(57)【要約】本発明は、新規な核内受容体ＥＲＲγ３に関する。ＥＲＲγ３自身は、ＤＮＡ結合ドメインを欠損している。しかしＥＲＲγ３は、ＥＲＲ、ＥＲ、あるいはＴＲ等の任意の核内受容体の、転写活性化作用を増強する作用を有する。また本発明者は、既知蛋白質ＥＲＲγ１およびＥＲＲγ２も、ＥＲＲγ３と同様に、他の核内受容体に対して転写活性化作用増強することを見だした。本発明は、これらＥＲＲγサブタイプによる他の核内受容体に対する転写活性化作用の増強作用を調節する機能を評価する方法と、この評価方法に基づくスクリーニング方法を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）核内受容体と共存するとき、当該核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）核内受容体と共存するとき、当該核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ該５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失した塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
【請求項２】
前記（ａ）の核内受容体が、サブファミリー３のグループＡ、サブファミリー３のグループＢ、サブファミリー３のグループＣ、およびサブファミリー１のグループＣからなる群から選択されたいずれかのグループに分類される核内受容体である請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記（ａ）の核内受容体が、エストロゲンレセプター関連レセプター、エストロゲンレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターで構成される群から選択されるいずれかの核内受容体であり、該核内受容体の転写活性化作用を上昇させる蛋白質をコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記（ａ）の核内受容体が、グルココルチコイドレセプターであり、該核内受容体の転写活性化作用を低下させる蛋白質をコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項５に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項５に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項９】
次の工程を含む、被験物質の、核内受容体複合体の転写調節活性を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体複合体が任意の核内受容体と次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質とからなる複合体である方法。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（１）任意の核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現し、かつ前記任意の核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）該核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現可能な条件下で前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程
【請求項１０】
任意の核内受容体が、サブファミリー３のグループＡ、サブファミリー３のグループＢ、サブファミリー３のグループＣ、およびサブファミリー１のグループＣからなる群から選択されたいずれかのグループに分類される核内受容体である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
任意の核内受容体が、エストロゲンレセプター関連レセプター、エストロゲンレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターで構成される群から選択されるいずれかの核内受容体である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
任意の核内受容体が、グルココルチコイドレセプターである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
次の工程を含む、核内受容体複合体の転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法。
（１）請求項９に記載の方法によって被験物質の核内受容体複合体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記核内受容体複合体の転写活性化作用を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
【請求項１４】
次の工程を含む、被験物質が核内受容体に結合する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（Ａ）配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）第２の核内受容体と共存するとき、当該第２の核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）第２の核内受容体と共存するとき、当該第２の核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ該５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失した塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体、そのリガンド、および被験物質を、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、
ｉ）核内受容体と被験物質を接触後にリガンドを接触させる、
ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とリガンドを接触させる、または
ｉｉｉ）核内受容体とリガンドを接触後に被験物質を接触させる
（２）核内受容体と結合したリガンドまたは被験物質の量を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体に結合する活性を検出する工程
【請求項１５】
リガンドが、エストロゲンレセプター関連レセプターのリガンド、アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核内受容体が、他の任意の第２の核内受容体と共存している請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
任意の第２の核内受容体が、サブファミリー３のグループＡ、サブファミリー３のグループＢ、サブファミリー３のグループＣ、およびサブファミリー１のグループＣからなる群から選択されたいずれかのグループに分類される核内受容体である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
任意の第２の核内受容体が、エストロゲンレセプター関連レセプター、エストロゲンレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターで構成される群から選択されるいずれかの核内受容体である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
任意の核内受容体が、グルココルチコイドレセプターである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
次の工程を含む、核内受容体に結合する活性を有する物質の評価方法。
（１）請求項１４に記載の方法によって被験物質の核内受容体に結合する活性を検出する工程、および
（２）前記核内受容体に結合する活性を有する被験物質を選択する工程
【請求項２１】
請求項１３、または請求項２０に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体の活性調節剤。
【請求項２２】
下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を有効成分として含有する、核内受容体の活性調節剤。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
【請求項２３】
下記の成分（１）〜（４）のいずれかを有効成分として含有する、核内受容体の活性抑制剤。
（１）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（２）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体、および
（３）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質
（４）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドの部分配列に対応するセンスＲＮＡおよびそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ
【請求項２４】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、核内受容体の活性が調節されたモデル動物。
（Ａ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（Ｂ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質、および
（Ｄ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項２５】
被検者から採取された生体試料における下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、および該発現レベルが健常者と比較して高いまたは低い場合に前記被検者が核内受容体の活性の異常に起因する疾患を有すると判定する工程を含む、核内受容体の活性の異常に起因する疾患の診断方法。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規な核内受容体、およびその用途に関する。
背景技術
核内受容体はリガンドに依存して活性が誘導される、一群の転写因子のスーパーファミリーを指す。核内受容体は、相互に高い相同性を示すＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン等の特徴的な構造を有する。
核内受容体は、その配列の高い相同性を利用して、新規な遺伝子が数多く発見されてきている。ヒトについては、現在までのところ４０数個の核内受容体遺伝子が報告されている。これらの中には、リガンドが未同定のもの、あるいは活性発現にリガンドを要しないものも含まれている。エストロゲンレセプター関連レセプター（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＲＲ）はエストロゲンレセプター（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＲ）と高い相同性を有する新規核内受容体遺伝子として発見された。ＥＲＲには、α、βおよびγの３種類のサブタイプの存在が知られている。このうち、ヒトＥＲＲγにはスプライシングの相違によりＮ末の２３アミノ酸残基の有無が生じる２種類のアイソフォームの存在が確認されている。これらのアイソフォームは、ｈＥＲＲγ１（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）、およびｈＥＲＲγ２（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）とに区別されている（１．Ｅｕｄｙ−ＪＤ，Ｙａｏ−ＳＦ，Ｗｅｓｔｏｎ−ＭＤ，Ｅｄｍｏｎｄｓ−ＭＭ，Ｔａｌｍａｄｇｅ−ＣＢ，Ｃｈｅｎｇ−ＪＪ，Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎｇ−ＷＪ  ＆  Ｓｕｍｅｇｉ−Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｓｈｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩａ  ａｔ  １ｑ４１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５０（１９９８）３８２−３８４．；Ｎａｇａｓｅ−Ｔ，Ｉｓｈｉｋａｗａ−Ｋ，Ｓｕｙａｍａ−Ｍ，Ｋｉｋｕｎｏ−Ｒ，Ｈｉｒｏｓａｗａ−Ｍ，Ｍｉｙａｊｉｍａ−Ｎ，Ｔａｎａｋａ−Ａ，Ｋｏｔａｎｉ−Ｈ，Ｎｏｍｕｒａ−Ｎ  ＆  Ｏｈａｒａ−Ｏ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．ＸＩＩ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  １００  ｎｅｗ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒａｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＤＮＡ  Ｒｅｓ．５（１９９８）３５５−３６４．；Ｃｈｅｎ−Ｆ，Ｚｈａｎｇ−Ｑ，Ｍｃｄｏｎａｌｄ−Ｔ，Ｄａｖｉｄｏｆｆ−ＭＪ，Ｂａｉｌｅｙ−Ｗ，Ｂａｉ−Ｃ，Ｌｉｕ−Ｑ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ−Ｔ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｈＥＲＲ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｎｏｖｅｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ．Ｇｅｎｅ  ２２８（１９９９）１０１−１０９．）。
ヒトＥＲＲγサブタイプの場合、２種類のアイソフォームＥＲＲγ１およびＥＲＲγ２をコードする少なくとも６種類の転写産物が組織依存的に存在することが５’ＲＡＣＥにより見出されている。（Ｈｅａｒｄ−ＤＪ，Ｎｏｒｂｙ−ＰＬ，Ｈｏｌｌｏｗａｙ−Ｊ  ＆  Ｖｉｓｓｉｎｇ−Ｈ．Ｈｕｍａｎ  ＥＲＲγ，ａ  ｔｈｉｒｄ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲＲ）ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４（２０００）３８２−３９２．）。
ＥＲＲの３種類のサブタイプα、β、およびγのＤＮＡ結合ドメインは互いに９３％以上の相同性を有しており、いずれもエストロゲン応答配列（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ；ＥＲＥ）、あるいはそのｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｈａｌｆ  ｓｉｔｅを認識して、リガンド非依存的に下流の遺伝子の転写を誘導する（Ｈｅａｒｄ−ＤＪ，Ｎｏｒｂｙ−ＰＬ，Ｈｏｌｌｏｗａｙ−Ｊ  ＆  Ｖｉｓｓｉｎｇ−Ｈ．Ｈｕｍａｎ  ＥＲＲ  ｇａｍｍａ，ａ  ｔｈｉｒｄ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲＲ）ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４（２０００）３８２−３９２．；Ｈｏｎｇ−Ｈ，Ｙａｎｇ−Ｌ  ＆  Ｓｔａｌｌｃｕｐ−ＭＲ．Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９）２２６１８−２２６２６．）。ＥＲＲγはリガンド非依存的に転写調節活性を有するが、そのリガンド結合ドメインは転写調節活性に必須であることが確認されている（Ｈｅａｒｄ−ＤＪ，Ｎｏｒｂｙ−ＰＬ，Ｈｏｌｌｏｗａｙ−Ｊ  ＆  Ｖｉｓｓｉｎｇ−Ｈ．Ｈｕｍａｎ  ＥＲＲγ，ａ  ｔｈｉｒｄ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲＲ）ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４（２０００）３８２−３９２．；Ｈｏｎｇ−Ｈ，Ｙａｎｇ−Ｌ  ＆  Ｓｔａｌｌｃｕｐ−ＭＲ．Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９）２２６１８−２２６２６．）。ＥＲのアゴニストであるｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌが、１０−６Ｍ以上の濃度において、３種類のいずれのサブタイプの転写活性化作用も阻害すること（Ｔｒｅｍｂｌａｙ−ＧＢ，Ｋｕｎａｔｈ−Ｔ，Ｂｅｒｇｅｒｏｎ−Ｄ，Ｌａｐｏｉｎｔｅ−Ｌ，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ−Ｃ，Ｂａｄｅｒ−ＪＡ，Ｒｏｓｓａｎｔ−Ｊ  ＆  Ｇｉｇｕｅｒｅ−Ｖ．Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ  ｂｅｔａ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５（２００１）８３３−８３８．）、またＥＲの部分アゴニストである４���ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎが、１０−６Ｍ以上の濃度においてＥＲＲγの転写活性化作用のみ阻害することが明らかにされている（Ｃｏｗａｒｄ−Ｐ，Ｌｅｅ−Ｄ，Ｈｕｌｌ−ＭＶ  ＆  Ｌｅｈｍａｎｎ−ＪＭ．４−Ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｓｉｆｅｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａｎｄ  ｄｅａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９８（２００１）８８８０−８８８４．）。ＥＲＲの生理的役割は未だ充分に解明されてはいないが、その応答配列がＥＲと交差していること等から、ＥＲの機能の調節因子としての役割が示唆されている（Ｅｕｄｙ−ＪＤ，Ｙａｏ−ＳＦ，Ｗｅｓｔｏｎ−ＭＤ，Ｅｄｍｏｎｄｓ−ＭＭ，Ｔａｌｍａｄｇｅ−ＣＢ，Ｃｈｅｎｇ−ＪＪ，Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎｇ−ＷＪ  ＆  Ｓｕｍｅｇｉ−Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｓｈｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩａ  ａｔ  １ｑ４１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５０（１９９８）３８２−３８４．；Ｙａｎｇ−Ｎ，Ｓｈｉｇｅｔａ−Ｈ，Ｓｈｉ−Ｈ  ＆  Ｔｅｎｇ−ＣＴ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｈＥＲＲ１，ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６）５７９５−５８０４．）。
発明の開示
本発明は、他の核内受容体の活性を調節する新規な核内受容体の提供を課題とする。また本発明は、核内受容体の転写調節活性を制御する因子の存在を明らかにし、これらの因子の作用を調節する活性を評価するための方法の提供を課題としている。
本発明者らは、新規な核内受容体を見出すために、核内受容体に特徴的なＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）やリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する蛋白質をコードする遺伝子を探索した。更に本発明者らは、探索によって絞り込まれた遺伝子について、その機能を解析した。その結果、ある種のＥＲＲγアイソフォームは、自身がＤＢＤの一部を欠損しているのもかかわらず、他の核内受容体の転写調節活性を制御する機能を有していることを見出した。
次に本発明者らは、各種の核内受容体とその活性を調節するＥＲＲγアイソフォームとの複合体が有している転写調節活性を調節する作用を評価するためのアッセイ系を確立した。更に本発明者らは、このアッセイ系を利用して、前記複合体の転写調節活性を調節する作用を有する被験物質を選択しうることを確認し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に関する。また本発明は、第２の核内受容体、およびこの第２の核内受容体と共存するとき、その活性を調節するＥＲＲγアイソフォームからなる複合体の、転写調節活性の測定方法に関する。更に本発明は、この測定方法に基づく、前記複合体の活性に及ぼす被験物質の影響の評価方法に関する。
