(57)【要約】カルボキシル基、メルカプト基およびその酸化型の基から選択される官能基を分子内に有する有機物質にフェライトを生成し結合することにより、有機物質とフェライトとの間に強い結合を持つフェライト結合有機物質を得ることができる。このフェライト結合有機物質の製造にはフェライトめっきを用いることができる。このフェライト結合有機物質に生体活性物資を保有させることにより、磁気的な操作が可能な各種薬剤、生体分析用試薬、ＤＮＡ、各種造影剤、あるいはＭＲＩの増感剤などへの幅広い利用が可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基、メルカプト基およびメルカプト基の酸化型の基から選択される官能基を有する有機物質と、
前記有機物質と前記官能基により結合したフェライトと
を備えていることを特徴とするフェライト結合有機物質。
【請求項２】
前記フェライトは、前記有機物質の存在下で生成されたものであり、その生成時に前記有機物質の前記官能基と化学結合していることを特徴とする請求の範囲１記載のフェライト結合有機物質。
【請求項３】
前記有機物質は、前記官能基に加えて、カルボキシル基、水酸基、カルバモイル基よりなる群から選択され、前記官能基に近接して存在し協力的に作用する基を有することを特徴とする請求の範囲２記載のフェライト結合有機物質。
【請求項４】
前記有機物質は、親水性の基を有することを特徴とする請求の範囲２記載のフェライト結合有機物質。
【請求項５】
前記有機物質は、フェライトに結合した有機物質とこの有機物質に結合し被覆を形成する高分子被覆物質とを備えていることを特徴とする請求の範囲２記載のフェライト結合有機物質。
【請求項６】
前記有機物質は、分子量５００以下の低分子の有機物質であることを特徴とする請求の範囲２記載のフェライト結合有機物質。
【請求項７】
前記有機物質は重合体であることを特徴とする請求項２記載のフェライト結合有機物質。
【請求項８】
前記有機物質は、前記官能基の付与された生体活性物質であることを特徴とする請求の範囲２記載のフェライト結合有機物質。
【請求項９】
前記フェライト結合有機物質は、前記有機物質に結合した生体活性物質を備えていることを特徴とする請求の範囲１記載のフェライト結合有機物質。
【請求項１０】
メルカプト基、メルカプト基の酸化型基、およびカルボキシル基からなる群から選択される基を持つ有機物質の水溶液中で、前記有機物質にフェライトを生成する工程を備えていることを特徴とするフェライト結合物質の製造方法。
【請求項１１】
前記有機物質にフェライトを生成する工程において、前記有機物質の水溶物または水和物を有する液に、Ｆｅ２＋イオンを必須成分としフェライトを構成する金属元素イオンを有する液を添加するとともに、アルカリ溶液を添加して前記有機物質水溶液のｐＨを制御し、液中の前記金属元素イオンを前記有機物質に吸着させ、酸化反応を行なってＦｅ２＋イオンを酸化することにより前記有機物質にフェライトを生成固定することを特徴とする請求の範囲１０記載のフェライト結合物質の製造方法。
【請求項１２】
前記Ｆｅ２＋イオンの酸化に酸化剤として過酸化水素を用いることを特徴とする請求の範囲１１記載のフェライト結合物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、有機物質とフェライトとが、有機物質の有する官能基を通じて強く結合したフェライト結合有機物質とその製造方法に関する。
背景技術
鉄を成分として持つ酸化物の磁性体であるフェライトは、例えば生体中にマグネタイトとして存在するなど、自然界に多く存在する物質である。またフェライトは化学組成や磁気特性がよく制御されたものが人工的に合成され量産されて、情報機器の部品材料などとして、広く利用されている。
有機物質にフェライトを結合させると、有機物質が磁気的に操作できるようになる。生物工学や医療などの分野では、有機物質にフェライトを付着させて磁気的に操作可能にしたものが活発に研究されている。例えば非特許文献１には、有機物質にフェライトを付着させることにより磁性を付与し、磁性を利用して薬剤や診断薬などの臨床学的研究についての多くの研究結果が記載されている。
これらの報告には、磁性を持つ微小球の表面に生体物質や薬剤を固定し、その輸送を磁気的に操作して患部に輸送することや、また磁性を持つ微小球の表面に酵素免疫試薬を固定し、磁気分離を用いて、迅速な分画処理ができることなどが記載されている。
有機物質にフェライトを結合する方法として、従来は各種の結合剤を用いる方法が主として用いられてきた。これに対し、非磁性の物質に直接フェライトを生成する方法により、介在物を必要とせずに有機物質とフェライトとの間に直接かつ強固な結合を得ることができる。
このような目的に適した方法としてフェライトめっきがある。フェライトめっき技術は、本発明者の一人である阿部らによって開発されたもので、例えば非特許文献２にその詳細が解説されている。フェライトめっきでは、めっき液のｐＨを中性付近に保ったまま行なうことができるという優れた特徴がある。またこのフェライトめっき技術を利用して、阿部、半田らは、特許文献１にて、生理活性を有する生体物質の生体活性を阻害しない部位にフェライトめっきによりフェライトを固定し、生理活性を有するとともに磁性を有するフェライト固定生体物質とその製造方法を提案している。
このようにフェライトめっきでは、反応液に浸された非磁性物質の表面に存在する水酸基（−ＯＨ基）に対し、フェライトを生成させており、例えば金属酸化物のように、表面に水酸基を多く保有している基体に対しては、フェライトめっきにより、フェライトと基体との間に強固な結合を得ることができることが知られていた。
しかしながら有機物質においては、その表面に水酸基が多数存在しているとは限らず、水酸基をあまり多く保有していない場合が少なくない。またたとえ水酸基を保有していたとしても、その水酸基が化学的に金属酸化物の水酸基と同様の性質を有しているとは限らず、この水酸基に対しフェライトめっきを試みたとしても、必ずしもフェライトと有機物質との間に強固な結合を得ることができるものではない。このため有機物質に対しフェライトめっきを行なうには、有機物質とフェライトとの間に強固な結合を得ることが可能な何か新しい条件を見出すことが必要であった。
本発明はこのような点に着目し研究を行なった結果、有機物質とフェライトとの強固な結合を得るための新しい条件を見出すことができ、さらに研究を進めることにより、本発明をなすに至ったもので、有機物質にフェライトを強固に結合したフェライト結合有機物質、およびその製造方法を提供するものである。
