(57)【要約】本発明は、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマー、具体的にはβ−アクチン又はＧＡＰＤＨの増幅を確認するための新規プライマーを提供することを目的とする。具体的には、β−アクチンについては配列番号２又は４〜４９のいずれかで表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、ＧＡＰＤＨについては配列番号５２〜９６のいずれかで表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーを選択し、組合せて使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法によりハウスキーピング遺伝子及び／又はハウスキーピング遺伝子に関連するｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマー。
【請求項２】
ハウスキーピング遺伝子が、β−アクチン遺伝子又はＧＡＰＤＨ遺伝子である請求の範囲第１項に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項３】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号１で表される塩基配列の第２４０〜３８０番目、又は第４０１〜１０６０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域から選択され、配列番号１又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２又は４〜３４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１０及び１４〜１７、２９〜５０の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマー。
【請求項５】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号５１で表される塩基配列の第１１０〜４５０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域から選択され、配列番号５１又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号５２〜７９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号５８及び６２〜６４、７３〜９６の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマー。
【請求項７】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求の範囲第３〜６項のいずれか１に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項８】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１で表される塩基配列の第２４０〜１０６０番目の領域及び／又はその相補鎖から選択され、配列番号１又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記請求の範囲第８項に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とするβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーセット。
【請求項１０】
前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする請求の範囲第８又は９項に記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項１１】
前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６つの遺伝子領域を認識することを特徴とする請求の範囲第９又は１０に記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項１２】
配列番号１０及び１４〜１７、２９〜３２、３５〜４２及び４３〜５０に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーであって、（ａ）ＦＩＰ：配列番号３５〜４２、（ｂ）ＲＩＰ：配列番号４３〜５０、（ｃ）Ｆ３：配列番号１０及び１４〜１７、及び（ｄ）Ｒ３：配列番号２９〜３２に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択し、組合せてなるプライマーセット。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項に記載のプライマーセットにさらに配列番号３３及び３４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項１４】
請求の範囲第５項に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーセット。
【請求項１５】
請求の範囲第５項に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とするＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーセット。
【請求項１６】
前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号５１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする請求の範囲第第１４又は１５項に記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項１７】
前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号５１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６つの遺伝子領域を認識することを特徴とする請求の範囲第１４〜１６項のいずれか１に記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項１８】
配列番号８０〜９６に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーであって、（ａ）ＦＩＰ：配列番号８０〜８７、（ｂ）ＲＩＰ：配列番号８８〜９６に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項１９】
請求の範囲第１８項に記載の選択された各プライマーの組合せに、さらに配列番号５８又は配列番号６２〜６４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドのいずれか１及び配列番号７３〜７７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドのいずれか１をプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項２０】
請求の範囲第１８又は１９項に記載のプライマーセットにさらに配列番号７８及び７９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項２１】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求の範囲第８〜２０項の何れか１に記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項２２】
