(57)【要約】ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する本発明の関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤は、関節軟骨細胞外マトリクス分解・変性の関与する疾患や病態、殊に骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節症等の予防並びに治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤。
【請求項２】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物が、ＦＫ２２８、下式（Ｉ）で示されるデプシペプチド化合物、下記一般式（ＩＩ）で示されるデプシペプチド化合物、下記一般式（ＩＩａ）で示されるデプシペプチド化合物、ＭＳ−２７−２７５、Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＳＡＨＡ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｉｖａｌｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｂｕｔｙｒａｔｅ、ＣＩ−９９４、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ、Ｔｒａｐｏｘｉｎ、ＣＨＡＰ及び酪酸から選択される請求の範囲１記載の剤。
2004017996.tif 000006
（式中Ｒは、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基又はイソブチル基を意味する。）
【請求項３】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物が、ＦＫ２２８、請求の範囲２記載の式（Ｉ）で示されるデプシペプチド化合物、請求の範囲２記載の一般式（ＩＩ）で示されるデプシペプチド化合物、請求の範囲２記載の一般式（ＩＩａ）で示されるデプシペプチド化合物、ＭＳ−２７−２７５、Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＳＡＨＡ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ及びＶａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄから選択される請求の範囲１記載の剤。
【請求項４】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物が、「吉田ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０年、第２６５巻、ｐ１７１７４−１７１７９」記載の方法により測定したヒストン脱アセチル化酵素阻害活性（ＩＣ５０値）が１００μＭ以下の濃度の化合物である請求の範囲１記載の剤。
【請求項５】
骨関節炎の予防又は治療剤である請求の範囲１記載の剤。
【請求項６】
関節リウマチの予防又は治療剤である請求の範囲１記載の剤。
【請求項７】
変形性関節症の予防又は治療剤である請求の範囲１記載の剤。
【請求項８】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する骨関節炎における関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
【請求項９】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する関節リウマチにおける関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する変形性関節炎における関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
【請求項１１】
関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害用医薬の製造の為のヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物の使用。
【請求項１２】
関節軟骨細胞外マトリクス分解に起因する疾患の予防及び治療方法であって、治療有効量のヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を患者に投与することからなる予防及び治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節症などの関節疾患の治療剤として有用な関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤に関する。
【背景技術】  細胞の核内のＤＮＡはヌクレオソームを基本としたクロマチン構造を形成している。ヌクレオソームはコアヒストン（ヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３，Ｈ４それぞれ２分子ずつから成る８量体）とＤＮＡとが巻き付いた構造体で、ヒストンＮ末端に存在する正電荷を帯びたリジン残基は負電荷を帯びたＤＮＡと電荷的に安定な状態を形成することでヌクレオソームは高次に折り畳まれた状態で存在している（Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  ８４，８１７−８１９，１９９６）。核内で遺伝子の転写反応が起こるためにはその構造を解けた状態にして、様々な転写因子がＤＮＡに接触できるようにすることが必要である。転写が抑制されている遺伝子領域のヒストンはアセチル化の程度は少なく、活発に転写が起こっている遺伝子領域のヒストンは強くアセチル化されているといったように、ヒストンのアセチル化と転写活性化の関連性が以前より知られていた（Ｈｅｂｂｅｓ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ  ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１３９５−１４０２，１９８８、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，３４９−３５２，１９９７）。ヌクレオソーム中のヒストンのリジン残基がアセチル化されるとその正電荷は中和され、ヌクレオソーム構造が弛緩することで様々な転写因子がＤＮＡに接触できるようになり、転写が起こりやすくなると考えられている（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，３０５−３１４，１９９３）。
