(57)【要約】本発明は、高分子成型担体と、該高分子成型担体にグラフト鎖を介して共有結合的に担持された抗環境ホルモン類抗体よりなる、環境ホルモン類分離材に関する。本発明によれば、環境ホルモン類を選択的かつ効率的に分離することができる環境ホルモン類分離材、および環境ホルモン類を選択的かつ効率的に高倍率で濃縮やクリーンアップすることができる環境ホルモン類の濃縮方法およびクリーンアップ方法を提供することができる。
2003101611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子成型担体と、該高分子成型担体にグラフト鎖を介して共有結合的に担持された抗環境ホルモン類抗体よりなる、環境ホルモン類分離材。
【請求項２】
高分子成型担体が、平膜、中空糸膜、不織布、織布、繊維、または成型ビーズである、請求項１記載の分離材。
【請求項３】
高分子成型担体が、多孔性中空糸膜または不織布である、請求項２記載の分離材。
【請求項４】
高分子成型担体が多孔性中空糸膜である、請求項３記載の分離材。
【請求項５】
多孔性中空糸膜が、細孔の孔径が０．０５〜１００μｍであり、かつ空隙率が２０〜８０％である、請求項４記載の分離材。
【請求項６】
高分子成型担体が不織布である、請求項３記載の分離材。
【請求項７】
不織布が、目付が１０〜２００ｇ／ｍ２である、請求項６記載の分離材。
【請求項８】
グラフト率が１０〜３００％である、請求項１〜７のいずれかに記載の分離材。
【請求項９】
抗環境ホルモン類抗体がポリクローナル抗体または組換え抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の分離材。
【請求項１０】
環境ホルモン類が、アルキルフェノール類、アルキルフェノールエトキシレート類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール類、女性ホルモン類、男性ホルモン類または甲状腺ホルモン類である、請求項１〜９のいずれかに記載の分離材。
【請求項１１】
（１）環境ホルモン類を含有する検体を請求項１〜１０のいずれかに記載の分離材に接触させることにより、該環境ホルモン類を抗環境ホルモン類抗体に捕捉させる工程と、
（２）該抗環境ホルモン類抗体に捕捉された該環境ホルモン類を解離させて回収する工程
を含む、環境ホルモン類の濃縮方法。
【請求項１２】
環境ホルモン類が、アルキルフェノール類、アルキルフェノールエトキシレート類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール類、女性ホルモン類、男性ホルモン類または甲状腺ホルモン類である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
環境ホルモン類を含有する検体を請求項１〜１０のいずれかに記載の分離材に接触させることにより、該環境ホルモン類を抗環境ホルモン類抗体に捕捉させることを含む、環境ホルモン類のクリーンアップ方法。
【請求項１４】
環境ホルモン類が、アルキルフェノール類、アルキルフェノールエトキシレート類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール類、女性ホルモン類、男性ホルモン類または甲状腺ホルモン類である、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、環境ホルモン類の分離材、濃縮方法およびクリーンアップ（分離除去）方法に関する。
背景技術
環境ホルモン類は、「内分泌攪乱物質」または「内分泌攪乱化学物質」とも称され、近年、それによる環境汚染が問題となっている。そこで、環境中の環境ホルモン類やその分解物を測定、分析して、その結果を環境保全に役立たせることが必要となる。
このような環境ホルモン類（その分解物も含む）を測定、分析する方法としては、従来から種々の方法が知られている。例えば、上水、河川水、湖沼水または下水中の環境ホルモン類を定量測定するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ガスクロマトグラフィー−高分解能マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＨＲＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−高分解能マススペクトロメトリー（ＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ）などがある。
また、環境ホルモン類は極微量しか存在しないことから、それらの物質を定量するには、それらの物質を高倍率で濃縮することが必要であり、また、選択的かつ効率的にクリーンアップすることが困難であった。しかしながら、従来の溶媒抽出法、固相抽出法等では夾雑物が多いために濃縮倍率をある程度以上にはすることが出来ず、また、活性炭などの吸着剤を用いる従来のクリーンアップ方法では選択的かつ効率的にクリーンアップすることは出来なかった。これに対し、抗体を利用する濃縮方法およびクリーンアップ方法は、抗原抗体反応を利用するためそのような問題がない。
しかしながら、これまで環境ホルモン類を選択的かつ効率的に分離することができる分離材は得られておらず、また、環境ホルモン類を選択的かつ効率的に高倍率で濃縮できる免疫学的濃縮法やクリーンアップする方法は未だ確立されていない。
発明の開示
本発明の目的は、環境ホルモン類を選択的かつ効率的に分離することができる環境ホルモン類分離材、ならびに環境ホルモン類を選択的かつ効率的に高倍率で濃縮やクリーンアップすることができる環境ホルモン類の濃縮およびクリーンアップ方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、高分子成型担体に環境ホルモン類に対する抗体を担持した分離材によって環境ホルモン類を選択的かつ効率的に分離することができることを見出し、さらに、該分離材を用いることによって、環境ホルモン類を選択的かつ効率的に高倍率で濃縮やクリーンアップすることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕  高分子成型担体と、該高分子成型担体にグラフト鎖を介して共有結合的に担持された抗環境ホルモン類抗体よりなる、環境ホルモン類分離材。
〔２〕  高分子成型担体が、平膜、中空糸膜、不織布、織布、繊維、または成型ビーズである、上記〔１〕記載の分離材。
〔３〕  高分子成型担体が、多孔性中空糸膜または不織布である、上記〔２〕記載の分離材。
〔４〕  高分子成型担体が多孔性中空糸膜である、上記〔３〕記載の分離材。
〔５〕  多孔性中空糸膜が、細孔の孔径が０．０５〜１００μｍであり、かつ空隙率が２０〜８０％である、上記〔４〕記載の分離材。
〔６〕  高分子成型担体が不織布である、上記〔３〕記載の分離材。
〔７〕  不織布が、目付が１０〜２００ｇ／ｍ２である、上記〔６〕記載の分離材。
〔８〕  グラフト率が１０〜３００％である、上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の分離材。
〔９〕  抗環境ホルモン類抗体がポリクローナル抗体または組換え抗体である、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の分離材。
〔１０〕  環境ホルモン類が、アルキルフェノール類、アルキルフェノールエトキシレート類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール類、女性ホルモン類、男性ホルモン類または甲状腺ホルモン類である、上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の分離材。
〔１１〕  （１）環境ホルモン類を含有する検体を上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の分離材に接触させることにより、該環境ホルモン類を抗環境ホルモン類抗体に捕捉させる工程と、
（２）該抗環境ホルモン類抗体に捕捉された該環境ホルモン類を解離させて回収する工程
を含む、環境ホルモン類の濃縮方法。
〔１２〕  環境ホルモン類が、アルキルフェノール類、アルキルフェノールエトキシレート類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール類、女性ホルモン類、男性ホルモン類または甲状腺ホルモン類である、上記〔１１〕記載の方法。
〔１３〕  環境ホルモン類を含有する検体を上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の分離材に接触させることにより、該環境ホルモン類を抗環境ホルモン類抗体に捕捉させることを含む、環境ホルモン類のクリーンアップ方法。
〔１４〕  環境ホルモン類が、アルキルフェノール類、アルキルフェノールエトキシレート類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール類、女性ホルモン類、男性ホルモン類または甲状腺ホルモン類である、上記〔１３〕記載の方法。
発明の詳細な説明
本発明の環境ホルモン類分離材は、高分子成型担体と、該高分子成型担体にグラフト鎖を介して共有結的に担持された抗環境ホルモン類抗体よりなるものである。
本発明における環境ホルモン類とは、動物の生体内に取り込まれた場合に、本来、その生体内で営まれている正常ホルモンの作用に影響を与え得る外因性の物質のことをいう。該環境ホルモン類としては、例えば、女性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、アルキルフェノールエトキシレート類、アルキルフェノール類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール類、その他の物質が挙げられる。また、これらの分解物も後述する抗環境ホルモン類抗体に吸着されるものである限り、本発明における環境ホルモン類に含まれる。
該女性ホルモン類としては、例えば、エストロゲン、エストラジオール（Ｅ２）、エストロン（Ｅ１）、エストリオール（Ｅ３）などが、該男性ホルモン類としては、例えば、アンドローゲン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオンなどが、該甲状腺ホルモン類としては、例えば、チロキシン（Ｔ３）、トリヨードチロニン（Ｔ４）などがそれぞれ挙げられ、また、これらの生体内代謝物である抱合体（例えば、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体など）もこれらに包含される。
該アルキルフェノールエトキシレート類（ＡＰＥ）としては、例えば、式（１）：
2003101611.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、各々、Ｈまたは炭素数１〜２０、好ましくは１〜１２の直鎖または分枝鎖（含ｓｅｃ−、ｔｅｒｔ−、ｉｓｏ−）アルキル、Ｒ４は、（ＯＣ２Ｈ４）ｍＯＨまたは（ＯＣ２Ｈ４）ｍＣＯＯＨ、ｍは、酸化エチレン鎖の平均数１〜７０、好ましくは１〜１５を意味する］で表されるアルキルフェノールエトキシレート類（ＡＰＥ）［例、ＮＰＥ（ノニルフェノールエトキシレート、例えば、ＮＰ２ＥＯ（平均酸化エチレン鎖数＝２）、ＮＰ５ＥＯ（平均酸化エチレン鎖数＝５）、ＮＰ１０ＥＯ（平均酸化エチレン鎖数＝１０）、ＮＰ１０ＥＣ（平均酸化エチレン鎖数＝１０、末端ＯＨ→カルボン酸）、ＯＰＥ（オクチルフェノールエトキシレート）など］などが挙げられる。
該アルキルフェノール類（ＡＰ）としては、例えば、式（２）：
2003101611.tif 000004
［式中、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、各々、Ｈまたは炭素数１〜２０、好ましくは１〜１２の直鎖または分枝鎖（含ｓｅｃ−、ｔｅｒｔ−、ｉｓｏ−）アルキルを意味する］で表されるアルキルフェノール類（ＡＰ）、［例、ＤＰ（４−ドデシルフェノール）、ＥＰ（４−エチルフェノール）、ＨＰ（ヘプチルフェノール）、ＩＰＰ（４−イソペンチルフェノール）、２−ＯＰ（２−オクチルフェノール）、４−ＮＰ（４−ノニルフェノール）、４−ＯＰ（４−オクチルフェノール）、４−ｓＢＰ（４−ｓｅｃ−ブチルフェノール）、４−ｔＢＰ（４−ｔ−ブチルフェノール）、４−ｔＰＰ（４−ｔ−ペンチルフェノール）、４−ｔＯＰ（４−ｔ−オクチルフェノール）など］などが挙げられる。
該樹脂成分類（ＰＲＣ）としては、例えば、式（３）：
2003101611.tif 000005
［式中、Ｒ９は、Ｃ、ＣＯまたはＳＯ２、Ｒ８およびＲ１０は、同一または異なって、各々、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）２ＯＨ、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、各々、存在せず、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨまたはＣ２Ｈ４ＣＯＯＨ、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、各々、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＣｌまたはＢｒを意味する］で表される樹脂成分類（ＰＲＣ）［例、ＢＰＡ（ビスフェノールＡ）、４，４’−ＥＢＰ（４，４’−エチリデンビスフェノール）、ＢＨＰＭ（ビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）メタン）、２，２’−ＢＨＰＰ（２，２’−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノール）、２，２’−ＢＭＨＰＰ（２，２’−ビス（ｍ−メチル−ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパン）、４，４’−ＢＨＰＰ（４，４’−ビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）ペンタン酸）、４，４’−ＤＤＭ（４，４’−ジアミノジフェニルメタン）、４，４’−ＤＤＥ（４，４’−ジヒドロキシジフェニルエーテル）、４，４’−ＤＯＨＤＳ（４，４’−ジヒドロキシジフェニルスルフォン）、４，４’−ＤＣｌＤＳ（４，４’−ジクロロジフェニルスルフォン）、ＢＨＥＤＢｒＰＳ（ビス［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３，５−ジブロモフェニル］スルフォン）、ＢＨＥＰＳ（ビス［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］スルフォン）、４，４’−ＤＤＥ（４，４’−ジヒドロキシデフェニルエーテル）、ｐ、ｐ’−ＤＢＰ（ｐ，ｐ’−ジヒドロキシベンゾフェノン）、ＨＢＰ（４−ヒドロキシビフェニール）など］などが挙げられる。
該樹脂可塑剤類（ＰＰ）としては、例えば、式（４）：
2003101611.tif 000006
［式中、Ｒ１７は、ｏ−フェニレンまたはテトラメチレン、Ｒ１８およびＲ１９は、同一または異なって、各々、Ｈ、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１２の直鎖または分枝鎖（含ｓｅｃ−、ｔｅｒｔ−、ｉｓｏ−）アルキル、ベンジルまたはシクロヘキシルを意味する］で表される樹脂可塑剤類［例、ＢＢＰ（フタル酸ブチルベンジル）、ＤＢＰ（フタル酸ジブチル）、ＤＣＨＰ（フタル酸ジシクロヘキシル）、ＤＥＰ（フタル酸ジエチル）、ＤＥＨＰ（フタル酸ジ（２−エチルヘキシル））、ＤＥＨＡ（アジピン酸ジエチルヘキシル）、ＤＨＰ（フタル酸ジヘキシル）、ＤＰＰ（フタル酸ジ−ｎ−ペンチル）、ＤＰｒＰ（フタル酸ジプロピル）など］などが挙げられる。
該クロロフェノール類（ＣＰ）としては、例えば、式（５）：
2003101611.tif 000007
［式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は、同一または異なって、各々、ＨまたはＣｌを意味する］で表されるクロロフェノール類（ＣＰ）［例、２−ＣＰ（２−クロロフェノール）、３−ＣＰ（３−クロロフェノール）、４−ＣＰ（４−クロロフェノール）、２，３−ＣＰ（２，３−ジクロロフェノール）、２，４−ＣＰ（２，４−ジクロロフェノール）、２，５−ＣＰ（２，５−ジクロロフェノール）、２，６−ＣＰ（２，６−ジクロロフェノール）、２，３，４−ＣＰ（２，３，４−トリクロロフェノール）、２，４，５−ＣＰ（２，４，５−トリクロロフェノール）、２，４，６−ＣＰ（２，４，６−トリクロロフェノール）、２，３，４，５−ＣＰ（２，３，４，５−テトラクロロフェノール）、２，３，４，６−ＣＰ（２，３，４，６−テトラクロロフェノール）、ＰＣＰ（ペンタクロロフェノール）など］などが挙げられる。
該その他の物質としては、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）を代表とするポリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＰＣＤＤ）、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（ＴＣＤＦ）を代表とするポリクロロジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリクロロビフェニル（ＰＣＢ）、ベンゾフェノン、ベンゾピラン、クロロベンゼン、ブロモナフトール、ニトロトルエン、トリブチル錫、各種農薬、重金属（例えば、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂなど）、合成エストロゲン（例、セントクロマン、エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ヘキセストール、２−ヒドロキシエストラジオール、タモキシフェン、ラロキシフェンなど）、食品、食品添加物（例えば、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、エコール、エンテロラクトン、フィトエストロゲン、クメストロール、ホルモノネチン、ダイゼイン、ビオチニンＡ、ゲステニンなど）などが挙げられる。
上記において、炭素数１〜２０の直鎖または分枝鎖アルキルの具体例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシルなどが挙げられる。前記の炭素数２〜１８のアルキルの具体例としては、上記の具体例においてメチル、ノナデシルおよびイコシル以外のものが挙げられる。
本発明における抗環境ホルモン類抗体とは、上記環境ホルモン類に対して特異的に結合する活性を有する蛋白質をいい、例えば、イムノグロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇ由来の組換え蛋白質などが挙げられる。該Ｉｇとしては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ヒト、ネコ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、シカ、カンガルーなどの哺乳動物、ニワトリ、七面鳥などの家禽類のものが好ましい。また、本発明においては、該抗環境ホルモン類抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および組換え抗体のいずれでもよく、本発明の分離材の使用目的により選択すればよい。
また、上記Ｉｇとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが挙げられるが、その部分でもよく、該部分としては例えばＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＩｇＧ（γ鎖）、ＩｇＧ（Ｆａｂ）、ＩｇＧ（Ｆｃ）、ＩｇＧ（Ｆａｂモノマー）、ＩｇＧ（Ｆｄ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＡ（α鎖）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ（μ鎖）、ＩｇＤ（δ鎖）、ＩｇＥ（ε鎖）、κ軽鎖、κ（フリー）鎖、λ軽鎖、λ（フリー）鎖などが挙げられる。
上記抗環境ホルモン類抗体であるＩｇの製造は、自体公知の方法、例えば、エンザイムイムノアッセイ、第４６頁〜７１頁および第８５頁〜１１０頁（Ｐ．ＴＩＪＳＳＥＮ著、石川栄治監訳、東京化学同人（１９８９））に記載される方法あるいはこれに準じる方法により行うことができる。これらの方法において、動物に、抗原である環境ホルモン類の誘導体とキャリヤー蛋白質との複合体を接種する際のキャリヤー蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと略す）、スカシ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略す）、牛チログロブリン（以下、ＢＴＧと略す）などが挙げられる。
環境ホルモン類の誘導体とキャリヤー蛋白質との複合体の形成は、例えば、式（６）：
2003101611.tif 000008
（式中、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＮＨ２またはＳＨを、Ａは、Ｒ基の離脱により、環境ホルモン類またはその類縁化合物となる基を示す。）で表される化合物を、自体公知の方法によりキャリヤー蛋白質に結合させることにより行うことができる。式（６）で表される化合物も、自体公知の方法で、適宜の原料に、カルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基を形成または導入することにより、化学的に合成できる。
