(57)【要約】本発明は、標的遺伝子と相補鎖核酸配列とコンポーネント配列からなる一本鎖ポリヌクレオチド配列を提供する。
2003070932.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列からなる標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列であって、標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列はコンポーネント（Ｉ）または（ＩＩＩ）のいずれか又はその部分配列に相補する配列を有するＲＮＡに対してＲＮＡ機能抑制活性を有する、
但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０のポリヌクレオチド配列を含み、
コンポーネント（ＩＩ）は、０塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列（但し、０塩基は結合を表す）、または非ヌクレオチド配列であり、
コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的な配列を含むポリヌクレオチド配列である。
【請求項２】
前記コンポーネント（ＩＩＩ）のポリヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものであることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
コンポーネント（Ｉ）または（ＩＩＩ）が１から数塩基のＵ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＡからなる配列を少なくとも何れかの末端にさらに有するか、相補的配列の内部において欠失、置換又は付加していることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
ポリヌクレオチド配列が化学的合成法または遺伝子組換え技術によって得られることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
配列番号１または２の一本鎖ＲＮＡからなる標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
コンポーネント（ＩＩ）がヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの組み合わせによってなる請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基以上１０キロ塩基未満のヌクレオチド配列からなる請求項６に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基長から数百塩基長のヌクレオチド配列からなる請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基長から数十塩基長のヌクレオチド配列からなる請求項８に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基長から２０塩基長のヌクレオチド配列からなる請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
コンポーネント（ＩＩ）が配列番号３または４に示されることを特徴とする請求項１０に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列が、ＰＮＡ、細胞質移行性配列、デコイ活性を有する配列、インターフェロン誘導抑制配列、ＲＮａｓｅ抑制活性、アンチセンス活性、リボザイム活性およびトランスファーＲＮＡのいずれかを有する配列、またはそれらの組み合わせによってなる請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
化学的合成法または遺伝子組換え技術によって請求項１〜１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を製造する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列がベクターに挿入された組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列をベクターに挿入することを特徴とする請求項１４の組換えベクターの製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１２の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を用いて、医薬品標的遺伝子をスクリーニングする方法において、
該方法は連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を細胞または組織に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列と相補する配列を有する遺伝子の、一本鎖ポリヌクレオチド配列によるＲＮＡ機能抑制活性の増減によって標的遺伝子の関連する機能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法であって、
（ａ）候補化合物と、該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物（または該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接的または間接的に結合させた標識により測定する方法、
（ｂ）候補化合物と、該一本鎖ポリヌクレオチド配列が導入された細胞（または該一本鎖ポリヌクレオチド配列を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合物との結合を、標識競合物質の存在下で測定する方法、
（ｃ）候補化合物が該一本鎖ポリヌクレオチド配列により、標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは該標的遺伝子発現産物の活性化または抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、前記ポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用いて調べる方法、
（ｄ）候補化合物と、標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を含有する溶液とを同時に混合して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドまたは該標的遺伝子発現産物の活性を測定し、該混合物の活性をスタンダードと比較する方法、および
（ｅ）候補化合物が細胞における該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドの産生に及ぼす効果を検出する方法
よりなる群から選択される方法のいずれかを用いることを特徴とする医薬品標的遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれかに記載の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１４の組換えベクターを有効成分とする医薬組成物。
【請求項１９】
連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントを有する単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を細胞または組織に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列と相補する配列を有する遺伝子のＲＮＡ機能抑制活性によって標的遺伝子の機能を抑制する方法
但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０のポリヌクレオチド配列を含み、
コンポーネント（ＩＩ）は、０塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列（但し、０塩基は結合を表す）、または非ヌクレオチド配列であり、
コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的な配列を含むポリヌクレオチド配列である。
【請求項２０】
コンポーネント（ＩＩＩ）のポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コンポーネント（Ｉ）または（ＩＩＩ）が１から数塩基のＵ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＡ配列の何れかの末端に有するか、内部において欠失、置換又は付加しているＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド配列が化学的合成法または遺伝子組換え技術によって得られたものであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
一本鎖ポリヌクレオチド配列が配列番号１または２の一本鎖ＲＮＡからなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
コンポーネント（ＩＩ）がヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの組み合わせによってなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基以上１０キロ塩基未満のヌクレオチド配列からなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基長から数百塩基長のヌクレオチド配列からなる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基長から数十塩基長のヌクレオチド配列からなる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基長から２０塩基長のヌクレオチド配列からなる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
コンポーネント（ＩＩ）が配列番号３または４に示されるものであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列が、ＰＮＡ、細胞質移行性配列、デコイ活性を有する配列、インターフェロン誘導抑制配列、ＲＮａｓｅ抑制活性、アンチセンス活性、リボザイム活性およびトランスファーＲＮＡのいずれかを有する配列、またはそれらの組み合わせによってなる請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１９〜３０に記載の標的遺伝子の機能を抑制する方法によって、標的遺伝子のタンパク質の発現を抑制する方法。
【請求項３２】
請求項１９〜３０に記載の標的遺伝子の機能を抑制する方法によって、標的遺伝子の転写物の活性を抑制する方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２の方法によって、産生した培養されたノックダウン細胞または組織または非ヒトノックダウン動物又はノックダウン植物。
【請求項３４】
臓器移植用である請求項３３に記載のノックダウン細胞または組織または非ヒトノックダウン動物。
【請求項３５】
請求項１７または１８に記載の医薬組成物からなる遺伝子治療剤。
【請求項３６】
連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントを有する単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を細胞または組織または非動物又は植物に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列と相補する配列を有する遺伝子のＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能を試験する方法
但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０のポリヌクレオチド配列を含み、
コンポーネント（ＩＩ）は、０塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列（但し、０塩基は結合を表す）、または非ヌクレオチド配列であり、
コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的な配列を含むポリヌクレオチド配列である。
【請求項３７】
被検化合物を細胞または組織または非ヒト動物又は植物と共に培養した後、該細胞または組織または非ヒト動物又は植物に対して、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントを有する単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を導入する工程、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のポリヌクレオチド配列と相補する配列を有する遺伝子のＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性をコントロールと比較する工程を包含する標的遺伝子の機能を増強する候補化合物を検出する方法
但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０のポリヌクレオチド配列を含み、
コンポーネント（ＩＩ）は、０塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列（但し、０塩基は結合を表す）、または非ヌクレオチド配列であり、
コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的な配列を含むポリヌクレオチド配列である。
【請求項３８】
コンポーネント（ＩＩＩ）が標的遺伝子に相補的な１８〜２５個のリボヌクレオチドに続く任意の種類の１〜５個のリボヌクレオチドからなり、コンポーネント（Ｉ）がコンポーネント（ＩＩＩ）の１８〜２５個のヌクレオチドに相補的な１８〜２５個のリボヌクレオチドからなる請求項１〜４のいずれかに記載の、標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列。
【請求項３９】
以下の工程を含む標的遺伝子用ヌクレオチドの合成方法：
（ｉ）  コンポーネント（ＩＩ）の３‘末端の数ヌクレオチドがコンポーネント（Ｉ）または（ＩＩ）の数ヌクレオチドに相補的になるようにコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる一本鎖ヌクレオチドを作製する工程、
（ｉｉ）  このコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる一本鎖ヌクレオチドを用いてヌクレオチド合成酵素活性によりコンポーネント（ＩＩＩ）を合成させる工程、またはこのコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる一本鎖ヌクレオチドを用いて細胞内に導入し細胞内に存在する上記ヌクレオチド合成酵素活性によりコンポーネント（ＩＩＩ）を合成させる工程。
【請求項４０】
コンポーネント（Ｉ）および（ＩＩＩ）がランダムなオリゴヌクレオチドである請求項３９の方法により得られたランダム化標的遺伝子用ヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、標的遺伝子に特異的なＲＮＡ機能抑制活性を有する一本鎖ポリヌクレオチド配列及び該ポリヌクレオチド配列を用いる標的遺伝子の機能抑制法に関する。
背景技術
ＲＮＡ干渉法（ＲＮＡインターフェアランス：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、標的とする遺伝子（以下、標的遺伝子）と相同配列を有する２本鎖ＲＮＡ、つまり１本のＲＮＡは標的遺伝子に対するセンス配列を有し、別の１本のＲＮＡは標的遺伝子に対するアンチセンス配列を有する、２つの相補的なＲＮＡから構成されている２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入することにより、標的遺伝子の転写産物（ＲＮＡ）が破壊される現象に基づく方法である（Ｆｉｒｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１（１９９８））。本明細書では、２本の別々の相補的分子がアニールする場合を２本鎖、１本の分子内で相補的部分がアニールしているか、２本の別々の相補的分子がアニールしているかを区別せずに使用する場合を２重鎖とよぶ。その遺伝子抑制効果および特異性はアンチセンス法より高く、有効濃度はより低いことが明らかとなっている。無脊椎動物においては２重鎖ＲＮＡの構造、特にその長さには制限がなく、２重鎖部分が長いほど有効度が高く、３０塩基対を超える２重鎖ＲＮＡを用いた時も遺伝子特異的なＲＮＡインターフェアランス現象を生じることが知られている。一方、脊椎動物においては、３０塩基対を超えるような２重鎖部分を有する長鎖２本鎖ＲＮＡの導入はインターフェロン系を活性化し、標的遺伝子以外の広範な遺伝子の非特異的な遺伝子機能抑制（ＲＮＡの非特異的な分解、ｍＲＮＡの非特異的な翻訳の抑制）および細胞死等を生じることが知られており、ＲＮＡインターフェアランス現象を利用した遺伝子機能抑制に関しては限定的な効果が得られているに過ぎなかった。
