(57)【要約】本発明は、ＲＢ及びＭｄｍ２を含む、ＲＢのポリユビキチン化を測定するための組成物及び該組成物を用いるＲＢのユビキチン化阻害剤をスクリーニングする方法に関する。さらに、ドミナントネガティブな作用を有する変異型Ｍｄｍ２を含むＲＢのポリユビキン化阻害剤に関する。
2003102576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＢ及びＭｄｍ２を含む、ＲＢのポリユビキチン化を測定するための組成物。
【請求項２】
下記工程：
試験化合物を請求の範囲第１項の組成物と接触させる工程、
試験化合物が、ＲＢのポリユビキチン化を阻害するか否かを測定する工程
を含むＲＢのユビキチン化阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項３】
試験化合物を請求の範囲第１項の組成物と接触させる工程を細胞中で行うことを特徴とする、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
Ｍｄｍ２変異体を含有する、ＲＢポリユビキチン化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＲＢ（網膜芽細胞腫タンパク質）及びＭｄｍ２（ｍｕｒｉｎｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２タンパク質）を含む、ＲＢのポリユビキチン化を測定するための組成物及び該組成物を用いるＲＢのユビキチン化阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
Ｍｄｍ２は本特許発明者の安田等が癌抑制遺伝子産物であるｐ５３のポリユビキチン化を触媒するユビキチンリガーゼであることを発見した（Ｒ．Ｈｏｎｄａ，Ｈ．Ｔａｎａｋａ，Ｈ．Ｙａｓｕｄａ：Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＤＭ２  ｉｓ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  Ｅ３  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐ５３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２０，２５−２７，１９９７）。ｐ５３は非常に不安定なタンパク質で、細胞がＤＮＡ損傷等の影響を受けた時にｐ５３のタンパク質レベルが上昇し、その結果、細胞をＧ１期に止め、ＤＮＡ複製を行うＳ期への侵入を阻止し、この間にＤＮＡの修復を行わせるか、あるいは修復が不可能と判断された場合には細胞をアポトーシスに導き、癌化した細胞の出現を未然に防ぐと考えられる。
ＲＢは９２８アミノ酸残基（分子量：約１１０ｋＤ）からなり、主に転写因子Ｅ２Ｆと結合してその活性を抑え、細胞周期をＧ１期に停止することにより細胞増殖を抑制する。また、サイクリン依存性キナーゼ（サイクリンＤ／サイクリン依存キナーゼ４）の作用によりＲＢがリン酸化されることにより、ＲＢはＥ２Ｆから解離し、サイクリンＥ、ジヒドロフォレートリダクターゼ遺伝子等のＧ１→Ｓ期の進行に必要な遺伝子群を活性化する。その結果、細胞周期が進行し、細胞増殖が再開される（図４Ｃ）。一方、ＲＢは、癌抑制遺伝子としても知られており、ＲＢ遺伝子の変異（活性の欠失）は網膜芽細胞腫、肺小細胞癌、乳癌、膀胱癌等においてしばしば検出される。これは、ＲＢによる細胞増殖抑制活性の消失がその一因となっている。
ｐ５３遺伝子及びＲＢ遺伝子の変異による同時不活化が、多くの癌で見出されている。その典型例として、ハイリスク型であるヒトパピローマウイルスの１６型及び１８型によるヒト子宮頸癌が、挙げられる。このウイルスは、癌化に必要なＥ６及びＥ７遺伝子を有し、Ｅ６タンパク質は、Ｅ６ＡＰ（Ｅ６−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と結合し、ｐ５３をポリユビキチン化するＥ３酵素として作用する。ポリユビキチン化されたｐ５３は、プロテアソームにより急速な分解を受ける。Ｅ７は、ＲＢをプロテアソームに動員して、ＲＢの分解を促進する。このように、２種類の癌抑制遺伝子産物であるｐ５３とＲＢの分解が、ヒト子宮頸癌の発症の重要な原因となっている。
従来、ＲＢをターゲットにしたドラッグディスカバリーは、サイクリン依存性キナーゼの特異的阻害剤の探索により行われてきた。ＲＢのリン酸化を阻害すると、ＲＢがＥ２Ｆと結合し、その転写活性を抑制する。その結果、その阻害剤は、Ｇ１期からＳ期への細胞周期の進行を阻止することができる。しかし、実際には、サイクリン依存性キナーゼだけに特異的に作用し、他のタイプのキナーゼには作用しない薬剤を見出すことは非常に困難であり、ＲＢリン酸化の阻害剤は、その特異性に難点があった。
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＲＢがポリユビキチン化されること、さらに、Ｍｄｍ２がＲＢのポリユビキチン化を触媒することを見出し、本発明を完成させた。
発明の開示
本発明は、癌化学療法の分野において、Ｍｄｍ２によるｐ５３とＲＢのポリユビキチン化の阻害剤を発見することができるという新たな知見をもたらす。また、Ｍｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化阻害剤、及び、Ｍｄｍ２によるｐ５３とＲＢのポリユビキチン化の両者の阻害剤は、癌細胞の増殖を阻害し、アポトーシスに導くことができ、さらに、Ｍｄｍ２は、基質特異性が高いことから、特異性の高い阻害剤を得ることができる。
また、本発明は、ＲＢ及びＭｄｍ２を含むＲＢのポリユビキチン化を測定するための組成物及び該組成物を用いるＲＢのポリユビキチン化阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明の組成物及びスクリーニング方法を用いることによって、ＲＢポリユビキチン化の特異的阻害剤を探索することができる。
また、本発明にしたがって得られた阻害剤は、Ｍｄｍ２によるｐ５３のポリユビキチン化も阻害する可能性がある。ＲＢ及びｐ５３の両者のポリユビキチン化を阻害し、そしてＩＣ５０が著しく低い阻害剤は、優れた制癌剤であると考えられる。