例えば、ＲがＣＯＯＨで、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（６）で表される化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルと無水コハク酸を脱水縮合（ハーフエステル）することにより製造できる［キャンサー・バイオケミストリー・バイオフィジックス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．），７，１７５（１９８４）］。ＲがＮＨ２で、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（６）で表される化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チオニルにより塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），６０，２５４０（１９３８）］、アンモニアで処理することにより製造できる［オーガニック・ファンクショナル・グループ・プレパレーションズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ），第１巻，３８２頁］。
ＲがＳＨで、Ａがポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（６）で表される化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩化チオニルにより塩素化した後［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），６０，２５４０（１９３８）］、水硫化ナトリウムと反応させることにより製造できる［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），７２，１８４３（１９５０）］。
上記Ｉｇは、自体公知の方法、すなわち、上記Ｉｇがポリクローナル抗体である場合、環境ホルモン類の誘導体とキャリアー蛋白質との複合体で免疫した動物から得ることができる。また、上記Ｉｇがモノクローナル抗体である場合、環境ホルモン類の誘導体とキャリアー蛋白質との複合体で免疫した動物の脾細胞またはリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに産生させることにより得ることができる。
動物を免疫するには、環境ホルモン類または上記で得られた複合体を動物に接種する。接種する動物としては、例えば、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリなどが用いられるが、環境ホルモン類に対するポリクローナル抗体が所望の場合には、ニワトリ、ウサギが特に好ましく、モノクローナル抗体が所望の場合には、マウスが特に好ましく用いられる。接種方法としては、通常実施される方法でよく、例えば、マウスに１回に約１〜１００μｇ、好ましくは約５０〜１００μｇを等容量（０．１ｍｌ）の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバンドまたはＲＩＢＩアジュバンドシステムＴＭで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる。
ここでポリクローナル抗体を得る場合、接種された動物の血清や家禽類の卵から、採取すればよい。
また、モノクローナル抗体を得るには、さらに次の操作が行われる。
これらの免疫動物、例えば、マウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。
免疫する方法としては、既知のインビトロ免疫法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）やマウスフットパッド法（Ｍｏｕｓｅ  Ｆｏｏｔ  Ｐａｄ）などを使用すれば、より短期間で抗体価が上昇する。
融合操作は既知の方法に従って実施でき、融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）や、センダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくは、ＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓｐ２／Ｏなどが用いられ、特にＰ３Ｕ１が好ましい。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は約１：１〜１０：１で、これに分子量約１，０００〜６，０００のＰＥＧが約１０〜８０％の濃度で添加され、約２０〜３７℃、好ましくは約３０〜３７℃で約３〜１０分インキュベートするのがよい。
ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の産生、精製も自体公知の方法で行うことができる。得られたモノクローナル抗体は、環境ホルモン類のみならず、式（６）で表される化合物に対する抗体となる。
抗体の産生、精製方法の具体例としては、例えば、前記「エンザイム・イムノアッセイ」第４６〜７１頁、第８５〜１１０頁に記載され、塩折（Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４）、イオン交換体（ＤＥＡＥ、ＱＡＥ、ＣＭ／ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｅｒｖａｃｅｌなど）、疎水クロマトグラフィー（Ｌ−フェニルアラニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなど）、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２００、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−３００など）、電気泳動（アガロースゲルによるゾーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動など）、超遠心（ショ糖密度勾配遠心法）、アフィニティークロマトグラフィー（固定化プロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ｓｕｐｅｒｏｓｅなど））などの方法が挙げられる。
所望の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、種々の方法が使用できるが、例えば、環境ホルモン類類似化合物（ハプテン）を結合させたＯＶＡを吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、ついで、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）標識した抗マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレート固相に結合した抗体を検出するＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。抗体活性陽性のハイブリドーマを直ちにクローニングに供するが、通常これは限界希釈法などで容易に実施される。
クローン化されたハイブリドーマ上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的とするモノクローナルなハイブリドーマを取得することができる。
このような方法により得られるハイブリドーマとしては、例えば、環境ホルモン類に対するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマＭＯＦ３−１３９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５９）、ＡＰ−１４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６３３）、ＢＰ２−１７７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６３４）、ＤＦ−３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６３５）およびＣＰ−８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６３６）（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／４３７９９号公報）、ならびに、後述の参考例２において得られたハイブリドーマＥ２−７３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６９）、Ｅ１−４２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６８）、ＥＥ２−２２７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６７）、ＥＥ２−３およびＥＥ２−８−１８などが挙げられる。
また、本発明においては、抗環境ホルモン類抗体としてＩｇ由来の組換え蛋白質を使用することもできる。該Ｉｇ由来の組換え蛋白質としては、上記環境ホルモン類抗体の遺伝子を取得し、元の抗体が持つ抗原に対する親和性、抗原結合能、交差反応性、抗原抗体反応妨害物質耐性、酵素発色反応妨害物質耐性、溶媒耐性等の種々の性質を遺伝子操作の改変技術により作出することにより得られた組換え蛋白質などが挙げられる。このような組換え蛋白質は、環境ホルモン類に対する結合能を有するばかりでなく、環境ホルモン類の測定・定量や濃縮に際し、感度の良い、交差反応性の少ない、妨害物質の影響を受けにくい、溶媒による影響を受けにくい等の有用な性質を有するので実用上好ましい。
上記Ｉｇ由来の組換え蛋白質としては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号１０で表されるアミノ酸配列、配列番号１４で表されるアミノ酸配列、配列番号１８で表されるアミノ酸配列、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、もしくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する抗環境ホルモン類抗体の重鎖可変領域、または、
配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号８で表されるアミノ酸配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列、配列番号１６で表されるアミノ酸配列、配列番号２０で表されるアミノ酸配列、配列番号２４で表されるアミノ酸配列、もしくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する抗環境ホルモン類抗体の軽鎖可変領域
を含み、かつ、遺伝子組換え技術により得られた蛋白質：
例えば、後記参考例３で得られた抗エストラジオールモノクローナル抗体可変領域（ｓｃＦｖ）、後記参考例６で得られた抗アルキルフェノールモノクローナル抗体のｓｃＦｖおよび抗アルキルフェノールエトキシレートモノクローナル抗体のｓｃＦｖなど
（２）（１）に記載の蛋白質の部分ペプチド、
などが挙げられる。
上述した環境ホルモン類に対する種々の抗体蛋白質遺伝子は、本明細書の開示に基づき公知の方法を用いて得ることができる。例えば、限定されるわけではないが、該遺伝子は、抗環境ホルモン類モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより得ることができる。
抗体蛋白のＮ末端アミノ酸配列を決定し、ついで、このアミノ酸配列より推定した塩基配列を持つプライマーを作成し、抗体産生ハイブリドーマより公知の方法によりｍＲＮＡを調製し、それを基に逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成後、本明細書に開示された抗環境ホルモン類モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列または塩基配列に基づき、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等を用いることによって、上記抗体蛋白質遺伝子を選択的に得ることが可能である。このような方法は周知であり、当業者は本明細書の開示に基づいて、上記抗体蛋白質遺伝子を容易に単離することが可能である。これらの方法の具体的操作方法としては、例えば、たとえば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などが挙げられる。また、ｍＲＮＡの抽出はアマシャム社のＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ精製キットの操作説明書に記載の方法で、ｃＤＮＡの合成や５’−ＲＡＣＥ法はクロンテック社のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥキットの操作説明書に記載の方法なども挙げられる。
なお、組換え抗体の作製方法などについては、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（ｅｄ：ｂｙ  Ｆ．Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（ＵＳＡ），１９９９）の第２章に、組換え抗体断片の作製方法、ハイブリドーマ細胞からの抗体遺伝子のクローニング方法、抗体遺伝子ライブラリーの作製方法、遺伝子ライブラリーからの組換え抗体の選択方法、抗体の遺伝子操作方法などが記載されており、これらの方法により組換え抗体の作製が可能である。
また、同書第４章には、組換え抗体や組換え抗体断片の製造方法も記載されておりインビトロではウサギ網状赤血球溶解物での発現が、原核生物では、大腸菌の細胞質、ペリプラスムの可溶性画分、ペリプラスムの封入体や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでの発現が、真核生物では、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａなどのカビ、昆虫細胞ではＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ、ｍｙｅｌｏｍａ、ＣＨＯ、ＣＯＳなどの動物細胞、タバコなどのトランスジェニック植物、トランスジェニック動物などでの発現方法が記載されており、これらにより形質転換体の作製が可能である。
さらに、同書第４章には、組換え抗体や組換え抗体の断片の精製方法も記載されており、まず、物理的な方法、例えば、組換え生物の遠心分離による集菌、超音波などによる細胞破砕、機械的な磨砕や酵素的な溶菌で目的物を分離する。次にイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを組み合わせて精製する。特にアフィニティークロマトグラフィーは効率的な方法であり、抗原認識特異性を活用した抗原特異的方法や、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａやｐｒｏｔｅｉｎ  ＧなどのＦｃ部位やＦａｂ’部位への結合を利用した抗体特異的方法や、そのような部位を持たないｓｃＦｖの場合にｔａｇといわれる小さなペプチド断片を持った融合抗体として発現させ、このｔａｇに特異的なアフィニティーカラムを使用する方法（例Ｈｉｓ−ｔａｇ，ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ，Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇなど）などにより精製することにより製造することが可能である。
まず、抗環境ホルモン類モノクローナル抗体産生細胞のｃＤＮＡライブラリーを構築し、保存性の高い免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域や可変領域のＮ末端配列等をコードするｃＤＮＡをプローブに用いて、当該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして抗環境ホルモン類モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡの単離を行うことができる。これらの方法の具体的操作方法としては、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などが挙げられる。
上記抗体蛋白質遺伝子は、また、本明細書の記載の配列に基づき、周知の技術を用いて化学的に合成してもよい。ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ＳｕｐｅｒＢｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法やＧｕｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。クローン化された抗体蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
上記抗体蛋白質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明の抗体蛋白質をコードするＤＮＡ、から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
〔組換え抗体の作製方法〕
組換え抗体としては、種々の形態のものが作製できるが、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥ  ＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／−ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に記載のものはその例であり、例えば、Ｆａｂ’ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｆ（ａｂ’）ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｆｖ）、ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｃＦＶ（χ−ｓｃＦｖ）、ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦＶ（ｓｃＦｖ）２、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−（ｓｃＦｖ）２、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｃＦｖ、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ｄｓＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｂ）、ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒｉａｂｏｄｙ、ＣＬ−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ＣＨ１−ＣＬ−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ＣＨ３−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ＣＨ３−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ＣＨ３−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｃ−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ  ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｉｇ−ｓｃＦｖ  ｆｕｓｉｏｎｓ、ｌｅｕｃｉｎｅ−ｚｉｐｐｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒｓ、ｈｅｌｉｘ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒｓ、４  ｈｅｌｉｘ−ｂｕｎｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｓｃＦｖ、ｉｎｔｒａｂｏｄｙなどが組換え抗体として作製可能である。また、変異処理を施した抗体遺伝子のシャフリングにより、目的の有用な性質を有する抗体を選択する方法も本発明の範囲内に入る。
〔組換え抗体の発現系〕
組換え抗体の発現系としては、効率よく組換え抗体を発現できる系であればどのような発現系でもよいが、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／−ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に纏められているように、例えば、哺乳動物細胞では、Ｆｖ、ｓｃＦｖやｓｃＦｖ誘導体、ｂｉｖａｌｅｎｔおよびｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓなどの発現が、昆虫細胞では、ｓｃＦｖやＦａｂなどの発現が、真菌細胞では、Ｆｖ、ｓｃＦｖやＦａｂなどの発現が、植物細胞では、ｓｃＦｖの発現が知られており、このように種々の発現系が使用可能である。
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製法〕
