(57)【要約】本発明は、無細胞タンパク質に用いるための細胞抽出液の凍結乾燥製剤であって、低温保存した場合と遜色のないタンパク質合成活性を有するもの、及びその利用方法等を提供する。詳しくは、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液に含まれる潮解性物質の濃度を、凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない量に低減した後に凍結乾燥することにより製剤化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を凍結乾燥して無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤を製造する方法であって、含有液に含まれる潮解性物質の含有量が、凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない量であることを特徴とする方法。
【請求項２】
潮解性物質含有量が、乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して０．０１重量部以下である請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤。
【請求項３】
潮解性物質が、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウムから選択されるものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液から低分子のタンパク質合成阻害物質を排除する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
低分子のタンパク質合成阻害物質が、分子量１４，０００ダルトン以下であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質合成阻害物質の排除が、少なくとも高エネルギーリン酸化合物を含む溶液中で行われることを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、コムギ胚芽抽出液であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出液が、タンパク質合成に必要な物質である少なくとも基質となるアミノ酸、エネルギー源を含む溶液を添加したものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法により製造された無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の製剤を含む無細胞タンパク質合成用キット
【請求項１１】
請求項９に記載の製剤に、少なくとも潮解性物質の濃度を無細胞タンパク質合成において最適濃度にするための溶液を組み合わせた無細胞タンパク質合成用キット。
【請求項１２】
翻訳鋳型を含むことによりタンパク質ライブラリーを合成できることを特徴とする請求項１０または１１に記載のタンパク質合成用キット。
【請求項１３】
請求項１０〜１２に記載の無細胞タンパク質合成用キットを利用して調整した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を用いるタンパク質合成方法。
【請求項１４】
酢酸カリウムの最終濃度が５０〜２００ｍＭとなるように調整する請求項１３に記載のタンパク質合成方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載のタンパク質合成方法で得られた合成タンパク質。
【発明の詳細な説明】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号２００２−１３８８２８からの優先権を請求する。
技術分野
本発明は、無細胞タンパク質合成に用いるための細胞抽出物含有凍結乾燥製剤、該製剤を用いた無細胞タンパク質合成方法、及び該製剤を含む無細胞タンパク質合成用キットに関するものである。
背景技術
細胞内で行われているタンパク質の合成反応は、まず遺伝情報をもつＤＮＡからその情報がｍＲＮＡに転写され、そしてリボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳して、タンパク質を合成するという工程で進行している。現在、この細胞内におけるタンパク質合成を試験管等の生体外で行う方法としては、例えばリボソームやその他のタンパク質合成に必要な成分を生物体から抽出し（以下、これを「無細胞タンパク質合成用細胞抽出物」と称することがある）、これらを用いた試験管内での無細胞タンパク質合成法の研究が盛んに行われている（特開平６−９８７９０号公報、特開平６−２２５７８３号公報、特開平７−１９４号公報、特開平９−２９１号公報、特開平７−１４７９９２号公報）。
これらの無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液、及び該抽出物含有液に、翻訳鋳型や酵素を除く翻訳反応に必要な成分を添加したタンパク質合成反応液（以下、これを「レディメイド型細胞抽出物含有液」と称することがある）は、常温では不安定であり−８０℃以下の超低温でのみ安定な保存が可能であった。しかし、無細胞タンパク質合成系は、翻訳反応の正確性や速度において生細胞に匹敵する性能を保持し、かつ目的とするタンパク質を複雑な精製工程を実施することなく得ることができる有用な方法である。そのため該合成系をより産業上に適用するため、合成効率の上昇のみならず上記の合成用細胞抽出物含有液やレディメイド型細胞抽出物含有液を安定的に高品質を保持して提供することが必要である。従来は無細胞タンパク質合成反応のためには、細胞抽出物含有液を初め、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰやカリウム、マグネシウムといった種々の成分をそれぞれ安定な状態で保持しておき、タンパク質合成反応開始に先だってそれらを最適の割合で混合する必要があった。この方法には、保存方法の他に、煩雑な操作を必要とすることから、合成試料が多数の場合には大きな困難を伴った。さらに、この従来法では、ハイスループットなタンパク質の合成のための全自動化システムの構築のネックとなっている。
本発明者らは先にタンパク質合成用細胞抽出物含有液やレディメイド型細胞抽出物含有液を凍結乾燥により製剤化する方法を提案している（特開２０００−３１６５９４号公報）が、該製剤は凍結乾燥工程中に溶解等が起こり、その結果該製剤の品質の低下が見られるという問題があった。「品質の低下」とは、該製剤に水を添加した際、製剤が完全に溶解せず、これを用いたタンパク質合成反応における合成活性も低下するものである。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、無細胞タンパク質用抽出物含有液に含まれる潮解性物質、例えば酢酸カリウムの濃度を６０ｍＭ以下に低減させた後にこれを凍結乾燥して製剤化することによれば、該含有液を工業的に実施可能な程度に安定的に保持できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
