(57)【要約】体毛の主要成分であるケラチンに結合するタンパク質群及びそれらをコードする遺伝子、特に毛髪ケラチンに特異的に強く結合する毛髪ケラチン付随タンパク質（ｋｅｒａｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＫＡＰ）や、それをコードする遺伝子などを提供するものである。ヒト２１番染色体の真正クロマチン領域約３３．５Ｍｂの塩基配列を決定し、２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．３）の塩基配列に対してドットマトリックス解析を行い、低頻度反復配列のホモロジーを検索し、毛根細胞以外では発現しない１６個のＫＡＰ遺伝子を見い出す。また、２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．１１）のＣＬＤＮ８遺伝子とＴＩＡＭ１遺伝子との間の約１Ｍｂにわたる配列に存在する高頻度反復配列をマスキングし、短い低頻度反復配列の有無を検索し、２２個のＫＡＰ遺伝子を見い出す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の毛髪ケラチン付随タンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号２ｎ−１（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質をコードする配列番号１５１，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９，１９３，１９５，１９７，１９９，２０１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３記載のＤＮＡとモデレートな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質。
【請求項７】
毛髪ケラチン結合活性を有する配列番号１５２，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４，１６６，１６８，１７０，１７２，１７４，１７６，１７８，１８０，１８２，１８４，１８６，１８８，１９０，１９４，１９６，１９８，２００，２０２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列番号１５２，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４，１６６，１６８，１７０，１７２，１７４，１７６，１７８，１８０，１８２，１８４，１８６，１８８，１９０，１９４，１９６，１９８，２００，２０２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質の一部からなり、ケラチンに特異的に結合することを特徴とするペプチド。
【請求項１０】
ＳＣＣＸＰＳＣＣＸＰ（Ｘ：Ｑ，Ｖ，Ｒ，Ｉ）又はＳＣＣＸＰＳＣＣＸＰ（Ｘ：Ｑ，Ｖ，Ｒ，Ｉ）の全部若しくは一部を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項１１】
ＹＧＧＸＧＹＧＳＧＹ（Ｘ：Ｙ，Ｌ，Ｆ）又はＹＧＧＸＧＹＧＳＧＹ（Ｘ：Ｙ，Ｌ，Ｆ）の全部若しくは一部を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項１２】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
【請求項１３】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１３又は１４記載の抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチド。
【請求項１６】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡから選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１７】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドから選ばれる１又は２以上のタンパク質又はペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１７記載の宿主細胞を培養することを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの製造方法。
【請求項１９】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
【請求項２０】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを過剰発現する非ヒト動物。
【請求項２１】
非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１９又は２０記載の非ヒト動物。
【請求項２２】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチド、あるいは請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを発現している細胞膜と、被検物質とを用いることを特徴とする毛髪ケラチン結合活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質若しくはペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを発現している細胞が、請求項１７記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２３記載の毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質若しくはペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２１のいずれか記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質、又は、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる毛髪ケラチン結合活性促進物質。
【請求項２７】
請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる毛髪ケラチン結合活性抑制物質。
【請求項２８】
請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの発現促進物質。
【請求項２９】
請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの発現抑制物質。
【請求項３０】
請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチド、請求項１５記載の組換えタンパク質若しくはペプチド、請求項１６記載の組換えベクター、請求項１７記載の宿主細胞、請求項２６記載の毛髪ケラチン結合活性促進物質、又は請求項２８記載の発現促進物質からなる群から選ばれた１種又は２種以上を有効成分とすることを特徴とする化粧・治療剤。
【請求項３１】
請求項１３若しくは１４記載の抗体、請求項２７記載の毛髪ケラチン結合活性抑制物質、又は請求項２９記載の発現抑制物質からなる群から選ばれた１種又は２種以上を有効成分とすることを特徴とする化粧・治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質若しくはペプチド及びそれをコードするケラチン付随タンパク質遺伝子、並びにかかるタンパク質・ペプチドを用いた、毛髪ケラチン結合活性促進物質又は抑制物質等のスクリーニング方法等に関する。
背景技術
