(57)【要約】本発明の課題は、活性の高いβ−ラクタムアシラーゼタンパク質、当該β−ラクタムアシラーゼタンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、および当該β−ラクタムアシラーゼを用いたアモキシシリン等のβ−ラクタム系抗生物質製造方法を提供することである。ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子をクローニングしてＤＮＡ塩基配列及びそれから予想されるアミノ酸配列を決定し、ステノトロフォモナスβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子を取得した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が産生するβ−ラクタムアシラーゼ。
【請求項２】
ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株が産生するβ−ラクタムアシラーゼ。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項８】
配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項９】
ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から単離された請求の範囲第３〜８項のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項１０】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質を生産し、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物。
【請求項１１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から単離された請求の範囲第１１〜１７項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２０】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２４】
請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載の遺伝子に含まれる転写調節配列を含む遺伝子。
【請求項２５】
請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載の遺伝子に含まれる翻訳調節配列を含む遺伝子。
【請求項２６】
転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にある請求の範囲第３〜９のいずれかに記載の遺伝子であって、当該調節配列の一方又は両方がそれぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子。
【請求項２７】
請求の範囲第３、４、５、６、７、８、９又は２６項に記載の遺伝子を１以上含む組換えベクター。
【請求項２８】
請求の範囲第２７項記載の組換えベクターで宿主を形質転換してなる形質転換体。
【請求項２９】
宿主がグラム陰性微生物である請求の範囲第２８項記載の形質転換体。
【請求項３０】
宿主がグラム陽性微生物である請求の範囲第２８項記載の形質転換体。
【請求項３１】
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３６２）である請求の範囲第２８項記載の形質転換体。
【請求項３２】
ｐＵＣＮＴＴｎ５−ＭｕＫＮＫ−Ｌ１／ＨＢ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３６９）である請求の範囲第２８項記載の形質転換体。
【請求項３３】
請求の範囲第２８〜３２項のいずれかに記載の形質転換体を培養し、当該形質転換体が産生したβ−ラクタムアシラーゼを回収することを特徴とする、β−ラクタムアシラーゼの製造方法。
【請求項３４】
請求の範囲第１１〜１８項のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるβ−ラクタムアシラーゼ。
【請求項３５】
請求の範囲第１０項記載の微生物、または請求の範囲第２８〜３２項のいずれかに記載の形質転換体を培養し、その菌体、菌体混合培養液、菌体の破砕物、もしくは、菌体から抽出精製されたβ−ラクタムアシラーゼ、を固定化してなる固定化β−ラクタムアシラーゼ。
【請求項３６】
請求の範囲第２７項記載の組換えベクターを調製し、当該組換えベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でβ−ラクタムアシラーゼを産生する又はその産生を増強する方法。
【請求項３７】
請求の範囲第３４項記載のβ−ラクタムアシラーゼによりβ−ラクタム系抗生物質を製造する方法。
【請求項３８】
β−ラクタム系抗生物質がアモキシシリンである請求の範囲第３７項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼをコードするＤＮＡを有する遺伝子及び基質分解を低減させアシラーゼ活性を増強させた該改変遺伝子、当該遺伝子の塩基配列から予想されるタンパク質、当該遺伝子によりコードされたβ−ラクタムアシラーゼ、当該遺伝子を有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、当該酵素の製造方法および当該酵素を用いたβ−ラクタム系抗生物質の生産方法に関する。
背景技術
アモキシシリン、アンピシリン、セファロスポリンをはじめとする多くのβ−ラクタム系抗生物質は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属およびセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属等の菌類を培養することによって得られる発酵生成物を出発材料として製造されている。
たとえば、ペニシリンＧ（ＰｅｎＧ）、ペニシリンＶ（ＰｅｎＶ）あるいはセファロスポリンＣからアミド結合を開裂（脱アシル化）し、半合成ペニシリン及びセファロスポリンの工業的生産の最も重要な中間体である６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）あるいは７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を生産するために、ペニシリンＧアシラーゼ（ペニシリンＧアミダーゼとも称されるベンジルペニシリンアミドヒドロラーゼ、ＥＣ３．５．１．１１）が産業上使用されている。この酵素は、ＰｅｎＧから通常化学的に製造されるフェニルアセチル−７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸の、７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）への変換にも工業的に使用されている。これらβ−ラクタム母核である６−ＡＰＡ、７−ＡＣＡ、７−ＡＤＣＡと側鎖化合物との化学合成反応により製造された半合成ペニシリン類およびセファロスポリン類は、β−ラクタム系抗生物質の重要な市場を形成している。
従来β−ラクタム母核生産での脱アシル化において有用な酵素は、加水分解酵素として分類され、当該分野においては通常「アシラーゼ」もしくは「アミダーゼ」と呼ばれている。これらアシラーゼ酵素の中でもβ−ラクタム系抗生物質を基質として認識するものは、さらに「β−ラクタムアシラーゼ」として特定されている。このβ−ラクタムアシラーゼの活性には、アシル基が水によって脱離する場合の加水分解（脱アシル）活性と、その可逆反応である活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する転移活性がある。この化学的形態は次の一般式によって表される。すなわち、特定のアシラーゼによって基質として受け入れられる化合物：Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙにおける該化学的形態ＸおよびＹの特性は、該当するアシラーゼの基質特異性によって決定される。Ｘは側鎖を表し、一方Ｙはアシルアクセプタ基を表している。例えば、ＰｅｎＧの場合Ｘ−ＣＯ−はフェニルアセチル側鎖を表し、かつ−ＮＨ−Ｙは６−ＡＰＡを表している。これらβ−ラクタムアシラーゼは、β−ラクタム系抗生物質の生産において、アシル基転移反応工程を化学合成法から酵素法へ転換する可能性があることにより注目されているが、いまだ生産効率が悪い点から実用化には至っていない。
β−ラクタムアシラーゼは、基質特異性や分子的特徴において以下のように分類されている（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１３１，１９９２、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１２９，１９９４）。β−ラクタムアシラーゼは大きく分けて、ペニシリンアシラーゼとセファロスポリンアシラーゼに分類され、さらにペニシリンアシラーゼはペニシリンＧアシラーゼと、ペニシリンＶアシラーゼ、アンピシリンアシラーゼに細分類され、セファロスポリンアシラーゼは、セファロスポリンアシラーゼとグルタリル−７−ＡＣＡ（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼに細分類される。