なお、有機物質にフェライトを結合するのとは逆に、無機物の粒子表面に有機物質を被覆することにより表面を安定化させた超常磁性微粒子に関する発明が特許文献２に記載されている。同様に表面を２−ヒドロキシニコチン酸などの有機物を被覆することにより表面を安定化させた強磁性金属微粒子の発明が特許文献３に記載されている。しかしながら既に形成されている無機物粒子の表面に有機物質を被覆した場合には、例えば水酸基を有する有機物質にフェライトめっきを行った場合のような無機物と有機物質との間に十分に強い結合を得ることができないという問題点があった。その理由として、無機物粒子の生成時であれば、粒子を構成する原子は活性化された状態にあり、他の物質と化学結合を作って強く結合できるのに対し、粒子が形成された後では、構成原子はすでに安定化しているため、このような化学結合に基づく強い結合を作ることができないことが挙げられる。
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発明の開示
本発明のフェライト結合有機物質は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）、メルカプト基（−ＳＨ基）およびメルカプト基の酸化型の基（−ＳＯ２Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、−Ｓ−Ｓ−基など）から選択される官能基を有する有機物質と、この有機物質とこの官能基により結合したフェライトとを備えていることを特徴としている。有機物質が有する上記の官能基によって有機物質はフェライトと強固な化学結合を持つ。
本発明のフェライト結合有機物質は、フェライトが有機物質の存在下で生成されたものであり、その生成時に有機物質の上記官能基と化学結合しているものが、フェライトと有機物質との間に強い結合を持つので好ましい。このようにフェライト生成の当初の段階でこの有機物質の上記官能基がフェライトと化学結合すると、フェライトと上記有機物質との間の結合は強固なものとなる。
本発明のフェライト結合物質の製造方法は、メルカプト基、メルカプト基の酸化型基、およびカルボキシル基からなる群から選択される基を持つ有機物質の水溶液中で前記有機物質にフェライトを生成する工程を備えたことを特徴とする。この製造方法によってフェライト結合物質を製造することにより、フェライトと有機物質との間に強力で安定した結合が得られる。
発明を実施するための最良の形態
本発明のフェライト結合有機物質は、カルボキシル基、メルカプト基およびメルカプト基の酸化型の基から選択される官能基を有する有機物質が、この官能基によりフェライトと結合したものである。
この有機物質とフェライトとが強い結合を持つためには、上記官能基１個あたりの分子量は５００以下であることが好ましく、２００以下であることがさらに好ましい。
本発明のフェライト結合有機物質において、フェライトはこの有機物質の存在下で、フェライトを有機物質の上記官能基に化学結合させて生成させたものがフェライトと有機物質との間に強い結合を持つことから好ましく、例えばこの有機物質の存在する水溶液中でフェライトをこの有機物質の官能基に化学結合させて生成させたものが好ましい。
有機物質の存在する水溶液中でフェライトを有機物質の上記官能基に化学結合させて生成する方法としては、後に詳述するフェライトめっきが特に適している。フェライトめっきを用いて製造されたフェライト結合有機物質においては、フェライトと有機物質との間に強い化学結合が存在する。
本発明のフェライト結合有機物質を構成するフェライトとしては、マグネタイトＦｅ３Ｏ４を用いることができる。また本発明のフェライト結合有機物質を構成するフェライトには、Ｚｎを成分として含有させることができ、またＣｏやＮｉなどの各種金属元素を含有させることができる。
マグネタイトはフェライト結合有機物質の形成に適しており、しかも比較的大きな磁化を有する。またフェライトがＺｎを含有することにより、磁化を高めることができ、その結果、磁界に対する応答の感度を高めることができる。さらにフェライトにＣｏやＮｉなどの各種金属元素を含有させることにより、フェライトの磁気特性や構造などの特性を適切に制御することができる。
本発明のフェライト結合有機物質を構成する有機物質は、カルボキシル基、メルカプト基およびメルカプト基の酸化型の基から選択される上記官能基に加えて、カルボキシル基、水酸基（−ＯＨ基）、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２基）よりなる群から選択され、前記官能基に近接して存在し協力的に作用する近接の官能基を有することが好ましい。
有機物質がこのような複数の官能基を有し、近接して存在し協力的に作用することにより、有機物質とフェライトとの間には強力な結合が得られる。
本発明のフェライトと結合するこのような有機物質として、例えば、フタル酸
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イソフタル酸
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およびテレフタル酸
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を挙げることができる。
このほか、本発明のフェライトと結合するこのような有機物質として、コハク酸
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グルタル酸
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アジピン酸
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ピメリン酸
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を挙げることができる。
また、二重結合を持つフマル酸
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およびマレイン酸
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などの不飽和酸を本発明におけるフェライトと結合するこうした有機物質として用いることができる。
