(57)【要約】ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを、非発現系ベクターに組み込み、宿主内に導入して、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングすることにより、１０１１以上のレパートリーを有する超レパートリー人工抗体ライブラリーを得た。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｅ）を備えることを特徴とする一本鎖抗体ライブラリーの作製方法。
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程
（ｂ）前記ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程
（ｃ）（ｂ）工程により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程
（ｄ）前記ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現系ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現系ベクターをともに宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングする工程
（ｅ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程
【請求項２】
ｃＤＮＡライブラリーが、末梢血ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、又は骨髄ｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項３】
ｃＤＮＡライブラリーがヒト又はマウス由来であることを特徴とする請求項１又は２記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項４】
配列番号１〜４８に示される塩基配列からなるプライマーのいずれか１以上用いてＰＣＲ法を行うことを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項５】
（ａ）工程が以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を備えることを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗体ライブラリーの作製方法。
（ｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１〜７及び配列番号８又は９に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号１０又は１１及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶκ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１８〜２１及び配列番号２２又は２３に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号２４又は２５及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶλ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号３０〜３８及び配列番号３９〜４２に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号４３〜４６及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
【請求項６】
（ｂ）工程が以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を備えることを特徴とする請求項５記載の一本鎖抗体ライブラリーの作製方法。
（ｉ）ＶＨ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１〜７及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（ｉｉ）Ｖκ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１８〜２１及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（ｉｉｉ）Ｖλ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号３０〜３８及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
【請求項７】
（ｂ）工程で得られるＶＨライブラリー及び／又はＶＬライブラリーが、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたライブラリーであることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項８】
（ｄ）工程に記載のシャッフリングが、リコンビナーゼを用いたＤＮＡ組換えによるシャッフリングであることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項９】
リコンビナーゼがリコンビナーゼＣｒｅ又はＦＬＰリコンビナーゼであることを特徴とする請求項８記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１０】
（ｄ）工程に記載のシャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体のみをファージ表面にディスプレイさせることを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１１】
異なる２つの非発現系ベクターが、プロモーターフリーのベクターとＳＤ配列フリーのベクターとから構成されることを特徴とする請求項１〜１０いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１２】
異なる２つの非発現系ベクターが、プロモーターフリーのベクターと転写終結シグナルが存在するベクターとから構成されることを特徴とする請求項１〜１０いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１３】
異なる２つの非発現系ベクターが、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列を有することを特徴とする請求項１〜１２いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１４】
リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列が変異型ｌｏｘＰ配列又は変異型ＦＲＴ配列であることを特徴とする請求項１３記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１５】
変異型ｌｏｘＰ配列がｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、又はｌｏｘ５１７１であることを特徴とする請求項１４記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１６】
異なる２つの非発現系ベクターが、図６または図７に記載されているベクターと図８または図９に記載されているベクターとから構成されることを特徴とする請求項１〜１０いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１７】
宿主が、一本鎖抗体をファージ表面に結合状態、又はファージ表面から遊離状態で選択的に発現しうる宿主であることを特徴とする請求項１〜１６いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１８】
一本鎖抗体をファージ表面に結合状態で選択的に発現しうる宿主がｓｕｐＥ変異を有する大腸菌であり、一本鎖抗体をファージ表面から遊離状態で選択的に発現しうる宿主がｓｕｐＥ変異を持たない大腸菌である、請求項１７記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項１９】
