(57)【要約】本発明は、癌細胞において特異的に遺伝子発現を起こす癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡ、このＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。具体的には、マウス非古典的組織適合抗原遺伝子（ＭＨＣクラスＩｂ遺伝子）のＱ５抗原遺伝子の転写開始点より５’上流−２６６７塩基から＋２２塩基のＤＮＡ（配列番号１）の少なくとも一部を含むＤＮＡ、およびそれを含むベクターである。上記ＤＮＡと目的のタンパク質または目的のポリペプチド若しくはＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列とを含有するベクターを癌細胞に導入し、目的のポリペプチド若しくはＲＮＡを癌細胞特異的に発現させる方法を提供する。さらに上記ベクターの癌の予防・治療、診断への応用が可能である。また新規な癌の遺伝子治療法や癌ワクチンを開発することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス非古典的組織適合抗原遺伝子（ＭＨＣクラスＩｂ遺伝子）のＱ５抗原遺伝子の転写開始点より５’上流−２６６７塩基から＋２２塩基のＤＮＡ（配列番号１）の少なくとも一部を含むＤＮＡ。
【請求項２】
前記ＤＮＡが少なくとも配列番号２（転写開始点より５’上流−２０４２塩基から＋２２塩基）に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記ＤＮＡが少なくとも配列番号３（転写開始点より５’上流−１４１４塩基から＋２２塩基）に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
前記ＤＮＡが少なくとも配列番号４（転写開始点より５’上流−８２９塩基から＋２２塩基）に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター。
【請求項６】
前記ベクターが、アデノウィルスベクターであることを特徴とする請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡと、所望のタンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含有することを特徴とする請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列が、非自己のＭＨＣクラスＩ分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、非自己のＭＨＣクラスＩＩ分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、サイトカインをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、サイトカイン受容体をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列が、細胞死を誘導するタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が、補助刺激分子をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列が、癌抗原をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列が、癌抑制遺伝子をコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド配列が、癌遺伝子のアンチセンスをコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列が、癌遺伝子若しくは変異遺伝子に対するリボザイム若しくはＲＮＡｉをコードするヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項５〜１７のいずれかに記載のベクターを癌細胞に導入し、所望のタンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡを発現させる方法。
【請求項１９】
請求項５〜１７のいずれかに記載のベクターが導入され、かつ所望のタンパク質またはポリペプチドを発現しうる形質転換体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の形質転換体を用いて細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する方法。
【請求項２１】
請求項５〜７のいずれかに記載のベクターを被検体に導入し、発現の有無により癌細胞の存在を判定する検査方法。
【請求項２２】
請求項５〜１７のいずれかに記載のベクターを用いる治療または予防方法。
【請求項２３】
癌の治療または予防方法である請求項２２に記載の治療または予防方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法により誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を用いる癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は癌細胞において特異的に遺伝子発現を起こす癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡ、このＤＮＡを含有する組換えベクター、および特にこのＤＮＡと目的のタンパク質または目的のポリペプチド若しくはＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列とを含有するベクターを癌細胞に導入し、目的のポリペプチド若しくはＲＮＡを癌細胞特異的に発現させる方法、該ベクターの導入による形質転換体、さらに上記ＤＮＡを含有するベクターを用いた癌の予防方法または治療方法およびそのための薬剤に関する。
背景技術
近年の癌免疫学において黒色腫細胞から同定されたＭＡＧＥペプチドが端緒となり、癌抗原の同定がさかんに行われている。癌抗原は、細胞の癌化に伴って生じた異常タンパク質が抗原提示機構の流れに乗って細胞表面に出現したものであるが、癌化の原因は個々の癌によって異なることから、その抗原性も個々の癌に特異的である。生体において、厳密に癌に特異的かつ共通的に産生される抗原と、そのような物質が癌細胞特異的に発現するような機構に関する詳細な研究はなされていなかった。
本発明者は、生体が本来的に持っている抗癌反応性についてマウスを使って研究を行った結果、抗癌反応に関わる免疫反応のなかで種々の癌細胞に対して共通的に反応するＴ細胞が存在することを明らかにした。そこで、このＴ細胞が種々の癌細胞の表面に共通的に存在する抗原を認識していると想定し、その抗原が何であるかを追求した。
まずマウスの癌細胞を調べた結果、癌の種類によらず共通的に、抗Ｑａ−２モノクローナル抗体で検出される細胞表面分子が発現していることを明らかにした。（Ｔ．Ｔａｎｉｎｏ，Ｎ．Ｓｅｏ，Ｔ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｃ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｉｔｏ，Ｍ．Ｓｅｋｉｍａｔａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｅｇａｗａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．３５，ｐｐ．２３０（１９９２））。
Ｑａ−２抗原はある系統のマウスの正常リンパ球表面に発現している抗原で、マウスの第１７番染色体Ｑａ／Ｔｌａ領域の非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原遺伝子群の一つであるＱ７、またはＱ７と構造が殆ど同一のＱ９遺伝子がコードするものであることが知られている。しかしＱａ−２抗体で検出される癌細胞表面分子は、Ｑａ−２抗原とは異なる分子であり、それがマウスの第１７番染色体Ｑａ／Ｔｌａ領域の非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原遺伝子群の一つであるＱ５抗原遺伝子がコードするものであることを明らかにした。そしてマウス実験癌細胞は、由来するマウスの系統、臓器、および癌化の原因によらず、検討されたすべての実験癌においてＱ５遺伝子の産物であるＱ５抗原が発現していることを確認した。（Ｎ．Ｓｅｏ，Ｔ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｃ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｉｔｏ，Ｔ．Ｔａｎｉｎｏ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｅｇａｗａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．５，ｐｐ．６４７（１９９２））。
Ｑ５抗原はＱａ−２−マウス（Ｑａ−２抗原を発現していないマウス）に対して部分的に共通の抗原性を有する。このことを利用して、Ｑａ−２−マウスにＱａ−２＋マウス（Ｑａ−２抗原を発現しているマウス）のリンパ球を抗原として投与して抗Ｑａ−２免疫を行った後、Ｑ５＋Ｑａ−２−癌細胞（Ｑ５抗原を発現しＱａ−２抗原を発現していない癌細胞）を移植する実験を行ったところ、移植に対する抵抗性が誘導された。また癌細胞を移植した後に抗Ｑａ−２免疫を行い、Ｑ５＋Ｑａ−２−癌細胞の転移に対する抵抗性も誘導されることを明らかにした。これらのことからマウス成体がＱ５抗原に対して免疫寛容の状態にないこと、すなわち正常成体ではＱ５抗原はほとんど発現しておらず、Ｑ５抗原の発現が癌細胞特異的であることを証明した（Ｋ．Ｅｇａｗａ，Ｎ．Ｓｅｏ，Ｔ．Ｔａｎｉｎｏ  ａｎｄ  Ｔ．Ｔｓｕｋｉｙａｍａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．４１，ｐｐ．３８４（１９９５））。
Ｑ５抗原は、遺伝子の突然変異によって生じた抗原あるいはそれに由来する異常なペプチドではなく、正常細胞中にも存在するＱ５抗原遺伝子が発現したものである。しかしＱ５抗原遺伝子が、癌細胞で特異的に発現している機構は不明であった。
