(57)【要約】ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識しアポトーシスを誘導するヒトＩｇＭに属するするモノクローナル抗体を得た。得られた抗体を用いてＨＩＶ感染細胞に特異的に反応し、感染細胞にアポトーシスを誘導して破壊に導くヒトＩｇＭ抗体を有効成分とするＨＩＶ感染患者治療剤等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識し、アポトーシスを誘導するヒトＩｇＭに属することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識し、ＨＩＶ感染細胞にアポトーシスを誘導するヒトＩｇＭ抗体を有効成分として含有することを特徴とするＨＩＶ感染症治療剤。
【請求項３】
ＡＩＤＳの発症を防止するためのものである請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
ＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体がＨ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号１の核酸配列を有する２Ｇ９抗体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体のＬ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号２の核酸配列を有する２Ｇ９抗体であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識し、アポトーシスを誘導するヒトＩｇＭに属することを特徴とする２Ｇ９抗体を産生する寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ―８３７８である細胞株。
【請求項７】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ―８３７８である細胞株が産生することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＨＩＶ感染細胞に特異的に反応し、ＨＩＶ感染細胞にアポトーシスを誘導するヒトＩｇＭモノクローナル抗体及びかかる抗体を有効成分として含有するＨＩＶ感染症治療剤に関する。
【背景技術】  ＨＩＶ感染症に対しては、逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼインヒビターとして種々の薬剤が開発されている。これらの薬剤を３種類ないし４種類を併用する多剤併用療法（ＨＡＡＲＴ：Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）がＨＩＶ感染患者に有効性を発揮し、血中ＨＩＶ量の激減やＣＤ４リンパ球量の改善などをもたらすことが出来るようになった。しかし、多剤併用療法によっても潜伏感染細胞は排除することはできず、ＨＩＶ感染患者を完全に治癒させることは難しく、ＨＩＶが潜伏感染した細胞は、薬剤投与を中止するとＨＩＶは再燃して増殖するという問題があった。
多剤併用療法を間欠的に中断再開を繰り返すとＨＩＶに対する免疫応答が効率良く誘導される場合のあることが報告されているが、確実な治療法とはなっていない。これは、ＨＩＶに対する免疫反応の重要性を示している知見である。
ＨＩＶ感染細胞に特異的に反応するヒト（型）モノクローナル抗体は、遺伝子組換によりヒト型化した抗体が作成されているが、それらはＩｇＧタイプの抗体である。それらは、ＨＩＶの感染を阻害する中和抗体であるが、感染細胞を傷害することは出来ない。
ヒトの細胞膜の上には、種特異的補体制御膜因子群（ＤＡＦ，Ｄｅｃａｙ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＭＣＰ，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＲＦ２０，２０ｋＤａ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒなど）が存在するが、同種のヒト補体の反応を防ぐために、補体反応を介した細胞溶解反応は起こらない。
一方、ＨＩＶ感染細胞に反応するヒト血清中のＩｇＭ抗体は、ＨＩＶ感染細胞を補体制御膜因子群に打ち勝ってヒト補体を介した細胞溶解反応を起こせることが発見された。ＨＩＶ感染によって発現が高まるＧＭ２やＧｇ４などのガングリオシドに対してＩｇＭ抗体がそのような作用を発揮することを知った（特開平９−２２７４０９（第２頁段落「０００９」））。
前記ガングリオシドのＧＭ２に対するヒトＩｇＭモノクローナル抗体としてＥＢウイルスで不死化したヒトＢリンパ芽球株が産生するＬ５５が報告されている。このヒトＩｇＭモノクローナル抗体を作用させたＨＩＶ感染細胞はヒト補体の反応を介して細胞溶解を起こすことがわかった。しかし、Ｌ５５抗体はＨＩＶ感染細胞に特異的なわけではないので、ＨＩＶ感染細胞以外の正常細胞にも反応する可能性がある。
【発明の開示】
本発明は、ＨＩＶ感染細胞に特異的に反応し、感染細胞にアポトーシスを誘導して破壊に導くヒトＩｇＭ抗体を有効成分とするＨＩＶ感染患者治療剤等を提供することにある。
上記の課題を解決するための本発明の第１の解決手段として、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識しアポトーシスを誘導するヒトＩｇＭに属することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。
また、本発明の第２の解決手段は、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識し、ＨＩＶ感染細胞にアポトーシスを誘導ヒトＩｇＭ抗体を有効成分として含有することを特徴とするＨＩＶ感染症治療剤を提供する。
