(57)【要約】本発明者が、ＣＲＡＭ結合タンパク質として単離・同定した新規タンパク質ＣＲＡＧは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、ＧＴＰａｓｅ活性配列と核移行シグナル配列とを有する。機能解析の結果、このタンパク質ＣＲＡＧは、神経細胞において物質の核内移行に関与しており、ポリグルタミン病における変性タンパク質の核内移行および当該変性タンパク質の消去にも関与していることが示された。このように、本発明は、神経細胞において物質の核内移行に関与する新規タンパク質、および当該タンパク質をコードする遺伝子等を提供するものである。したがって、本発明は、このような神経変性疾患の診断・治療等への利用が期待できる。
2004009812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、神経細胞において物質の核内移行に関与するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１３番目から１１６番目にある１以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、ＧＴＰアーゼ活性に異常を生じたタンパク質。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、３３８番目から３４４番目にある１以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、核移行能に異常を生じたタンパク質。
【請求項２】
請求の範囲１記載の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列を有し、上記（ａ）のタンパク質をコードする請求の範囲２記載の遺伝子。
【請求項４】
請求の範囲２または３記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求の範囲２または３記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項６】
請求の範囲２または３記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項７】
請求の範囲１記載の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質に対する抗体。
【請求項８】
請求の範囲１記載の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質、および／または、請求の範囲２もしくは３記載の遺伝子を含んでなる神経疾患治療用薬剤。
【請求項９】
請求の範囲１記載の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質、および／または、請求の範囲２もしくは３記載の遺伝子を含んでなるポリグルタミン病治療用薬剤。
【請求項１０】
請求の範囲１記載の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質、および／または、請求の範囲２もしくは３記載の遺伝子および／または、請求の範囲７に記載の抗体を用いてなる神経疾患の診断方法。
【請求項１１】
請求の範囲１記載の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質、および／または、請求の範囲２もしくは３記載の遺伝子および／または、請求の範囲７に記載の抗体を用いてなるポリグルタミン病の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、神経細胞において物質の核内移行に関与する新規タンパク質、および当該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその利用に関する。
【背景技術】  神経発生過程において分化した神経細胞は、軸索を進展し、最終的にそれぞれ特異的な標的を探し当て、神経伝達の場であるシナプスを形成する。この神経回路網の形成過程において、神経細胞は局所の標識分子を認識することの連続により、最終的な標的に至るものと考えられている。したがって、多数の分子および分子間認識が重要な役割を担っており、近年、これらの分子としてセマフォリンやＮＩ３５などの反発因子、さらにネトリン、カドヘリンなどの誘因因子が同定されるに至った。
現在、多数のセマフォリンファミリーおよびその受容体が同定され、セマフォリンを介する反発性のシグナル伝達機構が注目されている。１９９５年には、セマフォリンによる神経成長円錐崩壊の細胞内シグナル伝達に関与する分子としてＣＲＭＰ（Ｃｏｌｌａｐｓｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が同定された（Ｎａｔｕｒｅ  １９９５；３７６：５０９−５１４参照）。また、本発明者は、上記ＣＲＭＰに結合する新規のシグナル分子を同定し、「ＣＲＡＭ（ＣＲＭＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」と命名した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：２７２９１−２７３０２参照）。
ＣＲＭＰおよびＣＲＡＭは、線虫の神経走行異常を引き起こす原因遺伝子として知られている「ＵＮＣ−３３」の哺乳類ホモログであることが判明し、神経の働きに関与する重要な分子であると思われる。
ところで、最近は基礎研究から生まれた新技術を、新たな治療法、検査・診断方法、手術方法として臨床現場に利用する動きが活発であり、画期的治療法として注目されている再生医療、遺伝子治療の実現にも、こうした遺伝子レベル細胞レベルでの基礎研究が不可欠になっている。言い換えれば、上記のような神経発生や神経細胞機能の仕組みを調べる基礎研究を通じて、遺伝子治療に直接役立つ知見が得られる可能性があり、これを利用し、各種神経疾患（例えば、痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病、ポリグルタミン病などのような神経変性疾患、あるいは脊髄損傷や顔面神経麻痺などの神経麻痺）に対して、新たな神経再生技術の開発、新たな遺伝子治療法の開発、各種神経疾患の病態機序の研究、その治療薬の開発、さらには、新たな神経細胞・神経組織の人為的生産技術の開発、といった種々の応用面・臨床面での利用が期待できる。
