(57)【要約】本発明は、細胞死を促進するなどの新規機能を有するｐ１８ＡβｒＰ遺伝子およびその産物であるｐ１８ＡβｒＰ蛋白を提供する。本発明は、これらを応用したスクリーニング系ならびに該スクリーニング系により得られる細胞死を促進または抑制する物質、それらを含む疾病の治療／予防用の医薬組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：３に記載のヌクレオチド１４７から６４７までの塩基配列からなるｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のｃＤＮＡに相補的なｍＲＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白。
【請求項４】
請求項３記載の蛋白において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ以下の特徴を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードするＤＮＡ：
ａ）Ａβによって発現が亢進され、
ｂ）Ｈｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１と相互作用し、
ｃ）細胞分化を阻害する。
【請求項５】
請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ以下の特性を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードするＤＮＡ：
ａ）Ａβによって発現が亢進され、
ｂ）Ｈｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１と相互作用し、
ｃ）細胞分化を阻害する。
【請求項６】
請求項４または５記載のＤＮＡによりコードされるｐ１８ＡβｒＰ蛋白。
【請求項７】
請求項１、４または５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターによって遺伝子導入された形質転換体。
【請求項９】
分化誘導因子の存在下においてｐ１８ＡβｒＰを発現している細胞と試験物質とを接触させ、次いで、細胞死の抑制または促進を調べることを特徴とする、細胞死を促進または抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を抑制する物質。
【請求項１１】
請求項９記載の細胞評価系により見出されるｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を抑制する物質。
【請求項１２】
ｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を抑制する請求項１０または１１記載の物質。
【請求項１３】
配列表の配列番号：５に記載のヌクレオチド８２から１７０１までの塩基配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１３記載のｃＤＮＡに相補的なｍＲＮＡ。
【請求項１５】
配列表の配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する蛋白。
【請求項１６】
請求項１５記載の蛋白において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ請求項１５記載の蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ請求項１５記載の蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１６または１７記載のＤＮＡによりコードされ、かつ請求項１５記載の蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する蛋白。
【請求項１９】
ｐ６０ＴＲＰである請求項１５記載の蛋白、またはそれと同様の細胞死抑制作用を有するその変種蛋白。
【請求項２０】
請求項１３、１６または１７のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項２１】
請求項２０記載のベクターによって遺伝子導入された形質転換体。
【請求項２２】
請求項１０ないし２１のいずれか１項に記載の蛋白、ＤＮＡ、ベクターまたは形質転換体を含有する細胞死関連疾病の治療用医薬組成物。
【請求項２３】
ｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を促進する物質。
【請求項２４】
請求項９記載の細胞評価系により見出されるｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を促進する物質。
【請求項２５】
ｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を促進する請求項２３または２４記載の物質。
【請求項２６】
請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の物質を含有する、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防用医薬組成物。
【請求項２７】
対象から得た細胞中あるいは組織中のｐ１８ＡβｒＰ遺伝子またはｐ１８ＡβｒＰ蛋白の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞死に関連した疾病の診断方法。
【請求項２８】
対象から得た細胞中あるいは組織中のｐ１８ＡβｒＰ遺伝子またはｐ１８ＡβｒＰ蛋白の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞死に関連した疾病の診断用キット。
【請求項２９】
ｐ６０ＴＲＰと相互作用してｐ１８ＡβｒＰによる細胞死シグナルを阻害することによりｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を増強する物質。
【請求項３０】
ｐ６０ＴＲＰと相互作用してｐ１８ＡβｒＰによる細胞死シグナルの阻害を抑制することによりｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を弱める物質。
【請求項３１】
さらに請求項２９記載のｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を増強する物質を含有する請求項２２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アミロイドβ蛋白（以下、Ａβと略する）によってオリゴデンドロサイトで発現が亢進される新規遺伝子ｐ１８ＡβｒＰに関する。また、本遺伝子およびその産物であるｐ１８ＡβｒＰ蛋白は熱ショック蛋白Ｈｓｐ７０及び癌抑制蛋白Ｔｉｄ−１と相互作用をすることによって、神経栄養因子による神経突起の伸長促進と生存維持を抑制し、細胞死を促進するなどの新規機能を有する。また、本発明は、これらを応用したスクリーニング系ならびにそれらを使った細胞死抑制新規遺伝子および蛋白（ｐ６０ＴＲＰ）、ならびに細胞死促進物質およびその遺伝子に関するものである。さらに本発明はこれらの細胞死抑制物質・促進物質利用した、細胞死に関連した疾病の診断、治療、および予防に関するものである。
背景技術
アルツハイマー病の原因については現在不明である。しかし、その病理学的特徴として老人斑、神経原線維変化ならびに細胞死による大脳皮質及び海馬の著しい脳萎縮などが報告されている。Ｈｙｍａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５，１１６８（１９８４））及びＢｒａａｋら（Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８２，２３９（１９９１））はそれぞれアルツハイマー病における初期の病理学的変化として、内嗅領皮質を中心とした領域に特徴的な変性を見出しており、その原因についてＢｒａａｋらは内嗅領皮質では神経細胞に栄養を供給するオリゴデンドロサイトの変性の結果ではないかと報告（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓ．３、２３５（１９９７））している。しかし、いまだにそれを検証するような研究は行われていない。
発明の開示
そこで、我々は、かかる事情に鑑みて、鋭意研究を行った。その結果、ラットのオリゴデンドロサイトを用い、アルツハイマー病脳内に存在する老人斑の主成分であるＡβを同細胞に添加したところ、細胞死が認められた。そして、この細胞死に関与する遺伝子を探索した結果、新規遺伝子ｐ１８ＡβｒＰを見出した。さらに本遺伝子の機能について検討した結果、この遺伝子を発現させた細胞では、神経栄養因子による細胞の分化誘導が阻害され、細胞死が惹起された。また、本遺伝子転写産物であるこの蛋白質は、熱ショック蛋白質ｈｓｐ７０および／または癌抑制蛋白Ｔｉｄ−１と相互作用をすることによって細胞突起の伸長や分枝ならびに生存維持を抑制し、細胞死を促進する等の新規機能を有することが明らかとなった。さらに、この細胞死を抑制する遺伝子／蛋白質を探索した結果、新規遺伝子／蛋白質であるｐ６０ＴＲＰを見出した。
我々はラットのオリゴデンドロサイトＣＧ−４細胞にアルツハイマー病の神経毒とされるβアミロイド蛋白（Ａβ）の一例としてＡβ１−４２（βアミロイド蛋白質で１から４２番目のアミノ酸を含む；１０μｇ／ｍｌ、３７℃で６０時間処理）を添加した結果、細胞死が約５０％認められた（Ｂｒａｉｎ  Ａｇｉｎｇ  ２，３０（２００２））。このような細胞死は、β２５−３５（βアミロイド蛋白質２５から３５番目のアミノ酸を含む）、Ａβ１−４０（βアミロイド蛋白質１から４０番目のアミノ酸を含む）あるいはＡβ１−４３（βアミロイド蛋白質１から４３番目のアミノ酸を含む）など、他のＡβペプチドでも認められている（例えば、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５７，７０５（２０００）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，９２３５（２００１）等参照）ので、細胞死を引き起こす特徴はＡβペプチドに普遍的なものと考えられる。そこで、我々はＡβによって誘導された細胞死に関与する遺伝子を探索した結果、本遺伝子の発現亢進が見られた（実施例および図２参照）。本ｃＤＮＡはすでに見出されているヒト（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，７５４０（２００２））及びマウス（Ｇｅｎｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＡＫ０１３３９６，ＡＫ０１８３８５，ＡＫ０２０１４７，ＡＫ０１１４５４；Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２０００）の遺伝子と相同性を示すが新規なものであり、コードするアミノ酸配列もヒトやマウスのものとは違いがある。さらにｐ１８ＡβｒＰ蛋白は、熱ショック蛋白ｈｓｐ７０および癌抑制遺伝子Ｔｉｄ−１と相互作用の結果、神経栄養因子による神経突起伸長作用を抑制し、細胞死を誘導する等の新規機能を有する事が判明した（実施例および図３参照）。また、本遺伝子発現細胞でみられた細胞死を抑制する因子を検索した結果、新規遺伝子／蛋白質（ｐ６０ＴＲＰ）を見出した。
