(57)【要約】本発明は、生分解性および優れた物性を有する３−ヒドロキシアルカン酸を単独重合または共重合してなるポリエステルの、酵母を宿主とした製造方法に関する。ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加したポリエステル合成に関与する１種以上の酵素遺伝子を作成し、当該酵素遺伝子発現カセットを酵母に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、３−ヒドロキシアルカン酸を単独重合または共重合してなるポリエステルを菌体内に蓄積させ、その培養物からポリマーを採取することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した、酵母で発現可能な遺伝子。
【請求項２】
ペルオキシソーム配向シグナルが配列番号１または配列番号２によって示されるアミノ酸配列からなる請求の範囲第１項記載の遺伝子。
【請求項３】
ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡの塩基配列が配列番号３または配列番号４によって示される請求の範囲第１または２項記載の遺伝子。
【請求項４】
ポリエステルの合成に関与する酵素が細菌由来の酵素である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項５】
細菌がアエロモナス・キャビエである請求の範囲第４項記載の遺伝子。
【請求項６】
細菌由来の酵素の遺伝子の遺伝暗号ＣＴＧの少なくとも１つが、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣまたはＣＴＡに変換されていることを特徴とする請求の範囲第４または５項記載の遺伝子。
【請求項７】
ポリエステルの合成に関与する酵素がポリヒドロキシアルカン酸合成酵素またはＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼである請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項８】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子が配列番号５によって示される塩基配列からなる請求の範囲第７項記載の遺伝子。
【請求項９】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子が配列番号６によって示される塩基配列からなる請求の範囲第７項記載の遺伝子。
【請求項１０】
配列番号７または配列番号８によって示される塩基配列からなる請求の範囲第８項記載の遺伝子。
【請求項１１】
配列番号９または配列番号１０によって示される塩基配列からなる請求の範囲第９項記載の遺伝子。
【請求項１２】
請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の遺伝子から翻訳されるポリエステル合成に関与する酵素。
【請求項１３】
請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の遺伝子が、酵母に一種類以上導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１４】
請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の遺伝子と、酵母で機能するプロモーターおよびターミネーターからなる、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子発現カセットが、酵母に１種類以上導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１５】
プロモーターおよびターミネーターが、キャンディダ・マルトーサ由来である請求の範囲第１４項記載の形質転換体。
【請求項１６】
プロモーターが、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１、ＡＬＫ５またはＰＯＸ２由来である請求の範囲第１４または１５項記載の形質転換体。
【請求項１７】
ターミネーターが、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１由来である請求の範囲第１４〜１６項のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１８】
酵母が、アシクロコニディウム属，アンブロシオザイマ属，アルスロアスカス属，アルキシオザイマ属，アシュビア属，バブジェビア属，ベンシングトニア属，ボトリオアスカス属，ボトリオザイマ属，ブレッタノマイセス属，ビュレラ属，ビュレロマイセス属，キャンディダ属、シテロマイセス属，クラビスポラ属，クリプトコッカス属，シストフィロバシディウム属，デバリオマイセス属，デッケラ属，ディポダスコプシス属，ディポダスカス属，エニエラ属，エンドマイコプセラ属，エレマスカス属，エレモセシウム属，エリスロバシディウム属，フェロマイセス属，フィロバシディウム属，ガラクトマイセス属，ゲオトリクム属，ガイラーモンデラ属，ハンセニアスポラ属，ハンセヌラ属，ハセガワエア属，ホルターマンニア属，ホルモアスカス属，ハイフォピキア属，イサットヘンキア属，クロエケラ属，クロエケラスポラ属，クルイベロマイセス属，コンドア属，クライシア属，クルツマノマイセス属，ロイコスポリディウム属，リポマイセス属，ロデロマイセス属，マラセジア属，メトシュニコウィア属，ムラキア属，マイクソザイマ属，ナドソニア属，ナカザワエア属，ネマトスポラ属，オガタエア属，オースポリディウム属，パチソレン属，ファチコスポラ属，ファフィア属，ピキア属，ロドスポリディウム属，ロドトルラ属，サッカロマイセス属，サッカロマイコーデス属，サッカロマイコプシス属，サイトエラ属，サカグチア属，サターノスポラ属，シゾブラストスポリオン属，シゾサッカロマイセス属，シュワニオマイセス属，スポリディオボラス属，スポロボロマイセス属，スポロパキデミア属，ステファノアスカス属，ステリグマトマイセス属，ステリグマトスポリディウム属，シンビオタフリナ属，シンポディオマイセス属，シンポディオマイコプシス属，トルラスポラ属，トリコスポリエラ属，トリコスポロン属，トリゴノプシス属，ツチヤエア属，ウデニオマイセス属，ワルトマイセス属，ウィカーハミア属，ウィカーハミエラ属，ウィリオプシス属，ヤマダザイマ属，ヤロウィア属，ザイゴアスカス属，ザイゴサッカロマイセス属，ザイゴウィリオプシス属またはザイゴザイマ属のいずれかである請求の範囲第１３〜１７項のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１９】
酵母がキャンディダ属またはヤロウィア属である請求の範囲第１８項記載の形質転換体。
【請求項２０】
酵母がキャンディダ・マルトーサである請求の範囲第１９項記載の形質転換体。
【請求項２１】
ポリエステルが、下記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸の単独重合体または共重合体である請求の範囲第１３〜２０項のいずれかに記載の形質転換体。
2003033707.tif 000031
（式中、Ｒは、アルキル基を表す。）
【請求項２２】
ポリエステルが、下記式（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（３）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である請求の範囲第１３〜２１項のいずれかに記載の形質転換体。
2003033707.tif 000032
【請求項２３】
請求の範囲第１３〜２２項のいずれかに記載の形質転換体を用いるポリエステルの製造方法であって、前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ポリエステルを酵素合成するために必要な遺伝子、同遺伝子を利用してポリエステルを発酵合成する微生物、および、その微生物を用いたポリエステルの製造方法に関する。詳しくは、自然環境（土中、河川、海中）の下で、微生物の作用を受けて分解するプラスチック様高分子を酵素合成する宿主内で機能する遺伝子、および、同遺伝子で形質転換されたプラスチック様高分子を発酵合成する能力が改善された形質転換体、並びに、その形質転換体を利用したポリエステルの製造方法に関するものである。
背景技術
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）であり、１９２５年にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見された（Ｍ．Ｌｅｍｏｉｇｎｅ，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ，３９，１４４（１９２５））。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいグリーンプラスチックとして注目されてきた。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。
その中で、特開昭５７−１５０３９３号公報および特開昭５９−２２０１９２号公報等に３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）の製造方法が開示されている。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際のところＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルム等に使用するのに要求される柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）およびその製造方法について研究がなされた。例えば、特開平５−９３０４９号公報および特開平７−２６５０６５号公報にそれぞれ記載されている。これらの公報のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２８，４８２２−４８２３（１９９５））。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養し、３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。しかしながら、上記製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量３０％でありポリマー生産性が低いことから、実用化に向けさらに高い生産性が得られる方法が探索された。
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産するアエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）よりＰＨＡ（ポリヒドロキシアルカン酸）合成酵素遺伝子がクローニングされた（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ．１５，４８２１−４８３０（１９９７）、特開平１０−１０８６８２号公報）。本遺伝子をラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に導入した形質転換体を用い、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（Ｔ．Ｈｕｋｕｉ等  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．４９，３３３（１９９８））。また、大腸菌等の細菌や植物を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法も開示されている（ＷＯ  ００／４３５２５）が、その生産性は記載されていない。
上記ポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものから糸やフィルム等のような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、先に述べた製造方法ではＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性が依然として低く、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の実用化に向けた生産方法としては未だ不十分といわざるを得ない。