また本発明のフェライトと結合する有機物質として、メルカプト基とアミノ基とを持つ２−メルカプトアミン
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および６−アミンヘキサンチオール
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さらにメルカプト基とカルボキシル基とを持つ有機物質である２−メルカプトプロピオン酸
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を用いることができる。
また本発明のフェライトと結合する有機物質は、親水性の基を併せて有することが好ましい。この有機物質が親水性の基を有することにより、有機物質とフェライトとの結合が容易になり、その結合は強固で安定したものになる。
このような有機物質として、例えば次のようなアミノ酸およびその関連物質を挙げることができる。即ち、アスパラギン酸
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およびグルタミン酸
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を挙げることができる。
また本発明におけるフェライトと結合する有機物質として、アミノ酸固有の親水性の基であるアミノ基（−ＮＨ２基）およびカルボキシル基に加えて、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２基）を側鎖に持つアミノ酸であるアスパラギン
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およびグルタミン
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を用いることができる。
またアスパラギン酸のアミノ基を水酸基に置き換えた形のリンゴ酸
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を本発明におけるフェライトと結合する有機物質として用いることができる。
またアスパラギン酸の＞ＣＨ−ＮＨ２の部分を＞Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）に置き換えた形のオキサロ酢酸
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およびグルタミン酸の＞ＣＨ−ＮＨ２の部分を＞Ｃ＝Ｏに置き換えた形の２−ケトグルタル酸
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を、本発明におけるフェライトと結合する有機物質として用いることができる。
またアミノ酸固有の親水性の基であるアミノ基およびカルボキシル基のほかに、側鎖に水酸基を持つアミノ酸であるセリン
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およびスレオニン
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を本発明におけるフェライトと結合する有機物質として用いることができる。
また本発明のフェライトと結合する有機物質としては、メルカプト基を持つアミノ酸であるシステイン
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を用いることができる。
システインは酸化されることにより、まずシステインスルフィン酸
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となり、さらに酸化されてシステイン酸
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となる。これらの化合物はシステインと同様にフェライトとの結合を形成することができ、本発明のフェライトと結合する有機物質として用いることができる。
また２個のシスティンが酸化してジスルフィド結合したアミノ酸であるシスチン
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を、本発明においてフェライトと結合する有機物質として用いることができる。
またシステインの誘導体であるＮアセチルシステイン
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およびシステインエチルエステル
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を、同様に本発明においてフェライトと結合する有機物質として用いることができる。
これらの化合物においては親水性の原子団の−ＮＨ−（アミド結合）および−（ＣＯ）Ｏ−（エステル結合）が、メルカプト基とともにフェライトとの結合の形成に関与していると考えられる。
また本発明においてフェライトと結合する有機物質として、メルカプト基を２個有するジチオスレイトール
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を用いることができる。このジチオスレイトールには、２個のメルカプト基と２個の親水性の基である水酸基が存在し、フェライトとよく結合する。
上記の各種有機物質は、本発明に用いることのできる有機物質の具体例を述べたものであって、これらに限定されるものではない。本発明に用いることのできる有機物質のカルボキシル基をチオカルボキシル基−ＣＯＳＨで置き換えた有機化合物、例えばジメルカプトコハク酸ＨＳＯＣＨ２ＣＨ２ＯＳＨなど、さらにはこれら有機化合物のカルボキシル基をジチオカルボキシル基−ＣＳＳＨで置き換えた有機化合物を用いることもできる。
上述したフェライトと結合する有機物質は、いずれも分子量５００以下であり、そのほとんどは分子量２００以下の低分子の有機物質である。これら低分子の有機物質は、フェライトとの結合が良好であり、しかも微粒子状を保つことが容易であるなどの利点を有する。
本発明のフェライトと結合する有機物質は、フェライトに結合する上記の官能基を持つとともに、他の有機物質との結合が可能な官能基を持つ有機物質を好ましく用いることができる。このようなフェライトと結合する有機物質を用いれば、この有機物質にさらに他の有機物質を結合することができる。
