(57)【要約】配列番号２０で示されるアミノ酸配列及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子、その産物である酵素、その遺伝子ＤＮＡを含むプラスミド、形質転換体及びその形質転換体を用いたα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元方法に関する。本発明によれば、α位についてプロキラルな分子であるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の炭素・炭素二重結合に水素添加して、対応するα位について光学活性なα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を生産するのに有用な酵素遺伝子およびその産物としての酵素が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１９で示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項２】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１７で示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項３】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１８で示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項４】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項５】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
配列番号２１で示されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エッシェリッシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハロコッカス（Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロポリスポラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属及びキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属からなる群より選ばれる１種以上の微生物に由来するものである請求の範囲１乃至６のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項８】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物に由来する請求の範囲７に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項９】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属微生物に由来する請求の範囲７に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１０】
シュードモナス属微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１０）である請求の範囲８に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１１】
シュードモナス属微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１１）である請求の範囲８に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１２】
シュードモナス属微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１２）である請求の範囲８に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１３】
バークホルデリア属微生物が、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＳＤ８１６）である請求の範囲９に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１４】
還元酵素が、炭素・炭素二重結合の還元によって、α位がキラルなＳ体化合物を生成する触媒能を有することを特徴とする請求の範囲１乃至１３のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１５】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物が、下記一般式（１）
2003066863.tif 000035
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、Ｒ４はヒドロキシル基、炭素数１〜３の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基または１級〜３級アミノ基を表わす。但し、Ｒ３は水素原子であることはない。）で示される化合物であり、還元された化合物が下記一般式（２）
2003066863.tif 000036
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は上記と同じ意味を表わす。）で示される化合物である請求の範囲１乃至１４のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１６】
α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物が、下記一般式（１）
2003066863.tif 000037
（式中、Ｒ１、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がハロゲン原子、Ｒ４がヒドロキシル基を表わす。）で示されるα−ハロアクリル酸であり、還元された化合物が、下記一般式（２）
2003066863.tif 000038
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は上記と同じ意味を表わす。）で示される絶対配置Ｓのα−ハロプロピオン酸である請求の範囲１５に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１７】
Ｒ３が臭素原子である請求の範囲１６に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１８】
Ｒ３が塩素原子である請求の範囲１６に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項１９】
Ｒ３がフッ素原子である請求の範囲１６に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
【請求項２０】
請求の範囲１乃至１９のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子ＤＮＡを含んでなることを特徴とするプラスミド。
【請求項２１】
請求の範囲１乃至１９のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子と、ＮＡＤＰＨ類を補酵素として機能する酵素遺伝子を共に含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項２２】
請求の範囲２０または２１に記載のプラスミドで形質転換されてなる形質転換体。
【請求項２３】
請求の範囲２０に記載のプラスミドと、ＮＡＤＰＨ類を補酵素として機能する酵素遺伝子を含むプラスミドで同時に形質転換されてなる形質転換体。
【請求項２４】
請求の範囲１乃至１９のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子の発現産物であるα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質、または前記タンパク質を構成する１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質。
【請求項２５】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列質において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質。
【請求項２６】
配列番号２１で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質。
【請求項２７】
配列番号１９に示される塩基配列のうち６３１番目の塩基より上流側の塩基配列から選択された塩基配列と、３５４３番目の塩基より下流側の塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わせたプライマーを用いることを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
【請求項２８】
配列番号１９に示される塩基配列のうち６３１番目の塩基より上流側の塩基配列から選択された塩基配列と、２２７４番目の塩基より下流側の塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わせたプライマーを用いることを特徴とする置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
【請求項２９】
配列番号１９に示される塩基配列のうち２５４７番目の塩基より上流側の塩基配列から選択された塩基配列と、３５４３番目の塩基より下流側の塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わせたプライマーを用いることを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
【請求項３０】