ヒトの毛繊維は毛包において作出され、その毛包は異なった特殊な上皮と結合組織からなり、人体において最も活発な組織の一つである。毛繊維は主にｋｅｒａｔｉｎ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＫＩＦｓ）とｋｅｒａｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＫＡＰｓ；毛髪ケラチン付随タンパク質）から構成されており、ＫＩＦｓはさらにタイプＩとタイプＩＩに分類され、ヒト１２番、１７番染色体に遺伝子クラスターを形成していることが知られている（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．４８，１４８−１５１，１９８８、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２０，３５７−３６２，１９９５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，７２２−７３６，１９８８、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．７７，１６９−１７４，１９９７、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８２，１０９−１１２，１９８９、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．５７，３３−３８，１９９１、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２４，５０２−５０８，１９９４）。一方、ＫＡＰｓ（毛髪ケラチン付随タンパク質）はヒト以外の動物の研究から、ＫＩＦｓ間の空間を埋めるマトリックスとしての役割を果たしており、そのアミノ酸組成の違いにより３つのグループ、すなわちｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（システイン含量３０％以上）、ｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（システイン含量３０％以下）、ｈｉｇｈ  Ｇｌｙｃｉｎｅ／Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（グリシン−チロシン含量３５〜６０％）に大別されている。ＫＡＰｓは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジなどから多くのｃＤＮＡが単離されており、現在１７のサブファミリーに属するタンパク質が同定されている（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｇ．Ｅ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈａｉｒ．Ｉｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈａｉｒ（ｅｄ．Ｊｏｌｌｅｓ，Ｐ．，Ｚａｈｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｏｃｋｅｒ，Ｈ．），ｐｐ．５９−１４８，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ．，１９９７、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５４，４３７−４４２，１９９８、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１，１２８−１３２，１９９８、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１，８０４−８０９，１９９８、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８６，１９３−１９６，１９９９、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，１５４７−１５５８，２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１９４４０−１９４５１，２００１）が、ヒトのＫＡＰに関する研究は始まったばかりである。
本発明の課題は、体毛及び皮膚の主要成分であるケラチンに結合するタンパク質群及びそれらをコードする遺伝子、特に新たな増毛剤の開発に応用することができる、特異的に強く毛髪ケラチンに結合するタンパク質や、それをコードする遺伝子や、かかるタンパク質等を用いた毛髪ケラチン結合活性促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法などを提供することにある。
本発明者らは、ヒトゲノムプロジェクトの一環として国際協力により２１番染色体の真正クロマチン領域約３３．５Ｍｂの塩基配列を決定した。２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．３）の塩基配列に対してドットマトリックス解析を行い、低頻度反復配列の有無を検索した結果、０．０５〜１．２ｋｂ程度の短い配列２１個が１６３．５ｋｂにわたって散在しクラスターを形成していることを見い出し、さらに、これらの反復配列のホモロジーを検索したところ、毛繊維を形成するＫＡＰのうちシステインに富んだアミノ酸組成をもつｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｐｒｏｔｅｉｎに属するＫＡＰであることや、２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．３）はヒトのＫＡＰ遺伝子クラスターであることがわかった。また、かかる遺伝子クラスターについて詳細に解析したところ、２１個のうち５個が偽遺伝子であり、１６個のＫＡＰ遺伝子は毛根細胞以外では発現しないことから、毛に特異的に関与する遺伝子であることを見い出した。また、２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．１１）のＣＬＤＮ８遺伝子とＴＩＡＭ１遺伝子との間の約１Ｍｂにわたる配列に存在する高頻度反復配列をマスキングし、短い低頻度反復配列の有無を検索した結果、９５ｋｂにわたり５個の遺伝子と３個の偽遺伝子がクラスターを形成し、アミノ酸組成からｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅに属することや、約６００ｋｂにわたり、１８個の遺伝子と３個の偽遺伝子がクラスターを形成し、アミノ酸組成からｈｉｇｈ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ（Ｇ／Ｙ）ｔｙｐｅに属することを見い出した。さらに、これらヒトＫＡＰｓと相同性の高いアミノ酸配列を、Ｍｏｕｓｅ  ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔ−ｇｕｎ及びＢＬＡＳＴを用いたデータベース検索により、１４個のマウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ及び２９個のマウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのアミノ酸一次配列を得て、これらアミノ酸の一次配列よりアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を作製した後、リピートモチーフを探索し、２つの機能性ペプチド見い出した。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
発明の開示
すなわち本発明は、（ａ）配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（ｂ）配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質の毛髪ケラチン付随タンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号２ｎ−１（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ（請求項２）や、毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質をコードする配列番号１５１，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９，１９３，１９５，１９７，１９９，２０１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ（請求項３）や、請求項２又は３記載のＤＮＡとモデレートな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項４）に関する。
また本発明は、配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項５）や、配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質（請求項６）や、毛髪ケラチン結合活性を有する配列番号１５２，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４，１６６，１６８，１７０，１７２，１７４，１７６，１７８，１８０，１８２，１８４，１８６，１８８，１９０，１９４，１９６，１９８，２００，２０２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項７）や、配列番号１５２，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４，１６６，１６８，１７０，１７２，１７４，１７６，１７８，１８０，１８２，１８４，１８６，１８８，１９０，１９４，１９６，１９８，２００，２０２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質（請求項８）に関する。
