(57)【要約】本発明は、天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチド及び該ポリペプチドを主成分とする抗菌剤を提供する。該ポリペプチドは、ペプチド鎖中に１種類又は２種類以上の核移行性配列（ＮＬＳ）及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含む。また、該１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に包含されるアミノ酸残基の総数は、少なくとも５つであってペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、
そのペプチド鎖中に１種類又は２種類以上の核移行性配列（ＮＬＳ）及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含んでおり、
該１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数は、少なくとも５であり且つペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上である、抗菌性ポリペプチド。
【請求項２】
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の４０％以上が塩基性アミノ酸残基である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列が２単位以上相互に近接して配置されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の９０％以上である、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
ペプチド鎖中に、少なくとも１単位の核外移行性配列（ＮＥＳ）若しくは該ＮＥＳに部分的な改変が施された配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＮＥＳ又はＮＥＳの改変配列の少なくとも１単位は、前記ＮＬＳ又はＮＬＳの改変配列のＮ末端側又はＣ末端側に近接して配置されている、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、
配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含み、
該少なくとも１種類のアミノ酸配列又は改変アミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上である、抗菌性ポリペプチド。
【請求項９】
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下である、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、
配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列から実質的に構成される、抗菌性ポリペプチド。
【請求項１１】
ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基がアミド化されている、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを含む、抗菌剤。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
以下の（ａ）及び（ｂ）の要件を備えた抗菌性ポリペプチド：
（ａ）ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が５以上１００以下である；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含む；
をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列から実質的に構成される抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１７】
配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示されるアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１８】
抗菌性ポリペプチドを製造する方法であって、
核移行性配列（ＮＬＳ）として知られている５アミノ酸残基以上から成るアミノ酸配列を少なくとも１種類選択すること、
該選択したＮＬＳ及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含み、該１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸酸基の総数が全アミノ酸残基数の３０％以上となるようなペプチド鎖を設計すること、
該設計したペプチド鎖を有する抗菌性ポリペプチドを合成すること、
を包含する方法。
【請求項１９】
前記ＮＬＳの部分的な改変は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）ネイティブなＮＬＳの非塩基性アミノ酸残基を少なくとも一つ欠失させること；
（ｂ）ネイティブなＮＬＳに少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基を付加させること；および
（ｃ）ネイティブなＮＬＳに含まれる少なくとも一つの非塩基性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に置換すること；
のうちの少なくとも一つの処置を包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列を使用して前記ペプチド鎖の設計を行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下となるように該ペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
全アミノ酸残基数の４０％以上がアルギニン及び／又はリジンで構成されるようなペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列が２単位以上相互に近接して配置されるペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の９０％以上となるように、該ペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
化学合成法によって前記ペプチド鎖を有する抗菌性ポリペプチドを製造する、請求項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、天然には存在しない形態の独立したペプチド鎖から成る抗菌性ポリペプチド及び該ポリペプチドを主成分とする抗菌剤（薬学上の組成物）に関する。
背景技術
抗菌性ポリペプチドは幅広い抗菌スペクトルを有し、薬剤耐性菌が出現し難いと考えられていることから、ヒト及び動物の細菌感染性疾患の予防や治療、或いは、食材等の物品に抗菌性を付与する目的に抗菌性ポリペプチドの利用が期待されている。これまでに多くの抗菌性ポリペプチドが動植物から単離されている。
例えば、特開２０００−６３４００号公報には、タイワンカブトムシ由来の抗菌性ポリペプチド及び当該抗菌性ポリペプチドを有効成分とする抗菌剤が記載されている。また、特開２００１−１８６８８７号公報には、サソリ毒由来の抗菌性ポリペプチド及び当該抗菌性ポリペプチドを有効成分とする抗菌剤が記載されている。また、国際公開第ＷＯ９８／５１７９４号には、デフェンシンスーパーファミリーの一つであるヒト由来の抗菌性ポリペプチド及び当該抗菌性ポリペプチドを有効成分とする抗菌剤が記載されている。また、国際公開第ＷＯ９９／２６９７１号には、カゼイン由来の抗菌性ポリペプチド及び当該抗菌性ポリペプチドを有効成分とする抗菌剤（具体的には歯磨剤、口内洗浄液等の口用組成物）が記載されている。また、国際公開第ＷＯ００／０９５５３号には、アカガエル由来の抗菌性ポリペプチドが記載されている。また、国際公開第ＷＯ０１／００９１７５号には、植物デフェンシン由来の修飾システイン含有抗菌性ポリペプチドが記載されている。
上記の各公報に記載の抗菌性ポリペプチドは、何れも自然界において元々抗菌性ポリペプチドとして存在していたものを発見し単離したもの（或いは天然型抗菌性ポリペプチドのアミノ酸配列を一部改変したポリペプチド）である。従って、本来的に抗菌性ポリペプチドとして存在するペプチドを主成分とする限り、自然界において元来そのペプチドが奏していた抗菌活性や抗菌スペクトルを上回る抗菌性能を有する抗菌剤を開発することは困難である。
発明の開示
ここに開示される抗菌性ポリペプチドは、従前知られている抗菌性ポリペプチドとは異なるアプローチにより開発されたポリペプチドである。すなわち、本発明は、自然界において抗菌性ポリペプチドとして存在するペプチドとは異なるペプチドに含まれるアミノ酸配列を利用して創出された、天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドを提供する。また、本発明は、ここに開示される抗菌性ポリペプチドの製造方法を提供する。さらに本発明は、ここに開示される抗歯性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列及び該配列を含む（典型的にはそれら配列により実質的に構成される）天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチドを提供する。さらには、そのような抗菌性ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを主成分とする抗菌剤（薬学上の組成物）を提供する。
ここで開示される抗菌性ポリペプチドは、そのペプチド鎖中に、１種類又は２種類以上の核移行性配列（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：以下、ＮＬＳという）及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含んでいる。典型的には、上記１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に包含されるアミノ酸残基（即ち当該配列を構成するアミノ酸残基）の総数は少なくとも５であり、且つ、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上（好ましくは４０％以上）に相当する。
ＮＬＳは種々の生物種やウイルスから単離された核移行性配列であり、本来は細胞内で核に移行する種々のポリペプチド中に存在する部分的な配列である。しかし、本発明者は、独立した形態のＮＬＳそれ自体が細菌等に対して抗菌性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、主要構成要素としてＮＬＳを有することによって、高い抗菌活性を発揮し得る。特にグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対して幅広い抗菌スペクトルを有し得る。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、好ましくは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が５以上１００以下である。この程度の長さのポリペプチドであると、高い抗菌活性を安定して発揮させることができる。またペプチド鎖が比較的短いために合成が容易であり、経済的でもある。また、上記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に包含されるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の９０％以上（例えば１００％）であるペプチドが特に好ましい。かかるＮＬＳ主体のペプチドは、特に高い抗菌活性を有し得る。
また、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の４０％以上が塩基性アミノ酸残基（典型的にはアルギニン及びリジン）であることが好ましい。塩基性アミノ酸残基数の存在比率が高いと、より高い抗菌活性が得られ得る。
また、好ましい一つの抗菌性ポリペプチドは、上記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列が２単位以上相互に近接して配置されていることを特徴とする。一つのペプチド鎖にＮＬＳが２単位以上存在すると、抗菌活性が向上する。相互に隣接してタンデムに存在するものが特に好ましい。