例えば、神経変性疾患の１つであるポリグルタミン病は、ポリグルタミン鎖をもつ変性タンパク質が神経細胞内に核内凝集体を形成して、神経細胞に対して障害性を引き起こすことが疾患発症機構に密接に関与していると考えられている。このポリグルタミン変性タンパク質がどのようなメカニズムで核内に移行するのかは未だよくわかっておらず、もし神経細胞において物質の核内移行に関与する新規タンパク質が得られれば、当該タンパク質、その遺伝子等は、ポリグルタミン病の検査、診断、治療をはじめとして幅広い分野での利用が期待できるものである。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、神経細胞において物質の核内移行に関与する新規タンパク質、および当該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその利用の代表的な一例を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、前述したＣＲＡＭに結合する新規タンパク質ＣＲＡＧ、および当該タンパク質ＣＲＡＧをコードする遺伝子を同定し、その機能解析を種々の実験により行ったところ、このタンパク質ＣＲＡＧが神経細胞において物質の核内移行に関与すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明に係るタンパク質は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるタンパク質である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、神経細胞において物質の核内移行に関与するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１３番目から１１６番目にある１以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列（例えば、１１４番目のセリン残基がアスパラギン残基に置換されたアミノ酸配列）からなり、ＧＴＰアーゼ活性に異常を生じたタンパク質。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、３３８番目から３４４番目にある１以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列（例えば、３４２番目のリシン残基および３４３番目のアルギニン残基の双方がアスパラギン酸残基に置換されたアミノ酸配列）からなり、核移行能に異常を生じたタンパク質。
尚、上記（ｂ）のタンパク質における、「１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、配列番号１に示される塩基配列を有し、上記（ａ）のタンパク質（即ち、本発明者が同定した新規タンパク質ＣＲＡＧ）をコードする遺伝子が挙げられる。
尚、本発明に係る「遺伝子」は、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを含む意味である。また、ＤＮＡは２本鎖のみならず、それを構成するセンス鎖、アンチセンス鎖といった１本鎖でもよい。さらに、上記「遺伝子」は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
本発明に係る組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１に示される塩基配列が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明に係る形質転換体は、本発明の遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（線虫、キイロショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、上記タンパク質ＣＲＡＧの更なる機能解析、同タンパク質が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子の発現解析に利用することができる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
本発明に係る抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。
本発明の代表的な利用の例としては、例えば、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質、および／または、上記遺伝子を含んでなる神経疾患治療用薬剤、並びにポリグルタミン病治療用薬剤や、上記タンパク質、上記遺伝子および／または上記抗体を用いる神経疾患の診断方法、並びにポリグルタミン病の診断方法を挙げることができる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】  図１は、ラット脳の抽出液から、ＣＲＡＭアフィニティーカラムによりＣＲＡＭに結合するタンパク質のみを溶出して電気泳動を行った図面である。
図２は、本発明に係るＣＲＡＧタンパク質のアミノ酸配列を示す図面である。
図３は、マウス組織におけるＣＲＡＧの発現分布を調べたノーザンブロッティングの実験結果を示す図面である。
図４（ａ）は、ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＣＲＡＧを発現させた顕微鏡写真を示した図面であり、図４（ｂ）は、ＨＡ−ＣＲＡＧを発現させた顕微鏡写真を示した図面である。
図５（ａ）は、ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＣＲＡＧを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図５（ｂ）は、ＣＯＳ−７細胞にＨＡ−ＰＭＬを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図５（ｃ）は図５（ａ）および図５（ｂ）を合成した図面である。
図６は、本発明に係るＣＲＡＧタンパク質のアミノ酸配列と、ＣＲＡＧタンパク質変異体の変異部位を示す図面である。
図７は、ＣＯＳ−７細胞に、ＨＡ−ＣＲＡＧ−ＮＬＳｍを発現させた顕微鏡写真を示した図面である。
図８は、ＣＯＳ−７細胞にＡｔａｘｉｎ−３を発現させた顕微鏡写真を示す図面である。
図９（ａ）は、ＣＯＳ−７細胞にＨＡ−ＣＲＡＧを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図９（ｂ）は、ＣＯＳ−７細胞にＭｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３を発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図９（ｃ）は図９（ａ）および図９（ｂ）を合成した図面である。