ＶＨライブラリーが、１０６以上のライブラリーであることを特徴とする請求項１〜１８いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項２０】
ＶＬライブラリーが、１０５以上のライブラリーであることを特徴とする請求項１〜１９いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項２１】
一本鎖抗体ライブラリーが、１０１１以上のライブラリーであることを特徴とする請求項１〜２０いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項２２】
一本鎖抗体ライブラリーが、１０１２のライブラリーであることを特徴とする請求項２１記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
【請求項２３】
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、前記ＶＨ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングすることにより得られ、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたことを特徴とするＶＨライブラリー。
【請求項２４】
以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）から製造されることを特徴とする請求項２３記載のＶＨライブラリー。
（ｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１〜７及び配列番号８又は９に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号１０又は１１及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉ）前記ＶＨ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１〜７及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
【請求項２５】
１０６以上のライブラリーであることを特徴とする請求項２３又は２４記載のＶＨライブラリー。
【請求項２６】
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、前記ＶＬ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングすることにより得られ、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたことを特徴とするＶＬライブラリー。
【請求項２７】
以下の工程（ｉ）〜（Ｖ）から製造されることを特徴とする請求項２６記載のＶＬライブラリー。
（ｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶκ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１８〜２１及び配列番号２２又は２３に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号２４又は２５及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉ）前記Ｖκ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１８〜２１及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（ｉｉｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶλ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号３０〜３８及び配列番号３９〜４２に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号４３〜４６及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉＶ）前記Ｖλ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号３０〜３８及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（Ｖ）（ｉｉ）工程及び（ｉＶ）工程で得られる産物を混合する工程
【請求項２８】
１０５以上のライブラリーであることを特徴とする請求項２６又は２７記載のＶＬライブラリー。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか記載の作製方法によって得られる一本鎖抗体ライブラリー。
【請求項３０】
１０１１以上のライブラリーであることを特徴とする請求項２９記載の一本鎖抗体ライブラリー。
【請求項３１】
１０１２のライブラリーであることを特徴とする請求項３０記載の一本鎖抗体ライブラリー。
【請求項３２】
プロモーターフリーのベクターとＳＤ配列フリーのベクターとの組み合わせから構成されることを特徴とする一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
【請求項３３】
リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列を有することを特徴とする請求項３２記載の一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
【請求項３４】
リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列が変異型ｌｏｘＰ配列又は変異型ＦＲＴ配列であることを特徴とする請求項３３記載の一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
【請求項３５】
変異型ｌｏｘＰ配列がｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６又はｌｏｘ５１７１であることを特徴とする請求項３４記載の一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
【請求項３６】
図６または図７に記載されているベクターと図８または図９に記載されているベクターとの組み合わせから構成されることを特徴とする一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
【請求項３７】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを用いることを特徴とする抗体チップ。
【請求項３８】
カテゴライズされている一本鎖抗体ライブラリーであることを特徴とする請求項３７記載の抗体チップ。
【請求項３９】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを用いることを特徴とする抗体フィルター。
【請求項４０】
カテゴライズされている一本鎖抗体ライブラリーであることを特徴とする請求項３９記載の抗体フィルター。
【請求項４１】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする抗原特異的抗体のスクリーニング方法。
【請求項４２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴とする請求項４１記載の抗原特異的抗体のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターと抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）抗原に結合した一本鎖抗体を同定する工程
【請求項４３】
以下の工程（ａ）〜（ｇ）を備えることを特徴とする請求項４１記載の抗原特異的抗体のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーと抗原を接触させる工程
（ｂ）抗原に結合した一本鎖抗体提示ファージを回収する工程
（ｃ）（ｂ）工程で回収された一本鎖抗体提示ファージ液を中和する工程
（ｄ）（ｃ）工程で得られた一本鎖抗体提示ファージをｓｕｐＥ変異を有する大腸菌を用いて増幅する工程
