(57)【要約】      （修正有）【課題】血清の異常デスカルボキシプロトロンビンを検出するハイスループットのタンパクチップを提供する。【解決手段】タンパクチップの基質スライド上１には複数の検出サブエリア２が設けられ、検出サブエリア２のそれぞれが一つの血清サンプルの検出に使用される。検出サブエリア２のそれぞれに検出スポットエリアとコントロールスポットエリアが設けられる。検出スポットエリアに微量のＤＣＰ特異性抗体を吹き付けることによって形成された検出スポット３がある。コントロールスポットエリアにウシ血清アルブミンを吹き付けることによって形成されたコントロールスポット４がある。同一の検出スポットエリア内の全部の検出スポット３上の物質の濃度が同じである。異常デスカルボキシプロトロンビンを精確に検出することができるので、臨床に使用される場合、高感度、短時間、便利で経済的であるなどの利点がある。【選択図】図１
0003212507.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
血清の異常デスカルボキシプロトロンビン（以下「ＤＣＰ」）を検出するハイスループットのタンパクチップであって、
前記タンパクチップの基質スライド上には複数の検出サブエリアが設けられ、
前記検出サブエリアのそれぞれが一つの血清サンプルの検出に使用され、
前記検出サブエリアのそれぞれに検出スポットエリアとコントロールスポットエリアが設けられ、
前記検出スポットエリアに微量のＤＣＰ特異性抗体を吹き付けることによって形成された検出スポットがあり、
前記コントロールスポットエリアにウシ血清アルブミンを吹き付けることによって形成されたコントロールスポットがあり、同一の検出スポットエリア内の全部の検出スポット上の物質の濃度が同じであり、
前記検出スポットのそれぞれを形成するＤＣＰ特異性抗体の総量は３−５ｎｌで、濃度は３−５ｍｇ／ｍｌであり、それぞれの検出スポットは非接触型スポッターにより前記ＤＣＰ特異性抗体を６−１０回に分けて３００−５００ｐｌずつ吹き付けるように形成され、検出スポットの直径は０.５−１ｍｍである、ことを特徴とするタンパクチップ。
【請求項２】
前記検出スポットエリアのそれぞれは１列に並べられた４−８個の互いに隔離された検出スポットからなり、
前記コントロールスポットエリアのそれぞれは１列に並べられた４−８個の互いに隔離されたコントロールスポットからなり、
前記検出スポットとコントロールスポットが平行に両列に並べられることを特徴とする請求項１に記載のタンパクチップ。
【請求項３】
チップの長さ、幅、厚さが７６.４ｍｍ、２５.２ｍｍ、１ｍｍであり、
前記基質スライド上には検出サブエリアが１０個設けられることを特徴とする請求項２に記載のタンパクチップ。
【請求項４】
前記検出サブエリアの間には物理的遮断として凸部が設けられることを特徴とする請求項２に記載のタンパクチップ。
【請求項５】
前記ＤＣＰ特異性抗体はマウス抗ヒトＤＣＰであることを特徴とする請求項１に記載のタンパクチップ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパクチップと、ＨＲＰ標識プロトロンビンポリクローナル抗体と、ＨＲＰ化学発光基質液と、を含み、血清の異常デスカルボキシプロトロンビンを検出するキットであって、
前記ＨＲＰ標識プロトロンビンポリクローナル抗体はウサギ抗体で、前記検出スポット上に固定されたＤＣＰ特異性抗体とは異種由来であることを特徴とするキット。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案はタンパク検出技術に関し、特に血清の異常デスカルボキシプロトロンビンを検出するタンパクチップ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
デス-γ-カルボキシプロトロンビン（Des-γ-carboxy-prothrombin，ＤＣＰ）は肝細胞癌から生成された異常なプロトロンビンであり、正常なプロトロンビンに比べて、ＤＣＰの分子構造の特徴は、そのアラニンドメイン（Gla domain）中の一つあるいは複数のアラニン（Glu）残基が完全にGlaへカルボキシ化されていないため、凝固の機能を失っている。