さらに、本発明で開示したインビボのアッセイ系を用いることによってスクリーニングされた阻害剤を評価することができ、新規制癌剤を開発することができる。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＭｄｍ２及びＲＢは、大腸菌等の原核微生物の系、酵母の系、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞あるいは蚕の系、動物細胞を用いた系において組換型タンパク質として生産させ、その抽出液を使用することができる。さらに、抽出液から部分精製を行い調製したタンパク質がより好ましい。この場合に、予め遺伝子に、ヘキサヒスチジン又はＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）遺伝子を組み込み、それらのペプチド又はタンパク質との融合型として産生したタンパク質を用いることもできる。この手法をタグを付けるというが、これら以外にＸｐｒｅｓｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ等種々のタグを使用することができる。
Ｍｄｍ２及びＲＢ遺伝子は、ヒト由来のものが好ましい。ヒト以外にもマウス等の動物由来の遺伝子、酵母由来の遺伝子、植物由来の遺伝子等を使用することができる。
ポリユビキチン化ＲＢを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット法を用いて検出することができる。ポリユビキチン化ＲＢを検出するための抗体としてビオチン化ユビキチンを用いた場合にはアビジン−西洋ワサビパーオキシダーゼを、ＨＡタグユビキチンを用いた場合には抗ＨＡ抗体を、Ｘｐｒｅｓｓタグの結合したユビキチンあるいはＲＢを用いた場合には抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いることができる。特異的に結合した抗体を検出するために、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＡＰ発色キット（ＢｉｏＲａｄ社）、ＨＲＰ発色キット（ＢｉｏＲａｄ社）等を使用することができる。また、その他の免疫化学的手法も用いることができる。
Ｍｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化の特異的阻害剤をスクリーニングするために、ハイスループットアッセイシステム、例えば、シンチレーション近接アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ：ＳＰＡ）、時間分解蛍光法（Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＲＦ）及び均質時間分解蛍光法（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＨＴＲＦ）を使用することができる（Ｎ．Ｙａｂｕｋｉ，Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．Ｋｕｄｏｈ，Ｓ．Ｎｉｈｉｒａ，Ｃ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＨＴＲＦＴＭ）ｔｏ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｐｏｌｙ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｐ５３，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，２，２７９−２８７，１９９９）。この他にも、蛍光標識又は放射性同位元素標識を用いる系を使用することができる。
ＳＰＡ法では、１２５Ｉ−ユビキチン又は３Ｈ−ユビキチンとビオチン化したＲＢとを反応系に加えてポリユビキチン化反応を行う。ポリユビキチン化ＲＢをストレプトアビジン標識のＳＰＡビーズを用いてトラップすると、１２５Ｉ−又は３Ｈ−標識ポリユビキチンのβ線がＳＰＡビーズに照射されることによりＳＰＡビーズから光が放出される。この光量を３０秒間ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（Ｗａｌｌａｃ社）等の測定装置を用いて測定する。
ＨＴＲＦ法では、ユーロピウムクリプテートで標識したユビキチン及びビオチン化したＲＢを反応系に加え、ポリユビキチン化ＲＢを生成させ、その後、ストレプトアビジン標識ＸＬ６６５を添加する。ビオチン−アビジン結合によりＸＬ６６５とポリユビキチン化ＲＢとが複合体を形成する。この複合体に、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）等の測定装置を使用して３３７ｎｍの光を照射すると、ポリユビキチン鎖中のユーロピウムクリプテートが励起され、励起されたエネルギーがＸＬ６６５に転移する。その結果、ＸＬ６６５は、６６５ｎｍの光を放出する。この光の強度を測定し、この測定値をポリユビキチン化ＲＢの量に換算する。
このようなハイスループットスクリーニングを行うことにより、Ｍｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化の阻害剤を同定することができる。スクリーニングのためには、化合物のライブラリー、合成ペプチドライブラリー、ペプチド発現ファージライブラリー、微生物抽出液・培養濾液、生薬抽出物等のライブラリーを使用することができる。
一方、Ｍｄｍ２とＲＢの三次元構造からコンピューター上で阻害剤をデザインすることもできる。これをインシリコドラッグデザイン（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ）という。デザインされた化合物のＩＣ５０を上記アッセイ法を用いて算出することができる。
本発明は、さらに、インビトロで同定された阻害剤の細胞レベル（インビボ）での評価系も提供する。すなわち、阻害剤の細胞レベル（インビボ）での効果は、タグ付きのＲＢ、Ｍｄｍ２及びユビキチン発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、細胞内で生成したポリユビキチン化ＲＢ及びＲＢのレベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロット法を用いて検出することによって評価することができる（図２Ａ、Ｂ及びＤ）。また、癌細胞のフラット化の誘導を測定することによって、ＲＢポリユビキチン化阻害剤のＲＢの安定化に対する寄与を解析することも可能である（図４Ａ、Ｂ）。
阻害剤の多種類の誘導体を合成し、細胞レベルでの評価を行うことにより、候補化合物を同定することができる。さらに、この化合物を用いて担癌マウスモデルでの評価、マウス及び犬等の動物を用いる薬理試験、急性及び慢性毒性試験等の安全性試験、安定性試験等を経て、臨床試験に進むことができる。
