(57)【要約】宿主大腸菌を用いるチトクロームＰ−４５０遺伝子の発現系の提供。放線菌由来のフェレドキシン遺伝子、ならびに大腸菌に対して異種のフェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子を含む大腸菌が提供される、基質有機化合物の効果的な一原子酸素添加反応を進めるのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）由来チトクロームＰ−４５０遺伝子の発現系であって、該大腸菌が、異種微生物由来のフェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子と該チトクロームＰ−４５０遺伝子とを操作可能な形態で含んでなる組換えＤＮＡ分子を担持する発現系。
【請求項２】
フェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子が、独立して放線菌のいずれかの株に由来する請求項１記載の発現系。
【請求項３】
フェレドキシン遺伝子がミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属する微生物およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来である請求項１記載の発現系。
【請求項４】
フェレドキシン還元酵素遺伝子がストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来である請求項１記載の発現系。
【請求項５】
放線菌由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子が放線菌の同一の遺伝子クラスターに由来する請求項１に記載の発現系。
【請求項６】
フェレドキシン還元酵素遺伝子がストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）に由来する請求項１に記載の発現系。
【請求項７】
放線菌由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子が放線菌の同一の遺伝子クラスターに由来し、そしてフェレドキシン還元酵素遺伝子がストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）に由来する請求項１に記載の発現系。
【請求項８】
フェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子が、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のプチダレドキシン遺伝子（ｃａｍＢ）およびプチダレドキシン還元酵素遺伝子（ｃａｍＡ）である請求項１に記載の発現系。
【請求項９】
放線菌由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子が放線菌の同一の遺伝子クラスターに由来し、かつ、さらなるフェレドキシン遺伝子として、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のプチダレドキシン遺伝子（ｃａｍＢ）を含んでなる請求項１記載の発現系。
【請求項１０】
放線菌由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子が放線菌の同一の遺伝子クラスターに由来し、そしてフェレドキシン還元酵素遺伝子がシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のプチダレドキシン還元酵素遺伝子（ｃａｍＡ）であり、かつ、さらなるフェレドキシン遺伝子として、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のプチダレドキシン遺伝子（ｃａｍＢ）を含んでなる請求項１記載の発現系。
【請求項１１】
放線菌由来チトクロームＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子がミクロテトラスポーラ  レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ ｒｅｃｔｉｃａｔｉｎａ）由来のコンパクチン水酸化酵素遺伝子（ｍｏｘＡ）およびｍｏｘＡの下流に隣接して存在するフェレドキシン遺伝子（ｍｏｘＢ）である請求項１に記載の発現系。
【請求項１２】
放線菌由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子がミクロテトラスポーラ  レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ ｒｅｃｔｉｃａｔｉｎａ）由来のコンパクチン水酸化酵素遺伝子（ｍｏｘＡ）およびｍｏｘＡの下流に隣接して存在するフェレドキシン遺伝子（ｍｏｘＢ）であり、フェレドキシン還元酵素遺伝子がストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のフェレドキシン還元酵素遺伝子ｆｄｒ−１またはｆｄｒ−２である請求項１に記載の発現系。
【請求項１３】
放線菌由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子がミクロテトラスポーラ  レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ ｒｅｃｔｉｃａｔｉｎａ）由来のコンパクチン水酸化酵素遺伝子（ｍｏｘＡ）およびｍｏｘＡの下流に隣接して存在するフェレドキシン遺伝子（ｍｏｘＢ）であり、さらなるフェレドキシン遺伝子としてシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｄａ）由来のプチダレドキシン遺伝子（ｃａｍＢ）を含み、かつ、フェレドキシン還元酵素遺伝子がシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｄａ）由来のプチダレドキシン還元酵素遺伝子（ｃａｍＡ）である請求項１に記載の発現系。
【請求項１４】
チトクロームＰ−４５０遺伝子の発現の誘導が２０〜２４℃で都合よく行うことができる請求項１に記載の発現系。
【請求項１５】
該チトクロームＰ−４５０遺伝子が、配列番号１における塩基３１３〜塩基１５３３の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチド、および配列番号２における塩基５４４〜塩基１７５８の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチドを含んでなる請求項１記載の発現系。
【請求項１６】
該フェレドキシン遺伝子が、配列番号１における塩基１５４７〜塩基１７４１の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチド、および配列番号２における塩基１７８２〜塩基１９７０の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチドを含んでなる請求項１記載の発現系。
【請求項１７】
該フェレドキシン還元酵素遺伝子が、配列番号５における塩基１１８〜塩基１３７７の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチド、および配列番号８における塩基３４〜塩基１２９６の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチドからなる群より選ばれる請求項１記載の発現系。
【請求項１８】
該フェレドキシン遺伝子が、配列番号１６の塩基１４３９〜塩基１７５９の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチドを含んでなる請求項１記載の発現系。
【請求項１９】
該フェレドキシン還元酵素遺伝子が、配列番号１６における塩基１１５〜塩基１３８０の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ヌクレオチド配列に最低８０％の配列同一性を有する機能的に等価のポリヌクレオチドを含んでなる請求項１記載の発現系。
【請求項２０】
請求項１２または１３記載の発現系を用いてコンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）の６β位に水酸基を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、宿主大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）由来チトクロームＰ−４５０遺伝子の発現系に関する。
背景技術
チトクロームＰ−４５０遺伝子がコードするチトクロームＰ−４５０酵素（以下、単にＰ−４５０ともいう）は、還元型で一酸化炭素を結合して４５０ｎｍ付近にソーレー吸収帯（ｓｏｒｅｔ  ｂａｎｄ）を示す一群のプロトヘム含有蛋白質の総称である。Ｐ−４５０は多くの動植物組織、カビ、酵母のミクロソーム、一部の動物組織のミトコンドリアの内膜に結合しているほか、ある種の細菌、カビでは可溶性の形で存在している。
Ｐ−４５０は様々な基質特異性を有し、多種多様な有機化合物を基質とし得る異常に広い基質特異性を示す酵素がある一方で、比較的限られた種類の有機化合物としか反応しない基質特異性のかなり厳密な酵素も存在する。また反応部位に対する立体特異性（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）や位置特異性（ｒｅｇｉｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）にも優れた特性を示す。そして、Ｐ−４５０の具体的な機能としては、該Ｐ−４５０を発現する細胞の生体内異物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ）の水酸化反応、エポキシ化反応、脱アルキル化反応、脱窒素反応などの様々な反応を触媒することが知られている。例えば、ヒトに対して用いられる薬物の多くは多様なまたは特定のＰ−４５０のもつ作用、例えば水酸化などにより体内で代謝・不活性化されたり、逆にその薬理効果が向上したり、あるいは副作用が増強されたりするため、Ｐ−４５０は、薬物の代謝研究やプロドラッグ開発の観点から極めて高い医学的重要性を有する。
