(57)【要約】細胞の種類に関わらず、浮遊細胞やリン脂質小胞等を固相表面に固定化する安価で簡便な方法として、疎水性鎖と親水性鎖を持つ担体に細胞を接触させて細胞を固定化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性鎖と親水性鎖を持つ担体に細胞が固定化されていることを特徴とする細胞固定化体。
【請求項２】
担体は、担体本体に結合された固定化剤を有していることを特徴とする請求項１の細胞固定化体。
【請求項３】
固定化剤は、疎水性鎖と親水性鎖が結合してなる化合物である請求項２の細胞固定化体。
【請求項４】
固定化剤における疎水性鎖は、置換基を有していてもよい飽和または不飽和の炭化水素鎖、細胞膜を構成する脂質および複合脂質鎖からなる群より選択される少なくとも一種である請求項３の細胞固定化体。
【請求項５】
固定化剤における疎水性鎖は、炭素数６〜２２の範囲の飽和または不飽和の炭化水素鎖からなる群より選択される少なくとも一種である請求項４の細胞固定化体。
【請求項６】
固定化剤における親水性鎖は、蛋白質、オリゴヌクレチオド、グリコール酸と乳酸とＰ−ジオキサンの各々の誘導体の重合体または共重合体、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、および多糖類からなる群より選択される少なくとも一種である請求項２ないし５のいずれかの細胞固定化体。
【請求項７】
固定化剤における親水性鎖は、ポリエチレングリコールである請求項６の細胞固定化体。
【請求項８】
固定化剤における親水性鎖は、官能基を有する請求項６または７のいずれかの細胞固定化体。
【請求項９】
固定化剤における親水性鎖は、末端に活性エステル基を有する請求項８の細胞固定化体。
【請求項１０】
固定化剤は、ポリエチレンオキシド−オレイルエーテル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルである請求項２の細胞固定化体。
【請求項１１】
請求項２ないし１０のいずれかの細胞固定化体において、固定化剤は担体本体に吸着された固定化剤結合性物質を介して固定化されていることを特徴とする細胞固定化体。
【請求項１２】
固定化剤結合性物質は、蛋白質、ペプチド、シランカップリング剤、官能基を有するポリマーのうちの少なくとも一種である請求項１１の細胞固定化体。
【請求項１３】
遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれかの細胞固定化体。
【請求項１４】
請求項１ないし１２のいずれかの細胞固定化体の形成のための方法であって、疎水性基と親水性基を持つ担体に細胞を接触させて固定化することを特徴とする細胞固定化方法。
【請求項１５】
請求項１３の細胞固定化体の形成のための方法であって、疎水性基と親水性基を持つ担体に遺伝子含有液を接触させ、乾燥固化した後、細胞を接触させて固定化することを特徴とする細胞固定化体への遺伝子導入方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１３のいずれかの細胞固定化体に培養用培地を接触させ、細胞を培養することを特徴とする細胞固相培養方法。
【請求項１７】
疎水性鎖と親水性鎖を持つ担体にリポソームが固定化されていることを特徴とするリポソーム固定化体。
【請求項１８】
担体は担体本体に結合された固定化剤を有していることを特徴とする請求項１７のリポソーム固定化体。
【請求項１９】
固定化剤は、疎水性鎖と親水性鎖が結合してなる化合物である請求項１８のリポソーム固定化体。
【請求項２０】
固定化剤における疎水性鎖は、置換基を有していてもよい飽和または不飽和の炭化水素鎖、細胞膜を構成する脂質および複合脂質鎖からなる群より選択される少なくとも一種である請求項１９のリポソーム固定化体。
【請求項２１】
固定化剤における疎水性鎖は、炭素数６〜２２の範囲の飽和または不飽和の炭化水素鎖からなる群より選択される少なくとも一種である請求項２０のリポソーム固定化方法。
【請求項２２】
固定化剤における親水性鎖は、蛋白質、オリゴヌクレオチド、グリコール酸と乳酸とｐ−ジオキサンの各々の誘導体の重合体または共重合体、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアルキアミド、ポリアルキレングリコール、および多糖類からなる群より選択される少なくとも一種である請求項１９ないし２１のいずれかのリポソーム固定化体。
【請求項２３】
固定化剤における親水性鎖は、ポリエチレングリコールである請求項２２のリポソーム固定化体。
【請求項２４】
固定化剤における親水性鎖は、官能基を有する請求項２２または２３のいずれかのリポソーム固定化体。
【請求項２５】
固定化剤における親水性鎖は、末端に活性エステル基を有する請求項２４のリポソーム固定化体。
【請求項２６】
固定化剤は、ポリエチレンオキシド−オレイルエーテル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエスチルである請求項１８のリポソーム胞固定化体。
【請求項２７】
請求項１８ないし２６のいずれかのポリソーム固定化体において、固定化剤は、担体本体に吸着された固定化剤結合性物質を介して固定化されていることを特徴とするポリソーム固定化体。
【請求項２８】
固定化剤結合性物質は、蛋白質、ペプチド、シランカップリング剤、官能基を有するポリマーのうちの少なくとも一種である請求項２７のリポソーム固定化体。
【請求項２９】
請求項１７ないし２８のいずれかのリポソーム固定化体の形成のための方法であって、疎水性基と親水性基を持つ担体にリポソームを接触させて固定化することを特徴とするリポソーム固定化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、細胞およびリポソームを担体に固定化した固定化体とその固定化のための方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は細胞およびリポソームを速やかに固定化することのできる新しい固定化体とそのための簡便で汎用性の高い方法に関するものである。
背景技術
近年、ゲノムの解析によって膨大な遺伝子情報が明らかにされつつある。また、遺伝子の機能や遺伝子情報と蛋白質の関係についても解明されはじめ、これらの知見を元に、細胞や微生物の機能を利用した微量分析用センサーやマイクロリアクター等の細胞デバイスが盛んに研究されている。
一方、細胞が各部位に応じた三次元構造を構築できることは古くから知られているが、近年、このような細胞の高次な組織形成能に関する研究が進められている。細胞の高次な組織形成機構が解明され、その再現や制御が可能になれば、従来の合成材料による人工組織や人工臓器に比べ生体適合性が高い各種代替組織の生産が可能となることから、この技術は移植医療の面からも注目される。
また、最近、癌や白血病の治療法として造血幹細胞移植法が注目されているが、入手可能な造血幹細胞の量が極端に少ないことから、造血幹細胞の大量増殖技術が研究されている。
