(57)【要約】本発明は、動物の感染実験に依存することなく、タイプＩＩＩ分泌機構ならびにそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を特異的に阻害する物質を大量にしかも短時間で簡単に検出することができる検出法である。即ち、タイプＩＩＩ分泌機構を有するバクテリアと赤血球懸濁液を混合し、これにタイプＩＩＩ分泌機構阻害物質を加えることによって生ずる溶血活性の変化を検出することを特徴とする、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構を阻害する物質の検出法である。本検出法は、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構またはタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を阻害する物質を、赤血球の溶血活性を指標として数値化し、短時間に多くの試料の処理が可能であることから、医薬品の開発等に有利である。
2002057760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイプＩＩＩ分泌機構を有するバクテリアと赤血球懸濁液を混合し、これにタイプＩＩＩ分泌機構阻害剤を加えることによって生ずる溶血活性の変化を検出することことを特徴とする、タイプＩＩＩ分泌機構阻害剤の検出法。
【請求項２】
タイプＩＩＩ分泌機構を有するバクテリアと赤血球懸濁液を混合し、これにタイプＩＩＩ分泌機構によって分泌される蛋白質の機能を阻害する物質を加えることによって生ずる溶血活性の変化を検出することを特徴とする、タイプＩＩＩ分泌機構の分泌蛋白質の機能を阻害する物質の検出法。
【請求項３】
請求の範囲１によって生じる溶血活性を比色定量によって検出することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検出法。
【請求項４】
請求の範囲２によって生じる溶血活性を比色定量によって検出することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の検出法。
【請求項５】
バクテリアが、サルモネラ菌、緑膿菌、赤痢菌、病原血清型大腸菌およびボルデテラ菌である請求の範囲第１項に記載の検出法。
【請求項６】
バクテリアが、サルモネラ菌、緑膿菌、赤痢菌、病原血清型大腸菌およびボルデテラ菌である請求の範囲第２項に記載の検出法。
【請求項７】
サルモネラ菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＢ１４７、赤痢菌がＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＴＫ００１、病原血清型大腸菌がＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｅｓＴ変異株、Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｅｐＢ欠損株、Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｓｐＡ欠損株、Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｓｐＢ欠損株およびＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｓｐＤ欠損株である請求の範囲第１項、第２項、第３項または第５項のいずれかに記載の検出法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、例えばサルモネラ属、エルシニア属、シュードモナス属、赤痢菌、病原血清型大腸菌、腸管出血性大腸菌、またはボルデテラ属、に属するバクテリアに高度に保持されるタイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌される分泌蛋白質の機能を阻害する物質を短時間でかつ大量に検出する検出法に関する。
背景技術及び従来の技術
バクテリアの病原因子を菌体外に放出する機能を持つタイプＩＩＩ分泌機構は、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、病原血清型大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、以下ＥＰＥＣと略称することもある）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、そしてボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属に高度に保存されていることが既に報告されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｎｅ，１９９８，ｐ３８１）。
前述のタイプＩＩＩ分泌機構を保持するバクテリアは、この分泌機構を通して病原因子を菌体外に放出し、放出された病原因子の一部は宿主細胞へと移行することが知られている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｎｅ  １９９８，ｐ３８９〜）。そして、宿主細胞に移行した病原因子は細菌の病原性に大きく関与していることも既に報告されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｎｅ  １９９８，ｐ３８２〜）。
一方、タイプＩＩＩ分泌機構によって分泌される蛋白質（以下タイプＩＩＩ分泌蛋白質と略称することもある）を欠損させたＥＰＥＣ株においては、病原性を消失することがウサギの感染実験（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌｕｍｅ  １８８，Ｎｕｍｂｅｒ  １０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １６，１９９８  ｐ１９０７−１９１６）、及びヒトをボランティアとした感染実験（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊｕｎｅ  ２０００，ｐ３６８９−３６９５）により明らかにされている。このような事実から、タイプＩＩＩ分泌機構ならびにその分泌蛋白質の機能を阻害する物質は、新たな抗感染治療薬、予防薬としてその効果が期待されると考えられる。
しかしながら、従来、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構を阻害する物質の検出法に関しては未だ確立されておらず、抗菌性を主体とした物質の検出法が行われているのが現状である。抗菌活性を持つ物質、すなわち、抗生物質の検出法は、主にバイオアッセイにより行われていた。バイオアッセイには拡散法（微生物薬品化学改訂第３版、南江堂、上野芳夫、大村智編）等が挙げられる。拡散法は試験菌を含む寒天平板上におかれた濾紙に抗生物質を含ませると抗生物質が寒天中を拡散し、試験菌の発育を阻止した部分が透明帯として観察される。この阻止帯の直径と抗生物質の濃度から抗生物質の力価を算出する検出法である。
このような拡散法は、操作が簡単であり、多数の試料を短時間に処理することが可能であることから、抗生物質の検出に広く用いられていた。しかしながら、この方法によって得られる物質は、標的細菌だけではなく、正常な腸内細菌叢までも殺菌してしまうことから、菌交代症や多剤耐性菌の出現など、さまざまな社会問題を引き起こしているのが現状である。従って、このような検出法をバクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構を阻害する物質の検出に適用するには問題があった。このような事実から、タイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質を特異的に阻害する物質の検出法は、未だ確立されていなかったため、現状ではタイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を阻害する物質の検出は、動物の感染実験に頼らざる得ず、従って操作が複雑で大量の試料を短時間で評価することは極めて困難となる問題があった。
本発明者らはタイプＩＩＩ分泌機構ならびにそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を特異的に阻害する物質を大量にしかも短時間で検出する簡単な手法を確立することは、タイプＩＩＩ分泌機構を標的とした医薬品の開発ならびに評価に極めて重要であることに鑑みて研究を行った。その結果、本発明者らは動物の感染実験に依存することのない新規な検出法を見出した。
本発明の目的は、動物の感染実験に依存することなく、タイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を特異的に阻害する物質を大量にしかも短時間で簡単に検出することができる、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を阻害する物質の検出法である。
本発明の更なる目的は、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構ならびにそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を阻害する物質を、赤血球の溶血活性を指標として数値化し、短時間に多くの試料の処理を可能にする、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を阻害する物質の検出法である。
