(57)【要約】本発明は、（１）異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、ならびに（３）該酵母の生育状態を測定する工程を含み、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に該酵母の生育が低下もしくは向上する場合に被験試料中に生理活性物質が存在すると判定する、生理活性物質のスクリーニング方法、当該方法に使用される酵母、該スクリーニング方法により得られうる生理活性物質、ならびに該酵母を含んでなる生理活性物質のスクリーニング用キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、
（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、ならびに
（３）該酵母の生育状態を測定する工程、
を含み、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に該酵母の生育が低下もしくは向上する場合に被験試料中に生理活性物質が存在すると判定する、生理活性物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
異種タンパク質が、その非発現下と比べて発現下に該酵母の生育を低下させうるものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
異種タンパク質が、ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質である請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質が、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質である請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
工程（３）において酵母の生育状態を、酵母培養液の濁度変化、酵母の形態変化、酵母の湿重量変化、酵母の乾燥重量変化、酵母の内因性酵素活性変化または酵母の内因性タンパク質量変化をモニターすることにより測定する、請求項１〜４いずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
形質転換酵母が、呼吸能を欠損したものである請求項１〜５いずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母。
【請求項８】
生育状態の変化が生育の低下である請求項７記載の形質転換酵母。
【請求項９】
異種タンパク質が、少なくとも該タンパク質の活性部位を活性のある状態で保持してなるものである請求項７または８記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
異種タンパク質が、ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質である請求項７〜９いずれか記載の形質転換酵母。
【請求項１１】
ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質が、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質である請求項１０記載の形質転換酵母。
【請求項１２】
ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質が、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質および／またはＣａｆファミリーに属するタンパク質である、請求項１１記載の形質転換酵母。
【請求項１３】
Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質が、そのアミノ酸配列のＮ末端領域に、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または
（ｄ）Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域において配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、請求項１２記載の形質転換酵母。
【請求項１４】
Ｃａｆファミリーに属するタンパク質が、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または、
（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、請求項１２記載の形質転換酵母。
【請求項１５】
プロモーターに発現可能に連結された異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなるものである請求項７〜１４いずれか記載の形質転換酵母。
【請求項１６】
請求項６記載のスクリーニング方法用の、呼吸能を欠損してなる請求項７〜１５いずれか記載の形質転換酵母。
【請求項１７】
請求項１〜６いずれかに記載のスクリーニング方法により得られうる生理活性物質。
【請求項１８】
請求項７〜１６いずれかに記載の酵母を含んでなる生理活性物質のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞の増殖や分化に作用しうる生理活性物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  これまでに細胞周期調節に関与する種々の因子が報告され、その機能が徐々に明らかにされつつある。たとえば、Ｔｏｂファミリーという一群のタンパク質が知られており、該タンパク質をコードする遺伝子として、現在までに６種類のメンバーがホ乳類で見出されている（たとえば、吉田富，山本雅（２００１）実験医学，１９，１１９４−１１９８参照）。たとえば、Ｔｏｂを培養細胞に強制発現させると細胞増殖抑制を示すことが報告されている（たとえば、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｋ−Ｔｓｕｚｕｋｕ，Ｊ．，Ａｊｉｍａ，Ｒ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ，．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６，１３５６−１３７０参照）。この細胞増殖抑制の正確な分子メカニズムは不明であるが、Ｔｏｂは細胞周期のＧ０／Ｇ１期停止およびＧ２／Ｍ期停止の両方に関与しているものと考えられ、該タンパク質は転写因子のコファクターとして機能することが示唆されている。また、ｔｏｂ遺伝子欠損マウスでは骨量が増加することが知られている（たとえば、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，Ｕｍｅｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｍｉｎｏｗａ，Ｏ．，Ｕｓｕｉ，Ｍ．，Ｉｋｅｍａｔｓｕ，Ｎ．，Ｈｏｓｏｄａ，Ｅ．，Ｉｍａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｋｕｎｏ，Ｊ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，Ｎｏｄａ，Ｍ．，Ｎｏｄａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．（２０００）Ｃｅｌｌ，１０３，１０８５−１０９７参照）。Ｔｏｂは、細胞内シグナル伝達分子であるＳｍａｄに結合して骨形成因子（ＢＭＰ）シグナルを抑制し、ＢＭＰ依存的な骨芽細胞の増殖および分化を抑制して骨形成を制御していることが明らかにされている（たとえば、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，Ｕｍｅｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｍｉｎｏｗａ，Ｏ．，Ｕｓｕｉ，Ｍ．，Ｉｋｅｍａｔｓｕ，Ｎ．，Ｈｏｓｏｄａ，Ｅ．，Ｉｍａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｋｕｎｏ，Ｊ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，Ｎｏｄａ，Ｍ．，Ｎｏｄａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．（２０００）Ｃｅｌｌ，１０３，１０８５−１０９７参照）。
また、Ｃａｆファミリーという一群のタンパク質が知られている。このタンパク質は酵母を含むすべての真核生物に存在する。たとえば、Ｃａｆ１はＣＣＲ（ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）４と結合して細胞周期に影響を与えることが報告されている（たとえば、Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．，Ｃｈｉａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．，Ｍａｎｎ，Ｍ．，Ｄｅｎｉｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３１４，６８３−９４およびＢａｉ，Ｙ．，Ｓａｌｖａｄｏｒｅ，Ｃ．，Ｃｈｉａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｍ．Ａ．，Ｌｉｕ，Ｈ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｉｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）１９，６６４２−６６５１参照）。また、Ｃａｆ１はＴｏｂと相互作用することが知られており、２つの因子が相互作用することによって細胞周期においてＧ０期からＧ１期への移行にブレーキをかけている可能性が考えられている。ｔｏｂ遺伝子をノックアウトしたマウスでは癌の発生率が優位に増加することが報告されている（たとえば、特開２００１−２１１７８２号公報（第２頁）参照）。
一方、呼吸能が欠損した酵母を使用する技術としては、たとえば、異種のタンパク質の遺伝子を含むＤＮＡで形質転換された当該酵母の形質転換体を使用するタンパク質の製造方法が知られている（たとえば、特開平２−４１８号公報（特許請求の範囲、第２頁）参照）。当該文献においては、タンパク質の製造に用いられる酵母の呼吸能を欠損させることにより遺伝子の発現が高まることが開示されている。
しかしながら、呼吸能が欠損した酵母を生理活性物質のスクリーニングに使用できることや、それにより当該スクリーニングの効率を高めることができることについての開示はない。
【発明の開示】
以上のような細胞周期調節に関与する因子、特にＴｏｂファミリータンパク質やＣａｆファミリータンパク質等のホ乳類のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与する因子と同様な機能または該機能を阻害もしくは増大する機能を有する生理的に活性な物質は、細胞の増殖や分化が関与する種々の疾患の予防剤および／もしくは治療剤となる可能性がある。たとえば、Ｔｏｂの機能を阻害する物質は骨粗鬆症や骨折などの骨疾患の予防剤および／もしくは治療剤となる可能性があり、Ｃａｆ１と相互作用してＴｏｂと同様の作用を発揮する物質は発癌予防剤および／もしくは抗癌剤となる可能性がある。
従って、本発明は、生理活性物質を効率的にスクリーニングすることができる、酵母を使用した生理活性物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。また、当該方法に使用される酵母、該スクリーニング方法により得られうる生理活性物質、ならびに該酵母を含んでなる生理活性物質のスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、
〔１〕  （１）異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、
（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、ならびに
（３）該酵母の生育状態を測定する工程、
を含み、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に該酵母の生育が低下もしくは向上する場合に被験試料中に生理活性物質が存在すると判定する、生理活性物質のスクリーニング方法、
〔２〕  異種タンパク質が、その非発現下と比べて発現下に該酵母の生育を低下させうるものである前記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕  異種タンパク質が、ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質である前記〔１〕または〔２〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕  ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質が、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質である前記〔３〕記載のスクリーニング方法、
〔５〕  工程（３）において酵母の生育状態を、酵母培養液の濁度変化、酵母の形態変化、酵母の湿重量変化、酵母の乾燥重量変化、酵母の内因性酵素活性変化または酵母の内因性タンパク質量変化をモニターすることにより測定する、前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔６〕  形質転換酵母が、呼吸能を欠損したものである前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔７〕  異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母、
〔８〕  生育状態の変化が生育の低下である前記〔７〕記載の形質転換酵母、
〔９〕  異種タンパク質が、少なくとも該タンパク質の活性部位を活性のある状態で保持してなるものである前記〔７〕または〔８〕記載の形質転換酵母、
〔１０〕  異種タンパク質が、ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質である前記〔７〕〜〔９〕いずれか記載の形質転換酵母、
〔１１〕  ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質が、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質である前記〔１０〕記載の形質転換酵母、
〔１２〕  ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質が、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質および／またはＣａｆファミリーに属するタンパク質である、前記〔１１〕記載の形質転換酵母、
〔１３〕  Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質が、そのアミノ酸配列のＮ末端領域に、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または
（ｄ）Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域において配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、前記〔１２〕記載の形質転換酵母、
〔１４〕  Ｃａｆファミリーに属するタンパク質が、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または、
（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、前記〔１２〕記載の形質転換酵母、
〔１５〕  プロモーターに発現可能に連結された異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなるものである前記〔７〕〜〔１４〕いずれか記載の形質転換酵母、
〔１６〕  前記〔６〕記載のスクリーニング方法用の、呼吸能を欠損してなる前記〔７〕〜〔１５〕いずれか記載の形質転換酵母、
〔１７〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のスクリーニング方法により得られうる生理活性物質、ならびに
〔１８〕  前記〔７〕〜〔１６〕いずれかに記載の酵母を含んでなる生理活性物質のスクリーニング用キット、
に関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００α株形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第２図は、９時間培養した時点でのｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００α株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第３図は、７８時間培養した時点でのｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００α株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第４図は、１８１時間培養した時点でのｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００α株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第５図は、ｔｏｂ遺伝子を導入したＹＮＮ２７株形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第６図は、ｔｏｂ遺伝子を導入した２０Ｂ−１２株形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第７図は、ｔｏｂ遺伝子を導入したＹＮＮ２７株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第８図は、ｔｏｂ遺伝子を導入した２０Ｂ−１２株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第９図は、ＹＰＨ５００α株形質転換体におけるｐＥＳＣ−ＴＲＰの存在確認の結果を示すアガロースゲル電気泳動図である。
第１０図は、ＹＰＨ５００α株形質転換体におけるｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂの存在確認の結果を示すアガロースゲル電気泳動図である。