さらに本発明は、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質の一部からなり、ケラチンに特異的に結合することを特徴とするペプチド（請求項９）や、ＳＣＣＸＰＳＣＣＸＰ（Ｘ：Ｑ，Ｖ，Ｒ，Ｉ）又はＳＣＣＸＰＳＣＣＸＰ（Ｘ：Ｑ，Ｖ，Ｒ，Ｉ）の全部若しくは一部を含むことを特徴とするペプチド（請求項１０）や、ＹＧＧＸＧＹＧＳＧＹ（Ｘ：Ｙ，Ｌ，Ｆ）又はＹＧＧＸＧＹＧＳＧＹ（Ｘ：Ｙ，Ｌ，Ｆ）の全部若しくは一部を含むことを特徴とするペプチド（請求項１１）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド（請求項１２）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体（請求項１３）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３記載の抗体（請求項１４）や、請求項１３又は１４記載の抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチド（請求項１５）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡから選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む組換えベクター（請求項１６）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドから選ばれる１又は２以上のタンパク質又はペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１７）や、請求項１７記載の宿主細胞を培養することを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの製造方法（請求項１８）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物（請求項１９）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを過剰発現する非ヒト動物（請求項２０）や、非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１９又は２０記載の非ヒト動物（請求項２１）に関する。
また本発明は、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチド、あるいは請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを発現している細胞膜と、被検物質とを用いることを特徴とする毛髪ケラチン結合活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２２）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質若しくはペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２３）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドを発現している細胞が、請求項１７記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２３記載の毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質若しくはペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２４）や、請求項１９〜２１のいずれか記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質、又は、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２５）に関する。
さらに本発明は、請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる毛髪ケラチン結合活性促進物質（請求項２６）や、請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる毛髪ケラチン結合活性抑制物質（請求項２７）や、請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの発現促進物質（請求項２８）や、請求項２２〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチドの発現抑制物質（請求項２９）や、請求項５〜８のいずれか記載のタンパク質又は請求項９〜１１のいずれか記載のペプチド、請求項１５記載の組換えタンパク質若しくはペプチド、請求項１６記載の組換えベクター、請求項１７記載の宿主細胞、請求項２６記載の毛髪ケラチン結合活性促進物質、又は請求項２８記載の発現促進物質からなる群から選ばれた１種又は２種以上を有効成分とすることを特徴とする化粧・治療剤（請求項３０）や、請求項１３若しくは１４記載の抗体、請求項２７記載の毛髪ケラチン結合活性抑制物質、又は請求項２９記載の発現抑制物質からなる群から選ばれた１種又は２種以上を有効成分とすることを特徴とする化粧・治療剤（請求項３１）に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の対象となるタンパク質としては、ヒト２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．３）の塩基配列がコードするアミノ酸配列情報に基づいて同定することができる配列番号２ｎ（ｎ＝１から１６までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなる毛髪ケラチン付随タンパク質や、ヒト２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．１１）の塩基配列がコードするアミノ酸配列情報に基づいて同定することができる配列番号２ｎ（ｎ＝１７から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなる毛髪ケラチン付随タンパク質、すなわち配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなる毛髪ケラチン付随タンパク質（Ｋｅｒａｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＫＡＰ）や、配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質や、配列番号１５２，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４，１６６，１６８，１７０，１７２，１７４，１７６，１７８，１８０，１８２，１８４，１８６，１８８，１９０，１９４，１９６，１９８，２００，２０２に示されるアミノ酸配列からなる毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質や、配列番号１５２，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４，１６６，１６８，１７０，１７２，１７４，１７６，１７８，１８０，１８２，１８４，１８６，１８８，１９０，１９４，１９６，１９８，２００，２０２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質や、これらの組換えタンパク質等を挙げることができるが、ここで毛髪とは頭髪に限られず、全ての体毛を意味する。また、本発明の対象となる上記ケラチン付随タンパク質の部分ペプチドとしては、上記ケラチン付随タンパク質の一部からなり、かつ毛髪ケラチンに特異的に結合するアミノ酸配列を有するペプチドや、ＳＣＣＸＰＳＣＣＸＰ（Ｘ：Ｑ，Ｖ，Ｒ，Ｉ）又はＳＣＣＸＰＳＣＣＸＰ（Ｘ：Ｑ，Ｖ，Ｒ，Ｉ）の全部若しくは一部を含むペプチドや、ＹＧＧＸＧＹＧＳＧＹ（Ｘ：Ｙ，Ｌ，Ｆ）又はＹＧＧＸＧＹＧＳＧＹ（Ｘ：Ｙ，Ｌ，Ｆ）の全部若しくは一部を含むペプチドであれば特に制限されるものではない。