(57)【要約】サイズが数μｍ程度のＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体が混在する中から回収する方法を提供する。ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質（例えば、メチルセルロース）を利用して、微小物体を精度よくかつ簡便に回収する。本発明は、ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、支持体、及び微小物体から成る系において所望の微小物体を回収する方法であって、回収しようとする微小物体の周辺の媒体及び支持体を局所的にゲル化して該微小物体をこのゲル化した媒体と共に該支持体に固定する段階、該支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を除去する段階、及びゲル化した媒体をゾル化して所望の微小物体を回収する段階から成る微小物体を回収する方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、支持体、及び微小物体から成る系において所望の微小物体を回収する方法であって、回収しようとする微小物体の周辺の媒体を局所的にゲル化して該微小物体をこのゲル化した媒体と共に該支持体に固定する段階、該支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を除去する段階、及びゲル化した媒体をゾル化して所望の微小物体を回収する段階から成る微小物体を回収する方法。
【請求項２】
前記媒体が、ゾルとゲルの相転移温度を有し、該相転移温度以上に加熱されることによりゲル化し、該相転移温度以下に冷却されることによりゾル化する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相転移温度が室温〜９０℃である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記媒体が水溶性のセルロース誘導体又はその溶液である請求項２又は３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記セルロース誘導体がメチルセルロースである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記支持体が透明である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が透明電極（ＩＴＯ）である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微小物体が識別のためのマーカーを有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微小物体がＤＮＡ分子、細胞又は微生物である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記媒体を相転移温度以上に加熱する手段が赤外線の照射によるものであり、相転移温度以下に冷却する手段がこの照射を止めることである請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記加熱手段が赤外レーザーである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤外レーザーがＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
温度によりゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体及び支持体を保持する空間、該支持体全体を該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該支持体を局部的に該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該空間に該媒体を注入する流路、該空間に洗浄用液体を注入する流路、該空間から洗浄用液体を排出する流路、及び該空間から該媒体を排出する流路から成る、微小物体の回収装置。
【請求項１４】
前記媒体が水溶性のセルロース誘導体又はその溶液である請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記セルロース誘導体がメチルセルロースである請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記支持体が透明である請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記支持体が透明電極（ＩＴＯ）である請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
更に、加熱手段として前記空間を照射する赤外線照射装置を備えた請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記赤外線照射装置が赤外レーザーである請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記赤外レーザーがＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーである請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
更に、赤外線照射装置の赤外線を前記空間に集光するレンズを備えた請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
更に、前記空間を観察できる顕微鏡を備えた請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、多数の微小物体の中から特定の微小物体を回収する方法及び装置に関し、より詳細には、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体と混在する中から回収する方法及び装置に関する。
従来技術
従来、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体と混在する中から回収する方法として、マイクロピペットを用いてシャーレ等に入ったターゲットを光学顕微鏡下で観察しながら取り出したり、セルソーターを用いる方法などがとられていた（日本機会学会論文集６７巻６３５号Ｃ編１４６−１５３（平成１３年１月）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００１，２２，２８３−２８８）０  しかし、マイクロピペットを用いる方法では、顕微鏡下で微小な試料を高純度で選別し回収するためにはその作業に熟練した技術を要し、その実施に膨大な時間と費用を要している。また、セルソーターによる方法では、大きさが数十μｍ前後の対象物には有効性が示されているものの、数μｍ程度の微生物等の対象物への適用は難しく、サンプルを一列に整列させてシーケンシャルな分離作業を行うため、ランダムに分散したサンプルから任意に選ばれたターゲットを高速に取り出すことは不可能であった。
