(57)【要約】本発明の課題は、判定操作が容易で測定感度も良好な簡易型の、目視判定可能なＡＴＰ測定用試薬を提供する。本発明は、試料中に含まれるＡＴＰと、試薬中に含まれるアセチルリン酸に、試薬中に含まれるグルコキナーゼとアセテートキナーゼを併用して、グルコースからグルコース−６−リン酸の生成する反応を増幅し、さらにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼを組み合わせて目視可能な呈色反応へと導き、目視判定を可能としたＡＴＰ測定用試薬。
2003044222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＡＴＰ量に応じて、アセチルリン酸およびグルコースの存在下、アセテートキナーゼおよびグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼの二つの酵素からなる共役酵素反応系が作用することによりグルコース−６−リン酸を生じせしめ、引き続いて、生成したグルコース−６−リン酸に応じて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および色原体の存在下、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼまたは電子伝達物質の二つの酵素または一つの酵素と一つの電子伝達物質からなる共役酵素反応系が作用することにより色素を生じせしめ、生成した色素を定量することにより試料中のＡＴＰ量を測定することを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定方法。
【請求項２】
アセチルリン酸およびグルコースならびにアセテートキナーゼおよびグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼの二つの共役酵素からなり、試料中のＡＴＰ量に応じてグルコース−６−リン酸を生じせしめる試薬と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および色原体ならびにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼまたは電子伝達物質の二つの共役酵素または一つの酵素と一つの電子伝達物質からなり、グルコース−６−リン酸に応じて色素を生じせしめる試薬とからなることを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定試薬。
【請求項３】
請求項１に記載の測定方法において、判定精度を高めるために色原体としてジクロロフェノールインドフェノールおよびテトラゾリウムまたはその塩の２種類およびもともとの溶液を着色させておくための色素を共存させることを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定方法。
【請求項４】
請求項２に記載の測定試薬において、色原体としてジクロロフェノールインドフェノールおよびテトラゾリウムまたはその塩の２種類およびもともとの溶液を着色させておくための色素を共存させることを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定試薬。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載の測定方法に、酵素の化学修飾剤またはアセチルリン酸の分解促進剤の少なくとも一方を共存させ、反応を停止させることを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定方法。
【請求項６】
請求項２または請求項４に記載の測定試薬に、酵素の化学修飾剤またはアセチルリン酸の分解促進剤の少なくとも一方を共存させることを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定試薬。
【発明の詳細な説明】
＜技術分野＞
本発明は、ＡＴＰを測定するための方法および試薬に関するものであり、さらに詳しくは、判定操作が容易で測定感度も良好な簡易型の目視判定可能なＡＴＰ測定方法および測定用試薬に関するものである。
＜背景技術＞
ＡＴＰは高エネルギー化合物であり、多くの生物体のエネルギー代謝に関与していることから、ＡＴＰの測定は生物活性の指標として利用されている。具体的に、ＡＴＰの測定は、生細胞数、細胞の代謝変化、食品の成熟度や腐敗度などを含む食品の品質の管理、水質浄化での水質チェックなど様々な指標として用いられている。
従来から、ＡＴＰを測定する方法として、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる方法が、１９８５年のアナリティカル・バイオケミストリー誌１４６巻１１８頁や１９８５年のアナリティカル・バイオケミストリー誌１４５巻９頁などに記載されている。
酵素反応を利用してＡＴＰを測定する方法として、ホタル由来のルシフェラーゼと発光基質であるルシフェリンがＡＴＰ存在下で反応して発する光をルミノメーターなどで測定する生物発光法（ＵＳＰ５９０５０２９、特開平６−１２９９８８号など）、ヘキソキナーゼとピルベートキナーゼを併用して反応を増幅し、最終的にイソルミノールを使用した化学発光によりＡＴＰを定量する方法（特開昭６４−２３９００号など）、ＡＴＰ関連化合物を含む溶液にヌクレオシドホスホリラーゼとキサンチンオキシダーゼを加え、反応で生じる過酸化水素を定量する方法（特開昭６３−１１８４８号など）などが知られている。
さらに、ＡＴＰの分解物であるＡＤＰを酵素的に測定する方法として、ＡＤＰをリン酸化合物の存在下、キナーゼの作用でＡＴＰへと変換し、この反応でリン酸化合物から生じる脱リン酸化合物をＮＡＤの存在下、デヒドロゲナーゼの作用で酸化し、このとき生じるＮＡＤＨをジアホラーゼの反応で測定するなどの方法も知られている（ＵＳＰ４９２３７９６など）。
また、目視判定の可能性のある呈色反応によるＡＴＰの測定方法としては、ＡＴＰに、ＡＴＰ分解酵素を作用させ、生じたリン酸とモリブデンとの反応により生じるモリブデン青を測定する方法（特開平４−３６０７００号など）、ＡＴＰを含む溶液に、ニコチン酸アミドモノヌクレオチドとアデニリルトランスフェラーゼを作用させ、生じたＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と、還元型ＮＡＤを補酵素とする補酵素サイクリング反応を行い定量に結びつける方法（特開昭５９−１６６０９９号など）、ＡＴＰに、ＡＭＰ、グルコース−６−リン酸と、アデニレートキナーゼ、グルコキナーゼによる増幅反応を行い、生じたグルコースを呈色反応へと導く方法（ＵＳＰ６０４３０４７など）などが知られている。