ヒストンのアセチル化はヒストンアセチル化酵素（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；ＨＡＴ）とヒストン脱アセチル化酵素（ヒストンデアセチラーゼ（Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）；ＨＤＡＣ）とのバランスによって制御されていることが知られており、近年、いくつかのＨＡＴ並びにＨＤＡＣが同定されその転写調節における重要性が報告されている（Ｏｇｒｙｚｋｏ，Ｖ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  ８７，９５３−９５９，１９９６、Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５（１），１５−１９，２０００、Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，４８６８−４８７３，１９９９）。
一方で、細胞周期停止、形質転換細胞の形態正常化、分化誘導など多彩な作用を有する酪酸は、細胞内に高アセチル化ヒストンを蓄積させ、ＨＤＡＣ阻害作用を有することが以前より知られていた（Ｃｏｕｎｓｅｎｓ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，１７１６−１７２３，１９７９）。また、微生物代謝産物のＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ（ＴＳＡ）は細胞周期の停止、分化誘導を示すことが知られていたが（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７，３６８８−３６９１，１９８７、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １７７，１２２−１３１，１９８８）、細胞内に高アセチル化ヒストンを蓄積させ、部分精製したＨＤＡＣを用いた検討からＴＳＡが強力なＨＤＡＣ阻害剤であることが明らかとなった（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７１７４−１７１７９，１９９０）。
他のＨＤＡＣ阻害剤についても研究が進んでいる。微生物代謝産物であるＴｒａｐｏｘｉｎは細胞増殖を抑制し、ｖ−ｓｉｓ形質転換細胞の形態を正常化する作用が知られていたが（Ｉｔａｚａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４３（１２），１５２４−１５３４，１９９０）、後にＨＤＡＣ阻害剤であることが明らかとなった（Ｋｉｊｉｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２２４２９−２２４３５，１９９３）。その阻害形式は不可逆的であることから、このＴｒａｐｏｘｉｎを分子プローブとしてこれに結合するヒトＨＤＡＣのクローニングも報告されている（Ｔａｕｎｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２  ４０８−４１１，１９９６）。その他、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ（Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，３３５６−３３６１，１９９８）、Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ（Ｗａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｐ．Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９０（２１），１６２１−１６２５，１９９８）、Ｐｉｖａｌｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｂｕｔｙｒａｔｅ（Ａｖｉｒａｍ，Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６，９０６−９０９，１９９４）、ＭＳ−２７−２７５（Ｓａｉｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，４５９２−４５９７，１９９９）、ＣＩ−９９４（Ｈｏｗａｒｄ，Ｃ．Ｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ａｂｓｔ  ＃２８８６，２００２）、ＳＡＨＡ（Ｒｉｃｈｏｎ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，３００３−３００７，１９９８）、ＣＨＡＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（Ｆｕｒｕｍａｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，８７−９２，２００１）、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（Ｇｏｔｔｌｉｃｈｅｒ，Ｍ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０，６９６９−７８，２００１）、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（Ｐｅｒｅｚ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ａｂｓｔ  ＃３６７１，２００２、ＷＯ０２／２２５７７公報）、Ａｐｉｃｉｄｉｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，６０６８−６０７４，２０００）などの化合物がＨＤＡＣ阻害作用を有することが報告されている。
また、最近になって、いくつかのデプシペプチド誘導体が良好なＨＤＡＣ阻害作用を有することが報告されている。例えば、ＦＫ２２８（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４１，１２６−１３３，１９９８）及び下式（Ｉ）で示されるデプシペプチド化合物（国際公開ＷＯ０２／０６３０７号パンフレット公報：特許文献１）、下記一般式（ＩＩ）で示されるデプシペプチド化合物（特開２００１−３４８３４０号公報）及び下記一般式（ＩＩａ）で示されるデプシペプチド化合物（特開２００１−３５４６９４号公報）等の報告がある。以下、式（Ｉ）で示されるデプシペプチド化合物をＦＫ２８８還元体、一般式（ＩＩ）においてＲがイソプロピル基であるものを化合物Ａ、ｓｅｃ−ブチル基であるものを化合物Ｂ、イソブチル基であるものを化合物Ｃ、また一般式（ＩＩａ）で示されるデプシペプチド化合物を化合物Ａ〜Ｃの還元体とそれぞれ略記する。