（ｅ）（ｄ）工程で増幅された一本鎖抗体提示ファージと抗原を接触させる工程
（ｆ）一本鎖抗体提示ファージと抗原との結合を検出する工程
（ｇ）抗原に結合した一本鎖抗体を同定する工程
【請求項４４】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターを用いることを特徴とするエピトープ特異的抗体のスクリーニング方法。
【請求項４５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴とする請求項４４記載のエピトープ特異的抗体のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターと抗原エピトープを接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原エピトープとの結合を検出する工程
（ｃ）抗原エピトープに結合した一本鎖抗体を同定する工程
【請求項４６】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする抗体特異的抗原のスクリーニング方法。
【請求項４７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴とする請求項４６記載の抗体特異的抗原のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターと抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）一本鎖抗体に結合した抗原を同定する工程
【請求項４８】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする抗原に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項４９】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えることを特徴とする請求項４８記載の抗原に対するリガンドのスクリーニング方法。
（ａ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターと抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターと結合した抗原にリガンドを接触させる工程
（ｄ）抗原に結合したリガンドを検出する工程または、同定する工程
【請求項５０】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターを用いることを特徴とするタンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用を解析・評価する方法。
【請求項５１】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えることを特徴とする請求項５０記載のタンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用を解析・評価する方法。
（ａ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターとタンパク質およびＤＮＡを含む抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターと結合した抗原に別の抗原を接触させる工程
（ｄ）抗原に結合した同種分子または異種分子を検出する工程、または同定する工程
【請求項５２】
デジタルスクリーニング方法により、請求項４１〜４９のいずれか記載のスクリーニング方法、又は請求項５０もしくは５１記載のタンパク質−タンパク質間の相互作用若しくはタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用を解析・評価する方法を実施することを特徴とするデジタルスクリーニングシステム。
【請求項５３】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、請求項３７若しくは３８記載の抗体チップ、又は請求項３９若しくは４０記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする各種疾病の診断薬。
【請求項５４】
請求項５３記載の各種疾病の診断薬を含むことを特徴とする各種疾病の診断キット。
【請求項５５】
請求項５３記載の各種疾病の診断薬、又は請求項５４記載の各種疾病の診断キットを用いることを特徴とする各種疾病の診断方法。
【請求項５６】
請求項２９〜３１のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを用いることを特徴とする各種疾病の治療薬。
【請求項５７】
請求項５６記載各種疾病の治療薬を用いることを特徴とする各種疾病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、発現不能なレパートリーの混入や、抗体ライブラリーの不安定性の問題がない、カテゴライズされた一本鎖抗体ライブラリー、抗体チップ及び抗体フィルター、それらを用いた抗原特異的抗体、エピトープ特異的抗体、抗体特異的抗原、抗原に対するリガンド等のスクリーニングや、タンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用の解析・評価や、各種疾病の診断・治療薬などに関する。
背景技術
抗体分子はＨ鎖及びＬ鎖の２種類のポリペプチド鎖各２本から構成されている。Ｈ鎖とＬ鎖は、１１０個ほどのアミノ酸からなるドメインの連結によって構成され、Ｌ鎖は２つのドメイン（ＶＬ・ＣＬ）、Ｈ鎖は４つのドメイン（ＶＨ・ＣＨ１・ＣＨ２・ＣＨ３）からなることが知られている。Ｈ鎖の可変領域をコードする構造遺伝子（ＶＨ遺伝子）は、Ｖ遺伝子、Ｄ遺伝子、及びＪ遺伝子の３つの遺伝子断片からなるのに対して、Ｌ鎖の可変領域をコードする構造遺伝子（ＶＬ遺伝子）は、λ鎖・κ鎖ともに、Ｊ遺伝子及びＶ遺伝子の２つの遺伝子断片から構成されており、かかる可変領域には抗原を認識する抗原決定部位が形成される。同種動物・同一クラス内の免疫グロブリン分子間でもその一次構造に多様性がみられ、特に超可変領域という違いの著しい領域が含まれている。抗原分子と相補的な立体構造を形成し抗体の特異性を決める相補性決定部位（超可変領域；ＣＤＲ）と、これらの立体構造保持に働いている枠組み構造領域（ＦＲ）とがモザイク状に配置され、超可変領域には、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに多様性の高い領域がそれぞれ３箇所存在し、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３といわれており、ＣＤＲを構成するアミノ酸配列の多様性に起因して様々な抗原と特異的に結合することが知られている。
通常、動物に非自己の抗原を免疫して抗体を作製する方法が用いられており、したがって自已の生体内物質及び自己に類似のものに対する特異抗体の作製は困難とされていた。近年、ファージ抗体ライブラリーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。かかる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとすることができ、この方法によるとヒトの抗原に対する抗体の作製も可能である。このファージ抗体ライブラリーを用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗体を同定するために使用されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそれを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法等のスクリーニング方法についても既に数多くの研究が報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９：３８６−３９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９３，２１７：２２８−２５７）。