長鎖２重鎖ＲＮＡは細胞内で約２１ヌクレオチド長の小型ＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡである小型干渉性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（以下、ｓｉＲＮＡと略称する））に切断されて標的遺伝子抑制活性を有する分子として機能することが明らかにされ、ツッシュルら（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．）らは標的遺伝子と相同性を有するｓｉＲＮＡを哺乳類細胞に導入することにより、インターフェロン系の活性化を引き起こさずに、ＲＮＡインターフェアランス効果を生み出せることを証明した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８（２００１））。これらｓｉＲＮＡは長鎖２重鎖ＲＮＡと異なりインターフェロン系を活性化しないことに加えて、約２０ヌクレオチド長の部分で相補的なある特定の遺伝子のみをより特異的に抑制できる点で優れている。この従来技術は、哺乳類における効率的な遺伝子機能抑制系の発見であり、医薬品開発および遺伝子医薬の可能性を広げた。
本発明者らは、上記ｓｉＲＮＡによる標的ＲＮＡ分解を介したＲＮＡ遺伝子機能抑制の医薬品標的遺伝子スクリーニング、ノックダウンマウス作製による医薬品標的遺伝子のインビボ評価、遺伝子疾患に対する医薬組成物（遺伝子治療剤）へのより効率のよい適用を考え鋭意研究を行った。
上記目的を達成するには、合成ＲＮＡだけではなく、ＤＮＡプラスミドベクターからｓｉＲＮＡを転写する構造を有することが重要であるが、２つの異なる短鎖ＲＮＡを発現させること、そしてそれらを細胞内でアニールさせ標的とする細胞内においてＲＮＡインターフェアランス効果を発揮させること、は難しいと考えられた。
本発明者らは、鋭意研究の結果、はたして小型２本鎖ＲＮＡに代えて、標的遺伝子に相補する短鎖ポリヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドに相補的な短鎖ポリヌクレオチドとの間に任意のコンポーネントを有するポリヌクレオチド配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドを用いて、該一本鎖ポリヌクレオチドを細胞に導入し、標的遺伝子の活性を検討したところ該活性を抑制することが判明しここに発明を完成した。
本発明の目的は、標的遺伝子から転写されるＲＮＡを特異的に分解する、またはその翻訳を選択的に抑制することによって、目的とするＲＮＡまたはタンパク質の機能発現を抑制制御することが可能な一本鎖ポリヌクレオチドならびに該一本鎖ポリヌクレオチドによってその標的遺伝子の機能を抑制制御する方法を提供することにある。本発明によれば、簡便な遺伝子の機能解析方法、医薬品標的遺伝子を含む機能的遺伝子のスクリーニング方法、ノックダウンマウス作製等の遺伝子組換え動物、または遺伝子組換えウイルスを用いた医薬品標的遺伝子のインビボ評価方法、遺伝子疾患、感染症を含む疾患に対する医薬組成物（遺伝子治療剤）、ノックダウンブタ等を用いた移植用臓器産生動物を提供することが可能となる。
発明の開示
即ち、本発明によれば、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列であって、（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのいずれかに相補するＲＮＡに対してＲＮＡ機能抑制活性を有する標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０または１８〜２５のポリヌクレオチド配列、コンポーネント（ＩＩ）は、０塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列（但し、０塩基は結合を表す）、または非ヌクレオチド配列、コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的な配列を含むポリヌクレオチド配列、または前記の連続する１５〜３０、または１８〜２５のポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものである標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を提供することができる。
また、本発明によれば、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列及び／または相補的ポリヌクレオチドが１から数塩基のＵ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＡからなる配列を少なくとも何れかの末端にさらに有するか、相補的配列の内部において欠失、置換又は付加している標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を提供することができる。標的遺伝子は、ｍＲＮＡを含むタンパク質をコードするＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡを含むタンパク質をコードしない機能的ＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡであってもよい。
さらに、本発明によれば、上記ポリヌクレオチド配列が化学的合成法または遺伝子組換え技術によって得られる一本鎖ポリヌクレオチド配列であって、配列番号１または２の一本鎖ＲＮＡからなる標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列が提供できる。
また、本発明によれば、前記一本鎖ＲＮＡからなる標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（ＩＩ）がヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの組み合わせによってなる標的遺伝子用配列、前記コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基以上１０キロ塩基未満、１塩基長から数百塩基長（例えば、７００塩基、５００塩基または３００塩基）のヌクレオチド配列、１塩基長から数十塩基長（例えば７０塩基、５０塩基、３０塩基）のヌクレオチド配列からなる標的遺伝子用配列、１塩基長から２０塩基長のヌクレオチド配列、または配列番号３または４に示されるコンポーネント（ＩＩ）からなる標的遺伝子用配列が提供される。また、本発明によれば、前記のコンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列が、ＰＮＡ、細胞質移行性配列、デコイ活性を有する配列、インターフェロン誘導抑制配列、ＲＮａｓｅ抑制活性、アンチセンス活性、リボザイム活性およびトランスファーＲＮＡのいずれかを有する配列、またはそれらの組み合わせからなる前記標的遺伝子用配列が提供される。
本発明によれば、上記標的遺伝子用配列または該標的遺伝子用配列が組換えベクターに挿入された組換えベクター、該組換えベクターの製造方法が提供される。
また、本発明によれば前記の標的遺伝子用配列を用いて、医薬品標的遺伝子または有用な機能を有する遺伝子をスクリーニングする方法が提供される。
さらに本発明によれば前記の標的遺伝子用配列、または組換えベクターを有効成分とする医薬組成物または医薬組成物からなる遺伝子治療剤を提供することができる。
また、本発明によれば、以下の工程を含む標的遺伝子用ヌクレオチドの合成方法：
（ｉ）  コンポーネント（ＩＩ）の３‘末端の数ヌクレオチドがコンポーネント（Ｉ）または（ＩＩ）の数ヌクレオチドに相補的になるようにコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる一本鎖ヌクレオチドを作製する工程、
（ｉｉ）  このコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる一本鎖ヌクレオチドを用いてヌクレオチド合成酵素活性によりコンポーネント（ＩＩＩ）を合成させる工程、またはこのコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる一本鎖ヌクレオチドを用いて細胞内に導入し細胞内に存在する上記ヌクレオチド合成酵素活性によりコンポーネント（ＩＩＩ）を合成させる工程
が提供される。
また、本発明によれば、コンポーネント（Ｉ）および（ＩＩＩ）がランダムなオリゴヌクレオチドである前記方法により得られたランダム化標的遺伝子用ヌクレオチドが提供される。
本発明によれば、細胞または組織において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのいずれかに相補的な配列を有するＲＮＡに対してＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能を抑制する方法、
但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０または１８〜２５のポリヌクレオチド配列、コンポーネント（ＩＩ）は、１塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列、コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的配列を含むポリヌクレオチド配列、または前記の連続する１５〜３０、または１８〜２５のポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものである
が提供される。
また、本発明によれば、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのいずれかの配列が１から数塩基のＵ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＡが少なくとも何れかの末端に有するか、内部において欠失、置換又は付加している標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列である標的遺伝子の機能を抑制する方法を提供することができる。
さらに、本発明によれば、上記ポリヌクレオチド配列が化学的合成法または遺伝子組換え技術によって得られる一本鎖ポリヌクレオチド配列であって、配列番号１または２の一本鎖ＲＮＡからなる標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列である標的遺伝子の機能を抑制する方法が提供できる。
また、本発明によれば、前記標的遺伝子の機能を抑制する方法に用いられる一本鎖ＲＮＡからなる標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（ＩＩ）がヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの組み合わせによってなる標的遺伝子用配列、前記コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基以上１０キロ未満、１塩基長から数百塩基長（例えば、７００塩基、５００塩基または３００塩基）のヌクレオチド配列、１塩基長から数十塩基長（例えば７０塩基、５０塩基、３０塩基）のヌクレオチド配列からなる標的遺伝子用配列、１塩基長から２０塩基長のヌクレオチド配列、または配列番号３または４に示されるコンポーネント（ＩＩ）からなる標的遺伝子用配列を用いる方法が提供される。
また、本発明によれば、前記のコンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列が、ＰＮＡ、細胞質移行性配列、デコイ活性を有する配列、インターフェロン誘導抑制配列、ＲＮａｓｅ抑制活性、アンチセンス活性、リボザイム活性、トランスファーＲＮＡを有する配列、のいずれか、またはそれらの組み合わせからなる前記標的遺伝子用配列を用いる標的遺伝子の機能を抑制する方法が提供される。標的遺伝子は、ｍＲＮＡを含むタンパク質をコードするＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡを含むタンパク質をコードしない機能的ＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡであってもよい。
さらに本発明によれば、前記コンポーネント（ＩＩＩ）の連続する１５〜３０、または１８〜２５のポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものである標的遺伝子の機能を抑制する方法、または前記コンポーネント（Ｉ）または（ＩＩＩ）の配列が１から数塩基のＵ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＡが少なくとも何れかの末端に有するか、内部において欠失、置換又は付加している標的遺伝子の機能を抑制する方法、前記ポリヌクレオチド配列が化学的合成法または遺伝子組換え技術によって得られる標的遺伝子の機能を抑制する方法が提供される。
また、本発明によれば、配列番号１または２の一本鎖ＲＮＡを用いる標的遺伝子の機能を抑制する方法が提供される。
さらに本発明によれば、前記標的遺伝子の機能を抑制する方法において、標的遺伝子用配列のコンポーネント（ＩＩ）がヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの組み合わせによってなり、該コンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列が１塩基以上１０キロ未満、１塩基長から数百塩基長のヌクレオチド配列、１塩基長から数十塩基長のヌクレオチド配列からなる標的遺伝子用配列、１塩基長から２０塩基長のヌクレオチド配列、または配列番号３または４に示されるコンポーネント（ＩＩ）からなる標的遺伝子用配列である方法が提供される。
また、本発明によれば、前記のコンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列が、ＰＮＡ、細胞質移行性配列、デコイ活性を有する配列、インターフェロン誘導抑制配列、ＲＮａｓｅ抑制活性を有する配列、アンチセンス活性を有する配列、リボザイム活性を有する配列およびトランスファーＲＮＡ活性のいずれかを有する配列、またはそれらの組み合わせからなる前記標的遺伝子用配列を用いる標的遺伝子の機能を抑制する方法が提供される。
さらに本発明によれば、標的遺伝子から転写されるＲＮＡまたは標的遺伝子であるＲＮＡを特異的に分解する、またはその翻訳を選択的に抑制することによって、目的とするＲＮＡまたはタンパク質の機能発現を抑制する方法、または標的遺伝子を特異的に分解する方法によって、標的遺伝子の発現を抑制する方法、前記いずれかの方法によって、産生した培養されたノックダウン細胞または組織または非ヒト動物または植物を提供することができる。また本発明によれば、細胞または組織または非ヒト動物または植物において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織または該非ヒト動物または該植物に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのいずれかに相補する配列を有するＲＮＡに対してＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能を試験する方法や、被検化合物を細胞または組織と共に培養した後、該細胞または組織に対して、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのいずれかに相補するＲＮＡに対してＲＮＡ機能抑制活性を、コントロールと比較して標的遺伝子の機能阻害を促進する候補化合物を検出する方法を提供することができる（但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０または１８〜２５のポリヌクレオチド配列、コンポーネント（ＩＩ）は、１塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列、コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的配列を含むポリヌクレオチド配列、または前記の連続する１５〜３０、または１８〜２５のポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものである標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列である）。