【０００３】
正常なプロトロンビンは肝細胞ミクロソームの中で、主にビタミンＫのγ-グルタミルカルボキシラーゼ及補酵素とVitamin Ｋ reductase の関与の下で、構造Gla domainの中の第６，７，１４，１６，１９，２０，２５，２６，２９，和３２サイトの１０個のGlu残基をGlaにカルボキシル化して、活性プロトロンビンになり、前記いずれか一つのサイトあるいは複数のサイトのGlu残基のカルボキシル化が不完全の場合、ＤＣＰを生成でき、プロトロンビンに凝固の機能を失わせる。
【０００４】
研究によって、原発性肝癌の血清の中にＤＣＰが明らかに上がっていることが分かった。陸楓林らにより発表された『デス-γ-カルボキシプロトロンビンが原発性肝細胞癌に対する診断価値』中国腫瘍臨床ジャーナル  ２００９年０７期に開示されるように、ＤＣＰ値が腫瘍の大きさと正相関関係を呈している。このため、精確に血清の中のＤＣＰレベルをモニターすることは、臨床医師の予断、治療方案の選択及び治療効果の観測に対して重要な意義を持っている。臨床の検出には、病院側が日々大量なサンプルを検出することが必要のため、ハイスループットチップ検出は検出の効率を大幅に高められる。つまり、低コスト、迅速で効率的に、精確かつハイスループットの検出手段がベスト選択であるが、今現在ハイスループット検出ＤＣＰに関する記事がなかった。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００５】
本考案はタンパクチップ領域の血清ＤＣＰ検出の空白に基づいて、検出の精確性と感度と特異性を確保する上で、最大限に抗体と血清の用量を節約して臨床用に適応し、短時間、経済的で精確かつ便利である利点を有する血清の中のＤＣＰの検出に向いているハイスループットタンパクチップ、キット及びその作製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本考案の実施態様は以下に示す。
本考案の一側面が提供する血清の異常デスカルボキシプロトロンビンを検出するタンパクチップは、以下の特徴を有する。
前記タンパクチップの基質スライド上には複数の検出サブエリアが設けられ、前記検出サブエリアのそれぞれが一つの血清サンプルの検出に使用され、前記検出されるサブエリアのそれぞれに検出スポットエリアとコントロールスポットエリアが設けられる。前記検出スポットエリアに微量のＤＣＰ特異性抗体を吹き付けることによって形成された検出スポットがあり、前記コントロールスポットエリアにウシ血清アルブミンを吹き付けることによって形成されたコントロールスポットがあり、同一の検出スポットエリア内の全部の検出スポット上の物質の濃度が同じである。
【０００７】
前記検出スポットのそれぞれを形成するＤＣＰ特異性抗体の総量は３−５ｎｌで、濃度は３−５ｍｇ／ｍｌであり、それぞれの検出スポットが非接触型スポッターにより前記ＤＣＰ特異性抗体を６−１０回に分けて３００−５００ｐｌずつ吹き付けるように形成され、検出スポットの直径は０.５−１ｍｍである、ことを特徴とする。
【０００８】
前記検出スポットエリアのそれぞれが１列に並べられた４−８個の互いに隔離された検出スポットからなり、前記コントロールスポットエリアのそれぞれが１列に並べられた４−８個の互い独自に隔離されたコントロールスポットからなり、前記検出スポットとコントロールスポットが平行に両列に並べられることが好ましい。
【０００９】
チップの長さ、幅、厚さが７６.４ｍｍ、２５.２ｍｍ、１ｍｍであり、前記基質スライド上には検出サブエリアが１０個設けられることが好ましい。
前記検出サブエリアの間には物理的遮断として凸部が設けられることが好ましい。
前記ＤＣＰの特異性モノクローナル抗体はマウス抗ヒトＤＣＰであることが好ましい。
【００１０】
本考案のさらに一側面が提供する血清の異常デスカルボキシプロトロンビンを検出するためのタンパクチップの作製方法は、前記検出スポットのそれぞれを形成するためのＤＣＰ特異性抗体の総量が３ｎｌで濃度が４ｍｇ／ｍｌであり、前記ＤＣＰ特異性抗体を６−１０回に分けて３００−５００ｐｌずつ吹き付けることにより一つの前記検出スポットを形成し、検出スポットの直径は０.５−１ｍｍである、ことを特徴とする。