上記のような膨大なレパートリーを有する抗体ライブラリーは、免疫操作及びスクリーニング時間を省略できる優れた技術であり、多種の抗原に対して幅広い応用が可能であり、スクリーニングが容易である。しかし、既存の抗体ライブラリーは発現不能なレパートリーの混入と不安定性さにおいて問題があった。既存の発現型ライブラリーは、個々のクローンの増殖率が異なることが多く、多大なレパートリーを維持するのが困難であった。また、既存のライブラリー作製法として１０１２以上のレパートリーを得るために、脾臓や骨髄内細胞の抗体遺伝子生成中のレパートリーを用いたり、ランダムアミノ酸配列を抗体遺伝子中に組み込む方法が報告されている（Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２４８：９７−１０５）。しかし、これらの方法では、翻訳終了コドンの挿入や抗体分子の高次構造に影響するなど、抗体として機能しない遺伝子など、前記のように発現不能なレパートリーの混入と抗体ライブラリーの不安定性さが避けられなかった。
他方、ｓｃＦｖライブラリー内でシャッフリングを行いレパートリーを増大させ、ＶＨ−ｇｐ３断片部分をシャッフリングする大腸菌内ＶＬ−ＶＨシャッフリング（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０００，１８：７５−８０）や、多数の異なった出発原料の一本鎖又は二本鎖の親ＤＮＡ鋳型に由来する組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作製する方法（特表２００１−５１６２１５号公報）や、抗体由来ドメインの遺伝子ライブラリーを生成する工程、ファージ発現ベクター中に該ドメインをコードするものを挿入する工程、及び、該触媒性抗体を単離する工程を包含するファージ上に提示される触媒性抗体の産生方法（特表平１０−５０７３４１号公報）などが知られている。しかし、現実に１０１１以上、例えば１０１２のレパートリーを有する有用な一本鎖抗体ライブラリーは存在しなかった。また、シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を選択的に作製する方法は存在しなかった。
発明の開示
全ゲノム構造解析プロジェクトは塩基配列決定技術の急速な進歩により、ヒトにおいても間もなく終了するといわれている。しかし、塩基配列が決定されても遺伝子発現産物のうちデータベースを利用した相同タンパク質の検索などにより、機能が推定できる遺伝子は極めて少なく、また、実際に細胞内において発現、機能しているタンパク質の多くは細胞の状態によって、その発現量の変化や翻訳後修飾によって様々に変動する。このように生命活動のある瞬間に存在するタンパク質のセットはプロテオームという、ＰＲＯＴＥｉｎとｇｅｎＯＭＥを組み合わせた造語で表現される新たな概念として提唱されており（Ｋａｈｎ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：３６９−３７０）、プロテオームの全体像を把握し、別の瞬間の全体像と比較することでその変動を解析することが行われている。こうしたプロテオームの動態を大規模に解析することで生命現象を解析する試みがプロテオミクスと呼ばれるもので、ポストゲノムシークエンシングプロジェクトとして注目を集めている。現在までに多くの知見が集積されているゲノム解析をプロテオミクスに応用することができれば画期的なブレークスルーが期待される。本発明の課題は、発現不能なレパートリーの混入や、抗体ライブラリーの不安定性の問題がない、抗原特異的抗体、エピトープ特異的抗体、抗体特異的抗原、抗原に対するリガンド等のスクリーニングや、タンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用の解析・評価や、各種疾病の診断・治療などプロテオミクスに有用なカテゴライズされた１０１１以上の超レパートリー（目録）をもつ抗体ライブラリーや、抗体チップ、抗体フィルター、抗体ビーズを提供することにある。
本発明者らは、ゲノム解析を基礎としたプロテオミクスについて鋭意研究した結果、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れた１０６以上のＶＨライブラリーと１０５以上のＶＬライブラリーを、非発現系ベクターに組み込み、宿主内に導入して、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングすることにより、プロテオミクスの有用なツールとなる１０１１以上の一本鎖抗体ライブラリーやそれを用いた抗体チップや抗体フィルターが得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の（１）〜（５７）に記載の発明を提供するものである。
（１）  以下の工程（ａ）〜（ｅ）を備えることを特徴とする一本鎖抗体ライブラリーの作製方法。
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程
（ｂ）前記ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程
（ｃ）（ｂ）工程により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程
（ｄ）前記ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現系ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現系ベクターをともに宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングする工程
（ｅ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程
（２）  ｃＤＮＡライブラリーが、末梢血ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、又は骨髄ｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする（１）記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（３）  ｃＤＮＡライブラリーがヒト又はマウス由来であることを特徴とする（１）又は（２）記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（４）  配列番号１〜４８に示される塩基配列からなるプライマーのいずれか１以上用いてＰＣＲ法を行うことを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（５）  （ａ）工程が以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を備えることを特徴とする（１）記載の一本鎖抗体ライブラリーの作製方法。
（ｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１〜７及び配列番号８又は９に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号１０又は１１及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶκ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１８〜２１及び配列番号２２又は２３に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号２４又は２５及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶλ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号３０〜３８及び配列番号３９〜４２に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号４３〜４６及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（６）  （ｂ）工程が以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を備えることを特徴とする（５）記載の一本鎖抗体ライブラリーの作製方法。