これまで６−ＡＰＡ生産等で産業上利用されてきたペニシリンＧアシラーゼは小サブユニット（α：１６−２６ｋＤａ）と大サブユニット（α：５４−６６ｋＤａ）からなるヘテロ２量体を形成しており、一方ペニシリンＶアシラーゼは分子量３５ＫＤａのサブユニットの４量体、また、アンピシリンアシラーゼは分子量７２ｋＤａのホモ２量体の形成が知られている。また、基質特異性より、αアミノ酸ヒドロラーゼという名前をもつものもあるが、この場合も化学反応の形態では上記アシラーゼ活性に含まれる。
これらアシラーゼのうちペニシリンＧアシラーゼをコードしている微生物のアシラーゼ遺伝子配列が明らかにされている。即ち、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラ  シトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシア  レテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）（ＤＮＡ  ｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクター  ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２５，２８７，１９９５）等である。また、ヘテロ２量体構造を持つ、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、セファロスポリンアシラーゼはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）等が明らかにされている。
これらは遺伝子ファミリーとしてＤＮＡレベルで明らかにされているため遺伝子クローニングは容易であり、また、微生物ゲノムライブラリーの酵素活性を指標にした方法によってスクリーニングすることによるＤＮＡ取得も容易に可能である。
発明の要約
本発明が解決しようとする課題は、活性の高いβ−ラクタムアシラーゼタンパク質、当該β−ラクタムアシラーゼタンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、および当該β−ラクタムアシラーゼを用いたアモキシシリン等のβ−ラクタム系抗生物質の製造方法を提供することである。従来のペニシリンＧアシラーゼはアモキシシリン等のβ−ラクタム系抗生物質への合成効率が低く、またフェニル酢酸、フェノキシ酢酸やアモキシシリンで合成活性が強く阻害されるため、これら性質が改善された酵素の出現が工業的に有利であるために求められていた。
我々は６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）とＤ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）からアモキシシリンを効率よく生産する酵素を得ることを目的として様々な菌株を土壌よりスクリーニングした結果、グラム陰性細菌であるステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物がβ−ラクタムアシラーゼを生産することを見出した。この菌株からβ−ラクタムアシラーゼを精製し、さらにその遺伝子クローニングを行った。その結果、β−ラクタムアシラーゼ遺伝子をクローニングして配列番号１で示されるＤＮＡ塩基配列を決定した。本発明でいう遺伝子とは、機能を持つ核酸上の配列であり、例えばタンパク質やｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの一次構造を規定している核酸上の領域、またはｍＲＮＡへの転写調節領域、タンパク質への翻訳調節領域などの制御機能を持つ核酸上の領域を含む。該遺伝子のオープンリーディングフレームは１９１１塩基からなり、配列番号２で示される６３６アミノ酸配列からなる分子量約７０ｋＤａのタンパク質をコードしていることが判明した。さらに、該遺伝子を宿主中で発現させ、アシル化活性を有することを確認した。また、該構造遺伝子中、配列番号１で示されるＤＮＡ塩基配列の７３５番目のアデニンをグアニンに置換して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０４番目のメチオニンをバリンに変異させることにより、基質Ｄ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）のエステル分解活性が低減しアシラーゼ活性が増強した改変アシラーゼを創製することに成功し、本発明を完成するに至った。
本発明のβ−ラクタムアシラーゼ生産菌はステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属し、本発明者らが土壌より分離したステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株は本発明に最も有効に使用される菌株の一例である。
即ち、本発明は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が産生するβ−ラクタムアシラーゼ、およびステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株が産生するβ−ラクタムアシラーゼ、及び該酵素の基質Ｄ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）のエステル分解活性を低減させることによりアシラーゼ活性を増強させた改変アシラーゼに関する。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子に関し、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子に関し、さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子に関し、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子に関し、さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子に関する。
さらに、本発明は、配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む遺伝子に関する。また、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から単離された上記遺伝子に関する。
また、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質を生産し、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物に関する。
また、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、および、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から単離された上記ポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質に関し、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるアミノ酸配列からなるタンパク質に関し、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質に関し、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質に関する。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質に関する。
また、本発明は、上記遺伝子に含まれる転写調節配列を含む遺伝子；上記遺伝子に含まれる翻訳調節配列を含む遺伝子；転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にある上記遺伝子であって、当該調節配列の一方または両方がそれぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子に関する。
さらに、本発明は、上記遺伝子を１以上含む組換えベクター、上記組換えベクターで宿主を形質転換してなる形質転換体、宿主がグラム陰性微生物である上記形質転換体、宿主がグラム陽性微生物である上記形質転換体、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３６２）である上記形質転換体、及びｐＵＣＮＴ−Ｔｎ５−ＭｕＫＮＫ−Ｌ１／ＨＢ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３６９）である上記形質転換体に関する。
また、本発明は、上記形質転換体を培養し、当該形質転換体が産生したβ−ラクタムアシラーゼを回収することからなるβ−ラクタムアシラーゼの製造法に関し、上記ポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるβ−ラクタムアシラーゼにも関し、さらに、上記微生物または上記形質転換体を培養し、その菌体、菌体混合培養液、菌体の破砕物、もしくは、菌体から抽出精製されたβ−ラクタムアシラーゼ、を固定化してなる固定化β−ラクタムアシラーゼに関する。
さらに、上記組換えベクターを調製し、当該ベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でβ−ラクタムアシラーゼを産生するまたはその産生を増強する方法に関する。
また、本発明は、当該酵素を用いた、アモキシシリン等のβ−ラクタム系抗生物質の製造方法に関する。