本発明によって提供される他の好ましい抗菌性ポリペプチドは、ＮＬＳの抗菌活性を高め得る他の配列を含む。このことに関し、本発明者は核外移行性配列（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：以下、ＮＥＳという）として従来より知られていた配列が、ペプチドの抗菌活性を増大させることに寄与し得ることを見出した。従って、ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に加えて、ペプチド鎖中に更にＮＥＳ若しくは該ＮＥＳに部分的な改変が施された配列を少なくとも１単位含む抗菌性ポリペプチドが本発明によって提供される。
この態様の抗菌性ポリペプチドとして好ましいものは、ＮＥＳ又はＮＥＳの改変配列の少なくとも１単位が、ＮＬＳ又はＮＬＳの改変配列のＮ末端側又はＣ末端側に近接して配置されていることを特徴とする。ＮＥＳ（又はその改変配列）とＮＬＳ（又はその改変配列）とが相互に隣接するポリペプチド（ペプチド鎖）は、バクテリア、特に黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌に対して高い抗菌活性を発揮し得る。
また、本発明は、ここで開示される抗菌性ポリペプチドを主成分とする抗菌剤（即ち薬学上の組成物）を提供する。典型的には、抗菌剤は、用途に応じて、主成分たる本発明の抗菌性ポリペプチドの他に、薬学的に許容され得る種々の担体（副成分）を含有し得る。
また、本発明は、ここで開示される抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び該配列と相補的なヌクレオチド配列を提供する。さらに、それらヌクレオチド配列を含むか或いはそれら配列により実質的に構成される、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント又はＲＮＡセグメントの形態であり得る）を提供する。
さらに本発明は、ここで開示される抗菌性ポリペプチドを好適に製造する方法を提供する。典型的には、ここで開示される方法は、核移行性配列（ＮＬＳ）として知られている５アミノ酸残基以上から成るアミノ酸配列を少なくとも１種類選択すること、該選択したＮＬＳ及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含み、該１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数が全アミノ酸残基数の３０％以上（好ましくは４０％以上）となるようなペプチド鎖を設計すること、ならびに、該設計したペプチド鎖を有する抗菌性ポリペプチドを合成することを包含する。
好ましいＮＬＳの部分的な改変方法として、（ａ）ネイティブなＮＬＳの非塩基性アミノ酸残基を少なくとも一つ欠失させること、（ｂ）ネイティブなＮＬＳに少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基を付加させること、および、（ｃ）ネイティブなＮＬＳに含まれる少なくとも一つの非塩基性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に置換すること、等が挙げられる。
配列表フリーテキスト
配列番号８３    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号８４    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号８５    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号８６    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号８７    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号８８    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号８９    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９０    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９１    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９２    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９３    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９４    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９５    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９６    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９７    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９８    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号９９    設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１００  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０１  末端にアミド基を含む、設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０２  末端にアミド基を含む、設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０３  末端にアミド基を含む、設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０４  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０５  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０６  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０７  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０８  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１０９  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１１０  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１１１  設計された抗菌性ポリペプチドの配列をコードする合成ＤＮＡ。
配列番号１１２  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１１３  設計された抗菌性ポリペプチドの配列をコードする合成ＤＮＡ。
配列番号１１４  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１１５  設計された抗菌性ポリペプチドの配列をコードする合成ＤＮＡ。
配列番号１１６  設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号１１７  プライマーとして使用される合成ＤＮＡ。
配列番号１１８  プライマーとして使用される合成ＤＮＡ。
配列番号１１９  プライマーとして使用される合成ＤＮＡ。
配列番号１２０  プライマーとして使用される合成ＤＮＡ。
配列番号１２１  設計された抗菌性ポリペプチドの配列をコードする合成ＤＮＡ。
配列番号１２２  設計されたポリペプチド。
配列番号１２３  合成ＤＮＡ。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において「天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチド又はポリヌクレオチド」とは、そのペプチド鎖又はヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、人為的に化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）された抗菌性ポリペプチド又はポリヌクレオチドをいう。
「ポリペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。アミノ酸残基数が１０未満（例えば全アミノ酸残基数が５〜７）の所謂オリゴペプチドも本明細書におけるポリペプチドに包含される。
「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す一般的な用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントがポリヌクレオチドに包含される。
「アミノ酸残基」は、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語とする。
また、本明細書において「ＮＬＳ」または「核移行性配列」というときは、特に言及している場合を除き、特定のアミノ酸配列に限定されず、核移行性（核局在性）配列として知られているアミノ酸配列全般を指す。特に限定することを意図したものではないが、ＮＬＳとして知られるアミノ酸配列の典型例を本明細書の配列表（配列番号１〜８０）の欄に列記してある。
また、本明細書において「ＮＥＳ」または「核外移行性配列」というときは、特に言及している場合を除き、特定のアミノ酸配列に限定されず、核外移行性配列として知られているアミノ酸配列全般を指す。特に限定することを意図したものではないが、ＮＥＳの典型例が本明細書の配列表（配列番号８１，８２）に列記してある。
ＮＬＳ又はＮＥＳを含む抗菌性ポリペプチドについて、「ＮＬＳ（又はＮＥＳ）に部分的な改変が施された配列を含む抗菌性ポリペプチド」とは、所定のＮＬＳ（又はＮＥＳ）を含むポリペプチドが奏する抗菌性と実質的に同等又はそれ以上の抗菌性を奏するように、当該ＮＬＳ（又はＮＥＳ）の１〜数個のアミノ酸残基が修飾された配列（例えばＣ末端アミノ酸のカルボキシル基がアミド化された配列）、或いは当該ＮＬＳ（又はＮＥＳ）について１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変ＮＬＳ（又はＮＥＳ）を含む抗菌性ポリペプチドをいう。例えば、（ｉ）所定のＮＬＳのうちの１〜５個程度のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）によって生じた改変配列（例えば１個又は２，３個の塩基性アミノ酸残基がそれぞれ別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、（ｉｉ）所定のＮＬＳに１〜３程度のアミノ酸残基（好ましくは塩基性アミノ酸残基）が付加された改変配列、（ｉｉｉ）所定のＮＬＳから１〜３程度のアミノ酸残基（好ましくは非塩基性アミノ酸残基）が欠失した改変配列、（ｉｖ）ネイティブなＮＬＳのアミノ末端にメチオニン残基（アミノ基がホルミル化された場合を含む）が付加された改変配列等は、本明細書でいう「部分的な改変が施された配列を含む抗菌性ポリペプチド」に包含される典型例である。
また、ＮＬＳ及びＮＥＳについて１単位（ｕｎｉｔ）とは、ＮＬＳ又はＮＥＳを構成する一つの配列を指す。従って、あるペプチド鎖にＮＬＳが２単位含まれるというときは、それらが同種であるか異種であるかを問わず相互に独立してＮＬＳ（又はＮＥＳ）と認められる配列が当該ペプチド鎖中に二つ存在することを意味する。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば抗菌性ポリペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成、ポリヌクレオチド合成、ペプチドを成分とする薬剤の調製に関するような一般的事項）は、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、薬学、医学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。本明細書中に引用された特許文献、特許出願書類及び他の刊行物の全内容は参考として本明細書中に組み入れられている。
なお、以下の説明では、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基をＩＵＰＡＣ−ＩＵＢガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。また、特に断らない限り、ＮＬＳと記す場合は、上記の定義に基づく「部分的な改変が施された配列」（即ち改変ＮＬＳ配列）が包含されるものとする。ＮＥＳについても同様である。
