(57)【要約】味覚および消化管グルタミン酸センサーの実体を明らかにし、それを利用した技術を提供する。下記性質を有するグルタミン酸受容体タンパク質とこれに結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを探索する：（Ａ）タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有する、（Ｂ）タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも約４０９又は４８１アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記性質を有するグルタミン酸受容体タンパク質：
（Ａ）タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有する、
（Ｂ）タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも約４８１又は４０９アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。
【請求項２】
ラットの舌上皮おいて発現していることを特徴とする請求項１記載のグルタミン酸受容体タンパク質。
【請求項３】
配列番号６および８に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号７３〜７９０および７３〜４９７で表されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のグルタミン酸受容体タンパク質。
【請求項４】
１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含み、かつ、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得る請求項３記載のグルタミン酸受容体タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質をコードし、かつ、タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質を発現しないＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞を培地で培養し、同グルタミン酸受容体タンパク質を生成させることを特徴とする、グルタミン酸受容体タンパク質又はそれを保持する細胞の製造法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストの探索方法。
【請求項１０】
前記グルタミン酸受容体タンパク質を、請求項６記載の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記グルタミン酸受容体タンパク質を、請求項６記載の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規グルタミン酸受容体とその利用に関し、詳しくは、グルタミン酸受容体とそれをコードするＤＮＡ、ならびにそれらを利用して同受容体に結合するリガンドをスクリーニングする方法、及び受容体結合試験等に関する。
背景技術
ヒトの味覚は、塩味、甘味、酸味、苦味、うま味の５基本味から構成されると考えられている。各味覚は舌上の味雷に存在する味細胞に特異的に発現している個別の受容体に対する味物質の結合がトリガーとなり生じる。これまで、味覚受容体の候補として、ＥＮａＣ／Ｄｅｇ．（塩味受容体）、ＥｎａＣ，ＡＳＩＣ，ＨＣＮ（酸味）、Ｔ２Ｒ  ｆａｍｉｌｙ（苦味受容体）、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３（甘味受容体）、Ｔａｓｔｅ  ｍＧｌｕＲ４（うま味受容体）等がクローニングされている（詳しくは、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ  Ｂ，Ｎａｔｕｒｅ４１３：１３，２１９−２２５，２００１を参照、引用文献は本明細書に組み込まれる。以下同じ）。
特に、うま味受容体として、Ｃｈａｕｄｈａｒｉ，Ｎ．，Ｌａｎｄｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｒｏｐｅｒ，Ｓ．Ｄ．らが発見した、ラット味蕾細胞に発現する低親和性グルタミン酸受容体はうま味受容機構を分子レベルで実証する有力な証拠となった（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００，Ｆｅｂ；３（２）：１１３−９）。このうま味受容体は、ラット脳型代謝型グルタミン酸受容体のサブタイプであるタイプ４型（ｍＧｌｕＲ４）（Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９２，Ｊａｎ；８（１）：１６９−７９；Ｆｌｏｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆｅｂ；３４（２）：１４９−５５）とホスト遺伝子を同じとし、スプライシング変異により、脳型ｍＧｌｕＲ４の細胞外ドメインを一部欠損した味蕾型ｍＧｌｕＲ４であることから、新しいタイプの末梢型グルタミン酸受容体として、本受容体を利用した、グルタミン酸以外の特異的作動物質の発見が注目されている。
一方、グルタミン酸は、中枢神経系において主要な興奮性神経伝達物質であり、その制御異常は、記憶障害、虚血性脳障害、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン氏病、及びハンチントン舞踏病等の進行性脳障害などの病態形成に寄与していると広く考えられている（Ｍｅｌｄｒｕｍ，Ｂ．Ｓ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９４  Ｎｏｖ；４４（１１  Ｓｕｐｐｌ  ８）：Ｓ１４−２３；Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００１，Ｊｕｎ  １５；６９（４）：３６９−８１）。そのため、グルタミン酸受容体に関する多くの研究が脳神経系を通じてこれまでなされ、多くの受容体（イオン型受容体３種類、代謝型受容体８種類）が中枢神経系で発見され、いくつかのスプライシングバリアント体も見つかっている。特に、１９９２年、Ｎａｋａｎｉｓｈｉらにより代謝型グルタミン酸受容体タイプＩ型（ｍＧｌｕＲ１ａ）がクローニングされて以来、ｍＧｌｕＲ１には少なくとも３つ以上（ｍＧｌｕＲ１ｂ，ｍＧｌｕＲ１ｃ，ｍＧｌｕＲ１ｄ）のスプライシングバリアント体が確認されている（詳しくは、Ｈｅｒｍａｎｓ  Ｅ．＆  Ｃｈａｌｌｉｓｓ  Ｒ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．３５９：４６５−４８４，２００１を参照）。これらのバリアント体は全て、ｍＧｌｕＲ１ａのＣ−末端領域が短くなったものであり、神経細胞、グリア細胞に発現が確認されている。これら豊富な受容体情報をもとに、上記疾患に対する治療薬の開発を目指して、今日もその受容体特異的な作用薬の開発が精力的になされている（詳しくはＢａｒｎａｒｄ，Ｅ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９７，Ｍａｙ；１８（５）：１４１−８；Ｓｃｈｏｅｐｐ，Ｄ．Ｄ．，Ｃｏｎｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１９９３  Ｊａｎ；１４（１）：１３−２０を参照）。
今日我々は、末梢性グルタミン酸受容体の生理機能を示唆する幾つかの知見を有している（Ｂｅｒｋ，Ｍ．，Ｐｌｅｉｎ，Ｈ．，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００１，Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２４（３）：１２９−３２；Ｋａｒｉｍ，Ｆ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１，Ｊｕｎ  １；２１（１１）：３７７１−９；Ｂｅｒｋ，Ｍ．，Ｐｌｅｉｎ，Ｈ．，Ｂｅｌｓｈａｍ，Ｂ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０００；６６（２５）：２４２７−３２；Ｃａｒｌｔｏｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，１９９９，Ｆｅｂ  ２７；８２０（１−２）：６３−７０；Ｈａｘｈｉｕ．Ｍ．Ａ．，Ｅｒｏｋｗｕ，Ｂ．，Ｄｒｅｓｈａｊ，Ｉ．Ａ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．１９９７，Ｄｅｃ  １１；６７（３）：１９２−９；Ｉｎａｇａｋｉ，Ｎ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５，Ｍａｙ；９（８）：６８６−９１；Ｅｒｄｏ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９１，Ｎｏｖ；１２（１１）：４２６−９；Ａａｓ，Ｐ．