(57)【要約】本発明は、海洋性大型緑藻類の形態形成、成長促進を誘引する新規化学物質、微生物を用いて前記新規化学物質を製造する方法、及び前記新規化学物質を含有する藻類培養用培地に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質：
（ｉ）物質の色：無色
（ｉｉ）分子量：４５７
（ｉｉｉ）分子式：Ｃ２４Ｈ３１Ｎ３Ｏ４Ｓ
質量分析：ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ  ４５６［Ｍ−Ｈ］−（図１）
高分解能質量分析：実測値  ４５６．１９６０［Ｍ−Ｈ］−
計算値  ４５６．１９３０（Ｃ２４Ｈ３０Ｎ３Ｏ４Ｓ）
（ｉｖ）核磁気共鳴シグナル：
１）１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）、７５０ＭＨｚ）：（図２）
δｐｐｍ０．８１８（３Ｈ，ｓ），０．８３７（３Ｈ，ｓ），０．８８２（３Ｈ，ｓ），０．９６０（１Ｈ，ｍ），１．０５８（１Ｈ，ｍ），１．１６７（１Ｈ，ｍ），１．３２６（３Ｈ，ｓ），１．３７（１Ｈ，ｍ），１．３８（１Ｈ，ｍ），１．４０（１Ｈ，ｍ），１．５８（１Ｈ，ｍ），１．６１（２Ｈ，ｍ），１．５２（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ），１．７６（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ），２．０２４（１Ｈ，ｍ），２．１８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４，１４Ｈｚ），２．２９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４，１６．５Ｈｚ），７．６９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）、１２５ＭＨｚ）：（図３）
δｐｐｍ１５．２３６（ｑ），１９．０３７（ｔ），２０．２８７（ｔ），２０．９５５（ｑ），２１．８３５（ｑ），２５．９８７（ｔ），３３．３８１（ｓ），３３．６３６（ｑ），３７．３０８（ｓ），３９．５９０（ｔ），４１．１９９（ｔ），４２．３４６（ｔ），５２．７６９（ｄ），５６．３８１（ｄ），７９．０９６（ｓ），１１４．９６５（ｓ），１２４．３９９（ｄ），１３９．００４（ｓ），１４１．２３２（ｄ），１５０．２８２（ｓ），１５２．６５６（ｓ），１７２．０８１（ｓ），１７３．５３８（ｓ），１７４．６６１（ｓ）
を有する新規化学物質１。
【請求項２】
下記の理化学的性質：
（ｉ）物質の色：無色
（ｉｉ）核磁気共鳴シグナル：
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）、５００ＭＨｚ）：（図４）
δｐｐｍ０．８１５（３Ｈ，ｓ），０．８３４（３Ｈ，ｓ），０．８７７（３Ｈ，ｓ），０．９４９（１Ｈ，ｍ），１．０４８（１Ｈ，ｍ），１．１６３（１Ｈ，ｍ），１．２９７（３Ｈ，ｓ），１．３５−１．４０（３Ｈ，ｍ），１．５２−１．６３（４Ｈ，ｍ），１．７５３（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ），２．０１２（１Ｈ，ｍ），２．１５８（１Ｈ，ｍ），２．２９９（１Ｈ，ｍ），７．６４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
を有する新規化学物質２。
【請求項３】
請求の範囲第１項記載の新規化学物質１を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に新規化学物質１を生成蓄積させ、該生成蓄積した新規化学物質１を採取することを特徴とする新規化学物質１の製造法。
【請求項４】
請求の範囲第２項記載の新規化学物質２を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に新規化学物質２を生成蓄積させ、該生成蓄積した新規化学物質２を採取することを特徴とする新規化学物質２の製造法。
【請求項５】
微生物がＹＭ−２−２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１７）、テナシバキュラム・スピーシーズ（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）ＹＭ−１−６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１８）又はそれらの類似菌株である請求の範囲第３項記載の製造法。
【請求項６】
微生物がＹＭ−２−２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１７）、テナシバキュラム・スピーシーズ（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）ＹＭ−１−６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１８）又はそれらの類似菌株である請求の範囲第４項記載の製造法。
【請求項７】
請求の範囲第１項記載の新規化学物質１を有効成分として含有する藻類培養用培地。
【請求項８】
請求の範囲第２項記載の新規化学物質２を有効成分として含有する藻類培養用培地。
【請求項９】
請求の範囲第１項記載の新規化学物質１をトリメチルシリルジアゾメタンで処理することにより得られる該新規化学物質１のモノメチル化体、ジメチル化体又はトリメチル化体。
【請求項１０】
請求の範囲第９項記載のトリメチル化体を水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより得られる化合物又はその誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、微生物が生産する新規ビタミン様作用物質ならびにその製造法及び用途に関するものである。
【背景技術】  これまでアオサ、ヒトエグサ等の大型緑藻類の既存の合成培地を用いた室内培養では、純化するに従いカルス状又は単細胞状に藻体が崩れる現象がみられることが知られている（Ｌ．Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ；Ｕｌｖａ．Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．，１９５８，１１４，３７５．：Ｍ．Ｔａｔｅｗａｋｉ，Ｌ．Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ  ａｎｄ  Ｉ．Ｊ．Ｐｉｎｔｎｅｒ；Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１９８３，１９，４０９．）。また、このように形態を失った藻体に生海水や土壌抽出液、紅藻抽出液、褐藻抽出液、又はある種の海洋由来の微生物培養液を添加すると、葉状体回復や成長速度の増大が起こることが知られている（Ｍ．Ｔａｔｅｗａｋｉ，Ｌ．Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ  ａｎｄ  Ｉ．Ｊ．Ｐｉｎｔｎｅｒ；Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１９８３，１９，４０９．）が、それらの抽出液の有効成分、ビタミン様作用物質は見いだされていない。そのため、室内におけるアオサ、ヒトエグサ等の大型緑藻類の無菌培養細胞を用いた長期的な生理・生態研究、培養保存が困難であった。
【発明の開示】
海洋性大型緑藻類をすべての成分が既知である培地のみを使って無菌的に長期間培養することができれば、対象藻類の生理・生態研究のほかに養殖種である食用ヒトエグサ類の種苗生産や維持・管理、緑藻類の種の保存など実用的な培養手法として確立することができる。すでに本発明者はこのような観点から海洋性大型緑藻類の形態形成、成長促進を誘引する微生物を見出している（特願２００１−３９６３４２）。しかし、その微生物が生産する有効成分、ビタミン様作用物質は未知のままであった。
本発明はこのような新規ビタミン様作用物質を提供することを目的とする。
