(57)【要約】マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）を有効成分として含み、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染者の治療および病態進行を効果的に抑制する抗ＨＩＶ剤が開示されている。また、ＨＩＶ感染細胞をＭＢＰの存在下で培養する工程を含む、ＭＢＰが奏する抗ＨＩＶ活性の評価方法も開示されている。
2004002511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）を有効成分とする抗ＨＩＶ剤。
【請求項２】
前記ＭＢＰが、ＨＩＶ増殖抑制作用を有する請求項１に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項３】
前記増殖抑制作用が、ＨＩＶ中和作用である請求項２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項４】
前記増殖抑制作用が、ＨＩＶ発芽抑制作用である請求項２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項５】
前記ＭＢＰが、ヒト血清から単離および精製される請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項６】
前記ＭＢＰが、動物細胞から遺伝子工学的に分泌される請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項７】
前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項６に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項８】
前記ＨＩＶが、ＨＩＶタイプ１のグループＭのサブタイプＢに属するＨＩＶ株である請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項９】
前記ＨＩＶが、ＨＩＶタイプ１のグループＭのサブタイプＤに属するＨＩＶ株である請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１０】
前記ＨＩＶが、組換え型流行株である請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１１】
前記組換え型流行株が、ＣＲＦ０１＿ＡＥである請求項１０に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１２】
前記ＨＩＶが、ＣＣＲ５に対して指向性を有するウィルスである請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１３】
前記ＨＩＶが、ＣＸＣＲ４に対して指向性を有するウィルスである請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１４】
前記ＨＩＶが、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１５】
前記ＨＩＶが、マクロファージに対して指向性を有するウィルスである請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１６】
前記ＨＩＶが、Ｔ細胞に対して指向性を有するウィルスである請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１７】
前記ＨＩＶが、マクロファージおよびＴ細胞の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項１または２に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１８】
ＭＢＰの抗ＨＩＶ作用の評価方法であって、以下の工程、すなわち、
（１）標的細胞とＨＩＶとを共存せしめて得られた感染細胞を培養し、
（２）培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、
（３）清浄細胞をＭＢＰの存在下で培養し、および
（４）培養上清中のＨＩＶ由来のｐ２４蛋白を測定する、
工程を含む、ことを特徴とするＭＢＰの抗ＨＩＶ作用の評価方法。
【請求項１９】
ＭＢＰの抗ＨＩＶ作用の評価方法であって、以下の工程、すなわち；
（ａ）ＨＩＶとＭＢＰとが共存する第一混合系を培養し、
（ｂ）標的細胞とＭＢＰとが共存する第二混合系を培養し、
（ｃ）第一混合系と第二混合系とを合一して感染細胞を得、
（ｄ）得られた感染細胞を培養し、
（ｅ）培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、
（ｆ）清浄細胞を培養し、および
（ｇ）培養上清中のＨＩＶ由来のｐ２４蛋白を測定する、
工程を含む、ことを特徴とするＭＢＰの抗ＨＩＶ作用の評価方法。
【請求項２０】
前記工程（ａ）および（ｂ）が、並行して実施される請求項１９に記載の評価方法。
【請求項２１】
前記工程（ｆ）が、清浄細胞をＭＢＰの存在下で培養する請求項１９または２０に記載の評価方法。
【請求項２２】
前記抗ＨＩＶ作用が、ＨＩＶ増殖抑制作用である請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項２３】
前記増殖抑制作用が、ＨＩＶ中和作用である請求項２２に記載の評価方法。
【請求項２４】
前記増殖抑制作用が、ＨＩＶ発芽抑制作用である請求項２２に記載の評価方法。
【請求項２５】
前記ＭＢＰが、ヒト血清から単離および精製される請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項２６】
前記ＭＢＰが、動物細胞から遺伝子工学的に分泌される請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項２７】
前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項２６に記載の評価方法。
【請求項２８】
前記ＨＩＶが、ＨＩＶタイプ１のグループＭのサブタイプＢに属するＨＩＶ株である請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項２９】
前記ＨＩＶが、ＨＩＶタイプ１のグループＭのサブタイプＤに属するＨＩＶ株である請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３０】
前記ＨＩＶが、組換え型流行株である請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３１】
前記組換え型流行株が、ＣＲＦ０１＿ＡＥである請求項３０に記載の評価方法。
【請求項３２】
前記ＨＩＶが、ＣＣＲ５に対して指向性を有するウィルスである請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３３】
前記ＨＩＶが、ＣＸＣＲ４に対して指向性を有するウィルスである請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３４】
前記ＨＩＶが、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３５】
前記ＨＩＶが、マクロファージに対して指向性を有するウィルスである請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３６】
前記ＨＩＶが、Ｔ細胞に対して指向性を有するウィルスである請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３７】