上記本発明の対象となるケラチン付随タンパク質及びケラチン付随タンパク質の部分ペプチド、並びにこれらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体が特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドを総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」ということがある。なお、本件タンパク質・ペプチドはそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記本件タンパク質をコードするものであればどのようなものでもよく、例えば、配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列からなるケラチン付随タンパク質をコードする遺伝子や、配列番号２ｎ（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号２ｎ−１（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡや、毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質をコードする配列番号１５１，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９，１９３，１９５，１９７，１９９，２０１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡを具体的に挙げることができる。これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。例えば、配列番号２ｎ−１（ｎ＝１から１６までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ヒトゲノム２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．３）から、また、配列番号２ｎ−１（ｎ＝１７から３８までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ヒトゲノム２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．１１）から、その配列情報に基づいて常法により調製することができる。
また、ヒトＫＡＰファミリーは、タンパク質のアミノ酸レベルでは関連があるものの、ＤＮＡ塩基レベルではほとんど相同性を示さないことから、ＫＡＰ関連遺伝子を新たに見い出すには、幅広くスクリーニングすることが好ましい。かかる観点からして、本発明のＤＮＡとして、配列番号２ｎ−１（ｎ＝１から３９までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してモデレートな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ毛髪ケラチン結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。かかるＤＮＡを取得するためのモデレートな条件下のハイブリダイゼーションとしては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとしては、例えば、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したケラチン付随タンパク質等の精製や、ケラチン付随タンパク質の検出や、ケラチン付随タンパク質等に対する抗体の定量や、頭髪、髭等の増毛剤や、毛髪の着色剤、髪質（カール等）変換剤などの毛髪等の化粧・治療剤や、毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質又は本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明の前記タンパク質やペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本件タンパク質・ペプチド、融合タンパク質や融合ペプチド等の全部又は一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、本件タンパク質・ペプチドの検出・定量や、毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質又は本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質などとして、また毛繊維の形成などの機構を明らかにする上で有用である。
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件タンパク質・ペプチド、又はそれを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２，１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いることができる。
本発明の上記本件タンパク質・ペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件タンパク質・ペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件タンパク質・ペプチドに対する抗体は、前記のように、本件タンパク質・ペプチドの検出・定量や、毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質又は本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質などとして、また毛繊維の形成などの機構を明らかにする上で使用できる可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件タンパク質・ペプチドに包含される。
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件タンパク質・ペプチドの機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
本発明の組換えベクターとしては、上記本件タンパク質・ペプチドをコードするＤＮＡのうち、１又は２以上のＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されないが、本件タンパク質・ペプチドのうち、１又は２以上のタンパク質又はペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
本発明はまた、上記本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、かかる宿主細胞を培養することを特徴とする本件タンパク質・ペプチドの製造方法に関する。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８６）及び  Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
また、発現系としては、上記本件タンパク質・ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム、哺乳動物及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件タンパク質・ペプチドは、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、Ｆ．Ｐｉｅｔｒｉ−Ｒｏｕｘｅｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４７，１１７４−１１７９，１９９７）らの方法などを用いることができる。また、かかる本件タンパク質・ペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体やケラチンを結合させたカラムや、上記本件タンパク質・ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件タンパク質・ペプチドを得ることができる。上記本件タンパク質・ペプチドの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