ｃＤＮＡライブラリーの作製法としては、効率よくｃＤＮＡライブラリーを作製できる方法であればどのような方法でも良いが、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥ  ＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／−ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に述べられているファージディスプレイ法も、その一つである。
〔組換え抗体の選択方法〕
作製したライブラリーから、目的の組換え抗体を選択する方法としては、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥ  ＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／−ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に記載のプロトコール、「ファージミドライブラリーからの組換え抗体の単離法」や、「ｆｄファージライブラリーからのペプチドの単離法」などの方法も、選択方法として使用可能である。
発現に用いる遺伝子（ＤＮＡ）は、上記で得られた遺伝子（ＤＮＡ）が発現する抗環境ホルモン類抗体蛋白質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、もしくは、その部分ペプチドであるものでもよい。実質的に同一のアミノ酸配列とは、アミノ酸配列のうち、一部が改変されているもの、アミノ酸配列が付加されているもの、アミノ酸配列が削除されているもの等が挙げられる。遺伝子（ＤＮＡ）は、目的によりそのまま、または、所望により切断したり他のＤＮＡを付加するなどによりして使用することができる。該ＤＮＡには、末端に翻訳開始コドンＡＴＧを有していてもよい。自体公知の方法により行うことができる。例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等が挙げられる。
このようにして得られたＤＮＡ（ポリヌクレオチド）を、プロモーター、翻訳開始コドン、適当なシグナル配列等を、ベクターに自体公知の方法で組込むことにより、組換えベクターを製造することができる。該ベクターやプロモーターや宿主菌株としては、たとえば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）のＡｐｐｅｎｄｉｘ  ３に記載のベクター、プロモーターやエシェリヒア属菌株等が挙げられる。
ベクターとしては、上記以外に、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ−２７６、ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ、ｐＵＣＩ９、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ．）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージ、Ｍ１３Ｋ０７などのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば、いかなるものでもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞である場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなど、宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１Ｏプロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（以下ＡｍｐＲと略称する場合がある）、カナマイシン耐性遺伝子（以下ＫｍＲと略称する場合がある）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（以下ＣｍＲと略称する場合がある）等が挙げられる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、上記抗体蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ｏｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築された上記抗体蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オズ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレッック・アシッズ・リサーチ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０巻，５１７（１９７８）〕、ＨＢ１Ｏ１〔ジャーナル・オブ・モレキュー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕、ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）、ＴＧ−１、ＪＭ１０９などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２４巻，２５５（１９８３）］、２０７−２１［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）］などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ビボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる［前田ら，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）］。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻、１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６巻，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。このようにして、抗体蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
さらに、このようにして得られた形質転換体を培養することにより、上記蛋白質を生成せしめ、これを採取することにより上記蛋白質を製造することができる。培養に用いられる培地としては、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培地に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスティープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは細菌の場合は約５〜８が、カビや酵母の場合は約２〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）］が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸やイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ，ｋ．Ｌ．ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）］や、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地［Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）］が挙げられる。培地のｐＨは約２〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻、５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻、３９６（１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地〔ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９巻，５１９（１９６７），１９９培地［プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティー・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて炭酸ガスを含む通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に上記抗体蛋白質を生成せしめることができる。
このようにして得られた培養物から、目的とする上記抗体蛋白質を分離精製するには、例えば下記の方法により行うことができる。上記抗体蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により抗体蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に抗体蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる抗体蛋白質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これら公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等亀点の差を利用する方法などを用いて分離精製できる。
上記蛋白質またはその塩は、自体公知の蛋白質の合成法に従って、あるいは上記蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって製造することができる。蛋白質の合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。即ち、上記蛋白質を構成する部分ペプチド若しくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、精製物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の蛋白質を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下に記載された方法が挙げられる。
▲１▼Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチドシンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
▲２▼ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザペプチド（Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
▲４▼矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻  ペプチド合成  広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて上記蛋白質を精製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明の分離材における高分子成型担体を構成する高分子素材としては、分離膜（分離材）、濾過膜（濾過材）、カラム充填剤などの担体に使用されている公知の素材、例えば、
（１）天然高分子またはその誘導体：セルロースまたはセルロース誘導体（例えば、セルロース、再生セルロース、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ニトロセルロースなど）、アガロースなど；
（２）合成高分子：ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリエーテル、ポリアミド（例えば、ナイロンなど）、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、エチレン・ビニルアルコール共重合体など；
（３）（１）または（２）の高分子を架橋、表面処理（例えば、親水化処理など）の修飾を施したもの；修飾ポリスチレン、親水化ポリエチレンなど；
などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
好ましくは電離性放射線に感受性が高く劣化しないものが挙げられ、なかでもポリオレフィン（特にポリエチレン）やセルロースが好ましい。
本発明の分離材における高分子成型担体としては、分離膜（分離材）、濾過膜（濾過材）、カラム充填剤などとして公知の高分子を成型した担体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。好ましくは分離対象となる環境ホルモン類は極く微量しか含有しない試料（例えば、数ｎｇ／ｌ程度）が多いことから、大流量で処理すること（高速処理）が可能であるものが挙げられる。このような高分子成型担体としては、例えば、平膜、中空糸膜、不織布、織布、繊維、成型ビーズや汎用のろ紙などが挙げられる。なかでも多孔性平膜、多孔性中空糸膜などの多孔性担体や不織布が好ましく、特に多孔性中空糸膜および不織布が好ましい。担体を多孔性中空糸膜とした場合には、とりわけ高速処理を行うことが可能になるので、特に大量に試料を処理する場合に好適である。一方、担体を不織布とした場合、高速処理を行うことができるばかりでなく、試料中に存在する夾雑物に起因する目詰まりの発生を抑制することができるので、安定した処理が可能になる。
多孔性担体としては、孔径が０．０５〜１００μｍ（好ましくは０．１〜１０μｍ）の細孔を多数有し、かつ空隙率が２０〜８０％（好ましくは４０〜８０％）であるものが好ましい。
ここでいう細孔の孔径とは、細孔分布測定装置（ポロシメーター）を用いた水銀圧入法（柳田博明監修、「微粒子工学大系（第Ｉ巻）基本技術」、第１版、株式会社フジ・テクノシステム、２００１年１０月３１日、第４４２〜４４４頁）により測定される値をいう。
ここでいう空隙率とは、嵩密度と素材の真密度との相対比から求めた値をいう。具体的には、乾燥した多孔性中空糸膜などの多孔性担体をメタノールに浸して、内部細孔の表面を濡らした後、水に置換する。こうして得た水を含んだ多孔性担体の重さを測り、次にそれを乾燥させて多孔性担体の重さを測る。湿潤と乾燥状態での重さの差を水の密度を使って細孔（空隙）体積に変換する。細孔体積を多孔性担体全体の体積で割ることによって空隙率を算出できる。
不織布としては、その目付（密度）が１０〜２００ｇ／ｍ２であるものが好ましく、３０〜１００ｇ／ｍ２であるものがさらに好ましい。
ここでいう不織布の目付とは、不織布を適当な面積に切り取り、その乾燥重量を測り、次いで得られた重さを面積で割ることによって算出される値をいう。
本発明の分離材においては、抗環境ホルモン類抗体は高分子成型担体にグラフト鎖を介して共有結合的に担持される。ここでいう「グラフト鎖」とは、グラフト重合により担体基材（幹ポリマー）に形成された、反応性モノマーが重合したポリマー鎖（枝ポリマー）をいう。ここでいう反応性モノマーとは、グラフト重合可能なモノマーをいい、例えば、グラフト重合に使用可能なモノマーとして公知のものが挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明における反応性モノマーとしては、重合可能な官能基（例えば、ビニル基など）を有し、かつ、抗体とのカップリング可能な官能基（例えば、エポキシ基など）を有するものであることが好ましく、このようなものとしては、例えば、メタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）、アクリル酸グリシジル（ＡＭＡ）、ソルビン酸グリシジル、メタイタコン酸グリシジル、マレイン酸エチルグリシジル、ビニルスルホン酸グリシジルなどのエポキシ基含有ビニルモノマーなどが挙げられる。なかでも抗体とのカップリングが容易であることから、メタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）が好ましい。
本発明の好適な分離材であるグラフト鎖を介して抗体を担体に担持した分離材の製造方法としては特に限定されないが、用途に応じた分離材が容易に得られることから、既存の形状の担体基材に上記反応性モノマーを使用したグラフト重合により側鎖を形成させ、次いで該側鎖に対して抗体をカップリングさせることにより製造することが好ましい。
既存の形状の担体基材にグラフト鎖を形成させるためのグラフト重合法としては、特に限定されないが、反応条件が緩和であり、担体基材の特性を損なうことなくグラフト鎖を基材に形成させることができることから、担体基材（幹ポリマー）に対して放射線を照射してラジカル（反応開始点）を生成させ、これに反応性モノマーを接触させて枝ポリマーを形成する方法である放射線グラフト重合法が好ましい（図１の工程（１）および（２）参照）。
本発明における放射線グラフト重合に使用する反応性モノマーとしては、上述したものが挙げられる。
上記放射線グラフト重合に使用する放射線としては、例えば、α線、β線、γ線、電子線、加速電子線、Ｘ線などが挙げられ、放射線を照射する担体の素材、形状、厚みなどに応じて適宜決定すればよいが、本発明においては、通常、γ線、電子線を使用する。
γ線源としては、コバルト、セシウム、ストロンチウムなどが挙げられる。コバルトのγ線源は、透過深度が大きいため、電子線を用いる場合に比べて被照射体の厚みを厚くすることができるので、長尺物をロール状にしてバッチ法で照射する方法において好適に使用することができる。
電子線源としては、バンデグラフ、ライナック、サイクロトロンなどの加速器が用いられる。また、電子線源は照射線量率がγ線源の３００〜１０００倍と高く短時間照射が可能であるが、透過深度が小さいため、搬送装置を用いて薄層物を連続的に照射する場合に好適に使用することができる。また、加速電子線の透過深度は加速電圧に依存するので、被照射体の厚みや照射規模によって加速電圧を適宜設定することができる。
放射線の照射線量は一般的に１０〜５００ｋＧｙ（好ましくは５０〜１００ｋＧｙ）であり、照射時間は、γ線を用いる場合には１〜５０時間（好ましくは５〜１０時間）であり、電子線を用いる場合には１〜５００秒（好ましくは５〜１０秒）である。
また、放射線照射は、通常、室温（１０〜４０℃）で行うが、生成ラジカルの減衰を抑制するため、必要に応じて不活性ガス（例えば、窒素、アルゴンなど）中で行うことができる。
本発明における放射線グラフト重合においては、担体基材を放射線照射する際に上記反応性モノマーを共存させてもよく（同時照射法）、基材を放射線照射後に上記反応性モノマーを放射線照射された基材に接触させてもよい（前照射法）。好ましくは、同時照射法ではグラフト重合と同時にモノマーの単独重合が生成しやすいことから、前照射法を用いることが好ましい。
同時照射法は、発熱反応のため、電子線による短時間重合よりもγ線重合が安全であり、通常、不活性ガス雰囲気下、室温で１〜２時間γ線を照射することにより行う。
前照射法においては、担体基材に放射線照射して担体基材にラジカルを生成させた後に上記反応性モノマーを接触させてグラフト重合反応させる工程を含む。該グラフト重合反応工程は特に限定されないが、通常、反応性モノマーを含有する溶液に放射線照射によりラジカルが生成した基材を浸漬させることにより行うことができる。
上記反応性モノマーを含有する溶液に使用する溶媒としては、メタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などが用いられ、好ましくはメタノールが用いられる。また、該溶液中の反応性モノマーの濃度は、通常、１０〜６０重量％、好ましくは２０〜５０重量％である。
グラフト重合反応工程における反応温度および反応時間としては、特に限定されず、基材におけるラジカル生成度合い、使用する反応性モノマー、所望するグラフト率などを考慮して適宜設定すればよいが、通常、室温〜８０℃（好ましくは４０〜５０℃）の温度で行うことができる。
本発明の分離材においては、グラフト重合の度合いを示すグラフト率を１０〜３００％にすることが好ましく、５０〜２５０％にすることがさらに好ましい。
ここでいうグラフト率（ｄｇ）は下式（ｉ）：
2003101611.tif 000009
で表されるものである。
上記のようにして得られる担体のグラフト鎖と、官能基を有する抗環境ホルモン類抗体をカップリングさせることで本発明の好適な分離材を得ることができる（図１の工程（３）参照）。
本発明におけるカップリング反応は、抗体が変性しない条件で行うことが重要であるが、そのような条件としては、例えば、ｐＨ２．０〜１１．０（好ましくは６．０〜１０．５）の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液など）中、０〜４０℃（好ましくは４〜３０℃）の温度で、０．１〜７２時間（好ましくは０．５〜２４時間）が挙げられる。
本発明の分離材における担持される抗体の量（密度）は、特に限定されないが、好ましくは０．１〜２０ｍｇ−抗体／ｇ−分離材であり、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ−抗体／ｇ−分離材である。
本発明の分離材は、抗環境ホルモン類抗体が高分子成型担体に安定して担持されていることから、極く微量しか含まれていない試料（例えば、河川水、湖沼水、海水、地下水など）から環境ホルモン類を選択的かつ効率的に分離することができる。また、本発明の分離材に環境ホルモン類を捕捉させた後これを溶出液により溶出する場合、捕捉された環境ホルモン類を非常に少量の溶出液で溶出することができる。すなわち、本発明の分離材による環境ホルモン類の濃縮効率は極めて高い。したがって、該分離材は、環境ホルモン類の濃縮、クリーンアップなどに好適に使用することができる。