１．無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を凍結乾燥して無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤を製造する方法であって、含有液に含まれる潮解性物質の含有量が、凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない量であることを特徴とする方法。
２．潮解性物質含有量が、乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して０．０１重量部以下である前記１に記載の無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤。
３．潮解性物質が、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウムから選択されるものである前記１または２に記載の方法。
４．無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液から低分子のタンパク質合成阻害物質を排除する工程を含むことを特徴とする前記１に記載の方法。
５．低分子のタンパク質合成阻害物質が、分子量１４，０００ダルトン以下であることを特徴とする前記４に記載の方法。
６．タンパク質合成阻害物質の排除が、少なくとも高エネルギーリン酸化合物を含む溶液中で行われることを特徴とする前記４または５に記載の方法。
７．無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、コムギ胚芽抽出液であることを特徴とする前記１〜６のいずれかに記載の方法。
８．無細胞タンパク質合成用細胞抽出液が、タンパク質合成に必要な物質である少なくとも基質となるアミノ酸、エネルギー源を含む溶液を添加したものであることを特徴とする前記１〜７のいずれかに記載の方法。
９．前記１〜８に記載の方法により製造された無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤。
１０．前記９に記載の製剤を含む無細胞タンパク質合成用キット
１１．前記９に記載の製剤に、少なくとも潮解性物質の濃度を無細胞タンパク質合成において最適濃度にするための溶液を組み合わせた無細胞タンパク質合成用キット。
１２．翻訳鋳型を含むことによりタンパク質ライブラリーを合成できることを特徴とする前記１０または１１に記載のタンパク質合成用キット。
１３．前記１０〜１２に記載の無細胞タンパク質合成用キットを利用して調整した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を用いるタンパク質合成方法。
１４．酢酸カリウムの最終濃度が５０〜２００ｍＭとなるように調整する前記１３に記載のタンパク質合成方法。
１５．前記１３に記載のタンパク質合成方法で得られた合成タンパク質。
を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の凍結乾燥製剤は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液に含まれる潮解性物質の濃度を、凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない量以下に低減させた後に凍結乾燥することにより製造することができる。本発明の凍結乾燥製剤の製造に用いることのできる無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液とは、タンパク質合成に必要な成分を細胞から抽出したものだけでなく、該細胞抽出物含有液に無細胞タンパク質合成系に必要な各種イオン類、アミノ酸等の基質、エネルギー源、緩衝液、及びその他の有効因子等を添加したレディメイド型細胞抽出物含有液等も含むものである。それぞれの作製方法等を以下に詳細に説明する。
（１）無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液
［細胞抽出物含有液］
本発明に用いられる無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液としては、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成能を有するものであれば如何なるものであってもよい。ここで、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分を生物体から抽出し、この抽出液に転写、または翻訳鋳型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内で行う方法である。このうち、鋳型としてＲＮＡを用いるもの（これを以下「無細胞翻訳系」と称することがある）と、ＤＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼ等転写に必要な酵素をさらに添加して反応を行うもの（これを以下「無細胞転写／翻訳系」と称することがある）がある。本発明における無細胞タンパク質合成系は、上記の無細胞翻訳系、無細胞転写／翻訳系のいずれをも含む。
本発明に用いられる細胞抽出液として具体的には、大腸菌等の徴生物、植物種子の胚芽、ウサギ等の哺乳動物の網状赤血球等から調製されたものが用いられる。細胞抽出物含有液は、市販のものを用いることもできるし、上記微生物、胚芽、網状赤血球等からそれ自体既知の方法、具体的には、例えば大腸菌等の微生物細胞抽出液は、Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。
市販の細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうち、植物種子の胚芽抽出液を用いることが好ましく、植物種子としては、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物のものが好ましい。本発明の細胞抽出液としては、このうちコムギ胚芽抽出液を用いたものが好適である。
コムギ胚芽抽出液の調製法としては、コムギ胚芽の単離方法として、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）に記載の方法等が用いられ、また単離した胚芽からの細胞抽出液の抽出方法としては、例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０等に記載の方法を用いることができるが、以下にさらに詳細に説明する。
植物種子に含まれる胚芽の量は少ないため、胚芽を効率的に取得するためには胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、植物種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。植物種子に加える力は、植物種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。
通常は、公知の粉砕装置を用いて、植物種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