本発明者は、かかる事情を鑑み、新規な有効成分の探索を行い、その結果ＹＭ−２−２３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１７で、２００１年８月２０日付（原寄託）で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている（２００３年６月２５日付で原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））、テナシバキュラム・スピーシーズ（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）ＹＭ−１−６９（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１８で、２００１年８月２０日付（原寄託）で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている（２００３年６月２５日付で原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））、及びそれらの類似菌株の培養液から極めて強い活性を有する活性物質を単離し、またその化合物が新規物質であることを見出し、本発明を完成した。これまでＹＭ−２−２３株及び／又はＹＭ−１−６９株に類似するフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゾベリア（Ｚｏｂｅｌｌｉａ）属又はテナシバキュラム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ）属の産生する物質としてはリコペン、ゼアキサンチン等のカロテノイド類縁体が報告されているが、大型藻類の成長を促進する、あるいは形態をコントロールするような化合物の単離例はなく、世界で初めての報告となる。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）下記の理化学的性質：
１．物質の色：無色
２．分子量：４５７
３．分子式：Ｃ２４Ｈ３１Ｎ３Ｏ４Ｓ
質量分析：ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ  ４５６［Ｍ−Ｈ］−（図１）
高分解能質量分析：実測値  ４５６．１９６０［Ｍ−Ｈ］−
計算値  ４５６．１９３０（Ｃ２４Ｈ３０Ｎ３Ｏ４Ｓ）
４．核磁気共鳴シグナル：
１）１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）、７５０ＭＨｚ）：（図２）
δｐｐｍ０．８１８（３Ｈ，ｓ），０．８３７（３Ｈ，ｓ），０．８８２（３Ｈ，ｓ），０．９６０（１Ｈ，ｍ），１．０５８（１Ｈ，ｍ），１．１６７（１Ｈ，ｍ），１．３２６（３Ｈ，ｓ），１．３７（１Ｈ，ｍ），１．３８（１Ｈ，ｍ），１．４０（１Ｈ，ｍ），１．５８（１Ｈ，ｍ），１．６１（２Ｈ，ｍ），１．５２（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ），１．７６（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ），２．０２４（１Ｈ，ｍ），２．１８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４，１４Ｈｚ），２．２９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４，１６．５Ｈｚ），７．６９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）、１２５ＭＨｚ）：（図３）
δｐｐｍ１５．２３６（ｑ），１９．０３７（ｔ），２０．２８７（ｔ），２０．９５５（ｑ），２１．８３５（ｑ），２５．９８７（ｔ），３３．３８１（ｓ），３３．６３６（ｑ），３７．３０８（ｓ），３９．５９０（ｔ），４１．１９９（ｔ），４２．３４６（ｔ），５２．７６９（ｄ），５６．３８１（ｄ），７９．０９６（ｓ），１１４．９６５（ｓ），１２４．３９９（ｄ），１３９．００４（ｓ），１４１．２３２（ｄ），１５０．２８２（ｓ），１５２．６５６（ｓ），１７２．０８１（ｓ），１７３．５３８（ｓ），１７４．６６１（ｓ）
を有する新規化学物質１。
（２）下記の理化学的性質：
１．物質の色：無色
２．核磁気共鳴シグナル：
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）、５００ＭＨｚ）：（図４）
δｐｐｍ０．８１５（３Ｈ，ｓ），０．８３４（３Ｈ，ｓ），０．８７７（３Ｈ，ｓ），０．９４９（１Ｈ，ｍ），１．０４８（１Ｈ，ｍ），１．１６３（１Ｈ，ｍ），１．２９７（３Ｈ，ｓ），１．３５−１．４０（３Ｈ，ｍ），１．５２−１．６３（４Ｈ，ｍ），１．７５３（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ），２．０１２（１Ｈ，ｍ），２．１５８（１Ｈ，ｍ），２．２９９（１Ｈ，ｍ），７．６４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
を有する新規化学物質２。
（３）前記（１）に記載の新規化学物質１又は前記（２）に記載の新規化学物質２を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に新規化学物質１又は２を生成蓄積させ、該生成蓄積した新規化学物質１又は２を採取することを特徴とする新規化学物質１又は２の製造法。
（４）微生物がＹＭ−２−２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１７）、テナシバキュラム・スピーシーズ（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）ＹＭ−１−６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１８）又はそれらの類似菌株である前記（３）に記載の製造法。
（５）前記（１）に記載の新規化学物質１又は前記（２）に記載の新規化学物質２を有効成分として含有する藻類培養用培地。
（６）前記（１）に記載の新規化学物質１をトリメチルシリルジアゾメタンで処理することにより得られる該新規化学物質１のモノメチル化体、ジメチル化体又はトリメチル化体。
（７）前記（６）に記載のトリメチル化体を水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより得られる化合物又はその誘導体。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の新規化学物質１及び２は、微生物を用いて生産することが可能である。本発明の化学物質の製造に用いる微生物としては、該化学物質の生産能を有する微生物であれば特に限定されず、例えば、フラボバクテリウム属、ゾベリア属、テナシバキュラム属等のＣｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘに属する菌株や、これらの菌株に由来する変異株を挙げることができる。具体的には、ＹＭ−２−２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１７）、テナシバキュラム・スピーシーズ（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）ＹＭ−１−６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１８）や、これらの菌株に由来する変異株を挙げることができる。ＹＭ−１−６９株やＹＭ−２−２３株の代わりに、これらの菌株の類似菌株を使用してもよい。「ＹＭ−１−６９株の類似菌株」には、例えば、海洋性大型緑藻類に対し葉状体形成活性又は生長促進活性を示す菌株であって、配列番号１記載の塩基配列と８５％以上、好ましくは９５％以上相同な塩基配列で表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ３領域遺伝子を持つ菌株や配列番号３記載の塩基配列と７２％以上、好ましくは９５％以上相同な塩基配列で表されるｇｙｒＢ遺伝子を持つ菌株が含まれる。「ＹＭ−２−２３株の類似菌株」には、例えば、海洋性大型緑藻類に対し葉状体形成活性又は生長促進活性を示す菌株であって、配列番号２記載の塩基配列と８５％以上、好ましくは９５％以上相同な塩基配列で表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ３領域遺伝子を持つ菌株や配列番号４記載の塩基配列と７２％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上相同な塩基配列で表されるｇｙｒＢ遺伝子を持つ菌株が含まれる。