図１０（ａ）は、ＣＯＳ−７細胞にＭｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３を発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図１０（ｂ）は、ＣＯＳ−７細胞にＨＡ−ＣＲＡＧ−ＮＬＳｍを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図１０（ｃ）は図１０（ａ）および図１０（ｂ）を合成した図面である。
図１１は、ＭＪＤ患者脳の橋核神経細胞におけるＣＲＡＧタンパク質の局在を免疫組織化学的に調べた結果を示す図面である。
図１２（ａ）は、ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＣＲＡＧを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図１２（ｂ）は、ＣＯＳ−７細胞にＦ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図１２（ｃ）は図１０（ａ）および図１０（ｂ）を合成した図面である。
図１３（ａ）は、ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＣＲＡＧ−ＧＴＰｍを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図１３（ｂ）は、ＣＯＳ−７細胞にＦ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎを発現させたときの局在についての顕微鏡写真を示した図面であり、図１３（ｃ）は図１０（ａ）および図１０（ｂ）を合成した図面である。
図１４は、ＣＯＳ−７細胞に、Ｍｙｃ標識したＡｔａｘｉｎ−３（Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３）と、ＨＡ標識したＣＲＡＧ（ＨＡ−ＣＲＡＧ）とを導入し発現させ、免疫染色法により、それぞれの細胞内局在の動態を、時間経過をとりながら観察した結果を示す。同図左端に示す図は、上から順にＡｔａｘｉｎ−３の１日目の動態、同２日目の動態、および同３日目の動態を示す。また同図左から２列目に示す図は、上から順にＣＲＡＧの１日目の動態、同２日目の動態、および同３日目の動態を示す。また同図左から３列目に示す図は、それぞれ同図左端、同図左から２列目の図を合成した図である。また同図右端に示す図は、Ａｔａｘｉｎ−３のみをＣＯＳ−７細胞に導入した際のＡｔａｘｉｎ−３の動態を示し、上から１日目の動態、２日目の動態、３日目の動態を示す。
図１５は、ＣＲＡＧによるＡｔａｘｉｎ−３の消去活性をウエスタンブロット解析により検討した結果を示す。
図１６は、ＣＯＳ−７細胞内でＡｔａｘｉｎ−３を単独で発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３）、Ａｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧを発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３＋ＣＲＡＧ）、Ａｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧ核移行シグナル変異体を発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３＋ＣＲＡＧ  ＮＬＳｍ）、およびＡｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧ  ＧＴＰａｓｅ活性変異体を発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３＋ＣＲＡＧ  ＧＴＰｍ）における細胞毒性を検討した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
（１）本発明に係る遺伝子、およびそのタンパク質ＣＲＡＧ
本発明に係るタンパク質は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるタンパク質である。このうち（ａ）のタンパク質は、今回、本発明者がマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）から単離・同定した新規タンパク質であり、配列番号２に示されるように３６９個のアミノ酸残基からなり、分子量約４２ｋＤａのタンパク質である。
上記（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡ配列が、配列番号１に示される。このｃＤＮＡは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として開始コドンから終止コドンまで１，１１０ｂｐの長さを有するものであった。
上記（ａ）のタンパク質は、前述したＣＲＡＭに結合する新規タンパク質として単離・同定されたものである。また相同性検索の結果、このタンパク質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるｒａｓと相同性のＧＴＰａｓｅ活性配列を有していた。そこで、本発明者は、このタンパク質を「ＣＲＡＧ（ＣＲＡＭ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＧＴＰａｓｅ）」と命名した。
ＧＴＰａｓｅ活性配列は、ＧＴＰ結合タンパク質などが有するＧＴＰの加水分解（脱リン酸化）活性を持つ部位である。ＧＴＰ加水分解は、一般的にシグナル伝達などに利用されるので、上記タンパク質ＣＲＡＧは、そのＧＴＰ脱リン酸化作用によりシグナル伝達に関与している可能性がある。
このように上記ＣＲＡＧはＣＲＡＭと結合し、ＧＴＰａｓｅ活性配列を有するタンパク質であるが、さらに、上記ＣＲＡＧについて機能解析を進めることにより、以下の知見が得られた。
▲１▼ノーザンブロット解析の結果、上記ＣＲＡＧは神経特異的に発現する。
▲２▼上記ＣＲＡＧのｃＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に導入すると核内に局在し、１ないし数個のリング状核内封入体を形成した。
▲３▼上記ＣＲＡＧのｃＤＮＡ、および、神経成長円錐崩壊に関与する前記ＣＲＭＰ２のｃＤＮＡの双方をＣＯＳ−７細胞に導入したところ、ＣＲＡＧはＣＲＭＰ２と共局在し、ＣＲＡＭ／ＣＲＭＰ２複合体を核内に移行させることが示された。これに対して、後述するＣＲＡＧの核移行シグナル変異体では、ＣＲＭＰ２を核移行させなかった。
