(57)【要約】抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質をスクリーニングするのに有効なツールとなるカリウムチャネルＢＥＣ１を過剰発現したトランスジェニックマウスを開示する。また、該マウスの記憶学習能力を指標とした抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング方法、不安の亢進を指標とした抗不安用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング方法を開示する。さらに、前記スクリーニング方法により得ることができる、記憶学習カリウムチャネルの活性を阻害する物質を有効成分とする抗痴呆用、記憶学習改善用又は抗不安用医薬組成物の製造方法を開示する。
2003041496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドとプロモーターとからなる配列が導入されているトランスジェニック動物。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物及びその子孫動物であって、染色体上に上記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において該カリウムチャネルを発現することを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、脳に限定して発現されるポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる請求の範囲１又は請求の範囲２記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなりしかもカリウムチャネルであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとからなる配列が導入されたトランスジェニック動物。
【請求項５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもカリウムチャネルであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物及びその子孫動物であって、染色体上に上記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において該カリウムチャネルを発現することを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも脳に限定して発現されるポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる請求の範囲４又は請求の範囲５記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
プロモーターが、カリウムチャネルを脳に限定して発現させるプロモーターである請求の範囲１乃至請求の範囲６記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
プロモーターがα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩプロモーターである請求の範囲１乃至請求の範囲７記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
非ヒト動物がマウスである請求の範囲１乃至請求の範囲８記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
請求の範囲１乃至請求の範囲９に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
記憶学習能力を測定する工程
を含むことを特徴とする、被験物質が該カリウムチャネルを阻害するか否かを検出する方法。
【請求項１１】
請求の範囲１乃至請求の範囲９に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
不安を測定する工程
を含むことを特徴とする、被験物質が該カリウムチャネルを阻害するか否かを検出する方法。
【請求項１２】
請求の範囲１乃至請求の範囲９に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
記憶学習能力を測定する工程
を含むことを特徴とする、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を検出する方法。
【請求項１３】
請求の範囲１乃至請求の範囲９に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
不安を測定する工程
を含むことを特徴とする、不安抑制効果を検出する方法。
【請求項１４】
請求の範囲１乃至請求の範囲９に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、記憶学習能力を測定する工程及び
抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のスクリーニング法。
【請求項１５】
請求の範囲１乃至請求の範囲９に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、不安を測定する工程及び
不安抑制効果を有する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、抗不安用物質のスクリーニング法。
【請求項１６】
請求の範囲１４に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、抗痴呆用又は記憶学習改善治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項１７】
請求の範囲１５に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、抗不安作用のための医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質又は抗不安用物質をスクリーニングするのに有効なツールとなるモデル動物、そして、該モデル動物を用いた新規な抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質又は抗不安用物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
ヒトの精神活動の重要な部分を占める新しい情報の学習の障害と、すでに学習していた情報の保持ならびに想起の障害についての研究は、生命科学最後のフロンティアとされてきた脳の高次機能解明への中心的な課題である。しかしながら、現在でもなお、その障害の原因は不明であり、未だ充分に有効な薬剤はなく、治療薬の早急な出現が要望されている。痴呆患者の記憶学習障害をある程度改善することが報告されている薬剤についても、作用持続が短い、臨床有効幅が狭い（Ｆｅｌｄｍａｎ  Ｈら、（２００１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５７（４）、６１３−２０）、肝毒性等の副作用がでる（Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＷＫら、（１９８９）Ｌａｎｃｅｔ．１（８６４０）、７２９）ことなどが指摘されている。また、有効な治療効果を示す薬剤を見いだすためには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性だけではなく、薬剤自体のｉｎ  ｖｉｖｏでの生体内利用率や脳内移行性を考慮に入れる必要がある。従って、発症メカニズムの解明、発症の予防もしくは病態の改善、治療のための医療技術及び薬剤の開発等のためには、個体レベルで解析可能なモデル動物の存在が不可欠である。
