(57)【要約】本発明の目的は、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性の上昇した植物およびその作製方法、そのような植物の種子を提供すること、および、アミノ酸含量、特にセリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の含量が同条件で栽培された同種の野生型植物に比較して増大した植物およびその作製方法、それらの植物の種子を提供することである。本発明において、変異誘発、核酸分子導入等によりＧＧＴ活性の増大した植物が作製される。本発明において、ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物、特にＧＧＴ遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物および／または内在性のＧＧＴ活性を有する遺伝子の発現量を増大させ得る遺伝的構築物が植物に導入される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性が、同条件で栽培された同種の野生型植物と比較して増大した植物。
【請求項２】
アミノ酸含量が同条件で栽培された同種の野生型植物に比較して増大した請求項１記載の植物。
【請求項３】
セリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の含量が同条件で栽培された同種の野生型植物に比較して増大した請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
ＧＧＴ活性の増大がＧＧＴ遺伝子のコピー数の増加によって行われる、請求項１〜３のいずか１項記載の植物。
【請求項５】
ＧＧＴ活性の増大がＧＧＴ遺伝子に対応するｍＲＮＡ量の増加によって行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の植物。
【請求項６】
ＧＧＴ活性がペルオキシソームにおけるＧＧＴ活性である、請求項１〜５のいずれか１項記載の植物。
【請求項７】
ＧＧＴ活性が配列番号２または４に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性があるアミノ酸配列を有するタンパク質のグルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性である、請求項１〜６のいずれか１項記載の植物。
【請求項８】
ＧＧＴ活性が配列番号２または４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のＧＧＴ活性である、請求項６に記載の植物。
【請求項９】
グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物が導入された形質転換植物であって、同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較してＧＧＴ活性が増大された形質転換植物。
【請求項１０】
アミノ酸含量が同条件で栽培された対応する同種の非形質転換植物に対して増大した請求項９に記載の形質転換植物。
【請求項１１】
セリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の含量が同条件で栽培された対応する非形質転換植物に対して増大した請求項９または１０に記載の形質転換植物。
【請求項１２】
ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物がＧＧＴ遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物である、請求項９〜１１のいずれか１項記載の形質転換植物。
【請求項１３】
ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物がＧＧＴ遺伝子の転写量を増大させ得る遺伝的構築物を含む、請求項９〜１１のいずれか１項記載の形質転換植物。
【請求項１４】
ＧＧＴ遺伝子が、配列番号１または３に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する請求項１２記載の形質転換植物。
【請求項１５】
ＧＧＴ活性がペルオキシソームにおけるＧＧＴ活性である、請求項９〜１４のいずれか１項記載の形質転換植物。
【請求項１６】
ＧＧＴ遺伝子が、配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列を有する請求項１２記載の形質転換植物。
【請求項１７】
グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物を導入して形質転換植物を作製する工程であって、前記遺伝的構築物が同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較して前記形質転換植物中のＧＧＴ活性を増大し得るものである前記工程を含む、植物および／またはその種子のアミノ酸含量を増大させる方法。
【請求項１８】
ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物を導入して形質転換植物を作製する工程であって、前記遺伝的構築物が同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較して前記形質転換植物中のＧＧＴ活性を増大し得るものである前記工程を含む、植物および／またはその種子においてセリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギンからなる群より選ばれるアミノ酸の１以上の含量を増大させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物がＧＴＴ遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物である、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物がＧＴＴ遺伝子の転写量を増大させ得る遺伝的構築物を含む、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２１】
ＧＧＴ遺伝子が配列番号１または３に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＧＴ活性が、ペルオキシソームにおけるＧＧＴ活性である、請求項１７〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
ＧＧＴ遺伝子が、配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列を有する請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
請求項９〜１６のいずれか１項記載の形質転換植物の種子であって、ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物を含む植物種子。
【請求項２５】
下記のｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかを行うことにより、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の記載の植物を作製する方法：
ｉ）請求項１〜８のいずれか１項記載の植物の種子または請求項２４に記載の種子を発芽させる；
ｉｉ）請求項１〜１６のいずれか１項記載の植物の細胞から植物体を再生させる；
ｉｉｉ）請求項１〜１６のいずれか１項記載の植物を栄養増殖させる。
【請求項２６】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の植物または請求項２４記載の植物種子を原料とする飼料。
【請求項２７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の植物または請求項１８記載の種子からセリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸または前記アミノ酸を含む植物抽出物を回収することを特徴とする、セリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸または前記アミノ酸を含む植物抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の活性が増大した植物に関する。
また、本発明は、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）および／またはＧＧＴをコードする遺伝子の利用方法に関する。
また、本発明は、植物および／またはその種子のアミノ酸含量、特にセリン（Ｓｅｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸含量を増加させる方法、およびアミノ酸含量、特にセリン（Ｓｅｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸含量の増大した植物、およびそのような植物の作製方法に関する。
さらに本発明は、本発明の植物および／または種子の食品または飼料製造への使用、それらの植物および／または種子を含む食品または飼料に関する。
