(57)【要約】本発明は、生殖系列キメラ動物の効率的な作製方法およびヘテロ接合体ならびにホモ接合体動物の簡便な作製方法を提供する。具体的には、遺伝的要因により生殖細胞細胞を形成できない初期胚（胚盤胞胚）に対して胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を注入することにより、生殖細胞が注入したＥＳ細胞に由来するキメラ動物を作製する。得られたキメラ動物から得られる雌雄のヘテロ接合体を交配することでホモ接合体を得る。得られたキメラ動物は遺伝子機能の解析などを行う上で極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生殖細胞を形成することができない初期胚と、全能性細胞を用いることを特徴とする、生殖細胞が全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
【請求項２】
生殖細胞を形成することができない初期胚が異種間交雑により得られる受精胚、核移植胚、またはトランスジェニック胚である請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
全能性細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）である請求項１又は請求項２に記載の作製方法。
【請求項４】
全能性細胞が核移植胚あるいは核移植胚由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）である請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項５】
動物がマウスである請求項１〜４のいずれかに記載の作製方法。
【請求項６】
生殖細胞を形成することができない初期胚が実験用マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）とその同胞異種関係にあるＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓのマウスとの正逆の交配或は体外授精で得られる受精胚である請求項５に記載の作製方法。
【請求項７】
生殖細胞を形成することができない初期胚がｃ−ｋｉｔ変異によりなされる受精胚である請求項１〜５のいずれかに記載の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来するキメラ動物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物。
【請求項１１】
動物がマウスである請求項８〜１０のいずれかに記載のキメラ動物。
【請求項１２】
生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物と、所望する系統の雌性動物とを交配するか、又は、前記雄性キメラ動物から得られた精子を、所望する系統の卵子に体外授精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
【請求項１３】
生殖細胞が導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物と、所望する系統の雄性動物とを交配するか、又は、前記雌性キメラ動物から得られた卵子を所望する系統の精子に体外受精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
【請求項１４】
請求項９および１０により得られるキメラ動物の雌雄を交配、人工授精、体外授精、或は顕微授精することで得られるホモ接合体動物の作製方法。
【請求項１５】
動物がマウスである請求項１２〜１４のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１４のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物。
【請求項１７】
請求項１２〜１４のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の雌雄を交配することにより得られるホモ接合体動物。
【請求項１８】
動物がマウスである請求項１６又は１７に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明は、遺伝的に生殖細胞を形成できない初期胚（一般に胚盤胞）と全能性細胞を用いることにより、生殖細胞が形成されたキメラ動物の作製方法、および得られる個体の生殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物に関する。ここで言う全能性細胞とは生殖細胞に分化しうる多能性細胞である。更に、該キメラ動物から得られるヘテロ接合体動物およびホモ接合体動物に関する。
［背景技術］
