(57)【要約】特殊な機械や煩雑な操作を用いずに、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させる方法、及びその自己集合体の形成方法によって形成された自己集合体、並びにその自己集合体の形成方法を利用して、低コストで簡便に増幅された特定の遺伝子を検出する方法を提供する。オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体の形成方法において、該オリゴヌクレオチドとして遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドを含有する。上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて自己集合体を形成させ、形成された自己集合体を検出することにより、上記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドを検出する。
2003040367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体の形成方法であって、該オリゴヌクレオチドとして遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２】
前記自己集合体の形成方法が、お互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３】
前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一方が、前記ｎ（ｎ≧３）カ所の領域を含有する遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項４】
前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの構成が、１対１でハイブリダイゼーションする時に必ずｎ（ｎ≧３）カ所の相補的な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリダイゼーションするように構成されることを特徴とする請求項２又は３記載の一対のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項５】
前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対の構成が、該塩基配列領域が少なくとも１カ所異なるｍ（ｍ≧２）種の一対のプローブからなることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド・プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチド・プローブの相補的塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、前記プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＧ−Ｃ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項８】
前記自己集合体の形成方法が、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項９】
前記プローブの少なくとも一つが、遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１０】
前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１１】
前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１２】
前記ｎ≧２であり、前記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１３】
前記ｎ≧２であり、前記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項８記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１４】
前記プローブのハイブリダイゼーションが、あらかじめ前記ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させた後、前記架橋プローブと該ダイマーをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１５】
前記複数対のダイマー形成用プローブが、前記中央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマー形成用プローブからなることを特徴とする請求項８〜１４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１６】
前記一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列とすることを特徴とする請求項８〜１５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１７】
前記架橋プローブの少なくとも一つが、前記架橋プローブの２つの領域を含有する遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項８〜１６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１８】
前記遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドが、それぞれ第（２ｎ−１）の系のオリゴヌクレオチドの５’領域及び３’領域と相補的な領域を２箇所ずつ有する、少なくとも４箇所の領域からなるお互いに相補的な遺伝子断片であることを特徴とする請求項１７記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１９】
前記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項８〜１８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２０】
前記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの相補的塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、前記プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＧ−Ｃ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることを特徴とする請求項８〜１９のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２１】
前記遺伝子増幅反応に耐熱性核酸合成酵素を使用することを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２２】
前記遺伝子増幅反応に耐熱性核酸連結酵素を使用することを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２３】
前記遺伝子増幅反応に鎖置換型核酸合成酵素を使用することを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２４】
前記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドが、二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなるオリゴヌクレオチド断片であることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２５】
前記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドが、一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなるオリゴヌクレオチド断片であることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２６】
前記遺伝子増幅反応に用いられる増幅用プローブがＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２７】
前記遺伝子増幅反応に用いる増幅用プローブがＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２８】
前記遺伝子増幅反応に用いる増幅用プローブがＤＮＡとＲＮＡから構成されるキメラ型であることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２９】
前記遺伝子増幅反応に用いる一対の増幅用プローブの少なくとも一方の５’末端側及び／又は３’末端側の塩基をメチル化することを特徴とする請求項２６〜２８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３０】
前記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドが、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有するオリゴヌクレオチドを予め該相補的領域で切断し、ライゲーション反応により連結されたものであることを特徴とする請求項１〜２９のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３１】
前記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドを核酸分解酵素で分解することを特徴とする請求項１〜３０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３２】
前記核酸分解酵素にエキソヌクレアーゼを使用することを特徴とする請求項３１記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３３】
前記核酸分解酵素にＲＮａｓｅ  Ｈを用いることを特徴とする請求項３１記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３４】
前記核酸分解酵素に制限酵素を用いることを特徴とする請求項３１記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３５】
前記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項１〜３４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３６】
前記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項１〜３４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３７】
前記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝が一塩基多形であることを特徴とする請求項１〜３４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて形成されることを特徴とする自己集合体。
【請求項３９】
請求項１〜３７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて自己集合体を形成させ、形成された前記自己集合体を検出することにより、前記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドを検出することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドを用いた自己集合体の形成方法、形成された自己集合体、及びそれを利用した遺伝子の検出方法に関する。