上記▲１▼〜▲３▼の結果から、上記ＣＲＡＧは、神経細胞において目的タンパク質を核内移行させる作用を持つ可能性が考えられた。そこで、後述するポリグルタミン病との関わりを調べるためにさらに機能解析を行い、以下の知見が得られた。
▲４▼上記ＣＲＡＧのｃＤＮＡ、および、Ａｔａｘｉｎ−３（ポリグルタミン病の１つであるマシャド・ジョセフ病の原因遺伝子）のｃＤＮＡの双方をＣＯＳ−７細胞に導入したところ、ＣＲＡＧはＡｔａｘｉｎ−３と共局在し、Ａｔａｘｉｎ−３を核内に移行させることが示された。これに対して、後述するＣＲＡＧの核移行シグナル変異体では、Ａｔａｘｉｎ−３を核移行させなかった。
▲５▼ポリグルタミン病患者の脳においてＣＲＡＧが検出され、神経細胞の核内にＣＲＡＧの構造体が検出された。
▲６▼上記ＣＲＡＧのｃＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に導入し、このＣＯＳ−７細胞のユビキチンを染色したところ、ＣＲＡＧはユビキチンと共局在することが示された。これに対して、後述するＣＲＡＧのＧＴＰａｓｅ変異体では、ＣＲＡＧとユビキチンとの共局在は観察されなかった。
▲７▼ＣＲＡＧは、ＣＲＡＧが形成する核内封入体（以下適宜ＣＲＡＧ  Ｂｏｄｙと称する）において、Ａｔａｘｉｎ−３消去活性が認められた。
▲８▼ＣＯＳ−７細胞にＡｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧおよびＣＲＡＧ変異体を発現させて、Ａｔａｘｉｎ−３の細胞毒性に対するＣＲＡＧの効果を確かめた。その結果、ＣＲＡＧおよびＣＲＡＧの核移行シグナル変異体は、Ａｔａｘｉｎ−３の細胞毒性を抑制した。一方、ＧＴＰａｓｅ活性の変異体では、むしろＡｔａｘｉｎ−３の細胞毒性の促進効果が認められた。
ポリグルタミン病は、原因遺伝子の同定により新たに提唱された疾患群で、原因遺伝子の翻訳領域内にあるポリグルタミンをコードするＣＡＧリピートが、患者において特異的に伸張していることが明らかにされた疾患群である。疾患の数は年々増加し、現在までに９つの遺伝性神経変性疾患、すなわち、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マシャド・ジョセフ病（Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病：「ＭＪＤ」とも略称される）、Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  １型、２型、６型、７型、１７型が同定されている。現在、ポリグルタミン鎖をもつ変性タンパク質が神経細胞内に核内凝集体を形成して、神経細胞に対して障害性を引き起こすことが疾患発症機構に密接に関与していると考えられているが、ポリグルタミン変性タンパク質がどのようなメカニズムで核内に移行するのかは不明であった。
上記▲４▼〜▲６▼の実験結果から、上記ＣＲＡＧは、ポリグルタミン変性タンパク質であるＡｔａｘｉｎ−３と結合し、同タンパク質を核内に移行させる活性が見出された。これらの結果は、上記ＣＲＡＧがポリグルタミン変性タンパク質の核内移行を制御している可能性を示すものである。
また上記▲６▼〜▲８▼の結果から、上記ＣＲＡＧはユビキチン化、変性タンパク質の消去、変性タンパク質の細胞毒性の抑制に関与している可能性がある。ユビキチン化とは、ＡＴＰやＧＴＰなどのエネルギーによって目的タンパク質にユビキチンが鎖状に結合することであり、このユビキチン化部分をプロテアソームが認識して当該タンパク質をユビキチン共役タンパク質分解させることが最近明らかになってきた。つまり上記ＣＲＡＧは、ユビキチン化への関与という形で、このようなタンパク質分解機構に関与している可能性がある。
（２）本発明に係る遺伝子、タンパク質の利用方法
上記ＣＲＡＧは、以上のように、ポリグルタミン病における変性タンパク質の核内移行を制御している可能性がある。したがって、上記ＣＲＡＧは、ポリグルタミン病における変性タンパク質核内移行のメカニズムを解析するための研究材料として有用であり、ひいては、ポリグルタミン病の新たな検査法・診断法の開発、ポリグルタミン病治療に向けての分子基盤の作製および創薬に有用である。
特に、上記ＣＲＡＧの核移行シグナル配列を改変した変異体を発現させた場合は、ポリグルタミン変性タンパク質Ａｔａｘｉｎ−３の核移行もほぼ完全にブロックされ、Ａｔａｘｉｎ−３による細胞死も有意に抑制された（後述の実施例参照）。したがって、上記ＣＲＡＧの核移行シグナル変異体は、ポリグルタミン病の治療薬剤として利用できる可能性がある。なお、「ＣＲＡＧの核移行シグナル変異体」としては、前記（ｄ）に示される変異タンパク質が好ましい例として挙げられるが、これに限られるものではなく、例えば、上記核移行シグナルにある１以上のアミノ酸を他のアミノ酸に改変したものでもよい。同様に、ＣＲＡＧのＧＴＰａｓｅ活性欠損変異体としては、前記（ｃ）に示されるタンパク質が好ましい例として挙げられるが、これに限られるものではなく、後述するＧＴＰａｓｅ活性配列中の１以上のアミノ酸を他のアミノ酸に改変したものでもよい。
またＣＲＡＧは、ポリグルタミン変性タンパク質Ａｔａｘｉｎ−３をＣＲＡＧ  Ｂｏｄｙにおいて消去する活性を有することより、ポリグルタミン病の治療薬剤として利用できる可能性がある。なおＣＲＡＧとしては、例えば前記（ａ）（ｂ）に示されるタンパク質が挙げられる。
さらに上述のＣＲＡＧおよびＣＲＡＧの核移行シグナル変異体は、Ａｔａｘｉｎ−３の細胞毒性を抑制したことより、上述の知見と合わせて、ポリグルタミン病の治療薬、並びに変性タンパク質の蓄積により発症するアルツハイマー病、パーキンソン病、老人性痴呆などの疾患全般に応用できる可能性がある。
また後述のように、ポリグルタミン病患者の脳においてＣＲＡＧの集積が認められたので、その抗体などは検査・診断用に利用できる可能性がある。
さらに、上記ＣＲＡＧは、神経回路網形成過程を制御する分子群の１つであるＣＲＡＭと結合し、ＣＲＡＭ／ＣＲＭＰ２複合体を核内移行させる活性を持つことが示されたことから、神経回路網の形成メカニズムの詳細な解明に、さらには神経回路網の形成異常と関係する各種遺伝子疾患の発症機序の研究、その検査、診断、治療などに利用できる可能性がある。
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質の具体的な利用方法について説明する。
本発明に係るポリグルタミン病をはじめとする神経疾患の治療方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、前記（ａ）、（ｂ）または（ｄ）に示されるタンパク質を含む薬剤（便宜上、タンパク質薬剤と称する。）を用いる方法と、前記（ａ）、（ｂ）または（ｄ）に示されるタンパク質をコードする遺伝子（便宜上、遺伝子薬剤と称する）を用いる方法とを挙げることができる。