そのようなフェライトと結合する有機物質として、フェライトと結合する上記の官能基を持つとともに、重合により重合体の有機物質を形成することが可能な重合のための官能基を持つ単量体の有機物質を好ましく用いることができる。アミノ酸はアミノ基とカルボキシル基により、ポリペプチド結合が可能であり、側鎖にさらにカルボキシル基を持つアスパラギン酸や側鎖にメルカプト基を持つシステインなどのアミノ酸は、そのような単量体の有機物質である。
このようにフェライトと結合する有機物質が有機物質を結合するための官能基としては、上記したアミノ基とカルボキシル基に限定されず、ビニル基などを含め、結合する相手の有機物質の官能基に適合する各官能基が適用可能である。
フェライト結合有機物質を構成する有機物質は、フェライトと結合する有機物質とこの有機物質と結合を持ち被覆を形成する高分子被覆物質とを備えることができる。フェライト結合有機物質を生体内で用いる場合には、そのような高分子被覆物質として生体に対し適合性を有する物質、例えばグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）の重合体などにより、被覆を形成することができる。このような被覆物質は、単量体にフェライトと結合する有機物質に結合させ、この単量体を起点として重合を行なって高分子被覆物質とすることができる。またフェライトと結合させた有機物質に直接高分子被覆物質を結合させることもできる。
また、このように表面を有機物質で被覆した構成にすることにより、フェライト同士の凝集を弱めることができる。また一方で本発明のフェライト結合有機物質には、有機物質微粒子の表面をフェライトで被覆することも可能である。このような構造にすれば有機物質に対してフェライトの表面の持つ性質を付与することもできる。
また本発明のフェライト結合有機物質には重合体を用いることができる。即ち、本発明のフェライト結合有機物質はカルボキシル基、メルカプト基およびメルカプト基の酸化型の基から選択される官能基を複数個保有する重合体の有機物質と、この重合体の有機物質とこの官能基によって結合したフェライトとを有するものであってもよい。
本発明のフェライト結合有機物質を構成する重合体の有機物質として、例えば各種アミノ酸を重合したポリペプチドを挙げることができる。
例えばアスパラギン酸とアラニンとが結合したペプチド
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あるいはアスパラギン酸とアラニンとセリンが結合したペプチド
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など、フェライトと結合する基を有する各種アミノ酸を構成成分として持つ各種ペプチドを、本発明におけるフェライトと結合する重合体の有機物質として用いることができる。
これらのアミノ酸を成分として持つペフチドは、フェライトめっきによってフェライトと容易に結合することができる。これらのアミノ酸を成分として持つペフチドにおいては、側鎖のカルボキシル基などの親水性の基がフェライトとの結合に関与することに加えて、親水性の原子団である−ＣＯＮＨ−（ペプチド結合）がフェライトとの結合の形成に有効に作用している。
このような本発明のフェライト結合有機物質を構成する重合体の有機物質としてのペプチドは、人工的に合成したものであってもよく、またポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）
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のような天然に存在するペプチドであってもよい。
これらペフチドにおける側鎖のメルカプト基やカルボキシル基などの親水性の基の含有量や含有率は、必要とするフェライトとの結合の程度に応じ、適宜選択できるものである。
本発明においてフェライトと結合するペプチドは、フェライトと結合する官能基の付与されたたんぱく質であってもよい。フェライトめっきを用いれば、たんぱく質に付与されたこの官能基とフェライトとが強く結合することにより、たんぱく質とフェライトとの間に強い結合を得ることができる。
本発明におけるフェライトと結合する有機物質は、フェライトと結合する官能基の付与されたたんぱく質単体のほか、このたんぱく質が糖と複合した糖たんぱく質など、複合たんぱく質であってもよい。フェライトと結合するアミノ酸を含有するたんぱく質が複合された複合のたんぱく質であれば、このたんぱく質を通じてフェライトと複合タンパク質との結合を得ることができる。例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）にこの人工合成のペプチドを結合し、このペプチドにフェライトを強く結合させることによって、磁性の付与されたＤＮＡとすることもできる。
また本発明におけるフェライトと結合する有機物質は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とフェライトとを結合したものであってもよい。ここにＰＮＡはＤＮＡを模して人工合成されたペプチドであって、ＤＮＡと類似の機能を備えたものである。
また本発明のフェライト結合有機物質としてのたんぱく質は、フェライトと結合する官能基の付与されたたんぱく質であれば、生体の構造を形成する繊維状たんぱく質であってもよい。例えば羊毛のケラチンにはシステインやグルタミン酸を比較的多く含んでおり、これらを通じてフェライトを結合することができる。このほか、本発明のフェライト結合有機物質としてのたんぱく質は、フェライトと結合する官能基の付与されたたんぱく質であれば、輸送たんぱく質、免疫たんぱく質、あるいは酵素などのいずれのたんぱく質であってもよい。
本発明の実施例によれば、メルカプト基や近接して存在する２個のカルボキシル基を持つ有機物質が水酸基を持つ有機物質よりも容易にフェライトと結合する。このことから水酸基を有する部分に活性点を持つ酵素に対し、この活性点を損なわずに残したまま、メルカプト基やカルボキシル基にフェライトを結合することが可能である。
本発明のフェライト結合有機物質を構成する重合体の有機物質として、単量体有機化合物をエステル結合によって重合した重合体を有する有機物質を用いることもできる。エステル結合を有する有機化合物においては、親水性の原子団であるエステル結合がメルカプト基やカルボキシル基などとともにフェライトとの結合の形成に有効に作用していると考えられる。
また本発明のフェライト結合有機物質を構成する重合体の有機物質として、上記の各種単量体有機化合物を含有したペプチドやポリエステルだけでなく、広くメルカプト基、メルカプト基の酸化型基、カルボキシル基などの基を保有する各種の重合体の有機物質を用いることができる。