最近になって、菌体生産性の高い酵母を宿主とした生分解性ポリエステルの生産研究がＬｅａｆらによって行われた（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４２，ｐｐ１１６９−１１８０（１９９６））。酵母の一種であるサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）のポリエステル合成酵素遺伝子を導入して形質転換体を作製し、グルコースを炭素源として培養することによってＰ（３ＨＢ）の蓄積（ポリマー含量０．５％）を確認している。しかし、上記研究で生産されるポリマーは硬くて脆い性質を有するＰ（３ＨＢ）であった。
酵母は増殖が早く菌体生産性が高いことで知られている。その中でもキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母は、過去Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎとして注目され、ノルマルパラフィンを炭素源とした飼料用菌体生産が研究されてきた。また、近年キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の宿主ベクター系が開発され、遺伝子組換え技術を用いた物質生産が報告されている（化学と生物  ｖｏｌ．３８，Ｎｏ９，６１４（２０００））。キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）を宿主としたαアミラーゼの生産性は約１２．３ｇ／Ｌと高く、このように高い物質生産能力を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属は、ポリマー生産用宿主として期待される。さらに、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であることから、ポリマーの抽出精製工程をより簡単にすることも可能である。
そこで、優れた物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）をキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母を用いて生産する方法が求められていた。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、酵母で機能的かつ効率よく発現できるポリエステル合成に関与する遺伝子、同遺伝子から成る遺伝子発現カセットを酵母に形質転換した形質転換体、および、得られた形質転換体を培養することにより、生分解性および優れた物性を有するポリエステルを製造する方法を提供するものである。
本発明者らは様々な検討を行った結果、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子の一種以上のそれぞれに対して、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した、酵母で発現可能な新規遺伝子を作成し、これら遺伝子のそれぞれに、酵母で機能するプロモーターおよびターミネーターを連結することにより遺伝子発現カセットを作成し、さらに本遺伝子発現カセットを酵母に導入して形質転換体を作成し、本形質転換体を培養することにより、その培養物から極めて高い生産性が期待できる方法でポリエステルを製造できることを見いだした。
すなわち、本発明は、ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した、酵母で発現可能な遺伝子に関する。
その好ましい実施態様としては、ポリエステルの合成に関与する酵素が細菌由来の酵素、より好ましくはアエロモナス・キャビエ由来の酵素である上記遺伝子、また、細菌由来の遺伝子の遺伝暗号ＣＴＧの少なくとも１つが、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣまたはＣＴＡに変換されていることを特徴とする上記遺伝子に関する。
別の好ましい実施態様としては、ポリエステルの合成に関与する酵素がポリヒドロキシアルカン酸合成酵素またはＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼである上記遺伝子に関する。
また、本発明は、上記遺伝子から翻訳されるポリエステル合成に関与する酵素に関する。
さらに、本発明は、上記遺伝子が酵母に一種類以上導入されてなることを特徴とする形質転換体に関する。好ましくは、上記遺伝子と、酵母で機能するプロモーターおよびターミネーターからなる、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子発現カセットが、酵母に１種類以上導入されていることを特徴とする形質転換体に関する。
別の好ましい実施態様としては、ポリエステルが、下記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸の単独重合体または共重合体である上記形質転換体に関し、
2003033707.tif 000002
（式中、Ｒは、アルキル基を表す。）
さらに好ましくは、ポリエステルが、下記式（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（３）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である上記形質転換体に関する。
2003033707.tif 000003
また、本発明は、上記形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法に関する。
発明の詳細な開示
以下に、本発明の詳細を説明する。
（１）ポリエステルの合成に関与する酵素並びにそれをコードする遺伝子
本発明におけるポリエステルとしては特に限定されないが、一般式（１）：
2003033707.tif 000004
（式中、Ｒはアルキル基を示す。）
で示される３−ヒドロキシアルカン酸の単独重合体または共重合体が好ましい。つまり、式（１）で表される１種の３−ヒドロキシアルカン酸の単独重合体、または、式（１）で表される２種以上の３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体が好ましい。
また、式（２）：
2003033707.tif 000005
で示される３−ヒドロキシ酪酸と式（３）：
2003033707.tif 000006
で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合して得られる、式（４）：
2003033707.tif 000007
（式中、ｍ，ｎは１以上の整数を示す）で表される共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）がより好ましい。
ここで、上記一般式におけるＲはアルキル基を示し、好ましくは炭素数１〜１１、より好ましくは炭素数１〜４、さらに好ましくは炭素数１〜３である。
本発明でいう、ポリエステルの合成に関与する酵素としては、ポリエステル合成酵素だけでなく、ポリエステルの中間体を合成する酵素も含む。上記ポリエステル合成酵素としては、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸（以下ＰＨＡという）合成酵素等が挙げられる。また、ポリエステルの中間体を合成する酵素としては、例えば、β酸化経路の中間体のエノイルＣｏＡをモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換するＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７０，６９−７５（１９９９））や、アセチルＣｏＡを二量化してモノマーである３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを合成するβケトチオラーゼ・ＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｐｅｏｐｌｅｓ  ＯＰ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）１５２９８−１５３０３（１９８９））、３−ケトアシルＣｏＡリダクターゼ（ｆａｂＧ）（Ｑｕｎ  Ｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，ｖｏｌ．１８２，Ｎｏ．１０、ｐｐ２９７８−２９８１）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡエピメラーゼ（ｆａｄＢ）、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｑｕｎ  Ｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．４，ｐｐ１３１１−１３２０）等が挙げられる。
これらポリエステルの合成に関与する酵素としては特に限定されないが、細菌由来の酵素が好ましく、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）またはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来の酵素がより好ましく、例えば特開平１０−１０８６８２号公報に記載されている酵素を用いることができる。
上記のような細菌由来の酵素をコードする遺伝子を酵母に形質転換する場合、細菌由来の遺伝子をそのまま用いると宿主酵母の中には遺伝暗号読みとりに異常を示す場合がある。例えばキャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）（Ｙ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１  １６４−１６６（１９８９））やキャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）（Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ  １１  ４３−５２（１９９５））は、遺伝暗号ＣＴＧがロイシンではなくセリンに翻訳される酵母である。このような酵母において、当該酵母以外の生物由来のポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子を発現させる場合、遺伝暗号の読みとり異常が生じることがあるため、当該酵素のアミノ酸配列の異なった酵素が生産されることがある。その結果、当該酵素の機能が十分発揮できない恐れが生ずる可能性がある。
このような問題は、予め遺伝子内に含まれる遺伝暗号ＣＴＧの少なくとも一つを、ロイシンに対応する他の遺伝暗号（ＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴＣ，ＣＴＡ）に変換した遺伝子を使用することによって解決することができる。変換するロイシンに対応する他の遺伝暗号に制限はないが、導入する遺伝子の翻訳効率を考慮すると、遺伝子導入する宿主酵母において、使用頻度の高い遺伝暗号に変換することが好ましい。例えば、キャンディダ・マルトーサにおいては、遺伝暗号ＣＴＧをＴＴＡ，ＴＴＧのいずれかに変換することが望ましく、最も好適にはＴＴＧに変換することが望ましい。
また、遺伝子を構成する遺伝暗号の使用頻度は、生物によって偏りが見られる。すなわち、トリプトファンとメチオニン以外のアミノ酸では、当該アミノ酸に対応する複数の遺伝暗号が存在するが、遺伝暗号使用頻度に各生物特有の偏りが見られる。キャンディダ・マルトーサでは、例えばアラニンに対応する遺伝暗号はＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧであるが、最も高頻度に遺伝子を構成する遺伝暗号はＧＣＴである。このように複数ある同一アミノ酸を指定する遺伝暗号のうち、使用される遺伝暗号は生物によって偏りが認められ、使用頻度の高い遺伝暗号から成る遺伝子の翻訳効率が高いことが指摘されている。例えばアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子やＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のＧＣ含量はそれぞれ６７．１６％、６５．７７％であるが、キャンディダ・マルトーサ由来で現在までに報告されている酵素、例えばホスホグリセリン酸キナーゼではＧＣ含量３９．５５％、またＰ４５０（ＡＬＫ２−Ａ）ではＧＣ含量３５．６７％である。
