(57)【要約】ヒトｃＤＮＡライブラリーより、ヒストンアセチル化酵素ｐ３００のインヒビターを単離・同定した。このインヒビターは、８５５アミノ酸残基からなる核タンパク質である。このインヒビターは、ｐ３００のシステイン／ヒスチジンに富んだ領域に結合し、ｐ３００による転写活性化を阻害する。このｐ３００をコアクティベーターとするｐ５３の転写活性をも阻害し、ｐ５３に依存した細胞周期停止をも阻害した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のｐ３００インヒビターをコードした核酸。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるインヒビター。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるインヒビター。
【請求項２】
ｐ３００インヒビターをコードした下記（Ａ）または（Ｂ）の核酸。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする核酸。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸又はその相補鎖に対して相補的であり、少なくとも１５ヌクレオチド長を備えた核酸。
【請求項４】
請求項１または２に記載の核酸をコードしたｐ３００インヒビター。
【請求項５】
請求項４に記載のｐ３００インヒビターに特異的な抗体。
【請求項６】
請求項４に記載のｐ３００インヒビターまたは請求項１もしくは２に記載のインヒビターをコードした核酸を含む、転写阻害用組成物。
【請求項７】
請求項４に記載のｐ３００インヒビターを阻害し得る阻害物質のスクリーニング方法であって、
請求項４に記載のｐ３００インヒビターに被験試料を接触させる工程、
前記ｐ３００インヒビターと被験試料との結合活性を検出する工程、および
前記結合活性を有する化合物を選択する工程と、を含む、方法。
【請求項８】
請求項４に記載のインヒビターを阻害し得る阻害物質のスクリーニング方法であって、
被験試料存在下で請求項４に記載のｐ３００インヒビターとｐ３００とを接触させる工程、
前記ｐ３００インヒビターと前記ｐ３００との結合活性を測定する工程、および
被験試料非存在下における前記インヒビターと前記ｐ３００との結合活性に比べ、前記インヒビターと前記ｐ３００との結合活性を低下させ得る化合物を選択する工程とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒストンアセチル化酵素、特にｐ３００に対するインヒビターに関する。
背景技術
ｐ５３は遺伝毒性となるストレス等に応答して発現誘導され、種々の遺伝子の転写を活性化し、細胞周期の停止、ＤＮＡ修復あるいはアポトーシス誘導などの生理活性をもたらすことが広く知られている。また、ｐ５３に関する近年の研究により、ｐ５３による転写活性化は、転写共役因子としてヒストンアセチル化酵素が関与することが明らかにされている。ヒストンアセチル化酵素は、ヒストンＮ末端ドメインの特異的なＬｙｓ残基のε−アミノ基をアセチル化して正電荷を中和する。ヒヒストンがアセチル化されると、ヌクレオソーム構造が緩和され、転写因子がリクルートされやすくなり、転写が活性化されると考えられている。このようなｐ５３の転写活性化に関与するヒストンアセチル化酵素としては、ｐ３００、ＰＣＡＦ、ＰＭＬ、ＭＯＺなどが知られている。このうちｐ３００はヒストンをアセチル化するだけでなく、ｐ５３をもアセチル化して、ｐ５３の特異的ＤＮＡへの結合能を増強させることが報告されている（Ａｖａｎｔａｇｇｉａｔｉ  ＭＬら，Ｃｅｌｌ  ８９：１１７５−１１８４（１９９７）、Ｌｉｌｌ  ＮＬら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８２３−８２７（１９９７））。上記ｐ３００には、システイン／ヒスチジンに富んだＣＨ１ドメイン、ＣＨ３ドメイン、グルタミンに富んだＱリッチドメインが存在し、これらドメインのいずれかとｐ５３のＮ末端の転写活性化ドメインとが結合することも明らかにされている。
また、上記ＰＣＡＦはｐ３００とともにｐ５３のコアクティベーターとして機能することが報告されている（Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：３６９３−３６９６（１９９７））。さらに、ＪＭＹはｐ３００とともにｐ５３のコアクティベーターとして機能して、特に、アポトーシスを誘導するＢａｘ遺伝子を活性化する（Ｓｈｉｎｋａｍａ，Ｎ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４：３６５−３７６（１９９９））。このようにｐ３００はｐ５３機能発現に必須の共役因子であることが示されている。また、上記ｐ３００は上記ｐ５３の転写コアクティベーターとして機能する以外にも、種々の転写因子、例えばｐ７３（ｐ５３ファミリー）、ＣＲＥＢ、ＡＭＬ１、Ｍｙｂ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ、Ｃ／ＥＢＰ、ＩＲＦ３、ＭｙｏＤなどのコアクティベーターとしても機能することが明らかとなっている。
一方、ｐ５３遺伝子の変異が癌患者で観察されているのと同様に、ｐ３００遺伝子の変異が癌患者において観察されている。急性骨髄性白血病では、染色体転座によりｐ３００遺伝子の分断が観察されている（Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１５：８９−９４（２００１），Ｃｈａｆｆａｎｅｔ，Ｍ．ら，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２８：１３８−１４４（２０００），Ｉｄａ，Ｋ．ら，Ｂｌｏｏｄ，９０：４６９９−４７０４，（１９９７），Ｓａｔａｋｅ，Ｎ．ら，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０：６０−６３（１９９７），Ｔａｋｉ，Ｔ．ら，Ｂｌｏｏｄ，８９：３９４５−３９５０（１９９７），Ｓｏｂｕｌｏ，Ｏ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：８７３２−８７３７（１９９７），Ｂｏｒｒｏｗ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１４：３３−４１（１９９６），Ｐａｎａｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｉ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０：３９５−４０４（２００１）。また大腸癌や乳癌などの固形癌におけるｐ３００遺伝子の変異も報告されている（Ｇａｙｔｈｅｒ，Ｓ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４：３００−３０３（２０００））。さらに、ｐ３００は癌ウイルスの癌遺伝子産物の標的であり、アデノウイルスＥ１ＡやＳＶ４０Ｔ抗原、パピローマウイルスＥ６、ＨＴＬＶのＴａｘは、ｐ３００に結合してｐ３００の機能を阻害する。このようにｐ３００遺伝子の変異やｐ３００が上記癌遺伝子産物と結合することにより、ｐ３００におけるｐ５３のコアクティベーターとして転写活性化機能を阻害することで癌化させていることが予想されている。
上述したようにヒストンアセチル化酵素ｐ３００は、ｐ５３の生理活性の発現に重要な役割を果たし、ｐ３００の機能阻害により癌化を誘導する可能性があることが示唆されている。このｐ３００の機能・作用を解析する上で、阻害剤の開発は有益となる。また、癌患者などでｐ３００遺伝子の変異が観察されたが、生体内にｐ３００インヒビターが存在するか否かを知ることも、ｐ３００に関与する癌化の解明に有用となることが予想される。
発明の開示
そこで、本発明は、ｐ３００が関与する転写の解析またはｐ３００が関与する疾患の解析に有用となるヒト由来ｐ３００インヒビターを同定し、該ｐ３００インヒビターおよびこれをコードした核酸、特異的な抗体等を提供することを目的とする。
上記課題に鑑みて、本願発明者らは、ヒトｃＤＮＡライブラリーよりｐ３００と結合して、ｐ３００による転写活性化を阻害しうる遺伝子産物が存在することを見出し、その遺伝子を単離・同定した。そして本願発明者らは実際にＨＤＡＲＴの高発現によりｐ５３の活性が抑制されることを示した。さらに本願発明者らは、内在ＨＤＡＲＴの発現を抑制することにより、ｐ５３の生理機能にどのような影響を及ぼすかを検討し、ＨＤＡＲＴの発現抑制がｐ５３の機能発現の亢進につながることを証明した。
また、本願発明者らは、このインヒビターに対する抗体、さらには、インヒビターに対する阻害剤のスクリーニング方法を開発した。すなわち、本発明は、以下に示す通りである。