本発明の環境ホルモン類の濃縮方法は、
（１）環境ホルモン類を含有する検体を、上記環境ホルモン類分離材に接触させることにより、該環境ホルモン類を抗環境ホルモン類抗体に捕捉させる工程と、
（２）該抗環境ホルモン類抗体に捕捉された該環境ホルモン類を解離させて回収する工程
を含む方法である。
本方法における環境ホルモン類を含有する検体としては、上記環境ホルモン類を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、河川水、湖沼水、海水、地下水、上水、下水、土壌試料などが挙げられる。これらは本方法にそのまま適用してもよく、また、これらより自体公知の方法により分析用に調製した試料（例えば、不溶物をろ過や遠心分離などにより除去したもの）として適用してもよい。また、分離材に担持された抗環境ホルモン類抗体の変性などを避けるため、必要に応じて検体のｐＨや塩濃度を調整することも好ましい。
本発明の濃縮方法においては、上述した分離材を検体の種類および量、対象となる環境ホルモン類などに応じて適宜選択して使用することができる。
上記工程（１）は、上記環境ホルモン類を含有する検体を、上記高分子成型担体と、該高分子成型担体に担持された抗環境ホルモン類抗体よりなる抗環境ホルモン類分離材とを接触させることにより、抗原抗体反応を利用して、該検体中の環境ホルモン類を該分離材に含まれる抗環境ホルモン類抗体に捕捉させる工程である。
検体を分離材と接触させる方法としては特に限定されず、例えば、検体を分離材を通過させる方法（例えば、分離材を充填したカラムに検体を導入する方法、中空の分離材（例えば、中空糸膜）を使用する場合などにおいて分離材の膜内面に検体を導入する方法など）、検体と分離材を混合する方法（例えば、検体中に分離材を加えて撹拌する方法など）などが挙げられる。
検体と分離材の接触温度は、特に限定されるものではないが、分離材に担持された抗体の変性を避けるためなどから、通常、０〜４０℃（好ましくは４〜３０℃）である。また、接触時間は、使用する分離材の能力に応じて適宜設定すればよい。
上記工程（２）は、上記工程（１）で抗環境ホルモン類抗体に捕捉された環境ホルモン類を該抗環境ホルモン類抗体から解離させて回収する工程である。
環境ホルモン類を該抗環境ホルモン類抗体から解離させて回収する方法としては、例えば、ｐＨの変更（ｐＨを酸性（２．５〜３など）に下げる、ｐＨをアルカリ性（１１．５など）に上げるなど）、イオン強度の変更（ＮａＣｌなどの添加や塩濃度の変更など）、極性の変更（例えば、有機溶媒（メタノール、ジオキサン、エチレングリコールなど）、カオトロピック塩（ＳＣＮ−、ＣＣｌ３ＣＯＯ−、Ｉ−）などの添加や濃度変更など）、蛋白変性剤（尿素、塩酸グアニジンなど）の添加などの溶出液の性状変更や電気泳動などの公知の方法により抗環境ホルモン類抗体から環境ホルモン類を解離させ、これを回収するなどの方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以上のような本発明の濃縮方法により、環境中に極く微量しか存在しない環境ホルモン類を、免疫学的に夾雑物の少ない状態で、溶媒抽出法や固層抽出法などの従来の濃縮方法と比較して、はるかに高倍率（数千から数万倍）かつ効率的に濃縮することができる。
本発明の環境ホルモン類のクリーンアップ方法は、環境ホルモン類を含有する検体を上記分離材に接触させることにより、該環境ホルモン類を抗環境ホルモン類抗体に捕捉させることを含む方法である。本方法は上記環境ホルモン類の濃縮方法の工程（１）と同様に行うことができる。
本発明のクリーンアップ方法は、環境中に極く微量しか存在しない環境ホルモン類を、選択的かつ効率的にクリーンアップすることができるので、従来の方法と比べはるかに経済的である。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ  ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
ａ；Ａ  ：アデニン
ｔ；Ｔ  ：チミン
ｇ；Ｇ  ：グアニン
ｃ；Ｃ  ：シトシン
ｎ：未同定
ＲＮＡ  ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
アミノ酸の略記
３文字：１文字：日本名
Ｇｌｙ：  Ｇ  ：グリシン
Ａｌａ：  Ａ  ：アラニン
Ｖａｌ：  Ｖ  ：バリン
Ｌｅｕ：  Ｌ  ：ロイシン
Ｉｌｅ：  Ｉ  ：イソロイシン
Ｓｅｒ：  Ｓ  ：セリン
Ｔｈｒ：  Ｔ  ：スレオニン
Ｃｙｓ：  Ｃ  ：システイン
Ｍｅｔ：  Ｍ  ：メチオニン
Ｇｌｕ：  Ｅ  ：グルタミン酸
Ａｓｐ：  Ｄ  ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ：  Ｋ  ：リジン
Ａｒｇ：  Ｒ  ：アルギニン
Ｈｉｓ：  Ｈ  ：ヒスチジン
Ｐｈｅ：  Ｆ  ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ：  Ｙ  ：チロシン
Ｔｒｐ：  Ｗ  ：トリプトファン
Ｐｒｏ：  Ｐ  ：プロリン
Ａｓｎ：  Ｎ  ：アスパラギン
Ｇｌｎ：  Ｑ  ：グルタミン
Ａｓｘ：  Ｂ  ：Ａｓｎ＋Ａｓｐ
Ｇｌｘ：  Ｚ  ：Ｇｌｎ＋Ｇｌｕ
Ｘａａ：不明または他のアミノ酸
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実施例における多孔性担体の細孔の孔径および空隙率ならびに不織布の目付の測定は以下のようにして行った。
（多孔性担体の細孔の孔径）
細孔分布測定装置（ポロシメーター）を用いた水銀圧入法（柳田博明監修、「微粒子工学大系（第Ｉ）基本技術」、第１版、株式会社フジ・テクノシステム、２００１年１０月３１日、第４４２〜４４４頁）より測定した。
（空隙率）
乾燥した多孔性担体をメタノールに浸して、内部細孔の表面を濡らした後、水に置換した。得られた水を含んだ多孔性担体の重さを測り、次にそれを乾燥させて多孔性担体の重さを測定した。湿潤と乾燥状態での重さの差を水の密度を使って細孔（空隙）体積に変換し、細孔体積を多孔性担体全体の体積で割ることによって空隙率を算出した。
（不織布の目付）
不織布を適当な面積に切り取り、その乾燥重量を測り、次いで得られた重さを面積で割ることによって算出した。
実施例１  イムノアフィニティー多孔性中空糸膜の調製
イムノアフィニティー多孔性中空糸膜の調製には以下の材料を用いた。また、下記以外の試薬は分析等級以上のものを用いた。
・担体基材：
担体基材としてはポリエチレン製多孔性中空糸膜（旭化成株式会社製）を使用した。該中空糸の内径および外径は、それぞれ１．８ｍｍおよび３．１ｍｍであった。また、該中空糸は、７０％の空隙率を有し、かつ、孔径０．４μｍの細孔で三次元細孔ネットワークを形成していた。
・反応性モノマー：
反応性モノマーとしては、メタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ、ＣＨ２＝ＣＣＨ３ＣＯＯＣＨ２ＣＨＯＣＨ２）を東京化成株式会社より入手し、さらに精製することなく使用した。
・１７β−エストラジオール（以下、Ｅ２とも称する）：
和光純薬工業株式会社より入手した。
・抗エストロゲンポリクローナル抗体（以下、抗エストロゲン抗体または抗ＥＳ抗体とも称する）
後述する参考例１に従って製造したものを使用した。
イムノアフィニティー多孔性中空糸膜を以下の３工程で調製した（図１）。
（１）電子線照射による担体基材におけるラジカル形成：
１０ｃｍ長の上記中空糸膜に、カスケード型加速装置（Ｄｙｎａｍｉｔｒｏｎ  ｌＥＡ  ３０００−２５−２，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して、窒素雰囲気中、室温にて電子線を照射した。照射線量は２００ｋＧｙ（１０ｋＧｙ×２０分）とした。
（２）エポキシ基含有ビニルモノマー（ＧＭＡ）のグラフト重合：
電子線照射した上記中空糸膜を１０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡ／メタノール溶液に浸漬した。１２分後、該中空糸膜を取り出し、徹底的に洗浄し、残留するＧＭＡおよびポリＧＭＡホモポリマーを除去した。得られたＧＭＡグラフト多孔性中空糸膜（以下、ＧＭＡ糸と称する）におけるＧＭＡのグラフト率（ｄｇ：上記式（ｉ）で定義される）は１７０％であった。
（３）ＧＭＡグラフト多孔性中空糸膜のエポキシ基と抗体のカップリング：
上記ＧＭＡ糸を、抗ＥＳ抗体を１．７５ｍｇ／ｍＬで溶解した０．０２５Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）に、２７７Ｋにて、カップリング反応時間が４〜３６時間になるように浸漬した。カップリング後、ホウ酸で洗浄することにより、抗ＥＳ抗体含有多孔性中空糸膜（以下、ＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸と称する：ｑはリガンド密度（すなわち、カップリングした抗ＥＳ抗体量）を示す）を得た。
リガンド密度（すなわち、抗ＥＳ抗体固定化量）を、多孔性中空糸膜にグラフト重合したポリＧＭＡ鎖のエポキシ基と抗ＥＳ抗体の２７７Ｋでのカップリング反応における反応時間の関数として図３に示す。該リガンド密度はカップリング時間が増加するにつれて増加した。リガンド密度は、３６時間のカップリング時間で５．８ｍｇ／ｇ−ＧＭＡ糸となった。
実施例２
（１）Ｅ２のイムノアフィニティー多孔性中空糸膜への結合
３．１〜５．８ｍｇ／ｇ−ＧＭＡ糸の範囲のリガンド密度（ｑ）を有する種々のＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸（有効長さ２．０ｃｍ）を、図２に示すように実験装置中に設置した。次いで１．０μｇ／ＬのＥ２を含む１０％（ｖ／ｖ）メタノール／水を、室温にて３０〜１２０ｍＬ／時の範囲の一定の透過速度でＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸の膜内面から細孔を通じて膜外面に透過させた。ＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸の膜外面に透過された溶出液のＥ２濃度を、エストロゲン（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ；ＥＳ）ＥＬＩＳＡキット（武田薬品工業株式会社）を使用して継続的に定量した。溶出液量に対する溶出液中のＥ２濃度変化をプロットし、破過曲線を得た。また、Ｅ２の平衡結合能（ＥＢＣ）を下式（ｉｉ）のように計算した。
2003101611.tif 000010
［式中、Ｃ０およびＣは、それぞれ供給液および溶出液のＥ２濃度を示し、Ｖ、ＶｅおよびＷは、それぞれ溶出液量、ＣがＣ０に達したときの溶出液量およびＧＭＡ糸の重量を示す。］。
各ＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸に関する室温における一定の透過速度（６０ｍＬ／時）でのＥ２の破過曲線を図４に示す。また、各ＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸におけるＥ２の平衡結合能（ＥＢＣ）を結合率（これは固定化抗ＥＳ抗体量に対するＥ２結合量のモル比として定義される）と共に図５に示す。Ｅ２のＥＢＣは、リガンド密度（ｑ）が増加するにつれて直線的に増加した。また、結合率は一定して０．０８５であった。
ＥＳ−ＩＡ（４．８）糸（リガンド密度４．８ｍｇ／ｇ−ＧＭＡ糸）に対してＥ２溶液を種々の透過速度（滞留時間）で供給した場合の破過曲線を図６に示す。得られた破過曲線は、Ｅ２溶液の透過速度にかかわらず重なり合っていた。すなわち、Ｅ２溶液の透過速度を高めるほどに、Ｅ２のＥＳ−ＩＡ（４．８）糸への結合速度を高めることができた。これはＥ２の固定化抗体への拡散物質移動抵抗が無視できるためと考えられた。また、このことはＥ２を高速でクリーンアップするのに好適である。
（２）イムノアフィニティー多孔性中空糸膜に結合したＥ２の溶出
３〜５ｍＬのメタノールを、室温にてＥ２を結合させる各々の場合に対応する透過速度でＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸全体に透過させることによって、ＥＳ−ＩＡ（ｑ）糸に結合したＥ２を溶出した。膜外面の溶出液中のＥ２濃度をＥＳ  ＥＬＩＳＡキットを使用して継続的に定量した。溶出Ｅ２量を結合Ｅ２量で除したものである溶出率は、図７に示されるように、リガンド密度にかかわらず、ほぼ１００％であった。
実施例３  中空糸膜エストロゲンアフィニティーカラムによるＥ２の回収
（１）中空糸膜を用いたアフィニティーカラムの作製
実施例１により作製したＧＭＡ中空糸膜をメタノール、蒸留水に各々３０〜６０ｍｉｎ浸漬した。ついで後述する参考例１で得られた抗エストロゲン抗体（２ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ３０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０））を中空糸膜２ｃｍ当たり１ｍｌ添加し、４℃で一晩反応した。ペリスタポンプを用いてＧＭＡ膜を上記ホウ酸緩衝液で洗浄し、洗浄液中の抗体量を測定することにより、膜に結合した抗体量を算出した。
（２）アフィニティーカラムを用いたエストロゲン類の添加回収
上記アフィニティーカラムをＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、１０％メタノールに溶解したエストロゲン類（１７β−エストラジオール（Ｅ２）、もしくはエストロン（Ｅ１））を作製したアフィニティカラムにアプライした。ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、３０％メタノール（抗体カラム再利用の場合）または１００％メタノールで溶出した。３０％メタノール溶出サンプルは１０％メタノールとなるように蒸留水で希釈し、また１００％メタノール溶出サンプルは蒸発乾固後、１０％メタノールに再溶解した。本１０％メタノールサンプルをＥ２  ＥＬＩＳＡ（１７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ＥＬＩＳＡキット、武田薬品製、和光純薬発売、コード番号  ３００−０７７７１）もしくはＥＩ  ＥＬＩＳＡ（廣部ら、第３６回日本水環境学会年会講演集，ｐ４３３（２００２））により測定した。
なお、送液操作にはペリスタポンプを用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで実施した。
（３）カラム長のＥ２回収量に及ぼす影響
下記表１の通り、Ｅ２回収量はカラムの長さに比例して増加するが、回収液量は増加しないことから、以後の濃縮等で問題となる回収液量が増加すること無しに濃縮できるため、効率的な回収方法であることを確認できた。
2003101611.tif 000011
（４）アフィニティーカラムの再利用可否検討
カラムの再利用の可否を検討した結果を表２に示す。カラムからの溶出液に３０％メタノールを使用することにより、再利用が可能であり効率的に使用可能なことを確認できた。カラムとしては、ＧＭＡ膜の膜長は２ｃｍとし、３０％メタノール溶出後のカラムはＰＢＳ１０ｍｌで洗浄することにより再生した。
2003101611.tif 000012
（５）低濃度サンプルへの適用可否検討
アフィニティーカラムによる環境水の直接濃縮を目的に、下水流入水レベルのＥ１（１０ｎｇ／Ｌ，１００ｍｌ）の添加回収実験を行った。その結果を表３に示す。１０ｎｇ／Ｌというきわめて低濃度のサンプルでも、回収率８５％という良好な結果が得られた。このことから、本アフィニティーカラムが下水流入水レベルのエストロゲンの直接濃縮に使用可能なことが確認できた。
2003101611.tif 000013
実施例４  不織布を用いたエストロゲンアフィニティーカラムによるＥ２の回収
（１）不織布を用いたアフィニティーカラムの作製
実施例１の中空糸膜の代わりに高密度ポリエチレン製不織布（ＨＤＰＥ高密度ポリエチレン１００％、３．３ｄｔｅｘ）を使用して作製したＧＭＡ不織布（グラフト率２０７％、目付３０ｇ／ｍ２）を、裁断後（φ０．８，１．２，２．６ｃｍ）、リザーバー（３，６，６０ｍｌ容量：ＧＬサイエンス製）にフリット（ＧＬサイエンス製）で上下を挟み込むことにより充填した。メタノール、蒸留水に各々３０〜６０ｍｉｎ浸漬後、後述する参考例１で得られた抗エストロゲン抗体（２ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ３０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０））を２ｍｌ添加し、４℃で一晩反応した。未結合の抗体量を測定することにより、不織布に結合した抗体量を測定した。以上の操作の概要を図８および図９に示す。
（２）アフィニティーカラムを用いたエストロゲン類添加回収実験
上記アフィニティーカラムをＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、１０％メタノールに溶解したＥ２をアフィニティカラムに供与した。ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、１００％メタノール８ｍｌで溶出した。溶出液を蒸発乾固後、１０％メタノールに再溶解しＥ２  ＥＬＩＳＡにより測定した。なお、上記操作は市販の固相抽出装置（ＶＡＣ  ＥＬＵＴＥ−２４：ＧＬサイエンス製）を用い、流速３〜４ｍｌ／ｍｉｎで実施した。操作の概要を図９に示す。
（３）ＧＭＡ不織布の積層数および直径の影響
ＧＭＡ不織布の積層数および直径がＥ２回収率に及ぼす影響を調べた（Ｅ２：１ｎｇ／Ｌ，３００ｍｌ→２ｍｌに濃縮）。なお、φ１．２ｃｍの不織布については１０，２０，３０，４０枚の４段階で積層したものを、またφ０．８および２．６ｃｍの不織布については、不織布重量がφ１．２ｃｍの各段階と等しくなるように、２０，４０，６０，８０枚および３，６，９，１２枚積層したものを作成した。なお、ＧＭＡ不織布のグラフト率は２０７％（目付３０ｇ／ｍ２）であった。
その結果を表４に示す。φ１．２ｃｍ（４０枚）で８６％、φ２．６ｃｍ（１２枚）で９０％と良好であったのに対し、φ０．８ｃｍ（８０枚）では６５％となった。各直径での抗エストロゲン抗体の結合量はほぼ同等であったことから、ＧＭＡ不織布の直径が回収率に影響しており、その直径は１．２ｃｍ以上が好ましいことが判った。
なお、本実験は下水処理水中の濃度にあたるＥ２：１ｎｇ／Ｌで実施しており、不織布を用いても極低濃度のエストロゲンを直接濃縮できることも確認した。
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（４）不織布の密度およびグラフト率の影響
不織布の密度およびグラフト率（ＧＭＡ導入量／基材膜重量×１００（％））がＥ２回収率に及ぼす影響を調べた（Ｅ２：３ｎｇ／Ｌ，１００ｍｌ→２ｍｌに濃縮）。なお、不織布はいずれも３０枚積層した。その結果を表５に示す。同レベルでのグラフト率（５０〜１５０％）では、膜密度の上昇に伴い回収率が上昇した。一方、密度の最も低い３０ｇ／ｍ２の膜でもグラフト率を２００％程度にすることにより、十分な回収率が得られることがわかった。
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実施例５  不織布を用いた樹脂可塑剤類アフィニティーカラムによるＤＢＰの回収
（１）不織布を用いたアフィニティーカラムの作成
実施例４に従って製造したＧＭＡ不織布（グラフト率２０７％、目付３０ｇ／ｍ２）を裁断後（φ１．２ｃｍ）、リザーバー（６ｍｌ容量：ＧＬサイエンス製）にフリット（ＧＬサイエンス製）で上下を挟み込むことにより充填した。メタノール、蒸留水に各々３０〜６０ｍｉｎ浸漬後、後述する参考例１で得られた抗樹脂可塑剤類抗体（２ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ３０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０））を２ｍｌ添加し、４℃で一晩反応した。未結合の抗体量を測定することにより、不織布に結合した抗体量を測定した。
（２）アフィニティーカラムを用いたフタル酸ジブチル（ＤＢＰ）添加回収実験
上記アフィニティーカラムをＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、１０％メタノールに溶解したフタル酸ジブチル（ＤＢＰ）をアフィニティカラムに供与した。ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、１００％メタノール８ｍｌで溶出した。溶出液を蒸発乾固後、１０％メタノールに再溶解しＤＢＰ  ＥＬＩＳＡにより測定した。なお、上記操作は市販の固相抽出装置（ＶＡＣＥＬＵＴＥ−２４：ＧＬサイエンス製）を用い、流速３−４ｍｌ／ｍｉｎで実施した。
表６に示すとおり、ＤＢＰを３００ｎｇカラムへアプライしたところ１６７ｎｇが回収できた。このことから、担持する抗環境ホルモンポリクローナル抗体の種類を変えることにより、本手法が種々の物質の回収に適用できることが判明した。
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実施例６  不織布を用いた樹脂成分類アフィニティーカラムによるビスフェノールＡの回収
（１）不織布を用いたアフィニティーカラムの作成
実施例４に従って製造したＧＭＡ不織布（グラフト率１７０〜１９０％、目付６５ｇ／ｍ２）を裁断後（φ１．２ｃｍ）、リザーバー（６ｍｌ容量：ＧＬサイエンス製）にフリット（ＧＬサイエンス製）で上下を挟み込むことにより充填した。メタノール、蒸留水に各々３０〜６０ｍｉｎ浸漬後、後述する参考例１で得られた抗樹脂成分類抗体（５ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４））を２ｍｌ添加し、４℃で一晩反応した。未結合の抗体量を測定することにより、不織布に結合した抗体量を測定した。