ヒトＭｄｍ２（ＥＭＢＬ：Ｚ１２０２０）は、４９１アミノ酸残基からなり、ユビキチンリガーゼの活性に必要な触媒部位（リングフィンガードメイン）を４３８残基から４７８残基の間に有する。この領域のコンセンサス配列にある６つのシステイン残基のいずれか１つ以上を他のアミノ酸に置換するか又は欠失させるとユビキチンリガーゼの活性が消失する。このＭｄｍ２変異体は、ドミナントネガティブな作用を有し、ＲＢのポリユビキチン化を阻害する（図２Ａレーン１と３、図２Ｂ右図と左図レーン３と５）。したがって、ＲＢと結合する部位を保持し、ユビキチンリガーゼの活性を失ったドミナントネガティブなＭｄｍ２変異体をプラスミド又はウイルスベクターを用いて発現させることにより、野生型Ｍｄｍ２の過剰発現が原因である悪性腫瘍を治療することができる。
実施例
本発明を下記の実施例においてさらに具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
実施例１  Ｍｄｍ２は、ＲＢのポリユビキチン化を促進する。
（１）インビトロでＲＢは、Ｍｄｍ２によってポリユビキチン化される
ユビキチン活性化酵素（Ｅ１酵素）、Ｈｉｓ６−ＵｂｃＨ５（Ｅ２酵素）、野生型ＧＳＴ−Ｍｄｍ２（野生型ＧＳＴ−Ｍｄｍ２を発現しているＳｆ９細胞抽出液）、全配列を有する精製された組換型ＲＢ、ユビキチン、バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、２ｍＭ  ジチオトレイオール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ホスホクレアチニン、５００Ｕ／ｍｌ  ホスホクレアチニンキナーゼ、４ｍＭ  ＬＬｎＬ、２５μｇ／ｍｌ  ユビキチンアルデヒド、１０μｇ／ｍｌ  プロテアーゼ阻害剤）を３０℃で３０分間インキュベーションした。反応終了後、抗ＲＢ抗体（Ｃ−１５）を添加し、遠心分離により抗体がトラップしたＲＢ及びポリユビキチン化したＲＢを回収した（免疫沈降法）。このサンプルにＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で１０分間加熱することにより変性させ、それをＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。次に、ポリアクリルアミドゲルで分画されたタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜に移し、ＥＣＬ（化学発光）キットを用いて、ＲＢ及びポリユビキチン化したＲＢを抗ＲＢ抗体（Ｃ−１５）を用いて検出した（イムノブロッティング法）。
１７３ｋＤａの位置にポリユビキチン化ＲＢのスメアバンドが検出された（図１Ａ、レーン２）。反応液にＲＢを添加しない場合、また、変異型Ｍｄｍ２（Ｍｄｍ２のリングフィンガー領域のコンセンサス配列の６つのシステイン残基のいずれか１つ以上がアラニンに変異しており、ユビキチンリガーゼの活性を失っている）を用いた場合には、ポリユビキチン化されたＲＢは、検出されなかった（図１Ａ、レーン１と３）。したがって、Ｕｂｎ−ＲＢのスメアバンドがポリユビキチン化されたＲＢであることは明らかである。
（２）精製されたタンパク質を用いたＲＢのポリユビキチン化系の再構成。
精製されたＧＳＴ−Ｍｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化を検討した。
ユビキチン活性化酵素、Ｈｉｓ６−ＵｂｃＨ５、精製されたＧＳＴ−Ｍｄｍ２、精製された全配列を有する組換型ＲＢ、ビオチン化ユビキチン及びバッファーＡを３０℃で３０分間インキュベーションした。反応終了後、反応液にＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で１０分間加熱することにより変性させ、抗ＲＢ抗体３Ｈ９（ＭＢＬ社）を用いた免疫沈降法によりＲＢを分離した。得られたサンプルをＳＤＳ−６％ＰＡＧＥに供し、次にＰＶＤＦ膜に移した。これにアビジン−西洋ワサビパーオキシダーゼを加え、ＥＣＬ検出試薬により発色させ、ポリユビキチン化ＲＢ中のビオチン化ユビキチンを検出した。この結果、ビオチン化ユビキチンが１個、２個又は３個以上結合したＲＢが、検出された（図１Ｂ、レーン２）。一方、Ｅ２共役酵素であるＵｂｃＨ５を加えていない場合、さらに、変異型Ｍｄｍ２を用いた場合には、ＲＢのポリユビキチン化は、起こらなかった（図１Ｂレーン１と３）。したがって、図１Ｂのレーン２で検出されたスメアバンドは、ポリユビキチン化されたＲＢと判定される。
（３）Ｍｄｍ２と結合したＲＢがポリユビキチン化される。
Ｍｄｍ２と結合したＲＢがポリユビキチン化されることを証明するために、ポリユビキチン化反応の後にプルダウン法によりＭｄｍ２と結合したＲＢを回収し、ＲＢのポリユビキチン化を解析した。
野生型ＧＳＴ−Ｍｄｍ２を発現しているＳｆ９細胞抽出液を全配列を有する組換型ＲＢ又はＨｉｓ６−ｐ５３と４℃で３０分間インキュベーションした。次に、グルタチオンビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、ＧＳＴＭｄｍ２−ＲＢ複合体をＳｆ９細胞抽出液から回収した（プルダウン法）。
回収されたタンパク質にユビキチン活性化酵素、Ｈｉｓ６−ＵｂｃＨ５、ユビキチン及びバッファーＡを加え、３０℃で３０分間インキュベーションした。次に、上記（１）と同様に免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロットの一連の操作を行った。抗ＲＢ抗体Ｃ１５を用いてＲＢを検出したところ、ＲＢモノマーに加えてポリユビキチン化したＲＢが、検出された（図１Ｃ上図レーン２）。また、抗ｐ５３抗体Ｐａｂ２４０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いてＲＢを検出したところ、ｐ５３モノマーに加えてモノ、ジ、トリユビキチン化されたｐ５３が、検出された（図１Ｃ下図レーン４）。ＲＢを加えない場合（図１Ｃ上図レーン１）及び変異型ＧＳＴ−Ｍｄｍ２を発現しているＳｆ９細胞抽出液を用いた場合（図１Ｃ上図レーン３）では、ポリユビキチン化されたＲＢは、検出されなかった。
（４）細胞内でＭｄｍ２はＲＢと結合している
大腸癌細胞抽出液を用いて、Ｍｄｍ２がＲＢと結合しているかどうか解析した。細胞内では、ポリユビキチン化したＲＢは直ちにプロテアソームにより分解を受ける。この分解を防ぐために、２０μＭ  ＭＧ１１５（プロテアソーム阻害剤）存在下で８時間培養した大腸癌細胞ＨＣＴ１１６からセルライセートを調製し、得られたセルライセート中でＭｄｍ２とＲＢが結合しているかどうかを検討した。
セルライセートに抗Ｍｄｍ２抗体ＳＭＰ１４を加え、免疫沈降させ、Ｍｄｍ２複合体を回収した。次に、得られたＭｄｍ２複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＲＢ抗体を用いるイムノブロット法によりＲＢを検出した。その結果、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６中でＭｄｍ２と結合しているＨＣＴ１１６細胞に由来するＲＢが検出された（図１Ｄレーン４）。また、抗Ｍｄｍ２抗体を用いる免疫沈降では、ＨＣＴ１１６細胞に含まれる約８０ｋＤａのＭｄｍ２が検出された（図１Ｄレーン２）。コントロールであるマウスＩｇＧを用いた免疫沈降では、Ｍｄｍ２及びＲＢは検出されなかった。