すなわち、本発明は下記の（１）〜（３１）に記載のＤＮＡ、蛋白、物質、ベクター、形質転換体、医薬組成物およびキット等を提供するものである：
（１）配列表の配列番号：３に記載のヌクレオチド１４７から６４７までの塩基配列からなるｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡ；
（２）上記（１）に記載のｃＤＮＡに相補的なｍＲＮＡ；
（３）配列表の配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白；
（４）上記（３）に記載の蛋白において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ以下の特徴を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードするＤＮＡ：
ａ）Ａβによって発現が亢進され、
ｂ）Ｈｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１と相互作用し、
ｃ）細胞分化を阻害する；
（５）上記（１）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ以下の特性を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードするＤＮＡ：ａ）Ａβによって発現が亢進され、
ｂ）Ｈｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１と相互作用し、
ｃ）細胞分化を阻害する；
（６）上記（４）または（５）に記載のＤＮＡによりコードされるｐ１８ＡβｒＰ蛋白；
（７）上記（１）、（４）または（５）のいずれかに記載のＤＮＡを含有するベクター；
（８）上記（７）に記載のベクターによって遺伝子導入された形質転換体；
（９）分化誘導因子の存在下においてｐ１８ＡβｒＰを発現している細胞と試験物質とを接触させ、次いで、細胞死の抑制または促進を調べることを特徴とする、細胞死を促進または抑制する物質のスクリーニング方法；
（１０）ｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を抑制する物質；
（１１）上記（９）に記載の細胞評価系により見出されるｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を抑制する物質；
（１２）ｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を抑制する上記（１０）または（１１）に記載の物質；
（１３）配列表の配列番号：５に記載のヌクレオチド８２から１７０１までの塩基配列からなるｃＤＮＡ；
（１４）上記（１３）に記載のｃＤＮＡに相補的なｍＲＮＡ；
（１５）配列表の配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する蛋白；
（１６）上記（１５）に記載の蛋白において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ上記（１５）に記載の蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する蛋白をコードするＤＮＡ；
（１７）上記（１３）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ上記（１５）に記載の蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する蛋白をコードするＤＮＡ；
（１８）上記（１６）または（１７）に記載のＤＮＡによりコードされ、かつ上記（１５）に記載の蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する蛋白；
（１９）ｐ６０ＴＲＰである上記（１５）に記載の蛋白、またはそれと同様の細胞死抑制作用を有するその変種蛋白；
（２０）上記（１３）、（１６）または（１７）のいずれかに記載のＤＮＡを含有するベクター；
（２１）上記（２０）に記載のベクターによって遺伝子導入された形質転換体；
（２２）上記（１０）ないし（２１）のいずれかに記載の蛋白、ＤＮＡ、ベクターまたは形質転換体を含有する細胞死関連疾病の治療用医薬組成物；
（２３）ｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を促進する物質；
（２４）上記（９）に記載の細胞評価系により見出されるｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を促進する物質；
（２５）ｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を促進する上記（２３）または（２４）に記載の物質；
（２６）上記（２３）ないし（２５）のいずれかに記載の物質を含有する、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防用医薬組成物；
（２７）対象から得た細胞中あるいは組織中のｐ１８ＡβｒＰ遺伝子またはｐ１８ＡβｒＰ蛋白の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞死に関連した疾病の診断方法；
（２８）対象から得た細胞中あるいは組織中のｐ１８ＡβｒＰ遺伝子またはｐ１８ＡβｒＰ蛋白の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞死に関連した疾病の診断用キット；
（２９）ｐ６０ＴＲＰと相互作用してｐ１８ＡβｒＰによる細胞死シグナルを阻害することによりｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を増強する物質；
（３０）ｐ６０ＴＲＰと相互作用してｐ１８ＡβｒＰによる細胞死シグナルの阻害を抑制することによりｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を弱める物質；ならびに
（３１）さらに上記（２９）に記載のｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を増強する物質を含有する上記（２２）に記載の医薬組成物。
発明の詳細な説明
以下に、さらに本発明を詳細に説明する。
本発明は１の態様において、配列表の配列番号：３に記載のヌクレオチド１４７から６４７までの塩基配列からなるｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡに関するものである。また、本発明は上記ｃＤＮＡに相補的なｍＲＮＡにも関する。上記ｃＤＮＡは配列番号：４に示されるｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードするものである。したがって、本発明のｐ１８ＡβｒＰ蛋白は配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する。上記ｃＤＮＡは、典型的には、実施例の方法のセクションに示すようなＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡ差分法などを用いる方法で得ることができ、かかる方法は当業者に公知である。
したがって、もう１つの態様において、本発明は配列表の配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白に関する。蛋白のアミノ酸配列分析は、例えば、実施例の方法のセクションに記載の方法で行うことができる。この蛋白は配列番号：３に記載のヌクレオチド１４７から６４７までの塩基配列によりコードされる。この蛋白は、
ａ）Ａβによって発現が亢進され、
ｂ）Ｈｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１と相互作用し、
ｃ）細胞分化を阻害する。
という特性を有する。
特性ａ）に関しては、上述のごとく、我々は、ラットのオリゴデンドロサイトを用い、その前駆体蛋白質ＡＰＰから切断され、老人斑の主成分であるＡβ蛋白を同細胞に添加したところ、細胞死が認められたので、この細胞死に関与する遺伝子を探索した結果、新規遺伝子ｐ１８ＡβｒＰを見出している。すなわち、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白はＡβによって発現が亢進される。発現の亢進は、ｍＲＮＡレベル、または蛋白レベルいずれにおいても観察でき、ｍＲＮＡ量の増大は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、相補的なハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ法などによって調べることができ、蛋白発現量の増大は、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体および免疫抗体法などによって調べることができる。特性ｂ）に関しては、我々は、上述のごとく、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白質は熱ショック蛋白ｈｓｐ７０及び癌抑制蛋白Ｔｉｄ−１との相互作用をする事によって分化誘導因子による細胞突起の伸長・分枝ならびに生存維持を抑制し、細胞死を促進するなど新規機能を明らかにしている（実施例参照）。さらに特性ｃ）に関しても、我々は、この遺伝子を発現させた細胞では、神経栄養因子による細胞の分化誘導が阻害され、細胞死が惹起されることを見出している（実施例参照）。したがって、そのような分化阻害および／または細胞死の程度（細胞死に至る細胞の割合、細胞死に至る時間等）を調べることにより、この蛋白の活性がわかる。活性測定法の一例としては、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、それを用いて細胞、好ましくは神経細胞を形質転換し、次いで、分化誘導因子（例えばＮＧＦ）を作用させて細胞を培養し、同じ条件で培養された未形質転換細胞（対照）の細胞死と比較する方法がある。細胞死が起こったかどうかを判定するには、顕微鏡観察を用いるのが一般的である。細胞死が起こると、例えば、細胞収縮、空胞化、表面平滑化、および細胞ならびに核の断片化等が観察される。
また、本発明のｐ１８ＡβｒＰ蛋白は配列番号：４に記載の蛋白の変種も包含する。すなわち、配列番号：４に記載の蛋白において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されていても、上記特性ａ）、ｂ）およびｃ）を有する蛋白は本発明のｐ１８ＡβｒＰ蛋白である。このような蛋白をコードするＤＮＡも本発明に包含される。１もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は、例えば、部位特異的突然変異誘発やＰＣＲ法等の公知方法により行うことができる。ここで、１もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換を有していても、その蛋白は上記ａ）、ｂ）およびｃ）の特性を保持しており、やはり本発明のｐ１８ＡβｒＰ蛋白である。
