(57)【要約】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドは、癌細胞内において血管新生を阻害し、その阻害効果により癌細胞の増殖を阻害する活性を有する。本発明のペプチドは、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌等の癌の治療に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項６】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
Ｃ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失したアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｃ末端側アミノ酸を１〜５個欠失したアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加された、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩。
【請求項１１】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなる、癌治療用ペプチド。
【請求項１２】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個欠失したアミノ酸配列からなる、癌治療用ペプチド。
【請求項１３】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２０個欠失したアミノ酸配列からなる、癌治療用ペプチド。
【請求項１４】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１５個欠失したアミノ酸配列からなる、癌治療用ペプチド。
【請求項１５】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失したアミノ酸配列からなる、癌治療用ペプチド。
【請求項１６】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜５個欠失したアミノ酸配列からなる、癌治療用ペプチド。
【請求項１７】
Ｃ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失した、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチド。
【請求項１８】
Ｃ末端側アミノ酸を１〜５個欠失した、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチド。
【請求項１９】
一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチド。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩。
【請求項２１】
前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌又は膵臓癌である、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチド。
【請求項２２】
前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌又は膵臓癌である、請求項２０に記載の癌治療用ペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩。
【請求項２３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組換ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項２６】
請求項２５に記載の形質転換体を培養し、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチドを生成し、蓄積し、該ペプチドを採取することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチドの製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１０に記載のペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１０に記載のペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項２９】
前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌又は膵臓癌である、請求項２８に記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する、医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する、癌治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、癌の治療に有効なペプチド、及び該ペプチドを含有する医薬組成物等に関する。
背景技術
近年において、癌は、心臓病に次いで人に死をもたらす第二の原因となっている。癌の治療方法としては、通常、外科的手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、ハイパーサーミア等が行われているが、上記のいずれの治療法においても、癌細胞の根絶を目標に生細胞の除去や細胞死を誘導することが重要な課題である。
上述のように、癌の治療法においては、癌細胞の根絶が目標であり、癌細胞の死を誘導する遺伝子を癌細胞に導入したり、免疫応答を増強する遺伝子を癌細胞に導入する遺伝子治療法が開発されてきている。
しかし、癌細胞の死を誘導する遺伝子を癌細胞に導入する遺伝子治療法においては、現時点においては遺伝子を全ての癌細胞に導入する方法がなく、癌細胞の根絶という目標を達成することが困難である。また、免疫応答を増強する遺伝子を癌細胞に導入する遺伝子治療法においては、免疫応答が複数の段階で複雑に調節されているため、一種類の遺伝子を操作するのみでは免疫応答を増強させることは困難であることが明らかとなってきている。
一方、細胞内の特定の物質が不足するために疾病が発生する、免疫不全症のような疾患においては、その物質を補充する遺伝子を細胞内に導入する、遺伝子治療が成功している。従って、癌の遺伝子治療法においても、このような特定の物質を産生させることにより癌を治療するという戦略が重要となる。
アドレノメジュリンは、褐色細胞腫から最初に発見された、アミノ酸５２個からなるペプチドである（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．等，Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｉｎ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：５５３−５６０（１９９３））。アドレノメジュリンは降圧性ペプチドであり、１８５個のアミノ酸からなるプレプロホルモンから、連続的な酵素的分解及びアミド化を通して生成される。この酵素的分解及びアミド化の工程により５２個のアミノ酸からなるアドレノメジュリンが生成される。