例えばポリアクリル酸
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は、高い密度でカルボキシル基を有しており、容易にフェライトと結合することを明らかにすることができた。
ポリアクリル酸は、本発明のフェライト結合有機物質において、所定の有機物質を結合したフェライトにさらに補足的に被覆するのに用いることもできる。
このほか、広く用いられている各種の高分子物質について、これらの高分子物質にカルボキシル基、メルカプト基、あるいは水酸基などを保有させることにより、本発明におけるフェライトと結合する有機物質として用いることができる。単量体の重合によって合成され、一般に用いられている高分子材料の場合には、ポリエステルやポリアミドなど、重合前の単量体にはカルボキシル基などの官能基を持つものが用いられるものの、これらの基は通常は重合反応に用いられ、重合後にこれらの基を残留保有させることは、通常行なわれていない。しかし、これらの高分子にカルボキシル基やメルカプト基などを保有させることにより、本発明におけるフェライトと結合する有機物質として用いることが可能になる。その際のメルカプト基、メルカプト基の酸化型基、カルボキシル基などの基の量やその含有率は、必要とするフェライトとの結合の程度に応じ適宜選択できる。
本発明のフェライト結合有機物質においては、有機物質として上記の官能基の付与された生体活性物質を用いることができる。また本発明のフェライト結合有機物質には、フェライトと結合する有機物質に生体活性物質を結合させることができる。本発明のフェライト結合有機物質が高分子被覆物質で被覆されている場合には、この重合体の被覆物に機能性の物質を結合させることができる。
ここに生体活性物質は、生体において活性を有する物質であって、例えばＤＤＳ（磁気を用いたドラックデリバリーシステム）に使用可能な各種薬剤、磁気分離の可能な生体分析用試薬、ＤＮＡ、タンパク質が挙げられる。このほかに、造影剤やＭＲＩの増感剤などの機能を有する物質を挙げることができる。これらの物質は、フェライトと結合することによって磁性が付与され磁気的な操作が可能となる。
本発明のフェライト結合物質の製造方法は、メルカプト基、メルカプト基の酸化型基、およびカルボキシル基からなる群から選択される基を持つ有機物質の水溶物または水和物を有する液中で、有機物質にフェライトを生成する工程を備えたことを特徴とするものである。この有機物質の存在下でフェライトが有機物質に生成されると、フェライト生成の初期の段階でフェライトと有機物質の官能基とが化学結合するため、すでに製造されたフェライトに有機物質を結合させる方法に比べ、強力かつ安定したフェライトと有機物質との結合が得られる。
こうした有機物質にフェライトを生成する方法として、フェライトめっきが適しており、この方法により、有機物質とフェライトとを直接に結合させ、これらの間に強固な結合を得ることができる。
フェライトめっきはこの有機物質の水溶物または水和物を有する液に、Ｆｅ２＋イオンを必須成分としフェライトを構成する金属元素イオンを有する液を添加するとともに、アルカリ溶液を添加して前記有機物質水溶液のｐＨを制御し、液中の前記金属元素イオンを前記有機物質に吸着させ、酸化剤を添加して酸化反応を行なってＦｅ２＋イオンを酸化することにより前記有機物質にフェライトを生成固定することによって行なうことができる。
上記の酸化反応を行なうには、有機物質水溶液に酸素を吹き込む方法、攪拌などによって空気中の酸素を取り込む方法、酸化剤として亜硝酸（ＮａＮＯ２）を用いる方法のほかに、酸化剤として希釈した過酸化水素を使用する方法を好ましく用いることができる。
本発明のフェライト結合物質の製造方法において、有機物質を含有する水溶液のｐＨの変化を抑制して所定の範囲内にするには、有機物質水溶液に対してｐＨ緩衝剤、例えば酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、塩化アンモニウムと水酸化アンモニウムの混合溶液などを用いることができる。
なお、上記Ｆｅ２＋を必須成分とするフェライト構成元素を有する液に、Ｆｅ３＋を含有させることによって、フェライト生成反応を促進することができる。
本発明においてフェライトめっきは、例えば次のようにして行なわれる。まず上記の官能基を有する有機物質の水溶液または水和物を有する液を、２価鉄イオンＦｅ２＋イオンを含む反応液中に浸すと、金属イオンが官能基に吸着され、Ｈ＋が放出される。次に、２）空気中の酸素（Ｏ２）、亜硝酸（ＮａＮＯ２）などによって酸化反応を行なうと、吸着されたＦｅ２＋イオンの一部がＦｅ３＋イオンに酸化され、スピネル構造のフェライト層の生成反応が起こり、その表面には水酸基が生成する。すると、３）液中のＦｅ２＋イオンが、この表面に吸着され、Ｈ＋イオンが放出される。続いて再び酸化反応を行なうと、吸着されたＦｅ２＋イオンの一部がＦｅ３＋に酸化され、再びスピネル構造のフェライト層の生成反応が起こる。このプロセスを繰り返され、有機物質フェライト（マグネタイト）が成長し、フェライト結合有機物質が形成される。なお上記のプロセスにおいて、Ｆｅ２＋イオンの一部をＣｏ２＋イオン、Ｎｉ２＋イオンあるいはＺｎ２＋イオンなど他の金属イオンＭｎ＋で置き換えることにより、各種のフェライトが形成できる。
ところでこのようなフェライトめっきが可能な物質としては、従来は多数の水酸基が表面に存在するものが対象とされてきた。またカルボキシル基の存在下でのフェライトめっきについては、水面に展開されたアラキン酸ＣＨ３（ＣＨ２）１８ＣＯＯＨ単分子膜の水面下のカルボキシル基中の−ＯＨを反応場として用い、フェライト膜生成ができることを本発明者らはすでに明らかにしている。しかしながら、水酸基を持つ物質に対するフェライトめっきについては、すでに多くの知見がすでに得られているのに比べ、カルボキシル基を持つ物質に対するフェライトめっきについてはまだ全くわかっておらず、どのような場合にフェライトめっきが可能であってどのような結合が得られるかなどについても全く知見が得られなかった。ここにカルボキシル基中の−ＯＨは−ＣＯ−に隣接して存在し、通常の水酸基とはその性質が著しく異なる。本発明によってフェライトめっきによってフェライトと結合可能な有機物質として、水酸基を多数有するものに限ることなく、カルボキシル基、メルカプト基またはその関連の基を有する有機物質が、フェライトめっきにより有機物質とフェライトとの強固な結合を得ることができるようになり、しかもより強固な結合を得ることができるようになった。
