(57)【要約】ディファレンシャルディスプレイ法により、アトピー性皮膚炎患者の増悪期と寛解期に採取した好酸球において発現に差の見られる遺伝子を探索した。その結果、好酸球の減少を伴う寛解期にある患者の好酸球において、有意に発現が上昇しているＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）遺伝子を同定することに成功した。本発明者らは、該遺伝子をアレルギー性疾患の検査、および治療薬候補化合物のスクリーニングに使用できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法。
（ａ）被検者の好酸球細胞における、ＮＯＲ−１受容体タンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｂ）健常者の好酸球細胞における前記タンパク質または遺伝子の発現レベルと比較する工程
【請求項２】
遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
【請求項５】
次の工程（１）および（２）を含む、候補化合物が下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
（１）下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（ａ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（２）前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
【請求項６】
細胞が株化白血球細胞である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
次の工程（１）および（２）を含む、候補化合物が下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
（ａ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）被検動物に候補化合物を投与する工程、および
（２）被検動物の好酸球細胞における前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現強度を測定する工程、
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の方法によって、前記発現レベルに与える影響を検出し、対照と比較して前記発現シベルを上昇させる化合物を選択する工程を含む、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
次の工程（１）および（２）を含む、候補化合物がＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
（１）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードする遺伝子の転写調節領域と、レポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、候補化合物を接触させる工程、および
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって、候補化合物の前記活性に与える影響を検出し、対照と比較して前記活性を上昇させる化合物を選択する工程を含む、ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
次の工程（１）〜（３）を含む、アレルギー性疾患治療薬のための候補化合物をスクリーニングする方法。
（１）ＮＯＲ−１受容体タンパク質と被験化合物を接触させる工程
（２）ＮＯＲ−１受容体タンパク質と被験化合物との結合活性を測定する工程
（３）ＮＯＲ−１受容体タンパク質と結合する化合物を選択する工程
【請求項１２】
次の工程（１）〜（４）を含む、アレルギー性疾患治療薬のための候補化合物をスクリーニングする方法。
（１）ＮＯＲ−１受容体タンパク質または該タンパク質のリガンド結合領域と転写調節領域結合タンパク質との融合タンパク質を発現し得るＤＮＡ、および該転写調節領域結合タンパク質の結合するＤＮＡ配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するＤＮＡ、を導入した細胞を提供する工程
（２）前記細胞と被検化合物を接触させる工程
（３）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
（４）前記活性を変化させる化合物を選択する工程
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患治療薬。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができるシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬。
【請求項１５】
ＮＯＲ−１受容体のリガンドを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬。
【請求項１６】
ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンである、請求項１５に記載のアレルギー性疾患治療薬。
【請求項１７】
シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、プロスタグランジンＡ２、プロスタグランジンＡ１、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ２、１５（Ｒ）−１５−メチルプロスタグランジンＡ２、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ２、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ２、１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２、および８−イソプロスタグランジンＡ１からなる群より選択される、請求項１６に記載のアレルギー性疾患治療薬。
【請求項１８】
ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、表１４〜５８に掲載されたいずれかの化合物である、請求項１５に記載のアレルギー性疾患治療薬。
【請求項１９】
アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項１３〜１８のいずれかに記載の治療薬。
【請求項２０】
下記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの好酸球細胞における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患モデル動物。
（ａ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
トランスジェニック動物が、ノックアウト動物である請求項２０に記載のモデル動物。
【請求項２２】
細胞におけるＮＯＲ−１受容体タンパク質を活性化させることを特徴とする、細胞のアポトーシス誘導方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンと、細胞を接触させる工程を含む、請求項２２に記載のアポトーシス誘導方法。
【請求項２４】
細胞が好酸球細胞である、請求項２２または２３に記載のアポトーシス誘導方法。
【請求項２５】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンを含む、アポトーシス誘導剤。
【請求項２６】
ＮＯＲ−１受容体のリガンドを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項２７】
ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンである、請求項２６に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項２８】
シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、プロスタグランジンＡ２、プロスタグランジンＡ１、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ２、１５（Ｒ）−１５−メチルプロスタグランジンＡ２、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ２、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ２、１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２、および８−イソプロスタグランジンＡ１からなる群より選択される、請求項２７に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項２９】
ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、表１４〜５８に掲載されたいずれかの化合物である、請求項２６に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３０】
好酸球ＣＤ３０受容体のリガンドを含む、ＮＯＲ−１遺伝子発現誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アレルギー性疾患に関連するＮＯＲ−１遺伝子の発現を指標としたアレルギー性疾患の検査方法、およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法、並びにアレルギー性疾患の治療のための薬剤に関する。
【背景技術】  アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難である。
またアレルギー性疾患には、変異や欠陥を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
近年の遺伝子発現の解析技術の発達により、多くの臨床試料で、遺伝子の発現を解析・比較することが可能となった。このような方法としては、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）法が有用である。ディファレンシャルディスプレイ法は、ライアンおよびパディー（Ｌｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ）によって１９９２年に最初に開発された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７：９６７−９７１）。この方法を用いることによって、１回に数十種類以上のサンプルをスクリーニングすることができ、それらのサンプル中で発現が変化した遺伝子を検出することが可能である。このような方法を用いて、変異が生じた遺伝子や、時間や環境とともに発現が変わるような遺伝子を調べることによって、病因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされることが期待される。これらの遺伝子には、環境要因によって発現に影響を受けるような遺伝子も含まれる。
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンにかかわらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。例えば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類にかかわらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
好酸球数とＥＣＰ値は、Ｉ型アレルギーに引き続いて起きる遅延型反応や、アレルギー性炎症反応に関連する診断項目である。好酸球の数は、アレルギー症状の進展を反映するとされている。また、好酸球の顆粒に含まれるタンパク質であるＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）も、喘息患者の発作に伴って強く活性化される。これらの診断項目は、確かにアレルギー症状を反映するものではある。しかし、実際に診断の指標とできる範囲は限られている。