植物種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよいが、例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られた植物種子粉砕物から、通常公知の分篩装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常、胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。
洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄するのがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、例えば０．５％の濃度で使用することができる。
水又は水溶液による洗浄処理および界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
上記のように植物種子を粉砕して得られた粉砕物から植物胚芽を選別した後、洗浄して得られた無傷（発芽能を有する）の胚芽を細分化し、細分化された植物胚芽と抽出溶媒とを混合して胚芽抽出物を得、胚芽抽出物含有液を分離・精製する。
本発明においては、植物胚芽の細分化は、従来のように凍結した胚芽を乳鉢等により摩砕又は圧砕により行うことができるが、本発明者らが先に提案した、衝撃または切断により細分化することが好ましい（特願２００２−２３１３９、特願２００２−２３１３４０）。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕又は圧砕と比べて最小限に止めうる条件で植物胚芽を破壊することを意味する。
細分化する際に用いることのできる装置や方法としては、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いるのが好ましい（以下、この方法を単に「ワーリングブレンダー法」と称することがある）。刃状物の回転数は、通常１０００ｒｐｍ以上、好ましくは５０００ｒｐｍ以上であり、また、通常３００００ｒｐｍ以下、好ましくは２５０００ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常１０分以下、好ましくは５分以下である。細分化する際の温度は、胚芽のタンパク質合成能力が失われない温度であれば特に限定されないが、好ましくは１０℃以下で細分化の操作が可能な温度範囲、特に好ましくは４℃程度が適当である。
本発明のように衝撃または切断により胚芽を細分化することにより、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が全て破壊されてしまうのではなく、少なくともその一部は破壊されることなく残る。即ち、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることがないため、それらに含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の混入が少なく、細胞質に局在するタンパク質合成に必要なＲＮＡやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から抽出することができる。
次いで、細分化された胚芽に抽出溶媒を加えて攪拌した後、胚芽抽出物含有液を遠心分離等により回収し、ゲルろ過等により精製することにより胚芽抽出物を得ることができる。
また、衝撃または切断により胚芽を細分化する際に抽出溶媒を存在させることにより、植物胚芽を細分化する工程と細分化された植物胚芽と抽出溶媒とを混合して胚芽抽出物を得る工程を同時に行うことができる。この場合、胚芽と抽出に必要な量の抽出溶媒とを混合し、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽１ｇに対して、通常０．１ミリリットル以上、好ましくは０．５ミリリットル以上、より好ましくは１ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽１ｇに対して、１０ミリリットル以下、好ましくは５ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいし、凍結させていないものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのが好ましい。
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用の胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
次いで、遠心分離等により胚芽抽出物含有液を回収し、ゲルろ過等により精製することにより胚芽抽出物を得ることができる。ゲルろ過としては、例えば予め溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む溶媒）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５等のゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用の胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
このようにして得られた胚芽抽出物は、原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
上記胚芽抽出物は、細胞抽出液由来（および必要に応じて別途添加される）タンパク質を含有する。その含有量は、特に限定されないが、凍結乾燥状態での保存安定性、使い易さ等の点から、凍結乾燥前の組成物おいて、当該組成物全体の好ましくは１〜１０重量％、より好ましくは２．５〜５重量％であり、また、凍結乾燥後の凍結乾燥組成物において、当該凍結乾燥組成物全体の好ましくは１０〜９０重量％、より好ましくは２５〜７０重量％である。また、必要に応じて、ゲル濾過、透析等の常法により、凍結乾燥前の組成物において、タンパク質含有量を上記範囲内になるようにしてもよい。
なお、ここでいうタンパク質含有量は、吸光度（２６０，２８０，３２０ｎｍ）を測定することにより算出されるものである。
［低分子合成阻害物質の排除］
さらにこのような細胞抽出液は、タンパク質合成阻害活性を有する低分子の合成阻害物質を含んでおり、本発明者らが先に提案したとおり、これら阻害物質を取り除く（特許出願中）ことにより凍結製剤化した後も高いタンパク質合成活性が保持される。具体的には、細胞抽出液の構成成分から、これら低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画排除する。排除されるべき物質（低分子阻害物質）の分子量は、細胞抽出液中に含まれるタンパク質合成に必要な因子よりも小さいものであればよい。具体的には、分子量５０，０００〜１４，０００以下、好ましくは１４，０００以下のものが挙げられる。
低分子合成阻害物質の細胞抽出液からの排除方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられるが、具体的には透析膜を介した透析による方法、ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。このうち、透析による方法（透析法）が、透析内液に対しての物質の供給のし易さ等の点において好ましい。以下、透析法を用いる場合を例に詳細に説明する。
