(57)【要約】生体物質を精製する方法であって、前記生体物質を含む水溶液を、電解切断性アフィニティー担体と接触させ、そして、前記水溶液に電圧を印加して前記電解切断性アフィニティー担体を切断することにより前記生体物質を回収することを含む方法が開示される。本発明の電解切断性アフィニティー担体は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成され、電圧を印加することにより切断されることを特徴とする。本発明の方法により目的とする生体物質を簡便かつ高回収率で得ることができる。
2004018081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質を精製する方法であって、
前記生体物質を含む水溶液を、電解切断性アフィニティー担体と接触させ、そして、前記水溶液に電圧を印加して前記電解切断性アフィニティー担体を切断することにより前記生体物質を回収することを含む方法。
【請求項２】
前記電解切断性アフィニティー担体が、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記電解切断性リンカーが、酸化白金−珪素結合により固体担体に結合している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記電解切断性リンカーが、
電解切断部分、
前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および
前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
電圧を印加することにより切断される電解切断性アフィニティー担体であって、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成されることを特徴とする電解切断性アフィニティー担体。
【請求項６】
前記電解切断性リンカーが、酸化白金−珪素結合により固体担体に結合している、請求項５記載の電解切断性アフィニティー担体。
【請求項７】
前記電解切断性リンカーが、
電解切断部分、
前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および
前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アーム
を含むことを特徴とする、請求項５記載の電解切断性アフィニティー担体。
【請求項８】
請求項５、６または７に記載の電解切断性アフィニティー担体を含む生体物質精製用キット。
【請求項９】
電圧を印加することにより切断される電解切断性リンカーであって、
電解切断部分、
前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および
前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アーム
を含むことを特徴とする、電解切断性リンカー。
【請求項１０】
前記担体結合アームを介して結合した少なくとも１つの担体をさらに含む、請求項９記載の電解切断性リンカー。
【請求項１１】
前記担体結合アームが酸化白金−珪素結合により固体担体に結合している、請求項１０記載の電解切断性リンカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体物質を精製する方法、ならびに該方法において用いるための電解切断性アフィニティー担体に関する。本発明はまた、電解切断性アフィニティー担体を利用した生体物質精製用キット、および電解切断性リンカーに関する。
【背景技術】  夾雑蛋白質などの生体物質が含まれる溶液中から目的とする蛋白質のみを分離するために、種々の方法が知られている。例えば、目的とする蛋白質をタグ付きの融合蛋白質として組換え手法により発現させ、そのタグに特異的なリガンドを利用してタグ付きの蛋白質のみを選択的に結合させる方法が広く用いられている。この方法においては、目的とする蛋白質を回収するためには、塩濃度、ｐＨ、あるいは溶媒組成を変えたり、選択的結合の後に特異性の高いプロテアーゼでタグ部分を切断し、目的とする蛋白質のみを溶出させる（例えば、“Ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ”，Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｒｉｇａｕｔ，Ａｎｎａ  Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｒｕｔｚ，Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｗｉｌｍ，Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｍａｎｎ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｓｅｒａｐｈｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７，１０３０−１０３２（０１  Ｏｃｔ  １９９９））。しかし、この方法では非特異的に吸着した夾雑蛋白質が溶出されることがある。また、プロテアーゼで切断する方法の場合には、目的とする蛋白質の中にそのプロテアーゼ認識部位が存在すると、目的とする蛋白質自体が切断されてしまうという欠点がある。
