(57)【要約】造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を定量することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法、白血病と前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判定する方法、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判定する方法、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の遅延を判定する方法、または移植片対宿主反応病を判定する方法に関する。また、造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着遅延または移植片対宿主反応病（ＧＶＨＤ）の診断薬を提供することができる。
2003085399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法。
【請求項２】
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法。
【請求項３】
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判別する方法。
【請求項４】
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の状態を判定する方法。
【請求項５】
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を定量することを特徴とする、移植片対宿主反応病を判定する方法。
【請求項６】
判定または判別する方法が、免疫学的測定方法である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
免疫学的測定方法が、サンドイッチ法である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
サンドイッチ法が、造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）の異なるエピトープに反応する２種類の抗体を用いることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬。
【請求項１２】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態の診断薬。
【請求項１３】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる移植片対宿主反応病の診断薬。
【請求項１４】
抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の診断薬。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、請求項１４記載の診断薬。
【請求項１６】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を含む、白血病、前白血病あるいは非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態または移植片対宿主反応病の診断用キット。
【請求項１７】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を含む、請求項１６記載の診断用キット。
【請求項１８】
配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
【請求項１９】
配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判別する方法、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の状態を判定する方法、または移植片対宿主反応病を判定する方法に関する。また、造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態または移植片対宿主反応病の診断薬および診断キットに関する。
背景技術
白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患の診断、または白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患の治療後の診断は、白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患を治療するための方針を決定するのに重要である。
白血病の初発の診断としては、患者の末梢血中の白血球数を測定し、計測値が正常値を上回る場合に白血病の発生を疑う方法があげられる。しかしながら、風邪などの白血病以外の疾患であっても、体内の免疫反応の亢進により白血球数は増大するので、白血球数の測定だけでは、擬陽性の可能性がある。また、末梢血中の白血球数の正常値は、４，０００〜８，０００個／μＬと幅が広く、擬陰性の可能性がある。そこで、より確度の高い白血病の診断方法が求められている。
白血病再発の診断方法としては、ＷＴ−１遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる検出がある［臨床病理４８，１５５（２０００）、Ｂｌｏｏｄ，８４，３０７１（１９９４）、日本特許第３１２２７７１号］。しかしながら、該診断方法は操作が煩雑であるとともに、特殊な装置を必要としている。
また、上述の白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患、先天性代謝疾患、固形癌等の治療方法の一つとして、造血幹細胞移植療法があげられる。造血幹細胞移植療法の問題点としては、提供者の造血幹細胞と患者の造血幹細胞とのＨＬＡタイプの不適合、患者側の体調や感染症等などにより、移植した造血幹細胞が生着しない、造血幹細胞の生着が遅延する、移植片対宿主反応病（以下、ＧＶＨＤと称する）を発症するなど、造血幹細胞移植治療の効果が十分に得られないことがあげられ、最悪の場合、死の転帰をとることもある。
造血幹細胞の生着遅延に対しては、Ｇ−ＣＳＦを生体内に投与することにより、造血幹細胞の生着を促進させることができる。また、ＧＶＨＤに対しては、免疫抑制剤を生体内に投与することにより、提供された造血幹細胞の拒絶反応を抑制させることができる。しかしながら、いずれの薬剤も過剰に投与した場合には、副作用が懸念される。そのため、造血幹細胞の生着状態、ＧＶＨＤ発症を診断あるいは予知することは治療方針の決定に重要である。
造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着を確認する方法としては、末梢血中の白血球数や血小板数を測定し、それらの測定値が上昇すれば造血幹細胞が生着したことを診断することができる。しかしながら、造血幹細胞の生着は、移植後１０日から１ヶ月以上を要する事もあるため、末梢血中の白血球数や血小板数を測定することでは早期に造血幹細胞の生着を判断することができない。
ＧＶＨＤ発症の判定方法としては、造血幹細胞移植後のリカバリー期に現れる皮膚の発疹等を観察することがあげられる。しかしながら、簡便で確度の高いＧＶＨＤ発症の判定方法は知られていない。さらにＧＶＨＤ発症以前にＧＶＨＤの発症を予知する方法は知られていない。
ヒト造血幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＳＣＧＦと略記する）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質である［ＷＯ９８／０８８５９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，７５７７（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４９，１２４（１９９８）］。
ＳＣＧＦを認識する抗体としては、遺伝子組換え法により得られたＳＣＧＦ、ならびにＳＣＧＦのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体および細胞培養上清から部分精製されたＳＣＧＦや遺伝子組換え法により得られたＳＣＧＦを免疫原として調製したモノクローナル抗体が知られている［ＷＯ９８／０８８５９］。該モノクローナル抗体が中和活性を有すること、また遺伝子組換え法により得られたＳＣＧＦを免疫原として調製したポリクローナル抗体がＥＬＩＳＡで遺伝子組換え法により得られたＳＣＧＦと反応すること、ＳＣＧＦのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより遺伝子組換え法により得られたＳＣＧＦを検出できることが報告されている。
また、ＳＣＧＦのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原とした抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２が報告されている［Ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２，３０７（２００１）］。
ヒト正常組織に対してノーザンブロッティングを行った結果、ＳＣＧＦ遺伝子の発現は腎臓に多く、心臓に少なく、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、膵臓では発現が見られないこと［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，７５７７（１９９７）］、脾臓、胸腺、盲腸、骨髄、胎児肝に多く、末梢血に少ないこと［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４９，１２４（１９９８）］が知られている。また、正常新生児マウスにインサイテュハイブリダイゼーションを行った結果、骨髄、増殖軟骨、骨膜付近にＳＣＧＦが発現していることが報告されている［Ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２，３０７（２００１）］。
さらに、骨髄細胞株（ＨＴ６０、ＫＰＢ−Ｍ１５）、単核球細胞株（ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７）、赤芽球細胞株（ＨＥＬ）、繊維芽細胞株（ＮＨＦ）でＳＣＧＦ遺伝子の発現が見られるが、Ｂ細胞株（Ｕ２６６Ｂ１、ＩＭ−９）、Ｔ細胞株（ＭＯＬＴ−４）、赤芽球細胞株（Ｋ５６２）、上皮系癌細胞株（ＨｅＬａＳ３、Ａ４３１）、メラノーマ細胞株（Ｂｏｗｅｓ）、アデノウイルス形質転換胎生腎臓細胞株（２９３）、繊維芽細胞株（ＣＣＤ−８Ｌｕ）では、ＳＣＧＦ遺伝子の発現が見られないことが報告されている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，７５７７（１９９７）］。
しかし、正常及び血液疾患の、或いは造血幹細胞移植を受けたヒトを含む動物の末梢血、骨髄中の血球細胞でのＳＣＧＦのｍＲＮＡ量の差異に関する報告は無い。
組織や細胞のｍＲＮＡとコードされるタンパク質の量との相関は低く（相関係数＝０．４８）［Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８，５３３（１９９７）］、ＳＣＧＦのｍＲＮＡ量からＳＣＧＦ蛋白質量を推定する事も困難である。
以上のように、ヒトを含む動物の血清、血漿などの体液および組織中のＳＣＧＦ蛋白質の存在、機能、疾患との関係については明らかにされていない。
本発明の目的は、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の判定、白血病と前白血病または非白血病性悪性血液疾患との判別、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群との判別、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態およびＧＶＨＤを判定する方法、および白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態およびＧＶＨＤの診断薬ならびに診断キットを提供することにある。
発明の開示
本発明は以下（１）〜（２０）に関する。
（１）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法。
（２）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法。
（３）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判別する方法。
（４）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を測定することを特徴とする、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の状態を判定する方法。
（５）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を定量することを特徴とする、移植片対宿主反応病を判定する方法。
（６）  判定または判別する方法が、免疫学的測定方法である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  免疫学的測定方法が、サンドイッチ法である、上記（６）項に記載の方法。
（８）  サンドイッチ法が、造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）の異なるエピトープに反応する２種類の抗体を用いることを特徴とする、上記（７）記載の方法。
（９）  抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である上記（８）記載の方法。
（１０）  モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、上記（９）記載の方法。
（１１）  造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬。
（１２）  造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態の診断薬。
（１３）  造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を有効成分として含有してなる移植片対宿主反応病の診断薬。
（１４）  抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である上記（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の診断薬。
（１５）  モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、上記（１４）記載の診断薬。
（１６）  造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）に反応する抗体を含む、白血病、前白血病あるいは非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態または移植片対宿主反応病の診断用キット。
（１７）  造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を含む、上記（１６）記載の診断用キット。
（１８）  配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
（１９）  配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
（２０）  上記（１８）または（１９）項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法に関する。
白血病としては、造血系細胞のうち造血細胞などの未熟な細胞が腫瘍化されたものであればいかなるものも包含するが、急性リンパ性白血病（以下、ＡＬＬと称する）、急性骨髄性白血病（以下、ＡＭＬと称する）、慢性骨髄性白血病（以下、ＣＭＬと称する）などがあげられる。
前白血病としては、造血系細胞のうちリンパ球などの成熟な細胞が腫瘍化されたものであればいかなるものも包含されるが、骨髄異形性症候群（以下、ＭＤＳと称する）などがあげられる。
非白血病性悪性血液疾患としてリンパ腫や骨髄腫などがあげられる。
リンパ腫としては、ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫（以下、ＮＨＬと称する）などがあげられる。
骨髄腫としては、多発性骨髄腫（以下、ＭＭと称する）などがあげられる。
白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患患者の生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度は、健常人の生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度に比べて有意に上昇している。したがって、ＳＣＧＦ濃度にカットオフ値を設けて、採取した生体試料中のＳＣＧＦを定量し、ＳＣＧＦ濃度がカットオフ値より高い場合に白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患であると判定することができる。
カットオフ値とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性、カットオフ値以上であれば陽性として、またはカットオフ値以下であれば陽性、カットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる（金井正光編、臨床検査法提要  金原出版株式会社）。
カットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度があげられる。
ある母集団をカットオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものをａ（真陽性）、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものをｂ（偽陰性）、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものをｃ（偽陽性）、疾病患者でなく判定で陰性とされたものをｄ（真陰性）と表したときに、ａ／（ａ＋ｂ）で表される値を感度（真陽性率）、ｄ／（ｃ＋ｄ）で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。
目的とする疾患群と非疾患群との測定値の分布は通常、一部重複する。したがって、カットオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カットオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が５０％を超えない判定方法は、有用とは認められない。
カットオフ値を設定する方法としては、非疾患群の分布の９５％を含む、中央からの両端のいずれかの値をカットオフ値として設定する方法、非疾患群の分布が正規分布を示す場合、平均値＋２倍の標準偏差（ＳＤ）または平均値−２ＳＤをカットオフ値として設定する方法などがあげられる。
白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患であるか否かを判定する場合、カットオフ値を１５．０ｎｇ／ｍＬに設定した場合には、感度８９．５％、特異度７０％で判定することができ、カットオフ値を１３．０ｎｇ／ｍＬに設定した場合には、感度１００％、特異度６０％で判定することができる。健常人のＳＣＧＦ濃度よりカットオフ値を平均値＋２ＳＤの１８．２ｎｇ／ｍＬに設定すると、感度８９．５％、特異度１００％で判定することができる。また、このカットオフ値で白血病であるか否かを感度９５％、特異度１００％で、非白血病性悪性血液疾患であるか否かを感度７６．９％、特異度１００％、さらに前白血病であるか否かを感度１００％、特異度１００％で判定することができる。
生体試料としては、血液、尿、髄液、穿刺液などいかなるものでもよいが、好ましくは血液があげられる。血液としては、全血、血漿、血清、血球溶血液、血球内液などがあげられるが、好ましくは血清または血漿があげられる。
本発明は、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法に関する。
白血病患者の生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度は、前白血病または非白血病性悪性血液患者の生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度に比べて有意に上昇している。したがって、上述の方法で白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患と判定されたのち、さらに白血病と判定されるカットオフ値を設けて、採取した生体試料中のＳＣＧＦ濃度がそのカットオフ値よりも高い場合には、白血病、低い場合は前白血病または非白血病性悪性血液疾患であると判断することができる。
白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する場合、カットオフ値を２３．８ｎｇ／ｍＬに設定した場合には、感度８５％、特異度６９．２％で判別することができる。また、カットオフ値を非白血病性悪性血液疾患患者の平均値＋２ＳＤから３２．８ｎｇ／ｍＬに設定した場合には、感度８０％、特異度１００％で判別することができる。
本発明は、再生不良性貧血と骨髄異形性症候群とを判別する方法に関する。
再生不良性貧血と骨髄異形性症候群は、骨髄および末梢血において白血球の数や形態に異常が生じるのを特徴とする病態で、二つの疾患の判別は難しいとされてきた。
骨髄異形性症候群患者のＳＣＧＦ濃度は健常人の血液中に含まれるＳＣＧＦ濃度に比べ有意に上昇しているが、再生不良性貧血患者の血液中ＳＣＧＦ濃度は健常人と変わらない。骨髄異形性症候群患者の血中ＳＣＧＦ濃度は再生不良性貧血患者の血中ＳＣＧＦ濃度より有意に高く、両者の血中ＳＣＧＦ濃度を測定することで、再生不良性貧血か骨髄異形成症候群かと判別することができる。
そこで、白血球の異常が見られる患者のうち、再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者を判別する場合、再生不良性貧血患者のＳＣＧＦ濃度よりカットオフ値（平均値＋２ＳＤ＝１６．６ｎｇ／ｍＬ）を設定し、該カットオフ値によって判断すると、感度１００％、特異度１００％で再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者とを判別することができる。さらに基準値を１５．６ｎｇ／ｍＬ〜１８．６ｎｇ／ｍＬに設定すれば、感度１００％、特異度１００％で再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者とを判別することができる。
また、本発明は、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の遅延を判定する方法に関する。
造血幹細胞移植としては、造血幹細胞を移植する方法であればいかなるものでもよいが、骨髄移植、臍帯血移植、末梢血幹細胞移植等があげられる。
造血幹細胞移植から造血幹細胞の生着までの期間は、患者の末梢血の血球数を基準として以下にあげる４つの時期に分類される。すなわち、移植前で、抗癌剤などを大量投与した状態にあるプレ−コンディショニング期、移植を行った後に血球数が減少した状態にあるアプラスチック期、移植後に血球数が回復した状態にあるリカバリー期、および移植後に造血幹細胞が生着するステイブル期である。
造血幹細胞移植を行った患者のプレ−コンディショニング期およびアプラスチック期での生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度は、造血幹細胞の生着が遅延する患者の生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度のほうが造血幹細胞の生着が遅延しない患者の生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度に比べて高い。したがって、それぞれの時期のＳＣＧＦ濃度を測定し、造血幹細胞の生着が遅延するおそれがあると判断されるＳＣＧＦ濃度をカットオフ値として定め、ＳＣＧＦ濃度がカットオフ値より低い値の場合には生着の遅延は見られず、ＳＣＧＦ濃度がカットオフ値より高い値の場合には生着の遅延が起こると判定することができる。
造血幹細胞の生着遅延を判定するには、プレ−コンディショニング期の場合は、例えばカットオフ値を９．５ｎｇ／ｍＬに定めることにより感度７５％、特異度６７％で、アプラスチック期の場合は、カットオフ値を１２ｎｇ／ｍＬに定めることにより感度７５％、特異度６３％で判定することができる。
さらに、本発明はＧＶＨＤの発症を判定する方法に関する。
造血幹細胞移植を行った患者のアプラスチック期およびリカバリー期での生体試料中に含まれるＳＣＧＦ濃度は、ＧＶＨＤを発症する患者のほうが、ＧＶＨＤを発症しない患者に比べて高い。したがって、それぞれの時期のＳＣＧＦ濃度を測定し、それぞれの時期でＧＶＨＤを発症するおそれがあると判定されるカットオフ値を定め、ＳＣＧＦ濃度がカットオフ値より低い値の場合にはＧＶＨＤが発症するおそれはないが、ＳＣＧＦ濃度がカットオフ値より高い値の場合にはＧＶＨＤが発症するおそれがあると判断することができる。
造血幹細胞移植後のＧＶＨＤの発症を判定するには、プレ−コンディショニング期においては、カットオフ値を例えば５ｎｇ／ｍＬに定めることにより感度８７％、特異度５７％で、アプラスチック期においてはカットオフ値を例えば１０ｎｇ／ｍＬに定めることで感度８７％、特異度６３％で、リカバリー期ではカットオフ値を例えば１５ｎｇ／ｍＬに定めることで感度８７％、特異度６３％で、ＧＶＨＤ発症患者と非発症患者とを判定することができる。
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（以下、ＳＣＧＦと称す）を測定する方法としては、免疫学的測定法、分子生物学的測定法などいかなる方法でもよいが、好ましくは免疫学的測定法があげられる。
免疫学的測定法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法など抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
分子生物学的測定法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等があげられる。
イムノアッセイ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫検出法（ＲＩＡ）、酵素免疫検出法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫検出法（ＦＩＡ）、発光免疫検出法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、物理化学的検出法（ＴＩＡ，ＬＡＰＩＡ，ＰＣＩＡ）、フローサイトメトリーなどがあげられるが、好ましくは酵素免疫検出法があげられる。
放射免疫検出法で用いる放射性標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の放射性同位元素を用いることができる。例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等を用いることができる。
酵素免疫検出法で用いる酵素標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等を用いることができる。
さらに酵素免疫測定法は酵素の作用により生成した物質を測定することにより、測定・検出を行うが、紫外部または可視部に吸収極大を有する物質の吸光度を測定する方法、生成した蛍光物質の蛍光強度を測定する方法、生成した物質の発光強度を測定する方法など多様な測定方法をとることが出来る。例えば酵素標識体としてアルカリフォスファターゼを用いる場合は、アルカリホスファターゼ作用により紫外部または可視部に吸収極大を有する物質を生成するようなアルカリ性ホスファターゼの基質としては、例えば４−ニトロフェニルリン酸等が挙げられる。４−ニトロフェニルリン酸はアルカリホスファターゼにより４−ニトロフェノールに変換される。アルカリホスファターゼ作用により発光を生成するようなアルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシン）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）等が挙げられる。また、アルカリホスファターゼの作用により色素を生成する試薬として、アルカリホスファターゼの基質であるＮＡＤＰＨを含有する酵素サイクリング反応試薬ＡｍｐｌｉＱ（ダコ社製）が挙げられる。
発光免疫検出法で用いる発光標識体としては、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査４２（１９９８）］の発光体を用いることができる。例えば、アクリジニウムエステル、ロフィン等を用いることができる。
蛍光免疫検出法で用いる蛍光標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社製）の蛍光を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ等を用いることができる。
イムノアッセイ法における測定方法としては、競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド第５版（南光堂）］等があげられるが、好ましくはサンドイッチ法があげられる。
サンドイッチ法は、抗原抗体反応で結合した試料中の目的物質と第二の抗体に、第二の抗体（二次抗体）を同時に、または別々に反応させ、試料中の目的物質を同一または別々の抗体で検出または定量する方法である。多くの場合、測定操作中に試料中の非反応のサンプル成分や測定系成分を洗浄する工程を含む。例えば、固相に第一の抗体（一次抗体）を固定した後、測定したい試料を第一の試料と接触させる。試料中の非反応のサンプル成分を洗浄し、反応系から除去した後、抗原抗体反応で結合した試料中の目的物質と第一の抗体の複合体に、第二の抗体（二次抗体）を反応させ、測定系中の反応に関与しなかった第二次抗体などの成分を洗浄除去した後、反応系に存在する試料中の目的物質を検出または定量する方法である。
サンドイッチ法に用いる固相としては、ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレート、ポリスチレン製マイクロタイタープレート等があげられる。
サンドイッチ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。
サンドイッチ法で用いる一次抗体と二次抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識する抗体の組み合わせであればいかなるものでもよいが、少なくとも１つがモノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明のサンドイッチ法で用いられるモノクローナル抗体としては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体などがあげられる。
配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２１４２［Ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２，３０７（２００１）］が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２１４２があげられる。配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２８０４が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２８０４があげられる。配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２９４５が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２９４５があげられる。
モノクローナル抗体ＫＭ２１４２を生産するハイブリドーマＫＭ２１４２、モノクローナル抗体ＫＭ２８０４を生産するハイブリドーマＫＭ２８０４、モノクローナル抗体ＫＭ２９４５を生産するハイブリドーマＫＭ２９４５は、平成１４年２月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２３およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２４としてそれぞれ寄託されている。
上述のモノクローナル抗体はＳＣＧＦを認識する部位がそれぞれ異なるので、これらのモノクローナル抗体を組み合わせてサンドイッチ法を行うことができる。好ましいモノクローナル抗体の組み合わせとしては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、具体的にはハイブリドーマＫＭ２１４２［Ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２，３０７（２００１）］が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２１４２と、配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、具体的にはハイブリドーマＫＭ２８０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２３）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２８０４との組み合わせがあげられる。
本発明のサンドイッチ法によるＳＣＧＦを検出または定量する方法の具体例を以下に示す。
まず、適当な固定担体の表面に上述の抗ＳＣＧＦ抗体（一次抗体）を吸着固定する。一次抗体の固定は、例えば、当該抗体を適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等に希釈した後、これを固定担体の表面に接触させ、そして４〜３７℃にて３０分間以上反応させることなどにより行うことができる。
次に、固定担体表面の蛋白質結合能をブロックする。例えば、固定担体表面上の遊離結合基をブロッキング緩衝液と接触させる。
ブロッキング緩衝液としては、例えば１〜１０％のウシ血清アルブミン、１０〜３０％ブロックエース（雪印乳業社製）を含有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等があげられる。
ブロッキング処理は、４〜３７℃にて３０分間以上反応させることにより行うことができる。
次に、一次抗体を生体試料と接触させる。生体試料は必要に応じて、例えば０．０１〜１％のウシ血清アルブミンなどの蛋白質を含有する緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等で希釈してもよい。
一次抗体と生体試料との接触は、４〜３７℃にて３０分間以上反応させることにより行うことができる。
接触させた後、必要に応じてＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いて数回洗浄する。
このとき、生体試料中に存在するＳＣＧＦが、あらかじめ固定されている抗ＳＣＧＦ抗体と特異的に結合することにより、抗ＳＣＧＦ抗体を介して固定担体に固定される。
次に、ＳＣＧＦが固定された前記担体を、二次抗体を含有する溶液と接触させる。
二次抗体としては、一次抗体とエピトープの異なる抗ＳＣＧＦ抗体であればいかなるものでもよい。また、二次抗体は必要に応じて、前述の標識体で予め標識しておくことができる。
未吸着の二次抗体を除去するには、必要に応じてＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いて担体を数回洗浄する。これにより該二次抗体は、あらかじめ結合されている一次抗体及びＳＣＧＦを介して、固定担体に結合し、二次抗体の結合量が生体試料中のＳＣＧＦの量を反映することになる。
上記のようにして固定された二次抗体は、二次抗体の標識体に応じて測定することができる。また、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、該三次抗体を種々の方法により標識しておき、三次抗体の標識を検出または測定することもできる。
上記のようにして、結合された二次抗体の量を測定し、標準物質を用いて検量線を作成し、生体試料中のＳＣＧＦの量を測定することができる。
検量線は、標準物質として濃度が既知であるヒトＳＣＧＦ蛋白質を含む溶液を数点段階希釈したものを準備し、生体試料とともに上述のサンドイッチ法を行うことにより得られる。
本発明の白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着遅延の診断薬、およびＧＶＨＤ発症の診断薬に含有されるＳＣＧＦに対する抗体としては、ＳＣＧＦに反応する抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントなどいかなるものでもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が用いられる。
モノクローナル抗体としては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体があげられる。