したがって、ヒトを含む高等生物の薬物代謝機能をもつＰ−４５０は多岐にわたって長年研究されてきている。該酵素は高等生物の肝臓のミクロゾーム画分から得ることができるが単一のアイソザイムに精製することは難しい。そのため単一のアイソザイムをコードする遺伝子を大腸菌または酵母などの宿主において機能的に発現させて、簡便にその酵素がもつ代謝的役割を調べる技術が開発されている。
しかし、かかる薬物代謝機能をもつ高等生物のＰ−４５０を利用して工業的レベルで物質生産に結びつけた例はない。高等生物のＰ−４５０は大腸菌または酵母などの宿主にて機能的に発現させても細菌のもつＰ−４５０に比べて生産性が低いことや副反応が多いことから利用が限られている。
他方、微生物由来の、例えば、カビまたは細菌においては工業的に有用な物質の生産に役立つＰ−４５０の例が知られており、一部は実際に有用薬物の工業生産に利用されている。代表的な例は、放線菌ストレプトミセス  カルボフィラス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）によりコンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）の６β位を水酸化し、生成物として高脂血症の治療薬であるプラバスタチンを得るものである（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６３（１９９５）８１−８５、特開平６−７０７８０号公報）。また、放線菌シュードノカルジア  オートトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）を利用してビタミンＤ３の１α位と２５位を水酸化して活性型ビタミンＤ３を生産する方法も実用化されている。
このような放線菌由来のチトクロームＰ−４５０酵素を用いた薬物の微生物変換はその酵素を発現している放線菌の培養液または菌体を用いて行われてきた。放線菌由来のＰ−４５０をコードする遺伝子を同じ放線菌であり、かつ、宿主として適したストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）に導入してその酵素活性を発現させた培養液も用いられている。このような遺伝子をもつ放線菌による基質化合物の微生物変換は、その放線菌の培養および基質化合物の目的生成物への変換にかなりの時間を要する。また、酵素によっては効果的に酵素発現量を増やすための発現誘導条件の検討が必要である。さらに、基質や目的生成物の代謝および分解系が変換に用いる放線菌に存在する場合があり、このことが副産物の生成や基質および目的生成物の減少などを引き起こし、目的生成物の生産性を低下させることがある。
また、上述の高等生物由来のＰ−４５０の単一アイソザイムをコードする遺伝子を大腸菌などの微生物宿主において機能的に発現させる例に習い、ストレプトミセス  グリセウス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来チトクロームＰ−４５０遺伝子であるＣＹＰ１０５Ｄ１遺伝子を大腸菌で機能的に発現した報告がある（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９９）２６３：８３８−８４２）。この発現系では、Ｐ−４５０に対する大腸菌のペリプラズム中の適当な電子供与体がＰ−４５０と協同して炭化水素の水酸化を行っているようである（Ｋａｄｅｒｂｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６７（２００１）２１３６−２１３８）。このようなＰ−４５０遺伝子の発現系は、宿主大腸菌が放線菌等に比べて培養時間を短縮できる利点がある。
発明の開示
上述のＰ−４５０をもつ微生物による有機化合物の変換系は、例えば、生物触媒への応用および薬物の代謝研究での使用が企図されている。殊に、生物触媒への応用を考慮すると、より効率のよい生物変換を達成することが望まれるであろう。また、産業上重要な所望の放線菌由来Ｐ−４５０酵素を効率良くスクリーニングするには、ハイスルプット  スクリーニング（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）などにおけるロボットを用いて自動化された酵素アッセイ操作あるいはその他の簡便かつ迅速な酵素アッセイ操作の対象として好適な遺伝子ライブラリーが必要である。具体的には微生物、好ましくは、取扱いが簡便で生育の速い微生物を宿主とし、個々の構成クローンが、その宿主で発現が可能である放線菌由来の異なるチトクロームＰ−４５０遺伝子をもつライブラリー（放線菌チトクロームＰ−４５０発現ライブラリー）の提供が望まれる。
上述の課題の一つの解決策としては、少なくとも培養に要する時間が比較的短く、しかも、放線菌Ｐ−４５０を用いる変換に係る基質化合物および該化合物からの生成物の代謝および分解系が少ないとみなせる大腸菌を宿主として使用することが挙げられる。ところが、大腸菌を宿主とする上記Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．のごとく単に放線菌由来のＰ−４５０遺伝子を宿主大腸菌に組み込み培養するだけでは、他の放線菌由来の多種多様なＰ−４５０遺伝子の多くは機能的に発現できない（すなわち、Ｐ−４５０の所期の酵素活性が生じない。）ことが確認された。したがって、本発明者らは、放線菌由来の多種多様なＰ−４５０遺伝子を確実かつ、高酵素活性を伴って機能的に発現できる系の構築について検討してきた。その結果、大腸菌にとっては異種の細菌に由来する特定の電子伝達系をＰ−４５０遺伝子と共に組込み、そして共発現すると多種多様な放線菌のチトクロームＰ−４５０遺伝子が機能的に発現できることを見出した。
本発明は、かような知見に基づくものであり、宿主大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）由来チトクロームＰ−４５０遺伝子の発現系であって、該大腸菌が、異種微生物由来のフェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子と該チトクロームＰ−４５０遺伝子とを操作可能な形態で含んでなる組換えＤＮＡ分子を担持する発現系を提供する。
かような発現系は、上記Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の生来の電子伝達系と共役することのできない放線菌由来のチトクロームＰ−４５０をコードする遺伝子でも機能的に発現することができる。換言すれば、本発明に従う発現系は、大腸菌生来の電子伝達系と共役するか、またはしないかに拘わりなく、Ｐ−４５０の所期の酵素活性を生じうる。かくして、本明細書にいう「機能的に発現する」とは、関心のある遺伝子が、そのコードする蛋白質を活性を示す形態で発現されることを意味する。
以下、本発明を詳細に説明する。
宿主大腸菌とは、プラスミドやファージＤＮＡなどのベクターと挿入遺伝子の増殖に用いることのできる大腸菌をいい、例えば、宿主−ベクター系を用いる組換えＤＮＡ実験において、外来のＤＮＡを組込んだベクターが遺伝子導入後に複製可能な宿主であればいずれであってもよい。宿主−ベクター系の宿主として、市販されている大腸菌を都合よく利用できる。
本発明にいう「放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子」とは、本発明の目的に沿うＰ−４５０遺伝子をいずれかの形態（染色体またはプラスミド上、等）に有するものであれば、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属するいかなる属の細菌由来のチトクロームＰ−４５０遺伝子をも包含する。そして、チトクロームＰ−４５０遺伝子とは、上述したとおりの蛋白質であって、本発明に従って、一原子酸素添加反応を触媒する活性を有しうる蛋白質をコードする遺伝子のすべてをいう。限定されるものでないが、本発明の発現系に組み入れることを企図しているＰ−４５０遺伝子としては、かような機能を有し、既に、少なくとも一部のＤＮＡの配列決定が行われており、各配列情報が遺伝子データベース（ＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋ）から入手できる以下に列挙する放線菌に由来し、かつ上記活性を有しうる蛋白質をコードするか、または下記の具体的なチトクロームＰ−４５０の機能を有するものを挙げることができる。
2003087381.tif 000002
2003087381.tif 000003
2003087381.tif 000004
また、本発明で用いることのできる放線菌由来Ｐ−４５０遺伝子を記載し、殊に、これらの遺伝子を調製するのに参照できる文献記載のものとしては、それぞれ以下に記載のものを挙げることができる：
ストレプトミセス  カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）由来のコンパクチンの水酸化酵素（Ｐ−４５０ｓｃａ−２）、Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６３（１９９５）８１−８５または特開平６−７０７８０号公報；
ミクロテトラスポーラ  レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）、特開２００１−２８６２９３号公報；および
アミコラータ  エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ｓｐ．）、ビタミンＤ３の水酸化Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３８：１５２−１５７。