以上の結果より、Ｍｄｍ２は、ＲＢと結合し、かつ、ＲＢのポリユビキチン化反応を触媒するＥ３酵素であることが証明された。
実施例２  細胞内のＭｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化は、癌抑制遺伝子産物であるＡＲＦにより阻害を受ける。
（１）細胞内でＲＢは、Ｍｄｍ２によりポリユビキチン化される。
細胞にＲＢ、Ｍｄｍ２及びユビキチン発現プラスミドをコトランスフェクションし、この細胞を、ポリユビキチン化ＲＢの分解を防ぐためにプロテアソーム阻害剤の存在下で培養し、効率良くポリユビキチン化ＲＢを細胞内で生成させ、それを検出した。
ヒトＲＢ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−ｈＲＢ−ＲＩ＊：＊＊Ｘｐｒｅｓｓ−タグ付きＲＢを発現）、Ｍｄｍ２発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−Ｍｄｍ２）及びユビキチン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ユビキチン：ＨＡ＊＊＊−タグ付きユビキチンを発現）を、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６及び腎癌細胞ＨＥＫ２９３にそれぞれコトランスフェクションした。４０時間後、細胞を１０μＭ  ＭＧ１１５存在下で８時間インキュベーションし、その細胞抽出液を抗ＲＢ抗体Ｃ−１５を用いて免疫沈降した。得られたサンプルをＳＤＳサンプルバッファー中で変性させ、ＲＢと結合しているタンパク質を解離させた。この工程は、ＲＢ以外のポリユビキチン化タンパク質を除くために重要である。それを１ｍｌ  ＩＰバッファーで希釈後、抗ＲＢ抗体Ｃ−１５を用いて免疫沈降させた。免疫沈降により精製されたＲＢをＳＤＳ−７％ＰＡＧＥを用いて分画した後、ポリユビキチンを検出するために抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を、ＲＢを検出するために抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてイムノブロット法により検出した。
大腸癌細胞ＨＣＴ１１６細胞を用い、抗ＨＡ抗体によりイムノブロットを行った場合には、ポリユビキチン化されたＲＢと推定されるタンパク質が検出された（図２Ａレーン２）。Ｍｄｍ２発現プラスミドをトランスフェクションしない場合には、ポリユビキチン化ＲＢの検出レベルは、低かった（図２Ａレーン１）。Ｍｄｍ２発現プラスミドをトランスフェクションすることによって、ＲＢのポリユビキチン化が、顕著に増大した。一方、変異型Ｍｄｍ２発現プラスミドをトランスフェクションした場合には、ポリユビキチン化ＲＢは、ほとんど検出されなかった（図２Ａレーン３）。したがって、変異型Ｍｄｍ２は、ドミナントネガティブに作用する、即ち、変異型Ｍｄｍ２は、ＲＢのポリユビキチン化を阻害すると判断される。ユビキチン発現プラスミドをトランスフェクションしない場合には、レーン２で検出されたスメアバンドは、検出されなかった（図２Ａレーン４）。
次に、ヒトＲＢ発現プラスミドのトランスフェクションを効率良く行うために、腎癌細胞ＨＥＫ２９３を用いて同様の実験を行った。その結果、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いてＲＢの検出を行ったところ、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６ではポリユビキチン化ＲＢは検出されなかったが（データは示さず）、腎癌細胞ＨＥＫ２９３では高レベルでポリユビキチン化ＲＢが検出された（図２Ｂ右図レーン４）。したがって、ポリユビキチン化ＲＢの生成量は腎癌細胞においてより高いと判断される。また、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１１５添加により、ポリユビキチン化ＲＢの分解が抑制されたため、その検出量が増大した（図２Ｂ右図と左図レーン１と４）。また、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６を用いた図２Ａの結果を、腎癌細胞ＨＥＫ２９３を用いて再確認した。即ち、Ｍｄｍ２発現プラスミドのトランスフェクションによって、ＲＢのポリユビキチン化が顕著に増加した（図２Ｂ右図と左図レーン３と４）。また、変異型Ｍｄｍ２は、明らかにドミナントネガティブに作用した（図２Ｂ右図と左図レーン３と５）。また、ヒトＲＢ発現プラスミドをトランスフェクションしない場合には、ＲＢとポリユビキチン化ＲＢの両者は、ともに検出されなかった（図２Ｂ右図と左図レーン２）。
さらに、腎癌細胞ＨＥＫ２９３ではアデノウイルスのＥ１Ａタンパク質が発現しているが、Ｅ１ＡはＲＢのポリユビキチン化に全く影響しないと判定される。＊ＲＢ−ＲＩは、ＲＢのＮ末端がトランケートされており、３０１残基〜９２８残基までの全長のＣ末端側配列を有するＲＢを生成する。
＊＊ＸｐｒｅｓｓとはＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を意味し、ＲＢと融合して発現する。
＊＊＊ＨＡタグとはＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕのアミノ酸配列を意味し、ユビキチンと融合して発現する。
（２）Ｍｄｍ２により触媒されるｐ５３のポリユビキチン化は、ＡＲＦによって抑制される。
ＡＲＦは、Ｍｄｍ２によるｐ５３のユビキチン化を阻害する（Ｈｏｎｄａ  Ｒ．，Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ１９ＡＲＦ  ｗｉｔｈ  Ｍｄｍ２  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｄｍ２  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐ５３，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８，２２−２７，１９９９）。ここで、ＡＲＦが、ｐ５３に対するのと同様に、Ｍｄｍ２によるＲＢのユビキチン化を阻害するかどうか検討した。
