(57)【要約】本発明は、ヒトＣ型肝炎治療薬のスクリーニング系構築を目的とした、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の全長を発現するトランスジェニック動物を提供する。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを組み込み、ＨＣＶ遺伝子全長を発現することができる、トランスジェニックＣ型肝炎モデル動物およびＣ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを含むベクターをＥＳ細胞に導入し、該ＥＳ細胞を仮親中で個体発生させることを含む、全長ＨＣＶ遺伝子を保有するＣ型肝炎モデル動物の作出方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを組み込み、ＨＣＶ遺伝子全長を発現することができる、トランスジェニックＣ型肝炎モデル動物。
【請求項２】
動物がマウスである請求項１記載のＣ型肝炎モデル動物。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡが、スイッチング発現するように導入されている、請求項１または２記載のＣ型肝炎モデル動物。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡをスイッチング発現させる手段が、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡとプロモーターの間にｌｏｘＰ配列に挟まれたスタッファー遺伝子を介在させることである、請求項３記載のＣ型肝炎モデル動物。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを導入したＥＳ細胞（胚性幹細胞）を構成要素とするキメラ胚を個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞および生殖細胞染色体中に上記全長ＨＣＶ遺伝子を保有する、請求項１〜４のいずれか１項記載のＣ型肝炎モデル動物。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを含むベクターをＥＳ細胞に導入し、該ＥＳ細胞構成要素とするキメラ胚を仮親中で個体発生させることを含む、全長ＨＣＶ遺伝子を保有するＣ型肝炎モデル動物の作出方法。
【請求項７】
動物がマウスである、請求項６記載の作出方法。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡが、スイッチング発現するように導入される、請求項６または７記載の作出方法。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡをスイッチング発現させる手段が、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡとプロモーターの間にｌｏｘＰ配列に挟まれたスタッファー遺伝子を介在させることである、請求項８記載の作出方法。
【請求項１０】
以下の工程を含むＣ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項記載の動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）上記動物のＣ型肝炎ウイルス量を測定する工程、および
（ｃ）被験物質を投与しない場合と比較して、Ｃ型肝炎ウイルス量を減少させる物質を選択する工程
【請求項１１】
免疫不全状態が導入された請求項１〜５のいずれか１項記載のＣ型肝炎モデル動物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
ヒトＣ型肝炎治療薬のスクリーニング系構築を目的とした、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の全長を発現するトランスジェニック動物に関する。
背景技術
