(57)【要約】本発明は、動物細胞、例えば軟骨細胞または線維芽細胞の培養に適した３次元基材を提供する。該３次元基材は、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維であって、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地中に、室温で２週間置いても形態を保持する繊維より製造される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維であって、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地中に、室温で２週間置いても形態を保持する繊維。
【請求項２】
酸性生体高分子がヒアルロン酸、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸およびポリグルタミン酸よりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載のハイブリッド繊維。
【請求項３】
以下の工程：
１）キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製する；
２）キトサンの塩の水溶液を、アルカリ土類金属の塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる；
３）その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維を形成させる；
４）場合によりハイブリッド繊維を延伸する；、
５）ハイブリッド繊維を塩基、２塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または３酸塩基以上の有機酸もしくはその塩の水溶液で処理する；
ことを含む請求の範囲第１項に記載の繊維の製造方法。
【請求項４】
以下の工程：
１）キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製する；
２）キトサンの塩の水溶液を、塩基、２塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または３酸塩基以上の有機酸もしくはその塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる；
３）その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維を形成させる；
４）場合によりハイブリッド繊維を延伸する；
ことを含む請求の範囲第１項に記載の繊維の方法。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載の繊維よりなる動物細胞培養用３次元基材。
【請求項６】
動物細胞が軟骨細胞である請求の範囲第５項に記載の３次元基材。
【請求項７】
動物細胞が線維芽細胞である請求の範囲第５項に記載の３次元基材。
【請求項８】
動物細胞が未分化細胞である請求の範囲第５項に記載の３次元基材。
【請求項９】
請求の範囲第６項に記載の３次元基材を用いて、軟骨細胞を生体外で培養することを含む軟骨細胞の培養方法。
【請求項１０】
培養時に成長因子を添加する請求の範囲第９項に記載の培養方法。
【請求項１１】
培養を１〜１５％の低酸素条件下で行うこと、および／または０．１〜２０ＭＰａの圧負荷下で行うことを含む請求の範囲第９または１０項に記載の培養方法。
【請求項１２】
請求の範囲第７項に記載の３次元基材を用いて、線維芽細胞を生体外で培養することを含む線維芽細胞の培養方法。
【請求項１３】
培養時に成長因子を添加する請求の範囲第１２項に記載の培養方法。
【請求項１４】
培養を０．０１〜５０ｍｍ／ｃｍの引張り刺激を加えながら行う請求の範囲第１２または１３項に記載の培養方法。
【請求項１５】
請求の範囲第８項に記載の３次元基材を用いて、未分化細胞を生体外で培養することを含む動物細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、キトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維、および該ハイブリッド繊維の製造方法に関する。本発明はさらに、該ハイブリッド繊維よりなる動物細胞培養用３次元基材、並びに該基材を用いる動物細胞培養方法にも関する。
【背景技術】  高齢化社会を迎え、関節症患者は人口の１％にも達しようとしている。これらの疾患者の大部分は軟骨組織が損傷を受けたり壊死することによって起こる変形性関節症や慢性リウマチによるものと言われている。軟骨は自己再生能が極めて低いことから、外科的治療が必要な場合には人工関節置換術が施されている。しかし、この方法では装着物からの金属イオンの溶出による炎症や骨接合部との緩み、耐久性等に大きな課題があり、医療用具としての寿命は１０年程度とされていることから、人工関節手術は根治的な治療法にはなっていない。
また事故やスポーツによる靭帯（特に膝の関節を固定している膝前十字靭帯）や腱の損傷の治療では、自己の正常な靭帯あるいは腱の一部を移植する再建術が行われているが、この治療法では移植に使用した正常部位の筋力が半分程度に低下してしまい、運動機能に支障を生じることが大きな問題となっている。人工の合成繊維から成る人工靭帯を移植する手術も従来から検討されてきたが、細胞が付着しないために人工物が時間の経過とともに擦り切れてしまうという問題があり、現在は殆ど使用されていない状況にある。
そこで、近年、自己再生能の低い組織を対象に、正常部位の自己組織を一度体外に取り出し、培養して増殖・分化させた後、再び体内に移植して目的組織の再生を図ろうとする再生医療の研究が盛んに行われている。細胞はある物質の表面に接着することによって増殖・分化が起こることから、再生医療の発展には培養細胞が接着するための足場となる良好な人工基材（以下、基材と呼ぶ）の開発が不可欠とされている。
一般に、組織再生用の基材に求められる条件として、▲１▼炎症反応が見られず、生体親和性に優れていること、▲２▼生体吸収性であること、▲３▼細胞の接着性がよいこと、▲４▼細胞の活性を維持できること、▲５▼細胞の増殖・分化による組織再生が可能な３次元構造を有することが挙げられる。さらに、股関節部位の軟骨には２０Ｍｐａ程度までの圧縮応力がかかり、靭帯や腱には大きい引張り応力がかかる。このことから、軟骨組織再生用または靭帯や腱の再生用基材には上記５つの条件以外に、▲６▼体内で組織が再生されるまでの形状の安定性が確保されること、および▲７▼機械的強度を有することの２つの条件も満たす基材の開発が必要と考えられる。