（１）  下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のｐ３００インヒビターをコードした核酸。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるインヒビター、（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるインヒビター。
（２）  ｐ３００インヒビターをコードした下記（Ａ）または（Ｂ）の核酸。（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする核酸。
（３）  配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸又はその相補鎖に対して相補的であり、少なくとも１５ヌクレオチド長を備えた核酸。
（４）  上記（１）または（２）に記載の核酸をコードしたｐ３００インヒビター。
（５）  上記（４）に記載のｐ３００インヒビターに特異的な抗体。
（６）  上記（４）に記載のｐ３００インヒビターまたは上記（１）もしくは上記（２）に記載のインヒビターをコードした核酸を含む、転写阻害用組成物。
（７）  上記（４）に記載のｐ３００インヒビターを阻害し得る阻害物質のスクリーニング方法であって、上記（４）に記載のｐ３００インヒビターに被験試料を接触させる工程、前記ｐ３００インヒビターと被験試料との結合活性を検出する工程、および前記結合活性を有する化合物を選択する工程と、を含む、方法。
（８）  上記（４）に記載のインヒビターを阻害し得る阻害物質のスクリーニング方法であって、被験試料存在下で上記（４）に記載のｐ３００インヒビターとｐ３００とを接触させる工程、前記ｐ３００インヒビターと前記ｐ３００との結合活性を測定する工程、および被験試料非存在下における前記インヒビターと前記ｐ３００との結合活性に比べ、前記インヒビターと前記ｐ３００との結合活性を低下させ得る化合物を選択する工程とを含む、方法。
以下、本発明を実施の形態に基づき詳細に説明する。
本発明は、ｐ３００インヒビター（以下、本書においてｐ３００インヒビターを「ＨＤＡＲＴ」と称する）に関する。ここで、「ｐ３００」は、一般に、ヒトより同定された２４１４アミノ酸からなる核内リン酸化タンパク質を指すが、本書においては、ＨＤＡＲＴが結合し機能を阻害し得る限り、これと相同性を有するタンパク質をも含めることができる。この相同性を有するタンパク質としては、ＣＢＰがあり、ＣＢＰは上記ｐ３００とＣＢＰはほぼ同等の長さ（２４４１アミ酸）からなる核内リン酸化タンパク質である。両者とも、システイン／ヒスチジンに富んだ領域（ＣＨ領域）を３箇所（Ｎ末端側よりＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）有し、ＣＨ１とＣＨ２との間にはブロモドメイン（Ｂｒ）が存在し、さらに、Ｃ末端側にグルタミンに富んだ領域（Ｑリッチ）が存在し、両者はこれら機能ドメインにおいて非常に高いホモロジー（具体的には、ＣＨ１領域において９３％、中央の８００アミノ酸においては９５％）を有し、全体としても６０％のホモロジーを有する。特に、本願発明者らは、ｐ３００とＨＤＡＲＴとの結合実験において、ｐ３００のＣＨ１領域にＨＤＡＲＴが結合することを示しており、このようなＣＨ１においてｐ３００と高い相同性を有するＣＢＰについてもＨＤＡＲＴが結合しその機能を阻害し得る限り、本書における「ｐ３００」にｐ３００と相同あるいは類似タンパク質として「ＣＢＰ」を含めることができる。
上記ｐ３００は、転写因子、例えば、ｐ５３、ｐ７３（ｐ５３ファミリー）、ＣＲＥＢ、ＡＭＬ１、Ｍｙｂ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ、Ｃ／ＥＢＰ、ＩＲＦ３、ＭｙｏＤなどのコアクティベーターとして機能することから、ｐ３００インヒビターは、ｐ３００の機能阻害を通じて、これらｐ３００が共役する転写因子のインヒビターとしても機能し得る。こうしたｐ３００インヒビターとしては、具体的には、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるＨＤＡＲＴが挙げられるが、これに限られず、ＨＤＡＲＴと同様にｐ３００と結合し、その機能を阻害しうるＨＤＡＲＴ類似タンパク質もＨＤＡＲＴと均等のものとして、本書における「ｐ３００インヒビター（ＨＤＡＲＴ）」に含めることができる。この類似タンパク質としては、配列番号２におけるアミノ酸配列の一つまたは複数を置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
このＨＤＡＲＴ類似タンパク質は、ヒトより単離されたＨＤＡＲＴタンパク質の変異体、他の生物より単離されたＨＤＡＲＴカウンターパートおよび人工的に創製したＨＤＡＲＴ変異体が含まれる。なお、本明細書において「単離」とは、本来の環境（たとえば自然に発生するのであればその自然環境）から取り出された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指し、その自然状態から「人の手によって」変えられたものである。「単離」とは、対象化合物に実質的に富む試料中に存在する化合物および／または対象化合物が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合物を含むことを意味する。ここで「実質的に精製した」という用語は、その天然の環境から切り離されて、天然に関連している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、および最も好ましくは９０％含まない化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指す。
上記「アミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」において、アミノ酸の変異数や変異部位はＨＤＡＲＴタンパク質における機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内であると考えられる。
上記ＨＤＡＲＴはヒト由来の核タンパク質であることから、ＨＤＡＲＴの調製は、ヒトの核タンパク質を抽出し、例えば後述する抗ＨＤＡＲＴ抗体を用いて精製することができる。また、簡便には、後述する配列番号１に記載のＨＤＡＲＴをコードしたＤＮＡを担持したベクターを有する形質転換体を用いて精製することもできる。
上記ＨＤＡＲＴに類似したタンパク質の調整は、第一に当業者に周知のハイブリダイゼーション技術を用いて行うことができる。例えば、ＨＤＡＲＴをコードしたＤＮＡの塩基配列、例えば、配列番号１に記載の塩基配列またはその一部をプローブとして、ハイブリダイゼーションによりヒトを含めた哺乳類、その他種々の生物種からＨＤＡＲＴのｃＤＮＡと相同性の高いＤＮＡを単離し、単離されたＤＮＡからＨＤＡＲＴに類似したタンパク質を生成することができる。また、上記配列番号１に記載の塩基配列またはその一部をプライマーに用い当業者に周知なＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により調製することもできる。
上記ＨＤＡＲＴタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードしたＤＮＡを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃で、より厳しい条件としては、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃で、さらに厳しい条件としては、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳ等の試薬条件および温度条件の組合せは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるＤＮＡがコードするポリペプチドは、通常、本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９５％以上、さらに好ましくは少なくとも９７％以上（例えば、９８から９９％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
上記ＨＤＡＲＴと類似したタンパク質は、自然界から分離したタンパク質に限られず、配列番号２に記載のアミノ酸からなるＨＤＡＲＴタンパク質を人工的に改変する方法によっても調製することができる。この人工的な改変は、ＨＤＡＲＴタンパク質をコードしたＤＮＡ、例えば、配列番号１のＤＮＡを当業者に公知の技術、ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ作製方法、ＰＣＲ法、カセット変異法などを用いたｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓにより実行することができる。
ここで得られたＨＤＡＲＴ類似タンパク質が、ＨＤＡＲＴと同様にｐ３００に結合し、その機能を阻害するか否かは、例えば、ＴＷＯハイブリッドシステムや免疫沈降法を利用したｐ３００との結合活性の測定により、あるいは実施例８に示すようなｐ３００が起因する転写に対する阻害活性の測定を指標として判定することができる。