次に示す１）〜１２）のいずれかからなるβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号３５、４３、１４及び２９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号３６、４４、１５及び３０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号３７、４５、１０及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号４１、５０、１７及び３２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号３８、４５、１０及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号３９、４５、１０及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号４０、４５、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号４１、４５、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号３７、４６、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号３７、４７、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号３７、４８、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１２）配列番号３７、４９、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項２３】
次に示す１）〜１６）のいずれかからなるＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号８０、８８、６２及び７３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号８１、８９、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号８６、９５、５８及び７６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号８７、９６、６４及び７７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号８１、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号８２、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号８３、８９、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号８３、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号８４、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号８５、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１２）配列番号８１、９０、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１３）配列番号８１、９１、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１４）配列番号８１、９２、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１５）配列番号８１、９３、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１６）配列番号８１、９４、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項２４】
請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のプライマーを少なくとも１つ使用して行う核酸検出方法。
【請求項２５】
請求の範囲第８〜２３項のいずれか１に記載のプライマーセットを使用して行う核酸検出方法。
【請求項２６】
請求の範囲第２４又は２５項に記載の核酸検出方法に使用する試薬及び／又は試薬キット。
【請求項２７】
請求の範囲第２４又は２５項に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出システム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ハウスキーピング遺伝子を検出するための核酸増幅用プライマーに関する。
背景技術
近年の遺伝子工学及び分子生物学などの分野の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについて、ＤＮＡ又はＲＮＡレベルで診断することが可能になった。特に、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５）やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，９１−９２，１９９１、特許第２６４８８０２号公報及び特許第２６５０１５９号公報記載）などの核酸増幅方法により、従来困難であった生物検体中の極微量核酸量の検出が可能となり、遺伝子解析が飛躍的に容易なものとなった。
例えば、癌の分野では、リンパ節への癌転移診断が極めて重要な意義を有している。リンパ節への癌転移診断の１手法として、癌マーカーである例えばサイトケラチン（ＣＫ）のようなタンパク質を検出する方法がある。近年の遺伝子解析技術の発展により、癌マーカータンパク質に関するｍＲＮＡの発現を検出することで、効果的に癌診断が行われるようになった（北海道医学雑誌、ｐ．１３５−１４１，Ｖｏｌ．６６（２），１９９１）。ＲＴ−ＰＣＲにより、切除した組織からＣＫのｍＲＮＡ発現の検出が可能となり、癌転移の見落としの問題はある程度回避されるようになった。腫瘍や癌の診断分野では、このような核酸増幅方法が実用化されている（臨床検査法提要、第３１版、金原出版株式会社、１９９８年９月２０日発行）。
上記に示す以外のＤＮＡ増幅方法として、ＬＡＭＰ法が報告されている（特許文献１）。ＬＡＭＰ法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成するプライマーを含む複数のプライマーによる遺伝子増幅法である。まず、初期反応において、２種類のインナープライマー（ＦＩＰ，ＲＩＰ）と２種類のアウタープライマー（Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー）及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡから両端に一本鎖ループ部分をもつダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点構造となって、この構造の３’末端側から自己を鋳型としてＤＮＡの伸長・合成反応が進む。増幅産物は多数の繰り返し構造からなり、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。ＬＡＭＰ法は、鋳型ＤＮＡの２本鎖から１本鎖への熱変性の操作を必要とせず、増幅反応はすべて等温で連続的に進行することが特徴である（非特許文献１及び２）。鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。ＬＡＭＰ法では、３０分程度で検出に十分な増幅産物が得られる。したがって、核酸検出に要する時間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的としたリンパ節への癌転移の診断に適用できる。また、迅速に結果が得られることから、術中診断への適用も期待できる。