ＲｕＢｉｓｃｏのオキシゲナーゼ活性により生じたグリコール酸を消費する光呼吸において、グリコール酸はペルオキシソームで、グリコール酸オキシゲナーゼによりグリオキシル酸に、グリオキシル酸は少なくとも２つのグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼにより代謝されると考えられていた（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ：ＰＮＡＳ７７：２６８４−２６８７、１９８０）。これまで、ペルオキシソームで働くグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子は同定されていなかったが、最近になってＬｉｅｐｍａｎらはシロイヌナズナの光呼吸系で働くペルオキシソームに局在するアラニン：グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼを報告した（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２５：４８７−４９８）しかし、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子は知られていなかった。また、このグルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性が植物のダルタミン酸をはじめとする種々のアミノ酸含量、総アミノ酸含量の増減、光合成能、ストレス耐性を含む植物の特性にどのような役割を果たしているかは必ずしも明らかにされておらず、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質またはこれをコードする遺伝子を操作して植物の種々の特性を改善し得る可能性、特に植物体または種子において総アミノ酸含量および／または特定のアミノ酸含量を実際に増大させ得る可能性を示唆した報告はなされていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性の上昇した植物およびその作製方法、そのような植物の種子を提供することである。
また、本発明の目的は、アミノ酸含量、特にセリン（Ｓｅｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の含量が同条件で栽培された同種の野生型植物に比較して増大した植物およびその作製方法、それらの植物の種子を提供することである。
本発明の別な目的は、ＧＧＴおよびこれをコードする遺伝子の新規な利用方法を提供することである。
より具体的には、本発明の目的は、植物のアミノ酸含量を増大させるためのＧＧＴおよびこれをコードする遺伝子の利用法を提供することである。
また、本発明の目的は、アミノ酸含量、特にＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の含量が増大した植物および／または種子を含む飼料または食品、そのような植物および／または種子の飼料または食品製造への使用を提供することである。
さらにまた本発明の目的は、上記アミノ酸含量の増大した植物および／または種子からアミノ酸、、特にＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸または前記アミノ酸を含有する植物抽出物を製造する方法、および、アミノ酸、、特にＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸を製造するための、上記アミノ酸含量の増大した植物および／または種子の使用を提供することである。
また本発明の目的は、アミノ酸を出発物質とする他の物質生産の場または材料としての本発明の植物および／または種子の利用を提供することである。
本発明は、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性が同種の野生型植物に比較して増大された植物である。
本発明は、同種の野生型植物に比較して、ＧＧＴ活性を有する遺伝子の転写量が増大したことを特徴とする植物でもある。
また本発明は、ＧＧＴ活性を増大させることを特徴とする、植物のアミノ酸含量、特に、植物においてセリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の含量を増大させる方法である。
また本発明は、ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物、特にＧＧＴ遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物および／または内在性のＧＧＴ活性を有する遺伝子の発現量を増大させ得る遺伝的構築物が導入された形質転換植物であって、同条件で栽培された同種の天然の植物または対応する非形質転換植物に比較してＧＧＴ活性が増大した形質転換植物でもある。
さらに本発明は、ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物、特にＧＧＴ遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物および／または内在性のＧＧＴ活性を有する遺伝子の転写量を増大させ得る遺伝的構築物を植物に導入することを特徴とする、植物のＧＧＴ活性を増大させる方法でもある。
また、本発明は、ＧＧＴ活性が同種の野生型植物に比較して増大した植物、または、ＧＧＴ活性が対応する非形質転換植物に比較して増大した植物の種子を発芽させ、または前記植物若しくは形質転換植物の細胞から植物体を再生させ、または、前記植物若しくは形質転換植物を栄養増殖によって増殖させることを特徴とする、ＧＧＴ活性の上昇した植物を作製する方法でもある。
特に本発明において、ＧＧＴ活性は特にペルオキシソームにおけるＧＧＴ活性である。
ここで、本明細書において、「非形質転換植物」とは、ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物が導入された形質転換植物と対比する場合には「ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物が導入されていない植物」を意味する。この「ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物が導入されていない植物」には、野生型植物の他、ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物以外の遺伝子構築物が導入された植物も含まれる。また、「ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物」にはＧＧＴ遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物、例えば、適切なプロモーターに機能可能に接続されたＧＧＴ遺伝子を含む遺伝子構築物、および、ＧＧＴ遺伝子の転写量を増大させ得る遺伝的構築物、例えば、エンハンサーを含む構築物、が含まれる。ここで、本明細書において「遺伝的構築物」とは、何らかの形態で子孫へ遺伝し得る構築物、特に核酸分子をいい、遺伝子を含む遺伝的構築物である場合は特に「遺伝子構築物」ということがある。従って、「遺伝的構築物」には例えば、遺伝子を含む核酸分子の他、転写活性化エレメント、エンハンサー等を含む核酸断片も含まれる。
より具体的には、本発明は、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性のあるアミノ酸配列を有する、ＧＧＴ活性が、同条件で栽培された同種の野生型植物と比較してＧＧＴ活性が増大した植物である。
特に本発明は、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列を有するＧＧＴの活性が、同条件で栽培された野生型植物に比較して増大した植物である。
また、本発明は、配列番号１または３に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む遺伝的構築物が導入された形質転換植物であって、同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較してＧＧＴ活性が増大した形質転換植物である。
特に本発明は、配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が導入された形質転換植物であって、同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較してＧＧＴ活性が増大した形質転換植物である。
更に、本発明は、ＧＧＴを発現させ得る遺伝子構築物を導入して形質転換植物を作製する工程であって、前記遺伝子構築物が同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較して前記形質転換植物中のＧＧＴ活性を増大させ得るものである前記工程を含む、植物および／またはその種子のアミノ酸含量、特に、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸含量を増加させる方法、および、総アミノ酸含量が増加した植物、特に、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸含量が増加した植物および／またはその種子である。
本発明の植物のＧＧＴ活性は、同条件で栽培された対応する野生型植物または非形質転換植物に対して、対応する組織におけるＧＧＴ活性レベルにおいて好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは約３倍以上、特に好ましくは約５倍以上増大している。
【図面の簡単な説明】  図１は、高等植物における光呼吸経路の模式図である。グルタミングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼが触媒する反応を矢印で示した。
図２は、シロイヌナズナ由来グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列の比較である。全てのアミノ酸が同一である箇所はアスタリスクで示した。
図３は、シロイヌナズナ由来グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の構造及びｐＢＩ１０１への挿入位置を示す。エクソンを黒色のボックスで示した。ゲノム領域５０８９ｂｐをＰＣＲで増幅し、ゲノム上のＢａｍＨＩとプライマー上のＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＢＩ１０１（−ＧＵＳ／−ＮＯＳ−ｔｅｒ）にクローニングした。このベクターを用いてアグロバクテリウムを介してＧＧＴ１遺伝子破壊株（ｇｇｔ１−１）に導入した。
図４は、対照株とＧＧＴ１導入株の生育を比較した結果を示す。通常の培養条件下で２週間栽培した野生型非形質転換体（対照）とＧＧＴ１導入株（ｇｇｔ１−１／ＧＧＴ１）それぞれ９５個体の地上部の重量を測定し比較した。
図５は、ＧＧＴ１発現用構築物を導入した形質転換植物と野生型非形質転換植物のＧＧＴ１  ｍＲＮＡレベルにおける比較を示したグラフである。