従って、アレルゲンにかかわらず、アレルギー患者の病態の把握や治療方針の決定に役立てることができる診断指標が求められていた。患者に対する危険が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができるアレルギー性疾患のマーカーは非常に有用である。アレルギー性疾患に関連する遺伝子を同定することができれば、該遺伝子の発現を指標とすることにより、アレルギー性疾患の検査が可能となる。さらに、該タンパク質の細胞における機能が解明すれば、その機能に関する知見を基に、アレルギー性疾患の治療方法、および治療のための薬剤の開発が進むものと期待される。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、アレルギー性疾患に関連する遺伝子を同定することにある。さらに、本発明は、該遺伝子の発現を指標としたアレルギー性疾患の検査方法、およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法、並びにアレルギー性疾患の治療のための薬剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、既に確立された「蛍光ＤＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＤ）法」（Ｔ．Ｉｔｏら，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５１：２３１−２３６）の手順に基づき、複数のヒトの血液から調製した白血球細胞ＲＮＡサンプルを解析できるＤＤシステムを開発した（特願平１１−１２０４８９）。そして該システムを利用して、アレルギー性疾患特異的に発現量が異なる遺伝子の同定を試みた。
すなわち、まず本発明者らは、代表的なアレルギー性疾患であるアトピー性皮膚炎の患者について、皮膚炎症状の増悪期と寛解期とでアレルギー症状に関連するいくつかのパラメーターを比較した。その結果、一部の患者で寛解期における好酸球の減少が観察された。一般に好酸球は、アトピー性皮膚炎の代表的な臨床指標とされていることから、本発明者らはこの知見に着目した。そして、同一患者の増悪期と寛解期の間で、好酸球において発現レベルが変化する遺伝子を単離することができれば、アトピー性皮膚炎に直接的に関与する遺伝子の単離が可能となるものと考えた。
そこで、複数の被検者について、アトピー性皮膚炎の増悪期と寛解期に好酸球を採取して、前記システムを利用して好酸球で発現量が変化する遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、寛解期に好酸球の減少が観察された患者において有意に高い発現量を示す配列「２２５０−０１」の単離に成功した。ゲノムデータベース解析の結果、ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）と呼ばれる核内オーファン受容体のイントロン部分であることが分かった。そこで、ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の報告されているエクソン配列について発現測定を行ったところ、イントロン部分で測定したときの結果と同様に、好酸球減少の見られた著効例の寛解期に誘導されるという傾向が見られた。ＮＯＲ−１遺伝子はこれまでのところ、アレルギー性疾患との関連については報告されていない。
アトピー性皮膚炎の治療による寛解期に末梢血好酸球で、アポトーティックな性格が示唆されるような遺伝子の亢進が見られるのは、末梢血好酸球数の減少とよく対応しており、ＮＯＲ−１遺伝子の発現誘導は治療効果と相関する可能性が高いものと考えられる。
本発明のＮＯＲ−１遺伝子の発現量を指標とすることにより、アレルギー性疾患を検査することが可能である。
また、ＮＯＲ−１受容体はオーファン受容体であり生体内リガンドや活性化物質はこれまでのところ見つかっていなかった。本発明者らは、リガンドの探索のためのハイスループット系を開発し、この系を使用することによりＮＯＲ−１の転写活性化作用を有すると考えられる化合物の取得に成功した。該化合物はシクロペンテノン構造を持つプロスタグランジン（ＰＧＡ誘導体）であり、ＮＯＲ−１受容体の生体内リガンドである可能性が考えられた。また、該受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）領域を欠失させた変異体を用いた実験から、プロスタグランジン誘導体が実際に該受容体のＬＢＤ領域に作用して働くことが示唆された。さらに、ビアコアを利用した実験から、ＰＧＡ誘導体がＮＯＲ−１へ結合することが証明された。
即ち本発明者らは、アレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であること、および、ＰＧＡ誘導体がＮＯＲ−１のリガンド活性物質であることを見出した。
さらに本発明者らは、ファーマコフォアモデルにより、ＰＧＡ誘導体のＮＯＲ−１リガンド結合領域に対する結合位置をシミュレートし、ＰＧＡ誘導体のレポーター系における構造活性相関情報から、結合ポケットに適合するＰＧＡ誘導体以外の化合物をデータベースより選択した。これらの化合物は、ＮＯＲ−１受容体のリガンドとして機能することが期待される。
ＮＯＲ−１遺伝子の発現を誘導する化合物、あるいはＮＯＲ−１受容体と結合し、転写活性を促進する化合物（例えば、リガンド活性物質）は、アレルギー性疾患に対する治療効果が期待される。
また本発明者らは、好酸球ＣＤ３０に対するアゴニスト活性をもった抗ＣＤ３０抗体で細胞のアポトーシス刺激を行ったところ、培養末梢血好酸球中でＮＯＲ−１の発現が劇的に誘導されることを初めて見出した。このことから、好酸球ＣＤ３０リガンド刺激によって、ＮＯＲ−１遺伝子の発現を上昇させ、好酸球におけるＮｏｒ１の下流遺伝子の発現を制御することによって好酸球のアポトーシスを誘導することを機序とするアレルギー性疾患治療薬が提供される。
さらに本発明者らは、ヒトＮＯＲ−１遺伝子をアクチンプロモーターによって発現誘導させたトランスジェニックマウスを確立することに成功した。このマウスは、ＮＯＲ−１を介したアレルギー疾患の解析のための動物モデルとして非常に有用である。
本発明は、アレルギー性疾患時、特に好酸球の減少を伴う寛解期において高い発現を示すＮＯＲ−１遺伝子の発現を指標としたアレルギー性疾患の検査方法、およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法、並びにアレルギー性疾患の治療のための薬剤に関し、より具体的には、
〔１〕  次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法、
（ａ）被検者の好酸球細胞における、ＮＯＲ−１受容体タンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｂ）健常者の好酸球細胞における前記タンパク質または遺伝子の発現レベルと比較する工程
〔２〕  遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する、〔１〕に記載の検査方法、
〔３〕  アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、〔１〕または〔２〕に記載の検査方法、
〔４〕  ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬、
〔５〕  次の工程（１）および（２）を含む、候補化合物が下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（ａ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（２）前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程
〔６〕  細胞が株化白血球細胞である〔５〕に記載の方法、
〔７〕  次の工程（１）および（２）を含む、候補化合物が下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法、
（ａ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（１）被検動物に候補化合物を投与する工程、および
（２）被検動物の好酸球細胞における前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現強度を測定する工程
〔８〕  〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法によって、前記発現レベルに与える影響を検出し、対照と比較して前記発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程を含む、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法、
〔９〕  次の工程（１）および（２）を含む、候補化合物がＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法、
（１）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードする遺伝子の転写調節領域と、レポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、候補化合物を接触させる工程、および
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
〔１０〕  〔９〕に記載の方法によって、候補化合物の前記活性に与える影響を検出し、対照と比較して前記活性を上昇させる化合物を選択する工程を含む、ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法、
〔１１〕  次の工程（１）〜（３）を含む、アレルギー性疾患治療薬のための候補化合物をスクリーニングする方法、
（１）ＮＯＲ−１受容体タンパク質と被験化合物を接触させる工程
（２）ＮＯＲ−１受容体タンパク質と被験化合物との結合活性を測定する工程
（３）ＮＯＲ−１受容体タンパク質と結合する化合物を選択する工程
〔１２〕  次の工程（１）〜（４）を含む、アレルギー性疾患治療薬のための候補化合物をスクリーニングする方法、
（１）ＮＯＲ−１受容体タンパク質または該タンパク質のリガンド結合領域と転写調節領域結合タンパク質との融合タンパク質を発現し得るＤＮＡ、および該転写調節領域結合タンパク質の結合するＤＮＡ配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するＤＮＡ、を導入した細胞を提供する工程
（２）前記細胞と被検化合物を接触させる工程
（３）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
（４）前記活性を変化させる化合物を選択する工程
〔１３〕  〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患治療薬、
〔１４〕  〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができるシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬、
〔１５〕  ＮＯＲ−１受容体のリガンドを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬、
〔１６〕  ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンである、〔１５〕に記載のアレルギー性疾患治療薬、
〔１７〕  シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、プロスタグランジンＡ２、プロスタグランジンＡ１、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ２、１５（Ｒ）−１５−メチルプロスタグランジンＡ２、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ２、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ２、１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２、および８−イソプロスタグランジンＡ１からなる群より選択される、〔１６〕に記載のアレルギー性疾患治療薬、
〔１８〕  ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、表１４〜５８に掲載されたいずれかの化合物である、〔１５〕に記載のアレルギー性疾患治療薬、
〔１９〕  アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、〔１３〕〜〔１８〕のいずれかに記載の治療薬、
〔２０〕  下記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの好酸球細胞における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患モデル動物、
（ａ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔２１〕  トランスジェニック動物が、ノックアウト動物である〔２０〕に記載のモデル動物、
〔２２〕  細胞におけるＮＯＲ−１受容体タンパク質を活性化させることを特徴とする、細胞のアポトーシス誘導方法、
〔２３〕  〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンと、細胞を接触させる工程を含む、〔２２〕に記載のアポトーシス誘導方法、