また、公知の文献において遺伝子配列は記載されていないものの、Ｐ−４５０酵素の機能や生化学的性質が詳細に決定され、その情報をもとにそのＰ−４５０酵素をコードする遺伝子を容易に調製することができるものとして、ストレプトミセス  ロゼオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のプロゲステロン水酸化酵素（Ｂｅｒｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７７（２００１）８７−９６）が挙げられる。
本発明にいう、チトクロームＰ−４５０をコードする遺伝子（またはＰ−４５０遺伝子）とは、上述した放線菌の全ＤＮＡから単離できるか、あるいはそれらのヌクレオチド配列情報を基に、後述するようなＰＣＲ反応を利用して増幅することができ、かつ、本発明に従うＰ−４５０遺伝子の発現系において、機能的に発現できるものであればいずれも包含される。さらに、上記遺伝子（生来の遺伝子ともいう）と機能的に等価のポリヌクレオチドであって、本発明に従う発現系で対応する基質に対して一原子酸素添加反応を触媒する活性を生じるものも、本発明にいうＰ−４５０遺伝子に包含される。このような等価のポリヌクレオチドは、それらの相補物が、通常、対応する生来の遺伝子と、一定のハイブリダイゼーション条件下、例えば、６０℃で２×ＳＳＣ（標準クエン酸食塩水）中、好ましくは６０℃で０．５×ＳＳＣ中、特に好ましくは６０℃で０．２×ＳＳＣ中のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する、ポリヌクレオチドであろう。さらに、かようなポリヌクレオチドは、対応する生来の遺伝子のヌクレオチド配列とを整列させて比較した場合、最低８０％、好ましくは９０％、そして最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するであろう。このような「％同一性」は、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの百分率を意味する［すなわち、％同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）４０３−４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。］
本発明の発現系に含められるフェレドキシン遺伝子は、宿主大腸菌にとって異種微生物（または細菌）に由来するＤＮＡ分子である。一般にフェレドキシン遺伝子は、分子量が６，０００〜１４，０００程度の電子伝達体として機能する蛋白質をコードする。フェレドキシン遺伝子は、上記放線菌由来のＰ−４５０遺伝子と、さらに後述するフェレドキシン還元酵素遺伝子とも共発現することによって、Ｐ−４５０遺伝子を機能的に発現するのに関与するものであれば、大腸菌以外のいかなる細菌に由来するものであってもよい。細菌の具体例としては、限定されるものでないが、上述したＰ−４５０遺伝子の起源と同一もしくは異なる放線菌であることができる。
また、Ｐ−４５０遺伝子の起源たる放線菌とは異なる属に属する、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌に由来するフェレドキシン遺伝子を用いることもできる。このようなフェレドキシン遺伝子の例としては、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５（１９９０）６０６６−６０７３に記載されているプチダレドキシン（Ｐｕｔｉｄａｒｅｄｏｘｉｎ）遺伝子（またはｃａｍＢとも称する）であることもできる。
フェレドキシン遺伝子がＰ−４５０遺伝子と同一の放線菌に由来する場合、Ｐ−４５０遺伝子とフェレドキシン遺伝子は、全ＤＮＡ上で隣接して存在する遺伝子クラスターを構成する場合がある。かような場合には、両遺伝子を含むＤＮＡ断片を本発明に従う発現系で利用することもできる。本発明の発現系では、フェレドキシン遺伝子は重複して存在していてもよい。このような例で好ましいものとしては、放線菌に由来するフェレドキシン遺伝子とシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に由来する上記ｃａｍＢとの組み合わせ使用を挙げることができる。かような遺伝子も、上述したＰ−４５０遺伝子と同様に特定できる、機能的に等価のポリヌクレオチドを包含する。
本発明に従う発現系に必須の要素として含められるフェレドキシン還元酵素遺伝子は、宿主大腸菌とは異種であり、さらにＰ−４５０遺伝子の起源とも場合によって異種であってもよい細菌に由来するものであることができる。具体的には、上述のＰ−４５０遺伝子およびフェレドキシン遺伝子と共発現することができ、かつ、かような発現によりＰ−４５０遺伝子産物たるＰ−４５０酵素の所期の活性を示す、すなわち、基質に一原子酸素添加反応を触媒する、ことのできるフェレドキシン還元酵素をコードするものであれば、いかなる細菌に由来するフェレドキシン還元酵素遺伝子であっても本発明で使用できる。限定されるものでないが、放線菌に属するものとして、ストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）に由来するフェレドキシン還元酵素遺伝子（以下、本明細書ではｆｄｒ−１またはｆｄｒ−２という場合あり）、または上述のシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に由来するプチダレドキシン還元酵素遺伝子（またはｃａｍＡとも称する）を本発明で好ましく使用できる。また、かかる遺伝子も、上述したＰ−４５０遺伝子と同様に特定できる、機能的に等価のポリヌクレオチドを包含する。
本発明の発現系では、上記Ｐ−４５０遺伝子、フェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子が操作可能な形態で宿主大腸菌に含まれる。「操作可能な形態」とは、上記すべての遺伝子が機能的に発現できるような状態で宿主内に存在していることを意味する。かような状態の典型的な例は、上述のすべての遺伝子が、大腸菌で自律複製できるプラスミド中に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等ととも、適当な順序で組込まれて宿主中に存在しているか、あるいは染色体ＤＮＡ組込み型ベクターを介して、機能的に発現しうる状態で宿主大腸菌の染色体中に組込まれている場合を意味する。上記Ｐ−４５０遺伝子、フェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子は、上記プラスミド中でいかなる順序で配置されていてもよいが、通常、Ｐ−４５０遺伝子を最も上流に配置するのが好ましい。特に、Ｐ−４５０遺伝子とフェレドキシン遺伝子が同一の起源の遺伝子クラスター断片として利用される場合には、例えば、Ｐ−４５０遺伝子−フェレドキシン遺伝子−フェレドキシン還元酵素遺伝子の順、Ｐ−４５０遺伝子−フェレドキシン遺伝子−プチダレドキシン還元酵素遺伝子−プチダレドキシン遺伝子の順、またはＰ−４５０遺伝子−プチダレドキシン還元酵素遺伝子−プチダレドキシン遺伝子の順に配置されていることができる。
上記発現系で用いることのできるプラスミドまたはベクターは、大腸菌で、安定に自律複製できるか、大腸菌の染色体に外来の遺伝子を組込むことのできる組込み型ベクターであることができる。いずれも市販されているものをそのまま、あるいは必要により改変して用いればよい。これらのプラスミドとしては、遺伝子転写のための強力なプロモーターを備えたものが都合よく使用でき、かようなプラスミドとしては、例えば、ｐＥＴ１１およびｐＵＣ１８として市販されているものを挙げることができる。
こうして提供される本発明の放線菌由来チトクロームＰ−４５０遺伝子の発現系は、各種薬物の改変または前駆体から目的薬物への生物変換等に適するＰ−４５０酵素のスクリーニングに利用することができ、さらには前駆体から目的薬物の製造に利用することもできる。
以下に実施例をあげて、本発明を具体的に説明する。
発明を実施するための最良の形態
次式
2003087381.tif 000005
で表されるコンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）（また、上式の対応するδ−ラクトン体としても存在する）またはその塩の一原子酸素添加反応により、次式
2003087381.tif 000006
で表されるプラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、ならびに次式
2003087381.tif 000007
で、それぞれ表される異性体混合物（本明細書では「ＲＴ−５．８物質」という）を生成するＰ−４５０遺伝子発現系の構築例を参照しながら、本発明をさらに説明する。
なお、プラバスタチンナトリウムは高脂血症の治療剤として臨床上重要な医薬である。
コンパクチン［またはメバスタチン（ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）とも称されている］水酸化酵素活性を有する放線菌は、上記一覧表にも示したように、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するもの（例えば、特開昭５７−５０８９４号、特許第２６７２５５１号）やミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属するものがある。後者は本発明者らの一部が確認したものであるが、例えば、以下の手順に従って、Ｐ−４５０遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製できる。
ミクロテトラスポーラ  レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ  １４５２５からのＰ−４５０遺伝子の取得：