発明の開示
本発明は、Ｑ５抗原遺伝子が癌細胞で特異的かつ共通的に発現する機構に注目し、癌細胞特異的にＱ５抗原遺伝子の発現を誘導するＤＮＡを解明することにより、癌の診断法、免疫治療法・予防法、再発防止方法、癌遺伝子治療方法およびこれらの方法に有用な薬剤を提供することを目的としている。なお上記癌には、癌になった状態だけでなく、ウィルス感染症等が原因で変異した細胞が存在する状態、すなわち「前癌状態」も含む。「前癌状態」とは、たとえばある遺伝子が変異しているが、無限に増殖する状態にはなっていない状態をいう。
本発明者は、上記Ｑ５抗原遺伝子が癌細胞特異的に発現する機構について研究するうちに、Ｑ５抗原が癌細胞で特異的に発現しているのだとすれば、正常細胞では転写されず、細胞の癌化に伴ってのみ転写されるような、Ｑ５抗原遺伝子の転写を支配する調節機構が存在するはずであると発想した。生体において、癌細胞特異的かつ共通的に遺伝子発現を起こすような発現誘導ＤＮＡが存在するならば、このＤＮＡは癌の遺伝子治療の開発をはじめ、免疫治療法・免疫予防法の開発、および癌一般の診断薬の開発への利用が考えられるため、極めて有用であるといえる。
これに基づいて、後述の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に示すとおり、癌細胞特異的抗原であるマウスＱ５抗原遺伝子の近隣に、特に翻訳開始コドンより５’上流３．９ｋｂｐ領域に注目し、そのような調節機構に関与する領域が存在するかを調べたところ、Ｑ５抗原遺伝子の転写開始点より５’上流−２６６７塩基から＋２２塩基の２６８９ｂｐに相当するＤＮＡを含有するベクターを細胞に導入すればその細胞が癌細胞であるときのみ下流に連結した任意の外来遺伝子を発現させることができることを確認した。すなわち上記領域のＤＮＡは、癌細胞特異的に発現を誘導するＤＮＡであるという知見を得て、Ｑ５抗原遺伝子の転写を支配する調節機構に相当することを解明し、本発明を完成するに至った。
このような本発明は、以下に示されるような癌細胞特異的に遺伝子発現を誘導する癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡ、およびこれを含有する癌細胞特異的発現ベクター、該ベクターの導入による形質転換体、さらにはこれらの用途、たとえば癌の検査方法、診断薬、治療方法、予防方法、再発防止方法、癌遺伝子治療方法などを提供する。以下に本発明を詳述する。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、Ｑ５抗原の癌細胞特異的発現を誘導していると思われる領域として、マウスＱ５抗原遺伝子の翻訳開始コドンより５’上流３．９ｋｂｐ領域に注目し、その癌細胞特異的発現誘導の機能を以下（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のようにして確認した。なお、以下で記載する複数の文献は、引用して本明細書の内容とする。
（ｉ）癌細胞におけるＱ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ１０抗原遺伝子の転写の確認  先ず最初に、癌細胞特異的に発現している抗原がＱ５抗原であるということをさらに強く保証するため、転写レベルでの検討を加えることとした。Ｑ５抗原遺伝子と非常に相同性の高い遺伝子としてＱ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ６、Ｑ７、Ｑ８、Ｑ９、およびＱ１０遺伝子があるが、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（Ｈ−２ｋ）マウスでＱ６からＱ９に至る遺伝子領域が欠損していること、またＱ３遺伝子は擬遺伝子であることが知られている。そこで、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ１０抗原遺伝子からの転写についてＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検討した。
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ１０遺伝子の配列は詳細に報告されている（Ｓ．Ｗａｔｔｓ，Ａ  Ｃ．Ｄａｖｉｓ，Ｂ  Ｇａｕｔ，Ｃ  Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｌ．Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｒ  Ｓ．Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．１７４９（１９８９））ことから、これらの遺伝子特異的なプライマーを各々合成した。ＡＫＲ（Ｈ−２ｋ）マウス由来の悪性リンパ腫細胞株ＢＷ５１４７および、悪性繊維芽細胞株Ｗ２ＫからＲＮＡを抽出し、合成した各遺伝子特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、両癌細胞からの明らかな転写産物を認めたのはＱ５のみであり（図１）、増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認したところ、報告されていたＱ５抗原遺伝子の塩基配列と一致していた。
このことから癌細胞において癌細胞特異的かつ共通な抗原として発現しているのはＱ５抗原であることが確認された。図１のＧ３ＰＤＨ遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子でポジディブなコントロールとして併せ示した。
（ｉｉ）正常マウス各臓器におけるＱ５抗原遺伝子発現抑制レベルの検討
Ｑ５抗原の転写に関する研究としてはＳ．Ｃｃｈｗｅｍｍｌｅ等（Ｓ．Ｃｃｈｗｅｍｍｌｅ，Ｄ．Ｂｅｖｅｃ，Ｇ．Ｂｒｅｍ，Ｍ  Ｂ．Ｕｒｂａｎ，Ｐ  Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ａｎｄ  Ｅ  Ｈ．Ｗｅｉｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．３４，ｐｐ．２８（１９９１））とＡ．Ｒ−Ｅｎｇｅｌ等（Ａ．Ｒ−Ｅｎｇｅｌ，Ｅ  Ｌ．ｒｏｙ，Ｊ  Ｌ．ＤｉｅＧｕｅｓ  ａｎｄ  Ｎ．Ｆｅ  ＲＮＡｎｄｅｚ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．７３（１９９３））との２報があるのみで、Ｑ５抗原遺伝子の転写産物が認められているのは胎発生時および成体の胸腺と精巣のみであると報告されている。しかしながら、これらの報告における実験は、ノーザンブロッティングや、実際の配列と異なるプライマーを用いたＰＣＲしか行われておらず、Ｑ５抗原の特異的発現の決定的な証拠とはいえない。そこでＱ５抗原の発現抑制が転写レベルで行われているのか、翻訳レベルで行われているのかを確認するため、正常マウスの各臓器からＲＮＡを抽出し、Ｑ５抗原特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで転写産物（Ｑ５ｍＲＮＡ）の検出を試みた。
正常ＡＫＲ（Ｈ−２ｋ）マウスでは、僅かに末梢血単核球、および極僅かに胸腺に検出されただけであった（図２）。検出されたバンドがＱ５であるか否かを確定するため、ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡをシークエンスしたところ、報告されているＱ５抗原の配列と完全に一致した。また、正常ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、および正常Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスでは調べた限りのいずれの臓器でも検出されなかった（図３、図４）。
これらの結果から、Ｑ５抗原の発現制御レベルは基本的に転写レベルであり、末梢血単核球と胸腺では翻訳レベルで抑制される場合もあり得ることが示唆された。
（ｉｉｉ）担癌マウス各臓器におけるＱ５抗原遺伝子発現抑制レベルの検討
正常マウスと同様に、ＢＷ５１４７（リンフォーマ）担癌ＡＫＲマウス、ＭＨ１３４（肝癌）担癌Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスでの検討を行った。その結果、担癌状態の個体でも正常細胞では正常状態と同様の発現様式をとることが確認された（図５、図６）。
以上の結果より、担癌状態でも正常細胞では正常マウスとほぼ同様に転写制御が行われていることが明らかになった。
（ｉｖ）アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）発現の確認
近年発見されたアデノウィルスレセプター（ＣＡＲ）の発現が、リンパ球では認められないことから、（Ｒ  Ｐ．Ｌｅｏｎ，Ｔ．Ｈｅｄｌｕｎｄ，Ｓ  Ｊ．Ｍｅｅｃｈ，Ｓ  Ｌｉ，Ｊ．Ｓｃｈａａｃｋ，Ｓ  Ｐ．Ｈｕｎｇｅｒ，Ｒ  Ｃ．Ｄｕｋｅ  ａｎｄ  Ｊ．ＤｅＧｒｅｇｏｌｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．ｖｏｌ．９５，ｐｐ．１３１５９（１９９８），Ｓ．Ｈｕａｎｇ，Ｒ  Ｉ．Ｅｎｄｏ  ａｎｄ  Ｇ  Ｒ．Ｎｅｍｅｒｏｗ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６９，ｐｐ．２２５７（１９９５））アデノウイルスは通常、リンパ球には感染できないということが知られている。従って、Ｑ５抗原遺伝子の転写調節領域とアデノウイルスとを組み合わせることにより、正常細胞では発現せず、癌細胞では発現するという完全な癌細胞特異的発現誘導ベクターを提供できる可能性があると考えられる。そこで、健常人末梢血でのＣＡＲ発現をＣＡＲ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法で確認した。６名の健常人ボランティアの末梢血をしらべた結果、６名ともＣＡＲを発現していないことが確認された（図７）。
以上の結果より、Ｑ５抗原遺伝子の転写調節領域とアデノウイルスベクターとを組み合わせた「癌細胞特異的発現誘導ベクター」が提供できる可能性が強く示された。
（ｖ）Ｑ５抗原遺伝子５’上流ＤＮＡのクローニング
