(57)【要約】腫瘍細胞に起因する症状を改善するための一般式（１）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物である。一般式（１）2004002465.tif 000072（式中Ｒ１は水素またはＣ２−４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記式（Ａ）−（Ｂ）のいずれかで表される基である）2004002465.tif 000073（式中Ｒ３はＣ１−４のアルキル基である）
2004002465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善するための下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
2004002465.tif 000041
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000042
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２】
前記腫瘍細胞のアポトーシスによって、少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないで、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＮＦ−κＢの活性化を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記症状が、腫瘍転移であることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
血管内皮細胞との接着を阻害することにより、腫瘍転移を改善することを特徴とする請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記症状が、ホジキン病、癌悪疫質、白血病からなるグループから選ばれる症状であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記腫瘍細胞が、乳癌細胞であることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
2004002465.tif 000043
【請求項１１】
前記癌悪疫質の症状である、体重減少、ヘマトクリット値の減少、脂肪の減少、および筋肉の減少のうち、少なくとも一つの症状を予防または改善することを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞が形成する腫瘍内の血管新生を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＮＦ−κＢを活性化させる治療によるＮＦ−κＢの前記活性化を阻害することにより、前記治療の効果を増大させることができる下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
2004002465.tif 000044
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000045
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項１４】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、抗腫瘍剤を用いた治療であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗腫瘍剤を有効成分として含有することを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗腫瘍剤は、カンプトテシン、またはダウノルビシンであることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
2004002465.tif 000046
【請求項１９】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、腫瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細胞増殖阻害剤。
2004002465.tif 000047
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000048
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２０】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項１９に記載の腫瘍細胞増殖阻害剤。
2004002465.tif 000049
【請求項２１】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、血管内皮細胞の接着分子の発現を抑制するための接着分子発現抑制剤。
2004002465.tif 000050
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000051
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２２】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項２１に記載の血管内皮細胞由来の接着分子発現抑制剤。
2004002465.tif 000052
【請求項２３】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤。
2004002465.tif 000053
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000054
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２４】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項２３に記載のアポトーシス誘導剤。
2004002465.tif 000055
【請求項２５】
ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物を有効成分として含有する動脈硬化の予防・治療剤。
【請求項２６】
ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物が下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項２５に記載の予防・治療剤。
2004002465.tif 000056
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000057
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２７】
ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物を有効成分として含有する癌の予防・治療剤。
【請求項２８】
ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物が下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項２７に記載の予防・治療剤。
2004002465.tif 000058
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000059
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２９】
癌の転移抑制のために用いられる請求項２７に記載の予防・治療剤。
【請求項３０】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する悪疫質治療剤。
2004002465.tif 000060
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000061
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項３１】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項３０に記載の悪疫質治療剤。
2004002465.tif 000062
【請求項３２】
腫瘍患者における癌悪疫質の治療剤であることを特徴とする請求項３０に記載の悪疫質治療剤。
【請求項３３】
腫瘍患者における癌悪疫質の症状である、体重減少、ヘマトクリット値の減少、脂肪の減少、および筋肉の減少のうち、少なくとも一つの症状を予防または改善することを特徴とする請求項３０に記載の悪疫質治療剤。
【請求項３４】
ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物を有効成分として含有する悪疫質治療剤。
【請求項３５】
腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善するための下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とする治療方法。
2004002465.tif 000063
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000064
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項３６】
前記腫瘍細胞のアポトーシスによって、少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項３５に記載の治療方法。
【請求項３７】
前記腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないで、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項３５に記載の治療方法。
【請求項３８】
ＮＦ−κＢの活性化を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする請求項３５に記載の治療方法。
【請求項３９】
前記症状が、腫瘍転移、前記腫瘍細胞の増殖から生じる症状、ホジキン病、癌悪疫質からなるグループから選ばれる症状であることを特徴とする請求項３５に記載の治療方法。
【請求項４０】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項３５に記載の治療方法。
2004002465.tif 000065
【請求項４１】
血管内皮細胞と白血球との接着を阻害することにより、動脈硬化を改善するための下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とする治療方法。
2004002465.tif 000066
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000067
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項４２】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項４１に記載の治療方法。
2004002465.tif 000068
【請求項４３】
ＮＦ−κＢを活性化させる治療を行うステップと、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物を投与するステップとを含むことを特徴とする治療方法。
2004002465.tif 000069
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000070
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項４４】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、抗腫瘍剤の投与であることを特徴とする請求項４３に記載の治療方法。
【請求項４５】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であることを特徴とする請求項４３に記載の治療方法。
【請求項４６】
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴とする請求項４３に記載の治療方法。
2004002465.tif 000071
【発明の詳細な説明】
関連文献とのクロスリファレンス
本願は、２００２年６月２６日に出願した特願２００２−１８５８６６号、及び２００３年２月１４日に出願した特願２００３−３７１６７号に基づく優先権を主張する。それらの文献をこの明細書中に援用する。
【技術分野】  本発明は、医薬組成物、腫瘍細胞増殖阻害剤、接着分子発現抑制剤、アポトーシス誘導剤、動脈硬化または癌の予防・治療剤、及び悪疫質治療剤、並びに治療方法に関する。
【背景技術】  近年、各種腫瘍においてＮＦ−κＢの恒常的活性化が相次いで報告されている。例えば、膀胱癌（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：３７−４７，１９９９）、乳癌（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：３８１０−３８１８，２００１）、メラノーマ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４９０１−４９４９，２００１）などの腫瘍でＮＦ−κＢがしばしば活性化されている。このようなＮＦ−κＢの活性化はアポトーシス誘導機能を不活性化し、腫瘍の進展を促進している可能性があると考えられている。これは、ＩκＢを高発現させることでＮＦ−κＢを阻害し、ＮＦ−κＢの活性の高い新生細胞特異的に細胞死を誘導できることからも示唆される（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：３７−４７，１９９９）。
また、悪疫質（ｃａｃｈｅｘｉａ；悪液質とも表記される。）は、悪性腫瘍、結核、糖尿病、血液疾患、内分泌・代謝疾患などの慢性病において、食欲不振、進行する体重減少、貧血、皮膚乾燥、浮腫などを主症状とする全身不良を呈する疾患である。特に悪性腫瘍の末期患者などに、よくみられる症状であり、体重の減少・貧血などを中心とした全身機能の低下を示す。癌患者が悪疫質を発症すると、合併症のリスクが高くなり、化学療法に対する反応が悪くなる。さらに、全身の衰弱のため、癌に対する化学療法や放射線治療の副作用も大きくなり、悪疫質のため死に至ることもある。
これまで、悪疫質が発症する詳細なメカニズムは、完全には解明されていないが、近年になって、インターロイキン６（ＩＬ−６）や腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）など、幾つかのサイトカインの関与を含め、ようやく、そのメカニズムに関する手がかりが得られるようになってきた（最新医学  １９９９年  ５４巻１０号  ２５０２−２５０７頁）。例えば、癌悪疫質における様々な症状の発現機序としては、悪疫質によって発現が誘導され過剰発現したサイトカインが、中枢神経系に作用し、摂食減少、発熱、低血圧、無気力状態などの症状を引き起こし、また糖質、タンパク質、脂質の異化の亢進状態を招くとされる。
このような悪疫質における症状を抑制するのにステロイド投与が有効である。悪疫質患者にステロイドを投与すると、ステロイドの免疫反応抑制作用やそれによる抗炎症作用、さらに悪疫質誘導サイトカインの産生抑制作用により、癌悪疫質の代謝異常が是正され、体重減少、食欲不振、無気力、味覚異常、貧血などの悪疫質症状が軽減、改善される。しかし、ステロイドの長期服用は、その重篤な副作用が大きな問題となる。ステロイドは、本来自己の持つホルモンであるため、摂取したステロイドは過剰なホルモンと同様の作用効果を示し、例えば、腎臓における塩の再吸収に関与することにより、副作用として浮腫や高血圧が現われることがある。
一方、オメガ３不飽和脂肪酸が、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの産生を抑制したり、急性期反応蛋白の合成に影響することを利用して、ＥＰＡ（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の投与が悪疫質の改善に一定の効果を上げている。しかし、このような栄養製剤は、作用が間接的であるため、顕著で確実な効果は期待しにくい。