また、本発明によれば、細胞または組織または非ヒト動物または植物において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織または該非ヒト動物または該植物に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのいずれかに相補するＲＮＡに対してＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能相互作用物のスクリーニング方法が提供できる（但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０または１８〜２５のポリヌクレオチド配列、コンポーネント（ＩＩ）は、１塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列、コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的配列を含むポリヌクレオチド配列、または前記の連続する１５〜３０、または１８〜２５のポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものである標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列である）。
本発明によれば、細胞または組織または非ヒト動物または植物において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織または該非ヒト動物または該植物に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのいずれかに相補するＲＮＡに対してＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の関連する機能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法であって；
（ａ）候補化合物と、該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物（または該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接または間接的に結合させた標識により測定する方法、
（ｂ）候補化合物と、該一本鎖ポリヌクレオチド配列が導入された細胞（または該一本鎖ポリヌクレオチド配列を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合物との結合を、標識競合物質の存在下で測定する方法、
（ｃ）候補化合物が該一本鎖ポリヌクレオチド配列により、標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは該標的遺伝子発現産物の活性化または抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、前記ポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用いて調べる方法、
（ｄ）候補化合物と、標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を含有する溶液とを同時に混合して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドまたは該標的遺伝子発現産物の活性を測定し、該混合物の活性をスタンダードと比較する方法、および
（ｅ）候補化合物が細胞における該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドの産生に及ぼす効果を検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法（但し、コンポーネント（ＩＩＩ）は標的遺伝子に相補的配列を有する連続する１５〜３０または１８〜２５のポリヌクレオチド配列、コンポーネント（ＩＩ）は、１塩基から１０キロ塩基長のヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列、コンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）に相補的配列を含むポリヌクレオチド配列、または前記の連続する１５〜３０、または１８〜２５のポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡを含むものである標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列である）を提供することができる
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。また、ＤＮＡの合成、外因性遺伝子を含有するベクター（発現ベクター）の製造、該ベクターによって形質転換された宿主細胞及び宿主細胞が分泌する発現蛋白の製造方法などは、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。
本発明遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「ｕＧＬ３．１２ＲＮＡ」および「ｕＧＬ３．７ＲＮＡ」と名付けられた標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列から演繹されるものを挙げることができる。その塩基配列は、配列番号：１および２に示されるとおりである。
該ポリヌクレオチド配列は、配列番号：１に示される５２のポリヌクレオチド配列の新規な標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列であり、コンポーネント（Ｉ）が１９オリゴヌクレオチド、コンポーネント（ＩＩ）が１２のオリゴヌクレオチド、そしてコンポーネント（ＩＩＩ）が２１のオリゴヌクレオチド配列からなっている。また、配列番号：２に示される４５のポリヌクレオチド配列の新規な標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列であり、コンポーネント（Ｉ）が１９オリゴヌクレオチド、コンポーネント（ＩＩ）が７のオリゴヌクレオチド、そしてコンポーネント（ＩＩＩ）が２１のオリゴヌクレオチド配列からなっている。
尚、本発明において遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡ、または２本鎖ならびに１本鎖のＲＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびウイルスゲノムを含むＲＮＡおよびそれらの断片のいずれもが含まれる。
本発明において遺伝子とは、リーダ配列、コード領域、エキソン、イントロンを含む。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等を例示できる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含み、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＵｓｎＲＮＡ（ｕｒｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）、ウイルスゲノム、ウイルスｍＲＮＡ、５ｓＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボザイムおよび上記ＰＮＡ、または天然型ヌクレオチドと相補的結合が可能なポリアミン等も含み、特定アミノ酸配列を有するポリペプチドは、その断片、同族体、誘導体、変異体を含む。
変異体は、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加、および挿入された変異体；コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味する。
尚、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行なうこともできる。
上記ポリペプチドは、アレル体、ホモログ、天然の変異体で少なくとも９０％、好ましくは、９５％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％相同なものを含む。
本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列とは、３つのコンポーネントから構成されるヌクレオチドまたは非ヌクレオチド配列を有する一本鎖からなる配列として、該コンポーネントは連続してコンポーネント（Ｉ）＋コンポーネント（ＩＩ）＋コンポーネント（ＩＩＩ）の順序で連なる一本鎖からなるポリヌクレオチド配列として定義される。
上記３つのコンポーネントからなる一本鎖からなるポリヌクレオチド配列は、各コンポーネントが独立して作られた後、接合されるか、あるいは一つの構成要件として作られてもよい。上記標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列は、化学的合成されるか、または遺伝子組換え技術を用いて作られてもよい。これら技術は当業界において一般に用いられる方法で当業者であれば、十分に目的とする標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を得て、単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を得ることができる。上記においてＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。また、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を増幅させるか、発現ベクターに入れるために必要な二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
合成されたＲＮＡまたはＤＮＡは、ＰＡＧＥまたは陰イオン交換ＨＰＬＣなどで精製することができる。
また、ＲＮＡの合成は２’に水酸基を有するためＤＮＡ合成に比べて合成が難しく、その合成には２’に保護基を必要とし、生成後の脱塩・脱保護で収量が大幅に減ったり、鎖の安定性を失ったりすることも考えられるが、２’の保護にｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ（２’−ＡＣＥ）を用いる事により、安定したＲＮＡ合成を行なうことも可能で、該方法はＤｈａｒｍａｃｏｎ社の２’−ＡＣＥ合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドとして、２’を保護した後、使用時に揮発性バッファーを使用することにより、容易に脱塩・脱保護を行なうことができる（ｈｔｔｐ：／／ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ）。また、ＲＮＡの合成は市販のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３９００ハイスループットＤＮＡ合成器等とともにＲＮＡ合成用試薬を用いてホスホロアミダイド法により合成することもできる。
さらに、目的とするポリヌクレオチドの合成は、例えば被保護リボヌクレオチド・ホスホラミダイト法、前記２’−ＡＣＥ法および好適なデオキシリボ核酸／ＲＮＡ合成機を用いて、好ましくは、化学合成される。前記ポリヌクレオチドの合成は、市販のデオキシリボ核酸／ＲＮＡ合成機と該機器に付属の使用説明書に順じ、自身で合成してもよく、或いは、この種のポリヌクレオチドの合成を受託している会社、または部門に合成を委託することも当業界では容易である。前記委託先は、例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、ジェンセット・オリゴス（Ｇｅｎｓｅｔ  Ｏｌｉｇｏｓ社：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｅｔｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ／）、Ａｍｂｉｏｎ社、Ｘｅｒａｇｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｘｅｒａｇｏｎ．ｃｏｍ）、Ｐｅｒｉｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｒｂｉｏ．ｃｏｍ／）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ．ｃｏｍ）等により、デオキシリボ核酸／ＲＮＡ合成を行なうことができる。
上記本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列の取得方法は、〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。
また、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（Ｉ）または（ＩＩＩ）は、標的とする遺伝子のＲＮＡに一部または全部が相補するものであればよく、標的とするＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスゲノム、ウイルスｍＲＮＡ、ＸｉｓｔＲＮＡなど哺乳動物を含む細胞に存在しているＲＮＡ全てを対象にすることができる。かくして、標的遺伝子のＲＮＡと相補する部分を含むコンポーネント（ＩＩＩ）は、連続する１５から３０のポリヌクレオチド配列、好ましくは１８から２５のポリヌクレオチド配列、より好ましくは、１９から２１の長さからなるポリヌクレオチド配列がよい。また、コンポーネント（ＩＩＩ）の一部または全部が相補する標的として選択される遺伝子領域は、該遺伝子をコードする開始コドンから５０から１００塩基下流となるエキソン部位が好ましく選択され、５’および３’ＵＴＲｓを避けるのがよい。また標的遺伝子の相補部位の配列の特異性が高いことがより好ましい。また、選択される領域としては該領域中において、５０％程度のＧまたはＣを含んでいるＡＡ（Ｎ１９）ＴＴという配列領域が選択されるコンポーネント（ＩＩＩ）の一部または全部が相補する領域として例示できる。前記のような配列が見つからないケースにおいては、末端部位をＡＡ（Ｎ２１）もしくはＣＡ（Ｎ２１）として代用することもできる。
また、上記コンポーネント（ＩＩＩ）はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。
上記本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（ＩＩＩ）の標的遺伝子の相補する領域の決定は、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔサーチによって実施、決定することができる。または任意の配列になるように合成されたコンポーネント（ＩＩＩ）を用いて、標的遺伝子の機能を抑制するポリヌクレオチド配列を選択し、本発明の用途に使用することもできる。
また、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（Ｉ）は、コンポーネント（ＩＩＩ）の配列に相補する配列であるか、コンポーネント（ＩＩＩ）の配列に５０％超相補的であり、標的として選択される遺伝子領域にコンポーネントの（ＩＩＩ）の配列と同じく相補的であってもよい。さらに本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（ＩＩＩ）は、コンポーネントの（Ｉ）の配列長より、１若しくは数塩基長程長くなっていてもよく、例えば、２塩基のウラシル（Ｕ）が付加されていてもよい。また、前記標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（Ｉ）またはコンポーネント（ＩＩＩ）は、その配列において、いずれかが１から数塩基のＵ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＡが少なくとも何れかの末端に有するか、内部において欠失、置換又は付加していてもよい。