背景技術
近年、微量のターゲット遺伝子の検出を目的に遺伝子を増幅する各種遺伝子増幅法が開発されている。中でも耐熱性核酸合成酵素を使用するＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ法（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６８３，１９５、ＵＳＰ  ４，６８３，２０２、以下、ＰＣＲ法と称する）や耐熱性核酸連結酵素を使用するＬｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ法（ＵＳＰ  ５，７９２，６０７、以下、ＬＣＲ法と称する）、及び、鎖置換型核酸合成酵素を使用する  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（日本特許第２０７６０９６号、以下、ＳＤＡ法と称する）やＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ法（ＷＯ  ００／５６８７７、以下、ＩＣＡＮ法と称する）はそれぞれ核酸を合成する酵素の特徴を利用して開発された遺伝子の増幅法である。
これらの遺伝子増幅法は、遺伝子の特定部位のみを繰り返し複製する反応であり、その特定部位からなる遺伝子断片が増幅されるものである。そのため遺伝子増幅法による増幅産物は直鎖状の遺伝子の断片であるため、簡便に検出することが困難であり、現在市販されている遺伝子診断キットにおける遺伝子の検出法においては、主にＥＩＡ（エンザイム・イムノ・アッセイ）との組み合わせによる検出、又は、あらかじめ蛍光物質を遺伝子に標識して標的遺伝子を検出している。
しかし、ＥＩＡや蛍光物質を遺伝子に標識した測定では、特殊な機械と試薬が必要であり、操作も煩雑で判定するまでに１時間以上の時間を要しており、既存の遺伝子増幅法により増幅された遺伝子を簡便かつ安価で検出可能な方法が望まれていた。
一方、本出願人は、酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法（プローブ自己集合体の作製方法）を既に提案した（ＵＳＰ  ６，２６１，８４６、日本特許第３２６７５７６号及びＥＰ１，００２，８７７Ａ）。この方法は、３個所の領域から構成される一対のプローブ（ＨｏｎｅｙＣｏｍｂ  Ｐｒｏｂｅ、以下ＨＣＰと称する）を用いる方法であり、第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に各領域の塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のプローブを反応させた場合、お互いにハイブリダイズしてプローブの自己集合体を形成させることができる（Ｐｒｏｂｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＡＬＳＡＲ法と称する）。
発明の開示
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、ＥＩＡによる測定のように特殊な機械や試薬を用いずに、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させる方法、及びその自己集合体の形成方法によって形成された自己集合体、並びにその自己集合体の形成方法を利用して、低コストで簡便に増幅された特定の遺伝子を検出する方法を提供することを目的とする。
上記問題を解決するため、本発明者らは、さまざまなオリゴヌクレオチドの自己集合体の形成方法について研究を重ねてきた。その結果、遺伝子増幅反応により増幅されたオリゴヌクレオチドを自己集合体の形成のためのオリゴヌクレオチドとして利用することを見出した。増幅されたオリゴヌクレオチドは、自己集合反応によって容易に集合体を形成できるために、特別な機器を用いることなく遺伝子を検出することが可能になった。
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法は、オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体の形成方法であって、該オリゴヌクレオチドとして遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする。
上記自己集合体の形成方法の一例として、お互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（以下、ＨＣＰと称す場合がある）の複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させることができる。
上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一方を、前記ｎ（ｎ≧３）カ所の領域を含有する遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドを用いることができる。
上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの構成は、１対１でハイブリダイゼーションする時に必ずｎ（ｎ≧３）カ所の相補的な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリダイゼーションするように構成される。
また、上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対は、該塩基配列領域が少なくとも１カ所異なるｍ（ｍ≧２）種の一対のプローブを用いることができる。
上記自己集合体の形成方法の別の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させることができる。
上記複数対のダイマー形成用プローブ及び複数対の架橋プローブの少なくとも一つを、遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドを用いることができる。
上記自己集合体の形成方法の別の例において、ｎ＝１の場合、第１の系のダイマープローブと第２の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ＝１の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
ｎ＝１の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
上記自己集合体の形成方法の別の例において、ｎ≧２の場合、第１、第３、・・、第（２ｎ−１）の系のダイマー形成用プローブと第２、第４、・・、第２ｎの系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ≧２の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
ｎ≧２の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
上記プローブのハイブリダイゼーションを、あらかじめ上記ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させた後、上記架橋プローブと該ダイマーをハイブリダイゼーションさせることが好ましい。
上記複数対のダイマー形成用プローブは、前記中央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマー形成用プローブを用いることができる。
上記一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列とすることができる。
上記架橋プローブの少なくとも一つを、上記架橋プローブの２つの領域を含有する遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドを用いることができる。
上記遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドとして、それぞれ第（２ｎ−１）の系のオリゴヌクレオチドの５’領域及び３’領域と相補的な領域を２箇所ずつ有する、少なくとも４箇所の領域からなるお互いに相補的な遺伝子断片を用いることができる。
上記ＨＣＰ、ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブのような自己集合体形成に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブ（以下、単にプローブと称す場合がある）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
上記プローブの相補的塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＧ−Ｃ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることにより、塩基の積み重ね（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｓｅ）により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、より安定したオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる。
上記遺伝子増幅反応により増幅されたオリゴヌクレオチドとして、第１に、耐熱性核酸合成酵素を用いた遺伝子増幅反応により増幅されたものが用いられる。
上記遺伝子増幅反応により増幅されたオリゴヌクレオチドとして、第２に、耐熱性核酸連結酵素を用いた遺伝子増幅反応により増幅されたものが用いられる。
上記遺伝子増幅反応により増幅されたオリゴヌクレオチドとして、第３に、鎖置換型核酸合成酵素を用いた遺伝子増幅反応により増幅されたものが用いられる。
上記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドとして、二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなるオリゴヌクレオチド断片を用いることができる。
また、上記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドとして、一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのからなるオリゴヌクレオチド断片を用いることができる。
前記遺伝子増幅反応に用いられる増幅用のプローブ（以下、増幅用プローブと称すこともある）として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡから構成されるキメラ型プローブが挙げられる。
上記遺伝子増幅反応に用いる増幅用プローブは、一対の増幅用プローブの少なくとも一方にメチル化された塩基を有する増幅用プローブを用いることが好ましい。メチル化された塩基の位置は、増幅用プローブの５’末端〜５’末端周辺や３’末端〜３’末端周辺が好ましく、さらに好ましくは各末端から５塩基以内である。本発明において、５’末端及び５’末端周辺を５’末端側、３’末端及び３’末端周辺を３’末端側と称す。一対の増幅用プローブは、一方のプローブのみがメチル化されたものを用いてもよく、両方のプローブがメチル化されたものを用いてもよい。また、５’末端側及び３’末端側を共にメチル化してもよく、いずれかの末端側のみをメチル化したものを用いてもよい。また、ＤＮＡとＲＮＡからなるキメラプローブを増幅用プローブとして用いる場合ＤＮＡ領域及び／又はＲＮＡ領域の末端側をメチル化したものを用いることも可能であり、本発明に含まれるものである。
上記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドに、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有するオリゴヌクレオチドを予め該相補的領域で切断し、ライゲーション反応により連結されたものを用いることが好ましい。
上記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドを核酸分解酵素で分解することが好適である。