したがって、ステロイドのような広範な作用を有する薬剤とは異なり、悪疫質に特異的で、効果の顕著な薬剤の開発が求められるようになった。このような要請の下、例えば、サリドマイドにはＴＮＦ−αの阻害効果があるため、悪疫質の症状の改善が期待され、癌悪疫質の治療剤として用いられるようになった。しかし、ＴＮＦ−αには、血管新生という生体内での別の作用があり、従って、サリドマイドを投与すると、血管新生も阻害されるという副作用が生じる。このように、比較的特異性の高い薬剤であっても、副作用は必ず生じるのであるから、さまざまな状況下での使用を考慮すると、異なる作用機序を有する様々な薬剤の開発が望まれている。
一方、動脈硬化にはコレステロールを減少させて間接的に治療効果のあるメバロチンなどが使われているが効果が不十分である。癌細胞転移阻害剤として臨床使用されているものはまだない。金属プロテアーゼ阻害剤などが開発中であるが全く約束される状況ではない。一般的な抗癌剤は副作用が強く、使用が著しく限定されているのは周知のとおりである。
そこで、本発明は、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状を改善することができる医薬組成物を提供することを目的としてなされた。
【発明の開示】
ＮＦ−κＢは核内で機能する転写因子であるが、その内因性抑制因子であるＩκＢの存在下では、それらは複合体を形成し、不活性型として細胞質に存在する。細胞がＴＮＦ−αなどによる刺激を受けると、ＩκＢの分解が誘導されてＮＦ−κＢが活性化し、活性化したＮＦ−κＢは、核内に移行してＤＮＡのＮＦ−κＢ結合サイトに結合し、免疫反応や炎症反応に関与するサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αなど）および細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１など）をコードする遺伝子の発現を調節する（Ｇｈｏｓｈｉ，Ｓ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２２５−２６０（１９９８））。このように、ＴＮＦ−αの機能発現のための細胞内ターゲット分子の一つはＮＦ−κＢであると考えられる。
近年、ＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有する物質として、下記の一般式（１）で表される化合物が開発された（国際公開第ＷＯ０１／１２５８８号パンフレット；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０，８６５（２０００））。
2004002465.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
2004002465.tif 000004
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
動脈硬化にも癌細胞転移にも血管内皮細胞の接着因子発現が必要であることから、本発明者らは、接着因子を発現させない薬剤を用いることで問題点を解決した。同様に、悪疫質発症のメカニズムにＩＬ−６やＴＮＦ−αが関与しているとすると、その細胞内ターゲット分子であるＮＦ−κＢの機能阻害は、悪疫質による症状の予防／改善に有効である可能性があると考えた。
そこで、悪疫質の症状を誘発したモデルマウスに上記化合物を投与し、症状を観察したところ、悪疫質の症状の予防／改善に有効であることがわかり、本発明が完成した。本明細書では、症状とは、病気に羅患したことに伴って生じる幅広い現象を指し、必ずしも患者が訴える外見上の異常のみを指すものではない。
すなわち、本発明に係る医薬組成物は、腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善するための下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004002465.tif 000005
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000006
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
また、前記腫瘍細胞のアポトーシスによって、少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよいし、前記腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないで、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよい。
また、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよい。
前記症状は、例えば、腫瘍転移である。また、血管内皮細胞との接着を阻害することにより、腫瘍転移を改善することを特徴としてもよい。
前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよい。
また、前記症状が、例えば、ホジキン病、癌悪疫質、白血病からなるグループから選ばれる症状である。前記腫瘍細胞は、例えば乳癌細胞などである。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000007
前記癌悪疫質の症状である、体重減少、ヘマトクリット値の減少、脂肪の減少、および筋肉の減少のうち、少なくとも一つの症状が予防されるか、または改善することを特徴としてもよい。ただし、悪疫質に伴う諸症状は、これらに限らず、皮膚乾燥や浮腫などであっても、本発明の技術的範囲に属する。
また、本発明に係る医薬組成物は、前記腫瘍細胞が形成する腫瘍内の血管新生を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよい。
また、本発明に係る医薬組成物は、ＮＦ−κＢを活性化させる治療によるＮＦ−κＢの前記活性化を阻害することにより、前記治療の効果を増大させることができる下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004002465.tif 000008
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000009
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療は、抗腫瘍剤を用いた治療であってもよいし、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であってもよい。なお、前記医薬組成物と前記抗腫瘍剤とを有効成分として含有することとしてもよい。前記抗腫瘍剤としては、例えば、カンプトテシン、またはダウノルビシンである。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000010
本発明に係る腫瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細胞増殖阻害剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004002465.tif 000011
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000012
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000013
本発明に係る血管内皮細胞の接着分子の発現を抑制するための接着分子発現抑制剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004002465.tif 000014
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000015
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000016
本発明に係る腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004002465.tif 000017
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000018
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000019
本発明の動脈硬化の予防・治療剤は、ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物を有効成分として含有することを特徴とする。前記ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物は下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であってもよい。
2004002465.tif 000020
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000021
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
本発明の癌の予防・治療剤は、ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物を有効成分として含有することを特徴とする。前記ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物は下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であってもよい。
2004002465.tif 000022
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000023
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
また、前記予防・治療剤は、癌の転移抑制のために用いることとしてもよい。
本発明の悪疫質治療剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004002465.tif 000024
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000025
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000026
また、これらの化合物が、腫瘍患者（例えば、担癌患者）における癌悪疫質の治療剤であることを特徴としてもよいが、悪疫質を発症している患者であれば、その原因は癌でなくてもよい。
また、腫瘍患者（例えば、担癌患者）における癌悪疫質の症状である、体重減少、ヘマトクリット値の減少、脂肪の減少、および筋肉の減少のうち、少なくとも一つの症状を予防されるか、または改善することを特徴としてもよい。ただし、悪疫質に伴う諸症状は、これらに限らず、皮膚乾燥や浮腫などであっても、本発明の技術的範囲に属する。
さらに、本発明の悪疫質治療剤は、ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物を有効成分として含有してもよい。
本発明に係る治療方法は、腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善するための下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とする。
2004002465.tif 000027
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000028
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。なお、治療方法には、予防方法や進行抑制方法なども含まれる。
前記腫瘍細胞のアポトーシスによって、少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよいし、前記腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないで、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよい。また、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することにより、前記腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴としてもよい。
前記症状は、例えば、腫瘍転移、前記腫瘍細胞の増殖から生じる症状、ホジキン病、癌悪疫質からなるグループから選ばれる症状である。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000029
また、本発明に係る治療方法は、血管内皮細胞と白血球との接着を阻害することにより、動脈硬化を改善するための下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とする。
2004002465.tif 000030
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000031
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。なお、治療方法には、動脈硬化の予防方法や動脈硬化の進行抑制方法なども含まれる。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000032
さらに、本発明に係る治療方法は、ＮＦ−κＢを活性化させる治療を行うステップと、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物を投与するステップとを含むことを特徴とする。
2004002465.tif 000033
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル、プロピオニル、ブタノイル基及びこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
Ｒ２は、下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
2004002465.tif 000034
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。なお、治療方法には、予防方法や進行抑制方法なども含まれる。
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療は、抗腫瘍剤の投与であってもよいし、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であってもよい。
また、前記化合物が下記の式（１ａ）または（１ｂ）であることを特徴としてもよい。
2004002465.tif 000035
【図面の簡単な説明】  図１は、ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物が、動脈硬化および癌の転移を抑制する作用機構を説明する模式図である。
図２は、ＴＮＦ−αで刺激した時のＤＨＭＥＱによる阻害効果を示す図である。
図３は、ＴＮＦ−αで刺激した時のＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンの発現をＤＨＭＥＱが抑制した効果を示す図である。
図４は、ＤＨＭＥＱが、ＨＵＶＥＣｓと白血球（上）またはＨＵＶＥＣｓとＨＬ−６０細胞（下）の接着を抑制した効果を示す図である。
図５は、ＡＴＬ細胞の構成的ＮＦ−κＢ活性化に対するＤＨＭ２ＥＱの阻害作用に関する、ゲルシフトアッセイの解析結果を示す図である。
図６は、ＡＴＬ細胞の構成的ＮＦ−κＢ活性化に対するＤＨＭ２ＥＱの阻害作用に関する、レポーター遺伝子アッセイの解析結果を示す図である。
図７は、ＡＴＬ細胞の構成的ＮＦ−κＢ活性化に対するＤＨＭ２ＥＱの阻害作用に関する、共焦点顕微鏡の解析結果を示す図である。
図８は、ＤＨＭ２ＥＱのＡＴＬ細胞に対する増殖阻害作用の濃度依存性解析結果を示す図である。
図９は、ＤＨＭ２ＥＱのＡＴＬ細胞に対する増殖阻害作用の経時的解析結果を示す図である。
図１０は、ＤＨＭ２ＥＱのＡＴＬ患者末梢血細胞に対する増殖阻害作用の解析結果を示す図である。
図１１は、ＤＨＭ２ＥＱの正常末梢血単核球に対する増殖阻害作用の解析結果を示す図である。
図１２は、ＤＨＭ２ＥＱのＡＴＬ細胞に対するアポトーシス誘導作用の解析結果を示す図である。
図１３は、ＤＨＭ２ＥＱのホジキンリンパ腫細胞に対する増殖阻害作用の解析結果を示す図である。
図１４は、ＤＨＭ２ＥＱの多発性骨髄腫細胞に対する増殖阻害作用の解析結果を示す図である。
図１５は、ＴＮＦ−αによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化をＤＨＭＥＱが阻害する効果を示す図である。