「ＹＭ−１−６９株の類似菌株」及び「ＹＭ−２−２３株の類似菌株」としては、例えばＹＭ２−１０（ＭＢＩＣ  ０４６７１）、ＹＭ２−１１（ＭＢＩＣ  ０４６７２）、ＹＭ２−１２（ＭＢＩＣ  ０４６７３）、ＹＭ２−１３（ＭＢＩＣ  ０４６７４）、ＹＭ１−６６（ＭＢＩＣ  ０４６６３）、ＹＭ２−２４（ＭＢＩＣ  ０４６８４）、ＹＭ１−５１（ＭＢＩＣ  ０４６６２）、Ｚｏｂｅｌｌｉａｕｌｉｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  １４３９７）、ＹＭ１−１１（ＭＢＩＣ  ０４６９３）、Ｔ−５８８（ＭＢＩＣ  ０５９３０）、ＹＭ２−２２（ＭＢＩＣ  ０４６８２）、ＹＭ２−２７（ＭＢＩＣ  ０４６８７）、ＹＭ２−６（ＭＢＩＣ  ０４６６９）、ＹＭ１−６８（ＭＢＩＣ  ０４６６４）、ＹＭ１−３８（ＭＢＩＣ  ０４６６１）、ＹＭ２−４（ＭＢＩＣ  ０４６６７）、ＹＭ２−５（ＭＢＩＣ  ０４６６８）、ＹＭ２−７（ＭＢＩＣ  ０４６７０）、ＹＭ２−２１（ＭＢＩＣ  ０４６８１）、ＹＭ２−１（ＭＢＩＣ  ０４６６６）、Ｔ−５６５（ＭＢＩＣ  ０５８７７）、Ｔ−４２４（ＭＢＩＣ  ０５８７６）、［Ｃｙｔｏｐｈａｇａ］ｓｐ．ＵＰ７（ＭＢＩＣ  ０１４８４）、Ｔ−５５１（ＭＢＩＣ  ０５９２９）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒｈｅｐａｒｉｎｕｓ（ＩＦＯ  １２０１７）、Ｔ−５６１（ＭＢＩＣ  ０５８７９）、Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ（ＬＭＧ  １３１６４）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．（ＭＢＩＣ  ０１５３９）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．（ＭＢＩＣ  ０１５９９）、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｐｉｎｅｎｓｉｓ（ＤＳＭ  ２５８８）が挙げられる。
前記の菌株のうち、「ＭＢＩＣ」が付された菌株は、海洋バイオテクノロジー研究所カルチャーコレクション（Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＭＢＩＣ）（日本国岩手県釜石市平田３−７５−１）（ｈｔｔｐ：／／ｓｅａｓｑｕｉｒｔ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｃ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝ｔｏｐ）から、「ＩＦＯ」が付された菌株は、財団法人発酵研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ；ＩＦＯ）（日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）から、「ＡＴＣＣ」が付された菌株は、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から、「ＤＳＭ」が付された菌株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、「ＬＭＧ」が付された菌株は、ＢＣＣＭＴＭ／ＬＭＧ  Ｂａｔｅｒｉａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｇｅｎｔ（ＲＵＧ），Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｆａａｔ  ３５，Ｂ−９０００  Ｇｅｎｔ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から、それぞれ入手可能である。
１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ３領域遺伝子及び／又はｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列がＹＭ−１−６９株やＹＭ−２−２３株のそれと同一である菌株は、これらの類似菌株の中でも特に好ましい菌株である。
前記の微生物の培養に際しては、通常の海洋細菌の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単独又は組合せて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独又は組合せて用いられる。
そのほか、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム・８水塩、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。
更に、使用菌の生育や本発明の化学物質の生産を促進する微量成分（例えば糖類、アミノ酸、無機塩類など）を適当に添加することができる。
培養法としては、液体培養が最も効率よく、培養温度は３０℃程度が適当であり、培地のｐＨは、通常７〜９、好ましくは７．５〜８である。培地のｐＨ調整には水酸化ナトリウム水溶液や塩酸などが用いられる。
液体培養で１〜４日間培養を行うと、新規化学物質１又は２が培養液中及び菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止することが好ましい。特に、培養３日後がもっとも好ましい。
培養物から新規化学物質１又は２を単離精製するに際しては、微生物代謝産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。例えば、培養物を濾過や遠心分離により培養濾液と菌体に分け、菌体を含水メタノール、含水アセトニトリルなどで抽出する。次いで、抽出液から有機溶媒をロータリーエバポレーター等で減圧除去し、この抽出液と培養濾液とをあわせてポリスチレン系吸着剤（例えばスチレンジビニルベンゼンポリマー）などに吸着させる。吸着した活性物質を水洗して脱塩し、含水メタノール、含水アセトニトリルなどで活性物質を溶出する。溶出液を凍結乾燥などで減圧濃縮し、スチレンジビニルベンゼン系ポリマー、陰イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより、新規化学物質１又は２を得る。新規化学物質２は極めて不安定な化合物であるが、新規化学物質２を水酸化ナトリウム水溶液やアンモニア水などの強アルカリ水溶液中におくことにより、徐々に新規化学物質１に変化する。新規化学物質１は極めて安定な化合物である。
新規化学物質１を適当なメチル化剤（例えば、トリメチルシリルジアゾメタン）で処理することにより、新規化学物質１のモノメチル化体、ジメチル化体又はトリメチル化体を得ることができる。トリメチルシリルジアゾメタンの新規化学物質１に対するモル比を調節したり、反応条件の選択（例えば、反応温度やｐＨの設定、ジメチルアミノスルファートリフルオリド（ＤＡＳＴ）の存在下で反応）により、モノメチル化体、ジメチル化体又はトリメチル化体を選択的に得ることができる。
更に、前記トリメチル化体を水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより、後述する理化学的性質を有するＭｅ１Ｈ３を得ることができる。また、反応溶媒の極性、反応温度を変えることによりＭｅ１Ｈ３よりも更に還元された化合物Ｍｅ１Ｈ１を得ることができる。また、Ｍｅ１Ｈ１を強アルカリ条件下、式：ＲＩ（ここで、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基を表す。）で示されるヨウ化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）を作用させることによりメチル化体Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅ等のアルキル化体を得ることができる。これらの反応と、得られる生成物の情報は新規化学物質１及び２を特定する場合等に有益である。