上記ＨＤＡＲＴタンパク質およびこれに類似したタンパク質は、上述したｐ３００における転写因子のコアクティベーターとして転写因子による転写を促進する機能を阻害する。そのため、これらタンパク質は、ｐ３００がいかなる転写因子に関与しているか解析するための実験用ツールとして有益となる。また、ｐ３００やｐ５３などの機能が亢進することにより生じる異常なアポトーシスを抑制するための薬剤開発にも有用となる。
また、本発明はｐ３００インヒビターをコードしたＤＮＡに関する。このｐ３００インヒビターをコードしたＤＮＡには、ＨＤＡＲＴをコードしたＤＮＡ、および上記ＨＤＡＲＴ類似タンパク質をコードしたＤＮＡが含まれる。
ＨＤＡＲＴをコードしたＤＮＡの好適な例として、配列番号１に記載のコード領域が挙げられる。また、類似タンパク質をコードしたＤＮＡは、上記ｐ３００結合活性等を有するタンパク質が発現している生物組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１に記載のＤＮＡまたはその断片を標識化したプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、選抜することができる。または、配列番号１に記載のＤＮＡの一部を含む合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記活性を有するタンパク質が発現している組織由来のトータルＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより得ることもできる。
また、上述したＤＮＡは市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することもできる。例えば、配列番号１に記載のＤＮＡおよび相補鎖をそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて二本鎖にすることにより調製することができる。
上述したＤＮＡは、ｐ３００インヒビターの生産や、ｉｎ  ｖｉｖｏで該ｐ３００インヒビターを発現させ、ｐ３００の機能解析などを行うために用いることができる。このような場合には、上記ＤＮＡを適切な発現ベクターにつないで用いることができる。適当な発現ベクターは、タンパク質生産に用いる翻訳系により、適宜選択することができる。翻訳系は細胞系、無細胞系のいずでもよく目的により選択することができる。細胞系では、例えば、大腸菌で発現させるためのベクターとして、ｐＧＥＸ５Ｘ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ｐＴｒｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いることができる。特に、これら発現ベクターは、他のタンパク質（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグなど）との融合タンパク質として発現される。そのため、後述するタンパク質の精製を容易にすることができる。また、昆虫細胞や哺乳動物細胞を用いてタンパク質を生産させる場合には、バキュロウイルスを用いることができる（村松正実  編、ラボマニュアル遺伝子工学第３版、丸善株式会社、１９９６年発行、ｐｐ．２４２−２４６）。
宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができる。また、本発明のタンパク質を、上述したような、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグなどを結合した融合タンパク質の形で発現させた場合には、グルタチオンセファロースカラムやニッケルカラム等により精製することができる。
上記ＨＤＡＲＴ等をコードしたＤＮＡは、ＨＤＡＲＴ遺伝子の変異又は欠損に起因した疾患の治療や、さらには、ｐ３００の異常な亢進による細胞死を伴う疾患などの治療に用いてもよい。このような目的で使用するためには、所望の組織または細胞に該ＤＮＡを運搬するためのベクターに上記ＤＮＡを組み込んで使用することが好ましい。こうした遺伝子治療目的のベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられる（Ｙ．Ｎｉｉｔｓｕら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５：１３８５−１３９５（１９９８）。遺伝子の導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏやｅｘ  ｖｉｖｏなどが考えられる。
上記ＤＮＡは、全長として用いる場合に限られず、その一部フラグメントとして、ハイブリダイゼーション用プローブ、ＰＣＲプライマーまたはリボザイム誘導体として利用することができる。これらの目的で上記ＤＮＡの一部を用いる場合には、プローブ等としての特異性を保持できる長さ、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド長を有していることが好ましい。例えば、こうしたポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするものが挙げられる。ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションにおいて、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。上記プローブ、プライマーは、ＨＤＡＲＴあるいは類似タンパク質をコードしたＤＮＡのクローニングやＨＤＡＲＴの機能解析に用いることができる。また。制限断片多型解析方法などを通して、ＨＤＡＲＴ遺伝子もしくはｃＤＮＡの多型や変異を検出するために利用することができる。あるいは、例えばＨＤＡＲＴによるｐ３００阻害に起因した疾患の診断に使用することができる。
本発明はｐ３００インヒビタータンパク質に結合する抗体に関する。本抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識に結合し得るものであれは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを用い、周知の方法によりウサギ、モルモットなどの動物を免疫し、抗体価が上昇したことを確認した上で免疫動物の末梢血から血清を得ることにより調製することができる。一方、モノクローナル抗体は、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを用い、周知の方法によりマウスなどの動物を免疫し、抗体価が上昇した免疫動物の脾臓またはリンパ節を採取し、これら組織中の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させハイブリドーマを調製する。ハイブリドーマから産生される抗体を培養上清から回収することにより得ることができる。
これら抗体は、本発明のインヒビターをアフィニティー精製する際に利用することができる他、本発明のタンパク質の発現量検出等を通じて、被験者におけるＨＤＡＲＴの発現異常や構造異常に起因する疾患の検査や診断に用いることができる。なお、本発明のインヒビターを検出する目的で本抗体を用いる場合には、必要に応じてＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット法などの手法を用いることができる。
本発明は、ＨＤＡＲＴを阻害し得るＨＤＡＲＴ阻害剤のスクリーニング方法に関する。上記スクリーニング方法の第一の実施形態には、ＨＤＡＲＴに被験試料を接触させる工程、前記ＨＤＡＲＴと被験試料との結合活性を検出する工程、および前記結合活性を有する化合物を選択する工程とを含めることができる。
上記第一の実施形態に係るスクリーニング方法は、より具体的には、次のとおり実施することができる。ＨＤＡＲＴと結合する化合物を含むと予想される試料、例えば、細胞の培養上清や細胞抽出物を接触させ、その後、本発明の抗体を添加して、ＨＤＡＲＴとともに化合物を免疫沈降させることができる。そして免疫沈降産物中に含まれる候補化合物を電気泳動などにより検出することができる。また、結合が検出された試料からの候補化合物の回収は、ＨＤＡＲＴとの結合を利用し、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどにより実施することができる。