〔１〕下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）核内受容体と共存するとき、当該核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）核内受容体と共存するとき、当該核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ該５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失した塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
〔２〕前記（ａ）の核内受容体が、サブファミリー３のグループＡ、サブファミリー３のグループＢ、サブファミリー３のグループＣ、およびサブファミリー１のグループＣからなる群から選択されたいずれかのグループに分類される核内受容体である〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３〕前記（ａ）の核内受容体が、エストロゲンレセプター関連レセプター、エストロゲンレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターで構成される群から選択されるいずれかの核内受容体であり、該核内受容体の転写活性化作用を上昇させる蛋白質をコードする〔２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕前記（ａ）の核内受容体が、グルココルチコイドレセプターであり、該核内受容体の転写活性化作用を低下させる蛋白質をコードする〔２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔５〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔６〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔７〕〔１〕に記載のポリヌクレオチド、または〔５〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔８〕〔７〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔５〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔９〕次の工程を含む、被験物質の、核内受容体複合体の転写調節活性を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体複合体が任意の核内受容体と次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質とからなる複合体である方法。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（１）任意の核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現し、かつ前記任意の核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）該核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現可能な条件下で前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程
〔１０〕任意の核内受容体が、サブファミリー３のグループＡ、サブファミリー３のグループＢ、サブファミリー３のグループＣ、およびサブファミリー１のグループＣからなる群から選択されたいずれかのグループに分類される核内受容体である〔９〕に記載の方法。
〔１１〕任意の核内受容体が、エストロゲンレセプター関連レセプター、エストロゲンレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターで構成される群から選択されるいずれかの核内受容体である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕任意の核内受容体が、グルココルチコイドレセプターである〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕次の工程を含む、核内受容体複合体の転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔９〕に記載の方法によって被験物質の核内受容体複合体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記核内受容体複合体の転写活性化作用を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
〔１４〕次の工程を含む、被験物質が核内受容体に結合する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（Ａ）配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）第２の核内受容体と共存するとき、当該第２の核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）第２の核内受容体と共存するとき、当該第２の核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ該５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失した塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体、そのリガンド、および被験物質を、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、
ｉ）核内受容体と被験物質を接触後にリガンドを接触させる、
ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とリガンドを接触させる、または
ｉｉｉ）核内受容体とリガンドを接触後に被験物質を接触させる
（２）核内受容体と結合したリガンドまたは被験物質の量を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体に結合する活性を検出する工程
〔１５〕リガンドが、エストロゲンレセプター関連レセプターのリガンド、アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択されるいずれかの化合物である〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕核内受容体が、他の任意の第２の核内受容体と共存している〔１４〕に記載の方法。
〔１７〕任意の第２の核内受容体が、サブファミリー３のグループＡ、サブファミリー３のグループＢ、サブファミリー３のグループＣ、およびサブファミリー１のグループＣからなる群から選択されたいずれかのグループに分類される核内受容体である〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕任意の第２の核内受容体が、エストロゲンレセプター関連レセプター、エストロゲンレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターで構成される群から選択されるいずれかの核内受容体である〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕任意の核内受容体が、グルココルチコイドレセプターである〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕次の工程を含む、核内受容体に結合する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔１４〕に記載の方法によって被験物質の核内受容体に結合する活性を検出する工程、および
（２）前記核内受容体に結合する活性を有する被験物質を選択する工程
〔２１〕〔１３〕、または〔２０〕に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体の活性調節剤。
〔２２〕下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を有効成分として含有する、核内受容体の活性調節剤。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
〔２３〕下記の成分（１）〜（４）のいずれかを有効成分として含有する、核内受容体の活性抑制剤。
（１）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（２）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体、および
（３）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質
（４）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドの部分配列に対応するセンスＲＮＡおよびそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ
〔２４〕以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、核内受容体の活性が調節されたモデル動物。
（Ａ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（Ｂ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質、および
（Ｄ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
〔２５〕被検者から採取された生体試料における下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、および該発現レベルが健常者と比較して高いまたは低い場合に前記被検者が核内受容体の活性の異常に起因する疾患を有すると判定する工程を含む、核内受容体の活性の異常に起因する疾患の診断方法。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
本発明者らは、新規な核内受容体を見出すために、全長ｃＤＮＡライブラリーを対象として核内受容体に特徴的なＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）やリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する蛋白質をコードする遺伝子を探索した。探索された遺伝子の中で、特にＥＲＲγとの高い相同性が確認された、Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０に着目した。
Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０は３９６アミノ酸残基の蛋白質をコードする１１８８塩基長（６８４−１８７４）の領域を有する。ＥＲＲγ３の塩基配列を配列番号：１に、この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示した。この蛋白質には核内受容体ファミリーに共通するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）が存在した。Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０のｃＤＮＡと最も高い相同性を示したのは、ＥＲＲγの２種のアイソフォームＥＲＲγ１（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）とＥＲＲγ２（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）であった。それぞれのコードする蛋白質のアミノ酸配列を比較したところ、Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０がコードする蛋白質は、Ｎ末配列に関してＥＲＲγ２よりも２３アミノ酸残基長短い。またこの蛋白質には、ＥＲＲγ１およびＥＲＲγ２の両方に共通して存在するＤＢＤ領域に関して３９アミノ酸残基に相当する欠失が認められた。この欠失はＤＢＤに存在する２個のｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ構造の中、下流に存在するものに相当する（図１２）。
次に、Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０、およびＥＲＲγ１とＥＲＲγ２を構成する塩基配列を、ゲノムの塩基配列に照合した。その結果、Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０は、ＤＢＤの一部を構成するエクソンを欠くスプライシングバリアントであることが明らかとなった。これらの構造的な特徴に基づいて、本発明者らは、Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０をＥＲＲγの新たなアイソフォームであると結論し、ＥＲＲγ３と名付けた。すなわち本発明は、ＥＲＲγ３をコードする配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明には、配列番号：２に示したアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。本発明において「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質が次の性状（ａ）および（ｂ）を有するとき、その蛋白質は本発明の蛋白質であるＥＲＲγ３と機能的に同等であると言うことができる。
（ａ）核内受容体と共存するとき、当該核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
たとえば、次のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質であって、前記性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。
（Ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、または
（Ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
本発明において、ある蛋白質が第２の核内受容体分子と共存するときに当該核内受容体の転写活性化作用を調節することは、次のようにして確認することができる。以下の説明では、機能的な同等性を確認すべき蛋白質を、被験蛋白質と記載する。たとえば、前記性状（ａ）を確認するための手法としてレポータジーンアッセイを利用することができる。具体的には、任意の核内受容体と、性状（ａ）を有することを確認すべき被験蛋白質とを、細胞内で共発現させる。宿主となる細胞には、前記核内受容体の応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現するベクターを導入しておく。被験蛋白質が前記性状（ａ）を有していれば、核内受容体のみを発現させた場合に比べて、レポータ遺伝子の発現レベルが変化する。したがって、両者のレポータ遺伝子の発現レベルの比較結果に基づいて、被験蛋白質が性状（ａ）を有することを知ることができる。
本発明において、転写活性化作用の調節とは、前記第２の核内受容体が有している転写活性化作用を上昇または低下させることを言う。したがって、前記レポータ遺伝子の発現レベルが上昇するとき、被験蛋白質は、第２の核内受容体の転写活性化作用を上昇させる作用を有する。一方、発現レベルの低下は、被験蛋白質が第２の核内受容体の転写活性化作用を低下させる作用を有していることを意味する。転写活性化作用の調節は、被験蛋白質の第２の核内受容体との相互作用と言うこともできる。
本発明において、核内受容体の転写調節活性とは、核内受容体が転写ユニットによる遺伝子の転写を開始する活性を言う。一般に核内受容体は、転写共役因子と呼ばれる複数の因子をリクルートメントすることにより、転写を開始するとされている。核内受容体の転写調節活性によってもたらされる転写の活性化を転写活性化作用と言う。
また、被験蛋白質が核内受容体と結合することは、各種のバインディングアッセイの原理にしたがって、容易に確認することができる。たとえば、核内受容体、または被験蛋白質の一方に、タグを結合させ、他方を標識する。両者を接触後に、タグに親和性を有するリガンドを利用して、タグを結合させた核内受容体、または被験蛋白質を回収する。このとき、標識された分子がタグを結合させた分子とともに回収されれば、両者が結合親和性を有していることが確認できる。
一方、本発明における機能的同等性の指標とする、性状（ｂ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の少なくとも一部を欠損していることは、そのアミノ酸配列を解析することによって確認することができる。本発明における性状（ｂ）には、ＤＢＤの少なくとも一部を欠損する場合に加えて、ＤＢＤに変異を含むためにＤＮＡとの結合活性を失ったものも含まれる。たとえば、配列番号：２に示したＥＲＲγ３は、図１２に示すように、ＥＲＲγ２が有する２つのＺｉｎｃフィンガーのうちの１つを欠失している。
本発明において、任意の第２の核内受容体としては、サブファミリー３のグループＡ、サブファミリー３のグループＢ、サブファミリー３のグループＣ、およびサブファミリー１のグループＣなどに分類される核内受容体を示すことができる。核内受容体のサブファミリーおよびグループの定義、並びに命名法はＮｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの命名方法に従った（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（１９９９）Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｃｅｌｌ，９７，１６１−１６３．）。また核内受容体は、進化的な観点からも解析されている（Ｖ．Ｌａｕｄｅｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９（１９９７）２０７−２２６．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｅａｒｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）。
核内受容体スーパーファミリーは、主として、受容体蛋白質の進化的によく保存されたドメインであるＤＮＡ結合ドメインとリガンド結合ドメインのアミノ酸配列の類似度を比較することによって、６サブファミリー２６グループに分類されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓ−ｌｙｏｎ．ｆｒ／ＬＢＭＣ／ｌａｕｄｅｔ／ＮｕｃＲｅｃ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ＿ｔａｂｌｅ．ｈｔｍｌ）。サブファミリー、グループに属する各受容体については、ＮＵＲＥＢＡＳＥデータベースにより検索することができる（Ｊｏｒｇｅ  Ｄｕａｒｔｅ等、（２００２）ＮＵＲＥＢＡＳＥ：ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１，３６４−３６８．）。各グループには、たとえばそれぞれ次のような核内受容体が分類されている。
サブファミリー１グループＡ：
甲状腺ホルモンレセプター（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＲ）
サブファミリー３グループＢ：
エストロゲンレセプター関連レセプター（ＥＲＲ）
サブファミリー３グループＡ：
エストロゲンレセプター（ＥＲ）
サブファミリー３グループＣ：
グルココルチコイドレセプター（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＲ）
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質が、ＥＲＲ、ＥＲ、あるいはＴＲに対して、活性増強作用を有することは実施例に示したとおりである（図２０）。また配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質が、ＧＲに対してその活性抑制作用を有することが、実施例において示された（図２５）。