本発明の新規化学物質１及び２は、藻類培養用培地の有効成分として有用である。新規化学物質１及び２は、単独で用いても、また両者を併用してもよい。
前記藻類培養用培地の適用対象となる藻類としては、好ましくは海洋性大型緑藻類が挙げられる。海洋性大型緑藻類としては、アオサ（ＵＬＶＡＬＥＳ）目の海藻で、例えば、ヒトエグサ科（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａｔａｃｅａｅ）、アオサ科（Ｕｌｖａｃｅａｅ）などの緑藻を挙げることができる。具体的にはヒトエグサ科に属する海藻としてヒトエグサ属ヒトエグサ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａｎｉｔｉｄｕｍ）、同属マキヒトエ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａｏｘｙｓｐｅｒｍｕｍ）、同属エゾヒトエグサ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａａｎｇｉｃａｖａ）、アオサ科に属する海藻としてアオノリ属ヒラアオノリ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａｃｏｍｐｒｅｓｓａ）、同属ボウアオノリ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、同属ウスバアオノリ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａｌｉｎｚａ）、アオサ属ボタンアオサ（Ｕｌｖａｃｏｎｇｌｏｂａｔａ）、同属アナアオサ（Ｕｌｖａｐｅｒｔｕｓａ）などを例示することができる。
海洋性大型緑藻類の培養に使用する培地は、有効成分である新規化学物質１及び／又は２を含むこと以外は、従来の培養方法（海洋性大型緑藻類が単細胞化してしまう培養方法）で使用されていたものと同様でよく、例えば、ＡＳＰ７培地、ＰＥＳ培地、ＰＥＳＩ培地など、又は単に滅菌済みの海水を使用することができる。培地中における新規化学物質１及び／又は２の有効濃度は、葉状体形成誘導を発揮できる範囲内であれば特に限定されないが、１０−１２〜１０−３μｇ／ｍｌとするのが好ましい。
培養時の温度は、海洋性大型緑藻類が生存できる範囲内であれば特に制限はないが、１５〜２５℃程度が適当である。
【図面の簡単な説明】  図１は、新規化学物質１の質量スペクトルを示す。
図２は、新規化学物質１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図３は、新規化学物質１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図４は、新規化学物質２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図５は、実施例１のマキヒトエ培養実験におけるサンプルを添加しない場合の培養５日後のマキヒトエ培養細胞の写真である。
図６は、実施例１のマキヒトエ培養実験におけるサンプルを添加した場合の培養５日後のマキヒトエ培養細胞の写真である。
図７は、Ｍｅ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図８は、Ｍｅ１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図９は、Ｍｅ１Ｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図１０は、Ｍｅ１Ｈ３の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図１１は、Ｍｅ１Ｈ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図１２は、Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図１３は、実施例５の培養１０日後の７段階希釈の写真である。
図１４は、実施例５の培養１０日後の６段階希釈の写真である。
図１５は、実施例７におけるアナアオサでの実験結果を示す写真である。
図１６は、実施例７におけるボウアオノリでの実験結果を示す写真である。
図１７は、ＹＭ−１−６９株、ＹＭ−２−２３株及びこれらの類似菌株のｇｙｒＢ  ＤＮＡ系統樹を示す。
図１８は、ＹＭ−１−６９株、ＹＭ−２−２３株及びこれら類似菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ系統樹、並びにこれらの菌株の大型緑藻に対する形態形成誘導の比活性を示す。
図１９は、新規化学物質１の部分構造を示す。
図２０は、新規化学物質１のＨＭＢＣスペクトルを解析した結果を示す。
図２１は、Ｍｅ１の部分構造及び相対立体配置を示す。
図２２は、Ｍｅ１のＨＭＢＣスペクトルを解析した結果を示す。
図２３は、Ｍｅ１Ｈ３のスペクトルを解析した結果を示す。
図２４は、Ｍｅ１Ｈ３のＨＭＢＣスペクトルを解析した結果を示す。
図２５は、Ｍｅ１Ｈ１のスペクトルを解析した結果を示す。
図２６は、Ｍｅ１Ｈ１のＨＭＢＣスペクトルを解析した結果を示す。
図２７は、Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅのスペクトルを解析した結果を示す。
図２８は、Ｍｅ１Ｈ１ＭｅのＨＭＢＣスペクトルを解析した結果を示す。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００２−２０３６０８の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
〔参考例１〕微生物の単離
本発明に使用する菌株は以下のように単離した。採集した新鮮藻体約１グラムに滅菌済みの海水１０ミリリットルを添加し、１分程度激しくボルテックスした。上清を滅菌済み海水で更に１０倍、１００倍希釈し、そのうち１００マイクロリットルを１／１０マリンアガープレートに分注し、滅菌済みのコンラージ棒でプレート全体に塗り広げた。室温で２〜３日後に成長した黄〜赤色のコロニーをそれぞれ別のマリンアガープレートに植菌し、単菌化されるまで植菌を続けた。２４穴あるいは４８穴のマイクロプレートに２ないし１ミリリットルのＡＳＰ７培地を分注し、それぞれのウェルに単細胞化したマキヒトエを２０細胞程度添加した。これに単菌化した各分離株のコロニーを滅菌済みの白金耳などを使って２穴ずつ直接接種した。このプレートを１９〜２２℃、明期１４時間／暗期１０時間で５日間培養し、マキヒトエの葉状体形成を倒立顕微鏡下で確認した。葉状体の形成がみられた菌株については前記と同じ方法で追試を行って確認をした。以上のようなスクリーニングの結果、葉状体形成活性を示す菌株として、ＹＭ−１−６９株とＹＭ−２−２３株が単離された。ＹＭ−１−６９株はサボテングサ（Ｈａｌｉｍｅｄａｏｐｕｎｔｉａ）（緑藻ミル目）から単離された菌株であり、ＹＭ−２−２３株はヒトエグサ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａｎｉｔｉｄｕｍ）（緑藻アオサ目）から単離された菌株である。
〔参考例２〕微生物の同定
参考例１で得られた微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ３領域及びｇｙｒＢ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定した。ＹＭ−１−６９株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ３領域及びｇｙｒＢ遺伝子のＤＮＡ塩基配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号３に示す。また、ＹＭ−２−２３株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ３領域及びｇｙｒＢ遺伝子のＤＮＡ塩基配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号４に示す。得られた配列についてデータベース検索（ＤＤＢＪ−ｆａｓｔａ）を行った結果、各配列は表１に示す微生物の配列と高い相同性を示した。