本発明によって提供される抗菌性ポリペプチドは、天然に存在しない人為的に合成されたポリペプチドであり、ＮＬＳが組み込まれた又はＮＬＳのみから成る一次構造を有する。すなわち、ＮＬＳが一部分に含まれている天然の核移行性ポリペプチド（ペプチド鎖）と比較して、全体のアミノ酸配列に対するＮＬＳの占める割合が著しく大きくなっている。典型的には、ＮＬＳに包含されるアミノ酸残基の総数は少なくとも５アミノ酸（７アミノ酸以上が好ましい）であり、それらアミノ酸残基の数はペプチド鎖全長を構成するアミノ酸残基の総数の実に３０％以上（好ましくは４０％以上）である。さらには、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の７０％以上がＮＬＳ部分に含まれるものが好ましく、全アミノ酸残基数の９０％以上がＮＬＳ部分に含まれるものが特に好ましい。
本発明の抗菌性ペプチドは、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、抗菌活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。例えばここで開示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを化学合成する場合において、その一部又は全部をＤ型アミノ酸残基で構成することができる。ポリペプチドの鎖長（換言すればアミノ酸残基数）は、含有するＮＬＳやＮＥＳの長さに応じて異なり得るので特に限定されないが、５〜１００個程度のアミノ酸残基で構成されるものが好ましく、７〜５０個程度のアミノ酸残基で構成されるものがさらに好ましく、９〜３０個程度のアミノ酸残基で構成されるもの（表１参照）が特に好ましい。
ポリペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下で抗菌性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のポリペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、抗菌剤に適用するポリペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には全アミノ酸残基数：５〜３０、好ましくは全アミノ酸残基数：５〜２０）のものが好適である。システイン残基を含まないか或いはその存在割合の小さいアミノ酸配列が好ましい。
本発明のポリペプチドを構成するためのＮＬＳとしては、従来、各種の生物やウイルスから発見されたネイティブなＮＬＳの何れかを選択し、その配列のまま利用することができる。具体例として配列番号１〜配列番号８０にそれぞれ示されるＮＬＳが挙げられる。塩基性アミノ酸残基の含有率が高いものが好ましい。例えば、４０％以上（更に好ましくは５０％以上）のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基（リジン及び／又はアルギニン）であるものが好適である。それらのうちの１種類又は２種類以上のＮＬＳを含むポリペプチドが好ましい。
但し、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の４０％以上に相当し且つ少なくとも５個のアミノ酸残基がＮＬＳ部分に属するようにする。５〜２５個程度のアミノ酸残基で１単位を構成するＮＬＳが好適である。例えば、ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１）、ＲＶＨＰＹＱＲ（配列番号２）、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）ＧＫＫＲＳＫＡ（配列番号５）、ＲＧＲＲＲＲＱＲ（配列番号７）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２０）及びＰＲＲＲＫ（配列番号２６）のような５アミノ酸残基以上で構成されるＮＬＳを１単位又は２単位以上含むポリペプチド（典型的にはアミノ酸残基の総数が５〜１００）が好ましい。斯かるＮＬＳ１単位のみから成るポリペプチドであってもよい。
一方、ＲＫＲＲ（配列番号２７）のような、１単位が４アミノ酸残基以下のＮＬＳは、それ１単位のみでは本発明のポリペプチドを構成しない。この場合には、同種又は異なるＮＬＳと組み合わせ、全体で５アミノ酸残基以上となるアミノ酸配列を設計する。すなわち、１単位が４アミノ酸残基以下のＮＬＳを２単位以上（典型的には２単位、３単位又は４単位）含むアミノ酸配列を設計するとよい。例えばＮＬＳとしてＲＫＲＲ（配列番号２７）を選択した場合、その配列を二単位タンデムに繋いだ８アミノ酸残基から成る配列（ＲＫＲＲＲＫＲＲ）を設計することができる。
また、利用可能なデータベース等の情報源から抗菌性ポリペプチドを構築する為のＮＬＳを選択するにあたっては、塩基性アミノ酸残基に富むＮＬＳを選択することが好ましい。例えば、全アミノ酸残基数の４０％以上、好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上がアルギニン残基及び／又はリジン残基であるＮＬＳが好適な候補であり得る。
また、２単位又は３単位以上のＮＬＳを含むようにアミノ酸配列を設計する場合、好ましくは、これらＮＬＳがペプチド鎖中で隣接して配置されるように設計する。この場合、隣接する一方のＮＬＳのＣ末端アミノ酸と他方のＮＬＳのＮ末端アミノ酸とが直接結合した形態（後述する実施例参照）が好ましい。しかし、隣接する二つのＮＬＳの間にリンカーとして１〜数個のアミノ酸残基が介在してもよい。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、１種又は２種以上のＮＬＳのみで全体のアミノ酸配列が構成されているものであってもよいが、抗菌性を失わない限りにおいて、ＮＬＳに含まれないアミノ酸残基（アミノ酸配列）を含み得る。特に限定するものではないが、ＮＬＳ以外の部分配列としてはペプチド鎖の直鎖形状を維持し得る配列が好ましい。
また、内在するＮＬＳの抗菌活性を高める作用効果を奏する別の配列を含むようにアミノ酸配列を設計することが好ましい。上述のとおり、この目的に好適な配列の候補としてＮＥＳが挙げられる。
典型的なＮＥＳの配列としてＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号８１）、ＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩ（配列番号８２）が挙げられる。アミノ酸配列が既に知られている種々のＮＥＳをＮＬＳと組み合わせることにより、抗菌活性の高いポリペプチドを構築することができる。好ましくは、ＮＥＳがＮＬＳのＮ末端側又はＣ末端側に隣接するようにしてペプチド鎖を構築する。この形態のポリペプチドとしては、例えば、Ｎ末端側からＮＬＳ、ＮＥＳの順にタンデムに配置されたポリペプチド、或いは、Ｎ末端側からＮＥＳ、ＮＬＳの順にタンデムに配置されたポリペプチド、或いは、Ｎ末端側からＮＬＳ、ＮＥＳ、ＮＬＳの順にタンデムに配置されたポリペプチド（この場合、ＮＥＳを挟んでＮ末端側ＮＬＳとＣ末端側ＮＬＳとは同種でも異種でもよい。）が挙げられる。
本発明の抗菌性ポリペプチドを構成するＮＬＳやＮＥＳとして、天然タイプ（ｎａｔｉｖｅ  ｔｙｐｅ）の配列のみならず、抗菌性を損なわない限りにおいて、種々の部分的な改変が施された配列を用い得る。換言すれば、ネイティブなＮＬＳに好適な改変を施した配列を含むアミノ酸配列（ペプチド鎖）を設計することによって、より高い抗菌活性を発揮し得るポリペプチドを得ることができる。
この種の改変として、典型的なものに、配列中の１〜３アミノ酸残基を同類置換すること、および、ペプチド鎖（ＮＬＳ）のＮ末端にメチオニン残基を付加させること（設計したペプチド鎖を組換えＤＮＡ技術を用いて生合成する場合に好適である。）が挙げられる。これらの他、抗菌活性を高めるために行う好適な改変としては、ネイティブなＮＬＳの非塩基性アミノ酸残基（中性若しくは酸性アミノ酸残基）を少なくとも一つ欠失させること、ネイティブなＮＬＳに少なくとも一つの塩基性アミノ酸（典型的にはアルギニン又はリジン）を付加させること、および、ネイティブなＮＬＳに含まれる少なくとも一つの非塩基性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基と置換すること、が挙げられる。また、ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基をアミド化すること、或いはＮ末端のアミノ基をアシル化（典型的にはアセチル化）することも好ましい改変である。
例えば、７アミノ酸残基から成る典型的なＮＬＳであるＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）のプロリンを、塩基性アミノ酸残基に置換した配列ＲＫＫＫＲＫＶ（配列番号８３）を１単位又は２単位以上有するポリペプチドは、本発明によって提供される新規な抗菌性ポリペプチドの一つである。
このような改変配列から構成されたポリペプチドであって、さらにそのＣ末端のカルボキシル基をアミド化した修飾ポリペプチド、例えばＲＫＫＫＲＫＶ−ＣＯＮＨ２（配列番号１０２）やＲＫＫＫＲＫＶＲＫＫＫＲＫＶ−ＣＯＮＨ２（配列番号１０３）は、本発明によって提供される好適な新規の抗菌性ポリペプチドである。
本発明によって提供される新規なアミノ酸配列（設計されたペプチド鎖）の具体例として、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６に示されるアミノ酸配列（又は該配列の１、２又は数個のアミノ酸残基が置換（同類置換等）、欠失及び／又は付加されたような改変配列）が挙げられる。これらアミノ酸配列から実質的に構成されるポリペプチドは、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して高い抗菌活性を有する（後述する実施例参照）。
これらポリペプチドは、何れも３０アミノ酸残基以下（具体的には５〜２８アミノ酸残基）で構成されており、直鎖形状を維持するのに好適である。また、免疫原性も低いために抗菌剤の主成分（抗菌成分）として好適である。
さらに、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６の各々に示されるアミノ酸配列のうちの１種又は２種以上のアミノ酸配列（又は該配列の１、２又は数個のアミノ酸残基が置換（同類置換等）、欠失及び／又は付加されたような改変配列）を含む天然に存在しない人為的に合成されたポリペプチド（但し、全体で１００アミノ酸残基を越えない、好ましくは全体で５０アミノ酸残基を越えない）が本発明によって提供される。
上述のようにしてひとたびアミノ酸配列を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従い、従来公知の種々の方法でペプチド鎖（即ち本発明の抗菌性ポリペプチド）を合成することができる。例えば、一般的な化学合成法に準じて容易に抗菌性ポリペプチドを製造することができる。従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、或いはＦｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）を適用した固相合成法が好適である。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、市販のペプチド合成機（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を容易に合成することができる。
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて本発明の抗菌性ペプチドを生合成してもよい。このアプローチは、比較的鎖長の長いポリペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する抗菌性ポリペプチド（ＮＬＳをベースに設計したアミノ酸配列）をコードするように決定されたヌクレオチド配列（典型的にはＡＴＧ開始コドンを含む）を含むようにしてＤＮＡ（構造遺伝子）を合成する。このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の抗菌性ポリペプチドを得ることができる。例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した抗菌性ポリペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、本発明の抗菌性ポリペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち抗菌性ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片、後述する実施例参照）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばＳｈｉｍｉｚｕらの論文（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，７５１−７５５（２００１））、Ｍａｄｉｎらの論文（Ｍａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２），５５９−５６４（２０００））が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がタンパク質（ポリペプチド）の受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なＰＲＯＴＥＩＯＳ（商標）Ｗｈｅａｔｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ）が市販されている。