【００１１】
前記作製方法において、吹き付けの過程中に用いられる前記特異性抗体の温度が４−８℃であることが好ましい。
非接触型スポッターを使用して吹き付けスポッティングを行うことが好ましい。
【００１２】
本考案は前記タンパクチップに基づいて、前記いずれか一項に記載のタンパクチップ、及びＨＲＰ標識プロトロンビンポリクローナル抗体と、ＨＲＰ化学発光基質液と、を含め、前記ＨＲＰ標識プロトロンビンポリクローナル抗体はウサギ抗体で、前記検出スポット上に固定されたＤＣＰ特異性抗体とは異種由来である、ことを特徴とする血清の異常デスカルボキシプロトロンビンを検出するキットをも提供する。
【００１３】
本考案はＤＣＰを検出する化学発光タンパクチップを提供し、抗体抗原抗体サンドイッチ反応原理及び化学発光原理に基づいて、ＤＣＰ特異性抗体をチップスライダに吹き付けて検出スポットを形成し、血清の中のＤＣＰ（プロトロンビンの異常デスカルボキシル部分）と結合させるとともに、コントロールスポットが設けられている。
【００１４】
図１に示すように、本考案の一つの好ましい実施例には、一つの前記検出サブエリア２内にＤＣＰ特異性抗体が固定される検出スポット３とコントロールスポット４をそれぞれ４つ含めていて、検出スポット３とコントロールスポット４はそれぞれ平行に両列に並べられている。
【００１５】
一方、本考案は前記タンパクチップ及び化学発光の従来の試薬を含めるＤＣＰを検出する化学発光キットをも提供する。
【００１６】
本考案のタンパクチップの使用には三つの面の優勢を持っている。
一、血清の中のＤＣＰを検出する。
二、同時に複数のサンプルを検出できる。複数の重複しているサンプル、或いは異なる時間でスポットされたサンプルを検出してダイナミック値を取り、或いは異なるサンプルごとに検出し、ハイスループットの検出が実現される。
全体的に検出コストが下がり、検出の効率が高められる。
【００１７】
三、本考案のタンパクチップを使用すると、必要とする血液サンプルと抗体の量が大幅に減ることになる。スポッティングスポットのそれぞれには、毎回３００−５００ｐｌ、スポットごとに６−１０回、合計３ｎｌのスポッティング抗体が使用される。検出サブエリアのそれぞれには４つの検出スポットが設けられ、１２ｎｌの捕捉抗体が必要することになり、スポッティングの均一性が保証されるため、中空現象の発生を効果的に減らせる。しかもオリジナル血清量或いは希釈された血清を１０μlだけが必要になるのに対して、現在の他の免疫原理の検出方法では、抗体が大量に使用される他、オリジナル血清量或いは希釈された血清を少なくとも５０μlが必要である。
【００１８】
最後に、本考案はさらに前記キットを利用して血清に対するＤＣＰ検出を行う方法を提供する。
【００１９】
実験結果によれば、本考案の方法は発光強度によりプロトロンビンとＤＣＰを検出できることを証明した。
ＥＬＩＳＡ方法に比べると、感度と特異性がともに優れていて、時間の面から比べれば、ＥＬＩＳＡ検出は少なくとも３時間が必要することに対して、本考案の場合１.５時間だけになり、検出に必要とする血清量から比べれば、オリジナル血清量或いは希釈された血清を１０μlだけが必要になるが、ＥＬＩＳＡ方法はオリジナル血清量或いは希釈された血清を少なくとも５０μlが必要であり、捕捉抗体の用量から比べれば、必要量がＥＬＩＳＡ方法よりかはるかに低い。本考案のチップが非接触型インジェスト式スポッティング法を使用し、検出スポットのそれぞれに３００−５００ｐｌずつスポットごとに６−１０回、合計３ｎｌのスポット抗体を吹き付け、検出スポットの直径は０.５−１ｍｍである。
【００２０】
検出グリッドのそれぞれは４つの検出スポットがあり、１２ｎｌの捕捉抗体が必要になり、精確に吹き付けの体積をコントロールして、複数回吹き付けることによって、スポッティングの均一性が保証され、有効に中空現象の発生を抑えて、検出精度が大幅に高めるとともに、抗体の使用量と血清の用量が節約され、検出コストと費用が下がる。
このため、本考案が提供するキットと検出方法は、高感度、短時間、経済的などの特徴を持っていて、血液タンパク検出のコストと時間を大幅に下げることができる。