次いで、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（ＩＩ）は、ヌクレオチド配列、または非ヌクレオチド配列のいずれかであってもよく、またはそれらの組み合わせであってもよい。該ヌクレオチド配列は、例えば、ヌクレオチド配列が１塩基以上１０キロ塩基未満のヌクレオチド配列からなる、好ましくは、１塩基長から数百塩基長のヌクレオチド配列、１塩基長から数十塩基長のヌクレオチド配列、１塩基長から２０塩基長のヌクレオチド配列、スプライシングなどの細胞に備わる機構により細胞質において上記の長さのヌクレオチドを生じるコンポーネント（ＩＩ）或いは本発明の後記実施例に示される配列番号３または４に示される配列からなるヌクレオチド配列が例示できる。また該ヌクレオチド配列はコンポーネント（Ｉ）または（ＩＩＩ）の相補的な配列を含んでもよい。また本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列のコンポーネント（ＩＩ）の非ヌクレオチド配列としては、ポリアミド骨格を有する核酸類似の化学合成アナログのＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を例示できる。さらにコンポーネント（ＩＩ）を構成するヌクレオチド配列としては、ポリＡ、ｔＲＮＡ、ＵｓｎＲＮＡ、レトロウイルス由来のＣＴＥ配列などの細胞質移行性配列、ＮＦカッパβ結合配列、Ｅ２Ｆ結合配列、ＳＳＲＥ，ＮＦ−ＡＴなどのデコイ活性を有する配列、アデノウイルスのＶＡ１、またはＶＡ２  ＲＮＡなどのインターフェロン誘導抑制配列、ＲＮａｓｅ抑制活性、アンチセンス活性、リボザイム活性を有する配列、トランスファーＲＮＡ或いは発現部位を特定するためのマーカー配列、検出のための大腸菌での選択マーカー配列などのいずれか、またはそれらの組み合わせ配列であってもよい。デコイ活性等の部分的２重鎖を必要とする機能配列は相補的なヌクレオチドを含むことにより作製されてもよい。さらにコンポーネント（ＩＩ）の内部にイントロンのドナー配列、アクセプター配列を含むスプライシングに必要な配列を有し、これによりスプライシング機構を有する細胞内において、コンポーネント（ＩＩ）の一部が切り出されて再度連結されてもよい。これらコンポーネント（ＩＩ）の構成により、より所望のＲＮＡ機能抑制効果を増す効果や標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列の物としての安定性が得られる。
また、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列は、遺伝子組換え技術を用いても製造することもできる。例えば一旦、上記した連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる一本鎖ポリヌクレオチド配列を化学合成した後、該配列の両末端またはその外側に付加可能な任意配列（プロモータ配列、ターミネーター配列を含む）を基に、ＰＣＲ用プライマーを作製し、ＰＣＲにより、該配列を２本鎖ＤＮＡとした後、増幅することができる。前記において、各コンポーネントを全て化学合成してもよく、あるいは各コンポーネントを化学合成後連結させてもよい。また前記プロモーターは、インビトロ転写や大腸菌においてはＴ７プロモーター、真核細胞においてはＣＭＶプロモーター、真核細胞ＰｏｌＩＩＩ系においてはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなどを転写開始点に対して適切に配置でき、ターミネーターは、転写終結配列の他、自己切断型リボザイム等により、転写後産物を同部位にて切断することができる。あるいは増幅された２本鎖ＤＮＡをその末端に付加可能な制限酵素認識サイトを利用し制限酵素的にベクターに連結し、増幅し、目的とする標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を製造し、取得することができる。当該分野において各種プラスミドベクターへの組み込みは、技術的に今日何ら困難性はない。
さらにまた、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列は、遺伝子組換え技術を用いて、コンポーネント（Ｉ）および（ＩＩＩ）が相補性を有することを利用し、作製されてもよい。例えば、コンポーネント（ＩＩ）の３‘末端の数ヌクレオチド（コンポーネント（Ｉ）の部分配列）がコンポーネント（ＩＩＩ）の数ヌクレオチドに相補的になるように、化学的合成法または遺伝子組換え技術を用いてコンポーネント（Ｉ）およびコンポーネント（ＩＩＩ）の相補配列を作製する。数塩基対からなる相補的な２重鎖を形成したコンポーネント（Ｉ）のヌクレオチド３’末端およびコンポーネント（ＩＩＩ）のヌクレオチド３’末端より、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ等を含むヌクレオチド合成酵素を含む酵素を用いて、コンポーネント（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）からなる２本鎖ポリヌクレオチドを合成することができ、これにより本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を合成することができる。
コンポーネント（ＩＩＩ）はまた、化学的合成法または遺伝子組換え技術を用いて単独に合成され、コンポーネント（Ｉ）との相補性を利用してアニーリングさせ、コンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる分子の３’末端とコンポーネント（ＩＩＩ）の５’末端が化学的に連結またはリガーゼなどの酵素を用いて連結されてもよい。
さらに、例えば、コンポーネント（ＩＩ）の３‘末端の数ヌクレオチドがコンポーネント（Ｉ）または（ＩＩ）の数ヌクレオチドに相補的になるように、化学的合成法または遺伝子組換え技術を用いてコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）を作製する。このコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる分子を細胞内に導入し、細胞内に存在する上記ヌクレオチド合成酵素活性によりコンポーネント（ＩＩＩ）を合成させることができる。ヌクレオチド合成酵素は細胞に遺伝子組換え的にまたはウイルス感染等により導入されたものであってもよい。すなわちコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）のみからなる分子も本標的遺伝子用ポリヌクレオチドに含むことができる。
これらのコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）からなる標的遺伝子用ポリヌクレオチド、またはコンポーネント（Ｉ）および（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる標的遺伝子用ポリヌクレオチドを発現するベクターは、上記ベクター化の記載に基づき合成することができる。
さらに、培養細胞等に対して、各分子が異なる標的遺伝子の機能を抑制することができる標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列発現ベクターを導入することができ、これにより所望の表現型変化を引き起こした細胞等を選択することができ、該細胞内に導入されていた標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列発現ベクターを単離することができ、標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列発現ベクターのコンポーネント（Ｉ）または（ＩＩＩ）に相補性を有する遺伝子配列をＮＣＢＩのｂｌａｓｔサーチ等により検索することで、所望の表現型変化を引き起こした標的遺伝子を同定することが可能である。この目的を達成するために、上記の相補的合成法、相補的ライゲーション合成法、または細胞内相補鎖合成法を用いることにより、いわゆるランダム化標的遺伝子用ポリヌクレオチドを作製することができる。すなわちコンポーネント（Ｉ）に相当する各ヌクレオチド部位においてＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかのヌクレオチドがランダムに導入される合成様式を用いてコンポーネント（Ｉ）を合成し、上記方法により相補的なコンポーネント（ＩＩＩ）が作製される。このことによりランダム化遺伝子標的ベクターを作製することができ、これにより所望の表現型変化を引き起こす標的遺伝子を同定することができる。
かくして、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列がベクターならびに該組換えベクターが挿入された組換えベクターを容易に製造することが可能である。
上記組換えベクターならびに標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターの製造は、本発明により提供される標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列の配列情報に基づいて、上記したように常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，５９９０（１９８３）など参照〕に従って調製することができる。また、上記で製造された組換え体発現ベクターからの標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列の取得・精製は当業者であれば容易にできる。
また、標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列を導入したベクターは、２つに分かれたものの場合には、別々のプロモーターから転写させたオリゴＲＮＡが、非常に広い空間である細胞内（オリゴＲＮＡの１０の１３乗倍の空間）で偶然に出会い、会合し、二重鎖を形成する過程を経る必要があり、この効率が非常に低いため、２つに分かれたタイプは機能が弱いことも推定されるが、本発明標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列のような標的遺伝子配列に相補的配列を含むコンポーネント（ＩＩＩ）と、コンポーネント（ＩＩＩ）の配列に相補的な配列となるコンポーネント（Ｉ）の配列が一本鎖となっているために、細胞に導入された配列は相補性を有する分子として、必ずそばにいることとなり、非常に効率的にＲＮＡを破壊する二重鎖が形成されると考えられ、この点において本発明のベクターの作製の意味は大きい。
更に一本鎖となることにより、二本鎖に比較し、露出末端の片側を結果として保護することになる（本発明の場合は、コンポーネント（Ｉ）の３’末端側）、通常露出末端はヌクレアーゼの攻撃を受けやすいため、この点からも、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列を導入したベクターは、安定性が上昇することとなる。しかしながら２重鎖部分が３０塩基対を超える一本鎖は脊椎動物では特異的な遺伝子機能抑制を誘導できず、上記の利点以前に有用性が低い。
次いで、本発明によれば、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列を用いて、細胞または組織または非ヒト動物または植物における標的遺伝子の機能を抑制する方法を提供することができる。該方法の一具体例として、後記実施例で示される通り本発明の配列番号１および２で示される標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を用い、ＨｅＬａ細胞に対して標的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子に対して、標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列の投与の結果、該遺伝子ＲＮＡのＲＮＡ機能抑制効果によって標的遺伝子としたルシフェラーゼ遺伝子のルシフェラーゼ活性抑制効果を示すことができた。
より具体的には、標的とする遺伝子の遺伝子配列情報を基にＮＣＢＩのｂｌａｓｔサーチ等によって、標的遺伝子のコード領域の開示コドンから５０〜１００塩基下流にあり、５０％程度のＧまたはＣを含んでいるＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ配列領域をコンポーネント（Ｉ）の一部または全部が相補する領域として選択する。より好ましくは、該領域が標的とする遺伝子特異的配列を有する領域であることがよい。前記のような配列が見つからないケースにおいては、末端部位をＡＡ（Ｎ２１）もしくはＣＡとしてコンポーネント（ＩＩＩ）領域を相補的となるように設定し、例えば１９のオリゴヌクレオチド配列の３‘末端に２塩基のウラシルを付加する２１のオリゴヌクレオチド配列として塩基決定する、ついでコンポーネント（ＩＩＩ）の１９のオリゴヌクレオチド配列領域に相補的配列をコンポーネント（Ｉ）の構成配列として塩基決定する。ついでコンポーネント（ＩＩ）として、任意の７または１２塩基のＲＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド配列を決定し、これらを合わせて、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる一本鎖ポリヌクレオチド配列を市販の自動合成機にて化学合成し脱塩・精製した後、ＲＮＡトランスフェクション用にＲＮＡを蒸留水に溶解し、緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム，ｐＨ７．４に調製された３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，２ｍＭ酢酸マグネシウム）の混合液を調製し、各希釈倍率の溶液をＰＢＳや該緩衝液で希釈する。
次いで、標的遺伝子を有する調製された遺伝子発現ベクターを作製し上記で調製された各ＲＮＡを加えて、例えば５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地上に標的遺伝子発現ベクターと合成された本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチドを加えた反応溶液を作製し、ここにおいて前記培地に例えばリポフェクタミン２０００などのポリカチオン脂質リポソーム系のトランスフェクション試薬を用いると導入効率が上がる。前記試薬を添加した後、例えば株化された動物細胞のＨｅＬａ３細胞をコンフルーエント状態にした後、ＤＭＥＭ／１０培地（ＤＭＥＭ／１０：１０％牛胎児血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いて、５％ＣＯ２下、３７℃で前培養後、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＨｅＬａ３細胞を２４穴プレートの各ウェルに０．５ｍｌずつ添加し、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養し、前記で作製したトランスフェクション用複合体を各ウェルに添加後、さらに５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養した後、例えば標的とする遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子とする場合は、デュアル−ルシフェラーゼ・リポター・アッセイ・システム（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：＃Ｅ１９１０プロメガ社製）を用い、ルシフェラーゼの活性測定の化学発光をルミノメーターなどで測定する。その発光測定値の変化を本発明の標的明遺伝子用オリゴヌクレオチド配列を添加したものと添加しなかったもの、或いは非特異的オリゴヌクレオチド配列を添加したものをコントロールとして比較した結果から、例えば、コントロールと比較して、その抑制程度が５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％などの値を基準として、標的遺伝子のＲＮＡに対する本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列の標的遺伝子に対する特異的なＲＮＡ機能抑制ならびに遺伝子機能抑制効果を検討することができる。かくして、前記したような方法によって、本発明の細胞または組織において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントを有する単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列と相補する遺伝子のＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能を抑制する方法を提供することができる。また、本方法の実施において、標的とする遺伝子のＲＮＡを機能抑制する結果、遺伝子の発現が抑制されるか、または該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質の発現が抑制されることにより、細胞、組織における該遺伝子の機能に変化が見られることがあり、従って、本発明によれば、細胞または組織において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントを有する単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列と相補する遺伝子のＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能を抑制する方法によって、該標的遺伝子の機能発現を抑制する方法ならびに該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質の発現を抑制する方法が提供される。前記方���において、本発明の標的明遺伝子用オリゴヌクレオチド配列は上記したように様々なコンポーネント（ＩＩ）のヌクレオチド配列の改変・修飾或いは非ヌクレオチドの付加によりＲＮＡ機能抑制活性や細胞質移行活性を含めた機能をさらに高めることもできる。