発明の開示
タイプＩＩＩ分泌機構を保持するバクテリアと赤血球を混合させると、タイプＩＩＩ分泌機構に依存した溶血活性を示す。この溶血活性はタイプＩＩＩ分泌蛋白質が赤血球に作用して惹起することが明らかにされている［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）第６７巻、ｐ５５３８−５５４０］。本発明は、タイプＩＩＩ分泌機構を保持するバクテリアが起こす溶血活性に着目してなされたものであり、これにタイプＩＩＩ分泌機構を阻害する物質を加えると溶血活性が阻害されることに特徴づけられている。
本発明は赤血球の溶血活性を指標として、試験管内にて簡便にタイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を阻害する物質を検出する方法である。すなわち、タイプＩＩＩ分泌機構を有するバクテリアと赤血球懸濁液を混合し、これにタイプＩＩＩ分泌機構阻害物質を加えることによって生ずる溶血活性の変化を検出することを特徴とする、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構を阻害する物質の検出法である。また本発明はタイプＩＩＩ分泌機構を有するバクテリアと赤血球懸濁液を混合し、これにタイプＩＩＩ分泌機構によって分泌される蛋白質の機能を阻害する物質を加えることによって生ずる溶血活性の変化を検出することを特徴とする、タイプＩＩＩ分泌機構の分泌蛋白質機能を阻害する物質の検出法である。更に本発明による溶血活性は比色定量によって検出される検出法である。
本発明に用いられる溶血活性を誘導するための試験菌としてはタイプＩＩＩ分泌機構を保持する全てのバクテリアが含まれる。バクテリアの種類としては、例えばサルモネラ属、エルシニア属、シュードモナス属、赤痢菌、病原血清型大腸菌（または腸管病原性大腸菌）、腸管出血性大腸菌、及びボルデテラ属に属する細菌が挙げられる。また、これらのバクテリアに加えて、タイプＩＩＩ分泌機構とそれによって分泌される蛋白質をコードする３５．４ｋｂｐのＬｅｅと呼ばれる遺伝子群を含む領域を他のバクテリアに人為的に組み込んだ組換えバクテリア［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏ．（１９９７）第２７巻、ｐ３９９−４０７］、あるいはこれに類似した組換えバクテリアも本発明に含まれる。
試験菌の成育には栄養に富む培地よりも、Ｍ９培地のような比較的栄養の少ない培地が適している。また、試験菌の培養条件は３７℃が好ましく、培養は振盪培養よりも静置培養が適している。溶血活性の測定の原理は、赤血球膜が破壊されるとヘモグロビンが赤血球外へ放出されて反応溶液が赤色を呈することを利用し、この赤色を目視で判定する。この溶血活性に使用される赤血球はヒト由来のもののみに限定されるものではなく、例えばウサギ、ウマ、ヒツジなどの全ての種属の赤血球の利用が可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下に説明する実施例は、本発明をより完全に理解させるものであり、本発明に何ら制限を加えるものではない。
本発明の実施例に使用した菌株の性状および培地の性状は以下の参考例に示す通りである。
参考例１
病原血清型大腸菌
Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）Ｅ２３４８／６９（野性株）：［（Ｃｅｌｌ（１９９７）第９１巻、ｐ５１１−５２０）；ＡＴＣＣ１２７４０；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）より入手可能］
参考例１−１
ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株
ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株：［Ｔｉｒ特異的シャペロンの欠損株（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）；日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫より入手可能］
欠損株の作製は既に確立されている手法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５］を用いて行った。第１図はＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株の作製に使用されるプラスミドの構築の概略であり、第２図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第３図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢａｍＨＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  プライマーセット（第２図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された１．０ｋｂｐのｃｅｓＴ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５］にてｃｅｓＴ遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第３図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢａｍＨＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ、遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、各ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、Ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株の作製
ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コロニーをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株の確認を行った。
ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株の確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第２図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢａｍＨＩ  ５ユニットを加え３７℃で２時間反応させアガロース電気泳動を行った。ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入された制限酵素ＢａｍＨＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で欠損株を判定した。
参考例１−２
ＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株
ＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株：［タイプＩＩＩ分泌機構の欠損株（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９９５）第９２巻、ｐ７９９６−８０００）；米国、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｍｅｓ  Ｂ  Ｋａｐｅｒまたは日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫より入手可能］
ＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
第４図はＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株の作製に使用されるプラスミドの構築の概略である、第５図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第６図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第５図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された１．３ｋｂｐのｓｅｐＢ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法にてｓｅｐＢ遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第６図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸＴａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇｌＩＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ各遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、各ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、各遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
ＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株の作製
欠損株の作製は参考例１−１と同様の手法を用いて行った。ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は、既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コロニーをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株を作製した。
ＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株の確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第５図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇｌＩＩ  ５ユニットを加え３７℃で２時間反応させアガロース電気泳動を行った。ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入された制限酵素ＢｇｌＩＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で欠損株を判定した。
参考例１−３
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株［タイプＩＩＩ分泌蛋白質ｅｓｐＡの欠損株（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９６）第２０巻、ｐ３１３−３２３）；カナダ国、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｂ  Ｂｒｅｔｔ  Ｆｉｎｌａｙまたは日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫より入手可能］
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
第７図はＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株の作製に使用されるプラスミドの構築の概略である、第８図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第９図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第８図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された１．０ｋｂｐのｅｓｐＡ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ、各遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法にてｅｓｐＡ遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  プライマーセット（第９図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇｌＩＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｌと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株の作製
欠損株の作製は参考例１−１と同様の手法を用いて行った。バクテリアを２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は、既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、各遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コロニーをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株を作製した。
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株の確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第８図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇＩＩＩ  ５ユニットを加え３７℃で２時間反応させアガロース電気泳動を行った。ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入された制限酵素ＢｇｌＩＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で欠損株を判定した。
参考例１−４
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株：［タイプＩＩＩ分泌蛋白質ｅｓｐＢの欠損株（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ．（１９９３）第１７５巻、ｐ４６７０−４６８０）；米国、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｍｅｓ  Ｂ  Ｋａｐｅｒまたは日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫より入手可能］
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
第１０図はＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株の作製に使用されるプラスミドの構築の概略である、第１１図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第１２図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１１図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された１．０ｋｂｐのｅｓｐＢ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ各遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法にてｅｓｐＢ遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１２図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇｌＩＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ、遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｌと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、各遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株の作製
欠損株の作製は参考例１−１と同様の手法を用いて行った。ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は、既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、各遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コロニーをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株を作製した。
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株の確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１１図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇｌＩＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動を行った。ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入された制限酵素ＢｇｌＩＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で欠損株を判定した。
参考例１−５
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株［（タイプＩＩＩ分泌蛋白質ｅｓｐＤの欠損株）：（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９７）第６５巻、ｐ２２１１−２２１７）；米国、Ｄｅｖｉｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇまたは日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫より入手可能］
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