本発明において、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件タンパク質・ペプチドを発現する機能を失った非ヒト動物をいい、また、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物としては、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件タンパク質・ペプチドを大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することができる。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件タンパク質・ペプチド欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、ＫＡＰ１ノックアウトマウスやヒトＫＡＰ１トランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
例えば、ＫＡＰ１タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＫＡＰ１ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ヒトＫＡＰ１と相同性を有するマウスＫＡＰ１をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたマウスＫＡＰ１をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのマウスＫＡＰ１をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮雌親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＫＡＰ１ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＫＡＰ１ノックアウトマウスにおいてＫＡＰ１の発現能が欠失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＫＡＰ１の発現をウエスタンブロット法等により直接調べる方法がある。
ＫＡＰ１のトランスジェニックマウスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等に由来するＫＡＰ１をコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＫＡＰ１をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
また、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、本件タンパク質・ペプチド、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体、本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、以下に具体的に説明するように、頭髪、髭等の増毛剤、毛髪の着色剤、髪質（カール等）変換剤などの毛髪等の化粧・治療剤として、また、毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質のスクリーニングや、本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニングなどに用いることができるばかりでなく、また毛繊維の形成などの機構を明らかにする上で有用である。
本発明の毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質のスクリーニングとしては、前記本発明の本件タンパク質・ペプチド又は本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞膜と、被検物質とを用いる方法や、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等を挙げることができる。また、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等は本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法に用いることができる。
上記本件タンパク質・ペプチド又は本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞膜と被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチド又は細胞膜表面に発現している本件タンパク質・ペプチドと、被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの毛髪ケラチン結合能を測定し、被検物質と接触させていないものと比較評価する方法を具体的に挙げることができる。また、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの毛髪ケラチン結合能や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定し、被検物質と接触させていないものと比較評価する方法を具体的に挙げることができる。
前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、これら非ヒト動物から得られる細胞又は組織と、被検物質とをインビトロで接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドのケラチン結合能や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定し、被検物質と接触させていないものと比較評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細胞若しくは組織、又は非ヒト動物個体における該本件タンパク質・ペプチドの毛髪ケラチン結合能や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定し、被検物質非投与のものと比較評価する方法などを具体的に挙げることができる。
また上記スクリーニング方法により得られる本発明の毛髪ケラチン結合活性促進物質や本件タンパク質・ペプチドの発現促進物質は、毛髪ケラチン結合活性の促進や本件タンパク質・ペプチドの発現の促進を必要としている患者の治療等に用いることができる。さらに、これらの促進物質は、本件タンパク質・ペプチド、特に毛髪ケラチンと最も結合の強いタンパク質／ペプチドと併用することにより、頭髪、髭等の増毛剤、毛髪の天然着色剤、髪質（カール等）変換剤などの毛髪等の新たな化粧・治療剤として有用である。また、上記スクリーニング方法により得られる本発明の毛髪ケラチン結合活性抑制物質や本件タンパク質・ペプチドの発現抑制物質は、毛髪ケラチン結合活性の抑制や本件タンパク質・ペプチドの発現の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。これらの治療薬は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコール等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（２１番染色体長腕の塩基配列における低頻度反復配列の同定）
ヒトゲノムプロジェクトの一環として国際協力により、２１番染色体の真正クロマチン領域約３３．５Ｍｂの塩基配列を決定し、２１番染色体長腕の領域（２１ｑ２２．３）の塩基配列における低頻度反復配列の有無をドットマトリックス解析により検索した。その結果を図１に示す。その結果、２１ｑ２２．３において０．０５〜１．２ｋｂ程度の短い配列２１個が１６３．５ｋｂにわたって散在しクラスターを形成していることがわかった。上記２１個の反復配列をホモロジー検索した結果、これらの遺伝子がＫＡＰの一員であるマウスのＫｒｔａｐ１２−１とウサギのＫＡＰ４Ｌ、さらにマウスのｇＵＨＳ−ＳＥＲ−１、ｇＵＨＳ−ＳＥＲ−２と有意なホモロジーが確認できた。このことから、これらの遺伝子は毛繊維を形成するＫＡＰのうちシスティンに富んだアミノ酸組成をもつｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｐｒｏｔｅｉｎに属するＫＡＰであることがわかった。以上のことから、２１番染色体長腕における領域（２１ｑ２２．３）はヒトのＫＡＰ遺伝子クラスターであると推定し、詳細を調べてみたところ、２１個の遺伝子がクラスターを形成し、そのうち５個の遺伝子が偽遺伝子であることが明らかとなった。
実施例２（ヒト２１番染色体長腕における各ＫＡＰの配列分析）