発生工学技術の進歩により確立された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を受精胚に戻して個体に発生させる手法（Ｅｖａｎｓ  ＭＪ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎ  ＭＫ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５４−１５６（１９８１））と相同組換えをＥＳ細胞に施すという手法（Ｚｉｊｌｓｔｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，４３５−４３８（１９８９）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６，３１３−３２１（１９８９））を組み合わせることがマウスを用いて最初に行われ、ノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスの作製技術が確立された。この技術の完成により、これまでは専ら酵母やショウジョウバエでしか行えなかった変異体を作り、遺伝子の機能を探るということが哺乳動物でも行うことができるようになり、ポストゲノム時代の遺伝子機能解析に不可欠な重要な技術の１つとして注目されている。
ノックアウトマウスなどの遺伝子改変動物を効率よく作製するには大きく分けて３つのポイントがある。第１点は優良なＥＳ細胞を樹立すること。第２点はＥＳ細胞において遺伝子改変を効率よく行うこと。第３点は遺伝子改変されたＥＳ細胞がキメラマウスを形成し、得られたキメラマウスにおいてＥＳ細胞で行った遺伝子改変が生殖系列に伝播され次世代に伝達されることにある。
これまでの技術開発のなかで、第１点の優良なＥＳ細胞の樹立はマウスの系統に大きく依存し、樹立の確率が低いことに加え、樹立できたＥＳ細胞は継代を重ねるに従い生殖系列への伝播能を失うため、莫大な労力をつぎ込んで樹立したＥＳ細胞も、出来る限り、継代を繰り返さずに使用しているのが現状である。特に、近交系マウスのＥＳ細胞を用いる場合はその傾向が著しい。
第２点は相同組換え技術およびそれに関連する技術の改善が繰り返され、実用段階の技術として頻繁に利用されている。
第３点には問題点が多い。特に、キメラマウスは作製できたが生殖系列への伝播がないという苦い経験を多くの研究者がしており、ノックアウトマウスの作製においてはこの第３点が大きな壁となっている。このため、実際には、生殖系列への伝播実績があり、出来る限り継代を重ねていないＥＳ細胞を入手して使用する方法が取られているのが現状である。
一方、ＥＳ細胞は受胎産物を構成する全ての細胞系譜において正常な発達を遂げる能力を有するが、個体発生の過程において、注入するＥＳ細胞が注入される受精胚（一般に胚盤胞）に比べて胎盤などの胚外の細胞系譜に寄与する能力が低いと考えられている（Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ  Ｒ  Ｓ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｅ  Ｊ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０５，７３３−７３７（１９８９）；Ｎａｇｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０，８１５−８２１（１９９０））。そこで、ＥＳ細胞と発生分化の方向が主に胚外の胎盤へ偏りがある胚とを組み合わせることで、ＥＳ細胞を胚への発生分化の方向に導き、生殖組織を含む全ての組織がＥＳ細胞に由来するマウスを得る手法が提案されている。この場合には、マウスのＥＳ細胞とマウスの４倍体胚との組み合わせが最も適すると考えられている。すなわち、４倍体胚単独では着床後まで発生することは少なく、妊娠中期に至るものはほとんどない（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｍ  Ｈ  ＆  Ｗｅｂｂ  Ｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０，１１２１−１１３２（１９９０））。４倍体胚と正常な胚（２倍体）とのキメラでは、４倍体細胞は胚自体にはほとんど寄与しない反面、胚外の膜組織へはかなり広範に寄与することが報告されている（Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ  Ａ  Ｋ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．４１，４７−６４（１９７７））。そこで、マウスＥＳ細胞とマウス４倍体胚を組み合わせることで互いに補足し合って会合体キメラを作製する方法が提案されている。この場合には、胎仔はＥＳ細胞に由来するのに対し、大部分の胚外組織は４倍体細胞に由来する極性のあるキメラが作製されることが報告された（Ｎａｇｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０，８１５−８２１（１９９０））。しかし、この手法により、近交系マウスのＥＳ細胞よりキメラ個体を取得できた例は極めて稀であり、得られた場合もキメラマウスは呼吸障害や奇形などの障害を発症して長くは生存できず（Ｅｇｇａｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９８，６２０９−６２１４（２００１））、生殖系列キメラの実用的な作製方法とすることは困難である。
このため、遺伝子改変されたキメラ個体を形成し、得られたキメラ個体におけるＥＳ細胞に由来する遺伝子改変が生殖系列に伝播された次世代の個体を効率よく作製する技術の開発が切望されている。
［発明の開示］