従って、上述のようにしてひとたび抗菌性ポリペプチドのアミノ酸配列を決定・設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的のポリペプチドを容易に生産することができる。例えば、日本の（株）ポストゲノム研究所のピュアシステム（登録商標）に基づいて本発明のポリペプチドを容易に生産することができる。
本発明の抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列から実質的に構成される一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、抗菌性ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ポリペプチドを発現させるための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
例えば、本発明に係る抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメント等を包含する。）とを用いて外来ペプチド発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを構築することができる。ベクターの構成やその構築に使用される調節エレメントの種類は、目的とする宿主細胞のタイプに依存して異なり得る。組換えベクターの構築には、遺伝子工学分野でよく理解されている種々の制限酵素によるポリヌクレオチド切断技法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）やポリヌクレオチド断片連結技法（ｌｉｇａｔｉｏｎ）が採用される。これら技法は、市販されている種々の装置類を利用することによって容易に行うことができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドのいくつかは、新規なアミノ酸配列の抗菌性ポリペプチドをコードする。
例えば、以下の（ａ）及び（ｂ）の要件を備えた抗菌性ポリペプチド：
（ａ）ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が５以上１００以下である；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含む；
をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む（又はそれら配列から実質的に構成された）、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチドが提供される。
また、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列から実質的に構成される抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む（又はそれら配列から実質的に構成された）、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、比較的広い抗菌スペクトルを有しており、抗菌剤（薬学上の組成物）の主成分として好適に用いられる。例えば、細菌感染症の治療、創傷面の消毒、眼病予防、口腔内洗浄（うがい）、食品の防腐や鮮度保持、脱臭、家具や衛生機器表面の殺菌又は静菌等の目的に用いられ得る。
抗菌性ポリペプチドの他、抗菌剤に含まれる担体すなわち副次的成分（典型的には製薬上許容されるもの）としては、抗菌剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、色素、香料等が挙げられる。
抗菌剤の形態に関して特に限定はない。例えば、内用剤若しくは外用剤の典型的な形態として、軟膏、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセルが挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、抗菌性ポリペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。
処方に関する詳細な情報源として、例えばＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｏｒｗｉｎ  Ｈａｎｓｃｈ監修，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ刊（１９９０）が挙げられる。
本発明によって提供される抗菌剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射或いは浣腸によって患者に投与することができる。また、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、衛生陶器表面の消毒（殺菌）や食品の防腐目的に使用する場合は、比較的多量（例えば１〜１００ｍｇ／ｍｌ）のペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、或いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎず、従来のペプチド系抗生物質やペプチドを構成成分とする農薬、医薬部外品等と同じ形態、使用方法を適用することができる。
例えば、放射線治療を受けているガン患者やエイズ患者にとって、細菌感染症の予防及び治療は重大な関心事である。本発明によって提供される抗菌性ポリペプチドは、細菌に選択的に抗菌作用を示し得る。このため、本発明に係る抗菌性ポリペプチドは、抗菌剤の主成分として有用である。
また、本発明の抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、抗菌性ポリペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時生体（細胞）内で本発明に係る抗菌性ポリペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明によって提供される本発明の抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、上述した患者等に対し、細菌感染を予防し又は治療する薬剤として有用である。
再生医療の分野において、皮膚、骨、各種の臓器の培養時の細菌感染を防止することは重要である。本発明によって提供される抗菌性ポリペプチドは、哺乳動物細胞及び組織に対する毒性が極めて低く（後述する実施例参照）、細菌に選択的に抗菌作用を示す。このため、培養臓器等の細菌感染を防止する薬剤として極めて有用である。例えば、後述する実施例に示すように、適当な濃度で本発明の抗菌性ポリペプチド単独又は当該ポリペプチドを主成分の一つとする抗菌剤を培養液中に添加することにより、培養中の臓器等の細菌感染を防止することができる。
また、培養細胞や培養組織に対して、本発明の抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療に使用する素材として用いることができる。例えば、本発明の抗菌性ポリペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント又はＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする培養組織に導入することにより、常時或いは所望する時期に培養組織（細胞）内で本発明に係る抗菌性ポリペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明によって提供される本発明の抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、培養組織の細菌感染を防止する薬剤として有用である。
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜実施例１：抗菌性ポリペプチドの化学合成＞
計３６種類のポリペプチド（サンプル１〜３３、比較サンプル１〜３）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これらポリペプチドのアミノ酸配列を列挙している。
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表１に記すサンプル１〜６及び２７は、各々異なるネイティブタイプのＮＬＳ１単位のみから成るポリペプチドである。
サンプル７は、サンプル１のアミノ酸配列（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）におけるＮ末端アミノ酸のプロリンをアルギニンに置換した改変配列（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）から成るポリペプチドである。
サンプル８〜１１は、ＮＬＳと一般的なＮＥＳとをタンデムに連結した配列から成るポリペプチドである。すなわち、サンプル８では、ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）のＣ末端側にＮＥＳ（ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ：配列番号８１）が隣接している。逆にサンプル９では、ＮＥＳ（ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ：配列番号８１）のＣ末端側にＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）が隣接している。サンプル１０では、ＮＬＳ（ＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲ：配列番号２１）のＣ末端側にＮＥＳ（ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ：配列番号８１）が隣接しており、更にそのＣ末端にはアスパラギン酸が一つ付加している。サンプル１１では、ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）のＣ末端側にＮＥＳ（ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ：配列番号８１）が隣接し、さらにそのＣ末端側にＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）が隣接している。
サンプル１２〜１５は、サンプル７の改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）と一般的なＮＥＳとを連結した配列から成るポリペプチドである。すなわち、サンプル１２では、改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）のＣ末端側にＮＥＳ（ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ：配列番号８１）が隣接している。逆にサンプル１３では、ＮＥＳ（ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ：配列番号８１）のＣ末端側に改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）が隣接している。サンプル１４では、改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）のＣ末端側に別のＮＥＳ（ＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩ：配列番号８２）が隣接している。逆にサンプル１５では、ＮＥＳ（ＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩ：配列番号８２）のＣ末端側に改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）が隣接している。