上記の結果から、クラスターを形成し、配列番号２ｎ−１（ｎ＝１から１６までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列からなる１６個の遺伝子がコードする各ＫＡＰタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２ｎ（ｎ＝１から１６までのいずれかの整数を示す）に示されるように決定し、アミノ酸の同一性を調べてみた。それらの結果を図２及び３に示す。また、ＤＮＡＳＩＳ  Ｖ３．５（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＣＯ．，ＬＴＤ）及びＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ＶＥＲＳＩＯＮ  １．４（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０，１９９４）を用いて、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法により、２１ｑ２２．３のＫＡＰ遺伝子クラスターの系統樹を作成した。これらの結果をそれぞれ図４及び図５に示す。これらの結果から、ヒトＫＡＰは２つのサブファミリー［（ＫＡＰ０１〜１１及び１７），（ＫＡＰ１２〜１５）］に分類されることがわかったが、ファミリー間におけるＤＮＡ塩基レベルでの有意な相同性は認められなかった。しかし、タンパク質のアミノ酸レベルでは関連があるものの、ＤＮＡ塩基レベルではほとんど相同性を示さないこの様な遺伝子群が何故一ヵ所にクラスターを形成しているのかという問題はゲノム進化の上で非常に興味深い。上記の結果から、アミノ酸レベル及びＤＮＡ塩基レベルにおいて有意な同一性を示した、ＫＡＰ０２とＫＡＰ０９とのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の比較を図６に示す。図６の結果は、ＫＡＰ０２及びＫＡＰ０９のスプライシングされた転写産物の配列を表している。スプライシングされない転写産物からは、２５５アミノ酸（ＫＡＰ０２）と２９２アミノ酸（ＫＡＰ０９）のタンパクが作られるが、スプライシングされたＫＡＰ０２は最初の２６アミノ酸、ＫＡＰ０９は最初の５９アミノ酸だけが本来の配列でその後の配列は、スプライシングされない転写産物では３’ＵＴＲに相当する部分が翻訳された形になっている。したがって、これらスプライシングされた転写産物から作り出されるタンパクはケラチン付随タンパクとしての機能を持ち合わせていないと推定される。
また、各ＫＡＰタンパク質の予想される２次構造をＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ６．５．３  Ｔｒｉａｌ版（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．社製）を用いて調べてみた。結果を図７に示す。羊やウサギの既知のケラチン付随タンパク（ＫＡＰ）は２次構造予測上α−ｈｅｌｉｘ構造を取らないことが知られている（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｇ．Ｅ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈａｉｒ．Ｉｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈａｉｒ（ｅｄ．Ｊｏｌｌｅｓ，Ｐ．，Ｚａｈｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｏｃｋｅｒ，Ｈ．），ｐｐ．５９−１４８，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ，１９９７、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ５８，２２７−２３２，１９９７）。２１ｑ２２．３領域から見い出したＫＡＰｓも図７から明らかなように、α−ｈｅｌｉｘ構造を全く取らないと推定された。したがって２１ｑ２２．３領域のＫＡＰｓは従来言われているケラチン付随タンパクと同様の構造上の特徴を持ち合わせていることが明らかとなった。
実施例３（ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＫＡＰの遺伝子発現部位）
ヒトの毛根又は皮膚から全ＲＮＡをグアニジン−塩化セシウム法で抽出し、抽出した全ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（ニッポンジーン社製）で処理した。得られたＲＮＡ各５μｇずつ使用し、逆転写酵素（インビトロジェン社製）及びオリゴｄＴ１８プライマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡ（ＲＴ＋）を調製し、ＰＣＲを行い増幅した。なお、逆転写酵素反応を行わないものをネガティブコントロール（ＲＴ−）として用いた。ＰＣＲ法において用いたプライマー（配列番号７９〜１１６）及びＰＣＲ条件を［表１］に示す。
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上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）をアガロースゲル電気泳動（１．５％）にかけ、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し２５４ｎｍの紫外線照射によりバンドを検出した。その結果を図８（毛根）及び図９（皮膚）にそれぞれ示す。このことから、偽遺伝子ＫＡＰ１６Ｐ以外のすべてのＫＡＰ遺伝子は毛根において発現していたが、皮膚においては発現が認められなかったことから、毛髪に特異的に関与する遺伝子と考えられる。なお、図８に示されるように、ＫＡＰ０２及びＫＡＰ０９では、スプライシングを受けない正常のｍＲＮＡの他に、それよりも短い転写産物も存在し、後者はＫＡＰのコーディング領域内のスプライシング供与部位から３’ＵＴＲ内のスプライシング受容部位の間が除かれたスプライシング産物であった。その結果、図６に示したようなＫＡＰとしては機能しないタンパク質が生成する。なお、上記スプライシングによって生ずる短型転写産物は正常の転写物に比べて短いために、ＰＣＲの条件によっては短型のみが優先的に増幅する場合がある。
実施例４（２１ｑ２２．１１における新規ＫＡＰ遺伝子クラスターの同定）
２１ｑ２２．１１のＣＬＤＮ８遺伝子とＴＩＡＭ１遺伝子との間の約１Ｍｂにわたる領域には、明らかな遺伝子が１つも存在しないとされていた。この領域に対して、実施例１における２１ｑ２２．３領域と同様にドットマトリックス解析を行ったところ、２１ｑ２２．３領域で見られたような低頻度反復配列は検出されなかった。そこで、この領域の配列に存在する高頻度反復配列をＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ：８０／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）によってマスキングし、短い低頻度反復配列を見逃さないように注意を払い再び解析を行った。その結果、最初確認されなかった低頻度反復配列の存在を示す像が浮かび上がってきた（図１０参照）。この配列をホモロジー検索したところ、マウスＰｍｇ−１、Ｐｍｇ−２、ＨＧＴｐＩＩ．１と有意なホモロジーを示し、これらはＫＡＰの一員であることが判明した。Ｐｍｇ−１、Ｐｍｇ−２とホモロジーを示した配列は９５ｋｂにわたり、５個の遺伝子と３個の偽遺伝子がクラスターを形成し、アミノ酸組成からｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅに属することがわかった（図１０左）。配列番号２ｎ−１（ｎ＝１７から２１までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列からなる５個の遺伝子がコードする各ＫＡＰタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２ｎ（ｎ＝１７から２１までのいずれかの整数を示す）に示されるように決定した。また、ＨＧＴｐＩＩ．１とホモロジーを示した配列は約６００ｋｂにわたり、１８個の遺伝子と３個の偽遺伝子がクラスターを形成し、アミノ酸組成からｈｉｇｈ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔｙｐｅに属することが明らかとなった（図１０右）。配列番号２ｎ−１（ｎ＝２２から３９までのいずれかの整数を示す）に示される塩基配列からなる１８個の遺伝子がコードする各ＫＡＰタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２ｎ（ｎ＝２２から３９までのいずれかの整数を示す）に示されるように決定した。