図６は、ＧＧＴ１発現用構築物を導入した形質転換植物と野生型非形質転換植物のＧＧＴ酵素活性レベルにおける比較を示したグラフである。
図７は、ＰＮＳ培地上で７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で２週間生育させた芽生えのアミノ酸含量を測定した結果を示す。Ａ：主要アミノ酸含量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷ）、Ｂ：芽生えにおける総アミノ酸含量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷ）。
図８は、ＰＮＳを肥料として、ロックウール上で７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で４２日間栽培した植物体のロゼット葉中のアミノ酸含量を示す。Ａ：主要アミノ酸含量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷ）、Ｂ：総アミノ酸含量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷ）。
図９は、ＧＧＴ１発現用構築物を野生型株に導入した形質転換植物と野生型非形質転換植物のＧＧＴ１  ｍＲＮＡレベルにおける比較を示したグラフである。
図１０は、ＧＧＴ１発現用構築物を野生型株に導入した形質転換植物と野生型非形質転換植物のＧＧＴ酵素活性（Ａ）およびＨＰＲ活性（Ｂ）の比較を示したグラフである。野生型非形質転換植物のそれぞれの酵素活性を１とした。
図１１は、ＰＮＳ培地上で７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で２週間生育させた芽生えのセリンの含量を測定した結果を示す。
図１２は、ＧＧＴ１発現用構築物を野生型株に導入した形質転換植物と野生型非形質転換植物のＧＧＴ１  ｍＲＮＡレベル、ＧＧＴ酵素活性レベル、Ｓｅｒ含量をそれぞれ比較した結果を示す。それぞれの値の相関係数と回帰式を記入した。Ａ：ＧＧＴ１  ｍＲＮＡ相対量に対するＧＧＴ相対酵素活性を示したグラフ、Ｂ：ＧＧＴ１  ｍＲＮＡ相対量に対するＳｅｒ含量を示したグラフ；（Ｃ）ＧＧＴ相対酵素活性に対するＳｅｒ含量を示したグラフ。
図１３は、１／２ＭＳ培地上で７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で２週間生育させた芽生えのアミノ酸含量を測定した結果を示す。Ａ：主要アミノ酸含量、Ｂ：総アミノ酸含量
図１４は、連続光下およそ２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下、改変ＰＮＳ肥料（５ｍＭ  ＫＮＯ３を２．５ｍＭ  ＮＨ４ＮＯ３に置換）で栽培した植物体から得た種子のアミノ酸含量を示す（ｎ＝４）。主要アミノ酸含量（Ａ）、アルギニン含量（Ｂ）、総アミノ酸含量（Ｃ）をそれぞれ新鮮重量あたりの濃度ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷで示す。
図１５は、図１４におけるのと同等の条件で行った別個の実験の結果である。但し、ｎ＝２。主要アミノ酸含量（Ａ）、アルギニン含量（Ｂ）、総アミノ酸含量（Ｃ）をそれぞれ新鮮重量あたりの濃度ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷで示す。
図１６は、シロイヌナズナＧＧＴと、イネ由来のＧＧＴと推定されるタンパク質のアミノ酸レベルの相同性を示す。ＧＧＴ１：シロイヌナズナＧＧＴ、Ｊａｐｏｎｉｃａ＿ＧＧＴ：イネ、ジャポニカ種のＧＧＴと推定されるタンパク質、Ｉｎｄｉｃａ＿ＧＧＴ：イネ、インディカ種のＧＧＴと推定されるタンパク質。全てのアミノ酸が同一である箇所はアスタリスクで示した。
図１７は、シロイヌナズナ由来ＧＧＴ遺伝子導入イネ形質転換当代の日中の葉に置けるアミノ酸含量を測定した結果である。値は総アミノ酸含量に対する相対値である。アミノ酸は、主要なアミノ酸のうち総量に対する相対値が１０％程度のものを選び図に示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の目的は、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性が同種の野生型植物に対して増大した植物、またはＧＧＴ活性が対応する非形質転換植物に対して増大した形質転換植物を選抜または作製することによって達成することができる。
例えば、本発明の目的は、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）をコードする遺伝子（ＧＧＴ遺伝子）の発現を増大させ得る遺伝的構築物を植物に導入し、ＧＧＴ遺伝子の発現を増大させることによって達成することができる。このような遺伝子構築物には、ＧＧＴを発現し得る遺伝的構築物、転写活性化因子を発現し得る遺伝子構築物、転写活性を上昇させる機能を有する核酸断片等が含まれる。
本発明の実施態様の一つにおいては、ＧＧＴを発現し得る遺伝子構築物を植物に導入し、同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較してＧＧＴをコードする遺伝子の発現が増大した形質転換植物が選抜される。
本発明の他の実施態様においては、ＧＧＴ遺伝子のコピー数を増加させることによってＧＧＴ遺伝子の発現が全体として増大する。本発明のまた別の実施態様においては、転写活性化因子を発現させる、好ましくは過剰発現させることによりＧＧＴ遺伝子の転写量が増大し、ＧＧＴ活性が増大する。本発明のさらなる実施態様においては、転写活性化機能を有するシスエレメントを含むエンハンサー等の導入により、ＧＧＴ遺伝子の転写量が増大し、ＧＧＴ活性が増大する。
ここで「グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ」とは、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性、すなわち、グリオキシル酸＋グルタミン酸−＞グリシン＋αケトグルタル酸の反応を触媒する活性を有するタンパク質の総称である（図１参照）。特にこのようなタンパク質には、例えば配列番号２または４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上、特に好ましくは９０％以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質が含まれる。このような相同性は、例えばＦＡＳＴＡ等の当業者によく知られたプログラムを標準的なパラメーターと共に用いて計算することができる。例えば、、国立遺伝学研究所  生命情報・ＤＤＢＪ研究センター（ＤＤＢＪ／ＣＩＢ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）からＦＡＳＴＡ  Ｖｅｒ．２．０，３．０，３．２，３．３等が標準的パラメーターと共に提供されている。
同様に、「ＧＧＴをコードする遺伝子」または「ＧＧＴ遺伝子」とは、グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするいかなる遺伝子も含まれる。特に、このような遺伝子には、例えば、配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列と好ましくは７０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する遺伝子が含まれる。このような相同性も、例えば前述のＦＡＳＴＡ等を利用して計算することができる。このような相同性を有する核酸分子は配列番号１または３の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子でもある。このような遺伝子によってコードされるタンパク質には、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列に対して、アミノ酸の付加、置換、欠失を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を言う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件が５０℃、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には、途中にストップコドンが発生したものや活性中心の変異を失ったものも含まれるが、それらについては市販の活性発現ベクターにつなぎＧＧＴ酵素活性を記述の方法で測定することにより容易に取り除くことができる。
配列番号１または３と相同な遺伝子配列を有する、または配列番号２または４と相同なアミノ酸配列を有し、本発明においてこれらの遺伝子またはタンパク質と同等に利用できる遺伝子またはタンパク質であればよく、例えばイネ由来のものが含まれる。そのような例として、イネ、ジャポニカ種のＧＧＴと推定される遺伝子のヌクレオチド配列、およびその遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３４および３５に、同様に、イネ、インディカ種のＧＧＴと推定される遺伝子配列およびコードされ得るタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３６および３７にそれぞれ記載した。シロイヌナズナ由来のＧＧＴ１とこれらのイネ由来タンパク質のアミノ酸配列レベルの相同性を図１６に示した。ＧＧＴ１とジャポニカ種、インディカ種由来のＧＧＴ１に対応するタンパク質のアミノ酸配列レベルの相同性は非常に高いことが明らかである。
また本発明で使用し得るＧＧＴ遺伝子は、形質転換しようとする植物由来の同種遺伝子でもよく、他の供給源から得られた異種遺伝子でもよい。
また、「同条件で栽培された対応する非形質転換植物に比較してＧＧＴ活性が増大した形質転換植物」とは、注目している形質転換植物中に存在する、対応する非形質転換植物が本来有しているＧＧＴ遺伝子および形質転換に用いた遺伝子構築物上に存在するＧＧＴ遺伝子の両方の遺伝子に起因する全ＧＧＴ活性が、同条件で栽培された対応する非形質転換植物、すなわち、前述の形質転換植物と同一種の植物であって、ＧＧＴ遺伝子発現構築物によって形質転換を受けていない植物のＧＧＴ活性に比較して増大していることを言う。本明細書において、「非形質転換植物」とは、ＧＧＴを発現させ得る遺伝子構築物が導入された形質転換植物と比較する場合には「ＧＧＴを発現させ得る遺伝子構築物が導入されていない植物」を意味することはすでに述べた。