アドレノメジュリンは正常な副腎／髄質中及び心房、心室、内皮細胞、肺、脳、腎臓及び骨を含む多くの組織中に存在しており、血管拡張作用を有することが知られている。そして、アドレノメジュリンは、血管拡張作用を通じて細胞内の血管新生にも関与している。また、各種癌細胞中のアドレノメジュリン含有量は正常細胞に比べ高いことが知られている。癌細胞の増殖には血管新生が必要であり、血管新生を阻止することにより、癌細胞の増殖を抑制でき、癌を治療することが可能である。
従って、アドレノメジュリンの血管新生を阻害することのできる化合物を発見することにより、各種癌細胞の治療が可能である。
本発明の目的は、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌等の癌の治療に用いることができる新規化合物を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、アドレノメジュリンが癌細胞において多量に発現し、血管新生に関与していることに着目し、アドレノメジュリンのアンタゴニストの癌治療への使用について検討し、癌治療に用いることのできる新規な化合物について検討を行った。
本発明者らは、鋭意検討した結果、アドレノメジュリンのアミノ酸配列の一部を欠失したペプチドが癌細胞に対して細胞毒性活性を示すことを見出し、このペプチドが癌治療効果を奏することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドを提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなる、癌治療用ペプチドを提供するものである。
また、本発明は、前記ペプチド又は癌治療用ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、前記ペプチド又は癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを提供するものである。
また、本発明は、前記組換ベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、前記ペプチド又は癌治療用ペプチドを生成し、蓄積し、該ペプチドを採取することを特徴とする、ペプチド又は癌治療用ペプチドの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ペプチド又は癌治療用ペプチドを含有する医薬組成物又は癌治療用医薬組成物を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のペプチドは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドである。具体的には、本発明のペプチドは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個又は１〜５個欠失したアミノ酸配列からなる。なお、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドは、ヒト由来のアドレノメジュリンである。
本発明のペプチドは、公知の方法により、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドをタンパク質分解酵素により切断することにより得ることができる。
また、ヒトアドレノメジュリンは、そのｃＤＮＡの塩基配列は決定されており（Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９４，７２０（１９９３））、得ようとするペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを合成し、この合成したＤＮＡをベクターに組み込み、ＤＮＡを組み込んだベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、ペプチドを産生させて得ることも可能である。また、従来公知のペプチド合成法によって製造することもできる。
本発明のペプチドは、そのＣ末端側アミノ酸が１〜１０個、好ましくは１〜５個欠失したものであってもよい。このような、Ｃ末端側アミノ酸側アミノ酸が欠失したペプチドは、上述したようなペプチド合成法、形質転換体を作製して製造することができる。
本発明のペプチドは、癌治療用組成物として用いることができ、癌治療効果を発揮することができれば、その他の、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。一般的に、全アミノ酸配列のうちの、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるペプチドも実質的に同一である。
本発明のペプチドは、通常Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここで、エステルにおけるＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどの炭素数１〜６個のアルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの炭素数３〜８個のシクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどの炭素数６〜１２個のアリール基、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。
また、上記タンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものを用いることもできる。この場合のエステルとしては、例えば上述したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などの炭素数１〜６個のアシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
上記ペプチドの塩としては、特に生理学的に許容される酸付加塩であることが好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
次に、本発明の癌治療用ペプチドについて説明する。
本発明の癌治療用ペプチドは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドである。具体的には、本発明のペプチドは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個又は１〜５個欠失したアミノ酸配列からなる。なお、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドは、ヒト由来のアドレノメジュリンである。
本発明の癌治療用ペプチドは、公知の方法により、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドをタンパク質分解酵素により切断することにより得ることができる。
また、ヒトアドレノメジュリンは、そのｃＤＮＡの塩基配列は決定されており（Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９４，７２０（１９９３））、得ようとするペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを合成し、この合成したＤＮＡをベクターに組み込み、ＤＮＡを組み込んだベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、ペプチドを産生させて得ることも可能である。また、従来公知のペプチド合成法によって製造することもできる。