本発明者らは、上述の状況を鑑み、生殖系列キメラの作製方法について鋭意研究を行った。すなわち、本発明が解決すべき課題と目的は、遺伝子改変を施したＥＳ細胞等の全能性細胞を用いてノックアウトマウス等の遺伝子改変動物を効率よく作製することにある。とりわけ生殖系列キメラマウスの効率的な作製方法を構築することにある。すなわち、ノックアウトマウス等の遺伝子改変マウスの作製においては、遺伝子改変したＥＳ細胞を用いたキメラマウスを作製することはできるが、得られたキメラマウスには、遺伝子改変されたＥＳ細胞を生殖系列に伝播できず、遺伝子改変が次世代に伝達されないという問題をこれまでの研究者は経験してきた。改変遺伝子を持った子孫が出来るキメラマウスの作製が望まれ、これを解決する必要に迫られていた。本発明は、このような改変遺伝子が次世代に伝達されないという問題を解決するためになされたものである。
このため生殖細胞を形成することができない初期胚と全能性細胞を用い、この全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物を作製すればよいことに想到し、本発明の完成に到ったものである。ここでいう全能性細胞とは、生殖細胞に分化しうる多能性細胞、すなわちＥＳ細胞・ＥＧ細胞などの幹細胞や、始原生殖細胞、内部細胞塊、核移植胚などの再構築胚を含む。
本発明は生殖細胞を形成することができない初期胚にＥＳ細胞などの全能性細胞を導入し、この全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法及びＥＳ細胞などに施した遺伝子改変が子孫に伝達される動物を提供することを課題とする。
そこで本発明者らは、本課題を解決するためにＥＳ細胞（胚性幹細胞）などの全能性細胞による、生殖系列キメラマウスを効率的に作製する方法を検討した。
なお、本発明において生殖系列キメラとは、キメラ動物の生殖細胞が導入した全能性細胞に由来していることを意味する。一般にＥＳ細胞を用いた生殖系列キメラマウスは、ＥＳ細胞の由来となった系統と毛色の異なる系統との間でキメラマウスを作製し、得られたキメラマウスとＥＳ細胞の由来となった系統と毛色の異なる系統のマウスを交配して、その産仔を得て、ＥＳ細胞の由来となった系統の毛色を確認するまでは生殖系列キメラマウスであるかどうかを確認することができない。また、特に雄性の場合、ＥＳ細胞から生殖細胞が形成されていたとしても、生殖細胞に占めるＥＳ細胞の寄与率が低い場合にはＥＳ細胞の遺伝子を有する産仔を得ることは困難である。また、ＥＳ細胞由来の精子数が少ない場合や精子の活性が低い場合には受精に至らず次世代の産仔を得ることはできない。更に、遺伝子改変をミトコンドリアに施す場合には、ミトコンドリアが卵子由来であるため、雌性のＥＳ細胞を使用して雌性の生殖系列キメラマウスを作製しなければならない。
精巣内又は卵巣内に、ＥＳ細胞に由来する生殖細胞だけを有するキメラマウスを得ることができれば、次世代の産仔は確実にＥＳ細胞に由来した染色体を持つことができ、生殖系列キメラマウスを効率よく作製することができる。仮に、雄性のキメラマウスが得られたが、得られたキメラマウスの精子の数が少ない場合や、精子の活性が低い場合であっても、顕微受精（ＩＣＳＩ）などの技術を用いて容易に次世代産仔を得ることができる。
尚、雌性のキメラマウスの場合には、自然交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精により次世代産仔を取得することができる。
本発明は以上の検討に基づいてなされたもので、生殖系列キメラ動物の作製方法に関する。また、該方法により得られるキメラ動物及び該キメラ動物から得られる遺伝子改変動物に関する。すなわち、本発明は、遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚（一般に胚盤胞）と、全能性細胞とを用いることで、生殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物を作製する方法およびそれにより得られる生殖系列キメラ動物である。本発明における遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚は、異種交雑種第１代が生殖細胞を欠失するという遺伝的要因を利用することで作製することができる。この生殖細胞の欠失が雌雄生殖細胞のいずれに現れるかは動物種により異なる。例えば、マウスでは雄性生殖細胞が欠失する。即ち、実験用マウスのＣ５７ＢＬ／６と異種マウスのＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓとの正逆の交配、或は体外授精により得られる交雑種胚は雄性不稔となる（Ｍａｔｓｕｄａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８８，４８５０−４８５４（１９９１））。また、ｃ−ｋｉｔ変異マウスの、例えばＷｖ／＋マウスとＷ／＋マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚（Ｗｖ／Ｗ又はＷ／Ｗｖ）は、雌雄両性で生殖細胞を形成することができない（不稔／不妊）ので、この遺伝的要因を利用することで雌雄それぞれの生殖細胞を欠いたマウスを作製することができる（Ｋｕｓｓｅｌｌ  ＥＳ，Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２０，３５７−４５９（１９７９））。特に、Ｗｖ／Ｗ又はＷ／Ｗｖ受精胚を用いる場合は雌性のＥＳ細胞を用いて雌性の生殖系列キメラを作製することができる。また、核移植胚またはトランスジェニック胚としても作製することができる。