請求の範囲２２乃至２３に記載の形質転換体培養物および／または処理物を用いることを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子およびその産物である酵素に関する。さらに詳しく言えば、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エッシェリッシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハロコッカス（Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロポリスポラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属およびキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属からなる群より選ばれる１種以上の微生物に由来することを特徴とする、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合に水素添加して、対応するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を生成する活性を有するα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子およびその産物である酵素に関する。
さらには、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属微生物、特にシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１０）、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１１）、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１２）およびバークホリデリア・エスピー・ＳＤ８１６株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＳＤ８１６）に由来する上記活性を有するα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子およびその産物である酵素に関する。
また、本発明は、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物はα位についてプロキラルな分子であるが、この炭素・炭素二重結合に立体選択的に水素添加して、対応するα位について光学活性なα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物の製造に有用な還元酵素およびその産物である酵素に関する。
この新規な酵素遺伝子およびその産物である酵素は、種々の光学活性（α位の絶対配置は置換基によりＳ体またはＲ体となる。）を有する飽和カルボン酸やアミドなどの光学活性カルボニル化合物の製造分野に利用することができる。光学活性を有するカルボニル化合物は、古典的な化学プロセスでは調製が困難な、価値の高いキラル構築ブロックであり、特に医薬や農薬の原料として有用な物質群である。
従来技術
近年、微生物の炭素・炭素二重結合の還元により様々な化合物、特に光学活性体を製造する方法が注目され、種々のα，β−炭素・炭素二重結合を有し、かつα位に置換基を持つカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を微生物的に還元して対応するα位に置換基を持つα，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法が報告されている（例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６２，３３（１９８１）、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５，５１（１９８３）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ，Ａｃｔａ．，６２，４５５（１９７９）、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８４，１９５（１９９７）参照。）。
しかしながら、これらの方法で用いられている活性微生物から還元酵素が分離同定されている例は無い。そもそも、このグループに属する酵素の研究は、その不安定性のため分離同定が困難であることから極めて少ない。本発明の酵素も例外では無く、通常の方法では早い失活のため分離同定が不可能であった。
このためこれらの還元酵素を化合物製造に用いようとする時、遺伝子工学や代謝工学的なアプローチにより改善することは困難であり、それゆえ効率的な製法改良ができないという状況にあった。
発明の開示
したがって、本発明は、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を、微生物を用いて還元して対応するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を製造するのに有用な触媒酵素およびその遺伝子を提供することを課題とする。
本発明者らは、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の該炭素・炭素二重結合を還元して対応するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を生成する微生物が、驚くべきことに、好気性あるいは通性嫌気性細菌の比較的多くの属に渡って分布していることを土壌からの徹底的なスクリーニングにより見出している（特開平１０−２２４８２１号公報等）。
特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に属する微生物に本活性を有する株が多く存在すること、これらの株の中にはα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を還元して、純度の極めて高いα位の絶対配置Ｓ体のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を生成しうるものが存在することを見出した。
さらに本発明者らはこれらの活性微生物を用いて光学活性なα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法を確立することに成功し、この製法をさらに改良すべく還元酵素本体の同定さらにはその遺伝子の特定を目指して鋭意研究した結果、触媒酵素を同定し、作用機作の解明と高活性生物の取得に成功し、本発明に至ったものである。
すなわち、本発明は、以下の還元酵素遺伝子、プラスミド、形質転換体、タンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子の製造方法及びα、β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子に関する。
１．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１９で示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子。
２．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１７で示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子。
３．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１８で示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子。
４．配列番号２０で示されるアミノ酸配列及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
５．配列番号２０で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
６．配列番号２１で示されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
７．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エッシェリッシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハロコッカス（Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロポリスポラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属及びキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属からなる群より選ばれる１種以上の微生物に由来するものである前記１乃至６のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
８．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物に由来する前記７に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
９．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属微生物に由来する前記７に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１０．シュードモナス属微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１０）である前記８に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１１．シュードモナス属微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１１）である前記８に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１２．シュードモナス属微生物が、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＤ８１２）である前記８に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１３．バークホルデリア属微生物が、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＳＤ８１６）である前記９に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１４．還元酵素が、炭素・炭素二重結合の還元によって、α位がキラルなＳ体化合物を生成する触媒能を有することを特徴とする前記１乃至１３のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１５．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物が、下記一般式（１）