また、発明者らはマイクロ流体回路内でレーザートラップ、誘電泳動、マイクロキャピラリーフローを複合的に利用して分離を行う非接触式マニピレーション手法を用いた高速分離システムを考案した（特開平１１−３４６７５６、特願平１１−２１０７５０、特開２００１−０９５５５８、特開２００１−１４５４７８）。しかし、直接レーザートラップで微生物を搬送するため、微生物に損傷を与える危惧があり、これを避けるために、マイクロツールをレーザートラップして、微生物を押したり引いたりすることで、間接的に搬送する方法も考案したが、実際は操作が難しい等の問題があった。
発明が解決しようとする課題
本発明は、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体が混在する中から回収する方法であって、下記のような課題を解決できる方法を提供することを目的とする。
１．ランダムに分散した大量のサンプルから光学顕微鏡で観察しながら必要なサンプルを選択する。これは一般のセルソーターでは不可能である。
２．ランダムに分散したサンプルから任意のサンプルを選択する。必要なときに、必要なものだけをとりだせる。
３．高速分離を可能とする。
４．多量のサンプル（例えば、５万サンプル）から数サンプルを選ぶ場合に、簡単かつ精度よく分離する。
５．レーザーによる分離ターゲットへの直接照射を避け、分離物の損傷を回避する。特に微生物を分離する場合には、レーザー光が直接あたると、温度上昇や紫外線により微生物が死滅してしまう場合がある。
６．蛍光観察と画像処理を組み合わせて，選択のプロセスを自動化する。蛍光観察を行う場合は、観察面の垂直方向に存在する物体からの蛍光発光により、バックグラウンドノイズが発生し、蛍光観察の画像の分解能が低下し、像がぼやけるというの問題がある。このため、ノイズの原因となる不要な物体を除去できれば、バックグラウンドノイズを大幅に削減でき、コントラストの高い観察が可能となり、近接場のような高額な光学系を備える必要がない等のメリットがある。
７．微生物の培養チップとあわせて、集積化を可能とし、分離から培養までをワンチップ上で行う。
課題を解決するための手段
本発明においては、細胞あるいは微生物あるいはＤＮＡ分子などの微小物体を多数含む溶液の中から目標とする微小物体のみを回収するために、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質をその媒体として利用することに着目し、その相転移を起こさせる簡便な方法を考案して、微小物体を精度よくかつ簡便に回収する方法を完成させた。
本発明の方法においては、このような多数の微小物を分散したゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質又はそれを含む溶液を微小流路内に流し込む。ある特定の観察領域に存在する微小物体を、例えば顕微鏡により観察して、選択する。特に支持体（容器の底面等）付近に存在しているものの中から目標とするものを選択して、その周辺を局所的に目標物とともにゲル化すると、目標物を支持体（容器の底面等）に固定することができる。目標物をゲルとともに支持体に固定したあとに、微小流路内に流れをおこして、固定されていないものを除去する。十分に除去した後に媒体をゾル化することで粘度を下げる。再び、目標物を回収するための流れをおこすことで、目標物を回収することができる。
即ち、本発明は、ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、支持体、及び微小物体から成る系において所望の微小物体を回収する方法であって、回収しようとする微小物体の周辺の媒体及び支持体を局所的にゲル化して該微小物体をこのゲル化した媒体と共に該支持体に固定する段階、該支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を除去する段階、及びゲル化した媒体をゾル化して所望の微小物体を回収する段階から成る微小物体を回収する方法である。この微小物体には回収したい所望の微小物体と不要な微小物体とが含まれており、本発明によれば、この混合の中から所望の微小物体のみを高精度で取り出すことができる。
この媒体は、ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こすものであれば、本発明の方法に用いることができる。その中で特に温度によりこのような相転移を起こすものを用いるのが簡便である。即ち、この媒体は、ゾルとゲルの相転移温度を有し、該相転移温度以上に加熱されることによりゲル化し、該相転移温度以下に冷却されることによりゾル化することが好ましい。この相転移温度は、本発明の対象である微小物体の性質にもよるが、好ましくは室温〜９０℃、より好ましくは２０〜８５℃、更に好ましくは３０〜６０℃、である。特に微生物を分離回収するためにはこの相転移温度は３０〜５０℃が好ましい。またこの場合、媒体は、水溶性のセルロース誘導体又はその溶液であることが好ましく、このセルロース誘導体としてはメチルセルロースがより好ましく、例えば、信越化学工業社製メトローズＳＭ、ＳＨ、ＳＥ等が挙げられる。更に、媒体として、ポリＮイソプロピルアクリルアミドとポリエチレングリコール誘導体の重合物等を用いてもよい。この重合物は、例えば、メビオールジェル（登録商標、株式会社池田理化、転移温度２２℃）として市販されているが、分子設計により転換温度を３０〜３２℃に設定することも可能である。
例えば、メチルセルロース（メトローズＳＭ）は、通常２％溶液で約５５℃に加熱すると、白濁してゲル化し、冷却することで再びゾル化する。この変化は温度変化に対して可逆性があり、メチルセルロースは繊維であるため生体、人体に無害である。さらに、ＮａＣｌやＮａＯＨなどを混入することでゲル化温度が低下する。例えば、この２％溶液にＮａＣｌ  ５％を加えるとゲル化温度が約４０度に低下する。
メチルセルロース（メトローズＳＭ）は第１図にあるように、温度に起因した粘度の変化に対して、ヒステリシス特性を示す。このため、この特性を利用すると、複数のターゲットを取り出すことが可能となる。以下にその流れを示す。
１．電極によりゲル化開始温度直前のＴ２に加熱する。このとき、溶液中はすべてゾル化している。
２．微生物や細胞やＤＮＡなどサンプルが混入した溶液を流し入れる。
３．レーザーにより対象周辺のみをゲル化開始温度を超えＴ４まで加熱し、ゲル化する。その後すぐにレーザーを切る。しかし一度ゲル化温度Ｔ４を超えているため、対象周辺はゲル化したままになっており、底面に保持されたままとなる。
また、対象物が微生物のように、直接レーザーを照射したりその他の加熱手段のより直接対象物を加熱することが適当でない場合には、対象物の周辺を局所加熱して対象物を加熱しないまま支持体に固定してもよい。その例を第２図に示す。
４．工程３を繰り返すことで、複数の対象を加熱電極上に保持することが可能である。なお、微生物や細胞を対象とする場合には、通電によりこれらを死滅させないように、加熱電極を絶縁体でカバーする。
５．非対象物を除去するためのクリーンな流れを流す。このとき対象はゲル化した部分により底面に固定されており、流されることは無い。よって非対象のもののみが除去される。
６．工程２〜５を繰り返し、対象物を任意数保持することが可能となる。
７．電極加熱を切ることで温度は瞬時にＴ１になり、対象周辺のゲル化部分が瞬時にゾル化して底面に付着することなく流れに乗せることが可能な状態となる。
８．回収用の流れを流し、対象を回収ポートより回収する。