（２）アフィニティーカラムを用いたビスフェノールＡ（ＢＰＡ）添加回収実験
上記アフィニティーカラムをＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、蒸留水に溶解したビスフェノールＡ（ＢＰＡ）１０ｎｇ（濃度１０ｎｇ／ｌ）をアフィニティーカラムに供与した。ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄後、１００％メタノール８ｍｌで溶出した。溶出液を蒸発乾固後、１０％メタノールに再溶解しＢＰＡ  ＥＬＩＳＡにより測定した。なお、上記操作は市販の固相抽出装置（ＶＡＣ  ＥＬＵＴＥ−２４：ＧＬサイエンス製）を用い、流速３−４ｍｌ／ｍｉｎで実施した。
（３）結果
表７に示すとおり、１０ｎｇ（濃度１０ｎｇ／ｌ）のＢＰＡをアフィニティーカラムにアプライしたところ８．５ｎｇ（濃度１．０６ｎｇ／ｍｌ×８ｍｌ）のＢＰＡが回収できた。このことから、ＢＰＡにおいても、担持させる抗体に抗樹脂成分抗体を用れば、本手法によりＢＰＡが回収できることが示された。
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以上、実施例４、５および６の結果より、担持させる抗環境ホルモン類抗体の種類を変えることにより、本手法が種々の物質の回収に適用できることを確認した。
実施例７
後記参考例１で製造した抗エストロゲン（ＥＳ）抗体をモデル抗体として、本発明による抗環境ホルモン類抗体固定化担体と市販の担体を用いた抗環境ホルモン類抗体固定化担体のＥ２結合溶出試験を実施した。
〔方法〕
〔カラムへの抗体結合法〕
（１）市販カラム：
アフィゲル−１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製１５３−６０９９），
アフィゲル−ヒドラジド（Ｈｚ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、１５３−６０６０）
カラムの使用説明書に従い、抗ＥＳ抗体固定化カラムを作製した。
（２）グラフト化中空糸膜（ＧＭＡ糸）
実施例１に従って製造したＧＭＡ糸を、メタノール、蒸留水で洗浄後、ＰＢＳに溶解した抗ＥＳ抗体（抗ＥＳ−１  ウサギポリクローナル抗体）を一晩反応させ、グラフト重合したエポキシ基に抗体を導入した。
〔カラムへのサンプルアプライおよび溶出〕
サンプルとしては蒸留水に溶解した１７βエストラジオール（Ｅ２）を用いた。カラムからの溶出には１００％メタノールを用いた。
〔溶出液中のＥ２測定〕
溶出液を窒素パージにて蒸発乾固後、市販のＥ２  ＥＬＩＳＡキット（武田薬品工業製）にてサンプル中のＥ２を測定した。
〔結果〕
〔カラムへのＥ２結合量〕
市販カラムに関しては１ｍｌ当たりのＥ２吸着量を、グラフト化した中空糸膜に関しては２０ｍｍ当たりのＥ２吸着量を調べた。その結果、いずれの担体にもＥ２が３３〜３５ｎｇ程度結合しており、Ｅ２結合量に関しては同等であると判断した（表８）。
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〔各カラムからのＥ２溶出パターンの比較〕
各カラムからのＥ２溶出液（１００％メタノール）を１ｍｌずつ分画し、カラムからのＥ２溶出パターンを調べた。その結果、市販カラム（アフィゲル−１０，アフィゲル−Ｈｚ）と比較して、ＧＭＡ糸を用いた方が少ない溶出液量で溶出できることが判った（図１０）。
以上の結果より、各抗ＥＳ抗体固定化担体のＥ２の吸着能は同程度であったが、溶出パターンからみると、ＧＭＡ糸が他の担体に比べて最もシャープであり、濃縮効率が顕著に高いことが示された。更に、ＧＭＡ糸は抗体の結合操作が簡便である等、ハンドリング面でも優れていた。
参考例１  抗環境ホルモンポリクローナル抗体の作製
図１１に抗エストロゲン抗体の作製を例として作製法の概要を示す。
（１）ハプテンの作製
ｉ）エストロゲン類ポリクローナル抗体取得用ハプテン（Ｅ３−１６Ｇ）の作製  エストリオール１６α−（β−Ｄ−グルクロナイド）（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｅ−１８７７）（以下Ｅ３−１６Ｇと略）を購入し、ハプテン（Ｅ３−１６Ｇ）として使用した。
ｉｉ）樹脂可塑剤類ポリクローナル抗体取得用ハプテン（ＤＥＨＰ−１）の作製  下記の通り合成したものを、ハプテン（ＤＥＨＰ−１）として使用した。
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［第１工程：ジフェニルメチルエステルの合成］
８−ブロモオクタン酸（１）１０ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３００ｍｌに溶解し、氷冷下、ジフェニルジアゾメタン溶液約２０ｍｌを添加し１時間、さらに室温で終夜撹拌しながら反応させ反応物を減圧濃縮し、シリカゲルカラム（３００ｇ）にかけ、ヘキサン−酢酸エチル（９：１）で溶出し、単黄色油状物（粗２）２０ｇを得た。
［第２工程：ＤＢＵを用いたフタル酸エステル化］
８−ブロモオクタン酸ジフェニルメチルエステル（粗２）２０ｇ、フタル酸２．４２ｇと１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）をベンゼン６０ｍｌ中で加熱還流、終夜反応させ、さらに、ＤＢＵ２．２ｇを追加し、加熱還流を６時間し、室温に冷却後、水、クロロホルムを加え撹拌後、分液、水洗、亡硝乾燥後、減圧濃縮物を、シリカゲルカラム（３００ｇ）にかけ、ヘキサン−酢酸エチル（９：１）ついで同（２：１）で溶出し、フタル酸エステル（３）８．２ｇを得た。
［第３工程：接触還元による脱ジフェニルメチル化］
ＴＨＦ１００ｍｌにフタル酸エステル（３）４．１ｇを溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％ｗｅｔ品）０．４ｇを加え、Ｈ２を０．３ｍｌ／ｍｉｎで５時間吹き込み、さらに、１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％ｗｅｔ品）１．２ｇを追加し、Ｈ２を０．５ｍｌ／ｍｉｎで２時間吹き込んだ。触媒を濾去後、減圧濃縮液をＯＤＳカラム（Ｄａｉｓｏ  ｓｐ−１２０  ３０／５０μｍ；３×５０ｃｍ）にかけ、７５％ＭｅＯＨで溶出し、淡黄色油状物２．１ｇを得た。これを、酢酸エチルに溶解し、濾過後減圧濃縮し、エーテルに溶解、減圧濃縮し、淡黄色油状物（４）を得た。１Ｈ−ＮＭＲで目的構造を確認し、ＨＰＬＣ純度は９９％以上であった。
ｉｉｉ）樹脂成分類ポリクローナル抗体取得用ハプテン（ＢＰＡ−２）の作製
下記の通り合成したものをハプテン（ＢＰＡ−２）として使用した。
［第１工程］
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ビスフェノールＡ（５）１．５ｇ（６．５７ｍｍｏｌ）、４−ブロモブチロニトリル（６）０．９７ｇ（６．５７ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム０．６５ｇ（６．５７ｍｍｏｌ）を乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍｌに溶解し、室温で一晩撹拌した。得られた反応物をメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）５０ｍｌ、飽和食塩水５０ｍｌおよび水５０ｍｌで抽出し、飽和食塩水（５０ｍｌ×３）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して無色オイル（２．２３ｇ）を得た。これをクロロホルム／メタノール＝１０：１を展開溶媒としたシリカゲル（Ｄａｉｓｏｇｅｌ  ＩＲ−６０；１００ｇ）カラムクロマトグラフィーに付し、さらにクロロホルム／メタノール＝１０：１を展開溶媒としたシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０；５０ｇ）カラムクロマトグラフィーに付した。次いで、クロロホルムを展開溶媒としたシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０；５０ｇ）カラムクロマトグラフィーに付し、白色結晶（７）０．６ｇ（２．０３ｍｍｏｌ、収率３１％）を得た。
［第２工程］
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ビスフェノールＡ誘導体（７）０．６ｇ（２．０３ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム０．５７ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）、エタノール１０ｍｌおよび水１０ｍｌを混合し、８０℃で一晩撹拌した。エタノールを留去後、１Ｎ塩酸で酸性にし、酢酸エチル２０ｍｌで抽出した。飽和食塩水（５０ｍｌ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して白色結晶（０．５ｇ）を得た。イソプロピルエーテル、ヘキサンで洗浄した後、クロロホルム／メタノール＝１０／１を展開溶媒としたシリカゲル（Ｄａｉｓｏｇｅｌ  ＩＲ−６０；５０ｇ）カラムクロマトグラフィーに付し、次いで展開溶媒をクロロホルム／メタノール＝１／０→１０／１としたシリカゲル（Ｄａｉｓｏｇｅｌ  ＩＲ−６０；５０ｇ）カラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサンで洗浄して白色結晶（８）１５９ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ、収率２５％、ＨＰＬＣ純度９７．８％）を得た。
（２）免疫原の作製
ハプテン０．１０ｍｍｏｌを１ｍｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した（Ａ液）。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）０．１４ｍｍｏｌとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳＩ）０．１４ｍｍｏｌを１ｍｌＤＭＳＯに溶解した（Ｂ液）。Ａ液をＢ液に滴下し、撹拌しながら室温で一晩反応させ、ハプテン活性化エステルを作成した。
スカシ貝ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、ＫＬＨ）１０ｍｇ（０．１４５μｍｏｌ）を１ｍｌの０．１３ｍｏｌ１／Ｌ  ＮａＨＣＯ３に溶解し、上記ハプテン活性化エステルをハプテン：ＫＬＨ＝５０：１のモル比となるよう添加し、４℃で一晩攪拌しながら反応した。つぎに、４℃でＰＢＳに対し透析し、得られた免疫用抗原は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）にて蛋白質濃度を測定後、０．５ｍｇ／ｔｕｂｅとなるように分注し、−２０℃に保存した。
（３）標識抗原の作製
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＥＩＡ用、ベーリンガーマンハイム））５ｍｇ（０．１１８μｍｏｌ）を５ｍｌの０．１３Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶解し、ハプテン：酵素＝５：１のモル比となるよう、上記活ハプテン性化エステルを添加した。４℃で一晩反応後、分画分子量３０，０００のセントリコンＹＭ−３０（アミコン）を用い限外濾過濃縮し、ＰＢＳにて３回洗浄して、各環境ホルモンの酵素標識抗原を得た。
（４）抗体価測定用抗原の作製
オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）１０ｍｇ（０．１４５μｍｏｌ）を１ｍｌの０．１３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３に溶解し、上記ハプテン活性化エステルをハプテン：ＯＶＡ＝５０：１のモル比となるよう添加し、４℃で一晩攪拌しながら反応させた。つぎに、４℃でＰＢＳに対し透析し、得られた抗体価測定用抗原は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）にて蛋白質濃度を測定後、０．５ｍｇ／ｔｕｂｅとなるように分注し、−２０℃に保存した。
（５）ポリクローナル抗体の作製
１）免疫
免疫原（ハプテン−ＫＬＨ）０．５ｍｇを１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）（Ｆｒｅｕｎ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ社製）と等量混合し、全量をウサギ１匹に対して数カ所に分けて皮下注射した。以後、同様の免疫を２週間間隔で行った。２次免疫にはフロインド完全アジュバントを、３次免疫以降はフロインド不完全アジュバント（ＦＩＡ）（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）を用いた。
２）血清サンプリング
３次免疫以降、免疫１週間後にウサギ外縁耳静脈から血清をサンプリングした。サンプリングした血清にはアジ化ナトリウムを０．１％となるように添加し、抗体価測定時まで冷蔵保存した。
３）抗体価の測定
〔アッセイプレートの作成〕
ハプテン−ＯＶＡ（５００μｇ）を５０ｍｌのＰＢＳで希釈した。９６ｗｅｌｌマイクロプレート（コースター）に１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。４℃で１晩保存後、３００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで４倍希釈したブロックエース（大日本製薬、品番ＵＫ−Ｂ２５）（０．０１％チメロサール入り）を、２００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。４℃で１晩以上保存後使用した。
〔酵素標識二次抗体の希釈〕
酵素標識二次抗体（ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ−ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤ  ＧＯＡＴ  ＩＧＧ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＭＯＵＳＥ  ＩＧＧ（ＷＨＯＬＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＥ、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ｃａｔａｌｏｇ  ＃５５５５０）を、５０μｌずつチューブに分注し−２０℃に保存した（酵素標識二次抗体原液）。チューブ１本をＰＢＳ２．５ｍｌに溶解し、１００μｌずつチューブに分注し−２０℃に保存した（酵素標識二次抗体希釈液）。
〔発色基質〕
ＨＲＰ用基質キットとしてはパーオキシダーゼ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７２−１０６７）を使用した。
〔抗体価の測定〕
血清サンプルを、希釈用マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）を使用し、ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０添加）で２００倍から段階希釈（１２０μｌ／ｗｅｌｌ）し、３００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄したアッセイ用マイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ添加する。プレートシール（住友ベークライト、品番ＭＳ−３０００２０）を貼り、室温で１時間反応した。３００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄後、酵素標識二次抗体希釈液１００μｌを１０ｍｌ  ＰＢＳに溶解して５０００倍希釈した酵素標識二次抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。プレートシールを貼り、室温で１時間反応後、３００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄し、基質キット記載の方法で発色させ、プレートリーダーで吸光度を測定した。
４）ウサギ抗血清よりの抗体精製
〔硫安沈殿〕
抗体価の上昇したウサギより全採血後、抗血清を取得、生理食塩水で２倍希釈後、飽和硫安（１００％）を４０％となるように添加した。室温で１時間混合した後、遠心操作（１００００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）を行い、沈殿を取得した。沈殿を泡立てないように生理食塩水に溶解後、水、生理食塩水、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して順に透析した。
〔イオン交換クロマトグラフィーによる精製〕
血清３０ｍｌに対しＤＥ−５２セルロース（ワットマン製）を６０ｍｌ充填し、透析物をアプライした。約１Ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２４時間かけて流し、ＩｇＧ画分を分取した。取得したＩｇＧ画分は５ｍｇ／ｔｕｂｅに分注後、−２０℃で保存した。
以上の工程の結果の概要は下記のとおりである。
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Ｅ３−１６Ｇ−ＫＬＨ免疫ウサギでは、３次免疫（免疫回数３回）で抗体価は平衡に達し、ウサギ１羽から１６８ｍｇの精製抗エストロゲンポリクローナル抗体が得られた。この精製抗体のＥ２＝１００％としたときの交差反応性は表１０のとおりであり、１７β−エストラジオール（Ｅ２）、エストロン（Ｅ１）、エストリオール（Ｅ３）等にも交差反応性を有していることから、エストロゲン（女性ホルモン）類全てを濃縮あるいはクリーンアップ可能であることが判明した。
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また、ＤＥＨＰ−１−ＫＬＨ免疫ウサギでも、３次免疫（免疫回数３回）で抗体価は平衡に達し、ウサギ１羽から２５２ｍｇの精製抗樹脂可塑剤類抗体が得られた。この精製抗体のＤＢＰ＝１００％としたときの交差反応性は表１１のとおりであり、アルキル鎖が２（エチル）から７（ヘキシル）迄の種々の樹脂可塑剤に交差反応性を有していることから、多くの樹脂可塑剤類を濃縮あるいはクリーンアップ可能であることが判明した。
2003101611.tif 000024
また、ＢＰＡ−２−ＫＬＨ免疫ウサギでも、６次免疫（免疫回数６回）で抗体価は平衡に達し、ウサギ１羽から１７８ｍｇの精製抗樹脂製分類抗体が得られた。この精製抗体のＢＰＡ＝１００％としたときの交差反応性は表１２の通りであり、ＢＰＡに特異性が高いことから、ＢＰＡのみを特異的に濃縮あるいはクリーンアップ可能であることが判明した。
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参考例２
１．モノクローナル抗体の取得
１−１  ハプテンの作成
（１）エチニルエストラジオール抗体用ハプテンの作成
エチニルエストラジオール（ＥＥ２）１．０ｇとナトリウムメチラート０．７６ｇをエタノール３５ｍｌに溶解し、更にモノクロル酢酸０．４１ｇを添加した後、２２時間加熱還流した、減圧濃縮後、水、酢酸エチル各約１００ｍｌを加えて分液した。水層を酢酸エチル５０ｍｌで洗浄後、濃塩酸で水層を酸性化した（ｐＨ１−２）。酢酸エチル１００ｍｌおよび５０ｍｌで抽出後、有機層を飽和食塩水３０ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて脱水した。減圧濃縮液を−２０℃で２日間静置することにより一部が結晶化した。この一部を採取し、種結晶とした。濃縮液を少量のアセトンに溶解し、ヘキサンおよび種結晶を加え結晶を沈殿させた。濾取した結晶を減圧乾燥することにより目的物ＥＥ２−３−カルボキシメチルエーテル（ＥＥ２−３ＣＭＥ）を取得した。
（２）１７β−エストラジオール抗体用ハプテンの作成
１７β−エストラジオール（Ｅ２）１．０ｇとナトリウムメチラート０．８２ｇをエタノール３５ｍｌに溶解し、更にモノクロル酢酸０．４５ｇを添加した後、２日間加熱還流した、減圧濃縮後、水約３００ｍｌ、酢酸エチル約２００ｍｌを加えて分液した。水層を酢酸エチル５０ｍｌで洗浄後、濃塩酸で水層を酸性化した（ｐＨ１−２）。酢酸エチル１００ｍｌで２回抽出後、有機層を飽和食塩水３０ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて脱水した。減圧濃縮液を少量のアセトンに溶解し、イソプロピルエーテル（ＩＰＥ）を加え結晶を沈殿させた。濾取した結晶をＩＰＥにて洗浄後、減圧乾燥することにより目的物Ｅ２−３−カルボキシメチルエーテル（Ｅ２−３ＣＭＥ）を取得した。
（３）エストロン抗体用ハプテンの作成