Ｃ型肝炎ウイルス（以下，「ＨＣＶ」という）の遺伝子をマウスなどの小動物に導入し、導入した遺伝子を発現させて肝炎の発症モデル動物を作ろうという試みはこれまでも多く行われてきた（Ｃ．ＰａｓｑｕｉｎｅｌｌｉらＡｂｓｔｒａｃｔ  ｂｏｏｋ  ｏｆ  ２ｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊｕｌｙ  ３１−Ａｕｇｕｓｔ  ５，１９９４  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）；Ｃ．ＰａｓｑｕｉｎｅｌｌｉらＡｂｓｔｒａｃｔ  ｂｏｏｋ  ｏｆ  ３ｒｄ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ（Ａｕｇｕｓｔ  ２８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ３，１９９５  Ｇｏｌｄ  ｃｏａｓｔ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；Ｋａｚｕｈｉｋｏ  Ｋｏｉｋｅら、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６、ｐ３０３１−３０３８、１９９５；Ｔ．Ｋａｔｏ、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ、１４１、ｐ９５１−９５８、１９９６）。ＨＣＶと同様にヒトやチンパンジーにしか感染性がないポリオウイルスでは、受容体遺伝子をマウスに導入したトランスジェニックマウスが開発されており、ワクチンの評価系に利用されている。しかし、ＨＣＶについてはウイルスの受容体遺伝子や感染後の細胞内での挙動など、不明な点が多い。ほかの多くの遺伝子と異なり、ＨＣＶ遺伝子はマウス個体への組み込みが困難であり、また、うまく組み込まれてもＨＣＶ蛋白質の産生が認められない例がほとんどであった。さらに、ＨＣＶ蛋白質の産生が認められた極めて稀な例でも胎児期より蛋白質が産生され、免疫寛容になるために、生後も典型的な肝炎症状を呈するものはなく、肝炎モデルにはなり得なかった。
本発明者らは、先にＨＣＶ由来の部分ｃＤＮＡをスイッチング発現するように構築したベクターをマウスの受精卵へマイクロインジェクションにより導入することにより、マウスにヒトのＣ型肝炎と似た病態を発現させることに成功した（特開平１０−８４８１３号公報）。ここで、スイッチング発現とは、所望の時期に特定の遺伝子を発現させることができる発現システムをいい、動物がある程度成長した段階でＨＣＶ由来蛋白質を産生することができるため、Ｃ型肝炎モデル動物で問題となっていた免疫寛容の問題を回避することができた。
しかし、該発明において発現するのは、ＨＣＶの部分遺伝子であり、全長遺伝子を発現したという報告はなかった。
全長ＨＣＶ遺伝子をマウスに導入し、ＨＣＶ発現モデル動物を作成しようとする試みもあった（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８９，１５０−１５８，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９８）。しかし、上述のような発現制御はされておらず、さらに子孫マウスにおいて全長ＨＣＶが発現されているというデータは、得られていない。
一方、本発明者らは、ＨＣＶの全長遺伝子をスイッチング発現させることが可能なベクターの構築に成功していたが（特開２０００−１５２７９３号公報）、該ベクター確立の時点では、安定に遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作出したという報告はされていなかった。
発明の開示
本発明は、ＨＣＶ全長遺伝子を発現するＣ型肝炎モデル動物および該モデル動物を作出する方法の提供を課題とする。
本発明者らは、上記問題点に鑑み、Ｃ型肝炎モデル動物の作出について鋭意検討を行った結果、ＨＣＶの全長ｃＤＮＡをスウィッチング発現するように構築したベクターをＥＳ細胞を介して動物に導入することにより、安定的にＨＣＶ遺伝子を発現するトランスジェニック動物ラインが作出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の事項を要旨とする。
（１）  Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを組み込み、ＨＣＶ遺伝子全長を発現することができる、トランスジェニックＣ型肝炎モデル動物。
（２）  動物がマウスである（１）のＣ型肝炎モデル動物。
（３）  Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡが、スイッチング発現するように導入されている、（１）または（２）のＣ型肝炎モデル動物。
（４）  Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡをスイッチング発現させる手段が、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡとプロモーターの間にｌｏｘＰ配列に挟まれたスタッファー遺伝子を介在させることである、（３）のＣ型肝炎モデル動物。