本発明の第３の解決手段は、ＡＩＤＳの発症を防止するためのものである請求項２記載の治療剤を提供する。
本発明の第４の解決手段は、ＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体がＨ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号１の核酸配列を有する２Ｇ９抗体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体を提供する。
さらに、本発明の第５の解決手段は、ＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体のＬ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号２の核酸配列を有する２Ｇ９抗体であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は２Ｇ９抗体の特異性を示す図面である。
フローサイトメトリー法で解析した結果、非感染細胞は２Ｇ９抗体で染色されずＨＩＶ感染細胞が染色されていることを示す（ＰＢＭＣ：末梢血リンパ球；ＩＩＩＢ，ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ及びＭＮはＨＩＶ名）。
図２はＨＩＶ潜伏感染細胞にも２Ｇ９抗体が反応することを示す図面である。
潜伏感染細胞であるＯＭ１０．１細胞は、ＨＩＶ膜蛋白抗原であるｇｐ１２０に対する抗体（０．５β）は反応しないが２Ｇ９抗体は反応することを示す。
図３は２Ｇ９抗体によるＨＩＶ感染細胞のアポトーシスを示す図面である。
ＨＩＶを感染させたＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢ細胞に２Ｇ９抗体を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し２日間培養すると、ＴＵＮＥＬ法によるアポトーシス検出試薬で完全に染色されるようになることを示す。非感染ＭＯＬＴ−４細胞には全く影響を与えない。
図４は２Ｇ９抗体によるＨＩＶ潜伏感染細胞のアポトーシスを示す図面である。
ＨＩＶを感染させたＯＭ１０．１細胞に２Ｇ９抗体を１２．５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２日間培養すると、アポトーシス検出試薬Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ反応細胞が非添加時の５．５％から、２１．２％に増加することを示す。
図５は２Ｇ９μ鎖発現プラスミド構築模式図を示す。
発明を実施するための形態
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
本発明者らは、上記課題を解決するために、ヒトの免疫グロブリンに関する遺伝子を含む染色体を導入したキリンビール社製のマウス（ＴＣマウス：ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍｏｕｓｅ）にＨＩＶ感染細胞を免疫して、ＨＩＶ感染細胞に特異的に反応するヒト抗体を産生するマウスをえた。この免疫マウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを定法に従って作成した。得られたハイブリドーマの中からＨＩＶ感染細胞に反応するモノクローナル抗体を産生するクローンを選び出し、そのハイブリドーマクローンを２Ｇ９細胞株と命名した。２Ｇ９細胞株が産生するモノクローナル抗体である２Ｇ９抗体はヒトμ鎖とヒトκ鎖から成るヒトＩｇＭモノクローナル抗体である。２Ｇ９抗体はＨＩＶ感染細胞に特異的に反応するが、潜伏感染細胞株のＯＭ１０．１にも反応でき、これらの細胞にアポトーシスを誘導して破壊することができることを確認し、本発明を完成するに至った。本発明２Ｇ９抗体を産生する細胞株２Ｇ９は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に２００３年５月８日に国際寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７８が付与された。
２Ｇ９抗体と反応する抗原（２Ｇ９抗原）は、ＳＤＳ処理により２Ｇ９抗体との反応性を失うと考えられる。
２Ｇ９抗体をコードするκ鎖及びμ鎖それぞれにおける可変領域の遺伝子の塩基配列についての解析結果は、表１に示すごとくである。定常領域については、既報の塩基配列とほぼ同様である。
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ＯＭ１０．１細胞を含め、ＨＩＶ感染細胞に対して請求項１に記載の抗体、たとえば２Ｇ９抗体はアポトーシスを惹起させる特徴を有している。すなわち、これはＨＩＶ感染細胞を特異的にアポトーシスに陥らせることが出来るヒトＩｇＭモノクローナル抗体であり、ＯＭ１０．１細胞等のＨＩＶ潜伏感染細胞などに対してもアポトーシスを誘導することができるので、化学療法剤が効果を発揮することが出来ないＨＩＶ感染患者の体内に潜むＨＩＶ潜伏感染を排除するための治療剤としても使用することが出来る。
本発明のＨＩＶ感染細胞に特異的に反応し、ＨＩＶ感染細胞にアポトーシスを誘導して破壊に導く、ヒトＩｇＭ抗体を有効成分とするＨＩＶ感染患者治療剤等に利用するための治療剤は、生理学的なキャリアと組み合わせることによって得ることができる。生理学的に受容可能なキャリアは当該分野で周知であり、そして生理学的緩衝化食塩水もしくは他の緩衝作用を有する水溶液、又は溶媒、あるいはグリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）、又は注射可能な有機エステルのような溶剤を含む。生理学的に受容可能なキャリアはＩｇＭ抗体を安定化させるか、吸収を増大させる化合物をも含む。このような生理学的に受容可能な化合物は、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン等の糖類、アスコルビン酸、又はグルタチオン等の抗酸化剤、キレート剤、あるいはアルブミン等のタンパク質、または他の安定化剤、賦形剤を含む。さらに、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等の他の生理活性物質を添加することも可能である。生理学的に受容可能なキャリアの選択は、投与経路、対象疾患によりそれぞれに組み合わせることができる。