これとは別に、ジアホラーゼなどを用いた呈色反応において目視判定の精度を高めるために、色原体であるテトラゾリウムを複数同時に用いて多色を実現した例が知られている（日本特許１７８２３５９号、特開昭６２−２３９０５４号など）。しかし、これらはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドそのものやグルコースを被測定物質として考えられており、被測定物質１分子に対して色原体１分子が色素へと変化するのみである。このことより、被測定物質の測定可能な濃度範囲は、被測定物質の測定試薬溶液中の濃度に限定される。被測定物質の濃度範囲は測定試薬中において自ずと制限があり、実用には向かないものであった。
高速液体クロマトグラフィーやルミノメーターを用いる方法では、基本的に測定装置を用いた測定方法であるため、実際の現場では、測定装置が高価なこともあり、測定装置を必要としない判定操作が容易な目視判定可能なＡＴＰ測定試薬が望まれていた。
また、目視判定の可能性のある呈色反応によるＡＴＰの測定方法のうち、モリブデン青を測定する方法では、ＡＴＰを直接測定せず、ＡＴＰを分解して生じるリン酸を測定している。このため、生体などに由来するＡＴＰとは関係ないリン酸等を測定してしまう可能性が高い。リン酸は様々な合成品にも多く含まれるものである。
また、ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と、還元型ＮＡＤを補酵素とする補酵素サイクリング反応を行い定量に結びつける方法では、ＮＡＤが存在しない系に添加されたＡＴＰをＮＡＤに変換し、ＮＡＤと還元型ＮＡＤとのサイクリング反応により増幅を行っている。この場合、被測定試料は主に生物由来であるため、その試料中に含まれるＮＡＤや還元型ＮＡＤのコンタミネーションが避けられず、これがサイクリング反応を引き起こして大きなノイズとなり、ＡＴＰの測定に多大な支障をきたす可能性が非常に高い。このように、予想される様々なノイズを考えた場合、ＡＴＰを直接反応に取り込んで測定することが是非とも必要であると考えられる。
ＡＴＰに、ＡＭＰ、グルコース−６−リン酸と、アデニレートキナーゼ、グルコキナーゼによる増幅反応を行う、ＡＴＰを直接反応に取り込む方法では、グルコキナーゼの本来の触媒反応の方向ではない逆方向のグルコース−６−リン酸からグルコースへの脱リン反応を応用している。この逆反応は順反応に比べて小さなものである。一般的にＡＤＰからＡＴＰへの反応は非常に起こりにくいと考えられているため、この反応系を実施するためには、グルコキナーゼの使用量が莫大になることが予想される。グルコキナーゼのようなＡＴＰと反応する酵素には、ごく微量のＡＴＰが混在することが一般に知られており、本発明のような特に微量のＡＴＰを測定することが目的の場合、混在するＡＴＰがごく微量であるといえども測定に多大な影響を与えることが容易に考えられる。
本発明は、高速液体クロマトグラフィーやルミノメーターなどの高価な測定装置を必要とせずに目視判定ができ、かつＡＴＰを直接取り込み、グルコキナーゼの順反応を利用してＡＴＰを測定することで感度が良好なＡＴＰ測定方法および試薬を提供することを目的とするものである。
＜発明の開示＞
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アセテートキナーゼおよびグルコキナーゼ（またはヘキソキナーゼ）の二つの酵素からなる共役酵素反応系と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼの二つの酵素からなる共役酵素反応系とを組合わせることにより目視可能な呈色反応へと導くことができることを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明の第一は、試料中のＡＴＰ量に応じて、アセチルリン酸およびグルコースの存在下、アセテートキナーゼおよびグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼの二つの酵素からなる共役酵素反応系が作用することによりグルコース−６−リン酸を生じせしめ、引き続いて、生成したグルコース−６−リン酸に応じて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および色原体の存在下、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼまたは電子伝達物質の二つの酵素または一つの酵素と一つの電子伝達物質からなる共役酵素反応系が作用することにより色素を生じせしめ、生成した色素を定量することにより試料中のＡＴＰ量を測定することを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定方法を要旨とするものである。
本発明の第二は、アセチルリン酸およびグルコースならびにアセテートキナーゼおよびグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼの二つの共役酵素からなり、試料中のＡＴＰ量に応じてグルコース−６−リン酸を生じせしめる試薬と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および色原体ならびにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼまたは電子伝達物質の二つの共役酵素または一つの酵素と一つの電子伝達物質からなり、グルコース−６−リン酸に応じて色素を生じせしめる試薬とからなることを特徴とする目視判定可能なＡＴＰ測定試薬を要旨とするものである。
本発明の第三は、上記の第一の発明、第二の発明をさらに実用的にするために、上記の反応系において、色原体であるテトラゾリウムを複数同時に用いることによって、試薬のＡＴＰに由来する発色を多色にすること可能とした目視判定可能なＡＴＰの測定方法ならびに色原体を複数含む目視判定可能なＡＴＰ測定試薬を要旨とするものである。
本発明の第四は、上記の第一の発明、第二の発明、および第三の発明をさらに実用的にするために、上記の反応系を含む試薬中に反応停止薬を共存させることにより、一定時間後に第一の発明および第二の発明に記載の共役反応を停止させ、一定した時間の後に判定する必要のあった第一の発明、第二の発明、および第三の発明に記載の測定方法に対し、判定までの反応時間を例えば５分から２時間の間であれば何時でも同じ判定結果が得られるような機能を付加した目視判定可能なＡＴＰの測定方法、ならびに試薬中に反応停止薬を共存させた目視判定可能なＡＴＰの測定試薬を要旨とするものである。
＜発明を実施するための最良の形態＞
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で利用する呈色反応は図１に示した以下の二つのサイクリング反応が起こる共役酵素反応系の組み合わせに基づくものである。