ヒトｐ５３発現プラスミド、Ｍｄｍ２発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−Ｍｄｍ２）及びユビキチン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ユビキチン：ＨＡタグ付きユビキチンを発現）及びＡＲＦ発現プラスミドを、腎癌細胞ＨＥＫ２９３にコトランスフェクションした。４０時間後、細胞を１０μＭ  ＭＧ１１５と８時間インキュベーションを行い、その細胞抽出液を抗ｐ５３抗体Ｐａｂ１８０１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて免疫沈降させた。得られたサンプルをＳＤＳサンプルバッファー中で変性させ、ｐ５３と結合しているタンパク質を解離させた。そのサンプルをＳＤＳ−７％ＰＡＧＥにアプライし、その後イムノブロット法により、抗ＨＡ抗体を用いてポリユビキチン化されたｐ５３を検出した。
プロテアソーム阻害剤ＭＧ１１５の存在下でポリユビキチン化ｐ５３が検出された（図２Ｃレーン５〜８）。ＡＲＦ発現プラスミドをコトランスフェクションした場合には、ｐ５３のポリユビキチン化が低下しており、ＡＲＦはｐ５３のポリユビキチン化を抑制していると判定される（図２Ｃレーン６と７）。
次に、ｐ５３発現プラスミドをヒトＲＢ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−ｈＲＢ：全配列のＲＢを発現）に換えて、同様の実験を行った。さらに、癌抑制遺伝子ＢＲＣＡ１は、リングフィンガードメインを有しているので、ＲＢのポリユビキチン化を触媒するかどうかの検討を行うために、ＢＲＣＡ１発現プラスミドのトランスフェクションを行った。
前記（２）と同様な方法で実験した。抗ＲＢ抗体Ｃ−１５を用いて免疫沈降を行い、抗ＲＢ抗体及び抗Ｍｄｍ２抗体を用いたイムノブロット法により、検出を行った。その結果、ＡＲＦタンパク質は、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化及びＲＢのポリユビキチン化を明らかに阻害した（図２Ｄレーン３と４、レーン８と９）。一方、ＢＲＣＡ１は、ＲＢのポリユビキチン化を触媒しなかった（図２Ｄレーン１と２、レーン６と７）。
（３）Ｍｄｍ２は、ＲＢファミリーの中でＲＢのみをポリユビキチン化する。
ＲＢファミリーには、ＲＢ、ｐ１０７及びｐ１３０がある。Ｍｄｍ２によるポリユビキチン化は、ＲＢに特異的かどうかを検討した。
実施例２（２）と同様な方法で腎癌細胞ＨＥＫ２９３にＲＢ、ｐ１０７、ｐ１３０のいずれかの発現プラスミドを、Ｍｄｍ２発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−Ｍｄｍ２）及びユビキチン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ユビキチン：ＨＡ−タグ付きユビキチンを発現）と共にコトランスフェクションした。その後、実施例２（２）と同様な操作を行った。抗ＲＢ抗体Ｃ−１５、抗ｐ１０７抗体又は抗ｐ１３０抗体のいずれかを用いて免疫沈降を行った。それをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、各々のＲＢファミリータンパク質に対する抗体及び抗Ｍｄｍ２抗体を用いてイムノブロット法を用いて解析した。その結果、Ｍｄｍ２は、図２Ｄの結果と同様にＲＢをポリユビキチン化したが（図２Ｅ左上）、ＲＢファミリーのｐ１０７及びｐ１３０はポリユビキチン化しなかった（図２Ｅ中央上、右上）。実施例３  Ｍｄｍ２は、細胞内でＲＢのレベルをダウンレギュレーションする。（１）Ｍｄｍ２存在下では、細胞内ＲＢのレベルが低下する。
ｈＲＢ−ＲＩ、Ｍｄｍ２、ＬａｃＺ（大腸菌のβガラクトシダーゼ）を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘに左記ｃＤＮＡを挿入し、Ｘｐｒｅｓｓ配列をタグとした融合タンパク質を発現する）を大腸癌細胞ＨＣＴ１１６にトランスフェクションした。実施例２（２）と同様な操作を行った後、細胞抽出液をＳＤＳ−７％ＰＡＧＥに供し、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体又は抗Ｍｄｍ２抗体ＳＭＰ１４を用いたイムノブロット法でＲＢ、Ｍｄｍ２及びＬａｃＺタンパク質を検出した。
その結果、Ｍｄｍ２の発現により、ＲＢ量が顕著に低下した（図３Ａレーン２と３）。コントロールとして使用したＬａｃＺのレベルに変化はなかった（図３Ａレーン１〜３）。
次に、６μｇのｈＲＢ−ＲＩ発現プラスミドと３〜１２μｇのＭｄｍ２発現プラスミドとを腎癌細胞ＨＥＫ２９３にコトランスフェクションした。ＲＢの発現レベルに対するＭｄｍ２トランスフェクション量の用量依存性を検討したところ、野生型Ｍｄｍ２発現プラスミドのトランスフェクション量の増加に依存してＲＢのレベルは顕著に低下し、用量１２μｇにおいては、ＲＢはほとんど検出されなかった（図３Ｂレーン１〜４）。これに対して、変異型Ｍｄｍ２発現プラスミドをトランスフェクションした場合には、その量に関係なくＲＢは、高レベルで検出された（図３Ｂレーン５〜７）。
（２）Ｍｄｍ２によるＲＢのダウンレギュレーションには、ＲＢのＣ末端領域が必要である。
ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−ｈＲＢ−ＲＩ（ＲＢのＮ末端３００アミノ酸残基を欠失）、ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−ｈＲＢ−ＲＩ−Ｘｍｎ（ＲＢのＣ末端領域を欠失）、ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−ｈＲＢ−Ｘｍｎ−Ｎｏｔ（ＲＢのＣ末端領域を有する）、をｐｃＤＮＡ４−Ｍｄｍ２と共に腎癌細胞ＨＥＫ２９３にコトランスフェクションした。実施例２（２）と同様な操作を行った後、細胞抽出液をＳＤＳ−７％ＰＡＧＥに供し、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いたイムノブロット法でそれぞれのＲＢを検出した。
その結果、ＲＢのＣ末端を含有するＲＢ−ＲＩ及びＲＢ−Ｘｍｎ−Ｎｏｔでは、Ｍｄｍ２存在下でＲＢのレベルが、顕著に低下した（図３Ｃレーン１と２、５と６）。しかし、ＲＢのＣ末端を欠失したＲＢ−ＲＩ−Ｘｍｎでは、Ｍｄｍ２存在下でもＲＢのレベルは、一定であった（図３Ｂレーン３と４）。この結果は、Ｍｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化及びプロテアソームによる分解にＲＢのＣ末領域が関与していることを示す。
（３）パルスチェイス実験において、Ｍｄｍ２は、ＲＢの分解を促進する。