また、目的とする蛋白質に対する抗体をリガンドとして用いて蛋白質等の生体物質を結合させた後に、その蛋白質の抗原決定部位に対応する合成ペプチドを用いて蛋白質を回収する方法が知られているが、この方法では蛋白質の回収効率が低い。特に、抗原決定部位が不明である場合には、選択的に目的とする蛋白質だけを溶出することができず、蛋白質を含む生体物質の回収率がさらに低くなる。
担体に光感受性のリンカーを介してリガンドを結合させ、このリガンドに蛋白質を結合させた後に、光をあててリンカーを切断する方法も開発されている。この方法では、担体をカラムに充填するとカラム中で試料に十分に光をあてることができない。また、光エネルギーが弱いと十分な切断が得られないが、強すぎると標的蛋白質の構造が変化する可能性があり、光の強度の調節が困難であった。
さらに、目的とする蛋白質のシステイン残基やリン酸化セリン・スレオニン・チロシン残基をビオチンを連結させた修飾試薬で修飾し、担体に結合させたアビジンやストレプトアビジンを用いてシステインやリン酸化セリン・スレオニン・チロシン残基を含むペプチドだけを回収する方法も提唱されているが、回収率が非常に低いという欠点があった。
薬剤をアフィニティーリガンドとして担体に固定化し、目的とする薬剤のターゲット蛋白質を結合させ、薬剤を用いてターゲット蛋白質を回収する方法も知られている。特に疎水性の薬剤の場合、水溶液への溶解度が低く蛋白質の回収率が低い。また、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、あるいは蛋白質以外の生体物質をリガンドとして、蛋白質などの生体物質を結合させ、尿素や界面活性剤などを用いて生体物質の本来の構造を破壊することにより目的とする生体物質を回収する方法も知られているが、夾雑物も同時に回収され、選択的に目的とする生体物質を高い回収率で回収できない。こういった問題は、蛋白質のみならず、他の生体高分子、生理活性物質等の生体低分子でも全く同様である。
したがって、本発明は簡便な手段により、目的とする生体物質を高い回収率で得ることができる生体物質精製方法、ならびにこのような方法において用いるためのアフィニティー担体を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、生体物質をアフィニティー担体と結合させた後に、電気化学的手法によりアフィニティー担体を切断することにより、目的とする生体物質を容易に回収しうることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、生体物質を精製する方法であって、蛋白質などの生体物質を含む水溶液を、電解切断性アフィニティー担体と接触させ、そして、前記水溶液に電圧を印加して前記電解切断性アフィニティー担体を切断することにより前記蛋白質などの生体物質を回収することを含む方法を提供する。
本発明は、アフィニティ（親和性による親和力）を利用するアフィニティクロマトグラフィ技術で分離精製される生体物質すべてに適用することができる。本明細書においては、生体物質は生体高分子および生体低分子の両方を含む。前者の例には蛋白質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、酵素、糖、糖鎖などが含まれ、後者の例にはペプチド、脂質、ビタミン、金属錯体、ステロイド、テルペノイド（テルペン）、オータコイド、アルカロイド等の生理活性物質が含まれる。
電解切断性アフィニティー担体とは、アフィニティー精製に用いるための担体であって、電圧を印加することによりその一部が切断される特徴を有する担体をいう。好ましくは、該電解切断性アフィニティー担体は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成される。電解切断性リンカーとは、電圧を印加することにより切断されることができるリンカーである。好ましくは、該電解切断性リンカーは、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む。特に好ましくは、担体結合アームは酸化白金−珪素結合により担体に結合されている。
別の観点においては、本発明は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成されることを特徴とする電解切断性アフィニティー担体を提供する。リガンドとは、精製すべき目的物質と選択的もしくは特異的に結合しうる物質をいう。リガンドの例としては、限定されないが、抗原、抗体、ハプテン、ペプチド、レセプター、レセプターに結合する結合パートナー、ビオチン、アビジン、プロテインＡ等が含まれる。本発明の電解切断性アフィニティー担体は、電圧を印加することにより切断されることを特徴とする。好ましくは、該電解切断性リンカーは、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む。特に好ましくは、担体結合アームは酸化白金−珪素結合により担体に結合されている。