サンプル１６〜２２及び３０は、ＮＬＳ又は改変ＮＬＳを２単位以上連結した配列から成るポリペプチドである。すなわち、サンプル１６では、ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）が２単位連結している。サンプル１７では、ＮＬＳ（ＲＩＲＫＫＬＲ：配列番号４３）が２単位連結している。サンプル１８では、５アミノ酸残基から成るＮＬＳ（ＰＲＲＲＫ：配列番号２６）が２単位連結している。サンプル３０では、ＮＬＳ（ＬＫＲＫＬＱＲ：配列番号５０）が２単位連結している。サンプル１９では、二つの異なるＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４及びＰＰＲＫＫＲＴＶＶ：配列番号２８）が１単位ずつタンデムに連結している。
また、サンプル２０、２１及び２２は、各々、上記改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）が２単位、３単位及び４単位連結したものである。
サンプル２３は、ＮＬＳ（ＰＲＲＲＫ：配列番号２６）のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基がアミド化されたものである。
サンプル２４は、上記改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基がアミド化されたものである。
サンプル２５は、上記改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）を２単位連結した配列（ＲＫＫＫＲＫＶＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号９８）のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基がアミド化されたものである。
サンプル２６は、サンプル１のアミノ酸配列（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）のＮ末端側から第６番目のアミノ酸残基「リジン」を「アルギニン」に同類置換した配列（ＰＫＫＫＲＲＶ：配列番号１０４）から成るポリペプチドである。
サンプル２８は、サンプル７の改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）のＣ末端側に塩基性アミノ酸に富む７アミノ酸残基を付加したポリペプチドである。具体的には、改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）を反転させた配列（ＶＫＲＫＫＫＲ）を付加した。
サンプル２９は、サンプル７の改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）のＣ末端側に全て塩基性アミノ酸である６アミノ酸残基（ＫＲＫＫＫＲ）を付加したポリペプチドである。
サンプル３１は、サンプル１のＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号４）のＣ末端側に１０アミノ酸残基（ＡＬＧＫＬＡＬＧＫＬ）を付加したポリペプチドである。
サンプル３２は、サンプル２のＮＬＳ（ＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲ：配列番号２１）のＣ末端側に５アミノ酸残基（ＩＡＧＫＩ）を付加したポリペプチドである。
サンプル３３は、サンプル７の改変ＮＬＳ（ＲＫＫＫＲＫＶ：配列番号８３）を２単位連結し、さらにそのＮ末端側にメチオニン残基を付加したポリペプチドである。
本実施例では、後述する抗菌活性に関して上記各サンプルのポリペプチドの比較対照とするため、本発明の範疇に属しないポリペプチドを３種類合成した。
すなわち、比較サンプル１は、４アミノ酸残基から成る短いＮＬＳ（ＲＫＲＲ：配列番号２７）１単位のみから成るポリペプチドである。
また、比較サンプル２及び３は各々異なるＮＥＳ（ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ：配列番号８１、ＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩ：配列番号８２）１単位のみから成るポリペプチドであり、ＮＬＳを含まない。
上述した各ポリペプチド（個々のアミノ酸配列は表１及び配列表を参照）は、市販のペプチド合成機（ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＺＥＲ  ９０５０、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品）を用いて固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により合成した。なお、縮合剤としてＨＡＴＵ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品）を使用し、固相合成法に用いた樹脂及びアミノ酸はＮＯＶＡ  ｂｉｏｃｈｅｍ社から購入した。アミノ酸配列のＣ末端をアミド化する場合には、固相担体として「Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ（１００〜２００ｍｅｓｈ）」を使用した。
而して、上記ペプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応及び縮合反応を反復して樹脂に結合するＦｍｏｃ−アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、目的の鎖長の合成ペプチドを得た。具体的には、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ペプチド合成用グレード、関東化学（株）製品）によって、アミノ酸のアミノ保護基であるＦｍｏｃを切断除去し、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（−ＯＨ）各４ｅｑを反応させ、ＤＭＦで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦによりＦｍｏｃ基を切断し、ＤＭＦ、メタノールの順で上記反応物を洗浄した。
固相合成後、合成したペプチド鎖を樹脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール１．８ｍＬ、ｍ−クレゾール０．６ｍＬ、チオアニソール３．６ｍＬ及びトリフルオロ酢酸２４ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。その後、ペプチド鎖に結合していた樹脂を濾過して除去した。
次いで、濾液に冷却エタノールを加え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。その後、遠心分離（２５００ｒｐｍで５分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジエチルエーテルを新たに加えて十分に撹拌した後、上記と同じ条件で遠心分離を行った。この撹拌と遠心分離の処理を計３回反復して行った。
得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ６００：Ｗａｔｅｒｓ社製品）を用いて精製を行った。
具体的には、プレカラム（日本Ｗａｔｅｒｓ（株）製品、Ｇｕａｒｄ−Ｐａｋ  Ｄｅｌｔａｐａｋ  Ｃ１８Ａ３００）及びＣ１８逆相カラム（和光純薬工業（株）製品、Ｗａｋｏｐａｋ  ＷＳ−ＤＨＡ  ４．６×１５０ｍｍ  ＯＤＳ−Ｃ１８）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。すなわち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で１０％から８０％への濃度勾配を設ける）、１．５ｍＬ／分の流速で上記カラムを用いて３０〜４０分間の分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器（４９０Ｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ：Ｗａｔｅｒｓ社製品）を用いて波長：２２０ｎｍで検出され、記録チャート上にピークとして示される。
また、溶離した各ポリペプチドの分子量をＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＲＰ（商標）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。その結果、目的のポリペプチドが合成・精製されていることが確認された。
＜実施例２：合成ポリペプチドの抗菌活性＞
本発明に係る抗菌性ポリペプチド（サンプル１〜３３）及び比較サンプル１〜３のポリペプチドについて、グラム陰性細菌（大腸菌：Ｅ．ｃｏｌｉ）及びグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する抗菌活性（最小阻止濃度：ＭＩＣ）を９６穴（ｗｅｌｌ）マイクロプレートを用いた液体培地希釈法により求めた。
すなわち、ポリペプチド濃度が５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６、７．８、３．９、１．９、１．０及び０．５μＭとなる液体肉汁培地（ＤＩＦＣＯ社製品「ＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＢＲＯＴＨ  Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ」）をそれぞれ作成し、９６穴マイクロプレートに充填した。一方、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｌｅｎｎｏｘ（ＤＩＦＣＯ社製品）で１８時間、３７℃にて静置培養した菌液（約２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、薬剤溶液（上記ポリペプチド含有肉汁培地）と等量、９６穴マイクロプレートの各ウェル（ｗｅｌｌ）に接種した。接種後、３７℃の恒温器内で培養を開始し、２４時間後及び４８時間後の濁度により菌発生の有無を調べた。その計測時における菌による濁度の増加が認められない最小ポリペプチド濃度を本実施例におけるＭＩＣと定めた。
かかる抗菌試験に基づく各サンプル及び比較サンプルの抗菌活性（ＭＩＣ）を表２に示す。なお、表２のＭＩＣの単位はμＭである。
2003091429.tif 000003
表２に示す結果から明らかなように、本発明に係るポリペプチド（サンプル１〜３３）は、比較対照のポリペプチド（比較サンプル１〜３）と比べ、いずれも高い抗菌活性を示した。
ＮＬＳとＮＥＳとが近接して配置されているポリペプチド（サンプル１０，１４，１５等）ではグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のいずれに対しても高い抗菌活性が認められた。そして、ＮＬＳが２単位又はそれ以上タンデムに配置されているポリペプチド（例えばサンプル１６〜２２）において、特に高い抗菌活性が認められた。
また、ＮＬＳ又は改変ＮＬＳを１単位以上含み、且つ、塩基性アミノ酸残基に富む（好ましくは８以上有する）ポリペプチド（例えばサンプル２，５，１６〜２２，２８，２９）が、特に高い抗菌活性を示した。また、Ｃ末端がアミド化されたポリペプチド（サンプル２４）は、Ｃ末端がアミド化されていない同配列のポリペプチド（サンプル７）よりも高い抗菌活性を示すことが確かめられた。
表２に示す結果より、本発明に係る抗菌性ポリペプチドが優れた抗菌活性と広い抗菌スペクトルとを有することが確かめられた。
＜実施例３：抗菌スペクトル＞
次に、サンプル１６，１７，１０，１４及び２０のポリペプチドについて実施例２と同様の抗菌試験（ＭＩＣ測定試験）を種々の細菌（表３参照）を対象にして行い、これらポリペプチドの抗菌スペクトルを評価した。その結果、表３に示すように、本発明の抗菌性ポリペプチドは、広範囲のグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対して抗菌活性を有することが確かめられた。
2003091429.tif 000004
＜実施例４：哺乳動物に対する安全性試験＞
哺乳動物細胞に対する毒性試験を以下のように行った。
