(57)【要約】蛋白質を構成するアミノ酸の少なくとも一種であって、次の標識パターン；（ａ）１または２以上のメチレン基においてメチレン水素のうちの少なくとも一つの水素を残して他は重水素化されている（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基において一方のメチル基の水素は完全に重水素化されている（ｃ）プロキラルメチル基においてメチル基の水素は部分重水素化されている（ｄ）メチル基は一つの水素を残して他は重水素化され、芳香環水素は部分重水素化されているの少なくともいずれかを有していることを特徴とする安定同位体標識アミノ酸を提供する。この安定同位体標識アミノ酸を用いると、蛋白質の重水素置換を、残余水素核のＮＭＲ感度を損うことなく達成し、従来の限界を越えた高分子量蛋白質のＮＭＲスペクトルの迅速・確実な解析、立体構造の高精度決定を同時に達成することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を構成するアミノ酸の少なくとも一種であって、次の標識パターン；
（ａ）１または２以上のメチレン基においてメチレン水素のうちの少なくとも一つの水素を残して他は重水素化されている
（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基において一方のメチル基の水素は完全に重水素化されている
（ｃ）プロキラルメチル基においてメチル基の水素は部分重水素化されている
（ｄ）メチル基は一つの水素を残して他は重水素化され、芳香環水素は部分重水素化されている
の少なくともいずれかを有していることを特徴とする安定同位体標識アミノ酸。
【請求項２】
メチレン基および／またはメチル基において残余の水素を持つ炭素の全てが１３Ｃに置換されていることを特徴とする請求項１の安定同位体標識アミノ酸。
【請求項３】
窒素が全て１５Ｎに置換されていることを特徴とする請求項２の安定同位体標識アミノ酸。
【請求項４】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が、次の標識パターン
（ａ）水素原子を２つ有するメチレン基が存在する場合には、メチレン水素のうちの一つが重水素化されている、
（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水素が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されている、
（ｄ）上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他は重水素化されているか、又は該メチル基の全てのメチル基が重水素化されている、
（ｅ）芳香環水素が存在する場合には、該芳香環水素は部分重水素化されていてもよい、
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）において重水素化された後において、水素原子を持つメチレン基および／またはメチル基の炭素の全てが１３Ｃに置換されている、
（ｇ）窒素が全て１５Ｎに置換されている
を満たすことを特徴とする標的蛋白質を構成する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項５】
（ｅ）芳香環水素が存在する場合には、該芳香環水素が部分重水素化されている、請求項４記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項６】
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）において重水素化された後において、水素原子を持つメチレン基およびメチル基の炭素の全てが１３Ｃに置換されている、請求項５記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項７】
アミノ酸のカルボニル基及びグアニジル基を構成する炭素が１３Ｃに置換されている、請求項６記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項８】
請求項１記載の安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法であって、無細胞蛋白質合成により組み込むことを特徴とする安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法。
【請求項９】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項４記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いて、無細胞蛋白質合成を行うことを含む、安定同位体標識アミノ酸で構成される標的蛋白質の調製方法。
【請求項１０】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項５記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いる、請求項９記載の標的蛋白質の調製方法。
【請求項１１】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項６記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いる、請求項９記載の標的蛋白質の調製方法。
【請求項１２】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項７記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いる、請求項９記載の標的蛋白質の調製方法。
【請求項１３】
請求項１記載の安定同位体標識アミノ酸を標的蛋白質に組み込みＮＭＲスペクトルを測定して構造解析することを含む蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１４】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項４記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる標的蛋白質の構造をＮＭＲスペクトル測定により解析することを含む標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１５】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項５記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる請求項１４記載の標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１６】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項６記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる請求項１４記載の標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１７】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項７記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる請求項１４記載の標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１８】
安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸をカップリングすることを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法。
【請求項１９】
安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸を各々ｔｅｒｔ−ブチルエステル化し、これらを酸化的にカップリングした後、酸加水分解することを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法。
【請求項２０】
安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸を各々酸触媒の存在下に液化イソブテンと接触させて、安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸をｔｅｒｔ−ブチルエステル化する請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
安定同位体標識酢酸から得られる酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをエノラートとした後、有機セレン化合物の存在下で、安定同位体標識ブロモ酢酸から得られるブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを加え、酸化し、さらに加水分解することを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法。
【請求項２２】
請求項１８の方法で製造された安定同位体標識フマル酸を不斉ジヒドロキシル化試薬により酸化した後、さらに加水分解することを含む安定同位体標識酒石酸の製造方法。
【請求項２３】
不斉ジヒドロキシル化試薬が、ＡＤ−ｍｉｘ−α及びＡＤ−ｍｉｘ−βからなる群から選択される請求項２２の安定同位体標識酒石酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、安定同位体標識アミノ酸とその標的蛋白質への組み込み方法並びに蛋白質のＮＭＲ構造解析方法に関するものである。本発明は、又、位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸と酒石酸の製造方法に関するものである。さらに詳しくは、安定同位体標識酢酸を原料として、対称性および非対称性の安定同位体標識フマル酸を効率的に製造する方法と、高い光学純度で安定同位体標識酒石酸を製造する方法に関するものである。
従来、蛋白質のＮＭＲによる立体構造決定は１３Ｃ／１５Ｎ等の安定同位体により均一に標識した試料を用いて行われてきたが、この手法では分子量が２万を越えると急速に適用が困難となる。これらの問題を解決する手法として、１３Ｃ／１５Ｎに加えて蛋白質中の水素を５０−８０％程度ランダムに重水素（２Ｈ）置換し、残余水素（１Ｈ）核のＮＭＲ信号を利用する手法や、あるいはアミノ酸残基中のメチル基と芳香環部分の水素のみを残し全ての水素を重水素置換する方法などが提案されている。だが、これらの従来の手法は全て立体構造決定の精度を犠牲にして高分子量蛋白質の立体構造情報を得る手法であることから、その適用対象や有用性が限られている。
１９９０年１１月１５日東京化学同人発行の新生化学実験講座１タンパク質ＩＩＩ高次構造の主鎖カルボニル１３Ｃ−ＮＭＲによる高次構造解析の項には、［１−１３Ｃ，２，３−２Ｈ２］フェニルアラニン、［２Ｈ２］セリン及び［２Ｈ２］アラニンが記載されているが、これは、特異的多重標識法による側面二面角χの決定法で用いるものであって、これらの標識アミノ酸だけではなくて他のアミノ酸についても標識しこれらを標的たんぱく質に組み込んでその立体構造を解析しようとする試みは未だなされていない。
一方、ＮＭＲや質量分析による核酸や蛋白質等の生体内有機化合物の解析においては、１３Ｃや２Ｈなどの安定同位体で標識されたフマル酸や酒石酸が幅広く利用されている。最近では、安定同位体標識されたフマル酸や酒石酸から、高度に安定同位体標識されたアミノ酸を誘導し、これを用いてＮＭＲによる蛋白質の構造解析が行われている。したがって、安定同位体標識フマル酸や安定同位体標識酒石酸の需要は、今後も拡大することが予想される。
しかし、フマル酸の安定同位体標識体は極めて高価（例えば、１，２，３，４−１３Ｃ４フマル酸０．１ｇで１０万円以上）であり、安定同位体標識酒石酸に関しては、市販されていないのが実状である。
同位体標識フマル酸の合成に関しては、これまでに様々な合成方法が報告されている。たとえば、マロン酸エステル合成による方法（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４，２４１８，１９５２）、ジブロモコハク酸の脱離反応を用いる合成法（Ｒ．Ｆ．Ｎｙｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４，３４３４，１９５２）、アセチレンジカルボン酸の還元を経由する方法（Ｙ．Ｊ．Ｔｏｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７７，３０３，１９４９）などが知られている。
また、同位体標識酒石酸の合成に関しては、フマル酸のオスミウム酸化によるジヒドロキシル化（Ｈ．Ｅｒｌｅｎｍｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，２２，７０１，１９３９；Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４，２４１８，１９５２）などが知られている。
しかし、これら公知の方法は、いずれも安定同位体標識フマル酸や酒石酸の大量合成には適さない、あるいは位置選択性が低いという問題があった。例えば、Ｅ．Ｃ．ＪｏｒｇｅｎｓｅｎらやＲ．Ｆ．Ｎｙｓｔｒｏｍらによる同位体標識フマル酸の合成法は、いずれも小スケールでの合成に適した反応であるが、スケールアップが困難である。また、Ｙ．Ｊ．Ｔｏｐｐｅｒの方法は、１，４−１３Ｃ２体や２，３−１３Ｃ２体、あるいは１，２，３，４−１３Ｃ４体などの対称性を有する標識フマル酸の合成には適しているものの、非対称のフマル酸、すなわち１−１３Ｃ体や２−１３Ｃ体などの合成には適さない。
一方、Ｈ．Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒらによる標識酒石酸の合成では、得られる酒石酸はラセミ体であるためＬ−酒石酸あるいはＤ−酒石酸を単離するためには光学分割を行う必要がある。しかし、光学分割を行えば生成物の収率が低下するため、高価な安定同位体を用いる合成法としては有用とは言い難かったのが実状である。
発明の開示
本発明は、上記の従来の問題点を解消し、蛋白質の重水素置換を、残余水素核のＮＭＲ感度を損うことなく達成し、従来の限界を越えた高分子量蛋白質のＮＭＲスペクトルの迅速・確実な解析、立体構造の高精度決定を同時に達成することを目的とする。
本発明は、ＮＭＲスペクトル測定による標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法で好適に使用できる安定同位体標識アミノ酸及び標的蛋白質を構成する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを提供することを目的とする。
本発明は、又、安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、蛋白質のＮＭＲ構造解析方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、あらゆる標識パターンを有する位置選択的安定同位体標識フマル酸を、比較的安価に合成できる汎用性の高い方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、そのようにして得られた安定同位体標識フマル酸から、高い光学純度で安定同位体標識酒石酸を合成する方法を提供することをも目的とする。
本発明の上記目的及び他の目的は、以下の記載及び実施例から明らかとなるであろう。
本発明は、上記の課題を解決するものとして第１には、蛋白質を構成するアミノ酸の少なくとも一種であって、次の標識パターン；
（ａ）１または２以上のメチレン基においてメチレン水素のうちの少なくとも一つの水素を残して他は重水素化されている