更に本発明は、配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ該５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失した塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。配列番号：５の塩基配列は、ＥＲＲの既知アイソフォームであるＥＲＲγ２の塩基配列である。配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列は、ＤＢＤの一部をコードしている。したがって、この領域を欠失し、かつ残る塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドとして好ましい。
５９９−７１５に相当する塩基配列とは、配列番号：５に記載の塩基配列に対して、ある塩基配列を整列させたときに、配列番号：５における５９９−７１５に対応する位置に配置される、ある塩基配列中の塩基配列を言う。したがって、必ずしも５９９−７１５に位置するとは限らない。たとえば本発明の望ましいポリヌクレオチドである配列番号：１に記載の塩基配列では、１０８８−１０９４が配列番号：５における５９９−７１５に相当する。ある塩基配列が配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失していることは、両者を整列させることによって確認することができる。異なる塩基配列を整列させるためのアルゴリズムは公知である。たとえば図７−図１０は、配列番号：１に記載の塩基配列を配列番号：５の塩基配列と整列させた状態を示している。
更に本発明には、配列番号：５の塩基配列における５９９−７１５に相当する塩基配列を他の塩基配列に置換した塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。置換のための塩基配列は任意である。ただし本発明のポリヌクレオチドは、ＤＢＤの欠失を条件とする。また当該領域に隣接する塩基配列と連結したときに、１つの翻訳フレームを構成する必要がある。したがって、置換塩基配列は、フレームシフトや終止コドンをもたらさない塩基配列であり、かつ置換前の塩基配列がコードしていたＤＢＤと同じアミノ酸配列をコードしない塩基配列であることが求められる。
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法を利用して調製することができる。変異の導入方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５）等を示すことができる。また、このような蛋白質は自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列（配列番号：２）において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加等により異なる蛋白質も含まれる。
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り特に制限されない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
また、本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４）を用いて本発明の蛋白質をコードする塩基配列（配列番号：１）またはその一部をもとにこれと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、このポリヌクレオチドから機能的に同等な蛋白質を得ることは、通常行い得ることである。本発明には、本発明の蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も含まれる。
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常は洗浄のための条件として「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ストリンジェンシーに影響を与えるその他の条件として、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間などを示すことができる。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離される蛋白質は、配列番号：２に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列または該蛋白質をコードする塩基配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、たとえば８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。相同性の特定は、ＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，１９９７  Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．）を用いて決定することができる。
配列番号：２に示した本発明に基づくＥＲＲγ３のアミノ酸配列と、既知のアイソフォームであるＥＲＲγ１あるいはＥＲＲγ２のアミノ酸配列の間の相同性は８２．６％であった。本発明における望ましいアミノ酸配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列である。
また、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）を用いて、本実施例において同定された塩基配列（配列番号：１）の一部をもとにプライマーを設計し、これら塩基配列またはその一部と相同性の高いＤＮＡ断片を単離して、これをもとに本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることも可能である。本発明の蛋白質、並びに本発明における機能的に同等な蛋白質は、後に述べるような、当該蛋白質の機能を修飾する化合物の評価方法に用いることができる。またこれらの蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、当該蛋白質の製造、発現状態を知るためのプライマーまたはプローブとして有用である。
あるいは本発明は、本発明の蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。ドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、その発現によって細胞がもともと備えている内在性の野生型蛋白質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する。例えば、本発明の蛋白質における、他の核内受容体との相互作用に必要な領域、リガンドドメイン等、該蛋白質の活性に影響すると考えられる配列に相当する部分のアミノ酸配列を改変すれば、核内受領体の活性化作用を持たない不活性体を得ることができると考えられる。このようなアミノ酸配列をコードする遺伝子を細胞内に発現させれば、本発明のＥＲＲγ３の発現をドミナントネガティブ効果（不活性型の拮抗阻害）により抑制することができる。従って、ウイルスベクター等の遺伝子導入技術によって、不活性体遺伝子を細胞に導入発現させることで、核内受容体の活性を調節することができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを提供する。部分ペプチドは、本発明の蛋白質に対する抗体を得るための免疫原として有用である。特に、他の蛋白質との相同性が低い、本発明の蛋白質に固有のアミノ酸配列を含む部分ペプチドは、本発明の蛋白質に対して特異性の高い抗体を与える免疫原として期待される。このようなアミノ酸配列として、図１２に示す構造の中で、ＥＲＲγ３において欠失しているＺｉｎｃフィンガーに相当するアミノ酸配列を含む領域を挙げることができる。
本発明の部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは９アミノ酸以上、より好ましくは１２アミノ酸以上、より好ましくは１５アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチドのいずれかを含有する発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチド、あるいは前記いずれかの発現ベクターを保持する形質転換体、並びにその形質転換体を培養し、その培養物から本発明の蛋白質を単離することからなる、本発明の蛋白質、或いはその部分ペプチドの製造方法に関する。さらに本発明は、上記の方法で製造された蛋白質、或いはその部分ペプチドを提供する。
遺伝子組換え手法でポリペプチドを生産する場合、宿主細胞の種類により、目的ポリペプチドのグリコシル化の種類や程度の異なったものが得られることや、いわゆるポリペプチドの分泌生産法において、宿主細胞中で発現された前駆体ポリペプチドの末端（Ｎ−末端および／またはＣ−末端）アミノ酸配列がシグナル・ペプチダーゼ等によりプロセッシングを受け、種々の末端アミノ酸配列を持つポリペプチドが得られることは当業者に周知である。従って、そのようなポリペプチドも本発明の蛋白質の範囲に含まれることは、当業者ならば容易に理解し得ることである。
下記実施例には、発現ベクターとして哺乳類動物細胞内で機能するベクターの構築例が示されている。しかしながら、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが開示されている結果、これらに基づいて、酵母等の真菌類、並びに原核性細胞宿主に導入したとき、該宿主に本発明の蛋白質を発現、産生させ得る発現ベクターを構築することは当業者にとって容易である。従って、本発明は、本発明の核酸配列に基づき、当該技術分野既知の方法で構築される発現ベクターをも包含する。
本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現させるために用い得る微生物細胞には、例えば、原核性の細菌［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）］および真核性の酵母［例えばパン酵母菌（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］がある。また、哺乳類細胞には培養ヒト細胞および培養動物細胞が含まれる。さらには培養植物細胞も用い得る。
微生物の例としてはエシェリキア属に属する細菌やパン酵母がある。より具体的には、例えば次のような菌株を微生物宿主として挙げることができる。
エシェリキア属に属する細菌
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ  ３３６９４）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１−１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８７２）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１４４６）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１（ＡＴＣＣ  ３３８４９）等
パン酵母
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２（ＡＴＣＣ  ３８６２６）等
哺乳動物細胞の例としてはヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、マウスＬ９２９細胞およびチャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞等がある。
通常、原核生物である細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、終止コドンおよび自己複製可能ユニットから構成される。真核生物、即ち酵母や哺乳動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび終止コドンから構成されるのが好ましい。さらにエンハンサー配列、本発明の蛋白質の５’−および３’−非コード領域、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入することもできる。
上記の自己複製可能単位は、形質転換体の選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性）を含有していることが好ましい。細菌を宿主とする発現ベクターの場合、プロモーターという語句は、プロモーター、オペレーターおよびシャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列（例えばＡＡＧＧ等）からなるプロモーター・オペレーター領域を意味する。そのようなプロモーターの例としては、慣用のプロモーター・オペレーター領域が挙げられる。具体的には、ラクトースオペロン、ＰＬ−プロモーター、あるいはｔｒｐ−プロモーター等を示すことができる。酵母を宿主とする発現ベクターに用いられるプロモーターの例としてはｐｈｏ５プロモーターが挙げられる。更に、精製を容易に行うことを目的として、金属イオンキレートに対する親和性を持つ塩基性アミノ酸を、本発明の蛋白質におけるいずれかの末端に付加することができる。塩基性アミノ酸を付加する場合には、希望のアミノ酸をコードする塩基配列が連続した塩基配列を５’側に付加したプライマーを用いて、ＰＣＲを行えば、目的とする遺伝子の任意の末端に、オリゴペプチドを付加することができる。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、あるいはアルギニンなどを用いることができる。
哺乳動物細胞における発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、マウス・メタロチオネインＩ（ＭＭＴ）−プロモーター等が挙げられる。好ましい開始コドンの例としてメチオニンコドン（ＡＴＧ）が挙げられる。
終止コドンの例としては慣用されている終止コドン（例えばＴＡＧ、ＴＧＡ、等）が挙げられる。自己複製可能ユニットとは、それを含有する発現ベクターの全ＤＮＡを宿主細胞中で自己複製し得るＤＮＡ配列であって、天然のプラスミド、人工的に修飾したプラスミド、および合成プラスミドが挙げられる。人工的に修飾したプラスミドには、例えば天然プラスミドから調製したＤＮＡ断片等が含まれる。そのようなプラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプラスミドｐＢＲ３２２やその人工修飾体が挙げられる。人工修飾体とは、たとえばｐＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって得られたＤＮＡ断片等を示すことができる。また酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＪＤＢ２１９、ｐＪＤＢ２０７等が挙げられる。さらに、動物細胞用プラスミドとしては、例えばプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＭ３２４、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４５）、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７２２４）、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１４９）が挙げられる。
エンハンサー配列としては、例えばＳＶ４０のエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリアデニル化部位が挙げられる。
本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて、部分合成または全合成することによって得ることができる。或いは、ヒトｃＤＮＡライブラリーより、配列番号：１に記載の塩基配列に基づいて設定したプローブやプライマーを用いて取得することができる。更に、ゲノムＤＮＡを常法通り処理することによって、本発明の蛋白質をコードするゲノムＤＮＡを調製することができる。ゲノムＤＮＡの処理方法としては、例えば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスファターゼによる脱燐酸化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる燐酸化、およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション等の工程を含む処理方法を示すことができる。更にこのようにして取得したゲノムＤＮＡを利用し、ゲノムにおける本発明の遺伝子の転写開始点を明らかにし、より上流に位置する発現制御領域を特定することができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターやエンハンサー等の制御領域は、本発明の蛋白質の発現異常を検出するための標的領域として有用である。或いは、これらの領域を標的とするデコイ核酸医薬などにより、発現制御を実現することができる。
本発明の実施に必要な、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からの蛋白質の回収等の操作は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５）他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）］に準じて行なうことができる。
また、本発明の宿主細胞には、本発明のＥＲＲγ３の機能解析やこの蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤の評価方法のために用いる目的の細胞も含まれる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法等の方法で行うことが可能である。形質転換体からの本発明の蛋白質の調製は、当業者に公知の蛋白質の分離あるいは精製法を利用して行なうことができる。本発明は、こうして精製された実質的に純粋な蛋白質に関する。本発明において、実質的に純粋とは、ヒトに由来するその他の蛋白質を含まないことを言う。あるいは本発明における実質的に純粋な蛋白質は、たとえば８０％以上、通常９０％以上、または９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の純度を有する蛋白質を言う。
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（Ａ：Ｕ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡやＲＮＡを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
特に、配列番号：１に示す塩基配列のうち、既知のアイソフォームであるＥＲＲγ２に対する欠失部分を含む領域は、配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡの検出において有用である。この領域を構成する塩基配列、またはその相補配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、ＥＲＲγ３を特異的に検出するためのプローブ、あるいはプライマーとして有用である。
あるいは、配列番号：１に示す塩基配列のうち、前記欠失領域に隣接する領域にアニールするプライマーは、ＥＲＲγ３とその他のアイソフォームの識別に有用である。たとえば、欠失塩基配列内にアニールするプライマーと、欠失塩基配列に隣接する塩基配列とからなるプライマーセットは、既知のアイソフォームであるＥＲＲγ１やＥＲＲγ２を増幅することができる一方、欠失を有するＥＲＲγ３では増幅がみられない。あるいは、ＥＲＲγ３を構成する塩基配列中、他のアイソフォームと共有していない次のエクソンに相当する１−６７０に相当する領域にアニールするプライマーは、ＥＲＲγ３の特異的な増幅に有用である。
Ａエクソン（１−８０）
Ｂエクソン（８１−５５２）
Ｃエクソン（５５３−６７０）
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質の異常を検査あるいは診断するために利用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをプローブやプライマーとして用いたノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにより、発現異常を検査することができる。また本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ゲノムＤＮＡ−ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲを実施することができる。更に、本発明の蛋白質をコードする遺伝子やその発現制御領域を増幅し、ＲＦＬＰ解析、ＳＳＣＰ、シークエンシング等の方法により、配列の異常を検査あるいは診断することができる。
