(57)【要約】本発明は、さまざまな種類の標的細胞へのさまざまな選定分子の高効率な遺伝子の導入およびＨＴＳ化が可能である、標的細胞への選定分子の導入方法を提供するために、標的細胞への選定分子の導入方法であって、前記標的細胞の近傍に前記選定分子を添加するステップと、前記標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持するステップと、前記低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップと、前記低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、前記標的細胞に前記低温ガスプラズマを照射するステップと、を備える、標的細胞への選定分子の導入方法を提供する。
2004015101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞への選定分子の導入方法であって、
前記標的細胞の近傍に前記選定分子を添加するステップと、
前記標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持するステップと、
前記低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップと、
前記低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、
前記標的細胞に前記低温ガスプラズマを照射するステップと、
を備える、標的細胞への選定分子の導入方法。
【請求項２】
標的細胞の細胞融合方法であって、
複数の前記標的細胞が近傍に存在することとなるように添加するステップと、
前記標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持するステップと、
前記低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップと、
前記低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、
前記標的細胞に前記低温ガスプラズマを照射するステップと、
を備える、標的細胞の細胞融合方法。
【請求項３】
低温ガスプラズマを発生するためのエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給手段と、
前記低温ガスプラズマの照射領域を調節するプラズマ照射領域調節手段と、
選定分子が導入されるべき標的細胞を前記照射領域に保持する保持手段と、
を備えた、プラズマ照射装置。
【請求項４】
低温ガスプラズマを発生するためのエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給手段と、
前記低温ガスプラズマの照射領域を調節するプラズマ照射領域調節手段と、
細胞融合させるべき標的細胞を前記照射領域に保持する保持手段と、
を備えた、プラズマ照射装置。
【請求項５】
前記保持手段は、標的細胞または標的細胞を保持する容器を保持する試料台である、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項６】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記プラズマ発生エネルギー供給手段に対してガスを供給するガス供給手段を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項７】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記プラズマ発生エネルギー供給手段から前記保持手段への方向のガス流を発生させる前記ガス供給手段を含む、請求項６に記載のプラズマ照射装置。
【請求項８】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記ガス流の方向を変化させることができる前記ガス供給手段を含む、請求項６に記載のプラズマ照射装置。
【請求項９】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、直流または交流の電源と接続した対向する電極を含む、請求項６に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１０】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、
交流電源と接続した導電コイルと、
前記導電コイルの内部に設けた貫通空隙部を有する誘電体と、
を備える前記プラズマ発生エネルギー供給手段を含む、請求項６に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１１】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、
前記ガス流の流路の両側または片側に配置された誘電体と、
前記ガス流の流路および前記誘電体を含む領域の両側に配置された交流の電源に接続した対向する電極と、
を含む、請求項６に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１２】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記低温ガスプラズマに対して磁場を供給する手段を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１３】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、直流または交流の電源に接続した対向する電極を含む、請求項１２に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１４】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記低温ガスプラズマの発生と同期して磁場を発生するように制御されている前記磁場を供給する手段を含む、請求項１２に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１５】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記低温ガスプラズマを発生する電流の方向と直交する方向の磁場を発生するように設けられている前記磁場を供給する手段を含む、請求項１２に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１６】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記保持手段を駆動する手段を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１７】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記プラズマ発生エネルギー供給手段を駆動する手段を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１８】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、前記低温ガスプラズマの噴出口を備え、前記プラズマ照射領域調節手段は、前記低温ガスプラズマの噴出口を駆動する手段を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項１９】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記低温ガスプラズマの流路に設けられた、前記低温ガスプラズマが通過可能な領域を有する遮蔽板を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２０】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記低温ガスプラズマの流路に設けられた、前記低温ガスプラズマが通過可能な領域を互いの間に有する複数の遮蔽板を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２１】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記低温ガスプラズマが通過可能な領域の大きさが可変である前記遮蔽板を含む、請求項１９に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２２】
前記プラズマ照射領域調節手段は、単数または複数のチューブ状の前記低温ガスプラズマの噴出口を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２３】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、前記標的細胞および前記誘電体を含む領域の両側に配置された交流の電源に接続した対向する電極を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２４】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記標的細胞の両側または片側であって前記電極に挟まれた領域に配置された、形状を変化させることのできる前記誘電体を含む、請求項２３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２５】
前記誘電体は、プラスチックまたはガラスまたはセラミックスを含有する材質からなる前記誘電体を含む、請求項２３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２６】
前記誘電体は、前記標的細胞を保持する容器を含む、請求項２３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２７】
前記容器は、前記標的細胞を保持するための単数または複数の試料保持部を有する容器を含み、かつ前記電極の一方は、前記試料保持部に対応する位置に単数または複数に分岐した電極先端を備える、請求項２３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２８】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記電極先端と前記容器とを相対的に上下に駆動させる上下駆動機構を含む、請求項２７に記載のプラズマ照射装置。
【請求項２９】
前記プラズマ照射領域調節手段は、導電線と、前記道電線を被覆する誘電体と、を含む前記電極であって、前記導電線の先端は露出している前記電極を含む、請求項２７に記載のプラズマ照射装置。
【請求項３０】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、直流または交流の電源と接続した互いに形状が異なる対向する電極を含み、前記プラズマ照射領域調節手段は、前記保持手段および／または前記プラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項３１】
前記プラズマ照射領域調節手段は、
前記保持手段および／または前記プラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段と、
前記ガス流の方向を変化させることができる前記ガス供給手段と、
を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項３２】
前記プラズマ照射領域調節手段は、
前記保持手段および／または前記プラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段と、
前記低温ガスプラズマの流路に設けられた、前記低温ガスプラズマが通過可能な不均一な領域を有する遮蔽板と、
を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項３３】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、
複数の開口空隙部を有する誘電体と、
それぞれ異なる前記開口空隙部の内部に設けられ、直流または交流の電源と接続した対向する電極と、
を含む、請求項３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項３４】
前記プラズマ照射領域調節手段は、前記複数の開口空隙部のうち１以上の開口空隙部から前記保持手段への方向のガス流を発生させるガス供給手段を含む、請求項３３に記載のプラズマ照射装置。
【請求項３５】
前記プラズマ発生エネルギー供給手段は、複数に分岐し、それぞれ異なる前記開口空隙部の内部に設けられた電極先端を備え、前記複数の対向する電極のうち少なくとも一組の電極を含む、請求項３３に記載のプラズマ照射装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、標的細胞への選定分子の導入方法に関する。より詳しくは、本発明は、低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップを備える、標的細胞へのポリヌクレオチドや蛋白質や低分子化合物などの導入方法に関する。
また、本発明は、標的細胞の細胞融合方法に関する。より詳しくは、本発明は、低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップを備える、標的細胞の細胞融合方法に関する。
さらに、本発明は、標的細胞への選定分子の導入方法または標的細胞の細胞融合方法に用いるプラズマ照射装置に関する。より詳しくは、本発明は、低温ガスプラズマの照射領域を調節する機構を有する、プラズマ照射装置に関する。
【背景技術】  近年、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの解読がほぼ完了し、医学、薬学などの分野において、遺伝子工学関連の研究開発や医薬品開発を行なう際に、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やその誘導体などの高分子化合物、低分子生理活性物質、薬剤候補品などの選定分子を標的細胞内に導入し、標的細胞内での遺伝子の機能や生理活性分子の生理的な活性を試験する必要が増している。
現在のところ、標的細胞への選定分子の導入方法としては、エレクトロポレーション法、ジーンガン法、リポソーム法、細胞融合法、ウイルスベクター法などの方法が用いられているが、必ずしも十分に選定分子を細胞内に導入できるものではないという問題がある。
たとえば、エレクトロポレーション法やジーンガン法においては、多くの種類の標的細胞に応用できるが、操作が煩雑であり、ハイスループットスクリーニング化（本明細書において、ＨＴＳ化とも記載する）することが難しいという問題がある。また、リポソーム法や細胞融合法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるといった問題がある。さらに、ウイルスベクター法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるとともに、ベクターの構築に非常に多くの時間と労力とコストを要するという問題がある。
そして、いずれの方法も高価であるため、仮にＨＴＳ化できたとしても、その方法のランニングコストが非常に高価なものとなるか、あるいは、その方法に用いる装置が非常に高価なものとなるという問題がある。また、いずれの方法においても、すべての標的細胞への選定分子の導入効率が必ずしも十分に満足できる水準ではないという問題もある。
しかし、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの解読がほぼ完了し、機能未知な遺伝子の機能解析が急務となっている昨今の社会情勢の中で、ＨＴＳ化された標的細胞への選定分子の導入方法が必要不可欠な技術として、医薬品業界をはじめとする産業界からその開発を強く求められる状況となっている。
ここで、標的細胞への選定分子の導入方法をＨＴＳ化するためには、標的細胞への選定分子の導入効率を高めることが必要である。また、標的細胞への選定分子の導入方法を用いてさまざまな遺伝子の機能解析を可能にするためには、特定の限られた種類の標的細胞への遺伝子の導入が可能であるだけではなく、さまざまな種類の標的細胞への高効率な遺伝子の導入が可能である、標的細胞への選定分子の導入方法の開発が必要である。
しかし、産業界からの強い要望にも関わらず、多種類の標的細胞への高効率な選定分子の導入が可能である、標的細胞への選定分子の導入方法は、未だ公知のものとはなっていないのが現状である。
近年、遺伝子工学関連の研究開発や医薬品開発を行なう際に、同種のまたは異種の標的細胞を融合させることにより、さまざまな標的細胞の機能を試験する必要も同様に増しつつある。また、標的細胞の細胞融合方法においても同様にＨＴＳ化が強く望まれている。
現在のところ、標的細胞の細胞融合方法としては、不活性化したセンダイウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどを用いる方法、リゾレシチン、グリセロールオレイン酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを用いる方法、エレクトロポレーション法などの方法が用いられているが、必ずしも十分に細胞融合させることができるものではないという問題がある。
たとえば、エレクトロポレーション法においては、多くの種類の標的細胞に応用できるが、操作が煩雑であり、ＨＴＳ化することが難しいという問題がある。また、不活性化したウイルスを用いる方法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるといった問題がある。
さらに、いずれの方法も高価であるため、仮にＨＴＳ化できたとしても、その方法のランニングコストが非常に高価なものとなるか、あるいは、その方法に用いる装置が非常に高価なものとなるという問題がある。また、いずれの方法においても、すべての標的細胞の細胞融合効率は必ずしも十分に満足できる水準ではないという問題もある。
ここで、標的細胞の細胞融合方法をＨＴＳ化するためには、標的細胞の細胞融合効率を高めることが必要である。また、標的細胞の細胞融合方法を用いてさまざまな標的細胞の機能解析を可能にするためには、特定の限られた種類の標的細胞の細胞融合が可能であるだけではなく、さまざまな種類の標的細胞の細胞融合が可能である、標的細胞の細胞融合方法の開発が必要である。
しかし、産業界からの強い要望にも関わらず、多種類の標的細胞の高効率な細胞融合が可能である、標的細胞の細胞融合方法は、未だ公知のものとはなっていないのが現状である。
【発明の開示】
上記より、本発明の目的は、さまざまな種類の標的細胞へのさまざまな選定分子の高効率な遺伝子の導入およびＨＴＳ化が可能である、標的細胞への選定分子の導入方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、さまざまな種類の標的細胞の高効率な細胞融合およびＨＴＳ化が可能である、標的細胞の細胞融合方法を提供することである。
さらに、本発明のもう一つの目的は、さまざまな種類の標的細胞へのさまざまな選定分子の高効率な選定分子の導入、およびさまざまな種類の標的細胞の高効率な細胞融合に用いることのできる、高効率かつＨＴＳに適した装置を提供することである。
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、標的細胞の近傍に選定分子を添加するステップと、この標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持するステップと、この低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップと、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、この標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射するステップと、を備える、標的細胞への選定分子の導入方法である。
ここで、この標的細胞は、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞からなる群より選ばれる１種以上であることが好ましい。
また、この選定分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やその誘導体などの高分子化合物、低分子生理活性物質、薬剤候補品からなる群より選ばれる１種以上であることが望ましい。さらに、この選定分子は、ポリヌクレオチドを含むことが推奨される。
そして、この添加するステップは、この選定分子を含む溶液をこの標的細胞を含む細胞組成物に添加するステップを含むことが好ましい。また、この保持するステップは、固体基盤上にこの標的細胞を保持するステップを含むことが望ましい。さらに、この保持するステップは、培地表面にこの標的細胞を保持するステップを含むことが推奨される。
また、この供給するステップは、空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガス、キセノンガスからなる群より選ばれる１種以上を含むガスに、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーを供給するステップを含むことが好ましい。
さらに、この低温ガスプラズマは、低温ガスの弱電離プラズマを含むことが望ましい。また、この低温ガスプラズマは、低温ガスの非平衡プラズマを含むことが望ましい。
そして、この照射するステップは、大気圧条件下でこの標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射するステップを含むことが好ましい。
ここで、この照射するステップは、この低温ガスプラズマにガス流を供給するステップと、このガス流によりこの低温ガスプラズマをこの標的細胞の方向に移動させるステップと、を含むことが好ましい。また、この調節するステップは、このガス流の方向を変化させるステップを含むことが望ましい。
さらに、この照射するステップは、コロナ放電によりこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生するステップを含むことが推奨される。そして、この供給するステップは、直流または交流の電源により対向する電極に電圧を印加するステップを含むことが好ましい。また、この照射するステップは、このガス流中でこのコロナ放電を行なうステップと、このコロナ放電によりこのガス流中のこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生するステップと、を含むことが望ましい。