透析に用いる透析膜としては、５０，０００〜１２，０００の排除分子量を有するものが挙げられる、具体的には排除分子量１２，０００〜１４，０００の再生セルロース膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｓａｌｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ製）や、排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＴＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ製）等が好ましく用いられる。このような透析膜中に適当な量の上記細胞抽出液を入れ常法を用いて透析を行う。透析を行う時間は、３０分〜２４時間程度が好ましい。
このように低分子合成阻害物質の排除を行う際、細胞抽出液に不溶性成分が生成される場合には、これを阻害する（以下、これを「細胞抽出液の安定化」と称することがある）ことにより、最終的に得られる細胞抽出液（以下、これを「処理後細胞抽出液」と称することがある）のタンパク質合成活性が高まる。細胞抽出液の安定化の具体的な方法としては、上記（１）に記載した低分子阻害物質の排除を行う際に、少なくとも高エネルギーリン酸化合物、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ等を含む溶液中で行う方法が挙げられる。高エネルギーリン酸化合物としては、ＡＴＰが好ましく用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰとＧＴＰ、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、及び２０種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。
これらの成分（以下、これを「安定化成分」と称することがある）を含む溶液中で低分子阻害物質の排除を行う場合は、細胞抽出液に予め安定化成分を添加し、インキュベートした後、これを低分子阻害物質の排除工程に供してもよい。低分子合成阻害物質の排除に透析法を用いる場合は、細胞抽出液だけでなく透析外液にも安定化成分を添加して透析を行い低分子阻害物質の排除を行うこともできる。透析外液にも安定化成分を添加しておけば、透析中に安定化成分が分解されても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。このことは、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いる場合にも適用でき、それぞれの担体を安定化成分を含むろ過用緩衝液により平衡化した後に、安定化成分を含む細胞抽出液を供し、さらに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることができる。
安定化成分の添加量、及び安定化処理時間としては、細胞抽出液の種類や調製方法により適宜選択することができる。これらの選択の方法としては、試験的に量及び種類をふった安定化成分を細胞抽出液に添加し、適当な時間の後に低分子阻害物質の排除工程を行い、取得された処理後細胞抽出液を遠心分離等の方法で可溶化成分と不溶化成分に分離し、そのうちの不溶性成分が少ないものを選択する方法が挙げられる。さらには、取得された処理後細胞抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行い、タンパク質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。また、上記の選択方法において、細胞抽出液と透析法を用いる場合、適当な安定化成分を透析外液にも添加し、これらを用いて透析を適当時間行った後、得られた細胞抽出液中の不溶性成分量や、得られた細胞抽出液のタンパク質合成活性等により選択する方法も挙げられる。
このようにして選択された細胞抽出液の安定化条件の例として、具体的には、（１）に記載したブレンダー法を用いて調製したコムギ胚芽抽出液で、透析法により低分子阻害物質の排除工程を行う場合においては、そのコムギ胚芽抽出液、及び透析外液中に，ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ添加して３０分〜１時間以上の透析を行う方法等が挙げられる。透析を行う場合の温度は、タンパク質合成活性が失われず、かつ透析が可能な温度であれば如何なるものであってもよい。具体的には、最低温度としては、溶液が凍結しない温度で、通常−１０℃、好ましくは−５℃、最高温度としては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である４０℃、好ましくは３８℃である。
細胞抽出液への安定化成分の添加方法は、特に制限はなく、低分子阻害物質の排除工程の前に添加しこれを適当時間インキュベートして安定化を行った後、低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよいし、安定化成分を添加した細胞抽出液、及び／または安定化成分を添加した該排除工程に用いるための緩衝液を用いて低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよい。
［弱還元型無細胞タンパク質合成用細胞抽出液］
無細胞タンパク質合成系において、本発明者らが先に提案したとおり、翻訳反応液中の還元剤の濃度を調製することにより分子内ジスルフィド結合を保持させてタンパク質を合成することができる（特願２００２−０５３１６１）。このような翻訳反応液を作製するための本発明の凍結乾燥製剤は、細胞抽出物含有液中の還元剤の濃度を調節することにより作製することができる。具体的な還元剤とその濃度としては、該製剤を用いて作製した翻訳反応液中のジチオスレイトール（以下これを「ＤＴＴ」と称することがある）を最終濃度が、２０〜７０μＭ、好ましくは３０〜５０μＭ、２−メルカプトエタノールを最終濃度０．１〜０．２ｍＭ、グルタチオン／酸化型グルタチオンの濃度が３０〜５０μＭ／１〜５μＭとなる範囲が挙げられる。
このような翻訳反応液中の還元剤濃度は、上記したものに限定されるものではなく、合成しようとするタンパク質、あるいは用いる無細胞タンパク質合成系の種類により適宜変更することができる。還元剤の至適濃度範囲の選択法としては、特に制限はないが、例えば、ジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の効果によって判断する方法を挙げることができる。具体的には、還元剤の濃度を様々にふった翻訳反応液を調製し、これらにジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素を添加して分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質合成を行う。また、対照実験として同様の翻訳反応液にジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素を添加しないで同様のタンパク質合成を行う。ここで合成されるタンパク質の可溶化成分を、例えば遠心分離等の方法により分離する。この可溶化成分が全体の５０％（可溶化率５０％）以上であり、またその可溶化成分がジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の添加により増加した反応液が、該タンパク質の分子内ジスルフィド結合を保持したまま合成する反応液として適していると判断することができる。さらには、上記のジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の効果によって選択された還元剤の濃度範囲のうち、合成されるタンパク質量の最も多い還元剤の濃度をさらに好ましい濃度範囲として選択することができる。