（５）  Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを導入したＥＳ細胞（胚性幹細胞）をキメラ胚を介して個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体および生殖細胞中に上記全長ＨＣＶ遺伝子を保有する、（１）〜（４）のいずれかのＣ型肝炎モデル動物。
（６）  Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡを含むベクターをＥＳ細胞に導入し、該ＥＳ細胞をキメラ胚を介して個体発生させることを含む、全長ＨＣＶ遺伝子を保有するＣ型肝炎モデル動物の作出方法。
（７）  動物がマウスである、（６）の作出方法。
（８）  Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡが、スイッチング発現するように導入される、（６）または（７）の作出方法。
（９）  Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡをスイッチング発現させる手段が、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ＤＮＡとプロモーターの間にｌｏｘＰ配列に挟まれたスタッファー遺伝子を介在させることである、（８）の作出方法。
（１０）  以下の工程を含むＣ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
（ａ）（１）〜（５）のいずれかの動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）上記動物のＣ型肝炎ウイルス量を測定する工程、および
（ｃ）被験物質を投与しない場合と比較して、Ｃ型肝炎ウイルス量を減少させる物質を選択する工程
（１１）  免疫不全状態が導入された（１）〜（５）のいずれかのＣ型肝炎モデル動物。
本発明で用いた、全能性細胞に目的の遺伝子を導入し、該全能性細胞を個体発生させることを特徴とするトランスジェニック動物作出方法は、特に、従来発現が困難であったタンパク質等を発現することが可能なトランスジェニックマウスの作出に好適であると考えられる。従って、他の方法で作出したトランスジェニックマウスでは発現の困難であったタンパク質等でも、本発明で用いたトランスジェニック作出法ならば、発現することが可能である。ここでいう、発現の困難なタンパク質等とは、トランスジェニック動物中では発現量が少ないために、タンパク質等全体もしくは一部分の発現が確認できないタンパク質等または発現が強すぎて他の方法で作出したトランスジェニック動物では致死となってしまうようなタンパク質等のことをいう。
本発明は、全長ＨＣＶ  ＤＮＡ遺伝子が発現可能に導入された病態モデル動物であり、該モデル動物は、ライン化されており導入遺伝子を子孫に伝達することが可能である。
１．全長ＨＣＶ遺伝子を含むベクターの取得
本発明のモデル動物の作出に用いるベクターは、ＨＣＶ遺伝子の両末端が正確かつ均一に転写できるように構築されているベクターが好ましい。
ここで、「両末端を正確に転写できる」とは、ＤＮＡから作られるＲＮＡが、ウイルス本来のゲノムＲＮＡと全く同一かあるいは翻訳能力に影響を与えない程度の塩基配列の差異しか存在しない、という意味である。また、「両末端を均一に転写できる」とは、一定の再現性をもって特定の塩基配列を持つＲＮＡを作ることができる、という意味である。
ＲＮＡウイルスの遺伝子の両末端を正確かつ均一に転写するためには、ＨＣＶウイルスの遺伝子をコードするＤＮＡの５’末端の上流及び３’末端の下流のそれぞれにセルフプロセッシングにより切断するリボザイムをコードするＤＮＡを配置する方法を例示することができるが、これに限定されるわけではない。このようなＤＮＡとしてハンマーヘッドリボザイムをコードするＤＮＡが挙げられる（特開平２０００−１５２７９３号公報）。
全長ＨＣＶ遺伝子を含むベクターは、特開平２０００−１５２７９３号公報に記載の方法に従って、上述したようなリボザイムをコードする２つのＤＮＡとＨＣＶ遺伝子とを含むＤＮＡ断片をＰＣＲなどにより作製し、このＤＮＡ断片を適当なプロモーターとターミネーターを含むベクターに挿入することにより作製できる（ｐ５’−３’ＲＢＺ）。
本発明のベクターは、宿主細胞内に移入された後、直ちに発現するものであってもよいが、特定の処理によりはじめて発現を開始するものの方が好ましい。特定の処理により発現を開始させる手段としては、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼに認識されないプロモーターを使用する手段、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ発現システム（Ｎａｔ  ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１５０，ｐ４６７−４８６、特開平１０−８４８１３号公報）を使用する手段などを例示することができる。前者の手段では、ベクター中のプロモーターを認識できるＲＮＡポリメラーゼを宿主細胞内で発現させることにより、目的遺伝子の発現を開始させることができる。後者の手段では、Ｃｒｅ酵素を宿主細胞内で発現させることにより、目的遺伝子の発現を開始させることができる。