さらに、この照射するステップは、誘導結合プラズマ発生方式によりこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生するステップを含むことが好ましい。ここで、この供給するステップは、交流電源により導電コイルに電圧を印加するステップと、この電圧を印加されたこの導電コイルによりこの導電コイルの内部に設けられた貫通空隙部を有する誘電体を分極させるステップと、この分極された誘電体により前記低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをこのガスに供給するステップと、を含むことが推奨される。また、この照射するステップは、この誘電体の貫通空隙部にこのガス流を通過させるステップと、この導電コイルに交流電圧を印加してこのガス流中でこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生させるステップと、を含むことが好ましい。
そして、この照射するステップは、誘電体バリア放電によりこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生するステップを含むことが望ましい。ここで、この供給するステップは、交流の電源によりこのガス流の流路および誘電体を含む領域の両側に配置された対向する電極に電圧を印加するステップと、この電圧の印加された電極によりこのガス流の流路の両側または片側に配置されたこの誘電体を分極させるステップと、この分極された誘電体および／またはこの電圧の印加された電極により前記低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、を含むことが推奨される。また、この照射するステップは、このガス流中でこの誘電体バリア放電を行なうステップと、この誘電体バリア放電によりこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生するステップと、を含むことが好ましい。
さらに、この照射するステップは、この低温ガスプラズマに電磁気力を付加するステップと、この電磁気力によりこの低温ガスプラズマをこの標的細胞の方向に移動させるステップと、を含むことが望ましい。ここで、この調節するステップは、この低温ガスプラズマに対して磁場を供給するステップを含むことが推奨される。また、この照射するステップは、コロナ放電によりこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生するステップを含むことが好ましい。そして、この供給するステップは、交流の電源により対向する電極に電圧を印加するステップと、この電圧の印加された電極によりこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生するステップと、を含むことが望ましい。さらに、この照射するステップは、このコロナ放電と時間的に同期したこの磁場をこの低温ガスプラズマに印加するステップと、この磁場によりこの低温ガスプラズマにこの電磁気力を加えるステップと、を含むことが推奨される。また、この照射するステップは、このコロナ放電を発生させる電流の方向と空間的に直交した方向のこの磁場をこの低温ガスプラズマに印加するステップと、この磁場によりこの低温ガスプラズマにこの電磁気力を加えるステップと、を含むことが好ましい。
また、このプラズマ発生エネルギーを供給するステップは、複数の開口空隙部を有する誘電体と、それぞれ異なるこの開口空隙部の内部に設けられ、直流または交流の電源と接続した対向する電極に電圧を印加するステップを含むことが好ましい。さらに、このプラズマ照射領域を調節するステップは、ガス供給手段を用いてこの複数の開口空隙部のうち１以上の開口空隙部からこの保持手段への方向のガス流を発生させるステップを含むことが望ましい。そして、このプラズマ発生エネルギーを供給するステップは、複数に分岐し、それぞれ異なるこの開口空隙部の内部に設けられた電極先端を備え、この複数の対向する電極のうち少なくとも一組の電極を含む、対向する電極に電圧を印加するステップを含むことが推奨される。
また、この調節するステップは、この標的細胞をこの低温ガスプラズマを発生する部位に対して相対的に移動させるステップを含むことが好ましい。そして、この調節するステップは、この標的細胞をこの低温ガスプラズマを発生する部位に対して、この低温ガスプラズマを発生する部位から所定の距離に位置する平面内において、相対的に並進運動させるステップを含むことが推奨される。また、この調節するステップは、この標的細胞をこの低温ガスプラズマを発生する部位に対して相対的に回転運動させるステップを含むことが好ましい。さらに、この調節するステップは、この標的細胞をこの低温ガスプラズマを発生する部位に対して相対的に偏心回転運動させるステップを含むことが望ましい。また、この調節するステップは、この標的細胞を保持する部位を移動させるステップを含むことが好ましい。そして、この調節するステップは、この低温ガスプラズマを発生するためのエネルギーをこのガスに供給する部位を移動させるステップを含むことが望ましい。また、この調節するステップは、この低温ガスプラズマを噴出する部位を移動させるステップを含むことが推奨される。
さらに、この調節するステップは、この低温ガスプラズマの流路を部分的に遮蔽するステップを含むことが好ましい。また、この調節するステップは、この低温ガスプラズマの流路にこの低温ガスプラズマが通過可能な領域を有する遮蔽板を挿入するステップを含むことが望ましい。そして、この調節するステップは、この低温ガスプラズマの流路にこの低温ガスプラズマが通過可能な領域を互いの間に有する複数の遮蔽板を挿入するステップを含むことが推奨される。また、この調節するステップは、この低温ガスプラズマの流路にこの低温ガスプラズマが通過可能な領域の大きさが可変であるこの遮蔽板を挿入するステップを含むことが好ましい。
さらに、この調節するステップは、単数または複数のこの低温ガスプラズマの噴出口を設けるステップと、この単数または複数の噴出口によりこの低温ガスプラズマをこの標的細胞の方向に導くステップと、を含むことが望ましい。そして、この調節するステップは、単数または複数のチューブ状のこの低温ガスプラズマの噴出口を設けるステップを含むことが推奨される。また、この供給するステップは、この噴出口の内部においてこのこのガスにこの低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギー供給するステップを含むことが好ましい。
そして、この照射するステップは、誘電体バリア放電によりこの低温ガスプラズマを発生するステップを含むことが望ましい。また、この照射するステップは、この誘電体バリア放電を行なうステップと、この誘電体バリア放電によりこの低温ガスプラズマを発生させるステップと、を含むことが推奨される。さらに、この供給するステップは、この標的細胞の両側に設置された電極に交流の電源により電圧を印加するステップと、この電圧の印加された電極によりこのガスにこの低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーを供給するステップと、を含むことが好ましい。また、この照射するステップは、この標的細胞の両側または片側に誘電体を配置するステップと、この標的細胞およびこの誘電体を含む領域の両側に交流の電源に接続した対向する電極を配置するステップと、この電源によりこの電極に電圧を印加するステップと、この電圧を印加された電極によりこの誘電体を分極するステップと、この分極されたこの誘電体によりこのガスを電離させてこの低温ガスプラズマを発生させるステップと、を含むことが望ましい。そして、この調節するステップは、この誘電体の形状を変化させるステップを含むことが推奨される。また、この調節するステップは、この標的細胞の両側または片側にプラスチックまたはガラスまたはセラミックスを含有する材質からなるこの誘電体を設置するステップを含むことが好ましい。さらに、この調節するステップは、この標的細胞の両側または片側にこの標的細胞を保持する容器をこの誘電体として設置するステップを含むことが望ましい。そして、この調節するステップは、この標的細胞の両側または片側にこの標的細胞を保持するための単数または複数の試料保持部を有する容器をこの誘電体として設置するステップと、この標的細胞およびこの誘電体を含む領域の両側に交流の電源に接続した対向する電極であってこの電極の一方はこの試料保持部に対応する位置に単数または複数に分岐した電極先端を備える電極を設置するステップと、を含むことが推奨される。また、この調節するステップは、この電極先端を移動させるステップと、この電極先端とこの容器とを相対的に上下に移動させるステップと、この電極先端をこの試料保持部に挿入および脱離させるステップと、を含むことが好ましい。さらに、この調節するステップは、この容器を移動させるステップと、この電極先端とこの容器とを相対的に上下に移動させるステップと、この電極先端をこの試料保持部に挿入および脱離させるステップと、を含むことが望ましい。そして、この調節するステップは、この電極に含まれる導電線を誘電体で被覆するステップと、この導電線の先端を露出させるステップと、を含むことが推奨される。また、この照射するステップは、この容器の試料保持部の内部でこの誘電体バリア放電を行なうステップと、この低温ガスプラズマを発生させるステップと、を含むことが好ましい。
ここで、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、この添加するステップとこの保持するステップとこの調節するステップとこの供給するステップとこの照射するステップとの前に、この標的細胞と培養液とを含有する分散液からこの培養液を除去するステップを備えることが望ましい。また、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、この添加するステップとこの保持するステップとこの調節するステップとこの供給するステップとこの照射するステップとの前に、この標的細胞を前培養するステップを備えることが推奨される。さらに、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、この添加するステップとこの保持するステップとこの調節するステップとこの供給するステップとこの照射するステップとの後に、この標的細胞を後培養するステップを備えることが好ましい。
そして、本発明の標的細胞の細胞融合方法は、複数の前記標的細胞が近傍に存在することとなるように添加するステップと、前記標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持するステップと、前記低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップと、前記低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、前記標的細胞に前記低温ガスプラズマを照射するステップと、を備える、標的細胞の細胞融合方法である。
ここで、この複数の標的細胞は、同種の細胞を含むことが好ましい。あるいは、この複数の標的細胞は、異種の細胞を含むことも好ましい。また、この標的細胞は、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞からなる群より選ばれる１種以上であることが望ましい。
そして、本発明のプラズマ照射装置は、低温ガスプラズマを発生するためのエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給部と、この低温ガスプラズマの照射領域を調節するプラズマ照射領域調節部と、選定分子が導入されるべき標的細胞をこの照射領域に保持する保持部と、を備えた、プラズマ照射装置である。
また、本発明のプラズマ照射装置は、低温ガスプラズマを発生するためのエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給部と、この低温ガスプラズマの照射領域を調節するプラズマ照射領域調節部と、細胞融合させるべき標的細胞をこの照射領域に保持する保持部と、を備えた、プラズマ照射装置であってもよい。
ここで、この保持部は、標的細胞または標的細胞を保持する容器を保持する試料台であることが好ましい。
また、このプラズマ照射領域調節部は、このプラズマ発生エネルギー供給部に対して、空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガス、キセノンガスからなる群より選ばれる１種以上を含むガスを供給するガス供給部を含むことが望ましい。また、このプラズマ照射領域調節部は、このプラズマ発生エネルギー供給部に対して大気圧のこのガスを供給するこのガス供給部を含むことが推奨される。そして、このプラズマ照射領域調節部は、このプラズマ発生エネルギー供給部からこの保持部への方向のガス流を発生させるこのガス供給部を含むことが望ましい。
また、このプラズマ発生エネルギー供給部は、直流または交流の電源と接続した対向する電極を含むことが推奨される。さらに、このプラズマ発生エネルギー供給部は、このガスの流路の両側に設けられるこの電極を含むことが好ましい。
また、このプラズマ発生エネルギー供給部は、交流電源と接続した導電コイルと、この導電コイルの内部に設けた貫通空隙部を有する誘電体と、を備えるこのプラズマ発生エネルギー供給部を含むことが望ましい。ここで、このプラズマ発生エネルギー供給部は、このガスの流路の周囲に配置されたこの誘電体を含むことが推奨される。さらに、このプラズマ発生エネルギー供給部は、このガス流の流路の両側または片側に配置された誘電体と、このガス流の流路およびこの誘電体を含む領域の両側に配置された交流の電源に接続した対向する電極と、を含むことが好ましい。ここで、このプラズマ発生エネルギー供給部は、プラスチックまたはガラスを含む材質からなるこの誘電体を含むことが望ましい。
そして、このプラズマ照射領域調節部は、この低温ガスプラズマに対して磁場を供給する構造を含むことが推奨される。また、このプラズマ発生エネルギー供給部は、直流または交流の電源に接続した対向する電極を含むことが好ましい。さらに、このプラズマ照射領域調節部は、この低温ガスプラズマの発生と同期して、磁場を発生するように制御されているこの磁場を供給する構造を含むことが望ましい。そして、このプラズマ照射領域調節部は、この低温ガスプラズマを発生する電流の方向と直交する方向の磁場を発生するように設けられているこの磁場を供給する構造を含むことが推奨される。
また、このプラズマ照射領域調節部は、この保持部を駆動する構造を含むことが好ましい。ここで、このプラズマ照射領域調節部は、このプラズマ発生エネルギー供給部を駆動する構造を含むことが望ましい。さらに、このプラズマ発生エネルギー供給部は、この低温ガスプラズマの噴出口を備え、このプラズマ照射領域調節部は、この低温ガスプラズマの噴出口を駆動する構造を含むことが推奨される。
また、このプラズマ照射領域調節部は、この低温ガスプラズマの流路に設けられた、この低温ガスプラズマが通過可能な領域を有する遮蔽板を含むことが好ましい。さらに、このプラズマ照射領域調節部は、この低温ガスプラズマの流路に設けられた、この低温ガスプラズマが通過可能な領域を互いの間に有する複数の遮蔽板を含むことが望ましい。そして、このプラズマ照射領域調節部は、この低温ガスプラズマが通過可能な領域の大きさが可変であるこの遮蔽板を含むことが推奨される。
さらに、このプラズマ照射領域調節部は、単数または複数のチューブ状のこの低温ガスプラズマの噴出口を含むことが好ましい。また、このプラズマ発生エネルギー供給部は、この単数または複数のチューブ状のこの噴出口の内部にそれぞれ設けられているこのプラズマ発生エネルギー供給部を含むことが望ましい。
そして、このプラズマ発生エネルギー供給部は、この標的細胞の両側または片側に配置された誘電体と、この標的細胞およびこの誘電体を含む領域の両側に配置された交流の電源に接続した対向する電極と、を含むことが推奨される。ここで、このプラズマ照射領域調節部は、この標的細胞の存在領域に対応する領域に配置されたこの誘電体と、この標的細胞の存在領域に対応する領域に配置されたこの電極と、を含むことが好ましい。また、この誘電体は、プラスチックまたはガラスまたはセラミックスを含有する材質からなるこの誘電体を含むことが好ましい。さらに、この誘電体は、この標的細胞を保持する容器を含むことが望ましい。そして、この容器は、この標的細胞を保持するための単数または複数の試料保持部を有する容器を含み、かつこの電極の一方は、この試料保持部に対応する位置に単数または複数に分岐した電極先端を備えることが推奨される。また、このプラズマ照射領域調節部は、この電極先端とこの容器とを相対的に上下に駆動させる上下駆動機構を含むことが好ましい。また、このプラズマ照射領域調節部は、導電線と、この道電線を被覆する誘電体と、を含むこの電極であって、この導電線の先端は露出しているこの電極を含むことが望ましい。
ここで、このプラズマ発生エネルギー供給手段は、直流または交流の電源と接続した互いに形状が異なる対向する電極を含み、このプラズマ照射領域調節手段は、この保持手段および／または前記プラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段を含んでもよい。また、このプラズマ照射領域調節手段は、この保持手段および／または前記プラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段と、このガス流の方向を変化させることができるこのガス供給手段と、を含んでもよい。あるいは、このプラズマ照射領域調節手段は、この保持手段および／または前記プラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段と、この低温ガスプラズマの流路に設けられた、この低温ガスプラズマが通過可能な不均一な領域を有する遮蔽板と、を含んでもよい。
また、このプラズマ発生エネルギー供給手段は、複数の開口空隙部を有する誘電体と、それぞれ異なるこの開口空隙部の内部に設けられ、直流または交流の電源と接続した対向する電極と、を含んでもよい。あるいは、このプラズマ照射領域調節手段は、この複数の開口空隙部のうち１以上の開口空隙部からこの保持手段への方向のガス流を発生させるガス供給手段を含んでもよい。さらに、このプラズマ発生エネルギー供給手段は、複数に分岐し、それぞれ異なるこの開口空隙部の内部に設けられた電極先端を備え、この複数の対向する電極のうち少なくとも一組の電極を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法を説明するフローチャートである。
図２は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図３は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図４は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図５は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図６は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図７は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図８は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図９は、本発明のプラズマ照射装置に備わる電極先端を拡大して説明する概略図である。
図１０は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図１１は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図１２は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図１３は、図１２に示す本発明のプラズマ照射装置の一部を除去して内部の構造を説明する概略図である。
図１４は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図１５は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図１６は、図１５に示す本発明のプラズマ照射装置を容器内で用いる場合の断面の構造を説明する概略図である。
図１７は、本発明のプラズマ照射装置を複数の試料保持部を備える容器に適用する場合について説明する概略図である。
図１８は、図１７に示す本発明のプラズマ照射装置に備わる噴出口を拡大して説明する概略図である。
図１９は、本発明のプラズマ照射装置において、特定の条件で発生する低温ガスプラズマを分光的に測定した結果を示したグラフである。
図２０は、本発明のプラズマ照射装置において、特定の条件で発生する低温ガスプラズマを分光的に測定した結果を示したグラフである。
図２１は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図２２は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図２３は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図２４は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図２５は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図２６は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図２７は、本発明の実施例で用いるくの字形電極の一例を説明する図である。
図２８は、本発明の実施例で用いるカーブ形電極の一例を説明する図である。
図２９は、本発明の実施例で形状違い電極を用いた場合の細胞染色結果を説明する写真を示す図である。
図３０は、本発明の実施例で形状違い電極を用いた場合の細胞染色結果を説明する模式図である。
図３１は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
図３２は、本発明のプラズマ照射装置を説明する概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施の形態を示して本発明をより詳細に説明する。
＜標的細胞への選定分子の導入方法＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、標的細胞の近傍に選定分子を添加するステップと、この標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持するステップと、この低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップと、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、この標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射するステップと、を備える、標的細胞への選定分子の導入方法である。
