(57)【要約】ベンゼンに対して資化性を示すロドコッカス属細菌。この細菌は、ベンゼンに対して耐性も示す。例えば、ロドコッカス・エスピーＢ−４株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８２）、またはロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８３）。配列番号１で示される塩基配列を有するか、図３に示す制限酵素開裂地図で示される。配列番号２で示される塩基配列を有するか、図４に示す制限酵素開裂地図で示されるプラスミド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベンゼンに対して資化性を示すロドコッカス属細菌。
【請求項２】
ベンゼンに対して耐性を示すロドコッカス属細菌。
【請求項３】
ロドコッカス・エスピーＢ−４株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８２）、またはロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８３）である請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項４】
配列番号１で示される塩基配列を有するプラスミド。
【請求項５】
図３に示す制限酵素開裂地図で示されるプラスミド。
【請求項６】
配列番号２で示される塩基配列を有するプラスミド。
【請求項７】
図４に示す制限酵素開裂地図で示されるプラスミド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、有機溶媒、特にベンゼンに対する高度耐性及び資化性を有するロドコッカス属細菌に関する。
背景技術
微生物を用いて水に難溶性の物質を生産する場合に、生成した物質の回収の容易さ、反応平衡の移動による収量増大、毒性生成物の除去による反応阻害の回避、反応系の混合状態の改善による反応速度増大などを目的として、微生物生菌体を含む反応混合物に水と完全には混合せず相分離する有機溶媒を加えて二相系とすることが試みられている。
しかし、有機溶媒が微生物の細胞壁や膜構造に及ぼす障害のため、疎水性物質の溶解力が大きい芳香族系溶媒を用いることは、生物活性を長期間にわたり維持するという観点からは好ましくない。一方、毒性の低いパラフィン系溶媒などを使用する場合は、溶解力が不十分であったり、溶媒の除去に高温や減圧を必要とするなどの問題がある。
ところで、有機溶媒の分配係数（Ｐ）は、混じり合わない２種の溶媒系における平衡状態での物質の活動度の比として表され、物質の濃度が小さい場合は、その濃度を活動度とみなすことができる。生物反応に使用可能な有機溶媒を決定する際に、ｌｏｇＰを溶媒の極性の指標として用いると、生物反応と良好な相関が得られ、ｌｏｇＰ＜２の極性溶媒では反応性が低く、ｌｏｇＰ＝２〜４の溶媒中では反応性が中程度、ｌｏｇＰ＞４の非極性溶媒では反応性が高いことなどが知られている（Ｃ．Ｌａａｎｅ，Ｓ．Ｂｏｅｒｅｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｖｏｓ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，２５１，１９８５及びＣ．Ｌａａｎｅ，Ｓ．Ｂｏｅｒｅｎ，Ｋ．Ｖｏｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｖｅｅｇｅｒ；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３０，８１，１９８７）。有機溶媒の中でも、ベンゼンは、ｌｏｇＰ＝２であり、生物反応性が低い。
有機溶媒を含む培地中で、生育することのできる菌は数多く知られている。しかしながら、ベンゼンは多くの有機溶媒の中で特に微生物に対する毒性が強く、ベンゼンに耐性を持つ、あるいは資化性を持つ菌株はそれほど多く知られていない。例えば、ベンゼン濃度が水に対する飽和濃度以下の場合に耐性や資化性を示すロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３，２９７５−２９８１（１９９７））、ベンゼン５％（ｖ／ｖ）二相系で耐性を有するグラム陰性のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌（Ｊ  Ｆｅｒｍｅｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７６，１６８−１７３（１９９３））が知られているが、これらの文献に記載の濃度以上のベンゼンを含むベンゼン−水二相系において、ベンゼンに対する耐性及び資化性を有する細菌は知られていない。特にグラム陽性菌でベンゼン濃度が水に対する飽和濃度以下の場合においても生育するものは知られていなかった。その上、グラム陰性菌は、細胞表層に外膜を有するため、水に難溶性の物質の透過は困難であり、物質生産の手段としては好ましくない。これに対して、グラム陽性菌には、細胞表層に外膜がないので、物質生産には好適である。また、有機溶媒に対して耐性だけでなく資化性を有する細菌は、他の炭素源を供給せずに有機溶媒中で増殖することができる。そのため、有機溶媒を原料とした物質生産に用いられる細菌には、使用する有機溶媒に対する耐性に加えて、資化性を有することが望ましい。従って、ベンゼン−水二相系における生物反応のためには、ベンゼン濃度が高い反応系においても、耐性及び資化性を有するグラム陽性菌が必要とされる。
そこで、本発明は、有機溶媒、特にベンゼンに対して耐性及び資化性を有するグラム陽性菌を提供することを目的とする。