（ｉ）ＶＨ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１〜７及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（ｉｉ）Ｖκ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１８〜２１及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（ｉｉｉ）Ｖλ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号３０〜３８及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（７）  （ｂ）工程で得られるＶＨライブラリー及び／又はＶＬライブラリーが、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたライブラリーであることを特徴とする（１）〜（６）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（８）  （ｄ）工程に記載のシャッフリングが、リコンビナーゼを用いたＤＮＡ組換えによるシャッフリングであることを特徴とする（１）〜（７）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（９）  リコンビナーゼがリコンビナーゼＣｒｅ又はＦＬＰリコンビナーゼであることを特徴とする（８）記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１０）  （ｄ）工程に記載のシャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体のみをファージ表面にディスプレイさせることを特徴とする、（１）〜（９）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１１）  異なる２つの非発現系ベクターが、プロモーターフリーのベクターとＳＤ配列フリーのベクターとから構成されることを特徴とする（１）〜（１０）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１２）  異なる２つの非発現系ベクターが、プロモーターフリーのベクターと転写終結シグナルが存在するベクターとから構成されることを特徴とする（１）〜（１０）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１３）  異なる２つの非発現系ベクターが、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列を有することを特徴とする（１）〜（１２）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１４）  リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列が変異型ｌｏｘＰ配列又は変異型ＦＲＴ配列であることを特徴とする（１３）記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１５）  変異型ｌｏｘＰ配列がｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、又はｌｏｘ５１７１であることを特徴とする（１４）記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１６）  異なる２つの非発現系ベクターが、図６または図７に記載されているベクターと図８または図９に記載されているベクターとから構成されることを特徴とする（１）〜（１０）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１７）  宿主が、一本鎖抗体をファージ表面に結合状態、又はファージ表面から遊離状態で選択的に発現しうる宿主であることを特徴とする（１）〜（１６）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１８）  一本鎖抗体をファージ表面に結合状態で選択的に発現しうる宿主がｓｕｐＥ変異を有する大腸菌であり、一本鎖抗体をファージ表面から遊離状態で選択的に発現しうる宿主がｓｕｐＥ変異を持たない大腸菌である、（１７）記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（１９）  ＶＨライブラリーが、１０６以上のライブラリーであることを特徴とする（１）〜（１８）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（２０）  ＶＬライブラリーが、１０５以上のライブラリーであることを特徴とする（１）〜（１９）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（２１）  一本鎖抗体ライブラリーが、１０１１以上のライブラリーであることを特徴とする（１）〜（２０）いずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（２２）  一本鎖抗体ライブラリーが、１０１２のライブラリーであることを特徴とする（２１）記載の一本鎖抗体ライブラリーを作製する方法。
（２３）  ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、前記ＶＨ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングすることにより得られ、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたことを特徴とするＶＨライブラリー。
（２４）  以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）から製造されることを特徴とする（２３）記載のＶＨライブラリー。
（ｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１〜７及び配列番号８又は９に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号１０又は１１及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉ）前記ＶＨ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１〜７及び配列番号１２〜１７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（２５）  １０６以上のライブラリーであることを特徴とする（２３）又は（２４）記載のＶＨライブラリー。
（２６）  ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、前記ＶＬ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングすることにより得られ、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたことを特徴とするＶＬライブラリー。
（２７）  以下の工程（ｉ）〜（Ｖ）から製造されることを特徴とする（２６）記載のＶＬライブラリー。
（ｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶκ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号１８〜２１及び配列番号２２又は２３に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号２４又は２５及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉｉ）前記Ｖκ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号１８〜２１及び配列番号２６〜２９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（ｉｉｉ）ヒト末梢血ｃＤＮＡライブラリー及びヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶλ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、それぞれ配列番号３０〜３８及び配列番号３９〜４２に示される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号４３〜４６及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する工程
