(57)【要約】チオレドキシンと目的タンパク質との融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させることにより、前記融合タンパク質の少なくとも一部を可溶性タンパク質として合成する。前記目的タンパク質は膜タンパク質等の高度に疎水的なタンパク質であることが好ましく、特にＧタンパク質共役型受容体等の膜タンパク質を極めて可溶化しやすい状態で、しかも生物学的に活性な立体構造を形成し得る状態で製造することができる。本発明は、さらに、このような膜タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させるための組換えベクターも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオレドキシンと膜タンパク質との融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させることを特徴とするチオレドキシン融合膜タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記無細胞タンパク質合成系が、界面活性剤を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記チオレドキシン融合膜タンパク質が、無細胞タンパク質合成系における８時間以内の反応時間で、少なくとも１００μｇ／ｍｌの合成率で合成され得ることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
前記膜タンパク質が、Ｇタンパク質共役型受容体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
チオレドキシンと膜タンパク質との融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させる工程、及び前記融合タンパク質を限定分解して前記膜タンパク質を単離する工程を含む膜タンパク質の製造方法。
【請求項６】
前記無細胞タンパク質合成系が、界面活性剤を含む請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
前記チオレドキシン融合膜タンパク質が、無細胞タンパク質合成系における８時間以内の反応時間で、少なくとも１００μｇ／ｍｌの合成率で合成され得ることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項８】
前記膜タンパク質が、Ｇタンパク質共役型受容体であることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ７プロモーター配列の下流にリボソーム結合部位を介して連結されたチオレドキシン遺伝子と、該チオレドキシン遺伝子と融合して発現するように連結された膜タンパク質遺伝子とを含み、前記融合タンパク質遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させるためのポリヌクレオチドであって、前記プロモーター配列の近傍にオペレーター配列を含まないことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記膜タンパク質遺伝子が、Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
５’から３’の方向にＴ７プロモーター配列、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位及び転写終結配列を含むプラスミドベクターであって、前記マルチクローニング部位の上流又は下流に隣接してチオレドキシン遺伝子を含み、前記プロモーター配列の近傍にオペレーター配列を含まないことを特徴とするプラスミドベクター。
【請求項１２】
チオレドキシンと目的タンパク質との融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させることにより、前記融合タンパク質の少なくとも一部を可溶性タンパク質として合成することを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
チオレドキシン遺伝子と膜タンパク質遺伝子を連結する工程、
前記連結遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させる工程、
前記無細胞タンパク質合成系で発現されるタンパク質を界面活性剤及び均一な粒子径のリポソームと混合する工程、及び
前記混合物中の界面活性剤濃度を低下させる工程、
を含むことを特徴とするチオレドキシン融合膜タンパク質とリポソームとの複合体の製造方法。
【請求項１４】
前記リポソームの粒子径が、５０〜２００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
前記膜タンパク質が、Ｇタンパク質共役型受容体であることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複合体中のチオレドキシン融合Ｇタンパク質共役型受容体が、当該受容体のシグナル伝達機能を有することを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナル伝達機能が前記受容体のリガンドとの結合能である請求の範囲第１６項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法に関し、詳しくは膜タンパク質等の疎水性の高いタンパク質を無細胞タンパク質合成系で可溶性タンパク質として製造する方法に関する。
背景技術
近年、ヒトを含む多くの生物種のＤＮＡ塩基配列の解読が急速に進み、これら大量のゲノム配列情報から抽出される膨大な数の遺伝子について、個々の遺伝子にコードされるタンパク質の立体構造を体系的に解き明かし、構造と機能との関係を明確にしようとする「構造ゲノム科学」が重要な研究領域となっている。また、この研究を推進するための大規模解析に対応したハイスループットな解析手段が望まれている。
この「構造ゲノム科学」において、構造解析の対象となるタンパク質のうち、医薬品開発のターゲットとして最も重要なものとして膜タンパク質が挙げられる。膜タンパク質は刺激応答、細胞骨格及び接着、あるいは物質輸送、電子伝達などの細胞の重要な機能を担っているにもかかわらず、単離精製が極めて難しいため生化学的な解析が困難である。
従来、膜タンパク質を培養細胞中で発現させた場合、宿主細胞の有する局在化機構によりその細胞膜に蓄積されるため、得られたタンパク質の精製工程において各種可溶化剤の使用による細胞膜からの抽出が必要となり、時間と労力がかかる上、抽出効率の点でも問題がある。また、使用する可溶化剤の種類によってはタンパク質本来の構造や機能が失われることもある。
一方、膜タンパク質を大腸菌内で発現させると、多くの場合には不溶性の沈殿が生じ、精製する際に沈殿物をグアニジンや尿素などの強力な変性剤を用いた可溶化工程や、この可溶化工程で変性を起こしたタンパク質を本来の構造に戻す（フォールディング）工程が必要になり、時間と労力の観点のみならず、前記フォールディング工程の間に再不溶化が起こるといった現象も問題となる。
この問題を回避するために、従来技術においては大腸菌のヒートショックシャペロンやフォールダーゼを異種遺伝子と共発現させる方法が知られている。例えば特開平９−１０７９５４号公報には、このヒートショックシャペロンとして、大腸菌のＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ等に代表される熱ショックプロテインがあり、大腸菌内で新たに合成されたポリペプチドを正確にフォールディングするのを触媒する役割を果たしていることが記載されている。一方、フォールダーゼとしては、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼやペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ等が開示されており、これらのシャペロン又はフォールダーゼ、特に大腸菌のチオレドキシン等の過剰な共発現がマウスｃ−Ｍｙｂやヒトの転写因子であるｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白およびｐ５３癌抑制遺伝子産物を大腸菌培養物１リットルあたり数十ｍｇから１００ｍｇのレベルで可溶型タンパク質として発現することが記載されている。
更に別の方法としては、目的の異種遺伝子を他のタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法が知られている。他のタンパク質としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、又はプロテインＧ等が用いられ、通常、目的タンパク質をこれらのタンパク質のＣ末端側に融合したタンパク質として発現させる（前掲、特開平９−１０７９５４号公報等参照）。
しかしながら、これらの方法によってもなお、膜タンパク質のような高度に疎水的なタンパク質を発現させた場合には大腸菌内において凝集しやすく、また発現量も非常に少ないという問題が残されている。
上記のような状況に鑑み、本発明は、膜タンパク質等の高度に疎水的なタンパク質を極めて可溶化しやすい状態で、しかも生物学的に活性な立体構造を形成し得る状態で製造する方法を提供することを目的とする。
発明の開示
上記課題を解決するために本発明者等は種々の検討を行った結果、チオレドキシンと目的タンパク質との融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させた場合に、極めて効率良く大量のタンパク質が発現すること、及び目的タンパク質が高度に疎水的なタンパク質、例えば、膜タンパク質の場合においても、前記融合タンパク質の少なくとも一部は凝集することなく可溶性のタンパク質として得られることを見出した。さらに、このようにして得られた融合タンパク質、又はこの融合タンパク質を限定分解して単離した目的タンパク質は、本来の生物学的活性の少なくとも一部を有し、正確な立体構造を形成することを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は第一の視点において、チオレドキシンと膜タンパク質との融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させることを特徴とする。本発明の好ましい実施形態において、前記無細胞タンパク質合成系が界面活性剤を含むことにより、前記融合タンパク質の可溶化率をさらに高めることができる。従って、本発明の方法により合成されたチオレドキシン融合膜タンパク質は正確な立体構造を形成している可能性が極めて高く、そのため該タンパク質の構造が安定化して発現量が増加すると共に、その溶解性も向上するものと推測される。