後述の実施例では、このヒステリシス特性をうまく使うと、１電極上の複数のサンプルを取り出すことができる。
支持体は目標物を固定し、不要物を除去する際に目標物を固定しておくためのものであるので、このような目的にかなうのもであれば特に制限はない。通常は微小物体と媒体を入れておく容器であるが、容器とは別に、棒状、板状、網状あるいは格子状などの形状をした支持体を用いてもよい。支持体の材質には特に制限はない。但し、支持体が透明であると、その支持体を通して光を当てたり、目標物を観察したりすることが可能となり、更に、透過照明法により観察するタイプの顕微鏡を利用することができるため、好ましい。また、媒体が、温度によりゾルとゲルの相転移を起こすものである場合には、この媒体が加熱出来るものであれば好都合である。例えば、支持体が透明電極（ＩＴＯ）であれば、これに赤外レーザー光を照射して局部加熱することも出来るし、通電により全体又は部分を加熱することも出来るため特に好ましい。
また、本発明の方法の対象である微小物体として、ゲル化した媒体に取り込まれるものであればいかなるものでも対象とできるが、特にサイズが数ｎｍ〜約２００μｍ、好ましくは数ｎｍ〜約３０μｍのものが適している。本発明の方法は、特に、ＤＮＡ分子、細胞又は微生物等の微小物体を分離回収することに適している。このような微小物体は、通常、試料の形、大きさ、色、蛍光反応などを目視又は顕微鏡を通して目視で識別することができるが、この微小物体が何らかのマーカーを有することにより、これにより識別してもよい。本発明においては、このような選択は必ずしも目視で行われることを必要とせず、ＣＣＤカメラなどを用いた自動識別装置や蛍光反応を自動的に感知する装置などを用いて自動化してもよい。
なお、ＤＮＡ等の微小物体を観察するときにはバックグラウンドノイズが問題視されているが、本発明のように熱ゲル化を用いて、カバーガラス付近のＤＮＡだけを固定して、上方に漂っているＤＮＡを除去した後に、熱ゲル化を解除して観察すれば、バックグラウンドノイズの問題を解決できる。
従来法のエバネッセント照明を利用する方法（例えば、オリンパス光学工業製の全反射蛍光顕微鏡システム、ＴＩＲＦＭ）は、エバネッセント光を励起光としてガラスのごく近傍の蛍光分子のみを光らせる方法であるが、エバネッセント照明のための高価な光学系が必要となる。本発明の方法（熱ゲル化）を用いれば、第３図に示す支持体近傍の微小物体だけを一時固定し、洗浄によって観察ノイズになる蛍光分子や観察障害物を除去できるため、一般的に利用されている蛍光顕微鏡で感度の高い（バックグラウンドノイズの低い）観察が可能になる。
一般的に、通常の水銀ランプによる落射蛍光観察ではバックグラウンドノイズが観察の妨げとなるが、本発明の方法を利用して観察したいサンプルだけを蛍光物質で染色することで、ＤＮＡ以外の様々な試料の観察用途にも応用できる。
本発明において、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす手段は、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質の性質によって適宜選択すればよいが、温度によりゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質を用いるのが簡便である。
局所加熱の方法としては特に制限はないが、微小電極を微細加工により形成し、抵抗線加熱を行ったり、赤外線照射装置により局所的に加熱してもよい。
加熱電極等の抵抗線加熱を行う場合であって、対象物が微生物等の場合には、抵抗線を絶縁体で被覆して、これらが通電により死滅しないような配慮をすることが好ましい。絶縁体としては、酸化シリコン、窒化シリコン、ポリイミド樹脂等が挙げられる。
この局所加熱方法としては、特に、赤外線の照射により媒体を相転移温度以上に加熱し、この照射を止めることにより媒体を相転移温度以下に冷却することが好ましい。赤外線照射装置は公知のものを用いることできるが、赤外レーザーを用いることがよい。レーザーは対象物にそのまま照射してもよいし、レンズ等を用いて対象物に集光するように照射してもよい。赤外レーザーとしては、ＹＡＧレーザー（Ｎｄ−ＹＡＧレーザー）、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザー、ＣＯ２レーザー、ルビーレーザーなどいかなるものを用いてもよいが、ＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーを用いるのが簡便である。
また、加熱方法として、注入ポートから湯を注いでもよい。
また、本発明は、温度によりゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体及び支持体を保持する空間、該支持体全体を該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該支持体を局部的に該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該空間に該媒体を注入する流路、該空間に洗浄用液体を注入する流路、該空間から洗浄用液体を排出する流路、及び該空間から該媒体を排出する流路から成る、微小物体の回収装置である。これらの流路はそれぞれの他の流路を兼ねてもよい。
この装置は、適宜、更に、加熱手段として前記空間を照射する赤外線照射装置、好ましくは赤外レーザー、より好ましくはＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーを備えてもよく、更に赤外線照射装置の赤外線を前記空間に集光するレンズを備えてもよい。またこの装置は、更に、前記空間を観察できる顕微鏡を備えてもよい。この装置は、更に、ＣＣＤカメラなどを用いた形状識別装置や蛍光反応を自動的に感知する装置などを備え、識別作業を自動化したものであってもよい。
発明の効果
従来のセルソーターはシリアルな流れをおこして分離を行っているが、本発明によれば、２次元的に試料を広げて特性を比較し、ランダムに分散した中から目標物を選択することができる。観察領域を広げることで、１回の選別で１万個〜４万個の微小物体を比較して選別することができるため、分離速度の高速化が可能となる。また、選択した目標物をマイクロチップの内部あるいはマイクロマニピュレータに取り付け、吸引したピペットチップの内部に保持しておくことが可能となるため、必要なときに簡単に高速に取り出すことができる。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらは本発明を制限することを意図したものではない。
実施例１
本実施例では、目標物をゲルで固定して、ピペットで回収する。その様子を第４図に示す。
イースト菌（サイズ：約６μｍ）０．０１ｇをメチルセルロース（信越化学工業社製、メトローズＳＭ−４０００）の２％水溶液８ｍｌに混合したものをスピンコートにより基板（表面に電極（ＩＴＯ）を成膜したガラス）上に平面状に広げる。