エストラジオール−３，１７−ジアセテート（Ｅ２−３，１７−ｄｉＡｃｅ）２０ｇを酢酸２５ｍｌに溶解し、これを冷やしながら無水クロム酸９ｇ、酢酸２７ｍｌ、水４ｍｌの混液の４／５を徐々に加える。一夜攪拌後、水を加えてクロロホルムで抽出し、炭酸カリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮した。濃縮液をベンゼンに溶解後、カラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ  ｇｅｌ  ２ｗ）にかけ、熱ベンゼンで溶出し、粗６−オキソ−Ｅ２−３，１７−ｄｉＡｃｅを分取した（ＴＬＣで確認しながら原料を除去）。本物質を２−メトキシ−エタノールに溶解し、２０％ＮａＯＨを同量加え、１００℃、１時間反応させた。希塩酸にて酸性化後、酢酸エチルで溶出し、硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮し、メタノールから再結晶させた（６オキソ−Ｅ２）。６オキソ−Ｅ２  ３００ｍｇをエタノール２ｍｌに溶解し、炭酸カリウム微細粉末を５０ｍｇ添加し、ベンジルブロマイド５０μｌを添加し、撹拌（７０℃，２時間）し、濃縮物をメタノールを用い、再結晶化した（６−オキソ−Ｅ２−３−ベンジルエーテル）。６−オキソ−Ｅ２−３−ベンジルエーテルをメタノールに溶解し、カルボキシメトキシルアミン・１／２ＨＣｌとナトリウムメトキシド（１．２モル量）を少量の水で溶かし、メタノールで薄めて加えた。室温で１時間反応させ、２／３を蒸発させ、水とＨＣｌで酸性化後、酢酸エチル抽出、硫酸ナトリウムで脱水した。ヘキサンに溶解後、シリカゲルカラムに供与し、メタノールで溶出することにより、精製後、メタノールから再結晶させた。再結晶した物質０．６ｇをアセトン２ｍｌに溶解し、無水クロム酸１ｇ、酢酸５ｍｌ、水１ｍｌの混液の半分を加え、発熱が終了後、酢酸エチルにより、抽出し、蒸発乾固した（６−オキソ−Ｅ１−３−ベンジルエーテル）。６−オキソ−Ｅ１−３−ベンジルエーテル４００ｍｇをメタノール５ｍｌに溶解し、５％Ｐｄ・Ｃ１００ｍｇを加え水素を通して攪拌した。１時間反応後蒸発乾固させ、メタノールから再結晶させることにより、目的物６−オキソ−Ｅ１−６カルボキシメチルオキシム（Ｅ１−６ＣＭＯ）を取得した。
１−２  免疫原の調製
１−１で得られた３種のハプテンについてそれぞれ、ハプテン０．１モル、水溶性カルボジイミド０．１４モル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．１４モルをジメチルスルホキシド２ｍｌ中で一晩反応させて、活性化エステルを作成した。次にスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）１０ｍｇを０．１３モル重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）溶液に溶解し、本活性化エステル２００μｌを添加後、一晩４℃で反応させた。ダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対する透析により未反応の試薬を除去し、免疫原として凍結保存した。
１−３  免疫
１−２で得られた免疫原を５００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、等量のフロイントアジュバントまたはＲＩＢＩアジュバントシステムに添加した。充分乳濁後、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（メス）に１００μｇ／マウスで皮下投与し、２週間（フロインド）もしくは３週間（ＲＩＢＩ）間隔で追加免疫を実施した。５〜６回の追加免疫後、最大の血清抗体価を示した個体について、同免疫原を静脈投与し（５０μｇ／０．１ｍｌ  ＰＢＳ／マウス）最終免疫とした。
１−４  細胞融合
１−３で最終免疫を実施したマウスから脾臓を摘出し（最終免疫から３日後）、脾臓細胞を調製した。別途培養したマウスミエローマ細胞と脾臓細胞を１：５の割合でポリエチレングリコール（平均分子量４０００）存在下で接触させ、細胞融合を実施し、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。このハイブリドーマをＨＡＴ培地に懸濁後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに巻き込み、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で培養した。
１−５  ハイブリドーマのスクリーニング
（１）アッセイプレートの作成
ヤギ抗マウスＩｇＡＧＭ抗体（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ製、＃５５４６１）をＰＢＳに５０μｇ／ｍｌで溶解し、マイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。４℃で一晩反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）にて洗浄後（３００μｌ／ｗｅｌｌで２回）、ＰＢＳにて４倍稀釈したブロックエース（雪印乳業（株）、東京）を２００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。４℃で一晩以上反応させた後、使用時まで冷蔵で保存した。
（２）抗原酵素複合体（標識抗原）の作成
１−１で作成した３種のハプテンについてそれぞれ、ハプテン０．１モル、水溶性カルボジイミド０．１４モル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．１４モルをジメチルスルホキシド２ｍｌ中で一晩反応させて、活性化エステルを作成した。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１０ｍｇを０．１３モル重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）溶液１０ｍｌに溶解し、本活性化エステル１５μｌを添加後、一晩４℃で反応させた。限外ろ過により未反応の試薬を除去し、３ｍｇ／ｍｌの濃度で冷蔵保存した。
（３）１次スクリーニング（抗原結合能試験）
１−４で細胞を巻き込んだマイクロプレートについて、細胞の増殖が確認されたｗｅｌｌの培養液１００μｌを（１）で作成したアッセイプレート（使用前にＰＢＳ（またはＴ−ＰＢＳ）にて洗浄後（３００μｌ／ｗｅｌｌで２回））へ添加した。室温で１時間反応後、Ｔ−ＰＢＳにて洗浄し（３００μｌ／ｗｅｌｌで３回）、１−５（２）で作成した目的抗体の標識抗原をＴ−ＰＢＳに５０００倍希釈して、マイクロプレートに添加した。室温で１時間反応後、Ｔ−ＰＢＳにて洗浄し（３００μｌ／ｗｅｌｌで３回）、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質キット（日本バイオ・ラッド、東京、＃１７２−１０６６：以下発色基質）を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。３０分室温で反応後、１Ｎリン酸を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、発色反応を停止させた。４５０ｎｍの波長で吸光度を読みとり、吸光度１を越える細胞については２４ｗｅｌｌマイクロプレートへスケールアップした。
（４）２次スクリーニング（女性ホルモン阻害試験）
１−５（３）で２４ｗｅｌｌマイクロプレートへスケールアップした細胞について、充分な細胞増殖が確認されたｗｅｌｌの培養液を（１）で作成したアッセイプレート（使用前にＰＢＳ（またはＴ−ＰＢＳ）にて洗浄後（３００μｌ／ｗｅｌｌで２回））へ１００μｌずつ複数のｗｅｌｌに添加した。室温で１時間反応後、Ｔ−ＰＢＳにて洗浄し（３００μｌ／ｗｅｌｌで３回）、測定対象とする女性ホルモン（１ｎｇ／ｍｌ  ｉｎ  １０％メタノール（以下ＭｅＯＨ））、もしくは１０％ＭｅＯＨのみ（対照）と目的抗体の標識抗原（Ｔ−ＰＢＳで５０００倍希釈）を等量混合し、マイクロプレートに添加した。室温で１時間反応後、Ｔ−ＰＢＳにて洗浄し（３００μｌ／ｗｅｌｌで３回）、発色基質を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。３０分室温で反応後、１Ｎリン酸を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、発色反応を停止させた。４５０ｎｍの波長で吸光度を読みとり、対照と比較して、女性ホルモンの存在により吸光度の低下が２０％以上確認された細胞について常法に従いクローニングを実施し、下記の通り目的抗体産生ハイブリドーマ株を取得した。
（１）抗エストラジオールモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞
Ｅ２−７３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６９）、
（２）抗エストロンモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞
Ｅ１−４２０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６８）、
（３）抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞
ＥＥ２−２２７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６７）、
（４）抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞
ＥＥ２−３株
（この株より得られた抗体の洗剤に対する耐性度は、ＥＥ２−２７７株のものと同程度である。）
（５）エチニルエストラジオール抗モノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞
ＥＥ２−８−１８株
（この株より得られた抗体の洗剤に対する耐性度は、ＥＥ２−２７７株のものよりやや低い。）
上記マウスハイブリドーマ細胞Ｅ２−７３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６９）、マウスハイブリドーマ細胞Ｅ１−４２０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６８）、マウスハイブリドーマ細胞ＥＥ２−２２７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６７）は、ブダペスト条約の下、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２００１年４月２５日から、上記の受託番号で寄託されている。
参考例３
（１）抗エストラジオールモノクローナル抗体のＮ末端アミノ酸配列の決定
抗エストラジオールモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞（Ｅ２−７３株）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６９）培養上清よりＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎ（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ，エア・ブラウン（株）より購入）を用い精製された抗体蛋白質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により重鎖、軽鎖に分離精製し、ＰＶＤＦ膜に転写を行った。ポンソーＳにより染色後、蛋白質バンドを切り出した。切り出した膜上の蛋白質を、Ｐｆｕ  Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（宝酒造（株）より購入）２ｍＵで５０℃、１７時間処理を行った後、気相プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９４アプライドバイオシステムズジャパン）でＮ末端アミノ酸配列の決定を行い下記の結果を得た。
Ｅ２−７３重鎖：ＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳ
Ｅ２−７３軽鎖：ＤＩＶＭＴＱＳＰＴＦＬＳＴＳＬＧＤＫＩＴ
（２）抗エストラジオールモノクローナル抗体ｍＲＮＡの精製
抗エストラジオールモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞（Ｅ２−７３株）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６９）１Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを、ＲＮＡ調製溶液（ＩＳＯＧＥＮ溶液、和光純薬より購入）１ｍｌに懸濁し細胞を破壊し、マニュアルに従い細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍの吸光度から濃度を求め、得られたＲＮＡ約１００μｇよりｍＲＮＡ精製キット（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、宝酒造（株）より購入）を用い、約１．５μｇのｍＲＮＡを得た。
（３）抗エストラジオールモノクローナル抗体重鎖、軽鎖可変領域ｃＤＮＡ断片の取得と塩基配列の決定および重鎖、軽鎖各可変領域のアミノ酸配列の推定
ｃＤＮＡの合成は、軽鎖、重鎖用にｍＲＮＡ各約１００ｎｇを使い、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ−αＴＭ（東洋紡（株）より購入）を用いて行った。
次に、各鎖ｃＤＮＡ断片の増幅は、実施例１で得られたＮ末アミノ酸シーケンスから案出した下記に示す重鎖用プライマーと軽鎖用プライマーを用い、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（東洋紡（株）より購入）酵素を用い、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（バイオメトラより購入）で、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ２分、反復回数３０回でＰＣＲ反応を行った。
2003101611.tif 000026
2003101611.tif 000027
これにより、抗エストラジオールモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の可変領域に対するｃＤＮＡ断片を得た。各断片は、電気泳動後の２％アガロースより、マイクロスピンカラム（アマシャムファルマシアバイオテク（株）より購入）を用いて精製した。次に、ダイデオキシ法を用いて、各可変領域ｃＤＮＡの塩基配列を決定し、そのアミノ酸配列を推定した。シーケンス用プライマーは上記ＰＣＲ用のものを用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパンより購入）によりＰｅｒｓｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（バイオメトラより購入）で反応を行った後、ＤＮＡシーケンサー３１０（アプライドバイオシステムズジャパン）で塩基配列を決定した。
（４）抗エストラジオールモノクローナル抗体重鎖、軽鎖各可変領域ｃＤＮＡの１本鎖化（１本鎖可変部位抗体；ｓｃＦｖ）とｓｃＦｖ断片を含むプラスミドの構築
得られた重鎖、軽鎖の各断片をペプチドリンカー（（ＧＧＧＧＳ）Ｘ３）で繋ぎ、１本鎖（ｓｃＦｖ）とした。ｓｃＦｖ  ＤＮＡ断片をＨｉｎｃＩＩ切断ｐＵＣ１９にライゲーションキット（宝酒造より購入）を用いてライゲーションを行い、反応後ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡より購入）に加え、形質転換を行った。形質転換体よりプラスミドを精製し、ダイデオキシ法を用いて、ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した。そして上記の各可変領域の塩基配列との一致を確認し、（配列番号１および３）、アミノ酸配列を決定した（配列番号２および４）。
即ち、配列番号１はマウスハイブリドーマ細胞Ｅ２−７３株の産生する抗体の重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を示し、配列番号２はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号３はマウスハイブリドーマ細胞Ｅ２−７３株の産生する抗体の軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を示し、配列番号４はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
（５）抗エストラジオールモノクローナル抗体可変領域の発現
抗エストラジオールモノクローナル抗体可変領域のｃＤＮＡを発現させるため、リコンビナントファージ生産システム（アマシャムファルマシアバイオテクより購入）を使用した。このシステムを利用するために上記のプラスミドより制限酵素ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩにより切り出したｓｃＦｖとｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅファージミド（アマシャムファルマシアバイオテクより購入）をＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＥＢより購入）を用いてライゲーションし、プラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ／Ｅ２−７３ｓｃＦｖＨＬを得た。得られたプラスミドを、ＴＧ１コンピテントセル（大腸菌ＴＧ−１）（東洋紡より購入）にエレクトロポーレーションによって形質転換し、プラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ／Ｅ２−７３ｓｃＦｖＨＬを保持する形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧ／ｐＣＡＮ−Ｅ２ｓｃＦｖＨＬを製造した。当該大腸菌形質転換体は、ブダペスト条約の下、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。以下にその受託番号および受託日を示す。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧ／ｐＣＡＮ−Ｅ２ｓｃＦｖＨＬ
寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９１２
受託日：２００２年２月２２日
さらに、このようにして得られた形質転換体にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（アマシャムファルマシアバイオテクより購入）を用いることにより抗体発現ファージを得た。その後、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってこのファージでの発現ｓｃＦｖ抗体のエストラジオールに対する反応性を確認した。ＥＬＩＳＡはまず、プレートにハプテン蛋白質複合体（β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ６−（ｏ−ＣＡＲＢＯＸＹ−ＭＥＴＨＹＬ）ＯＸＩＭＥ：ＢＳＡ  ＳＩＧＭＡより購入）を１００μｌ加えて、４℃で一晩静置した。その後、３％スキムミルクでブロッキングを１．５時間、３７℃で行い、ＰＢＳで２回洗浄後、発現したｓｃＦｖと終濃度１ｍｇ／ｍｌ、０．０３７ｍｇ／ｍｌ、０ｍｇ／ｍｌの遊離抗原を混ぜたものをプレートに１００μｌ加えて室温で３時間静置した。その後、０．５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで２回、ＰＢＳで１回洗浄し、そこに５００倍希釈したＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３：第二抗体（アマシャムファルマシアバイオテクより購入）を１００μｌ加えて室温で２時間静置した。その後、０．５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで２回、ＰＢＳで１回洗浄し、基質溶液（０．２％ｏ−フェニレンジアミン溶液、０．００３％Ｈ２Ｏ２）を加え、室温で２０分反応させた後反応停止液（４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を加え、吸光度を（４９２ｎｍ）測定した（図１２）。得られた結果より、本ｓｃＦｖが女性ホルモン結合能を有していることが確認できた。
参考例４
（１）抗エストロンモノクローナル抗体のＮ末端アミノ酸配列の決定
抗エストロンモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞（Ｅ１−４２０株）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６８）培養上清よりＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎ（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ，エア・ブラウン（株）より購入）を用い精製された抗体蛋白質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により重鎖、軽鎖に分離精製し、ＰＶＤＦ膜に転写を行った。ポンソーＳにより染色後、蛋白質バンドを切り出した。切り出した膜上の蛋白質を、Ｐｆｕ  Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（宝酒造（株）より購入）２ｍＵで５０℃、１７時間処理を行った後、気相プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９４アプライドバイオシステムズジャパン）でＮ末端アミノ酸配列の決定を行い下記の結果を得た。