また、上記ポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるβ−ラクタムアシラーゼにより、アモキシシリン等のβ−ラクタム系抗生物質を製造する方法に関する。
本発明のステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼ酵素は、報告されているエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラ  シトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシア  レテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＤＮＡ  ｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクター  ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ペニシリンアシラーゼ（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２５，２８７，１９９５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｃ４２７  ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＧＫ１６  セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ８３  セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）の遺伝子配列と特徴的な相同性を示さない。また、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼに関するＤＮＡ配列ならびにアミノ酸配列に関する報告はない。
酵素遺伝子を取得する過程で、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株ゲノムライブラリーから通常のアシラーゼ酵素活性測定スクリーニングも試みたが、活性を示す陽性クローンを得ることはできなかった。これは、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）β−ラクタムアシラーゼ自身のプロモーターが宿主大腸菌内でＲＮＡ転写活性を持たないあるいは弱いので、宿主大腸菌内で酵素が発現しない又は発現が非常に弱いと推測された。
発明の詳細な開示
以下、本発明を詳細に説明する。
ここで述べる遺伝子とは、アミノ酸をコードする領域と、５’上流および３’下流でＲＮＡに転写される領域、さらにこの領域外の部分でも転写および翻訳の実行や効率に関わる調節領域を含む領域のことを示す。ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）由来の本発明の遺伝子をステノトロフォモナスマルトフィリア−β−ラクタムアシラーゼ（ｓｍａｃｙ）、ｓｍａｃｙ遺伝子の発現ポリペプチドをＳＭＡＣＹと略する。
本発明の一つの形態によると、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が産生するβ−ラクタムアシラーゼが提供される。ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物としては、β−ラクタムアシラーゼを産生する能力がある限り特に限定されないが、例えば、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ステノトロフォモナス  アシダミニフィラ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄａｍｉｎｉｐｈｉｌａ）、ステノトロフォモナス  アフリカナ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ａｆｒｉｃａｎａ）、ステノトロフォモナス  ニトリトイレダカアンス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｎｉｔｒｉｔｉｒｅｄｕｃａｎｓ）等が挙げられる。
好ましくはステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株が産生するβ−ラクタムアシラーゼが提供される。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質もしくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質もしくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質もしくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有する遺伝子が提供される。本発明のＤＮＡであって配列番号１と完全同一の塩基配列を有しないものを、以下では「ＤＮＡ変異体」とも称する。
当該遺伝子は、好ましくはステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から単離されたものである。より好ましくはステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）から単離されたものである。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、活性が性質的に同質なタンパク質を構成しており、配列番号２で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が全体で約８０％以上、好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。
また、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。
つまり、本発明において、ＤＮＡ変異体は、当該分野において既知の方法によって、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡから調製することができる。このような操作としては、例えば、部位特異的突然変異誘発、点変異、欠失、重複、逆位、転座、遺伝コードの縮重等により、アミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを変更する保存的変更が挙げられる。
上記ＤＮＡ変異体としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたタンパク質をコードするＤＮＡが好ましく、なかでも、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるタンパク質をコードするＤＮＡがより好ましい。配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンをバリンに置換するには、例えば、配列番号１で示されるＤＮＡ塩基配列の７３５番目のアデニンがグアニンに置換されたＤＮＡを用いる。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有する遺伝子が提供される。
ここで、「翻訳後修飾」とは、ｍＲＮＡからタンパク質へ翻訳後の部分的なアミノ酸配列の除去や修飾であり、たとえば、微生物のペリプラズム領域へタンパク質が移行する際に必要であるシグナル配列（タンパク質Ｎ末端部分の約２０アミノ酸であり疎水性アミノ酸を特徴とする）が酵素的に除去されたものである。
β−ラクタムアシラーゼ活性とは、アシル基が水によって脱離する場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。なお、加水分解活性の場合は、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンの加水分解を触媒する酵素量とし、また、転移活性の場合は、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンを合成する酵素量とし、ＨＰＬＣ等を用いて定量を行うことができる。
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む遺伝子であってもよい。つまり、配列番号１で示される塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するものである。
また、本発明は、以下のポリヌクレオチドを提供するものである。配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、および、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｂｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から単離された上記ポリヌクレオチド。
さらに、本発明のタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよいし、また、配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質であってもよいし、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、翻訳後修飾され、かつβ−ラクタムアシラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。本発明のタンパク質であって配列番号２と完全同一のアミノ酸配列を有しないものを、以下では「変異タンパク質」とも称する。