また、上記各試験において使用される細胞、組織、細胞溶解液、臓器などの材料は、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を用いて、標的とする遺伝子ＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性によって該遺伝子に対するＲＮＡ機能抑制効果や遺伝子の機能変化を見るために使用される標的遺伝子の取得は、例えば開示された遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。具体的には、標的遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７８，６６１３（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）など〕。
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、標的遺伝子を発現する各種の細胞、組織、細胞溶解液やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、ヒト体液、血液または組織からのこれらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。或いは寄託または市販されているマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、サルのＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトの胚性腎細胞の２９３細胞の樹立細胞株を用いてもよい。
上記したように本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターは、その標的とする遺伝子のＲＮＡを機能抑制する活性を有し、該活性により、遺伝子の機能を抑制する遺伝子機能抑制方法を提供することができるため、例えば、遺伝子のＲＮＡの発現を抑制するか、遺伝子によってコードされるアミノ酸のタンパク質の発現を抑制することによって該遺伝子またはタンパク質の機能を抑制することができるので、各種疾患に関連して高発現する遺伝子または遺伝子変異により有害な機能を有するようになった遺伝子またはウイルス由来遺伝子の発現を抑制することによって、これら遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターは、標的遺伝子用配列または遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、あるいはこれら配列が組み込まれたの組換えベクターを有効成分とする医薬組成物および該医薬組成物からなる遺伝子治療剤を提供することができる。
このように本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターによれば、標的遺伝子の機能を抑制することとなるので、対象とされる各種疾患は、遺伝子の高発現または遺伝子変異により有害な機能を有するようになった遺伝子またはウイルス由来遺伝子との関連が判明している遺伝子関連疾患、例えば、ｃ−ｅｒｂＢ，ｅｒｂ遺伝子などと関連している乳がん、ｈｓｔ−１、ｓｒｃ，ｆｐｓ，ａｂｌ，ｍｙｃ，ｊｕｎ，ｍｙｂなどの癌関連遺伝子、白血病ウイルス、乳がんウイルス、肉腫ウイルスなどのＲＮＡ腫瘍ウイルス、ＨＢＶ、ＨＣＶなどの肝炎ウイルス、ＮＰＹ遺伝子、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子が関連した肥満など、遺伝子との関連の有無が判明しているような疾患に対して本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを有効成分とする医薬組成物は、これら疾患の治療に有効である。
さらに異種間または同種間で行われる臓器または細胞移植において、本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを用いることにより、拒絶反応を引き起こす遺伝子の機能を抑制することが可能となり、幹細胞移植を含めた各種臓器疾患、神経疾患の治療に用いることができる。
従って、本発明は、本発明の医薬組成物または医薬組成物を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターにより本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを導入した細胞を有効成分とする医薬を提供しようとするものである。
即ち、本発明によれば、本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを含有する医薬組成物または遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターにより本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを導入した細胞、並びに該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターにより本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤が提供される。
更にまた、本発明によれば、上記本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを含有する遺伝子治療用導入用のウイルスベクターを有効成分として含有する医薬、特に、ｃ−ｅｒｂＢ，ｅｒｂ遺伝子などと関連している乳がん、ｈｓｔ−１、ｓｒｃ，ｆｐｓ，ａｂｌ，ｍｙｃ，ｊｕｎ，ｍｙｂなどの癌関連遺伝子、白血病ウイルス、乳がんウイルス、肉腫ウイルスなどのＲＮＡ腫瘍ウイルス、これらに対しては抗癌剤として、ＨＢＶ、ＨＣＶなどの肝炎ウイルス、これらに対しては抗肝炎治療剤として、ＮＰＹ遺伝子、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、ＭＧＡＴ遺伝子、ＤＧＡＴ遺伝子が関連した肥満など、これに対しては抗肥満剤として、疾患関連遺伝子の高発現による活性を抑制するための処置等に使用される当該医薬が提供される。
以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１））、アウスベル（Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２））、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８５））、アナンド（Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２））、グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９１））及びフィンク（Ｆｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１１−１９（１９９２）に記載されている。
遺伝子治療または遺伝子機能抑制を介する移植治療においては、本発明は、上記したような疾患関連遺伝子の発現する細胞において、細胞内のＲＮＡに対して相補的配列を持つヌクレオチド提供し、該ＲＮＡを機能抑制することにより、翻訳またはＲＮＡの機能を阻害し、上記疾患関連遺伝子の発現を抑制するための遺伝子機能抑制医薬の提供による上記のような疾患の病態を惹起するか進行させる活性を抑制または不活性化させる遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えば本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを上記疾患関連遺伝子を有する細胞本来のＲＮＡ機能抑制させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害し、標的とする遺伝子の発現を抑制する方法である。本方法において、ヌクレオチド相補性の特異性を利用し、異常型のＲＮＡのみの機能を抑制し、正常型の機能を抑制しないアレル特異的機能抑制法を提供することもできる。そのためには遺伝子のＲＮＡと相補的な本発明のコンポーネント（ＩＩＩ）を含んだ一本鎖ポリヌクレオチドを製造し、該一本鎖ポリヌクレオチドを標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
かかる疾患関連遺伝子の機能発現を抑制する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞における遺伝子機能の活性を抑制することができる。当該遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、またはレトロウイルスベクターを用いて染色体内に挿入して維持することができ、目的の細胞に導入することができる。
上記遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列、あるいはこれら配列が組み込まれた組換えベクターを用いた癌の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列を組み込み、これを標的遺伝子機能活性発現細胞に感染させて標的とする遺伝子のＲＮＡを機能抑制させることにより、所望の抗癌効果を得ることが出来る。
かかる組換え及び染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結した遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列のコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐｗＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１又は６、ロイクリンなどを例示できる。
脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン、チロシンヒドロキシラーゼ膵臓ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
さらになお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、タンパク質をコードしない短いＲＮＡを発現することが知られているＵ６ｓｎＲＮＡ、７ＳＫ、ｔＲＮＡなどのＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターを使用することができる。またｐｏｌ  ＩＩＩ系の人工的に改変されたプロモーターが使用できる。
なお遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入用ベクターの製造において、導入される遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列は、標的遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
かかる遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入、ＨＶＪエンベロープ法などを始めとする、細胞にＲＮＡまたはＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列で形質転換された細胞は、それ自体単離状態で遺伝子により発現される機能の活性を抑制するのための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
遺伝子治療においては、上記の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の標的細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位に癌遺伝子や腫瘍ウイルスの標的遺伝子ＲＮＡが発現し得るいずれの細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。レトロウイルス等を用いて恒久的に導入することもできる。
本発明の遺伝子治療方法は、前述する遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入用の材料（遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞または組織を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞または組織を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）法の両方の方法を包含する。
また遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列または該配列をＰＣＲ法で増幅した配列を直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断することも可能である。
また、遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列を導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、癌遺伝子の発現が認められる癌細胞、特に乳房、腎臓、精巣、小腸組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、脂肪細胞、如き細胞などを挙げることができる。
上記遺伝子治療における遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入方法には、ウイルス的導入方法及び非ウイルス的導入方法が含まれる。
ウイルス的導入方法としては、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）ベクターなどがあげられる。
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ポリヌクレオチドを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させポリヌクレオチドを細胞内に導入する膜融合リポソーム法；ポリヌクレオチドのプラスミドを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にポリヌクレオチドを導入する方法；オリゴヌクレオチドのプラスミドを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチド法；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドを本発明のポリヌクレオチドと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法などを使用することができる。
一例として、本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ：ＥＢＶ）は、１９６４年にエプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）らによりバーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Ｋｉｅｆｆ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ，Ｄ．：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐｐ．１８８９−１９２０〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子に相補的配列を有するポリヌクレオチド断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
組換えウイルスベクターを用いることなく所望の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列を標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