ＧＧＴ活性の増大は遺伝子発現の転写レベル、翻訳レベル、翻訳後修飾レベルのいずれにおいても行われ得る。例えば、ＧＧＴを発現し得る遺伝子構築物を導入すること、および、ＧＧＴの発現調節因子や翻訳調節因子、転写後調節因子などのＧＧＴ活性および／または転写量の調節に関わる上流の因子を制御することによってＧＧＴ活性を増大させることができる。より具体的には、例えば、特にＧＧＴを発現し得る遺伝子構築物を導入すること、あるいは内在性ＧＧＴ遺伝子のコピー数を増大させること、転写活性化因子を導入すること、内在性ＧＧＴ遺伝子の転写活性を上昇させるようなエンハンサーを導入すること等によって達成することができる。このような方法は当業者には知られたものである。例えば、ストレス誘導プロモーターであるｒｄ２９Ａ遺伝子のプロモーターの制御下においてＤＲＥＢ１Ａ遺伝子を発現させるとストレスに応答してＤＲＥＢ１の標的遺伝子の発現が野生型植物と比較して大幅に増大することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，２８７−，１９９９）。また、転写活性化のためにエンハンサーをランダムに挿入し、その中から特徴的な形質をもつ個体を選抜することにより標的遺伝子を同定できたことが報告されている（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，３４，７４１−７５０，２００３；Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２９，１５４４−１４４６，２００２）。
本発明において、本発明の形質転換植物のＧＧＴ活性は同条件で栽培された対応する非形質転換植物に対して、対応する組織におけるＧＧＴ活性レベルにおいて、好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは約３倍以上、特に好ましくは約５倍以上に増大している。
また、ｍＲＮＡレベルにおいても、本発明の形質転換植物のＧＧＴ  ｍＲＮＡレベルは同条件で栽培された対応する非形質転換植物に対して、対応する組織におけるＧＧＴ  ｍＲＮＡレベルにおいて好ましくは約２倍以上、より好ましくは約５倍以上、最も好ましくは約３０倍以上まで増大する。本発明の植物および本発明の方法によって得られる植物においてＧＧＴ活性とｍＲＮＡ量は強い正の相関関係が見られる。
本明細書において、植物体の一部においてのみＧＧＴ活性が増大した植物、例えば、塊茎を含む茎、葉、花においてのみＧＧＴ活性が増大した植物およびそのような植物の作出方法も本発明に含まれる。従って、植物体の一部においてのみ総アミノ酸含量の増加、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの少なくとも１以上のアミノ酸含量、特にＳｅｒおよび／またはＡｒｇ含量の増加が見られる場合も本発明の範囲に含まれる。
本発明においてＧＧＴ活性の増大はペルオキシソーム、特に光合成組織のペルオキシソームにおいて行われることが好ましい。光合成組織は通常の培養あるいは栽培条件下で光合成を行っている組織であればよく、たとえば、葉、茎、鞘その他が含まれる。
本発明で標的とするＧＧＴ遺伝子は種々の植物体から取得することもできる。たとえば、ＧＧＴ遺伝子は、データベース上でグルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼあるいはアラニンアミノトランスフェラーゼをキーワードとして検索することにより、そのＤＮＡ塩基配列情報を得ることが可能である。配列情報をもとにＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥを行い、全長ｃＤＮＡを取得できる。また既知の配列情報をもとにｃＤＮＡライブラリーから適切なプローブを用いたハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、取得することも可能である。このスクリーニングに用いるプローブはＧＧＴのアミノ酸または塩基配列をもとに調製することが可能である。
本発明においては、前述したように発現を増大させるべきＧＧＴはペルオキシソーム、特に光合成組織のペルオキシソームに局在することが好ましい。このようなペルオキシソームへの局在は、ペルオキシソーム局在タンパク質に特徴的なＮ末端近傍配列あるいはＣ末端近傍配列の存在によって推定することができる。このような配列としては、例えば、Ｎ末端側配列として、Ａｒｇ−（Ｌｅｕ／Ｇｌｎ／Ｉｌｅ）−Ｘ５−Ｈｉｓ−Ｌｅｕまたはこれと類似した配列、Ｃ末端側配列として、（Ｓｅｒ／Ａｌａ）−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ）またはこれと類似した配列が挙げられる。また、ＧＧＴ活性を有するタンパク質に前述のようなペルオキシソーム局在タンパク質に特徴的なＮ末端配列あるいはＣ末端配列を人工的に付加してもよい。更に、得られたＧＧＴ遺伝子に、ＧＦＰやＧＵＳといったレポーター遺伝子を、ペルオキシソームへの局在性を保持するように融合させ、細胞内で発現させ、観察することで確認することもできる。あるいは、タグつきのＧＧＴを発現させ、特異的抗体を用いて局在性を確認してもよい。
本発明において、ＧＧＴ遺伝子発現を増大させるための遺伝子構築物は当業者によく知られた方法を利用して作製することが出来る。ＧＧＴ遺伝子発現のためのプロモーターは植物で機能するプロモーターであればよく、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１−３９０７，１９８７）、トウモロコシユビキチン（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：６７５−６８９，１９９２）、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター等によってＧＧＴ発現を駆動する遺伝子構築物を利用することが出来る。特に、高発現プロモーターが好ましい。ターミネーターも植物細胞内で機能するものであればよく、例えばＣａＭＶ由来のターミネーターやノパリン合成遺伝子由来のターミネーターを利用することが出来る。また、植物のゲノム中に存在するＧＧＴ発現単位を用いることも出来る。核酸構築物を設計および単離し、その配列を決定する方法を含む分子生物学的手段については例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓのような文献を参照することができる。あるいは、本発明に使用し得る核酸構築物を作製するためにＰＣＲ法を初めとする遺伝子増幅が必要になることもあるが、そのような手法についてはＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌｏ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）などを参照することができる。
上述の実施態様において使用し得る核酸構築物導入法は特に限定されず、植物細胞あるいは植物体への遺伝子導入法として当業者に知られた方法を宿主に応じて選択することができる。例えば、アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを利用することができる。アグロバクテリウムを利用する場合は、移入される配列は左右のＴ−ＤＮＡボーダー配列の間に挿入されることが好ましい。このようなＴ−ＤＮＡをベースとする形質転換ベクターの適切な設計および構築は当業者によく知られたものである。また、そのような核酸構築物を有するアグロバクテリウムを特定の植物に感染させるための条件も当業者によく知られたものである。そのような技術および条件については、例えば、秀潤社、細胞工学別冊「モデル植物の実験プロトコル  イネ・シロイヌナズナ編」（１９９６）等を参照することができる。
遺伝的改変操作を行う植物種は特に限定されないが、栽培および形質転換が容易で植物体への再生系が確立している植物種が好ましい。本発明に適した植物は前述の特性を有するものの他、大量栽培技術の確立した植物種や食品としての利用価値の高い植物等がより好ましい。そのような植物には、モデル植物としてのシロイヌナズナの他に、イネ、トウモロコシ、コムギ、テンサイ、キャッサバ、ホウレンソウ、キャベツ、レタス、サラダナ、セロリ、キュウリ、トマト、ソラマメ、ダイズ、アズキ、インゲン、エンドウ等が含まれる。これらの植物は天然のものでもよく、すでに遺伝的改変を受けた植物、例えばその植物にとって天然のＧＧＴ遺伝子の発現が増大した植物であってもよい。何らかの遺伝的改変を受けた植物は、既存のライブラリー、例えば既存の遺伝子強発現ライブラリーから選択することもできる。
次に上述のように遺伝的に操作された植物細胞等は、形質転換体について選抜される。この選抜は、例えば形質転換に使用した核酸構築物上に存在していたマーカー遺伝子の発現に基づいて行ってもよい。例えば、マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合は、適当な濃度の抗生物質または除草剤等を含む培地上で操作された植物細胞等を培養または生育させることにより選抜することができる。あるいは、マーカー遺伝子がβ−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などの場合はその活性についてスクリーニングすることにより形質転換体を選抜することができる。このようにして同定された形質転換体、例えば、プロトプラスト、カルス、外植片等から植物体への再生を行なうことが出来る。この再生には使用する宿主植物について当業者に知られた方法を利用することができる。このようにして得られた植物体は通常の方法、すなわち非形質転換体と同様の条件または、各形質転換体に適した条件で栽培してよく、本発明の核酸構築物を含む形質転換植物を同定するために前述のマーカー遺伝子に基づく選抜に加えて、種々の分子生物学的手法を利用することができる。ＧＧＴ遺伝子のゲノムへの挿入の確認、挿入位置の同定、ゲノム中へ挿入されたコピー数の確認等を調べるためには、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲなどを利用することができる。