上記核酸分解酵素として、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、制限酵素等を用いることが好ましい。
本発明の自己集合体は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて形成されるものである。
本発明の遺伝子の検出方法は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて自己集合体を形成させ、形成された上記自己集合体を検出することにより、前記遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドを検出することを特徴とする。
上記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることが可能である。
上記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることが可能である。
上記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝に一塩基多形を用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
本発明は、遺伝子増幅方法で合成されたオリゴヌクレオチドを用いて等温で酵素不在の条件下で自己集合反応をさせることにより二本鎖の自己集合体を形成させるものである。
使用するプローブの本数は、特に限定されないが、１０２〜１０１５本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０〜９０℃、好ましくは５５〜７０℃である。これら条件は特に限定されない。
プローブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ＷＯ  ９２／２０７０２）やＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８．５４，３６０７−３６３０．，Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８．１２０，１３２５２−１３２５３．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．２０００．９７，５６３３−５６３８．）が挙げられる。また、プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。また、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、例えば、ＤＮＡとＲＮＡとなら構成されるプローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
また、プローブの各領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１０〜４０塩基である。
上記遺伝子増幅方法は特に限定されず、例えば、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＬＣＲ法等の既存の遺伝子増幅法により増幅された２本鎖もしくは１本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを自己集合反応用のオリゴヌクレオチドとして用いることができる。
図１は、ＰＡＬＳＡＲ法による一対のＨＣＰ（Ｎｏ．１プローブ及びＮｏ．２プローブ）を用いた自己集合体の形成方法の一例を示す模式図である。同図において、Ｎｏ．１プローブは、Ｘ１領域、Ｘ２領域及びＸ３領域を有し、Ｎｏ．２プローブは、Ｘ’１領域、Ｘ’２領域及びＸ’３領域を有している［図１（ａ）］。このＮｏ．１プローブとＮｏ．２プローブは、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ１領域はＸ’１領域とだけ結合し、Ｘ２領城はＸ’２領域とだけ結合し、Ｘ３領域はＸ’３領域とだけ結合するような構成とされており、３つの結合パターンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼーションする。［図１（ｂ）］。
３つの結合パターンで互い違いにハイブリダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、図１（ｃ）に模式的な一例を示したように、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、二本鎖の自己集合体を形成させることができる。
図１は、相補的な塩基配列領域が３箇所からなるＨＣＰについて説明したが、相補的な塩基配列領域を４箇所以上有するＨＣＰを用いた場合についても同様に自己集合体を形成させることができる。
上記ＨＣＰを用いた自己集合体の形成方法において、異なる相補的領域を有する２種以上のＨＣＰを用いることもできる。図２は、相補的な領域が３箇所からなる２種の一対のＨＣＰ（Ｎｏ．３及びＮｏ．４プローブ、Ｎｏ．５及びＮｏ．６プローブ）より形成された自己集合体の検出方法の一例を示す。同図において、Ｎｏ．３プローブは、Ｘ領域、α領域及びＺ領域を有し、Ｎｏ．４プローブは、Ｘ’領域、α’領域及びＺ’領域を有している［図２（ａ）］。また、Ｎｏ．５プローブは、Ｘ領域、β領域及びＺ領域を有し、Ｎｏ．６プローブは、Ｘ’領域、β’領域及びＺ’領域を有している［図２（ｂ）］。図２に示すように、２組のＨＣＰは、相補領域が１箇所異なるＨＣＰである。各プローブは、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ領域はＸ’領域とだけ結合し、Ｚ領域はＸ’領域とだけ結合し、α領域はα’領域とだけ結合し、β領域はβ’領域とだけ結合するような構成とされている。２組のＨＣＰはそれぞれ、α領域とα’領域もしくはβ領域とβ’領域がハイブリダイズし、ダイマーを形成することができ、これらダイマー［図２（ｃ）］よりＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、二本鎖の自己集合体を形成させることができる［図２（ｄ）］。
図３は、ＰＡＬＳＡＲ法によるダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法の一例を示す模式図である。図３に示した如く、第１の系の一対のダイマー形成用プローブは、一対のオリゴヌクレオチドを３つの領域に分け、中央領域を互いに相補的な領域とするとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とし、ダイマープローブを形成する［図３（ａ）］。第２の系の一対の架橋プローブは、一対のオリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各領域を互いに非相補的な塩基配列とし、３’側領域は、ダイマー形成用プローブの３’側領域と、５’側領域はダイマー形成用プローブの５’側領域と、それぞれ相補的な塩基配列とする［図３（ｂ）］。第１の系のダイマープローブに対して、第２の系の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する［図３（ｃ）］。
図４は、ＰＡＬＳＡＲ法によるダイマー形成用プローブと架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法の別の例を示す模式図である。ダイマー形成用プローブと架橋プローブの５’側領域及び３’側領域の相補的領域の組み合わせとしては、図３の組み合わせを図４に示した如く変更することも可能である。
図３及び図４において、第１の系からなるダイマー形成用プローブと第２の系からなる架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法について説明したが、図５及び図６に示した如く、第１、３、・・（２ｎ−１）の系からなるダイマー形成用プローブと第２、４、・・２ｎの系からなる架橋プローブを用いて自己集合体を形成させることもできる。図５は、ｎ≧２の場合の自己集合体の形成方法の一例を示した図であり、図６は、ｎ≧２の場合の自己集合体の形成方法の別の例を示した図である。
上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法において、非相補的な塩基配列とは、お互いにハイブリダイズしない塩基配列であれば、いかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。
上記ダイマー形成用プローブの構成は、各系のダイマー形成用プローブが１種類のものでもよく、１つの系に中央領域の異なる数種類のダイマー形成用プローブを含んでいてもよく、特に限定されない。更にはお互いに完全に相補性のないダイマー形成用プローブ及び架橋プローブのセットを、２組以上同時におこなってもよい。
上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法において、ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させる時期は、ダイマー形成前のダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応させても良く、あらかじめダイマー形成用プローブによりダイマーを形成させた後に架橋プローブと反応させても良く、特に限定されないが、あらかじめダイマーを形成させた後、架橋プローブと反応させ、自己集合体を形成させる方がより好適である。
本発明のオリゴヌクレオチドにより自己集合体の形成方法は、上記自己集合体の形成方法において、遺伝子増幅反応により合成されたオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ、プローブとして用いるものである。
本発明の遺伝子増幅方法で合成されたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例は、上記ＰＡＬＳＡＲ法において、耐熱性核酸合成酵素又は鎖置換型核酸合成酵素等の既存の遺伝子増幅法により増幅された遺伝子をプローブとして用いるものである。以下、増幅された遺伝子を架橋プローブとして用いる場合について述べる。
図７は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図である。図７に示した如く、既存の遺伝子増幅法により増幅されたお互いに相補的な一対の遺伝子断片を用いて、自己集合体を形成させることができる。まず、図７（ａ）に示すように、お互いに相補的な遺伝子断片を、４つの領域（Ａ〜Ｄ領域及びＡ’〜Ｄ’領域）にわける。更に、一対のオリゴヌクレオチドの各５’側の２領域（Ａ領域及びＢ領域、Ｃ’領域及びＤ’領域）を選択し、選択した２領域のうち５’側に位置する領域（Ａ領域、Ｄ’領域）を架橋プローブの５’側領域に、３’側に位置する領域（Ｂ領域、Ｃ’領域）を架橋プローブの３’側領域として、それに対応する一対のダイマー形成用プローブを、図７（ｂ）に示す如く作製する。遺伝子断片にはそれぞれ、３’側領域にダイマー形成用プローブの各領域とハイブリダイズしない余分な配列（Ｃ領域及びＤ領域、Ａ’領域及びＢ’領域、以下タグと称することもある）が存在するが、一対の遺伝子断片は、一対のダイマー形成用プローブから成るダイマープローブに架橋するようにハイブリダイズし、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体が形成される［図７（ｃ）］。
図８は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図である。図８（ａ）及び（ｂ）に示した如く、一対の遺伝子断片に対し、各３’側の２領域（Ｃ領域及びＤ領域、Ａ’領域及びＢ’領域）を一対の架橋プローブの５’側領域及び３’側領域として用いることができる。この場合、遺伝子断片にはそれぞれ、５’側領域にダイマー形成用プローブの各領域とハイブリダイズしない余分な配列（Ａ領域及びＢ領域、Ｃ’領域及びＤ’領域）が存在する。この一対の遺伝子断片は、一対のダイマー形成用プローブから成るダイマープローブに架橋するようにハイブリダイズし、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体が形成される［図８（ｃ）］。