上記フェライトめっきでは、１）ｐＨが８〜１０の中性に近い領域でフェライト生成反応を行なうことができ、２）そのフェライト生成反応温度として、室温を含む３℃〜３０℃程度の温度で行なうことができ、しかも３）大気開放系での酸化によるＦｅ２＋からＦｅ３＋への反応が利用できる。また、より緩やかな酸化を行なってフェライト生成反応を行なうには、非開放系でＮａＮＯ２などのほか、希釈された過酸化水素を酸化剤として用いることができる。このようにフェライトめっきによれば、有機物質に対し穏やかな条件で有機物質とフェライトとを直接に結合することができる。
次に本発明のフェライト結合有機物質の製造方法の一実施形態について、図を用いて具体的に説明する。
図１は、本発明のフェライト結合有機物質製造方法の一実施形態について、その流れ図を示したものである。図１において、フェライトと結合可能な基を有する有機物質に塩化アンモニウムなどの緩衝剤を加えてｐＨ値の安定を保った水溶液１０１に、Ｆｅ２＋を必須成分とするフェライト構成金属イオンの水溶液１０２を添加し、有機物質にこのＦｅ２＋を必須成分とするフェライト構成元素の金属イオンを吸着させる。この添加の際には例えばアンモニア水溶液などのアルカリ水溶液１０３を同時添加して、有機物質を有する水溶液のｐＨを８〜１０の値に保つ。この液を攪拌したり空気を吹き込むなどして、Ｆｅ２＋を酸化することによって有機物質にフェライト相を生成固定させる。続いて水洗浄などの洗浄工程１０６で洗浄を行ってフェライト結合有機物質１０７を得る。
この有機物質にフェライトを生成固定する工程によれば、フェライトと結合させる有機物質が活性を有するたんぱく質など生体物質の場合に、有機物質を有する水１０１の温度を、例えば４℃などの低温に保つことによって、生体物質の活性の低下を防ぐことができる。
次に本発明のフェライト結合有機物質の用途について述べる。本発明のフェライト結合有機物質は、有機物質にフェライトが直接結合し、しかも強く結合しており、フェライトを介して有機物質を磁気的に操作することができるので、さまざまな用途が可能である。
まず、フェライトと有機物質との結合が強固であることを利用し、有機物で被覆された各種フェライト粒子分散体として用いることができる。
本発明の有機物質でフェライトが被覆されたフェライト結合有機物質は、その表面にリガンド、すなわち酵素、たんぱく質の一部、ペプチド、薬物、ＤＮＡなど生体分子に対して特異的吸着を行なう物質を固定し、アフィニティクロマトグラフィに用いることができる。またリガンドの物質に上記したフェライトと結合する官能基を付与して直接にフェライトと結合しアフィニティクロマトグラフィに用いることもできる。これらの担体はフェライトを保有することにより磁性を有し、磁気分離が可能であるため、分離に要する時間が著しく短くて済む。また本発明のこのようなフェライト結合有機物質の分散体を用いた担体は、フェライトとリガンドとの間に余分な結合剤などの介在を必要とせず、強力な結合が得られることや、担体の大きさも微細なものが可能である。
生体内の薬剤や内分泌撹乱物質などの化学物質をリガンドとした上記本発明のフェライト結合有機物質の分散体を用いた担体を用い、このリガンドに選択的に結合する生体内の受容体を同定したり、生体内のある受容体をリガンドとし、このリガンドに特異的に結合する薬剤や内分泌撹乱物質などの化学物質を同定することができる。
また本発明のフェライト結合有機物質は、薬剤搬送の担体や磁気分離の媒体として用いることができる。生体内の薬剤や内分泌撹乱物質などの化学物質は、通常たんぱく質と結合し、たんぱく質の形で存在する。また、これらに選択的に結合する生体内の受容体もたんぱく質である。本発明によれば、たんぱく質の薬剤に対しフェライトを強く結合させることにより、磁性の付与された薬剤を磁気的に誘導するなどの磁気的な操作が可能となる。フェライトとたんぱく質とは強く結合しているので、操作の段階でフェライトと有機物質とが分離する心配がない。
また本発明のフェライト結合有機物質は、操作の段階でフェライトと有機物質とが分離せず、磁気的に誘導可能であるという特徴を生かし、局所に所定の量を存在させ、ＭＲＩのコントラストを高める増感剤や、温熱療法の際の高周波交流磁界によって局所を選択的に温める発熱物質として用いることができる。
また本発明によれば、フェライト結合有機物質が繊維あるいは樹脂であり、この繊維がメルカプト基、メルカプト基の酸化型の基、およびカルボキシル基の少なくとも何れかを有し、これにフェライトが結合することにより、繊維あるいは樹脂などの構造体で磁性を付与されたものが可能である。ここで用いられる繊維あるいは樹脂は、人工的に合成したものであってもよく、また羊毛のようにシステインを多く含むケラチンなどを成分として有し、生体によって合成されたものであってもよい。またこの場合にフェライトとしてマグネタイトのように導電性を有するものを用いることにより、この繊維あるいは樹脂に導電性を付与し、帯電の防止をすることもできる。
また本発明のフェライト結合有機物質として、一方にメルカプト基、メルカプト基の酸化型の基およびカルボキシル基の少なくとも何れかを有し、他方がアルキル基などの疎水性の基を有する線状の有機物質を用い、フェライトとメルカプト基、メルカプト基の酸化型の基およびカルボキシル基の少なくとも何れかとを結合させ、フェライトの周囲をこの有機物質で覆うことにより、立体障害により粒子間の凝集力を低減させた磁性粒子粉体を得ることができる。こうした粒子は例えば油性の磁性コロイド粒子や、磁気トナー用粒子、あるいは塗布型の磁気記録媒体用磁性粒子などとして広く用いることができる。またフェライトの周囲を他端が親水性の有機物質を結合して覆えば、立体障害により粒子間の凝集力が低減され、水中で分散性の良好な磁性粒子が得られ、水性の磁性コロイドなどとして広く用いることができる。
本発明の有機物質に結合するフェライトは、その大きさについて特に制限されるものではなく、目的に応じて任意の大きさを選定して用いることができる。例えば生体中の抗体などのたんぱく質に上記した官能基を付与してフェライトを結合する場合には、フェライトの大きさをたんぱく質の大きさの１／１０から１０倍の大きさの範囲内にすることにより、その取り扱いが容易となることから好ましい。またフェライトの固定されたたんぱく質が、フェライトの持つ残留磁化によって吸引力を及ぼしあい、凝集するのを回避するために、フェライトの大きさが１００ｎｍ以下であることが好ましく、超常磁性的挙動を示す１０ｎｍ以下であることがより好ましい。他方でフェライトが磁性を保持するためには、フェライトの大きさが５ｎｍ以上であることが好ましい。
