(57)【要約】本発明は、リゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質を提供し、かかる物質はリゾホスファチジン酸の生理活性に起因する疾病の診断、リゾホスファチジン酸の生理活性に起因する症状の軽減または疾患の予防もしくは治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質。
【請求項２】
リゾホスファチジン酸合成酵素の抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の物質。
【請求項３】
被検化合物の存在下、リゾリン脂質とリゾホスファチジン酸合成酵素とを反応させ、リゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を測定することを特徴とするリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求の範囲第３項に記載のスクリーニング方法により選択されるリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質。
【請求項５】
リゾリン脂質とリゾホスファチジン酸合成酵素とを含有することを特徴とするリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質のスクリーニング用キット。
【請求項６】
請求の範囲第１項、第２項または第４項に記載の物質を含む医薬。
【請求項７】
ガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患または動脈硬化症の治療または予防薬であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の医薬。
【請求項８】
リゾホスファチジン酸合成酵素の活性を測定するか、またはリゾホスファチジン酸合成酵素の抗体を使用することを特徴とするガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患、動脈硬化症または妊娠中毒症の診断方法。
【請求項９】
（ａ）リゾリン脂質、または（ｂ）リゾホスファチジン酸合成酵素の抗体を含むことを特徴とするガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患、動脈硬化症または妊娠中毒症の診断用キット。
【請求項１０】
リゾホスファチジン酸合成酵素を含むことを特徴とする医薬。
【請求項１１】
妊娠中毒症の治療または予防薬であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の医薬。
【請求項１２】
ヌクレオチドまたはそのアナログを含むことを特徴とするリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、リゾホスファチジン酸合成酵素（以下、ＬＰＬＤという）のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質（以下、ＬＰＬＤ阻害物質という）およびＬＰＬＤ阻害物質のスクリーニング方法、ならびにリゾホスファチジン酸（以下、ＬＰＡという）の生理活性に起因する疾患の予防もしくは治療薬または前記疾患の診断方法等に関する。
背景技術
細胞膜に刺激が加わるとホスホリパーゼ群が活性化され、細胞膜等の構成リン脂質が分解され、アラキドン酸誘導体、血小板活性化因子、ＬＰＡ、スフィンゴシン−１−リン酸、アナンダミド等の脂質メディエーターが生体内でつくられる。近年、脂質メディエーターの１つであるＬＰＡは、さまざまな生理活性を持つことが見出されている（Ｔｏｋｕｍｕｒａ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３４，ｐ１５１−１８４（１９９５）、Ｍｏｏｌｅｎａａｒ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９，ｐ１６８−１７３（１９９７））。ＬＰＡが有する生理活性としては、例えば、細胞増殖の促進、細胞分化の抑制、がん細胞の浸潤促進、走行性の促進、細胞接着、アポトーシスの抑制などが挙げられ、かかる活性はヒトなどの疾病を惹起する場合がある。
従来、ＬＰＡの生合成経路については、以下のような考察がなされている。ＬＰＡはグリセロリン脂質のｄｅ  ｎｏｖｏ生合成系の最初の中間産物であり、Ｇ３Ｐ（ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の１位にアシル−ＣｏＡのアシル基がアシル転位酵素により付加されて作られる。この反応はリン脂質生合成系の律速反応であり、次の２位にアシル基を転移する反応のほうが早い。そのため、前記生合成系においてＬＰＡは直ちにホスファチジン酸（ＰＡ）になるから、この経路では通常は生体内に蓄積しない。生体内で生理活性物質として働くＬＰＡは、リン脂質分解系の産物であると考えられている（粂  和彦，細胞工学  Ｖｏｌ．１７Ｎｏ．５（１９９８））。細胞間にわたる伝達物質としてのＬＰＡの機能を考えると、細胞表面あるいは細胞外液でＬＰＡを生成する経路が合目的であり、本発明者の一人である徳村は、体液中にリゾリン脂質からＬＰＡを生成する活性があることを見出したが（Ｔｏｋｕｍｕｒａ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３４，ｐ１５１−１８４（１９９５））、その実体を解明できなかった。すなわち、リン脂質分解によるＬＰＡの生合成経路については、その詳細が十分に解明されたとは言えず、前記ＬＰＡの生合成に関わる酵素はいまだ特定されていない。
発明の開示
本発明は、ＬＰＡの生理活性に起因する疾病の診断方法、ＬＰＡの生理活性に起因する症状の軽減または疾患の予防もしくは治療に有用な物質、該物質のスクリーニング方法および該物質を含む医薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、ＬＰＡの生合成経路を解明すべく鋭意検討したところ、ＬＰＬＤを単離精製することに成功した。ＬＰＬＤの単離精製によって、ＬＰＬＤのＬＰＡ産生能を阻害する物質を製造することが可能になる。かかるＬＰＬＤ阻害物質は、上述したようなＬＰＡによる好ましくない生理活性の発現、例えば、ＬＰＡによるがん細胞の浸潤促進、がん細胞増殖の促進、走行性の促進などを抑えることができる。その結果、該ＬＰＬＤ阻害物質は、例えば抗がん剤などの医薬有効成分として使用することができる。
一方で、ＬＰＬＤの生体内量が通常よりも少ないことに起因して、例えば妊娠中毒症に代表されるような症状が出現する場合も考えられる。そこで、ＬＰＬＤを含む医薬は、前記症状もしくは疾患の予防または治療薬として使用することができる。
なお、単離精製されたＬＰＬＤのアミノ酸配列を決定したところ、Ａｕｔｏｔａｘｉｎ（Ｍａｒｙ  Ｌ．Ｓｔｒａｃｋｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．４，ｐｐ２５２４−２５２９（１９９２））として知られている細胞運動性促進タンパクと同じ構造を有することがわかった。しかし、ＡｕｔｏｔａｘｉｎがＬＰＡ生合成酵素であることは全く知られていない。
本発明者らは、このような新知見を得た後、さらに検討を重ね、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）  リゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質、
（２）  リゾホスファチジン酸合成酵素の抗体であることを特徴とする前記（１）に記載の物質、
（３）  被検化合物の存在下、リゾリン脂質とリゾホスファチジン酸合成酵素とを反応させ、リゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を測定することを特徴とするリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質のスクリーニング方法、
（４）  前記（３）に記載のスクリーニング方法により選択されるリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質、
（５）  リゾリン脂質とリゾホスファチジン酸合成酵素とを含有することを特徴とするリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能を阻害する物質のスクリーニング用キット、
（６）  前記（１）、（２）または（４）に記載の物質を含む医薬、
（７）  ガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患または動脈硬化症の治療または予防薬であることを特徴とする前記（６）に記載の医薬、
（８）  リゾホスファチジン酸合成酵素の活性を測定するか、またはリゾホスファチジン酸合成酵素の抗体を使用することを特徴とするガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患、動脈硬化症または妊娠中毒症の診断方法、
（９）  （ａ）リゾリン脂質、または（ｂ）リゾホスファチジン酸合成酵素の抗体を含むことを特徴とするガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患、動脈硬化症または妊娠中毒症の診断用キット、
（１０）  リゾホスファチジン酸合成酵素を含むことを特徴とする医薬、
（１１）  妊娠中毒症の治療または予防薬であることを特徴とする前記（１０）に記載の医薬、
（１２）  ヌクレオチドまたはそのアナログを含むことを特徴とするリゾホスファチジン酸合成酵素のリゾホスファチジン酸産生能阻害剤、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＬＰＬＤのＬＰＡ産生能を阻害する物質、すなわちＬＰＬＤ阻害物質を提供する。