【００２１】
以上で、本考案の方法は異常デスカルボキシ特異抗体と、化学発光検出方法およびタンパクチップ技術の応用を結び付けて、キットによるＤＣＰ検出結果の高感度、精確性、効率性と低コストを確保する。本考案が提供する検出方法は実施可能、信頼でき、経済的、かつ、簡単で、時間の短縮になる方法である。本考案の実施形態は大規模でハイスループットの血清の中のＤＣＰの検出に経済的で信頼性の高いキットと検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＤＣＰタンパク質チップの構造図であり、その中、１が基質スライド、２が検出サブエリア、３が検出スポット、４がコントロールスポット、５が物理的遮断である。
【図２】ＤＣＰ抗体サンドイッチ法によるタンパク質チップのフローチャートである。
【図３】ＤＣＰ抗体スポットチップによる肝癌と正常な血清サンプルの検出のスキャン図であり、その中、１−８が肝癌血清、９が健康コントロール血清、１０がブランクコントロールである。
【考案を実施するための形態】
【００２３】
＜実施例１タンパク質チップ１−４の作製及び検証＞
主な設備
化学発光スキャナー、アメリカＧＥ会社製。
【００２４】
主要の試薬及びその出処
マウスモノクローナル抗体ＤＣＰ抗体（日本富士レビオ株式会社公司）、アルデヒドチップ（上海百傲公司）、ＨＲＰ標識プロトロンビンウサギ抗体（アメリカFitzgerald会社）、ＨＲＰ化学発光基質液Ａ液とＢ液を１：１の比率で混ぜて新しく調製する。（アメリカMillipore会社）。
異常プロトロンビン標準品：日本富士レビオ株式会社公司。
実験に使用される試薬と設備：ＤＣＰ抗体（日本富士レビオ株式会社公司）；ＨＲＰ標識プロトロンビンウサギ抗体（アメリカFitzgerald会社）；化学発光スキャナー。（アメリカＧＥ会社）。
【００２５】
ＰＢＳ調合法：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）８ｇ、塩化カリウム（ＫＣｌ）０.２ｇ、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）１.４４ｇ、
リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）０.２４ｇ、調節ｐＨ７．４、定容１Ｌ
ＰＢＳＴ調合法：ＰＢＳ,１Ｌ＋Tween-２０，１ｍｌ
基質スライド１はアルデヒドチップ（上海百傲公司）、チップごとに１０個の検出グリッド（検出サブエリア）を含め、グリッドごとに一つの血清を検出し、一回の検出に１０部の血清を検出し、長さ×幅×厚さが７６.４×２５.２×１ｍｍである。
【００２６】
ステップ１．チップ１−４を作製する
検出サブエリア２のそれぞれに検出スポットエリアとコントロールスポットエリアが設けられ、前記検出スポットエリアに微量のＤＣＰ特異性抗体を吹き付けることによって形成された検出スポット３があり、前記コントロールスポットエリアに濃度が４ｍｇ／ｍｌであるウシ血清アルブミンを吹き付けることによって形成されたコントロールスポット４がある。ＤＣＰ抗体スポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌである。
【００２７】
スポッティング仕様を以下に示す。
チップ１：検出グリッドのそれぞれに、マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに１０μlの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（bovine serum albumin，ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに１０μl；
チップ２：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに５μｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに５μｌ；