Ｑ５抗原遺伝子５’上流ＤＮＡの塩基配列は−２１０ｂｐまでしか明らかにされていなかった〔ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ１６４２３，（Ｓ．Ｗａｔｔｓ，Ａ  Ｃ．Ｄａｖｉｓ，Ｂ  Ｇａｕｔ，Ｃ  Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｌ．Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｒ  Ｓ．Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．１７４９（１９８９））〕。そこで、まずＨ−２ｋマウスであるＡＫＲ由来ＢＷ５１４７細胞から、染色体ＤＮＡを抽出精製した。次にこの染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｑ４ｋ（Ｓ．Ｃｃｈｗｅｍｍｌｅ，Ｄ．Ｂｅｖｅｃ，Ｇ．Ｂｒｅｍ，Ｍ  Ｂ．Ｕｒｂａｎ，Ｐ  Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ａｎｄ  Ｅ  Ｈ．Ｗｅｉｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．３４，ｐｐ．２８（１９９１））およびＱ５ｋの翻訳領域中に各々２種類ずつの特異的プライマーを作製し、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりＱ４ｋ−Ｅｘｏｎ５からＱ５ｋ−Ｅｘｏｎ２までのＤＮＡ断片を増幅した。そして増幅した約８．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８ベクターのＳｍａＩサイトに繋いだ後、大腸菌に導入してクローニングを行いｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（８．３ｋ）のクローンを複数得た。
（ｖｉ）Ｑ５ｋ遺伝子５’上流ＤＮＡの塩基配列決定
塩基配列決定に先立ち、ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（８．３ｋ）をＳａｃＩ消化し、目的に対して余分と思われるＱ４ｋの全翻訳領域を含む４．２ｋｂｐを欠失させ、さらにＳａｌＩで消化し、この部位にＡｐａＩリンカーを挿入したクローンｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（Ｓａｃ−Ｅ２）を得た。ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（Ｓａｃ−Ｅ２）を利用し、Ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  Ｕｎｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ＳＵＤ）法で以下のように塩基配列を決定していった。
ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（Ｓａｃ−Ｅ２）をＡｐａＩおよびＸｂａＩで消化した後５分、１０分、１５分、２０分、または２５分間それぞれＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）消化を行った。これらＥｘｏ  ＩＩＩ消化したＤＮＡの末端をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅおよびＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍａｅｎｔを用いて平滑にし、アガロース電気泳動を行った後、各サイズのＤＮＡフラグメントを回収、精製した。このようにして得たＤＮＡをセルフライゲーションにより環状化し、大腸菌に導入した。出現した大腸菌コロニー中のプラスミドがもつインサートＤＮＡの長さを、ベクターマルチクローニングサイトの両端のプライマーを用いたＰＣＲ反応で確認し、サイズの異なる１７〜２５クローンを選択した。選択した各クローンのインサート部分の塩基配列をサイクルシークエンス法により解読した。各々のクローンから解読された塩基配列に基づき、重複した配列部分を利用してインサートＤＮＡの４．１ｋｂｐ全領域の塩基配列を繋ぎあわせた。
実際には、上記ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（８．３ｋ）の３クローン分について上記操作を行い、そのコンセンサス配列を決定した。Ｑ５翻訳領域は、報告されている配列とこのコンセンサス配列とが完全に一致したことから、翻訳開始コドンより５’上流の配列を配列番号５に示した通りに決定した。配列番号５の配列は予想される転写開始点を境とし、５’上流側、下流側をそれぞれ＋と−とで番号付けして表１に示した。また、その制限酵素地図を図８および図９に示した。
以下、配列番号１、２、３、４の配列をそれぞれの制限酵素の位置でＨｉｎｄ、Ｂｓｔ、Ｐｖｕ、Ｎｃｏで略称することがある。
決定した配列をＧｅｎｏｍｎｅｔ  ＤＤＢＪ  ＦＡＳＴＡでホモロジー検索した結果、一致するデータも全領域にわたる相同な配列をもつものも存在しなかった。
2003102186.tif 000002
2003102186.tif 000003
（ｖｉｉ）ヒト癌細胞中での転写制御
Ｑ５遺伝子の転写調節領域をヒトの癌遺伝子治療に応用するためには、ヒトの癌細胞中で転写を起こすことが必須となる。そこで、レポーター遺伝子にｌａｃＺを利用し、その上流にＱ５遺伝子５’上流領域を配したアデノウイルスベクターを４種構築（図８）、精製し、ヒトの癌細胞中で転写されるか否かを検討した。
ヒト癌細胞株ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、およびＤＬＤ−１（大腸癌）を用いて検討したところ、すべての癌細胞中でレポーター遺伝子の発現が認められた（図１０、１１、１２、１３）。さらにレポーター遺伝子にルシフェラーゼを利用し、その上流にＱ５遺伝子５’上流領域を配したプラスミドＤＮＡを構築し（図９）、その転写活性の定量を行った。
ヒト癌細胞株ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）を用いて検討したところ、すべての癌細胞中でレポーター遺伝子の発現が認められた（図１４、１５、１６）。また、ＳＶ４０プロモーターとｐＧＬ３／Ｑ５．Ｈｉｎｄとの比較においては５０％以上の発現を示した（表２）。これらの結果から、ヒトの癌細胞中においても、Ｑ５遺伝子５’上流領域は十分な転写を誘導できることが明らかになった。
2003102186.tif 000004
（ｖｉｉｉ）正常細胞における転写制御領域の検討
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養可能とされている細胞株や、初代培養細胞に正常細胞といわれるものがあるが、真に正常であるという保証がない。そこで発明者らは、正常細胞における評価に担癌マウスｉｎ  ｖｉｖｏの系の正常細胞を用いた。
Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（８週齢、雄）マウスの腹部皮内にＭＨ１３４肝癌細胞を２×１０５個移植し、１週間後に癌組織の直径が約７ｍｍになったものを用いた。
図８に示した構造のＤＮＡを含む組換えアデノウィルス、Ａｄ／Ｈｉｎｄ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｂｓｔ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｐｖｕ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｎｃｏ−ｌａｃＺを精製し、それぞれ３×１０９ｐｆｕ／ｍｏｕｓｅを１群２から４匹に投与し、その３日後に各臓器を取り出し、凍結切片を作製した。この切片をｌａｃＺ染色により検討したところ、陽性対照として用いたＡｄ／ＣＡＧ−ｌａｃＺでは様々な正常細胞が染色された（下記表３）が、Ａｄ／Ｈｉｎｄ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｂｓｔ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｐｖｕ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｎｃｏ−ｌａｃＺは４種類ともがん組織以外の他の正常細胞では全く染色を認めなかった（表３、図１７、１８、１９、２０）。ここでＣＡＧはポジティブなコントロールとしてのプロモーター遺伝子を示す。
2003102186.tif 000005
以上の結果に基づき、本発明者らはＱ５抗原遺伝子の転写開始点より５’上流−２６６７塩基から＋２２塩基の２６８９ｂｐに相当するＤＮＡは癌細胞特異的に発現を誘導するＤＮＡであり、これを含有するベクターを細胞に導入すればその細胞が癌細胞であるときのみ下流に連結した任意の外来遺伝子を発現させることができることを知見し、本発明を完成した。
従って本発明は、癌細胞特異的に遺伝子発現を誘導する癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡ、およびこれを含有する癌細胞特異的発現ベクターを提供する。
（１）癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡ
（１−１）本発明のＤＮＡは、マウス非古典的組織適合抗原遺伝子（ＭＨＣクラスＩｂ遺伝子）のＱ５抗原遺伝子の予想される転写開始点を含み５’上流に−８００塩基以上の配列を有するＤＮＡである。
（１−２）本発明のＤＮＡの具体例は、以下のＡ〜Ｅが例示される。
Ａ：マウス非古典的組織適合抗原遺伝子（ＭＨＣクラスＩｂ遺伝子）のＱ５抗原遺伝子の転写開始点より５’上流−２６６７塩基から＋２２塩基のＤＮＡ（配列番号１）の少なくとも一部からなるＤＮＡ。
Ｂ：少なくとも配列表の配列番号２（＝転写開始点より５’上流−２０４２塩基から＋２２塩基）に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