第１１図は、ｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００α株形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第１２図は、ｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００α株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第１３図は、ｈｃａｆ１遺伝子を導入したＩＮＶＳｃ１株形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第１４図は、ｈｃａｆ１遺伝子を導入したＩＮＶＳｃ１株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第１５図は、ｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子を導入したＩＮＶＳｃ１株形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第１６図は、ｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子を導入したＩＮＶＳｃ１株形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第１７図は、ｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第１８図は、６９時間培養した時点でのｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第１９図は、ｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第２０図は、４５時間培養した時点でのｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第２１図は、ｔｏｂ遣伝子とｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第２２図は、１４４時間培養した時点でのｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第２３図は、ｌｃｋ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第２４図は、４７時間培養した時点でのｌｃｋ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第２５図は、ｌｃｋＹＦ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第２６図は、９５時間培養した時点でのｌｃｋＹＦ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第２７図は、４種類のベクターを同時に用いてｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第２８図は、ｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
第２９図は、１６８時間培養した時点での４種類のベクターを同時に用いてｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のＴｏｂ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
第３０図は、１６８時間培養した時点での４種類のベクターを同時に用いてｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の生理活性物質のスクリーニング方法では、異種タンパク質を発現可能である形質転換酵母を、該異種タンパク質を発現可能な条件下、すなわち、該酵母の生育状態が変化しうる条件下に培養し、その際、該酵母を被験試料と接触させ、被験試料が存在しない場合（非存在下）を対照として被験試料が存在する場合（存在下）に酵母の生育が低下もしくは向上する場合、被験試料中に生理活性物質が存在すると判定する。
本明細書において、「異種タンパク質」とは、酵母の生育状態に変化をもたらしうる酵母にとって異種のタンパク質をいう。「異種タンパク質」には、当該タンパク質と同様の機能を有するものである限り、その断片が含まれる。また、「異種タンパク質を発現可能」とは、該酵母が異種タンパク質をコードする遺伝子を含有しており（すなわち、該酵母が該遺伝子で形質転換されており）、かつ当該タンパク質の発現が実際に可能であることをいう。また、「生理活性物質」とは、生体に対し何らかの生理作用を発揮しうる物質、例えば、細胞の増殖や分化に作用しうる物質、特にホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に影響を与えうる化合物、例えば、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与する因子と同様な機能または該機能を阻害もしくは増大する機能を有する化合物をいう。
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法では、例えば、被験試料の非存在下および存在下で異種タンパク質を発現する酵母の増殖曲線をそれぞれ作成し、得られた増殖曲線を対比することで、被験試料の非存在下を対照とした被験試料の存在下での当該酵母の生育状態に対する被験試料の影響を正確に把握することができる。従って、被験試料中の生理活性物質の存在を高い信頼性をもって検出することができる。それゆえ、本発明のスクリーニング方法によれば、効率的に生理活性物質をスクリーニングすることができる。
本発明に使用される酵母は、異種タンパク質を発現可能なものである。該酵母は本発明に包含される。該酵母は、異種タンパク質を発現していない状態（非発現下）と比べて発現している状態（発現下）で生育状態の変化、例えば、生育の低下もしくは向上が認められるという性質を有する。また、本発明に使用される酵母としては、呼吸能が欠損したものであるのが好ましい。すなわち、異種タンパク質を発現可能な呼吸能を有する酵母に比べて、呼吸能が欠損した酵母は、（イ）生育状態の変化がより鋭敏であり、（ロ）異種タンパク質の非発現下においてはより安定した生育を示す。このような現象は、酵母の呼吸能の欠損と関係するものと推定されるが未だそのメカニズムの詳細は不明である。しかしながら、前記（イ）は、前記（ロ）が認められるという事実を考慮すると、呼吸能の欠損に伴う、例えば、異種タンパク質の発現量の増大（例えば、特開平２−４１８号公報参照）に単純に依存するものではない、と考えられる。
「生育の低下」とは、異種タンパク質の非発現下および発現下での酵母の増殖曲線を得、それぞれの世代時間を求め、それらを対比した場合に、非発現下に比べて発現下に酵母の世代時間が長くなることをいう。また、世代時間の代わりに増殖速度を求めてもよい。その場合、対数増殖期の増殖曲線の傾きが小さくなることをいう。一方、「生育の向上」とは、非発現下に比べて発現下に酵母の世代時間が短くなることをいう。また、対数増殖期の増殖曲線の傾きが大きくなることをいう。「生育状態の変化がより鋭敏である」とは、同一種の異種タンパク質を発現する酵母個体間でバラツキなく一様な生育状態の変化が認められることをいう。「安定した生育」とは、同一種の異種タンパク質の非発現下にある酵母個体間でバラツキなく一様な生育状態が示されることをいう。
増殖曲線は酵母の培養時間に対して増殖の程度を示す任意のパラメータ（例えば、後述の酵母培養液の濁度等）の値をプロットすることにより作成する。本発明の酵母の性質の具体的な評価方法については後述する。
異種タンパク質としては、酵母の生育状態に変化をもたらしうるタンパク質であれば特に限定されるものではない。当該タンパク質としては、好ましくは酵母の生育を低下もしくは向上させうるタンパク質であり、より好ましくは酵母の生育を低下させうるタンパク質である。また、当該タンパク質としては、好ましくは細胞の増殖や分化に関わるタンパク質、より好ましくはホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質である。中でも、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質が特に好ましい。
ここで、「ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質（以下、シグナルタンパク質という）」とは、ホ乳類細胞における細胞周期のうちＧ０期からＧ１期およびＧ１期からＳ期に至る過程に関与し、その進行または停止を制御する機能を有するタンパク質をいう。また、「ホ乳類細胞」とはホ乳類に由来する細胞であればよく、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタなどの偶蹄類、ネコなどの食肉類、ゾウなどの長鼻類、ウマなどの奇蹄類、家兎などのウサギ類、コウモリなどの翼手類、カンガルー、ワラビーなどの有袋類、カモノハシ、ハリモグラなど単孔類等由来の細胞が挙げられる。
シグナルタンパク質は一般に、それが酵母で発現された場合、酵母の生育を低下させる性質を有すると考えられる。かかるシグナルタンパク質としては、例えば、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質、Ｃａｆファミリーに属するタンパク質、サイクリンファミリーに属するタンパク質、ＣＤＫ（ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ）ファミリーに属するタンパク質、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ｐ５３ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ｐ２１ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ＧＡＤＤ４５（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｕｉｃｉｂｌｅ）ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、Ｅ２Ｆファミリータンパク質に属するタンパク質、ｐ１５ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ｐ１６ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、Ａｒｆファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ＴＧＦβファミリーに属するタンパク質、ヒストンジエステラーゼ類等が挙げられる。
Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質は、そのアミノ酸配列のＮ末端領域に、通常、配列番号：１に示すアミノ酸配列と相同性をもつ約１１０アミノ酸残基からなる相同性領域を有する。従って、当該タンパク質としては、▲１▼Ｎ末端領域に配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、もしくは▲２▼該相同性領域を有するタンパク質が好ましい。前記▲２▼のタンパク質としては、その発現下に酵母の生育の低下をもたらしうるものである限り、そのＮ末端領域に、配列番号：１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、また、配列番号：１のアミノ酸配列との配列同一性が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
さらに、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質の前記相同性領域には、Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域に配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるＢｏｘ  Ａ（ＧＲ  Ｂｏｘともいう）と呼ばれるさらに相同性の高い領域（高度保存領域）が存在することが知られている。また、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質には、前記相同性領域に、当該Ｂｏｘ  Ａに加えて配列番号：３に示すアミノ酸配列からなるＢｏｘＢと呼ばれる高度保存領域の存在が知られているものもある。Ｂｏｘ  ＡおよびＢｏｘ  Ｂについては、Ｔｉｒｏｎｅ，Ｆ．，（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１８７，１５５−１６５を参照されたい。例えば、Ｂｏｘ  ＡおよびＢｏｘ  Ｂの存在が知られているＴｏｂファミリーに属するタンパク質について具体的にそれらのアミノ酸配列上の位置を示せば、ｈＴｏｂはＮ末端から４０〜５８位にＢｏｘ  Ａを７６位〜９５位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｈＴｏｂ２はＮ末端から４０〜５８位にＢｏｘ  Ａを７６位〜９６位にＢｏｘ  Ｂを有し、Ｐｃ３はＮ末端から５０〜６８位にＢｏｘ  Ａを１２４位〜１４３位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｈＡｎａはＮ末端から４２〜６０位にＢｏｘ  Ａを８８位〜１１７位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｍＢｔｇ３はＮ末端から４２〜６０位にＢｏｘ  Ａを８８位〜１１７位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｈＰｃ３ＢはＮ末端から４２〜６０位にＢｏｘ  Ａを８８位〜１１７位にＢｏｘ  Ｂを有する。よって、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質としては、その発現下に酵母の生育の低下をもたらしうるものである限り、Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域に配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質としては、Ｂｏｘ  ＡおよびＢｏｘ  Ｂを共に有するものが好ましい。
Ｃａｆファミリーに属するタンパク質は、ｈＣａｆ１に代表される。ｈＣａｆ１は配列番号：４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である。Ｃａｆファミリーに属するタンパク質としては、その発現下に酵母の生育の低下をもたらしうるものである限り、配列番号：４のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、また、配列番号：４のアミノ酸配列との配列同一性が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
なお、前記「少なくとも１つ」とは１もしくは数個の意である。また、本明細書において「Ｎ末端領域」という場合、当該領域はアミノ酸配列でＮ末端から始まり、Ｎ末端から４００残基までの領域をいう。
アミノ酸配列の配列同一性とは、２つのアミノ酸配列間におけるアミノ酸残基の配列類似性をいう。配列同一性は、比較対象のアミノ酸配列の領域に渡って最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定されうる。
配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一のアミノ酸残基を決定して適合部位の数を決定し、次いで、比較対象の配列領域内のアミノ酸残基の総数で、前記適合部位の数を割り、得られた数値に１００を乗ずることにより算出される。配列同一性は、配列解析ソフト、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等のネットワークサービスを利用して求めることができる。
例えば、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質としては、例えば、Ｔｏｂ、Ｔｏｂ２、Ｂｔｇ１、Ｐｃ３／Ｔｉｓ２１／Ｂｔｇ２、Ａｎａ／Ｂｔｇ３、Ｂ９．１０、Ｐｃ３Ｋ、Ｐｃ３Ｂ、Ｂ９．１５等が挙げられる。Ｃａｆファミリーに属するタンパク質としては、例えば、Ｃａｆ１、Ｃａｆ２、ＰＯＰ２等が挙げられる。また、サイクリンファミリーに属するタンパク質としては、例えば、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ１，Ｄ２，Ｄ３、サイクリンＥ等が挙げられる。
本発明の酵母としては、本発明の所望の効果の発現の観点から、少なくともその活性部位を活性のある状態で保持してなる異種タンパク質（もしくはその断片）を発現可能であるものが好ましい。なお、本明細書において、断片でない、いわゆる完全タンパク質としての異種タンパク質とは、そのアミノ酸配列の全長からなる完全なタンパク質または１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加等された実質的に完全なタンパク質をいう。一方、その断片とは完全タンパク質としての異種タンパク質の一部分をいう。かかる断片は、好ましくは５残基以上、より好ましくは５〜１００，０００残基、さらに好ましくは１０〜５０，０００残基、特に好ましくは１００〜１０，０００残基のアミノ酸からなるペプチドであるのが好適である。当該断片としては、例えば、シグナルタンパク質の活性部位を含む、好ましくは５残基以上、より好ましくは５〜１００，０００残基、さらに好ましくは１０〜５０，０００残基、特に好ましくは１００〜１０，０００残基のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。
「活性部位」とは、異種タンパク質がその活性を発揮するのに必要な部位をいう。例えば、シグナルタンパク質では、細胞周期のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与する機能を発現するために必要な部位に相当する。シグナルタンパク質の活性部位のアミノ酸配列上の位置および当該部位を構成するアミノ酸配列については未だ不明であるが、例えば、Ｔｏｂの活性部位は、前記相同性領域に存在するものと推定される。Ｔｏｂの活性部位を構成すると推定される相同性領域のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。
また、「活性を保持した状態」とは、活性部位が活性発現に必要な高次構造を有してなることをいう。例えば、シグナルタンパク質またはその断片の場合、それらが活性部位を活性のある状態で保持してなるものであるか否かは、その発現下に酵母の生育の低下が生ずるか否かにより評価することができる。すなわち、酵母の生育の低下が生じた場合、発現したシグナルタンパク質またはその断片は活性部位を活性のある状態で保持してなるものである、と判定する。