チップ３：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに１μｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに１μｌ；
チップ４：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに１００ｎｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに１００ｎｌ；
従来の接触型スポッティング方式を使用する。
【００２８】
ステップ２.検量線と標準品を使ってチップを検証する
標準品の作製：
正常の血清へシリーズの勾配濃度の異常プロトロンビン標準品とテスト用の標準品を添加する。
標準品血清：０ｍＡＵ／ｍｌ、５ｍＡＵ／ｍｌ、１０ｍＡＵ／ｍｌ、２０ｍＡＵ／ｍｌ、４０ｍＡＵ／ｍｌ、８０ｍＡＵ／ｍｌ、１６０ｍＡＵ／ｍｌ、３２０ｍＡＵ／ｍｌ、６４０ｍＡＵ／ｍｌ；
テスト用の標準品血清：０ｍＡＵ／ｍｌ、２ｍＡＵ／ｍｌ、４ｍＡＵ／ｍｌ、８ｍＡＵ／ｍｌ、１６ｍＡＵ／ｍｌ、３５ｍＡＵ／ｍｌ、５０ｍＡＵ／ｍｌ、７０ｍＡＵ／ｍ、９０ｍＡＵ／ｍｌ、１２０ｍＡＵ／ｍｌ、１５０ｍＡＵ／ｍｌ、３００ｍＡＵ／ｍｌ；
【００２９】
タンパクチップ操作の流れ：
未検サンプル１０μｌ（２.５μｌの血清をＰＢＳで４倍希釈して得たものでもよい）をチップの個々検出サブエリアにスポットし、３７℃で３０分インキュベートしたあと、抗体と抗原が互いに結合する特徴を利用し、血清の中のＤＣＰとＤＣＰ抗体を結合させて抗原抗体複合体を生成する。
ＰＢＳＴで４回洗浄し、非特異結合を取り除いたあと、ＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識ウサギ一次抗体を入れて、３７℃で３０分インキュベートする。ウサギ抗体は抗原と結合して、ＤＣＰ抗体―ＤＣＰ−ウサギＨＲＰ標識プロトロンビン抗体複合体を生成する。
ＰＢＳＴで４回洗浄し、非特異結合を取り除いたあと、ＨＲＰ発光基質を入れて、３７℃で３０分インキュベートし、化学発光スキャンナーでスキャンして検出スポットの画素値を取る。
【００３０】
固相キャリア上の化学発光画素は標本の中に検出を受けた抗原の量と正の相関を呈し、チップ捕捉スポッディング抗体（マウス一次抗体）と検出用の抗体（ウサギ一次抗体）は異種の動物から採集され、プロトロンビンの異なる抗原エピトープを狙っている。図２は抗体サンドイッチ法によるタンパクチップのフローチャートである。
【００３１】
標準品血清の濃度を横軸、画素値を縦軸として、検量線を作るとともに、検量線回帰方程式を作成する。
チップ１−４による検量線回帰方程式の相関係数の二乗値Ｒ2は０.５５−０.６の間にあり、標準品濃度と画素値の間のリニア相関性が低い。
【００３２】
調製された他のシリーズの異なる濃度のテスト標準品血清を使って検量線を検証したところ、得た結果がテスト標準品血清自身の濃度と大きな差が現われて、その中でも濃度が８０ｍＡＵ／ｍｌより低いテスト標準品血清の検出数値が何回繰り返しても３０ｍＡＵ／ｍｌより低く、診断判定値である４０ｍＡＵ／ｍｌを下回り、偽陰性を呈していた。
【００３３】
ステップ３：ＤＣＰの含有量が既知である臨床血清を使ってこれらのチップを検証する。血清サンプルは以下に示すようである。
肝癌血清３５部：北京医科大学付属佑安病院標本銀行から提供され、その異常デスカルボキシプロトロンビンの濃度が診断判定値４０ｍＡＵ／ｍｌ（ｌｍＡＵ／ｍｌ＝１ｎｇ／ｍｌ）より高いことが知られている。
正常の健康者の血清２８部；異常デスカルボキシプロトロンビンの濃度が異常デスカルボキシプロトロンビン濃度より低い。
ブランクコントロール７部（ブランクコントロールは１×ＰＢＳ）、検出結果は以下の表１に示す。
【００３４】
【表１】
0003212507.tif 000003
【００３５】
表１の結果から分かるように、ブランクコントロールの９部からＤＣＰを検出しなかった。健康血清の２８部からＤＣＰを検出しなかった。肝癌血清の３５部のうち、僅か２０−２４部からＤＣＰが閾値を上回ることを検出したので、つまり、これらのチップが（２０〜２４）／３５＝５７.１％〜６８.６％の検出感度を有していて、検出漏れの比率が非常に高い。
【００３６】