再生医療の観点から線維芽細胞や平滑筋細胞、内皮細胞等の間質細胞を生体吸収性材料（ポリグリコール酸、綿、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、コラーゲン、ポリヒドロキシアルカノエート）または非生体吸収性材料（ポリアミド化合物、ポリエステル化合物、ポリスチレン化合物、ポリプロピレン化合物、ポリアクリレート化合物、ポリビニル化合物、ポリカーボネート化合物、ポリテトラフルオロエチレン化合物、ニトロセルロース化合物）から成る３次元支持体（フレームワーク）に埋め込んで培養し、間質細胞と間質細胞が自然に分泌する結合組織タンパク質によって架橋される３次元構造物を包んだ生間質組織を調製し、この構造物を移植または埋め込む方法も報告されている（特表平１１−５０６６１１号公報）。
また、天然の高分子を用いて靭帯や腱を再構築するための線維芽細胞培養用基材として、コラーゲンのスポンジやファイバー（Ｄｕｎｎ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，２９，１３６３−１３７１（１９９５））、コラーゲンにグリコサミノグリカンを結合させたスポンジ状の構造物（Ｔｏｒｒｅｓ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，１６０７−１６１９（２０００））、ポリ乳酸のファイバーの表面にコラーゲンを結合させた構造物（Ｉｄｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，Ｃ１７，９５−９９（２００１））、コラーゲンファイバーにノルジヒドログアヤレチン酸を架橋した構造物（Ｋｏｏｂ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，５６，４０−４８（２００１））等を用いて、線維芽細胞の増殖性や靭帯組織の再生検討が報告されている。
しかし、このようなコラーゲンを使用する方法ではコラーゲン基材が生体と同種的なものであることから、これに伴う抗原性や感染が深刻な問題となる可能性が高い。また、コラーゲンゲルやコラーゲンを用いた基材は変位を受けて元に戻ることが困難であり、生体吸収性の合成ポリマーのような変位に対する弾力性に欠いていることも靭帯や腱の再生基材としては大きな問題となる。
これまでの生体吸収性の軟骨細胞培養基材として、ポリグリコール酸やポリ乳酸等の合成高分子を用いたファイバーやスポンジが検討されてきた（特公平６−６１５５号公報、特表平８−５１１６７９号公報、Ｉｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｐｒｏｃ．，２５２，３５９−３６５（１９９２），Ｆｒｅｅｄ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，２７，１１−２３（１９９３）等）。上記合成高分子材料は体内での加水分解物が生体内の代謝中間体と同一であるため毒性がなく、高重合体が得られるため機械的強度を有し、成形が容易であるなどの長所がある。しかし、これらの生体吸収性合成高分子は細胞の接着性に欠けるために、材料表面に生体の細胞接着性因子であるＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のトリペプチド）や、ゼラチン、コラーゲン等の生体高分子を固定化する方法によって細胞の接着性を向上させることが検討されてきた（Ｙａｍａｏｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５，２６５−２７１，（１９９９）等）。しかし、この様な化学的固定方法は操作が繁雑であり、また、固定化処理に使用した薬品の残存等も懸念される。
一方、天然高分子を用いた軟骨細胞培養用基材としては、コラーゲンのゲルやスポンジ状基材（特開平６−２２７４４、特表平９−５１０６３９、特開２００１−２２４６７８、Ｆｕｊｉｓａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，１５５−１６２（１９９６）等）、キチンやキトサンのスポンジ状基材が検討されてきた（Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，１５３−１５９（２０００）等）。これらの基材は形状安定性および機械的強度に問題がある。また、コラーゲンは原材料費が高価であるとともに、抗原性やＢＳＥ等の感染も懸念される。
酸性（アニオン系）高分子と塩基性（カチオン系）高分子の複合体から成る培養基材が報告されている（特開平６−３３５３８２号公報、特開平６−２７７０３８号公報）が、この方法では両者の溶液を混合し、乾燥させただけの板状や薄膜状構造物であり、それ自体が繊維等から成る多孔性の３次元構造物ではない。また、上記溶液を適当な材料（ガラスや金属、プラスチック等）の表面に塗布や噴霧する方法も記載されているが、基材全体が生体吸収性のものではないために、生体での吸収性が要求される軟骨組織再生用の培養基材には適用できない。
生体吸収性の酸性高分子と塩基性高分子のハイブリッド繊維を作製する方法が報告されている（特開２００２−２９１４６１）。しかし、この繊維の作製方法では酸性高分子であるアルギン酸等を主原料とし、これに極少量の塩基性高分子であるキトサン等を付与するものであるため、例えばアルギン酸を主材料とした繊維は親水性のために培養液中で膨潤し、形状が不安定である。また、酢酸に溶解したキトサンを塩化カルシウム中で紡糸し、ヒアルロン酸溶液中に浸漬した後、巻き取とって、乾燥させただけのシート状繊維の周辺にキトサン溶液（酢酸に溶解したもの）を塗布して重ね合せた後、乾燥させたものを３次元の培養基材として用いた報告もなされている（岩崎ら、第７５回日本整形外科学会学術集会、２００２．５．１６−１９（岡山）；山根ら、第１６回日本整形外科学会基礎学術集会、２００１．１０．１８（広島）、第２０回日本運動器移植・再生医学研究会、２００１．１０．２７（京都））。しかし、これらの繊維はキトサンが酢酸塩を形成したまま繊維化されているため、培養溶液中で繊維が少しずつ膨潤したり溶け出し培養中での基材形状の安定性が悪く基材内部での軟骨細胞の増殖性も低下するという問題があった。
発明が解決しようとする技術的課題
本発明は組織再生用培養基材に要求される上記条件をすべて満たした動物細胞培養用基材を提供することを目的とする。即ち、本発明は、
１）動物細胞の培養において細胞の播種が容易であり、播種時、及び増殖した動物細胞が培養基材に容易に吸着・接着する。
２）軟骨細胞または線維芽細胞等の動物細胞が基材の表面および内部で増殖し、コラーゲンなど細胞外マトリックスが分泌され結合組織を形成する。
３）形成された結合組織が占め得る３次元的空間を有する。
４）移植後組織が再生するまで十分な機械的強度を有する。