また、本発明のＥＲＲγアイソフォームは、核内受容体の転写活性化作用を刺激することから、該因子をコードするポリヌクレオチドを、該因子が関連する疾患の遺伝子治療に用いることも可能である。即ち、宿主の疾患部位において適切に発現されるよう該ポリヌクレオチドを導入することにより、本発明のＥＲＲγ３を発現させ、該因子が関連する疾患を治療あるいは予防することが可能である。本発明において「発現」とは、転写および／または翻訳が含まれる。本発明のポリヌクレオチドを用いた発現の解析により、遺伝子の転写レベルでの発現を検査あるいは診断することができる。また、本発明の蛋白質に対する抗体を用いれば、遺伝子の翻訳レベルでの発現を検査あるいは診断することができる。
エストロゲンのシグナル伝達に関与するＥＲＲの転写調節活性の調節作用を有するＥＲＲγ３は、エストロゲンのシグナル伝達の異常に起因する疾患の診断や治療に有用である。たとえば、健常者に比べてＥＲＲγ３の発現レベルが低下している場合には、エストロゲンのシグナル伝達が不完全である可能性が疑われる。このような状態にある患者に、ＥＲＲγ３やそれを発現するベクターを投与することによって、エストロゲンのシグナル伝達を正常化することができる。
エストロゲンのシグナル伝達の異常に起因する疾患としては、乳癌、子宮癌、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、全身性エリテマトーデス、あるいはアルツハイマー病を示すことができる。乳癌や子宮癌では、ＥＲ活性の上昇が見られる。逆にＥＲの機能低下は、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、全身性エリテマトーデス、あるいはアルツハイマー病の原因の一つと考えられている。したがって、本発明によるＥＲＲγ３は、これらの疾患の治療や診断に有用である。
更に本発明のＥＲＲγ３は、ＥＲのみならずＴＲの転写調節活性の調節作用を有する。したがってＥＲＲγ３は、甲状腺ホルモンのシグナル伝達の異常に起因する疾患の診断や治療にも有用である。この種の疾患としては、たとえばＴＲの機能亢進を伴う注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）をあげることができる。
加えて本発明のＥＲＲγ３は、ＧＲの転写調節活性を抑制する作用を有する。したがってＥＲＲγ３は、グルココルチコイドのシグナル伝達の異常に起因する疾患の診断や治療にも有用である。この種の疾患としては、たとえば次のような疾患を示すことができる。
慢性関節リウマチ、                    高脂血症、
喘息、                                グルココルチコイド抵抗症、
炎症性腸疾患、                        高血圧、
リンパ腫、                    １０    動脈硬化症、
白血病、                              腎不全、
高血糖症、                            多発性硬化症
また、「配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド」には、本発明の蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。一方、本発明におけるアンチセンスとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現を抑制するポリヌクレオチドを意味する。
また、「配列番号：１に記載の塩基配列の部分配列に対応するセンスＲＮＡ及びそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ」には、本発明の蛋白質の発現を抑制する為のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が含まれる。本発明における２本鎖ＲＮＡは、２つのストランドからなる２本鎖ＲＮＡに加え、センス配列とアンチセンス配列を含むヘアピンループ構造を構成する１本鎖のＲＮＡを含む。
本発明によるアンチセンス、またはｓｉＲＮＡは、ＥＲＲγ３によるＥＲＲ活性刺激作用を抑制し、ＥＲＲの活性調節剤として用いることができる。あるいは上記アンチセンス、またはｓｉＲＮＡは、ＥＲＲγ３によるＧＲ活性に対する阻害作用を抑制し、ＧＲの活性調節剤として用いることができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡでもアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスＤＮＡは、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ、さらに好ましくは５００ｂｐ以上の鎖長を有し、通常、３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内の鎖長を有する。該アンチセンスＤＮＡを単独あるいは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等の適当なベクターにアンチセンス方向に挿入して用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ｂｐ以上、通常１００ｂｐ以内、好ましくは２０ｂｐ以上、５０ｂｐ以内の鎖長を有する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオエート法（Ｓｔｅｉｎ  ″Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．″  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９−３２２１（１９８８））等により調製することが可能である。
またｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを投与することにより、生体に導入することができる。ｓｉＲＮＡ発現用ベクターは公知である。
このようなアンチセンス、またはｓｉＲＮＡには、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の異常に起因する疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。本発明の蛋白質の異常には、蛋白質の機能異常や発現異常などが含まれる。遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター等を利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法等により患者へ投与することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクターなどを利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法などにより患者へ投与することができる。
エストロゲンのシグナル伝達に関与するＥＲＲの転写調節活性の調節作用を有するＥＲＲγ３の発現を抑制するアンチセンスは、エストロゲンのシグナル伝達の亢進に起因する疾患の診断や治療に有用である。たとえば、健常者に比べてＥＲＲγ３の転写レベルが上昇している場合には、エストロゲンのシグナル伝達が亢進している可能性が疑われる。このような状態にある患者に、ＥＲＲγ３のアンチセンスを発現するベクターを投与することによって、エストロゲンのシグナル伝達を正常化することができる。
たとえばエストロゲンのシグナル伝達の亢進に起因する疾患としては、乳癌や子宮癌を示すことができる。したがって、本発明によるＥＲＲγ３は、これらの疾患の治療や診断に有用である。
本発明は、また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、ＥＲＲγ３に特異的に見出されるアミノ酸配列によって構成される抗原決定基を認識する抗体に関する。ＥＲＲγ３に特異的に見出されるアミノ酸配列には、たとえば配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、Ｚｉｎｃフィンガーの欠損によって生じた固有のアミノ酸配列を示すことができる。ＥＲＲγ２は、配列番号：２における１３５位（Ｇ）と１３６位（Ｖ）の間に、Ｚｉｎｃフィンガーに相当する３９アミノ酸からなるアミノ酸配列を有している。つまり配列番号：２における１３５−１３６位のアミノ酸配列を含む領域は、ＥＲＲγ３に固有のアミノ酸配列と言うことができる。したがって、１３５−１３６位を含むアミノ酸配列で構成される抗原決定基を認識する抗体は、本発明の抗体に含まれる。更に、この領域によって構成される、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の立体構造からなる抗原決定基を認識する抗体も、本発明に含まれる。これらの抗原決定基を特異的に認識することができる抗体は、ＥＲＲγ３の検出や精製に有用である。
抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
抗体は、ポリクローナル抗体の場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドを家兎に免疫することにより得ることが可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２〜１１．１３）。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドを用いてマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質の精製に加え、例えば、これら蛋白質の発現異常や構造異常の検査あるいは診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞等から蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査あるいは診断することができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質に関連した疾患の治療等の目的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｏｃｉ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６」参照）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３，９９−１２１（１９９１））。
本発明はまた、次の工程を含む、被験物質の、核内受容体複合体の転写調節活性を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体複合体が任意の核内受容体と次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質とからなる複合体である方法に関する。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（１）任意の核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現し、かつ前記任意の核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）該核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現可能な条件下で前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程
本発明の方法において、核内受容体複合体とは、任意の核内受容体と前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質とからなる複合体を言う。このような複合体は、複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡを、同じ細胞において共発現させることによって、得ることができる。あるいは、個別に精製した蛋白質を、混合することによって核内受容体複合体とすることもできる。
前記検出方法において、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質とは、前記任意の核内受容体に結合してその作用を増強する機能を有する蛋白質を言う。配列番号：２は本発明者らによって新たに見出された蛋白質ＥＲＲγ３のアミノ酸配列である。一方、配列番号：４および配列番号：６に記載のアミノ酸配列は、ＥＲＲγ１およびＥＲＲγ２のアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は公知である。しかしＥＲＲγ１あるいはＥＲＲγ２は、これらの分子自身が転写調節活性を有することは知られていたものの、他の核内受容体の転写活性化作用を増強する作用を有することは知られていなかった。
ある蛋白質が他の核内受容体分子と共存するときに当該核内受容体の転写活性化作用を調節することを確認するための方法は既に述べた。
本発明の検出方法において、配列番号：２のアミノ酸配列を有する蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、先に述べた性状（ａ）および（ｂ）を有する。すなわち、他の核内受容体の転写活性化作用を調節する作用に加えて、望ましくはＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損する蛋白質は、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質として望ましい。
本発明において、任意の核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現し、かつ前記任意の核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞は、たとえば次のようにして得ることができる。
まず、任意の核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現させるためには、これらの核内受容体をコードするＤＮＡを細胞に導入する。本発明において、任意の核内受容体としては、エストロゲンレセプター関連レセプター（ＥＲＲ）、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、甲状腺ホルモンレセプター（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＲ）、およびグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）等を示すことができる。更にこれらの核内受容体のアイソフォームも、それが転写調節活性を有する限り本発明の検出方法に用いることができる。これらの核内受容体をコードするＤＮＡは、公知である。本発明に利用しうる核内受容体遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を以下に示す。
2003080831.tif 000002
一方、任意の核内受容体に対して転写活性化作用を調節する核内受容体をコードするＤＮＡとしては、たとえば、配列番号：１、配列番号：３、あるいは配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡを示すことができる。本発明においては、これらの塩基配列に加え、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列を有する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを利用することもできる。配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列からなる蛋白質が、ＥＲＲ、ＥＲ、あるいはＴＲに対して、活性増強作用を有することは実施例に示したとおりである。あるいは、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列からなる蛋白質が、ＧＲに対して、活性抑制作用を有することを実施例に示した。
これらのＤＮＡは、それぞれの塩基配列情報に基づいて、ヒト、あるいは他の動物、線虫、および酵母などの生物に由来するｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲやハイブリダイズを利用したスクリーニング方法によって得ることができる。あるいはまた、これらの塩基配列情報に基づいて、必要な塩基配列を有するＤＮＡを合成することもできる。
これらのＤＮＡは、別々に、あるいは共通の発現ベクターにクローニングし、細胞へ導入する。発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＭＭ３２４、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ  ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ  ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ  ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられる。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、哺乳動物細胞において外来遺伝子の高度な発現を可能とするベクターである。任意の核内受容体遺伝子と、その転写活性化作用を増強する核内受容体遺伝子を別のベクターに導入した場合には、両者をコトランスフェクションすることによって細胞に導入する。２つのベクターの導入を確認するために、各ベクターには異なる選択マーカーを付与しておくことができる。あるいは１つのベクターに両方の遺伝子を保持させて、細胞に導入することもできる。
本発明において、これらの核内受容体をコードするＤＮＡを導入する細胞としては、これらのＤＮＡを蛋白質に翻訳し、かつその細胞に導入される前記任意の核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞が用いられる。本発明において、核内受容体の転写活性化作用によって、その応答配列の制御下にレポータ遺伝子が転写されるように配置された、応答配列とレポータ遺伝子の組み合せを発現カセットと言う。発現カセットは、プラスミドとして細胞に導入することもできるし、細胞のゲノムにインテグレートしておくこともできる。
応答配列とは、核内受容体のＤＢＤと結合し、転写ユニットによるｍＲＮＡへの転写の開始に必要な塩基配列である。たとえば前記の任意の核内受容体の応答配列は公知である。
たとえば実施例に用いたエストロゲン応答配列ＥＲＥ（ＥＲＲＥ）は、配列番号：１５の塩基配列からなる（Ｌｕ−Ｄ，Ｋｉｒｉｙａｍａ−Ｙ，Ｌｅｅ−ＫＹ  ＆  Ｇｉｇｕｅｒｅ−Ｖ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐＳ２  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＥＲＲ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２００１）６７５５−６７６１．）。その他、ＥＲ、ＴＲ、レチノイン酸Ｘ受容体（ＲＸＲ）、およびペルオキシソーム増殖剤応答性レセプター（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＰＡＲ）などの核内受容体についても、それぞれの応答配列が次に記載の論文において明らかにされている。
ＥＲ：文献参照  Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓ−Ｌ，Ｓｃｈｏｒｐｐ−Ｍ，Ｗａｇｎｅｒ−Ｕ  ＆  Ｒｙｆｆｅｌ−ＧＵ．Ａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ５’  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ  Ａ２  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ４６（１９８６）１０５３−１０６１．
ＴＲ：文献参照  Ｂｒｅｎｔ−ＧＡ，Ｈａｒｎｅｙ−ＪＷ，Ｃｈｅｎ−Ｙ，Ｗａｒｎｅ−ＲＬ，Ｍｏｏｒｅ−ＤＤ  ＆  Ｌａｒｓｅｎ−ＰＲ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３（１９８９）１９９６−２００４．
ＲＸＲ：文献参照  Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ−ＤＪ，Ｕｍｅｓｏｎｏ−Ｋ，Ｋｌｉｅｗｅｒ−ＳＡ，Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ−Ｕ，Ｏｎｇ−ＥＳ  ＆  Ｅｖａｎｓ−ＲＭ．Ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＸＲ  ａｎｄ  ＲＡＲ．Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１）５５５−５６１．