本発明の酵母としては、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質および／またはＣａｆファミリーに属するタンパク質を発現可能なものが好ましく、中でもＴｏｂファミリーに属するタンパク質およびＣａｆファミリーに属するタンパク質の両方を共に発現可能なものがより好ましい。例えば、ＴｏｂとＣａｆ１を酵母において同時に発現させた場合、それらを各々単独で発現させる場合よりも酵母の生育の低下が増大する。それゆえ、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質およびＣａｆファミリーに属するタンパク質の両方を共に発現させることにより、酵母の生育の低下をより明確に捉えることが可能であると考えられる。より具体的には、Ｔｏｂファミリーのタンパク質としてＴｏｂ、Ｔｏｂ２、Ｂｔｇ１、Ｐｃ３／Ｔｉｓ２１／Ｂｔｇ２、Ａｎａ／Ｂｔｇ３、Ｂ９．１０、Ｐｃ３Ｋ、Ｐｃ３Ｂ、Ｂ９．１５を、Ｃａｆファミリーのタンパク質としてＣａｆ１、Ｃａｆ２、ＰＯＰ２を、また、Ｔｏｂファミリーのタンパク質とＣａｆファミリーのタンパク質の組合せとして、ここに具体的に示すそれらのタンパク質の少なくとも１つずつの組み合わせを発現可能な酵母が、本発明の所望の効果の発現の観点から、特に好ましい。
本発明において好適に使用される呼吸能が欠損した酵母は、（ｉ）異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子で酵母を形質転換し、得られた酵母の呼吸能欠損株を得ることにより、又は（ｉｉ）呼吸能欠損株を得た後、それを異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子で形質転換することにより、得ることができる。呼吸能を有する酵母は、呼吸能を欠損させる工程を実施しないこと以外は、後述するような通常の酵母を用いて同様にして得ることができる。
異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子による酵母の形質転換は、当該遺伝子を含有してなるベクター、好ましくは発現ベクターを酵母に導入することにより行うのが好適である。
発現ベクターは、通常、プロモーター、異種タンパク質をコードする遺伝子およびターミネーターを含んでなる。該遺伝子はプロモーターに発現可能に連結される。ここで、「プロモーターに発現可能に連結される」とは、遺伝子にコードされるタンパク質の発現がプロモーターの制御下に誘導されうるように該遺伝子が該プロモーターに連結されることをいう。また、該発現ベクターは、多くの場合、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、ならびに大腸菌で機能する複製起点を含んでなる。さらに、エンハンサーおよび酵母で機能する複製起点が含まれていてもよい。発現ベクターを構成するこれらの要素の配置関係は所望の効果を奏しうるように適宜決定することができる。
このような発現ベクターは、例えば、酵母ベクターとして知られるＹＩｐ型、ＹＥｐ型、ＹＲｐ型、ＹＣｐ型の任意のプラスミドベクターにプロモーター、マルチクローニングサイト、ターミネーター等をこの順で導入した後、異種タンパク質をコードする遺伝子の上流に翻訳開始コドンを、下流に翻訳終止コドンを付加したものを前記マルチクローニングサイトに導入することにより構築することができる。このような組換え発現ベクターの構築には慣用の組換えＤＮＡ技術を利用できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９等参照）。前記プラスミドベクターとしては、異種タンパク質、例えば、シグナルタンパク質の発現量が多量である方が好ましいという観点から、ＹＥｐ型のプラスミドベクターが望ましい。もしくはプラスミドベクターの宿主内保持安定性が高いという観点からＹＣｐ型のプラスミドベクターが望ましい。当該ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ２４、ＹＥｐ１３等が挙げられる。
前記プロモーターとしては、例えば、誘導可能なＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、ＬＡＣ４、ＰＨＯ５、ＳＵＣ２等のプロモーターが好適に使用される。また、非誘導型のＡＤＨ、ＰＧＫ等の解糖系の酵素のプロモーターを使用してもよい。ターミネーターは使用するプロモーターに応じて任意のものを選択すればよい。選択マーカー遺伝子として使用する抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、大腸菌用としてのアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、酵母用としてのＧ４１８耐性遺伝子等が挙げられる。また、栄養要求性変異を相補する遺伝子としては、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ４、ＡＤＥ２等が挙げられる。
また、本発明の発現ベクターの構築には、予めＧＡＬ１等のプロモーターが組み込まれた種々のベクターを利用することもできる。かかるベクターとしては、例えばｐＥＳＣ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等が挙げられる。さらに、酵母において発現される異種タンパク質にタグ付加を所望する場合においても、前記ｐＥＳＣ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓにはタグがついているのでそれを用いればよい。この場合、タグに特異的な抗体もしくは特異的な親和性を用いて目的タンパク質の検出および精製を行うことができるという利点がある。
所望の異種タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列についての情報は、例えば、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）より入手可能である。異種タンパク質の好適な例としてのシグナルタンパク質をコードする遺伝子の例を挙げておく。例えば、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質およびＣａｆファミリーに属するタンパク質をそれぞれコードする遺伝子について、以下に各遺伝子名と対応するアクセッション番号を例示する：ｔｏｂ（アクセッション番号：Ｄ３８３０５（ヒト）；Ｄ７８３８２（マウス））、ｔｏｂ２（アクセッション番号：ＡＢ０３５２０７（ヒト）；ＡＢ０４１２２５（マウス））、ｂｔｇ１（アクセッション番号：Ｘ６１１２３（ヒト）；Ｌ１６８４６（マウス）；Ｘ６４１４６（Ｇ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、ｐｃ３／ｔｉｓ２１／ｂｔｇ２（アクセッション番号：Ｍ６０９２１（ラット）；Ｍ６４２９２（マウス）；Ｙ０９９４３（ヒト））、ａｎａ／ｂｔｇ３（アクセッション番号：ＮＭ００６８０６．１（ヒト）；Ｚ７２０００（マウス））、ｂ９．１０（アクセッション番号：Ｘ７３３１６（Ｘ．ｌｅｅｖｉｓ））、ｐｃ３Ｂ（アクセッション番号：ＡＪ２７１３５１．１（ヒト）；ＡＪ００５１２０（マウス））、ｂ９．１５（アクセッション番号：Ｘ７３３１７（Ｘ．ｌｅｅｖｉｓ））、ｃａｆ１（アクセッション番号：Ｌ４６７２２（ヒト）；Ｕ２１８５５（マウス））、ｐｏｐ２（アクセッション番号：Ｄ１２８０７（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））。また、ｐｃ３Ｋおよびｃａｆ２については、Ｐｒｅｖｏｔ，Ｄ．，Ｍｏｒｒｅｌ，Ａ−Ｐ．，Ｖｏｅｌｔｚｅｌ，Ｔ．，Ｒｏｓｔａｎ，Ｍ−Ｃ．，Ｒｉｍｏｋｈ，Ｒ．，Ｍａｇａｕｄ，Ｊ−Ｐ．，ａｎｄ  Ｃｏｒｂｏ，Ｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，９６４０−９６４８およびＢｅｋｏ，Ｚ．，Ｓｏｐｉｃｚｋｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｃａｒｒ，Ａ．Ｍ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２６０，４３４−４４３を参照されたい。
得られた塩基配列についての情報に基づいて一対のプライマーを作製し、鋳型ＤＮＡとして、例えば、ヒトのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、異種タンパク質、例えば、シグナルタンパク質またはその断片をコードする遺伝子を適宜増幅することができる。
例えば、ＴｏｂファミリーもしくはＣａｆファミリーに属するタンパク質として、前記する特定のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ醒配列を有するタンパク質の発現を所望する場合には、例えば、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子に対し公知のランダム変異導入法や部位特異的変異導入法により所望の変異を導入し、得られた遺伝子を酵母導入用の遺伝子として用いればよい。また、例えば、シグナルタンパク質の断片の発現を所望する場合には、例えば、所望の断片をコードする遺伝子領域のみが増幅されるように適宜プライマーの配列を選択してＰＣＲを行い、得られた遺伝子を酵母導入用の遺伝子として用いればよい。また、該断片の発現は、シグナルタンパク質をコードする遺伝子の任意の位置にストップコドンを導入して発現させる方法や制限酵素により所望の部分ペプチドに対応する遺伝子領域を切り出し、適切な発現ベクターに導入して発現させる方法等によっても行うことができる。
通常、酵母の形質転換は１種の異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなる１種の発現ベクターを用いて行えばよい。例えば、ｔｏｂもしくはｃａｆ１を含有してなる１種の発現ベクターで酵母を形質転換する。他方、それぞれ１種の異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなる２種以上の発現ベクターで、あるいは２種以上の異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなる１種の発現ベクターで酵母を形質転換してもよい。例えば、ｔｏｂを含有してなる１種の発現ベクターとｃａｆ１を含有してなる１種の発現ベクターとを用いて、或いはｔｏｂとｃａｆ１とが間接的に連結されてなる遺伝子部分を含有してなる１種の発現ベクター（以下、タンデム化発現ベクターという）で酵母を形質転換する。
該タンデム化発現ベクターは、例えば、以下のようにして得られる。例えば、単一の発現ベクター内において、ｔｏｂおよびｃａｆ１の転写がそれぞれ別個のプロモーターによって制御を受けることができるように、ｔｏｂ等の遺伝子とプロモーターとを当該ベクター内に配置する。なお、これらの方法において使用されうるプロモーターやその他の要素等は前記と同様である。
また、異種タンパク質をコードする遺伝子を相同組換えにより酵母の染色体へ挿入してもよい。例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある２つの塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に、例えば、ｔｏｂ等の遺伝子を配置してなるベクターを用いて酵母を形質転換すればよい。標的挿入部位としては、当該部位にｔｏｂ等の遺伝子を挿入することで酵母の内因性プロモーターと該遺伝子とが発現可能に連結されうる部位が好ましい。かかる場合には、ｔｏｂ等の遺伝子は、酵母の内因性プロモーターの制御下に発現可能となるため、形質転換に用いるベクター中、該遺伝子はプロモーターと発現可能に連結されている必要は必ずしもない。一方、ベクター中、ｔｏｂ等の遺伝子を、例えば、誘導型のプロモーターと発現可能に連結しておき、プロモーターと共に該遺伝子を染色体に挿入し、外部より発現制御可能となるようにしてもよい。このようなベクターの構築には、ＹＩｐ型ベクターのような組み込み型ベクターが好適に使用される。
前記のベクターによる酵母の形質転換は慣用の手法により行うことができる。
例えば、酢酸リチウム法（Ｉｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１，３３６−３３９（１９８５））、プロトプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９−１９３３（１９７８））等により、酵母を形質転換することができる。形質転換操作後、好ましくは選択マーカー遺伝子の性質に応じて常法により形質転換された酵母を選抜する。得られた酵母は異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子を含むが、当該遺伝子を含むか否かについては、該酵母からＤＮＡを抽出後、制限酵素を用いて、あるいはＰＣＲ法や公知の塩基配列決定法により確認することができる。本発明の酵母としては、本発明の所望の効果の発現の観点から、プロモーターに発現可能に連結された、異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子を含むものが好適である。
また、呼吸能が欠損した酵母は公知の方法により容易に得ることができる。酵母は嫌気的条件でも好気的条件でも生育が可能であり、前者の場合は細胞質内の解糖系により、後者の場合には、ミトコンドリア内の酸化的リン酸化により、生育に必要なＡＴＰを獲得している。従って、ミトコンドリアＤＮＡの一部あるいは全部を欠失させることによって呼吸能欠損株（ρ−）が得られる（酵母の解剖、柳島直彦、大嶋泰治、大隅正子編、講談社サイエンティフィク、ｐ１３７〜１４７，１９８１年）。なお、ミトコンドリアＤＮＡの全部が欠失した呼吸能欠損株をρ０と表わすことがあるが、本明細書ではρ−とρ０を総称してρ−と表わす。
呼吸能を有する酵母（親株ρ＋）から呼吸能欠損株（ρ−）を得る具体的な方法は、例えば、Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．，Ｓｔｅａｒｎｓ，Ｔ．著，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００年版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）に記載されている。すなわち、親株をエチジウムブロマイドを含む培地で培養したのち、炭素源としてグルコースを含む培地では生育できるが、グリセロールを含む培地では生育できな菌株を分離することによって呼吸能欠損株を容易に得ることができる。また、頻度は低いが親株の単一コロニーの中から呼吸能欠損株を得ることができる。
以上のような所望の性質を有する本発明の酵母の調製に使用可能な酵母としては、例えば、Ｂｏｏｎｅ，Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ著，Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊（２０００年）に酵母として記載されている微生物群が挙げられる。酵母の種類は特に限定されるものではないが、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クルイベロマイセス属、ピキア属などの酵母が挙げられる。本発明においては、サッカロミセス属またはシゾサッカロミセス属に属する酵母を使用するのが好ましく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などを使用するのがより好ましい。なお、クルイベロマイセス属に属する酵母としては、例えば、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）が、ピキア属に属する酵母としては、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
得られた酵母が所望の性質を有する酵母であるか否かは、異種タンパク質の非発現下での生育状態の安定性および／または異種タンパク質の発現下での酵母の生育状態の変化および／または該タンパク質の発現を確認することにより評価することができる。具体的には、例えば、後述の実施例Ａ−１に記載の方法により評価することができる。なお、非誘導型のプロモーターを使用した場合には発現と非発現のオン・オフができないことから、かかるプロモーターを使用した酵母の性質評価においては、非発現下にある酵母として異種タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターを用いること以外は本発明の酵母と同様の操作により得られた酵母を用いる。一方、当該酵母は誘導型のプロモーターを使用した場合にも非発現下にある酵母として使用可能である。
得られた酵母は、それを使用するまでの間、適宜保存することが可能である。保存条件としては、菌体を液体培地に植菌して定常期に達するまで培養した後、培養液を集菌し、その沈殿を１０％グリセロール溶液に懸濁したものを−８０℃のフリーザーにて保存する、という条件が好適である。
本発明の酵母は異種タンパク質を発現するが、その結果、生育状態に変化が生ずるという性質を有する。そのメカニズムについて詳細は未だ不明であるが、該異種タンパク質が酵母の増殖および／または分化に関する調節機構に作用し該変化が生じているものと考えられる。
本発明の酵母は、本発明の生理活性物質のスクリーニング方法に好適に使用されるものであるが、以上のような性質を有することから、細胞の増殖や分化に関わる作用因子や、その作用メカニズムについての研究等においても種々の用途が期待される。従って、本発明の一態様として、本発明の酵母からなる、生理活性物質のスクリーニング用試薬、細胞の増殖や分化に関わる作用因子や、その作用メカニズムについての研究用試薬等が提供される。当該試薬は本発明の酵母そのものからなってもよく、所望により任意に他の成分をさらに含ませてもよい。例えば、前記保存状態にある形態での提供が可能である。
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法は、以上のような本発明の酵母を使用するものであるが、具体的には、
（１）異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、
（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、並びに
（３）該酵母の生育状態を測定する工程、
を含むものである。そして、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に該酵母の生育が低下若しくは向上する場合に被験試料中に生理活性物質が存在すると判定する。