ｍＲＮＡを定量する際に、サンプル中の内部コントロールとして、つまり組織によって発現量に差のないと考えられるハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを用いることができる。該ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを内部コントロールとして使用することにより、標的遺伝子のｍＲＮＡの抽出効率やｃＤＮＡの合成効率を考慮しなくても相対的な標的遺伝子のｍＲＮＡの検出が可能という利点がある。
ハウスキーピング遺伝子の例として、細胞骨格の構成成分であるβ−アクチンの遺伝子や解糖系の主要酵素であるグリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（以下、「ＧＡＰＤＨ」という。）遺伝子が挙げられる。
内部コントロールの目的で使用されるハウスキーピング遺伝子に関し、より効果的な核酸増幅用プライマーの開発が望まれている。
（β−アクチン遺伝子について）
アクチンは全ての真核細胞に多量に見いだされるタンパク質である。このタンパク質は高等生物の細胞において有糸分裂における役割、運動性や構造の完全性を含む、多くの構造的及び調節的機能を提供する。脊椎動物では６つのアクチンのアイソフォームが同定されており、それらの内訳は４つの筋肉型（骨格筋、心筋、大動脈型平滑筋及び胃型平滑筋のアクチン）及び２つの非筋肉型（細胞質のβ−アクチン及びγ−アクチン）である。筋肉アクチンは存在が組織特異的であり、筋肉の収縮に関与する。対照的に、細胞質アクチンは基本的に全ての細胞に見いだされ、多くの細胞機能に関与する。細胞内に存在するアクチンはその多様性にもかかわらず、アミノ酸配列がアクチンの型及び真核生物の種間において高度に保存されている。
ヒトの細胞質β−アクチン遺伝子の配列は既に決定され、他種のβ−アクチン遺伝子と比較されている（Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｉｉｊｉｍａ，ｅｔ．ａｌ．ＰＮＡＳ  ８２，ｐ．６１３３−６１３７（１９８５）、欧州特許出願第０１７４６０８号、Ｐｏｎｔｅ  ｅｔ．ａｌ．１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，ｐ．１６８７−１６９６（１９８４））。ヒトβ−アクチン遺伝子の全体を増幅するためのプライマーは、クローンテックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からＭＡＰＰＩＮＧ  Ａｍｐｌｉｍｅｒｓｈｉｔｏベーターアクチン用の名で市販されている。また、ヒトβ−アクチンのヌクレオチド配列と種特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関し、これらのオリゴヌクレオチドを核酸増幅反応における内部コントロールとして、また核酸増幅反応に用いる試料の完全性の決定を行う手段として用いることが報告されている（特開平７−９９９８１）。
（ＧＡＰＤＨ遺伝子について）
ヒトグリセロアルデヒド−３−リン酸は、生体内の解糖系、ペントースリン酸サイクルなどの糖代謝や、脂質合成における重要な中間体のひとつであり、ヒトの生体内には広く分布している。また、この物質から脂質を合成するためには、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）が必要であるため、当該酵素もヒトの生体内に広く分布している。
内部コントロールの目的で使用されるβ−アクチンやＧＡＰＤＨに関し、より効果的な核酸増幅用プライマーの開発が望まれている。
（特許文献１）国際公開第ＷＯ  ００／２８０８２号パンフレット
（非特許文献１）Ｂｉｏベンチャー、２００１年、Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，ｐ．１０９−１１５
（非特許文献２）ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ、２００１年、Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２，Ｐ．１５−２９
発明の開示
本発明は、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマー、具体的にはβ−アクチン遺伝子又はＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを増幅するための新規プライマーを提供することを目的とする。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ハウスキーピング遺伝子用核酸増幅用プライマーを構築することができた。
即ち本発明は、
１．ＬＡＭＰ法によりハウスキーピング遺伝子及び／又はハウスキーピング遺伝子に関連するｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマー、
２．ハウスキーピング遺伝子が、β−アクチン遺伝子又はＧＡＰＤＨ遺伝子である前項１に記載の核酸増幅用プライマー、
３．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号１で表される塩基配列の第２４０〜３８０番目、又は第４０１〜１０６０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域から選択され、配列番号１又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２又は４〜３４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
４．配列番号１０及び１４〜１７、２９〜５０の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマー、
５．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号５１で表される塩基配列の第１１０〜４５０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域から選択され、配列番号５１又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号５２〜７９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
６．配列番号５８及び６２〜６４、７３〜９６の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマー、
７．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項３〜６のいずれか１に記載の核酸増幅用プライマー、
８．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１で表される塩基配列の第２４０〜１０６０番目の領域及び／又はその相補鎖から選択され、配列番号１又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
９．前項８に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とするβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーセット、
１０．前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする前項８又は９に記載の核酸増幅用プライマーセット、
１１．前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６つの遺伝子領域を認識することを特徴とする前項９又は１０に記載の核酸増幅用プライマーセット、
１２．配列番号１０及び１４〜１７、２９〜３２、３５〜４２及び４３〜５０に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーであって、（ａ）ＦＩＰ：配列番号３５〜４２、（ｂ）ＲＩＰ：配列番号４３〜５０、（ｃ）Ｆ３：配列番号１０及び１４〜１７、及び（ｄ）Ｒ３：配列番号２９〜３２に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択し、組合せてなるプライマーセット、