配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２１４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２２）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２１４２があげられる。配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２８０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２３）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２８０４があげられる。配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２９４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２４）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２９４５があげられる。
本発明のキットとしては、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
試薬としてはＳＣＧＦに反応する抗体を含み、また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、ＳＣＧＦなどの標準物質なども含まれる。
生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにＢＳＡやカゼインなどのタンパク質を含む水溶液などがあげられる。
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、本発明の抗体または抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用等公知の方法により調製することができる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体等を疎水固相化したものがあげられる。
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等があげられる。
洗浄液としては、リン酸やトリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）、ＨＥＰＥＳやＭＯＰＳなどのグッドバッファー類などの緩衝剤などに、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン６０、ツイーン８０、トリトンＴＭＸ−７０５などの界面活性剤、ＮａＣｌ、ＫＣｌや硫酸アンモニウムなどの塩、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、塩酸グアニジン、尿素やソディウムドデシルサルフェートなどの変性剤、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸などの安定化剤の少なくとも１種類を含む液があげられる。具体的には、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツィーン２０およびｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液からなるツイーンＰＢＳ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツィーン２０およびｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなるツイーンＴＢＳなどがあげられる。
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、本発明の抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどのタンパク質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリフォスファターゼであれば、４−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
標準物質としては、ＷＯ９８／０８８６９に記載の方法により調製できるＳＣＧＦ、キットに用いられる２種類の抗体のエピトープを含有するペプチドなどがあげられる。
本発明は、また、配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体に関する。
配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２８０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２３）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２８０４があげられる。配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ２９４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９２４）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ２９４５があげられる。
本発明に用いられるモノクローナル抗体の製造方法としては、公知のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができる。
以下に、本発明に用いるモノクローナル抗体の製造方法を詳細に説明する。
（１）抗原の調製
抗原としては、ヒトＳＣＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して得られたヒトＳＣＧＦ蛋白質、ペプチド合成により得られたヒトＳＣＧＦ部分配列を有する合成ペプチドなどがあげられる。
抗原用部分ペプチドとしては、５〜３０残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１５７，１０５−１３２（１９８２）］などにより、親水性の高い部分配列を予測することで、立体構造上蛋白質表面に存在する部分を推測することができる。即ち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。さらに、蛋白質の二次構造情報も参考にできる。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎの方法［アドバンセズ・イン・エンザイモロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），４７，４５−１４７（１９７８）］などによりアミノ酸配列から予測した蛋白質二次構造において、ターン構造やランダムコイル構造を有する部分が抗原用ペプチドとして適していると考えることができる。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには、蛋白質と架橋するためにシステインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化する。
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる［インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３５，１６１−２１４（１９９０）、「ソリッド−フェーズ・ペプタイド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，メソッズ・イン・エンザイモロジー第２８９巻（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９），グレッグ・Ｂ・フィールズ（Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ）編，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），（１９９７）、「ペプタイド・シンセシス・プロトコール（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」，メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー第３５巻（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３５），マイケル・Ｗ・ペニントン（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ），ベン・Ｍ・ダン（Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ）編，ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ），（１９９４）］。
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、以後ＡＣＴ社と略称する）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、ノバビオケム社（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社、アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ．）、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに（１）で調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど］とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として提供する。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８：１−７（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９（１９７６）］、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３：１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）］などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬ／１０８抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地］１００ｍＬ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり下記に述べる酵素免疫測定法などにより、ヒトＳＣＧＦに反応し、ヒトＳＣＧＦを含まない抗原に反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
酵素免疫測定法
抗原あるいは抗原を発現した細胞などを９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行い、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６〜５×１０７細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行い、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
［実施例］
実施例１．ヒトＳＣＧＦ部分ペプチドを用いた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体の作製
（１）ヒトＳＣＧＦ部分ペプチドの合成
ヒトＳＣＧＦ蛋白配列を解析し、親水性の高い部分、Ｎ末端、Ｃ末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる部分配列として、化合物１（ＳＣＧＦ−１）を選択した。
（略号について）
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１３８巻，９頁（１９８４年）］に従った。
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｘ：Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｙ：グリシン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル−Ｌ−アルギニン
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−トリチル−Ｌ−グルタミン
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｉｎｄ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−トリプトファン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。
質量分析は、日本電子ＪＭＳ−ＨＸ１１０Ａを用いＦＡＢ−ＭＳ法により、もしくはブルカー社製質量分析装置ＲＥＦＬＥＸを用いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により行った。行った。アミノ酸分析は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ａ．）らの方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２２２，１９（１９９４）］により行った。加水分解は塩酸蒸気中１１０℃で２０時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ−Ｔａｇ）アミノ酸分析計（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い分析した。
▲１▼化合物１（ＳＣＧＦ−１）（配列番号４）（Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ＯＨ）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、１４．１μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−ＣｌＴｒｔｒｅｓｉｎ樹脂、ノバビオケム社製）３０ｍｇを自動合成機（島津製作所）の反応容器に入れ、６００μＬのＤＭＦを加えて３分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液９００μＬを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｂ）担体樹脂を９００μＬのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
（ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１４１μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１４１μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ１水和物（１４１μｍｏｌ）およびＮＭＭ（２１２μｍｏｌ）をＤＭＦ（４９４μＬ）中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を３０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｄ）担体樹脂を９００μＬのＤＭＦで１分間洗浄後溶液を排出し、これを５回繰り返した。
こうして、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が担体上に合成された。
次に、（ａ）（ｂ）の工程の後、（ｃ）の工程でＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｄ）の洗浄工程を経て、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が担体上に合成された。
以下、工程（ｃ）において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した後、（ａ）（ｂ）の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、Ｎ末端が無保護であり側鎖が保護されたペプチドの結合した担体樹脂を得た。次に得られた担体樹脂に対し次の（ｅ）〜（ｇ）の操作を行った。
（ｅ）担体樹脂を８００μＬのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を３回繰り返した。
（ｆ）無水酢酸（２８２μｍｏｌ）及びＤＭＦ（５００μＬ）を樹脂に加えて混合物を２時間攪拌し、溶液を排出した。
（ｇ）担体樹脂を８００μＬのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を３回繰り返した。
この後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、Ｎ末端がアセチル化された側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、５ｍｇ／ｍＬの濃度で２−メチルインドールを含むＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液１ｍＬを加えて室温で６時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍＬを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして４４．６ｍｇを取得した。この粗生成物全量をジチオスレイトールおよびＤＭＦからなる混合溶液に溶解し、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を１．６ｍｇ得た。
質量分析［ＴＯＦＭＳ］；ｍ／ｚ＝２５２０．７（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ｇｌｘ  ７．６（８），Ｇｌｙ  ４．０（４），Ａｒｇ  ２．９（３），Ａｌａ  ２．２（２），Ｌｅｕ  １．２（１），Ｃｙｓ  １．７（１）（２）免疫原の調製
実施例１（１）で得られたヒトＳＣＧＦ部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍＬに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍＬ  ＭＢＳ（ナカライテスク社製）を滴下して３０分間撹拌反応させる。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢ２．５ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析した。
（３）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１（２）で調製したペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌ラット（ＳＤ）に投与し、２週間後より１００μｇのコンジュゲートを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下の（４）に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（４）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には実施例１（１）で得られたヒトＳＣＧＦ部分ペプチドをサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す。）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例１（２）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ（シグマ社製）を用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを１０μｇ／ｍＬ，５０μＬ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を５０μＬ／穴で分注し２時間反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を５０μＬ／穴で加えて室温、１時間反応させ、ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後ＡＢＴＳ基質液［２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅ−ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて測定した。
（５）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（６）ハイブリドーマの作製
実施例１（３）で得られたラット脾細胞と（５）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬ／１０８ラット脾細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍＬ中に懸濁した。
この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間、培養した。この培養上清を実施例１（４）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ヒトＳＣＧＦ部分ペプチド（化合物１）に反応して、別のＳＣＧＦ部分ペプチドである配列番号１の１４０〜１５６番目のアミノ酸配列からなるペプチドに反応しない穴を選び、さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＭ２１４１、ＫＭ２１４２、ＫＭ２１４３、ＫＭ２１４４、ＫＭ２１４５を確立した。
（７）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に実施例１（６）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。モノクローナル抗体がＩｇＭのときは、５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、塩化ナトリウム０．５Ｍを添加したＰＢＳで透析後、セルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）（ベットボリューム７５０ｍＬ）のカラムに流速１５ｍＬ／時で通塔しＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。モノクローナル抗体がＩｇＧのときは、カプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い決定した（表１）。
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（８）ヒトＳＣＧＦ部分ペプチドとの反応性（酵素免疫測定法）
実施例１（６）で選択された抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体のヒトＳＣＧＦ部分ペプチド（化合物１）との反応性を（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。コントロールペプチドとしては、化合物１とは異なるＳＣＧＦ部分ペプチドである配列番号１の１４０〜１５６番目のアミノ酸配列からなるペプチドを用いた。第１図に示すように、抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体（ＫＭ２１４１〜２１４５）は化合物１に特異的に反応し、コントロールペプチドには反応しなかった。
実施例２．動物細胞を用いたヒトＳＣＧＦの発現と精製
（１）ヒトＳＣＧＦ発現用プラスミドｐＡＧＥ−ＳＣＧＦαの構築およびヒトＳＣＧＦの動物細胞での発現
動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ２１０（ＷＯ９６／３４０１６）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ処理断片とＳＣＧＦタンパク質をコードするＤＮＡ［Ｍｉｏ  ｅｔ．ａｌ．，ＢＢＲＣ  ２４９，１２４−１３０（１９９８）］とを連結することにより、ヒトＳＣＧＦ発現ベクターｐＡＧＥ−ＳＣＧＦαを構築した。
動物細胞へのプラスミドの導入は宮地等の方法に従いエレクトロポレーション法［Ｍｉｙａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０（１９９０）］により行った。４μｇのｐＡＧＥ−ＳＣＧＦ−ａを４×１０６個のｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株［Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）］へ導入した。この細胞を１０ｍＬのＭＥＭａ２０００−ｄＦＣＳ（５）培地［ｄＦＣＳを５％、７．５％ＮａＨＣＯ３を１／４０量、２００ｍＬグルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製、５，０００単位／ｍＬペニシリンおよび５，０００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）を０．５％含むＭＥＭａ２０００培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）］に懸濁し、１０ｃｍプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。ハイグロマイシン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）を終濃度０．３ｍｇ／ｍＬになるよう添加し、さらに１〜２週間培養した。形質転換細胞がコンフルエントになった時点で回収し、ハイグロマイシンを０．３ｍｇ／ｍＬ、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＭＥＭａ２０００−ｄＦＣＳ（５）培地に１〜２×１０６細胞／ｍＬになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍＬ分注した。１〜２週間の培養後、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性の細胞を０．３ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン、２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ含有ＭＥＭａ２０００−ｄＦＣＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍＬ分注した。１〜２週間の培養後、２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性の細胞を得た。この２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性細胞を下記に示す培地１）および培地２）を用いて、２Ｌのローラーボトル（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）で３７℃、８０回転／分で培養を行った。
培地１）無血清Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）
培地２）１０ｍｇ／Ｌのａｐｒｏｔｉｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を含む無血清Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ３０１培地
約５日間の培養後、細胞を遠心分離し、培養上清サンプルを得た。
（２）モノクローナル抗体ＫＭ２１４２を用いたウェスタンブロッティングによる培養上清中のＳＣＧＦタンパク質の存在確認
実施例１で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２を用いたウェスタンブロッティングにより、前記（１）で得られた培養上清中のＳＣＧＦタンパク質の存在を、以下の方法により確認した。
後述（３）および（４）のＳＣＧＦタンパク質のクロマトグラフィーによる精製における各精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａの方法［Ｊ．Ｂ．Ｃ．２６２，１００３５−１００３８（１９８７）］に従ってＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、ミリポア社製）へ電気的に転写した。転写膜はブロッキング溶液［１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファー（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，２．７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，９．６ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２））］中で３０分間振盪した後、ブロッキング溶液で１ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体を含む溶液中で室温６０分間振盪した。該転写膜はさらに０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファーで５分間洗浄を２回、ＰＢＳバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、パーオキシダーゼで標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ａｎｔｉ−ｒａｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  １．３ｇ／Ｌ，ＤＡＫＯ社製）をＰＢＳで１／１，０００に希釈した溶液中で室温６０分間振盪した。０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファーで５分間洗浄を２回、ＰＢＳバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、発光法（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）により検出を行った。
（３）ＣＨＯ細胞培養上清からのヒトＳＣＧＦタンパク質の精製
実施例３に記載する抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体の作製を行うために、上記（１）の培地１）の培養条件で得たＣＨＯ細胞培養上清から以下の２段階のクロマトグラフィーによって精製ヒトＳＣＧＦタンパク質を取得した。
第１段階：亜鉛キレートクロマトグラフィー
Ｚｎ２＋イオンで飽和させたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ担体（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を２．５ｃｍφ×２０ｃｍのカラム（ＢｉｏＲａｄ社製）に１１ｃｍの高さまで充填し、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で平衡化した。これに上記（１）で得たＣＨＯ細胞培養上清２．４Ｌを添加し、同緩衝液で十分に洗浄後、０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体ＫＭ２１４２によるウェスタンブロッティングで交差する約４５ｋＤａのバンドを含む画分を回収した。
第２段階：ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィー
上記亜鉛キレートクロマトグラフィー粗精製画分に終濃度６５％となるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌後、４℃で２時間放置した。１８，８００×ｇで３０分間遠心分離して得られた沈澱を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同トリス塩酸緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に添加した。同緩衝液で十分洗浄後、０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体ＫＭ２１４２によるウェスタンブロッティングで交差する約４５ｋＤａのバンドを含む画分を回収した（第２図のレーン２）。
（４）ＣＨＯ培養上清からのヒトＳＣＧＦタンパク質の高純度精製
実施例６に記載するヒトＳＣＧＦ定量系で用いるヒトＳＣＧＦタンパク質標準品は、上記（１）の培地２）の培養条件で得たＣＨＯ細胞培養上清から以下の３段階のクロマトグラフィーにより精製し、取得した。
第１段階：亜鉛キレートクロマトグラフィー
Ｚｎ２＋イオンで飽和させたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ担体（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を５．０ｃｍφ  ｘ  ２０ｃｍのカラム（ＢｉｏＲａｄ社製）に１４．５ｃｍの高さまで充填し、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で平衡化した。これに上記（１）で得たＣＨＯ細胞培養上清１２Ｌを添加し、同緩衝液で十分に洗浄後、０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記（２）で示したＫＭ２１４２によるウェスタンブロッティングで交差する約４５ｋＤａのバンドを含む画分を回収した。
第２段階：ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィー
上記亜鉛キレートクロマトグラフィー粗精製画分に終濃度５０％となるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌後、４℃で２時間放置した。１８，８００ｇで３０分間遠心分離して得られた沈澱を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同トリス塩酸緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ１０／１０カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に添加した。同緩衝液で十分洗浄後、０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記（２）で示したＫＭ２１４２によるウェスタンブロッティングで交差する約４５ｋＤａのバンドを含む画分を回収した。
第３段階：Ｓ−４００ゲルろ過クロマトグラフィー
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ担体（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）をＸＫ５０／６０カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に５１．５ｃｍの高さまで充填したカラムとＸＫ５０／１００カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に９３ｃｍの高さまで充填したカラムを直列に連結し、ＰＢＳバッファーで十分平衡化した。これに上記ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィー精製画分２８ｍＬを添加し、６ｍＬ／分の流速でＰＢＳバッファーにより溶出した。溶出画分の一部を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体ＫＭ２１４２によるウェスタンブロッティングで交差する約４５ｋＤａのバンドを含む画分を回収した。
（５）ヒトＳＣＧＦタンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析
実施例２（３）で得られた精製ヒトＳＣＧＦタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はタンパク質化学の常法に従い決定した。精製ヒトＳＣＧＦタンパク質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色（第２図レーン２）あるいはＰ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａの方法に従ってＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、アプライド  バイオシステムズ社製）へ電気的に転写した。転写した膜はクマジーブルー染色し、見かけ上分子量が４５ｋＤａ（第２図レーン２、バンドＡ）、４１ｋＤａ（第２図レーン２、バンドＢ）、３４ｋＤａ（第２図レーン２、バンドＣ）の各バンドを切り出し、気相プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所）を用いてメーカー推奨の方法によりアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列は配列番号５、６、７に記載したように、配列番号１に記載したＳＣＧＦのアミノ酸配列のＮ末端から１アミノ酸残基目、２９アミノ酸残基目、６０アミノ酸残基目からのアミノ酸配列にそれぞれ一致した。以下、第２図レーン２に示した見かけ分子量約４１ｋＤａのＮ末端２８残基欠失ＳＣＧＦタンパク質をΔ２８体、約３４ｋＤａのＮ末端５９残基欠失ＳＣＧＦタンパク質をΔ５９体と称する。