次に、得られた形質転換植物は、ＧＧＴタンパク質量、ＧＧＴ活性、およびＧＧＴのｍＲＮＡ量について評価することができる。例えばタンパク質の量はウエスタンブロット等の方法により、ｍＲＮＡ量はノーザンブロット、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法によって評価することができる。またＧＧＴ活性は、一般的な方法（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：１５２０−１５２５）によって測定することができる。例えば、光合成組織におけるＧＧＴ活性を測定するには、まず、植物の葉等の光合成組織を液体窒素で凍結後粉砕し、適当な抽出液、例えば、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、１０ｍＭ  ＤＴＴを含むバッファーに懸濁し、限外濾過をおこない、前述した方法（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：１５２０−１５２５）によって測定すればよい。ペルオキシソームに局在するＧＧＴ活性を測定するには、一般的な方法（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４３：７０５−７１３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：５１７９−５１８４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４９：２４９−２５１等）に従って、ペルオキシソームを単離し、前述した方法によって測定すればよい。これらの方法はいずれも当業者にはよく知られたものである。
本発明において、形質転換植物のＧＧＴ活性は同条件で栽培された対応する非形質転換植物に対して、対応する組織におけるＧＧＴ活性レベルにおいて好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは約３倍以上、特に好ましくは約５倍以上にまで増大している。
得られた植物は、植物体中のアミノ酸含量について評価することができる。アミノ酸含量は、例えば、植物体またはその一部破砕し、抽出液を通常のアミノ酸分析装置にかけることによって調べることができる。例えば、植物体またはその一部からなるサンプルに８０％エタノールを５００μｌ加え、細胞破砕機ＭＭ３００（ＱＩＡＧＥＮ）で破砕後、８０℃で１０分間処理することでアミノ酸を抽出できる．遠心分離後、減圧旋回を行い残ったサンプルを０．０２ＮのＨＣｌに溶かすことで分析サンプルを調製できる。０．２２μｍのフィルターを通すことで不純物を除去しアミノ酸分析にはアミノ酸アナライザーＬＳ−８８００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いアミノ酸含量を測定することができる。植物体中のアミノ酸含量は、同条件で生育させた対照植物に対する、総アミノ酸量、セリン（Ｓｅｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）の少なくとも１つの含量、特定の組織、好ましくは光合成組織、例えば、葉あたりの総アミノ酸量、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの１以上の含量の増加割合等を指標として定量化し、場合により統計的に処理することができる。その結果、いずれか１以上の指標について、増加が統計的に有意であれば、例えば有意水準５％において統計的に有意であれば、その結果に対応して、対照植物に比較して総アミノ酸量、あるいは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの１以上の含量が有意に増加したと判断することができる。
また、ＧＧＴ遺伝子の発現が増大した植物は、エンハンサーやＴ−ＤＮＡタグをランダムに挿入した植物ライブラリーからＧＧＴ活性の増加した植物を得ることも可能である。
更に、ＧＧＴ遺伝子の発現が増大した植物は、上述のような直接的な分子生物学的手法によらずに得ることも可能である。すなわち、既知の変異原を作用させ、上述のような特性を指標として、ＧＧＴ遺伝子の発現が増大し、ＧＧＴ活性が上昇した植物を選抜することが可能である。植物に対して変異を誘導する物質および変異誘導方法は当業者によく知られたものである。変異原としては、例えば、ＥＭＳ、メチルニトロソウレア、γ−線、ＵＶ、イオンビーム、Ｘ線の照射等が利用できる。
本発明により、アミノ酸含量の増大、特にＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの一以上のアミノ酸含量が増大した植物が得られる。特に、本発明により、総アミノ酸含量が同条件で栽培された対応する非形質転換植物または野生型植物に対して好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは４倍以上増加した成体植物が得られる。特にＳｅｒ含量については、本発明により、同種の野生型植物または対応する非形質転換植物に比較して、約２倍以上、好ましくは３倍以上、特に好ましくは２０倍またはそれ以上の増大が得られる。Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ含量についても約１．５倍以上、好ましくは約３倍以上、最も好ましくは５倍以上の増大が得られる。特にＡｓｎ、Ａｒｇについては５倍以上の増大が得られる。
また、窒素肥料を硝酸態のみにして本発明の植物を栽培することにより、Ｓｅｒ含量を特に増大させることができる。一方、窒素肥料としてアンモニア態を含ませることにより、Ｓｅｒに加えてＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ含量を増大させることができる。従って、栽培条件、特に窒素肥料の性質を変えることにより、本発明の植物のアミノ酸含量を制御することもできる。
このようにして、アミノ酸含量が増大した植物が同定されたならば、その形質が遺伝的に安定に保持されるか否かを調べることもできる。このためには通常光条件下で植物体を栽培して種子を採取し、その後代における形質および分離を解析すればよい。形質転換体については後代における導入核酸構築物の有無、その位置、その発現等は初代形質転換体と同様に解析することができる。直接的な遺伝子導入に依らずに本発明の植物を得た場合も、同様に遺伝的変異の有無、その位置等を解析することができる。
アミノ酸含量が増大した植物は導入したゲノムに組み込まれた核酸構築物由来の配列に関して、あるいは、変異若しくは破壊された遺伝子に関して、ヘテロ接合の場合もホモ接合の場合もあり得るが、必要に応じて交配すること等によりヘテロ接合体もホモ接合体も導くことができる。ゲノムに組み込まれた核酸構築物由来の配列は後代においてメンデルの遺伝法則に従って分離する。従って、本発明の目的のためには、形質の安定性の観点からホモ接合植物を使用するのが好ましい。本発明の植物は、通常の栽培条件下で栽培することができる。
本発明の植物は、ＧＧＴ活性の上昇した植物または上述のアミノ酸含量の増大した植物の細胞や植物体の一部から植物体を再生させることによって作製および／または増殖させることもできる。例えば、ＭＳ基本培地に適切なホルモンを加えた培地上で本発明の植物の細胞または組織片を培養することによって、場合によりカルス等の細胞塊形成または胚形成を経て、本発明の植物の特性を有する植物を再生させることができる。このような、植物細胞または植物の一部から植物体を再生させる技術は当業者にはよく知られている。本発明のＧＧＴ活性の上昇した植物または上述のアミノ酸含量の増大した植物が種子繁殖可能な場合は、本発明の植物から種子、好ましくはヘテロ接合種子を採取し、通常の方法に従って、例えば単に適切な土壌に播種することにより、上述の特性を有する本発明の植物を得ることができる。
本発明の種子を製造する場合には、ホモ接合体植物を栽培し、その種子を回収することが特に好ましい。ホモ接合体の選抜は、世代を繰り返し、注目している表現型について分離しなくなるまで、すなわち、全ての後代において注目している表現型が現れる株を選抜することによって行なうことができる。更に、ＰＣＲやサザン解析によってホモ接合体を選抜することも可能である。本発明の種子は、植物体について上述した方法に準じてアミノ酸含量を測定することにより、同条件で栽培された対応する野生型植物より得られる種子に比較してアミノ酸含量、特に、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの少なくとも１つの含量が増加していることを確認することができる。
さらに、本発明の植物が栄養増殖可能である場合には、植物の一部から直接本発明の植物の特性を有する植物を増殖および／または増殖させることができる。このような増殖方法は当業者にはよく知られている（例えば、講談社  園芸大百科  １０  栽培の方法、１９８０を参照せよ）。栄養増殖方法には例えば、イモやニンジンなどの場合のように塊根または塊茎を用いる方法、挿し木による方法、接木による方法などが含まれるがこれらに限定されない。このようにして作製および／または増殖させた植物の特性、特にアミノ酸含量は上述したように評価することができる。
本発明の植物および種子は、食品および食品材料として、対応する野生型植物と同様に利用することが出来る。従って、本発明の植物および種子は、そのまま、あるいは通常の調理法および加工法に従って食品として利用することができ、飼料としても利用することができる。
本発明の、または本発明の方法によってアミノ酸含量、特に、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの少なくとも１つの含量が増大した植物からこれらのアミノ酸を含む植物抽出物を得るためには、植物からアミノ酸画分を含む抽出物を得る一般に知られた方法、特にＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの少なくとも一つを含む画分を抽出するための方法を利用することができる。Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの少なくとも一つを含む抽出物からこれらのいずれかのアミノ酸を精製するためには、種々のクロマトグラフィーを含む、当業者に知られた多数の方法が利用できる。