まず、試料中に含まれるＡＴＰは、試薬中のグルコキナーゼの反応で、グルコースをリン酸化してグルコース−６−リン酸を生じせしめ、ＡＤＰへと変化する。さらに、このＡＴＰより生じたＡＤＰはアセチルリン酸の共存下で、アセテートキナーゼの反応によりＡＴＰへと再生される。このように、グルコース、グルコキナーゼ、アセチルリン酸、アセテートキナーゼが共存する系に、微量でもＡＴＰもしくはＡＴＰの分解物であるＡＤＰが添加されることで、添加されたＡＴＰもしくはＡＤＰの量に依存した速度で、グルコースまたはアセチルリン酸が全て消費され尽くすまで連続的にグルコース−６−リン酸が生成し続ける。
さらに、生じたグルコース−６−リン酸を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略記する）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰと略記する）の共存下、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの反応で酸化してグルコン酸−６−リン酸に変換し、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略記する）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略記する）へと還元せしめる。生じたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、ジアホラーゼの反応で、色原体を還元して呈色へと導き、ＮＡＤまたはＮＡＤＰに再生される。このように、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、色原体、ジアホラーゼが共存する系により、生じたグルコース−６−リン酸は色素を生ぜしめ呈色を導く。
このように、本発明において用いられる反応原理は、グルコース、グルコキナーゼ、アセチルリン酸、アセテートキナーゼが共存する系にＡＴＰが添加されることで、サイクリング反応がおこり、添加されたＡＴＰの量に応じた速度でグルコース−６−リン酸が生成し、次いで生成したグルコース−６−リン酸は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、色原体、ジアホラーゼが共存するサイクリング反応系へ供給され色素を生じせしめて呈色へと導くことによるものである。
この呈色の速度は、結局のところ添加されたＡＴＰの量に依存することから、この呈色を一定時間で観察することで、添加されたＡＴＰを定量的に測定できることになる。また、呈色反応であるため、目視判定も実施できるものである。
なお、この反応原理に類似した反応系として、グルコースの定量を目的としたものが知られている（特開平１０−３３１９６号、特開平１１−２５３１９３号）。これらは、グルコースを、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ、テトラゾリウムと、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼを含む反応系による呈色反応で測定している。この反応系においてグルコースとＡＴＰとを単純に置き換えただけでは、マイクロモル量からミリモル量のＡＴＰが存在してかろうじて呈色が観察されるようなものである。本発明が測定しようとするＡＴＰは、生細胞数、細胞の代謝変化、食品の成熟度や腐敗度などを含む食品の品質の管理、水質浄化での水質チェックなど様々な指標として用いられている極微量のＡＴＰであり、求められる測定方法には、ＡＴＰの量として、少なくとも１ナノモル量が充分測定できる感度が必要である。これは、用いられている酵素のミカエリス定数Ｋｍなどのパラメーターから予想される、反応を実施し得るに必要な量の１千分の１以下の量でしかなく、したがって、これより呈色に導くためには、少なくとも１千倍以上のＡＴＰの増幅が必要と考えられる。
また、バイオリアクターを用いて、ＡＴＰをサイクリング反応により再生産して、グルコースよりグルコース−６−リン酸を生成させる方法は、１９９１年の成書「エンザイム・イン・カーボハイドレート・シンセシス」第９章１１１頁―１２０頁（米国化学会、ＡＣＳシンポジウム・シリーズＮｏ．４６６の再掲載）や１９８６年の澱粉科学誌３３巻２１８頁などに記載されている。しかし、これらの方法は、ミリモル量からモル量のレベルでのＡＴＰの増幅反応であり、本発明のようなナノモル量のレベルの増幅とはまったく異なるものである。また、ＡＴＰのサイクリングについても、数時間かけて１００回程度のサイクリングを実施しているものであり、本発明のように数分間で１千倍以上の増幅が求められるものとは、まったく異質のものである。
本発明の測定方法の使用に際しては、上記した二つのサイクリング反応が同時に進行し色素の呈色を判定できる状態であればいかなる形態でも構わない。例えば、アセチルリン酸、グルコース、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼ（またはヘキソキナーゼ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、色原体を含む緩衝液とすることが挙げられる。この緩衝液に、ＡＴＰを含む試料を滴下し、呈色を観測することで試料中のＡＴＰを測定することが出来る。緩衝液の種類や濃度に関しては反応を阻害しない限り特に限定は無い。
また、好ましくは、アセチルリン酸、グルコース、ＮＡＤまたはＮＡＤＨ、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼ（またはヘキソキナーゼ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、色原体並びにＡＴＰは、反応時に同時に同一の溶液中に存在するのがよく、反応まではその形体に特に限定は無く、それぞれ個別に、または同一に、または幾つか組み合わされて溶液状態、粉末状態、試験紙や不織布などに含浸された状態、さらには試験紙や不織布上で乾燥された状態等でも良い。
さらに、本発明はその性質上、生体試料を用いることが多い。例えば、グルコース、ＮＡＤ、各種酵素などは、比較的高濃度で生体試料中に含まれることが多く、見かけ上、このような構成成分を含まない測定試薬の構築も可能である。しかし、本発明の本質は、ＡＴＰの測定時に全ての構成成分が存在することであり、これらの各成分が、人為的に加えられたものか、試料に由来するものかは問題ではない。
本発明において、ＮＡＤまたはＮＡＤＰは、反応をならしめるものであれば、その塩の形態に特に限定されない。