さらに別の観点においては、本発明は、上述の電解切断性アフィニティー担体を含む蛋白質などの生体物質精製用キットを提供する。
また別の観点においては、本発明は、電圧を印加することにより切断される電解切断性リンカーであって、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む電解切断性リンカーを提供する。この電解切断性リンカーには、担体結合アームを介して少なくとも１つの担体を結合することができる。
本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いることにより、目的とする生体物質をリガンドに結合させた後に担体と水溶液の間に微弱な電圧を印加することによって、電解切断性アフィニティー担体がその中のリンカーの特定の部位で切断されるため、生体物質を効率よく回収することができる。本発明にしたがう生体物質の精製方法は、生体物質の回収率が高いため、構造未知の複数の生体物質を微量の試料から回収する場合に特に有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の構成の１つの態様を示す。
図２は、本発明の電解切断性アフィニティー担体を充填したカラムの模式図を示す。
図３は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図４は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図５は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図６は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図７は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ断面図とそれを用いた生体物質とリガンドの相互作用を検知する原理の模式図を示す。
図８は、本発明の電解切断性アフィニティー担体をＢＩＡｃｏｒｅチップに適応した模式図を示す。
図９は、酸化白金−珪素結合により担体に結合した本発明の電解切断性リンカーの好ましい例を示す。
図１０は、本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いる電解切断の例を示す。
図１１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の製造および使用に適した装置の例を示す。
図１２は、リガンドとしてビオチンを用いる本発明の電解切断性アフィニティー担体を示す。
図１３は、リガンドとしてビオチンを用いる本発明の電解切断性アフィニティー担体の製造方法を示す。
図１４は、リガンドとしてビオチンを用いる本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いるアビジンの結合および切断を示す。
発明の詳細な説明
図１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の構成の１つの態様を示す。この態様においては、本発明の電解切断性アフィニティー担体は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成される。好ましくは、電解切断性リンカーは、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む。
担体としては、水素よりイオン化傾向の小さい金属であればいずれの金属を用いることもできるが、好ましくは金および白金である。その理由は、金および白金と生体物質との親和性が低いので、夾雑物が混入しにくいこと、変化しにくく再利用可能であることである。もちろん、他の金属またはその他の導電性材料の表面に金または白金を蒸着またはメッキしたものを用いてもよい。また、担体として炭素（カーボンブラック等）を用いることもできる。この場合、炭素担体の表面をカルボキシル基で誘導化することにより、目的とする蛋白質がリガンドではなく担体に吸着することを防止することが好ましい。
担体は、当該技術分野において蛋白質あるいは生体物質アフィニティー精製用に一般に用いられる担体と同様の形状、例えば直径０．１μｍ−１ｍｍのビーズ形状とすることができる。好ましくは、精製すべき蛋白質と接触する表面積を大きくするために、直径１−２０μｍのビーズを用いる。あるいは、担体はスポンジ状または多孔性のマトリクスの形状であってもよい。
電解切断部分は、電圧を印加することにより電子移動に伴って開裂する芳香族性の基であり、例えば以下のような基を用いることができる：
2004018081.tif 000003
［式中、Ｘは炭素、酸素、窒素、または硫黄原子であり、Ｒは水素、炭化水素基、アシル基または炭素、酸素、窒素、硫黄を介して結合する置換基であり、■はリガンド結合アームまたは担体結合アームである］。