＜実施例２.チップ５−７の作製及び検証＞
ステップ１．チップを作製する
チップ５：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに１０ｎｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに１０ｎｌ；
コントロールチップ６：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに５ｎｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに５ｎｌ；
コントロールチップ７：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに２ｎｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに２ｎｌ；
【００３７】
コントロールチップ５−７に対しては、ドイツＧＥＳＩＭ会社Nano-Plotter Ｎｐ２.１型番非接触型皮昇級スポッターを使用し、圧電スポットピンを使って、スポッターのキャビン内部の温度を４−８℃に制御する。
【００３８】
ステップ２の段取りと実験試薬は実施例１と同じである。
チップ５−７による検量線回帰方程式の相関係数の二乗値Ｒ2はだんだん６.５−７.５の間まで上り、標準品濃度と画素値の間のリニア関係が著しく改善されることが看取される。
調製された他のシリーズの異なる濃度のテスト標準品血清を使って検量線を検証したところ、得た結果がテスト標準品血清自身の濃度との差が縮めて、最も低い検出限界が４ｍＡＵ／ｍまで及ぶ。
【００３９】
ステップ３.既知の臨床血清検証チップを使用する。
血清は実施例１のステップ３と同じで、検出結果の統計を表２に示す。
【００４０】
【表２】
0003212507.tif 000004
【００４１】
表２の結果から分かるように、ブランクコントロールの９部からＤＣＰを検出しなかった。健康血清の２８部からＤＣＰを検出しなかった。肝癌血清の３５部のうち、２７−３０部からＤＣＰが閾値を上回ることを検出したので、これらのチップが（２７〜３０）／３５＝７７.１％〜８５.７％の検出感度を有していて、検出率が著しく上がったが、まだ相当比率の検出漏れが存在している。ステップ２のテスト標準品血清の検証状況と結び合わせると、検出限界が足りないことが検出漏れにつながるという仮結論が得られる。
【００４２】
並行実施例では、さらにスポット量を下げるが、作製による検量線には、さらなる標準品濃度と画素値の間のリニア関係の改善が未だに看取されていない。テスト標準品血清及び臨床血清のテストについても、チップ５−７と比べて顕著に改善されていない。
【００４３】
＜実施例３.チップ８−１０の作製及び検証＞
発明者が抗体の精製や試薬処方から検出の温度や時間などまで多方面に試みていたが、いずれも標準品濃度と画素値の間のリニア関係のさらなる改善が看取されず、検出率が９０％を突破しがたい。偶然の試験で、発明者は抗体のスポッティングを微量に分けて複数回行うようにスポッティングして得たチップが、実施例２に対して他の条件が変わらない場合、検量線相関係数Ｒ2が予想外に０.９−０.９５まで躍進し、検出率も従って９２−９５％まで上がった。具体的には以下に示す。
【００４４】
ステップ１．チップ８と９の作製
チップ８：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに３ｎｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに５ｎｌ；
ドイツＧＥＳＩＭ会社Nano-Plotter Ｎｐ２.１型番非接触型皮昇級スポッターを応用し、圧電スポットピンを使って、スポッターのキャビン内部の温度を４−８℃に制御し、３００−５００ｐｌずつスポットごとに３−５回、合計３ｎｌのスポット抗体を吹き付けて、検出スポットの直径は０.５−１ｍｍである。チップの構造は、図１に示すようである。
【００４５】