前者の方法に用いられる薬剤すなわちタンパク質薬剤の具体的な構成は特に限定されるものではなく、前記（ａ）、（ｂ）または（ｄ）に示されるタンパク質を含んでおり、使用時に当該タンパク質が十分な機能を発揮できるようになっていればよい。
本発明に係るタンパク質薬剤の使用形態すなわちヒトへの投与方法も特に限定されるものではなく、例えば、静脈注射で投与する方法等により局部的に投与する等を挙げることができる。さらに、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。
後者の方法に用いられる薬剤すなわち遺伝子薬剤の具体的な構成は特に限定されるものではないが、例えば、前記（ａ）、（ｂ）または（ｄ）に示されるタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを挙げることができる。
より具体的には、本発明に係る組換え発現ベクターとしては、前記（ａ）、（ｂ）または（ｄ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものであればよいが、例えば、配列番号１に示される塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターを挙げることができる。
上記発現ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係る上記タンパク質ＣＲＡＧ又はその変異タンパク質を発現させることができる。ホスト細胞への遺伝子導入方法としては、遺伝子が組み込まれた発現ベクターをエンドサイトーシスによって目的細胞に導入する方法（リン酸カルシウム法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクトロポレーション法、遺伝子銃法）、超音波法、単純拡散法、電荷を有する脂質を用いる方法、リポソーム法、あるいは、ウィルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入を行う方法、などがあり、このうち適当な方法によって遺伝子を導入し細胞内発現させればよい。
上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ等のエピトープをコードする塩基配列を付加してもよい。この場合、各エピトープを認識する抗体を用いることによって、本発明に係る遺伝子の発現を容易に確認することができる。あるいは、遺伝子の発現を観察するため、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）と本発明に係るタンパク質との融合タンパク質を発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
本発明に係る遺伝子の一部配列またはその相補配列は、遺伝子検出器具のプローブとして利用可能である。遺伝子検出器具としては、例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなる各種検査・診断用のＤＮＡチップが挙げられる。尚、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができ、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ  ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）などを挙げることができる。
尚、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
プローブとして用いるオリゴヌクレオチドの長さは、その特徴的・特異的配列により目的遺伝子の発現を検出できるものであれば特に限定されるものではないが、合成オリゴヌクレオチドの場合は１０以上３０以下が好ましく、１５以上２５以下がより好ましい。
本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、ＣＲＡＧタンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。従来公知の方法としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））等が例示される。
上記ＣＲＡＧタンパク質やその遺伝子、またはそのヒトホモログを目的の細胞に導入して神経疾患治療用薬剤として使用する場合、遺伝子やタンパク質以外に、これらを効率よく細胞内に導入するための運搬体（ベクター、外被タンパク質等）を含むものであってもよく、また、各種の試薬や反応液、酵素などと組み合わせて使用してもよい。
（３）本発明に係る遺伝子、タンパク質の取得方法
以上、本発明のタンパク質、遺伝子の構造、機能および利用方法などの諸特徴について説明したが、以下では、本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法について説明する。
本発明のタンパク質ＣＲＡＧをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、従来公知のＤＮＡライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニング・ベクターを使用して対象となる動物からゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製するステップと、上記ＣＲＡＧの遺伝子配列の少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出するステップとを含む方法を用いることができる。
プローブに用いる領域は、本発明のタンパク質ＣＲＡＧをコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを設計して用いてもよい。また、上記ライブラリーからのスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
また、上記プローブの配列を、本発明のタンパク質ＣＲＡＧの機能上重要と考えられる領域（例えば、ＧＴＰａｓｅ活性配列や核移行シグナル配列）の中から選択し、ヒトやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ＣＲＡＧと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