第１３図はＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株の作製に使用されるプラスミドの構築の概略である、第１４図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第１５図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢａｍＨＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１４図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された１．１ｋｂｐのｅｓｐＤ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ、各遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法にてｅｓｐＤ遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  プライマーセット（第１５図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢａｍＨＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ、遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え３７℃で２時間反応させた。反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｌと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、各遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株の作製
欠損株の作製は参考例１−１と同様の手法を用いて行った。ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は、既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、各遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コロニーをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株を作製した。
ＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株の確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  プライマーセット（第１４図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢａｍＨＩ  ５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動を行った。ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入された制限酵素ＢａｍＨＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で変異株を判定した。
参考例２
赤痢菌
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ＹＳＨ６０００（野性株）：［（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８６）第５１巻、ｐ４７０−４７５）；ＡＴＣＣ２５８７５；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）より入手可能］
参考例２−１
赤痢菌ｉｐａＣ欠損株
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＴＫ００１：［（Ｉｐａｃ欠損株、タイプＩＩＩ分泌蛋白質の欠損株）；日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫より入手可能］
赤痢菌ｉｐａＣ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
第１６図はｉｐａＣ欠損株の作製に使用されるプラスミドの構築の概略である、第１７図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第１８図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢａｍＨＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１７図参照）及び２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された１．１ｋｂｐのｉｐａＣ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩをそれぞれ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法にてｉｐａＣ遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１８図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢａｍＨＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ、遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩをそれぞれ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、各ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｌと制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
赤痢菌ｉｐａＣ欠損株の作製
欠損株の作製は参考例１−１と同様の手法を用いて行った。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａを２０ｍｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ社、米国）に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＢＨＩ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は、既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、各遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａを塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コローをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、赤痢菌ｉｐａＣ欠損株を作製した。
赤痢菌ｉｐａＣ欠損株の確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１７図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢａｍＨＩ  ５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動を行った。ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入された制限酵素ＢａｍＨＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で変異株を判定した。
参考例３
サルモネラ菌
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ１１（野性株）：［（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ．（１９９２）第１７４巻、ｐ４３３８−４３４９；ＡＴＣＣ１４０２８；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）より入手可能］
参考例３−１
サルモネラｉｎｖＡ欠損株
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＢ１４７：［（ｉｎｖＡ欠損株、タイプＩＩＩ分泌機構の欠損株（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ．（１９９２）第１７５巻、ｐ４３３８−４３４９；米国、Ｂｏｙｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｙａｌｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｒｇｅ  Ｅ  Ｇａｌａｎまたは日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫）より入手可能］
サルモネラｉｎｖＡ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