2004007510.tif 000002
また、ＹＭ−１−６９株及びＹＭ−２−２３株の生理生化学的性質について調査した結果を表２に示す。
2004007510.tif 000003
表１及び表２の結果から、ＹＭ−１−６９株はテナシバキュラム・スピーシーズ（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）と同定され、ＹＭ−２−２３株はＣｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘに属する菌株と同定された。
［実施例１］マキヒトエ培養実験
抗生物質等で無菌化処理したマキヒトエ（Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａｏｘｙｓｐｅｒｍｕｍ）はＡＳＰ７培地などの合成培地中では天然に見られるような葉状形態を失い、ほぼ単細胞状態となる。
４８孔浮遊培養用マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製、以下４８−ＭＴＰと略す）の一列目に改変ＡＳＰ７培地を１ｍｌ、二列目以降に０．９ｍｌを添加し、一列目に試験対象となる活性物質分画フラクションを１１μｌずつ添加し、ピペッティングによりよく撹拌しながら次の列に１００μｌを添加した。この操作を各フラクションに対して８〜１８回繰りかえすことにより、１０倍ずつの希釈系列を８〜１８段階作成することができる。最後の列に余る１００μｌは破棄した。ここに、最終的に細胞濃度が１ｍｌあたり１０〜２０細胞となるように希釈したマキヒトエ培養液を４８−ＭＴＰのすべての孔に１００μｌずつ添加して総量を１ｍｌとした。この４８−ＭＴＰを明期のみの条件で２２℃、３〜５日間培養し、倒立顕微鏡下で葉状体形成の判定を行った。葉状体形成が見られた最も低いサンプル濃度を最少有効濃度（ＭＥＣ）と定義し、ＭＥＣの最も低いサンプルに活性物質が集中していると考え、分離の指標とした。
サンプルを添加しない場合の培養５日後のマキヒトエ培養細胞の写真を図５に示す。また、サンプルを添加した場合の培養５日後のマキヒトエ培養細胞の写真を図６に示す。活性物質が存在した場合は図６のように葉状体の形成が見られた。
なお、ＡＳＰ７培地の組成は以下の通りである。
2004007510.tif 000004
2004007510.tif 000005
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［実施例２］新規化学物質１の分離・精製
種菌としてＹＭ−２−２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４１７）を用いた。本培養培地は、マリンブロス（ディフコ社製、３７．４ｇ／ｌ、又は表示成分に従って各試薬を混合して調製）を用いた。該菌株を１００ｍｌ三角フラスコ中で５０ｍｌのマリンブロスを用いて３０℃で２４時間振盪（毎分１００回転）培養し、これを更に培地４５０ｍｌのバッフル付１リットル容三角フラスコに全量を植菌し、同様の条件で２４時間培養した。本培養は、培地が８００ｍｌ入ったバッフル付１リットル容三角フラスコ１６本で振盪培養（毎分１３０回転）及び培地が４５０ｍｌ入った１リットル容三角フラスコ１０本で振盪培養（毎分１００回転）で行い、培養温度３０℃、培養時間は３日間とした。このようにして得られた培養液約１８リットルを遠心分離した。菌体は抽出するまで−２０℃に、培養濾液は４℃で保管した。前記本培養４回分（約７２リットル分）の菌体を５０％アセトニトリル水溶液１２００ｍｌで二回抽出し、濃縮した。濃縮液を培養濾液約７２リットルとあわせ、スチレンジビニルベンゼンポリマーであるダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社）２５００ｍｌに吸着させた。樹脂を１０％アセトニトリル水溶液６０００ｍｌで洗浄して脱塩し、５０％アセトニトリル水溶液６０００ｍｌで溶出して葉状体形成誘因画分を得た。活性画分をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０（Ｍ）（東ソー株式会社）に吸着させ、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ−２０％アセトニトリルで洗浄した後、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ−２０％アセトニトリル水溶液で活性画分を溶出した。溶出画分を減圧濃縮してアセトニトリルを除いた後、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社）５００ｍｌに吸着させ、１０％アセトニトリル水溶液１０００ｍｌで洗浄して脱塩し、５０％アセトニトリル水溶液１０００ｍｌで活性画分を得た。減圧濃縮した後、凍結乾燥を行い葉状体形成誘因画分を得た。前記培養と粗画分の調製二回分（培養液約１４０リットル分）をあわせて、移動相として１００ｍＭ  ＮａＣｌ−２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−２０％アセトニトリル水溶液（ｐＨ９）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス株式会社製Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ内径２５ｍｍ×長さ１２００ｍｍ）で精製し、葉状体誘因活性を示す画分を得た。この活性画分を濃縮、脱塩後、凍結乾燥し、移動相として１４〜２２％アセトニトリル−５ｇ（ＮＨ４）２ＣＯ３／ｌ水溶液を用いた高速液体クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス株式会社製ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣ  ３  ＭＬ、内径６．４ｍｍ×長さ１００ｍｍ×２本直列）で分離し、活性画分を凍結乾燥後、更に移動相として５〜２５％アセトニトリル−１％  ＮＨ３水溶液を用いた高速液体クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス株式会社製ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣ  ３  ＭＬ、内径６．４ｍｍ×長さ１００ｍｍ×２本直列）にて精製したところ、前記の理化学的性質を有する本発明の新規化学物質１を約１４０μｇ得た。
［実施例３］新規化学物質２の分離・精製
実施例２に従って分離される新規化学物質１は最終精製における５〜２５％アセトニトリル−１％  ＮＨ３水溶液という強アルカリ条件で新規化学物質２が変化したものであることが明らかになっている。また、新規化学物質１は精製前の培養液上清に新規化学物質２とともに存在する。新規化学物質２は中性−弱酸性で極めて不安定であるがアルカリ条件で誘導される新規化学物質１は比較的安定である。実施例２における最終精製の段階で、移動相として１７％アセトニトリル−５ｇ（ＮＨ４）２ＣＯ３＋５ｍｌ  ＮＨ３／ｌ水溶液を用いた高速液体クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス株式会社製ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣ  ３  ＭＬ、内径６．４ｍｍ×長さ１００ｍｍ×２本直列）により分離を行うと図４のような１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す化学物質２を得ることができる。
［実施例４］新規化学物質１のメチル化体及びその誘導体の調製と理化学的性質