これらの細胞デバイスの構築、細胞の高次組織形成機構の解明、および造血幹細胞の増殖等の技術においては、高密度で細胞を固定化することが重要であり、その方法として様々なものが提案されている。
例えば、古くから知られている方法としては、接着細胞を担体に固定する方法がある。最近では、接着細胞が接着できない担体、あるいは接着できないように処理した担体等を用いて細胞接着部位を限定し、マイクロアレイ化する技術も報告されている。例えばＳｈｕｇｕａｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０，１２１３−１２２０，１９９９には、金箔表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とＰＥＧ−細胞接着ペプチドを、チオールを介して固定化することにより、ＰＥＧを固定化した部位には細胞が接着せず、ＰＥＧ−細胞接着ペプチドを固定化した部位には細胞が接着するようになることが報告されている。また、Ｊｕｎａｉｄ  Ｚｉａｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１（６８３３）１０７−１１０，２００１には、ＤＮＡとゼラチンの混合液をスライドガラス上にアレイ状にスポットし、その上に接着細胞を添加、接触させた際に、細胞とゼラチンの結合が起こった場所では細胞が同所に混在する遺伝子を取り込み、一過性遺伝子発現細胞のアレイ体が形成できることが報告されている。
しかし、以上のような細胞の固定化方法は、いずれも疎水性担体やコラーゲンコーティング担体に接着する性質を有する接着細胞に関するものであり、血球細胞や造血幹細胞、または一部の癌細胞等の浮遊細胞や細菌、あるいはリン脂質小胞体等を固定化する方法はほとんど知られていなかったのが実情である。
浮遊細胞や細菌を生きた状態で固定化するための汎用性の高い技術が確立されれば、医療分野や研究対象として有用性が高い。
また、皮膚等の再生医療へは、現在のところコラーゲン等のスキャホールド（足場）やコーティングに接着細胞を固定化する方法が適用されているが、接着、増殖までには長時間を要する上、重力に逆らって細胞を固定化させることは難しいのが実情である。
したがって、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解決し、細胞の種類に関わらず、浮遊細胞、細菌、リン脂質小胞体等を固相表面に固定化した固定化体を提供し、またそれらを得るための安価で簡便な固定化方法を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、まず、第１には、疎水性鎖と親水性鎖を持つ担体に細胞が固定化されていることを特徴とする細胞固定化体を提供する。
また、この出願の発明は、第２には、担体が担体本体に結合された固定化剤を有していることを特徴とする上記の細胞固定化体を提供する。
第３には、この出願の発明は、固定化剤が疎水性鎖と親水性鎖が結合してなる化合物である前記いずれかの細胞固定化体を提供する。
この出願の発明は、第４には、固定化剤における疎水性鎖が置換基を有していてもよい飽和または不飽和の炭化水素鎖、細胞膜を構成する脂質および複合脂質鎖からなる群より選択される少なくとも一種のものである細胞固定化体を、また、第５には、固定化剤における疎水性鎖が炭素数６〜２２の範囲の飽和または不飽和の炭化水素鎖からなる群より選択される少なくとも一種のものである細胞固定化体を提供する。
また、この出願の発明は、第６には、固定化剤における親水性鎖が蛋白質、オリゴヌクレチオド、グリコール酸と乳酸とＰ−ジオキサンの各々の誘導体の重合体または共重合体、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、および多糖類からなる群より選択される少なくとも一種である細胞固定化体を提供する。
さらに、この出願の発明は、第７には、固定化剤における親水性鎖がポリエチレングリコールである細胞固定化体を、第８には、固定化剤における親水性鎖が官能基を有するものである細胞固定化体を、第９には、固定化剤における親水性鎖が末端に活性エステル基を有するものである細胞固定化体を提供する。
さらに、第１０には、この出願の発明は、固定化剤がポリエチレンオキシド−オレイルエーテル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルである細胞固定化体を提供する。
そして、この出願の発明は、第１１には、上記第２ないし第１０のいずれかの発明の細胞固定化体において、固定化剤が担体本体に吸着された固定化剤結合性物質を介して固定化されていることを特徴とする細胞固定化体を提供し、第１２には、固定化剤結合性物質が蛋白質、ペプチド、シランカップリング剤、官能基を有するポリマーのうちの少なくとも一種である細胞固定化体を提供する。
この出願の発明は、第１３には、遺伝子が導入されていることを特徴とする前記いずれかの細胞固定化体を提供する。
さらに、第１４には、この出願の発明は、上記第１ないし第１２の発明のいずれかの細胞固定体の形成のための方法であって、疎水性基と親水性基を持つ担体に細胞を接触させて固定化することを特徴とする細胞固定化方法を提供する。
この出願の発明は、第１５には、前記第１３の発明の細胞固定化体の形成のための方法であって、疎水性基と親水性基を持つ担体に遺伝子含有液を接触させ、乾燥固化した後、細胞を接触させて固定化することを特徴とする細胞固定化体への遺伝子導入方法を提供する。
また、この出願の発明は、第１６には、前記いずれかの細胞固定化体に培養用培地を接触させ、細胞を培養することを特徴とする細胞固相培養方法を提供する。
第１７には、この出願の発明は、疎水性鎖と親水性鎖を持つ担体にリポソームが固定化されていることを特徴とするリポソーム固定化体を提供し、第１８には、担体が担体本体に結合された固定化剤を有していることを特徴とするリポソーム固定化体を提供する。
この出願の発明は、第１９には、固定化剤が疎水性鎖と親水性鎖が結合してなる化合物であるリポソーム固定化体を、第２０には、固定化剤における疎水性鎖が置換基を有していてもよい飽和または不飽和の炭化水素鎖、細胞膜を構成する脂質および複合脂質鎖からなる群より選択される少なくとも一種のものであるリポソーム固定化体を、そして、第２１には、固定化剤における疎水性鎖が炭素数６〜２２の範囲の飽和または不飽和の炭化水素鎖からなる群より選択される少なくとも一種のものであるリポソーム固定化体を提供する。
第２２には、この出願の発明は、固定化剤における親水性鎖が蛋白質、オリゴヌクレオチド、グリコール酸と乳酸とｐ−ジオキサンの各々の誘導体の重合体または共重合体、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアルキアミド、ポリアルキレングリコール、および多糖類からなる群より選択される少なくとも一種であるリポソーム固定化体を提供する。
