(57)【要約】グアノシン、グアノシン５’−モノリン酸及び２−アミノ−６−置換プリンの群から選ばれる１種の化合物と２’−デオキシヌクレオシドをヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素の存在下で反応させることを特徴とする２’−デオキシグアノシンの製造法。本発明方法は、２’−デオキシグアノシンを安価で入手し易い原料を使用して効率的に合成することができ、精製の障害となるグアノシンが反応液にほとんど存在しないため単離精製も極めて容易で、実用的な２’−デオキシグアノシンの製造法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアノシン、グアノシン５’−モノリン酸及び２−アミノ−６−置換プリンの群から選ばれる１種の化合物と２’−デオキシヌクレオシドをヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素の存在下で反応させることを特徴とする２’−デオキシグアノシンの製造法。
【請求項２】
化合物がグアノシン、加水分解酵素がヌクレオシダーゼである請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ、ヌクレオシダーゼがプリンヌクレオシダーゼ及び２’−デオキシヌクレオシドが２’−デオキシピリミジンヌクレオシドである請求項２記載の製造法。
【請求項４】
２’−デオキシヌクレオシドがチミジンである請求項２又は３項記載の製造法。
【請求項５】
化合物がグアノシン５’−モノリン酸、加水分解酵素がヌクレオシダーゼである請求項１記載の製造法。
【請求項６】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ、ヌクレオシダーゼがイノシン酸ヌクレオシダーゼ及び２’−デオキシヌクレオシドが２’−デオキシピリミジンヌクレオシドである請求項５記載の製造法。
【請求項７】
２’−デオキシヌクレオシドがチミジンである請求項５又は６記載の製造法。
【請求項８】
化合物が２−アミノ−６−置換プリン、加水分解酵素がデアミナーゼである請求項１記載の製造法。
【請求項９】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ、デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼ及び２’−デオキシヌクレオシドが２’−デオキシピリミジンヌクレオシドである請求項８記載の製造法。
【請求項１０】
２−アミノ−６−置換プリンにおける置換基が、加水分解可能な基である請求項８又は９記載の製造法。
【請求項１１】
２−アミノ−６−置換プリンが２−アミノ−６−ハロゲノプリンである請求項８又は９記載の製造法。
【請求項１２】
２−アミノ−６−ハロゲノプリンが２−アミノ−６−クロロプリンである請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
２−アミノ−６−置換プリンが２，６−ジアミノプリンである請求項８又は９記載の製造法。
【請求項１４】
２’−デオキシヌクレオシドがチミジンである請求項８又は９記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素の２種の酵素を併用（カップリング）した２’−デオキシグアノシンの製造法に関するものである。
背景技術
２’−デオキシヌクレオシド類は、アンチセンス医薬品（２’−デオキシヌクレオチドのオリゴマー等）を初めとする種々の医薬品の原料等に有用な化合物である。
従来、これらの２’−デオキシヌクレオシド類は、化学的に合成するか、白子等のＤＮＡを酵素分解することにより調製されている。化学的合成法では製造コストが高く、またＤＮＡ分解法では生成する４種の２’−デオキシヌクレオシドの種別需要と供給のバランスが取れず、効率的ではないという問題がある。
近年、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用いた２’−デオキシヌクレオシド類の合成法が開発されている。この酵素法は、化学的に容易に合成可能な２’−デオキシウリジン又はチミジンを２−デオキシリボースの供与体とし、化学的に合成可能な核酸塩基又はリボヌクレオシドとリン酸イオンを添加することで、酵素の糖転移反応により目的とする２’−デオキシヌクレオシドを合成しようとするものである。
しかしながら、４種の２’−デオキシヌクレオシドの中で、グアニンの難溶性に起因して、２’−デオキシグアノシンだけがその効率的な製造法が確立されていないのが現状である（例えば、特開平１１−１３７２９０号公報では、２’−デオキシグアノシンの収率は、１ｇ／Ｌ（３．６ｍｍｏｌ／Ｌ）程度である。）。
従来この問題を解決するため、いくつかの方法が報告がなされている。
（１）方法１；微生物を酵素源（ヌクレオシド・ホスホリラーゼ）として、２’−デオキシウリジン又はチミジンとグアノシン又はグアニル酸を基質として２’−デオキシグアノシンを合成する方法（特開平１１−１３７２９０号公報）。
グアニンの代りにグアノシン又はグアニル酸を基質としても、２’−デオキシグアノシンの生成量はせいぜい６．３〜７．３ｇ／Ｌ（２２．８〜２６．４ｍｍｏｌ／Ｌ）程度である。またこの方法では、大量の培養菌体を必要としたり、反応中のグアノシンと２’−デオキシグアノシンを分離精製しなければならないという問題点もある。しかし、グアノシンと２’−デオキシグアノシンはその物性がほぼ同一であることから、グアノシンと２’−デオキシグアノシンの混合物より２’−デオキシグアノシンのみを単離精製することはほとんど不可能であり、この方法は実用的な方法とはなり得ないと考えられる。
（２）方法２；微生物を酵素源（ヌクレオシド・ホスホリラーゼ）として、２’−デオキシウリジン又はチミジンとジアミノプリンを基質としてジアミノプリン２’−デオキシリボシドを合成し、これにアデノシンデアミナーゼを作用させて２’−デオキシグアノシンを合成する方法（特開平１１−１３７２８９号公報、米国特許第６１９７５５２号明細書）。
この方法は、溶解性の高いジアミノプリンを基質とすることで、上記方法１の欠点を改善するものであるが、ジアミノプリンは比較的高価な化合物であり、収率的にも必ずしも満足できる方法とはいえない。