上記膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１５９，３９９−４９９（１９８５）；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ｅｄ．ｂｙ  Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｇｍｂｈ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９５，ｐｐ．３３７−３４９〕。
また、別のリポソームを用いて遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列を標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・ポリヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Ｙａｇｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，１９６，１０４２−１０４８（１９９３）〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｌａｒｇｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列を導入することも可能である。
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とする遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列を導入した後、得られる細胞を再移植する手法（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や動脈硬化症、癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適である。
第２法は、目的遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）を直接患者の体内や脳、腎臓、精巣、小腸組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法（直接法）である。
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべき遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）を含有するベクターを加える。遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列の導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、２５００回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列の導入効率を前記ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲや、例えば所望の対象が一疾患関連遺伝子の発現する機能活性であればその活性の程度を測定することにより、目的遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）の導入効果を確認する。
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞１×１０８細胞に対して１×１０３ｃｆｕから１×１０８ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
上記第１法の別法として、目的遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へ遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）を導入する方法を採用することもできる。
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）が導入されるか否かを、予め遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列のＰＣＲ法による検索やｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲ法によって確認するか、あるいは目的遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、あるいは膜蛋白（ｅｎｖ）遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際して遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列の導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
本発明はまた、本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列あるいはこれらの配列を組み込んだ導入用ベクターまたは目的遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列（疾患関連遺伝子のＲＮＡに相補的オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
例えば、本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列が包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
一般には、医薬製剤としての所望遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０３ｐｆｕから１×１０１５ｐｆｕ程度とするのがよい。
また所望の導入用遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列が導入された細胞の場合は、１×１０４細胞／ｂｏｄｙから１×１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度の範囲から選ばれるのが適当である。
該製剤は１日に１回または数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
また、本発明の細胞または組織において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントを有する単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列と相補する遺伝子のＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能を抑制する方法ならびに該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質またはＲＮＡの発現を抑制する方法が提供により、また標的遺伝子の機能の変化を容易に試験する方法が提供される。該方法は、例えば後期実施例に示されるように、本発明の標的標的遺伝子のｍＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性を有することによって標的遺伝子の機能を抑制する方法により、対応して現れる遺伝子の機能の変化を合わせて観察することができる。該遺伝子の機能変化は、遺伝子の発現の抑制を判定するノーザンブロット分析、ＤＮＡアレイ分析や遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質の発現の抑制を判定する、タンパク質に対する抗体を用いるイムノブロット分析などとともに、酵素反応、蛍光反応など各種活性機能の変化を同時に検出し、かくし本発明の方法によれば該細胞または組織において検出される全ての遺伝子またはタンパク質の発現量の変動等を含む細胞、組織の有する機能の変化も観察することができる方法を提供することができる。
さらに本発明によれば、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を用いる上記各方法によって産生した培養された細胞または組織の機能が低下したノックダウン細胞または組織または非ヒト動物または植物を提供することができ、本発明は、本発明の遺伝子破壊する方法によって産生した培養された細胞または組織または非ヒト動物または植物の機能が低下したノックダウン細胞、組織、非ヒト動物または植物を提供することができる。非ヒトノックダウン動物の作製においては、本発明の遺伝子標的用ポリヌクレオチド配列、または標的遺伝子用配列あるいはこれらの配列を組み込んだ導入用ベクターを受精卵に導入することなどにより容易に達成され、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、カエル、サカナなどのノックダウン動物を作成すことができる。植物においても同様に、ダイズ、インゲンマメ等の豆科植物、イネ、小麦、とうもろこし、イモ類等の穀物類、キュウリ、トマト、ピーマン、ナス、アスパラガス、タマネギ等の野菜類、リンゴ、ブドウ、イチジク、キウイ、柑橘類（ミカン等）、ストロベリー、アーモンド、モモ、メロン、クルミなどの果物または木の実植物、ヒノキ、ヤシ、スギ、カエデ、シダ類、クチナシ、ニチニチソウ等の装飾作物、バラ、カーネーション、菊、ヒルガオ、ホウセンカ、ベゴニア等の観賞用植物などについて、容易にノックダウン植物を作成することができる
該機能が低下したノックダウン細胞または組織または該非ヒト動物または該植物の提供によれば、該細胞または組織を用いて、該細胞または組織の機能に影響を与えることができるかもしれない候補化合物を検出することができる。前記において、細胞または組織または非ヒト動物または植物の機能の変化に併せて病気の病態や生物の発育、耐性などに変化が観られることがむすびつけられるならば、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列を用いて、前記細胞、組織などへの候補化合物を投与し、遺伝子の機能の変化を観察することにより、細胞、組織などへの影響を観ることができ、候補化合物の医薬、農薬なとの領域への有用性を判定することができる。
上記のように本発明はまた、被検化合物を細胞または組織と共に培養した後、該細胞または組織に対して、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントを有する単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列該細胞または該組織に導入し、前記前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のポリヌクレオチド配列と相補する遺伝子のＲＮＡのＲＮＡ機能抑制する活性を、コントロールと比較して標的遺伝子のＲＮＡの破壊を促進する候補化合物を検出する方法を提供することができる。
また、上記候補化合物を検出する方法としては、例えば本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列を用いて、医薬品標的遺伝子をスクリーニングする方法において、
細胞または組織において、連続する（Ｉ）＋（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）のコンポーネントからなる単離または精製された一本鎖ポリヌクレオチド配列を該細胞または該組織または該非ヒト動物に導入し、前記（Ｉ）または（ＩＩＩ）のコンポーネントのポリヌクレオチド配列と相補する遺伝子のｍＲＮＡのＲＮＡ機能抑制する活性をすることによって標的遺伝子の機能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法として、より詳しくは、以下の方法：
（ａ）候補化合物と、該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物（または該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接または間接的に結合させた標識により測定する方法、
（ｂ）候補化合物と、該一本鎖ポリヌクレオチド配列が導入された細胞（または該一本鎖ポリヌクレオチド配列を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合物との結合を、標識競合物質の存在下で測定する方法、
（ｃ）候補化合物が該一本鎖ポリヌクレオチド配列により、標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは該標的遺伝子発現産物の活性化または抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、前記ポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用いて調べる方法、
（ｄ）候補化合物と、標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドまたは標的遺伝子発現産物を含有する溶液とを同時に混合して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドまたは該標的遺伝子発現産物の活性を測定し、該混合物の活性をスタンダードと比較する方法、および
（ｅ）候補化合物が細胞における該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のポリペプチドの産生に及ぼす効果を検出する方法よりなる群から選択される方法のいずれかを用いることを特徴とする医薬品標的遺伝子をスクリーニングする方法を用いることが可能である。
上記において、候補化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列を用いて、前記細胞、組織または非ヒト動物などへの候補化合物を投与し、遺伝子の機能の変化を観察することにより、コントロールと比較して標的遺伝子のＲＮＡの破壊を促進する候補化合物を検出する方法の具体的方法の一例としては、後記実施例に示された標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列をトランスフェクションする前後において候補化合物を添加した細胞または組織溶解液など共に培養し、前後における本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列による標的遺伝子の破壊を促進または抑制する程度を観察することで、候補化合物の効果（測定活性に与える影響）を判定することができる。
候補化合物の効果は、例えば、上記活性試験の場合において候補化合物の測定活性に与える影響がコントロールまたは候補化合物非添加と比較して、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進している場合、該候補化合物を本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列の作用を促進する化合物として選択することができる。一方、例えば、上記活性試験の場合におけ候補化合物の測定活性に与える影響がコントロールまたは候補化合物非添加と比較して、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害されている場合、該候補化合物を本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列の作用を阻害する化合物として選択することができる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる候補化合物を医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクター等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療の目的で本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターの癌細胞にある標的遺伝子のＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療の目的で本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターの癌細胞にある標的遺伝子のＲＮＡのＲＮＡ機能抑制活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も同様である。
また、本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列、または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターを用いることにより、標的遺伝子破壊動物を提供することができる。すなわち、本発明は、標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列、または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターを有する非ヒト哺乳動物、非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である動物、前記ゲッ歯動物がマウスまたはラットである前記動物を提供するものである。