さらに、この出願の発明は、第２３には、固定化剤における親水性鎖がポリアルキレングリコールであるリポソーム固定化体を、第２４には、固定化剤における親水性鎖が官能基を有するものであるリポソーム固定化体を、そして、第２５には、固定化剤における親水性鎖が末端に活性エステル基を有するものである前記いずれかのリポソーム固定化体を提供する。
この出願の発明は、第２６には、固定化剤がポリエチレンオキシド−オレイルエーテル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエスチルである前記のリポソーム固定化体を提供する。
そして、この出願の発明は、第２７には上記第１８ないし第２６のいずれかの発明のリポソーム固定化体において、固定化剤が、担体本体に吸着された固定化剤結合性物質を介して固定化されていることを特徴とするポリソーム固定化体を提供し、第２８には固定化剤結合性物質が蛋白質、ペピチド、シランカップリング剤、官能基を有するポリマーのうちの少なくとも一種のうちのリポソーム固定化体をも提供する。
さらにこの出願の発明は、第２９には、上記いずれかのリポソーム固定化体の形成のための方法であって、疎水性基と親水性基を持つ担体にリポソームを接触させて固定化することを特徴とするリポソーム固定化方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明において、細胞およびリポソームの固定化とは、細胞やリポソームを、担体に、たとえば固定化剤を介して結合させることをいい、この出願の発明の固定化方法は、担体、たとえば担体本体に固定化剤を結合させた後、得られた固定化剤結合担体に細胞またはリポソームを接触させて細胞やリポソームを固定化するというものである。
ただし、この出願の発明において、「細胞」とは、一般に培養器具等の担体表面に接着・伸展せず、懸濁または沈殿状態で増殖する「浮遊細胞」と呼ばれるもの（例えば血球細胞）や、担体表面に接着・伸展する「接着細胞」をＥＤＴＡ−トリプシン、ディスパーゼ等の適当な分散剤で担体から分散させ、一時的に浮遊させたもの（例えばＥＤＴＡ液で担体から剥離した線維芽細胞）、および担体に接着した状態の細胞を含む。また、細菌、ウィルス、オルガネラ、細胞壁を除去した植物細胞（プロトプラスト）等の表面にリン脂質二重膜を有する生命体も含まれる。この出願の発明において、「リポソーム」とは、生命体以外のリン脂質膜を有する小胞体を含む。リン脂質膜の内部には各種の物質を包含していてもよい。すなわち、この出願の発明の固定化方法では、浮遊細胞や一時的に浮遊させた細胞等を担体に固定化できるだけでなく、担体に接着している細胞を別の担体に細胞固定剤を介して固定化させたり、生命体以外のリン脂質小胞体と細胞を同時に、かつ同一の担体に固定化させたりすることもできる。
図１にこの出願の発明の細胞およびリポソームの固定化方法の概念を示した。まず、この出願の発明では、担体本体（１）の表面に固定化剤（３）を結合する。このとき、担体本体（１）は、液体や気体ではなく、人為的に操作できる物質であって、細胞が共存できる溶液中において不溶のものであればどのようなものでもよい。例えばプラスチック、樹脂、高分子、有機物、ガラス、金属等が例示される。さらに、このような担体本体（１）は基板状であっても、コロイド状や粒子状であってもよい。
この出願の発明の細胞およびリポソームの固定化方法では、担体本体（１）が固定化剤（３）と結合可能な官能基を有するものであれば、固定化剤（３）は直接担体本体（１）に結合される。一方、担体本体（１）が固定化剤（３）と結合できる官能基を有さない場合には、固定化剤（３）とそのような官能基を有する結合性物質（２）を担体本体（１）表面に物理吸着させ、この結合性物質（２）と固定化剤（３）を化学結合させればよい。
このとき、担体本体（１）としては、シリコンチェンバー、ガラス板、アクリル板等各種のものが例示される。また、結合性物質（２）としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、コラーゲン等を使用することができる。さらに、固定化剤（３）は、担体本体（１）（または結合性物質（２））とも細胞膜（またはリン脂質膜）（４１）とも結合できる化合物であればよく、具体的には、疎水性鎖（３１）と親水性鎖（３２）を有する化合物として表される。
疎水性鎖（３１）は、単鎖であっても複数鎖であってもよく、置換基を有していてもよい飽和または不飽和の炭化水素鎖や複合脂質鎖から適宜選択される。たとえば、炭素数６〜２２の範囲の飽和または不飽和の炭化水素鎖であって、ミリスチル基（Ｃ１４）、パルミチル基（Ｃ１６）、ステアリル基（Ｃ１８）等の飽和アルキル基やオレイル基（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）８）、等の不飽和炭化水素等が例示され、なかでも、リノール基、リノレイル基等も含めた炭素数１４〜１８のものが好適なものとして例示される。さらにリン脂質が例示される。さらに、これらの疎水性鎖は、Ｎ、Ｓ、Ｏ等のヘテロ原子や置換基を有していてもよい。なかでも生体膜を構成するリン脂質の一部であるオレイル基は好ましいものである。
一方、親水性鎖（３２）は、蛋白質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、およびデキストラン等の多糖類、あるいはグリコール酸誘導体や乳酸誘導体、ｐ−ジオキサン誘導体の重合体や共重合体等から選択される。中でもポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は生体適合性があり好ましい。このような親水性鎖（３２）は、さらに、官能基を有していたり、化学修飾されていてもよく、たとえば末端にコハク酸を結合してカルボキシル基としたり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等の活性エステル基を有していてもよい。このように親水性鎖（３２）を化学修飾することにより、固定化剤（３）と担体本体（１）あるいは固定化剤（３）と結合性物質（２）の結合性を制御することが可能となる。
以上より、この出願の発明において、固定化剤（３）として好ましい化合物を例示するならば、次式（Ｉ）
2003074691.tif 000002
で表されるポリエチレンオキシド−オレイルエール−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルが挙げられる。ただし、このとき、ＰＥＧの分子量は限定されない。また、オキシアルキレン鎖の単位数としては３〜５００のものが例示され、より好ましくは８〜３００、さらに好ましくは  １２〜２００程度とすることにより、細胞およびリポソームが強固かつ安定に固定化される。