本発明において用いることができる電解切断部分の好ましい例としては、以下の基が含まれるが、これらに限定されない。本発明において用いることができる適当な電解切断部分は、アフィニティによる精製等の技術分野に精通している者であれば、本明細書の開示に基づいて容易に設計し合成することができる。
2004018081.tif 000004
2004018081.tif 000005
リガンド結合アームとは、電解切断性部分とリガンドを適当な距離で結合させるためのスペーサー基である。リガンド結合アームは、好ましくは炭素数３−１００の長さのアルキレン鎖であり、ここで、隣接していない１またはそれ以上の−ＣＨ２−基は、独立して、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−Ｏ−または−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい。リガンド結合アームは、末端にリガンドを結合するための官能基、例えば−ＣＯＯＨ基または−ＮＨ２基、あるいはサクシニルイミド基またはエポキシ基を有する。また、リガンド結合アームの末端には蛋白質修飾・アミノ酸修飾・核酸修飾およびその他の生体物質修飾に用いるいかなる化合物の反応官能基を付加してもよい。本発明において用いることができるリガンド結合アームの好ましい例としては、以下の基が含まれるが、これらに限定されない。
2004018081.tif 000006
当業者は、本明細書の開示に基づいて、本発明において用いることができる適当なリガンド結合アームを容易に設計し合成することができる。特に、アフィニティー精製に用いるリガンドおよび精製すべき蛋白質などの生体物質の物理学的性質（例えば、分子のサイズ、電荷）および化学的性質に基づいて、リガンド結合アームの長さおよび疎水性・親水性を適宜選択することができる。
担体結合アームとは、電解切断性部分と担体とを適当な距離で結合させるためのスペーサー基である。担体結合アームは、リガンド結合アーム（炭素数３−１００の長さ）より短いほうが好ましく、より好ましくは炭素数３−１０の長さのアルキレン鎖であり、ここで、隣接していない１またはそれ以上の−ＣＨ２−基は、独立して、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−Ｏ−または−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい。電解切断性部分と担体との間の距離が一定の長さ（電圧、電解質溶液の性質、電解切断性部分の性質等により決定される）以下であれば、本発明の電解切断性アフィニティー担体は電圧を印加したときにその電解切断性部分で切断される。担体結合アームの長さがこれより長い場合には、本発明の電解切断性アフィニティー担体が動くことにより担体から一定の距離以下に達したときに切断が生ずる。したがって、担体結合アームの特に好ましい長さは炭素数３−６の長さである。担体結合アームの長さがより長い場合には、種々の官能基をアーム中に組み込むことによりアームの親水性・疎水性等の性質を調節することができるため、このような態様もまた好ましい。担体結合アームは、末端に担体と結合するための官能基を有する。担体が金である場合は適切な官能基は−ＳＨ基であり、担体が白金である場合には、適切な官能基は、−Ｓｉ（ＥｔＯ）３または−Ｓｉ（ＭｅＯ）３である。あるいは、担体の表面が−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２基などで誘導化されている場合には、これらの官能基と結合しうる官能基、例えば、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨなどであってもよい。本発明において用いることができる担体結合アームの好ましい例としては、以下の基が含まれるが、これらに限定されない。
2004018081.tif 000007
当業者は、本明細書の開示に基づいて、本発明において用いることができる適当な担体結合アームを容易に設計し合成することができる。特に、精製すべき蛋白質などの生体物質の性質および担体の材料に基づいて、担体結合アームの長さおよび疎水性あるいは親水性を適切に選択することができる。
本発明の特に好ましい態様においては、担体と担体結合アームとは酸化白金−珪素結合により結合している。担体を陽極として電解酸化によりリンカーを切断する場合、担体と担体結合アームが例えばＡｕ−Ｓ結合により結合していると、この結合部分も酸化的に開裂する可能性がある。担体と電解切断性リンカーとの間で切断が起こると、非特異的に結合した夾雑成分も同時に溶出する割合が多くなるため、電解切断の条件を注意深く設定する必要がある。これに対し、酸化白金−珪素結合は水溶液中の酸化処理では結合は殆ど開裂しないため、電解切断性部分で選択的に電解酸化開裂反応を起こさせることが可能である。このことにより、反応の制御が容易となり、生体成分の混合物中に含まれる還元反応系の影響を受けず、外部スイッチにより選択的に切断できるという利点を有する。
図３−６は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。本発明の範囲はこれらに限定されない。