，Ｔａｎｓｏ，Ｒ．，Ｆｏｎｎｕｍ，Ｆ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８９，Ｍａｙ  ２；１６４（１）：９３−１０２；Ｓａｉｄ，Ｓ．Ｉ．，Ｄｅｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１，Ｊｕｌ；２２（７）：３４４−５；Ｓｋｅｒｒｙ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｅｎｅｖｅｒ，Ｐ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１，Ａｐｒ；２２（４）：１７４−８１）。しかしながら、これらの末梢性グルタミン酸受容体は体内の末梢神経系組織、平滑筋、免疫系臓器に発現しているものであり、舌上皮、消化管粘膜上皮に発現している報告は見当たらない。ヒトを含めた哺乳動物が正常に成長（ｇｒｏｗｔｈ）し、正常な生活（健康）を維持するためには、必要な時期に必要な量の栄養素を経口より摂取する必要がある。それを主として担っているのが食べ物の味（味覚）であり、食べた後の内臓感覚に主として由来する食後の満足感である。例えば、塩味（ナトリウム、カリウムなど）はミネラルのマーカーとして体液浸透圧の保持等に、甘味（グルコース）は炭水化物のマーカーとしてエネルギー補給に、うま味（グルタミン酸ナトリウム）はタンパク質源のマーカーとしてエネルギー・体蛋白補給、苦味は有害物質のマーカーとしての意味があると考えられている。そして、必要量を十分摂取したかどうかは、胃および小腸、及び肝臓−門脈系に存在する栄養素センサーを介して迷走神経求心路を活性化し、延髄孤束核へ入力され、一連の脳内プロセスを得ることによって、満足感（ｓａｔｉｅｔｙ）として判断される（Ｂｒａｙ，Ｇ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．，２０００；５９：３７３−８４；Ｂｒａｙ，Ｇ．Ａ．，Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１９８９：７３：２９）。
一般に動物は摂取する際に食物中に含まれる栄養素の中で最も重要な蛋白質の存在をアミノ酸と抗酸関連物質であるＡＭＰ、ＩＭＰ、ＧＭＰなどの５’−モノリボヌクレオチドとにより認知している。脊椎動物では肉食性の魚類は、他の動物の組織である蛋白質を含む食物糖原性アミノ酸とアルギニンおよびＡＭＰやＩＭＰにより認知し、摂食行動を示す。両者の共存する食物は味応答が相乗的に増強され、より容易に蛋白質の認知ができるようになる。一方、陸棲の動物は視覚や嗅覚により蛋白質を含む食物（生きた動物や死ガイ）により探索し摂食するが、その際もアミノ酸と抗酸関連物質が有力な味覚情報を源となる。ヒトを含む高等哺乳類では、食物に含まれる蛋白質に最も多く存在するグルタミン酸と核酸関連物質との間で味覚応答が相乗的に増強することが知られ、これを手がかりに物質的受容体の存在を前提にした数多くの研究が生化学的、電気生理学的、行動科学的に行われ、現在、うま味（Ｕｍａｍｉ  ｔａｓｔｅ）として基本味の一つとして国際的に認知されている。現在、うま味物質としてはグルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏ−ｓｏｄｉｕｍＬ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）関連物質やイノシン酸あるいはグアニル酸などの核酸関係物質など、殆ど全てが舌上のグルタミン酸受容に関わる物質であり、世界中で食品として消費されている。
一方、内臓感覚を担う、消化管における栄養素認識（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｅ）機構に関する生理学的検討は古くから行われており、消化管内には内容物を知覚するセンサーが存在すると想定されている（詳しくは、Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，１９８３；９：１９９−２０６；Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｌｕｃｃｈｉｎｉ，Ｓ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，１９９２；４１：１５−８を参照）。これら消化管センサーとしては、グルコースセンサー（Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）１９７８，２８２，４８５−５０６），温度センサー（Ｅｌ  Ｏｕａｚｚａｎｉ，Ｔ．，Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９７９；１５；３４：４１９−３４）、浸透圧センサー（Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，１９８６；１６：１５９−７０）、ｐＨセンサー、アミノ酸センサー（Ｍｅｉ，Ｎ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９８５；６５：２１１−３７）、圧センサー（Ｂａｒｂｅｒ，Ｗ．Ｄ．，Ｂｕｒｋｓ，Ｔ．Ｆ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１９８７；１６：５２１−４）が挙げられる。
特に、消化管でのグルタミン酸を認識するセンサーとしては、新島らが、主として胃、小腸を支配している迷走神経胃枝及び腹腔枝の神経活動を電気的に捉える手法を用いて、グルタミン酸の消化管内投与時に神経興奮が起こることを見出し、迷走神経終末にグルタミン酸認識機構が存在すると仮定し、グルタミン酸センサーとしてその存在を示唆した（Ｎｉｉｊｉｍａ，Ａ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，１９９１；４９：１０２５−８）。
発明の開示
上述のように、うま味（グルタミン酸）受容体、特にｍＧｌｕＲ４に関しては多くの研究がなされているが、その他のうま剤味受容体候補に関する知見はなく、うま味研究の進展及び、新規うま味物質の発見には至っていない。本発明の第一の目的は、新たなうま味受容体候補遺伝子提供することで、新規なうま味物質の効率的なスクリーニング系を提供するものである。
また、グルタミン酸受容体及び消化管センサーについて多くの研究がなされているが、今日まで、グルタミン酸センサーの実体は不明であり、研究の進展は見られていない。グルタミン酸センサーを含んだ舌上皮における味覚認識及び消化管センサーに必要な受容機構（受容体、トランスポーター等）が単離されていないことが、この分野の研究の進展を妨げている。グルタミン酸消化管センサーの実体が解明されれば、下記に挙げる栄養素認識機構の調節を目的とした薬剤等の開発が可能であると考えた。
即ち、栄養素認識機構は、満足感（ｓａｔａｉｅｔｙ）あるいは飽きにも重要な役割を果たし、過食による体調不全、および偏食による摂取栄養素の偏りを是正する。この消化管における栄養素認識が正常に行われなくなると、当然ながら、消化吸収の全体のプロセスが乱れ、過食、偏食、食欲不振、消化不良、下痢、便秘等が引き起こされることが考えられる。より医学的には、心因性過食症、拒食症及び肥満症、胃酸分泌異常、消化管血流異常、消化酵素分泌異常等による消化性潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍）、ストレス性潰瘍、薬物性（ＮＳＡＩＤｓ等）急性潰瘍、虚血性潰瘍（虚血性大腸炎）、インシュリン分泌異常又は消化管ホルモン分泌異常による糖尿病、運動性機能異常による胃もたれ、むかつき、便秘、下痢、過敏性腸症候群などの要因として考えられる。
また、近年、肥満者の急増は社会現象化し、問題となっている。これらの人は基礎代謝が低下した人が多く、また過食傾向にあると言われ、これらの人の食べたいという欲求を如何にコントロールするかは社会的関心が非常に大きい。無理なダイエットを試みる人も多いが、多くの場合、失敗に終わっている。消化管における栄養素認識機構を是正し、食事による満足感を如何に正常に得るかは、これらの人にとっても非常に重要である。
本発明の第二の目的は、上記観点からなされたものであり、舌上皮及び消化管グルタミン酸センサーの実体を明らかにし、それを利用した技術を提供することを課題とする。
本発明者らは、代謝型グルタミン酸受容体（１型）の細胞内ドメインを認識する抗体を用いた免疫組織学的手法により、舌上皮及び消化管内における受容体分布を検討した。その結果、舌上皮及び、胃内粘膜層には代謝型グルタミン酸１型受容体（ＧｌｕＲ１）陽性細胞が存在すること見い出した。舌上皮では味雷中の味細胞先端部が、胃では、胃体部の粘液分泌細胞（副細胞）及びペプシノーゲン分泌細胞（主細胞）、並びに幽門部の粘液細胞がｍＧｌｕＲ１陽性であった。そして、舌上皮サンプルから新規なグルタミン酸受容体と思われるｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。このグルタミン酸受容体は、これまで実態が不明であった、新たなうま味受容体、或いは、消化管グルタミン酸センサーである可能性が高く、本受容体ｃＤＮＡ、精製受容体及び本受容体発現細胞は、うま味物質及び、消化管グルタミン酸センサーの機能調節剤のスクリーニングに有用であると考えられる。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、その要旨は以下のとおりである。