また、前記のとおり、固定化剤（３）を、結合性物質（２）を介して担体本体（１）に結合させる場合には、結合性物質（２）は、固定化剤（３）の親水性鎖（３２）と結合できる官能基を有するものであればよい。例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、アルデヒド基等を有する物質が考慮される。
以上のとおりのこの出願の発明の細胞およびリポソームの固定化方法では、担体本体（１）表面には、結合性物質（２）を介しまたは介さずに、固定化剤（３）の親水性鎖（３２）が結合し、固定化剤（３）の疎水性鎖（３１）が、細胞膜またはリン脂質膜中（４１）に取りこまれることにより、細胞やリポソーム（４）が固定化されるのである。
もちろん、この出願の発明において担体本体（１）そのものが疎水性鎖と親水性鎖を有していてもよいことは言うまでもない。この場合には、固定化剤そのものを用いる必要はない。
以上のとおりのこの出願の発明の細胞およびリポソームの固定化方法について、その手順を図２に例示した。もちろん、この出願の発明の細胞およびリポソームの固定化方法は、図２および以下に示されるものに限定されず、様々な態様が可能である。
（Ｉ）まず、シリコンチャンバー（１１）等に培養皿（１）を導入し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（２）とリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）を入れ、４〜３７℃で１０分〜４８時間放置することにより培養皿（１）表面にＢＳＡ（２）を物理吸着させる。（このとき、培養皿（１）はガラス製、ポリスチレン製等、市販のものを適用できる。）培養皿表面をＰＢＳで数回洗浄した後、
（ＩＩ）３μＭ以上（例えば１００ｍＭまで）のＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＥＧ−ＮＨＳ（３）のＰＢＳ溶液を添加し、室温で３０秒〜１時間程度放置する。（このとき、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（３）を溶解するために、ＰＢＳ溶液には有機溶媒が少量含まれていてもよい。）得られたＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ固定化担体は、使用するまで溶液中または乾燥して保存できる。
（ＩＩＩ）必要に応じて、ＰＢＳ／ＰＢＳ溶液をさらに添加し、室温で１０分以上３時間程度放置してＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（３）が結合されなかった領域をＢＳＡ（２）でブロッキングする。（なお、このとき、さらに  ＰＥＧ−ＮＨＳを添加すれば、細胞（４）の非特異的吸着を抑制できる。（Ｓｈｕｎｇｕａｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．２０，１２１３−１２２０，１９９９））
（ＩＶ）細胞（４）をＰＢＳまたは血清不含培養液に懸濁し、培養皿（１）に添加して室温で細胞が底面に沈むまで（例えば約１〜１５分間）静置する。
（Ｖ）必要に応じて、培養皿（１）をＰＢＳで洗浄すれば、細胞（４）がＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（３）とＢＳＡ（２）を介して担体（１）に固定化された細胞固定化担体が得られる。
この出願の発明では、また、任意の遺伝子が導入された細胞固定化体も提供される。このような細胞固定化体は、前記の方法により担体本体（１）の表面に、結合性物質（２）を介しまたは介さずに、固定化剤（３）を結合させた後、遺伝子を含有する溶液を接触させ、そこに前記の方法により細胞（４）を接触させることにより得られる。このとき、遺伝子を含有する溶液としては、市販の遺伝子導入試薬が適用できる。しかし、この出願の発明の遺伝子導入方法では、結合性物質（２）を介しまたは介さずに、固定化剤（３）を結合させた後、遺伝子導入試薬を添加し、これを乾燥固化させた後、この上に細胞（４）を接触させる点で、従来の細胞への遺伝子導入方法とは異なる。このような方法により、遺伝子の分散を防ぎながら細胞が遺伝子を取りこめるようになるため、所望の大きさ（例えば１００μｍ２〜１ｍｍ２）の特定位置に種々の遺伝子が導入された細胞を固定化した遺伝子発現細胞のアレイ体を作製することができるのである。したがって、この出願の発明の遺伝子が導入された細胞固定化体を用いることにより、これまで接着細胞への適用に限定されていたＣｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを浮遊細胞に対しても行うことが可能となり、種々導入した遺伝子の性質を細胞での発現を通して分析できる。
この出願の発明では、さらに、以上のとおりの方法により固定化された細胞を培養する固相培養方法をも提供する。このような固相培養方法では、固定化された浮遊細胞を固定化された状態で通常の培養条件により増殖することが可能となる。したがって、例えば前記の方法により任意の細胞を導入された細胞固定化体を用いて遺伝子発現やその機能解析を固定化細胞の生存している状態で行うことが可能となる。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明する。もちろん、この出願の発明は以下の実施例に限定されるものではなく、様々な態様が可能であることはいうまでもない。
実  施  例
以下の実施例において、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳおよびＰＥＧ−ＮＨＳはいずれも日本油脂株式会社より提供されたものを使用した。
１．浮遊細胞および接着細胞の固定化
＜実施例１＞
（１）Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ固定化担体の作製
ポリスチレン製培養皿に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ（Ｆａｔｔｙａｃｉｄ  ｆｒｅｅ，ｌｏｗ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ；Ｓｉｇｍａ））／リン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ））水溶液を適量添加し、３７℃で３時間放置し、ＢＳＡを培養皿に吸着させた。培養皿をＰＢＳで数回洗浄し、化学式（Ｉ）に示されるＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳ（ＰＥＧ  Ｍｗ：４０００Ｄａ、ｎ＝９０）のＰＢＳ溶液（１００μＭ）を添加して室温で１時間反応させた。
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培養皿をさらにＰＢＳで数回洗浄し、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）結合担体を得た。
得られた担体は、使用まで溶液中４℃で、あるいは乾燥して保存した。