１３．前項１２に記載のプライマーセットにさらに配列番号３３及び３４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
１４．前項５に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーセット、
１５．前項５に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とするＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーセット、
１６．前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号５１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする前項１４又は１５に記載の核酸増幅用プライマーセット、
１７．前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号５１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６つの遺伝子領域を認識することを特徴とする前項１４〜１６のいずれか１に記載の核酸増幅用プライマーセット、
１８．配列番号８０〜９６に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーであって、（ａ）ＦＩＰ：配列番号８０〜８７、（ｂ）ＲＩＰ：配列番号８８〜９６に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット、
１９．前項１８に記載の選択された各プライマーの組合せに、さらに配列番号５８又は配列番号６２〜６４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドのいずれか１及び配列番号７３〜７７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドのいずれか１をプライマーとして含むプライマーセット、
２０．前項１８又は１９に記載のプライマーセットにさらに配列番号７８及び７９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２１．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項８〜２０の何れか１に記載の核酸増幅用プライマーセット、
２２．次に示す１）〜１２）のいずれかからなるβ−アクチン検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号３５、４３、１４及び２９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号３６、４４、１５及び３０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号３７、４５、１０及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号４１、５０、１７及び３２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号３８、４５、１０及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号３９、４５、１０及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号４０、４５、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号４１、４５、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号３７、４６、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号３７、４７、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号３７、４８、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１２）配列番号３７、４９、１６及び３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２３．次に示す１）〜１６）のいずれかからなるＧＡＰＤＨ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号８０、８８、６２及び７３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号８１、８９、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号８６、９５、５８及び７６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号８７、９６、６４及び７７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号８１、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号８２、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号８３、８９、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号８３、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号８４、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号８５、８９、６２及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１２）配列番号８１、９０、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１３）配列番号８１、９１、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１４）配列番号８１、９２、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１５）配列番号８１、９３、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１６）配列番号８１、９４、６３及び７５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２４．前項１〜７のいずれかに記載のプライマーを少なくとも１つ使用して行う核酸検出方法、
２５．前項８〜２３項のいずれか１に記載のプライマーセットを使用して行う核酸検出方法、
２６．前項２４又は２５に記載の核酸検出方法に使用する試薬及び／又は試薬キット、
２７．前項２４又は２５に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出システム、からなる。
発明を実施実施するための最良の形態
（プライマーの設計）
本発明は、ハウスキーピング遺伝子の核酸増幅法、より具体的にはβ−アクチン遺伝子又はＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡに関する核酸増幅法に適用可能な核酸増幅用のプライマーを提供するものである。
ＬＡＭＰ法で用いるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。