上記スクリーニング方法を実施するための具体的な手段として、「ウエストウエスタンブロッティング法」を用いることができる。すなわち、ＨＤＡＲＴと結合するタンパク質を発現していることが予想される組織もしくは細胞よりファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをアガロース上で発現させて、これをフィルターに転写後、標識したＨＤＡＲＴを反応させて、結合するタンパク質を発現しているプラークを検出する。または、「ＴＷＯハイブリッドシステム」を用いて上記スクリーニングを実施することもできる。すなわち、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域（ＤＮＡ−ＢＤ）と上記ＨＤＡＲＴとの融合タンパク質、およびＧＡＬ４転写活性化領域（ＡＤ）と被験核酸（例えば被験ｃＤＮＡ）を融合させたライブラリー融合体を同時に酵母内に発現させ、両者が相互作用する場合には、ＤＮＡ−ＢＤとＡＤが近接し、レポーター遺伝子が発現される。レポーター遺伝子の発現を指標に、候補化合物が含まれる酵母を選択し、選択された酵母細胞よりライブラリー融合体を回収することにより、ＨＤＡＲＴと相互作用する物質を得ることができる。
また、固相などに固定させたＨＤＡＲＴに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニングにより候補化合物を単離する方法も当業者の技術範囲内である。
第二の実施形態に係るＨＤＡＲＴ阻害剤のスクリーニング方法には、被験試料存在下でＨＤＡＲＴとｐ３００とを接触させる工程、前記ＨＤＡＲＴと前記ｐ３００との結合活性を測定する工程、および被験試料非存在下における前記ＨＤＡＲＴと前記ｐ３００との結合活性に比べ、前記ＨＤＡＲＴと前記ｐ３００との結合活性を低下させ得る化合物を選択する工程とが含まれる。すなわち、この方法はＨＤＡＲＴがｐ３００に結合することを利用して、これらの結合を阻害し得る化合物を選択する方法である。すなわち、この方法では、ＨＤＡＲＴに結合しｐ３００との結合を阻害する化合物のほかに、ｐ３００と結合しＨＤＡＲＴの結合を阻害し、ＨＤＡＲＴによるｐ３００阻害活性を妨げるものが選抜され得る。
上記第二の実施形態のスクリーニング方法は、上述した免疫沈降法などの免疫学的な手法を用いて行うことができる。すなわち、ｐ３００、ＨＤＡＲＴおよびＨＤＡＲＴと結合する化合物を含むと予想される試料、例えば、細胞の培養上清や細胞抽出物を混合した後、抗ＨＤＡＲＴ抗体または抗ｐ３００抗体で免疫沈降させ、免疫沈降産物中のｐ３００またはＨＤＡＲＴが、試料非添加の場合に比べ、低下することを指標にＨＤＡＲＴ阻害化合物を選抜することができる。
また、ｐ３００はｐ５３を介してＢａｘ遺伝子のプロモーターに結合して、転写を促進し、また、ＨＤＡＲＴはこれらｐ５３およびｐ３００による転写を抑制する。そのため、Ｂａｘプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結させ、ｐ５３存在下、ｐ３００、ＨＤＡＲＴ、さらに被験試料を作用させ、ｐ３００およびＨＤＡＲＴを作用させた場合に比してレポーター遺伝子の発現量を増加させた化合物を選抜することもできる。なお、ここでＢａｘプロモーターは、ｐ３００が転写因子に共役して転写を促進させるプロモーターの一例であり、これ以外にもｐ３００が関与するプロモーターに変更して上記スクリーニングを実施することは当業者の技術範囲内である。また、上記レポーター遺伝子として、その発現を検出し得るものであれば、特に制限はなく、当業者が一般的に各種解析系に使用し得るレポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ遺伝子、βカラクトシダーゼ遺伝子などのいずれを使用することができる。
なお、上記スクリーニング方法における被験試料としては、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、タンパク質、天然または合成ペプチド、天然化合物、血清などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明のタンパク質との結合活性を指標とした上記スクリーニングにより単離された化合物を被験試料として用いることも可能である。
本スクリーニング方法により選抜された化合物は、ＨＤＡＲＴ阻害を介して、ｐ３００による種々の転写因子からの転写を促進させ、ｐ５３などの転写因子がかかわる生理学的な活性を発現させることが可能となる。したがって、ＨＤＡＲＴの異常により、ｐ３００が機能阻害されている場合には、選抜された化合物によるＨＤＡＲＴの発現を調節することが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ＨＤＡＲＴｃＤＮＡの単離
ヒト新規遺伝子を同定するために、未解析で残されていたＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のＥＳＴ  ｃｌｏｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｗ５２９３０の塩基配列を決定した。配列決定により、Ｗ５２９３０インサートに転写制御に関与すると思われる核酸が含まれていることが予想された。
Ｗ５２９３０インサート中に含まれるＯＲＦの５’上流配列を決定するために、５’ＲＡＣＥ法を実行した。５’ＲＡＣＥ法は、健常人の末梢血からＥＢウイルスを用いて樹立した細胞株を材料とし、プライマーＪＰ３  ＡＳ１（配列番号３）、ＪＰ３  ＡＳ２（配列番号４）を用いて、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）により、添付のプロトコールに従って行った。なお、本実施例における塩基配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてシーケンス反応を行い、「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（ＴＭ）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で泳動および解析を行うことにより実施した。
Ｗ５２９３０のインサートにおける決定した塩基配列に、上記で得られた５’上流配列と合わせてＨＤＡＲＴの全ｃＤＮＡ配列を同定した。決定したｃＤＮＡ配列を配列番号１に示す。また、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＨＤＡＲＴは８５５アミノ酸をコードし、１５個のＴＰＲドメインと３つの酸性領域をもっている（図１Ａ）。なお、このタンパク質をＨＤＡＲＴと称する。
次に、ＨＤＡＲＴの細胞内局在を解析するために、ＨＤＡＲＴの抗体を作製した。プライマーＨｉｓ−Ｓ１（配列番号５）とＨｉｓ−ＡＳ１（配列番号６）を用いて、上記ＰｌａｓｍｉｄＷ５２９３０をｔｅｍｐｌａｔｅとしてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をＢａｎＨＩとＸｈｏＩで消化後、ＨＤＡＲＴの２９６から４３１アミノ酸をコードした領域をｐＴｒｃ  ＨｉｓＢ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ  ｓｉｔｅにサブクローニングした。ＨＤＡＲＴの組換えタンパク質（Ｈｉｓ  ｔａｇｇｅｄ  ＨＤＡＲＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を大腸菌ＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ添付のプロコトールにしたがって導入・発現させ、目的のタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ  ｒｅｓｉｎを用いたＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により添付のプロトコールに従って精製した。
上記精製したタンパク質（５ｍｇ）を抗原として、定法に従って抗ヒトＨＤＡＲＴ  Ｒａｂｉｔ抗血清を作製した。この抗血清をさらに、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＨＤＡＲＴタンパクとＰｒｏｔＯｎＴＭＫｉｔ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて精製し、抗ヒトＨＤＡＲＴポリクローナル抗体を得た。ここで得られた抗体を用い、チャンバースライド上に固定されたＨｅＬａ細胞を免疫染色した。陰性対照として、免疫前ラビット血清を用いて、同様に免疫染色を行った。この免疫染色と並行して細胞の核内ＤＮＡをＤＡＰＩにより染色した。免疫染色およびＤＡＰＩ染色より、抗ＨＤＡＲＴ抗体により核が染色されていた（図１ｂ）。
［実施例２］  ＨＤＡＲＴによるｐ５３依存的な転写活性化の抑制