ここで、ＬＰＡとしては、グリセロール骨格の１位または２位に脂肪酸を持ち、３位にリン酸基が結合した構造を持つ化合物が挙げられるが、３位のリン酸が環状に２位にも結合しているサイクリックホスファチジン酸も含めることができる。グリセロール骨格の１位に脂肪酸を有する化合物としては、１−アシルリゾホスファチジン酸、１−アルキルリゾホスファチジン酸、１−アルケニルリゾホスファチジン酸等が挙げられる。また、２位に脂肪酸を持つ化合物には２−アシルリゾホスファチジン酸等が挙げられる。脂肪酸は、直鎖であっても分鎖を有していてもよく、飽和であっても不飽和であってもよい。脂肪酸の炭素数は、約１２〜２４個程度であることが好ましい。本発明にかかるＬＰＬＤ阻害物質としては、上記ＬＰＡのうち、炭素数１２〜２４程度の不飽和脂肪酸を有するリゾホスファチジン酸の産生を阻害するものが好ましく、炭素数１２〜２４程度の直鎖不飽和脂肪酸を有する１−アシルリゾホスファチジン酸の産生を阻害するものがより好ましい。
本発明にかかるＬＰＬＤ阻害物質は、どのようなものでもよく、下記する方法により容易にスクリーニングすることができる。
なかでも、本発明にかかるＬＰＬＤ阻害物質の好適な例としては、ヌクレオチドまたはそのアナログが挙げられる。前記ヌクレオチドとしては、特に限定されず、ヌクレオシドの糖部分がリン酸エステルとなっている物質などが挙げられる。ヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基としては、アデノシン残基、グアノシン残基、シチジン残基、ウリジン残基もしくはリボチミジン残基などのリボヌクレオシド残基；デオキシアデノシン残基、デオキシグアノシン残基、デオキシシチジン残基、デオキシウリジン残基もしくはデオキシチミジン残基などのデオキシリボヌクレオシド残基；ジデオキシアデノシン残基、ジデオキシグアノシン残基、ジデオキシシチジン残基、ジデオキシウリジン残基もしくはジデオキシチミジン残基などのジデオキシリボヌクレオシド残基などが挙げられる。具体的に前記ヌクレオチドとしては、ヌクレオシド−５’−一リン酸、ヌクレオシド−５’−二リン酸、ヌクレオシド−５’−三リン酸、ヌクレオシド−３’−一リン酸またはリボヌクレオシド−２’−一リン酸などが挙げられる。ヌクレオチドのアナログとしては、特に限定されず公知の化合物を用いてよい。ｄＮＴＰ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣを示す。）の〔１−チオ〕トリホスフェート（またはα−チオトリホスフェート）アナログ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、７−Ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ、ｄＩＴＰ、ヒドロキシメチルｄＵＴＰ、２Ｍｅ−ＡＭＰ、２Ｍｅ−ＡＤＰ、２Ｍｅ−ＡＴＰ、１Ｍｅ−ＧＭＰ、１Ｍｅ−ＧＤＰ、１Ｍｅ−ＧＴＰ、５Ｍｅ−ＣＭＰ、５Ｍｅ−ＣＤＰ、５Ｍｅ−ＣＴＰ、５ＭｅＯ−ＣＭＰ、５ＭｅＯ−ＣＤＰ、５ＭｅＯ−ＣＴＰまたはｐ−ニトロフェニル−５’−ＴＭＰなどが挙げられる。本発明においてヌクレオチドまたはそのアナログは、ＡＴＰまたはｐ−ニトロフェニル−５’−ＴＭＰが特に好適な例として挙げられる。
さらに、本発明にかかるＬＰＬＤ阻害物質の他の好適な例としては、ＬＰＬＤまたはＬＰＬＤの部分ペプチドに対する抗体（以下、ＬＰＬＤ抗体という。）が挙げられる。前記ＬＰＬＤ抗体は、例えばポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。かかるＬＰＬＤ抗体は、ＬＰＬＤまたはＬＰＬＤの部分ペプチドを抗原として用い、公知の抗体製造方法に従って製造することができる。具体的には、前記ＬＰＬＤ抗体は、例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法  改訂第２版（堀尾武一編集  南江堂発行  １９９４年）」または「Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８２  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．１９９０」などに記載の方法に従って作製することができる。
より具体的に、上記本発明にかかるＬＰＬＤ抗体のうち、モノクローナル抗体（以下、ＬＰＬＤモノクローナル抗体という）は、例えば以下の方法に従って作製することができる。
まず、ＬＰＬＤまたはＬＰＬＤの部分ペプチドを、温血動物に対して、担体、希釈剤とともに投与する。このとき、動物への抗原投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。前記投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギまたはニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の約２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融含させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、公知の方法で行えばよい。例えば標識化したＬＰＬＤまたはＬＰＬＤの部分ペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５））に従い実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、ＰＥＧを用いるのが好ましい。骨髄腫細胞としては、例えばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１を用いるのが好ましい。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の程度で添加され、約２０〜４０℃程度、好ましくは約３０〜３７℃程度で約１〜１０分間程度インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
ＬＰＬＤ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、（ａ）例えば抗原を直接あるいは担体とともに吸着させたマイクロプレートなどの固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを加え、固相に結合したＬＰＬＤモノクローナル抗体を検出する方法、（ｂ）抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＬＰＬＤまたはＬＰＬＤの部分ペプチドを加え、マイクロプレートに結合したＬＰＬＤモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
ＬＰＬＤモノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノブテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば約１〜２０％程度、好ましくは約１０〜２０％程度の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、約１〜１０％程度の牛胎児血清を含むＧｌＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常約２０〜４０℃程度、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常約５日〜３週間程度、好ましくは約１週間〜２週間程度である。培養は、通常約５％炭酸ガス下で行なわれる。
ついで、ＬＰＬＤモノクローナル抗体を免疫グロブリンの分離精製方法に従って分離精製する。公知の免疫グロブリンの分離精製方法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、または抗原結合固相あるいはプロテインＡもしくはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などが挙げられる。
また、例えば前記本発明にかかるＬＰＬＤ抗体のうちポリクローナル抗体（以下、ＬＰＬＤポリクローナル抗体という。）は、以下のような方法で作製することができる。すなわち、上述した抗原（ＬＰＬＤまたはＬＰＬＤの部分ペプチド）自体、またはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のＬＰＬＤまたはＬＰＬＤの部分ペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
各工程について以下に詳細に述べる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等のキャリアー蛋白質を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。なかでも、前記縮合剤としては、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基もしくはジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
上述のような抗原とキャリアー蛋白質との複合体または抗原自体は、温血動物に対して抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ＬＰＬＤポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液または腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のＬＰＬＤポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
また、抗原がＬＰＬＤの部分ペプチドである場合は、ＰＶＰ法、グルタルアルデヒド法、ＭＢＳ法などの方法を用いて、前記ポリクローナル抗体を作製することができる。
ＬＰＬＤ抗体の作製において使用される抗原としてのＬＰＬＤは、下記の実施例に記載するようにヒトの血漿から単離精製することができる。また、ＬＰＬＤは、ヒトの血漿からのみならず、種々の生物の抽出液や培養液などから単離精製されたものを用いてよい。さらに、ＬＰＬＤは、遺伝子組換えによる蛋白質の発現方法により得ることができる。遺伝子組換え技術により得られるＬＰＬＤは、そのアミノ酸配列において置換、欠損、付加などの変異が起こっていてもよい。その場合、変異箇所は、１または数箇所、好ましくは約１〜４箇所であることが好ましい。遺伝子組換え技術によりＬＰＬＤを生成する方法は、該技術分野において十分に確立されているので常法にしたがってよい。具体的には、前記方法としては、まずＬＰＬＤをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、かかる発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、ついで形質転換体を培養し、培養物からＬＰＬＤを抽出精製するという方法が挙げられる。