（１）下記性質を有するグルタミン酸受容体タンパク質：
（Ａ）タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有する、
（Ｂ）タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも４８１又は４０９アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。
（２）ラットの舌上皮に発現していることを特徴とする（１）のグルタミン酸受容体タンパク質。
（３）  配列番号６および８に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号７３〜７９０および７３〜４９７で表されるアミノ酸配列を有する（１）のグルタミン酸受容体タンパク質。
（４）１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含み、かつ、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得る（３）のグルタミン酸受容体タンパク質。
（５）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質をコードし、かつ、タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質を発現しないＤＮＡ。
（６）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞。
（７）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞を培地で培養し、同グルタミン酸受容体タンパク質を生成させ、前記細胞より前記グルタミン酸受容体タンパク質を採取することを特徴とする、グルタミン酸受容体タンパク質の製造法。
（８）（１）〜（４）のいずれか一項に記載のグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索方法。
（９）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することを特徴とする、グルタミン酸のアゴニストの探索方法。
（１０）前記グルタミン酸受容体タンパク質を、（６）の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる（８）の方法。
（１１）前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する（１０）の方法。
（１２）前記グルタミン酸受容体タンパク質を、（６）の細胞又は同細胞から調製される膜画分を用いる（９）の方法。
（１３）前記結合の阻害又は促進を、グルタミン酸受容体タンパク質が発生するセカンドメッセンジャーにより検出する（１２）の方法。
（１４）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質に特異的に結合する抗体。
（１５）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質と同タンパク質に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれかのグルタミン酸受容体タンパク質と被検物質とを反応させ、該反応を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストを探索する工程と、
前記ステップにより得られるグルタミン酸のアゴニストを有効成分として医薬組成物を調製する工程を含む、
グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のグルタミン酸受容体タンパク質は、典型的には、配列表の配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号１〜７１８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、配列表の配列番号４のアミノ酸配列においてアミノ酸１〜４２５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、配列表の配列番号６のアミノ酸配列においてアミノ酸１〜７９０を有するタンパク質、及び配列番号８のアミノ酸配列においてアミノ酸１〜４９７を有するタンパク質である。本タンパク質をコードするラットｃＤＮＡの塩基配列のオープンリーディング領域を配列番号１、３、５、７、９、及び１０に示す。
本発明者らはこれらグルタミン酸受容体タンパク質の変異体が舌上皮細胞から見出された味蕾型（Ｔａｓｔｅ  ｔｙｐｅ）の代謝型グルタミン酸１型受容体（ｍＧｌｕＲ１）であることから、ｍＧｌｕＲＴと命名し、さらに配列の相同性から配列番号１及び３でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴα、配列番号５及び７でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴβ、配列番号９及び１０でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴγと命名した。またｍＧｌｕＲ１においてもＣ末端のスプライシング変異により、Ａ型（ｍＧｌｕＲ１ａ）及びＢ型（ｍＧｌｕＲ１ｂ）の二種が知られているが、本発明のタンパク質においても配列番号１及び３、５及び７、９及び１０によりコードされるタンパク質がそれぞれＡ型及びＢ型に対応する変異型であるため、配列番号１でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴαａ、配列番号３でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴαｂ、配列番号５でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴβａ、配列番号７でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴβｂ、配列番号９でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴγａ及び配列番号１０でコードされるタンパク質をｍＧｌｕＲＴγｂとそれぞれ命名した。以下本発明のグルタミン酸受容体タンパク質を総称して、本明細書ではｍＧｌｕＲ１変異体と呼ぶことがある。配列番号１、３、５、７、９及び１０に示す塩基配列の上流に適当なプロモーターを連結し、適当な細胞で発現させれば、活性のあるグルタミン酸受容体を産生させることができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列と、脳においてその存在が確認されている、脳型代謝型グルタミン酸１型受容体（以下ｍＧｌｕＲ１という。）との比較を図１に示す。ｍＧｌｕＲＴαａのＣ末端側（配列番号２中、アミノ酸番号１〜７１８）はｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲＴαｂのＣ末端側（配列番号４中、アミノ酸番号１〜４２５）はｍＧｌｕＲ１ｂとそれぞれ一致していたが、ｍＧｌｕＲ１に比べてＮ末端側は４８１アミノ酸残基短かった。一方ｍＧｌｕＲＴβ及びｍＧｌｕＲＴγはそのコード領域を共にし、いずれもＡ型（ｍＧｌｕＲＴβａ及びｍＧｌｕＲＴγａ）のＣ末端側（配列番号６中、アミノ酸番号１〜７９０）はｍＧｌｕＲ１ａ、Ｂ型（ｍＧｌｕＲＴβｂ及びｍＧｌｕＲＴγｂ）のＣ末端側（配列番号８中アミノ酸番号１〜４９７）はｍＧｌｕＲ１ｂとそれぞれ一致していたが、ｍＧｌｕＲ１に比べてＮ末端側は４０９アミノ酸残基短かった。後述するように、本発明のグルタミン酸受容体タンパク質は、ｍＧｌｕＲ１と共通の遺伝子に由来するスプライシング変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であると考えられた。以下、本発明のグルタミン酸受容体タンパク質を、本明細書ではｍＧｌｕＲ１変異体と呼ぶことがある。