（３）方法３；チミジンを２−デオキシリボース供与体としてグアニンとのヌクレオシドホスホリラーゼ反応による２’−デオキシグアノシンを合成する系において、生成するチミンを酵素分解して反応平衡を２’−デオキシグアノシン合成に傾けるという方法（特開平１１−４６７９０号公報、米国特許第６０１７７３６号明細書）。
この方法により１２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ程度の２’−デオキシグアノシンを合成できることが報告されているが、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ等の特殊な酵素を必要とし、必ずしも汎用性の高い方法とはいえない。
（４）方法４；２−デオキシリボース１−リン酸とグアニンを基質とし、ヌクレオシドホスホリラーゼを触媒とした２’−デオキシグアノシンの合成系に塩化カルシム添加して合成効率を高める方法（特開２００１−２６５９９号公報、国際公開第００／７００７４号パンフレット）。
しかしこの方法は、２−デオキシリボース１−リンの入手が困難であり、収率も８ｍｍｏｌ／Ｌ程度であり、実用に耐え得る方法ではない。
（５）方法５；２−デオキシリボース１−リン酸とグリオキサールグアニンを基質とし、ヌクレオシドホスホリラーゼを触媒としたグリオキサールデオキシグアノシンを生成し、これをアルカリ分解して２’−デオキシグアノシンを合成する方法（特開２００１−２６９１９２号明細書、欧州特許第１１３８７７５号明細書）。
この方法は２−デオキシリボース１−リンの入手が困難であり、また、どの程度の収率で２’−デオキシグアノシンが得られるかは明確に開示されていない。
更に本発明者らは、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを触媒とし、グアニンとチミジン又は２’−デオキシウリジンを基質とした２’−デオキシグアノシンの合成を先に提案したが、グアニンが難溶性のため、２〜３ｍｍｏｌ／Ｌ前後の２’−デオキシグアノシンしか合成することができなかった（特開２００１−４６０９７号公報）。
このように、２’−デオキシグアノシンの酵素合成に関しては、種々検討されているが、実用的な方法は未だ提案されていない。
従って、本発明の目的は、安価で入手し易い原料を使用して酵素合成法による２’−デオキシグアノシンの効率的かつ実用的な製造法を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた２’−デオキシグアノシンの製造法の検討を鋭意重ねた結果、安価なグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸と、２’−デオキシグアノシン以外の２’−デオキシヌクレオシドを基質とし、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素であるヌクレオシダーゼを併用すると２’−デオキシグアノシンが効率的に製造できることを見出した。
一般に、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは、溶解状態のグアニンしか基質として認識しないと考えられる。グアニンとチミジン又は２’−デオキシウリジンを基質とし、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いて２’−デオキシグアノシンの合成をした場合、２〜３ｍｍｏｌ／Ｌ前後の２’−デオキシグアノシンしか合成できないため、グアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸（ＧＭＰ）をヌクレオシダーゼでグアニンとリボース又はリボース５−リン酸に分解したとしても、グアニンはすぐに不溶状態となって析出し、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質とはなり得ないと考えられていた。
しかしながら、まったく驚くべきことに、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとヌクレオシダーゼとを併用（カップリング）した２’−デオキシグアノシンの製造法には、（１）ヌクレオシダーゼは、不溶状態のグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸が存在したとしても、何の問題もなくグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸を分解し続けること、（２）グアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸をヌクレオシダーゼでグアニンとリボースあるいはリボース５−リン酸に分解する際にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを反応系に共存させておくことで、生成したグアニンが析出する前にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質として認識され、速やかに２’−デオキシグアノシンが生成し、グアニンの析出はほとんど観察されないこと、（３）ヌクレオシダーゼは、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドのみに作用し、２’−デオキシヌクレオシドには作用しないので、ヌクレオシダーゼにより目的とする２’−デオキシグアノシンが分解されることはないこと、（４）２’−デオキシグアノシンの単離精製の障害となるグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸はヌクレオシダーゼで完全に分解させることが可能であるため、２’−デオキシグアノシンの単離精製が容易なこと等の数々の利点を有し、２’−デオキシグアノシンを高収率で製造できる実用的な方法であることを確認し、本発明を完成した。
更に、本発明者らは、グアニンの代わりに２−アミノ−６−置換プリンと２’−デオキシヌクレオシドを用い、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素を併用しても、２’−デオキシグアノシンを効率良く製造できることを見出した。