実施例３．ＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦ蛋白質を用いた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体の作製
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例２（３）で得られたＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質（ＳＣＧＦ、Δ２８体、Δ５９体のＳＣＧＦ混合物）１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に投与し、２週間後より１００μｇのヒトＳＣＧＦ蛋白を１週間に１回、計３回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法（ただしアッセイ用の抗原にはＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質、コントロール抗原として１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いた。）および以下に示すサンドイッチＥＬＩＳＡ法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
抗体産生細胞の調製は実施例１（３）と同様に行った。
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡ法
９６穴のＥＩＡプレート（グライナー社製）に実施例１で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２を１０μｇ／ｍＬ、５０μＬ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質を５μｇ／ｍＬで１％ＢＳＡ−ＰＢＳ希釈したものを５０μＬ／穴で分注し、室温２時間反応させた。対象として１％ＢＳＡ−ＰＢＳを５０μＬ／穴分注し、同様に反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、上記（１）で得られた被免疫マウス抗血清の培養上清を５０μＬ／穴で分注し、２時間反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン（ラット血清蛋白吸収ずみ；カルタグ社製）を５０μＬ／穴で加えて室温で１時間反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて測定した。
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
実施例１（５）と同様に調製を行った。
（４）ハイブリドーマの作製
実施例１（６）と同様に実施例３（１）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞との細胞融合を行った。
得られた細胞懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間、培養した。この培養上清を実施例３（２）に記載したサンドイッチＥＬＩＳＡ法で調べ、ヒトＳＣＧＦ蛋白質に反応してコントロールである１％ＢＳＡ−ＰＢＳに反応しない穴を選び、さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＭ２８０１、ＫＭ２８０２、ＫＭ２８０３およびＫＭ２８０４を確立した。
（５）モノクローナル抗体の精製
実施例１（７）と同様に実施例３（４）で得られたハイブリドーマ株をヌード雌マウスに腹腔内投与を行い、得られた腹水より精製モノクローナル抗体を取得した。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い、決定した。その結果を表２に示す。
2003085399.tif 000004
（６）ＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質との反応性（酵素免疫測定法）
実施例３（４）で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体のＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦ蛋白質との反応性を実施例１（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。第３図に示すように、抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体（ＫＭ２８０１、ＫＭ２８０２、ＫＭ２８０３およびＫＭ２８０４）はＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質に特異的に反応し、コントロールの１％ＢＳＡ−ＰＢＳには反応しなかった。
実施例４．ＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦタンパク質（ＣＨＯ細胞発現）を用いた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体の作製
実施例３記載の未変性ヒトＳＣＧＦ蛋白質を免疫原に用いた場合には、Δ５９体に反応するモノクローナル抗体は得られなかった。そこで、Δ５９体に反応するモノクローナル抗体を作製するため、ＳＤＳ変性ＳＣＧＦを免疫原に用いてハイブリドーマの作製を試みた。
（１）免疫原の調製
実施例２（３）で得られたＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質をＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム；ナカライテスク社製）を加えて変性させたものを作製し、免疫原とした。すなわち５％ＳＤＳ−ＰＢＳを調製し、ＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質に９分の１量加え、１００℃で５分間煮沸したものをＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦタンパク質とした。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例４（１）で得られたＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦタンパク質１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に投与し、２週間後より１００μｇのＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦタンパク質を１週間に１回、計３回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法（ただしアッセイ用の抗原にはＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦ蛋白質、コントロール抗原として１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いた。）で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
抗体産生細胞の調製は実施例１（３）に記載の方法と同様に行った。
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
実施例１（５）に記載の方法と同様の調製を行った。
（４）ハイブリドーマの作製
実施例１（６）と同様にして、実施例４（２）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞との細胞融合を行った。
得られた細胞懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間、培養した。この培養上清を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法で調べ、ＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦ蛋白に反応してコントロールである１％ＢＳＡ−ＰＢＳに反応しない穴を選び、さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＭ２９４１、ＫＭ２９４２、ＫＭ２９４３、ＫＭ２９４４およびＫＭ２９４５を確立した。
（５）モノクローナル抗体の精製
実施例１（７）と同様に実施例４（４）で得られたハイブリドーマ株をヌード雌マウスの腹腔内投与を行い、得られた腹水より精製モノクローナル抗体を取得した。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い、決定した。その結果を表３に示す。
2003085399.tif 000005
（６）ＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦタンパク質との反応性（酵素免疫測定法）
実施例４（４）で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体のＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦタンパク質との反応性を実施例１（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。第４図に示すように、抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体（ＫＭ２９４１、ＫＭ２９４２、ＫＭ２９４３、ＫＭ２９４４およびＫＭ２９４５）はＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦタンパク質に特異的に反応し、コントロールの１％ＢＳＡ−ＰＢＳには反応しなかった。
実施例５．抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ヒトおよびマウスＳＣＧＦタンパク質に対する反応性
実施例１、３および４で作製された抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体のヒトおよびマウスＳＣＧＦタンパク質に対する反応性を酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）で検討した。マウスＳＣＧＦタンパク質は実施例２記載の方法に準じて作製した。
アッセイ用の抗原としてＣＨＯ細胞発現ヒトおよびマウスＳＣＧＦタンパク質を用い、実施例１（４）に記載の方法により行った。結果を第５図に示す。
抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２は配列番号１に示すＳＣＧＦのアミノ酸配列のＮ末端から６残基目から２５残基目までに相当する部分ペプチド（化合物１）を抗原に用いて作製されたハイブリドーマ由来の抗体である。抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２は、ＳＣＧＦタンパク質に対する反応性をも有していることが示された。また、抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２はヒトおよびマウスＳＣＧＦタンパク質の両方に反応性を有していた。
抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２８０４はＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦを抗原に用いて作製したハイブリドーマ由来の抗体である。抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２８０４はヒトＳＣＧＦにのみ反応し、マウスＳＣＧＦに対する交叉反応性は示さなかった。
抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２９４５はＳＤＳ変性ＳＣＧＦタンパク質（ＣＨＯ細胞発現）を抗原に用いて作製したハイブリドーマ由来の抗体である。抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２９４５は、未変性のＳＣＧＦタンパク質に対する反応性をも有していることが示された。また、抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２９４５はマウスＳＣＧＦに対する交叉反応性は示さなかった。
（２）ウェスタンブロッティング
実施例２（３）で得られたＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質を用い、実施例３および４で作製された抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２８０４およびＫＭ２９４５のウェスタンブロッティングにおける反応性を検討した。
実施例２（２）と同様にＰＶＤＦ膜に転写したサンプルを、ブロッキング溶液中で室温３０分間振盪後、ブロッキング溶液で１ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ＳＣＧＦモノクローナル抗体で室温６０分間振盪した。転写膜はさらに０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファーで５分間洗浄を２回、ＰＢＳバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、ＰＢＳで１／１，０００に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）溶液中で室温６０分間振盪した。０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファーで５分間洗浄を２回、ＰＢＳバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、上述のＥＣＬ発光法により検出した。
第２図におけるレーン３、４、５はそれぞれＫＭ２１４２、ＫＭ２８０４、ＫＭ２９４５を用いた精製ヒトＳＣＧＦタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す。ＫＭ２８０４はＮ末端５９残基欠失ＳＣＧＦタンパク質であるΔ５９体には反応性を有していないが、全長ＳＣＧＦおよびＮ末端２８残基欠失ＳＣＧＦタンパク質であるΔ２８体には反応性を有していた。また、ＫＭ２９４５は全長ＳＣＧＦおよび欠失体のいずれも反応性を有していた。
実施例６．ヒトＳＣＧＦ定量系
実施例１で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２を以下の方法によりビオチン標識した。実施例１で得られたＫＭ２１４２精製抗体をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、１／４容量の０．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸バッファー（ｐＨ９．２）を加えた。さらにバッファーと同量のＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ（１ｍｇ／ｍＬにジメチルホルムアミドにて溶解；ピアス社製）を攪拌下滴下した。３時間、室温で攪拌反応を行った後、ＰＢＳで一晩透析したものをビオチン標識ＫＭ２１４２として用いた。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、実施例３で得られた抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２８０４を５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、実施例２（４）で得られたＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦタンパク質を血清希釈液（協和メデックス社製）で１７．５ｎｇ／ｍＬから２倍希釈系列で１４点希釈したものを５０μＬ／穴で分注し室温で２時間反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、上記で得られたビオチン標識ＫＭ２１４２（０．２μｇ／ｍＬにＢＳＡ−ＰＢＳにて希釈）を５０μＬ／穴で加えて室温、２時間反応させ、ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、さらにアルカリフォスファターゼ標識アビジン（ザイメッド社製）を３２，０００倍希釈で５０μＬ／穴で加えて室温、１時間反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡｍｐｌｉＱ（ＤＡＫＯ社製）を用いて発色させＯＤ４９０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅ−ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて測定した。その結果、第６図に示すように、本定量系によりヒトＳＣＧＦタンパク質を０．０４〜２．０ｎｇ／ｍＬの範囲で定量することが可能であった。
実施例７．白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の血清ＳＣＧＦ濃度
インフォームドコンセントを得た白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の血清中のＳＣＧＦ濃度を実施例６の方法で測定した。また血球検査値が正常値を示す男女１０名の健常人を対象例として同じく血清中のＳＣＧＦ濃度を測定した。その結果を第７図に示す。
健常人の値の分布が正規分布を示すことを確認した後、この群より平均値とスタンダードデビエーション（ＳＤ）を計算し、平均値＋２ＳＤの値を正常と異常とを区別する基準値に設定した。この基準値をもとに、白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の値を正常・異常に分別し、白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患がＳＣＧＦ測定値で検出可能か否かを確認した。その結果を表４に示す。
2003085399.tif 000006
健常人群に比較し、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）の患者の中央値は有意に高く、ＳＣＧＦ測定値がこれら疾患で有意に上昇していることが示された（第７図）。
また健常人の値から定めたカットオフ値を用いて白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患を高い感度で検出できることが示された（表４）。一方、同じ血液疾患でありながら、再生不良性貧血（ＡＡ）患者の値は健常人との有意差が観察されず、またカットオフ値を用いてもこの疾患を検出出来なかった。
血液細胞数の異常を伴う疾患である非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を比較すると、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの白血病患者のＦ血液中ＳＣＧＦ濃度は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などの他の前白血病や非白血病性悪性血液疾患患者の血液中ＳＣＧＦ濃度に比較して有意に高く、血液中ＳＣＧＦ濃度は白血病と前白血病や非白血病性悪性血液疾患との判別に利用可能であった。また、判別診断の難しいＡＡ患者とＭＤＳ患者を比較してみると、ＭＤＳ患者血中ＳＣＧＦ濃度はＡＡ患者のそれと比較して有意に高く、両者を血中ＳＣＧＦ濃度で判別診断することが可能であった。
実施例８．造血幹細胞移植後ＧＶＨＤ発症とＳＣＧＦ濃度
インフォームドコンセントを得た白血病および前白血病患者で造血幹細胞移植を受けた２３例の内、ＧＶＨＤを発症した例１５例、発症しなかった例８例の血清中ＳＣＧＦ濃度を実施例６の方法を用いて各ステージ毎に測定した。その結果を第８図に示す。
造血幹細胞移植を受けた患者のＳＣＧＦ濃度はプレーコンディショニング期やアプラスチック期に比べ、リカバリー期やステイブル期の方が有意に高値を示した。
造血幹細胞移植を受けた患者のうち、ＧＶＨＤを発症した症例は発症しなかった例に比べ、アプラスチック期およびリカバリー期において有意に血清中ＳＣＧＦ濃度が高いので、血清中のＳＣＧＦ濃度を測定することによって、ＧＶＨＤ発症を判定可能であった。
さらにカットオフ値を定めてＧＶＨＤ発症例と非発症例とを判定できないかを検討した。その結果を第９図に示す。プレーコンディショニング期においては、カットオフ値を例えば５ｎｇ／ｍＬに定めることにより感度８７％、特異度５７％で、アプラスチック期においてはカットオフ値を１０ｎｇ／ｍＬに定めることで感度８７％、特異度６３％で、リカバリー期ではカットオフ値を１５ｎｇ／ｍＬに定めることで感度８７％、特異度６３％で、それぞれＳＣＧＦ濃度を測定し、これを診断に用いなかった時に比べて有意（ｐ＜０．０５）にＧＶＨＤ発症例と非発症例とを判別ＧＶＨＤ可能であった。
実施例９．移植造血幹細胞の生着と血清ＳＣＧＦ濃度
インフォームドコンセントを得た血液疾患患者で造血幹細胞移植を受けた２３例のうち、生着が遅延した例４例、遅延しなかった例１９例の血清中ＳＣＧＦ濃度を実施例６の方法を用いて各ステージ毎に測定した。結果を第１０図に示す。
生着非遅延例では、リカバリー期およびステイブル期のＳＣＧＦ濃度は、プレーコンディショニング期に比して有意に上昇した。一方、生着遅延例では、これらの期においても有意な上昇は観察されなかった。
そこで、造血幹細胞移植患者のＳＣＧＦ濃度を測定し、そのカットオフ値を定めてその値と個々患者の値比較から造血幹細胞生着遅延例と非遅延例を判定できないかを検討した。その結果を第１１図に示す。プレーコンディショニング期においては、カットオフ値を例えば９．５ｎｇ／ｍＬに定めることにより感度７５％、特異度６７％で、アプラスチック期においてはカットオフ値を１２ｎｇ／ｍＬに定めることで感度７５％、特異度６３％で、造血幹細胞生着遅延例と非遅延例とを判別することが可能であった。
実施例１０．白血病患者の末梢血細胞におけるＳＣＧＦの発現
インフォームドコンセントを得た種々の白血病患者の末梢血細胞をＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、プロトコールにしたがって全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡ１μｇをＤＮａｓｅＩ（ＧＩＢＣＯ社製）処理し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて逆転写し、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを調製した。Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、調製したＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号８および９ならびに配列番号１０および１１の塩基配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーとして、それぞれ、ヒトＧ３ＰＤＨ、ＳＣＧＦ遺伝子の検出を検討したところ、Ｇ３ＰＤＨの検出量がほぼ同等となる条件下で、健常人１人では、ＳＣＧＦの発現を検出できなかったが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）２例中１例、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）２例中２例でＳＣＧＦの発現が検出された。
産業上の利用可能性
本発明は、ＳＣＧＦに反応する抗体を用いた、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法、造血幹細胞移植後の造血幹細胞生着遅延および移植片対宿主反応病を判定する方法、およびそれらの診断薬ならびに診断キットを提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、モノクローナル抗体のヒトＳＣＧＦ部分ペプチド（化合物１）に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第２図は、精製ヒトＳＣＧＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング結果を示す。レーン１および２は分子量マーカーと精製ヒトＳＣＧＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。レーン３、４、５はそれぞれＫＭ２１４２、ＫＭ２８０４、ＫＭ２９４５を用いた精製ヒトＳＣＧＦタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す図である。
１：分子量マーカーのレーン
２：精製ＳＣＧＦを解析し、銀染色したレーン
３：抗ＳＣＧＦ抗体ＫＭ２１４２を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
４：抗ＳＣＧＦ抗体ＫＭ２８０４を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
５：抗ＳＣＧＦ抗体ＫＭ２９４５を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
Ａ：ＳＣＧＦタンパク質の分子量を示す。
Ｂ：Ｎ末端２８残基欠失ＳＣＧＦタンパク質Δ２８体の分子量を示す。
Ｃ：Ｎ末端５９残基欠失ＳＣＧＦタンパク質Δ５９体の分子量を示す。
第３図は、モノクローナル抗体の、ＣＨＯ細胞発現ヒトＳＣＧＦ蛋白に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第４図は、モノクローナル抗体の、ＳＤＳ変性ヒトＳＣＧＦ蛋白（ＣＨＯ細胞発現）に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第５図は、モノクローナル抗体の、ヒトおよびマウスＳＣＧＦ蛋白（ＣＨＯ細胞発現）に対する反応性を示す。（バインディングＥＬＩＳＡ）
第６図は、モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＳＣＧＦ蛋白の定量曲線を示す図である。
第７図は、各種血液疾患患者血清中ＳＣＧＦ濃度を示す。横実線は各種血液疾患群の中央値を、横点線は健常人群から求めたカットオフ値（１８．２ｎｇ／ｍＬ）を示す図である。
＊：Ｎｏｒｍａｌ（健常人群）あるいはＡＡ（再生不良性貧血群）との有意差  ｐ＜０．０５、
＃：ＮＨＬ（非ホジキンリンパ腫）との有意差  Ｐ＜０．０５、＄：ＭＭ（多発性骨髄腫）との有意差  ｐ＜０．０５
第８図は、造血幹細胞移植患者血清中ＳＣＧＦ濃度によるＧＶＨＤ発症および非発症の差を示す図である。横実線は各群の中央値を示す。
＊：ＧＶＨＤ非発症例との有意差  ｐ＜０．０５、
＃：プレ−コンディショニング期との有意差  ｐ＜０．０５、
＄：アプラスチック期との有意差  ｐ＜０．０５、
＆：リカバリー期との有意差  ｐ＜０．０５
第９図は、造血幹細胞移植患者血清中ＳＣＧＦ濃度とＧＶＨＤ発症患者の検出感度、非発症患者の特異度との関係を示す図である。●：感度、○：特異度、縦点線は仮のカットオフ値を示す。
第１０図は、造血幹細胞移植患者血清中ＳＣＧＦ濃度による生着遅延および非遅延の差を示す図である。横実線は各群の中央値を示す。
＃：プレ−コンディショニング期との有意差  ｐ＜０．０５、
＄：アプラスチック期との有意差  ｐ＜０．０５、
＆：リカバリー期との有意差  ｐ＜０．０５
第１１図は、造血幹細胞移植患者血清中ＳＣＧＦ濃度と造血幹細胞生着遅延例の検出感度、非遅延例の特異度との関係を示す図である。●：感度、○：特異度、縦点線は仮のカットオフ値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2003085399.tif 000024
【図１１】
2003085399.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月1日(2004.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】        明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判別する方法、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の状態を判定する方法、または移植片対宿主反応病を判定する方法に関する。また、造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態または移植片対宿主反応病の診断薬および診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患の診断、または白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患の治療後の診断は、白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患を治療するための方針を決定するのに重要である。
【０００３】
白血病の初発の診断としては、患者の末梢血中の白血球数を測定し、計測値が正常値を上回る場合に白血病の発生を疑う方法があげられる。しかしながら、風邪などの白血病以外の疾患であっても、体内の免疫反応の亢進により白血球数は増大するので、白血球数の測定だけでは、擬陽性の可能性がある。また、末梢血中の白血球数の正常値は、4,000〜8,000個/μLと幅が広く、擬陰性の可能性がある。そこで、より確度の高い白血病の診断方法が求められている。
【０００４】
白血病再発の診断方法としては、WT-1遺伝子のRT-PCRによる検出がある［臨床病理48,155(2000)、Blood, 84, 3071 (1994)、日本特許第３１２２７７１号］。しかしながら、該診断方法は操作が煩雑であるとともに、特殊な装置を必要としている。
【０００５】
また、上述の白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患、先天性代謝疾患、固形癌等の治療方法の一つとして、造血幹細胞移植療法があげられる。造血幹細胞移植療法の問題点としては、提供者の造血幹細胞と患者の造血幹細胞とのＨＬＡタイプの不適合、患者側の体調や感染症等などにより、移植した造血幹細胞が生着しない、造血幹細胞の生着が遅延する、移植片対宿主反応病（以下、GVHDと称する）を発症するなど、造血幹細胞移植治療の効果が十分に得られないことがあげられ、最悪の場合、死の転帰をとることもある。
【０００６】
造血幹細胞の生着遅延に対しては、G-CSFを生体内に投与することにより、造血幹細胞の生着を促進させることができる。また、GVHDに対しては、免疫抑制剤を生体内に投与することにより、提供された造血幹細胞の拒絶反応を抑制させることができる。しかしながら、いずれの薬剤も過剰に投与した場合には、副作用が懸念される。そのため、造血幹細胞の生着状態、GVHD発症を診断あるいは予知することは治療方針の決定に重要である。
【０００７】
造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着を確認する方法としては、末梢血中の白血球数や血小板数を測定し、それらの測定値が上昇すれば造血幹細胞が生着したことを診断することができる。しかしながら、造血幹細胞の生着は、移植後10日から1ヶ月以上を要する事もあるため、末梢血中の白血球数や血小板数を測定することでは早期に造血幹細胞の生着を判断することができない。
【０００８】
GVHD発症の判定方法としては、造血幹細胞移植後のリカバリー期に現れる皮膚の発疹等を観察することがあげられる。しかしながら、簡便で確度の高いGVHD発症の判定方法は知られていない。さらにGVHD発症以前にGVHDの発症を予知する方法は知られていない。
【０００９】
ヒト造血幹細胞増殖因子（Stem Cell Growth Factor；以下、SCGFと略記する）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質である［WO98/08869、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)、Biochem. Biophys. Res. Comm., 249, 124 (1998)］。
【００１０】
SCGFを認識する抗体としては、遺伝子組換え法により得られたSCGF、ならびにSCGFのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体および細胞培養上清から部分精製されたSCGFや遺伝子組換え法により得られたSCGFを免疫原として調製したモノクローナル抗体が知られている［WO98/08869］。該モノクローナル抗体が中和活性を有すること、また遺伝子組換え法により得られたSCGFを免疫原として調製したポリクローナル抗体がELISAで遺伝子組換え法により得られたSCGFと反応すること、SCGFのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより遺伝子組換え法により得られたSCGFを検出できることが報告されている。
【００１１】
また、SCGFのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原とした抗SCGFモノクローナル抗体KM2142が報告されている［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］。
【００１２】
ヒト正常組織に対してノーザンブロッティングを行った結果、SCGF遺伝子の発現は腎臓に多く、心臓に少なく、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、膵臓では発現が見られないこと［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)］、脾臓、胸腺、盲腸、骨髄、胎児肝に多く、末梢血に少ないこと［Biochem. Biophys. Res. Comm., 249, 124 (1998)］が知られている。また、正常新生児マウスにインサイテュハイブリダイゼーションを行った結果、骨髄、増殖軟骨、骨膜付近にSCGFが発現していることが報告されている［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］。
【００１３】
さらに、骨髄細胞株(HT60、KPB-M15)、単核球細胞株(THP-1、U-937)、赤芽球細胞株(HEL)、繊維芽細胞株(NHF)でSCGF遺伝子の発現が見られるが、B細胞株(U266B1、IM-9)、T細胞株(MOLT-4)、赤芽球細胞株(K562)、上皮系癌細胞株(HeLaS3、A431)、メラノーマ細胞株(Bowes)、アデノウイルス形質転換胎生腎臓細胞株(293)、繊維芽細胞株(CCD-8Lu)では、SCGF遺伝子の発現が見られないことが報告されている［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)］。
【００１４】
しかし、正常及び血液疾患の、或いは造血幹細胞移植を受けたヒトを含む動物の末梢血、骨髄中の血球細胞でのSCGFのmRNA量の差異に関する報告は無い。
組織や細胞のmRNAとコードされるタンパク質の量との相関は低く（相関係数＝0.48）［Electrophoresis, 18, 533 (1997)］、SCGFのmRNA量からSCGF蛋白質量を推定する事も困難である。
【００１５】
以上のように、ヒトを含む動物の血清、血漿などの体液および組織中のSCGF蛋白質の存在、機能、疾患との関係については明らかにされていない。
【００１６】
本発明の目的は、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の判定、白血病と前白血病または非白血病性悪性血液疾患との判別、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群との判別、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態およびGVHDを判定する方法、および白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態およびGVHDの診断薬ならびに診断キットを提供することにある。
【発明の開示】
【００１７】
本発明は以下（１）〜（２０）に関する。
（１）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法。
（２）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法。
（３）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判別する方法。
（４）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の状態を判定する方法。
（５）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を定量することを特徴とする、移植片対宿主反応病を判定する方法。
（６）  判定または判別する方法が、免疫学的測定方法である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  免疫学的測定方法が、サンドイッチ法である、上記（６）項に記載の方法。
（８）  サンドイッチ法が、造血幹細胞増殖因子（SCGF）の異なるエピトープに反応する２種類の抗体を用いることを特徴とする、上記（７）記載の方法。
（９）  抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である上記（８）記載の方法。
（１０）  モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、上記（９）記載の方法。
（１１）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬。