ここで、図１は、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法を説明するフローチャートである。
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、標的細胞の近傍に選定分子を添加し（ステップＳ１０５）、この標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持し、（ステップＳ１０７）、この低温ガスプラズマの照射領域を調節し（ステップＳ１０９）、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給し（ステップＳ１１１）、この標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射する（ステップＳ１１３）ことにより行なわれる。
なお、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法においては、標的細胞の近傍に選定分子を添加し（ステップＳ１０５）、この標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持し、（ステップＳ１０７）、この低温ガスプラズマの照射領域を調節し（ステップＳ１０９）、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給し（ステップＳ１１１）、この標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射する（ステップＳ１１３）ことの前に、この標的細胞と培養液とを含有する分散液から培養液を除去する（ステップＳ１０３）ことが好ましい。標的細胞の周囲から培養液を除去することにより、標的細胞へ直接低温ガスプラズマが照射されやすくなるためである。
そして、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法においては、標的細胞の近傍に選定分子を添加し（ステップＳ１０５）、この標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持し（ステップＳ１０７）、この低温ガスプラズマの照射領域を調節し（ステップＳ１０９）、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給し（ステップＳ１１１）、この標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射する（ステップＳ１１３）ことの前に、標的細胞を前培養する（ステップＳ１０１）ことが好ましい。前培養を行なうことにより、十分な量の標的細胞を確保することができるからである。
さらに、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法においては、標的細胞の近傍に選定分子を添加し（ステップＳ１０５）、この標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持し、（ステップＳ１０７）、この低温ガスプラズマの照射領域を調節し（ステップＳ１０９）、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給し（ステップＳ１１１）、この標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射する（ステップＳ１１３）ことの後に、標的細胞を後培養する（ステップＳ１１５）ことが好ましい。
また、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法においては、他の付加的なステップが備わっていてもよい。たとえば、標的細胞を後培養する（ステップＳ１１５）ことの後に、さらに選定分子の導入された標的細胞をスクリーニングしてもよい。
＜選定分子の導入に用いられる標的細胞＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法において用いる標的細胞とは、選定分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特に特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞などが挙げられる。これらの標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
なお、上記のヒトの個体から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。また、上記のヒトの個体から採取された細胞には、ヒトの個体から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
さらに、上記のヒト以外の動物細胞および植物細胞には、個体内に存在する細胞と、組織内に存在する細胞と、個体や組織から採取された細胞と、個体や組織から採取された細胞から培養された細胞とが含まれる。
ここで、上記とは別の側面から捉えれば、本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌、枯草菌などの原核細胞や、酵母、ヒト以外の動物細胞、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体に含まれる細胞、植物細胞などの真核細胞が含まれる。
さらに、本発明に用いる標的細胞には、赤血球ゴーストやリポソームなどの脂質二重膜構造をもつものも含まれる。
また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、選定分子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピータント細胞としての処理を施されたものであることが好ましい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透析しやすくなった大腸菌のコンピータント細胞などが挙げられる。
＜標的細胞に導入される選定分子＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法において用いる選定分子とは、標的細胞に導入するために選定した分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではない。このような選定分子の具体例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やその誘導体などの高分子化合物、低分子生理活性物質、薬剤候補品などが挙げられる。これらの選定分子は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
また、上記のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの誘導体には、ベクター、アンチセンスポリヌクレオチド、デコイポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉなどが含まれる。
さらに、上記の蛋白質分子、蛋白質分子誘導体には、シグナル伝達因子や、転写調節因子、各種酵素、各種受容体などが含まれる。
＜標的細胞の近傍に選定分子を添加するステップ＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法における、標的細胞の近傍に選定分子を添加するステップ（図１のステップＳ１０５）について、より詳細に説明する。
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法においては、特に限定するものではないが、標的細胞の近傍に選定分子を添加する際には、たとえば選定分子を含む溶液または懸濁液を標的細胞を含む細胞組成物に添加することが好ましい。
なお、本発明において、標的細胞の近傍とは、標的細胞の表面の外側の領域であって、選定分子の拡散運動などにより、選定分子と標的細胞の表面とが接触し得る領域を示すものとする。すなわち、標的細胞の近傍に選定分子が存在するという場合には、選定分子と標的細胞の表面とは直接接触していてもよいし、直接接触しておらず、両者の間に水分子などが存在していてもよい。
よって、標的細胞の近傍に選定分子が存在するといえる具体的な場合としては、同一の溶液または懸濁液内において選定分子と標的細胞とが適当な濃度で混合されている場合、標的細胞が選定分子を含む溶液または懸濁液と混合されて細胞組成物を構成する場合、および標的細胞を含む細胞組成物の表面に選定分子を含む溶液または懸濁液が存在する場合などが挙げられる。
また、上記の選定分子を含む溶液または懸濁液は、特に限定するものではないが、たとえば選定分子を含む水溶液または懸濁液であることが好ましい。また、該水溶液または懸濁液の溶媒または分散媒としては、たとえば生理食塩水やｐＨ緩衝溶液などが挙げられる。
さらに、上記の標的細胞を含む細胞組成物は、特に限定するものではないが、たとえば標的細胞と水溶液を含む細胞組成物などが挙げられる。なお、該水溶液としては、生理食塩水やｐＨ緩衝溶液や標的細胞の培養液などが挙げられる。
そして、該細胞組成物は、たとえば標的細胞が水溶液に懸濁した懸濁液であってもよく、スラリー状またはペースト状の細胞組成物であってもよく、ゲル状または固形状の細胞組成物であってもよい。
もちろん、上記の標的細胞を含む細胞組成物は、水溶液などを含まず、標的細胞のみからなる細胞組成物であってもよい。
なお、標的細胞の近傍に選定分子を添加する際には、たとえば標的細胞組成物に選定分子を含む溶液または懸濁液を滴下する方法、標的細胞組成物と選定分子を含む溶液または懸濁液とを混合する方法などを用いることができる。
＜標的細胞を照射領域に保持するステップ＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法における、標的細胞を照射領域に保持するステップ（図１のステップＳ１０７）について、より詳細に説明する。
本発明において、標的細胞を照射領域に保持する際には、特に限定するものではないが、たとえば照射領域内に存在する固体基盤上に標的細胞を保持することが好ましい。
ここで、上記の固体基盤上に保持される標的細胞としては、たとえばプレートなどの細胞培養容器上で培養した培養接着細胞や、培養液中に懸濁している標的細胞を遠心分離または濾過などの操作により分離して、培養液を除去した標的細胞をプレートなどの固体基盤上に設置したものなどが挙げられる。なお、上記の固体基盤上に存在する標的細胞は、固体基盤上に固定されている必要はなく、固体基盤上に設置されているだけでもよい。
また、上記固体基盤は、標的細胞を保持することのできる構造であれば特に限定されるものではないが、たとえばプレート、シャーレ、チューブ、試験管、フラスコなどが挙げられる。
また、本発明において、標的細胞を照射領域に保持する際には、特に限定するものではないが、たとえば照射領域内に存在する培地表面に標的細胞を保持してもよい。
ここで、上記の培地表面に保持される標的細胞としては、たとえば固体培地上で培養された標的細胞や、液体培地中で培養され、液体培地の表面に浮遊している標的細胞などが挙げられる。
また、上記の培地は、標的細胞を培養することのできる組成の培地であれば特に限定されるものではないが、たとえば寒天培地をはじめとする固体培地や試験管やフラスコ内の液体培地などが挙げられる。
＜低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップ＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法における、低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップ（図１のステップＳ１０９）について、より詳細に説明する。
ここで、本発明において、低温ガスプラズマの照射領域の調節とは、該低温ガスプラズマの照射領域の拡大、縮小、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマのプラズマ強度分布の変化などを示すものとする。また、本発明において、低温ガスプラズマの照射領域の調節とは、該低温ガスプラズマの照射領域の拡大、縮小、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマのプラズマ強度分布の変化などが生じるように、プラズマ発生エネルギー供給部において生じた低温ガスプラズマを標的細胞に向かって移動させることも含むものとする。
本発明において、低温ガスプラズマの照射領域を調節することにより、適度な強度の低温ガスプラズマを、比較的均一な状態で目的の照射領域において標的細胞に照射することが可能となるため、標的細胞への選定分子の導入効率を高めることができるという利点がある。
＜低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップ＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法における、低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップ（図１のステップＳ１１１）について、より詳細に説明する。
一般に、空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガス、キセノンガスなどのガスが電離して低温ガスプラズマになっている状態は非常に不安定な状態であるため、低温ガスプラズマを発生させるためには、多量のエネルギーを上記のガスに供給することが必要である。
そこで、本発明においては、後述するように、コロナ放電方式の電極などに直流または交流の電源を接続して該電極に電圧を印加することによりコロナ放電を行なうことによって、あるいは誘電体バリア放電方式の電極に交流の電源を接続して該電極に電圧を印加することにより誘電体バリア放電を行なうことによって、あるいは誘電結合方式によって、上記のガスに多量のエネルギーを供給する。
＜標的細胞に低温ガスプラズマを照射するステップ＞
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法における、標的細胞に低温ガスプラズマを照射するステップ（図１のステップＳ１１３）について、より詳細に説明する。
そして、本発明において、標的細胞に低温ガスプラズマを照射する際には、特に限定するものではないが、空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガス、キセノンガスなどから低温ガスプラズマを照射することが好ましい。なお、これらのガスは単一の種類で用いられてもよく、二以上の種類を混合して用いられてもよい。
なお、これらのガスの中では、空気を用いることが好ましい。空気は大気中に多量に存在しており、入手も容易かつ安価だからである。ここで、上記の空気としては、ガスボンベなどに詰められた産業用の空気を用いてもよいが、雰囲気中に存在する空気をそのまま用いてもよい。
ここで、本発明に用いる低温ガスプラズマは、低温ガスの弱電離プラズマであることが好ましい。また、本発明に用いる低温ガスプラズマは、低温ガスの非平衡プラズマであることが好ましい。
本発明において、標的細胞に低温ガスプラズマを照射する際には、本発明のプラズマ照射装置を用いて、大気圧条件下で標的細胞に低温ガスプラズマを照射することが好ましい。
＜プラズマ照射装置＞
図２は、図１に示す本発明の標的細胞１５への選定分子の導入方法に用いられる本発明のプラズマ照射装置１０００を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置の構造は、図２に示す構造に限定されるものではない。
ここで、図２に記載される本発明のプラズマ装置は、上述した本発明の標的細胞への選定分子の導入方法、および後述する本発明の標的細胞の細胞融合方法に好適に用いられる構造および機能を有している。
特に、図２に記載される本発明のプラズマ装置に備えられたプラズマ照射領域調節部は、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法、および後述する本発明の標的細胞の細胞融合方法のうち、低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップに好適に用いられる構造および機能を有している。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００は、本発明の標的細胞１５への選定分子の導入方法においては、この標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持し（図１のステップＳ１０７）、この低温ガスプラズマの照射領域を調節し（図１のステップＳ１０９）、この低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給し（図１のステップＳ１１１）、この標的細胞にこの低温ガスプラズマを照射する（図１のステップＳ１１３）際に用いられるプラズマ照射装置１０００である。
そして、本発明のプラズマ照射装置１０００は、低温ガスプラズマを発生するためのエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給部と、低温ガスプラズマの照射領域を調節するプラズマ照射領域調節部と、選定分子が導入されるべき標的細胞を照射領域に保持する保持部と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。
ここで、本発明において、低温ガスプラズマを発生するためのエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給部は、特に限定するものではないが、たとえば後述するコロナ放電方式、誘導結合プラズマ発生方式、誘電体バリア放電方式、沿面放電方式などにより低温ガスプラズマを発生することのできるプラズマ発生エネルギー供給部であることが好ましい。
また、本発明において、低温ガスプラズマの照射領域を調節するプラズマ照射領域調節部は、特に限定するものではないが、たとえば後述するガス流動方式、相対移動方式、遮蔽板方式、誘電体バリア放電方式、磁場流動方式などにより低温ガスプラズマの照射領域を調節することのできるプラズマ照射領域調節部であることが好ましい。
そして、本発明において、選定分子が導入されるべき標的細胞１５を照射領域に保持する保持部は、たとえば後述する試料台１などであることが好ましい。
図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においては、プラズマ発生エネルギー供給部は、電源９と、電極５と、正負二本の導電線３０７とを備えている。また、該電源９は、信号発生器２０１、リニアアンプ２０３、整合回路２０５、昇圧トランス２０７を備えており、それらとヘッド部２２９に設けられた電極５とは正負二本の導電線３０１，３０３，３０５，３０７で互いに電気的に接続しているため、電極間電圧、電極距離、周波数、パルス周期、Ｄｕｔｙなどのパラメータを種々の条件に設定することができる。そのため、ヘッド部２２９に設けられた電極５で放電させることにより種々の性質の低温ガスプラズマを発生させることができる。
一方、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においては、プラズマ照射領域調節部は、ガスの噴出し方向を変化させることのできるガス供給部１３を備えている。また、該ガス供給部１３は、二つのガスボンベまたはエアーポンプ２０９，２１７、電磁弁２１１，２１９，２２７、ニードル弁２１３，２２１、流量計２１５，２２３、混合器２２５を備えており、それらとヘッド部２２９に設けられたガス噴出口６とはガス導管４０９，４１１，４１３，４１５，４１７，４１９，４２１，４２３，４２５，４２７で接続している。そのため、ガスボンベまたはエアーポンプ２０９，２１７より供給された単一または二種の混合ガスを、ニードル弁２１３，２２１で適当な流量に調節してヘッド部２２９に設けられたガス噴出口６に供給することができる。
さらに、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においては、保持部は、試料台１を備えている。そのため、該試料台１の上面に標的細胞１５を設置し、プラズマ照射領域に標的細胞１５を保持することができる。
そして、ヘッド部２２９に設けられた電極５で発生した低温ガスプラズマは、同じくヘッド部２２９に設けられたガス噴出口６から供給されるガスにより低温ガスプラズマの流れの方向２３３に向かって吹出され、その先の保持部に設置された試料台１上に設置された標的細胞１５に照射される。
すなわち、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においては、標的細胞の種類、あるいは選定分子の種類に応じて、標的細胞に照射される低温ガスプラズマの条件を変化させることができるように、上記の電極間電圧、電極距離、周波数、パルス周期、Ｄｕｔｙなどのパラメータや、供給される単一または二種の混合ガスの種類、混合比率、流量などを変化させることができる。
＜ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部＞
図３は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置の構造は、図３に示す構造に限定されるものではない。
本発明の第一の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、試料台１を備えた保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。
ここで、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、図３に示すように、コロナ放電２により低温ガスプラズマ３を発生するエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給部５０１である。
なお、本発明において、コロナ放電２とは、導体間の電場が平衡でない状態において、表面の電場の大きいところに部分的絶縁破壊がおこって現れる発光放電を示すものとする。
そして、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、図３に示すように、直流または交流の電源９に接続した対向する電極５ａ，５ｂを備えることが好ましい。対向する電極５ａ，５ｂ間に直流または交流の電圧を印加することによりコロナ放電２を起こし、低温ガスプラズマ３を発生させることができるからである。
また、本実施の形態において、プラズマ照射領域調節部５０３は、図３に示すように、低温ガスプラズマ３に対して、標的細胞１５への方向のガス流を供給することのできるガス供給部１３を備える。