さらに本発明は、配列番号：３のヌクレオチド１４７から６４７までの塩基配列からなるｃＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡにも関する。このＤＮＡは特性ａ）、ｂ）およびｃ）を有するｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードする。なお、ストリンジェントな条件は、例えば、当業者によく知られており、多くの教科書や文献に記載されている。ストリンジェントな条件としては、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔおよび０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイダイズさせる条件が例示される。
さらに本発明は、配列番号：３のヌクレオチド１４７から６４７までの塩基配列からなるｃＤＮＡに対して少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上１００％未満のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡにも関する。
上記のいずれかのＤＮＡによりコードされる蛋白も本発明のｐ１８ＡβｒＰ蛋白である。
さらなる態様において本発明は、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードする上記のいずれかのＤＮＡを含有するベクターにも関する。ｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードする上記のいずれかのＤＮＡを挿入して神経細胞の形質転換に使用するベクターとしては、文献に記載された種々のベクターあるいは種々の市販ベクターを用いることができ、例えば、ｐＶｇＲＸＲ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（登録商標）、あるいはＬＮＣＸ２などのウイルスベクター等がある。形質転換法としては、リン酸カルシウム法、Ｓｕｐｅｒ  Ｆｅｃｔｏｒ試薬による方法、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬などを用いたｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ法等が知られている。スクリーニングに使用する細胞としてはいずれの細胞でもよいが、神経細胞が好ましく、好ましい神経細胞の例としては、ＰＣ１２細胞、ＮＢ２ａ、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、Ｂ１０４、ＳＨＳＹ−５Ｙ、初代培養神経細胞等が挙げられる。上記ベクター、細胞の形質転換、および細胞培養の条件は個々の細胞に応じて決定され、当業者の知識の範囲内であるか、あるいは容易に決定できるものである。このような形質転換体も本発明に包含される。ｐ１８ＡβｒＰ蛋白の発現を容易にチェックできるように、発現されるｐ１８ＡβｒＰ蛋白に検出可能なタグを付しておくことが望ましい。タグはＤＮＡレベルで付加することができ、例えば、緑色蛍光蛋白ＤＮＡ、赤色蛍光蛋白ＤＮＡ、ｍｙｃ遺伝子等を、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードするＤＮＡ配列に融合させておいて発現させることができる。特に緑色蛍光蛋白との融合物が簡便で感度の高いものとして推奨される。発現細胞を選択した後、上記ａ）、ｂ）およびｃ）の特性をチェックしておくことが必要である。
ｐ１８ＡβｒＰ蛋白を発現する細胞を当業者に公知の適当な手段（ｐ１８ＡβｒＰ特異的抗体による免疫沈降法等の使用）にて抽出し、次いで、精製（上記抗体を担体としたセファロースカラム等の使用）することにより、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白を単離することができる。
さらに本発明は、分化誘導因子の存在下においてｐ１８ＡβｒＰを発現している細胞と試験物質とを接触させ、次いで、細胞死の抑制または促進を調べることを特徴とする、細胞死を促進または抑制する物質のスクリーニング方法にも関する。
ｐ１８ＡβｒＰと相互作用してその機能を抑制する物質、あるいはｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を抑制する物質のスクリーニング方法の例としては、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、それを用いて細胞、好ましくは神経細胞を形質転換し、次いで、試験物質存在下において分化誘導因子（例えばＮＧＦ）を作用させて細胞を培養し、神経細胞の場合には神経突起伸長および細胞死についてアッセイし、試験物質不存在下および／または分化誘導因子不存在下での結果（すなわち、対照系）と比較する方法がある。適当なベクターおよび細胞は当業者に知られており、上述の例が挙げられる。ｐ１８ＡβｒＰ発現細胞は一定濃度の分化誘導因子の存在下においても、神経突起の伸長が抑制され（神経細胞の場合）、細胞死が観察される。一方、ｐ１８ＡβｒＰと相互作用してその機能を抑制する物質、あるいはｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を抑制する物質が存在すると、細胞の神経突起は成長し（神経細胞の場合）細胞死が回避される。そのような場合、試験物質はｐ１８ＡβｒＰと相互作用してその機能を抑制して細胞死を抑制する物質であるか、あるいはｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を抑制する物質である可能性がある。
ｐ１８ＡβｒＰと相互作用してその機能を促進する物質、あるいはｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を促進する物質のスクリーニング方法の例としては、ｐ１８ＡβｒＰ蛋白をコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、それを用いて神経細胞を形質転換し、次いで、試験物質存在下において分化誘導因子を作用させて細胞を培養し、神経突起伸長および細胞死についてアッセイし、試験物質不存在下での結果と比較する方法がある。適当なベクターおよび細胞は当業者に知られており、上述の例が挙げられる。ｐ１８ＡβｒＰと相互作用してその機能を抑制する物質のスクリーニングに用いるよりも高い濃度の分化誘導因子の存在下において神経突起を伸長させている神経細胞または細胞死を起こしていない細胞に試験物質を添加して、その神経突起成長が抑制され（神経細胞の場合）あるいは細胞死が観察される場合には、試験物質はｐ１８ＡβｒＰと相互作用してその機能を促進して細胞死を促進する物質であるか、あるいはｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を促進する物質である可能性がある。
細胞死が起こったかどうかの判定方法の例としては上記の顕微鏡観察による方法がある。
さらに本発明は、ｐ１８ＡβｒＰと相互作用して細胞死を抑制する物質および細胞死を促進する物質に関する。該物質はｐ１８ＡβｒＰと相互作用するものであるが、ｐ１８ＡβｒＰとＨｓｐ７０および／またはＴｉｄ−１との相互作用に影響することにより細胞死を抑制または促進する物質も本発明に包含される。好ましくは、細胞死を抑制または促進する物質は上記スクリーニング法により得られるものである。かかる物質は、いすれの種類の分子であってもよく、例えば、蛋白、ペプチド、その他の低分子有機化合物などの小型分子が挙げられる。
本発明の細胞死を抑制する物質は、例えば、神経細胞の細胞死に関連する脳内神経変性疾病、例えば、アルツハイマー病、ダウン症やその他の痴呆症のほか、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性疾患、パーキンソン氏病などの予防および／または治療に有用である。したがって、本発明は、１の態様において、上記の細胞死抑制物質を含有する、細胞死関連疾病の治療および／または予防用の医薬組成物に関する。通常、医薬組成物は医薬上許容される担体または賦形剤を含有する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。
本発明の上記スクリーニングにおいて、細胞死を抑制するｐ６０ＴＲＰ蛋白をコードするｐ６０ＴＲＰ遺伝子およびそれによりコードされるｐ６０ＴＲＰ蛋白が見出された。
したがって、本発明はさらなる態様において、配列表の配列番号：５に記載のヌクレオチド８２から１７０１までの塩基配列からなるｃＤＮＡに関するものである。また、本発明は上記ｃＤＮＡに相補的なｍＲＮＡにも関する。上記ｃＤＮＡは配列番号：６に示される蛋白をコードするものである。ここで、配列番号：６に示すアミノ酸配列はラットｐ６０ＴＲＰのものであり、それゆえ、配列番号：５のヌクレオチド配列（ヌクレオチド８２から１７０１まで）はラットｐ６０ＴＲＰ蛋白をコードするものである。以下、本明細書において、ラットｐ６０ＴＲＰを単にｐ６０ＴＲＰという。したがって、本発明のｐ６０ＴＲＰ蛋白は配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する。上記ｃＤＮＡは、典型的には、実施例の方法のセクションに示すようなＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡ差分法をなどを用いる方法で得ることができ、かかる方法は当業者に公知である。
本発明は、もう１つの態様において、ｐ６０ＴＲＰ蛋白のアミノ酸配列（配列番号：６）において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する変種ｐ６０ＴＲＰ蛋白をコードするＤＮＡ、ならびにかかるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する蛋白と同様の細胞死抑制作用を有する変種ｐ６０ＴＲＰ蛋白をコードするＤＮＡに関する。なお、ストリンジェントな条件は、多くの教科書や文献に記載されており、当業者によく知られている。ストリンジェントな条件としては、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔおよび０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイダイズさせる条件が例示される。
さらに本発明は、配列番号：３のヌクレオチド１４７から６４７までの塩基配列からなるｃＤＮＡに対して少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上１００％未満のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡにも関する。
上記のいずれかのＤＮＡによりコードされる蛋白も本発明のｐ６０ＴＲＰ蛋白である。
本明細書において、上記のような変種ｐ６０ＴＲＰ蛋白であっても、配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する蛋白、すなわちｐ６０ＴＲＰ蛋白と同様の細胞死抑制作用を有するかぎり、ｐ６０ＴＲＰ蛋白と称することがある。また、ラット以外の種由来のｐ６０ＴＲＰ相同蛋白、例えばヒトのｐ６０ＴＲＰ蛋白であっても、配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する蛋白、すなわちｐ６０ＴＲＰ蛋白と同様の細胞死抑制作用を有するかぎり、変種ｐ６０ＴＲＰあるいは単にｐ６０ＴＲＰ蛋白と称することがある。かかる相同ｐ６０ＴＲＰ蛋白はラットｐ６０ＴＲＰ蛋白に対して少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上１００％未満の相同性を有する。