チップ９：マウスＤＣＰモノクローナル抗体のスポッティング濃度は４ｍｇ／ｍｌで、検出スポットごとに５ｎｌの抗体；１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとし、コントロールスポットごとに５ｎｌ；
ドイツＧＥＳＩＭ会社Nano-Plotter Ｎｐ２.１型番非接触型皮昇級スポッターを応用し、圧電スポットピンを使って、スポッターのキャビン内部の温度を４−８℃に制御し、３００−５００ｐｌずつスポットごとに６−１０回、合計３ｎｌのスポット抗体を吹き付けて、検出スポットの直径は０．５−１ｍｍである。
【００４６】
ステップ２の段取りと実験試薬は実施例１と同じである。
チップ８或いは９による検量線回帰方程式の相関係数の二乗値Ｒ2は９.２−９.５の間まで躍進し、標準品濃度と画素値の間のリニア関係が非常に著しく改善されている。
調製された他のシリーズの異なる濃度のテスト標準品血清を使って検量線を検証したところ、得た結果がテスト標準品血清自身の濃度と僅かの差しかなく、誤差許容範囲内にある。
【００４７】
ステップ３.既知の臨床血清検証チップを使用する。
血清は実施例１のステップ３と同じで、検出結果の統計を表３に示す。
【００４８】
【表３】
0003212507.tif 000005
【００４９】
表３の結果から分かるように、ブランクコントロールの７部からＤＣＰを検出しなかった。健康血清の２８部からＤＣＰを検出しなかった。肝癌血清の３５部のうち、３３部からＤＣＰが閾値を上回ることを検出したので、つまり、これらのチップが（３３〜３４）／３５＝９４.３％〜９７.１％の検出感度を有していて、検出率が１００％に近い。
【００５０】
＜実験例  ベストチップ態様の応用効果＞
検量線回帰方程式の相関係数Ｒ2は０.９８である。
血清サンプル：
肝癌血清８部：北京医科大学付属佑安病院標本銀行から提供され（その異常デスカルボキシプロトロンビンの濃度が診断判定値４０ｍＡＵ／ｍｌ（ｌｍＡＵ／ｍｌ＝１ｎｇ／ｍｌ）より高いことが知られている）；
正常の健康者の血清１部；
ブランクコントロール１部（ブランクコントロールは１×ＰＢＳ）。
【００５１】
本チップの検出結果：
ブランクコントロールと健康コントロールから異常プロトロンビンが検出されていないので、本実験に使用されたチップが有効であることを証明した。正常な人体内に異常プロトロンビンが存在しないため、健康血清からはプロトロンビンを検出しなかった。本考案が提供するチップ及び方法で検出される偽陽性は０で、検出結果が高精度に肝癌血清と正常血清を区別できることを説明した。
【００５２】
肝癌血清の８部の検出スポットのスキャン及び計算結果は陽性を示すことは、８部の肝癌血清のうち、特に肝癌末期の患者体内には異常デスカルボキシプロトロンビンがあることを証明し、８つの陽性検出サブエリアの検出スポットが異なる程度の亮度を示すことは、８部の肝癌血清が異なる濃度の異常デスカルボキシプロトロンビンを含むことを証明する。例えば図３に示すように、そのうち、３と５は弱陽性を示し、検出スポットが微かに光るのに対して、１，２，４，６，７，８は全て強い陽性を示している。
検出結果によれば、本考案のタンパクチップが高精度に肝癌血清を検出でき、そして半定量的に血清の中の異常デスカルボキシプロトロンビンの濃度を検出できることを証明した。前記データによると、本考案のチップと方法の精確性と信頼性が高いことを証明した。その他の数十部の外来診療で肝癌に確診された患者の血清の検出では、検出感度と特異性が９０％以上である。
【００５３】
本考案のキットは、「一部のチップは検出サブエリア２の間には物理的遮断として凸部が設けられることが好ましい実施例３に示すチップ」と、ＨＲＰ標識プロトロンビンポリクローナル抗体と、ＨＲＰ化学発光基質液と、を含む。前記ＨＲＰ標識プロトロンビンポリクローナル抗体はウサギ抗体で、前記検出スポット上に固定されたＤＣＰ特異性抗体とは異種由来である。
【符号の説明】
【００５４】
１・・・基質スライド
２・・・検出サブエリア
３・・・検出スポット
４・・・コントロールスポット
５・・・物理的手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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