本発明癌治療用のペプチドは、そのＣ末端側アミノ酸が１〜１０個、好ましくは１〜５個欠失したものであってもよい。このような、Ｃ末端側アミノ酸側アミノ酸が欠失した癌治療用ペプチドは、上述したようなペプチド合成法、形質転換体を作製して製造することができる。
本発明の癌治療用ペプチドは、その他の、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよく、この点については、上述した本発明のペプチドと同様である。
また、アミド又はそのエステルまたはその塩についても、上述した本発明のペプチドと同様である。
本発明のペプチド及び癌治療用ペプチドの具体例としては、例えば配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
本発明のペプチド、及び癌治療用ペプチドは、癌治療の目的で用いることができ、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌等の癌の治療に用いることができる。本発明のペプチド及び癌治療用ペプチドは、癌細胞内に導入されると、癌細胞内における血管新生を阻害し、その阻害効果により癌細胞の増殖を阻害すると考えられる。
本発明のペプチド及び癌治療用ペプチドの抗癌活性は、例えばマウス等の動物に癌を発生させた後にペプチドを投与し、癌細胞の消失を調べることにより評価することができる。
次に、本発明のペプチド又は癌治療用ペプチド（以下、単に「ペプチド」ともいう）をコードする塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子について説明する。上述したように、ヒトアドレノメジュリンは、そのｃＤＮＡ配列が決定されており、その塩基配列を利用し、得ようとするペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを合成することにより得ることができる。
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、適当なベクターに、本発明のペプチドの遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより実施される。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ１３又はＹＣｐ５０等）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルス等の動物ウイルス等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター等が好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞等が用いられる。
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
本発明のペプチドをコードする遺伝子を植物に形質転換し、トランスジェニック植物を得る場合は、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に遺伝子を導入することができる。例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜６００Ｖ、１００μＦ、２０ｍｓｅｃの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等の適当なアグロバクテリウムに導入し、この株をバキュームインフィルトレーション法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｓｅｒ．ＩＩＩ  Ｓｃｉ．Ｖｉｅ，３１６，１１９４−１１９９に記載の方法）等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）自体をそのまま使用するか、切片を調製した後に使用するか、又はプロトプラストを調製して使用する。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＯＳ  １０００／Ｈｅ；ＢｉｏＲａｄ等）を用いて処理する。処理の条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１１００ｐｓｉ程度の圧力、５〜１０ｃｍ程度の距離で行う。
また、形質転換に用いられる植物としては、針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物等いずれであってもよい。
大腸菌等の細菌への組換ベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換ベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換ベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が揚げられる。
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために用いた条件と同様の条件にて行われる。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
本発明のペプチドは、前記形質転換体を培養し、該ペプチドを生成、蓄積し、該ペプチドを採取することにより製造することができる。培養し、前記ペプチドが蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。
例えば、宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロ％ノー留等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鐵、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、浸透培養又は通気攪拌培養等の好気的条件の下で行う。培養温度、培養時間は、宿主が大腸菌の場合、約１５〜４３℃の温度で約１２〜４８時間行う。宿主がバチルス属菌の場合、約３０〜４０℃の温度で約１２〜１００時間行う。宿主が酵母の場合は、約２０〜３５℃の温度で約２４〜１００時間行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることができる。ｐＨの調製を行う必要がある場合、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して培養を行う。例えば、Ｔ７プロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＰＴＧ等を培地に添加して培養を行ってもよい。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＡＡ等を培地に添加してもよい
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する場合、用いられる培地としては、一般に用いられているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、通常、５％程度の二酸化炭素の存在下で約３７℃の温度で１〜３０日間行う。
培養後、本発明のペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。すなわち、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を生成することができる。