このような還元剤濃度を有する反応液の調製方法としては、還元剤を含まない無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を調製し、これに無細胞タンパク質合成系に必要な成分とともに、上記の濃度範囲となるように還元剤を添加する方法や、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液から上記の濃度範囲となるように還元剤を除去する方法等が用いられる。無細胞タンパク質合成用細胞抽出液はこれを抽出する際に高度の還元条件を必要とするため、抽出後にこの溶液から還元剤を取り除く方法がより簡便である。細胞抽出液から還元剤を取り除く方法としては、ゲルろ過用担体を用いる方法等が挙げられる。具体的には、例えば、セファデックスＧ−２５カラムを予め還元剤を含まない適当な緩衝液で平衡化してから、これに細胞抽出液を通す方法等が挙げられる。
かくして作製した弱還元型無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を凍結乾燥した製剤を用いてタンパク質合成を行う場合には、後述する合成用反応液に、さらにジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素を添加して翻訳反応を行えば、分子内のジスルフィド結合が保持されたタンパク質を高効率で合成することができる。ジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素としては、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の無細胞翻訳系への添加量は、酵素の種類によって適宜選択することができる。具体的には、コムギ胚芽から抽出した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液であって、還元剤としてＤＴＴを２０〜７０、好ましくは３０〜５０μＭ含有する翻訳反応液にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを添加する場合、最終濃度で０．０１〜１０μＭの範囲、好ましくは０．５μＭとなるように添加する。また、添加の時期はジスルフィド結合が形成される効率から無細胞翻訳反応開始前に添加しておくことが好ましい。
［レディメイド型細胞抽出物含有液］
かくして得られる各種細胞物含有液は、これにタンパク質合成に必要な翻訳鋳型、核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、エネルギー源等（以下、これを「翻訳反応用添加物」と称することがある）を添加して適当なタンパク質合成用システムに付することによりタンパク質合成を行うことができる。そこで、本発明の凍結保存製剤を製造するための無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液には、上記した各種細胞抽出液に翻訳鋳型及び核酸分解阻害剤以外の翻訳反応用添加物を添加した液（本明細書中ではこれを「レディメイド型細胞抽出物含有液」と称することがある）も含まれる。
（２）凍結乾燥製剤の製造
（１）に記載した細胞抽出物含有液は、抽出溶媒、あるいは抽出した後に行うゲルろ過に用いる緩衝液などが酢酸カリウム、酢酸マグネシウムなどの潮解性物質を含んでいる。このため、従来の抽出溶媒を用いて調製された細胞抽出物含有液をそのまま乾燥製剤とした場合、凍結乾燥工程において溶解等が起こり、その結果該製剤の品質の低下が見られるという問題があった。品質の低下とは、該製剤に水を添加した際、製剤が完全に溶解せず、これを用いたタンパク質合成反応における合成活性も低下するものである。
そこで、本発明においては、該細胞抽出物含有液に含まれる潮解性物質の濃度を凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない程度に低減する。ここで取得される細胞抽出物含有液を、以下、「潮解物質低減化細胞抽出物含有液」と称することがある。潮解性物質の具体的な低減方法としては、例えば、予め潮解性物質を低減、または含まない溶液（以下、これを「潮解性物質低減化緩衝液」と称することがある）で平衡化しておいたゲル担体を用いたゲルろ過法、あるいは透析法等が挙げられる。細胞抽出物含有液の潮解性物質の濃度としては、その総濃度が６０ｍＭ以下となるまで低減する。また、コムギ胚芽抽出物含有液の場合、抽出液中に含まれる酢酸カリウムの濃度を６０ｍＭ以下、好ましくは５０ｍＭ以下に低減する。
また、上記凍結乾燥製剤における、潮解性を示す物質（潮解性物質）は、凍結乾燥状態での保存安定性を低下させない含有量は、当該凍結乾燥製剤中に含有されるタンパク質１重量部に対して、０．０１重量部以下が好ましく、特に０．００５重量部以下が好ましい。従って、凍結乾燥前に細胞抽出液を、ゲル濾過、透析等することにより、凍結乾燥組成物において該潮解性物質の含有量が上記範囲内になるようにすることが好ましい。
上記の潮解性物質の低減は、細胞抽出物含有液を（１）に記載の方法によって製造した後に行ってもよいし、それぞれの製造工程に含まれるゲルろ過または透析に上記の低潮解性緩衝液を適用して行うこともできる。
さらに、潮解性物質低減化細胞抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が排除可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子サイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＭｉｎｉｓａｒｔＴＭ等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、先ずポアサイズが大きめのフィルターを用い、次に混入する可能性のある微生物が排除可能なポアサイズのフィルターを用いて、ろ過するのが好ましい。
かくして得られる潮解性物質低減化細胞抽出物含有液は、これを凍結乾燥することにより製剤化する。凍結乾燥の方法は、それ自体既知の通常用いられる方法から適宜選択することができるが、具体的には、例えば、液体窒素により急速に凍結させ、これを通常の凍結乾燥機を用いて乾燥する方法等が用いられる。凍結乾燥温度及び時間等は、用いる凍結乾燥機の使用方法に準じることが好ましい。このようにして除水が完成して得られる本発明の凍結乾燥製剤は室温で非常に安定であり、かつこれに水などを添加した細胞抽出物含有液は超低温により保存した場合と遜色のないタンパク質合成活性を有するものである。また、保存容器中の空気を窒素ガスに置換することは、該製剤の保存方法としてさらに好適である。
（３）無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤を用いた無細胞タンパク質合成