７μｇのＲＢ−ＲＩ発現プラスミド、１４μｇのエンプテイベクター、及び野生型Ｍｄｍ２発現プラスミド又は変異型Ｍｄｍ２発現プラスミドを腎癌細胞ＨＥＫ２９３にコトランスフェクションした。４２時間後、８７．５μＣｉのＴｒａｎｓ３５Ｓ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を用いて細胞を１時間標識した。その後、Ｔｒａｎｓ３５Ｓを除いてパルスチェイスを行った。０分、５分、１０分、１５分、２０分後に細胞をハーベストした。その細胞抽出液を抗ＲＢ抗体Ｃ−１５を用いて免疫沈降させ、次にプロテインＧ−セファロースＣＬ−４Ｂを用いて抗体と結合したＲＢを精製した。その試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる電気泳動を行い、得られたゲルを乾燥し、イメージングプレート（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ社）に適用した。得られた結果をＢＡＳ−１０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ社）を用いて解析し、ＲＢに取り込まれた３５Ｓを定量した。図３Ｄにはイメージングプレート上の結果を、図３Ｅにはパルスチェイス０時間におけるＲＢの３５Ｓ強度を１００％とした相対的比率で表したグラフを示した。その結果、Ｍｄｍ２は、細胞内でＲＢの分解を促進していることが明らかとなった（図３Ｅ、ｖｅｃｔｏｒとｗｔ−Ｍｄｍ２）。さらに、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１１５存在下では、Ｍｄｍ２によるＲＢ分解促進は、完全に抑制された（図３Ｅ  ｖｅｃｔｏｒ、ｗｔ−Ｍｄｍ２、ｗｔ−Ｍｄｍ２＋ＭＧ１１５）。これは、ポリユビキチン化されたＲＢのプロテアソームによる分解がＭＧ１１５で抑制されたことを示す。一方、変異型Ｍｄｍ２をトランスフェクションした場合には、細胞内のＲＢはより安定化すると判断された（図３Ｅ、ｖｅｃｔｏｒとｍｔ−Ｍｄｍ２）。
この点について再確認するために、ヒトグリオブラストーマＴ９８Ｇ細胞（野性型ｐ５３を欠失している）に変異型Ｍｄｍ２発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−ｍｔ−Ｍｄｍ２）とＲＢ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−ｈＲＢ−ＲＩ）をコトランスフェクションし、４８時間後に抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いて変異型Ｍｄｍ２を、抗ＲＢ抗体Ｃ１５を用いてＲＢを免疫染色した。その結果、変異型Ｍｄｍ２は、明らかにＲＢを集積した（図３Ｆ矢印）。したがって、変異型Ｍｄｍ２は、ドミナントネガティブに作用すると結論された。
実施例４  Ｍｄｍ２は細胞のフラット化を抑制する
骨肉腫細胞（ＲＢ遺伝子を欠失している）を用いてＲＢ遺伝子を発現させると、細胞のフラット化が誘導されることが知られている（Ｓ．Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ．Ｙａｍａｄａ，Ｈ．Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｔ．Ｋｏｎｄｏ，Ｈ．Ｏｚａｗａ，Ａ．Ｋａｋｉｔａ，Ｍ．Ｈａｔａｋｅｙａｍａ：Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＲＢ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｐ１６ＩＮＫ４ａ  ｌｏｓｓ  ｏｒ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６，１１３６２−１１３７０，２００１）。そこで、ＲＢにより誘導される細胞のフラット化に対するＭｄｍ２の影響を検討した。
２種類のプラスミドを骨肉腫細胞にコトランスフェクションした。１種類は、テトラサイクリン不在下でＲＢを発現するＳＲＢ−１プラスミドであり、もう１種類は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミド（ＥＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社；図４Ａ、Ｂで「ｖｅｃｔｏｒ」と表示）、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−ｗｔＭｄｍ２プラスミド（同一のｍＲＮＡからＥＧＦＰとｗｔＭｄｍ２を翻訳するシステムを有する；図４Ａ、Ｂで「ｗｔ−Ｍｄｍ２」と表示）、及びｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−ｍｔＭｄｍ２プラスミド（ＥＧＦＰと変異型Ｍｄｍ２を同時発現する；図４Ａ、Ｂで「ｍｔ−Ｍｄｍ２」と表示）のいずれかであった。培地は、１０％ＦＢＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ネオマイシン）、０．３ｍｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン、１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＤＭＥＭを使用した。６穴プレートでのトランスフェクション後、骨肉腫細胞を７〜８日培養した。一定の視野におけるＧＦＰ陽性細胞数を蛍光顕微鏡を用いて計数し（倍率：２００倍）、ＧＦＰ陽性細胞中のフラット化した細胞数を位相差顕微鏡を用いて計数した。テトラサイクリン存在下では、ＲＢは骨肉腫細胞内で発現していないためにフラット型細胞の占める％は、非常に低かった（図４Ｂテトラサイクリン（＋））。しかし、テトラサイクリン不在下では、ＲＢが発現するために、約６４％がフラット型であった（図４Ｂテトラサイクリン（−）／Ｖｅｃｔｏｒ）。また、野性型Ｍｄｍ２の発現下では、フラット型細胞の割合は、約２６％に減少した（図４Ｂテトラサイクリン（−）／ｗｔ−Ｍｄｍ２）。これは、野性型Ｍｄｍ２がＲＢのポリユビキチン化を触媒し、ＲＢのレベルが低下したためである。変異型Ｍｄｍ２は、ＲＢのユビキチン化を触媒しないことから、そのフラット化に対する影響は、ほとんど認められなかった（図４Ｂテトラサイクリン（−）／ｍｔ−Ｍｄｍ２）。
産業上の利用可能性
本発明の組成物は、ＲＢのポリユビキチン化の阻害剤及びそれを含有する医薬品の開発に有用である。