図１６は、ＭＣＦ−７に対するＤＨＭＥＱの増殖抑制効果を示す図である。
図１７は、ＳＣＩＤマウス移植ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７に対するＤＨＭＥＱの増殖抑制効果を示す図である。
図１８は、ルイス肺腫瘍と、ＨＴ−２９に対するＣＯＸ−２阻害剤セレコキシブの増殖抑制効果を示す図である。
図１９は、本発明の一実施例において、ｐ６ｋｂ−ＬｕｃをＪＣＡ−１細胞にトランスフェクトし、様々な濃度のＤＨＭＥＱを投与した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
図２０は、本発明の一実施例において、ＪＣＡ−１細胞を接種した担癌マウスにＤＨＭＥＱを投与した時のマウスの体重の時間的変化を示すグラフである。
図２１は、本発明の一実施例において、ＪＣＡ−１細胞を接種した担癌マウスにＤＨＭＥＱを投与した時の腫瘍径より算出した腫瘍重量の時間的変化を示すグラフである。
図２２は、本発明の一実施例において、ＪＣＡ−１細胞を接種した担癌マウスにＤＨＭＥＱを投与開始後２６日目の腫瘍重量を示すグラフである。
図２３は、本発明の一実施例において、ＪＣＡ−１細胞を接種した担癌マウスにＤＨＭＥＱを投与開始後２６日目の精巣周囲の脂肪の重量を示すグラフである。
図２４は、本発明の一実施例において、ＪＣＡ−１細胞を接種した担癌マウスにＤＨＭＥＱを投与開始後２６日目の腓腹筋の重量を示すグラフである。
図２５は、本発明の一実施例において、ＪＣＡ−１細胞を接種した担癌マウスにＤＨＭＥＱを投与開始後２６日目のヘマトクリット値を示すグラフである。
図２６は、本発明の一実施例において、ＪＣＡ−１細胞を接種した担癌マウスにＤＨＭＥＱを投与開始後２６日目に解剖して測定した各臓器の重量を示す表である。
図２７は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱによる多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株の構成的ＮＦ−κＢ活性化阻害作用についての結果を示す図である。
図２８は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱによる多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株の増殖阻害作用についての結果を示す図である。
図２９は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱによる多発性骨髄腫（ＭＭ）患者細胞の増殖阻害作用についての結果を示す図である。
図３０は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱによるホジキンリンパ腫（ＨＬ）細胞株の構成的ＮＦ−κＢ活性化阻害作用についての結果を示す図である。
図３１は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果についての結果を示す図である。
図３２は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果が抗腫瘍剤によるＮＦ−κＢ活性化の阻害によるものであることを示す図である。
図３３は、本発明の一実施例において、ＡＴＬ細胞株を腹腔内に接種したＳＣＩＤマウスを用い、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＨＭＥＱの効果を調べた結果を示す図である。
図３４は、本発明の一実施例において、放射線照射した腫瘍細胞におけるＤＨＭＥＱのアポトーシス増強効果について調べた結果を示す図である。
図３５は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱのｉｎ  ｖｉｖｏヒト膵癌に対する腫瘍細胞の増殖抑制効果について調べた結果を示す図である。
図３６は、本発明の一実施例において、ＤＨＭＥＱの放射線併用におけるヒト膵癌細胞株に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果について調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであろう。以下に記載される発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい形態を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書に記した記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者に明らかである。
本発明に係る医薬組成物は、腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することが可能である。腫瘍細胞に起因する症状の改善には、腫瘍細胞にアポトーシスを生じさせてもよい。この方法の対象症状としては、例えば、ホジキン病、白血病などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、腫瘍細胞に起因する症状の改善には、腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないでもよく、例えば、腫瘍転移、癌悪疫質などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ここで、腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないとは、本発明に係る医薬組成物を患部に投与しても、その効果はその患部における腫瘍細胞のアポトーシスに依存しないことを意味するが、アポトーシスが依存しない効果とは別に、腫瘍細胞のアポトーシスが生じていてもかまわない。なお、腫瘍とは、広義の癌と同じ意味を有し、例えば、リンパ系悪性腫瘍、乳癌、担癌、膵癌などを指す。
ＮＦ−κＢの活性化は、アポトーシスの制御、細胞増殖、細胞分化等をはじめとする腫瘍形成の様々な面に関与することが報告されている（Ａｌｂｅｒｔ  Ｓ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：２４１−２４６（２００１））。さらに、化学療法又は放射線療法による癌細胞でのＮＦ−κＢの活性化は、癌治療の効果を減少させることが報告されている（Ａｌｂｅｒｔ  Ｓ．Ｂａｌｄｗｉｎ，前出）。従って、本発明者らは、上述のように癌においても、抗生物質エポキシクイノマイシンＣ（ｅｐｏｘｙｑｕｉｎｏｍｉｃｉｎ  Ｃ）の構造をもとに、デザインし、合成した上述の一般式（１）で表されるＤＨＭＥＱが抗癌作用を有すると考えていた。
本発明者らは、ＤＨＭＥＱを用いて、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬ）細胞のＮＦ−κＢの活性化に与える影響を調べたところ、ＤＨＭＥＱは、ＡＴＬ細胞のＮＦ−κＢの活性化を阻害することを明らかにした。また、ＤＨＭＥＱを用いて、ＡＴＬ細胞の増殖に与える影響を調べたところ、ＤＨＭＥＱは、正常細胞の増殖は阻害しないが、ＡＴＬ細胞の増殖は阻害することを明らかにした。さらに、ＡＴＬ細胞のアポトーシスの誘導に与える影響を調べたところ、ＤＨＭＥＱはＡＴＬ細胞のアポトーシスは誘導するが、正常細胞のアポトーシスは誘導しないことを明らかにした。なお、ＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物としては、サリチル酸アミド誘導体（ＷＯ０１／１２５８８  Ａ１）、パネポキシドン（ｐａｎｅｐｏｘｙｄｏｎｅ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６，２１４−２２１，１９９６），シクロエポキシドン（ｃｙｃｌｏｅｐｏｘｙｄｏｎ；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５１，４５５−４６３，１９９８），ＳＮ−５０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４２５５−１４２５８）を挙げることができる。その他のＮＦ−κＢ阻害作用を有する化合物の製造方法は、以下の文献に記載されている。パネポキシドンはＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６，２１４−２２１，１９９６に記載され、シクロエポキシドンはＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５１，４５５−４６３，１９９８に、ＳＮ５０はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４２５５−１４２５８，１９９５に記載されている。
また、本発明者らは、ＤＨＭＥＱを用いて、ホジキンリンパ腫細胞の増殖に与える影響を調べたところ、ＤＨＭＥＱは、ＮＦ−κＢが活性化しているホジキンリンパ腫細胞の増殖は阻害するが、ＮＦ−κＢが活性化していない骨髄球系の白血病細胞の増殖は阻害しないことを明らかにした。また、ＤＨＭＥＱを用いて、多発性骨髄腫細胞の増殖に与える影響を調べたところ、ＤＨＭＥＱは多発性骨髄腫細胞の増殖も阻害することを明らかにした。
従来の化学療法は細胞に普遍的な増殖機構を広く標的としているため、腫瘍細胞のみならず正常細胞に対する影響も大きく、必ずしも有効な治療手段となっていなかった。しかし、上述の一般式（１）で表されるＮＦ−κＢ阻害剤ＤＨＭＥＱは、ＮＦ−κＢが活性化している白血病細胞のアポトーシスを誘導し、同じ濃度でヒト正常白血球のアポトーシスを全く誘導しないという実験結果（図８及び１１）から、腫瘍細胞に対する特異性が高いことが明らかになっている。従って、ＤＨＭＥＱは、従来の化学療法より副作用が少なく、悪性腫瘍をはじめとする腫瘍に対して医薬組成物としてより有用である。
また、ＤＨＭＥＱは、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤としても有用である。例えば、本発明に係る医薬組成物は、リンパ系悪性腫瘍細胞の増殖阻害作用及びリンパ系悪性腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用によって、リンパ系悪性腫瘍を予防又は治療することができる。予防又は治療の対象となるリンパ系悪性腫瘍の種類は特に限定されるものではないが、悪性リンパ腫、白血病又は骨髄腫の予防又は治療に好適に使用できる。悪性リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫等が含まれ、骨髄腫には、多発性骨髄腫等の形質細胞性腫瘍等が含まれ、白血病には、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、慢性リンパ性白血病等が含まれる。
本発明に係る腫瘍細胞増殖阻害剤は、リンパ系悪性腫瘍細胞の増殖阻害作用によって、リンパ系悪性腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、これにより、リンパ系悪性腫瘍を予防又は治療することができる。増殖阻害の対象となるリンパ系悪性腫瘍細胞の種類は特に限定されるものではないが、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は骨髄腫細胞の増殖阻害に好適に使用できる。悪性リンパ腫、白血病又は骨髄腫には、上記に例示した各種リンパ系悪性腫瘍が含まれる。
本発明に係るアポトーシス誘導剤は、リンパ系悪性腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用によって、リンパ系悪性腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができ、これにより、リンパ系悪性腫瘍を予防又は治療することができる。アポトーシス誘導の対象となるリンパ系悪性腫瘍細胞の種類は特に限定されるものではないが、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は骨髄腫細胞のアポトーシス誘導に好適に使用できる。悪性リンパ腫、白血病又は骨髄腫には、上記に例示した各種リンパ系悪性腫瘍が含まれる。
本発明に係る医薬組成物、腫瘍細胞増殖阻害剤、及びアポトーシス誘導剤は、リンパ系悪性腫瘍細胞に対して特異的に作用し、正常細胞に対する悪影響はほとんど示さないので、リンパ系悪性腫瘍の優れた予防・治療効果が期待できる。
一般式（１）で表される化合物（特に、ＤＨＭＥＱ）およびその薬理学的に許容される塩は癌細胞にも作用するが、癌組織の間質（癌組織の中でも正常細胞による構成される部分）細胞に作用する。特に、癌組織中の血管内皮細胞において、ＤＨＭＥＱはアポトーシスは起こさないが、接着因子等の発現を抑えて（図５）、癌の進展に抑制効果を与える。
炎症性刺激や物理的刺激などが血管内皮細胞に加わると、接着分子の発現が増強され、白血球が血管内皮細胞表面上に接着し、血管外へ移動する。これは、血管内皮細胞内の転写因子であるＮＦ−κＢが活性化されることにより、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンなどの接着分子の発現を活性化するからである。また、転移能の高い大腸癌でもＥ−セレクチンのリガンドであるシアリルルイス−Ｘが高発現することが報告されており、血管内皮細胞内の転写因子であるＮＦ−κＢが活性化されると、大腸癌細胞が血管内皮細胞表面上に接着しやすくなり、これにより血管外へ浸出しやすくなり、転移促進に働くことが考えられている。そこで、血管内皮細胞表面上の上記接着分子の発現を抑制することは動脈硬化や腫瘍転移の制御につながると考えられ、ＮＦ−κＢ阻害剤は動脈硬化や癌細胞の転移抑制に有用であると考えられる。
そこで、本発明者らは、ＤＨＭＥＱを用いて、ＤＨＭＥＱがヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）の接着分子発現に与える影響を調べた。ＴＮＦ−αによるＮＦ−κＢの活性化をゲルシフトアッセイにより評価したところ、ＩκＢ−αの分解を抑制することなく、ＮＦ−κＢの活性化を抑制した。また、ウエスタンブロッティング法でＴＮＦ−αによって誘導されるＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンの発現に与えるＤＨＭＥＱの影響を調べたところ、これら接着分子の発現を抑制し、実際に白血球とＨＵＶＥＣｓの接着、白血病細胞とＨＵＶＥＣｓの接着も阻害することを見い出した。白血球の血管壁への接着は脂質の蓄積などを介して動脈硬化を誘導する一方、癌細胞の接着は血管からの侵出、転移を引き起こす。そこでこれら接着を阻害することは、前者において抗動脈硬化剤に、後者において癌転移抑制剤につながる。従って、ＮＦ−κＢ阻害作用を有する上記化合物は動脈硬化または癌細胞の転移を抑制するのに有用である（図１）。また、後述する実施例により、ＤＨＭＥＱは血管内皮細胞の接着因子の発現抑制剤として有用である。
アポトーシス非依存性効果の他の例として、細胞の増殖抑制がある。本発明者らは、ＤＨＭＥＱを用いて、ヒト乳癌細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで増殖に与える影響を調べたところ、ＤＨＭＥＱがヒト乳癌細胞の増殖を抑制することを明らかにした。一般式（１）で表される化合物およびその薬理学的に許容される塩は、乳癌細胞の増殖抑制効果を有する。従って、これらの化合物は、乳癌の予防・治療剤として有用である。
従来、乳癌の治療は、大別すると、化学療法（抗癌剤を使用する治療法）とホルモン療法の２つの方法が知られている。これらの方法は、ともに癌を縮小させ、また再発を防ぐ効果があることが知られているが、問題点もあった。すなわち、抗癌剤の場合は毒性（副作用）があるという最大の問題があり、薬剤耐性も大きな問題であった。ホルモン療法では、まずホルモン感受性のある癌にしか効かないという問題点がある。ホルモン感受性のある癌は全体の約６０％であり、残りの４０％の患者は最初からホルモン療法を適用することができない。またホルモン療法も耐性の出現があり、大きな問題となっている。従って、ＤＨＭＥＱは乳癌に対して非常に有用であるといえる。
また、本発明者らは、慢性病、特に、悪性腫瘍の末期患者などによくみられる悪疫質発症のメカニズムにＩＬ−６やＴＮＦ−αが関与しているため、その細胞内ターゲット分子であるＮＦ−κＢの機能阻害は、悪疫質による症状の予防／改善に有効であると考え、悪疫質についてもＤＨＭＥＱが有用であるか否かを調べた。すなわち、悪疫質の症状を誘発したモデルマウスにＤＨＭＥＱを投与し、症状を観察したところ、ＤＨＭＥＱが悪疫質の症状の予防／改善に有効であることを見い出した。これにより、ＤＨＭＥＱは悪疫質にも有用であることが明らかとなった。