この際、変異タンパク質としては、上述のようなＤＮＡ変異体によってコードされるタンパク質、さらには、基本的なβ−ラクタムアシラーゼ活性は変化させずにアミノ酸配列が保存的あるいは半保存的に変更（例えば、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族鎖を有するアミノ酸同士の置換や、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の芳香族鎖を有するアミノ酸同士の置換）されたタンパク質等が挙げられる。
上記変異タンパク質として、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンが置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、なかでも、配列番号２で示されるアミノ酸配列において２０４番目のメチオニンがバリンであるアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましい。このような変異β−ラクタムアシラーゼは、基質Ｄ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）のエステル分解活性が低減されアシラーゼ活性が増強される。
また、本発明は、上述の本発明の遺伝子に含まれる転写調節配列を含む遺伝子、及び、翻訳調節配列を含む遺伝子を提供する。当該転写調節配列としては、配列番号１の１２５番目から１００塩基上流部分を含む配列である。当該翻訳調節配列としては、配列番号１の１２５番目から５０塩基上流部分を含む配列である。
さらに、本発明は、転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にあり、当該調節配列の一方または両方が、それぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子を提供する。
ここで、同じ又は異なる生物から得られた他の転写調節配列及び翻訳調節配列としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されることはなく、当該分野において既知のものが使用される。具体的には、大腸菌や放線菌由来の一般的な調節配列等が挙げられる。
本発明の別の形態によると、上述の本発明の遺伝子を１以上含む組換えベクターが提供される。また、当該組換えベクターを含む形質転換体も提供される。
この組換えベクターは、本発明の遺伝子を、適当な制限酵素で切断された組換え用ベクター中に連結されることによって調製される。
本発明の組換えベクター作製に用いられる組換え用ベクターとしては、従来公知のものを使用することができ、例えば、転写効率を上げるために例えばｌａｃオペロン、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどを挿入遺伝子の上流に付与し、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などを持つベクター等が挙げられる。
組換えベクターの調製法としては、当業者に周知の方法を採用することができ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載の方法を適用することができる。
また、形質転換体の作製に用いられる宿主としては、特に制限されないが、例えば、グラム陰性微生物、グラム陽性微生物等が挙げられる。グラム陰性微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ）属等が挙げられ、グラム陽性微生物としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）属が挙げられる。
形質転換体の調製法としては、当業者に周知の方法を採用することができ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載の方法を適用することができる。
このようにして得られた形質転換体としては、具体的にはｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１（受託番号；ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３６２、寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）、原寄託日；平成１４年１０月３０日）、及びｐＵＣＮＴ−Ｔｎ５−ＭｕＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１（受託番号；ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３６９、寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）、原寄託日；平成１５年４月２３日）を挙げることができる。
さらに本発明は、上述した制御配列に関して操作された、β−ラクタムアシラーゼ遺伝子を含む組換えベクター、および当該組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明の別の形態によると、上記形質転換体を培養し、当該形質転換体が産生したβ−ラクタムアシラーゼを回収することからなるβ−ラクタムアシラーゼの製造法、つまり、β−ラクタムアシラーゼをコードされた形質転換体、またはβ−ラクタムアシラーゼをコードされた組換えベクターを含む形質転換体を培養し、単離形態のβ−ラクタムアシラーゼを回収することからなるβ−ラクタムアシラーゼの製造方法を提供する。
また、上記微生物または上記形質転換体を培養し、その菌体、菌体混合培養液、菌体の破砕物、もしくは、菌体から抽出精製されたβ−ラクタムアシラーゼ、を固定化してなる固定化β−ラクタムアシラーゼを提供する。
さらに、上記組換えベクターを調製し、当該組換えベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でβ−ラクタムアシラーゼを産生する又はその産生を増強する方法を提供する。
形質転換体は通常の栄養培地で培養することにより導入した組換えＤＮＡの形質を発現させることができる。組換えＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由来の性質が付与されている場合は、その性質に合わせて培地に薬剤（例えばカナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等）を補ってもかまわない。
このようにして得られた形質転換体を酵素源として得るには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが、必要に応じてＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の添加などの酵素誘導のための処理を行うこともできる。
形質転換体の培養のために用いられる培地としては、通常、炭素源（例えば、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類等）、窒素源（例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩等）および無機イオン（例えば、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン等）を含有する普通の培地が挙げられる。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。
さらに本発明の別の形態によると、前記β−ラクタムアシラーゼ酵素を作用させる様態としては、当該形質転換体の培養液、菌体、菌体処理物、固定化菌体、菌体から抽出した酵素、固定化酵素などを挙げることができる。これらは、大規模なアシル化またはアシル基転換化工程で使用することができる。
菌体処理物としては、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥体、アセトン乾燥体、リゾチームで処理した菌体、超音波破砕した菌体が挙げられる。
当該酵素含有液からは、公知のタンパク質あるいは酵素等の単離または精製方法により、さらに精製を行うことができる。例えば、硫安、食塩、硫酸ナトリウム等を添加する塩析沈殿法やアセトン等を添加する有機溶媒沈殿等の手段により沈殿物として本酵素を回収することができる。また、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の手段を組み合わせることにより精製することができる。
このようにして得られた当該β−ラクタムアシラーゼはフェニル酢酸、フェノキシ酢酸、アモキシシリンによる酵素阻害をほとんど示さないという特徴的な性質を持つ。
さらに、これら菌体、菌体処理物、無細胞酵素抽出物、精製酵素は、公知の手段で固定化することができる。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行うことができる。なお、固定化法については、例えばＷＯ９６／２０２７５に示される方法が参考になる。