〔２４〕  細胞が好酸球細胞である、〔２２〕または〔２３〕に記載のアポトーシス誘導方法、
〔２５〕  〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンを含む、アポトーシス誘導剤、
〔２６〕  ＮＯＲ−１受容体のリガンドを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤、
〔２７〕  ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンである、〔２６〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔２８〕  シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、プロスタグランジンＡ２、プロスタグランジンＡ１、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ２、１５（Ｒ）−１５−メチルプロスタグランジンＡ２、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ２、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ２、１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２、および８−イソプロスタグランジンＡ１からなる群より選択される、〔２７〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔２９〕  ＮＯＲ−１受容体のリガンドが、表１４〜５８に掲載されたいずれかの化合物である、〔２６〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔３０〕  好酸球ＣＤ３０受容体のリガンドを台む、ＮＯＲ−１遺伝子発現誘導剤、を提供するものである。
本発明者らは、ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）遺伝子（本明細書においては、単に「ＮＯＲ−１」と記載する場合あり）が、アトピー性皮膚炎の患者の増悪期と寛解期との比較において、好酸球の減少を伴った寛解期にある患者の好酸球で発現量が増加することを見出した。従って、ＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルを指標することにより、被検者に対してアレルギー性疾患の検査を行うことができる。
本発明は、ＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルを測定することを特徴とする、アレルギー性疾患の検査方法を提供する。
本発明の方法の好ましい態様においては、次の工程を含む。
（ａ）被検者の好酸球細胞における、ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｂ）健常者の好酸球細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）受容体は、表１に示すような種々の呼び名を持った３つのサブファミリーを構成する核内オーファン受容体のγタイプであり、種を超えて主としてＮＯＲ−１と呼ばれている。
2004003198.tif 000002
これらＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）受容体タンパク質のアミノ酸配列、または該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に関する情報は、当業者においては公知の各種遺伝子データベース等から容易に取得することができる。具体的には、ヒトＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードする遺伝子（ＮＯＲ−１遺伝子）の塩基配列を配列番号：１に、ＮＯＲ−１受容体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、以下のような検査が含まれる。例えば、被検者がアレルギー性疾患を罹患しているか否かの検査、アレルギー性疾患を被り易い体質か否かの検査、またはアレルギー症状が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査等が挙げられる。本発明のＮＯＲ−１遺伝子は、特に好酸球の減少を伴った寛解期にあるアトピー性皮膚炎患者の好酸球で発現量の増加を示した。好酸球はアトピー性皮膚炎の代表的な臨床マーカーであることから、その減少と関連する臨床マーカーは、治療効果の判定に有用である。より具体的には、ＮＯＲ−１遺伝子の発現の上昇は、好酸球の減少を伴ってアレルギー性疾患の改善が進んでいることを示している。
アトピー性皮膚炎の重症度と好酸球数は相関しており、好酸球数を積極的に減らすことは治療につながる可能性がある。数の減少に伴って好酸球に特異的に誘導されてくるこの遺伝子を測定するとともに、細胞の外から積極的に誘導するような方法や物質を見つけ出せば、アトピー性皮膚炎の新しい治療法及びそれを評価するための診断法につながる可能性がある。
本発明において、ＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルとは、該遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びにタンパク質への翻訳を含む。従って、本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、該遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法におけるＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルの測定は、当業者においては、公知の遺伝子解析方法に従って実施することができる。具体的には、例えばＮＯＲ−１遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明のアレルギー性疾患検査用試薬として用いられるプローブまたはプライマーとしては、配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成（単離）されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ  ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ  ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ  ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ  ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ  ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｚｉｎｎ  Ｋ，Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ  ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、ＮＯＲ−１遺伝子によりコードされるタンパク質を検出することにより行うこともできる。このような検査方法としては、例えば、該遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いるＮＯＲ−１タンパク質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
ＮＯＲ−１タンパク質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いるタンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えばＮＯＲ−１遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、発現させた組み換えタンパク質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、ＮＯＲ−１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
本発明においては、被検者の好酸球細胞を試料とすることが好ましい。好酸球細胞は、末梢血から公知の方法によって調製することができる。すなわち、例えばヘパリン採血した血液を遠心分離によって分画し、白血球細胞を分離する。次に白血球細胞から、フィコールによる遠心分離等によって顆粒球細胞を分取し、更にＣＤ１６抗体を用いた好中球のディプリーション等によって好酸球細胞を分離することができる。分離された好酸球を破壊してライセートとすれば、前記タンパク質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。好酸球のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。
あるいは、好酸球の分離を行わず、全血や、末梢血白血球集団を対象として、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルを測定しても良い。この場合には、測定値の補正を行うことによって、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を求めることができる。例えば好酸球に特異的に発現し、かつ細胞の状態にかかわらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することができる。
また検出すべきタンパク質が分泌型のタンパク質である場合には、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とするタンパク質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。
本発明によるアレルギー性疾患の検査の結果、特にアトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患の患者において本発明の遺伝子の発現レベルが上昇している場合に、好酸球の減少を伴ってアレルギー症状の改善が進んでいるものと推定される。
また本発明は、下記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの好酸球細胞における発現レベルを低下させたトランスジェニック非ヒト動物からなるアレルギー性疾患モデル動物に関する。
（ａ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）ＮＯＲ−１受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明において、発現レベルの低下とは、遺伝子の機能を実質的に消失させたノックアウト状態が含まれる。本発明において、遺伝子の機能が実質的に消失した状態とは、遺伝子の発現や、この遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を見出すことができない状態を言う。遺伝子の発現レベルは、例えば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物であるタンパク質の活性が実質的に見出せないことは、正常な状態と比較することにより確認することができる。
このようなトランスジェニック動物には、例えば遺伝子のコード領域に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列の変異や終止コドンを生じさせて、本来のタンパク質の活性を発現できない状態とした動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本発明の遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明のトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
本発明のトランスジェニック動物には、例えば、配列番号：１に示す塩基配列からなるヒトＮＯＲ−１遺伝子の非ヒト動物種におけるホモログの発現が抑止されたノックアウト動物が含まれる。ノックアウト動物の表現型を観察することにより、ノックアウトした遺伝子の働きを具体的に知ることができる。配列番号：１に示す塩基配列からなるＮＯＲ−１遺伝子は、ヒトにおいてアトピー皮膚炎の好酸球の減少を伴った寛解期における好酸球中で発現が上昇していた。従って、そのホモログをノックアウトした動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として有用である。
例えば、本発明によるノックアウト動物が皮膚炎を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