すなわち、Ａ１７２（ヒト神経膠腫）細胞を前日に９６穴プレートの１ウェル当たり８×１０３個ずつまき、３７℃で５％ＣＯ２の条件下、静置培養した。次の日、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ポリペプチド（サンプル１〜２６のいずれか）を０、０．５、５、２５、５０、１００、２００、４００μｇ／ｍｌの濃度で含む無血清培地（血清無添加のＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製培地「ＲＰＭＩ１６４０」）をウェル当たり１００μｌずつ添加した（１試料当たりウェル数（ｎ）＝１又は２）。その後、上記と同様の条件で２４時間静置培養した。
培養終了後、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、５％ＷＳＴ−８（細胞増殖測定用試薬：キシダ化学（株）製品）を含むＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ含有）をウェル当たり１００μｌずつ添加し、上記と同様の条件で１時間静置培養した。その後、プレートリーダーを用い、主波長４５０ｎｍ、参照波長６００ｎｍとして吸光度を測定した。ポリペプチド０μｇ／ｍｌ（即ち無添加）の試料の吸光度値を１００％とし、各ポリペプチド濃度における相対的細胞生存率を求めた。ここで、ポリペプチド濃度１００μｇ／ｍｌにおける相対的細胞生存率が８０％以上のものを「毒性なし」、８０％未満のものを「毒性あり」とした。その結果、いずれのポリペプチド（サンプル１〜２６）についても「毒性なし」であった。
また、サンプル１０，１２，１３，１４，１５及び２０を各々含む計６種類のペプチド含有注射液（溶媒：生理食塩水）を調製した。これらをそれぞれマウスに腹腔内注射し、ＬＤ５０値を求めた。
その結果、ここで試験した抗菌性ポリペプチドのＬＤ５０は、いずれも１５０ｍｇ／ｋｇより大きかった。すなわち、本発明に係る抗菌性ポリペプチドの哺乳動物に対する毒性が極めて低いことが確かめられた。
＜実施例５：顆粒剤の調製＞
サンプル２０のポリペプチド５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、抗菌性ポリペプチドを主成分とする顆粒剤を得た。
＜実施例６：抗菌性ポリペプチドの遺伝子工学的合成（１）＞
市販の核酸合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品「ＡＢＩ３９００」）を使用マニュアルに準じて使用して、配列表の配列番号１１１、１１３及び１１５に示すヌクレオチド配列から成る一本鎖ＤＮＡを合成した。また、それらＤＮＡに基づいて二本鎖ＤＮＡを形成するためのプライマーとして、１種類のフォワードプライマー（配列番号１１７）及び３種類のリバースプライマー（配列番号１１８、１１９及び１２０）を化学合成した。なお、配列番号１１８、１１９及び１２０の各リバースプライマーは、それぞれ、配列番号１１１、１１３及び１１５に示す配列の二本鎖ＤＮＡを合成するために使用される。
そして、これらプライマーを使用した一般的なポリメラーゼ連鎖反応（例えば「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ刊（１９９３）の記述が参考になる。）により、配列表の配列番号１１１、１１３及び１１５に示すヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡを合成した。
これら配列番号１１１、１１３及び１１５に示す二本鎖ＤＮＡは、それぞれ、配列番号１１２、１１４及び１１６に示すアミノ酸配列の抗菌性ポリペプチドをコードしており、そのコード領域の上流側（５’末端側）にプロモータ配列を有し、下流側（３’末端側）に終止コドンを有している。
次に、Ｓｈｉｍｉｚｕらの論文（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，７５１−７５５（２００１））に記載されるプロトコルに準じて、配列番号１１５に示すヌクレオチド配列のＤＮＡを鋳型にして無細胞タンパク質合成システム（無細胞発現システム）によって、アミノ酸配列がＭＰＫＫＫＲＫＶＬＰＰＬＥＲＬＴＬＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１６）のポリペプチドを合成した。
すなわち、以下の成分：９ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｍＭリン酸カリウム、９５ｍＭグルタミン酸カリウム、５ｍＭ塩化アンモニウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭスペルミジン、８ｍＭプトレッシン、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＣＴＰ、１ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭリン酸クレアチン、２．８ユニット（Ａ２６０）のｔＲＮＡ混合物（Ｒｏｃｈｅ社製品）、０．５μｇの１０−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、０．１ｍＭの各アミノ酸、１２ピコモルのリボソーム、及びＨｉｓ−ｔａｇ付きの各種酵素及びファクター類（即ち、１μｇの開始因子１（ＩＦ１）、２μｇのＩＦ２、０．７５μｇのＩＦ３、１μｇの伸長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）、２μｇのＥＦ−Ｔｕ、１μｇのＥＦ−Ｔｓ、０．５μｇの終結因子１（ＲＦ１）、０．５μｇのＲＦ３、０．５μｇのＲＲＦ、それぞれ３０〜３００ユニットのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（計２０種類）及びメチオニル−ｔＲＮＡトランスフォーミラーゼ、０．２μｇのクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製品）、０．１５μｇのミオキナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製品）、０．０５４μｇのヌクレオシド−ジホスフェートキナーゼ、０．１ユニットのピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ社製品）及び０．５μｇのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）；
を含む反応液５０μｌ（ｐＨ７．３）を調製した。この反応液を３７℃で５分間インキュベートした。その後、上記鋳型ＤＮＡをこの反応液に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、反応液を氷中に移すことにより、ペプチドの合成反応を停止させた。
次いで、反応液を限外濾過用デバイス（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−１００デバイス、ミリポア社製品）に装填して遠心分離し、溶出液を回収した。次いで、回収液をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。そして、この精製液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することにより、目的のポリペプチドが合成されていることを確認した。
すなわち、回収した精製液（目的のペプチドを含む。）の一部を１５〜２５％のアクリルアミド濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲルに載せ、３００Ｖで５０分間の電気泳動を行った。尚、このゲルには、最終的な精製液の他に、上述したペプチド合成反応直後即ち上記３７℃１時間インキュベーション直後の反応液の一部、および、上記限外濾過後の溶出液の一部も同時に載せた。また、ネガティブコントロールとして、上記鋳型ＤＮＡ（配列番号１１５）を添加しないことを除いて同様のプロセスを実施して得た上記３７℃１時間インキュベーション直後の反応液、上記限外濾過の溶出液および上記精製液を同じゲルに載せた。さらに、別途ペプチド合成機（上述のＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＺＥＲ  ９０５０）で合成した配列番号１１６のポリペプチド（ＭＰＫＫＫＲＫＶＬＰＰＬＥＲＬＴＬＰＫＫＫＲＫＶ）を同じゲルに載せた。
電気泳動後、蛍光染色剤（アマシャムバイオサイエンス（株）製品：ＳＹＰＲＯ（商標）Ｏｒａｎｇｅ）を含む染色液（７．５％酢酸）にゲルを４０分間浸漬し、ゲル中に含まれるペプチドのバンドを染色した。その後、７．５％酢酸中にゲルを漬けて余剰の染色剤を除去した。そして、アマシャムファルマシア（株）製品のイメージアナライザー（商品名「Ｔｙｐｈｏｏｎ」）を使用して解析した（励起波長：５３２ｎｍ、蛍光フィルター：５８０ＢＰ３０）。結果（染色後のイメージ）を図１に示す。図１に示すレーン１は、アマシャムバイオサイエンス（株）製品のＬＭＷマーカー（製品名：ＬＭＷ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ、製品コード：１７−０４４６−０１）の泳動パターンを示しており、レーン下流側から約１４．４ｋＤａ、２０．１ｋＤａ、３０ｋＤａ、４５ｋＤａ、６６ｋＤａ、９７ｋＤａのバンドがみられる。レーン２は、アマシャムバイオサイエンス（株）製品のペプチドマーカーキット（製品名：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ、製品コード：８０−１１２９−８３）の泳動パターンを示しており、レーン下流側から約６．２ｋＤａ、８．２ｋＤａ及び１０．７ｋＤａ、１４．４ｋＤａ、１６．９ｋＤａのバンドがみられる。レーン３及びレーン４は、それぞれ、鋳型ＤＮＡを含む場合と含まない場合の上記ペプチド合成反応直後の反応液の泳動パターンを示している。また、レーン５及びレーン６は、それぞれ、鋳型ＤＮＡを含む場合と含まない場合の上記限外濾過の溶出液の泳動パターンを示している。また、レーン７は、鋳型ＤＮＡを含む場合のＮｉ−ＮＴＡアガロースを流通した上記精製液の泳動パターンを示している。レーン８は、ペプチド合成機によって合成した目的配列のポリペプチド（配列番号１１６）の泳動パターン（７０ｎｇ／３．４μｌ）を示している。レーン９は、鋳型ＤＮＡを含まない場合のＮｉ−ＮＴＡアガロースを流通した上記精製液の泳動パターンを示している。なお、レーン１０は、同様の無細胞タンパク質合成システム（上記Ｓｈｉｍｉｚｕらの論文参照）によって合成し、同様のプロセスで精製した後のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の泳動パターンを示している。
図１から明らかなように、レーン３、５及び７（矢印参照）には、レーン８（矢印参照）と同じ位置に明確なバンドが存在している。このバンドは、鋳型ＤＮＡを添加していないレーン４、６及び９には認められない。
次に、上記ゲルを乾燥後、レーン７の目的のバンド（図１において矢印で示したバンド）を切り出し、アマシャムバイオサイエンス社製のマトリックス支援イオン化−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：商品名「Ｖｏｙａｇｅｒ  ＲＰｄｅ」）を用いて、ポリペプチドのＰＭＦ分析（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｓｓ  Ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。その結果、図２に示すような分子イオンのピークが認められた。観察されたピークの質量数（［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３９．９４、［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１４７０．４９）は、計算上の質量数（［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３９．８９、［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１４７０．４５）とほぼ一致していた。また、Ｎ末端及び／又はＣ末端が分解されたペプチド或いは側鎖に修飾を受けたアミノ酸残基を有するペプチドの存在を示すピークは認められなかった（但しＮ末端のメチオニンのアミノ基は正常にホルミル化されている。）。
次に、上記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳをＰＳＤモードで運転してＰＳＤ（ｐｏｓｔ−ｓｏｕｒｃｅｄｅｃａｙ）解析（即ちＴＯＦ  ＭＳ内を飛行中にフラグメント化した励起分子イオンを検出する方法）を行った。その結果、図３に示すようなフラグメントイオンのピークを得た。かかる解析により、レーン７の目的のポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ末端から順にＭ−Ｐ−（Ｋ／Ｑ）−（Ｋ／Ｑ）−（Ｋ／Ｑ）−Ｒ−（Ｋ／Ｑ）−Ｖ−（Ｌ／Ｉ）と同定された。この結果は、配列番号１１６のポリペプチドのアミノ酸配列ＭＰＫＫＫＲＫＶＬと一致する。