Ｅ１−４２０重鎖：ＩＱＬＶＥＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳ
Ｅ１−４２０軽鎖：ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡ
（２）抗エストロンモノクローナル抗体ｍＲＮＡの精製
抗エストロンモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞（Ｅ１−４２０株）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６８）１Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを、ＲＮＡ調製溶液（ＩＳＯＧＥＮ溶液、和光純薬より購入）１ｍｌに懸濁し細胞を破壊し、マニュアルに従い細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍの吸光度から濃度を求め、得られたＲＮＡ約１００μｇよりｍＲＮＡ精製キット（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、宝酒造（株）より購入）を用い、約１．５μｇのｍＲＮＡを得た。
（３）抗エストロンモノクローナル抗体重鎖、軽鎖可変領域ｃＤＮＡ断片の取得と塩基配列の決定および重鎖、軽鎖各可変領域のアミノ酸配列の推定
ｃＤＮＡの合成は、軽鎖、重鎖用にｍＲＮＡ各約１００ｎｇを使い、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ−αＴＭ（東洋紡（株）より購入）を用いて行った。次に、各鎖ｃＤＮＡ断片の増幅は、上記（１）で得られたＮ末アミノ酸シーケンスから案出した下記に示す重鎖用プライマーと軽鎖用プライマーを用い、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（東洋紡（株）より購入）酵素を用い、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（バイオメトラより購入）で、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ２分、反復回数３０回でＰＣＲ反応を行った。
2003101611.tif 000028
これにより、抗エストロンモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の可変領域に対するｃＤＮＡ断片を得た。各断片は、電気泳動後の２％アガロースより、マイクロスピンカラム（アマシャムファルマシアバイオテク（株）より購入）を用いて精製した。
その後、ダイデオキシ法を用いて、各可変領域ｃＤＮＡの塩基配列を決定し、そのアミノ酸配列を推定した。シーケンス用プライマーは上記ＰＣＲ用のものを用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパンより購入）によりＰｅｒｓｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（バイオメトラより購入）で反応を行った後、ＤＮＡシーケンサー３１０（アプライドバイオシステムズジャパン）で塩基配列を決定し（配列番号５および７）、アミノ酸配列を決定した。（配列番号６および８）
即ち、配列番号５はマウスハイブリドーマ細胞Ｅ１−４２０株の産生する抗体の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号６はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号７はマウスハイブリドーマ細胞Ｅ１−４２０株の産生する抗体の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号８はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
参考例５
（１）抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体のＮ末端アミノ酸配列の決定
参考例２で得られた抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞（ＥＥ２−３株，またはＥＥ２−８−１８株）培養上清よりＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎ（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ，エア・ブラウン（株）より購入）を用い精製された抗体蛋白質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により重鎖、軽鎖に分離精製し、ＰＶＤＦ膜に転写を行った。ポンソーＳにより染色後、蛋白質バンドを切り出した。切り出した膜上の蛋白質を、Ｐｆｕ  Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（宝酒造（株）より購入）２ｍＵで５０℃、１７時間処理を行った後、気相プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９４アプライドバイオシステムズジャパン）でＮ末端アミノ酸配列の決定を行い下記の結果を得た。
ＥＥ２−３重鎖：ＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴ
ＥＥ２−３軽鎖：ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴ
ＥＥ２−８−１８重鎖：ＶＱＶＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＬ
ＥＥ２−８−１８軽鎖：ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬ？Ａ？ＶＧ？ＴＶＴ
（２）抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体ｍＲＮＡの精製
参考例２で得られた抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体生産マウスハイブリドーマ細胞（ＥＥ２−３株，またはＥＥ２−８−１８株）１Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを、ＲＮＡ調製溶液（ＩＳＯＧＥＮ溶液、和光純薬より購入）１ｍｌに懸濁し細胞を破壊し、マニュアルに従い細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍの吸光度から濃度を求め、得られたＲＮＡ約１００μｇよりｍＲＮＡ精製キット（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、宝酒造（株）より購入）を用い、夫々約１．５μｇのｍＲＮＡを得た。
（３）抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体重鎖、軽鎖可変領域ｃＤＮＡ断片の取得と塩基配列の決定および重鎖、軽鎖各可変領域のアミノ酸配列の推定
ｃＤＮＡの合成は、軽鎖、重鎖用にｍＲＮＡ各約１００ｎｇを使い、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ−αＴＭ（東洋紡（株）より購入）を用いて行った。次に、各鎖ｃＤＮＡ断片の増幅は、実施例１で得られたＮ末アミノ酸シーケンスから案出した下記に示す重鎖用プライマーと軽鎖用プライマーを用い、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（東洋紡（株）より購入）酵素を用い、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（バイオメトラより購入）で、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ２分、反復回数３０回でＰＣＲ反応を行った。
2003101611.tif 000029
これにより、抗エチニルエストラジオールモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の可変領域に対するｃＤＮＡ断片を得た。各断片は、電気泳動後の２％アガロースより、マイクロスピンカラム（アマシャムファルマシアバイオテク（株）より購入）を用いて精製した。
その後、ダイデオキシ法を用いて、各可変領域ｃＤＮＡの塩基配列を決定し、そのアミノ酸配列を推定した。シーケンス用プライマーは上記ＰＣＲ用のものを用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパンより購入）によりＰｅｒｓｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（バイオメトラより購入）で反応を行った後、ＤＮＡシーケンサー３１０（アプライドバイオシステムズジャパン）で塩基配列を決定し（配列番号９，１１，１３および１５）、アミノ酸配列を決定した。（配列番号１０，１２，１４および１６）
即ち、配列番号９はマウスハイブリドーマ細胞ＥＥ２−３の産生する抗体の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号１０はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号１１はマウスハイブリドーマ細胞ＥＥ２−３の産生する抗体の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号１２はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号１３はマウスハイブリドーマ細胞ＥＥ２−８−１８の産生する抗体の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号１４はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号１５はマウスハイブリドーマ細胞ＥＥ２−８−１８の産生する抗体の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号１６はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
参考例６
（１）５’−Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法による抗アルキルフェノールモノクローナル抗体及び抗アルキルフェノールエトキシレートモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡのクローニング
抗アルキルフェノールモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞ＡＰ−１４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６３３）、及び抗アルキルフェノールエトキシレートモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞ＭＯＦ３−１３９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５９）（いずれも、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／４３７９９号公報の実施例に記載の方法により製造された）、を出発材料とした。まず、１０％の牛胎児血清（ＪＲＨ社より購入）を含むＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ社より購入）で培養した２ｘ１０７個の各ハイブリドーマ細胞から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入）を用いて付属の説明書に従い、約２μｇのｍＲＮＡを各々抽出した。このｍＲＮＡを鋳型として、ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）を用いて付属の説明書に従い、逆転写反応を行って一本鎖ｃＤＮＡを各々合成した。ＡＰ−１４のサブクラスはＩｇＧ２ｂ、κ鎖、ＭＯＦ３−１３９のサブクラスはＩｇＧ１、κ鎖であることが明らかとなっていることから、重鎖ＩｇＧ１の定常領域に特異的なＣｇａｍｍａ１プライマー、重鎖ＩｇＧ２ｂの定常領域に特異的なＣｇａｍｍａ２ｂプライマー、及び軽鎖の定常領域に特異的なＣｋａｐｐａプライマーを合成し、これら３種のプライマーとＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて５’−ＲＡＣＥ法により、ＡＰ−１４及びＭＯＦ３−１３９の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡをそれぞれ単離した。
2003101611.tif 000030
ＲＡＣＥ産物増幅のためのＰＣＲ反応液の組成は、３４．５μＬの滅菌水、５μＬの１０ＸＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）、１μＬの５０ＸＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）、２．５μＬのｃＤＮＡサンプル、５μＬのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）と１μＬの１０μＭ  Ｃｇａｍｍａ１プライマー、１０μＭ  Ｃｇａｍｍａ２ｂプライマー、または１０μＭ  Ｃｋａｐｐａプライマーで全量を５０μＬとし、ＰＣＲは９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で３分の反応を３０回繰り返した。反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可変領域をコードする部分を含むと推測される約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片と、重鎖可変領域をコードする部分を含むと推測される約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。
（２）抗アルキルフェノールモノクローナル抗体及び抗アルキルフェノールエトキシレートモノクローナル抗体の塩基配列の決定
上記（１）で調製した抗体重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社より購入）に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。増殖した大腸菌から組換えｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒを抽出し、ＡＰ−１４及びＭＯＦ３−１３９の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列をダイデオキシ法により決定し、配列番号１７、１９、２１、２３に示す。配列番号１８、２０、２２、２４はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
即ち、配列番号１７はマウスハイブリドーマ細胞ＡＰ−１４株の産生する抗体の重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を示し、配列番号１８はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号１９はマウスハイブリドーマ細胞ＡＰ−１４株の産生する抗体の軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を示し、配列番号２０はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号２１はマウスハイブリドーマ細胞ＭＯＦ３−１３９株の産生する抗体の重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を示し、配列番号２２はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
配列番号２３はマウスハイブリドーマ細胞ＭＯＦ３−１３９株の産生する抗体の軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を示し、配列番号２４はこれに対応するアミノ酸配列を示す。
（３）プライマーの合成
上記（２）で決定したＡＰ−１４及びＭＯＦ３−１３９の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列情報を基に、ＡＰ−１４ｓｃＦｖ及びＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖ遺伝子やキメラ遺伝子を構築するための下記に示す１２種類のプライマーを合成した。
2003101611.tif 000031
（４）抗アルキルフェノールモノクローナル抗体及び抗アルキルフェノールエトキシレートモノクローナル抗体の単鎖可変領域抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子の構築
１）ＡＰ−１４ｓｃＦｖＨＬ遺伝子の構築
ＡＰ−１４ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー０１とプライマー０２を、ＡＰ−１４ＶＬ遺伝子の増幅には、プライマー０３とプライマー０４を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０１とプライマー０４を使用して、後述の手順により、ＡＰ−１４ｓｃＦｖＨＬ遺伝子を構築した。
２）ＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＨＬ遺伝子の構築
ＭＯＦ３−１３９ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー０５とプライマー０６を、ＭＯＦ３−１３９ＶＬ遺伝子の増幅には、プライマー０３とプライマー０４を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０５とプライマー０４を使用して、後述の手順により、ＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＨＬ遺伝子を構築した。
３）ＡＰ−１４ｓｃＦｖＬＨ遺伝子の構築
ＡＰ−１４ＶＬ遺伝子の増幅には、プライマー０７とプライマー０８を、ＡＰ−１４ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー０９とプライマー１０を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０７とプライマー１０を使用して、後述の手順により、ＡＰ−１４ｓｃＦｖＬＨ遺伝子を構築した。
４）ＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＬＨ遺伝子の構築
ＭＯＦ３−１３９ＶＬ遺伝子の増幅には、プライマー０７とプライマー０８を、ＭＯＦ３−１３９ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー１１とプライマー１２を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０７とプライマー１２を使用して、後述の手順により、ＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＬＨ遺伝子を構築した。
５）ＡＰ−１４ＶＨ／ＭＯＦ３−１３９ＶＬ遺伝子の構築
ＡＰ−１４ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー０１とプライマー０２を、ＭＯＦ３−１３９ＶＬ遺伝子の増幅には、プライマー０３とプライマー０４を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０１とプライマー０４を使用して、後述の手順により、ＡＰ−１４ＶＨ／ＭＯＦ３−１３９ＶＬ遺伝子を構築した。
６）ＭＯＦ３−１３９ＶＨ／ＡＰ−１４ＶＬ遺伝子の構築
ＭＯＦ３−１３９ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー０５とプライマー０６を、ＡＰ−１４ＶＬ遺伝子の増幅の増幅には、プライマー０３とプライマー０４を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０５とプライマー０４を使用して、後述の手順により、ＡＰ−１４ＶＨ／ＭＯＦ３−１３９ＶＬ遺伝子を構築した。
７）ＡＰ−１４ＶＬ／ＭＯＦ３−１３９ＶＨ遺伝子の構築
ＡＰ−１４ＶＬ遺伝子の増幅には、プライマー０７とプライマー０８を、ＭＯＦ３−１３９ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー１１とプライマー１２を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０７とプライマー１２を使用して、後述の手順により、ＡＰ−１４ＶＬ／ＭＯＦ３−１３９ＶＨ遺伝子を構築した。
８）ＭＯＦ３−１３９ＶＬ／ＡＰ−１４ＶＨ遺伝子の構築
ＭＯＦ３−１３９ＶＬ遺伝子の増幅には、プライマー０７とプライマー０８を、ＡＰ−１４ＶＨ遺伝子の増幅には、プライマー０９とプライマー１０を使用し、そのｓｃＦｖ遺伝子の構築には、プライマー０７とプライマー１０を使用して、後述の手順により、ＭＯＦ３−１３９ＶＬ／ＡＰ−１４ＶＨ遺伝子を構築した。