すなわち、本実施の形態のガス供給部１３は、低温ガスプラズマ３をガス流により移動させることにより、低温ガスプラズマ３の照射領域の拡大、縮小、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマのプラズマ強度分布の変化などを生じさせ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
ここで、本実施の形態のガス供給部１３は、ガス流路１１の方向、断面の大きさ、断面の形状などを変化させることにより、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができることが好ましい。
なお、ガス流路１１の方向、断面の大きさ、断面の形状などを変化させる方法は、特に限定するものではないが、たとえばガス供給部１３のガス噴出口の方向、断面の大きさ、断面の形状などを変化させることにより実現可能である。あるいは、ガス供給部１３とコロナ放電２が起こる部位との間に、邪魔板や案内板やスリットなどを設けることによっても実現可能である。
また、本実施の形態におけるガス供給部１３の構造は、特に限定されるものではなく、たとえばガスボンベまたはエアーポンプなどを備えた構造であってもよく、また雰囲気ガスにガス流を起こすファンを備えた構造などであってもよい。なお、本発明に用いるガス供給部１３は、ガス流の流速を制御する機構を備えていることが好ましい。
すなわち、本実施の形態においては、プラズマ発生エネルギー供給部５０１によりガス流路１１中でコロナ放電２を行なうことにより、低温ガスプラズマ３を発生し、ガス流路１１の方向、断面の大きさ、断面の形状などを変化させることにより、低温ガスプラズマ３の標的細胞１５に対する照射領域を調節することができる。
また、本実施の形態においては、このようにガス流路１１中でコロナ放電２を行なうことにより、低温ガスプラズマ３の発生源である電極５ａ，５ｂにガスを供給すると同時に、低温ガスプラズマ３をガス流により移動させることもできるので、プラズマ照射装置の構造および動作が単純かつ簡明なものとなり、プラズマ照射装置の製造コストが安価で、動作効率がよいという利点がある。
さらに、本実施の形態においては、保持部５０５は、図３に示すように、試料台１を備える。ここで、試料台１の構造は、特に限定するものではないが、たとえば標的細胞１５を保持する容器を上面に保持することのできる平板上の構造であることが好ましい。
なお、図３には、標的細胞１５を保持する試料台１、ガスの流路１１、導電線７ａ，７ｂも説明のために記載されている。
さらに、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえばガス流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３は、コロナ放電方式以外の方式によるプラズマ発生エネルギー供給部５０１と組合わされてもよい。また、ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３は、他の方式のプラズマ照射領域調節部５０３と組合わせて用いられてもよい。
＜保持部駆動方式のプラズマ照射領域調節部＞
図４は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図４に示す構造に限定されるものではない。
本発明の第二の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂと、試料台１を備えた保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。なお、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
ここで、本実施の形態において、プラズマ照射領域調節部５０３ａ，５０３ｂは、図４に示すように、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂとを備える。なお、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、説明を繰り返さない。
そして、本実施の形態において、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂは、保持部５０５を移動させることのできる駆動機構を備えている。このように、保持部５０５を駆動機構を用いて移動させることにより、保持部５０５に設置された標的細胞１５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に移動させることとなり、その結果低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的に変動するため、低温ガスプラズマ３の照射領域の拡大、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布の変化などを生じさせ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
ここで、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して、プラズマ発生エネルギー供給部５０１から所定の距離に位置する平面内において移動させる駆動機構であることが好ましい。低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的にプラズマ発生エネルギー供給部５０１から所定の距離に位置する平面内において移動することとなり、低温ガスプラズマ３の照射領域が拡大し、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布が均一化することとなるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率が向上する傾向があるからである。
また、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に回転運動させる駆動機構であってもよい。さらに、該回転運動は、偏心回転運動であることがより好ましい。低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的に回転運動または偏心回転運動することとなり、低温ガスプラズマ３の照射領域が拡大し、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布が均一化することとなるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率が向上する傾向があるからである。
そして、本実施の形態の駆動機構の構造は、特に限定するものではないが、たとえば保持部５０５に備えられた試料台１の下部に接続された振動機または回転モーターなどを備える構造であることが好ましい。なお、本実施の形態の駆動機構は、並進運動あるいは回転運動のパターンや速度を制御する機構を備えていることが好ましい。
なお、図４には、コロナ放電２、電極５ａ，５ｂ、導電線７ａ，７ｂ、電源９、ガスの流路１１、ガス供給部１３、試料台が回転運動する場合の回転運動の方向１７も説明のために記載されている。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば保持部駆動方式のプラズマ照射領域調節部５０３ｂは、コロナ放電方式以外の方式によるプラズマ発生エネルギー供給部５０１と組合わされてもよい。また、保持部駆動方式のプラズマ照射領域調節部５０３ｂは、ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３ａ以外の方式のプラズマ照射領域調節部５０３ａと組合わせて用いられてもよい。
＜プラズマ発生エネルギー供給部駆動方式のプラズマ照射領域調節部＞
図５は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図５に示す構造に限定されるものではない。
本発明の第三の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式およびプラズマ発生エネルギー供給部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、試料台１を備えた保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。なお、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
ここで、本実施の形態において、プラズマ照射領域調節部５０３は、図５に示すように、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部と、プラズマ発生エネルギー供給部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部とを備える。なお、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部については、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、説明を繰り返さない。
そして、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３は、プラズマ発生エネルギー供給部５０１を移動させることのできる駆動機構を備えている。このように、プラズマ発生エネルギー供給部５０１を駆動機構を用いて移動させることにより、保持部５０５に設置された標的細胞１５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に移動させることとなり、その結果低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的に変動するため、低温ガスプラズマ３の照射領域の拡大、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布の変化などを生じさせ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
ここで、プラズマ発生エネルギー供給部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３は、プラズマ発生エネルギー供給部全体を駆動させる構造を備えていてもよいが、たとえばプラズマ発生エネルギー供給部が低温ガスプラズマの噴出口を備える場合には、低温ガスプラズマの噴出口を駆動する構造を備えていてもよい。
ここで、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して、プラズマ発生エネルギー供給部５０１から所定の距離に位置する平面内において相対的に移動させる駆動機構であることが好ましい。低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的にプラズマ発生エネルギー供給部５０１から所定の距離に位置する平面内において移動することとなり、低温ガスプラズマ３の照射領域が拡大し、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布が均一化することとなるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率が向上する傾向があるからである。
また、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に回転運動させる駆動機構であってもよい。さらに、該回転運動は、偏心回転運動であることがより好ましい。低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的に回転運動または偏心回転運動することとなり、低温ガスプラズマ３の照射領域が拡大し、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布が均一化することとなるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率が向上する傾向があるからである。
そして、本実施の形態の駆動機構の構造は、特に限定するものではないが、たとえば、図５に示すように、電極５ａ，５ｂに導電線７ａ，７ｂを介して接続された風車２８と、ガス供給手段１３とを備える構造であることが好ましい。このような構造を備えることにより、本実施の形態の駆動機構においては、ガス供給手段１３により供給されるガス流の運動エネルギーが風車２８の回転運動エネルギーに変換され、その回転運動エネルギーが導電線７ａ，７ｂを介して電極５ａ，５ｂに伝達され、電極５ａ，５ｂが回転しながらコロナ放電２を行なうことになる結果、低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的に回転運動することとなり、低温ガスプラズマ３の照射領域が拡大し、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布が均一化することとなる。
あるいは、本実施の形態の駆動機構の構造は、たとえばプラズマ発生エネルギー供給部５０１に備えられた電極５ａ，５ｂの側部に接続された振動機または回転モーターなどを備える構造であってもよい。なお、本実施の形態の駆動機構は回転運動の速度を制御する機構を備えていることが好ましい。
なお、図５には、電源９、ガスの流路１１、導電線１９ａ，１９ｂ，上部の導電リング２１、下部の導電リング２３、摺動部２５ａ，２５ｂ，２５ｃ，２５ｄ、中心線２６も説明のために記載されている。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえばプラズマ発生エネルギー供給部駆動方式のプラズマ照射領域調節部５０３は、コロナ放電方式以外の方式によるプラズマ発生エネルギー供給部５０１と組合わされてもよい。また、プラズマ発生エネルギー供給部駆動方式のプラズマ照射領域調節部５０３は、ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３以外の方式のプラズマ照射領域調節部５０３と組合わせて用いられてもよい。
＜遮蔽板方式のプラズマ照射領域調節部＞
図６は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図６に示す構造に限定されるものではない。
本発明の第四の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、遮蔽板方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｃと、試料台１を備えた保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。なお、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
ここで、本実施の形態において、プラズマ照射領域調節部は、図６に示すように、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、遮蔽板方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｃとを備える。なお、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部については、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、説明を繰り返さない。
そして、本実施の形態において、遮蔽板方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｃは、低温ガスプラズマ３を遮蔽することのできる遮蔽板２７ａ，２７ｂを備えている。このように、低温ガスプラズマ３を遮蔽板２７ａ，２７ｂを用いて遮蔽することにより、低温ガスプラズマ３の照射領域の縮小、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布の変化などを生じさせ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
ここで、本実施の形態において、遮蔽板２７ａ，２７ｂは、低温ガスプラズマ３の流路を部分的にのみ遮蔽する構造であることが好ましい。なお、本実施の形態において、遮蔽板２７ａ，２７ｂは、単数であってもよく、複数であってもよい。
また、本実施の形態において、遮蔽板２７ａ，２７ｂは、低温ガスプラズマ３の流路に設けられていることが好ましい。すなわち、電極５ａ，５ｂと、試料台１との間に設けられていることが好ましい。
さらに、本実施の形態において、遮蔽板２７ａ，２７ｂは、低温ガスプラズマ３が通過可能な領域を有することが好ましい。たとえば、低温ガスプラズマ３が通過可能な開口部などを有することが好ましい。あるいは、遮蔽板２７ａ，２７ｂが複数の場合には、図６に示すように、低温ガスプラズマ３が通過可能な領域を互いの間に有することも好ましい。
そして、本実施の形態において、遮蔽板２７ａ，２７ｂの形成する、低温ガスプラズマ３が通過可能な領域の大きさまたは形状は、可変であることが好ましい。低温ガスプラズマ３が通過可能な領域の大きさまたは形状を変化させることにより、低温ガスプラズマ３の照射領域も変化するため、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができるからである。
また、本実施の形態において、遮蔽板２７ａ，２７ｂの形状は、特に限定するものではないが、たとえば平板状であることが好ましい。また、遮蔽板２７ａ，２７ｂの材質は、特に限定するものではないが、たとえばガラスやセラミックスなどを含む材質であることが好ましい。
なお、図６には、コロナ放電２、導電線７ａ，７ｂ、電源９、ガスの流路１１、ガス供給部１３も説明のために記載されている。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば遮蔽板方式のプラズマ照射領域調節部５０３ｃは、コロナ放電方式以外の方式によるプラズマ発生エネルギー供給部５０１と組合わされてもよい。また、遮蔽板方式のプラズマ照射領域調節部５０３ｃは、ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３ａ以外の方式のプラズマ照射領域調節部５０３ａと組合わせて用いられてもよい。
＜誘電体バリア放電方式のプラズマ照射領域調節部＞
図７は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図７に示す構造に限定されるものではない。
本発明の第五の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、誘電体バリア放電に用いる誘電体２９ｂを試料台として備える保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。
ここで、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、図７に示すように、誘電体バリア放電方式により低温ガスプラズマ３を発生するエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給部５０１である。
なお、本発明において、誘電体バリア放電とは、電極間に単数または複数の固体誘電体を挿入することによって、固体誘電体のほぼ全面に均一に絶縁破壊がおこって現れる発光放電を示すものとする。
そして、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、図７に示すように、交流の電源９に接続した対向する電極５ａ，５ｂを備えることが好ましい。対向する電極５ａ，５ｂ間に交流の電圧を印加することにより電極５ａ，５ｂ間に電場を形成することができるからである。
また、本実施の形態において、プラズマ照射領域調節部５０３は、図７に示すように、固体誘電体２９ａ，２９ｂを備える。ここで、電極５ａ，５ｂ間に形成された電場内に誘電体２９ａ，２９ｂを挿入することにより、誘電体２９ａ，２９ｂが分極して、誘電体２９ａ，２９ｂ間で誘電体バリア放電を起こし、均一な低温ガスプラズマ３を発生させることができる。
すなわち、本実施の形態のプラズマ照射領域調節部５０３は、低温ガスプラズマ３を発生させたい領域の大きさおよび形状に対応した大きさおよび形状の誘電体２９ａ，２９ｂを電極５ａ，５ｂ間に挿入することにより、低温ガスプラズマ３を発生させたい領域において均一な低温ガスプラズマ３を発生させることができ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
ここで、本実施の形態のプラズマ照射領域調節部５０３は、誘電体２９ａ，２９ｂの大きさ、形状などを変化させることにより、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができることが好ましい。
なお、ガス流路１１の方向、断面の大きさ、断面の形状などを変化させる方法は、特に限定するものではないが、たとえば誘電体２９ａ，２９ｂを交換可能とする構造とすることにより実現可能である。
また、本実施の形態のプラズマ照射領域調節部５０３の構造は、特に限定されるものではなく、標的細胞１５の両側に誘電体２９ａ，２９ｂが挿入されていてもよく、あるいは標的細胞１５の一方のみに誘電体２９ａ，２９ｂが挿入されていてもよい。そして、誘電体２９ａ，２９ｂは、電極５ａ，５ｂに挟まれた領域に挿入されることが好ましい。
本実施の形態を用いることにより、標的細胞１５の存在領域に対応する領域で均一な誘電体バリア放電を行なうことが可能であり、均一な強度分布の低温ガスプラズマ３を標的細胞１５に照射することができるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率を高めることができるという利点がある。
なお、本実施の形態において、誘電体２９ａ，２９ｂは、プラスチックまたはガラスまたはセラミックスを含有する材質からなることが好ましい。プラスチック、ガラスおよびセラミックスは、誘電体２９ａ，２９ｂとしての性質を有し、安価で入手も容易だからである。
また、本実施の形態において、標的細胞１５を保持する容器が誘電体２９ａ，２９ｂとしての性質を有するのであれば、誘電体２９ａ，２９ｂとして標的細胞１５を保持する容器を用いてもよい。標的細胞１５を用いる容器の多くは、誘電体２９ａ，２９ｂとしての性質を有するプラスチックまたはガラスまたはセラミックスを材質とするからである。
また、本実施の形態において、保持部５０５は、誘電体バリア放電に用いる誘電体２９ｂを試料台として備える。もっとも、本実施の形態においては、標的細胞１５を保持する容器を誘電体２９ｂとして用いるのであれば、保持部５０５は、電極５ｂを試料台として用いてもよい。
なお、図７には、導電線７ａ，７ｂも説明のために記載されている。
そして、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば誘電体バリア放電方式のプラズマ発生エネルギー供給部５０１は、誘電体バリア放電方式以外の方式によるプラズマ照射領域調節部５０３と組合わされてもよい。
＜多穴ウェル対応型誘電体バリア放電方式のプラズマ照射領域調節部＞