固定化に使用される支持体としては、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ５６８またはＤＳ１７１８６（ローム・アンド・ハース社：登録商標）などのフェノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９３５、ＩＲＡ９４５、ＩＲＡ９０１（ローム・アンド・ハース社：登録商標）、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＯＣ１０３７（バイエル社：登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＥＸ−０５（三菱化学：登録商標）などのポリスチレン樹脂のような各種アミンやアンモニウム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種陰イオン交換樹脂が適している。その他、ＤＥＡＥ−セルロースなどの支持体も使用することができる。
さらに、酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、通常、架橋剤を用いるが、好適な例として、グルタルアルデヒドを挙げることができる。使用する酵素は、精製酵素だけでなく、菌体、菌体処理物、無細胞酵素抽出物など種々の精製度のものが使用できる。固定化菌体あるいは固定化酵素の調製は、菌体液あるいは酵素液を支持体を加えて攪拌して吸着させた後、架橋処理をする等の通常の調製法が使用できる。
β−ラクタム系抗生物質は、β−ラクタム母核基質と側鎖基質を水や緩衝液などの媒質中で当該酵素と接触させる方法により合成することができる。この際用いる側鎖基質としては、エステル化合物およびその塩酸塩やアミド体を用いることができる。β−ラクタム系抗生物質がアモキシシリンである場合には、β−ラクタム母核基質が６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）であり、側鎖基質がＤ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）等である。
すなわち、当該反応は、通常、菌体、菌体処理物、無細胞酵素抽出物、精製酵素またはそれらの固定化物を、基質を含む媒質中に溶解あるいは懸濁させ、または通過させることにより行うことができる。この反応は、例えば２０〜４０℃で３０分から８時間程度反応させることによって行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。つまり、本発明の遺伝子、タンパク質、組換えベクター、形質転換体、β−ラクタム系抗生物質の生産等の実施態様を以下に説明するが、本発明は下記実施態様に制限されるものではない。
材料及び方法
β−ラクタムアシラーゼ遺伝子のクローニング
全体的な遺伝子操作およびクローニング法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているように行った。ＤＮＡ操作に使用した酵素、プラスミド及びイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニング宿主は、市場の供給者から購入しその説明に従い使用した。
培地
Ｂ培地
ペプトン  ５ｇ／ｌ、イーストエクストラクト  ５ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２ｇ／ｌ、シュークロース  ２０ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １ｇ／ｌ、グルタミン酸ナトリウム  ２ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、ｐＨ７．２
ＬＢ培地
バクトトリプトン  １０ｇ／ｌ、イーストエクストラクト  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０
ＣＭ培地
肉エキス  １０ｇ／ｌ、イーストエクストラクト  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ３ｇ／ｌ、ｐＨ７．０
緩衝液
１×ＳＳＣ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ
３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）３０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整
５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ５．０）５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ＫＯＨでｐＨ５．０に調整
菌株
ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株を、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の供与株として使用した。
エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を組換えプラスミドの宿主として使用した。
シュードモナス  リボフラビナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）をバイオアッセイ菌として使用した。
β−ラクタムアシラーゼ活性
β−ラクタムアシラーゼの活性とは、アシル基が水によって脱離する場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。
加水分解活性の場合、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンの加水分解を触媒する酵素量とする。
転移活性の場合、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンを合成する酵素量とする。
反応条件は以下に示し、定量はＨＰＬＣにより行った。
アモキシシリンの分解反応
アモキシシリンを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かした液２００μｌに、（試験例１）の酵素液１０μｌを加え、３０℃で振とうしながら１時間反応させ、１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。
アモキシシリン合成反応
６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かして基質液とした。菌体あるいは粗酵素液を基質液に懸濁し、３０℃で４時間振とうしながら反応させた。１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。
Ｄ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）加水分解反応
ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ８．０）に０．５％になるように溶かして基質液とした。菌体あるいは粗酵素液を基質液に懸濁し、３０℃で４時間振とうしながら反応させた。１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いた検出
菌体反応、粗酵素反応における、アモキシシリンの検出を薄層クロマトグラフィーで行った。反応液を遠心して上清を回収してシリカゲル薄層プレートに微量スポットし、酢酸エチル：酢酸：水＝６０：２０：２０の展開溶媒にて展開させ、溶媒除去後ニンヒドリン反応にてアモキシシリンを検出した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた検出
反応液を遠心して上清を回収し、移動相で１０倍希釈してＨＰＬＣで測定した。分析条件は、カラムはコスモシル５Ｃ１８  ＡＲ（ナカライテスク社）を用い、移動相は１％アセトニトリル／５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３５°Ｃ、測定波長２２５ｎｍで行った。ピークは標準品を用いて同定し、アモキシシリンの標準品として、アモキシシリン三水和物（和光純薬）を用いた。保持時間は、ＨＰＧ  １．８ｍｉｎ、６−ＡＰＡ  ５．９ｍｉｎ、アモキシシリン  ７．５ｍｉｎ、ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ  ９．４ｍｉｎであった。
（実施例１）ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株のβ−ラクタムアシラーゼの精製
ＫＮＫ１２Ａ株をＢ培地を用いて３０℃で増殖させた。以下の操作は、４℃で行った。細胞を遠心分離により回収し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、ＥＤＴＡ・２Ｎａを４．７ｇ／ｌ、リゾチームを０．１３ｇ／ｌになるよう添加し、一晩撹拌した。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを３．１３ｇ／ｌ、ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉを０．０６ｍｇ／ｌになるように添加して一晩反応させ、菌体を超音波破砕し、上清を遠心分離で回収した。Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・Ｈ２Ｏを２２．９ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を２２．９ｇ／ｌになるよう添加し、上清を遠心分離で回収した。透析後、陽イオン交換ゲルクロマトグラフ（ＣＭセファロースＣＬ−６Ｂ）を３回、ゲル濾過クロマトグラフ（セファクリル−３００）を１回用いて精製を行った（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４（５），１０６９，１９８０）。カラムから溶出された画分はＴＬＣによりアモキシシリン合成活性を確認し、次の精製段階へ進めた。得られたＳＭＡＣＹタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約７０ｋＤａの分子量を示した。