第１９図はｉｎｖＡ欠損株作製に使用されるプラスミドの構築の概略である、第２０図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第２１図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＸｂａＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第２０図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された２．０ｋｂｐのｉｎｖＡ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法にてｉｎｖＡ遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１８図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＸｂａＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ、遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、５Ｍ  ＮａＣｌを１μｌと制限酵素ＳａｌＩを５ユニット加え、さらに３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、各ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｌと制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
サルモネラｉｎｖＡ欠損株の作製
欠損株の作製は参考例１−１と同様の手法を用いて行った。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は、既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、各遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コロニーをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、サルモネラｉｎｖＡ欠損株を作製した。
サルモネラｉｎｖＡ欠損株確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第１７図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＸｂａＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動を行った。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入されたＸｂａＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で変異株を判定した。
参考例４
緑膿菌
Ｐｓｕｅｄｏｍａｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１：［ＡＴＣＣ１５６９２；（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）より入手可能］
参考例５
ボルデテラ属
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ  Ｓ７９８（野性株）：［ＡＴＣＣ７８０；（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．）より入手可能］
参考例５−１
ボルデテラｂｓｃＮ欠損株
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ  Ｓ７９８  ＢｓｃＮ欠損株：［日本国東京都港区白金５丁目９番１号、社団法人北里研究所、阿部章夫より入手可能］
ボルデテラｂｓｃＮ欠損株の取得に用いられる組換えプラスミドの作製
第２２図はｂｓｃＮ欠損株の作製に使用されるプラスミドの構築の概略である、第２３図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセット、第２４図はその組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ染色体ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第２２図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回の増幅後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された１．３ｋｂｐのｂｓｃＮ遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの５０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩとＳｍａＩをそれぞれ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。
制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｇと制限酵素ＳａｃＩとＳｍａＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製、米国）０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液で大腸菌を形質変換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
得られた組換えプラスミドはリバースＰＣＲ法にて遺伝子の中心部分に終止コドンを挿入した。組換えプラスミド０．０５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーセット（第２４図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で５分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた。
これを５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇｌＩＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動にて精製した。これを２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌を形質転換させ、遺伝子断片の翻訳領域に終止コドンが挿入された組換えプラスミドを得た。
終止コドンを含む遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミド１μｇを５０μｌの５０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＳａｃＩとＳｍａＩをそれぞれ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。制限酵素処理後、ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で精製した。精製されたＤＮＡ断片の０．１μｌと制限酵素ＳｍａＩとＳａｃＩで切断したｐＣＶＤ４４２［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）第５９巻、ｐ４３１０−４３１７］０．２μｇを、２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ジチオスレイトール、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの溶液に加え、１６℃で１６時間反応させた。このリガーゼ溶液にて大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８３）第１巻、ｐ７８４−７９１）を形質転換させ、遺伝子断片が組み込まれた組換えプラスミドを得た。
ボルデテラｂｓｃＮ欠損株の作製
欠損株の作製は参考例１−１と同様の手法を用いて行った。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜振とう培養を行った。一夜培養液を遠心して菌体を集め、それを１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、懸濁液を０．１ｍｌずつナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜培養した。得られたコロニーをさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸耐性菌株を確立した。このナリジキス酸耐性菌株を用いて欠損株を作製した。欠損株の作製は、既に確立されている手法を用いて行った［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。すなわち、各遺伝子に終止コドンが挿入された遺伝子断片を含む組換えプラスミドで大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒを形質転換し、この形質転換体をＬＢ寒天培地に綿棒で塗布した。さらに塗布された菌体上に、ナリジキス酸耐性のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを塗布した。二つの菌体が塗布されたＬＢ寒天培地を３７℃で６時間培養した。