図８は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図８に示す構造に限定されるものではない。また、図８においては、低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇの発生の様子がよく分かるように、容器３１を透明なものとして記載した。
本発明の第六の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、誘電体バリア放電に用いる誘電体２９ｂを試料台として備える保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。
ここで、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、図８に示すように、誘電体バリア放電方式により低温ガスプラズマ３を発生するエネルギーをガスに供給するプラズマ発生エネルギー供給部５０１である。
なお、本発明において、誘電体バリア放電とは、気体中の導体間の電場が平衡でない領域に固体誘電体を挿入することによって、固体誘電体のほぼ全面に均一に絶縁破壊がおこって現れる発光放電を示すものとする。
そして、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、図８に示すように、交流の電源９に接続した対向する電極５ａ，５ｂ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇを備えることが好ましい。対向する電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇと５ｂとの間に交流の電圧を印加することにより電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇと５ｂとの間に電場を形成することができるからである。
また、本実施の形態において、プラズマ照射領域調節部５０３は、図８に示すように、固体誘電体２９ｂを備える。ここで、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇと５ｂとの間に形成された電場内に誘電体２９ｂを挿入することにより、誘電体２９ｂが分極して、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇと誘電体２９ｂとの間で誘電体バリア放電を起こし、均一な低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを発生させることができる。
図８に示すように、両側にある電極５ａ，５ｂ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの一方の電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇが、容器３１の試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇに対応する位置に単数または複数に分岐した電極先端を備えることにより、低温ガスプラズマ３を発生させたい試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇ内において均一な低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを発生させるという形で、低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇの照射領域の調節をすることができる。
その結果、本実施の形態においては、試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇ内の標的細胞１５ａ，１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ，１５ｇに均一な低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを照射することができるため、標的細胞１５ａ，１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ，１５ｇへの選定分子の導入効率を高めることができる。
ここで、本実施の形態においては、プラズマ照射領域調節部５０３は、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの数、大きさ、形状などを変化させることにより、低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇの照射領域の調節をすることができることが好ましい。
なお、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの数、大きさ、形状などを変化させる方法は、特に限定するものではないが、たとえば電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇを交換可能とする構造とすることにより実現可能である。
また、本実施の形態のプラズマ照射領域調節部５０３の構造は、特に限定されるものではなく、標的細胞１５の一方のみに誘電体が挿入されていてもよく、あるいは標的細胞１５の両側に誘電体２９ｂが挿入されていてもよい。すなわち、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの下部に誘電体が貼付などされて挿入されていてもよい。そして、誘電体２９ｂは、容器３１と電極５ｂとに挟まれた領域に挿入されることが好ましい。
また、本実施の形態において、保持部５０５は、誘電体バリア放電に用いる誘電体２９ｂを試料台として備える。もっとも、本実施の形態においては、標的細胞１５を保持する容器３１を誘電体２９ｂとして用いるのであれば、保持部５０５は、電極５ｂを試料台として用いてもよい。
また、本実施の形態において、容器３１は、標的細胞１５を保持するための単数または複数の試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇを有する容器３１であることが好ましい。このように多数の試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇを有する容器３１を用いて、本発明の標的細胞１５ａ，１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ，１５ｇへの選定分子の導入方法を実施することにより、一度に多くの標的細胞１５ａ，１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ，１５ｇへの選定分子の導入を行なうことができ、本発明のハイスループット化を実現することができ、実施効率が著しく高まるからである。
さらに、本実施の形態においては、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの先端と容器３１とを相対的に上下に駆動させる上下駆動機構を備えることが好ましい。このような上下駆動機構を用いて、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの先端と容器３１とを相対的に上下に移動させることにより、電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの先端を容器３１の試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇに挿入および脱離させることができる。
なお、図８には、導電線７ａ，７ｂ，８ａ，８ｃ，８ｄ，８ｅ，８ｆ，８ｇも説明のために記載されている。
図９は、図８に示す本発明のプラズマ照射装置１０００の電極５ａ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇの先端部付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図９に示す構造に限定されるものではない。また、図９においては、低温ガスプラズマ３の発生の様子がよく分かるように、試料保持部３３を透明なものとして記載した。
図９に示すように、本実施の形態においては、電極の先端部は、露出した電極先端３７ａと、導電線３７ｂと、導電線３７ｂを被覆する誘電体３５と、を備えていることが好ましい。電極の先端部このような構造を有していることにより、容器の試料保持部３３の内部で誘電体バリア放電が行なわれ、その結果標的細胞１５の存在領域を含む領域で低温ガスプラズマ３が発生するため、標的細胞１５に均一な低温ガスプラズマ３を照射することができ、標的細胞１５への選定分子の導入効率を高めることができる。
そして、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば誘電体バリア放電方式のプラズマ発生エネルギー供給部５０１は、誘電体バリア放電方式以外の方式によるプラズマ照射領域調節部５０３と組合わされてもよい。
＜誘導結合プラズマ発生方式のプラズマ発生エネルギー供給部＞
図１０は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１０に示す構造に限定されるものではない。
ここで、本発明の第七の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、誘導結合方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、試料台１を備える保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。なお、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
また、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、誘導結合プラズマ発生方式を用いて、低温ガスプラズマ３を発生するために必要なエネルギーをガスに供給する。
また、本実施の形態において、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、交流電源９と接続した導電コイル３９と、この導電コイル３９の内部に設けた貫通空隙部４３を有する誘電体４１と、を備える。
そして、本実施の形態においては、この誘電体４１の貫通空隙部４３にガス流を通過させ、導電コイル３９に交流電圧を印加することにより、ガス流中で低温ガスプラズマ３を発生させる。
なお、本実施の形態において、誘電体４１は、プラスチックまたはガラスまたはセラミックスを含有する材質からなることが好ましい。プラスチックまたはガラスは、誘電体４１としての性質を有し、安価で入手も容易だからである。
また、図１０においては、誘電体４１は、円筒状の形状に記載されているが、誘電体４１の形状は特に円筒状に限定されるものではなく、ガス流を通過させることのできる貫通空隙部を有するような形状であれば、用途に応じてさまざまな形状をとり得る。
なお、図１０には、導電線７ａ，７ｂ、電源９、ガスの流路１１、ガス供給部１３、標的細胞１５も説明のために記載されている。
そして、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば誘導結合プラズマ発生方式のプラズマ発生エネルギー供給部５０１は、ガス流動方式以外の方式によるプラズマ照射領域調節部５０３と組合わされてもよい。
＜電磁気力流動方式によるプラズマ照射領域調節部＞
図１１は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１１に示す構造に限定されるものではない。
ここで、本発明の第八の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、電磁気流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、試料台１を備える保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。なお、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
また、本実施の形態において、電磁気流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３は、低温ガスプラズマ３を電磁気力により移動させることにより低温ガスプラズマ３の照射領域を調節する。
そのため、本実施の形態においては、図１１に示すように、プラズマ照射領域調節部５０３は、低温ガスプラズマに対して磁場を供給する構造を含んでいる。
また、本実施の形態においては、図１１に示すように、プラズマ発生エネルギー供給部５０１は、コロナ放電２により低温ガスプラズマ３を発生することができるように、直流または交流の電源９に導電線７ａ，７ｂを介して接続した対向する電極５ａ，５ｂを備えている。
よって、本実施の形態においては、低温ガスプラズマ３に印加する磁場の方向４７を変化させることにより、電磁気力の方向４９も変化させることができるので、低温ガスプラズマ３の移動方向を変化させることとなり、結果として低温ガスプラズマ３の照射領域の拡大、縮小、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマのプラズマ強度分布の変化などを生じさせ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
なお、低温ガスプラズマ３に印加する磁場の方向４７を変化させるためには、磁場の発生源の設置の方向を変化させればよい。また、磁場の発生源は、永久磁石であってもよく、導電コイルに電流を流して磁場を発生させたものであってもよい。導電コイルにより磁場を発生させている場合には、導電コイルに流す電流の向きを変えても、磁場の方向４７を変化させることができる。
ここで、本実施の形態においては、プラズマ照射領域調節部５０３は、コロナ放電２と時間的に同期した磁場を低温ガスプラズマ３に印加することにより、低温ガスプラズマ３に電磁気力を加えることができる構造であることが好ましい。電極５ａ，５ｂに接続された電源９が交流である場合には、コロナ放電２の電流の方向４５が経時的に変化するため、適切な方向の電磁気力を発生させるためには、磁場の方向４７も時間的に同期して変化する必要があるからである。
さらに、本実施の形態においては、プラズマ照射領域調節部５０３は、コロナ放電２を発生する電流の方向と空間的に直交した方向の磁場を低温ガスプラズマ３に印加することにより、低温ガスプラズマ３に前記電磁気力を加えることができる構造であることが好ましい。フレミングの左手の法則より、放電２の電流の方向４５と磁場の方向４７が直行する場合に、電流の方向４５と磁場の方向４７とにさらに直交する方向に電磁気力が発生するからである。
なお、図１１には、標的細胞１５も説明のために記載されている。
ここで、図１２は、図１１に示す本発明のプラズマ照射装置１０００において、電源９が交流である場合に、コロナ放電２と時間的に同期した磁場を低温ガスプラズマ３に印加することができるようにした本発明のプラズマ照射装置１０００の構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１２に示す構造に限定されるものではない。
また、図１３は、図１２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００において、磁場発生板５５を除去して、磁場発生板５３，５５に挟まれた領域を見やすくした本発明のプラズマ照射装置１０００の構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１３に示す構造に限定されるものではない。
そして、図１２および図１３に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においては、交流の電源９により導電コイル３９に交流の電流が流れることにより、導電コイル３９内の誘電体５１に磁場が発生する。この磁場は、誘電体５１を介して磁場発生板５３，５５に伝達され、磁場発生板５３，５５に挟まれた領域で磁場が発生する。このとき、導電コイル３９と電極５ａ，５ｂは導電線７ａ，７ｂを介して接続しているため、電極５ａ，５ｂ間に発生するコロナ放電２と、磁場発生板５３，５５に挟まれた領域で発生する磁場とは、時間的に同期することになる。
さらに、図１２および図１３に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においては、同様に電極５ａ，５ｂ間に発生するコロナ放電２の電流の方向４５と、磁場発生板５３，５５に挟まれた領域で発生する磁場の方向４７とは、空間的に直交することになる。
それゆえ、図１２および図１３に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においては、電極５ａ，５ｂに接続された電源９が交流であり、コロナ放電２の電流の方向４５が経時的に変化する場合においても、フレミングの左手の法則より、電流の方向４５と磁場の方向４７とにさらに直交する方向に電磁気力が一定の方向に発生することとなる。
なお、図１２および図１３に示す本発明のプラズマ照射装置１０００においても、低温ガスプラズマ３に印加する磁場の方向４７を変化させることにより、電磁気力の方向４９も変化させることができることが好ましい。具体的には、磁場発生板５３，５５の方向を変化させることができることが好ましい。
このような構造を有することにより、電磁気力の方向４９を変化させ、低温ガスプラズマ３の移動方向を変化させることができ、結果として低温ガスプラズマ３の照射領域の拡大、縮小、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマのプラズマ強度分布の変化などを生じさせ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
また、図１２および図１３においては、同じ電源から直列に電場と磁場をもたらす方式について説明したが、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造はこのような構造に限定させるものではない。
すなわち、本発明のプラズマ照射装置１０００は、電場と磁場を別電源からもたらす構造であってもよいし、あるいは同じ電源から別ライン（すなわち並列）でもたらす構造であってもよい。ただし、これらの構造を採用する場合には、電場と磁場の位相を合わせて同期させる機構を設ける必要がある。
なお、図１２および図１３には、試料保持部１、標的細胞１５、プラズマ発生エネルギー供給部５０１、プラズマ照射領域調節部５０３、保持部５０５も説明のために記載されている。
そして、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば電磁気力流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３は、コロナ放電方式以外のプラズマ発生エネルギー供給部５０１と組合わされてもよい。
＜誘電体バリア放電方式によるプラズマ発生エネルギー供給部とガス流動方式によるプラズマ照射領域調節部の組合せ＞
図１４は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１４に示す構造に限定されるものではない。
ここで、本発明の第九の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、試料台１を備える保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。なお、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
本実施の形態においては、誘電体バリア放電方式によるプラズマ発生エネルギー供給部５０１とガス流動方式によるプラズマ照射領域調節部５０３の組合せの構造、機能および利点について説明する。
ここで、本実施の形態においては、図１４に示すように、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１は、ガス流の流路１１の両側または片側に配置された誘電体２９ａ，２９ｂと、ガス流の流路１１および誘電体２９ａ，２９ｂを含む領域の両側に配置された交流の電源９に接続した対向する電極５ａ，５ｂと、を含む構造を備えることが好ましい。
そして、本実施の形態においては、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１は、ガス流中で誘電体バリア放電を行なうことにより低温ガスプラズマ３を発生することが好ましい。
このように、誘電体バリア放電方式により発生した低温ガスプラズマ３は、一般的に照射領域におけるプラズマ強度の均一性に比較的優れる。そのため、誘電体バリア放電方式により発生した低温ガスプラズマ３を、ガス流動方式によるプラズマ照射領域調節部５０３に備えられたガス供給部１３から噴出すガス流により移動させて、保持部５０５に備えられた試料台１上の標的細胞１５に照射することにより、照射領域におけるプラズマ強度の均一性に優れた低温ガスプラズマ３を標的細胞１５に照射することができる。その結果、標的細胞１５への選定分子の導入効率をさらに高めることができる。
なお、図１４には、導電線７ａ，７ｂも説明のために記載されている。
ここで、図１５は、図１４に示す本発明のプラズマ照射装置１０００において、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１が円筒形である場合の本発明のプラズマ照射装置１０００の構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１５に示す構造に限定されるものではない。また、図１５においては、プラズマ発生エネルギー供給部５０１の内部構造がよく分かるように、電極５ａ，５ｂ、誘電体２９ａ，２９ｂ，５９を透明なものとして記載した。
また、図１６は、図１５に示す本発明のプラズマ照射装置１０００が容器６１内に設置された場合の本発明のプラズマ照射装置１０００の構成を説明する断面図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１６に示す構造に限定されるものではない。
なお、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１が円筒形である場合においても、図１５および図１６に示すように、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１は、ガス流の流路１１の両側または片側に配置された誘電体２９ａ，２９ｂと、ガス流の流路１１および誘電体２９ａ，２９ｂを含む領域の両側に配置された交流の電源９に接続した対向する電極５ａ，５ｂと、を含む構造を備えることが好ましい。
