(57)【要約】本発明は、α−ヘリックス構造モデルにおいて、交互に配置された二つの疎水面と二つの親水面の４つの面から構成される特定構造をもつ１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチド、それとペプチド結合物質との複合体、該ＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー、及びそれらの製造方法、並びにＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーに結合もしくは包含させた物質を細胞内へ送達する方法を提供する。本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドは、安全性が高く、ペプチドと結合する物質との複合体の作製が容易（優れた操作性）であり、複合体の溶解性に優れた、細胞へのペプチドと結合する物質の導入選択性が優れ、導入効率が高いベクターとなり、ＰＥＧ化学修飾による比活性が低下しない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１８アミノ酸からなる配列を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化学修飾ペプチドであって、
前記１８アミノ酸からなる配列が、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、交互に配置された二つの疎水面と二つの親水面の４つの面から構成され、
前記疎水面の１つが５〜７アミノ酸から構成され、かつ疎水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であり、
前記親水面の１つが５〜６アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であって、かつアルギニン又はリジンから選ばれるアミノ酸の構成比率が５０モル％以上であり、
前記疎水面の別の１つが２〜４疎水性アミノ酸から構成され、
前記親水面の別の１つが３〜５アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上である、ＰＥＧ化学修飾ペプチド。
【請求項２】
全アミノ酸数が２０以上であって、両端がＮ末端及びＣ末端であり、両端のアミノ酸を除いた任意の連続した１８アミノ酸が、前記１８アミノ酸からなる配列を示す請求項１に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端及びＣ末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である請求項１又は２に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
【請求項４】
前記１８アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連続した１８アミノ酸配列である請求項１〜３のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６
但し、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８、及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつそのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
【請求項５】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、下記のアミノ酸配列からなる請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７
但し、
Ｘ１及びＸ３７は親水性アミノ酸であり、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、［Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつ、そのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
【請求項６】
前記Ｘ１〜Ｘ３７が下記のアミノ酸である請求項５に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
Ｘ１はトレオニンであり、
Ｘ３７はセリンであり、
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３及びＸ２１はそれぞれチロシン、フェニルアラニン、セリン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１５、Ｘ２４、及びＸ３３はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、
Ｘ７、Ｘ１３、Ｘ２５、及びＸ３１はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ１０及びＸ２８はそれぞれセリン、アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
Ｘ１１及びＸ２９はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
Ｘ１２及びＸ３０はそれぞれバリン、ロイシン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１４及びＸ３２はそれぞれグルタミン、アスパラギン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれアラニン又はアルギニンであり、
Ｘ１８はアルギニン、リジン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１９はロイシン又はトレオニンであり、
Ｘ３６はアルギニン又はセリンである。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
【請求項７】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１〜２４のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
【請求項８】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１６又は１９のアミノ酸配列からなる請求項１〜６のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
【請求項９】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのＰＥＧ部分の分子量が、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａである請求項１〜８のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
【請求項１０】
以下の１８アミノ酸からなる配列を含むＰＥＧ化学修飾ペプチド、及び、ペプチドと結合する物質を含有する複合体であって、
前記１８アミノ酸からなる配列が、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、交互に配置された二つの疎水面と二つの親水面の４つの面から構成され、
前記疎水面の１つが５〜７アミノ酸から構成され、かつ疎水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であり、
前記親水面の１つが５〜６アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であって、かつアルギニン又はリジンから選ばれるアミノ酸の構成比率が５０モル％以上であり、
前記疎水面の別の１つが２〜４疎水性アミノ酸から構成され、
前記親水面の別の１つが３〜５アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上である複合体。
【請求項１１】
全アミノ酸数が２０以上であって、両端がＮ末端及びＣ末端であり、両端のアミノ酸を除いた任意の連続した１８アミノ酸が、前記１８アミノ酸からなる配列を示す請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｎ末端及びＣ末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である請求項１０又は１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記１８アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連続した１８アミノ酸配列である請求項１０〜１２のいずれかに記載の複合体。
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６
但し、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８、及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつそのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
【請求項１４】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、下記のアミノ酸配列からなる請求項１０〜１３のいずれかに記載の複合体。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７
但し、
Ｘ１及びＸ３７は親水性アミノ酸であり、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつ、そのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
【請求項１５】
前記Ｘ１〜Ｘ３７が下記のアミノ酸である請求項１４に記載の複合体。
Ｘ１はトレオニンであり、
Ｘ３７はセリンであり、
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３及びＸ２１はそれぞれチロシン、フェニルアラニン、セリン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１５、Ｘ２４、及びＸ３３はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、
Ｘ７、Ｘ１３、Ｘ２５、及びＸ３１はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ１０及びＸ２８はそれぞれセリン、アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
Ｘ１１及びＸ２９はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
Ｘ１２及びＸ３０はそれぞれバリン、ロイシン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１４及びＸ３２はそれぞれグルタミン、アスパラギン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれアラニン又はアルギニンであり、
Ｘ１８はアルギニン、リジン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１９はロイシン又はトレオニンであり、
Ｘ３６はアルギニン又はセリンである。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
【請求項１６】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１〜２４のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１５のいずれかに記載の複合体。
【請求項１７】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１６又は１９のアミノ酸配列を含む請求項１０〜１５のいずれかに記載の複合体。
【請求項１８】
ペプチドと結合する物質が核酸である、請求項１０〜１７のいずれかに記載の複合体。
【請求項１９】
前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのＰＥＧ部分の分子量が、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａである請求項１０〜１８のいずれかに記載の複合体。
【請求項２０】
１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと活性化ポリエチレングリコールとを反応させる、請求項１〜９のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドの製造方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法により製造される、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により化学修飾されたペプチド。
【請求項２２】
ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを反応させる工程、
ｂ）前記ａ）により得られるＰＥＧ化学修飾ペプチドと、ペプチドと結合する物質とを反応させる工程、
よりなる、請求項１０〜１９のいずれかに記載の複合体の製造方法。
【請求項２３】
ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、ペプチドと結合する物質とを反応させる工程、
ｂ）前記ペプチドと前記ペプチドと結合する物質との反応物を、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる工程、
よりなる、請求項１０〜１９のいずれかに記載の複合体の製造方法。
【請求項２４】
請求項２２又は２３の方法により製造される、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により化学修飾されているＰＥＧ化学修飾ペプチドとペプチドと結合する物質との複合体。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー。
【請求項２６】
ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチド、若しくは１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインが結合したペプチドと、活性化ＰＥＧとを反応させる工程、
ｂ）前記ａ）により得られる反応物とキャリアーとを反応させる工程、若しくは、前記ａ）により得られる反応物を構成要素としてキャリアーを構築する工程、
よりなる、請求項２５に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーの製造方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法により製造されるＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー。
【請求項２８】
請求項２５に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーに結合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、交互に配置された２つの疎水面と２つの親水面とで構成され、２つの親水面のうち少なくとも１つの面が正荷電面である、１８アミノ酸からなる配列を含む、ポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と略記する）により化学修飾されたペプチド（本明細書において、「ＰＥＧ化学修飾ペプチド」と略記する）、及び、その製造方法に関する。
また、本発明は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドと、ペプチドと結合する物質との複合体、及び、その製造方法に関する。
また、本発明は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー、及び、その製造方法に関する。
また、本発明は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーに結合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法に関する。
背景技術
病原微生物、病原性ウイルスやヒトの全遺伝子配列が解明されつつある今日、得られた遺伝情報を基に疾患の治療を行う試みが盛んに為されるようになり、そのひとつとして、ＤＮＡやＲＮＡ及びこれらの誘導体、修飾体や改変体、いわゆる核酸を体内に投与する治療法が試みられている。これは、核酸を体内に投与することによって特定の遺伝子の発現量や特定の生理活性因子の機能発現を増減させたり、あるいは、導入した核酸がコードする生理活性物質を体内で産生させることにより疾患の治療を行うものであるが、多くの場合、核酸の細胞内への導入効率を高める手段としてベクター（導入剤）が用いられている。
これらベクターの代表例の一つは、ウイルスベクターである。ウイルスが元来有する細胞への感染能力を利用するもので、一例としてレトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターを挙げることができ、応用例として、アデノシンデアミナーゼ欠損症の遺伝子治療を目的としたアデノシンデアミナーゼ遺伝子の導入（Ｂｌａｅｓｅ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｓｅ，Ｖｏｌ．２７０，４７５（１９９５））や癌の治療を目的としたｐ５３遺伝子の導入（Ｓｗｉｓｈｅｒ  Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，Ｖｏｌ．９１，７６３（１９９９））を挙げることができる。しかしながら、ウイルスベクターは、細胞への核酸の導入効率は高いものの野生型ウイルス（病原性ウイルス）の出現や高い抗原性による重篤な免疫応答の誘導が知られており、安全性の面で大きな不安材料を抱えている。さらに、ベクターの作製工程が極めて複雑であり一般的に工業化することが難しいという問題点がある。
もう一つのベクターの代表例は、リポソームベクターである。荷電したリポソームが細胞に付着して取込まれる性質を利用したもので、リポソームの中に核酸が封入されたものや、核酸の周囲にリポソームが付着塊を形成しているものが知られている。リポソームの中に核酸が封入されたものの応用例としては脳腫瘍の治療を目的としたインターフェロンβ遺伝子の導入（Ｍ．Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５０，７８２６（１９９０））を挙げることができ、また、核酸の周囲にリポソームが付着塊を形成させる方法の応用例としては細胞工学実験で多用されている培養細胞への遺伝子導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．８４，７４１３（１９８７））を挙げることができる。リポソームベクターは、構成成分の主体が天然のリン脂質である場合には安全性の面ではウイルスベクターよりもはるかに優れているものの、ベクターの作成工程及びベクターと核酸との複合体の作製工程が複雑、細胞への核酸の導入効率が低いという問題点がある。また、リポソームの構成成分が合成脂質である場合には細胞への核酸の導入効率及び操作性は改善されるものの毒性が出現するという問題点がある。さらに、いずれのリポソームも、核酸との複合体形成後の保存性が悪いために製剤化上の課題を抱えている。
この他のベクターの例としてはペプチドベクターを挙げることができ、その一つとして、ポリリジン及びその修飾体が研究されている。このベクターは、正に荷電したペプチドが負に荷電した核酸と静電的に結合し、かつ、細胞にも付着しやすい性質を利用したものである。しかし、ポリリジンを単独でペプチドベクターとして用いる場合、共有結合したオリゴヌクレオチドは細胞へ導入される（Ｌｅｍａｉｔｒｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．８４，６４８（１９８７））が、静電的に結合したオリゴヌクレオチドやプラスミドを実質的に細胞へ導入するためにはポリリジンを糖や糖蛋白質あるいはリン脂質などで修飾する必要があることが多数の研究から明らかにされている（Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６２，４４２９（１９８７）、Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１０６５，８（１９９１）、Ｌｉａｎｇ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１２７９，２２７（１９９６））。また、未修飾のポリリジンは動物体内に投与した場合に著しい毒性を示す。
ペプチドベクターの他の例としては、ペプチド単独で核酸のベクターとなり得るものが挙げられ、α−ヘリックス構造を有する両親媒性塩基性ペプチドがその構造上の特徴からペプチド単独で核酸のベクターとして導入効率が高いことが示されている（Ｎｉｉｄｏｍｅ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７２，１５３０７（１９９７））。
しかし、このペプチドは、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、疎水面と荷電面（親水面）とからなる典型的な二面構造を示し、核酸を細胞に導入する能力を維持するためには疎水面の割合を大きくする必要があり、その結果、水溶性が悪いという欠点を有している。
この場合水溶性を改善するために疎水面の割合を小さくすると細胞への核酸導入能が減少してしまう。また、該ペプチドの荷電面である親水面はその割合が小さく核酸が静電的に結合するとペプチドの親水性が消失し、ペプチドと核酸との複合体は極めて難溶性となり、結果として実質的に問題となるような凝集体を形成し易いという欠点をも有している。さらに、血清中で容易に凝集してしまうため、動物体内に投与した場合に著しい毒性を示す。
故に、ペプチドベクターは、一般的性状として、核酸と単に混合するだけで複合体が形成されるという優れた操作性を有しているが、特に血液中では容易に凝集塊を形成し易いという欠点があり、さらに、核酸との複合体も溶解性が悪く、毒性も強く、実用上の欠点がある。
また、いずれのベクターであっても核酸を導入する細胞の選択性がなく、核酸の導入が希望される細胞と同様に核酸の導入が希望されない細胞にも核酸が導入されてしまい、副作用の出現に対する危惧が持たれている。