このタンパク質が転写に関与するかを調べるために、以下の実験を行った。野生型ｐ５３を保持するｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ由来Ｕ−２ＯＳ細胞（５Ｘ１０４細胞／ウェル）を２４ウエルプレートに播き１６時間培養後、レポータープラスミドとしてＢａｘプロモーターレポータープラスミド（０．３μｇ）およびインターナルコントロールｐｈＲＬ−ＴＫプラスミド（５ｎｇ）とともに、ｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ発現ベクターをＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使って細胞に導入した。ここで用いたＢａｘプロモーターレポータープラスミドは、Ｂａｘ遺伝子のプロモーター配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子をつないだものであり、ｐ５３依存的にＢａｘプロモーターからの転写が行われ、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼが発現される。すなわち、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ｐ５３依存的なＢａｘプロモーターの転写活性を測定することができる。ｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ発現ベクターは、プライマーＳ３（配列番号１３）とＡＳ８（配列番号１４）を用い、Ｗ５２９３０を鋳型としてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をＢａｎＨＩで消化後、おなじＢａｍＨＩで消化したｐｃＤＮＡ３  ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）につないで構築した。なお、この発現ベクターの導入量は、０，０．２，０．５μｇとし、トータルＤＮＡ導入量を０．５μｇとなるようにｐｃＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄで補正した。
導入後、１０％牛胎仔血清を含んだＤｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）培地を用い、５％炭酸ガス中、３７℃にて培養した。２４時間後、細胞をトリプシン処理によって回収し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、添付のプロトコールに従って、ルシフェラーゼ活性とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定した。測定には、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いた。各ウエルごとの遺伝子の導入効率を平均化するために、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性値で補正したルシフェラーゼ活性を転写活性とした。いずれの実験も２セットづつサンプルを用意し、それぞれ二回行った実験結果（計４サンプル）の平均と標準偏差を示した（図２）。なお、エラーバーは標準偏差を示す。
図２に示すように、ＨＤＡＲＴは導入量に依存して、Ｂａｘ  ｐｒｏｍｏｔｅｒからの転写活性を抑制した。この結果より、ＨＤＡＲＴはｐ５３依存的な転写活性化を抑制することが示された。
［実施例３］  ｐ５３が関与する種々のプロモーターのＨＤＡＲＴによる転写抑制
上記実施例２において、ＨＤＡＲＴがｐ５３により転写活性化され得るＢａｘプロモーターからの転写を抑制したことから、上記Ｂａｘ以外のｐ５３標的遺伝子プロモーターへのＨＤＡＲＴの影響をさらに調べた。
ともに野生型ｐ５３を保持するＵ−２ＯＳ細胞とＨＣＴ１１６細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）に、それぞれ０．３μｇのｐ２１  ｐｒｏｍｏｔｅｒまたはｐＧ１３  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ、５ｎｇのｐｈＲＬ  ｐｌａｓｍｉｄとともに、０．５μｇのｐｃＤＮＡ３（−）もしくはｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ（＋）の発現ベクターを上記と同様に「Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ」を用いてトランスフェクションした。なお、ｐ２１プロモーターおよびｐＧ１３プロモーターはともにＰ５３により転写活性化され、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼが発現すると考えられる。
導入２４時間後にルシフェラーゼ活性とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を実施例２と同様に測定し、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性値でルシフェラーゼ活性の値を補正した。ｐｃＤＮＡ３を導入したときの補正後ルシフェラーゼ値を１００％として、２回の実験の平均値を表した（図３）。エラーバーは標準偏差を示す。
図３に示すように、ＨＤＡＲＴ（−）では、ｐ２１、ｐＧ１３プロモーターから転写は活性化されたが、ＨＤＡＲＴ（＋）では、これらプロモーターの転写活性化は抑制された。従って、ＨＤＡＲＴは、ｐ５３による転写活性化を抑制することが示唆された。
［実施例４］  外来性ｐ５３による転写活性化に対するＨＤＡＲＴの抑制活性
さらにｐ５３による転写活性化に対するＨＤＡＲＴの抑制効果を確認するために、外来から細胞にｐ５３を導入し、ｐ５３による転写活性化をＨＤＡＲＴが抑制するかを以下の方法で解析した。
ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ由来のＳａｏｓ２細胞（ｐ５３陰性）に０．２μｇのｐＧ１３  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ、５ｎｇのｐｈＲＬ  ｐｌａｓｍｉｄ、０．４μｇのｐｃＤＮＡ３（−）もしくはｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ｐ５３（＋）、０．４μｇのｐｃＤＮＡ３（−）またはｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ（＋）発現ベクターをトランスフェクションした。導入２４時間後にルシフェラーゼ活性とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクション効率をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性で補正したルシフェラーゼ活性値の２回の実験平均値を示した（図４）。エラーバーは標準偏差を示す。
図４に示すように、ＨＤＡＲＴが導入されていない細胞（Ｍｏｃｋ）では、ｐ５３を導入することによりｐＧ１３レポーターにおける転写が著しく活性化されたが、ＨＤＡＲＴが導入された細胞では、このｐ５３による転写活性化がｐ５３非導入の陰性細胞と同等程度まで抑制された。この結果より、ＨＤＡＲＴはｐ５３の転写活性化を抑制することが明確に示された。
［実施例５］  放射線照射刺激後のｐ５３によるＧａｄｄ４５、ｐ２１遺伝子発現誘導のＨＤＡＲＴによる抑制
細胞に放射線を照射することによりｐ５３が誘導され、誘導されたｐ５３により標的遺伝子Ｇａｄｄ４５、ｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１）の発現が誘導される。この放射線照射により誘導される内在ｐ５３による転写活性化をＨＤＡＲＴが抑制するかを以下の通り解析した。
Ｕ−２ＯＳ細胞に１μｇのｐｃＤＮＡ３（−）またはｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ（＋）発現ベクターをトランスフェクションした。導入２４時間後に、放射線（１２Ｇｙ）を照射した。陰性対照として、同様にトランスフェクション処理等をした非照射群を準備した。照射４時間後に、これら細胞よりｍＲＮＡを精製した。ｐ２１、ＧＡＤＤ４５、β−Ａｃｔｉｎの次に示すプライマーでＲＴ−ＰＣＲを行った。ｐ２１  ｓｅｎｓｅプライマー：ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＧＧＡ（配列番号７）、ｐ２１  ａｎｔｉｓｅｎｓｅプライマー：ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＧＧＣ  ＴＴ（配列番号８）、ＧＡＤＤ４５  ｓｅｎｓｅプライマー：ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＧＣ（配列番号９）、ＧＡＤＤ４５  ａｎｔｉｓｅｎｓｅプライマー：ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＴＣ（配列番号１０）、β−Ａｃｔｉｎ  ｓｅｎｓｅプライマー：ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＴ（配列番号１１）、β−Ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅプライマー：ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＡＴ（配列番号１２）。これらの組合せのプライマーを用いたＰＣＲにより得られた各産物をアガロースゲル電気泳動により検出した（図５）。また、各細胞におけるＨＤＡＲＴの発現とｐ５３タンパク量の増加を上記抗ＨＤＡＲＴ抗体または抗ｐ５３抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。なお、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの方法は当業者に周知の方法で行った。