本発明の無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤は、これに必要な水分及び翻訳反応に必要な成分を添加することによって翻訳反応液を作製し、これを適当な無細胞タンパク質合成システムに付することにより無細胞タンパク質合成を行うことができる。添加する成分は、翻訳反応液中の潮解性物質を最適濃度にするための物質を含む溶液である。また、該溶液中の物質及び量は、凍結乾燥のために潮解性物質を低減する工程を行う以前の状態に製剤を戻すような物質、及びさらに翻訳反応を行うために添加が必要な成分が挙げられる。具体的には、例えば、潮解性物質として酢酸カリウム含有量を低減した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を凍結乾燥した製剤の場合、該製剤から作製される細胞抽出物含有液の最終濃度として５０〜２００ｍＭとなるように酢酸カリウム溶液等を添加する。
ここで、上記の凍結乾燥製剤を用いて後述する透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．，５１４，１０２−１０５（２００２））等を用いて翻訳反応を行う場合、透析外液または下槽液などの翻訳反応液に必要な成分を供給する液に、（２）で排除した潮解性物質を翻訳反応に必要な量添加しておくことによれば、上記で凍結製剤を戻す際にこれを添加する必要はない。
また、上記（１）［弱還元型無細胞タンパク質合成用細胞抽出液］に記載した細胞抽出物含有液を用いて翻訳反応を行う場合には、還元剤濃度は上記した範囲に調製する。
また、さらに翻訳反応を行うためにに添加が必要な成分とは、例えば（１）でレディメイド型細胞抽出物含有液を用いて凍結乾燥製剤とした場合とそうでない場合で異なるが、いずれにしても最終翻訳反応溶液として、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等がそれぞれ濃度としては、ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ含まれるように添加することが好ましい。
ここで、細胞抽出液として上記（１）に記載したブレンダー法により調製したコムギ胚芽抽出液を用いる場合には、通常ｔＲＮＡの添加は必要無い。また、分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質を合成する場合には、還元剤の濃度を上記（１）に記載した範囲とすることが好ましい。
タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））のように、該細胞抽出液に無細胞タンパク質合成に必要なエネルギー源やアミノ酸、あるいはｔＲＮＡを添加して行う方法や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．，５１４，１０２−１０５（２００２））等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３公報：以下これを「不連続ゲルろ過法」と称することがある）等を用いることができる。
また、かくして得られる翻訳反応液には、目的タンパク質が高濃度に含まれているので、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過等のそれ自体既知の分離、精製法により、該反応液から目的タンパク質を容易に取得することができる。
（４）無細胞タンパク質合成用キット
本発明のタンパク質合成用凍結乾燥製剤は少なくとも該製剤を含む無細胞タンパク質合成用キットとして提供することができる。本発明のキットには、該製剤の他に、（３）に記載した翻訳反応液を作製するために必要な成分、ＲＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール用翻訳鋳型核酸、翻訳鋳型を作製するためのベクター、バッファー類反応容器等が含まれる。
また、さらに翻訳鋳型となる核酸を含むことによれば、タンパク質の要時調製を行うタイプのタンパク質ライブラリー調製用キットを提供することができる。さらに、上記の翻訳鋳型として、ある特定の物質と特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸を目的のポリペプチドをコードする核酸と融合させたものと、上述の特定の物質を結合した固相体を添付することによれば、要時調製を行うタイプのタンパク質チップ調製用キットを提供することもできる。
しかし、これら全ての試薬類を含む必要はなく、本発明の処理後細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成等に用い得るキットであれば如何なる試薬の組み合わせのものでもよい。
実施例
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１  潮解性物質低減化細胞抽出物含有液の作製及び凍結乾燥製剤の作製
（１）コムギ胚芽抽出液の調製
北海道産チホクコムギ種子（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製：Ｒｏｔｏｒ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍｉｌｌ  ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ１４型）に添加し、回転数８，０００ｒｐｍで種子を温和に粉砕した。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７〜１．００ｍｍ）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液（容量比＝四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機ＢＬＭ−３００Ｋ（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別排除する手段を有する装置である。
色彩選別機のベージュ色のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／ｃｍ２となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのＣＣＤラインセンサー（２０４８画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を排除するために、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別した。
得られたコムギ胚芽画分を４℃の蒸留水に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次いで、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ：ナカライ・テクトニクス社製）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄してコムギ胚芽を得、以下の操作を４℃で行った。