本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全てＥＳ細胞に由来するため、雄性キメラ動物を交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精して、ＥＳ細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。得られた雌雄のヘテロ接合体を交配してホモ接合体を容易に得ることができる。
更に、雌性の遺伝子改変を施したＥＳ細胞から作製した雌性のキメラ動物を交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精してＥＳ細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。
本発明は以下のような方法とその方法によって作製されるキメラ動物を提供するものである。
（１）生殖細胞を形成することができない初期胚と、全能性細胞を用いることを特徴とする、生殖細胞が全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
（２）生殖細胞を形成することができない初期胚が異種間交雑により得られる受精胚、核移植胚、またはトランスジェニック胚である前記（１）の作製方法。
（３）全能性細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）である前記（１）又は（２）の作製方法。
（４）全能性細胞が核移植胚あるいは核移植胚由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）である前記（１）又は（２）の作製方法。
（５）動物がマウスである前記（１）乃至（４）のいずれかの作製方法。
（６）生殖細胞を形成することができない初期胚が実験用マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）とその同胞異種関係にあるＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓのマウスとの正逆の交配或は体外授精で得られる受精胚である前記（５）の作製方法。
（７）生殖細胞を形成することができない初期胚がｃ−ｋｉｔ変異によりなされる受精胚である前記（１）乃至（５）のいずれかの作製方法。
（８）前記（１）乃至（７）のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来するキメラ動物。
（９）前記（１）乃至（７）のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物。
（１０）前記（１）乃至（７）のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物。
（１１）動物がマウスである前記（８）乃至（１０）のいずれかのキメラ動物。
（１２）生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物と、所望する系統の雌性動物とを交配するか、又は、前記雄性キメラ動物から得られた精子を、所望する系統の卵子に体外授精または顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
（１３）生殖細胞が導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物と、所望する系統の雄性動物とを交配するか、又は、前記雌性キメラ動物から得られた卵子を所望する系統の精子に体外受精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
（１４）前記（９）および（１０）により得られるキメラ動物の雌雄を交配、人工授精、体外授精、或は顕微授精することで得られるホモ接合体動物の作製方法。
（１５）動物がマウスである前記（１２）乃至（１４）のいずれかの作製方法。
（１６）前記（１２）乃至（１４）のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物。
（１７）前記（１２）乃至（１４）のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の雌雄を交配することにより得られるホモ接合体動物。
（１８）動物がマウスである前記（１６）又は（１７）の動物。
［発明を実施するための最良の形態］
本発明のキメラ動物は、遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚に対してＥＳ細胞のような全能性細胞を注入することで作製する。得られたキメラ動物の全ての生殖細胞は注入した全能性細胞、例えばＥＳ細胞を用いた場合には、ＥＳ細胞に由来する。以下の説明においては、全能性細胞の一例としてＥＳ細胞を例示して説明するが、全能性細胞をＥＳ細胞に限ったものではない。得られたキメラ動物の精子、又は卵子は全てＥＳ細胞に由来し、次世代の産仔には必ずＥＳ細胞に由来した染色体が伝播し、遺伝子対の一方はＥＳ細胞の遺伝子であるヘテロ接合体となる。