トランスジェニックマウスは、遺伝子の機能を生体内で見せる方法として，人体の各疾患のモデル開発とこれによる各種治療剤の開発が期待されるものである。生きる生命に対して世界で最初に特許を受けた白血病モデルであるｃ−ｍｙｃ癌遺伝子導入トランスジェニックマウス（米国特許第５０８７５７１号）を初めとして、前立腺肥大マウス（米国特許第５１７５３８３号）や糖尿病発生マウス（日本国特許第２７７１４９３号）、アルツハイマー病モデルマウス（Ｇａｍｅｓ  Ｄら、（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ３７３（６５１４）、５２３−７）等、様々な病態モデルマウスが紹介されてきている。ＡＰＰトランスジェニックを代表とする痴呆関連のトランスジェニック動物の多くは痴呆の病理変化を示すもののこれらの動物で記憶学習の障害を行動様式として検出することは困難であり、加齢などいくつかの要因をプラスして検出することが試みられている（Ｍｏｒａｎ  ＰＭら、（１９９５）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９２、５３４１−５３４５；Ｈｓｉａｏ  Ｋら、（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４、９９−１０２；Ａｒｅｎｄａｓｈ  ＧＷら、（２００１）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９１、４２−５３）。しかしながら、そうしたトランスジェニック動物の作製には時間がかかり、抗痴呆用物質をスクリーニングするために記憶学習の障害を行動様式として検出できるトランスジェニック動物を大量かつ簡便に作製し利用することは現実的ではなかった。
従って、抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質をスクリーニングするのに有効なツールとなるモデル動物、該モデル動物を用いた抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のスクリーニング方法が待望されている。
一方、不安は、現在の又は潜在的な危険に対する警告として作用する生理的現象である。不安は、何も現実の危険がないのに起こるとき、又はその感情の強さが激化するときに病的なものになる。生理的及び病的不安は両方とも、器官障害が以前から存在しているにも関わらず発生すると生命を脅かし得るし、また種々の生理的機能不全を起こすか又は永続させるかもしれないことが知られている。不安のモデルとなるトランスジェニック動物に関しての種々の報告（Ｈｏｌｍｅｓ  Ａ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ  ２５（３）、２６１−７３）がある。しかしながら、現在でもなお、副作用の少ない利用可能な最適な薬剤はない。
本発明のトランスジェニック動物の作製に用いることのできるカリウムチャネルＢＥＣ１については本発明者らがＷＯ９９／３７６７７に開示しており、また、ＢＥＣ１と９８−９９％の相同性を有するポリヌクレオチド、ポリペプチドについては種々の報告（ＷＯ００／０５３４６、ＷＯ００／０９５３４、ＷＯ９９／４３６９６）がある。しかしながら、ＢＥＣ１トランスジェニック動物は現実に作製されておらず、その機能について全て理解されているわけではなかった。
発明の開示
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、カリウムチャネルＢＥＣ１（Ｍｉｙａｋｅ  Ａ．ら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７４、２５０１８−２５０２５）を過剰発現したトランスジェニックマウスの作製に成功、該トランスジェニックマウスの記憶学習能力が低下し、抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のスクリーニングツールになることを見出した。また、意外にも、該トランスジェニックマウスの不安が亢進し、抗不安用物質のスクリーニングツールになることを見出した。更に、該トランスジェニックマウスの記憶学習能力を指標とすることにより抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング系を、該トランスジェニックマウスの不安を指標とすることにより抗不安用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング系を構築した。この結果、抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質又は抗不安用物質をスクリーニングするのに有効なツールとなるモデル動物であるＢＥＣ１トランスジェニック動物及び該トランスジェニック動物を用いた抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質又は抗不安用物質のスクリーニング方法を提供し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドとプロモーターとからなる配列が導入されているトランスジェニック動物、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物及びその子孫動物であって、染色体上に上記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において該カリウムチャネルを発現することを特徴とするトランスジェニック動物、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、脳に限定して発現されるポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる（１）又は（２）記載のトランスジェニック動物、
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなりしかもカリウムチャネルであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとからなる配列が導入されたトランスジェニック動物、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもカリウムチャネルであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物及びその子孫動物であって、染色体上に上記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において該カリウムチャネルを発現することを特徴とするトランスジェニック動物、
（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも脳に限定して発現されるポリペプチドであるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドをプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる（４）又は（５）記載のトランスジェニック動物、
（７）プロモーターが、カリウムチャネルを脳に限定して発現させるプロモーターである（１）乃至（６）記載のトランスジェニック動物、
（８）プロモーターがα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩプロモーターである（１）乃至（７）記載のトランスジェニック動物、
（９）非ヒト動物がマウスである（１）乃至（８）記載のトランスジェニック動物、
（１０）（１）乃至（９）に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
記憶学習能力を測定する工程
を含むことを特徴とする、被験物質が該カリウムチャネルを阻害するか否かを検出する方法、
（１１）（１）乃至（９）に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
不安を測定する工程
を含むことを特徴とする、被験物質が該カリウムチャネルを阻害するか否かを検出する方法、
（１２）（１）乃至（９）に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
記憶学習能力を測定する工程
を含むことを特徴とする、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を検出する方法、
（１３）（１）乃至（９）に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程及び
不安を測定する工程
を含むことを特徴とする、不安抑制効果を検出する方法、