図９は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第３の実施の形態を原理的に示す模式図である。図９（ａ）及び（ｂ）に示した如く、一対の遺伝子断片に対し、隣接しない２領域（Ａ領域及びＢ領域、Ｄ’領域及びＣ’領域）を一対の架橋プローブの５’側領域及び３’側領域として用いることができる。この場合も、図９（ｃ）に示した如く、一対の遺伝子断片が、一対のダイマー形成用プローブから成るダイマープローブに架橋するようにハイブリダイズし、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体が形成される。
また、既存の遺伝子増幅法により増幅された一対の遺伝予断片を５領域以上に分け、そのうちの２領域ずつをダイマープローブと架橋する２領域として用いることも可能である。
図１０は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第４の実施の形態を原理的に示す模式図である。図１０（ａ）に示すように、お互いに相補的な遺伝子断片を、５つの領域（Ａ〜Ｅ領域及びＡ’〜Ｅ’領域）にわける。更に、一対のオリゴヌクレオチドの各５’側の２領域（Ａ領域及びＢ領域、Ｃ’領域及びＤ’領域）を選択し、選択した２領域のうち５’側に位置する領域（Ａ領域、Ｄ’領域）を架橋プローブの５’側領域に、３’側に位置する領域（Ｂ領域、Ｃ’領域）を架橋プローブの３’側領域として、それに対応する一対のダイマー形成用プローブを、図１０（ｂ）に示す如く作製する。遺伝子断片にはそれぞれ、３’側領域にダイマー形成用プローブの各領域とハイブリダイズしない余分な配列（Ｅ、Ｃ及びＤ領域、Ａ’、Ｂ’及びＥ’領域）が存在するが、一対の遺伝子断片は、一対のダイマー形成用プローブから成るダイマープローブに架橋するようにハイブリダイズし、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体が形成される［図１０（ｃ）］。
上記した如く、お互いに相補的な一対の遺伝子断片をＰＡＬＳＡＲ法の架橋プローブとして用いることが可能である。遺伝子断片の各領域のうち、どの２領域をダイマープローブとハイブリダイズする領域とするかは、特に限定されず、２領域が隣接していて良く、隣接していなくても良い。また、遺伝子断片の末端に必ずしも存在しなくても良い。
本発明に係るオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法において、既存の遺伝子増幅反応により増幅された遺伝子断片を、あらかじめ酵素等を用いてダイマー形成用プローブと非相補的な領域を切断しておき、切断された一対の遺伝子断片を架橋プローブとして用いて、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、自己集合体を形成させることが好ましい。
切断された遺伝子断片による自己集合体の形成方法を、図１１〜図１３に示す。図１１及び図１２は、それぞれ図７及び図１０の一対の遺伝子断片を切断した場合の自己集合体の形成方法を示す。図１３は、ダイマー形成用プローブと架橋プローブの相補的領域を図４に示す組み合わせとした場合での、一対の遺伝子断片を切断した場合の自己集合体の形成方法を示す。ダイマープローブに架橋しない余分な領域を切断することにより、自己集合体の形成効率を高めることができる。
遺伝子断片の切断方法は、特に限定されないが、制限酵素やＲＮａｓｅ  Ｈなどの酵素を用いることが好ましい。
本発明に係るオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法において、ダイマー形成用プローブからダイマープローブを形成させる時期は、ダイマー形成前のダイマー形成用プローブと遺伝子断片を同時に反応させても良く、あらかじめダイマー形成用プローブによりダイマープローブを形成させた後に遺伝子断片と反応させても良く、特に限定されないが、あらかじめダイマープローブを形成させた後、自己集合体を形成させる方がより好適である。
本発明に係るオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法は、上記ダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブと同様なダイマープローブと、架橋プローブを架橋するようにハイブリダイゼーションさせ、自己集合体を形成させる自己集合体の形成方法を含むものである。
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法に用いる一対の遺伝子断片は、２本共に遺伝子増幅反応により増幅された遺伝子断片である必要はなく、例えば、図１４に示す如く、架橋プローブとして用いる一対の遺伝子断片のうち、一方を既存の遺伝子増幅法により増幅された遺伝子断片［図１４（ａ）］を用い、もう一方をあらかじめ作製しておいた遺伝子断片［図１４（ｃ）］を用いることも可能である。これら一対の遺伝子断片とそれに対応する一対のダイマー形成用プローブ［図１４（ｂ）］をハイブリダイゼーションさせることにより、自己集合体が形成する［図１４（ｄ）］。用いる遺伝子断片は、上記した如く、それぞれダイマープローブと架橋するようにハイブリダイズする２領域を含むものであれば特に限定されない。図１４（ａ）において、好適な例として、ダイマープローブとそれぞれ架橋するＡ領域とＢ領域、さらにいずれともハイブリダイズしないＹ領域からなる一本鎖の遺伝子断片を示したが、Ｙ領域は、いかなる配列でも良く、特に限定されないものである。上記したように、余分なタグを含む遺伝子断片の場合は、そのまま用いてもよいが、その領域を切断後、自己集合体を形成させることがより好ましい。
既存の遺伝子増幅法では、大過剰のプライマー等の増幅用プローブを用いて遺伝子増幅を行うため、増幅後の溶液には増幅された遺伝子断片と共に、過剰の増幅用プローブが存在する。この過剰の増幅用プローブ存在下では、自己集合体形成の効率が低下するなど、問題が生じやすい。この増幅用プローブを除去し、自己集合体形成の効率を高める方法として、エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩやＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩ等）もしくはＲＮＡからなる増幅用プローブ及びＲＮａｓｅ  Ｈを用いることが好ましい。増幅用ＲＮＡプローブ及びＲＮａｓｅ  Ｈを用いた場合、自己集合体形成反応のプローブとして用いられるターゲット遺伝子として、耐熱性ＤＮＡ合成酵素で増幅された遺伝子断片や、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素で増幅された遺伝子断片を好適に用いることができる。耐熱性ＤＮＡ合成酵素としては、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）などが好適に用いられる。図１５及び図１６に、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、増幅用ＲＮＡプローブ及びＲＮａｓｅ  Ｈを用いた自己集合体の形成方法の模式図を示す。
図１５（ａ）に示した如く、一対の増幅用ＲＮＡプローブを用いてＤＮＡを増幅すると、ＤＮＡ（Ａ’、Ｂ’領域、Ｃ、Ｄ領域）とＲＮＡ（Ｘ領域、Ｙ領域）よりなる一対の遺伝子断片が増幅される［図１５（ａ）及び図１６（ｂ）］。この増幅後の溶液にＲＮａｓｅ  Ｈを加えて反応させることにより、遺伝子断片のＲＮＡ領域部分と増幅用ＲＮＡプローブが加水分解される。図１６（ｃ）に示した如く、ＲＮａｓｅ  Ｈ処理後の一対の遺伝子断片を２領域に分けることにより、お互いに非相補的な２領域からなる一対の架橋プローブが形成される。ＲＮａｓｅ  Ｈ処理後の一対の遺伝子断片に相補的領域が残らないように増幅用ＲＮＡプローブを構成することが好ましいが、特に限定されるものではなく、お互いに相補的な領域を含む場合も本発明に含まれる。上記一対の架橋プローブが、あらかじめ作製しておいた、架橋プローブに対応するダイマープローブ［図１６（ｄ）］に架橋するようにハイブリダイズし、自己集合体を形成する［図１６（ｅ）］。上記方法により、増幅用プローブを除去し、且つ、ダイマープローブに架橋しない余分な配列を削除し、自己集合体形成の効率を高めることができる。
本発明の遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の例は、上記ＰＡＬＳＡＲ法において、耐熱性核酸連結酵素により連結された、末端側の塩基がメチル化されているオリゴヌクレオチド（以下、メチル化プローブと称すことがある）をプローブとして用いるものである。ターゲット遺伝子と相補的な領域を有するメチル化プローブを用いて、ターゲット遺伝子と相補的な領域をあらかじめ切断しておき、ターゲット遺伝子の存在下で耐熱性リガーゼ酵素により切断された遺伝子を連結反応させる。連結反応後はエキソヌクレアーゼを用いて自己集合反応の競合物質となる未反応のメチル化プローブを分解することを特徴とする。遺伝子増幅反応に用いるオリゴヌクレオチドのメチル化した塩基を図１７に示す。以下、増幅された遺伝子をダイマー形成用プローブとして用いる場合について一例を述べる。
図１８〜図２１は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の例の実施の形態を原理的に示す模式図である。図１８に示した如く、第１の系のダイマー形成用プローブと、第２の系の架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法において、図１８（ａ）（ｂ）に示すように、ターゲット遺伝子［図１８（ａ）］から、ターゲット遺伝子と相補的な領域（α’及びβ’領域、α及びβ領域）を中央領域に有するダイマー形成用プローブを作製し、５’末端側と３’末端側の塩基をメチル化し、さらにターゲット遺伝子と相補的な中央領域をあらかじめ切断しておく［図１８（ｂ）］。図１９（ｃ）に示した如く、切断されたダイマー形成用プローブは、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後、図１９（ｄ）に示すように、耐熱性リガーゼ酵素により、ダイマー形成用プローブが連結される。この一連の反応をサーマルサイクラーにより繰り返し、連結されたダイマー形成用プローブを増やす。その後、核酸分解酵素、例えばＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩ等のエキソヌクレアーゼ、を加えると、ターゲット遺伝子が存在し、ダイマー形成用プローブが連結されている場合、図２０（ｅ）に示したように、連結されたダイマー形成用プローブの両端の塩基はメチル化されているために分解されないが、ターゲット遺伝子が存在せず、ダイマー形成用プローブが切断されたまま存在する場合、連結されていないダイマー形成用プローブ［図２０（ｆ）］は切断されている部分がメチル化されていないために完全に分解されてしまい、自己集合体も形成されない［図２１（ｈ）］。連結されたダイマー形成用プローブは、別に用意した架橋プローブを加えることにより自己集合体を形成することができる［図２１（ｇ）］。従って、自己集合体の形成を確認することにより、自己集合体の存在を確認することができる。
本発明の遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例は、上記ＰＡＬＳＡＲ法において、末端側の塩基がメチル化された増幅用プローブ及び耐熱性核酸合成酵素を用いて増幅されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるものである。少なくとも一方の増幅用プローブの３’末端側の塩基をメチル化し、５’末端側の塩基をリン酸化して、耐熱性ＤＮＡ合成酵素による遺伝子増幅用のプローブとして使用する。遺伝子増幅後はエキソヌクレアーゼを用いて自己集合反応の競合物質となる過剰に存在する増幅用プローブを分解することを特徴とする。以下に、増幅された遺伝子（以下、合成プローブと称すこともある）を架橋プローブもしくはＨＣＰとして用いる場合について説明する。