また、本発明に係る医薬組成物は、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することができるため、ＮＦ−κＢの活性化により起こるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の遺伝子発現を抑制することができると考えられる。また、シクロオキシゲナーゼ−２の遺伝子発現を抑制することができることにより、プロスタグランジンの合成も抑制することができる。これにより、プロスタグランジンにより促進される腫瘍血管の新生を阻害又は抑制することができると考えられる。従って、本発明に係る医薬組成物は、腫瘍内における血管新生を阻害し、腫瘍への酸素や栄養分の供給を阻害することにより抗腫瘍作用を呈する癌治療薬としても有用であると期待される。
また、本発明者らは、化学療法や放射線療法などのＮＦ−κＢを活性化させる治療による腫瘍細胞でのＮＦ−κＢの活性化を阻害することにより、腫瘍治療の効果を増大させることができるのではないかと考え、まず、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果を調べた。すなわち、カンプトテシン（ＣＰＴ）、ダウノマイシン（ＤＮＲ）などの抗腫瘍剤を用い、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果を検討したところ、いずれにおいてもＤＨＭＥＱは抗腫瘍剤の効果を増強することが見い出された。
また、本発明者らは、各抗腫瘍剤処理によるＮＦ−κＢ活性化を調べた。いずれの抗腫瘍剤（カンプトテシン（ＣＰＴ）、ダウノマイシン（ＤＮＲ）、エトポシド（ＥＴＰ））で処理しても処理前のものと比較して、一過的に３から２０倍のＮＦ−κＢ活性が腫瘍細胞に生じていることを見い出した。これにより、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果は抗腫瘍剤によるＮＦ−κＢ活性化の阻害によるものであることを明らかにした。
次に、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤によるＮＦ−κＢ活性化の阻害について調べるために、各抗腫瘍剤（カンプトテシン（ＣＰＴ）、ダウノマイシン（ＤＮＲ））にＤＨＭＥＱを併用して腫瘍細胞を処理した時のＮＦ−κＢ活性化を調べたところ、いずれの抗腫瘍剤で処理してもＮＦ−κＢ活性化はＤＨＭＥＱ併用により強く抑制されることを見い出した。
一方、放射線治療は活性酵素を発生させるので正常組織のＤＮＡも傷つけて別の癌を発生させたり、残っている癌細胞を悪化させたりする可能性がある。また、放射線照射による酸化ストレスによって、ＮＦ−κＢの活性化が誘導されると、癌細胞はアポトーシスを起こしにくくなり、放射線治療に抵抗性を示すことが知られている。そこで、本発明者らは、ＤＨＭＥＱと放射線照射とを併用した場合も相乗効果が得られるのではないかと考え、ＤＨＭＥＱの放射線併用における腫瘍細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果について調べた。その結果、放射線照射との併用でＤＨＭＥＱは相乗的な増殖抑制効果を示すことを見い出した。
このように、本発明に係る医薬組成物は、抗腫瘍剤を用いる治療や腫瘍細胞に対する放射線照射による治療などにより引き起こされるＮＦ−κＢの活性化の阻害剤としても有用である。また、本発明に係る医薬組成物は、抗ウイルス剤との併用も有用である。なお、抗腫瘍剤を用いる治療としては、ＮＦ−κＢを活性化させる抗腫瘍剤であれば特に限定されるものではないが、例えば、カンプトテシン、ダウノルビシンなどを挙げることができる。
本発明に係る医薬組成物は、腫瘍疾患、アレルギー疾患、免疫疾患、炎症性疾患などの疾患に対して用いられる治療と併用することにより、治療の効果を増大させることができる。本発明の医薬組成物は、ＮＦ−κＢを活性化させる治療と同時に用いてもよいが、ＮＦ−κＢを活性化させる治療の後にＮＦ−κＢの活性化を阻害するために用いることとしてもよい。また、ＮＦ−κＢの活性化を阻害するために、予め上記疾患を伴うヒト及びヒト以外の哺乳類動物に投与することとしてもよい。
一方、現在の抗癌剤治療の一つの大きな問題点は癌細胞に薬剤排出を機構とする耐性がしばしば生じることである。正常細胞への作用は一般的には耐性が生じにくいとされている。従って、まずこの点が本発明の乳癌の予防・治療剤の有利な点である。次には毒性が低いことが予測されており、化学療法に比較した場合の有利な点である。さらに、作用メカニズムからすると、ホルモン療法が対象としないホルモン非感受性の腫瘍も治療の対象になる。この点はホルモン療法と比べ大きな利点になる。以上より、毒性が少ないこと、ホルモン療法と対象が重ならないこと、血管内皮細胞等に耐性が生じにくいことは、臨床上大きな利点となる。また、これらの点は、既存の薬剤との幅広い併用や癌予防への応用の可能性を示唆するものでもある。
以上のことから、本発明に係る医薬組成物は、腫瘍細胞増殖阻害剤、接着分子発現抑制剤、アポトーシス誘導剤、動脈硬化または癌の予防・治療剤、リンパ系悪性腫瘍の予防・治療剤、乳癌の予防・治療剤、悪疫質治療剤などに有用であるといえる。
従って、本発明に係る一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物は、腫瘍、悪疫質、動脈硬化などの治療（予防や進行抑制剤などを含む）に有用である。
以下、本発明の化合物の製造方法、使用形態、使用例（実施例）について、詳細に記述する。
＝＝＝本発明の化合物の製造方法＝＝＝
一般式（１）で表される化合物は、Ｗｉｐｆらの合成法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１２号，１５４９〜１５６１頁，１９９５年）に準じて製造することができる。
以下に、一般式（１）で表される化合物の製造方法の一例を下記の反応工程式に基づいて説明する。
2004002465.tif 000036
工程ａ：Ｎ−（２−アルカノイルベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンの調製
２，５−ジメトキシアニリンを溶媒（ピリジンなど）に溶解させ、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、式（７）のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドの酢酸エチル溶液を加えて、攪拌しながら反応させる。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルを加え、塩酸、水、重曹水、水で順次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮、及び真空乾燥することにより式（２）で示されるＮ−（２−アルカノイルベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリン化合物が得られる。この化合物は精製せず、次の工程に使用できる。
工程ｂ：３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノン化合物の調製
上記で得られた式（２）の化合物をメタノールなどの溶媒に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、ジアセトキシヨードベンゼンを加え、室温で攪拌しながら反応させる。減圧濃縮後、酢酸エチルを加え、重曹水、食塩水で順次洗浄し、溶剤を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製することにより、式（３）で示される３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノン化合物が得られる。
工程ｃ：５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン化合物の調製
式（３）で示される３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノンを溶剤（テトラヒドロフラン、メタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、過酸化水素水及び水酸化ナトリウムを加え、攪拌しながら反応させる。反応液に酢酸エチルを加え、塩酸溶液、チオ硫酸ナトリウム水溶液、食塩水で順次洗浄し、大気中で乾燥した後、真空乾燥する。残存する原料化合物を除去するため、残渣をアセトンに溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌して原料化合物を分解する。メタノールを減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルを加え、水で洗浄する。酢酸エチル層を乾燥して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、式（４）で示される５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン化合物が得られる。
工程ｄ：５，６−エポキシ−２−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンの調製
式（４）の５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン化合物を溶剤（塩化メチレンなど）に溶解させ、氷冷下で無機酸または有機酸（三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体など）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、酢酸エチル層を濃縮した後、得られた残渣をメタノールで洗浄して式（５）で示される５，６−エポキシ−２−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンが得られる。
工程ｅ：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン（１ａ，ＤＨＭ２ＥＱ）の調製
式（５）で示される５，６−エポキシ−２−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンを、溶媒（メタノール、エタノール、ＴＨＦなど）に懸濁し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（水素化ホウ素ナトリウムなど）を加えて反応させる。反応液に溶剤（酢酸エチル、塩化メチレンなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮して、メタノールで懸濁、攪拌、洗浄して、式（１ａ）で示される５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン（ＤＨＭ２ＥＱ）が得られる。
工程ｆ：３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミドシクロヘキセンの調製
式（４）の５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン化合物をメタノールなどの溶剤と重曹水混合溶媒に溶解し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（水素化ホウ素ナトリウムなど）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（酢酸エチルなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥し、カラムクロマトグラフィーなどで精製して、式（６）で示される３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミドシクロヘキセンを得る。
工程ｇ：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン（１ｂ，ＤＨＭ３ＥＱ）の調製
式（６）で示される３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミドシクロヘキセンを溶剤（アセトンなど）に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を乾燥し、減圧濃縮して、精製して、式（１ｂ）の５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン（ＤＨＭ３ＥＱ）を得ることができる。
一般式（１）で表される化合物は、弱酸性物質であり、それらの塩としては第４級アンモニウム塩などの有機塩基の塩、あるいは各種金属との塩、例えばナトリウムのようなアルカリ金属との塩があり、これらの塩の形でも利用できる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。
＝＝＝本発明の化合物の使用形態＝＝＝
一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗癌剤、ホルモン療法剤）と組み合わせて使用してもよい。
一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩をヒトに投与する場合には、例えば、成人１日あたり約１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは４〜１２ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回または数回に分けて経口投与または静注してもよいが、その投与量や投与回数は、疾患の種類、症状、年齢、体重、治療期間、治療効果、投与方法などにより適宜変更しうる。
一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩は、薬理上許容される担体と配合し、乳剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして経口投与してもよいし、注射剤などの製剤にして皮下、筋肉内、腹腔内や静脈内へ注射する、あるいは、坐薬（座剤）などの製剤にして直腸内投与する、あるいは、噴霧剤などの製剤にして口腔または気道粘膜へ噴霧する、あるいは、軟膏やテープ剤などの製剤にして患部（例えば、皮膚や粘膜など）に塗布又は貼付するような態様で非経口投与することもできる。
乳剤やシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として使用して製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として使用して製造できる。
注射剤は、例えば、塩溶液、ブドウ糖溶液またはこれらの混合物を担体として使用して製造できる。座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等を担体として使用して製造できる。噴霧剤は、例えば、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体として、乳糖、グリセリン等を使用して製造でき、エアロゾル、ドライパウダー等に製剤化できる。
薬理上許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が１種又は２種以上用いられ、製剤化されていてもよい。具体的には、水、薬理上許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等を挙げることができる。
製剤化に際して使用される添加物としては、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを用いてもよい。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、充填剤、増量剤、付湿剤、表面活性剤、安定化剤、殺菌剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などの製剤添加物を用いることもできる。これらの添加物は製剤の投与単位形態等に応じて適宜選択される。なお、これらの添加物のうち、通常の製剤に使用される成分、例えば、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が好ましく選択される。
添加剤の具体例を以下に例示する。
安定化剤：ヒト血清アルブミン；グリシン、システィン、グルタミン酸等のＬ−アミノ酸；グルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類及びそれらの誘導体等の糖類；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体等。
界面活性剤：ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面活性剤。