こうして得られた本発明のペプチドは、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に断片化することもできる。また、キナーゼ等のタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることもできる。本発明の又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
次に、本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物について説明する。本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物は、本発明のペプチド又は癌治療用ペプチドを含有する。本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物は、医薬的に使用可能な担体と、本発明のペプチド又は癌治療用ペプチドとを含有する。本発明のペプチドの含有量は、必要な患者に投与した際に、癌細胞の成長を抑制し、癌細胞を縮小させ、または治療患者に治療効果を与える量であると定義される。患者に投与すべき投与量は、一般に、患者の体表面積、体重、病状等に基づいて決定される。動物及びヒトにおける薬剤の投与量の相互関係は公知であり、また体表面積は、患者の慎重及び体重から決定することができる。
本発明のペプチドの投与量は、およそ０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ程度である。なお、ペプチドの投与量は、投与方法、賦形剤の量、他の抗癌剤及び放射線治療等の他の治療方法を併用する場合には変えることが好ましい。
本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物は、皮下、腹膜腔内、筋肉内、静脈等の非経口的に投与することができる。非経口投与製剤の形態の例として、例えば等張塩溶液中に、５％程度の濃度のグルコース又は他の公知の医薬的に使用可能な賦形剤と、活性剤を含む水溶液が挙げられる。シクロデキストリン等の可溶化剤や当業者に公知の他の可溶剤を賦形剤として添加してもよい。
本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物は、公知の方法を用いた他の投与方法により製剤中に配合することができる。医薬組成物又は癌治療用医薬組成物は、例えばカプセル、ゲル封入剤または錠剤等の経口投与のための製剤中に配合することもできる。カプセルは、ゼラチンまたはセルロース誘導体等の公知の医薬的に使用可能な材料からなる。錠剤は、本発明のペプチド及び固体担体、ならびに滑剤の混合物を、公知の方法により圧縮することにより得られる。固体担体としては、例えばデンプン、糖ベントナイト等が挙げられる。本発明のペプチドは、例えばバインダーとして乳糖又はマンニトール、及び公知の充填剤及び錠剤化試薬を含む硬殻錠剤又はカプセルの形態で投与することができる。
本発明のペプチド、又は癌治療用ペプチドを含有する医薬組成物、又は癌治療用医薬組成物は、癌治療の目的で用いることができ、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌等の癌の治療に用いることができる。本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物に含まれるペプチド及び癌治療用ペプチドは、癌細胞内に導入されると、癌細胞内における血管新生を阻害し、その阻害効果により癌細胞の増殖を阻害すると考えられる。
本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物の抗癌活性は、例えばマウス等の動物に癌を発生させた後に医薬組成物又は癌治療用医薬組成物を投与し、癌の消失について調べることにより評価することができる。
また、本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物は、本発明のペプチド又は癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する。
本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物の投与方法としては、非ウイルスベクターを用いた投与形態及びウイルスベクターを用いた投与形態とがある。
非ウイルスベクターを用いる場合は、慣用の遺伝子発現ベクターに本発明のペプチド又は癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれた組換発現ベクターを用いて以下のような手法を用いて、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを細胞や組織に導入することができる。細胞への遺伝子導入法としては、リン酸のカルシウム共沈法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法等が揚げられる。
また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、受容体介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。ここで用いられる発現ベクターとしては、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）などが挙げられる。
ウイルスベクターを用いて投与する場合のウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。更に具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれた組換発現ベクターを用いて遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが望ましい。
本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物の患者への導入法としては、医薬組成物を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で医薬組成物を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある
本発明の医薬組成物をｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療対象の細胞、組織、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与することができる。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば、有効成分のＤＮＡを含有した注射剤の場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、場合によっては、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。
また、癌細胞特定的な表面抗原を標的とした導入としては、癌細胞表面に特異的に発現している癌抗原や、正常細胞にも発現しているが癌細胞において特に多く発現している癌抗原（トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体等）を標的として、癌細胞への選択的な導入を行うことが可能である。