ノックアウト動物の作製方法は公知である。例えばマウスにおいて、胚性幹細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウト動物を作製する方法が公知である。例えば、受精卵に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラ動物を得る。このキメラ動物（キメラとは、２個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう）と正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体を作製することができる。さらに、ヘテロ接合体同士を交配すれば、ホモ接合体が作製できる。本発明によるトランスジェニック動物は、これらヘテロ接合体と、ホモ接合体のいずれをも含む。
相同組換えとは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している２つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別にはＰＣＲを使用することができる。挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマーとして使ったＰＣＲ反応を行い、増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明する。また、胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させておき、導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することができる等、公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することができる。
本発明者らは、後述の実施例で示すように実際にヒトＮＯＲ−１遺伝子をアクチンプロモーターで発現誘導させたトランスジェニック（ＴＧ）マウスを確立することに成功した。本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様の一例として、上記ＴＧマウスを示すことができる。
本発明によるトランスジェニック動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。
本発明によって、ＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルが好酸球の減少を伴う寛解期にあるアトピー性皮膚炎患者の好酸球において、上昇することが明らかとなった。従って、好酸球細胞においてＮＯＲ−１遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に低下させた動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。なお好酸球における発現レベルの低下とは、白血球集団全体における前記遺伝子の発現レベルの低下を含む。すなわち、前記遺伝子の発現レベルを低下させるのは好酸球のみである場合のみならず、白血球集団全体において前記遺伝子の発現レベルが低下している場合を含む。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、通常、前記（ａ）または（ｂ）に記載した遺伝子のいずれかを意味する。より具体的には、本発明における機能的に同等な遺伝子として、ＮＯＲ−１をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子も挙げられる。本発明におけるストリンジェントな条件として、一般的には以下のような条件を示すことができる。例えば、４ｘＳＳＣ、６５℃でハイブリダイゼーションさせ、０．１ｘＳＳＣを用いて６５℃で１時間洗浄する。ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。従って当業者であれば、これらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を実験または経験的に設定することができる。
本発明におけるモデル動物には、例えば前記トランスジェニック動物等を利用することができる。
更に本発明は、候補化合物が本発明のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法を提供する。本発明において、ＮＯＲ−１遺伝子は、好酸球の減少を伴う寛解期にあるアトピー性皮膚炎患者の好酸球において有意に発現レベルが上昇している。従って、これらの遺伝子の発現レベルに与える影響を検出する方法に基づいて、その発現レベルを上昇させることができる化合物を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップを誘導する作用を持つ化合物である。本発明はさらに、ＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルに加えて、ＮＯＲ−１遺伝子産物タンパク質の活性（転写活性化能）を検出する方法を提供するとともに、ＮＯＲ−１遺伝子産物タンパク質の活性（転写活性化能）を上昇させる化合物を選択することによって、アレルギーの治療薬を得ることができる。
候補化合物が本発明のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響の検出方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うこともできる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの影響を検出するには、適当な被検動物を利用する。被検動物には、例えばアレルギー性疾患モデル動物や、前記（ａ）または（ｂ）に記載の遺伝子の好酸球細胞における発現が抑制されたトランスジェニック非ヒト動物からなるアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。本発明に基づくｉｎ  ｖｉｖｏでの発現レベルに与える影響の検出は、例えば以下のような工程に従って実施することができる。
（１）被検動物に侯補化合物を投与する工程
（２）被検動物の好酸球細胞における前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程
本発明の検出方法における被検動物としては、例えば、ＮＯＲ−１遺伝子のアンチセンスを発現させることによりＮＯＲ−１遺伝子の発現を低下させたトランスジェニック動物を利用することができる。このようなトランスジェニック動物は、例えば以下のようにして作成することができる。すなわち、まずＮＯＲ−１遺伝子の配列の全長配列もしくは部分配列を、適当なプロモーター配列の下流に逆向きの方向で組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを構築する。この発現ベクターを核へ導入すれば、ＮＯＲ−１遺伝子のアンチセンスを発現し、ＮＯＲ−１遺伝子の発現が低下したトランスジェニック動物を得ることができる。発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物におけるＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルを調整することができる。
このようにしてＮＯＲ−１遺伝子の発現を低下させたモデル動物に薬剤候補化合物を投与し、モデル動物の好酸球におけるＮＯＲ−１遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、ＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。
本発明のスクリーニング方法により、ＮＯＲ−１遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、例えば次のような作用点を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
・ＮＯＲ−１遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の活性化
・ＮＯＲ−１遺伝子の転写活性の上昇
・ＮＯＲ−１遺伝子の転写産物の安定化もしくは分解の阻害、等
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、例えば、前記（ａ）または（ｂ）に記載した遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、前記遺伝子の発現レベルを検出する方法を利用することができる。具体的には、例えば以下のような工程に従って実施することができる。
（１）前記（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程
本発明において、工程（１）に用いるための細胞は、これらポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明の検出方法においては、前記（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドを発現する細胞として、株化白血球細胞を用いることもできる。株化白血球細胞としては、Ｅｏｌ、ＹＹ−１、ＨＬ−６０、ＴＦ−１、およびＡＭＬ１４．３Ｄ１０など白血球由来の株化細胞を例示できる。白血球細胞株の中でも、好酸球に由来する細胞株は、本発明の検出方法に好適である。好酸球に由来する細胞株としては、例えば、Ｅｏｌ、ＹＹ−１、ＡＭＬ１４．３Ｄ１０等を挙げることができる。
Ｅｏｌ（Ｅｏｌ−１：Ｓａｉｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｂｌｏｏｄ  ６６，１２３３−１２４０，１９８５）は、林原研究所より入手することができる。同様にＹＹ−１（Ｏｇａｔａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｄ  ｔｈｅ  ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｓｕｐｐｌ  １，２４−２７，１９９７）は、サイトシグナル研究所より分与される。またＡＭＬ１４．３Ｄ１０（Ｂａｕｍａｎｎ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ＡＭＬ１４  ａｎｄ  ＡＭＬ１４．３Ｄ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：ａ  ｌｏｎｇ−ｏｖｅｒｄｕｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  ｍｏｒｅ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１６，１６−２４，１９９８）は、米国オハイオ州、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＶＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＤａｙｔｏｎのＰａｕｌ  ＣＣより、商業的に入手可能である。
その他、未分化白血球細胞株であるＨＬ−６０クローン１５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６４）は、酪酸存在下で１週間程度培養すれば、好酸球に分化し好酸球細胞株とすることができる。好酸球であることは、形態的に、多形核で好酸球顆粒が認められることにより判別することができる。形態的な観察は、ギムザ染色やディフクイック染色によって行われる。一般に、好酸球を含むヒト白血球細胞株は、白血病の患者サンプルから不死化した細胞をクローニングすることにより樹立することができる。従って、当業者は、必要に応じて好酸球細胞株を公知の方法によって得ることもできる。このスクリーニング方法においては、まず前記株化白血球細胞に候補化合物を添加する。その後、該株化白血球細胞における前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検出方法のための細胞として、前記（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドの発現を調節した形質転換細胞を用いることができる。このような形質転換細胞としては、例えば当該ポリヌクレオチドのアンチセンス発現ベクターを形質転換した細胞を挙げることができる。アンチセンス発現ベクターによる形質転換細胞は、前記トランスジェニック動物の作成と同様の原理によって得ることができる。得られた形質転換細胞を用いて該遺伝子の発現レベルに与える候補化合物の影響を検出することもできる。
なお本発明の方法において、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらにＮＯＲ−１遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流にこの転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子として、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
