(57)【要約】幅広い抗菌スペクトルを有し、農業、医薬、工業において有用な耐熱性の抗微生物活性を有する蛋白質、病原菌に対して抵抗性を示す植物を提供する。配列番号１乃至５の何れかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされる抗微生物活性を有する蛋白質、該抗微生物活性を有する蛋白質を有効成分とする殺菌剤、抗菌剤及び工業用抗菌・抗カビ剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号６乃至１０の何れかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６乃至１０の何れかのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗微生物活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
（ａ）配列番号１乃至５の何れかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１乃至５の何れかのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ抗微生物活性を有する蛋白質をコードする、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項６】
形質転換細胞が植物由来である、請求項５に記載の形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換細胞を再生して得られる病原微生物に抵抗性を示す植物体又はその子孫。
【請求項８】
請求項５又は請求項６に記載の形質転換細胞を培養し、培地または細胞抽出物から目的の抗微生物活性を有する蛋白質を回収することを特徴とする、請求項１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の蛋白質の何れかを有効成分とする殺菌剤、抗菌剤、又は工業用抗菌・抗カビ剤。
【請求項１０】
農園芸用、医薬用または工業用である、請求項９に記載の殺菌剤、抗菌剤又は工業用抗菌・抗カビ剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗微生物活性を有する新規な蛋白質、上記蛋白質をコードする遺伝子、並びに上記蛋白質および上記遺伝子の利用法に関する。
背景技術
昆虫由来の抗微生物蛋白質は、多くの種類の昆虫より１５０種類近くが見つかっている。この中で糸状菌に対して活性のあるものとしては、双翅目昆虫のＤｒｏｓｏｍｙｃｉｎ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４；２６９（５２）：３３１５９−３３１６３］や鱗翅目昆虫のＨｅｌｉｏｍｉｃｉｎ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４（１４）：９３２０−９３２６）］や半翅目昆虫のＴｈａｎａｔｉｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６；９３：９３２０−９３２６）などが報告されている。
一方、鞘翅目昆虫であるタイワンカブトムシ（Ｏｒｙｃｔｅｓｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）からは抗細菌ペプチドとして、トリファシン（特開平８−２８３２９１）、オリクチン（特開平８−２８３２９２）、ライナサラシン（特開平８−２８３２９４）、Ｄｅｆｅｎｓｉｎ［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９；２６６：６１６−６２３）］が報告されているが、糸状菌に活性を示す抗微生物蛋白質はいまだ知られていない。
近年、昆虫より得られた抗微生物蛋白質遺伝子を植物に導入し、病害抵抗性を付与する試みが行われている。センチニクバエより得られたＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ  ＩＡを導入したタバコ［Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｅ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０００；１３（８）８６０−８６８］、カイコより得られたＣｅｃｒｏｐｉｎ  Ｂを導入したイネ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ  ２０００；４８４：７−１１）などが報告されているが、実用化には至っていない。その理由の一つとして、導入した遺伝子が、植物に多大な被害を与える植物病原糸状菌に対して活性のある蛋白質の遺伝子として得られたものではなかったことが考えられる。従って、従来の抗微生物蛋白質より糸状菌に対して活性のある抗微生物蛋白質およびその遺伝子を同定して、利用することが望まれている。
また、工業用抗菌・抗カビ剤としては、これまでに有機窒素系化合物、有機窒素イオウ系化合物、有機ハロゲン系化合物、含窒素脂肪族ポリマー及び重金属配位化合物等が使用されている。しかしこれらは刺激性があり労安法上問題になる薬剤、使用薬量が多く環境保護の観点から問題になる薬剤、ホルマリン或いはハロゲンを遊離し、人体への影響及び環境汚染が懸念される薬剤及び重金属による環境汚染が懸念される薬剤を含んでおり、工業用抗菌・抗カビ剤全体が、好ましい薬剤のみで構成されているとは言えない。
一方、医薬分野において、メチシリンやバンコマイシン等の抗生物質に耐性を示す多剤耐性細菌が問題となっており、これらの多剤耐性菌に対して効果がある有効な薬剤が望まれている。
発明の開示
本発明は、比較的低濃度で様々な植物病原菌の生長を抑止できる新規な抗微生物蛋白質を探索、同定し、さらに該蛋白質をコードする遺伝子をクローニングしてその塩基配列を特定し、本発明の遺伝子を適当な宿主生物（微生物、動物または植物など）に導入して形質転換体を作出し、本発明の遺伝子の利用を図ることである。また、本発明の別の目的は、本発明の抗微生物蛋白質を含む農園芸用殺菌剤、医薬品又は工業用抗菌・抗カビ剤を提供することである。
課題を解決するための手段
本発明者らは、先ず、イネ紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗微生物活性を検定するためのアッセイ系を確立した。次いで、タイワンカブトムシ体液から蛋白質成分を抽出し、各種カラムクロマトグラフィーを組み合わせ、各画分を上記アッセイ系に供試することにより、抗微生物蛋白質画分を同定し、抗微生物蛋白質を単離・精製することに成功した。
さらに本発明者らは、精製蛋白質の部分アミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するＲＴ−ＰＣＲ法により当該蛋白質をコードする完全長のｃＤＮＡを単離し、全塩基配列を決定した。上記の通り、本発明者らは、タイワンカブトムシ由来の新規な抗微生物蛋白質の単離とそれをコードするＤＮＡのクローニングに成功し、また当該蛋白質のアミノ酸配列と当該ＤＮＡの塩基配列を決定して、本発明を完成するに至った。
（ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡは、後述する５種類の抗微生物活性を有する蛋白質をそれぞれコードするＤＮＡである。
該ＤＮＡは、タイワンカブトムシの幼虫から抽出したＤＮＡ及びＲＮＡから単離同定することもできるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。また、本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などの酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
本発明のＤＮＡの塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１乃至５に記載の各塩基配列からなるＤＮＡの何れかとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