また、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１が円筒形である場合においても、図１５および図１６に示すように、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１は、ガス流中で誘電体バリア放電を行なうことにより低温ガスプラズマ３を発生することが好ましい。
そして、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１が円筒形である場合においても、誘電体バリア放電方式により発生した低温ガスプラズマ３は、一般的に照射領域におけるプラズマ強度の均一性に比較的優れている。
そのため、図１５および図１６に示す構造においても、誘電体バリア放電方式により発生した低温ガスプラズマ３を、ガス流動方式によるプラズマ照射領域調節部５０３に備えられたガス供給部１３から噴出すガス流により移動させて、保持部５０５に備えられた試料台１上の標的細胞１５に照射することにより、照射領域におけるプラズマ強度の均一性に優れた低温ガスプラズマ３を標的細胞１５に照射することができる。その結果、標的細胞１５への選定分子の導入効率をさらに高めることができる。
なお、図１５および図１６には、導電線７ａ，７ｂ、誘電体５９も説明のために記載されている。
そして、図１５および図１６に示すように、誘電体バリア放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１が円筒形である場合には、一般に円筒形であることが多いシャーレ内に標的細胞１５を保持する場合に、シャーレ内で容易に低温ガスプラズマ３を発生させることができるため、作業効率が向上し、ハイスループット化の実現のために役立つという利点がある。
そして、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば誘電体バリア放電方式によるプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３との組合せは、試料台１を備えない保持部５０５と組合わされてもよい。
たとえば、誘電体バリア放電方式によるプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部５０３との組合せは、標的細胞１５を浮遊させる液体からなる保持部５０５と組合わされてもよい。
＜単数または複数の低温ガスプラズマの噴出口を有する実施の形態＞
図１７は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１７に示す構造に限定されるものではない。また、図１７においては、低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇの発生の様子がよく分かるように、容器３１を透明なものとして記載した。
ここで、本発明の第十の実施の形態のプラズマ照射装置１０００は、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇ内に設けられたプラズマ発生エネルギー供給部と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部と、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを備えたプラズマ照射領域調節部と、任意の保持部と、を備えた、プラズマ照射装置１０００である。なお、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部については、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
ここで、本実施の形態においては、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇ内に設けられたプラズマ発生エネルギー供給部と、ガス流動方式によるプラズマ照射領域調節部と、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを備えたプラズマ照射領域調節部と、の組合せの構造、機能および利点について説明する。
ここで、本実施の形態においては、プラズマ発生エネルギー供給部は、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇの内部において低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを発生し、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを介して標的細胞１５ａ，１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ，１５ｇに低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを照射する。
そのため、本実施の形態においては、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを備えたプラズマ照射領域調節部は、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇの下部にのみ低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを照射することにより、標的細胞１５ａ，１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ，１５ｇに対する低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇの照射領域を調節することができる。
ここで、本実施の形態においては、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを備えたプラズマ照射領域調節部は、単数または複数のチューブ状の低温ガスプラズマの噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを備えることが好ましい。チューブ状であることにより、多穴ウェル型の容器３１の試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇ，３３ｅ内に存在する標的細胞１５ａ，１５ｃ，１５ｄ，１５ｅ，１５ｆ，１５ｇに対して低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを照射することが容易となるからである。
また、本実施の形態においては、プラズマ発生エネルギー供給部は、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇの内部に、プラズマ発生エネルギー供給部を備えることが好ましい。単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇの上部からガス供給部１３により、ガスの流路１１ａ，１１ｃ，１１ｄ，１１ｅ，１１ｆ，１１ｇを通してガスを供給することにより、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇの内部で発生した低温ガスプラズマ３ａ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇを単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇの下部から噴出させることができるからである。
また、本実施の形態においては、プラズマ照射領域調節部は、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを、多穴ウェル型の容器３１の試料保持部３３ａ，３３ｃ，３３ｄ，３３ｅ，３３ｆ，３３ｇ，３３ｅ内に出し入れすることのできる単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇの駆動機構あるいは多穴ウェル型の容器３１の駆動機構を備えていることが好ましい。
なお、図１７には、正負二本の導電線６３ａ，６３ｃ，６３ｄ，６３ｅ，６３ｆ，６３ｇ、上下駆動方向６７も説明のために記載されている。
ここで、図１８は、図１７に示す本発明のプラズマ照射装置１０００において、低温ガスプラズマの噴出口付近を拡大して示した本発明のプラズマ照射装置１０００の構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図１８に示す構造に限定されるものではない。また、図１８においては、低温ガスプラズマ３の発生の様子がよく分かるように、試料保持部３３を透明なものとして記載した。
なお、本実施の形態においては、図１８に示すように、内部にプラズマ発生エネルギー供給部を備える噴出口６５内で発生した低温ガスプラズマ３は、ガス供給部１３から供給されるガス流により、試料保持部３３内に存在する標的細胞１５の方向に移動させられる。そのため、低温ガスプラズマ３は、確実に標的細胞１５の存在する領域まで導かれるので、標的細胞１５への選定分子の導入効率が向上することとなる。
なお、図１８には、導電線７ａ，７ｂ、電源９、ガス流の流路１１、正負二本の導電線６３も説明のために記載されている。
そして、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを備えるプラズマ照射領域調節部は、ガス流動方式のプラズマ照射領域調節部以外のプラズマ照射領域調節部と組合わされてもよい。たとえば、単数または複数の噴出口６５ａ，６５ｃ，６５ｄ，６５ｅ，６５ｆ，６５ｇを備えるプラズマ照射領域調節部は、磁場流動方式のプラズマ照射領域調節部と組合わされてもよい。
＜互いに形状の異なる対向する電極と、試料回転法や電極回転法との組合せ＞
図２１は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図２１に示す構造に限定されるものではない。
ここで、本発明の第十一の実施の形態のプラズマ照射装置は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂと、試料台１を備えた保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置である。なお、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
ここで、円形シャーレ内に満遍なくプラズマを照射させる方法として、上述の試料回転法や電極回転法があるが、水平方向にプラズマ強度が均一なプラズマをシャーレの半径部分にあてた場合、その状態でシャーレを回転させると中央部ほどプラズマ照射強度が強くなる傾向がある。したがって、中央部の照射が適当な場合には周辺部の照射が弱すぎることになり、周辺部の照射が適当な場合には中央部の照射が強すぎることになる。そのため、何らかの方法で水平方向のプラズマ強度に差を生じさせて外周側により強いプラズマがあたるようにすれば、結果としてシャーレ全体に適度な強度で均一に照射することができる。
そこで、本実施の形態のプラズマ照射装置においては、このプラズマ発生エネルギー供給手段５０１は、直流または交流の電源９と接続した互いに形状が異なる対向する電極５ａ，５ｂを含み、このプラズマ照射領域調節手段５０３ｂは、この保持手段５０５および／またはこのプラズマ発生エネルギー供給手段５０１を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段を含む構造を採用している。
具体的には、図２１に示すように一方のくの字形電極５ｂでは、電極の先端がガス流に対して最も下流に位置するため、電極上の放電位置が固定されるのに対し、カーブ形電極５ａでは、電極の先端がガス流に対して最も下流に位置しないため、放電位置がカーブ状の部分に広がる傾向がある。したがって、放電位置が固定されたくの字形電極５ｂの側ほどプラズマ強度が強くなり、これを標的細胞１５を担持するシャーレの外周側に設置すれば、シャーレ内を均一に照射することができる。その結果、シャーレ全体としての標的細胞への選定分子の導入効率が高まり、標的細胞の死滅率も減少できる利点がある。
ここで、本実施の形態において、プラズマ照射領域調節部５０３ａ，５０３ｂは、図２１に示すように、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂとを備える。なお、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、説明を繰り返さない。
そして、本実施の形態において、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂは、保持部５０５を移動させることのできる駆動機構を備えている。このように、保持部５０５を駆動機構を用いて移動させることにより、保持部５０５に設置された標的細胞１５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に移動させることとなり、その結果低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的に変動するため、低温ガスプラズマ３の照射領域の拡大、変形や、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布の変化などを生じさせ、低温ガスプラズマ３の照射領域の調節をすることができる。
ここで、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して、プラズマ発生エネルギー供給部５０１から所定の距離に位置する平面内において移動させる駆動機構であることが好ましい。低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的にプラズマ発生エネルギー供給部５０１から所定の距離に位置する平面内において移動することとなり、低温ガスプラズマ３の照射領域が拡大し、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布が均一化することとなるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率が向上する傾向があるからである。
また、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に回転運動させる駆動機構であってもよい。さらに、該回転運動は、偏心回転運動であることがより好ましい。低温ガスプラズマ３の照射領域が経時的に回転運動または偏心回転運動することとなり、低温ガスプラズマ３の照射領域が拡大し、該照射領域内における低温ガスプラズマ３のプラズマ強度分布が均一化することとなるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率が向上する傾向があるからである。
そして、本実施の形態の駆動機構の構造は、特に限定するものではないが、たとえば保持部５０５に備えられた試料台１の下部に接続された振動機または回転モーターなどを備える構造であることが好ましい。なお、本実施の形態の駆動機構は、並進運動あるいは回転運動のパターンや速度を制御する機構を備えていることが好ましい。
なお、図２１には、コロナ放電２、電極５ａ，５ｂ、導電線７ａ，７ｂ、電源９、ガスの流路１１、ガス供給部１３、試料台が回転運動する場合の回転運動の方向１７も説明のために記載されている。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば互いに形状が異なる対向する電極は、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、互いに異なる他の形状であってもよい。
＜ガス流の方向を調整する方法と試料回転法や電極回転法との組合せ＞
図２２は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図２２に示す構造に限定されるものではない。
ここで、本発明の第十二の実施の形態のプラズマ照射装置は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂと、試料台１を備えた保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置である。なお、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
ここで、円形シャーレ内に満遍なくプラズマを照射させる方法として、上述の試料回転法や電極回転法があるが、水平方向にプラズマ強度が均一なプラズマをシャーレの半径部分にあてた場合、その状態でシャーレを回転させると中央部ほどプラズマ照射強度が強くなる傾向がある。したがって、中央部の照射が適当な場合には周辺部の照射が弱すぎることになり、周辺部の照射が適当な場合には中央部の照射が強すぎることになる。そのため、何らかの方法で水平方向のプラズマ強度に差を生じさせて外周側により強いプラズマがあたるようにすれば、結果としてシャーレ全体に適度な強度で均一に照射することができる。
そこで、本実施の形態のプラズマ照射装置においては、このプラズマ照射領域調節手段は、この保持手段および／またはこのプラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段と、このガス流の方向を変化させることができるこのガス供給手段と、を含む構造を採用している。
具体的には、図２２に示すように、この保持手段および／またはこのプラズマ発生エネルギー供給手段の回転運動および／または偏心回転運動の中心軸から外周方向へガス流を傾けることにより、風の流れる方向ほどプラズマが強く吹出される傾向がある。そのため、このプラズマ発生エネルギー供給手段をシャーレなどの保持手段の外周側に設置すればシャーレ内を均一に照射することができる利点がある。
なお、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に回転運動および／または偏心回転運動させる駆動機構であるが、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
なお、図２１には、コロナ放電２、電極５ａ，５ｂ、導電線７ａ，７ｂ、電源９、ガスの流路１１、ガス供給部１３、試料台が回転運動する場合の回転運動の方向１７も説明のために記載されている。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば同一形状の対向する電極を用いることに限定されず、互いに形状が異なる対向する電極と組合せても、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、好適に用いることができる。
＜不均等シールド法と試料回転法や電極回転法との組合せ＞
図２３は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図２３に示す構造に限定されるものではない。
ここで、本発明の第十三の実施の形態のプラズマ照射装置は、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、ガス流動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ａと、保持部駆動方式を用いたプラズマ照射領域調節部５０３ｂと、試料台１を備えた保持部５０５と、を備えた、プラズマ照射装置である。なお、コロナ放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部５０１と、試料台１を備えた保持部５０５とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
ここで、円形シャーレ内に満遍なくプラズマを照射させる方法として、上述の試料回転法や電極回転法があるが、水平方向にプラズマ強度が均一なプラズマをシャーレの半径部分にあてた場合、その状態でシャーレを回転させると中央部ほどプラズマ照射強度が強くなる傾向がある。したがって、中央部の照射が適当な場合には周辺部の照射が弱すぎることになり、周辺部の照射が適当な場合には中央部の照射が強すぎることになる。そのため、何らかの方法で水平方向のプラズマ強度に差を生じさせて外周側により強いプラズマがあたるようにすれば、結果としてシャーレ全体に適度な強度で均一に照射することができる。
そこで、本実施の形態のプラズマ照射装置においては、このプラズマ照射領域調節手段は、この保持手段および／またはこのプラズマ発生エネルギー供給手段を回転運動および／または偏心回転運動により駆動する手段と、この低温ガスプラズマの流路に設けられた、この低温ガスプラズマが通過可能な不均一な領域を有する遮蔽板と、を含む構造を採用している。
具体的には、図２３に示すように、プラズマの吹出し口を遮蔽板（シールド）２７ａ，２７ｂで遮る場合、奥深く遮るほどプラズマが強く吹出される傾向がある。そのため、プラズマ発生エネルギー供給手段のより深く遮った側をシャーレなどの保持手段の外周側に設置すれば、シャーレ内を均一に照射することができる利点がある。
なお、本実施の形態の駆動機構は、保持部５０５をプラズマ発生エネルギー供給部５０１に対して相対的に回転運動および／または偏心回転運動させる駆動機構であるが、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
なお、図２１には、コロナ放電２、電極５ａ，５ｂ、導電線７ａ，７ｂ、電源９、ガスの流路１１、ガス供給部１３、試料台が回転運動する場合の回転運動の方向１７も説明のために記載されている。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば同一形状の対向する電極を用いることに限定されず、互いに形状が異なる対向する電極と組合せても、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、好適に用いることができる。
＜沿面放電方式の活用＞
図２４は、図２に示す本発明のプラズマ照射装置１０００のヘッド部２２９付近のより詳細な構成を説明する概略図である。なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、図２４に示す構造に限定されるものではない。
ここで、本発明の第十四の実施の形態のプラズマ照射装置は、沿面放電方式を用いたプラズマ発生エネルギー供給部と、沿面放電方式を用いたプラズマ照射領域調節部と、容器６１を備えた保持部と、を備えた、プラズマ照射装置である。なお、容器６１を備えた保持部とについては、既に本発明の上記の実施の形態において説明しているので、ここでは説明を繰り返さない。
本実施の形態のプラズマ照射装置においては、このプラズマ発生エネルギー供給手段は、図２４に示すように、複数の開口空隙部を有する誘電体２９ａ，２９ｂ，２９ｃと、それぞれ異なる前記開口空隙部の内部に設けられ、直流または交流の電源９と接続した対向する電極５ａ，５ｂと、を含む構造を採用している。
なお、図２４には、プラズマ３、標的細胞１５、導電線７ａ，７ｂも説明のために記載されている。