（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基において一方のメチル基の水素は完全に重水素化されている
（ｃ）プロキラルメチル基においてメチル基の水素は部分重水素化されている
（ｄ）メチル基は一つの水素を残して他は重水素化され、芳香環水素は部分重水素化されている
の少なくともいずれかを有していることを特徴とする安定同位体標識アミノ酸を提供する。
この第１の発明において、メチレン基および／またはメチル基において残余の水素を持つ炭素のすべてが１３Ｃに置換されているのが好ましい。又、窒素が全て１５Ｎで置換されているのが好ましい。
また、本発明は、第２には、上記の安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法であって、無細胞蛋白質合成により組み込むことを特徴とする安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法を提供する。
また、本発明は、第３には、上記の安定同位体標識アミノ酸を標的蛋白質に組み込みＮＭＲスペクトルを測定して構造解析することを特徴とする蛋白質のＮＭＲ構造解析方法を提供する。
本発明は、第４には、安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸をカップリングすることを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法を提供する。
本発明は、第５には、安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸を各々ｔｅｒｔ−ブチルエステル化し、これらを酸化的にカップリングした後、酸加水分解することを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法を提供する。
第５の発明においては、安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸を各々酸触媒の存在下に液化イソブテンと接触させて、安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸をｔｅｒｔ−ブチルエステル化するのが好ましい。
本発明は、第６には、安定同位体標識酢酸から得られる酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをエノラートとした後、有機セレン化合物の存在下で、安定同位体標識ブロモ酢酸から得られるブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを加え、酸化し、さらに加水分解することを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法を提供する。
本発明は、第７には、上記の方法で製造された安定同位体標識フマル酸を不斉ジヒドロキシル化試薬により酸化した後、さらに加水分解することを含む安定同位体標識酒石酸の製造方法を提供する。
第７の発明においては、不斉ジヒドロキシル化試薬が、ＡＤ−ｍｉｘ−α及びＡＤ−ｍｉｘ−βからなる群から選択されるのが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
なによりもまず強調されることは、この出願の発明の安定同位体標識アミノ酸とこれを用いた蛋白質のＮＭＲ解析において重要なことは、従来のように非選択的（ランダム）にアミノ酸の重水素置換するかわりに、特定の位置と立体環境にある水素を厳密に選択して重水素化することである。これにより、構造決定に不要な水素は完全に重水素化され、一方必要な水素の感度は一切低下しない。このことにより、不要なシグナルは除去され、得られる立体構造の精度が向上すると同時にシグナル解析・構造決定に要する時間は著しく短縮されるのである。
重水素化の手法やこの出願の発明の標識アミノ酸の化学合成については様々な手段が採用されてよく、たとえば後述の実施例に例示したような反応スキームに沿って化学合成されて調製されてもよい。
調製された安定同位体標識アミノ酸は、ＮＭＲによる蛋白質の構造解析のために標的とする蛋白質に組み込まれることになる。
蛋白質を構成するアミノ酸のうちで任意に選定した一つ、複数、或は全てをここで示すような立体構造情報の入手、ＮＭＲスペクトル解析を最も有効ならしめるパターンを有する安定同位体標識アミノ酸で置換することが可能である。このための蛋白質調製手法としては、培養生物細胞を用いた通常の高発現蛋白質合成系、有機化学的・酵素化学的ペプチド・蛋白質合成手法、或は無細胞抽出液を用いる蛋白質調製法などの何れの手法でも利用することが可能である。しかしながら、通常の培養生物細胞を用いる手法では問題となるアミノ酸代謝による同位体希釈や拡散の制御が容易であること、また多量合成が困難な標識アミノ酸を極めて高効率で蛋白質に取り込むことを可能にする点などを考慮すると、無細胞抽出液を用いる蛋白質合成法は、この出願の発明の目的には特に優れた手法である。但し、このことは他の手法の実用的価値を排除するものではない。
ＮＭＲによるスペクトル測定や蛋白質の構造解析のための手法も様々であってよい。また、リガンド結合による構造変化部位の特定等も可能である。
いずれにしても、この出願の発明で使用するアミノ酸は、様々な重水素標識パターンを持つことに最大の特徴があり、それらが蛋白質に取り込まれた際には従来の手法によっては得ることが困難な蛋白質の立体構造解析上の有用性をもたらすことがこの出願の発明の骨子である。このために、それら様々な重水素標識パターンを明確に定義することがこの出願の発明の概要を理解する上で不可欠である。以下に、その定義を述べる。
立体選択重水素化（Ｓｔｅｒｅｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｕｔｅｒａｔｉｏｎ，ＳＳＤ）：
アミノ酸のｍｅｔｈｙｌｅｎｅプロトン、ｇｅｍ−ｍｅｔｈｙｌ（例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕの二つのｐｒｏｃｈｉｒａｌ  ｍｅｔｈｙｌ）は、重水素化により一方を完全にスペクトル上消去しても、もう一方のプロトン（残余プロトン）に関する立体帰属（ｐｒｏ−Ｒ、ｐｒｏ−Ｓ）情報と、炭素原子周囲の四面体性を考慮すれば、必要な立体構造情報は得られる。この場合、消去する側のメチル基の炭素は１２Ｃのままにし、スピン系を単純とするのが好ましい。また側鎖からスタートして主鎖で検出するまでに磁化が減衰してしまうような従来の磁化移動による側鎖のシグナル帰属において、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなどの枝分かれのあるアミノ酸においても正確な情報を得ることが可能になる。
位置選択重水素化（Ｒｅｇｉｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｕｔｅｒａｔｉｏｎ，ＲＳＤ）：
アミノ酸側鎖のスピン系が複雑な場合、特定部位を選択的に重水素化する手法によりスピン系を大幅に単純化し、蛋白質の立体構造情報の入手を著しく容易にすることができる。
立体整列重水素化（Ｓｔｅｒｅｏ−ａｒｒａｙ  Ｄｅｕｔｅｒａｔｉｏｎ，ＳＡＤ）：
複数のプロキラル中心がある場合には、通常の重水素化により極めて多数の同位体異性体が生じ、構造情報の測定感度・精度を著しく損なう。このような場合には、重水素化により生じる新たなキラル中心同士の立体化学的相関を保ちつつ、同時に立体選択的重水素化することにより、単一の同位体異性体のみが含まれるようにすることができる。このような新規標識パターンを立体整列重水素化と呼ぶことにする。
プロトン濃度最小化（Ｐｒｏｔｏｎ−ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ＰＤＭ）：
メチル基、芳香環水素などは磁気的に等価であり、従って重複した構造情報を与えるプロトンが存在する。これらのプロトンは必要最小限のプロトンを残して、残りを全て重水素化する（ＣＨ３→ＣＨＤ２等）することにより、蛋白質のプロトン濃度を最小限にすることができる。この手法をプロトン濃度最小化法と呼ぶ。
これら定義に従って、実際的手段として、この出願の発明の第１の態様は、安定同位体標識アミノ酸は、前記のとおりの標識パターン；
（ａ）１または２以上のメチレン基においてメチレン水素のうちの少なくとも一つの水素を残して他は立体選択的に重水素化（ＣＤＨ）されている、
（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基において一方のメチル基の水素は完全に重水素化（ＣＤ３）されている、
（ｃ）プロキラルメチル基においてメチル基の水素は部分重水素化（ＣＤＨ２，ＣＤ２Ｈ）されている、
（ｄ）メチル基は一つの水素を残して他は重水素化（ＣＤ２Ｈ）され、芳香環水素は部分重水素化されている、
の少なくともいずれかを有している。
以上に分類した重水素化手法を組み合わせることにより蛋白質の立体構造情報の取得に最適なアミノ酸をデザインすることができる。また、上記のとおり、この出願の発明においては、メチレン基やメチル基の重水素化について、ＮＭＲ測定技術の観点からは、主鎖、側鎖シグナルの帰属のために残余となる水素を持つ炭素は、全て１３Ｃに、またアミノ酸を構成する窒素についてはその全てを１５Ｎに置換することが好ましい。一方、ＣＤ３として水素を完全に消去する場合には、むしろ、１２Ｃのままにしておくのが、１３Ｃ−１３Ｃ間のスピン結合がないだけ有利ともなる。なお、ここで、上記の「帰属」とは、アミノ酸配列のなかで何番目の残基に由来しているシグナルであるのかを決めることを意味している。
上記第１の態様において、安定同位体標識アミノ酸としては、標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が、次の標識パターン
（ａ）水素原子を２つ有するメチレン基が存在する場合には、メチレン水素のうちの一つが重水素化されている、
（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水素が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されている、
（ｄ）上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他は重水素化されているか、又は該メチル基の全てのメチル基が重水素化されている、
（ｅ）芳香環水素が存在する場合には、該芳香環水素は部分重水素化されていてもよい、
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）において重水素化された後において、水素原子を持つメチレン基および／またはメチル基の炭素の全てが１３Ｃに置換されている、
（ｇ）窒素が全て１５Ｎに置換されている
を満たす、標的蛋白質を構成する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせとして用いるのが好ましい。
ここでは、さらに、（ｅ）芳香環水素が存在する場合には、該芳香環水素が部分重水素化されているのが好ましく、（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）において重水素化された後において、水素原子を持つメチレン基およびメチル基の炭素の全てが１３Ｃに置換されているのが好ましい。又、アミノ酸のカルボニル基及びグアニジル基を構成する炭素が１３Ｃに置換されているのが好ましい。さらに、１Ｈが結合している炭素は全て１３Ｃに置換されているのが好ましい。
図１には、蛋白質を構成する２０種類のアミノ酸に関してそのような手法の全てを組み合わせてデザインした安定同位体標識アミノ酸の構造を示した。ここで示したパターンは蛋白質の立体構造決定への応用をターゲットとしたものであるが、必要な構造情報により、或は目標とする蛋白質の性質により様々なデザインが可能である。
本発明の第２の態様である安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法としては、標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として上記安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いて、無細胞蛋白質合成を行うことを含む、安定同位体標識アミノ酸で構成される標的蛋白質の調製方法が好ましい。
又、本発明の第３の態様である蛋白質のＮＭＲ構造解析方法としては、標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が上記安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる標的蛋白質の構造をＮＭＲスペクトル測定により解析することを含む標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法が好ましい。
本発明の第４の態様である位置選択的安定同位体標識フマル酸の製造方法において、原料として使用される安定同位体標識酢酸および安定同位体標識ブロモ酢酸は、どのような標識パターンのもの、すなわち、どのような位置に安定同位体を有するものであってもよい。また、安定同位体の導入箇所や数も限定されず、複数の安定同位体を有するものであってもよい。具体的には、［１−１３Ｃ］酢酸、［２−１３Ｃ］酢酸、［１，２−１３Ｃ２］酢酸、［２−２Ｈ３；１−１３Ｃ］酢酸、［２−２Ｈ３；２−１３Ｃ］酢酸、［２−２Ｈ３；１，２−１３Ｃ２］酢酸などが例示される。また、ブロモ酢酸においても、［１−１３Ｃ］ブロモ酢酸、［２−１３Ｃ］ブロモ酢酸、［１，２−１３Ｃ２］ブロモ酢酸、［２−２Ｈ３；１−１３Ｃ］ブロモ酢酸、［２−２Ｈ３；２−１３Ｃ］ブロモ酢酸、［２−２Ｈ３；１，２−１３Ｃ２］ブロモ酢酸等が例示される。これらをカップリングすることにより、あらゆる標識パターンのフマル酸の合成が可能となる。
安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸のカップリングは、まず、各々をｔｅｒｔ−ブチルエステル化した後に行う。このとき、ｔｅｒｔ−ブチルエステル化の方法は、とくに限定されない。例えば、酢酸は、Ｒ．Ｖ．Ｏｐｐｅｎａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎａｔｓｈ，Ｃｈｅｍ．，９７，６２，１９６６およびＲ．Ｓ．Ｍｏｎｓｏｎ，″Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″，Ａｃａｄｅｍｉｃ，１９７１，ｐ．６２記載のｔｅｒｔ−ブチルアルコールと炭化カルシウムをから合成する方法（化学式（Ｉ））、Ｂ．Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６５，９８９，１９４３記載のｔｅｒｔ−ブチルアルコールと塩化アセチルから合成する方法（化学式（ＩＩ））、Ｃ．Ｄ．Ｈｕｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６１，３３５５，１９３９）記載のケテンとｔｅｒｔ−ブチルアルコールから合成する方法（化学式（ＩＩＩ））などの公知の手法によりエステル化できる。
2003053910.tif 000003
一方、ブロモ酢酸は、例えば以下の化学式（ＩＶ）〜（ＶＩ）に示される一般的な手法により、エステル化できる。
2003053910.tif 000004
この出願の発明では、安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸を各々酸触媒下で液化イソブテンとともに密閉し、室温で攪拌する方法が簡便であり、最も好ましい。このとき、使用される酸触媒はとくに限定されないが、各種のイオン交換樹脂を担体固定化触媒として使用すれば、触媒の除去操作が簡単になり、好ましい（例えば、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｅｎ  Ｔｒａｎｓ．１，３８１５−４１９５，２０００）。具体的には、スルホン酸系のカチオン交換樹脂（例えば、Ｄｏｗ社製Ｄｏｗｅｘ（登録商標）Ｗ−Ｘ８、Ｒｏｈｍ  Ｈａａｓ社製Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ）登録商標）Ｒ１５など）が例示される。これらのカチオン交換樹脂系触媒は、濾過により簡単に取り除くことができる。