従来、上述したように、ヌクレオシドホスホリラーゼとアデノシンデアミナーゼとの併用によるデオキシヌクレオシド化合物の合成は種々報告されている（例えば、特開平１１−１３７２８９号公報、米国特許６１９７５５２号明細書、特許第３０３３９１８号公報等）が、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素を併用してデオキシヌクレオシド化合物を製造することに関する報告はない。
本発明者らは、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた反応の方が、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用いた反応より反応効率が高いことを見出し、更に当該酵素と加水分解酵素とを併用することで２’−デオキシグアノシンを効率よく製造できることを確認し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、グアノシン、グアノシン５’−モノリン酸及び２−アミノ−６−置換プリンの群から選ばれる１種の化合物と２’−デオキシヌクレオシドをヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素の存在下で反応させることを特徴とする２’−デオキシグアノシンの製造法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明において使用するヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとしては、２−デオキシリボシル基を転移できる活性を有するものであれば特に限定されず、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩ、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ等が挙げられる。
本発明において使用する加水分解酵素は、ヌクレオシダーゼ、２−アミノ−６−置換プリンの６位置換基を加水分解する酵素（以下、６位置換基加水分解酵素ということもある）である。
本発明の２’−デオキシグアノシンの製造法は、使用する加水分解酵素と化合物の種類により次の３種の製造法に分けられる。
使用する加水分解酵素がヌクレオシダーゼである場合は、次の２種の製造法が挙げられる。
第一番目の製造法は、グアノシンと２’−デオキシヌクレオシドをヌクレオシダーゼとヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの存在下に反応させて行う２’−デオキシグアノシンを製造法である。
すなわち、グアノシン（Ｒ−Ｇｕａ）をヌクレオシダーゼ（Ｅ１）で加水分解しグアニンを生成させ、次いで、もしくは同時並行的にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（Ｅ２）の存在下でグアニンと２’−デオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ｂ）とを反応させて２’−デオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇｕａ）を製造する。
2003057895.tif 000002
第二番目の製造法は、グアノシン５’−モノリン酸と２’−デオキシヌクレオシドをヌクレオシダーゼとヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの存在下に反応させて行う２’−デオキシグアノシンの製造法である。
すなわち、グアノシン５’−モノリン酸（Ｐ−Ｒ−Ｇｕａ）をヌクレオシダーゼ（Ｅ１）で加水分解しグアニンを生成させ、次いで、もしくは同時並行的にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（Ｅ２）の存在下でグアニンと２’−デオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ｂ）とを反応させて２’−デオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇｕａ）を製造する。
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そして、これらのヌクレオオシダーゼとしては、ヌクレオシド又はヌクレオチドを核酸塩基と糖又は糖リン酸に加水分解できる活性を有する酵素であればよく、プリンヌクレオシダーゼ、イノシン酸ヌクレオシダーゼ等が挙げられる。
第三番目の製造法は、加水分解酵素が２−アミノ−６−置換プリンの６位の置換基を加水分解する酵素である場合である。この６位置換基加水分解酵素には、２−アミノ−６−置換プリンを有するヌクレオシドの６位の置換基を加水分解する酵素も含まれる。この製造法は、２−アミノ−６−置換プリンと２’−デオキシヌクレオシドとをヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと６位置換基加水分解酵素との存在下に反応させて行う２’−デオキシグアノシンの製造法である。
すなわち、２−アミノ−６−置換プリン（２−ＡＰ）と２’−デオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ｂ）とをヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（Ｅ２）の存在下反応させて２−アミノ−６−置換プリン−２’−デオキシリボシド（ｄＲ−２−ＡＰ）を生成させ、次いで６位置換基加水分解酵素（Ｅ３）で当該生成物の６位置換基を加水分解して２’−デオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇｕａ）を製造する。
2003057895.tif 000004
この６位置換基加水分解酵素としては、２−アミノ−６−置換プリン又はそれを有するヌクレオシドの６位の置換基を加水分解して２−アミノ−６−オキソプリン（グアニン）又はそれを有するヌクレオシドを生成できる活性を有するものであれば特に限定されず、具体的にはデアミナーゼ、より具体的にはアデノシンデアミナーゼ等が挙げられる。