Ｃ：少なくとも配列表の配列番号３（＝転写開始点よりより５’上流−１４１４塩基から＋２２塩基）に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
Ｄ：少なくとも配列表の配列番号４（＝転写開始点よりより５’上流−８２９塩基から＋２２塩基）に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
Ｅ：マウス非古典的組織適合抗原遺伝子（ＭＨＣクラスＩｂ遺伝子）のＱ５抗原遺伝子の転写開始点より５’上流−３９０１塩基から＋２２塩基のＤＮＡ（配列番号１）の少なくとも一部からなるＤＮＡ。
（１−３）また、本発明のＤＮＡは、以下のＡ’〜Ｄ’が例示される。
Ａ’：配列番号１のＤＮＡにさらに５’上流−２６６８塩基から−３９０３塩基までの１〜１２３６個の塩基のうち任意の数の連続した塩基配列が付加されたＤＮＡ。
Ｂ’：配列番号２のＤＮＡにさらに５’上流−２０４３塩基から−２６６６塩基までの１〜６２４個の塩基のうち任意の数の連続した塩基配列が付加されたＤＮＡ。
Ｃ’：配列番号３のＤＮＡにさらに５’上流−１４１５塩基から−２０４１塩基までの１〜６２７個の塩基のうち任意の数の連続した塩基配列が付加されたＤＮＡ。
Ｄ’：配列番号４のＤＮＡにさらに５’上流−８３０塩基から−１４１３塩基までの１〜５８４個の塩基のうち任意の数の連続した塩基配列が付加されたＤＮＡ。
（１−４）一般にＤＮＡはそれらの配列中の１つまたは２以下、または３以下、または数個以下の塩基が、付加、欠失、置換または挿入されてもその主たる機能を保持する場合が多い。したがって、本発明のＤＮＡには、後述する▲１▼、または、▲１▼および▲２▼の活性を有する限り、上記の（１−１）〜（１−３）の配列中の１つまたは数個以下の塩基が、付加、欠失、置換または挿入された配列も含まれる。また、本発明のＤＮＡには、上記の（１−１）〜（１−３）の配列中の１つまたは数個以下の塩基が、ポイントミューテーションで変異された配列も含まれる。
（１−５）本発明のＤＮＡは、後述する▲１▼、または、▲１▼および▲２▼の活性を有する限り、上記の（１−１）〜（１−４）の配列の部分が含まれる。
（１−６）本発明のＤＮＡは、後述する▲１▼、または、▲１▼および▲２▼の活性を有する限り、上記の（１−１）〜（１−５）の配列と相同性を有する配列が含まれる。ここで相同性とは、塩基配列の６０％以上が一致する配列を持つことをいう。
（１−７）本発明のＤＮＡは、後述する▲１▼、または、▲１▼および▲２▼の活性を有する限り、上記の（１−１）〜（１−６）の配列の相補鎖と特異的にハイブリダイズする配列が含まれる。
ここで特異的にハイブリダイズするとは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６８℃２時間以上ハイブリダイズすることをいう。
＜本発明のＤＮＡの活性＞
▲１▼本発明のＤＮＡは、その下流の遺伝子発現を癌細胞特異的に発現誘導する活性を有する。
▲２▼本発明のＤＮＡは、癌の種類によらず共通的にその下流の遺伝子発現を癌細胞特異的に発現誘導する活性を有する。
また本発明の別の態様のＤＮＡは、上記の（１−１）〜（１−７）のＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列である。
これらのアンチセンス配列は癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡの下流の遺伝子の発現を阻害する働きをする可能性がある。
なお、本発明で「ヌクレオチド配列」とは、塩基がピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチドからなる配列であって、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体を含む。
また、「ＤＮＡ」とは、塩基としてアデニン、グアニン、シトシン、チミンの他、少量のメチル化塩基すなわち５−メチルシトシン、６−メチルアミノプリンなどが含まれる。
本発明のＤＮＡは、染色体ＤＮＡライブラリをスクリーニングして単離して得たものでも、ＰＣＲ法により得られるものでも、合成したものでも良い。
（２）癌細胞特異的発現ベクター
（２−１）ベクター
本発明のＤＮＡを製造する方法に用いるベクターとしては、大腸菌等の公知の宿主に遺伝子を導入できるベクターであれば特に限定されない。認識部位が存在しない制限酵素のクローニング部位を持つシャトルベクターを選択し、このクローニング部位で本発明のＤＮＡを連結する。これを大腸菌等の適切な宿主に導入して、所望のクローンを選択し、得られたクローンからベクターＤＮＡを抽出、精製する。
本発明のＤＮＡを組み込み、癌細胞特異的に発現させるベクターとしては、動物細胞への遺伝子導入に用いられるベクターであれば特に限定されないが、例えばプラスミドベクター、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、ＨＩＶベクター、リポソームベクター等を用いることができる。またウィルスベクター作製用シャトルベクターに挿入した後、ウィルスベクターに組み込むことができる。これらの中では、癌細胞に導入するという点からアデノウィルスベクターが好ましい。
ベクター中に、ベクター自身の発現用プロモーター／エンハンサー配列が存在する場合は、その領域を欠失させておくのが好ましい。
（２−２）目的のタンパク質または目的のポリペプチド若しくはＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列
本発明の癌細胞特異的発現ベクターに組み込み、発現させる目的のタンパク質またはポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列としては、上記（２−１）のベクターによって発現させることができるものであれば特に限定されないが、有用性の観点から、非自己のＭＨＣクラスＩ分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、非自己のＭＨＣクラスＩＩ分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、サイトカイン類をコードするヌクレオチド配列、サイトカインレセプターをコードするヌクレオチド配列、細胞死を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、補助刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６等）をコードするヌクレオチド配列、癌抗原をコードするヌクレオチド配列、癌抑制遺伝子をコードするヌクレオチド配列、癌遺伝子のアンチセンスのヌクレオチド配列等が好ましい。具体的にはヒトの非自己のＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃのそれぞれ少なくとも細胞外ドメインの一部、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、リンホトキシンレセプター、ＴＲＡＩＬレセプター、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｒａｓ、ｐ５３、ＬＩＧＨＴ、ウィルスタンパク等をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。
ＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列としては、癌遺伝子若しくは変異遺伝子に対するリボザイム（酵素活性をもつＲＮＡ）若しくはＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）をコードするヌクレオチド配列が好ましい。
上記のヌクレオチド配列はいずれも公知であるので、ＤＮＡライブラリーから一般的な方法でクローニングして得ることができる。これらのヌクレオチド配列を、リン酸トリエステル法やアミダイト法等の公知の方法を用いて化学合成して得ることもできる。またＧｅｎｅＢａｎｋから入手することもできる。
（２−３）癌細胞特異的発現ベクターの構築
ベクターのクローニング部位に癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡと目的のタンパク質・ポリペプチド若しくはＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列とを組み込む。以下に市販のアデノウィルスベクター（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（宝酒造製））を使って癌細胞特異的発現ベクターを構築する方法を説明する。
癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡには認識部位が存在しない制限酵素のクローニング部位を持つシャトルベクターを選択し、前記クローニング部位で癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡを連結する。これを大腸菌に導入して、所望のクローンを選択し、得られたクローンからベクターＤＮＡを抽出、精製する。次いで癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡの下流のクローニング部位に目的のタンパク質・ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするヌクレオチドを連結し、これを大腸菌に導入して、所望のクローンを選択し、得られたクローンからベクターＤＮＡを抽出、精製する。得られたベクターＤＮＡから癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡと前記ヌクレオチド配列とを含む領域を、制限酵素（切断面が平滑末端になるもの）で切断して取り出す。以上で、大腸菌で目的ＤＮＡを増幅させた。この断片を、制限酵素（ＳｗａＩ）で切断後脱リン酸化したアデノウイルスベクターであるコスミドベクターｐＡｘｃｗに挿入し、パッケージングキット（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））を用いてパッケージングする。これをＶＣＳ−２５７大腸菌等に感染させ、出現したコロニーから常法に従いコスミドＤＮＡを精製し、所望のベクターを選択する。