新規化学物質１約１４０μｇをメタノール４０μｌに溶かし、ベンゼン１６０μｌ、トリメチルシリルジアゾメタン（１０％、ｎ−ヘキサン溶液、東京化成工業株式会社製）１００μｌを添加してよく撹拌し室温で２時間反応させた。ジアゾメタンの黄色が消えるまで少量ずつ酢酸を添加し、エバポレーターで溶媒を留去した後、移動相として５０〜１００％アセトニトリル−水を用いた高速液体クロマトグラフィー（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ、内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）にて分離したところほぼ定量的（収量約１５２μｇ、収率９９％）に新規化学物質１のトリメチル体（以下Ｍｅ１と略す）を得た。また、このトリメチル体はＮＭＲ測定溶媒である重メタノール中でメトキシ基（−ＯＣＨ３）の一つが徐々に重メトキシ基（−ＯＣＤ３）と置換しＭｅ１Ｂを与える。Ｍｅ１約１５２μｇをメタノール２００μｌに溶かし氷冷下水素化ホウ素ナトリウム１ｍｇを添加し１時間還元させた。反応液を、移動相として５０〜１００％アセトニトリル−水を用いた高速液体クロマトグラフィー（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ、内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）にて分離したところ高収量で（収量約１４０μｇ、収率９８％）Ｍｅ１の還元体（以下Ｍｅ１Ｈ３と略す）を得た。ここで得たＭｅ１Ｈ３の全量を乾燥ジエチルエーテル４００μｌに溶かし、室温で２０ｍｇ／ｍｌ水素化ホウ素ナトリウムエタノール溶液１００μｌを添加し室温で１５０分間反応させた。飽和塩化ナトリウム水溶液１００μｌを添加して１０分間撹拌した後、エバポレーターで溶媒を留去した。移動相として５０〜１００％アセトニトリル−水を用いた高速液体クロマトグラフィー（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ、内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）にて分離したところほぼ定量的（収量約１２３μｇ、収率９９％）にＭｅ１の高還元体（以下Ｍｅ１Ｈ１と略す）を得た。更に、ここで得たＭｅ１Ｈ１の全量を乾燥ジメチルスルホキシド４００μｌに溶かし、細かく砕いた水酸化ナトリウム１ｍｇを添加した後、ヨウ化メチル４０μｌを加えて室温で３０分反応させた。氷冷下、蒸留水５００μｌを加えて反応を止めた後、移動相として５０〜１００％アセトニトリル−水を用いた高速液体クロマトグラフィー（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ、内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）にて反応液をそのまま分離したところほぼ定量的（収量約１３５μｇ、収率９９％）にＭｅ１Ｈ１のメチル化体（以下Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅと略す）を得た。
ここで得た化合物は、以下に示した理化学的性質を示した。
［Ｍｅ１の理化学的性質］
１．物質の色：無色
２．分子量：４９９
３．分子式：Ｃ２７Ｈ３７Ｎ３Ｏ４Ｓ
質量分析：ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ  ５００［Ｍ＋Ｈ］＋
高分解能質量分析：実測値  ５００．２５６９［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値  ５００．２５８３（Ｃ２７Ｈ３８Ｎ３Ｏ４Ｓ）
４．核磁気共鳴シグナル：
１）１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、５００ＭＨｚ）：（図７）
δｐｐｍ０．９１６（３Ｈ，ｓ），０．９４１（３Ｈ，ｓ），０．９７３（３Ｈ，ｓ），１．０８６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５，１２．５，１３．０Ｈｚ），１．１３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，１２．０Ｈｚ），１．２７１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０，１３．０，１４．０Ｈｚ），１．３８０（３Ｈ，ｓ），１．４７（２Ｈ，ｍ），１．５０（１Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｍ），１．６９（２Ｈ，ｍ），１．７３（１Ｈ，ｍ），１．８４（１Ｈ，ｍ），２．１３０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５，７．０，１２．５Ｈｚ），２．３４（２Ｈ，ｍ），３．４８８（３Ｈ，ｓ），３．９１４（３Ｈ，ｓ），４．０３４（３Ｈ，ｓ），７．９１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．２５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（重メタノール、１２５ＭＨｚ）：（図８）
δｐｐｍ１５．４１３（ｑ），１９．５５９（ｔ），２０．７９７（ｔ），２０．９６１（ｑ），２１．９８１（ｑ），２８．４１６（ｔ），３３．８５５（ｑ），３４．１６４（ｓ），３７．９２８（ｓ），４０．３５６（ｔ），４１．７２２（ｔ），４２．９９６（ｔ），５２．２６６（ｑ），５３．２５５（ｑ），５２．２５５（ｑ），５３．３２８（ｄ），５７．４３２（ｄ），７９．２９１（ｓ），１２０．０（ｓ），１２７．３９２（ｄ），１４０．４０７（ｄ），１４１．６（ｓ），１４６．６５９（ｓ），１４９．８（ｓ），１６４．７６１（ｓ），１６６．０２７（ｓ），１６７．４０２（ｓ）
５．溶解性：水及びＤＭＳＯに難溶、５０〜１００％メタノール水溶液、５０〜１００％アセトニトリル水溶液などの含水溶媒に可溶、ヘキサン、クロロホルム等の低極性有機溶媒に難溶。
［Ｍｅ１Ｂの理化学的性質］
１．物質の色：無色
２．分子量：５０２
３．分子式：Ｃ２７Ｈ３４Ｄ３Ｎ３Ｏ４Ｓ
質量分析：ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ  ５０３［Ｍ＋Ｈ］＋
高分解能質量分析：実測値  ５０３．２７７７［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値  ５０３．２７７２（Ｃ２７Ｈ３５Ｄ３Ｎ３Ｏ４Ｓ）
４．核磁気共鳴シグナル：
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、５００ＭＨｚ）：（図９）
δｐｐｍ０．９１６（３Ｈ，ｓ），０．９４１（３Ｈ，ｓ），０．９７３（３Ｈ，ｓ），１．０８６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５，１２．５，１３．０Ｈｚ），１．１３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，１２．０Ｈｚ），１．２７１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０，１３．０，１４．０Ｈｚ），１．３８０（３Ｈ，ｓ），１．４７（２Ｈ，ｍ），１．５０（１Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｍ），１．６９（２Ｈ，ｍ），１．７３（１Ｈ，ｍ），１．８４（１Ｈ，ｍ），２．１３０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５，７．０，１２．５Ｈｚ），２．３４（２Ｈ，ｍ），３．４８８（３Ｈ，ｓ），３．９１４（３Ｈ，ｓ），７．９１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．２５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
５．溶解性：水及びＤＭＳＯに難溶、５０〜１００％メタノール水溶液、５０〜１００％アセトニトリル水溶液などの含水溶媒に可溶、ヘキサン、クロロホルム等の低極性有機溶媒に難溶。
［Ｍｅ１Ｈ３の理化学的性質］
１．物質の色：無色
２．分子量：４７１
３．分子式：Ｃ２６Ｈ３７Ｎ３Ｏ３Ｓ