（ｉＶ）前記Ｖλ領域におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片とを、配列番号３０〜３８及び配列番号４７又は４８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によりシャッフリングする工程
（Ｖ）（ｉｉ）工程及び（ｉＶ）工程で得られる産物を混合する工程
（２８）  １０５以上のライブラリーであることを特徴とする（２６）又は（２７）記載のＶＬライブラリー。
（２９）  （１）〜（２２）のいずれか記載の作製方法によって得られる一本鎖抗体ライブラリー。
（３０）  １０１１以上のライブラリーであることを特徴とする（２９）記載の一本鎖抗体ライブラリー。
（３１）  １０１２のライブラリーであることを特徴とする（３０）記載の一本鎖抗体ライブラリー。
（３２）  プロモーターフリーのベクターとＳＤ配列フリーのベクターとの組み合わせから構成されることを特徴とする一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
（３３）  リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列を有することを特徴とする（３２）記載の一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
（３４）  リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列が変異型ｌｏｘＰ配列又は変異型ＦＲＴ配列であることを特徴とする（３３）記載の一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
（３５）  変異型ｌｏｘＰ配列がｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６又はｌｏｘ５１７１であることを特徴とする（３４）記載の一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
（３６）  図６または図７に記載されているベクターと図８または図９に記載されているベクターとの組み合わせから構成されることを特徴とする一本鎖抗体ライブラリー作製用非発現系ベクター。
（３７）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを用いることを特徴とする抗体チップ。
（３８）  カテゴライズされている一本鎖抗体ライブラリーであることを特徴とする（３７）記載の抗体チップ。
（３９）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを用いることを特徴とする抗体フィルター。
（４０）  カテゴライズされている一本鎖抗体ライブラリーであることを特徴とする（３９）記載の抗体フィルター。
（４１）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする抗原特異的抗体のスクリーニング方法。
（４２）  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴とする（４１）記載の抗原特異的抗体のスクリーニング方法。
（ａ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターと抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）抗原に結合した一本鎖抗体を同定する工程
（４３）  以下の工程（ａ）〜（ｇ）を備えることを特徴とする（４１）記載の抗原特異的抗体のスクリーニング方法。
（ａ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーと抗原を接触させる工程
（ｂ）抗原に結合した一本鎖抗体提示ファージを回収する工程
（ｃ）（ｂ）工程で回収された一本鎖抗体提示ファージ液を中和する工程
（ｄ）（ｃ）工程で得られた一本鎖抗体提示ファージをｓｕｐＥ変異を有する大腸菌を用いて増幅する工程
（ｅ）（ｄ）工程で増幅された一本鎖抗体提示ファージと抗原を接触させる工程
（ｆ）一本鎖抗体提示ファージと抗原との結合を検出する工程
（ｇ）抗原に結合した一本鎖抗体を同定する工程
（４４）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターを用いることを特徴とするエピトープ特異的抗体のスクリーニング方法。
（４５）  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴とする（４４）記載のエピトープ特異的抗体のスクリーニング方法。
（ａ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターと抗原エピトープを接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原エピトープとの結合を検出する工程
（ｃ）抗原エピトープに結合した一本鎖抗体を同定する工程
（４６）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする抗体特異的抗原のスクリーニング方法。
（４７）  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えることを特徴とする（４６）記載の抗体特異的抗原のスクリーニング方法。
（ａ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターと抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）一本鎖抗体に結合した抗原を同定する工程
（４８）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする抗原に対するリガンドのスクリーニング方法。
（４９）  以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えることを特徴とする（４８）記載の抗原に対するリガンドのスクリーニング方法。
（ａ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターと抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターと結合した抗原にリガンドを接触させる工程
（ｄ）抗原に結合したリガンドを検出する工程または、同定する工程
（５０）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターを用いることを特徴とするタンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用を解析・評価する方法。
（５１）  以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えることを特徴とする（５０）記載のタンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用を解析・評価する方法。
（ａ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターとタンパク質およびＤＮＡを含む抗原を接触させる工程
（ｂ）一本鎖抗体と抗原との結合を検出する工程
（ｃ）（２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターと結合した抗原に別の抗原を接触させる工程
（ｄ）抗原に結合した同種分子または異種分子を検出する工程、または同定する工程
（５２）  デジタルスクリーニング方法により、（４１）〜（４９）のいずれか記載のスクリーニング方法、又は（５０）もしくは（５１）記載のタンパク質−タンパク質間の相互作用若しくはタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用を解析・評価する方法を実施することを特徴とするデジタルスクリーニングシステム。
（５３）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリー、（３７）若しくは（３８）記載の抗体チップ、又は（３９）若しくは（４０）記載の抗体フィルターを用いることを特徴とする各種疾病の診断薬。
（５４）  （５３）記載の各種疾病の診断薬を含むことを特徴とする各種疾病の診断キット。