本発明においては、反応の性質上、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの代わりにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いても構わない。用いられたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは第２のサイクリング系の構成要素である、色原体とジアホラーゼにより酸化され、ＮＡＤまたはＮＡＤＰへと変換される。このようにＮＡＤまたはＮＡＤＰの代わりにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いても同じことになる。この際、色原体も還元されて呈色するが、これは試薬のブランクに相当する初期の呈色となる。しかし、実使用においては、ブランクの上昇は好ましくないため、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを用いるのが良い。さらに、本発明においては、ＮＡＤは、しばしその分解産物であるＡＤＰの含有が観察されるため、実使用においては、ＮＡＤＰを用いるのがより好ましい。
ＮＡＤまたはＮＡＤＰ等の使用量は、反応を充分ならしめる範囲であれば、特に限定されるものではないが、コストや製造などを考慮した場合の実用的な使用量の範囲は、反応時の反応液ミリリットルあたり０．１ナノモル〜１０００マイクロモルであり、さらに好ましくは１ナノ〜１００マイクロモルの量が含まれる濃度である。
本発明に用いられるアセテートキナーゼ［ＥＣ２．７．２．１］は、その供給源となる生物種等は特に限定されるものではなく、例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス、大腸菌等の微生物由来のもの等が挙げられる。なかでも、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のアセテートキナーゼは保存安定性に優れていることから特に好ましい。
アセテートキナーゼの使用量は、反応を充分ならしめる範囲であれば、特に限定されるものではないが、コストや製造などを考慮した場合の実用的な使用量の範囲は、反応時の反応液ミリリットルあたり０．００１〜１００００ユニットであり、さらに好ましくは０．０１〜１０００ユニット、最も適する範囲は０．１〜５００ユニットである。
本発明に用いられるグルコキナーゼ［ＥＣ２．７．２．２］またはヘキソキナーゼ［ＥＣ．２．７．１．１］は、その供給源となる生物種等は特に限定されるものではなく、例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス、ザイモモナス・モビリス、酵母等の微生物由来のもの等が挙げられる。
また、グルコキナーゼとヘキソキナーゼの違いについては、それぞれの酵素の性質において、グルコースへの反応や、反応の特異性などに若干の違いはあるものの、どちらの酵素も、その反応の本質において、ＡＴＰの共存下でグルコースをグルコース−６−リン酸に返還し、ＡＤＰを生じる点は同じであるため、本発明の用途においては、反応の観点からは両酵素に差は認められない。しかし、保存安定性に優れていることから、バチルス・ステアロサーモフィルス由来やザイモモナス・モビリス由来のグルコキナーゼが特に好ましい。
グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼの使用量は、反応を充分ならしめる範囲であれば、特に限定されるものではないが、コストや製造などを考慮した場合の実用的な使用量の範囲は、反応時の反応液ミリリットルあたり０．００１〜１００００ユニットであり、さらに好ましくは０．０１〜１０００ユニット、最も適する範囲は０．１〜５００ユニットである。
本発明に用いられるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．４９］は、その供給源となる生物種等は特に限定されるものではなく、例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス、ザイモモナス・モビリス、ロイコノストック・メゼンテロイデス、酵母等の微生物由来のもの等が挙げられる。なかでも、微生物由来の酵素は生産性が良く入手も容易であることから好ましく、さらに、保存安定性に優れていることから、バチルス・ステアロサーモフィルス由来やザイモモナス・モビリス由来やロイコノストック・メゼンテロイデス由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの使用量は、反応を充分ならしめる範囲であれば、特に限定されるものではないが、コストや製造などを考慮した場合の実用的な使用量の範囲は、反応時の反応液ミリリットルあたり０．００１〜１００００ユニットであり、さらに好ましくは０．０１〜１０００ユニット、最も適する範囲は０．０１〜５０ユニットである。
さらに、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの反応を促進するために、６−ホスホグルコノラクトナーゼ［ＥＣ３．１．１．３１］を添加しても良い。この酵素は、グルコース−６−リン酸が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼにより酸化され、６−ホスホグルコノラクトンを生じ、この６−ホスホグルコノラクトンが自然に加水分解されて６−ホスホグルコン酸を生じる過程において、６−ホスホグルコノラクトンから６−ホスホグルコン酸への加水分解を触媒する酵素である。この添加により、より効率的な反応が可能になる。
これに加えて、さらに反応感度を上げるために、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．４１］を添加しても良い。この酵素は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下で、６−ホスホグルコン酸をリブロース−５−リン酸へと酸化し、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生ずる。この添加により、本発明において、グルコース−６−リン酸が生じた後の色素を生成するサイクリング系の反応において、色原体を還元するのに要するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成がグルコース−６−リン酸１分子に対して２分子となるため、サイクリング効率が約２倍となり、より高感度なＡＴＰの測定が可能となる。
６−ホスホグルコノラクトナーゼや６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの使用量は、反応を充分ならしめる範囲であれば、特に限定されるものではないが、コストや製造などを考慮した場合の実用的な使用量の範囲は、それぞれ、反応時の反応液ミリリットルあたり０．００１〜１００００ユニットであり、さらに好ましくは０．０１〜１０００ユニット、最も適する範囲は０．０１〜５０ユニットである。