ＬＰＬＤをコードするＤＮＡは、公知の塩基配列情報から容易に得ることができる。ＬＰＬＤをコードするＤＮＡの塩基配列情報は、Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｋａｗａｇｏｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（０４−ＦＥＢ−１９９５）ｔｏ  ｔｈｅ  ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．またはＨｉｒｏｙｕｋｉ  Ｋａｗａｇｏｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０（２），ｐ３８０−３８４（１９９５）に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のホスホジエステラーゼＩαのｃＤＮＡとして記載されている。
このとき、ＬＰＬＤをコードするＤＮＡは、公知の塩基配列情報と全く同一である必要はなく、相同性を有するものであればよい。具体的には、ＬＰＬＤをコードするＤＮＡとしては、公知の塩基配列情報の塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が好ましく、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡがより好ましい。前記ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
ＬＰＬＤをコードするＤＮＡは、例えば、上述の公知の塩基配列情報から公知方法を用いて化学合成によって得ることができる。化学合成法としては、例えばフォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法が挙げられる。また、該塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、各種生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから選択したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０））を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、上記のＤＮＡを取得することもできる。またさらに、公知塩基配列情報に基づき、その全長または一部を化学合成したＤＮＡまたはポリヌクレオチドをプローブとして、各種生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、上記ＤＮＡを取得することもできる。
また、上記のＤＮＡは公知のアミノ酸配列情報からも容易に得ることができる。ＬＰＬＤのアミノ酸配列情報は、Ｌｅｅ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１８（３），ｐ７１４−７１９（１９９６）に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）から単離されたａｕｔｏｔａｘｉｎとして記載されている。また、前記アミノ酸配列情報は、Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｋａｗａｇｏｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（０４−ＦＥＢ−１９９５）ｔｏ  ｔｈｅ  ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．またはＨｉｒｏｙｕｋｉ  Ｋａｗａｇｏｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０（２），ｐ３８０−３８４（１９９５）に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のホスホジエステラーゼＩαとして記載されている。さらに、前記アミノ酸配列情報は、Ｍｕｒａｔａ，Ｊ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：ｐ３０４７９−３０４８４またはＳｔｒａｃｋｅ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：ｐ２５２４−２５２９に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のａｕｔｏｔａｘｉｎ前駆体として記載されている。
公知のアミノ酸配列情報から上記のＤＮＡを得る方法としては、自体公知の方法を用いてよい。具体的には、例えば、公知のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって前記ｃＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅する方法、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡと、上記公知のアミノ酸配列の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したもの（プローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別する方法などが挙げられる。
以上述べてきたＬＰＬＤをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入する。前記発現ベクターとしては、大腸菌、枯草菌もしくは酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。また、発現ベクターとしては、プロモーターを有し、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含有しているものを用いることができる。
ついで、かかる発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。ついで形質転換された宿主細胞を培養し、培養物からＬＰＬＤを得る。形質転換の方法、宿主細胞の培養条件などは、宿主細胞の種類などにより異なり、例えば、モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８９）などに記載されている公知の条件に従って行うことができる。
抗体の作製において使用される抗原としてのＬＰＬＤの部分ペプチドは、上述のようにして得られるＬＰＬＤのいずれの部分であってもよい。還元条件下での精製ＬＰＬＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約７５ｋＤａと約３０ｋＤａの２つのタンパク質のバンドが見られる。そのため、約１１０ｋＤａのＬＰＬＤは、これら２つのペプチドがジスルフィド架橋を介して架橋することにより構成されている。したがって、本発明においては、前記約７５ｋＤａまたは約３０ｋＤａの２つのペプチドを抗原として用いることにより、本発明にかかる抗体を作製することができる。また、そのアミノ酸配列において置換、欠損、付加などの変異が起こっていてもよい。その場合、変異箇所は、１または数箇所、好ましくは約１〜４箇所であることが好ましい。ＬＰＬＤの部分ペプチドは、化学合成することができる。
本発明にかかるＬＰＬＤ阻害物質は、ＬＰＬＤの前駆体に対する抗体であってもよい。すなわち、上記のような抗体の作製において使用される抗原としては、ＬＰＬＤの前駆体であってもよい。以下「ＬＰＬＤ抗体」には、ＬＰＬＤの前駆体に対する抗体も含まれる。ＬＰＬＤは、推測される膜貫通ドメインをもつ前駆体タンパク質にある多様なタンパク質分解の切断部によって発生する。タンパク質分解の切断部の一つは、３５番目のアルギニンと３６番目のアラニンの間に位置しており、膜貫通ドメインを含むＮ末端部分が切り離される。
以上のようにして作製することができるＬＰＬＤ抗体を用いて、被検物質中のＬＰＬＤの量を測定することができる。ＬＰＬＤの量を測定することにより、ＬＰＡの生理活性に起因する症状または疾患の診断が可能になる。すなわち、ＬＰＬＤの量が通常よりも有意に多ければ、ＬＰＡの生理活性に起因する症状または疾患が発症している可能性が高く、前記症状または疾患の早期発見につながる。なお、ＬＰＡの生理活性に起因する症状または疾患については後述する。また、ＬＰＬＤの量を測定することにより、ＬＰＬＤの生体内量が通常よりも多いことまたは通常よりも少ないことに起因する症状または疾患の診断が可能になる。例えば、妊娠中毒症はＬＰＬＤ（ＬＰＡ−ＳＥ）の生体内量が通常よりも有意に少ない。そこで、生体から採取した被検物質中のＬＰＬＤ（ＬＰＡ−ＳＥ）の量を測定し、その量が通常よりも有意に少なければ、妊娠中毒症の可能性が高いと診断できる。
以上より、本発明は、（ａ）ＬＰＡの生理活性に起因する症状もしくは疾患、または（ｂ）ＬＰＬＤの生体内量が通常よりも多いことまたは通常よりも少ないことに起因する症状または疾患の診断方法、およびＬＰＬＤ抗体を含むことを特徴とする前記症状または疾患の診断用キットを提供する。
本発明にかかる診断方法および診断用キットにおいて用いるＬＰＬＤ抗体を使ったＬＰＬＤの測定方法としては、被検物質中の抗原、すなわちＬＰＬＤの量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定方法であれば、いずれの測定方法を用いてもよい。例えばネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。中でも、感度および特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。上記測定方法において、用いる抗体は抗体分子そのものを用いてもよく、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。また、ここで用いられるＬＰＬＤ抗体は、測定する被検物質を採取した生物種と同じ生物種から単離生成されたＬＰＬＤまたはその部分ペプチドを抗原として上述のように作製されたＬＰＬＤ抗体が好ましい。