実施例５（組換えヒトＫＡＰｓの作製）
組換えヒトｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ及びｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓを作製した。ヒトｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ遺伝子として、ＫＡＰ０４遺伝子（配列番号７）、ＫＡＰ０５遺伝子（配列番号９）、ＫＡＰ０８遺伝子（配列番号１５）、ＫＡＰ１１遺伝子（配列番号２１）、ＫＡＰ１２遺伝子（配列番号２３）、ＫＡＰ１５遺伝子（配列番号２９）を用い、ｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ遺伝子として、ｐｍｇ０４遺伝子（配列番号４７）、ＧＹ０２遺伝子（配列番号４５）、ＧＹ２９遺伝子（配列番号７１）、ＧＹ３４遺伝子（配列番号７７）を用いた。また、発現ベクターとして、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ及びｐＴｒｉＥｘ−１．１（いずれもＮｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（ＳＩＧＭＡ社製）を用い、宿主細胞として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃ１  Ｃｏｍｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．７０９２０−４）を用いた。
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まず、ベクターｐＴｒｉＥｘ−１．１、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）及びｐＦＬＡＧ−ＣＴＣを用いて、以下の表２に示す３６種類の組換えヒトＫＡＰｓの発現系を作製した。各組換えヒトＫＡＰｓの発現をＣ．Ｂ．Ｂ．染色により確認し、うちＨｉｓ−ｔａｇ及びＦＬＡＧ−ｔａｇのある１８種類についてはウエスタンブロットにより発現の有無を確認した。クマシーブリリアントブルー（Ｃ．Ｂ．Ｂ．）染色とウエスタンブロットの結果を図１１に示す。ウエスタンブロット（図１１右）により、全ての組換えヒトｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓの発現が確認できたが、Ｃ．Ｂ．Ｂ．染色（図１１左）により確認できるほどの高発現系を得ることはできなかった。そこで、ベクターｐＥＴ−３２ａを用いて、発現系を再構築した。また、表３に示されるように、同時にヒトｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓについても同様の発現系を作製した。ｐＥＴ−３２ａはＮ末側に２０ｋＤａのＨｉｓ−ｔａｇ及びＳ−ｔａｇをもつことより、翻訳効率の増加と可溶化度の上昇が期待された。Ｃ．Ｂ．Ｂ．染色とウエスタンブロットの結果を図１２に示す。Ｃ．Ｂ．Ｂ．染色（図１２上）及びウエスタンブロット（図１２下）の結果、低分子のｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅに関して発現量の改善が認められた。また、ｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅに関しては全てにおいて高発現が認められた。
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実施例６（組換えヒトＫＡＰｓの精製）
組換えヒトｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰ１５−Ｈｉｓ６（ｐＥＴ−３２ａ）を、Ｎｉ−ＮＴＡレジンを用いて精製した。結果を図１３に示す。図１３中、レーン１は菌体可溶画分、レーン２は７．５Ｍの塩酸グアニジンと４０ｍＭのＤＴＴ処理画分、レーン３は菌体不可溶画分、レーン４は７．５Ｍの塩酸グアニジン処理画分、レーン５は非吸着画分、レーン６は２０ｍＭのイミダゾール洗浄画分、レーン７は３００ｍＭのイミダゾール溶出画分を示す。その結果、７．５Ｍの塩酸グアニジンにて一部溶解したことから、精製が可能であることがわかった。しかし依然として大部分は不溶性画分に回収された。そこで、Ｓ−Ｓ結合の切断と再結合のブロックを目的として、４０ｍＭのＤＴＴ及びＳＨ基保護剤であるＴＡＰＳスルホネートを用いて不溶性画分を処理したところ、ＫＡＰ１５−Ｈｉｓ６を可溶性画分として回収するに至った（レーン２）。この画分を透析後、Ｎｉ−ＮＴＡレジンにより精製したところ、９０％以上の純度にてＫＡＰ１５−Ｈｉｓ６が得られた（レーン７）。
組換えヒトＨｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅ  ＧＹ０２−Ｈｉｓ６（ｐＥＴ−３２ａ）及びｐｍｇ０４−Ｈｉｓ６（ｐＥＴ−３２ａ）を、Ｎｉ−ＮＴＡレジンを用いて精製した。また、菌体不溶画分を７．５Ｍの塩酸グアニジンにて可溶化し、Ｎｉ−ＮＴＡレジンにより精製を行った。結果を図１４に示す。図１４中、レーン１は菌体可溶画分、レーン２は７．５Ｍの塩酸グアニジン（ｐＨ８．０）処理画分、レーン３は菌体不可溶画分、レーン４は非吸着画分、レーン５は２０ｍＭのイミダゾール洗浄画分、レーン６は５００ｍＭのイミダゾール溶出画分を示す。その結果、ＧＹ０２−Ｈｉｓ６、ｐｍｇ０４−Ｈｉｓ６のいずれも高収量での精製が可能であることがわかった。
そこで、ＧＹ０２−Ｈｉｓ６及びｐｍｇ０４−Ｈｉｓ６の大量精製を行い、精製したＧＹ０２−Ｈｉｓ６及びｐｍｇ０４−Ｈｉｓ６について、リフォールディング条件の検討を行った。検討の結果、以下の条件下にてリフォールディングを行ったＧＹ０２−Ｈｉｓ６に関しては、図１５に示すように、非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）にてシングルバンドとして検出することができたことより、正常にフォールディングした状態のＧＹ０２−Ｈｉｓ６が得られることがわかった。一方、ｐｍｇ０４−Ｈｉｓ６に関してはＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより検出することができず、凝集体を形成していることが予想される。
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実施例７（マウスＫＡＰｓの探索）
ヒトＫＡＰｓの養毛・増毛・発毛因子としての臨床的作用を検討するために、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ及びマウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓを探索した。すなわち、マウスにおける直接の塗布実験を目的として、まずマウスＫＡＰｓの探索を行った。本発明のヒトＫＡＰｓに相同性の高いアミノ酸配列を、Ｍｏｕｓｅ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔ−ｇｕｎ及びＢＬＡＳＴを用いたデータベース検索により、１４個のマウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ及び２９個のマウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのアミノ酸一次配列を得た。１４個のマウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓは、すべて既知のマウスＫＡＰｓで、それらのアミノ酸配列が図１６〜１８に示されるように、アミノ酸配列の相同性からグループ１〜３に分けることができる。これら１４個のマウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ遺伝子の塩基配列をＭＭＵＫｒｔａｐ１４、ＭＭＵＫｒｔａｐ１５、…の順に配列番号２ｎ−１（ｎ＝５９から７２までのいずれかの整数を示す）に、ＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を同じくＭＭＵＫｒｔａｐ１４、ＭＭＵＫｒｔａｐ１５、…の順に配列番号２ｎ（ｎ＝５９から７２までのいずれかの整数を示す）に示す。また、２９個のマウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓは、それらのアミノ酸配列が図１９〜２５に示されるように、アミノ酸配列の相同性からグループ１〜７に分けることができる。これら２９個のマウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ遺伝子の塩基配列をｍＫＡＰ１−１、ｍＫＡＰ１−２、…の順に配列番号２ｎ−１（ｎ＝７３から１０１までのいずれかの整数を示す）に、ＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を同じくｍＫＡＰ１−１、ｍＫＡＰ１−２、…の順に配列番号２ｎ（ｎ＝７３から１０１までのいずれかの整数を示す）に示す。これら２９個のマウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓの塩基配列及びアミノ酸配列は既知であるが、図２６に示すように、ｍＫＡＰ１−１、ｍＫＡＰ１−２、ｍＫＡＰ１−３、ｍＫＡＰ１−５、ｍＫＡＰ６−３を除き、その機能がＫＡＰｓであることは知られていなかった。