2003066863.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、Ｒ４はヒドロキシル基、炭素数１〜３の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基または１級〜３級アミノ基を表わす。但し、Ｒ３は水素原子であることはない。）で示される化合物であり、還元された化合物が下記一般式（２）
2003066863.tif 000003
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は上記と同じ意味を表わす。）で示される化合物である前記１乃至１４のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１６．α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物が、下記一般式（１）
2003066863.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がハロゲン原子、Ｒ４がヒドロキシル基を表わす。）で示されるα−ハロアクリル酸であり、還元された化合物が、下記一般式（２）
2003066863.tif 000005
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は上記と同じ意味を表わす。）で示される絶対配置Ｓのα−ハロプロピオン酸である前記１５に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１７．Ｒ３が臭素原子である前記１６に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１８．Ｒ３が塩素原子である前記１６に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
１９．Ｒ３がフッ素原子である前記１６に記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
２０．前記１乃至１９のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子ＤＮＡを含んでなることを特徴とするプラスミド。
２１．前記１乃至１９のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子と、ＮＡＤＰＨ類を補酵素として機能する酵素遺伝子を共に含むことを特徴とするプラスミド。
２２．前記２０または２１に記載のプラスミドで形質転換されてなる形質転換体。
２３．前記２０に記載のプラスミドと、ＮＡＤＰＨ類を補酵素として機能する酵素遺伝子を含むプラスミドで同時に形質転換されてなる形質転換体。
２４．前記１乃至１９のいずれかに記載のα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子の発現産物であるα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質、または前記タンパク質を構成する１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質。
２５．配列番号２０で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列質において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質。
２６．配列番号２１で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質。
２７．配列番号１９に示される塩基配列のうち６３１番目の塩基より上流側の塩基配列から選択された塩基配列と、３５４３番目の塩基より下流側の塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わせたプライマーを用いることを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
２８．配列番号１９に示される塩基配列のうち６３１番目の塩基より上流側の塩基配列から選択された塩基配列と、２２７４番目の塩基より下流側の塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わせたプライマーを用いることを特徴とする置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
２９．配列番号１９に示される塩基配列のうち２５４７番目の塩基より上流側の塩基配列から選択された塩基配列と、３５４３番目の塩基より下流側の塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わせたプライマーを用いることを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
３０．前記２２乃至２３に記載の形質転換体培養物および／または処理物を用いることを特徴とするα−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元方法。
発明の詳細な説明
本発明において、α−置換−α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子およびその産物である酵素は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エッシェリッシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハロコッカス（Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロポリスポラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属のいずれかに属する微生物に存在する。
好適にはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属あるいはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属微生物に由来する。
本発明において用いる由来微生物としては、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有する株であれば特に制限はないが、例えば、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株、またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株等が好適である。
中でも比較的高い還元活性の観点から、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株が特に好適に用いられる。
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株等は、土壌中から単離されたものであり、各種のカルボニル化合物を分解資化する能力を有している。
これらシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株およびシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株は、それぞれ生命研菌寄第ＢＰ−６７６７号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６７）［生命研菌寄第１６７４６号（ＦＥＲＭ−１６７４６）から移管］、生命研菌寄第ＢＰ−６７６８号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６８）［生命研菌寄第１６７４７号（ＦＥＲＭ  １６７４７）から移管］および生命研菌寄第ＢＰ−６７６９号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６９）［生命研菌寄第１６７４８号（ＦＥＲＭＢＰ−６７６９）から移管］、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株は、生命研菌寄第ＢＰ−６７７０号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７７０）として生命工業技術研究所に寄託されている。
これらの分離・培養は、特開平１０−２２４８２１号公報に詳細に示されている方法等を用いることができる。
上記活性微生物では、培養条件によってその還元活性が異なることがある。すなわち、還元基質であるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物を炭素源として培養した場合と、糖類など一般的な炭素源を用いて培養した場合で菌体が示すα，β−炭素・炭素二重結合の還元活性が異なり、還元基質を炭素源として培養した菌体は反応開始時から高い還元活性を示すことがある。このことは還元酵素の一部または全てが還元基質によって誘導されることを示唆しており、この差を解析することによって還元酵素を同定することが可能となる。
還元活性の高い菌体を得る培養の炭素源としては一般式（１）
2003066863.tif 000006
で示される化合物を用いることができる。一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または飽和もしくは不飽和含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わす。好ましいＲ１、Ｒ２としては水素原子を挙げることができる。