本発明は、標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列、または標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターを有する非ヒト哺乳動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とする標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列、また標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターを転移することによって作出することができる。また、該標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列、また標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターの転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列、また標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクターを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列、標的遺伝子用配列、また標的遺伝子用ポリヌクレオチド配列または標的遺伝子用配列が挿入された組換えベクター転移動物を作出することもできる。
該非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病態動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。また同様に、ヒトへの臓器移植時に、臓器拒絶反応に関わる遺伝子等を抑制したノックダウンブタなどが好ましい。
本発明によれば標的遺伝子のＲＮＡ機能抑制活性を有する一本鎖ポリヌクレオチド、該一本鎖ポリヌクレオチドによってその標的遺伝子の機能発現を抑制制御する方法を提供することができ、そして該遺伝子機能発現を選択的に抑制することによって、目的とするタンパク質またはＲＮＡの機能発現を抑制制御することが可能な一本鎖ポリヌクレオチドならびにその機能発現を抑制方法を提供することができる。また本発明によれば、簡便な遺伝子の機能解析方法、医薬品標的遺伝子のスクリーニング方法、ノックダウンマウス作製による医薬品標的遺伝子のインビボ評価方法、遺伝子疾患に対する医薬組成物（遺伝子治療剤）を提供することが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
実施例１：本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチドの合成
本実施例においては、標的遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４７２９６）の配列位置４３４−４５２に相当する１９ヌクレオチドの配列をＲＮＡインターフェアランスの標的部位として、２種のコンポーネント配列を有する標的遺伝子用ポリヌクレオチドを合成した。
ＲＮＡ配列の合成は、ホスホロアミダイト法を用いる市販の自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３９００ハイスループットＤＮＡ合成器）とともにＲＮＡ合成用試薬を用いて合成した。尚、非特異的コントロール用として、ＥＧＦＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ５５７６３）の配列位置９３６−９５４に相補する２１ｍｅｒからなるフォワード配列（Ｆ）とリバース配列（Ｒ）のＲＮＡを合成した。
かくして得られた本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチドのうち、コンポーネント（ＩＩ）の配列が１２塩基のものをｕＧＬ３．１２ＲＮＡと命名し、コンポーネント（ＩＩ）の配列が７塩基のものをｕＧＬ３．７ＲＮＡと命名した。合成されたｕＧＬ３．１２ＲＮＡおよびｕＧＬ３．７ＲＮＡの配列はそれぞれ配列番号１および２に示され、ｕＧＬ３．１２ＲＮＡおよびｕＧＬ３．７ＲＮＡのコンポーネント配列は配列番号３および４に示される。
また、非特異的コントロール用として、ＥＧＦＰの配列位置９３６−９５４に相補する２１ｍｅｒからなるフォワード配列（Ｆ）ＲＮＡとリバース配列（Ｒ）ＲＮＡの配列番号５および６に示されるとおりであり、上記配列の末端にそれぞれ２塩基のＵＵ（ウラシル）が付加されたものである。
実施例２：本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチドを用いたＲＮＡ機能抑制活性試験
１．ＲＮＡトランスフェクション用ＲＮＡの調製
上記で得られたｕＧＬ３．１２ＲＮＡ（１４２ナノモル）およびｕＧＬ３．７ＲＮＡ（１３５ナノモル）を各々蒸留水に溶解して１００ピコモル／μｌ液を調製した。
次いで３０μｌの上記ＲＮＡ溶解液、３０μｌの蒸留水、および２４０μｌの緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム，ｐＨ７．４に調製された３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，２ｍＭ酢酸マグネシウム）の混合液を調製し、ｕＧＬ３．１２ＲＮＡ原液およびｕＧＬ３．７ＲＮＡ原液（原液：１０ｐｍｏｌｅ／ｕｌ）とした。希釈倍率（Ｘ５、Ｘ５０）に応じた希釈は全て上記緩衝液で行った。
２．非特異的コントロールｓｉＲＮＡの調製
上記実施例１で得られたＥＧＦＰ遺伝子の配列位置９３６−９５４に相補する２１ｍｅｒからなる１本鎖フォワード配列（Ｆ）ＲＮＡとリバース配列（Ｒ）ＲＮＡの各１０ピコモルずつを混合し、アニーリングバッファを加えて１００μｌとし、緩衝液によって５倍希釈して、コントロールｓｉＲＮＡ溶液（ＥＧＦＰｃ２）とした。
３．トランスフェクション複合体の調製
レポーター遺伝子発現ベクターの調製は、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を有するクローニングベクターｐＧＬ３−コントロール（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ：プロメガ社製）および（ウミシイタケ：Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＲＬ／ＴＫ（ｐＲＬ／ＴＫ：プロメガ社製）のそれぞれに、上記で調製された各ＲＮＡを加えてトランスフェクション複合体の調製を行なった。
即ち、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地（ギブコ−ＢＲＬ社製）に上記各レポーター遺伝子（１μｇのｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌと０．１μｇのｐＲＬ／ＴＫ）、および本発明の標的遺伝子用ポリヌクレオチドのｕＧＬ３．１２ＲＮＡおよびｕＧＬ３．７ＲＮＡ、または非特異的コントロールｓｉＲＮＡを加えた溶液（ＥＧＦＰｃ２）を調製した（ａ液）。
別途５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に１．５μｌのリポフェクタミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００：ライフ・テクノロジー社製）を加えて懸濁し、室温で５分間清置した（ｂ液）。そしてａ液とｂ液を混合して、２０分間反応し、トランスフェクション複合体とした。
４．トランスフェクション
まず、ＨｅＬａ３細胞をコンフルーエント直前までＤＭＥＭ／１０培地（ＤＭＥＭ／１０：１０％牛胎児血清（ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製、＃１０２０−９０）を添加したＤ−ＭＥＭ培地（ＳｉＩＧＭＡ社）を用いて、１０センチ径のシャーレにて、５％ＣＯ２下、３７℃で前培養した。前培養後の細胞をＰＢＳで洗浄後、１ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡで処理して細胞を剥がし、１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０に再懸濁した。血球計算盤を用いて細胞数を計測し、１．２ｘ１０５／０．５ｍｌとなるよう、ＤＭＥＭ／１０を用いて調製した。ＨｅＬａ３細胞を２４穴プレートの各ウェルに０．５ｍｌずつ添加し、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養した。
トランスフェクションは、２４穴プレートのＨｅＬａ３細胞の培養上清を吸引除去し、新しいＤＭＥＭ／１０を０．５ｍｌずつ各ウェルに添加した。次いで０．１ｍｌのトランスフェクション複合体を各ウェルに添加後、プレートを緩やかに揺すって均一にした後、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養した。
５．ルシフェラーゼの活性測定
デュアル−ルシフェラーゼ・リポター・アッセイ・システム（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：＃Ｅ１９１０プロメガ社製）を用い、操作はこの試薬に添付のプロトコールに沿った。培養プレートにキットに添付の溶解緩衝液４００μｌを加え、細胞を溶解させた後、卓上遠心機で１５００ｒｐｍ、５秒遠心し、この上清２０μｌを、添付の反応試薬ＬＡＲＩＩ１００μｌに混合し、１回目の化学発光をルミノメーターで測定は、ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社）の発光測定プログラムを用いて行った。
ホタル・ルシフェラーゼの測定値を、（ウミシイタケ：Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（インターナルスタンダード）の値で補正し、更にＲＮＡ非存在下での数値を１．０として、Ｆ−Ｌｕｃ／Ｒ−Ｌｕｃの相対値を算出した。
結果を図１または表１に示す。
2003070932.tif 000003
図１または表１に示されたように、試験結果を補正値でみると、非特異的配列によるコントロールを１．００として比較すると、コンポーネント（ＩＩ）が７塩基長においては、５０倍希釈、５倍希釈、原液が、それぞれ０．６５、０．２４、０．０９と濃度依存に数値が小さくなり、原液においては約９０％活性が抑制されていた。また、同様に１２塩基長においては、５０倍希釈、５倍希釈、原液が、それぞれ０．７３、０．２１、０．１１と濃度依存に数値が小さくなり、原液においては約９０％活性が抑制され、コンポーネント（ＩＩ）の大きさにかかわらず、いずれにおいても、濃度依存的にルシフェラーゼ活性を抑制していることが判明した。
図１または表１の結果から、本発明の一本鎖の標的遺伝子用ポリヌクレオチドのｕＧＬ３．１２ＲＮＡおよびｕＧＬ３．７ＲＮＡによって標的遺伝子であるルシフェラーゼ活性が濃度依存的に抑制され、ＲＮＡ機能抑制活性を有することが確認された。
また、本試験においてはコンポーネント（ＩＩ）の長さ（７塩基長または１２塩基長）による活性の差異は認められなかった。
続いてコンポーネント（ＩＩ）がヘアピンのような相補的な配列（−ＡＡＴＴ−）であっても、ＲＮＡ機能抑制活性を有することが確認された（データ示さず）。
実施例３  Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制ベクターによるＲＮＡ機能抑制効果
本実施例においては標的遺伝子をＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０３４４５）の配列位置６４０−６６２に相当する２３ヌクレオチドの配列をＲＮＡインターフェアランスの標的部位として細胞内で発現するベクターを作製し、そのＲＮＡ機能抑制効果を評価した。
（１）Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制細胞の作製
１．  Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制ベクターの作製：
Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制ベクターは以下のように調製した。
ヒトＵ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒを以下のプライマーを用いて（オリゴマー１および２；配列番号７，８）ＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ増幅断片を鋳型にして、オリゴマー１（配列番号７）およびオリゴマー３（配列番号９）を用いてＰＣＲを行い、制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉ切断部位を導入した改変Ｕ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒを作製した。この増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断したｐＵＣ１９ベクターへクローニングした（ｐＵＣ１９Ｕ６）。
マウスＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒは以下のプライマーを用いて（オリゴマー４および５；配列番号１０，１１）ＰＣＲで増幅した後に、増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したｐＵＣ１９ベクターへクローニングした（ｐＵＣ１９  Ｈ１）。
オリゴマー名１（配列番号７）：Ｕ６Ｐ．Ｆ，枠内；ＥｃｏＲＩ切断部位
2003070932.tif 000004
オリゴマー名２（配列番号８）：Ｕ６ＣＳＰ４５Ｒ，枠内；Ｃｓｐ４５Ｉ切断部位
2003070932.tif 000005
オリゴマー名３（配列番号９）：Ｕ６Ｐ．Ｒ，枠内；ＸｂａＩ切断部位
2003070932.tif 000006
オリゴマー名４（配列番号１０）：ｍＨ１．Ｆ，枠内；ＥｃｏＲＩ切断部位
2003070932.tif 000007
オリゴマー名５（配列番号１１）：ｍＨ１．Ｒ，枠内；ＳａｌＩ切断部位）
2003070932.tif 000008
次にオリゴマー１（配列番号１２）とオリゴマー２（配列番号１３）をアニーリングさせ、Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造）でＤＮＡ合成した後にＸｂａＩ、ＳａｌＩで切断して、同様にＸｂａＩ、ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１９Ｈ１ベクターへとクローニングし、ｐＵＣ１９Ｈ１−Ｌａｍｉｎと命名した。
またｐＵＣ１９  ｖｅｃｔｏｒの制限酵素ＮｄｅＩサイトに以下のプライマー（オリゴマー５および６、配列番号１６，１７）でｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から増幅したネオマイシン耐性遺伝子を挿入して、ｐＵＣ１９−ｎｅｏベクターを作製した。このベクターのＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に、ｐＵＣ１９Ｈ１−ＬａｍｉｎベクターからＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって切断した、ＲＮＡ抑制機能を有する断片を導入し、Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制ベクターとした。
オリゴマー名１（配列番号１２）：ｈＬａｍｉｎＡＣ−４．Ｈ１Ｆ，枠内；ＸｂａＩ切断部位、下線；ｓｔｅｍ領域、斜体；ｌｏｏｐ領域
2003070932.tif 000009
オリゴマー名２（配列番号１３）：ｈＬａｍｉｎＡＣ−４．Ｒ，枠内；ＳａｌＩ切断部位、下線；ｓｔｅｍ領域、斜体；ｌｏｏｐ領域
2003070932.tif 000010
オリゴマー名３（配列番号１４）：Ｎｅｏ−Ｎｄｅ．Ｆ，枠内；ＮｄｅＩ切断部位
2003070932.tif 000011
オリゴマー名４（配列番号１５）：Ｎｅｏ−Ｎｄｅ．Ｒ，枠内；ＮｄｅＩ切断部位
2003070932.tif 000012
２．トランスフェクション複合体の調製：  上記１で得られたＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制ベクターの１μｇを５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えた（Ａ液）。別に、３μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに加えて混合し、５分間室温で静置した（Ｂ液）。Ａ液とＢ液を混合し、２０分間室温で反応して、トランスフェクション複合体を調製した。