（１４）（１）乃至（９）に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、記憶学習能力を測定する工程及び
抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のスクリーニング法、
（１５）（１）乃至（９）に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与する工程、不安を測定する工程及び
不安抑制効果を有する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、抗不安用物質のスクリーニング法、
（１６）（１４）に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、抗痴呆用又は記憶学習改善治療用医薬組成物の製造方法、
（１７）（１５）に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、抗不安作用のための医薬組成物の製造方法、
に関する。
本発明のトランスジェニック動物の作製に用いることのできるＢＥＣ１と９８−９９％の相同性を有するポリヌクレオチド、ポリペプチドについては種々の報告（ＷＯ００／０５３４６、ＷＯ００／０９５３４、ＷＯ９９／４３６９６）があるが、いずれも明確な用途が解明されていない。また、前記ＷＯ００／０５３４６及びＷＯ９９／４３６９６にはトランスジェニック動物に関する記載はあるが、具体的な作製方法は記載されておらず、実際に取得したという実施例や該動物の機能の裏付け記載も存在しない。一方、前記パンフレットに加えてＢＥＣ１について本発明者らがＷＯ９９／３７６７７に開示しているが、トランスジェニック動物に関する記載はない。
すなわち、本願記載のＢＥＣ１トランスジェニック動物、該動物を用いた抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質及び／又は抗不安用物質のスクリーニング方法、抗痴呆用、記憶学習改善用及び／又は抗不安用医薬組成物の製造方法は本願発明者らが初めて行った発明である。
これまでに記憶学習障害の行動様式を示すことが報告されているＢＥＣ１以外のトランスジェニック動物の多くは、障害の検出に加齢などいくつかの要因をプラスする必要があったため（Ｍｏｒａｎ  ＰＭら、（１９９５）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９２、５３４１−５３４５；Ｈｓｉａｏ  Ｋら、（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４、９９−１０２；Ａｒｅｎｄａｓｈ  ＧＷら、（２００１）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９１、４２−５３）そうしたトランスジェニック動物の作製には時間及び費用がかかり、抗痴呆用物質をスクリーニングするために記憶学習の障害を行動様式として検出できるトランスジェニック動物を大量かつ簡便に作製し利用することは現実的ではなかった。本願記載のＢＥＣ１トランスジェニック動物は若年で記憶学習障害の行動を示すため、簡便かつ低コストで作製し、抗痴呆用物質のスクリーニングに用いることができるものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「カリウムチャネル」は「カリウムチャネル蛋白質」を、「ＢＥＣ１」は「ＢＥＣ１蛋白質」を表す。本明細書中で使用される「学習」とは外界の情報を獲得することであり、「記憶」は学習によって獲得された情報の保持及び再生、ならびにその過程を含む。「記憶学習（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ）」とは「学習」及び「記憶」双方の概念を併せ示し、「記憶学習能力」は外界の情報を獲得、保持及び再生する能力を示す。
「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物作製用であって、プロモーター領域とカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を表す。
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のトランスジェニック動物作製用の導入遺伝子に含まれるポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
本発明のトランスジェニック動物作製用の導入遺伝子に含まれるポリヌクレオチドによりコードされるカリウムチャネルポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもカリウムチャネルであるポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、カリウムチャネルであるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。
機能的等価改変体としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、カリウムチャネルであるポリペプチドポリペプチド」、「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、カリウムチャネルであるポリペプチド」あるいは「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、脳に限定して発現されるカリウムチャネルであるポリペプチド」が好ましく、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、カリウムチャネルであるポリペプチドポリペプチド」がより好ましい。
相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもカリウムチャネルである限り特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができ、好ましくは脳に限定して発現されるカリウムチャネルである。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ  ７３、２３７−２４４、１９９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、４６７３−４６８０、１９９４）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ  ｔｕｐｌｅ  １
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ３
Ｗｉｎｄｏｗ  ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ  Ｓａｖｅｄ  ５
以上、本発明のトランスジェニック動物作製用の導入遺伝子に含まれるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドについて説明したが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、その機能的等価改変体、及びその相同ポリペプチドを総称して、以下、「記憶学習カリウムチャネル」と称する。「記憶学習カリウムチャネル」は「記憶学習カリウムチャネル蛋白質」を表す。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである蛋白質をＢＥＣ１と称する。
また、記憶学習カリウムチャネルをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるポリヌクレオチド、その機能的等価改変体、又は、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドなら何れでもよい。好ましくは、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１記載の塩基配列である。
［２］記憶学習カリウムチャネルを発現することを特徴とするトランスジェニック動物の作製方法