得られたベクターをＤＮＡ−ＴＰＣとともに、リン酸カルシウム法で２９３細胞に感染させ、９６ｗｅｌｌプレートで７〜１５日培養する。２９３細胞が死滅したｗｅｌｌから死細胞とその培地を回収し、凍結融解を６回行った後、遠心して得られた上清を一次ウィルス液とする。ウィルス液には、癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡ＋所望のタンパク質・ポリペプチド若しくはＲＮＡをコードするＤＮＡが組み込まれたアデノウイルスベクターＤＮＡからなる「組換えアデノウイルス粒子」が含まれる。
一次ウィルス液を２９３細胞およびＨｅＬａ細胞の培養上清中に加えて、２９３細胞は完全に死滅し、ＨｅＬａ細胞は死なないものを選択する。この工程で野生型アデノウイルスが混入したものを排除し、目的の組換えアデノウイルス増幅物を選択する。選択されたものを一次ウィルス液を調製したのと同様に、死細胞とその培地を回収して凍結融解を６回行った後に遠心し、得られた上清を二次ウィルス液とする。一方、死細胞からＤＮＡを調製して、所望のベクターＤＮＡが得られたかを確認し、確認できたものについてはさらに三次ウィルス液、および四次ウィルス液を調製する。
四次ウィルス液を２９３細胞に感染させて、所望の構造を確認できたベクターを癌細胞特異的発現ベクターとする。所望量のウィルス粒子が得られれば四次ウィルス液まで調製しなくても良いし、必要ならさらに高次のウィルス液を調製しても良い。また、天然型ウイルスの混入がないことを確認した後、この四次ウィルス液を密度勾配遠心等で精製し、力価を決定する。以上のように調製したウイルス液を遺伝子治療に応用する。
上記のように本発明の癌細胞特異的発現ベクターを利用することによる癌の遺伝子治療方法や癌ワクチンを開発することができる。
（３）細胞加工方法（形質転換体の製造方法）
本発明の癌細胞特異的ベクターを癌細胞に導入し、組み込まれた目的のヌクレオチドを発現させる。癌細胞は真核細胞であれば特に制限されないが、有用性の観点からヒト、マウス等の哺乳類の細胞が好ましい。癌細胞は、生体内に存在しているものであっても生体外に取り出したものであってもよい。生体から直接採取した癌組織から癌細胞を調製する場合、細菌等に汚染されている可能性が高いので、培養液中に抗生物質を添加しておくのが好ましい。また採取した組織片が癌組織であることを確認するために、病理組織標本等を作製しておくことが好ましい。
（３−１）癌細胞特異的発現ベクターの細胞への導入
本発明の癌細胞特異的発現ベクターをｅｘ  ｖｉｖｏで癌細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の一般的な方法を用いることができる。ウィルスベクターであれば、培地中に含有させることにより癌細胞に感染させて導入することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで癌細胞に導入する方法としては、適当な力価になるように生理食塩水等に懸濁した癌細胞特異的発現ベクターを静脈注射、動脈注射、筋肉注射、局所注入等の方法によって導入する方法や経口投与、経気道投与、経皮投与等によって導入する方法が挙げられる。
（３−２）癌細胞特異的発現ベクター導入細胞の培養
ｅｘ  ｖｉｖｏで癌細胞特異的発現ベクターを導入した癌細胞の培養は、常法の細胞培養方法に従って行う。細胞間結合が強い癌組織の場合は、組織片のまま培養するのが好ましく、その場合には常法の組織片培養法に従う。
（３−３）タンパク質・ポリペプチド若しくはＲＮＡの発現の確認
目的のタンパク質・ポリペプチド若しくはＲＮＡの発現は、遺伝子産物を解析するための公知の方法によって確認することができる。例えば蛍光抗体法、酵素抗体法、フローサイトメトリーを用いた方法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡ塩基配列決定法等が挙げられる。
（４）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導
本発明の癌細胞特異的発現ベクターによって、癌細胞に非自己ＭＨＣクラスＩ分子等の抗原分子を発現させた加工細胞を用いて、常法に従い細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができる。
また、本発明の癌細胞特異的発現ベクターが導入され、かつ所望のタンパク質、ポリペプチドを発現し得る形質転換体である加工細胞を用いることにより、発現させた抗原分子のみならず、癌細胞本来の癌抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）も同時に誘導することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、生体に戻すなどして癌の治療に用いることができる。
（５）癌細胞の存在のスクリーニング
本発明の癌細胞特異的発現ベクターを、ヒトの組織、臓器、体液等の被検体の細胞に導入し、本発明の癌細胞特異的発現ＤＮＡの下流の所望のタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、所望のタンパク質等を発現すれば、被検体の細胞は癌細胞であることがわかり、癌細胞の存在を判定することができる。したがって本発明では、癌細胞特異的発現ベクターを、被検体に導入し、発現の有無により癌細胞の存在を判定する検査方法、癌細胞特異的発現ＤＮＡを含む癌の診断薬を提供することができる。本発明では、癌細胞が存在する状態であれば癌が診断でき、癌になっている状態の診断だけでなく、発病にはいたっていないがウィルス（Ｃ型肝炎等）に感染した細胞が存在し、徐々に癌に移行するいわゆる前癌状態も診断できる。
本発明の癌細胞特異的発現ＤＮＡと共にベクターに導入されるヌクレオチド配列は、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のほかに、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等のレポーター遺伝子を用いることができる。
（６）癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡおよびベクターの癌の治療・予防用途
癌細胞は、自己の細胞が変異したものであり、生体内では免疫系が非自己と認識できない状態となったとき、異常増殖して病状が進行する。しかしながら、本発明に係るＤＮＡおよびベクターを用いれば、所望のタンパク質、ポリペプチド若しくはＲＮＡを癌細胞特異的に発現させることができるので、免疫系が非自己と認識できるタンパク質、ポリペプチドを発現させることにより、癌細胞を非自己と認識し、癌細胞を排除することが可能となり、効果的な癌治療が可能となる。また、癌細胞が存在する状態であれば、癌疾患を臨床的に発病している状態の治療だけでなく、たとえばウィルス感染症（Ｃ型肝炎等）のように徐々に癌に移行する変異細胞の存在する状態、いわゆる前癌状態となった場合も、本発明に係るＤＮＡおよびベクターを用いて治療することができる。したがって上記治療の語には、治療・予防および再発防止を含む。
またたとえば何らかの変異が起きることによって融合タンパク質を生じる場合があるが、それが癌遺伝子によるものでなくてもがん化の原因となることがあり、癌遺伝子のみならず癌を引き起こす可能性のある変異遺伝子に対してＲＮＡ干渉を起こすことができるＲＮＡｉもしくはリボザイムをコードするＤＮＡを含む本発明のベクターを用いることにより癌の治療が可能である。
本発明では、癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡを含有するベクターを用いる癌の免疫治療方法、免疫予防方法および再発防止方法が提供される。
また上記（４）に記載の形質転換体を用いて、抗原分子の発現とともに誘導させた細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生体に戻す癌の治療方法も有効である。
さらに、本発明の癌細胞特異的発現誘導ベクターは、癌細胞特異的転写因子の研究、その転写因子の阻害に対する研究への利用も考えられる。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例中の諸操作は、特に断らない限り「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌら編、第３版（２００１）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」に記載の方法に準じて行った。
実施例１
＜Ｑ５抗原遺伝子の正常マウス各臓器における発現抑制レベルの検討＞
正常ＡＫＲ（Ｈ−２ｋ）マウス、正常ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスおよび正常Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス各々１０週齢、雄２匹ずつを用いた。各マウスをエーテル麻酔下で心採血を行い、約１ｍｌずつの末梢血を得た。この末梢血を生理食塩水（生食）で各々７．５ｍｌずつに希釈し、３ｍｌのリンフォプレップ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）に重層した後、室温で２５００回転、３０分間の遠心を行い、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）画分を得た。各々のＰＢＭＣ画分を生食で１０ｍｌに希釈し、４℃で１５００回転、５分間の遠心を行い、ＰＢＭＣを沈澱させることで洗浄した。この洗浄を２回行った後、沈澱を回収しＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン：Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社製）１ｍｌに溶解させ、直ちに−８０℃に保存した。別に各マウスの各臓器を摘出し、生食でよく洗浄した後、１ｍｌのＩｓｏｇｅｎ中でホモジネート後、直ちに−８０℃に保存した。