また本発明のフェライトに結合した有機物質には蛍光物質を固定することができる。こうすることによって、蛍光物質により有機物質の存在位置を常に明らかにすることができる。
（実施例１）単量体有機物質へのフェライトの結合固定
０．１ｍｏｌ／Ｌ濃度のＦｅＣｌ２水溶液と０．１ｍｏｌ／Ｌ濃度の水溶液とを等体積混合し、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋とを有し、ｐＨが２の液を用意した。
次に市販の２８重量％アンモニア水溶液を、０．０１重量％に水で希釈したものを用意した。
次にアミノ酸としてアスパラギン酸（略号Ａｓｐ）を、１ｍｍｏｌ／Ｌ濃度で、ＮＨ４ＯＨとＮＨ４Ｃｌからなる１ｍｏｌ／Ｌ濃度緩衝液によりｐＨ８．４からｐＨ１０．０に調整したアミノ酸溶液とした。
図２に示したように、符号２０１で示した上記アスパラギン酸水溶液１００μＬを容器２０２に入れたものを氷塊２０３を有する氷槽２０４の中に配置し、先に用意したＦｅ２＋とＦｅ３＋とを有する水溶液２０５をパイプ２０６から、また０．０１重量％のＮＨ４ＯＨ水溶液２０７をパイプ２０８から、それぞれ各５０μＬを少しずつ滴下し、ピペット２０９で空気２１０を入れながらよく混ぜた。
こうして２時間の反応の後、磁気分離を用いて水分を除去し、水を添加してよく混合し、再び水分の除去する操作を繰り返し、十分に洗浄を行なってアスパラギン酸の結合したフェライト（マグネタイト）を得た。なお水分の除去には遠心分離を用いることもできる。
得られたアスパラギン酸の結合したフェライトについて、アスパラギン酸の結合量の定量分析を行った。まずフェライトを塩酸によって溶解し、続いてこの溶解液をアルカリ性にして鉄イオンを沈殿させ、沈殿を除去した。
アスパラギン酸を有する溶解物をガラス試験管に入れて乾燥した後、ウオーターズ社ピコタグワークステーションアクセサリーリアクションバイアル中で塩酸蒸気の存在下１１０℃、１６時間処理した。反応後、水０．１ｍＬとトリエチルアミン０．０１ｍＬとを加え、生じた沈殿を除去した上澄みを乾燥後、和光純薬社のプロトコルに従い、フェニルイソチオシアネートにより誘導体にし、同社製ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）カラム（ワコーパック  ＷＳ−ＰＴＣカラム）を装着した、ウオーターズ社製６００型ＨＰＬＣポンプシステムにより分離し、検出をウオーターズ社製９９６型フォトダイオードアレイ検出器により、２５４ｎｍの光吸収を測定することにより行なった。
図３はアスパラギン酸溶液のｐＨを８．４に調整し、アスパラギン酸の投入量とフェライトに結合し固定されたアスパラギン酸量との関係を求めた結果を示す図である。
上記の手順でアスパラギン酸が結合し固定されたフェライトについて、陽イオン性、陰イオン性および非イオン性の各種の界面活性剤水溶液で洗浄を繰り返した後、上記手順にて定量分析を行ったところ、洗浄によるフェライトに対するアスパラギン酸の結合量には変化がみられなかった。このことから、フェライトに対するアスパラギン酸の結合は界面活性剤で外れる弱い結合ではなく、より強固なものであることがわかった。
図３から読み取れる通り、アスパラギン酸溶液のｐＨを８．４に調整した場合、アスパラギン酸がフェライトに結合し固定された量は、アスパラギン酸溶液のモル濃度が１００ｎｍｏｌのとき、３．８ｎｍｏｌであった。なお、またアスパラギン酸溶液のｐＨを１０．０に調整した場合には、アスパラギン酸がフェライトに結合し固定された量は０．３ｎｍｏｌに減少した。
上記アスパラギン酸の場合と同じ手順で、他の２０種の有機物質に対するフェライトの結合固定量を求めた。これらの結果を表１にまとめて示す。
2003066644.tif 000036
Ｘ線回折を用い、作製した上記微粒子の結晶性成分の同定を行なった。アスパラギン酸を固定化した微粒子の回折シグナルから、この微粒子がＦｅ３Ｏ４−γＦｅ２Ｏ３の混合単結晶であることが示された。システインを固定化した微粒子は、システイン量の増加とともに赤みを増してくる。このような微粒子のＸ線回折の結果は、それがαＦｅＯＯＨの出現によるものであることが示された。
これらの微粒子の磁気測定により飽和磁化を求めた結果、システイン量の増加とともに磁性を持つフェライトが減少し非磁性のαＦｅＯＯＨの増加に対応し、飽和磁化が減少することがわかった。他方、アスパラギン酸を固定した場合には、飽和磁化の減少はみられなかった。これらの飽和磁化測定の結果は、Ｘ線回折の結果とよく対応していることがわかった。
上記アスパラギン酸を固定化したフェライト微粒子を乾燥した後、プレス成形してターゲットを作製し、レーザー解離イオン化質量分析装置により、表面分析を行った。このアスパラギン酸を固定化したフェライトとアスパラギン酸を固定化していないフェライトとの差スペクトルに、ＦｅＣＯＯ＋に一致する分子量９９．９のシグナルが認められた。これは鉄原子に配位したカルボキシル基の解裂により生成したものと考えられ、従ってこのシグナルはカルボキシル基とフェライト中の鉄原子との直接的な結合を強く示唆するものである。
上記アスパラギン酸を固定化したフェライト微粒子を、透過型電子顕微鏡により観察した。図５は観察された電子顕微鏡像の模式図である。図５に示したように、径が約１０ｎｍのフェライト粒子１の周囲を、このフェライトに結合したアスパラギン酸の層２が覆っていることが見出された。
アスパラギン酸またはシステインを固定したフェライト微粒子に対して、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、８ｍｏｌ／Ｌ尿素、４ｍｏｌ／Ｌグアニジン、１％ラウリル硫酸ナトリウムをそれぞれ含む水溶液を加えて１０分間置いた後、よく水により洗浄した。これらの試料のアスパラギン酸またはシステインの量を測定すると、それぞれの水溶液で処理した場合と処理前とを比較して有意な差が認められなかった。したがって、フェライト結合有機物質は、これらの処理について安定であるといえる。塩化ナトリウムはイオン結合を切断し、尿素・グアニジンは水素結合を切断し、ラウリル硫酸ナトリウムは疎水的相互作用に強く影響を与えることから、これらの処理に安定であることは、フェライト有機物質の結合が化学的に強固であることを意味する。
（比較例１）他のアミノ酸の場合