本発明の一つの実施形態において、前記膜タンパク質には、受容体タンパク質、チャネルタンパク質及び輸送体タンパク質などが含まれ、これらと同様に、転写因子、シグナル伝達タンパク質、薬物代謝酵素及び脂質代謝酵素などにも適用することができる。
本発明の他の実施形態において、前記チオレドキシンは、大腸菌のチオレドキシン、哺乳類のチオレドキシン、又は酵母のチオレドキシンであり、それらのポリペプチドにおいて１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなり前記融合タンパク質の少なくとも一部を可溶化しうるポリペプチドも含まれる。
さらに本発明の好ましい実施形態において、前記チオレドキシン融合膜タンパク質は、無細胞タンパク質合成系における８時間以内の反応時間で、１００μｇ／ｍｌ以上の合成率で合成することができる融合タンパク質である。無細胞タンパク質合成系としては、バッチ法や透析法など種々の方法を使用することができるが一般的には透析法の方がタンパク質の合成率が高い。本実施形態においては、これら種々の合成法のうち何れかの方法において少なくとも１００μｇ／ｍｌの発現量が得られれば良く、合成反応開始後、６〜８時間以内の何れかの時点において適宜サンプリングを行ってタンパク質の合成率を確認することができる。さらに、好ましい系を選択することによって、前記チオレドキシン融合膜タンパク質は、無細胞タンパク質合成系における６〜８時間以内の反応時間で、少なくとも、５００μｇ／ｍｌ、好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ以上の合成率で合成することができる。
また、前記何れかの方法により合成したチオレドキシン融合膜タンパク質をさらに限定分解して膜タンパク質を単離する工程を含む膜タンパク質の製造方法が提供される。
さらに本発明の別の視点において、Ｔ７プロモーター配列の下流にリボソーム結合部位を介して連結されたチオレドキシン遺伝子と、該チオレドキシン遺伝子と融合して発現するように連結された膜タンパク質遺伝子とを含み、前記融合タンパク質遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させるためのポリヌクレオチドであって、前記プロモーター配列の近傍にオペレーター配列を含まないことを特徴とするポリヌクレオチドが提供される。
更になお異なる視点において、本発明は、５’から３’の方向にＴ７プロモーター配列、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位及び転写終結配列を含むプラスミドベクターであって、前記マルチクローニング部位の上流又は下流に隣接してチオレドキシン遺伝子を含み、前記プロモーター配列の近傍にオペレーター配列を含まないプラスミドベクターである。
本発明の他の一つの実施形態において、チオレドキシンと目的タンパク質との融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させることにより、前記融合タンパク質の少なくとも一部を可溶性タンパク質として合成することを特徴とする融合タンパク質の製造方法が提供される。
さらに、本発明の別の視点において、チオレドキシン遺伝子と膜タンパク質遺伝子を連結する工程、前記連結遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させる工程、前記無細胞タンパク質合成系で発現されるタンパク質を界面活性剤及び均一な粒子径のリポソームと混合する工程、及び前記混合物中の界面活性剤濃度を低下させる工程、を含むことを特徴とするチオレドキシン融合膜タンパク質とリポソームとの複合体の製造方法が提供される。前記リポソームの粒子径は、５０〜２００ｎｍの範囲内にあることが好ましく、さらに好ましくは８０〜１５０ｎｍであり、最も好ましくは約１００ｎｍである。
発明を実施するための最良の形態
（目的タンパク質）
本発明の方法における目的タンパク質は、大腸菌のタンパク質、酵母のタンパク質、又は哺乳動物のタンパク質など特に限定されないが、例えば分子内に疎水性の大きい部分を局部的に含むような難溶性タンパク質について有効な結果が得られる。本明細書において「タンパク質」とは、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、一般的には構成アミノ酸の数が数十個以上のものをいう。「タンパク質」又は「ポリペプチド」には、翻訳後のプロセッシングなどの天然のプロセス、又は当該分野で周知の化学的な修飾方法の何れかによって修飾がなされたアミノ酸配列が含まれる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含むタンパク質内の何れの位置に生じさせることもできる。
本発明の好ましい態様において、目的タンパク質は、受容体タンパク質、チャネルタンパク質及び輸送体タンパク質等の膜タンパク質、又は転写因子、抗体、シグナル伝達タンパク質等の創薬の対象として重要なタンパク質である。本明細書において「膜タンパク質」とは、膜内在性タンパク質の他、パルミトイル化、ゲラニル化、ミリストイル化されて修飾部分が膜脂質に埋め込まれているもの、あるいは膜脂質や膜タンパク質と相互作用しているものまでも含む。特に膜貫通部位をもつ膜内在性タンパク質は、膜脂質に組み込まれやすいように配列された疎水的アミノ酸配列を有するため、極めて水に溶けにくい性質を示す。組換えＤＮＡ技術を用いてこれらの膜タンパク質を異種宿主で発現させると、すぐに凝集して不溶性の沈殿を生ずるので、生物学的に活性でかつ正確な立体構造を有するタンパク質を調製することが困難である。しかし、これらの膜タンパク質の中には細胞内のシグナル伝達や増殖制御など重要な働きを有するものが多く、創薬のターゲットとして極めて重要である。
シグナル伝達経路とは、Ｇタンパク質やｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャーによって調節される医学的に重要な生物学的経路である。このシグナル伝達経路に関与するタンパク質としては、ペプチド性ホルモン、神経伝達物質、などのリガンドと結合するＧタンパク質共役型受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質自身、ホスポリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼなどのエフェクタータンパク質、及びプロテインキナーゼＡやプロテインキナーゼＣなどがある。
膜タンパク質であるＧＰＣＲスーパーファミリーは、αヘリックスによる膜貫通部位を７ヶ所もっているので７回膜貫通型受容体とも呼ばれる。共役するＧタンパク質は通常三量体であり、α、β、γのサブユニットからなる。非常に多くのリガンドがＧＰＣＲに結合することが知られており、例えばドーパミン、アドレナリン、エンドセリン、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、味覚成分や嗅覚成分が含まれる。この受容体の活動をコントロールすることは、神経、免疫、血圧、代謝に関係する疾患の治療に有効である。真核生物のゲノム解析によって数多くの受容体が同定されており、包括的な研究手段が必要とされているが、ＧＰＣＲは７個の膜貫通領域を有するという構造上、極めて疎水性が高く従来の技術では大量発現で凝集が起こりやすいという問題がある。
従って、本発明の１つの実施形態において、チオレドキシンと、目的タンパク質であるＧＰＣＲとの融合タンパク質を無細胞タンパク質合成系で発現させることを特徴とするチオレドキシン融合ＧＰＣＲの製造方法が提供される。当該方法により製造されたチオレドキシン融合ＧＰＣＲは、凝集することなく容易に界面活性剤で可溶化したり、及び／又は脂質成分と混合することによりシグナル伝達機能を有する受容体タンパク質として再構成することができる。ＧＰＣＲのシグナル伝達機能は種々の方法で評価することができ、例えば、そのリガンドとの結合活性や、Ｇタンパク質の活性等を測定することにより示される。また、本発明においてＧＰＣＲとは、天然に存在するＧＰＣＲについて１又は複数（数個）のアミノ酸が欠失、付加、又は置換されたものであり、且つ当該ＧＰＣＲの有するシグナル伝達機能を保持しているものを含む。さらに他のペプチド配列、例えば、Ｇタンパク質との融合タンパク質を含む。本発明のＧＰＣＲは、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾臓細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）若しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織（例えば、脳、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など）又はその培養細胞株などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
その他の細胞膜受容体としては、イオンチャネル内蔵受容体（脳内のグルタミン酸受容体等）があり、トランスポーターとしては、グルコースやアミノ酸等の比較的低分子物質から、タンパク質やＤＮＡ等の比較的大きな分子を輸送するためのもの等がある。
膜結合酵素としては、上述したＧタンパク質等の細胞内へのシグナル伝達に関与する多くのタンパク質が存在し、細胞増殖の調節や細胞のガン化等に関し重要な働きをしている。さらに、このような従来から公知の膜タンパク質のみならず、ゲノム情報からその存在が推測されるものの未だその機能が明らかでない新規な膜タンパク質も含まれる。これらの膜タンパク質を正確な立体構造を形成し得る状態で製造し、その機能を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それらの機能と密接に関連した医薬品の開発に重要な手段を提供する。
異なる視点において、上記膜タンパク質等はその生理活性の発現に際し、特定のリガンドと結合し又は相互作用するという特徴を有する。シグナル伝達経路においてはＧＰＣＲとＧタンパク質との相互作用のようにタンパク質−タンパク質間の相互作用がその調節機能において重要な役割を果たしている。一方、転写因子と呼ばれるタンパク質はＤＮＡと相互作用して遺伝子の発現を調節する機能を有する。その他にペプチドやアミノ酸又はそれらの誘導体、更に金属イオンなどの低分子と相互作用するタンパク質もあり、これらのリガンドとの相互作用がタンパク質の機能の発現に重要であるだけでなく、その立体構造を維持するためにも重要な場合がある。従って、このようなリガンド結合タンパク質は、そのリガンドの非存在下において発現させると正確な立体構造を形成することが難しく凝集して不溶化が起こりやすい。本発明の方法においては、このようなリガンド結合タンパク質をも目的タンパク質とする。