一時的に−８０℃で保存した各臓器を室温に戻した後、直ちに４℃で３０００回転、１０分間の遠心を行い、上清を回収した。この上清からＩｓｏｇｅｎの説明書に添付されている方法に従い、ＲＮＡを回収した。さらに微量に存在しているＤＮＡを分解するため、ＤＮａｓｅＩによる消化を３７℃で３０分間行い、フェノール、クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱、エタノールリンスを行った後、ＲＮａｓｅフリー蒸留水０．１５ｍｌに溶解させ、精製回収されたＲＮＡ量を分光光度計により定量した。
各ＲＮＡの定量値に基づき、各々５０ｎｇを逆転写反応に使用し、得られたｃＤＮＡの一部を鋳型として、Ｑ５特異的なプライマー、５’−ＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＴ−３’、および５’−ＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧ−３’を用いたＰＣＲ法で評価した。このとき、陽性対照にはＧ３ＰＤＨ特異的プライマー、５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’、および５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’を用いた。また各々のＲＮＡサンプルから、逆転写反応なしでＱ５特異的なプライマーを用いＰＣＲ法を行い、ＤＮＡの増幅が起こらないことを確認した。結果を図２、図３、図４に示した。図２に示したように、正常ＡＫＲ（Ｈ−２ｋ）マウスでは末梢血リンパ球に僅かと胸腺に極僅かの転写産物が検出されただけであった。検出されたバンドがＱ５抗原遺伝子由来であるか否かを確定するため、ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡをシークエンスしたところ、報告されているＱ５抗原遺伝子のものと一致した。正常ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（図３）、および正常Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス（図４）では、いずれの臓器でもＱ５抗原遺伝子の転写産物は検出されなかった。
これらの結果から、Ｑ５抗原の発現制御レベルは基本的に転写レベルであり、末梢血単核球と胸腺では翻訳レベルで抑制される場合もあり得ることが示唆された。
実施例２
＜Ｑ５抗原遺伝子の担癌マウス各臓器における発現抑制レベルの検討＞
ＡＫＲマウスの腹腔で継代していたＢＷ５１４７リンフォーマを回収し、生食で２回洗浄後、２×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｍｏｕｓｅで別のＡＫＲマウスの腹部皮内に移植した。１週間後、腫瘍径が約７ｍｍになったところで、正常マウスの場合と同様に各臓器を回収した。同様にＣ３Ｈ／ＨｅマウスへＭＨ１３４肝癌を移植し、各臓器を回収した。正常マウスの場合と同様に回収した各臓器からＲＮＡを抽出、精製し、ＲＴ−ＰＣＲ法で解析した。ＢＷ５１４７担癌ＡＫＲマウスでは、末梢血単核球のみで転写産物が検出されただけであった（図５）。またＭＨ１３４担癌Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスでは、いずれの臓器でも検出されなかった（図６）。
実施例１、２より担癌状態でも正常マウスと同様に転写制御が行われていることが明らかとなった。
実施例３
＜アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現の確認＞
ＣＡＲが発現していることが明らかなＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）細胞株、および健常人８例の末梢血単核球各々から、正常マウスの場合と同様にＲＮＡを抽出、精製した。回収したＲＮＡ量を定量した後、ＣＡＲ特異的プライマー５’−ＣＴＴＧＴＴＡＡＧＣＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣ−３’、および５’−ＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣ−３’を用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、転写レベルの発現を確認した。図７に示した結果の通り、ＨｅＬａ細胞ではＣＡＲの発現を認めたが、健常人８例は全例においてＣＡＲの発現を認めなかった。
以上の結果より、Ｑ５遺伝子の転写調節領域とアデノウイルスベクターを組み合わせた癌細胞特異的発現誘導ベクターの特異性および有用性が示唆された。
実施例４
＜Ｑ５ｋ遺伝子５’上流ＤＮＡのクローニング＞
最初にＨ−２ｋマウスであるＡＫＲ由来ＢＷ５１４７細胞から、常法に従い染色体ＤＮＡを抽出精製した。次にこの染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行ったが、用いたプライマーの塩基配列は、Ｓ．Ｃｃｈｗｅｍｍｌｅ，Ｄ．Ｂｅｖｅｃ，Ｇ．Ｂｒｅｍ，Ｍ  Ｂ．Ｕｒｂａｎ，Ｐ  Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ａｎｄ  Ｅ  Ｈ．Ｗｅｉｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．３４，ｐｐ．２８（１９９１）に報告されている染色体ＤＮＡの塩基配列を参照し、Ｑ４ｋとＱ５ｋの翻訳領域中に相当する領域に設けた。１ｓｔ−ＰＣＲ用のプライマー配列は、５’−ＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＴＧＡＣＡＴＧ−３’、および５’−ＣＣＡＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＴＴ−３’であり、２ｎｄ−ＰＣＲ用のプライマー配列は５’−ＴＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＧ−３’、および５’−ＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴ−３’である。このＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより、約８．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物を得た。
上記Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ産物にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を施し、ＤＮＡ末端を平滑にし、精製した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ処理で末端にリン酸を付加させた。別にｐＵＣ１１８をＳｍａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理により末端のリン酸を外し、精製したベクターＤＮＡを用意した。これら、８．３ｋｂｐＤＮＡ断片とベクターＤＮＡをライゲーション反応で結合させ、大腸菌ＪＭ−１０９にエレクトロポレーションで導入した。出現してきたコロニーのインサートＤＮＡのサイズを調べ、目的とする８．３ｋｂｐをもつクローンを選択した。さらに、選択したクローンの塩基配列をｐＵＣ１１８のユニバーサルプライマー５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’を用いたサイクルシークエンス法で解読し、Ｑ５ｋのプライマー近傍のＤＮＡ配列が確認できたものを選択することでＱ５ｋ遺伝子５’上流ＤＮＡのクローニングに成功した（ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（８．３ｋ））。
実施例５
＜Ｑ５ｋ遺伝子５’上流ＤＮＡの塩基配列決定＞
実施例４によりクローニングされたＱ４ｋからＱ５ｋのコーディング領域を含むクローンから、目的に無関係と考えられるＱ４ｋのコーディング領域を欠失させるため、ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（８．３ｋ）をＳａｃＩで消化し、一度セルフライゲーションにより、インサートＤＮＡのサイズを４．１ｋｂｐにしたものをサブクローニングした（ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（４．１ｋ））。次にｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（４．１ｋ）をＳａｌＩ消化し、この部位にＡｐａＩリンカーを挿入したクローンｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（Ｓａｃ−Ｅ２）を得た。
解読にはｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（Ｓａｃ−Ｅ２）を利用し、Ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  Ｕｎｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ＳＵＤ）法で以下のように塩基配列を決定していった。
ｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（Ｓａｃ−Ｅ２）をＡｐａＩおよびＸｂａＩで消化し、引き続き５、１０、１５、２０または２５分間のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）消化を行った。これらＥｘｏ  ＩＩＩ消化したＤＮＡの末端をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅおよびＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍ  ａｅｎｔにより平滑にし、アガロース電気泳動後、各サイズのＤＮＡフラグメントを回収、精製した。このようにして得たＤＮＡをセルフライゲーションにより環状化し、大腸菌に導入した。出現してきた大腸菌コロニー中のプラスミドがもつインサートＤＮＡのサイズをベクターマクチクローニングサイトの両端のユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ反応で確認し、サイズの異なる１７〜２５クローンを選択した。選択した各クローンのインサート部分の塩基配列をサイクルシークエンス法により解読した。各々のクローンから解読された塩基配列に基づき、重複した配列部分を利用してインサートＤＮＡの４．１ｋｂｐ全領域の塩基配列を繋ぎあわせた。