配列番号１乃至５に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質が抗微生物活性を保持する範囲内において、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１乃至５に記載のＤＮＡのいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗微生物活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号１乃至５に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１乃至５に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するものであれば許容範囲内である。また、ハイブリダイズする程度としては、通常の条件下、例えばＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、室温で０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１乃至５に記載の核酸の何れかにハイブリダイズする程度であればよい。
本発明のＤＮＡは、適当なベクターに組換えることによって、それらにコードされる抗微生物活性を有する蛋白質の遺伝子組換え手法による好適な組換えベクター、好ましくは発現ベクターとすることができる。該組換えベクターは環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、該組換えベクターは、本発明のＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
本発明の配列番号１乃至５の何れかに記載のＤＮＡにハイブリするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、例えば配列番号１２乃至１８の何れかに記載のオリゴヌクレオチドは、タイワンカブトムシ幼虫の脂肪体のｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うときのプライマーとなる。このＰＣＲ法により、本発明の抗菌蛋白質をコードする完全長ｃＤＮＡクローンを単離することが容易となり、本発明の遺伝子の単離方法が提供される。
（抗微生物活性を有する蛋白質）
本発明の蛋白質は、配列番号６乃至１０に示されるアミノ酸配列からなる、抗微生物活性を有する蛋白質である。ここにいう抗微生物活性とは、種々の糸状菌及び種々の細菌に及ぶ、幅広い微生物の生育を抑制あるいは死滅させる活性を意味する。特に、農業上重大な被害を与える植物病原糸状菌や細菌、医学上重篤な感染症を引き起こす糸状菌や細菌、産業上重大な被害を与える糸状菌や細菌に対して、生育抑制あるいは死滅活性を意味する。
本発明の蛋白質は、植物病原菌に対して抗菌効果のあるタイワンカブトムシ幼虫、特に３齢幼虫の体液から調製することができるが、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、天然由来の蛋白質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させた蛋白質、あるいは化学合成蛋白質の何れでもよい。
配列番号６に記載の蛋白質は全長６６アミノ酸残基からなる蛋白質である。この蛋白質がプロセッシングを受けてＮ末端及び／又はＣ末端が切断されることにより、配列番号７に示される全長３６アミノ酸残基からなる蛋白質（ＳＰ４０８０）、配列番号８に示される全長３８アミノ酸残基からなる蛋白質（ＳＰ４２６６）、配列番号９に示される全長３８アミノ酸残基からなる蛋白質（ＳＰ４３３７）、配列番号１０に示される全長４０アミノ酸残基からなる蛋白質（ＳＰ４５２３）が、それぞれ生じていると想定される。この様に、配列番号７乃至１０に示されるアミノ酸配列は、すべて配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分配列に相当する。
本発明の抗微生物活性を有する蛋白質のアミノ酸配列について、公知の蛋白質データーベースに対して相同性検索を行った結果、５０％を超える高い相同性を示す公知のアミノ酸配列は確認できなかった。このことから、本発明の抗微生物活性を有する蛋白質は、これまでにない特徴的なアミノ酸配列からなる蛋白質であると考えられる。
配列番号６乃至１０の蛋白質は、いずれも１００℃、１０分間の熱処理を行った後も、植物病原菌に対して抗微生物活性を有する蛋白質である。
本発明の蛋白質は、植物病原菌であるイネ紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、イネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、コムギ葉枯病菌（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、シバブラウンパッチ病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、トマト疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｃｅ）、衛生病原菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの、糸状菌から細菌にわたる幅広い菌種に対して生育抑制あるいは死滅活性を示すものである。特に、イネ紋枯病菌、シバブラウンパッチ病菌、黄色ブドウ球菌及び大腸菌に対して顕著な抗微生物活性を示す。
なお、上記の抗微生物活性を有する限り、配列番号６乃至１０に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においては抗微生物活性を有する、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
従って、配列番号６乃至１０に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異が本発明の本質的機能である抗微生物活性を有する蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多形等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質が抗微生物活性を保持する限り特に制限はないが、変異個数は通常十数アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内である。
（形質転換植物）
本発明の形質転換植物は、植物細胞内で機能しうる適当なプロモーターの制御下に置いた本発明の遺伝子を用い、これをそのままあるいは適当なベクターに組み込んで形質転換した宿主植物細胞を基に再生した、本発明の抗微生物活性を有する蛋白質を発現することにより植物病原菌等に耐性を示す植物体あるいはその子孫である。
本発明の形質転換植物は、その植物体中に本発明である抗微生物活性を有する蛋白質を発現することができる。
本発明の形質転換植物には全ての植物種が含まれるが、例えば、単子葉植物ではイネ科、ヤシ科、ユリ科、ラン科、サトイモ科等が挙げられる。
イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、シバ、ヨシ、サトウキビ、トウモロコシ、アワ、ヒエ等が挙げられる。
ユリ科植物としては、ネギ、ユリ、チューリップ等が挙げられる。
双子葉植物では、ブナ科、サボテン科、ツバキ科、アオイ科、ウリ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、トウダイグサ科、ブドウ科、ミカン科、セリ科、ナス科、シソ科、キク科、サクラソウ科等が挙げられる。
ツバキ科植物としては、チャ等が挙げられる。
アオイ科植物としては、ワタ等が挙げられる。
ウリ科植物としては、キュウリ、メロン、カボチャ等が挙げられる。
アブラナ科植物としては、アブラナ、シロイヌナズナ、ダイコン、ワサビ、キャベツ等が挙げられる。
バラ科植物としては、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、バラ等が挙げられる。
マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ等が挙げられる。
ナス科植物としては、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト等が挙げられる。
キク科植物としては、キク、シュンギク、ヒマワリ、レタス等が挙げられる。
サクラソウ科植物としては、サクラソウ、シクラメン等が挙げられる。
また、スギ科、マツ科、ヒノキ科等の裸子植物に属する植物体も含まれる。
（抗菌剤、殺菌剤、工業用抗菌・抗カビ剤）
本発明の抗菌剤、殺菌剤、又は工業用抗菌・抗カビ剤は、抗微生物活性を有する蛋白質を有効成分として、そのままあるいはこれと適当な賦形剤等を組合せることで調製されるものである。有効成分である抗微生物活性を有する蛋白質の広範な抗菌スペクトルを有するという特性から、農園芸用殺菌剤、医薬用抗菌剤、工業用抗菌・抗カビ剤としての使用に好適である。