従って、本明細書において「リガンド」とは、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子のようにタンパク質と特異的に結合する物質の総称である。細胞膜内に存在する種々の受容体と結合するレクチン、ホルモン、神経伝達物質なども指す。低分子量の分子、イオンばかりでなく高分子量物質に至るまで広く用いられる。
（発現用ポリヌクレオチドの構築）
上記目的タンパク質を無細胞タンパク質合成系でチオレドキシンとの融合タンパク質として発現させる。「融合タンパク質」とは、少なくとも２つの、関連しない、融合された遺伝子又はその断片によってコードされるタンパク質をいう。従って、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドには、チオレドキシン遺伝子のほかに１又は２以上の他の遺伝子又はその断片が含まれていても良い。本発明に用いられるチオレドキシンは大腸菌のチオレドキシン（Ｌｕｎｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，１０４６９−１０４７４（１９８４））のみでなく、哺乳類のチオレドキシン（Ｗｏｌｌｍａｎ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１５５０６−１５５１２（１９８８））、酵母のチオレドキシン、プロテインジスルフィドイソメラーゼのチオレドキシンドメイン（Ｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１７，２６７−２７０（１９８５））及びこれらのポリペプチドにおいて１又は複数のアミノ酸が欠失、付加又は置換され且つジスルフィド結合の形成を触媒しうるポリペプチド等も使用可能である。
これらのタンパク質又はポリペプチド（これらの用語は同義である）をコードするポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの何れかからなる任意の長さの核酸重合物である。また、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡである。更に、従来から公知の任意の修飾を施されていても良く、例えば、蛍光物質などによる標識、メチル化、キャップ構造の付加、ヌクレオチドアナログなどにより置換されていても良い。
ＤＮＡの場合には通常二本鎖であるが、環状二本鎖でも直鎖状二本鎖でもいずれでも良く、これらは無細胞タンパク質合成系で転写及び翻訳される。これらは当業者に周知であって大腸菌等を宿主とする従来の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。あるいは、宿主細胞を形質転換することなくＰＣＲ等の試験管内でのＤＮＡ増幅技術によって調製することもできる。ＲＮＡの場合には、通常一本鎖のｍＲＮＡとして用いられ、無細胞タンパク質合成系で翻訳される。これらの技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９；Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ．），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，１９８５；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４等に記載されている。
無細胞タンパク質合成系での転写、翻訳に必要な配列としては、例えばＴ７プロモーター等の強力なプロモーター、リボソーム結合部位、Ｔ７ターミネーター等の配列の他に、発現した融合タンパク質の精製を効率的に行うためヒスチジンやＧＳＴなどのタグ配列を付加することもできる。
目的タンパク質をチオレドキシンとの融合タンパク質として発現させるためには種々の方法を用いることができ、例えば、目的タンパク質のＮ末端側やＣ末端側でチオレドキシンと融合させて、或は目的タンパク質を構成するドメインの間にチオレドキシン配列を挿入して融合タンパク質を発現させることができる。チオレドキシン配列の近傍にマルチクローニング部位を有するプラスミドベクターは目的タンパク質の遺伝子を挿入して無細胞タンパク質合成系での鋳型ＤＮＡを作成するために好ましく用いられる。また、融合タンパク質から目的タンパク質のみを限定的に切り出して単離するため、チオレドキシンと目的タンパク質の境界領域にエンテロキナーゼなどのプロテアーゼによって切断される特異的な配列を挿入しておくことが特に好ましい。
さらに、効率的な発現のためにはプロモーターの働きを制御するオペレーター配列を含まないことが好ましく、例えば、市販の大腸菌での発現ベクターを用いる場合にはラクトースオペレーター等の制御配列を除去する。
本明細書において「プロモーター」とは、調節遺伝子の一種で、σ因子をもつＲＮＡポリメラーゼが結合し、オペロンの転写を開始する部位をいう。「オペレーター」とは、作動遺伝子ともいい、リプレッサーの結合部位で、調節遺伝子の一種をいう。ＲＮＡポリメラーゼの作用部位であるプロモーターとオペロンの構造遺伝子の中間、又はプロモーターと一部重なり合ってオペロンの一端に存在している。オペレーターにリプレッサーが結合するとＲＮＡポリメラーゼによる転写が阻害される。通常２０〜３０塩基対の部分的なパリンドローム構造からなる（例えば、ラクトースオペレーター）。
（無細胞タンパク質合成系による発現）
上記のように調製したポリヌクレオチドを無細胞タンパク質合成系で発現させる。本発明における無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系であり、このような合成系としてはｍＲＮＡの情報を読み取ってリボゾーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、又はＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何れでも良い。ＤＮＡを鋳型として用いる場合には、ＰＣＲ等の試験管内での増幅反応により、従来必要とされたクローニングという煩雑な操作を経ることなく、多数の鋳型ＤＮＡを同時並行的に迅速に調製することができる。
上記細胞抽出液としては、リボゾーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に必要な成分を含む真核細胞又は原核細胞の抽出液が使用可能である。前記真核細胞及び原核細胞としては従来公知のものが何れも使用可能であり、具体的に例示すれば、大腸菌、好熱性細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母などが挙げられ、特に大腸菌由来のもの（例えば大腸菌Ｓ３０細胞抽出液）又は高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のものが高い合成量を得る点において望ましい。該大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９（ｒｎａ，ｍｅｔ），ＢＬ２１，ＢＬ２１  ｓｔａｒ，ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ株等から公知の方法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）に従って調製できるし、あるいはＰｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを使用してもよい。
このような細胞抽出液は、上記各細胞抽出液が濃縮されたもの（以下「濃縮細胞抽出液」という。）でもよいし、未濃縮のもの（以下「粗細胞抽出液」という。）であっても良いが、濃縮細胞抽出液を使用することにより、より高いタンパク質合成量が得られる。この濃縮細胞抽出液を得る方法としては、任意の手段例えば限外濾過、透析、ＰＥＧ沈殿等によって行うことができる。
本発明の無細胞タンパク質合成系の組成としては、大腸菌Ｓ３０等の粗細胞抽出液又は濃縮細胞抽出液（１０〜９０重量％）の他に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ（ｍＲＭＡ等）、ＡＴＰ（０．５〜５ｍＭ）、ＧＴＰ（０．００５〜１．０ｍＭ）、ＣＴＰ（０．００５〜１．０ｍＭ）、ＵＴＰ（０．００５〜１．０ｍＭ）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮａｓｅ阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型とする場合）及びｔＲＮＡ等を含むことができる。その他、ＡＴＰ再生系、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類（０．１〜５ｍＭ、還元剤（例えば１〜１０ｍＭのジチオスレイトール）等が含まれる。
緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類としては、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩等）、グルタミン酸塩等が使用でき、抗菌剤としてはアジ化ナトリウム、アンピシリン等が使用可能である。またＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等の市販の酵素を使用できる。
本発明において、ＡＴＰ再生系としては好ましくは０．０２〜５μｇ／μｌのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と１０〜１００ｍＭのクレアチンホスフェート（ＣＰ）の組合せが挙げられるが、これに限定されるものではなく、従来より公知の材料が何れも使用可能であり、上記以外に例えば１〜２０ｍＭのホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）と０．０１〜１μｇ／μｌのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の組合せ等が使用可能である。これらＰＫ及びＣＫは何れもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれＰＥＰおよびＣＰを基質として必要とする。