洗浄した胚芽湿重量に対して２倍容量の抽出溶媒（８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．８、２００ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、８ｍＭジチオスレイトール、（各０．６ｍＭの２０種類のＬ型アミノ酸を添加しておいてもよい））を加え、ワーリングブレンダーを用い、５，０００〜２０，０００ｒｐｍで３０秒間ずつ３回の胚芽の限定破砕を行った。このホモジネートから、高速遠心機を用いた３０，０００×ｇ、３０分間の遠心により得られる遠心上清を再度同様な条件で遠心し、上清を取得した。本試料は、−８０℃以下の長期保存で活性の低下は見られなかった。取得した上清をポアサイズが０．２μｍのフィルター（ニューステラデイスク２５：倉敷紡績社製）を通し、ろ過滅菌と混入微細塵芥の除去を行った。
次に、このろ液をあらかじめ溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、それぞれ０、２５、５０、１００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、８ｍＭジチオスレイトール、各０．３ｍＭの２０種類Ｌ型アミノ酸混液（タンパク質の合成目的に応じて、アミノ酸を添加しなくてもよいし、標識アミノ酸であってもよい））で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られたろ液を、再度３０，０００×ｇ、３０分間の遠心し、回収した上清の濃度を、Ａ２６０ｎｍが９０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．４〜１．６）に調整した。
（２）凍結乾燥製剤化
上記（１）で取得した潮解性物質低減型細胞抽出液（酢酸カリウム濃度が０〜５０ｍＭ）、及びコントロールとして通常の１００ｍＭ酢酸カリウムを含む細胞抽出物含有液を以下のようにして凍結乾燥した。
各細胞抽出物含有液を、液体窒素で凍結後、凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ社製：Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５）を用いて添付の取扱説明書に準じた３時間の運転で除水した。調製した粉末状の試料は、その成分が化学変化しないように２種類の方法、真空及び窒素充填下に封管して４℃で保存した。
実施例２  凍結乾燥製剤のタンパク質合成活性の解析
実施例１で作製した凍結乾燥製剤（細胞抽出物含有液５０μｌ分）に４０〜４５μｌのそれぞれ最終濃度で、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３８０ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各０．３ｍＭ  Ｌ型アミノ酸２０種類、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ（和光純薬社製）、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ（和光純薬社製）、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、１Ｕ／μｌ  Ｒｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、０．５μｇ／ｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を加え、十分溶解した後に、翻訳鋳型ｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）１μｇを入れ、反応溶液の１０倍容量の透析外液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．００５％ＮａＮ３）に対しての透析系で、反応は２６℃で２４時間、及び４８時間行った。透析膜は、排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。コントロールとして、凍結乾燥していない細胞抽出物含有液についても同様にしてタンパク質合成反応を行った。
翻訳鋳型となるｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）は、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをフェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿の後、Ｎｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により精製して用いた。
反応終了後の合成反応液中のＧＦＰ活性はＴｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用い添付の手技に従って蛍光強度から定量した。これらの結果を図１に示す。図１から明らかなように、凍結乾燥を細胞抽出物含有液中の酢酸カリウム濃度を１００ｍＭで行った凍結乾燥製剤は、そのタンパク質合成活性が凍結乾燥しなかったものに比べて７割程度に低下する。しかし、酢酸カリウム濃度を５０ｍＭ以下にして凍結乾燥を行ったものについては、反応を４８時間行った後にも凍結乾燥しなかったものに比べてその活性が同等、または増加していることがわかった。
実施例３  低分子阻害物質を排除した細胞抽出物含有液を凍結乾燥製剤化した場合のタンパク質合成活性解析
（１）透析膜による低分子阻害物質の排除
実施例１で調製したコムギ胚芽抽出液は、タンパク質合成に必要な因子（ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、リボソーム、翻訳開始因子、ペプチド鎖伸長因子、翻訳終結因子等）と、それ以外の分子、特にタンパク質合成を特異的、または非特異的に阻害する物質を含んでいるので、これを分子量の違いを利用して分画し、タンパク質阻害成分を排除したコムギ抽出液を調製した（特願２００２−０２３１４１明細書）。
分画には透析膜を用いた。透析膜は排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。この排除分子量はタンパク質合成に必要な因子を通さず、それ以下の分子量を有する分子を分画し得るものとして選択した。
透析に供するコムギ胚芽抽出液は全容量の２／３容のコムギ胚芽抽出液（実施例１で調製したもの）、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、０／５０／１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭジチオスレイトール、０．３８０ｍＭスペルミジン、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）、１．２ｍＭ  ＡＴＰを添加したものを調製して用いた。
透析は、上記のそれぞれの抽出液と、胚芽抽出液を含まない以外は全て同組成の溶液を透析外液として抽出液の５０倍量を用い、２６℃、又は４℃で１２時間静置して行った。