このような反応において、イソブテンや触媒の量、温度、時間等の反応条件はとくに限定されない。例えば、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）Ｒ１５を用いて酢酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル化を行った場合、イソブテンの量は、酢酸に対して１当量以上あればよく、３当量添加することにより、高い反応収率が得られる。また、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）Ｒ１５の量は、１ｗｔ％以上とすることができる。１ｗｔ％でも十分に高い収率でｔｅｒｔ−ブチルエステル化が進行する。さらに、反応温度は、低温でよく、０℃〜室温付近でよい。このような条件下で反応は３時間以内に終了し、ｔ−ブチルエステル化反応は、９０％以上の高収率で進行する。したがって、生成物の精製を行うことなく次工程に進むことができる。
以上のとおりの方法により得られた安定同位体標識酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルと安定同位体標識ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルのカップリングは、種々の有機合成反応を経由して行うことができる。例えば、Ｌｅｏ  Ａ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０，７２７７，１９９５に記載の酢酸エステルを酸化的にニ量化する方法（ＶＩＩ）や、Ｎｅｄ  Ａ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３４，４４５７，１９９３；Ｔ．Ｊ．Ｂｒｏｃｋｓｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３９６，１９７５に記載の酢酸エステルのヨウ素化を経由し、コハク酸エステルとした後（ＶＩＩＩ）、各種の試薬を用いてフマル酸に変換する方法（ＩＸ）が例示される。
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好ましくは、セレネニル中間体を経由するコハク酸誘導体の合成方法を適用する。具体的には、まず、安定同位体標識酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをエノラートとする。具体的には、強塩基性のリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）と接触させ、リチウムエノラートとする。ここに塩化フェニルセレネニル、臭化フェニルセレネニル、ヨウ化フェニルセレネニル等の有機セレン化合物を加え、さらに安定同位体標識ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを加えると、２−フェニルセレネニルコハク酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステルが得られる。また、ＬＤＡの代わりにヘキサメチルジシロキサンリチウム（ＬｉＨＭＤＳ）やヘキサメチルジシロキサンナトリウム（ＮａＨＭＤＳ）、さらには、ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）を用いてもよいが、ＬＤＡを用いることにより高収率で反応が進行する。
このとき使用されるＬＤＡ（ＬｉＮ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２）と塩化フェニルセレネニル（Ｃ６Ｈ５ＳｅＣｌ）は、いずれも水と激しく反応するため、反応は窒素やヘリウム等の不活性ガス雰囲気、脱水条件下で行うことが望ましい。また、反応は、ＴＨＦ、ＤＭＥ、エーテル、ＤＭＰＵ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルプロピレンウレア）等の適当な有機溶媒を用いて溶液系で行うことが好ましい。
以上のとおりの反応方法により得られた２−フェニルセレネニルコハク酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステルを酸化すればフマル酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステルが得られる。酸化はどのような方法で行ってもよく、様々な公知の手法が適用できる。好ましくは、ｍ−クロロ過安息香酸や過酸化水素等の過酸化物を用いる。また、有機セレン化合物は、過酸化水素等により再度酸化すれば、水溶性となり、水洗除去できる。そして、フマル酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステルを塩酸、硫酸等の酸により加水分解すれば、安定同位体標識フマル酸が得られるのである。
もちろん、所望の化合物が安定同位体標識フマル酸エステル誘導体の場合には、最後の加水分解を行わずに、フマル酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルから種々の有機合成の手法により目的の化合物を合成してもよい。
この出願の発明は、また、以上のとおりの方法により得られた安定同位体標識フマル酸から安定同位体標識酒石酸を得る方法をも提供する。まず、位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸を、フマル酸ジエチルエステルとした後、不斉ジヒドロキシル化して酒石酸ジエチルエステルとする。
このとき、フマル酸ジエチルエステルは、例えば、フマル酸に塩化チオニルを接触させ、ジエチルエーテルに溶解して得られる。また、不斉ジヒドロキシル化試薬としては、例えばＨａｒｔｍｕｔｈ  Ｃ．Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９４，２４８３，１９９４に示される各種のリガンドを有する酸化オスミウムを用いることができる。中でもＫ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓらにより開発されたＡＤ−ｍｉｘ−αやＡＤ−ｍｉｘ−βが好ましく用いられる。ＡＤ−ｍｉｘ−αおよびＡＤ−ｍｉｘ−βは、いずれもオスミウム酸カリウム、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム、炭酸カリウムおよびキラルリガンドの（ＤＨＱ）２ＰＨＡＬまたは（ＤＨＱＤ）２ＰＨＡＬ（化学式（Ｘ））を含有している。
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もちろん、これら以外の公知または新規の不斉ジヒドロキシル化試薬を用いてもよい。このとき、使用される不斉ジヒドロキシル化試薬のキラリティーにより、Ｄ−酒石酸ジエチルエステルまたはＬ−酒石酸ジエチルエステルのいずれかが選択的に得られる。例えばＡＤ−ｍｉｘ−βを用いればＤ−酒石酸ジエチルエステルが９９％ｅｅ以上の高い光学純度で得られる。このようにして得られた酒石酸ジエチルエステルを加水分解することにより、安定同位体標識酒石酸が得られる。
もちろん、所望の化合物が安定同位体標識酒石酸エステル誘導体の場合には、最後の加水分解工程を経ることなく、酒石酸ジエチルエステルから各種の有機合成手法により目的の化合物を合成してもよい。
以上のとおりのこの出願の発明の安定同位体標識フマル酸および安定同位体標識酒石酸の製造方法では、いずれの反応工程も、室温以下の低温で、比較的短時間に進行する。また、いずれの反応工程も収率が６０〜９０％以上と高い。さらに、出発物質の安定同位体標識酢酸は比較的安価で（例えば、標識位置に応じて１０ｇ約５千円〜１ｇ約６万円）ある。以上より、この出願の発明の製造方法は、大スケールで位置選択的に安定同位体標識フマル酸や安定同位体標識酒石酸を合成する方法として有用であるといえる。
以下に、実施例として、様々な標識パターンを持つアミノ酸を用いて標識した蛋白質の調製と、それらのＮＭＲスペクトルが、立体構造を入手する上でどのような優れた特徴を有するかに関して例示する。
もちろん、下記の実施例はこの出願の発明についての具体的な理解を得るための例示であって、これらの例示によってこの出願の発明が限定されることはない。
実施例
実施例１  ＳＳＤ−グリシンを組み込んだ蛋白質の調製とＮＭＲ測定
まず立体選択的モノ重水素化した（２Ｓ）−〔１，２−１３Ｃ２；２−１５Ｎ；２−２Ｈ〕グリシン（以下、ＳＳＤ−グリシンと呼ぶ）の合成を、下記のスキーム１に沿って、工程１から工程１２として詳細に説明する。
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＜工程１＞
文献記載の手法（Ｋ．Ｐ．Ｒ．Ｋａｒｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２７，３４１５，１９８６）を参考に〔ｕｌ−１３Ｃ６〕−グルコース（１０．０６ｇ，５５．８ｍｍｏｌ）（１）を原料に用いて化合物（２）（１２．５５ｇ，４８．２ｍｍｏｌ，８７％）を得た。
＜工程２、工程３、工程４＞
化合物（２）（１２．５５ｇ，４８．２ｍｍｏｌ）を文献記載の手法（Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，４６７３，１９８８）を用いて化合物（３）（２２．０８ｇ，４４．３ｍｍｏｌ）に変換した。得られた化合物（３）に８０％−酢酸３００ｍｌを加え溶解した後、７５℃、３時間の条件で脱保護させた。室温まで冷却した後、減圧下濃縮した。エタノールを用いて共沸する作業を４回繰り返し化合物（４）とした後、文献記載の手法（Ｃ．Ｈｕｂｓｃｈｗｅｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，９６２，１９８６）を用いて目的物（５）（１２．９ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）を化合物（２）から６８％の収率で得た。
＜工程５＞
化合物（５）（３．６６ｇ，８．５８ｍｍｏｌ）に塩化メチレン１５０ｍｌを加え溶解させた後、シリカゲル（７３．８ｇ）、重水素化トリブチルスズ（５．０ｇ，７．２ｍｍｏｌ）を加え１８時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルカラムへチャージし塩化メチレン１Ｌを用い有機スズ化合物を溶出した後に、酢酸エチル３Ｌを用いて化合物（６ａ）（３．１３ｇ，７．２９ｍｍｏｌ）を８５％の収率で得た。
＜工程６、工程７＞
化合物（６ａ）を文献記載の方法（Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，１２２１，１９９３）を参考に５位をトシル化した。得られた化合物（７）をテトラヒドロフラン８３ｍｌに溶かし、１Ｍ−テトラブチルアンモニウムフルオリド／テトラヒドロフラン溶液（１３．９ｍｌ，１３．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。反応混合物をヘキサン：酢酸エチル＝１：１のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（８）（２．７３ｇ，７．７９ｍｍｏｌ，６７％）を得た。
＜工程８＞
化合物（８）（２．２２ｇ，６．３４ｍｍｏｌ）を塩化メチン１１０ｍｌに溶かし、０℃まで温度を下げ、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬（８．０５ｇ，１８．９９ｍｍｏｌ）を加えて０℃のまま撹拌した。室温まで昇温さえて１．５時間撹拌した。６ｇのチオ硫酸ナトリウムを溶かした飽和炭酸水素ナトリウム４０ｍｌと酢酸エチル５０ｍｌを加え再び５分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム５０ｍｌで２回、水５０ｍｌで１回、ブライン５０ｍｌで１回洗浄、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して化合物（９）を得た。
＜工程９＞
化合物（９）をメタノール７５ｍｌに溶かしたものを０℃まで温度を下げ、これに水素化ホウ素ナトリウム（１２０ｍｇ，３．１７ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶かして加えた、２分後に氷浴から出して１．５時間撹拌を続けた。アセトン８０ｍｌを加えさらに５分間撹拌した。水２０ｍｌを加えて、減圧濃縮後、これに酢酸エチル４０ｍｌを加えて水（４０ｍｌ×１）、ブライン（４０ｍｌ×１）で洗浄し有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して化合物（１０）を得た。
＜工程１０＞
化合物（１０）をＤＭＦに溶解し窒素置換して、フタルイミドカリウム（１．７６ｇ，９．５１ｍｍｏｌ）を加えた。これを７０℃の条件下１０時間撹拌して、濃縮、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（１１）を得た。
＜工程１１＞
化合物（１１）を酢酸５０ｍｌと５Ｎ−硫酸５０ｍｌの混合溶媒に溶かして６５℃の条件で１時間撹拌させた。室温まで冷えたら、撹拌しながらＫＭｎＯ４（４．１５ｇ，２６．１１ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。チオ硫酸ナトリウムを色が消えるまで加えて、さらに水を２０ｍｌ加えた。塩化メチレン（３０ｍｌ×３）で抽出し、有機相を水（２０ｍｌ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮し化合物（１２）を得た。
＜工程１２＞
化合物（１２）を１Ｎ−塩酸５０ｍｌで還流させた。冷却後生じた白色針状結晶をろ取し、ろ液をＤｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８で精製し、ＳＳＤ−グリシン（１３ａ）を得た。（３９１ｍｇ，９４．９５ｍｍｏｌ，７８％）
＜化合物（６ｂ）の合成＞
化合物（５）から化合物（６ｂ）とすることにより２位の立体配置が逆のＳＳＤ−グリシン（１３ｂ）の合成も可能である。
すなわち、化合物（５）（５．０ｇ，１１．７２ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（３００ｍｌ）に溶かし、アルゴン雰囲気下０℃まで冷却した。マグネシウムジブロミドジエチルエーテル錯体（１７．９６ｇ，６９．５４ｍｍｏｌ）を加えてから５分間撹拌し、重水素化トリｔｅｒｔ−ブトキシアルミニウムリチウム（８．８８ｇ，３４．７７ｍｍｏｌ）を加えて０℃のまま４時間撹拌した。０℃で１Ｎ−塩酸３０ｍｌ加えて１０分間撹拌した。酢酸エチル（２５０ｍｌ×４）で抽出し有機層をブライン（１００ｍｌ×１）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮して化合物（６ｂ）を得た。
＜標識蛋白質の調製＞
上記ＳＳＤ−グリシン（１３ａ及び１３ｂ）を高度選択的に組み込むプロセスを確立するためのモデル蛋白質としては、大腸菌由来のプロリン残基シス−トランス変換酵素ＥＰＰｌｂ（分子量１８ｋＤａ）を用いた。従来の大腸菌等を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質調製法によっては、Ｇｌｙのメチレンプロトンは、グリシン−セリン間の相互変換を触媒する酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）の作用により同位体の希釈・拡散を押さえることは困難であった。本法では、Ｓ３０無細胞抽出液を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成法（以下、無細胞蛋白合成法と呼ぶ）を用いることにより、ＳＨＭＴの阻害剤として知られるシクロセリンを十分量添加しても全く蛋白質合成機能は低下しないために、高い立体選択性を保ちつつ、二種類のＳＳＤ−グリシン、（２Ｓ）−、及び（３Ｒ）−〔１，２−１３Ｃ２；１−１５Ｎ；２−２Ｈ〕−Ｇｌｙ，で標識したＥＰＰｌｂの調製に成功した。