さらなる態様において、本発明は、上記ｐ６０ＴＲＰ蛋白（変種も含む）をコードするＤＮＡを含有するベクター、ならびにそれにより形質転換された細胞等の形質転換体にも関する。
ｐ６０ＴＲＰ蛋白をコードする上記のいずれかのＤＮＡを挿入して神経細胞の形質転換に使用するベクターとしては、文献に記載された種々のベクターあるいは種々の市販ベクターを用いることができ、例えば、ｐＶｇＲＸＲ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（登録商標）、あるいはＬＮＣＸ２などのウイルスベクター等がある。形質転換法としては、リン酸カルシウム法、Ｓｕｐｅｒ  Ｆｅｃｔｏｒ試薬による方法、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬などを用いたｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ法等が知られている。スクリーニングに使用する細胞としてはいずれの細胞でもよいが、神経細胞が好ましく、好ましい神経細胞の例としては、ＰＣ１２細胞、ＮＢ２ａ、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、Ｂ１０４、ＳＨＳＹ−５Ｙ、初代培養神経細胞等が挙げられる。上記ベクターの構築、細胞の形質転換、細胞培養の条件は個々の細胞に応じて決定され、当業者の知識の範囲内であるか、あるいは容易に決定できるものである。このような形質転換体も本発明に包含される。ｐ６０ＴＲＰ蛋白の発現を容易にチェックできるように、発現されるｐ６０ＴＲＰ蛋白に検出可能なタグを付しておくことが望ましい。タグはＤＮＡレベルで付加することができ、例えば、緑色蛍光蛋白ＤＮＡ、赤色蛍光蛋白ＤＮＡ、ｍｙｃ遺伝子等を、ｐ６０ＴＲＰ蛋白をコードするＤＮＡ配列に融合させておいて発現させることができる。特に緑色蛍光蛋白との融合物が簡便で感度の高いものとして推奨される。発現細胞を選択した後、本明細書記載のスクリーニングアッセイにて細胞死抑制作用をチェックしておくことが必要である。
ｐ６０ＴＲＰ蛋白を発現する細胞を当業者に公知の適当な手段（ｐ６０ＴＲＰ特異的抗体による免疫沈降法等の使用）にて抽出し、次いで、精製（上記抗体を担体としたセファロースカラム等の使用）することにより、ｐ６０ＴＲＰ蛋白を単離することができる。
さらなる態様において、本発明は、上記ｐ６０ＴＲＰ蛋白（変種も含む）、それをコードするＤＮＡ、上記ｐ６０ＴＲＰ蛋白（変種も含む）をコードするＤＮＡを含有するベクター、あるいはそれにより形質転換された形質転換体を含有する細胞死抑制用医薬組成物にも関する。さらに、これらの物質または形質転換体を対象に投与することを特徴とする対象における細胞死抑制方法、ならびに細胞死抑制用医薬を製造するためのこれらの物質または形質転換体の使用にも関する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。これらの細胞死抑制のための組成物、方法および使用は、細胞死に関連した種々の脳内神経変性疾病、例えば、アルツハイマー病、ダウン症やその他の痴呆症のほか、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性疾患、パーキンソン病等を治療および／または予防することができる。上記治療において、ｐ６０ＴＲＰ遺伝子またはそれを含むベクターを用いる場合には遺伝子治療となり、対象から得た細胞に該遺伝子またはベクターを注入して培養し、ついで対象に戻すことも可能であり、あるいは対象にｐ６０ＴＲＰ遺伝子またはそれを含むベクターを直接導入してもよい。
さらに本発明は、ｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制作用を調節（促進または抑制）する物質も提供する。詳細には、かかる物質は、ｐ６０ＴＲＰと相互作用してｐ１８ＡβｒＰによる細胞死シグナルを阻害することによりｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を増強する物質（ｐ６０ＴＲＰのアゴニスト）、ならびにｐ６０ＴＲＰと相互作用してｐ１８ＡβｒＰによる細胞死シグナルの阻害を抑制することによりｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制効果を弱める物質（ｐ６０ＴＲＰのアンタゴニスト）である。このようなｐ６０ＴＲＰの細胞死抑制作用を調節する物質としては天然または合成の蛋白、ペプチド、核酸等があるが、これらに限らず、天然または合成の低分子化合物であってもよい。ｐ６０ＴＲＰアゴニストの例としてはＰＰ２Ａ蛋白およびＲａｎＢＰ５蛋白等が挙げられる。このようなｐ６０ＴＲＰのアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングには後述のようにＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍを用いるのが一般的である。
また例えば、ｐ６０ＴＲＰのアゴニストをｐ６０ＴＲＰ含有医薬組成物中に添加して細胞死抑制作用をさらに増強させ、アルツハイマー病等の細胞死関連疾病をより効果的に治療あるいは予防することもできる。
一方、本発明の細胞死を促進する物質は、例えば、細胞死系の確立、細胞死に関連した種々の研究に有用であり、例えば、神経細胞の細胞死に関連した疾病、例えば、アルツハイマー病の機構解明に有用である。さらに本発明の細胞死を促進する物質は、細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば、癌や自己免疫疾患などの治療および／または予防に有用である。したがって、もう１つの態様において、本発明は、上記の細胞死促進物質を含有する、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防用の医薬組成物に関する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。また本発明は、上記の細胞死促進物質を対象に投与することを特徴とする、対象における細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防方法にも関する。本発明は、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防用の医薬の製造における上記の細胞死促進物質の使用にも関する。細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防においても、上記のような遺伝子治療を適用してもよい。
さらに本発明は、対象から得られた細胞や組織中のｐ１８ＡβｒＰ遺伝子またはｐ１８ＡβｒＰ蛋白の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞、特に神経細胞の細胞死を調べる方法、ならびにかかる細胞死に関連した疾病の診断方法にも関する。対象から得られた試料細胞や組織中のｐ１８ＡβｒＰ遺伝子を例えばｍＲＮＡレベルで検出してもよく、試料細胞中のｐ１８ＡβｒＰ蛋白を検出してもよい。このような検出は当業者によく知られている手段、例えば、ｐ１８ＡβｒＰ遺伝子の相補的なプローブ（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）を用いるハイブリダイゼーション法あるいはｐ１８ＡβｒＰ蛋白に対するモノクローナル抗体（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）との結合を用いて行うことができる。上記の場合には、標識のシグナル強度を調べることによりｐ１８ＡβｒＰ遺伝子の発現強度あるいはｐ１８ＡβｒＰ蛋白量を測定することができる。
また本発明は、対象から得られた細胞や組織中のｐ１８ＡβｒＰ遺伝子またはｐ１８ＡβｒＰ蛋白の発現レベルを調べることを特徴とする、細胞、特に神経細胞の細胞死を調べるためのキット、ならびにかかる細胞死に関連した疾病の診断用キットにも関する。キットの成分としては、例えば、ｐ１８ＡβｒＰ遺伝子の相補的なプローブ（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）および／またはｐ１８ＡβｒＰ蛋白に対するモノクローナル抗体（好ましくは、例えば、放射性同位元素または蛍光基または酵素等で標識しておく）が含まれる。通常には、取り扱い説明書をキットに添付する。
実施例
以下に実施例により本発明を説明するが、実施例はあくまでも説明を目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
Ｉ．実験方法
ラット細胞の調製：ＣＧ−４（オリゴデンドロサイト前駆細胞，岡崎国立共同研究機構・生理学研究所・神経情報部門、池中一裕教授から分与していただいた）の培養は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１ｖ／ｖ），Ｎ１含有（５ｍｇ／ｌのインスリン、１６．１ｍｇ／ｌのプトレシン、５０ｍｇ／ｌのトランスフェリン、４．６ｍｇ／ｌのＤ−ガラクトース、８ｍｇ／ｌの亜セレン酸Ｎａ、２．４ｇ／ｌ  ＨＣＯ３）、および３０％（ｖ／ｖ）のＢ１０４細胞の血清を含まない培養液で培養し、さらにオリゴデンドロサイトへの分化誘導にはＣＧ−４細胞は２４時間、Ｂ１０４細胞は分裂促進因子なしに培養したのち、２％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を加え生存を促進させた。
ＲＴ−ＰＣＲ法：ｍＲＮＡの分析ならびにｐ６０ＴＲＰの単離はＲＴ−ＰＣＲ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，７９（２００２））を用いて行った。すなわち、細胞の全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬プロトコール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，ＮＹ，ＵＳＡ）に従って調製した。クロロホルムでｍＲＮＡを抽出後、ＲＮＡは水層に等量のイソプロピルアルコールを添加して沈殿させ、７５％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない水に溶解後、分光光度計で吸光度（２６０ｎｍ）を測定した。各サンプル中の全ＲＮＡ（０．２μｇ／μｌ）はまず、ｃＤＮＡに逆転写（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−ｐｒｉｍｅｄ−ＳＭＡＲＴＴＭｃＤＮＡ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（クロンテック、東京、日本）；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，ＮＹ，ＵＳＡ））し、その０．５μｌをｐ１８ＡβｒＰ特異的プライマー（センス：５’−ａｔｇａｇｔｇａａｔｇｇａｃｇａａｇａａａａｇｃｃｃｃｔｔａｇａａｔｇｇｇａｇｇａｔ−３’（配列番号：１）；アンチセンス：５’−ｔｃｔｇｇｇａａｇｃｔｇａａａｇａｔｇｇｃｃｔｔｇａａｔａａｇａｔｃｃｔｇａａｔｔｃｇｇｇ−３’（配列番号：２）を用いてＰＣＲ反応（反応容量；２５μｌ）に使用した。各ｃＤＮＡ増幅に用いた反応繰り返し回数はＥｌｏｎｇａｓｅＴＭ酵素混合プロトコールに従って直線範囲で行った。