図５に示すように、放射線照射された細胞内では、非照射群に比べｐ５３のバンド強度が上昇し発現が上昇していることが確認された。ＨＤＡＲＴ非存在下では、このｐ５３の発現誘導に対応して標的遺伝子ｐ２１、ＧＡＤＤ４５の発現が誘導された（レーン２）。一方、ＨＤＡＲＴ存在下では、ｐ５３の発現誘導に対応した標的遺伝子ｐ２１、ＧＡＤＤ４５の発現が抑制された（レーン４）。この結果より、生理的条件下における内在性ｐ５３に依存した標的遺伝子の発現誘導をもＨＤＡＲＴは抑制することが確認された。
［実施例６］  放射線照射後のｐ５３ｄｅｐｅｎｄｅｎｔな細胞周期の停止のＨＤＡＲＴによる阻害
ＨＤＡＲＴによるｐ５３依存性転写活性化の抑制が観察されたことから、この抑制によるｐ５３の生理活性への影響を解析した。ここでは、ｐ５３の生理活性として、細胞周期の停止に対する影響を以下の通り調べた。
Ｕ−２ＯＳ細胞に、２μｇのｐｃＤＮＡ３（Ｍｏｃｋ）またはｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ（ＨＤＡＲＴ）の発現ベクターを導入した。導入１６時間後に電離放射線を照射（１２Ｇｙ）または非照射（０Ｇｙ）した。照射２４時間後に細胞を７０％エタノールで固定し、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）でＤＮＡを染色したのち、フローサイトメーターにより細胞周期を解析した。
細胞周期を解析した結果、図６に示すように、ＨＤＡＲＴ非導入群では、放射線照射によりＧ２／Ｍのピークが放射線非照射群に比して増加し、Ｇ２／Ｍで細胞周期が停止していることが示された。一方、ＨＤＡＲＴ導入群では、放射線照射（１２Ｇｙ）によるＧ２／Ｍ  ａｒｒｅｓｔが阻害された。ＨＤＡＲＴはｐ５３による転写活性化の抑制を介して、ｐ５３の生理活性を抑制することが示された。
［実施例７］  ｐ５３のコアクティベーターｐ３００による転写活性化のＨＤＡＲＴによる抑制
ｐ５３による種々の遺伝子の転写活性化は、コアクティベーターであるｐ３００のｐ５３への結合を介して生じると考えられている。そこでＨＤＡＲＴによるｐ５３の転写活性化の阻害がｐ５３に直接作用することにより生じるか、もしくは、コアクティベーターｐ３００に作用して生じるかを解析した。
Ｕ−２ＯＳ細胞に、２０ｎｇのｐ２１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ、５ｎｇのｐｈＲＬ  ｐｌａｓｍｉｄ、０．５μｇのｐｃＤＮＡ３（−）またはｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴの発現ベクターと、０．３μｇのｐＣＭＶ（−）またはｐＣＭＶ−ｐ３００（＋）の発現ベクターを導入した。導入２４時間後にルシフェラーゼ活性とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定した。導入効率をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性で補正し、ルシフェラーゼ活性値を求めた。このルシフェラーゼ活性値は２回の実験の平均値として示した。また、ｐ３００およびＨＤＡＲＴ非導入細胞（ｐＣＭＶ（−）とｐｃＤＮＡ３（−）を導入した細胞）の値を１００％とし、相対的ルシフェラーゼ活性として表した（図７）。エラーバーは標準偏差を示す。
図７に示すように、ＨＤＡＲＴ非存在下において、ｐ５３による転写活性化はｐ３００を発現させることにより著しく上昇した。しかし、ＨＤＡＲＴ存在下では、ｐ３００による転写活性化の上昇を完全に抑制した。また更に、ＨＤＡＲＴ存在下では、ｐ５３による転写の活性化をも抑制することが示唆された。
［実施例８］  ＨＤＡＲＴによるｐ３００の転写活性化能の濃度依存的な抑制
さらに、ＨＤＡＲＴのｐ３００への作用を解析するために、ＨＤＡＲＴの濃度を変えた際のｐ３００による転写活性化にどのように影響を与えるかを調べた。
Ｕ−２ＯＳ細胞に、０．１μｇのＧＡＬ４のｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ、５ｎｇのｐｈＲＬ  ｐｌａｓｍｉｄ、０．１μｇのｐｃＤＮＡ３−ＧＡＬ４ｐ３００  ｐｌａｓｍｉｄとともに、０、０．１，０．３，０．５μｇのｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴの発現ベクターを導入した。発現ベクター全体の量はｐｃＤＮＡ３  ｐｌａｓｍｉｄで０．５μｇに合わせた。導入２４時間後に、ルシフェラーゼ活性とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定した。導入効率を補正したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性値の２回の実験の平均値を、ｐｃＤＮＡ３のみを導入したときの値を１００％として表した（図８）。エラーバーは標準偏差を示す。
図８に示すように、ＨＤＡＲＴの導入量を増加させるに従って、ｐ３００によるルシフェラーゼ遺伝子の発現誘導が抑制された。この結果より、ＨＤＡＲＴによりｐ３００自身がもつ転写性化能を抑制することが示された。
［実施例９］  ＨＤＡＲＴとｐ３００タンパクと直接結合
上記実施例７、８により、ＨＤＡＲＴはｐ３００による転写活性化を阻害することが示されたことから、ＨＤＡＲＴによるｐ３００の阻害が両者の直接結合によるものか否かを調べるために、精製したＧＳＴ−ｐ３００融合タンパクとｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＨＤＡＲＴタンパクを用いた結合実験を以下の通り行った。
ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＧＳＴ−ｐ３００  ＣＨ１（ｐ３００システイン／ヒスチジンリッチ領域１：ｐ３００のアミノ酸配列３００残基から５２８残基）、ＧＳＴ−ｐ３００  Δ  ＣＨ１（ｐ３００システイン／ヒスチジンに富んだ配列を欠失させたｐ３００ＣＨ１）、ＧＳＴ−ｐ３００  ＣＨ３（ｐ３００システイン／ヒスチジンリッチ領域１：ｐ３００のアミノ酸配列１７００残基から１９６６残基）のそれぞれの融合タンパク発現ベクターを大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ）に添付のプロコトールにしたがって導入し、導入後、０．１ｍＭのＩＰＴＧ存在下で３７度４時間の培養により発現させた。
集菌後、ＧＳＴ  Ｌｙｓｉｓバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｈｃｌ，ｐＨ８．５，３００ｍＭ  ＬｉＣｌ，０．５％  ＮＰ４０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で溶菌し、３０秒の超音波処理により細胞を破砕後、タンパク質を抽出し、グルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質を精製した。
一方、ＨＤＡＲＴタンパクは２μｇのｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ  ｐｌａｓｍｉｄよりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴＮＴ（Ｒ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて合成し、その際３５Ｓ−メチオニン（ＡＧ１０９４，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で標識した。