前記ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするｃＤＮＡ配列を、ｍＧｌｕＲ１  ｍＲＮＡ配列と比較したところ、これらは共通の遺伝子に由来することが示唆された。すなわち、ｍＧｌｕＲ１変異体は、ｍＧｌｕＲ１遺伝子中のエクソンが選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）により脱落し生じた結果であると推定される。詳細を図１に示す。脳型ｍＧｌｕＲ１はエクソン１−９から成り、サブタイプであるＡ型（ｍＧｌｕＲ１ａ）はエクソン１−７および９からなり、Ｂ型（ｍＧｌｕＲ１ｂ）はエクソン１−８からなる（図１Ａ参照）。一方、本発明のｍＧｌｕＲ１変異体のうち、ｍＧｌｕＲＴαａはエクソン５−７及び９からなり、ｍＧｌｕＲＴαｂはエクソン５−８からなり（図１Ｂ参照）、ｍＧｌｕＲＴβａはエクソン３−７および９からなり、ｍＧｌｕＲＴβｂはエクソン３−８からなり、ｍＧｌｕＲＴγａはエクソン４−７および９からなり、ｍＧｌｕＲＴγｂはエクソン４−８からなる（図１Ｃ参照）。ｍＧｌｕＲＴβを構成するエクソン３には開始メチオニンコドンがコードされていないため、ｍＧｌｕＲＴβのコード領域はエクソン４中のメチオニンから始まり、結果としてｍＧｌｕＲＴβおよびｍＧｌｕＲＴγのコード領域は共通している。ここに、エクソン１〜６は細胞外ドメイン、エクソン７は７回膜貫通ドメイン、及びエクソン８−９は細胞内ドメインにそれぞれ相当する。
図２に、ｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ１変異体の構造を示す。ｍＧｌｕＲ１は、細胞内ドメイン（エクソン１〜６）と、７回膜貫通ドメイン（エクソン７）と、細胞外ドメイン（Ａ型：エクソン９、Ｂ型：エクソン８）からなっている。ｍＧｌｕＲ１変異体も、ｍＧｌｕＲ１と同様の細胞内ドメインと７回膜貫通ドメインを有しており、ｍＧｌｕＲ１のそれらと同一の配列を有している。
なお、ｍＧｌｕＲＴαはエクソン５からスタートするので、配列番号２記載のアミノ酸配列（ｍＧｌｕＲＴαａ）は配列番号６記載のアミノ酸配列中（ｍＧｌｕＲＴβａ及びｍＧｌｕＲＴγａ）の７３〜７９０に相当し、配列番号４記載のアミノ酸配列（ｍＧｌｕＲＴαｂ）は配列番号８記載のアミノ酸配列中（ｍＧｌｕＲＴβｂ及びｍＧｌｕＲＴγｂ）の７３〜４９７に相当する。
すなわち、本発明のｍＧｌｕＲ１変異体は、タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質と共通の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有し、タイプ１型代謝型グルタミン酸受容体タンパク質よりも４０９又は４８１アミノ酸残基短い細胞外ドメインを有する。すなわち、本発明のｍＧｌｕＲ１変異体はリガンドとの作用部位である細胞外ドメインにおいてｍＧｌｕＲ１と異なるため、リガンドとの親和性においてｍＧｌｕＲ１と異なることが予想される一方、７回膜貫通型Ｇタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）のイフェクター領域である細胞内ドメインにおいてｍＧｌｕＲ１と共通するため、セカンドメッセンジャーを発生し得る、機能性受容体である。
本発明のｍＧｌｕＲ１変異体は、ラット由来のものでもよいし、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得るという性質を持つ限り、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウサギといった哺乳類や鳥類、魚類その他いかなる動物由来のｍＧｌｕＲ１変異体でもよい。ｍＧｌｕＲ１変異体を医薬組成物の成分として用いる場合には、哺乳類由来のものが好ましい。
本発明のｍＧｌｕＲ１変異体は、配列番号６に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号７３〜７９０で表されるアミノ酸配列（配列番号２に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質あるいは、配列番号８に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号７３〜４９７で表されるアミノ酸配列（配列番号４に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質に加えて、グルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得るという性質を持つ限り、配列番号２、４、６および８に示すアミノ酸配列において１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するものであってもよい。
ここで、「複数」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、配列番号２、４、６および８に示すアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上となるような数が挙げられる。より具体的には、２〜１１５個、好ましくは、２〜５８個、より好ましくは２〜３０個である。
尚、本発明のグルタミン酸受容体は、精製又は単離された形態であってもよいが、活性を必要とする場合は、適当な細胞で発現され、同細胞の膜に局在化した形態、又は、ｍＧｌｕＲ１変異体が発現した細胞から調製される膜画分に含まれる形態であることが好ましい。したがって、本発明のグルタミン酸受容体には、このようなｍＧｌｕＲ１変異体を発現している細胞又は同細胞から調製された膜画分も含まれる。
ｍＧｌｕＲ１変異体は、例えば、ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを適当な宿主細胞に導入し、発現させることによって取得することができる。前記ＤＮＡとしては、マウス等の哺乳類細胞の染色体から単離したｍＧｌｕＲ１変異体をコードする遺伝子又はｃＤＮＡが挙げられる。尚、染色体遺伝子を用いる場合は、ｍＧｌｕＲ１変異体を生成させるように、転写後のスプライシング等のプロセスを調節する必要があると考えられるため、ｃＤＮＡを用いることが好ましい。
ｍＧｌｕＲ１変異体ｃＤＮＡは、ラット等の哺乳動物の舌上皮から調製したＲＮＡを鋳型とし、例えば発明の実施の形態にに示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ｍＧｌｕＲ１変異体ｃＤＮＡを増幅することによって、クローニングすることができる。また、本発明により、ｍＧｌｕＲ１変異体の構造、特にＮ末端領域の特徴的な構造が明らかになったので、それらの構造に基づいて、ｍＧｌｕＲ１変異体ｃＤＮＡのクローニング及び同定は容易に行うことができる。こうして得られるｍＧｌｕＲ１変異体ｃＤＮＡのオープンリーディング領域塩基配列が、配列番号１、３、５、７、９および１０に示した配列である。
すなわち、本発明の別の形態は、本発明のｍＧｌｕＲ１変異体をコードするポリヌクレオチドである。本発明のｍＧｌｕＲ１変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のｍＧｌｕＲ１変異体をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであれば、脳型ｍＧｌｕＲ１をコードしない限りいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡであり、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本差の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであっても良い。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖）であってもよい。当該ポリヌクレオチドは典型的には配列番号１、３、５、７、９及び１０で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。
ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７、９及び１０に示す塩基配列以外にも、これらの塩基配列を有するＤＮＡ又は同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ましくは７５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを導入する細胞としては、ｍＧｌｕＲ１変異体の活性を必要とする場合は、動物細胞、昆虫細胞又は酵母が好ましく、動物細胞が特に好ましい。例えば、ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを導入し、一時的な機能発現が可能と考えられる細胞として、アフリカツメガエル卵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞、ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）細胞、Ｓｆ−９  ｉｎｓｅｃｔ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＯＣＡ−２細胞等が挙げられる。また、ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込み、ｍＧｌｕＲ１変異体を永久的に発現させる場合には、上記の細胞のうち、アフリカツメガエル卵母細胞以外の細胞が挙げられる。