本発明の酵母では、前記するように、発現する異種タンパク質が増殖および／または分化に関する調節機構に作用して生育状態の変化（例えば、生育の低下もしくは向上）が生ずるものと考えられる。従って、被験試料の存在下に異種タンパク質を発現する酵母を培養した際に、例えば、当該酵母が異種タンパク質の発現で生育が低下する酵母である場合、被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が向上した時、あるいは当該酵母が異種タンパク質の発現で生育が向上する酵母である場合、被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が低下した時、被験試料中の成分が、例えば、異種タンパク質等に結合し、該タンパク質等の作用に対し何らかの影響を与えているものと考えられる。例えば、酵母で発現する異種タンパク質がＴｏｂの場合、被験試料を存在させることで被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が向上した場合、該被験試料中の成分はＴｏｂの機能を阻害する可能性がある。また、例えば、酵母で発現する異種タンパク質がＴｏｂおよびＣａｆ１の両者である場合、Ｃａｆ１はＴｏｂと相互作用してその効果を発揮することが知られていることから、被験試料を存在させることで被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が向上した場合、該被験試料中の成分はＣａｆ１と結合し得、Ｔｏｂ様の作用を発揮する可能性がある。
本発明に使用される本発明の酵母には、前記するように、誘導型のプロモーターまたは非誘導型のプロモーターを使用可能である。以下においては、説明の簡略化の観点から、発現のオン・オフが可能で、異種タンパク質の発現制御が容易である誘導型のプロモーターを使用して得られた酵母を用いる場合について説明する。
被験試料としては特に限定されるものではないが、例えば、化学的に合成された合成化合物、植物や動物の組織から得られた抽出物およびそれらから精製された化合物、微生物や植物・動物細胞の培養液およびそれらから抽出／精製された化合物等が挙げられる。該試料は適宜任意のバッファー等で希釈したものであってもよい。
工程（１）において酵母を被験試料と接触させる方法は特に限定されるものではない。例えば、工程（２）では異種タンパク質を発現する条件下、すなわち、生育状態の変化が生ずる条件下に酵母の培養（本培養）を行うが、本培養前に異種タンパク質等を発現しない条件下、すなわち、生育状態の変化が生じない条件下において該酵母を前培養して種培養液を得、それを生育状態の変化が生ずる条件下にある培養液に添加して本培養を行う態様（態様１）では、酵母と被験試料との接触は、例えば、種培養液を本培養のための培養液に添加する際に同時に被験試料を添加して行うのが好適である。また、本培養において酵母を数分から数時間程度培養した後、異種タンパク質等の発現を制御するプロモーターに応じた所定の成分を培地に添加して生育状態の変化が生ずる条件とする態様（態様２）では、例えば、該成分を本培養のための培養液に添加する際に同時に被験試料を添加して酵母と被験試料とを接触させるのが好適である。
前培養は、例えば、酵母の培養に適した公知の培地に、適宜保存されていた酵母を接種して行う。培養は通常の酵母用培養条件、例えば、２４〜３７℃にて２〜３日間、好気的または嫌気的条件下で行う。また、培養は、例えば、フラスコ、試験管等で行えばよい。
本培養も前培養と同様の条件で行うことができるが、前記態様１の場合には酵母が生育状態の変化を生ずる条件下にある培地を用いる。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子がＧＡＬ１プロモーターの制御下に連結されている場合には、前培養に使用した培地にガラクトースを添加した培地を用いればよい。また、本培養は、多数の被験試料を同時に試験することができる等の理由から、マイクロタイタープレートのウエル中で行うこともできる。
工程（３）での酵母の生育状態の測定は、酵母の培養過程における菌体の増殖の程度の指標となる任意のパラメータを測定することにより行なう。酵母の生育状態の測定は、具体的には、例えば、酵母培養液の濁度変化、酵母の形態変化、酵母の湿重量変化、酵母の乾燥重量変化、酵母の内因性酵素活性変化または酵母の内因性タンパク質量変化をモニターすることにより行うのが好ましいが、これらの方法に限定されるものではない。酵母培養液の濁度変化は、本培養の際に培養液の濁度を、例えば、分光光度計により経時的に測定することによりモニターすることができる。同様に、酵母の形態変化は、例えば、光学顕微鏡により経時的に酵母の形態を観察することによりモニターすることができる。酵母の湿重量変化は培養液を経時的に回収して集菌（例えば、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離による）し、その重量を測定することにより、また、酵母の乾燥重量変化は集菌した酵母を乾燥（例えば、１０５℃で４時間の維持による）後、その重量を測定することにより、それぞれモニターすることができる。酵母の内因性酵素活性変化のモニターは、例えば、インベルターゼ、ヘキソキナーゼの活性を常法により経時的に測定することにより行うことができる。また、酵母の内因性タンパク質量変化のモニターは、生育段階によって発現量が変化しないタンパク質の量的変化をモニターすることが好ましく、例えば、アクチンやＵＲＡ３の量を当該タンパク質に特異的な抗体によるウエスタンブロッティングにより経時的に測定することにより行うことができる。なお、本発明の酵母の生育状態の変化は種々の原因により培養途中で外れる場合があるため、モニターは１０〜３００時間行うのが好適であり、８０〜２００時間行うのがより好適である。
一方、対照として、工程（１）で酵母と被験試料とを接触させないこと以外は同様の操作を行い、同様に酵母の生育状態の測定を行う。
次いで、得られた結果に基づき、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の低下もしくは向上が認められるか否かについて評価する。評価は、得られた酵母の生育状態の測定結果を時間に対してプロットすることにより酵母の増殖曲線を得、被験試料と接触させた場合に得られた酵母の増殖曲線と対照の増殖曲線とを対比することにより行うのが好適である。具体的には、被験試料の存在下および非存在下での酵母の増殖曲線を得、それぞれ世代時間を求め、それらを対比し、被験試料の非存在下に比べて存在下に酵母の世代時間が長くなる場合、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の低下が認められた、と評価する。一方、被験試料の非存在下に比べて存在下に酵母の世代時間が短くなる場合、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の向上が認められた、と評価する。また、世代時間の代わりに増殖速度を求めてもよい。この場合、増殖速度が遅くなった場合に、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の低下が認められた、と評価する。また、増殖速度が速くなった場合に、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の向上が認められた、と評価する。なお、酵母の生育状態の測定を酵母の形態変化をモニターすることにより行った場合は、形態変化を起こした細胞数をヘマトメーター等でカウントし、それを酵母の培養時間に対してプロットすることにより増殖曲線を得る。
以上の結果、被験試料の存在下に酵母の生育の低下もしくは向上が認められた場合、被験試料中に生理活性物質が存在すると判定する。当該生理活性物質は、異種タンパク質の発現に伴う本発明の酵母の生育状態の変化に対し何らかの影響を及ぼしうる、例えば、当該変化を相殺しうるような活性を有することから、該活性を指標として、さらに、所望により、例えば、遠心分離、ろ過、液−液分配、吸着／溶出、クロマトグラフ、再結晶等を組み合わせ、公知の精製方法に従って該物質を単離することができる。
また、本発明は前記スクリーニング方法により得られうる生理活性物質を提供する。該生理活性物質は少なくともスクリーニング過程で使用する異種タンパク質の機能に関連した生理活性を有する。たとえば、異種タンパク質がシグナルタンパク質であった場合、該生理活性物質は細胞周期の制御機構に作用しうると考えられることから、たとえば、細胞周期の制御機構の解明等の研究や、細胞周期の制御機構の異常が発症や病態進行の原因のうちの少なくとも１つとなっている疾患等の治療または予防への使用が期待される。たとえば、Ｔｏｂの機能を阻害する物質は骨粗鬆症や骨折などの骨疾患の治療剤となる可能性があり、Ｃａｆ１と相互作用してＴｏｂと同様の作用を発揮する物質は抗癌剤となる可能性がある。
該スクリーニング方法により、生理活性物質として、たとえば、チロシンキナーゼ阻害剤が得られうるが、かかる物質はタンパク質のチロシン残基のリン酸化を阻害するという機能を有しており、該阻害剤は、たとえば、チロシンキナーゼがかかわる過剰な細胞内シグナル伝達が病態の悪化の原因となっている疾患の治療薬、より具体的には制癌剤などとして使用されうる。
本発明の生理活性物質を医薬製剤とする場合には、たとえば、経口または非経口投与に適した公知の有機または無機の担体、腑形剤、その他の添加剤を用いて常法に従って経口または非経口投与の固体状、半固体状または液状の製剤として調製できる。生理活性物質の投与量は、各物質の性質に応じ、所望の効果が得られうるように適宜調整すればよい。また、該製剤における生理活性物質の含有量は、その使用方法に応じて生理活性物質の所定量が投与できるようであれば特に限定されるものではない。
さらに、本発明の一態様として、本発明の酵母を含んでなる生理活性物質のスクリーニング用キットを提供する。当該キットは本発明の生理活性物質のスクリーニング方法に好適に用いることができる。キットには、所望により、任意の培地、酵母の生育状態の測定に使用される種々の試薬（たとえば、タンパク質定量用試薬、形質転換用のプラスミドベクター、宿主の酵母、Ｔｏｂ等の特異抗体、酵素活性定量試薬等）、および本発明の生理活性物質のスクリーニング方法を実施するための説明書等を含めてもよい。
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
（Ａ）呼吸能を有する酵母での実施例
以下の実施例において使用した菌株、培地、試薬、ならびに一般的な実験方法を、以下にまとめて示す。
１．菌株
本実験で使用した菌株を表１に示す。
2004022742.tif 000002
２．培地
培地は全てオートクレーブして用いた。各培地の組成については、酵母用の培地につきＢｕｒｋｅ，Ｄ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．，Ｓｔｅａｒｎｓ，Ｔ．著，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００年版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００年）を、大腸菌用の培地につきＳａｍｂｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９年）を参照のこと。
（１）大腸菌の培養には、以下の培地を用いた。
・ＬＢ液体培地
・ＬＢ固形培地
・ＬＢ＋Ａｍｐ（アンピシリン）培地（Ａｍｐ濃度１００μｇ／ｍｌ）
（２）大腸菌の形質転換には、以下の培地を用いた。
・ＳＯＢ培地
・ＳＯＣ培地
（３）酵母宿主の培養には、以下の培地を用いた。
・ＹＰＤ液体培地
・ＹＰＤ固形培地
（４）酵母形質転換体の培養には、以下の培地を用いた。
・ＣＳＭ液体培地
・ＣＳＭ固形培地
・ＣＳＭ−ＴＲＰ培地
・ＣＳＭ−ＵＲＡ培地
・ＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ培地
３．試薬
各試薬の組成については、酵母用につきＢｕｒｋｅ，Ｄ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．，Ｓｔｅａｒｎｓ，Ｔ．著，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００年版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００年）を、大腸菌用につきＳａｍｂｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９年）を参照のこと。
・ＴＢ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）
・３Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）溶液（ｐＨ４．８）
・グルコースバッファー（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）
・１％ＳＤＳ−０．２Ｎ  ＮａＯＨ（プラスミド抽出用溶液ＩＩ）
・ＴＥ
・１０×ＴＢＥ
・アクリルアミド：ビス（３０：０．８）
・１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．８）
・０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）
・サンプルバッファー（Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）
・Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇバッファー
・ＰＢＳ
・ＴＰＢＳ
・０．２Ｍ酢酸リチウム（ＬｉＯＡｃ）溶液
・７０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
４．実験方法
（１）大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
−８０℃で保存してあるＪＭ１０９のコンピテント細胞１００μｌを氷上で溶解し、５μｌのプラスミドＤＮＡを加えて氷上で３０分間静置した。４２℃、３０秒間ヒートショックを行った後氷上で２分間静置し、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加えてよく混合し、３７℃で４５分間培養した。それをＡｍｐ濃度１００μｇ／ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ固形培地にまき、３７℃で一夜培養した。
（２）プラスミドＤＮＡの中量調製法（中量抽出）
３０ｍｌ  ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地で培養した菌体を遠心用チューブに移して室温で８０００ｒｐｍ、５分間遠心することによって集菌した。沈殿物に３ｍｌのリゾチーム溶液（５ｍｇリゾチーム／１ｍｌグルコースバッファー）を添加、緩やかに溶解した後、氷上に５分間静置した。４ｍｌのＮａＯＨ−ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％  ＳＤＳ）を加えて緩やかに混合し、氷上に５分間静置した。３ｍｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃ溶液（ｐＨ４．８）を加え、緩やかに混合し、氷上に１０分間静置した後、１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心を行った。上清を新しいチューブに移し、６ｍｌのイソプロパノールを加えて−２０℃に２０分間静置した後、１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心を行った。沈殿を２ｍｌの７０％エタノールで洗浄した後、３００μｌのＴＥに溶解してエッペンドルフ（登録商標）チューブに移し、同じく３００μｌのＴＥで遠心チューブを洗浄してエッペンドルフ（登録商標）チューブに移した（計６００μｌ）。６μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを加えて３７℃で２０分間インキュベートした後、フェノール抽出を３回、クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を３回行った。１２０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液と２４０μｌの３０％  ＰＥＧ＃６０００を加えて混合した後−２０℃で４０分間静置し、４℃で３０分間静置した。１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した後、沈殿を回収してチューブの中の水分を完全に取り除き、８０μｌの滅菌水に溶解した。４．８μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液と１９２μｌのエタノールを加えて混合し、−２０℃で３０分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心した後、沈殿に２００μｌの７０％エタノールを加えて緩やかに沈殿を洗った。１４，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心した後沈殿を吸引ポンプで乾燥し、１００μｌのＴＥに溶解した。その後、ＯＤ２６０値及び電気泳動によって濃度を測定した。
（３）ＰＣＲ法
９８℃・３０秒間、６０℃・６０秒間、７２℃・９０秒間のサイクルを２５サイクルという条件で行った。５ｎｇ／μｌのサンプルＤＮＡ１０μｌに対し５０μＭのプライマーをそれぞれ５μｌずつ、ＮＥＢ×１０バッファーを１０μｌ、４ｍＭ  ４ｄＮＴＰミックスを１０μｌ、ＮＥＢ  Ｖｅｎｔｐｏｌ（２Ｕ／μｌ）を０．５μｌ、滅菌水を５９．５μｌ加えて計１００μｌに調整し、それに１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを１μｌ、ミネラルオイルを６０μｌ加えて反応を行った。
（４）アガロースゲルの切り出しによるＤＮＡの単離
中量抽出によって調製したプラスミドＤＮＡ５μｇ分を１００μｌの系で制限酵素で処理後、Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ  ２０μｌを加えて１２０μｌとした。電気泳動装置「ミューピッド（登録商標）」（株式会社アドバンス製）の６ｍｍの幅のコーム３つを１つになるようにセロファンテープで巻き、０．７％のアガロースゲルを作製した。１２０μｌのサンプルをゲルにアプライして泳動を行い、泳動終了後３６５ｎｍ長波長ＤＮＡ切り出し用ランプをゲルにあてながらカッターナイフを用いて目的のバンドを切り出した。回収したゲルを２５０μｌの０．５×ＴＢＥ入りの透析チューブに入れ、それをミューピッドにセットして通常の方向に泳動を３０分間行い、その後逆方向に泳動を３０秒間行った。０．５×ＴＢＥを回収してフェノール抽出を２回、エーテル抽出を３回行った。
（５）プラスミドＤＮＡの小スケール調製法（ミニプレップ）