このような方法としては、例えば、癌細胞特異的な表面抗原に対するモノクローナル固体をカップリングさせたリポソームで本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する医薬組成物又は癌治療用医薬組成物を包み込み、得られたイムノリポソームを用いることにより、癌細胞に特異的に本発明の医薬組成物を導入することができる。
前記製剤中のＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。
本発明のペプチド又は癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する医薬組成物、又は癌治療用医薬組成物は癌治療の目的で用いることができ、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌等の癌の治療に用いることができる。本発明のペプチド又は癌治療用ペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する医薬組成物、又は癌治療用医薬組成物は、細胞内に導入された後、本発明のペプチドを産生し、癌細胞内における血管新生を阻害し、その阻害効果により癌細胞の増殖を阻害すると考えられる。
本発明のペプチド又は癌治療用ペプチドは、上述のごとく癌治療の目的で用いることができるが、対象となる動物としては特に制限なく、例えばヒト及びその他のほ乳類、例えばラット、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ及びノウサギ等が挙げられる。
本発明の医薬組成物又は癌治療用医薬組成物の抗癌活性は、例えばマウス等の動物に癌を発生させた後に医薬組成物又は癌治療用医薬組成物を投与し、癌細胞の大きさの変化を調べることにより評価することができる。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
各種の癌細胞株を低酸素条件下にて培養し、アドレノメジュリンｍＲＮＡ発現についてノーザンブロット法により調べた。癌細胞株の低酸素下培養は、低酸素培養チャンバー（和研薬工業（株）製）を用いて１％Ｏ２濃度において１２時間培養を行った。また、コントロールとして、２０％Ｏ２濃度における培養も行った。培養後各種癌細胞株よりＴＲＩＺＯＬ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を用いてＲＮＡを抽出した。２０μｇのＲＮＡをｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌにて電気泳動した後、アドレノメジュリン特異的プローブにてハイブリダイズした。結果を図１に示す。
なお、用いた癌細胞株は以下の通りである。
ＫＡＴＯ  ＩＩＩ  胃癌細胞株
ＨＣＴ１１６      大腸癌細胞株
ＤＬＤ１          大腸癌細胞株
ＫＭ−１２        大腸癌細胞株
ＰＣ−６          肺癌細胞株
ＴＡＯＶ          卵巣癌細胞株
ＰＣＩ−１０      膵癌細胞株
ＨｅｐＧ２        肝癌細胞株
ＴＴＯＶ          卵巣癌細胞株
ＰＣＩ−１９      膵癌細胞株
ＰＣＩ−３５      膵癌細胞株
ＰＣＩ−４３      膵癌細胞株
ＢｘＰＣ−３      膵癌細胞株
ＫＭＰ−２        膵癌細胞株
図１は、各種癌細胞から抽出したＲＮＡのノーザンブロット法の結果を示す図である。図１は、アドレノメジュリン特異的プローブと反応する２８Ｓ部分について示す。図１に示すように、低酸素（１％酸素）濃度にて培養した癌細胞（図１においてＨで示す）においては、通常の酸素濃度（２０％酸素）濃度にて培養した癌細胞（図１においてＮで示す）に比べ、アドレノメジュリンのｍＲＮＡが増加することがわかる。なお、この傾向は、特に膵癌細胞において顕著であった
実施例２
ＣＢ１７ｌｃｒ−ｓｃｉｄ  Ｊｌマウス（ＣＬＥＡ  ＪＡＰＡＮ  Ｉｎｃ．）の背部皮下に１０７個のＰＣＩ−４３細胞を移植した。ＰＣＩ−４３細胞が増殖して腫瘍を形成し、７日経過後に腫瘍の直径が５ｍｍを越えたことを確認した。７日経過後に腫瘍の直径が５ｍｍを越えたことを確認した後、７日目より１日に１回ずつ、１６日目まで、アドレノメジュリン、及び本発明のペプチドを５０μｇ（０．１ｍｌの生理食塩水に溶解）ずつ腫瘍内に注入した。なお、本発明のペプチドとしては、配列番号：２に示すものを用いた（以下、本明細書において「アドレノメジュリンアンタゴニスト」ともいう）。このペプチドは、和光純薬工業（株）より購入した。
３日おきに腫瘍の直径を測定した。測定は肉眼で行った。結果を図２に示す。図２は、アドレノメジュリン、アドレノメジュリン及び生理食塩水（Ｖ３）を投与した場合の腫瘍の大きさを示すグラフである。横軸はＰＣＩ−４３を移植してからの日数であり、縦軸は腫瘍の大きさを体積（ｍｍ３）で表わしたものである。グラフの上部の矢印は、アドレノメジュリン、アドレノメジュリン及び生理食塩水を投与したタイミングを示す。ＣＢ１７ｌｃｒ−ｓｃｉｄ  Ｊｌマウスは、それぞれの系において、５匹ずつ用いた。
図２から明らかなように、アドレノメジュリンアンタゴニストを７日目から１６目目まで投与した系においては、腫瘍の大きさが小さくなり、２１日目には肉眼ではほとんど見ることができない程度の大きさになっていた。これに対し、アドレノメジュリン及び生理食塩水を投与した系においては、腫瘍の大きさはほとんど変わらなかった。
実施例３
ＣＢ１７ｌｃｒ−ｓｃｉｄ  Ｊｌマウス（ＣＬＥＡ  ＪＡＰＡＮ  Ｉｎｃ．）の背部皮下に１０７個のＰＣＩ−４３細胞を移植した。ＰＣＩ−４３細胞が増殖して腫瘍を形成し、７目経過後に腫瘍の直径が５ｍｍを越えたことを確認した。７日経過後に腫瘍の直径が５ｍｍを越えたことを確認した後、７日目より３日に１回ずつ、すなわち７日目、１０日目、１３日目及び１６日目に、アドレノメジュリン、及びアドレノメジュリンアンタゴニストを５０μｇ（０．１ｍｌの生理食塩水に溶解）ずつ腫瘍内に注入した。なお、用いたアドレノメジュリン及びアドレノメジュリンアンタゴニストは、実施例１と同じものである。
２１日目にマウスを犠牲死させ、腫瘍を摘出した後、腫瘍の重量を測定した。摘出した腫瘍の写真を図３に示す。また、摘出した腫瘍の重量を測定した結果を図４に示す。
図３から明らかなように、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与した系においては、アドレノメジュリンを投与した系に比較し、腫瘍の大きさは小さくなっていた。また、図４から明らかなように、アドレノメジュリンを投与した系の腫瘍の重量は約０．０５ｇであったのに対し、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与した系においては約０．０３ｇである、腫瘍の重量は約半分に減少した。
実施例４
本発明のペプチドの血管新生に及ぼす影響について調べた。実施例３で用いたマウスの腫瘍組織を用いて実験を行った。マウスの腫瘍組織を取り出し、血管内皮細胞特異的細胞表面マーカーであるＣＤ３１抗原を抗ＣＤ３１抗体を用いて染色した。染色は以下のように行った。なお、実験は５匹のマウスを用いて行った。
腫瘍組織を液体窒素にて凍結し、凍結切片を作製した。凍結切片をアルブミン溶液にて３０分間前処置した後、過酸化水素にて内因性のペルオキシダーゼ活性を抑制した。その後、抗ＣＤ３１抗体にて１時間室温下で処理した。洗浄した後、二次抗体にて１時間処理し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にて発色させた。
