(57)【要約】原虫性疾患の治療に有効なＥＰＯ含有医薬組成物、ＥＰＯを原虫性疾患の患者に投与することによる原虫性疾患の治療方法、及び原虫性疾患治療剤を製造するためのＥＰＯの使用が開示されている。原虫性疾患の治療には、いくつかの薬剤が使用されているが、これら薬剤は比較的副作用が高く、特にペンタミジンは原虫性疾患に効果があるとされているが、重篤な低血圧、低血糖及び不整脈が現われることがあり、しかも腎臓及び肝臓に障害のある患者については、腎又は肝機能障害を悪化させると共に副作用を発現しやすくなる、また、低血圧又は高血圧症の患者、及び低血糖又は高血糖症患者の症状を悪化させるおそれもある。本発明は、このような、副作用がないか又は副作用の低い原虫性疾患治療剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンを有効成分とする原虫性疾患治療剤。
【請求項２】
原虫性疾患が貧血を伴う疾患である請求項１に記載の原虫性疾患治療剤。
【請求項３】
原虫性疾患がトリパノソーマ症又はマラリアである請求項１に記載の原虫性疾患治療剤。
【請求項４】
原虫性疾患がトリパノソーマ症である請求項２に記載の原虫性疾患治療剤。
【請求項５】
エリスロポエチンを有効成分として注射剤として処方された請求項１に記載の原虫性疾患治療剤。
【請求項６】
有効量のエリスロポエチンを、原虫性疾患患者に投与することからなる、原虫性疾患の治療方法。
【請求項７】
原虫性疾患が貧血を伴う疾患である請求項６に記載の治療方法。
【請求項８】
原虫性疾患がトリパノソーマ症又はマラリアである請求項６に記載の治療方法。
【請求項９】
原虫性疾患がトリパノソーマ症である請求項８に記載の治療方法。
【請求項１０】
原虫性疾患治療剤を製造するためのエリスロポエチンの使用。
【請求項１１】
原虫性疾患治療剤が、注射剤である請求項１０に記載のエリスロポエチンの使用。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を有効成分とする原虫性疾患治療剤に関する。
［背景技術］
原虫性疾患は、種々の原虫（原生動物）のヒト又は他の動物への感染によって引き起こされるの疾患の総称である。代表的な原虫性疾患としては、トリパノソーマ症、アメーバ感染症、マラリア、トキソプラズマ症、ニューモシスチス症、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、リーシュマニア症等の感染による疾患が知られている。
このうち、トリパノソーマ症は、睡眠病とも呼ばれ、主として中部及び東部アフリカに分布するアフリカトリパノソーマ症と、中南米に分布し、シャーガス病とも呼ばれるアメリカトリパノソーマ症とが知られている。前者はツェツェバエが媒介し、後者はサシガメが媒介する。いずれのトリパノソーマ症も、発熱、頭痛、リンパ節腫脹等の症状がみられ、死亡に至る。
現在、トリパノソーマ症の主な治療法としては、ペンタミジン等を投与しているが、重篤な低血圧、低血糖及び不整脈が現われる等の副作用を生じることがあり慎重な投与が勧められている。
トリパノソーマ症及びマラリア感染では、主要な臨床的および実験室的知見として貧血がみられるが、貧血の病因形成に関しては、ほとんど知られていない。１９６５年、Ｂｕｚａら（Ｂｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．１１３，３４３−３５６（１９９５））は、トリパノソーマ・コンゴレンセ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ：以下、Ｔ．コンゴレンセと記すこともある）に感染した子ウシは、血液中でのＥＰＯ濃度が上昇しているにもかかわらず、重症の貧血を示したことを報告した。病原性マラリア（プラスモディウム・バージャイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ））でのネズミ感染で、同様の観察が３０年前に公表されている（Ｒｅｎｃｒｉｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０，８３１−８３３（１９７４））。前掲のＢｕｚａ等の報告によれば、赤血球産生系に作用する阻害因子が存在する可能性を強く示唆しているため、トリパノソーマを含む原虫感染に関連する貧血の治療のために、ＥＰＯの投与は全く試みられてこなかった。しかしながら、高用量での外因性ＥＰＯの投与によって、原虫の感染で生じる貧血が解消するか否かについては結論づけられていなかった。内因性ＥＰＯがこの種の貧血を解消しないことは、これまでの報告から明らかである。
これまで、原虫性疾患の治療には、いくつかの薬剤が使用されているが、これら薬剤は比較的副作用が高い。特にペンタミジンは原虫性疾患に効果があるとされているが、重篤な低血圧、低血糖及び不整脈が現われることがあり、しかも腎臓及び肝臓に障害のある患者については、腎又は肝機能障害を悪化させると共に副作用を発現しやすくなる、また、低血圧又は高血圧症の患者、及び低血糖又は高血糖症患者の症状を悪化させるおそれもある。このような状況に鑑み、原虫性疾患に有効であり、かつ副作用の低い薬剤の開発が望まれていた。
［発明の開示］
本願発明者等は、ＥＰＯの投与により、原虫性疾患に起因する貧血が改善されることを確認し、更に驚くべきことに、原虫性疾患自体の治療にＥＰＯの投与が有効であることを見出し、この知見に基づき、原虫性疾患の治療に有効なＥＰＯ含有医薬組成物を開発した。
［発明を実施するための態様］
本発明の原虫性疾患とは、種々の病原性寄生原虫（原生動物）のヒト又は他の動物への感染によって引き起こされるの疾患の総称である。代表的な原虫性疾患としては、アメーバ感染症、トリパノソーマ症、マラリア、トキソプラズマ症、ニューモシスチス症、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、リーシュマニア症等の感染による疾患が知られている。本発明の治療の対象として特に注目している原虫性疾患は、トリパノソーマ症、マラリア、バベシア症、リーシュマニア症等の貧血を伴う疾患であり、特にトリパノソーマ症の治療に有効である。