具体的には、増幅すべき標的ＤＮＡの、３’末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域を、５’末端側から順にＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域を規定し、少なくともこの６つの領域に対し、実質的に同一な塩基配列、又は実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖を選択し、少なくとも４種のプライマーを設計する。
実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、ある塩基配列を鋳型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してハイブリダイズし、相補鎖合成の起点を与えるとき、この配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。例えば、Ｆ２に対して実質的に同一な塩基配列とは、Ｆ２と全く同一な塩基配列に加えて、Ｆ２にハイブリダイズして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩基配列を含む。
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語はいずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを要しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点となる３’末端を提供することができる配列を意味する。
本発明のプライマーは、以下に述べる各種の核酸合成反応において与えられた環境のもとで必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長をもつ。具体的には５〜２００塩基、より望ましくは１０〜５０塩基対とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は最低５塩基前後であることから、ハイブリダイズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を維持するためには、１０塩基以上の長さを維持するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型にハイブリダイズしうる鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。
本発明において、標的ＤＮＡの塩基配列から選択されるプライマーは、各々ＦＩＰ（ｆｏｒｗａｒｄ  ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）、Ｆ３プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｏｕｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）、ＲＩＰ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）及びＲ３プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｏｕｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）のいずれかを構成する。
ＦＩＰは、標的ＤＮＡのＦ２ｃ領域と実質的に相補的なＦ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＦ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。この場合において、Ｆ２及びＦ１ｃの配列間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。この標的ＤＮＡに依存しない配列の長さは０〜５０塩基、好ましくは０〜４０塩基であれば許容しうる。
Ｆ３プライマーは、標的ＤＮＡのＦ３ｃ領域と実質的に相補的なＦ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
ＲＩＰは、標的ＤＮＡのＲ２ｃ領域と実質的に相補的なＲ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＲ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。ＲＩＰもＦＩＰと同様に、Ｒ２及びＲ１ｃの配列の間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。
Ｒ３プライマーは、標的ＤＮＡのＲ３ｃ領域と実質的に相補的なＲ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
また、ＬＡＭＰ法では、少なくとも１種以上のループプライマーを併用することで増幅時間を短縮することができる（国際公開ＷＯ  ０２／２４９０２号公報）。ループプライマーとは、ダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分、具体的には例えばＲ１領域とＲ２領域の間、あるいはＦ１領域とＦ２領域の間に相補的な配列をもつプライマーをいう。ループプライマーを用いることにより  ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。このループプライマーは、ＤＮＡ合成過程でできたＦＩＰ又はＲＩＰがハイブリダイズしないループ領域にハイブリダイズするように設計する。
上記プライマーを構築するために選択される遺伝子の領域は、塩基組成、ＧＣ含量、二次構造、Ｔｍ値などに注意し、ＤＮＡ領域を認識する塩基配列の長さは、塩基数が少なくとも５塩基以上、好ましくは１０〜３０塩基、より好ましくは１７〜２５塩基のものを選択することができる。Ｔｍ値は、一般的にＮｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で求めることができる。ＤＮＡ領域は、Ｔｍ値が５５〜６５℃、好ましくは５８〜６４℃のものを選択し、ＧＣ含量が４０〜７０％、好ましくは５０〜６５％のものを選択することができる。
本発明のプライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。
本発明で選択されるβ−アクチン遺伝子の領域は、配列番号１で表される塩基配列の第２４０〜１０６０番目及び／又はその相補鎖の領域、好ましくは第２４０〜３８０番目若しくは第４０１〜１０６０番目、より好ましくは第７４０〜９９０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれる。
本発明におけるβ−アクチン検出用のプライマーは、１）配列番号１で表される塩基配列の第２４０〜１０６０番目、好ましくは第２４０〜３８０番目若しくは第４０１〜１０６０番目、より好ましくは第７４０〜９９０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）配列番号２〜５０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、プライマーとして使用可能なものが選択され、設計される。
また、本発明で選択されるＧＡＰＤＨ遺伝子の領域は、配列番号５１で表される塩基配列の第１１０〜４５０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれる。
本発明におけるＧＡＰＤＨのプライマーは、１）配列番号５１で表される塩基配列の第１１０番目〜第４５０番目の領域及び／又はその相補鎖に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）配列番号５２〜９６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、プライマーとして使用可能なものが選択され、設計される。