エッペンドルフ（登録商標）チューブに入った１．２ｍｌ  ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に形質転換した大腸菌のコロニーを接種し、３７℃、一夜培養した。培養液を室温で１２，０００ｒｐｍ、１分間遠心した後、１００μｌのグルコースバッファーを加えてボルテックスし、沈殿を完全に懸濁した。１５０μｌのＮａＯＨ−ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％  ＳＤＳ）を加え、チューブを上下に振って穏やかに混ぜた後、氷中に５分間静置した。１５０μｌの３Ｍ酢酸カリウムバッファーを加えて混合した後、５００μｌのフェノールを加えて混合し、４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。上層（約５００μｌ回収）を別のチューブに移し、等量（５００μｌ）のクロロホルムを加えて４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。上層（約４００μｌ回収）を別のチューブに移し、二倍量（８００μｌ）のエタノールを加えてよく混ぜ、−２０℃で３０分間静置した後、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心を行い、沈殿に２００μｌの７０％エタノールを加えて軽く混合した。４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、沈殿を吸引ポンプで乾燥させた後、２０μｌのＲＮａｓｅ入りＴＥ（１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  １μｌ−ＴＥ  ２０μｌ）に溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、取得したプラスミドＤＮＡを制限酵素で処理し、電気泳動による確認を行った。
（６）酵母の形質転換（酢酸リチウム法）
５ｍｌのＹＰＤ液体培地に酵母を植菌し、３０℃、一夜の前培養を行った。培養液のうちの１ｍｌを２０ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌し、３０℃で４〜６時間、ＫＵ（Ｋｌｅｔｔ  ｕｎｉｔ）値が６０前後になるまで培養した。培養液のＯＤ６００値を測定し、測定値から菌体数が２×１０８ｃｅｌｌｓになるように培養液の量を計算して計りとり、５０ｍｌの遠心チューブに移した。室温で３０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った後、沈殿を１０ｍｌのＴＥに懸濁し、同様に室温で３０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。沈殿を１ｍｌのＴＥに懸濁して１ｍｌの０．２Ｍ酢酸リチウム溶液を加え、３０℃で１時間培養した（コンピテント細胞作製終了）。作製したコンピテント細胞を２００μｌずつ１．５ｍｌのチューブに分注し、それにそれぞれ５μｇ分のＤＮＡを加え、氷上で３０分間静置した。２００μｌの７０％ＰＥＧ４０００を加えてよく混合し、３０℃で１時間インキュベートした後、４２℃で５分間のヒートショックを行った。その後すぐに４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、沈殿を前もって氷上で冷やしておいた１ｍｌの滅菌水に懸濁した。４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、沈殿を冷却した１００μｌの滅菌水に懸濁した後、ＣＳＭ−ＴＲＰ固形培地にまき、３０℃で３〜５日間培養した。なお、ＫＵ値は、Ｋｌｅｔｔ  Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ光電光度計（Ｋｌｅｔｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社製）により測定した。
（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウエスタンブロッティング
▲１▼タンパク質の調製（アルカリ−ＴＣＡ−ＳＤＳ法）
５ｍｌの培養液をエッペンドルフ（登録商標）チューブに移して１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心することによって集菌し、それを２、３回繰り返した。沈殿を１．２５ｍｌの滅菌水に懸濁し、１６０μｌのＭｅ−ＮａＯＨを加えて氷上に１０分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心後、上清をピペットマンを用いて完全に除去し、沈殿に１．５ｍｌの冷アセトンを加え、ボルテックスおよび超音波処理で菌体を完全懸濁にした。氷上に１０分間静置した後、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心して沈殿を回収し、エッペンドルフチューブのふたを開けてしばらく室温に静置し、アセトンをとばした（アセトン洗浄）。アセトン洗浄をもう一度行った後、沈殿を１５０μｌの１％  ＳＤＳ／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ｐＨ試験紙でｐＨが中性かアルカリ性であることを確認した後、超音波処理で沈殿を溶解した。９５℃、３分間加熱した後、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収し、Ｌｏｗｒｙ法を用いてタンパク質の量を測定した。
▲２▼Ｌｏｗｒｙ法
本法については、「Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．，Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ｎ．Ｊ．，Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｒａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３，２６５−２７５」に記載されている。はじめにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて標準曲線を作成した。ＢＳＡを１０，２０，３０，４０，５０，７０，９０，１１０，１３０μｇ／２００μｌになるようにそれぞれ調整し、そのサンプルに１ｍｌのＣ液を入れてボルテックスし、室温に１０分間静置した。０．１ｍｌのＬｏｗｒｙ試薬を加え、ボルテックス、室温で３０分間静置した後、ＯＤ７５０とＯＤ５００の値を測定し、得られた値から標準曲線を作成した。同様にして目的サンプルのＯＤ７５０とＯＤ５００の値を測定し、標準曲線に照らし合わせてタンパク質の量を決定した。
▲３▼ゲルの作製、準備および電気泳動
本法の実施には電気泳動装置ＭＯＤＥＬ  ＢＥ−２３０（ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ社製）を用いた。分離ゲルは７％と１０％のものをそれぞれ用いた。ガラス平板、ガラスプレート、パッドを７０％エタノールできれいにふき取った後、それらをクリップでとめ、分離ゲルに１０％  ＡＰＳ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ）を加えてプレートに流し込み、その上に１ｍｌの滅菌水を流し込んだ。室温で３０分間静置した後、滅菌水を捨てて残った水分をろ紙を用いて取り除いた後、濃縮ゲルに１０％  ＡＰＳを加えてプレートに流し込み、コームを差し込んで室温で３０分間静置した。分離ゲルおよび濃縮ゲルの組成はＬａｅｍｎｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５，１９７０もしくは新生化学実験講座１．タンパク質Ｉ  分離・精製・性質，日本生化学会編，東京化学同人，１９９７に記載されている。
作製したゲルのコームをはずし、小さい薬さじで残ったゲルをかきとり、コームの穴に残ったゲルを蒸留水で洗った。パッドをはずし、クリップで泳動層の上層と一緒に両端をとめ、泳動層の下層に泳動バッファーを入れて上層を下層にはめた。上層に新しい泳動バッファーを入れ、マーカーとサンプルをアプライした後、コードを接続して３０ｍＡの電流で泳動を行った。泳動終了後、クリップをはずして分離ゲルのみを回収してタッパーに移した。
▲４▼ウエスタンブロッティング
Ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇバッファーにひたしたゲルと同じ大きさのろ紙６枚とニトロセルロース膜をウエスタンブロッティング用の電極板にろ紙３枚、ゲル、ニトロセルロース膜、ろ紙３枚の順に重ね、１００ｍＡで１時間、電流を流した。電流を流し終わった後、ニトロセルロース膜をプラスチックケースに移し、ＴＰＢＳ中で一時間振とうし（２０分おきに液を交換）、５ｍｌのＴＰＢＳに５μｌの一次抗体を加えて一時間振とうした。ＴＰＢＳで３０分間振とうした後（１０分おきに液を交換）、５ｍｌのＴＰＢＳに５μｌの２次抗体を加え、１時間振とうした。ＰＢＳで３０分間振とうした後（１０分おきに液を交換）、６ｍｇの４−クロロ−１−ナフトールを２ｍｌのメタノールに溶解し、１０ｍｌのＰＢＳと５μｌのＨ２Ｏ２を加えたものにニトロセルロース膜を入れ、手で振とうして発光させた。滅菌水で１５〜３０分間振とうした後、ろ紙とアルミホイルに包んで保存した。
実施例Ａ−１  酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅにおけるｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子の発現１
本実施例ではｔｏｂ遺伝子を酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００α株に導入することにより菌体内においてＴｏｂタンパク質を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｔｏｂ遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて酵母を形質転換して、その生育状態を観察した。
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＴＲＰをサブクローニングに使用した。また、ｔｏｂ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂ（ｐＭＥ１８ＳのＥｃｏＲＩ部位にｔｏｂ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
（１）ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂの作製
ｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＴＲＰについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂをテンプレートとし、
フォワードプライマー：
2004022742.tif 000003
リバースプライマー：
2004022742.tif 000004
を用いてＰＣＲを行い、ｔｏｂ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＴＲＰについてもＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｔｏｂ遺伝子とｐＥＳＣ−ＴＲＰの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。
（２）ＹＰＨ５００α株におけるＴｏｂタンパク質の発現および生育実験
作製したプラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００α株の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＴＲＰ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってトリプトファン要求性を持つ形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地にコロニーを植菌し、３０℃で２〜３日間振とう培養を行った。培養液０．１ｍｌをそれぞれ２本の５ｍｌ  ＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地と１本のＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地に植え継ぎ、３０℃で４〜７日間振とう培養した。その間２時間おきにＴｏｂタンパク質が発現しているＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地のＫＵ値を測定し、それにより酵母の生育状態を観察した。また、もう一方のＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地の培養液からタンパク質を回収し、ウエスタンブロッティングを行うことにより、Ｔｏｂタンパク質の発現を確認した。ＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地に植菌した酵母を対数増殖期の中期まで培養した後、５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地で洗浄し、懸濁した。それを３０℃で数時間培養した後、タンパク質を回収し、ウエスタンブロッティングを行った。
（３）Ｔｏｂタンパク質の発現によるＹＰＨ５００α株の生育阻害の解析
酵母用のタンパク質発現ベクターであるｐＥＳＣベクターはＧＡＬ１プロモーターを持ち、ガラクトースの存在下においてのみ目的遺伝子を発現させる。ｔｏｂ遺伝子の発現によるＹＰＨ５００α株の生育状態の変化を調べるためにまずグルコースの入った培地で前培養を行い、その後ガラクトースの入った培地に植えかえることによってｔｏｂ遺伝子を発現させ、該酵母の生育を調べた。
実験方法としては、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂによるＹＰＨ５００α株形質転換体をつまようじの先を用いて５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地に植菌し、３０℃、１７０ｒｐｍで２〜３日間振とう培養を行い、ｆｕｌｌ  ｇｒｏｗｔｈまで培養した。その後、その培養液から１００μｌとって５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地に植菌し、同様の条件で５〜７日間の培養を行った。２時間ごとにＫＵ値を測定し、それぞれの酵母の生育状態について調べた。
ＹＰＨ５００α株におけるｔｏｂ遺伝子の発現
ＹＰＨ５００α株について、培養時間に対してＫＵ値をプロットし増殖曲線を作成した。結果を第１図に示す。
なお、本明細書において図中、各プラスミド名は当該プラスミドにより形質転換した酵母の結果であることを示し、各プラスミド名の後の数字は当該プラスミドを用いて得られた別個の形質転換酵母であることを示す。
ベクターのみであるｐＥＳＣ−ＴＲＰを導入した対照と比べ、ｔｏｂ遺伝子の入ったｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂを導入した場合に明らかに生育が悪かった。すなわち、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−１、２、８に比べｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−６、１１、１５は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−６、１１、１５では生育状態が阻害されたと判定できる。この結果からＹＰＨ５００α株におけるＴｏｂタンパク質の発現は酵母の生育を阻害することが分かる。ただし、ｔｏｂ遺伝子が生育を抑えるのは培養を始めてから２、３日間くらいであり、１２０時間経過した段階では生育が対照であるベクターのみの場合に追いついてくるということも分かった。これはＴｏｂは酵母を死滅させるのではなく生育を抑える（生育速度が遅い）ので長時間培養によって定常期に到達し、対照の酵母の生育に追いつく、ということが考えられる。また、使用しているプラスミドは多コピーのプラスミドなので、その安定性については不明であることから、培養の段階でプラスミドが抜け落ち、それによってＴｏｂタンパク質の発現量が減ったため、ということも考えられる。また、培養の段階で自然突然変異が起こることによってＴｏｂタンパク質に強い酵母が現れ、それらだけが生き残ってまた増殖を続け、最終的に対照と同じレベルまで増殖が追いついたということも考えられる。Ｔｏｂは非常に分解されやすいタンパク質なので、分解されることによって生育が回復した、ということも考えられる。
以上の形質転換酵母を用いてさらに２回、また別の形質転換酵母を用いて同様の実験を行ったが、同様の生育阻害が観察された。
また、前記同様の形質転換酵母を用いた別の実験で９時間、７８時間、１８１時間培養した時点で培養を止め、その培養液を用いてウエスタンブロッティングを行った。前培養のＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地から０．１ｍｌずつ別のＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地１本ずつとＣＳＭ−Ｇａｌ液体培地２本ずつに植菌した。ＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地で定常期に達する直前まで培養し、集菌してＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地で洗浄した後、ＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地に懸濁して９時間培養を行い、その培養液を用いてウエスタンブロッティングを行った。ＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇａｌ液体培地の１本を増殖曲線の作成に用い、もう１本を７８時間培養した時点（生育に差がある時点）で培養を止め、ウエスタンブロッティングを行った。増殖曲線作成用に培養していた培養液を１８１時間培養した時点で培養を止め、ウエスタンブロッティングを行った。９時間培養した時点での結果を第２図に、７８時間培養した時点での結果を第３図に、１８１時間培養した時点での結果を第４図に示す。各場合、実験条件によりＴｏｂタンパク質が捉えられない場合があったが、いずれの酵母についてもいずれかの実験条件ではＴｏｂタンパク質が捉えられ、したがって実質的には全ての場合にＴｏｂタンパク質が捉えられたことになる。すなわち、ガラクトースを含んだ培地でＴｏｂを発現させ、生育に差がある時点でタンパク質を回収した場合にＴｏｂタンパク質が全てつかまった、という結果が得られた。なお、Ｔｏｂタンパク質の検出にはＴｏｂ抗体（第２図および第４図）及びｍｙｃ抗体（第３図）を用いた。ｍｙｃ抗体とはＴｏｂタンパク質のＣ末端に付与したｍｙｃタグに対する特異的抗体である。
実施例Ａ−２  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｔｏｂ遺伝子の発現２