何れの場合でも、本発明の抗微生物蛋白質を単独で使用してもよく、また必要により、他の公知の農薬、医薬、工業用抗菌・抗カビ成分、防虫活性成分等と組み合わせて使用することは差し支えない。更に、本発明において有効成分として使用する抗微生物活性を有する蛋白質は、単一の蛋白質或いは数種類の蛋白質の混合物から構成されていてもよい。
本発明の農園芸用殺菌剤の対象となる植物病害は極めて多岐に渡り、イネのいもち病（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、ごま葉枯病（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）、紋枯病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ムギ類のうどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ＳＰ．ｈｏｒｄｅｉ、ｆ．ＳＰ．ｔｒｉｔｉｃｉ）、斑葉病（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｅａ）、網斑病（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ）、赤かび病（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｒｅｃｏｎｄｉｔａ、Ｐ．ｈｏｒｄｅｉ）、雪腐病（Ｔｙｐｈｕｌａ  ＳＰ．、Ｍｉｃｒｏｎｅｃｔｒｉｅｌｌａ  ｎｉｖａｉｓ）、裸黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｕ．ｎｕｄａ）、アイスポット（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、雲形病（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｅｃａｌｉｓ）、葉枯病（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ふ枯病（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、カンキツの黒点病（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｃｉｔｒｉ）、そうか病（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｆａｗｃｅｔｔｉ）、果実腐敗病（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｉｇｉｔａｔｕｍ、Ｐ．ｉｔａｌｉｃｕｍ）、リンゴのモニリア病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｍａｌｉ）、腐らん病（Ｖａｌｓａ  ｍａｌｉ）、うどんこ病（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、斑点落葉病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｍａｌｉ）、黒星病（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、ナシの黒星病（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｎａｓｈｉｃｏｌａ）、黒斑病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  Ｋｉｋｕｃｈｉａｎａ）、赤星病（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｈａｒａｅａｎｕｍ）、モモの灰星病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、黒星病（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ）、フォモプシス腐敗病（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ブドウのべと病（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）、黒とう病（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ａｍｐｅｌｉｎａ）、晩腐病（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、うどんこ病（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｎｅｃａｔｏｒ）、さび病（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ａｍｐｅｌｏｐｓｉｄｉｓ）、カキの炭そ病（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋａｋｉ）、落葉病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋａｋｉ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｎａｗａｅ）、ウリ類のべと病（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｅｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、炭そ病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、うどんこ病（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、つる枯病（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｍｅｌｏｎｉｓ）、トマトの疫病（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、萎ちょう病（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、輪紋病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、葉かび病（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖａｍ）、ナスの褐紋病（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｖｅｘａｎｓ）、うどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｏａｒｕｍ）、アブラナ科野菜の黒斑病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｊａｐ���ｎｉｃａ）、白斑病（Ｃｅｒｏｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ネギのさび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ａｌｌｉｉ）、ダイズの紫斑病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ）、黒とう病（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、黒点病（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｌｕｍ）、インゲンの炭そ病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）、ラッカセイの黒渋病（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｐｅｒｓｏｎａｔｕｍ）、褐斑病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）、エンドウのうどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｐｉｓｉ）、ジャガイモの夏疫病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、イチゴのうどんこ病（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ）、チャの網もち病（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、白星病（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｌｅｕｃｏｓｐｉｌａ）、タバコの赤星病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｌｏｎｇｉｐｅｓ）、うどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）、炭そ病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔａｂａｃｕｍ）、テンサイの褐斑病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、バラの黒星病（Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ  ｒｏｓａｅ）、うどんこ病（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｐａｎｎｏｓａ）、キクの褐斑病（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉｉｎｄｉｃｉ）、白さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｉａｎａ）、ベントグラスのブラウンパッチ（Ｐｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ピシウムブライト（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ダラースポット（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、各種雪腐病（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｓｐｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ、  Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）、ヘルミントスポリウム病（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎｕｍ、Ｈ．ｅｒｙｔｈｒｏｓｐｉｌｕｍ）、ノシバ、コウライシバの各種ピシウム病（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｐｅｒｉｐｌｏｃｕｍ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐ．ｖａｎｔｅｒｐｏｏｌｉｉ）、葉腐病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、種々の作物の灰色かび病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、菌核病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）等が挙げられる。従って、本発明の抗微生物活性を有する蛋白質は、畑地、水田、芝生地、果樹園、牧草地、温室その他非耕地の植物病害防除剤の有効成分として用いることができる。
本発明の医薬用抗菌剤は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、アスペルギルス症発病菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌）、カンジダ症発病菌（Ｃａｎｄｉｄａ属菌）、ムコール症発病菌（Ｍｕｃｏｒ属菌、Ａｂｓｉｄｉａ属菌）、クリプトコッカス症発病菌（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌）、北アメリカ分芽菌症発病菌（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ属菌）、パラコクシジオイデス症発病菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属菌）、コクシジオイデス症発病菌（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属菌）、スポロトリコーシス発病菌（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ属菌）、クロモミコーシス発病菌（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ属菌）、ヒストプラズマ症発病菌（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属菌）、皮膚糸状菌症発病菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属菌、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ属菌、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ属菌）、その他の病原微生物に抗菌効果を示す点で有用である。
本発明の工業用抗菌・抗カビ剤において有効成分として使用する抗微生物活性を有する蛋白質は、適当な担体及び補助剤、例えば、結合剤、安定剤などと配合して混合し、常法によって液剤、水和剤、乳剤、ゾル剤（フロアブル剤）及びその他の適当な剤形に製剤化して使用される。
本発明の抗微生物活性を有する蛋白質を有効成分として含む工業用抗菌・抗カビ剤は、水性の塗料、接着材、ラテックス、アクリル等のエマルジョン製品、デンプン、顔料、炭酸カルシウム等のスラリー製品及びジョイントセメントの中の細菌、真菌の生長抑制；建材（建築建材、土木建材等）の木材の防腐；工場の製造設備及びビル空調等における冷却塔、パルプ及び製紙工場等の殺菌及びスライム生成防止；繊維、織物及び皮革への噴霧または浸漬処理による抗菌・抗カビ処理；塗料皮膜、特に外装塗料の塗料皮膜が風雨に曝されている間に発生する細菌・真菌による攻撃からの防御；塩化ビニル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリコン、変性シリコン、ナイロン、エポキシ等の樹脂から成る内装・外装材（住宅用、医療施設用）、建材（建築建材、土木建材等）、家電製品、家庭用雑貨、スポーツ用品等の抗菌・抗カビ；サトウキビ及びテンサイ糖の製造装置へのスライム堆積の防護；エアーウオッシャー、スクラッバーシステム及び工業用淡水供給システムにおける微生物蓄積及び堆積の防止；食品工場等の衛生環境保持；製造設備の洗浄時、下水処理場、し尿処理場等の消臭殺菌；紙被覆材及び被覆加工における細菌及び真菌の生育防止；化粧品及びトイレタリー製品の微生物汚染の防止；プール、冷却水等の微生物の生育防止；農業用配合物、電着システム、診断及び薬剤製品、医療機器等の微生物汚染の防止；写真処理における微生物蓄積の防止；などに使用することができる。
製剤化された本発明の工業用抗菌・抗カビ剤は、各種の製剤をそのまま、又は水若しくは適当な有機溶媒で希釈して、各種の工業用原材料中にまたは製品中に添加混合する方法、各種の工業用原材料や製品の表面に塗布または噴霧する方法または各種の工業用原材料や製品を本発明の工業用抗菌・抗カビ剤の希釈液中に浸漬する方法、等を含め、これまでに一般的に行われてきた工業用抗菌・抗カビ剤の使用方法に従って各種の方法により使用できるが、いずれの特定の方法のみに限定されるものではない。
以上に述べた本発明の殺菌剤、抗菌剤、工業用抗菌・抗カビ剤の剤形は、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを混合して調製した剤形であってもよく、例えば、錠剤、丸剤、散剤、頼粒剤、液剤、水和剤、乳剤、注射剤、塗布剤、座剤、エアゾール剤、ゾル剤（フロアブル剤）などの剤形を挙げることができる。
発明の実施の形態
（ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡは、本発明の実施例に従ってタイワンカブトムシ幼虫、特に３齢幼虫から抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを基にクローニングすることが可能であり、本発明によって開示された塩基配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションやＰＣＲという遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種からも同様の抗微生物活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を単離することができる。また、ＤＮＡ合成機を用いて一部あるいは全てを化学合成することも可能である。