本発明の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系に界面活性剤を添加することによって融合タンパク質の可溶化率がさらに向上する。界面活性剤は合成すべき目的タンパク質の種類によって適宜選択して使用されることが望ましく、タンパク質の変性を起こさないものであれば従来公知のものがいずれも使用可能である。通常用いられる界面活性剤には、その電気的性質により、非イオン性、陰イオン性、及び両性イオン性に大別される。非イオン性界面活性剤としては、ジギトニン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系）、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ系）、β−ドデシルマルトシド、β−オクチルグルコシド、β−ノニルグルコシド、β−ヘプチルチオグルコシド、β−オクチルチオグルコシド、スクロースモノデカノエート、スクロースモノドデカノエート、オクチルテトラオキシエチレン、オクチルペンタオキシエチレン、及びドデシルオクタオキシエチレン等が挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、タウロデオキシコール酸等が挙げられる。両性イオン性界面活性剤としてはＮ，Ｎ−ジメチルデシルアミンＮ−オキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアンモニオプロパンスルホネート、及び（３−［（３−コルアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）等が挙げられる。
これらの界面活性剤は、一種のみで単独使用してもよく、また二種以上を組み合わせてもよい。これらの界面活性剤の使用量は、目的タンパク質の種類に応じて適宜設定されることが好ましいが、通常用いられる濃度としてはその界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の１〜５０倍量程度が好ましく、より好ましくは３から１０倍程度使用される。例えば、界面活性剤としてジギトニンやＢｒｉｊ３５等の非イオン性界面活性剤を使用した場合、その濃度はジギトニンでは０．１〜２．０容量％程度が好ましく、より好ましくは０．４〜１．５容量％程度である。また、Ｂｒｉｊ３５では０．０１〜０．５容量％程度が好ましく、より好ましくは０．０２〜０．２容量％程度である。
本発明の方法により製造した目的タンパク質やそのドメインの構造をＮＭＲ法により解析するためには１３Ｃ／１５Ｎで標識したサンプルを調製することが好ましい。そこで、１３Ｃ／１５Ｎで標識したタンパク質を製造するためには、無細胞タンパク質合成系に、１３Ｃ／１５Ｎで標識したアルガルのアミノ酸混合物や２０種類の１３Ｃ／１５Ｎで標識したアミノ酸を、標識されていないアミノ酸のかわりに用いることができる。このようにして合成したタンパク質は、１３Ｃ／１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを測定することができる。また、アミノ酸のメチレン基の１つを特異的に重水素化する安定同位体標識と１３Ｃ／１５Ｎで標識とを組合わせて行うことは、本発明の無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法に非常に適している。なぜなら、大腸菌の細胞内で発現させようとする場合に比べて、化学合成した安定同位体標識アミノ酸の消費量が約１／１００以下であり、非常に経済的だからである。
他方、本発明の方法により製造した目的タンパク質やそのドメインの構造をＸ線結晶解析に用いる場合は、セレノメチオニンやセレノシステインなどの異常散乱を起こす原子を含むアミノ酸を無細胞タンパク質合成系に添加して目的タンパク質を合成することができる。大腸菌などの細胞内での発現法では、アミノ酸代謝やセレノメチオニンなどの毒性のために、タンパク質の収量が低くなったりセレノメチオニンの置換率が低くなったりする場合があるが、本発明の無細胞タンパク質合成系によれば、このような影響を回避して９８％以上の極めて高い置換率で目的タンパク質を合成することができる。このようにして合成された重原子置換タンパク質は、多波長異常散乱（ＭＡＤ）法により、１つの結晶で完全なデータセットをそろえることができ、Ｘ線結晶解析による立体構造決定にかかる時間を短縮することができる。
本発明の無細胞タンパク質合成系には、バッチ法の他、従来公知の技術がいずれも適用可能であるが、目的タンパク質の合成率を上げるためには、例えばフロー法や透析法が好ましい。これらの方法では合成反応中、基質を補充することで反応持続時間を延ばすことができ、通常、透析法ではバッチ法に比べて同量の細胞抽出液から約１０倍量のタンパク質を産生することができる。最適化した無細胞タンパク質合成系での生産性は大腸菌などの細胞内における生産性をはるかに超えるものである。
さらに、本発明においては、無細胞タンパク質合成系にタンパク質又はそのドメインと結合するリガンドを添加することで、合成されるタンパク質量を増加させ、可溶化率を向上させることができる。このリガンドは、目的タンパク質又はそのドメインによって異なるが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質及びこれらの誘導体、アルカロイド、テルペン、補酵素及び金属イオンからなる群から選択される１種又は２種以上のリガンドである。これらのリガンドと結合することによって目的タンパク質の立体構造が安定化し、分解が抑制されると共に、正確な立体構造が形成されることによって不溶化や凝集も抑制されるものと推測される。
従って、本発明の一つの実施形態において、目的タンパク質をチオレドキシンとの融合タンパク質として無細胞タンパク質合成系で製造する方法であって、前記目的タンパク質に結合するリガンドを、前記無細胞タンパク質合成系に添加することを特徴とする、前記融合タンパク質の製造方法が提供される。
発現した目的タンパク質の量は種々の方法によって測定することができる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は最も一般的な分析方法である。還元条件下でＳＤＳによってタンパク質を処理するとタンパク質は完全に変性し、ポリペプチドに解離する。ポリペプチドは還元条件下、重量比で約１．４倍量のＳＤＳと結合し、ＳＤＳ複合体を形成する。形成されたＳＤＳ複合体は、過剰のドデシル硫酸イオンの負電荷により、一定の電場内を一定の速度で移動する。従って、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動すれば分子ふるい作用により分子量に基づいてタンパク質を分離することができ、目的のタンパク質を分子量を指標として検出することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、１種類のｐＨの緩衝液を用いる連続緩衝液系と、複数のｐＨの緩衝液を用いる不連続緩衝液系とがある。また、分離するタンパク質の種類によって、低ＢＩＳ濃度ゲル電気泳動、濃度勾配ゲル電気泳動、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いることができる。分離されたタンパク質は一般的にはクーマシーブルーなどの色素により染色して定量することができる。銀染色法はクーマシーブルー染色の２０〜１００倍の感度でタンパク質を同定することができる。あるいは、市販されているＳＹＰＲＯ  ＲｕｂｙやＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅなどの蛍光試薬を用いてゲル上で感度よく検出できる（Ｐａｔｔｏｎ，Ｗ．Ｆ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２１，１１２３−１１４４（２０００））。またタンパク質を放射能標識したオートラジオグラフィーや、フルオログラフィーによって検出することができる。
（発現したタンパク質の精製と生物学的活性の評価）
合成した融合タンパク質の精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量及び種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法はタンパク質の性質に応じて従来公知のものを単独に又は適宜組合せて使用できる。例えば、硫酸アンモニウム又はアセトン沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動ゲルからの抽出、クロマトフォーカシング等の慣用の技術を挙げることができる。
本発明の好ましい実施形態において、チオレドキシンと目的タンパク質の間にプロテアーゼによって切断される特異的な配列を挿入しておき、この特異的な配列を限定的に分解する酵素を作用させて融合タンパク質から目的タンパク質のみを精製する。この限定分解酵素としては種々のものが利用でき、例えば、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、第１０因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ）及びエンテロキナーゼなどがある。
さらに、膜タンパク質等の生体内での構造や機能をより正確に解析するためには、無細胞タンパク質合成系で合成されるタンパク質を人工膜やリポソーム等に再構成することが好ましい。第１の方法として、かかる再構成は界面活性剤と脂質とを添加した無細胞タンパク質合成系で、合成反応と同時に又は一定時間経過後に界面活性剤濃度を低下させることによって、合成されたタンパク質をリポソーム（脂質ベジクル）に再構成する。ここで、再構成とは、脂質によって形成された二分子層又は多重層からなるリポソームに、合成された膜タンパク質の少なくとも一部が埋め込まれることによって生体内における状態に類似した系を構築することである。この方法に使用し得る脂質にはアシルグリセロール（中性脂肪）やコレステロールエステル等の単純脂質の他、リン脂質や糖脂質等の複合脂質が含まれる。リン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）プラズマローゲン、スフィンゴミエリン、セラミドシリアチン及びこれらの誘導体等があり、糖脂質にはセレブロシド、グロボシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質と総称されるもの等が挙げられる。これらは一種又は二種以上を組み合わせて使用することができ、その使用量は用いる脂質によって適宜設定されることが好ましいが、通常、０．１〜１０ｍＭ程度である。