実施例１．２Ｇ９抗体の特異性
２Ｇ９抗体による、ＨＩＶ感染細胞に対する反応性をフローサイトメトリー法で解析した。培養細胞株であるＵ９３７細胞、ＭＯＬＴ−４細胞およびＣＥＭ細胞を被験細胞として用いた。ＨＩＶ感染細胞としては、Ｕ９３７細胞にＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株を感染させたＵ９３７／ＩＩＩＢ、臨床分離株（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ）のｍｏｍｏ株を感染させたＵ９３７／ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ、ＭＮ株を感染させたＵ９３７／ＭＮおよび、ＭＯＬＴ−４にＩＩＩＢ株を感染させたＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢなどを用いた。それぞれの細胞に２Ｇ９抗体を作用させて洗浄後、蛍光色素で標識した抗ヒトＩｇＭ抗体で染色し、細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーで解析した。その結果、２Ｇ９抗体はＨＩＶ感染細胞のＵ９３７／ＩＩＩＢ、Ｕ９３７／ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ、Ｕ９３７／ＭＮおよびＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢを強く染色したが、非感染のＵ９３７細胞、ＭＯＬＴ−４細胞およびＣＥＭ細胞に対しては全く染色性を示さなかった。さらに、正常人の末梢血リンパ球および末梢血リンパ球をフィトヘモアグルチニン（ＰＨＡ）で刺激して３日間培養した活性化リンパ球などについても解析を行ったが、これらも２Ｇ９抗体とは反応しなかった。したがって、２Ｇ９抗体はＨＩＶ感染細胞に特異的に反応するが、正常細胞には反応しないことが明らかとなった（図１）。さらに、ＯＭ１０．１細胞はＨＩＶ潜伏感染細胞株とされ、ｇｐ１２０などのＨＩＶの抗原は通常は発現していない。ところが、２Ｇ９抗体はＯＭ１０．１細胞に対して反応したので、潜伏感染状態の細胞に対しても、２Ｇ９抗体が反応しうることが明らかになった（図２）。
実施例２．２Ｇ９抗体によるＨＩＶ感染細胞のアポトーシス
ＨＩＶ−１を感染させたＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢ細胞を２０％非働化ヒト血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に５ｘ１０５／ｍｌに調製し、これに１００μｇ／ｍｌの２Ｇ９抗体を等容量加えて２日間５％炭酸ガス培養器（３７度Ｃ）中で培養した。培養後、アポトーシスの指標であるＤＮＡフラグメンテーションをＴＵＮＥＬ法を用いて染色した後、１％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定してフローサイトメトリーで解析した。図３に示すように、２Ｇ９抗体を作用させてないときには染色されないが、２Ｇ９抗体の存在下で培養した時には完全染色され、２Ｇ９抗体には、感染細胞に対してアポトーシスを誘導する作用があることが認められた。非感染細胞のＭＯＬＴ−４細胞に対してはこのような傷害作用を示さなかった（図３）。
実施例３．２Ｇ９抗体によるＨＩＶ潜伏感染細胞のアポトーシス
ＨＩＶ−１潜伏感染細胞株であるＯＭ１０．１細胞を２０％非働化ヒト血清を含む細胞培養液（ＲＰＭＩ１６４０培地）中に１ｘ１０５／ｍｌに調製し、これに１２．５μｇ／ｍｌの２Ｇ９抗体を等容量加えて２日間３７度で培養した。培養後、アポトーシス検出試薬であるＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色したあと、１％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定してフローサイトメトリーで解析した。その結果、図４に示すように、２Ｇ９抗体を作用させてないときには５．５％の染色度であったものが、２Ｇ９抗体の存在下で培養した時には２１．２％の染色度を示し、２Ｇ９抗体には、ＨＩＶ−１潜伏感染細胞のＯＭ１０．１細胞に対してもアポトーシスを誘導する作用があることが認められた（図４）。
実施例４．抗体の遺伝子工学的手法を用いた再構築
表１に示した２Ｇ９抗体可変領域の塩基配列を基にして２Ｇ９抗体を再構築する方法は、以下に示すｓｈｏｔ−ｇｕｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｒｅｓ．１３，３３０５−３３１６（１９８５））等の遺伝子工学的手法を用いて２Ｇ９抗体を産生する細胞株を樹立する方法を例示する。
表記の塩基配列を翻訳し、２Ｇ９抗体の可変領域のアミノ酸配列を得る。２Ｇ９抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列はオリジナルの２Ｇ９抗体可変領域の塩基配列に加えて、さらにその使用コドンを変化させることにより表２に示すように多種存在する。それらの中からオリゴヌクレオチドとして化学合成可能な適当な長さ毎に、ある種の制限酵素認識断片を持つものを選び出した（表２）。