2004017996.tif 000002
（式中Ｒは、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基又はイソブチル基を意味する。）
ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞周期停止、形質転換細胞の形態正常化、分化誘導、アポトーシス誘導、血管新生阻害作用などを示すことから、抗腫瘍剤としての効果が期待されている（非特許文献１及び２参照）。またその他にも、例えば感染症、自己免疫疾患、皮膚病（非特許文献３参照）などの細胞増殖性疾患の治療・改善薬、またハンチントン病などの進行性神経変性疾患の予防・治療薬（非特許文献４参照）、さらに遺伝子治療におけるベクター導入の効率化（非特許文献５参照）、導入遺伝子の発現亢進（非特許文献６参照）など様々な応用も試みられている。
しかしながら、現在まで、ＨＤＡＣと関節軟骨細胞外マトリクスの関連を示す具体的報告は無く、ＨＤＡＣ阻害剤が関節軟骨細胞外マトリクス成分の分解・変性を阻害し、関節軟骨細胞外マトリクス成分の分解・変性を伴う関節疾患の予防・治療に有用であることを示唆する報告も何等なされていない。
なお、前記ＦＫ２２８還元体の特許明細書（特許文献１）には、ＦＫ２２８還元体はそのＨＤＡＣ阻害活性により異常な遺伝子発現によって引き起こされる疾患に有用として、多数の疾患が羅列されている中にリウマチ性関節炎や変形性関節症が挙げられているが、具体的な効果の記載は無く、治療効果を示す根拠も示されていない。また、国際公開ＷＯ０２／０５５０１７号パンフレット（特許文献２）には、ＨＤＡＣ阻害剤が全身性エリトマトーデス患者から採取したＴ細胞において異常な免疫関連遺伝子の発現を正常な状態にする効果が示されたことに基づき、関節リウマチを含む自己免疫疾患の治療に使用できるとの記載がある。しかしながら、関節リウマチに対する具体的な効果の開示は無く、ＨＤＡＣ阻害剤が関節軟骨細胞外マトリクス成分の分解・変性を阻害することを示唆する記載も無い。
骨関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）などの関節疾患は、関節軟骨の損傷・変性を主病変とする疾患である。関節疾患の中で最も患者数の多い疾患はＯＡであるが、現行の治療法においては鎮痛消炎剤やヒアルロン酸製剤が軟骨変性・軟骨下骨破壊に伴う痛みを軽減する目的で対症療法的に用いられているに過ぎず、十分な治療効果を上げているとは言えない状況にある。
関節疾患は、外傷による軟骨表面の亀裂、自己免疫の異常或いはマトリクスメタロプロテアーゼの異常等、様々の原因により生じ、その初期の段階においては関節軟骨における細胞外マトリクスの分解・変性が共通して観察される（非特許文献７及び８参照）。細胞外マトリクスは主にＩＩ型コラーゲンと軟骨特異的プロテオグリカンであるアグリカンから構成されており、どちらの破綻も細胞外マトリクスの破壊を引き起こし、軟骨組織の破壊につながる。さらにこの軟骨組織の破壊が、ＲＡにおいては軟骨下骨組織の露出、破壊、変性を引き起こし、関節機能の障害を招く一方、ＯＡにおいては軟骨下骨の増殖による骨棘形成や骨硬化を引き起こし、関節の変形を招く（前記非特許文献８参照）。そのため、古くからこれらの関節疾患に共通する細胞外マトリクスの分解．変性を制御することが関節疾患の治療に繋がると考えられており、その分解を担うプロテアーゼ（コラゲナーゼ、アグリカナーゼ）の同定、そして、それらの阻害剤の探索、医薬品としての開発の試みが精力的に行われてきている（前記非特許文献７、９及び１０参照）。しかしながら、現在に至るまで、関節軟骨細胞外マトリクスの分解・変性を制御する関節疾患治療薬は上市されていない（非特許文献１１及び１２参照）。
今なお、関節軟骨細胞外マトリクスの分解を良好に阻害する医薬の創製が切望されている。
【非特許文献１】Ｍａｒｋｓ，Ｐ．Ａ．ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ」、２０００年、第９２巻、ｐ．１２１０−１２１６
【非特許文献２】Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２００１年、第７巻、ｐ．４３７−４４３
【非特許文献３】Ｄａｒｋｉｎ−Ｒａｔｔｒａｙ，Ｓ．Ｊ．ら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」、１９９６年、第９３巻、ｐ．１３１４３−１３１４７
【非特許文献４】Ｓｔｅｆｆａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ」、２００１年、第４１３巻、ｐ．７３９−７４３
【非特許文献５】Ｄｉｏｎ，Ｌ．Ｄ．ら、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、１９９７年、第２３１巻、ｐ．２０１−２０９
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｙ．ら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」、１９９７年、第９４巻、ｐ．５７９８−５８０３
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｎ、「別冊・医学のあゆみ（細胞外マトリックス）」、医歯薬出版株式会社、１９９７年２月２５日、ｐ．８１−８５
【非特許文献８】Ｏｚａｋｉ，Ｓら、「知っておきたい骨・関節疾患の新たな診療」、真興交易（株）医書出版部、２００１年１１月２０日、ｐ．４６−９５
【非特許文献９】Ｌｏｈｍａｎｄｅｒ，ＬＳ．ら、「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ」、１９９３年、第３６巻、第９号、ｐ．１２１４−２２
【非特許文献１０】Ｍａｌｆａｉｔ、ＡＭ．ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２００２年、第２７７巻、第２５号、ｐ．２２２０１−８
【非特許文献１１】Ｃｌｏｓｅ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、２００１年、第６０巻、第３号、ｐ．６２〜６７
【非特許文献１２】Ａｒｎｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、２００２年、第２巻、ｐ．３２２−３２９
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／０６３０７号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ０２／０５５０１７号パンフレット