併用する酵素の組み合わせとしては、第一番目の製造法には、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとプリンヌクレオシドに作用するヌクレオシダーゼ（プリンヌクレオシダーゼ）の組み合わせが、第二番目の製造法には、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとイノシン酸ヌクレオシダーゼの組み合わせが、第三番目の製造法には、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとアデノシンデアミナーゼの組み合わせがそれぞれ好適である。
本発明で使用する酵素は、いずれも公知の酵素であり、動物由来、植物由来、微生物に由来する特定酵素に限定されず、すべての由来の酵素を使用することができる。酵素調製の簡便性等の点から微生物由来の酵素を使用するのが好都合である。例えば、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは乳酸菌に属する微生物から容易に調製でき、ヌクレオシダーゼ及びアデノシン・デアミナーゼは細菌、酵母、かびに属する微生物から容易に調製することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＬＩ．４４６（１９７８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７９，６３０−６３３（１９５７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，８８４−８９４（２００１）、Ｂｕｌｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，２３，２８１−２８８（１９５９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，７４０−７４６（１９６７）等参照）。
微生物を培養するための培地としては、これらの微生物が資化可能な炭素源及び窒素源を適当量含有し、必要に応じて金属塩、微量発育促進物質、消泡剤等を添加した培地が使用される。具体的には、培地成分としては糖類（グルコース、サッカロース等）、天然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ふすま、米等）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類等、窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物等、金属塩としては亜鉛、鉄、マグネシウム等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩等、微量発育促進物質としては、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビオチン等が挙げられる。
培養は、通常の液体培養法（振盪培養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養等）又は固体培養法によって、２０〜５０℃の温度条件下で必要により通気攪拌しながら、目的とする酵素活性が十分得られるまで行えばよい。
このようにして得られた培養物を、使用目的に応じ適宜処理加工したものを酵素調製物として使用する。酵素調製物は特に制限されるものではなく、例えば、微生物の培養物自体、培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈殿分離、凝集分離、洗浄、水抽出等）によって分離された菌体又はその菌体処理物又は酵素抽出物を挙げることができる。
菌体処理物としては、更に具体的には、生菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理等により物理的に菌体を破砕するか、又はリゾチーム処理等酵素的に溶菌させた後、菌体残渣を遠心分離により除去した無細胞抽出液を挙げることができる。また、この無細胞抽出液又は前記の酵素抽出物を熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノール等の溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理等の酵素精製に通常使用されている処理を単独で又は数種組み合わせて得られる粗精製酵素、精製酵素を例示することもできる。
更に、上記酵素の遺伝子がクローニングされている場合には、クローン化されたＤＮＡ断片を用い、公知の組換えＤＮＡ手法で目的とする酵素を調製することも可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，（５３３１），１４５３−１４７４，（１９９７）等参照）。すわなち、遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、当該発現ベクターを用いた目的とする酵素活性を有する酵素の調製等は、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓ等編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））に記載の方法に従って行うことができる。
なお、乳酸菌のヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングと発現に関しては文献（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，２２３４−２２４５（２０００））に記載されており、大腸菌のヌクレオシダーゼ遺伝子のクローニングと発現に関しても文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，８８４−８９４（２００１））に記載されており、また大腸菌のアデノシン・デアミナーゼ遺伝子のクローニングと発現に関しても文献（特開平５−２１９９７８号公報）に記載されている。