本発明に用いられるにジアホラーゼとしては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の共存下で色原体の還元反応を触媒するものであれば、その供給源となる生物種等は特に限定されるものではなく、例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス、クロストリジウム・クルイベリ等の微生物由来のものや、ブタ心臓由来のもの等が挙げられる。なかでも、微生物由来の酵素は生産性が良く入手も容易であることから好ましく、さらに、保存安定性に優れていることから、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のジアホラーゼＩ［ＥＣ１．６．４．３］またはジアホラーゼＩＩ［ＥＣ１．６．９９．−］が特に好ましい。
また、ジアホラーゼの代わりにフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やメルドラーブルーなどの電子伝達物質を用いても同じ効果が得られることも一般的に知られている。
ジアホラーゼの使用量は、反応を充分ならしめる範囲であれば、特に限定されるものではないが、コストや製造などを考慮した場合の実用的な使用量の範囲は、反応時の反応液ミリリットルあたり０．００１〜１００００ユニットであり、さらに好ましくは０．０１〜１０００ユニット、最も適する範囲は０．１〜１００ユニットである。
本発明に用いられる色原体は、目視可能な色調で呈色、つまり３００ｎｍから８００ｎｍの範囲の波長領域の一部または全部で光吸収を有する変色をおこなうものである。この色原体は、当該反応により可視領域に吸収が無いものが有るように変化するか、吸収領域が有るものが無いように変化するか、または吸収スペクトルが異なるように変化するかのいずれかでも良く、より具体的には、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）の存在下、ジアホラーゼの作用により、還元されて呈色するものである。例えば、以下の例に限定されるわけではないが、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下、ＤＣＰＩＰと略す。）［ケミカルアブストラクト登録番号６２０−４５−１］、メチレン・ブルー［ケミカルアブストラクト登録番号６１−７３−４］、レザズリン［ケミカルアブストラクト登録番号６２７５８−１３−８］などの色素やテトラゾリウム類等が用いられる。
なかでも、テトラゾリウム類は特に好ましく、具体的な例としてｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレット［ケミカルアブストラクト登録番号１４６−６８−９］、ＭＴＴ［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−９３−１］、ネオテトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−９５−３］、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−８３−９］、テトラニトロ・ブルー・テトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号４２７９８−９８−１］、テトラゾリウム・ブルー［ケミカルアブストラクト登録番号１８７１−２２−３］、テトラゾリウム・レッド（トリフェニル・テトラゾリウム）［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−９６−４］、テトラゾリウム・バイオレット［ケミカルアブストラクト登録番号１７１９−７１−７］、チオカルバミル・ニトロ・ブルー・テトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号３６８８９−４３−７］、ＸＴＴ［ケミカルアブストラクト登録番号１１１０７２−３１−２］、ＷＳＴ−１［ケミカルアブストラクト登録番号１５０８４９−５２−８］、ＷＳＴ−３［ケミカルアブストラクト未登録］等、または、それらの塩等が挙げられる。
さらに色原体であるテトラゾリウムを複数同時に用いて多色の発色を得ることもできる。これは、従来技術（日本特許１７８２３５９号、特開昭６２−２３９０５４号など）にある同様の反応を組み合わせたものであるが、従来技術では呈色へ導く反応に酵素の共役反応が考慮されておらず、広い呈色域を所持しながら、被測定物質１分子に対して色原体１分子が色素へと変化するのみであるため、被測定物質の測定可能な濃度範囲は、被測定物質の測定試薬溶液中の濃度に限定される。被測定物質の濃度範囲は測定試薬中において自ずと制限があるため、この広い呈色域を有効に活用できるものではなかった。
酵素の共役系を応用した本発明は、被測定物質が酵素反応により増幅されるため、任意の反応時間を限定することにより被測定物質の初期の濃度に関係なく、見かけ上の被測定物質の濃度の増加を任意にコントロールすることが出来る。本発明に、この多色発色の技術を応用することで、非常に広い被測定物質の濃度範囲を意向に応じて反映することが出来るようになった。これは従来技術を単純に適用しただけでは完成せず、必要な測定濃度範囲と呈色域を一致させるために色原体の濃度比などを限定して初めて完成したものであり、従来技術から単純に思いつくことができるものではない。
呈色を広範囲にするために用いるテトラゾリウム塩類としては例えば一つはＤＣＰＩＰでありさらに一つはｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレットやテトラゾリウム・レッドやテトラゾリウム・バイオレットなどが用いられる。ＤＣＰＩＰはもともと青く着色した色素であり、ジアホラーゼや電子伝達物質などの作用により還元されて無色透明となる性質を有する色素である。これに対し、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレットや、テトラゾリウム・レッドやテトラゾリウム・バイオレットなどは、もともと無色から薄く黄色に着色した色素であり、ジアホラーゼや電子伝達物質などの作用により還元されて赤色から赤紫色を呈する性質を有する色素である。ＤＣＰＩＰとｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレットや、テトラゾリウム・レッドやテトラゾリウム・バイオレットなどを同時に用いることで、最初、青く呈色していた溶液が、ジアホラーゼや電子伝達物質などの作用による還元反応が進むにつれ短い透明な期間を経由して赤色から赤紫色を呈するようになる。これらを同時に用いることで青色から赤色の呈色が実現できる。また、これに加え、もともとの溶液を酸化還元を受けにくい色素により黄色く着色することで上述の反応において透明な期間に、もともと着色しておいた黄色が観察されることから、見かけ上、反応により、青色から黄色を経て赤色へと変化する呈色反応も実現できる。
色原体の使用量は、反応を充分ならしめる範囲であれば、特に限定されるものではないが、コストや製造などを考慮した場合の実用的な使用量の範囲は、反応時の反応液ミリリットルあたり０．１ナノモル〜１０００マイクロモルであり、さらに好ましくは１ナノ〜１００マイクロモルの量が含まれる濃度である。