タイワンカブトムシ以外の生物由来の相同遺伝子をスクリーニングするためのハイブリダイゼーション条件は、特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’Ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃〜６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することにより、ある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知である。
上記のようなハイブリダイゼーションを使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列番号１乃至５に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するものが好ましい。
また、配列番号１２〜１８の何れかに記載のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドも、ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。このプライマーは、配列番号６及び１０のアミノ酸配列に基づいて、各々の蛋白質をコードする遺伝子断片のクローニングのためのＰＣＲ用プライマーとして設計すればよく、当該アミノ酸をコードすることが可能な全ての塩基をミックスしたプライマーとしても使用することができる。これらのプライマーを用いて、大腸菌を接種して免疫したタイワンカブトムシ幼虫脂肪体ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、本発明の配列番号１乃至５の何れかのＤＮＡを増幅させ、単離することができる。
本発明の組換えベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１．５３（１９８９）に記載の方法などにより、適当なプラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込むことで調製することができる。
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示されるがこれらに限定されない。
所望の蛋白質を生産する目的においては、いわゆる発現ベククーが有用である。発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望の蛋白質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−ｃ２、ｐＭＡＬ−Ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５ｋ、ｐＰＩＣ９ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢＩｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いて本発明の蛋白質を生産する場合には、一般に発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、所望の抗微生物蛋白質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではプラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。また、エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望の抗微生物蛋白質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
このようにして得られる組換えベクター、好ましくは組換えプラスミドは、適当な宿主細胞に組み込むことができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。宿主細胞としては、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌ではＭ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１など、酵母ではＩＮＶＳｃｌ（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など、昆虫細胞ではＢｍＮ４、カイコ幼虫などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラツト由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
特に、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７２；６９：２１１０）、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７９；１６８：，１１１）やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７１；５６：２０９）によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９７８；７５：１９２７）やリチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３；１５３：１６３）によって、植物細胞の場合は、例えばリーフデイスク法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５；２２７：１２９）、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ．１９８６；３１９：７９１）によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９７３；５２：４５６）、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８３；３：２１５６−２１６５）によってそれぞれ形質転換することができる。
（形質転換植物）
本発明の形質転換植物は、植物細胞内で機能しうる適当なプロモーターの制御下に置いた本発明の遺伝子を用い、これをそのままあるいは適当なベクターに組み込んで形質転換した宿主植物細胞を基に再生した、植物病原菌等に耐性を示す植物体あるいはその子孫である。
本発明の形質転換植物は、その植物体中に本発明である抗微生物活性を有する蛋白質を発現することができる。
本発明の遺伝子を植物細胞に形質転換する方法に使用し得る発現ベクターとしては、ｐＵＣ系ベクター（例えばｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９）、ｐＢＲ系ベクター（例えばｐＢＲ３２２）、ｐＢＩ系ベクター（例えばｐＢＩ１１２、ｐＢＩ２２１）、ｐＧＡ系ベクター（ｐＧＡ４９２、ｐＧＡＨ）、ｐＮＣ（日産化学社製）などが挙げられる。また、この他にもウイルスベクターなども挙げることができる。また、連結するターミネーター遺伝子としては、３５Ｓターミネーター遺伝子やＮｏｓターミネーター遺伝子が挙げられる。
構築した発現ベクターの植物への導入方法としては、間接導入法及び直接導入法が挙げられる。間接導入法としては、たとえばアグロバクテリウムを用いた方法が挙げられる。直接導入法としては、たとえばエレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、シリコンカーバイド法等があげられる。
形質転換させた植物細胞から植物固体を再生させる方法は、従来知られた手法を用いればよく、特別な制限はない。
（抗微生物活性を有する蛋白質）
本発明の蛋白質は、例えば後述の実施例に従って、種々のカラムクロマトグラフィー（Ｃ１８、Ｃ８、ゲル濾過、イオン交換）などの蛋白質精製および単離のために慣用される方法を適宜組み合わせることで製造することができる。特に、タイワンカブトムシ幼虫の体液を１００℃、１０分間の熱処理を行うことにより、より容易に精製を行うことができる。
この様に、本発明の蛋白質は、天然に発現しているタイワンカブトムシから調製することができるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３０Ａ型、パーキンエルマージャパン（株）製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。その純度の面から、化学合成蛋白質あるいは遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