（２）細胞の固定化
血清無添加培地（ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬））に浮遊細胞（ｍｏｕｓｅｍｙｅｌｏｉｄ  ３２Ｄ）１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを懸濁し、（１）で得たＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）結合担体に適量添加して細胞が固相表面へ沈降するまで室温で１５分程度静置した。
また、ＰＢＳで固相を洗浄し、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）の非結合領域にある細胞を除去した。
（３）細胞固定化の確認
細胞をＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ染色し、透過顕微鏡および蛍光顕微鏡で細胞の固定化を確認した。さらに、固定化細胞を７０％ＥｔＯＨで処理し、細胞を死滅させた後、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ染色し、同様に顕微鏡で細胞を観察した。
図３に透過顕微鏡および蛍光顕微鏡の画像を示した（Ｉ：明視野像、ＩＩ：蛍光画像）。
図３より、３２Ｄ細胞の固定化が確認された（図３Ａ）。また、死滅させた細胞の画像（図３Ｂ）との比較により、固定化された細胞が生細胞であることが確認された。
＜比較例１＞
Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳの代わりにＯｌｅｙｌ鎖を有さないＰＥＧ（５０００）−ＮＨＳを用いて実施例１と同様の方法で３２Ｄ細胞を固定化した。
顕微鏡明視野像を図４Ｂに示した。
Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳを用いた系（図４Ａ）では、３２Ｄ細胞が生きたまま固定化されていることが確認された。一方、Ｏｌｅｙｌ鎖を有さないＰＥＧ（５０００）−ＮＨＳを用いた系（図４Ｂ）では、３２Ｄ細胞の固定化が見られなかった。
これより、細胞の固定化においては、疎水性鎖（Ｏｌｅｙｌ鎖）が必要であることが示唆された。
＜実施例２＞
実施例１と同様の方法で、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）の代わりにＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳ（ＰＥＧ  Ｍｗ：８０００Ｄａ、ｎ＝１８０）を用いて固定化担体を作製し、３２Ｄ細胞を固定化した。
＜比較例２＞
実施例２と同様の方法でＢＳＡを培養皿に吸着させた後、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳを添加せずに３２Ｄ細胞溶液（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を直接添加して細胞が固相表面へ沈降するまで静置し、ＰＢＳで固相を洗浄した。
図５に実施例２および比較例２の顕微鏡明視野像を示した。
ＢＳＡにＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳを結合させた系（図５Ａ−Ｉ）では、固定化担体に細胞が固定化されることが確認された。一方、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳを結合させない領域（図５Ａ−ＩＩ）では、細胞の固定化は見られなかった。
さらに、ＢＳＡを吸着させた後、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳを結合せずに直接細胞を添加した場合には、細胞が固定化されないことが確認された（図５Ｂ）。これより、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳがＰＥＧの分子量に関わらず、細胞の固定化剤として有効であることが確認された。
＜実施例３＞
実施例１と同様の操作をＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳの代わりにＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳ（ＰＥＧ  Ｍｗ：２０００Ｄａ、ｎ＝４０）を用いて行い、３２Ｄ細胞を固定化した。
＜比較例３＞
ＢＳＡを吸着させることなく、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳを直接培養皿に結合させた後、実施例１（２）と同様の操作により３２Ｄ細胞を固定化した。
また、ＢＳＡを吸着させた後、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳを介さずに直接３２Ｄ細胞を固定化した。
さらに、ＢＳＡの吸着もＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳの結合も行わずに、培養皿に直接３２Ｄ細胞を沈着させた。
実施例３と比較例３によって得られた細胞固定化担体における細胞密度を測定し、図６に示した。
図６より、ＢＳＡ吸着とＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳの結合を行った場合（＋／＋）に細胞密度が最も高く、生細胞密度も多いことが確認された。一方、ＢＳＡを吸着させた後、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳを介さずに直接３２Ｄ細胞を固定化させた場合（＋／−）には、細胞の固定化はほとんど見られず、確認された細胞もすべて死細胞であった。
これより、生細胞を高い細胞密度で担体に固定化するためには、固定化剤を用いることが効果的であり、とくにＢＳＡを担体表面に吸着させた後に固定化剤としてＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳを結合させ、細胞を固定化する方法が高い効果を示すことが確認された。
＜実施例４＞
実施例２と同様の方法で、固定化担体を作製し、３２Ｄ細胞の代わりに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌヒト白血病細胞（Ｋ５６２）懸濁液によりＫ５６２細胞を固定化した。
＜比較例４＞
また、実施例４と同様の方法でＢＳＡを培養皿に吸着させ、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳを添加せずにＫ５６２細胞溶液（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を添加して細胞が固定化担体表面へ沈降するまで静置し、ＰＢＳで固相を洗浄した。
図７に実施例４および比較例４の顕微鏡明視野像を示した。