（実施例２）ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株のβ−ラクタムアシラーゼのアミノ酸配列の決定
上記（実施例１）の精製法で得られたＳＭＡＣＹタンパク質を、リジルエンドペプチダーゼにより限定分解し、ペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。ＳＭＡＣＹタンパク質をバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４Ｍ  Ｕｒｅａ）に懸濁してリジルエンドペプチダーゼをＳＭＡＣＹタンパク質の１／５０量になるよう添加し、３７℃で６時間反応させた。逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ワイエムシィ社））にてペプチドを分取し、Ｍｏｄｅｌ  ４９Ｘプロテインシークエンサー（アプライド・バイオシステム社）で解析を行った。得られたアミノ酸配列を、配列番号３に示した。
（実施例３）ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子のクローニング
ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株のゲノムＤＮＡを単離してＮｃｏＩで消化した６−８ｋｂｐのフラクションを、ＮｃｏＩおよびアルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）処理したｐＳＬ３０１プラスミド（インビトロジェン社）にクローニングしたものを、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株に形質転換し、Ｌ−Ａｍｐプレート（ＬＢ培地にバクトアガー  １５ｇ／ｌ、アンピシリン  ５０ｍｇ／ｌになるよう添加したもの）にまき、３７℃で一晩培養した。このプレートのコロニーをナイロンメンブレンにレプリカし、コロニーが適当な大きさになるまで培養した後、菌体を溶菌してフィルターを作成した。配列番号３に含まれるアミノ酸配列で、配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４に示されるＫ１オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ３’−ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）でＫ１オリゴヌクレオチドの３’末端を蛍光ラベルし、５０℃のハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、２０倍希釈ｌｉｑｕｉｄ  ｂｌｏｃｋ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）、０．５％ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）中で一晩ハイブリダイズさせた。室温の５×ＳＳＣ溶液（０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、次いで４２℃の１×ＳＳＣ溶液（０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）中でメンブレンを洗浄し、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）で検出を行い、陽性クローンを得た。このクローンより得られたプラスミドをｐＳＬＫＮＫ２７とした。このｐＳＬＫＮＫ２７には約６．３ｋｂｐのゲノム断片が挿入されていた。
（実施例４）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の配列決定
上記で得られた陽性クローンの配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステム社）を用いたデオキシ配列決定によりシークエンシング反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステム社）で解析を行った。得られたβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子配列を配列番号１に、予測されたアミノ酸配列を配列番号２に示した。
（実施例５）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
ｐＵＣ１９プラスミドのｌａｃ  Ｚ遺伝子の開始コドン部位にＮｄｅ  Ｉサイトを作製するプライマーを作製してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｐＵＣ１９プラスミドにＮｄｅ  Ｉサイトを１カ所加えたｐＵＣＮｄｅプラスミドを作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）プラスミドも同様にＰＣＲを行い、Ｎｃｏ  ＩサイトをＮｄｅ  Ｉサイトに変えたｐＴｒｃＮｄｅプラスミドを作製した。ｐＵＣＮｄｅプラスミドをＮｄｅ  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉで切断した２．０ｋｂｐ断片と、ｐＴｒｃＮｄｅプラスミドをＮｄｅ  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉで切断した０．６ｋｂｐ断片をライゲーションして、ｐＵＣＮＴプラスミドを作製した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７，１４９，１９９９、ＷＯ９４／０３６１３）。
ｐＵＣＮＴプラスミドをＣｒｆ１０  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉで切断した１．８ｋｂｐの断片と、ｐＫＣ７プラスミド（Ｇｅｎｅ，７，７９，１９７９）をテンプレートとしてカナマイシン耐性遺伝子をＣｒｆ１０  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉサイトを持つようにＰＣＲで１．２ｋｂｐの断片を作製し、ライゲーションしてｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５（ｋａｍｒ）プラスミドを作製した。
次に、ｐＳＬＫＮＫ２７をテンプレートとし、Ｋ−Ｎｄｅ  Ｉ−４プライマー（配列番号６：ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＧＴＧＣＣＧＴＡＧＣ）とＫ−ＢａｍＨ  Ｉ−１プライマー（配列番号７：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣ）を用いてＰＣＲを行ってβ−ラクタムアシラーゼ構造遺伝子断片を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５（ｋａｍｒ）プラスミドベクターのＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトにクローニングし、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌとした。この発現ベクターの構築図を図１に示した。
（実施例６）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の発現
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−ＬプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１に形質転換した株（ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１）をＬＢ培地にカナマイシンを５０ｍｇ／ｌになるよう添加したものにまき、３０℃で一晩培養した。菌体を遠心分離で回収し、３０ｍＭ  ＫＰＢに懸濁した後、超音波破砕して上清を遠心分離で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、約７０ｋＤａのバンドが確認され、β−ラクタムアシラーゼが発現されていることが確認された。
（実施例７）β−ラクタムアシラーゼ活性の確認
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１株を（実施例６）と同様に一晩培養後、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加してさらに３時間培養した。菌体をＬｙｓｏｚｙｍｅ  ０．４４ｍｇ／ｍｌで１５分間氷上で処理し、超音波破砕、遠心した上清を粗酵素液とした。粗酵素液の総タンパク質量はブラッドフォード法にて定量した。基質（０．５％ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ，０．５％６−ＡＰＡ）２００μｌに２５μｇのタンパク質を添加し、３０℃で１時間振とうしながら反応させ、１０倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析し、アモキシシリンのピークを検出した。これにより、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５プラスミドにクローニングされたステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株β−ラクタムアシラーゼ遺伝子がエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株で発現され、活性を持つことが確認された。