一方、ホスファチジルセリンやホスファチジルエタノールアミンは、細胞表層を形成する脂質二重層の構成成分に含まれるアミノリン脂質であり、脂質二重層の外層と内層に含まれる比率が細胞の状態によって変化するリン脂質である。
例えば、血液凝固反応が進展している部位が代表例として示されるように、細胞が何らかの刺激を受けたときに細胞膜の脂質二重層の外層に含まれる割合が増加するリン脂質であり（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｓｃｈｒｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１０７１，３１３（１９９１））、炎症若しくは免疫担当細胞による細胞の活性化、及び／又は障害若しくはアポトーシス等のいわゆる免疫応答反応が進展している部位、異常な細胞分裂が進展していわゆる細胞が癌化している部位、血液凝固反応若しくは動脈硬化が進展して血管を構成する細胞が障害されている部位、活性酸素による細胞の障害反応が進展している部位あるいは蛋白質分解酵素による細胞の活性化及び／又は障害反応が進展している部位、等における細胞、例えば、損傷を受けたり変性したり活性化された、いわゆる正常でない細胞において脂質二重層の外層に含まれる割合が増加すると考えられるリン脂質である。また、ホスファチジルセリンは、アレルゲンが細胞表面のＩｇＥ抗体に結合してアレルギー反応（脱顆粒反応）が惹起された細胞（例えば肥満細胞や好塩基球）においても、顆粒に含まれる成分として脱顆粒の際に細胞表面に表出するリン脂質であることが知られている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１２３，２４９（２０００））。
なお、最近の知見では、アポトーシス誘導物質（例えば抗癌剤）などを投与された細胞や放射線照射を受けた細胞でｐ５３などのアポトーシス関連遺伝子が関与したシグナルが伝達された細胞であっても、薬剤耐性をもつ細胞（抗癌剤耐性癌細胞など）は、アポトーシスを生じることなくＤＮＡ修復が行われて生存しており、その際、細胞表層にホスファチジルセリンを表出していることが報告されている（Ｇｅｓｋｅ，ＦＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，Ｖｏｌ．８，１８２（２００１））。
ところで、生理活性を有するペプチドやポリペプチドをＰＥＧで修飾することは、生体内でペプチドやポリペプチドの機能を発揮させる上で有用な手段であることがこれまでの多数の研究から明らかにされている。これは、ＰＥＧで修飾することにより、ペプチドやポリペプチドの親水性が上昇して生体内蛋白質との相互作用が減弱することに加えて、網内系に認識されにくくなるためにマクロファージ等に捕獲されにくくなる結果体内動態が改善され、生体内での生理活性の維持・持続がもたらされるためと推定されている。具体的にＰＥＧ修飾の有用性を例示すれば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をＰＥＧで修飾したＰＥＧ−ＡＤＡはＡＤＡ欠損症の治療において臨床的に有効であることが示されている例（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１６，５８９（１９８７））や、インターフェロン（ＩＦＮ）をＰＥＧで修飾することにより生体内における抗ウイルス作用が増強される例（Ｐｅｒｒｙ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｒｕｇｓ，６１，２２６３（２００１））を挙げることができる。
また、生理活性を有するペプチドやポリペプチドのみならず、ドラッグデリバリーを目的として用いられる薬剤のキャリアーをＰＥＧで修飾することも有用であることが明らかにされつつある（丸山一雄，日本臨床，８０，６３２（１９９８））。例えば、リポソームをＰＥＧで修飾すると、ペプチドやポリペプチドをＰＥＧで修飾した場合と同様に、生体内で保持される時間が延長されるばかりでなく、網内系に認識されにくくなるために抗原性が減弱するという効果が現れることが明らかにされている。具体的に薬剤のキャリアーをＰＥＧで修飾することの有用性を例示すれば、抗癌剤であるドキソルビシンを包含させたリポソームをＰＥＧで修飾すると、未修飾の場合に比して薬剤の効果が高まることが示されている（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３７４３（１９９６））。
一方、副作用の軽減および薬効の上昇を目的として、ＰＥＧで修飾されたキャリアーに部位指向性を付与する試みがなされている。この具体例としては、ＰＥＧで修飾されたキャリアーを更にＰＥＧ修飾抗体で修飾する方法が例示される（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３４，７４（１９９５））。
リポソーム以外の例としては、遺伝子の導入に用いられるＰＥＧ化ポリリジンが挙げられる（Ｌｅｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４，３３９（２００１））。
ポリリジンはそのままでは毒性が極めて強いがＰＥＧ修飾を施すと毒性が減弱することが知られている。
このように、ＰＥＧ修飾は有用性のある技術であるが、修飾後のペプチドやポリペプチドの比活性が低下してしまうという課題を抱えている。これは、活性中心もＰＥＧ化されてしまうことによるものである。例えば、アルギナーゼをＰＥＧ化すると比活性は６５％にまで減少してしまうことが示されている（Ｓａｖｏｃａ  Ｋ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５７８，４７（１９７９））。
したがって、比活性を低下させることなくＰＥＧ修飾することができれば有用性がさらに高まることが期待される。
また、ＰＥＧで修飾されたキャリアーに部位指向性を付与する手段としてＰＥＧ修飾抗体を用いる場合、抗体はＰＥＧ分子による立体障害を受け易く効果が現れにくい、という課題を抱えている。したがって、より有用な部位指向性を付与する手段の開発が望まれている。
以上より、本発明の課題は、安全性が高く、ペプチドと結合する物質との複合体の作製が容易（優れた操作性）であり、複合体の溶解性に優れた、細胞へのペプチドと結合する物質の導入選択性が優れ、導入効率が高いベクターとなる、ＰＥＧ化学修飾による比活性が低下しない新規ＰＥＧ化学修飾ペプチド、及び、その製造方法を提供することである。
また、本発明の課題は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドと、ペプチドと結合する物質との複合体、及び、その製造方法を提供することである。
また、本発明の課題は、薬剤を結合もしくは包含するキャリアーに部位指向性を付与するためのＰＥＧ化学修飾ペプチド、該ペプチドによって修飾されたキャリアー、及び、その製造方法を提供することである。
また、本発明の課題は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーに結合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法を提供することである。
発明の開示
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、
▲１▼ペプチド（後述する本発明に用いるペプチド及び本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチド）と結合する物質（本明細書において、「ペプチド結合物質」と略記する）と結合し、特定のリン脂質に親和性を有するペプチドは、細胞へのペプチドと結合する物質の導入効率が高く、毒性が低く、溶解性にも優れた、ペプチド結合物質のベクターとなり得ること、
▲２▼アミノ酸配列から規定される構造上の特徴を有するペプチドは、特定のリン脂質への集積性が高く、特定の細胞へ、ペプチド結合物質を導入する選択性に優れること、
▲３▼また、当該ペプチドをＰＥＧによって化学修飾することにより、細胞への、ペプチド結合物質の導入効率が、より高くなること、
▲４▼また、当該ペプチドをＰＥＧによって化学修飾することにより得られるＰＥＧ化学修飾ペプチドは、薬剤を結合もしくは包含するキャリアーに部位指向性を付与するための素子と成り得ること
▲５▼また、当該ＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーに結合もしくは包含された物質は特定の細胞へ効率よく送達されることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明により、下記（１）〜（９）または（２１）のＰＥＧ化学修飾ペプチド、（１０）〜（１９）または（２４）のＰＥＧ化学修飾ペプチドとペプチド結合物質との複合体、（２０）、（２２）または（２３）のそれらの製造方法、（２５）または（２７）のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー、（２６）のそれらの製造方法、（２８）の送達方法が提供される。
（１）本発明の第１態様は、
１８アミノ酸からなる配列を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化学修飾ペプチドであって、
前記１８アミノ酸からなる配列が、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、交互に配置された二つの疎水面と二つの親水面の４つの面から構成され、
前記疎水面の１つが５〜７アミノ酸から構成され、かつ疎水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であり、
前記親水面の１つが５〜６アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であって、かつアルギニン又はリジンから選ばれるアミノ酸の構成比率が５０モル％以上であり、
前記疎水面の別の１つが２〜４疎水性アミノ酸から構成され、
前記親水面の別の１つが３〜５アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上である、ＰＥＧ化学修飾ペプチド。
（２）全アミノ酸数が２０以上であって、両端がＮ末端及びＣ末端であり、両端のアミノ酸を除いた任意の連続した１８アミノ酸が、前記１８アミノ酸からなる配列を示す（１）に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
（３）Ｎ末端及びＣ末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である（１）又は（２）に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
（４）前記１８アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連続した１８アミノ酸配列である（１）〜（３）のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６
但し、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８、及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつそのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
（５）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、下記のアミノ酸配列からなる（１）〜（４）のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７
但し、
Ｘ１及びＸ３７は親水性アミノ酸であり、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつ、そのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
（６）前記Ｘ１〜Ｘ３７が下記のアミノ酸である（５）に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
Ｘ１はトレオニンであり、
Ｘ３７はセリンであり、
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３及びＸ２１はそれぞれチロシン、フェニルアラニン、セリン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１５、Ｘ２４、及びＸ３３はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、
Ｘ７、Ｘ１３、Ｘ２５、及びＸ３１はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ１０及びＸ２８はそれぞれセリン、アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
Ｘ１１及びＸ２９はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
Ｘ１２及びＸ３０はそれぞれバリン、ロイシン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１４及びＸ３２はそれぞれグルタミン、アスパラギン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれアラニン又はアルギニンであり、
Ｘ１８はアルギニン、リジン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１９はロイシン又はトレオニンであり、
Ｘ３６はアルギニン又はセリンである。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
（７）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１〜２４のいずれかのアミノ酸配列からなる、（１）〜（６）のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
（８）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１６又は１９のアミノ酸配列からなる、（１）〜（６）のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
（９）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのＰＥＧ部分の分子量が、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａである（１）〜（８）のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチド。
（１０）本発明の第２態様は、
以下の１８アミノ酸からなる配列を含むＰＥＧ化学修飾ペプチド、及び、ペプチドと結合する物質を含有する複合体であって、
前記１８アミノ酸からなる配列が、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、交互に配置された二つの疎水面と二つの親水面の４つの面から構成され、
前記疎水面の１つが５〜７アミノ酸から構成され、かつ疎水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であり、
前記親水面の１つが５〜６アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上であって、かつアルギニン又はリジンから選ばれるアミノ酸の構成比率が５０モル％以上であり、
前記疎水面の別の１つが２〜４疎水性アミノ酸から構成され、
前記親水面の別の１つが３〜５アミノ酸から構成され、かつ親水性アミノ酸の構成比率が８０モル％以上である、複合体。
（１１）全アミノ酸数が２０以上であって、両端がＮ末端及びＣ末端であり、両端のアミノ酸を除いた任意の連続した１８アミノ酸が、前記１８アミノ酸からなる配列を示す（１０）に記載の複合体。
（１２）Ｎ末端及びＣ末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である（１０）又は（１１）に記載の複合体。
（１３）前記１８アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連続した１８アミノ酸配列である（１０）〜（１２）のいずれかに記載の複合体。
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６
但し、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８、及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつそのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
（１４）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、下記のアミノ酸配列からなる（１０）〜（１３）のいずれかに記載の複合体。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７
但し、
Ｘ１及びＸ３７は親水性アミノ酸であり、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上は中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつ、そのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
（１５）前記Ｘ１〜Ｘ３７が下記のアミノ酸である（１４）に記載の複合体。
Ｘ１はトレオニンであり、
Ｘ３７はセリンであり、
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３及びＸ２１はそれぞれチロシン、フェニルアラニン、セリン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１５、Ｘ２４、及びＸ３３はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、
Ｘ７、Ｘ１３、Ｘ２５、及びＸ３１はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ１０及びＸ２８はそれぞれセリン、アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
Ｘ１１及びＸ２９はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
Ｘ１２及びＸ３０はそれぞれバリン、ロイシン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１４及びＸ３２はそれぞれグルタミン、アスパラギン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれアラニン又はアルギニンであり、
Ｘ１８はアルギニン、リジン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１９はロイシン又はトレオニンであり、
Ｘ３６はアルギニン又はセリンである。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
（１６）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１〜２４のいずれかのアミノ酸配列を含む、（１０）〜（１５）のいずれかに記載の複合体。
（１７）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのペプチド部分が、配列番号１６又は１９のアミノ酸配列を含む（１０）〜（１５）のいずれかに記載の複合体。
（１８）ペプチドと結合する物質が核酸である、（１０）〜（１７）のいずれかに記載の複合体。
（１９）前記１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧ化学修飾ペプチドのＰＥＧ部分の分子量が、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａである（１０）〜（１８）のいずれかに記載の複合体。
（２０）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと活性化ポリエチレングリコールとを反応させる、（１）〜（９）のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドの製造方法。
（２１）（２０）の方法により製造される、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により化学修飾されたペプチド。
（２２）ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを反応させる工程、
ｂ）前記ａ）により得られるＰＥＧ化学修飾ペプチドと、ペプチドと結合する物質とを反応させる工程、
よりなる、（１０）〜（１９）のいずれかに記載の複合体の製造方法。
（２３）ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、ペプチドと結合する物質とを反応させる工程、
ｂ）前記ペプチドと前記ペプチドと結合する物質との反応物を、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる工程、
よりなる、（１０）〜（１９）のいずれかに記載の複合体の製造方法。
（２４）（２２）又は（２３）の方法により製造される、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により化学修飾されているＰＥＧ化学修飾ペプチドとペプチドと結合する物質との複合体。
（２５）（１）〜（８）のいずれかに記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー。
（２６）ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチド、若しくは１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインが結合したペプチドと、活性化ＰＥＧとを反応させる工程、
ｂ）前記ａ）により得られる反応物とキャリアーとを反応させる工程、若しくは、前記ａ）により得られる反応物を構成要素としてキャリアーを構築する工程、
よりなる、（２５）に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーの製造方法。
（２７）（２６）の方法により製造されるＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー。