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ発現システムは、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた挿入遺伝子（Ｓｔｕｆｆｅｒ、これが、プロモーターと目的とする遺伝子の間に介在し、その遺伝子の発現を抑制する）と、挿入遺伝子を１つのｌｏｘＰ配列とともに除去するＰ１ファージＣｒｅＤＮＡ組換え酵素（以下、単に「Ｃｒｅ」という）とからなり、Ｃｒｅを作用させることにより任意の時期に目的の遺伝子を発現させることができる。スタッファーは、特定の遣伝子に限定されず、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子がスタッファーとして挙げられる。ｌｏｘＰ配列は、大腸菌Ｐ１ファージの遺伝子に由来する長さ３４ｂｐのＤＮＡである。Ｃｒｅは、大陽菌Ｐ１ファージに由来する分子量約３８ｋＤのＤＮＡ組換え酵素である。Ｃｒｅは例えば、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスを感染させることにより作用させることができる。ＨＣＶ由来のｃＤＮＡをスイッチング発現させることにより、動物がある程度成長した段階でＨＣＶ由来の蛋白質を産生させることができる。
スイッチング発現する機能を有する、プロモーターとｌｏｘＰ配列を含むベクターは、特開平１０−８４８１３号公報に記載の方法に従って作製でき（ｐＣＡＬＮ／ｐＢＲ）、該ｐＣＡＬＮ／ｐＢＲを導入した大陽菌は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７５３として１９９７年７月２２日に寄託されている。
前記全長ＨＣＶ遺伝子を含むベクターとスイッチング発現する機能を有する、プロモーターとｌｏｘＰ配列を含むベクターを用いて、本発明の全長ＨＣＶ遺伝子を有するモデル動物の作出に直接用いるベクター（ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ  ＲＢＺ）を特開平２０００−１５２７９３号公報に記載の方法に従って作製することができる。該ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ  ＲＢＺを導入した大腸菌は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６３として１９９７年１０月３１日に寄託されている。
２．全長ＨＣＶ遺伝子発現トランスジェニック動物の作出
トランスジェニック動物は、例えば、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７３８０−７３８４，１９８０の方法等に従って、上記導入遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞および生殖細胞染色体中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって作出することができる。個体へと発生させる全能性細胞は、目的のタンパク質の発現の程度が好ましい全能性細胞を選択しておくことが望ましい。哺乳動物としては、好ましくはマウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類であり、それらの中でも特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが好ましいが、技術的にはヒトを除く全ての動物種を対象とすることが可能である。遺伝子を導入する全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を勘案した場合、ＥＳ細胞を用いることが望ましい。ＥＳ細胞を胚盤胞の中に注入すると、宿主胚の内部細胞塊と混ざりあってマウス胚と胎仔の形成に寄与してキメラマウスができる。また、胎仔本体がＥＳ細胞だけからなるマウスができることもある。キメラマウスの中でＥＳ細胞が将来卵や精子を形成する始原生殖細胞の形成に寄与した場合、生殖系列キメラができ、このキメラマウスを交配することにより、ＥＳ細胞由来のマウス個体を得ることができる。培養細胞への遺伝子導入法としては、公知の静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等も利用できるが、エレクトロポレーション法が好ましい。