図７より、ＢＳＡにＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳが結合した固定化担体に生細胞が固定化されることが確認された（図７Ａ）。一方、ＢＳＡを吸着させた後にＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳを結合しない場合には、細胞が固定化されないことが確認された（図７Ｂ）。
これより、本願発明の細胞固定化方法がヒト細胞にも適用できることが確認された。
＜実施例５＞
実施例１と同様の方法で、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳ（ＰＥＧ  Ｍｗ：４０００Ｄａ、ｎ＝９０）を用いて固定化担体を作製し、非接着細胞として、ヒトＢ細胞リンパ腫ＤａｕｄｉおよびヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔを各々固定化した。
同様に、接着細胞として、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３、および１２９ＳＶ系統由来マウスＥＳ細胞を固定化した。
非接着細胞および接着細胞のいずれにおいても、数分以内に固定化担体表面への固定化が起こった。したがって、本願発明の細胞固定化方法により、細胞本来の特性による接着に依存しない固定化が可能となることが確認された。
図８に実施例５の顕微鏡明視野像を示した。細胞添加量が少なかった場合には疎な固定化数となった（図８Ｃ）ものの、いずれの細胞についても、固定化が確認された。また、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳを直径約５００μｍの円形に結合させた場合には、対応する円形に細胞が固定化された（図８Ｄ）。これより、本願発明の方法により接着細胞についても細胞本来の特性に依存しない、所望の位置への固定化が可能となることが確認された。
２．細胞への遺伝子導入
＜実施例６＞
実施例５と同様の方法で、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳを用いて固定化担体を作製し、その表面に以下の遺伝子混合液を少量（約０．１〜１μＬ）スポットし、乾燥固化させた。
その上に、ＰＢＳまたは無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁した細胞を添加し、室温で３０分静置して細胞を固定化した。固定化されなかった細胞をＰＢＳで洗浄し、除去した後、培養液を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培に置換し、３７℃で２４〜７２時間培養した。
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図９に培養から４８時間後の細胞の顕微鏡明視野像と蛍光画像を重ね合わせた画像を示した。遺伝子混合液をスポットした部分にのみ赤色蛍光蛋白質の蛍光が観察されたことから、本願発明の遺伝子導入方法により、市販の遺伝子導入試薬を用いて細胞の固定化と遺伝子導入を同時に行うことができることが確認された。
この方法では、遺伝子混合液を乾燥固化することにより、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ上にスポットした遺伝子混合液が拡散せず、また、遺伝子混合液をスポットした位置に固定化された細胞は、遺伝子を細胞内に取り込めることが明らかになった。
３．細胞の固相培養
＜実施例７＞
ＰＢＳに懸濁したマウス骨髄性白血病細胞３２Ｄ及びヒト赤白血病細胞Ｋ５６２をＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳスポット（直径約１ｍｍ）上に１／３コンフルエント量程度（およそ３０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２）添加し、室温で１０分間静置して細胞を固定化した。その後、ＰＢＳで洗浄し、固定化されていない細胞を除去した。１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、固定化された細胞を３７℃で一定期間培養した。
図１０に各固定化細胞の培養期間毎の顕微鏡明視野像（および蛍光画像）を示した。
３２Ｄ細胞を３日間培養したところ、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳスポット上のみでコンフルエントまで細胞が増殖していることが確認された。また、Ｋ５６２細胞についても、同様に、３日間の培養によりＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳスポット上のみでコンフルエントまで増殖していることが確認された。いずれの細胞でも、４日目までの生存が確認された。
さらに培養を続け、７日間培養された細胞の生存率をＣａｌｃｅｉｎＡＭを用いて調べたところ、固定化されているすべての細胞の生存が確認できた。７日間の培養後にはＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（９０）−ＮＨＳスポット以外への非特異吸着的な細胞の接着も観察されたが、これはＫ５６２細胞の性質によるものであり、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳ固定化に起因する現象ではなかった。また、７日間培養した固定化Ｋ５６２では、分化やアポトーシスも観察されなかった。
Ｋ５６２は未分化細胞であり、ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）系シグナルやＰｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ（ＰＫＣ）及びカルシウム系シグナルにより、それぞれ赤芽球や巨核球に分化することが知られている。しかし、分化もアポトーシスも見られなかったことから、ＭＡＰ系、ＰＫＣ及びカルシウム系シグナル、あるいはアポトーシス関連シグナルが本願発明の固定化方法により影響されないことが示された。
＜実施例８＞
Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）発現ベクターのｐＭＥ−ＥＧＦＰと赤色蛍光蛋白質遺伝子発現ベクターのｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の２種類の遺伝子について遺伝子混合液を調製し、固定化担体とした同一容器内表面に、約５００μｍ離して各々スポットした（直径：約１ｍｍ、混合液量：約０．３μｌ）。遺伝子発現細胞が、各々定義された位置にのみに固定化されるか、あるいは、発現細胞が分散して別のスポット上に移動するクロスコンタミネーションが起こるかを調べた。