【発明の開示】
本発明者等は、ＨＤＡＣ阻害化合物の作用につき鋭意検討する中で、多くの構造の全く異なるＨＤＡＣ阻害化合物が、いずれも良好な関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害作用を有することを知見し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、ＨＤＡＣ阻害化合物を有効成分として含有する関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤に関する。殊に、関節軟骨細胞外マトリクスの分解・変性の関与する骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節症等の予防又は治療剤に関する。
また、本発明は、ＨＤＡＣ阻害化合物を有効成分として含有する骨関節炎、関節リウマチ又は変形性関節炎等における関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤に関する。
また、本発明は、関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害用医薬の製造の為のＨＤＡＣ阻害化合物の使用に関する。
更に、本発明は、関節軟骨細胞外マトリクス分解に起因する疾患の予防及び治療方法であって、治療有効量のＨＤＡＣ阻害化合物を患者に投与することからなる予防及び治療方法に関する。
本発明は転写調節に関与するＨＤＡＣ阻害化合物が、意外にも骨関節炎の主病変である関節細胞外マトリクス分解・変性そのものを抑制し、骨関節炎治療の中心的役割を担え得る可能性を見出したものであり、まさに画期的な発明であるといえる。
以下、本発明につき詳述する。
本発明医薬に用いられるＨＤＡＣ阻害化合物としては、ＨＤＡＣを阻害する化合物並びにその塩であり、具体的には、公知のＨＤＡＣ阻害化合物である、ＦＫ２２８及びその還元体、デプシペプチド化合物（化合物Ａ，Ｂ及びＣ）及びそれらの還元体、ＭＳ−２７−２７５、Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＳＡＨＡ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、酪酸及びその誘導体（Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ、Ｐｉｖａｌｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｂｕｔｙｒａｔｃ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ等）、ＣＩ−９９４、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ、Ｔｒａｐｏｘｉｎ並びにＣＨＡＰなどが挙げられる。これらのＨＤＡＣ阻害化合物は、市販されているか、文献既知の方法を用いて入手することができる。好ましくは、ＦＫ２２８及びその還元体、デプシペプチド化合物（化合物Ａ，Ｂ及びＣ）及びそれらの還元体、ＭＳ−２７−２７５、Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＳＡＨＡ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ及びＶａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄであり、より好ましくは、ＦＫ２２８及びその還元体、デプシペプチド化合物（化合物Ａ，Ｂ及びＣ）及びそれらの還元体、ＭＳ−２７−２７５、Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＳＡＨＡ及びＡｐｉｃｉｄｉｎである。また、同様の作用を持つこれらの化合物の誘導体も本発明のＨＤＡＣ阻害化合物として好適である。
ＨＤＡＣ阻害活性は、公知の一般的方法、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７１７４−１７１７９，１９９０に記載の方法に従って容易に測定できる。具体的には、当該文献記載の方法で調製された［３Ｈ］アセチルヒストン及びヒストン脱アセチル化酵素画分を使用し、被験化合物を［３Ｈ］アセチルヒストンとＤＴＴを含む反応溶液中に加え、室温にて１時間プレインキュベーション後、ヒストン脱アセチル化酵素画分を混合し室温にて２時間反応させ、１Ｍ塩酸及び酢酸エチルを添加後、遠心分離により分離した酢酸エチル層中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定することにより行うことができる。
代表的なＨＤＡＣ阻害化合物の、ＨＤＡＣ阻害活性を引用文献名と共に示す。なお、化合物Ａについては上記方法にて測定した結果を示す。
・ＦＫ２２８：１．１ｎＭ（ＩＣ５０値；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４１，１２６−１３３，１９９８）
・化合物Ａ：３０ｎＭにおいて約８５％阻害
・ＭＳ−２７−２７５：２μＭ（ＩＣ５０値；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，４５９２−４５９７，１９９９）
・酪酸（Ｎａ塩）：２８０μＭ（ＩＣ５０値；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４１，１２６−１３３，１９９８）
・Ｂｕｔｙｒａｔｅｓ（酪酸，Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ，ｅｔｃ．）：ｍＭオーダー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００２  １，２８７−２９９，２００２）
・Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ：ｍＭオーダー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００２  １，２８７−２９９，２００２）
・Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ：２．１ｎＭ（ＩＣ５０値；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４１，１２６−１３３，１９９８）
・ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４：０．０３μＭ（ＩＣ５０値；Ｂｌｏｏｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｐａｐｅｒ，ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｎｅ  １９，２００３）
・ＳＡＨＡ：１０〜２０ｎＭ（ＩＣ５０値；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，３００３−３００７，１９９８）
・Ａｐｉｃｉｄｉｎ：５ｎＭ（ＩＣ５０値；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，６０６８−６０７４，２０００）
本発明の別の好ましいＨＤＡＣ阻害化合物は、上記Ｙｏｓｈｉｄａ等の方法により測定したＨＤＡＣ阻害活性（ＩＣ５０値）が１００μＭ以下、より好ましくは１０μＭ以下、更に好ましくは１μＭ以下の化合物である。
以下に本発明の関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤の製剤化法及び投与方法を詳述する。
ＨＤＡＣ阻害化合物の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、通常用いられている製剤用の担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、注射剤、坐剤、軟膏、貼付剤等に調製され、経口的又は非経口的に投与される。
ＨＤＡＣ阻害化合物のヒトに対する臨床投与量は、ＨＤＡＣ阻害化合物の種類に応じて適宜設定することができる。通常経口投与の場合、１日当たり約０．００１から５００ｍｇ、好ましくは０．０１〜３００ｍｇが適当であり、これを１回であるいは２乃至４回に分けて投与する。関節内、筋肉内、皮下若しくは静脈内等に非経口投与される場合は、１回当たり約０．０００１から１００ｍｇが、好ましくは０．００１〜１０ｍｇが適当である。投与頻度、投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
本発明による経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性化合物が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤や繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、更に安定化剤や溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣または胃溶性あるいは腸溶性化合物のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に溶解補助剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射剤用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルアルコールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ラクトース）、溶解補助剤のような添加剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらは又無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
本発明医薬に用いられる化合物の溶解性が低い場合には、可溶化処理を施してもよい。可溶化処理としては、医薬製剤に適用できる公知の方法、例えば界面活性剤を添加する方法、薬物と可溶化剤例えば高分子（水溶性高分子や腸溶性高分子）との固体分散体を形成する方法が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例にて本発明の有効成分であるＨＤＡＣ阻害化合物の関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害作用を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ウサギ軟骨初代培養細胞におけるプロテオグリカン（ＰＧ）破壊阻害活性（レチノイン酸刺激）
（試験方法）
ウサギ（日本白色種、オス、１．０〜１．５ｋｇ）を過剰麻酔下で致死させた後、膝関節を摘出し、関節表面の軟骨層をメスにて剥離、細断した。さらに、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％−１ｍＭ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）にて３７℃、１時間処理の後、１５００ｒｐｍ、５分で遠心分離し沈殿した細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）で洗浄した。続いてコラゲナーゼＡ（０．１５％；ベーリンガー・マンハイム社製）／ＤＭＥＭにて３７℃、３〜１２時間処理した後、ナイロンメッシュフィルター（１００μｍ、Ｆａｌｃｏｎ社製）通過画分を１５００ｒｐｍ、５分の遠心分離にかけ、軟骨細胞を沈殿させた。ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地で十分に洗浄した後、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁し、Ｉ型コラーゲンをコートした９６穴プレート（旭テクノグラス社製）に２００μｌ／穴で蒔いた。３日後に培地を５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸含有ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地（以下、アスコルビン酸培地）２００μｌに交換し、さらに２日間培養を２回繰り返した。その後、ウサギ膝関節軟骨初代培養細胞を終濃度１０μＣｉ／ｍｌのＮａ２３５ＳＯ４含有アスコルビン酸培地２００μｌにて３日間培養、標識した後、２００μｌのアスコルビン酸培地で３回洗浄し、２００μｌのアスコルビン酸培地で１日間培養した。終濃度１μＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（シグマ社製）で刺激し、４８時間後の培養上清を２０μｌずつ回収し、トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用い、放射活性を計測した。被験化合物は刺激開始と同時添加し、レチノイン酸非添加群を１００％、レチノイン酸添加群を０％とした百分率でそのＰＧ分解阻害活性を算出した。
（被験化合物）
2004017996.tif 000003