標識物質を用いる上記測定方法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなどが挙げられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチンーアビジン系を用いることもできる。抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂またはガラス等が挙げられる。
上記測定方法としてサンドイッチ法を用いる場合の詳細な測定方法について以下に述べる。まず、不溶化したＬＰＬＤ抗体に被検物質を反応させ（１次反応）、さらに標識化ＬＰＬＤ抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検物質中のＬＰＬＤを定量することができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
また、（ａ）ＬＰＡの生理活性に起因する症状もしくは疾患、または（ｂ）ＬＰＬＤの生体内量が通常よりも多いことまたは通常よりも少ないことに起因する症状または疾患の診断方法としては、ＬＰＬＤの活性を測定することによっても行うことができる。
ＬＰＬＤの活性の測定は、例えば、ＬＰＬＤのＬＰＡ産生能を測定することによって行うことができる。ＬＰＬＤのＬＰＡ産生能を測定する方法としては、公知の方法を用いてよい。例えば、リゾリン脂質を基質として用い、該基質がＬＰＬＤの触媒作用により分解されてできた反応物の量を測ることにより測定できる。より具体的には、リゾホスファチジルコリンとＬＰＬＤを反応させることにより、生成するコリンまたはＬＰＡを公知方法で測定することで、ＬＰＬＤのＬＰＡ産生能を測定するという方法が好適に用いられる。ＬＰＡを測定する方法としては、放射性同位元素、有色物質または蛍光物質にて標識したリゾホスファチジルコリンから生じた標識ＬＰＡを放射活性測定、比色または蛍光測定により定量するという方法が挙げられる。このとき、標識として用いられる放射性同位元素、有色物質または蛍光物質としては、上述のような公知のものを用いてよい。また、前記コリンを測定する方法としては、コリンにコリンオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素の量をペルオキシダーゼにて測るという方法が挙げられる。
前記ＬＰＬＤ活性の測定方法の好ましい態様を以下に示す。まず、生体内から採取した例えば血液などの被検物質を、所望により２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）などを用いて希釈する。前記リゾリン脂質溶液と被検物質溶液とを約３７℃程度の温度下で約１時間程度インキュベートする。ついで、上記混液に発蛍光物質であるＨＰＰＡ（３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸）、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）などのペルオキシダーゼとコリンオキシターゼとを入れてよく混合する。この液を約３７℃程度で１５分間程度インキュベートする。以上の反応で生成された蛍光物質の蛍光強度を測定する（励起波長；３２０ｎｍ、発光波長；４０４ｎｍ）ことにより被検物質中のＬＰＬＤの活性を測定することができる。
また、本発明は、リゾリン脂質を含有することを特徴とする前記症状または疾患の診断用キットを提供する。
前記診断用キットにおいては、リゾリン脂質として放射性同位元素、有色物質または蛍光物質にて標識したリゾリン脂質を用いることが好ましい態様として挙げられる。この場合、被検物質中のＬＰＬＤの作用により、基質である標識リゾリン脂質が分解され、その結果生じる標識ＬＰＡの放射活性測定、比色または蛍光測定を行うにより、ＬＰＬＤの活性を測定することができる。
また、リゾリン脂質がリゾホスファチジルコリンである場合は、コリンオキシターゼおよびペルオキシダーゼがさらに組み合わされていることが他の好ましい態様として挙げられる。
前記診断用キットにおいては、リゾリン脂質、好ましくはリゾホスファチジルコリンが約０．２５重量％ＢＳＡを含む生理食塩水に最終濃度が約０．１５ｍＭ程度となるように溶解されていることが好ましい。
本発明は、ＬＰＬＤ阻害物質のスクリーニング方法も提供する。前記スクリーニング方法としては、ＬＰＬＤのＬＰＡの産生能を測定できる方法であればとくに限定されない。具体的には、前記スクリーニング方法としては、例えば、被検化合物の存在下、リゾリン脂質とＬＰＬＤとを反応させ、ＬＰＬＤのＬＰＡ産生能を測定し、ＬＰＡ産生能を低下させる物質をスクリーニングするという方法が挙げられる。
本発明にかかるスクリーニング方法で用いる被検化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられる。被検化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、被検化合物は、単一物質であってもよいし、混合物であってもよい。
上記スクリーニング方法で用いるリゾリン脂質としては、特に限定されないが、例えばリゾホスファチジルコリンなどが挙げられる。
本発明にかかるスクリーニング方法において、ＬＰＬＤのＬＰＡ産生能を測定する方法としては、公知の方法を用いてよく、上述のような方法を用いるのが特に好ましい。ここで用いるＬＰＬＤは、種々の生物の抽出液や培養液などから単離精製されたものを用いてよい。
本発明は、リゾリン脂質とＬＰＬＤとを含有することを特徴とする上記スクリーニング方法に好適に用いられるスクリーニング用キットをも提供する。スクリーニング用キットの態様としては、上述したリゾリン脂質を含む診断用キットに、さらにＬＰＬＤが含有されている態様が挙げられる。
本発明は、ＬＰＬＤ阻害物質を含有する医薬を提供する。ここで、ＬＰＬＤ阻害物質としては、ＬＰＬＤ抗体を用いることが好ましく、測定する被検物質を採取した生物種と同じ生物種から単離生成されたＬＰＬＤまたはその部分ペプチドを抗原として、上述のように作製されたＬＰＬＤ抗体を用いることがより好ましい。また、ＬＰＬＤ阻害物質としては、ヌクレオチドまたはそのアナログを用いることも好ましい。
前記医薬としては、ＬＰＬＤ阻害物質をそのまま、またはＬＰＬＤ阻害物質を溶液もしくは懸濁液にして、さらに前記溶液もしくは懸濁液を粒状もしくは粉状の乾燥物として投与してもよい。しかし、一般的には、有効成分であるＬＰＬＤ阻害物質と１または２以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。このような医薬組成物は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って製造することが可能である。
本発明にかかる医薬は、いかなる剤形を有していてもよい。例えば、経口投与に適する製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などを挙げることができる。非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを挙げることができる。
本発明にかかる医薬において、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを製剤用添加物として用いることができる。
本発明にかかる医薬において、生理学的に認められる担体に、有効成分であるＬＰＬＤ阻害物質と、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、結合剤、安定剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を、溶解または懸濁させることにより、非経口投与に適する製剤を調製することができる。
前記生理学的に認められる担体としては、例えば、製剤が注射剤の場合は、生理食塩水などの塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物、その他Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールなどの水性媒体が挙げられる。かかる水性媒体には、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などが添加されていてもよい。また、注射剤の担体としては、例えば、ゴマ油、大豆油などの油性液を用いることもできる。かかる油性液には、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどが添加されていてもよい。また、製剤が腸内投与のための坐剤の場合は、例えばカカオ脂、水素化脂肪または水素化カルボン酸などが、前記担体として挙げられる。
非経口投与に適する製剤の代表例である注射剤の製剤用添加物としては、具体的に、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝剤；例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど無痛化剤；例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど安定剤；例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど保存剤などが挙げられる。
本発明にかかる医薬は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
本発明の医薬の投与量および投与頻度は特に限定されず、治療すべき病態の種類、投与経路、患者の年齢および体重、症状、および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。例えば、静脈内注射で全身投与する場合は、成人一日あたり、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ程度、なかでも約０．１ｍｇ／ｋｇ程度を投与することが好ましく、経口投与の場合は、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度、なかでも約１ｍｇ／ｋｇ程度投与することが好ましい。しかし、投与量はこの特定の例に限定されることはない。