また、上記ＣＲＡＧのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質を作製する方法としては、例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法や、部位特異的突然変異誘発法（ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）等が挙げられる。また、文献「細胞工学別冊  新細胞工学実験プロトコール  秀潤社  ２４１−２４８（１９９３）」に記載の方法、さらには、市販のキット（例えば、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ストラタジーン社製）を利用する方法も可能である。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られているが、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。本発明に含まれる変異タンパク質は、野性型と比べてそのＧＴＰａｓｅ活性や核移行能がより優れたものであってもよいし、より劣ったものであってもよい。また、ＧＴＰａｓｅ活性や核移行能が欠損したものであってもよいし、野性型と同様のＧＴＰａｓｅ活性や核移行能を有するものであってもよい。さらに、サイレント変異（アミノ酸配列は変わらず、塩基配列のみが変化する変異）であってもよい。
以下では、実施例によって本発明についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、前述した様々な態様が可能であることはいうまでもない。
〔実施例１：ＣＲＡＭに結合する新規タンパク質の同定〕
生後２０日齢ラット脳（約１００ｇ）を小片に切断し、氷点下で破砕した。以降すべての手順は４℃下で行われた。得られた細胞破砕液を８，０００×ｇで１０分間遠心分離して脂質や壊れ残りの細胞を除去した後、さらに１００，０００×ｇで６０分間遠心して上清の可溶性画分を分離した。得られた可溶性画分は、抗ＣＲＡＭ抗体アフィニティーカラムに吸着させ、抽出液で洗浄した後、１ｍＭの抗ＣＲＡＭ抗体抗原ペプチド（ＣＲＡＭの４６８〜４８５番目のアミノ酸配列）を用いて溶出した。溶出した３０ｍｌの溶出画分は、ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ３０（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いた遠心式限外濾過法により１ｍｌまで約３０倍濃縮した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびＣＢＢ（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）染色法により分析した結果、分子量４２ｋＤａ付近の位置にタンパク質のバンドが検出された（図１）ので、このタンパク質についてさらに詳細に分析した。
〔実施例２：上記タンパク質のアミノ酸配列の決定〕
ポリアクリルアミドゲルにおける４２ｋＤａタンパク質を含む部分を切り取り、組成２０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３，１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル，０．１％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００の反応液１００μｌにて、３μｇの溶解エンドペプチダーゼにより３７℃で一晩消化した。得られたペプチドは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のモデル１７３Ａ、液体クロマトグラフィシステム（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）により分離され、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のモデル４９２、自動アミノ酸シークエンサーによりアミノ酸配列を決定した。
上記ペプチドのアミノ酸配列について、ＥＭＢＬデータバンクの公開タンパク質シークエンスを用いたＢＬＡＳＴ相同検索を行うと、ペプチド断片はｒａｓ相同性のＧＴＰａｓｅ活性配列を有していた。図２の下線を付した部分は、このｒａｓ相同領域を示すものである。
〔実施例３：上記タンパク質をコードする遺伝子配列の決定〕
上記タンパク質をコードするＤＮＡを取得するため、次のようなＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、生後２０日齢マウス脳からｏｌｉｇｏ−ｄＴセルロースを用いて全ｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。これを鋳型として、上記タンパク質の決定したアミノ酸配列をもとに配列番号３および４に示されるプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
増幅されたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル上で分離された。ＤＮＡ断片は、ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いて回収され、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローン化された。クローン化されたＰＣＲ断片は、ＡＢＩ−３７７自動ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列が確認された。さらに解析を進めた結果、上記タンパク質をコードする全長遺伝子（ｃＤＮＡ）を発生過程のマウス脳からクローニングし、そのＯＲＦ領域の全塩基配列（１，１１０ｂｐ）を決定した。その塩基配列が配列番号１に示される。
上記タンパク質は、ＣＲＡＭに結合する新規タンパク質であり、ｒａｓ相同性のＧＴＰａｓｅ活性配列を有するものであったため、本発明者は、このタンパク質を「ＣＲＡＧ（ＣＲＡＭ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＧＴＰａｓｅ）」と命名した。
〔実施例４：上記タンパク質ＣＲＡＧの神経特異的発現〕
マウス各組織における上記ＣＲＡＧの発現の有無を調べるために、心臓、脳、肝臓、脾臓、腎臓、胎児、肺、胸腺、精巣、卵巣の各組織よりｍＲＮＡを抽出し、ノーザンブロッティングを行った。その結果を図３に示す。同図に示すように、上記ＣＲＡＧのｍＲＮＡは脳で特異的に強く発現しており、上記ＣＲＡＧの神経特異的な発現が示された。