さらに本発明は、本発明で提供されるロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌で複製するプラスミドベクターの構築を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、東広島市の交通量が多い道路端の土壌、下水処理施設の活性汚泥および汚濁している河川の堆積物から、以下の分離方法により、有機溶媒、特にベンゼンに対して耐性及び資化性を有する菌株（以下、「ベンゼン資化性細菌」、「ベンゼン資化性菌」という）を取得して、本発明であるベンゼンに対して資化性を示すロドコッカス属細菌を完成させた。
発明を実施するための最良の形態
［分離方法］
ベンゼンを唯一の炭素源とした培地を用いて集積培養を数回行い、ベンゼン資化性細菌を単離した。手順は下記の通りである。
１．採取した試料５ｇをスクリューキャップ付きの５０ｍｌ容バイアル瓶に入れる。さらにベンゼン１ｍｌを入れたダラム管（微小試験管）を入れてキャップをし、２８℃で１週間馴化培養を行った（図１）。
２．馴化培養後、試料１ｇを５ｍｌの滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）に懸濁した。その上清１ｍｌをスクリューキャップ付きバイアル瓶中の１０ｍｌのＭＭ培地に植菌し、さらにベンゼン１ｍｌを入れたダラム管（微小試験管）を入れてキャップをし、２８℃で振とう培養を行った（図１）。ＭＭ培地の組成は、Ｋ２ＨＰＯ４，４．３ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４，３．４ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４，２．０ｇ／ｌ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．１６ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，１ｍｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．６ｍｇ／ｌ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，２６ｍｇ／ｌ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，２ｍｇ／ｌ；ＺｎＣｌ２，０．１ｍｇ／ｌ；ＣｏＣｌ２，０．１ｍｇ／ｌ；ＮｉＳＯ４，１０μｇ／ｌ；Ｎａ２ＳｅＯ４・１０Ｈ２Ｏ，１０μｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．１ｍｇ／ｌである。
３．ベンゼン資化性微生物群集が増殖し、６００ｎｍ光を用いた濁度がおよそ０．５程度に到達したら、その培養液０．１ｍｌをスクリューキャップ付きバイアル瓶中の１０ｍｌのＭＭ培地に植菌し、さらにベンゼン１ｍｌを入れたダラム管（微小試験管）を入れてキャップをし、２８℃で振とう培養を行った。この操作をさらにもう１回行った。
４．３の培養液を生理食塩水で段階的に希釈し、希釈液１００μｌを２．０％寒天を含んだＭＭ寒天培地に塗布した。希釈液を塗布した寒天培地プレートをタッパーウエア等の密閉性の容器に入れた。この容器には、ベンゼンを入れたバイアル瓶を配置し、蒸気でベンゼンを供給した。数日間２８℃で培養を行った。
５．４の操作で生じた単一コロニーを取得することで、ベンゼン資化性細菌を単離した。
以上の操作の結果、道路端土壌、活性汚泥、河川堆積物から１株ずつベンゼン資化性細菌を単離した。そして、それぞれをＢ−４株、Ｂ−９株、Ｂ−１０株と命名した。
［取得したベンゼン資化性細菌の分類］
常法に従ってＢ−４、Ｂ−９及びＢ−１０株の染色体ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型、真正細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー（６３ｆ，５’−ＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号６）；１３８７ｒ，ＧＧＧＣＧＧＷＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号７））、ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用い、ＤＮＡ増幅装置（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、９６００型）でそれぞれの菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの一部（１．３ｋｂ）を増幅した。ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））により増幅断片をクローニングした後、Ｄｙｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターＤＮＡシーケンシングキット（アマシャムファルマシア）とＤＮＡシーケンサ（ＡＢＩ３１０）により部分的に塩基配列を決定した。Ｂ−４株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号３、Ｂ−９株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号４、Ｂ−１０株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号５に示す通りであった。
得られたＤＮＡ塩基配列を用いてＤＮＡデータバンクに対して相同性（ＦＡＳＴＡ）検索を行ったところ、以下に示す通り、いずれの菌株のＤＮＡ配列もロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡと高い相同性を示した。尚、菌株名末尾の括弧内の番号は、ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ）の登録番号である。