これらの細胞にｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを導入する方法としては公知の方法を用いることができる。細胞へのＤＮＡの導入等の操作に必要な技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）等に記載されている。
一方、ｍＧｌｕＲ１変異体を、ｍＧｌｕＲ１変異体に特異的に結合する抗体を作製するための免疫源として用いる場合のように、生理活性を必要としない場合には、ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを導入する細胞は、ｍＧｌｕＲ１変異体を活性のある形態で発現しない細胞であってもよい。そのような細胞としては、エシェリヒア・コリをはじめとする異種蛋白質生産に通常用いられている微生物細胞を用いることができる。
ｍＧｌｕＲ１変異体を宿主細胞中で産生させるためには、宿主細胞に適したプロモーターおよびエンハンサー等の発現調節配列に、ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを連結する。また、ｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡは、必要に応じて、プロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含んでいてもよい。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。
上記のようにして得られるｍＧｌｕＲ１変異体をコードするＤＮＡを発現可能な形態で保持する細胞を培地で培養し、ｍＧｌｕＲ１変異体を生成させることにより、ｍＧｌｕＲ１変異体及びｍＧｌｕＲａ１変異体を保持する細胞を製造することができる。
活性なｍＧｌｕＲ１変異体、すなわちグルタミン酸が結合することによってセカンドメッセンジャーを発生し得るｍＧｌｕＲ１変異体は、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索等に利用することができる。例えば、ｍＧｌｕＲ１変異体と、ｍＧｌｕＲ１変異体に結合する物質とを被検物質の存在下で反応させ、該反応の阻害又は促進を検出することにより、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーター（以下、これらを「リガンド」と総称することがある）を探索することができる。アロステリックモジュレーターは、ｍＧｌｕＲ１変異体とグルタミン酸との結合部位以外の部位に結合し、アゴニスト又はアンタゴニストと同様の機能を示す。
また、グルタミン酸のアゴニストは、ｍＧｌｕＲ１変異体と被検物質とを反応させ、該反応を検出することによっても、探索することができる。
活性なｍＧｌｕＲ１変異体としては、ｍＧｌｕＲ１変異体を発現している細胞、又は同細胞から調製される膜画分が挙げられる。このような膜画分は、例えば、上記のように細胞に活性なｍＧｌｕＲ１変異体を発現させ、そして、細胞を超音波などで破砕後、密度勾配遠心法で膜画分を集めることにより調製することができる。
また、前記ｍＧｌｕＲ１変異体に結合する物質として、グルタミン酸もしくはグルタミン酸アゴニスト、又はｍＧｌｕＲ１に結合する公知のリガンド（例えばグルタミン酸、キスカル酸、ＣＨＰＧ，ＭＰＥＰ，ＬＹ３６７３８５等）等が挙げられる。ｍＧｌｕＲ１変異体の活性を調節する物質としては、細胞内カルシウム濃度に影響を与える薬剤（カルシウムチャンネルおよびナトリウムチャンネルオープナー、Ｎａ／Ｋポンプ阻害剤、Ｎａ／Ｃａ交換系作用剤、Ｃａ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロテインキナーゼＣ作用剤）、細胞内ｃＡＭＰ濃度に影響を与える薬剤（フォスフォジエステラーゼ作用剤、アデニレートシクラーゼ作用剤）、細胞内ｃＧＭＰ濃度に影響を与える薬剤（ｃＧＭＰ依存性フォスフォジエステラーゼ作用剤、グアニレートシクラーゼ作用剤）等が挙げられる。
ｍＧｌｕＲ１変異体と、これに結合する物質との反応の阻害又は促進は、ｍＧｌｕＲ１変異体にグルタミン酸等のリガンドが結合することによって発生するセカンドメッセンジャーを検出することによって、検出することができる。また、セカンドメッセンジャーを検出する代わりに、既知のリガンドを標識したものを用い、標識リガンドとｍＧｌｕＲ１変異体との結合を測定することによっても、前記反応の阻害又は促進を検出することができる。
また、ｍＧｌｕＲ１変異体とグルタミン酸のアゴニストとの反応は、ｍＧｌｕＲ１変異体とグルタミン酸のアゴニストとの結合により発生するセカンドメッセンジャーを検出することによって、検出することができる。
ｍＧｌｕＲ１変異体は、細胞内ドメインは脳型及び味蕾型ｍＧｌｕＲ１と同一であり、脳型及び味蕾型ｍＧｌｕＲ１の細胞内シグナル伝達機序は同じであるから、ｍＧｌｕＲ１変異体も同様であると予想される。したがって、前記セカンドメッセンジャーは、Ｇｑ（ＧＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を活性化しフォスフォリパーゼＣの活性化に伴うイノシトール三燐酸（ＩＰ３）産生に伴う、細胞内カルシウム濃度の上昇である。また、シグナル伝達におけるカルシウム変動の下流には、細胞内カルシウム依存性のプロテインキナーゼを介した遺伝子発現調節によるものと、細胞質・膜蛋白の燐酸化による急性期の機能調節がある。したがって、細胞膜フラクションの蛋白リン酸化、カルシウム依存性フォスフォジエステラーゼの活性化に伴う、細胞内ｃＡＭＰ，ｃＧＭＰ変動、チャンネル機能変化の測定等によって、カルシウム、ＩＰ３以外のセカンドメッセンジャーを検出することができる。
以下に、ｍＧｌｕＲ１変異体を用いたリガンド探索の具体的な方法を例示する。
（１）アフリカツメガエル卵母細胞に、ｍＧｌｕＲ１変異体ｃＲＮＡを発現させ、２電極ボルテージクランプ法により、細胞内カルシウム依存性クロライド電流の増強或いは減弱を指標に、ｍＧｌｕＲ１変異体に作用するリガンド検索を行う（Ｐｉｎ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２  Ｎｏｖ  １；８９（２１）：１０３３１−５；Ｋａｓａｈａｒａ  Ｊ，Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９４  Ｎｏｖ  ２１；３５５（１）：４１−４；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９３  Ｓｅｐ  １５；２６８（２６）：１９３４１−５）。
（２）ｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞又は同細胞から調製した膜画分に、リガンド候補化合物、及びｍＧｌｕＲ１に作用する既知のリガンド（例えばグルタミン酸、キスカル酸、ＣＨＰＧ，ＭＰＥＰ，ＬＹ３６７３８５等）を一定期間作用させ、ｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞の細胞膜又は膜画分に結合した既知リガンドの量を測定することにより、リガンド検索を行う（Ｎａｐｌｅｓ  ＭＡ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００１；４０（２）：１７０−７；Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｃ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｊａｎ；３６（１）：２１−３０；Ｈ．Ｉ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｓ．Ｊ．Ｅｎｎａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｋｕｈａｒ  ｅｄｓ，１９５８，Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。既知リガンドの量は、それらの物質の一部を放射活性ラベルし、細胞膜又は膜画分に結合する放射活性の量により、測定することができる。
（３）ｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞に、あらかじめカルシウム感受性色素（例えばＦｕｒａ−２、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３等）を導入し、リガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞を一定期間接触させたときの蛍光強度比（細胞内カルシウム濃度）変化を指標として、リガンド検索を行う。あるいは、ｍＧｌｕＲ１変異体アゴニストと、リガンド候補化合物と、カルシウム感受性色素を導入したｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞とを一定期間接触させたときの蛍光強度比（細胞内カルシウム濃度）変化により、リガンド検索を行う。