〔実施例５：上記ＣＲＡＧの細胞内分布〕
ＣＯＳ−７細胞に上記ＣＲＡＧと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質（ＧＦＰ−ＣＲＡＧ）を発現させた顕微鏡写真を図４（ａ）に、ＣＯＳ−７細胞にＨＡ標識したＣＲＡＧ（ＨＡ−ＣＲＡＧ）を発現させた顕微鏡写真を図４（ｂ）にそれぞれ示す。これら実験の結果、上記ＣＲＡＧは、ＣＯＳ−７細胞の核内にびまん性に存在し、多くの場合、１ないし数個のリング状の核内封入体を形成していた。
さらに、上記ＣＲＡＧが形成する核内封入体の局在と、核内構造物として知られるＰＭＬ体（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｂｏｄｉｅｓ）の局在とを比較する実験を行った。実験では、ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＣＲＡＧおよびＨＡ−ＰＭＬを共発現させ、両者の局在を調べた。その結果を図５に示す。同図（ａ）は、ＧＦＰ−ＣＲＡＧの局在を示す顕微鏡写真、同図（ｂ）は、ＨＡ−ＰＭＬの局在を示す顕微鏡写真、同図（ｃ）は、それらを合成した顕微鏡写真である。これら実験の結果、ＣＲＡＧが形成する核内封入体はＰＭＬ体の一部と重なるものの、これとは別のユニークな核内構造物であることが示された。
〔実施例６：上記ＣＲＡＧによるＣＲＡＭ／ＣＲＭＰ２複合体の核内移行〕
ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＣＲＡＭおよびＨＡ−ＣＲＡＧを共発現させたところ、両者の共局在が観察された。さらに、ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＣＲＡＧおよびＦＬＡＧ−ＣＲＭＰ２を共発現させたところ、核内での両者の共局在が観察された。ＣＲＡＭとＣＲＭＰ２とは複合体を形成することが知られているので、上記ＣＲＡＧはＣＲＡＭ／ＣＲＭＰ２複合体に結合していると考えられる。また、ＣＲＡＧとＣＲＭＰ２とは、核内での両者の共局在が認められたので、ＣＲＡＧはＣＲＡＭ／ＣＲＭＰ２複合体を核内に移行させる働きを持つものと考えられる。実際、海馬神経細胞においてＣＲＡＭの細胞内局在を調べたところ、ＣＲＡＭは核内に局在していた。
〔実施例７：上記ＣＲＡＧ変異体の核移行能の検討〕
上記ＣＲＡＧのＧＴＰａｓｅ活性欠損変異体、および核移行シグナル変異体を作製し、それぞれの変異体を発現させた場合の核内封入体形成の有無などを調べた。
上記ＣＲＡＧのＧＴＰａｓｅ活性には、図６の下線部で示される１１３〜１１６番目のアミノ酸配列が必須と考えられたので、ＧＴＰａｓｅ活性欠損変異体はこの部分のアミノ酸配列「ＫＳＡＬ」を「ＫＮＡＬ」に改変することにより作製した。また、上記ＣＲＡＧの核移行シグナルは、図６の２重下線部で示される３３８〜３４４番目のアミノ酸配列と考えられたので、核移行シグナル変異体はこの部分の配列「ＲＫＱＳＫＲＲ」を「ＲＫＱＳＥＥＲ」に改変することにより作製した。
上記ＣＲＡＧのＧＴＰａｓｅ活性欠損変異体（ＣＲＡＧ  ＧＴＰａｓｅ  Ｍｕｔａｎｔ）をＣＯＳ−７細胞に発現させたところ、このＣＲＡＧ  ＧＴＰａｓｅ  Ｍｕｔａｎｔは核内封入体を形成した。一方、上記ＣＲＡＧの核移行シグナル変異体（ＣＲＡＧ  ＮＬＳ  Ｍｕｔａｎｔ）をＣＯＳ−７細胞に発現させた場合は、このＣＲＡＧ  ＮＬＳ  Ｍｕｔａｎｔは核内に移行せず、図７に示すように核外に分布していた。また、この場合は、ＣＲＡＭ／ＣＲＭＰ２複合体の核移行もブロックされた。
以上の結果から、ＣＲＡＧの核移行、およびＣＲＡＧによるＣＲＡＭ／ＣＲＭＰ２複合体の核移行が、ＧＴＰａｓｅ非依存性で、核移行シグナル依存性であることが示された。
〔実施例８：上記ＣＲＡＧによるＡｔａｘｉｎ−３の核移行〕
ポリグルタミン病の１つであるＭＪＤ病の原因遺伝子Ａｔａｘｉｎ−３を、Ｎ末端でＭｙｃ標識してＣＯＳ−７細胞に導入した。このＣＯＳ−７細胞において、抗Ｍｙｃ抗体でＡｔａｘｉｎ−３を免疫染色すると、図８に示すように核内への移行が認められた。
次に、ＣＯＳ−７細胞に、Ｍｙｃ標識したＡｔａｘｉｎ−３（Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３）と、ＨＡ標識したＣＲＡＧ（ＨＡ−ＣＲＡＧ）とを導入して免疫染色した。その結果を図９に示す。同図（ａ）は、ＨＡ−ＣＲＡＧの局在を示す顕微鏡写真、同図（ｂ）は、Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３の局在を示す顕微鏡写真、同図（ｃ）は、それらを合成した顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真からわかるように、ＨＡ−ＣＲＡＧはＭｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３と共局在していた。
さらに、ＣＯＳ−７細胞に、Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３と、ＨＡ標識したＣＲＡＧ核移行シグナル変異体（ＨＡ−ＣＲＡＧ−ＮＬＳｍ）とを導入して免疫染色した。その結果を図１０に示す。同図（ａ）は、Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３の局在を示す顕微鏡写真、同図（ｂ）は、ＨＡ−ＣＲＡＧ−ＮＬＳｍの局在を示す顕微鏡写真、同図（ｃ）は、それらを合成した顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真からわかるように、Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３とＨＡ−ＣＲＡＧ−ＮＬＳｍとは核外で共局在していた。
以上の結果から、ＣＲＡＧはＡｔａｘｉｎ−３と結合してＡｔａｘｉｎ−３を核内に移行させること、その核内移行には核移行シグナルが必須であることが示された。
〔実施例９：ＭＪＤ患者脳の神経細胞におけるＣＲＡＧの核内集積〕
ＭＪＤ患者脳（橋）のパラフィン切片標本にて、抗ＣＲＡＧ抗体を用いて免疫組織化学的検索を行った。抗ＣＲＡＧ抗体希釈価１００倍にて橋核神経細胞の細胞体が陽性に染色されるとともに、その一部の細胞の核内の核小体とは異なる構造物が陽性に染色された（図１１）。ポリグルタミン病患者の脳においてＣＲＡＧの集積が認められたので、その抗体などは検査・診断用に利用できる可能性がある。
〔実施例１０：ＣＲＡＧによるＡｔａｘｉｎ−３のユビキチン化修飾〕