Ｂ−４株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性は、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）ＳＮＫ１０６（ＡＢ０３７１０２）に対して９７％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）ＳＮＫ１０３（ＡＢ０３７１００）に対して９７％、ロドコッカス・ウラチスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）（Ｚ３７１３８）に対して９７％であった。
Ｂ−９株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性は、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）ＳＡＯ１０１（ＡＢ０３２５６５）に対して９９％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）１ＣＰ（Ｙ１１８９３）に対して９９％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）ＧＭ−２９（Ｙ１１８９２）に対して９９％であった。
Ｂ−１０株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性は、ロドコッカス・ウラチスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）（Ｚ３７１３８）に対して１００％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｍ２１３（ＡＦ０９５７１５）に対して１００％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）ＳＡＯ１０１（ＡＢ０３２５６５）に対して１００％であった。
３株とも短桿菌、運動性：陰性、ＯＦテスト：ｏｘｉｄａｔｉｖｅ、オキシダーゼ活性：陽性、カタラーゼ活性：陽性、ゼラチン溶解活性：陰性、３０℃での増殖：陽性、３７℃での増殖：陰性であった。また、糖の資化性のパターンは表２の通りとなった。
2003072762.tif 000002
Ｄ−ツラノースを資化し、Ｌ−ラムノースを資化できないことは、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）の特徴である。１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列もロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）と相同性が高いことから、取得した菌株Ｂ−９株及びＢ−１０株をロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）と同定し、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０株と命名した。また、Ｂ−４株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列は、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）との相同性が比較的高いが、Ｂ−９株及びＢ−１０株よりも相同性が低い。そのため、Ｂ−４株を、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株と命名した。
これらの菌株は、平成１４年２月２０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、それぞれロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７２７）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７２８）、及びロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｂ−１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７２９）として原寄託され、平成１５年１月２７日にそれぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８２及びＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８３として国際寄託に移管されている。
尚、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の分類によると、ある程度の有機溶媒耐性を示すことが知られているシュードモナス属細菌の多くは、バイオセーフティ・レベル２に指定されているのに対し、同コレクションに含まれているロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１７０３９、ＡＴＣＣ５１８８１、及びＡＴＣＣ５１８８２）はいずれも、バイオセーフティ・レベル１に指定されている。また、我が国の植物防疫所及び動物検疫所での輸入禁止該当品ではない。