本発明の電解切断性リンカーに、リガンド結合アームを介して少なくとも１つのリガンドを結合させ、さらに担体結合アームを介して少なくとも１つの担体を結合させることにより、電解切断性アフィニティー担体を得ることができる。本発明の電解切断性アフィニティー担体は、蛋白質などの生体物質を高い回収率で精製するのに有用である。
本発明の電解切断性アフィニティー担体の構成は図１に示される。本発明の電解切断性アフィニティー担体を、目的とする蛋白質などの生体物質を含む水溶液と接触させ、洗浄して夾雑蛋白質などの生体物質を除去する。このとき、夾雑物質の一部が担体と非特異的に吸着したまま残ってもよい。次に担体と水溶液の間に電圧を印加することにより、電解切断性アフィニティー担体の電解切断性部分が開裂する。印加する電圧は、０．５Ｖ−１．５Ｖ、より好ましくは０．５Ｖ−１．２Ｖであり、最も好ましくは１Ｖである。電圧が低いほど切断効率が低下し、電圧が１．５Ｖより高いと水が電気分解してしまう。
電圧の印加方法は、定電圧の印加の他、パルス電圧印加および正弦波、鋸状波、三角波などで往復掃引（スイープ）して印加する方法など、任意の方法を採用できる。電解切断性部分が単一の特定電圧で切断される場合には、その電圧以上の定電圧の印加を持続して印加すればよい。しかしながら、切断電圧にばらつきがある場合も多いので、より確実には切断電圧の最大最小をカバーする電圧範囲を掃引（スイープ）させて印加するのが好ましい。
図２は、本発明の電解切断性アフィニティー担体を充填したカラムによる蛋白質精製の態様を示す。本発明の電解切断性アフィニティー担体を電解質溶液とともにカラムに充填し、担体と電気的に連絡するよう電極を装着する。対電極は、電解質溶液と電気的に連絡するように装着する。精製すべき蛋白質を含む溶液をカラムに負荷し、蛋白質をリガンドに結合させる。カラムを洗浄して夾雑蛋白質を除去した後、電極に電圧を印加すると、電解切断性リンカーはその電解切断部分で切断されて、リガンドに結合した蛋白質が担体から解離する。解離した蛋白質をカラムから溶出することにより、目的とする蛋白質を回収することができる。
図１１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の製造および使用に適した装置の例を示す。図１１Ａは、本発明の電解切断性リンカーを白金担体に結合させるために用いることができる反応カラムの例である。電解反応を実施する場合には、図１１Ｂに示すように電極を装着する。このようなカラムを、図１１Ｃに示す吸引瓶に装着し、上部から反応液、洗浄溶液または溶出液を加える。溶液と白金粒子とを所望の時間接触させた後に系を吸引することにより、瓶の内部に溶液を回収することができる。
本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いると、蛋白質を溶出する条件を適切に選択することにより、担体または電解切断性リンカーの担体結合アームに非特異的に吸着した夾雑蛋白質の溶出を防止することができるため、回収された蛋白質中への夾雑蛋白質の混入が非常に少ないという利点を有する。
本発明はまた、本発明の電解切断性アフィニティー担体を含む生体物質精製用キットを提供する。電解切断性アフィニティー担体はカラムに充填した形状で提供してもよい。キットはさらに、試料を溶解するための溶液、洗浄液、および溶出液を含んでいてもよい。あるいは、キットは担体に結合した電解切断性リンカーを含むものであってもよく、この場合、ユーザが目的に応じてリンカーにリガンドを結合させることができる。
本発明の電解切断性アフィニティー担体は、特に、リアルタイムＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）用のバイオチップに容易に適用可能である。ＢＩＡ用バイオチップは、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標；以下、「ＢＩＡｃｏｒｅチップ」と呼ぶ）の商品名であり、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されている。かかるチップ技術は、ＵＳＰ５，６４１，６４０、ＵＳＰ５，９５５，７２９、特許第３２９４６０５号、特表平０７−５０７８６５に開示されており、下記にその概略を説明する。
ＢＩＡｃｏｒｅチップは、センサチップの表面にある分子間の相互作用を検知するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）現象を利用する。リガンドと蛋白質などの生体物質が相互作用できるように、これら物質を流す微細なフローチャネルをＢＩＡｃｏｒｅチップ表面上に形成する。その表面にリガンドを固定する。図７に、ＢＩＡｃｏｒｅチップ断面図とそれを用いた生体物質とリガンドの相互作用を検知する原理の模式図を示す。