（２８）（２５）に記載のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーに結合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法。
発明を実施するための最良の形態
以下に、より詳細に本発明を説明する。
本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチド（本発明の第一の態様）は、エドモンソン・ホイール・プロット法（Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎ，Ａ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，Ｖｏｌ．７，１２１（１９６７））によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、交互に配置された二つの疎水面（側面Ａ、側面Ｃ）と二つの親水面（側面Ｂ、側面Ｄ）の４つの面から構成され、二つの親水面（側面Ｂ、側面Ｄ）のうち少なくとも１つ（側面Ｂ）が正荷電面である１８アミノ酸からなる配列を含む、ＰＥＧにより化学修飾されたペプチド（以下、「ＰＥＧ化学修飾ペプチド」と略記する）である。
本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドは、後に詳述する、上記１８アミノ酸からなる配列を含むペプチド（以下、「本発明に用いるペプチド」と略記する）を、例えば、活性化ＰＥＧで化学修飾して得られる。
ＰＥＧにより化学修飾する方法は、特に限定されず、例えば、活性化ＰＥＧを用いる方法、ＰＥＧと活性化剤等を用いる方法等が挙げられる。
化学修飾する方法に用いられる活性化ＰＥＧは、活性化ＰＥＧであれば特に限定されず、直鎖構造又は分岐鎖構造のものであってもよく、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社製）、や同社製のｍＰＥＧ−ＳＢＡ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｍＰＥＧ  ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ｍＰＥＧ−ＳＳ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｍＰＥＧ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｍＰＥＧ）、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｍＰＥＧ）、ｍＰＥＧ−ｅｐｏｘｉｄｅ、ｍＰＥＧ−ＣＤＩ（ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍＰＥＧ）、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍＰＥＧ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ｍＰＥＧ−ａｌｄｅｈｙｄｅ、ｍＰＥＧ−Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ、ｍＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ（ｍＰＥＧ  ｏｒｔｈｏｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）等の活性化ＰＥＧ等が挙げられる。またＰＥＧは、公知の方法で合成したものを用いることもできる。
また、化学修飾する方法に用いられる活性化ＰＥＧは、ＰＥＧにリン脂質が結合したものでもよく、例えば、ＭＡＬ−ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＰＥＧ）、ＮＨＳ−ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等の活性化ＰＥＧ等が挙げられる。
ＰＥＧの重量平均分子量は、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであればよく、好ましくは約１，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａ、さらに好ましくは約２，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａである。
この範囲であれば、活性化ＰＥＧはペプチドと反応しても、ＰＥＧ化修飾ペプチドは元のペプチドの活性を維持し、かつ溶解性を更に上げる、抗原性を減弱する、毒性を減弱するなど、より好ましい性質を付与することが可能である。
ＰＥＧと活性化剤等により化学修飾する方法に用いられるＰＥＧ、活性化剤は通常用いられるものであれば、任意に選択して用いることができる。
本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドにおけるＰＥＧの修飾（結合）位置は、特に限定されず、何れであってもよいが、本発明に用いるペプチドが核酸等のペプチド結合物質及びホスファチジルセリン等と結合する位置以外の位置であるのが好ましく、そのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖の位置がより好ましい。
ペプチドの所望する位置にＰＥＧを導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。
また、本発明に用いるペプチドに対する、ＰＥＧの修飾量（結合量）も特に限定されない。
本発明に用いるペプチドを活性化ＰＥＧで修飾することにより、本発明に用いるペプチドが本来有する特徴、性質等（詳細は後述する）をより優れたものとすることができる。
具体的には、本発明に用いるペプチドに対して、例えば、標的細胞への遺伝子や薬剤の取り込み率の向上、薬理活性の向上、毒性の低減等の優れた効果を有する。
次に、本発明に用いるペプチドである、１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドの必須構造である「１８アミノ酸からなる配列」について図を用いて説明する。
エドモンソン・ホイール・プロット法はα−ヘリックスの中心線を基点としたアミノ酸の相対位置を示すモデルであって、１８アミノ酸で一巡し、１９番目のアミノ酸が１番目のアミノ酸と同位置に来るように表記する。
この表記法によって描かれるモデルでは、通常、基点となる第一番目のアミノ酸が時計の１２時の位置に来るよう記載されるが、アミノ酸配列が同一である限り表記上の起点が異なっても図上の各アミノ酸の相対的位置は変わらず、例えば図１において、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はいずれも本質的に同一である。
以下、本明細書において、「面」とは、モデルで互いに連続して隣接するアミノ酸から構成される領域を言う。面は、構成アミノ酸数が１以上であればよく、好ましくは、構成アミノ酸数が２以上である。
「互いに連続して隣接する」とは、例えば図１において、１番目と１２番目のアミノ酸の位置関係や、１５番目、８番目、１番目及び１２番目の４アミノ酸の位置関係を指す。一方、１番目と１０番目のアミノ酸の位置関係は互いに連続していない。また、１番目と５番目のアミノ酸の位置関係は「互いに連続して隣接する」位置関係ではないが、１２番目のアミノ酸を含むことにより同一の面を形成してもよい。
「疎水面」とは、実質的に疎水性アミノ酸を多く含む面である。疎水性アミノ酸は、実質的に疎水性であれば限定されない。天然の疎水性アミノ酸、それと性質がほぼ同等の修飾されたアミノ酸や合成アミノ酸なども含まれる。
本発明に用いるペプチドは、疎水面に疎水性アミノ酸を８０モル％以上含むことが好ましい。また、酸性親水性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）を含まないことがより好ましい。これはペプチドの正荷電部分と核酸の陰荷電部分とが静電的に結合するので、酸性親水性アミノ酸が該結合に対して阻害的に作用するからである。
また、疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、プロリン、チロシン、アラニン、フェニルアラニン、メチオニン、システイン、グリシンから選ばれるアミノ酸であることが好ましい。また、疎水面のうちの一つ（側面Ａ）は５〜７アミノ酸から構成されていることが好ましい。疎水面の別の一つ（側面Ｃ）は２〜４アミノ酸から構成されていることが好ましい。特に側面Ｃはすべて疎水性アミノ酸であることが好ましい。
疎水面（側面Ａ、側面Ｃ）の一例を図２に示す。
「親水面」とは、実質的に親水性アミノ酸を多く含む面である。親水性アミノ酸は、実質的に親水性であれば限定されない。天然の親水性アミノ酸、それと性質がほぼ同等の修飾されたアミノ酸や合成アミノ酸なども含まれる。
「正荷電面」とは、「親水面」であって、かつ、実質的に正に荷電した親水性アミノ酸を多く含む面である。実質的に正に荷電した天然の親水性アミノ酸、それと性質がほぼ同等の修飾されたアミノ酸や合成アミノ酸なども含まれる。
本発明に用いるペプチドは、親水面に親水性アミノ酸を８０モル％以上含むことが好ましい。また、親水性アミノ酸はアスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸から選ばれるアミノ酸であることが好ましい。さらに、酸性親水性アミノ酸以外の親水性アミノ酸、すなわちアスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、アルギニン、ヒスチジン又はリジンから選ばれるアミノ酸であることが好ましい。これはペプチドの正荷電部分と核酸の陰荷電部分とが静電的に結合するので、酸性親水性アミノ酸が該結合に対して阻害的に作用するからである。
親水面のうちの一つ（側面Ｂ）は正荷電面であり、５〜６アミノ酸から構成されていることが好ましい。さらにリジン又はアルギニンから選ばれるアミノ酸の構成比率が５０モル％以上であることが好ましい。
親水面の別の一つ（側面Ｄ）は３〜５アミノ酸から構成されていることが好ましい。
親水面（側面Ｄ）及び正荷電面（側面Ｂ）の一例を図２に示す。
なお、モル％とは、疎水面を構成するアミノ酸の数に対する該面に含まれる疎水性アミノ酸の数の比、親水面を構成するアミノ酸の数に対する該面に含まれる親水性アミノ酸の数の比又は正荷電面を構成するアミノ酸の数に対する該面に含まれるリジン又はアルギニンから選ばれるアミノ酸の数の比である。
本発明に用いるペプチドの特徴である交互に配置された二つの疎水面と二つの親水面（ただし、少なくとも一面は正荷電面）から構成される四面構造は、モデル上に図示された１８アミノ酸を前述の定義にしたがって面に分割した場合に、二つの疎水面（側面Ａ、側面Ｃ）と二つの親水面（側面Ｂ、側面Ｄ：但し、少なくとも側面Ｂは正荷電面）とが互いに交互に隣接して４つの面を構成する構造である。
なお、疎水面と疎水面とが直接隣接する場合は２つの疎水面ではなく全体として１つの疎水面であり、親水面と親水面とが直接隣接する場合は２つの親水面ではなく全体として１つの親水面であり、正荷電面と正荷電面とが直接隣接する場合は２つの正荷電面ではなく全体として１つの正荷電面である。
すなわち、該四面構造において、疎水面と疎水面、親水面と親水面、及び正荷電面と正荷電面とは互いに隣接しない。
「交互に隣接して４つの面を構成する構造」は、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルにおいて、向かって右廻りに、側面Ａ→側面Ｂ→側面Ｃ→側面Ｄ（→側面Ａ）又は、向かって右廻りに、側面Ａ→側面Ｄ→側面Ｃ→側面Ｂ（→側面Ａ）となるよう配置され、機能が保持される限りいずれの形態であっても良い。好ましくは、向かって右廻りに、側面Ａ→側面Ｂ→側面Ｃ→側面Ｄ（→側面Ａ）になるよう配置される配列である。なお、該四面構造は、各々の面がその性質を維持する限り、分割方法、すなわち、１８アミノ酸の個々のアミノ酸の４つの面への割り振り方は特に制限されない。
アミノ酸配列に基づき、側面Ａは５〜７アミノ酸、側面Ｂは５〜６アミノ酸、側面Ｃは２〜４アミノ酸、側面Ｄは３〜５アミノ酸となるよう割り振られることが好ましい。
一例として、アミノ酸配列の各面への割り振りが異なる３つの配列を図３及び図４にＡ〜Ｃ（Ｃ１及びＣ２）として示す。なお、Ｃ１とＣ２のアミノ酸配列は全く同一であり、アミノ酸配列の各面への割り振りを変化させた場合にどちらでも前述の定義に含まれる例である。Ａ〜Ｃ（Ｃ１及びＣ２）におけるアミノ酸の割り振りは下記のとおりである。
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本発明に用いるペプチドは、上記した特徴である四面構造を示す１８アミノ酸からなる配列を含むことにより、ペプチド自身の水溶性が優れている、及び、ペプチド結合物質と複合体を形成するとき、その複合体が実質的に問題となる凝集体を形成しないという特徴を有する。
本発明に用いるペプチドは、「従来技術」に記載したα−ヘリックス構造を有するペプチドベクターと異なり、α−ヘリックス構造をとる際に疎水面が複数形成されるため、疎水面の割合を小さくして水溶性を向上させても、ペプチド結合物質を細胞に導入する能力が高い。一方、同時に親水面が複数形成されるため、親水面の割合が二面構造の場合に比べて大きくなり、少なくとも一つ存在する正荷電面にペプチド結合物質が静電的に結合してもペプチドの親水性は完全には消失しないので、ペプチドとペプチド結合物質との複合体は水溶性を維持し、結果として実質的に問題となるような凝集塊を形成することがない。したがって、ペプチドが高いペプチド結合物質導入能と優れた水溶性を併せ持つためには、α−ヘリックス構造をとる際に疎水面と親水面（少なくとも一面は正荷電面）とが各々複数形成されることが必要である。
そして、上記性質を有する本発明に用いるペプチドを含む、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドは、上記性質、特性に対して、より優れる。
なお、疎水面と親水面が複数形成され、かつペプチドベクターとしての機能が維持される限り、面の数に制限はない。好ましくは各々二面である。特に、複数の親水面のうち少なくとも一面が中性親水性アミノ酸に富んだ面（実質的に荷電状態にない）であれば、該面がペプチド結合物質と結合することはなく、その結果、該面の水溶性がほぼ完全に維持されるので、より好ましい。
本発明に用いるペプチドは、その機能が保持される限り、アミノ酸配列の長さは何ら制限されない。好ましくは全アミノ酸残基数が２０以上、より好ましくは２５以上、更に好ましくは３０以上のペプチドである。また、好ましくは全アミノ酸数が１００以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは４０以下のペプチドである。
本発明に用いるペプチドは、任意のアミノ酸を起点とした連続する１８アミノ酸配列を一つ以上含む。好ましくは、任意のアミノ酸を起点とした連続する１８アミノ酸配列が各々独立して二つ以上存在する、及び／又は二つ以上存在する配列が部分的に重複して存在する。より好ましくは、両端のアミノ酸を除く任意の連続した１８アミノ酸配列が、本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列を示すペプチドである。すなわち両端のアミノ酸を除いた任意の連続した１８アミノ酸配列が重複してすべて本発明の四面構造を示すペプチドである。
ここで言う「１８アミノ酸配列」は、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックスモデルにおいて側面Ａ、側面Ｂ、側面Ｃ、側面Ｄが右回りに配置（本明細書において、「本発明の四面構造」と略記する）されている１８アミノ酸からなる配列（本明細書において、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」と略記する）である。
「両端のアミノ酸を除く任意の連続した１８アミノ酸配列」とは、例えば、Ｎ（但し、Ｎは２０以上）個のアミノ酸からなるペプチドにおいて２番目〜１９番目、３番目〜２０番目、４番目〜２１番目、以下同様に（Ｎ−１８）番目〜（Ｎ−１）番目までの任意の配列である。「重複してすべて本発明の四面構造を示す」とは、前述の２番目〜１９番目、３番目〜２０番目、４番目〜２１番目、以下同様に（Ｎ−１８）番目〜（Ｎ−１）番目までのすべての配列が本発明の四面構造を示すことである。一例として配列番号１６のペプチドの２番目〜１９番目、３番目〜２０番目、４番目〜２１番目、１９〜３６番目の１８アミノ酸からなる配列を、図５及び図６にＡ〜Ｄとしてエドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックスモデルで示した。これらの配列は、いずれも本発明の四面構造を示す。
本発明に用いるペプチドは、該ペプチドと、ペプチド結合物質との複合体の溶解性を更に改善するという観点から、少なくとも一端が、好ましくは両端が親水性アミノ酸であることが好ましい。
ここでいうペプチド結合物質には、核酸、酸性蛋白質等の酸性高分子、負に荷電した側鎖を有する低分子化合物等で生理活性を有する物質等が含まれる（詳しくは後述する）。
親水性アミノ酸は親水性である限り限定されない。好ましくは酸性親水性アミノ酸以外の親水性アミノ酸、より好ましくは中性親水性アミノ酸、さらに好ましくはトレオニン又はセリンである。
本発明に用いるペプチドに含まれる「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」の好適例として、下記のアミノ酸配列の中の任意の連続した１８アミノ酸からなる配列が挙げられる。
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６
但し、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上が疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８、及びＸ３０は、それぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上が中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつ、そのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
好ましくは、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ２４、Ｘ２９、及びＸ３３はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１２、Ｘ１９、及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸であり、
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸であり、
Ｘ１３及びＸ３１はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸であり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれ疎水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ２１、及びＸ２８はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
より好ましくは
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３及びＸ２１はそれぞれチロシン、フェニルアラニン、セリン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１５、Ｘ２４、及びＸ３３はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、
Ｘ７、Ｘ１３、Ｘ２５、及びＸ３１はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ１０及びＸ２８はそれぞれセリン、アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
Ｘ１１及びＸ２９はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
Ｘ１２及びＸ３０はそれぞれバリン、ロイシン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１４及びＸ３２はそれぞれグルタミン、アスパラギン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれアラニン又はアルギニンであり、
Ｘ１８はアルギニン、リジン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１９はロイシン又はトレオニンであり、
Ｘ３６はアルギニン又はセリンである。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
なお、前記において、疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、プロリン、チロシン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、メチオニン又はグリシンのいずれかから選ばれるアミノ酸であり、塩基性親水性アミノ酸はアルギニン、ヒスチジン又はリジンのいずれかから選ばれるアミノ酸であり、中性親水性アミノ酸はアスパラギン、グルタミン、トレオニン又はセリンのいずれかから選ばれるアミノ酸である。
また、本発明に用いるペプチドの好適例として、下記のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７
但し、
Ｘ１及びＸ３７は親水性アミノ酸であり、
「Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、及びＸ１９」、「Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、及びＸ２２」、「Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、及びＸ２６」、「Ｘ１５、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、及びＸ２９」、並びに「Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、及びＸ３３」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上が疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ２１、Ｘ２８、及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、４アミノ酸以上が中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、かつ、そのうち少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ６、Ｘ１７、Ｘ２４、及びＸ３５はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