本発明のロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０並びにロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株は、後述する実施例に示すように、ベンゼンに対して資化性を示すロドコッカス属細菌である。さらに、これら本発明のロドコッカス属細菌は、後述する実施例に示すように、ベンゼン以外に、トルエン、スチレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、ｎ−オクタン及びｎ−デカンに対しても資化性を示す。
本発明のロドコッカス属細菌は、ベンゼンに対して優れた耐性を示す。ベンゼン濃度が水に対する飽和濃度以上になると、多くの微生物は生育できなくなるが、本発明のロドコッカス属細菌は、その濃度をはるかに超える濃度、例えば２０％（ｖ／ｖ）においても良好に生育するという、優れたベンゼン耐性を有している。
さらに本発明のロドコッカス属細菌は、後述する実施例に示すように、他の有機溶媒に耐性を有し、そのような有機溶媒の例としては、トルエン、スチレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、ｎ−オクタン及びｎ−デカンを挙げることができる。
本発明のロドコッカス属細菌は、上記のように、有機溶媒、特にベンゼンに対する資化性を有し、かつベンゼンを含む種々の有機溶媒に対して耐性を示すことから、有機溶媒を原料とした物質生産等に用いることができる。
さらに本発明は、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株由来のプラスミドに関する。第１のプラスミドは、配列番号１で示される塩基配列を有し、かつ図３に示す制限酵素開裂地図で示される４４３７ｂｐのプラスミドである。第２のプラスミドは、配列番号２で示される塩基配列を有し、図４に示す制限酵素開裂地図で示される２７７４ｂｐのプラスミドである。
これらのプラスミドは、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株の培養液から、後述する実施例に示すような方法で調製することができる。これらのプラスミドは、ベンゼン等の有機溶媒に対する資化性と耐性を有するロドコッカス属細菌の形質転換に利用することができる。なお、これらのプラスミドは、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性等の薬剤耐性マーカーやプロモーター、マルチクローニングサイト等を導入し、物質生産等に利用しやすいものに改変することができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
［有機溶媒の資化性］
ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０株並びにロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株の有機溶媒の資化性について検討した。ＭＭ培地に表２に示した有機溶媒を１０％（ｖ／ｖ）添加した培地１０ｍｌを５０ｍｌのスクリューキャップ付バイアル瓶に入れ、これに植菌し、２８℃で２日間振とう培養を行い増殖をＯＤ６００にて計測した。ＯＤ６００は、６００ｎｍ光を用いた濁度を示し、菌体濃度の指標として用いることができる。なお、振とうはロータリーシェーカーで１２０ｒｐｍの速度で行った。結果を表２に示す。
表２に示したｌｏｇＰＯＷ値は、有機溶媒の分配係数の対数値であり、以下の方法によって実験的に求めた値である。
水・オクタノール（１：１）の混合液に、検定溶媒ｍを溶解したときの水相の溶媒ｍの濃度を［ｍ］Ｗ、オクタノール中の溶媒ｍの濃度を［ｍ］Ｏとしたとき、ｌｏｇＰＯＷは、以下の式から求められる。
ｌｏｇＰＯＷ＝ｌｏｇ（［ｍ］Ｏ／［ｍ］Ｗ）
上記式から明らかなように、疎水性が高いほど（オクタノールに溶けやすいほど）、ｌｏｇＰＯＷは高い値となり、水に溶けやすいほどｌｏｇＰＯＷは低い値となる。
有機溶媒を重層した二相培養系において、有機溶媒の毒性は、ｌｏｇＰＯＷ値に依存し、ｌｏｇＰＯＷが低いほど毒性が高いことが実験的に示されている（Ａ．Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２６４−２６６，１９８９）。即ち、有機溶媒が毒性を発揮するためには、菌が存在する水相に溶け入ることが必要であるので、水に溶けやすく、水相に高濃度で存在できる有機溶媒ほど、有機溶媒二相培養系において、毒性が強いといえる。従って、ｌｏｇＰＯＷは、異なる溶媒の毒性比較パラメーターとして用いることができる。
2003072762.tif 000003
培養開始時のＯＤ６００は各溶媒系においてそれぞれ０．０３であったのに対し、ベンゼン、トルエン、スチレン、ｏ−、ｍ−、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、ｎ−オクタン又はｎ−デカンを含む有機溶媒−水相の二相系（１０％有機溶媒が存在）の培養における取得菌株のＯＤ６００値は、いずれも培養開始時と比べて大きく上昇した。各溶媒系には、有機溶媒以外の炭素源が存在しないため、表２に示す結果から、取得菌株は、上記有機溶媒を炭素源として使用することができ、資化性を有することがわかる。特に、ベンゼンのｌｏｇＰＯＷの値は２．０と極めて低いかかわらず二相系でベンゼンを資化できるということは、取得菌株が極めて強い有機溶媒耐性能を有することを意味する。
実施例２
［ベンゼンの資化性］
ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株並びにロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０株について、ベンゼン資化性を検討した。表３に示した濃度になるようにベンゼンを添加したＭＭ培地１０ｍｌを５０ｍｌのスクリューキャップ付バイアル瓶に入れ、これに植菌し、２８℃で２日間振とう培養を行い、増殖をＯＤ６００にて計測した。なお、振とうはロータリーシェーカーで１２０ｒｐｍの速度で行った。結果を表３に示す。