（結果）  結果を下表１に示す。各ＨＤＡＣ阻害化合物は、構造に関係なく、そのＨＤＡＣ阻害を示す濃度域において、濃度依存的にＰＧ分解を阻害することが判明した。
2004017996.tif 000004
実施例２：ウサギ軟骨初代培養細胞におけるＰＧ破壊阻害活性（ＩＬ−１刺激）
（試験方法）
実施例１と同様にしてウサギ軟骨初代培養細胞を調製した。終濃度１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｃｍ社製）で刺激し、４８時間後の培養上清を２０μｌずつ回収し、トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用い、放射活性を計測した。被験化合物は刺激開始と同時添加し、ＩＬ−１非添加群を１００％、ＩＬ−１添加群を０％とした百分率でそのＰＧ分解阻害活性を算出した。
（結果）  結果を下表２に示す。被験化合物である各種ＨＤＡＣ阻害化合物は、そのＨＤＡＣ阻害を示す濃度域において、ＰＧ分解を阻害することが判明した。
2004017996.tif 000005
上記実施例１並びに２の試験方法は、関節軟骨に対する被験化合物の作用、特に細胞外マトリクスの分解・変性に対する作用を評価する簡便な評価法として、従来より関節疾患治療剤のスクリーニングに広く用いられている方法である（Ｓｐｉｒｉｔｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ；３９，Ｃ１６０−２，１９９３）。実際、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、レチノイン酸またはＩＬ−１等によるＰＧ分解を抑制する作用があるマトリクスメタロプロテアーゼ阻害剤（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４４（２），４０４−１２，１９９７）は、骨関節炎モデルマウスにおいても細胞外マトリクスの分解・変性を良好に抑制することが確認されている（Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．５４（８），６６２−９，１９９５、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８２（２），４４９−５７，１９９５、Ａｄｖ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．１２（２），８２−５，１９９８及びＩｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ．４９（４），１４４−６，２０００）。よって、本評価系で優れた効果が確認された本発明の有効成分であるＨＤＡＣ阻害化合物は、関節軟骨細胞外マトリクスの分解・変性を抑制する薬剤として有用である。特に、本発明の有効成分であるＨＤＡＣ阻害化合物は、軟骨細胞外マトリクスの分解・変性を惹起する代表的な刺激物質であるＩＬ−１或いはレチノイン酸のいずれに対しても良好に関節軟骨細胞細胞外マトリクスの分解・変性を抑制する作用を有し、刺激物質の種類にかかわらず軟骨細胞細胞外マトリクスの分解・変性を抑制する薬剤として有用である。
【産業上の利用可能性】  本発明医薬の有効成分であるＨＤＡＣ阻害化合物は、前記実施例に示したように、関節軟骨細胞外マトリクスの分解を良好に阻害することから、本発明医薬は、特に関節軟骨細胞外マトリクスの分解・変性の関与する骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節症等の予防又は治療剤として有用である。
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月12日(2005.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤。
【請求項２】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物が、FK228、下式（I）で示されるデプシペプチド化合物、下記一般式（II）で示されるデプシペプチド化合物、下記一般式（IIa）で示されるデプシペプチド化合物、MS-27-275、Trichostatin A、NVP-LAQ824、SAHA、Apicidin、Phenylbutyrate、Valproic acid、Pivaloyloxymethyl butyrate、CI-994、Depudecin、Trapoxin、CHAP及び酪酸から選択される請求項１記載の剤。
【化１】
2004017996.tif 000007
（式中Rは、イソプロピル基、sec-ブチル基又はイソブチル基を意味する。）
【請求項３】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物が、FK228、請求項２記載の式（I）で示されるデプシペプチド化合物、請求項２記載の一般式（II）で示されるデプシペプチド化合物、請求項２記載の一般式（IIa）で示されるデプシペプチド化合物、MS-27-275、Trichostatin A、NVP-LAQ824、SAHA、Apicidin、Phenylbutyrate及びValproic acidから選択される請求項１記載の剤。
【請求項４】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物が、「吉田ら、Journal of Biological Chemistry、1990年、第265巻、p17174-17179」記載の方法により測定したヒストン脱アセチル化酵素阻害活性（IC50値）が100 μM以下の濃度の化合物である請求項１記載の剤。
【請求項５】
骨関節炎の予防又は治療剤である請求項１乃至４記載の剤。
【請求項６】
関節リウマチの予防又は治療剤である請求項１乃至４記載の剤。
【請求項７】
変形性関節症の予防又は治療剤である請求項１乃至４記載の剤。
【請求項８】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する骨関節炎における関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
【請求項９】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する関節リウマチにおける関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する変形性関節炎における関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
【国際調査報告】
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