このように遺伝暗号使用頻度の偏りの結果、遺伝子のＧＣ含量が変化する。したがって、例えばポリエステル合成に関与する遺伝子をキャンディダ・マルトーサにおいて効率よく発現させるためには、前記の遺伝暗号ＣＴＧを他のロイシン対応遺伝暗号に変更することに加えて、キャンディダ・マルトーサにおいて使用頻度の高い遺伝暗号に変更した当該遺伝子を使用することが好ましい。
キャンディダ・マルトーサにおける遺伝暗号使用頻度に関しては、Ｋｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ編集のＮｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版）において記載されている。アラニンに対応する遺伝暗号はＧＣＴが好ましく、アルギニンではＡＧＡ、アスパラギンではＡＡＣまたはＡＡＴ、アスパラギン酸ではＧＡＴ、システインではＴＧＴ、グリシンではＧＧＴ、グルタミンではＣＡＡ、グルタミン酸ではＧＡＡ、ヒスチジンではＣＡＣまたはＣＡＴ、イソロイシンではＡＴＴ、ロイシンではＴＴＧまたはＴＴＡ、リジンではＡＡＡ、フェニルアラニンではＴＴＣまたはＴＴＴ、プロリンではＣＣＡ、セリンではＴＣＴ、スレオニンではＡＣＴ、チロシンではＴＡＴまたはＴＡＣ、バリンではＧＴＴがそれぞれ好ましいが、特にこれらの遺伝暗号に制限されない。
一例として、キャンディダ・マルトーサを宿主とした場合、本ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子として、配列番号５で示されるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子、配列番号６で示されるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を利用することができる。
なお、上記配列番号５又は６で表される遺伝子の塩基配列は、実質的な酵素活性を有する限り、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換および／または付加されたものであってもよい。
ここで、「１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素  増刊  遺伝子増幅ＰＣＲ法  ＴＡＫＫＡＪ  ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編  加藤郁之進鑑訳  ＰＣＲテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の方法により、欠失、置換および／または付加できる程度の数の塩基が、欠失、置換および／または付加されてなる塩基配列を意味する。
また、上記塩基配列からなるＤＮＡは、実質的な酵素活性を有する限り、配列番号５又は６に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
「配列番号５又は６に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号５又は６に示す塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、又はサザン・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡのことをいう。当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に準じて該ハイブリダイゼーションを実施して、目的とするＤＮＡを容易に取得できる。
（２）ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した、酵母で発現可能な遺伝子
本発明の特徴は、上記ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した、酵母で発現可能な遺伝子を利用することにある。
酵母を用いてポリエステルを発酵生産させる場合、炭素源としては、炭水化物、油脂類、脂肪酸類、ｎ−パラフィン等、酵母が利用できるものであれば特に制限なく利用することができる。しかし、油脂類、脂肪酸類あるいはｎ−パラフィン等を炭素源としてポリエステルを発酵生産する場合、これらの炭素源はβ酸化経路を経て代謝されるが、β酸化経路の代謝中間体は効率よくポリエステル合成の基質として利用される（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，Ｎｏ．１５，４８２１−４８３０（１９９７），Ｑ．Ｒｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，Ｎｏ．１０，２９７８−２９８１（２０００））。ここで、酵母におけるβ酸化は、細胞内小器官であるペルオキシソーム内で行われることから、ポリエステルの効率の良い合成のためには、ポリエステル合成に関与する酵素がペルオキシソームに局在することが好ましい。
ペルオキシソームへ輸送されるタンパク質は、遊離のリボソーム上で合成され、そのタンパク質配列中にあるペルオキシソーム配向シグナルの働きにより、ペルオキシソームへ輸送される（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．，１２５，９９−１０６，（１９９２）、板井  康能，化学と生物，３５，Ｎｏ．１０，６８７−６９５（１９９７）Ｅ．Ｈ．Ｈｅｔｔｅｍａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４５１，１７−３４（１９９９））。従って、これらペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを、ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に付加させることにより、ポリエステルの合成に関与する酵素をペルオキシソームに局在化させることができ、ポリエステルを効率よく合成することができる。
また、植物において、ＰＨＡ合成酵素遺伝子をペルオキシソームに配向させることが報告されている（ＷＯ９９／３５２７８）。
カルボキシル末端にあるペルオキシソーム配向シグナルとして、３つのアミノ酸配列から成る「（セリン／アラニン／システイン）−（リジン／アルギニン／ヒスチジン）−ロイシン」が知られている。ここで、例えば、（セリン／アラニン／システイン）とは、セリン、アラニンまたはシステインのいずれかであるということを意味する。ポリエステルの合成に関与する酵素をペルオキシソームに配向させるためには、前記３アミノ酸を同酵素のカルボキシル末端に付加すればよい。このうち、一般的なカルボキシル末端ペルオキシソーム配向シグナルとして知られている「セリン−リジン−ロイシン」（以下ＳＫＬと略す）（配列番号１）や、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）でカルボキシル末端ペルオキシソーム配向シグナルとして知られている（Ｊ．Ｄ．Ａｉｔｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３１９７−２３２０３（１９９１））「アラニン−リジン−イソロイシン」（以下ＡＫＩと略す）（配列番号２）をカルボキシル末端に付加するのが好ましい。
上記アミノ酸に対応する塩基配列に特に制限はなく、例えばＳＫＬであれば配列番号３、ＡＫＩであれば配列番号４の塩基配列を使用することができる。
また、Ｎ末端付近に存在する９つのアミノ酸配列「（アルギニン／リジン）−（ロイシン／バリン／イソロイシン）−（５アミノ酸）−（ヒスチジン／グルタミン）−（ロイシン／アラニン）」もペルオキシソーム配向シグナルとして知られている。これらの配列をポリエステル合成に関与する酵素に挿入、付加することによっても、同酵素をペルオキシソームに局在させることができる。
上記ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡをポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に付加した新規遺伝子は、化学合成法やＰＣＲ法等を用いて作製することができる。以下、一例として、ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子としての、配列番号５で示されるＰＨＡ合成酵素遺伝子、配列番号６で示されるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のカルボキシル末端に、ＰＣＲによってＳＫＬを付加する方法について説明する。
ＰＣＲ用プライマーとして配列番号１１と配列番号１２を用いて、配列番号５で示されるＰＨＡ合成酵素遺伝子を鋳型にしてＰＣＲ反応を実施し、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡをＰＨＡ合成酵素遺伝子に付加した新規遺伝子（以下ＯＲＦ２Ｓと略す）（配列番号７）を作製することができる。同様に、ＰＣＲ用プライマーとして配列番号１４と配列番号１５を用いて、配列番号６で示されるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を鋳型にしてＰＣＲ反応を実施し、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡをＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子に付加した新規遺伝子（以下ＯＲＦ３Ｓと略す）（配列番号９）を作製することができる。ここで用いるＰＣＲ条件は、目的遺伝子断片が増幅できればどのような条件を用いてもよい。
また、上記と同様にして、ＰＨＡ合成酵素遺伝子、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のカルボキシル末端に、ＰＣＲによってＡＫＩを付加することができる。配列番号１１と１３をプライマーとして使用して、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を鋳型にしてＰＣＲ反応を実施し、新規遺伝子（以下ＯＲＦ２Ａと略す）（配列番号８）を作製することができる。同様に、配列番号１４と１６をプライマーとして使用して、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を鋳型にしてＰＣＲ反応を実施し、新規遺伝子（以下ＯＲＦ３Ａと略す）（配列番号１０）を作製することができる。
なお、上記配列番号７〜１０で表される新規遺伝子の塩基配列は、それぞれ、実質的な酵素活性を有する限り、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換および／または付加されたものであってもよい。また、上記塩基配列からなるＤＮＡは、それぞれ、実質的な酵素活性を有する限り、上記配列番号に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
上記ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した遺伝子は、酵母で発現可能な遺伝子である。