生殖細胞を形成することができない初期胚、例えば受精胚は遺伝的要因により起こる生殖細胞の形成不全を利用することで作製する。このためには、２種の方法を提案することができる。すなわち、マウスでは異種交雑種第１代の雄は不稔を示すことから、実験用マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）とその同胞異種関係にあるマウスを自然交配して異種交雑受精胚を得る。このとき繁殖能力に優れた実験用マウスの雌から卵子を得る方が好ましい。すなわち、実験用マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の雌とその同胞異種関係にある雄を自然交配して異種交雑受精胚を得ることが望ましい。特に、３週齢から４週齢の若齢期実験用雌マウスをホルモン処理して過剰排卵を誘起した後に交配することで多くの受精胚を得ることができる。
更に、過剰排卵を誘起した若齢期の実験用雌マウスから採取した卵子と異種マウスの精子を体外授精して得た異種交雑種胚を効率よく大量に得ることができる。実験用マウスはＣ５７ＢＬ／６などが使用できる。
一方、交配相手である異種マウスはＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓやＭｕｓ  ｃａｒｏｌｉ、Ｍｕｓ  ｐａｈａｒｉ等が使用できるが、体外授精に関する情報が比較的集積されてきているＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓが好ましく、異種交雑種胚を安定して得ることができるＣ５７ＢＬ／６雌性マウスとＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ雄性マウスの組み合わせが好ましい。
更に、第２の方法として、ｃ−ｋｉｔ変異マウス、例えば、Ｗｖ／＋マウスとＷ／＋マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚（Ｗｖ／Ｗ又はＷ／Ｗｖ）は生殖細胞の形成不全が起こるということを利用して作製することができる。特に、Ｗｖ／Ｗ又はＷ／Ｗｖ受精胚を用いる場合は雌性のＥＳ細胞を用いて雌性の生殖系列キメラを作製することができる。
このようにして得られた受精胚はすべて遺伝的に生殖細胞を形成しない受精胚である。その結果、この胚にＥＳ細胞を注入して得られたキメラマウスの生殖細胞では、全てＥＳ細胞に由来する精子又は卵子が形成される。
かくして得られた雄性のキメラマウスの精子（生殖細胞）はＥＳ細胞に由来し、このキメラマウスと実験用雌マウスを交配して得られた産仔はＥＳ細胞の染色体対の一方を持つヘテロ接合体となる。このように得られる該キメラマウスはＥＳ細胞由来の生殖系列キメラマウスとなる。更に、得られる該キメラマウスの精子数が少ない場合や精子の活性が低い場合には自然交配では受精に至らないが、その場合にも、精子を採取して顕微受精（ＩＣＳＩ）などの技術を用いて次世代産仔を得ることができる。一方、Ｗｖ／Ｗ受精胚を用いる場合は雌性のＥＳ細胞を用いて雌性の生殖系列キメラ動物を作製することができる。この場合、ミトコンドリア改変等を行った遺伝子改変動物を作製する場合は有利である。
以上述べたとおり、本発明は生殖系列キメラ動物を効率よく作製することができる。本発明の適応によって、これまでほとんど成功していない近交系マウス由来ＥＳ細胞からのノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスが作製できると予測される。また、これまで生殖系列キメラを得ることができなかったＥＳ細胞からも、遺伝子改変マウスができる可能性がある。またＥＳ細胞に限らず全能性細胞ならば応用が可能であると考えられる。
上記はマウスによって例示したがこの操作はすべての哺乳動物に応用することができる。例えば家畜などにおいては、体細胞、或は遺伝子を改変した体細胞から核移植によりクローン胚を作製し、本発明の方法を適用することによって効率的に生殖系列キメラ動物を作製することが可能となる。また鳥類や爬虫類、両生類、魚類などの実験動物にも応用することができる。この場合異数体胚を不妊胚として用いることも可能である。さらに、野生動物にも応用することもできる。
さらに、本発明により得られる全ての生殖細胞がＥＳ細胞に由来するキメラ動物の次世代産仔からは、染色体対の一方がＥＳ細胞に由来する雌雄のヘテロ接合体動物を得ることができ、得られた雌雄のヘテロ接合体を交配することでホモ接合体動物（ホモ型遺伝子改変動物）を作製することができる。
［実施例］
以下の実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
キメラ作製に用いる受精胚の調製
（１）雄性の生殖細胞を形成することができない受精胚の取得
