸクローン１２と称す。
Ｆｘクローン８、Ｆｘクローン１２に挿入されたｃＤＮＡの塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入ｃＤＮＡがチャイニーズハムスターのＦｘのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）部分配列をコードすることを確認した。
（４）ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの合成
本項（１）で抽出したＣＨＯ／ＤＧ４４全ＲＮＡからの５’および３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製を、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて行った。方法は添付の説明書に従った。ただしＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を逆転写酵素として用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは各々、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。（５）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＦｘ全長ｃＤＮＡの決定
上記（３）項で決定したチャイニーズハムスターＦｘの部分配列をもとにチャイニーズハムスターＦｘに特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＦＸＧＳＰ１−１（配列番号４４）およびＦＸＧＳＰ１−２（配列番号４５）、チャイニーズハムスターＦｘ特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＦＸＧＳＰ２−１（配列番号４６）およびＦＸＧＳＰ２−２（配列番号４７）を設計した。
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本項（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌチャイニーズハムスターＦｘ特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲは９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より１μｌをとりＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで５０倍に希釈した水溶液１μｌをテンプレートとして使用し、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。一回目および２回目のＰＣＲで用いたプライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長を第２表に示した。
2003055993.tif 000012
ＰＣＲ後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片をＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、チャイニーズハムスターＦｘの５’領域を含むｃＤＮＡを６クローンを得た。各々をＦｘ５’クローン２５、Ｆｘ５’クローン２６、Ｆｘ５’クローン２７、Ｆｘ５’クローン２８、Ｆｘ５’クローン３１、Ｆｘ５’クローン３２と称す。
同様にチャイニーズハムスターＦｘの３’領域を含むｃＤＮＡを５クローンを得た。各々Ｆｘ３’をＦｘ３’クローン１、Ｆｘ３’クローン３、Ｆｘ３’クローン６、Ｆｘ３’クローン８、Ｆｘ３’クローン９と称す。
上記、５’および３’ＲＡＣＥにより取得した各クローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法より決定した各ｃＤＮＡの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターＦｘｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号４８に示す。配列番号４８のＯＲＦは、塩基番号９５〜１０６０であり、終止コドンを除く塩基番号９５〜１０５７に対応するアミノ酸配列を配列番号６２に示す。
２．ＣＨＯ細胞のＧＦＰＰ  ｃＤＮＡ配列の決定
（１）チャイニーズハムスターＧＦＰＰのｃＤＮＡ部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターＧＦＰＰのｃＤＮＡ部分断片を取得した。まず公的データーベースに登録されているヒトＧＦＰＰのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  登録番号ＡＦ０１７４４５）、該配列と相同性の高いマウスＥＳＴ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  登録番号ＡＩ４６７１９５、ＡＡ４２２６５８、ＢＥ３０４３２５、ＡＩ４６６４７４）、およびＲａｔ  ＥＳＴ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  登録番号ＢＦ５４６３７２、ＡＩ０５８４００、ＡＷ１４４７８３）の塩基配列を比較し、３種間で保存性の高い領域にラットＧＦＰＰに特異的なプライマーＧＦＰＰ  ＦＷ９およびＧＦＰＰ  ＲＶ９（配列番号４９および配列番号５０）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項１（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記ＧＦＰＰ特異的プライマーＧＦＰＰ  ＦＷ９およびＧＦＰＰ  ＲＶ９（配列番号４９および配列番号５０）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片１．４ＫｂｐをＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、ＧＦＰＰ  ｃＤＮＡ部分断片が組み込まれた３クローンを得た。各々ＧＦＰＰクローン８、ＧＦＰＰクローン１１、ＧＦＰＰクローン１２と称す。
ＧＦＰＰクローン８、ＧＦＰＰクローン１１、ＧＦＰＰクローン１２に挿入されたｃＤＮＡの塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入ｃＤＮＡがチャイニーズハムスターのＧＦＰＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の部分配列をコードすることを確認した。
（２）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＧＦＰＰ全長ｃＤＮＡの決定
本項２（１）で決定したチャイニーズハムスターＦｘの部分配列をもとにチャイニーズハムスターＦｘに特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＧＦＰＰ  ＧＳＰ１−１（配列番号５２）およびＧＦＰＰ  ＧＳＰ１−２（配列番号５３）、チャイニーズハムスターＧＦＰＰ特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＧＦＰＰ  ＧＳＰ２−１（配列番号５４）およびＧＦＰＰ  ＧＳＰ２−２（配列番号５５）を設計した。
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本項（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡ１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌチャイニーズハムスターＧＦＰＰ特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲは９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より１μｌをとりＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで５０倍に希釈した水溶液１μｌをテンプレートとして、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。一回目および２回目のＰＣＲで用いたプライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長を第３表に示した。