後に実験例において具体的に説明するように、トリパノソーマ、特にウシに対する病原性が強いトリパノソーマ・コンゴレンセ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）をマウス一匹当り１０００細胞感染させた場合、非処理の場合では、短期間に全て死亡したが、ヒト組換えＥＰＯ（ｒ−ｈＥＰＯ）を投与することにより、その致死率が劇的に改善されることを確認した。この知見に基づいて、本発明の発明者等は、ヒト又はその他の動物の原虫性疾患、特に貧血を伴う原虫性疾患（例えば、トリパノソーマ症、マラリア等）の治療用としてＥＰＯ含有薬剤を開発し、その薬効を確認して本発明を完成した。
また、トリパノソーマは同じ系統であれば、２度目の感染では死を免れる可能性もあるので、ＥＰＯとトリパノソーマを同時投与して、トリパノソーマの致死的感染を回避させることにより、ワクチンとしての利用も可能である。
本発明で使用する活性成分であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、例えば、ヒト再生不良性貧血患者の尿から抽出して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平１−３８，８００号公報）や、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列に対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を採取し、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次いで適当な宿主（例えば、大腸菌の如き菌類や、酵母類や、植物の細胞株や、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスＣ−１２７細胞等の動物の細胞株等）で生産させる遺伝子組換技術により製造されたもの〔例えば、特公平１−４４３１７号公報；Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊａｃｏｂｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，８０６〜８１０（１９８５）〕等を挙げることができる。
また、本発明で使用できるＥＰＯは、上記由来のもの以外に、それらの改変体であってもよい。ＥＰＯ改変体としては、例えば、特開平３−１５１３９９号公報に記載された改変体が挙げられる。上記ＥＰＯ改変体としては、もとの糖蛋白質のペプチド鎖のＡｓｎがＧｌｎに変異し、結合するＮ結合型糖鎖の結合数が変異したものがある。また他に、アミノ酸変異としては、特開平２−５９５９９号公報、特開平３−７２８５５号公報記載のものが挙げられる。即ち、ＥＰＯの有するＥＰＯレセプターへの作用特性を失わない限り、アミノ酸の変異、欠失、付加は何個でもよい。
本発明のＥＰＯを有効成分とする製剤については、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤等を添加することができる。ここで、懸濁化剤の例としては例えばメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができ、溶解補助剤としては例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができ、安定化剤としては例えばヒト血清アルブミン、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができ、等張化剤としては例えばＤ−マンニトール、ソルビトール等を挙げることができ、また、保存剤としては例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができ、更に、吸着防止剤としては例えばヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
本発明のＥＰＯを有効成分とし、安定化剤としてある種のアミノ酸を添加することにより、ヒト血清アルブミンや精製ゼラチンを含まない安定なＥＰＯ溶液製剤を使用することもできる。この安定なＥＰＯ溶液製剤は特開平１０−１８２４８１号公報に記載されている。この公報の説明は本明細書の一部に含まれるものとする。
このＥＰＯ溶液製剤で安定化剤として添加するアミノ酸には、遊離のアミノ酸ならびにそのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の溶液製剤には、これらのアミノ酸の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましいアミノ酸は、Ｄ−、Ｌ−およびＤＬ一体のロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンならびにそれらの塩であり、より好ましいのはＬ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−リジンならびにそれらの塩である。特に好ましいのは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−リジンならびにそれらの塩である。最も好ましいのはＬ−ヒスチジンならびにその塩である。
この安定なＥＰＯ溶液製剤の製法等の詳細については上記公報に記載された通りである。
本発明の目的の予防、治療薬における、これらＥＰＯの投与量については、対象となる疾患やその病状等を配慮して適宜決定できるものであるが、投与量については、通常成人１人当たり０．１〜５００μｇ、好ましくは５〜１００μｇである。
以下に実験例及び実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実験例及び実施例によって限定されるものではない。
［実験例１］  ｒ−ｈｕ−ＥＰＯ投与による効果
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウス（ＣＬＥＡ、日本・東京）を、腹腔内注射により、１０００細胞のＴ．コンゴレンセ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ケニア）に感染させた（第０日）。マウスは、毎日、５０００  Ｕ／ｋｇ（実験１）または１０００Ｕ／ｋｇ（実験２）の用量で、感染第０日から第７日まで８日間、組換えヒトエリスロポエチン（ｒ−ｈｕ−ＥＰＯ；中外製薬、日本・東京）で処置し、そしてその生存率、ヘマトクリット値および単位血液量あたりの原虫数を監視した。