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制限酵素認識断片ごとに区切られた塩基配列を基にオリゴヌクレオチドを化学合成した。合成したオリゴヌクレオチドを順次それぞれの制限酵素で消化後、ライゲーションしていくことにより２Ｇ９抗体可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全長を得た。Ｈ鎖、Ｌ鎖とも同様に得られた２Ｇ９抗体可変領域のｃＤＮＡ断片（それぞれｒＶμ２Ｇ９，ｒＶκ２Ｇ９）をキメラ抗体作成法と同様にヒトＩｇＭ抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖の定常領域遺伝子配列（Ｃμ，Ｃκ）を有するベクターに組み込み、リコンビナント２Ｇ９μ鎖，κ鎖発現プラスミド（それぞれｒＶμ２Ｇ９−Ｃμ，ｒＶκ２Ｇ９−Ｃκ）を得た（図５）。
実施例５．  リコンビナント抗体の発現
この再構成２Ｇ９抗体遺伝子発現プラスミドによって得られる抗体活性をＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）における一時発現系で検討した。これら２種のプラスミド（ｒＶμ２Ｇ９−Ｃμ，ｒＶκ２Ｇ９−Ｃκ）とヒトＩｇＭ抗体Ｊ鎖発現プラスミド（Ｃｊ）の混合物をＧＩＢＣＯ社製のプロトコールどおりに、リポフェクトアミン試薬を用いて遺伝子を導入した。その後、通常培養条件下で２日間培養を続け、遺伝子導入細胞の培養上清を回収した。得られた培養上清を抗ヒトμ抗体、抗ヒトκ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるアッセイ系により、培養上清中に存在するリコンビナント２Ｇ９抗体を確認した。また、この培養上清を用いてＵ９３７細胞、ＭＯＬＴ−４細胞およびＵ９３７細胞にＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株を感染させたＵ９３７／ＩＩＩＢ、ＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢなどを用いてＦＡＣＳ解析を行って、前記した特異性を有する抗体であることを確認した。更に、蛍光標識したもとの２Ｇ９抗体とこの培養上清を同時にＵ９３７／ＩＩＩＢ、ＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢに作用させる競合阻害試験によりリコンビナント２Ｇ９抗体の活性を確認した。
したがって、表１に示された２Ｇ９抗体のμ鎖、κ鎖可変領域の塩基配列が抗ＨＩＶ活性を担う極めて重要な領域であることが確認された。
この結果から、これらのμ鎖可変領域の塩基配列、及びκ鎖可変領域の塩基配列をコードする遺伝子はリコンビナント抗ＨＩＶ抗体を作成するにあたり極めて有用な遺伝子であることが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明により得られた２Ｇ９抗体は、潜伏感染細胞のＯＭ１０．１細胞に対してもアポトーシスを誘導する作用があることが認められた。感染細胞に対してアポトーシスを誘導する作用が２Ｇ９抗体にあることが認められた。これに対し、非感染細胞のＵ９３７やＭＯＬＴ−４細胞に対してはこのような傷害作用を示さなかった。この結果、潜伏感染細胞などに対してもアポトーシスを誘導できることから、化学療法剤が効果を発揮することが出来ない感染患者の体内に潜む潜伏感染を排除するための治療剤としても使用しうる。また、リコンビナント抗ＨＩＶ抗体を作成するにあたり極めて有用なμ鎖可変領域の塩基配列、及びκ鎖可変領域の塩基配列をコードする遺伝子を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月21日(2003.10.21)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（補正後）腫瘍細胞や正常細胞に発現が認められず、ＨＩＶ感染細胞に特異的に発現する抗原を認識し、アポトーシスを誘導するヒトＩｇＭに属することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
（補正後）腫瘍細胞や正常細胞を認識せず、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識し、ＨＩＶ感染細胞にアポトーシスを誘導するヒトＩｇＭ抗体を有効成分として含有することを特徴とするＨＩＶ感染症治療剤。
【請求項３】
ＡＩＤＳの発症を防止するためのものである請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
ＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体がＨ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号１の核酸配列を有する２Ｇ９抗体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体のＬ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号２の核酸配列を有する２Ｇ９抗体であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体。
【請求項６】
（補正後）腫瘍細胞や正常細胞を認識せず、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識し、アポトーシスを誘導するヒトＩｇＭに属することを特徴とする２Ｇ９抗体を産生する寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７８である細胞株。
【請求項７】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７８である細胞株が産生することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【国際調査報告】
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