導入遺伝子に含まれる記憶学習カリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドは、ＷＯ９９／３７６７７記載の方法に従って得ることができる。例えば、配列番号１記載のＢＥＣ１遺伝子は公知の配列（ＷＯ９９／３７６７７）の任意部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いてヒト細胞から単離したｍＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ法）により調製することもできる。また、導入遺伝子には、カリウムチャネルの発現を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー配列を連結する。このプロモーター／エンハンサー配列の選択によって、該カリウムチャネルを全身性に発現させることもでき、また、特定の組織で選択的に発現させることもできる。プロモーターとしては、特に限定されるものではないが、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（α−ｃａｌｃｉｕｍ−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ、α−ＣａＭ−ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ）遺伝子のプロモーター領域（Ｍａｙｆｏｒｄ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３２５０−１３２５５）、神経細胞特異的エノラーゼのプロモーター領域（Ｑｕｏｎ，Ｄ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，２３９−２４１）、又はＴｈｙ−１遺伝子のプロモーター領域（Ｖｉｄａｌ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ  ９：８３３−８４０）などが利用でき、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域の利用が好ましい。α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ遺伝子が脳選択的であり特に前脳に発現選択性が高い神経細胞遺伝子であることから、該プロモーター領域を用いることにより脳、特に前脳（大脳皮質、海馬）に選択的に目的遺伝子を発現させることができる。
より具体的には実施例１に記載の方法で本発明のトランスジェニック動物作製用導入遺伝子を得ることができる。本発明のトランスジェニック動物作製用導入遺伝子は、例えば、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域の下流に５’イントロンとポリＡ付加シグナルを持ったＢＥＣ１ｃＤＮＡをつないだ遺伝子が挙げられる。該導入遺伝子の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ、Ｒ．Ｋ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、４８７−４９１；以下、ＰＣＲという）を用いた方法を挙げることができる。また、本発明の遺伝子操作技術は公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することができる。
まず、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域の調製のためには、遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ２２２７９６）で表される各塩基配列の情報に基づいて、本発明のＤＮＡを増幅することのできるプライマーセット、例えば、配列番号３と配列番号４を設計する。
設計した前記プライマーセットと、鋳型であるゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲを実施することにより、該導入遺伝子の一部を得ることができる。ゲノムＤＮＡは市販品（クロンテック社）を用いることができ、また、動物血液を用いて市販のゲノムＤＮＡ抽出キット（キアゲン社）により得ることもできる。さらに、得られたＤＮＡを適当なベクターに組み込むことにより、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩプロモーター領域を得ることができる。
一方、該カリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドは次のように得ることができるが、この方法に限らず、ＷＯ９９／３７６７７記載の方法でも得ることができる。
該カリウムチャネルを産生する能力を有する細胞あるいは組織、例えばヒト脳から該カリウムチャネルをコードするものを包含するｍＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。該カリウムチャネルの産生能力を有する細胞あるいは組織は、該カリウムチャネルをコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング法、該カリウムチャネルに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えばｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製することができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出せずとも、市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いても良い。
次に、精製されたｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し、目的とするカリウムチャネルＤＮＡを増幅する。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、上記ＤＮＡを制限酸素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
本発明のトランスジェニック動物作製用の導入遺伝子は、任意のプロモーター領域と記憶学習カリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み、プロモーター活性の調節下にあるように、記憶学習カリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドを配置する限り、プロモーター及び記憶学習カリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドの配置順序は特に限定されるものではない。実施例１に記載のように、適当なベクターのマルチクローニングサイトに、順次、前記プロモーター領域と記憶学習カリウムチャネル遺伝子を導入することにより本発明のトランスジェニック動物作製用の導入遺伝子は調製することができる。前記ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８（東洋紡績社）を挙げることができる。
本発明のトランスジェニック動物は、該導入遺伝子が導入されており、記憶学習カリウムチャネルが過剰発現されている限り、特に限定されるものではないが、例えば、導入する遺伝子として、該導入遺伝子を使用すること以外は、従来公知の方法（例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１７５−８４、１９９０）に基づいて作製することができる。具体的には、例えば、後述の実施例１に記載の手順に基づいて作製することができる。すなわち、前記導入遺伝子を非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作製することができる。本明細書において「動物」とは、ヒトを除く動物（すなわち、非ヒト動物）を意味し、例えば、ヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、イルカ、又はウマ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生類（例えば、カエル）、爬虫類、又は昆虫（例えば、ショウジョウバエ）などを挙げることができる。非ヒト動物としては、技術的にはすべての動物種を対象とすることが可能であるが、特には近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが好ましい。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また、培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、ＤＮＡの物理的注入（マイクロインジェクション）法が好ましい。