Ｍｄｍ２のリングフィンガー領域のコンセンサス配列であるシステインを他のアミノ酸に変えた変異型Ｍｄｍ２は、ドミナントネガティブな作用を有する。ドミナントネガティブＭｄｍ２を発現するプラスミド及びウイルスベクターは、癌の遺伝子治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、インビトロでのＲＢのポリユビキチン化反応を示す。ＲＢのポリユビキチン化反応後、抗ＲＢ抗体を用いてＲＢを免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）後、抗ＲＢ抗体を用いたイムノブロット法でＲＢ及びそのポリユビキチン化されたタンパク質を検出した（ＩＢ：αＲＢで表示）。ｆｕｌｌ−ＲＢは全配列を有するＲＢを表し、その添加の有無を＋又は−で表した。「Ｍｄｍ２の欄の＋」は、野性型Ｍｄｍ２の添加、「Ｍｄｍ２の欄のｍｔ」は、変異型Ｍｄｍ２の添加を意味する。１１１ｋＤａの位置にＲＢが、そして１７３ｋＤａの位置にポリユビキチン化ＲＢ（Ｕｂｎ−ＲＢ）が、検出された（レーン２）。
図１Ｂは、ＲＢのポリユビキチン化系の再構成を示す。ビオチン化ユビキチン（ビオチン−Ｕｂ）、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン共役酵素ＵｂｃＨ５（Ｅ２）及び全配列を有するＲＢ（ｆｕｌｌ−ＲＢ）の反応系への添加の有無を＋又は−で表示した。「Ｍｄｍ２の欄の＋」は、野性型Ｍｄｍ２の添加、そして「Ｍｄｍ２の欄のｍｔ」は、変異型Ｍｄｍ２の添加を意味する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、アビジン−西洋ワサビパーオキシダーゼを用いてＲＢに結合したビオチン化Ｕｂを検出した（アビジン−ＨＲＰによる検出）。Ｕｂ１−ＲＢはモノユビキチン化ＲＢを、Ｕｂ２−ＲＢは、ジユビキチン化ＲＢを、ＵｂｎＲＢは、ポリユビキチン化ＲＢを意味する。レーン２において、Ｕｂ１−ＲＢ、Ｕｂ２−ＲＢ及びＵｂｎ−ＲＢが検出された。
図１Ｃは、Ｍｄｍ２と結合したＲＢ及びｐ５３がポリユビキチン化されることを示す。反応系にＧＳＴ−Ｍｄｍ２の野性型（＋）又は変異型（ｍｔ）を用いた。全配列を有するＲＢ（ｆｕｌｌ−ＲＢ）及びｐ５３の添加の有無を＋又は−で表示した。グルタチオンビーズを用いるプルダウンによって、ＧＳＴ−Ｍｄｍ２と結合したタンパク質を分離した（ＧＳＴ−プルダウン）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＲＢ抗体（ＩＢ：αＲＢ）又は抗ｐ５３抗体（ＩＢ：αｐ５３）を用いてイムノブロット法で検出を行った。図１Ｃ上図レーン２ではＵｂｎ−ＲＢが、図１Ｃ下図レーン４ではモノユビキチン化ｐ５３（Ｕｂ１−ｐ５３）、ジユビキチン化ｐ５３（Ｕｂ２−ｐ５３）及びトリユビキチン化ｐ５３（Ｕｂ３−ｐ５３）が検出された。
図１Ｄは、ＲＢが細胞内でＭｄｍ２と結合していることを示す。大腸癌細胞抽出液をマウスＩｇＧ（ＩｇＧ）及び抗Ｍｄｍ２抗体（αＭｄｍ）を用いて免疫沈降（ＩＰ）させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗Ｍｄｍ２抗体を用いたイムノブロット（ＩＢ：αＭｄｍ）又は抗ＲＢ抗体を用いたイムノブロット（ＩＢ：αＲＢ）により、Ｍｄｍ２（レーン２）及びＲＢ（レーン４）が検出された。ｅｎｄｏ−Ｍｄｍ２は、内在性Ｍｄｍ２を、ｅｎｄｏ−ＲＢは、内在性ＲＢを意味する。
図２Ａは、大腸癌細胞におけるＭｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化を示す。トランスフェクションに使用したプラスミド名をその発現タンパク質名で表示した。Ｎ末端をトランケートしたＲＢ（ＲＢ−ＲＩ）及びＨＡタグ付きユビキチン（ＨＡ−Ｕｂ）発現プラスミドのトランスフェクションの有無を＋又は−で表示した。野性型Ｍｄｍ２発現プラスミドをトランスフェクトした場合を＋、変異型Ｍｄｍ２発現プラスミドをトランスフェクトした場合を「ｍｔ」、Ｍｄｍ２発現プラスミドをトランスフェクトしない場合を−で表示した。細胞の培養時にプロテアソーム阻害剤を添加した場合を「ＭＧ１１５の欄の＋」と表示した。矢印はＲＢモノマーの位置を示す。最初に細胞抽出液を抗ＲＢ抗体を用いて免疫沈降し（１ｓｔ  ＩＰ：αＲＢ（Ｃ１５））、次に、挟雑物を除くために抗ＲＢ抗体を用いてさらに免疫沈降した（２ｎｄ  ＩＰ：αＲＢ（Ｃ１５））。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＨＡ抗体を用いてＨＡタグ付きポリユビキチン化ＲＢ（Ｕｂｎ−ＲＢ）を検出した（ＩＢ：αＨＡ）。レーン２では、Ｕｂｎ−ＲＢが高レベルで検出された。
図２Ｂは、腎癌細胞におけるＭｄｍ２によるＲＢのポリユビキチン化を示す。右側の図では、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いたイムノブロット法でＲＢの検出を行った（αＸｐｒｅｓｓ）こと、及び比較例としてＭＧ１１５を添加しない群（ＭＧ１１５の欄の−）を設けたことを除き、図２Ａと同様な条件で実験を行った。
図２Ｃは、ＡＲＦタンパク質によるｐ５３のポリユビキチン化の抑制を示す。図２Ａに記載したＲＢ−ＲＩ発現プラスミドの代りにｐ５３発現プラスミドを使用し、さらに、ＡＲＦ発現プラスミドのトランスフェクション（ＡＲＦの欄の＋又は−）を加えた群を設けた。抗ｐ５３抗体を用いて細胞抽出液を免疫沈降した（ＩＰ：αｐ５３）。抗ＨＡ抗体を用いるイムノブロット法によって免疫グロブリンＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ−Ｈ）、モノユビキチン化ｐ５３（Ｕｂ１−ｐ５３）、ジユビキチン化ｐ５３（Ｕｂ２−ｐ５３）及びポリユビキチン化ｐ５３（Ｕｂｎ−ｐ５３）が、検出された。
図２Ｄは、ＡＲＦタンパク質によるＲＢのポリユビキチン化の抑制を示す。図２Ａの実験で行ったＲＢ−ＲＩ（Ｎ末端トランケートＲＢ）発現プラスミドの代りにｆｕｌｌ−ＲＢ（全配列を有するＲＢ）発現プラスミドを用いた。レーン１と６では、ＢＲＣＡ１発現プラスミドをコトランスフェクションした（ＢＲＣＡ１の欄の＋）。レーン４と９では、ＡＲＦ発現プラスミドをコトランスフェクションした（ＡＲＦの欄の＋）。細胞培養を、１０μＭ  ＭＧ１１５添加及び無添加（ＭＧ１１５の溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した：ＤＭＳＯ）の２種類の条件で行った。イムノブロット法では、抗ＲＢ抗体を用いたポリユビキチン化ＲＢの検出（上図、ＩＢ：αＲＢ）、抗Ｍｄｍ２抗体を用いたポリユビキチン化Ｍｄｍ２の検出（中図、ＩＢ：αＭｄｍ２）、及び抗ＡＲＦ抗体を用いたＡＲＦの検出（下図、Ｉｎｐｕｔ：ポリアクリルアミドゲル上の試料中に含まれるＡＲＦ）を行った。
図２Ｅは、Ｍｄｍ２は、ＲＢファミリーの中でＲＢのみをポリユビキチン化することを示す。
左図：細胞抽出液の免疫沈降は抗ＲＢ抗体を用いた（ＩＰ：αＲＢ）。イムノブロットは上図では抗ＲＢ抗体（ＩＢ：αＲＢ）を用いて、下図では抗Ｍｄｍ２抗体（ＩＢ：αＭｄｍ２）を用いた。それぞれポリユビキチン化ＲＢ（左上図）及びポリユビキチン化Ｍｄｍ２（左下図）を検出した。