本実施の形態においては、このような構造で電極間を誘電体で隔てることにより、誘電体を避けての最もインピーダンスが低いルートに沿って放電が発生するというメカニズムによって沿面放電によるプラズマが発生する。そして、沿面放電によるプラズマでは、放電パスを適当なルートに固定することにより、目的の箇所に再現性よくプラズマを照射することができるという特徴がある。
なお、本実施の形態において、誘電体２９ａ，２９ｂ，２９ｃは、プラスチックまたはガラスまたはセラミックスを含有する材質からなることが好ましい。プラスチックまたはガラスは、誘電体としての性質を有し、安価で入手も容易だからである。さらに、本実施の形態における誘電体は、沿面放電によるプラズマにさらされることから、耐熱性を有することが好ましい。
また、図２４においては、誘電体２９ａ，２９ｂ，２９ｃは、貫通空隙部を有する構造に記載されているが、誘電体の形状は特に貫通空隙部を有する構造に限定されるものではなく、電極５ａ，５ｂを挿入することのできる開口空隙部を有するような形状であれば、空隙部は誘電体を貫通している必要はなく、用途に応じてさまざまな形状をとり得る。
本実施の形態を用いることにより、標的細胞１５の存在領域に対応する領域で均一な沿面放電を行なうことが可能であり、均一な強度分布の低温ガスプラズマ３を標的細胞１５に照射することができるため、標的細胞１５への選定分子の導入効率を高めることができるという利点がある。
また、本実施の形態のプラズマ照射装置においては、図２５に示すように、このプラズマ照射領域調節手段は、この複数の開口空隙部のうち１以上の開口空隙部から容器６１などの保持手段への方向のガス流１１を発生させるガス供給手段１３を含む構造を採用してもよい。
なお、図２５には、電極５ａ，５ｂ、導電線７ａ，７ｂ、電源９、誘電体２９ａ，２９ｂ，２９ｃ、沿面放電によるプラズマ３、標的細胞１５も説明のために記載されている。
このような構造を採用することにより、試料のシャーレ底が深い場合など電極−試料間距離を十分に近づけることができないような場合にも、十分に試料にプラズマを照射することができる利点がある。
あるいは、本実施の形態のプラズマ照射装置においては、図２６に示すように、このプラズマ発生エネルギー供給手段は、複数に分岐し、それぞれ異なるこの開口空隙部の内部に設けられた電極先端を備え、この複数の対向する電極５ａ，５ｂ，５ｃのうち少なくとも一組の電極（たとえば、５ａおよび５ｂの組や５ａおよび５ｃの組など）を含む構造を採用してもよい。
なお、図２６には、導電線７ａ，７ｂ、電源９、誘電体２９ａ，２９ｂ，２９ｃ、沿面放電によるプラズマ３、標的細胞１５、容器６１も説明のために記載されている。
このような構造を採用することにより、比較的低い印加電圧で比較的広い試料面を照射することができるという利点がある。
なお、本発明のプラズマ照射装置１０００の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば単数または複数の噴出口を備えたプラズマ照射領域調節部と組合せても、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、好適に用いることができる。
＜標的細胞の細胞融合方法＞
本発明の標的細胞の細胞融合方法は、複数の前記標的細胞が近傍に存在することとなるように添加するステップと、前記標的細胞を低温ガスプラズマの照射領域に保持するステップと、前記低温ガスプラズマの照射領域を調節するステップと、前記低温ガスプラズマを発生するために必要なエネルギーをガスに供給するステップと、前記標的細胞に前記低温ガスプラズマを照射するステップと、を備える、標的細胞の細胞融合方法である。
本発明の標的細胞の細胞融合方法も、上記の本発明の標的細胞への選定分子の導入方法と同様に、他の付加的ステップを備えていることが好ましい。他の付加的ステップの内容については、上記の本発明の標的細胞への選定分子の導入方法において説明しているため、説明を繰り返さない。
また、本発明の標的細胞の細胞融合方法も、上記の本発明の標的細胞への選定分子の導入方法と同様の種類の標的細胞を用いることが好ましい。標的細胞の種類については、上記の本発明の標的細胞への選定分子の導入方法において説明しているため、説明を繰り返さない。
さらに、本発明の標的細胞の細胞融合方法も、上記の本発明の標的細胞への選定分子の導入方法と同様のプラズマ照射装置を用いることが好ましい。プラズマ照射装置の構造および機能については、上記の本発明の標的細胞への選定分子の導入方法において説明しているため、説明を繰り返さない。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例では動物樹立細胞株への標的分子の導入を試みた。
本実施例を行うにあたり、まず、図２に示す電源９を有するおよびガス供給部１３を有する、本発明のプラズマ照射装置１０００を作製した。なお、このプラズマ発生エネルギー供給部５０１のヘッド部２２９およびプラズマ照射領域調節部５０３および保持部５０５は、図３に示すような構造となるように作製した。
本プラズマ照射装置は、電極間電圧を数ｋＶ〜十数ｋＶの範囲に設定でき、電極間距離を１０〜１５ｍｍの範囲に設定でき、周波数を２０〜４０ｋＨｚの範囲に設定でき、パルス周期を３０〜９０Ｈｚの範囲に設定でき、Ｄｕｔｙを２５〜１００％の範囲に設定でき、ガスとしては空気、窒素、酸素、二酸化炭素、アルゴンや、ヘリウム：空気＝１：１の混合ガスなどを選択でき、低温ガスプラズマの照射時間を約１〜１２０秒間の範囲に設定できるように作製した。
本プラズマ照射装置により、たとえば、図１９および図２０に表示したような分光スペクトルを有する低温ガスプラズマを発生させることができる。なお、図１９および図２０に表示した分光スペクトルは、大塚電子製分光器ＭＣＰＤ−３０００を用いて、該分光器のプローブを低温ガスプラズマより約３ｃｍ離れた位置に設置して、測定したものである。
ここで、図１９は、ガス種：空気、周波数：２３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％の条件で低温ガスプラズマを発生させた際の測定値に基づくグラフである。また、図２０は、ガス種：アルゴン、周波数：２３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％の条件で低温ガスプラズマを発生させた際の測定値に基づくグラフである。
本実施例では、上記のプラズマ照射装置を用いて、標的細胞への選択分子の導入を実施した。
まず、チャイニーズハムスター肺線芽細胞（本明細書においてＣＨＬ細胞とも記載する）を標的細胞として、直径６０ｍｍの培養プレート（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）にまき、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり１×１０６個で培養を開始した。標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に１１０ｍの緑色蛍光蛋白質（本明細書においてＧＦＰとも記載する）発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、本プラズマ照射装置を用いてさまざまな条件で低温ガスプラズマの照射を行った。
低温ガスプラズマの照射後、標的細胞に直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの発現を観察し、視野あたりの発現細胞数を定量化した。また、ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて、ｗｅｌｌ内全細胞あたりのＧＦＰ発現細胞数を定量化した。
その結果、いずれの条件においても細胞内にＧＦＰの発現が観察された。導入効率としては顕微鏡による目視で最大約６０％、ＦＡＣＳによる検討で約５〜２５％であった。
【実施例２】  本実施例では、接着性動物樹立細胞株への標的分子の導入を試みた。
まず、標的細胞として動物樹立細胞を６−ｗｅｌｌプレートにまき、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり、ＣＨＬ細胞の場合１×１０６個、ヒト子宮癌由来Ｈｅｌａ細胞の場合２．５×１０５個、ラットのＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＲＬ−１７２１）の場合１×１０６個で培養を開始した。標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、標的細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）液（１μｇ／μｌ）を加え、実施例１と同じプラズマ発生装置を用いて低温ガスプラズマの照射を行なった。
ここで、低温ガスプラズマの照射は、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶの範囲、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で、それぞれ約３秒間照射することにより行なった。なお、電極から標的細胞までの距離は適正な条件を選択した。
次に、低温ガスプラズマを照射後、直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いて標的細胞におけるＧＦＰの発現を観察し、視野あたりの発現細胞数を定量化した。また、ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（本明細書において単にＦＡＣＳとも記載する）を用いてｗｅｌｌ内全細胞あたりのＧＦＰ発現細胞数を定量化した。
その結果、いずれの標的細胞においても細胞内にＧＦＰの発現が観察された。遺伝子の導入効率としては、ＣＨＬ細胞およびＨｅｌａ細胞の場合、顕微鏡による目視で最大約７０％、ＦＡＣＳによる検討（シャーレ内全細胞数当たりの潰伝子導入効率）で約３０％であった。また、ＰＣ１２細胞の場合、ＧＦＰ遺伝子の導入効率は、５０〜６０％であった。一般に、Ｈｅｌａ細胞およびＰＣ１２細胞は既存法では導入効率が低いとされているが、本発明の方法により領域によっては、それぞれＨｅｌａ細胞では約７０％程度、ＰＣ１２細胞では５０〜６０％と高い導入効率を得ることが可能になった。
【実施例３】  本実施例では、浮遊性動物樹立細胞株への標的分子の導入を試みた。
まず、標的細胞としてヒト急性リンパ芽球性白血病末梢血由来Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞を２．２５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で含むリン酸バッファー懸濁液を調整し、その２５μｌに等量のＧＦＰ発現プラスミド溶液（２μｇ／μｌ）を混合後、その混合液を新しい６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり５０μｌ入れた。
そして、上記の混合液をｗｅｌｌ底面に薄く広げたのち、実施例１と同じプラズマ照射装置を用いて、標的細胞に低温ガスプラズマの照射を行なった。ここで、低温ガスプラズマの照射は、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶ、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で、約１〜３秒間照射することにより行なった。なお、電極から標的細胞までの距離は適正な条件を選択した。
続いて、プラズマ照射後直ちに培地を加えて３７℃、二酸化炭素５％の条件下で一晩培養後、蛍光顕微鏡を用いて標的細胞におけるＧＦＰの発現を観察し、さらにＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて、ｗｅｌｌ内全細胞あたりのＧＦＰ発現細胞数を定量化した。
その結果、浮遊性動物樹立細胞株においても、蛍光顕微鏡を用いた観察により細胞内にＧＦＰの発現が観察された。ＦＡＣＳを用いて検討した、浮遊性動物樹立細胞株への遺伝子の導入効率は約２５％であった。
【実施例４】  本実施例では、ラット大脳皮質細胞への標的分子の導入を試みた。
まず、標的細胞であるラット大脳皮質細胞は、次のように調製した。すなわち、妊娠ラット（Ｗｉｓｔｅｒ，１７日日）を麻酔後開腹して胎仔を子宮ごとＬ−１５（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に取り出し、胎仔全脳中より大脳皮質部位を切り分けた。大脳皮質部に０．２５％トリプシン溶液４０ｍｌと１％ＤＮＡｓｅ溶液８０μｌを加え、３７℃で２０分間インキュベート後、上清を持ててＦＢＳ  １０ｍｌを加え、ピペッティングで標的細胞をほぐした。これをセルストレイナーに通し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を２０ｍｌ程度加えて遠心により標的細胞を集めた。
標的細胞の濃度が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、培養開始用Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（２５μＭグルタミン酸、５００μＭグルタミン、３０ｎＭ  ＮａＳｅＯ３、ペニシリン・ストレプトマイシン含有）に懸濁し、３７℃、二酸化炭素５％条件下で６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用いて培養を開始した。
次いで、標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、実施例１と同じプラズマ照射装置を用いて、標的細胞に低温ガスプラズマの照射を行なった。ここで、低温ガスプラズマの照射は、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶ、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で、約１秒間照射した。
続いて、低温ガスプラズマ照射後、直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いて標的細胞におけるＧＦＰの発現を観察した。
その結果、ラット大脳皮質細胞においても、細胞内にＧＦＰ発現細胞が観察された。導入効率は一視野あたり、最大で約７０％であった。既存の濃伝子導入法ではほとんど遺伝子の導入が得られなかった動物初代培養細胞において、本発明の方法により安全、簡便かつ効率的な遺伝子導入が可能になった。
【実施例５】  本実施例では、ラット小脳顆粒細胞への標的分子の導入を試みた。
まず、生後９日日のＷｉｓｔｅｒラットをエーテル麻酔し脳を摘出後、標的細胞である小脳を切り出し髄膜を除去した。小脳を細断後、パパイン溶液（ＤＬ−システイン（Ｓｉｇｍａ）２ｍｇ、アルブミン５０ｍｇを溶かしたリン酸緩衝液１０ｍｌに、パパイン（ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−ｂｉｏｃｈｅｍ）９０単位を混ぜて３７℃で暫く放置して活性化後、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）を５０μｌ加え、使用時にはフィルター濾過滅菌した）１０ｍｌを加え、３７℃で約３０分間浸透させた。
次いで、上記の懸濁液にウマ血清（ＨＳ）６ｍｌを添加し、遠心して沈殿した組織を、血清培地（５％ＰＦＣＳ、５％ＨＳ、含有ＤＭＥ／Ｆ１２（１／１）培地）に懸濁させた。この懸濁液を、標的細胞の濃度が２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように、ポリエチレンイミンコートした６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまきつけ、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養後、１μＭ  ＡｒａＣ（Ｓｉｇｍａ）含有血清入り高カリウム（２６ｍＭ）培地（５％ＨＳ，重炭酸カリウム／２．１ｇ、３０ｎＭ  Ｎａ２ＳｅＯ４  ｉｎ  ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ））に培地交換し、３７℃、二酸化炭素５％条件下で５日間培養した。
続いて、標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、標的細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、実施例１と同じプラズマ照射装置を用いて、標的細胞に低温ガスプラズマを照射した。低温ガスプラズマの照射は、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶ、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件下で、約１秒間照射することにより行なった。
そして、低温ガスプラズマ照射後、標的細胞に直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの発現を観察した。
その結果、ラット小脳顆粒細胞においても、細胞内にＧＦＰ発現細胞が観察された。導入効率は一視野あたり、最大で約４０％であった。既存の濃伝子導入法ではほとんど遺伝子の導入が得られなかった動物初代培養細胞において、本発明の方法により安全、簡便かつ効率的な遺伝子導入が可能になった。
【実施例６】  本実施例では、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への標的分子の導入を試みた。
まず、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞Ｔｏｔａｌ  Ｋｉｔ（東洋紡績（株））を用いて標的細胞である正常ヒト臍帯静脈内皮細胞を培養した。次いで、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり２．５×１０５個まき、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。
次いで、標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、標的細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、実施例１と同じプラズマ照射装置を用いて、標的細胞に低温ガスプラズマの照射を行なった。低温ガスプラズマの照射は、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶ、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で、約１〜３秒間照射することにより行なった。
続いて、低温ガスプラズマの照射後、標的細胞に直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの発見を観察した。
その結果、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞においても、細胞内にＧＦＰ発現細胞が観察された。導入効率は一視野あたり、最大で約５０％であった。既存の濃伝子導入法ではほとんど遺伝子の導入が得られなかった動物初代培養細胞において、本発明の方法により安全、簡便かつ効率的な遺伝子導入が可能になった。
【実施例７】  ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への標的分子の導入を試みた。
本実施例では、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法により遺伝子を導入された標的細胞がその細胞としての機能を維持しているが否かを検討するため、ＧＦＰ遺伝子が導入されたＰＣ１２細胞について交感神経系への分化能が維持されているか否かについて検討した。
まず、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法を用いて、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子を導入したＰＣ１２細胞の培養液に、ＮＧＦの濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるようにＮＧＦを添加して６日間培養を行なった後、蛍光顕微鏡にて細胞内にＧＦＰの発現が確認されているＰＣ１２細胞の形態を観察して、交感神経様細胞への分化能を検討した。
その結果、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法によりＧＦＰ遺伝子の導入されたＰＣ１２細胞は、ＮＧＦ添加６日後においてもＧＦＰを発現し、かつ細胞の形態観察から確かに神経突起の伸展が行われていることが認められた。このことにより、低温ガスプラズマの照射による標的細胞への遺伝子の導入方法は、ＰＣ１２細胞が本来持っているＮＧＦに対する交感神経様細胞への分化能という性質を変えていないことが確認された。
【実施例８】  本実施例では、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法により導入された遺伝子が標的細胞内でその機能を発揮できるか否かについて検討するために、ＰＣ１２細胞へ導入されたＣＲＥＢが同じく導入されたＰＫＡ遺伝子により活性化されるか否かをレポータージーンアッセイを用いて検討した。
まず、標的細胞であるラットｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７２１）をコラーゲンＩＶでコートした６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり１×１０５個まき、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。
次に、標的細胞がプレートによくはりついていることを確認した後、培養プレートから培地を除去して標的細胞表面に、ＰＫＡ遺伝子（ｐＦＣ−ＰＫＡ）（１μｇ／μｌ）と活性化ＣＲＥＢの応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結されているＣＲＥＢレポーター遺伝子（ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）（１μｇ／μｌ）および内部標準としてウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＬ−ＳＶ４０）をそれぞれ１７μｌずつ混合した混合液を用い、実施例２と同様にして、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法によって共導入したＰＣ１２細胞の導入１日後におけるルシフェラーゼ活性を検討した。
その結果、コントロールベクターを導入した標的細胞に比較して、ＰＫＡ遺伝子を導入した標的細胞は、有意にルシフェラーゼ活性の上昇、すなわちＣＲＥＢの転写活性の上昇が認められた。このことにより低温ガスプラズマの照射による標的細胞への遺伝子の導入法において、樹立培養細胞であるＰＣ１２細胞において、導入された遺伝子がその機能を発現することが確認された。