前記ＨＩＶが、マクロファージおよびＴ細胞の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項１８または１９に記載の評価方法。
【請求項３８】
請求項１８または１９に記載の評価方法によって決定された抗ＨＩＶ作用を有するＭＢＰ。
【請求項３９】
ＭＢＰを有効成分とする抗ＨＩＶ剤のＨＩＶ感染者への使用。
【請求項４０】
前記ＨＩＶ感染者が、ＣＣＲ５に対して指向性を有するウィルスによる罹患者である請求項３９に記載の抗ＨＩＶ剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、マンノース結合タンパク質（ＭＡＮＮＯＳＥ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ、以下、単に「ＭＢＰ」と称する）の新規用途、特に、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＵＭＡＮ  ＩＭＭＵＮＯＤＥＦＩＣＩＥＮＣＹ  ＶＩＲＵＳ、以下、単に「ＨＩＶ」と称する）を原因とする感染症の治療の際に用いる抗ＨＩＶ剤でのＭＢＰの利用に関する。
【背景技術】  ＭＢＰは、マンナン結合タンパク質、マンナン結合レクチン、マンノース結合レクチンなどと称されている物質であって、その分子内部にコラーゲン様構造およびカルシウム要求性の糖認識領域を有するＣ型レクチン、すなわち、コレクチンに属する物質である［Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９５，ｐｐ．６５８−６６４（１９８０）］。
図４を参照すれば、ＭＢＰは、一般に、そのＮ末端側からＣ末端側（図４の左端から右端）に向けて、Ｎ末端領域（システインリッチ領域）、コラーゲン様領域、ネック領域、および糖認識領域（ＣＲＤ）の４つの領域から構成されている。そして、ネック領域およびコラーゲン様領域でのヘリックス構造によって、１本当たり約３０ｋＤａ〜約３３ｋＤａの３つのポリペプチドが分子間結合して、約９０ｋＤａ〜約９９ｋＤａの１つのサブユニット構造（３量体）が形成されている。そして、このサブユニット構造の２〜６個が、さらにブーケ様に結合してホモオリゴマー構造を形成している。
ＭＢＰに関するこれまでの基礎研究から、生体内に進入してきた微生物に対して、ＭＢＰは、当該微生物表面の糖鎖に結合して、補体系を活性化させて、微生物感染の初期防御に関与していることが示唆されている［Ｈｏｌｍｓｋｏｖ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１５，ｐｐ．６７−７４（１９９４）およびＴｕｒｎｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７，ｐｐ．５３２−５４０（１９９６）］。それに加えて、ＭＢＰの欠損者では、感染症が起こりやすいこと［Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４５，ｐｐ．８８６−８８９（１９９５）］、動脈硬化性アテローム患者にＭＢＰ欠損者が多いこと［Ｍａｄｓｅｎ，Ｈ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３５２，ｐｐ．９５９−９６０（１９９８）］、ＭＢＰ遺伝子変異によって重症マラリアになりやすいこと［Ｌｕｔｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７８，ｐｐ．１２２１−１２２４（１９９８）］、それに、ＭＢＰ遺伝子変異により嚢胞性線維症において肺での感染症を重症化させること［Ｇａｒｒｅｄ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４，ｐｐ．４３１−４３７（１９９９）］、などがこれまでに報告されている。
さらに、ＭＢＰの治療薬用途に向けた検討として、ＭＢＰ欠損患者にＭＢＰを投与することで、補体依存性のオプソニン活性の正常化が起こり、易感染性が改善されることが報告されている［Ｖａｌｄｉｍａｒｓｓｏｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４８，ｐｐ．１１６−１２３（１９９８）］。また、嚢胞性繊維症の患者にＭＢＰを投与したところ、患者の臨床症状は安定化したことも報告されている［Ｇａｒｒｅｄ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．，３３（３），ｐｐ．２０１−２０７（２００２）］。
ところで、ＨＩＶの感染者数は世界規模で年々増加し続けており、その多くは、発展途上国で発生しており、これらの国々では、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者の急増という事態を招いている。特に、タイ国のクレイドＥ型と呼ばれるウィルス（サブタイプＥ型ウィルス）は、極めて感染力が高く、世界保健機構（ＷＨＯ）では、サブタイプＥ型ウィルスによる感染者が、今後、世界で最も多くなると予測している。
日本では、欧米と同様に、サブタイプＢ型ウィルスによる感染者が多かったが、最近になって、サブタイプＥ型ウィルスによる感染者も増加する傾向にある。
ＨＩＶ感染症に効果的に対応するには、新規の感染者数の発生を予防すること、すなわち、ワクチンの開発が緊急の課題とされている。とりわけ、米国やフランスなどでは、ワクチンの研究が積極的に進められているが、現在研究中のワクチンは、サブタイプＢ型ウィルスに対処するものであって、サブタイプＥ型ウィルスに対するワクチンの研究は、未だにほとんどなされていないのが現状である。さらに、サブタイプＤ型ウィルスとしては、アジアや中央アフリカに主に分布している、劇症型を示すＮＤＫ株が知られている。
前述したように、サブタイプＢ型ウィルスは、広く世界に分布している実情があるにもかかわらず、未だにそのワクチンは研究中であり、その実用化がほど遠いのが現状である。また、サブタイプＥ型ウィルス、ＣＲＦ０１＿ＡＥは、感染力が強く今後その感染範囲の拡大が予測されており、そして、サブタイプＤ型ウィルスには、劇症型を示すものがある。従って、このようなサブタイプに属するウィルスに対して効果的な薬剤の開発も待望されているのが実情である。
また、エイズ（ＡＩＤＳ）ワクチンには、エイズウィルスのウィルス粒子をそのまま使う生ワクチン、ウィルス粒子の一部分を用いるコンポーネントワクチン、ウィルス遺伝子の組換えを行って得たリコンビナントワクチン、ウィルスを死滅させてその蛋白構造のみを保った死菌ワクチンなどが研究されている。しかしながら、それらの実用性を考慮すると、ＨＩＶ感染の防御効果、すなわち、有効性（免疫能の誘導）のみならず、その安全性も考慮する必要がある。
現在のところ、エイズの治療においては、多剤併用療法（ＨＡＡＲＴ）がよく使われている。ＨＡＡＲＴ療法が提唱された当時は、画期的な化学療法と言われたが、現在では、薬剤耐性ウィルスの出現、ＨＩＶの高度ゲノム変異、長期および大量服用による副作用などの問題が認知されたこともあって、使用する薬剤の選択および使用方法が極めて複雑になってきている。
ＨＩＶは、高度のゲノム多様性を有するウィルスであり、その原因は、主として２つあると考えられている。
まず第一に、ＨＩＶゲノムの複製エラーによる多様性の増大が挙げられる。通常、ゲノムＲＮＡから逆転写酵素によってＤＮＡが作られ、その後、宿主細胞ゲノムに組み込まれるという複製過程をとっている。逆転写酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているため、複製された塩基配列に対する校正機能を有していない。また、逆転写酵素の基質特異性が低いので、逆転写反応の際に塩基の置換、欠失、挿入、重複などの変異が、極めて高頻度に発生する［Ｍａｎｓｋｙ，Ｌ．Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，ｐｐ．１３３７−１３４５（１９９８）］。
