(57)【要約】Ｌ−スレオニンを生産するエシェリヒア属する細菌であって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された細菌を用いて、Ｌ−スレオニンを生産する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−スレオニンを生産するエシェリヒア属する細菌であって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された細菌。
【請求項２】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現量が上昇することによりアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を上昇させるか、又は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強するように同遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記遺伝子を含む低コピー数ベクターによる前記細菌の形質転換により、前記コピー数が上昇した請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である請求項２〜４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６】
前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が、以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質をコードする請求項５に記載の細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む請求項５に記載の細菌：
（ａ）配列番号１の塩基番号１〜１１９６の塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基番号１〜１１９６の塩基配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、６０℃で洗浄が行われる条件である、請求項７に記載の細菌。
【請求項９】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性なアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ホモセリンキナーゼをコードする、ｔｈｒＢ遺伝子、スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子、及び、膜貫通タンパク質と予想されるタンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子の発現が増強されるようにさらに改変された請求項１〜８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１０】
変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子、ｔｈｒＣ遺伝子、及びｒｈｔＡ遺伝子の発現量が上昇するように改変された請求項９に記載の細菌。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養して、培地中にＬ−スレオニンを生成、蓄積させ、同培地からＬ−スレオニンを採取することを特徴とするＬ−スレオニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はバイオテクノロジー、具体的には発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法に関し、さらに具体的には、細菌エシェリヒア・コリ由来の遺伝子に関する。該遺伝子はＬ−アミノ酸、例えば、Ｌ−スレオニンの生産性の向上に有用である。
背景技術
従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界より得られる微生物の菌株、または同微生物をＬ−アミノ酸生産能を増強させるために改変された変異株を用いた発酵法により、工業的に生産されている。
Ｌ−アミノ酸生産能を増強するために、例えば、組換えＤＮＡによる形質転換によって微生物の生合成遺伝子を増幅させる方法が用いられてきた（例えば、米国特許４，２７８，７６５を参照）。これらの技術は、アミノ酸生合成系酵素の活性上昇および／または生成するＬ−アミノ酸もしくはその副生物によるフィードバック阻害に対する標的酵素の脱感作に基づいている（例えば、特開昭５６−１８５９６（１９８１）、国際公開ＷＯ９５／１６０４２、または米国特許５，６６１，０１２および６，０４０，１６０参照）。
発酵法によるＬ−スレオニンの生産に用いられる種々の菌株が知られている。すなわち、Ｌ−スレオニン生合成に関与する酵素の活性を増加させた菌株（米国特許第５，１７５，１０７号、第５，６６１，０１２号、第５，７０５，３７１号、第５，９３９，３０７号、欧州特許第０２１９０２７号）、Ｌ−スレオニンおよびそのアナログ等の化学物質に耐性な菌株（国際公開第ＷＯ０１１４５２５Ａ１号、欧州特許第３０１５７２Ａ２号、米国特許第５，３７６，５３８号）、生成したＬ−アミノ酸又はその副生物によるフィードバック阻害に対して脱感作された標的酵素を有する菌株（米国特許第５，１７５，１０７号、第５，６６１，０１２号）、不活性化したスレオニン分解酵素を有する株（米国特許第５，９３９，３０７号、第６，２９７，０３１号）が知られている。
既知のスレオニン生産株であるＶＫＰＭ  Ｂ−３９９６株（米国特許第５，１７５，１０７号および第５，７０５，３７１号）は、現時点で最良のスレオニン生産株である。ＶＫＰＭ  Ｂ−３９９６株の構築のため、親株であるエシェリヒア・コリ  Ｋ−１２（ＶＫＰＭ  Ｂ−７）に種々の変異及び後述のプラスミドが導入された。変異型ｔｈｒＡ遺伝子（変異型ｔｈｒＡ４４２）は、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性なアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードしている。変異型ｉｌｖＡ遺伝子（変異ｉｌｖＡ４４２）は、低活性のスレオニンデアミナーゼをコードしているため、イソロイシン生合成が低下し、イソロイシン飢餓というリーキーな表現型を示す。ｉｌｖＡ４４２変異を持つ細菌では、ｔｈｒＡＢＣオペロンの転写はイソロイシンによって抑制されないため、スレオニン生産に非常に有効である。ｔｄｈ遺伝子の不活性化は、スレオニン分解を抑制する。スクロース同化の決定遺伝子（ｓｃｒＫＹＡＢＲ遺伝子）が、前記菌株に導入された。さらにスレオニン生合成を制御する遺伝子群の発現を増加させるため、変異スレオニンオペロンｔｈｒＡ４４２ＢＣを持つプラスミドｐＶＩＣ４０が中間体菌株であるＴＤＨ６に導入された。同菌株の発酵中に蓄積したＬ−スレオニンの量は、８５ｇ／Ｌに達した。