上記で最初にクローニングしたｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（８．３ｋ）の３クローン分を同様に行い、そのコンセンサス配列を決定した。Ｑ５翻訳領域については、報告されている配列とこのコンセンサス配列とが完全に一致したことから、翻訳開始コドンより５’上流の配列を配列番号５に示した通りに決定した。また、その制限酵素地図を図８に示した。
実施例６
＜ヒト癌細胞中での転写制御＞
図８に示した制限酵素地図のＨｉｎｄＩＩＩ（−２６６７）サイト、ＢｓｔＸＩサイト、ＰｖｕＩＩ（−１４１４）サイト、ＮｃｏＩサイト各々からＱ５遺伝子の翻訳開始コドン直前（＋２２）までのＤＮＡの３’下流にＬａｃＺ遺伝子−ＢＧＨｐｏｌｙＡ部位を配したアデノウイルスベクターを作製、精製し、ウイルス力価を決定した（方法はＴａｋａｒａ社のキットに添付のマニュアルに従った）。これら組み換えアデノウイルスベクターをｍ．ｏ．ｉ．＝１０、１００、１０００でヒト癌細胞株に感染させ、レポーター遺伝子のＬａｃＺの発現を発色により検討した。ＨｅＬａ、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＤＬＤ−１細胞すべてで染色が確認された。そのうちｍ．ｏ．ｉ．＝１０００の結果を図１０、図１１、図１２および図１３に示した。
さらに、図９に示した制限酵素地図のＨｉｎｄＩＩＩ（−２６６７）、ＢｓｔＸＩ、ＰｖｕＩＩ（−１４１４）、ＮｃｏＩから翻訳開始コドンの直前（＋２２）までのＤＮＡを、各々レポーター遺伝子としてルシフェラーゼをもつｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のクローニングサイトに挿入しサブクローニングを行い、塩基配列を確認しレポータープラスミドを作製した。これらレポータープラスミドを内部標準用のプラスミドｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と共にＨｅＬａ、ＤＵ１４５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にリポフェクション法で導入し、２日後にデュアルルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）でレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現量を定量した。図１４、図１５および図１６に示した結果から、全ての細胞において全てのレポーター遺伝子の発現が認められ、レポータープラスミド間での比較では、ｐＧＬ３／Ｑ５．ＮｃｏＩで発現量が低くなるが、その他は同程度の発現量であった。また表２に示したように、陽性対照として用いたＳＶ４０プロモーター（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ製））とｐＧＬ３／Ｑ５．ＨｉｎｄＩＩＩを比較しても、ｐＧＬ３／Ｑ５．ＨｉｎｄＩＩＩはｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌの５０％以上の発現をもたらすことが明らかになった。これらの結果から、Ｑ５−５’上流転写調節領域ＤＮＡはヒト癌細胞中で十分な転写を誘導することが確認された。
実施例７
＜正常細胞における転写制御領域の検討＞
癌細胞中では、予想される転写開始点より５’上流−１４１４塩基（ＰｖｕＩＩ部位）から＋２２塩基の領域以上あれば転写誘導活性が高く維持できることが明らかになったが、正常細胞中での転写抑制に必要な領域と一致するかは不明なので、正常細胞中での転写制御を検討する必要がある。ところが、正常細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養可能とされている細胞株や、初代培養細胞もあるが、検討時に真に正常であるという保証がない。そこで発明者らは、担癌マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏの系で行った。
Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（１０週齢、雄）マウスの腹部皮内に、ＭＨ１３４肝癌を２×１０５個移植し、１週間後に癌組織の直径が約７ｍｍになったものを用いた。ヒト癌細胞中での転写制御の検討に用いた精製Ａｄ／Ｈｉｎｄ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｂｓｔ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｐｖｕ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｎｃｏ−ｌａｃＺそれぞれ３×１０９ｐｆｕ／ｍｏｕｓｅを１群２から４匹に投与し、その３日後に各臓器を取り出し、凍結切片を作製した。この切片をｌａｃＺ染色により検討したところ、陽性対照として用いたＡｄ／ＣＡＧ−ｌａｃＺでは様々な正常細胞が染色されたが、Ａｄ／Ｈｉｎｄ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｂｓｔ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｐｖｕ−ｌａｃＺ、Ａｄ／Ｎｃｏ−ｌａｃＺは４種類ともがん組織以外の正常細胞は全く染色されなかった（図１７、図１８、図１９、図２０、表３）。
以上の結果から、Ｑ５抗原遺伝子５’上流転写調節領域ＤＮＡは、癌細胞中では転写を誘導し、ほとんどの正常細胞中では転写を抑制することが明らかになった。さらにアデノウイルスベクターの様にＰＢＭＣに遺伝子導入されないベクターと組み合わせることにより、癌細胞特異的発現誘導ベクターを提供できることを発見した。
実施例８
＜マウスを用いた治療実験＞
（１）非自己のＭＨＣクラスＩ分子を発現する組み換えアデノウイルスの調製
担癌モデルマウスとしてＣ３Ｈ／Ｈｅ（Ｈ−２Ｄｋ）マウスおよびＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２Ｄｂ）マウスを利用することを前提に、Ｈ−２Ｄｄ抗原発現組換えアデノウイルスの調製を計画した。このときＨ−２Ｄｄ抗原の発現制御はＱ５（Ｐｖｕ）の転写調節ＤＮＡの配列を利用した。
ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｄｄ）マウスから胸腺を摘出し、これを滅菌処理したスライドガラスですり潰して胸腺細胞を分取した。分取した細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンと５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んだＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、シャーレに播いた。この細胞懸濁液にＩＦＮ−γを５０ｎｇ／ｍｌになるように加え、ＣＯ２インキュベーター中で一晩培養した。培養後、細胞を回収しＰＢＳで洗浄後、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン社）で溶解した。Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳに添付されているプロトコールに従い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ｏｌｉｇｏｄＴをプライマーに用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型に、Ｈ−２Ｄｄ特異的プライマー５’−ＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＣＧＣ−３’、および５’−ＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧ−３’を用いてＰＣＲ反応を行った。反応後、ＰＣＲ産物の一部をアガロースゲル電気泳動で検査したとろ、予想される１．１ｋｂｐの位置にバンドを認めた。
残りのＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化したＤＮＡフラグメントにライゲーション反応で挿入した。大腸菌ＪＭ１０９をこのライゲーション産物でトランスフォームし、出現したコロニーから、１．１ｋｂｐのインサートＤＮＡをもつクローンを選択した。選択したクローンからプラスミドを抽出、精製し、塩基配列の確認を行い、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ  ＤＤＢＪ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４７３２６の塩基配列と完全に一致したプラスミド（ｐＵＣ１９／Ｈ−２Ｄｄ）を選択した。
ｐＵＣ１９／Ｈ−２ＤｄをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、１．１ｋｂｐのインサートＤＮＡを回収、精製した。この１．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを、ｐＲｃ−ＣＭＶベクターをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化したＤＮＡフラグメントをライゲーション反応で挿入し、大腸菌ＪＭ１０９をこのライゲーション産物でトランスフォームした。出現したコロニーから１．１ｋｂｐのＤＮＡをもつクローンを選択した。選択したクローンからプラスミドを抽出、精製し、塩基配列の確認を行い、問題のないクローンをｐＲｃ−ＣＭＶ／Ｈ−２Ｄｄとして選択した。