図７中、Ｆは生体物質のフローチャネル、Ｇは金の蒸着膜、Ｐは偏光、Ｒは全反射光である。Ｌはリガンド、Ｄはデキストラン、ＤＬはデキストランの結合リンカーである。ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面には、１００ｎｍ程度の長さのデキストランが結合しており、そのデキストランに目的とするリガンドが結合している。リガンドは、図に示すように単独のリガンドが一本のデキストランについていてもよく、複数のリガンドが枝別れしたデキストランに果実のようについていてもよい。ＳＰＲでは、およそ１００ｎｍ以内の距離のリガンドに物質が結合した場合、検出可能といわれている。物質と表面に固定されたリガンドが相互作用するとき、ＳＰＲによる屈折率の変化が生じるので、このセンサチップの裏面にてこれを光学的に測定する。このことで、リガンドと蛋白質を含む生体物質との相互作用が検知でき、かつ、反射光の反射角等から相互作用が定量化できる。図７に示すように、ＢＩＡｃｏｒｅチップの表面には、ＳＰＲを用いるために光学的特性のよい（全反射率の高い）金の蒸着膜が用いられている。
金の薄膜が用いられていることから、本発明の電解切断性アフィニティー担体をＢＩＡｃｏｒｅチップに容易に適用することが可能である。すなわち、ＢＩＡｃｏｒｅチップの金の薄膜面に本発明の電解切断性アフィニティ担体を結合することができる。あるいは、従来用いられているデキストランの一部に本発明の電解切断性アフィニティ担体を結合させてもよい。そして、電圧を印加するための電極の一方をＢＩＡｃｏｒｅチップの金の薄膜に電気的に接続する。このような電気的な回路の追加は容易である。このようにすれば、リアルタイムＢＩＡ技術により物質と固定リガンドの相互作用を定量的にリアルタイムでモニターし、所望のタイミングで固定リガンドを切り離すことができる。たとえば、リガンドと蛋白質の結合が検知されたあとで、チップ表面のフローで洗浄試薬を流し、洗浄が完了した後に結合蛋白質を切り離せば、固定リガンドに特異的に結合する蛋白質のみを高純度で回収することができる。
図８は、本発明の電解切断性アフィニティー担体をＢＩＡｃｏｒｅチップに適応した例の模式図である。ＬＡがリガンド結合アーム、ＣＰが切断部位、ＣＡが担体結合アームである。担体結合アームの長さは、金の蒸着膜を電極として電圧を印加したときに電解切断性アフィニティー担体が切断部位で切断されるように選択される。あるいは、より長い担体結合アームの長さを選択して、本発明の電解切断性アフィニティー担体がＢＩＡｃｏｒｅチップの表面に固定されるリガンドと共にフローチャネルの流れの中で非定常的に動くことにより、切断部が担体から所定の距離に移動した際に切断されるようにしてもよい。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００２−２４１０７２号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。以下の実施例は、電子移動に伴って開裂する本発明の電解切断性リンカーの化学合成および切断、ならびにこれを用いる蛋白質の精製の例を示す。
実施例１．金粒子上に硫黄原子を介して結合した電解開裂ユニットを有するリンカーの合成
2004018081.tif 000008
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド（１０ｍｍｏｌ）
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および３−メルカプト−プロピオン酸（２２ｍｍｏｌ）
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をジクロロメタンに室温にて溶解した。次に、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体（０．１ｍｍｏｌ）を添加し、５分間攪拌した。直ちに反応溶液に食塩水を添加し、酢酸エチルによって抽出した。酢酸エチル層は食塩水により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで酢酸エチル溶液を乾燥、ろ過、濃縮乾固した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒  ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、３−［（２−カルボキシ−エチルスルファニル）−（４−ヒドロキシ−フェニル）−メチルスルファニル］−プロピオン酸を得た。
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新たに３−メルカプト−プロピオン酸（５ｍｍｏｌ）に、２０ｍｍｏｌの塩化チオニルを加え、１時間室温で攪拌した。この溶液を、減圧濃縮後、ジクロロメタンを加え、さらに先に調製した３−［（２−カルボキシ−エチルスルファニル）−（４−ヒドロキシ−フェニル）−メチルスルファニル］−プロピオン酸（５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２０ｍｍｏｌ）を加えアルゴン気流下、室温でさらに１６時間攪拌した。反応終了後、５％クエン酸水溶液および酢酸エチルを加え、生成物を酢酸エチルによって抽出した。酢酸エチル層はさらに５％クエン酸水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、濃縮した。残渣にアセトニトリルを加えて溶解し、さらに金粒子を添加し、アルゴン気流下、室温で１８時間放置した。続いて、金粒子をろ別、アセトニトリルで５回洗浄後、ジメチルホルムアミドに浸漬した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０ｍｍｏｌ）および２，２′−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（２０ｍｍｏｌ）