実施例Ａ−１と同様にして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＮＮ２７株および２０Ｂ−１２株の形質転換体を各々得て、当該酵母の生育状態について調べた。
それぞれの形質転換体について増殖曲線を作成した。結果を第５図および第６図に示す。これらの菌株では培養を始めてしばらくは生育に差が見られなかったが、ＹＮＮ２７株で４８時間頃から、２０Ｂ−１２株では２４時間頃からわずかだが差が見られた。しかも今回は培養を続けてもその差が縮まらず、持続して見られた。今回は前培養のＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地から０．１ｍｌずつ別のＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地とＣＳＭ−Ｇａｌ液体培地にそれぞれ植菌し、ＣＳＭ−Ｇａｌ液体培地は増殖曲線の作成に用いた。ＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ液体培地をｆｕｌｌ  ｇｒｏｗｔｈの手前まで培養し、集菌してＣＳＭ−Ｇａｌ液体培地で洗浄した後、ＣＳＭ−Ｇａｌ液体培地に懸濁して５時間培養を行い、その培養液を用いてウエスタンブロッティングを行った。また、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質の定量は行わず、適当量のタンパク質をアプライした。ＹＮＮ２７株についての結果を第７図に、２０Ｂ−１２株についての結果を第８図に示す（タンパク質の検出にはｍｙｃ抗体を用いた）。結果から分かるように、ｔｏｂ遺伝子の入った全てのサンプルに関してはっきりとタンパク質の発現が見られた。
実施例Ａ−３  形質転換酵母におけるプラスミドＤＮＡの存在確認
実施例Ａ−１で使用した酵母形質転換体にプラスミドが正しく組み込まれているかどうか確認するために、酵母のミニプレップを行った。それぞれのプラスミドについて３つの形質転換体について酵母のミニプレップを行い、それを大腸菌に形質転換して得られた形質転換体についてそれぞれ５つづつ大腸菌のミニプレップを行い、制限酵素で切断して確認を行った。つまり１つのプラスミドについて１５個のサンプルについて調べた。５ｍｌのＹＰＤ液体培地に酵母の形質転換体を植菌し、３０℃、一夜培養した後、８０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。沈殿を０．５ｍｌの１Ｍ  ソルビトール（ｐＨ７．５）に溶解し、エッペンドルフ（登録商標）チューブに移した後、３．６μｌの２−メルカプトエタノールと２０μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ  ｚｙｍｌｙａｓｅ  ６０，０００を加え、３７℃に６０分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、２０秒間遠心した後、沈殿を０．５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解し、５０μｌの１０％  ＳＤＳを加えてよく混合し、６５℃に３０分間静置した。０．２ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムを加え、氷上に１時間静置した後、１４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。上層を別のエッペンドルフ（登録商標）チューブに移し、同量のイソプロパノールを加えて混合し、室温に５分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、１０秒間の遠心を行った後、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、沈殿を乾燥させ、３００μｌのＲＮａｓｅを含むＴＥに溶解した。３７℃に３０分間静置した後、フェノール抽出を２回、エーテル抽出を３回行い、エタノール沈殿を行った後、５０μｌのＴＥに溶解した。その後、調製したＤＮＡ  ５μｌを用いて大腸菌の形質転換を行い、得られた大腸菌の形質転換体からミニプレップによってプラスミドＤＮＡを調製した。そして適当な制限酵素で切断した後、電気泳動によりプラスミドの確認を行った。ｐＥＳＣ−ＴＲＰについての結果を第９図に、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂについての結果を第１０図にそれぞれ示す。
ｐＥＳＣ−ＴＲＰについては、大腸菌のミニプレップを行った後、ＸｂａＩで切断してチェックした。その結果、それ以外は対照と同じ５．５ｋｂと１．０ｋｂのバンドの存在が確認できた。この結果から、ｐＥＳＣ−ＴＲＰについてはほぼ完璧にプラスミドが酵母に形質転換されていることが確認できた。
ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂについては、大腸菌のミニプレップを行った後、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断してチェックした。いくつか薄くて分かりづらいバンドがあるが、ほぼ全ての場合に対照と同じ６．５ｋｂと１．２ｋｂのバンドが確認できた。この結果から、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂについてもほぼ完璧にプラスミドが酵母に形質転換されていることが確認できた。
実施例Ａ−４  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｈｃａｆ１遺伝子の発現１
本実施例ではｈｃａｆ１遺伝子を酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００α株に導入することにより菌体内においてＣａｆタンパク質を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｈｃａｆ１遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて酵母を形質転換して、その生育状態を観察した。
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＵＲＡをサブクローニングに使用した。また、ｈｃａｆ１遺伝子は、該遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１（ｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にｈｃａｆ１−ｍｙｃ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
（１）ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１の作製
ｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１を用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＵＲＡについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡについてもＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｈｃａｆ１遺伝子とｐＥＳＣ−ＵＲＡの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。遺伝子導入部分の両側からシークエンスを行うことにより、導入遺伝子の塩基配列の確認を行った。
（２）ＹＰＨ５００α株におけるＣａｆタンパク質の発現および生育実験
作製したプラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００α株の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＵＲＡ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってウラシル要求性を持たない形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇｌｃ液体培地にコロニーを植菌し、３０℃で２〜３日間振とう培養を行った。培養液０．１ｍｌをそれぞれ２本の５ｍｌＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地と１本のＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇｌｃ液体培地に植え継ぎ、３０℃で４〜７日間振とう培養した。その間２時間おきにＣａｆタンパク質が発現しているＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地のＫＵ値を測定し、それにより酵母の生育状態を観察した。また、もう一方のＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地の培養液からタンパク質を回収し、ウエスタンブロッティングを行うことにより、Ｃａｆタンパク質の発現を確認した。ＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇｌｃ液体培地に植菌した酵母を対数増殖期の中期まで培養した後、５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地で洗浄し、懸濁した。それを３０℃で数時間培養した後、タンパク質を回収し、ウエスタンブロッティングを行った。
（３）Ｃａｆタンパク質の発現によるＹＰＨ５００α株の生育阻害の解析
酵母用のタンパク質発現ベクターであるｐＥＳＣベクターはＧＡＬ１プロモーターを持ち、ガラクトースの存在下においてのみ目的遺伝子を発現させる。ｈｃａｆ１遺伝子の発現によるＹＰＨ５００α株の生育状態の変化を調べるためにまずグルコースの入った培地で前培養を行い、その後ガラクトースの入った培地に植えかえることによってｈｃａｆ１遺伝子を発現させ、該酵母の生育を調べた。具体的な実験方法は実施例Ａ−１と同様とした。
ＹＰＨ５００α株におけるｈｃａｆ１遺伝子の発現
ＹＰＨ５００α株についての生育状態の観察結果（増殖曲線）を第１１図に示す。全体的に見て対照のベクターを導入した酵母とｈｃａｆ１導入酵母との間での生育の差はｔｏｂ遺伝子の場合ほど大きくはなかったが、同様にｈｃａｆ１遺伝子を導入した酵母形質転換体で生育阻害が認められた。
ウエスタンブロッティング用に培養していたＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地を７０時間培養した時点で培養を止め、アルカリ−ＴＣＡ法によりタンパク質を回収してウエスタンブロッティングを行った。また、同じくウエスタンブロッティング用に培養していたＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇｌｃ液体培地を対数増殖期の中期まで培養した後、ＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地で洗浄し、懸濁した。その培地を１０時間培養した後、タンパク質を回収してウエスタンブロッティングを行った。結果を第１２図に示す。７．５％のアクリルアミドゲルに５０μｇ分のタンパク質をアプライし、１次抗体にｍｙｃ抗体を用いてタンパク質の検出を行った。図から分かるように、ほぼ全てのサンプルにおいてＣａｆタンパク質がとらえられた。
Ｔｏｂのウエスタンブロッティングを行った際はＴｏｂのバンド以外に菌体内のプロテアーゼによって分解されたＴｏｂのバンドが現れていたが、今回はＣａｆのバンドだけが得られた。これらの結果からＣａｆは非常に安定なタンパク質であると言える。これは動物細胞で行った実験においても同様の結果が示されており、酵母における実験において動物細胞と同じ傾向の結果が得られた。
実施例Ａ−５  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｈｃａｆ１遺伝子の発現２
実施例Ａ−４と同様にして酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃ１株にｈｃａｆ１遺伝子を導入し、生育を調べた。結果を第１３図に示す。ＹＰＨ５００α株と比べてＣａｆによる生育阻害の度合いは少ないが、生育のばらつきがない、安定した結果が得られた。
ウエスタンブロッティング用に培養していたＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地を２４時間培養した時点で培養を止め、アルカリ−ＴＣＡ法によりタンパク質を回収してウエスタンブロッティングを行った。結果を第１４図に示す。前回同様、５０μｇ分のタンパク質を７．５％のゲルにアプライして電気泳動を行い、一次抗体にｍｙｃ抗体を用いてタンパク質の検出を行った。
実施例Ａ−６  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子の同時発現
本実施例ではｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子とを酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃ１株に同時に導入することにより菌体内においてＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質とを共に発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、以前構築したｔｏｂ遺伝子導入用プラスミドとｈｃａｆ１遺伝子導入用プラスミドとを用いて酵母を形質転換して、その生育状態を観察した。
形質転換用ベクターとして、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ（ｐＥＳＣ−ＴＲＰのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位にｔｏｂ遺伝子を挿入したもの）とｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１（ｐＥＳＣ−ＵＲＡのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にｈｃａｆ１遺伝子を挿入したもの）を用いた。
（１）ＩＮＶＳｃｌ株におけるＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の同時発現および生育実験
前記プラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＩＮＶＳｃ１株の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってトリプトファン要求性とウラシル要求性を合わせ持つ形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ  Ｇｌｃ液体培地にコロニーを植菌し、３０℃で２〜３日間振とう培養を行った。培養液０．１ｍｌをそれぞれ２本の５ｍｌ  ＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地に植え継ぎ、３０℃で４〜７日間振とう培養した。その間、数時間おきにＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質が発現しているＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地のＫＵ値を測定し、それにより酵母の生育状態を観察した。また、もう一方のＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ  Ｇａｌ液体培地の培養液からタンパク質を回収し、ウエスタンブロッティングを行うことにより、Ｔｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の発現を確認した。
（２）Ｔｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の同時発現によるＩＮＶＳｃ１株の生育阻害の解析
酵母用のタンパク質発現ベクターであるｐＥＳＣ  ＶｅｃｔｏｒｓはＧＡＬ１プロモーターを持ち、ガラクトースの存在下においてのみ目的遺伝子を発現させる。ｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子の同時発現によるＩＮＶＳｃ１株の生育状態の変化を調べるためにまずグルコースの入った培地で前培養を行い、その後ガラクトースの入った培地に植えかえることによってｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子を同時発現させ、酵母の生育を調べた。
ＩＮＶＳｃ１株におけるｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子の同時発現
ＩＮＶＳｃ１株について、培養時間に対してＫＵ値をプロットし増殖曲線を作成した。結果を第１５図に示す。
前記のＩＮＶＳｃ１株の実験でｔｏｂ遺伝子やｈｃａｆ１遺伝子を単独で導入した場合と同様に対照と比べて生育の阻害が認められ、その程度は単独の場合よりも大きかった。
ウエスタンブロッティングの結果を第１６図に示す。７．５％アクリルアミドゲルに５０μｇ分のタンパク質をアプライし、一次抗体にｍｙｃ抗体を用いてタンパク質の検出を行った。図から分かるように、Ｔｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質がそれぞれ明確にとらえられ、それぞれのタンパク質の発現が確認できた。
（Ｂ）呼吸能を有する酵母での実施例
以下の実施例において使用した菌株を表２に示す。
2004022742.tif 000005
また、酵母の呼吸能欠損株（ρ−）の取得は以下の方法により行った。
（１）酵母の呼吸能欠損株（ρ−）の取得
５ｍｌの２５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）添加ＳＤ培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ＋２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）に酵母親株（ρ＋）を植菌し、ｆｕｌｌｇｒｏｗｔｈまで３０℃で３日間培養した。その培養液から０．１ｍｌとって新しいＥｔＢｒ添加ＳＤ培地に植え継ぎ、ｆｕｌｌ  ｇｒｏｗｔｈまで３０℃で３日間培養した後、滅菌水で希釈してＹＰＤプレートに塗布接種し、３０℃で３日間培養した。得られたシングルコロニーをＹＰＤプレートとＹＰグリセロールプレートに植え継ぎ、呼吸能欠損株（ρ−）の取得を確認した。
なお、以下の実施例で使用した培地、試薬、ならびに一般的な実験方法は、前記（Ａ）で記載したものと同様である。。
実施例Ｂ−１  酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子の発現