（４）ｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞に、あらかじめｃＡＭＰ感受性蛍光蛋白質（例えばＦｌＣＲｈＲ等）を導入し、リガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞を一定期間接触させたときの蛍光強度比（細胞内ｃＡＭＰ濃度）変化を指標として、リガンド検索を行う（Ａｄａｍｓ  ＳＲ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１  Ｆｅｂ  ２１；３４９（６３１１）：６９４−７）。
（５）リガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞を一定期間接触させたとき、あるいは、ｍＧｌｕＲ１変異体作動薬とリガンド候補化合物とｍＧｌｕＲ１変異体発現細胞を一定期間接触させたときのプロトン産生量をサイトセンサーにより測定し、プロトン産生量を指標としてリガンド検索を行う（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ＨＭ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２  Ｓｅｐ２５；２５７（５０７８）：１９０６−１２）。
上記のようにして検索されるグルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを有効成分として含む食品添加物は新規うま味調節物質として使用ができる。また、上記のようにして検索されるグルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを有効成分として含む医薬組成物は、グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合することにより発生するセカンドメッセンジャーを調節するための医薬として使用することができる。セカンドメッセンジャーを調節することによって、グルタミン酸受容体異常に起因する疾患、病態を改善、予防することができる。
グルタミン酸受容体異常に起因する迷走神経制御異常としては、求心路異常（栄養素認識障害）と遠心路異常がある。求心路異常に起因する疾患又は病態としては、過食症、拒食症及び肥満症等が挙げられる。また、遠心路異常に起因するものとしては、胃酸分泌異常、消化管血流異常、消化酵素分泌異常等による消化性潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍）、ストレス性潰瘍、薬物性（ＮＳＡＩＤｓ等）急性潰瘍、虚血性潰瘍（虚血性大腸炎）、インシュリン分泌異常又は消化管ホルモン分泌異常による糖尿病、過食症、拒食症、肥満症、及び、運動性機能異常による胃もたれ、むかつき、便秘、下痢、過敏性腸症候群などが挙げられる。
ｍＧｌｕＲ１変異体を免疫源として用いることにより、ｍＧｌｕＲ１変異体に特異的に結合する抗体を作製することができる。特に、ｍＧｌｕＲ１変異体はＮ末端が新規なアミノ酸配列を有しているので、この部分をエピトープとする抗体、特にモノクローナル抗体は、ｍＧｌｕＲ１変異体に結合し、他のグルタミン酸受容体には結合しないと予想される。さらに、３次元構造予測から新規のＮ末細胞内ドメイン（細胞表面露出部分）のアミノ酸残基を推定することにより、ｍＧｌｕＲ１変異体特異的抗体を作ることが可能である。ｍＧｌｕＲ１変異体に特異的な抗体は、ｍＧｌｕＲ１変異体特異的な免疫染色等に用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．  ラット有郭乳頭からの新規な代謝型グルタミン酸受容体ｃＤＮＡのクローニング
１６週齢のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット１０匹分の有郭乳頭由来の全ＲＮＡを抽出し逆転写反応によりｃＤＮＡを得た（使用キット  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）。ｍＧｌｕＲ１の全長をコードするｃＤＮＡを鋳型とし、Ｚ−ＴａｑによってＰＣＲを行った。この酵素は３’側の複製効率がよくその後のＴＯＰＯ  ＴＡクローニングリアクションに適している。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルで電気泳動し、それらの配列はＡＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００（ＡＢ１社）で解析した。
有郭乳頭より見出された６種類のｍＧｌｕＲ１変異体ｃＤＮＡ（ｍＧｌｕＲＴαａ、ｍＧｌｕＲＴαｂ、ｍＧｌｕＲＴβａ、ｍＧｌｕＲＴβｂ、ｍＧｌｕＲＴγａ、ｍＧｌｕＲＴγｂ）には５’側にユニークな配列が存在しその部分にはｓｔｏｐコドンがある。その上流は既知の物と同一であり、それらはＡ型或いはＢ型のｍＧｌｕＲ１の配列に酷似していた。このユニークな部分は翻訳されていないので、アミノ酸の配列は６種類のｍＧｌｕＲ１変異体ｃＤＮＡのいずれもｍＧｌｕＲ１のアミノ酸配列の一部と同一であるが、鎖長は短い。
６種類のｍＧｌｕＲ１変異体ｃＤＮＡに特異的な  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒｓをＨｏｋｋａｉｄｏＳｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅで作製し（使用したプライマーは表１に示す）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒｓは脳のタイプのｍＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅから以下のものを作った（Ｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７６０，１９９１）（ｍＧｌｕＲ１−４２５３Ｒ  ５’−ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  Ａ−３’（配列番号１７），ｍＧｌｕＲ１−４１９８Ｒ  ５’−ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号１８）：Ａタイプ用とｍＧｌｕＲ１−３２６６Ｒ  ５’−ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＡ−３’（配列番号１９）：Ｂタイプ用）。
１５０ｎｇのｃＤＮＡを鋳型とし１０μＭ  ｆｏｒｗａｒｄとｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ，１０ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ，２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２．５ｍＭ  ｄＮＴＰをミックスし０．２５ｕｎｉｔｓのＺ−Ｔａｑ酵素を入れトータル１０μｌとした。  ＰＣＲの条件はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００：９４℃→２０ｓｅｃｏｎｄｓ，５６℃→１ｍｉｎｕｔｅ，６８℃→３ｍｉｎｕｔｅｓを３０サイクル行い  最後に１０ｍｉｎｕｔｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ→６８℃した。更に２ｎｄ．ＰＣＲを行い、得られたテンプレートをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターでクローニングを行った．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｌｏｎｅｓはｃｏｌｏｎｉ  ＰＣＲを行いｐｌａｓｍｉｄｓはＨｉｓｐｅｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ−ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）で精製し機能解析を行った。
その結果、配列番号１，３，５，７，９及び１０記載の新規なｃＤＮＡが見出された。得られたクローンは、新規な細胞外ドメインを有するｍＧｌｕＲ１のスプライシング変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であることが示された。
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2003068818.tif 000003
実施例２．  免疫染色手法によるグルタミン酸受容体局在の同定
＜１＞ラット舌の切片標本の作製
ラット（Ｗｉｓｔａｒ系、雄、１０〜１５週齢）をエーテル麻酔下で心臓右心耳を切開して放血し、その後すぐ舌部位を採材した。
