(57)【要約】ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物菌体の懸濁液の物理的破砕処理を、前記懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加しながら行った後、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を分離することからなる、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物菌体の懸濁液の物理的破砕処理を、前記懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加しながら行った後、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を分離することを特徴とする、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項２】
アルカリの添加は、懸濁液のｐＨをコントロールしながら行う請求の範囲第１項記載の製造方法。
【請求項３】
懸濁液のｐＨを９〜１３．５の間にコントロールする請求の範囲第２項記載の製造方法。
【請求項４】
懸濁液の物理的破砕処理は、前記懸濁液の攪拌下で行う請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
懸濁液の物理的破砕処理は、２０℃以上４０℃未満の温度で行う請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）と他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体である請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との２成分共重合体、または、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との３成分共重合体である請求の範囲第６項記載の製造方法。
【請求項８】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、アエロモナス・キャビエである請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子を導入された菌株である請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を、微生物菌体から分離精製する方法に関するものである。
背景技術
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後ＰＨＡと称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、プラスチック廃棄物は焼却、埋め立てなどにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋立地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋立、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならないＰＨＡの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体としての利用が可能と考えられる。
微生物が生成するＰＨＡは、通常顆粒体を形成してその微生物の菌体内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、ＰＨＡが可溶である有機溶媒を用いて菌体からＰＨＡを抽出する方法と、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を破砕もしくは可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法に分けられる。
有機溶媒による抽出を利用したＰＨＡの分離精製方法では、ＰＨＡが可溶である溶媒として、例えば１，２−ジクロロエタンやクロロホルムといったハロゲン含有炭化水素を用いて抽出する方法がある（特開昭５５−１１８３９４号、特開昭５７−６５１９３号）。しかし、これらハロゲン含有炭化水素は疎水性溶媒であるため、抽出前に、菌体を予め乾燥する等の、溶媒が菌体中のＰＨＡと接触できるようにするための工程が必要となる。また、これらの方法においてはＰＨＡを実用に値する濃度（たとえば５％）以上に溶解すると抽出液は極めて粘重となり、溶解しなかった菌体残査とＰＨＡを含む溶媒層との分離が非常に困難である。更に、溶媒層からＰＨＡを高い回収率で再沈殿させるためには溶媒層の４〜５倍容のメタノールやヘキサン等のＰＨＡ不溶性溶媒が必要であるなど、再沈殿工程には大容量の容器が必要とされる。さらには、溶媒の使用量が膨大なため、溶媒の回収コストと損失溶媒のコストがかさむことになる。加えて近年、環境保護の観点から有機ハロゲン化合物の使用は制限される方向にあり、この方法での工業化は難しいのが現状である。
そこで、ＰＨＡが可溶でありかつ水と混ざり合う溶媒、例えばジオキサン（特開昭６３−１９８９９１号）またはプロパンジオール（特開平０２−６９１８７号）またはテトラヒドロフラン（特開平０７−７９７８８号）の様な親水性溶媒を用いた抽出方法も提案されている。これらの方法は乾燥菌体や湿菌体からでもＰＨＡを抽出することが可能な点と、菌体残査と分離した溶媒層を冷却するだけでＰＨＡの沈殿物が得られる点では好ましいと考えられる。しかし、これらの方法でもＰＨＡの溶解した溶媒層の粘重性の問題は解決されておらず、加えて抽出効率を上げるためには加熱が必要であり、水存在下で加熱するためにＰＨＡの加水分解による低分子化が避けられないことや、回収率が劣ることなどの欠点を有している。