増幅ステップの変性時間は９４℃で１分間、アニーリングは特異的プライマーと共に、６５℃で５０秒間行い、さらに６８℃（６５℃／２４回）で１分間延長して行った。ラットｐ６０ＴＲＰｃＤＮＡはラット脳ｃＤＮＡライブラリー（ｐＡＰ３ｎｅｏ，ＴａＫａＲａ）由来のプライマーを用いて５’−ＲＡＣＥ−ＲＴ−ＰＣＲにより作製した。ｐ６０ＴＲＰは以下の方法（Ｈｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１５，７９（２００２））で単離した。すなわち、全細胞ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に従って単離した。クロロホルムで抽出後、ＲＮＡは水層にイソプロピルアルコールを添加し沈殿させ、７５％のエタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない水に再度溶解し、分光光度計（２６０ｎｍ）で定量した。それぞれのサンプルの全ＲＮＡ（０．２μｇ／μｌ）は最初、ｃＤＮＡ（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−ｐｒｉｍｅｄ−ＳＭＡＲＴＴＭ−ｃＤＮＡ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＴＭ（Ｇｉｂｃｏ））に従って転写し、その０．５μｌをラット（ｒ）／ヒト（ｈ）ｐ６０ＴＲＰ−特異的プライマー（単離のため：センス：５’−ｇｃｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａａｔｔｃｇａｃｇｔ−３’（配列番号：９）、アンチセンス：５’−ｃｇｃｇａｃｇｔａｃｇａｔｔｔａａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａ−３’（配列番号：１０）；ｒ−センス：５’−ａｔｇａｃｔｇｇｃｔｃａａａｇａａｔａａｇｇｃｔｃｇｇｇｃｔｃａｇｇｃｔａａａｃｔｇ−３’（配列番号：１１）、ｒ−アンチセンス：５’−ｔｔａｃａｔｔｃｔｔｔｃａａｔａａｔｃｃｃｔｔｔａａｃｔｔｃａｃｇｇａａｔａｔｇｇｃａｇｔ−３’（配列番号：１２）；ｈ−センス：５’−ａｔｇｇｃｔｇｇｇａｃｔａａｇａａｔａａｇａｃａａｇａｇｃｃｃａｇｇｃｃａａａａｃ−３’（配列番号：１３）、ｈ−アンチセンス：５’−ｃａｔｔｇｔｔｔｃａａｔａａｔｃｔｃｔｔｔａａｃｔｔｃｃｃｔｇａａａａｔｇｇｃｃａｔｇａｇ−３’（配列番号：１４））を使ってＰＣＲ増幅反応（反応容量２５μｌ）に使用した。サイクル数はＥｌｏｎｇａｓｅＴＭｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）に従って、反応に直線性のある範囲で行なった。変性温度は９４℃で０．５分間、アニーリングは６５℃で５０秒間（アニーリング温度）、延長は６８℃で２分間（アニーリング温度：６５℃／１６サイクル）でＰＣＲを行なった。
恒常的に発現しているリボゾーム蛋白Ｓ１２のＰＣＲ増幅反応（６０℃／１６回）は導入したＲＮＡの測定に使用した。ＲＮＡサンプルを使った逆転写なし、あるいはＲＮＡなしのコントロールはＤＮＡの混入がないことを証明するために使用した。ＰＣＲ反応の解析は１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜にＤＮＡ断片を移し、蛍光ラベルしたＤＮＡプローブでハイブリダイズして行った。膜は蛍光イメージャー５９５（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ｖｅｒ．５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、東京、日本）を使って解析を行った。ノンパラメトリック統計解析（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ｔｅｓｔ）に付け加えて、結果の統計分析は分散分析（ＡＮＯＶＡ）で行い、誤差は標準誤差で示した。
ｃＤＮＡ差分：Ａβ１−４２を添加し細胞死を誘導した細胞群と、対照細胞群に発現しているｍＲＮＡの違いを明らかにするためにＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ−ｃＤＮＡ差分（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を行った。すなわち、ＣＧ−４細胞を牛胎児血清（ＦＣＳ）±Ａβ１−４２（１０μｇ／ｍｌ）の条件下で６０時間インキュベートし、ｃＤＮＡ差分（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８８，３７（２０００）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９，９２４（２００１））を行った。各群のｍＲＮＡはＳＭＡＲＴＴＭ−ＰＣＲ−ｃＤＮＡ（クロンテック）合成によりｃＤＮＡに転換し、修飾したオリゴｄＴプライマー（ＣＤＳプライマー）で第１鎖合成を行った。ＳＭＡＲＴＴＭ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｎｃｈｏｒ配列とポリＡ＋配列は端から端までｃＤＮＡ増幅（ＬＤ−ＰＣＲ）のためのユニバーサルなプライミング部位として用いた。Ａβ１−４２処理細胞群のｃＤＮＡと対照細胞群のｃＤＮＡをハイブリダイゼーションで除去し、ハイブリダイゼーションしなかったｃＤＮＡをＡβ１−４２で活性化された差分ｃＤＮＡとした。このｃＤＮＡはＴＯＰＯ（登録商標）−Ｔ／Ａクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、サザンブロットで確認した。塩基配列はシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＭＴＭＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｅｍｅｒ；シーケンサー：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｍｏｄｅｌ  ３１０））で解析した。
ｃＤＮＡクローニング：ｃＤＮＡサブトラクション後、ラットｐ１８ＡβｒＰのＥＳＴ配列からの完全長ｃＤＮＡはデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の部分ｃＤＮＡ／ＥＳＴ配列からデザインしたオリゴヌクレオチドを用い、５’−ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）とＲＴ−ＰＣＲ実験にラット脳ｃＤＮＡライブラリー（ＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ  ＲｅａｄｙＴＭＳｕｐｅｒ  ＤＮＡ；クロンテック、東京、日本）を使ってスクリーニングして得た。解析用のｐ１８ＡβｒＰの構築はラットｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡをｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）Ｔ／Ａクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、東京、日本）に挿入して行った。発現用ｐ１８ＡβｒＰの構築（ｐ１８ＡβｒＰ−ＣＴ−ＧＦＰ）はｐ１８ＡβｒＰのＣ端に緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）用のｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、東京、日本）をラットｐ１８ＡβｒＰｃＤＮＡに挿入して行った。
ｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡ配列ならびにアミノ酸分析：ｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は重複のないＧｅｎＢａｎｋＣＤＳトランスレーションに対するＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）Ｂｌａｓｔｐ  ２．０プログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９（１９９７））とＵｎｉＧｅｎｅデータベース（ＮＣＢＩ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，２２８９（１９９７））に加えて、ＰＤＢ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲおよびＰＲＦを使って行った。相同性の検索はＢｌａｓｔとＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒ．１０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）アルゴリズムとＢｅｓｔＦｉｔ（Ｅｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０  ＧＣＧ）を使って行った。アミノ酸配列のモチーフ探索はＰＲＯＳＩＴＥ−Ｐｒｏｆｉｌｅ、ＢＬＯＣＫＳ−、ＰｒｏＤｏｍ−、ＰＲＩＮＴＳ−、Ｐｆａｍ−およびＰＳＯＲＴＩＩ−プログラムを使って行った（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，２６０（１９９９），Ｉｎｔｅｌｌｉｇ．Ｓｙｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４，１０９（１９９６）；Ｉｎｔｅｌｌｉｇ．Ｓｙｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５，１４７（１９９７））。リン酸化部位はＮｅｔＰｈｏｓ  ２．０（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４，１３５１（１９９９））を使って、さらにその他の分析はＥｘＰＡＳｙ  ｗｗｗサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）の他、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ及びアミノ酸組成サーチ（ＡＡＣｏｍｐＩｄｅｎｔ）ｈｔｔｐ：／／ｋｒ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ａａｃｏｍｐ／を使って行った。決定されたｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：３（図１ａ）および配列番号：４（図１ｂ）に示す。さらに、本発明のラットｐ１８ＡβｒＰ蛋白、ならびにヒトおよびマウスの相同蛋白のアミノ酸配列を比較して図１ｃに示す。
ｐ１８ＡβｒＰ発現組織の分析：常法に従い、ラットから２２の組織（１＝脳、２＝心臓、３＝腎臓、４＝脾臓、５＝肝臓、６＝結腸、７＝肝臓、８＝小腸、９＝筋肉、１０＝胃、１１＝精巣、１２＝唾液腺、１３＝甲状腺、１４＝副腎、１５＝膵臓、１６＝卵巣、１７＝子宮、１８＝前立腺、１９＝皮膚、２０＝白血球、２１＝骨髄、および２２＝胎児脳（番号は図４のレーン番号と一致））を取り、試料を調製した。組織試料の調製は、各組織試料よりｃＤＮＡを前述の方法（ＲＴ−ＰＣＲの項）で調製して行った。組織特異的はｐ１８ＡβｒＰの発現を調べるため、Ｒａｐｉｄ−ＳｃａｎＴＭ−Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｎｅｌｓ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いた。ＰＣＲ産物は標準２％ＤＮＡ電気泳動アガロースＥ−ｇｅｌＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って分析した。