透析後の透析内液の一部を実施例１と同様にして凍結乾燥し、残りを−８０℃で保存した。凍結乾燥後の製剤については、酢酸カリウムの最終濃度が１００ｍＭとなるように酢酸カリウム溶液を添加した。タンパク質合成反応は、上記したそれぞれの反応液に翻訳鋳型ｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）１μｇを入れ、反応溶液の１０倍容量の透析外液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．００５％ＮａＮ３）に対しての透析系で、反応は２６℃で２４時間、及び４８時間行った。透析膜は、排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。
反応終了後の合成反応液中のＧＦＰ活性はＴｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用い添付の手技に従って蛍光強度から定量した。これらの結果を図２に示す。図中、前処理とは上記で行った低分子阻害物質の排除処理を意味し、「−」は該処理を行っていない細胞抽出物含有液を用いたことを示し、「＋」は該処理を行った細胞抽出物含有液を用いたことを示す。また、凍結乾燥についても同様に、「−」は−８０℃保存したもの、「＋」は凍結乾燥製剤としたものを用いたことを示す。図２から明らかなように、酢酸カリウム濃度が１００ｍＭで凍結乾燥を行うと、低分子阻害物質を除外した細胞抽出物含有液でも、行わなかった低温保存物よりもタンパク質合成活性が劣る。これに対し、低分子阻害物質排除処理後に酢酸カリウム濃度を５０ｍＭ以下として凍結乾燥したものは、低温保存したものに対し同等またはそれ以上のタンパク質合成活性を有することがわかった。
産業上の利用可能性
本発明の無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤、及びそれを用いたタンパク質合成方法は、従来無細胞タンパク質合成反応用試薬類に必要であった超低温保存や煩雑な操作を必要とせず、ハイスループットなタンパク質の合成のための全自動化システムの構築のための重要なツールとなり得るものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、酢酸カリウムの濃度が異なるコムギ胚芽抽出物含有液を凍結乾燥製剤の無細胞タンパク質合成活性を示すグラフである。
図２は、低分子阻害物質除外処理を行ったコムギ胚芽抽出物含有液について、酢酸カリウムの濃度を変えて凍結乾燥した製剤の無細胞タンパク質合成活性を示すグラフである。
【図１】
2003095661.tif 000002
【図２】
2003095661.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月25日(2003.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を凍結乾燥して無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤を製造する方法であって、含有液に含まれる潮解性物質の含有量が、凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない量であることを特徴とする方法。
【請求項２】
潮解性物質含有量が、乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して０．０１重量部以下である請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤。
【請求項３】
潮解性物質が、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウムから選択されるものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液から低分子のタンパク質合成阻害物質を排除する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
低分子のタンパク質合成阻害物質が、分子量１４，０００ダルトン以下であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質合成阻害物質の排除が、少なくとも高エネルギーリン酸化合物を含む溶液中で行われることを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、コムギ胚芽抽出液であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出液が、タンパク質合成に必要な物質である少なくとも基質となるアミノ酸、エネルギー源を含む溶液を添加したものであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８に記載の方法により製造された無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の製剤を含む無細胞タンパク質合成用キット
【請求項１１】
請求項９に記載の製剤に、少なくとも潮解性物質の濃度を無細胞タンパク質合成において最適濃度にするための溶液を組み合わせた無細胞タンパク質合成用キット。
【請求項１２】
翻訳鋳型を含むことによりタンパク質ライブラリーを合成できることを特徴とする請求項１０または１１に記載のタンパク質合成用キット。
【請求項１３】
請求項１０〜１２に記載の無細胞タンパク質合成用キットを利用して調整した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を用いるタンパク質合成方法。
【請求項１４】
酢酸カリウムの最終濃度が５０〜２００ｍＭとなるように調整する請求項１３に記載のタンパク質合成方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載のタンパク質合成方法で得られた合成タンパク質。
【請求項１６】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液から低分子のタンパク質合成阻害物質を排除する工程を含み、タンパク質合成阻害物質の排除が、少なくとも高エネルギーリン酸化合物を含む溶液中で行われることを特徴とすることを特徴とする無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を製造する方法。
【請求項１７】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液から低分子のタンパク質合成阻害物質を排除する工程を含み、タンパク質合成阻害物質の排除が、少なくとも高エネルギーリン酸化合物を含む溶液中で行われることを特徴とする、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を凍結乾燥して無細胞タンパク質合成用凍結乾燥製剤を製造する方法。
【請求項１８】
細胞抽出液に予め高エネルギーリン酸化合物を添加し、インキュベートした後、これを低分子阻害物質の排除工程に供する請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
低分子合成阻害物質の排除に透析方法を用いる場合は、細胞抽出液だけでなく透析外液にも高エネルギーリン酸化合物を添加して透析を行う請求項１８に記載の方法。
【国際調査報告】
2003095661.tif 000004
2003095661.tif 000005
2003095661.tif 000006