＜標識蛋白質のＮＭＲ測定＞
ＮＭＲ測定試料は、ＳＳＤ−グリシンで標識したＥＰＰｌｂを用いて、論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）に従って調製した。なお、グリシン残基メチレンプロトンのシグナル帰属は、上記論文に記載した主鎖ＮＭＲシグナルの帰属情報をもとに行った。
（２Ｓ）−，及び（３Ｒ）−〔１，２−１３Ｃ２；１−１５Ｎ；２−２Ｈ〕−グリシンを取り込ませたＥＰＰｌｂ試料、〔１，２−１３Ｃ２；１−１５Ｎ〕−グリシンを組み込んだＥＰＰｌｂ試料の夫々について測定した１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを図２に比較して示した。この図２から明らかなように、従来の均一標識体標識試料を用いる方法では、ＮＭＲスペクトルは込み合い、蛋白質の立体構造決定において不可欠なメチレンプロトンの立体特異的帰属は事実上不可能である。一方、立体特異的に重水素化されたＳＳＤ−グリシンを取り込ませた蛋白質ではＮＭＲスペクトルはシグナルの総数は半分に減少し、かつメチレンプロトン間のスピン結合によるシグナルの分裂や線幅の増大が除かれる。このようにスペクトルは通常のグリシン選択的標識単純化され、全てのシグナルを二次元ＮＭＲ上で分離して観測でき、また立体特異的なシグナルの帰属は既に試料調製段階で終了しており、新たに帰属をする必要はない。重要なことは、立体化学的帰属が終了しているために、二種のＳＳＤ−グリシンで標識した蛋白質試料のうち、何れか一方のみが必要であるということである。
すなわち、この出願の発明の手段を適用することにより構造決定に不要なシグナルは除去され、シグナル解析及び構造決定に要する時間を著しく短縮する方法を提供することが可能になる。
実施例２  ＳＡＤ−リジンを組み込んだ蛋白質の調製とＮＭＲ測定
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−〔１，２，３，４，５，６−１３Ｃ６；２，６−１５Ｎ２；３，４，５，６−２Ｈ４〕リジン（以下、ＳＡＤ−リジンと呼ぶ）の合成を、スキーム２に沿って、工程１３から工程１６として詳細に説明する。
2003053910.tif 000008
＜工程１３＞
文献記載の手法（Ｍ．Ｏｂａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，９２７５，１９９９）を均一に１３Ｃ−標識したＬ−グルタミン酸から誘導した（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−〔１，２，３，４，５−１３Ｃ５；２−１５Ｎ；３，４−２Ｈ２〕グルタミン酸（以下、ＳＡＤ−グルタミン酸と呼ぶ）（１４）（２５．０２ｍｍｏｌ）を０．２Ｍピリジン塩酸塩重水溶液（２００ｍｌ）に溶解した後、ピリドキサールリン酸（２００ｍｇ）及びジチオトレイトール（１２０ｍｇ）を加えたピリジンを用いてｐＨを５にした。この溶液にグルタミン酸デカルボキシラーゼ（１０００Ｕ，２１０ｍｌ）を加え遮光下３７℃で３時間撹拌した。得られた反応混合物を３０度以下の温度で減圧濃縮し、残渣をＳＫ１Ｂを用いて精製した。得られた標識アミノブタン酸を５０ｍｌの水に溶解し、そこに炭酸水素ナトリウム（２．８３ｇ，２６．６６ｍｍｏｌ）及びＮ−エトキシカルボニルフタルイミド（６．３７ｇ，２９．０８ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌した。反応溶液に注意深く濃塩酸を加えｐＨを５にし、生じた結晶を濾取した。濾紙上の結晶を冷水で洗った後、結晶を真空乾燥容器中で乾燥させ化合物（１５）（４．４３ｇ，１８．３２ｍｍｏｌ，７５％）を得た。
＜工程１４＞
化合物（１５）を塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解した後、この溶液に室温で塩化チオニル（１１．９ｇ，１００ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌し次いで４０℃で２時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。得られた残渣をベンゼンに溶解した後、アルゴン雰囲気下テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０．２１ｇ，５ｗ／ｗ％）及び重水素化トリブチルスズ（３．２２７ｍｌ，１２ｍｍｏｌ）を加え室温で５分間撹拌した。反応混合物を濃縮後、ヘキサン：酢酸エチル＝７：３を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した化合物（１６）（２．１０１ｇ，９．３４ｍｍｏｌ，９３％）を得た。
＜工程１５＞
図に示した標識ジケトピペラジン誘導体（１．７７７ｇ，４．９５ｍｍｏｌ）及び化合物（１６）（１．０１３ｇ，４．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（４５ｍｌ）に溶解したものをアルゴン雰囲気下−４０℃に撹拌下冷却し、そこにカリウムｔｅｒｔ−ブドキシド（０．６１６ｇ）のテトラヒドロフラン（４５ｍｌ）溶液を加えた。反応溶液を３時間かけて徐々に室温に戻した後、飽和塩化アンモニウムを加えた。反応混合物を酢酸エチルにより抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮した。残渣をヘキサン：酢酸エチル＝６５：３５を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより化合物（１７）（１．２７０ｇ，２．７２ｍｍｏｌ，６１％）が得られた。
＜工程１６＞
化合物（１７）（１．２５１ｇ，２．６８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍｌ）に溶解した。これに二酸化白金（０．０２３ｇ，０．１ｍｍｏｌ）を加え、反応容器内の空気重水素ガスで置換した。重水素ガスの圧力を１ｋｇｆ／ｃｍ２とし室温で２時間撹拌した。触媒を濾過により取り除いた後、濃縮し濃臭化水素酸を加え１４０℃で４８時間撹拌した。減圧濃縮後Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８を用いてイオン交換することによりＳＡＤ−リジン（１８）（０．３６０ｇ，１．７３ｍｍｏｌ，６５％）を得た。
＜標識蛋白質の調製＞
ＳＡＤ−リジンを組み込んだＥＰＰｌｂは論文記載の方法（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）にＳＡＤ−リジンを添加することにより調製した。
＜標識蛋白質のＮＭＲ測定例＞
ＮＭＲ試料は論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）を用い、論文記載の蛋白質主鎖ＮＭＲ信号の帰属の情報をもとに帰属を行った。
ＳＡＤ−リジンを取り込ませたＥＰＰｌｂ試料についてＨＣＣＨ  ＴＯＣＳＹスペクトルを測定した。〔ｕｌ−１３Ｃ；１５Ｎ〕−リジンを組み込んだ従来法との比較を図３に示す。この図３より、ＳＡＤ−リジンを組み込んだ蛋白質は従来法に比べて単純化されていることがわかる。また長鎖アミノ酸の側鎖の信号を高感度で観測されていることから、従来は利用できなかった長鎖アミノ酸の側鎖のＮＭＲ信号も構造情報の取得に利用可能になる。
すなわち、この出願の発明の手段を適用することにより、構造決定に不要なシグナルは除去され、残余シグナルの感度が向上することから、従来の限界を超えた高分子量蛋白質の迅速かつ確実なシグナル解析及び立体構造の高精度決定が可能になる。
実施例３  ＳＡＤ−グルタミンを組み込んだ蛋白質の調製とＮＭＲ測定
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−〔１，２，３，４，５−１３Ｃ５；２，５−１５Ｎ２；３，４−２Ｈ２〕グルタミン（以下、ＳＡＤ−グルタミン）の合成をスキーム３に沿って工程１７として詳細に説明する。
2003053910.tif 000009
＜工程１７＞
メタノール（１３０５μｌ）に濃硫酸（５５μｌ）を加え−５〜−１０℃に冷却し、この溶液をＳＡＤ−グルタミン酸（１４）（９８ｍｇ，７１９μｍｏｌ）が入っている２ｍｌのバイアルに加え−４℃にて１時間撹拌し室温に戻しさらに２時間撹拌した。撹拌終了後０℃に保ちつつ、二硫化炭素１５６μｌを加えた。さらにこの容器に１５Ｎ標識−アンモニアガスを１４分間封入した。室温にて１０日放置した後、メタノールを加え生じた結晶を濾取した。濾液を濃縮しこれを蒸留水に溶かし陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ−５０、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ９６ＳＢ及び陰イオン股間樹脂ＩＲＡ６７により順次精製しＳＡＤ−グルタミン（１９）（２６ｍｇ）を得た。
＜標識蛋白質の調製＞
上記ＳＡＤ−グルタミン（１９）を組み込んだ蛋白質試料は、モデル蛋白質にＥＰＰｌｂ蛋白を用い、論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）にＳＡＤ−グルタミン、グルタミン酸−グルタミン間の変換に関係する酵素を阻害するメチオニンスルホキシミン及び６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンを添加することにより調製した。これらの標識体は従来のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質調製法では、代謝変換を阻害し且つ蛋白質を生産する条件が設定できないために、調製することはできなかった。
＜標識蛋白質のＮＭＲ測定例＞
ＮＭＲ試料は論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）を用い、論文記載の蛋白質主鎖ＮＭＲ信号の帰属の情報もとに帰属を行った。
ＳＡＤ−グルタミンを取り込ませたＥＰＰｌｂ試料についてＨＣＣＨ  ＴＯＣＳＹスペクトルを測定した。〔ｕｌ−１３Ｃ；１５Ｎ〕−グルタミンを組み込んだ従来法との比較を図４に示す。図４より、ＳＡＤ−グルタミンを組み込んだ蛋白質は従来法に比べ単純化されていることがわかる。また長鎖アミノ酸の側鎖の信号を高感度で観測することができることから、従来は利用できなかった長鎖アミノ酸の側鎖のＮＭＲ信号を構造情報の取得に利用できる。
すなわち、この出願の発明の手段を適用することにより、構造決定に不要なシグナルは除去され、残余シグナルの感度が向上することから、従来の限界を超えた高分子量蛋白質の迅速かつ確実なシグナル解析及び立体構造の高精度決定が可能になる。
実施例４  ＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンを組み込んだ蛋白質の調製とＮＭＲ測定
まず（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−〔１，２，３，４，５−１３Ｃ５；２−１５Ｎ；３，５，５，５′，５′，５′−２Ｈ６〕ロイシン（以下、ＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンと呼ぶ）の合成を、スキーム４に沿って、工程１８から工程３１として詳細に説明する。
2003053910.tif 000010
＜工程１８＞
ＳＡＤ−グルタミン酸（１４）（２．５６ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍｌ）に氷冷下、塩化チオニル（４．５２ｇ，３８．０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一時間撹拌した後、一時間還流した。溶媒を留去した後、残留物にＨ２Ｏを加え飽和炭酸水素ナトリウムを用いて中和し、減圧下１５０℃で一時間撹拌した。有機物をクロロホルムで抽出し、抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去し化合物（２０）を定量的に得た。
＜工程１９＞
化合物（２０）（２．７３ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１７ｍｌ）にテトラヒドロホウ酸リチウム（０．４０ｇ，１８．２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフランの懸濁溶液（１７ｍｌ）を滴下し、室温で２５時間撹拌した。反応混合物に２０％酢酸（２０ｍｌ）を加えた後減圧濃縮した。残留物をＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８で処理した後、減圧濃縮し有機物をクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥後、減圧濃縮し化合物（２１）（１．０６ｇ，８．６５ｍｍｏｌ，５２％）を得た。
＜工程２０＞
化合物（２１）（１．０６ｇ，８．６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）にｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．４４ｇ，９．５２ｍｍｏｌ）とイミダゾール（１．３６ｇ，１９．９ｍｍｏｌ）を加え室温で２１時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し減圧濃縮して化合物（２２）（１．６９ｇ，７．１４ｍｍｏｌ，８３％）を得た。
＜工程２１＞
化合物（２２）（１．６９ｇ，７．１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１５ｍｌ）にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１．８７ｇ，８．５７ｍｍｏｌ）を加えた後、ジメチルアミノピリジン（０．８７ｇ，７．１４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残留物を酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸水素カリウム水溶液、水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し溶媒を留去し残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５）で精製して化合物（２３）（１．９０ｇ，５．６４ｍｍｏｌ，７９％）を得た。
＜工程２２＞
１Ｍヘキサメチルジシラザンナトリウムアミド−テトラヒドロフラン溶液（１１．８ｍｌ，１１．８ｍｍｏｌ）に３，３−ジメチルプロピレンウレア（１．４５ｍｌ，１１．８ｍｍｏｌ）を加え０℃で１０分間撹拌した。反応溶液を−７８℃まで冷却し化合物（２３）（１．９０ｇ，５．６４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）を加え同温度で３０分撹拌した。さらに塩化フェニルセレネニル（１．１９ｇ，６．２０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）を加え−７８℃で２時間撹拌した。同温度で反応混合物に重水素化ヨウ化メチル（０．９０ｇ，６．２０ｍｍｏｌ）を加え室温に昇温した後エーテルを加え、有機層を水と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝９４：６）で精製し化合物（２４）（１．５２ｇ，３．０６ｍｍｏｌ，５４％）を得た。
＜工程２３＞