例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶かしたベクターをマイクロピペットで受精卵に注入し、この卵をホルモン処理（ＰＧＦ２α、ｈＣＧ、エストラジオール、ＬＨ等）又は小動物では物理的刺激により擬妊娠状態にした宿主動物の子宮内に移植する。この宿主動物を飼育して分娩させることによって遺伝子導入非ヒト動物が得られる。遺伝子導入非ヒト動物が得られたか否かは、体の一部（例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認することにより知ることができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ）とすれば、導入遺伝子はその子孫の５０％に伝達され、野生型又は変異型の動物を効率よく作出することが可能である。
このようにして作製したトランスジェニック動物は、該チャネルを対象とした薬剤のスクリーニング、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を検出する方法、不安抑制効果を検出する方法、抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のスクリーニング法、抗不安用物質のスクリーニング法に有用である。
本発明のスクリーニング法で使用する被検物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５））によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
［３］記憶学習能力測定方法、記憶学習改善用物質の検出（スクリーニング）法
以下に記憶学習能力測定方法、記憶学習改善用物質の検出（スクリーニング）法を挙げる。以下の記憶学習能力測定方法により試験化合物が記憶学習カリウムチャネルを阻害するか否かを検出することができる。
１．受動的回避試験を用いた方法
受動的回避試験により記憶学習能力を測定し抗痴呆効果及び記憶学習改善効果を検出することができる。受動的回避試験は、ＭｃＧａｕｇｈ  ＪＬ（１９６６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５３：１３５１−１３５８にならい、より具体的には実施例５に記載の方法で実施できる。試験化合物は実験初日のトレーニング開始前（たとえば１５〜３０分前）に投与する。試験化合物投与群の暗箱進入潜時が溶媒投与群に比較して延長されれば、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果があると判断できる。抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する試験化合物を抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質として選択することができる。なお、溶媒投与群とは試験化合物の溶媒（例えば、０．５％メチルセルロース生理食塩水など）のみを投与した一群を指す。
２．モリス式水迷路試験を用いた方法
モリス式水迷路試験を用いた方法により記憶学習能力を測定し抗痴呆効果及び記憶学習改善効果を検出することができる。Ｗｅｎｋ  ＧＬ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．８．５Ａ．１−８．５Ｂ．７の方法に従い、実施例４記載のように実施できる。試験化合物の投与は各日毎、トレーニング前（たとえば０〜３０分前）に投与する。トレーニング開始２日目以降の試験化合物投与群のプラットフォーム到達潜時が溶媒投与群に比較して短縮されていれば、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果があると判断できる。抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する試験化合物を抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質として選択することができる。
３．音手かがり恐怖条件付けを用いた方法
音手かがり恐怖条件付けを用いた方法により記憶学習能力を測定し抗痴呆効果及び記憶学習改善効果を検出することができる。Ｗｅｈｎｅｒ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：３３１−３３４の方法に従って実施できる。トランスジェニックマウスに音刺激（５ｋＨｚ  １０秒間）を提示した直後、定電流刺激（０．５ｍＡ１秒間）を負荷する。試験化合物は音・電気刺激提示３０分前に投与する。２４時間後にマウスに音刺激のみを提示し、マウスの不動時間を５分間測定する。試験化合物投与群の不動時間が、溶媒投与群に比較して延長していれば、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果があると判断できる。抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する試験化合物を抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質として選択することができる。
４．物体認識試験（Ｏｂｊｅｃｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｔａｓｋ）を用いた方法
物体認識試験を用いた方法により記憶学習能力を測定し抗痴呆効果及び記憶学習改善効果を検出することができる。Ｅｎｎａｃｅｕｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｃｏｕｒ  Ｊ（１９８８）Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：４７−５９の方法に従い実施できる。６０ｃｍ四方のフィールド内に２つの同一の物体を静置した後トランスジェニックマウスをフィールドに入れ、フィールド内を５分間自由に探索させる。試験化合物はマウスをフィールドに入れる１時間前に投与する。１時間後、２つの物体のうち１つを異なった新奇な物体と置き換え、再びマウスに５分間フィールド内を探索させる。新奇な物体に対する探索時間と古い物体に対する探索時間の差を記憶保持の指標とし、この差が試験化合物投与群で延長されていれば、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果があると判断できる。抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する試験化合物を抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質として選択することができる。
５．瞬目反射条件付けを用いた方法
瞬目反射条件付けを用いた方法により記憶学習能力を測定し抗痴呆効果及び記憶学習改善効果を検出することができる。マウス瞬目反射条件付けの方法はＣｈｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６：２８２９−２８３８に従い実施できる。トランスジェニックマウスの瞼の筋肉に電極を埋め込み、瞼筋の筋電図を記録する。マウスに音刺激（５ｋＨｚ２秒間）を提示した直後、埋め込んだ電極より電気刺激を与えマウスに瞬目を惹起させる。音−電気対刺激を１日５０回提示し、このトレーニングを連続７日間行う。試験化合物は各日毎、刺激の提示前１時間前に投与する。条件付け記憶獲得は、音刺激提示後電気刺激提示前に発生した瞼筋の活動発生回数を指標とする。トレーニング開始２日目以降、試験化合物投与群の瞼筋活動発生回数が溶媒投与群を上回れば、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果があると判断できる。抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する試験化合物を抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質として選択することができる。