なお、上記アミノ酸配列において、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
好ましくは
Ｘ１及びＸ３７はそれぞれトレオニン又はセリンであり、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ２４、Ｘ２９、及びＸ３３はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１２、Ｘ１９、及びＸ３０はそれぞれ疎水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸であり、
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸であり、
Ｘ１３及びＸ３１はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸であり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれ疎水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、
「Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、及びＸ１６」、「Ｘ５、Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、及びＸ２０」、「Ｘ９、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、及びＸ２３」、「Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７」、「Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、及びＸ３１」、並びに「Ｘ２０、Ｘ２３、Ｘ２７、Ｘ３１、及びＸ３４」において、それぞれ５アミノ酸中、少なくとも３アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３、Ｘ１０、Ｘ２１、及びＸ２８はそれぞれ疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
Ｘ７、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２５、Ｘ３２、及びＸ３６はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸である。
なお、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
より好ましくは、
Ｘ１はトレオニンであり、
Ｘ３７はセリンであり、
Ｘ２、Ｘ５、Ｘ９、Ｘ２０、Ｘ２３、及びＸ２７はそれぞれアルギニン又はリジンであり、
Ｘ３及びＸ２１はそれぞれチロシン、フェニルアラニン、セリン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ４、Ｘ１７、Ｘ２２、及びＸ３５はそれぞれロイシンであり、
Ｘ６、Ｘ１５、Ｘ２４、及びＸ３３はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、
Ｘ７、Ｘ１３、Ｘ２５、及びＸ３１はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、
Ｘ８及びＸ２６はそれぞれプロリンであり、
Ｘ１０及びＸ２８はそれぞれセリン、アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
Ｘ１１及びＸ２９はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
Ｘ１２及びＸ３０はそれぞれバリン、ロイシン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１４及びＸ３２はそれぞれグルタミン、アスパラギン又はアルギニンのいずれかであり、
Ｘ１６及びＸ３４はそれぞれアラニン又はアルギニンであり、
Ｘ１８はアルギニン、リジン又はセリンのいずれかであり、
Ｘ１９はロイシン又はトレオニンであり、
Ｘ３６はアルギニン又はセリンである。
なお、上記アミノ酸配列中、Ｘ２からＸ３６までのアミノ酸は少なくとも連続して１８アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されてもよい。
なお、前記において、疎水性アミノ酸、塩基性親水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸は、前述のアミノ酸配列Ｘ２〜Ｘ３６で説明したのと同じである。
ただし、前述のアミノ酸配列は本発明に用いるペプチドの一例であり、本発明に用いるペプチドは、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」を含み、かつその機能を保持し、ＰＥＧ化学修飾ペプチドの機能等を保持する限り、必要に応じて前述のアミノ酸配列に欠失、付加、挿入又は置換などを施すことが可能である。
また、ＰＥＧ化学修飾ペプチドの機能等を保持する限り、必要に応じて、アミノ酸以外の分子による修飾を施すことも可能である。例えば、生体内における安定性をより上昇させるための糖鎖や脂質若しくは高分子化合物による修飾、及び／又は、抗原提示細胞による該ペプチドの認識をより低く抑えるための糖鎖や脂質若しくは高分子化合物による修飾を施してもよい。例えば、マンノース、コレステロールによる修飾が挙げられる。これらのペプチドも本発明に用いるペプチドに含まれる。
本発明に用いるペプチドの好ましい態様は酸性親水性アミノ酸を含まないが、この性質は特に修飾を施す場合有用である。すなわち、酸性アミノ酸が含まれずＣ末端にのみカルボキシル基が存在するよう設計することが可能なので、カルボキシル基に依存した反応を利用して修飾を施す場合、部位特異的なＣ末端の修飾が可能となり有利である。
また、システイン残基のチオール基を利用した部位特異的な修飾を実施する場合、アミノ酸配列中にシステインが一つだけ含まれるように、好ましくは本発明に用いるペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に付加すれば、例えば本発明のポリエチレングリコール修飾等する場合に選択的な修飾が可能となり有利である。
ところで、アミノ酸は側鎖分子の種類、性質によって分類されるが、ペプチドの高次構造を考察する上で重要な指標となる分類は、側鎖分子の極性による分類である。具体的には、以下のように分類される。
（１）疎水性アミノ酸…グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、トリプトファン、プロリン
（２）酸性親水性アミノ酸…アスパラギン酸、グルタミン酸
（３）中性親水性アミノ酸…セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン
（４）塩基性親水性アミノ酸…アルギニン、リジン、ヒスチジン
したがって、本発明に用いるペプチドにおいては、上記同じ分類に属するアミノ酸であれば、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」という要件を満たしつつ、相互にアミノ酸置換が可能である。例えば、イソロイシンとロイシン、バリンとロイシン、チロシンとフェニルアラニン、トリプトファンとロイシン、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニン、アルギニンとリジン、ヒスチジンとリジンとは互いに置換が可能である。
なお、ヒスチジンは塩基性親水性アミノ酸に分類されるが、特定の条件下、例えば生理的条件下では荷電状態が小さく、したがって、中性親水性アミノ酸に近い性質をも併せ持っているので、ヒスチジンは塩基性親水性アミノ酸のみならず、中性親水性アミノ酸との置換も可能である。
一方、異なる分類に属するアミノ酸であっても、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」という要件を満足する限り相互置換することが可能である。
一例を挙げれば下記の通りである。
（１）疎水性アミノ酸（中性）と中性親水性アミノ酸との置換（中性の任意のアミノ酸との置換と同義）
例：ロイシンとトレオニン、ロイシンとセリン、バリンとセリン、チロシンとセリン
（２）疎水性アミノ酸（中性）と塩基性親水性アミノ酸との置換（疎水／親水、中性／塩基性という互いに相反する置換であり、酸性親水性アミノ酸以外の任意のアミノ酸との置換と同義）
例：アラニンとアルギニン、チロシンとアルギニン
（３）中性親水性アミノ酸と塩基性親水性アミノ酸との置換（酸性親水性アミノ酸以外の任意の親水性アミノ酸との置換と同義）
例：セリンとアルギニン、グルタミンとアルギニン
さらに、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」という要件を満足する限り、前述のアミノ酸置換を組み合せて実施することも可能である。すなわち、同属内でのアミノ酸置換を組み合せた一例として、イソロイシンからロイシンへの置換とバリンからロイシンへの置換とを同時に実施する場合、互いに属が異なるアミノ酸置換を組み合せた一例として、チロシンからセリンへの置換とセリンからロイシンへの置換とを同時に実施する場合、あるいは、同属内でのアミノ酸置換と属が異なるアミノ酸置換とを組み合せた一例として、イソロイシンからロイシンへの置換とロイシンからトレオニンへの置換とを同時に実施する場合を挙げることができる。組み合せることが可能なアミノ酸置換数は、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」という要件を満足する限り特に制限はない。好ましくは１８アミノ酸当り３以下である。
例えば、実施例１２及び１３は、本発明に用いるペプチドが前述の「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」という要件を満足する限り相互置換することが可能であることを示している。
本発明に用いるペプチドとして、配列番号１〜２４のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを例示する。好ましくは、配列番号１６又は１９のいずれかのアミノ酸配列からからなるペプチドである。
本発明に用いるペプチドは、核酸との結合能と、核酸を細胞へ導入する能力を有し、かつホスファチジルセリンに特異的に親和性を有するペプチドである。
また、ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸いずれでもよく、かつ天然型アミノ酸と性質がほぼ同等の通常のアミノ酸以外のアミノ酸や合成修飾アミノ酸であってもよい。この中には例えばヒドロキシプロリン、ホモセリン、メチルシステインなどが含まれる。
本発明は、上記１８アミノ酸からなる配列を含むペプチド（本発明に用いるペプチド）と、該ペプチドをＰＥＧで修飾して得られる、ＰＥＧ化学修飾ペプチドであるが、また、該ＰＥＧ化学修飾ペプチドとペプチドと結合する物質（ペプチド結合物質）との複合体も含む。
本発明の第２態様は、該ＰＥＧ化学修飾ペプチドとペプチドと結合する物質（ペプチド結合物質）との複合体である。
ここで、「複合体」とは、本発明に用いるペプチドとＰＥＧとペプチド結合物質との凝集体、混合物、組成物であってもよい。
また、本発明に用いるペプチドに対する、ＰＥＧ及び／又はペプチド結合物質の結合位置もペプチドの機能を保持する限り特に限定されない。
実施例３０の結果から、本発明に用いるペプチドと、ＰＥＧと、ペプチド結合物質とが複合体（凝集体、混合物、組成物等）を形成していることが分かる。
本発明の複合体を構成する「ペプチド結合物質」とは、上記したように、核酸、酸性蛋白質等の酸性高分子、負に荷電した側鎖（リン酸基等）を有する低分子化合物等で生理活性を有する物質等である。
ここで、「酸性蛋白質等の酸性高分子」とは、酸性アミノ酸を多く含み負に荷電している蛋白質（例えばアルブミン）や分子全体として負に荷電した状態にある蛋白質以外の高分子（例えばヘパリンやヒアルロン酸等）が例示される。
「負に荷電した側鎖を有する低分子化合物」とは、リン酸基等を側鎖に有する低分子化合物で、リン酸化されたアシクロビル等が例示される。
「核酸」とは、ヌクレオシドやヌクレオチド、ヌクレオチドが２個以上つながったオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはこれらの誘導体、修飾体若しくは改変体などが含まれる。
「核酸の誘導体」には核酸を構成する原子の一部が他の原子に置換したものが含まれる。例えば、ホスホジエステル結合部位の酸素原子の一つを硫黄原子に置換したいわゆるＰＳ体が含まれる。
「核酸の修飾体」には核酸を構成する原子の一部に他の原子団が置換・付加したものが含まれる。例えば、核酸の五炭糖部位の２’部位にある炭素原子にメトキシ基（−Ｏ−ＣＨ３）や、核酸配列の一部に糖、リン脂質やポリエチレングリコールが付加したものが含まれる。
「核酸の改変体」には期待される核酸の機能を維持しながら全く異なる骨格を有する分子が含まれる。例えば、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；ＰＮＡ）が含まれる。また、核酸の中には、生体内における特定の蛋白質の発現量を増減する、若しくは特定の因子の機能発現を調節するポリヌクレオチドであるＤＮＡやＲＮＡ、又はこれらの誘導体、修飾体若しくは改変体、あるいは「誘導」「修飾」「改変」が組合わさったもの、及びこれらの誘導体、修飾体若しくは改変体の混合物若しくはキメラ体などが含まれる。
また、前記核酸は一本鎖でも二本以上の鎖から構成されていてもよく、担体に結合していてもよい。例えば、蛋白質をコードするＤＮＡや該ＤＮＡに発現調節ユニットが接続されたプラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、おとり型二本鎖核酸（以降デコイと記す）、アプタマー、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
「特定の蛋白質」又は「特定の因子」とは、発現量を増減する、若しくは機能発現の調節を意図する蛋白質又は因子である。これらは、元来生体内に存在する物質であっても、存在しない物質であってもよい。
「ペプチド結合物質と結合する能力」は、核酸を例にとって説明すれば、核酸と本発明に用いるペプチドのとの混合液を電気泳動した後、核酸の染色像を検出することにより調べることができる。例えば、核酸が泳動されず、核酸の染色像が得られない場合、若しくは、核酸のみの泳動の染色像と比較して、電気泳動時の移動度が小さい領域に染色像が得られる場合は、ペプチドが「ペプチド結合物質と結合する能力」を有しているとする。さらに具体的な方法として、後述する実施例８が例示される。
「ペプチド結合物質を細胞へ導入する能力」は、核酸を例にとって説明すれば、蛍光標識した核酸を用いて蛍光顕微鏡下で細胞を観察する方法若しくはレポーター遺伝子を発現するプラスミドを用いて細胞が発現するレポーター蛋白質を測定する方法等により測定することができる。また、レポーター蛋白質が発現した結果として認められる薬理作用を指標として測定することもできる。レポーターとしては蛍ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはＨＳＶ−ｔｋ等が挙げられる。さらに具体的な方法として，後述する実施例９が例示される。この方法を用いて細胞が発現する蛍ルシフェラーゼの量を測定する場合、蛋白質１ｍｇの１秒当たりの蛍光カウント数を測定する。このときの蛍光カウント数が１０，０００以上の場合、レポーター遺伝子が細胞に導入されたとし、ペプチドは「ペプチド結合物質を細胞へ導入する能力」を有するとする。
なお、本明細書において、「細胞へ導入する」と「細胞内へ導入する」は同義語として記載する。
以下、本明細書において、「細胞内」とは、細胞を構成するユニット及びその内部を言う。例えば、細胞の輪郭を構成するリン脂質二重層内、リン脂質二重層間、細胞質、あるいはオルガネラ（細胞小器官）若しくは核又はそれらの内部が挙げられる。
「特異的に親和性を有する」とは、いずれかの特異的な相互作用をすることをいう。例えば、互いに結合すること、複合体を形成すること、互いに分子を認識すること、一定の方向へ移動若しくは集合しようとすること、分子の形状が変化すること、又は互いに反応すること等が挙げられる。例えば、血清アルブミン存在下であっても親和性を有すれば、特異的に親和性を有することになる。
通常、ペプチドがある物質と相互作用をする場合でも、他のペプチドや蛋白質が共存することによってその相互作用が消失する場合は、その相互作用は非特異的である。すなわち、アルブミン等の蛋白質が多量に存在すると、非特異的な相互作用は消失する。したがって、例えば、血清アルブミン非存在下でホスファチジルセリンに親和性を有していても、血清アルブミン存在下ではホスファチジルセリンに親和性を有していないペプチドは、ホスファチジルセリンとの相互作用は非特異的であり、生体内ではホスファチジルセリンに親和性を有していない。
一方、他のペプチドや蛋白質が共存しても当該ペプチドの特定の物質に対する相互作用が消失しない場合は、相互作用は特異的であり、「特異的に親和性を有する」ことになる。
「キャリアー」とは、薬剤などと結合または薬剤などを包含し、それらを送達する物質をいう。そのような性質を有するものであれば特に制限はないが、脂質や高分子などで構成されたキャリアーが好ましく、好ましい具体例としては、リポソーム、デンドリマー、ナノパーティクル等が挙げられる。また、キャリアーと薬剤などとの組合せに特に制限はないが、より安定して薬剤などを保持するためには互いに静電的に反発しないことが好ましく、その好適例として、正荷電を有するドキソルビシンと中性もしくは陰荷電リポソームとの組合せが例示される。
また、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾したキャリアーは体内動態が改善されるばかりでなく特定の部位への指向性も有するので特に有用である。ここで、ＰＥＧ化学修飾ペプチドはキャリアーと複合体を形成することができる限りＰＥＧ化学修飾に用いる活性化ＰＥＧに制限はないが、キャリアーの構成成分にリン脂質が含まれる場合には、リン脂質が結合した活性化ＰＥＧを用いることが好ましい。また、ペプチドで修飾されていないＰＥＧ分子数と本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチド分子数との比は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾したキャリアーの体内動態が改善される限り特段の制限はないが、キャリアーがリポソームの場合には好ましくは１：１〜１：０．００１、より好ましくは１：０．３〜１：０．０１、さらに好ましくは１：０．２〜１：０．０２である。
以下、本発明に用いるペプチドの性質、特徴等、及び、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドの改良された性質、特徴等について、実施例等を参照して説明する。
なお、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドの改良された性質、特徴等には、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドとペプチド結合物質との複合体の性質、特徴等、および本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーの性質、特徴等を含む。
本発明に用いるペプチド（ＰＥＧ修飾していない１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドをさす）及び本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチド（以下、両者を併せて「本発明のペプチド」と略記する）は核酸との結合能を有する。好ましくは、ペプチドの有する別の機能である核酸を細胞へ導入する能力及び血清アルブミン存在下でのホスファチジルセリンとの親和性、並びに核酸の保持する機能のいずれもが完全には損なわれることなく、該ペプチドと核酸とが実質的に一体となって複合体を形成する能力を有するペプチドである。
本発明のペプチドの核酸との結合における結合様式には何ら制限はなく、静電的な結合や疎水結合、及び共有結合が含まれる。
本発明のペプチドは、上記複合体を形成し、該ペプチドと結合した核酸を細胞へ導入する能力を有し、好ましくは、核酸が分解を受けずに、核酸の所望の機能を保持した状態で核酸を細胞内へ導入する能力を有する。
本発明に用いるペプチドの核酸導入能は、具体的には、実施例９の核酸導入能の測定において、測定値は蛋白質１ｍｇの１秒当たりの蛍光カウント数が１０，０００以上である。好ましくは１００，０００以上であり、より好ましくは１，０００，０００以上である。
本発明のペプチドが前記特徴を有することにより、該ペプチドを使用して、核酸を細胞内へ導入したときに、結果として、核酸が保持する所望の機能を細胞内で発揮することが可能である。例えば、プラスミドに挿入された外来遺伝子が細胞内で発現して所望の蛋白質が産生されること、又は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイ、アプタマー若しくはリボザイム等によって特定の生理活性物質の産生が抑制されること等が挙げられる。なお、「所望の蛋白質」には最終的な活性体のみならず前駆体も含まれる。
後述する実施例１１及び実施例２４はプラスミドに組み込まれた蛍ルシフェラーゼ遺伝子が、本発明に用いるペプチドにより、細胞内に導入された後、転写・翻訳の過程を経て細胞内に蛍ルシフェラーゼが産生・蓄積している具体例である。また、実施例１６及び実施例２５は、プラスミドに組み込まれた単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（以降ＨＳＶ−ｔｋと記す）遺伝子が、本発明に用いるペプチドにより、腫瘍細胞内に導入された後、転写・翻訳の過程を経て腫瘍細胞内にＨＳＶ−ｔｋが産生・蓄積し、腫瘍細胞のガンシクロビル感受性を亢進して薬効（抗腫瘍効果）を示した具体例である。
さらに本発明のペプチドの好ましい例は、血清アルブミン存在下でホスファチジルセリンに特異的に親和性を有し、ホスファチジルセリン以外のリン脂質、例えばホスファチジルコリン、に親和性を有しないペプチドである。
ホスファチジルセリン以外のリン脂質とは親和性を有しない、好ましい本発明のペプチドとホスファチジルセリンとの相互作用、すなわち結合は、電荷による結合又は非特異的結合による結合のみではなく、該ペプチドがホスファチジルセリンの分子構造を認識する結合である。