以上の結果から、鋳型ＤＮＡを用いると、上述の無細胞タンパク質合成システムによって、本発明の抗菌性ペプチドが容易に合成・製造し得ることが確かめられた。
＜実施例７：抗菌性ポリペプチドの遺伝子工学的合成（２）＞
組換えＤＮＡ技法を用いて目的のポリペプチド（上述のサンプル１７）の配列を含むＧＳＴ融合タンパク質（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質）を大腸菌内で発現させ、回収したＧＳＴ融合タンパク質を酵素で消化して目的のポリペプチド（断片）を分離・精製した。
先ず、市販の核酸合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品「ＡＢＩ３９００」）を使用マニュアルに準じて使用して、配列番号１２１及び１２３に示す互いに相補するヌクレオチド配列から成る一本鎖ＤＮＡをそれぞれ合成した。次いでこれらＤＮＡをアニーリングして二本鎖ＤＮＡを得た。配列番号１２１が本実施例に係るポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列であり、配列番号１２３がその相補配列である。この合成ポリヌクレオチドにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１２１及び配列番号１２２に示している。このアミノ酸配列は、上述のサンプル１７（配列番号９３）のアミノ酸配列と、そのＮ末端側に配置された１つのメチオニン残基、６つの連続するヒスチジン残基及び１つのグルタミン酸残基とから構成されている。メチオニン残基は後述する融合タンパク質が不溶性として発現した場合に融合ＧＳＴ部分から目的のアミノ酸配列部分を臭化シアン切断できるようにするために挿入されている。また、６個のヒスチジン配列は、融合ＧＳＴを切断後に目的のポリペプチド（断片）をアフィニティ回収するためのタグ部分である。さらにヒスチジンに隣接するグルタミン酸残基は、目的のポリペプチドからタグ部分を切り取るために挿入されている。
配列番号１２１に示す配列から明らかなように、この合成ポリヌクレオチドの両端（即ちメチオニンに対応するコドンの上流及び終始コドンの下流）にはそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩの認識サイトが含まれている。この二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断した。制限酵素消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、両端にＥｃｏＲＩ切断サイト及びＰｓｔＩ切断サイトを有するＤＮＡ断片を精製した。
次に、図４に示すように、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社から購入したＧＳＴ融合タンパク質発現ベクター（ｐＥＴ−４１ａ（＋）ＤＮＡ：カタログＮｏ．７０５５６−３）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩサイトに上記二本鎖ＤＮＡ（配列番号１２１）をライゲーション（挿入）した。なお、使用したＧＳＴ融合タンパク質発現ベクター「ｐＥＴ−４１ａ（＋）」（全ヌクレオチド配列：５９３３ｂｐ）のクローニング／発現領域の詳細なマップはノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社のカタログに詳細に記載してある。
ライゲーション処理したプラスミドを用いてコンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）を形質転換した。得られた形質転換体をカナマイシンを含むＬＢ培地（Ｋｍ＋）を用いて３７℃で培養し、その培養物から上記二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドで形質転換されたクローンを単離した。このクローンを培養し、その培養物から上記二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドを単離・回収した。次に、回収した組換えプラスミドを使用し、融合タンパク質高発現用大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））を形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ培地（Ｋｍ＋）を用いて３７℃で培養し、その培養物から上記二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドで形質転換されたクローンを単離した。
次に、上記単離したクローンをＬＢ培地（Ｋｍ＋）３リットルを用いて３０℃で培養した。ＯＤ６００が０．９のときにＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、融合タンパクの産生を誘導した。そして６時間後に培養液を遠心分離し、約１１．６ｇの菌体（ウェット状態）を回収し、凍結保存した。
後日、凍結保存菌体を約１００ｍｌのＰＢＳに懸濁し、２０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度１％となるように添加した。この懸濁液に超音波処理を施して菌体を破砕した後、遠心分離を行って上清約１１０ｍｌを回収した。この上清を１ｍｌ容量のグルタチオンセファロース（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂカラムにアプライし、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳでカラム内を洗浄し、更にＰＢＳで洗浄した。次いで、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をカラムに流し、目的の融合タンパク質をカラムから溶出した。これにより、約６０ｍｇの融合タンパク質を得た。
次に、回収した融合タンパク質溶液をトロンビンで処理した。すなわち、融合タンパク質溶液に所定力価のトロンビン（即ち融合タンパク質２０μｇあたり約０．０１Ｕ）を添加し、２０で一晩放置した。この反応により、融合タンパク質をＧＳＴ部分と目的のアミノ酸配列を含むペプチド部分とに分断した。
このタンパク質分解酵素処理溶液を次いでグルタチオンセファロース４Ｂカラムにアプライし、そのパス画分を回収した。更にカラムを１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで洗浄し、その一部（初期の溶出画分）も回収した。そして、この回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することにより、目的のポリペプチドが回収されていることを確認した。すなわち、回収した精製液（目的のペプチドを含む。）の一部を１５〜２５％のアクリルアミド濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル（マルチゲル１５／２５：第一化学（株）製品）に載せ、３０ｍＡで約２時間の電気泳動を行った。その結果を図５に示す。ゲルのレーンＭはペプチドマーカ（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）の泳動パターンであり、レーン１は上記トロンビン処理前の融合タンパク質溶液の泳動パターンであり、レーン２はトロンビン処理後のタンパク質溶液の泳動パターンであり、レーン３は上記カラムからのパス画分の泳動パターンであり、レーン４及び５は上記カラムを洗浄した洗浄液を回収した画分の泳動パターンである。なお、レーン６〜１１は、上記カラムから分取した溶出画分の泳動パターンである。図示されるように、レーン２〜５において、ＧＳＴと分離した目的のアミノ酸配列（配列番号１２２）を含むペプチドフラグメントのバンドが認められた。
次に、これら回収物を透析用パックに入れ、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）で透析した。その後、パック内の液を回収し、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃを適量添加した炭酸水素アンモニウム緩衝液（ＰＨ７．８）中で３７℃、１８時間の酵素処理（切断処理）を行った。その後、酵素処理液を回収し、逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。即ち、サイズが４．６×２５０ｍｍの逆相カラム（Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８  ＨＧ：和光純薬工業（株）製品）に酵素処理液をアプライし、日本分光（株）のＲＰ−ＨＰＬＣ（ＪＡＳＣＯ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍ、ポンプ：ＰＵ−９８０、ＵＶ検出器：ＵＶ−９７０）を用いて、Ａ溶液：０．０５ｖｏｌ％ＴＦＡ含有蒸留水、Ｂ液：０．０５ｖｏｌ％ＴＦＡ含有９０ｖｏｌ％アセトニトリル溶液、グラジエント：１００％Ａ液→１００％Ｂ液、４０分）、フローレート：１ｍｌ／分の条件で逆相クロマトグラフィーを行った。その結果、溶出開始から概ね２０分経過した時期にカラムから溶出してきた画分に目的のペプチドフラグメントとみられるピークを検出した（図８Ａ）。すなわち、このピークの位置（溶出時期）は化学合成品（サンプル１７）のポリペプチド（０．１ｍｇ／ｍｌのサンプル１００μｌ）を同カラムにアプライして同じ条件で溶出した場合と同じであった（図８Ｂ）。
次いで、当該ピーク画分を分取し、さらに逆相クロマトグラフィーに供した。即ち、サイズが４．６×１５０ｍｍの逆相カラム（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ−１８：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製品）に上記分取した酵素処理液をアプライし、日本分光（株）のＲＰ−ＨＰＬＣ（ＪＡＳＣＯ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍ、ポンプ：ＰＵ−９８０、ＵＶ検出器：ＵＶ−９７０）を用いて、Ａ溶液：０．１５ｖｏｌ％ＴＦＡ含有蒸留水、Ｂ液：０．１ｖｏｌ％ＴＦＡ含有アセトニトリル、グラジエント：１００％Ａ液→５０％Ａ液／５０％Ｂ液、４０分）、フローレート：１ｍｌ／分の条件で、逆相クロマトグラフィーを行った。その結果、図６に示すように、溶出開始から概ね２０分経過した時期にカラムから溶出してきた画分に目的のペプチドフラグメントとみられるシングルピークを検出した。さらに、このピーク画分に含まれるペプチドの分子量をＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＲＰ（商標）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳに基づいて決定した（図７）。その結果、決定された分子量（１９２０．７８）はアミノ酸配列に基づく理論上の分子量（１９２０．５１）と同等であった。
次に、上述した実施例２と同様の方法により、上記逆相クロマトグラフィーによって精製されたポリペプチドの抗菌活性（ＭＩＣ）を調べた。結果を表４に示す。
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表４に示す結果から明らかなように、組換え大腸菌から分離精製したポリペプチドは、比較対照のポリペプチド（上記実施例２における比較サンプル１及び２）と比べ、高い抗菌活性を示し、そのＭＩＣ値は化学合成によって製造した同じアミノ酸配列のポリペプチド（上述のサンプル１７）と同程度であった。
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、請求の範囲を限定するものではない。請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
また、本明細書に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組み合わせによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組み合わせに限定されるものではない。また、本明細書に例示した技術は複数目的を同時に達成するものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１（ＦＩＧ．１）は、無細胞タンパク質合成システムにより合成したポリペプチドを含む試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した結果を示す写真である。