2003072762.tif 000004
表３から、これら菌株が、ベンゼンが高濃度で存在する場合にも、高い資化性を有することが示された。
実施例３
［グルコースを炭素源として添加した時の有機溶媒耐性］
実施例１に示した試験では、耐性はあっても資化できないために増殖しなかった可能性があるため、ＭＭ培地に炭素源としてグルコース（５ｇ／ｌ）を添加した培地に１０％（ｖ／ｖ）有機溶媒を添加した培地での増殖を調べた。結果を表４に示す。
2003072762.tif 000005
いずれの菌株もｎ−デカン存在下での増殖は極めて良好であった。また、Ｂ−４株とＢ−９株はシクロヘキサン存在下で良好な生育を示し、これら物質に対して強い耐性を持つことが示された。ｎ−デカン及びシクロヘキサノン以外の有機溶媒は、概ね有機溶媒を炭素源とした培養の方が多少よい増殖を示した。
実施例４
［プラスミドの調製］
本発明のベンゼン資化性細菌を用いて、有機溶媒を原料とした物質変換による物質生産を行おうとするとき、本発明のベンゼン資化性細菌の物質変換能を向上させるために遺伝子操作が可能であることが望ましい。遺伝子操作を行うためには、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌で複製するプラスミドベクターの構築が必要である。もし、取得した菌株が適当な大きさ（１０ｋｂ以下）のプラスミドを保持していれば、プラスミド構築に活用することができる。そこで、取得菌株のプラスミドの検索を行った。プラスミド試料の調製方法を以下に示す。
プラスミド試料の調製法
４．５ｍｌの培養液から遠心分離で菌体を回収する。５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むＧＴＥ緩衝液（５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μｌに菌体を懸濁し、３７℃，２時間反応させる。１％ＳＤＳ，０．２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液２００μｌを添加し、よく混合し、氷上に５分間置く。氷冷した５Ｍ  ＣＨ３ＣＯ２Ｋ（ｐＨ５．２）１５０μｌ添加し、よく混合し、氷上に５分間置く。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移す。ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール／クロロフォルム混合液（１：１，ｖ／ｖ）４５０μｌ添加し、５分間混合する。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上層（水層）を新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移す。９９．５％エタノールを９００μｌ添加し、混合した後、１０分間氷上に置く。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除く。７０％エタノールで沈澱を洗浄後、１０分間風乾する。ＲＮａｓｅＡ  ５０μｇ／ｍｌ含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）２５μｌに沈澱を溶解する。
上記の方法で調製したプラスミド試料を１％アガロースゲル電気泳動で解析したところ、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株が４４３７ｂｐと２７７４ｂｐの大きさの環状プラスミドを保持していることが明らかとなった（図２）。４４３７ｂｐの大きさの環状プラスミドの塩基配列を配列番号１に、２７７４ｂｐの大きさの環状プラスミドの塩基配列を配列番号２に示す。これら環状プラスミドの制限酵素開裂地図を常法により作成し、図３及び４に示す。
産業上の利用分野
本発明により、有機溶媒、特にベンゼンに対する資化性を有するロドコッカス属細菌が提供される。本発明のベンゼン資化性細菌は、有機溶媒を原料とした物質生産に用いることができる。更に、本発明のベンゼン資化性細菌から調製されたプラスミドを用いて、プラスミドベクターを構築することができる。
【配列表】
2003072762.tif 000006
2003072762.tif 000007
2003072762.tif 000008
2003072762.tif 000009
2003072762.tif 000010
2003072762.tif 000011
2003072762.tif 000012
2003072762.tif 000013
2003072762.tif 000014
【図面の簡単な説明】
図１は、ベンゼン資化性菌の培養方法を示す。
図２は、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｂ−４株のプラスミドを１％アガロースゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図３は、４４３７ｂｐの環状プラスミドの制限酵素開裂地図を示す。
図４は、２７７４ｂｐの環状プラスミドの制限酵素開裂地図を示す。
【図１】
2003072762.tif 000015
【図２】
2003072762.tif 000016
【図３】
2003072762.tif 000017
【図４】
2003072762.tif 000018
【国際調査報告】
2003072762.tif 000019
2003072762.tif 000020
2003072762.tif 000021
2003072762.tif 000022