このことは、例えば、本発明に用いるペプチドについて、実施例２０又は実施例２１に示されている。
ホスファチジルセリンは、前述の通り、細胞表層を形成する脂質二重層の構成成分に含まれるリン脂質であり、脂質二重層の外層と内層に含まれる比率が細胞の状態によって変化するリン脂質であるので、例えば、損傷を受けたり変性したり活性化された、炎症部位の細胞等のいわゆる正常でない細胞において脂質二重層の外層に含まれる割合が増加すると考えられるリン脂質である。したがって、本発明のペプチドは選択的に炎症部位の細胞等の正常でない細胞に結合する。さらにホスファチジルセリンは、生体内においても、血液凝固反応が進行する「場」を提供したり、マクロファージがアポトーシスに陥った細胞を認識して貪食する際の目印となっているリン脂質である。したがって、本発明のペプチドは選択的に正常でない細胞、例えば生体内において血液凝固反応が進行する「場」に結合する。
このように、本発明のペプチドは、核酸との結合能と、該核酸を細胞へ導入する能力を有し、かつ血清アルブミン存在下でホスファチジルセリンに親和性を有することを特徴とする。
本発明のペプチドは、含有物なし、又は無機塩のみを含む水溶液中では不規則な構造を示すが、特定の物質の共存下では、α−ヘリックス構造が認められるペプチドであるのが好ましい。
「特定の物質」とは本発明のペプチドと相互作用して該ペプチドがα−ヘリックス構造を取ることを誘起する物質である。例えば、両親媒性物質であり、この中にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤又はホスファチジルセリン等の特定のリン脂質が含まれる。
ペプチドの高次構造中におけるα−ヘリックス構造の有無は、一般的にＣＤスペクトル測定によって知ることができる。すなわち、ペプチドの高次構造中にα−ヘリックス構造が含まれる場合、ＣＤスペクトル測定の平均残基楕円率曲線が、α−ヘリックス構造の特徴である曲線、すなわち、波長２０５〜２１０ｎｍの領域及び波長２２０〜２２５ｎｍの領域の二ヶ所に極小値が認められるいわゆるＷ字型の曲線となる（「タンパク質の旋光性（生物化学実験法６）、浜口浩三ら著、学会出版センター、１９７９」）。なお、ペプチドの高次構造中にα−ヘリックス構造が含まれる割合は、測定された平均残基楕円率曲線から所定の計算方法によって得ることができる。所定の計算方法としては、代表的なものとして、Ｃｈｅｎ等の方法（Ｙ．Ｈ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１１，４１２０（１９７２））、Ｙａｎｇ等の方法（Ｊ．Ｔ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．９１，１３（１９７８））、Ｗｏｏｄｙ等の方法（Ｒ．Ｗ．Ｗｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２４２，４９７（１９９４））などを挙げることができる。
ただし、用いる方法によって算出される数値が異なるので、算出された数値と共に、算出に用いた方法を明記することが好ましい。
上述したように、本発明の好ましいペプチドは、特定の物質の共存下では、α−ヘリックス構造を取り、例えば、該ペプチドは界面活性剤又は細胞膜上のホスファチジルセリン等の特定のリン脂質等の両親媒性物質との相互作用によってα−ヘリックス構造を取る。それにより該ペプチド及び該ペプチドを含む物質の細胞膜透過性が上昇し、結果的に該ペプチド及び該ペプチドを含む物質が速やかに細胞内に移行する。
要するに、本発明のペプチドの好ましい例は、ｐＨ５〜８の、含有物なし、又は無機塩のみを含む水溶液中でのＣＤスペクトル測定ではα−ヘリックス構造が認められないが、ｐＨ５〜８の５ｍＭ  ＳＤＳ含有水溶液中でのＣＤスペクトル測定では、平均残基楕円率曲線の波長２０５〜２１０ｎｍの領域及び波長２２０〜２２５ｎｍの領域の二ヶ所に極小値を示し、それにより、α−ヘリックス構造が認められるペプチドである。
また、高次構造中のα−ヘリックス構造の含有割合が、Ｃｈｅｎ等の方法によって計算した場合に２５％以上であるペプチドが好ましい。より好ましくは３０％以上であるペプチドである。さらに好ましくは３５％以上であるペプチドである。
上記本発明のペプチドは両親媒性物質存在下の水溶液中でα−ヘリックス構造が認められる。またホスファチジルセリンに親和性を有することから、正常でない細胞、例えば損傷を受けたり変性したり活性化された細胞の表面に選択的に集積し、該細胞膜上のホスファチジルセリンとの相互作用によりα−ヘリックス構造をとり、該細胞内に選択的に取り込まれる。
また、本発明のペプチドは、蛋白質共存下で実質的に凝集体を形成しないペプチドが好ましい。
例えば、上記の好ましいペプチドの例においては、両親媒性物質が存在しなければα−ヘリックス構造を取らず、蛋白質共存下においても溶解性が保持される。そのため、該ペプチドをヒトに投与しても、該ペプチドは実質的に問題となるような凝集体を血液中で形成せず、血管閉塞を起こすことがなく、安全性が高まる。例えば、本発明に用いるペプチドについて、安全性が高いことは実施例２６に示されている。
また、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドは、さらに安全性が高い。
本発明のペプチドが蛋白質共存下で実質的に凝集体を形成するか否かは、該ペプチドを含む血清アルブミン水溶液の濁度を光学的に測定することで判定することができる。例えば、波長３４０ｎｍ〜６６０ｎｍ、特に波長６００ｎｍでの該ペプチドを含む血清アルブミン水溶液の吸光度を測定することにより判定できる。
本発明のペプチドは、核酸と容易に結合するという特徴、核酸との複合体形成時に溶解性が高いという特徴、核酸を細胞内に導入する能力が高いという特徴、安全性が高いという特徴、及び、血清アルブミン存在下でホスファチジルセリンに親和性を有するので、正常でない細胞内へ選択的に取り込まれるという特徴を有するのでペプチドベクターとして有用である。
「ペプチドベクター」とは、所望の物質を細胞内へ導入することができるペプチドならびにその誘導体、修飾体及び改変体である。
さらに本発明のペプチドは、核酸のヌクレアーゼによる分解を防ぐことができるという特徴を有する。このため、天然型（Ｐ＝Ｏ体）のオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドは、血液中及び細胞中に存在するヌクレアーゼによって容易に分解されるが、本発明のペプチドが結合すればヌクレアーゼによる分解を受けない。
核酸にヌクレアーゼ耐性を付与するか否かは、ヌクレアーゼが存在する溶液中で核酸と本発明のペプチドとの複合体を反応させた後、核酸を抽出して電気泳動し、核酸の染色像を検出することにより調べることができる。例えば、ペプチドが核酸にヌクレアーゼ耐性を付与すれば、核酸は分解されないので核酸の染色像が得られる。具体的な方法は後述する実施例１８及び実施例１９に記載した。
本発明のペプチドをペプチドベクターとして使用することにより、該ベクターと結合する物質、好ましくは核酸を細胞内へ導入すること、及び核酸を細胞内へ導入して該核酸が有する機能を細胞内で発現させることができる。
実施例１１から実施例１６は本発明に用いるペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を細胞内へ導入することにより該核酸がコードする蛍ルシフェラーゼ及びＨＳＶ−ｔｋを細胞内で発現させた例であり、実施例２４及び実施例２５は本発明に用いるペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を細胞内へ導入することにより該核酸がコードする蛍ルシフェラーゼ及びＨＳＶ−ｔｋを細胞内で発現させた例である。特に実施例２５は、本発明に用いるペプチドによって腫瘍細胞内に導入されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が腫瘍細胞内で発現し、腫瘍細胞のガンシクロビル感受性を亢進して薬効（抗腫瘍効果）を示した具体例であるが、本実施例で使用したプラスミドの用量は１０μｇであり、該使用量は既報のリポソームベクターを利用して行われた同様の薬理実験（Ａｏｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．８，１１０５（１９９７））で使用された用量（１５０μｇ）よりも遥かに低用量である。これは、実施例１７及び実施例１８に例示されるように、本発明に用いるペプチドは核酸の安定性をリポソームよりも上昇させ、かつ、本発明に用いるペプチドと核酸との結合体は安定性がリポソームよりも高いので、核酸を細胞内へ導入する際に本発明に用いるペプチドを用いることが有用で、核酸を細胞内へ導入するベクターとして本発明に用いるペプチドが優れていることを示している。
そして、上記の優れた性質を有するペプチドを含む、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドは、さらに優れた上記性質を示す。
本発明のペプチドをベクターとして使用する他の例を挙げれば、
レポーター蛋白質（緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）やβ−ガラクトシダーゼ）を発現するプラスミド、
抗腫瘍効果を示すサイトカイン（インターロイキン２、インターフェロンβ等）を発現するプラスミド、
アポトーシスを誘導して細胞殺傷効果を示す生理活性物質（Ｆａｓリガンド、ｐ５３、カスパーゼ３、カスパーゼ８、Ｂａｘ（Ｂｃｌ−２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等）を発現するプラスミド、
ＴＮＦ−α若しくはインターロイキン６等のリガンドに競争的に結合することにより該リガンドが誘起する反応を抑制して、例えば慢性関節リウマチ等の病態を改善することができる該リガンドに対する可溶型の受容体を発現するプラスミド、
ワクチンとしてアレルギー反応を抑制するペプチド／ポリペプチド若しくは例えばダニ抗原等の抗原蛋白である蛋白質を発現するプラスミド、
循環器疾患である閉塞性動脈硬化症の病態の改善あるいは損傷部位の回復（リモデリング）を推進する効果がある血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）若しくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を発現するプラスミド、
経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄を抑制する効果があるＣＤＣ２キナーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、及び、
細胞周期調節遺伝子の転写調節因子であるＥ２Ｆや炎症性サイトカインの転写調節因子であるＮＦκＢが結合する核酸配列に対するデコイ、ならびに、
抗ウイルス効果を示すリン酸化された核酸アナログの活性化体など
を細胞内へ導入すること、及び、それらの機能を細胞内で発現させることが可能となる。
本発明のペプチドは、核酸との結合能と、該核酸を細胞へ導入する能力を有し、かつ血清アルブミン存在下でホスファチジルセリンに親和性を有することを特徴とするので、ホスファチジルセリンをより多く細胞表層へ表出させている細胞により高率に核酸を導入できる。このことにより、疾病の治療を目的として遺伝子若しくはアンチセンスＤＮＡ等の核酸を細胞へ導入しようとする場合に、ホスファチジルセリンの細胞表層への表出量が増加した損傷を受けたり変性したり活性化された炎症細胞等の、いわゆる正常でない細胞、免疫担当細胞に、より多くの該核酸が選択的に導入されることになり、すなわち副作用を低減することができる。
具体的な例を挙げれば、本発明のペプチドをベクターとして用いて腫瘍細胞に核酸を導入して癌治療を行う場合、正常細胞には核酸はほとんど導入されず、腫瘍細胞に高率に核酸が導入される。また、アレルギーの治療を目的として核酸を細胞へ導入しようとする場合、免疫担当細胞によりアレルギー反応が惹起された細胞に特異的に核酸が導入される。
さらに、本発明のペプチドが有する「ホスファチジルセリンをより多く細胞表層へ表出させている細胞により高率に核酸を導入する」という性質を利用して、あらかじめ所望の特定の細胞や臓器におけるホスファチジルセリンの表出量を増加させておくことにより、所望の特定の細胞や臓器により高率に核酸を導入することができる。例えば、特定の細胞・臓器に薬剤を作用させることにより該細胞・臓器は薬剤の薬理作用によりホスファチジルセリンの表出量を増加させた上で、本発明のペプチドをベクターとして用いることにより該細胞・臓器へ高率に核酸を導入することができる。
具体的な例を挙げれば、化学療法による癌治療において抗癌剤の服用のみでは十分に治療効果が表われない場合であっても、該化学療法剤を服用させて、該化学療法剤の薬理効果により腫瘍細胞をホスファチジルセリンの表出量を増加させた上で、本発明のペプチドをベクターとして用いて高率に抗腫瘍効果を示す遺伝子若しくはアンチセンスＤＮＡ等の核酸を腫瘍細胞に導入することにより、該核酸の治療効果を上げることができる。
本発明のペプチドは核酸と容易に結合し、該核酸を細胞内へ導入する。また、本発明のペプチドは、核酸のみならずペプチド結合物質を細胞内へ導入することが可能である。本発明のペプチドと核酸との結合の形態が特に限定されないことと同様に、本発明のペプチドと該物質との結合の形態もとくに限定されない。好ましくは、該物質を細胞内へ導入する時の本発明のペプチドと該物質の結合形態が非共有結合によることであり、さらに好ましくは静電的結合によることである。特に好ましくは、本発明のペプチドが有する正電荷と、該物質が有する負電荷による静電的結合によることである。すなわち、本発明には上記の結合形態によりペプチド結合物質を細胞内に導入することが含まれる。
なお、本発明に用いるペプチドと本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドの性質、特徴について併せて説明したが、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドは、本発明に用いるペプチドをＰＥＧで化学修飾しているため、本発明に用いるペプチドに対して、例えば、標的細胞への遺伝子や薬剤の取り込み率の向上、薬理活性の向上、毒性の低減等の優れた効果を有する。
具体的には、後述する実施例２８及び２９の結果から、本発明に用いるペプチドを活性化ＰＥＧで修飾しても、比活性が低下せず（実施例２８）、また、ペプチド結合物質の導入率が、約３倍程度向上（実施例２９）し、有用である。
また、後述する実施例３５〜３７の結果から、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーは、キャリアーに包含された薬剤の導入率を３〜３３倍程度向上し（実施例３５および３６）、また、担癌マウスの生存期間の延長効果を有し（実施例３７）、有用である。
本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドの製法について、以下述べる。
本発明に用いるペプチドは、化学合成によって得ることができる。
例えば、自動ペプチド合成機（４３２Ａ型、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて合成することにより得ることができる。
また、本発明に用いるペプチドは遺伝子工学的手法によって得ることもできる。遺伝子工学的手法による場合、以下の工程を行うことにより、所望のペプチドを得ることができる。
（１）当該ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを得る工程、
（２）ベクターに当該ＤＮＡを組み入れて、当該ＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを得る工程、
（３）当該組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換させて、当該ペプチドを発現し得る形質転換体を得る工程、
（４）該形質転換体を培養して、当該ペプチドを産生せしめ、培養混合物から当該ペプチドを回収する工程、
本発明に用いるペプチドをコードするＤＮＡは、実質的に本発明に用いるペプチドをコードする塩基配列を有するものであればいずれでもよい。公知のように、遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子からコードされるペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子配列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することができる。したがって、該ＤＮＡは、遺伝子コードの縮重に基づき、塩基配列の一個以上の塩基が置換された塩基配列を有していてもよい。特に、本発明に用いるペプチドを遺伝子工学の手法を用いて製造する際に、特定の宿主細胞で使用頻度の高いコドンとなるように一個以上の塩基を置換した塩基配列を有していてもよい。また該ＤＮＡは組換えＤＮＡ、例えばプラスミド、発現ベクターでもよい。
配列番号１、１６、１９のペプチドをコードする配列番号２８〜３０のＤＮＡを例示する。
当該ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを得る工程は例えば、自動核酸合成機を用いて合成することにより得ることができる。
ベクターに当該ＤＮＡを組み入れて、当該ＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを得る工程、及び、当該組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換させて、当該ペプチドを発現し得る形質転換体を得る工程は成書（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された一般的な遺伝子工学の手法に基づいて実施することが可能である。なお、本発明に用いるペプチドは、メチオニンを含まないよう設計することが可能なので、メチオニンを介在させて複数の本発明のペプチドが連結したペプチドを遺伝子工学的に産生した後ブロムシアンで切断して得ることも可能である。
生産される当該ペプチドは、多くの文献や成書（例えば、「新生化学実験講座１：タンパク質Ｉ」（日本生化学会編、東京化学同人、１９９０年）、「化学増刊１０２：タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」（宇井信生ら編、化学同人、１９８５年））に記載された方法を参考にして、精製、単離及び回収することができる。すなわち、脱塩、濃縮、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過のうちから選ばれる少なくとも一つの方法を用いて当該ペプチドを純粋な形で得ることができる。
本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドは、上記方法により得られる本発明に用いるペプチドを上記のＰＥＧで化学修飾して得られる。
ＰＥＧ化学修飾条件は特に限定されず、当業者に公知の方法を適宜選択できる。
具体的には、それぞれ適当な溶媒に溶解したペプチド溶液と活性化ＰＥＧ溶液とを混合し、約１〜約４０℃で、約１分〜約２４時間程度反応させる。
なお、ＰＥＧ化学修飾後、通常用いられる方法、条件で、精製することもできる。
上記製造方法において、活性化ＰＥＧの使用量は、本発明に用いるペプチドの量に対してモル比で０．０００１〜１００００であり好ましくは０．０１〜１００であり、特に好ましくは０．１〜１０である。この範囲であれば、活性化ＰＥＧはペプチドと反応しても、ＰＥＧ化学修飾ペプチドは元のペプチドの活性を維持し、かつ溶解性を更に上げる、抗原性を減弱する、毒性を減弱するなど、より好ましい性質を付与することが可能だからである。
ＰＥＧ化学修飾ペプチドのＰＥＧ部分の平均分子量は、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであり、好ましくは、約１，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａ、さらに好ましくは、約２，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａである。
この範囲であれば、ＰＥＧ化修飾ペプチドは元のペプチドの活性を維持し、かつ溶解性を更に上げる、抗原性を減弱する、毒性を減弱するなど、より好ましい性質を付与することが可能である。
本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドとペプチド結合物質との複合体の製造法について、以下述べる。
該複合体の製造方法は、上記した、本発明に用いるペプチド、活性化ＰＥＧ及びペプチド結合物質を用いて、
Ｉ）ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを反応させる工程、
ｂ）前記ａ）により得られるＰＥＧ化学修飾ペプチドと、ペプチドと結合する物質とを反応させる工程、
よりなる製造方法、
又は、
ＩＩ）ａ）１８アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、ペプチド結合物質と反応させる工程、
ｂ）該ペプチドと該ペプチド結合物質との反応物を、活性化ＰＥＧと反応させる工程、
よりなる製造方法である。
ペプチドと該ペプチド結合物質との反応物を予め形成し、反応物をＰＥＧ修飾することにより不必要なＰＥＧ修飾を抑制することができるため、ＩＩ）の方法が好ましい。
このＩＩ）の方法を用いれば、ＰＥＧ修飾によってペプチドの機能が発揮されるために必要な部位（ペプチドの活性中心）が覆われてしまったり、ペプチドの構造が変化し標的に近づけないなど比活性の低下をもたらす不必要なＰＥＧ修飾を抑制することが可能であり、ＰＥＧ修飾の有用性を更に向上させることができる。
方法Ｉ）のａ）における反応条件は、上記本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドの製造条件を選択でき、Ｉ）のｂ）における反応条件は、後述するＩＩ）のａ）と同様の条件を選択できる。
方法ＩＩ）の工程ａ）の反応条件は特に限定されず、該反応物が形成できる条件を任意に選択でき、具体的には、それぞれ適当な溶媒に溶解したペプチド溶液と該ペプチド結合物質の溶液とを約１〜約４０℃で、約１分〜約２４時間程度混合させる条件が挙げられる。
方法ＩＩ）の工程ｂ）の反応条件は特に限定されず、該複合体が形成できる条件を任意に選択でき、具体的には、上記した、本発明に用いるペプチドのＰＥＧ化学修飾の条件が挙げられる。
より具体的には、実施例２７に記載されている。
該製造方法に用いられる、本発明に用いるペプチド、活性化ＰＥＧ及びペプチド結合物質の量比は、該複合体が用いられる用途、該複合体に要求される性質、特徴、薬理活性、安全性等を考慮して任意の比率とすることができる。
具体的には、方法ＩＩ）の工程ａ）で用いるペプチド結合物質は、該ペプチドが有する正電荷（＋）の個数とペプチド結合物質が有する負電荷（−）の個数との比（＋／−比）が２以上となるよう、より好ましくは３以上となるよう使用する。また、該比は好ましくは１００以下であり、より好ましくは５０以下である。その範囲であれば、ペプチドとペプチド結合物質が複合体を形成することができる。