化合物（２４）（１．５２ｇ，３．０６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１２ｍｌ）溶液を０℃に冷却し３０％過酸化水素水（３．４７ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）を滴下した。室温に昇温し１時間撹拌後ＴＬＣを用いて原料の消失を確認した。反応混合物をエーテルで抽出した後、有機層を飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５）で精製し化合物（２５）（０．８０６ｇ，２．３６ｍｍｏｌ，７７％）を得た。
＜工程２４＞
化合物（２５）（０．８０６ｇ，２．３６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（２５ｍｌ）に二酸化白金（０．０４ｇ，５ｗｔ％）を加え水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒をろ別した後、ろ液を減圧濃縮し化合物（２６）を定量的に得た。
＜工程２５＞
化合物（２６）（０．８１ｇ，２．３６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（２５ｍｌ）にｐ−トルエンスルホン酸（０．０４ｇ，０．２３６ｍｍｏｌ，１０ｍｏｌ％）を加え室温で１８時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、酢酸エチルで抽出し飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥し減圧濃縮して化合物（２７）（０．４２６ｇ，１．７８ｍｍｏｌ，７５％）を得た。
＜工程２６＞
化合物（２７）（０．４２６ｇ，１．７８ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（１０ｍｌ）に過ヨウ素酸ナトリウム（３．８１ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）、塩化ルテニウム１水和物（０．１１ｇ）、Ｈ２Ｏ（１２ｍｌ）の混合物を加え０℃で１時間撹拌した。室温まで昇温して更に１時間撹拌した後、有機層を分離しイソプロパノール（１０ｍｌ）を加え１時間撹拌した。不溶物をろ別した後、ろ液を減圧濃縮し、残査をクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し溶媒を留去して化合物（２８）を定量的に得た。
＜工程２７＞
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジネオペンチルアセタール（０．７４ｇ，３．２１ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブタノール（０．４０ｇ，５．３４ｍｍｏｌ）の混合物を化合物（２８）（０．４５ｇ，１．７８ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１０ｍｌ）に還流しながら加え、更に３０分還流した。反応溶液を室温まで冷却した後、酢酸エチルを加え有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝８０：２０）で精製し化合物（２９）（０．２７１ｇ，０．８８ｍｍｏｌ，４９％）を得た。
＜工程２８＞
化合物（２９）（０．２７１ｇ，０．８８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）を０℃に冷却し１Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（１．０５ｍｌ）を滴下した。反応混合物を室温まで昇温して３０分撹拌後ＴＬＣを用いて原料の消失を確認した。生成物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出した後、酢酸エチルで洗浄し水層をクエン酸を用いてｐＨ３−４にした。有機物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去して化合物（３０）を定量的に得た。
＜工程２９＞
化合物（３０）（０．２８７ｇ，０．８８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）をアルゴン気流下−４０℃に冷却しトリエチルアミン（０．１２ｇ，１．１４ｍｍｏｌ）、クロロギ酸イソブチル（０．１５ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。析出したトリエチルアミン塩酸塩をアルゴン気流下ろ別した後、ろ液を０℃に冷却し重水素化ホウ素ナトリウム（０．１１ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（８ｍｌ）、重水（６ｍｌ）の混合物を加え１．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化ナトリウム水溶液、１０％クエン酸水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝７５：２５）で精製し化合物（３１）（０．１６８ｇ，０．５３ｍｍｏｌ，６１％）を得た。
＜工程３０＞
トリフェニルホスフィン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ３ｍｍｏｌ  Ｐ／ｇｒｅｓｉｎ，０．３９ｇ，１．１７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン懸濁液（５ｍｌ）にヨウ素（０．３０ｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を加え室温で１０分撹拌した後、イミダゾール（０．０８ｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を加え室温で１０分撹拌した。反応混合物に化合物（３１）（０．１６８ｇ，０．５３３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１５ｍｌ）を加え２時間還流した。不溶物をろ別した後ろ液を減圧濃縮し残留物をエーテルで抽出し飽和チオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮して化合物（３２）（０．１９９ｇ，０．４６８ｍｍｏｌ，８８％）を得た。
＜工程３１＞
化合物（３２）（０．１９９ｇ，０．４６８ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１０ｍｌ）に水素化トリブチルスズ（０．２１ｇ，０．７０ｍｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（７．７ｍｇ）を加え１時間還流した。溶媒を留去した後、残留物に１Ｍ  塩酸（１５ｍｌ）を加え１３０℃で１時間還流した。水層をクロロホルムで洗浄した後、減圧濃縮しＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８でイオン交換を行いＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシン（３３）（０．０４８６ｇ，０．３４ｍｍｏｌ，７３％）を得た。
＜標識蛋白質の調製＞
上記ＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンを組み込んだ蛋白質試料の調製は、モデル蛋白質にＥＰＰｌｂ蛋白を用い論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）にＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンを添加することにより調製した。
＜標識蛋白質のＮＭＲ測定例＞
ＮＭＲ試料は論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）を用い、論文記載の蛋白質主鎖ＮＭＲ信号の帰属の情報をもとに帰属を行った。
ＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンを取り込ませたＥＰＰｌｂ試料について１Ｈ−１３Ｃ  ＣＴ−ＨＳＱＣを測定した。〔ｕｌ−１３Ｃ；１５Ｎ〕−ロイシンを組み込んだ従来法との比較を図５及び図６に示す。図５及び図６より、ＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンを組み込んだ蛋白質は、従来法に比べシグナルが単純化されていることがわかる。特に注目すべき点は、ロイシンのメチル基の一方は完全に重水素置換すると同時に炭素原子は核スピンをもたない１２Ｃのままにしてあり、他方のメチル基は３個の水素のうちで構造取得のために最小限必要な水素１個のみを残して他の２個は重水素化してある点である。中心炭素原子はＮＭＲ測定・帰属に配慮して１３Ｃに置換してある。プロトン密度が低下するために線幅が減少し、重水素化にともなうプロトン数の減少をほぼ完全に補っている点である。実際の構造決定に利用する複雑な測定においては、測定感度は従来法にくらべてむしろ大きく向上することが予測される。
このようにＳＡＤ／ＰＤＭ−アミノ酸を用いれば全てのプロトンを有する炭素は１３Ｃ−１Ｈ対のみになり、緩和時間の測定・解析、残余双極子相互作用定数の構造決定への応用など、新しいＮＭＲ技術の開発に不可欠な標識蛋白質試料が得られる。
実施例５  ＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニンを組み込んだ蛋白質の調製とＮＭＲ測定
まず（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−〔１，２，３，４，６−１３Ｃ５２−１５Ｎ；３，４，６，６−２Ｈ４〕メチオニン（以下、ＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニンと呼ぶ）の合成を、スキーム５に沿って、工程３１から工程３８として詳細に説明する。
2003053910.tif 000011
＜工程３２、工程３３＞
文献記載の手法（Ｋ．Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１９００−１９０３，１９８８）を参考に（２Ｓ，３Ｒ）−〔１，２，３，４−１３Ｃ４；２−１５Ｎ；３−２Ｈ〕アスパラギン酸（３４）を原料に用いて化合物（３５）へ変換した。この化合物（３５）（２．８２ｇ，１０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０．０ｍｌ）に溶解し、この溶液をＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ  ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（４．８４ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（３０．０ｍｌ）溶液に２０分かけて滴下した。さらに１時間撹拌した後、ジエチルエーテル（５０ｍｌ）を加え、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム（５０．０ｍｌ）にチオ硫酸ナトリウム（１５．０ｇ）を混ぜたものを加え１０分間撹拌した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（５０．０ｍｌ）、水（５０．０ｍｌ）で洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し定量的に化合物（３６）を得た。
＜工程３４＞
窒素雰囲気下、水素化アルミニウムリチウム（６０．０ｍｍｏｌ，２．２８ｇ）にテトラヒドロフラン（４．０ｍｌ）を加えたものに、エタノール（６０．６ｍｌ，２．７８ｇ）とテトラヒドロフラン（１６．０ｍｌ）を混ぜたもの、次いで（ｓ）−（−）−ビナフロトール（６０．６ｍｍｏｌ，１７．３４ｇ）をテトラヒドロフラン（９０．０ｍｌ）に溶解したものを、撹拌下それぞれシリンジで徐々に加え、室温で３０分撹拌した。反応液を−１００℃に冷却し、これに化合物（３６）（１．６７ｇ，６．００ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１１．０ｍｌ）溶解したものをシリンジで徐々に加え、同温度において３時間撹拌した。その後−７８℃で１０時間撹拌した。次に０．５Ｎ−塩酸（１．０ｍｌ）を加え１５分間撹拌した後、ハイフロス−パセルを用いてろ過し有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた粗生成物にヘキサンを加え、過剰なナフトールを結晶化して除き、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し化合物（３７）を得た。（０．３１５ｇ，１．１２ｍｍｏｌ，１９％）
＜工程３５＞
化合物（３７）（０．３１５ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１５．０ｍｌ）に溶解し、窒素気流下、０度においてトリエチルアミン（０．１２５ｇ，１．２３ｍｍｏｌ）を加え、次いでメタンスルホニルクロリド（０．１４１ｇ，１．２３ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。水（１０．０ｍｌ）を加え、さらに１５分間撹拌した。次に、有機層を０．５Ｎ−塩化水素（３０ｍｌ×２）、水（３０ｍｌ×２）、飽和炭酸水素ナトリウム（３０ｍｌ×２）、飽和食塩水（３０ｍｌ×２）で洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し化合物（３８）を得た。（０．３６０ｇ，１．１０ｍｍｏｌ，９８％）
＜工程３６＞
化合物（３８）（０．３６０ｇ，１．１０ｍｍｏｌ）に水（２０ｍｌ）、カリウム−Ｏ−ｔ−ブチルジチオカーボネート（０．２２５ｇ，１．２１ｇ）、アリコート３３６（３３．０ｍｇ，３７．０μｌ）を加えたものを室温で３０分間激しく撹拌した。次に、４５度から５０度で１０分間撹拌した後、１０分以上かけて７５度から８０度にし、さらに２０分間撹拌した。水層が透明になり、黄色の油状物質が出てきたところで石油エーテル（２０．０ｍｌ）を加え、有機層を水（３０．０ｍｌ×２）で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し化合物（３９）を得た。（０．１０１ｇ，０．３４０ｍｍｏｌ，３１％）
＜工程３７＞
窒素気流下、化合物（３９）（０．１０１ｇ，０．３４０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１５．０ｍｌ）に溶解した。−７８度において、１．６Ｍ−ｎ−ブチルリチウム（０．２３３ｍｌ）を加え１５分間撹拌した後、１３ＣＤ２ＨＩ（５４．２ｍｇ，０．３７４ｍｍｏｌ）を加え９０分間撹拌した。飽和塩化アンモニウム（１．００ｍｌ）を加え、５分間撹拌した。室温に戻してＴＨＦを留去した後、酢酸エチル（３０．０ｍｌ）を加え、水（３０．０ｍｌ）、飽和食塩水（３０．０ｍｌ）で有機層を洗い、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し化合物（４０）を得た。（９９．３ｍｇ，０．３１７ｍｍｏｌ，９３％）
＜工程３８＞
化合物（４０）（９９．３ｍｇ，３１．７ｍｍｏｌ）に１Ｎ−塩酸（１５ｍｌ）を加え、１１０度で３時間還流した。水を留去した後、この塩酸塩を少量の水に溶解しイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８により精製しＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニン（４１）をほぼ定量的に得た。（５０．１ｍｇ，０．３２０ｍｇ，＞９９％）
＜標識蛋白質の調製＞