本実施例ではｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子を酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＴｏｂタンパク質を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｔｏｂ遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＴＲＰをサブクローニングに使用した。また、ｔｏｂ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂ（ｐＭＥ１８ＳのＥｃｏＲＩ部位にｔｏｂ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
（１）ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂの作製
ｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＴＲＰについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂをテンプレートとし、
フォワードプライマー：
2004022742.tif 000006
リバースプライマー：
2004022742.tif 000007
を用いてＰＣＲを行い、ｔｏｂ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＴＲＰについてもＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｔｏｂ遺伝子とｐＥＳＣ−ＴＲＰの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＴｏｂタンパク質の発現および生育実験
作製したプラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＴＲＰ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってトリプトファン要求性を持つ形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ（２％）培地にコロニーを植菌して前々培養を行った。前々培養を３０℃で１６２時間行った時点で培養液から０．１ｍｌとって５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｒａｆ（２％）培地に植え継ぎ、さらに前培養を１２２時間行った後、培養液から０．１ｍｌとって２本づつの５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｒａｆ（２％）培地とＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地にそれぞれ植え継ぎ、生育を観察した。ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収を６９時間培養時点で行った。１０％のアクリルアミドゲルを用いて５０μｇ分のタンパク質を泳動し、次いでニトロセルロース膜に転写した。Ｔｏｂタンパク質の検出にはｍｙｃ抗体を用いた。ｍｙｃ抗体とはＴｏｂタンパク質のＣ末端に付与したｍｙｃタグに対する特異的抗体である。
（３）Ｔｏｂタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
酵母用のタンパク質発現ベクターであるｐＥＳＣベクターはＧＡＬ１プロモーターを持ち、ガラクトースの存在下においてのみ目的遺伝子を発現させる。そこで、ガラクトースの存在下に形質転換酵母を培養しＴｏｂタンパク質の発現を誘導した。
ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）について培養時間に対してＫＵ値をプロットし増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を第１７図に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を第１８図に示す。
第１７図より、Ｔｏｂタンパク質の非発現下（Ｒａｆ）および発現下（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、Ｔｏｂタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−１９、２２、２３（Ｒａｆ）に比べｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−１９、２２、２３（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−１９、２２、２３（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、第１８図に示すように、Ｔｏｂタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＴｏｂタンパク質が捉えられた。
実施例Ｂ−２  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｃａｆ（ｈｃａｆ１）遺伝子の発現
本実施例ではｃａｆ（ｈｃａｆ１）遺伝子を酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＣａｆタンパク質を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｈｃａｆ１遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＵＲＡをサブクローニングに使用した。また、ｈｃａｆ１遺伝子は、該遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１（ｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にｈｃａｆ１−ｍｙｃ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
（１）ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１の作製
ｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１を用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＵＲＡについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡについてもＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｈｃａｆ１遺伝子とｐＥＳＣ−ＵＲＡの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。遺伝子導入部分の両側からシークエンスを行うことにより、導入遺伝子の塩基配列の確認を行った。
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＣａｆタンパク質の発現および生育実験
実施例Ｂ−１と同様にしてＣａｆタンパク質の発現および生育実験を行った。なお、培地はＣＳＭ−ＵＲＡ培地を使用した。また、ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収は４５時間培養時点で行った。
（３）Ｃａｆタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
実施例Ｂ−１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を第１９図に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を第２０図に示す。
第１９図より、Ｃａｆタンパク質の非発現下および発現下で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、Ｃａｆタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１−１３、１４、１５、１６（Ｒａｆ）に比べｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１−１３、１４、１５、１６（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１−１３、１４、１５、１６（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、第２０図に示すように、Ｃａｆタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＣａｆタンパク質が捉えられた。
実施例Ｂ−３  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子の同時発現
本実施例ではｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子とｃａｆ（ｈｃａｆ１）遺伝子とを酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に同時に導入することにより菌体内においてＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質とを共に発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、以前構築したｔｏｂ遺伝子導入用プラスミドとｈｃａｆ１遺伝子導入用プラスミドとを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
（１）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の発現および生育実験
ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）をｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂとｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１で同時に形質転換すること以外は実施例Ｂ−１と同様にしてＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の同時発現および生育実験を行った。なお、ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収は１４４時間培養時点で行った。
（２）Ｔｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の同時発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
実施例Ｂ−１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を第２１図に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を第２２図に示す。なお、図中、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂをｐＴｔｏｂと、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１をｐＵｈｃａｆ１と、略して記載する。
第２１図より、前記両タンパク質の非発現下および発現下で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、両タンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＴｔｏｂ＋ｐＵｈｃａｆ１−１３、１５、１６、１７（Ｒａｆ）に比べｐＴｔｏｂ＋ｐＵｈｃａｆ１−１３、１５、１６、１７（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＴｔｏｂ＋ｐＵｈｃａｆ１−１３、１５、１６、１７（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、Ｔｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質を酵母において同時に発現させた場合、それらを各々単独で発現させる場合よりも酵母の生育の低下が増大することが分かる。第２２図に示すように、両タンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質が捉えられた。
実施例Ｂ−４  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｌｃｋ遺伝子の発現
本実施例ではｌｃｋ遺伝子を酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＬｃｋタンパク質（チロシンキナーゼ）を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｌｃｋ遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＵＲＡをサブクローニングに使用した。また、ｌｃｋ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ１８ＳＨ−ｌｃｋ（ｐＭＥ１８ＳＨ〔ｐＭＥ１８Ｓの元のＨｉｎｄＩＩＩ部位をつぶして、その後ＥｃｏＲＩ部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位に改変したベクター〕のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｌｃｋ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
のものを増幅して用いた。
（１）ｐＵｌｃｋの作製
ｐＭＥ１８ＳＨ−ｌｃｋを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＵＲＡについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したｐＭＥ１８ＳＨ−ｌｃｋをテンプレートとし、
フォワードプライマー：
2004022742.tif 000008
リバースプライマー：
2004022742.tif 000009
を用いてＰＣＲを行い、ｌｃｋ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩで処理した後、ｋｉｎａｓｅによって末端のリン酸化を行い、その後ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡをＢａｍＨＩで処理した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によって末端の平滑化を行った。それをＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｌｃｋ遺伝子とｐＥＳＣ−ＵＲＡの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。遺伝子導入部分の両側からシークエンスを行うことにより、導入遺伝子の塩基配列の確認を行った。
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＬｃｋタンパク質の発現および生育実験  作製したプラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＵＲＡ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってウラシル要求性を持たない形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）培地にコロニーを植菌し、前培養を３０℃で９６時間行った後、培養液から０．１ｍｌとって２本づつの５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）培地とＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地にそれぞれ植え継ぎ、生育を観察した。ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収を４７時間培養時点で行った。７．５％のアクリルアミドゲルを用いて５０μｇ分のタンパク質を泳動し、次いでニトロセルロース膜に転写した。Ｌｃｋタンパク質の検出にはｍｙｃ抗体を用いた。
（３）Ｌｃｋタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
実施例Ｂ−１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を第２３図に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を第２４図に示す。
第２３図より、Ｌｃｋタンパク質の非発現下および発現下で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、Ｌｃｋタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＵｌｃｋ−２、３、４（Ｒａｆ）に比べｐＵｌｃｋ−２、３、４（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＵｌｃｋ−２、３、４（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、第２４図に示すように、Ｌｃｋタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＬｃｋタンパク質が捉えられた。
実施例Ｂ−５  酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｌｃｋＹＦ遺伝子の発現とＰＰ２添加による生育抑制の解除
本実施例ではｌｃｋＹＦ遺伝子を酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＬｃｋＹＦタンパク質（Ｓｒｃ型チロシンキナーゼ）を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。同時に、ＬｃｋＹＦタンパク質を発現させた酵母を生育する際に代表的なＳｒｃ型チロシンキナーゼ選択的阻害剤であるＰＰ２（４−アミノ−５−（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製）を添加した酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｌｃｋＹＦ遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察すると同時に、培養の際にｌｃｋＹＦ遺伝子の発現産物であるＬｃｋＹＦタンパク質の阻害剤ＰＰ２を添加した形質転換酵母の生育状態も観察した。