図１１に培養開始４８時間後の各スポットの蛍光画像と明視野像を示した。これより、２種類の遺伝子がそれぞれ定義されたスポット上にのみ固定化されていることが確認され、本願発明の細胞の固相培養方法においてクロスコンタミネーションが起こらないことが示された。
＜実施例９＞
Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳを用いて固定化担体を作製し、その表面にｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１遺伝子混合液をスポットし、その上にさらにＨＥＫ２９３を固定化した。この固定化ＨＥＫ２９３細胞の上に、次のゲル溶液を添加し（ゲル化後の厚さ５００μｍ程度となるように）、３７℃で３０分間加温し、ゲル化させた。
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得られたゲルの上に１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを適量添加し、ＣＯ２インキュベーター内において３７℃で７２時間加温培養した。
図１２に、固定化ＨＥＫ２９３細胞の共焦点蛍光三次元画像と共焦点三次元透過像を示した。これより、ゲル中で固定化された細胞についても増殖が可能であり、遺伝子スポット上に固定化された細胞では赤色蛍光蛋白質が発現していることが確認された。
＜実施例１０＞
Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ表面上でｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞に導入しながら固定化した。
まず、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（８０００）−ＮＨＳ（ＰＥＧ  Ｍｗ：８０００Ｄａ、ｎ＝１８０）を用いて固定化担体を作製した後、次に示したｓｉＲＮＡ混合液を０．１〜１μＬスポットし、乾燥固化させた。
その上に無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁したＫ５６２細胞を添加し、４℃で１０分間静置して固定化させた。ＰＢＳで固定化されなかった細胞を洗浄除去した後、培地を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に置換し、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で加温し、その後共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察した。
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図１３に共焦点明視野像、共焦点蛍光画像、およびこれらの像を重ね合わせた像を示した。ｓｉＲＮＡ混合液スポット上に内部に蛍光が観察される細胞が見られたことから、本願発明の方法を応用することにより、特定位置に固定化した細胞にのみｓｉＲＮＡを導入できることが示された。
４．リポソームの固定化
＜実施例１１＞
（１）フルオレセイン封入リポソームの調製
カチオニックリポソーム（ＥＬ−Ｃ−０１；日本油脂製）、弱負電荷リポソーム（ＥＬ−Ｎ−０１；日本油脂製）、およびアニオニックリポソーム（ＥＬ−Ａ−０１；日本油脂製）をそれぞれ個別のバイアルに入れ、各バイアルに０．２ｍＭの５−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｉｎ（蛍光物質）を２ｍｌずつ添加し、ＰＢＳでＰＤ−１０（アマシャムファルマシア）バイオテクを用いてゲルろ過して３種類のフルオレセイン封入リポソームを調製した。
各リポソーム懸濁液における脂質量は０．０１２５ｍｍｏｌ／ｍｌとした。
（２）Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）固定化担体の調製
ＭａｔＴｅｋ製ガラスボトムディッシュ（Ｎｏ．０、ノンコート）のガラス部分に１％ＢＳＡを０．１ｍｌ添加し、４℃で一晩放置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．１ｍＭのＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳを０．１ｍｌ添加し、室温で１時間放置した後ＰＢＳで洗浄した。
（３）リポソームの固定化
３枚のＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）固定化ガラスボトムディッシュに各フルオレセイン封入リポソームを０．１ｍｌずつ添加し、室温で１５分間放置した。ＰＢＳで４回洗浄した後、ＰＢＳを１ｍｌ添加した。
これらを共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
＜比較例５＞
実施例５と同様の方法で、ガラスボトムディッシュにＢＳＡを吸着した後、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）を結合せずに直接リポソームを固定化し、同様に評価した。
実施例５および比較例５の顕微鏡像を図１４に示した。
カチオニックリポソーム（図１４Ａ）、弱負電荷リポソーム（図１４Ｂ）、およびアニオニックリポソーム（図１４Ｃ）のいずれのリポソームもＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）を用いた場合（図１４Ｉ）に固定化されることが確認された。
一方、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）を結合せずにＢＳＡを吸着したガラスボトムディッシュに直接リポソームを添加した場合には、いずれのリポソームも固定化されなかった（図１４ＩＩ）。
５．大腸菌の固定化
＜実施例１２＞
実施例１と同様にして、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）を用いて固定化担体を作製し、その表面にＧＳＴ−ＥＧＦＰ発現大腸菌を固定化した。
図１５（Ａ）は、その結果を明視野像と蛍光画像の重ね合わせ像として示したものであり、図１５（Ｂ）は蛍光画像を示したものである。
これにより大腸菌の固定化が確認された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明により、生細胞やリポソームを高い細胞密度で担体に固定化する簡便な方法が提供される。この発明の細胞およびリポソームの固定化方法は、接着細胞だけでなく、浮遊細胞やリン脂質小胞体にも適用できる汎用性の高い方法である。また、この出願の発明により、担体に固定化された細胞に遺伝子を導入する方法や固定化された細胞を培養する方法も提供される。これらの方法を適用することにより、細胞センサーや細胞マイクロアレイ、マイクロリアクター等の細胞デバイスの構築や、細胞の高次組織形成機構の解明や再生医療、造血幹細胞の増殖等が可能となることから、この出願の発明は、多くの分野において有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