本発明にかかる医薬は、ＬＰＡの生理活性に起因する症状または疾患の予防または治療に用いることができる。ＬＰＡの生理活性に起因する症状としては、具体的にはガン細胞の浸潤促進、がん細胞増殖の促進、走行性の促進などが挙げられる。すなわち、本発明にかかる医薬は、ガン細胞の浸潤、がん細胞増殖および走行性などを阻害すること等により、ガンの予防または治療剤として用いることができる。本発明にかかる医薬を適用できる癌としては、特に限定されず、例えば大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、腹膜癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、扁平上皮癌などが挙げられる。とくに、本発明にかかる医薬は、前立腺癌、または卵巣癌、子宮癌（子宮内膜癌、子宮頸癌）もしくは腹膜癌などの婦人科ガンの予防または治療に用いることが好ましい。
また前記ＬＰＡの生理活性に起因する症状としては、具体的には男性生殖系疾患も挙げられる。すなわち、本発明にかかる医薬は、男性生殖系疾患の予防または治療剤として用いることができる。前記男性生殖系疾患としては、例えば、前立腺肥大、前立腺癌または前立腺炎などの前立腺疾患などが挙げられる。また前記ＬＰＡの生理活性に起因する症状としては、具体的には女性生殖系疾患も挙げられる。すなわち、本発明にかかる医薬は、女性生殖系疾患の予防または治療剤として用いることができる。女性生殖系疾患としては、上述の婦人科癌のみならず、例えば子宮内膜症などが挙げられる。さらに、前記疾患とまでは至らないが、男性生殖系または女性生殖系の正常機能のコントロールが失われている状態を改善したり、また前記状態に至らないよう予防したりするために、本発明にかかる医薬を用いることもできる。
さらに、本発明にかかる医薬は、動脈硬化、特にアテローム動脈硬化の予防または治療剤として用いることもできる。ＬＰＡは、単核細胞の血管内皮細胞への付着を誘導し、平滑筋細胞の増殖と脱分化を促進するが、本発明にかかる医薬に含まれるＬＰＬＤ阻害剤によりＬＰＡの産生が抑制されると、前記作用が抑制されるためである。これは、高コレステロールの食物を与えたウサギで、血清中のＬＰＬＤ活性の増加がみられることからも示唆される。
また、本発明は、ＬＰＬＤを含むことを特徴とするＬＰＬＤの生体内量が通常よりも多いことまたは通常よりも少ないことに起因する症状もしくは疾患の予防または治療薬を提供することもできる。また、前記医薬を投与することを特長とする前記症状もしくは疾患の予防または治療方法を提供することもできる。例えば、妊娠中毒症はＬＰＬＤの生体内量が通常よりも有意に少ない。そこで、ＬＰＬＤを含む医薬は、妊娠中毒症の予防または治療薬として有用である。
ヌクレオチドＰＤＥ活性を有するいくつかの画分が、ヒト血漿の電気泳動によって分離される。その一部は、ｐＮＴ−ＴＭＰに対するＫｍ値（３０ｍＭ）が他に対するＫｍ値よりもずっと高く、そして妊娠時に増加することがわかった。１６：０−ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）を用いた測定によれば、血漿ＬＰＬＤ活性はヒトの妊娠期に増加し、分娩後には妊娠していない女性のレベルにまで下がることがわかった。また、切迫早産の患者から妊娠第三期（一期は３ヶ月）に得られた血清におけるＬＰＬＤ活性は、正常な妊婦のものと比べて有意に高かった。したがって、ＬＰＡのＬＰＬＤに媒介された産物は、出産において生理的な役割を果たしている。そのため、例えば、ＬＰＬＤ阻害剤を含む医薬は、切迫早産の予防治療薬として用いることができる。また、上述のように出産後にはＬＰＬＤ活性が低下することから、出産後もＬＰＬＤ活性が低下しないことに起因する種々の症状の予防治療薬として用いることができる。一方、上述のようにＬＰＬＤは妊娠時に増加することから、妊娠時にＬＰＬＤが増加しないことに伴う種々の症状、例えば妊娠中毒症などの予防治療薬として用いることができる。また、ＬＰＬＤを含む医薬は、出産を促進するための医薬として、または陣痛促進剤として用いることもできる。
実施例
〔実施例１  ＬＰＬＤの精製〕
ヒト血漿から下記のようにしてＬＰＬＤを精製した。
まず、ヒト血漿９３７ｍｌに硫酸アンモニウム（以下、硫安という）１５３．７ｇ（３０％飽和硫安）を加え、氷中で１時間静置後、４℃の下８０００ｒｐｍで４０分間遠心処理した。ついで、上清をとり、上清（９５０ｍｌ）に硫安１７２ｇ（６０％飽和硫安）を加え、氷中で１時間静置後、４℃の下８０００ｒｐｍで４０分間遠心処理した。ついで、沈殿（硫安画分）に２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌを加えて沈殿を溶かし、得られた硫安画分溶液１００ｍｌを透析膜に入れ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）８Ｌ（途中、液交換１回）で計２６時間透析した。透析後の液量は、１９４ｍｌであった。
得られた透析後の液を、下記の条件で陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの条件
サンプル量；１０ｍｌ（２０回の繰り返し）
カラム；ハイプレップ（ＨｉＰｒｅｐ）１６／１０  Ｑ  ＸＬ（アマシャムファルマシアバイオテク（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）製）
緩衝液；Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），Ｂ＝Ａ＋１Ｍ塩化ナトリウム
溶出溶媒の傾斜；０→１００％Ｂ４０分（１００ｍｌ）
流量；２．５ｍｌ／分
分画；２．５ｍｌ／試験管
陰イオン交換クロマトグラフィー後、各フラクションのＬＰＬＤ活性測定を以下のように行った。まず、０．２５重量％ＢＳＡを含む生理食塩水に、最終濃度が０．１５ｍＭになるように溶解した１４：０  ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）５０μｌと、各画分１００μｌとを混合し、３７℃で１時間インキュベートした（一次アッセイ）。このとき、各画分に含まれるＬＰＬＤの量に応じてＬＰＣからコリンが産生される。この混液から１００μＬ取り、７．５ｍＭ  ＨＰＰＡ（３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸）０．２ｍｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２．６ｍｌ、２．０Ｕ／ｍｌ  ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）０．１ｍｌを加え、さらに３００Ｕ／ｍｌコリンオキシターゼ１０μＬを入れてよく混合し、この液を３７℃で１５分間インキュベートした。このとき産生されたコリンはコリンオキシターゼと反応し、過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素はＨＲＰを触媒として酸化発蛍光するＨＰＰＡが形成される。この最終的に生成された蛍光物質の蛍光強度を測定する（励起波長；３２０ｎｍ、発光波長；４０４ｎｍ）ことでコリンを定量することができる。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られたフラクションを回収した。回収したフラクションの液量の合計は３２０ｍｌであった。
上記のようにして回収された液を、下記の条件でハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけた。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの条件
サンプル量；２０ｍｌ（１６回の繰り返し）
カラム；ハイドロキシアパタイト  タイプＩ  カラム（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）５ｍｌ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製）
緩衝液；Ａ＝１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８），Ｂ＝５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）
溶出溶媒の傾斜；０→５０％Ｂ５０分（１００ｍｌ），５０→１００％Ｂ５分（１０ｍｌ）
流量；２ｍｌ／分
分画；２ｍｌ／試験管
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー後、各フラクションのＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られたフラクションを回収した。回収したフラクションの液量の合計は１９４ｍｌであった。
上記のようにして回収された液を、下記の条件でヘパリンアフィニティクロマトグラフィーにかけた。
ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーの条件
サンプル量；１０ｍｌ（２０回の繰り返し）
カラム；ハイトラップ  ヘパリン  ＨＰ（ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ）５ｍｌ（アマシャムファルマシアバイオテク（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）製）
緩衝液；Ａ＝５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），Ｂ＝Ａ＋１Ｍ塩化ナトリウム
溶出溶媒の傾斜；１５％Ｂ５分（１０ｍｌ），２５％Ｂ５分（１０ｍｌ），１００％Ｂ５分（１０ｍｌ）（段階的）
流量；２ｍｌ／分
分画；２ｍｌ／試験管
ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー後、各フラクションのＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られたフラクションを回収した。回収したフラクションの液量の合計は１２０ｍｌであった。
上記のようにして回収された液を、下記の条件でコンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィーにかけた。
コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィーの条件
サンプル量；２０ｍｌ（６回の繰り返し）
カラム；コンカナバリンＡ  セファロース（Ｃｏｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（アマシャムファルマシアバイオテク（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）製）／ＨＲ  １６／１０  １５ｍｌ
緩衝液；Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４），Ｂ＝Ａ＋０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
溶出溶媒の傾斜；１００％Ｂ３３分（５０ｍｌ）
流量；１．５ｍｌ／分
分画；１．５ｍｌ／試験管
コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィー後、各フラクションのＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られたフラクションを回収した。回収したフラクションの液量の合計は１８０ｍｌであった。
上記のようにして回収された液を、下記の条件で陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの条件
サンプル量；１５ｍｌ（１２回の繰り返し）
カラム；リソースＱ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ）６ｍｌ（アマシャムファルマシアバイオテク（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）製）
緩衝液；Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），Ｂ＝Ａ＋１Ｍ塩化ナトリウム
溶出溶媒の傾斜；０→５０％Ｂ５０分（５０ｍｌ），５０→１００％Ｂ５分（５ｍｌ），１００％Ｂ５分（５ｍｌ）
流量；２ｍｌ／分
分画；２ｍｌ／試験管
陰イオン交換クロマトグラフィー後、各フラクションのＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られたフラクションを回収した。回収したフラクションの液量の合計は２４ｍｌであった。
上記のようにして回収された液を限外ろ過法により濃縮した後に、下記の条件でゲルろ過クロマトグラフィーにかけた。
ゲルろ過クロマトグラフィーの条件
サンプル量；０．５ｍｌ（１０回の繰り返し）
カラム；スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００  ＨＲ  １０／３０
緩衝液；５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）＋０．２Ｍ塩化ナトリウム
流量；０．５ｍｌ／分
分画；０．５ｍｌ／試験管
ゲルろ過クロマトグラフィー後、各フラクションのＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られたフラクションを回収した。回収したフラクションの液量の合計１２ｍｌであった。以上のようにして、ヒト血漿からＬＰＬＤを精製できた。精製ＬＰＬＤはポリアクリルアミド電気泳動にて約１１万の分子量を示した。
〔実施例２  ＬＰＬＤ抗体の作製〕
実施例１で得られたＬＰＬＤを用いて、「蛋白質・酵素の基礎実験法  改訂第２版（堀尾武一編集  南江堂発行  １９９４年）」４９４〜４９８頁に記載の方法に従ってＬＰＬＤ抗体の作製を作製する。
〔実施例３  ＬＰＬＤのアミノ酸配列の同定〕
上記実施例１にて精製したヒト血漿ＬＰＬＤ画分をジチオスレイトール非存在下、７．５％ゲルでポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した。このゲルから１１０ｋＤａのバンドを切り出し、トリプシンで処理した。この処理後のタンパク質を直接、ナノエレクトロスプレーイオン化源を備えるタンデムマススペクトロメーター（Ｑ−Ｔｏｆ２）とつながった、Ｃ１８カラム（０．１×５０ｍｍ）を接続したナノスケール高速液体クロマトグラフィーにて分析し、陽イオンタンデムマススペクトルを測定した。このタンデムマススペクトルをマスコットサーチプログラム（Ｍａｓｃｏｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ）によりデータベース検索した。その結果、４つのアミノ酸配列断片がヒトのオートタキシン（Ａｕｔｏｔａｘｉｎ）（Ｌｅｅ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１８，７１４−７１９（１９９６））および、これと５アミノ酸残基（７３Ａｓｐ→Ｈｉｓ，１００Ａｌａ→Ｇｌｙ，６４４Ｓｅｒ→Ａｒｇ，７０３Ｖａｌ→Ａｌａ，７６９Ｔｙｒ→Ｈｉｓ）が異なるヒトのホスホジエステラーゼＩα（Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉ  α）（Ｋａｗａｇｏｅ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０，３８０−３８４（１９９５））の配列と一致した。
さらに、上記条件と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜に電気的（２００ｍＡ）に転写した。この膜をクマシーブリリアントブルー染色後１１０ｋＤａのバンドを切り出し、精製ＬＰＬＤタンパク質のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーにて分析した。その結果、ヒトのオートタキシンおよびホスホジエステラーゼＩαの部分配列と一致する２種類のＮ末端配列を決定できた。これらの結果を第１図に示す。
〔実施例４  抗ＬＰＬＤ抗体の作製〕
＜工程  １  免疫感作＞
ＬＰＬＤのアミノ酸配列（第１図参照）のうち３０９〜３２７番目部位についてペプチドを合成し、このＬＰＬＤ合成ペプチド６．３ｍｇをキーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）１３．４ｍｇに結合させたもの１ｍｇについて、フロイントの完全アジュバントと等量混合し、ウサギの背部皮下および大腿部筋肉に分散投与した。２、４、６及び８週間後にそれぞれペプチド−ＫＬＨ  １ｍｇをフロイントの不完全アジュバントと等量混合したものをウサギの背部皮下および大腿部筋肉に分散投与し、合計５回免疫を行った。
＜工程  ２  硫安分画＞
上記で免疫感作したウサギから全血液を採血し、血清５０ｍｌに硫酸アンモニウム（以下、硫安という）飽和溶液３４ｍｌ（４０％飽和硫安）を加え、２〜１０℃で一晩静置後、４℃、３０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。遠心後の沈殿に蒸留水１５ｍｌを加えて溶かし、得られた溶液を透析膜に入れ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳという）に対して透析した（途中、液交換３回）。透析後、溶液を０．４５μｍのフィルターでろ過した。
＜工程  ３  プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー＞
４０ｍｌのプロテインＡカラムをＰＢＳで平衡化した後、上記透析後溶液をアプライし、素通り画分にタンパク質の溶出がなくなるまで同緩衝液にて洗浄した。その後、１００ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ３．０）で抗体を溶出させ、この溶出を回収後直ちに１Ｍトリス溶液（ｐＨ９．０）を添加して中和した。
この溶出した抗体を透析膜に入れ、ＰＢＳで透析した（途中、液交換３回）。透析後、溶液を０．４５μｍのフィルターでろ過した。
＜工程  ４  ウエスタンブロット＞
上記の実施例１に従って精製されたＬＰＬＤタンパク質を７．５％ゲルによりＳＤＳ−ＰＡＧＥし、これをＰＶＤＦ膜に電気的（２００ｍＡ）に転写した。転写後の膜をブロックエース（大日本製薬）で、４℃で一晩ブロッキングした。上記精製抗体を１０％ブロックエースで１０００倍に希釈した溶液で、ＰＶＤＦ膜を室温にて２時間反応させた。０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む１０％ブロックエースにて５分間の洗浄を３回繰り返した後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ抗体を１０％ブロックエースで１００００倍に希釈した溶液で、ＰＶＤＦ膜を室温にて１時間反応させた。ＰＢＳにて５分間の洗浄を３回繰り返した。その後、３−アミノ−９−エチルカルバゾールを６ｍｌジメチルスルホキシドに溶解したものおよび、３０％過酸化水素水３０μｌを加えた５０ｍｌのＰＢＳを用いて発色させた。第２図のように上記精製抗体は１１０ｋＤａのタンパク質と特異的に反応することがわかった。また、この分子量は上記実施例１によって精製されたＬＰＬＤタンパク質の分子量と一致しており、この抗体がＬＰＬＤタンパク質を正しく認識していることを確認した。
〔実施例５  ヒト血漿ＬＰＬＤの精製〕
ヒト血漿から下記のようにしてＬＰＬＤを精製した。
＜工程１  硫安分画および透析＞
まず、ヒト血漿１１５０ｍｌに硫酸アンモニウム（以下、硫安という）１８０．９５ｇ（３０％飽和硫安）を加え、氷中で１時間静置後、４℃，８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。次に、この上清に硫安２０４．０５ｇ（６０％飽和硫安）を加え、氷中で１時間静置後、４℃，８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。この沈殿（硫安画分）に２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて沈殿を溶かし、得られた硫安画分溶液１４４ｍｌを透析膜に入れ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０リットル（途中、液交換１回）で計３８時間透析した。透析後の液量は、２３４．６ｍｌであった。