ここで、酵母としては、特に制限はなく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている、アシクロコニディウム属（Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ属），アンブロシオザイマ属（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ属），アルスロアスカス属（Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ属），アルキシオザイマ属（Ａｒｘｉｏｚｙｍａ属），アシュビア属（Ａｓｈｂｙａ属），バブジェビア属（Ｂａｂｊｅｖｉａ属），ベンシングトニア属（Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属），ボトリオアスカス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属），ボトリオザイマ属（Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ属），ブレッタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属），ビュレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ属），ビュレロマイセス属（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属），キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属），シテロマイセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属），クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属），クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属），シストフィロバシディウム属（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属），デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ属），ディポダスコプシス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ属），ディポダスカス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ属），エニエラ属（Ｅｅｎｉｅｌｌａ属），エンドマイコプセラ属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ属），エレマスカス属（Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ属），エレモセシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属），エリスロバシディウム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属），フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），ガラクトマイセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ属），ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属），ガイラーモンデラ属（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ属），ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属），ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属），ハセガワエア属（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ属），ホルターマンニア属（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ属），ホルモアスカス属（Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ属），ハイフォピキア属（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ属），イサットヘンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属），クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属），クロエケラスポラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ属），クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属），コンドア属（Ｋｏｎｄｏａ属），クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ属），クルツマノマイセス属（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属），ロイコスポリディウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属），ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属），マラセジア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属），メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属），ムラキア属（Ｍｒａｋｉａ属），マイクソザイマ属（Ｍｙｘｏｚｙｍａ属），ナドソニア属（Ｎａｄｓｏｎｉａ属），ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ属），ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ属），オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ属），オースポリディウム属（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属），ファチコスポラ属（Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ属），ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ属），ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属），ロドスポリディウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属），サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），サッカロマイコーデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属），サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），サイトエラ属（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属），サカグチア属（Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属），サターノスポラ属（Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ属），シゾブラストスポリオン属（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ属），シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属），スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属），スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属），スポロパキデミア属（Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ属），ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属），ステリグマトマイセス属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属），ステリグマトスポリディウム属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），シンビオタフリナ属（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ属），シンポディオマイセス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ属），シンポディオマイコプシス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属），トリコスポリエラ属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属），トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属），トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属），ツチヤエア属（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属），ウデニオマイセス属（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属），ワルトマイセス属（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ属），ウィカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ属），ウィカーハミエラ属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ属），ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ属），ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属），ザイゴアスカス属（Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ属），ザイゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），ザイゴウィリオプシス属（Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ザイゴザイマ属（Ｚｙｇｏｚｙｍａ属）等の酵母を使用することができる。
上記酵母のうち、油脂を炭素源とした場合の増殖性がよく、菌株の安全性が高く、菌体と培養液の分離が比較的容易である点から、好ましくはキャンディダ属またはヤロウィア属のものであり、より好ましくはキャンディダ・マルトーサ、ヤロウィア・リポリティカであり、さらに好ましくはキャンディダ・マルトーサである。
また、上記ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した遺伝子から、ポリエステルの合成に関与する酵素が翻訳される。
（３）遺伝子発現カセットの構築
上記ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した遺伝子を酵母で発現させるには、当該遺伝子の５′上流にプロモーター、ＵＡＳ等のＤＮＡ配列が、当該遺伝子の３′下流にポリＡ付加シグナル、ターミネーター等のＤＮＡ配列が必要である。酵母の染色体上に上記条件を満たす適当な部位があれば、当該遺伝子を直接挿入しても良いし、また、適当なプロモーターおよびターミネーターを有するプラスミドに当該遺伝子を挿入し、このプラスミドを酵母に形質転換させることもできる。本発明においては、当該遺伝子の５’上流にプロモーター、３’下流にターミネーターを連結した遺伝子発現カセットを構築し、これを酵母に形質転換するのが好ましい。
使用するプロモーター、ターミネーターは、酵母で機能するものであればどのような配列でも利用できる。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターを用いてもよい。本発明においては、上記プロモーター、ターミネーターが、キャンディダ・マルトーサで機能するものであることが好ましく、上記プロモーター、ターミネーターがキャンディダ・マルトーサ由来であることが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１、ＡＬＫ５またはＰＯＸ２遺伝子由来のプロモーター、ＡＬＫ１遺伝子由来のターミネーターを利用する。