2003055993.tif 000013
ＰＣＲ後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片をＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、チャイニーズハムスターＧＦＰＰの５’領域を含むｃＤＮＡを４クローンを得た。各々をＧＦＰＰ５’クローン１、ＧＦＰＰ５’クローン２、ＧＦＰＰ５’クローン３、ＧＦＰＰ５’クローン４と称す。
同様にチャイニーズハムスターＧＦＰＰの３’領域を含むｃＤＮＡを３クローンを得た。各々をＧＦＰＰ３’クローン１０、ＧＦＰＰ３’クローン１６、ＧＦＰＰ３’クローン２０と称す。
上記、５’および３’ＲＡＣＥにより取得した各クローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。塩基配列決定後、各ｃＤＮＡの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターＧＦＰＰ  ｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号５１に示す。配列番号５１のＯＲＦは、塩基番号２７〜１７９９であり、終止コドンを除く塩基番号２７〜１７９６に対応するアミノ酸配列を配列番号６３に示す。
実施例１０  α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体の活性評価
１．α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体の調製
実施例１の３項で精製したＫＭ３０６５と、ＣＨＯ細胞由来のＲｉｔｕｘａｎＴＭを用い、ＫＭ３０６５：ＲｉｔｕｘａｎＴＭ＝２４：６６、３４：５６、４４：４６の割合で混合した。これらの試料を実施例３の方法にしたがって糖鎖分析を行なった。α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合は、それぞれ２６％、３５％、４４％であった。以下、これらの試料を抗ＣＤ２０キメラ抗体（２６％）、抗ＣＤ２０キメラ抗体（３５％）、抗ＣＤ２０キメラ抗体（４４％）と表記する。第２１図には、各試料の糖鎖分析の結果を示した。
２．ＣＤ２０発現細胞株に対する結合活性の評価（蛍光抗体法）
実施例１０の１項で調製した３種類のα−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体に、実施例３で糖鎖分析を行ったＫＭ３０６５及びＲｉｔｕｘａｎＴＭ（それぞれ抗ＣＤ２０キメラ抗体（９６％）、抗ＣＤ２０キメラ抗体（６％）と表記する）を加えた５種類の抗体の結合活性を実施例２の１項に示した蛍光抗体法にしたがって測定した。第２２図に示したように、抗体濃度０．０１６〜２μｇ／ｍＬにおいていずれの抗体もＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）に対してほぼ同等の結合活性を示し、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合は、抗体の抗原結合活性に影響を与えないことが明らかとなった。
３．ＣＤ２０発現細胞株に対する細胞傷害活性の評価（５１Ｃｒリリース法）
ＣＤ２０陽性であるヒトＢリンパ球細胞株ＷＩＬ２−Ｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８８８５）に対するＡＤＣＣ活性を、健常人ドナーＡから採取したエフェクター細胞を用いて、以下のようにして測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＷＩＬ２−Ｓ細胞の２×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地を用いた懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を１０ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。培地で３回遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ヒトエフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（２×１０５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。さらに、各種α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体を各最終濃度０．００１〜１μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。細胞傷害活性（％）は下式により求めた。
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第２３図には、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体の各種濃度（０．００１〜１μｇ／ｍＬ）におけるＡＤＣＣ活性を健常人ドナーＡのエフェクター細胞を用いて上記の方法により測定した結果を示した。第２３図に示したように、抗ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、いずれの抗体濃度においても、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合が増加すると上昇する傾向を示した。抗体濃度が低ければ、ＡＤＣＣ活性は低下する。抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬでは、α−１，６−フコースが結合しない糖鎖が２６％、３５％、４４％及び９６％の抗体はほぼ同様の高いＡＤＣＣ活性を示したが、α−１，６−フコースが結合しない糖鎖が６％の抗体ではＡＤＣＣ活性は低かった。
４．ＣＤ２０発現細胞株に対するＡＤＣＣ活性の評価（ＬＤＨ法）
Ｒａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を、実施例２の２項に示したＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）活性測定法により、健常人ドナーＢより採取したエフェクター細胞を用いて評価した。エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１、最終抗体濃度は０．０００１〜１μｇ／ｍＬとし、全量２００μＬになるように添加して、３７℃で４時間反応させた後、実施例２の２項にしたがって、測定を行った。第２４図には、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体の各種濃度（０．０００１〜１μｇ／ｍＬ）におけるＡＤＣＣ活性を健常人ドナーＢのエフェクター細胞を用いて測定した結果を示した。第２４図に示したように、抗ＣＤ２０キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、いずれの抗体濃度においても、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合が増加すると上昇する傾向を示した。抗体濃度が低ければ、ＡＤＣＣ活性は低下する。抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬでは、α−１，６−フコースが結合しない糖鎖が２６％、３５％、４４％及び９６％の抗体は高いＡＤＣＣ活性を示したが、α−１，６−フコースが結合しない糖鎖が６％の抗体ではＡＤＣＣ活性は低かった。
第２３図および第２４図の結果は、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合に応じてＡＤＣＣ活性が上昇すること、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合が約２０％以上の抗体組成物は、十分高いＡＤＣＣ活性を有することを示し、ヒトエフェクター細胞のドナーまたは標的細胞が異なっても同様の結果が得られた。
実施例１１：バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体の活性評価