以下の実施例は、モデル植物としてのシロイヌナズナ、およびイネを材料として本発明の植物等を得る方法、および得られた植物および種子の特性を記載したものである。本発明の植物、その種子、および本発明の方法は、シロイヌナズナおよびイネという特定の植物種に限定されないことは当業者には明らかであろう。
さらに、本明細書の開示内容により、ＧＧＴ遺伝子が形質転換植物の作製においてマーカー遺伝子として利用できることも当業者には明らかであろう。例えば、ＧＧＴを特異的に阻害する物質に対する耐性を与える、ストレス耐性を与える等のためにＧＧＴ遺伝子を利用することができ、そのような阻害物質存在下またはストレス下における形質転換植物のスクリーニングに利用することが出来る。
【実施例】  植物の栽培は全て以下の条件で行った：
プレート上での培養の為の基本培地として、１％（ｗ／ｖ）シュークロース、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、０．８％（ｗ／ｖ）寒天を含むＰＮＳ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：４３０−４３４）またはＭＳ（Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４７９）無機塩類を用いた。ロックウール上での栽培では、ＰＮＳ無機塩類のみを栄養源とした。
また、すでに取得していたシロイヌナズナＧＧＴ欠損株をモデル植物として形質転換実験に用いた。ＧＧＴ欠損株の取得方法を参考例１および２に示す。
参考例１．シロイヌナズナのＧＧＴ欠損株の取得
（１）ＧＧＴ欠損株のスクリーニングのためのプライマー作製
ＧＧＴ遺伝子は、ＡｌａＡＴ遺伝子でもあるので、シロイヌナズナのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡｌａＡＴ）遺伝子の情報を基にＧＧＴ遺伝子を取得した。
インターネット上に公開されているＡｌａＡＴ遺伝子データ（ＧｅｎＢａｎｋ）をもとにＡｌａＡＴ（ＧＧＴ）のコピー数および配列を予測しプライマーを作製した。Ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓをキーワードにデータ検索を行った結果、少なくともゲノム上に４コピー、ＧＧＴ遺伝子と予想される遺伝子が存在することが分かった。各遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＡＣ００５２９２（Ｆ２６Ｆ２４．１６）、ＡＣ０１１６６３（Ｆ５Ａ１８．２４）、ＡＣ０１６５２９（Ｔ１０Ｄ１０．２０）、ＡＣ０２６４７９（Ｔ１３Ｍ２２．３）であった。それぞれの遺伝子をＧＧＴ１、ＧＧＴ２  ＧＧＴ３およびＧＧＴ４と命名し、それぞれのｃＤＮＡヌクレオチド配列を配列番号１、３、５および７に、予想されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６および８に記載した。ＧＧＴ１に対するＧＧＴ２、ＧＧＴ３、ＧＧＴ４の相同性は以下の表１の通りである。また、予想される各アミノ酸配列の比較を図２に示した
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ＥＳＴ情報を調べた結果、４コピーのうちＧＧＴ１の発現量がもっとも高い事が予想された。そこでＧＧＴ１の配列をもとに遺伝子破壊株スクリーニングの為のＰＣＲプライマーを作製した（表２）。これらのプライマーは、かずさＤＮＡ研究所が提供しているシステムに対応して設計されている。
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（３）ＧＧＴ破壊株の単離
かずさＤＮＡ研究所が提供しているシステムを利用し遺伝子破壊シロイヌナズナライブラリーに対してＧＧＴに関するスクリーニングを行った。スクリーニングは、植物細胞工学シリーズ１４「植物のゲノム研究プロトコール」（秀潤社）２−４−ｃに書かれている手順に従って行った。
１次スクリーニングでは遺伝子側のプライマーとして（ＡＡＴ１Ｕ／ＡＡＴ１Ｌ）を用い、タグプライマーには（００Ｌ／０２Ｌ／０３Ｌ／０４Ｌ／０５Ｌ／０６Ｌ／００Ｒ／０２Ｒ／０３Ｒ／０４Ｒ／０５Ｒ／０６Ｒ）をそれぞれ対応するプールにおいて用いた。使用したタグプライマー各プールとの関係は表３に示した。
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ポリメラーゼはＥＸ−ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。反応液の組成は２０μｌ中に約３８．４ｎｇ（約１００ｐｇ  ｘ  ３８４）鋳型ＤＮＡ、１０ｐｍｏｌタグプライマー、１０ｐｍｏｌ遺伝子プライマー、２μｌ  １０ｘバッファー、５ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、０．５Ｕ  Ｅｘ−ｔａｑとした。ＰＣＲのサイクルは９４℃にて４５秒、５２℃にて４５秒、７２℃にて３分を１サイクルとして３５サイクル行った。１０μｌ  ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動により分離した。ＥｔＢｒ染色により増幅されたＤＮＡ断片を観察した。このゲルは変性液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で２０分間浸透し変性させた後、中和液［０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ］中で２０分間浸とうし、２０  ｘ  ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を用いてメンブレン−ＨｙｂｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にブロットした。ブロット後、ＵＶ架橋でメンブレンにＤＮＡを固定した。ハイブリダイゼーションおよび検出はＡｌｋＰｈｏｓ−Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い添付のプロトコールにしたがった。ハイブリダイゼーションは６５℃で行った。プローブはＡＡＴ１Ｕ／ＡＡＴ１Ｌを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行いその増幅断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。
１次スクリーニングでは３８４の独立したタグ挿入ラインから抽出したゲノムＤＮＡのミックスを１プールとして、５４プール（３８４  ｘ  ５４＝２０７３６ライン）においてＰＣＲを行った。増幅産物に対してサザン分析を行い目的産物が増幅されたかを確認した。１次スクリーニングでポジティブな結果が得られたプールＰ００３５に関して２次スクリーニングを行った。２次スクリーニングのためのＰＣＲのプライマーの組み合わせは、１次スクリーニングでポジティブな結果の得られた、ＡＡＴ１Ｕ／００ＬとＡＡＴ１Ｌ／００Ｌとした。２次スクリーニングの結果、単一のライン８０４６においてＧＧＴ１タグが挿入されていたことが明らかになった。
（４）タグ挿入位置の決定
決定したタグ挿入ラインから抽出したＤＮＡを鋳型に２組のプライマーセット（ＡＡＴ１Ｕ／００Ｌ、ＡＡＴ１Ｌ／００Ｌ）でＰＣＲを行い増幅した断片をｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。配列決定にはＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を用いた。
タグは第６エキソンに１６ｂｐの欠失を伴って挿入されており、タグの挿入により１７６−ＧＧＴＬＶ−１８０から１７６−ＡＩＱＬ（ｅｎｄ）−１８０に置換されていることが明らかになった。
参考例２．ＧＧＴ欠損ホモ接合株の取得
（１）ホモ接合体の選抜
タグの挿入が確認されたラインのＴ２種子を１０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＭＳ培地上に播種した。３週後にロックウールに移植しロッゼット葉約５ｍｍ四方のサンプルからＤＮＡを抽出した。抽出方法はＬｉの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８：４５７−４６３）に従った。ホモ接合体を同定するため、タグを挟むプライマー（ＡＡＴ１Ｕ／ＡＡＴ１Ｌ２）でＰＣＲを行った。ＰＣＲは変性９４℃にて３０秒、アニーリング５７℃にて３０秒、伸長を７２℃にて６０秒とし３０サイクル行った。コントロールには野生型のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。ＰＣＲ産物の一部を電気泳動により１％アガロースゲルで分離した。ホモ接合体は３５ラインのうち１１ライン存在した。
（２）ＧＧＴ発現の検出
ホモ接合体が得られたラインについて、その後代を用いて遺伝子破壊が起こっているかをＲＴ−ＰＣＲで確認した。ホモ接合体からの種子を１０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＭＳ培地上に播種し、すべての個体が耐性を示すことを確認した。播種後２週間の幼植物からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理後ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ）を用いてオリゴｄＴプライマーから逆転写を行い、合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてタグを挟むプライマー（ＡＡＴ１ＲＴＵ／ＡＡＴ１ＲＴＬ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは変性を９４℃にて３０秒、アニーリングを５７℃にて３０秒、伸長を７２℃にて６０秒とし、２８サイクル行った。コントロールにはＥＦ１−α（ＥＦＵ／ＥＦＬ）を用いた。ＰＣＲ産物の一部を電気泳動により１％アガロースゲルで分離した。タグ挿入ラインではＧＧＴ１の完全なｍＲＮＡは検出されなかった。