切り出した舌標本は４％パラホルムアルデヒド（４℃）で一昼夜振蕩し、浸漬固定した。その後２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ−ＰＢＳに３〜４日浸漬して凍結保護（Ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）した後、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ□（ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に包埋し、クリオスタットで５−７μｍに薄切した。切片は室温にて乾燥させた後、染色に用いるまで４℃で保存した。
＜２＞抗代謝型グルタミン酸受容体１型抗体による免疫染色
切片の免疫染色は、Ｄｒｅｎｇｋ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．７８：１０９−１１２，２０００、及びＭｉａｍｐａｍｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．７７：１４０−１５１，１９９９に記載の方法に準じて行った。切片はまずＰＢＳで洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼによる反応を阻止するために、３％過酸化水素・メタノールで１５分処理した。次に、切片をＰＢＳで洗浄した後、１０％正常馬血清を含む１％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を用いて１時間ブロッキングを行った。再びＰＢＳで洗った後、１％正常馬血清を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した一次抗体（ａｎｔｉ−ｍＧｌｕＲ１ａ，ｒａｂｂｉｔ，ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ｃａｔ＃ＡＢ１５５１）を４℃で２晩反応させた。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した２次抗体（ａｎｔｉ−ｍＧｌｕＲ１ａ，ｒａｂｂｉｔ，ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ｃａｔ＃ＡＢ１５５１）を室温で１時間反応を行った。最後にＶｅｃｔｏｒｓｔａｉｎ  ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いてＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）反応を行い、０．０２５％ジアミノベンチジン−０．２５％塩化ニッケル−０．０１％Ｈ２０２で発色させた。反応終了後、切片をＰＢＳで洗い、エタノール・キシレンで脱水、封入の後、顕微鏡にて観察した。一次抗体を用いないものをネガティブコントロールとした。
＜３＞結果
免疫染色の結果を図３に示す。舌標本では抗ｍＧｌｕＲ１抗体で味細胞が染色された（図３Ａ）。味細胞にｍＧｌｕＲ１受容体は発現されていないと一般的に考えられている。したがって、ｍＧｌｕＲ１変異体は、味細胞に発現していると考えられ、機能的にはうま味受容との関連が示唆された。胃標本（図３Ｂ）では抗ｍＧｌｕＲ１によりそれぞれ、幽門部粘液産生細胞、胃体部主細胞、副細胞が染色された。これらの細胞には、ｍＧｌｕＲ１受容体は発現していないと一般的に考えられている。したがって、ｍＧｌｕＲ１変異体は、粘液産生細胞、主細胞に発現していると考えられ、機能的には粘液分泌、消化酵素分泌との関連が示唆された。
実施例３．  ｍＧｌｕＲ１変異体の機能の推定
ラット（Ｗｉｓｔａｒ系、雄、８〜１０週齢：日本チャールズリバー）を１８時間絶食後、ウレタン麻酔（１ｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）下に開腹し、実態顕微鏡下で迷走神経胃枝を５ｍｍ前後剥離した。迷走神経束を切断後、小型オペ台（８×６ｍｍ）上に迷走神経束をのせて、周囲の脂肪及び結合組織を注意深く剥離し、その臓器側末端繊維を記録用のプラチナ製双極電極に載せ、流動パラフィン・ワセリン（１：１）混合液で周囲組織と絶縁した。また、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、味の素株式会社製）の投与ルートとして、経口で胃内にシリコンチューブを留置した。
神経活動電位は、微小電位増幅器（ＷＰＩ社製ＤＡＭ−８０）により１００００倍に増幅し、ベッセルフィルター（４−ｐｏｌｅ，Ｈｉｇｈ  Ｃｕｔ  １０Ｈｚ，Ｌｏｗ  Ｃｕｔ  １ＫＨｚ）によりノイズを低減させた後、Ａ／Ｄ変換（Ｐｏｗｅｒｌａｂ  ４ｓｐ，ＡＤＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）後、コンピュータに取り込んだ（ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｒａｔｅ  ３ＫＨｚ，ｉＢｏｏｋ）。同時に、増幅信号をオシロスコープでモニタしながらウィンドー・ディスクリミネータ（ダイヤメディカル社製ＤＳＥ−４３５）によりノイズ成分と神経信号成分を分離し、スパイクカウンター（Ｓｐｉｋｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ダイヤメディカル社製ＤＳＥ−３３５Ｐ）で５秒積算後、チャートレコーダ（日本光電製ＷＴ−４６５Ｇ）で記録した。スパイク波形の解析は、ＳＨＥソフトウエア（ＡＤＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いた。
結果を図４に示す。胃内にＭＳＧ  １５０ｍＭを投与した時の迷走神経胃枝の求心活動は亢進した。迷走神経求心路は内臓感覚、特に、胃および腸からの栄養情報を延髄孤束核に送り込み、満足感、不快感などの食後感覚、及び迷走神経遠心路調節による消化調節を行うシグナル伝導路と考えられている。したがって、ＭＳＧの消化管内投与により迷走神経求心路活動が亢進したことは、ＭＳＧがそのシグナル発生要因であり、消化管内腔に発現しているｍＧｌｕＲ１変異体が、そのシグナル発生を仲介している可能性を示している。
実施例４．  ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＧｌｕＲ１変異体の組織における発現
Ｗｈｏｌｅ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
有郭乳頭と脳のＴｏｔａｌ  ＲＮＡをトランスクリプターゼにより逆転写したｃＤＮＡを使用した。１ｓｔＰＣＲのＰｒｉｍｅｒはｍＧｌｕＲ１−７９０−１Ｆ（Ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号１３）とｍＧｌｕＲ１−４２５３Ｒ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）（配列番号１７）及びＺ−Ｔａｑにより３０ｃｙｃｌｅのＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を１０倍希釈した物を２ｎｄ  ＰＣＲのテンプレートとした。２ｎｄ  ＰＣＲのｐｒｉｍｅｒ  はｍＧｌｕＲＴαについてはｍＧｌｕＲ１−７１８−３Ｆ（Ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＧＧＧ−３’）（配列番号１２）およびｍＧｌｕＲ１−３２６６Ｒ（Ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＡ−３’）（配列番号１９）を用い、ｍＧｌｕＲＴβについてはｍＧｌｕＲ１−７９０−２Ｆ（Ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号１４）とｍＧｌｕＲ１−４１９８Ｒ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）（５’−ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  Ｃ−３’）（配列番号１８）を用いた。及びＺ−Ｔａｑにより同じく３０ｃｙｃｌｅで行った。得られたＰＣＲ産物はＡＢＩ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００で確認済みである。尚、使用したＰＣＲの機種はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００である。この結果、ｍＧｌｕＲＴαについては１７６０ｂｐ（Ａ型）及び１９００ｂｐ（Ｂ型）付近にバンドが確認され、ｍＧｌｕＲＴβｂについては２０００ｂｐ付近にバンドが確認され、有郭乳頭においてその発現が確認された（図５Ａ及び５Ｂ）。
実施例５．
機能解析
卵母細胞の単離（Ｏｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）
アフリカツメガエル卵母細胞発現系をラット有郭乳頭由来ｍＧｌｕＲ１  ｍＲＮＡの機能解析に用いた。
メスのアフリカツメガエル（ワタナベ増殖より購入）は、卵母細胞を単離するまで魚水槽にて飼育した。アフリカツメガエルは脱イオン化水中、濃度１ｇ／Ｌにて溶解し、ＮａＨＣＯ３（５００ｍｇ／Ｌ）にて緩衝したトリカインメタンスルフォン酸塩（ＭＳ２２２、シグマ）で麻酔した。手で解剖し、ステージＶ及びＶＩの卵母細胞を卵巣から回収し、０．２％コラーゲナーゼＳ−１（新田ゼラチン）溶液中で解離するまでインキュベートした（３０分〜１時間）。コラーゲナーゼ処理後、卵母細胞を洗浄し、濾胞を除去し、顕微鏡下で選別し、１８℃にて１晩インキュベートした。
