(57)【要約】生体試料中の補酵素Ａ（ＣｏＡ）類の高感度で再現性に優れた濃度測定法として、生体試料を強酸性溶液を使用して抽出するステップ、固相抽出ステップ、内部標準物質を添加するステップ、ＬＣ−ＭＳを用いて検出するステップを備えることを特徴とする補酵素Ａ類の測定方法を提供するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の補酵素Ａ類の濃度を測定する方法であり、生体試料を強酸性溶液を使用して抽出するステップ、固相抽出ステップ、内部標準物質を添加するステップ、ＬＣ−ＭＳを用いて検出するステップを備えることを特徴とする補酵素Ａ類の測定方法。
【請求項２】
上記生体試料から補酵素Ａ類を抽出するステップが、凍結粉砕した上記生体試料を過塩素酸溶液で攪拌した後に、上清を遠心分離するステップであることを特徴とする請求項１記載の補酵素Ａ類の測定方法。
【請求項３】
上記固相抽出ステップが、上記補酵素Ａ類を強酸性溶液で抽出した上清を中和した後、オクタデシルシリル基乃至オクチルシリル基を有するシリカゲルを充填した逆相系カートリッジにアプライし、水系溶媒で洗浄した後、有機系溶媒で溶出させるステップであることを特徴とする請求項１、２記載の補酵素Ａ類の測定方法。
【請求項４】
上記逆相カートリッジを、アセトニトリル及び１Ｍ酢酸アンモニウム溶液でコンディショニングした後に、上記上清をアプライすることを特徴とする請求項３記載の補酵素Ａ類の測定方法。
【請求項５】
上記有機系溶媒が、アセトニトリル及び酢酸アンモニウム混合溶液であることを特徴とする請求項３記載の補酵素Ａ類の測定方法。
【請求項６】
該補酵素Ａ類が脂肪酸補酵素Ａエステル類であり、該内部標準物質が、該補酵素Ａ類の構造類似体であることを特徴とする請求項１記載の補酵素Ａ類の測定方法。
【請求項７】
該脂肪酸補酵素Ａエステル類が、主炭素鎖の炭素数が２〜８個の短鎖脂肪酸補酵素Ａエステルであり、該構造類似体が該補酵素Ａ類との炭素数差が３個以内であり、且つアシル基の主炭素鎖の水素が３個以上重水素に置換されたもの、或いは主炭素の炭素が３個以上１３Ｃに置換されたものであることを特徴とする請求項６記載の補酵素Ａ類の測定方法。
【請求項８】
該補酵素Ａ類がマロニルＣｏＡであり、該構造類似体がアセチルＣｏＡ−ｄ３体、メチルマロニルＣｏＡ−ｄ３体、メチルマロニルＣｏＡ−ｄ４体、プロピオニルＣｏＡ−ｄ３体、プロピオニルＣｏＡ−ｄ５体、メチルマロニルＣｏＡ−１３Ｃ３体であることを特徴とする請求項７記載の補酵素Ａ類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体試料中の補酵素Ａ類（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、以下ＣｏＡ類と称す）の定量測定方法に関する。
背景技術
ＣｏＡ類は脂肪酸の生合成、分解、転移、ホルモン合成と調節、ＴＣＡサイクルなどの経路に含まれ、生命機能維持に欠かせない重要な化合物である。脂質代謝の機能解析研究などにおいて、ＣｏＡ類のマーカーとしての役割が重要視され、生体試料中のＣｏＡ類の濃度を正確に測定する方法が求められてきた。
このような中で、脂質代謝機構の構成成分であるマロニルＣｏＡは、ミトコンドリアに於ける脂肪酸酸化と脂質合成に関与する為、脂質代謝調節の上で重要な役割を担い、心臓や骨格筋での脂質エネルギー代謝、大脳視床下部におけるニューロペプチドＹの発現制御、食物摂取、エネルギー消費制御など重要な調節因子として脚光を浴びている。
かかるＣｏＡ類の測定方法としては、古くから酵素法やＨＰＬＣ法など各種方法が開発されている。例えば酵素法による測定方法としてはＧｕｙｎｎらの方法（Ｇｕｙｎｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７５，３５，３１２）やＭｃＧａｒｒｙらの方法（ＭｃＧａｒｒｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７８，２５３，２２，８２９１）などがある。これは例えばマロニルＣｏＡを測定対象にするときには、放射能ラベルしたアセチルＣｏＡなどのマロニルＣｏＡ依存的な取り込みを測定するものである。しかし、この方法は特定のＣｏＡ類が測定対象となり汎用性がなく、測定時に共存する他のＣｏＡ類によって調節がかかり真の値を示さない場合があり、更に操作が煩雑であるなどの欠点がある。