これら二菌体の混合物をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一夜静置培養することにより、組換えプラスミドが変異を起こす菌体の染色体上に挿入されたものを選択した。出現した菌のコロニーはさらにナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、ナリジキス酸とアンピシリンの両者に対して耐性であることを確認した。確認した菌体コロニーをナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で３．５時間振とう培養した。振とう培養後、菌体をナリジキス酸（３０μｇ／ｍｌ）含有のシュクロース寒天培地に塗布する。得られたコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、ボルデテラｂｓｃＮ欠損株を作製した。
ボルデテラｂｓｃＮ欠損株の確認
欠損株より染色体ＤＮＡを調製し、その０．５μｇを１００μｌの２５ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  プライマーセット（第２３図参照）、２．５ユニットＴａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製、日本国）の溶液に加えた。この混合液をＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製、独国）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０回繰り返した。３０回のサイクル後、さらに７２℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子断片をエタノール沈殿法によって集めた後、５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、２５℃）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に加え、これに制限酵素ＢｇｌＩＩ  ５ユニットを加え、３７℃で２時間反応させ、アガロース電気泳動を行った。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片が、終止コドンの直下流に挿入されたＢｇｌＩＩにて消化され、断片が二つに分断されるか否で変異株を判定した。
参考例６
シュクロース寒天培地
トリプトン                                １０．０ｇ
イーストエキストラクト                      ５．０ｇ
シュクロース                              ５０．０ｇ
寒天（Ｄｉｆｃｏ社、米国）                １５．０ｇ
蒸留水                                １０００  ｍｌ
上記の組成のものを１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌をかける。
参考例７
Ｍ９培地
リン酸水素二ナトリウム７水和物            １２．８ｇ
リン酸二水素カリウム                        ３．０ｇ
塩化ナトリウム                              ０．５ｇ
塩化アンモニウム                            １．０ｇ
蒸留水                                １０００  ｍｌ
上記組成のものを１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌をかけた後、以下の組成のものを無菌的に加える。
２０％グルコース                          ２０．０ｍｌ
１０％カザミノ酸                          １０．０ｍｌ
１Ｍ硫酸マグネシウム                        １．０ｍｌ
参考例８
ＬＢ培地
トリプトン                                １０．０ｇ
イーストエキストラクト                      ５．０ｇ
塩化ナトリウム                            １０．０ｇ
水酸化ナトリウムにてｐＨを７．２に調整した後、蒸留水にて全量１０００ｍｌにする。１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌をかける。
参考例９
ＬＢ寒天培地
トリプトン                                １０．０ｇ
イーストエキストラクト                      ５．０ｇ
塩化ナトリウム                            １０．０ｇ
寒天（Ｄｉｆｃｏ社、米国）                １５．０ｇ
蒸留水                                １０００  ｍｌ
上記組成のものを１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌をかける。
参考例１０
シュタイナー・ショルト培地
グルタミン酸                              １０．７ｇ
プロリン                                    ０．２４ｇ
塩化ナトリウム                              ２．５ｇ
塩化カリウム                                ０．２ｇ
リン酸二水素カリウム                        ０．５ｇ
塩化マグネシウム６水和物                    ０．１ｇ
塩化カルシウム                              ０．０２ｇ
トリス緩衝液                                ６．１ｇ
カザミノ酸                                １０．０ｇ
ジメチルｂシクロデキストリン                １．０ｇ
上記組成のものを塩酸にてｐＨを７．４に調整した後、蒸留水にて全量１０００ｍｌにする。１２１℃で１５分間、蒸気滅菌をかけた後、以下の組成に調整したものを１０００ｍｌにつき１０ｍｌを無菌的に加える。
Ｌ−システイン塩酸塩１水和物                ４．０ｇ
硫酸鉄７水和物                              １．０ｇ
アスコルビン酸                            ４０．０ｇ
ニコチン酸                                  ０．４ｇ
還元型グルタチオン                        １５．０ｇ
蒸留水にて全量１０００ｍｌにした後、ろ過滅菌する。
実施例１−（１）
試験菌液の培養方法
菌株としてＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株をＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜（約１６時間）培養する。得られた菌の集落を一白金耳採取し、３ｍｌのＬＢ培地に植菌後、３７℃で一夜静置培養した。菌の一夜培養液０．５ｍｌを５０ｍｌのＭ９培地に植菌して、さらに３７℃で４時間、静置培養した。培養後、菌の培養液を遠心分離機（ベックマンＧＳ−６ＫＲ、ベックマン社製、米国）にて３５００ｒｐｍ、１５分間の遠心で集菌して菌体沈渣を得た。この菌体沈渣を新鮮なＭ９培地の５ｍｌに懸濁し、これを試験菌液とした。
実施例１−（２）
試験菌液の培養方法
菌株としてＥＰＥＣ株を用いてＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一夜（約１６時間）培養する。得られた菌の集落を一白金耳採取し、３ｍｌのＬＢ培地に植菌後、３７℃で一夜静置培養した。菌の一夜培養液０．５ｍｌを５０ｍｌのＭ９培地に植菌して、さらに３７℃で４時間、静置培養した。培養後、菌の培養液を遠心分離機（ベックマンＧＳ−６ＫＲ、ベックマン社製、米国）にて３５００ｒｐｍ、１５分間の遠心で集菌して菌体沈渣を得た。この菌体沈渣を新鮮なＭ９培地の５ｍｌに懸濁し、これを試験菌液とした。
実施例２
赤血球懸濁液の作製
ウサギ保存血（日本生物材料センターより入手可能）８ｍｌを５０ｍｌの遠心管に移し、４０ｍｌのＰＢＳ（０．８％  ＮａＣｌ、０．０２％  ＫＣｌ、０．１１５％  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２％  ＫＨ２ＰＯ４）を加えて、静かに混和した。混和後、９℃で遠心分離機（ベックマンＧＳ−６ＫＲ、ベックマン社製、米国）にて２５００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、上清を捨て赤血球沈渣を得た。この赤血球沈渣をさらに４０ｍｌのＰＢＳ（０．８％  ＮａＣｌ、０．０２％  ＫＣｌ、０．１１５％  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２％  ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄後、同様な操作にて遠心し、赤血球沈渣を得た。この操作をもう一度行った。遠心によって得られた赤血球沈渣の湿重量を測定し、これと同じ重量のＭ９培地を加えて赤血球の沈渣を懸濁し、赤血球懸濁液を得た。