（１２）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態の診断薬。
（１３）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる移植片対宿主反応病の診断薬。
（１４）  抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である上記（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の診断薬。
（１５）  モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、上記（１４）記載の診断薬。
（１６）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を含む、白血病、前白血病あるいは非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態または移植片対宿主反応病の診断用キット。
（１７）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）を含む、上記（１６）記載の診断用キット。
（１８）  配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
（１９）  配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
（２０）  上記（１８）または（１９）項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法に関する。
【００１９】
白血病としては、造血系細胞のうち造血細胞などの未熟な細胞が腫瘍化されたものであればいかなるものも包含するが、急性リンパ性白血病（以下、ALLと称する）、急性骨髄性白血病（以下、AMLと称する）、慢性骨髄性白血病（以下、CMLと称する）などがあげられる。
【００２０】
前白血病としては、造血系細胞のうちリンパ球などの成熟な細胞が腫瘍化されたものであればいかなるものも包含されるが、骨髄異形性症候群（以下、MDSと称する）などがあげられる。
【００２１】
非白血病性悪性血液疾患としてリンパ腫や骨髄腫などがあげられる。
リンパ腫としては、ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫（以下、NHLと称する）などがあげられる。
【００２２】
骨髄腫としては、多発性骨髄腫（以下、MMと称する）などがあげられる。
白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度は、健常人の生体試料中に含まれるSCGF濃度に比べて有意に上昇している。したがって、SCGF濃度にカットオフ値を設けて、採取した生体試料中のSCGFを定量し、SCGF濃度がカットオフ値より高い場合に白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患であると判定することができる。
【００２３】
カットオフ値とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性、カットオフ値以上であれば陽性として、またはカットオフ値以下であれば陽性、カットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる（金井正光編、臨床検査法提要 金原出版株式会社）。
【００２４】
カットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度があげられる。
【００２５】
ある母集団をカットオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものをａ（真陽性）、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものをｂ（偽陰性）、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものをｃ（偽陽性）、疾病患者でなく判定で陰性とされたものをｄ（真陰性）と表したときに、ａ／（ａ＋ｂ）で表される値を感度（真陽性率）、ｄ／（ｃ＋ｄ）で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。
【００２６】
目的とする疾患群と非疾患群との測定値の分布は通常、一部重複する。したがって、カットオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カットオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が５０％を超えない判定方法は、有用とは認められない。
【００２７】
カットオフ値を設定する方法としては、非疾患群の分布の９５％を含む、中央からの両端のいずれかの値をカットオフ値として設定する方法、非疾患群の分布が正規分布を示す場合、平均値＋２倍の標準偏差（ＳＤ）または平均値−２ＳＤをカットオフ値として設定する方法などがあげられる。
【００２８】
白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患であるか否かを判定する場合、カットオフ値を15.0ng/mLに設定した場合には、感度89.5%、特異度70%で判定することができ、カットオフ値を13.0ng/mLに設定した場合には、感度100%、特異度60%で判定することができる。健常人のSCGF濃度よりカットオフ値を平均値＋２ＳＤの18.2ng/mLに設定すると、感度89.5%、特異度100%で判定することができる。また、このカットオフ値で白血病であるか否かを感度95％、特異度100%で、非白血病性悪性血液疾患であるか否かを感度76.9%、特異度100%、さらに前白血病であるか否かを感度100%、特異度100%で判定することができる。
【００２９】
生体試料としては、血液、尿、髄液、穿刺液などいかなるものでもよいが、好ましくは血液があげられる。血液としては、全血、血漿、血清、血球溶血液、血球内液などがあげられるが、好ましくは血清または血漿があげられる。
【００３０】
本発明は、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法に関する。
【００３１】
白血病患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度は、前白血病または非白血病性悪性血液患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度に比べて有意に上昇している。したがって、上述の方法で白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患と判定されたのち、さらに白血病と判定されるカットオフ値を設けて、採取した生体試料中のSCGF濃度がそのカットオフ値よりも高い場合には、白血病、低い場合は前白血病または非白血病性悪性血液疾患であると判断することができる。
【００３２】
白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する場合、カットオフ値を23.8ng/mLに設定した場合には、感度85%、特異度69.2%で判別することができる。また、カットオフ値を非白血病性悪性血液疾患患者の平均値＋２ＳＤから32.8ng/mLに設定した場合には、感度80%、特異度100%で判別することができる。
【００３３】
本発明は、再生不良性貧血と骨髄異形性症候群とを判別する方法に関する。
再生不良性貧血と骨髄異形性症候群は、骨髄および末梢血において白血球の数や形態に異常が生じるのを特徴とする病態で、二つの疾患の判別は難しいとされてきた。
【００３４】
骨髄異形性症候群患者のSCGF濃度は健常人の血液中に含まれるSCGF濃度に比べ有意に上昇しているが、再生不良性貧血患者の血液中SCGF濃度は健常人と変わらない。骨髄異形性症候群患者の血中SCGF濃度は再生不良性貧血患者の血中SCGF濃度より有意に高く、両者の血中SCGF濃度を測定することで、再生不良性貧血か骨髄異形成症候群かと判別することができる。
【００３５】
そこで、白血球の異常が見られる患者のうち、再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者を判別する場合、再生不良性貧血患者のSCGF濃度よりカットオフ値（平均値＋2SD=16.6ng/mL）を設定し、該カットオフ値によって判断すると、感度100%、特異度100%で再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者とを判別することができる。さらに基準値を15.6ng/mL〜18.6ng/mLに設定すれば、感度100%、特異度100%で再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者とを判別することができる。
【００３６】
また、本発明は、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の遅延を判定する方法に関する。
【００３７】
造血幹細胞移植としては、造血幹細胞を移植する方法であればいかなるものでもよいが、骨髄移植、臍帯血移植、末梢血幹細胞移植等があげられる。
【００３８】
造血幹細胞移植から造血幹細胞の生着までの期間は、患者の末梢血の血球数を基準として以下にあげる４つの時期に分類される。すなわち、移植前で、抗癌剤などを大量投与した状態にあるプレ−コンディショニング期、移植を行った後に血球数が減少した状態にあるアプラスチック期、移植後に血球数が回復した状態にあるリカバリー期、および移植後に造血幹細胞が生着するステイブル期である。
【００３９】
造血幹細胞移植を行った患者のプレ−コンディショニング期およびアプラスチック期での生体試料中に含まれるSCGF濃度は、造血幹細胞の生着が遅延する患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度のほうが造血幹細胞の生着が遅延しない患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度に比べて高い。したがって、それぞれの時期のSCGF濃度を測定し、造血幹細胞の生着が遅延するおそれがあると判断されるSCGF濃度をカットオフ値として定め、SCGF濃度がカットオフ値より低い値の場合には生着の遅延は見られず、SCGF濃度がカットオフ値より高い値の場合には生着の遅延が起こると判定することができる。
【００４０】
造血幹細胞の生着遅延を判定するには、プレ−コンディショニング期の場合は、例えばカットオフ値を9.5ng/mLに定めることにより感度75%、特異度67%で、アプラスチック期の場合は、カットオフ値を12ng/mLに定めることにより感度75%、特異度63%で判定することができる。
【００４１】
さらに、本発明はGVHDの発症を判定する方法に関する。
【００４２】
造血幹細胞移植を行った患者のアプラスチック期およびリカバリー期での生体試料中に含まれるSCGF濃度は、GVHDを発症する患者のほうが、GVHDを発症しない患者に比べて高い。したがって、それぞれの時期のSCGF濃度を測定し、それぞれの時期でGVHDを発症するおそれがあると判定されるカットオフ値を定め、SCGF濃度がカットオフ値より低い値の場合にはGVHDが発症するおそれはないが、SCGF濃度がカットオフ値より高い値の場合にはGVHDが発症するおそれがあると判断することができる。
【００４３】
造血幹細胞移植後のGVHDの発症を判定するには、プレ−コンディショニング期においては、カットオフ値を例えば5ng/mLに定めることにより感度87%、特異度57%で、アプラスチック期においてはカットオフ値を例えば10ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、リカバリー期ではカットオフ値を例えば15ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、GVHD発症患者と非発症患者とを判定することができる。
【００４４】
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（以下、SCGFと称す）を測定する方法としては、免疫学的測定法、分子生物学的測定法などいかなる方法でもよいが、好ましくは免疫学的測定法があげられる。
【００４５】
免疫学的測定法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法など抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
【００４６】
分子生物学的測定法としては、RT-PCR法、ノーザンブロッティング法、in situハイブリダイゼーション法等があげられる。
【００４７】
イムノアッセイ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫検出法（RIA）、酵素免疫検出法（EIAまたはELISA）、蛍光免疫検出法（FIA）、発光免疫検出法（luminescent immunoassay）、物理化学的検出法（TIA，LAPIA，PCIA）、フローサイトメトリーなどがあげられるが、好ましくは酵素免疫検出法があげられる。
【００４８】
放射免疫検出法で用いる放射性標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の放射性同位元素を用いることができる。例えば、32P、125I、131I等を用いることができる。
【００４９】
酵素免疫検出法で用いる酵素標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等を用いることができる。
【００５０】
さらに酵素免疫測定法は酵素の作用により生成した物質を測定することにより、測定・検出を行うが、紫外部または可視部に吸収極大を有する物質の吸光度を測定する方法、生成した蛍光物質の蛍光強度を測定する方法、生成した物質の発光強度を測定する方法など多様な測定方法をとることが出来る。例えば酵素標識体としてアルカリフォスファターゼを用いる場合は、アルカリホスファターゼ作用により紫外部または可視部に吸収極大を有する物質を生成するようなアルカリ性ホスファターゼの基質としては、例えば４−ニトロフェニルリン酸等が挙げられる。４−ニトロフェニルリン酸はアルカリホスファターゼにより４−ニトロフェノールに変換される。アルカリホスファターゼ作用により発光を生成するようなアルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシン）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）等が挙げられる。また、アルカリホスファターゼの作用により色素を生成する試薬として、アルカリホスファターゼの基質であるＮＡＤＰＨを含有する酵素サイクリング反応試薬ＡｍｐｌｉＱ（ダコ社製）が挙げられる。
【００５１】
発光免疫検出法で用いる発光標識体としては、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店； 臨床検査42(1998)］の発光体を用いることができる。例えば、アクリジニウムエステル、ロフィン等を用いることができる。
蛍光免疫検出法で用いる蛍光標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社製）の蛍光を用いることができる。例えば、FITC、RITC等を用いることができる。
【００５２】
イムノアッセイ法における測定方法としては、競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド 第５版（南光堂）］等があげられるが、好ましくはサンドイッチ法があげられる。
【００５３】
サンドイッチ法は、抗原抗体反応で結合した試料中の目的物質と第一の抗体に、第二の抗体（二次抗体）を同時に、または別々に反応させ、試料中の目的物質を同一または別々の抗体で検出または定量する方法である。多くの場合、測定操作中に試料中の非反応のサンプル成分や測定系成分を洗浄する工程を含む。例えば、固相に第一の抗体（一次抗体）を固定した後、測定したい試料を第一の試料と接触させる。試料中の非反応のサンプル成分を洗浄し、反応系から除去した後、抗原抗体反応で結合した試料中の目的物質と第一の抗体の複合体に、第二の抗体（二次抗体）を反応させ、測定系中の反応に関与しなかった第二次抗体などの成分を洗浄除去した後、反応系に存在する試料中の目的物質を検出または定量する方法である。
【００５４】
サンドイッチ法に用いる固相としては、ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレート、ポリスチレン製マイクロタイタープレート等があげられる。
【００５５】
サンドイッチ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Fab、Fab'、F(ab)2などの抗体フラグメントを用いてもよい。
【００５６】
サンドイッチ法で用いる一次抗体と二次抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識する抗体の組み合わせであればいかなるものでもよいが、少なくとも１つがモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００５７】
本発明のサンドイッチ法で用いられるモノクローナル抗体としては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体などがあげられる。
【００５８】
配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2142［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］が生産するモノクローナル抗体KM2142があげられる。配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2804が生産するモノクローナル抗体KM2804があげられる。配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2945が生産するモノクローナル抗体KM2945があげられる。
【００５９】
モノクローナル抗体KM2142を生産するハイブリドーマKM2142、モノクローナル抗体KM2804を生産するハイブリドーマKM2804、モノクローナル抗体KM2945を生産するハイブリドーマKM2945は、平成１４年２月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にFERM BP-7922、FERM BP-7923およびFERM BP-7924としてそれぞれ寄託されている。
【００６０】
上述のモノクローナル抗体はSCGFを認識する部位がそれぞれ異なるので、これらのモノクローナル抗体を組み合わせてサンドイッチ法を行うことができる。好ましいモノクローナル抗体の組み合わせとしては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、具体的にはハイブリドーマKM2142［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］が生産するモノクローナル抗体KM2142と、配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、具体的にはハイブリドーマKM2804(FERM BP-7923)が生産するモノクローナル抗体KM2804との組み合わせがあげられる。
【００６１】
本発明のサンドイッチ法によるSCGFを検出または定量する方法の具体例を以下に示す。
【００６２】
まず、適当な固定担体の表面に上述の抗SCGF抗体（一次抗体）を吸着固定する。一次抗体の固定は、例えば、当該抗体を適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等に希釈した後、これを固定担体の表面に接触させ、そして4〜37℃にて30分間以上反応させることなどにより行うことができる。
【００６３】
次に、固定担体表面の蛋白質結合能をブロックする。例えば、固定担体表面上の遊離結合基をブロッキング緩衝液と接触させる。
【００６４】
ブロッキング緩衝液としては、例えば1〜10%のウシ血清アルブミン、10〜30%ブロックエース（雪印乳業社製）を含有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等があげられる。
【００６５】
ブロッキング処理は、4〜37℃にて30分間以上反応させることにより行うことができる。
【００６６】
次に、一次抗体を生体試料と接触させる。生体試料は必要に応じて、例えば0.01〜1%のウシ血清アルブミンなどの蛋白質を含有する緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等で希釈してもよい。
【００６７】
一次抗体と生体試料との接触は、4〜37℃にて30分間以上反応させることにより行うことができる。
【００６８】
接触させた後、必要に応じてTween20等の界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いて数回洗浄する。
【００６９】
このとき、生体試料中に存在するSCGFが、あらかじめ固定されている抗SCGF抗体と特異的に結合することにより、抗SCGF抗体を介して固定担体に固定される。
【００７０】
次に、SCGFが固定された前記担体を、二次抗体を含有する溶液と接触させる。
【００７１】
二次抗体としては、一次抗体とエピトープの異なる抗SCGF抗体であればいかなるものでもよい。また、二次抗体は必要に応じて、前述の標識体で予め標識しておくことができる。
【００７２】
未吸着の二次抗体を除去するには、必要に応じてTween20等の界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いて担体を数回洗浄する。これにより該二次抗体は、あらかじめ結合されている一次抗体及びSCGFを介して、固定担体に結合し、二次抗体の結合量が生体試料中のSCGFの量を反映することになる。
【００７３】
上記のようにして固定された二次抗体は、二次抗体の標識体に応じて測定することができる。また、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、該三次抗体を種々の方法により標識しておき、三次抗体の標識を検出または測定することもできる。
【００７４】
上記のようにして、結合された二次抗体の量を測定し、標準物質を用いて検量線を作成し、生体試料中のSCGFの量を測定することができる。
【００７５】
検量線は、標準物質として濃度が既知であるヒトSCGF蛋白質を含む溶液を数点段階希釈したものを準備し、生体試料とともに上述のサンドイッチ法を行うことにより得られる。
【００７６】
本発明の白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着遅延の診断薬、およびGVHD発症の診断薬に含有されるSCGFに対する抗体としては、SCGFに反応する抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントなどいかなるものでもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が用いられる。
【００７７】
モノクローナル抗体としては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体があげられる。
【００７８】
配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2142(FERM BP-7922)が生産するモノクローナル抗体KM2142があげられる。配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2804(FERM BP-7923)が生産するモノクローナル抗体KM2804があげられる。配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2945(FERM BP-7924)が生産するモノクローナル抗体KM2945があげられる。
【００７９】
本発明のキットとしては、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
【００８０】
試薬としてはSCGFに反応する抗体を含み、また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、SCGFなどの標準物質なども含まれる。
【００８１】
生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにＢＳＡやカゼインなどのタンパク質を含む水溶液などがあげられる。
【００８２】
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、本発明の抗体または抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用等公知の方法により調製することができる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体等を疎水固相化したものがあげられる。
【００８３】
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等があげられる。
【００８４】
洗浄液としては、リン酸やトリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）、ＨＥＰＥＳやＭＯＰＳなどのグッドバッファー類などの緩衝剤などに、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン６０、ツイーン８０、トリトンＴＭ Ｘ−７０５などの界面活性剤、ＮａＣｌ、ＫＣｌや硫酸アンモニウムなどの塩、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、塩酸グアニジン、尿素やソディウムドデシルサルフェートなどの変性剤、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸などの安定化剤の少なくとも１種類を含む液があげられる。具体的には、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツィーン２０およびｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液からなるツイーンＰＢＳ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツィーン２０およびｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなるツイーンＴＢＳなどがあげられる。
【００８５】
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、本発明の抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどのタンパク質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
【００８６】
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリフォスファターゼであれば、４−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
【００８７】
標準物質としては、WO98/08869に記載の方法により調製できるSCGF、キットに用いられる２種類の抗体のエピトープを含有するペプチドなどがあげられる。
【００８８】
本発明は、また、配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体に関する。
【００８９】
配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2804(FERM BP-7923)が生産するモノクローナル抗体KM2804があげられる。配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2945（FERM BP-7924）が生産するモノクローナル抗体KM2945があげられる。
【００９０】
本発明に用いられるモノクローナル抗体の製造方法としては、公知のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができる。
以下に、本発明に用いるモノクローナル抗体の製造方法を詳細に説明する。
（１）抗原の調製
抗原としては、ヒトSCGFをコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して得られたヒトSCGF蛋白質、ペプチド合成により得られたヒトSCGF部分配列を有する合成ペプチドなどがあげられる。
抗原用部分ペプチドとしては、5〜30残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。KyteとDoolittleの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 157, 105-132 (1982)］などにより、親水性の高い部分配列を予測することで、立体構造上蛋白質表面に存在する部分を推測することができる。即ち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のN末端、C末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。さらに、蛋白質の二次構造情報も参考にできる。Chou-Fasmanの方法［アドバンセズ・イン・エンザイモロジー (Advances in Enzymology), 47, 45-147 (1978)］などによりアミノ酸配列から予測した蛋白質二次構造において、ターン構造やランダムコイル構造を有する部分が抗原用ペプチドとして適していると考えることができる。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには、蛋白質と架橋するためにシステインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのN末端はアセチル化、C末端はアミド化する。
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる［インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ(International Journal of Peptide Protein Research), 35, 161-214 (1990)、「ソリッド−フェーズ・ペプタイド・シンセシス(Solid-Phase Peptide Synthesis)」, メソッズ・イン・エンザイモロジー 第289巻(Methods in Enzymology, vol. 289) ,グレッグ・B・フィールズ(Gregg B. Fields)編,アカデミック・プレス(Academic Press), (1997)、「ペプタイド・シンセシス・プロトコール(Peptide Synthesis Protocols)」, メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー 第35巻(Methods in Molecular Biology, vol. 35) ,マイケル・W・ペニントン(Michael W. Pennington) ,ベン・M・ダン(Ben M. Dunn) 編,ヒューマナ・プレス(Humana Press), (1994)］。
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Advanced ChemTech Inc., USA、以後 ACT社と略称する）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護した Nα-Fmoc-アミノ酸あるいは Nα-Boc-アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ABI 社、島津製作所、国産化学（株）、ノバビオケム社（NovaBiochem）、渡辺化学（株）、ACT 社、アナスペック社（AnaSpec Inc.）、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。
【００９１】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに（1）で調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（complete freund's adjuvant）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど］とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として提供する。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH 7.65)で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
【００９２】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18:1-7 (1978)］、P3-NS1/1-Ag41（NS-1）［European J. Immunology, 6: 511-519 (1976)］、SP2/O-Ag14(SP-2)［Nature,276: 269-270 (1978)］、P3-X63-Ag8653(653)［J.Immunology, 123:1548-1550 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)［Nature, 256:495-497 (1975)］などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（1.5mmol/L）、２−メルカプトエタノール（5×10-5 mol/L）、ジェンタマイシン（10μg/mL）および牛胎児血清(FCS)を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（15μg/mL）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０7個以上の細胞数を確保する。
【００９３】
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水１リットル、pH 7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,000（PEG-1,000）2g、MEM2mLおよびジメチルスルホキシド0.7mLの混液0.2〜1mL/108抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにする。遠心分離（900rpm、5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（10-4mol/L）、チミジン（1.5×10-5mol/L）およびアミノプテリン（4×10-7mol/L）を加えた培地］100mL中に懸濁する。この懸濁液を96穴培養用プレートに100μL/穴ずつ分注し、5% CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり下記に述べる酵素免疫測定法などにより、ヒトSCGFに反応し、ヒトSCGFを含まない抗原に反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
酵素免疫測定法
抗原あるいは抗原を発現した細胞などを96ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行い、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【００９４】
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5mLを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×106〜5×107細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3,000rpm、5分間）して固形分を除去後、40〜50％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行い、IgGあるいは、IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および280nmでの吸光度より算出する。
［実施例］
【００９５】
実施例１．ヒトSCGF部分ペプチドを用いた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製
（１）ヒトSCGF部分ペプチドの合成
ヒトSCGF蛋白配列を解析し、親水性の高い部分、N末端、C末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる部分配列として、化合物1(SCGF-1)を選択した。
（略号について）
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するIUPAC-IUB委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）の勧告［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）, 138巻, ９頁（1984 年）］に従った。
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ala: L-アラニン
Arg: L-アルギニン
Cys: L-システイン