代謝型グルタミン酸ｃＲＮＡの調整（Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃＲＮＡ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）
変異型ｍＧｌｕＲ１  ｃＤＮＡはラット脳及び味覚乳頭全ＲＮＡから以下のプライマー（ｍＧｌｕＲＴβ：１ｓｔ  ＰＣＲ：ｍＧｌｕＲ１−７９０−１Ｆ  ５’−ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ−３’（配列番号１３）ｍＧｌｕＲ１−４２５３Ｒ  ５’−ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  Ａ−３’（配列番号１７）、２ｎｄ  ＰＣＲ：ｍＧｌｕＲ１  ７９０−２Ｆ  ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧ−３’（配列番号１４）；ｍＧｌｕＲ１  ４１９８  ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号１８）、ｍＧｌｕＲＴγ  ：１ｓｔ  ＰＣＲ：ｍＧｌｕＲ１−１５９９−２００Ｆ  ５’−ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＡＧＴ  ＣＧＧ  ＴＣ−３’（配列番号１５）ｍＧｌｕＲ１−４２５３Ｒ  ５’−ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  Ａ−３’（配列番号１７）２ｎｄ  ＰＣＲ：ｍＧｌｕＲ１−１５９９−２２１Ｆ  ５’−ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  Ｃ−３’（配列番号１６）ｍＧｌｕＲ１  ４１９８  ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号１８））及び校正酵素Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により構築した。このポリメラーゼはＰＣＲ断片中に平滑末端を残すため、ＰＣＲ増幅ｍＧｌｕＲＴβａとｍＧｌｕＲＴγａ鋳型ＤＮＡをＴＯＰＯ−ＴＡクローニング反応によりｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ／ｍＧｌｕＲＴγベクターはＥｃｏＲＶ、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ／ｍＧｌｕＲＴβベクターはＸｂａＩにより直線化し、フェノール−クロロホルム混合液により抽出し、酢酸ナトリウムと共にエタノールで沈殿した。シークエンス解析後、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯプロモーターに結合する、Ｓｐ６プロモーター用のＡｍｂｉｏｎ社製転写キット（ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ｋｉｔ）を用い、ｃＲＮＡを調製した。簡略には、約１μｇの直鎖状鋳型ＤＮＡを２μＬ酵素混合液（１０μＬ  ２ＸＮＴＰ／Ｃａｐ及び１０ｘｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒにより最終濃度２０μＬ  ｖｏｌｕｍｅとする。）により転写する。反応液はｃＲＮＡ合成のため、３７℃にて３時間インキュベートし、残った鋳型ＤＮＡは１μＬ  ＤＮａｓｅ  １を１５分間添加し、分解した。転写物はフェノール・クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿により精製した。ｃＲＮＡはジエチルピロカルボン酸処理水中で再構成し、卵母細胞への注入前にＵＶ照射下で定量した。
ｃＲＮＡ  注入  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
回収後２４時間で、透明な動物極及び植物極を有する健康なアフリカツメガエル卵母細胞に、直径１２μｍの標準径ガラスキャピラリーチューブ２５ｎＬあたり１００ｎｇのｍＲＮＡを注入した（マイクロインジェクター、ＷＰＩ）。２ｍＭピルビン酸及び０．５ｍＭテオフィリンを添加したＭＢＳ溶液［８８ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＫＣｌ，２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．３３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２，０．９１ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５］中で、７２時間インキュベートした後、卵母細胞は電気生理学的アッセイに用いた（Ｓａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）。
膜電流測定法
卵母細胞の膜電流測定はＧｅｎｅｃｌａｍｐ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い２電極膜電位固定法により測定した。測定に用いるガラス微小電極はプーラー（Ｓｈｕｔｔｅｒ社）で作成し、３Ｍ  ＫＣＬ充填時の電極抵抗が１−３ＭΩのものを用いた。処置した卵母細胞を測定用チャンバーに移し、実体顕微鏡下にガラス電極を挿入後、−７０ｍＶに電位固定下にグルタミン酸刺激時のカルシウム依存性クロライド電流を測定した。実験はラットｍＧｌｕＲ１変異体を発現卵母細胞および非発現卵母細胞の両者で行った。
ｍＧｌｕＲＴβａを発現させた卵母細胞の膜電流測定記録結果を図６に示した。測定バス内をメディウムから５０ｍＭグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）を含んだメディウムに置換すると、持続的な内向き電流が惹起され、この内向き電流は再度メディウム置換により消失することが確認できた。これは、本受容体にグルタミン酸が作用し、細胞内情報伝達系を介したカルシウム依存的クロライドチャンネルが活性化された結果、内向き電流として測定されたものと考えられる。また、同様の内向き電流はｍＧｌｕＲＴγａ発現卵母細胞においても観察された。なお、ここには示していないが、ｃＲＮＡをインジェクションしていない卵母細胞ではこのような反応は認められなかった。これより、本発明のクローニング遺伝子産物であるｍＧｌｕＲ１変異体にはグルタミン酸受容を行い、細胞内カルシウム動因を引き起こす作用があることが証明された。同様の手順に従い、ｍＧｌｕＲＴαについてもリガンド作用を確認することができ、また、アゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターを探索することができる。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規な代謝型グルタミン酸受容体が提供される。本グルタミン酸受容体は、グルタミン酸のアゴニストもしくはアンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターの探索に用いることができる。また、新規うま味物質としての食品添加物として、また、消化管における代謝異常による疾患、症状を改善する医薬として用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ１変異体（ｍＧｌｕＲＴα、ｍＧｌｕＲＴβおよびｍＧｌｕＲＴγ）のスプライシングの概要を示す図である。
図２はｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ１変異体（ｍＧｌｕＲＴα、ｍＧｌｕＲＴβおよびｍＧｌｕＲＴγ）の構造の概要を示す図である。
図３Ａはラット味蕾（有郭乳頭）の抗ｍＧｌｕＲ１抗体による免疫染色の結果を示す図である。
図３Ｂはラット胃の抗ｍＧｌｕＲ１抗体による免疫染色の結果を示す図である。
図４は迷走神経胃枝求心性神経活動に対するＬ−グルタミン酸の作用を示す図である。横軸は時間。縦軸は神経活動を表す。
図５はＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＧｌｕＲ１変異体をコードするヌクレオチドの組織における発現を確認した図である（図５Ａ：ｍＧｌｕＲＴα、図５Ｂ：ｍＧｌｕＲＴβ）。味蕾においてｍＧｌｕＲ１変異体が発現していることが確認された。
図６はアフリカツメガエル卵母細胞にｍＧｌｕＲ１変異体を発現させ、グルタミン酸ナトリウムを作用させた際の膜電流変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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