Ｒ３はハロゲン原子、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または飽和もしくは不飽和含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表す。好ましいＲ３としてはハロゲン原子、特に塩素原子、臭素原子を挙げることができる。
Ｒ４はヒドロキシル基、炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、１級〜３級アミノ基を表わし、好ましいＲ４としてはヒドロキシル基を挙げることができる。
具体的にはα−クロロアクリル酸、α−ブロモアクリル酸、２−クロロ−２−ブテン酸、２−ブロモ−２−ブテン酸、２−クロロ−２−ペンテン酸、２−ブロモ−２−ペンテン酸、それらのメチルエステル、エチルエステルなどが挙げられ、好ましくはα−クロロアクリル酸、α−ブロモアクリル酸である。
すなわち、通常の細菌に用いられる無機塩培地（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２ｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４  １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ０．１ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５ｇ／Ｌ）に、例えば、α−クロロアクリル酸のようなα位に置換基を持つα，β−不飽和カルボニル化合物を実質的に唯一の炭素源として２ｇ／Ｌ添加した最少培地５ｍＬに菌株を植菌し、２８℃で１２〜７２時間振とう培養を行うと、還元活性の高い菌体が得られる。一方、上記培養条件のうち炭素源だけを還元基質の代謝生成物、例えば、α−クロロアクリル酸などの置換アクリル酸の場合は乳酸に変えて培養すると、反応初期には還元活性を示さない菌体が得られる。
これらの菌体をそれぞれ遠心分離に供して回収し、フレンチプレス等の方法により破壊して得た無細胞抽出液をカラムクロマトグラフィーに供してタンパク質の分離パターンを比較すると、両者で異なるタンパク質が見い出される。
このうち還元基質を用いて培養した菌体で生成量が増加したタンパク質を分離し、その活性を測定すれば酵素の同定が可能である。しかしながら一般に、これらの酵素は無細胞抽出液の状態では安定性が低く、比較的速やかに活性が消失してしまうため分離同定が困難な場合が多い。これこそがこの群に属する酵素の研究が他の安定な酵素に比して遅れている一因となっている。
このような場合、窒素雰囲気下などで分離作業を行う事で活性を保つことができる場合もあるが、まずタンパク質の部分配列を明らかにし、部分配列から推定したＤＮＡ塩基配列をプローブとして遺伝子をクローニングし、この遺伝子を発現させてタンパク質を著量取得した後活性などの解析を行う方法が有効である。
すなわち、異なる炭素源を用いて無細胞抽出液を二次元タンパク質電気泳動などで分離したタンパク質の生成パターンを比較して、還元基質で培養した菌体で増加しているタンパク質を見いだす。このタンパク質をＰＶＤＦメンブレンなどに移して、気相エドマン分解装置などによりＮ末端配列の解析を行う。得られたＮ末端配列から、ＤＮＡ塩基配列を推測し、オリゴヌクレオチドを合成することにより、染色体から還元酵素群の遺伝子を取得するのに有用なプローブ（ある配列のＤＮＡを見出す時に用いる、識別可能な標識を施したＤＮＡ断片）を作成する。
本発明の還元酵素遺伝子は、このようにして作成したＤＮＡプローブを用いて、遺伝子工学で用いられるサザンハイブリダイゼーション等の通常の方法によって容易に取得することができる。すなわち、前記微生物から抽出したＤＮＡ（染色体及びプラスミドを持つ場合はプラスミドを含む）を適当な制限酵素で切断して断片化し、アガロースゲル電気泳動などの方法でサイズ分離した後ニトロセルロース膜に転写した断片に対して、識別可能な標識を施したプローブをハイブリダイゼーション（ＤＮＡとＤＮＡの間で、その塩基配列に相補性が高いときに二重鎖を形成することで、対合とも言う）させることで、プローブと特異的にハイブリダイゼーションする断片、すなわち目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。このとき、遺伝子が途中で切断された部分断片が取得される場合もあるが、制限酵素の種類を変えて同様の検出を行ったり、先に取得された部分断片をプローブとして用いるなどして、遺伝子全体を取得することができる。
本発明の還元酵素群の遺伝子に対してハイブリダイゼーション法を用いる場合、ハイブリダイズさせるＤＮＡの長さによって最適な条件には違いがあるが、十分に特異的なハイプリダイゼーション結果が得られるストリンジェント条件は、通常のハイブリダイゼーション溶液の塩濃度範囲で約４０℃〜７０℃、好ましくは４７℃〜６０℃である。
本発明の還元酵素群の遺伝子は、遺伝子およびその周辺配列の適当な位置にハイブリダイゼーションするプライマーを作成し、前記の微生物ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても容易に取得することができる。
プライマーとは、コピーしたいＤＮＡ鎖にハイブリダイゼーションし、ＤＮＡ合成開始点となり得る断片である。ＤＮＡの酵素合成は、鋳型ＤＮＡにハイブリダイゼーションしたプライマーの３’−ＯＨ部分にＤＮＡポリメラーゼがデオキシリボヌクレオチドをジエステル結合する形で進むため、ＤＮＡの複製の開始にはプライマーが必須である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でもプライマーが使用され、このプライマーの選択によって目的のＤＮＡを正しく効率良くコピーできるかが決まる。
本発明において用いることができるプライマーは、本発明の還元酵素遺伝子およびその周辺配列にハイブリダイゼーションしてＤＮＡ合成開始点となり得るものであれば特に制限は無く、例えば、断片の配列相補性の高さの度合い、断片の長さ、断片に対する修飾などに制限は無い。例えば、生成する断片をプラスミドに接続するためのアダプタ配列を含むプライマー、生成した遺伝子断片の検出を容易にする蛍光物質で修飾したプライマー等を目的に応じて自由に設計し用いることができる。
本発明において有用な還元酵素群の遺伝子を得るのに有用な一組のプライマーは、配列番号１９に示される塩基配列のうち、上流遺伝子の開始コドンの第一塩基である６３１番目の塩基より上流の配列を含む一つと、下流遺伝子終了コドンの第三塩基である３５４３番目の塩基より下流の配列を含む他一つを、相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせたものである。また、有用な他の一組のプライマーは、配列番号１９に示される塩基配列のうち、上流遺伝子の開始コドンの第一塩基である６３１番目の塩基より上流の配列を含む一つと、上流遺伝子の終了コドン第三塩基である２２７４番目の塩基より下流の配列を含む他一つを、相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせたものである。さらに有用な他の一組のプライマーは、配列番号１９に示される塩基配列のうち、下流遺伝子の開始コドンの第一塩基である２５４２番目の塩基より上流の配列を含む一つと、下流遺伝子終了コドンの第三塩基である３５４３番目の塩基より下流の配列を含む他一つを、相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせたものである。この３種の組み合わせで、それぞれ遺伝子群全体、上流遺伝子、下流遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を得ることができる。さらに、配列番号１７で示される塩基配列の両末端１０数個から数１０個の塩基配列を、相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせた一組のプライマーも有用である。この組み合わせでは、配列番号１７で示される塩基配列に相当するＤＮＡを作成することができ、本発明の下流遺伝子に相当する遺伝子を作成することができる。同様にして、配列番号１８で示される塩基配列の両末端１０数個から数１０個の塩基配列を、相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせた一組のプライマーも有用である。この組み合わせでは、配列番号１８で示される塩基配列に相当するＤＮＡを作成することができ、本発明の上流遺伝子に相当する遺伝子を作成することができる。
これらのプライマーを用いて遺伝子を取得する方法に特に制限は無いが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が最も簡便に用いることのできる方法である。反応条件はＤＮＡ合成反応による生成物が取得される限り制限は無いが、通常変性温度は９０℃〜１００℃、好ましくは９４℃〜９８℃、アニーリング温度は３０℃〜７０℃、好ましくは３７℃〜６５℃、さらに好ましくはプライマーのＴｍより５℃高い温度、伸長温度は６５℃〜７５℃、好ましくは７２℃からそれぞれの最適条件を組み合わせて用いることができる。反応サイクル数は生成物が必要量取得できるまで繰り返すことができるが、通常１５〜５０サイクル程度から選択すればよい。取得される遺伝子の配列は鋳型とするＤＮＡ鎖の配列、合成に用いるＤＮＡポリメラーゼの校正機構（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ；ＤＮＡの複製時に誤って取り込まれた塩基を、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除くことで誤りを無くす機能）強度によって相互に配列の異なる部分を持つ近縁の変異体が取得されるが、これら近縁の還元酵素遺伝子は、プライマーの設計の元となったオリジナルの還元酵素遺伝子と同様に本発明に用いることができる。
これらの遺伝子を、一般的に知られる発現ベクター等を用いて宿主生物体内で発現できる形で生物に導入することにより、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の該炭素・炭素二重結合を還元して対応するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を生成する高い還元活性を示す生物を作出できる。この時、下流遺伝子は単独ではなく、上流遺伝子と組み合わせて用いることにより還元活性を得ることが出来る。