第一、二番目の製造法に使用するグアノシン及びグアノシン５’−モノリン酸としては、市販のものが使用できる。
第三番目の製造法に使用する２−アミノ−６−置換プリンとしては、２−アミノ−６−置換プリンにおける置換基が加水分解可能な基であるプリン誘導体であれば使用することができ、具体的には２−アミノ−６−ハロゲノプリン及び２，６−ジアミノプリンを挙げることができる。なお、２−アミノ−６−ハロゲノプリンとしては、２−アミノ−６−クロロプリンが好ましい。
本発明で使用する２−デオキシリボースの供与体としての２’−デオキシヌクレオシドとしては、市販の２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシウリジン、チミジン等を使用でき、２’−デオキシピリミジンヌクレオシドが好ましく、特にチミジンが好適である。
２’−デオキシグアノシンの合成：
第一又は二番目の製造法による２’−デオキシグアノシンの合成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度になるようにグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸と２’−デオキシヌクレオシドを水又は緩衝液（ｐＨ３〜１０）に溶解又は懸濁させ、０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．０１ユニット／ｍＬ以上のヌクレオシダーゼとヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを使用し、１０℃以上、好ましくは３０℃以上、７０℃以下、好ましくは６５℃以下の温度条件で、１０分〜５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施するのが好ましい。
この反応は、ヌクレオシダーゼによりグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸をグアニンとリボース又はリボース５−リン酸に分解する際に、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを反応系に共存させておくことが肝要である。生成したグアニンが析出する前にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質として認識され、速やかに２’−デオキシグアノシンが生成し、グアニンの析出はほとんどない。
２’−デオキシグアノシンの合成条件は、例えば、（１）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの酵素活性をヌクレオシダーゼの酵素活性より高め、具体的には２倍以上、好ましくは５倍以上に設定、（２）２’−デオキシヌクレオシドの濃度をグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸の濃度より高めに、好ましくは２倍以上の濃度に設定することにより、２’−デオキシグアノシンを高収率で合成することが可能である。この最適条件は、小規模試験にて決定することができる。
第三番目の製造法による２’−デオキシグアノシンの合成反応は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼによる反応と、加水分解酵素による反応の２つの反応工程からなり、２つの反応を同時並行的に行ってもよく、順次行ってもよい。
すなわち、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の２’−デオキシヌクレオシドと２−アミノ−６−置換プリンとを水又は緩衝液に溶解又は懸濁させ、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いて２−アミノ−６−置換プリン−２’−デオキシリボシドを調製し、この中間体を単離し又は単離することなく、アデノシン・デアミナーゼ等の加水分解酵素を水性媒体中で作用させることで目的とする２’−デオキシグアノシンを製造することができる。
この反応は、０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．０１ユニット／ｍＬ以上のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ、及び２ユニット／ｍＬ以上、好ましくは２０ユニット／ｍＬ以上のアデノシン・デアミナーゼを使用し、ｐＨ３〜１０、好ましくは５〜９、温度１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の条件下で１０分〜５０時間程度、必要により攪拌しながら実施するのが好ましい。
上記反応において、２−アミノ−６−置換プリン−２’−デオキシリボシドを反応液から単離することなく加水分解酵素を作用させる場合には、一旦加熱処理やアルカリ処理等を施してヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを失活させた後、加水分解酵素を作用させるのが好ましい。
上記いずれの反応も、反応温度が１０℃未満のときは反応速度が遅く、反応効率が悪い。一方、反応温度が７０℃を越える場合には酵素が変性、失活する可能性があり、好ましくない。また、反応途中でｐＨが変動するので、酸又はアルカリを用いて上記ｐＨ範囲に補正すればよい。
２’−デオキシグアノシンの精製：
生成した２’−デオキシグアノシンは核酸関連物質の精製法として通常使用されている方法又はこれを応用した方法によって分離精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法等各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出等二液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添加等溶解度の差を利用する方法等の２’−デオキシヌクレオシドの分離精製で使用されている一般的な分離精製法を単独で又は適宜組み合わせて行えばよい。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結及び大腸菌の形質転換法は、全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（前述）に従って行った。また、各種制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等は全て宝酒造（株）より入手した。