ＵＶ−ＨＰＬＣ法（例えばＨｏｓｏｋａｗａ，Ｙ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７８，９１，１，３７０、Ｄｅｍｏｚ，Ａ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，１９９５，６６７，１，１４８など参照。）によるＣｏＡ類の測定の報告例は非常に多い。測定する生体試料としても筋肉、心臓、肝臓中などの濃度が測定されている。しかし、ＵＶ−ＨＰＬＣ法は感度が低いため、臓器のように夾雑物が多い試料中では再現性が悪く、特に脳中濃度は測られておらず、より高感度、再現性に優れた方法が期待されている。
また感度を得るための別の方法として、ＬＣ−ＭＳ法（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ａ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９５，１２９を参照）が開発されている。かかる方法は菌中のアセチルＣｏＡ濃度を３次元イオントラップ型マススペクトロメータで測定したものである。かかる方法では測定対象であるＣｏＡの検出とピーク分離には成功しているが、絶対検量線法を採用し、内部標準物質を使用しておらず、正確性、再現性を得るには不十分である。また測定対象物質がアセチルＣｏＡであり、極性が低くＨＰＬＣ上での分離が容易である。さらに、菌中試料は測定を妨害するような夾雑物含量が低く、試料中のアセチルＣｏＡ濃度が高いなどの優位な点がある。それに比べて極性が高くＨＰＬＣ上での分離が困難な場合、動物臓器のように測定を妨害する夾雑物含量が多い試料の場合、試料中濃度が低い場合、などのＣｏＡ類（たとえば動物臓器中のマロニルＣｏＡ）の測定には充分に対応できない問題がある。
本発明は上記問題点を解決するものであり、生体試料中ＣｏＡ類の高感度で再現性に優れた濃度測定法を提供するものである。
発明の開示
本願発明者らは、上記のような課題のもとに鋭意研究を重ねた結果、以下の方法を見出した。すなわち本発明は、生体試料中の補酵素Ａ類の濃度を測定する方法であり、生体試料を強酸性溶液を使用して抽出するステップ、固相抽出ステップ、内部標準物質を添加するステップ、ＬＣ−ＭＳを用いて検出するステップを備えることを特徴とする補酵素Ａ類の測定方法を提供するものである。
また本発明は、上記生体試料から補酵素Ａ類を抽出するステップが、凍結粉砕した上記生体試料を過塩素酸溶液で攪拌した後に、上清を遠心分離するステップであることを特徴とする上記補酵素Ａ類の測定方法を提供する。
上記固相抽出ステップは、上記補酵素Ａ類を強酸性溶液で抽出した上清を中和した後、オクタデシルシリル基乃至オクチルシリル基を有するシリカゲルを充填した逆相系カートリッジにアプライし、水系溶媒で洗浄した後、有機系溶媒で溶出させるステップであることを特徴とする。特に上記逆相カートリッジを、アセトニトリル及び１Ｍ酢酸アンモニウム溶液でコンディショニングした後に、上記上清をアップイし、アセトニトリル及び酢酸アンモニウム混合溶液で溶出させることを特徴とする。
また本発明は、該補酵素Ａ類が脂肪酸補酵素Ａエステル類であり、該内部標準物質が、該補酵素Ａ類の構造類似体であることを特徴とする補酵素Ａ類の測定方法を提供するものである。