染色結果を図５に示す。図５において左側はアドレノメジュリンを投与したマウスの腫瘍組織を染色した結果であり、右側はアドレノメジュリンアンタゴニストを投与したマウスにおける結果である。図５において、茶色く染色されているところが、新生された血管である。図５から明らかなように、アドレノメジュリンを投与した系においては太い血管が新生されているのに対し、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与した系においては、新生された血管は細いものであり、血管新生が阻害されることがわかった。
次に、実施例４において用いた血管内皮細胞の新生された血管を１００個任意に選択し、それぞれの直径を測定した。表１に、新生された血管の直径を２μｍ未満、２μｍ以上８μｍ未満、８μｍ以上、の３グループに分け、それぞれのグループに含まれる血管が何個ずつあるかの結果を示す。また、血管の直径の平均及び標準偏差も表１に示す。表１中、ＡＭはアドレノメジュリン、ＡＭＡはアドレノメジュリンアンタゴニストを示す。
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表１から明らかなように、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与したマウスにおいては、血管の直径が小さくなっており、特に直径の大きい血管はほとんどなく、血管新生が阻害されていることがわかる。また、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与したマウスにおいては、血管の直径はアドレノメジュリンを投与したマウスの１／２であった。
実施例５
本発明のペプチドの細胞増殖に及ぼす影響について調べた。実施例２で用いたマウスの腫瘍細胞のＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ、増殖細胞核抗原）を抗ＰＣＮＡ抗体を用いて染色した。染色方法は実施例４と同様である。なお、実験は５匹のマウスを用いて行った。結果を図６に示す。図６において左側はアドレノメジュリンを投与したマウスの腫瘍細胞を染色した結果であり、右側はアドレノメジュリンアンタゴニストを投与したマウスにおける結果である。
図６から明らかなように、アドレノメジュリンを投与した系においては抗ＰＣＮＡ抗体と反応する細胞が多数存在するのに対し、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与した系においては、抗ＰＣＮＡ抗体と反応する細胞は少ないことがわかった。なお、ＰＣＮＡラベリングインデックスは、アドレノメジュリン、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与した系において、それぞれ２５．８±３．９、及び６．３±５．２であった。すなわち、アドレノメジュリンアンタゴニストを投与したマウスにおいては、アドレノメジュリンを投与したマウスと比較し、増殖細胞は約１／４に減少していた。
以上詳述した通り、本発明のペプチドは、癌細胞内において血管新生を阻害し、その阻害効果により癌細胞の増殖を阻害する活性を有する。本発明のペプチドは、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌等の癌の治療に用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、各種細胞を低酸素条件下にて培養した際の、アドレノメジュリンｍＲＮＡの発現を調べた結果である。
図２は、本発明のペプチドを腫瘍に投与した際の腫瘍の大きさの変化を示すグラフである。
図３は、マウスから摘出した腫瘍の写真である。
図４は、マウスから摘出した腫瘍の重量を測定した結果である。
図５は、腫瘍組織を抗ＣＤ３１抗体を用いて染色した結果を示す写真である。
図６は、腫瘍細胞を抗ＰＣＮＡ抗体を用いて染色した結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月26日(2003.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
（削除）
【請求項３１】
（削除）
【請求項３２】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項３３】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドの一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項３４】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種のペプチド、又は上記ペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項３５】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種のペプチドの一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項３６】
上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌又は膵臓癌である、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項３７】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項３８】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を少なくとも１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドの一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項３９】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失したアミノ酸配列からなるペブチド、及び配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種のペブチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項４０】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜２０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号；１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜１０個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側アミノ酸を１〜５個欠失したアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種のペプチドの一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項４１】
上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌又は膵臓癌である、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の胃癌治療用医薬組成物。
【国際調査報告】
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