遺伝子はＰＣＲにより構築した。まず、重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片を増幅させるために、ＡＰ−１４及びＭＯＦ３−１３９の重鎖もしくは軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡが挿入されたプラスミドと、各々に対応したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、例えばＡＰ−１４の重鎖を増幅する場合、１μＬの５０ＸＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）、５μＬの１０ＸｃＤＮＡ  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）、１μＬの５０ＸｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）、０．５μＬの組換えプラスミド（この場合はＡＰ−１４の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片が挿入された組換えｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）（１００ｎｇ）、０．５μＬのプライマー０１（５０ｐｍｏｌ）、０．５μＬのプライマー０２（５０ｐｍｏｌ）、４１．５μＬの滅菌水で全量を５０μＬとした。ＰＣＲの条件は９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で１分の反応を３０回繰り返した。ＡＰ−１４及びＭＯＦ３−１３９の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡをそれぞれ増幅した後、各反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可変領域をコードする約４００ｂｐのｃＤＮＡ断片と重鎖可変領域をコードする約４００ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅をそれぞれ確認した。ｃＤＮＡ断片をそれぞれ精製した後、重鎖および軽鎖可変領域を連結したｓｃＦｖ遺伝子の構築に用いた。重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、例えばＡＰ−１４の重鎖を増幅する場合、２１．５μＬのＡＰ−１４の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ溶解液、２１．５μＬのＡＰ−１４の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ溶解液、５μＬの１０ＸｃＤＮＡ  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μＬの５０ＸｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、１μＬの５０ＸＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘで全量を５０μＬとした。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の反応を７回繰り返した。その後、１μＬの５０ＸＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ、５μＬの１０ＸｃＤＮＡ  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μＬの５０ＸｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、０．５μＬのプライマー０１（５０ｐｍｏｌ）、０．５μＬのプライマー０６（５０ｐｍｏｌ）、４２μＬの滅菌水で全量を５０μＬとし、前記ＰＣＲ反応液に加えた。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で１分の反応を３０回繰り返した。この反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、約７５０ｂｐのＡＰ−１４ｓｃＦｖ及びＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖ遺伝子断片の増幅を確認し、精製した。
以上の手順で作製した８種類の抗環境ホルモン単鎖可変領域抗体の概念図を図１３に示す。
（５）抗アルキルフェノールモノクローナル抗体及び抗アルキルフェノールエトキシレートモノクローナル抗体のｓｃＦｖ発現プラスミドの構築
上記（４）で調製した８種類の遺伝子のそれぞれをクローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。増殖した大腸菌から、導入した組換えプラスミドを抽出し、当該遺伝子の塩基配列を確認した。当該遺伝子を挿入した組換えプラスミドおよび大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２７ｂを制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩでそれぞれ消化し、当該遺伝子と大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２７ｂを連結して次の発現プラスミド
ｐＥＴ−２７ｂ／ＡＰ−１４ｓｃＦｖＨＬ、
ｐＥＴ−２７ｂ／ＡＰ−１４ｓｃＦｖＬＨ、
ｐＥＴ−２７ｂ／ＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＨＬ、
ｐＥＴ−２７ｂ／ＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＬＨ、
ｐＥＴ−２７ｂ／ＡＰ−１４ＶＨ／ＭＯＦ３−１３９ＶＬｓｃＦｖ、
ｐＥＴ−２７ｂ／ＭＯＦ３−１３９ＶＬ／ＡＰ−１４ＶＨｓｃＦｖ、
ｐＥＴ−２７ｂ／ＭＯＦ３−１３９ＶＨ／ＡＰ−１４ＶＬｓｃＦｖ、
ｐＥＴ−２７ｂ／ＡＰ−１４ＶＬ／ＭＯＦ３−１３９ＶＨｓｃＦｖ、
を構築した。
（６）抗アルキルフェノールモノクローナル抗体及び抗アルキルフェノールエトキシレートモノクローナル抗体のｓｃＦｖの調製
上記（５）で調製した８種類の発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）株に各々導入し、発現プラスミドを導入した形質転換体８株を製造した。
ＡＰ−１４ｓｃＦｖＨＬ発現プラスミドｐＥＴ−２７ｂ／ＡＰ−１４ｓｃＦｖＨＬを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）株に導入した株：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ／ｐＥＴ−ＡＰｓｃＦｖＨＬおよびＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＨＬ発現プラスミドｐＥＴ−２７ｂ／ＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖＨＬを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）株に導入した株：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ／ｐＥＴ−ＭＯＦｓｃＦｖＨＬは、ブダペスト条約の下、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。以下にその受託番号および受託日を示す。
（ａ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ／ｐＥＴ−ＡＰｓｃＦｖＨＬ
寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９１０
受託日：２００２年２月２２日
（ｂ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ／ｐＥＴ−ＭＯＦｓｃＦｖＨＬ
寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９１１
受託日：２００２年２月２２
上記で得られた８種類の形質転換コロニーをそれぞれ２５μｇ／ｍＬのカナマイシン（ナカライテスクより購入）および３３μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ナカライテスクより購入）を含む、５ｍＬの２ＸＹＴ培地（１．７％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ（ナカライテスクより購入）、１％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスクより購入）、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（ナカライテスクより購入））に植菌し、２３℃で一晩振盪培養した。この懸濁液を８００ｍＬのＳＢ培地（３．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ、２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）に懸濁し、２３℃で一晩振盪培養した。この懸濁液にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスクより購入）を終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに２３℃で６時間振盪培養した後、１５００ｇで２０分間遠心分離し、上清を除去した。沈澱した菌体を氷冷した３２ｍＬのＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース（それぞれナカライテスクより購入））に懸濁し、さらに、氷冷した４８ｍＬの０．２ＸＴＥＳ緩衝液（０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍスクロース）を加え、十分に撹拌した。この懸濁液を３０分間氷冷した後、１２０００ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清をＡＰ−１４ｓｃＦｖ及びＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖとして使用した。所定の蛋白質が発現していることを、抗ＨＳＶタグ抗体を用いたウエスタンブロット法（下記）により確認した結果を図１４に示す。８種のｓｃＦｖ抗体（約３０ｋＤａ）が大腸菌内で各々発現していることを確認した。
ウエスタンブロット法：
約１０μｇのｓｃＦｖを各々１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ゲル内のｓｃＦｖをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ブロックエースでブロッキングを行った後、０．１μｇ／ｍＬの抗ＨＳＶ抗体溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間浸透した。洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス抗体抗体溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で３０分間浸透した。洗浄後、発色基質溶液（ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）にＰＶＤＦ膜を浸し、発色反応を行った。
（７）間接競合ＥＬＩＳＡによる抗体性能比較
９６穴マイクロタイタープレートに、５μｇ／ｍＬのハプテンと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）との結合体を１００μＬずつ各ウェルに分注し、４℃で一晩放置した。内容液を除去した後、蒸留水で４倍希釈したブロックエース（大日本製薬より購入）を各ウェルに３００μＬずつ分注し、４℃で一晩放置した。内容液を除去した後、リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ナカライテスクより購入）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で段階的に希釈したノニルフェノールデカエトキシレート標準溶液を各ウェルに５０μＬずつ分注し、実施例６で調製したＡＰ−１４ｓｃＦｖ、またはＭＯＦ３−１３９ｓｃＦｖをリン酸緩衝液で希釈して、各ウェルに５０μＬずつ分注した。２５℃で１時間インキュベートした後、リン酸緩衝液で各ウェルを４回洗浄した。次に、リン酸緩衝液で０．１μｇ／ｍＬに希釈したマウス抗ＨＳＶタグ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入）を各ウェルに１００μＬずつ分注し、２５℃で１時間インキュベートした。リン酸緩衝液で各ウェルを４回洗浄し、リン酸緩衝液で２，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体・抗体（Ｐｉｅｒｃｅ社より購入）を各ウェルに１００μＬずつ分注し、２５℃で１時間インキュベートした。リン酸緩衝液で各ウェルを３回洗浄した後、発色基質溶液（１００ｍｇ／Ｌテトラメチルベンジジン（和光純薬工業より購入）、０．００６％（ｖ／ｖ）過酸化水素水を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に添加）を各ウェルに１００μＬずつ分注した。室温で１０分間インキュベートした後、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ分注して酵素反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
対照として、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体で間接競合ＥＬＩＳＡを行った。前記と同様にハプテンとＢＳＡとの結合体を固定した９６穴マイクロタイタープレートに、リン酸緩衝液で段階的に希釈したノニルフェノールデカエトキシレート標準溶液を各ウェルに５０μＬずつ分注し、ＡＰ−１４またはＭＯＦ３−１３９をリン酸緩衝液で希釈して、各ウェルに５０μＬずつ分注した。２５℃で１時間インキュベートした後、リン酸緩衝液で各ウェルを３回洗浄し、リン酸緩衝液で２，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体・抗体（Ｐｉｅｒｃｅ社より購入）を各ウェルに１００μＬずつ分注し、２５℃で１時間インキュベートした。リン酸緩衝液で各ウェルを３回洗浄した後、前記発色基質溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注した。室温で１０分間インキュベートした後、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ分注して酵素反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を図１５に示す。図１５から明らかなように、作製した抗環境ホルモン単鎖可変領域抗体は抗体として使用可能であった。
産業上の利用可能性
本発明の分離材は、環境ホルモン類を選択的かつ効率的に分離することができるので、これを用いることにより環境中に極く微量しか存在しない環境ホルモン類を、免疫学的に夾雑物の少ない状態で、高倍率かつ効率的に濃縮することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００２−１５９７２８号を基礎としており、その内容は本明細書中に全て包含されるものである。
配列表フリーテキスト
配列番号２５：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２６：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２７：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２８：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２９：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３０：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３１：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３２：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３３：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３４：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３５：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３６：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３７：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３８：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３９：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４０：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４１：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４２：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４３：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４４：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４５：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４６：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４７：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４８：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４９：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５０：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５１：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５２：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５３：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５４：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５５：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【配列表】
2003101611.tif 000032
2003101611.tif 000033
2003101611.tif 000034
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【図面の簡単な説明】
図１は抗ＥＳ抗体固定化多孔性中空糸膜の製造スキームを示す。
図２はＥＳ−ＩＡ糸を使用するＥ２回収用実験装置を示す。
図３はカップリング時間に対する抗ＥＳ抗体固定化量を示す。
図４は種々の抗ＥＳ抗体固定化量についてのＥ２の破過曲線を示す。
図５は固定化抗ＥＳ抗体量に対するＥ２結合量を示す。
図６はＥＳ−ＩＡ（４．８）糸の細孔を通過するＥ２溶液の透過速度への破過曲線の依存性を示す。
図７は多孔性中空糸膜上に固定化された抗ＥＳ抗体量の関数としての溶出率を示す。
図８は抗ＥＳ抗体固定化不織布の製造スキームを示す。
図９はＧＭＡ不織布への抗ＥＳ抗体の固定化の概要と不織布を用いたエストロゲンアフィニティーカラムによるＥ２の回収方法の概要を示す。
図１０は各抗エストロゲン抗体固定化担体のＥ２溶出パターンを示す。
図１１は抗エストロゲン抗体の作製を例とするポリクローナル抗体の作製法の概要を示す。
図１２は参考例３で構築したエストラジオール１本鎖可変領域抗体が１７β−エストラジオールと結合したことを示す。
図１３は参考例６で構築した８種類の抗環境ホルモン類単鎖可変領域抗体の概念図である。
図１４は参考例６で構築した８種類の抗環境ホルモン類単鎖可変領域抗体のウエスタンブロットの図である。
図１５は参考例６で構築した８種類の抗環境ホルモン類単鎖可変領域抗体の性能をＥＬＩＳＡにより比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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