５）生体適合性および生体吸収性を有し、組織再生後は究極的には消滅する、動物細胞培養用基材を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明は、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維であって、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地中に、室温で２週間置いても形態を保持する繊維に関する。「形態を保持する」とは、溶解、または膨潤せずもとの形態を失わないことを言う。
本発明はまた、以下の工程：
１）キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製する；
２）キトサンの塩の水溶液を、アルカリ土類金属の塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる；
３）その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維を形成させる；
４）場合によりハイブリッド繊維を延伸する；、
５）ハイブリッド繊維を塩基、２塩基酸以上の無機酸の若しくはその塩、または３塩基酸以上の有機酸もしくはその塩の水溶液で処理する；
を含む上記繊維の製造方法にも関する。
本発明はまた、以下の工程：
１）キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製する；
２）キトサンの塩の水溶液を、塩基、２塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または３塩基酸以上の有機酸もしくはその塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる；
３）形成された繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維を形成させる；
４）場合によりハイブリッド繊維を延伸する；
ことを含む上記繊維の製造方法にも関する。
本発明はさらに、該繊維よりなる動物細胞培養用３次元基材にも関する。動物細胞としては、限定されるものではないが軟骨細胞、線維芽細胞、神経細胞、これらの細胞に分化する未分化細胞を含む。
本発明は、該３次元基材を培養基材として用いて、動物細胞を生体外で培養することを含む動物細胞の培養方法にも関する。
本発明は、上記培養によって得られる、培養基材に増殖した動物細胞が結合した移植用基材にも関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の３次元基材を用いて培養した軟骨細胞の、培養２１日目の光学顕微鏡写真を示す模写図である。
図２は、同じく軟骨細胞培養２１日目のアルシアンブルー・サフラニン染色の結果を示す写真の模写図である。
図３は、培養１日目、７日目、１４日目、および２１日目の３次元基材あたりの、軟骨細胞のタンパク質量および酸性ムコ多糖量を示すグラフである。
図４は、ウサギの膝関節部位に欠損部を作製し、ここに予め２週間ウサギ軟骨細胞を培養した３次元基材を移植し、移植後８週目に欠損部を開腹しサフラニン０染色による組織観察を行った結果を示す写真の模写図である。
図５は、培養１日目、７日目、１４日目、および２８日目の３次元基材あたりの、線維芽細胞のＤＮＡ量を示すグラフである。
図６は、３次元基材で２８日間培養した線維芽細胞を、抗マウス抗体を用いたｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ法によるＩ型コラーゲンの免疫組織染色の結果を示す写真の模写図である。
図７は３次元基材で２８日間培養した線維芽細胞の走査型電子顕微鏡写真を示す模写図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者は、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンと生体吸収性の酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維であって、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地中に、室温で２週間置いても形態を保持する繊維を製造する２つの方法を考案した。
第一の方法では、先ず塩基性高分子であるキトサンを酸の水溶液に溶解してキトサンの塩の水溶液を調製する。この場合用いる酸としては無機酸または有機酸のいずれでもよい。無機酸の好ましい例は、塩酸、硝酸等の１塩基酸であり、有機酸の好ましい例はギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、アスコルビン酸等である。
キトサン塩の水溶液を湿式紡糸して繊維を調製する。湿式紡糸とは適当な溶剤に溶解した紡糸原液をノズルを通して脱溶媒和力の大きな凝固浴中に押出して凝固させる方法である。
凝固剤としては、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ土類金属の水溶性の塩、例えばハロゲン塩を用いる。特に好ましいのは塩化カルシウムである。アルカリ土類金属塩を水、水／アルコールの混合溶媒に溶解して用いる。アルカリ土類金属塩の濃度は、１０％から飽和濃度まで、好ましくは４０〜６０％である。
上記キトサン塩の水溶液をノズルから凝固剤を含む凝固浴中に押し出して、キトサンを凝固させ繊維を形成させる。形成した繊維はアルコール等の水と相溶性の溶媒／水の混合溶媒に浸漬し過剰の凝固剤を除去する。
本明細書で用いる「酸性生体高分子」とは、カルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基等の酸性の基を有する天然に由来する高分子、またはその塩をいう。好ましい態様では生体高分子は多糖類である。天然に存在する生体高分子をいずれかの物理的、化学的、あるいは酵素的手段により低分子量化したもの、あるいは上記酸性基またはその塩を生じさせたものも「酸性生体高分子」に含む。
カルボキシル基を有する酸性生体高分子の例としては、グルコン酸、グルクロン酸、イズロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、ガラクツロン酸、グルロン酸、シアル酸グルタミン酸を含むポリマー、例えばヒアルロン酸、アルギン酸、ヘパリン、ポリグルタミン酸等が挙げられる。
硫酸基を有する酸性生体高分子の例としてはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸等が挙げられる。リン酸基を有する酸性生体高分子の例としてはＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。複合体の製造においてこれらの酸性生体高分子の２種以上を用いてよい。酸性生体高分子の好ましい例はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸である。