該遺伝子は、多くのＰ−４５０水酸化酵素ファミリーにおいて高い確率でアミノ酸配列が保存されていることが知られている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２、３３３５−３３４５（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、１６１２２−１６１３０（１９８５）等）領域のアミノ酸配列を参考にデザインしたプライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法により得ることができる。例えば、一定の培養条件下で、ＩＦＯ  １４５２５株を培養し、得られた菌体を破砕して染色体ＤＮＡを得る。得られた染色体ＤＮＡに対して、Ｐ−４５０水酸化酵素ファミリーに共通して存在する酸素結合領域とヘム結合領域のアミノ酸配列から設計したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片を取得し、これを基にさらにＰＣＲ反応を行い、最初のＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片の両外側の周辺領域を取得する（下流には、フェレドキシンをコードする遺伝子が存在していた。）これらの操作はいずれも、当該技術分野で周知の方法で実施することができる。これらの操作全体についての詳細は、本出願人による特願２００１−４７６６４明細書に記載されている（該明細書の内容は引用することにより本明細書に組み入れられる。）。こうして取得されたＰ−４５０遺伝子の周辺領域を含むヌクレオチド配列（コード配列におけるアミノ酸配列）を配列表の配列番号１に示す。この配列の塩基３１３〜塩基１５３３までの連続するヌクレオチド配列がＰ−４５０遺伝子（ｍｏｘＡ）に相当し、そして塩基１５４７〜塩基１７４１までの連続するヌクレオチド配列がフェレドキシン遺伝子（ｍｏｘＢ）に相当する。
ストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＴＭ−６またはＴＭ−７からのＰ−４５０遺伝子の取得：
本出願人は、日本国内の土壌より分離した多数のストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物について、コンパクチンを基質とし、プラバスタチンに生物変換しうる微生物として、上記ＴＭ−６およびＴＭ−７株を同定した。そして、これらの菌株は茨城県つくば市東１−１−１中央第６独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに平成１３年４月２５日付で寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３１１およびＦＥＲＭ  Ｐ−１８３１２で受託されている。
その後、これらの菌株ＴＭ−６およびＴＭ−７は、所謂、ブダペスト条約の規定上の国際寄託当局でもある前記の特許生物寄託センターに、該条約に基づく寄託への移管請求を行い、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００２およびＦＥＲＭ  ＢＰ−８００３で受領された。
ＴＭ−７株について、上記ＩＦＯ  １４５２５株と同様に目的遺伝子領域をＰＣＲで増幅し、目的遺伝子とその周辺領域のＤＮＡ断片について配列決定した結果を配列番号２に示す。この配列における塩基５４４〜塩基１７５８までの連続するヌクレオチド配列がＰ−４５０遺伝子（ｂｏｘＡ）に相当し、そして塩基１７８２〜１９７０までの連続するヌクレオチド配列がフェレドキシン遺伝子（ｂｏｘＢ）に相当する。これらの遺伝子の取得操作は、本出願人による特願２００１−１６６４１２明細書に詳細に記載されている（該明細書の内容は引用することにより本明細書に組み入れられる。）
なお、上記ｂｏｘＡのヌクレオチド配列は、例えば、特許第２６７２５５１号公報に記載されているストレプトミセス  カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＡＮＫ  ６２５８５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４５）のＰ−４５０遺伝子についてシーケンス決定を行い、対比したところ約７５％の相同性があり、上記ｍｏｘＡとは約４６％の相同性があり、その他、ストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の水酸化酵素遺伝子とは約７５％の相同性があり、ストレプトミセス  テンダエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ）Ｔｊｉ  ９０１株のニッコーマイシン（ｎｉｋｋｏｍｙｃｉｎ）生合成経路にあるピリジルホモスレオニン  モノオキシゲナーゼ（ｐｙｒｉｄｙｌｈｏｍｏｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子との相同性は約４６％であった。
以上の説明または後述する実施例の説明、さらには当該技術分野に周知の技法または遺伝子データベースの情報に従えば、当業者は、一原子酸素添加を行うべく基質を用いて、該基質の生物変換について既知の［例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から発行されているタイプカルチャーのカタログ等に記載の］放線菌をスクリーニングし、所期の酵素活性を有する菌株を同定した後、上述と同様にＰＣＲ操作等を実施することにより、多種多様のＰ−４５０遺伝子を取得できるであろう。したがって、本発明にいう放線菌由来チトクロームＰ−４５０遺伝子には、それら自体既知のもののみならず、当業者が取得することのできる放線菌由来チトクロームＰ−４５０遺伝子のすべてが包含される。
本発明に従う発現系に含められるフェレドキシン遺伝子およびフェレドキシン還元酵素遺伝子の取得、また、これらとＰ−４５０遺伝子との操作可能な連結による発現系の構築も、上記Ｐ−４５０遺伝子と同様に、または文献記載の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に加え、後述の実施例に記載の方法を参照すれば、当業者にとって極めて容易であろう。
こうして、構築されたＰ−４５０遺伝子の発現系は、大腸菌を増殖させる条件下でＰ−４５０遺伝子を機能的に発現させることができる、かような発現系にＰ−４５０遺伝子産物の酵素の基質を共存させて適当な条件下でインキュベート（または発現系たる形質転換体を培養）することにより、基質に一原子酸素が添加した生成物を得ることができる。
通常、培養は大腸菌の栄養培地となり得、さらに基質の生物変換に悪影響を及ぼさない培地で行う。このような培地は、適当な炭素源、窒素源、無機塩および天然有機栄養物等により成り立っている。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、ソルビトール、有機酸類等を単独に用いるかもしくは併用でき、その使用濃度は特に限定されず、おおよそ１〜１０％が適当である。窒素源としてはアンモニア、尿素、硫安、硝安、酢安等の化合物を一種または二種以上使用することができる。無機塩としては、燐酸一カリウム、燐酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などの塩類を使用することができる。さらに使用菌の生育促進効果を持つ有機栄養源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などが用いられ、さらにビタミン類、核酸類を少量培地に含有せしめることもできる。
本発明の発現系では、宿主大腸菌を大腸菌の増殖に適する温度、例えば２８〜４０℃で培養した後、約２５℃以下、好ましくは２０〜２４℃の温度下でＰ−４５０酵素を誘導すると、高力価で所期の活性を生じるＰ−４５０酵素を得ることができる。
以下、放線菌由来チトクロームＰ−４５０酵素としてコンパクチンの水酸化酵素をコードするミクロテトラスポーラ  レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ  １４５２５由来の遺伝子ｍｏｘＡを例として、その発現系の構築例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの例に何ら制限されるものではない。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：
以下の実施例で行うＰＣＲの条件は、それぞれ以下のとおりである。
（１）ゲノムＤＮＡを鋳型とする場合の条件
2003087381.tif 000008
（温度条件）
９４℃３分
（９８℃  ２０秒、６３℃  ３０秒、６８℃  ２分）３０サイクル
７２℃  ５分
（２）プラスミドＤＮＡ（ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ１）を鋳型とする場合の条件
2003087381.tif 000009
（温度条件）
９４℃  ３分
（９８℃  ２０秒、６３℃  ３０秒、６８℃  ２分）２５サイクル
７２℃  ５分。
実施例１  プラスミドの構築
（１）ｐＴ７−ｆｄｒ１
ストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）［Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）より分譲された。］のゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーＦＤＲ１−１Ｆ（５’−ＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧ−３’）（配列番号３参照）とＦＤＲ１−２Ｒ（５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧＴＣＧＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＣＧ−３’）（配列番号４参照）を用いてＰＣＲを行い、１．３ｋｂのフェレドキシン還元酵素に相同性を有する蛋白をコードする遺伝子（以下ｆｄｒ−１と表記する。配列番号５参照）断片を増幅した。この断片を制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｆｄｒ−１遺伝子断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片を大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ１１ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｄｅ  Ｉ部位およびＢａｍＨＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結して、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＴ７−ｆｄｒ１を構築した。