また、酵素活性の測定と単位の算出は以下の方法で行った。
＜ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの活性の測定＞
５ｍｍｏｌ／Ｌのチミジンとシトシンを含有する２０ｍｍｏｌ／ＬのＭＯＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に酵素標品を加えて４０℃に保温し、反応終了後、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。２’−デオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、４０℃で１分間に１μｍｏｌｅの２’−デオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
＜ヌクレオシダーゼの活性の測定＞
５ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン又はグアノシン５’−モノリン酸を含む２０ｍｍｏｌ／ＬＭＯＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に酵素標品を加え、３７℃で保温し、反応終了後等量の０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させる。反応液中のグアニンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのグアニンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
＜アデノシン・デアミナーゼの活性の測定＞
アデノシンを含む反応液５ｍＬ（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．２），３０ｍｍｏｌ／Ｌアデノシン）をあらかじめ３７℃に加温しておき、無細胞抽出液を５μＬ添加して、３７℃で５分間反応させた後、０．２ｍＬ採取して、等量の０．１ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムと混合させることにより酵素を失活させる。この溶液を１６６倍希釈後、イノシンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのイノシンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
＜プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ及びピリミジン・ヌクレオシドホスホリラーゼの活性の測定＞
特開平４−４８８２号公報に記載の方法に従い、７０℃又は５０℃におけるイノシン及びウリジンの加リン酸分解活性を測定した。
実施例１
（１）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼーＩＩの調製
文献（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，２２４３−２２４５（２０００））の方法に従って、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ８０１８株のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｄｔＢ）のクローニングし、発現プラスミドｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を作製した。
プラスミドｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を保持する大腸菌ＪＭ１０９を２ｘＴＹ培地に接種した。３７℃２時間培養後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加して５時間培養した２５℃にて１６時間培養してｎｄｔＢ遺伝子を大量発現させた。遠心分離により回収した菌体を破砕用懸濁液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕、遠心分離により無細胞抽出液（比活性３６．１８ユニット／ｍｇ−タンパク質）を調製した。
これを、更に前述の文献の方法に従って、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィの操作により部分精製し、酵素標品（比活性３６．６９ユニット／ｍｇ−タンパク質）を調製した。
（２）大腸菌ヌクレオシダーゼの調製
（２−１）大腸菌ヌクレオシダーゼｙａａＦ遺伝子のクローニング
大腸菌ＪＭ１０５株（ＡＴＣＣ４７０１６）の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ヌクレオシダーゼ（ｙａａＦ）遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，８８４−８９４（２００１））を増幅した。
2003057895.tif 000005
ＰＣＲによるｙａａＦ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．００１％  ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１ｍｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−ＥＬｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５７℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｙａａＦを単離した。