＜工程２  陰イオン交換クロマトグラフィー▲１▼＞
得られた透析後の液を、下記の条件で陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの条件
サンプル量；１５ｍｌ（１１回の繰り返し）
カラム；ハイプレップ（ＨｉＰｒｅｐ）１６／１０  Ｑ  ＸＬ（アマシャムファルマシアバイオテク（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）製）
緩衝液；Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），Ｂ＝Ａ＋１Ｍ塩化ナトリウム
溶出溶媒の傾斜；０→１００％Ｂ４０分（１００ｍｌ）
流量；２．５ｍｌ／分
分画；２．５ｍｌ／試験管
陰イオン交換クロマトグラフィー後、各画分のＬＰＬＤ活性測定を以下のように行った。まず、０．２５重量％ＢＳＡ（ウシ血漿アルブミン）を含む生理食塩水に、最終濃度が０．１５ｍＭになるように溶解した１４：０  ＬＰＣ（リゾフォスファチジルコリン）５０μｌと、各画分１０μｌ及び１００μｌの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、３７℃で１時間インキュベートした。このとき、各画分に含まれるＬＰＬＤの量に応じてＬＰＣからコリンが産生される。この混液から１００μｌを取り、７．５ｍＭ  ＨＰＰＡ（３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸）０．２ｍｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２．６ｍｌ、２．０Ｕ／ｍｌ  ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）０．１ｍｌを加え、さらに３００Ｕ／ｍｌコリンオキシターゼ１０μｌを入れてよく混合し、この液を３７℃で１５分間インキュベートした。このとき産生されたコリンはコリンオキシダーゼと反応し、過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素はＨＲＰを触媒として酸化発蛍光するＨＰＰＡが形成される。この最終的に生成された蛍光物質の蛍光強度を測定する（励起波長；３２０ｎｍ、蛍光波長；４０４ｎｍ）ことでコリンを定量することができる。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られた画分を回収した。回収した画分の液量の合計は２２０ｍｌであった。
＜工程３  ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー＞
上記のようにして回収された液を、下記の条件でハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけた。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの条件
サンプル量；２０ｍｌ（１０回の繰り返し）
カラム；バイオスケール  セラミック  ハイドロキシアパタイト  タイプＩ  カラム（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）５ｍｌ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製）
緩衝液；Ａ＝１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８），Ｂ＝５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）
溶出溶媒の傾斜；０→５０％Ｂ５０分（７５ｍｌ），５０→１００％Ｂ５分（７．５ｍｌ）
流量；１．５ｍｌ／分
分画；１．５ｍｌ／試験管
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー後、各画分のＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られた画分を回収した。回収した画分の液量の合計は８８ｍｌであった。
＜工程４  ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー＞
上記のようにして回収された液を、下記の条件でヘパリンアフィニティクロマトグラフィーにかけた。
ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーの条件
サンプル量；１５ｍｌ（６回の繰り返し）
カラム；ハイトラップ  ヘパリン  ＨＰ（ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ）５ｍｌ（アマシャムファルマシアバイオテク（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）製）
緩衝液；Ａ＝５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），Ｂ＝Ａ＋１Ｍ塩化ナトリウム
溶出溶媒の傾斜；１５％Ｂ５分（１０ｍｌ），２５％Ｂ５分（１０ｍｌ），１００％Ｂ５分（１０ｍｌ）（段階的）
流速；２ｍｌ／分
分画；２ｍｌ／試験管
ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー後、各画分のＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られた画分を回収した。回収した画分の液量の合計は５５ｍｌであった。
＜工程５  コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィー＞
上記のようにして回収された液を、下記の条件でコンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィーにかけた。
コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィーの条件
サンプル量；２２ｍｌ（２回の繰り返し）
カラム；コンカナバリンＡ  セファロース（Ｃｏｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（アマシャムファルマシアバイオテク（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）製）／ＨＲ  １６／１０  １５ｍｌ
緩衝液；Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４），Ｂ＝Ａ＋０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
溶出溶媒の傾斜；１００％Ｂ３３分（５０ｍｌ）
流速；１．５ｍｌ／分
分画；１．５ｍｌ／試験管
コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィー後、各画分のＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られた画分を回収した。回収した画分の液量の合計は１２１．６ｍｌであった。
＜工程６  疎水性クロマトグラフィー＞
上記のようにして回収された液を、下記の条件で疎水性クロマトグラフィーにかけた。
疎水性クロマトグラフィーの条件
サンプル量；２３ｍｌ（５回の繰り返し）
カラム；ＴＳＫゲル  フェニル−５ＰＷ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ）（７．５×７５ｍｍ）（東ソー株式会社製）
緩衝液；Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），Ｂ＝Ａ＋１Ｍ硫酸アンモニウム
溶出溶媒の傾斜；１００→０％Ｂ５０分（５０ｍｌ）
流量；１ｍｌ／分
分画；１ｍｌ／試験管
疎水性クロマトグラフィー後、各画分のＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。
この活性測定でＬＰＬＤ活性が見られた画分を回収した。回収した画分の液量の合計は７８．１ｍｌであった。
＜工程７  陰イオン交換クロマトグラフィー▲２▼＞
上記のようにして回収された液を、さらに下記の条件で陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの条件
サンプル量；５０ｍｌ
カラム；ＴＳＫゲル  バイオアシストＱ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｉｏ−Ａｓｓｉｓｔ  Ｑ）（４．６×５０ｍｍ）（東ソー株式会社製）
緩衝液；Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）＋２０％グリセロール，Ｂ＝Ａ＋１Ｍ塩化ナトリウム
溶出溶媒の傾斜；０→５０％Ｂ５０分（２５ｍｌ），５０→１００％Ｂ５分（２．５ｍｌ）
流量；０．５ｍｌ／分
分画；０．５ｍｌ／試験管
陰イオン交換クロマトグラフィー後、各画分のＬＰＬＤ活性測定を上記と同様に行った。その結果を第３図に示す。画分４６〜５１を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、得られたゲルを銀染色した。その結果を第４図に示した。矢印は、ＬＰＬＤ活性を有する１１０ｋＤａのバンドである。また、同じ画分に最終濃度０．５％ジチオスレイトールを加え、９５℃で５分加熱処理後１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、得られたゲルを銀染色した。その結果を第４図Ｂに示した。還元条件下において、ＬＰＬＤの１１０ｋＤａバンドは７７ｋＤａと３０ｋＤａの２本のバンド（矢印）にわかれた。なお、本分析で還元条件下においても分解しない１１０ｋＤａのバンドが存在したことから、本サンプル中にはタンパク質配列内部で切断されていない分子種も存在することが分かる。
各工程において回収された液中の総タンパク質量、総ＬＰＬＤ活性および、そこから得られたＬＰＬＤタンパク質の収率、精製率を第１表に示す。なお、総活性におけるｕｎｉｔは、各液中に含まれるＬＰＬＤの量に応じてＬＰＣから１時間に産生されるコリンの量（ｎｍｏｌ）を示す。「−」は値を測定できなかった項目に記入している。