このように透明な基板を用いることで、倒立顕微鏡で目標物を観察できる。この基板を倒立型の光学顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７０）により観察して目標物を選択する。特に底面付近に存在しているものの中から目標とするものを選択して、その目標物付近の基板を、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社製、Ｊ２０−ＩＲ−２Ｅ、波長：１０６４ｎｍ）を対物レンズ（オリンパス社製、ＵＰｌａｎＡｐｏ  １００ｘ／１．３５）で集光して照射した。この照射により、この基板の周辺が局所的にレーザーで加熱され、メチルセルロースが目標物とともにゲル化するため、この目標物は基板上に固定される。この際、レーザー照射により生成したゲルは一定時間ゲルを保つため、複数の目標物を固定した。
目標物をゲルとともに基板底面に固定したあとに、それ以外の不要物を水で洗浄し除去した。十分に除去した後に目標物の加熱をとめて、ゾル化することで固定を解除し、マイクロマニピュレータに取り付けた回収用のピペットを用いて目標物を回収した。
実施例２
本実施例で用いたマイクロチップの概略図を第５図と第６図に示す。
これらのマイクロチップは交差する２つの流路を備えている。これら２つの流路は微細加工により型をつくり、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）により型どりして微小流体チップを製作した。第５図のものは２つの流路が十文字型に交差しており、第６図のものは２つの流路がＴ型に交差しており、一つの排出ポートがサンプルと洗浄液の排出を兼ねている。
一方の流路は分離したい目標物を含むゾル／ゲル相転移物質を投入し、その後固定した目標物以外の不要物を洗浄して除去するための水の流路であり、もう一方の流路は固定した目標物を回収するための流路である。
２つの流路の交差点（観察領域）を倒立型の光学顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７０）により観察し、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社製、Ｊ２０−ＩＲ−２Ｅ、波長：１０６４ｎｍ）を対物レンズ（オリンパス社製、ＵＰｌａｎＡｐｏ  １００ｘ／１．３５）で集光して照射することが出来るようになっている。この観察領域の底には透明電極（松浪硝子工業（株）社製、ＩＴＯ付き薄板ガラス）を成膜し、パターニングしてある。更に、この透明電極の表面を酸化シリコンでコートした。
このマイクロチップをこの光学顕微鏡のステージの上にセットした。このステージは可動であり、観察領域を移動させながら、顕微鏡による観察とレーザー照射が出来る。
このマイクロチップの投入ポートから、イースト菌（サイズ：約６μｍ）０．０１ｇをメチルセルロース（信越化学工業社製、商品名：メトローズＳＭ）の２％水溶液８ｍｌに混合したものを投入する。このとき、抽出ポートのバルブは閉めておく。
その後、透明電極を通電して暖め、透明電極の表面上をゲル化し、表面付近に存在する試料や不純物を透明電極上に一旦固定する。その後、洗浄水注入ポートより水を注入して、固定されていないメチルセルロース等を除去する。
その後、冷却した透明電極を、熱ゲル化開始温度付近まで熱ゲル化開始温度を超えない程度まで通電して暖め、２本の微小流路の交差点付近を倒立顕微鏡で観察し、目標物を選択する。目標物を選択したら目標物（上記試料）付近の透明電極にレーザーを集光して照射する。集光した付近の透明電極は加熱されて、その付近のメチルセルロースが目標物を取り込んだ状態でゲル化する。その様子を第７図に示す。その後、洗浄水注入ポートから洗浄水を流して固定されていないメチルセルロース等の不要物を除去し、排出ポートから捨てる。
次に、抽出ポートのバルブを開けて、回収用の流れを起こし、透明電極の通電を止めて加熱をとめ、抽出ポートから目標物を回収する。
以後、再び抽出ポートのバルブを閉めて、投入ポートから試料を含んだ溶液を投入し、同様の手順を連続的に繰り返すことで、目標物を必要数回収した。
第５図のものに比べて第６図のものの方が洗浄液や回収液の滞留が少ないため、回収物の純度が高かった。
実施例３
観察領域の上部と下部に透明電極（ＩＴＯ）を設けた他は、実施例１と同様のマイクロチップを用いた。
このマイクロチップに実施例１と同様の試料とメチルセルロースの混合物を投入した。
両方の透明電極を通電して暖め、試料や不純物を全て一旦固定する。その後、実施例１と同様の手順で目標物付近にレーザーを照射する。その様子を第８図に示す。その後、透明電極の通電を止め、洗浄水注入ポートより水を注入して、不要物を除去する。その後、残った目標物を回収した。
この方法によれば、下部と上部の電極の局所加熱により固定を行うため、底面付近にない試料であっても環境中に固定できるメリットがある。
実施例４
本実施例では、加熱による目標物の固定方法として電極への通電過熱とレーザー照射による局所加熱を組み合わせた。そのマイクロチップの概略を第９図に示す。
このマイクロチップを顕微鏡のステージ上に設置する。顕微鏡の観察倍率に応じて観察領域を変えることができ、ステージを移動することで、広範囲の観察が可能となる。電極の数は複数用意することで、大量の試料を処理することが可能となり作業効率が向上できる。電極への通電過熱による固定では、数ミクロン程度の目標物を一つだけ固定するためには電極の数を増やす必要がある。このため、数千から数万の微小物試料から目標物を一つだけ取り出すには多数の電極が必要になり、システムが複雑になる。そこで、一度に数千から数万の微小物試料を一度に固定できる電極を複数用意する。本実施例では電極Ａ〜Ｄまで４つの独立した電極を用意した。
実施例１の試料を用い、実施例１と同様に、試料導入時や洗浄時や回収時に適宜バルブの制御を行った。
まず、微小物試料を投入後、全ての電極に通電加熱して、微小物試料を固定した。必要に応じて、洗浄水を流して固定されていない試料は捨てた。次に、電極Ａの通電加熱をやめて、電極Ａ上の微小物試料を評価して目標物を決め、レーザー照射による局所加熱により目標物を固定した。固定後は洗浄水を流して、電極Ａ付近の目標物以外の資料を捨てた。その後、電極Ａを通電加熱して先ほど選択した目標物を固定し、レーザー照射をやめた。次に電極Ｂ上の微小物試料を評価して先ほどと同じプロセスを繰りかえした。電極Ｃ、Ｄについても同様の手順を繰り返して、少なくとも４個の目標物を固定した。最後に洗浄後に欲しい目標物がのっている電極だけ通電加熱をやめ、回収用の流れによってその目標物だけを抽出した。
なお、ここでは電極が４つの例を示したが、電極の数を増やせば、大量の試料を高速に処理することが可能となる。顕微鏡のステージを自動化すれば、分離作業を自動化することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、メチルセルロース（メトローズＳＭ）の温度に対する粘度の変化を示すグラフである。ヒステリシス特性を示す。
第２図は、対象物の周辺のみを局所加熱して対象物を固定する方法を示す。
第３図は、本発明の方法（熱ゲル化）により、支持体近傍の微小物体だけを一時固定して観察する方法を示す。
第４図は、目標物をゲルで固定して、ピペットで回収する様子を示す。
第５図は、マイクロチップの概略図である。上図はマイクロチップを上から見た図であり、下図はその断面である。
第６図は、別のマイクロチップの概略図である。マイクロチップを上から見た図である。
第７図は、実施例２において、透明電極にレーザーを集光し（左図）、メチルセルロースが目標物を取り込んだ状態でゲル化した様子（右図）を示す。
第８図は、実施例３において、透明電極にレーザーを集光し（左図）、メチルセルロースが目標物を取り込んだ状態でゲル化した様子（右図）を示す。