３．トランスフェクション：  トランスフェクション前日に、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地（シグマ社製）を用いて、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞の２Ｘ１０５／ｍｌ溶液を調製し、２４穴プレートの一ウエル当たり０．５ｍｌずつ加えた。ＣＯ２培養器（サンヨー社製）にて３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養を行った。上記２で調製したトランスフェクションミックスを、２４穴プレートの一ウエル当たり１００μｌ加えた後、培養プレートをＣＯ２培養器に戻し、引き続き一晩培養を行った。
４．細胞の選別と株化：  細胞培養プレートの各ウエルをＰＢＳにて洗浄後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で細胞を剥がして回収した。回収後の細胞を、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地（シグマ社製）に再懸濁し、１０ｃｍディッシュに全量をまいた。翌日、培養上清を吸引除去し、１０ｍｌの選択培養液（１０％ＦＢＳ、５００μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社製））を加えた。２から３日に一度、新しい選択培養液に交換しながらＣＯ２培養器（サンヨー社製）にて３７℃、５％ＣＯ２で培養を行い、最終的に３１個のジェネシティン耐性の細胞株を得た。得られた株をＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制細胞株として、以下の評価に用いた。
（２）Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制細胞株の評価
１．ＲＮＡ調製：
３１種類のＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制細胞株を培養した１０ｃｍディッシュを、各々ＰＢＳで二回洗浄後、ディッシュあたり３ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて細胞を溶解した。溶解した細胞液を各々１５ｍｌの別々の遠心チューブに移した後、各々０．２ｍｌのクロロホルムを加えて激しく混合した後、室温で３分間静置し、４℃、３０００ｒｐｍで４０分間遠心分離を行った。水相（一番上の部分）を各々新しいチューブに移した後、０．５ｍｌのイソプロパノールを加えて混合し、５〜１０分間室温で静置した。４℃、３０００ｒｐｍで４０分間遠心分離を行い、ＲＮＡ沈殿とし、７０％エタノールで一度洗浄した後、ＤＷに溶解した。各試料の吸光度２６０ｎｍをＤＵ６５０（ベックマン社製）で測定し、測定値をもとにＲＮＡ濃度を算出し、ノザン解析に使用した。
２．蛋白質調製：
３１種類のＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制細胞株を培養した１０ｃｍディッシュを、各々ＰＢＳで洗浄後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で細胞を剥がして回収した。回収後の細胞を更にＰＢＳで洗浄後、５０００ｒｐｍ、５分間の微量遠心で細胞を回収した。回収した細胞をｂｏｉｌｉｎｇ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５％ＳＤＳ，５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏ−ｖａｎａｄａｔｅ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４）に溶解した後、１００℃で５分間処理し、直後に氷冷した。１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離を行い、その上清を回収して蛋白質溶液とした。蛋白質溶液は蒸留水を用いて１０倍希釈した後、総タンパク濃度を測定した。ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ試薬（ｃｙｔｏｓｌｅｌｅｔｏｎ社製）で反応後の希釈蛋白質溶液の吸光度を測定した。ＢＳＡを標準品として測定値を補正し、最終的に１μｇ／μＬの濃度に調製してサンプルとした
３．ノザンハイブリダイゼーションによるＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ  ｍＲＮＡ発現解析：
上記１．で調製したＲＮＡを用いてＬａｍｉｎＡ／Ｃ  ｍＲＮＡ発現解析を行った。
Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ  ｍＲＮＡ発現解析
２０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを変性アガロースゲルで泳動して分離した後に、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）へキャピラリーブロッティング法により転写した。さらにＵＶクロスリンク法によってＲＮＡをメンブレンに架橋した。メンブレンはｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ溶液（５０％ホルムアミド，５×ＳＳＰＥ，２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄサケ精子ＤＮＡ）にて４２℃、１時間処理した後に、３２Ｐ  ｄＣＴＰでアイソトープラベルしたｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子断片をプローブとして用いて一晩ｈｙｂｒｉｄｉｚｅした。メンブレンの洗浄は２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液によって室温にて５分間行い、この操作を３回繰り返した。その後５０℃で１０分、６５℃で１０分２回洗浄を行った。洗浄が終わったメンブレンはＸ線フィルムによって一晩露光した。
結果を図２に示す。Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制細胞株では、ベクター未導入細胞株と比べてＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ  ｍＲＮＡの発現が抑制されており、Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制ベクターが、遺伝子特異的にＲＮＡ機能抑制活性を有することが明らかとなった。
４．ウエスタン法による解析：
上記２．で濃度調製した蛋白質サンプルを、ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒを用いて２倍希釈した。その６μＬを１３％ＳＤＳアクリルアミドゲルに重層し、３００Ｖ，４０ｍＡの条件で８０分間ＳＤＳ  ＰＡＧＥを行った。セミドライブロッティング装置を使用して、泳動したゲルから、３００Ｖ，１４０ｍＡ，６０ｍｉｎの条件で蛋白質をニトロセルロース膜（ＢＩＯＲＡＤ社）に転写した。蛋白質をブロットしたニトロセルロース膜は、１０００倍希釈した抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）、またはコントロール抗体（αＴｕｂｕｌｉｎ抗体、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で処理後、引き続きＨＲＰ標識ヤギＡｎｔｉｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体で反応した。Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ特異的バンドの検出は、抗原抗体反応後のニトロセルロース膜をＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で反応後、Ｘ腺フィルムに露光することにより行った。
結果を図２に示す。各サンプルより検出されたバンドの濃度は、ノザン解析によるＬａｍｉｎ  Ａ／ＣのｍＲＮＡの濃度とほぼ一致し、ｍＲＮＡだけでなく翻訳後のタンパク質においても抑制効果を有することが明らかとなった。
実施例４．ホタルルシフェラーゼ遺伝子機能抑制ベクターのＲＮＡ機能抑制効果
本実施例においては、標的遺伝子をホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．４７２９６）の配列位置３５７−３８１に相当する２５ヌクレオチドの配列をＲＮＡインターフェアランスの標的部位として、標的遺伝子用ポリヌクレオチドを細胞内で発現するホタルルシフェラーゼ遺伝子機能抑制ベクターを作製し、そのＲＮＡ機能抑制効果を評価した。
ホタルルシフェラーゼ遺伝子機能抑制ベクター作製：  Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーター制御下で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子機能抑制ポリヌクレオチドを発現するベクター二種類（Ｕ６Ｈ１  ２５ｓｔｅｍ−Ｌｕｃ、及びＵ６Ｈ１  ２５ｓｔｅｍｌｏｏｐ−Ｌｕｃ）、およびホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する配列を含まないコントロールベクターを構築した。
コントロールベクター
実施例３で作製したｐＵＣ１９Ｕ６を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、ヒトＵ６プロモーターを単離し、その断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断したｐＢＳベクターへクローニングした（ｐＢＳＵ６）。つぎに実施例３で作製したｐＵＣ１９Ｈ１ベクターより以下のプライマー（オリゴマー１及び２）でＰＣＲにより増幅して、マウスＨ１プロモーターを単離し、その増幅断片をＳａｃＩ及びＳｐｅＩで切断し、ＳａｃＩ及びＳｐｅＩで切断したｐＢＳＵ６へクローニングし、コントロールベクターとした
オリゴマー名１：ｂｉＨ１ｐｒｏ．ＳａｃＩ配列番号１６
2003070932.tif 000013
オリゴマー名２：ｂｉＨ１ｐｒｏ．ＳｐｅＩ−２  配列番号１７
2003070932.tif 000014
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子ＲＮＡ機能抑制ベクター
１．Ｕ６Ｈ１  ２５ｓｔｅｍ−Ｌｕｃ
配列番号１８、１９の下記のオリゴマー１及びオリゴマー２をアニーリングさせた後、制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉ及びＸｂａＩで切断したコントロールベクターにクローニングした。
オリゴマー名１配列番号１８：２５ｓ＃４Ｆ  枠内；  Ｃｓｐ４５Ｉ切断末端、下線ｓｔｅｍ領域
2003070932.tif 000015
オリゴマー名２配列番号１９：  ２５ｓ＃４Ｒ枠内；  ＸｂａＩ切断末端、下線ｓｔｅｍ領域
2003070932.tif 000016
２．Ｕ６Ｈ１  ２５ｓｔｅｍｌｏｏｐ−Ｌｕｃ
配列番号２０、２１の下記のオリゴマー１およびオリゴマー２をアニーリングさせた後、Ｅｘ−Ｔａｑを用いてＤＮＡ合成を行い、ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏを合成した。合成したｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏを制限酵素Ｃｓｐ４５ＩおよびＸｂａＩで切断して、Ｃｓｐ４５Ｉ及びＸｂａＩで切断したｐＢＳＵ６へクローニングした。
オリゴマー名１；ＳＴ−ＵＨＧＬ３＃４Ｆ  配列番号２０；枠内；Ｃｓｐ４５Ｉ切断部位、下線；ｓｔｅｍ領域、斜体；ｌｏｏｐ領域
2003070932.tif 000017
（鎖長５２ｍｅｒ）
オリゴマー名２  配列番号２１；ＳＴ−ＵＨＧＬ３＃４Ｒ    枠内；ＸｂａＩ切断部位、下線；ｓｔｅｍ領域、斜体；ｌｏｏｐ領域
2003070932.tif 000018
（鎖長５３ｍｅｒ）
１．  トランスフェクション複合体の調製：  １．８μｇのｐＧＬ３コントロールベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、０．２μｇのｐＲＬ／ＴＫベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及び上記１で得られたＲＮＡｉ誘導ベクターの２０μｇを２００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えた（Ａ液）。Ａ液は、ＲＮＡｉ誘導ベクターとコントロールベクターの計３種類の各々について、別個に調製した。別に、１２μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに加えて混合し、５分間室温で静置したものを３本調製した（Ｂ液）。Ａ液とＢ液を混合し、２０分間室温で反応して、トランスフェクション複合体（３種類）を調製した。
２．  トランスフェクション：  トランスフェクション前日に、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地（シグマ社製）を用いて、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞の１０５／ｍｌ溶液を調製し、２４穴プレートの一ウエル当たり０．５ｍｌずつ加えた。ＣＯ２培養器（サンヨー社製）にて３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養を行った。上記２で調製したトランスフェクション複合体の３種類を、２４穴プレートの一ウエル当たり１００μｌずつ（一種について４つのウェル；ｎ＝４）別のウエルに加えた後、培養プレートをＣＯ２培養器に戻し、引き続き１日間培養を行った。
３．  ルシフェラーゼアッセイ：  デュアル  ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製）を用い、操作はこのキットに添付のプロトコールに準じた。培養プレートより培地を吸引除去し、細胞をＰＢＳで一度洗浄した。キットに添付の溶解液を０．２ｍｌ／ウェルで添加し、細胞を溶解させた後、溶解液の２０μｌを添付の反応試薬ＬＡＲＩＩ１００μｌと混合し、ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）の発光測定プログラムを用いてホタルルシフェラーゼの活性を測定した。引き続き、Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｒｏ試薬を１００μｌ加えた後、ウミシイタケルシフェラーゼの活性をＧＥＮｉｏｓの発光測定プログラムにて測定した。ホタルルシフェラーゼの測定値をウミシイタケルシフェラーゼの測定値で割った値を算出後、コントロールベクターで得られた値を１００として、各々相対値を算出した。
４．  解析結果：  結果は図３に示す。それぞれのＲＮＡｉ誘導ベクターで処理した場合、コントロールベクターで処理した場合のルシフェラーゼ発現量を１００として、Ｕ６Ｈ１  ２５ｓｔｅｍ−Ｌｕｃでは３２．８％、Ｕ６Ｈ１  ２５ｓｔｅｍｌｏｏｐ−Ｌｕｃでは１６．０％に減少した。いずれの機能抑制ベクターを用いた場合にも、ルシフェラーゼ活性を抑制することが判明した。図３の結果から、本発明の機能抑制ベクターにより、標的遺伝子であるルシフェラーゼの活性が効果的に抑制されており、ＲＮＡ機能抑制活性を有することが確認された。
【配列表】
2003070932.tif 000019
2003070932.tif 000020
2003070932.tif 000021
2003070932.tif 000022
2003070932.tif 000023
2003070932.tif 000024
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明標的遺伝子用ポリヌクレオチドによるＲＮＡ機能抑制効果を示す。
図２は、Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ遺伝子機能抑制ベクターによるＲＮＡ機能抑制効果を示す。
図３は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子機能抑制ベクターのＲＮＡ機能抑制効果を示す。
【図１】
2003070932.tif 000025
【図２】
2003070932.tif 000026
【図３】
2003070932.tif 000027
【国際調査報告】
2003070932.tif 000028
2003070932.tif 000029
2003070932.tif 000030
2003070932.tif 000031