方法ＩＩ）の工程ｂ）で用いる活性化ＰＥＧは、本発明に用いるペプチドの量に対してモル比で０．０００１〜１００００であり好ましくは０．０１〜１００であり、特に好ましくは０．１〜１０である。この範囲であれば、活性化ＰＥＧはペプチドと反応しても、ＰＥＧ化修飾ペプチドは元のペプチドの活性を維持し、かつ溶解性を更に上げる、抗原性を減弱する、毒性を減弱するなど、より好ましい性質を付与することが可能だからである。
また、当該方法により製造される、本発明のＰＥＧ化学修飾ペプチドと、ペプチド結合物質との複合体、上記３成分の混合物、組成物、凝集体等も本発明に含まれるのはいうまでもない。実施例３０の結果から、本発明に用いるペプチドと、ＰＥＧと、ペプチド結合物質とが複合体（凝集体、混合物、組成物等）を形成していることが分かる。
実施例
以下、実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは実施の一例として示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は当該分野における慣例略号に基づくものである。
＜実施例１＞ペプチドの化学合成
配列番号１〜２７のアミノ酸配列を有するペプチドを、自動ペプチド合成機（４３２Ａ型、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて固相合成した。なお、３０残基以上の長さを有するペプチドの合成は、２５残基目のアミノ酸が脱保護されない状態で合成を中断し、２６残基目以降のアミノ酸カラムを合成機に装着し直した後合成を再開させて合成を遂行した。他の操作方法については、特に明記しない限り添付の操作マニュアルに従った。切り出し、脱保護反応を行い、エーテル中でペプチドを沈殿させた後、エーテルを除去し、蒸留水に溶解させて凍結乾燥した。続いて、配列番号１〜２６のペプチドは１０ｍＭ  ＨＣｌを含む２０％アセトニトリル水溶液で、配列番号２７のペプチドは１０ｍＭ  ＨＣｌを含む１５％アセトニトリル／１５％イソプロパノール水溶液で各々溶解し、Ｃ１８カラム（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８ＡＧ１２０、資生堂社製）、高速液体クロマトグラフィー（６２５ＬＣシステム、ウォーターズ社製）を用いて、配列番号１〜２６のペプチドは１０ｍＭ  ＨＣｌを含む２０％〜７０％アセトニトリル水溶液で直線濃度勾配法により単一ピークが得られるよう精製し、配列番号２７のペプチドは１０ｍＭ  ＨＣｌを含む１５％〜５０％アセトニトリル／１５％〜５０％イソプロパノール水溶液で直線濃度勾配法により単一ピークが得られるよう精製した。精製ペプチドは凍結乾燥した後蒸留水に溶解させ、凍結保存した。
収量は、それぞれ３０ｍｇ〜４０ｍｇであった。
＜実施例２＞ペプチドの検定（１）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ型質量分析計（ＶｏｙａｇｅｒＤＥ−ＳＴＲ、ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、質量分析により得られた合成ペプチドの分子量を測定し、ペプチドが目的物であることを検証した。操作方法については、特に明記しない限り添付の操作マニュアルに従った。概略は以下のとおりである。
すなわち、まず、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）を０．１ｖｏｌ％  ＴＦＡ／５０ｖｏｌ％  アセトニトリル／純水で溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマトリックス溶液を調製した。つぎに、サンプルプレート上で、実施例１に記載の方法で取得したペプチド水溶液（１０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬとマトリックス溶液０．５μＬとを混合し、乾燥させて試料を結晶化したのち、以下の条件で分析を行った。
測定モード：Ｌｉｎｅａｒ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ
キャリブレーション：外部標準法（ただし、標準品は▲１▼ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩ、▲２▼ＡＣＴＨ（１−１７ｃｌｉｐ）、▲３▼ＡＣＴＨ（１８−３９ｃｌｉｐ）、▲４▼ＡＣＴＨ（７−３８ｃｌｉｐ）、▲５▼Ｉｎｓｕｌｉｎ（ｂｏｖｉｎｅ））
その結果、合成及び精製したいずれのペプチドの分子量も理論分子量と一致することが確認できた。
＜実施例３＞ペプチドの検定（２）
アミノ酸組成分析により、実施例１で得られた合成ペプチド溶液の濃度を決定した。アミノ酸組成分析はニンヒドリン法により行った。
すなわち、試料をガラス試験管中で乾固し、６Ｎ  ＨＣｌ１００μＬを添加、真空封管下、１１０℃で２２時間加水分解を行った。試料を乾固後、純水に溶解しアミノ酸分析計（Ｌ−８５００型、日立社製）を用いて分析を行った。ペプチド水溶液の濃度は７〜１０ｍｇ／ｍＬであった。
＜実施例４＞ＢＳＡ中での濁度測定
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度１％、ペプチド濃度が５０μＭとなるよう水溶液を調製し、分光光度計（ＤＵ６４０型、ベックマン社製）を用いて波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表１に示したが、いずれも０．１以下であった。
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＜実施例５＞ＣＤスペクトルの測定
５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）中に溶解させたペプチドのＣＤスペクトルを、５ｍＭ  ＳＤＳ存在下、非存在下で円二色性分散計（Ｊ−５００Ａ型、日本分光社製）を用いて測定した。なお、セル長は１ｍｍ、３５℃、積算回数６回で行った。
図７〜図９は、各々配列番号１、配列番号４及び配列番号１６のペプチドのＣＤスペクトル測定による平均残基楕円率曲線を示す図であり、図から明らかなように、ＳＤＳ存在下のものの平均残基楕円率曲線では、波長２０５〜２１０ｎｍの領域と、波長２２０〜２２５ｎｍの領域に極小値を認められるいわゆるＷ型の曲線となり、α−ヘリックス構造を取っていることが確認できる。
すなわち、遺伝子導入能が認められた配列番号１、配列番号４及び配列番号１６のペプチドでは、無機塩のみを含む水溶液中ではα−ヘリックス構造をとらないが、ＳＤＳ存在下ではα−ヘリックス構造をとることが示された。
＜実施例６＞オリゴヌクレオチドの合成
２１ｍｅｒ長の未標識オリゴヌクレオチドは、ＯＰＣカラム（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて精製した調製物を、ＦＩＴＣ標識した２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣ法により精製した調製物を、各々（株）サワデー・テクノロジー社に合成委託し入手した。
＜実施例７＞Ｐｌａｓｍｉｄの調製
蛍ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とした発現プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーター下に蛍ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれた市販のプラスミド（ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）又はＣＭＶ初期プロモーター下に蛍ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（Ｆ））若しくはＥＦ−１αプロモーター下に蛍ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミド（ｐＥＦ−Ｌｕｃ）を使用した。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をレポーター遺伝子とした発現プラスミドは、ＥＦ−１αプロモーター下にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が組み込まれたプラスミド（ｐＥＦ−ｔｋ）又はＣＭＶ初期プロモーター下にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が組み込まれたプラスミド（ｐＣＭＶ−ｔｋ）を使用した。これらのプラスミド及び汎用プラスミドであるｐＵＣ１１９及びｐＢＲ３２２は、必要に応じて大腸菌を用いて増幅させたのち、公知の方法に従って精製して使用した。
＜実施例８＞核酸との結合能の評価
（１）オリゴヌクレオチドとの結合能の評価
１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）中で、実施例６に記載の方法によって調製した２１ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチド（終濃度６．７μＭ）と、実施例１〜３に記載の方法によって調製した各ペプチドを電荷比（＋／−比）が０〜１０となるよう混合し、３７℃、３０分静置した。続いて、この溶液７．５μＬと等量の８０％ホルムアミド含有トリス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．２）とを混合して、７Ｍ尿素を含有する２５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。泳動後、ゲルを、５０％ホルムアミドを含む５％Ｓｔａｉｎｓ  ａｌｌ（フナコシ社製）水溶液で染色・水洗してオリゴヌクレオチドとペプチドとの結合の有無を判定した。
図１０に配列番号１のペプチドを用いた場合の電気泳動図を示す。図１０で＋／−比（電荷比）は、ペプチドの正電荷を有する基の個数（＋）と、核酸の有する負電荷の基の個数（−）を比で表したものである。図から明らかなように、電荷比（＋／−比）が増加するにしたがってオリゴヌクレオチドのペプチドへの結合量は増加し、電荷比（＋／−比）１０で完全に結合した。同様に、配列番号２〜２４のペプチドにおいても電荷比（＋／−比）１０において結合が認められた。
（２）プラスミドとの結合能の評価
１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）中で、実施例７に記載の方法によって調製したプラスミド（ｐＵＣ１１９：終濃度＝２０μｇ／ｍＬ）と、実施例１〜３に記載の方法によって調製した各ペプチドを電荷比（＋／−比）が０〜３となるよう混合し、３７℃、３０分静置したのち、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ってプラスミドとペプチドとの結合の有無を判定した。
図１１に配列番号１のペプチドを用いた場合の電気泳動図を示す。図１１で＋／−比（電荷比）は、ペプチドの正電荷を有する基の個数（＋）とプラスミドの負電荷を有する基の個数（−）を比で表したものである。図から明らかなように、電荷比（＋／−比）が増加するにしたがってプラスミドのペプチドへの結合量は増加し、電荷比（＋／−比）３で完全に結合した。同様に、配列番号２〜２４のペプチドにおいても電荷比（＋／−比）３において結合が認められた。
＜実施例９＞核酸導入能の評価（１）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入したサル腎臓由来株化細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、ヒト膀胱癌細胞（Ｔ２４細胞）、及び大日本製薬より購入したヒト肺癌細胞（Ａ５４９細胞）を２４ウェル培養プレート（ナルジェヌンク社製）に１ウェルあたり１×１０５細胞の割合で植え込み、Ｖｅｒｏ細胞とＡ５４９細胞は１０％ウシ胎児血清（以降ＦＢＳと記す：ニチレイ社製）含有ＤＭＥＭ（ライフテックオリエンタル社製）で、Ｔ２４細胞は１０％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ（ライフテックオリエンタル社製）で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。培地を除去した後、実施例７で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド濃度が１μｇ／ｍＬになるよう、及び、実施例１で調製したペプチド濃度が１．２５、２．５、又は５μＭとなるように調製したｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ライフテックオリエンタル社製）を添加して５時間培養した。続いて、Ｖｅｒｏ細胞とＡ５４９細胞は、培地を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに、またＴ２４細胞は１０％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａに置換して５％ＣＯ２雰囲気下３７℃でさらに２４時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社製）の方法に準じて細胞内で発現しているルシフェラーゼ活性を測定した。すなわち、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（以降ＰＢＳと記す：ＳＩＧＭＡ社製）で洗浄し、キットに付属しているＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解した。
この細胞溶解液２０μＬとキットに付属のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＲｅａｇｅｎｔＩＩ  １００μＬとを蛍光測定用プレート（ＭｉｃｒｏｌｉｔｅＴＭ１  ｐｌａｔｅ：ダイナテック社製）に添加して混和後、マルチラベルカウンター（ＡＲＶＯＴＭ  ＳＹ１４２０ＭＵＬＴＩ  ＬＡＢＥＬ  ＣＯＵＮＴＥＲ：ワラックベルトールド社製）を用いて蛍光を１秒間測定した。
細胞溶解液中のタンパク質濃度は、ディスポーザブルキュベット（ＵＶケイコウキュベットＡ２０４Ｘ：フナコシ社製）中で、超純水７９２μＬに細胞溶解液８μＬとプロテインアッセイ溶液（バイオラッド社製）２００μＬを混和後、５分間、室温で静置し、分光光度計（ＤＵ６４０：ベックマン社製）で５９５ｎｍの吸光度で測定した。スタンダードタンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。以上の結果から細胞溶解液中のタンパク質１ｍｇあたり、１秒あたりのカウント数を算出してルシフェラーゼ活性とし、ペプチド濃度が異なる３条件の中で最も高い値を示したものをそのペプチドの遺伝子導入能とした。
＜実施例１０＞核酸導入能の評価（２）
Ｖｅｒｏ細胞をチャンバー付スライドガラス（Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩｃｈａｍｂｅｒＳｌｉｄｅ  ｓｉｚｅ４ｗｅｌｌ：ナルジェヌンク社製）の各ウェルに１×１０５細胞の割合で植え込み、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間、培養した。培地を除去後、実施例６で調製したＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド濃度３００ｎＭ、実施例１で調製した配列番号１のペプチド２．５μＭを含有するｏｐｔｉ−ＭＥＭを添加し４時間培養した。１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに置換して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でさらに２４時間、培養した後、細胞をＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、蛍光顕微鏡（ＡＨ−３：オリンパス社製）で細胞核にＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドが集積しているか否かを確認した。その結果、細胞核にＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドが集積していることを確認した。一方、配列番号１のペプチド非存在下では、細胞内にＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドは認められなかった。
＜実施例１１＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（１）
実施例９に記載の方法にしたがって、配列番号１のペプチドの細胞への核酸導入能を検証した。図１２は、配列番号１のペプチドの有無による、細胞内へ導入されるプラスミド量の差をルシフェラーゼ活性により比較した図である。図に示したように、配列番号１のペプチドは核酸を細胞内へ導入する能力を有することが認められた。一方、配列番号１のペプチド非存在下では核酸は細胞内へ導入されなかった。
＜実施例１２＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（２）
配列番号１のペプチドを基準として、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」中の１箇所若しくは２箇所をアミノ酸置換した配列番号２〜１８のペプチドの、細胞への核酸導入能を実施例９に記載の方法にしたがって評価した。その結果、いずれのペプチドも細胞への核酸導入能を有していることがわかった。
なお、核酸導入能は、たんぱく質１ｍｇあたり、１秒あたりの蛍光カウント数（ｃｐｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）により以下のように分類し、結果の一覧を表２に示した。
１０，０００以上  １００，０００未満              …  １＋
１００，０００以上  １，０００，０００未満        …  ２＋
１，０００，０００以上  １０，０００，０００未満  …  ３＋
１０，０００，０００以上  １００，０００，０００未満
…  ４＋
１００，０００，０００以上  １，０００，０００，０００未満
…  ５＋
１，０００，０００，０００以上                    …  ６＋
なお、配列番号１は、上記分類では３＋に相当する。
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＜実施例１３＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（３）
配列番号１のペプチドを基準として、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」中の３箇所をアミノ酸置換した配列番号１９〜２２のペプチドの、細胞への核酸導入能を実施例９の記載の方法にしたがって評価した。その結果、このペプチドは細胞への核酸導入能を有していることがわかった。
なお、核酸導入能は、たんぱく質１ｍｇあたり、１秒あたりの蛍光カウント数により実施例１２に記載の方法にしたがって分類し、結果の一覧を表２に示した。
＜実施例１４＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（４）
配列番号１及び配列番号４のペプチドを基準として、各々の欠失体である配列番号２３、２４のペプチドを作成し、細胞への核酸導入能を実施例９の記載の方法にしたがって評価した。その結果、いずれのペプチドも細胞への核酸導入能を有していることがわかった。
なお、核酸導入能は、たんぱく質１ｍｇあたり、１秒あたりの蛍光カウント数により実施例１２に記載の方法にしたがって分類し、結果の一覧を表２に示した。
＜実施例１５＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（５）
実施例９の方法にしたがって、配列番号１６のペプチドの各種株化癌細胞への核酸導入能を検証した。
癌細胞は、ヒト子宮癌細胞ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５（ＡＴＣＣより購入）、ヒト腎由来形質転換細胞２９３（ＡＴＣＣより購入）、ヒト肝癌細胞ＳＫ−ＨＥＰ−１（ＡＴＣＣより購入）、ヒト卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣより購入）、ラット脳腫瘍細胞Ｆ９８（ＡＴＣＣより購入）、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６／ＢＬ６（北海道大学免疫科学研究所化学部門より譲渡）、ヒト子宮癌細胞ＭＥＳ−ＳＡ（ＡＴＣＣより購入）、マウス肺癌細胞Ｌｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（財団法人  癌研究会より譲渡）、マウス肝癌細胞ＭＨ１３４（財団法人  実験動物中央研究所より譲渡）、ヒト子宮癌細胞ＭＥＳ−ＳＡ／Ｍｘ２（ＡＴＣＣより購入）、ヒト髄芽腫細胞Ｄａｏｙ（ＡＴＣＣより購入）、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ（ＡＴＣＣより購入）、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣＣより購入）、ヒト膠芽腫細胞Ｕ−８７  ＭＧ（ＡＴＣＣより購入）、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣより購入）、ヒト腎癌細胞Ａ−４９８（ＡＴＣＣより購入）、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６／Ｆ１０（ＡＴＣＣより購入）、ヒト前立腺癌細胞ＤＵ  １４５（ＡＴＣＣより購入）、ヒト脳腫瘍細胞Ｕ−１３８  ＭＧ（ＡＴＣＣより購入）、マウス肉腫細胞Ｍｅｔｈ−Ａ（国立がんセンターより譲渡）を用いた。各細胞の培養に用いた増殖培地は、表５中に記載した。なお、添加物ＮＥＡＡ（ＩＣＮ社製）は非必須アミノ酸であり、Ｎａ・Ｐｙｒ（ＩＣＮ社製）はピルビン酸ナトリウムを示す。また、ＦＢＳは全てニチレイ社製のものを、培地はライフテックオリエンタル社製のものを使用し、全ての増殖培地にペニシリン・ストレプトマイシン（ＩＣＮ社製）を添加した。
継代維持した細胞を２４ウェル培養プレートに１ウェルあたり１×１０５細胞の割合で植え込み、各増殖培地で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。培地を除去した後、実施例７で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド濃度が１μｇ／ｍＬになるよう、及び、実施例１で調製したペプチド濃度が２．５μＭとなるように調製したｏｐｔｉ−ＭＥＭを添加して５時間培養した。続いて、培地を各増殖培地に置換して５％ＣＯ２雰囲気下３７℃でさらに２４時間培養した後、実施例９に記載の方法にしたがって細胞内で発現しているルシフェラーゼ活性を測定し、実施例１２に記載の基準にしたがってペプチドの遺伝子導入能を表３に示した。