（結果）
実験１
図１に示すように、Ｔ．コンゴレンセ（１０００細胞）に感染したすべてのマウスが、感染第９日までに死亡した。しかし、５０００Ｕ／ｋｇのｒ−ｈｕ−ＥＰＯで処置した感染マウスでは、原虫感染第１６日および第３３日に、それぞれ、すべてのマウスおよび５０％のマウスが、まだ生存していた。ｒ−ｈｕ−ＥＰＯを投与した、原虫に感染していないマウスにおいて、ヘマトクリット値の顕著な増加以外、いかなる臨床的副作用も検出されなかった（図２）。ｒ−ｈｕ−ＥＰＯで処置した感染マウスとｒ−ｈｕ−ＥＰＯを投与した寄生虫に感染していないマウスとの両者のヘマトクリット値は、第６日まで、同じ様に増加した。しかし、ｒ−ｈｕ−ＥＰＯで処置した感染マウスのヘマトクリット値は、第９日から、ｒ−ｈｕ−ＥＰＯを投与したマウスのものより、低くなる傾向があった。さらに、ｒ−ｈｕ−ＥＰＯで処置した感染マウスのヘマトクリット値は、第１６日以降、全く処置しない対照マウスと比較してはるかに低くなった。トリパノソーマに感染したマウスの大部分は、感染経過中、重症の貧血を示さなかった。しかし、衰弱し、瀕死の感染マウスの１匹を切迫屠殺した際、そのヘマトクリット値は３０％に減少していた。生存動物における寄生虫血症（パラシテミア：循環血液中に原虫が存在する症状）の増加は、持続した増加よりむしろ、いくつかの別個のピークとして現れた。ＥＰＯを投与しない感染マウスのほぼすべてが、寄生虫血症の第一のピークで、またはその直後に死亡した（２１０８−３４１３  ｘ  １０４細胞／ｍｌ血液；図３）。
実験２
マウスをＴ．コンゴレンセ（１０００細胞）に感染させると、実験１の結果と同様に、９日以内にすべてのマウスが死亡した。一方、Ｔ．コンゴレンセ（１０００細胞）に感染し、そして１０００Ｕ／ｋｇのｒ−ｈｕ−ＥＰＯで、８日間処置したマウスの生存率は、第９日に７５％であった。生存率は、第１２日に５０％に減少し、そして観察期間中、維持された（図４）。１０００Ｕ／ｋｇのｒ−ｈｕ−ＥＰＯで、８日間処置した感染マウスのヘマトクリット値は、第６日に５６％に増加し、そして第９日に、まったく処置しない対照値以下の、４２％に急速に減少した（図５）。ｒ−ｈｕ−ＥＰＯ処置しないトリパノソーマ感染マウスは、寄生虫血症の第一のピーク付近で死亡した（２．４−１０．１  ｘ  １０４細胞／ｍｌ血液）。生存動物の寄生虫血症は、実験１で観察されるように、いくつかの別個のピークを有した（図６）。動物の成長曲線は、実験群間で異ならなかった（図７）。
［実験例２］  ｒ−ｈｕ−ＥＰＯ、又はペンタミジン投与による効果
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウス（ＣＬＥＡ、日本・東京）各群４匹を、腹腔内注射により、１０００細胞のＴ．コンゴレンセ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ケニア）に感染させた（第０日）。マウスは、毎日、５０００Ｕ／ｋｇの用量で、感染第０日から第７日まで８日間、組換えヒトエリスロポエチン（中外製薬、日本・東京）で処置するか、又は同様に、４ｍｇ／ｋｇの既存の抗原虫剤であるペンタミジン（ベナンバックス：中外製薬：以下Ｐｅｎと略す）で処置し、そしてその生存率及びヘマトクリット値を０日から２日毎に監視した。
感染マウス、ｒ−ｈｕ−ＥＰＯで処置した感染マウス、及びペンタミジン（Ｐｅｎ）で処置した感染マウスのそれぞれの生存率を図８に示した。
ＥＰＯ及びＰｅｎの投与によって、Ｔ．ｃｏｎｇ感染後の生存日数は有意に改善された。ＥＰＯの効果は、Ｐｅｎと同等あるいはそれ以上であった。但し、ＥＰＯとＰｅｎとの間には統計学的に有意差はなかった。
感染マウス、ｒ−ｈｕ−ＥＰＯで処置した感染マウス、及びペンタミジンで処置した感染マウスのそれぞれのヘマトクリット値を図９に示した。
ＥＰＯの８日間投与によって、Ｔ．ｃｏｎｇ感染による貧血の改善効果が認められたが、Ｐｅｎにその効果は観察されなかった。なお、Ｐｅｎの投与後、一過性にヘマトクリット値は４０％程度にまで減少した。
これらの結果から、Ｐｅｎには造血効果が認められないので、ＥＰＯとは異なる作用で抗原虫効果を発揮していると考えられるから、作用機序の異なるＥＰＯとＰｅｎとを併用することにより、一層の延命効果が期待される。
以下に、製剤に関する実施例を示す。
［実施例１］
エリスロポエチン                  ８μｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
［実施例２］
エリスロポエチン                  ８μｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
［実施例３］
エリスロポエチン                １６μｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
［実施例４］
エリスロポエチン                １６μｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
［実施例５］
エリスロポエチン                  ８μｇ
ヒト血清アルブミン                ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
［実施例６］
エリスロポエチン                  ８μｇ
ヒト血清アルブミン                ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
［実施例７］
エリスロポエチン                １６μｇ
ヒト血清アルブミン                ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
［実施例８］
エリスロポエチン                １６μｇ