第２の方法として、無細胞タンパク質合成系で合成されたチオレドキシン融合膜タンパク質をろ過や遠心分離法等によって回収、精製した後、界面活性剤とリポソームとを加えて混合後、界面活性剤濃度を低下させることによって目的のチオレドキシン融合膜タンパク質とリポソームとの複合体を調製することができる。タンパク質合成反応後に添加される界面活性剤としては、合成されたチオレドキシン融合膜タンパク質を可溶化し、凝集を阻害するものであれば何でもよく緩和な界面活性剤に限定されない。好ましくは、Ｎ−ラウリルサルコシンやＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド等を使用することができる。
あるいは、これら第１の方法及び第２の方法を組み合わせて行うことが更に好ましい。このように脂質やリポソームの存在下に合成され、及び／又は合成後にリポソームと混合されたチオレドキシン融合膜タンパク質、或いは当該融合タンパク質のチオレドキシン部分をエンテロキナーゼ等によって限定分解した膜タンパク質は、界面活性剤の濃度を低下させることによって脂質の二分子層や多重層が形成される際に、これに組み込まれて再構成が行われる。界面活性剤の濃度を低下させるためには、例えば、透析法、希釈法や界面活性剤に対する吸着剤を添加する方法等が挙げられる。
本明細書において、「リポソーム（脂質ベジクル）」とは、上述した脂質が水溶液中で自己集合してできる二重層膜の小胞のことをいい、当業者に公知の方法で容易に調製することができる。例えば、脂質の薄層に水溶液を加えて攪拌し、必要に応じ粒子径の大きさを調節する。リポソームの性質は脂質の組成（陽イオン性、陰イオン性、又は中性の脂質種）によって異なるが何れの脂質を用いた場合でも同一の方法によって調製することができる。まず最初に、２種以上の脂質成分からなる場合には、これらの脂質を有機溶媒中等ででよく混合する。次に有機溶媒を留去して脂質膜を形成する。続いて、乾燥した脂質膜に水溶液を加えて攪拌する。水溶液の温度は、当該脂質のゲル−液晶転移温度以上であることが好ましい。このようにして形成されたリポソームは、大きな多重層ベジクル（ＬＭＶ）でありそれぞれの脂質二重層は水層により隔てられている。一旦、安定なＬＭＶが形成されると、超音波処理や機械的処理等の種々の方法によりその粒子径を所望の大きさに小型化することができる。
本発明において、無細胞タンパク質合成反応中に、又はタンパク質合成後に添加されるリポソームは、均一な粒子径を有する単層ベジクル（ＵＶ）であることが好ましい。上記、超音波処理や機械的処理条件を調節することによって当業者であれば容易にリポソームの粒子径を均一化することができる。例えば、超音波処理を行うことによって、通常、平均粒子径が１５〜５０ｎｍの範囲内の小さな単層ベジクル（ＳＵＶ）が生成する。水浴方式や、プローブチップ又はカップホーンを備えた超音波処理装置が一般的に用いられる。一方、機械的処理方法として、押し出し器（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）による方法が知られている（例えば、Ａｖａｎｔｉ社製のＭｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）。この押し出し法は、脂質の懸濁液を一定の孔径（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）を有するポリカーボネート製のフィルターに機械的に通すことによって、用いたフィルターの孔径に近い粒子径のリポソームを調製する方法である。最終的な孔径のフィルターに通す前に、ＬＭＶの懸濁液を予め凍結融解や孔径の大きなフィルターに通して置くことが好ましい。超音波処理の場合と同様に、押し出し操作中の温度は当該脂質のゲル−液晶転移温度以上であることが好ましい。押し出し器によって調製されるリポソームの粒子径は、フィルターの通過回数によって異なる。押し出し処理当初（最初の２〜３回）は、元の粒子径のＬＭＶと所望の粒子径のリポソームとの２つの粒子径分布が見られるが、フィルターを十分な回数通すことによって単一の粒子径分布を示すリポソームが得られる。例えば、孔径が１００ｎｍのフィルターを用いた場合には、一般的には、平均粒子径が１２０から１４０ｎｍの大きな単一層ベジクル（ＬＵＶ）が得られる。
また、本発明に用いるリポソームの粒子径は、５０〜２００ｎｍの範囲内であることが好ましい。このような粒子径は光子相関法（光散乱法ともいう。Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＩＳＯ  １３３２１）やゼータ電位測定装置、電気的測定法（コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ）等を用いる。）、又は超遠心分離法等により測定することができる。
あるいは、本発明の異なる実施形態において、界面活性剤によるチオレドキシン融合膜タンパク質の変性を極力抑えるために、上記透析法に変えて、凍結・融解・超音波処理法（Ｆｒｅｅｚｅ−Ｔｈａｗ−Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）や、疎水性クロマトグラフィーの繰り返しによる界面活性剤の除去（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を行うこともできる（Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｆ．，Ｉｎｄｉｖｅｒｉ，Ｃ．，Ｂｉｓａｃｃｉａ，Ｆ．ａｎｄ  Ｉａｃｏｂａｚｚｉ，Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６０，３４９−３６９（１９９５）参照）。凍結・融解・超音波処理法は、界面活性剤に溶解したタンパク質とリポソームとを混合した後、液体窒素等を用いて急速に冷却し、１５〜２０℃に融解して短時間超音波処理する方法である。急速な冷凍によってリポソーム膜に空いた穴へ、ゆっくりと融解することによってタンパク質が挿入されると共に極めて短い時間の超音波処理によってリポソーム膜の穴がふさがれる。一方、疎水性クロマトグラフィーの繰り返し法は、界面活性剤、タンパク質、及びリン脂質をアンバーライトＸＡＤ−２等が充填されたカラムに繰り返し通すことにより界面活性剤を除去し、タンパク質・リポソーム複合体を形成する方法である。疎水性の樹脂が非イオン性界面活性剤を選択的に吸着することによって、残存するリン脂質とタンパク質がゆっくりと二分子層を形成するものと考えられる。
本発明の方法により製造された均一な粒子径を有するチオレドキシン融合膜タンパク質とリポソームとの複合体は、結晶化させて立体構造を解析するために用いる他、ガラス基板やマイクロプレートタイターのウェル内に固相化して、当該膜タンパク質に結合するリガンドをスクリーニングするために用いることができる。
実施例
以下に本発明の実施例として、ラット由来ニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）、ヒト由来ムスカリン性アセチルコリン受容体ｍ２サブタイプ（ｍ２）、及びヒト由来β２−アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ−Ｇｓ）をコードするｃＤＮＡフラグメントを用いて本発明の方法について検討した結果を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、ここで％は、特記しない限り容量％である。
実施例１  ラットニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）の合成
ＮＴＲは、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーであり、そのリガンドであるニューロテンシンの結合により、Ｇタンパク質を介してホスホリパーゼＣを活性化し、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸／ジアシルグリセロールを産生する働きを有する。本実施例では、このＮＴＲとチオレドキシンとの融合タンパク質を発現させる種々の組換えベクターを作製し無細胞タンパク質合成系での発現量を調べた。なお、チオレドキシンと融合させない場合を対照とした。
（１）ＮＴＲ発現用プラスミドの調製
ＮＴＲ  ｃＤＮＡを含むベクターｐＲＧ／ＩＩＩ−ｈｓ−ＭＢＰ−Ｔ４３ＮＴＲ−ＴｒｘＡ−Ｈ１０（Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２７，８９９−９０３（１９９９）参照）を鋳型とし、２種類のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＮＴＲ  ｃＤＮＡ断片を増幅した。５’プライマＭＴ４３−ＮＴＲ：５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＡＴＣＣＧＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＡＣ−３’（配列番号１）と、３’プライマー；５’−ＧＴＡＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２）を用いて増幅したｃＤＮＡ断片は、開始コドンのメチオニンを含むＮＴＲの４３番目のアミノ酸からＣ末端アミノ酸までのコード領域（ＭＴ４３ＮＴＲ）を含む。一方、５’プライマーＭＢＰ−Ｔ４３ＮＴＲ：５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’（配列番号３）と、３’プライマー：５’−ＧＴＡＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２）とを用いて増幅したｃＤＮＡは大腸菌のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の下流にＮＴＲの４３番目のアミノ酸からＣ末端アミノ酸までが連結されたポリペプチド（ＭＢＰ−Ｔ４３ＮＴＲ）をコードする。これら２種類のｃＤＮＡ断片をチオレドキシンとの融合タンパク質を発現させるためのベクターｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にクローン化し、それぞれの発現プラスミドを作製した。同様にして、これらのｃＤＮＡ断片は、チオレドキシンと融合しないタンパク質を発現するｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にもクローン化して対照実験に用いた。