また、溶液の着色に用いる黄色色素は目的とする発色が得られ、反応を阻害しない限り特に限定されないが、本来黄色く着色しているジアホラーゼそのもの、チタン・イエロー、食用色素黄色３号、食用色素黄色４号などが用いられる。好ましくは反応液において、０．０００１％から１％である。
ここで用いる黄色色素の濃度は目的とする発色が確認できる濃度であれば特に限定され無い。特に色素を用いた場合非常に微量で目的の着色を達成できる。
本発明の測定方法を実施する場合には、以下のような操作により行うことができる。
ＡＴＰは、おおよそ生物の細胞内に含まれているため、本発明に用いられる試料は、生物そのもの若しくはその一部を含む試料であればよく、通常は液体状態のものを用いる。しかし、場合によっては例えば粉末のように見かけ上乾燥しているものを試料として用いることもできる。見かけ上乾燥している場合には、これらを直接、試薬溶液（複数または単数）と混合しても良いし、また、別な液体と混合して溶液状態にしてから試薬溶液（複数または単数）と混合してもよい。
また、ＡＴＰは主に細胞内に含まれるため、このＡＴＰの試料溶液中への漏出効率をあげるために、界面活性剤や有機溶媒などを用いて細胞を予め破砕しておいてもよい。
本発明の測定方法を溶液状態で実施する場合には、ＡＴＰを含む試料と、少なくともアセチルリン酸、グルコース、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、色原体、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼまたは電子伝達物質を含む試薬溶液とを混合する第一ステップ、この混合により、ＡＴＰの量に応じた速度で色素が生成する第二ステップ、生成した色素を定量してＡＴＰ量を導き出す第三ステップからなる。
第一のステップは、第二のステップに到るまでに、少なくともＡＴＰと、アセチルリン酸、グルコース、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、色原体、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼまたは電子伝達物質を同一の溶液内に存在させるためのステップであり、アセチルリン酸、グルコース、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、色原体、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼまたは電子伝達物質が同一の試薬溶液に存在した場合には、この試薬溶液とＡＴＰを含む試料溶液とを混合する一度の操作を含むステップであり、またアセチルリン酸、グルコース、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、色原体、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼまたは電子伝達物質が複数の試薬溶液に分かれて存在している場合には、その試薬溶液の数に応じて全ての溶液とＡＴＰを含む試料溶液とを混合するために必要な操作数が増加する操作を含むステップである。つまり、たとえば、アセチルリン酸、グルコース、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、色原体、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼまたは電子伝達物質が２つの試薬溶液に分かれて存在した場合、試料溶液と一番目の試薬溶液を混合する第一の操作と、続いて二番目の試薬溶液を混合する第二の操作を含むか、または一番目の試薬溶液と二番目の試薬溶液を混合して新たな試薬溶液を作成する第一の操作と、この新たな試薬溶液に試料溶液を混合する第二の操作を含むか、またはこれらの溶液を同時に混合するひとつの操作を含むことになる。さらに、これらの溶液のうち幾つかが乾燥状態で存在した場合、これに試料溶液、試薬溶液またはそれ以外の何らかの液体成分を滴下して溶液とする操作が追加されることを含むステップである。
第二のステップは、試料溶液と試薬溶液（単数または複数）を混合して以降、溶液内で自動的に生ずるステップである。このステップが実施されるためには、混合溶液のｐＨが少なくとも２から１２の範囲におさまり、また混合溶液の温度が１０℃から８０℃の範囲にあることが必要である。これを実現するために、少なくとも試薬溶液には緩衝液を含ませておく必要があり、通常、人間の活動できる環境下に存在すれば何ら問題は無いが、混合溶液の温度を積極的に当該範囲内に納めるために、混合溶液を当該温度範囲内に保温または加温する操作を含めてもよい。
第三のステップは、第一の操作としてＡＴＰの量に応じた速度で生成した色素を定量する操作を含む。色素の定量は混合溶液が試験管などに入っていた場合、分光光度計を用いて波長３００〜８００ｎｍ、好ましくは４００〜８００ｎｍ、さらに好ましくは４５０〜７００ｎｍにおける吸光度を測ることにより色素量を測定する操作を含むか、定量用の色見本と比較して測定する操作を含む。また、必要な試薬を含む少量の溶液あるいはゼラチンがろ紙などの担体に担持され、見かけ上、液体で無い状態で色素を生成させた場合には、定量用の色見本と比較して測定する操作を含むものである。さらに測定された色素量からＡＴＰの測定は、そのつど、または予め作成された換算式などにより、ＡＴＰ量を測定する第二の操作を含むものである。
広範囲な呈色をより実用的にするためには、色調の変化は反応時間に応じて経時的に起こるため、反応を任意の時間で停止するために、反応停止剤を一定時間後またはあらかじめ反応液に添加することも出来る。反応停止剤としては、まず無水酢酸、無水マレイン酸、フタル酸、アジ化ソーダ、ヨウ素、など一般的に知られる酵素の化学修飾剤が挙げられる。これらの酵素の化学修飾剤を反応液に共存させることで、共役反応中に酵素の化学修飾が完了し、酵素が失活して反応が一定時間で停止するものである。一般的に化学修飾剤が酵素を失活させて反応を阻害することが知られている。反応液中に化学修飾剤を共存させた場合、酵素が先に阻害を受けて失活し反応が進行しないと考えられていた。今回、この化学修飾による酵素の失活が予想より時間がかかることを発見した。これより酵素と化学修飾剤を共存させた場合、酵素が失活するまでの間は主たる反応が進行し、かつ一定時間後に化学修飾が終了し酵素が失活して反応が停止することを見出した。この発見を応用し、酵素と化学修飾剤を共存させることで、一定時間、主たる反応が進行し、その後、酵素の失活により反応が停止する反応試薬が完成した。
これに用いる化学修飾剤の種類は目的とする修飾反応が実施できるものであれば特に限定されない。またその濃度も目的とする修飾反応が実施できる濃度であれば特に限定され無いが、好ましくは反応液において、それぞれ０．００１％から１０％、好ましくは０．００２％から１％、さらに好ましくは０．０１％から０．５％である。