しかも、ＨＩＶは、生体内で１０９−１０／日の割合で増殖し［Ｐｅｒｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１，ｐｐ．１５８２−１５８６（１９９６）］、年間３００サイクルの複製が繰り返されていると考えられている。従って、ＨＩＶに感染すると同時に変異の蓄積がはじまり、さらなるゲノムの多様性が生じることとなる。
次に、異系統のウィルス間の遺伝子組換えによる多様性の増大が挙げられる。ＨＩＶが属するレトロウィルスの遺伝学的組換えは、通常、ウィルス粒子内への相同性のある２つのＲＮＡゲノムの取り込みと、逆転写酵素による鋳型乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈ）機能によって奏する強制コピー選択（ｆｏｒｃｅｄ  ｃｏｐｙ  ｃｈｏｉｃｅ）［Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，４２，ｐｐ．１−２６（１９７９）］と称するメカニズムとによって、高頻度に生じることが知られている［Ｊｅｔｚｔ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，ｐｐ．１２３４−１２４０（２０００）］。従って、このような高度のゲノム多様性を獲得することで、ＨＩＶの準種性、サブタイプの分化、組換えウィルスの出現、薬剤耐性変異、ＣＴＬエスケープ変異などを引き起こすものと考えられている。
ＨＩＶは、遺伝学的系統によって、ＨＩＶタイプ１（ＨＩＶ−１）とＨＩＶタイプ２（ＨＩＶ−２）の２種に大別され、ＨＩＶ−１は、さらにグループＭ、グループＯおよびグループＮに分類される。
グループＭは、ＨＩＶ−１の中で最も主要なグループであり、サブタイプＡ〜Ｄ、Ｆ〜Ｈ、ＪおよびＫの９種に分類されている。サブタイプＡおよびＦは、それぞれ、サブ−サブタイプＡ、Ａ２およびＦ１、Ｆ２にさらに分類されている。
なお、サブタイプＥは、現在のところ、ＣＲＦ０１＿ＡＥとして分類されつつあるので、本明細書では、サブタイプＥを、「ＣＲＦ０１＿ＡＥ」（前出）とする。
ＨＩＶ−２は、サブタイプＡ〜Ｇに分類されている［Ｃｈａｒｎｅａｕ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０５，ｐｐ．２４７−２５３（１９９４）；Ｇｕｒｔｌｅｒ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，ｐｐ．１５８１−１５８５（１９９４）；Ｓｉｍｏｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４，ｐｐ．１０３２−１０３７（１９９８）；Ｔｒｉｑｕｅｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１６，ｐｐ．１３９−１５１（２０００）；Ｒｏｂｅｒｔｏｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，ｐｐ．５５−５６（２０００）；Ｔｒｉｑｕｅｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５９，ｐｐ．９９−１０９（１９９９）］。
また、ＨＩＶの組換えウィルスの分類として、組換え型流行株（ＣＲＦｓ：ＣＲＦ０１〜ＣＲＦ１２）、孤立型組換えウィルス（ＵＲＦｓ：ＵＲＦｓＡ／Ｃ、ＵＲＦｓＡ／Ｄ、ＵＲＦｓＢ／Ｅ、ＵＲＦｓＢ／Ｃ）、帰属不明の組換えウィルス（ＭＡＬ株）、グループＭ／Ｏ間組換えウィルスなどが報告されている［Ｃａｒｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２４７，ｐｐ．２２−３１（１９９８）；Ｍｏｔｏｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１６，ｐｐ．１８３１−１８４３（２０００）；Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，ｐｐ．７３６８−７３７５（１９９９）；Ｔａｋｅｈｉｓａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，ｐｐ．６８１０−６８２０（１９９９）；武部豊、日本ウィルス学会雑誌，５０（２），ｐｐ．１２３−１３８（２００１）］。
ＨＩＶの糖蛋白質として、エンベロープ糖蛋白質であるｇｐ１２０と、膜貫通糖蛋白質であるｇｐ４１とがある。これら糖蛋白質は、ウィルスゲノム状の「ｅｎｖ」と称する遺伝子でコードされたｇｐ１６０が、宿主のプロテアーゼで切断されて生じる［Ｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６０，ｐｐ．３５８−３６１（１９９２）］。
ｇｐ１２０には、Ｎ−結合型糖鎖結合部位が２４箇所存在し［Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｃ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，ｐｐ．１０３７３−１０３８２（１９９０）］、糖鎖はｇｐ１２０分子の約半分を占めている［Ａｌｌａｎｓ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，ｐｐ．１０９１−１０９４（１９８５）］ので、ＨＩＶは糖鎖で覆われたウィルスであるといえる。ＨＩＶの標的細胞への感染には、ｇｐ１２０の糖鎖が必要であることが種々の実験により証明されている［Ｆｅｎｎｉｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３，ｐｐ．６３９−６４６（１９８９）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，ｐｐ．５４２４−５４２８（１９８７）；Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐｐ．９２４８−９２５２（１９８８）；Ｐａｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，ｐｐ．３３８４−３３８８（１９８９）］。
ところで、ＨＩＶ−１粒子が細胞に感染する際の作用機構として、まず、細胞膜上のＣＤ４にｇｐ１２０が結合し、次いで、コレセプター（ケモカインレセプター）にｇｐ１２０のＶ３ループが結合し、次いで、ｇｐ４１が細胞膜に侵入して膜融合を引き起こす、との一連の作用が考えられていいる。これまでに多様なケモカインレセプターが報告されており、例えば、ＣＣＲ５（マクロファージ指向性ウィルスのコレセプター）、ＣＸＣＲ４（Ｔ細胞指向性ウィルスのコレセプター）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６／ＳＴＲＬ３３およびＣＸ３ＣＲ１などが報告されている。ＨＩＶの分類方法として、前述した遺伝学的系統による方法の他に、これらケモカインレセプターに基づいて分類する方法もある。例えば、コレセプターとしてＣＣＲ５を介するウィルスはＣＣＲ５（単にＲ５とも称する）指向性ウィルス、コレセプターとしてＣＸＣＲ４を介するウィルスはＣＸＣＲ４（単にＸ４とも称する）指向性ウィルス、同様にして、ＣＣＲ１指向性ウィルス、ＣＣＲ２ｂ指向性ウィルスなどに分類される。これらの中でも、特に、Ｒ５指向性ウィルスは、マクロファージ指向性のウィルスであり、また、Ｘ４指向性ウィルスは、Ｔ細胞指向性ウィルスに分類される。また、Ｒ５Ｘ４指向性ウィルスは、マクロマージおよびＴ細胞の双方に対して指向性を示すウィルスに分類される。