中央図：細胞抽出液の免疫沈降は抗ｐ１０７抗体を用いた（ＩＰ：αｐ１０７）。イムノブロットでは、上図では抗ｐ１０７抗体（ＩＢ：αｐ１０７）を、下図では抗Ｍｄｍ２抗体（ＩＢ：αＭｄｍ２）を用いた。ポリユビキチン化ｐ１０７は、検出されなかった。
右図：細胞抽出液の免疫沈降は抗ｐ１３０抗体を用いた（ＩＰ：αｐ１３０）。イムノブロットは、上図では抗ｐ１３０抗体（ＩＢ：αｐ１３０）を用いて、下図では抗Ｍｄｍ２抗体（ＩＢ：αＭｄｍ２）を用いて行った。ｐ１３０のポリユビキチン化は検出されなかった。
図３Ａは、Ｍｄｍ２が、細胞内での、ＲＢレベルを低下させることを示す。ＲＢ−ＲＩ、Ｍｄｍ２、ＬａｃＺ発現プラスミドを大腸癌細胞ＨＣＴ１１６にトランスフェクションした。細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いてＲＢ−ＲＩを、抗Ｍｄｍ２抗体を用いて導入したプラスミドよって発現されたＭｄｍ２（ｅｘｏ＊−Ｍｄｍ２）及び細胞内に予め存在するＭｄｍ２（ｅｎｄｏ＊＊−Ｍｄｍ２）を、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いてＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）を検出した。＊外来性の略、＊＊内在性の略
図３Ｂは、Ｍｄｍ２発現プラスミドの量に依存したＲＢのレベルの低下を示す。Ｘｐｒｅｓｓタグ付きＲＢ−ＲＩ発現プラスミド（ＲＢ−ＲＩ）、及びＸｐｒｅｓｓタグ付き野性型（Ｍｄｍ２−ｗｔ）又は変異型Ｍｄｍ２発現プラスミド（Ｍｄｍ２−ｍｔ）を腎癌細胞ＨＥＫ２９３にコトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたＲＢ−ＲＩ発現プラスミド量は６μｇであり、Ｍｄｍ２発現プラスミドは無添加（レーン１）、３μｇ（レーン２と５）、６μｇ（レーン３と６）、１２μｇ（レーン４と７）であった。Ｍｄｍ２及びＲＢ−ＲＩタンパク質を抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いたイムノブロットにより検出した。レーン１〜４で、野性型Ｍｄｍ２発現プラスミドの量に依存したＲＢ−ＲＩタンパク質の低下が認められる。
図３Ｃは、Ｍｄｍ２によるＲＢレベルの低下にＲＢのＣ末領域が必要であることを示す。ＲＢ−ＲＩはＲＢのＮ末端の３００アミノ酸残基を欠失、ＲＢ−ＲＩ−ＸｍｎはＲＢのＣ末端領域を欠失、ＲＢ−Ｘｍｎ−ＮｏｔはＲＢのＣ末端領域を有している。各々のＲＢ発現プラスミドをＲＩ、ＲＩ−Ｘｍｎ、Ｘｍｎ−Ｎｏｔと表示した。腎癌細胞ＨＥＫ２９３をトランスフェクションに使用した。Ｍｄｍ２発現プラスミドのトランスフェクションの有無を＋又は−で表示した。抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いたイムノブロットによって異なるサイズのトランケートＲＢを検出した。Ｃ末領域を有するＲＢレベルは、Ｍｄｍ２存在下で減少した（レーン２、６）。
図３Ｄは、パルスチェイス法におけるＲＢの分解を示す。腎癌細胞ＨＥＫ２９３をエンプティベクター（ｖｅｃｔｏｒ）、野性型Ｍｄｍ２発現プラスミド（ｗｔ−Ｍｄｍ２）及び変異型Ｍｄｍ２発現プラスミド（ｍｔ−Ｍｄｍ２）を用いてコトランスフェクトした。ｗｔ−Ｍｄｍ２をトランスフェクション後にＭＧ１１５存在下で培養した細胞をｗｔ−Ｍｄｍ２＋ＭＧ１１５と表記した。細胞をＴｒａｎｓ３５Ｓで標識した後、細胞を洗浄しＴｒａｎｓ３５Ｓを除去し、細胞の培養を継続した。０、５、１０、２０時間後のＲＢに取り込まれたＴｒａｎｓ３５ＳをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＢＡＳ−１０００を用いて解析した（パルスチェイス法）。
図３Ｅは、パルスチェイス法におけるＲＢ分解のグラフを示す。図３Ｄの結果を数値化し、グラフで表示した。０時間のＲＢレベルを１００％とした相対的％で示した（ＲＢタンパク質（％））。
図３Ｆは、変異型Ｍｄｍ２によるＲＢレベルの上昇を示す。ヒトグリオブラストーマＴ９８Ｇ細胞に変異型Ｍｄｍ２発現プラスミド及びＲＢ発現プラスミドをコトランスフェクションし、４８時間後に抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いて変異型Ｍｄｍ２（αＸｐｒｅｓｓ）を、抗ＲＢ抗体Ｃ１５を用いてＲＢ（αＲＢ（Ｃ１５））を免疫染色した。矢印は変異型Ｍｄｍ２の検出された位置でのＲＢの蛍光を示している。
図４Ａは、Ｍｄｍ２が細胞のフラット化を抑制することを示す。ＧＦＰを発現（矢印で表示）している骨肉腫細胞におけるフラット化した細胞の割合を計測した。エンプティベクター（ｖｅｃｔｏｒ）、ｗｔ−Ｍｄｍ２発現ベクター（ｗｔ−Ｍｄｍ２）、ｍｔ−Ｍｄｍ２発現ベクター（ｍｔ−Ｍｄｍ２）の各々を、ＲＢ発現プラスミド（テトラサイクリンにより制御される）とコトランスフェクションした。テトラサイクリンの有無を＋又は−で示した。位相差顕微鏡（ａ、ｂ、ｅ、ｆ、ｉ、ｊ）及び蛍光顕微鏡（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ）を用いてフラット化した細胞の割合を計測した。
図４Ｂは、図４Ａで得られた結果を棒グラフで表示した。ＧＦＰ発現細胞中のフラット化した細胞数の割合を％で表示した。＊はｐ＜０．００１である。
図４Ｃは、Ｍｄｍ２がｐ５３経路及びＲＢ経路に関与するモデルを示す。ｐ５３経路：ＤＮＡ損傷、ストレス条件下でＡＴＭキナーゼ等が誘導され、ｐ５３がリン酸化を受ける。その結果、細胞周期の停止又はアポトーシスが誘導される。ＲＢ経路：ＲＢはサイクリンＤ／Ｃｄｋ４によりリン酸化される。その結果、ＲＢは、転写因子Ｅ２Ｆから遊離し、細胞周期が、Ｇ１期からＳ期に進行する。染色体のＩＮＫ４／ＡＲＦ領域からｐ１６ＩＮＫ４ａとＡＲＦタンパク質が、転写、翻訳される。ｐ１６ＩＮＫ４ａは、サイクリンＤ／Ｃｄｋ４と結合し、キナーゼ活性を阻害する。その結果、ＲＢがＥ２Ｆと結合し、細胞周期をＧ１期で停止させる。
Ｍｄｍ２は、ｐ５３及びＲＢのポリユビキチン化を媒介し、それらのタンパク質はプロテアソームにより分解される。この経路が促進されると癌抑制遺伝子産物のｐ５３及びＲＢの両者のレベルが低下し、癌化の一因となる。ＡＲＦタンパク質は、Ｍｄｍ２によるｐ５３及びＲＢのポリユビキチン化を抑制する。このように、ｐ１６ＩＮＫ４ａとＡＲＦタンパク質は、細胞周期をＧ１期でアレストする作用を有し、癌抑制因子として作用する。
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【国際調査報告】
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