緩衝剤：ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸およびそれらの塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）。
等張化剤：塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等。
キレート剤：エデト酸ナトリウム、クエン酸等。
製剤中の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩（有効成分）の含有率は、１〜９０重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を５〜８０重量％含有させるのが好ましい。シロップ剤などの液剤の場合には、有効成分を１〜３０重量％含有させるのが好ましい。さらに、非経口投与する注射剤の場合には、有効成分を１〜１０重量％含有させるのが好ましい。
一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の製剤化は、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壊剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、ＣＭＣ・Ｎａ、ＣＭＣ・Ｃａ、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェノール、塩化ベンザルコニウムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルベート８０、２０など）、緩衝剤（クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸など）、希釈剤などを用いて、公知の方法で行われる。
以下、本発明にかかる実施例を詳細に説明する。以下の記載では、特に説明がない場合、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、以下の実施例で用いた式（１ａ）で表される化合物（ＤＨＭＥＱ）は、ＷＯ０１／１２５８８  Ａ１の実施例１〜５に記載の方法により製造した。以下、式（１ａ）で表される化合物を「ＤＨＭ２ＥＱ」と呼び、式（１ｂ）で表される化合物を「ＤＨＭ３ＥＱ」と呼ぶ場合がある。
【実施例１】  ゲルシフトアッセイ（Ｇｅｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ；Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ））によりＮＦ−κＢの活性化を調べたところ、ＤＨＭＥＱはＨＵＶＥＣｓ（慶應病院にて臍帯より調製した）においてＴＮＦ−α（Ｔｅｃｈｎｅ）、ＩＬ−１β（ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ  ＥＣ  ＬＴＤ）、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）によるＮＦ−κＢの活性化を３μｇ／ｍｌで完全に抑制した。図２にはＨＵＶＥＣｓをＴＮＦ−αで刺激した時のＤＨＭＥＱによるＮＦ−κＢ活性化に対する阻害効果を示す。実験方法は以下のとおりである。
ＨＵＶＥＣｓを以下のようにしてＤＨＭＥＱで前処理した。すなわち、メタノールで希釈したＤＨＭＥＱを、ＨＵＶＥＣｓを培養している培養液の中にデータに示す濃度になるよう、培養液量の１％量を添加し３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。
ＤＨＭＥＱを２時間前処理したＨＵＶＥＣｓと無処理のＨＵＶＥＣｓをそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β、１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで刺激し（すなわち、それぞれの培養液中に添加し、データに示す時間（０、５、１０、３０分等）、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。）、細胞をサンプリングした。集めた細胞を４００μｌのｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）：ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＤＴＴ（Ｍｅｒｃｋ）、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ））で懸濁し、１５分間静置した後１５０００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。再度４００μｌのｂｕｆｆｅｒ  Ａを加え、１５０００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。次に、４０μｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ：ｐＨ７．９、２５％グリセロール（関東化学）、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ（関東化学）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（関東化学）、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）を加え、指でタッピングして細胞を懸濁し、２０分間静置した後、１５０００×ｇで５分間遠心にかけ上清を回収し、これを核抽出物とした。４μｌの下記の合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２μｌの［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、２μｌの１０×Ｔ４  ＰＮＫ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）：ｐＨ７．６、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ．ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（関東化学））を加え、蒸留水で全量１８μｌとした。さらに１０ｕｎｉｔｓ／μｌのＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を２μｌ加え、３７℃で１０分間反応させた。反応後、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を８０μｌ加え反応を止めた。これをＮｉｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で精製し、３２ＰでラベルされたＮＦ−κＢプローブを得た。
合成オリゴヌクレオチド：
2004002465.tif 000037
次に、５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（３７５ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ７．０、７．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、７．５ｍＭ  ＤＴＴ、３７．５％  グリセロール、１．５％  ＮＰ−４０（ナカライテスク）、０．５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））を４μｌ、１μｇ／μｌに調整したｐｏｌｙ  ｄＩ−ｄＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を１μｌ、５μｇ分の核抽出物を加え全量が１７μｌになるように蒸留水を加えた。スーパーシフト用のサンプルにはさらに抗ｐ６５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を０．５μｇ分添加した。これに３２ＰでラベルされたＮＦ−κＢプローブを３μｌ加え、２５℃で３０分間インキュベートした。その後１時間あらかじめ電流を流しておいた４％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）（６．７ｍＭアクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ；３０／２；和光）、１．２５ｍｌ  １０×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ（０．９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ（関東化学）：ｐＨ８．３、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、４２ｍｌ  Ｈ２Ｏ、５００μｌ  ＡＰＳ（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ；関東化学）、５０μｌ  ＴＥＭＥＤ（関東化学））のウェルにこの２０μｌのサンプルをアプライし、１５０Ｖで泳動した。泳動後、ゲルをろ紙に移し、ゲルドライヤーを用いて乾燥させ、それをフィルムに感光させた。
【実施例２】  ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法により、ＴＮＦ−αで刺激した時のＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）の発現にＤＨＭＥＱが与える影響を調べたところ、ＴＮＦ−α単独のときＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の発現は刺激後９時間でピークを迎え、Ｅ−セレクチンの発現は刺激後６時間でピークを迎えるが、図３に示すようにＤＨＭＥＱを２時間前処理したＨＵＶＥＣｓではそれら接着分子のいずれの発現も顕著に抑制された。実験方法は以下のとおりである。
ＤＨＭＥＱを２時間前処理したＨＵＶＥＣｓと無処理のＨＵＶＥＣｓをそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αで刺激し、細胞をサンプリングした。これにｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＦ（関東化学）、４００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４（関東化学）、１％  ＮＰ−４０、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ；（財）微生物化学研究所）、１μｇ／ｍｌ  アンチパイン（ａｎｔｉｐａｉｎ；（財）微生物化学研究所）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を加え、氷上で５分ごとに撹拌しながら３０分間可溶化し、その後１５０００×ｇで１０分間遠心にかけ上清を回収した。この上清のタンパク質濃度をクマシーブリリアントブルー液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で定量し、濃度を調整したあと３×ＳＤＳ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ６．８、３０％  グリセロール、３％  ＳＤＳ（関東化学）、０．０３ｍｇ／ｍｌ  ブロモフェノール・ブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）、１５０μｌ／ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ；関東化学））を、加えたｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒの半分量加え、５分間煮沸した。これをサンプルとし、１２．５％  ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）を用いて電気泳動した。電気泳動後、ゲル内のタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーし、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ；雪印）を含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ７．６、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）でブロッキングを行った。その後、ＩＣＡＭ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＶＣＡＭ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｅ−セレクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）それぞれの抗体を用いてＰＶＤＦ膜と抗体反応をさせ、さらにそれぞれに適した２次抗体（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、及びＥ−セレクチンの２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））と反応させた。そして、ＥＣＬ法により発色させ、フィルムに感光させた。
【実施例３】  図４に示すように白血球（実験者の血液より調製）、ＨＬ−６０細胞（細胞バンクより購入）共にＴＮＦ−α刺激し、３、６、９時間後の細胞接着数は時間依存的に増加したが、ＤＨＭＥＱを３μｇ／ｍｌ処理するとその接着は顕著に抑制された。この濃度のＤＨＭＥＱはＨＵＶＥＣｓに対して、毒性も増殖抑制も示さなかった。実験方法は以下のとおりである。
２４ウェルプレートにＨＵＶＥＣｓをまき、コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に培養した。培地の組成は、９．８ｇ／ｌ培地１９９（ニッスイより供与），１．８ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ），１０ｍｌ／ｌ  １Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ），３０ｍｇ／ｌ  ＥＣＧＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），６ｍｌ／ｌヘパリンナトリウム注射液（武田薬品），１０％ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳ（ＪＲＨ）である。その後、以下の実験を行った。ＤＨＭＥＱを２時間前処理したＨＵＶＥＣｓと無処理のＨＵＶＥＣｓをそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αで刺激し、刺激後０、３、６、９時間の白血球およびヒト急性前骨髄球性白血病株ＨＬ−６０細胞のＨＵＶＥＣｓに対する接着を評価した。今回、比重遠心分離法により分離した単核球を白血球として用いた。
ＴＮＦ−αで刺激後、ウェルをＨＢＳＳ＋（ニッスイより供与）で２回洗い、５００μｌの培地（培地の組成：９．８ｇ／ｌ培地１９９（ニッスイより供与），１．８ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ），１０ｍｌ／ｌ  １Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ），３０ｍｇ／ｌ  ＥＣＧＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），６ｍｌ／ｌヘパリンナトリウム注射液（武田薬品），１０％ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳ（ＪＲＨ））で培地交換を行い、白血球は２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル、ＨＬ−６０細胞は７×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるようにウェルに入れた。５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートし、その後ＨＢＳＳ＋で３回穏やかに洗い、その状態を写真にとってＨＵＶＥＣｓに接着している細胞数を数えた。
以上のように毒性、増殖抑制を示さずＮＦ−κＢの活性化を抑制し、ＨＵＶＥＣｓと白血球および白血病細胞の接着を抑制したという点で、このＤＨＭＥＱは実験や臨床での長期使用が可能であり、有用であると考えられる。