ＭＢＰとＨＩＶとの関係に関して、ＭＢＰのホモ遺伝子変異を有するヒトにおいてＨＩＶの感染のリスクが高く、また、ＡＩＤＳ診断後の生存期間が短いことが報告されている［Ｇａｒｒｅｄ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４９，ｐｐ．２３６−２４０（１９９７）］。しかし、その後、逆に遺伝子変異のあるグループの方がＡＩＤＳに移行しにくいという報告［Ｍａｓｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｉｄｓ，１２，ｐｐ．２２７５−２２８０（１９９８）］がされたり、遺伝子変異とＡＩＤＳの予後とは関係ないという報告［ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ＳＴＤ．ＡＩＤＳ．，９，ｐｐ．６８３−６８８（１９９８）］もされている。さらに、ＭＢＰが、ｇｐ１２０と結合することが報告されている［Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ，３，ｐｐ．７９３−７９８（１９８９）；Ｍｉｚｕｏｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，ｐｐ．１３８３４−１３８３９（１９８９）；Ｓａｉｆｕｄｄｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１，ｐｐ．９４９−９５５（２０００）］。
しかしながら、ＭＢＰによる抗ＨＩＶ作用の有無、それに、ＭＢＰによるＨＩＶ増殖抑制作用の有無については全く不明であった。これらは、ＭＢＰを抗ＨＩＶ剤として利用する上での有用性を判定する際の最も重要な要素であるにもかかわらず、これまで、一切証明がなされていなかったことを指し示すものである。
また、ＭＢＰの抗ＨＩＶ作用を評価できる評価系も存在していなかったので、ＭＢＰを利用した抗ＨＩＶ剤の開発が進展していない状況にあった。
また、ＨＩＶを薬剤治療するにあたって懸念される薬剤耐性ウィルスの出現、ＨＩＶの高度ゲノム変異、長期および大量服用による副作用などの問題が未解決のままである。さらに、ワクチンの開発も困難を極め、特に、サブタイプＥの研究は全く進んでいないのが実情である。
ところで、Ｒ５指向性ウィルスは中和抗体によって中和されにくく、病態進行に深く関わっていることが判明している。とりわけ、感染初期におけるＲ５指向性ウィルスに対する治療方法が、患者の予後に重大な影響を及ぼすものと考えられているため、初期感染時でのＲ５指向性ウィルスへの的確な対処が要求される。また、感染伝播するＨＩＶのほとんどがＣＣＲ５指向性ウィルスであることから、ＣＣＲ５が、予防治療や感染・伝播抑制の標的としても注目を浴びている。一方で、臨床経過が進行して病態が後期段階に近づくにつれて、ＣＣＲ５指向性ウィルスからＣＸＣＲ４指向性ウィルスへの移行が進み、後期段階に至ると、ＣＸＣＲ４指向性ウィルスの存在が顕著となることが知られている。
このようなケモカインレセプターの存在が判明したのはごく最近であり、これらケモカインレセプターを標的とする治療薬の開発は、未だ基礎研究段階でしかない。これらケモカインレセプターの阻害剤についての開発も行われているが、ＣＣＲ５阻害薬を投与した場合には、ＣＸＣＲ４指向性ウィルスの出現を速め、病態進行の助長に至ることが危惧されているなど、懸念すべき重大な問題が未解決のままとなっている。
それゆえ、臨床医からは上記した一連の問題を回避でき、しかも、安全でかつＨＩＶウィルスのサブタイプ、ケモカインレセプターに対する指向性、それにマクロファージやＴ細胞への指向性などの諸要素に関係なく抗ＨＩＶ作用を示す薬剤の開発が切望されているのである。
とりわけ、サブタイプＢ型ウィルス、ＣＲＦ０１＿ＡＥ、サブタイプＤ型ウィルスに対して抗ウィルス作用を示す薬剤の開発、それに、ＣＣＲ５指向性ウィルス、ＣＸＣＲ４指向性ウィルス、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４指向性ウィルスに抗ＨＩＶ作用を示す薬剤の開発が望まれているのである。そして、同様に、マクロファージ指向性ウィルス、Ｔ細胞指向性ウィルス、マクロファージ／Ｔ細胞指向性ウィルスに対して抗ＨＩＶ作用を示す薬剤の開発も待望されているのである。
【発明の開示】
本発明は、上記従来技術で指摘されていた問題点に鑑みて発明されたものであり、とりわけ、本発明者らは、ＭＢＰの抗ＨＩＶ作用を定量可能な評価系を初めて確立したのである。また、その評価系を利用することで、ＭＢＰによる抗ＨＩＶ作用、つまり、ＨＩＶ増殖抑制作用を初めて証明して、抗ＨＩＶ剤としてのＭＢＰの用途を切り開いたのである。そして、本発明者らは、ＭＢＰが、サブタイプＥ型ＨＩＶは勿論、その他のクレイド（サブタイプ）に属するＨＩＶに対しても抗ＨＩＶ作用を示すことを証明したのである。
すなわち、本発明の要旨とするところは、ＭＢＰを有効成分とする抗ＨＩＶ剤にある。ＭＢＰを有効成分とする本発明の抗ＨＩＶ剤によれば、ＭＢＰの標的が糖鎖であるため、ＨＩＶゲノム変異によるＭＢＰ耐性株の出現による影響を受けにくい点で有利である。また、ＭＢＰは、生体に常在する物質であるため、従来の化学療法に使用される化合物で認められる副作用が生じないという利点がある。
そして、本発明の他の態様によれば、抗ＨＩＶ作用の評価方法、すなわち、
（１）標的細胞とＨＩＶとを共存せしめて得られた感染細胞を培養し、
（２）培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、
（３）清浄細胞をＭＢＰの存在下で培養し、および
（４）培養上清中のＨＩＶ由来のｐ２４蛋白を測定する、
工程を含んだ、ＭＢＰが奏する抗ＨＩＶ作用の評価方法も提供される。
また、本発明の別の態様によると、抗ＨＩＶ作用の他の評価方法、すなわち、
（ａ）ＨＩＶとＭＢＰとが共存する第一混合系を培養し、
（ｂ）標的細胞とＭＢＰとが共存する第二混合系を、好ましくは、第一混合系と並行して培養し、
（ｃ）第一混合系と第二混合系とを合一して感染細胞を得、
（ｄ）得られた感染細胞を培養し、
（ｅ）培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、
（ｆ）清浄細胞を、好ましくは、ＭＢＰの存在下で培養し、および
（ｇ）培養上清中のＨＩＶ由来のｐ２４蛋白を測定する、
工程を含んだ、ＭＢＰが奏する抗ＨＩＶ作用の評価方法も提供される。
これら評価方法によって、ＭＢＰが潜在的に保有している抗ＨＩＶ作用が、客観的に容易に確認および検証することが可能となる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＨＩＶ感染細胞ＮＤＫ／Ｍ８１６６における組換え型マンノース結合タンパク質（ｒＭＢＰ）とＨＩＶ活性との相関を示すグラフである。
第２図は、ＨＩＶ感染細胞ＬＰ６５／Ｍ８１６６における組換え型マンノース結合タンパク質（ｒＭＢＰ）とＨＩＶ活性との相関を示すグラフである。
第３図は、ＨＩＶ感染細胞ＮＤＫ／Ｍ８１６６における天然型マンノース結合タンパク質（ｎＭＢＰ）とＨＩＶ活性との相関を示すグラフである。
第４図は、マンノース結合タンパク質の構造を示す概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の抗ＨＩＶ剤は、有効成分として用いたＭＢＰが奏するＨＩＶ増殖抑制作用、例えば、ＨＩＶ中和作用やＨＩＶ発芽抑制作用などを利用するものであるため、エイズ患者およびＨＩＶ感染者の治療および病態進行の抑制に有用である。