ＣＯＳ−７細胞に、ＧＦＰ−ＣＲＡＧと、ＦＬＡＧ標識したユビキチン（Ｆ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）とを導入して免疫染色した。その結果を図１２に示す。同図（ａ）は、ＧＦＰ−ＣＲＡＧの局在を示す顕微鏡写真、同図（ｂ）は、Ｆ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎの局在を示す顕微鏡写真、同図（ｃ）は、それらを合成した顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真からわかるように、ＧＦＰ−ＣＲＡＧはＦ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎと共局在していた。この結果から、ＣＲＡＧはＡｔａｘｉｎ−３などのユビキチン化修飾に関与している可能性が示された。
同様の実験を、ＧＦＰ−ＣＲＡＧの代わりにＣＲＡＧのＧＴＰａｓｅ活性欠損変異体をＧＦＰ標識したもの（ＧＦＰ−ＣＲＡＭ−ＧＴＰｍ）で行うと、図１３に示されるように、ＧＦＰ−ＣＲＡＧ−ＧＴＰｍとＦ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎとの共局在は認められず、Ａｔａｘｉｎ−３などのユビキチン化がＧＴＰａｓｅ依存性であることが示された。
〔実施例１１：ＣＲＡＧによるＡｔａｘｉｎ−３の消去〕
ＣＯＳ−７細胞に、Ｍｙｃ標識したＡｔａｘｉｎ−３（Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３）と、ＨＡ標識したＣＲＡＧ（ＨＡ−ＣＲＡＧ）とを導入し発現させた。免疫染色法により、それぞれの細胞内局在の動態を、時間経過をとりながら観察した。また比較として、ＣＯＳ−７細胞に、Ｍｙｃ標識したＡｔａｘｉｎ−３（Ｍｙｃ−Ａｔａｘｉｎ−３）のみを導入し、同様に試験を行った。その結果を図１４に示す。同図左端に示す図は、上から順にＡｔａｘｉｎ−３の１日目の動態、同２日目の動態、および同３日目の動態を示す。また同図左から２列目に示す図は、上から順にＣＲＡＧの１日目の動態、同２日目の動態、および同３日目の動態を示す。また同図左から３列目に示す図は、それぞれ同図左端、同図左から２列目の図を合成した図である。また同図右端に示す図は、Ａｔａｘｉｎ−３のみをＣＯＳ−７細胞で発現させた際のＡｔａｘｉｎ−３の動態を示し、上から１日目の動態、２日目の動態、３日目の動態を示す。
遺伝子導入１日後においてＣＲＡＧ  ＢｏｄｙでＡｔａｘｉｎ−３と共局在が認められた。２日後においてＡｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧ  Ｂｏｄｙの部分的な共局在とＡｔａｘｉｎ−３の減少が認められた。この傾向は３日後においてさらに顕著に現れた。Ａｔａｘｉｎ−３単独に発現させた細胞内においては、Ａｔａｘｉｎ−３の減少は認められなかった。以上の結果より、Ａｔａｘｉｎ−３はＣＲＡＧ  Ｂｏｄｙ内で消去されていることが示唆された。
〔実施例１２：ウエスタンブロット解析によるＣＲＡＧのＡｔａｘｉｎ−３消去活性の検討〕
上記実施例１１と同様の実験を行い、ＣＲＡＧによるＡｔａｘｉｎ−３の消去活性をウエスタンブロット解析により検討した。図１５にＣＯＳ−７細胞内でＡｔａｘｉｎ−３を単独で発現した場合、およびＣＲＡＧとＡｔａｘｉｎ−３を発現した場合におけるＡｔａｘｉｎ−３およびＣＲＡＧの経時変化を示す。
図１５の結果より、Ａｔａｘｉｎ−３単独で発現した場合は、Ａｔａｘｉｎ−３のシグナルが変化しなかったのに対し、ＣＲＡＧとＡｔａｘｉｎ−３を発現した場合は、時間の経過とともにＡｔａｘｉｎ−３のシグナルが明らかに弱くなっていることがわかる。よって、ＣＲＡＧにより病原性Ａｔａｘｉｎ−３が消去されていることがウエスタンブロット解析により確認された。
〔実施例１３：ＣＲＡＧによるＡｔａｘｉｎ−３の細胞毒性の抑制〕
ＣＯＳ−７細胞にＡｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧおよびＣＲＡＧ変異体（ＣＲＡＧ核移行シグナル変異体およびＣＲＡＧ  ＧＴＰａｓｅ活性変異体）を発現させて、Ａｔａｘｉｎ−３の細胞毒性に対するＣＲＡＧの効果を検討した。図１６にＣＯＳ−７細胞内でＡｔａｘｉｎ−３を単独で発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３）、Ａｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧを発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３＋ＣＲＡＧ）、Ａｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧ核移行シグナル変異体を発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３＋ＣＲＡＧ  ＮＬＳｍ）、およびＡｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧ  ＧＴＰａｓｅ活性変異体を発現させた場合（Ａｔａｘｉｎ−３＋ＣＲＡＧ  ＧＴＰｍ）における細胞毒性を検討した結果を示す。
その結果、Ａｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧを発現させた場合、Ａｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧ核移行シグナル変異体を発現させた場合において、細胞毒性の明らかな低下が見られ、ＣＲＡＧおよびＣＲＡＧ核移行シグナル変異体の、Ａｔａｘｉｎ−３の細胞毒性の抑制効果が認められた。一方、Ａｔａｘｉｎ−３とＣＲＡＧ  ＧＴＰａｓｅ活性変異体を発現させた場合、Ａｔａｘｉｎ−３の細胞毒性が若干増加した。
以上の結果より、ＣＲＡＧ等を用いたポリグルタミンや各種変性疾患の診断・治療法の開発が期待される。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明に係るタンパク質は、神経細胞において物質の核内移行に関与する新規タンパク質であるので、本発明は、その核内移行メカニズムの研究ツールとして、さらに、ポリグルタミン病等に代表される各種神経疾患の発症機構や病態解明の研究材料として、また、その検査・診断法の開発、治療法の開発などに幅広く利用できるものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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