キトサンと酸性生体高分子との複合体とは正の電荷を有するキトサンと負の電荷を有する酸性生体高分子との間の静電的相互作用により形成される複合体をいう。複合体の生成には酸性生体高分子とキトサンを適当な媒体、例えば水中で接触させればよい。キトサン／酸性生体高分子複合体を生成させる場合、両者の水溶液を混合する必要は必ずしも無く、固体のキトサンに酸性生体高分子の溶液を接触させればよいことを見出した。
酸性生体高分子を水または水／アルコールの混合溶媒等に溶解した溶液を調製する。酸性生体高分子の濃度は０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜１％とする。上記キトサン繊維を酸性生体高分子の溶液に浸漬すると、繊維表面で塩基性高分子であるキトサンと酸性生体高分子の複合体が形成される。この繊維は内部がキトサン塩で表面がキトサンと酸性生体高分子の複合体で被覆されたハイブリッド繊維である。該繊維は場合により延伸してもよい。複合体の生成反応は延伸後に行ってもよい。
このようにして生成した繊維を、無機塩基、２塩基酸以上の無機酸若しくはその塩、３塩基酸以上の有機酸もしくはその塩の水溶液または水／水と相溶性有機溶媒混合物溶液で後処理する。この後処理を行わないと培養基材として用いた場合に培養液中で繊維が徐々に溶解し、基材の形態の安定性が保てない。無機塩基の例としてはＮａＯＨ，ＫＯＨなどのアルカリ金属水酸化物を含む。２塩基酸以上の無機酸の例は硫酸、リン酸等であり、その塩の例は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム等及びこれらに対応するカリウム塩、アンモニウム塩を含む。３塩基酸以上の有機酸の例はクエン酸、エチレンジアミン四酢酸、１，１，２−トリカルボキシエタン、１，１，２−トリカルボキシ−２−メチルエタン、１，１，３−トリカルボキシプロパン、１，２，３−トリカルボキシプロパン、１，１，２，２−テトラカルボキシエタン、１，２，２，３−テトラカルボキシプロパン等を含む。これら後処理剤の濃度は０．１〜１０％、好ましくはアルカリ金属水酸化物等の無機塩基は０．２〜１％、無機酸および有機酸は１〜３％である。処理後、十分水で洗浄して、次にメタノール等に浸漬して脱水し、乾燥する。
第２の製造方法では凝固剤として無機塩基、２塩基酸以上の無機酸若しくはその塩、３塩基酸以上の有機酸もしくはその塩を用いること、及び後処理を行わない点が第１の方法と異なる。すなわち、キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製し；キトサンの塩の水溶液を、塩基、２塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または３塩基酸以上の有機酸もしくはその塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させる。形成した繊維はアルコール等の水と相溶性の溶媒／水の混合溶媒に浸漬し、過剰の凝固剤を除去する；その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維を形成させ、場合によりハイブリッド繊維を延伸することにより製造する。凝固剤としての無機塩基、２塩基酸以上の無機酸若しくはその塩、３塩基酸以上の有機酸もしくはその塩の例は第１の製造方法の後処理剤として挙げたのと同様である。凝固剤の濃度は０．５〜３０％とする。キトサン濃度、キトサンを溶解するに必要な酸の種類および濃度、酸性生体高分子の溶液の濃度は第１の製造方法と同様でよい。
このようにして製造される、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、表面がキトサンと酸性生体高分子の複合体で被覆されたキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維は、相当の強度を有し、軟骨細胞や線維芽細胞等の動物細胞がよく付着するとともに、生体吸収性であり、生体適合性を有する。
動物細胞の移植用基材として用いるために、基材はその内部に細胞が増殖し、細胞から分泌されたマトリックスを保持しうる空間を有し、力が加わった場合の形態安定性および強度を有する３次元基材とすることが必要である。上記要件を満たす３次元基材は、本発明の方法で製造したハイブリッド繊維から製造する織物、編物、または組み紐より製造できる。織物、編物、または組み紐は従来公知の方法により製造できる。織物、編物または組み紐は必要に応じ折り重ね、または積み重ねて、厚みを生じさせる。折り重ね、積み重ねた織物、編物または組み紐は本発明の繊維を用いて固定して一体化する。また折り重ね、積み重ねた織物、編物または組み紐はその内部に該繊維をこれら以外の形態で含んでいてもよい。３次元基材の形状は損傷部に応じて変化させる。
従って本発明の３次元基材は培養基材として以下のような好ましい性質を有する。
１）軟骨細胞または線維芽細胞等の動物細胞の培養において細胞の播種が容易であり、播種時、及び増殖した軟骨細胞または線維芽細胞等の動物細胞が培養基材に吸着・接着する。
２）軟骨細胞または線維芽細胞等の動物細胞が基材の表面および内部で増殖し、コラーゲンなど細胞外マトリックスが分泌され結合組織を形成する。
３）形成された結合組織が占め得る３次元的空間を有する。
５）移植後組織が再生するまで十分な機械的強度を有する。
４）生体適合性および生体吸収性を有し、組織再生後は究極的には消滅する。
上記の３次元培養基材を用いる動物細胞の培養は通常の動物細胞培養法（例えば、Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ，Ｍ．，”Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５８：５６０（１９７９）を参照）に準じて行う。先ず、予め、該培養基材をオートクレーブで加熱滅菌するか、ガス殺菌等を行い形状・特性が壊れないように殺菌処理を施し、殺菌した培地に添加する。次に、動物細胞を培養基材上にできるだけ３次元的に均一に播いて培養する。培養に使用する細胞としてはウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒト等の哺乳動物由来の細胞であれば、いずれの細胞でも培養可能である。好ましい細胞は、ヒト由来のものであり、特に好ましいのは移植しようとする患者由来の細胞である。
培地としては、通常の動物細胞培養法で用いられるもの、例えばヒト血清を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）などが使用出来る。培地にはいずれかの成長因子、例えばＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子−β）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子），ＣｈＭ−１（コンドロモジェリン−１）などを添加してもよい。