図２２〜図２７は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図である。図２２（ａ）に示したターゲット遺伝子の実線部分と相補的で３’末端側の塩基がメチル化されたプローブ［図２２（ｂ）］を用意する。次にターゲット遺伝子にメチル化した増幅用プローブをアニーリング［図２３（ｃ）］させ、耐熱性ＤＮＡ合成酵素によりＤＮＡを合成させる［図２３（ｄ）］。この一連の反応をサーマルサイクラーにより繰り返し［図２４（ｅ），（ｆ）］、増幅された合成プローブを増やし［図２５（ｇ）］、核酸分解酵素、例えばＴ７  Ｇｅｎｅ  ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ等のエキソヌクレアーゼ、を加えることにより、図２５（ｈ）に示したように増幅された合成プローブは５’側からメチル化されている塩基の前まで分解される。分解された合成プローブ［図２６（ｉ）］は、一対の架橋プローブ［図２６（ｊ）］もしくは２種の一対のＨＣＰの一方［図２６（ｋ）］として用いることが可能であり、別に用意したダイマー形成用プローブ、又はもう一方のＨＣＰを加えることにより自己集合体を形成することができる。
また、図２７（ｌ），（ｍ）に示したように、分解された合成プローブはさらに未反応プローブとハイブリダイゼーションさせた後、酵素処理をすることにより、より完全に５’側からメチル化されている塩基の前まで分解することができる［図２７（ｎ）］。
図２８〜図３３は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図である。図２８はメチル化された増幅用プローブを用いた耐熱性ＤＮＡ合成酵素による遺伝子増幅と自己集合体の形成である。図２８（ａ）に示したターゲット遺伝子の実線部分と相補的であり、かつ一方の３’末端側の塩基のみがメチル化された増幅用プローブ［図２８（ｂ）］を用意する。次にターゲット遺伝子に増幅用プローブをアニーリング［図２９（ｃ）］させ、耐熱性ＤＮＡ合成酵素によりＤＮＡを合成させる［図２９（ｄ）］。この一連の反応をサーマルサイクラーにより繰り返し［図３０（ｅ），（ｆ）］、増幅された合成プローブを増やし［図３１（ｇ）］、核酸分解酵素、例えばＴ７  Ｇｅｎｅ  ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ等のエキソヌクレアーゼ、を加えることにより、図３１（ｈ）に示したように増幅されたプローブは５’側からメチル化されている塩基の前まで分解される。分解された合成プローブ［図３２（ｉ）］は、一対の架橋プローブの一方［図３２（ｊ）］もしくは一対のＨＣＰの一方［図３２（ｋ）］として用いることが可能であり、別に用意したもう一方の架橋プローブ及び一対のダイマー形成用プローブ、又はもう一方のＨＣＰを加えることにより自己集合体を形成することができる。
また、図３３（ｌ）に示したように、分解された合成プローブはさらに未反応プローブとハイブリダイゼーションさせた後、酵素処理をすることにより、未反応プローブをより完全に分解することができる［図３３（ｍ）］。
本発明の遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例は、上記ＰＡＬＳＡＲ法において、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるキメラ型プローブであり、かつ、ＲＮＡと隣接するＤＮＡの３’末端側の塩基がメチル化されたプローブを増幅用プローブとして用いて、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素により増幅された遺伝子（合成プローブ）をプローブとして用いるものである。少なくとも一方の増幅用プローブの３’側の塩基をＲＮＡ、５’側の塩基をＤＮＡとし、かつ３’末端側の塩基をメチル化して鎖置換型ＤＮＡ合成酵素による遺伝子増幅用のプローブとして使用し、遺伝子増幅後はエキソヌクレアーゼを用いて自己集合反応の競合物質となる過剰に存在する増幅用プローブを分解することを特徴とする。以下に、増幅された遺伝子を架橋プローブもしくはＨＣＰとして用いる場合について説明する。
図３４〜図３９は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例の実施の形態の一例を原理的に示す模式図である。ターゲット遺伝子［図３４（ａ）］の実線部分と相補的であり、ＤＮＡとＲＮＡから構成され、ＲＮＡと隣接するＤＮＡの３’末端側の塩基のみがメチル化された増幅用プローブ［図３４（ｂ）］を用意する。次にターゲット遺伝子に上記増幅用プローブをアニーリング［図３５（ｃ）］させ、ＲＮａｓｅ  ＨによりＲＮＡ部分を切断し［図３５（ｄ）］、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によりＤＮＡを合成させる［図３６（ｅ）］。この一連の反応を等温で繰り返し、増幅された合成プローブを増やし［図３６（ｆ），図３７（ｈ）］、核酸分解酵素、例えばＴ７  Ｇｅｎｅ  ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ等のエキソヌクレアーゼ、を加えることにより、図３７（ｉ）に示したように増幅された合成プローブは５’側からメチル化されている塩基の前まで分解される。分解された合成プローブ［図３８（ｊ）］は、一対の架橋プローブ［図３８（ｋ）］もしくは２種の一対のＨＣＰの一方［図３８（ｌ）］として用いることが可能であり、別に用意した一対のダイマー形成用プローブ、又はもう一方のＨＣＰを加えることにより自己集合体を形成することができる。
また、図３９（ｍ），（ｎ）に示したように、分解された合成プローブはさらに未反応プローブとハイブリダイゼーションした後、酵素処理をすることにより、未反応プローブをより完全に分解することができる［図３９（ｏ）］。
本発明の遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例は、上記ＰＡＬＳＡＲ法において、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるキメラ型プローブを増幅用プローブとして用いて、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素により増幅された遺伝子をプローブとして用いるものである。少なくとも一方の増幅用プローブの３’側の塩基をＲＮＡ、５’側の塩基をＤＮＡとして鎖置換型ＤＮＡ合成酵素による遺伝子増幅用のプローブとして使用する。遺伝子増幅後はエキソヌクレアーゼを用いて自己集合反応の競合物質となる過剰に存在する増幅用プローブを分解することを特徴とする。以下に、増幅された遺伝子（合成プローブ）を架橋プローブもしくはＨＣＰとして用いる場合について説明する。
図４０〜図４５は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例の実施の形態の一例を原理的に示す模式図である。図４０（ａ）に示したターゲット遺伝子の実線部分と相補的であり、ＤＮＡとＲＮＡから構成された増幅用プローブ［図４０（ｂ）］を用意する。次にターゲット遺伝子に上記増幅用プローブをアニーリング［図４１（ｃ）］させ、ＲＮａｓｅ  ＨによりＲＮＡ部分を切断し［図４１（ｄ）］、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によりＤＮＡを合成させる［図４２（ｅ）］。この一連の反応を等温で繰り返し、増幅された合成プローブを増やし［図４２（ｆ），図４３（ｈ）］、核酸分解酵素、例えばＴ７  Ｇｅｎｅ  ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ等のエキソヌクレアーゼ、を加えることにより、図４３（ｉ）に示したように増幅された合成プローブは５’側からＲＮＡの部分まで分解される。分解された合成プローブ［図４４（ｊ）］は、一対の架橋プローブ［図４４（ｋ）］もしくは２種の一対のＨＣＰの一方［図４４（ｌ）］として用いることが可能であり、別に用意した一対のダイマー形成用プローブ、又はもう一方のＨＣＰを加えることにより自己集合体を形成することができる。
また、図４５（ｍ），（ｎ）に示したように、分解された合成プローブはさらに未反応プローブとハイブリダイゼーションした後、酵素処理することにより、未反応プローブをより完全に分解することができる［図４５（ｏ）］。
上記方法により形成された自己集合体は、一般的なアガロースゲル電気泳動法等によって、簡単に確認することができる。
また、本発明において形成される自己集合体の塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることから、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認することも可能である。
さらには、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認することも可能である。例えば、自己集合体は、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発する色素を添加し、セフェイド社のＩ−ＣＯＲＥＴＭ（Ｓｍａｒｔ  ＣｙｃｌｅｒＴＭ）等を用いて蛍光の発光状態を観察することにより検出可能である。
上記した如く、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法は、ターゲット遺伝子が存在する場合にのみ自己集合体が形成されるため、形成された自己集合体を検出することにより、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。
実施例
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないことは勿論である。
（実施例１〜１６）
以下に実施例１〜１６において用いたオリゴヌクレオチド・プローブを示す。
［１］架橋プローブ−１（下線部；余分な配列（タグ）］
2003040367.tif 000003
［２］架橋プローブ−２（下線部；余分な配列（タグ）］
2003040367.tif 000004
2003040367.tif 000005
［３］架橋プローブ−３
2003040367.tif 000006
［４］架橋プローブ−４
2003040367.tif 000007
［５］ダイマー形成用プローブ−１
2003040367.tif 000008
［６］ダイマー形成用プローブ−２
2003040367.tif 000009
（実施例１〜１４）
（１）目的
既存の遺伝子増幅法にて増幅されると予想されるダイマープローブとハイブリダイズしない余分な配列（タグ）をもつ遺伝子断片を架橋プローブとして用いた場合において、ダイマープローブとの自己集合体形成が可能であるか調べた。
（２）材料
（ａ）架橋プローブとして、既存の遺伝子増幅法にて増幅されると仮定した、互いに相補的な配列をもつ８０塩基の合成オリゴヌクレオチド２本（架橋プローブ−１及び架橋プローブ−２）、及びこれらに対応するダイマー形成用プローブ（ダイマー形成用プローブ−１及びダイマー形成用プローブ−２）を作成した。各プローブはそれぞれ１００ｐｍｏｌ／μＬに調製した。
（ｂ）実施例１〜７は、緩衝液として２Ｍ−ＣａＣｌ２溶液を用いた。実施例８〜１４は、緩衝液として２０×ＳＳＣ溶液（３Ｍ−ＮａＣｌ、０．３Ｍ−Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、実施例８〜１４において２０×ＳＳＣ溶液は、３Ｍ−ＮａＣｌとして扱った）を用いた。
（３）方法
（ａ）反応液の調製
架橋プローブ−１、架橋プローブ−２、ダイマー形成用プローブ−１及びダイマー形成用プローブをそれぞれ０．５μＬ加えて、緩衝液（２Ｍ−ＣａＣｌ２溶液又は３Ｍ−ＮａＣｌ溶液）及び滅菌再蒸留水を加えて計２０μＬの反応液を調製した。緩衝液及び滅菌再蒸留水は、反応液中の緩衝液の濃度がそれぞれ１．２Ｍ（実施例１、８）、１．０Ｍ（実施例２、９）、０．８Ｍ（実施例３、１０）、０．６Ｍ（実施例４、１１）、０．４Ｍ（実施例５、１２）、０．２Ｍ（実施例６、１３）、０．０５Ｍ（実施例７、１４）となるように添加した。