本発明の還元酵素遺伝子を発現させる生物としては、特に制限は無いが、宿主−ベクター系の開発されている微生物、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属するカビなどが挙げられる。好適な微生物の一例としては、大腸菌が挙げられる。作出した活性微生物は、前記の酵素誘導基質を炭素源とした培地を用いる必要が無く、一般的な栄養培地、すなわちＬＢ培地等で培養することで活性微生物菌体を得ることができる。
作出した還元活性微生物を用いる還元反応の条件は、特開２０００−１０６８９１に開示されている本酵素起源微生物の反応と同様にして行うことができる。
すなわち、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の炭素・炭素二重結合の還元反応は、前記微生物が持つ還元力が安定に発現する条件下であれば、該微生物の培養液中、前記方法により培養して得た菌体、または前記方法により培養して得た菌体を破砕して得られる無細胞抽出液等の微生物の処理物のいずれを用いても行うことができる。
すなわち、培養して得た菌体を用いる場合は、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物を培養液に、０．１質量％〜１０質量％の濃度、好ましくは０．２質量％〜２質量％の濃度になるように連続的または回分的に添加し、培養温度１５℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３７℃で培養し、培養液中に相当するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。
あるいは、前記方法により培養して得た培養物から遠心分離などの方法で回収した菌体を、適当な溶液、例えば希薄なｐＨ緩衝溶液のごとき水溶液に懸濁した溶液に、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物を、例えば、０．１質量％〜１０質量％の濃度、好ましくは０．２質量％〜２質量％の濃度になるように連続的または回分的に添加し、反応温度１５℃〜５０℃、好ましくは、２５℃〜３７℃、より好ましくは２８℃〜３５℃、反応ｐＨ６．０〜９．０、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．３に調節して反応させ、該菌体懸濁液中に相当するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。ｐＨ維持は、水性バッファ、たとえばリン酸カリウムもしくはトリス／ＨＣｌを１０ｍＭ〜１Ｍの範囲で含むような水性バッファで行うことが好ましい。
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の添加の時期と、速度または回数は、反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択できる。
微生物の処理物を用いる場合は、例えば、前記培養法による培養物を遠心分離に供して回収した菌体を、フレンチプレス等の方法により破壊して得た無細胞抽出液を、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の濃度が、０．１質量％〜１０質量％、好ましくは０．２質量％〜２質量％であり、反応液のｐＨ維持に有効な成分を１０ｍＭ〜１Ｍの範囲で含むような反応液に添加して、反応温度１５℃〜５０℃、好ましくは２８℃〜３５℃の範囲で反応させ、相当するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。
さらに本発明においては、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の還元活性の維持に有効な物質、たとえば使用する微生物が酸化することのできる糖や有機酸のごとき化合物、好ましくはグルコースやＬ−乳酸等を、単独で、あるいはα−クロロアクリル酸との混合溶液として反応中、０．１質量％〜１０質量％の濃度、好ましくは０．２質量％〜１質量％の濃度になるように連続的または回分的に添加しながら反応させることができる。α−クロロアクリル酸とこれら被酸化物質との添加割合は１〜２０：１の間で任意に選択できる。この糖や有機酸の添加により反応時間を延長することができる。このことにより、目的生成物であるα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の反応液中の濃度を高くすることができ、生成物を単離収得するのに好ましい。特にこれらの被酸化物質を用いて補酵素ＮＡＤＰＨの還元型を効率良く再生できる系を強化するため、適当な酸化還元酵素遺伝子、例えば、リンゴ酸脱水素酵素遺伝子やグルタミン酸脱水素酵素遺伝子を、還元酵素遺伝子と共発現するよう微生物に導入することによって、生産性を大幅に改善することができる。このような方法は、例えば特開昭６１−１２８８９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．６，２２１−２７０（１９８８）に開示されている。
反応は培養中で無い場合は、好気的、嫌気的いずれの環境でも行うことができる。菌体または無細胞抽出液と基質であるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換ハロカルボニル化合物の比率、あるいは基質の添加の時期、速度または回数は、反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択できる。
本発明においては、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の還元によって生成するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物は、使用する微生物にとって代謝中間体であってさらに分解を受ける場合がある。このような場合には、分解活性を持たない宿主微生物を選択するか作成することにより分解反応を停止させることができる。
さらに、本発明で用いられる微生物の菌体あるいは無細胞抽出液は、慣用の方法、たとえば、吸着、包括、架橋などの方法により、種々の固定化担体に固定化して用いることができる。担体の種類は特に制限されず、たとえば、セルロースなどの多糖系材料、ポリマー系材料、コラーゲン等のタンパク質系材料などを用いることができる。
本発明で生成したα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物は、常用の溶媒抽出、蒸留といった精製法を用いて、単離精製することができる。たとえば、α−クロロアクリル酸から生成したα−クロロプロピオン酸は、培養液や反応液から有機溶媒抽出、蒸留等に供することにより得ることができる。また、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物はα位についてプロキラルな分子であるが、本発明の還元法によって生成するキラルなα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物の鏡像異性体の純度は、キラルカラム材料でのＧＣ、ＨＰＬＣあるいは旋光計で決定することができる。
このように、本発明は、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して対応する絶対配置Ｓ体のα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を製造するのに有用な還元酵素群およびその遺伝子群を提供するものである。さらに、これらの遺伝子を用いて高生産生物を取得し、これを用いた製造方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。実施例中、全ての塩基配列決定では、ＰＣＲ産物をプラスミドに組み込むことなく、直接鋳型として使用し、ＤＮＡシーケンサーｍｏｄｅｌ３７７（ＡＢＩ社製）の標準的な反応・分離・解析条件により両鎖について解読した。
実施例１：α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元活性の検出
還元活性の検出は、α−クロロアクリル酸またはα−クロロ−α，β−ブテン酸を基質として、還元生成物であるα−クロロプロピオン酸、α−クロロ酪酸を、ガスクロマトグラフィーを用いて定量した。遠心に供して菌体を除去した反応液または培地上清０．４ｍＬに、０．４ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌを混合した後、次の条件でガスクロマトグラフィー分析を行った。
本体：ＧＣ−７Ａ（株式会社島津製作所製）、
カラム：Ｔｈｅｒｍｏｎ−３０００／ＳＨＩＮＣＡＲＢＯＮ  Ａ  ２．６ｍｍ×２．１ｍ、
キャリアガス：窒素５０ｍＬ／ｍｉｎ、
検出：ＦＩＤ、
カラム温度：２００℃（一定）、
インジェクション：２〜１０マイクロリター，２６０℃、
記録：クロマトコーダー１２（ＳＩＣ）。
実施例２
（１）シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の還元基質を炭素源とした培養
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を次の培地において培養した。
培地組成：α−クロロアクリル酸（２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．５ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（２ｇ／Ｌ）、リン酸二水素ナトリウム（１ｇ／Ｌ）、リン酸水素二カリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０．１ｇ／Ｌ）。
培地の作成は以下のような手順にて行った。