汎用されるペプチド合成装置を用いて、配列番号６乃至１０のアミノ酸配列からなる蛋白質を合成するには、格別の工夫は必要とせず、一般的な合成条件に従って行えばよい。
また、配列番号１乃至５のＤＮＡ配列の何れかを有し、先に例示したような所望の宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて大腸菌、酵母、昆虫あるいは動物細胞を形質転換させ、該形質転換細胞を適当な培養条件で培養することにより、当該蛋白質を組換え体として大量に得ることができる。
形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養については各種の成書（例えば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヒキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、抗微生物活性を有する蛋白質として機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
（殺菌剤、抗菌剤、工業用抗菌・抗カビ剤）
本発明の抗菌剤、殺菌剤又は工業用抗菌・抗カビ剤は、本発明の蛋白質を単独で、あるいは必要に応じて、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを混合して、調製することができる。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば蒸留水、食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類などが挙げられる。
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）などの補助剤を含んでいてもよい。これらは、必要に応じてバクテリア保留フイルターを通す濾過、別の殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた、例えば凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物の形態で製造し、使用前に無菌の蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
このようにして得られる抗菌剤、殺菌剤または工業用抗菌・抗カビ剤の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、頼粒剤、液剤、乳剤等の形態により散布することができる。
本発明の抗微生物活性を有する蛋白質を有効成分とする農園芸用の殺菌剤等は、真菌類あるいは細菌が関与する植物の疾患予防及び治療などに利用することが可能である。本発明の殺菌剤等は通常、植物の全身または局所的に散布することができる。
抗微生物活性を有する蛋白質の植物病害防除剤としての施用薬量は、適用場面、施用時期、施用方法、栽培作物等により差異はあるが、一般には有効成分量として１ｈａ当たり０．００１〜１０ｋｇ程度、好ましくは０．００１〜５ｋｇ程度が適当である。散布は、植物の種類、生育段階、症状、散布方法、処理時間、散布する蛋白質の種類（全長の蛋白質、該蛋白質の一部を置換、欠失、挿入及び／又は付加したクンパク質など）、生育している場所の気候、生育している場所の土壌などにより異なるが、一日一回から複数回散布することができる。
本発明の医薬用の抗菌剤等は、本発明の蛋白質を単独で、あるいは必要に応じて医薬として許容される賦形剤、活性成分、補充剤などと混合して所望の剤形に調製することができる。剤形としては、注射剤（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内注射）、液状塗布剤、ゲルおよび軟膏剤、座剤、エアゾール剤などによる非経口投与剤形、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、液剤、乳剤、縣濁剤液剤等による経口投与剤形を挙げることができる。
経口投与用の錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤の調製には、例えば白糖、乳糖、ブドウ糖、澱粉、マンニットなどの賦形剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、例えば澱粉、カルボキシメチルセルロース又はそのカルシウム塩、微結晶セルロース、ポリエチレングリコールなどの崩壊剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、シリカなどの潤沢剤、例えばラウリル酸ナトリウム、グリセロールなどの潤滑剤、等が使用される。
注射剤、液剤、乳剤、縣濁剤、シロップ剤及びエアゾール剤の調製には、例えば水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコールなどの活性成分の溶剤、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、水素添加ヒマシ油のポリオキシエチレンエーテル、レシチンなどの界面活性剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム塩、メチルセルロース等のセルロース誘導体、トラガント、アラビアゴム等の天然ゴム類などの縣濁剤、例えばパラオキシ安息香酸のエステル、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩などの保存剤、等が使用される。
経皮吸収型製剤である軟膏の調製には、例えば白色ワセリン、流動パラフィン、高級アルコール、マクロゴール、水性ゲル基剤等が用いられる。座剤の調製には、例えばポリエチレングリコール、ラノリン、ココナット油等が使用される。
本発明の抗微生物活性を有する蛋白質を含有する上記の医薬組成物は、全組成物の重量に対して、本蛋白質を約０．１〜９９．５％、好ましくは約０．５〜９５％を含有する。本蛋白質又は本蛋白質を含有する組成物に加えて、他の薬学的に活性な化合物を含ませることができ、本発明の蛋白質の複数を含ませてもよい。
本蛋白質の臨床的投与量は、年齢、体重、患者の感受性、症状の程度等により異なるが、通常効果的な投与量は、成人一日０．００３〜１．５ｇ好ましくは０．０１〜０．６ｇ程度である。しかし、必要により上記の範囲外の量を用いることもできる。
本発明の工業用抗菌・抗カビ剤を調製する場合には、有効成分である本蛋白質は液剤、水和剤、乳剤、ゾル剤及びその他の適当な製剤が調製できる限りにおいて濃度に上限はないが、これら製剤の重量に対し、１−９０質量％、好ましくは３−４０質量％の割合で配合される。
使用できる担体としては、工業用抗菌・抗カビ剤に常用されるものであれば固体又は液体のいずれも使用でき、特定のものに限定されるものではない。固体担体の例としては、鉱物質粉末、例えばカオリン、ベントナイト、クレー、モンモリロナイト等が挙げられる。液体担体の例としては、水、アルコール類、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、ニトリル類、例えばアセトニトリル、プロピオニトリル等が挙げられる。
また、これらの他に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アラビアゴム、ザンサンガム、ヒドロキシプロピルセルロース等の増粘剤及び各種補助剤を配合することができる。さらに必要に応じて紫外線吸収剤等のような安定化剤を適量加えることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１：抗微生物活性を有する蛋白質の精製
１）タイワンカブトムシ幼虫からの体液採取
タイワンカブトムシの３齢幼虫に大腸菌（ＪＭ１０９、１０６ｃｅｌｌ／頭）を接種し、抗微生物活性を有する蛋白質の発現を誘導した後、１５時間後にプロテアーゼインヒビターを溶解した生理食塩水に体液を採取した。得られた体液を１００℃で１０分間熱処理し、遠心分離により不溶物を除き、熱処理体液とした。
２）カラムクロマトグラフィーによる抗微生物蛋白質の精製
後述する抗糸状菌活性評価法を用いて、抗微生物蛋白質の単離を行った。