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を添加し、室温にて４時間攪拌した。次に、金粒子をろ別し、アセトニトリルで５回洗浄した。このようにして得られた金粒子は末端にアミノ基を有し、任意のリガンドを当該アミンと結合させることができる。
実施例２．水溶液中における電気化学的な切断
末端アミンにリガンドのモデルとして、塩化ベンゾイルを反応させることによりベンゾイル化した。化学修飾済みの金粒子をジメチルホルムアミド中に分散させたのち、過剰量の塩化ベンゾイルを添加し、室温にて３時間攪拌した。反応容器を氷冷した後、メタノールを滴下した。その後、金粒子を分別し、アセトニトリルで５回洗浄、さらに純水で３回洗浄した。得られた金粒子を図２のようにカラム管に詰め、白金導線をセットした後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を満たした。次に、金粒子側を陽極として、端子電圧０ｖから１．６Ｖの間で繰り返し電位を掃引した（往復掃引、１００ｍＶ／ｓｅｃ）。４０回掃引後、導線を外し、カラムから緩衝液を溶出させた。本緩衝液から、電解によってジチオアセタール部分で切断されたリガンドユニットが回収された。
実施例３．白金−酸化白金粒子上に珪素原子を介して結合した電解開裂ユニットを有するリンカーの合成
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２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド（１０ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフランに溶解し、アルゴン気流下、トリフェニルホスホラニリデン酢酸メチルエステル（１２ｍｍｏｌ）を添加し、１８時間室温にて攪拌した。反応液に飽和食塩水および酢酸エチルを添加し、酢酸エチル層を飽和食塩水で２回洗浄後、濃縮乾固した。この残渣に酢酸エチルおよび５％パラジウム／炭素存在下、水素ガス気流下にて接触水素添加を行った。水素添加完了後、パラジウム／炭素をろ過して除き、濃縮乾固した。残渣を希塩酸にて加水分解し、３−（２，５−ジヒドロキシ−フェニル）−プロピオン酸を得た。
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一方、表面を酸化白金とした白金粒子１．０グラムをアセトニトリル中に分散後、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（１０ｍｍｏｌ）を添加し、室温、アルゴン気流下２４時間攪拌した。白金粒子をろ別し、アセトニトリルで５回洗浄後、再び白金粒子をアセトニトリルに浸漬した。次に、無水コハク酸（１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０ｍｍｏｌ）を添加し、４時間室温にて攪拌を続けた。反応終了後白金粒子をろ別、アセトニトリルでさらに５回洗浄した。続いて、得られた白金粒子をさらに新たなアセトニトリルに分散し、塩化チオニル（１０ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン気流下で室温にて３時間攪拌した。反応終了後、白金粒子をろ過、洗浄し、直ちに、３−（２，５−ジヒドロキシ−フェニル）−プロピオン酸（１０ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液中に白金粒子を浸漬、攪拌し、１６時間放置した。最後に、白金粒子をろ別、洗浄した。次に、この白金粒子をアセトニトリルに浸漬した後、１，６−ジアミノヘキサン（１０ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２０ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて１０時間攪拌した。反応終了後、白金粒子をろ別、洗浄し、目的とする金−酸化白金粒子上に珪素原子を介して結合した電解開裂ユニットを有するリンカーを得た。このようにして得られた白金粒子は末端にアミノ基を有し、任意のリガンドを当該アミンと結合させることができる。
実施例４．水溶液中における電気化学的切断