前記成分のうち、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを除く全成分を９５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整し、５Ｌのフラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。続いて、この培地の温度が７０℃程度まで下がった後、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後混合した。さらに酸素の供給やｐＨ調節をすることなく、この培地に５％予備培養物（ＯＤ６６０ｎｍ＝１．１０）を接種し３０℃で１２〜２４時間、振とうしながら株を培養した。
（２）シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の還元生成物を炭素源とした培養
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を次の培地において培養した。
培地組成：Ｌ−乳酸（２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．５ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（２ｇ／Ｌ）、リン酸二水素ナトリウム（１ｇ／Ｌ）、リン酸水素二カリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０．１ｇ／Ｌ）。
培地の作成は以下のように行った。
前記成分のうち、Ｌ−乳酸および硫酸マグネシウムを除く全成分を９５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整し、５Ｌのフラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。続いて、この培地の温度が７０℃程度まで下がった後、Ｌ−乳酸および硫酸マグネシウムを５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後混合した。さらに酸素の供給やｐＨ調節をすることなく、この培地に５％予備培養物（ＯＤ６６０ｎｍ＝１．１０）を接種し３０℃で１２〜２４時間、振とうしながら株を培養した。
実施例３：α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応
実施例２において、２種の異なる炭素源を用いて培養したシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を、それぞれ遠心分離に供して菌体を回収した。
この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０ｍＬに懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
反応液から、特定の時点で０．５ｍＬのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４ｍＬに、０．１ｍＬの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４ｍＬの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析した。
還元基質を用いて培養した菌体の反応では、反応直後からα−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現した。反応速度は全ての基質を消費するまでほぼ直線的であった。一方、乳酸を炭素源として培養した菌体の反応では、反応開始直後はα−クロロアクリル酸の消費もα−クロロプロピオン酸のピークも見られず、開始から約５時間次第に還元活性が上昇した。結果を図１に示す。
実施例４
（１）バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の還元基質を炭素源とした培養
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株を次の培地において培養した。
培地組成：α−クロロアクリル酸（２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．５ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（２ｇ／Ｌ）、リン酸二水素ナトリウム（１ｇ／Ｌ）、リン酸水素二カリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０．１ｇ／Ｌ）。
培地の作成は以下のように行った。
前記成分のうち、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを除く全成分を９５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整し、５Ｌのフラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。続いて、この培地の温度が７０℃程度まで下がった後、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後混合した。
さらに酸素の供給やｐＨ調節をすることなく、この培地に５％予備培養物（ＯＤ６６０ｎｍ＝１．１０）を接種し３０℃で１２〜２４時間、振とうしながら株を培養した。
（２）バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の糖を炭素源とした培養
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株を次の培地において培養した。
培地組成：Ｄ−グルコース（２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．５ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（２ｇ／Ｌ）、リン酸二水素ナトリウム（１ｇ／Ｌ）、リン酸水素二カリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０．１ｇ／Ｌ）。
培地の作成は以下のように行った。
前記成分のうち、Ｄ−グルコースおよび硫酸マグネシウムを除く全成分を９５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整し、５Ｌのフラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。続いて、この培地の温度が７０℃程度まで下がった後、Ｄ−グルコースおよび硫酸マグネシウムを５０ｍＬの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後混合した。
さらに酸素の供給や、ｐＨ調節をすることなく、この培地に５％予備培養物（ＯＤ６６０ｎｍ＝１．１０）を接種し３０℃で１２〜２４時間、振とうしながら株を培養した。
実施例５：α−クロロ−α，β−ブテン酸を基質とする菌体懸濁反応
実施例４において、２種の異なる炭素源を用いて培養したバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株を、それぞれ遠心分離に供して菌体を回収した。この菌体を、α−クロロ−α，β−ブテン酸０．２％、リン酸緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０ｍＬに懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
反応液から、特定の時点で０．５ｍＬのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４ｍＬに、０．１ｍＬの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４ｍＬの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析した。
還元基質を用いて培養した菌体の反応では、反応直後からα−クロロ−α，β−ブテン酸の消費に伴って、α−クロロ酪酸の位置にピークが出現した。反応速度は全ての基質を消費するまでほぼ直線的であった。一方、乳酸を炭素源として培養した菌体の反応では、反応開始直後はα−クロロ−α，β−ブテン酸の消費もα−クロロ酪酸のピークも見られず、開始から約６〜１０時間の間に次第に還元活性が上昇した。結果を図２に示す。
実施例６：タンパク質生成パターンの二次元電気泳動による解析
（１）粗酵素抽出液の調整
実施例２で還元活性が異なることを確認したシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株１８時間培養菌体を遠心分離に供して菌体を回収した。滅菌水で洗浄した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。菌体を超音波破砕機（ＢＩＯＭＣ  ７５００  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ（ＰＵＬＳＥＤ，５０  ｏｆ  ％ＤＵＴＹ  ＣＹＣＬＥ，ａｂｏｕｔ  ４．５  ｏｆ  ＯＵＴ  ＰＵＴ  ＣＯＮＴＲＯＬ））で破砕し、未破砕の細胞と不溶物を遠心（１６４００×ｇ，５ｍｉｎ，４℃）して除去した。
同様にして、実施例５で還元活性が異なることを確認したバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の粗酵素抽出液も調整した。
（２）一次泳動：等電点電気泳動
尿素１．９２ｇ、３０％アクリルアミド混液（アクリルアミド  ２９．２％（ｗ／ｖ）、Ｎ−Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミド０．８％（ｗ／ｖ））０．５３ｍＬ、脱イオン水１．０ｍＬを混合し、尿素が完全に溶解した後、１０％ノニデットＰ−４０  ０．８ｍＬ、バイオライト３／１０アンフォオライト（ＢＩＯ−ＲＡＤ）２００μＬ、１０％過硫酸アンモニウム８μＬ，ＴＥＭＥＤ  ５．６μＬを混合した。この溶液を、一方をシールしたガラス管（長さ１３ｍｍ×内径２ｍｍ）に速やかに注入し、８Ｍ尿素溶液を積層し１〜２時間静置してゲルを固化させた。
作成したゲルをセミマイクロドライゲル電気泳動装置（ＫＳ−８１１０、オリエンタルインスツルメンツ社製）に設置し、泳動上層と下層にそれぞれ２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液と１０ｍＭ硫酸溶液を入れ、２００Ｖ１５分、３００Ｖ１５分、４００Ｖ３０分プレランを行った。