ＮＯＲ−１遺伝子の転写調節領域は、当業者においては、一般的な方法、例えば、以下の方法により取得することができる。まず、配列番号：１に記載された塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、ＮＯＲ−１遺伝子の転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を検出することによって、転写調節領域に対する候補化合物の作用を評価することができる。
本発明の前記ポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法に基づいて、前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。本発明は、次の工程を含む前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物のスクリーニング方法に関する。
すなわち本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、候補化合物による前記ポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出し、対照と比較して前記発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程を含む、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
あるいは本発明は、ＮＯＲ−１遺伝子の転写調節領域を利用するレポーターアッセイによる、転写調節領域に作用する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明によるレポーターアッセイの結果に基づいて、対象と比較してレポーター遺伝子の発現を上昇させる化合物を選択することにより、ＮＯＲ−１遺伝子の発現を誘導する化合物を取得することができる。あるいは、リガンド結合領域に結合するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
本発明者らによってアレルギー性疾患に関連するタンパク質として見出されたＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）受容体タンパク質は、オーファン受容体であり生体内リガンド活性物質はこれまでのところ見つかっていない。ＮＯＲ−１タンパク質のリガンド活性物質は、好酸球細胞内でダイレクトにＮＯＲ−１を活性化し、アポトーシスを促進させるものと考えられる。従って、ＮＯＲ−１受容体のリガンド活性物質はアレルギー性疾患治療薬となるものと期待される。通常、受容体タンパク質と結合し得る化合物の探索を行うことにより、該受容体のリガンドを取得することが可能である。
本発明は、ＮＯＲ−１タンパク質と結合し得る化合物を選択することを特徴とする、アレルギー性疾患治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。本方法においては、ＮＯＲ−１受容体タンパク質と被験化合物を接触させ、次いで、ＮＯＲ−１受容体タンパク質と被験化合物との結合活性を測定し、ＮＯＲ−１受容体タンパク質と結合する化合物を選択する。また、単に結合をするのみでなく、ＮＯＲ−１の転写活性を測定し、アゴニスト、アンタゴニストを選択する。
本方法におけるＮＯＲ−１受容体タンパク質には、その部分ペプチドも含まれる。上記方法におけるＮＯＲ−１受容体タンパク質と被検化合物との結合活性の測定は、当業者においては公知の方法を利用して実施することができる。
例えば、ＮＯＲ−１と結合する化合物がタンパク質である場合には、本発明のスクリーニング方法は、ウエストウエスタンブロッテイング法により行うことができる。具体的には、ＮＯＲ−１タンパク質と結合するタンパク質（被検タンパク質）を発現していることが予想される組織または細胞よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰＩＩなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定する。次いで、ＮＯＲ−１タンパク質をビオチンラベル化、あるいはＧＳＴタンパク質との融合タンパク質として精製し、これを上記フィルターと反応させ、被検タンパク質を発現しているプラークを、ストレプトアビジンや抗ＧＳＴ抗体などにより検出を行うことにより、結合活性を評価することができる。
また、本発明のアレルギー性疾患治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法の別の態様においては、下記の工程を含む。
（１）ＮＯＲ−１受容体タンパク質または該タンパク質のリガンド結合領域と転写調節タンパク質との融合タンパク質を発現し得るＤＮＡ、および該転写調節タンパク質の結合するＤＮＡ配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するＤＮＡ、を導入した細胞を提供する工程
（２）前記細胞と被検化合物を接触させる工程
（３）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
（４）前記活性を変化させる化合物を選択する工程
上記方法における「機能的に結合した」とは、ＮＯＲ−１受容体タンパク質または該タンパク質のリガンド結合領域が、該受容体タンパク質のリガンドもしくはリガンド様化合物と結合した際に、レポーター遺伝子が発現し得るように結合した状態を指す。上記方法における「転写調節領域結合タンパク質」としては、通常、ＧＡＬ４タンパク質を好適に使用することができる。また、上記「転写調節領域結合タンパク質の結合し得るＤＮＡ配列」としては、例えば、ＧＡＬ４結合ＤＮＡ領域を挙げることができる。さらに本発明の上記スクリーニング方法は、ハイスループットで行うことが可能である。
上記スクリーニング方法の好ましい態様としては、「ｔｗｏハイブリッドシステム」（例えば、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、文献「Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２」）を用いてスクリーニングを行うことができる。本発明の上記方法は、より具体的には、以下のようにして実施することができるが、この方法に特に限定されず、当業者においては、以下に例示した方法を適宜改変して実施することが可能である。
ｔｗｏ−ハイブリッドシステムにおいては、ＮＯＲ−１タンパク質またはその部分ペプチドを、通常、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＮＯＲ−１タンパク質またはその部分ペプチドと結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＮＯＲ−１タンパク質またはそのリガンド結合領域を含む部分ペプチドと結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を得ることができる。これによりＮＯＲ−１タンパク質またはその部分ペプチドに結合するタンパク質またはその遺伝子を調製することが可能である。ｔｗｏハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。ｔｗｏハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞等を使って行うこともできる。
本発明者らは、哺乳動物細胞を用いたｔｗｏハイブリッドシステムを応用して、ＮＯＲ−１タンパク質の転写活性化機能を上昇させるリガンドをスクリーニングすることが可能なハイスループット系を構築した。この系は、従来の哺乳動物におけるｔｗｏハイブリッドシステムを改良したものであり、この系の概略を図３に示す（詳細は後述の実施例を参照）。
本発明のスクリーニング方法は、好ましくは、上記の本発明者らによって開発されたハイスループット系を用いて行うことができる。ＮＯＲ−１は、他のサブファミリー（αとβ）とは異なり、転写活性にリガンド結合領域だけでなく、Ｎ末近傍のＡＦ１領域（図４）が重要であることが、本発明者らによって示唆された。従って、上記の方法における、ＧＡＬ４と融合タンパク質を形成させるＮＯＲ−１タンパク質は、リガンド結合領域だけではなく、全長タンパク質であることが好ましい。
ＮＯＲ−１は、アトピー性皮膚炎末梢血のような白血球が機能亢進した状態で発現誘導され、その結果として細胞にアポトーシスが誘導される可能性が高い。生体内に存在するリガンドは、核内受容体が高発現している場所に存在する可能性がある。そこで本発明者らは、このような条件で産生されると予想される低分子の脂溶性メディエーターをリガンド候補被検化合物として、上記の方法によりスクリーニングを行った。そして本発明者らは、脂溶性メディエーターの中から、リガンド活性物質として、プロスタグランジンＡ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、プロスタグランジンＡ１（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ１）、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ２（１６，１６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１５（Ｒ）−１５−メチルプロスタグランジンＡ２（１５（Ｒ）−１５−ｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ２（１６−ｐｈｅｎｏｘｙ  ｔｅｔｒａｎｏｒ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ２（１７−ｐｈｅｎｙｌ  ｔｒｉｎｏｒ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５  ｄｅｏｘｙ−ｄｅｌｔａ１２，１４−ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｊ２）、８−イソプロスタグランジンＡ１（８−ｉｓｏ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ１）等を取得することに成功した。これらの化合物は、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンである。このことは、本発明の方法によってＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の転写活性化機能をアップレギュレートするリガンド活性物質を実際に取得することが可能であることを示すものである。
ＮＯＲ−１タンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＮＯＲ−１タンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＮＯＲ−１タンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、ＮＯＲ−１タンパク質と結合したタンパク質を調製することができる。
取得したタンパク質は、例えば、該タンパク質のアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＮＯＲ−１タンパク質と被検化合物との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。従って、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりＮＯＲ−１タンパク質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
ＮＯＲ−１タンパク質と結合する化合物を単離することは、当業者においては通常行い得ることである。上記以外の方法として、例えば、固定したＮＯＲ−１タンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法等を示すことができる。
本発明による、候補化合物のＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルや転写活性化機構に与える影響を検出する方法に用いられる細胞、並びに該遺伝子の発現レベルを調べるためのポリヌクレオチド、あるいは抗体を組み合わせて、この方法のための検出用キットとすることができる。キットには、陽性対照や陰性対照として用いられる候補化合物や指示書を組み合わせることもできる。本発明に基づく候補化合物のＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルや転写活性化機構に与える影響を検出するためのキットは、例えば、ＮＯＲ−１遺伝子の発現レベルや転写活性化機構を修飾する化合物のスクリーニング用キットとして利用することができる。