（５５）  （５３）記載の各種疾病の診断薬、又は（５４）記載の各種疾病の診断キットを用いることを特徴とする各種疾病の診断方法。
（５６）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の一本鎖抗体ライブラリーを用いることを特徴とする各種疾病の治療薬。
（５７）  （５６）記載各種疾病の治療薬を用いることを特徴とする各種疾病の治療方法。
本発明の一本鎖抗体ライブラリーの作製方法としては、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、かかるＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングすることによって得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む、それらをともに宿主内に導入して、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングしたものであれば特に制限されるものではない。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片とＣＤＲ３領域を含む断片のシャッフリングだけでなく、ＣＤＲ１領域を含む断片とＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含む断片のシャッフリングや、ＣＤＲ１領域を含む断片、ＣＤＲ２領域を含む断片、ＣＤＲ３領域を含む断片のシャッフリングでもよい。また、ＶＨ領域では上記のようなシャッフリングを行い、ＶＬ領域ではシャッフリングを行わない等、ＶＨ領域でのシャッフリングとＶＬ領域でのシャッフリングの組み合わせが異なっていてもよい。
従来、ＶＨ又はＶＬ領域内のシャッフリング方法としては、ランダムに切断した異なるＤＮＡ分子を混合し、変性及び会合させて、ヘテロＤＮＡ分子を生成する方法が知られていた。しかしながら、この方法は、ヘテロＤＮＡ分子の生成時にあやまったアニーリングが生じやすく、また、ＶＨ又はＶＬ領域内のＦＷ（フレームワーク）部分に多くの変異が生じるため、正常な抗体遺伝子が創製される効率が悪いという問題があった。
また、ＶＨ領域とＶＬ領域間のシャッフリング方法としては、ＶＨ又はＶＬ領域を先に選択しておき、選択したＶＨ又はＶＬ領域の抗原への結合を高めるようなＶＨ又はＶＬ領域をさらに選択する方法が知られていた。しかしながら、この方法は、選択に手間がかかるという問題があった。また、ＶＨ又はＶＬ領域の片側だけの選択の場合、ＶＨ領域とＶＬ領域間の疎水性表面が露出しているために、抗原との非特異的結合が生じ、その結果選択されたＶＨ又はＶＬ領域は、抗体分子を形成した際に、抗原と結合不可能な抗体分子が生じる可能性があった。
また、ＰＣＲ法によってＶＨ領域とＶＬ領域間をシャッフリングする方法、ＶＨ領域とＶＬ領域を別々にサブクローニングすることによってＶＨ領域とＶＬ領域間をシャッフリングする方法が知られていた。しかしながら、これらの方法は、２回のクローニングが必要であり、かつ、一本鎖抗体の多様性を保持するにはかなりの手間であった。さらに、リコンビナーゼを用いたＤＮＡ組換えによりＶＨ領域とＶＬ領域間をシャッフリングする方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０００，１８：７５−８０）も知られていた。しなしながら、この方法は、一次ライブラリーが一本鎖抗体の発現ベクターであるため不安定性の問題があった。また、ＤＮＡ組換えが生じたことを判定すること、一本鎖抗体を選択的に作製することは困難であった。
また、上述のいずれの方法によっても、現実に１０１１以上のレパートリーを有する有用な一本鎖抗体ライブラリーを得ることはできなかった。
これに対し、本発明の方法により１０１１以上のレパートリーを有する一本鎖抗体ライブラリーを、例えば１０１２のレパートリーを有する一本鎖抗体ライブラリーを得ることができる。また、本発明の方法により簡便かつ短期間に一本鎖抗体ライブラリーを得ることができ、該一本鎖抗体ライブラリーの安定供給が可能である。また、本発明の方法により複数抗原に対して同時にスクリーニングすることができる。さらに、本発明における一本鎖抗体は、例えば抗体提示型ファージとして単離されるため、一本鎖抗体の大量調製及びＩｇＧへの転換が容易である。
本発明におけるｃＤＮＡライブラリーとしては、ヒト等のイムノグロブリン（抗体）遺伝子からなるものであればどのようなものでもよく、例えばヒトやマウス等の末梢血ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、骨髄ｃＤＮＡライブラリー等を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングは、リコンビナーゼを用いたＤＮＡ組換えによるシャッフリングであることが好ましい。
また、本発明において、ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる方法としては、該一本鎖抗体のみをファージ表面にディスプレイさせる方法であることが好ましい。例えば、図１４に記載のように、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域がシャッフリングしたときのみ、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子が発現するように、異なる２つの非発現系ベクターを構築することで実施することができる。
また、本発明におけるＶＨライブラリー及び／又はＶＬライブラリーとしては、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域を有するライブラリーであればどのようなものでもよいが、発現不能なレパートリーの混入が少なく、安定性に優れたライブラリーであることが好ましい。以下にＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーの作製方法について具体的に説明するが、これらの方法に特に限定されるものではない。上記ヒト等の末梢血ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、骨髄ｃＤＮＡライブラリー等のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、イムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とを、かかる断片をそれぞれ増幅しうるプライマー、例えば配列番号１〜４８に示される塩基配列からなるプライマーのいずれか１以上、好ましくは全てを用いてＰＣＲを行い、ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングすることにより、ＶＬライブラリーにおいては１０６以上のライブラリーを、ＶＬライブラリーにおいては１０５以上のライブラリーを得ることができる。このような方法によって、従来の方法と比較して、簡便かつ短期間に高品質なライブラリーを得ることができる。また、生体内での抗体産生機構による変異に由来するいくつかまたはすべてのＦＷ（フレームワーク）とＣＤＲに変異が存在するライブラリーを得ることができ、生体内に存在しないレパートリーを創製することが可能である。これらの変異は生体内での抗体産生機構を経た変異であるため、抗体としての機能や構造を保っている可能性が高く、人工的な変異を導入したライブラリーに比較して本ライブラリーは高品質である。しかし、レパートリーを増やす目的で、ＰＣＲ条件の検討や変異を誘発する試薬等で人工的な変異を導入することも実施するのは容易である。
本発明における異なる２つの非発現系ベクターとしては、それ単独では宿主中で発現することができず、異なる２つの非発現系ベクターが組み合わさることにより、ＶＨ領域及びＶＬ領域を発現することができるものであればどのようなものでもよい。本発明においては、非発現系ベクターを用いるため、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーが安定に存在し、レパートリーの維持も容易である。