泳動上層とゲル上部の水酸化ナトリウム溶液を取り除き、試料溶液（１００〜３００μｇ／１２．５μＬのタンパク質を含む溶液、１０％ノニデットＰ−４０  ３μＬ、バイオライト３／１０アンフォオライト（ＢＩＯ−ＲＡＤ）１．５μＬ、２−メルカプトエタノール１．５μＬを混合して調整したもの）をシリンジを用いてゲル上部に供し、続いてサンプルオーバーレイ溶液（尿素０．４８ｇ、１０％ノニデットＰ−４０  ２００μＬ、バイオライト３／１０アンフォオライト（ＢＩＯ−ＲＡＤ）５０μＬ、脱イオン水３８０ｍＬを混合したもの）２０μＬ、さらに２０ｍＭ水酸化ナトリウム液（適量）を積層し、泳動上層に２０ｍＭ水酸化ナトリウム液を満たし、４００Ｖで１２時間、続いて８００Ｖで１時間電気泳動した。
一次泳動の終了したゲルをガラス管から取り出し、４０ｍＬの脱イオン水中で５分間室温振とうし、続いて４ｍＬの平衡化緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．５ｍＬ、１０％ＳＤＳ１．６ｍＬ、０．１％ＢＰＢ０．０５ｍＬ、２−メルカプトエタノール２ｍＬ、脱イオン水１．６５ｍＬを混合する）で２０分間室温振とうした。
（３）二次泳動：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはスラブゲル装置（ＫＳ−８０００  ＳＥ  ｔｙｐｅ，ＭＡＲＹＳＯＬ）を用いて通常の方法により行った。すなわち、平衡化が終了したゲルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲル上端に０．５％アガロースを用いて固定し、２５ｍＡ定電流で約４時間泳動した。
（４）タンパク質の検出：ＣＢＢ染色
泳動終了したスラブゲル中のタンパク質の検出は、通常のＣＢＢ染色によって行った。すなわち、ＣＢＢ溶液（クマジーブリリアントブルーＲ−２５０  ０．２５ｇをメタノール５００ｍＬ、酢酸５０ｍＬ、脱イオン水４５０ｍＬに溶解）にて１時間染色した後、脱イオン水で洗浄し、続いて脱色液（メタノール５０ｍＬ，酢酸７０ｍＬ，脱イオン水８８０ｍＬ）で一昼夜脱色した。
その後ゲルを保存液（８７％（ｗ／ｖ）グリセロール液２３ｍＬ，エタノール１５０ｍＬ，脱イオン水３２７ｍＬ）に３時間浸透した。
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株のＬ−乳酸培養菌体およびα−クロロアクリル酸培養菌体、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のＤ−グルコース培養菌体とα−クロロアクリル酸培養菌体から調整した粗酵素抽出液試料の二次元電気泳動分離パターンを比較した結果、それぞれの菌株の組で、ほぼ同じ位置に、α−クロロアクリル酸培養菌体に特徴的な生成タンパク質が複数あることを見いだした。シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の結果を図３に示す。
実施例７（１）：末端配列の決定
実施例６で見いだしたα−クロロアクリル酸培養菌体に特徴的なタンパク質を解析するため、実施例６で示したバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロアクリル酸培養菌体の試料について二次電気泳動分離したタンパク質を、セミドライ転写装置（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  Ｒ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ：０．４５ｍＬ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写した。
転写は同機の標準的な使用法に従い、限界電流０．８ｍＡ、１３Ｖ、０．２２〜０．２６Ａで４５分間で行った。転写し終わったＰＶＤＦ膜をＣＢＢ溶液で染色した後、α−クロロアクリル酸培養菌体試料で特徴的に出現した３種のタンパク質に相当するスポットを切り出し、ペプチドシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１  Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて分析した。その結果、その１種は既知酵素である脱ハロゲン酵素（デハロゲナーゼ、Ｌ−ＤＥＸ）であることが判明したが、残る２種は配列番号１および３に示した新規なペプチド配列を有することが判った。
実施例７（２）：内部配列の決定
さらに配列情報を得るため、実施例７で示した新規な２種のタンパク質について、リジルエンドペプチダーゼによるインゲル（ｉｎ  ｇｅｌ）部分分解を行った。
実施例６の二次元電気泳動後、ＣＢＢ染色したゲルから目的の２スポットに相当する部分を切り出し、そのゲル片にリジルエンドペプチダーゼを含むトリス緩衝液を加え、３５℃で一晩消化した後、その反応液を下記条件の逆相ＨＰＬＣに供して、断片化ペプチドを分離した。
カラム：ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ、
溶媒：ＴＦＡ／Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ系、グラジェント溶出、
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、
検出波長：２１０ｎｍ。
得られたクロマトグラムから適当なピークを選択し、そのフラクションをペプチドシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１  Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて分析した結果、配列番号２、４および５に示す３つの内部アミノ酸配列が得られた。
実施例８：ＣＡＡ４３  Ｎ末端部分遺伝子断片の取得
まず、配列番号１および２に記載の、ＣＡＡ４３のＮ末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列に基づき縮重プライマー１および縮重プライマー２をそれぞれ設計した。
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株  染色体ＤＮＡの抽出にはＱＩＡＧＥＮ  ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  １００／ＧおよびＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｅｔ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社製）を使用した。
ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株  染色体ＤＮ    ５ｎｇ
プライマー１（配列番号１に対応）                        １０ｐｍｏｌ
プライマー２（配列番号２に対応）                        １０ｐｍｏｌ
ＴａＫａＲａ  ＬＡＴａｑ                                ０．５ｕｎｉｔ
ｄＮＴＰ混合物（２．５ｍＭｅａｃｈ）                    ２．０μＬ
１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢＵＦＦＥＲＩＩ（Ｍｇ２＋Ｆｒｅｅ）２．５μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                    ２．５μＬ
滅菌蒸留水                                              ２５μＬに調整
［反応サイクル］
１サイクル：
変性（９５℃、４ｍｉｎ）、
アニーリング（４７．９℃、１ｍｉｎ）、
伸長（７２℃、２ｍｉｎ）。
２〜３０サイクル：
変性（９５℃、１ｍｉｎ）、
アニーリング（４７．９℃、１ｍｉｎ）、
伸長（７２℃、２ｍｉｎ）。
このバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株  染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＣＡＡ４３遺伝子の一部をコードすると考えられる、ＤＮＡ断片（３５０ｂｐ）を得た。この部分断片の配列を配列番号１１に示した。
実施例９：ＣＡＡ４３のＣ末端領域をコードする遺伝子断片の取得
実施例８で得られた配列番号１１で示される塩基配列に基づいて、配列番号８および９に記載の下流方向のプライマー２種を設計した。これらのプライマーとＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてＣＡＡ４３のＣ末端側をコードする遺伝子のクローニングを試みた。反応等は、Ｋｉｔに添付の標準的な手法に従って行った。その結果、ＸｂａＩ処理したバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株  染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでＤＮＡ断片（１．３ｋｂ）を取得し、その塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号１２に示したが、本配列中に終止コドンを確認した。
実施例１０：ＣＡＡ４３のＮ末端領域およびその上流に存在する遺伝子の取得
実施例８で得られた配列番号１１で示される塩基配列に基づいて、配列番号１０に記載のｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ（ゲノム工学の基礎参照、（２００２）東京化学同人）用のプライマーを設計した。これと配列番号８に記載のプライマーを組み合わせて、ｓａｌＩ処理したバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株  染色体ＤＮＡを鋳型として下記条件によりｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ＳＤ８１６株染色体ＤＮＡ  ＳａｌＩ処理物                ２００ｎｇ