一方、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法として、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９，１９８−２０９頁（１９５８）には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、プロセスとしては簡単ではあるが、大量の次亜塩素酸ナトリウムを使用する必要があるためにコストが高くなる。また、ＰＨＡの著しい低分子化が引き起こされることや得られたＰＨＡ内に無視できない量の塩素が残存することから実用には適さないと考えられる。特公平０４−６１６３８号には、ＰＨＡを含有する微生物菌体懸濁液を１００℃以上で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理とを組み合わせて、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、熱処理によってタンパク質が変性・不溶化するために、次のタンパク質分解酵素処理工程での負荷が増大すること、更には、処理工程が多く複雑であること等の欠点を有している。
また、ＰＨＡ含有微生物菌体を破砕する方法として、界面活性剤で処理したのち、菌体から放出された核酸を過酸化水素処理して分解し、ＰＨＡを分離する方法が提案されている（特表平０８−５０２４１５号）が、界面活性剤を含む廃液は発泡が激しいことに加えて高いＢＯＤ負荷値を持つ。このような観点から界面活性剤の使用は工業的規模において望ましくない。
また、ＰＨＡ含有微生物菌体を高圧ホモジナイザーで破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平０７−１７７８９４号、特開平０７−３１４８８号）。しかし、これらの方法は微生物菌体懸濁液を少なくとも３回、場合によっては加温して１０回高圧処理をしているが、なおかつ得られるＰＨＡの純度は６５〜８９％程度と低いという欠点がある。また、ＰＨＡ含有微生物懸濁液にアルカリを添加して加熱し、細胞を破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平０７−３１４８７）。しかし、得られるポリマーの純度は７５．１〜８０．５％と低く、収率向上のためにアルカリ添加量を増やすとポリマーの低分子化が起こるなどの欠点があった。さらに、アルカリ添加後に物理的破砕を行う方法もいくつか提案されているが（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、２、９５−１０５項、１９９１、特開平０７−３１４８９）、アルカリ処理だけでは菌体構成成分は少量しか菌体外に出ておらず、続く高圧破砕処理後でも菌体構成成分がＰＨＡ画分に残存しており効率的でないこと、従って微生物菌体懸濁液を少なくとも５回高圧処理しなければ純度の高いＰＨＡを得ることは出来ず、なおかつ得られるＰＨＡの純度は７７〜８５％程度と低いという欠点がある。加えて、アルカリを添加する方法においては、一般に、微生物菌体から流出する菌体成分、特に核酸が、菌体懸濁液の粘度を上昇させ、その後の処理が困難になるという問題があった。
また、ＰＨＡ含有微生物懸濁液をｐＨ２未満の酸性に調整し５０度以上でＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平１１−２６６８９１）。しかし、この方法はｐＨ２未満のような強酸性で処理を行うために工業的規模では望ましくないこと、純度向上のためには酸処理の後にアルカリ性に調整する必要があり大量の塩が発生すること、また、得られるＰＨＡの分子量が２４７万から１００万程度にまで低下するなどの欠点を有している。
発明の要約
本発明の目的は、従来技術における上記の課題を解決し、ＰＨＡ含有微生物菌体からＰＨＡ以外の菌体構成成分を効率よく除き、少ない工程数で深刻な分子量の低下を起こすことなく高純度のＰＨＡを高収率で得ることのできるＰＨＡの分離精製方法を提供することにある。
本発明者らは、ＰＨＡの工業的に有利な生産方法について鋭意検討した。その結果、（ｉ）ＰＨＡを含有する微生物菌体の懸濁液の物理的破砕処理を、前記懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加しながら行うことによって、微生物菌体から漏洩したＰＨＡ以外の菌体構成成分による懸濁液の粘度の向上を防げること、（ｉｉ）菌体懸濁液の粘度向上を防ぐことによって懸濁液のｐＨのコントロールが可能となり、（ｉｉｉ）さらに、懸濁液のｐＨのコントロールにより、低いアルカリ濃度で処理を行うことが可能となるため、著しい分子量低下を起こすことなく、高純度のＰＨＡが分離できることを見いだし、本発明に到達した。
すなわち本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物菌体の懸濁液の物理的破砕処理を、前記懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加しながら行った後、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を分離することからなる、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