ＨＣＶ全長遺伝子導入を行った一部のＥＳ細胞においては、細胞染色体中に導入遺伝子が導入される。遺伝子導入ベクターにおいてマーカー遺伝子を利用している場合には、所望の遺伝子導入が行われた細胞はマーカー遺伝子を得ることとなるので、このマーカー遺伝子を指標とすることにより選抜を行うことができる。例えば、マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、ベクター導入後の細胞を、致死濃度の薬剤存在下で培養することにより所望の遣伝子導入が行われた細胞を選抜することができる。
本発明の哺乳動物作出は、上述の哺乳動物細胞を初期胚と集合、あるいは胚盤胞腔に注入してキメラ胚を得、該キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、個体まで発生させることによって行うことができる。胚に注入する細胞として、ＥＳ細胞を用いた場合には、これを胚盤胞に注入することによりキメラ胚を作製することができる。注入に用いる胚盤胞は、妊娠した雌の子宮を灌流することによって得ることができる。胚に注入した細胞が発生分化中の胚に取り込まれたか否かを個体作出後に検定できるようにするため、作出された個体の外部的特徴（例えば、毛色）が、注入した細胞に由来する部分と胚盤胞に由来する部分とで異なるように、胚盤胞を得る系統を選択することが望ましい。得られた動物の中から全長ＨＣＶ  ＤＮＡを有しているものを選抜し、さらにＨＣＶ由来のＤＮＡがスイッチング発現するものを選抜して、本発明のＣ型肝炎モデル動物を得ることができる。また、キメラ動物の生殖細胞が注入した細胞に由来すれば、キメラ動物を適当な系統の同種動物と交配させ産仔を得ることによっても本発明のＣ型肝炎モデル動物を得ることができる。
得られた動物からＤＮＡを抽出し、それを鋳型とし、導入したＤＮＡに対応するオリゴヌクレオチドを合成してプライマーとし、ＰＣＲを行う。ＨＣＶのｃＤＮＡが導入されていれば増幅ＨＣＶ  ＤＮＡが検出されるが、ＨＣＶのＤＮＡが導入されていなければ増幅ＨＣＶ  ＤＮＡは検出されない。また、ＨＣＶのＤＮＡがスイッチング発現しているかどうかは、ＨＣＶのＤＮＡの発現を阻害している配列を除去し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで該ＤＮＡに対応する蛋白質が産生されているかどうかを調べればよい。ＨＣＶのＤＮＡに対応する蛋白質が産生されているかどうかは、ウエスタンブロット法や蛍光抗体染色法などにより調べることができる。
ＨＣＶのＤＮＡは、スイッチング発現するので本発明のＣ型肝炎モデル動物は、そのままの状態では肝炎を発症せず、肝炎を発症させるためには当該ＤＮＡの発現を抑制している配列を除去することが必要である。そのような抑制配列を除去するには、ＤＮＡ組換え酵素を用いればよく、例えば、抑制配列が、ｌｏｘＰ配列であれば、ｌｏｘＰ配列を除去する酵素であるＣｒｅを発現するアデノウイルスＡｘＮＣｒｅを感染させればよい。ＣｒｅおよびＡｘＮＣｒｅは、Ｙｕｍｉ  ＫａｎｅｇａｗａらＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，１９，３８  １６−２１，１９９５の記載に従って作製することができる。
導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ）として、交配によりＨＣＶ遣伝子を染色体の一部に安定的に発現可能に組み込んだ動物を効率よく作出することができる。
また、本発明のＨＣＶ遺伝子発現トランスジェニック動物の作出方法は、全長ＨＣＶ遺伝子だけではなく、部分ＨＣＶ遺伝子にも応用できる。
本発明においては、さらに多くのＨＣＶを発現させる目的で、本発明のＨＣＶ遣伝子発現トランスジェニック動物にさらなる処置を施してもよい。
例えば、本発明のＨＣＶ遺伝子発現トランスジェニック動物におけるＨＣＶ発現量をさらに多くする目的で、本発明のトランスジェニック動物の免疫機能を欠損・抑制し、免疫不全の状態にすることも可能である。具体的な例としては、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ発現システムを用いている場合、ＨＣＶの発現を誘導する為に投与されたＣｒｅ発現アデノウイルス感染細胞が、ＣＤ８抗原陽性細胞障害性Ｔ細胞などの免疫細胞によって排除されることが考えられる。そのような場合、本発明のトランスジェニック動物が免疫不全の状態であれば、Ｃｒｅ発現アデノウイルス感染細胞の排除が起こりにくくなり、効率よくＨＣＶの発現ができると考えられる。免疫不全の状態になった本発明のトランスジェニック動物は、免疫機能の全部又は一部が欠損していたり、免疫機能の全部又は一部が抑制されている動物であれば特に制限されない。そのような免疫不全なトランスジェニック動物を作製する方法としては、例えば、本発明のトランスジェニック動物を免疫不全動物と交配させて得る方法や、本発明のトランスジェニック動物に薬剤を投与して免疫を抑制する方法、本発明のトランスジェニック動物に免疫寛容を引き起こす方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