（２）ｐＴ７−ｆｄｒ２
同じ条件にて上記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりプライマーＦＤＲ２−３Ｆ（５’−ＣＧＡＣＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧ−３’）（配列番号６参照）とＦＤＲ２−４Ｒ（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＧＡＣＧＡＧＧＣＴＴＴＣＧＡＧＧＧ−３’）（配列番号７参照）を用いてＰＣＲを行い、ｆｄｒ−１とは異なる１．３ｋｂのフェレドキシン還元酵素に相同性を有する蛋白ををコードする遺伝子（以下ｆｄｒ−２と表記する。配列番号８参照）断片を増幅した。この断片を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩおよびＳｐｅ  Ｉで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｆｄｒ−１遺伝子断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。一方でプラスミドｐＴ７−ｆｄｒ１をＢａｍ  ＨＩおよびＳｐｅ  Ｉで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｐＥＴ１１ａベクター断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。このベクター断片と前述のｆｄｒ−１遺伝子断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結して、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＴ７−ｆｄｒ２を構築した。
（３）ｐＴ７−ｃａｍＡＢ
シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ１７４５３のゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーＰＲＲ−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’）（配列番号９参照）とＰＲＲ−２Ｒ（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＣ−３’）（配列番号１０参照）を用いてＰＣＲを行い、のプチダレドキシン還元酵素遺伝子（ｃａｍＡ）およびその遺伝子すぐ下流のプチダレドキシン遺伝子（ｃａｍＢ）を含む１．６５ｋｂの断片（ｃａｍＡＢ断片、配列番号１６参照）を増幅した。この断片を制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｃａｍＡＢ断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片を大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ１１ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｄｅ  Ｉ部位およびＢａｍＨＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結して、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＴ７−ｃａｍＡＢを構築した。
（４）ｐＭｏｘＡＢ
ＩＦＯ１４５２５株のゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーＭｏｘ−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧ−３’）（配列番号１１参照）とＭｏｘ−１２Ｒ（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＴＧＧ−３’）（配列番号１２参照）を用いてＰＣＲを行い、１．４ｋｂのコンパクチン水酸化酵素をコードする遺伝子（ｍｏｘＡ）およびその遺伝子の下流に隣接するフェレドキシン遺伝子（ｍｏｘＢ）の断片（ｍｏｘＡＢ断片）を増幅した。この断片を制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩ  Ｉで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｍｏｘＡＢ遺伝子断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片を前述のプラスミドｐＥＴ１１ａのＮｄｅ  Ｉ部位およびＢａｍ  ＨＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、プラスミドｐＭｏｘＡＢを構築した。ｐＭｏｘＡＢの構造図を図１に示した。
（５）ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ１およびｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ２
ＩＦＯ１４５２５株のゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーＭｏｘ−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧ−３’）（上記参照）とＭｏｘ−２Ｒ（５’−ＣＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＴＧＧ−３’）（配列番号１３参照）を用いてＰＣＲを行い、コンパクチン水酸化酵素をコードする遺伝子（ｍｏｘＡ）およびその遺伝子の下流に隣接するフェレドキシン遺伝子（ｍｏｘＢ）を含む１．４ｋｂの断片（ｍｏｘＡＢ断片）を増幅した。この断片を制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｍｏｘＡＢ遺伝子断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片を前述のプラスミドｐＴ７−ｆｄｒ１のＮｄｅ  Ｉ部位およびＳｐｅ  Ｉ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、プラスミドｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ１を構築した。ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ１の構造図を図２に示した。
また同じ挿入断片を別のプラスミドｐＴ７−ｆｄｒ２のＮｄｅ  Ｉ部位およびＳｐｅ  Ｉ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、プラスミドｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ２を構築した。ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ２の構造図を図３に示した。
（６）ｐＭｏｘＡＢ−ｃａｍＡＢ
ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ１のＤＮＡを鋳型にしてプライマーＭｏｘ−３Ｆ（５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＣ−３’）（配列番号１４参照）とＭｏｘ−５Ｒ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＧＴＣＣＣＧ−３’）（配列番号１５参照）を用いてＰＣＲを行い、１．５ｋｂのコンパクチン水酸化活性をもつチトクロームＰ４５０酵素をコードする遺伝子およびその遺伝子の下流に隣接するフェレドキシン遺伝子（ｍｏｘＡＢ遺伝子）の断片を増幅した。この断片をプラスミドｐＴ７−ｃａｍＡＢのＮｄｅ  Ｉ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、プラスミドｐＭｏｘＡＢ−ｃａｍＡＢを構築した。ｐＭｏｘＡＢ−ｃａｍＡＢの構造図を図４に示した。
実施例２  放線菌由来チトクロームＰ４５０酵素活性を発現する組換え体の調製
３つのプラスミドすなわちｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ１、ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ２、ｐＭｏｘＡＢ−ｃａｍＡＢで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して各々のプラスミドの形質転換株を得た。これらの株は、その単一のコロニーをＬＢ培地２ｍｌに接種し、２８℃で１６時間２２０ｒｐｍで振とう培養し、培養液２００μｌを等量（２００μｌ）の４０％グリセロール（滅菌済み）と混合して調製されるグリセロールカルチャーとして、使用時まで−８０℃で保存した。一方でｐＭｏｘＡＢおよびベクターとして使用したｐＥＴ１１ａも同様にして大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して各々のプラスミドの形質転換株を得た。これらの形質転換株は対照として使用した。
実施例３  コンパクチンからプラバスタチンおよび水酸化類縁体の生産
（１）静菌体を用いた生産方法