これとは別に、反応停止剤としてアセチルリン酸の分解促進剤が挙げられる。亜鉛、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、など主に２価の金属イオンとアセチルリン酸が共存することでアセチルリン酸の分解が促進されることがわかった。
これよりアセチルリン酸等を含む反応系にアセチルリン酸の分解促進剤を共存させた場合、アセチルリン酸がアセチルリン酸の分解促進剤により徐々に分解し、一定時間後にアセチルリン酸が消失して反応が停止することを見出した。この発見を応用し、アセチルリン酸とアセチルリン酸の分解促進剤を共存させることで、一定時間、主たる反応が進行し、その後、アセチルリン酸の消失により反応が停止する反応試薬が完成した。
この２価の金属イオンの種類は目的とする分解反応が実施できるものであれば特に限定されないが、好ましくは亜鉛、マンガン、鉄、銅が用いられる。またその濃度も目的とする停止反応が実施できる濃度であれば特に限定され無いが、好ましくは反応液において、それぞれ反応液リットル当り０．００１ミリモルから１０モル、好ましくは０．０１ミリモルから１モル、さらに好ましくは０．１ミリモルから５００ミリモルの濃度である。
これらのアセチルリン酸の分解促進剤は１種を反応液に共存させることで十分にその目的を達するものであるが、２種以上共存させても特に問題はない。
また、反応停止剤としてアセチルリン酸の分解促進剤と化学修飾剤を併用しても良い。
また、ここに挙げた色原体並びに反応停止剤は、好ましくはアセチルリン酸、グルコース、ＮＡＤまたはＮＡＤＨ、アセテートキナーゼ、グルコキナーゼ（またはヘキソキナーゼ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、並びにＡＴＰと、反応時に同時に同一の溶液中に存在するのがよく、反応まではその形態に特に限定は無く、それぞれ個別に、または同一に、または幾つか組み合わされて溶液状態、粉末状態、試験紙や不織布などに含浸された状態、さらには試験紙や不織布上で乾燥された状態等でも良い。
＜実施例＞
以下に、実施例により本発明をより具体的に示す。
反応の測定には日立製の分光光度計Ｕ−３２１０を用いた。目視判定用の色見本には、分光光度計での結果を参考にし、財団法人日本規格協会発行のＪＩＳＺ８７２１準拠の標準色表光沢版３０頁の５ＰＢ−Ｖ３Ｎ１０、Ｖ５Ｎ８、Ｖ７Ｎ４、Ｖ９Ｎ２および白色を、それぞれ判定強度＋４、＋３、＋２、＋１、０として用いた。アセテートキナーゼ（バチルス・ステアロサーモフィルス由来）、グルコキナーゼ（バチルス・ステアロサーモフィルス由来）、ジアホラーゼ（バチルス・ステアロサーモフィルス由来のジアホラーゼＩ）はユニチカ製のものを入手して用いた。またヘキソキナーゼ（酵母由来）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ロイコノストック・メゼンテロイデス由来）はロッシュ製のものを用いた。それぞれの酵素のユニットは入手時のラベルに記載してある表示のユニット数をそのまま用いた。
実施例１
アセチルリン酸を１０ミリモル、グルコースを１０ミリモル、ＮＡＤを１ミリモル、およびＤＣＰＩＰを５０マイクロモルの濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２．７ミリリットルと、ミリリットルあたりアセテートキナーゼを１０ユニット、ヘキソキナーゼを１０ユニット、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを１０ユニット、およびジアホラーゼを１０ユニットの濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．３ミリリットルとを３７℃で保温した分光光度計用の標準セルに滴下し、これにＡＴＰを含む試料溶液０．１ミリリットルを添加してよく撹拌した。分光光度計にて６００ｎｍの吸光度変化を測定した。この結果を図２に示した。また、分光光度計にて測定された反応後５分の吸光度の値を、それぞれのＡＴＰ初濃度に対してプロットした結果を図３に示した。これらの結果から、色原体にＤＣＰＩＰを用いた場合、ＡＴＰが良好に測定できることが分かった。
実施例２
アセチルリン酸を５ミリモル、グルコースを５ミリモル、ＮＡＤを１ミリモル、およびテトラゾリウム・ブルーを１ミリモルの濃度で含む２５ミリモルの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を２．７ミリリットルと、ミリリットルあたりアセテートキナーゼを１００ユニットの濃度で含む１０ミリモルの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、ヘキソキナーゼを１０００ユニットの濃度で含む１０ミリモルの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを１０００ユニットの濃度で含む１０ミリモルの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、ジアホラーゼを１０００ユニットの濃度で含む１０ミリモルの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を、それぞれ１０マイクロリットルづつとを３７℃で保温した分光光度計用の標準セルに滴下し、これにＡＴＰを含む試料溶液５０マイクロリットルを添加してよく撹拌した。この５分後に分光光度計にて６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示した。この結果、色原体にテトラゾリウム・ブルーを用いた場合、ＡＴＰが良好に測定できることが分かった。
実施例３
アセチルリン酸を１０ミリモル、グルコースを１０ミリモル、ＮＡＤを１ミリモル、およびＤＣＰＩＰを５０マイクロモルの濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を４．５ミリリットルと、ミリリットルあたりアセテートキナーゼを１ユニット、ヘキソキナーゼを１ユニット、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを１ユニット、およびジアホラーゼを１ユニットの濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ミリリットルを１５ｍＬ用の試験管に滴下し混合した。これに、ＡＴＰの最終濃度が反応試薬ミリリットルあたり０、１、１０、１００、１０００、１００００ピコモルとなる量のＡＴＰを含む試料溶液１．０ミリリットルを添加してよく撹拌し、室温で１０分間放置した。その後、判定用の色見本を用いて色の強度を判定した。