（２）無細胞タンパク質合成系によるチオレドキシン融合ＮＴＲの合成
大腸菌Ｓ３０抽出液は、Ｚｕｂａｙら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉ．，７，２６７−２８７，１９７３）の方法に従って大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株から調製した。タンパク質合成反応は下記の表１に示した組成の溶液に、Ｌ−［１４Ｃ］Ｌｅｕｃｉｎｅと、上記各種類の発現プラスミドを１〜２０μｇ／ｍｌの種々の濃度で添加した。同じ組成の反応液に終濃度０．２％のジギトニン（和光純薬）を加えたものも調製した。タンパク質合成反応は、７．２μｌの大腸菌Ｓ３０抽出液を加えて全量を３０μｌとした反応溶液中で、３７℃、１時間バッチ法により行った。
2003097829.tif 000002
2003097829.tif 000003
（３）発現量の測定
合成反応終了後、得られた合成反応液より５μｌ取り出し、不溶性画分と上清画分に含まれる標識タンパク質全体（全タンパク質）の放射能を、ＴＯＰ  ＣＯＵＮＴ（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いて測定した。次に、残りの反応液２５μｌを３，０００ｘｇ、１０分間遠心した後、上清５μｌ取り出して同様に放射能の検出を行った。なお、タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）は目的とするタンパク質中のロイシンの個数等から、あらかじめ算出した単位放射能あたりの係数を乗じて求めた。その結果を第１図〜第４図に示す。第１図はチオレドキシンと融合させないでＭＴ４３−ＮＴＲのみを発現させた場合の結果である。用いた鋳型ＤＮＡの量及び界面活性剤の添加の有無にかかわりなく、何れの条件下においてもほとんどタンパク質の発現は認められなかった。これに対し、チオレドキシンと融合させた場合には第２図に示したように鋳型ＤＮＡの添加量が増えると共に融合タンパク質の発現量も増加した。特に０．２％ジギトニンを添加した条件下ではほとんどのタンパク質が上清画分に見出された。同様に、大腸菌のＭＢＰと融合させたＮＴＲについても第３図に示したようにほとんど発現は認められないが、このＭＢＰ−Ｔ４３ＮＴＲを更にチオレドキシンと融合させることによって第４図に示したように大量の融合タンパク質が発現した。この場合にも０．２％のジギトニン添加によってほとんどのタンパク質が上清画分に見出された。これらの結果より、チオレドキシンとＮＴＲとの融合タンパク質は無細胞タンパク質合成系で極めて大量に、かつ可溶化しやすい状態で合成されることが分かる。また、ＭＢＰ−Ｔ４３ＮＴＲのみ発現させた場合の結果より、単に他のタンパク質と融合させただけでは発現量は少なく、チオレドキシンと融合させることにより本発明の効果が得られることが理解される。
実施例２  ヒト由来ムスカリン性アセチルコリン受容体ｍ２サブタイプ（ｍ２）の合成
ｍ２は、Ｇタンパク質連結型受容体ファミリーのメンバーであり、主に心臓や腸（平滑筋）などの末梢組織から中枢にかけて発現している受容体である。そのｃＤＮＡの塩基配列は公知であり、バキュロウイルスなどの発現系において遺伝子発現が試みられている（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｇａ  Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２０，１２３２−１２３８（１９９６））。本実施例では、東京大学、芳賀博士より提供を受けたヒト由来ｍ２  ｃＤＮＡ（前掲参照）を鋳型として、５’プライマー；５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ−３’（配列番号４）と、３’プライマー；５’−ＣＣＴＴＧＴＡＧＣＧＣＣＴＡＴＧＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＧＡＣＡ−３’（配列番号５）とを用いて、実施例１と同様の方法により無細胞タンパク質合成系での発現量を調べた。
その結果を第５図〜第７図に示した。第５図に示したように、対照実験のためにｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化してｍ２のみを発現させた場合は界面活性剤の添加の有無に関係なくほとんど発現が認められなかった。一方、ｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化してチオレドキシンとの融合タンパク質を発現した場合は、第６図に示したように鋳型ＤＮＡの添加量に依存して発現することが認められた。第７図は、０．２％ジギトニン又は０．１％Ｂｒｉｊ３５を添加した場合の結果であり、実施例１と同様にほとんどのタンパク質が上清画分に移行し、極めて可溶性の高い状態で大量のタンパク質が発現することが分かった。
実施例３  β２−アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ）の合成
β２ＡＲは、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーであり、そのリガンドであるアドレナリンの結合により、促進性Ｇタンパク質を介してアデニリルシクラーゼを活性化させ、細胞内環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）濃度を上昇させる働きを有する。このタンパク質は既に公知であり、そのｃＤＮＡの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋに登録されている（アクセッション番号ＡＦ０２２９５６）。本実施例ではこのβ２ＡＲとチオレドキシンとの融合タンパク質の発現効率を上げるために、３種類のベクターを作製し、これらにβ２ＡＲをコードするＤＮＡをクローン化してバッチ法による無細胞タンパク質合成系で発現させ、チオレドキシン融合タンパク質の発現量を調べた。次に、透析法による無細胞タンパク質合成系でβ２ＡＲ−Ｇｓを大量に発現させ、合成されたβ２ＡＲ−Ｇｓを再構成してリガンドとの結合能力を評価した。
（１）チオレドキシン融合発現ベクターの構築
ヒトβ２−アドレナリン作動性受容体と促進性Ｇタンパク質（Ｇｓ）との融合遺伝子を含むプラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ−β２ＡＲ−Ｇｓ−Ｈ６は、デューク大学メディカルセンターのＲｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ博士より提供を受けた（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４６−５０（１９８７））。このプラスミドＤＮＡを鋳型とし、共通の正方向プライマー；５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＣＡ−３’（配列番号６）、並びにβ２ＡＲ−Ｇｓ用逆方向プライマー；５’−ＴＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧ−３’（配列番号７）及びβ２ＡＲ用逆方向プライマー；５’−ＣＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＡＣＧＡＣ−３’（配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、促進性Ｇタンパク質と融合したβ２ＡＲ（β２ＡＲ−Ｇｓ）及びβ２ＡＲ単独のｃＤＮＡ断片を増幅した。これらのｃＤＮＡ断片をチオレドキシンとの融合又は非融合タンパク質を発現させるためのベクターｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ又はｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にそれぞれクローン化し、４種類の発現プラスミド（β２ＡＲ／１０２，β２ＡＲ−Ｇｓ／１０２，β２ＡＲ／１０１，及びβ２ＡＲ−Ｇｓ／１０１）を作製した（第８図参照）。
チオレドキシンとの融合タンパク質の発現効率を上げるために、市販のプラスミドｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯのチオレドキシン配列の後ろに９種類の制限酵素（ＨｐａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＫｐｎＩ，ＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ，ＰｍａＣＩ，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ）によるマルチクローン化部位を導入したベクター（ＭＣＳと称する。）、このベクターのラクトースオペレーター配列（ｌａｃＯ）を欠損させたベクター（ＭＣＳ−ΔｌａｃＯと称する。）、及びＭＣＳからＶ５エピトープと６個のヒスチジン配列を欠損したベクター（ＭＣＳ−ΔＶＨと称する。）をそれぞれ作製した。具体的には、まず制限酵素切断部位をコードするオリゴヌクレオチド：５’−ＧＴＴＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号９）を合成し、ｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化して、マルチクローン化部位を有するベクターＭＣＳ（６３６９ｂｐ）を作製した。次に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて、２３塩基対のラクトースオペレーター配列を、１７塩基対の配列；５’−ＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号１０）に置き換えた。また同様にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてＭＣＳからＶ５エピトープと６個のヒスチジン配列を欠失させたＭＣＳ−ΔＶＨ（６２７９ｂｐ）を作製した。これらのベクターにβ２ＡＲｃＤＮＡを挿入して発現用プラスミドを作製した。すなわち、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−β２ＡＲ−Ｇｓ−Ｈ６を鋳型とし、５’プライマー；５’−ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧ−３’（配列番号１１）及び３’プライマー；５’−ＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＴＴＴＧＴＡＣ−３’（配列番号１２）を用い、ＰＣＲを行って、β２ＡＲｃＤＮＡ断片を増幅した。このｃＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断して上記３種類のベクターのマルチクローン化部位にクローン化し無細胞タンパク質合成系での発現用プラスミドを構築した（第８図参照）。それぞれの発現ベクターはβ２ＡＲ／ＭＣＳ，β２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔｌａｃＯ，及びβ２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔＶＨと称する。