１ｍｌのＧＳＴ  Ｌｙｓｉｓバッファに、１μｇの上記精製したＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク、１０μｌの標識ＨＤＡＲＴタンパク、及び３０μｌのグルタチオンセファロース４Ｂビーズを添加、混合し、１時間、４℃で反応させた。反応後、セファロースを４回、ＧＳＴ  Ｌｙｓｉｓバッファで洗浄後、サンプルバッファー（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４，１０％  ＳＤＳ，５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２５％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｈａｎｏｌ）中で、９８℃、５分加熱することによりタンパク質を溶出した。溶出した試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。泳動後のゲルをクマジーブルー溶液で染色し、分離されたタンパク質を確認した後（図９上図）、乾燥させた。その後、オートラジオグラフィーを行い、標識化ＨＤＡＲＴを検出した（図９下図）。
図９に示す通り、ＨＤＡＲＴはＧＳＴタンパク単独では結合しないが（レーン２）、ｐ３００のＣＨ１、ＣＨ３ドメインと結合した（レーン３、５）。このｐ３００のＣＨ１領域からシステイン・ヒスチジンリッチなドメインを欠失させたもの（ΔＣＨＩ）では、ＨＤＡＲＴの結合は著しく阻害された（レーン４）。ｐ３００とＨＤＡＲＴとの結合には、ｐ３００上のシステイン・ヒスチジンリッチな領域が必要であることが示された。
［実施例１０］  内在ＨＤＡＲＴのｓｉＲＮＡノックダウン効果による、ｐ５３の転写活性の上昇（アポトーシスの亢進）
内在ＨＤＡＲＴの発現を抑制することにより、ｐ５３の生理機能にどのような影響を及ぼすかを調べることにより、ｐ５３の正常な生理機能におけるＨＤＡＲＴの重要性を検討した。
細胞レベルでの遺伝子発現抑制にはアンチセンスＲＮＡやリボザイムＲＮＡなどの手法が用いられてきたが、近年ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を用いて効率良く特異的に遺伝子の発現を抑制できることが示された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  Ｗ，Ｙａｌｃｉｎ  Ａ，Ｗｅｂｅｒ  Ｋ，Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．Ｅｌｂａｓｈｉｅｒ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  Ｍａｙ  ２４；４１１（６８３６）：４９４−８）。本願発明者らはＨＤＡＲＴに対する特異的ｓｉＲＮＡを用いて内在ＨＤＡＲＴの発現を抑制し、ｐ５３の主要な機能の一つであるＤＮＡ二重鎖切断後の細胞死誘導に対する影響を調べた。ｐ５３の阻害分子であるところのＨＤＡＲＴの発現抑制が、ｐ５３の活性化につながり細胞死が亢進することが期待される。ＤＮＡ二重鎖切断の誘導剤としてエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を用いた。この薬剤は、抗癌剤の一種で、睾丸や膀胱癌、肺癌、悪性リンパ腫、急性白血病などの治療に使用される。作用機序としてはトポイソメラーゼＩＩアルファを阻害し細胞周期のＳ期及びＧ２／Ｍ期の細胞に対して特にＤＮＡ二重鎖切断を起こし、細胞死を誘導する（小川一誠他：癌と化学療法，１０，２４０３（１９８３）、野田起一郎他：癌と化学療法，２１，１６３３（１９９４））。この際の細胞死の誘導にはｐ５３が必須であるとされている（Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．Ｅ．，Ｊａｃｋｓ，Ｔ．，＆  Ｈｏｕｓｍａｎ，Ｄ．Ｅ．（１９９３）．Ｃｅｌｌ  ７４，９５４−９６７、Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｂｏｄｉｓ，Ｓ．，ＭｃＣｌａｔｃｈｅｙ，Ａ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｌ．，Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．Ｅ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．，Ｈｏｕｓｍａｎ，Ｄ．Ｅ．，＆  Ｊａｃｋｓ，Ｔ．（１９９４）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６，８０７８１０、Ｆａｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｅｌｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｂａｅ，Ｉ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｊ．，Ｊｏｎｄｌｅ，Ｄ．，Ｂｈａｔｉａ，Ｋ．，Ｆｏｒｎａｃｅ，Ａ．Ｊ．，Ｍａｇｒａｔｈ，Ｉ．，Ｋｏｈｎ，Ｋ．Ｗ．，＆  ＯÅｆＣｏｎｎｏｒ，Ｐ．Ｍ．（１９９４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，５８２４５８３０、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｇｒｉｍｍ，Ｅ．Ａ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｗ．，Ｏｗｅｎｓｃｈａｕｂ，Ｌ．Ｂ．，＆  Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ａ．（１９９４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，２２８７２２９１）。したがって、エトポシドにより誘導される細胞死に対する影響を解析することにより、細胞死誘導というｐ５３の主要な生理活性とＨＤＡＲＴの機能との関連を調べることができる。また、この薬剤は正常な細胞の成長にも影響を与えるので、臨床においては白血球減少や脱毛などの副作用や服用後数年を経て発症する二次性白血病などが重大な問題となっている。よってＨＤＡＲＴの発現を抑制しエトポシドに対する感受性が上がれば、臨床への応用も期待できる。
（１）ｓｉＲＮＡの設計
ＨＤＡＲＴのｍＲＮＡ中５’−ＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＴＧＣ／配列番号１５（ｆｉｒｓｔメチオニンのＡＴＧのＡを１とした場合、９３から１１１番目の塩基にあたる）をｔａｒｇｅｔとしたｓｉＲＮＡの作製にはセンス鎖として５’−ＣＣＡＡＵＵＣＵＣＵＧＵＣＡＡＡＵＧＣＴＴ／配列番号１６を、アンチセンス鎖としてし５’−ＧＣＡＵＵＵＧＡＣＡＧＡＧＡＡＵＵＧＧＴＴ／配列番号１７のＲＮＡ−ＤＮＡバイブリットオリゴを用いた。内部コントロールとして用いたルシフェレース（ＧＬ３遺伝子）に対するｓｉＲＮＡの作製にはＥｌｂａｓｈｉｒらの文献（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  Ｗ，Ｙａｌｃｉｎ  Ａ，Ｗｅｂｅｒ  Ｋ，Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．Ｅｌｂａｓｈｉｅｒ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  Ｍａｙ  ２４；４１１（６８３６）：４９４−８）より引用し、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ／配列番号１８を、アンチセンス鎖としてし５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧＴＴ／配列番号１９のＲＮＡ−ＤＮＡバイブリットオリゴを用いた。これらはすべてＪｂｉｏＳ株式会社日本バイオサービスに合成を依頼した。
（２）ｓｉＲＮＡの作製
合成されたＲＮＡ−ＤＮＡバイブリットオリゴのセンス鎖とアンチセンス鎖をアニールさせるためにそれぞれ５０μＭに希釈したものを３０μｌずつと５Ｘ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２５０ｍＭ  ＫＣｌ，７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１５μｌを混合する。溶液を９０℃で１分間加熱し、スピンダウン後に３７度６０分間静置し、２０μＭのｓｉＲＮＡを作製した。
（３）細胞へのｓｉＲＮＡの導入と細胞死解析
５Ｘ１０５の細胞を６ｃｍプレートに播き、１６時間培養後にそれぞれの２０μＭ  ｓｉＲＮＡ１０μｌをＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。方法はＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥに付属のプロトコールに従った。ｓｉＲＮＡを導入後、４８時間培養後に１０μＭのエトポシドを添加または非添加し、さらに４８時間培養後に細胞死の割合を解析した。細胞死の解析は、細胞を回収し、非固定細胞を２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）で染色後ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて行った。ＰＩ強陽性の分画を死細胞とした。