細胞死抑制物質および／または細胞死促進物質のスクリーニング法−細胞死抑制物質ｐ６０ＴＲＰの取得：ｐ１８ＡβｒＰを発現させたＰＣ１２細胞においてはＮＧＦの添加にもかかわらず、細胞の分化、生存ならびに神経突起伸長がみられなかったが、この細胞においてラットｃＤＮＡライブラリーを発現させた結果、ｐ１８ＡβｒＰが発現しているにもかかわらず生存する細胞が見出された。そこで生存細胞からｄｅａｔｈ  ｔｒａｐ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ法（Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１７（１９９７））により、この生存に関与した遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ法によって見出し、ｐ６０ＴＲＰ遺伝子と命名した。また、この遺伝子によりコードされる細胞死抑制蛋白をｐ６０ＴＲＰ蛋白と命名した。
ｐ６０ＴＲＰｃＤＮＡ塩基配列および蛋白質一次構造の分析：ｐ６０ＴＲＰのｃＤＮＡおよび蛋白の配列分析はＵｎｉＧｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＮＣＢＩ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７））とＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＰＤＢ＋Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＰＲＦデータベースを用いたＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）Ｂｌａｓｔ  ２．０プログラムを検索ツールとして行ない、ホモロジー検索にはＢｌａｓｔおよびＦＡＳＴ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ））アルゴリズムを使用し、ＢｅｓｔＦｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，ＧＣＧ）を使って位置合わせを行なった。蛋白質の配列はＥｘＰＡＳｙ−ｗｗｗ−ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）：ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌおよびアミノ酸組成検索（ＡＡＣｏｍｐＩｄｅｎｔ）：ｈｔｔｐ：／／ｋｒ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ａａｃｏｍｐ／を用いて決定した。アミノ酸配列のモチーフの検索はＰＲＯＳＩＴＥ  Ｐｒｏｆｉｌｅ、ＢＬＯＣＫＳ−ＰｒｏＤｏｍ−ＰＲＩＮＴＳ−Ｐｆａｍ−およびＰＳＯＲＴ  ＩＩ−プログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，２６０（１９９９）；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４，１０９（１９９６）；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５，１４７（１９９７））を使って行なった。リン酸化部位の顕作はＮｅｔＰｈｏｓ  ２．０蛋白リン酸化検索サーバー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４，１３５１（１９９１））を用いて行なった。
組織ｐ６０ＴＲＰの発現解析：ｐ６０ＴＲＰの組織特異的遺伝子発現の分析はＲａｐｉｄ−ＳｃａｎＴＭ−Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｎｅｌｓ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用い、組織ｃＤＮＡを半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に付した。ＰＣＲ産物は標準１．５％ＤＮＡ電気泳動アガロースＥゲルＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒａｉｎ  Ａｇｉｎｇ  ２，３０（２００２））を使って行なった。
細胞培養：Ｂ１０４ラット神経芽細胞腫細胞（例えば、岡崎国立共同研究機構・生理学研究所の池中一裕教授から入手）およびＰＣ１２細胞（例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７２１）の培養はＮ２含有１０％牛胎児血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）で、また、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞株は１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件下で培養を行った。ＣＧ−４（オリゴデンドロサイト前駆細胞）の培養は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１ｖ／ｖ），Ｎ１含有（５ｍｇ／ｌのインスリン、１６．１ｍｇ／ｌのプトレシン、５０ｍｇ／ｌのトランスフェリン、４．６ｍｇ／ｌのＤ−ガラクトース、８ｍｇ／ｌの亜セレン酸Ｎａ、２．４ｇ／ｌ  ＨＣＯ３）、および３０％（ｖ／ｖ）のＢ１０４細胞の血清を含まない培養液で培養し、さらにオリゴデンドロサイトへの分化誘導にはＣＧ−４細胞は２４時間、Ｂ１０４細胞は分裂促進因子なしに培養したのち、２％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を加え生存を促進させた。細胞死の誘導には、細胞をＦＣＳ±Ａβ（１０μｇ／ｍｌ（ペプチド研、大阪、日本）になるよう血清を含まない液に１ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝液−生食（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に溶解し、２４時間３７℃でインキュベートしたものを用いた）で６０〜７２時間培養し、その後、細胞の生存はＰｒｏｍｅｇａキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を用いて測定した。神経突起伸長の誘導のため、ＰＣ１２細胞はｐ１８ＡβｒＰ−ＣＴ−ＧＦＰあるいはコントロールベクターを遺伝子導入した後、２４時間ＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で誘導した。
細胞への遺伝子導入：ｐ１８ＡβｒＰのＣ末端にＧＦＰ（緑色蛍光蛋白）を導入したｐ１８ＡβｒＰ−ＣＴ−ＧＦＰ、ラットｐ６０ＴＲＰ  ｃＤＮＡのＣ末端部分にＧＦＰ（ｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（登録商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）あるいはＤｓＲｅｄ１（ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素クローニング部位，クローンテック，東京，日本）を導入したｐ６０ＴＲＰ−ＣＴ−ＧＦＰおよびｐ６０ＴＲＰ−ＣＴ−ＤｓＲｅｄ１を作製した。さらにｐ６０ＴＲＰは同じｍＲＮＡ（ｐ６０ＴＲＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）からＧＦＰと共発現させるためｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローンした。ｐ１８ＡβｒＰ−ＣＴ−ＧＦＰあるいはｐ６０ＴＲＰ−ＤｓＲｅｄ１、ｐ６０ＴＲＰ−ＧＦＰ、ｐ６０ＴＲＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ＧＦＰ（クロンテック、東京、日本）発現ベクターあるいは空プラスミド（コントロール）をＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）およびＰＣ１２細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７２１）に一過性に遺伝子導入（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔｏｒ，Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，東京）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）／Ｎ２含有培養液を使用して３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の条件で培養を行なった。遺伝子導入効率は常に５０−６０％となるようＧＦＰとｐ５３−／ＰＫＣ−ＤｓＲｅｄ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の同時発現によって確認した（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，７９（２００２））。細胞死／生存の評価は遺伝子導入４８時間後に蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０，オリンパス，東京，日本）下で観察して行なった。さらに２４時間後ＮＧＦ（ｍｕｒｉｎｅ  ＮＧＦ  ２．５Ｓ，５０ｎｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を同ＰＣ１２細胞に添加し、１２０時間後に細胞の生存をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で測定し、蛍光顕微鏡下で観察した。
Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ：イースト株にはＭａＶ２０３（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を使用した。ラットｐ１８ＡβｒＰあるいはラットｐ６０ＴＲＰはｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）からＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを有するｐＤＥＳＴＴＭ３２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローンした。また、ＰｒｏＱｕｅｓｔＴＭｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄラット脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をもつ活性化ドメイン発現ベクターとしてｐＥＸＰ−ＡＤ５０を使用した。活性選別のためにＨＩＳ３，ＵＲＡ３及びｌａｃＺの３種のレポーター遺伝子を使用した。それぞれの遺伝子はイースト遺伝子内の異なる場所に安定的に組み込まれており、ＵＲＡ３，ＨＩＳ３及びｌａｃＺのプロモーター領域はＧＡＬ４結合部位を除いて異なる。標準的ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍに較べて、このＰｒｏＱＵＥＳＴＴＭＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍでは３つの独立した転写がそれぞれ別個の染色体で起こるので偽陽性反応は少ないとされる。ＨＩＳ３及びＵＲＡ３レポーター遺伝子の誘導はｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ依存的に起こり、それぞれヒスチジンあるいはウラシルを含まないプレートでも細胞が成長するので判別が可能である。一方、ＬａｃＺ遺伝子の誘導ではＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）法で青色に変色する。さらに、ＵＲＡ３の誘導は５−フルオロオロト酸（５ＦＯＡ）から５−フルオロウラシルへの変化による毒性のため、細胞はウラシルを含まない培養液中では成長するが、５ＦＯＡを含む培養液中では成長が阻害される。したがって、この系では４つの表現系すなわち、Ｈｉｓ（３ＡＴ（登録商標））、β−ｇａｌ、Ｕｒａ＋及び５ＦＯＡＳによって本当の相互作用を示す蛋白質を探索することができ、偽陽性反応を除くことができる。また、ＡＲＳ／ＣＥＮベクターを使うことによって、発現レベルと毒性を下げることができる。陽性のクローンは再形質転換によって確認される。相互作用をする蛋白質を含む場合、イースト細胞はｄｂ−ラットｐ６０ＴＲＰあるいはｄｂ−ラットｐ１８ＡβｒＰおよびａｄ−Ｙ（Ｙとして例えばＰＰ２ＡあるいはＴＩＤ−１）と結合する。以上を含むイースト株由来のプラスミドＤＮＡはエレクトロポレーション法で大腸菌に導入し、形質転換体はアンピシリンで、また、ｄｂ−ラットｐ１８ＡβｒＰはゲンタマイシンで選択される。これらの大腸菌のプラスミドＤＮＡ  ａｄ−Ｙ（Ｙとして例えばＰＰ２ＡあるいはラットＴＩＤ−１）はｐＤＢＬｅｕあるいはｄｂ−ラットｐ１８ＡβｒＰあるいはｄｂ−ラットｐ６０ＴＲＰと一緒にＭａＶ２０３へ導入されるが、ｄｂ−ラットｐ１８ＡβｒＰあるいはｐｄｂ−ラットｐ６０ＴＲＰによるレポーター遺伝子の誘導が真の陽性反応となる。
抗−ｐ６０ＴＲＰ抗体の作成：ウサギ抗−ｐ６０ＴＲＰ抗体はｐ６０ＴＲＰのＮ末端ドメイン（アミノ酸（ａａ）３５−ａａ４５；ＲＧＡＧＫＮＲＤＫＧＫ−ｃｙｓ）に対する高い親和性を有するものを作成（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，東京、日本）して使用した。
蛋白の免疫沈降とウエスタンブロット分析：約５ｘ１０６個のＰＣ１２細胞にｐ６０ＴＲＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを一過性に遺伝子導入２４時間後に、さらに４８時間培養を継続したのち、細胞はトリス−生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ，ｐＨ７．２）で２回洗浄し、０．５ｍｌの氷冷した緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１％  ＮＰ４０，２％  グリセロール，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン，１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン，０．５ｍＭ  バナジウム酸Ｎａ）を用いて４℃で細胞を溶解し、核を４℃で遠心分離して除去した。抗体（抗ｐ６０ＴＲＰ）とともに４℃で２時間インキューベートした後、５０％のプロテインＡセファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂを５００μｌ添加し、さらに２時間インキュベートした。免疫沈降物は３回洗浄し、５０μｌのＬａｅｍｍｌｉ−ｐｒｏｔｅｉｎ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，東京、日本）を加え、ウエスタンブロット分析を行なった。すなわち、蛋白質は１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離した。蛋白質はフッ化ビニリデン樹脂膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，東京、日本）に移した後、抗−ＰＰ２Ａ〈制御サブユニット〉抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）と免疫反応し、第二フルオレスセイン結合抗−ヤギ抗体ならびに第三アルカリフォスファターゼ結合抗フルオレスセイン抗体を加え、アルカリフォスファターゼの基質とともにインキュベートして行なった（ＥＣＦＴＭウエスタンブロットキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ，東京、日本）。
細胞死評価：ＰＣ１２細胞は５０−８０％の集密度に培養し、遺伝子導入２４時間前にトリプシン処理し、抗生物質を含まない新鮮な培養液で５倍に希釈（１〜３ｘ１０５個／ｍｌ）し、２４穴プレート（５００μｌ／ウェル）に移して培養した。細胞死評価実験では細胞にＧＦＰを発現させない（対照−１）とＧＦＰのみを発現させた対照−２とｐ６０ＴＲＰ遺伝子をＳｉ−ＲＮＡでノックアウトさせた場合について検討した。Ｓｉ−ＲＮＡによる遺伝子ノックアウトはＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、１ウェル当たり０．５μｇ  ｓｉＲＮＡの導入を行なった（Ｂｒａｉｎ  Ａｇｉｎｇ  ２、４４（２００２））。遺伝子導入効率は１μｇ  ＧＦＰ発現ベクターと０．２μｇ  ｓｉＲＮＡの共発現後、蛍光顕微鏡で決定した（Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０４，１２７（２００２）；Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４（２００１））。Ｓｉ−ＲＮＡによる細胞死／生存率は、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８８，３７（２０００））で発現４８時間後に測定した。ｐ６０ＴＲＰのためのｓｉＲＮＡ配列はスタートコドンに対して相対的にｎｔ３１０−ｎｔ３３０の配列を用いた。ｐ６０ＴＲＰ特異的２１−核酸二重鎖ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔａ，ＣＯ，ＵＳＡ；Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，東京、日本）から得た。
上記の実験方法は当該分野で知られている典型的なものであり、当業者はそれらの変法、あるいはそれらに代わる方法を認識しており、あるいは容易に思いつくはずである。
ＩＩ．実験結果
本発明における実験結果を以下に説明する。
（１）本発明のラットｐ１８ＡβｒＰのｃＤＮＡの塩基配列はヒトおよびマウスのそれらと相同的であり、そのアミノ酸配列を図１ｃに比較して示した。したがって、本発明のラットｐ１８ＡβｒＰのｃＤＮＡ塩基配列は、上掲の文献に記載されたヒト塩基配列およびＧｅｎｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ中の配列とは異なる新規なものであり、さらに図１ｃからわかるようにｐ１８ＡβｒＰ蛋白アミノ酸配列はヒトおよびマウスのものとは異なる新規なものであることがわかった。
（２）Ａβ１−４２（１０μｇ／ｍｌ）を添加して３７℃で６０時間後、ラットＣＧ４オリゴデンドロサイトのライゼート中のｐ１８ＡβｒＰ発現についてサザンブロット法により調べたところ、Ａβ１−４２により発現が亢進されることがわかった（図２左パネル参照）。レーン１は対照、レーン２はＡβ処理（Ａβ）を示す。ｐ１８ＡβｒＰ  ｍＲＮＡ転写量をデンシトメーターにて定量したところ、Ａβ１−４２の添加によって増加することがわかった（図２の右パネル参照）。
（３）ｐ１８ＡβｒＰはＮＧＦによって分化誘導されたＰＣ１２細胞において、神経突起伸長の抑制ならびに細胞死を惹起した。ｐ１８ＡβｒＰの神経細胞における機能を明らかにする目的で、ＰＣ１２細胞にｐ１８ＡβｒＰのＣ末端にＧＦＰを融合させた蛋白質の遺伝子を導入し４８時間後にその発現を確認した。その後、２４時間後にＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１２０時間後において蛍光顕微鏡下において観察の結果、図３に示すようにＮＧＦの存在下にもかかわらず神経突起伸長の抑制ならびに細胞死がみられ、２週間後には全ての細胞が死滅した。一方、同遺伝子を発現していない細胞（蛍光なし）ではＮＧＦにより明らかに突起の伸長が促進され生存した。これらのパターンのいくつかを図３のパネルａ〜ｉに示す。例えば、パネルｃおよびｆにおいて、矢印のＧＦＰ蛍光を示すｐ１８ＡβｒＰ陽性細胞は萎縮し、細胞死を起こして浮遊しているのが観察された。また、パネルｄの矢印の同細胞では細胞の形状はとどめるが、神経突起の伸長が抑制されているのが観察された。
（４）本発明のｐ１８ＡβｒＰと相互作用する蛋白質を、上で説明したＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてスクリーニングした結果、熱ショック蛋白ｈｓｐ７０及び癌抑制蛋白質Ｔｉｄ−１と相互作用することが見出された。上記の細胞死誘導作用および細胞分化抑制作用はかかる相互作用によるものと考えられた。
（５）ｐ１８ＡβｒＰのｍＲＮＡのラットの種々の組織における発現をＲＴ−ＰＣＲ法により、非定量的ｍＲＮＡ発現分析を行った結果、図４に示すように脳を含む２２種の臓器または組織で発現していることが確認された。
（６）ｐ６０ＴＲＰの単離、特徴、発現組織および細胞
ｐ１８ＡβｒＰとラット脳ｃＤＮＡライブラリーの遺伝子導入後、ｐ６０ＴＲＰは生存細胞からＲＴ−ＰＣＲによって見出された（図７）。この新規遺伝子のラットｃＤＮＡ塩基配列を配列番号：５および図５Ａに、アミノ酸配列を配列番号：６および図５Ｂ示し、参考としてその相同ヒト遺伝子ｃＤＮＡを配列番号：７および図６Ａに、アミノ酸配列を配列番号：８および図６Ｂに示す。ラットｃＤＮＡ（配列番号：５のヌクレオチド８２から１７０１まで）によってコードされる蛋白質は配列番号：６に示される５３９個のアミノ酸からなる分子量約５９．７２ｋＤａの蛋白質である。このラットｐ６０ＴＲＰ  ｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列はヒトのものとは明らかに異なる新規なものである。ラットｐ６０ＴＲＰ蛋白とヒト相同性ｐ６０ＴＲＰ蛋白とのアミノ酸配列相同性から、ヒトの相同性ｐ６０ＴＲＰ蛋白もラットｐ６０ＴＲＰ蛋白と同様の細胞死抑制作用を有すると考えられる。ｐ６０ＴＲＰ蛋白は、その配列から新規蛋白質ファミリーと考えられ、ｂＨＬＨドメイン（配列番号：６で示す配列のアミノ酸４９１からアミノ酸５０７まで）を有する。このようなドメインを有するｐ６０ＴＲＰ蛋白ファミリーのメンバーとしては：