Gln: L-グルタミン
Glu: L-グルタミン酸
Glx: L-グルタミン酸
Gly: グリシン
Leu: L-ロイシン
Trp: L-トリプトファン
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
tBu: ｔ-ブチル
Trt: トリチル
Boc: t-ブチルオキシカルボニル
Pmc: 2, 2, 5, 7, 8-ペンタメチルクロマン-6-スルフォニル
Fmoc-Arg(Pmc)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
-Ng-2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルフォニル-L-アルギニン
Fmoc-Gln(Trt)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nε-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Glu(OtBu)-OH: Nα−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-t-ブチルエステル
Fmoc-Trp(Boc)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nind-t-ブチルオキシカルボニル-L-トリプトファン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
PyBOP: ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt: N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMM: N-メチルモルホリン
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
TFA: トリフルオロ酢酸
【００９６】
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。
質量分析は、日本電子JMS-HX110Aを用いFAB-MS法により、もしくはブルカー社製質量分析装置REFLEXを用いMALDI-TOFMS法により行った。行った。アミノ酸分析は、コーエン（Cohen, S. A.）らの方法［アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry), 222, 19 (1994)］により行った。加水分解は塩酸蒸気中110℃で20時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Waters AccQ-Tag）アミノ酸分析計（Waters社製）を用い分析した。
【００９７】
(1)化合物１(SCGF-1)（配列番号４）（Ac-Arg-Glu-Trp-Glu-Gly-Gly-Trp
-Gly-Gly-Ala-Gln-Glu-Glu-Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Ala-Leu-Cys-OH）の合成
Fmoc-Cys(Trt)、14.1μmol が結合した担体樹脂（H-Cys(Trt)-2-ClTrt resin樹脂、ノバビオケム社製）30mgを自動合成機（島津製作所）の反応容器に入れ、600μLのDMFを加えて３分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
(a) 30%ピペリジン-DMF溶液900μLを加えて混合物を4分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう1回繰り返した。
(b) 担体樹脂を900μLのDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を5回繰り返した。
(c) Fmoc-Leu-OH (141μmol)、PyBOP (141μmol)、HOBt1水和物(141μmol)およびNMM(212μmol)をDMF (494μL)中で3分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を30分間攪拌し、溶液を排出した。
(d) 担体樹脂を900μLのDMFで1分間洗浄後溶液を排出し、これを5回繰り返した。
【００９８】
こうして、Fmoc-Leu-Cys(Trt) が担体上に合成された。
次に、(a) (b) の工程の後、(c) の工程で Fmoc-Ala-OH を用いて縮合反応を行い、(d) の洗浄工程を経て、Fmoc-Ala- Leu-Cys(Trt) が担体上に合成された。
以下、工程 (c) において、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH を順次用いて、(a)〜(d) を繰り返した後、(a) (b) の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下12時間乾燥して、N末端が無保護であり側鎖が保護されたペプチドの結合した担体樹脂を得た。次に得られた担体樹脂に対し次の (e)〜(g) の操作を行った。
(e) 担体樹脂を800μLのDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を3回繰り返した。
(f) 無水酢酸 (282μmol) 及びDMF(500μL) を樹脂に加えて混合物を2時間攪拌し、溶液を排出した。
(g) 担体樹脂を 800μLのDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を3回繰り返した。
【００９９】
この後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下 12 時間乾燥して、N末端がアセチル化された側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、5mg/mLの濃度で2-メチルインドールを含むTFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液 1mL を加えて室温で6時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10mL を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして44.6mgを取得した。この粗生成物全量をジチオスレイトールおよびDMFからなる混合溶液に溶解し、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA 水溶液に、TFA 0.1% を含む 90% アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物1を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物1を1.6mg 得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 2520.7 (M+H+)
アミノ酸分析; Glx 7.6 (8), Gly 4.0 (4), Arg 2.9 (3), Ala 2.2 (2), Leu 1.2 (1), Cys 1.7 (1)
【０１００】
（２）免疫原の調製
実施例１（１）で得られたヒトSCGF部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で以下の方法でKLH（カルビオケム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、KLHをPBSに溶解して10mg/mLに調整し、1/10 容量の25mg/mL MBS（ナカライテスク社製）を滴下して30分間撹拌反応させる。あらかじめPBSで平衡化したセファデックスG-25カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのMBSを除いて得られたKLH-MB 2.5mgを 0.1mol/Lリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に溶解したペプチド 1mg と混合し、室温で3時間、攪拌反応させた。反応後、PBSで透析した。
【０１０１】
（３）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１（２）で調製したペプチド-KLHコンジュゲート 100μg をアルミニウムゲル 2mg および百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製） 1×109 細胞とともに5週令雌ラット（SD）に投与し、２週間後より 100μg のコンジュゲートを１週間に１回、計4回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下の（４）に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH 7.65）で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
【０１０２】
（４）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には実施例１（１）で得られたヒトSCGF部分ペプチドをサイログロブリン（以下、THYと略す。）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例１（２）に記した通りであるが、架橋剤にはMBSの代わりにSMCC（シグマ社製）を用いた。96穴のEIA用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを10μg/mL, 50μL/穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1% BSA-PBSを100μL/穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。1% BSA-PBSを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を50μL/穴で分注し２時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を50μL/穴で加えて室温、１時間反応させ、tween-PBSで洗浄後ABTS基質液［2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させOD415nmの吸光度をプレートリーダー（E-max;Molecular Devices社製）にて測定した。
【０１０３】
（５）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3-U1を正常培地で培養し、細胞融合時に2×107以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
【０１０４】
（６）ハイブリドーマの作製
実施例１（３）で得られたラット脾細胞と（５）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,000（PEG-1,000）2g、ＭＥＭ培地2mL およびジメチルスルホキシド 0.7mLの混液 0.2〜1mL/108ラット脾細胞を加え、1〜2分間毎にＭＥＭ培地1〜2mLを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が50mLになるようにした。遠心分離（900rpm、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100mL中に懸濁した。
この懸濁液を96穴培養用プレートに100μL/穴ずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間、培養した。この培養上清を実施例１（４）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ヒトSCGF部分ペプチド（化合物１）に反応して、別のSCGF部分ペプチドである配列番号1の140〜156番目のアミノ酸配列からなるペプチドに反応しない穴を選び、さらにHT培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマKM2141、KM2142、KM2143、KM2144、KM2145を確立した。
【０１０５】
（７）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb/c ）に実施例１（６）で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜8mL/匹）し、遠心分離（3,000rpm、５分間）して固形分を除去した。モノクローナル抗体がIgMのときは、50％硫酸アンモニウムにて塩析し、塩化ナトリウム0.5Mを添加したPBSで透析後、セルロファインGSL2000（生化学工業社製）（ベットボリューム750mL）のカラムに流速15mL/時で通塔しIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。モノクローナル抗体がIgGのときは、カプリル酸沈殿法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い決定した（表１）。
【０１０６】
【表１】    
2003085399.tif 000026
【０１０７】
（８）ヒトSCGF部分ペプチドとの反応性（酵素免疫測定法）
実施例１（６）で選択された抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のヒトSCGF部分ペプチド（化合物１）との反応性を（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。コントロールペプチドとしては、化合物１とは異なるSCGF部分ペプチドである配列番号1の140〜156番目のアミノ酸配列からなるペプチドを用いた。第１図に示すように、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体(KM2141〜2145)は化合物１に特異的に反応し、コントロールペプチドには反応しなかった。
【０１０８】
実施例２．動物細胞を用いたヒトSCGFの発現と精製
【０１０９】
（１）ヒトSCGF発現用プラスミドpAGE-SCGFαの構築およびヒトSCGFの動物細胞での発現
動物細胞用発現ベクターpAGE210（WO96/34016）のHindIII／KpnI処理断片とSCGFタンパク質をコードするDNA［Mio et.al., BBRC 249, 124- 130 (1998)］とを連結することにより、ヒトSCGF発現ベクターpAGE-SCGFαを構築した。
動物細胞へのプラスミドの導入は宮地等の方法に従いエレクトロポレーション法［Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133-140 (1990)］により行った。4μgのpAGE-SCGF-aを4×106個のdhfr遺伝子欠損CHO細胞株［Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)］へ導入した。この細胞を10mLのMEMa2000-dFCS(5)培地［dFCSを5%、7.5% NaHCO3を1/40量、200mL グルタミン溶液（GIBCO/BRL社製）を3%、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO/BRL社製、5,000単位/mLペニシリンおよび5,000 mg/mLストレプトマイシン含有）を0.5%含むMEM a2000培地（GIBCO/BRL社製）］に懸濁し、10cmプレート（IWAKI社製）に入れ、37℃のCO2インキュベーター中で24時間培養した。ハイグロマイシン（GIBCO/BRL社製）を終濃度0.3 mg/mLになるよう添加し、さらに1〜2週間培養した。形質転換細胞がコンフルエントになった時点で回収し、ハイグロマイシンを0.3mg/mL、methotrexate（MTX）を50nmol/L含むMEMa2000-dFCS(5)培地に1〜2×106細胞/mLになるように懸濁し、F75フラスコ（Greiner社製）に2 mL分注した。１〜２週間の培養後、50nmol/L MTX耐性の細胞を0.3 mg/mLハイグロマイシン、200nmol/L MTX含有MEMa2000-dFCS(5)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、F75フラスコ（Greiner社製）に2mL分注した。1〜2週間の培養後、200nmol/L MTX耐性の細胞を得た。この200 nmol/L MTX耐性細胞を下記に示す培地１）および培地２）を用いて、2 Lのローラーボトル（Greiner社製）で37℃、80回転/分で培養を行った。
培地１） 無血清Ex-cell 301 培地（JRH Biosciences社製）
培地２） 10mg/Lのaprotinin（Sigma社製）を含む無血清 Ex-cell 301
培地
【０１１０】
約5日間の培養後、細胞を遠心分離し、培養上清サンプルを得た。
【０１１１】
（２）モノクローナル抗体KM2142を用いたウェスタンブロッティングによる培養上清中のSCGFタンパク質の存在確認
実施例１で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2142を用いたウェスタンブロッティングにより、前記（１）で得られた培養上清中のSCGFタンパク質の存在を、以下の方法により確認した。
後述（３）および（４）のSCGFタンパク質のクロマトグラフィーによる精製における各精製画分をSDS-PAGEで分離後、P. Matsudairaの方法［J.B.C. 262, 10035-10038 (1987)］に従ってPVDF膜（Immobilon Transfer Membranes、ミリポア社製）へ電気的に転写した。転写膜はブロッキング溶液［1% BSAを含むPBSバッファー(137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 9.6 mmol/L Na2HPO4/KH2PO4 (pH 7.2))］中で30分間振盪した後、ブロッキング溶液で1mg/mLに希釈した抗SCGFモノクローナル抗体を含む溶液中で室温60 分間振盪した。該転写膜はさらに0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの5分間洗浄を1回実施した後、パーオキシダーゼで標識された抗ラットIgG抗体（anti-rat immunoglobulin 1.3g/L, DAKO社製）をPBSで1/1,000に希釈した溶液中で室温60分間振盪した。0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの5分間洗浄を１回実施した後、発光法（ECL Western blotting detection reagents、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）により検出を行った。
【０１１２】
（３）CHO細胞培養上清からのヒトSCGFタンパク質の精製
実施例３に記載する抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製を行うために、上記（１）の培地１）の培養条件で得たCHO細胞培養上清から以下の２段階のクロマトグラフィーによって精製ヒトSCGFタンパク質を取得した。
第1段階：亜鉛キレートクロマトグラフィー
Zn2+イオンで飽和させたChelating Sepharose Fast Flow担体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を2.5 cm φ×20 cmのカラム（BioRad社製）に11 cmの高さまで充填し、0.5mol/L 塩化ナトリウムを含む20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 7.1）で平衡化した。これに上記（１）で得たCHO細胞培養上清2.4Lを添加し、同緩衝液で十分に洗浄後、0〜100 mmol/L ヒスチジン直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体KM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
第2段階：MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー
上記亜鉛キレートクロマトグラフィー粗精製画分に終濃度65%となるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌後、4℃で2時間放置した。18,800×gで30分間遠心分離して得られた沈澱を10mmol/L トリス塩酸緩衝液(pH 7.0)に溶解し、同トリス塩酸緩衝液で平衡化したMonoQ HR 5/5 カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に添加した。同緩衝液で十分洗浄後、0〜1 mol/L 塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体KM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した（第２図のレーン２）。
【０１０３】
（４）CHO培養上清からのヒトSCGFタンパク質の高純度精製
実施例６に記載するヒトSCGF定量系で用いるヒトSCGFタンパク質標準品は、上記（１）の培地２）の培養条件で得たCHO細胞培養上清から以下の３段階のクロマトグラフィーにより精製し、取得した。
第1段階：亜鉛キレートクロマトグラフィー
Zn2+イオンで飽和させたChelating Sepharose Fast Flow担体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を5.0cmφ x 20cmのカラム（BioRad社製）に14.5cmの高さまで充填し、0.5mol/L 塩化ナトリウムを含む20mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 7.1）で平衡化した。これに上記（１）で得たCHO細胞培養上清12Lを添加し、同緩衝液で十分に洗浄後、0〜100mmol/L ヒスチジン直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したKM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
第2段階：MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー
上記亜鉛キレートクロマトグラフィー粗精製画分に終濃度50%となるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌後、4℃で2時間放置した。18,800 gで30分間遠心分離して得られた沈澱を10mmol/L トリス塩酸緩衝液(pH 7.0)に溶解し、同トリス塩酸緩衝液で平衡化したMonoQ HR 10/10 カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に添加した。同緩衝液で十分洗浄後、0〜1 mol/L 塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したKM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
第3段階：S-400ゲルろ過クロマトグラフィー
Sephacryl S-400 HR担体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）をXK50/60カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に51.5cmの高さまで充填したカラムとXK50/100カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に93cmの高さまで充填したカラムを直列に連結し、PBSバッファーで十分平衡化した。これに上記MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー精製画分28mLを添加し、6mL/分の流速でPBSバッファーにより溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体KM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
【０１０４】
（５）ヒトSCGFタンパク質のN末端アミノ酸配列解析
実施例２（３）で得られた精製ヒトSCGFタンパク質のN末端アミノ酸配列はタンパク質化学の常法に従い決定した。精製ヒトSCGFタンパク質を含む画分をSDS-PAGE後、銀染色（第２図レーン２）あるいはP. Matsudairaの方法に従ってPVDF膜（ProBlott、アプライド バイオシステムズ社製）へ電気的に転写した。転写した膜はクマジーブルー染色し、見かけ上分子量が45kDa（第２図レーン２、バンドA）、41kDa（第２図レーン２、バンドB）、34kDa（第２図レーン２、バンドC）の各バンドを切り出し、気相プロテインシーケンサー（PPSQ-10、島津製作所）を用いてメーカー推奨の方法によりアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列は配列番号５、６、７に記載したように、配列番号１に記載したSCGFのアミノ酸配列のN末端から１アミノ酸残基目、２９アミノ酸残基目、６０アミノ酸残基目からのアミノ酸配列にそれぞれ一致した。以下、第２図レーン２に示した見かけ分子量約41kDaのN末端２８残基欠失SCGFタンパク質をΔ２８体、約34kDaのN末端５９残基欠失SCGFタンパク質をΔ５９体と称する。
【０１０５】
実施例３．CHO細胞発現ヒトSCGF蛋白質を用いた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製
【０１０６】
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例２（３）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質（SCGF、Δ28体、Δ59体のSCGF混合物）100μgをアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×109細胞とともに６週令雌マウス（Balb/c）に投与し、２週間後より100μgのヒトSCGF蛋白を１週間に１回、計３回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法（ただしアッセイ用の抗原にはCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質、コントロール抗原として１％BSA−PBSを用いた。）および以下に示すサンドイッチELISA法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
抗体産生細胞の調製は実施例１（３）と同様に行った。
【０１０７】
（２）サンドイッチELISA法
96穴のEIAプレート（グライナー社製）に実施例１で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2142を10μg/mL、50μL/穴で分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％BSA-PBSを100μL/穴で加え、室温1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1％BSA-PBSを捨て、CHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質を５μg/mLで１％BSA-PBS希釈したものを50μL/穴で分注し、室温２時間反応させた。対象として1%BSA-PBSを50μL/穴分注し、同様に反応させた。tween-PBSで洗浄後、上記（１）で得られた被免疫マウス抗血清の培養上清を50μL/穴で分注し、２時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン（ラット血清蛋白吸収ずみ；カルタグ社製）を50μL/穴で加えて室温で１時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させOD415nmの吸光度をプレートリーダー（Emax;Molecular Devices社製）にて測定した。
【０１０８】
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
実施例１（５）と同様に調製を行った。
【０１０９】
（４）ハイブリドーマの作製
実施例１（６）と同様に実施例３（１）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞との細胞融合を行った。
得られた細胞懸濁液を96穴培養用プレートに100μＬ/穴ずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間、培養した。この培養上清を実施例３（２）に記載したサンドイッチELISA法で調べ、ヒトSCGF蛋白質に反応してコントロールである1%BSA-PBSに反応しない穴を選び、さらにHT培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマKM2801、KM2802、KM2803およびKM2804を確立した。
【０１１０】
（５）モノクローナル抗体の精製
実施例１（７）と同様に実施例３（４）で得られたハイブリドーマ株をヌード雌マウスに腹腔内投与を行い、得られた腹水より精製モノクローナル抗体を取得した。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い、決定した。その結果を表２に示す。
【０１１１】
【表２】
2003085399.tif 000027
【０１１２】
（６）CHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質との反応性（酵素免疫測定法）
実施例３（４）で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のCHO細胞発現ヒトSCGF蛋白質との反応性を実施例１（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。第３図に示すように、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体（KM2801、KM2802、KM2803およびKM2804）はCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質に特異的に反応し、コントロールの１％BSA-PBSには反応しなかった。
実施例４．SDS変性ヒトSCGFタンパク質（CHO細胞発現）を用いた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製
実施例３記載の未変性ヒトSCGF蛋白質を免疫原に用いた場合には、Δ５９体に反応するモノクローナル抗体は得られなかった。そこで、△５９体に反応するモノクローナル抗体を作製するため、SDS変性SCGFを免疫原に用いてハイブリドーマの作製を試みた。
【０１１３】
（１）免疫原の調製
実施例２（３）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質をSDS（ラウリル硫酸ナトリウム；ナカライテスク社製）を加えて変性させたものを作製し、免疫原とした。すなわち５％SDS−PBSを調製し、CHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質に9分の１量加え、100℃で５分間煮沸したものをSDS変性ヒトSCGFタンパク質とした。
【０１１４】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例４（１）で得られたSDS変性ヒトSCGFタンパク質100μgをアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）1×109細胞とともに６週令雌マウス（Balb/c）に投与し、２週間後より100μgのSDS変性ヒトSCGFタンパク質を１週間に１回、計３回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法（ただしアッセイ用の抗原にはSDS変性ヒトSCGF蛋白質、コントロール抗原として１％BSA-PBSを用いた。）で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
【０１１５】
抗体産生細胞の調製は実施例１（３）に記載の方法と同様に行った。
【０１１６】
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
実施例１（５）に記載の方法と同様の調製を行った。
【０１１７】
（４）ハイブリドーマの作製
実施例１（６）と同様にして、実施例４（２）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞との細胞融合を行った。
得られた細胞懸濁液を96穴培養用プレートに100μL/穴ずつ分注し、5％CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間、培養した。この培養上清を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法で調べ、SDS変性ヒトSCGF蛋白に反応してコントロールである１％BSA-PBSに反応しない穴を選び、さらにHT培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマKM2941、KM2942、KM2943、KM2944およびKM2945を確立した。
【０１１８】
（５）モノクローナル抗体の精製
実施例１（７）と同様に実施例４（４）で得られたハイブリドーマ株をヌード雌マウスの腹腔内投与を行い、得られた腹水より精製モノクローナル抗体を取得した。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い、決定した。その結果を表３に示す。
【０１１９】
【表３】
2003085399.tif 000028
【０１２０】
（６）SDS変性ヒトSCGFタンパク質との反応性（酵素免疫測定法）
実施例４（４）で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のSDS変性ヒトSCGFタンパク質との反応性を実施例１（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。第４図に示すように、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体（KM2941、KM2942、KM2943、KM2944およびKM2945）はSDS変性ヒトSCGFタンパク質に特異的に反応し、コントロールの１％BSA-PBSには反応しなかった。
【０１２１】
実施例５．抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ヒトおよびマウスSCGFタンパク質に対する反応性
実施例１、３および４で作製された抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のヒトおよびマウスSCGFタンパク質に対する反応性を酵素免疫測定法（バインディングELISA）で検討した。マウスSCGFタンパク質は実施例２記載の方法に準じて作製した。
アッセイ用の抗原としてCHO細胞発現ヒトおよびマウスSCGFタンパク質を用い、実施例１（４）に記載の方法により行った。結果を第５図に示す。
抗SCGFモノクローナル抗体KM2142は配列番号１に示すSCGFのアミノ酸配列のＮ末端から6残基目から２５残基目までに相当する部分ペプチド（化合物１）を抗原に用いて作製されたハイブリドーマ由来の抗体である。抗SCGFモノクローナル抗体KM2142は、SCGFタンパク質に対する反応性をも有していることが示された。また、抗SCGFモノクローナル抗体KM2142はヒトおよびマウスSCGFタンパク質の両方に反応性を有していた。
抗SCGFモノクローナル抗体KM2804はCHO細胞発現ヒトSCGFを抗原に用いて作製したハイブリドーマ由来の抗体である。抗SCGFモノクローナル抗体KM2804はヒトSCGFにのみ反応し、マウスSCGFに対する交叉反応性は示さなかった。
抗SCGFモノクローナル抗体KM2945はSDS変性SCGFタンパク質（CHO細胞発現）を抗原に用いて作製したハイブリドーマ由来の抗体である。抗SCGFモノクローナル抗体KM2945は、未変性のSCGFタンパク質に対する反応性をも有していることが示された。また、抗SCGFモノクローナル抗体KM2945はマウスSCGFに対する交叉反応性は示さなかった。
【０１１２】
（２）ウェスタンブロッティング
実施例２（３）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質を用い、実施例３および４で作製された抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2804およびKM2945のウェスタンブロッティングにおける反応性を検討した。
実施例２（２）と同様にPVDF膜に転写したサンプルを、ブロッキング溶液中で室温30分間振盪後、ブロッキング溶液で1mg/mLに希釈した抗SCGFモノクローナル抗体で室温60分間振盪した。転写膜はさらに0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、PBSで1/1,000に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）溶液中で室温60分間振盪した。0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、上述のECL発光法により検出した。