【実施例４】成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬ）細胞の構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）ＮＦ−κＢ活性化に対するＤＨＭ２ＥＱの阻害作用
（１）ゲルシフトアッセイ
細胞の核内に存在する転写因子がプロモーターの特定の塩基配列を持つ領域と結合するかどうかを以下の方法によって検討した。
２×１０６個のＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）とコントロール細胞株（Ｋ５６２，Ｊｕｒｋａｔ＋ＴＮＦ）とを１０μｇ／ｍｌのＤＨＭ２ＥＱで１２時間処理し、各細胞株から核抽出液を調製した。また、ＤＨＭ２ＥＱで処理しない各細胞株からも同様に核抽出液を調製した。なお、細胞株ＭＴ−１及びＴＬ−Ｏｍ１は、ＨＴＬＶ−１でトランスフォームした細胞株で、これらの細胞株ではＮＦ−κＢが活性化している。細胞株Ｋ５６２（骨髄球系の白血病細胞株）は構成的ＮＦ−κＢを認めない細胞株であり（陰性コントロール）、Ｊｕｒｋａｔ＋ＴＮＦは、ＴＮＦ処理したＪｕｒｋａｔ細胞株である（陽性コントロール）。
ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて末端ラベルして３２Ｐ標識ＮＦ−κＢプローブを作製した。
核抽出液のタンパク量２μｇ相当と、１０，０００ｃｐｍ相当のＮＦ−κＢプローブとを２０μｌのボリュームで混合し、室温で３０分間反応させた。反応後の溶液を７．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲルを乾燥後、Ｘ線フィルムに感光させた。
結果を図５に示す。なお、図中、左から６レーンにおいて、「−」はＤＨＭ２ＥＱ未処理の結果、「＋」はＤＨＭ２ＥＱ処理の結果を示す。右端２レーンの陽性コントロールにおける「−」と「＋」は、「ｃｏｍｐ」と右に表示されているように、非標識プローブによる競合阻害（「＋」は競合分子存在下での実験）の結果を示し、シグナルがＮＦ−κＢ結合配列に特異的であることを示す。
図５に示すように、ＤＨＭ２ＥＱ処理によってＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）におけるＮＦ−κＢのシグナルがほぼ消失した。一方、Ｋ５６２では、ＮＦ−κＢの活性化が観察されていない。
（２）レポーター遺伝子アッセイ（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ；Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）
ＮＦ−κＢの転写活性を検討するため、ＮＦ−κＢ結合配列を６コピーくり返して持つ人工的なプロモーターでドライブされるルシフェラーゼコンストラクト（６ｋＢ−Ｌｕｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）をレポーターとして用い、このプラスミドＤＮＡをＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）及びコントロール細胞株（Ｋ５６２）に一過性に導入した（２×１０５個細胞／トランスフェクションのスケールで、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてトランスフェクションした）。１２時間後より、５μｇ／ｍｌのＤＨＭ２ＥＱで処理し、４８時間後に細胞を回収して、ＮＦ−κＢの転写活性をルシフェラーゼの酵素活性として評価した。また、ＤＨＭ２ＥＱで処理しない各細胞株においても同様の評価を行なった。なお、全ての実験は３回行い平均値と標準偏差を算出した。
結果を図６に示す。なお、図中、「−」はＤＨＭ２ＥＱ未処理の結果、「＋」はＤＨＭ２ＥＱ処理の結果を示す。
図６に示すように、ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）では、ルシフェラーゼ活性がＤＨＭ２ＥＱ処理によって約５０％に抑制され、ＤＨＭ２ＥＱによるＡＴＬ細胞株のＮＦ−κＢ転写活性抑制効果が認められた。一方、ネガティブコントロール細胞株（Ｋ５６２）ではルシフェラーゼ活性が認められなかった。
（３）共焦点顕微鏡による解析
ＤＨＭ２ＥＱはＮＦ−κＢのサブユニットｐ６５の核移行を阻害すると考えられる。そこで、ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）を１０μｇ／ｍｌのＤＨＭ２ＥＱで２４時間処理し、蛍光標識した抗ｐ６５抗体を用いて、ｐ６５の分布を共焦点顕微鏡により検討した。また、ＤＨＭ２ＥＱで処理しない各細胞株についても同様の検討を行なった。
結果を図７に示す。なお、図中、「−」はＤＨＭ２ＥＱ未処理の結果、「＋」はＤＨＭ２ＥＱ処理の結果を示す。
図７に示すように、ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）では、核が黒く抜けており、ＤＨＭ２ＥＱ処理によってｐ６５の核移行が阻害されていることが示された。
上記（１）〜（３）の結果から、ＤＨＭ２ＥＱが、ＡＴＬ細胞の構成的ＮＦ−κＢ活性化を阻害することが確認された。
【実施例５】ＤＨＭ２ＥＱのＡＴＬ細胞に対する増殖阻害作用
（１）ＤＨＭ２ＥＱの増殖阻害作用の濃度依存性解析
９６ウェルのプレートに、ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）及びコントロール細胞株（Ｋ５６２）の各細胞を１×１０５個／ウェル播き、ＤＨＭ２ＥＱを目的の最終濃度（２，５，１０μｇ／ｍｌ）になるように添加した。溶媒であるＤＭＳＯのみを等容量加えたもの（０μｇ／ｍｌ）をコントロールとして用いた。７２時間培養後、ＭＴＴアッセイ法により、細胞の生存率を判定した。相対ＭＴＴ値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＭＴＴ  ｖａｌｕｅ）は、ＤＨＭ２ＥＱ未処理細胞のＭＴＴ値に対するＤＨＭ２ＥＱ処理細胞のＭＴＴ値の比、すなわち（ＤＨＭ２ＥＱ処理細胞のＭＴＴ値／ＤＨＭ２ＥＱ未処理細胞のＭＴＴ値）×１００（％）として求めた。
結果を図８に示す。なお、図中、□はＫ５６２、▲はＴＬ−Ｏｍ１、■はＭＴ−１の結果を示す。
図８に示すように、ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）ではＤＨＭ２ＥＱ添加濃度に比例して細胞増殖が阻害されるのに対し、コントロール細胞株（Ｋ５６２）では細胞増殖がほとんど阻害されなかった。
（２）ＤＨＭ２ＥＱの増殖阻害作用の経時的解析
ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）及びコントロール細胞株（Ｋ５６２）に対してＤＨＭ２ＥＱを最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように添加して、１２，２４，４８，７２時間培養を行い、増殖阻害作用をＭＴＴアッセイ法により検討した。溶媒であるＤＭＳＯのみを等容量加えたものをコントロールとして用いた。相対ＭＴＴ値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＭＴＴ  ｖａｌｕｅ）は上記（１）と同様にして求めた。
結果を図９に示す。なお、図中、□はＫ５６２、▲はＴＬ−Ｏｍ１、■はＭＴ−１の結果を示す。
図９に示すように、ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）ではＤＨＭ２ＥＱ処理時間に比例して細胞増殖が阻害されるのに対し、コントロール細胞株（Ｋ５６２）では細胞増殖がほとんど阻害されなかった。
（３）ＤＨＭ２ＥＱのＡＴＬ患者末梢血細胞に対する増殖阻害作用
ＡＴＬ患者末梢血より単核球を分離し、ＡＴＬ細胞を分離した。患者３症例について、分離したＡＴＬ細胞に対しＤＨＭ２ＥＱを最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、２４時間培養を行い、増殖阻害作用をＭＴＴアッセイ法により検討した。溶媒であるＤＭＳＯのみを等容量加えたものをコントロールとして用い、ＤＨＭ２ＥＱ未処理細胞のＭＴＴ値に対するＤＨＭ２ＥＱ処理細胞のＭＴＴ値の比、すなわち（ＤＨＭ２ＥＱ処理細胞のＭＴＴ値／ＤＨＭ２ＥＱ未処理細胞のＭＴＴ値）によって、増殖阻害作用を評価した。
結果を図１０に示す。
図１０に示すように、ＤＨＭ２ＥＱは、いずれのＡＴＬ患者から得られたＡＴＬ細胞に対しても増殖阻害作用を示すことが確認された。
（４）ＤＨＭ２ＥＱの正常末梢血単核球に対する増殖阻害作用
正常末梢血より単核球を分離し、ＤＨＭ２ＥＱを最終濃度が２，５，１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、７２時間培養を行い、増殖阻害作用をＭＴＴアッセイ法により検討した。溶媒であるＤＭＳＯのみを等容量加えたもの（０μｇ／ｍｌ）をコントロールとして用いた。細胞の生存率（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、コントロール（ＤＨＭ２ＥＱ未処理）のＭＴＴ値を１００％としてそれとの比で表した。
結果を図１１に示す。
図１１に示すように、ＤＨＭ２ＥＱは、正常末梢血単核球に対してほとんど増殖阻害作用を示さなかった。
上記（１）〜（４）の結果から、ＤＨＭ２ＥＱは、ＡＴＬ細胞の増殖は阻害するが、正常細胞の増殖は阻害しないことが確認された。
【実施例６】ＤＨＭ２ＥＱのＡＴＬ細胞に対するアポトーシス誘導作用
ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）及びコントロール細胞株（Ｋ５６２）に対してＤＨＭ２ＥＱを最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように添加して７２時間培養を行った後、ヘキスト染色して核の濃縮あるいは断片化を蛍光顕微鏡で観察することによりアポトーシスの検討を行った。また、溶媒であるＤＭＳＯのみを等容量加えたものについても同様の検討を行った。
結果を図１２に示す。なお、図中、「−」はＤＨＭ２ＥＱ未処理（ＤＭＳＯのみ）の結果、「＋」はＤＨＭ２ＥＱ処理の結果を示す。
図１２に示すように、ＡＴＬ細胞株（ＭＴ−１，ＴＬ−Ｏｍ１）ではＤＨＭ２ＥＱ処理によりアポトーシスが誘導され、核の断片化が観察されたのに対し、ＤＨＭ２ＥＱ未処理細胞及びコントロール細胞株（Ｋ５６２）ではアポトーシスは観察されなかった。
この結果から、ＤＨＭ２ＥＱは、ＡＴＬ細胞のアポトーシスは誘導するが、正常細胞のアポトーシスは誘導しないことが確認された。
【実施例７】ＤＨＭ２ＥＱのホジキンリンパ腫細胞に対する増殖阻害作用
ＤＨＭ２ＥＱのホジキンリンパ腫細胞に対する増殖阻害作用の経時的解析及び濃度依存性解析を、実施例２と同様にして行った。ホジキンリンパ腫細胞としては、ホジキンリンパ腫細胞株ＫＭＨ−２及びＬ−５４０を用いた。
結果を図１３に示す。なお、図中、■はＫ５６２、○はＫＭＨ−２、●はＬ−５４０の結果を示す。
図１３示すように、ホジキンリンパ腫細胞株（ＫＭＨ−２，Ｌ−５４０）ではＤＨＭ２ＥＱ添加濃度に比例して細胞増殖が阻害されるのに対し、コントロール細胞株（Ｋ５６２）では細胞増殖がほとんど阻害されなかった。また、ホジキンリンパ腫細胞株（ＫＭＨ−２，Ｌ−５４０）ではＤＨＭ２ＥＱ処理時間に比例して細胞増殖が阻害されるのに対し、コントロール細胞株（Ｋ５６２）では時間が経っても細胞増殖がほとんど阻害されなかった。
これらの結果から、ＤＨＭ２ＥＱは、ＮＦ−κＢが構成的に活性化しているホジキンリンパ腫細胞の増殖は阻害するが、ＮＦ−κＢ活性化のないコントロール細胞の増殖は阻害しないことが確認された。
【実施例８】ＤＨＭ２ＥＱの多発性骨髄腫細胞に対する増殖阻害作用
ＤＨＭ２ＥＱの多発性骨髄腫細胞に対する増殖阻害作用の濃度依存性解析を、実施例２と同様にして行った。多発性骨髄腫細胞としては、多発性骨髄腫細胞株１９６ＴＩＢを用いた。
結果を図１４に示す。なお、図中、「−」はＤＨＭ２ＥＱ未処理の結果、「＋」はＤＨＭ２ＥＱ処理の結果を示す。
図１４に示すように、多発性骨髄腫細胞株（１９６ＴＩＢ）ではＤＨＭ２ＥＱ添加濃度に比例して細胞増殖が阻害された。
この結果から、ＤＨＭ２ＥＱは、多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害することが確認された。
【実施例９】ＭＣＦ−７細胞におけるＮＦ−κＢとＤＮＡの結合をＤＨＭＥＱが阻害する効果
１．方法
１−１  核抽出物の調製
ＭＣＦ−７細胞（オックスフォード大学Ａｄｒｉａｎ  Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ教授より分与）を１×１０５細胞／ｍｌで４ｍｌずつ６０ｍｌ  ｄｉｓｈに１つの条件につき２枚ずつまいた。翌日、６０ｍｍ  ｄｉｓｈ中の培地を２ｍｌに合わせて、１、３、１０μｇ／ｍｌに調製したＤＨＭＥＱを２時間処理後、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理した。ＴＮＦ−α処理３０分後に６０ｍｍ  ｄｉｓｈ中の培地をサッカー（ｓｕｃｋｅｒ）で抜き、細胞を外用ＰＢＳ−で２回洗浄しｃｏｌｄ  ＰＢＳ−を１ｍｌ入れ、ラバーポリスマンを用いて細胞をはがし（２回）、１５ｍｌ遠心チューブに入れ、２枚の６０ｍｍ  ｄｉｓｈから１５ｍｌ遠心チューブに細胞を集め、１，０００ｒｐｍで５分間遠心にかけ、上清を除去した。これにｃｏｌｄ  ＰＢＳ−を７００μｌ入れ、細胞をピッペッティングしてから１．５ｍｌエッペンドルフチューブに集め（２回）、３，５００ｒｐｍで５分間遠心にかけ、上清を除去した。以下の操作は氷中で行った。ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ：ｐＨ７．９，１．５ｍＭ  ＤＴＴ，０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）４００μｌに懸濁し、ボルテックスで攪拌した後１５分間静置し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心にかけ上清を除去した。またｂｕｆｆｅｒ  Ａを４００μｌずつ加え、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心にかけ上清を除去した。次に、集めた核を４０μｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ：ｐＨ７．９，２５％グリセロール，４２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁させ、２０分間静置した後、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心にかけ、上清をエッペンに回収し、核抽出物とした。
１−２  プローブの調製
４μｌの１．７５ｐｍｏｌ／μｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｍａｄｉｓｏｎ，ＭＡ）、２μｌの１０×Ｔ４  ＰＮＫ  ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＤＴＴ）、及び１０μｌの蒸留水を混ぜ、さらに、２μｌの［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ、２μｌのＴ４  ＰＮＫを加え、３７℃で１０分間インキュベート後、８０μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えて反応を停止させた。
次に、Ｎｉｃｋ  ｃｏｌｕｍｎをスタンドに取り付け、カラムの下に廃液びんを置き、上下のキャップをはずして、カラムに充填してあるＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを廃液びんに回収した。３ｍｌ程度の蒸留水を壁を伝わらせてカラムに加え、廃液びんに回収した。ここで、１００μｌのラベル化したＤＮＡ溶液を、壁に伝わらないようにしてカラムにのせた。下に１．５ｍｌエッペンドルフチューブを準備して４００μｌの蒸留水をカラムに加え、出てきた溶液をエッペンドルフチューブに回収した（ｆｒａｃｔｉｏｎ  １）。下に新しいエッペンドルフチューブを準備し、さらに４００μｌの蒸留水をカラムにのせ、出てきた溶液をエッペンドルフチューブに回収した（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２＝ｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）。滴定が終わったらキャップを閉め、ガイガーカウンターでカラムとｆｒａｃｔｉｏｎ  １，ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２それぞれ測定し、ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２＞カラム＞ｆｒａｃｔｉｏｎ  １となることを確認した。