本発明のスクリーニング方法に用いる被検候補化合物としては、特に制限されないが、例えば、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー等が挙げられる。また、本発明のＮＯＲ−１タンパク質と結合する化合物のスクリーニング方法においては、特に制限されないが、低分子の脂溶性メディエーターを被検候補化合物とすることが好まＬい。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。ＮＯＲ−１遺伝子は、アトピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加する。従って、この遺伝子の発現あるいは機能を増強することができる化合物には、アトピー性皮膚炎の症状を抑える作用が期待できる。また、本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、ＮＯＲ−１活性化とそれに伴う好酸球アポトーシス誘導という全く新しい作用機序を有するアレルギー性疾患治療薬となるものと期待される。従って本発明は、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬を提供する。なお上記化合物には、本発明のスクリーニング方法を用いて単離しうる化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される化合物も含まれる。上述のように、脂溶性メディエーターの中から、ＮＯＲ−１の転写活性化能を増強する化合物（ＮＯＲ−１のリガンド活性物質）として本発明者らにより、シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが見出された。従って、本発明のアレルギー性疾患治療薬として、例えば、本発明のスクリーニング方法によって得ることができるシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬を好適に挙げることができる。該プロスタグランジンの具体例としては、プロスタグランジンＡ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、プロスタグランジンＡ１（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ１）、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ２（１６，１６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１５（Ｒ）−１５−メチルプロスタグランジンＡ２（１５（Ｒ）−１５−ｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ２（１６−ｐｈｅｎｏｘｙ  ｔｅｔｒａｎｏｒ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ２（１７−ｐｈｅｎｙｌ  ｔｒｉｎｏｒ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２）、１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５  ｄｅｏｘｙ−ｄｅｌｔａ１２，１４−ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｊ２）、８−イソプロスタグランジンＡ１（８−ｉｓｏ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ１）等を挙げることができる。
また本発明のＮＯＲ−１受容体のリガンド活性を有する物質は、好酸球のアポトーシスを誘導し、抗アレルギー作用を有するものと考えられる。従って、本発明は、ＮＯＲ−１受容体のリガンドを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤、並びに、ＮＯＲ−１受容体のリガンドを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬を提供する。本発明のアポトーシス誘導剤は、好ましくは、好酸球のアポトーシス誘導剤である。
ＮＯＲ−１受容体のリガンドとしては、上記のシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジン、後述の表１４〜５８に掲載の化合物等を挙げることができる。その他、ＮＯＲ−１の転写に影響を与える化合物として例えば、文献『Ａｂａｙｒａｔｎａ  Ｗａｎｓａ  ＫＳ，Ｈａｒｒｉｓ  ＪＭ，Ｙａｎ  Ｇ，Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ  Ｐ，Ｍｕｓｃａｔ  ＧＥ，Ｔｈｅ  ＡＦ−１  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＮＯＲ−１／ＮＲ４Ａ３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ，ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｎｅ  ａｎｔｉ−ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ａｐｒ  ２２［Ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］』に記載の化合物を挙げることができる。
また、ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の合成リガンドは、当業者においてはＮＯＲ−１の立体構造とのドッキングスタディーから容易に推察され合成展開することが可能である。
「ドッキングスタディー」とは通常、受容体の立体構造に基づいた３Ｄクエリーファーマコファーモデルにより、数１０万個の化合物の３次元ＤＢの中から、リガンド結合ドメインにフィットする化合物やコンフォーメーションをコンピュータ上で探索することを言う。ドッキングスタディーは、例えば、以下の（１）〜（４）の手順に従って行われる。
（１）Ｍｏｄｅｌｅｒによるタンパクの３Ｄ構造の構築（ホモロジーモデル）
（２）Ｃ２．ＬｉｇａｎｄＦｉｔによる結合部位の検索
（３）Ｃ２・ＳＢＦによる結合部位のＰｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅクエリ構築
（４）Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅクエリによる３Ｄデータベースの検索
３Ｄ  Ｐｈａｒｍｏｃｏｐｈｏｒｅ検索に関する文献としては、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｉｕｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，２）−ＵＳ−ＩＳＢＮ：０９６３６８１７６１（Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ）Ｇｕｎｅｒ，Ｏｓｍａｎ  Ｆ．（Ｅｄｔ）／Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｌ  Ｕｎｉｖ  Ｌｉｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  １９９９／１２等を挙げることができる。
このような合成リガンドを有効成分として含有する薬剤もまた、本発明のアレルギー性疾患治療薬に含まれる。また、上記合成リガンドは被検候補化合物として、本発明の上記方法に供することにより、真のリガンドであるか否かを評価することも可能である。
また本発明者らは、本発明のＮＯＲ−１受容体の発現が好酸球内で特異的に誘導されることを初めて見出したことから、該受容体の低分子リガンドの探索を行った。より詳しくは、ファーマコフォアモデルにより、ＰＧＡ誘導体のＮＯＲ−１リガンド結合領域に対する結合位置をシミュレートし、ＰＧＡ誘導体のレポーター系における構造活性相関情報から、結合ポケットに適合するＰＧＡ誘導体以外の化合物をデータベースより選択した。従って、本発明のＮＯＲ−１受容体のリガンドとして、上記のようにして選択された化合物を挙げることができる。より具体的には表１４〜５８に掲載の化合物を示すことができる。これらの化合物は、本発明の受容体に対するアゴニスト抗体よりも、有用であるものと考えられる。
また本発明者らは、好酸球ＣＤ３０リガンド刺激によって、ＮＯＲ−１遺伝子の発現を上昇させることを見出した。本発明は、好酸球ＣＤ３０受容体のリガンドを含む、ＮＯＲ−１遺伝子の発現誘導剤を提供する。該発現誘導剤は、好酸球におけるＮｏｒ１の下流遺伝子の発現を制御することによって好酸球のアポトーシスを誘導することを機序とする、アレルギー性疾患治療薬となることが期待される。
本発明のアレルギー性疾患治療薬は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することも可能である。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。非経口剤としては、例えば、注射剤、座薬、塗り薬等を挙げることができる。注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
また本発明者らは、ＮＯＲ−１受容体タンパク質の発現が亢進することにより、細胞がアポトーシス誘導することを見出した。従って、細胞においてＮＯＲ−１タンパク質を活性化させることにより、アポトーシスを誘導させることが可能である。従って本発明は、細胞におけるＮＯＲ−１受容体タンパク質を活性化させることを特徴とする、細胞のアポトーシス誘導方法を提供する。上記方法には、ＮＯＲ−１遺伝子の発現を活性化させることにより、細胞のアポトーシス誘導を行う方法も含まれる。
本方法の好ましい態様においては、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンと細胞とを接触させることにより、アポトーシスの誘導を行う。本発明の上記方法における細胞は、好酸球細胞であることが好ましい。アトピー性皮膚炎の治療における寛解期において末梢血好酸球数が減少することが知られている。よって、本発明の方法を利用して好酸球を特異的に細胞死に導くことにより、アレルギー性疾患を治療することが可能と考えられる。即ち、本方法は、アレルギー性疾患の治療方法として有用である。
また、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンは、アポトーシスを誘導する作用があるものと考えられることから、本発明は、これら化合物を含有するアポトーシス誘導剤も提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、アトピー性皮膚炎患者（患者番号１〜７）の、増悪期と寛解期におけるβアクチンにより補正した２２５０−０１発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ  ＲＮＡ）を示す図である。
図２は、増悪期から寛解期に伴って好酸球数の減少する患者のみにおける、ＮＯＲ−１遺伝子のＯＲＦ部位で測定した発現量を示す図である。
図３は、本発明者らによって構築されたＮＯＲ−１受容体のリガンド探索系を模式的に示す図である。ＸにＮＯＲ−１の全長遺伝子またはリガンド結合部位、Ｙにｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＲＸＲ）αの全長遺伝子を挿入する。これらをＮＩＨ３Ｔ３細胞に遺伝子導入し、誘導されてくるルシフェラーゼの活性を測定する。
図４は、ＮＯＲ−１受容体タンパク質の構造を模式的に示す図である。
図５は、図３のシステムを用いたときのｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２およびｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ１のＮＯＲ−１転写活性化作用を示す図である。
図６は、ファーマコフォアモデルにより、ＰＧＡ誘導体のＮＯＲ−１リガンド結合領域に対する結合位置をシミュレートした、ガンマモデルにおける１５（Ｒ）−１５−メチル−プロスタグランジンＡ２（１５（Ｒ）−１５−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２  ｉｎ  ｇａｍｍａ  ｍｏｄｅｌ）の図である。
図７は、ＮＯＲ−１のＬＢＤ欠失変異体によるＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２の転写活性低下の結果を示すグラフである。△ＬＢＤが欠失変異体である。
図８は、ビアコアＳ５１を用いてＮＯＲ−１のＬＢＤにＰＧＡ１、ＰＧＡ２が結合する様子を捉えた図である。ＧＳＴを比較対照として用いた。１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ＰＧＡ２をネガティブコントロールとして使用した。
図９は、抗ＣＤ３０抗体または抗Ｆａｓ抗体によって、末梢血好酸球をアポトーシス刺激した場合のＮＯＲ−１の発現誘導結果を示すグラフである。ｂｅｔａ−アクチン補正値、ＧＡＰＤＨ補正値を示す。