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９  ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組合せて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
本発明において増幅されるべき核酸の鋳型はハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡであるから、使用するプライマーが、検体中に含まれるゲノムＤＮＡを増幅しないように設計することが必要とされる。具体的には、本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも１つは、例えばβ−アクチン又はＧＡＰＤＨの遺伝子において複数のエクソンにまたがる領域を含むものであることが望ましい。このような工夫を行うことによって、ゲノムＤＮＡ由来の配列の増幅が排除され、β−アクチン又はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ由来の配列を選択的に増幅することが可能となる。
（プライマーセット）
本発明のプライマーを使用して核酸増幅を行う場合、少なくとも２種を組合せてプライマーセットとして使用する。ＬＡＭＰ法では、少なくとも４種のプライマー（ＦＩＰ、Ｆ３プライマー、ＲＩＰ、Ｒ３プライマー）を組合せてプライマーセットとして使用する。さらに、１種以上のループプライマーを組合せて、プライマーセットとして使用することもできる。
（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、ＲＮＡを鋳型とするＬＡＭＰ法であり、ＬＡＭＰ法の基本的な考え方は特許文献１に記載の通りである。ＲＴ−ＬＡＭＰ法では一つの溶液中で、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを合成しながら、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。具体的には次の１）のステップを経た後、２）〜５）ステップの繰り返しにより、ＤＮＡの伸長が繰り返され、標的ＤＮＡの増幅が行われる。
１）鋳型ＲＮＡ鎖にＦＩＰが結合し、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。この反応は逆転写酵素、例えばＡＭＶ由来の逆転写酵素等を用いる。
２）上記１）で合成したＦＩＰからのＤＮＡ鎖を、Ｆ３プライマーが鋳型ＲＮＡから剥がしながら、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。以降ＤＮＡ鎖の伸長はＤＮＡポリメラーゼによる。
３）上記２）で剥がされたＤＮＡ鎖に、ＲＩＰが結合してＤＮＡ鎖が伸長する。
４）上記３）で伸長したＲＩＰからのＤＮＡ鎖をＲ３プライマーが剥がしながら、ＦＩＰからのＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長し、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。
５）上記４）で剥がされたＤＮＡ鎖の両端の配列は、同じＤＮＡ鎖の配列中に相補的な配列を有するので、各々ハイブリダイズし、両端にループ構造を持つ。
なお、例えばＢｃａＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、このような酵素を使用する場合は、上記の反応は１つの酵素で実施することができる。
（測定方法）
ＬＡＭＰ法では、合成されたＤＮＡ鎖は自己の配列に対して相補的な配列をもつので、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、増幅生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、あるいはＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎのような２本鎖インターカーレーターである蛍光色素の存在下で本発明のプライマーを用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉鎖系でＤＮＡの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である（臨床検査法提要、３１版１３１８頁；特開２００１−２４２１６９号公報参照。以下単に「リアルタイム法」という。）。
（試薬、試薬キット、その他）
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類がキットとして提供される。
本発明は、核酸増幅用プライマー及びプライマーセット、ならびにこれらのプライマーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に使用される検出試薬、核酸検出キットならびに核酸検出システム全体に及ぶ。
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）β−アクチン遺伝子領域の選択
配列番号１に記載する塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いて、ＬＡＭＰ法に適切なβ−アクチンの遺伝子領域の位置を検討した。遺伝子領域の選択は、Ｆ１ｃ及びＲ１ｃはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２及びＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３及びＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃により遺伝子領域を選択した結果、次に示す配列番号１に記載する塩基配列上の第２４０〜１０６０番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる配列が選択された。
Ｆ１ｃ：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000002
Ｆ２  ：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000003
2003070935.tif 000004
Ｆ３  ：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000005
Ｒ１ｃ：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000006
Ｒ２  ：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000007
Ｒ３  ：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000008
2003070935.tif 000009
ｌｏｏｐ  Ｆ：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000010
ｌｏｏｐ  Ｒ：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000011
（実施例２）β−アクチン用プライマーの設計
選択された領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用されるβ−アクチン用の次の核酸増幅用プライマーが得られた。
ＦＩＰ：（領域Ｆ１ｃの塩基配列とＦ２の塩基配列を連結したもの）
ＡＦＡ−１  （配列番号３５）配列番号２及び７の配列を連結
ＡＦＡ−２  （配列番号３６）配列番号３及び８の配列を連結
ＡＦＡ−４  （配列番号３７）配列番号５及び１１の配列を連結
ＡＦＡ−４ａ（配列番号３８）配列番号５及び１２の配列を連結
ＡＦＡ−４ｃ（配列番号３９）配列番号５及び１０の配列を連結
ＡＦＡ−４ｄ（配列番号４０）配列番号４及び９の配列を連結
ＡＦＡ−４ｅ（配列番号４１）配列番号４及び１０の配列を連結
ＡＦＡ−６  （配列番号４２）配列番号６及び１３の配列を連結