実施例３
評価する試料の準備
９６穴のマイクロプレート（３７９９、コースター社製、米国）に予め１０μｌのＭ９培地を入れておき、精製水あるいはメタノール溶液に溶かした評価試料５μｌをこれに加え、混和した。この評価試料の乾燥を防ぐために、マイクロプレートは赤血球懸濁液と試験菌液［実施例１−（１）あるいは（２）］の混液を加えるまで、水をしみ込ませたキムワイプ（クレシア社製、日本国）を敷き詰めた密閉型の箱に入れておいた。
実施例４
マイクロプレートを用いた評価方法
前記の実施例２で調製しておいた赤血球懸濁液に等量の試験菌液［実施例１−（１）あるいは（２）］を加えた後、この混合液を１００μｌずつ実施例３で準備した評価試料を入れておいたマイクロプレートの各穴に加えた。赤血球懸濁液５０μｌに等量のＭ９培地を加えて、これを陰性の対照とした。また、赤血球懸濁液５０μｌに等量の試験菌液［実施例１−（１）あるいは（２）］を加えて、これを陽性の対照とした。陰性と陽性の対照を評価試料の含まないマイクロプレートの穴に入れ対照群とした。このマイクロプレートを９℃で、遠心分離機（ベックマンＧＳ−６ＫＲ、ベックマン社製、米国）にて１５００ｒｐｍ、１０分間の遠心を行うことにより、試験菌液と赤血球懸濁液の接触を高めた。
遠心後のマイクロプレートを３７℃で約９０分間反応後、このマイクロプレートの各穴に１５０μｌのＰＢＳ（０．８％  ＮａＣｌ、０．０２％  ＫＣｌ、０．１１５％  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２％  ＫＨ２ＰＯ４）を加え、穏やかに懸濁後、９℃で、遠心分離機（ベックマンＧＳ−６ＫＲ、ベックマン社製、米国）にて１５００ｒｐｍ、１０分間の遠心を行った。遠心によって得られた上清１００μｌを新たなマイクロプレート（３７９９、コースター社製、米国）に移して、上清中に現れたヘモグロビンの赤色をマイクロプレートリーダー（マルチスキャンプラスＭｋＩＩ、大日本製薬社製、日本国）を用いて、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
評価試料が、どの程度タイプＩＩＩ分泌機構を阻害したのかについての阻害率は、次式にて求めた。
阻害率（％）＝１００−［（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００］
ただし、式中、
Ａ：評価試料を含んだものの波長
Ｂ：陰性対照の波長５５０ｎｍ値
Ｃ：陽性対照の波長５５０ｎｍ値
実施例５
本検出法がタイプＩＩＩ分泌機構に特異的であることの証明
現時点においてはタイプＩＩＩ分泌機構の阻害剤は存在せず、従ってこの検出法をタイプＩＩＩ分泌機構の阻害剤にて検証することはできない。しかしながら、本検出法がタイプＩＩＩ分泌機構に特異的であるか否かについては、タイプＩＩＩ分泌機構の欠損した菌株を試験菌株として使用することによって証明が可能である。試験菌株にはＥＰＥＣのタイプＩＩＩ分泌機構に変異を持つＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株を用いた。このＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株はタイプＩＩＩ分泌機構に変異を持つために、タイプＩＩＩ分泌蛋白質を菌体外に放出することができない。
一方、タイプＩＩＩ分泌蛋白質の変異株として、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株およびＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株を用いた。これら４つの欠損株、ｓｅｐＢ欠損株、ｅｓｐＡ欠損株、ｅｓｐＢ欠損株、及びｅｓｐＤ欠損株は溶血活性を持たないことが既に報告されている（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）第６７巻、ｐ５５３８−５５４０）。ＥＰＥＣ野性株とＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株、及びＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株を試験菌株として、実施例１から４と同様な操作にて溶血活性を惹起させ、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。ＥＰＥＣ野性株の溶血活性を１００％として、各欠損株の溶血活性の百分率を前述の阻害率の式によって算出した。その結果は第２５図に示した。
第２５図の結果から明らかなように、タイプＩＩＩ分泌機構の欠損株であるＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株は、ＥＰＥＣ野性株と比較して溶血活性が著しく減少した。更にタイプＩＩＩ分泌蛋白質の変異株であるＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株およびＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株においても、ＥＰＥＣ野性株と比較して溶血活性が極度に低下した。一方、タイプＩＩＩ分泌機構に関与していないＴｉｒ特異的シャペロンのＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株では第２５図から明らかなように溶血活性になんら影響を与えなかった。
以上のことから、本発明の検出法の原理となる溶血活性は、タイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質に完全に依存していることを示すものである。
尚、本発明において、前記の実施例１−（１）の培養方法における溶血活性の試験菌株として、ＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株を使用した。このＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株はＴｉｒの特異的シャペロンであり、この欠損によりＴｉｒが不安定になりタイプＩＩＩ分泌機構を介したＴｉｒの宿主細胞への移行に支障をきたすことが報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂ．（１９９９）第３３巻、ｐ１１６２−１１７５）。更に、感染実験の検討からＴｉｒは病原因子として働くことが明らかにされている（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２０００）第６８巻、ｐ２１７１−２１８２）。それ故、Ｔｉｒの宿主細胞内移行に障害を持つＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株は、ＥＰＥＣ野性株に比べて病原性が低下していると考えられるため、本検出法に使用される試験菌株には、野性株と比較して病原性が減少したＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株の使用が好ましいと考えられる。
実施例６
本検出法がＥＰＥＣだけではなく、タイプＩＩＩ分泌機構を持つ他のバクテリアを試験菌として用いても有効であることの証明
前記の実施例５において、本検出法はタイプＩＩＩ分泌機構とタイプＩＩＩ分泌蛋白質に依存することを示した。しかしながら、実施例５ではＥＰＥＣ株以外のタイプＩＩＩ分泌機構を持つバクテリアを試験菌として用いても有効であることの証明にはならない。そこで、タイプＩＩＩ分泌機構を保持する赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、並びにボルデテラ  ブロンヒセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）を試験菌として、溶血活性を持つのか否かを確認した。但し、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに関しては、ＬＢ培地では成育が遅いのでシュタイナー・ショルト培地で一夜培養した菌液を、直接溶血活性の試験に使用した。
溶血活性の試験は、実施例１から４と同様な操作にて溶血活性を惹起させ、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その測定結果を第２６図に示した。第２６図から明らかなように、ＥＰＥＣ野性株の溶血活性を１００％として、各菌株の溶血活性を求めると、ＥＰＥＣ野性株に比較して赤痢菌、サルモネラ菌、緑膿菌、及びＢｏｒｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにおいても、それぞれ溶血活性を持つことが明らかにされた。このことから、本検出法には、ＥＰＥＣ野性株だけではなく、他のタイプＩＩＩ分泌機構を保持するバクテリアも試験菌として使用できることを示すものである。
実施例７
異なったバクテリアを使用して得られた溶血活性がタイプＩＩＩ分泌機構に依存しているか否かの証明