プライマー１（配列番号８）                              １０ｐｍｏｌ
プライマー２（配列番号１０）                            １０ｐｍｏｌ
ＴａＫａＲａ  ＬＡＴａｑ                                ２．５ｕｎｉｔ
ｄＮＴＰ混合物（２．５ｍＭｅａｃｈ）                    ８．０μＬ
１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ２＋Ｆｒｅｅ）５．０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                    ５．０μＬ
滅菌蒸留水                                              ５０μＬに調整
［反応サイクル］
１サイクル：
変性（９４℃、４．５ｍｉｎ）、
アニーリング（５５℃、３０ｓｅｃ）、
伸長（７２℃、４ｍｉｎ）。
２〜３０サイクル：
変性（９４℃、３０ｓｅｃ）、
アニーリング（５５℃、３０ｓｅｃ）、
伸長（７２℃、４ｍｉｎ）。
その結果、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片が取得された。この断片の塩基配列を配列番号１３に示したが、断片にはＣＡＡ４３のＮ末端領域アミノ酸配列０．５ｋｂの他、配列番号４で示されるＣＡＡ６７の配列をコードする部分が含まれており、ＣＡＡ６７のＣ末端領域アミノ酸配列をコードすると考えられる部分０．８ｋｂを含むことが判明した。ＣＡＡ６７のコード領域はＣＡＡ４３のコード領域の上流に連続して存在しており、両遺伝子はクラスターを形成していることが明らかになった。
実施例１１：ＣＡＡ６７のＮ末端をコードするＤＮＡ断片の取得
実施例１０で明らかになった、ＣＡＡ６７の内部アミノ酸配列をコードする塩基配列を基に、配列番号１４および１５に記載のＣＡＡ６７遺伝子の上流方向のプライマー２種を設計した。これらのプライマーとＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてＣＡＡ６７のＮ末端側をコードする遺伝子のクローニングを試みた。反応等は、Ｋｉｔに添付の標準的な手法に従って行った。その結果、ＰｓｔＩ処理したバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでＤＮＡ断片（１．８ｋｂ）を取得した。決定した塩基配列を配列番号１２に示したが、配列番号４，５に記載のＣＡＡ６７の内部アミノ酸配列と配列番号３に記載のＣＡＡ６７のＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片であることを確認した。
実施例１２：各遺伝子の全配列と遺伝子クラスター配列の決定：
実施例８、９、１０で得られたＤＮＡ断片により、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ／ＡＴＳＱ核酸配列自動結合ソフトウエアにより、配列番号１７に記載のＣＡＡ４３遺伝子の全塩基配列を決定した。同様にして、実施例１０および１１で得られたＤＮＡ断片により、配列番号１８に記載のＣＡＡ６７遺伝子の全塩基配列を決定した。さらに、実施例８〜１１で得られたＤＮＡ断片により、両遺伝子が存在する配列番号１９に記載のクラスター塩基配列を決定した。配列番号２０と２１は、それぞれ配列番号１７と１８に対応するアミノ酸配列である。
実施例１３：ＣＡＡ４３及びＣＡＡ６７を含む遺伝子断片の作成
実施例１２で得られた配列番号１９で示される塩基配列に基づいて、配列番号２２および２３に記載のプライマーを設計した。これらを組み合わせて、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株  染色体ＤＮＡを鋳型として下記条件によりＰＣＲを行い、還元酵素遺伝子全長をコードするＤＮＡ断片２９１３ｂｐを作成した。
［反応液組成］（全量  ５０μＬ）
ＳＤ８１６株染色体ＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）                ４．０μＬ
１０μＭプライマー１（配列番号２２）                    １．５μＬ
１０μＭプライマー２（配列番号２３）                    １．５μＬ
ＴＯＹＯＢＯ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１ｕｎｉｔ／μＬ）    １．０μＬ
ｄＮＴＰ混合物（２．５ｍＭｅａｃｈ）                    ５．０μＬ
１０×ＫＯＤ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋Ｆｒｅｅ）  ５．０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                                    ２．０μＬ
滅菌蒸留水                                              ３０μＬ
［反応サイクル］
１サイクル：
変性（９４℃、２ｍｉｎ）、
２〜３０サイクル：
変性（９４℃、１５ｓｅｃ）、
アニーリング（５２．３℃、３０ｓｅｃ）、
伸長（６８℃、３ｍｉｎ）。
実施例１４：ＣＡＡ４３及びＣＡＡ６７発現系の構築
実施例１３で得られたＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯのＴ７プロモーター下流に挿入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（エッシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入した。インサートとベクターのライゲーション、形質転換および遺伝子の発現にはｐＥＴ１０１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
実施例１５：ＣＡＡ４３及びＣＡＡ６７活性菌体を用いた還元反応
実施例１４で得られた菌体を、５ｍｌのＬＢ培地（１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ）、０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）、１％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）、１００ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン）で培養（３７℃、１３０ｒｐｍ、１０ｈ）した。得られた菌体を１ｍｌの６０ｍＭリン酸バッファ（１ｍＭ  ＤＴＴ添加、ｐＨ７．１）に懸濁した。菌体を超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）により破砕し、遠心（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を行った。得られた菌体破砕液上清の還元活性を実施例１の方法に従い測定した。その際、各種の補酵素を反応液に添加して還元活性を測定したところ、反応液にＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸）を添加した時のみ十分な還元活性が観察された。
そこで次に、反応液（３ｍＭ  ２−ＣＡＡ、０．６５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、６０ｍＭ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．１））にＮＡＤＰＨを１／１０容量添加し、光路長０．２ｃｍのセル中、３０℃で反応させた時の経時的なＮＡＤＰＨの減少を３３９ｎｍの吸光度変化で測定した。１分間当たりに１ｍｍｏｌのＮＡＤＰＨを減少させる酵素量を酵素活性の１ｕｎｉｔと定義し、比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）をもとめた。形質転換体とＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の２−ＣＡＡ還元酵素活性を表１に示した。形質転換体で顕著な２−ＣＡＡ還元活性が認められた。
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産業上の利用可能性
本発明は、微生物の産生する酵素を用いてα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して対応するα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を、経済性、操作性、プロセスの安全性に優れた方法で製造するのに有用な高い触媒活性を有する関連酵素をコードする塩基酸配列を提供する。さらには、α位についてプロキラルな分子であるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−置換カルボニル化合物の炭素・炭素二重結合に水素添加して、対応するα位について医農薬等のキラル構築ブロックとして有用な高純度の光学活性なα−置換−α，β−飽和カルボニル化合物を製造するのに有用な還元酵素およびその遺伝子を提供するものである。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の培養炭素源による反応曲線の差違を示すグラフである。
図２は、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の培養炭素源による反応曲線の差違を示すグラフである。
図３は、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の培養炭素源による生成タンパク質の相違を、二次元電気泳動で比較した結果である。
図４は、ＣＡＡ４３遺伝子とＣＡＡ６７遺伝子の位置関係、および各ＤＮＡ断片（配列番号をＮｏ．で記載）の位置を示す概略図である。
図５は、不斉還元酵素遺伝子発現用ベクターの設計を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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