Ｏ４３１６８、Ｑ９６Ｄ０９、ＱＢＶＺ３、Ｑ９ＣＶＶ３、Ｑ９Ｈ９６９、Ｑ９２０Ｒ４、Ｑ９ＢＥ１１、Ｑ９Ｃ０Ｇ２、Ｑ９ＣＸＱ７、Ｑ９ＵＪＣ４、Ｑ８Ｒ０９５、Ｏ６０２６７、Ｑ９ＮＰＥ４／Ｑ９ＵＨ６２、Ｑ９ＮＴＳ２、Ｑ９ＢＴＭ６、Ｑ９Ｈ２Ｑ０、Ｑ９Ｐ２９１、Ｑ９ＮＷＪ１３、Ｑ９ＣＸ１９、Ｑ９ＤＣ３２、Ｑ９ＣＺ８７、Ｑ９ＣＵＮ３、Ｑ９Ｄ０Ｌ７、Ｑ９ＣＳ８１、Ｑ９ＣＸ８３
が挙げられる。
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、組織発現パターンを検索した結果、そのｍＲＮＡは脳、腎臓、脾臓で高い発現が認められ、心臓および骨格筋でも発現が見られたが、肺や肝臓では発現は検出されなかった（図８）。図９にＣＨＯ細胞でのｐ６０ＴＲＰ−ＧＦＰおよびｐ６０ＴＲＰ−ＤｓＲｅｄ１の蛍光像を示す。ｐ６０ＴＲＰ−ＧＦＰあるいはｐ６０ＴＲＰ−ＤｓＲｅｄ１融合蛋白はＣＨＯ細胞において細胞質に特に局在化し（図９パネルＡおよびＢ）、核にも存在していた（図９パネルＣ−Ｆ）。
また、ｐ６０ＴＲＰはＰＣ１２細胞においてＮＧＦ誘導による神経突起伸長に影響を与えなかった。図１０に示すように、ＰＣ１２細胞においてｐ６０ＴＲＰ発現２４時間後にＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに１２０時間培養した後にＮＧＦによる神経突起の伸長作用が抑制されていないことがｐ６０ＴＲＰとＧＦＰの共発現細胞で観察できた。
（７）ｐ６０ＴＲＰと相互作用する蛋白質
Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍにより、２つの蛋白質がｐ６０ＴＲＰと相互作用することが明らかにされた。すなわち、細胞内シグナル伝達において重要な脱リン酸化反応を行なうＰＰ２Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ａ）と細胞質から核へのｂＨＬＨ転写因子の輸送に関与するＲａｎＢＰ５（Ｒａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ５）である。ｐ６０ＴＲＰは図１１に示すように、免疫沈降ならびにそのウェスタンブロット分析から、ＰＰ２Ａと結合することが示される。ｐ６０ＴＲＰはこれらの蛋白質と相互作用し、ｐ１８ＡβｒＰによる細胞死シグナルの阻害により細胞死を阻害したと考えられる。
（８）ｐ６０ＴＲＰとＰＰ２Ａの免疫沈降
図１１はｐ６０ＴＲＰとＰＰ２Ａとの免疫沈降のウエスタンブロット分析の結果である。ＰＣ１２細胞に発現したｐ６０ＴＲＰはＰＰ２Ａと相互作用し複合体形成により、約ｐ６０ｋＤａに共沈されることが免疫沈降反応実験によって確認された。
（９）ｐ６０ＴＲＰ遺伝子ノックアウトによる細胞生存率の低下
ｐ６０ＴＲＰ特異的ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックアウトによって、ＰＣ１２細胞が対照群にくらべて、有意に生存率が低下した。すなわち、図１２に示すように、対照−１の生存率１００％に対して、ＧＦＰのみを発現させた対照−２では１０２％と変化はみられなかったが、ｐ６０ＴＲＰをノックアウトしたｐ６０ＴＲＰ−ｓｉＲＮＡでは７６％に生存率が有意に低下した（ｐ＜０．０５）。このことにより、ｐ６０ＴＲＰ蛋白の細胞死抑制効果がさらに確認された。
以上、本発明を実施例を参照して具体的かつ詳細に説明したが、当業者は、上記説明に記載された以外の改変や変法、例えば、適切な細胞株の選択等を容易に行なって本発明を実施することが可能である。
産業上の利用可能性
本発明により、アミロイドβ蛋白（以下、Ａβと略する）によってオリゴデンドロサイトで発現が亢進される新規遺伝子ｐ１８ＡβｒＰが見出され、その機能についても明らかとなった。すなわち本遺伝子およびその産物であるｐ１８ＡβｒＰ蛋白は熱ショック蛋白Ｈｓｐ７０および癌抑制蛋白Ｔｉｄ−１と相互作用をすることによって、神経栄養因子による神経突起の伸長促進と生存維持を抑制し、細胞死を促進するなどの新規機能を有することが明らかとなった。したがって、本発明は、これらを応用したスクリーニング系ならびにそれらを使った細胞死促進ならびに抑制に関する物質、あるいはそれらを利用した疾病の診断、予防を提供するものである。さらに本発明において、上記スクリーニングによりラットの細胞死抑制蛋白ｐ６０ＴＲＰおよびそれをコードする遺伝子をはじめて見出し、ｐ６０ＴＲＰ蛋白の作用効果、すなわち細胞死抑制作用についてもはじめて確認した。したがって、本発明はそれらを利用した細胞死関連疾病の診断、予防を提供するものである。
2003074701.tif 000002
2003074701.tif 000003
【配列表】
2003074701.tif 000004
2003074701.tif 000005
2003074701.tif 000006
2003074701.tif 000007
2003074701.tif 000008
2003074701.tif 000009
2003074701.tif 000010
2003074701.tif 000011
2003074701.tif 000012
2003074701.tif 000013
2003074701.tif 000014
2003074701.tif 000015
2003074701.tif 000016
【図面の簡単な説明】
図１はｐ１８ＡβｒＰ  ｃＤＮＡの塩基配列（図１ａ）及びアミノ酸配列（図１ｂ）を示す。図１ｃは、本発明のラットｐ１８ＡβｒＰ蛋白（Ｒ）、ならびにヒト（Ｈ）、マウス（Ｍ）の相同蛋白、およびヒトの短い相同蛋白（ｓＨ）のアミノ酸配列を比較して図１ｃに示す。図１ｃのアミノ酸配列に付した下線は推定上のｎＮＯＳ  ＰＤＺドメインを示す。
図２の左パネルはＡβ１−４２（１０μｇ／ｍｌ）を添加して３７℃で６０時間後、ラットＣＧ４オリゴデンドロサイトのライゼートのサザンブロットを示す。レーン１は対照、レー２はＡβ処理（Ａβ）を示す。図２の右パネルはｐ１８ＡβｒＰ  ｍＲＮＡ転写物の定量を示す。数値は６回の個々の実験におけるｐ１８ＡβｒＰとＳ１２のＰＣＲ産物のデンシトメーターの比率±標準誤差である（＊＊Ｐ＜０．０１対照群に対する有意水準）。
図３はＮＧＦ添加後のｐ１８ＡβｒＰ発現細胞および非発現細胞における神経突起の伸長を示す。ＮＧＦ添加１２０時間後、ｐ１８ＡβｒＰ陽性細胞は神経突起の伸長がみられなかったが（矢印で示す）、非発現細胞でははっきりと神経突起の伸長が認められた。パネルｉのスケールバーは２５μｍである。この長さのスケールバーは、パネルａでは７５μｍ、パネルｂ〜ｈでは５０μｍに相当する。さらに、ｐ１８ＡβｒＰ陽性細胞は発現後２週間以上生存せず死滅した。
図４はｐ１８ＡβｒＰの発現パターンを調べた結果を示す。そのｍＲＮＡは検討した２２部位全てで発現していることが明らかにされた。１は脳、２は心臓、３は腎臓、４は脾臓、５は肝臓、６は結腸、７は肝臓、８は小腸、９は筋肉、１０は胃、１１は精巣、１２は唾液腺、１３は甲状腺、１４は副腎、１５は膵臓、１６は卵巣、１７は子宮、１８は前立腺、１９は皮膚、２０は白血球、２１は骨髄、および２２は胎児脳での発現を示す。
図５ａはラットｐ６０ＴＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、図５ｂはラットｐ６０ＴＲＰ蛋白のアミノ酸配列を示す。
図６ａはヒト相同性６０ＴＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、図６ｂはヒトｐ６０ＴＲＰ蛋白のアミノ酸配列を示す。
図７は生存細胞（ＰＣ１２細胞）におけるｐ６０ＴＲＰの存在およびＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。パネルＡは生存コロニー、パネルＢは生存コロニーを３日培養したもの、パネルＣはＲＴ−ＰＣＲのアガロースゲルを示す。
図８はｐ６０ＴＲＰの組織特異的発現を示すＲＴ−ＰＣＲによる半定量的ｍＲＮＡの発現を示す。レーンＭはマーカー、レーン１は心臓、レーン２は脳、レーン３は腎臓、レーン４は肝臓、レーン５は脾臓、レーン６は膵臓、レーン７は肺、レーン８は骨格筋である。
図９はＣＨＯ細胞でのｐ６０ＴＲＰ−ＧＦＰおよびｐ６０ＴＲＰ−ＤｓＲｅｄＩの蛍光像を示す。各パネルの倍率は同じである。パネルＡはｐ６０ＴＲＰ−ＣＴ−ＧＦＰを示し、その他（Ｂ〜Ｆ’）はｐ６０ＴＲＰ−ＣＴ−ＤｓＲｅｄ１を示す。Ｂはｐ６０ＴＲＰが細胞質に、Ｃは核に存在することを示す。ＤとＤ’、ＥとＥ’、ＦとＦ’はそれぞれ核での存在を示すが、’を付けたほうの図によって周囲の細胞像を合わせて見ることができる。パネルＦ’中のスケールバーの長さは５０μｍである。
図１０はｐ６０ＴＲＰ発現によるＰＣ１２細胞への影響を示す。ｐ６０ＴＲＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによってｐ６０ＴＲＰはＧＦＰと共に発現させ、発現２４時間後にＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、さらに培養１２０時間後の細胞の蛍光顕微鏡像を示す。ｐ６０ＴＲＰを発現した細胞はＧＦＰによる蛍光発光によって区別できる。ｐ６０ＴＲＰはＰＣ１２細胞においてＮＧＦ誘導による神経突起伸長に影響を与えなかった。スケールは５０μｍである。各パネルの倍率は同じである。
図１１はＰＰ２Ａのウエスタンブロット分析を示す。レーン１は分子量のマーカー、レーン２はｐ６０ＴＲＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを遺伝子導入されたＰＣ１２細胞を用いてポリクロナールヤギ抗ＰＰ２Ａ抗体での蛋白沈降を示す。レーン３はポリクロナールウサギ抗ｐ６０ＴＲＰ抗体での蛋白沈降で約６０ｋＤａに単一バンドがみられた。
図１２はｐ６０ＴＲＰ遺伝子ノックアウトによるＰＣ１２細胞での細胞生存率を示す。各生存率は８回の独立した実験での平均値±標準誤差をプロットしたものである。対照−１の生存率１００％に対して、ＧＦＰのみを発現させた対照−２では１０２％と変化はみられなかったが、ｐ６０ＴＲＰをノックアウトしたｐ６０ＴＲＰ−ｓｉＲＮＡでは生存率が７６％に有意に低下した。有意水準；＊ｐ＜０．０５（対照との比較）
【図１ａ】
2003074701.tif 000017
【図１ｂ】
2003074701.tif 000018
【図１ｃ】
2003074701.tif 000019
【図２】
2003074701.tif 000020
【図３】
2003074701.tif 000021
【図４】
2003074701.tif 000022
【図５ａ】
2003074701.tif 000023
【図５ｂ】
2003074701.tif 000024
【図６ａ】
2003074701.tif 000025
【図６ｂ】
2003074701.tif 000026
【図７】
2003074701.tif 000027
【図８】
2003074701.tif 000028
【図９】
2003074701.tif 000029
【図１０】
2003074701.tif 000030
【図１１】
2003074701.tif 000031
【図１２】
2003074701.tif 000032
【国際調査報告】
2003074701.tif 000033
2003074701.tif 000034
2003074701.tif 000035
2003074701.tif 000036
2003074701.tif 000037
2003074701.tif 000038
2003074701.tif 000039
2003074701.tif 000040