この結果に基づき、このタグ挿入株をｇｇｔ１−１と命名した。このｇｇｔ１−１株は通常の光強度では生育が顕著に阻害されるが、弱光下（およそ３０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１）では非形質転換植物と比較して生育に大きな差がないことが明らかになった。また、後述するような方法でＧＧＴ活性を測定した結果、ｇｇｔ１−１ではＧＧＴ活性が顕著に低下していること分かった。従って、ＧＧＴ活性を増大させるための実験材料としてｇｇｔ１−１を用いた。
実施例１．ＧＧＴ活性が増大した形質転換植物の作製
（１）ＧＧＴ遺伝子発現用遺伝子構築物の導入
ＧＧＴ１のゲノム領域５０８９ｂｐをＰＣＲ法にて増幅した。上流プライマーには（５’−ＣＡＡＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＴＡＡＧＡＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’：配列番号２８）を、下流プライマーには（５’−ＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＣＣ−３’：配列番号２９）を用いた。ＧＧＴ１をコードする塩基配列とＧＧＴ群のアミノ酸配列を配列番号１および２に、導入した遺伝子の構造は図３に示した。増幅した断片はバイナリーベクターｐＢＩ１０１のＧＵＳ／ＮＯＳ−ｔｅｒを除いたベクターのＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩサイトにクローニングし、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナのＧＧＴ１遺伝子破壊株（ｇｇｔ１−１）に導入した。得られた形質転換体をＰＮＳ培地に播種後２週間、７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で生育させ、幼植物体地上部の重量を測定したところ、遺伝子破壊により起こる生育阻害が完全に相補され、さらに野生型と比較して生育が促進されていた（図４）。
（２）ＧＧＴ遺伝子の発現の確認
導入した遺伝子の発現を定量ＰＣＲによって確認した。５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む１／２ＭＳ培地上に播種し、すべての個体が耐性を示すラインをＲＮＡの供給源として選択した。ＰＮＳ培地上で３０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で２週間生育させた芽生えの地上部からＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理後ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ）を用いてｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマーから逆転写を行い、合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲ用プライマー（５’−ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＧＴＧ−３’：配列番号３０、および５’−ＧＡＡＴＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＧ−３’：配列番号３１）を用いてＰＣＲを行った。
ＡＣＴＩＮ２の定量ＰＣＲ用プライマーには（５’−ＧＧＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧ−３’：配列番号３２および５’−ＧＧＴＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴ−３’：配列番号３３）を用いた。定量ＰＣＲはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００を用い、反応の条件は５０℃２分間、９５℃１０分間を１サイクル、続いて、９５℃１５秒６０℃６０秒を４０サイクルで行った。
それぞれ３回独立にＲＮＡを抽出し実験を行い、ＧＧＴ１の発現量はＡＣＴＩＮ２の発現量により標準化した。ＧＧＴ１の発現量の定量結果を図５に示した。遺伝子導入ラインでは発現量が２倍程度増加していた。
実施例２．ＧＧＴ活性が増大した形質転換植物の特性評価
（１）ＧＧＴ酵素活性の測定
酵素活性の測定の為、ＰＮＳ培地に播種後２週間、３０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で生育させた芽生えの地上部からタンパク質を抽出した。新鮮質量約２００ｍｇの植物体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて組織を破砕した。抽出用緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），１０ｍＭ  ＤＴＴ］を１ｍｌ加え、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、不溶物を除去した。さらに３回同操作を繰り返した。脱塩処理は限外ろ過フィルターＵＦＶ５ＢＧＣ００（ミリポア）を用いて行った。１０，０００ｒｐｍで約４５分遠心分離をおこない抽出液０．５ｍｌを１０倍に濃縮した。抽出用緩衝液で１０倍に希釈し、同操作を３回繰り返した。タンパク質濃度をＰｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。最終濃度が１ｍｇ／ｍｌ粗抽出液となるように１０％グリセロールを含む抽出用緩衝液を加え、粗抽出液とした。
ＧＧＴ（Ｇｌｕ＋ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ−＞Ｇｌｙ＋αＫＧ）の活性はＮＡＤ＋−ＧＤＨ（ＥＣ１．４．１．３）によるＮＡＤＨの酸化反応と共役させＯ．Ｄ．３４０ｎｍの変化により測定した。反応は０．６ｍｌ反応液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），１００ｍＭ  Ｇｌｕ，０．１１ｍＭピリドキサル５−リン酸，０．１８ｍＭ  ＮＡＤＨ，１５ｍＭグリオキシル酸，５００Ｕ／ｌ  ＧＤＨ（Ｇ２５０１）］に対して５０μｇ粗抽出液を用いて行った。コントロールにはＨＰＲの活性を用いた。ＨＰＲの活性はＮＡＤＨの酸化によるＯ．Ｄ．３４０ｎｍの変化により測定した。反応は０．６ｍｌ反応液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），５ｍＭヒドロキシピルビン酸および０．１８ｍＭ  ＮＡＤＨ］に対して５０μｇ粗抽出液を用いて行った。ＧＧＴとＨＰＲ活性を図６に示した。ＧＧＴ活性は、対応する非形質転換植物に比べてＧＧＴ遺伝子導入ラインでは約２倍になっていることが分かった。
（２）アミノ酸分析
遊離アミノ酸含量を測定する為、ＰＮＳ培地に播種後２週間、７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で生育させた幼植物体地上部およびＰＮＳを栄養源としてロックウールで６週間栽培した植物のロゼット葉からアミノ酸を抽出した。新鮮質量約１００ｍｇの植物体を液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。凍結サンプルに８０％エタノールを５００μｌ加え、細胞破砕機ＭＭ３００（ＱＩＡＧＥＮ）で破砕後、８０℃で１０分間処理することでアミノ酸を抽出した。１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後上清を取り、沈殿に８０℃の８０％エタノールを５００μｌ加えて、十分撹拌した後に再び８０℃で１０分間処理した。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後の上清を取りアミノ酸抽出液とした。１ｍｌのアミノ酸抽出液を減圧旋回にかけ、エタノールおよび水分を完全に除去した。５００μｌの水と等量のジエチルエーテルに溶かし、遠心分離後の下層を減圧旋回にかけた。残ったサンプルに０．０２Ｎ  ＨＣｌを最終濃度１０μｌ／ｍｇ  ＦＷになるように加えボルテックス後に遠心分離を行い上清を回収した。０．２２μｍのフィルターを通すことで不純物を除去し分析用のサンプルとした。
アミノ酸分析はアミノ酸アナライザーＬＳ−８８００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて行った。総アミノ酸含量と主要なアミノ酸の含量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷ）を図７および８に示した。分析の結果ＧＧＴ１過剰発現ラインではセリン含量が顕著に増大しており、ロックウール上で生育させた植物体では総アミノ酸含量、アルギニン含量も増加していた。
（３）窒素含量分析
ＰＮＳ培地に播種後２週間、７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下で生育させ、幼植物体地上部の窒素含量を測定した．測定は住友化学分析センター製のスミグラフＮＣ−１０００型を用いて行った。測定の結果、表４に示す通りＧＧＴ過剰発現ラインでは乾燥質量に対する総窒素量が増加していた。
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実施例３  ＧＧＴ活性がより増大した形質転換植物の作製
さらにＧＧＴ活性が増大した植物を作製することを目的とし、野生型株にＧＧＴ遺伝子発現用遺伝子構築物を導入し、特性評価を行なった．なお、ＧＧＴ１遺伝子破壊株（ｇｇｔ１−１）にＧＧＴ発現構築物を導入して得られるＧＧＴ１遺伝子導入株を（ｇｇｔ１−１／ＧＧＴ１）と表記し、野生型株にＧＧＴ発現構築物を導入して得られるＧＧＴ１遺伝子導入株を（ＷＴ／ＧＧＴ１）と表記する。
（１）ＧＧＴ遺伝子発現用遺伝子構築物の導入
実施例１（１）に記載した方法と同様な方法を用いて野生型株（Ｃｏｌ−０）にＧＧＴ１遺伝子を導入した。
（２）ＧＧＴ遺伝子の発現の確認
導入した遺伝子の発現は実施例１（２）記載の方法を用いて確認した。ＲＮＡの供給源として、ＰＮＳ培地上で２週間栽培した野生株、（ｇｇｔ１−１／ＧＧＴ１）株２系統、および（ＷＴ／ＧＧＴ１）株７系統を用いた。ＧＧＴ１の発現量の定量結果を図９に示した。遺伝子導入ラインでは発現量が５−３０倍増加していた。