実施例１と同じ操作で、上記以外の各種アミノ酸についてフェライトとの結合による固定を試みた。その結果、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）およびリシン（Ｌｙｓ）の結合を試みた各フェライト試料からは、アミノ酸は検出されなかった。
（実施例２）ペプチドへのフェライトとの結合固定
次の３種のペプチド：
１）Ａｓｐ・Ａｌａ・Ａｓｐ・Ａｌａ・Ａｓｐ・Ａｌａ・Ａｓｐ・Ａｌａ
２）Ａｓｐ・Ａｌａ・Ａｓｐ・Ａｌａ
３）Ａｓｐ・Ａｌａ・Ｓｅｒ・Ａｌａ・Ａｓｐ・Ａｌａ・Ｓｅｒ・Ａｌａ
４）Ａｓｐ・Ａｌａ・Ｓｅｒ・Ａｌａ
をアミノ酸のペプチド結合を行って合成した。
これらのポリペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ基をアミノ基の保護基とする固相合成法を用い、一般的な手法により行なった。保護基を付加された目的ポリペプチドは、トリフルオロ酢酸を主成分とする反応試薬で処理することにより、保護基を切断し、逆相ＨＰＬＣにより９９％以上の純度まで精製した。得られたペプチドは質量分析器により精密質量を分析し、目的物であることを確認した。
これらペプチドそれぞれについて、先の実施例１と同じ操作により、ペプチド水溶液にフェライト（マグネタイト）を生成し、ペプチドの固定されたフェライトを得た。
このペプチドの固定されたフェライトに対し、ペプチドの定量分析を実施例１と同じ手順で行なった。図４にこの結果を示す。図４から、アスパラギン酸（Ａｓｐ）の比率が多いペプチドが、フェライトとよく結合し固定されることがわかる。これらペプチドにおいて、アスパラギン酸の残基であるカルボキシル基同士は、互いに実質的には空間的に近接して存在しており、これらが互いに協力的に作用し、フェライトと強い結合を形成しているものと考えられる。
（比較例２）他のペプチドの場合
次のペプチド：
１）Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
を合成し、これらペプチドについて、上記実施例２と同じ操作を行って、このペプチドのフェライト固定を試みた。また実施例２と同じ手順によってフェライトに結合固定されたペプチドの定量を行なった結果、グリシンだけからなるペプチドがフェライトと結合するものは見出されなかった。
（実施例３）ポリアクリル酸に対するフェライトの結合固定と定量
平均分子量２０００のポリアクリル酸を０．０１〜０．１重量％含む水溶液（１Ｍアンモニウム緩衝液、ｐＨ８．４）０．１ｍＬに対し、実施例１と同じ条件でフェライトめっきによりフェライトを生成させた。
フェライトと結合したポリアクリル酸に水溶性カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクンイミドを加えて反応させた後、ペプチド（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ）を加えてカルボキシル基と縮合反応を行なった。蒸留水で洗浄の後、塩酸で加水分解し、遊離するアミノ酸（Ｇｌｙ）を通常のアミノ酸の分析方法により定量した。その結果、ポリアクリル酸固定量応じたＧｌｙが検出され、ポリアクリル酸のフェライトへの固定量が定量できた。
この結果から、ポリアクリル酸を含まない水溶液に生成したフェライトのＧｌｙ検出量０．６ｎｍｏｌに対し、０．０１７重量％ポリアクリル酸水溶液に生成したフェライトのＧｌｙ検出量として２．５ｎｍｏｌ、また０．０３重量％ポリアクリル酸水溶液に生成したフェライトのＧｌｙ検出量として３．２ｎｍｏｌを得た。
本実施例において、ポリアクリル酸にフェライトを結合したものの懸濁液について、４００ｎｍの可視光の吸収測定により、長時間放置による懸濁の度合の変化を調べたところ、吸光度は変化せず、凝集による沈降が生じていないことがわかった。
（実施例４）抗ガン剤メトトレキサートとフェライトとの結合体
上記実施例３と同様のプロセスにより、下記の化学式で与えられる抗ガン剤メトトレキサート（ＭＴＸ）とフェライトとを結合し、磁性を持つ結合体を得た。このＭＴＸにおいては、一方の端がグルタミン酸の構造を有し、２個のカルボキシル基を有し、これらの基が近接して存在し協力的に作用することにより、フェライトとの強い結合を得ることができるものと考えられる。
このＭＴＸのフェライト結合体について、酸溶解物の逆相−ＨＰＬＣ分析および質量分析を行なった。その結果、フェライトの溶解によって生じたとみなされるＦｅ３＋のピークと、ＭＴＸの分子量に一致するピークとを得た。
2003066644.tif 000037
定量の結果、フェライトに対するＭＴＸの付着量は６．４ｎｍｏｌ／ｍｇあるいは２．９μｇ／ｍｇであった。
このようにしてフェライトと結合する有機物質を介して薬剤やその他の機能性の物質とフェライトとを結合することができる。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、有機物質とフェライトとを強く結合させることができ、この結合を通じて薬剤、試薬、診断薬などの有用な各種の有用な機能性の物質とフェライトとを強く結合させることができる。ここに有機物質とフェライトとの結合は、フェライトめっきを用い、簡便に行なうことができる。このようにして形成されたフェライト結合有機物質は、磁性が付与され磁気的な操作が可能であるため、例えばＤＤＳ（磁気を用いたドラックデリバリーシステム）に使用可能な各種薬剤、磁気分離の可能な生体分析用試薬、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、各種造影剤やＭＲＩ表示用の増感剤などとして幅広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明におけるフェライト固定有機物質の製造方法の一実施形態を示す流れ図である。
図２は本発明におけるフェライト固定有機物質の作製装置を模式的に示す断面図である。
図３はアスパラギン酸の投入量とフェライトに固定されたアスパラギン酸量との関係を示す図である。
図４は各種ペプチドの投入量と固定されたペプチドのモル数との関係を示す図である。
図５はアスパラギン酸を固定化したフェライト微粒子の透過型電子顕微鏡像を模式的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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