上記ＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニンを組み込んだ蛋白質試料は、モデル蛋白質にＥＰＰｌｂ蛋白を用い論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）にＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニンを添加することにより調製した。
＜標識蛋白質のＮＭＲ測定例＞
ＮＭＲ試料は論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）を用い、論文記載の蛋白質主鎖ＮＭＲ信号の帰属の情報をもとに帰属を行った。
ＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニンを取り込ませたＥＰＰｌｂ試料について１Ｈ−１３ＣＣＴ−ＨＳＱＣを測定した。〔ｕｌ−１３Ｃ；１５Ｎ〕−メチオニンを組み込んだ従来法との比較を図７に示す。図７より、ＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニンを組み込んだ蛋白質は、従来法に比べ単純化されていることがわかる。また長鎖アミノ酸の側鎖の信号を高感度で観測することができることから、従来は利用できなかった長鎖アミノ酸の側鎖のＮＭＲ信号を構造情報の取得に利用できる。
すなわち、この出願の発明の手段を適用することにより、構造決定に不要なシグナルは除去され、残余シグナルの感度が向上することから、従来の限界を超えた高分子量蛋白質の迅速かつ確実なシグナル解析及び立体構造の高精度決定が可能になる。
実施例６  β位のＳＳＤ標識した芳香族アミノ酸を組み込んだ蛋白質の調製とＮＭＲ測定
（２Ｓ，３Ｒ）及び（２Ｓ，３Ｓ）−〔３，２′，３′，４′，５′，６′−２Ｈ６；１，３−１３Ｃ２；２−１５Ｎ〕−フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンの合成
文献記載の方法（Ｍａｋｏｔｏ  Ｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，１９９５，１６０３）を参考に合成した。
＜標識蛋白質の調製＞
上記の立体選択的に重水素で標識された芳香族アミノ酸を組み込んだ蛋白質試料は、モデル蛋白質にＥＰＰｌｂ蛋白を用い論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）により調製した。
＜標識蛋白質のＮＭＲ測定例＞
ＮＭＲ試料は論文記載の条件（Ｅ．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １８，７５−７６，２０００）を用い、論文記載の蛋白質主鎖ＮＭＲ信号の帰属の情報をもとに帰属した。
標識芳香族アミノ酸を取り込ませたＥＰＰｌｂ試料について１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣを測定した。従来法との比較を図８に示す。この図８より明らかなように、従来法では混み合ったＮＭＲスペクトルになるが（ａ及びｂ）、ＳＳＤ標識アミノ酸を取り込ませた蛋白質ではＮＭＲスペクトルは単純化される（ｃ及びｄ）。また立体特異的な信号の帰属も誤りなくできる。
Ｈｉｓ９２におけるスライスデータを図９に示す。図９のようにＳＳＤ標識したヒスチジンは、ＣＨ，ＨＨ双極子相互作用がなくなるため重水素化されていないヒスチジン残基に比べ信号強度が約７倍増大する。
すなわち、この出願の発明の手段を適用することにより、構造決定に不要なシグナルは除去され、残余シグナルの感度が向上することから、従来の限界を超えた高分子量蛋白質の迅速かつ確実なシグナル解析及び立体構造の高精度決定が可能になる。
実施例７  安定同位体標識アミノ酸（以下、ＳＡＩＬアミノ酸ともいう）のみからなる蛋白質の調製とＮＭＲ測定及び構造解析
上記実施例において合成したＳＡＩＬアミノ酸以外のＳＡＩＬアミノ酸、すなわちＳＡＩＬアラニン、ＳＡＩＬバリン、ＳＡＩＬイソロイシン、ＳＡＩＬセリン、ＳＡＩＬプロリン及びＳＡＩＬアルギニンは、以下に示す手法により合成した。
ＳＡＩＬアラニンの合成
［１，２−１３Ｃ２；２−１５Ｎ］グリシンメチルエステルのベンゾフェノンイミンを用いたシッフ塩基アルキル化により合成した。合成したＳＡＩＬアラニンの構造式を図１に示す。
ＳＡＩＬバリンの合成
目的とする標識パターンになる様に文献記載の方法（Ｊａｃｋ  Ｅ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，４０８９−４１００，（１９９５））を一部変更して合成した（スキーム６）。すなわち、基質に［１，２，３，４−１３Ｃ４；２−１５Ｎ］アスパラギン酸を用い、工程３９におけるメチル化剤に［２Ｈ３］ヨウ化メチルを用い、工程４０における還元条件にＮａＢＤ４／ＭｅＯＤを用いた。
2003053910.tif 000012
ＳＡＩＬプロリンの合成
文献記載の手法（Ｍ．Ｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，９２７５−９２７８，１９９９）を均一に１３Ｃ、１５Ｎ標識したＬ−グルタミン酸から誘導した。合成したＳＡＩＬプロリンの構造式を図１に示す。
ＳＡＩＬアルギニンの合成
スキーム７に沿って合成した。工程４１から工程３８を詳細に説明する。
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＜工程４１＞
工程１３で得られた化合物（１５）（２．４１ｇ，１０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解した後、この溶液に室温で塩化チオニル（１１．９ｇ，１００ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌し次いで４０℃で２時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。得られた残渣をベンゼンに溶解した後、アルゴン雰囲気下テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０．２１ｇ，５ｗ／ｗ％）及び重水素化トリブチルスズ（３．２２７ｍｌ，１２ｍｍｏｌ）を加え室温で５分間撹拌した。反応混合物を濃縮後、ヘキサン：酢酸エチル＝７：３を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し化合物（４２）（２．１０１ｇ，９．３４ｍｍｏｌ，９３％）を得た。
＜工程４２＞
（２Ｒ）−［２−１５Ｎ］−フェニルグリシノール（０．４４ｇ，３．２ｍｍｏｌ）を化合物４２（０．７２１ｇ，３．２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（３２ｍｌ）に加え窒素雰囲気下室温で１時間撹拌した。さらに、［１３Ｃ］−シアン化ナトリウム（０．３２ｇ，６．４ｍｍｏｌ）及び酢酸（０．３８７ｍｌ，６．４ｍｍｏｌ）を順次加え室温で２４時間撹拌した。反応混合物に６Ｍ塩酸（１０ｍｌ）を加えた後、クロロホルムを用いて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮した。残渣をヘキサン／酢酸エチルを用いたフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し化合物４３（０．７６２４ｇ，２．０４４ｍｍｏｌ，６４％）を得た。
＜工程４３＞
工程４２で得られた化合物４３（０．７６２４ｇ，２．０４４ｍｍｏｌ）をメタノール：クロロホルム＝１：２の溶液（２４ｍｌ）に溶かし、０℃に冷却した後酢酸パラジウム（１．５５ｇ，３．１７ｍｍｏｌ）を加え５分間撹拌した。反応溶液に０．２Ｍリン酸緩衝液（５０ｍｌ）を加え０℃で４０分撹拌した。その後生じた結晶を濾過した後濾液をクロロホルムを用いて抽出した。クロロホルム層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮し、残渣に濃塩酸（５０ｍｌ）を加え１４０℃の油浴の５時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮後Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８を用いてイオン交換することによりオルニチン（０．５８３ｇ）が得られた。得られたオルニチンを水（３ｍｌ）に溶解し塩基性炭酸銅（１．６２ｇ，７．３２ｍｍｏｌ）を加え８０℃で２４時間撹拌した。不溶な結晶を濾過により取り除いたの後濾液を凍結乾燥により濃縮した。得られた固体を水（１．８ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した後、そこにＯ−メチルイソ尿素塩酸塩（０．２４６ｇ，２．１１６ｍｍｏｌ）、次いで７．４％水酸化ナトリウム水溶液（１．１５ｍｌ，２．１１６ｍｍｏｌ）を加え室温に戻し５日間撹拌した。反応溶液をＤｏｗｅｘ５０ｗ−Ｘ８を用いて精製し、得られたアルギニンに塩酸を加えｐＨを６にし凍結乾燥することによりアルギニン塩酸塩（０．３９４ｇ，１．７６５ｍｍｏｌ）を得た。
＜工程４４＞
（２Ｒ）−［２−１５Ｎ］フェニルグリシノールの合成
５０ｍｌのオートクレーブ管に磁気撹拌子、α−ブロモフェニル酢酸（４．３ｇ，２０ｍｍｏｌ）及びメタノール（２０ｍｌ）を入れ、これを氷浴により冷却した。そこにアンモニアガスを飽和になるまで注入した後密封し室温に戻して２４時間撹拌した。反応系に生じた結晶を濾取した後乾燥することにより（２ＳＲ）−［２−１５Ｎ］フェニルグリシン（２．７３３ｇ，１７．９８ｍｍｏｌ）を得た。得られた（２ＳＲ）−［２−１５Ｎ］フェニルグリシンを文献記載の方法（Ｔ．Ｓｈｉｒａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，６４，１９１−１９５，１９９１）により（２Ｒ）−［２−１５Ｎ］フェニルグリシンに変換した。収量は、１．９０ｇ（１２．４９８ｍｍｏｌ）であった。得られた（２Ｒ）−［２−１５Ｎ］フェニルグリシンを文献記載の方法（Ｅｒｎｅｓｔｏ  Ｎｉｃｏｌ□ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８，７６６−７７０，１９９３）により（２Ｒ）−［２−１５Ｎ］フェニルグリシノールに変換した。収量は（１０．１２５ｍｍｏｌ）であった。
ＳＡＩＬイソロイシンの合成
ＳＡＩＬイソロイシンは下記に示した文献を参考にスキーム８及びスキーム９に沿って合成した。
2003053910.tif 000014
2003053910.tif 000015
＜工程４５、工程４６＞
１３Ｃ均一標識酒石酸誘導体を原料に用いて文献記載（Ｖ．Ｓｃｈｕｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４５，５３８−５４１，１９８０）の方法を利用し［１，２，３，４−１３Ｃ４；１，１，４，４−２Ｈ４］２，３−ブタンジオールを合成した。
＜工程４７から工程５１＞
工程４６により得られたブタンジオールを文献記載（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｋ．Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０２，７３４４−７３４８，１９８０）の手法を利用してイソ酪酸へ誘導した。
＜工程５１から工程５４＞
工程５１により得られたイソ酪酸を文献記載（Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｍ．Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔ．，３７，１５１７−１５２０，１９９６）の方法を利用しＳＡＩＬイソロイシンに変換した。
ＳＡＩＬスレオニンの合成
ＳＡＩＬスレオニンは下記に示した文献を参考にスキーム１０に沿って合成した。
2003053910.tif 000016
＜工程５５＞
化合物（８）（７９４ｇ，２．２１ｍｍｏｌ）を文献記載の手法（Ｙ．Ｕｅｎｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７９５，（１９８３））を用いて化合物（５１）（５００ｍｇ，２．２６ｍｍｏｌ）に変換した。
＜工程５６＞
化合物（５１）（５００ｍｇ，２．２６ｍｍｏｌ）を塩化メチン３０ｍｌに溶かし、０℃まで温度を下げ、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬（１．９０ｇ，４．４９ｍｍｏｌ）を加えて０℃のまま撹拌した。室温まで昇温させて１．５時間撹拌した。１２ｇのチオ硫酸ナトリウムを溶かした飽和炭酸水素ナトリウム６０ｍｌと酢酸エチル５０ｍｌを加え再び５分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム５０ｍｌで２回、水５０ｍｌで１回、ブライン５０ｍｌで１回洗浄、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して化合物（５２）を得た。
＜工程５７＞
化合物（５２）をメタノール２０ｍｌに溶かしたものを０℃まで温度を下げ、これに水素化ホウ素ナトリウム（７０ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍｌに溶かして加えた、２分後に氷浴から出して１．５時間撹拌を続けた。アセトン１０ｍｌを加えさらに５分間撹拌した。水２０ｍｌを加えて、減圧濃縮後、これに酢酸エチル４０ｍｌを加えて水（４０ｍｌ×１）、ブライン（４０ｍｌ×１）で洗浄し有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して化合物（５３）を得た。
＜工程５８＞
化合物（５３）を塩化メチレンに溶解し窒素置換して、ジメチルアミノピリジン（５００ｍｇ，４．０３ｍｍｏｌ），トリフルオロメタンスルホニルクロライド（５００μｌ，４．６８ｍｍｏｌ）を加えこれを０℃の条件下１時間撹拌して、これに酢酸エチル３０ｍｌを加えて水（２０ｍｌ×２）、ブライン（２０ｍｌ×１）で洗浄し有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して化合物（５４）を得た。
＜工程５９＞
化合物（５４）をトルエン８０ｍｌに溶解し窒素置換して、フタルイミドカリウム（１．４０ｇ，７．６８ｍｍｏｌ）、１８−ｃｒｏｗｎ−６（１５０ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、これを１３０℃の条件下３日間撹拌して冷却後、これに酢酸エチル１００ｍｌを加えて水（５０ｍｌ×２）、ブライン（５０ｍｌ×１）で洗浄し有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮した。反応混合物をヘキサン：酢酸エチル＝１：１のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（５５）（４２１ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ，６０％）を得た。
＜工程６０＞
化合物（５５）（３８９ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ）を文献記載の手法（Ｆｒｉｅｄｅｒ  Ｗ．Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．７９０，１９８８）を用いて化合物（５６）（３０９ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）に変換した。
＜工程６１＞
化合物（５６）（３０９ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）を１Ｎ−塩酸５０ｍｌで１２時間還流させた。冷却後生じた白色針状結晶をろ取し、ろ液をＤｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８で精製し、スレオニン（５７）を得た。（５０ｍｇ，０．４００ｍｍｏｌ）
ＳＡＩＬセリンの合成