免疫不全状態のトランスジェニック動物を作製する為に、本発明のトランスジェニック動物と交配させる免疫不全動物は当業者が適宜選択することができるが、動物がマウスの場合には、例えばヌードマウス、ｓｃｉｄマウス、ｓｃｉｄ−ＮＯＤマウス、ＲＡＧ−１ＫＯマウス、ＲＡＧ−２ＫＯマウス、ＩＲＦ−１ＫＯマウス、などを挙げることができる。
本発明のトランスジェニック動物を免疫不全状態にする為に投与される薬剤の具体的な例としては、免疫抑制剤を挙げることができる。免疫抑制剤は免疫抑制効果があれば特に制限されず、例えば市販されているサイクロスポリン、タクロリムス、ステロイド、ある種の抗癌剤、抗ＣＤ８抗体等の免疫抑制効果が知られている抗体などを便用することが可能である。
免疫寛容は、抗原特異的に免疫応答が失われている状態であり、胎児期または生後間もない動物に寛容原となる抗原を複数回投与したり、動物の体内で寛容原をコードする遺伝子を発現させること等によって引き起こすことが可能である。従って、例えば、アデノウイルスの排除を起こりにくくする場合には、アデノウイルス由来の抗原を寛容原として用いればよい。
本発明のＨＣＶ遺伝子発現トランスジェニック動物には、免疫不全状態が導入されたトランスジェニック動物などのように、さらに多くのＨＣＶを発現させる為に更なる処置が施されたトランスジェニック動物も含まれる。
３．Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニング
全長ＨＣＶ遺伝子発現トランスジェニック動物を用いて、Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニングを行うことができる。
本発明の全長ＨＣＶ遺伝子を発現するトランスジェニック動物に被験物質を投与し、該動物中のＣ型肝炎ウイルス量を測定し、被験物質を投与しない場合のＣ型肝炎ウイルス量と比較することにより、Ｃ型肝炎ウイルス量を減少させる物質、すなわちＣ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質をスクリーニングすることが可能である。
本スクリーニング方法において、ＨＣＶ量は、ＨＣＶそのもののみならずＨＣＶ量を直接あるいは間接的に示すものならば何を測定してもよい。例えば、血中のウイルス量を直接測定してもよいし、肝炎の指標である血清生化学値（ＡＬＴ、ＡＳＴ）などを指標としてＨＣＶ量を測定してもよい。簡便なのは血中のウイルス量を直接測定することであり、その場合の測定方法としては吸光度測定、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＭＡ−ＨＰＡ、ＥＬＩＳＡなど公知のいずれの方法を用いてもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明の技術的範囲は、実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕  導入ＤＮＡコンストラクト
リボザイムによる感染性ＨＣＶを産生するプラスミドの構築の略図を示す（図１）。図１中、最下段のプラスミドの図に付された数字は、ＥｃｏＲＩサイトの最初の塩基を１として、その位置から制限酵素サイトの最初の塩基までの数を表している。ＸｈｏＩおよびＸｂｏＩサイトは図に表記以外にも存在する。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーとニワトリβアクチンプロモーター、ｌｏｘＰ配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘＰ配列、リボザイム、ＨＣＶ全長ｃＤＮＡおよびリボザイムを順に接続した構築となっている。導入ＤＮＡフラグメントはＥｃｏＲＶおよびＸｍｎＩで切り出すことができる。制限酵素処理したベクターをアガロースゲル電気泳動し、必要なＤＮＡフラグメントを回収した。回収したＤＮＡフラグメントはＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製した後に、フェノール／クロロホルム、次いでクロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。沈殿を７０％エタノールで洗浄した後に、滅菌ＰＢＳで溶解した。