使用の際は精製した標識されたＤＮＡプローブを約３×１０４ｃｐｍ／μｌに蒸留水で希釈した。
ＤＮＡプローブの塩基配列は以下の通りである。
５’−ＡＴＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号３、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７，２４６２５−２４６３０，２００２）
１−３  結合反応（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）およびゲル（ｇｅｌ）電気泳動
５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（３７５ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ７．０，７．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，７．５ｍＭ  ＤＴＴ，３７．５％グリセロール，１．５％  ＮＰ−４０，１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を４μｌ，１μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙ  ｄＩ−ｄＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）を１μｌ，核抽出物をタンパク量５μｇ分に、全量が１７μｌになるように水をくわえた。これに３μｌのＤＮＡプローブを加え、混和してから２５℃で２０分間インキュベートした。その後、２０μｌの反応液を４％ポリアクリルアミドゲルのウェルに移し、０．２５×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒを用いて、１５０Ｖで泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、フィルムに感光させた。
２．結果
ＤＨＭＥＱを処理していないコントロール細胞ではＴＮＦ−α処理３０分後にＮＦ−κＢとＤＮＡの結合を示すバンドが観察されたが、ＤＨＭＥＱで処理した細胞では、ＮＦ−κＢとＤＮＡの結合は濃度依存的に阻害され、１０μｇ／ｍｌの濃度でＮＦ−κＢとＤＮＡの結合は完全に阻害された（図１５）。
したがって、ＤＨＭＥＱはＴＮＦ−αによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化を阻害するということが示された。
【実施例１０】ＤＨＭＥＱのヒト乳癌細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＮＦ−κＢ非恒常的活性化腫瘍）をＤＨＭＥＱ；１０，５０μｇ／ｍｌ下に２４，４８，７２時間培養し、増殖抑制効果を検討したところ、コントロールに比較して１０μｇ／ｍｌでは２４時間で３９％，４８時間で２５％，７２時間で１７％の細胞が生存し、５０μｇ／ｍｌでは２４時間以降生存細胞は認められなかった（図１６）。濃度及び時間に依存的に細胞増殖が抑制された。
以上の実験結果からは、ＤＨＭＥＱは時間依存性に癌細胞増殖を抑制するが、短時間では比較的高濃度でもアポトーシスの誘導効果は少なく、抗癌剤とは異なる機構を有していることがわかる。これは、ＤＨＭＥＱを生体内で副作用の少ない薬剤として用いることができることを示唆している。
実験方法の詳細は以下のとおりである。
ＭＣＦ−７を６穴プレートに１×１０５／ウェルで播き、翌日ＤＨＭＥＱ；１０，５０μｇ／ｍｌの培地（５ｍｌ）と各々の濃度のＤＨＭＥＱと等量のＤＭＳＯ（ＤＨＭＥＱの溶解に使用）のみのコントロール培地（５ｍｌ）に上清を変えた。各々の群は３ウェルずつで行った。ここを０時間とし、２４，４８，７２時間培養した後にトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）＋ＥＤＴＡで細胞を剥がし、トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）で細胞数を計測して、平均値と標準偏差を算出した。各々、ＤＭＳＯのみのコントロール細胞との比較で、データを出し、ブロットした。
【実施例１１】ＤＨＭＥＱのヒト乳癌細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ＳＣＩＤマウス（日本クレア）皮下腫瘍モデルに４ｍｇ／ｋｇのＤＨＭＥＱを週３日投与し、経時的に腫瘍体積を測定して、腫瘍増殖抑制効果を検討した。また、マウスの体重も同時に測定した。その結果、有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた（図１７）。マウスの死亡、体重減少は見られなかった。
実験方法の詳細は以下のとおりである。
６週令のＳＣＩＤマウス背部皮下にＰＢＳ  １００μｌに浮遊させた１×１０６のＭＣＦ−７を接種した。ＤＨＭＥＱは０．５％メチルセルロース液（メチルセルロース：ナカライテスク）に２００μｌで４ｍｇ／ｋｇとなるよう懸濁した。薬剤含有液もしくは０．５％メチルセルロース液をＭＣＦ−７接種翌日より週３回、２００μｌを腹腔内投与した（各群８匹）。腫瘍の長径および短径を７日おきにノギスで測定し、（長径）×（短径）２／２で腫瘍体積を算出した。同時に体重も測定した。
既存の乳癌治療薬の動物実験における腫瘍増殖抑制効果については、いわゆる抗癌剤では、多くのデータがある。しかし、本薬剤の有効性を類似の機構を有する薬剤と比較する場合、近年その腫瘍増殖抑制における有効性が明らかとなっている抗炎症剤ＣＯＸ−２阻害剤が妥当である。ＣＯＸ−２阻害剤では、ＭＣＦ−７に対する有効性の報告はみられないが、他のＭＣＦ−７同様に頻用される癌細胞の増殖抑制効果（図１８：ルイス肺（Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ）腫瘍と、ＨＴ−２９に対するＣＯＸ−２阻害剤セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の有効性を示す）と比較すると少なくとも同等以上の効果があると結論できる。実験方法は以下の通りである（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０，１３０６−１３１１，Ｍａｒｃｈ  １，２０００．）。ルイス肺腫瘍１０６個をＣ５７／Ｂ１６マウスの後肢に接種し、接種日からセレコキシブ（Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ／Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．提供）をおのおの１６０，４８０，１６００，３２００ｐｐｍで混合した餌を与えた群（ｎ＝２０／ｇｒｏｕｐ）の腫瘍体積をｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒを用いて週２回測定した。ＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞株１０６個をヌードマウスの後肢に接種し、腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した時点から１６０ｐｐｍで経口投与し、週１回測定した。データはｍｅａｎ±ＳＤ。
以上のことから、ＤＨＭＥＱはアポトーシス非依存性の強い抗腫瘍効果を有することがわかった。また、その低副作用性が示唆された。従って、ＤＨＭＥＱは、乳癌の原発巣の増殖抑制、原発巣から他の組織への癌の転移に効果があるのみならず、予後の乳癌の転移を抑制したり、乳癌を予防するのに有効であることもわかった。
現在、乳癌の予防薬として唯一使用されているのは抗エストロゲン剤タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である（北米で認められている。わが国ではその有用性が確認されておらず、使用は認められていない）。タモキシフェンの作用機序はエストロゲン受容体に結合し、女性ホルモンエストロゲンの結合を拮抗阻害することにある。従って、タモキシフェンによる発癌予防効果はホルモン感受性の乳癌のみに限られる。ホルモン非感受性の乳癌における発癌は予防できない。また、タモキシフェンには子宮体癌を発生させる副作用がある。ホルモン療法剤以外に乳癌発癌抑制作用を示すものはまだない。本薬剤は従来の強い細胞障害性を有する薬剤とは異なる機序を有する。従って、将来的にがん予防に使用される可能性がある。さらに本薬剤によるＮＦ−κＢの非活性化はＮＦ−κＢ同様に炎症の中心的なメヂエーターであるＣＯＸ−２の産生もそのカスケードの上流において阻害する。
まとめ：
１）本発明の薬剤は毒性が極めて低いことより、抗癌剤などと全く異なる利点を有する。
２）ホルモン感受性癌のみを対象とするホルモン療法ともそのスペクトラムにおいて大きく異なる。以上より、臨床的に考慮し、極めて新規性が高い。
３）加えて、最近注目を集める乳癌の化学予防の観点からも、新規メカニズムを有する薬剤として有望である。
【実施例１２】毒性試験
ＤＨＭＥＱの急性毒性試験は以下のように行った。ＤＨＭＥＱを１０％ＤＭＳＯ  ｓａｌｉｎｅ＋Ｔｗｅｅｎ８０  １滴に溶解し、ＩＣＲマウスの腹腔に投与し、２４時間後マウスの生死、状態を調べた。その結果、０．１５６，０．３１３，０．６２５，１．２５，２．５ｍｇ／マウスでは生存、５ｍｇ／マウスでは即日死亡した。即日死亡マウスは解剖所見の結果、臓器の沈着有、腹水少量であった。５ｍｇ／マウスは約２５０ｍｇ／ｋｇにあたる。急性毒性ＬＤ５０は１８７．５ｍｇ／ｋｇと算出した。
【実施例１３】  一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の悪疫質に対する効果を検定するため、悪疫質を誘発したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをヒト悪疫質患者のモデルマウスとして用いた。この際、悪疫質症状の誘発には、アンドロゲン非感受性ヒト前立腺癌細胞株ＪＣＡ−１を用いた。
ＤＨＭＥＱによるＮＦ−κＢ活性の阻害効果を測定するため、ＮＦ−κＢの転写活性を指標に、様々な濃度のＤＨＭＥＱに対するＮＦ−κＢ活性を測定した。レポーターには、ＮＦ−κＢ結合配列を６コピー繰り返して有するプロモーターの下流に、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして有するベクターコンストラクト（ｐ６ｋｂ−Ｌｕｃ）を用いた。このレポータープラスミドを、ＧｅｎｅＰＯＥＴＥＲ（商標；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＪＣＡ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１４時間後に、細胞培地に２．５，５，１０，２０，４０μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱを添加し、さらに８時間培養して、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして、何も処理を行わないものと、ＤＨＭＥＱを含有しない溶媒（ここではＤＭＳＯ）のみで処理したものをとり、同時に実験を行った。それぞれのルシフェラーゼ活性を測定し、その絶対値をそれぞれの殺細胞率で標準化して表した。なお、全ての実験は独立に３回行い、平均値と標準偏差を算出した。結果を図１９に示す。
図１９に明らかなように、細胞内のＮＦ−κＢ活性は、投与したＤＨＭＥＱ濃度が高くなるほど、阻害効果が有意に大きくなった。このことから、ＤＨＭＥＱは、ＪＣＡ−１細胞のＮＦ−κＢ活性を、濃度依存的に阻害することが明らかとなった。
【実施例１４】  悪疫質の症状に対するＤＨＭＥＱの効果を測定するため、上記ヌードマウスを用いて、悪疫質モデルマウスを作製した。６週令のヌードマウス側腹皮下に、ＰＢＳ  １００μｌに懸濁した１×１０７個のＪＣＡ−１細胞を接種した（以下、担癌マウスと呼ぶ）。接種されたマウスは、接種１４日後、触診できる位に腫瘍が増大した時点で、ランダムに３つのグループに分け、グループ２（Ｇｒ２；１３匹）には８ｍｇ／ｋｇ体重のＤＨＭＥＱを毎日投与し、グループ３（Ｇｒ３；１３匹）にはＤＭＳＯを毎日投与し、グループ４（Ｇｒ４；１１匹）には何も投与しなかった。なお、ＪＣＡ−１細胞を接種していない正常ヌードマウスをグループ１（Ｇｒ１；１４匹）とした（以下、正常マウスと呼ぶ）。ＤＨＭＥＱを投与した翌日より、１日おきに、体重（図２０）と腫瘍径より算出した腫瘍重量（図２１）を測定した。ＤＨＭＥＱ投与開始後２６日目に、全てのマウスを解剖し、腫瘍の重量（図２２）、精巣周囲の脂肪の重量（図２３）、腓腹筋の重量（図２４）、ヘマトクリット値（図２５；血中細胞成分の全血液量に対する容積の割合。血液を遠心することによって測定できる。）を測定し、グループごとに測定値を集計した。
実験結果を以下に述べる。まず、８ｍｇ／ｋｇ体重のＤＨＭＥＱ投与群（Ｇｒ２）は、非投与群（Ｇｒ３，Ｇｒ４）に対し、有意に体重の減少が抑制された（図２０）。しかし、上記の濃度のＤＨＭＥＱでは、腫瘍の退縮効果は観察されなかった（図２１、図２２）。実験終了時（ＤＨＭＥＱ投与開始後２６日目）における測定では、精巣周囲の脂肪の重量（図２３）や腓腹筋の重量（図２４）は、ＤＨＭＥＱ投与群（Ｇｒ２）において、非投与群（Ｇｒ３，Ｇｒ４）に対し、有意に重量の減少が抑制された。また、ヘマトクリック値では、ＤＨＭＥＱ投与群（Ｇｒ２）において、非投与群（Ｇｒ３，Ｇｒ４）に対し、有意に回復傾向にあった。実験終了時に各群に各臓器の重量を測定し、比較検討したが、ＤＨＭＥＱの投与による各臓器への好ましくない影響は認められなかった（図２６）。
以上より、ＪＣＡ−１細胞の接種によって癌を生じ、悪疫質症状を引き起こしたマウスに対し、ＤＨＭＥＱを投与することにより、生じた癌の大きさや重量に影響を与えない濃度であっても、悪疫質症状の緩和や抑制が観察された。
【実施例１５】ＤＨＭＥＱによる多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株の構成的ＮＦ−κＢ活性化阻害作用
２×１０６個のＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６を１０μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱで１２時間処理し、各細胞株から核抽出液を調製し、実施例４の（１）と同様の方法によりゲルシフトアッセイを行い、ＤＨＭＥＱのＮＦ−κＢ阻害作用を検討した。この結果、ＭＭ細胞株においてＤＨＭＥＱ処理によりＮＦ−κＢによるシグナルが消失することが明らかとなった（図２７のＡ）。なお、ＴＮＦ処理したＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ＋ＴＮＦ）は陽性コントロールとして用いた。図中の「ｃｏｍｐ」は非標識プローブによる競合阻害実験の結果で、シグナルがＮＦ−κＢ結合配列に特異的であることを示す。
次に、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６を１０μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱで処理し、各細胞株から核抽出液を調製し、実施例４の（１）と同様の方法によりゲルシフトアッセイを行い、時間経過によるＮＦ−κＢ阻害作用を検討した。その結果を図２７のＢに示す。これにより、ＤＨＭＥＱ処理後１時間でほぼＮＦ−κＢの活性化は阻害され、１６時間の時点においてもＮＦ−κＢの活性化阻害が持続されるのが確認できた。
次にＮＦ−κＢの活性化阻害効果をレポーターアッセイを用いて調べた。まず、６ｋＢ−Ｌｕｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡをＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６にトランスフェクションにより導入した（２×１０５個細胞／トランスフェクションのスケールで、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてトランスフェクトした）。１２時間後より５μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱで１２時間処理を行い、ＤＨＭＥＱによるＮＦ−κＢの転写抑制効果を検討した。その結果を図２７のＣに示す。これにより、ＤＨＭＥＱで処理したＭＴ−１及びＴＬ−Ｏｍ１は、未処理のものに比べてＮＦ−κＢの転写が約５０％抑制されることが明らかとなった。従って、ＤＨＭＥＱによるＮＦ−κＢの転写抑制効果が示された。
【実施例１６】ＤＨＭＥＱによる多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株の増殖阻害作用