［１，２，３−１３Ｃ３；２−１５Ｎ］セリンを文献記載の方法（Ｍａｒｋ  Ａ．Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３，３６３１−３６４６，１９９８）利用しアルデヒド体（５８）に誘導した後、これをスキーム１１に沿って（Ｓ）−ＢＩＮＡＬ−Ｄを用いて不斉還元後加水分解することによりＳＡＩＬセリン（６０）へ誘導した。合成したＳＡＩＬセリンの構造を図１に示す。
2003053910.tif 000017
＜工程６２＞
ＬｉＡｌＤ４（５７．５８７ｍｏｌ，５７．５８７ｍｌ）、ＥｔＯＤ（５８．１６２ｍｍｏｌ，２．７３８ｇ，４１９ｇ）ｉｎ  ＴＨＦ（２９ｍｌ）、ＴＨＦ（８０ｍｌ）に溶解した（Ｓ）−（−）−Ｂｉｎａｐｈｔａｌ（５８．７３８ｍｍｏｌ，１６．８１９ｇ）を順に加え、アルゴン気流下、室温で３０分撹拌後、−１００度にして、化合物５８（３．７２８ｇ，１２．７９７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１３ｍｌ）溶液を加え３時間撹拌後、−７８度で１８時間撹拌した。０．５Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍｌ）で後処理後、セライトを用いてろ過し、エーテルで抽出後濃縮することにより化合物５９を得た（収率１５％）。
＜工程６３＞
化合物５９（１．４５１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（０．７ｍｌ）と、Ｈ２Ｏ（０．５０ｍｌ）を加えて、室温で３０分撹拌後濃縮した。ＣｓＣＯ３（９．６ｍｍｏｌ，３．１４ｇ）を加え、ＭｅＯＨ（２２．５ｍｌ）とＨ２Ｏ（６ｍｌ）に溶解し、１７時間撹拌後ＨＣｌを用いて酸性にした後イオン交換することによりＳＡＩＬ−セリン（６０）を得た。
システイン合成
ＳＡＩＬシステインはスキーム１２に沿って合成した。
2003053910.tif 000018
＜工程６４＞
ＴＨＦ（６ｍｌ）に、ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（２．４６ｍｍｏｌ，６１８ｍｇ）、を加え、アルゴン雰囲気下、０度にした。そして、ＤＥＡＤの４０％トルエン溶液（２．４６ｍｍｏｌ，１．１２ｍｌ）を加えた。ここに、化合物５９（１．２３ｍｍｏｌ，３５６ｍｇ）とｔｈｉｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（２．４６ｍｍｏｌ，１８７ｍｇ）のＴＨＦ（３ｍｌ）溶液を２分かけて摘下した。そして、０度で１時間、室温で１時間、攪拌を行った。濃縮後、カラムで生成し、化合物７を得た。化合物８（０．３２６，０．９４ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（５．０ｍｌ）、２Ｎ  ＮＨ４ＯＨ（５ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、濃縮し化合物８を得た。そして脱保護し、イオン交換樹脂で生成を行ったところ、２７％の収率で目的化合物６１が得られた。
＜アスパラギンの合成＞
ＳＡＩＬアスパラギン酸を文献記載の方法（Ａ．Ｆ．Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，４６１５，１９５３）利用し、窒素源に１５Ｎ標識アンモニアガスを用いて合成した。
＜標識蛋白質の調製＞
上記の標識アミノ酸を組み込んだ蛋白質試料は、モデル蛋白質にカルモジュリン蛋白を用いた。カルモジュリンの発現は無細胞蛋白質合成法の内、Ｚｕｂａｙによって確立された手法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ｐｐ２０１−２２３，Ｏｘｆｏｒｄ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ）に従って行った。その手法との相違点は大腸菌抽出液をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により脱塩処理したことと、アミノ酸混合物として上記のアミノ酸を残基数に比例した割合で混合したもの（図１１）を用いたことである。カルモジュリン発現用ＤＮＡは、カルモジュリンの配列を挿入したｐＥＴ−３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。この無細胞合成系により３７℃にて８時間の反応を行い、アミノ酸混合物４４ｍｇから４．４ｍｇの精製カルモジュリンを得た。この様にして調製したＳＡＩＬカルモジュリンの重水素化率は５６％となり、アミノ酸側鎖のシグナル数は重水素標識していない時に比べて６０％にまで減少した。
＜標識蛋白質のＮＭＲ測定＞
この様にして得られたＳＡＩＬカルモジュリン４．４ｍｇを１ｍＭのＮＭＲ試料となるように１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＮａＮ３、１０％Ｄ２Ｏ、ｐＨ６．５に溶解させた。ＳＡＩＬカルモジュリンの比較対象として重水素標識していないカルモジュリンを用いた。すべてのＮＭＲ測定はＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ６００、またはＤＲＸ８００を用い、３７℃にて行った。ＮＭＲスペクトル変換にはＸＷＩＮＮＭＲ  ｖｅｒ．２．６（Ｂｒｕｋｅｒ）もしくはＮＭＲＰｉｐｅ  ｖｅｒ．１．７（Ｄｅｌａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，２７７−２９３，１９９５）を用いた。これらの１Ｈ−１３ＣＣＴ−ＨＳＱＣスペクトルを図１２に示す。ＳＡＩＬカルモジュリンのスペクトルでは、シグナルの先鋭化、縮重の軽減が見られる。またＳＡＩＬカルモジュリンのスペクトルは線幅の先鋭化により均一標識カルモジュリンよりも数倍感度良く測定することができた。
その他、カルモジュリンの主鎖、側鎖に由来するＮＭＲシグナルを帰属する目的で下記の測定をおこなった。
１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、１５Ｎ−ＴＯＣＳＹ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＴＯＣＳＹ（ａｒｏｍａｔｉｃ）、ＮＯＥＳＹ（ａｒｏｍａｔｉｃ）
以上の測定の内、１Ｈ−１３Ｃ  ＣＴ−ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹにおいては連続波による重水素デカップリングを適用した。
以上の測定から得られるスペクトルをＳｐａｒｋｙ  ｖｅｒ．３．１０５（ＵＣＳＦ）により解析し、シグナルの帰属を行った。
また、立体構造計算に用いるＮＯＥを検出するために、１５Ｎ−ＮＯＥＳＹ、１３Ｃ−ＮＯＥＳＹ、１Ｈ−１ＨＮＯＥＳＹ測定を行った。
＜標識蛋白質の構造計算＞
上記主鎖、側鎖シグナルの帰属結果を用いて、ＮＯＥＳＹスペクトル解析と立体構造計算を行った。この過程においてはＮＯＥＳＹ自動解析プログラムであるＣＡＮＤＩＤ（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＮＯＥａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＣＡＮＤＩＤ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｏｒｓｉｏｎ  ａｎｇｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ＤＹＡＮＡ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１９，２０９−２２７．）と構造計算用ねじれ角動力学アルゴリズムであるＤＹＡＮＡ（Ｐ．Ｇｕｎｔｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｔｏｒｓｉｏｎ  ａｎｇｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒＮＭＲ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｐｒｏｇｒａｍ  ＤＹＡＮＡ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，２８３−２９８．）を連携させたプログラム、ＣＹＡＮＡ（ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ＮＭＲ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｃ  ｂｙ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇｕｎｔｅｒｔ）（Ｐ．Ｇｕｎｔｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，２８３−２９８（１９９７）．Ｔ．Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１９，２０９−２２７，（２００２））を用いた。このＣＹＡＮＡを１４Ｘｅｏｎプロセッサー搭載のＬｉｎｕｘクラスター上で動作させた。ＮＯＥ解析から２０個の立体構造を決定するまでの１サイクルを自動反復により合計７サイクル繰り返した。７サイクル終了後、最終的な構造計算に用いたデータを下記に示す。
2003053910.tif 000019
均一標識体を用いて手動でＮＯＥＳＹスペクトル解析を行った場合では立体構造計算に数ヶ月以上を要していた。しかし上述の手法ではわずか約３０分で構造を決定することが可能になった。この大幅な所要時間の短縮は、構造決定に不要なシグナルが除去され、残余シグナルの感度と分解能が向上したために確実なシグナル解析がなされたことと、自動化プログラムの補助に由来する。得られた最終２０構造の図を図１３に示す。
すなわち、この出願の発明の手段を適用することにより、構造決定に不要なシグナルは除去され、残余シグナルの感度が向上することから、従来の限界を超えた高分子量蛋白質の迅速かつ確実なシグナル解析及び立体構造の高精度決定が可能になる。
以上のように、実施例１〜７では、様々な同位体標識パターンを有するアミノ酸類の合成、およびそれら標識アミノ酸類を無細胞蛋白質調製法により標的蛋白質に、効率良く、又代謝変換・希釈なしに組み込む技術、さらには得られた標識蛋白質のＮＭＲスペクトルの測定から、従来の同位体利用ＮＭＲ技術をはるかに上回る高度な構造情報が、高分子量蛋白質に関して得られることを示した。さらに実施例７では、蛋白質を構成する２０種類全てのアミノ酸残基を図１で示した標識アミノ酸類に一括して置換したＲＳＤ／ＳＳＤ／ＳＡＤ／ＰＤＭ−アミノ酸標識蛋白質の調製とそれらの立体構造決定への応用を行った。残余プロトンの立体化学的帰属が明瞭であるこの出願の発明手段を用いることにより、これにより標識された蛋白質は、高精度の溶液構造の決定を迅速且つ精密に達成することが可能であることを示した。また、図１０に示したように、コンピュータ上の計算実験から、残余プロトンの立体化学的帰属が明瞭であるこの出願の発明手段を用いることにより、標識された蛋白質（ｃ）は、全てのプロトン情報が得られた場合（ｂ）と遜色ない高精度の溶液構造の決定が可能であることを示している。
もちろん、この出願の発明はその細部においてさらに様々な実施の形態が可能であることは言うまでもない。
実施例８：安定同位体標識フマル酸の合成
（１）安定同位体標識酢酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル化
オートクレーブ管を−５０℃に冷却し、液化イソブテン（１８ｍｌ，２０９ｍｍｏｌ）を注入した。［１−１３Ｃ］酢酸（１３ＣＨ３１３ＣＯ２Ｈ；ＩＳＯＴＥＣ  ｉｎｃ．製）（４ｍｌ，６９．５ｍｍｏｌ）とＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）Ｒ１５（Ｒｏｈｍ  Ｈａａｓ社製）（０．０４ｇ，１ｗｔ％）を加えて密封し、室温に戻して５時間攪拌した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）Ｒ１５は、濾過により除去した。得られた酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの収率は９１％であった。
（２）安定同位体標識ブロモ酢酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル化
オートクレーブ管を−５０℃に冷却し、液化イソブテン（３０ｍｌ，３２１ｍｍｏｌ）を注入した。［１−１３Ｃ］ブロモ酢酸（１３ＣＨ２Ｂｒ１３ＣＯ２Ｈ；ＩＳＯＴＥＣ  ｉｎｃ．製）（１４．３２ｇ，１０３ｍｍｏｌ）とＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）Ｒ１５（Ｒｏｈｍ  Ｈａａｓ社製）（０．０７ｇ，０．５ｗｔ％）を加えて密封し、室温に戻して２４時間攪拌した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）Ｒ１５は、濾過により除去した。得られたブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの収率は９７％であった。
（３）安定同位体標識フマル酸の合成
窒素雰囲気化で、上記（１）で合成された酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．３３８ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）とジメチルプロピレンウレア（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（１．２０９ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン１０ｍｌを三口のナスフラスコに入れ、−７８℃に冷却した。次に、２Ｍ−リチウムジイソプロピルアミド−テトラヒドロフラン溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（１０ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）を滴下し、−７８℃で１時間攪拌し後、さらに塩化フェニルセレネニル（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（１．９２８ｇ，１０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１５ｍｌに溶かし滴下した。
−７８℃で２時間攪拌した後、上記（２）で合成されたブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．４７７ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、さらに滴下した。−７８℃で１時間攪拌した後、室温に戻し、さらに室温で１時間攪拌した。
飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、ジエチルエーテルを用いて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した。
さらに、残渣を塩化メチレン（４０ｍｌ）に溶かし、炭酸水素ナトリウム（２．５２ｇ，３０ｍｍｏｌ）を加えて−７８℃に冷却した。ｍ−クロロ過安息香酸（東京化成社製）（３．４５１ｇ，１３ｍｍｏｌ）を加えた後、室温に戻し、１．５時間攪拌した。得られた反応混合物を水洗した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。
残渣をテトラヒドロフラン４０ｍｌに溶解した後０℃に冷却した。そこに３０％過酸化水素水（５ｍｌ，４４ｍｍｏｌ）を滴下し、室温に戻した後１時間攪拌した。反応混合物をジエチルエーテルにより抽出し、エーテル層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、リン酸二水素ナトリウム水溶液、および飽和食塩水を用いて順次洗浄した。エーテル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、さらに減圧濃縮した。