播種した細胞が培養基材上で良好に増殖、分化するためには細胞付着・吸着性の高い培養基材は極めて重要である。
生体内の軟骨組織には血管が発達していないことから低酸素条件となっていること、また、体重による圧負荷を受けていることから、これらの生体条件に近い条件での培養も有効と考えられる。このため軟骨細胞の培養では、１〜１５％の低酸素条件下で行うことや、０．１〜２０ＭＰａ（周期負荷の場合には０．０１〜２Ｈｚ）の圧をかけて培養を行うこと、およびこれらの条件を組み合わせて培養することも可能である。圧を負荷する方法については、具体的にはポンプやピストン状のものを用いて培地に空気圧や水圧を加える方法等がある。
また、靭帯や腱組織では引っ張り応力が加えられており、これに近い条件下での培養も有効と考えられる。このため、線維芽細胞の培養では０．０１〜５０ｍｍ／ｃｍ（周期負荷の場合には０．０１〜２Ｈｚ）の引っ張り刺激下で培養を行ってもよい。引っ張り刺激の負荷は具体的には、培地に浸けた基材の両端を伸縮性を有する器具等に固定し、一定の伸縮変化を加えることにより行う。
軟骨細胞の培養では、少なくとも細胞外マトリックスが形成されるまで行なう。通常、培養２〜４週間程度で軟骨細胞が本発明の３次元培養基材の上に良好に接着、増殖し、コラーゲン様の細胞外マトリックスが形成される。
このようにして製造される、本発明の、キトサンと酸性生体高分子とのハイブッリド繊維よりなる３次元基材、及び３次元基材に付着した軟骨組織を含む基材は、軟骨損傷の修復のための移植用基材として好適に用いることができる。
線維芽細胞の培養は、少なくとも細胞外マトリックスが形成されるまで行なう。通常、培養２〜４週間程度で線維芽細胞が本発明の３次元培養基材の上に良好に接着、増殖し、コラーゲン様の細胞外マトリックスが形成される。場合によっては、体外で十分な移植用組織を作製するために、２ケ月程度の培養を行う。
このようにして製造される、本発明の、キトサンと酸性生体高分子とのハイブッリド繊維よりなる３次元基材、及び３次元基材に付着した線維芽細胞を含む基材は、靭帯や腱の修復のための移植用基材として好適に用いることができる。
未分化細胞を用いる場合には、例えば骨髄液から間葉系幹細胞を密度勾配遠心法等で分離した後、ＤＥＭＥ等の培地にＴＧＦ−βやＦＧＦ等の成長因子を添加して軟骨細胞や線維芽細胞へ分化させた後、３次元基材上に播種し、増殖・分化させることも可能である。また、基材上への細胞の播種は未分化細胞の状態で行うこともできる。
また、神経幹細胞を用いてＥＧＦ（上皮増殖因子）等を培地に添加し神経細胞に分化させた後、３次元基材上に播種し、増殖・分化させることも可能である。また、基材上への細胞の播種は未分化細胞の状態で行うこともできる。
以下に本発明を実施例により説明する。本発明がこれら実施例に限定されるものではないことは明かである。
【実施例】
【実施例１】キトサンとヒアルロン酸のハイブリッド繊維（１）および（２）の製造
８（重量／容量）％のキトサン（君津化学工業社製、Ｆ２Ｐ、分子量：約１６５，０００）を４％酢酸水溶液に溶解した溶液をカラム（ガラス製、内径４５ｍｍ、長さ４１０ｍｍ）に詰め、濾布で加圧（０．６ｋｇｆ／ｃｍ２）濾過した。この濾液を紡糸用カラム（ガラス製、内径４５ｍｍ、長さ４１０ｍｍ）に詰め、これを紡糸液として簡易紡糸装置を用い、以下のような方法によって繊維を作製した。５０ホール（小孔：φ０．１ｍｍ）のノズルから、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の加圧下で飽和塩化カルシウム溶液中（第１凝固浴：水／メタノール＝１／１（容量）、浴長１００ｃｍ、容量約２Ｌ）に上記紡糸液を押出し、次に水／メタノール＝１／１（容量）に浸漬（第２凝固浴：浴長５０ｃｍ、容量約１Ｌ）し、さらに０．０５％ヒアルロン酸溶液（水／メタノール＝１／１（容量））に浸漬（第３凝固浴：浴長５０ｃｍ、容量約１５０ｍｌ）した後、ローラー（第１ローラー：速度３．２ｍ／ｍｉｎ、第２ローラー：３．２ｍ／ｍｉｎ、延伸倍率１．０）にかけ、最後に巻取りローラーで巻き取った後、０．８％（重量／容量）の水酸化ナトリウム溶液（水／メタノール＝１／９（容量））に約１５時間浸漬後、水洗し、さらにメタノールに約２時間浸漬後取り出し室温で風乾させ、またはローラーから糸状に巻取りそのまま室温で風乾させ、しなやかなキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（以下、「キトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（１）」と呼ぶ）を得た。
第３凝固浴中のヒアルロン酸濃度を０．１％（重量／容量）としたことを除いて、上記と同様な方法で紡糸を行ない、しなやかなキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（以下、「キトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（２）」と呼ぶ）を得た。
比較例１
後処理を行わないハイブリッド繊維の製造
紡糸後水酸化ナトリウム溶液で後処理を行わないことを除いては実施例１のキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（１）と同条件で繊維を製造した。
比較例２
キトサン単独繊維（ａ）の製造
第３凝固浴中にヒアルロン酸を添加しないことを除いて、実施例１と同様な方法で紡糸を行ない、キトサン単独の繊維（以下、「キトサン繊維（ａ）」と呼ぶ）を得た。
【実施例２】キトサンとヒアルロン酸とのハイブリッド繊維（３）および（４）の製造
３．５（重量／容量）％のキトサン（君津化学工業社製、Ｂ、分子量：約６００，０００）を２％水酢酸に溶解した溶液をカラムに詰め、濾布で加圧ろ過した。この濾液を紡糸用カラムに詰め、これを紡糸液として簡易紡糸装置を用い、以下のような方法によって繊維を作製した。５０ホール（小孔：０．１ｍｍφ）のノズルから、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の加圧下で５３（重量／容量）％塩化カルシウム溶液中（第１凝固浴：水／メタノール＝１／１（容量）、浴長１００ｃｍ、容量約２Ｌ）に上記紡糸液を押出し、次に水／メタノール＝１／１（容量））に浸漬（第２凝固浴：浴長５０ｃｍ、容量約１Ｌ）、さらに０．０５％ヒアルロン酸溶液（水／メタノール＝１／１（容量））に浸漬（第３凝固浴：浴長５０ｃｍ、容量約１５０ｍｌ）した後、ローラー（第１ローラー：速度４．４ｍ／ｍｉｎ、第２ローラー：４．５ｍ／ｍｉｎ；延伸倍率１．０２）にかけ、最後に巻取りローラーで巻き取った後、０．２％（重量／容量）の水酸化ナトリウム溶液（水／メタノール＝１／９（容量））に約１５時間浸漬後、水洗し、さらにメタノールに約２時間浸漬後、そのまま乾燥、またはローラーから巻取り糸状にして乾燥させることによって、しなやかなキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（以下、「キトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（３）」と呼ぶ）を得た。