細胞増殖阻害に対するＤＨＭＥＱの濃度の影響を調べるために、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６を用いて実施例５の（１）と同様の方法により、細胞の生存率を判定した。その結果を図２８のＡに示す。なお、図中の横軸はＤＨＭＥＱの濃度を示し、縦軸はＤＨＭＥＱ未処理細胞に対する処理細胞のＭＴＴ値の相対値、すなわち（ＤＨＭＥＱ処理／未処理）×１００％を示す。図２８のＡに示すように、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６はＤＨＭＥＱの濃度に比例して細胞増殖が抑制されることが明らかとなった。
次に、ＤＨＭＥＱの増殖抑制の時間経過による影響を調べるため、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６を用いて、実施例５の（２）と同様の方法により、時間経過に対する増殖阻害作用をＭＴＴアッセイ法により検討した。その結果を図２８のＢに示す。なお、図中の横軸はＤＨＭＥＱの濃度を示し、縦軸はＤＨＭＥＱ未処理細胞に対する処理細胞のＭＴＴ値の相対値、すなわち（ＤＨＭＥＱ／未処理）×１００％を示す。図２８のＢに示されるように、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６はＤＨＭＥＱの処理時間に比例して細胞増殖が抑制されることが明らかとなった。
また、ＤＨＭＥＱによるＭＭ細胞株へのアポトーシスの誘導について調べるため、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６に対し、１０μｇ／ｍｌの濃度で０、２４、４８時間培養を行い、アネキシンＶ染色によりアポトーシスの検討を行った。その結果を図２８のＣに示す。これにより、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６はＤＨＭＥＱ処理によりアネキシンＶ陽性細胞が生じ、アポトーシスが誘導されていることが明らかとなった。
また、ＤＨＭＥＱによるＭＭ細胞株のアポトーシスの誘導を確認するため、ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６に対し、１０μｇ／ｍｌの濃度で７２時間培養を行い、ヘキスト染色して核の濃縮あるいは断片化を蛍光顕微鏡で観察することによりアポトーシスの検討を行った。その結果を図２８のＤに示す。ＭＭ細胞株ＫＭＭ１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６においては、ＤＨＭＥＱ処理により核の断片化した像が観察された。以上の結果から、ＤＨＭＥＱは、ＡＴＬ細胞のアポトーシスを誘導することを確認した。
【実施例１７】ＤＨＭＥＱによる多発性骨髄腫（ＭＭ）患者細胞の増殖阻害作用
次に、ＤＨＭＥＱの多発性骨髄腫（ＭＭ）患者細胞の増殖阻害作用を調べるため、ＭＭ細胞（ＭＭ１，ＭＭ２，ＭＭ３）を患者骨髄より分離し、ＤＨＭＥＱ  １０μｇ／ｍｌの濃度で４８時間培養を行い、増殖阻害作用をＭＴＴアッセイ法により検討した。その結果を図２９のＡに示す。なお、コントロールとして正常末梢血より分離した単核球（ＰＢＭＣ）を用いた。図中の縦軸はＤＨＭＥＱ未処理細胞に対する処理細胞のＭＴＴ値の相対値、すなわち（ＤＨＭＥＱ処理／未処理）×１００％を示す。図２９のＡに示されるように、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者からのＭＭ細胞はＤＨＭＥＱの濃度に比例して増殖が抑制されたのに対し、正常末梢血より分離した単核球への影響はほとんど認められなかった。
このことから、ＤＨＭＥＱは、ＭＭ患者のＭＭ細胞に対しては増殖阻害活性をもつが、正常単核球に対してはほとんど作用せず、副作用の少ない医薬組成物として機能しうることが明らかとなった。
また、ＤＨＭＥＱによる多発性骨髄腫（ＭＭ）患者細胞へのアポトーシスの誘導について調べるため、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者細胞に対し、ＤＨＭＥＱ  １０μｇ／ｍｌの濃度で７２時間培養を行い、ヘキスト染色して核の濃縮あるいは断片化を蛍光顕微鏡で観察することによりアポトーシスの検討を行った。その結果を図２９のＢに示す。図２９のＢに示されるように、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者からのＭＭ細胞はＤＨＭＥＱ処理によりアポトーシスが誘導され、核が断片化することを確認した。
【実施例１８】ＤＨＭＥＱによるホジキンリンパ腫（ＨＬ）細胞株の構成的ＮＦ−κＢ活性化阻害作用
２×１０６個のＨＬ細胞株ＫＭＨ２、Ｌ４２８、Ｌ５４０、ＨＤＬＭ２およびコントロール細胞株Ｋ５６２を１０μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱで１２時間処理し、各細胞株から核抽出液を調製し、実施例４の（１）と同様の方法によりゲルシフトアッセイを行い、ＮＦ−κＢ阻害作用を検討した。その結果、ＨＬ細胞株ではＤＨＭＥＱによりＮＦ−κＢのシグナルがほぼ消失することが明らかとなった（図３０のＡ）。なお、細胞株Ｋ５６２（骨髄球系の白血病細胞株）はＮＦ−κＢの構成的活性化を認めない細胞株であり、ネガティブコントロールとして用いた。一方、ＴＮＦ処理したＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ＋ＴＮＦ）はポジティブコントロールとして用いた。図中の「ｃｏｍｐ」は非標識プローブによる競合阻害実験で、シグナルがＮＦ−κＢ結合配列に特異的であることを示す。
次に、ＨＬ細胞株ＫＭＨ２、Ｌ５４０を１０μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱで処理し、各細胞株から核抽出液を調製し、実施例４の（１）と同様の方法によりゲルシフトアッセイを行い、時間経過によるＮＦ−κＢ阻害作用を検討した。その結果、処理後１時間でほぼＮＦ−κＢの活性化は阻害され、１６時間の時点においてもＮＦ−κＢの活性化阻害が持続されるのが確認できた（図３０のＢ）。
ＮＦ−κＢは、ｐ５０、ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌの各構成因子からなる複合体である。そこで、ＨＬ細胞株ＫＭＨ２、Ｌ４２８、Ｌ−５４０、ＨＤＬＭ２において構成的に活性化されているＮＦ−κＢの構成因子について検討を行った。実施例１に記載の方法と同様にＮＦ−κＢのｐ５０、ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌに対する抗体を用い、スーパーシフトを行った。その結果を図３０のＣに示す。図３０のＣに示すように、特にｐ５０に対してスーパーシフトが観察され、ＨＬ細胞株のいずれにおいてもｐ５０が複合体中に存在することが確認できた。
Ｌ４２８及びＫＭＨ２においては、ＤＨＭＥＱ処理後も弱いシグナルが残存する。そこで、これらのシグナルがＤＨＭＥＱ抵抗性のＮＦ−κＢの特異的な構成因子を有しているかどうか調べた。また、ＨＬ細胞株ＫＭＨ２、Ｌ４２８Ｌ−５４０、ＨＤＬＭ２を５μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱで１２時間処理し、残存するＮＦ−κＢの成分をＮＦ−κＢのｐ５０、ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌに対する抗体を用いて、実施例１に記載の方法と同様にスーパーシフトを行った。その結果を図３０のＤに示す。図３０のＤに示すように、残存する成分は主にｐ５０で図３０のＣと同様の結果が得られ、ＤＨＭＥＱに対して抵抗性を示す特有の構成因子はないと考えられた。
【実施例１９】ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果
カンプトテシン（ＣＰＴ）、ダウノマイシン（ＤＮＲ）、エトポシド（ＥＴＰ）を抗腫瘍剤として用い、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果を検討した。抗腫瘍剤作用およびその増強効果は実施例５の（２）に記載のＭＴＴアッセイ法により検討した。その結果を図３１に示す。なお、本実施例において、細胞はＫＭＨ２を用いた。図中の横軸は各抗腫瘍剤の濃度およびＤＨＭＥＱ濃度を示す。各々抗癌剤の濃度を３段階とし、それぞれについてＤＨＭＥＱのみ、抗腫瘍剤のみ、両者併用で検討した。ＤＨＭＥＱは１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し、処理時間は４８時間とした。縦軸は未処理細胞に対する処理細胞のＭＴＴ値の相対値、すなわち（処理／未処理）×１００％を示す。図３１のＡは抗腫瘍剤としてカンプトテシン（ＣＰＴ）を、Ｂは抗癌剤としてダウノマイシン（ＤＮＲ）を、Ｃは抗腫瘍剤としてエトポシド（ＥＴＰ）を用いた。この結果、いずれにおいてもＤＨＭＥＱは抗腫瘍剤の効果を増強することが示された。
【実施例２０】ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤作用増強効果は抗腫瘍剤によるＮＦ−κＢ活性化の阻害による
各抗腫瘍剤処理によるＮＦ−κＢ活性化を調べるために、各抗腫瘍剤（カンプトテシン（ＣＰＴ）、ダウノマイシン（ＤＮＲ）、エトポシド（ＥＴＰ））で腫瘍細胞を処理した時のＮＦ−κＢ活性化を実施例４の（１）に記載のゲルシフトアッセイにより調べた。その結果を図３２のＡに示す。なお、本実施例において、細胞はＫＭＨ２を用いた。図中の各パネル下段は得られたシグナルを定量化し、処理前を１とした時の相対値を示す。図３２のＡに示されるように、いずれの抗腫瘍剤で処理しても処理前のものと比較して、一過的に３から２０倍のＮＦ−κＢ活性が腫瘍細胞に生じていることが示された。
腫瘍細胞において、カンプトテシン（ＣＰＴ）及びダウノマイシン（ＤＮＲ）により誘導されたＮＦ−κＢの構成因子を調べるため、実施例１に記載の方法と同様にＮＦ−κＢのｐ５０、ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌに対する抗体を用い、スーパーシフトを行った。その結果を図３２のＢに示す。図３２のＢに示すように、カンプトテシン（ＣＰＴ）又はダウノマイシン（ＤＮＲ）で処理した腫瘍細胞において活性化ＮＦ−κＢは主にｐ５０を含んでいることが明らかとなった。
次に、ＤＨＭＥＱによる抗腫瘍剤によるＮＦ−κＢ活性化の阻害について調べるために、各抗腫瘍剤（カンプトテシン（ＣＰＴ）、ダウノマイシン（ＤＮＲ））にＤＨＭＥＱを併用して腫瘍細胞を処理した時のＮＦ−κＢ誘導を実施例４の（１）に記載のゲルシフトアッセイを行い、時間経過によるＮＦ−κＢ阻害作用を検討した。その結果を図３２のＣに示す。なお、本実施例において、細胞はＫＭＨ２を用いた。図中の各パネル下段は得られたシグナルを定量化し、処理前を１とした時の相対値を示す。図３２のＣに示されるように、いずれの抗腫瘍剤で処理してもＮＦ−κＢ誘導はＤＨＭＥＱ併用により強く抑制された。
【実施例２１】  ＡＴＬ細胞株を腹腔内に接種したＳＣＩＤマウスを用い、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＨＭＥＱの効果を調べた。まず、ＳＣＩＤ（Ｍａｌｅ  Ｃ．Ｂ１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ  ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）マウス（ＣＢ１７系統、５週齢、雄；ＳＬＣ  Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ））を１ｍｇのＩＬ−２レセプター抗体（ＴＭ−β１；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２２２２−２２２８，１９９１）で３〜５日間処理し、３−４×１０７のＡＴＬ細胞株ＭＴ−２を腹腔内に接種した。その後、それらのマウスに０．５％ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ）液に溶解したＤＨＭＥＱ  ４ｍｇ／ｋｇ−体重又は１２ｍｇ／ｋｇ−体重を１ヶ月にわたり週３回腹腔内に投与し、生存率およびマウスの状態を観察した。対照群にはＤＨＭＥＱを含まない０．５％ＣＭＣ液を同様に１ヶ月にわたり週３回腹腔内に投与した。その結果を図３３に示す。なお、生存曲線はカプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒ）法により計算し、統計学的有意差はＣｏｘ−Ｍａｎｔｅｌテストにて判定した。図３３に示されるように、ＤＨＭＥＱ  ４ｍｇ／ｋｇ投与群（ＤＨＭＥＱ（＋））は実験開始後、約２００日で６匹中４匹が生存し、これに対し、対照群（ＤＨＭＥＱ（−））は５匹全例が死亡し、統計学的に有意差を得た（Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌテスト；ｐ＜０．０５）。また、ＤＨＭＥＱ  １２ｍｇ／ｋｇ投与群（ＤＨＭＥＱ（＋））は実験開始後約３０日で６匹中５匹生存したが、これに対し非投与群（ＤＨＭＥＱ（−））は５匹中４匹が死亡し、統計学的に有意差を得た（Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌテスト；ｐ＜０．０５）。なお、投与群（ＤＨＭＥＱ（＋））はマウスの体重等に異常は認めず、ＤＨＭＥＱ  ４ｍｇ／ｋｇの３倍量を用いても毒性は認めなかった。この結果、ＤＨＭＥＱはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて移植ＡＴＬ細胞によるマウス個体の死亡を救う（ｒｅｓｃｕｅ）ことができることが明らかとなった。
【実施例２２】ＤＨＭＥＱと放射線照射とを併用した場合の相乗効果
ＤＨＭＥＱのｉｎ  ｖｉｖｏヒト膵癌に対する腫瘍細胞の増殖抑制効果について調べた。２×１０６のヒト膵癌細胞株ＰＫ−２をＳＣＩＤマウス（７匹）の右背部皮下に接種し、ＤＨＭＥＱ  １２ｍｇ／ｋｇを１日置きに１回２００μｌで５日間腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。その後、７日ごとに腫瘍の長径と短径を測定し、（長径）×（短径）２×０．５により腫瘍体積を算出した。その結果を図３４に示す。図３４に示されるように、ＤＨＭＥＱを用いると腫瘍細胞の増殖が有意に抑制されることが明らかとなった。
次に、放射線照射した腫瘍細胞におけるＤＨＭＥＱのアポトーシス増強効果について調べた。ＤＨＭＥＱ  １０μｇ／ｍｌを６時間投与したヒト膵癌細胞株Ｃｏｌｏ３５７と、２０Ｇｙの放射線を照射して６時間インキュベーションしたヒト膵癌細胞株Ｃｏｌｏ３５７と、２０Ｇｙの放射線を照射した直後からＤＨＭＥＱ  １０μｇ／ｍｌを６時間投与したヒト膵癌細胞株Ｃｏｌｏ３５７を、それぞれアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）−ＶとＰＩ（プロピジウムイオダイド）で二重染色し、フローサイトメトリーでアポトーシス初期段階にある細胞（右下）を測定し、その比率を算定した。その結果を図３５に示す。図３５に示されるように、ＤＨＭＥＱ単独ではヒト膵癌細胞株Ｃｏｌｏ３５７においてアポトーシスは誘導されなかった。これに対して、２０Ｇｙの放射線照射した後、ＤＨＭＥＱを投与した細胞では、２０Ｇｙの放射線照射のみを行った細胞に比べ、アポトーシスの誘導能が約３倍増強することが明らかとなった。
また、ＤＨＭＥＱの放射線併用におけるヒト膵癌細胞株に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果について調べた。５×１０５のヒト膵癌細胞株Ｐａｎｃ−１、ＰＫ−８、Ｃｏｌｏ３５７を１０ｃｍ  ｄｉｓｈにまき、２日後に２．５Ｇｙ若しくは１０Ｇｙで放射線照射を行い、続いて併用群では１０μｇ／ｍｌのＤＨＭＥＱを４時間投与し、２４時間後に細胞数を計測した。なお、放射線照射終了後若しくは薬剤添加時を０時間とした。その結果を図３６に示す。これにより、ＤＨＭＥＱは４時間の薬剤接触のみで、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−８、Ｃｏｌｏ３５７に対し十分な増殖抑制効果を有し、その効果は２．５Ｇｙ相当の放射線照射に匹敵した。放射線抵抗性でかつＤＨＭＥＱ単独の効果が乏しいＰａｎｃ−１においては、放射線照射とＤＨＭＥＱとの併用でおのおのの治療抵抗性が消失した。Ｃｏｌｏ３５７とＰａｎｃ−１では、放射線照射との併用でＤＨＭＥＱは相乗的な増殖抑制効果を示し、２．５Ｇｙの照射効果を４倍の１０Ｇｙ相当まで増強することが明らかとなった。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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