【実施例９】  本実施例では、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法により導入された遺伝子が標的細胞内でその機能を発揮できるか否かについて検討するために、ラット小脳顆粒細胞へ導入されたＣＲＥＢが同じく導入されたＰＫＡ遺伝子により活性化されるか否かを、実施例８と同様にして、レポータージーンアッセイを用いて検討した。
まず、実施例５と同様にして樹立した、標的細胞であるラット小脳頻粒細胞がプレートによくはりついていることを確認した後、培養プレートから培地を除去して標的細胞表面に、ＰＫＡ遺伝子（ｐＦＣ−ＰＫＡ）（１μｇ／μｌ）と活性化ＣＲＥＢの応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結されているＣＲＥＢレポーター遺伝子（ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）（１μｇ／μｌ）および内部標準としてウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＬ−ＳＶ４０）をそれぞれ１７μｌずつ混合した混合液を用い、実施例２と同様にして、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法によって共導入したＰＣ１２細胞の導入１日後におけるルシフェラーゼ活性を検討した。
その結果、コントロールベクターを導入した標的細胞に比較して、ＰＫＡ遺伝子を導入した標的細胞は、有意にルシフェラーゼ活性の上昇、すなわちＣＲＥＢの転写活性の上昇が認められた。このことにより低温ガスプラズマの照射による標的細胞への遺伝子の導入法において、樹立培養細胞であるラット小脳頻粒細胞においても、導入された遺伝子がその機能を発現することが確認された。
すなわち、本発明の低温ガスプラズマを用いた標的細胞への選定分子の導入方法は、ＰＫＡ遺伝子による標的細胞のＣＲＥＢシグナル伝達経路に異常を与えていないことが確認された。
このように、本発明の低温ガスプラズマを用いた標的細胞への選定分子の導入方法を用いることにより、従来法では濃伝子導入が困難であった初代神経細胞を標的細胞として用いても、遺伝子を導入することができ、かつ該遺伝子の機能を発現させることができ、また該遺伝子を用いて簡単にレポータージーンアッセイを行なえることが明らかとなった。
【実施例１０】  本実施例では、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法により導入された遺伝子が標的細胞内でその機能を発揮できるか否かについて検討するために、ラット小脳顆粒細胞へ導入されたＢＡＤ遺伝子がラット小脳顆粒細胞のアポトーシスを誘導するか否かを検討した。
まず、標的細胞であるラット小脳顆粒細胞を実施例５と同様にして調製し、ＡｒａＣ添加後５日目の標的細胞について、培地を抜取った後、１ｗｅｌｌあたりアポトーシス誘導遺伝子であるＢＡＤ遺伝子（ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ−ＢＡＤ）溶液（１μｇ／５０μｌ）５０μｌを添加して実施例２と同一の条件で、標的細胞に低温ガスプラズマの照射を行なった。
その後、直ちに標的細胞に培地を添加し、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養後、ＣａｓｐＡＳＥ  ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、標的細胞のＣａｓｐａｓｅ活性を測定することにより、標的細胞においてアポトーシスが誘導されているか否かについて検討した。
その結果、コントロールベクターのみを導入した細胞に比べ、ＢＡＤ遺伝子が導入された細胞では、有意にＣａｓｐａｓｅ活性を有する、つまり、アポトーシスが誘導されている細胞が検出された。
また、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法によりＢＡＤ遺伝子を導入された細胞が確かにアポトーシスを誘導されていることを確認するために、ＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてＤＮＡ断片化も合わせて検討した。
その結果、コントロールベクターのみを導入した細胞に比べ、ＢＡＤ遺伝子が導入された細胞では、有意にＤＮＡ断片化を起こしている細胞が検出された。
これらの結果、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法によって細胞に導入されたＢＡＤ遺伝子は、ラット小脳顆粒細胞において有意にアポトーシスを誘導し、該ＢＡＤ遺伝子としての機能を発揮することが確認された。以上のことから、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法により初代培養細胞に導入された遺伝子は、該初代培養細胞において確かにその機能を発揮することが確認された。
【実施例１１】  本実施例では、チャイニーズハムスター肺由来細胞（ＣＨＬ細胞）、ヒト子宮癌由来Ｈｅｌａ紬胞、およびラットｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ＰＣ１２細胞を用いた細胞融合について検討した。
まず、実施例２と同様にしてＧＦＰ遺伝子を導入したＣＨＬ細胞、およぴＨｅｌａ細胞について、蛍光顕微鏡を用いて融合細胞の検出を行なった。またディフ・クイック（国際試薬（株））を用いて核を染色し、融合細胞の様子を顕微鏡にて観察した。標的細胞の核の染色は次のように行なった。
すなわち、低温ガスプラズマを照射して培養１日後の標的細胞について、細胞培養液を吸取って除去し、リン酸緩衝液でシャーレに接着している標的細胞を洗浄後、１ｗｅｌｌ当たりメタノール（和光純薬工業（株））を約５ｍｌ加え、室温にて５分間固定した。その後、染色液Ｉを１ｗｅｌｌ当たり約２ｍｌ添加後、すぐ吸取って除去し、続いて染色液ＩＩを約２ｍｌ添加後、またすぐ吸取って除去した。イオン交換水で上記の接着細胞を数回洗浄後、顕微鏡にて標的細胞を観察した。
本発明の標的細胞への選定分子の導入方法によりＧＦＰ遺伝子を導入されたＣＨＬ細胞、およびＨｅｌａ細胞の中には、細胞同士が融合して大きくなった細胞が観察された。また、低温ガスプラズマを照射されたそれぞれの標的細胞の核を染色したところ、標的細胞とともに核も融合しているもの、また標的細胞が融合して多核になっているものが観察された。
また、標的細胞数を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌあたり５×１０６個とやや多めにまいた条件で、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子を導入したラットのｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ＰＣ１２細胞について、実施例７と同様にしてＮＧＦを添加して、細胞融合したＰＣ１２細胞の分化能を検討した。
その結果、ＰＣ１２細胞の融合細胞についても、ＮＧＦ添加６日後においてＧＦＰを発現し、かつ確かに神経突起の伸展が行われていることが認められた。このことにより、低温ガスプラズマの照射により形成された融合細胞も、ＰＣ１２細胞が本来持っているＮＧＦに対する交感神経様細胞への分化能という性質を変えていないことが示唆された。
【実施例１２】  本実施例では、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法を利用することにより、リポソーム法では遺伝子が導入されにくい条件における、標的細胞への遺伝子の導入が可能となるか否かについて検討した。
ここで、リポソーム法は、リポソーム試薬と導入されるプラスミドベクターとの混合により適切なサイズの混合粒子を作製し、標的細胞に取込ませる方法である。そのため、標的細胞に取り込まれる適正なサイズおよび数量の粒子を作製する必要がある。
本実施例では、適正化された条件より濃い濃度のプラスミドおよびリポソーム試薬を用いて、標的細胞への遺伝子導入効率が改善されるか否かをＧＦＰ遺伝子を用いて次のように検討した。
すなわち、あらかじめＧＦＰ発現用プラスミド１００μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔ  ｉｎ  ２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）１００μｌを混合し、室温で１５分間設置して、プラスミド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを作製した。前日から６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにて培養していたＣＨＬ細胞の培養上清を抜取り、プラスミド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを２００μｌ添加した。
次いで、上記の混合液に、実施例１と同じプラズマ照射装置にて、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で低温ガスプラズマを照射後、直ちに標的細胞に培地を加えて３７℃、二酸化炭素５％条件下で培養した。
続いて、１日培養後、蛍光顕微鏡、およびＦＡＣＳを用いてＧＦＰを発現している標的細胞を検出した。
その結果、上記の条件下においても、リポソーム法単独でわずかにＧＦＰ遺伝子の導入された標的細胞が検出された。しかし、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法をリポソーム法と組合わせたものは、リポソーム法単独の場合に比べ、低温ガスプラズマが照射された領域において、ＧＦＰ遺伝子の導入された標的細胞数が増加していた。
また、ｗｅｌｌ中の総細胞数に対する遺伝子導入された標的細胞数の割合をＦＡＣＳを用いて検討したところ、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法をリポソーム法と組合わせたものは、リポソーム法単独の場合に比べ、約１．６倍の遺伝子導入効率の増加が見られた。
従って、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、他の遺伝子導入法と組合わせることにより、あるいはリポソームをはじめとする、プラスミドベクターに標的細胞内への移動を促す担体などを結合させることにより、これまで遺伝子の導入効率の悪かった条件下においても、あるいはこれまで遺伝子の導入が困難であった種類の標的細胞においても、遺伝子の導入効率の改善が見込まれることが期待される。
【実施例１３】  本実施例では、マウス個体への色素分子の導入を試みた。
まず、麻酔下のヌードマウス（８週齢、メス、日本チャールス・リバー（株））の腹部一面に薄くＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅ（１０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水溶液）を塗付した。
次いで、実施例１と同じプラズマ照射装置を用いて、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶ、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で、低温ガスプラズマを２．５秒間ヌードマウスの腹部に照射した。このとき、電極からヌードマウスの腹部までの距離は、遠い箇所で約２４ｍｍ、近い箇所で約１８ｍｍとなるようにした。
続いて、そのまま３分程度放置後、ヌードマウスの腹部のＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗布した場所を水を含んだ脱脂綿で拭取り、続いて７０％エタノールを含んだ脱脂綿できれいに拭取り、皮膚への色素の沈着を観察した。そして、低温ガスプラズマのみを照射したヌードマウスの腹部、およびＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗布したが低温ガスプラズマを照射しなかったヌードマウスの腹部と、それぞれ目視の観察により比較した。
その結果、低温ガスプラズマを照射しただけのヌードマウスの腹部、およびＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗布したが低温ガスプラズマを照射しなかったヌードマウスの腹部においては、いずれも皮膚に色素の沈着は見られなかった。それに対して、Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗布して低温ガスプラズマを照射したヌードマウスの腹部は、腹部のプラズマ照射領域に青色の斑点がいくつか確認された。また、低温ガスプラズマの照射から約２４時間後においてもその斑点は観察された。
【実施例１４】  本実施例では、回転台の利用によるプラズマ照射領域の調節を試みた。
まず、標的細胞としてチャイニーズハムスター肺繊維芽細胞（ＣＨＬ細胞）を直径６０ｍｍのｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅにまき、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり１×１０６個で培養を開始した。標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、標的細胞表面に１１０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加えた。
次いで、実施例１と同じプラズマ照射装置を用いて、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶ、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で、低温ガスプラズマを３秒間標的細胞に照射した。その際、標的細胞を２つの試料に分け、一方の試料は、ｐｌａｔｅを回転数１．６回転／秒で回転させた回転台（ターンテーブル）の上に載せて、ｐｌａｔｅ全体に満遍なく照射した。もう一方の試料は、ｐｌａｔｅを所定の位置に固定した状態で照射した。
照射後直ちに標的細胞に培地を加えて一晩培養し、翌日ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いてｐｌａｔｅ内全細胞あたりのＧＦＰ蛋白質発現率を測定した。
その結果、標的細胞への選定分子の導入効率は、回転台を使用しなかった試料では１４〜１８％であったのに対し、回転台を使用した試料では３０〜３７％であった。
【実施例１５】  本実施例では、遮蔽板の利用によるプラズマ照射領域の調節を試みた。
まず、標的細胞としてチャイニーズハムスター肺繊維芽細胞（ＣＨＬ細胞）を直径６０ｍｍのｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅにまき、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり１×１０６個で培養を開始した。標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、標的細胞表面に１１０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加えた。なお、この標的細胞は、後述する低温ガスプラズマの照射のため、２つの試料に分けられた。
次いで、実施例１と同じプラズマ照射装置の低温ガスプラズマの噴出口（幅３８ｍｍ）の両端に、ガラス製の遮蔽板を取付け、噴出口の幅を２２．５ｍｍにした。そして、放電時の電極間電圧：１０〜１４ｋＶ、電極間距離：１３ｍｍ、周波数：２３．３ｋＨｚ、パルス周期：６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ：５０％、ガス種：空気、ガス流量：３８Ｌ／ｍｉｎの条件で、低温ガスプラズマを３秒間標的細胞に照射した。その際、標的細胞を回転台（ターンテーブル）に載せ、回転数１．６回転／秒で回転させながらｐｌａｔｅ全体に満遍なく照射した。一方で、遮蔽板の効果を検証するため、遮蔽板を外した状態で別の試料に同じ条件で低温ガスプラズマを照射した。
照射後直ちに標的細胞に培地を加えて一晩培養し、翌日ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いてｐｌａｔｅ内全細胞あたりのＧＦＰ蛋白質発現率および標的細胞死滅率を測定した。
その結果、標的細胞への選定分子の導入効率は、遮蔽板を使用しなかった試料ではＧＦＰ発現率は３６〜４３％、標的細胞死滅率は１０〜１３％であったのに対し、遮蔽板を使用した試料ではＧＦＰ発現率は５４〜５８％、標的細胞死滅率は３〜４％であった。
【実施例１６】  本実施例では、試料回転法と組合せての形状違い電極の利用を試みた。
具体的には、形状違い電極の使用による照射均一化効果を確認するため、以下の実験を行った。
まず、標的細胞として、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞ＣＨＬ細胞を直径６０ｍｍのｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ（シャーレ）にまき、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。この際、培養細胞数は１シャーレあたり４×１０５個で培養を開始した。そして、細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に１１０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加えた。
プラズマ照射装置による照射では、図２１に示すように、一つの試料は図２７および図２８に示される形状違い（くの字形，カーブ形）の電極を用い、プラズマがシャーレの半径部分にあたる位置で、くの字形の電極が回転の外周側になるように設置した。他の二つの試料は、図３１および図３２に示すように、カーブ形またはくの字形の同形状の電極を用いた。
ここで、図２１の電極５ｂの拡大図であるくの字形電極の形状２７１を図２７として示す。また、図２１の電極５ａの拡大図であるカーブ形電極の形状２８１を図２８として示す。
ここで、水平方向にプラズマ強度が均一なプラズマをシャーレの半径部分にあてた場合、その状態でシャーレを回転させると中央部ほどプラズマ照射強度が強くなる傾向がある。そこで、上記の形状違いの電極を用いた場合には、電極形状を不均等にして水平方向のプラズマ強度に差を生じさせた。このようにした場合、くの字形電極では電極上のプラズマ放電位置が固定されるのに対し、カーブ形電極ではプラズマ放電位置が広がる傾向がある。したがって固定されたくの字形電極の側ほどプラズマ強度が強くなる傾向があるため、上記の形状違いの電極と回転法とを組合せることにより、結果としてシャーレ全体に均一に照射することができる。これに対して、同形状電極を用いた場合には、シャーレ内の照射ムラのため、シャーレ全体での導入率も比較的低くなり、標的細胞の死滅も比較的多くなる。
次いで、試料を電極−試料底距離２２ｍｍの位置に設置して回転数約１回転／秒で回転させながら、周波数２０ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ５０％、ガスとして空気を用い、ガス流量９０Ｌ／ｍｉｎの条件でプラズマを発生させて３秒間試料にプラズマを照射した。照射後直ちに培地を加えて一晩培養した。
翌日ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いてシャーレ内全細胞あたりのＧＦＰ蛋白発現率を測定した。その結果、導入効率は、形状違い（くの字形，カーブ形）を使用した試料では４３〜５８％であったのに対し、カーブ形の同形状電極を使用した試料では３８〜４７％、くの字形の同形状電極を使用した試料では２７〜３４％と、形状違い電極を用いることによるシャーレ全体での遺伝子導入率の向上が認められた。
一方、同じ条件でプラズマ照射した試料につき、ディフ・クイック（国際試薬株式会社）を用いて核を染色して接着細胞を可視化し、照射の均一性を評価した。
染色は次の手順で実施した。プララズマ照射後一晩培養した試料から培養液を吸取って除去し、リン酸緩衝液でシャーレに接着している細胞を洗浄後、１シャーレ当たり２〜５ｍＬの固定液を加えて細胞を固定した。その後、染色液Ｉを１シャーレ当たり２〜５ｍＬ添加して５分程度放置後、液を吸い取って除去した。続いて染色液ＩＩを１シャーレ当たり２〜５ｍＬ添加して５分程度放置後、液を吸取って除去した。イオン交換水で接着細胞を数回洗浄し、風乾後目視にて観察した。プラズマ照射がシャーレ内で均一な場合には、接着細胞がシャーレ全体残るために全体が染色される。一方プラズマ照射がシャーレ内で不均一な場合には、照射強度の強すぎる箇所が生じてその箇所で細胞が死滅してはがれてしまうため、染色されない。したがって、シャーレ内に染色されない箇所が認められる。
観察の結果、図２９の写真および図３０の模式図に示す通り、電極形状違いの試料では均一に染色が認められたが、同形状電極を用いた試料ではいずれの場合も、特に中央部に染色されない箇所が認められた。すなわち形状違い電極の利用によりシャーレ全体への照射を均一化して細胞死滅箇所を少なくできることが確認された。
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】  上記の結果より、本発明の標的細胞への選定分子の導入方法は、標的細胞に低温ガスプラズマを照射することにより、多種多様な選定分子を多種多様な標的細胞に高効率に導入することができ、かつＨＴＳ化が可能な標的細胞への選定分子の導入方法であることがわかる。
また、本発明の標的細胞の細胞融合方法を用いて、複数の標的細胞に低温ガスプラズマを照射することにより、標的細胞同士の細胞融合も行うことができる。
さらに、本発明の標的細胞への選定分子および本発明の標的細胞の細胞融合方法は、従来のエレクトロポレーション法のように、１つ１つの試料に対し電極を用いて電界をかける様な煩雑な操作の必要もなく、また遺伝子銃のような大がかりな装置も必要としない。そのため、本発明の標的細胞への選定分子および本発明の標的細胞の細胞融合方法は、従来法に比べて非常に簡便、高効率かつＨＴＳ化が可能な方法である。
また、本発明のプラズマ照射装置は、低温ガスプラズマの照射領域を調節するプラズマ照射領域調節部を備えているため、必要な照射領域の標的細胞に対して、必要な強度の低温ガスプラズマを照射することができる。それゆえ、本発明のプラズマ照射装置は、本発明の標的細胞への選定分子および本発明の標的細胞の細胞融合方法に好適に用いられる高効率かつＨＴＳに適した装置である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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