質量分析：ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ  ４７２［Ｍ＋Ｈ］＋
高分解能質量分析：実測値  ４７２．２６３０［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値  ４７２．２６３４（Ｃ２６Ｈ３８Ｎ３Ｏ３Ｓ）
４．核磁気共鳴シグナル：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）：（図１０）
δｐｐｍ０．８０２（３Ｈ，ｓ），０．８１０（３Ｈ，ｓ），０．８８５（３Ｈ，ｓ），０．９５１（１Ｈ，ｍ），１．０１８（１Ｈ，ｍ），１．１５０（１Ｈ，ｍ），１．２５４（３Ｈ，ｓ），１．３５（１Ｈ，ｍ），１．３６（１Ｈ，ｍ）１．３７（１Ｈ，ｍ），１．５０（１Ｈ，ｍ），１．５４（１Ｈ，ｍ），１．５７（１Ｈ，ｍ），１．５８（１Ｈ，ｍ），１．６８８（１Ｈ，ｍ），１．９８４（１Ｈ，ｍ），２．１７４（２Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．３９９（３Ｈ，ｓ），３．７４１（３Ｈ，ｓ），４．５７０（２Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），５．４９５（１Ｈ，ｂｒ  ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．５８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（重メタノール、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）及びＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）スペクトルをもとにケミカルシフトを算定）：
δｐｐｍ１４．２（ｑ），１７．７（ｔ），１９．０（ｔ），２０．０（ｑ），２１．１（ｑ），２６．７（ｔ），３３．０（ｑ），３３．３（ｓ），３６．１（ｓ），３８．３（ｔ），４０．１（ｔ），４１．１（ｔ），５１．２（ｑ），５１．２（ｄ），５２．０（ｑ），５５．２（ｄ），６３．７（ｔ），７６．８（ｓ），１１９．２（ｓ），１２１．８（ｄ），１３４．１（ｓ），１３８．３（ｄ），１４６．２（ｓ），１５９．８（ｓ），１６２．８（ｓ），１６６．２（ｓ）
５．溶解性：水及び１００％メタノールに難溶、５０％メタノール水溶液、５０％アセトニトリル水溶液などの含水溶媒に可溶、ＤＭＳＯに可溶、ヘキサン、クロロホルム等の低極性有機溶媒に難溶。
［Ｍｅ１Ｈ１の理化学的性質］
１．物質の色：無色
２．分子量：４１５
３．分子式：Ｃ２４Ｈ３７Ｎ３ＯＳ
質量分析：ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ  ４１６［Ｍ＋Ｈ］＋
高分解能質量分析：実測値  ４１６．２７４７［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値  ４１６．２７３５（Ｃ２４Ｈ３８Ｎ３ＯＳ）
４．核磁気共鳴シグナル：
１）１Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム、５００ＭＨｚ）：（図１１）
δｐｐｍ０．８４２（６Ｈ，ｓ），０．９１８（３Ｈ，ｓ），０．９７（１Ｈ，ｍ），１．０４（１Ｈ，ｍ），１．１８（１Ｈ，ｍ），１．３２７（３Ｈ，ｓ），１．３６（１Ｈ，ｍ），１．４２（１Ｈ，ｍ），１．４５（１Ｈ，ｍ），１．５５（１Ｈ，ｍ），１．５８（１Ｈ，ｍ），１．６４（１Ｈ，ｍ），１．６６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１２Ｈｚ），１．７８（１Ｈ，ｍ），２．０２（２Ｈ，ｍ），２．０５（１Ｈ，ｍ），３．６５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ），４．６４７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ），４．８０１（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），７．２２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）及びＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）スペクトルをもとにケミカルシフトを算定）
δｐｐｍ１５．１（ｑ），１８．４（ｔ），１９．８（ｔ），２０．９（ｑ），２１．５（ｑ），２５．１（ｔ），３３．２（ｓ），３３．３（ｑ），３６．８（ｓ），３９．２（ｔ），４０．７（ｔ），４１．７（ｔ），５２．５（ｄ），５６．０（ｄ），６０．６１（ｔ），６２．３３（ｔ），６４．７３（ｔ），７７．０（ｓ），１０６．０（ｓ），１１９．８（ｄ），１３３．２（ｓ），１３９．７（ｄ），１４８．０（ｓ），１５６．２（ｓ）
５．溶解性：水に難溶、１０〜１００％メタノール水溶液、１０〜１００％アセトニトリル水溶液などの含水溶媒に可溶、ヘキサン、クロロホルム等の低極性有機溶媒に可溶。
［Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅの理化学的性質］
１．物質の色：無色
２．分子量：４５７
３．分子式：Ｃ２７Ｈ４３Ｎ３ＯＳ
質量分析：ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ  ４５８［Ｍ＋Ｈ］＋
高分解能質量分析：実測値  ４５８．３２０１［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値  ４５８．３２０５（Ｃ２７Ｈ４４Ｎ３ＯＳ）
４．核磁気共鳴シグナル：
１）１Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム、５００ＭＨｚ）：（図１２）
δｐｐｍ０．８４７（６Ｈ，ｓ），０．９２１（３Ｈ，ｓ），０．９６（１Ｈ，ｍ），１．０５（１Ｈ，ｍ），１．１８（１Ｈ，ｍ），１．３３１（３Ｈ，ｓ），１．３６（１Ｈ，ｍ），１．４１（１Ｈ，ｍ），１．４３（１Ｈ，ｍ），１．５７（１Ｈ，ｍ），１．５９（１Ｈ，ｍ），１．６７（１Ｈ，ｍ），１．６８（１Ｈ，ｍ），１．７７（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ），２．００（１Ｈ，ｍ），２．０９（１Ｈ，ｍ），２．１６（１Ｈ，ｍ），３．１９（３Ｈ，ｂｒ  ｓ），３．４５（３Ｈ，ｂｒ  ｓ），３．５０９（３Ｈ，ｓ），３．５６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ），４．４１９（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１０．５Ｈｚ），４．６４４（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），７．３５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．４８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）及びＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）スペクトルをもとにケミカルシフトを算定）
δｐｐｍ１５．０（ｑ），１８．７（ｔ），２０．０（ｔ），２０．６（ｑ），２１．７（ｑ），２６．２（ｔ），３３．２（ｓ），３３．５（ｑ），３６．９（ｓ），３９．４（ｔ），４１．０（ｔ），４２．０（ｔ），５２．８（ｄ），５６．２（ｄ），５８．４（ｑ），５９．０（ｑ），５９．１（ｑ），７０．２（ｓ），７４．０（ｓ），７５．６（ｓ），７６．９（ｓ），１０９．９（ｓ），１２０．５（ｄ），１３５．１（ｓ），１３９．２（ｄ），１４５．７（ｓ），１５５．１（ｓ）
５．溶解性：水に難溶、３０〜１００％メタノール水溶液、３０〜１００％アセトニトリル水溶液などの含水溶媒に可溶、ヘキサン、クロロホルム等の低極性有機溶媒に可溶。
［実施例５］新規化学物質１の最少有効濃度（ＭＥＣ）の検討