第９図は、マイクロチップの概略図である。Ａ〜Ｄは加熱可能な電極を示す。縦と横の流路は第７図のものと同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月19日(2004.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、支持体、及び微小物体から成る系において所望の微小物体を回収する方法であって、回収しようとする微小物体の周辺の媒体を局所的にゲル化して該微小物体をこのゲル化した媒体と共に該支持体に固定する段階、該支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を除去する段階、及びゲル化した媒体をゾル化して所望の微小物体を回収する段階から成る微小物体を回収する方法。
【請求項２】
前記媒体が、ゾルとゲルの相転移温度を有し、該相転移温度以上に加熱されることによりゲル化し、該相転移温度以下に冷却されることによりゾル化する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相転移温度が室温〜９０℃である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記媒体が水溶性のセルロース誘導体又はその溶液である請求項２又は３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記セルロース誘導体がメチルセルロースである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記支持体が透明である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が透明電極（ＩＴＯ）である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微小物体が識別のためのマーカーを有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微小物体がＤＮＡ分子、細胞又は微生物である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記媒体を相転移温度以上に加熱する手段が赤外線の照射によるものであり、相転移温度以下に冷却する手段がこの照射を止めることである請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記加熱手段が赤外レーザーである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤外レーザーがＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
温度によりゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体及び支持体を保持する空間、該支持体全体を該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該支持体を局部的に該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該空間に該媒体を注入する流路、該空間に洗浄用液体を注入する流路、該空間から洗浄用液体を排出する流路、及び該空間から該媒体を排出する流路から成る、微小物体の回収装置。
【請求項１４】
前記媒体が水溶性のセルロース誘導体又はその溶液である請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記セルロース誘導体がメチルセルロースである請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記支持体が透明である請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記支持体が透明電極（ＩＴＯ）である請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
更に、加熱手段として前記空間を照射する赤外線照射装置を備えた請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記赤外線照射装置が赤外レーザーである請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記赤外レーザーがＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーである請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
更に、赤外線照射装置の赤外線を前記空間に集光するレンズを備えた請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
更に、前記空間を観察できる顕微鏡を備えた請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、多数の微小物体の中から特定の微小物体を回収する方法及び装置に関し、より詳細には、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体と混在する中から回収する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体と混在する中から回収する方法として、マイクロピペットを用いてシャーレ等に入ったターゲットを光学顕微鏡下で観察しながら取り出したり、セルソーターを用いる方法などがとられていた（非特許文献１、２）。しかし、マイクロピペットを用いる方法では、顕微鏡下で微小な試料を高純度で選別し回収するためにはその作業に熟練した技術を要し、その実施に膨大な時間と費用を要している。また、セルソーターによる方法では、大きさが数十μｍ前後の対象物には有効性が示されているものの、数μｍ程度の微生物等の対象物への適用は難しく、サンプルを一列に整列させてシーケンシャルな分離作業を行うため、ランダムに分散したサンプルから任意に選ばれたターゲットを高速に取り出すことは不可能であった。
また、発明者らはマイクロ流体回路内でレーザートラップ、誘電泳動、マイクロキャピラリーフローを複合的に利用して分離を行う非接触式マニピレーション手法を用いた高速分離システムを考案した（特許文献１〜４）。しかし、直接レーザートラップで微生物を搬送するため、微生物に損傷を与える危惧があり、これを避けるために、マイクロツールをレーザートラップして、微生物を押したり引いたりすることで、間接的に搬送する方法も考案したが、実際は操作が難しい等の問題があった。
【０００３】
【特許文献１】特開平11-346756
【特許文献２】特願平11-210750
【特許文献３】特開2001-095558
【特許文献４】特開2001-145478）
【非特許文献１】日本機会学会論文集 67巻635号C編146-153(平成13年1月)
【非特許文献２】Electrophoresis 2001, 22, 283-288
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体が混在する中から回収する方法であって、下記のような課題を解決できる方法を提供することを目的とする。