本発明者らは、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について、最小培地中における高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性に関与する変異であるｔｈｒＲ（ここではｒｈｔＡ２３と呼ぶ）を有する変異株を取得している（Ａｓｔａｕｒｏｖａ，Ｏ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１，６１１−６１６（１９８５））。この変異によって、ＶＫＰＭ−３９９６株のような、Ｌ−スレオニン（旧ソ連特許９７４８１７）、ホモセリンおよびグルタミン酸（Ａｓｔａｕｒｏｖａ，Ｏ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，５５６−５６１，１９９１、ＥＰ  １０１３７６５  Ａ）を生産するエシェリヒア・コリの、それぞれのアミノ酸生産能が向上した。
さらに、本発明者らは、ｒｈｔＡ遺伝子が、グルタミン輸送系の構成成分をコードするｇｌｎＨＰＱオペロンに近接するのエシェリヒア・コリ染色体上１８分に存在すること、および、ｒｈｔＡ遺伝子がｐｅｒＢとｏｍｐＸ遺伝子の間に位置するＯＲＦ１（ｙｂｉＦ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＡ２１８５４１，ｇｉ：４４０１８１の７６４から１６５１番）と同一であることを明らかにしている。ＯＲＦ１によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、ｒｈｔＡ（ｒｈｔ：ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性））と称されている。また、本発明者らは、ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンからマイナス１位におけるＧからＡへの置換であることを見い出した（ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ  ｏｆ  １７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  １９９７  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ａｕｇｕｓｔ  ２４−２９，１９９７，ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．４５７，ＥＰ  １０１３７６５  Ａ）。
スレオニン生合成の主経路が研究され、大幅に最適化された状態においては、アスパラギン酸のようなスレオニンの遠位前駆体を細菌に加える量を増加させることで、スレオニン生産株のさらなる改良を行うことができる。
アスパラギン酸が、アスパラギン酸ファミリーに属するアミノ酸（スレオニン、メチオニン、リジン）、または細菌の細胞壁の構成成分であるジアミノピメリン酸の合成のための炭素供給源であることは既に知られている。これらの合成は、いくつかの分岐点を有し、極めて鋭敏な調節機構を有する複雑な経路により行われる。アスパラギン酸、アスパラギン酸セミアルデヒド、ホモセリンの分岐点においては、この生合成ステップに由来する多くのアミノ酸が存在するように、同様に多くのアイソザイムが存在する。ｔｈｒＡＢＣオペロンの一部によりコードされるアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩは、スレオニン生合成経路の第一および第三の反応を行う。スレオニンおよびイソロイシンは、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの発現を制御し、スレオニンは前記反応を触媒する活性の両方を阻害する（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ  ｉｎ  Ｃｈｉｅｆ：Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９９６）。
アスパラギン酸の合成には二つの遺伝子が関与する。すなわち、ａｓｐＣ遺伝子によってコードされるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）、および、ａｓｐＡ遺伝子の産物であるアスパルターゼである。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、オキサロ酢酸をアスパラギン酸に変換する。アスパルターゼはフマル酸をアスパラギン酸に変換する。
アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の一つであるＬ−リジンの生成に対する、ａｓｐＣ遺伝子増幅の効果が示されている。ａｓｐＣ遺伝子の増幅は、エシェリヒア・コリによるＬ−リジン生産に用いられている（米国特許第６，０４０，１６０号）。アスパルトキナーゼを保持し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを含む数種の酵素をコードするＤＮＡの発現が増強されたコリネ型細菌が、Ｌ−リジン生産に用いられている（米国特許第６，００４，７７３号）。
また、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、コリネ型細菌によるＬ−スレオニンおよびＬ−リジンの生産に有用であることが知られている（米国特許４，９８０，２８５）。
しかし今日まで、Ｌ−スレオニン生産において、アスパルギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強されたエシェリヒア属細菌を使用したという報告はなされていない。
発明の開示
本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌の生産性を増強すること、および、これらの株を用いたＬ−スレオニンの製造法を提供することを課題とする。
上記課題は、低コピー数のベクターにクローン化されたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子が、Ｌ−スレオニン生産能を増強し得ることを見出すことにより、達成された。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−スレオニンを生産するエシェリヒア属する細菌であって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された細菌。
（２）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現量が上昇することによりアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強された（１）に記載の細菌。