また、本発明の抗ＨＩＶ剤での有効成分であるＭＢＰは、天然物および合成物（組換体を含む）の別を問わず、所定のＨＩＶ増殖抑制作用を奏するものであればいずれでも可能である。とりわけ、ＭＢＰとして、ヒト血清から単離および精製されたＭＢＰや、動物細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（以下、単に、「ＣＨＯ細胞」と称する）から遺伝子工学的に分泌されたＭＢＰが、本発明において好適に利用可能である。
本発明で適用可能なＭＢＰの一つである組換え型ヒトマンナン結合タンパク質（以下、単に「ｒｈＭＢＰ」と称する）は、例えば、国際公開公報第ＷＯ９９／３７６７６号を参照すれば、以下の工程、すなわち、（ｉ）天然型ヒトマンナン結合タンパク質（以下、単に「ｎｈＭＢＰ」と称する）のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）の６６ｂｐ〜８１２ｂｐに対応する７４７個の連続するポリヌクレオチド（配列番号：２）をプラスミドｐＮＯＷ１に挿入して、発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰを構築し、（ｉｉ）発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰを、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ｄｈｆｒ−）のＣＨＯ細胞に導入して形質転換体を得、（ｉｉｉ）得られた形質転換体をネオマイシンを含んだ培養培地にて培養して、ネオマイシン耐性細胞を取得し、（ｉｖ）選択したネオマイシン耐性細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）を含んだ培養培地にて培養して、メトトレキセート耐性の細胞を取得し、および（ｖ）選択したメトトレキセート耐性細胞からｒｈＭＢＰを回収する、との一連の工程を経ることによって製造可能である。
前述した製造方法の詳細は、以下のように説明される。
まず、発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰの構築を行う。ｎｈＭＢＰを構成するアミノ酸は、Ｈｅｒｍａｎらによって、すでに解析および報告されている［Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ．Ｅｘｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｉｔｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １０”，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０（４），ｐｐ．１１７５−１１８９（１９８９）］。ｎｈＭＢＰを構成するアミノ酸配列を、配列番号：３に示した。
これら配列情報を踏まえて、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クローンラック社製）から、ｎｈＭＢＰの開始コドンからストップコドンまでを増幅させ、得られたｎｈＭＢＰのｃＤＮＡを制限酵素で消化して、ｎｈＭＢＰのｃＤＮＡの６６〜８１２ｂｐに対応する７４７個の連続するポリヌクレオチド（配列番号：２）を取得し、これを挿入体とする。次に、発現ベクターｐＮＯＷ１を、制限酵素で消化して、ｐＣＭＶとＢＧＰポリＡの間に、前述の挿入体をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）を用いて挿入する。このようにして得られた発現ベクターを、プラスミｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰと命名する。
次に、発現クローンの選択を行う。ジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ｄｈｆｒ−）のＣＨＯ細胞への発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰの導入は、以下のようにして行う。ウシ胎児血清添加ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を調製し、これに（ｄｈｆｒ−）ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞株を混合し、３７℃で、５％炭酸ガスの条件下で、２４時間培養する。培養上清を廃棄して、その代わりに、発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰをリポフェクチン溶液に混合して、これに予め調製しておいた溶液を含むＦＣＳ添加ＩＭＤＭを加え、さらにヒポキサンチン（ＧＩＢＣＯ社製）とチミジン（ＧＩＢＣＯ社製）を加えた後に培養を行って、ｄｈｆｒ−の宿主ＣＨＯ細胞への発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰの導入を行う。その後、培養上清を廃棄し、ＦＣＳ、ヒポキサンチン、チミジン添加ＩＭＤＭを加え、さらに培養を行う。
ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性ＣＨＯ細胞を取得するために、発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＭＢＰが導入された細胞を培養した後、これをトリプシン処理し、ネオマイシン（Ｇ４１８）を含むＦＣＳ添加ＩＭＤＭで細胞を懸濁する。この懸濁物を、その後、マイクロプレートに播種し、３７℃、５％炭酸ガス（ＣＯ２）の条件下で、２週間培養することで、ネオマイシン耐性の細胞（クローン）が出現する。
ｒｈＭＢＰの産生が確認されたクローンの中からいくつかを選択し、各クローンの培養を行う。各培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成のＦＣＳ添加ＩＭＤＭを加え、４日間培養し、その培養上清を回収する。回収した培養上清中のｒｈＭＢＰの産生量を測定する。なお、ｒｈＭＢＰの産生量は、対照としてのｎｈＭＢＰ、コレクチンの糖認識領域（ＣＲＤ）とネック領域に対する（大腸菌で発現させた）抗ウサギポリクローナル抗体およびｎｈＭＢＰ（定量対象）を用いて、鈴木らの方法［Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｃｏｎｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ  ａ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３８，ｐｐ．８５６−８６３（１９９７）］に準じて定量することができる。
メトトレキセート耐性のＣＨＯ細胞の取得には、ｒｈＭＢＰ産生クローンをさらに継代培養して安定化させた後、低濃度のメトトレキセートを培地に加えて遺伝子増幅を行う。まず、メトトレキセート、ネオマイシン（Ｇ４１８）を加えた１０％透析済ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンス社製）添加ＩＭＤＭに、選択した各細胞クローンを混合し、播種した。３７℃、５％炭酸ガス（ＣＯ２）の条件下で、２週間培養を行うことにより、メトトレキセート耐性の細胞（クローン）が現れる。これらメトトレキセート耐性のクローンのｒｈＭＢＰ産生性を確認すると、高水準の産生レベルが確認される。
これらクローンから任意のクローンを選択し、それぞれを播種し、２週間培養する。培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成のＦＣＳ添加ＩＭＤＭ（メトトレキセート、ネオマイシン（Ｇ４１８）を加えたもの）を加え、４日間培養し、その培養上清を回収し、ｒｈＭＢＰの産生レベルを確認する。
ｒｈＭＢＰを精製するために、得られたクローンの中で最も産生効率の高いクローンを、播種し、培養する。そして、培養上清を廃棄し、メトトレキセート、ネオマイシン（Ｇ４１８）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（ビタミンＣを添加する場合は終濃度が１００ｍＭになるようにビタミンＣを添加）を加え、４日間培養する。その培養上清を回収し、ＴＢＳ（ＴＢＳ  ｐｏｗｄｅｒ（宝酒造社製）より調製）に対して透析を行い、次いで、ＴＢＳＣ（５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＴＢＳ）に対して透析を行う。その後、マンナン−アガロース（ＳＩＧＭＡ社製）により精製を行う。すなわち、マンナン−アガロースをカラム（Ｃｏｌｕｍｎ  ＰＤ−１０、Ｅｍｐｔｙ、ファルマシア社製）に詰め、そこに透析済の培養液を通し、ＴＢＳＣで洗浄後、ＴＢＳＥ（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＴＢＳ）で溶出する。溶出後、終濃度が１５ｍＭになるように１Ｍ  ＣａＣｌ２を加える。そして、再度、マンナン−アガロースに適用し、ＴＢＳＣで洗浄後、１００ｍＭのマンノースを含むＴＢＳで溶出する。その後に、改めて、ＴＢＳＣに対して透析を行って、ｒｈＭＢＰの精製品を得る。
このようにして得られた精製ｒｈＭＢＰは、ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した際の２８０ｎｍでの吸光度が、１，０００〜１，３００ｋＤａの分子量、特に１，１５０ｋＤａの分子量にて特異的なピークを示す。また、２００〜４００ｋＤａの分子量、特に３００ｋＤａの分子量にて特異的なピークを示す。なお、ｒｈＭＢＰのゲル濾過クロマトグラフィー分析は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを用い、流速０．５ｍｌ／分で、スーパーロース６  ＨＲ１０／３０（φ１０ｍｍ×長さ３００ｍｍ；ファルマシア社製）の条件で実施する。そして、４０μｇのｒｈＭＢＰを、このカラムに流し、２８０ｎｍの吸光度で測定する。
なお、国際公開公報第ＷＯ９９／３７６７６号に記載の方法に従って合成されたｒｈＭＢＰを、本発明の抗ＨＩＶ剤の有効成分として使用する場合には、前出の精製ｒｈＭＢＰを用いるのが好ましい。この精製ｒｈＭＢＰを、さらにゲル濾過クロマトグラフィーに適用した際に得られる、２８０ｎｍでの吸光度測定によって、１，０００〜１，３００ｋＤａの分子量に現れる分画物、２００〜４００ｋＤａの分子量に現れる分画物、またはこれら分画物の双方を含む精製ｒｈＭＢＰを用いることもできる。
そして、本発明の抗ＨＩＶ剤は、いずれのタイプのＨＩＶ株に対しても有効に作用するものであるが、後述の実施例の記載からも明らかなように、ＨＩＶ−１のグループＭのサブタイプＢに属するＨＩＶの他、ＨＩＶ−１のグループＭのサブタイプＤに属するＨＩＶや、組換え型流行株、特に、ＣＲＦ０１＿ＡＥ株に対して顕著な抗ＨＩＶ作用を奏する。
また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、ＣＣＲ５指向性ウィルス、ＣＸＣＲ４指向性ウィルス、およびＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４指向性ウィルスに対しても顕著な抗ＨＩＶ作用を奏する。さらに、本発明の抗ＨＩＶ剤は、マクロファージ指向性ウィルス、Ｔ細胞指向性ウィルス、およびマクロファージ／Ｔ細胞指向性ウィルスに対しても、同様に顕著な抗ＨＩＶ作用を呈する。
本発明の抗ＨＩＶ剤を、エイズ治療剤またはＨＩＶ感染の病態進行抑制剤として用いる場合、生体へのタンパク質の取り込みに好都合な剤型および投与経路（静脈内投与など）を選択するのが好ましい。例えば、本発明の医薬組成物の投与方法として、静脈内投与以外に、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与、経口投与などが適宜選択でき、その投与方法に応じて、種々の形態の製剤として用いることができる。以下に、静脈投与製剤について記載するが、本発明において用いられる剤型は、これらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種製剤を利用することができる。
日本人（４７９例）におけるＭＢＰの遺伝子変異および血中ＭＢＰ濃度を検討したところ、ＭＢＰの遺伝子変異は、コドン５４（ＧＧＣ→ＧＡＣ）にのみ認められ、各ジェノタイプの比率は、Ｗｉｌｄ／Ｗｉｌｄで７０．８％、Ｗｉｌｄ／ｍｕｔａｎｔで２２．５％、ｍｕｔａｎｔ／ｍｕｔａｎｔで６．７％であることが報告されている。また、血中ＭＢＰ濃度は、Ｗｉｌｄ／Ｗｉｌｄで０．１８〜４．３５μｇ／ｍｌ（平均１．２６μｇ／ｍｌ）、Ｗｉｌｄ／ｍｕｔａｎｔで０．００〜０．８０μｇ／ｍｌ（平均０．２３μｇ／ｍｌ）、ｍｕｔａｎｔ／ｍｕｔａｎａｔで０．００〜０．２０μｇ／ｍｌ（平均０．０４μｇ／ｍｌ）であることも報告されている［芥子宏行ら、医学のあゆみ，１９４（１２），ｐｐ．９５７−９５８（２０００）］。
本発明の抗ＨＩＶ剤を、エイズ治療剤またはＨＩＶ感染後の病態進行抑制剤として用いる場合、本発明の抗ＨＩＶ剤の静脈内投与量は、健常人の血中ＭＢＰ濃度が約１μｇ／ｍｌ〜約１．５μｇ／ｍｌであるので、血中ＭＢＰ濃度をＥＬＩＳＡなどの手法により測定した後、Ｃ型肝炎などの肝障害によりＭＢＰの産生量が低下したり、あるいは遺伝子変異によって血中濃度が低い場合には、まずは、血中ＭＢＰ濃度を約１μｇ／ｍｌ〜約１．５μｇ／ｍｌとなるように投与量を決定してもよい。そして、ＨＩＶ−ＲＮＡ量およびＣＤ４陽性細胞数を定期的にモニタリングし、モニタリングの結果とＭＢＰ投与量との関係を把握した上で、有効血中ＭＢＰ濃度値を決定する必要がある。血中ＭＢＰ濃度が正常値であれば、徐々に血中濃度を高くして（例えば、約１．５μｇ／ｍｌ〜約５．０μｇ／ｍｌ）、ＨＩＶ−ＲＮＡ量およびＣＤ４陽性細胞数を定期的にモニタリグし、モニタリングの結果とＭＢＰ投与量との関係を把握した上で、有効血中ＭＢＰ濃度値を決定すればよい。
ＭＢＰの有効血中濃度は、個人が生来有する血中ＭＢＰ濃度に左右されるため一定するものではないが、好ましくは、約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１．５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌに設定するのが好ましく、投与直前または投与直後の血中濃度は、これらの範囲外であってもよい。さらに、遺伝子変異によっても、血中ＭＢＰ濃度の低下が認められることから、ＭＢＰの投与量は、遺伝子変異も考慮して決定すべきである。
また、その剤型（経口投与剤、注射剤、座剤等の公知の剤型）に応じて、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を、製剤原料として加えることができる。
このような添加剤の具体例を、以下に例示するが、これらに限定されるものではない。
溶          剤：  精製水、注射用水、生理食塩水、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン。
賦    形    剤：  デンプン類、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール。
コーティング剤：  白糖、ゼラチン、酢酸フタル酸セルロース、および上掲の高分子賦形剤。