その中でも該脂肪酸補酵素Ａエステル類が、主炭素鎖の炭素数が２〜８個の短鎖脂肪酸補酵素Ａエステルであり、該構造類似体が該補酵素Ａ類との炭素数差が３個以内であり、且つアシル基の主炭素鎖の水素が３個以上重水素、或は１３Ｃに置換されたもの、特に該補酵素Ａ類がマロニルＣｏＡであり、該構造類似体がアセチルＣｏＡ−ｄ３体、メチルマロニルＣｏＡ−ｄ３体、メチルマロニルＣｏＡ−ｄ４体、プロピオニルＣｏＡ−ｄ３体、プロピオニルＣｏＡ−ｄ５体、マロニルＣｏＡ−１３Ｃ３体であることを特徴とする補酵素Ａ類の測定方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＣｏＡ類の測定方法であり、生体試料からの強酸性溶液による抽出、必要に応じた濃縮操作、内部標準物質の添加、ＨＰＬＣ注入サンプルの調整、ＣｏＡ類と内部標準物質のＨＰＬＣ分離、ＣｏＡ類と内部標準物質の質量分析計による検出、検出された測定対象ＣｏＡと内部標準物質の面積比からの定量で構成される。
ＣｏＡ類の生体試料からの強酸性溶液による抽出において、生体試料とはＣｏＡ類が内在するすべての試料が対象であり、具体例としては、人や動物の臓器、人、動物、植物などの組織、細胞、菌などが挙げられる。臓器のなかでも特に筋肉、心臓、肝臓、脳中のＣｏＡ類の測定が重要である。
測定対象のＣｏＡ類としては、チオール基がアシル化されたアシルＣｏＡ類や、チオール基が酸化的に結合したＣｏＡ酸化体類、１級アミンがアシル化されたＮ−アシルＣｏＡ類が挙げられる。ここで挙げたＣｏＡ類には生体試料中には存在しないものが含まれるが、これらについても機能解析などの研究目的で使用され、医薬品開発の効果評価の為に重要である。
アシルＣｏＡ類の具体例として、アセトアセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、スクシニルＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ、グルタリルＣｏＡ、ＣｏＡ、アセチルＣｏＡ、ベンゾイルＣｏＡ、フェニルアセチルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ、イソバレリルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、ベーターメチルクロトニルＣｏＡ、チグリルＣｏＡ、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、ヘキサノイルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、アクリロイルＣｏＡ、アラキドイルＣｏＡ、デカノイルＣｏＡ、エライドイルＣｏＡ、オレオイルＣｏＡ、パルミトレオイルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡ、リノレオイルＣｏＡ、ローロイルＣｏＡ、ミリストレオイルＣｏＡ、ナーボノイルＣｏＡ、ステロイルＣｏＡ、オクタノイルＣｏＡ、ミリストイルＣｏＡ、アラキドニルＣｏＡ、ヘプタデカノイルＣｏＡ、ノナデカノイルＣｏＡ、ドコサヘキサノイルＣｏＡ、ペンタデカノイルＣｏＡ、ベーターヒドロキシブチリルＣｏＡ、ヘプタノイルＣｏＡ、バレリルＣｏＡ、２−ブテノイルＣｏＡ、ステアロイルＣｏＡなどが挙げられる。
Ｎ−アシルＣｏＡ類の具体例としては、Ｎ−ブチリルＣｏＡ、Ｎ−デカノイルＣｏＡ、Ｎ−ヘキサノイルＣｏＡなどが挙げられる。
チオール基が酸化的に結合したＣｏＡ酸化体類の具体例としてはＣｏＡ酸化体、ＣｏＡグルタチオンジスルフィドなどが挙げられる。
なかでも、アセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、スクシニルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、アクリロイルＣｏＡ、オレオイルＣｏＡ、ステアロイルＣｏＡ、リノレニルＣｏＡ、アラキドニルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡ、ステロイルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ、ＣｏＡ酸化体、ＣｏＡグルタチオンジスルフィドなどが好ましく、特にアセチルＣｏＡ、ＣｏＡ、スクシニルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ、ＣｏＡグルタチオンジスルフィドといった短鎖（Ｃ８以下）脂肪酸ＣｏＡエステル類、チオエステル類などの測定に適している。