ＲＩＰ：（領域Ｒ１ｃの塩基配列とＲ２の塩基配列を連結したもの）
ＡＲＡ−１  （配列番号４３）配列番号１８及び２３の配列を連結
ＡＲＡ−２  （配列番号４４）配列番号１９及び２４の配列を連結
ＡＲＡ−４  （配列番号４５）配列番号２０及び２５の配列を連結
ＡＲＡ−４ａ（配列番号４６）配列番号２０及び２７の配列を連結
ＡＲＡ−４ｂ（配列番号４７）配列番号２０及び２６の配列を連結
ＡＲＡ−４ｄ（配列番号４８）配列番号２１及び２７の配列を連結
ＡＲＡ−４ｅ（配列番号４９）配列番号２１及び２６の配列を連結
ＡＲＡ−６  （配列番号５０）配列番号２２及び２８の配列を連結
Ｆ３プライマー：（Ｆ３領域の塩基配列と同一の配列）
ＡＦ３−１  （配列番号１４）
ＡＦ３−２  （配列番号１５）
ＡＦ３−４  （配列番号１０）
ＡＦ３−６  （配列番号１７）
ＡＦ３−９  （配列番号１６）
Ｒ３プライマー：（Ｒ３領域の塩基配列と同一の配列）
ＡＲ３−１  （配列番号２９）
ＡＲ３−２  （配列番号３０）
ＡＲ３−４  （配列番号３１）
ＡＲ３−６  （配列番号３２）
ループルライマー：
（ｌｏｏｐ  Ｆ又はｌｏｏｐ  Ｒ領域の塩基配列と同一の配列）
ＡＤ−ＬＰＦ１  （配列番号３３）
ＡＤ−ＬＰＲ１  （配列番号３４）
（実施例３）ＧＡＰＤＨの遺伝子領域の選択
配列番号５１に記載する塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いて、ＬＡＭＰ法に適切なＧＡＰＤＨの遺伝子領域の位置を検討した。遺伝子領域の選択は、Ｆ１ｃ及びＲ１ＣはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２及びＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３及びＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃により遺伝子領域を選択した結果、次に示す配列番号５１に記載する塩基配列上の第１１０〜４５０番目の領域に含まれる配列が選択された。
Ｆ１ｃ：配列番号５１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000012
Ｆ２  ：配列番号５１に記載する配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000013
Ｆ３  ：配列番号５１に記載する配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000014
Ｒ１ｃ：配列番号５１に記載する配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000015
Ｒ２  ：配列番号５１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000016
2003070935.tif 000017
Ｒ３  ：配列番号５１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000018
ｌｏｏｐ  Ｆ：配列番号５１に記載の配列の相補鎖における遺伝子領域
2003070935.tif 000019
ｌｏｏｐ  Ｒ：配列番号５１に記載の配列上の遺伝子領域
2003070935.tif 000020
（実施例４）ＧＡＰＤＨプライマーの設計
選択された領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用されるＧＡＰＤＨ用の次の核酸増幅用プライマーが得られた。
ＦＩＰ：（領域Ｆ１ｃの塩基配列とＦ２の塩基配列を連結したもの）
ＦＡ−２  （配列番号８０）配列番号５２及び５７の配列を連結
ＦＡ−３  （配列番号８１）配列番号５４及び５９の配列を連結
ＦＡ−３ｂ（配列番号８２）配列番号５４及び５８の配列を連結
ＦＡ−３ｄ（配列番号８３）配列番号５３及び５９の配列を連結
ＦＡ−３ｅ（配列番号８４）配列番号５３及び５８の配列を連結
ＦＡ−３ｇ（配列番号８５）配列番号５３及び５７の配列を連結
ＦＡ−５  （配列番号８６）配列番号５５及び６０の配列を連結
ＦＡ−７  （配列番号８７）配列番号５６及び６１の配列を連結
ＲＩＰ：（領域Ｒ１ｃの塩基配列とＲ２の塩基配列を連結したもの）
ＲＡ−２  （配列番号８８）配列番号６５及び８０の配列を連結
ＲＡ−３  （配列番号８９）配列番号６７及び８３の配列を連結
ＲＡ−３ａ（配列番号９０）配列番号６７及び８４の配列を連結
ＲＡ−３ｂ（配列番号９１）配列番号６７及び８２の配列を連結
ＲＡ−３ｃ（配列番号９２）配列番号６７及び８１の配列を連結
ＲＡ−３ｄ（配列番号９３）配列番号６６及び８３の配列を連結
ＲＡ−３ｅ（配列番号９４）配列番号６６及び８４の配列を連結
ＲＡ−５  （配列番号９５）配列番号６８及び７５の配列を連結
ＲＡ−７  （配列番号９６）配列番号６９及び７６の配列を連結
Ｆ３  ：（Ｆ３領域の塩基配列と同一の配列）
Ｆ３−３  （配列番号６３）
Ｆ３−４  （配列番号６８）
Ｆ３−６  （配列番号６４）
Ｆ３−８  （配列番号６２）
Ｒ３  ：（Ｒ３領域の塩基配列と同一の配列）
Ｒ３−２  （配列番号７３）
Ｒ３−３  （配列番号７５）
Ｒ３−５  （配列番号７６）
Ｒ３−７  （配列番号７７）
ループプライマー：
（ｌｏｏｐ  Ｆ又はｌｏｏｐ  Ｒ領域の塩基配列と同一の配列）
ＧＣ−ＬＰＦ１（配列番号７８）
ＧＣ−ＬＰＲ１（配列番号７９）
（実験例１）
実施例２に記載するβ−アクチン用プライマーを、表１に記載する各組合せで用いた場合の、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による反応開始後増幅の確認までに要する時間を調べた。
１）ヒトβ−アクチンのｍＲＮＡ試料
ヒトβ−アクチンの鋳型として、市販のヒトトータルＲＮＡ（Ｒａｊｉ細胞由来、ＡＢＩ社製）を使用した。
２）β−アクチン用プライマー
各プライマーは（表１）の組合せで使用した。
2003070935.tif 000021
３）反応液組成
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４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
上記４種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ＲＮＡ試料を２μｌ（２０ｎｇのヒトトータルＲＮＡを含む）添加し、６５℃で１時間加温して行った。
５）増幅の確認
増幅産物は２本鎖構造をもつので、エチジウムブロマイドがインターカレートして蛍光を発する。その蛍光強度の増加を、ＡＢＩ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いてリアルタイム法により測定した。
６）結果
各プライマーセットを用いて反応させた場合のβ−アクチンの増幅確認までの時間を表１に示した。その結果、増幅は各プライマーセットにおいて最大４５分で確認され、殆どの場合に３０分以内に確認された。
（実験例２）
実験例１で検討したβ−アクチン用プライマーセットのうち、最も短時間で増幅が確認されたプライマーセットを選択し、さらにループプライマーを組合せたプライマーセットを用いてＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の感度を調べた。
１）ヒトβ−アクチンのｍＲＮＡ試料
実験例１と同様にした。
２）プライマーセット
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３）反応液組成
実験例１と同様の組成に、さらにＦ３ループプライマー及びＲ３ループプライマーを各々５ｐｍｏｌとなるように加えた。
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
実験例１と同様に行った。上記６種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ＲＮＡ試料２μｌ（２０ｎｇのヒトトータルＲＮＡを含む）添加し、６５℃で１時間加温して行った。