結果を表１に示した。試薬はもともと青く着色しており、ＡＴＰが反応溶液中にない場合、青いままであり、色強度は＋４となる。また、ＡＴＰが試薬の測定限界を超えて大量に存在する場合、試薬の青色はすべて脱色して、反応溶液は透明になり色強度は０となる。この結果より、ＡＴＰの最終濃度が反応試薬ミリリットルあたり１ピコモルから１００００ピコモルの範囲で、ＡＴＰの初濃度のおおよその濃度が判定できた。
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実施例４
アセチルリン酸を１０ミリモル、グルコースを１０ミリモル、ＮＡＤを１ミリモル、およびＤＣＰＩＰを１０マイクロモル、ｐ−ニトロヨウドテトラゾリウム・バイオレットを０．１％、黄色３号を０．０２％の濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を４．５ミリリットルと、ミリリットルあたりアセテートキナーゼを１ユニット、ヘキソキナーゼを１ユニット、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを１ユニット、およびジアホラーゼを５ユニットの濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ミリリットルを１５ｍＬ用の試験管に滴下し混合した。これに、ＡＴＰの最終濃度が反応試薬ミリリットルあたり０、１、１０、１００、１０００、１００００ピコモルとなる量のＡＴＰを含む試料溶液１．０ミリリットルを添加してよく撹拌し、室温で３０分間放置した。その後、目視により色を判定した。
結果を表２に示した。この結果より、ＡＴＰの最終濃度が反応試薬ミリリットルあたり１ピコモルから１０００ピコモルの範囲で、ＡＴＰの初濃度のおおよその濃度が判定できた。
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実施例５
アセチルリン酸を１０ミリモル、グルコースを１０ミリモル、ＮＡＤを１ミリモル、およびテトラゾリウム・バイオレットを０．１％、化学修飾剤であるフタル酸を０．１％の濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を４．５ミリリットルと、ＡＴＰの最終濃度が反応試薬ミリリットルあたり１００ピコモルとなる量のＡＴＰを含む試料溶液１．０ミリリットルを添加してよく撹拌し、これに、ミリリットルあたりアセテートキナーゼを１ユニット、ヘキソキナーゼを１ユニット、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを１ユニット、およびジアホラーゼを５ユニットの濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ミリリットルを１５ｍＬ用の試験管に滴下し混合した。このように酵素と基質および化学修飾剤が共存した状態で５５０ｎｍの吸光度変化によりＡＴＰに依存する着色反応を経時的に追跡した。結果を図５に示した。フタル酸を含ませないことにした以外は、全く上記と同様な操作により測定した結果を図５に併せて示した。
図５の結果より、フタル酸を添加することで約２０分後に反応が停止したことがわかった。
実施例６
アセチルリン酸を１０ミリモル、グルコースを１０ミリモル、ＮＡＤを１ミリモル、およびＤＣＰＩＰを０．００５％、ｐ−ニトロヨウドテトラゾリウム・バイオレットを０．１％、黄色３号を０．００２％、の濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を４．５ミリリットルと、ミリリットルあたりアセテートキナーゼを１ユニット、ヘキソキナーゼを１ユニット、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを１ユニット、およびジアホラーゼを５ユニットの濃度で、さらにアセチルリン酸の分解剤である鉄イオンを最終的に５ミリモルの濃度で含む５０ミリモルの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ミリリットルを１５ｍＬ用の試験管に滴下し混合した。これに、ＡＴＰの最終濃度が反応試薬ミリリットルあたり１０ピコモルとなる量のＡＴＰを含む試料溶液１．０ミリリットルを添加してよく撹拌した。このようにアセチルリン酸の分解促進剤を同時に含む状態で４００ｎｍ〜７００ｎｍの間の吸光度変化により、ＡＴＰに依存する着色反応を経時的に追跡した。結果を図６に示した。また、目視により、この間の色の変化を判定した。結果を表３に示した。鉄イオンを含ませないことにした以外は、全く上記と同様な操作により測定した結果を、図６及び表３に併せて示した。
図６並びに表３の結果より、鉄イオンを添加することで約１５分後に反応が停止したことがわかった。
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以上、実施例１から６に示した結果より、本発明に記載の測定方法よりＡＴＰが良好に測定できることが分かった。また、ＡＴＰの目視によるおおよその濃度の判定も可能であることがわかった。さらに実用的に十分な一定時間後に反応を停止することも可能になった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００１年１１月２１日出願の日本特許出願（特願２００１−３５６１４１）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
＜産業上の利用可能性＞
本発明により、操作が容易で測定感度も良好な目視判定可能なＡＴＰ測定用試薬の提供が可能となった。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の測定方法の反応原理を示す図である。
図２は、ＤＣＰＩＰを色原体に用いた本発明のＡＴＰ測定用試薬により各種濃度のＡＴＰを測定したときの吸光度の経時変化を示す図である。
図３は、ＤＣＰＩＰを色原体に用いた本発明のＡＴＰ測定用試薬により各種濃度のＡＴＰを測定したときの検量線を示す図である。
図４は、テトラゾリウムを色原体に用いた本発明のＡＴＰ測定用試薬により各種濃度のＡＴＰを測定したときの検量線を示す図である。
図５は、反応停止剤（化学修飾剤）を添加しない場合の反応曲線と反応停止剤（化学修飾剤）を添加した場合の反応曲線を比較した図である。
図６は、多色発色系において反応停止剤（アセチルリン酸の分解促進剤）を添加しない場合（ａ）と反応停止剤（アセチルリン酸の分解促進剤）を添加した場合（ｂ）を比較した図である。
なお、図中の略号は以下の意味である。ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、ＡＤＰ：アデノシン二リン酸、ＮＡＤ（Ｐ）：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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