第３凝固浴中のヒアルロン酸濃度を０．１％（重量／容量）としたことを除いて、上記と同様な方法で調整、紡糸を行ない、しなやかなキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（以下、「キトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維（４）」と呼ぶ）を得た。
比較例３
キトサン単独繊維（ｂ）の製造
第３凝固浴中にヒアルロン酸を添加しないことを除いて、実施例２と同様な方法で紡糸を行ない、キトサン単独の繊維（以下、「キトサン繊維（ｂ）」と呼ぶ）を得た。
【実施例３】種々の後処理剤を用いるハイブリッド繊維の製造
実施例２において後処理剤の０．２％（重量／容量）の水酸化ナトリウム溶液（水／メタノール＝１／９（容量））の代わりに以下の化合物を後処理剤として用いたことを除けば実施例２と同様にして（ヒアルロン酸濃度０．０５％）キトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維を得た。
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【実施例４】種々の凝固剤を用いるハイブリッド繊維の製造
３．５（重量／容量）％のキトサン（君津化学工業社製、Ｂ、分子量：約６００，０００）を２％酢酸に溶解した溶液をカラムに詰め、濾布で加圧ろ過した。この濾液を紡糸用カラムに詰め、これを紡糸液として簡易紡糸装置を用い、以下のような方法によって繊維を作製した。５０ホール（小孔：０．１ｍｍφ）のノズルから、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の加圧下で表２に示す各種凝固液中（第１凝固浴：浴長１００ｃｍ、容量約２Ｌ）に上記紡糸液を押出し、次に水／メタノール＝１／１（容量））に浸漬（第２浴：浴長５０ｃｍ、容量約１Ｌ）した。次に０．０５％ヒアルロン酸溶液（水／メタノール＝１／１（容量））に浸漬（浴長５０ｃｍ、容量約１５０ｍｌ）した後、ローラー（第１ローラー：速度４．４ｍ／ｍｉｎ、第２ローラー：４．５ｍ／ｍｉｎ；延伸倍率１．０２）にかけ、最後に巻取りローラーで巻き取った。その後、水に１０分間浸漬後もう一度水洗し、さらにメタノールに約２時間浸漬脱水後、乾燥させて繊維を得た。
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【実施例５】キトサンとアルギン酸のハイブリッド繊維の製造
実施例２において０．０５％ヒアルロン酸に変えて、それぞれ０．０５％および０．１％アルギン酸を用いた外は実施例２と同様にしてキトサンとアルギン酸のハイブリッド繊維を製造した。
【実施例６】キトサンとヒアルロン酸ハイブリッド繊維の引張強度試験
実施例１及び２で作製した各繊維の引張強度および伸度を測定した。破断時の荷重および伸び率の測定はＪＩＳ繊維規格Ｌ１０１５に従った。また、各繊維の断面積は顕微鏡下での画像処理により求めた。
繊維の破断力および伸度（伸び）の測定方法：
糸状の各繊維（モノフィラメントが５０本束になったもの）を長さ約４０ｍｍに切断し、両端をそれぞれ接着性のある紙（ここではポストイットを使用）で挟み、標点間距離を２０ｍｍにした各サンプルを作製した。このサンプルの両端をクリップ式つかみ具（製品番号３４３−０６７４２−０３、島津製作所製）に固定し、上端側のつかみ具をロードセル（２０Ｎ、製品番号３４６−５１２９４−０７、島津製作所製）につるした後、卓上型精密万能試験機（ＡＧＳ−Ｈ、製品番号３４６−５１２９９−０２、島津製作所製）にセットした。引張速度２０ｍｍ／ｍｉｎで垂直方向に引張り、破断点での力および変位から破断力および伸度（伸び）を測定し、これらのデータをパソコン（ＩＢＭ、ＮｅｔＶｉｓｔａ  Ａ４０）に取込んだ。測定およびデータの解析には専用のソフト（ＴＲＡＰＥＺＩＵＭ、島津製作所製）を使用した。
繊維断面積の測定方法：
糸状の各繊維（モノフィラメントが５０本束になったもの）を長さ約５ｍｍに切断し、これらを直径約１ｍｍφの小孔をあけたプラスチック板の穴に挿し固定した。このプラスチック板を光学顕微鏡（ＢＸ５０、オリンパス光学工業社製）の台座に乗せ、繊維断面の画像をＣＣＤカメラを含むカメラコントロールユニット（ＩＣＤ−７４０、池上通信機社製）を通して捕らえた後、画像処理装置（ＶＩＤＥＯ  ＭＩＣＲＯ  ＭＥＴＥＲ：Ｍｏｄｅｌ  ＶＭ−３０、オリンパス光学工業社製、モニター画面：ＴＭ１１５０、池上通信機社製）によって断面積を測定した。
各繊維の強度及び伸度を表３に示す。
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キトサン単独繊維の強度は約１３０Ｎ／ｍｍ２であったが、ヒアルロン酸とのハイブリッド化によって繊維強度は約１５０〜２２０Ｎ／ｍｍ２まで上昇した。
なお、コラーゲンファイバーにノルジヒドログアヤレチン酸を架橋した構造物（ファイバー）での強度は約５０Ｎ／ｍｍ２である（Ｋｏｏｂ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，５６，４０−４８（２００１））ことから、本発明のキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維の強度はコラーゲン繊維に比べて３〜５倍程度の強度を有することが確認された。
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【実施例７】キトサンとヒアルロン酸とのハイブリッド繊維の軟骨細胞の接着性
軟骨細胞が基材上で良好な増殖・分化を起こすためには、軟骨細胞が培養基材に出来るだけ多く接着することが必要である。このため、実施例２で作製したキトサン単独繊維およびキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維への軟骨細胞の接着性を評価した。比較対象として市販の医療用吸収性縫合糸（生体吸収性合成高分子）：ポリグラクチン−９１０（Ｖｉｃｒｙｌ  ３−０、ＥｔｈｉｃｏｎＣｏ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた。