実施例８（機能性ペプチドのデザイン）
ＫＡＰｓを育毛剤として応用するに際し、インタクトなサイズでは組織に対する浸透性に問題がある可能性がある。そこで、毛髪構成分子の材料という観点から、ＫＡＰｓ配列上の最小繰り返し単位を探索し、組織内部での架橋を目的としたペプチドのデザインを試みた。実施例７で得られたアミノ酸の一次配列よりアラインメントを作製した後、リピートモチーフを探索し、２つの機能性ペプチド、すなわち、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ：Ｎ末−ＳＣＣＸＰＳＣＣＸＰ−Ｃ末（Ｘ：Ｑ，Ｖ，Ｒ，Ｉ）［配列番号２０３］及びマウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓ：Ｎ末−ＹＧＧＸＧＹＧＳＧＹ−Ｃ末（Ｘ：Ｙ，Ｌ，Ｆ）［配列番号２０４］をデザインした。これら機能性ペプチドを用いて、マウス背部体毛を除毛した後、各ペプチド濃度０．１％をプロピレングリコールに溶解したものを連続塗布し、１ヶ月間の毛周期変化と体毛の成長速度、成長量に対する影響を観察することにより、体毛成長速度の増加、毛髪重量の増加、発毛抑制等を調べることにより、発毛剤・育毛剤・脱毛剤への応用が期待できる。
産業上の利用可能性
本発明のケラチン付随タンパク質やそれらをコードする遺伝子は、毛に特異的に関与する遺伝子であることから、それらのタンパク質の性状を解析し、毛髪ケラチンと特に強く結合するタンパク質を同定することにより、頭髪、髭等の増毛剤や、毛髪の着色剤、髪質（カール等）変換剤などの毛髪等の化粧・治療剤などの開発に有用であり、また、毛髪ケラチン結合活性促進若しくは抑制物質のスクリーニングや、本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニンなどに用いることもできる。さらに、毛繊維の形成などの機構を明らかにすることもできる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト染色体２１ｑ２２．３領域における低頻度反復配列の有無を調べた結果を示す写真である。
第２図は、本発明の各ＫＡＰのアミノ酸配列の一覧を示す写真である。
第３図は、ヒト染色体２１ｑ２２．３領域の各ＫＡＰのアミノ酸配列間の同一性を調べた結果を示す図である。
第４図は、ヒト染色体２１ｑ２２．３領域における各ＫＡＰの系統樹を示す図である。
第５図は、ヒト染色体２１ｑ２２．３領域におけるＫＡＰの系統樹を示す図である。
第６図は、本発明ＫＡＰ０２及びＫＡＰ０９をコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）及びアミノ酸配列を比較した図である。
第７図は、本発明の各ＫＡＰタンパク質の推定される二次構造を示す写真である。
第８図は、毛根におけるヒト２１番染色体ｑ２２．３領域の各ＫＡＰの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を示す図である。
第９図は、皮膚におけるヒト２１番染色体ｑ２２．３領域の各ＫＡＰの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を示す図である。
第１０図は、ヒト染色体２１ｑ２２．１１領域において新規ＫＡＰ遺伝子クラスターが存在するか否かを調べた結果を示す図である。
第１１図は、ベクターｐＴｒｉＥｘ−１．１、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）及びｐＦＬＡＧ−ＣＴＣを用いた、３６種類の組換えヒトＫＡＰｓ発現のＣ．Ｂ．Ｂ．染色とウエスタンブロットの結果を示す写真である。
第１２図は、ｐＥＴ−３２ａを用いた、１０種類の組換えヒトＫＡＰｓ発現のＣ．Ｂ．Ｂ．染色とウエスタンブロットの結果を示す写真である。
第１３図は、Ｎｉ−ＮＴＡレジンを用いて精製した、組換えヒトｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰ１５−Ｈｉｓ６（ｐＥＴ−３２ａ）のＣ．Ｂ．Ｂ．染色とウエスタンブロットの結果を示す写真である。
第１４図は、Ｎｉ−ＮＴＡレジンを用いて精製した、組換えヒトＨｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＧＹ０２−Ｈｉｓ６（ｐＥＴ−３２ａ）及びｐｍｇ０４−Ｈｉｓ６（ｐＥＴ−３２ａ）のＣ．Ｂ．Ｂ．染色とウエスタンブロットの結果を示す写真である。
第１５図は、リフォールディングを行った組換えヒトＨｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＧＹ０２−Ｈｉｓ６及びｐｍｇ０４−Ｈｉｓ６のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
第１６図は、マウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ１に属する３個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第１７図は、マウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ２に属する３個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第１８図は、マウスｈｉｇｈ  Ｇ／Ｙ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ３に属する８個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第１９図は、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ１に属する５個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第２０図は、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ２に属する５個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第２１図は、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ３に属する２個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第２２図は、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ４に属する４個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第２３図は、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ５に属する５個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第２４図は、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ６に属する５個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第２５図は、マウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのグループ７に属する３個のＫＡＰｓタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
第２６図は、２９個のマウスｈｉｇｈ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｙｐｅＫＡＰｓのジェンバンク・アクセッション・ナンバーを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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