熱処理体液を０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化したＳｅｐ−ｐａｋ  Ｖａｃ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に透過し、抗微生物蛋白質を吸着させた。Ｓｅｐ−ｐａｋカラムを０．０５％ＴＦＡで洗浄した後、２０、４０、６０％アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）で抗微生物蛋白質を溶出した。各溶出画分を遠心エバポレーターで濃縮しアセトニトリルを除去した後、抗糸状菌活性評価を行った。最も強い活性を示した４０％溶出画分について、ＡＫＴＡ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）に接続したＲｅｓｏｕｒｓｅ  ＲＰＣ  １ｍｌカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に透過させた後、２０−４０％アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエント、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で抗微生物蛋白質の溶出を行った。この条件下で２６〜３２％で溶出される活性画分について回収を行い、遠心エバポレーターで濃縮を行った。この得られた活性画分を、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ（６００Ｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、４８６  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、６２６  Ｐｕｍｐ）に接続したＳｅｎｓｈｕｐａｋ  ＶＰ−３１８  φ４．６×２５０ｍｍ（Ｓｅｎｓｈｕ）に透過し、２０−２６％アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエント、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で抗微生物蛋白質の溶出を行った。
２２０ｎｍの吸収でモニターリングしながらピークごとに分取を行い、各ピークについて抗糸状菌活性評価を行った。２２−２３％アセトニトリルで溶出される活性ピークについて、さらにＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣに接続したＳｅｎｓｈｕｐａｋ  ＶＰ−３１８  φ４．６×２５０ｍｍ（Ｓｅｎｓｈｕ）に透過し、３０−４０％アセトニトリル［０．０５％ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏｂｕｔｈａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＦＢＡ）］のグラジエント、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で抗微生物蛋白質の溶出を行った。２２０ｎｍの吸収でモニターリングしながらピークごとに分取を行い、各ピークについて抗糸状菌活性評価を行った。２４−２７％アセトニトリルで溶出される活性ピークについて、ＳＭＡＲＴ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）に接続したＳｅｐｈａｓｉｌ  Ｃ８  ＳＣ  ２．１／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）に透過し、２０−２６％アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）のグラジエント、０．１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。２２０ｎｍの吸収でモニターリングしながらピークごとに分取を行い、各ピークについて抗糸状菌活性評価を行った（第１図）。活性の確認されたピークについて、Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での分析を行った。得られた画分は分子量４０８０Ｄａの成分をメイン（第１成分）として含み、分子量４２６６Ｄａ（第２成分）も含んでいた（第２図）。これらの成分については種々のカラムを用いて精製を試みたが、分離することは困難であった。
３）抗糸状菌活性評価系
イネ紋枯病菌をポテトデキストロース（ＰＤ）培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いて、２５℃、５日間培養した後、ホモジナイザーで菌糸を細断した。得られた菌糸細断溶液より菌糸塊を除いた後、遠心分離で菌糸を回収し、ＰＤ培地を用いて菌糸１０５個／ｍｌに調整した。菌糸溶液２５０μｌに溶解させたＰＤＡ培地を添加し５ｍｌにした後、シャーレ（直径８．４ｃｍ）に広げた。培地が固まった後、活性評価用試料１μｌをスポットし、２４時間、２５℃で培養した後、スポットした地点の周りにできた阻止円の大きさを計測した。
実施例２：抗微生物ペプチドのｃＤＮＡの単離
１）抗微生物蛋白質のアミノ酸分析
実施例１の２）の第１、第２の両成分を含む活性画分についてプロテインシーケンサー（４９２ｃＬＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｓｅｒ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｏｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたエドマン分解法によりＮ末端のアミノ酸配列の解析を行った。その結果、第１成分のＮ末端配列はＥＬＰＫＬＰＤＤＫＶＬＩＲＳＲＳＮＸＰＫであり、第２成分はＤＡＥＬＰＫＬＰＤＤであった。分子量の違いおよびＮ末端の１０残基目までのアミノ酸配列より、第２成分は第１成分のＮ末端に２残基アミノ酸がついた蛋白質であることが推測された。
さらにアミノ酸配列を解析するため、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（ベーリンガー・マンハイム）を用いて抗微生物蛋白質を部分消化し、アミノ酸配列の解析を行った。その結果、２１残基目以降はＧＫＶＷＤＧＦであり、Ｎ末端より２７残基目までのアミノ酸配列を決定することができた。
２）３’−ＲＡＣＥ用ディジェネレートプライマーの設計
上記で決定されたアミノ酸配列を基に、考えられる全ての塩基がミックスされたプライマーを３つ合成した（Ｔｍは５０〜５５℃）。Ｐ４０８０−１（５−ａａｒｙｔｎｃｃｎｇａｙｇａｙａａｒｇｔ−３’）（配列番号１２）、Ｐ４０８０−２（５’−ｃｃｎｇａｙｇａｙａａｒｇｔｎｙｔｎａｔ−３’）（配列番号１３）、Ｐ４０８０−３（５’−ｇａｙｇｃｎｇａｒｙｔｎｃｃｎａａ−３’）（配列番号１４）、（ただし、ｒはａまたはｇ、ｙはｃまたはｔ、ｎはａまたはｔまたはｃまたはｄ、をそれぞれ示す）。
３）タイワンカブトムシ幼虫脂肪体からのｃＤＮＡの合成
大腸菌接種６時間後のタイワンカブトムシ３齢幼虫の脂肪体よりｍＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて抽出し、このうち３μｇをＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍａｓｈａｍｐｈａｌｍａｓｉａ）に供試しｃＤＮＡの合成を行った。すべての手順はキット添付の説明書に従った。
４）３’−ＲＡＣＥ
上記で合成したプライマーおよびキット添付のＮｏｔＩ−ｄｔプライマーを用いて２）で合成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、抗微生物蛋白質の３‘領域のスクリーニングを行った。増幅した断片について、ゲル精製を行った後、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングを行った。増幅断片のＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンサー（３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により決定した。ＤＮＡ配列より推測されるアミノ酸配列が、プロテインシーケンサーより得られた配列と一致する増幅断片を得、抗微生物蛋白質の３’領域のＤＮＡ配列を決定した。
５）５’−ＲＡＣＥ用ディジェネレートプライマーの設計
３’−ＲＡＣＥで決定したＤＮＡ配列を基に５’−ＲＡＣＥ用のプライマー３つを合成した（Ｔｍは５０〜６５℃）。Ｐ４０８０−４（５’−ｃｇａｔａｔａｃａａｇｃａｔｃａａｔｇｃ−３’）（配列番号１５）、Ｐ４０８０−５（５’−ｇｃｇａａｃｇｇｔｇａｔｔｔａｃａｇｔｃａａａｔｃｃａｔｔｃ−３’）（配列番号１６）およびＰ４０８０−６（５’−ｇｃｃｔｔｔｔｇｇａｃａｇｔｔａｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｔａａｔ−３’）（配列番号１７）。