ＬｃｋＹＦタンパク質とは、Ｌｃｋタンパク質の５０５番目のチロシン（Ｔｙｒ５０５）をフェニルアラニンに置換することによって作成した活性化型のタンパク質である。Ｌｃｋタンパク質はＴｙｒ５０５がリン酸化されることによってその活性が低下することが知られている。そこでＴｙｒ５０５をフェニルアラニンに置換することによってそのリン酸化を阻害し、活性化させたタンパク質がＬｃｋＹＦタンパク質である。
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＵＲＡをサブクローニングに使用した。また、ｌｃｋＹＦ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ−ＬｃｋＹＦ（ｐＭＥ１８ＳＨ〔ｐＭＥ１８ＳのもとのＨｉｎｄＩＩＩ部位をつぶして、そのＥｃｏＲＩ部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位に改変したベクター〕のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｌｃｋＹＦ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。また、ｌｃｋ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ−Ｌｃｋ（ｐＭＥ１８ＳＨのＨｉｎｄＩＩＩ部位にｌｃｋ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
（１）ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦの作製
ｐＭＥ−Ｌｃｋをテンプレートとし、
フォワードプライマー：
2004022742.tif 000010
リバースプライマー：
2004022742.tif 000011
を用いてＰＣＲを行い、ｌｃｋ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩで処理した後、キナーゼによって末端のリン酸化を行い、その後ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡをＢａｍＨＩで処理した後、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｎｚｙｍｅによって末端ＤＮＡの平滑化を行った。その後ＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｌｃｋ遺伝子の断片とｐＥＳＣ−ＵＲＡの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。遺伝子導入部分の両側からシークエンスを行うことにより、導入遺伝子の塩基配列の確認を行った。構築したプラスミドをｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋと命名した。
その後ｐＭＥ−ＬｃｋＹＦをテンプレートとし、
フォワードプライマー：
2004022742.tif 000012
リバースプライマー：
2004022742.tif 000013
を用いてＰＣＲを行い、ｌｃｋＹＦ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋをＳｍａＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｌｃｋＹＦ遺伝子の断片とｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。遺伝子導入部分の両側からシークエンスを行うことにより、導入遺伝子の塩基配列の確認を行った。構築したプラスミドをｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦと命名した。
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＬｃｋＹＦタンパク質の発現および生育実験  作製したプラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＵＲＡ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってウラシル要求性を持たない形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）培地にコロニーを植菌し、前培養を３０℃で３日間行った後、培養液から０．１ｍｌとってＰＰ２を終濃度０、１、５μＭとなるように培地に添加した５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地に植え継ぎ、生育を観察した。ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収を９５時間培養時点で行った。７．５％のアクリルアミドゲルを用いて５０μｇ分のタンパク質を泳動し、次いでニトロセルロース膜に転写した。ＬｃｋＹＦタンパク質の検出には抗リン酸化チロシン抗体である４Ｇ１０抗体を用いた。
（３）Ｌｃｋタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育低下とＰＰ２添加による生育低下抑制の解析
実施例Ｂ−１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を第２５図に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を第２６図に示す。
第２５図より、ＬｃｋＹＦタンパク質の非発現下および発現下で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、ＬｃｋＹＦタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。さらに、ＰＰ２を添加することによって用量依存的にＬｃｋＹＦタンパク質の発現下で認められる生育の低下が抑制されることがわかる。すなわち、０μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）に比べて０μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、０μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦ）では生育の低下が生じたと判定できる。加えて、ＰＰ２を添加して培養を行った１、５μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦ）では、世代時間と増殖速度が０μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）と０μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦ）の間の値となり、添加濃度が増えるにつれて世代時間が短くなり、増殖速度が大きくなることから、用量依存的にＬｃｋＹＦタンパク質の発現に伴う生育低下が抑制された、すなわち、生育が向上したと判定できる。また、第２６図に示すように、ＬｃｋＹＦタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＬｃｋＹＦタンパク質によってリン酸化された酵母のタンパク質およびＬｃｋＹＦタンパク質そのものが捉えられた。また、ＰＰ２添加によって著しい生育の回復が見られた５μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦ）については、ＰＰ２を添加しない場合や１μＭ（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｌｃｋＹＦ）と比較して発現量の低下がみられた。この結果はＰＰ２添加によってＬｃｋＹＦタンパク質の活性が抑制されたことを示している。
実施例Ｂ−６  酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｒｖｉｓａｅの呼吸能欠損株における４種類の発現ベクターを同時に用いたｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子の発現
本実施例では４種類の発現ベクターを同時に用いてｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子を酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＴｏｂタンパク質を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、４種類のｔｏｂ遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築した４種類のプラスミドを同時に用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＴＲＰ、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｐＥＳＣ−ＬＵＥ、ｐＥＳＣ−ＨＩＳをサブクローニングに使用した。また、ｔｏｂ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ１８Ｓ−Ｔｏｂ（ｐＭＥ１８ＳのＥｃｏＲＩ部位にｔｏｂ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
（１）ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂの作製
実施例Ｂ−１と同様の方法を用いてｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂを調製した。
（２）ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂの作製
ｐＭＥ１８Ｓ−Ｔｏｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＴＲＰについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ−Ｔｏｂをテンプレートとし、
フォワードプライマー：
2004022742.tif 000014
リバースプライマー：
2004022742.tif 000015
を用いてＰＣＲを行い、ｔｏｂ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＴＲＰについてもＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｔｏｂ遺伝子とｐＥＳＣ−ＴＲＰの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。
（３）ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｔｏｂの作製
ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂをＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡについてもＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｔｏｂ遺伝子とｐＥＳＣ−ＵＲＡの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。
（４）ｐＥＳＣ−ＬＵＥ−ｔｏｂの作製
ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂをＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＬＵＥについてもＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｔｏｂ遺伝子とｐＥＳＣ−ＬＵＥの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。
（５）ｐＥＳＣ−ＨＩＳ−ｔｏｂの作製
ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂをＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＨＩＳについてもＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｔｏｂ遺伝子とｐＥＳＣ−ＨＩＳの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。
（６）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＴｏｂタンパク質の発現および生育実験
作製した４種類のプラスミドを同時に用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ−ＬＵＥ−ＨＩＳ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってトリプトファン・ウラシル・ロイシン・ヒスチジン要求性を持つ形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ−ＬＵＥ−ＨＩＳ  Ｒａｆ（２％）培地にコロニーを植菌して前培養を行った。前培養を３０℃で７２時間行った後、培養液から１００μｌとって９００μｌのＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ−ＬＵＥ−ＨＩＳ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地に加え、それによって培養液を１０倍希釈した。希釈した培養液を４０μｌとってマイクロプレートに加え、それに１６０μｌのＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ−ＬＵＥ−ＨＩＳ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地を加えることによってさらに５倍希釈を行った。これらの実験操作によって５０倍希釈した培養液の入ったマイクロプレートを３０℃のインキュベーター内で振とう培養した。培養液の濁度をマイクロプレートリーダーを用いて経時的に測定することにより、生育を観察した。また、ウエスタンブロッティングを行う目的で試験管による培養を並行して行った。前培養の培養液から１００μｌとって５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ−ＵＲＡ−ＬＵＥ−ＨＩＳ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地に植え継ぎ、３０℃のインキュベーター内で振とう培養した。ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収を１６８時間培養時点で行った。１０％のアクリルアミドゲルを用いて５０μｇ分のタンパク質を泳動し、次いでニトロセルロース膜に転写した。Ｔｏｂタンパク質の検出にはＴｏｂ抗体（免疫生物研究所製）、ｍｙｃ抗体を用いた。
対照実験として、実施例Ｂ−１と同様にプラスミドとしてｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂのみを用いて形質転換を行う実験を行った。
（７）Ｔｏｂタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析  実施例Ｂ−１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。
ただし、本実施例では、培養時に試験管の代わりに９６ウェル・マイクロプレートを用い、クレット計の代わりにマイクロプレートリーダー（大日本製薬社製）を用いて６２０ｎｍにおける吸光度を測定することによって濁度の測定を行った。
４種類のベクターを同時に用いて形質転換した酵母の増殖曲線を第２７図に、対照実験の増殖曲線を第２８図に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を第２９図、第３０図に示す。
なお、図中、４種類のプラスミドをあわせて４×ｐＥＳＣ  ｖｅｃｔｏｒｓと略して記載する。
第２７図、第２８図より、Ｔｏｂタンパク質の非発現下（ベクターのみを導入したもの）および発現下（ｔｏｂ遺伝子を組み込んだベクターを導入したもの）で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、Ｔｏｂタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。さらに、４種類のベクターを同時に用いて発現させると生育の低下の程度が強くなることがわかる。また、第２９図、第３０図に示すように、Ｔｏｂタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＴｏｂタンパク質が捉えられた。
【配列表フリーテキスト】  配列番号：５は、ｔｏｂ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：６は、ｔｏｂ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、ｌｃｋ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：８は、ｌｃｋ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：９は、ｌｃｋＹＦ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
【産業上の利用可能性】  本発明により、生理活性物質を効率的にスクリーニングすることができる生理活性物質のスクリーニング方法が提供される。当該方法により得られる生理活性物質は、たとえば、ホ乳類のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与する因子と同様な機能または該機能を阻害もしくは増大する機能を有する。従って、当該生理活性物質は細胞の増殖や分化が関与する種々の疾患の治療剤および／または予防剤となる可能性がある。また、当該方法に使用される、異種タンパク質を発現可能な呼吸能を欠損した酵母は、当該タンパク質の非発現下と比べて発現下で生育状態が変化し、異種タンパク質を発現可能な呼吸能を有する酵母に比べ、前記変化はより鋭敏であり、しかも、異種タンパク質の非発現下においてはより安定した生育を示す、という性質を有する。当該性質は、前記方法において、生理活性物質のスクリーニングの効率化に大きく寄与する。
【配列表】
2004022742.tif 000016
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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