（３）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を上昇させるか、又は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強するように同遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強された（１）に記載の細菌。
（４）前記遺伝子を含む低コピー数ベクターによる前記細菌の形質転換により、前記コピー数が上昇した（３）に記載の細菌。
（５）前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（２）〜（４）のいずれかに記載の細菌。
（６）前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が、以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質をコードする（５）に記載の細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（７）前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む（５）に記載の細菌：
（ａ）配列番号１の塩基番号１〜１１９６の塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基番号１〜１１９６の塩基配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、６０℃で洗浄が行われる条件である、（７）に記載の細菌。
（９）スレオニンによるフィードバック阻害に耐性なアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ホモセリンキナーゼをコードする、ｔｈｒＢ遺伝子、スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子、及び、膜貫通タンパク質と予想されるタンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子の発現が増強されるようにさらに改変された（１）〜（８）のいずれかに記載の細菌。
（１０）変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子、ｔｈｒＣ遺伝子、及びｒｈｔＡ遺伝子の発現量が上昇するように改変された（９）に記載の細菌。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載の細菌を培地中で培養して、培地中にＬ−スレオニンを生成、蓄積させ、同培地からＬ−スレオニンを採取することを特徴とするＬ−スレオニンの製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、Ｌ−スレオニンを生産するエシェリヒア属する細菌であって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された細菌である。
本発明に使用することのできるエシェリヒア属細菌は、特に制限されないが、例えばＮｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．らにより記載されている細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１２０８，Ｔａｂｌｅ  １）が挙げられる。
本明細書において、「Ｌ−スレオニンを生産する細菌」とは、本発明の細菌を培地で培養したときに、同培地中にＬ−スレオニンを蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−スレオニン生産能は、育種によって付与又は増強され得る。
「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性」という用語は、ピリドキサル５’−リン酸を用いて、オキサロ酢酸及びＬ−グルタミン酸からＬ−アスパラギン酸を生成し、α−ケトグルタル酸を遊離する反応を触媒する活性を意味する。
「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された」という用語は、細胞当たりの活性が、非改変株、例えば野生株の活性よりも高くなったことを意味する。例えば、細胞当たりのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ分子の数が上昇する場合、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ分子当たりの比活性が上昇する場合等が挙げられる。さらに、比較対照としての野生株としては、例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２が挙げられる。細胞内のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が増強される結果、培地に蓄積するＬ−スレオニンの量が上昇するという効果が得られる。
細菌細胞内のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増強は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を増強することによって達成することができる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子としては、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子、及び、コリネ型細菌等のような他の細菌に由来する遺伝子のいずれも用いることができる。これらの遺伝子の中では、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子が好ましい。
エシェリヒア・コリのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるａｓｐＣはすでに明らかにされている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＣ  ０００９１３．１，ｇｉ：１６１２８８９５の配列の９８３７４２〜９８４９３２番）。したがって、ａｓｐＣ遺伝子は、同遺伝子の配列に基づいて調製したプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション：Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）によって取得することができる。同様にして、他の微生物のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を取得することができる。
エシェリヒア・コリを起源とするａｓｐＣ遺伝子は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