図１０は、好酸球特異的細胞株であるＡＭＬ１４．３Ｄ１０を抗ＣＤ３０抗体、抗Ｆａｓ抗体で処理した場合のアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
図１１は、好酸球特異的細胞株であるＡＭＬ１４．３Ｄ１０を抗ＣＤ３０抗体または抗Ｆａｓ抗体で処理した場合のＮＯＲ−１の発現誘導を示すグラフである。
図１２は、Ｎｏｒ１を含む核内受容体Ｎｕｒサブファミリーによる好酸球細胞死によるアレルギー疾患治療の作業仮説を示す図である。
図１３は、ＮＯＲ−１トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの写真である。トランスジェニックマウスの特徴としては、体重が半分にまで減少すること、胸腺萎縮、脾臓萎縮などが観察された。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ディファレンシャルディスプレイ解析
アトピー性皮膚炎の同一患者における増悪期と、薬物治療その他による寛解期の末梢血より単離した血球細胞を比較して、発現変動している新しい治療関連遺伝子あるいは診断に有用な遺伝子を見出すことを目的としてスクリーニングを行った。
（１）被検者
血液を採取した７例のアトピー性皮膚炎患者のプロフィールを表２に示す。アレルゲン非特異的（Ｔｏｔａｌ  ＩｇＥ）、ダニおよびスギ特異的ＩｇＥはＥＩＡ法により測定した。すなわち、抗ヒトＩｇＥ抗体を結合させたキャップに被検血清を反応させ、血清中のアレルゲン非特異的ＩｇＥ抗体、またはダニ、スギ特異的ＩｇＥ抗体を結合させた。次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体と基質液（４−メチルウンベルフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加え、反応させて蛍光物質を生成させた。反応停止液を加えて反応を停止させ、同時測定の標準ＩｇＥの蛍光強度より抗体濃度を決定した。ＬＤＨの測定は、ＵＶ法（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ−Ｌａ  Ｄｕｅ法）により、ピルビン酸とＮＡＤＨの反応によるＮＡＤＨの減少速度を吸光度の減少から算出した。ＬＤＨ値の測定には、ＬタイプワコーＬＤＨ（和光純薬）と７１７０型自動分析装置（日立）を用いた。好酸球数は、ＥＤＴＡ添加血液２ｍｌを試料として鏡検法と自動血球分析装置ＳＥ−９０００（ＲＦ／ＤＣインピーダンス方式、Ｓｙｓｍｅｘ製造）により測定した。
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（２）ディファレンシャルディスプレイ解析
患者から採取した全血に３％デキストラン溶液を加えて３０分室温放置し、赤血球を沈降させた。上層の白血球画分を回収し、フィコール溶液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ；アマシャムファルマシアバイオテク）の上に載せて１５００ｒｐｍ、３０分室温で遠心した。下層に回収された顆粒球画分をＣＤ１６抗体磁気ビーズと４℃で３０分反応させ、ＭＡＣＳを用いた分離でトラップさせずに溶出する細胞を好酸球として実験に用いた。
上記のように調製した好酸球をＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、この溶液から、Ｉｓｏｇｅｎに添付されているプロトコルに従ってＲＮＡを分離した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。回収した全ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ（日本ジーン；和光純薬）を加えて３７℃１５分反応させ、フェノール−クロロホルム抽出してエタノール沈殿でＲＮＡを回収した。
このように調製した全ＲＮＡを用いて蛍光ディファレンシャルディスプレイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ，「ＤＤ」と略記する）解析を行った。ＤＤ解析は文献（Ｔ．Ｉｔｏら，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５１：２３１−２３６）に記載の方法に準じて行った。まず全ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得た。第一次ＤＤ−ＰＣＲ反応用には３種のアンカープライマーの各々について全ＲＮＡの各０．２μｇを用いてｃＤＮＡを調製した。第二次ＤＤ−ＰＣＲ反応用には、３種のアンカープライマーの各々についてＲＮＡ  ０．４μｇを用いてｃＤＮＡを調製した。いずれのｃＤＮＡも、０．４ｎｇ／μｌ  ＲＮＡ相当の最終濃度に希釈し、実験に用いた。１反応あたり１ｎｇ  ＲＮＡ相当のｃＤＮＡを用いてＤＤ−ＰＣＲ反応を行った。反応液の組成は表３の通りである。
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ＰＣＲの反応条件は、「９５℃３分、４０℃５分、７２℃５分」を１サイクル、続いて、「９４℃１５秒、４０℃２分、７２℃１分」を３０サイクルの後、７２℃５分、その後連続的に４℃にした。
使用したプライマー対はアンカープライマーであるＧＴ１５Ａ（配列番号：３）、ＧＴ１５Ｃ（配列番号：４）、およびＧＴ１５Ｇ（配列番号：５）に対して任意プライマーをそれぞれＡＧ  １〜１１０、ＡＧ  １１１〜１９９、およびＡＧ  ２００〜２８７を組み合わせ、計２８７組の反応をおこなった。なお、任意プライマーとしてはＧＣ含量５０％の１０ヌクレオチドからなるオリゴマーを設計し、合成して用いた。
ゲル電気泳動は、６％変性ポリアクリルアミドゲルを作製し、２．５μｌの試料をアプライし、４０Ｗで２１０分間泳動した。その後、日立製蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ  ＩＩを用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出によって泳動画像を得た。
増悪期及び寛解期の両サンプルを並べて泳動し、ほとんどの患者で同方向に発現が変動している遺伝子バンドを目で判定し、切り取ってＴＡクローニングおよび配列決定を行った。その結果、増悪期に比べ寛解期に有意に発現の亢進するＤＮＡ配列（ＤＤ解析のバンドＩＤ  ２２５０−０１；以後、この配列を「２２５０−０１」と称す）を見出した。バンドＩＤ  ２２５０−０１の増幅に用いたプライマーセットを以下に示す。
バンドＩＤ：２２５０−０１
断片の長さ：４２１ｂｐ（プライマーの配列を除く）
アンカープライマー：ＧＴ１５Ｃ
任意プライマーの名前：ＡＧ００１６４
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（３）発現解析
２２５０−０１の発現量を定量的に確認するために、同一臨床サンプルを用いてさらにＡＢＩ  ７７００による定量的ＰＣＲを行った。ＡＢＩ  ７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ディファレンシャルディスプレイ法によって得られた配列情報からＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識されている
・２２５０−０１フォーワードプライマー
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・２２５０−０１リバースプライマー
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・２２５０−０１  ＴａｑＭａｎプローブ
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鋳型には全ＲＮＡからポリＴ（１２〜１８ｍｅｒ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを用いた。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表４に示した。
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また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子の定量には、ヒトｃＤＮＡを鋳型として用いた。
βアクチン測定用のプライマーとプローブは、ＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥバイオシステムズ）に添付のものを用いて行った。塩基配列は以下の通りである。βアクチンにより補正した「２２５０−０１」発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ  ＲＮＡ）を表５および図１に示す。
・βアクチンフォーワードプライマー
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・βアクチンリバースプライマー
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・βアクチンＴａｑＭａｎプローブ
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（４）統計解析
上記のデータを利用して、パラメトリック多重比較検定、およびノンパラメトリック多重比較検定を行った。上記のアトピー性皮膚炎患者７例の内４例（患者番号１，２，３，５）については，治療による寛解期への移行に伴って好酸球数が顕著に減少する。血中好酸球数は，アトピー性皮膚炎の有用な臨床指標となっている。そこで、寛解期への移行に伴って好酸球数が顕著に減少する患者試料（患者番号１，２，３，５）（ｎ＝４）４例のみについても統計的に解析した。統計解析は、Ｔｈｅ  ＳＡＳ  ＳＹＳＴＥＭのＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ  ４．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。結果を表６に示す。
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その結果、上記のアトピー性皮膚炎患者７例中３例の患者（患者番号１，３，５）において、２２５０−０１の発現の著しい上昇が観察された。この３例の患者は、治療による寛解期への移行に伴って好酸球数が顕著に減少する４例（表２参照）の患者に含まれていた。血中好酸球数は、アトピー性皮膚炎の有用な臨床指標となっている。そこで、寛解期への移行に伴って好酸球数が顕著に減少するこれら４例の患者試料（患者番号１，２，３，５）（ｎ＝４）の２２５０−０１の発現量の変化を統計的に解析した。統計解析は、Ｔｈｅ  ＳＡＳ  ＳＹＳＴＥＭのＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ  ４．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。
その結果、増悪期に比べ寛解期で有意に発現が上昇することが確認された（ｐ＝０．０５７２）。逆に好酸球の減少が見られない患者には、発現の著しい低下が見られた（患者番号４，６）。以上の知見は、２２５０−０１がアトピー性皮膚炎の寛解期における好酸球の減少に伴って、発現が上昇することを示している。
［実施例２］各種血液細胞での２２５０−０１の発現
５人の健常人の末梢血から分離した細胞での２２５０−０１の発現を調べた。好酸球（Ｅ）の分離は上記の通り行った。好中球（Ｎ）は好酸球を溶出させた後、ＣＤ１６抗体磁気ビーズでトラップされた細胞を磁界から外して溶出、回収して調製した。一方、フィコール遠心分離で中間層に回収される単球画分を、ＭＡＣＳ  ＣＤ３抗体磁気ビーズにより溶出画分（Ｍ：ｍｏｎｏｃｙｔｅとＢ  ｃｅｌｌの混合物）とトラップされる画分（Ｔ  ｃｅｌｌ画分）に分離した。次に、溶出画分をＭＡＣＳ  ＣＤ１４抗体磁気ビーズにより、溶出画分（Ｂ  ｃｅｌｌ画分）とトラップされる画分（ｍｏｏｃｙｔｅ画分）に分け、それぞれを精製Ｔ細胞、精製Ｂ細胞、そして精製単球とした。
好酸球はＩｓｏｇｅｎ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、そして単球はＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可溶化し、全ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理後（方法は前述の通り）遺伝子発現解析に供した。用いたプライマー、プローブ等は上記と同一である。これらの血球細胞での平均発現量（ＡＶＥＲＡＧＥ：ｃｏｐｙ／ｎｇ（補正値））は以下の通りであった。
好酸球（Ｅ）：９６０
好中球（Ｎ）：７３
好塩基球（Ｂ）：３６
Ｔ細胞（Ｔ）：１１
単球（Ｍ）：１０３
この結果は、２２５０−０１が好酸球特異的に発現していることを示している。
［実施例３］塩基配列の伸長