１．ランダムに分散した大量のサンプルから光学顕微鏡で観察しながら必要なサンプルを選択する。これは一般のセルソーターでは不可能である。
２．ランダムに分散したサンプルから任意のサンプルを選択する。必要なときに、必要なものだけをとりだせる。
３．高速分離を可能とする。
４．多量のサンプル（例えば、５万サンプル）から数サンプルを選ぶ場合に、簡単かつ精度よく分離する。
５．レーザーによる分離ターゲットへの直接照射を避け、分離物の損傷を回避する。特に微生物を分離する場合には、レーザー光が直接あたると、温度上昇や紫外線により微生物が死滅してしまう場合がある。
６．蛍光観察と画像処理を組み合わせて，選択のプロセスを自動化する。蛍光観察を行う場合は、観察面の垂直方向に存在する物体からの蛍光発光により、バックグラウンドノイズが発生し、蛍光観察の画像の分解能が低下し、像がぼやけるというの問題がある。このため、ノイズの原因となる不要な物体を除去できれば、バックグラウンドノイズを大幅に削減でき、コントラストの高い観察が可能となり、近接場のような高額な光学系を備える必要がない等のメリットがある。
７．微生物の培養チップとあわせて、集積化を可能とし、分離から培養までをワンチップ上で行う。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明においては、細胞あるいは微生物あるいはＤＮＡ分子などの微小物体を多数含む溶液の中から目標とする微小物体のみを回収するために、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質をその媒体として利用することに着目し、その相転移を起こさせる簡便な方法を考案して、微小物体を精度よくかつ簡便に回収する方法を完成させた。
本発明の方法においては、このような多数の微小物を分散したゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質又はそれを含む溶液を微小流路内に流し込む。ある特定の観察領域に存在する微小物体を、例えば顕微鏡により観察して、選択する。特に支持体（容器の底面等）付近に存在しているものの中から目標とするものを選択して、その周辺を局所的に目標物とともにゲル化すると、目標物を支持体（容器の底面等）に固定することができる。目標物をゲルとともに支持体に固定したあとに、微小流路内に流れをおこして、固定されていないものを除去する。十分に除去した後に媒体をゾル化することで粘度を下げる。再び、目標物を回収するための流れをおこすことで、目標物を回収することができる。
【０００６】
即ち、本発明は、ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、支持体、及び微小物体から成る系において所望の微小物体を回収する方法であって、回収しようとする微小物体の周辺の媒体及び支持体を局所的にゲル化して該微小物体をこのゲル化した媒体と共に該支持体に固定する段階、該支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を除去する段階、及びゲル化した媒体をゾル化して所望の微小物体を回収する段階から成る微小物体を回収する方法である。この微小物体には回収したい所望の微小物体と不要な微小物体とが含まれており、本発明によれば、この混合の中から所望の微小物体のみを高精度で取り出すことができる。
【０００７】
この媒体は、ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こすものであれば、本発明の方法に用いることができる。その中で特に温度によりこのような相転移を起こすものを用いるのが簡便である。即ち、この媒体は、ゾルとゲルの相転移温度を有し、該相転移温度以上に加熱されることによりゲル化し、該相転移温度以下に冷却されることによりゾル化することが好ましい。この相転移温度は、本発明の対象である微小物体の性質にもよるが、好ましくは室温〜９０℃、より好ましくは２０〜８５℃、更に好ましくは３０〜６０℃、である。特に微生物を分離回収するためにはこの相転移温度は３０〜５０℃が好ましい。またこの場合、媒体は、水溶性のセルロース誘導体又はその溶液であることが好ましく、このセルロース誘導体としてはメチルセルロースがより好ましく、例えば、信越化学工業社製メトローズＳＭ、ＳＨ、ＳＥ等が挙げられる。更に、媒体として、ポリＮイソプロピルアクリルアミドとポリエチレングリコール誘導体の重合物等を用いてもよい。この重合物は、例えば、メビオールジェル（登録商標、株式会社池田理化、転移温度２２℃）として市販されているが、分子設計により転換温度を３０〜３２℃に設定することも可能である。
【０００８】
例えば、メチルセルロース（メトローズＳＭ）は、通常２％溶液で約５５℃に加熱すると、白濁してゲル化し、冷却することで再びゾル化する。この変化は温度変化に対して可逆性があり、メチルセルロースは繊維であるため生体、人体に無害である。さらに、ＮａＣｌやＮａＯＨなどを混入することでゲル化温度が低下する。例えば、この２％溶液にＮａＣｌ ５％を加えるとゲル化温度が約４０度に低下する。
【０００９】
メチルセルロース（メトローズＳＭ）は図１にあるように、温度に起因した粘度の変化に対して、ヒステリシス特性を示す。このため、この特性を利用すると、複数のターゲットを取り出すことが可能となる。以下にその流れを示す。
１．電極によりゲル化開始温度直前のＴ２に加熱する。このとき、溶液中はすべてゾル化している。
２．微生物や細胞やＤＮＡなどサンプルが混入した溶液を流し入れる。
３．レーザーにより対象周辺のみをゲル化開始温度を超えＴ４まで加熱し、ゲル化する。その後すぐにレーザーを切る。しかし一度ゲル化温度Ｔ４を超えているため、対象周辺はゲル化したままになっており、底面に保持されたままとなる。また、対象物が微生物のように、直接レーザーを照射したりその他の加熱手段のより直接対象物を加熱することが適当でない場合には、対象物の周辺を局所加熱して対象物を加熱しないまま支持体に固定してもよい。その例を図２に示す。
４．工程３を繰り返すことで、複数の対象を加熱電極上に保持することが可能である。なお、微生物や細胞を対象とする場合には、通電によりこれらを死滅させないように、加熱電極を絶縁体でカバーする。
５．非対象物を除去するためのクリーンな流れを流す。このとき対象はゲル化した部分により底面に固定されており、流されることは無い。よって非対象のもののみが除去される。
６．工程２〜５を繰り返し、対象物を任意数保持することが可能となる。
７．電極加熱を切ることで温度は瞬時にＴ１になり、対象周辺のゲル化部分が瞬時にゾル化して底面に付着することなく流れに乗せることが可能な状態となる。
８．回収用の流れを流し、対象を回収ポートより回収する。
【００１０】
後述の実施例では、このヒステリシス特性をうまく使うと、１電極上の複数のサンプルを取り出すことができる。
支持体は目標物を固定し、不要物を除去する際に目標物を固定しておくためのものであるので、このような目的にかなうのもであれば特に制限はない。通常は微小物体と媒体を入れておく容器であるが、容器とは別に、棒状、板状、網状あるいは格子状などの形状をした支持体を用いてもよい。支持体の材質には特に制限はない。但し、支持体が透明であると、その支持体を通して光を当てたり、目標物を観察したりすることが可能となり、更に、透過照明法により観察するタイプの顕微鏡を利用することができるため、好ましい。また、媒体が、温度によりゾルとゲルの相転移を起こすものである場合には、この媒体が加熱出来るものであれば好都合である。例えば、支持体が透明電極（ＩＴＯ）であれば、これに赤外レーザー光を照射して局部加熱することも出来るし、通電により全体又は部分を加熱することも出来るため特に好ましい。