その好ましい実施態様としては、上記アルカリの添加は、上記懸濁液のｐＨをコントロールしながら行う上記製造方法に関し、より好ましくは、上記懸濁液のｐＨを９〜１３．５の間にコントロールする上記製造方法に関する。また、上記懸濁液の物理的破砕処理は、上記懸濁液の攪拌下で行うことが好ましい。さらに、上記懸濁液の物理的破砕処理は、２０℃以上４０℃未満の温度で行うことが好ましい。
別の好ましい実施態様としては、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）と他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体である上記製造方法、より好ましくは、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との２成分共重合体、または、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との３成分共重合体である上記製造方法に関する。
また別の好ましい実施態様としては、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、アエロモナス・キャビエ、あるいは、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子を導入された菌株である上記製造方法に関する。
以下に本発明を詳述する。
発明の詳細な開示
本発明に用いられる微生物は、細胞内にＰＨＡを蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えば、Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．ｌａｔｕｓ等のアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の菌等が挙げられる。特に、Ａ．ｃａｖｉａｅ等の菌株、更には、ＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＣ３２（ブダペスト条約に基づく寄託、国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）、移管日１９９７年８月７日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８、１９９６年８月１２日に寄託された微工研菌寄第Ｐ−１５７８６号より移管）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７））がより好ましい。本発明においては、これら微生物を適切な条件下で培養して菌体内にＰＨＡを蓄積させた微生物菌体が用いられる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平０５−９３０４９等に挙げられる公知の方法が用いられる。
本発明におけるＰＨＡとは、ヒドロキシアルカン酸の重合体の総称であり、ヒドロキシアルカン酸成分としては特に限定されないが、具体的には、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）のホモポリマーや、３ＨＢと他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体、またはＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）を含む３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体などが挙げられる。なかでもモノマー成分として３ＨＨを含む重合体、例えば、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，４８２２−４８２８（１９９５））または、３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（特許第２７７７５７号，特開平０８−２８９７９７号）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体を構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、３ＨＨユニットを１〜９９モル％といった組成比のものが好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体を構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５モル％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６モル％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０モル％といった範囲のものが好適である。
処理される微生物菌体内のＰＨＡ含有率は、高い方が好ましいのは当然であり、工業レベルでの適用においては乾燥菌体中に２０重量％以上のＰＨＡが含有されているのが好ましく、アルカリ処理、物理的破砕処理、分離操作、分離ポリマーの純度等を考慮すると５０重量％以上のＰＨＡが含有されているのが特に好ましい。