（２）バッチ法によるタンパク質合成率の比較
実施例１と同様の方法により、大腸菌Ｓ３０抽出液と、第８図に示した７種類の発現ベクターとを用いてβ２ＡＲタンパク質を合成した。なお、表１に示した組成の溶液に、０．４６ｍＭのＬ−［１４Ｃ］Ｌｅｕｃｉｎｅ（２２０−３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ，Ｍｏｒａｖｅｋ）と、上記各種類の発現プラスミドを１０μｇ／μｌの濃度で添加した。タンパク質合成反応は、７．２μｌの大腸菌Ｓ３０抽出液を加えて全量を３０μｌとした反応溶液中で、３７℃、１時間行った。これらの結果を第９Ａ図及び第９Ｂ図に示した。第９Ａ図は、反応液１ｍｌ当たりの全合成タンパク質量を標識された放射活性から計算した値を示した。第９Ｂ図は、合成反応終了後の試料をＭＵＬＴＩＧＥＬ１０／２０（第一化学薬品）ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲルを乾燥させ、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ（ＢＡＳ−ＳＲ２０４０、富士フィルム）に密着させて暗所に２４時間置いた後、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２５００（富士フィルム）を用いてオートラジオグラフィーにより標識タンパク質の検出を行ったものである。レーン１はβ２ＡＲ／１０１を、レーン２はβ２ＡＲ／１０２を、レーン３はβ２ＡＲ−Ｇｓ／１０１を、レーン４はβ２ＡＲ−Ｇｓ／１０２を、レーン５はβ２ＡＲ／ＭＣＳを、レーン６はβ２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔｌａｃＯを、及びレーン７はβ２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔＶＨを鋳型ＤＮＡとして用いた結果である。第９Ａ図及び第９Ｂ図の結果より、チオレドキシンと融合させなかったタンパク質（レーン１及び３）はほとんど発現しなかったが、チオレドキシンと融合させることによって発現量は著しく増加することが分かる（レーン２及びレーン４〜７）。第９Ｂ図から明らかなように、これらのタンパク質の見かけの分子量は、それぞれ６４ｋＤａ（レーン２、５及び６）、１０９ｋＤａ（レーン４）及び６１ｋＤａ（レーン７）であり、推定値とほぼ一致した。さらに第９Ａ図からは、３０μｌの反応溶液を用いたわずか１時間の合成反応によって、約１５０〜２５０μｇ／ｍｌものタンパク質が合成されていることが分かる。
次に、β２ＡＲ／ＭＣＳ，β２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔｌａｃＯ，及びβ２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔＶＨの３種類の発現ベクターを用いて、鋳型ＤＮＡ量を変えて合成反応を行った。その結果を第１０図に示した。第１０Ｂ図に示したように、β２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔｌａｃＯの場合には、鋳型ＤＮＡの添加量に依存せず、１μｇ／μｌの添加量でも十分な融合タンパク質が合成された。他の発現プラスミドを鋳型とした場合は、低濃度域では鋳型ＤＮＡ量に依存してタンパク質合成量も増加した（第１０Ａ図及び第１０Ｃ図）。これらの結果より、ラクトースオペレーターを除去した鋳型ＤＮＡは本発明の方法による無細胞タンパク質合成系での発現効率が極めて優れていることが理解される。
（３）β２ＡＲの合成に対する界面活性剤の影響
大腸菌Ｓ３０抽出液を用いて実施例１と同様の方法でβ２ＡＲタンパク質を合成した。なお、表１に示した組成の溶液に、Ｌ−［１４Ｃ］Ｌｅｕｃｉｎｅと、β２ＡＲ−Ｇｓ／１０２を１０μｇ／μｌの濃度で添加した。タンパク質合成反応は、７．２μｌの大腸菌Ｓ３０抽出液を加えて全量を３０μｌとした反応溶液中で、３７℃、１時間行った。第１１Ａ図は、１８種類の界面活性剤を用いてβ２ＡＲタンパク質の発現及び可溶化に及ぼす影響を調べた結果である。反応溶液１ｍｌ当たりの合成された全タンパク質を黒い棒グラフで、上清中のタンパク質量を白い棒グラフで示した。レーン１は対照として純水を、レーン２はＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）を、レーン３はＮ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＭ）を、レーン４はジギトニンを、レーン５はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を、レーン６はＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０を、レーン７はポリオキシエチレン８ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ８）を、レーン８はポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５）を、レーン９はＴｗｅｃｎ２０を、レーン１０はＴｗｅｅｎ４０を、レーン１１はＴｗｅｅｎ６０を、レーン１２はＴｗｅｅｎ８０を、レーン１３はＨＥＣＡＭＥＧを、レーン１４はＣＨＡＰＳを、レーン１５はデオキシコール酸を、レーン１６はコール酸ナトリウムを、レーン１７はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、レーン１８はＮ−ラウリルサルコシンをそれぞれ添加した。添加した界面活性剤濃度はいずれも１％以下である。第１１Ｂ図は、ジギトニンとＢｒｉｊ３５の添加濃度について最適化した結果を、合成された全タンパク質量を黒い棒グラフで、上清中のタンパク質量を白い棒グラフで示した。
第１１Ａ図の結果より、Ｂｒｉｊ３５とジギトニンは合成された膜タンパク質の凝集を効果的に抑止した。０．０５％以上のＢｒｉｊ３５及び０．２％以上のジギトニンを含む反応溶液中で合成されたタンパク質は、遠心分離の上清画分にほとんど残存した（第１１Ｂ図参照）。また、これらの界面活性剤は可溶性タンパク質の量を増加させたが、発現量には影響しなかった。これに対し、ＣＨＡＰＳ、コール酸類及びＯＧはタンパク質合成を完全に阻害し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００は可溶化（溶解性）に対する影響をほとんど有していないことが分かった。なお、Ｂｒｉｊ３５（レーン８）とＣ１２Ｅ８（レーン７）とは類似の化学構造を有する非イオン性界面活性剤であるが、ラウリルエーテル鎖長の違いによって合成されたタンパク質の溶解性に及ぼす影響が全く異なっていた。
さらに、β２ＡＲ／ＭＣＳ，β２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔｌａｃＯ，及びβ２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔＶＨの３種類の発現ベクターを用いてジギトニンとＢｒｉｊ３５の添加効果を確認した。その結果を第１２図に示す。ラクトースオペレーターを除去した鋳型ＤＮＡ（β２ＡＲ／ＭＣＳ−ΔｌａｃＯ）を用いた場合には、無細胞タンパク質合成系で合成された全タンパク質量が増加するだけでなく、ジギトニンやＢｒｉｊ３５の添加によって合成されたタンパク質の溶解性が著しく向上していることが分かった（第１２図Ｂ参照）。
（４）透析法によるβ２ＡＲ−Ｇｓの合成量の検討
以下の表２に示した組成の反応内液４．５ｍｌと、表３に示した組成の反応外液４５ｍｌを用いて透析法により蛋白質合成を行った。反応内液は０．９ｍｌずつ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ，分画分子量５０，０００）５本に分注し、反応外液中に浮遊させて３０℃で最長８時間までタンパク質合成を行った。
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透析開始後、最長８時間まで経過時に電気泳動用サンプルを２５μｌの採取した。アセトン沈殿により不純物を除いた後１５，０００ｒｐｍ、１０分間４℃で遠心し、沈殿を回収した。沈殿を乾燥後、８Ｍ尿素とＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えて溶解した。これらの試料（合成反応液１μｌ相当分）を４〜２０％グラジエントゲルを用いて定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）、若しくはＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）で染色し、又は抗β２ＡＲ抗体若しくは抗Ｖ５抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った。これらの結果を第１３Ａ図に示した。第１３Ａ図で、Ｍは分子量マーカーを、１〜８は各合成時間を示す。合成開始１時間後からＣＢＢ染色法により推定分子量約１０９ｋＤａにチオレドキシンと融合したβ２ＡＲ−Ｇｓが認められ、８時間経過後まで継続して合成量が増加した。合成されたチオレドキシン融合タンパク質は、抗β２ＡＲ抗体、及び／又は抗Ｖ５抗体との免疫反応性により確認することができた。一方、既知の濃度のＢＳＡと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ゲルをＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅで染色し、その画像をＢｉｏＲａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸで取り込み、ＢＳＡのタンパク質濃度（０．０２５〜０．４ｍｇ／ｍｌ）とバンドの濃さとの相関から標準曲線を作製した。チオレドキシンと融合したβ２ＡＲ−Ｇｓの合成量をバンドの濃さからＢＳＡ量に換算して求めた。解析ソフトはＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅを使用した。その結果を第１３Ｂ図に示した。第１３Ｂ図に示したように、透析法による無細胞タンパク質合成系での合成反応は８時間まで継続して合成率が上昇し、分子量が１００ｋＤａ以上の大きな膜タンパク質であるチオレドキシン融合ＧＰＣＲを、６〜８時間で１ｍｇ／ｍｌ以上の大量合成が可能であることが示された。