生体試料からＣｏＡ類を抽出する際に使用する強酸性溶液は、一般的に生体試料をタンパク変性させ、測定対象化合物を抽出する溶液であり、好適な具体例としてはトリクロロ酢酸溶液、過塩素酸溶液などが挙げられる。具体的抽出方法は特に限定するものではなく、測定する試料、測定対象により適宜選択するものであり、例えば筋肉や脳などの生体組織を液体窒素で凍結後粉砕し、上記強酸性溶液で所定濃度となるように加え、充分に攪拌した後、遠心分離し、その上清を生体試料抽出溶液とする。
添加する内部標準物質の好適な具体例は、上記のＣｏＡ類、あるいはそれらの同位体である。内部標準法の性格からすれば、測定対象ＣｏＡと内部標準物質は物理的性質、化学的性質などが類似であり、本法の過程においてできるだけ両者が同じ挙動を示すが、検出する際には、互いに干渉せず分離できる関係が好ましい。かかる関係を満足する為に以下のような内部標準物質の選択基準を満たすようなＣｏＡ類縁体、ＣｏＡ同位体を選択するのが好ましい。
ＣｏＡ類縁体は測定対象ＣｏＡと比較して、炭素数差が３個以内であり、測定対象ＣｏＡの主炭素鎖がアルコール、アミン、カルボン酸などの官能基を有する場合は、内部標準物質も同様の官能基を有することが好ましい。またＣｏＡ同位体は、測定対象ＣｏＡのアシル基の主炭素鎖の水素が３個以上重水素、または１３Ｃに置き換わっているものであって、かつ上記ＣｏＡ類縁体の基準を満たすものが好ましい。
一方でＣｏＡ類は、基本的には生体由来のものが存在する為、使用する内部標準物質としては前記重水素体や１３Ｃ体、Ｎ−アシルＣｏＡなど人工的に合成したものが好ましい。例えば、ラット肝臓中のマロニルＣｏＡを測定するには、アセチルＣｏＡが高濃度で内在するためアセチルＣｏＡを内部標準物質として使用することは出来ず、アセチルＣｏＡ−ｄ３体、アセトアセチルＣｏＡ−ｄ３体、アセトアセチルＣｏＡ−ｄ５体、メチルマロニルＣｏＡ−ｄ３体、メチルマロニルＣｏＡ−ｄ４体、プロピオニルＣｏＡ−ｄ３体、プロピオニルＣｏＡ−ｄ５体、イソブチリルＣｏＡ−ｄ７体、或はメチルマロニルＣｏＡ−１３Ｃ３体を使用するのが好ましい。
内部標準物質の添加は強酸性溶液にて生体試料中からＣｏＡを抽出した上清に添加するか、強酸性溶液中に初めから加えておくかのどちらでもよい。また処理過程であまりに内部標準物質の挙動が異なるのであれば、ＨＰＬＣサンプル調製時に添加し、質量分析計のイオン化の補正の役割のみとして使用してもよい。
抽出上清は強酸性溶液である為、中和、溶媒交換等により中性領域にｐＨを調整した後、ＨＰＬＣに注入する。ＨＰＬＣ注入サンプルは、ｐＨを３〜１０に調整する。なかでもｐＨが３〜８の中性領域で測定するのが測定感度、再現性、安定性の点から好ましい。ｐＨ２以下の酸性側になると、ＣｏＡのリン酸基の影響を受けてクロマトのピークのテーリングが起こる他、カラムに吸着するなどの影響がある。またｐＨ１０以上の塩基性になると、ＣｏＡ類が分解するなどの影響が出る。ｐＨの調製に用いる試薬には、酢酸アンモニウムやリン酸カリウムなどの緩衝作用を有するｐＨ調整剤を使用することが出来る。
脳など生体試料中のＣｏＡ類の濃度が低い試料測定、高感度分析を行なうに当たっては濃縮操作を実施する。濃縮の好適な方法としては、凍結乾燥、減圧濃縮、液液抽出、固相抽出、オンライン濃縮などが挙げられるが、なかでも固相抽出が好ましい。
固相抽出は、逆相系、順相系、イオン交換性などの市販カートリッジがあるが、逆相系カートリッジが再現性が良く、ＣｏＡ類測定に適している。順相系はＣｏＡ類の極性が高い為適さず、イオン交換系は、今回の強酸性溶液で抽出する場合、塩濃度が高すぎて担体に保持させることが困難である。