本発明における微生物菌体の懸濁液とは、培養終了後の培養懸濁液そのまま、または、培養液から遠心分離等で分離した菌体を水に懸濁させた水性の懸濁液である。ここでの菌体の懸濁濃度は、乾燥菌体換算で５００ｇ／ｌ以下が好ましく、さらに好ましくは３００ｇ／ｌ以下である。
本発明で使用するアルカリとしては、ｐＨを所定の範囲に調整できるものであれば特に限定されるものではないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の有機酸アルカリ金属塩、ホウ砂等のアルカリ金属ホウ酸塩、リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウム等のアルカリ金属リン酸塩、アンモニア水等が挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどが好ましい。アルカリは直接添加してもよいが、水溶液として添加するのが好ましい。
本発明における物理的破砕処理とは、超音波による破砕、乳化分散機、高圧ホモジナイザーやミル等による破砕が挙げられる。上記高圧ホモジナイザーとしては特に限定されないが、例えば、独国ＡＰＶ・ゴーリン社製のマントンゴーリン、デンマークＡＰＶラニー社製のミニラボ、米国Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製のマイクロフルイタイザー等を用いることができる。上記ミルとしては特に限定されないが、例えば、スイスＷｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製のダイノーミル等を用いることができる。上記乳化分散機としては特に限定されないが、例えば、英国シルバーソン社製シルバーソンミキサー、日本国エムテック社製クリアーミックス、日本国エバラ社製エバラマイルダー等を用いることができる。アルカリ処理により菌体内より溶出し、主に粘度の上昇の原因となる核酸を効率よく破砕し、かつ、菌体細胞壁や細胞膜や不溶性蛋白質などのポリマー以外の不溶性物質を十分に分散できるものであればこれらに限定されるものではない。また、これらのうち２種類以上の破砕機を同時または順次用いることにより更にポリマーの純度を向上させることができる。
上記物理的破砕処理は、上記懸濁液を攪拌しながら行ってもよい。攪拌を行うための手段としては特に限定されず、通常の機械的攪拌を行える手段であればよい。
本発明においては、ＰＨＡ含有微生物菌体の懸濁液の物理的破砕処理を、前記懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加しながら行う。アルカリ処理によって、微生物菌体からＰＨＡと一緒に核酸や菌体細胞壁、細胞膜、不溶性蛋白質などの不溶性物質が流出する。この時、物理的破砕処理を行うことで菌体を完全に破砕し、流出成分を細分化し、粘度の上昇を防ぐとともに、不溶性物質のアルカリ可溶化を進め、ＰＨＡの収率を向上させることが可能となる。
本発明においては、物理的破砕処理とアルカリ添加は同時に行ってもよいし、物理的破砕処理のみを開始した後、アルカリ添加を開始してもよいし、物理的破砕処理とアルカリ添加を交互に行ってもよいし、物理的破砕処理とアルカリ添加を行った後、物理的破砕処理のみをさらに続行してもよい。
本発明においては、上記アルカリ添加時に上記懸濁液のｐＨをコントロールすることが好ましい。より好ましくはｐＨ９以上、更に好ましくはｐＨ１０以上にコントロールする。また、より好ましくは１３．５以下、更に好ましくは１３以下にコントロールする。ｐＨが１３．５を超えるとＰＨＡの分解が激しい場合があり、ｐＨが９未満ではＰＨＡの分離効果が低くなる場合がある。コントロールするｐＨの上下幅としては設定値の上下それぞれ１以内が好ましく、更に好ましくは上下それぞれ０．５以内である。
本発明においては、上記懸濁液のｐＨをコントロールしながらアルカリを連続的あるいは断続的に添加するのが好ましい。
本発明者等は、微生物菌体からのＰＨＡの分離精製において、微生物菌体に対して一度にアルカリを添加する従来の方法では、添加直後は一旦高濃度のアルカリがＰＨＡと接触することになりＰＨＡの低分子化が起きたり、反応が進むにつれアルカリが消費されてｐＨが低下し効率的な抽出を最後まで行えないことを経験した。また、微生物菌体に対してある規定量のアルカリを添加する方法では、微生物菌体懸濁液に含まれる培養液成分などが酸性物質の場合にはそれと反応したり、緩衝状態となったりして、目的を達成しないことも経験した。それに対し、本発明の好ましい方法では、ｐＨをアルカリにコントロールするために連続的あるいは断続的にアルカリを添加するので、不溶物を効果的に溶解でき効率的なＰＨＡの分離が行える。また、アルカリの絶対量ではなくｐＨによって適宜アルカリの添加量は調整されるので、微生物の培養条件や培養後から菌体破砕までに経過した時間、あるいはその微生物菌体懸濁液中の副成分の影響を受けることなく、再現性のある結果を得ることが可能である。
ｐＨコントロールの点においても、上記懸濁液の物理的破砕処理を、上記懸濁液にアルカリを添加しながら行うことは必要である。物理的破砕処理時にアルカリ添加を行わない場合には、上述したように菌体懸濁液の粘度が上昇し、撹拌が困難となりｐＨのコントロールを行うことが出来なくなる。従って、添加したアルカリの濃度分布が生じ、アルカリ濃度の高い部分が存在することで、ＰＨＡの低分子化が引き起こされることになる。