（１）レクチンクロマトグラフィーによる抗ＣＤ２０キメラ抗体の分離
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖に親和性があるレクチンが固定化されたカラムを用いて、実施例１の３項で精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５を分離した。
精製された抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５を含む溶液をレクチンカラム（ＬＡ−ＰＨＡ−Ｅ４、４．６×１５０ｍｍ、ホーネンコーポレーション社製）に通塔した。ＨＰＬＣシステムとしてはＳｈｉｍａｄｚｕ社製ＬＣ−６Ａを用い、流速０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温にてレクチンクロマトグラフィーを行った。５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを平衡化し、精製されたＫＭ３０６５を含む溶液を注入後、５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）中０Ｍから５８ｍＭへの四ほう酸カリウム（Ｋ２Ｂ４Ｏ７、ナカライテスク社製）によるリニアグラジエント（３５分間）にて溶出した。その後５分間四ほう酸カリウム濃度を１００ｍＭに維持し、その後さらに５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２０分間通塔することにより、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５を、９〜１４分、１４〜１７分、１７〜２２分、２２〜３４分に溶出した４つの画分（画分▲１▼〜▲４▼）に分離した（第２５図）。
（２）糖鎖分析
前項で分離した４つの画分（画分▲１▼〜▲４▼）と分離前の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５の糖鎖分析を、実施例３に示す方法で行った。ＰＡ化糖鎖群は、１５分から４５分の範囲に溶出した。各ＰＡ化糖鎖のピーク面積の合計に占める、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖の割合を算出した結果、分離前の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５の該糖鎖の割合は２０％であるのに対し、画分▲１▼：０％、画分▲２▼：８％、画分▲３▼：３３％、画分▲４▼：４５％であった（第２６図）。α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合はそれぞれ分離前の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５：９６％、画分▲１▼：９３％、画分▲２▼：９４％、画分▲３▼：９２％、画分▲４▼：９０％であった。以上の結果から、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖に親和性があるレクチンが固定化されたカラムを用いて、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合がほぼ均一であり、かつバイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖が結合した抗体分子の割合の異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体が調製されたことを確認した。
（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）の測定  レクチンクロマトグラフィーによって分離した４つの画分（画分▲１▼〜▲４▼）、ならびに分離前の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）測定を、実施例２の２項に示す方法で行った（第２７図）。その結果、レクチンクロマトグラフィーによって分離した４つの画分は、分離前の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５とほぼ同じ強さのＡＤＣＣ活性を示した。α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合は前項の結果から９０％〜９６％とほぼ均一であり、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子がＡＤＣＣ活性に与える影響はほぼ同じであると考えられた。α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合が高くＡＤＣＣ活性が高い抗体に、更にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを付加してもＡＤＣＣ活性の強さは増強しなかった。すなわち、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した割合の高い抗体はバイセクティングＧｌｃＮＡｃの有無には関係なく、α−１，６−フコースを持つ糖鎖が結合した割合の高い抗体に比べてＡＤＣＣ活性が高いことが分かった。
産業上の利用可能性
本発明によりＣＤ２０に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物、該抗体組成物を生産する細胞またはトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する医薬が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの構築過程を示した図である。
第２図は、プラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの構築過程を示した図である。
第３図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの構築過程を示した図である。
第４図は、蛍光抗体法を用いて、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５及びＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０発現細胞Ｒａｊｉ細胞との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した結果である。各濃度における相対蛍光強度を縦軸に、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＫＭ３０６５の活性をそれぞれ示す。
第５図は、蛍光抗体法を用いて、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５及びＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０陰性細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞との結合活性を測定した図である。
第６図は、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５及びＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０発現細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。ＡはＲａｊｉ細胞、ＢはＲａｍｏｓ細胞、ＣはＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞にしたものである。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＫＭ３０６５の活性をそれぞれ示す。
第７図は、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５及びＲｉｔｕｘａｎＴＭからＰＡ化糖鎖を調製し、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第８図は、プラスミドＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１の構築を示した図である。