ここで、「数個」のアミノ酸の数は、前記タンパク質の三次元におけるアミノ酸残基の位置または種類により異なる。この数は、タンパク質（Ａ）においては、２〜３０、好ましくは２〜１５、さらに好ましくは２〜５であり得る。これは、以下の理由による。いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そのようなアミノ酸の相違はタンパク質の三次元構造およびその活性にさほど影響を及ぼさない。そのため、タンパク質（Ｂ）は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを構成する全アミノ酸残基に対して、３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上の相同性を持ち、かつ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するものであってもよい。
上述のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えばアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（配列番号２）の塩基配列を、例えば部位特異的変異法により、１又は２以上の特定部位のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加を含むように改変することにより、取得することができる。上記のような改変されたＤＮＡは、一般に知られた変異処理法によっても取得することができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミンで処理する方法、または同ＤＮＡを保持する細菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸等の変異剤によって処理する方法が挙げられる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、取得することができる。また、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、変異を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ又はそれを保持する細胞から、例えば、配列表に配列番号１として示す塩基配列を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより取得することができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。この条件を数値で明確に表すことは困難であるが、例えば、ストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、互いに５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の通常の条件、すなわち、６０℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ相当する塩濃度で、ＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が例示される。
プローブとしては、配列番号１の塩基配列の部分配列もまた使用することができる。そのようなプローブは、プライマーとして配列番号１の塩基配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチド、および、鋳型として配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ断片を用いたＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐ長のＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合、ハイブリダイゼーションの洗浄条件は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳを含む。
上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または付加には、例えば、個体における差異、又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを有する細菌の種もしくは属における差異により、天然に生じる変異（ミュータントまたはバリアント）も含まれる。
タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換とは、例えば、通常の方法により、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強し、細菌細胞内の同タンパク質の活性を増強するために、前記ＤＮＡを細菌細胞へ導入することを意味する。
遺伝子発現を増強させる方法には、遺伝子コピー数を増加させる方法が含まれる。エシェリヒア属細菌中で機能するベクターに遺伝子を導入することにより、遺伝子のコピー数が増加する。そのような目的のため、低コピー数のベクターが好適に用いられ得る。低コピー数のベクター例としては、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９等が挙げられる。
また、遺伝子発現の増強は、例えば、相同組換えなどの方法により、細菌染色体に遺伝子を多コピーで導入することによっても達成できる。形質転換の方法としては、これまで報告されている公知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２で報告されている、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し、ＤＮＡの透過性を上昇させる方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））を採用することができる。
一方、遺伝子発現の増強は、本発明のＤＮＡを強力なプロモーターの制御下に置くことによっても達成し得る。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ラムダファージのＰＲ、ＰＬプロモーターは、強力なプロモーターとして知られている。強力なプロモーターの使用は、遺伝子コピー数の増幅と組み合わせてもよい。