軟骨細胞は日本白色家兎（８週齢、体重１．８〜２．０ｋｇ）の膝関節部位から分離調整した。軟骨細胞の濃度は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし、細胞の接着性評価は西村の方法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．７，１００−１０４，１９８５）に準じた。すなわち、各繊維を１０ｍｍの長さに切断し、テフロンチューブ（内径：５ｍｍ、長さ：３０ｍｍ）に一定量（１００ｍｇ）ずつ密に詰めた後、このチューブの片端から軟骨細胞を含む試料液１００μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）１ｍｌを流し、得られた流出液中の細胞数をカウントし、細胞流出率を算出した。
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上記に示すようにＶｉｃｒｙｌと作製した生体高分子繊維との間には細胞接着性にＡＮＯＶＡによる統計処理で有意な差が認められた。
【実施例８】キトサンとヒアルロン酸ハイブリッド繊維の線維芽細胞接着性
線維芽細胞をうまく培養するためには、線維芽細胞が３次元培養基材に出来るだけ多く接着することが必要である。実施例１で作製したキトサン単独繊維およびキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維への線維芽細胞の接着性を検討した。コントロールとして市販の医療用吸収性縫合糸：ポリグラクチン−９１０（Ｖｉｃｒｙｌ、ＥｔｈｉｃｏｎＣｏ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた。
（試験方法）
線維芽細胞は滅菌下で日本白色家兎（８〜１０週齢、体重１．８〜２．０ｋｇ）の膝蓋腱から分離調製した。線維芽細胞の濃度は１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし、細胞の接着性は西村の方法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．７，１００−１０４，１９８５）に準じて評価した。つまり、各繊維を５ｍｍの長さに切断し、テフロン（登録商標）チューブ（内径：５ｍｍ、長さ：３０ｍｍ）に一定量詰めた。このチューブの片端から線維芽細胞を含む試料液１ｍｌを添加し、室温で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）１ｍｌを流し、得られた洗浄液中の細胞数をカウントし、繊維に接着していない細胞数とした。
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上に示すようにＶｉｃｒｙｌと作製した生体高分子繊維との間には細胞接着性に分散分析法（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）による統計処理で有意な差が認められた。キトサン単独繊維とキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド繊維との間にも有意差があり、線維芽細胞の接着性はハイブリッド繊維の方が良いことが認められた。
【実施例９】培養液中での繊維の安定性
実施例１〜４で製造した各キトサン／ヒアルロン酸ハイブリッド繊維、比較例１で製造したキトサン／ヒアルロン酸ハイブリッド繊維、比較例２および３で製造したキトサン単独繊維、各約２０ｍｇずつを試験管に入れ、これに１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｓｉｇｍａ社製、コードＤ５７９６）培養液２ｍｌを加えて、室温で２週間放置した。
このうち比較例１のハイブリッド繊維の内、塩化カルシウムを凝固剤として用い、後処理を行わなかった繊維では繊維の形状が不鮮明となり、培養液の色も黄色に変化した。他の繊維では、形状変化は全く見られず、培養液の色も元の赤色のままであった。
【実施例１０】キトサンとヒアルロン酸とのハイブリッド長繊維からの３次元培養基材の作製
実施例１の方法で紡糸後、水酸化ナトリウムおよびメタノール処理した繊維（ローラーに巻いたまま）から１００ｍ以上の長い繊維（長繊維）を作製した。
さらにこの長繊維を撚糸した後、市販の編組機を用いて、帯状構造物を作製した。これを用いて一定形状を有する３次元の培養基材を作製した。
【実施例１１】３次元基材を用いた軟骨細胞の培養
実施例１０の３次元基材を用いて軟骨細胞の培養試験を実施した。
Ｋａｗａｓａｋｉら、およびＹａｓｕｉらの方法（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７９，１４２−１４８（１９９９），Ｙａｓｕｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５０，９２−１００（１９８２））に準じて軟骨細胞の採取および培養を行った。すなわち、日本白色家兎（８週齢、体重１．８〜２．０ｋｇ）の膝関節部位から軟骨組織片を採取し、０．２５％トリプシン溶液を添加して３７℃で２５分間処理した後、０．２５％コラゲナーゼ（タイプＩＩ）溶液を添加し、３７℃で５時間程度処理を行い、細胞を単離した。この細胞浮遊液を５０μｌ採取しトリパンブルー５０μｌを加えた後、良く攪拌した後、２０μｌを血球計算盤に乗せて細胞数をカウントし、全細胞数を算出した。予めオートクレーブ滅菌しておいたキトサン−ヒアルロン酸ハイブリッド３次元基材をマルチウェルプレート（１２ウェル、Ｆａｌｃｏｎ社製）に入れ、繊維上に各ウェル当り５×１０５個となるように軟骨細胞を含む溶液約１００μｌを添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃の培養器で１時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ培地２ｍｌを少量ずつ添加し、さらに０．１％アスコルビン酸ホスフェート２０μｌを加えて、上記条件下で培養した。
図１には培養２１日目の光学顕微鏡写真を示したが、播種した軟骨細胞は繊維上および繊維間の隙間で良好に増殖していることが確認された。また、図２にはアルシアンブルー・サフラニン染色の結果を示したが、青色に強く染色された細胞外マトリックスが多数確認された。以上のことから、この繊維上で軟骨細胞は順調に増殖・分化し、コンドロイチン硫酸等の細胞外マトリックスを盛んに産生していることが判る。また、図３には、培養１日目、７日目、１４日目および２１日目の３次元基材当りのタンパク量および酸性ムコ多糖量の測定結果を示したが、培養に伴って両者とも増加した。これらのことからも軟骨細胞は良好な増殖・分化によって各種タンパクの合成およびコンドロイチン硫酸等の細胞外マトリックスを産生していることが判る。
【実施例１２】培養した３次元基材の動物への移植における軟骨組織再生評価