５）増幅の確認
実験例１と同様に行った。
６）結果
その結果を第１図に示した。その結果、β−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ鋳型量が多いほうが、短時間で増幅の確認ができた。増幅は、鋳型量が０．０２ｎｇの場合でも３０分以内に確認され、鋳型量が２０ｎｇ場合では１５分程度で確認された。
（実験例３）
ＬＳ１８０細胞（大腸癌細胞株）及びＲａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫細胞株）の培養細胞中におけるβ−アクチンの増幅を調べた。
つまり、サイトケラチンが陽性のＬＳ１８０細胞溶液を、サイトケラチンが陰性のＲａｊｉ細胞溶液で稀釈した場合の、各濃度のＬＳ１８０細胞溶液試料でのβ−アクチンの増幅について調べ、サイトケラチンの腫瘍マーカーを測定する場合に、β−アクチンがデータ補正のコントロールとして使用可能か否かを検討した。
１）試料
ＬＳ１８０細胞及びＲａｊｉ細胞の総細胞数が８０００となるように試料を調製した。総細胞数８０００のうち、ＬＳ１８０細胞数が８０００、８００、８０、８及び０となるようにした。
２）β−アクチン用プライマー
実験例２と同様のプライマーを選択した。
３）反応液組成
実験例２と同様の組成の反応液を使用した。
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
実験例２と同様に行った。
５）核酸の検出
実験例２と同様の６種のプライマーを含む反応液２３μｌに、細胞の懸濁液を２μｌ添加し、６５℃で１時間加温して行った。
６）結果
その結果を第２図に示した。その結果、ＬＳ１８０細胞及びＲａｊｉ細胞の比率が異なる場合でも、β−アクチンは１５分程度で増幅が確認された。このことより、腫瘍マーカーの有無にかかわらず、ヒト細胞中にはβ−アクチンが構成的に発現していることが確認され、β−アクチンがＬＡＭＰ法におけるデータ補正のコントロールとして使用可能であることが示された。
（実験例４）
実施例４に記載するＧＡＰＤＨ用プライマーを、表３に記載の各組合せで用いた場合の、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による反応開始後増幅の確認までに要する時間を調べた。
１）ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ試料
ＧＡＰＤＨの鋳型として、市販のヒトトータルＲＮＡ（Ｒａｊｉ細胞由来、ＡＢＩ社製）を使用した。
２）ＧＡＰＤＨ用プライマー
各プライマーは（表３）の組合せのものを用いた。
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３）反応液組成
実験例１と同様の組成の反応液を使用した。
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
実験例１と同様に行った。上記４種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ＲＮＡ試料２μｌ（２０ｎｇのヒトトータルＲＮＡを含む）添加し、６５℃で１時間加温して行った。
５）増幅の確認
実験例１と同様に行った。
６）結果
各プライマーセットを用いて反応させた場合のＧＡＰＤＨの増幅確認までの時間を表３に示した。その結果、増幅は各プライマーセットにおいて最大４５分で確認され、殆どの場合に３０分以内に確認された。
（実験例５）
実験例４で検討したＧＡＰＤＨ用プライマーセットのうち、最も短時間で増幅が確認されたプライマーセットを選択し、さらにループプライマーを組合せたプライマーセットを用いてＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の感度を調べた。
１）ヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ試料
ＧＡＰＤＨの鋳型として、市販のヒトトータルＲＮＡ（Ｒａｊｉ細胞由来、ＡＢＩ社製）を使用した。
２）プライマーセット
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３）反応液組成
実験例２と同様の組成の反応液を使用した。
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
実験例２と同様に行った。
５）核酸の検出
実験例２と同様に行った。
６）結果
その結果を第３図に示した。その結果、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの鋳型量が多いほうが、短時間で増幅が確認された。しかし鋳型量が０．０２ｎｇの場合でも３０分以内に増幅が確認され、鋳型量が２０ｎｇ場合に１０分程度で増幅が確認された。
（実験例６）
ＬＳ１８０細胞（大腸癌細胞株）及びＲａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫細胞株）の培養細胞中におけるＧＡＰＤＨの増幅を調べた。つまり、サイトケラチンが陽性のＬＳ１８０細胞溶液を、サイトケラチンが陰性のＲａｊｉ細胞溶液で稀釈した場合の、各濃度のＬＳ１８０細胞溶液試料でのＧＡＰＤＨの増幅について調べ、サイトケラチンの腫瘍マーカーを測定する場合に、ＧＡＰＤＨがデータ補正のコントロールとして使用可能か否かを検討した。
１）試料
ＬＳ１８０細胞及びＲａｊｉ細胞の総細胞数が８０００となるように試料を調製した。総細胞数８０００のうち、ＬＳ１８０細胞数が８０００、８００、８０、８及び０となるようにした。
２）ＧＡＰＤＨ用プライマーセット
実験例５と同様のプライマーセットを選択した。
３）反応液組成
実験例２と同様の組成の反応液を使用した。
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
実験例２と同様に行った。実験例５と同様の６種のプライマーを含む反応液２３μｌに、細胞の懸濁液を２μｌ添加し、６５℃で１時間加温して行った。
５）核酸の検出
実験例２と同様に行った。
６）結果
その結果を第４図に示した。その結果、ＬＳ１８０細胞及びＲａｊｉ細胞の比率が異なる場合でも、ＧＡＰＤＨは１０分程度で増幅が確認された。このことより、腫瘍マーカーの有無にかかわらず、ヒト細胞中にはＧＡＰＤＨが構成的に発現していることが確認され、ＧＡＰＤＨがＬＡＭＰ法におけるデータ補正のコントロールとして使用可能であることが示された。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明のプライマー又はプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うと、速い場合で１５分以内にβ−アクチン又はＧＡＰＤＨの増幅が確認される。
また、サイトケラチンのような腫瘍マーカーの有無にかかわらず、ヒト細胞からβ−アクチンやＧＡＰＤＨの存在が認められることにより、これらがＬＡＭＰ法においてデータ補正のコントロールとして使用可能であることがわかった。
このことから、本発明のプライマー、又はプライマーセットを用いると、核酸増幅手段を用いた癌転移診断に際し、診断に要する時間が短縮され、信頼性のある診断が可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のβ−アクチン用プライマーを用いたときの感度を示す図であり（実験例２）、第２図は、ＬＳ１８０細胞及びＲａｊｉ細胞の培養液中で、本発明のβ−アクチン用プライマーを用いて測定したときの結果（実験例３）を示す図である。
第３図は、本発明のＧＡＰＤＨ用プライマーを用いたときの感度を示す図であり（実験例５）、第４図は、ＬＳ１８０細胞及びＲａｊｉ細胞の培養液中で、本発明のＧＡＰＤＨ用プライマーを用いて測定したときの結果（実験例６）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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