第2図におけるレーン３、４、５はそれぞれKM2142、KM2804、KM2945を用いた精製ヒトSCGFタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す。KM2804はN末端５９残基欠失SCGFタンパク質であるΔ５９体には反応性を有していないが、全長SCGFおよびN末端２８残基欠失SCGFタンパク質であるΔ２８体には反応性を有していた。また、KM2945は全長SCGFおよび欠失体のいずれも反応性を有していた。
【０１１４】
実施例６．ヒトSCGF定量系
実施例１で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2142を以下の方法によりビオチン標識した。実施例１で得られたKM2142精製抗体をPBSで1mg/mLに希釈し、1/4容量の0.5mol/L炭酸バッファー（pH 9.2）を加えた。さらにバッファーと同量のNHS-Lc-Biotin（1mg/mLにジメチルホルムアミドにて溶解；ピアス社製）を攪拌下滴下した。３時間、室温で攪拌反応を行った後、PBSで一晩透析したものをビオチン標識KM2142として用いた。
96穴のEIA用プレート（グライナー社製）に、実施例３で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2804を5μg/mL、50μL/穴で分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1%BSA-PBSを100μL/穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、実施例２（４）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質を血清希釈液（協和メデックス社製）で17.5ng/mLから２倍希釈系列で14点希釈したものを50μＬ/穴で分注し室温で２時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、上記で得られたビオチン標識KM2142（0.2μg/mLにBSA-PBSにて希釈）を50μL/穴で加えて室温、２時間反応させ、tween-PBSで洗浄後、さらにアルカリフォスファターゼ標識アビジン（ザイメッド社製）を32,000倍希釈で50μL/穴で加えて室温、１時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、AmpliQ（DAKO社製）を用いて発色させOD490nmの吸光度をプレートリーダー（E-max；Molecular Devices社製）にて測定した。その結果、第６図に示すように、本定量系によりヒトSCGFタンパク質を0.04〜2.0ng/mLの範囲で定量することが可能であった。
【０１１５】
実施例７．白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の血清SCGF濃度
インフォームドコンセントを得た白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の血清中のSCGF濃度を実施例６の方法で測定した。また血球検査値が正常値を示す男女10名の健常人を対象例として同じく血清中のSCGF濃度を測定した。その結果を第７図に示す。
健常人の値の分布が正規分布を示すことを確認した後、この群より平均値とスタンダードデビエーション（ＳＤ）を計算し、平均値＋２ＳＤの値を正常と異常とを区別する基準値に設定した。この基準値をもとに、白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の値を正常・異常に分別し、白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患がSCGF測定値で検出可能か否かを確認した。その結果を表４に示す。
【０１１６】
【表４】
2003085399.tif 000029
【０１１６】
健常人群に比較し、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄異形成症候群（MDS）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫（MM）の患者の中央値は有意に高く、SCGF測定値がこれら疾患で有意に上昇していることが示された（第７図）。
【０１１７】
また健常人の値から定めたカットオフ値を用いて白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患を高い感度で検出できることが示された（表４）。一方、同じ血液疾患でありながら、再生不良性貧血（AA）患者の値は健常人との有意差が観察されず、またカットオフ値を用いてもこの疾患を検出出来なかった。
血液細胞数の異常を伴う疾患である非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫（MM）、骨髄異形成症候群（MDS）、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）を比較すると、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）などの白血病患者のＦ血液中SCGF濃度は、非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫(MM)、骨髄異形成症候群（MDS）などの他の前白血病や非白血病性悪性血液疾患患者の血液中SCGF濃度に比較して有意に高く、血液中SCGF濃度は白血病と前白血病や非白血病性悪性血液疾患との判別に利用可能であった。また、判別診断の難しいAA患者とMDS患者を比較してみると、MDS患者血中SCGF濃度はAA患者のそれと比較して有意に高く、両者を血中SCGF濃度で判別診断することが可能であった。
【０１１８】
実施例８．造血幹細胞移植後GVHD発症とSCGF濃度
インフォームドコンセントを得た白血病および前白血病患者で造血幹細胞移植を受けた23例の内、GVHDを発症した例15例、発症しなかった例8例の血清中SCGF濃度を実施例６の方法を用いて各ステージ毎に測定した。その結果を第８図に示す。
造血幹細胞移植を受けた患者のSCGF濃度はプレ−コンディショニング期やアプラスチック期に比べ、リカバリー期やステイブル期の方が有意に高値を示した。
造血幹細胞移植を受けた患者のうち、GVHDを発症した症例は発症しなかった例に比べ、アプラスチック期およびリカバリー期において有意に血清中SCGF濃度が高いので、血清中のSCGF濃度を測定することによって、GVHD発症を判定可能であった。
さらにカットオフ値を定めてGVHD発症例と非発症例とを判定できないかを検討した。その結果を第９図に示す。プレ−コンディショニング期においては、カットオフ値を例えば5ng/mLに定めることにより感度87%、特異度57%で、アプラスチック期においてはカットオフ値を10ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、リカバリー期ではカットオフ値を15ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、それぞれSCGF濃度を測定し、これを診断に用いなかった時に比べて有意(p<0.05)にGVHD発症例と非発症例とを判別GVHD可能であった。
【０１１９】
実施例９．移植造血幹細胞の生着と血清SCGF濃度
インフォームドコンセントを得た血液疾患患者で造血幹細胞移植を受けた23例のうち、生着が遅延した例4例、遅延しなかった例19例の血清中SCGF濃度を実施例６の方法を用いて各ステージ毎に測定した。結果を第１０図に示す。
生着非遅延例では、リカバリー期およびステイブル期のSCGF濃度は、プレ−コンディショニング期に比して有意に上昇した。一方、生着遅延例では、これらの期においても有意な上昇は観察されなかった。
そこで、造血幹細胞移植患者のSCGF濃度を測定し、そのカットオフ値を定めてその値と個々患者の値比較から造血幹細胞生着遅延例と非遅延例を判定できないかを検討した。その結果を第１１図に示す。プレ−コンディショニング期においては、カットオフ値を例えば9.5ng/mLに定めることにより感度75%、特異度67%で、アプラスチック期においてはカットオフ値を12ng/mLに定めることで感度75%、特異度63%で、造血幹細胞生着遅延例と非遅延例とを判別することが可能であった。
【０１２０】
実施例１０．白血病患者の末梢血細胞におけるSCGFの発現
インフォームドコンセントを得た種々の白血病患者の末梢血細胞をRneasy Mini Kit (Qiagen社製)を用い、プロトコールにしたがって全RNAを抽出し、全RNA1μｇをDNaseI (GIBCO社製)処理し、SuperScript First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR (GIBCO社製)を用いて逆転写し、First-Strand DNAを調製した。Taq Polymerase (TaKaRa社製)を用い、調製したFirst-Strand DNAを鋳型とし、配列番号８および９ならびに配列番号１０および１１の塩基配列を有するオリゴDNAをプライマーとして、それぞれ、ヒトG3PDH、SCGF遺伝子の検出を検討したところ、G3PDHの検出量がほぼ同等となる条件下で、健常人1人では、SCGFの発現を検出できなかったが、急性リンパ性白血病（ALL）2例中1例、急性骨髄性白血病（AML）2例中2例でSCGFの発現が検出された。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、SCGFに反応する抗体を用いた、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法、造血幹細胞移植後の造血幹細胞生着遅延および移植片対宿主反応病を判定する方法、およびそれらの診断薬ならびに診断キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
第１図は、モノクローナル抗体のヒトSCGF部分ペプチド（化合物１）に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第２図は、精製ヒトSCGFタンパク質のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング結果を示す。レーン１および２は分子量マーカーと精製ヒトSCGFタンパク質のSDS-PAGEパターンを示す。レーン３、４、５はそれぞれKM2142、KM2804、KM2945を用いた精製ヒトSCGFタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す図である。
1:分子量マーカーのレーン
2:精製SCGFを解析し、銀染色したレーン
3:抗SCGF抗体KM2142を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
4:抗SCGF抗体KM2804を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
5:抗SCGF抗体KM2945を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
A:SCGFタンパク質の分子量を示す。
B:N末端28残基欠失SCGFタンパク質Δ28体の分子量を示す。
C:N末端59残基欠失SCGFタンパク質Δ59体の分子量を示す。
第３図は、モノクローナル抗体の、ＣＨＯ細胞発現ヒトSCGF蛋白に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第４図は、モノクローナル抗体の、ＳＤＳ変性ヒトSCGF蛋白（ＣＨＯ細胞発現）に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第５図は、モノクローナル抗体の、ヒトおよびマウスSCGF蛋白（ＣＨＯ細胞発現）に対する反応性を示す。（バインディングＥＬＩＳＡ）
第６図は、モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトSCGF蛋白の定量曲線を示す図である。
第７図は、各種血液疾患患者血清中SCGF濃度を示す。横実線は各種血液疾患群の中央値を、横点線は健常人群から求めたカットオフ値(18.2ng/mL)を示す図である。
＊：Normal（健常人群）あるいはAA（再生不良性貧血群）との有意差  p<0.05、
＃：NHL（非ホジキンリンパ腫）との有意差  P<0.05、＄：MM（多発性骨髄腫）との有意差  p<0.05
第８図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度によるGVHD発症および非発症の差を示す図である。横実線は各群の中央値を示す。
＊：GVHD非発症例との有意差  p<0.05、
＃：プレ−コンディショニング期との有意差  p<0.05、
＄：アプラスチック期との有意差  p<0.05、
＆：リカバリー期との有意差  p<0.05
第９図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度とGVHD発症患者の検出感度、非発症患者の特異度との関係を示す図である。●：感度、○：特異度、縦点線は仮のカットオフ値を示す。
第１０図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度による生着遅延および非遅延の差を示す図である。横実線は各群の中央値を示す。
＃：プレ−コンディショニング期との有意差  p<0.05、
＄：アプラスチック期との有意差  p<0.05、
＆：リカバリー期との有意差  p<0.05
第１１図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度と造血幹細胞生着遅延例の検出感度、非遅延例の特異度との関係を示す図である。●：感度、○：特異度、縦点線は仮のカットオフ値を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月20日(2005.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判別する方法、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の状態を判定する方法、または移植片対宿主反応病を判定する方法に関する。また、造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態または移植片対宿主反応病の診断薬および診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患の診断、または白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患の治療後の診断は、白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患を治療するための方針を決定するのに重要である。
【０００３】
白血病の初発の診断としては、患者の末梢血中の白血球数を測定し、計測値が正常値を上回る場合に白血病の発生を疑う方法があげられる。しかしながら、風邪などの白血病以外の疾患であっても、体内の免疫反応の亢進により白血球数は増大するので、白血球数の測定だけでは、擬陽性の可能性がある。また、末梢血中の白血球数の正常値は、4,000〜8,000個/μLと幅が広く、擬陰性の可能性がある。そこで、より確度の高い白血病の診断方法が求められている。
【０００４】
白血病再発の診断方法としては、WT-1遺伝子のRT-PCRによる検出がある［臨床病理48,155(2000)、Blood, 84, 3071 (1994)、日本特許第３１２２７７１号］。しかしながら、該診断方法は操作が煩雑であるとともに、特殊な装置を必要としている。
【０００５】
また、上述の白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患、先天性代謝疾患、固形癌等の治療方法の一つとして、造血幹細胞移植療法があげられる。造血幹細胞移植療法の問題点としては、提供者の造血幹細胞と患者の造血幹細胞とのＨＬＡタイプの不適合、患者側の体調や感染症等などにより、移植した造血幹細胞が生着しない、造血幹細胞の生着が遅延する、移植片対宿主反応病（以下、GVHDと称する）を発症するなど、造血幹細胞移植治療の効果が十分に得られないことがあげられ、最悪の場合、死の転帰をとることもある。
【０００６】
造血幹細胞の生着遅延に対しては、G-CSFを生体内に投与することにより、造血幹細胞の生着を促進させることができる。また、GVHDに対しては、免疫抑制剤を生体内に投与することにより、提供された造血幹細胞の拒絶反応を抑制させることができる。しかしながら、いずれの薬剤も過剰に投与した場合には、副作用が懸念される。そのため、造血幹細胞の生着状態、GVHD発症を診断あるいは予知することは治療方針の決定に重要である。
【０００７】
造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着を確認する方法としては、末梢血中の白血球数や血小板数を測定し、それらの測定値が上昇すれば造血幹細胞が生着したことを診断することができる。しかしながら、造血幹細胞の生着は、移植後10日から1ヶ月以上を要する事もあるため、末梢血中の白血球数や血小板数を測定することでは早期に造血幹細胞の生着を判断することができない。
【０００８】
GVHD発症の判定方法としては、造血幹細胞移植後のリカバリー期に現れる皮膚の発疹等を観察することがあげられる。しかしながら、簡便で確度の高いGVHD発症の判定方法は知られていない。さらにGVHD発症以前にGVHDの発症を予知する方法は知られていない。
【０００９】
ヒト造血幹細胞増殖因子（Stem Cell Growth Factor；以下、SCGFと略記する）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質である［WO98/08869、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)、Biochem. Biophys. Res. Comm., 249, 124 (1998)］。
【００１０】
SCGFを認識する抗体としては、遺伝子組換え法により得られたSCGF、ならびにSCGFのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体および細胞培養上清から部分精製されたSCGFや遺伝子組換え法により得られたSCGFを免疫原として調製したモノクローナル抗体が知られている［WO98/08869］。該モノクローナル抗体が中和活性を有すること、また遺伝子組換え法により得られたSCGFを免疫原として調製したポリクローナル抗体がELISAで遺伝子組換え法により得られたSCGFと反応すること、SCGFのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより遺伝子組換え法により得られたSCGFを検出できることが報告されている。
【００１１】
また、SCGFのＮ末端から６残基目から２５残基目までの部分ペプチドを免疫原とした抗SCGFモノクローナル抗体KM2142が報告されている［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］。
【００１２】
ヒト正常組織に対してノーザンブロッティングを行った結果、SCGF遺伝子の発現は腎臓に多く、心臓に少なく、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、膵臓では発現が見られないこと［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)］、脾臓、胸腺、盲腸、骨髄、胎児肝に多く、末梢血に少ないこと［Biochem. Biophys. Res. Comm., 249, 124 (1998)］が知られている。また、正常新生児マウスにインサイテュハイブリダイゼーションを行った結果、骨髄、増殖軟骨、骨膜付近にSCGFが発現していることが報告されている［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］。
【００１３】
さらに、骨髄細胞株(HT60、KPB-M15)、単核球細胞株(THP-1、U-937)、赤芽球細胞株(HEL)、繊維芽細胞株(NHF)でSCGF遺伝子の発現が見られるが、B細胞株(U266B1、IM-9)、T細胞株(MOLT-4)、赤芽球細胞株(K562)、上皮系癌細胞株(HeLaS3、A431)、メラノーマ細胞株(Bowes)、アデノウイルス形質転換胎生腎臓細胞株(293)、繊維芽細胞株(CCD-8Lu)では、SCGF遺伝子の発現が見られないことが報告されている［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)］。
【００１４】
しかし、正常及び血液疾患の、或いは造血幹細胞移植を受けたヒトを含む動物の末梢血、骨髄中の血球細胞でのSCGFのmRNA量の差異に関する報告は無い。
組織や細胞のmRNAとコードされるタンパク質の量との相関は低く（相関係数＝0.48）［Electrophoresis, 18, 533 (1997)］、SCGFのmRNA量からSCGF蛋白質量を推定する事も困難である。
【００１５】
以上のように、ヒトを含む動物の血清、血漿などの体液および組織中のSCGF蛋白質の存在、機能、疾患との関係については明らかにされていない。
【００１６】
本発明の目的は、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の判定、白血病と前白血病または非白血病性悪性血液疾患との判別、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群との判別、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態およびGVHDを判定する方法、および白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態およびGVHDの診断薬ならびに診断キットを提供することにある。
【発明の開示】
【００１７】
本発明は以下（１）〜（２０）に関する。
（１）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法。
（２）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法。
（３）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、再生不良性貧血と骨髄異形成症候群とを判別する方法。
（４）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を測定することを特徴とする、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の状態を判定する方法。
（５）  生体試料中の造血幹細胞増殖因子（SCGF）を定量することを特徴とする、移植片対宿主反応病を判定する方法。
（６）  判定または判別する方法が、免疫学的測定方法である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  免疫学的測定方法が、サンドイッチ法である、上記（６）項に記載の方法。
（８）  サンドイッチ法が、造血幹細胞増殖因子（SCGF）の異なるエピトープに反応する２種類の抗体を用いることを特徴とする、上記（７）記載の方法。
（９）  抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である上記（８）記載の方法。
（１０）  モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、上記（９）記載の方法。
（１１）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬。
（１２）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態の診断薬。
（１３）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を有効成分として含有してなる移植片対宿主反応病の診断薬。
（１４）  抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から選ばれる抗体である上記（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の診断薬。
（１５）  モノクローナル抗体が、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、上記（１４）記載の診断薬。
（１６）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）に反応する抗体を含む、白血病、前白血病あるいは非白血病性悪性血液疾患、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着状態または移植片対宿主反応病の診断用キット。
（１７）  造血幹細胞増殖因子（SCGF）を含む、上記（１６）記載の診断用キット。
（１８）  配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
（１９）  配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体。
（２０）  上記（１８）または（１９）項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法に関する。
【００１９】
白血病としては、造血系細胞のうち造血細胞などの未熟な細胞が腫瘍化されたものであればいかなるものも包含するが、急性リンパ性白血病（以下、ALLと称する）、急性骨髄性白血病（以下、AMLと称する）、慢性骨髄性白血病（以下、CMLと称する）などがあげられる。
【００２０】
前白血病としては、造血系細胞のうちリンパ球などの成熟な細胞が腫瘍化されたものであればいかなるものも包含されるが、骨髄異形性症候群（以下、MDSと称する）などがあげられる。
【００２１】
非白血病性悪性血液疾患としてリンパ腫や骨髄腫などがあげられる。
リンパ腫としては、ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫（以下、NHLと称する）などがあげられる。
【００２２】
骨髄腫としては、多発性骨髄腫（以下、MMと称する）などがあげられる。
白血病、前白血病および非白血病性悪性血液疾患患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度は、健常人の生体試料中に含まれるSCGF濃度に比べて有意に上昇している。したがって、SCGF濃度にカットオフ値を設けて、採取した生体試料中のSCGFを定量し、SCGF濃度がカットオフ値より高い場合に白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患であると判定することができる。
【００２３】
カットオフ値とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性、カットオフ値以上であれば陽性として、またはカットオフ値以下であれば陽性、カットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる（金井正光編、臨床検査法提要 金原出版株式会社）。
【００２４】
カットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度があげられる。
【００２５】
ある母集団をカットオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものをａ（真陽性）、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものをｂ（偽陰性）、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものをｃ（偽陽性）、疾病患者でなく判定で陰性とされたものをｄ（真陰性）と表したときに、ａ／（ａ＋ｂ）で表される値を感度（真陽性率）、ｄ／（ｃ＋ｄ）で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。
【００２６】
目的とする疾患群と非疾患群との測定値の分布は通常、一部重複する。したがって、カットオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カットオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が５０％を超えない判定方法は、有用とは認められない。
【００２７】
カットオフ値を設定する方法としては、非疾患群の分布の９５％を含む、中央からの両端のいずれかの値をカットオフ値として設定する方法、非疾患群の分布が正規分布を示す場合、平均値＋２倍の標準偏差（ＳＤ）または平均値−２ＳＤをカットオフ値として設定する方法などがあげられる。
【００２８】
白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患であるか否かを判定する場合、カットオフ値を15.0ng/mLに設定した場合には、感度89.5%、特異度70%で判定することができ、カットオフ値を13.0ng/mLに設定した場合には、感度100%、特異度60%で判定することができる。健常人のSCGF濃度よりカットオフ値を平均値＋２ＳＤの18.2ng/mLに設定すると、感度89.5%、特異度100%で判定することができる。また、このカットオフ値で白血病であるか否かを感度95％、特異度100%で、非白血病性悪性血液疾患であるか否かを感度76.9%、特異度100%、さらに前白血病であるか否かを感度100%、特異度100%で判定することができる。
【００２９】
生体試料としては、血液、尿、髄液、穿刺液などいかなるものでもよいが、好ましくは血液があげられる。血液としては、全血、血漿、血清、血球溶血液、血球内液などがあげられるが、好ましくは血清または血漿があげられる。
【００３０】
本発明は、白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する方法に関する。
【００３１】
白血病患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度は、前白血病または非白血病性悪性血液患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度に比べて有意に上昇している。したがって、上述の方法で白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患と判定されたのち、さらに白血病と判定されるカットオフ値を設けて、採取した生体試料中のSCGF濃度がそのカットオフ値よりも高い場合には、白血病、低い場合は前白血病または非白血病性悪性血液疾患であると判断することができる。
【００３２】
白血病と、前白血病または非白血病性悪性血液疾患とを判別する場合、カットオフ値を23.8ng/mLに設定した場合には、感度85%、特異度69.2%で判別することができる。また、カットオフ値を非白血病性悪性血液疾患患者の平均値＋２ＳＤから32.8ng/mLに設定した場合には、感度80%、特異度100%で判別することができる。
【００３３】
本発明は、再生不良性貧血と骨髄異形性症候群とを判別する方法に関する。
再生不良性貧血と骨髄異形性症候群は、骨髄および末梢血において白血球の数や形態に異常が生じるのを特徴とする病態で、二つの疾患の判別は難しいとされてきた。
【００３４】
骨髄異形性症候群患者のSCGF濃度は健常人の血液中に含まれるSCGF濃度に比べ有意に上昇しているが、再生不良性貧血患者の血液中SCGF濃度は健常人と変わらない。骨髄異形性症候群患者の血中SCGF濃度は再生不良性貧血患者の血中SCGF濃度より有意に高く、両者の血中SCGF濃度を測定することで、再生不良性貧血か骨髄異形成症候群かと判別することができる。
【００３５】
そこで、白血球の異常が見られる患者のうち、再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者を判別する場合、再生不良性貧血患者のSCGF濃度よりカットオフ値（平均値＋2SD=16.6ng/mL）を設定し、該カットオフ値によって判断すると、感度100%、特異度100%で再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者とを判別することができる。さらに基準値を15.6ng/mL〜18.6ng/mLに設定すれば、感度100%、特異度100%で再生不良性貧血患者と骨髄異形性症候群患者とを判別することができる。
【００３６】
また、本発明は、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着の遅延を判定する方法に関する。
【００３７】
造血幹細胞移植としては、造血幹細胞を移植する方法であればいかなるものでもよいが、骨髄移植、臍帯血移植、末梢血幹細胞移植等があげられる。
【００３８】
造血幹細胞移植から造血幹細胞の生着までの期間は、患者の末梢血の血球数を基準として以下にあげる４つの時期に分類される。すなわち、移植前で、抗癌剤などを大量投与した状態にあるプレ−コンディショニング期、移植を行った後に血球数が減少した状態にあるアプラスチック期、移植後に血球数が回復した状態にあるリカバリー期、および移植後に造血幹細胞が生着するステイブル期である。
【００３９】
造血幹細胞移植を行った患者のプレ−コンディショニング期およびアプラスチック期での生体試料中に含まれるSCGF濃度は、造血幹細胞の生着が遅延する患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度のほうが造血幹細胞の生着が遅延しない患者の生体試料中に含まれるSCGF濃度に比べて高い。したがって、それぞれの時期のSCGF濃度を測定し、造血幹細胞の生着が遅延するおそれがあると判断されるSCGF濃度をカットオフ値として定め、SCGF濃度がカットオフ値より低い値の場合には生着の遅延は見られず、SCGF濃度がカットオフ値より高い値の場合には生着の遅延が起こると判定することができる。
【００４０】
造血幹細胞の生着遅延を判定するには、プレ−コンディショニング期の場合は、例えばカットオフ値を9.5ng/mLに定めることにより感度75%、特異度67%で、アプラスチック期の場合は、カットオフ値を12ng/mLに定めることにより感度75%、特異度63%で判定することができる。
【００４１】
さらに、本発明はGVHDの発症を判定する方法に関する。
【００４２】
造血幹細胞移植を行った患者のアプラスチック期およびリカバリー期での生体試料中に含まれるSCGF濃度は、GVHDを発症する患者のほうが、GVHDを発症しない患者に比べて高い。したがって、それぞれの時期のSCGF濃度を測定し、それぞれの時期でGVHDを発症するおそれがあると判定されるカットオフ値を定め、SCGF濃度がカットオフ値より低い値の場合にはGVHDが発症するおそれはないが、SCGF濃度がカットオフ値より高い値の場合にはGVHDが発症するおそれがあると判断することができる。
【００４３】
造血幹細胞移植後のGVHDの発症を判定するには、プレ−コンディショニング期においては、カットオフ値を例えば5ng/mLに定めることにより感度87%、特異度57%で、アプラスチック期においてはカットオフ値を例えば10ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、リカバリー期ではカットオフ値を例えば15ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、GVHD発症患者と非発症患者とを判定することができる。
【００４４】
生体試料中の造血幹細胞増殖因子（以下、SCGFと称す）を測定する方法としては、免疫学的測定法、分子生物学的測定法などいかなる方法でもよいが、好ましくは免疫学的測定法があげられる。
【００４５】
免疫学的測定法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法など抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
【００４６】
分子生物学的測定法としては、RT-PCR法、ノーザンブロッティング法、in situハイブリダイゼーション法等があげられる。
【００４７】
イムノアッセイ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫検出法（RIA）、酵素免疫検出法（EIAまたはELISA）、蛍光免疫検出法（FIA）、発光免疫検出法（luminescent immunoassay）、物理化学的検出法（TIA，LAPIA，PCIA）、フローサイトメトリーなどがあげられるが、好ましくは酵素免疫検出法があげられる。
【００４８】
放射免疫検出法で用いる放射性標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の放射性同位元素を用いることができる。例えば、32P、125I、131I等を用いることができる。
【００４９】
酵素免疫検出法で用いる酵素標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等を用いることができる。
【００５０】