（実施例８）β−ラクタムアシラーゼの精製
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１株を（実施例１）のように培養し、細胞破砕した後、上清を遠心分離で回収した。この上清を０．４５μｍフィルターで濾過し、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓシステム（アマシャムファルマシア  バイオテック社）を用い、陽イオン交換ゲルクロマトグラフを行った。カラムから溶出された画分はＴＬＣによりアモキシシリン合成活性を確認した。アモキシシリン合成活性を示した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、β−ラクタムアシラーゼがフラクションの総タンパク質の１０％以上を占めるまで精製が進んでいることが確認できたので、このフラクションを用いて以下の諸性質を調べた。
（試験例１）アモキシシリン合成活性の比較
ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株由来β−ラクタムアシラーゼと既知のエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅ（ｓｉｇｍａ社）のアモキシシリン合成活性を比較した。酵素液として、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株由来β−ラクタムアシラーゼは（実施例８）で得られたフラクション（酵素濃度  約３．２ｎｇ／１０μｌ）、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅは１００倍希釈液（１０．２  ｍｕｎｉｔ／１０μｌ、酵素濃度  約３．５ｎｇ／１０μｌ）を用いた。
６−ＡＰＡ及びＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かした基質液２００μｌに、酵素液１０μｌを加え、３０℃で振とうしながら反応させた。反応開始から０、５、１０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０分間後に１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。生成したアモキシシリンの検出はＨＰＬＣを用いて行った。その結果を図３に示す。
この結果から、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株由来β−ラクタムアシラーゼは、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅと比較して、非常に高い変換率でアモキシシリンを合成することがわかった。
（試験例２）フェニル酢酸（ＰＡＡ）とフェノキシ酢酸（ＰＸＡ）による合成活性阻害の比較
６−ＡＰＡ及びＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かした基質液２００μｌに、（試験例１）の酵素液１０μｌを加えた。ＰＡＡは０．３％、ＰＸＡは０．３５％になるように加え、３０℃で振とうしながら１時間反応させ、１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。生成したアモキシシリンの検出はＨＰＬＣを用いて行った。それぞれの酵素において、基質のみで反応させた時のアモキシシリン合成量を１００％とする、相対活性を表した結果を表１に示す。
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この結果から、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅはフェニル酢酸又はフェノキシ酢酸によってアモキシシリンの合成が阻害されるが、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株由来β−ラクタムアシラーゼは、まったく阻害されないか、又は、阻害されたとしてもわずかであることがわかった。
（試験例３）アモキシシリンの分解活性
アモキシシリンを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かした液２００μｌに、（試験例１）の酵素液１０μｌを加え、３０℃で振とうしながら１時間反応させ、１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。残存したアモキシシリンの検出はＨＰＬＣを用いて行った。その結果を図４に示す。
この結果から、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅがアモキシシリンを非常に素早く分解するのに対して、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株由来β−ラクタムアシラーゼはアモキシシリンの分解速度が遅いことがわかった。
（試験例４）ＨＰＧＯＭｅの分解活性の比較
ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かした液２００μｌに、（試験例１）の酵素液１０μｌを加え、３０℃で振とうしながら１時間反応させ、１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。残存したＨＰＧＯＭｅの検出はＨＰＬＣを用いて行った。その結果を図５に示す。
この結果から、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＫＮＫ１２Ａ株由来β−ラクタムアシラーゼは、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅに対して、ＨＰＧＯＭｅの分解速度が速いことがわかった。
（実施例９）β−ラクタムアシラーゼの樹脂への固定化
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１株を（実施例７）と同様に培養後、菌体破砕処理を行い粗酵素液を調製した。これに、０．１Ｍ  ＫＰＢ  （ｐＨ７．０）で平衡化したＤｕｏｌｉｔｅＡ−５６８（ローム・アンド・ハース社）を、総タンパク質４０ｍｇに対して樹脂１ｇになるように添加し、窒素シール下、４℃で２０時間攪拌し、吸着させた。この吸着樹脂を０．１Ｍ  ＫＰＢ  （ｐＨ７．０）および１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で洗浄後、０．２％  グルタルアルデヒド、０．１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で４℃、１０分間反応させてタンパク質を架橋し、固定化樹脂を作製した。この樹脂を基質（０．５％  ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ  ０．５％  ６−ＡＰＡ）  ２００μｌに対し１ｍｇ添加し、３０℃で４時間振とうしながら反応させ、１０倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析し、アモキシシリンのピークを検出した。
（実施例１０）ランダム変異導入アシラーゼ酵素組換体ライブラリーの作製
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌプラスミドをテンプレートとし、ＭＴ−１９７プライマー（配列番号８：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡ）とＭＴ−１９８プライマー（配列番号９：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣＧＡ）とを使用してＰＣＲを行った。反応にはＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を使用した。０．２ｍｌのマイクロチューブに１ｎｇのテンプレートとそれぞれ１０ｐｍｏｌｅのプライマーを加え、キットに付属のバッファーを５μｌ、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを１μｌ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加した。また、８ｍＭ  ＭｎＳＯ４溶液を０から４μｌまで、２ｍＭ  ｄＧＴＰ溶液を１から５μｌまで添加量を変えることでランダム変異個数を長さ１ｋｂｐあたり２．０から８．１個となるよう調整した。滅菌水を加えて反応液量を５０μｌに合わせた後に、９４℃３０秒・６８℃２分の反応を２５サイクル行ってＤＮＡの増幅と変異導入を行った。