（ｂ）自己集合体形成反応
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いて、上記の各反応液をまず９４℃／３０秒で反応させ、その後７０℃／１時間にて反応させることにより自己集合体形成反応を行った。
（ｃ）アガロースゲル電気泳動法による自己集合体の確認
自己集合体形成反応後の反応液８μｌに２μｌのｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ３：１  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）にて１００Ｖ、３０分間電気泳動を行った。分子サイズマーカーとしてＤＮＡ  Ｍｏｌｗｘｕｌｅ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＸＶ（ベーリンガー・マンハイム（株）製）を用いた。
（実施例１５及び１６）
（１）目的
既存の遺伝子増幅法にて増幅し、酵素等にてダイマープローブとハイブリダイズしない余分な配列（タグ）を削除した遺伝子断片を架橋プローブとして用いた場合において、ＰＡＬＳＡＲ法に従い、自己集合体が形成されるか調べた。
（２）材料
（ａ）架橋プローブとして、実施例１〜１４において用いた合成オリゴヌクレオチドからタグを除去した、互いに非相補的な一対のオリゴヌクレオチド（架橋プローブ−３及び架橋プローブ−４）を合成し、架橋プローブとして用いた。ダイマー形成用プローブとして、実施例１〜１４において用いたダイマー形成用プローブ−１及びダイマー形成用プローブ−２を用いた。各プローブはそれぞれ１００ｐｍｏｌ／μＬに調製した。
（ｂ）緩衝液は、実施例１５では２Ｍ−ＣａＣｌ２溶液を、実施例１６では３Ｍ−ＮａＣｌ溶液をそれぞれ用いた。
（３）方法
（ａ）反応液の調製
架橋プローブ−３、架橋プローブ−４、ダイマー形成用プローブ−１及びダイマー形成用プローブをそれぞれ０．５μＬ加えて、緩衝液及び滅菌再蒸留水を加えて計２０μＬの反応液を調製した。緩衝液及び滅菌再蒸留水は、反応液中の緩衝液の濃度が１．２Ｍとなるように添加した。
（ｂ）自己集合体形成反応
実施例１〜１４と同様の手順及び条件にて、自己集合体の形成反応を行った。
（ｃ）アガロースゲル電気泳動法による自己集合体の確認
実施例１〜１４と同様の手順及び条件にて、自己集合体の確認を行った。
（４）結果
実施例１〜１６の結果を図４６に示す。余分な配列（タグ）をもつ架橋プローブの場合、実施例１〜７のＣａｃｌ２溶液中での反応（レーン１〜７）と、実施例８〜１４の２０×ＳＳＣ溶液中での反応（レーン９〜１５）を比較してみると、ＣａＣｌ２溶液中でのみ自己集合体形成がみられた。特に自己集合体形成が顕著であるＣａＣｌ２溶液濃度は、０．８Ｍ（レーン３）近辺であることがわかった。余分な配列（タグ）を削除した実施例１５（レーン８）及び実施例１６（レーン１６）では、緩衝液によらず、共に自己集合体形成が観察された。これらの結果より、余分な配列（タグ）を削除した架橋プローブの方が自己集合体形成の効率は良いが、お互いに相補的な配列であり、余分な配列（タグ）をもつ架橋プローブにおいてもダイマープローブとの自己集合体形成が可能であることを確認できた。これより、既存の遺伝子増幅法と自己集合体形成反応を組み合わせた系に応用が可能であることが示される。
（実施例１７及び比較例１）
以下に実施例１７及び比較例１において用いたオリゴヌクレオチド・
2003040367.tif 000010
［７］ターゲット遺伝子−Ａ（下線部：相補的な領域）
2003040367.tif 000011
［８］ターゲット遺伝子−Ｂ（下線部：相補的な領域）
2003040367.tif 000012
［９］メチル化プローブ−１（下線部：中央領域）
2003040367.tif 000013
［１０］メチル化プローブ−２（下線部：中央領域）
2003040367.tif 000014
［１１］メチル化プローブ−３（下線部：中央領域）
2003040367.tif 000015
［１２］メチル化プローブ−４（下線部：中央領域）
2003040367.tif 000016
［１３］架橋プローブ−５
2003040367.tif 000017
［１４］架橋プローブ−６
2003040367.tif 000018
（１）目的
ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーションに依存して連結されるダイマー形成用プローブと、その連結されたダイマー形成用プローブと架橋プローブを用いた自己集合体の形成によるターゲット遺伝子の確認を行った。
（２）材料
（ａ）ターゲット遺伝子として、ＭＲＳＡのＰＢＰｇｅｎｅ由来の合成オリゴヌクレオチドであるターゲット遺伝子−Ａ及びターゲット遺伝子−Ｂを用いた。ターゲット遺伝子はそれぞれ１ｐｍｏｌ／μＬに調製した。
（ｂ）中央領域にターゲット遺伝子−Ａ及びＢと相補的な領域を有する一対のダイマー形成用プローブ及び対応する一対の架橋プローブ（架橋プローブ−５，６）を作製し、上記一対のダイマー形成用プローブの５’末端及び３’末端をそれぞれメチル化し、中央領域をそれぞれ切断し、切断部位の５’末端をリン酸化したプローブ（メチル化プローブ−１〜４）を作製した。プローブはそれぞれ５０ｐｍｏｌ／μＬに調製した。
（ｃ）緩衝液として２０×ＳＳＣ（３Ｍ−ＮａＣｌ，０．３Ｍ−Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．０）を用いた。
（３）方法
（ａ）反応液の調製
０．２ｍＬチューブに、ターゲット遺伝子Ａ及びＢを各１μＬ、メチル化プローブ−１〜４を各１μＬ、耐熱性リガーゼ酵素（Ｔｓｃ−Ｌｉｇａｓｅ、日本ロシュ社製）を１μＬ、リガーゼに添付された１０×ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ加え、滅菌蒸留水で２０μＬの反応液とした（実施例３７）。また、対照として、上記反応液に対し、ターゲット遺伝子を添加していない反応液も作製した（比較例１）。
（ｂ）メチル化プローブの耐熱性リガーゼ酵素による遺伝子増幅方法
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いて、上記の各反応液を９５℃で３分間反応させた後、９４℃１５秒間→６３℃４分間を４０サイクル行い、ライゲーション反応によるダイマー形成用プローブの増幅を行った。次に、９９℃１０分間反応させてリガーゼを失活させた後、氷冷を行い形成させたダイマー形成用プローブを１本鎖にした。
（ｃ）エキソヌクレアーゼによる処理
上記反応後の反応液にエキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩ、ｕｓｂ社製）を１μＬ添加し、３７℃で６０分間反応させた。対照として、エキソヌクレアーゼの代わりに滅菌蒸留水を添加した場合についても同様に行った。反応後の反応液を６％変性ポリアクリルアミド（７Ｍ  Ｕｒｅａ）を用いて変性ＰＡＧＥ電気泳動法を行った。
（ｄ）自己集合体の形成方法。
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いて、上記反応後の各反応液に２０×ＳＳＣ（最終濃度：１０×ＳＳＣ）を加え、９４℃／３０秒で反応させた後、７０℃／１時間にて反応させることにより自己集合体の形成反応を行った。
（ｅ）アガロースゲル電気泳動法による自己集合体の確認
自己集合体形成反応後の反応液８μＬに２μＬのｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ３：１  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）にて１００Ｖ、３０分間電気泳動を行った。分子サイズマーカーとして、ＤＮＡマーカー（λ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ）を用いた。
（４）結果
実施例１７及び比較例１の変性ＰＡＧＥ電気泳動法の結果を図４７に示す。図４７のレーン１（実施例１７、酵素未処理）に示した如く、ターゲット遺伝子が存在する場合、切断されたダイマー形成用プローブが連結され、矢印（ａ）の位置のバンドが検出された。図４７のレーン３（実施例１７、酵素処理）に示したように、連結されたダイマー形成用プローブはエキソヌクレアーゼ処理でも分解されないため、レーン１と同じ（ａ）の位置にバンドが検出された。一方、図４７のレーン２（比較例１、酵素未処理）とレーン４（比較例１、酵素処理）に示したように、ターゲット遺伝子が存在しない場合には、切断されたダイマー形成用プローブは連結されず、（ａ）の位置にバンドは検出されなかった。また、レーン１及び２において、矢印（ｂ）の位置に検出された連結されなかったメチル化プローブは、エキソヌクレアーゼ処理により分解されるため、レーン３及び４においてそのバンドは検出されなかった。
実施例１７及び比較例１のアガロースゲル電気泳動法の結果を図４８に示す。連結されたダイマープローブは架橋プローブを反応させることにより自己集合体を形成した（図４８、レーン１、実施例１７）。また、連結されなかった未反応プローブのダイマープローブでは架橋プローブと反応させても自己集合体は形成されなかった（図４８、レーン２、比較例１）。
（実施例１８及び比較例２）
以下に、実施例１８及び比較例２において用いたオリゴヌクレオチ
2003040367.tif 000019
［１５］増幅用プローブ−１（メチル化プローブ）
2003040367.tif 000020
［１６］増幅用プローブ−２（メチル化プローブ）
2003040367.tif 000021
［１７］増幅用プローブ−３（非メチル化プローブ）
2003040367.tif 000022
［１８］増幅用プローブ−４（非メチル化プローブ）
2003040367.tif 000023
［１９］ダイマー形成用プローブ−３
2003040367.tif 000024
［２０］ダイマー形成用プローブ−４
2003040367.tif 000025
（１）目的
メチル化された増幅用プローブを用いた耐熱性ＤＮＡ合成酵素による遺伝子増幅と自己集合体の形成による増幅された遺伝子の確認を行った。
（２）材料
（ａ）テンペレートＤＮＡとして用いたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＳ６１１０領域の塩基配列の一部をターゲット遺伝子として用いた。
（ｂ）ターゲット遺伝子を増幅させる増幅用プローブとして、それぞれ３’末端をメチル化した一対の増幅用プローブ−１及び２（実施例１８）、並びにメチル化されていない一対の増幅用プローブ−３及び４（比較例２）を作製した。ダイマー形成用プローブとして、増幅される合成プローブを架橋プローブとして用いるように構成された一対のダイマー形成用プローブ−３及び４を作製した。プローブはそれぞれ５０ｐｍｏｌ／μＬに調製した。
（ｃ）緩衝液として２０×ＳＳＣ（３Ｍ−ＮａＣｌ，０．３Ｍ−Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．０）を用いた。
（３）方法
（ａ）反応液の調製
０．２ｍＬチューブに、テンペレートＤＮＡを１μＬ、増幅用プローブ−１及び２をそれぞれ０．５μＬ、１０×ＰＣＲバッファー（１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ：宝酒造社製）を５μＬ、ｄＮＴＰミックス（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：宝酒造社製）を４μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μ）：宝酒造社製）を０．１μＬ加え、滅菌蒸留水で５０μＬのＰＣＲ反応液とした（実施例１８）。対照として、上記反応溶液において、増幅用プローブ−１及び２の代わりに増幅用プローブ−３及び４を添加したＰＣＲ反応液も作製した（比較例２）。
（ｂ）ＰＣＲ反応
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いて、上記各ＰＣＲ反応液を９４℃にて１分間処理した後、９４℃３０秒間→６０℃２分間を３５サイクル行った。