３．５週齢のＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ型ミトコンドリアを持つＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｂ６−ｍｔＳＰＥ：戻し交配により細胞質内のミトコンドリアを野生種由来近交系Ｍｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓのそれに置換したＣ５７ＢＬ／６マウス）の腹腔に妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を５ＩＵ／０．０５ｍｌ／匹の割合で投与し、その４８時間後に絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を５ＩＵ／０．０５ｍｌ／匹の割合で投与して過剰排卵誘起処理を施した。次に過剰排卵誘起処理を施した雌マウスと、性成熟した（６週齢以上）雄の野生種由来近交系Ｍｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓと同居させて自然交配させた。交配確認後３．５日目の雌マウスの子宮を摘出して、Ｍ２培地（９４．７ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７８ｍＭ  ＫＣｌ，１．７１ｍＭ  ＣａＣ１２，１．１９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１．１９ｍＭ  ＭｇＳＯ４，４．００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２１．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２３．３ｍＭ乳酸ナトリウム，０．３３ｍＭピルビン酸ナトリウム，１ｇ／Ｌグルコース，４ｇ／Ｌ  ＢＳＡ，１００ＩＵ／ｍＬペニシリン，５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）で還流して採取した胚を同培地で洗浄して同胞異種胚（胚盤胞期胚）を調製した。
一方、体外授精により同胞異種胚を調製する場合は、前述の方法で過剰排卵誘起処理を施したＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ｈＣＧ投与後１６時間後）を頚椎脱臼で安楽死させて卵管を摘出し、ミネラルオイルで覆ったｍＴＹＨ培地（１９９．３７ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７８ｍＭ  ＫＣｌ，１．７１ｍＭ  ＣａＣ１２，１．１９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１．１９ｍＭ  ＭｇＳＯ４，２５．０７ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１．００ｍＭピルビン酸ナトリウム，４ｇ／Ｌ  ＢＳＡ，１００ＩＵ／ｍＬペニシリン，５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）液滴のミネラルオイル部位に採取した卵管をつけた。次に、実体顕微鏡下で２本の２７Ｇ注射針を用いて卵管を破り、卵子を含む卵丘細胞群をｍＴＹＨ培地液滴内に導入した。尚、血液や組織の混入を防ぐため、卵管は培地内に入れないように注意した。精子は前培養を行うため、Ｍｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ雄マウスを頚椎脱臼により安楽死させて精巣上体尾部を摘出し、精巣上体尾部に付着している血液をキムワイプでふき取った後、指で保持して最も太い精管をめがけて２３Ｇ注射針で切れ目を入れ、出てきた精子塊を注射針ですくい取り、ミネラルオイルで覆った０．３ｍｌのｍＴＹＨ培地液またはｍＴＹＨ培地（１９９．３７ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７８ｍＭ  ＫＣｌ，１．７１ｍＭ  ＣａＣ１２，１．１９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１．１９ｍＭ  ＭｇＳＯ４，２５．０７ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１．００ｍＭピルビン酸ナトリウム，１ｇ／Ｌグルコース，４ｇ／Ｌ  ＢＳＡ，１００ＩＵ／ｍＬペニシリン，５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に導入してＣＯ２インキュベーター内で２〜８時間培養して前培養を行った。前培養を終えた精子を先に調製した卵子を含む受精用培地（ｍＴＹＨ培地）に最終精子濃度が１〜５×１０５個／ｍＬになるように媒精した。媒精した卵子をＣＯ２インキュベーター内で８〜１０時間培養した。次に、卵子を発生用の０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ添加Ｍ１６培地（９４．５９ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７８ｍＭ  ＫＣｌ，１．７１ｍＭ  ＣａＣ１２，１．１９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１．１９ｍＭ  ＭｇＳＯ４，２５．０７ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２３．２８ｍＭ乳酸ナトリウム，０．３３ｍＭピルビン酸ナトリウム，１ｇ／Ｌグルコース，４ｇ／Ｌ  ＢＳＡ，１００ＩＵ／ｍＬペニシリン，５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）で洗浄後に同培地に移し、実体顕微鏡で受精卵を確認した後、ＣＯ２インキュベーター内で９６時間培養し、胚盤胞期胚を調製した。
（２）雌雄両性の生殖細胞を形成することができない受精胚の取得