前述の実施例２で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換株のグリセロールカルチャー１０μｌを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＬＢ培地２ｍｌに加え、２８℃で１６時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液２５０μｌを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＮＺＣＹＭ培地２５ｍｌに加え、３７℃で２．５時間振とう培養後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧを２５μｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  ５−アミノレブリン酸を２５μｌ順次添加し、１８−２８℃（この温度を「誘導温度」とする。）、１２０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。この培養液１０ｍｌから遠心分離により回収した菌体を変換緩衝液−２（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２ｍＭ  ＤＴＴ，１０％グリセロール，［ｐＨ７．３］）で１回洗浄し、次に菌体を１ｍｌの同緩衝液に懸濁し、静菌体懸濁液とした。この静菌体懸濁液にコンパクチンナトリウム塩（終濃度２５０μｇ／ｍｌ）およびＮＡＤＰＨ（終濃度１ｍＭ）を添加し、振とう条件下（２２０ｒｐｍ）、３２℃で２４−４８時間インキュベートした（この時間を「変換時間」とする。）。その後、この反応液１００μｌにアセトニトリル１００μｌを加えて、１分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより得られた上清をＨＰＬＣで分析し、基質のコンパクチンが水酸化されることにより生成したプラバスタチンおよびその他の水酸化体を検出した。ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃ−４ＲＡ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃ
カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（ＹＭＣ，Ｉｎｃ．），７５ｍｍ  ｘ  ４．６ｍｍＩ．Ｄ．
移動相：Ａ；イオン交換水／酢酸／トリエチルアミン＝９９８：１：１
Ｂ；メタノール／酢酸／トリエチルアミン＝９９８：１：１
グラジエント時間設定：０分  移動相Ａ／Ｂ＝５０：５０
３．００分  移動相Ａ／Ｂ＝１０：９０
３．５０分  移動相Ａ／Ｂ＝１０：９０
３．５１分  移動相Ａ／Ｂ＝５０：５０
６．００分  終了
流速：２．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ  ２３７ｎｍ
インジェクション容量：１０μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：６分
保持時間：コンパクチン      ４．２分
プラバスタチン    ２．７分
ＲＴ−５．８物質  ３．６分
（２）フェドバッチ（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）法による生産方法
ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換株のグリセロールカルチャー１０μｌを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＬＢ培地２ｍｌに加え、２８℃で１６時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液２５０μｌを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＭ９−プラス培地（Ｍ９塩，０．４％グルコース０．５％カザミノ酸、１００μｇ／ｍｌチアミン、２０μｌ／ｍｌチミン、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２５ｍｌに加え、３７℃で２．５時間振とう培養後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧを２５μｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  ５−アミノレブリン酸を２５μｌ順次添加し、２２℃、１２０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。この培養液に２．５ｍｌの変換混合物（２．５ｍｇ／ｍｌコンパクチンナトリウム塩、１ｍｇ／ｍｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、５０％グリセロール）を添加し、さらに２２℃で９６時間培養を継続した。ここで変換混合物を添加してからの時間を「培養時間」とした。この培養液１００μｌにアセトニトリル１００μｌを加えて、１分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより得られた上清を前述と同じ条件でＨＰＬＣで分析し、基質のコンパクチンが水酸化されることにより生成したプラバスタチンおよびその他の水酸化体を検出した。
実施例３（１）に記載した大腸菌形質転換株を用いた１８−２８℃の蛋白質誘導条件下で、変換時間を４８時間としたときの静菌体によるプラバスタチンおよびＲＴ−５．８物質の生産量の測定結果を表１に示す。
2003087381.tif 000010
誘導温度は２２℃の時が最も生産性が高く、その条件ではＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のフェレドキシン還元酵素（ｆｄｒ−１およびｆｄｒ−２）を共発現させた株はいずれも培地中に１．７μｇ／ｍｌ〜２．１μｇ／ｍｌのプラバスタチンおよび８．４μｇ／ｍｌ〜１０．２μｇ／ｍｌのＲＴ−５．８物質を蓄積した。ｃａｍＡＢを共発現させた株はさらに高い生産性を示し、培地中に６．０９μｇ／ｍのプラバスタチンおよび３３．５５μｇ／ｍのＲＴ−５．８物質を蓄積した。対照としてベクターのみ（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１１ａ）、あるいはフェレドキシン還元酵素を含まない株（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭｏｘＡＢ）ではプラバスタチンおよびＲＴ−５．８物質はほとんど検出されなかった。
実施例４（２）に記載したフェドバッチ法によるプラバスタチンの生産試験の結果を表２に示す。
2003087381.tif 000011
培養時間９６時間の結果で見ると、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のフェレドキシン還元酵素（ｆｄｒ−１およびｆｄｒ−２）を共発現させた株はいずれも培地中に０．２８μｇ／ｍ〜０．６１μｇ／ｍｌのＲＴ−５．８物質を蓄積したが、プラバスタチンの蓄積は検出されなかった。一方、ｃａｍＡＢを共発現させた株は高い生産性を示し、培地中に０．９５μｇ／ｍｌのプラバスタチンおよび１２．４４μｇ／ｍｌのＲＴ−５．８物質を蓄積した。対照としてベクターのみ（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１１ａ）、あるいはフェレドキシン還元酵素を含まない株（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭｏｘＡＢ）ではプラバスタチンおよびＲＴ−５．８物質は検出されなかった。
ｃａｍＡＢを共発現させた株、すなわちｐＭｏｘＡＢ−ｃａｍＡＢを導入した大腸菌においてその導入遺伝子のうちｍｏｘＢ（フェレドキシン遺伝子）とｃａｍＢ（プチダレドキシン遺伝子）の機能が重複している。そこでｐＭｏｘＡＢ−ｃａｍＡＢに含まれる構成遺伝子のうち活性発現に関与に必須な遺伝子を検証するため、構成遺伝子のうち１つないし２つの遺伝子を欠失したプラスミドを構築し、大腸菌に導入した。これらの株の静菌体を用いて、変換時間を２４時間としたときのコンパクチンの水酸化体の生産量を結果を表３に示す。
2003087381.tif 000012
以上より、活性の発現には少なくともｍｏｘＡ、ｍｏｘＢ、ｃａｍＡの３遺伝子が必須であるが、これにｃａｍＢを加えることで、極めて高い活性の上昇が認められ、コンパクチン水酸化体の生産量で約１０倍増加した。
実施例５  プラスミドの構築
（１）ｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ  １７４５３のゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーＰＲＲ−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’）（配列番号９参照）とＰＲＲ−２Ｒ（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＣ−３’）（配列番号１０参照）を用いて下記の条件でＰＣＲを行った。
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（温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒、６３℃  ３０秒、６８℃  ２分）３０サイクル
７２℃  ５分
ｐｕｔｉｄａｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（ｃａｍＡ）およびその遺伝子すぐ下流のｐｕｔｉｄａｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子（ｃａｍＢ）を含む１．５ｋｂの増幅された断片（ｃａｍＡＢ断片）を制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｃａｍＡＢ断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片を大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ１１ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｄｅ  Ｉ部位およびＢａｍＨＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＴ７−ｃａｍＡＢを構築した。次に２種の合成オリゴＤＮＡＳＰ−１（５’−ＴＡＴＧＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＴＴＡ−３’）（配列番号１７参照）およびＳＰ−２（５’−ＴＡＴＡＡＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＡＣＴＡＧＴＧＡＣＧＣＡ−３’）（配列番号１８参照）をアニールして得られるリンカー１分子をこのプラスミドのＮｄｅ  Ｉ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢを構築した。ｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢの構造図を図５に示した。
（２）ｐＣＢＭ−ｃａｍＡＢ
カルボマイシン（ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ）生産菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＡＴＣＣ１１４１６の全ＤＮＡを鋳型にしてプライマーＣＢ−４Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＣＴＧＡＴＧ−３’）（配列番号１９参照）およびＣＢ−５Ｒ（５’−ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＣＧＧＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣ−３’）（配列番号２０参照）を用いて下記の条件でＰＣＲを行うことで１．２５ｋｂのＯＲＦ−Ａ（カルボマイシンＢの１２，１３位のエポキシ化酵素をコードするシトクロムＰ４５０遺伝子）断片を得た（ＯＲＦ−Ａの遺伝子配列および機能についてはＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．５９，５８２−５８８，１９９５に記載されている；引用することによりこの文献の内容は本明細書に組み入れられる。）。
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（温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒、６３℃  ３０秒、６８℃  ２分）３０サイクル
７２℃  ５分
この遺伝子断片をＮｄｅ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉで消化したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したＯＲＦ−Ａ断片を含むゲル切片から同断片を同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片をｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢのＮｄｅ  Ｉ−Ｓｐｅ  Ｉ部位へＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、プラスミドｐＣＢＭ−ｃａｍＡＢを構築した。ｐＣＢＭ−ｃａｍＡＢの構造図を図６に示した。
（３）ｐＳＣ１５４Ａ１−ｃａｍＡＢ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫより分譲）の全ＤＮＡをＢａｍ  ＨＩおよびＰｓｔ  Ｉで分解し、１００ｎｇ／μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）溶液とした。このＤＮＡを鋳型にしてプライマー１５４Ａ１−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣ−３’）（配列番号２１参照）および１５４Ａ１−２Ｒ（５’−ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧ−３’）（配列番号２２参照）を用いて下記の条件でＰＣＲを行うことで１．２ｋｂのＣＹＰ１５４Ａ１をコードする遺伝子断片を得た（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来ＣＹＰ１５４Ａ１をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は遺伝子データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋに遺伝子名ＳＣＥ６．２１として公開されている）。
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（温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒、６３℃  ３０秒、６８℃  ２分）３０サイクル
７２℃  ５分
この遺伝子断片をＮｄｅ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉで消化したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したＣＹＰ１５４Ａ１遺伝子断片を含むゲル切片から同断片を同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片をｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢのＮｄｅ  Ｉ−Ｓｐｅ  Ｉ部位へＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、プラスミドｐＳＣ１５４Ａ１−ｃａｍＡＢを構築した。ｐＳＣ１５４Ａ１−ｃａｍＡＢの構造図を図７に示した。
（４）ｐＤｏｘＡ１−ｃａｍＡＢ
ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）生産菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９０５０の全ＤＮＡを鋳型にしてプライマーＤｏｘＡ−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧＴＧ−３’）（配列番号２３参照）およびＤｏｘＡ−２Ｒ（５’−ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＣＧＧＧＣＡＧＴＴＣ−３’）（配列番号２４参照）を用いて下記の条件でＰＣＲを行うことで１．２ｋｂのｄｏｘＡ（ダウノマイシンの生合成に関与するシトクロムＰ４５０遺伝子）断片を得た。ｄｏｘＡ遺伝子のＤＮＡ配列はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８１，Ｎｏ．１，３０５−３１８，１９９９（引用することにより。この文献の内容は本明細書に組み入れられる。）に記載されている。
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（温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒、６３℃  ３０秒、６８℃  ２分）３０サイクル
７２℃  ５分
この遺伝子断片をＮｄｅ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉで消化したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｄｏｘＡ断片を含むゲル切片から同断片を同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片をｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢのＮｄｅ  Ｉ−Ｓｐｅ  Ｉ部位へＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、プラスミドｐＤｏｘＡ１−ｃａｍＡＢを構築した。ｐＤｏｘＡ１−ｃａｍＡＢの構造図を図８に示した。
実施例６  チトクロームＰ４５０を発現させた大腸菌組換体を用いた微生物変換
（１）カルボマイシンＡの生産