【００１１】
また、本発明の方法の対象である微小物体として、ゲル化した媒体に取り込まれるものであればいかなるものでも対象とできるが、特にサイズが数ｎｍ〜約２００μｍ、好ましくは数ｎｍ〜約３０μｍのものが適している。本発明の方法は、特に、ＤＮＡ分子、細胞又は微生物等の微小物体を分離回収することに適している。このような微小物体は、通常、試料の形、大きさ、色、蛍光反応などを目視又は顕微鏡を通して目視で識別することができるが、この微小物体が何らかのマーカーを有することにより、これにより識別してもよい。本発明においては、このような選択は必ずしも目視で行われることを必要とせず、ＣＣＤカメラなどを用いた自動識別装置や蛍光反応を自動的に感知する装置などを用いて自動化してもよい。
【００１２】
なお、ＤＮＡ等の微小物体を観察するときにはバックグラウンドノイズが問題視されているが、本発明のように熱ゲル化を用いて、カバーガラス付近のＤＮＡだけを固定して、上方に漂っているＤＮＡを除去した後に、熱ゲル化を解除して観察すれば、バックグラウンドノイズの問題を解決できる。
従来法のエバネッセント照明を利用する方法（例えば、オリンパス光学工業製の全反射蛍光顕微鏡システム、ＴＩＲＦＭ）は、エバネッセント光を励起光としてガラスのごく近傍の蛍光分子のみを光らせる方法であるが、エバネッセント照明のための高価な光学系が必要となる。本発明の方法（熱ゲル化）を用いれば、図３に示す支持体近傍の微小物体だけを一時固定し、洗浄によって観察ノイズになる蛍光分子や観察障害物を除去できるため、一般的に利用されている蛍光顕微鏡で感度の高い（バックグラウンドノイズの低い）観察が可能になる。
【００１３】
一般的に、通常の水銀ランプによる落射蛍光観察ではバックグラウンドノイズが観察の妨げとなるが、本発明の方法を利用して観察したいサンプルだけを蛍光物質で染色することで、ＤＮＡ以外の様々な試料の観察用途にも応用できる。
本発明において、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす手段は、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質の性質によって適宜選択すればよいが、温度によりゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質を用いるのが簡便である。
局所加熱の方法としては特に制限はないが、微小電極を微細加工により形成し、抵抗線加熱を行ったり、赤外線照射装置により局所的に加熱してもよい。
加熱電極等の抵抗線加熱を行う場合であって、対象物が微生物等の場合には、抵抗線を絶縁体で被覆して、これらが通電により死滅しないような配慮をすることが好ましい。絶縁体としては、酸化シリコン、窒化シリコン、ポリイミド樹脂等が挙げられる。
【００１４】
この局所加熱方法としては、特に、赤外線の照射により媒体を相転移温度以上に加熱し、この照射を止めることにより媒体を相転移温度以下に冷却することが好ましい。赤外線照射装置は公知のものを用いることできるが、赤外レーザーを用いることがよい。レーザーは対象物にそのまま照射してもよいし、レンズ等を用いて対象物に集光するように照射してもよい。赤外レーザーとしては、ＹＡＧレーザー（Ｎｄ−ＹＡＧレーザー）、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザー、ＣＯ２レーザー、ルビーレーザーなどいかなるものを用いてもよいが、ＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーを用いるのが簡便である。
また、加熱方法として、注入ポートから湯を注いでもよい。
【００１５】
また、本発明は、温度によりゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体及び支持体を保持する空間、該支持体全体を該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該支持体を局部的に該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、該空間に該媒体を注入する流路、該空間に洗浄用液体を注入する流路、該空間から洗浄用液体を排出する流路、及び該空間から該媒体を排出する流路から成る、微小物体の回収装置である。これらの流路はそれぞれの他の流路を兼ねてもよい。
【００１６】
この装置は、適宜、更に、加熱手段として前記空間を照射する赤外線照射装置、好ましくは赤外レーザー、より好ましくはＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザーを備えてもよく、更に赤外線照射装置の赤外線を前記空間に集光するレンズを備えてもよい。またこの装置は、更に、前記空間を観察できる顕微鏡を備えてもよい。この装置は、更に、ＣＣＤカメラなどを用いた形状識別装置や蛍光反応を自動的に感知する装置などを備え、識別作業を自動化したものであってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
従来のセルソーターはシリアルな流れをおこして分離を行っているが、本発明によれば、２次元的に試料を広げて特性を比較し、ランダムに分散した中から目標物を選択することができる。観察領域を広げることで、１回の選別で1万個〜４万個の微小物体を比較して選別することができるため、分離速度の高速化が可能となる。また、選択した目標物をマイクロチップの内部あるいはマイクロマニピュレータに取り付け、吸引したピペットチップの内部に保持しておくことが可能となるため、必要なときに簡単に高速に取り出すことができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１８】
本実施例では、目標物をゲルで固定して、ピペットで回収する。その様子を図４に示す。
イースト菌（サイズ：約６μｍ）０．０１ｇをメチルセルロース（信越化学工業社製、メトローズＳＭ−４０００）の２％水溶液８ｍｌに混合したものをスピンコートにより基板（表面に電極（ＩＴＯ）を成膜したガラス）上に平面状に広げる。
【００１９】
このように透明な基板を用いることで、倒立顕微鏡で目標物を観察できる。この基板を倒立型の光学顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７０）により観察して目標物を選択する。特に底面付近に存在しているものの中から目標とするものを選択して、その目標物付近の基板を、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザー（Spectra-Physics社製、J20-IR-2E、波長：１０６４ｎｍ）を対物レンズ（オリンパス社製、UPlanApo 100x/1.35）で集光して照射した。この照射により、この基板の周辺が局所的にレーザーで加熱され、メチルセルロースが目標物とともにゲル化するため、この目標物は基板上に固定される。この際、レーザー照射により生成したゲルは一定時間ゲルを保つため、複数の目標物を固定した。