実施例１の場合と同様に４８−ＭＴＰに単離精製した新規化学物質１を終濃度１μｇ／ｍｌからはじめ、１６段階希釈を行った。このとき、マキヒトエの細胞は培地１ｍｌあたり約２０細胞とした。希釈の際は一段階希釈するごとにピペットチップを交換した。このシリーズを３列用意し、実施例１と同様に３日間培養した。その結果、１２段階希釈の列までマキヒトエの葉状体形成が見られた。このことから新規化学物質１のＭＥＣは、
１μｇ／ｍｌ×１０−１２＝１ａｇ／ｍｌ（ａｔｔｏ−ｇｒａｍ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ）
となる。長期の培養に伴い、新規化学物質１は増殖したマキヒトエに消費され、葉状体が崩壊し始める。培養１０日後の７段階希釈（新規化学物質１終濃度１×１０−７μｇ／ｍｌ）の写真を図１３に示す。葉状体の原型がやや残っているが葉状体崩壊が観察される。培養１０日後の６段階希釈（新規化学物質１終濃度１×１０−６μｇ／ｍｌ）の写真を図１４に示す。葉状体が崩壊せずに維持されており、培養１０日後のＭＥＣは、
１×１０−６μｇ／ｍｌ＝１ｐｇ／ｍｌ（ｐｉｃｏ−ｇｒａｍ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ）
となる。マキヒトエの細胞は実施例１の条件では一日に約２回細胞分裂を行うことから初期細胞数が２０の場合、３日後には計算上、
２０×（２×２）３＝１，２８０細胞
であるが、１０日間の培養では計算上、
２０×（２×２）１０＝２０，９７１，５２０細胞
となり、３日後と比べると１０日後には細胞数が１０，０００倍以上に増殖しており、ＭＥＣが細胞数と培養日数によって大きく変化することが説明できる。つまり、新規化学物質１は培養日数と細胞の増殖に応じて適宜添加する必要がある。
［実施例６］新規化学物質１及び誘導体の活性
実施例５と同様に新規化学物質１及びその誘導体についての最少有効濃度を測定したところ以下のような結果となった。
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新規化学物質１をメチル化すると活性が１／１０８に減少した。このことから活性には実施例４に示したようにトリメチルシリルジアゾメタン等のメチル化剤でメチル化される官能基が重要であると考えられる。
［実施例７］アナアオサ、ボウアオノリの培養実験
静岡県清水市三保で採集したアナアオサ（Ｕｌｖａｐｅｒｔｕｓａ）、ボウアオノリ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）から得られた遊走細胞を抗生物質混液添加ＡＳＰ７培地で走光性を利用して洗浄後、滅菌したカバーガラスを敷き詰めた角形シャーレに添加して５日間の無菌化処理を行った。カバーガラスに遊走細胞が着底し発生が始まったところで各カバーガラスを６−ＭＴＰの各孔に入れ、抗生物質の入っていないＡＳＰ７培地１０ｍｌを添加した。試験区には新規化学物質１を１ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、対象区には何も添加せずに実施例１と同じ条件で７日間培養した。１０日後、試験区、対象区のカバーガラスを更に同じ条件の培地が添加してある培養試験管に植え継いで更に７日間培養した。アナアオサでの実験結果を図１５に、ボウアオノリの実験結果を図１６に示す。試験区、対象区を比較すると明らかなように、対象区の場合は仮根だけが異常に発達し、正常な葉状体の形成が見られないが、新規化学物質１を添加した場合は、着底後の正常な発生と葉状体の形成が見られた。
また、抗生物質混液添加ＡＳＰ７培地は、ＡＳＰ７培地に以下の組成を持つ抗生物質混液を２％添加したものである。
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［実施例８］大型緑藻に対する形態形成誘導の比活性
実施例５と同様にして、ＹＭ−１−６９株及びＹＭ−２−２３株、並びに図１７に示した類似菌株についての最少有効濃度を測定したところ図１８に示す結果が得られた。ここで、横軸は類似菌株の培養上清１μｌで活性化されるマキヒトエ培養液のｍｌ数を表す。例えば、図１８においてＹＭ−２−２３株は培養上清液１μｌでマキヒトエ培養液約８０００ｍｌ活性化させることが可能である。
［実施例９］新規化学物質１及びその誘導体の部分構造の決定
新規化学物質１の各種ＮＭＲスペクトル及びマススペクトルから図１９に示した部分構造が導かれた。これらの部分構造を、ＨＭＢＣスペクトルを解析することにより図２０に示したｄｒｉｍａｎタイプのテルペノイド構造と４置換ベンゼン環につなげることができた。図２１に示したように、新規化学物質１のトリメチル化体Ｍｅ１のＮＭＲスペクトルからは更に４置換ベンゼン環の一置換基の部分構造とＮＯＥＳＹスペクトルを解析することにより相対立体配置を決定した。また、図２２に示したようにＨＭＢＣスペクトルからこれまでの推定構造を確認した。図２３及び図２４に示したようにＭｅ１Ｈ３においては、ｄｒｉｍａｎ部分とベンゼン環の間でＮＯＥＳＹ及びＨＭＢＣスペクトルの相関ピークが観察され、これら二つの構造を炭素番号１１−１６、及び８−０−２１でつなぎ、部分構造を推定した。新規化学物質１の還元体Ｍｅ１Ｈ１においては２４位のメチレン基とベンゼン環上の２１位の間に相関ピークが観測され、図２５及び図２６に示したように４置換ベンゼン環の最後の置換基が決定した。Ｍｅ１Ｈ１のメチル化体Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅの各種ＮＭＲスペクトルから図２７及び図２８に示したようにベンゼン環、Ｎ−メチル基、２４位のメチレン基の相関が観測され、これまでの推定部分構造を確認した。
実施例４に示したように、Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅは新規化学物質１をメチル化、還元反応、再メチル化した化合物であるので、新規化学物質１は式１：
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に示したような構造となる。また、実施例３に示したように、新規化学物質１は新規化学物質２のアルカリ処理による誘導体であるため、新規化学物質２は、前記式１の化合物のケトン体である式２、式３あるいは式４のいずれかで示される化合物、あるいはこれらの混合物である。
式２：
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式３：
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式４：
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更に、Ｍｅ１の構造を式５に、実施例４に示したＭｅ１の重メトキシ置換基体Ｍｅ１Ｂの構造を式６に、Ｍｅ１の部分還元体Ｍｅ１Ｈ３の構造を式７に、Ｍｅ１の還元体Ｍｅ１Ｈ１の構造を式８に、Ｍｅ１Ｈ１の再メチル化体Ｍｅ１Ｈ１Ｍｅの構造を式９に示した。
式５：
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式６：
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式７：
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式８：
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式９：
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本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明は、新規化学物質を使ったアオサ、ヒトエグサなどの海洋性大型緑藻類の新規な培養・養殖技術を提供する。この方法によれば、実験室内での無菌的な培養や種苗の安全な維持管理、更に、養殖現場等での海洋性大型緑藻類の安定な成長と生産を行うことが可能である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１７】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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