（５）β２ＡＲ−Ｇｓの再構成とリガンド結合活性の測定
上記透析法によるタンパク質合成反応を６時間行った後、反応内液にＮ−ラウロイルサルコシンを０．５％となるように加え、１分間超音波処理した。続いて、界面活性剤を希釈するためにＰＢＳを添加し、１０％のβ−ドデシルマルトシド（ナカライテスク社製）を滴下して加え、終濃度１％とした。この溶液１ｍｌと、上記無細胞タンパク質合成系で用いたのと同じリポソーム１２．５μｌとを混合し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ，分画分子量５０，０００）に移し、１％ＣＡＲＢＩＯＳＯＲＢ（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ社）を加えたリン酸緩衝液中、６〜１２時間ごとに緩衝液を交換しながら４℃で３〜４日間透析した。再構成した透析終了後のチオレドキシン融合β２ＡＲ−Ｇｓとリポソームとの複合体を４℃で１００，０００ｘｇ、１時間超遠心分離を行い、得られた沈殿画分（再構成された膜画分）を５０μｌのインキュベーションバッファー（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。
リガンドとの結合飽和実験については、この再構成膜画分（チオレドキシン融合β２ＡＲ−Ｇｓとリポソーム複合体）を０〜２５ｎＭのトリチウム標識したＤｉｈｉｄｒｏａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ（［３Ｈ］ＤＨＡ）と共に、最終容量２００μｌのインキュベーションバッファー中で２５℃にて６０分間インキュベートした。競合実験については、上記再構成膜画分を１０−８〜１０−２ＭのＡｌｐｒｅｎｏｌｏｌ（Ｓｉｇｍａ社）の存在又は非存在下で１０ｎＭの［３Ｈ］ＤＨＡと共にインキュベートした。
９６ｗｅｌｌのＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用意し、あらかじめ２００μｌの０．３％ポリエチレンイミンで２回、続けて２００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で９回洗浄した。この９６ｗｅｌｌ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒに上記反応液を加えた後、インキュベーションバッファーで５回洗浄した。その後、９６ｗｅｌｌ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒを乾燥させ、各ｗｅｌｌに５０μｌのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−Ｏ（Ｐａｃｋａｒｄ社）を加え、暗所で１０分間静置した。これをＴＯＰＣＯＵＮＴ（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いて各ｗｅｌｌ毎の［３Ｈ］Ｄｉｈｉｄｒｏａｌｐｒｅｎｏｌｏｌに由来する放射能を測定した。これらの結果より飽和曲線（第１４Ａ図）及び競合曲線（第１４Ｂ図）を作成し、結合定数（Ｋｄ値）をＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＺＭ３．０３（Ｇｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算した。
第１４Ａ図より、合成されたチオレドキシン融合β２ＡＲ−リポソーム複合体はリガンドである［３Ｈ］ＤＨＡとの結合活性を有し、当該融合タンパク質が細胞膜上に存在する場合と同様に正確な立体構造を有すること、従って、生化学的、又は構造科学的研究に実用的な価値を有することが分かった。３回の独立した実験の結果、最も高いＫｄ値は、４．３ｎＭであり、平均値は５．５±１．１ｎＭであった。なお陽性対照として用いた昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）で発現されたヒトβ２ＡＲのＫｄ値は３．９ｎＭ（ｎ＝１）であった。また、第１４Ｂ図は、競合するリガンド濃度を１０−８〜１０−２Ｍのアルプレノロールを用いて調べた。チオレドキシン融合β２ＡＲ−リポソーム複合体のＥＣ５０値（５０％阻害を起こすリガンド濃度）は、２ヶ所及び１ヶ所の結合部位に対する競合についてそれぞれ２．２ｘ１０−８Ｍ及び１．０ｘ１０−５Ｍ（ｎ＝５）であり、Ｓｆ９細胞で発現されたヒトβ２ＡＲのＥＣ５０値（１．０ｘ１０−８Ｍ，ｎ＝１）に比べてわずかに低いアルプレノロール感受性を示した。これらの結果より、無細胞タンパク質合成系でチオレドキシンと融合させて発現したβ２ＡＲは、リポソームとの複合体として再構成することにより、Ｓｆ９細胞で発現されたヒトβ２ＡＲと比較してわずかに低いながらＤＨＡ結合活性を有することが明らかとなった。チオレドキシンに由来する領域の存在は、融合タンパク質リガンド結合活性に大きな影響を与えないものと推測される。
産業上の利用の可能性
本発明の方法により、膜タンパク質等の高度に疎水的なタンパク質をチオレドキシンとの融合タンパク質として極めて効率的かつ大量に無細胞タンパク質合成系で合成することができる。合成された融合タンパク質は可溶化しやすく、しかも本来の生物学的活性を示す。これらの結果より、本発明の方法で合成したタンパク質は正確な立体構造を形成していることが示唆されるため、立体構造の解析や細胞内での機能解析に用いることができる。本発明の方法は、このような解析を通じて医薬品の開発等に極めて有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＭＴ４３−ＮＴＲをバッチ法による無細胞タンパク質合成系で発現させた結果を示したものである。
第２図は、本発明の方法により、チオレドキシンと融合させたＭＴ４３−ＮＴＲをバッチ法による無細胞タンパク質合成系で発現させた結果を示したものである。
第３図は、ＭＢＰ−Ｔ４３ＮＴＲをバッチ法による無細胞タンパク質合成系で発現させた結果を示したものである。
第４図は、チオレドキシンと融合させたＭＢＰ−Ｔ４３ＮＴＲをバッチ法による無細胞タンパク質合成系で発現させた結果である。
第５図はｍ２をバッチ法による無細胞タンパク質合成系で発現させた結果である。
第６図は、チオレドキシンと融合させたｍ２をバッチ法による無細胞タンパク質合成系で発現させた結果である。
第７図は、チオレドキシンと融合させたｍ２をバッチ法による無細胞タンパク質合成系で、０．２％ジギトニン又は０．１％Ｂｒｉｊ３５を添加して発現させた結果である。
第８図は、チオレドキシンと融合させたヒトβ２ＡＲを発現させるために構築した種々の発現ベクターを示す。図中、β２ＡＲはヒトβ２−アドレナリン作動性受容体を、β２ＡＲ−Ｇｓは促進性Ｇタンパク質と融合したヒトβ２−アドレナリン作動性受容体を、Ｔ７はＴ７プロモーターを、ＬａｃＯはラクトースオペレーターを、ＲＢＳはリボゾーム結合部位を、ＨＰ  ｔｒｘＡはヒスチジン付加チオレドキシンを、ＥＫはエンテロキナーゼ切断部位を、Ｖ５はパラミキソウイルスＳＶ５のＰ及びＶタンパク質由来のＶ５ドメインを、Ｈ６はヘキサヒスチジンを、Ｓｔｏｐは終止コドンを、Ｔ７  ｔｅｒｍはＴ７ターミネーターを、ＭＣＳは９種類の制限酵素（ＨｐａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＫｐｎＩ，ＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ，ＰｍａＣＩ，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ）切断部位を含むマルチクローニング部位をそれぞれ示す。
第９図は、バッチ法による無細胞タンパク質合成系で合成した種々のチオレドキシン融合又は非融合β２ＡＲタンパク質の発現量を示す。第９Ａ図は、標識タンパク質の放射活性から計算した合成反応溶液１ｍｌ当たりのタンパク質量である。第９Ｂ図は、各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しオートラジオグラフィーで検出した結果である。
第１０図は、３種類の発現ベクターにクローン化したβ２ＡＲを、鋳型ＤＮＡ量を変えてバッチ法による無細胞タンパク質合成系で合成した結果を示す。
第１１図は、β２ＡＲ−Ｇｓの合成量及び溶解性に与える種々の界面活性剤の添加効果を示す。第１１Ａ図は、１８種類の界面活性剤の効果をバッチ法による無細胞タンパク質合成系で調べた結果である。第１１Ｂ図は、ジギトニンとＢｒｉｊ３５の添加濃度について最適化した結果を、合成された全タンパク質量を黒い棒グラフで、上清中のタンパク質量を白い棒グラフで示す。
第１２図は、３種類の発現ベクターにクローン化したβ２ＡＲを、種々の界面活性剤濃度でバッチ法による無細胞タンパク質合成系で合成した結果を示す。
第１３図は、透析法による無細胞タンパク質合成系を用いたβ２ＡＲ−Ｇｓの経時的な合成量の変化を示す。第１３Ａ図は、合成反応溶液１μｌを４〜２０％のグラジエントゲルで分離し、クーマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ）、抗β２ＡＲ抗体（抗β２ＡＲ）、又は抗Ｖ５抗体（抗Ｖ５）により検出したウエスタンブロッティングの結果を示す。第１３Ｂ図は、合成反応開始後０、１、２、３、６、８時間における発現量を示す。
第１４図は、再構成されたβ２ＡＲ−Ｇｓのリガンド結合活性を示す。第１４Ａ図は、無細胞タンパク質合成系で合成され、リポソームと複合体を形成したβ２ＡＲ−Ｇｓ（■）とＳｆ９細胞で発現したβ２ＡＲ（□）とのリガンド結合飽和曲線を示す。第１４Ｂ図は、無細胞タンパク質合成系で合成され、リポソームと複合体を形成したβ２ＡＲ−Ｇｓ（■）とＳｆ９細胞で発現したβ２ＡＲ（□）とのアルプレノロールに対する競合曲線を示す。それぞれのデータは二重測定の平均値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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