ランダム変異導入したＤＮＡをテンプレートとし、ａｔｔＢ１プライマー（配列番号１０：ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ）とａｔｔＢ２プライマー（配列番号１１：ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ）とを使用して定法に従いＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片１３０ｎｇと、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）に付属のｐＤＯＮＲ（インビトロジェン社）を３００ｎｇ、バッファーを４μｌ、ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ４μｌを混合して、滅菌水で反応液量を２０μｌに合わせてから２５℃で１時間の反応の後に、２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加して３７℃で１０分の反応を行った。
（実施例１１）ランダム変異株のスクリーニング
ランダム変異導入ＤＮＡライブラリーでＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換して、カナマイシンを２５ｍｇ／Ｌになるように添加したＬＢ寒天平板培地にコロニーが１枚あたり１００個程度になるようにまき、３７℃で一晩静置培養した。生じたコロニーをベルベットでカナマイシン含有ＣＭ寒天平板培地２枚にレプリカし、再び３７℃で一晩静置培養した。レプリカしたプレートの１枚に、４２℃に保温しておいた７ｍｌのＣＭ軟寒天培地に０．０２％のＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌと０．０１％の６−ＡＰＡ、０．３％のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ  ＣＭ培地終夜培養液を混合して重層し、固化した後に２８℃で一晩静置培養を行った。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａの生育阻止円が現れたコロニーをアモキシシリンが生成されたポジティブ株とした。
ポジティブ株をレプリカプレートから１０ｍｌのＣＭ培地に植菌して、３７℃で一晩しんとう培養した。２ｍｌの培養液から菌体を遠心分離で回収し、ｐＨ６．０の３０ｍＭ  ＫＰＢに懸濁した後に１ｍｌの基質（３０ｍＭ  ＫＰＢに０．５％  ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ、０．５％  ６−ＡＰＡを溶解させてｐＨ６．０に調整）に混合して３０℃で１時間反応させた。５０μｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えて反応を停止した後、遠心した上清を３０ｍＭ  ＫＰＢで２５倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析した。数万個の変異株の中から、生成アモキシシリン／副生成ＨＰＧの比率がコントロールの組み換えβ−ラクタムアシラーゼ生産株  ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１株と比べて約２倍に向上した変異株０９０２−２−１株を取得した。得られた変異株の保持するプラスミドを通常のアルカリ法で調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステムズ社）を用いてシークエンシング反応を行い、その配列をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社）で解析を行った。得られた塩基配列情報より、配列番号１で示されるβ−ラクタムアシラーゼ構造遺伝子中７３５番目アデニンのグアニンへの変異が明らかになり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０４番目のメチオニンがバリンに変異していることが明らかになった。
（実施例１２）変異型アシラーゼ発現ベクターの作製
変異株０９０２−２−１株の保持するプラスミドをテンプレートにし、ＭＴ−２１６プライマー（配列番号１２：ＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＧＡＴＴＣＧＣＣＧＣＧＣＡＴＧＣＧＣＧＡＣＣ）とＭＴ−２１９プライマー（配列番号１３：ＧＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＴＧＧ）とを使用してＰＣＲを行った。得られた約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩとで完全消化した。
一方、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌプラスミドをテンプレートにし、ＭＴ−２１７プライマー（配列番号１４：ＴＣＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＧＴＡＧＧＧＣ）とＭＴ−２１８プライマー（配列番号１５：ＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣ）とを使用してＰＣＲを行った。得られた約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで完全消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで部分消化した。
両者を混合してライゲーション反応を行い、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーからアルカリ法でプラスミドを調製し、１アミノ酸置換変異アシラーゼ遺伝子をコードする変異プラスミドｐＵＣＮＴ−Ｔｎ５−ＭｕＫＮＫ−Ｌ１を作製した。この発現ベクターを図２に示した。
（実施例１３）  変異型アシラーゼの能力比較試験
β−ラクタムアシラーゼ生産株  ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＫＮＫ−Ｌ／ＨＢ１０１株と１アミノ酸置換変異β−ラクタムアシラーゼ生産株  ｐＵＣＮＴ−Ｔｎ５−ＭｕＫＮＫ−Ｌ１／ＨＢ１０１株を１０ｍｌのＣＭ培地に植菌して、３７℃で一晩振盪培養した。２ｍｌの培養液から菌体を遠心分離で回収し、ｐＨ６．０の３０ｍＭ  ＫＰＢに懸濁した後に１ｍｌの基質（３０ｍＭ  ＫＰＢに０．５％  ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ、０．５％  ６−ＡＰＡを溶解させてｐＨ６．０に調整）に混合して３０℃で反応させた。反応開始から１０、２０、３０、６０、９０、１８０分後に１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止した後、遠心した上清を３０ｍＭ  ＫＰＢで２５倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析した。そのアモキシリン変換効率比較を図６に、Ｄ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）のエステル分解度比較を図７に示す。
産業上の利用可能性
ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼ遺伝子或いは基質分解活性を低減させアシラーゼ活性を増強させた該改変遺伝子を発現ベクターに結合して宿主中で発現させることにより、効率よくβ−ラクタムアシラーゼ或いは改変β−ラクタムアシラーゼを調製することができる。このβ−ラクタムアシラーゼ或いは改変β−ラクタムアシラーゼを利用して、大量の脱アシル化／アシル基転換化の工程に使用することができ、たとえば、アモキシシリンの酵素的生産法に利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例５で行った本発明の１態様であるβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子の発現ベクターの構築図である。
図２は、実施例１２で構築した本発明の変異β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の発現ベクター図である。
図３は、試験例１で行ったアモキシシリンの合成活性の比較結果を示すグラフである。
図４は、試験例３で行ったアモキシシリンの分解活性の比較結果を示すグラフである。
図５は、試験例１で行ったＤ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）の分解活性の比較結果を示すグラフである。
図６は、実施例１３で行った変異β−ラクタムアシラーゼのアモキシシリンの合成活性の比較結果を示すグラフである。
図７は、実施例１３で行ったＤ−ｐ−ハイドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）のエステル分解活性の比較結果を示すグラフである。
なお、図３、図４、図５、図６および図７のグラフ中において、ＫＮＫ１２Ａはステノトロフォモナス  マルトフィリアＫＮＫ１２Ａ株由来β−ラクタムアシラーゼを表し、ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅはエシェリヒア  コリ由来  ＰｅｎＧ  ａｍｉｄａｓｅを表し、変異型はｐＵＣＮＴ−Ｔｎ５−ＭｕＫＮＫ−Ｌ１／ＨＢ１０１株産生１アミノ酸置換変異β−ラクタムアシラーゼを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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