〔比較例１〕  受精卵へのマイクロインジェクションによるトランスジェニックマウスの作出
（１）マイクロインジェクション
ＤＮＡフラグメントのマイクロインジェクションにはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）系あるいはＢＡＬＢ／ｃ系マウスの前核期受精卵を用いた。Ｂ６系は凍結受精卵を融解して用いた。ＢＡＬＢ／ｃ系受精卵は過剰排卵処理を施した雌を同系の雄と交配し、翌朝プラグ確認された雌の卵管膨大部より回収した。回収した卵子はヒアルロニダーゼ処理して卵丘細胞を除去し、１００μＭのＥＤＴＡを添加したＷｈｉｔｔｅｎ’ｓ（ＷＭ＋ＥＤＴＡ）培地で洗浄した後に前核期受精卵を選別して用いた。導入フラグメントはＰＢＳで希釈して約３ｎｇ／μｌに調製したものを、マイクロマニピュレータを用いて受精卵前核へマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションは、「Ｃ５７ＢＬ／６系マウスを用いたトランスジェニックマウスの作製法」  ジーンターゲティングの最新技術  別冊実験医学（羊土社）（２０００）ｐｐ１９０−２０７、上田乙也、寺社下浩一、鈴木宏志に記載の方法で行った。翌日に２細胞期に発生した胚を受容雌卵管に移植した。移植１９日後に帝王切開あるいは自然分娩にて産仔を得た。
遺伝子型解析は、サザンブロットにより実施した。プローブは導入フラグメントに含まれるネオマイシン耐性遺伝子あるいはＨＣＶコア蛋白遺伝子の一部を、α［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識して用いた。
コア蛋白は定量法にて、ＮＳ５Ｂ蛋白はウエスタンブロットにて検出を行なった。
Ｂ６系受精卵を用いて得られたＦｏｕｎｄｅｒは５匹（＃４雄、５雄、８雌、９雌および１０雄）であった。これらのＦｏｕｎｄｅｒを交配したところ、うち３匹のＦｏｕｎｄｅｒ（＃４、５および１０）に由来する次世代個体が得られた。また、ＢＡＬＢ／ｃ系受精卵を用いて得られたＦｏｕｎｄｅｒは１０匹（＃１−５、１−１１、２−２３、３−５、４−１、４−３、４−１２、４−２１、５−９および５−１５）であった。うち＃１−５および＃４−１は次世代は得られるものの導入遺伝子の伝達が確認されなかった。Ｆｏｕｎｄｅｒの交配の結果、ライン化できたのは８ラインであった。これらのＴｇｍ（トランスジェニックマウス）を用いて遺伝子発現の確認を行った。遺伝子発現の解析はアデノウイルスベクターによりＣｒｅ遺伝子を導入して、スタッファーであるネオマイシン耐性遺伝子を除去することによって下流のＨＣＶ遺伝子の発現を誘導した後に、コア蛋白およびＮＳ５Ｂ蛋白の検出を試みた。その結果、明瞭にＨＣＶ遺伝子の発現があると判断できるラインは得られなかった。有用なラインを得るためには、非常に多くのラインを樹立する必要があるが、前核へのマイクロインジェクション法では作出効率が１〜２％と極めて低いので樹立可能なライン数に限界がある（図２）。
〔実施例２〕  ＥＳ細胞への遺伝子導入およびキメラマウスの作出
Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｉｔ（Ｌｅｘｉｃｏｎ）を使用した。ＥＳ細胞の培養やトランスフォーマントのスクリーニングは基本的にキット添付のプロトコールに従って実施した。遺伝子導入は４０μｇの導入ＤＮＡフラグメントを２３０Ｖ，５００μＦの条件でエレクトロポレーションによって行なった。エレクトロポレーション４８時間後に２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した培地に交換し、導入クローンを選択培養した。Ｇ４１８添加培地で生育したコロニーをピックアップし、９６穴プレートで増殖させた。増殖させたクローンの一部をサザンブロットで遺伝子型解析した。期待されるシグナルが得られたクローンを１×１０６程度に増殖させ、Ｃｒｅ遺伝子をアデノウイルスベクター（Ａｄ／Ｃｒｅ）により導入することによってＳｔｕｆｆｅｒ配列を除去することでＨＣＶ遣伝子の発現を認導し、コア蛋白およびＮＳ５Ｂの発現量を検討した。