図２（ＦＩＧ．２）は、無細胞タンパク質合成システムにより合成したポリペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて解析した際に得られた分子イオンのピークを示すマススペクトルである。横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）、縦軸は相対強度である。
図３（ＦＩＧ．３）は、無細胞タンパク質合成システムにより合成したポリペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて解析した際に得られたフラグメントイオンのピークを示すマススペクトルである。横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）、縦軸は相対強度である。
図４（ＦＩＧ．４）は、ここで開示された合成ポリヌクレオチドを市販の発現ベクター（ｐＥＴ−４１ａ（＋））に挿入した状態を示す模式図である。
図５（ＦＩＧ．５）は、組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロセスによって精製した試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した結果を示す写真である。
図６（ＦＩＧ．６）は、組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロセスによって処理し、精製した試料を逆相クロマトグラフで分析した結果を示すクロマトグラムである。横軸はリテンションタイム（分）、縦軸はピーク強度（μＶ）である。
図７（ＦＩＧ．７）は、組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロセスによって精製したポリペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて解析した際に得られた分子イオンのピークを示すマススペクトルである。横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）、縦軸は相対強度である。
図８Ａ（ＦＩＧ．８Ａ）は、組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロセスによって処理した試料を逆相クロマトグラフで分析した結果を示すクロマトグラムである。横軸はリテンションタイム（分）、縦軸はピーク強度（μＶ）である。図８Ｂ（ＦＩＧ．８Ｂ）は、化学合成したポリペプチド試料を逆相クロマトグラフで分析した結果を示すクロマトグラムである。横軸はリテンションタイム（分）、縦軸はピーク強度（μＶ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月1日(2003.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、そのペプチド鎖中に１種類又は２種類以上の核移行性配列（ＮＬＳ）及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含んでおり、該１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数は少なくとも５であり且つペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上である抗菌性ポリペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを含む、抗菌剤。
【請求項２】
前記ポリペプチドのペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下である、請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項３】
前記ポリペプチドのペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の４０％以上が塩基性アミノ酸残基である、請求項１又は２に記載の抗菌剤。
【請求項４】
前記ポリペプチドにおいて前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列が２単位以上相互に近接して配置されている、請求項１〜３のいずれかに記載の抗菌剤。
【請求項５】
前記ポリペプチドの前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の９０％以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗菌剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドのペプチド鎖中に、少なくとも１単位の核外移行性配列（ＮＥＳ）若しくは該ＮＥＳに部分的な改変が施された配列を含む、請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項７】
前記ポリペプチドの前記ＮＥＳ又はＮＥＳの改変配列の少なくとも１単位は、前記ＮＬＳ又はＮＬＳの改変配列のＮ末端側又はＣ末端側に近接して配置されている、請求項６に記載の抗菌剤。
【請求項８】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含み、該少なくとも１種類のアミノ酸配列又は改変アミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上である抗菌性ポリペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを含む、抗菌剤。
【請求項９】
前記ポリペプチドのペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下である、請求項８に記載の抗菌剤。
【請求項１０】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列から実質的に構成される抗菌性ポリペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを含む、抗菌剤。
【請求項１１】
前記ポリペプチドのペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基がアミド化されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗菌剤。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
抗菌性ポリペプチドを主成分とする抗菌剤の調製方法であって、
核移行性配列（ＮＬＳ）として知られている５アミノ酸残基以上から成るアミノ酸配列を少なくとも１種類選択すること、
該選択したＮＬＳ及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含み、該１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸酸基の総数が全アミノ酸残基数の３０％以上となるようなペプチド鎖を設計すること、
該設計したペプチド鎖を有する抗菌性ポリペプチドを合成すること、および
該合成したポリペプチドと少なくとも一種の薬学的に許容され得る担体とを混合すること、を包含する方法。
【請求項１９】
前記ＮＬＳの部分的な改変は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）ネイティブなＮＬＳの非塩基性アミノ酸残基を少なくとも一つ欠失させること；
（ｂ）ネイティブなＮＬＳに少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基を付加させること；および
（ｃ）ネイティブなＮＬＳに含まれる少なくとも一つの非塩基性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に置換すること；
のうちの少なくとも一つの処置を包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１６から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示される少なくとも１種類のアミノ酸配列を使用して前記ペプチド鎖の設計を行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下となるように該ペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
全アミノ酸残基数の４０％以上がアルギニン及び／又はリジンで構成されるようなペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列が２単位以上相互に近接して配置されるペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の９０％以上となるように、該ペプチド鎖を設計する、請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
化学合成法によって前記ペプチド鎖を有する抗菌性ポリペプチドを製造する、請求項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、そのペプチド鎖中に１種類又は２種類以上の核移行性配列（ＮＬＳ）及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列が２単位以上相互に近接して配置されており、該２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数はペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上であり、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下である、ポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数がペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の９０％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０７、または配列番号１１０に示すアミノ酸配列又は該配列の１、２又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含む、請求項２６又は２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、そのペプチド鎖中に１種類又は２種類以上の核移行性配列（ＮＬＳ）及び／又は該ＮＬＳに部分的な改変が施された配列を１単位又は２単位以上含んでおり、該１単位又は２単位以上のＮＬＳ及び／又はＮＬＳの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数は少なくとも５であり且つペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の３０％以上であり、更に該ペプチド鎖中に少なくとも１単位の核外移行性配列（ＮＥＳ）若しくは該ＮＥＳに部分的な改変が施された配列を含み、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下である、ポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、または配列番号９１に示すアミノ酸配列又は該配列の１、２又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド。
【請求項３２】
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下であり、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０７及び配列番号１１０から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示されるアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項３４】
配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０７及び配列番号１１０から成る群から選択されるいずれかの配列番号で示されるアミノ酸配列又は該配列において１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【国際調査報告】
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