実施例１で決定した塩基配列に基づいて、５’ＲＡＣＥ法により２２５０−０１の塩基配列解析を進めた。さらに、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）により末梢血好酸球ＲＮＡから作製したファージｃＤＮＡライブラリーを用いて、プラークハイブリダイゼーションによるクローニングを行った。２２５０−０１の配列内に設計したプライマー２２５０−０１Ｆ及び２２５０−０１Ｒを用いて２２５０−０１の配列を含むプラスミドを鋳型に増幅後、精製した２５９ｂｐのＰＣＲ産物をプローブとして用いた。その結果２２５０−０１の配列を含む約２ｋｂのインサートを持つクローンが得られた。決定した塩基配列２０８７ｂｐを配列番号：１５に示す。ゲノムデータベース解析の結果、この配列はＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）と呼ばれる核内オーファン受容体のイントロン部分であることが分かった。
・プライマー配列
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［実施例４］ＮＯＲ−１遺伝子の発現解析
ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の報告されているエクソン配列について７７００による発現測定を行った。ＴａｑＭａｎ法に使用したプライマーおよびプローブは次の通りである。
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その結果、イントロン部分で測定したときの結果と同様に、好酸球減少のみられた著効例の寛解期に誘導されるという傾向は再現した（図２）。
アトピー性皮膚炎の、治療による寛解期に末梢血好酸球でこのようなアポトーティックな性格が示唆されるような遺伝子が亢進しているのは、末梢血好酸球数の減少とよく対応しており、この遺伝子の発現誘導は治療効果と相関する可能性が高いと考えられる。
［実施例５］ＮＯＲ−１受容体リガンドの探索
好酸球を特異的に細胞死に導く経路を、ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の機能の増強を通じて促進することは、喘息のみでなく、本発明者らが調べたアトピー性皮膚炎も含めた種々のアレルギー性疾患の治療に繋がる可能性が高い。ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）は構造上核内受容体であるが、オーファン受容体であり生体内リガンドや活性化物質はまだわかっていない。もしもそれらが見出されれば、好酸球細胞内でダイレクトにＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）を活性化しアポトーシスを促進させることができる。従って、リガンド活性物質は抗アレルギー薬としての可能性が高いと考え、リガンドスクリーニングのためのハイスループット系を構築した。
Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄのシステムを若干改変し、図３のように、ｐＢＩＮＤの中にＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）のリガンド結合領域配列または全長遺伝子（図４）を挿入し、ＮＯＲ−１とＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域がｉｎ  ｆｒａｍｅで融合したタンパク質が発現されるようにした。ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の場合は、他のサブファミリー（αとβ）と異なり、転写活性にＮ末に近いＡＦ１領域が重要であることが推察され、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｈｙｂｒｉｄシステムにおいてもリガンド結合領域だけでなく全長遺伝子を挿入することが必要であることが分かった。実際、リガンド結合領域のみを組み込んだスクリーニング系では、哺乳類のメタボリックマップ上に存在する、生体内リガンドの可能性のあるどのような脂溶性代謝物にも活性が見出されなかった。ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の全長遺伝子をｐＢＩＮＤに挿入したプラスミドとＧＡＬ４結合サイトをもったルシフェラーゼレポータープラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞にコトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を自動測定した。この系にさらに低分子物質を加えて、転写増強活性でスクリーニングを行うことができる。
ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）は、アトピー性皮膚炎末梢血のような白血球が機能亢進した状態で発現誘導され、その結果として細胞にアポトーシスが誘導される可能性が高い。生体内に存在するリガンドは、核内受容体が高発現している場所に存在する可能性がある。そこで、このような条件で産生されると予想される低分子の脂溶性メディエーターをリガンド候補としてアッセイ系に加え、ルシフェラーゼ活性の増強作用で評価した。脂溶性メディエーターの中から、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ１、１５（Ｒ）−１５−ｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２、１６−ｐｈｅｎｏｘｙ  ｔｅｔｒａｎｏｒ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２、１７−ｐｈｅｎｙｌ  ｔｒｉｎｏｒ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２等のシクロペンテノン構造をもったプロスタグランジンに、ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の転写活性化能を増強させる作用があることを見出した（図５、表７〜１３）。このように本発明者らの確立した方法によって、ハイスループットでＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の生体内リガンド及び合成リガンドを発見する道が開かれたとともに、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ１等の化合物およびその近辺の代謝物が、ＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ）の真の生体内リガンドとしての可能性が高いことが明らかになった。
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［実施例６］バーチャル化合物
ファーマコフォアモデルにより、ＰＧＡ誘導体のＮｏｒ１リガンド結合領域に対する結合位置をシミュレートし（図６）、ＰＧＡ誘導体のレポーター系における構造活性相関情報から、結合ポケットに同様にはまるＰＧＡ誘導体以外の化合物をカタリストＤＢにより選択した（ＢｉｏＢｙｔｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｉｌｅ  ２００１  ３９，３８３化合物、２，１９８，６４６  ｃｏｎｆｓよりスクリーニング）。シミュレーションの結果、強く結合する化合物として選ばれてきた１５５化合物のリスト（含む構造式）を表１４〜４９、次に選ばれてきた２８１化合物のリストを表５０〜５８に示す。
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［実施例７］ＬＢＤ欠失変異体（ＬＢＤ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）による活性低下
Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄレポーター系において、Ｎｏｒ１のＬＢＤ領域を完全に欠失させた遺伝子を導入したところ、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２による転写活性は顕著に抑制された（図７）。したがって、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ａ２は実際にこれらの核内受容体のＬＢＤ領域に作用して働いていることが示唆された。
［実施例８］ビアコアによるＰＧＡ誘導体のＮｏｒ１への結合の証明
Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄレポーター系において明らかになった、Ｎｏｒ１に対するＰＧＡ誘導体のリガンド結合活性を完全証明するために、Ｎｏｒ１のＧＳＴ−ＬＢＤを大腸菌で発現させ精製した。ビアコアＳ５１を用い、ＧＳＴとの比較対照のもと、Ｎｏｒ１のＬＢＤにＰＧＡ１、ＰＧＡ２が結合している様子を捉えることができた（図８）。レポーターで活性のなかったネガティブコントロール化合物の１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ＰＧＡ２ではＬＢＤに結合しなかった。
【実施例９】  アトピー性皮膚炎の、治療による寛解期に末梢血好酸球でこのようなアポトーティックな性格が示唆されるような遺伝子が亢進しているのは、末梢血好酸球数の減少とよく対応しており、この遺伝子の発現誘導は治療効果と相関する可能性が高いと考えられる。そこで、どのような刺激でこの遺伝子が好酸球から発現されるかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べた。
健常人から末梢血好酸球を大量に採取し、シャーレでの活性化を抑えて浮遊培養させ、ＩＬ−５やＩＬ−４などのサイトカイン刺激で活性化させたが、Ｎｏｒ１の誘導はみられなかった。それに対し、好酸球に特異的な細胞内経路でアポトーシスを誘導させ、喘息などの治療薬として可能性があることから最近注目されている好酸球ＣＤ３０に対するアゴニスト活性をもった抗ＣＤ３０抗体で、細胞をアポトーシス刺激すると、１−３時間の処理の間に培養末梢血好酸球中でＮｏｒ１が劇的に誘導されることが明らかになった（表５９、図９）。以下の表５９は、ヒト末梢血好酸球のアポトーシス誘導についてまとめたものである。
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抗Ｆａｓ抗体では、抗ＣＤ３０抗体より反応が遅いながらアポトーシスが起こるにも関わらず、Ｎｏｒ１の誘導がかからなかったので、これまでとは違った好酸球特異的アポトーシス経路の可能性がある。これらの現象（アポトーシス誘導及びＮｏｒ１の発現誘導）は、好酸球特異的細胞株であるＡＭＬ１４．３Ｄ１０を抗ＣＤ３０抗体で処理したときも同様に観察された（図１０、１１）。
この、好酸球を特異的に細胞死に導く経路を、Ｎｏｒ１の機能の増強を通じて促進することは、喘息のみでなく、本発明者らの調べたアトピー性皮膚炎も含めた種々のアレルギー疾患の治療に繋がる可能性が高い。本発明者らの意図する治療戦略の一例を図１２に示す。
［実施例１０］トランスジェニック（ＴＧ）マウスの確立
ヒトＮｏｒ１遺伝子をアクチンプロモーターで導入したＴＧマウスの確立に成功した（図１３）。このマウスは、体重が野生株の半分しかなく、胸腺、脾臓の萎縮が観察された。脾臓細胞数が減少し、その機能も低下していた。Ｎｏｒ１を介したアレルギー疾患解析の動物モデルとして使用できる。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、アトピー性皮膚炎患者の増悪期と寛解期とで好酸球において発現に差の見られる遺伝子が提供された。本発明の遺伝子の発現を指標にすることにより、アレルギー性疾患の検査、および治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能となった。
本発明におけるアレルギー性疾患関連遺伝子は、アレルゲンの種類にかかわらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。従って、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、末梢血好酸球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。従って本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味で本発明の方法の診断的価値は高い。
更に、本発明のスクリーニング方法は、アトピー性皮膚炎の代表的な臨床マーカーである好酸球の増減と密接に関連する遺伝子機能を指標として実施される。従って、このスクリーニング方法によって見出すことができる化合物は、幅広いアレルギーの病態制御に有用であると期待できる。
また本発明により提供されるアレルギー性疾患治療薬は、ＮＯＲ−１の活性化とそれに伴う好酸球のアポトーシス誘導という全く新しい作用機序をもった医薬品として有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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