基          剤：  ワセリン、植物油、マクロゴール、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤。
結    合    剤：  デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ。
滑    沢    剤：  ステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類、コムギデンプン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール。
崩    壊    剤：  デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、セルロースおよびその誘導体、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース。
溶解補助剤    ：  シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール。
懸  濁  化  剤：  アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤。
粘    稠    剤：  カルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム。
乳    化    剤：  アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、各種界面活性剤、レシチン。
安    定    剤：  亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、キレート剤、不活性ガス、還元性物質。
緩    衝    剤：  リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸。
等  張  化  剤：  塩化ナトリウム、ブドウ糖。
無  痛  化  剤：  塩酸プロカイン、リドカイン、ベンジルアルコール。
保    存    剤：  安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール。
矯    味    剤：  白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン。
芳    香    剤：  トウヒチンキ、ローズ油。
着    色    剤：  水溶性食用色素、レーキ色素。
本発明の抗ＨＩＶ剤は、上掲した成分に加えて、製薬上許容される塩を含有することも可能である。製薬上許容される塩（類）としては、例えば、無機塩基、有機塩基等の塩基との塩、無機酸、有機酸、塩基性または酸性アミノ酸などの酸付加塩等が挙げられる。このような塩（類）の具体例を、以下に例示するが、これらに限定されるものではない。
無  機  塩  基：  ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム、アンモニウム等。
有  機  塩  基：  エタノールアミン等の第一級アミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等の第二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン等の第三級アミン。
無    機    酸：  塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸。
有    機    酸：  ギ酸、酢酸、乳酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸。
塩基性アミノ酸：  アルギニン、リジン、オルニチン。
酸  性アミノ酸：  アスパラギン酸、グルタミン酸。
【実施例】  以下に、本発明を実施例に沿って具体的に説明するが、これら実施例の開示によって本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
ところで、以下の実施例において実証された抗ＨＩＶ作用の語は、ＨＩＶに対する中和作用のみならず、ＨＩＶに対する発芽抑制作用をも包含するものであるが、便宜上、単に「中和作用」と記載する。
また、実施例１および２で用いたＨＩＶ株の詳細を、表１にまとめた。
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【実施例１】  本実施例では、ＭＢＰによる抗ＨＩＶ活性を検討した。
まず、ＨＩＶ株として、ＨＩＶ−ＮＤＫ実験株（サブタイプＤ；以下、単に「ＮＤＫ」と称する）と、組換え型流行株ＣＲＦ０１＿ＡＥ（臨床分離株；以下、単に「ＬＰ６５」と称する）とを準備した。
次に、これらＨＩＶ株で、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ））でブラスト化したヒト末梢血単核球（ヒトＰＢＭＣ；以下、単に「ＰＢＭＣ」と称する）とＴ細胞系の株化細胞Ｍ８１６６（以下、単に「Ｍ８１６６」と称する）を、それぞれ感染させた。
なお、ＮＤＫとＭ８１６６の双方は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍより入手可能な株である。
ところで、ＭＢＰとしては、ヒト血液より精製したｎｈＭＢＰと、国際公開公報第ＷＯ９９／３７６７６号に記載の方法により合成されたｒｈＭＢＰを用いた。
劇症型ウィルスであるＮＤＫを、ＰＢＭＣおよびＭ８１６６にそれぞれ添加し、これらを、３７℃で、１時間培養して感染させて得られた感染株を、それぞれＮＤＫ／ＰＢＭＣおよびＮＤＫ／Ｍ８１６６と称する。また、ＬＰ６５を、ＰＢＭＣおよびＭ８１６６にそれぞれ添加し、これらを３７℃で、１時間培養することによってＨＩＶ感染させた。なお、ＮＤＫおよびＬＰ６５の双方共に、１００ＴＣＩＤ５０のウィルスに相当する量を、５×１０６個／ｍｌの細胞に対して添加した。得られた感染細胞を、それぞれ「ＬＰ６５／ＰＢＭＣ」および「ＬＰ６５／Ｍ８１６６」と命名した。
その後、感染細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、４種のウィルス感染細胞（ＮＤＫ／ＰＢＭＣ、ＮＤＫ／Ｍ８１６６、ＬＰ６５／ＰＢＭＣ、ＬＰ６５／Ｍ８１６６）に、ｎｈＭＢＰまたはｒｈＭＢＰを、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度（図１）または１〜３０μｇ／ｍｌの濃度（図２〜図３）で添加した。この時の細胞の濃度は、２００μｌ当たり１×１０６個／ｍｌの濃度（すなわち、２×１０５個／２００μｌ）である。つまり、１／５規模の２００μｌの系内に、ＭＢＰ  １〜１００μｇ／１×１０６個／ｍｌまたはＭＢＰ  １〜３０μｇ／１×１０６個／ｍｌの濃度の細胞を置き、これをヒト血清添加培地で、３７℃、５％炭酸ガス存在下、１週間培養した。培養後のウィルス量の変化の指標として、培養上清中のＨＩＶ由来のｐ２４抗原量を全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスｆ：富士レビオ社製）を用いてＥＬＩＳＡ測定し、ＭＢＰ非添加群と比較した。
その結果、図３に記載のグラフにあるように、ｎｈＭＢＰ添加群にてＨＩＶ量の抑制（ＨＩＶ増殖抑制）が認められた。また、図１に記載のグラフから見てとれる通り、ＮＤＫ／Ｍ８１６６については、ｒｈＭＢＰ濃度が１０μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌの場合、培養上清中のｐ２４抗原量が、培養後速やかにｒｈＭＢＰ非添加群の約５０％にまで抑制されていたことが確認された。さらに、図２に記載のグラフから明らかなように、臨床分離株ＬＰ６５（ＨＩＶ−１の組換え型流行株ＣＲＦ０１＿ＡＥ）についても、ｒｈＭＢＰは、ＬＰ６５を濃度依存的に中和するＩＣ５０が、約１０μｇ／ｍｌの濃度で抗ＨＩＶ効果（ＨＩＶ増殖抑制効果）が認められ、つまり、その抗ＨＩＶ作用（中和作用）はサブタイプに関係なく認められた。