ＰＰＡＲ：文献参照  Ｔｕｇｗｏｏｄ  ＪＤ，Ｉｓｓｅｍａｎｎ−Ｉ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ−ＲＧ，Ｂｕｎｄｅｌｌ−ＫＲ，ＭｃＰｈｅａｔ−ＷＬ  ＆  Ｇｒｅｅｎ−Ｓ．Ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ５’  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ａｃｙｌ  ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（１９９２）４３３−４３９．
これらの応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現させるためには、その応答配列の制御下に発現している遺伝子をレポータ遺伝子に組み換えれば良い。応答配列の下流にレポータ遺伝子を配置した発現カセットを有するプラスミドを、レポータプラスミドと呼ぶ。
レポータプラスミドは、レポータベクターを用いれば容易に構築することができる。レポータレポータベクターは、レポータ遺伝子と、その上流に任意の応答配列を挿入するためのクローニングサイトを有するベクターである。たとえば、レポータ遺伝子としてルシフェラーゼを有するレポータベクターＰＧＶＰ２が市販されている。レポータベクターのクローニングサイトに、前記応答配列を挿入することによって、本発明に用いるレポータプラスミドとすることができる。応答配列は、タンデムに、複数個を挿入することによって、対応する核内受容体の応答性を高めることができる。その結果、転写調節活性に対するより高い検出感度を期待できる。挿入すべき応答配列は、化学的に合成することができる。
本発明において、レポータ遺伝子としては、容易にシグナルを測定することができる任意のレポータ遺伝子を利用することができる。遺伝子の発現調節機構を解析するためのレポータ遺伝子は公知である。具体的には、例えばルシフェラーゼ、カタラーゼ、βガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の遺伝子がレポータ遺伝子として一般に用いられる。ベクターを導入する細胞には、例えば当該遺伝子を欠失させた動物細胞を用いることができる。
上記各種の遺伝子を導入する細胞には、動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞などを用いることができる。たとえば実施例において用いたサル腎由来の細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ−７０）は、本発明における望ましい細胞の一つである。
本発明においては、被験物質の存在下、該任意の核内受容体、および（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を発現可能な条件下で前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルが測定される。前記検出方法において、２つの核内受容体が発現可能な条件下とは、導入されたベクターが有する核内受容体遺伝子が宿主細胞において発現される条件を言う。たとえば、ベクターに誘導性のプロモーターが利用されている場合には、発現の誘導に必要な条件下で培養する。
このとき、任意の核内受容体が、リガンド依存性である場合には、細胞にリガンドを供給するのが望ましい。他方リガンド非依存的に転写調節活性を発現する核内受容体においては、リガンドを与えない状態で上記方法を実施することができる。たとえば実施例において任意の核内受容体としてて用いたＥＲＲは、リガンド非依存性の核内受容体である。
本発明の検出方法において、被験物質は、培養物に添加することにより、前記細胞に接触させることができる。あるいは、被験物質が蛋白質であれば、それをコードする遺伝子を同じ細胞に導入することで、核内受容体に接触させることができる。更に、被験物質を発現する細胞を、前記核内受容体を発現する細胞とともに共培養することによって、接触させることもできる。
核内受容体が発現すれば、レポータ遺伝子が転写され蛋白質が発現する。レポータ遺伝子の発現レベルは、この蛋白質に由来するシグナルの大きさに基づいて測定することができる。たとえばレポータ遺伝子としてルシフェラーゼを用いた場合は、ルシフェラーゼ活性を発光強度として測定することができる。あるいはレポータ遺伝子がＧＦＰであれば、ＧＦＰの蛍光強度を測定することができる。
このとき、共存する被験物質が転写調節活性を調節する作用を有していれば、レポータ遺伝子の転写レベルは変化する。この変化の程度に基づいて、被験物質が転写を阻害する場合には、レポータ遺伝子の転写は抑制され、レポータ遺伝子のシグナルが低下する。逆に転写活性化作用を増強する作用を有する被験物質は、レポータ遺伝子のシグナルを上昇させる。したがって、レポータ遺伝子の転写レベルを指標として、被験物質の転写調節活性に及ぼす影響を評価することができる。
あらかじめ転写調節活性に与える影響がわかっている物質を利用して、転写調節活性に与える影響の大きさとレポータ遺伝子のシグナル強度の関係を明らかにしておけば、転写調節活性に与える影響が未知の物質について、その作用をシグナルの強度から定量的に評価することもできる。
本発明の検出方法によって、任意の核内受容体と、この核内受容体の転写活性化作用を増強する核内受容体との複合体の転写調節活性を調節する活性を評価することができる。本発明の転写調節活性を調節する活性の検出方法は、転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記任意の核内受容体と、この核内受容体の転写活性化作用を増強する核内受容体との複合体の転写調節活性を調節する活性を評価する方法によって当該活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記核内受容体の転写活性化作用を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
上記の各種のベクターを導入した細胞は、核内受容体の発現に伴って、レポータ遺伝子によるシグナルを生成する。得られた細胞を９６ウエルマルチプレートに播種し、細胞に導入した遺伝子の発現を誘導する条件下で培養を開始する。このとき評価すべき被験物質を各ウエルに加えることにより、核内受容体複合体の転写活性化作用に作用して、発現を抑制する、あるいは促進する活性をレポータ遺伝子を指標として容易に検出することができる。
例えば、レポータ遺伝子としてＧＦＰを用いた場合、被験物質を加えた状態および加えない場合でのＧＦＰの発光量の比較を行うことにより、発現制御領域に対する影響を評価することができる。比較にあたっては、たとえば２倍以上若しくは１／２以下、好ましくは５倍若しくは１／５以下、より好ましくは１０倍以上若しくは１／１０以下の発光量比を示す場合に、有意な差があると判定することができる。本方法は動物細胞ばかりでなく、導入された核内受容体の転写活性化作用を再現できる宿主であれば、真核生物あるいは原核生物を問わず応用することができる。このとき、細胞はレポータ遺伝子が発現可能な条件下で培養される。
本発明の評価方法に用いる被験物質は特に制限されない。具体的には、たとえば細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物等が挙げられる。あるいは、前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体も、スクリーニングに用いる候補物質として有用である。
一方、本発明の評価方法における対照には、転写調節活性に与える影響がわかっている化合物を用いることができる。より具体的には、たとえば転写調節活性に影響を与えないことが明らかな物質を対照とすることができる。被験物質をなんら与えない場合の測定結果を、転写調節活性に影響を与えない場合の対照とすることもできる。
あるいは予め目的とする作用を有することがわかっている物質を対照として、その物質よりもシグナルの変化が大きい物質を探索することによって、より大きな作用を有する物質を選択することもできる。
本発明の評価方法は、目的とする活性を有する化合物のスクリーニング方法や、化合物のキャラクタリゼーション等に利用することができる。たとえば、幅広い物質に対して本発明に基づく評価方法を実施し、目的とする活性に優れる化合物の選択を繰り返すことにより、スクリーニングを実施することができる。あるいは、前記検出方法を利用して、特定の化合物の特性を解析することもできる。
更に本発明は、次の工程を含む、被験物質が核内受容体に結合する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法に関する。
（Ａ）配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）核内受容体と共存するとき、当該核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（Ｃ）に記載の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ該５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失した塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体、そのリガンド、および被験物質を、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、
ｉ）核内受容体と被験物質を接触後にリガンドを接触させる、
ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とリガンドを接触させる、または
ｉｉｉ）核内受容体とリガンドを接触後に被験物質を接触させる
（２）核内受容体と結合したリガンドまたは被験物質の量を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体に結合する活性を検出する工程
先に述べた転写調節活性におよぼす影響の検出方法が細胞内における挙動を指標としているのに対して、この方法では物質間の相互作用に基づいて核内受容体に結合する活性を見出している。本発明による被験物質の核内受容体に対する結合活性を検出する方法において、核内受容体とは、本発明において見出されたＥＲＲγ３、またはＥＲＲγ３と機能的に同等な蛋白質が用いられる。これらの核内受容体に対する結合活性は、リガンドとの競合を観察することにより検出される。
本発明において、前記核内受容体のリガントしては、たとえばエストロゲンレセプター関連レセプターに結合することが明らかな物質、リガンド、アゴニスト、あるいはアンタゴニストを用いることができる。ＥＲＲγ１やＥＲＲγ２に結合するリガンドとしては、ジエチルエストラジオール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ；ＤＥＳ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、あるいは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ｈｙｄｏｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ；４−ＯＨＴ）等を示すことができる。このうち、タモキシフェンは、ＥＲＲへの結合活性を有するが、その転写調節活性に対する影響は持たない。また４−ＯＨＴおよびＤＥＳは、ＥＲＲγ１やＥＲＲγ２に結合してその転写活性化作用を抑制する。したがって、これらのリガンドは、ＥＲＲγ１やＥＲＲγ２に対する不活化薬あるいはインヒビターと言える。
その他、ＥＲＲγ３に特異的なリガンドを用いることもできる。ＥＲＲγ３に特異的なリガンドは、レポータジーンアッセイや、物理化学的手法による直接的な核内受容体との結合の測定に基づいて見出すことができる。後者には放射活性標識リガンドとの結合競合阻害測定法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により結合を検出する方法、結合複合体を質量分析計（ＭＳ）で検出する方法等が存在する。
すなわち、リガンドの候補物質について、ＥＲＲγ３とその応答配列を有するレポータプラスミドで形質転換した細胞に与え、レポータ遺伝子の発現レベルを観察することにより、ＥＲＲγ３のリガンドであるかどうかを評価することができる。レポータジーンアッセイにおいて、レポータ遺伝子の発現レベルが、候補物質の濃度依存的に上昇すれば、その化合物はＥＲＲγ３のリガンドであると考えられる。
一方、物理化学的手法によってリガンドを探索するには、精製したＥＲＲγ３蛋白質に対するリガンド候補物質の結合作用を観察すれば良い。物質間の結合は、先に示した分析技術により、高感度に、しかも迅速に検出することができる。ＥＲＲγ３に結合する物質は、リガンドとして、あるいはアゴニストやアンタゴニストの候補として有用である。
本発明において、核内受容体、そのリガンド、および被験物質は、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させられる。まずｉ）核内受容体と被験物質を接触後にリガンドを接触させることにより、リガンドの核内受容体への結合を阻害する作用を評価することができる。次に、ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とリガンドを接触させることによって、核内受容体に対して被験物質がリガンドと競合する作用を評価することができる。更に、ｉｉｉ）核内受容体とリガンドを接触後に被験物質を接触させることによって、被験物質の核内状態に結合したリガンドを置換する作用を評価することができる。これらの方法によって見出される作用を有する化合物は、いずれもＥＲＲγ３のアゴニスト、あるいはアンタゴニストの候補化合物として有用である。
更に本発明の検出方法は、核内受容体と結合したリガンドまたは被験物質の量を測定する工程を含む。核内受容体への、リガンドまたは被験物質の結合量は、これらの物質を標識しておくことにより測定することができる。リガンド、あるいは被験物質は、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、酵素活性物質、あるいはタグによって標識することができる。核内受容体に結合したリガンドまたは被験物質を測定するには、核内受容体を反応液から分離し、分離された画分に含まれる標識を測定すれば良い。核内受容体を予め固相に結合させておくと、核内受容体を容易に反応液から分離することができる。固相には、磁性粒子や反応容器の内壁などが一般に用いられる。
本発明の検出方法では、核内受容体に結合したリガンド（または被験物質）の量が、被験物質の前記核内受容体に結合する活性と関連付けられる。本発明において、核内受容体に結合したリガンドの量が、被験物質を添加しない場合に比べて低下するとき、被験物質は核内受容体への結合活性を有していると判定される。あるいは、核内受容体に結合する被験化合物の量を測定する場合には、リガンドの存在しない状態における被験物質の結合量に比べて、リガンド存在下での結合量が低下する場合に、当該被験物質がリガンドとの結合阻害作用を有すると判断される。
本発明の結合活性の検出方法に基づいて、前記核内受容体に対する結合活性を有する化合物の評価方法が提供される。すなわち前記検出方法の結果、核内受容体への結合活性を測定し、対照と比較して結合活性が大きい物質を選択することにより、核内受容体に対する結合活性を有する物質をスクリーニングすることができる。本発明の評価方法によって得られる物質は、前記核内受容体に対する結合作用を有することから、前記核内受容体のアゴニスト、あるいはアンタゴニストとして作用する可能性が大きい。このような物質は、本発明の核内受容体ＥＲＲγ３の活性調節剤として有用である。
本発明の評価方法において、被験物質としては、前記転写調節活性を調節する作用の評価方法と同様の物質を用いることができる。また本発明の評価方法においては、被験物質を接触させない場合を対照とすることができる。あるいは、本発明の核内受容体への結合作用を有することが明らかな物質を対照として用いることにより、当該化合物よりも結合作用の大きい物質を探索することもできる。
本発明の評価方法により単離される化合物は、核内受容体の転写活性化作用を促進または阻害する化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）の候補となる。また、生体内において、核内受容体間、核内受容体とその応答配列間、核内受容体とコファクター間等の相互作用を促進または阻害する化合物の候補となる。これら化合物は、核内受容体が関連する疾患の予防や治療のための医薬品として応用が考えられる。
エストロゲンのシグナル伝達に関与するＥＲＲの転写調節活性の調節作用を有するＥＲＲγ３に対するアゴニスト、あるいはアンタゴニストは、エストロゲンのシグナル伝達の異常に起因する疾患の治療に有用である。たとえば、健常者に比べてＥＲＲγ３の発現レベルが低下している場合には、エストロゲンのシグナル伝達が不完全である可能性が疑われる。このような状態にある患者に、ＥＲＲγ３のアゴニストを投与することによって、エストロゲンのシグナル伝達を正常化することができる。あるいは逆にエストロゲンのシグナル伝達が亢進している状態にある患者には、ＥＲＲγ３に対してアンタゴニストとして作用する化合物を投与することにより、シグナル伝達を正常化することができる。
ＥＲの活性亢進を伴う疾患として、子宮癌や乳癌を挙げられる。したがって、本発明によって得ることができるＥＲＲγ３に対するアンタゴニストは、これらの疾患の治療に有用である。またＥＲの活性低下が見られる疾患としては、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、全身性エリテマトーデス、あるいはアルツハイマー病を示すことができる。したがって、本発明によって得られるＥＲＲγ３に対するアゴニストは、これらの疾患の治療に有用である。
本発明のキットには更に細胞の培養のための培地、および培養容器をパッケージすることができる。培養容器は、ハイスループットスクリーニングに適用できる形状とするのが有利である。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアル、核内受容体の転写調節活性に対する影響の大きさが予め確認されている物質を対照として組み合せることもできる。
本発明による任意の核内受容体と、この核内受容体の転写活性化作用を増強する核内受容体との複合体の転写調節活性を調節する活性を評価する方法に必要な要素は、キットとすることができる。本発明のキットは、たとえば、任意の核内受容体をコードするポリヌクレオチドおよび下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現し、かつこの細胞において、前記任意の核内受容体の応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現しうる細胞を含む。
（Ａ）配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）核内受容体と共存するとき、当該核内受容体の転写活性化作用を調節する、および
（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠損している
（Ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（Ｃ）に記載の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、５９９−７１５に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ該５９９−７１５に相当する塩基配列を欠失した塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
任意の核内受容体をコードするポリヌクレオチドと（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドとは、いずれか一方のみをキットの構成要素とし、他方はキットの使用者が自由に組み合せられるようにすることもできる。そのために、核内受容体の発現用ベクターをキットの構成要素とすることができる。任意の核内受容体を使用者が選択する場合には、レポータベクターをキットにパッケージして、使用者自身が核内受容体に応じた応答配列をレポータプラスミドとして構築できるようにすることもできる。
あるいは本発明の核内受容体ＥＲＲγ３に結合する活性を評価する方法に必要な要素は、キットとすることができる。本発明のキットは、たとえば、本発明の核内受容体ＥＲＲγ３（またはその機能的に同等な蛋白質）、および標識リガンドを含む。本発明の核内受容体ＥＲＲγ３（またはその機能的に同等な蛋白質）は、予め固相化しておくこともできる。本発明のキットには、本発明の核内受容体ＥＲＲγ３（またはその機能的に同等な蛋白質）に対する結合活性を有することが明らかな物質を陽性対照として添付することができる。更に、標識成分を測定するために必要な付加的な成分を組み合せることもできる。
更に本発明は、本発明の評価方法によって得ることができる物質の医薬用途に関する。すなわち本発明は、前記評価方法によって選択される化合物の、核内受容体の転写調節活性制御における使用に関する。あるいは本発明は、これらの化合物を有効成分として含有することを特徴とする、核内受容体の異常に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。加えて本発明は、本発明による評価方法によって選択される化合物を投与する工程を含む、核内受容体の転写調節活性の制御方法に関する。あるいは本発明は、本発明による評価方法によって選択される化合物の核内受容体の活性調節剤の製造における使用に関する。