図１は、この出願の発明の細胞およびリポソームの固定化方法の概念を表す概略模式図である。（１：担体本体、２：結合性物質、３：固定化剤、３１：疎水性鎖、３２：親水性鎖、４：細胞またはリポソーム、４１：細胞膜またはリン脂質膜）
図２は、この出願の発明の細胞およびリポソームの固定化方法の手順を例示した概略模式図である。（１：担体本体（培養皿）、１１：シリコンチャンバー、２：結合性物質（ＢＳＡ）、３：固定化剤（Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、３１：疎水性鎖、３２：親水性鎖、４：細胞またはリポソーム、４１：細胞膜またはリン脂質膜）
図３は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化した３２Ｄ細胞と７０％ＥｔＯＨで処理し、死滅させた３２Ｄ細胞をＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ染色した透過顕微鏡および蛍光顕微鏡の画像を示す写真である。（Ａ：３２Ｄ細胞、Ｂ：死滅細胞、Ｉ：顕微鏡明視野像、ＩＩ：蛍光顕微鏡像）
図４は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化した３２Ｄ細胞とＯｌｅｙｌ鎖を有さないＰＥＧ（５０００）を用いて固定化操作を行った３２Ｄ細胞の顕微鏡明視野像を示す写真である。（Ａ：ＢＳＡ／Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）−ＮＨＳ、Ｂ：ＢＳＡ／ＰＥＧ（５０００））
図５は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化した３２Ｄ細胞と、ＢＳＡを培養皿に吸着させた後、直接細胞の固定化操作を行った３２Ｄ細胞の顕微鏡明視野像を示す写真である。（Ａ：ＢＳＡ／Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳ領域（Ｉ）およびＢＳＡ領域（ＩＩ）、Ｂ：ＢＳＡ）
図６は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化した３２Ｄ細胞と、ＢＳＡを吸着せずにＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳを直接培養皿に結合させて固定化した３２Ｄ細胞と、ＢＳＡを吸着させた後直接固定化させた３２Ｄ細胞の細胞密度を示した図である。（黒：死細胞の数、白：生細胞の数）
図７は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化したヒト白血病細胞（Ｋ５６２）細胞とＢＳＡを培養皿に吸着させた後、直接固定化操作を行ったＫ５６２細胞の顕微鏡明視野像を示す写真である。（Ａ：ＢＳＡ／Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）−ＮＨＳ、Ｂ：ＢＳＡ）
図８は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化した各種非接着細胞および接着細胞の光学顕微鏡明視野像を示す図である。（Ａ：ヒトＢ細胞リンパ腫Ｄａｕｄｉ、Ｂ：ヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ、Ｃ：マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、Ｄ：ヒト胚性腎臓細胞２９３、Ｅ：マウスＥＳ細胞）
図９は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により遺伝子導入と固定化を行ったＫ５６２細胞の顕微鏡明視野像と蛍光画像を重ね合わせた画像を示す図である。（Ａ：遺伝子混合液をスポットしていない領域、Ｂ：遺伝子混合液をスポットした領域、全面：Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＳを用いた固定化担体表面、１：Ｋ５６２細胞、２：遺伝子発現された赤色蛍光蛋白質ＤｓＲｅｄ２（赤色））
図１０は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化を行った３２Ｄ細胞およびＫ５６２細胞の培養期間毎の顕微鏡明視野像（および蛍光画像）を示す図である。（Ｉ：３２Ｄ細胞、ＩＩ：Ｋ５６２細胞、Ａ：培養開始時、Ｂ：２日後、Ｃ：３日後、Ｄ：０日後、Ｅ：３日後、Ｆ：７日後の蛍光画像）
図１１は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により約５００μｍ離れた位置に固定化された２種類の遺伝子発現細胞の４８時間後の蛍光画像と明視野像を示す写真である。各遺伝子発現細胞が定義された位置にのみ固定化され、クロスコンタミネーションが起こらないことを示す。（Ａ：ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１、Ｂ：ｐＭＥ−ＥＧＦＰ、Ｉ：蛍光画像、ＩＩ：明視野像）
図１２は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法により固定化を行ったＨＥＫ２９３細胞をゲル包埋培養した際の共焦点３次元画像と共焦点３次元透過像を示す写真である。（Ａ：共焦点３次元画像、Ｂ：共焦点３次元透過像）
図１３は、この出願の発明の実施例において、本願発明の方法によりｓｉＲＮＡの導入と細胞固定化を行ったＨＥＫ２９３細胞の共焦点明視野像、共焦点蛍光画像、およびそれらを重ね合わせた画像を示す写真である。（Ａ：共焦点明視野像、Ｂ：共焦点蛍光画像、Ｃ：ＡとＢを重ね合わせた画像）
図１４は、この出願の発明の実施例として、固定化したリポソームと、ＢＳＡを培養皿に吸着させた後、直接固定化操作を行った比較のためのリポソームの顕微鏡明視野像を示す写真である。（Ａ：カチオニックリポソーム、Ｂ：弱負電荷リポソーム、Ｃ：アニオニックリポソーム、Ｉ：ＢＳＡ／Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（４０００）、ＩＩ：ＢＳＡ）
図１５は、Ｏｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（２０００）固相化ガラス上に固定化したＧＳＴ−ＥＧＦＰ発現大腸菌について示した、（Ａ）明視野像と蛍光画像との重ね合わせ、（Ｂ）蛍光画像を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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