（４）実験結果
（ａ）Ｕ−２  ＯＳ細胞（ヒト骨肉種由来）とＨ１２９９細胞（ヒト大腸癌由来）にＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡを導入し、内在ＨＤＡＲＴの発現が抑制されるか否かを検討した。上記の方法で述べたような手法でそれぞれのｓｉＲＮＡを導入し、４８時間後に細胞を回収し、常法のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより、抗ＨＤＡＲＴ抗体と抗α−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を用いてそれそれのタンパク質の発現を解析した。結果を図１０に示す。レーン１と２はＵ−２ＯＳ、レーン３と４はＨ１２９９細胞から抽出したタンパク質を泳動している。また、レーン１とレーン３は内部コントロールのルシフェレースに対するｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ．ｓｉＲＮＡ）を導入したもの、レーン２と４はＨＤＡＲＴに対するｓｉＲＮＡ（ＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡ）を導入したものである。レーン２とレーン４でＨＤＡＲＴタンパクの発現量が減少していることが分った。コントロールタンパク質のα−ｔｕｂｕｌｉｎの発現量は各群で変化は見られなかった。
（ｂ）次いで、エトポシド添加後に誘導される細胞死に対するＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡの影響を検討した。結果を図１１に示す。４枚のパネルのうち、上段がＣｏｎｔ．ｓｉＲＮＡを導入したもの、下段がＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡを導入したもので、エトポシドについてはそれぞれ左側（−）が無添加、右側（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）が添加群を示している。各パネルのＸ軸がＰＩの蛍光強度をＹ軸が細胞数を表している。バーで示した部分はＰＩ強陽性の分画であり、死細胞である。各ヒストグラム内の数字は、バーで示した部分の細胞の割合を表している。
（ｃ）（ｂ）の実験を２回行い、その平均値を棒グラフで表した（図１２）。エラーバーは標準偏差を表す。グラフ中、＊１と＊２の間の危険率はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によるとＰ＜５％であり、有意であるとみなされた。ＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡを導入した群ではエトポシドにより誘導される細胞死がコントロールに比して、約２倍上昇することがわかった。
本実施例により、ＨＤＡＲＴに対するｓｉＲＮＡを用いて、特異的に高率良く、内在ＨＤＡＲＴの発現を抑制できた。また、ＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡを用いて、内在ＨＤＡＲＴの発現を抑制させることにより、抗癌剤の一つであるエトポシドに対する感受性を亢進させることができた。Ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡを高率よく発現させる系ができれば、感受性の亢進により抗癌剤の投与量を減少させることができ、副作用の軽減につながることが予想される。また、今までの至適濃度の抗癌剤で効かなかった癌に対しても感受性をあげることができる可能性がある。
産業上の利用の可能性
本発明のＨＤＡＲＴは、ｐ３００に結合し、ｐ３００をコアクティベーターとする転写因子により転写を阻害する。このようにｐ３００は種々の転写因子に関与し、種々の生理学的な活性の発現を担うと考えられる重要なタンパク質である。このような重要なタンパク質に対するインヒビターはｐ３００の機能解析を進める上で有益となる。
また、ＨＤＡＲＴはｐ３００阻害を通じて、転写因子ｐ５３に依存した細胞周期停止を阻害した。このことから、ＨＤＡＲＴがｐ３００阻害を介してｐ５３機能発現を阻害し癌化を誘導することも予想される。また、ｐ３００あるいはｐ５３機能異常に関与する疾患に対する治療薬の開発に、ＨＤＡＲＴが有用になることが示唆される。
さらに、ＨＤＡＲＴをｓｉＲＮＡによりノックダウンすることにより生理的影響を検討した結果、ｐ３００、ｐ５３の転写活性上昇によるアポトーシスの亢進が見られた。従って、ＨＤＡＲＴの阻害剤は、抗癌剤あるいは抗癌剤の併用剤（抗癌剤感受性の上昇）として大いに有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＤＡＲＴタンパク質の構造を模式的に示す図、およびＨＤＡＲＴの細胞内局在の解析結果を示す写真である。（Ａ）にＨＤＡＲＴタンパク質の構造を模式的に示し、ハッチで示したボックスはテトラトリコペプチドリピート（３４アミノ酸からなる繰返し配列）を表し、黒塗りのボックスは酸性領域を表す。（Ｂ）は、ＨＤＡＲＴの細胞内局在の解析結果であり、ＨＤＡＲＴが核タンパクであることが示されている。
図２は、ｐ５３による転写活性をＨＤＡＲＴが濃度依存的に阻害したことを示すグラフである。グラフの下部にＨＤＡＲＴの投与量を模式的に示し、グラフの縦軸はＢａｘプロモーターから発現されたルシフェラーゼの相対的な活性を示す。
図３は、ｐ５３が発現しているＵ２ＯＳおよびＨＣＴ１１６の２種類の細胞およびｐ５３が結合することが報告されている２種類のプロモーターｐ２１、ｐＧ１３を用い、プロモーターの下流につながれたルシフェラーゼ活性を基にＨＤＡＲＴの転写抑制を測定した結果を示すグラフである。図において、「−」はＨＤＡＲＴ非投与を「＋」はＨＤＡＲＴ投与を示す。
図４は、細胞外から人工的にｐ５３およびＨＤＡＲＴを投与した際の、ｐＧ１３レポーター遺伝子におけるルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。図において、「Ｍｏｃｋ」はＨＤＡＲＴ非投与のコントロール細胞、ＨＤＡＲＴはＨＤＡＲＴ投与細胞群である。また「−」はｐ５３非投与を、「＋」はｐ５３投与を表す。
図５は、電離放射線（ＩＲ）照射により内因性ｐ５３を誘導した後にＨＤＡＲＴ投与した際の、ｐ５３標的遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す電気泳動の写真である。図上部の「−」は放射線非照射、「＋」は放射線照射を表す。Ｇａｄｄ４５、ｐ２１は解析対象のｐ５３標的遺伝子であり、アクチンは内部コントロールである。
図６は、電離放射線（ＩＲ）照射によるｐ５３に依存した細胞周期の停止がＨＤＡＲＴ投与により阻害されるか否かを解析した結果を示すフローサイトメトリーのヒストグラムを示す図である。放射線照射により細胞周期の停止が生じ（右上）、放射線照射後ＨＤＡＲＴ投与した細胞では細胞周期の停止が解消された（右下）。
図７は、ｐ５３のコアクティベーターｐ３００の転写活性をＨＤＡＲＴが阻害するかを解析した結果を示すグラフである。グラフにおいて、ｐ３００は「＋」はｐ３００遺伝子を外部より投入し過剰発現させた細胞であり、「−」はｐ３００遺伝子が外部導入されていない群を示す。「ｐＤＮＡ３−ｍｏｃｋ」はＨＤＡＲＴを保持しないコントロールのプラスミド投与群を、また、「ｐＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ」はＨＤＡＲＴを保持したプラスミドを投与した群を表する。
図８は、ＨＤＡＲＴが直接ｐ３００に作用して転写阻害をもたらすか否かを解析するために、ｐ５３を介しないＧＡＬ４レポーター解析系を用いて、ＨＤＡＲＴによる転写阻害を測定した結果を示すグラフである。図中グラフの下部には、ＨＤＡＲＴの投与量が示されている。さらにその下には、本解析系を模式的に示し、ＧＡＬ４−ｐ３００融合タンパク質はＧＡＬ４結合部位に結合してレポーターであるルシフェラーゼ遺伝子を発現させる。
図９は、ｐ３００とＨＤＡＲＴとの結合活性をＧＳＴ−ｐ３００融合タンパク質を用いて解析した結果を示す電気泳動の写真である。クマシーブルー染色により抗ＧＳＴ抗体で免疫沈降したトータルタンパク質が検出され、オートラジオグラフィーでは、標識されたＨＤＡＲＴが検出される。
図１０は、ウェスタンブロッティングにより内在ＨＤＡＲＴの発現が抑制されるか否かを検討した結果を示す写真である。
図１１は、エトポシド添加後に誘導される細胞死に対するＨＤＡＲＴ  ｓｉＲＮＡの影響を検討した結果を示す図である。
図１２は、図１１の実験を２回行い、その平均を棒グラフで表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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