また、使用したＭＢＰ濃度範囲においては、ｎｈＭＢＰおよびｒｈＭＢＰのいずれでも、細胞に対する顕著な増殖抑制や細胞毒性は認められなかった。加えて、本実験系においては、ＨＩＶの発芽抑制作用、つまり、感染細胞からのＨＩＶの放出抑制作用も示唆されていた。
以上のことから、本発明の抗ＨＩＶ剤が、サブタイプＥ型ＨＩＶおよびサブタイプＤ型ＨＩＶの双方に対して抗ＨＩＶ作用を示すことが明らかとなった。同様に、本発明の抗ＨＩＶ剤が、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４指向性ウィルス、それに、マクロファージ／Ｔ細胞指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を示すことも明らかとなったのである。
【実施例２】  ＨＩＶ株として、９２Ｔｈ０１４実験株（サブタイプＢ）とＪＲＣＳＦ実験株（サブタイプＢ）を準備した。なお、これら実験株は、そのいずれもが、米国国立衛生研究所のＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍより入手可能である。また、ＰＢＭＣ、ｎｈＭＢＰおよびｒｈＭＢＰは、実施例１に記載のものを用いた。
まず、１００ＴＣＩＤ５０の力価に相当するウィルス溶液５０μｌと、その終濃度を２、６、２０、６０μｇ／ｍｌの濃度としたｎｈＭＢＰまたはｒｈＭＢＰの溶液５０μｌとを混合した。次いで、この混合溶液を、３７℃、５％炭酸ガス存在下で、１時間培養して、ｎｈＭＢＰまたはｒｈＭＢＰの終濃度が１、３、１０、３０μｇ／ｍｌに調整された第一混合系を調製した。
これと並行して、ＰＢＭＣを２×１０５個／５０μｌの濃度に調整し、これに、その終濃度を２、６、２０、６０μｇ／ｍｌの濃度としたｎｈＭＢＰまたはｒｈＭＢＰの溶液５０μｌとを混合した。次いで、この混合溶液を、３７℃、５％炭酸ガス存在下で、１時間培養して、ｎｈＭＢＰまたはｒｈＭＢＰの終濃度が１、３、１０、３０μｇ／ｍｌに調整された第二混合系を調製した。
次に、双方のＭＢＰ濃度（終濃度）が共に１、３、１０、３０μｇ／ｍｌのいずれかに調整された第一混合系と第二混合系液とを合わせて、３７℃で一昼夜培養した後、未反応のＭＢＰとウィルスを洗浄除去した。洗浄後、洗浄前のＭＢＰ終濃度と同じになるように、新鮮なｎｈＭＢＰまたはｒｈＭＢＰを添加し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地（インターロイキン−２を２０単位／ｍｌ、ペニシリンを５０単位／ｍｌ、ストレプトマイシンを５０単位／ｍｌ含有）で７日間培養した。培養後のウィルス量変化の指標として、培養上清中のＨＩＶ由来のｐ２４抗原量を、全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスｆ：富士レビオ社製）を用いてＥＬＩＳＡ測定し、ＭＢＰ非添加群と比較した。
その結果、野生株ウィルスであるＪＲＣＳＦおよび９２Ｔｈ０１４のいずれのウィルスに対しても有意な抗ＨＩＶ活性（ＨＩＶ増殖抑制活性）が認められた。ｐ２４抗原量を半減させるのに必要なＭＢＰの量（５０％抑制濃度）は、ＪＲＣＳＦの場合、ｎｈＭＢＰで０．１９μｇ、ｒｈＭＢＰで２．７４μｇ以下であった。同様に、９２Ｔｈ０１４の場合、ｎｈＭＢＰで７μｇ、ｒｈＭＢＰで１．５７μｇ以下であった。これらのことから、ＭＢＰは、野生型サブタイプＢのウィルス株に対しても優れた抗ＨＩＶ活性（中和活性）を示すことが明らかとなった。
また、本実施例での結果から、本発明の抗ＨＩＶ剤は、ＣＣＲ５指向性ウィルス、それに、マクロファージ指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を示すことが明らかとなった。さらに、本実施例にあっては、ＭＢＰがＣＣＲ５指向性ウィルスに対して抗ＨＩＶ用を示すことを直接的に証明していることから、ＭＢＰをＨＩＶ感染初期の治療のみならず、予防治療や感染・伝播抑制に対しても効果的に使用できることが判明したのである。さらに、本実施例では、本発明の抗ＨＩＶ剤が、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を呈することを直接的に証明できたことから、ＨＩＶ感染の感染初期のみならず、臨床経過が進行した病態においてもなお（つまり、ＨＩＶ感染者のみならずＨＩＶ患者にも）効果的であることが明らかになったのである。
実施例１および実施例２で得られた結果から、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４指向性ウィルスに対して抗ＨＩＶ作用を示したＭＢＰは、ＣＣＲ５指向性ウィルスに対しても同様の抗ＨＩＶ作用を示したことから、ＭＢＰはＣＸＣＲ４指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を示すものと考えられる。同じく、マクロファージ／Ｔ細胞指向性ウィルスに対して抗ＨＩＶ作用を示したＭＢＰは、マクロファージ指向性ウィルスに対しても同様の抗ＨＩＶ作用を示したことから、ＭＢＰはＴ細胞指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を示すものと考えられる。
実施例１および実施例２での実験結果から、本発明の抗ＨＩＶ剤が、ＣＣＲ５指向性ウィルス、ＣＸＣＲ４指向性ウィルス、それに、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を示すことが明らかになったのである。加えて、本発明の抗ＨＩＶ剤は、マクロファージ指向性ウィルス、Ｔ細胞指向性ウィルス、そして、マクロファージ／Ｔ細胞指向性ウィルスに対して抗ＨＩＶ作用を示すことも判明したのである。
【産業上の利用可能性】  ＭＢＰを有効成分とする本発明の抗ＨＩＶ剤は、活性の中和が最も困難とされている組換え型流行株ＣＲＦ０１＿ＡＥウィルスを含む多様なＨＩＶ株に対して中和活性を示す。つまり、本発明の抗ＨＩＶ剤は、ウィルスのサブタイプ、ケモカインレセプター指向性、マクロファージ／Ｔ細胞指向性の種類・程度に関係なく、とりわけ、現在のところ最も懸案となっている、サブタイプＢ型ＨＩＶ、サブタイプＤ型ＨＩＶ、それに、ＣＲＦ０１＿ＡＥに対して所定の抗ＨＩＶ作用を呈する。
また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、ＣＣＲ５指向性ウィルス、ＣＸＣＲ４指向性ウィルス、それに、ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を示す。さらに、本発明の抗ＨＩＶ剤は、マクロファージ指向性ウィルス、Ｔ細胞指向性ウィルス、そして、マクロファージ／Ｔ細胞指向性ウィルスに対しても抗ＨＩＶ作用を示す。
また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、糖鎖を標的にしているため、ＨＩＶゲノム変異によるＭＢＰ耐性株の出現の可能性が小さい。それに加えて、ＭＢＰ自体が生体内に常在するため、従来のＨＩＶ治療で利用されていた化合物に認められた副作用もない。
このように、本発明の抗ＨＩＶ剤は、ＨＩＶを原因とする感染症に多様に対応可能であり、その治療において極めて有用なものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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