固相抽出の操作は、まず、固相カートリッジを有機溶媒と水系溶媒などを用いてコンディショニング操作を施した後、生体試料中から強酸性溶液で抽出したＣｏＡ類の抽出上清を中和したものをカートリッジにアプライし、ＣｏＡ類を固相カートリッジに吸着させ、次いで水系溶媒で洗浄した後、吸着したＣｏＡ類を溶出させる。
コンディショニング操作は、有機溶媒と高濃度の塩類溶液で行う。逆相系カートリッジを使用する場合はアセトニトリル及び１Ｍ酢酸アンモニウムでコンディショニングを行う。具体的には、１００％アセトニトリルを固相カートリッジに注入させた後、塩類の析出を避ける為、一旦５０％アセトニトリル水溶液でカートリッジ中のアセトニトリル濃度を下げ、その後１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を注入することでカートリッジのコンディショニングを行う。
５０ｍＭ程度の低濃度の酢酸アンモニウムでは、逆相系カートリッジにＣｏＡ類を完全に保持することが出来ず、回収率が悪くなる。
コンディショニング操作に使用する有機溶媒は、アセトニトリルのほか、メタノール、２−プロパノール等の一般的有機溶媒を使用することが出来る。また塩溶液としては、酢酸アンモニウムの他、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、或はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム等を使用することが出来る。含有濃度は２００ｍＭから２Ｍが好ましい。
洗浄用の水系溶液は、水が好ましいが、これに酢酸アンモニウムやリン酸ナトリウム等の塩類を含んでも良い。更に洗浄効果を高めるために、ＣｏＡ類が溶出しない程度のアセトニトリルやメタノール等の有機溶媒を含有することも可能である。ＣｏＡ類の洗浄溶媒の水の比率は５０％以上とし、特に短鎖脂肪酸ＣｏＡエステルの測定では極性が高い為、有機溶媒無添加の水溶液とするのが好ましい。
その後、溶出溶媒を使用して、カートリッジに保持した測定対象ＣｏＡを溶出する。溶出溶媒は固相抽出で使用される一般的な有機溶媒、例えばメタノール、アセトニトリル、２−プロパノール、アセトン、テトラヒドロフランなどと水または前述の洗浄液で使用した水系溶媒の混合液を使用し、混合比率（０〜１００％）は測定対象のＣｏＡ及び内部標準物質の溶出動態及び夾雑物の溶出動態から適宜決定する。
マロニルＣｏＡなどの短鎖脂肪酸ＣｏＡエステルの場合、２０％程度の有機溶媒溶液で溶出が可能であるが、その後の溶媒留去のため２０〜７５％で行なうのが好ましい。１００％近くになると夾雑物溶出の影響がある。
溶出液の溶媒を留去して、再溶解液で残渣を再溶解する。もし、内部標準物質を強酸性溶液による抽出液に添加しなかった場合、この時点で一定量を添加する。
ＣｏＡ類と内部標準物質のＨＰＬＣ分離において、液体クロマトグラフ用分離カラムは一般的に逆相クロマトグラフィー用として市販されているものを使用すればよいが、なかでもオクタデシルシラン基（Ｃ１８）が結合しているシリカベースの充填剤が好ましい。その他オクチルシラン基（Ｃ８）が結合したシリカベースの充填剤やアミド系、特にカルバモイル基化学結合型シリカゲルを使用することも可能である。
カラムサイズは市販されている分析用のものでよく、内径１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下で、長さが５０ｍｍ以上、２５０ｍｍ以下のもので測定が可能である。ただし、サイズに関してはこれに限定することなく、基本的には測定対象物質がきちんと保持されて、きれいなピーク形状を示せばよい。移動相は逆相ＨＰＬＣで通常用いられる溶媒を使用し、好ましくは蒸発性または昇華性の酢酸アンモニウムなどの塩が含有されている方がよい。
ＣｏＡ類と内部標準物質の質量分析計による検出において、質量分析計の好適な具体例は四重極型、セクター型、トリプル四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、四重極飛行時間ハイブリッド型などが挙げられる。なかでも四重極型、トリプル四重極型が好ましく、特にトリプル四重極型が最も好ましい。検出条件は化合物に応じたマスユニットを設定し、分析カラム上で分離されたピークを検出する。