生殖細胞形成に関与するｃ−ｋｉｔの変異を持つＷ系統ヘテロ接合体の雌雄マウスの交配又は体外授精によってＷｖ／Ｗ或はＷ／Ｗｖホモ接合体の受精胚の作製を（１）に記載した方法に準じて胚盤胞期胚を調製した。
実施例２
キメラマウスの作製
実施例１に記載したＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ型ミトコンドリアＤＮＡを持つ近交系Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｂ６−ｍｔＳＰＥ）の卵子と野生種由来近交系Ｍｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ精子の体外授精法で調製した胚盤胞期胚（ミトコンドリアＤＮＡはＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ型）に対して常法に従い近交系Ｃ５７ＢＬ／６由来のＥＳ細胞（ミトコンドリアＤＮＡはＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ型）を注入した。４８個の胚盤胞期胚を使用して、１個の胚に対して５個のＥＳ細胞を注入し、４８個の注入胚を得た。８週齢の精管結紮雄マウスと交配することで得た交配２日目の３匹の６週齢の仮親用ＣＤ−１雌マウス子宮に１６個の注入胚を移植し、３匹のキメラ産仔を得た。
実施例３
キメラマウス生殖細胞の系譜
実施例２で得た雄性キメラマウスを飼育して性成熟させた。毛色で低モザイク、中モザイク及び黒色の３種を選抜し、精巣上体尾部より精子を採取した。得られた精子のミトコンドリアＤＮＡをＰＣＲ解析することで、生殖細胞の系譜を調べた。精子がＥＳ細胞に由来する場合はＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ型のミトコンドリアＤＮＡが、受精卵に由来する場合はＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ型のミトコンドリアＤＮＡが検出される。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法（Ｋａｎｅｄａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２，４５４２−４５４６（１９９５））の解析の結果、いずれのマウスにおいても得られた精子はＥＳ細胞に由来した。尚、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６−ｍｔＳＰＥ）の卵子とＭｕｓ  ｓｐｒｅｔｕｓ精子の体外授精で得られた異種交雑種Ｆ１雄性マウスにおいて精子を確認することは出来ず、また、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとの交配でも産仔を得ることができなかったことから、異種交雑種Ｆ１雄性マウスが生殖細胞を形成できないことを確認した。
［産業上の利用の可能性］
本発明により得られるキメラ動物の作る生殖細胞は注入したＥＳ細胞に由来するため、該キメラ動物と所望する系統の動物との交配により、或は、該キメラ動物から得られた精子と所望する系統の卵子で体外授精して得られた受精卵を仮親に移植することにより産仔を得ることで、染色体対の一方がＥＳ細胞に由来するヘテロ接合体の雌雄動物を得ることができる。こうして得られたヘテロ接合体の雌雄を交配することでホモ接合体動物を作製することができる。通常、ここで使用するＥＳ細胞は、予め相同組換えなどにより所望する遺伝子改変を施したＥＳ細胞を使用することができるため、遺伝子改変がなされたホモ接合体動物を容易に得ることができる。更に、Ｗｖ／＋マウスとＷ／＋マウスの正逆の交配或は体外授精により得られるＷｖ／Ｗ又はＷ／Ｗｖ受精胚などのｃ−ｋｉｔ変異マウスの受精胚を用いた場合、雄性のみらならず雌性の生殖細胞も形成することができない。このためＥＳ細胞は雄性のみならず雌性であっても、得られたキメラマウスの全ての生殖細胞に注入したＥＳ細胞が寄与するため、雄性のＥＳ細胞に限定されることなく、雌雄いずれのＥＳ細胞でも生殖系列キメラ動物を作製することができる。
また本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全てＥＳ細胞に由来するため、雄性キメラ動物を交配或は体外授精してＥＳ細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。この得られた雌雄のヘテロ接合体は、相互に交配してホモ接合体を容易に得ることができるため、遺伝子機能解析に極めて有用である。更に、遺伝子改変を施した雌性ＥＳ細胞を樹立して作製した雌性のキメラ動物を交配或は人工授精してＥＳ細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。この得られた雌雄のヘテロ接合体を交配することで同様にホモ接合体を容易に得ることができる。また、キメラ動物の雌雄を交配することでホモ接合体を得ることもできると考えられる。以上の方法で得られる遺伝子改変動物は、遺伝子機能解析に極めて有用である。
そしてこのような操作を簡便に行うことが可能となり、従来非効率的であった生殖系列キメラ動物の作製を効率的に行うことが可能となる。
【国際調査報告】
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