ゼラチン                          ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量              ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
［実施例９〜１２］
実施例５〜８におけるヒト血清アルブミンに代えて５ｍｇのデキストラン４０を用い、これら実施例５〜８と同様にして注射剤を調製した。
［実施例１３］
注射用蒸留水１００ｍｌ中にＤ−マンニトール５ｇ、エリスロポエチン１ｍｇ、ヒト血清アルブミン１００ｍｇを無菌的に溶解して水溶液を調製し、１ｍｌずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
［実施例１４］
調剤溶液１ｍｌ中に以下の成分：
ＥＰＯ                                        １５００国際単位
非イオン性界面活性剤                                ０．０５ｍｇ
（ポリソルベート８０：日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム                                        ８．５ｍｇ
Ｌ−アルギニン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）              １０ｍｇ
を含み、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（和光純薬社製）にてｐＨ６．０に調整した溶液を、５ｍｌのガラスバイアルに１ｍｌ充填し、打栓、密封し、溶液製剤に供した。
［実施例１５］
調剤溶液１ｍｌ中に以下の成分：
ＥＰＯ                                        １５００国際単位
非イオン性界面活性剤                                ０．０５ｍｇ
（ポリソルベート８０：日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム                                        ８．５ｍｇ
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）              １０ｍｇ
上記実施例１４と同様に溶液製剤を調製した。
［実施例１６］
調剤溶液１ｍｌ中に以下の成分：
ＥＰＯ                                        １５００国際単位
非イオン性界面活性剤                                ０．０５ｍｇ
（ポリソルベート８０：日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム                                        ８．５ｍｇ
Ｌ−リジン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）                  １０ｍｇ
上記実施例１４と同様に溶液製剤を調製した。
［産業上の利用可能性］
ＥＰＯを有効成分として含有する薬剤は原虫性疾患、特に貧血を伴い高い致死率を呈する原虫性疾患（例えば、トリパノソーマ症、マラリア等）の治療に有効であり、しかも副作用が低く安全である。また、ＥＰＯと原虫とを同時投与して、死亡に至らずに原虫に感染させることによって、ワクチンとして利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスの生存率に及ぼすＥＰＯ（５０００Ｕ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
図２は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスのヘマトクリット値に及ぼすＥＰＯ（５０００Ｕ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
図３は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスのパラシテミア（寄生虫血症）に及ぼすＥＰＯ（５０００Ｕ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
図４は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスの生存率に及ぼすＥＰＯ（１０００Ｕ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
図５は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスのヘマトクリット値に及ぼすＥＰＯ（１０００Ｕ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
図６は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスのパラシテミアに及ぼすＥＰＯ（１０００Ｕ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
図７は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスの体重の推移を示すグラフである。
図８は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスの生存率に及ぼすＥＰＯ（５０００Ｕ／ｋｇ）、及びＰｅｎ（４ｍｇ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
図９は、トリパノソーマ・コンゴレンセを感染させたマウスのヘマトクリット値に及ぼすＥＰＯ（５０００Ｕ／ｋｇ）、及びＰｅｎ（４ｍｇ／ｋｇ）の投与効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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