６．海馬ＣＡ１における長期増強（ＬＴＰ）を指標とした方法
海馬ＣＡ１におけるＬＴＰを指標とした方法により記憶学習能力を測定し抗痴呆効果及び記憶学習改善効果を検出することができる。海馬ＣＡ１におけるＬＴＰは、Ｔｓｉｅｎ、ＪＺ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７、１３２７−１３３８あるいはＯｋａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９３、６１−６７などにならい、より具体的には実施例７に記載の方法で実施できる。試験化合物はテタヌス刺激前（たとえば１５〜３０分前）に添加する。試験化合物添加時のＬＴＰが溶媒添加時に比較して促進されれば、抗痴呆効果又は記憶学習改善効果があると判断できる。抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有する試験化合物を抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質として選択することができる。
［４］不安測定方法、抗不安用物質の検出方法
以下に不安測定方法、抗不安用物質の検出方法を挙げる。以下の不安測定方法により試験化合物が記憶学習カリウムチャネルを阻害するか否かを検出することができる。
１．明暗探索試験を用いた方法
明暗探索試験を用いた方法により不安を測定し不安抑制効果を検出することができる。Ｃｒａｗｌｙ  ＪＮ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの方法に従い、実施例６記載のように実施できる。試験化合物の投与は試験開始３０分前に行う。試験化合物投与群で明箱滞在時間、又は明暗移動回数が溶媒投与群を上回っていれば、不安抑制効果があると判断できる。不安抑制効果を有する試験化合物を抗不安用物質として選択することができる。
２．その他、コンフリクト試験（Ｃａｒｌｉｎｉら、（１９７８）Ｍｏｄ．Ｐｒｏｂｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １３，８０−１０２）高架式十字迷路（Ｈａｎｄｌｅｙ  ＳＬ、Ｍｉｔｈａｎｉ  Ｓ（１９８４）Ｎａｕｎｙｎ−ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈｉｖｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３２７：１−５）などにより不安を測定し不安抑制効果を検出することができる。これらの方法において、試験化合物をトランスジェニックマウスに投与しスコアに改善が見られた場合は、不安抑制効果があると判断できる。不安抑制効果を有する試験化合物を抗不安用物質として選択することができる。
［５］抗痴呆用、記憶学習改善治療用又は抗不安用医薬組成物の製造方法
本発明のスクリーニング法により選択される記憶学習カリウムチャネルの活性を阻害する物質を主成分として、医薬を得ることができる。これらの医薬は、抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質または抗不安用物質として有用である。
記憶学習カリウムチャネルの活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬製剤は、有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。投与は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与が挙げられる。特に胃で消化されるペプチドにあっては静注等の非経口投与が望ましい。
本発明による経口投与のための固体組成物は、一つ又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することにより、調製することができる。前記固体組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、溶解剤、又は溶解補助剤などを含有することができる。錠剤や丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記液体組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、植物油（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、若しくはオリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
本発明のスクリーニング法により得られた記憶学習カリウムチャネルの活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬の投与量は、前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
実施例
以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、遺伝子操作技術に関しては公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
実施例１．＜ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作製用導入遺伝子の構築＞
配列番号２記載のアミノ酸配列を有するＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスを作製するための導入遺伝子は、α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域の下流に５’イントロンとポリＡ付加シグナルを持った、ＢＥＣ１  ｃＤＮＡ（配列番号１）をつないだ遺伝子からなっている。
α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩのプロモーター領域は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって互いにオーバーラップする部分を持つ２断片として取得した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムＤＮＡは、同マウスの血液からゲノムＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。プライマーは遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ２２２７９６）をもとに設計した。フォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて４．６ｋｂの遺伝子断片を得た。前記フォワードプライマーの５’末端側にはＡａｔＩＩ認識配列が付加してある。また、フォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて３．７ｋｂの遺伝子断片を得た。前記リバースプライマーの５’末端側にはＳａｌＩ認識配列が付加してある。それぞれのＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて９９℃（１分）熱変性後、９９℃（１５秒）、５８℃（１５秒）、７５℃（１０分）を４５サイクル、あるいは９５℃（１分）熱変性後、９５℃（１５秒）、６２℃（１５秒）、７５℃（８分）を４０サイクル実施し、得られた遺伝子断片は、クローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ  ｐｌａｓｍｉｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。４．６−ｋｂ断片と３．７−ｋｂ断片のオーバーラップする部分には内在性のＸｍａＩ認識配列が存在する。４．６−ｋｂ断片を制限酵素ＡａｔＩＩ及びＸｍａＩで消化し、３．７−ｋｂ断片を制限酵素ＸｍａＩ及びＳａｌＩで消化した。得られた各断片をライゲーションし、ＡａｔＩＩ及びＳａｌＩ認識配列を利用してプラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社）、にクローニングした。以上の操作により目的のα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩプロモーター領域が得られた。