Ａｄ／ＣｒｅによりＨＣＶコア蛋白およびＮＳ５Ｂ蛋白の発現の高いＥＳ細胞クローンからキメラマウスの作製を行なった。ホスト胚としてはＣ５７ＢＬ６（Ｂ６）系の胚盤胞を用いた。４８時間間隔で妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）およびヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、各５ｉｕ．を腹腔内投与することにより過剰排卵処理を施した雌マウスを同系統の雄と交配し、翌朝プラグ形成が確認された雌より妊娠２．５日に８細胞期から桑実期の胚を回収し、さらに２４時間培養して得られた胚盤胞をＥＳ細胞の注入に用いた。注入はピエゾマイクロマニピュレータを用いて行い、注入後に偽妊娠２日の受容雌子宮内に移植した。移植１７日後に自然分娩あるいは帝王切開して産仔を得た（Ｋａｗａｓｅら、Ｃｏｎｔｅｍｐ  ＴＯＰ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ，４０，３１−３４，Ｍａｒｃｈ（２００１））。離乳時にＥＳ細胞に由来する野生色の毛色の割合により、ＥＳ細胞の寄与率を推定した。雄キメラマウスを性成熟後にＢ６系雌マウスと交配して得られた産仔の毛色によりＥＳ細胞の生殖系列伝達を検討した。
２回のエレクトロポレーション（ＥＰ）を実施した。１回目のＥＰ後に行った選択培養により４５個のＧ４１８耐性クローンが得られた。うち４３クローンがＰＣＲ陽性であったが、サザンブロットでの検出により正常な位置のシグナルが得られたのはサザンブロットが実施可能であった３７クローンのうち２７クローンであった。異常な位置にシグナルが認められたクローンはその後の解析には使用せず、正常なもののみ増殖させて蛋白発現解析に供した。
その結果、コア蛋白が４００ｐｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上の発現がある７クローンについてＮＳ５Ｂ蛋白の検出を実施したところ、うち３クローン（＃Ａ２０、Ａ２６およびＡ４１）に明瞭なシグナルが認められた。
２回目のＥＰ後には２４０個のＧ４１８耐性クローンが得られたが、サザンブロット解析が可能であった２０１個のうち正常な位置にシグナルが認められたのは１４３クローンであった。うち５２クローンを増殖させて蛋白発現解析に供した。コア蛋白が４００ｐｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であった５クローンのうち、ＮＳ５Ｂ蛋白が検出されたのは３クローン（＃Ｂ１５、Ｂ２０およびＢ２７）であった（図３）。
キメラマウス作製成績を図に示す。作製を行った５クローンのうち４クローンで毛色キメラマウスが得られた。このうち、３クローンで生殖系列が伝達するか否かの確認を行った。クローン＃Ａ２６、＃Ｂ１５および＃Ｂ２０において毛色での判定によりＥＳ細胞に由来する産仔が得られた（図４）。
さらに、Ｂ１５ライン７匹、Ｂ２０ライン２匹を用いて、マウス腎より初代培養を作成し、Ｃｒｅ発現アデノウイルス感染によって発現誘導を試みたところ、両ラインとも定量可能なレベルのコア蛋白の発現が観察された。この際、同時に解析したＡ４１キメラマウス（不妊によりライン確立を断念したライン）では、わずかな発現しか観察されなかった。また、ウエスタンブロットによるＮＳ５Ｂ蛋白の発現を確認したところ両ラインともＮＳ５Ｂが検出され、導入遺伝子が確実に機能していることが判明した（図５）。さらに、マウスに直接Ｃｒｅ発現アデノウイルスを接種したところ、肝臓中でコア蛋白の発現が観察された。これらの結果は、作出したトランスジェニックマウスラインが全蛋白を発現していることを示している。本発明のトランスジェニックマウスは、全長発現ユニットを挿入してＨＣＶ蛋白の発現が観察された世界初のマウスである。
産業上の利用可能性
本発明のトランスジェニック動物は、ＨＣＶの全長蛋白を発現し、しかも交配により子孫にＨＣＶ全長遺伝子を伝達することができ、Ｃ型肝炎の発症機構の解明、ヒトＣ型肝炎治療薬のスクリーニング系の開発に有用である。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のトランスジェニック動物の作出に用いるベクターの構築を示す図であり、図１Ａはｐ５’−３’ＲＢＺまでの構築を、図１Ｂはｐ５’−３’ＲＢＺからｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ  ＲＢＺまでの構築を示す。
図２は、マイクロインジェクション法により作出した、トランスジェニックマウスの作出の結果を示す表である。
図３は、ＥＳ細胞への遺伝子導入の結果を示す表である。
図４は、ＥＳ細胞を介して作出したトランスジェニックマウスの作出の結果を示す表である。
図５は、トランスジェニックマウスにおけるＨＣＶ遺伝子の発現を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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