また、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加するようにプロモーターに変異を導入することによっても、プロモーターを増強することができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサー領域のいくつかの塩基、特に、開始コドンのすぐ上流の塩基の置換が、ｍＲＮＡ翻訳能に大きな影響を及ぼすことが知られている。例えば、開始コドンの前の３つのヌクレオチドの性質に応じて、発現レベルが２０倍の範囲で変化することが見い出されている（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｏｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，３６５−４０３，１９８１；Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，６２３−６２９，１９８４）。本発明者らは、以前に、ｒｈｔＡ２３変異は、ＡＴＧ開始コドンからマイナス１位におけるＧからＡへの置換であることを示している（ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ  ｏｆ  １７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  １９９７  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ａｕｇｕｓｔ  ２４−２９，１９９７，ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．４５７）。それによって、ｒｈｔＡ２３変異は、ｒｈｔＡ遺伝子の発現を増強し、その結果、スレオニン、ホモセリン、および細胞外に輸送される他のいくつかの物質に対する耐性を増強することが示唆される。
さらに、細菌の染色体上のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター領域に、強力なプロモーターに改変されるような変異を導入してもよい。発現調節配列の改変は、例えば、国際公開ＷＯ００／１８９３５及び特公平１−２１５２８０に開示されているような、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして、行うことができる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数は、細菌の染色体ＤＮＡに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子をマルチコピーで導入することによっても、達成することができる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子をマルチコピーで細菌染色体に導入するには、標的である染色体ＤＮＡ上に存在するマルチコピーの配列を利用した相同組換えを行う。染色体で上にマルチコピーで存在する配列としては、転位因子の末端に存在するインバーテッドリピートを用いることができる。また、特開平２−１０９９８５に開示されているように、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子をトランスポゾンに組み込み、それを転移させて染色体ＤＮＡに同遺伝子をマルチコピーで導入することができる。
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化とライゲーション、形質転換、プライマーオリゴヌクレオチドの選択などの方法は、当業者によく知られた通常の方法で行うことができる。これらの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。
本発明の細菌は、Ｌ−スレオニン生産能を元々有する細菌に、前述のＤＮＡを導入することによって取得され得る。あるいは、本発明の細菌は、すでに前記ＤＮＡを持つ細菌に、Ｌ−スレオニン生産能を付与することにより取得され得る。  ａｓｐＣ遺伝子によりコードされるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性が増強される親株としては、エシェリヒア・コリ  ＶＫＰＭ  Ｂ−３９９６株（米国特許第５，１７５，１０７号、米国特許第５，７０５，３７１号）、エシェリヒア・コリ  ＮＲＲＬ−２１５９３株（米国特許第５，９３９，３０７号）、エシェリヒア・コリ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７５６株（米国特許第５，４７４，９１８号）、エシェリヒア・コリ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５１９株およびＦＥＲＭ  ＢＰ−３５２０株（米国特許第５，３７６，５３８号）、エシェリヒア・コリ  ＭＧ４４２株（Ｇｕｓｙａｔｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｋａ（ｉｎ  Ｒｕｓｓｉａｎ），１４，９４７−９５６（１９７８））、エシェリヒア・コリ  ＶＬ６４３株及びＶＬ２０５５株（ＥＰ  １１４９９１１  Ａ）などの、スレオニン生産性エシェリヒア属細菌を用いることができる。
Ｂ−３９９６株は、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、ｉｌｖＡ遺伝子にリーキー変異を有している。同株は、スレオニン及びホモセリンに対する高度な耐性に関与するｒｈｔ遺伝子に変異を有している。Ｂ−３９９６株は、スレオニンによるフィードバック耐性が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型ｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡ＊ＢＣオペロンをＲＳＦ１０１０由来のベクターに挿入することによって取得されたプラスミドｐＶＩＣ４０を保持している。Ｂ−３９９６株は、１９８７年４月７日に、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ）（住所：Ｄｏｒｏｚｈｎｙ  ｐｒｏｅｚｄ．１，Ｍｏｓｃｏｗ  １１３５４５，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）に、Ｂ−３９９６の受託番号で寄託されている。
本発明の細菌は、ａｓｐＣ遺伝子に加えて、以下の群から選択される１または２以上の遺伝子の発現が増強されるようにさらに改変されていることが好ましい。
・スレオニンによるフィードバック阻害に耐性なアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型ｔｈｒＡ遺伝子
・ホモセリンキナーゼをコードする、ｔｈｒＢ遺伝子
・スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子
・膜貫通タンパク質と予想されるタンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子
前記細菌の最も好ましい態様は、ａｓｐＣ遺伝子、変異型ｔｈｒＡ遺伝子、ｔｈｒＢ遺伝子、ｔｈｒＣ遺伝子、及びｒｈｔＡ遺伝子の発現量が上昇するように改変された細菌である。
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養して、培地中にＬ−スレオニンを生成、蓄積させ、同培地からＬ−スレオニンを採取する、Ｌ−スレオニンの製造法を含む。