検出された測定対象ＣｏＡと内部標準物質の面積比からの定量において、検量線用に調整したサンプルを上記検出条件を用いて測定し、得られた測定対象ＣｏＡと内部標準物質とのピーク面積比と濃度を用いて検量線を作成する。検量線は最小二乗法による一次回帰直線から作成し、実サンプル測定で得られた測定対象ＣｏＡと内部標準物質とのピーク面積比を逆算回帰させ、測定対象ＣｏＡの濃度を算出する。
実施例
以下、本発明のＣｏＡ類の測定方法について、筋肉中、肝臓中及び脳中のマロニルＣｏＡの測定に関する実施例を示す。
１．標準溶液の調製
マロニルＣｏＡリチウム塩、数ｍｇを精密天秤で正確に量りとり、１０ｍＭの濃度になるように６％過塩素酸で溶解し標準原液とした。この標準原液を６％過塩素酸で順次希釈することにより、１０μＭ，５μＭ，１μＭ，５００ｎＭ，１００ｎＭ，５０ｎＭ，１０ｎＭ検量線用標準溶液を調製した。また同様に標準原液を６％過塩素酸で順次希釈することにより、５０μＭ，５μＭ，５００ｎＭ再現性確認（ＱＣ）用標準溶液を調製した。
２．内部標準溶液（ＩＳ）の調製
アセチルＣｏＡ−ｄ３体  数ｍｇを精密天秤で正確に量りとり、１０ｍＭの濃度になるように６％過塩素酸で溶解し標準原液とした。この標準原液を６％過塩素酸で希釈することにより、５μＭの溶液を調製した。尚、アセチルＣｏＡ−ｄ３体は、原料にＣｏＡと、無水酢酸―ｄ６を用いてＳｉｍｏｎの方法（Ｓｉｍｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．，１９５３，７５，２５２０）に従って合成した。
３．測定試料溶液の調製
１）生体試料抽出液の調製
ウイスター系ラットの筋肉、肝臓、脳を摘出した直後に、液体窒素中で凍らせ粉々に粉砕した後、６％過塩素酸を５ｍｌ／ｇ  ｗｅｔ  ｗｔ．になるように加え、よく攪拌した。９０００回転で遠心分離し、上清を生体試料抽出夜とした。
２）試料前処理法
筋肉、肝臓中濃度測定の場合：１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ未調製）３００μＬに、検量線用標準溶液、生体試料抽出液、ＱＣ用は生体抽出液の複数個体分をプールしたもの２００μＬ、ＩＳ溶液２０μＬ、ＱＣ用のみＱＣ用標準溶液２０μＬを添加して、固相抽出用試料とした。
脳中濃度測定の場合：１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ未調製）４５０μＬに、検量線用標準溶液、生体試料抽出液、ＱＣ用は生体抽出液の複数個体分をプールしたもの４００μＬ、ＩＳ溶液２０μＬ、ＱＣ用のみＱＣ用標準溶液２０μＬを添加して、固相抽出用試料とした。
固相抽出カートリッジであるボンドエルートＣ１８  １００ｍｇ／１ｍＬ（バリアン社製）をアセトニトリル１ｍＬ、５０％アセトニトリル水溶液１ｍＬ、１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ未調整）１ｍＬでコンディショニングした後、固相抽出用試料をアプライした。水１ｍＬで洗浄し、アセトニトリル／５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ未調整）＝２／８の混合溶液１ｍＬで溶出した溶液を凍結乾燥して溶媒留去した。そして残渣に水２００μＬを加えて溶解したものを測定試料溶液とし、２０μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
４．測定装置および装置条件
１）測定機器
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムとして、以下に記載のある装置、機器を使用した。
ＨＰＬＣシステム  ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）