６）５’−ＲＡＣＥ
上記の脂肪体より回収したｍＲＮＡについて、上記合成のプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて５’領域のｃＤＮＡを合成した。
２つのプライマーとキット添付のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒを用いて、上記で合成した５’領域のｃＤＮＡのスクリーニングを行った。増幅した断片についてクローニングを行い、ＤＮＡ配列の決定を行った。ＤＮＡ配列より推測されるアミノ酸配列が、プロテインシーケンサーより得られた配列と一致する増幅断片を得、抗微生物蛋白質の５’領域のＤＮＡ配列を決定した。
７）完全長ｃＤＮＡの取得
５’ＲＡＣＥより得られた上流配列を基にプライマーを合成し（Ｐ４０８０−７、５’−ａａｇｇｇａｃｇａｔｃａａａａｔｇａａａ−３’）（配列番号１８）、ＮｏｔＩ−ｄｔプライマーとともに上記で合成したｃＤＮＡのスクリーニングを行った。増幅した断片についてクローニングを行い、ＤＮＡ配列の決定を行った。３’、５’−ＲＡＣＥで得られたＤＮＡ配列と完全に一致する完全長ｃＤＮＡを得た。その結果、本発明のタイワンカブトムシ幼虫体液由来の抗微生物蛋白質をコードするｃＤＮＡは全長２０１塩基からなり、６６個のアミノ酸をコードしていた。また、アミノ酸配列とＤＮＡ配列についてデーターベース（ＳＷＩＳＳ  ＰＲＯＴ）の相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を行うと、高い相同性のある配列は存在していないことから、本蛋白質は新規な蛋白質であると考えられた。
なお、上記した４０８０Ｄａの配列中で唯一決定されなかった第１８番目のアミノ酸は、その部分に相当するｃＤＮＡ配列からシステイン（Ｃｙｓ）であることが明らかとなった。エドマン分解では、システインは解析できないためアミノ酸シーケンシングの際に検出不能であったと思われる。
また、完全長ｃＤＮＡより推定される蛋白質と、タイワンカブトムシ幼虫体液より得られた蛋白質の分子量に２５８Ｄａの差があることより、天然蛋白質のＣ末端の解析をＳｅｑｕａｚｙｍｅ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて行った。その結果、タイワンカブトムシ幼虫体液より精製によって得られた抗微生物蛋白質は、Ｃ末端よりセリン（Ｓｅｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アラニン（Ａｌａ）であると推定され、ｃＤＮＡより予想される成熟蛋白質のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ）の２残基が切れていることがわかった。
実施例３：合成蛋白質の活性評価
１）蛋白質の合成
ｃＤＮＡより推定されるアミノ酸配列を基に成熟蛋白質と思われる４種類の蛋白質（ＳＰ４０８０、ＳＰ４２６６、ＳＰ４３３７、ＳＰ４５２３）の合成を蛋白質自動合成機（９０５０  Ｐｌｕｓ  Ｐｅｐｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｆ−ｍｏｋ法で行った。
２）ジスルフィド結合の形成
合成によって得られた蛋白質約３０ｍｇを、９０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｈ８．０）に溶解した後、５ｍＭの２，２’−ｂｉｓｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ５ｍｌを添加し、室温で１０分間撹拌してジスルフィド結合を形成させた。
３）合成蛋白質の精製
ジスルフィド結合を形成させた溶液を、ＡＫＴＡに接続したμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  φ２０×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムに透過し、２５−３２％アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）グラジエント、流速１２ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行った。２２０ｎｍの吸収でモニターリングしながらピークごとに分取を行い、各ピークについてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ分析を行った。目的の分子量を示すピークを含む画分について、遠心エバポレーターでアセトニトリルを除いた後、ＡＫＴＡに接続したμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  φ２０×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムに透過し、３５−４０％アセトニトリル（０．０５％ＨＦＢＡ）グラジエント、流速１２ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行った。２２０ｎｍの吸収でモニターリングしながらピークごとに分取を行い、各ピークについてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ分析を行い目的の分子量を示すピークを回収した。得られた画分をＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）に接続したＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  φ４．６×２５０ｍｍカラム（Ｓｅｎｓｈｕ）、２０−３０％アセトニトリルグラジエントで分析し、９０％以上の純度を示すことを確認した。また得られた合成蛋白質について、プロテインシーケンサーでアミノ酸配列を確認し、ｃＤＮＡより推測される蛋白質と同じことを確認した。
４）合成蛋白質の抗微生物活性評価
上記の抗イネ紋枯病菌活性評価方法を用いて、４種類の合成蛋白質の活性評価を行った。その結果、いずれの蛋白質もほぼ同様の活性を示した（表１）。
2003033532.tif 000002
また、抗微生物蛋白質の活性スペクトラムを調べるため、イネいもち病菌、コムギ葉枯病菌、シバブラウンパッチ病菌、トマト疫病菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌等の菌株を用いて活性評価を行った。
イネいもち病菌、ムギ葉枯病菌、シバブラウンパッチ病菌についてはイネ紋枯病菌と同様の方法で抗糸状菌活性評価を行った。トマト疫病菌は培地にＶ８ジュース培地を使用し、２０℃で培養を行った。黄色ブドウ球菌、大腸菌は培地にＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いて３７℃で１２時間培養し、Ａ５９５＝０．０１になるように調整後、菌溶液５００μｌに溶解させたＮＢＡ培地を全量が５ｍｌになるように添加し、シャーレ（直径８．４ｃｍ）に広げ、活性評価用プレートとした。各菌株について抗微生物蛋白質５０μｇをスポットして、その周りにできた生育阻止円を計測した（表２）。
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本抗微生物蛋白質はイネ紋枯病菌、シバブラウンパッチ病菌、黄色ブドウ球、大腸菌に対して４ｍｍ以上の生育阻止円を形成する強い活性を示し、イネいもち病菌、コムギ葉枯病菌、トマト疫病菌に対しても活性を示した。
以上のことより、本発明のタイワンカブトムシ幼虫体液由来の抗微生物蛋白質は、種々の植物病原糸状菌および病原細菌に対して抗微生物活性を持つことが示された。
発明の効果
本発明の蛋白質を有効成分として含む製剤を作出すれば、強力かつスペクトラムの広い農園芸用殺菌剤または医薬用抗菌剤としての利用が期待できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、タイワンカブトムシ幼虫体液からの抗微生物蛋白質の最終精製のチャートを表す。
図２は、タイワンカブトムシ幼虫体液から精製した抗微生物蛋白質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を表す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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