末端アミンにリガンドのモデルとして、塩化ベンゾイルを反応させることによりベンゾイル化した。化学修飾済みの金粒子をジメチルホルムアミド中に分散させたのち、過剰量の塩化ベンゾイルを添加した。室温にて３時間攪拌した。反応容器を氷冷した後、メタノールを滴下した。その後、白金粒子を分別し、アセトニトリルで５回洗浄、さらに純水で３回洗浄した。得られた白金粒子を図２のようにカラム管に詰め、白金導線をセットした後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を満たした。次に、白金粒子側を陽極として、端子電圧０Ｖから１．６Ｖの間で繰り返し電位を掃引した（往復掃引、１００ｍＶ／ｓｅｃ）。４０回掃引後、導線を外し、カラムから緩衝液を溶出させた。本緩衝液から、電解によってフェニルエステル部分で切断されたリガンドユニットが回収された。
実施例５．生体物質のアフィニティー吸着−電解切断法による精製
金表面に結合させることにより調製した次式：
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のリンカーを有する金粒子２．０ｇを、乾燥ジメチルホルムアミド１０ｍｌ中に分散させた。この分散溶液にビオチン２０ｍｇ、ジシクロヘキシルカルボジイミド１００ｍｇを添加し、アルゴン気流下、室温にて２４時間攪拌することにより、次式：
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に示すリガンド結合体を作成した。この分散溶液をろ過、アセトニトリルで５回洗浄後、燐酸緩衝液中に分散した。このようにして得られた、ビオチンが結合した金粒子をカラムに詰めた。このとき、導線および対極をセットした。次に、分離目的とする糖タンパク質アビジン２ｍｇを含む燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌを、通過させた（流速約０．２ｍｌ／ｍｉｎ）。続いて、生体分子を含まない燐酸緩衝液４０ｍｌを用い、同じ流速にて洗浄操作を行い、洗浄液中に蛋白質が溶出しないことを、紫外線吸収スペクトルおよび高速液体クロマトグラフィーによって確認した。次に、電解によるアビジン−ビオチン複合体の溶出を行った。このとき、溶出液として同じ燐酸緩衝液を用い、カラムに溶出液を供給しながら、０ボルトから１．５ボルトの範囲で電位掃引を繰り返した。このとき溶出液を捕集し、複合体の溶出を紫外線吸収および高速液体クロマトグラフィーによって確認した。
実施例６．  白金粒子アフィニティー担体の製造
パラメトキシベンズアルデヒドおよび３−メルカプトプロピルトリメトキシシランから、図９に記載のスキームにしたがって、電解切断性リンカーを合成した。このリンカーをｎ−ブタノールに溶解し、表面を酸化白金とした粒径１−１０μｍの白金粒子１ｇを加えて、酸化白金表面にトリアルコキシシリル基を解してリンカーを結合させた。シリル基一つあたり１から３個の酸素原子を介して白金表面に結合していた。電解溶液中で白金担体を陽極として通電することにより、選択的にベンジルジチオアセタール部位が酸化的に開裂し、切断されたアルデヒドが溶出した。
実施例７．  白金粒子アフィニティー担体を用いる電解切断
実施例６において製造した電解切断性リンカーに４−ブロモブタン酸を反応させて、末端にカルボキシル基を導入し、これにリガンドのモデルとして色素（Ａｚｕｒｅ  Ａ）を結合させた。実験は図１１に示す装置を用いて行った。色素を結合させた酸化白金粒子をカラムに充填し、電解溶液（１Ｍ  過塩素酸リチウム水溶液）を満たし１０分間放置した後に、電解溶液を吸引除去した。カラムを３回、電解溶液（１Ｍ  過塩素酸リチウム水溶液）で洗浄した。洗浄溶液は透明であり、色素成分が溶出しないことを確認した。次に、電解溶液を充填し、白金担体を陽極として通電（１．５Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ，５分間）した。吸引ろ過すると青色色素が溶出した。すなわち、選択的にベンジルジチオアセタール部位が酸化的に開裂し、切断されたアルデヒド（青色色素）が溶出した。電解時間が３０秒の段階では、溶出色素の吸光度により判定して、白金１グラムあたりの色素の量は０．１ｘ１０−５モルであった。５分間の通電後に溶出した色素は白金１グラムあたり０．８ｘ１０−５モルであった。このことから、明らかに通電、すなわち電解酸化によって色素成分が切断され、溶出されたことが示された。
実施例８．リガンドとしてビオチンを有する白金粒子アフィニティー担体の製造
図１２に示すビオチン結合白金粒子アフィニティー担体を合成した。合成方法は図１３に記載されるスキームにしたがった。得られたビオチン結合電解切断アフィニティー担体をカラムに充填し、カラムにアビジン水溶液を流し、続いて純水および電解質溶液で洗浄した。次に、このアフィニティー担体に１．５Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ，５分間電位を印加した後、カラム中の電解液を溶出させた。溶出液を電気泳動法により分析して、アビジンが溶出されたことを確認した（図１４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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