一方、ＢＥＣ１  ｃＤＮＡ（配列番号１）は、５’イントロンとポリＡ付加シグナルを含んだ断片として、カリウムチャネル発現ベクターｐＭＥ−Ｅ１（ＷＯ  ９９／３７６７７に記載）を鋳型としてＰＣＲにより取得した。フォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ５’イントロンの上流配列とポリＡ付加シグナルの下流配列から設計した。前記フォワードプライマーにはＳａｌＩ認識配列を、リバースプライマーにはＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ認識配列を付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて９６℃（１分）熱変性後、９６℃（１５秒）、６０℃（１５秒）、７５℃（８分）を３０サイクル実施した。得られた３．７−ｋｂ断片は、クローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ  ｐｌａｓｍｉｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。同断片はＳｐｅＩ認識配列及びＫｐｎＩ認識配列を利用してプラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社）にサブクローニングし、さらにその上流にＡａｔＩＩ認識配列及びＳａｌＩ認識配列を利用して前記α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩのプロモーター領域をサブクローニングした。以上の操作により最終的なＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作成用導入遺伝子（１２ｋｂ）を持つプラスミド（ｐＣＭ−Ｅ１  ｐｌａｓｍｉｄと命名した）が得られた。
実施例２．＜ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの作製及び同定＞
ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作製用導入遺伝子（１２ｋｂ）は、ｐＣＭ−Ｅ１からＡａｔＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いて切り出した後単離精製した。得られた同遺伝子をＣ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２マウスのＦ１交雑マウスの受精卵２８３個にマイクロインジェクションした後、同受精卵を仮親ＩＣＲマウスの卵管に移植した（Ｈｏｇａｎ、Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）。妊娠マウスを自然分娩させ、得られた仔マウス８１匹についてトランスジェニックマウスの同定を行った。
トランスジェニックマウスを同定するため、仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡはマウスの尻尾からゲノムＤＮＡ抽出キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−、東洋紡績社）を用いて精製した。ＢＥＣ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１）よりフォワードプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてＰＣＲを行うと、導入遺伝子からは２４５−ｂｐ断片が、マウスゲノムＤＮＡからはマウスＢＥＣ１が９３−ｂｐイントロンを含んだ３３８−ｂｐ断片として増幅される。同プライマーを用いて、得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、９４℃（１分）熱変性を行った後、９４℃（１５秒）、６０℃（１５秒）、７２℃（３０秒）を３５サイクル実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡを検出した（図１）。その結果、仔マウス８１匹中１６匹がトランスジェニックマウスであることが同定された。
実施例３．＜ＢＥＣ１  ｍＲＮＡの定量＞
導入された遺伝子が実際に機能しＢＥＣ１  ｍＲＮＡが過剰発現していることを確認するため、トランスジェニックマウスの脳でのＢＥＣ１  ｍＲＮＡの発現を解析した。脳摘出用のＦ１マウスを得るため、トランスジェニックマウス１６匹のうち１１匹についてＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させた。その結果、５匹のトランスジェニックマウスにおいてＦ１マウスへの導入遺伝子の伝播が確認された。得られたＦ１トランスジェニックマウス（４週齢）から前脳と小脳を摘出し、それぞれＲＮＡを単離した。各ＲＮＡはゲノムＤＮＡの混入を防ぐするためＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で消化した。得られたＲＮＡ中のＢＥＣ１  ｍＲＮＡコピー数をＰＲＩＳＭ７７００（ＡＢＩ社）と蛍光試薬ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲにより定量した。リアルタイムＰＣＲの鋳型として、各ＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  ｋｉｔ、クロンテック社）により合成した一本鎖ｃＤＮＡを用いた。フォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、導入遺伝子であるヒトＢＥＣ１とラット及びマウスのＢＥＣ１に共通する配列から設計した。
リアルタイムＰＣＲの結果、５系統のトランスジェニックマウスのうち３系統（＃６−５、＃７−７、＃９−５）に野生型の約１０倍の前脳選択的なＢＥＣ１  ｍＲＮＡ過剰発現が認められた（図２）。系統＃９−５を選択し、さらに脳各部位（大脳皮質、海馬、線条体、視床下部、視床、中脳、脳幹、小脳）のＢＥＣ１  ｍＲＮＡ発現量を野生型マウスとトランスジェニックマウスで比較した。その結果、トランスジェニックマウスでのＢＥＣ１  ｍＲＮＡ過剰発現は、野生型でも発現の認められた大脳皮質、海馬、線条体において顕著であることが確認された。
実施例４．＜ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスのモリス式水迷路試験における学習行動解析＞
ＢＥＣ１過剰発現の学習行動に与える作用を解析するため、＃９−５系統のトランスジェニックマウスと野生型マウスのモリス式水迷路における学習行動を比較した。
生後１０週齢オスのトランスジェニックマウス（１２匹）と野生型マウス（１５匹）を用いた。直径１００ｃｍの円形のプールに絵の具を用いて白濁させた水をはり、水面下５ｍｍの位置に直径１０ｃｍの円形のプラットフォームを設置した。実験時の室温及び水温は２３℃であった。プールに入れたマウスの水泳の軌跡を水迷路画像解析装置（ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ−小原医科産業）によって記録解析し、プラットフォームへの到達時間、プールを４分割したときの各領域への滞在時間を測定した。トレーニングの１試行は７０秒とし、１日３試行のトレーニングを５日間行った。トレーニング初日のプラットフォーム到達所要時間は両群ともほぼ同じ値であったが、トレーニング開始３日目以降はトランスジェニックマウスの所要時間は野生型よりも延長された。トレーニング最終日には、プラットフォーム到達所要時間（平均値±標準誤差）は野生型６．９±１．０秒に対しトランスジェニックマウス１８．１±６．４秒となり統計的に有意な差が認められた（ｐ〈０．０５：二元配置分散分析）。
トレーニング終了後、プラットフォームを除去したプールに４０秒間マウスを入れ、マウスのプラットフォーム存在領域に滞在する時間を測定した。その結果、トランスジェニックマウスの滞在時間は野生型よりも統計的に有意に短かった（ｐ〈０．０１：Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。