例えば、プロモーターとしては、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ００４８１）のプロモーターＡＬＫ１ｐ（配列番号１７）、ＡＬＫ５遺伝子のプロモーターＡＬＫ５ｐ（配列番号１８）、ＰＯＸ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ２１２２８）のプロモーターＰＯＸ２ｐ（配列番号１９）等を用いることができる。また、ターミネーターとしては、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子のターミネーターＡＬＫ１ｔ（配列番号２０）等を用いることができる。
なお、上記プロモーター、ターミネーターの塩基配列は、キャンディダ・マルトーサで機能する配列であれば、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であってもよい。また、上記塩基配列からなるＤＮＡは、それぞれ、キャンディダ・マルトーサで機能するものであれば、上記配列番号に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
上記プロモーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の５’上流に、ターミネーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の３’下流に、それぞれ連結される。
遺伝子発現カセットの構築に用いられるベクターは、大腸菌において自律増殖するプラスミドであればどのようなベクターでもよく、さらに酵母において自律増殖可能な領域を合わせ持っていてもよい。酵母において自律増殖できるベクターは、菌体内に保持される。また、遺伝子発現カセットを染色体上に組み込むこともできる。一例として、キャンディダ・マルトーサにおいて自律増殖可能なｐＵＴＵ１を用いることができる（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７３，３９４８−３９５３（１９９８））。
プロモーターおよびターミネーターと構造遺伝子を連結するための制限酵素部位を作成するためには、ＰＣＲ法が利用できる。ＰＣＲに用いるプライマー配列は特に限定されないが、例えば、配列番号２１から配列番号２８に示す配列を使用できる。ＰＣＲの条件は目的遺伝子断片が増幅できればどのような条件を用いてもよい。
本発明の遺伝子発現カセットの構築方法は特に限定されないが、一例として、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡ配列をポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子に付加した遺伝子として、前記ＯＲＦ２ＳとＯＲＦ３Ｓの２種類の遺伝子を用いた場合の構築方法として以下に説明する。
（ａ）ＡＬＫ１ｐ、ＡＬＫ５ｐとＡＬＫ１ｔを用いた場合
プロモーター部分は、ＡＬＫ１遺伝子を鋳型にして配列番号２１と配列番号２２を用いて、５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＮｄｅＩのＡＬＫ１ｐを作製することができる。ターミネーター部分は、ＡＬＫ１遺伝子を鋳型にして配列番号２７と配列番号２８を用いて、５’末端がＨｉｎｄＩＩＩ、３’末端がＥｃｏＲＶのＡＬＫ１ｔを作製することができる。ベクターには、ｐＵＴＵ１とキャンディダ・マルトーサのＡＤＥ１遺伝子（配列番号２９）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ００８５５）（Ｓ．Ｋａｗａｉ，ｅｔ  ａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５５，５９−６５（１９９１））を用いて、マーカー遺伝子をウラシルからアデニンに変更したベクターｐＵＴＡ１（図１）とｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）を使用することができる。
ｐＵＣＮＴのＰｖｕＩＩ、ＮｄｅＩサイトにＡＬＫ１ｐを結合してｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｐを構築し、ｐＵＣＮＴのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩサイトにＡＬＫ１ｔを結合してｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｔを構築し、次いで、ｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｐからＰｖｕＩＩとＮｄｅＩでＡＬＫ１ｐを切り出し、ｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｔのＰｖｕＩＩ、ＮｄｅＩサイトに結合して、ｐＵＡＬ１（図２）を構築することができる。
次に、ｐＵＡＬ１のＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトにＯＲＦ２Ｓを結合し、プラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ｓ（図３）を構築することができる。
さらに、プラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２ＳからＥｃｏＴ２２Ｉを用いて、ＯＲＦ２Ｓとともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切り出し、ｐＵＴＡ１のＰｓｔＩサイトに結合し、ｐＨＡ２Ｓ（図４）を構築することができる。
以上の構築方法を図８と図９にまとめて記載した。なお、図８、図９における「＊１」は、ここで図８と図９がつながっていることを示す。
一方、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ１２７１７）を鋳型にして、配列番号２３と２４を使用して、５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＮｄｅＩのＡＬＫ５ｐ（配列番号１８）を作製することができる。このＤＮＡ断片をｐＵＡＬ１のＡＬＫ１ｐと入れ替えることで、ｐＵＡＬ５が構築できる。このプラスミドからＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩを用いてＡＬＫ５プロモーター、ＡＬＫ１ターミネーターを切り出し、市販のベクターｐＳＴＶ２８のＳｍａＩ、ＰｖｕＩサイトに接続することで、ｐＳＴＡＬ５を構築することができる。このプラスミドのＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトにＯＲＦ３Ｓを結合し、ｐＳＴＡＬ５−ＯＲＦ３Ｓ（図５）が構築できる。
さらに、ｐＳＴＡＬ５−ＯＲＦ３ＳからＳａｌＩを用いてＯＲＦ３Ｓとともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切り出し、ｐＨＡ２ＳのＳａｌＩサイトに結合したプラスミドｐＨＡ２３Ｓ２（図６）を構築することができる。
以上の構築方法を図１０と図１１にまとめて記載した。なお、図１０、図１１における「＊２」は、ここで図１０と図１１がつながっていることを示す。
（ｂ）ＡＬＫ１ｐ、ＰＯＸ２ｐとＡＬＫ１ｔを用いた場合
キャンディダ・マルトーサのＰＯＸ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ２１２２８）を鋳型にして、配列番号２５と配列番号２６を使用して、５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＮｄｅＩのＰＯＸ２ｐ（配列番号１９）を作製することができる。このＤＮＡ断片をｐＵＣＮＴ−ＯＲＦ３Ｓｔのｌａｃプロモーターと入れ替えることで、ｐＰＯＸ２−ＯＲＦ３Ｓが構築できる。ｐＰＯＸ２−ＯＲＦ３ＳからＳａｌＩを用いてＯＲＦ３Ｓとともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切り出し、ｐＨＡ２ＳのＳａｌＩサイトに結合したプラスミドｐＨＡ２３Ｓ１（図７）を構築することができる。以上の構築方法を図１２にまとめて記載した。
以上の方法により、酵母キャンディダ・マルトーサにおいて、一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を単独重合または共重合してなるポリエステルを製造するための遺伝子発現カセットを構築することができる。
（４）宿主
本発明でいう酵母には特に制限はなく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている、アシクロコニディウム属（Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ属），アンブロシオザイマ属（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ属），アルスロアスカス属（Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ属），アルキシオザイマ属（Ａｒｘｉｏｚｙｍａ属），アシュビア属（Ａｓｈｂｙａ属），バブジェビア属（Ｂａｂｊｅｖｉａ属），ベンシングトニア属（Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属），ボトリオアスカス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属），ボトリオザイマ属（Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ属），ブレッタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属），ビュレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ属），ビュレロマイセス属（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属），キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属），シテロマイセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属），クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属），クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属），シストフィロバシディウム属（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属），デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ属），ディポダスコプシス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ属），ディポダスカス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ属），エニエラ属（Ｅｅｎｉｅｌｌａ属），エンドマイコプセラ属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ属），エレマスカス属（Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ属），エレモセシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属），エリスロバシディウム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属），フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），ガラクトマイセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ属），ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属），ガイラーモンデラ属（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ属），ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属），ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属），ハセガワエア属（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ属），ホルターマンニア属（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ属），ホルモアスカス属（Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ属），ハイフォピキア属（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ属），イサットヘンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属），クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属），クロエケラスポラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ属），クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属），コンドア属（Ｋｏｎｄｏａ属），クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ属），クルツマノマイセス属（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属），ロイコスポリディウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属），ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属），マラセジア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属），メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属），ムラキア属（Ｍｒａｋｉａ属），マイクソザイマ属（Ｍｙｘｏｚｙｍａ属），ナドソニア属（Ｎａｄｓｏｎｉａ属），ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ属），ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ属），オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ属），オースポリディウム属（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属），ファチコスポラ属（Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ属），ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ属），ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属），ロドスポリディウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属），サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），サッカロマイコーデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属），サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），サイトエラ属（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属），サカグチア属（Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属），サターノスポラ属（Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ属），シゾプラストスポリオン属（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ属），シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属），スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属），スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属），スポロパキデミア属（Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ属），ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属），ステリグマトマイセス属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属），ステリグマトスポリディウム属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），シンビオタフリナ属（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ属），シンポディオマイセス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ属），シンポディオマイコプシス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属），トリコスポリエラ属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属），トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属），トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属），ツチヤエア属（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属），ウデニオマイセス属（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属），ワルトマイセス属（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ属），ウィカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ属），ウィカーハミエラ属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ属），ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ属），ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属），ザイゴアスカス属（Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ属），ザイゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），ザイゴウィリオプシス属（Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ザイゴザイマ属（Ｚｙｇｏｚｙｍａ属）等の酵母を使用することができる。
また、本発明の形質転換体の宿主として用いられる酵母としては、特に限定されないが、油脂を炭素源とした場合の増殖性がよく、菌株の安全性が高く、菌体と培養液の分離が比較的容易である点から、好ましくはキャンディダ属またはヤロウィア属のものであり、より好ましくはキャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらに好ましくはキャンディダ・マルトーサである。
なお、宿主として用いられる酵母のうち、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ＡＣ１６株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３６６として、平成１２年１１月１５日に、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。
（５）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、上記ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した遺伝子が、酵母に一種類以上導入されてなるものである。また、上記遺伝子と、酵母で機能するプロモーターおよびターミネーターからなる、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子発現カセットが、酵母に１種類以上導入されていることが好ましい。
ポリマー合成に関与する遺伝子発現カセット組換えベクターの酵母への導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）等を用いることができる。また、Ｆａｓｔ  ＴｒａｃｋＴＭ−Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＫｉｔＳＭ（Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような市販の形質転換キットを利用することもできる。
一例として、宿主として、キャンディダ・マルトーサＣＨＡ１株（Ｓ．Ｋａｗａｉ，ｅｔ  ａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５５，５９−６５（１９９１））を用いることができる。上記の形質転換法を用いて、ポリマー合成に関与する遺伝子発現カセットで本菌株を形質転換し、例えば、上述したｐＨＡ２ＳやｐＨＡ２３Ｓ２等のプラスミドを有するキャンディダ・マルトーサ形質転換体を作製することができる。
なお、上記形質転換体のうち、プラスミドｐＨＡ２３Ｓ１を導入した株である、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ＡＣ１６（ｐＨＡ２３Ｓ１）は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７６２として、プラスミドｐＨＡ２３Ｓ２を導入した株である、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ＡＣ１６（ｐＨＡ２３Ｓ２）は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７６３として、それぞれ平成１３年１０月３日に、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。
（６）ポリエステルの製造
本発明のポリエステルの製造方法においては、本発明の上記形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取する。
つまり、本発明のポリエステルの製造は、培養培地に上記形質転換体を添加して培養した後、得られた当該培養菌体または培養物からポリエステルを回収することにより行うことができる。ここで、培養温度は、その菌の生育可能な温度、好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２８℃〜３４℃である。また、培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１〜７日間が好ましく、また連続培養も可能である。
培養培地は、酵母が利用できるものである限り特に限定されない。例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。