ｐＴｒｃ−ｙａａＦは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断部位に大腸菌のｙａａＦ構造遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２−２）大腸菌ヌクレオシダーゼ（ＹａａＦ）の調製
プラスミドｐＴｒｃ−ｙａａＦを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μＬ／ｍｇのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で振盪培養した。菌体数が４ｘ１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で８時間振盪培養を続けた。
培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ、１０分）により菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム）に懸濁した。超音波処理により菌体を破砕し、更に遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。得られた無細胞抽出液を１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）１Ｌ、２回の透析を行い、透析チューブより回収した液を遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）することで沈殿物を除去した。得られた上清画分をＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ樹脂カラム（５０ｍＬ；（株）東ソー）に吸着させ、同緩衝液で未吸着試料を溶出した後、２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する同緩衝液を用いて塩濃度の直線勾配をかけることにより吸着試料を溶出させた。
ヌクレオシダーゼ活性を有する画分を回収し、これを同緩衝液１Ｌで透析した後、ＭｏｎｏＱカラム（１ｍＬ；アマシャム−ファルマシア）に吸着させた。未吸着試料を同緩衝液で溶出させた後、続いて２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する同緩衝液を用いて吸着試料を溶出させた。ヌクレオシダーゼ活性を有する画分を回収した後、同緩衝液１Ｌで透析し、得られたヌクレオシダーゼ活性画分を酵素標品とした。なお、酵素標品におけるヌクレオシダーゼ活性は  ５．２ユニット／ｍｇタンパク質であった。
（３）チミジンを用いた２’−デオキシグアノシンの合成
７０ｍｍｏｌ／Ｌ  チミジン、３５ｍｍｏｌ／Ｌ  グアノシンを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ  ０．３０ユニット／ｍＬ，ヌクレオシダーゼ  ０．０６ユニット／ｍＬとなるように酵素標品を添加し、４２℃で攪拌しながら３２時間反応させた。その結果、３１．０ｍｍｏｌ／Ｌの２’−デオキシグアノシンの生成が確認され、グアノシンは検出されなかった。
実施例２
（１）イノシン酸ヌクレオシダーゼの調製
文献（Ｂｕｌｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，２３，２８１−２８８（１９５９））の方法に従って、アスペルギル・オリゼの麹からイノシン酸ヌクレオシダーゼを調製する。
（２）チミジンを用いた２’−デオキシグアノシンの合成
２５ｍｍｏｌ／Ｌ  チミジン、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  グアノシン５’−モノリン酸を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ  ０．３３ユニット／ｍＬ、イノシン酸ヌクレオシダーゼ  ０．１５ユニット／ｍＬとなるように酵素標品を加え３７℃で攪拌しながら１８時間程度反応させ２’−デオキシグアノシンを得る。
実施例３
（１）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの調製
ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する栄養培地１００ｍＬに、特開２００２−１７３９３号公報に記載の方法に従い調製した組換えベクターｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を保持する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］を植菌し、３７℃で振盪培養した。
４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍＬの蒸留水に懸濁した。菌体懸濁液を超音波粉砕機にて処理して、更に遠心分離（１２，０００ｘｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。
（２）プリンヌクレオシド・ホスホリラーゼの調製
ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する栄養培地１００ｍＬに、特開平９−１１７２９８号公報に記載の方法に従い調製した組換えベクターｐＴｒｃ−Ｂ５６を保持する大腸菌ＪＭ１０９「ｐＴｒｃ−Ｂ５６」を植菌し、３７℃で振盪培養した。
４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、２０ｍＬの緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有）に懸濁した。菌体懸濁液に終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチームを加え、３７℃で１時間保温することで形質転換体を溶菌させ、更に遠心分離（１２，０００ｘｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。
（３）ピリミジンヌクレオシド・ホスホリラーゼの調製
ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する栄養培地１００ｍＬに、特開平６−２５３８５４号公報に記載の方法に従い調製した組換えベクターｐＴｒｃ−ｐｙｎを保持する大腸菌ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−ｐｙｎ］を植菌し、３７℃で振盪培養した。
４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で１６時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、２０ｍＬの緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有）に懸濁した。菌体懸濁液に終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチームを加え、３７℃で１時間保温することで形質転換体を溶菌させ、更に遠心分離（１２，０００ｘｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。
（４）アデノシン・デアミナーゼの調製
ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する栄養培地１００ｍＬに、特開平５−２１９９７８号公報に記載の方法に従い調製した組換えベクターｐＤＲ−ａｄｄを保持する大腸菌形質転換体ＪＭ１０５［ｐＤＲ−ａｄｄ］を植菌し、３７℃で振盪培養した。
４×１０８個／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で３時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．２）、１０％エチレングリコール）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、更に遠心分離（２，０００ｘｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。
（５）２−アミノ−６−クロロプリン−２’−デオキシリボシドの合成（酵素の違いによるモル収率の比較）
１００ｍｍｏｌ／Ｌチミジン（ヤマサ醤油）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ２−アミノ−６−クロロプリン（シグマ）、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ  ０．３８５ユニット／ｍＬ、又はプリン・ヌクレオシドホスホリラーゼ−ＩＩ  ０．７７ユニット／ｍＬとピリミジン・ヌクレオシドホスホリラーゼ  ０．３８５ユニット／ｍＬを含む溶液５ｍＬを４０℃又は５０℃で攪拌しながら１６時間反応させた。反応結果を表１に示す。
表１から明らかなように、ヌクレオシドホスホリラーゼを用いるより、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた方が、効率よく２−アミノ−６−クロロプリン−２’−デオキシリボシドを合成することができる。なお、モル収率は、２−アミノ−６−クロロプリンが２−アミノ−６−クロロプリン−２’−デオキシリボシドの合成に利用された百分率で示す。
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（６）２’−デオキシグアノシンの合成
上記（５）のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩを用いて得られた反応液１ｍＬに２０％水酸化ナトリウムを１０μＬ加えたのち、０．１ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたのち、アデノシン・デアミナーゼ  ５０ユニット／ｍＬを添加して４０℃で攪拌しながら１３時間反応させた。
その結果、４３．２ｍｍｏｌ／Ｌの２−アミノ−６−クロロプリン−２’−デオキシリボシドから４２．０ｍｍｏｌ／Ｌの２’−デオキシグアノシンが合成されていた（モル収率９７．２％）。
実施例４
（１）２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドの合成
１００ｍｍｏｌ／Ｌチミジン（ヤマサ醤油）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ２，６−ジアミノプリン（シグマ）、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ  ０．３８５ユニット／ｍＬを含む溶液５ｍＬを４０℃で攪拌しながら１６時間反応させた。この結果、４８．２ｍｍｏｌ／Ｌの２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドが合成された。
（２）２’−デオキシグアノシンの合成
上記（１）で得られた反応液１ｍＬに２０％水酸化ナトリウムを１０μＬ加えたのち、０．１ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたのち、アデノシン・デアミナーゼ  ５０ユニット／ｍＬを添加して４０℃で攪拌しながら１３時間反応させた。
その結果、４３．９ｍｍｏｌ／Ｌの２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドから４１．２ｍｍｏｌ／Ｌの２’−デオキシグアノシンが合成されていた（モル収率９３．８％）。
産業上の利用可能性
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと加水分解酵素を併用（カップリング）する本発明方法は、２’−デオキシグアノシンを安価で入手し易い原料を使用して効率的に合成することができ、精製の障害となるグアノシンが反応液にほとんど存在しないため単離精製も極めて容易で実用的な２’−デオキシグアノシンの製造法である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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