第９図は、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏの構築を示した図である。
第１０図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１の構築を示した図である。
第１１図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２の構築を示した図である。
第１２図は、プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築を示した図である。
第１３図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築を示した図である。
第１４図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４の構築を示した図である。
第１５図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５の構築を示した図である。
第１６図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築を示した図である。
第１７図は、蛍光抗体法を用いて、レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産した抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｒ９２−３−１の結合活性を抗体濃度を変化させて測定した結果である。各濃度における相対蛍光強度を縦軸に、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＲ９２−３−１の活性をそれぞれ示す。
第１８図は、レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産した抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｒ９２−３−１のＡＤＣＣ活性を、Ｒａｊｉ細胞を標的細胞にして評価した結果を示したものである。グラフの縦軸に標的細胞の細胞傷害活性を、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＲ９２−３−１のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
第１９図は、レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産した抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｒ９２−３−１から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。逆相ＨＰＬＣの分析条件、糖鎖構造の同定、α−１，６−フコースが結合しない糖鎖群の割合の算出は、実施例３と同じ方法で行った。
第２０図は、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ  ｃＤＮＡクローン２２−８の５’末端にクローン３４−２の５’末端を導入したプラスミドＣＨＯ−ＧＭＤの作製工程を示した図である。
第２１図は、３種類の抗ＣＤ２０キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。逆相ＨＰＬＣの分析条件、糖鎖構造の同定、α−１，６−フコース非結合糖鎖群の割合の算出は、実施例３と同じ方法で行った。
第２２図は、蛍光抗体法を用いて、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合が異なる５種類の抗ＣＤ２０キメラ抗体のＣＤ２０発現細胞に対する結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＣＤ２０との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。□が抗ＣＤ２０キメラ抗体（９６％）、■が抗ＣＤ２０キメラ抗体（４４％）、△が抗ＣＤ２０キメラ抗体（３５％）、▲が抗ＣＤ２０キメラ抗体（２６％）、○が抗ＣＤ２０キメラ抗体（６％）の活性をそれぞれ示す。
第２３図は、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合が異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体のＷＩＬ２−Ｓ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。ドナーＡのエフェクター細胞を用いて５１Ｃｒ法により測定した結果を示し、縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□が抗ＣＤ２０キメラ抗体（９６％）、■が抗ＣＤ２０キメラ抗体（４４％）、△が抗ＣＤ２０キメラ抗体（３５％）、▲が抗ＣＤ２０キメラ抗体（２６％）、○が抗ＣＤ２０キメラ抗体（６％）の活性をそれぞれ示す。
第２４図は、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が結合した抗体分子の割合が異なる抗ＣＤ２０キメラ抗体のＲａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。ドナーＢのエフェクター細胞を用いてＬＤＨ法により測定した結果を示し、縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□が抗ＣＤ２０キメラ抗体（９６％）、■が抗ＣＤ２０キメラ抗体（４４％）、△が抗ＣＤ２０キメラ抗体（３５％）、▲が抗ＣＤ２０キメラ抗体（２６％）、○が抗ＣＤ２０キメラ抗体（６％）の活性をそれぞれ示す。
第２５図は、抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５を、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖に親和性があるレクチンが固定化されたカラムを用いて分離した溶離図を示したものである。縦軸に２８０ｎｍにおける吸光度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。▲１▼〜▲４▼は、それぞれ画分▲１▼〜画分▲４▼の溶出位置を示す。
第２６図は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖に親和性があるレクチンが固定化されたカラムを用いて分離した画分▲１▼〜▲４▼と、分離前の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。上段左図に分離前のＫＭ３０６５、上段右図に画分▲１▼、中段左図に画分▲２▼、中段右図に画分▲３▼、下段左図に画分▲４▼の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中黒く塗りつぶしたピークは抗体由来のＰＡ化糖鎖を示し、「＊」はバイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つＰＡ化糖鎖を示す。
第２７図は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖に親和性があるレクチンが固定化されたカラムを用いて分離した画分▲１▼〜▲４▼、ならびに分離前の抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５の、Ｒａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。健常人ドナー由来のエフェクター細胞を用いてＬＤＨ法により測定した結果を示し、縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。●が分離前のＫＭ３０６５、○が画分▲１▼、△が画分▲２▼、◇が画分▲３▼、◆が画分▲４▼、□がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、×が抗体非添加の活性をそれぞれ示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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