前記の実施例６において、試験菌としてＥＰＥＣ野性株だけではなく、他のタイプＩＩＩ分泌機構を保持するバクテリアも使用できることを証明した。しかしながら、上記実施例６で異なったバクテリアを使用して得られた溶血活性がタイプＩＩＩ分泌機構に依存しているか否かに関しては不明である。そこで、赤痢菌、サルモネラ菌及びボルデテラ菌の各菌株におけるタイプＩＩＩ分泌機構ならびにそれの分泌によるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の欠損株を用いて、前記実施例６と同様の溶血試験によって溶血活性を求め、各菌株の親株と比較した。その結果を第２７図に示した。
第２７図に示されるように、赤痢菌、サルモネラ菌およびボルデテラ菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）の親株を１００％としたとき、各菌株におけるタイプＩＩＩ分泌機構とタイプＩＩＩ分泌機構の欠損株の溶血活性は極度に阻害された。すなわち、赤痢菌においてタイプＩＩＩ分泌蛋白質の欠損株である赤痢菌ｉｐａＣ欠損株では、溶血活性が著しく減少した。また、サルモネラ菌のタイプＩＩＩ分泌機構の欠損株である、サルモネラｉｎｖＡ欠損株およびボルデテラ菌のタイプＩＩＩ分泌機構の欠損株である、ボルデテラｂｓｃＮ欠損株においても、前記赤痢菌ｉｐａＣ欠損株と同様に溶血活性が著しく減少した。これらのことから、サルモネラ菌、赤痢菌、並びにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにおいても、検出の根幹となる溶血活性は、タイプＩＩＩ分泌機構およびそのタイプＩＩＩ分泌蛋白質に依存していることを示すものである。これらの結果より本検出法は、ＥＰＥＣのタイプＩＩＩ分泌機構に限定されるものではなく、他のタイプＩＩＩ分泌機構を保持する細菌を試験菌として使用可能であることを示すものである。
実施例８
本検出法の評価
前記の実施例７から明らかなように、本検出法はタイプＩＩＩ分泌機構およびそれから分泌するタイプＩＩＩ分泌蛋白質に依存していることを示すものであり、かつ、試験菌としてＥＰＥＣ株に限定されないことを示した。前述したようにタイプＩＩＩ分泌機構を阻害する物質は、これまで効率的な検出法が確立されていないことから開発がなされていない。このような理由から、現在使用されている抗生物質を本検出法に適用して、その評価を行った。
使用した抗生物質はテトラサイクリンである。テトラサイクリンは細菌のリボソームの３０Ｓサブユニットに結合することによって蛋白質合成を阻害する。このような蛋白質合成阻害により、タイプＩＩＩ分泌機構を構成する蛋白質も合成されないことから、テトラサイクリンはタイプＩＩＩ分泌機構を介した溶血活性を阻害するものと推定された。
そこで、メタノール溶液にテトラサイクリンを１２５μｇ／ｍｌとなるように調製して、これを評価試料として実施例１から５までの一連の検出法を実施した。すなわち、試験菌としてＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株を用いて、バクテリアと赤血球懸濁液の混合液を作製した。この混合液１００μｌに対してメタノール溶液に溶かしたテトラサイクリン溶液を５μｌ加えて、赤血球とバクテリアの接触を高めるために遠心した。遠心後、マイクロプレートを３７℃で約９０分間反応後、実施例４に従って阻害率を求めた。
試験菌にテトラサイクリンを加えていない無添加の溶血活性を１００％とし、テトラサイクリンを添加したものの溶血活性の試験結果を第２８図に示した。第２８図から明らかなように、テトラサイクリンは顕著に溶血活性を阻害した。更に、実施例４における阻害率の算出法によりテトラサイクリンの阻害率を求めたところ下記の結果が得られた。
１００−［（０．１３−０．０７）／（１．３０−０．０７）×１００］＝９５．１％。
尚、テトラサイクリンの反応溶液中の終濃度は、６μｇ／ｍｌという低濃度にも関わらず、溶血活性をほぼ１００％まで阻害する結果が得られた。このように細菌の蛋白質合成阻害剤の添加で、タイプＩＩＩ分泌機構の構成蛋白質の合成が阻害されると、溶血活性が著しく阻害されたことが確認された。
以上の結果より、本検出法にてタイプＩＩＩ分泌機構ならびにタイプＩＩＩ分泌機構によって分泌される蛋白質の機能を阻害する物質の評価検定が可能であることを示すものである。しかしながら、前記したように、テトラサイクリンは正常な腸内細菌叢まで殺菌してしまうという欠点があることはいうまでもまい。
産業上の利用可能性
本発明は、バクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構ならびにそれから分泌されるタイプＩＩＩ分泌蛋白質の機能を阻害する物質を、動物の感染実験を行わずに、赤血球の溶血活性を指標として数値化し、短時間に多くの試料の処理が可能であることから、医薬品の開発等に有利な方法である。
【図面の簡単な説明】
第１図はＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第２図は第１図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第３図は第１図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢａｍＨＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第４図はＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第５図は第４図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第６図は第４図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第７図はＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第８図は第７図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第９図は第７図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第１０図はＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第１１図は第１０図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第１２図は第１０図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第１３図はＥＰＥＣ  ｅｓｐＤ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第１４図は第１３図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第１５図は第１３図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢａｍＨＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第１６図は赤痢菌ｉｐａＣ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第１７図は第１６図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第１８図は第１６図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢａｍＨＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第１９図はサルモネラｉｎｖＡ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第２０図は第１９図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第２１図は第１９図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＸｂａＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第２２図ボルデテラｂｓｃＮ欠損株の作製に用いられる組換えプラスミドの構築図である。
第２３図は第２２図の組換えプラスミドの構築に際して用いられる遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
第２４図は第２２図の組換えプラスミドの構築に際して用いられるリバースＰＣＲ法によって終止コドンとＢｇｌＩＩ部位を挿入するためのプライマーセットである。
第２５図はＥＰＥＣ野性株とＥＰＥＣ  ｃｅｓＴ欠損株、ＥＰＥＣ  ｓｅｐＢ欠損株、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＡ欠損株、ＥＰＥＣ  ｅｓｐＢ欠損株、ＥＰＥＣｅｓｐＤ欠損株における溶血活性を百分率にて比較したものである。
第２６図はＥＰＥＣ野性株とタイプＩＩＩ分泌機構を有する他の菌属の赤痢菌、サルモネラ菌、緑膿菌ならびにボルデテラ菌における溶血活性をＥＰＥＣ野性株の溶血活性を１００％として比較したものである。
第２７図はタイプＩＩＩ分泌機構を保持する赤痢菌と赤痢菌ｉｐａＣ欠損株、サルモネラ菌とサルモネラｉｎｖＡ欠損株、ボルデテラ菌とボルデテラｂｓｃＮ欠損株における溶血活性の比較である。
第２８図は試験菌に抗生物質を加えない無添加の溶血活性と抗生物質添加における溶血活性の阻害をあらわした比較である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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