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＜実施例１６＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（６）
実施例７で調製したＨＳＶ−ｔｋ発現プラスミドを実施例１で調製した配列番号１６のペプチドを用いてＬｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（マウス肺癌細胞）に組み込み、ガンシクロビル（以降ＧＣＶと記す）感受性亢進効果を検討した。すなわち、９６ｗｅｌｌ培養プレート（ナルジェヌンク社製）に細胞を５×１０３細胞の割合で植え込み、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。培地を除去後、ＨＳＶ−ｔｋ発現プラスミド濃度が１μｇ／ｍＬになるよう、及び配列番号１６のペプチド濃度が２．５μＭとなるように調製したｏｐｔｉ−ＭＥＭを１００μＬずつウェルに添加して５時間培養した。続いてＧＣＶ（デノシン：田辺製薬株式会社製）を０、２、２０、２００μＭ含有した２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを１００μＬずつウェルに添加して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３日間培養した。細胞の増殖抑制効果はＷＳＴ−１アッセイで測定した。すなわち、ＷＳＴ−１溶液（宝酒造社製）を１０μＬずつ各ウェルに添加し、１時間反応後、マルチラベルカウンターを用いて測定波長６２０ｎｍ、リファレンス波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果、図１３に示すようにＨＳＶ−ｔｋ発現プラスミドが細胞内へ導入されたＬｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞はＧＣＶの用量に依存して細胞増殖が抑制されたのに対し、対照としてルシフェラーゼ発現プラスミドが細胞内へ導入された細胞はＧＣＶ感受性亢進効果が認められなかった。
＜実施例１７＞核酸との複合体の保存安定性の評価
プラスミドとペプチドの複合体の保存安定性を評価した。
実施例７で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド濃度が２μｇ／ｍＬになるよう、及び、実施例１で調製した配列番号４のペプチド濃度が５μＭとなるように調製したｏｐｔｉ−ＭＥＭにおいて、遺伝子導入時直前に調製したものと１週間（７日）前に調製して４℃で保存したものを各々用いて、実施例９に記載の方法にしたがってＶｅｒｏ細胞にルシフェラーゼ発現プラスミドを導入しルシフェラーゼ活性を測定した。
図１４は、遺伝子導入直前に調製したペプチド／プラスミド複合体の遺伝子導入活性を１００％とし、４℃で一週間保存したペプチド／プラスミド複合体の遺伝子導入活性の相対値を示したものである。図１４に示したとおり、４℃で一週間保存したペプチド／プラスミド複合体の遺伝子導入活性は遺伝子導入直前に調製した該複合体の遺伝子導入活性とほぼ同等であった。
なお参考までに、市販のプラスミド導入剤であるリポフェクチンあるいはリポフェクトアミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００：ライフテックオリエンタル社製）を添付のプロトコールにしたがってルシフェラーゼ発現プラスミドと混合し、同様に、４℃で一週間保存した後の遺伝子導入活性を評価した結果、いずれも著しい活性の低下が認められた。図１４に結果を示す。
＜実施例１８＞ヌクレアーゼ耐性付与能の評価（１）
天然型（Ｐ＝Ｏ体）オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性付与能を評価した。すなわち、実施例１で調製した配列番号１のペプチドを５０μＭ、実施例６で調製したＰ＝Ｏ体オリゴヌクレオチドを３μＭ、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２ｍＭ  ＣａＣｌ２をそれぞれ含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８）にヌクレアーゼＢａｌ３１（宝酒造社製）２Ｕを加えて３０℃、６０分反応させた。続いて、フェノール／クロロホルムで未分解オリゴヌクレオチドを抽出した後、実施例８に記載の方法にしたがって電気泳動を行い、オリゴヌクレオチドを染色した。
図１５に電気泳動図を示す。図から明らかなように、配列番号１のペプチドは、天然型（Ｐ＝Ｏ体）オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性付与能があることが示された。
なお参考までに、市販のプラスミド導入剤であるリポフェクチンあるいはリポフェクトアミン２０００を用いて同様にヌクレアーゼ耐性付与能を評価したところ、いずれもオリゴヌクレオチドの泳動染色像は得られず、オリゴヌクレオチドが分解されていることが示された。図１５に結果を示す。
＜実施例１９＞ヌクレアーゼ耐性付与能の評価（２）
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８）中で、実施例７に記載の方法で調製したｐＢＲ３２２（終濃度２０μｇ／ｍＬ）と、実施例１で調製した配列番号１６のペプチドを電荷比（＋／−比）が０〜１０となるよう混合し、ＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）５Ｕを加えて３０℃、６０分反応させた。続いて、フェノール／クロロホルムで未分解のプラスミドを抽出した後、実施例８に記載の方法にしたがって電気泳動を行い、プラスミドを染色した。
図１６に電気泳動図を示す。図から明らかなように、配列番号１６のペプチドは、プラスミドへのヌクレアーゼ耐性付与能があることが示された。
＜実施例２０＞ペプチドのホスファチジルセリン親和性の評価（ＥＩＡ）
ペプチドのホスファチジルセリンとの特異的な親和性は、血清アルブミン存在下でホスファチジルセリンには結合するがホスファチジルコリンには結合しないことが知られているヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩを用いてヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩのホスファチジルセリン結合に対する阻害活性で測定した。すなわち、ホスファチジルセリン（ＳＩＧＭＡ社製）：ホスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ社製）＝３：７となるよう混和したリン脂質を１０μｇ／ｍＬ含有したエタノール溶液を９６ウェルプレート（イムロンＩ：ダイナテック社製）に各ウェルに１００μＬずつ添加して、濃縮遠心機（ＥＣ−９５Ｃ、佐久間製作所製）を用いて４０℃で４０分間乾固した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，ＦｒａｃｔｉｏｎＶ  以降ＢＳＡと記す：生化学工業製）含有ＴＢＳ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４），０．９％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ）溶液を２００μＬずつを各ウェルに添加して３７℃で２．５時間静置し、ブロッキングしたのち、プレートを水洗し、終濃度１μｇ／ｍＬのヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩ（アメリカンダイアグノスティカ社製）と各用量の実施例１で調製したペプチドを混和した５％ＢＳＡ含有ＴＢＳ溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加して４℃で２４時間反応させた。
反応終了後は、成書（「酵素免疫測定法（第三版）」、石川栄治ら著、医学書院、１９８７）に記載の一般的方法に従って、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）によりホスファチジルセリンに結合したヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩを測定した。すなわち、１次抗体として抗ヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩマウスモノクローナル抗体（ＥＳＨ８：アメリカンダイアグノスティカ社製）、２次抗体として西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐ０２６０、ダコ社製）を用い、テトラメチルベンジジンを発色基質としてその吸光度を測定波長４５０ｎｍ、リファレンス波長６３０ｎｍで分光光度計（ＮＪ−２１００型、インターメッド社製）により測定した。
ペプチドのホスファチジルセリンとの親和性の強度は、ヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩのみ添加したウェルの吸光度からヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩを添加しなかったウェルの吸光度を引いた値をコントロール値（１００％）とし、ヒトＦａｃｔｏｒＶＩＩＩとペプチドを混和して添加したウェルの吸光度から各種ペプチドのみを添加したウェルの吸光度を引いた値をコントロール値で除した時に０．５となるペプチド濃度をＩＣ５０値と定め、ＩＣ５０値が１μＭ以下の場合を＋＋、１μＭより大きく１０μＭ以下の場合を＋、と定めて評価した。なお、１０μＭ以上の場合は特異的な親和性はないと判定した。結果を表４に示す。
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＜実施例２１＞  ペプチドのホスファチジルセリン親和性の評価（２）
ペプチドのホスファチジルセリン特異的親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ＝ＳＰＲ）によりビアコア２０００（ビアコア社製）を用いて測定した。すなわち、ＨＰＡ  ｃｈｉｐ（ビアコア社製）のフローセル１にホスファチジルコリンを、フローセル２にホスファチジルセリン５０％／ホスファチジルコリン５０％を固相化し、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ存在下でペプチドの各脂質に対する結合能を測定し親和性を評価した。その結果、配列番号１のペプチドはホスファチジルコリンを固相化したフローセル１と比較して、ホスファチジルセリン５０％／ホスファチジルコリン５０％を固相化したフローセル２において強く結合し、ホスファチジルセリンに特異的な親和性を示した（図１７）。それに対して、配列番号１の配列をランダムに入れ替えた配列番号２５のペプチドはホスファチジルコリンを固相化したフローセル１にも、ホスファチジルセリン５０％／ホスファチジルコリン５０％を固相化したフローセル２においても結合せず、親和性を示さなかった（図１８）。
＜実施例２２＞ホスファチジルセリン表出量と導入効率との相関（選択性）
ペプチドの遺伝子導入能の強さとホスファチジルセリン親和性との相関を明らかにするために、ホスファチジルセリンの細胞表層への表出量が異なる細胞を用いて検討を行った。すなわち、Ｖｅｒｏ、Ａ５４９、Ｔ２４の各細胞を用いて実施例９の記載にしたがって実施例１で調製した配列番号１のペプチドを用いて実施例７で調製したルシフェラーゼ発現プラスミドを導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。一方、各種細胞の細胞膜外に表出しているホスファチジルセリン量はＦＩＴＣ標識したアネキシンＶ（ＡＮＮＥＸＩＮＶ−ＦＩＴＣ：ファーミンジェン社製）を用いて添付の説明書に従って細胞を標識し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ：ペクトン・ディッキンソン社製）で測定した。すなわち、培養フラスコで培養した各種培養細胞を剥離し、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ溶液と混和後、フローサイトメトリーで細胞のＦＩＴＣ蛍光強度を測定し、各細胞の平均蛍光強度を細胞株のホスファチジルセリン表出量とした。
その結果、表５に示した通り、ホスファチジルセリン表出量（アネキシンＶ結合量）とペプチドベクターの遺伝子導入活性とが相関した。
なお、参考までに、市販のプラスミド導入剤であるリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：ライフテックオリエンタル社製）を添付のプロトコールにしたがって用いたところ、いずれの細胞にも同等にプラスミドが導入され、ホスファチジルセリンを特異的には認識しないことが示された。
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＜実施例２３＞ホスファチジルセリン表出量と導入効率との相関（２）
ペプチドの遺伝子導入能の強さとホスファチジルセリン親和性との相関を明らかにするために、ホスファチジルセリンを表出していない状態の細胞と、該細胞を刺激してホスファチジルセリンを表出した細胞とを用いてペプチドの核酸導入能の検討を行った。細胞は、ＲＢＬ−２Ｈ３ラット好塩基球由来培養細胞（ＡＴＣＣより購入）を使用し、抗ＤＮＰマウスモノクローナルＩｇＥ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）で感作し、ＤＮＰ−ＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）で脱顆粒反応を惹起し、この細胞に配列番号１６のペプチドを用いて実施例９に記載の方法に準じてルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。すなわち、２４ウェルプレートにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を３×１０５細胞の割合で植え込み、更に１００ｎｇ／ｍＬの濃度になるように抗ＤＮＰマウスモノクローナルＩｇＥ抗体を添加し、２４時間培養した。そして各ウェルをＰＢＳで２回洗浄後、ＤＮＰ−ＢＳＡを１０ｎｇ／ｍＬになるように添加し、脱顆粒反応を４５分間惹起した。更に培地を除去後、生理食塩水で各ウェルを洗浄し、実施例７で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド濃度が１μｇ／ｍＬになるよう、及び、実施例１で調製した配列番号１６のペプチド濃度が２．５μＭとなるように調製したｏｐｔｉ−ＭＥＭを添加して５時間培養した。
続いて培地を１５％非働化ＦＢＳ含有ＭＥＭ（ＮＥＡＡ、Ｎａ・Ｐｙｒ添加）に交換し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１日間培養した。その後、細胞を剥離し、実施例９に記載の方法でルシフェラーゼ活性を測定した。一方、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の脱顆粒反応によるホスファチジルセリン表出量は、以下に記載の方法で測定した。すなわち、６ウェル培養プレート（ナルジェヌンク社製）にＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１．５×１０６細胞の割合で植え込み、更に１００ｎｇ／ｍＬの濃度になるように抗ＤＮＰマウスモノクローナルＩｇＥ抗体を添加し、１５％非働化ＦＢＳ含有ＭＥＭ（ＮＥＡＡ、Ｎａ・Ｐｙｒ添加）で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。そして各ウェルをＰＢＳで２回洗浄後、ＤＮＰ−ＢＳＡを１０ｎｇ／ｍＬになるように添加し、脱顆粒反応を４５分間惹起した。細胞を剥離後、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（ＭＢＬ社製）を用いて添付の説明書にしたがって細胞を標識し、フローサイトメトリーで測定した。
その結果、脱顆粒刺激した細胞の表面にはホスファチジルセリンが表出し（図１９）、更にペプチドの脱顆粒刺激したＲＢＬ−２Ｈ３細胞への遺伝子導入能は、脱顆粒反応していない細胞と比較して著しく上昇した（図２０）。
なお、市販の遺伝子導入剤リポフェクトアミン２０００の遺伝子導入能は、脱顆粒反応した細胞では脱顆粒前と同等か、やや減少した。
＜実施例２４＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（７）
ｉｎ  ｖｉｖｏでペプチドが遺伝子導入能を示すことを証明するため、Ｍｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞移植腹水癌モデルを用いてペプチドが有する細胞への核酸導入能の検討を行った。すなわち、Ｍｅｔｈ−Ａ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールス・リバーより購入）の腹腔に４×１０６細胞移植し、４日後に実施例７で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド３０μｇと実施例１で調製した配列番号１６のペプチド１１３ｎｍｏｌの混和物を腹腔内投与した。更に１日後にマウスを屠殺し、腹腔内のＭｅｔｈ−Ａ細胞を回収して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、図２１に示すように対照として生理食塩水のみを投与したマウス及びルシフェラーゼ発現プラスミド３０μｇのみを投与したマウスでは全くルシフェラーゼの発現が認められなかったのに対し、ルシフェラーゼ発現プラスミド３０μｇと配列番号１６のペプチド１１３ｎｍｏｌの混和物を腹腔内投与したマウスではルシフェラーゼの発現が認められた。
＜実施例２５＞ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価（８）
ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドの遺伝子導入により薬理効果を示すことを証明するため、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子導入によるＧＣＶ感受性の亢進を利用した抗腫瘍効果をＬｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（マウス肺癌細胞）腹腔内播種モデルを用いて検討した。すなわち、Ｌｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールス・リバーより購入）の腹腔内に１×１０５細胞移植し、実施例７で調製したＨＳＶ−ｔｋ発現プラスミド１０μｇと実施例１で調製した配列番号１６のペプチド４０ｎｍｏｌの混和物を細胞移植後に腹腔内投与し、更にＧＣＶを３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で移植後１日目から８日目まで投与した。その結果、図２２に示すようにマウスの平均生存期間は生理食塩水投与群とＧＣＶを３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で単独投与した群はいずれも１４日であったのに対し、ＨＳＶ−ｔｋ発現プラスミド１０μｇと配列番号１６のペプチド  ４０ｎｍｏｌの混和物を投与後、ＧＣＶを３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で投与した群は細胞移植後２０日目でも全マウスが生存していた。
＜実施例２６＞ペプチドの毒性の評価
マウスの尾静脈より本発明に用いるペプチドを投与して毒性を評価した。マウスは５週齢、メスのＢＡＬＢ／ｃを用いて、ペプチドの投与用量は５ｍｇ／ｋｇとした。その結果、本発明に用いるペプチド（配列番号１６）を投与してもマウスになんら影響が認められなかった。これにより、本発明に用いるペプチドが血液中で凝集塊を形成せず、安全性が高いことがわかる。
＜実施例２７＞プラスミド／ペプチド複合体のＰＥＧ修飾
プラスミドとペプチドの複合体の活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による修飾を行った。
まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子導入に用いるＰＥＧ修飾したプラスミド／ペプチド複合体を以下の方法で調製した。
すなわち、あらかじめ、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）を１６μｇ／ｍＬの濃度で含む生理食塩水１００μＬと配列番号１６のペプチドを４８μＭの濃度で含む生理食塩水１００μＬとを室温で混合した。
そこへ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍ．Ｗ．５０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社製）を２３ｍｇ／ｍＬの濃度で含む生理食塩水１０μＬを添加し、室温で１時間反応させてＰＥＧ修飾したｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ペプチド複合体（ＰＥＧ１）を得た。
次に、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子導入に用いるＰＥＧ修飾したプラスミド／ペプチド複合体を以下の方法で調製した。
すなわち、あらかじめ、前述のプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）を２６８μｇ／ｍＬの濃度で含む５％グルコース水溶液１０５０μＬと配列番号１６のペプチドを８０４μＭの濃度で含む５％グルコース溶液１０５０μＬとを室温で混合し複合体を形成させた。
そこへ、前述のｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００を２６３．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含む５％グルコース溶液１５０μＬを添加し、室温で１時間反応させてＰＥＧ修飾したｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ペプチド複合体（ＰＥＧ２）を得た。
＜実施例２８＞ＰＥＧ修飾した、プラスミド／ペプチド複合体の遺伝子導入能の評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
実施例２７に記載した方法にしたがって調製したｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ペプチド複合体（ＰＥＧ１）、若しくは、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃと配列番号１６のペプチドの複合体（ＰＥＧ未修飾物）を、１μｇ／ｍＬのプラスミド濃度で実施例９に記載した方法にしたがってＶｅｒｏ細胞へ導入し、発現したルシフェラーゼの活性を測定した。