以上の結果は、トランスジェニックマウスではプラットフォーム位置の記憶学習が低下していることを示す。ＢＥＣ１トランスジェニックマウスを用いた本方法により抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質をスクリーニングできる。
実施例５．＜ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの受動的回避試験における学習行動解析＞
生後８週齢メスの＃９−５系統トランスジェニックマウス（６匹）と野生型マウス（８匹）を用いた。マウス用明暗実験装置（小原医科産業）の明箱部分にマウスを入れ、マウスが暗箱に進入した時点で６０Ｖ・２秒間の定電圧刺激を与えた。２４時間後に再びマウスを明箱に入れ、この時の暗箱進入潜時を測定した。
その結果、トランスジェニックマウスの暗箱進入潜時は１６７秒（中央値）であり野生型マウスの６００秒（中央値）に比べ有意に短かった（ｐ〈０．０５：Ｗｉｌｅｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔ）。トランスジェニックマウスでは暗箱に関連づけられた電気刺激を学習する能力が低下していることが示された。ＢＥＣ１トランスジェニックマウスを用いた本方法により抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質をスクリーニングできる。
実施例６．＜ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの明暗における不安の解析＞
ＢＥＣ１過剰発現の動物の不安への作用を解析するため、＃９−５系統のトランスジェニックマウスと野生型マウスを用い、明暗探索試験を実施した。明暗探索箱（室町機械）は隣接する３０ｃｍ四方の明箱と３０ｃｍ×２０ｃｍの暗箱からなり、小さな穴を通じてマウスは自由に２つの箱を行き来できるようになっている。マウスを探索箱に５分間入れ、それぞれの箱への滞在時間、明暗移動回数を赤外線センサーによりカウントした。その結果、野生型の移動回数（平均値±標準誤差）は１４．３±１．５回であったのに対し、トランスジェニックマウスでは９．４±１．９回と有意に減少していた（ｐ〈０．０５  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。また明箱滞在時間も、野生型６１．４±４．９秒であったのに対し、トランスジェニックマウスは４２．４±７．５秒で有意な低下が見られた（ｐ〈０．０５  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。トランスジェニックマウスでは不安が亢進していることが示された。ＢＥＣ１トランスジェニックマウスを用いた本方法により抗不安用物質をスクリーニングできる。
実施例７．＜ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの海馬ＣＡ１におけるＬＴＰの解析＞
シナプス伝達効率が長期にわたって増強する現象ＬＴＰは、記憶学習の基礎過程と考えられている。ＢＥＣ１過剰発現のＬＴＰに与える作用を解析するため、＃９−５系統のトランスジェニックマウスと野生型マウスの海馬ＣＡ１におけるＬＴＰを比較した。
生後３ヶ月齢のトランスジェニックマウスと野生型マウスそれぞれ５匹から海馬スライスを調製した。海馬スライスの調製方法はＥｄｗａｒｓ，ＦＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａ  ｔｈｉｎ  ｓｌｉｃｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐａｔｃｈ  ｃｌａｍｐ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｆｌｅｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  ４１４：６００−６１２に倣った。細胞外電場電位は、スライスが置かれたＭｕｌｔｉ−Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ｄｉｓｈ（松下電気、Ｏｋａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９３、６１−６７）を用いて記録された。ＣＡ１錐体細胞のシナプス反応はシャッファー側枝−ＣＡ１経路の刺激により惹起された。野生型マウスのスライスにおいて、テタヌス刺激（１００Ｈｚ、１秒間）はシナプス反応の増強を誘導した（テタヌス刺激４５分後において２４３±２６．９％）。一方、トランスジェニックマウスのスライスにおいて、同様の刺激は有意に小さな増強しか誘導しなかった（１２６±１３．６％、ｐ〈０．０５  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。トランスジェニックマウスでは海馬ＬＴＰが抑制されていることが示された。
これらの結果は、ＢＥＣ１が海馬ＬＴＰの形成を抑制することで記憶学習の障害を引き起こしている可能性を示唆している。本トランスジェニックマウスの海馬ＬＴＰは、抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のスクリーニングの指標として有用である。
実施例８．＜記憶学習カリウムチャネル阻害作用を機序とした抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング＞
記憶学習カリウムチャネル阻害作用を機序とした抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングを実施例５と同様の受動的回避試験にて実施した。試験化合物は、０．５％メチルセルロース生理食塩水に懸濁し、定電圧刺激３０分前あるいは直後に腹腔内投与した。２４時間後に再びマウスを明箱に入れ、この時の暗箱進入潜時を測定した。０．５％メチルセルロース生理食塩水投与群に比較して暗箱進入潜時が延長される効果を有する１つの化合物を得た。この化合物は抗痴呆効果又は記憶学習改善効果を有すると判断できる。
産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法によって、抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質又は抗不安物質として有用な物質をｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングすることができる。
本発明のトランスジェニック動物の記憶学習能力を指標とすることにより記憶学習カリウムチャネル阻害作用を機序とした抗痴呆用物質又は記憶学習改善用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング、同動物の不安を指標とすることにより記憶学習カリウムチャネル阻害作用を機序とした抗不安用物質のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングを実施することができる。すなわち、本発明のトランスジェニック動物は抗痴呆用物質、記憶学習改善用物質又は抗不安用物質のスクリーニングツールとして利用できる。
また、本発明のスクリーニング方法により得ることができる、記憶学習カリウムチャネルの活性を阻害する物質を有効成分とし、担体、賦形剤及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、抗痴呆用又は記憶学習改善用あるいは抗不安用医薬組成物を製造することができる。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３、６、７、８の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、トランスジェニックマウス同定の為に仔マウス尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示すグラフである。Ｎはネガティブコントロール（マウスゲノムＤＮＡ  ３３８ｂｐ）、Ｐはポジティブコントロール（導入遺伝子２４５ｂｐ）を示す。
図２は、Ｆ１トランスジェニックマウス（＃６−２、＃７−３、＃６−５、＃７−７、＃９−５）及び野生型（Ｗｔ）マウスの前脳及び小脳におけるＢＥＣ１ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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