実施例４  ＧＧＴ活性がより増大した形質転換植物の特性評価
（１）ＧＧＴ酵素活性の測定
酵素活性の測定は実施例２（１）記載の方法を用いて行なった。ＧＧＴ活性および対照としたＨＰＲ活性を図１０に示した。野生型に比べてＧＧＴ遺伝子導入ラインではＧＧＴ活性は約２から６倍になっていた。
（２）アミノ酸分析
遊離アミノ酸含量は実施例２（２）記載の方法を用いて行なった。実施例３（２）および４（１）においてＧＧＴ発現量と酵素活性を測定した株について、ＰＮＳ培地上でのセリン含量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＦＷ）を図１１に示した。さらに、合計４０系統についての測定結果を表５に示した。発現量、酵素活性、セリン含量の相関を図１２に示した。１／２ＭＳ培地上で生育させた植物の主要なアミノ酸含量と総アミノ酸含量を図１３に示した。種子中のアミノ酸含量は図１４および１５に示した。分析の結果ＧＧＴ１過剰発現ラインではセリン含量が最大２０倍程度増大していた。発現量、酵素活性、セリン含量を比較したところ、それぞれに有意な相関があることが示された。
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また１／２ＭＳ培地で生育させた場合はＮｏ４の株で対照と比較しセリン以外にアスパラギンが５倍、グルタミンが３倍、アルギニンが５倍、総アミノ酸が４倍程度増大していた。さらに、ＧＧＴ１過剰発現ラインは、窒素源が硝酸態のみからなるＰＮＳ培地で栽培した場合にはＳｅｒ含量が顕著に増加し、アンモニア態窒素を含む１／２ＭＳ培地で栽培した場合にはＳｅｒ含量の増加に加え、アスパラギン、グルタミン、アルギニンが３−５倍程度増加した。
種子中のアミノ酸は、連続光下およそ２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光条件下、改変ＰＮＳ肥料（５ｍＭ  ＫＮＯ３を２．５ｍＭ  ＮＨ４ＮＯ３に置換）で栽培した植物体から得た種子を用いて測定した。ｇｇｔ１−１／ＧＧＴ１  ４−７株は野生型株と比較して、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、グリシン、アルギニンの蓄積増加が見られた。また総アミノ酸含量も増加した。
実施例５  トマト  ポテトのＧＧＴ形質転換体の作出
（１）トマト形質転換体の作出
トマト（栽培品種、ミニトマト（株）福花園種苗）の種子を７０％エタノール（３０秒）、２％次亜塩素酸ナトリウム（１５分）を用いて表面殺菌した後、植物ホルモンを含まないＭＳ寒天培地に置床し、１６時間日長、２５℃で１週間培養する。得られた無菌幼植物より子葉を切り取り、２ｍｇ／ｌゼアチンと０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸を加えたＭＳ寒天培地（再分化培地、９ｃｍシャーレ使用）に置床し２日間同条件で培養する。構築した遺伝子を含むアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０１）はＹＥＰ培地（表−３）で一晩培養したものを感染に用いる。２日間培養した子葉を滅菌シャーレに集めアグロバクテリウム液を加え感染させる。滅菌したろ紙を用いて余分なアグロバクテリウム液を子葉から取り除き、さらに、アグロバクテリウムの急激な増殖を防ぐため、先に用いたシャーレ培地に滅菌ろ紙を敷き、その上に感染させた子葉を乗せ、２４時間共存培養する。
その後、子葉を５０ｍｇ／ｌカナマイシン、５００ｍｇ／ｌクラフォランを含むＭＳ再分化培地（選抜培地）に移し、形質転換体の選抜を行う。再分化したシュートを新しい選抜培地に移し再選抜を行う。緑色で旺盛に生育したシュートを茎の部分で切り取り、植物ホルモンを含まないＭＳ培地（発根培地，試験管）に移す。発根した再分化植物を順次土壌に馴化さる。
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（２）ポテト形質転換体の作出
茎頂培養によってポテト（バレイショ）の無菌植物を得、茎頂を継代することによって材料を増やした。ＭＳ培地に２％ショ糖を加えた液体培地（１０ｍｌ）に茎頂を入れ、発根を誘導した。発根後、１６％ショ糖を含むＭＳ液体培地を１０ｍｌ加え、暗所培養を行い、マイクロチューバーを誘導した。６−８週後のマイクロチューバーをディスク状に切り、皮をむいた後、２８℃で一晩培養した実施例１（１）記載の遺伝子構築物を導入したアグロバクテリウム（実施例１（１）記載の遺伝子構築物を導入した）を感染させる。滅菌ろ紙を敷いたＭＳ寒天培地（ＭＳ培地、２．０ｍｇ／ｌゼアチン，０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸，０．３％ゲルライト）上に乗せ、２５℃、１６時間日長で２日間共存培養する。その後選抜培地｛ＭＳ培地、２．０ｍｇ／ｌゼアチン，０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸，０．３％ゲルライト，５０ｍｇ／ｌカナマイシン，５００ｍｇ／ｌクラフォラン｝に移し、同条件で培養する。１週間ごとに新しい選抜培地に移し、再分化したシュートを植物ホルモンの含まない選抜培地に移し、発根を誘導する。実施例１（１）記載の遺伝子構築物を導入したアグロバクテリウムを感染させ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌを含む培地で選抜を行う。
実施例６．イネのＧＧＴ形質転換体の作出
（１）シロイヌナズナＧＧＡ１導入イネ形質転換体の作製
シロイヌナズナＧＧＴ１のｃＤＮＡ領域をＰＣＲ法にて増幅した。上流プライマーには（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＣＴ−３’：配列番号３８）を、下流プライマーには（５’−ＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＧＡＡＴＡＡ−３’：配列番号３９）を用いた。増幅した断片は、下線で示した制限酵素部位（ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ）を用いてＣＡＢプロモーター（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４２  １３８−，２００１）の下流に接続し、バイナリーベクターｐＩＧ１２１ＨＭの３５Ｓプロモーター＋ＧＵＳ領域と置換した。アグロバクテリウムを介してイネ（品種  キタアケ）に導入した。形質転換は鳥山らの方法を用いた（モデル植物の実験プロトコールＰ９３−  １９９６年  秀潤社）。
ハイグロマイシンを含む選抜培地上で耐性を示した個体を土に鉢上げした後、葉をサンプリングしＲＮＡの抽出、アミノ酸分析に用いた。
（２）ＧＧＴ１遺伝子の発現の確認
薬剤耐性を指標として選抜した２０株について導入した遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理後ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ）を用いて。ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマーから逆転写を行い、合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ用プライマー（５’−ＴＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＧＧＡＴＴＣＴＴＧ−３’：配列番号４０、および５’−ＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡ−３’：配列番号４１）を用いてＰＣＲを行った。反応は９５℃１５秒、６０℃６０秒を４０サイクルという条件で行った。調べた２０株の形質転換ラインでは、ＧＧＴ１のＤＮＡ断片の増幅が確認できたことから、導入遺伝子が発現していることが示された。
（３）ＧＧＴ１遺伝子導入イネのアミノ酸含量
遊離アミノ酸含量の測定は実施例２（２）記載の方法を用いて行なった。形質転換体では非形質転換体と比較し有意にＳｅｒ含量が増加していることが示された（図１７）。
【配列表フリーテキスト】配列番号９−３３、３８−４１：ＰＣＲプライマー
本発明により、植物の特性を改善するためのグルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の新規な利用方法が提供される。
本発明によりＧＧＴ活性の上昇した植物が提供される。より具体的には、本発明により、ＧＧＴ活性レベルにおいて好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは約３倍以上、特に好ましくは約５倍以上にまで増大した植物が提供される。
また本発明により、植物および／またはその種子のアミノ酸含量の増大、特に、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの少なくとも一つを増加させる方法、アミノ酸含量、特にＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの少なくとも一つが増加した植物および／または種子、それらの植物および／または種子の飼料製造への使用およびグルタミン酸含量の増加した植物および／または種子を含む飼料が提供される。
また、本発明によりＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎの一以上のアミノ酸を多量に含む植物抽出物が容易に得られる。
さらに、植物のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸含量とリジン含量の変化には強い相関があることが示唆されており（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５，８４５−８５３，２００３）従って、グルタミンおよび／またはアスパラギン含量の増加した本発明の植物またはそのような植物を作製する方法により、リジン含量の増加した植物を提供し得る。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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