麻酔下で日本白色家兎（８週齢、体重１．８〜２．０ｋｇ）の膝関節部位に約４×６ｍｍ、深さ約１．５ｍｍの欠損部を作製し、ここに予め２週間ウサギ軟骨細胞を培養した実施例１０の３次元基材を移植し、基材の両側を生体吸収性の縫合糸で軽く固定した。移植後８週目に欠損部を開腹しサフラニン０染色による組織観察を行った結果、培養基材を移植した欠損部位に赤く染色された軟骨基質が認められ、軟骨組織の再生が起こっていることを確認した。なお、基材の固着性も非常に良好であり、また、基材自体は次第に吸収されている様子が観察された（図４）。また、基材移植に伴う炎症細胞等の浸潤は殆ど見られなかったことから、基材移植に伴う強い異物反応は起こっていないものと考えられる。
【実施例１３】３次元基材を用いた線維芽細胞の培養
Ｍａｒｔｉｎの方法（Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，３９，１９７３）に準じて線維芽細胞の採集および培養を行った。すなわち日本白色家兎（８〜１０週齢、体重１．８〜２．０ｋｇ）の膝蓋腱から２ｍｍ角の小片を作製し、カバーグラスをかけて直径３５ｍｍのシャーレに固定した。これに１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃の培養器で２週間培養した。線維芽細胞がコンフルエントな状態になったところで培地を除き、ＰＢＳ（−）で洗浄した。０．２５％トリプシン０．５ｍｌを加えて３７℃で１５分間インキュベート後、培地１ｍｌを添加し、細胞を回収した。この細胞懸濁液５０μｌに０．０４％トリパンブルー５０μｌを加え血球計算盤で細胞数をカウントした。予めオートクレーブ滅菌しておいたキトサンとヒアルロン酸とのハイブリッド繊維から成る実施例１０の３次元基材を１２穴のプレートに置き、繊維上に各プレート当り１×１０６個となるように線維芽細胞を含む溶液約１００μｌを添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃の培養器で１時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ培地約２ｍｌを添加し上記条件下で培養した。培養後１日目、７日目、１４日目および２８日目に、細胞数の指標であるＤＮＡ量を測定した。
測定は、Ｒａｇｏらの方法（Ｒａｇｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１，３１−３４（１９９０））に準じて行った。即ち、０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化ナトリウムを添加して２Ｍ溶液とした。培養した線維芽細胞を基材ごと取り出し、ＰＢＳで培地を洗い流した。ハサミを用いて基材を細かく刻んだ後１．５ｍＬ容量のチューブに移し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（２Ｍ  塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．４）を１ｍＬ添加してよく撹拌し、室温で１分間放置した。この溶液を再度よく撹拌した後、その上清部分を試料溶液とした。試料溶液１００μＬに０．０５Ｍリン酸緩衝液（２Ｍ  塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．４）２ｍＬを加え、さらに蛍光試薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、０．０２％溶液を精製水により調製）を１０μＬ添加して十分撹拌した後、分光蛍光光度計（ＲＴ−５３００ＰＣ、島津製作所社製）を用いて蛍光強度（励起波長３５６ｎｍ、吸収波長４５８ｎｍ）を測定した。標品のＤＮＡを用いて０〜１２５μｇ／ｍＬの範囲で検量線を作成した後、この検量線から各試料溶液中に含まれるＤＮＡ濃度を求めた。図５に示したように、培養に伴ってＤＮＡ量は増加し、３次元基材上で線維芽細胞が良好に増殖することを確認した。
また、図６には抗マウス抗体を用いたｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ法によるＩ型コラーゲンの免疫組織染色の結果（３次元基材で２８日間培養したもの）を示したが、細胞外基質が染色されており、このハイブリッド繊維から作製した３次元基材は靭帯および腱組織の細胞外マトリックスであるタイプＩコラーゲンの産生にも優れていることを確認した。図７には、この３次元基材を用いて２８日間培養した場合の走査型電子顕微鏡像を示した。資料の作製方法は以下のとおりである。０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を調製した。このリン酸緩衝液２００ｍＬにショ糖６．８５ｇを添加し、０．１Ｍショ糖含有０．１Ｍリン酸緩衝液を作製した。また同様にして、０．２Ｍショ糖含有０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を作製した。さらに、０．２Ｍショ糖含有０．２Ｍリン酸緩衝液を用いて２％オスミウム酸溶液を２倍に希釈した１％オスミウム酸溶液を調製した。
２８日間培養した基材を０．１Ｍショ糖加０．１Ｍリン酸緩衝液中に浸漬し、３７℃で１０分間放置した。この操作を３回繰り返した後、２％グルタルアルデヒド溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液で調製）中に浸漬し、３７℃で１時間放置して前固定処理を行った。この細胞を含む基材を０．１Ｍショ糖加０．１Ｍリン酸緩衝液中に浸漬し、３７℃で１０分間放置して洗浄した。この操作を３回繰り返した後、室温で１％オスミウム酸溶液に１時間浸漬して後固定処理を行った。さらに導電染色を行うために、０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて洗浄した後、室温で２％タンニン酸水溶液に２時間浸漬し、続いて０．１Ｍリン酸緩衝液中に２時間浸漬した。その後、２％オスミウム酸溶液（ショ糖を０．３４ｇ／１０ｍＬ添加）中に２時間浸漬し、再び０．１Ｍリン酸緩衝液中に２時間浸漬した。
この基材を２０％エタノールから順次１０％間隔で濃度を上げたエタノール溶液（２０〜９９．５％）に１０分間ずつ浸け、最後に無水エタノールに３０分間、２回浸漬して脱水した。その後、酢酸イソアミル中に３０分間２回浸漬を繰り返して、エタノールから酢酸イソアミルへの置換を行った。液化ＣＯ２を移行液として用いて臨界点乾燥処理（３１℃、７２．８気圧）を行った試料にイオン・スパッタ装置（Ｅ−１０２、日立製作所社製）を用いて白金−パラジウム蒸着処理を行った後、走査型電子顕微鏡（Ｓ−２３００型、日立製作所社製）を用いて３次元基材での線維芽細胞の増殖・分化の状況を観察した。その結果、線維芽細胞は３次元基材の表面で増殖・分化し、その周辺にはコラーゲンと思われる多数の糸状物質が観察された（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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