本発明においては、ＰＨＡ含有微生物菌体からＰＨＡを分離する工程において、従来のように、物理的破砕処理とアルカリ添加を高温で実施する必要はない。むしろ、アルカリ状態における高温処理はＰＨＡの低分子化を引き起こす要因となるため、好ましくない。本発明における物理的破砕処理とアルカリ添加の好ましい温度条件は、５０℃以下であり、より好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは４０℃未満である。下限は２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましい。
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明のＰＨＡの分離精製を実施するための微生物菌体を破砕する装置の一例の概略図である。勿論本発明はこれら装置例に限定されるものではない。
符号１は全体で本発明の菌体破砕装置を示している。図１（ａ）および（ｂ）における符号６はアルカリの薬剤を貯留するためのｐＨ調整剤貯留槽であり、該ｐＨ調整剤貯留槽６内の薬剤が、ポンプ４によって管路５を介して菌体破砕槽１１に供給され、菌体破砕槽１１内の微生物懸濁液のｐＨを調整する。さらに、菌体破砕槽１１にはｐＨ調整剤貯留槽６より供給されたｐＨ調整剤を、菌体破砕槽１１内の菌体懸濁液に均一に攪拌混合するための撹拌装置２が付設されている。また、菌体破砕槽１１には、菌体破砕槽１１内の菌体懸濁液のｐＨを検知して、所定のｐＨとなるようにポンプ４からの供給量を制御するために、ｐＨ計７とｐＨ検知制御装置から構成されるｐＨ検知制御手段が付設されている。
図１（ａ）において、菌体破砕槽１１内の菌体懸濁液は、ポンプ１０を介して破砕装置９に供給され、該破砕装置９により微生物菌体から溶出した粘度の上昇の原因となる核酸を効率よく破砕し、管路８を介して菌体破砕槽１１内へ供給するようになっている。それによって菌体破砕槽１１内の菌体懸濁液の粘度が低下し、撹拌装置２によって菌体懸濁液が均一となり、菌体懸濁液のｐＨを厳密に調整できるようになっている。
図１（ｂ）においては、破砕装置１２は菌体破砕槽１１内に付設されており、該破砕槽１１内で該破砕装置１２により微生物菌体から溶出した粘度の上昇の原因となる核酸を効率よく破砕するようになっている。また、破砕装置１２が核酸の破砕を行うと同時に、該菌体懸濁液を均一に攪拌する能力を有するものであるならば、（ｂ）における攪拌装置２は省略することが出来る。
本発明の製造方法によって得られたＰＨＡは、そのままでも高純度であるが、目的に応じて、公知の精製方法、例えば、リゾチーム等の溶菌酵素（特公平４−６１６３８号）、トリプシンやプロナーゼ等の蛋白質分解酵素（特開平５−３３６９８２号）、過酸化水素等の過酸化物（特表平８−５０２４１５号）等を作用させる方法により、更にポリマー純度を向上させることができる。
発明を実施するための最良の形態
本実施例で用いた微生物は、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユウトロファス  ＡＣ３２（寄託については上記を参照）である。これを、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７）に記載の方法で培養し、平均分子量１００万のポリ（Ｄ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエート）〔以下ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略称する〕を約６０ｗｔ％含有した菌体を得た。次にこれを遠心（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）によって培養液から分離し、このペースト状菌体に水を加えて５０ｇ菌体／ｌの水性懸濁液とした。この水性懸濁液を用いて、以下に示す実施例を行ったが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
菌体から分離して得られたｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の純度は、以下のようにして決定した。菌体より分離して得られた沈殿物１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、メタノール０．８５ｍｌと濃硫酸０．２５ｍｌを加えて１００℃で１４０分間処理した。これを冷却後、硫酸アンモニア飽和水溶液０．５ｍｌを加えて激しく攪拌して静置し、下層部をキャピラリーガスクロマトグラフィーにて分析して、分離物中のｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の純度を求めた。
菌体から分離して得られたｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の分子量は、菌体より分離して得られた沈殿物１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液を東ソー社製ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＧＭＨＸＬ（７．８ｘ３００ｍｍ、２本連結）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として分析した。
（実施例１）
ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含有菌体の該懸濁液５００ｍｌを作成し、ｐＨ電極とシルバーソンミキサーを装着した１Ｌの反応容器に入れ３５℃に保温した。ｐＨ電極は丸菱バイオエンジ社製ラボコントローラーＭＤＬ−６Ｃ型に接続し、該懸濁液のｐＨが設定値以下になるとペリスタポンプが作動し水酸化ナトリウム水溶液が設定値に達するまで該懸濁液内に入るように設定した。これは、図１の（ｂ）タイプの菌体破砕装置に相当する。シルバーソンミキサーの回転数を３０００回転に設定し、ラボコントローラーのｐＨを１１．８に設定し２時間攪拌を行った（この間１規定の水酸化ナトリウム水溶液４０ｍｌを必要とした）。処理後の懸濁液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して沈殿物を得た。沈殿物は水で１回、メタノールで２回洗浄し減圧下に乾燥し、ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の粉体を得た。このｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）粉体の純度は９２％と高純度であり、平均分子量は８７万であった。
（実施例２）
該懸濁液のｐＨの調整を炭酸ナトリウム水溶液で行うこと、およびｐＨの設定値を１１．０に設定した以外は、実施例１と同様にして操作を行った。その結果、得られたｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の粉体の純度は９１％と高純度であり、平均分子量は８９万であった。
（実施例３）
実施例１と同様にラボコントローラーのｐＨを１１．８に設定し１時間攪拌を行った。処理後の懸濁液を独国ＡＰＶ・ゴーリン社製のマントンゴーリンに通して７０００ｐｓｉで更に物理的破砕を行った。処理後の懸濁液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して沈殿物を得た。沈殿物は水で１回、メタノールで２回洗浄し減圧下に乾燥しｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の粉体を得た。このｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）粉体の純度は９９％と非常に高純度であり、平均分子量は８７万であった。
（比較例１）
実施例１においてシルバーソンミキサーの代わりにメカニカルスターラー（１００回転）を用いて攪拌を行った以外は同様の操作を行った。上記メカニカルスターラーは懸濁液の攪拌のみを行うものであり、物理的破砕を行い得るものではない。その結果、アルカリを添加すると懸濁液は粘重となり攪拌することが出来なくなり、正常なｐＨを測定することが出来なくなった。懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）したが沈殿物を得ることは出来なかった。
（比較例２）
実施例１においてラボコントローラーでｐＨの調整を行わず１規定の水酸化ナトリウム水溶液（４０ｍｌ）を一度に加えてシルバーソンミキサーで２時間攪拌を行った以外は同様の操作を行った。その結果、得られたｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）粉体の純度は９０％と高純度であったが、平均分子量は３０万で低分子化が激しかった。
（比較例３）
特開平７−３１４８７号記載の実施例の条件でアルカリ処理を行った。すなわち、ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含有菌体を４０ｇ／ｌとなるように該懸濁液５００ｍｌを作成し、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で４ｍＭおよび８ｍＭに調整し８０℃で１時間加熱攪拌した。処理後の懸濁液を室温まで冷却後、遠心分離して沈殿物を得ようとしたが、実施例記載の２７００ｒｐｍでは沈殿物が得られなかった。そこで、該懸濁液と等量のメタノールを加えて８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い沈殿物を得た。沈殿物は水で１回、メタノールで２回洗浄し減圧下に乾燥し、ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の粉体を得た。このｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）粉体の純度は、アルカリ濃度が４ｍＭおよび８ｍＭの時、それぞれ７２％、７０％であり、平均分子量はそれぞれ８７万、６５万であった。この結果、この方法により得られるｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）粉体の純度は低く、また、８ｍＭの条件ではポリマーの低分子化が激しいことが判明した。
産業上の利用可能性
本発明のＰＨＡの分離精製方法は、極めて簡便な分離精製方法によって、高純度のＰＨＡを得ることが可能である。この方法により懸濁液のｐＨを精密に制御でき、ＰＨＡの深刻な分子量低下を招くことなく、収率良く高純度のＰＨＡを得ることができる。従って本発明は微生物によるＰＨＡの工業的生産の効率向上およびコストの低減に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明のＰＨＡの製造方法を実施するための微生物菌体を破砕する装置の一例の概略図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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