目標物をゲルとともに基板底面に固定したあとに、それ以外の不要物を水で洗浄し除去した。十分に除去した後に目標物の加熱をとめて、ゾル化することで固定を解除し、マイクロマニピュレータに取り付けた回収用のピペットを用いて目標物を回収した。
【実施例２】
【００２０】
本実施例で用いたマイクロチップの概略図を図５と図６に示す。
これらのマイクロチップは交差する２つの流路を備えている。これら２つの流路は微細加工により型をつくり、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）により型どりして微小流体チップを製作した。図５のものは２つの流路が十文字型に交差しており、図６のものは２つの流路がＴ型に交差しており、一つの排出ポートがサンプルと洗浄液の排出を兼ねている。
一方の流路は分離したい目標物を含むゾル／ゲル相転移物質を投入し、その後固定した目標物以外の不要物を洗浄して除去するための水の流路であり、もう一方の流路は固定した目標物を回収するための流路である。
【００２１】
２つの流路の交差点（観察領域）を倒立型の光学顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７０）により観察し、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザー（Spectra-Physics社製、J20-IR-2E、波長：１０６４ｎｍ）を対物レンズ（オリンパス社製、UPlanApo 100x/1.35）で集光して照射することが出来るようになっている。この観察領域の底には透明電極（松浪硝子工業（株）社製、ＩＴＯ付き薄板ガラス）を成膜し、パターニングしてある。更に、この透明電極の表面を酸化シリコンでコートした。
このマイクロチップをこの光学顕微鏡のステージの上にセットした。このステージは可動であり、観察領域を移動させながら、顕微鏡による観察とレーザー照射が出来る。
【００２２】
このマイクロチップの投入ポートから、イースト菌（サイズ：約６μｍ）０．０１ｇをメチルセルロース（信越化学工業社製、商品名：メトローズＳＭ）の２％水溶液８ｍｌに混合したものを投入する。このとき、抽出ポートのバルブは閉めておく。
その後、透明電極を通電して暖め、透明電極の表面上をゲル化し、表面付近に存在する試料や不純物を透明電極上に一旦固定する。その後、洗浄水注入ポートより水を注入して、固定されていないメチルセルロース等を除去する。
【００２３】
その後、冷却した透明電極を、熱ゲル化開始温度付近まで熱ゲル化開始温度を超えない程度まで通電して暖め、２本の微小流路の交差点付近を倒立顕微鏡で観察し、目標物を選択する。目標物を選択したら目標物（上記試料）付近の透明電極にレーザーを集光して照射する。集光した付近の透明電極は加熱されて、その付近のメチルセルロースが目標物を取り込んだ状態でゲル化する。その様子を図７に示す。その後、洗浄水注入ポートから洗浄水を流して固定されていないメチルセルロース等の不要物を除去し、排出ポートから捨てる。
【００２４】
次に、抽出ポートのバルブを開けて、回収用の流れを起こし、透明電極の通電を止めて加熱をとめ、抽出ポートから目標物を回収する。
以後、再び抽出ポートのバルブを閉めて、投入ポートから試料を含んだ溶液を投入し、同様の手順を連続的に繰り返すことで、目標物を必要数回収した。
図５のものに比べて図６のものの方が洗浄液や回収液の滞留が少ないため、回収物の純度が高かった。
【実施例３】
【００２５】
観察領域の上部と下部に透明電極（ＩＴＯ）を設けた他は、実施例１と同様のマイクロチップを用いた。
このマイクロチップに実施例１と同様の試料とメチルセルロースの混合物を投入した。
両方の透明電極を通電して暖め、試料や不純物を全て一旦固定する。その後、実施例１と同様の手順で目標物付近にレーザーを照射する。その様子を図８に示す。その後、透明電極の通電を止め、洗浄水注入ポートより水を注入して、不要物を除去する。その後、残った目標物を回収した。
この方法によれば、下部と上部の電極の局所加熱により固定を行うため、底面付近にない試料であっても環境中に固定できるメリットがある。
【実施例４】
【００２６】
本実施例では、加熱による目標物の固定方法として電極への通電過熱とレーザー照射による局所加熱を組み合わせた。そのマイクロチップの概略を図９に示す。
このマイクロチップを顕微鏡のステージ上に設置する。顕微鏡の観察倍率に応じて観察領域を変えることができ、ステージを移動することで、広範囲の観察が可能となる。電極の数は複数用意することで、大量の試料を処理することが可能となり作業効率が向上できる。電極への通電過熱による固定では、数ミクロン程度の目標物を一つだけ固定するためには電極の数を増やす必要がある。このため、数千から数万の微小物試料から目標物を一つだけ取り出すには多数の電極が必要になり、システムが複雑になる。そこで、一度に数千から数万の微小物試料を一度に固定できる電極を複数用意する。本実施例では電極Ａ〜Ｄまで４つの独立した電極を用意した。
【００２７】
実施例１の試料を用い、実施例１と同様に、試料導入時や洗浄時や回収時に適宜バルブの制御を行った。
まず、微小物試料を投入後、全ての電極に通電加熱して、微小物試料を固定した。必要に応じて、洗浄水を流して固定されていない試料は捨てた。次に、電極Ａの通電加熱をやめて、電極Ａ上の微小物試料を評価して目標物を決め、レーザー照射による局所加熱により目標物を固定した。固定後は洗浄水を流して、電極Ａ付近の目標物以外の資料を捨てた。その後、電極Ａを通電加熱して先ほど選択した目標物を固定し、レーザー照射をやめた。次に電極Ｂ上の微小物試料を評価して先ほどと同じプロセスを繰りかえした。電極Ｃ、Ｄについても同様の手順を繰り返して、少なくとも４個の目標物を固定した。最後に洗浄後に欲しい目標物がのっている電極だけ通電加熱をやめ、回収用の流れによってその目標物だけを抽出した。
なお、ここでは電極が４つの例を示したが、電極の数を増やせば、大量の試料を高速に処理することが可能となる。顕微鏡のステージを自動化すれば、分離作業を自動化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】メチルセルロース（メトローズＳＭ）の温度に対する粘度の変化を示すグラフである。ヒステリシス特性を示す。
【図２】対象物の周辺のみを局所加熱して対象物を固定する方法を示す。
【図３】本発明の方法（熱ゲル化）により、支持体近傍の微小物体だけを一時固定して観察する方法を示す。
【図４】目標物をゲルで固定して、ピペットで回収する様子を示す。
【図５】マイクロチップの概略図である。上図はマイクロチップを上から見た図であり、下図はその断面である。
【図６】別のマイクロチップの概略図である。マイクロチップを上から見た図である。
【図７】実施例２において、透明電極にレーザーを集光し（左図）、メチルセルロースが目標物を取り込んだ状態でゲル化した様子（右図）を示す。
【図８】実施例３において、透明電極にレーザーを集光し（左図）、メチルセルロースが目標物を取り込んだ状態でゲル化した様子（右図）を示す。
【図９】マイクロチップの概略図である。Ａ〜Ｄは加熱可能な電極を示す。縦と横の流路は図７のものと同様である。
【国際調査報告】
2003095088.tif 000012
2003095088.tif 000013
2003095088.tif 000014