本発明においては、培養、Ｌ−アミノ酸の培地からの採取および精製等は、微生物を用いてアミノ酸を生産する通常の発酵法と同様のやり方で行うことができる。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機質、及び、必要に応じて微生物が成育するために必要な適量の栄養分を含むものであれば、合成培地または天然培地のいずもでもよい。炭素源としては、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、および種々の有機酸が挙げられる。用いる微生物の同化の形態に応じて、エタノールおよびグリセロールのようなアルコールも使用することができる。窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、ダイズ水解物および醗酵性微生物の消化物のような天然の窒素源が使用される。無機物としては、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウムなどが用いられる。ビタミンとしては、チアミン、酵母抽出物などが用いられる。
培養は、振盪培養および通気撹拌培養のような好気的な条件下で、温度は２０から４０℃、好ましくは３０から３８℃の間で行うことが好ましい。培養中のｐＨは通常５から９、好ましくは６．５から７．２の間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１日から５日間の培養で、培養液中にＬ−スレオニンが蓄積する。
培養の後に、遠心分離や膜濾過により、細胞のような固形物を培養液から取り除き、続いてイオン交換、濃縮および結晶法により、採取、精製することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  エシェリヒア・コリのａｓｐＣ遺伝子のｐＭＷ１１９ベクターへのクローニング
ａｓｐＣ遺伝子は、配列番号３及び４に示すプライマーを用いたＰＣＲにより、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡから取得した。得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＳｔｕＩにより処理し、予め制限酵素ＨｉｎｃＩＩ及びＥｃｏＲＩで処理した安定な低コピープラスミドｐＭＷ１１９（ｐＳＣ１０１レプリコン）に、Ｐｌａｃプロモーターの制御下となるように連結した。こうして、プラスミドｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣを構築した。また、ａｓｐＣ遺伝子を、Ｐｌａｃプロモーターの代わりに、強力なラムダファージのＰｒプロモーターの制御下に置いた。Ｐｒプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡは、配列表の配列番号５及び６に示す化学合成した５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを用いて作製した。続いて、この二本鎖ＤＮＡを、予めＰｖｕＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＭＷ−Ｐｌａｃ−ａｓｐＣプラスミドに連結した。こうして、ｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣプラスミドを構築した。
これらのプラスミドを用いることにより、ａｓｐＣ遺伝子を非制御、かつ、高レベルで発現させることができる。プラスミドｐＭＷ−Ｐｌａｃ−ａｓｐＣ及びｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣプラスミドｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣは、プラスミドｐＶＩＣ４０（ｐＲＳＦ１０１０レプリコン）と和合性であるので、これらの２つのプラスミド、ｐＶＩＣ４０およびｐＭＷ−Ｐｌａｃ−ａｓｐＣ、又はｐＶＩＣ４０およびｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣは、細菌中で同時に維持され得る。
プラスミドｐＭＷ−Ｐｌａｃ−ａｓｐＣ及びｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣは、各々ストレプトマイシン耐性のスレオニン生産性エシェリヒア・コリＢ−３９９６株（米国特許第５，１７５，１０７号）に導入された。こうして、Ｂ−３９９６（ｐＭＷ−Ｐｌａｃ−ａｓｐＣ）及びＢ−３９９６（ｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣ）が得られた。
実施例２  スレオニン生産に対するａｓｐＣ遺伝子増幅の効果
エシェリヒア・コリＢ−３９９６（ｐＭＷ−Ｐｌａｃ−ａｓｐＣ）及びＢ−３９９６（ｐＭ−ＰＲ−ａｓｐＣ）を、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬ−寒天プレート上で、３７℃で１８〜２４時間培養した。次いで、一白金耳の細胞を、下記組成のＬ−培地５０ｍｌに移した：トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ。振盪機（２４０ｒｐｍ）を用いて、３７℃で５時間以内培養した細胞（５０ｍｌ、ＯＤ５４０：２ｏ．ｕ．）を、４５０ｍｌの発酵培地に接種した。１．０Ｌ容量の研究用ファーメンターを用いて、１２００ｒｐｍで攪拌、通気（１／１ｖｖｍ）下、３７℃でバッチ発酵を行った。ｐＨは、８％アンモニア水溶液を用いて、自動的に６．６に維持した。結果を表１に示す。
〔発酵培地の構成（ｇ／Ｌ）〕
スクロース            １００．０
ＮＨ４Ｃｌ                １．７５
ＫＨ２ＰＯ４              １．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．８
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．０１
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ      ０．０１
豆濃（ＴＮ）              ０．１５
Ｂｅｔａｉｎｅ            １．０
Ｌ−イソロイシン          ０．２
スクロースおよび硫酸マグネシウムは、別個に滅菌した。ｐＨは６．６に調整した。
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産業上の利用の可能性
本発明により、Ｌ−スレオニンを効率よく製造することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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