ｐＲｃ−ＣＭＶ／Ｈ−２Ｄｄを、ＮｒｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｈ−２Ｄｄ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントを回収した。これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により、末端を平滑にした。これと別にｐＵＣ１１８／Ｑ５−５’（Ｓａｃ−Ｅ２）を、ＰｖｕＩＩとＢａｍＨＩで消化し、Ｑ５−５’ＤＮＡのＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡフラグメントを回収した。これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により、末端を平滑化し、さらにカイネーション反応を施すことで、末端にリン酸基を付加させた。これらのＤＮＡフラグメントをライゲーション反応により結合させ、大腸菌ＪＭ１０９をこのライゲーション産物でトランスフォームした。出現したコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｈ−２Ｄｄ  ｃＤＮＡの上流に正しい向きでＱ５−５’のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡが連結されたクローン（ｐＲｃ−ＣＭＶ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄ）を選択した。
ｐＡｘｃｗをＳｗａＩ消化し、ＣＩＡＰ処理したコスミドベクターを調製した。これと別に、ｐＲｃ−ＣＭＶ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄを、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで消化し、Ｑ５−５’のＰｖｕＩＩサイトからｐＲｃ−ＣＭＶのｐｏｌｙＡサイトを含むＤＮＡフラグメントを回収した。このＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により、末端を平滑化し、さらにカイネーション反応を施すことで、末端にリン酸基を付加させた。このＤＮＡフラグメントと先に調製したコスミドベクターをライゲーション反応させ、パッケージング反応した後、大腸菌ＶＣＳ−２５７に感染させた。出現したコロニーからコスミドＤＮＡを抽出し、インサートＤＮＡを含むクローンを選択した。インサートＤＮＡを含むコスミドＤＮＡをアデノ落としした後、インサートＤＮＡの塩基配列を確認した。問題のなかったクローンをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、２日後に細胞を回収した。回収した細胞と抗Ｈ−２Ｄｄモノクローナル抗体（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社）を一次抗体に、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧを二次抗体に用いて反応させた後、蛍光顕微鏡とフローサイトメーターによる解析で、蛍光が確認されたクローンを選択した。アデノ落としＤＮＡによる解析で選択したコスミドＤＮＡ（ｐＡｘｃｗ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄ）を２９３にトランスフェクションし、常法を用いてＡｄ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄを調製、精製し、精製Ａｄ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄを得た。
（２）ＭＨ１３４担癌マウスを用いた検討
Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスを７週齢で購入し、一週間の馴飼後、２×１０５個のＭＨ１３４肝癌細胞を腹部皮内に移植した。５日後、腫瘍径が約７ｍｍになったところで、一群５〜７匹ずつの三群に分け、一群に精製Ａｄ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄを３×１０９ｐｆｕ／５０μｌで、もう一群には、陰性対照として同様に調製したＡｄ／Ａｘｃｗを３×１０９ｐｆｕ／５０μｌで、残りの一群は生理食塩水を５０μｌ腫瘍局所に投与した。その２日後、もう一度同様に投与した。引き続、腫瘍径の測定と生死の確認を行った。
腫瘍径を測定した結果を図２１に示した。他の二群と比較し、Ａｄ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄ投与群では有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた（ｐ＜０．０１）。
この治療効果は、癌細胞特異的に発現した非自己ＭＨＣにより、癌細胞特異的にアロの免疫反応が誘発された結果、癌細胞が排除される。すなわち、通常生体内では癌細胞は非自己と認識されず、免疫機能による排除から免れている。しかし上述の通り、癌細胞でも、免疫系が非常に強く認識できるアロ抗原を発現していると、免疫系が非自己と認識できるので、癌細胞が排除されると考えられた。
以上から、Ｑ５遺伝子上流転写調節領域を利用することで、癌細胞特異的に非自己のＭＨＣ分子を発現させる様式の遺伝子治療剤と治療方法を提供でき、この種の薬剤を用いた治療法は副作用が少なく、高い治療効果が得られることが予想された。さらにＱ５遺伝子上流転写調節領域は、様々な遺伝子を癌細胞特異的に発現させる事が可能なことから、様々な癌遺伝子治療・予防剤に応用可能と考えられた。
産業上の利用可能性
本発明の癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡは、癌細胞等の未分化かつ異常な細胞においてのみ発現誘導活性を示す新規な癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡであり、またこのＤＮＡを含有させてなるベクターは、癌細胞において下流に連結した遺伝子を発現させる機能を有する癌細胞特異的発現誘導ベクターである。
このような本発明に係るＤＮＡおよびベクターを用いれば、所望のタンパク質、ポリペプチド若しくはＲＮＡを癌細胞特異的に発現させることができるので、免疫系が非自己と認識できるタンパク質若しくはポリペプチドを発現させることにより、癌細胞を非自己と認識し、癌細胞を排除することが可能となり、効果的な癌治療が可能となる。本発明に係る癌細胞特異的発現誘導ＤＮＡおよびベクターは、癌治療に好適に用いることができる。さらに、このベクターを利用して、新規な癌の遺伝子治療法や癌ワクチンを開発することができる。
癌の治療の他にも、癌の診断への応用や、癌細胞特異的転写因子の研究、またその転写因子の阻害に関する研究への用途も考えられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウス腫瘍細胞株におけるＭＨＣクラスＩｂ遺伝子群の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた結果のバンドを示す図である。
図２は、正常ＡＫＲ（Ｈ−２ｋ）マウスの各臓器毎のＱ５転写産物（ｍＲＮＡ）を調べた結果のバンドを示す図である。
図３は、正常ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスの各臓器毎のＱ５転写産物（ｍＲＮＡ）を調べた結果のバンドを示す図である。
図４は、正常Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスの各臓器毎のＱ５転写産物（ｍＲＮＡ）を調べた結果のバンドを示す図である。
図５は、ＢＷ５１４７担癌ＡＫＲマウスの各臓器毎のＱ５転写産物（ｍＲＮＡ）を調べた結果のバンドを示す図である。
図６は、ＭＨ１３４担癌Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの各臓器毎のＱ５転写産物（ｍＲＮＡ）を調べた結果のバンドを示す図である。
図７は、健常人末梢血におけるＣＡＲの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果のバンドを示す図である。
図８は、制限酵素地図と、レポーター遺伝子にｌａｃＺを用いたアデノウィルスベクター構成図である。
図９は、制限酵素地図と、レポーター遺伝子にルシフェラーゼを用いたプラスミドＤＮＡ構成図である。
図１０は、ヒト癌細胞株ＨｅＬａにおけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図１１は、ヒト癌細胞株ＤＵ１４５におけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図１２は、ヒト癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図１３は、ヒト癌細胞株ＤＬＤ−１におけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図１４は、ヒト癌細胞株ＨｅＬａにおけるルシフェラーゼの発現を示す相対活性図である。
図１５は、ヒト癌細胞株ＤＵ１４５におけるルシフェラーゼの発現を示す相対活性図である。
図１６は、ヒト癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるルシフェラーゼの発現を示す相対活性図である。
図１７は、正常細胞（ＰＢＭＣ）におけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図１８は、正常細胞（胸腺）におけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図１９は、正常細胞（精巣）におけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図２０は、正常細胞（肝臓）におけるｌａｃＺの発現を示す組織染色図（倍率２００倍）である。
図２１は、ＭＨ１３４肝癌担癌マウスにおけるＡｄ／Ｑ５−Ｈ−２Ｄｄの局所投与によるＭＨ１３４肝癌の増殖抑制効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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