（ｃ−１）エキソヌクレアーゼによる処理（１）
別の０．２ｍＬチューブに上記ＰＣＲ反応後の反応液を１０μＬ移し、エキソヌクレアーゼ（Ｔ７  Ｇｅｎｅ  ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を０．１μＬ、５×Ｔ７  Ｇｅｎｅ  ６  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を２μＬ加え、滅菌蒸留水を加えて計１３μＬの反応液とした。この反応液を３７℃で３０分間反応させた後、８５℃で１５分加熱を行い、エキソヌクレアーゼを失活させた。対照として、エキソヌクレアーゼの代わりに滅菌蒸留水を添加した場合についても同様に行った。エキソヌクレアーゼによる処理後、反応液１０μＬを、１６％ポリアクリルアミドゲル（２９：１、バイオラッド社製）を用いて電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
（ｃ−２）エキソヌクレアーゼによる処理（２）
上記ＰＣＲ反応後の実施例１８の反応液に対し、上記エキソヌクレアーゼ処理（１）の反応条件を３７℃／３０分間→８５℃／１５分間の反応から３７℃／３０分間→５７℃／３０分間→３７℃／３０分間→８５℃／１５分間の反応に変更した以外は同様の条件及び手順にてエキソヌクレアーゼ処理を行った。
（ｄ）自己集合体の形成反応
上記エキソヌクレアーゼ処理（１）及び（２）後の実施例１８の各反応液に、ダイマー形成用プローブ−３及び４を各１μＬ添加し、２０×ＳＳＣを最終濃度が１０×ＳＳＣとなるように加え、９４℃にて３０秒間処理した後、６０℃１時間の自己集合体形成反応を行った。
（ｅ）アガロースゲル電気泳動法による自己集合体の確認
実施例１７と同様の手順及び条件にて、自己集合体の確認を行った。
（４）結果
実施例１８及び比較例２のＰＡＧＥ電気泳動法の結果を図４９に示す。図４９において、レーン１は１０ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ、レーン２は対照に用いた４０ｍｅｒの一本鎖オリゴヌクレオチド、レーン３は対照に用いた６０ｍｅｒの一本鎖オリゴヌクレオチド、レーン４は比較例２（酵素未処理）、レーン５は実施例１８（酵素未処理）、レーン６は比較例２（酵素処理）、レーン７は実施例１８（酵素処理）をそれぞれ示した。
図４９のレーン５及びレーン７に示した如く、メチル化された増幅用プローブを用いた実施例１８では、ＰＣＲ反応により目的の増幅産物である合成プローブのバンドが４０ｂｐの位置に検出され、更にエキソヌクレアーゼ処理を行うことにより４０ｂｐのバンドが分解され新たに２０ｂｐの位置にバンドが検出された。この２０ｂｐのバンドはエキソヌクレアーゼ処理により２０ｍｅｒに分解された合成プローブと２０ｍｅｒの未反応の増幅用プローブとのハイブリッドである。これによって、メチル化された増幅用プローブを用いた増幅産物をエキソヌクレアーゼ処理することによって相補鎖が分解され、目的の２０ｍｅｒの一対の架橋プローブが得られることがわかる。
一方、図４９のレーン４及びレーン６に示した如く、対照である非メチル化プローブを増幅用プローブとして用いた比較例２では、ＰＣＲ反応により目的の増幅産物のバンドが４０ｂｐの位置に検出されたが、エキソヌクレアーゼ処理を行うと４０ｂｐのバンドが分解されるのみで、新たに別の大きさのバンドは検出されなかった。
実施例１８のアガロースゲル電気泳動の結果を図５０に示す。レーン１［エキソヌクレアーゼ処理（２）］において、合成プローブの相補鎖となる未反応の増幅用プローブが除去された為、合成プローブとダイマー形成用プローブによる自己集合体の形成が確認された。
一方、合成プローブと未反応の増幅用プローブがハイブリッドを形成した状態でダイマー形成用プローブを添加したレーン２［エキソヌクレアーゼ処理（１）］においては、自己集合体の形成は確認されなかった。
（実施例１９及び比較例３〜５）
以下に実施例１９において用いたＤＮＡ及びＲＮＡからなるオリゴヌ
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［２１］増幅用キメラプローブ−１（３’側３塩基をＲＮＡとする）
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［２２］増幅用キメラプローブ−２（３’側３塩基をＲＮＡとする）
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（１）目的
キメラ化された増幅用プローブ（ＤＮＡ及びＲＮＡからなるプローブ）を用いた鎖置換型核酸合成酵素による遺伝子増幅と自己集合体の形成による増幅された遺伝子の確認を行った。
（２）材料
（ａ）テンペレートＤＮＡとして用いたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＳ６１１０領域の塩基配列の一部をターゲット遺伝子として用いた。
（ｂ）ターゲット遺伝子を増幅させる増幅用プローブとして、それぞれ３’側の３塩基をＲＮＡにした一対の増幅用キメラプローブ−１及び２（実施例１９）を作製した。ダイマー形成用プローブとして、実施例１８と同様、ダイマー形成用プローブ−３及び４を用いた。プローブはそれぞれ５０ｐｍｏｌ／μＬに調製した。
（ｃ）緩衝液として２０×ＳＳＣ（３Ｍ−ＮａＣｌ、０．３Ｍ−Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）を用いた。
（３）方法
（ａ）反応液の調製
０．２ｍＬチューブに、テンペレートＤＮＡを１μＬ、増幅用キメラプローブ−１及び２をそれぞれ０．２５μＬ、トリス系バッファー（０．１Ｍトリス塩酸バッファー、ｐＨ７．５）を７．５μＬ、ｄＮＴＰミックス（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：宝酒造社製）を１μＬ、Ｂｃａｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２２Ｕ／μＬ：宝酒造社製）を０．１５μＬ、ＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍＬ：宝酒造社製）を０．２μＬ、１０％グリセロールを６．５μＬ、ＤＭＳＯを１μＬ、ＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）を５μＬ、ＲＮａｓｅＨ（６０Ｕ／μＬ：宝酒造社製）を０．５μＬ加え、滅菌蒸留水で２５μＬの反応液とした。
対照として、テンペレートＤＮＡのかわりに滅菌蒸留水を１μＬ加えた反応液も作製した（比較例３）。
（ｂ）増幅反応
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いて、上記の反応液を６０℃で６０分間反応させた後、９５℃で５分加熱を行い、酵素を失活させた。この反応溶液を「合成プローブ」溶液とした。
（ｃ）アクリルアミドゲル電気泳動法による増幅産物の検出
上記合成プローブ溶液８μＬを、１６％ポリアクリルアミドゲル（２９：１、バイオラッド社製）を用いて電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
（ｄ）自己集合体の形成反応
０．２ｍＬチューブに、ダイマー形成用プローブ−３及び４を各１μＬ、２０×ＳＳＣを１２μＬ加え、滅菌蒸留水で２０μＬとした。
この反応溶液を９４℃にて３０秒間処理した後、６０℃で１８時間反応させ、これを「ダイマープローブ」溶液とした。
次に、自己集合体の形成反応として、別の０．２ｍＬチューブに合成プローブ溶液を５μＬ、ダイマープローブ溶液を１０μＬ、２０×ＳＳＣを５μＬ加え、６０℃で１８時間反応させた。
対照として、合成プローブ溶液のみ（比較例４）、及びダイマープローブ溶液のみ（比較例５）の反応も行った。
（ｅ）蛍光顕微鏡による確認
上記（ｄ）自己集合体の形成反応溶液５μＬに、臭化エチジウム（１０ｍｇ／ｍＬ）を１／１０００に希釈し５μＬを加え、３０分間放置した。これをスライドグラス上に３μＬ滴下し、蛍光顕微鏡にて観察した。
（４）結果
１：アクリルアミドゲル電気泳動法による増幅産物の検出
図５１に実施例１９及び比較例３のアクリルアミドゲル電気泳動法の結果を示す。レーンＭは１０ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ、レーン１は比較例３、レーン２及び３は実施例１９をそれぞれ示した。その結果、実施例１９のターゲットＤＮＡを添加した場合のみ、４０ｂｐと２０ｂｐの増幅産物のバンドが検出された。この２０ｂｐのバンドは増幅された４０ｂｐの合成プローブが、共存するＲＮａｓｅＨによりＲＮＡ部分が分解され切り出された２０ｍｅｒの合成プローブと２０ｍｅｒの未反応プローブとのハイブリッドである。
２：蛍光顕微鏡による確認
図５２〜５４に実施例１９及び比較例４，５の蛍光顕微鏡による結果をそれぞれ示す。ダイマープローブと合成プローブの混合溶液を反応させた場合（実施例１９）のみ、スライドグラス上に粒子状の自己集合体が確認できた。
産業上の利用可能性
以上述べた如く、本発明の遺伝子増幅反応により得られる合成プローブによる自己集合体の形成方法によれば、ＥＩＡによる特殊な機械や試薬を用いずに、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができ、本発明の遺伝子の検出方法により、特殊な機械や煩雑な操作を用いずに、低コストで簡便に特定の遺伝子を検出することができる。本発明の自己集合体は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法により効率的に形成されるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法による一対のＨＣＰを用いた自己集合体の形成方法の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のＨＣＰ、（ｂ）はＨＣＰの結合態様の一例、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図２は、本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法による一対のＨＣＰを用いた自己集合体の形成方法の別の例を示す模式図であり、（ａ）（ｂ）はそれぞれ相補領域の１箇所異なる一対のＨＣＰ、（ｃ）は上記ＨＣＰより形成されるダイマー、（ｄ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図３は、本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法によるｎ＝１の場合のダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は一対の架橋プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図４は、本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法によるｎ＝１の場合のダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法の別の例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は一対の架橋プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図５は、本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法によるｎ≧２の場合のダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成された４組のダイマープローブ、及び４組の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図６は、本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法によるｎ≧２の場合のダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