前述の実施例５で得られたプラスミドのうちｐＣＢＭ−ｃａｍＡＢで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して得られた株のグリセロールカルチャー１０μｌを、アンピシリン５０ｕｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＬＢ培地２ｍｌに加え、２８℃で１６時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液２５０μｌを、アンピシリン５０ｕｇ／ｍｌを添加したＮＺＣＹＭ培地２５ｍｌに加え、３７℃で２．５時間振とう培養後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧを２５μｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  δ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄを２５μｌ順次添加し、２２℃、１２０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。この培養液から遠心分離により回収した菌体を変換用緩衝液−２（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２ｍＭ  ＤＴＴ，１０％グリセロール，［ｐＨ７．３］）で１回洗浄し、次に菌体を３ｍｌの同緩衝液に懸濁し、静菌体懸濁液とした。この静菌体懸濁液６００μｌにカルボマイシンＢメタノール溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）３μｌを加えて、しんとう（２２０ｒｐｍ）しながら２８℃で５時間インキュベートした。その後、この反応液に１００μｌの５０％Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．５）、１００μｌの酢酸エチルを加えて、ボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で１６，０００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた酢酸エチル相のうち１０μｌをＴＬＣプレートにスポットして酢酸エチル：ジエチルアミン（１００：２）で展開した。このプレートに１０％硫酸を噴霧後１００℃で１０分加熱した。発色したスポットの発色強度を２波長クロマトスキャナーＣＳ−９３０（島津製作所）で波長６００ｎｍで分析することで、基質のカルボマイシンＢ（ＴＬＣにおけるＲＦ値：０．７１）がエポキシ化されることにより生成したカルボマイシンＡ（ＴＬＣにおけるＲＦ値：０．６４）の生成量を評価した。その結果、カルボマイシンＡの生成が確認され、その生産量は９０μｇ／ｍｌであった。一方、対照株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ）を用いて同じ条件で基質変換反応および分析を行った時、カルボマイシンＡの生成は検出されなかった。
（２）７−エトキシクマリンの脱エチル化
前述の実施例５で得られたプラスミドのうちｐＳＣ１５４Ａ１−ｃａｍＡＢで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して得られた株のグリセロールカルチャー１０μｌを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＬＢ培地２ｍｌに加え、２８℃で１６時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液２５０μｌを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したＮＺＣＹＭ培地２５ｍｌに加え、３７℃で２．５時間振とう培養後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧを２５μｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  δ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄを２５ｕｌ順次添加し、２２℃、１２０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。この培養液から遠心分離により回収した菌体を変換用緩衝液−２（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２ｍＭ  ＤＴＴ，１０％グリセロール，［ｐＨ７．３］）で１回洗浄し、次に菌体を６ｍｌの同緩衝液に懸濁し、静菌体懸濁液とした。この静菌体懸濁液１ｍｌに、７−エトキシクマリンのＤＭＳＯ溶液（５０ｍＭ）を５μｌを加えて、しんとう（２２０ｒｐｍ）しながら２８℃で２０時間インキュベートした。その後、この反応液に２００μｌの酢酸エチルを加えて、ボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で１６，０００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた酢酸エチル相のうち１００μｌを減圧下で乾固した。乾固物を１００ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに溶解した。この溶液を８０倍に希釈してＦ−２０００型分光蛍光光度計（日立サイエンスシステムズ）にて励起波長３８０ｎｍにおける蛍光（波長４６０ｎｍ）を測定することで、基質の７−エトキシクマリンが脱エチル化されることにより生成した７−ヒドロキシクマリンの生成量を評価した。その結果、蛍光強度は２７７０を示し、７−ヒドロキシクマリンの生成が確認された。一方、対照株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ）を用いて同条件で基質変換反応および分析を行った時の蛍光強度は３以下であった。
（３）１３−ジヒドロダウノマイシンの脱水素化
前述の実施例５で得られたプラスミドのうちｐＤｏｘＡ１−ｃａｍＡＢで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して得られた株のグリセロールカルチャー１０ｕｌを、アンピシリン５０ｕｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＬＢ培地２ｍｌに加え、２８℃で１６時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液２５０μｌを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したＮＺＣＹＭ培地２５ｍｌに加え、３７℃で２．５時間振とう培養後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧを２５μｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  δ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄを２５μｌ順次添加し、２２℃、１２０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。この培養液から遠心分離により回収した菌体を変換用緩衝液−２（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２ｍＭ  ＤＴＴ，１０％グリセロール，［ｐＨ７．３］）で１回洗浄し、次に菌体を４ｍｌの同緩衝液に懸濁し、静菌体懸濁液とした。この静菌体懸濁液１ｍｌに１３−ジヒドロダウノマイシンのメタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて、しんとう（２２０ｒｐｍ）しながら２８℃で２４時間インキュベートした。その後、この反応液４００μｌに１．２ｍｌのアセトンを加えてボルテックス後、３００μｌのクロロホルムで抽出した。この抽出液を減圧条件下で乾固させたのち、５００μｌの０．３Ｍ塩酸で溶解し、８０℃で３０分加熱した。この液を１００μｌのクロロホルムで抽出し、抽出液を減圧条件下で乾固させた。乾固物をメタノール１００μｌに溶解後、次の条件下ＨＰＬＣで基質の１３−ジヒドロダウノマイシンが脱水素化されることにより生成したダウノマイシンを検出した。
（ＨＰＬＣの分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ島津ＬＣ１０  Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃ（島津製作所）
カラム：ＺＯＲＢＡＸ  ＴＭＳ（５μ）  ４．６ｍＩＤ  ｘ  ２５０ｍｍ
移動相：水：アセトニトリル：メタノール：リン酸＝５４０：２９０：１７０：２（容積比）の混合液にラウリル硫酸ナトリウム１．０ｇを加えて溶かし、２Ｎ−ＮａＯＨを加えてｐＨを３．６に調整したもの。
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２５４ｎｍ
インジェクション容量：２０ｕｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：２０ｍｉｎ
保持時間：１３−ジヒドロダウノマイシン    ４．８ｍｉｎ
ダウノマイシン    ５．９ｍｉｎ
分析の結果、３．７μｇ／ｍｌのダウノマイシンを検出した。一方、対照株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ）を用いて同じ条件で基質変換反応および分析を行った時、ダウノマイシンの生成は検出されなかった。
産業上の利用可能性
放線菌由来チトクロームＰ−４５０遺伝子を、大腸菌を宿主として構築した組換え体を用いて基質有機化合物の一原子酸素添加反応を効率良く製造することができる。
一方で産業上重要な所望の放線菌由来Ｐ４５０酵素を効率良くスクリーニングするためのハイスループット  スクリーニング（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）あるいはその他の簡便かつ迅速な酵素アッセイスクリーニングの対象として好適な遺伝子ライブラリーを提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミド  ｐＭｏｘＡＢの構造図である。
図２は、プラスミド  ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ１の構造図である。
図３は、プラスミド  ｐＭｏｘＡＢ−ｆｄｒ２の構造図である。
図４は、プラスミド  ｐＭｏｘＡＢ−ｃａｍＡＢの構造図である。
図５は、プラスミド  ｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢの構造図である。
図６は、プラスミド  ｐＣＢＭ−ｃａｍＡＢの構造図である。
図７は、プラスミド  ｐＳＣ１５４Ａ１−ｃａｍＡＢの構造図である。
図８は、プラスミド  ｐＤｏｘＡ１−ｃａｍＡＢの構造図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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