炭素源としては、酵母が資化できるものである限り特に限定されず、例えば炭水化物、油脂類、脂肪酸類、ｎ−パラフィン等を用いることができる。炭水化物としては、例えばグルコース、シュークロース、グリセリン等が挙げられる。油脂類としては、例えばナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸類としては、例えばヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。ｎ−パラフィンとしては、例えばドデカン、テトラデカン等が挙げられる。
また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質（例えば、アルコール等）を添加すればよい。誘導物質が主要炭素源である場合もある。
一例として、キャンディダ・マルトーサの培養において、炭素源として油脂類を用いて培養することもできる。また、油脂を資化できないかまたは効率よく資化できない酵母では、培地中にリパーゼを添加することによって改善することもできる。さらに、リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資化能を付与することもできる。
また、炭素源として奇数の炭素鎖を有する脂肪酸やｎ−パラフィン等を用いた場合、上記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を単独重合または共重合してなるポリエステルの炭素鎖に奇数成分の割合を高めることができる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類等が挙げられる。
本発明において、ポリエステルの菌体からの回収は、例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、遠心分離器等で培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。沈殿したポリエステルから、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させて、ポリエステルを回収することができる。
本発明では、ポリエステルを生産する菌体として酵母を使用するため、上記のような簡便な分離回収方法が利用可能である。
また、得られたポリエステルの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行う。
本発明のポリエステルの製造方法は、上述のような構成からなるので、一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸の単独重合体または共重合体であるポリエステルを生産性良く製造することができる。
また、上述したプラスミドｐＨＡ２Ｓ等を用いて、ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した遺伝子と、酵母で機能するプロモーターおよびターミネーターを有するキャンディダ・マルトーサ形質転換体を作製し、培養する方法により、前述の式（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸と式（３）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
（実施例１）ポリエステル合成に関与する遺伝子の設計と合成
ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子として、アエロモナス・キャビエの由来のＰＨＡ合成酵素と、β酸化経路の中間体のエノイルＣｏＡをモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換するＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７０，６９−７５（１９９９））のアミノ酸配列をもとに、当該酵素遺伝子を合成した。
キャンディダ・マルトーサは、ＣＴＧコドンをロイシンではなくセリンに翻訳する酵母である。このため、ロイシンコドンにはＣＴＧを割り当てなかった。各アミノ酸に対応するコドンはキャンディダ・マルトーサにおいて使用頻度の高いコドンを優先的に選択した。コドンの使用頻度はＫｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ著のＮｏｎｃｏｎｖｅｎｄｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版）を参考にした。
遺伝子の設計は次のようにして行った。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素と、β酸化経路の中間体のエノイルＣｏＡをモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換するＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼのそれぞれのＤＮＡ配列とアミノ酸配列をもとに、各アミノ酸に対応する最適コドンを割り当てた。
さらに、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素のＤＮＡ配列において、２個所のＫｐｎＩ部位を作成するために、９６９番目のＴをＣ、１４４９番目のＴをＣに変換した。
以上の置換によっては、当該遺伝子のアミノ酸配列は変更されない。
このようにしてＰＨＡ合成酵素遺伝子（ＯＲＦ２）（配列番号５）とＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ＯＲＦ３）（配列番号６）を設計し、化学合成した。
（実施例２）ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子発現カセットの構築
（ａ）ＡＬＫ１ｐ、ＡＬＫ５ｐとＡＬＫ１ｔを用いた場合
キャンディダ・マルトーサでＯＲＦ２、ＯＲＦ３を発現させるために、それぞれの５′上流にキャンディダ・マルトーサ由来プロモーターを、３’下流にターミネーターを連結することにした。ＯＲＦ２にはＡＬＫ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ００４８１）のプロモーターＡＬＫ１ｐ（配列番号１７）を、またＯＲＦ３にはＡＬＫ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ１２７１７）のプロモーターＡＬＫ５ｐ（配列番号１８）を連結することにした。３’下流には共にキャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子のターミネーターＡＬＫ１ｔ（配列番号２０）を連結することにした。プロモーターおよびターミネーターと構造遺伝子を連結するための制限酵素部位を作成するために、ＰＣＲ法を利用した。ＰＣＲに用いたプライマー配列を配列番号２１から配列番号２８に示す。ＰＣＲの条件は９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイクルとし、これを２５回繰り返して、目的遺伝子断片を増幅した。ポリメラーゼは宝酒造社製のＥｘＴａｑを使用した。
ＡＬＫ１ｐは、ＡＬＫ１遺伝子を鋳型にして配列番号２１と配列番号２２を用いて、５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＮｄｅＩのＡＬＫ１ｐを作製した。ＡＬＫ５ｐは、ＡＬＫ５遺伝子を鋳型にして配列番号２３と配列番号２４を用いて、５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＮｄｅＩのＡＬＫ５ｐを作製した。ＡＬＫ１ｔは、ＡＬＫ１遺伝子を鋳型にして配列番号２７と配列番号２８を用いて、５’末端がＨｉｎｄＩＩＩ、３’末端がＥｃｏＲＶのＡＬＫ１ｔを作製した。
最終的にＯＲＦ２とＯＲＦ３を連結するベクターには、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）にキャンディダ・マルトーサの自己複製領域（ＡＲＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ２９７５８）およびＵＲＡ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ１２７２０）を連結したｐＵＴＵ１（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７３，３９４８−３９５３（１９９８））と、キャンディダ・マルトーサのＡＤＥ１遺伝子（配列番号２９）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ００８５５）（Ｓ．Ｋａｗａｉ，ｅｔ  ａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５５，５９−６５（１９９１））を用いて、マーカー遺伝子をウラシルからアデニンに変更したベクターであるｐＵＴＡ１（図１）を構築し使用した。
次に、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のＰｖｕＩＩ、ＮｄｅＩサイトにＡＬＫ１ｐを結合してｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｐを構築した。また、ｐＵＣＮＴのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩサイトにＡＬＫ１ｔを結合してｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｔを構築した。ｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｐからＰｖｕＩＩとＮｄｅＩでＡＬＫ１ｐを切り出し、ｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｔのＰｖｕＩＩ、ＮｄｅＩサイトに結合して、ｐＵＡＬ１（図２）を構築した。
前記ＯＲＦ２、ＯＲＦ３がキャンディダ・マルトーサで発現し、ペルオキシソームに配向するように、それぞれのカルボキシ末端にペルオキシソーム配向シグナルを付加することにした。付加するペルオキシソーム配向シグナルとしては、カルボキシ末端にＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（ＳＫＬ）またはＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（ＡＫＩ）のアミノ酸を使用することにした。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３遺伝子にこれらのアミノ酸を付加して得られた遺伝子（ＯＲＦ２Ｓ、ＯＲＦ２Ａ、ＯＲＦ３Ｓ、ＯＲＦ３Ａ）の塩基配列を、配列番号７から１０に示した。ＯＲＦ２のＤＮＡを鋳型にして、配列番号１１と１２をプライマーとして使用してＯＲＦ２Ｓを、また配列番号１１と１３を使用してＯＲＦ２Ａを作成した。同様に、ＯＲＦ３のＤＮＡを鋳型にして、配列番号１４と１５をプライマーとして使用してＯＲＦ３Ｓを、また配列番号１４と１６を使用してＯＲＦ３Ａを作成した。ＰＣＲの条件は上記のとおりに行った。
増幅したＤＮＡをＮｄｅＩとＰｓｔＩで処理し、ＯＲＦ２ＳはｐＵＡＬ１のＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトに結合してプラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ｓを構築し、また、同様にしてｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ａ（図３）を構築した。ＯＲＦ３ＳはｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１ｔのＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトに結合し、ｐＵＣＮＴ−ＯＲＦ３Ｓｔを構築した。ＯＲＦ３Ａは、ＯＲＦ３Ｓと同様の方法を用いて構築した。
プラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ｓ、ｐＵＡＬ−ＯＲＦ２ＡからＥｃｏＴ２２Ｉを用いて、ＯＲＦ２Ｓ、ＯＲＦ２Ａとともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切り出し、ｐＵＴＡ１のＰｓｔＩサイトに結合し、ｐＨＡ２Ｓ、ｐＨＡ２Ａ（図４）を構築した。
キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ１２７１７）を鋳型とし、配列番号２３と２４を使用して５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＮｄｅＩのＡＬＫ５ｐ（配列番号１８）を作製した。このＤＮＡ断片をｐＵＡＬ１のＡＬＫ１ｐと入れ替え、ｐＵＡＬ５を構築した。このプラスミドからＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩを用いてＡＬＫ５プロモーター、ＡＬＫ１ターミネーターを切り出し、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）のＳｍａＩ、ＰｖｕＩサイトに接続することで、ｐＳＴＡＬ５を構築した。このプラスミドのＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトにＯＲＦ３Ｓを結合し、ｐＳＴＡＬ５−ＯＲＦ３Ｓ（図５）を構築した。
ｐＳＴＡＬ５−ＯＲＦ３ＳからＳａｌＩを用いてＯＲＦ３Ｓとともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切り出し、ｐＨＡ２ＳのＳａｌＩサイトに結合したプラスミドｐＨＡ２３Ｓ２（図６）を構築した。
（ｂ）ＡＬＫ１ｐ、ＰＯＸ２ｐとＡＬＫ１ｔを用いた場合
キャンディダ・マルトーサのＰＯＸ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ２１２２８）を元にして配列番号２５と配列番号２６をプライマーとして設計した。これらを使用しキャンディダ・マルトーサＩＡＭ１２２４７のゲノムＤＮＡを鋳型として、５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＮｄｅＩのＰＯＸ２ｐ（配列番号１９）を作製した。このＤＮＡ断片をｐＵＣＮＴ−ＯＲＦ３Ｓｔのｌａｃプロモーターと入れ替え、ｐＰＯＸ２−ＯＲＦ３Ｓを構築した。ｐＰＯＸ２−ＯＲＦ３ＳからＳａｌＩを用いてＯＲＦ３Ｓとともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切り出し、ｐＨＡ２ＳのＳａｌＩサイトに結合したプラスミドｐＨＡ２３Ｓ１（図７）を構築することができた。
全体の構築図を図８〜図１２に示す。
（実施例３）形質転換体の構築
酵母菌の培養用に使用した試薬は、特に断らない限り和光純薬から販売されているものを用いた。また本発明の実施において、多くの市販のキットを用いたが、特に断らない限り添付の使用説明書に従って行った。
宿主には、ＡＤＥ１遺伝子破壊株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されているキャンディダ・マルトーサＡＣ１６株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３６６）を使用し、これに、上記の本発明の遺伝子発現カセットであるプラスミドｐＨＡ２Ｓ、ｐＨＡ２Ａ、ｐＨＡ２３Ｓ１、ｐＨＡ２３Ｓ２をそれぞれ導入した。構築したプラスミドを宿主に導入する方法は、エレクトロポレーション法で行った。遺伝子導入装置はＢＴＸ社製のＥＬＥＣＴＲＯ  ＣＥＬＬ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲ  ６００を用いた。キュベットはＢＩＯ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＣＯ．ＬＴＤ製のＢＭ６２００を用いた。コンピテント細胞１００μｌにプラスミド１μｌを加え、調製したコンピテント細胞／プラスミド溶液を１００μｌ取りキュベットに注入し、パルス装置にセットした。続いて、静電容量４０μＦ、抵抗値２４６ｏｈｍ、電圧１．９ＫＶの条件で電気パルスをかけた。パルス後、それぞれのキュベットに１Ｍソルビトールを１ｍｌ加え、穏やかに混合し、室温で１時間放置した。プラスミドを導入後、選択プレート（０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天）で培養し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体のうち、プラスミドｐＨＡ２３Ｓ１を導入した株は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ＡＣ１６（ｐＨＡ２３Ｓ１）、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７６２として、また、プラスミドｐＨＡ２３Ｓ２を導入した株は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ＡＣ１６（ｐＨＡ２３Ｓ２）、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７６３として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託した。
（実施例４）形質転換体を使用したポリマー生産
（ａ）プラスミドｐＨＡ２Ｓ、ｐＨＡ２Ａを導入した形質転換体を使用したポリマー生産
ポリマー生産に必要な遺伝子を導入したキャンディダ・マルトーサ形質転換体を次のように培養した。培地はＹＮＢ培地（０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）に、１ｗ／ｖ％カサミノ酸、１ｖ／ｖ％テトラデカンを添加した培地を使用した。
各形質転換体のグリセロールストック５００μｌを、５０ｍｌの前培地が入った５００ｍｌ坂口フラスコに接種して２０時間培養し、３００ｍＬの生産培地を入れた２Ｌ坂口フラスコに１０ｖ／ｖ％接種した。これを培養温度３０℃、振盪速度９０ｒｐｍ、４日間培養という条件で培養した。培養液から、遠心分離によって菌体を回収し、８０ｍｌの蒸留水に懸濁して超高圧ホモジナイザー（ＡＰＶ社製  Ｒａｎｎｉｅ２０００  １５０００Ｐｓｉで１５分）で破砕した後、遠心分離を行い、得られた沈殿物をメタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。
得られた乾燥菌体を粉砕し、クロロホルムを１００ｍｌ添加し一晩攪拌して抽出した。濾過して菌体を除去し、濾液をエバポレーターで１−２ｍｌにまで濃縮し、濃縮液に約１０ｍｌのヘキサンを添加して、ポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を析出させた。このときの培養結果を表１に示す。
2003033707.tif 000008
（ｂ）プラスミドｐＨＡ２Ｓ、ｐＨＡ２３Ｓ１、ｐＨＡ２３Ｓ２を導入した形質転換体を使用したポリマー生産
培地はＹＮＢ培地（０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）に、２ｖ／ｖ％ドデカンまたは２ｖ／ｖ％ヤシ油を添加した培地を使用した。
培養条件は、培養日数を２日間とした以外は上記（ａ）項記載の方法で行った。ポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の抽出も同様に上記（ａ）項記載の方法で行った。培養結果を表２に示す。
2003033707.tif 000009
（比較例１）
ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加しないポリエステル合成酵素遺伝子により構築したプラスミドｐＵＴＡ−ＯＲＦ２３（ＷＯ０１／８８１４４）を導入した形質転換体（菌体量１０．３ｇ／Ｌ）を用いた以外は、実施例４の（ａ）と同様にして培養を行った。その結果、得られたポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含量は０．１ｗｔ％であった。
このように、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加したポリエステル合成酵素遺伝子を作成し、当該酵素遺伝子とプロモーターおよびターミネーターからなる発現カセットを酵母に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加しないポリエステル合成酵素遺伝子を用いた場合に比べて、より多量のポリエステルを製造することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、生分解性および優れた物性を有する上記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を単独重合または共重合してなるポリエステルを、酵母を用いて、高い生産性で製造することが可能となった。
【配列表】
2003033707.tif 000010
2003033707.tif 000011
2003033707.tif 000012
2003033707.tif 000013
2003033707.tif 000014
2003033707.tif 000015
2003033707.tif 000016
2003033707.tif 000017
2003033707.tif 000018
2003033707.tif 000019
2003033707.tif 000020
2003033707.tif 000021
2003033707.tif 000022
2003033707.tif 000023
2003033707.tif 000024
2003033707.tif 000025
2003033707.tif 000026
2003033707.tif 000027
2003033707.tif 000028
2003033707.tif 000029
2003033707.tif 000030
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例においてベクターとして使用したプラスミドｐＵＴＡ１を示す模式図である。
図２は、実施例において構築したプラスミドｐＵＡＬ１を示す模式図である。
図３は、実施例において構築したプラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ｓ、ｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ａを示す模式図である。
図４は、実施例において構築したプラスミドｐＨＡ２Ｓ、ｐＨＡ２Ａを示す模式図である。
図５は、実施例において構築したプラスミドｐＳＴＡＬ５−ＯＲＦ３Ｓを示す模式図である。
図６は、実施例において構築したプラスミドｐＨＡ２３Ｓ２を示す模式図である。
図７は、実施例において構築したプラスミドｐＨＡ２３Ｓ１を示す模式図である。
図８、図９は、本発明の形質転換体を作成する際に用いられるプラスミドｐＨＡ２Ｓ、ｐＨＡ２Ａの構築方法を示したプラスミド構築図である。
図１０、図１１は、本発明の形質転換体を作成する際に用いられるプラスミドｐＨＡ２３Ｓ２の構築方法を示したプラスミド構築図である。
図１２は、本発明の形質転換体を作成する際に用いられるプラスミドｐＨＡ２３Ｓ１の構築方法を示したプラスミド構築図である。
【図１】
2003033707.tif 000033
【図２】
2003033707.tif 000034
【図３】
2003033707.tif 000035
【図４】
2003033707.tif 000036
【図５】
2003033707.tif 000037
【図６】
2003033707.tif 000038
【図７】
2003033707.tif 000039
【図８】
2003033707.tif 000040
【図９】
2003033707.tif 000041
【図１０】
2003033707.tif 000042
【図１１】
2003033707.tif 000043
【図１２】
2003033707.tif 000044
【国際調査報告】
2003033707.tif 000045
2003033707.tif 000046
2003033707.tif 000047
2003033707.tif 000048