合体の形成方法の別の例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成された４組のダイマープローブ、及び４組の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図７は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）は一対の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図８は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）は一対の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図９は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第３の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）は一対の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図１０は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の例の第４の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）は一対の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図１１は、酵素により切断された一対の遺伝子断片を用いた自己集合体の形成方法の第１の例を示す模式図であり、（ａ）は一対の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図１２は、酵素により切断された一対の遺伝子断片を用いた自己集合体の形成方法の第２の例を示す模式図であり、（ａ）は一対の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図１３は、酵素により切断された一対の遺伝子断片を用いた自己集合体の形成方法の第３の例を示す模式図であり、（ａ）は一対の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図１４は、遺伝子断片とあらかじめ作製しておいた架橋プローブによる自己集合体の形成方法を示す模式図であり、（ａ）は一本鎖の遺伝子断片、（ｂ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）は、あらかじめ作製しておいた架橋プローブ、（ｄ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図１５は、増幅用ＲＮＡプローブを用いた遺伝子増幅により増幅された遺伝子断片及びＲＮａｓｅ  Ｈを用いた自己集合体の形成方法の例を示す模式図であり、（ａ）は増幅用ＲＮＡプローブを用いたＤＮＡの増幅を示す。
図１６は、増幅用ＲＮＡプローブを用いた遺伝子増幅により増幅された遺伝子断片及びＲＮａｓｅ  Ｈを用いた自己集合体の形成方法の例を示す模式図であり、（ｂ）は増幅用ＲＮＡプローブを用いて増幅された一対の遺伝子断片、（ｃ）はＲＮａｓｅ  Ｈ処理後の一対の遺伝子断片、（ｄ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｅ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
図１７は、本発明で用いたオリゴヌクレオチドのメチル化した塩基を示す。
図１８は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）は切断されているメチル化したダイマー形成用プローブをそれぞれ示す。
図１９は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｃ）はターゲット遺伝子と切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション、（ｄ）は切断されたダイマー形成用プローブの連結反応をそれぞれ示す。
図２０は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｅ）は連結されたダイマー形成用プローブに対する核酸分解酵素による処理、（ｆ）は未反応のダイマー形成用プローブに対する核酸分解酵素による処理をそれぞれ示す。
図２１は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｇ）は連結されたダイマー形成用プローブにおける自己集合体の形成、（ｈ）は分解されたダイマー形成用プローブにおける自己集合体の未形成をそれぞれ示す。
図２２は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）はメチル化した増幅用プローブをそれぞれ示す。
図２３は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｃ）はターゲット遺伝子とメチル化した増幅用プローブのハイブリダイゼーション、（ｄ）はＤＮＡ合成をそれぞれ示す。
図２４は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｅ）は合成されたＤＮＡと増幅用プローブのハイブリダイゼーション、（ｆ）はＤＮＡ合成をそれぞれ示す。
図２５は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｇ）は合成プローブ、（ｈ）は核酸分解酵素による分解をそれぞれ示す。
図２６は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｉ）は核酸分解酵素により分解された合成プローブ、（ｊ）は合成プローブの架橋プローブとしての使用、（ｋ）は合成プローブのＨＣＰとしての使用をそれぞれ示す。
図２７は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｌ）及び（ｍ）は分解された合成プローブと未反応プローブのハイブリダイゼーション、（ｎ）は核酸分解酵素による処理をそれぞれ示す。
図２８は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）は一方のみメチル化した増幅用プローブをそれぞれ示す。
図２９は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｃ）はターゲット遺伝子と増幅用プローブのハイブリダイゼーション、（ｄ）はＤＮＡ合成をそれぞれ示す。
図３０は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｅ）は合成されたＤＮＡと増幅用プローブのハイブリダイゼーション、（ｆ）はＤＮＡ合成をそれぞれ示す。
図３１は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｇ）は合成プローブ、（ｈ）は核酸分解酵素による分解をそれぞれ示す。
図３２は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第２の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｉ）は核酸分解酵素により分解された合成プローブ、（ｊ）は合成プローブの架橋プローブとしての使用、（ｋ）は合成プローブのＨＣＰとしての使用をそれぞれ示す。
図３３は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第３の例の第１の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｌ）は分解された合成プローブと未反応プローブのハイブリダイゼーション、（ｍ）は核酸分解酵素による処理をそれぞれ示す。
図３４は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）はメチル化したキメラ型増幅用プローブをそれぞれ示す。
図３５は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｃ）はターゲット遺伝子とメチル化したキメラ型増幅用プローブのハイブリダイゼーション、（ｄ）はＲＮａｓｅＨによる処理をそれぞれ示す。
図３６は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｅ）は鎖置換型酵素によるＤＮＡの合成、（ｆ）は合成プローブ、（ｇ）は未反応のプローブをそれぞれ示す。
図３７は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｈ）は合成プローブ、（ｉ）は核酸分解酵素による分解をそれぞれ示す。
図３８は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｊ）は核酸分解酵素により分解された合成プローブ、（ｋ）は合成プローブの架橋プローブとしての利用、（ｌ）は合成プローブのＨＣＰとしての利用をそれぞれ示す。
図３９は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第４の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｍ）及び（ｎ）は分解された合成プローブと未反応プローブのハイブリダイゼーション、（ｏ）は核酸分解酵素による処理をそれぞれ示す。
図４０は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）はキメラ型増幅用プローブをそれぞれ示す。
図４１は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｃ）はターゲット遺伝子とキメラ型増幅用プローブのハイブリダイゼーション、（ｄ）はＲＮａｓｅＨによる処理をそれぞれ示す。
図４２は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｅ）は鎖置換型酵素によるＤＮＡの合成、（ｆ）は合成プローブ、（ｇ）は未反応プローブをそれぞれ示す。
図４３は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｈ）は合成プローブ、（ｉ）は核酸分解酵素による分解をそれぞれ示す。
図４４は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｊ）は核酸分解酵素により分解された合成プローブ、（ｋ）は合成プローブの架橋プローブとしての利用、（ｌ）は合成プローブのＨＣＰとしての利用をそれぞれ示す。
図４５は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第５の例の実施の形態を原理的に示す模式図であり、（ｍ）及び（ｎ）は分解された合成プローブと未反応プローブのハイブリダイゼーション、（ｏ）は核酸分解酵素による処理をそれぞれ示す。
図４６は、実施例１〜１６の結果を示す写真である。
図４７は、実施例１７及び比較例１の変性ＰＡＧＥ電気泳動法の結果を示す写真である。
図４８は、実施例１７及び比較例１のアガロースゲル電気泳動法の結果を示す写真である。
図４９は、実施例１８及び比較例２のＰＡＧＥ電気泳動法の結果を示す写真である。
図５０は、実施例１８のアガロースゲル電気泳動法の結果を示す写真である。
図５１は、実施例１９及び比較例３のＰＡＧＥ電気泳動法の結果を示す写真である。
図５２は、実施例１９の蛍光顕微鏡による結果を示す写真である。
図５３は、比較例４の蛍光顕微鏡による結果を示す写真である。
図５４は、比較例５の蛍光顕微鏡による結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
2003040367.tif 000089
【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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