さらに酵素免疫測定法は酵素の作用により生成した物質を測定することにより、測定・検出を行うが、紫外部または可視部に吸収極大を有する物質の吸光度を測定する方法、生成した蛍光物質の蛍光強度を測定する方法、生成した物質の発光強度を測定する方法など多様な測定方法をとることが出来る。例えば酵素標識体としてアルカリフォスファターゼを用いる場合は、アルカリホスファターゼ作用により紫外部または可視部に吸収極大を有する物質を生成するようなアルカリ性ホスファターゼの基質としては、例えば４−ニトロフェニルリン酸等が挙げられる。４−ニトロフェニルリン酸はアルカリホスファターゼにより４−ニトロフェノールに変換される。アルカリホスファターゼ作用により発光を生成するようなアルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシン）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）等が挙げられる。また、アルカリホスファターゼの作用により色素を生成する試薬として、アルカリホスファターゼの基質であるＮＡＤＰＨを含有する酵素サイクリング反応試薬ＡｍｐｌｉＱ（ダコ社製）が挙げられる。
【００５１】
発光免疫検出法で用いる発光標識体としては、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店； 臨床検査42(1998)］の発光体を用いることができる。例えば、アクリジニウムエステル、ロフィン等を用いることができる。
蛍光免疫検出法で用いる蛍光標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社製）の蛍光を用いることができる。例えば、FITC、RITC等を用いることができる。
【００５２】
イムノアッセイ法における測定方法としては、競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド 第５版（南光堂）］等があげられるが、好ましくはサンドイッチ法があげられる。
【００５３】
サンドイッチ法は、抗原抗体反応で結合した試料中の目的物質と第一の抗体に、第二の抗体（二次抗体）を同時に、または別々に反応させ、試料中の目的物質を同一または別々の抗体で検出または定量する方法である。多くの場合、測定操作中に試料中の非反応のサンプル成分や測定系成分を洗浄する工程を含む。例えば、固相に第一の抗体（一次抗体）を固定した後、測定したい試料を第一の抗体と接触させる。試料中の非反応のサンプル成分を洗浄し、反応系から除去した後、抗原抗体反応で結合した試料中の目的物質と第一の抗体の複合体に、第二の抗体（二次抗体）を反応させ、測定系中の反応に関与しなかった第二次抗体などの成分を洗浄除去した後、反応系に存在する試料中の目的物質を検出または定量する方法である。
【００５４】
サンドイッチ法に用いる固相としては、ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレート、ポリスチレン製マイクロタイタープレート等があげられる。
【００５５】
サンドイッチ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Fab、Fab'、F(ab)2などの抗体フラグメントを用いてもよい。
【００５６】
サンドイッチ法で用いる一次抗体と二次抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識する抗体の組み合わせであればいかなるものでもよいが、少なくとも１つがモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００５７】
本発明のサンドイッチ法で用いられるモノクローナル抗体としては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体などがあげられる。
【００５８】
配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2142［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］が生産するモノクローナル抗体KM2142があげられる。配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2804が生産するモノクローナル抗体KM2804があげられる。配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2945が生産するモノクローナル抗体KM2945があげられる。
【００５９】
モノクローナル抗体KM2142を生産するハイブリドーマKM2142、モノクローナル抗体KM2804を生産するハイブリドーマKM2804、モノクローナル抗体KM2945を生産するハイブリドーマKM2945は、平成１４年２月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にFERM BP-7922、FERM BP-7923およびFERM BP-7924としてそれぞれ寄託されている。
【００６０】
上述のモノクローナル抗体はSCGFを認識する部位がそれぞれ異なるので、これらのモノクローナル抗体を組み合わせてサンドイッチ法を行うことができる。好ましいモノクローナル抗体の組み合わせとしては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、具体的にはハイブリドーマKM2142［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］が生産するモノクローナル抗体KM2142と、配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、具体的にはハイブリドーマKM2804(FERM BP-7923)が生産するモノクローナル抗体KM2804との組み合わせがあげられる。
【００６１】
本発明のサンドイッチ法によるSCGFを検出または定量する方法の具体例を以下に示す。
【００６２】
まず、適当な固定担体の表面に上述の抗SCGF抗体（一次抗体）を吸着固定する。一次抗体の固定は、例えば、当該抗体を適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等に希釈した後、これを固定担体の表面に接触させ、そして4〜37℃にて30分間以上反応させることなどにより行うことができる。
【００６３】
次に、固定担体表面の蛋白質結合能をブロックする。例えば、固定担体表面上の遊離結合基をブロッキング緩衝液と接触させる。
【００６４】
ブロッキング緩衝液としては、例えば1〜10%のウシ血清アルブミン、10〜30%ブロックエース（雪印乳業社製）を含有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等があげられる。
【００６５】
ブロッキング処理は、4〜37℃にて30分間以上反応させることにより行うことができる。
【００６６】
次に、一次抗体を生体試料と接触させる。生体試料は必要に応じて、例えば0.01〜1%のウシ血清アルブミンなどの蛋白質を含有する緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等で希釈してもよい。
【００６７】
一次抗体と生体試料との接触は、4〜37℃にて30分間以上反応させることにより行うことができる。
【００６８】
接触させた後、必要に応じてTween20等の界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いて数回洗浄する。
【００６９】
このとき、生体試料中に存在するSCGFが、あらかじめ固定されている抗SCGF抗体と特異的に結合することにより、抗SCGF抗体を介して固定担体に固定される。
【００７０】
次に、SCGFが固定された前記担体を、二次抗体を含有する溶液と接触させる。
【００７１】
二次抗体としては、一次抗体とエピトープの異なる抗SCGF抗体であればいかなるものでもよい。また、二次抗体は必要に応じて、前述の標識体で予め標識しておくことができる。
【００７２】
未吸着の二次抗体を除去するには、必要に応じてTween20等の界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いて担体を数回洗浄する。これにより該二次抗体は、あらかじめ結合されている一次抗体及びSCGFを介して、固定担体に結合し、二次抗体の結合量が生体試料中のSCGFの量を反映することになる。
【００７３】
上記のようにして固定された二次抗体は、二次抗体の標識体に応じて測定することができる。また、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、該三次抗体を種々の方法により標識しておき、三次抗体の標識を検出または測定することもできる。
【００７４】
上記のようにして、結合された二次抗体の量を測定し、標準物質を用いて検量線を作成し、生体試料中のSCGFの量を測定することができる。
【００７５】
検量線は、標準物質として濃度が既知であるヒトSCGF蛋白質を含む溶液を数点段階希釈したものを準備し、生体試料とともに上述のサンドイッチ法を行うことにより得られる。
【００７６】
本発明の白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患の診断薬、造血幹細胞移植後の造血幹細胞の生着遅延の診断薬、およびGVHD発症の診断薬に含有されるSCGFに対する抗体としては、SCGFに反応する抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントなどいかなるものでもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が用いられる。
【００７７】
モノクローナル抗体としては、配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体、配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体があげられる。
【００７８】
配列番号１の６〜２８番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2142(FERM BP-7922)が生産するモノクローナル抗体KM2142があげられる。配列番号１の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2804(FERM BP-7923)が生産するモノクローナル抗体KM2804があげられる。配列番号１の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2945(FERM BP-7924)が生産するモノクローナル抗体KM2945があげられる。
【００７９】
本発明のキットとしては、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
【００８０】
試薬としてはSCGFに反応する抗体を含み、また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、SCGFなどの標準物質なども含まれる。
【００８１】
生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにＢＳＡやカゼインなどのタンパク質を含む水溶液などがあげられる。
【００８２】
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、本発明の抗体または抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用等公知の方法により調製することができる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体等を疎水固相化したものがあげられる。
【００８３】
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等があげられる。
【００８４】
洗浄液としては、リン酸やトリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）、ＨＥＰＥＳやＭＯＰＳなどのグッドバッファー類などの緩衝剤などに、ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン６０、ツイーン８０、トリトンＴＭ Ｘ−７０５などの界面活性剤、ＮａＣｌ、ＫＣｌや硫酸アンモニウムなどの塩、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、塩酸グアニジン、尿素やソディウムドデシルサルフェートなどの変性剤、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸などの安定化剤の少なくとも１種類を含む液があげられる。具体的には、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツィーン２０およびｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液からなるツイーンＰＢＳ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツィーン２０およびｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなるツイーンＴＢＳなどがあげられる。
【００８５】
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、本発明の抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどのタンパク質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
【００８６】
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリフォスファターゼであれば、４−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
【００８７】
標準物質としては、WO98/08869に記載の方法により調製できるSCGF、キットに用いられる２種類の抗体のエピトープを含有するペプチドなどがあげられる。
【００８８】
本発明は、また、配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体および配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体に関する。
【００８９】
配列番号１記載の２９〜５９番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2804(FERM BP-7923)が生産するモノクローナル抗体KM2804があげられる。配列番号１記載の６０〜３０２番目のアミノ酸配列で示された領域を認識するモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM2945（FERM BP-7924）が生産するモノクローナル抗体KM2945があげられる。
【００９０】
本発明に用いられるモノクローナル抗体の製造方法としては、公知のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができる。
以下に、本発明に用いるモノクローナル抗体の製造方法を詳細に説明する。
（１）抗原の調製
抗原としては、ヒトSCGFをコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して得られたヒトSCGF蛋白質、ペプチド合成により得られたヒトSCGF部分配列を有する合成ペプチドなどがあげられる。
抗原用部分ペプチドとしては、5〜30残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。KyteとDoolittleの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 157, 105-132 (1982)］などにより、親水性の高い部分配列を予測することで、立体構造上蛋白質表面に存在する部分を推測することができる。即ち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のN末端、C末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。さらに、蛋白質の二次構造情報も参考にできる。Chou-Fasmanの方法［アドバンセズ・イン・エンザイモロジー (Advances in Enzymology), 47, 45-147 (1978)］などによりアミノ酸配列から予測した蛋白質二次構造において、ターン構造やランダムコイル構造を有する部分が抗原用ペプチドとして適していると考えることができる。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには、蛋白質と架橋するためにシステインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのN末端はアセチル化、C末端はアミド化する。
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる［インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ(International Journal of Peptide Protein Research), 35, 161-214 (1990)、「ソリッド−フェーズ・ペプタイド・シンセシス(Solid-Phase Peptide Synthesis)」, メソッズ・イン・エンザイモロジー 第289巻(Methods in Enzymology, vol. 289) ,グレッグ・B・フィールズ(Gregg B. Fields)編,アカデミック・プレス(Academic Press), (1997)、「ペプタイド・シンセシス・プロトコール(Peptide Synthesis Protocols)」, メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー 第35巻(Methods in Molecular Biology, vol. 35) ,マイケル・W・ペニントン(Michael W. Pennington) ,ベン・M・ダン(Ben M. Dunn) 編,ヒューマナ・プレス(Humana Press), (1994)］。
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Advanced ChemTech Inc., USA、以後 ACT社と略称する）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護した Nα-Fmoc-アミノ酸あるいは Nα-Boc-アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ABI 社、島津製作所、国産化学（株）、ノバビオケム社（NovaBiochem）、渡辺化学（株）、ACT 社、アナスペック社（AnaSpec Inc.）、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。
【００９１】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに（1）で調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（complete freund's adjuvant）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど］とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として提供する。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH 7.65)で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
【００９２】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18:1-7 (1978)］、P3-NS1/1-Ag41（NS-1）［European J. Immunology, 6: 511-519 (1976)］、SP2/O-Ag14(SP-2)［Nature,276: 269-270 (1978)］、P3-X63-Ag8653(653)［J.Immunology, 123:1548-1550 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)［Nature, 256:495-497 (1975)］などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（1.5mmol/L）、２−メルカプトエタノール（5×10-5 mol/L）、ジェンタマイシン（10μg/mL）および牛胎児血清(FCS)を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（15μg/mL）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０7個以上の細胞数を確保する。
【００９３】
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水１リットル、pH 7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,000（PEG-1,000）2g、MEM2mLおよびジメチルスルホキシド0.7mLの混液0.2〜1mL/108抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにする。遠心分離（900rpm、5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（10-4mol/L）、チミジン（1.5×10-5mol/L）およびアミノプテリン（4×10-7mol/L）を加えた培地］100mL中に懸濁する。この懸濁液を96穴培養用プレートに100μL/穴ずつ分注し、5% CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり下記に述べる酵素免疫測定法などにより、ヒトSCGFに反応し、ヒトSCGFを含まない抗原に反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
酵素免疫測定法
抗原あるいは抗原を発現した細胞などを96ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行い、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【００９４】
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5mLを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×106〜5×107細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3,000rpm、5分間）して固形分を除去後、40〜50％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行い、IgGあるいは、IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および280nmでの吸光度より算出する。
［実施例］
【００９５】
実施例１．ヒトSCGF部分ペプチドを用いた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製
（１）ヒトSCGF部分ペプチドの合成
ヒトSCGF蛋白配列を解析し、親水性の高い部分、N末端、C末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる部分配列として、化合物1(SCGF-1)を選択した。
（略号について）
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するIUPAC-IUB委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）の勧告［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）, 138巻, ９頁（1984 年）］に従った。
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ala: L-アラニン
Arg: L-アルギニン
Cys: L-システイン
Gln: L-グルタミン
Glu: L-グルタミン酸
Glx: L-グルタミン酸
Gly: グリシン
Leu: L-ロイシン
Trp: L-トリプトファン
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
tBu: ｔ-ブチル
Trt: トリチル
Boc: t-ブチルオキシカルボニル
Pmc: 2, 2, 5, 7, 8-ペンタメチルクロマン-6-スルフォニル
Fmoc-Arg(Pmc)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
-Ng-2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルフォニル-L-アルギニン
Fmoc-Gln(Trt)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nε-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Glu(OtBu)-OH: Nα−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-t-ブチルエステル
Fmoc-Trp(Boc)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nind-t-ブチルオキシカルボニル-L-トリプトファン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
PyBOP: ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt: N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMM: N-メチルモルホリン
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
TFA: トリフルオロ酢酸
【００９６】
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。
質量分析は、日本電子JMS-HX110Aを用いFAB-MS法により、もしくはブルカー社製質量分析装置REFLEXを用いMALDI-TOFMS法により行った。行った。アミノ酸分析は、コーエン（Cohen, S. A.）らの方法［アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry), 222, 19 (1994)］により行った。加水分解は塩酸蒸気中110℃で20時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Waters AccQ-Tag）アミノ酸分析計（Waters社製）を用い分析した。
【００９７】
(1)化合物１(SCGF-1)（配列番号４）（Ac-Arg-Glu-Trp-Glu-Gly-Gly-Trp
-Gly-Gly-Ala-Gln-Glu-Glu-Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Ala-Leu-Cys-OH）の合成
Fmoc-Cys(Trt)、14.1μmol が結合した担体樹脂（H-Cys(Trt)-2-ClTrt resin樹脂、ノバビオケム社製）30mgを自動合成機（島津製作所）の反応容器に入れ、600μLのDMFを加えて３分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
(a) 30%ピペリジン-DMF溶液900μLを加えて混合物を4分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう1回繰り返した。
(b) 担体樹脂を900μLのDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を5回繰り返した。
(c) Fmoc-Leu-OH (141μmol)、PyBOP (141μmol)、HOBt1水和物(141μmol)およびNMM(212μmol)をDMF (494μL)中で3分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を30分間攪拌し、溶液を排出した。
(d) 担体樹脂を900μLのDMFで1分間洗浄後溶液を排出し、これを5回繰り返した。
【００９８】
こうして、Fmoc-Leu-Cys(Trt) が担体上に合成された。
次に、(a) (b) の工程の後、(c) の工程で Fmoc-Ala-OH を用いて縮合反応を行い、(d) の洗浄工程を経て、Fmoc-Ala- Leu-Cys(Trt) が担体上に合成された。
以下、工程 (c) において、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH を順次用いて、(a)〜(d) を繰り返した後、(a) (b) の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下12時間乾燥して、N末端が無保護であり側鎖が保護されたペプチドの結合した担体樹脂を得た。次に得られた担体樹脂に対し次の (e)〜(g) の操作を行った。
(e) 担体樹脂を800μLのDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を3回繰り返した。
(f) 無水酢酸 (282μmol) 及びDMF(500μL) を樹脂に加えて混合物を2時間攪拌し、溶液を排出した。
(g) 担体樹脂を 800μLのDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を3回繰り返した。
【００９９】
この後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下 12 時間乾燥して、N末端がアセチル化された側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、5mg/mLの濃度で2-メチルインドールを含むTFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液 1mL を加えて室温で6時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10mL を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして44.6mgを取得した。この粗生成物全量をジチオスレイトールおよびDMFからなる混合溶液に溶解し、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA 水溶液に、TFA 0.1% を含む 90% アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物1を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物1を1.6mg 得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 2520.7 (M+H+)
アミノ酸分析; Glx 7.6 (8), Gly 4.0 (4), Arg 2.9 (3), Ala 2.2 (2), Leu 1.2 (1), Cys 1.7 (1)
【０１００】
（２）免疫原の調製
実施例１（１）で得られたヒトSCGF部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で以下の方法でKLH（カルビオケム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、KLHをPBSに溶解して10mg/mLに調整し、1/10 容量の25mg/mL MBS（ナカライテスク社製）を滴下して30分間撹拌反応させる。あらかじめPBSで平衡化したセファデックスG-25カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのMBSを除いて得られたKLH-MB 2.5mgを 0.1mol/Lリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に溶解したペプチド 1mg と混合し、室温で3時間、攪拌反応させた。反応後、PBSで透析した。
【０１０１】
（３）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１（２）で調製したペプチド-KLHコンジュゲート 100μg をアルミニウムゲル 2mg および百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製） 1×109 細胞とともに5週令雌ラット（SD）に投与し、２週間後より 100μg のコンジュゲートを１週間に１回、計4回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下の（４）に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH 7.65）で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
【０１０２】
（４）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には実施例１（１）で得られたヒトSCGF部分ペプチドをサイログロブリン（以下、THYと略す。）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例１（２）に記した通りであるが、架橋剤にはMBSの代わりにSMCC（シグマ社製）を用いた。96穴のEIA用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを10μg/mL, 50μL/穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1% BSA-PBSを100μL/穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。1% BSA-PBSを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を50μL/穴で分注し２時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を50μL/穴で加えて室温、１時間反応させ、tween-PBSで洗浄後ABTS基質液［2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させOD415nmの吸光度をプレートリーダー（E-max;Molecular Devices社製）にて測定した。
【０１０３】
（５）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3-U1を正常培地で培養し、細胞融合時に2×107以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
【０１０４】
（６）ハイブリドーマの作製
実施例１（３）で得られたラット脾細胞と（５）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,000（PEG-1,000）2g、ＭＥＭ培地2mL およびジメチルスルホキシド 0.7mLの混液 0.2〜1mL/108ラット脾細胞を加え、1〜2分間毎にＭＥＭ培地1〜2mLを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が50mLになるようにした。遠心分離（900rpm、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100mL中に懸濁した。
この懸濁液を96穴培養用プレートに100μL/穴ずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間、培養した。この培養上清を実施例１（４）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ヒトSCGF部分ペプチド（化合物１）に反応して、別のSCGF部分ペプチドである配列番号1の140〜156番目のアミノ酸配列からなるペプチドに反応しない穴を選び、さらにHT培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマKM2141、KM2142、KM2143、KM2144、KM2145を確立した。
【０１０５】
（７）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb/c ）に実施例１（６）で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜8mL/匹）し、遠心分離（3,000rpm、５分間）して固形分を除去した。モノクローナル抗体がIgMのときは、50％硫酸アンモニウムにて塩析し、塩化ナトリウム0.5Mを添加したPBSで透析後、セルロファインGSL2000（生化学工業社製）（ベットボリューム750mL）のカラムに流速15mL/時で通塔しIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。モノクローナル抗体がIgGのときは、カプリル酸沈殿法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い決定した（表１）。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
（８）ヒトSCGF部分ペプチドとの反応性（酵素免疫測定法）