本発明において核内受容体の異常に特徴付けられる疾患とは、核内受容体の発現レベルや活性の亢進や低下によってもたらされる疾患を意味する。このような疾患としては、たとえば乳癌、子宮癌、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、および注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）などを示すことができる。
更に本発明は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を有効成分として含有する、核内受容体の活性調節剤に関する。加えて本発明は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を投与する工程を含む、核内受容体の活性調節方法に関する。あるいは本発明は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の核内受容体の活性調節剤の製造における使用に関する。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
また本発明は、下記の成分（１）〜（４）のいずれかを有効成分として含有する、核内受容体の活性抑制剤に関する。加えて本発明は、下記の成分（１）〜（４）のいずれかを投与する工程を含む核内受容体の活性抑制方法に関する。あるいは本発明は、下記の（１）〜（４）のいずれかの成分の核内受容体の活性抑制剤の製造における使用に関する。
（１）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（２）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体、および
（３）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質
（４）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドの部分配列に対応するセンスＲＮＡおよびそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ
本発明の核内受容体の活性調節剤または活性抑制剤は、核内受容体の転写活性化作用の抑制、または亢進よって特徴付けられる疾患の治療に用いられる。
本発明の蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体、ドミナントネガティブの形質を有する蛋白質、および本発明の評価方法により単離される物質は、核内受容体の転写調節活性を調節するために有用である。また、本発明においてこれらを医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等、当業者に公知の方法により行い得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することができる。また、該化合物がＤＮＡによりコードされ得るものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
投与量や投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動する。当業者であれば、必要に応じて投与量や投与方法を適宜選択することができる。
さらに本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、核内受容体の活性が調節されたモデル動物に関する。
（Ａ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（Ｂ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質、および
（Ｄ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質
たとえば上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの蛋白質を過剰発現させたトランスジェニック動物は、核内受容体の転写活性化作用が亢進した疾患を誘導するモデル動物として、有用である。核内受容体の転写活性化作用が亢進した疾患としては、乳癌や子宮癌、あるいは注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を示すことができる。したがって、本発明のモデル動物は、これらの疾患に対する治療薬の評価に用いることができる。
更に本発明は、被検者から採取された生体試料における下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、核内受容体の活性の異常に起因する疾患と関連付ける工程を含む、核内受容体の活性の異常に起因する疾患の診断方法に関する。
（Ａ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に記載の塩基配列と８０％以上のホモロジーを有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
これらポリヌクレオチドの発現レベルは、ｍＲＮＡの定量、あるいは翻訳産物である蛋白質の定量、さらには蛋白質の活性などを指標として測定することができる。ｍＲＮＡや蛋白質の測定方法は公知である。たとえば被検者の疾患標的臓器よりバイオプシーにより細胞を採取し、通常の方法によりＲＮＡ画分を調製した後、ＥＲＲγ３特異的配列をプライマーに使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、疾患標的臓器におけるＥＲＲγ３の発現レベルを測定することができる。
また上記ポリヌクレオチド（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、いずれも任意の核内受容体に対して、その転写活性化作用を増強する作用を有する。したがって、この作用を指標として、これらの蛋白質の活性に基づいて、その発現レベルを知ることもできる。
得られた測定値を健常者と比較し、有意な差が見られた場合には、核内受容体による転写調節活性の異常が疑われる。あるいは、ＥＲＲγ３の遺伝子の変異や多型を指標として、ＥＲＲγ３の活性の異常に起因する疾患の診断が可能である。たとえば、乳癌、子宮癌はＥＲの機能亢進、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病はＥＲの機能低下が原因と考えられる。また注意欠陥多動性障害は、ＴＲの機能亢進が原因と考えられる。ＥＲＲγ３は、ＥＲあるいはＴＲの活性の増強作用を有する。したがって機能亢進に起因する疾患は、ＥＲＲγ３の活性増強につながる遺伝子変異を有する可能性がある。逆に機能低下に起因する疾患では、ＥＲＲγ３の活性低下の原因となる遺伝子変異を有する可能性が存在する。ＥＲＲγ３に関するＳＮＰｓ等の遺伝子変異と上記の疾患感受性との相関が証明されれば、被検者の血液を採取し、ＥＲＲγ３遺伝子内の変異を測定する手法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等）により変異を同定し疾患発症の予測あるいは発症機序の解明に利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されない。また本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例１  オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）ｍＲＮＡ抽出
ヒト全脳（Ｂｒａｉｎ，ｗｈｏｌｅ）組織より全ＲＮＡとして抽出されたｍＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ＃６４０２０−１）を購入した。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
ＲＮＡよりオリゴキャプ法［Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１−１７４（１９９４）］を改良した方法（ＷＯ  ０１／０４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：７）およびＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：８）を用いて、ＷＯ  ０１／０４２８６に記載したようにＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’（配列番号：９）と３’（配列番号：１０）のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩ切断した。次いで、通常は２ｋｂ以上（場合によっては３ｋｂ以上）に分画したｃＤＮＡ断片をＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（図１）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃＤＮＡライブラリー（ＢＲＡＷＨ）を作製した。
オリゴキャップ法を改良した方法で作製した高全長率ｃＤＮＡライブラリー（既知ｍＲＮＡのタンパク質コード領域を指標にして算出した各ｃＤＮＡライブラリーの５’端の全長率は平均９０％）は、真核細胞での発現が可能な発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を用いて作製した。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３にはクローニング部位の上流にＳＲαプロモーターとＳＶ４０ｓｍａｌｌ  ｔイントロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０ポリＡ付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩサイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化したｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞などに導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物である蛋白質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
実施例２  ｃＤＮＡクローン末端配列解析と全長塩基配列解析クローンの選択
ｃＤＮＡライブラリーより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｅｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７００，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析した。得られたデータについてはデータベース化を行った。
解析されたｃＤＮＡクローンの５’末端配列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓの表記があるデータを対象にしたＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、ヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させた。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択し、選択されたクローンについては必要に応じ３’末端配列を５’末端配列と同様の方法で解析取得した。取得された末端配列のデータを解析し、５’末端と３’末端の配列でコンティグを作るクローンは除いた。更に再度前記と同様にＢＬＡＳＴによる相同性検索によりヒトのｍＲＮＡ配列（特許化または特許出願された配列を含む）に同一なものは除いた。こうして選択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローンを得た。
実施例３  全長塩基配列解析
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて各々全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は、主にカスタム合成ＤＮＡプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成ＤＮＡプライマーを用い、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のＤＮＡシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を解析した。一部のクローンについては、Ｌｉｃｏｒ社製ＤＮＡシーケンサーも利用した。
また、一部のクローンについてはカスタムプライマーを用いずｃＤＮＡが含まれるプラスミドをランダムに切断するショットガン法を用いて同様にＤＮＡシーケンサーでＤＮＡ塩基配列を決定した。全長塩基配列は上記方法により決定された部分塩基配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。
次に、決定された全長塩基配列から、蛋白質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。こうして決定された塩基配列のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索を行い、核内受容体ＥＲＲγと高い相同性を示すクローンＣ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０を見出した。
実施例４  ＜ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの塩基配列の配列解析及びＥＲＲγ既知ｉｓｏｆｏｒｍ  ｃＤＮＡ配列との比較＞
ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの３３６２塩基配列（図２−図６；配列番号：１）についてＤＮＡ配列解析ソフトｂｉｏＳＣＯＵＴ（Ｌｉｏｎ社）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ由来データベースに対して配列相同性検索及び機能モチーフ検索を行った。更に文献情報を基に既報告のＥＲＲγアイソフォームの配列と比較検討した（図７−図１０）。
ＥＲＲγ３は３９６アミノ酸残基の蛋白質をコードする１１８８塩基長（６８４−１８７４）の領域を有し、本蛋白質には核内受容体ファミリーに共通するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）が存在した。本ｃＤＮＡと最も高い相同性を示したのがＥＲＲγの２種のアイソフォームＥＲＲγ１（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）とＥＲＲγ２（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）であった。夫々のコードする蛋白質のアミノ酸配列を比較したところ、Ｎ末配列に関してＥＲＲγ２よりもＥＲＲγ３は２３アミノ酸残基長短く、またＥＲＲγ１、ＥＲＲγ２に共通して、ＥＲＲγ３はＤＢＤ領域に関して３９アミノ酸残基に相当する欠失が認められた。本欠失はＤＢＤに存在する２個のｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ構造の中、下流に存在するものに相当する（図１３）。
実施例５  ＜ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡのヒト染色体へのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏマッピング＞
ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡ塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ及びＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅヒトゲノム配列データベース由来配列に対してＢＬＡＳＴ検索を行った。５’端及び３’端の短い配列が未ヒットであることを除いてｃＤＮＡ配列がヒト第一染色体ｑ４１部位の複数クローンの配列と一致し、エクソン配列を同定することができた（図１３）。
その結果、ＥＲＲγ３遺伝子は少なくとも９個のエクソンから構成されていることを明らかにした。更に１）本エクソン配列で一義的に決まる各イントロン配列について境界配列がＧＴ−ＡＴルールを満足していること、２）ＤＢＤ領域に相当する塩基配列の欠失が既知アイソフォームＥＲＲγ２の一つのエクソンに完全に一致することから、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの既知アイソフォームとの相違が人為的な結果でないことを明確に示すことができた。
実施例６  ＜ＥＲＲγ３のヒト各種組織中発現の評価＞
ＥＲＲγ３及びＥＲＲγ２の組織発現分布を、市販ヒト組織由来ｃＤＮＡを鋳型にし、各アイソフォーム特異的プライマーセットを使用してＰＣＲ法により測定した。ＰＣＲ反応液組成は２０μｌの容量中に鋳型としてヒト心臓、腎臓、肝臓、脾臓、脳あるいは骨格筋ｃＤＮＡ各１μｇ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １．６μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）１μｌ、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）１μｌ、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー１μｌ、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー１μｌ、滅菌水１１．４μｌとした。
使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
ＥＲＲγ３の増幅用：
2003080831.tif 000003
ＥＲＲγ２の増幅用：
2003080831.tif 000004
ＰＣＲ増幅は９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分を１サイクルとし、３５回実施した。同時に、各組識について同一条件にて、ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅとして知られているｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）についてのＰＣＲを行い、発現の対照とした。ＥＲＲγ２は心臓、腎臓、脾臓、骨格筋、胎盤、前立腺における発現が認められたが、ＥＲＲγ３の発現は骨格筋、前立腺、脂肪細胞と限定的であった（図１４）。
実施例７  ＜ＥＲＲγ３の転写調節活性評価のためのレポータジーンアッセイ系の構築＞
ＥＲＲγ３の転写調節活性評価のためのレポータジーンアッセイ系を構築するために、ＥＲＥ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を組み込んだレポータプラスミド、ＥＲＲγ３及びＥＲＲγ２の発現プラスミドを以下の通り作製した。レポータジーンアッセイは、培養細胞にレポータプラスミド及び発現プラスミドをリポフェクション法により導入し一定時間培養後、細胞溶解液にて処理し、溶解液をデュアルルシフェラーゼ法によりルミノメーターを使用してレポータ活性を測定した。
ＥＲＥレポータプラスミドはルシフェラーゼを使用するレポータベクターＰＧＶＰ２（和光純薬工業製造）のＢｇｌＩＩ部位にＥＲＥ配列に対応する合成ＤＮＡをタンデムに複数個挿入することにより作製した。ＥＲＥ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ応答配列）に対応する２１ｍｅｒの互いに相補的な合成ＤＮＡ（５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＡ−３’／配列番号：１５，５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＡ−３’／配列番号：１６）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’端のリン酸化を行った後、各相補鎖を等量混合し、６５℃、１５分にて加熱変性後徐冷により、アニーリングを行い、挿込ＤＮＡ断片を調製した。本断片を制限酵素ＢｇｌＩＩにより切断されたＰＧＶＰ２と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの形質転換に供した。