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〔実施例６〕
ヒト血漿から精製したＬＰＬＤの基質特異性を、下記３つの方法により調べた。結果は、同じ測定を３回行い、その平均値で示した。
（Ａ）精製した血漿ＬＰＬＤによるパルミトイル（１６：０）−ＬＰＣおよびｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ５’−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｐＮＰ−ＴＭＰという。）の加水分解の経時変化を、下記のようにして測定した。すなわち、精製した血漿ＬＰＬＤサンプル（０．０３ｍｌ）を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈して０．１ｍＬにし、０．４５ｍＭの１６：０−ＬＰＣ  ０．０５ｍＬとともに、３０μＭのＣｏ２＋の存在下および非存在下、３７℃で１〜２４時間インキュベートした。アッセイ混合液中０．１ｍｌ中に生成したコリンを、実施例１に記載の方法と全く同じ方法で測定し、ＬＰＬＤ活性を測定した。また、精製した血漿ＬＰＬＤサンプル（０．１ｍＬ）を０．４５ｍＭのｐＮＰ−ＴＭＰ  ０．０５ｍｌとともに、３０μＭのＣｏ２＋の存在下および非存在下、３７℃で１〜２４時間インキュベートした。アッセイ混合液（０．１ｍＬ）を０．１ＮのＮａＯＨ  １．０ｍｌとともに混合し、４００ｎｍでの吸光度を測定し、ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）（以下、ＰＤＥという。）活性を測定した。
前記試験の結果を第５図Ａに示した。２４時間におけるＬＰＬＤ活性は、ＰＤＥ活性よりも低かったが、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔから算出される１６：０−ＬＰＣに対するＬＰＬＤ活性のＫｍ値は０．２６±０．５ｍＭであり、ｐＮＰ−ＴＭＰに対するＰＤＥ活性のＫｍ値５．５±０．５ｍＭよりも、ずっと低かった。Ｃｏ２＋は、ＬＰＬＤ活性だけでなく、ＰＤＥ活性をも増加させた。
（Ｂ）ＡＴＰおよびｐＮＰ−ＴＭＰのＬＰＬＤ活性に対する効果を、精製した血漿ＬＰＬＤの３．３倍希釈溶液で測定した。ＡＴＰまたはｐＮＰ−ＴＭＰを第５図Ｂに示した濃度で前記血漿ＬＰＬＤの希釈溶液に混合した混合液（０．１ｍｌ）をＣｏ２＋の非存在下で０．４５ｍＭの１６：０−ＬＰＣ  ０．０５ｍｌとともに２４時間インキュベートした。かかる試験の結果を、第５図Ｂに示した。第５図Ｂから明らかなように、ＡＴＰおよびｐＮＰ−ＴＭＰは、濃度依存的にＬＰＬＤ活性を抑制した。
上記（Ａ）および（Ｂ）の結果から、精製された血漿ＬＰＬＤは、ＰＤＥ活性を有し、かつ、ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）、ＡＴＰおよびｐＮＰ−ＴＭＰの活性部位には重複があることがわかった。
（Ｃ）精製したＬＰＬＤの基質特異性を、上述したように、３０μＭのＣｏ２＋の存在下および非存在下で、第５図Ｃに示した様々なコリンリン脂質を最終濃度０．１５ｍＭで用いて測定した。かかる基質特異性は、Ｃｏ２＋の非存在下での１８：２−ＬＰＣに対するＬＰＬＤの基質特異性と比較したときの比活性（％）として示した。かかる試験の結果を第５図Ｃに示した。
上記の試験を行った結果、ＬＰＬＤの基質特異性はアシルＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）＞アルキルＬＰＣ＞アルケニルＬＰＣの順序で高く、ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＧＰＣ）に対する特異性は見られなかった。このことから、活性には脂肪酸部分と活性部位におけるアミノ酸残基との疎水性相互作用が必要であることが示唆された。
１−ミリストイル（Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）（１４：０）−ＬＰＣは、飽和脂肪アシルＬＰＣのなかで最もよい基質であり、不飽和Ｃ１８−脂肪アシルＬＰＣは飽和脂肪アシルＬＰＣより基質特異性が高かった。ＬＰＬＤは、ＬＰＬＤ活性を測定する間アセチル移行を最小化するためにアセチル化された２−アラキドノイル（２０：４）−ＬＰＣを加水分解するが、その速度はアセチル化１−２０：４−ＬＰＣの加水分解速度よりも高かった（第５図Ｃ）。従って、ＬＰＬＤは、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ（Ｅｄｇ）７ＬＰＡレセプターに対する好ましいＬＰＡをより効率よく供給する。Ｅｄｇ７は、ＬＰＡの１−飽和アシル基または不飽和アシル基よりも、２−不飽和アシル基に応答する。ＬＰＬＤは、ホスファチジルコリン（ＰＣｓ）を、２つの飽和短鎖または長鎖アシル基に加水分解するのではなく、２つの飽和中鎖アシル基に加水分解する（第５図Ｃ）。
Ｃｏ２＋は、アシルＬＰＣ、および１−リノレオイル（１８：２）−ＬＰＣを除く関連類似体の全ての活性を増加させた。また、飽和アシルＬＰＣの最適鎖長を１４から１２へ、ＰＣの最適鎖長を１０から８へそれぞれ変化させた。さらに、不飽和アシルＬＰＡのｃｉｓ二重結合の最適数は２から１に変化した。このような精製ＬＰＬＤの基質特異性におけるＣｏ２＋で誘導された変更は、Ｃｏ２＋イオンが、ａｕｔｏｔａｘｉｎの２段階触媒反応で重要な役割をしている、ＬＰＬＤにもともと結合している金属イオンと交換されることを示唆している。
産業上の利用可能性
本発明は、今まで解明されていなかったＬＰＡの生合成に関与する酵素（ＬＰＬＤ）の単離精製に成功したことに基づき、ＬＰＬＤ阻害物質を提供する。かかるＬＰＬＤ阻害物質は、ＬＰＡの生理活性に起因する症状または疾患の予防または治療に用いることができる。より具体的には、本発明にかかる医薬は、ガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患、動脈硬化症の予防または治療に有用である。また、本発明は、ＬＰＬＤ阻害物質のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットをも提供する。これにより、前記症状または疾患の予防または治療薬として用いることができる物質を容易に選択することができるようになる。
本発明にかかる診断方法または診断薬を用いることにより、（ａ）ＬＰＡの生理活性に起因する症状もしくは疾患、または（ｂ）ＬＰＬＤの生体内量が通常よりも多いことまたは通常よりも少ないことに起因する症状または疾患の早期発見または治療が容易になる。本発明にかかる診断方法または診断薬は、とくにガン、男性生殖系疾患、女性生殖系疾患、動脈硬化症または妊娠中毒症の診断に用いることが好ましい。
本発明は、さらにＬＰＬＤを含む医薬を提供する。かかる医薬は、妊娠中毒症などのＬＰＬＤの体内量が通常より少ないことに起因する症状や疾患の予防または治療薬、出産の促進もしくは陣痛の促進に用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、決定したＬＰＬＤのアミノ酸配列とヒトオートタキシンのアミノ酸配列の比較を示す。
ヒトオートタキシンのアミノ酸配列（Ｋａｗａｇｏｅ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０，３８０−３８４（１９９５））は１文字表記で示している。精製ヒト血漿ＬＰＬＤの、タンデムマス解析により得られたヒトオートタキシンの配列に一致する４つのペプチド断片を二重の下線で示す。また、プロテインシークエンサーの分析から決定した同精製ＬＰＬＤの２種類のＮ末端配列を一重の下線で示す。同配列に網掛けした領域は、抗ＬＰＬＤ抗体作製のために合成したペプチド配列を示す。
第２図は、抗ＬＰＬＤ抗体を用いたＬＰＬＤタンパク質のウエスタンブロットの結果を示す。
精製ヒト血漿ＬＰＬＤ画分をジチオスレイトール非存在下、７．５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後に、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を抗ＬＰＬＤ抗体で処理し、発色させたところ、約１１０ｋＤａの位置にバンドが検出できた。このバンドの位置は精製ＬＰＬＤタンパク質の分子量と一致する。
第３図は、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＬＰＬＤタンパク質の溶出曲線を示す。
ＴＳＫゲル  バイオアシストＱカラムを用いたクロマトグラフィーにおける２８０ｎｍの溶出曲線と、各溶出画分のＬＰＬＤ活性を示す。ＬＰＬＤ活性は最終濃度０．１５ｍＭの１４：０−ＬＰＣを基質とし、１時間のインキュベート後に測定した。
第４図は、精製ＬＰＬＤタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
第３図に示す陰イオン交換クロマトグラフィーの画分４６〜５１をジチオスレイトール非存在下、７．５％ゲル使用（Ａ）、あるいは最終濃度０．５％ジチオスレイトール存在下、１２．５％ゲル使用（Ｂ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥし、銀染色を行った。矢印は１１０ｋＤａ（Ａ）、１１０，７７，３０ｋＤａ（Ｂ）のＬＰＬＤタンパク質のバンドを示す。
第５図は、ヒト血漿ＬＰＬＤの基質特異性を示す。
Ａ；精製血漿ＬＰＬＤにおけるＬＰＬＤ活性及びヌクレオチドホスホジステラーゼ（ＰＤＥ）活性の経時変化を３０μＭ  Ｃｏ２＋存在下あるいは非存在下条件で測定した。
Ｂ；ＬＰＬＤ活性に対するＡＴＰ及びｐ−ニトロフェニル５’−チミジンリン酸（ｐＮＰ−ＴＭＰ）の影響を、精製血漿ＬＰＬＤの３．３倍希釈溶液を用いて調べた。
Ｃ；精製ＬＰＬＤの基質特異性を、最終濃度０．１５ｍＭの種々のコリンリン脂質及びｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）について、３０μＭ  Ｃｏ２＋存在下あるいは非存在下条件で調べた。グラフ上の値はＣｏ２＋非存在下での１８：２−ＬＰＣの活性を１００％とした相対活性（％）で表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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