実施例１（６）で選択された抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のヒトSCGF部分ペプチド（化合物１）との反応性を（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。コントロールペプチドとしては、化合物１とは異なるSCGF部分ペプチドである配列番号1の140〜156番目のアミノ酸配列からなるペプチドを用いた。第１図に示すように、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体(KM2141〜2145)は化合物１に特異的に反応し、コントロールペプチドには反応しなかった。
【０１０８】
実施例２．動物細胞を用いたヒトSCGFの発現と精製
【０１０９】
（１）ヒトSCGF発現用プラスミドpAGE-SCGFαの構築およびヒトSCGFの動物細胞での発現
動物細胞用発現ベクターpAGE210（WO96/34016）のHindIII／KpnI処理断片とSCGFタンパク質をコードするDNA［Mio et.al., BBRC 249, 124- 130 (1998)］とを連結することにより、ヒトSCGF発現ベクターpAGE-SCGFαを構築した。
動物細胞へのプラスミドの導入は宮地等の方法に従いエレクトロポレーション法［Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133-140 (1990)］により行った。4μgのpAGE-SCGF-aを4×106個のdhfr遺伝子欠損CHO細胞株［Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)］へ導入した。この細胞を10mLのMEMa2000-dFCS(5)培地［dFCSを5%、7.5% NaHCO3を1/40量、200mL グルタミン溶液（GIBCO/BRL社製）を3%、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO/BRL社製、5,000単位/mLペニシリンおよび5,000 mg/mLストレプトマイシン含有）を0.5%含むMEM a2000培地（GIBCO/BRL社製）］に懸濁し、10cmプレート（IWAKI社製）に入れ、37℃のCO2インキュベーター中で24時間培養した。ハイグロマイシン（GIBCO/BRL社製）を終濃度0.3 mg/mLになるよう添加し、さらに1〜2週間培養した。形質転換細胞がコンフルエントになった時点で回収し、ハイグロマイシンを0.3mg/mL、methotrexate（MTX）を50nmol/L含むMEMa2000-dFCS(5)培地に1〜2×106細胞/mLになるように懸濁し、F75フラスコ（Greiner社製）に2 mL分注した。１〜２週間の培養後、50nmol/L MTX耐性の細胞を0.3 mg/mLハイグロマイシン、200nmol/L MTX含有MEMa2000-dFCS(5)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、F75フラスコ（Greiner社製）に2mL分注した。1〜2週間の培養後、200nmol/L MTX耐性の細胞を得た。この200 nmol/L MTX耐性細胞を下記に示す培地１）および培地２）を用いて、2 Lのローラーボトル（Greiner社製）で37℃、80回転/分で培養を行った。
培地１） 無血清Ex-cell 301 培地（JRH Biosciences社製）
培地２） 10mg/Lのaprotinin（Sigma社製）を含む無血清 Ex-cell 301
培地
【０１１０】
約5日間の培養後、細胞を遠心分離し、培養上清サンプルを得た。
【０１１１】
（２）モノクローナル抗体KM2142を用いたウェスタンブロッティングによる培養上清中のSCGFタンパク質の存在確認
実施例１で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2142を用いたウェスタンブロッティングにより、前記（１）で得られた培養上清中のSCGFタンパク質の存在を、以下の方法により確認した。
後述（３）および（４）のSCGFタンパク質のクロマトグラフィーによる精製における各精製画分をSDS-PAGEで分離後、P. Matsudairaの方法［J.B.C. 262, 10035-10038 (1987)］に従ってPVDF膜（Immobilon Transfer Membranes、ミリポア社製）へ電気的に転写した。転写膜はブロッキング溶液［1% BSAを含むPBSバッファー(137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 9.6 mmol/L Na2HPO4/KH2PO4 (pH 7.2))］中で30分間振盪した後、ブロッキング溶液で1mg/mLに希釈した抗SCGFモノクローナル抗体を含む溶液中で室温60 分間振盪した。該転写膜はさらに0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの5分間洗浄を1回実施した後、パーオキシダーゼで標識された抗ラットIgG抗体（anti-rat immunoglobulin 1.3g/L, DAKO社製）をPBSで1/1,000に希釈した溶液中で室温60分間振盪した。0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの5分間洗浄を１回実施した後、発光法（ECL Western blotting detection reagents、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）により検出を行った。
【０１１２】
（３）CHO細胞培養上清からのヒトSCGFタンパク質の精製
実施例３に記載する抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製を行うために、上記（１）の培地１）の培養条件で得たCHO細胞培養上清から以下の２段階のクロマトグラフィーによって精製ヒトSCGFタンパク質を取得した。
第1段階：亜鉛キレートクロマトグラフィー
Zn2+イオンで飽和させたChelating Sepharose Fast Flow担体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を2.5 cm φ×20 cmのカラム（BioRad社製）に11 cmの高さまで充填し、0.5mol/L 塩化ナトリウムを含む20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 7.1）で平衡化した。これに上記（１）で得たCHO細胞培養上清2.4Lを添加し、同緩衝液で十分に洗浄後、0〜100 mmol/L ヒスチジン直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体KM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
第2段階：MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー
上記亜鉛キレートクロマトグラフィー粗精製画分に終濃度65%となるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌後、4℃で2時間放置した。18,800×gで30分間遠心分離して得られた沈澱を10mmol/L トリス塩酸緩衝液(pH 7.0)に溶解し、同トリス塩酸緩衝液で平衡化したMonoQ HR 5/5 カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に添加した。同緩衝液で十分洗浄後、0〜1 mol/L 塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体KM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した（第２図のレーン２）。
【０１１３】
（４）CHO培養上清からのヒトSCGFタンパク質の高純度精製
実施例６に記載するヒトSCGF定量系で用いるヒトSCGFタンパク質標準品は、上記（１）の培地２）の培養条件で得たCHO細胞培養上清から以下の３段階のクロマトグラフィーにより精製し、取得した。
第1段階：亜鉛キレートクロマトグラフィー
Zn2+イオンで飽和させたChelating Sepharose Fast Flow担体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を5.0cmφ x 20cmのカラム（BioRad社製）に14.5cmの高さまで充填し、0.5mol/L 塩化ナトリウムを含む20mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 7.1）で平衡化した。これに上記（１）で得たCHO細胞培養上清12Lを添加し、同緩衝液で十分に洗浄後、0〜100mmol/L ヒスチジン直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したKM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
第2段階：MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー
上記亜鉛キレートクロマトグラフィー粗精製画分に終濃度50%となるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌後、4℃で2時間放置した。18,800 gで30分間遠心分離して得られた沈澱を10mmol/L トリス塩酸緩衝液(pH 7.0)に溶解し、同トリス塩酸緩衝液で平衡化したMonoQ HR 10/10 カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に添加した。同緩衝液で十分洗浄後、0〜1 mol/L 塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したKM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
第3段階：S-400ゲルろ過クロマトグラフィー
Sephacryl S-400 HR担体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）をXK50/60カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に51.5cmの高さまで充填したカラムとXK50/100カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に93cmの高さまで充填したカラムを直列に連結し、PBSバッファーで十分平衡化した。これに上記MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー精製画分28mLを添加し、6mL/分の流速でPBSバッファーにより溶出した。溶出画分の一部を用いてSDS-PAGEを行い、上記（２）で示したモノクローナル抗体KM2142によるウェスタンブロッティングで交差する約45kDaのバンドを含む画分を回収した。
【０１１４】
（５）ヒトSCGFタンパク質のN末端アミノ酸配列解析
実施例２（３）で得られた精製ヒトSCGFタンパク質のN末端アミノ酸配列はタンパク質化学の常法に従い決定した。精製ヒトSCGFタンパク質を含む画分をSDS-PAGE後、銀染色（第２図レーン２）あるいはP. Matsudairaの方法に従ってPVDF膜（ProBlott、アプライド バイオシステムズ社製）へ電気的に転写した。転写した膜はクマジーブルー染色し、見かけ上分子量が45kDa（第２図レーン２、バンドA）、41kDa（第２図レーン２、バンドB）、34kDa（第２図レーン２、バンドC）の各バンドを切り出し、気相プロテインシーケンサー（PPSQ-10、島津製作所）を用いてメーカー推奨の方法によりアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列は配列番号５、６、７に記載したように、配列番号１に記載したSCGFのアミノ酸配列のN末端から１アミノ酸残基目、２９アミノ酸残基目、６０アミノ酸残基目からのアミノ酸配列にそれぞれ一致した。以下、第２図レーン２に示した見かけ分子量約41kDaのN末端２８残基欠失SCGFタンパク質をΔ２８体、約34kDaのN末端５９残基欠失SCGFタンパク質をΔ５９体と称する。
【０１１５】
実施例３．CHO細胞発現ヒトSCGF蛋白質を用いた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製
【０１１６】
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例２（３）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質（SCGF、Δ28体、Δ59体のSCGF混合物）100μgをアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×109細胞とともに６週令雌マウス（Balb/c）に投与し、２週間後より100μgのヒトSCGF蛋白を１週間に１回、計３回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法（ただしアッセイ用の抗原にはCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質、コントロール抗原として１％BSA−PBSを用いた。）および以下に示すサンドイッチELISA法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
抗体産生細胞の調製は実施例１（３）と同様に行った。
【０１１７】
（２）サンドイッチELISA法
96穴のEIAプレート（グライナー社製）に実施例１で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2142を10μg/mL、50μL/穴で分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1％BSA-PBSを100μL/穴で加え、室温1時間反応させて残っている活性基をブロックした。1％BSA-PBSを捨て、CHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質を５μg/mLで１％BSA-PBS希釈したものを50μL/穴で分注し、室温２時間反応させた。対象として1%BSA-PBSを50μL/穴分注し、同様に反応させた。tween-PBSで洗浄後、上記（１）で得られた被免疫マウス抗血清の培養上清を50μL/穴で分注し、２時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン（ラット血清蛋白吸収ずみ；カルタグ社製）を50μL/穴で加えて室温で１時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させOD415nmの吸光度をプレートリーダー（Emax;Molecular Devices社製）にて測定した。
【０１１８】
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
実施例１（５）と同様に調製を行った。
【０１１９】
（４）ハイブリドーマの作製
実施例１（６）と同様に実施例３（１）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞との細胞融合を行った。
得られた細胞懸濁液を96穴培養用プレートに100μＬ/穴ずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間、培養した。この培養上清を実施例３（２）に記載したサンドイッチELISA法で調べ、ヒトSCGF蛋白質に反応してコントロールである1%BSA-PBSに反応しない穴を選び、さらにHT培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマKM2801、KM2802、KM2803およびKM2804を確立した。
【０１２０】
（５）モノクローナル抗体の精製
実施例１（７）と同様に実施例３（４）で得られたハイブリドーマ株をヌード雌マウスに腹腔内投与を行い、得られた腹水より精製モノクローナル抗体を取得した。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い、決定した。その結果を表２に示す。
【０１２１】
【表２】
2003085399.tif 000031
【０１２２】
（６）CHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質との反応性（酵素免疫測定法）
実施例３（４）で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のCHO細胞発現ヒトSCGF蛋白質との反応性を実施例１（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。第３図に示すように、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体（KM2801、KM2802、KM2803およびKM2804）はCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質に特異的に反応し、コントロールの１％BSA-PBSには反応しなかった。
実施例４．SDS変性ヒトSCGFタンパク質（CHO細胞発現）を用いた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の作製
実施例３記載の未変性ヒトSCGF蛋白質を免疫原に用いた場合には、Δ５９体に反応するモノクローナル抗体は得られなかった。そこで、△５９体に反応するモノクローナル抗体を作製するため、SDS変性SCGFを免疫原に用いてハイブリドーマの作製を試みた。
【０１２３】
（１）免疫原の調製
実施例２（３）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質をSDS（ラウリル硫酸ナトリウム；ナカライテスク社製）を加えて変性させたものを作製し、免疫原とした。すなわち５％SDS−PBSを調製し、CHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質に9分の１量加え、100℃で５分間煮沸したものをSDS変性ヒトSCGFタンパク質とした。
【０１２４】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例４（１）で得られたSDS変性ヒトSCGFタンパク質100μgをアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）1×109細胞とともに６週令雌マウス（Balb/c）に投与し、２週間後より100μgのSDS変性ヒトSCGFタンパク質を１週間に１回、計３回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法（ただしアッセイ用の抗原にはSDS変性ヒトSCGF蛋白質、コントロール抗原として１％BSA-PBSを用いた。）で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
【０１２５】
抗体産生細胞の調製は実施例１（３）に記載の方法と同様に行った。
【０１２６】
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
実施例１（５）に記載の方法と同様の調製を行った。
【０１２７】
（４）ハイブリドーマの作製
実施例１（６）と同様にして、実施例４（２）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞との細胞融合を行った。
得られた細胞懸濁液を96穴培養用プレートに100μL/穴ずつ分注し、5％CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間、培養した。この培養上清を実施例１（４）で示した酵素免疫測定法で調べ、SDS変性ヒトSCGF蛋白に反応してコントロールである１％BSA-PBSに反応しない穴を選び、さらにHT培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して抗ヒトSCGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマKM2941、KM2942、KM2943、KM2944およびKM2945を確立した。
【０１２８】
（５）モノクローナル抗体の精製
実施例１（７）と同様に実施例４（４）で得られたハイブリドーマ株をヌード雌マウスの腹腔内投与を行い、得られた腹水より精製モノクローナル抗体を取得した。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い、決定した。その結果を表３に示す。
【０１２９】
【表３】
2003085399.tif 000032
【０１３０】
（６）SDS変性ヒトSCGFタンパク質との反応性（酵素免疫測定法）
実施例４（４）で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のSDS変性ヒトSCGFタンパク質との反応性を実施例１（４）に示した酵素免疫測定法にて調べた。第４図に示すように、抗ヒトSCGFモノクローナル抗体（KM2941、KM2942、KM2943、KM2944およびKM2945）はSDS変性ヒトSCGFタンパク質に特異的に反応し、コントロールの１％BSA-PBSには反応しなかった。
【０１３１】
実施例５．抗ヒトSCGFモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ヒトおよびマウスSCGFタンパク質に対する反応性
実施例１、３および４で作製された抗ヒトSCGFモノクローナル抗体のヒトおよびマウスSCGFタンパク質に対する反応性を酵素免疫測定法（バインディングELISA）で検討した。マウスSCGFタンパク質は実施例２記載の方法に準じて作製した。
アッセイ用の抗原としてCHO細胞発現ヒトおよびマウスSCGFタンパク質を用い、実施例１（４）に記載の方法により行った。結果を第５図に示す。
抗SCGFモノクローナル抗体KM2142は配列番号１に示すSCGFのアミノ酸配列のＮ末端から6残基目から２５残基目までに相当する部分ペプチド（化合物１）を抗原に用いて作製されたハイブリドーマ由来の抗体である。抗SCGFモノクローナル抗体KM2142は、SCGFタンパク質に対する反応性をも有していることが示された。また、抗SCGFモノクローナル抗体KM2142はヒトおよびマウスSCGFタンパク質の両方に反応性を有していた。
抗SCGFモノクローナル抗体KM2804はCHO細胞発現ヒトSCGFを抗原に用いて作製したハイブリドーマ由来の抗体である。抗SCGFモノクローナル抗体KM2804はヒトSCGFにのみ反応し、マウスSCGFに対する交叉反応性は示さなかった。
抗SCGFモノクローナル抗体KM2945はSDS変性SCGFタンパク質（CHO細胞発現）を抗原に用いて作製したハイブリドーマ由来の抗体である。抗SCGFモノクローナル抗体KM2945は、未変性のSCGFタンパク質に対する反応性をも有していることが示された。また、抗SCGFモノクローナル抗体KM2945はマウスSCGFに対する交叉反応性は示さなかった。
【０１３２】
（２）ウェスタンブロッティング
実施例２（３）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質を用い、実施例３および４で作製された抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2804およびKM2945のウェスタンブロッティングにおける反応性を検討した。
実施例２（２）と同様にPVDF膜に転写したサンプルを、ブロッキング溶液中で室温30分間振盪後、ブロッキング溶液で1mg/mLに希釈した抗SCGFモノクローナル抗体で室温60分間振盪した。転写膜はさらに0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、PBSで1/1,000に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）溶液中で室温60分間振盪した。0.05% tween20を含むPBSバッファーで5分間洗浄を2回、PBSバッファーでの５分間洗浄を１回実施した後、上述のECL発光法により検出した。
第2図におけるレーン３、４、５はそれぞれKM2142、KM2804、KM2945を用いた精製ヒトSCGFタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す。KM2804はN末端５９残基欠失SCGFタンパク質であるΔ５９体には反応性を有していないが、全長SCGFおよびN末端２８残基欠失SCGFタンパク質であるΔ２８体には反応性を有していた。また、KM2945は全長SCGFおよび欠失体のいずれも反応性を有していた。
【０１３３】
実施例６．ヒトSCGF定量系
実施例１で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2142を以下の方法によりビオチン標識した。実施例１で得られたKM2142精製抗体をPBSで1mg/mLに希釈し、1/4容量の0.5mol/L炭酸バッファー（pH 9.2）を加えた。さらにバッファーと同量のNHS-Lc-Biotin（1mg/mLにジメチルホルムアミドにて溶解；ピアス社製）を攪拌下滴下した。３時間、室温で攪拌反応を行った後、PBSで一晩透析したものをビオチン標識KM2142として用いた。
96穴のEIA用プレート（グライナー社製）に、実施例３で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体KM2804を5μg/mL、50μL/穴で分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1%BSA-PBSを100μL/穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。1%BSA-PBSを捨て、実施例２（４）で得られたCHO細胞発現ヒトSCGFタンパク質を血清希釈液（協和メデックス社製）で17.5ng/mLから２倍希釈系列で14点希釈したものを50μＬ/穴で分注し室温で２時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、上記で得られたビオチン標識KM2142（0.2μg/mLにBSA-PBSにて希釈）を50μL/穴で加えて室温、２時間反応させ、tween-PBSで洗浄後、さらにアルカリフォスファターゼ標識アビジン（ザイメッド社製）を32,000倍希釈で50μL/穴で加えて室温、１時間反応させた。tween-PBSで洗浄後、AmpliQ（DAKO社製）を用いて発色させOD490nmの吸光度をプレートリーダー（E-max；Molecular Devices社製）にて測定した。その結果、第６図に示すように、本定量系によりヒトSCGFタンパク質を0.04〜2.0ng/mLの範囲で定量することが可能であった。
【０１３４】
実施例７．白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の血清SCGF濃度
インフォームドコンセントを得た白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の血清中のSCGF濃度を実施例６の方法で測定した。また血球検査値が正常値を示す男女10名の健常人を対象例として同じく血清中のSCGF濃度を測定した。その結果を第７図に示す。
健常人の値の分布が正規分布を示すことを確認した後、この群より平均値とスタンダードデビエーション（ＳＤ）を計算し、平均値＋２ＳＤの値を正常と異常とを区別する基準値に設定した。この基準値をもとに、白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患の値を正常・異常に分別し、白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患がSCGF測定値で検出可能か否かを確認した。その結果を表４に示す。
【０１３５】
【表４】
2003085399.tif 000033
【０１３６】
健常人群に比較し、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄異形成症候群（MDS）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫（MM）の患者の中央値は有意に高く、SCGF測定値がこれら疾患で有意に上昇していることが示された（第７図）。
【０１３７】
また健常人の値から定めたカットオフ値を用いて白血病、前白血病患者および非白血病性悪性血液疾患を高い感度で検出できることが示された（表４）。一方、同じ血液疾患でありながら、再生不良性貧血（AA）患者の値は健常人との有意差が観察されず、またカットオフ値を用いてもこの疾患を検出出来なかった。
血液細胞数の異常を伴う疾患である非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫（MM）、骨髄異形成症候群（MDS）、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）を比較すると、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）などの白血病患者のＦ血液中SCGF濃度は、非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫(MM)、骨髄異形成症候群（MDS）などの他の前白血病や非白血病性悪性血液疾患患者の血液中SCGF濃度に比較して有意に高く、血液中SCGF濃度は白血病と前白血病や非白血病性悪性血液疾患との判別に利用可能であった。また、判別診断の難しいAA患者とMDS患者を比較してみると、MDS患者血中SCGF濃度はAA患者のそれと比較して有意に高く、両者を血中SCGF濃度で判別診断することが可能であった。
【０１３８】
実施例８．造血幹細胞移植後GVHD発症とSCGF濃度
インフォームドコンセントを得た白血病および前白血病患者で造血幹細胞移植を受けた23例の内、GVHDを発症した例15例、発症しなかった例8例の血清中SCGF濃度を実施例６の方法を用いて各ステージ毎に測定した。その結果を第８図に示す。
造血幹細胞移植を受けた患者のSCGF濃度はプレ−コンディショニング期やアプラスチック期に比べ、リカバリー期やステイブル期の方が有意に高値を示した。
造血幹細胞移植を受けた患者のうち、GVHDを発症した症例は発症しなかった例に比べ、アプラスチック期およびリカバリー期において有意に血清中SCGF濃度が高いので、血清中のSCGF濃度を測定することによって、GVHD発症を判定可能であった。
さらにカットオフ値を定めてGVHD発症例と非発症例とを判定できないかを検討した。その結果を第９図に示す。プレ−コンディショニング期においては、カットオフ値を例えば5ng/mLに定めることにより感度87%、特異度57%で、アプラスチック期においてはカットオフ値を10ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、リカバリー期ではカットオフ値を15ng/mLに定めることで感度87%、特異度63%で、それぞれSCGF濃度を測定し、これを診断に用いなかった時に比べて有意(p<0.05)にGVHD発症例と非発症例とを判別GVHD可能であった。
【０１３９】
実施例９．移植造血幹細胞の生着と血清SCGF濃度
インフォームドコンセントを得た血液疾患患者で造血幹細胞移植を受けた23例のうち、生着が遅延した例4例、遅延しなかった例19例の血清中SCGF濃度を実施例６の方法を用いて各ステージ毎に測定した。結果を第１０図に示す。
生着非遅延例では、リカバリー期およびステイブル期のSCGF濃度は、プレ−コンディショニング期に比して有意に上昇した。一方、生着遅延例では、これらの期においても有意な上昇は観察されなかった。
そこで、造血幹細胞移植患者のSCGF濃度を測定し、そのカットオフ値を定めてその値と個々患者の値比較から造血幹細胞生着遅延例と非遅延例を判定できないかを検討した。その結果を第１１図に示す。プレ−コンディショニング期においては、カットオフ値を例えば9.5ng/mLに定めることにより感度75%、特異度67%で、アプラスチック期においてはカットオフ値を12ng/mLに定めることで感度75%、特異度63%で、造血幹細胞生着遅延例と非遅延例とを判別することが可能であった。
【０１４０】
実施例１０．白血病患者の末梢血細胞におけるSCGFの発現
インフォームドコンセントを得た種々の白血病患者の末梢血細胞をRneasy Mini Kit (Qiagen社製)を用い、プロトコールにしたがって全RNAを抽出し、全RNA1μｇをDNaseI (GIBCO社製)処理し、SuperScript First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR (GIBCO社製)を用いて逆転写し、First-Strand DNAを調製した。Taq Polymerase (TaKaRa社製)を用い、調製したFirst-Strand DNAを鋳型とし、配列番号８および９ならびに配列番号１０および１１の塩基配列を有するオリゴDNAをプライマーとして、それぞれ、ヒトG3PDH、SCGF遺伝子の検出を検討したところ、G3PDHの検出量がほぼ同等となる条件下で、健常人1人では、SCGFの発現を検出できなかったが、急性リンパ性白血病（ALL）2例中1例、急性骨髄性白血病（AML）2例中2例でSCGFの発現が検出された。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、SCGFに反応する抗体を用いた、白血病、前白血病または非白血病性悪性血液疾患を判定する方法、造血幹細胞移植後の造血幹細胞生着遅延および移植片対宿主反応病を判定する方法、およびそれらの診断薬ならびに診断キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
第１図は、モノクローナル抗体のヒトSCGF部分ペプチド（化合物１）に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第２図は、精製ヒトSCGFタンパク質のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング結果を示す。レーン１および２は分子量マーカーと精製ヒトSCGFタンパク質のSDS-PAGEパターンを示す。レーン３、４、５はそれぞれKM2142、KM2804、KM2945を用いた精製ヒトSCGFタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す図である。
1:分子量マーカーのレーン
2:精製SCGFを解析し、銀染色したレーン
3:抗SCGF抗体KM2142を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
4:抗SCGF抗体KM2804を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
5:抗SCGF抗体KM2945を用いてウェスタンブロッティングしたレーン
A:SCGFタンパク質の分子量を示す。
B:N末端28残基欠失SCGFタンパク質Δ28体の分子量を示す。
C:N末端59残基欠失SCGFタンパク質Δ59体の分子量を示す。
第３図は、モノクローナル抗体の、ＣＨＯ細胞発現ヒトSCGF蛋白に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第４図は、モノクローナル抗体の、ＳＤＳ変性ヒトSCGF蛋白（ＣＨＯ細胞発現）に対する反応性を示す図である（バインディングＥＬＩＳＡ）。
第５図は、モノクローナル抗体の、ヒトおよびマウスSCGF蛋白（ＣＨＯ細胞発現）に対する反応性を示す。（バインディングＥＬＩＳＡ）
第６図は、モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトSCGF蛋白の定量曲線を示す図である。
第７図は、各種血液疾患患者血清中SCGF濃度を示す。横実線は各種血液疾患群の中央値を、横点線は健常人群から求めたカットオフ値(18.2ng/mL)を示す図である。
＊：Normal（健常人群）あるいはAA（再生不良性貧血群）との有意差  p<0.05、
＃：NHL（非ホジキンリンパ腫）との有意差  P<0.05、＄：MM（多発性骨髄腫）との有意差  p<0.05
第８図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度によるGVHD発症および非発症の差を示す図である。横実線は各群の中央値を示す。
＊：GVHD非発症例との有意差  p<0.05、
＃：プレ−コンディショニング期との有意差  p<0.05、
＄：アプラスチック期との有意差  p<0.05、
＆：リカバリー期との有意差  p<0.05
第９図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度とGVHD発症患者の検出感度、非発症患者の特異度との関係を示す図である。●：感度、○：特異度、縦点線は仮のカットオフ値を示す。
第１０図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度による生着遅延および非遅延の差を示す図である。横実線は各群の中央値を示す。
＃：プレ−コンディショニング期との有意差  p<0.05、
＄：アプラスチック期との有意差  p<0.05、
＆：リカバリー期との有意差  p<0.05
第１１図は、造血幹細胞移植患者血清中SCGF濃度と造血幹細胞生着遅延例の検出感度、非遅延例の特異度との関係を示す図である。●：感度、○：特異度、縦点線は仮のカットオフ値を示す。
【国際調査報告】
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2003085399.tif 000035
2003085399.tif 000036
2003085399.tif 000037
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