市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピタント（東洋紡）を使用して定法により形質転換を行い、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。得られた形質転換体についてコロニーＰＣＲにより、組換えプラスミド中の挿入断片の有無、サイズを確認し、複数個が挿入されているクローンについて更に塩基配列の確認を行い、挿入応答配列の個数、正逆の向きを確認した。その中で応答配列が４個タンデムに挿入されたクローンをレポータプラスミドとした。
ＥＲＲγ３及びＥＲＲγ２の発現プラスミドは発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニング部位にコーディング領域を含む配列を挿入して作製した。挿入断片はＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）についてはｐＭＥ１８ＳＦＬ３−Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０を鋳型にして、対照となるＥＲＲγ２についてはヒト骨格筋由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ増幅法により調製した。ＰＣＲに使用したプライマーは次のとおりである。
ＥＲＲγ３用：
2003080831.tif 000005
ＥＲＲγ２用：
2003080831.tif 000006
ＰＣＲ増幅条件は９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分の１サイクルを３５回実施した。得られた挿入断片及び発現ベクター夫々について制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより切断し、各切断断片をアガロース電気泳動にて分離精製後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。本反応液によりＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン耐性により形質転換体を取得した。得られた形質転換体についてコロニーＰＣＲにより組換えプラスミド中の挿入断片を確認し、更に塩基配列決定により配列を確認した。ＰＣＲ由来の塩基置換が存在したので、これを消去するために、変異を含む制限酵素断片を他のクローン由来の変異の無い断片と差代える組換え実験を追加した。
上述の通り取得したレポータプラスミド及び発現プラスミドについて、各プラスミド保有株を大量培養して、市販のプラスミドＤＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりＤＮＡを調製し、レポータジーンアッセイに供した。
実施例８  ＜ＥＲＲγ３の転写調節活性及びＥＲＲγ２に対する転写調節作用＞
ＥＲＲγ３の転写調節活性をレポータジーンアッセイを使用して評価した。ＥＲＲγ３単独の転写調節活性及びＥＲＲγ３のＥＲＲγ２転写調節活性に対する調節作用をＥＲＲγ３の転写調節活性を対照に検討した。また、ＥＲＲγ２に対する４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ）の阻害活性が知られているので、夫々の転写調節活性について４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎに対する応答性も評価した（図１５）。
レポータジーンアッセイはＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）を宿主に使用し、ルシフェラーゼレポータプラスミドおよびＥＲＲγ３発現プラスミド、ＥＲＲγ２発現プラスミドあるいは両発現プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行い、さらに細胞を各種濃度（０，１０−１０−１０−５Ｍ）の４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより実施した。
形質転換は下記の通り行った。ＣＶ−１細胞を１０％牛胎児血清、２０００Ｕ／ｌペニシリンＧ、１００ｍｇ／ｌストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／２．５ｍｌの濃度になるように懸濁し、２．５ｍｌ６ウェルプレートにまき、ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で１８〜２４時間培養を行った。転写因子発現プラスミド、ルシフェラーゼレポータプラスミドおよび測定値補正用ルシフェラーゼレポータプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）各１μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）で全量１５０μｌになるように溶解し、細胞形質転換用試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）７μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ１４３μｌに希釈した液に対し、混合液を攪拌しながら滴下し、２０分放置した。
ＰＢＳ（−）１ｍｌで２回洗浄した細胞に本ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ−ＤＮＡ混合液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ１．５ｍｌに希釈した後、添加し４時間培養した。形質転換液を除き、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ２００μｌを添加し、３７℃で５分保温した。ＤＭＥＭ培地１ｍｌを加え、細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、１０００ｒｐｍ、３分間遠心した。遠心後、１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度になるように再度ＤＭＥＭ培地に懸濁し、１００μｌを９６ウェルプレートにまいた。薬剤を評価する場合、予め終濃度の１０００倍希釈濃度薬剤ＤＭＳＯ溶解液を培地で希釈して２倍濃度薬液とし、薬液５０μｌに１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μｌの細胞を懸濁液５０μｌを添加した。ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で２４時間培養を行った。
ルシフェラーゼ活性測定試薬としてＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。９６ウェルプレート各ウェルの上清を除き、ＰＢＳ（−）１００μｌで１回洗浄し、×１  ＰＬＢ（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）２０μｌ加え、１５分間室温放置後、測定時まで−２０℃のフリーザーに保存した。ルミノメーターとしてＡＲＶＯＴＭＨＴＳ１４２０マルチラベルカウンタ（Ｗａｌｌａｃ社）を使用した。測定プロトコールは１ウェルにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＲｅａｇｅｎｔＩＩ  ５０μｌ添加、０．３秒振とう、１秒測定、Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏＴＭＲｅａｇｅｎｔ  ５０μｌ添加、０．３秒振とう、１秒測定である。得られたｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼの測定値は内部対照としてのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの測定値で除することにより補正した。例数３で平均値および標準誤差を算出した。
ＥＲＲγ３は単独では、そのＤＮＡ結合ドメインの欠失から予想されるように転写調節活性を有さなかったが、ＥＲＲγ２と共存下でＥＲＲγ２の転写活性化作用を顕著に（５３−６８％）増強する作用を有することを明らかにした。また本増強作用は高濃度の（１０−６Ｍ以上）４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎにより消失した。
実施例９  ＜ＥＲＲγ３のＥＲα、ＥＲβ及びＴＲに対する転写調節作用＞
ＥＲＲγ３の他の核内受容体に対する転写調節活性調節作用がＥＲＲγ２以外にも存在するか否かを確認するために、ＥＲＲγに類縁の核内受容体ＥＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）α、ＥＲβ及びＴＲ（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対するＥＲＲγ３の転写調節活性調節作用をレポータジーンアッセイにより評価した。レポータジーンアッセイの詳細は、ＥＲα、ＥＲβ及びＴＲの発現プラスミドを使用する以外は実施例８と同様である。また、細胞を薬剤に接触させる際に４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ以外に、ＥＲα、ＥＲβに関する実験では１０−５Ｍ（Ｒ）−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ、ＴＲに関する実験では１０−５Ｍ  ｔｈｙｒｏｘｉｎｅを接触させた。
ＥＲＲγ３はＥＲα、ＥＲβ及びＴＲの転写調節活性を夫々のリガンド存在下で顕著に増強する作用を有することを明らかにした。ＥＲαに対しては１３−７４％（図１６）、ＥＲβに対しては６００−６５０％（図１７）、そしてＴＲに対しては１２８−２２９％（図１８）の増強作用が認められた。またＥＲβ及びＴＲに対する増強作用に対しては、４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎは影響を示さなかったが、ＥＲＲγ３のＥＲαに対する増強作用はリガンド存在下、４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎの濃度依存的に増大した。ＥＲＲγ２は、図２１に示すようにＥＲα等のＤＢＬを有する他の核内受容体と複合体を形成し、その転写活性化作用を増強する作用を有することが裏付けられた。
実施例１０  ＜ＥＲαに対する転写調節作用に関するＥＲＲγ３とＥＲＲγ２の比較＞
ＥＲＲγ３のＥＲα転写活性化作用の増強作用に対するＥＲαリガンド（Ｒ）−ｅｓｔｒａｄｉｏｌの影響及び、ＥＲＲγ２にＥＲＲγ３と同様の転写調節作用が存在するか否かをレポータジーンアッセイにより評価した（図１９−図２０）。レポータジーンアッセイの詳細は、実施例８と同様である。形質転換細胞を（Ｒ）−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ非存在下あるいは１０−７Ｍ  β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ存在下で、各種濃度４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎと接触させた。４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ非存在下、β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ非存在で６４％、１０−７Ｍ  β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ存在で１８％のＥＲαの転写活性化作用の増強作用をＥＲＲγ３は有することを明らかにした。ＥＲＲγ３の転写増強作用に対する４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎの影響はβ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌの濃度に依存して変化することが示された。本実験で検討したβ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌの濃度では、４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎの高濃度でＥＲＲγ３の転写増強作用は消失した。また、ＥＲＲγ２をＥＲαと共存させるとＥＲＲγ３と同様の挙動で転写増強作用を示すことを明らかにした。本知見は本実施例で始めて示したものである。
実施例１１  ＜ＥＲＲγ３のＲＡＲα転写誘導活性に対する効果＞
ＥＲＲγ３のレチノイン酸受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＡＲ）転写活性化作用の増強作用に対するリガンド４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ及び５ｘ１０−８Ｍのおよびｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄの影響をレポータジーンアッセイにより評価した（図２２）。ＲＡＲは、サブファミリー１グループＢに分類される核内受容体である。
レポータージーンアッセイはＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）を宿主に使用し、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＰ２−ＲＡＲＥおよびＥＲＲγ３発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＥＲＲγ３、ＲＡＲα発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＲＡＲαあるいは両発現プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行い、さらに細胞を各種濃度（０，１０−１０−１０−５Ｍ）の４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ及び５ｘ１０−８Ｍのｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより実施した。
形質転換は下記の通り行った。ＣＶ−１細胞を１０％牛胎児血清，２０００Ｕ／ｌペニシリンＧ，１００ｍｇ／ｌストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／２．５ｍｌの濃度になるように懸濁し、２．５ｍｌ６ウェルプレートにまき、ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で１８〜２４時間培養を行った。転写因子発現プラスミド、ルシフェラーゼレポータープラスミドおよび測定値補正用ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）各１μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）で全量１５０μｌになるように溶解し、細胞形質転換用試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）７μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ１４３μｌに希釈した液に対し、混合液を攪拌しながら滴下し、２０分放置した。ＰＢＳ（−）１ｍｌで２回洗浄した細胞に本Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ−ＤＮＡ混合液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ１．５ｍｌに希釈した後、添加し４時間培養した。形質転換液を除き、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ２００μｌを添加し、３７℃で５分保温した。ＤＭＥＭ培地１ｍｌを加え、細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、１０００ｒｐｍ、３分間遠心した。遠心後、１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度になるように再度ＤＭＥＭ培地に懸濁し、１００μｌを９６ウェルプレートにまいた。薬剤を評価する場合、予め終濃度の１０００倍希釈濃度薬剤ＤＭＳＯ溶解液を培地で希釈して２倍濃度薬液とし、薬液５０μｌに１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μｌの細胞懸濁液５０μｌを添加した。ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で２４時間培養を行った。ルシフェラーゼ活性測定試薬としてＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。９６ウェルプレート各ウェルの上清を除き、ＰＢＳ（−）１００μｌで１回洗浄し、×１  ＰＬＢ（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）２０ｕｌ加え、１５分間室温放置後、測定時まで−２０℃のフリーザーに保存した。ルミノメーターとしてＡＲＶＯＴＭＨＴＳ１４２０マルチラベルカウンタ（Ｗａｌｌａｃ社）を使用した。測定プロトコールは１ウェルにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＲｅａｇｅｎｔＩＩ  ５０μｌ添加、０．３秒振盪、１秒測定、Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏＴＭＲｅａｇｅｎｔ５０μｌ添加、０．３秒振盪、１秒測定である。得られたｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼの測定値は内部対照としてのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの測定値で除することにより補正した。例数３で平均値および標準誤差を算出した。
ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ５ｘ１０−８Ｍ存在下でＲＡＲはＲＡＲＥ支配下の転写を誘導したが、このＲＡＲの転写誘導活性に対して、ＥＲＲγ３は有意な修飾作用を示さなかった（図２２）。
実施例１２  ＜ＥＲＲγ３のＶＤＲ転写誘導活性に対する効果＞
ＥＲＲγ３のビタミンＤ受容体（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＤＲ）転写活性化作用の増強作用に対するＶＤＲリガンドｃａｌｃｉｔｒｉｏｌの影響をレポータジーンアッセイにより評価した（図２３）。ＶＤＲは、サブファミリー１グループＩに分類される核内受容体である。
レポータージーンアッセイはＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）を宿主に使用し、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＰ２−ＶＤＲＥおよびＥＲＲγ３発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＥＲＲγ３、ＶＤＲ発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＶＤＲあるいは両発現プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行い、さらに細胞を各種濃度（０，１０−１０−１０−５Ｍ）の４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ及び５ｘ１０−８Ｍのｃａｌｃｉｔｒｉｏｌに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより実施した。実験法の詳細は実施例１１に記載の通りである。
ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ  ５ｘ１０−８Ｍ存在下でＶＤＲはＶＤＲＥ支配下の転写を誘導したが、このＲＡＲの転写誘導活性に対して、ＥＲＲγ３は有意な修飾作用を示さなかった（図２３）。
実施例１３  ＜ＥＲＲγ３のＰＰＡＲα，β，γ転写誘導活性に対する効果＞
ＥＲＲγ３のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＰＡＲ）α、β、またはγの転写活性化作用の増強作用に対するリガンドの影響をレポータジーンアッセイにより評価した（図２４）。リガンドには、４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎおよびｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ（ＰＰＡＲα）、ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎ、あるいはｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅを用いた。ＰＰＡＲα、β、およびγは、いずれもサブファミリー１グループＣに分類される核内受容体である。
レポータージーンアッセイはＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）を宿主に使用し、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＰ２−ＰＰＲＥ１およびＥＲＲγ３発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＥＲＲγ３、ＰＰＡＲα，β，γ発現プラスミドｐｃＤＮＡＩ−ｈＰＰＡＲα，ｐＣＤＭ８−ｈＰＰＡＲβ２、ｐＣＤＭ８−ｈＰＰＡＲγ１−３あるいはＥＲＲγ３及びＰＰＡＲ両発現プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行い、さらに細胞を各種濃度（０，１０−１０−１０−５Ｍ）の４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ及び１０−５Ｍのｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ（ＰＰＡＲα）、１０−５Ｍのｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎあるいは１０−６Ｍのｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより実施した。実験法の詳細は実施例１１に記載の通りである。
ｂｅｚｆｉｂｒａｔｅ１０−５Ｍ、ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎ１０−５Ｍ及びｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ１０−６Ｍ存在下で夫々、ＰＰＡＲα，β及びγはＰＰＲＥ支配下の転写を誘導したが（図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ，図２４Ｅ、および図２４Ｆ）、このＰＰＡＲの転写誘導活性に対して、ＥＲＲγ３は有意な修飾作用を示さなかった（図２４Ｂ，図２４Ｄ，図２４Ｆ）。
実施例１４  ＜ＥＲＲγ３のＧＲ転写誘導活性に対する抑制作用＞
ＥＲＲγ３のグルココルチコイド受容体（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＲ）転写活性化作用の増強作用に対するリガンド４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎおよびｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅの影響をレポータジーンアッセイにより評価した（図２５）。
レポータージーンアッセイはＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）を宿主に使用し、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＲＥ−ｌｕｃおよびＥＲＲγ３発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＥＲＲγ３、ＧＲ発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＧＲあるいは両発現プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行い、さらに細胞を各種濃度（０，１０−１０−１０−５Ｍ）の４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ及び１０−５Ｍのｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより実施した。実験法の詳細は実施例１１に記載の通りである。
ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ１０−５Ｍ存在下でＧＲはＧＲＥ支配下の転写を誘導したが（図２５Ａ、図２５Ｂ）、このＧＲの転写誘導活性に対して、ＥＲＲγ３は抑制作用を示した。更に４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎは１０−５ＭでＥＲＲγ３の抑制作用を解除することが明らかになった（図２５Ｂ）。
実施例１５  ＜マウスにおけるＥＲＲγ３の発現＞
ＥＲＲγ３のマウス組織発現分布を、市販マウス組織由来ｃＤＮＡを鋳型にし、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。マウスＥＲＲγ３の塩基配列はマウスＥＲＲγ２の塩基配列に基づいて予測した。マウスＥＲＲγ３配列に基づきＥＲＲγ３選択的なＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法のＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣ／配列番号：２１，ＣＧＡＣＣＴＣＣＡＣＧＣＡＣＴＣＴＧ／配列番号：２２）及びｐｒｏｂｅ（ＦＡＭ−ＡＧＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＧＴＣＴＴＧＡ−ＴＡＭＲＡ／配列番号：２３）を設計した。本ｐｒｏｂｅはＥＲＲγ２のｅｘｏｎ  Ｆ（ＥＲＲγ３では欠失しているｅｘｏｎ）の両端のスプライシング部位を跨るように設計しているので、ＥＲＲγ２とはｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎせず、ＥＲＲγ３のみを検出すると考えられる。ＰＣＲ反応液組成は５０μｌの容量中に鋳型として市販マウス各種組織（胚および肺）由来ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）夫々４０ｐｇ及び１０ｐｇ、１ｘＴａｑＭａｎ  ＥＺ  ｂｕｆｆｅｒ，３００μＭ  ｄＡＴＰ，３００μＭ  ｄＧＴＰ，３００μＭ  ｄＣＴＰ，６００μＭ  ｄＵＴＰ，２００ｎＭ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ，２００ｎＭ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ，１００ｎＭ  ｐｒｏｂｅ，５Ｕ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．５Ｕ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ，４ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２を含む。ＰＣＲ増幅は５０℃２分、６０℃３０分、９５℃５分処理後、９５℃２０秒、６５℃１分を１サイクルとし、ＥＲＲγ３の発現は胚（図２６Ａ）及び肺（図２６Ｂ）に認められた。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規な核内受容体ＥＲＲγ３が提供された。このＥＲＲγ３は、任意の核内受容体の転写活性化作用を増強する活性を有する蛋白質である。更に本発明は、既知蛋白質であるＥＲＲγ１およびＥＲＲγ２が、ＥＲＲγ３蛋白質と同様に他の核内受容体の転写活性化作用を増強する作用を有していることを明らかにした。
本発明によって見出された、これらの蛋白質による他の核内受容体に対する転写活性化作用の増強作用は新規な知見である。核内受容体の転写調節活性の制御は、シグナル伝達を通じて細胞の活動を制御することにつながる。このような考えかたに基づいて、これまでにも様々な核内受容体について機能解析が行われてきた。そして明らかにされた機能の制御によって、細胞の活動を制御する試みが続けられている。しかしこれらの試みの多くは、特定の核内受容体を標的として進められてきた。しかし本発明者らの研究によって、核内受容体の活性が単一の受容体のみならず、他の核内受容体分子との相互作用によってもコントロールされていることが明らかとなった。言いかえれば、核内受容体を標的として、シグナル伝達経路の制御を行うためには、特定の核内受容体に対する作用のみならず、その核内受容体の転写調節活性を調節しているほかの核内受容体との相互作用についても考慮する必要があることが明らかとなった。
本発明は、ＥＲＲγ３、あるいはＥＲＲγ１若しくはＥＲＲγ２の、他の核内受容体に対する転写活性化作用の増強作用を評価する方法を提供した。更に本発明は、この増強作用に与える被験物質の影響を評価する方法を提供した。本発明の評価方法に基づいて、ＥＲＲγ３、あるいはＥＲＲγ１若しくはＥＲＲγ２の、他の核内受容体に対する転写活性化作用の増強作用を調節する活性について、被験物質を評価することが可能となった。その結果、本発明に基づいて、前記転写活性化作用の増強作用を調節する作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物は、本発明によって明らかにされたＥＲＲγ３、あるいはＥＲＲγ１若しくはＥＲＲγ２の、他の核内受容体に対する転写活性化作用の増強作用を調節する化合物である。このような化合物は、細胞活動の制御において、新規な標的に作用する薬剤として有用である。
またＥＲＲγ３、あるいはＥＲＲγ１若しくはＥＲＲγ２のそのもの、あるいはこの蛋白質の活性や発現を調節することができる化合物についても、核内受容体の転写調節活性の異常に起因する疾患において、有用な治療剤となる。
ＥＲＲγ３、あるいはＥＲＲγ１若しくはＥＲＲγ２蛋白質は、核内受容体の異常によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。より具体的には、ＥＲＲγ１若しくはＥＲＲγ２の発現レベルや活性の調節によって、乳癌、子宮癌、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病（以上ＥＲ関連）、あるいは注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）等の疾患に対する治療効果を達成することができる。
更に本発明は、ＥＲＲγ３、あるいはＥＲＲγ１若しくはＥＲＲγ２をコードするポリヌクレオチドのアンチセンス、２本鎖ＲＮＡ、あるいはこれらの蛋白質に対するドミナントネガティブの形質を有する蛋白質を提供する。アンチセンスやドミナントネガティブの形質を有する蛋白質は、これらの核内受容体の転写調節活性の異常によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。より具体的には、これらのポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、疾病の原因となっているＥＲなどの核内受容体の転写調節活性の調節によって治療効果を達成することができる。
【配列表】
2003080831.tif 000007
2003080831.tif 000008
2003080831.tif 000009
2003080831.tif 000010
2003080831.tif 000011
2003080831.tif 000012
2003080831.tif 000013
2003080831.tif 000014
2003080831.tif 000015
2003080831.tif 000016
2003080831.tif 000017
2003080831.tif 000018
2003080831.tif 000019
2003080831.tif 000020
2003080831.tif 000021
2003080831.tif 000022
2003080831.tif 000023
2003080831.tif 000024
2003080831.tif 000025
2003080831.tif 000026
2003080831.tif 000027
2003080831.tif 000028
2003080831.tif 000029
2003080831.tif 000030
2003080831.tif 000031
2003080831.tif 000032
2003080831.tif 000033
2003080831.tif 000034
2003080831.tif 000035
2003080831.tif 000036
2003080831.tif 000037
2003080831.tif 000038
2003080831.tif 000039
2003080831.tif 000040
2003080831.tif 000041
2003080831.tif 000042
2003080831.tif 000043
2003080831.tif 000044
【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のベクターのマップ
図２は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列を示す。
図３は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列を示す。（図２の続き）
図４は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列を示す。（図３の続き）
図５は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの塩基配列を示す。（図４の続き）
図６は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）ｃＤＮＡの塩基配列を示す。（図５の続き）
図７は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）とＥＲＲγ２の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。上の列がＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）の塩基配列（３４７９ｂｐ）、下の列がＥＲＲγ２の塩基配列（２９８５ｂｐ）である。塩基が一致している部分を「＊」で示した。
図８は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）とＥＲＲγ２の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図７の続き）
図９は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）とＥＲＲγ２の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図８の続き）
図１０は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）とＥＲＲγ２の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図９の続き）
図１１は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）とＥＲＲγ２の、翻訳アミノ酸配列を比較した結果（上）を示す。アミノ酸配列の上の列がＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）のアミノ酸配列（３９６ａａ）、下の列がＥＲＲγ２のアミノ酸配列（４５８ａａ）を示す。「−」はアミノ酸の欠失を、また「＊」は両者の間でアミノ酸が一致したことを示す。
図１２は、ＥＲＲγ３におけるＺｉｎｃフィンガーの欠失を示す。ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）におけるＺｉｎｃフィンガーの欠失は細字で示した。
図１３は、ＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）とＥＲＲγ２の、ゲノム塩基配列に対する検索結果と、その結果に基づく予測エクソンを示す。ＢＲＡＷＨがＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）の予測エクソンを示す。斜線および横線を付けたのは、各アイソフォームに固有のエクソンである。
図１４は、骨格筋と脂肪細胞におけるＥＲＲγ３（Ｃ−ＢＲＡＷＨ２０１７２５０）／レーン４とＥＲＲγ２／レーン３の発現レベルを測定した結果を示す写真。レーン１は１００ｂｐラダー、レーン２はＧＡＰＤＨの結果を示す。
図１５は、ＥＲＲγ３単独の転写調節活性、およびＥＲＲγ３のＥＲＲγ２転写調節活性に対する調節作用を測定した結果を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図１６は、リガンド存在下における、ＥＲＲγ３によるＥＲαの転写活性化作用の増強作用を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図１７は、リガンド存在下における、ＥＲＲγ３によるＥＲβの転写活性化作用の増強作用を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図１８は、リガンド存在下における、ＥＲＲγ３によるＴＲの転写活性化作用の増強作用を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図１９は、βエストラジオール非存在下における、ＥＲＲγ３のＥＲα転写活性化作用の増強作用に対する４−ヒドロキシタモキシフェンの影響を示す図。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図２０は、βエストラジオール存在下における、ＥＲＲγ３のＥＲα転写活性化作用の増強作用に対する４−ヒドロキシタモキシフェンの影響を示す図。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図２１は、ＥＲＲγ３のＥＲαの転写活性化作用の増強作用を示す図。
図２２は、レチノイン酸存在下における、ＲＡＲの転写誘導活性に対するＥＲＲγ３の調節作用を示す図。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図２３は、カルシトリオール存在下における、ＶＤＲの転写誘導活性に対するＥＲＲγ３の調節作用を示す図。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図２４は、ベザフィブラート、カルバサイクリン、ロシグリタゾン存在下における、ＰＰＡＲα，βおよびγの転写誘導活性に対するＥＲＲγ３の調節作用を示す図。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図２５は、デキサメタゾン存在下における、ＥＲＲγ３によるＧＲの転写活性化作用の抑制作用を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸は４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す。
図２６は、ＥＲＲγ３のマウス組織発現分布をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法により測定した結果を示す図。
【図１】
2003080831.tif 000045
【図２】
2003080831.tif 000046
【図３】
2003080831.tif 000047
【図４】
2003080831.tif 000048
【図５】
2003080831.tif 000049
【図６】
2003080831.tif 000050
【図７】
2003080831.tif 000051
【図８】
2003080831.tif 000052
【図９】
2003080831.tif 000053
【図１０】
2003080831.tif 000054
【図１１】
2003080831.tif 000055
【図１２】
2003080831.tif 000056
【図１３】
2003080831.tif 000057
【図１４】
2003080831.tif 000058
【図１５】
2003080831.tif 000059
【図１６】
2003080831.tif 000060
【図１７】
2003080831.tif 000061
【図１８】
2003080831.tif 000062
【図１９】
2003080831.tif 000063
【図２０】
2003080831.tif 000064
【図２１】
2003080831.tif 000065
【図２２】
2003080831.tif 000066
【図２３】
2003080831.tif 000067
【図２４】
2003080831.tif 000068
【図２５】
2003080831.tif 000069
【図２６】
2003080831.tif 000070
【国際調査報告】
2003080831.tif 000071
2003080831.tif 000072
2003080831.tif 000073
2003080831.tif 000074
2003080831.tif 000075
2003080831.tif 000076
2003080831.tif 000077