残渣をヘキサン：酢酸エチル＝９８：２の溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、フマル酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。得られたフマル酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステルに１Ｍ塩酸２０ｍｌを加え、１１０℃で２時間攪拌した後、減圧濃縮して安定同位体標識フマル酸を収率６１％（０．７１３ｇ，６．１４ｍｍｏｌ）で得た。
実施例９：フマル酸のＤ−酒石酸ジエチルエステルへの変換
実施例８で得られた安定同位体標識フマル酸（０．１１９ｇ，１．０２７ｍｍｏｌ）をエタノールに溶解し、０℃に冷却した後、塩化チオニル２．５等量を滴下した。室温に戻した後、２時間攪拌した。
濃縮して亜硫酸ガスを除去した後、ジエチルエーテルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、吸引濾過し、濃縮した後、フマル酸ジエチルエステルを得た。
ｔｅｒｔ−ブタノール：水＝１：１の溶媒（１０ｍｌ）にＡＤ−ｍｉｘ−β（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（１．４５ｇ）を溶かした。さらに、メタンスルホアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（０．１０１ｇ，１．０６１ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却し、そこにフマル酸ジエチルエステルを一度に加え、０℃で２４時間、激しく攪拌した。さらに、亜硫酸ナトリウム（ＷＡＫＯ社製）（１．５ｇ）を加え、室温に戻して１時間攪拌した後、塩化メチレンで抽出し、さらにリン酸二水素ナトリウムで洗浄した。
無水硫酸マグネシウムで乾燥した後減圧濃縮し、残渣をヘキサン：酢酸エチル＝７：３を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｄ−酒石酸ジエチルエステル（０．１５１ｇ，０．７３２ｍｍｏｌ，７１％，＞９９％ｅｅ）を得た。
同定結果を表１に示した。
2003053910.tif 000020
ただし、測定は、１Ｈ  ＮＭＲはＶａｌｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ３００を用いてすべて１３Ｃデカップル（１Ｈ［１３Ｃ］ＮＭＲ）して行い、非標識のものと比較して結果を得た。
以上詳しく説明したように、本発明の第１から第３の態様によって、蛋白質全体の重水素置換を残余シグナルの感度を向上させると同時に達成することができ、従来の限界を超えた高分子量蛋白質の迅速かつ確実なシグナル解析及び立体構造の高精度決定が可能になる。
つまり、次のような効果が奏せられる。
（１）ＮＭＲシグナルの線幅が著しく鋭くなる（シグナルの分離能の向上）。
（２）測定感度の向上（測定時間の短縮）
（３）ＮＭＲスペクトル解析の精度向上、解析時間の短縮・自動化等が可能。
（４）ＮＭＲの応用が可能な蛋白質分子量限界の拡張（約２倍以上、即ち５万程度の構造決定が可能）。
（５）構造解析の精度向上（全てのシグナルの立体特異的帰属が自動的になされるため）。
（６）側鎖末端迄のシグナルを利用した構造決定、構造情報の取得が可能（ゲノム創薬・ドラッグデザインへの応用）。
このため、構造ゲノム科学で要求される、高精度・ハイスループットな構造決定にとっても、この出願の発明とその延長上に明瞭に想定される構造決定技術は極めて有効である。
又、本発明の第４〜第７の態様によって、安価な安定同位体試薬である安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸をカップリングすることにより、これまで入手が困難であった位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸と酒石酸を効率良く製造する方法が提供される。この発明の方法では、あらゆるパターンの同位体標識フマル酸や酒石酸の製造が可能な上、収率や光学純度も高い。
近年、蛋白質の立体構造解析等において、安定同位体標識フマル酸や安定同位体酒石酸が用いられており、需要が高まっていることからも、この出願の発明の位置選択的安定同位体標識フマル酸と酒石酸の製造方法は、有用性が高いといえる。
【図面の簡単な説明】
図１：  蛋白質を構成する２０種類のアミノ酸についての、重水素化デザインされた構造を例示した図である。
図２：  ＳＳＤ−グリシンを組み込んだＥＰＰ１ｂ蛋白質（１８．２ｋＤａ）の１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを比較例示した図である。
図３：  ＳＡＤ−リジンを組み込んだＥＰＰ１ｂ蛋白質（１８．２ｋＤａ）のＨＣＣＴ  ＴＯＣＳＹスペクトルを比較例示した図である。
図４：  ＳＡＤ−グルタミンを組み込んだＥＰＰ１ｂ蛋白質（１８．２ｋＤａ）のＨＣＣＴ  ＴＯＣＳＹスペクトルを比較例示した図である。
図５：  ＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンを組み込んだＥＰＰ１ｂ蛋白質（１８．２ｋＤａ）の１Ｈ−１３Ｃ  β領域における１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを比較例示した図である。
図６：  ＳＡＤ／ＰＤＭ−ロイシンを組み込んだＥＰＰ１ｂ蛋白質（１８．２ｋＤａ）の１Ｈ−１３Ｃ  γ領域における１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを比較例示した図である。
図７：  ＳＡＤ／ＰＤＭ−メチオニンを組み込んだＥＰＰ１ｂ蛋白質（１８．２ｋＤａ）の１Ｈ−１３Ｃ  γ領域における１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを比較例示した図である。
図８：  β位をＳＳＤ標識した芳香族アミノ酸を組み込んだＥＰＰＩｂ蛋白質（１８．２ｋＤａ）の１Ｈ−１３Ｃβ領域における１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを比較例示した図である。
図９：  Ｈ９２の信号のスライスデータを比較例示した図である。
図１０：  リゾチームの構造計算のシミュレーションの結果を例示した図である。
図１１：  カルモジュリン蛋白質の合成に用いた安定同位体標識アミノ酸（ＳＡＩＬアミノ酸）の組み合わせを示す。
図１２：  図１１に示したＳＡＩＬアミノ酸の組み合わせを用いて合成したカルモジュリン蛋白質の１Ｈ−１３Ｃ  ＣＴ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。
図１３：  図１１に示したＳＡＩＬアミノ酸の組み合わせを用いて合成したカルモジュリン蛋白質のＣＹＡＮＡによる構造計算により得られた最終２０構造の図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月24日(2004.2.24)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を構成するアミノ酸の少なくとも一種であって、次の標識パターン；
（ａ）１または２以上のメチレン基においてメチレン水素のうちの少なくとも一つの水素を残して他は重水素化されている
（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基において一方のメチル基の水素は完全に重水素化されている
（ｃ）プロキラルメチル基においてメチル基の水素は部分重水素化されている
（ｄ）メチル基は一つの水素を残して他は重水素化され、芳香環水素は部分重水素化されている
の少なくともいずれかを有していること、及び窒素が全て１５Ｎに置換されていることを特徴とする安定同位体標識アミノ酸。
【請求項２】
メチレン基および／またはメチル基において残余の水素を持つ炭素の全てが１３Ｃに置換されていることを特徴とする請求項１の安定同位体標識アミノ酸。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が、次の標識パターン
（ａ）水素原子を２つ有するメチレン基が存在する場合には、メチレン水素のうちの一つが重水素化されている、
（ｂ）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水素が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されている、
（ｄ）上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他は重水素化されているか、又は該メチル基の全てのメチル基が重水素化されている、
（ｅ）芳香環水素が存在する場合には、該芳香環水素は部分重水素化されていてもよい、
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）において重水素化された後において、水素原子を持つメチレン基および／またはメチル基の炭素の全てが１３Ｃに置換されている、
（ｇ）窒素が全て１５Ｎに置換されている
を満たすことを特徴とする標的蛋白質を構成する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項５】
（ｅ）芳香環水素が存在する場合には、該芳香環水素が部分重水素化されている、請求項４記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項６】
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）において重水素化された後において、水素原子を持つメチレン基およびメチル基の炭素の全てが１３Ｃに置換されている、請求項５記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項７】
アミノ酸のカルボニル基及びグアニジル基を構成する炭素が１３Ｃに置換されている、請求項６記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
【請求項８】
請求項１記載の安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法であって、無細胞蛋白質合成により組み込むことを特徴とする安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法。
【請求項９】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項４記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いて、無細胞蛋白質合成を行うことを含む、安定同位体標識アミノ酸で構成される標的蛋白質の調製方法。
【請求項１０】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項５記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いる、請求項９記載の標的蛋白質の調製方法。
【請求項１１】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項６記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いる、請求項９記載の標的蛋白質の調製方法。
【請求項１２】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項７記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを用いる、請求項９記載の標的蛋白質の調製方法。
【請求項１３】
請求項１記載の安定同位体標識アミノ酸を標的蛋白質に組み込みＮＭＲスペクトルを測定して構造解析することを含む蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１４】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項４記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる標的蛋白質の構造をＮＭＲスペクトル測定により解析することを含む標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１５】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項５記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる請求項１４記載の標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１６】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項６記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる請求項１４記載の標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１７】
標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項７記載の安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる請求項１４記載の標的蛋白質のＮＭＲ構造解析方法。
【請求項１８】
安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸をカップリングすることを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法。
【請求項１９】
安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸を各々ｔｅｒｔ−ブチルエステル化し、これらを酸化的にカップリングした後、酸加水分解することを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法。
【請求項２０】
安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸を各々酸触媒の存在下に液化イソブテンと接触させて、安定同位体標識酢酸と安定同位体標識ブロモ酢酸をｔｅｒｔ−ブチルエステル化する請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
安定同位体標識酢酸から得られる酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをエノラートとした後、有機セレン化合物の存在下で、安定同位体標識ブロモ酢酸から得られるブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを加え、酸化し、さらに加水分解することを含む位置選択的に安定同位体標識されたフマル酸の製造方法。
【請求項２２】
請求項１８の方法で製造された安定同位体標識フマル酸を不斉ジヒドロキシル化試薬により酸化した後、さらに加水分解することを含む安定同位体標識酒石酸の製造方法。
【請求項２３】
不斉ジヒドロキシル化試薬が、ＡＤ−ｍｉｘ−α及びＡＤ−ｍｉｘ−βからなる群から選択される請求項２２の安定同位体標識酒石酸の製造方法。
【国際調査報告】
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2003053910.tif 000035
2003053910.tif 000036
2003053910.tif 000037
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