その結果、図２３に示すように、ＰＥＧ修飾した複合体を導入したＶｅｒｏ細胞のルシフェラーゼ活性は、ＰＥＧ修飾していない複合体を導入したＶｅｒｏ細胞のルシフェラーゼ活性と同等であり、ＰＥＧ修飾によってもプラスミド／ペプチド複合体の遺伝子導入能が低下しないことが確認された。
＜実施例２９＞ＰＥＧ修飾した、プラスミド／ペプチド複合体の遺伝子導入能の評価（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
アナフィラキシーショックマウスを用いて、ＰＥＧ修飾したプラスミド／ペプチド複合体の遺伝子導入能をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。
はじめに、アナフィラキシーショックマウスを得るために、マウスのｏｖａｌｂｕｍｉｎ（以下ＯＶＡと記載する）感作を以下の方法で実施した。すなわち、まず、ＯＶＡ（Ｅｇｇ  Ａｌｕｂｕｍｉｎ，５×  Ｃｒｙｓｔ、生化学工業社製）を１．８％塩化ナトリウム水溶液で３２μｇ／ｍＬとなるよう調製した。
次に、水酸化アルミニウムゲル（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ、ＳＥＲＶＡ社製）を超純水で８ｍｇ／ｍＬとなるよう調製し、この溶液を氷冷し、攪拌しながら前述のＯＶＡ溶液を等容混和してＯＶＡ／水酸化アルミニウムゲル溶液を調製した。
続いて、このＯＶＡ／水酸化アルミニウムゲル溶液をＢＡＬＢ／ｃマウス（オス、４ｗ、日本チャールス・リバー社）の腹腔に５００μＬ投与してＯＶＡ感作を行った。感作は、５日間おいて２回行った。
遺伝子導入は、感作開始後１３日目に実施した。
すなわち、実施例２７に記載した方法にしたがって調製したＰＥＧ修飾したｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ペプチド複合体（ＰＥＧ２）、若しくは、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃと配列番号１６のペプチドの複合体（ＰＥＧ未修飾物）を、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ換算で５０μｇの用量で、ＯＶＡ  ５０μｇと同時に前述のＯＶＡ感作マウスに尾静脈から全身投与した。
翌日、右肺を摘出し、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製）５００μＬ中で、Ｈａｎｄｙ  Ｐｅｓｔｌｅ（東洋紡社製）を用いて磨砕した。磨砕液を小型遠心分離機（トミー社製）で１２０００回転で１５分間遠心分離し、上清２０μＬを実施例９の方法にしたがってルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、図２４に示すようにＰＥＧ修飾していない複合体を投与したマウスの肺よりも、ＰＥＧ修飾した複合体を投与したマウスの肺の方が明らかにルシフェラーゼ活性が高かった。
＜実施例３０＞ＰＥＧ修飾した、プラスミド／ペプチド複合体中に存在するＰＥＧ修飾ペプチドの同定
実施例２７で調製したｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ペプチド複合体（ＰＥＧ１）の反応液５５０μＬを、遠心限外ろ過器Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１００（アミコン社製）に移し、４℃で１，０００ｘｇ  １０分間の遠心分離を行い、未反応の遊離ペプチド及び遊離ＰＥＧを分離・除去した。ろ過器に生理食塩水５００μＬを添加し、再度４℃で１，０００ｘｇ  １０分間遠心分離する操作を３回繰り返して洗浄した後、非還元ＳＤＳサンプルバッファー（第一化学薬品）５０μＬを添加して室温で５分間静置し、限外ろ過膜上に残留したｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ペプチド複合体（ＰＥＧ１）を含む試料液（Ｍ）を回収した。
次に、この試料液（Ｍ）２５μＬを５−２０％グラジエントゲル（アトー）を用いたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（２０ｍＡ定電流、９０分間）に供した。電気泳動後のゲルは、銀染色キットＩＩ（和光純薬社製）を用いて染色した。
その結果、図２５に示したとおり、分子量１０，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ付近にブロードな染色像が認められ、ペプチド部分の分子量、及び、１分子あたりのＰＥＧ部分の分子量がそれぞれ約５，０００Ｄａであるから、ペプチド１分子あたりのＰＥＧ結合数は１〜３分子と推定された。
＜実施例３１＞修飾用ペプチドの化学合成および検定
配列番号１６のペプチドのＣ末端側若しくはＮ末端側にシステインを付加したペプチド（以下、各々、ペプチド１６ＣＣ、ペプチド１６ＮＣと記載する）を自動ペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ社製、４３３型）を用いて添付の操作マニュアルに従って固相合成した。切り出し、脱保護反応を行い、エーテル中でペプチドを沈殿させた後、エーテルを除去し、蒸留水に溶解させて凍結乾燥した。続いて、１０ｍＭ  ＨＣｌを含む２０％アセトニトリル水溶液で溶解し、Ｃ１８カラム（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８ＡＧ１２０、資生堂社製）、高速液体クロマトグラフィー（６２５ＬＣシステム、ウォーターズ社製）を用いて、１０ｍＭ  ＨＣｌを含む２０％〜７０％アセトニトリル水溶液で直線濃度勾配法により単一ピークが得られるよう精製した。精製ペプチドは凍結乾燥した後蒸留水に溶解させ、凍結保存した。収量は、それぞれ４０ｍｇ〜５０ｍｇであった。
続いて、実施例２に記載の方法にしたがって、得られたペプチドが目的物であることを確認し、実施例３に記載の方法にしたがって、ペプチド濃度を決定した。
＜実施例３２＞リン脂質が結合したＰＥＧ化学修飾ペプチドの調製
マレイミド基を末端に持つＰＥＧが付加した合成リン脂質（ＤＳＰＥ−２０ＭＡ，日本油脂社製）のＰＥＧの末端部位に、ペプチド１６ＣＣ若しくはペプチド１６ＮＣを結合させた「リン脂質が結合したＰＥＧ化学修飾ペプチド」（以下、各々ＤＳＰＥ−１６ＣＣ、ＤＳＰＥ−１６ＮＣと記載する）を調製した。すなわち、ＤＳＰＥ−２０ＭＡ水溶液を６μｍｏｌ／ｍＬとなるよう調製し、ペプチド１６ＣＣ水溶液およびペプチド１６ＮＣ水溶液を各々１５０ｎｍｏｌ／ｍＬ、３００ｎｍｏｌ／ｍＬ、６００ｎｍｏｌ／ｍＬとなるよう調製した。続いて、３０μＬのＤＳＰＥ−２０ＭＡ溶液と、３０μＬの各濃度のペプチド溶液をそれぞれ等量混和し、ＤＳＰＥ−２０ＭＡの２．５％、５％、１０％がＤＳＰＥ−１６ＣＣもしくはＤＳＰＥ−１６ＮＣに転化するよう室温で２時間反応させた後、１８μｍｏｌ／ｍＬのシステイン水溶液を３０μＬ添加して反応を停止させた。なお、ペプチド溶液の代わりに３０μＬの水を混和したものをコントロールとして調製した。
＜実施例３３＞ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾したドキソルビシン含有リポソームの作成
ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾したリポソーム製剤を作成した。まず初めに、陰荷電リポソーム（ＥＬ−Ａ−０１，日本油脂社製）と塩酸ドキソルビシン（和光純薬社製）を用いてドキソルビシン包含リポソームを調製した。すなわち、ＥＬ−Ａ−０１を５０μｍｏｌ／ｍＬになるように５％グルコース溶液に懸濁し、塩酸ドキソルビシンを５μｍｏｌ／ｍＬになるように５％グルコース溶液に溶解して、ＥＬ−Ａ−０１懸濁液３０μＬと塩酸ドキソルビシン溶液３０μＬとを等量混和し、６０℃で５分間加熱した。次に、このドキソルビシンが包含されたリポソームの表面に実施例３２で調製したＤＳＰＥ−１６ＣＣまたはＤＳＰＥ−１６ＮＣを融合させた。すなわち、前述のとおり調製したドキソルビシン包含リポソーム溶液（６０μＬ）と、実施例３２で調製したＤＳＰＥ−１６ＣＣを含む溶液またはＤＳＰＥ−１６ＮＣを含む溶液７５μＬとを混和し、６０℃で５分間加熱した。
反応させた混和液は遠心分離し（１００００ｇ、２０分間、４℃）、上清を除いてリポソームに包含されていないドキソルビシンを除いた。この操作を更に１回繰り返して、最後に５％グルコース溶液１２０μＬに懸濁して、ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾されたドキソルビシン包含リポソームを得た。
＜実施例３４＞ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾されたドキソルビシン包含リポソーム中のドキソルビシンの定量
実施例３３で作成したリポソーム中のドキソルビシンの濃度を定量した。すなわち、実施例３３で作成したリポソーム溶液２０μＬと、５％グルコース溶液１８０μＬを混和して１０倍に希釈し、更に４００μＬのイソプロピルアルコールと混和してリポソームを崩壊させ、溶液中に放出されたドキソルビシン量を４７０ｎｍの吸光度により測定した。一方、０、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍＬのドキソルビシンを含む５％グルコース溶液を標準サンプルとして調製し、それぞれ２００μＬにイソプロピルアルコール４００μＬを混和し検量線を作成した。
＜実施例３５＞ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾されたドキソルビシン包含リポソームの細胞増殖抑制効果の評価（１）
実施例３３の方法で作成したＤＳＰＥ−１６ＣＣで修飾したドキソルビシン包含リポソームの細胞増殖抑制効果を、Ｂ１６−ＢＬ６マウスメラノーマ細胞とＭｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞で評価した。
まず、実施例２３に記載の方法にしたがって細胞表面のホスファチジルセリンの量を測定した。Ｂ１６−ＢＬ６細胞とＭｅｔｈ−Ａ細胞をＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶで処理し、フローサイトメトリーで測定した結果、Ｂ１６−ＢＬ６の平均蛍光強度は７３５でＭｅｔｈ−Ａ細胞は１１４であり、Ｂ１６−ＢＬ６細胞の方が高かった。
次にＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾されたドキソルビシン包含リポソームの細胞増殖抑制効果を評価した。すなわち、Ｂ１６−ＢＬ６細胞とＭｅｔｈ−Ａ細胞を各々９６ウェルプレートに１×１０３細胞の割合で植込み、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１日間培養した。翌日、各細胞にＤＳＰＥ−１６ＣＣで修飾したドキソルビシン包含リポソームをドキソルビシン濃度換算で０、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎｇ／ｍＬの用量で添加し、更に３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養後、ＷＳＴ−１溶液（ＴＡＫＡＲＡ社製）を１０μＬずつ各ウェルに添加し発色させた。細胞増殖抑制効果はサンプル非添加群の吸光度を１００％として各サンプルの活性を評価した。その結果、リポソーム表面に存在する総ＰＥＧ分子の２．５％、５％、１０％がＰＥＧ化学修飾ペプチドに該当するドキソルビシン包含リポソームの細胞増殖抑制効果は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドを含まないドキソルビシン包含リポソームと比較して、ＩＣ５０値でホスファチジルセリンの表出量の低いＭｅｔｈ−Ａ細胞では最大で約３倍の増強効果が認められ、ホスファチジルセリンの表出量の高いＢ１６−ＢＬ６細胞では最大で約３３倍の増強効果が認められた（表６）。
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＜実施例３６＞ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾されたドキソルビシン包含リポソームの細胞増殖抑制効果の評価（２）
実施例３３の方法で作成したＤＳＰＥ−１６ＮＣで修飾したドキソルビシン包含リポソームの細胞増殖抑制効果を、実施例３５に記載の方法にしたがってＢ１６−ＢＬ６マウスメラノーマ細胞で評価した。その結果、リポソーム表面に存在する総ＰＥＧ分子の２．５％、５％、１０％がＰＥＧ化学修飾ペプチドに該当するドキソルビシン包含リポソームの細胞増殖抑制効果は、ＰＥＧ化学修飾ペプチドを含まないドキソルビシン包含リポソームと比較して、ＩＣ５０値で最大で約１０倍の増強効果が認められた（表７）。
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＜実施例３７＞ＰＥＧ化学修飾ペプチドで修飾されたドキソルビシン包含リポソームの担癌マウス生存期間延長効果
実施例３３の方法で作成したＤＳＰＥ−１６ＮＣで修飾したドキソルビシン包含リポソームの担癌マウス生存期間延長効果を、Ｂ１６−ＢＬ６マウスメラノーマ細胞担癌マウスで評価した。すなわち、１．０×１０６細胞のＢ１６−ＢＬ６マウスメラノーマ細胞をＣ５７／ＢＬ６マウス（７週令、メス、日本チャールスリバー）の脇腹に皮内移植し、移植後６日目に腫瘍体積を指標に群れ分けを行った。コントロール（５％グルコースのみ）および各リポソーム製剤（ドキソルビシン換算量として５ｍｇ／ｋｇの用量）の投与は、細胞移植後、６日目および９日目に行った。その結果、５％グルコースのみ投与したマウスの平均生存期間は３０．４日であり、ＰＥＧ化学修飾ペプチドを含まないドキソルビシン包含リポソームを投与したマウスの平均生存期間は３９．２日であり、リポソーム表面に存在する総ＰＥＧ分子の６％がＰＥＧ化学修飾ペプチドに該当するドキソルビシン包含リポソームを投与した担癌マウスの平均生存期間は４８．０日であった。
＜比較例１＞
配列番号１のペプチドとアミノ酸組成は同じであるが、アミノ酸配列がまったく不規則で「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」を含まないペプチド（配列番号２５）について、核酸導入能を実施例９に記載の方法にしたがって、また、ホスファチジルセリン親和性を実施例２０に記載の方法にしたがって評価した。その結果、核酸導入能、ホスファチジルセリン親和性いずれも認められなかった。
また、実施例５に記載の方法にしたがってＣＤスペクトルを測定した。その結果、ＳＤＳ存在下においてもα−ヘリックス構造は認められなかった。
＜比較例２＞
配列番号１のペプチドにアミノ酸置換を施し、「本発明の四面構造を示す１８アミノ酸配列」を含まないペプチドとなった配列番号２６について、実施例９に記載の方法にしたがって核酸導入能を評価した。その結果、蛍光カウント数は１００００未満であり、核酸導入能は認められなかった。
＜比較例３＞
ポリリジン（平均分子量：１１０００）のホスファチジルセリン親和性を実施例２０に記載の方法にしたがって評価した。その結果、ホスファチジルセリン親和性は認められなかった。また、実施例４に記載の方法にしたがってＢＳＡ溶液中での吸光度を測定した。その結果、測定値は１以上であり、凝集体の形成が認められた。
＜比較例４＞
α−ヘリックス構造を有する両親媒性塩基性ペプチドである４６（（Ｎｉｉｄｏｍｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７２，１５３０７（１９９７）））（配列番号２７のペプチド）のホスファチジルセリン親和性を実施例２０に記載の方法にしたがって評価した。その結果、ホスファチジルセリン親和性は認められなかった。また、実施例４に記載の方法にしたがってＢＳＡ溶液中での吸光度を測定した。その結果、測定値は１以上であり、凝集体の形成が認められた。
＜比較例５＞
比較例４に記載した４６（配列番号２７のペプチド）を実施例２６に記載した方法にしたがってマウスに投与したところ、マウスは投与直後に死亡した。
これは、該ペプチドがα−ヘリックス構造を有する両親媒性塩基性ペプチドであるため血液中で凝集塊を形成し易く、動物体内に投与した場合に著しい毒性を示す結果を反映しているものと考えられた。
産業上の利用可能性
本発明により、安全性が高く、ペプチドと結合する物質との複合体の作製が容易（優れた操作性）であり、複合体の溶解性に優れた、細胞へのペプチドと結合する物質の導入選択性が優れ、導入効率が高いベクターとなる、ＰＥＧ化学修飾による比活性が低下しない新規ＰＥＧ化学修飾ペプチド、及び、その製造方法を提供できる。
また、本発明により、ＰＥＧ化学修飾ペプチドと、ペプチドと結合する物質との複合体、及び、その製造方法を提供できる。
また、本発明により、ＰＥＧ化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー、及び、その製造方法を提供できる。
具体的な、本発明の効果を以下に述べる。
本発明のペプチドは、核酸と結合能を有し、該核酸を細胞へ導入する能力を有するため、ペプチドベクターとして有用である。
特定の物質の共存下でのみα−ヘリックス構造を取るため、血清中で実質的な凝集体を形成せず、溶解性が高い。
また、該ペプチドと核酸が結合した場合、該核酸にヌクレアーゼ耐性能を付与するため、安定である。
さらに該ペプチドがホスファチジルセリンに親和性を有する。このため、炎症若しくは免疫担当細胞による細胞の活性化及び／若しくは障害若しくはアポトーシス等のいわゆる免疫応答反応が進展している部位、異常な細胞分裂が進展していわゆる細胞が癌化している部位、血液凝固反応や動脈硬化が進展して血管を構成する細胞が障害されている部位、活性酸素による細胞の障害反応が進展している部位若しくは蛋白質分解酵素による細胞の活性化及び／若しくは障害反応が進展している部位等における細胞、組織及び臓器に核酸を選択的に導入するため、核酸の投与量も少なくてすみ，副作用も軽減する。
本発明のＰＥＧ修飾ペプチドは、上記の特徴、効果を保持し、かつ、活性化ＰＥＧ化学修飾により、例えば、標的細胞への遺伝子や薬剤の取り込み率の向上、薬理活性の向上、毒性の低減等に優れる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１の（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、エドモンソン・ホイール・プロット法によるα−ヘリックス構造モデルの概念図である（但し、□で囲んだアミノ酸は疎水性アミノ酸、○で囲んだアミノ酸は塩基性親水性アミノ酸、囲みのないアミノ酸は中性親水性アミノ酸である（以下の図面において同じ））。
図２は、本発明に用いるペプチドの１８アミノ酸配列の四面構造の一例を示す図である。
図３の（Ａ），（Ｂ）は、各面への割り振りが異なる本発明に用いるペプチドの四面構造の例を示す図である。
図４の（ａ）は（Ｃ１）を表し、（ｂ）は（Ｃ２）を表す。（Ｃ１）及び（Ｃ２）は、各面への割り振りが異なる本発明に用いるペプチドの四面構造の例を示す図である。
図５の（Ａ），（Ｂ）は、本発明の１８アミノ酸配列を含むペプチドの四面構造の例を示す図である。
図６の（ａ）は（Ｃ）を表し、（ｂ）は（Ｄ）を表す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、本発明の１８アミノ酸配列を含むペプチドの四面構造の例を示す図である。
図７の（ａ）は、ＳＤＳ（−）のＣＤスペクトル測定による平均残基楕円率曲線を示した図であり、（ｂ）は、ＳＤＳ（＋）のＣＤスペクトル測定による平均残基楕円率曲線を示した図である。
図８の（ａ）は、ＳＤＳ（−）のＣＤスペクトル測定による平均残基楕円率曲線を示した図であり、（ｂ）は、ＳＤＳ（＋）のＣＤスペクトル測定による平均残基楕円率曲線を示した図である。
図９の（ａ）は、ＳＤＳ（−）のＣＤスペクトル測定による平均残基楕円率曲線を示した図であり、（ｂ）は、ＳＤＳ（＋）のＣＤスペクトル測定による平均残基楕円率曲線を示した図である。
図１０は、配列番号１のペプチドとオリゴヌクレオチドの混合物の電気泳動図である。
図１１は、配列番号１のペプチドとプラスミドの混合物の電気泳動図である。
図１２は、配列番号１のペプチドの有無による、細胞内へのプラスミドの導入能を、プラスミドが発現するルシフェラーゼ活性を指標として表した図である。
図１３は、配列番号１６のペプチドを用いてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むプラスミドを細胞内に導入するとＧＣＶ感受性が亢進することを示した図である。
図１４は、配列番号１のペプチドが有する細胞内へのプラスミドの導入能を、プラスミドとの複合体を４℃で保存する前後において、プラスミドが発現するルシフェラーゼ活性を指標として表した図である。
図１５は、配列番号１のペプチドとオリゴヌクレオチドの混合物をヌクレアーゼ処理した後のオリゴヌクレオチドの電気泳動図である。
図１６は、配列番号１６のペプチドとプラスミドの混合物をヌクレアーゼ処理した後のプラスミドの電気泳動図である。コントロールはヌクレアーゼ未処理のプラスミドである。
図１７は、配列番号１のペプチドとホスファチジルセリンの特異的親和性をビアコア２０００を用いて測定した図である。
図１８は、配列番号２５のペプチドがホスファチジルセリンにもホスファチジルコリンにも親和性を示さないことをビアコア２０００を用いて測定した図である。
図１９は、細胞を脱顆粒刺激すると細胞表面にホスファチジルセリンが表出することをフローサイトメトリーを用いて示した図である。
図２０は、配列番号１６のペプチドは、脱顆粒反応が起きて細胞表面にホスファチジルセリンが表出した細胞により多く遺伝子導入することを示した図である。
図２１は、配列番号１６のペプチドが、マウスへ移植した癌細胞内へプラスミドを導入する能力があることを、プラスミドが発現するルシフェラーゼ活性を指標として表した図である。
図２２は、配列番号１６のペプチドを用いてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むプラスミドをマウスに移植した癌細胞内に導入してＧＣＶ投与するとマウスの生存期間が延長することを示した図である。
図２３は、Ｖｅｒｏ細胞を用いて、ＰＥＧ修飾したプラスミド／ペプチド複合体と、同ＰＥＧ未修飾体の遺伝子導入能を比較した図である。
図２４は、アナフィラキシーショックマウスを用いて、ＰＥＧ修飾したプラスミド／ペプチド複合体と、同ＰＥＧ未修飾体の遺伝子導入能を比較した図である。
図２５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＰＥＧ修飾したプラスミド／ペプチド複合体中に存在するＰＥＧ修飾ペプチドを同定した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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