オートサンプラー  ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＩＬ−ＨＴｃ（島津製作所）
質量分析装置      ：ＡＰＩ３０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
２）ＨＰＬＣ条件
ＨＰＬＣの分析条件は、分析カラムとしてＡＱＵＡ  Ｃ１８、ガードカラムとしてＡＱＵＡ  Ｃ１８用ガードカラムを使用し、カラム温度２５℃、移動相は１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ未調整）水溶液（Ａ液）およびメタノール（Ｂ液）を使用し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、表１に示すグラジエント条件で行なった。
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３）ＭＳ条件
質量分析は、イオン化法（ターボイオンスプレー、ポジティブモード）で行い、マロニルＣｏＡイオン（Ｑ１：８５４（ｍ／ｚ）、Ｑ３：３４７（ｍ／ｚ））、アセチルＣｏＡ−ｄ３体イオン（Ｑ１：８１３（ｍ／ｚ）、Ｑ３：３０６（ｍ／ｚ））を測定した。
４）定量値の算出方法
ピークの同定はＭＲＭ法（マロニルＣｏＡ：ｍ／ｚ  ８５４→３４７，ＩＳ：ｍ／ｚ  ８１３→３０６）により得られた保持時間及びモニターイオンの質量数により行い、定量はマロニルＣｏＡとＩＳのピーク面積比による内部標準法によって行なった。検量線式、ＱＣ試料及び生体試料中抽出液の定量値について、
検量線式はＩＳに対するマロニルＣｏＡのピーク面積比（ｙ）と濃度（ｘ）との関係を用いて最小二乗法（重み１／ｘ）により求めた。
ｙ＝ａｘ＋ｂ
ｘ：濃度、ｙ：ピーク面積比
ＱＣ試料及び生体試料中抽出液の濃度は、検量線式により次式で求めた。
ｘ＝（ｙ−ｂ）／ａ
ｘ：求める濃度
５．結果
１）直線性：検量線用試料を上記分析法に従って測定し、検量線を作成した（表２）。１／Ｘの重み付けを行い、相関係数（ｒ）は０．９９９８、相対誤差（ＲＥ）は−７．５〜＋６．８％と、良好な直線性を示した。
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２）再現性：
再現性確認（ＱＣ）試料として、ブランク試料（Ｑ０）及び５００ｎＭ，５μＭ，５０μＭのＱＣ用標準溶液を添加したＱＣ試料（Ｑ１，Ｑ２，Ｑ３、各濃度Ｎ＝３）のマロニルＣｏＡ濃度を測定した。ＱＣ１〜ＱＣ３は、得られた定量値からＱ０を差し引いた値であり、表３から表５に示すように、筋肉中濃度においては精度（％ＣＶ）１．７〜９．１％、真度（％ＲＥ）−４．３〜５．７％、肝臓中濃度においては精度（％ＣＶ）３．０〜８．２％、真度（％ＲＥ）−５．６〜９．１％、脳中濃度においては精度（％ＣＶ）２．０〜７．５％、真度（％ＲＥ）−３．６〜６．９％といずれも良好な値を示した。
３）生体試料中のマロニルＣｏＡ濃度の測定：
ウイスター系ラット６個体について、筋肉、肝臓、及び脳中のマロニルＣｏＡ濃度を測定した。クロマトグラム（図１乃至図３）及び測定結果（表６乃至表８）を示す。
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発明の効果
本発明による測定法によれば、生体試料中のＣｏＡ類をＬＣ−ＭＳを用いて、正確に再現性よく定量的に測定することが可能となる。
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【図面の簡単な説明】
図１は、ウイスター系ラット筋肉試料測定時のクロマトグラムを示す。
図２は、ウイスター系ラット肝臓試料測定時のクロマトグラムを示す。
図３は、ウイスター系ラット脳試料測定時のクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2003081229.tif 000012
2003081229.tif 000013