本発明における異なる２つの非発現系ベクターとしては、例えば、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列等の発現を調節する制御配列を含んだ、プロモーターフリーのベクター（プロモーターが存在しないベクター）と、ＳＤ配列フリーのベクター（ＳＤ配列が存在しないベクター）とから構成されているものや、一本鎖抗体ではないが、Ｆａｂ抗体ディスプレー用として、−［プロモーター］−［ｌｏｘ］−［転写終結シグナル］−［ｌｏｘ］−［ＳＤ−ＶＨ−ＣＨ−ｇ３タンパク質］−（プロモーター存在しないベクター）と、−（［転写終結シグナル］）−［ｌｏｘ］−［ＳＤ−ＶＬ−ＣＬ］−［ｌｏｘ］−（転写終結シグナルが存在するベクター；組換えが起こるまで遺伝子領域まで転写されない、すなわち翻訳もされないベクター）とから構成されているものを具体的に挙げることができる。また、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列等の発現を調節する制御配列を含んだプロモーターフリーのベクターとしては、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋ等の発現ベクターを具体的に挙げることができるが、これらに制限されるものではない。なお、これらベクターの開裂地図はそれぞれ図８及び図９に示しており、作製方法は実施例２に記載している。また、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列等の発現を調節する制御配列を含んだＳＤ配列フリーのベクターとしては、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３等のベクターを具体的に挙げることができるが、これらに制限されるものではない。なお、これらベクターの開裂地図はそれぞれ図６及び図７に示しており、作製方法は実施例１に記載している。また、上記ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３は、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｒ発現ユニットを組み込んでいることから、創薬や遺伝子治療用の抗体を選別するために、癌細胞などをスクリーニングの材料として細胞に取り込まれる抗体を選択することができる。かかる細胞に取り込まれた抗体ファージは、ＤＮＡを遊離しＤＮＡ上の動物細胞用遺伝子発現ユニットがあれば遺伝子発現されることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９  ｖｏｌ．２８８：２０３−２１１）。具体的には、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３を用いた抗体ライブラリーを細胞に添加し、２日後にピューロマイシンを培地に添加しさらに２日後生存した細胞の全ＤＮＡを回収し、大腸菌に遺伝子導入してアンピシリン耐性コロニーを得ることにより、抗体ファージ由来のプラスミドを回収することができる。実際のスクリーニングにおいては、目的細胞に結合する抗体ファージの選択を３回ほど繰り返し目的細胞に結合する抗体ファージを増幅してから、ピューロマイシンでの選別を行うことが好ましい。
上記リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配列としては、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰ配列や、酵母サッカロミセス・セレビッシェのＦＬＰリコンビナーゼが認識するＦＲＴ配列を例示することができ、またかかる野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列とは、野生型逆方向反復配列における塩基が１又は２以上置換、欠失、付加等の変異を受け、その変異によりリコンビナーゼによる特異的ＤＮＡ組換え反応における基質特異性が変化する配列をいい、かかる変異型逆方向反復配列としては、野生型ｌｏｘＰ配列の逆方向反復配列領域の塩基配列の一部を他の塩基に置換した変異型ｌｏｘＰ配列を有するｌｏｘ７１、変異型ｌｏｘＰ配列を有するｌｏｘ６６（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４：８６８−８７２）、ｌｏｘ５１７１や、上記野生型ｌｏｘＰ配列のスペーサー領域の塩基配列の一部を他の塩基に置換した変異型ｌｏｘＰ配列（特開平１１−１９６８８０号公報）や、野生型ＦＲＴ配列の逆方向反復配列領域の塩基配列の一部を他の塩基に置換した変異型ＦＲＴ配列（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，２８４：３６３−３８４）等を具体的に例示することができる。また、上記非発現系ベクターとしては、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する非発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。
本発明における宿主としては一本鎖抗体をファージ表面等の生物材料に結合状態、またはファージ等の生物材料表面から遊離状態で選択的に発現しうるものであれば特に制限されるものではない。一本鎖抗体をファージ表面に結合させた状態で発現させるためには、ｌｏｘ組換え後のベクター内ファージ表面タンパク（ｇ３タンパク）配列の直前にあるアンバー翻訳終了コドンをアミノ酸に翻訳可能なｓｕｐＥ変異を有する宿主大腸菌を用いて、抗体提示ファージを産生させる（図１）。また、一本鎖抗体を遊離状態で発現させるためには、抗体提示ファージを上記ｓｕｐＥ変異を持たない宿主大腸菌に感染させる（図１）。または抗体提示ファージが感染した大腸菌から抗体提示ファージ由来のプラスミドを単離し、ｓｕｐＥ変異を持たない宿主大腸菌に導入し、抗体の発現誘導を行う。かかる宿主として、例えば、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ショウジョウバエＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができ、かかる宿主へのＶＨベクター及び／又はＶＬベクターの導入としては、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、塩化カルシウムなど化学物質を用いたコンピテント細胞法、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、ファージやウイルス等を用いた感染などにより行うことができる。
本発明の一本鎖抗体ライブラリーの作製方法により得られる一本鎖抗体ライブラリーや、かかる一本鎖抗体ライブラリーを用いた抗体チップや抗体フィルターは、発現不能なレパートリーの混入や、抗体ライブラリーの不安定性の問題がなく、また、抗原特異的抗体、エピトープ特異的抗体、抗体特異的抗原、抗原に対するリガンド等をスクリーニングできるだけでなく、タンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用の解析・評価や、各種疾病の診断・治療などに有用である（図１〜５及び実施例６参照）。
本発明の抗体チップ又は抗体フィルターとしては、一本鎖抗体ライブラリーの全部又は一部が結合したものであればどのようなものでもよく、例えば、以下の方法により作製することができる。それぞれのビーズに異なる単一ペプチドが結合したビーズの集団（ランダムペプチドビーズ：Ｍｅｔｈｏｄ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９６，９：４８２−４９３）に結合する抗体提示ファージ、または、ランダムペプチドが結合したカラムに結合する抗体提示ファージ、または、ビオチン等で標識されたランダムペプチドに結合する抗体提示ファージをビオチン等を結合するビーズ等で、ファージごと回収し、クローン化する。それをｓｕｐＥ変異を持たない大腸菌で発現させ可溶性抗体に変換し、チップ化する（図１Ａ）。抗体提示ファージのままでもチップ化は可能である。チップ上に抗体を固定するには、例えば可溶性抗体のＣ末ないし抗体提示ファージの抗体部分のＣ末側に存在する６ｘＨｉｓタグに結合する様々な化合物、例えばキアゲン社ＮＴＡやクロンテック社のＴＡＬＯＮ残基や抗Ｈｉｓタグ抗体を用いることができる。チップの作製法は以下に記載されている。キアゲン社のＮｉ−ＮＴＡが結合した９６ウェルプレートを利用することもできる（図１Ｂ）。これら抗体と結合するペプチド配列は、例えば、デジタルハイブリダイゼーション（ＷＯ９９／３１２７０）を応用した方法（図２）や質量分析機を利用した方法（図３）で同定できる。
以下に、デジタルハイブリダイゼーション（ＷＯ９９／３１２７０）を応用した方法を例示するが、本発明の方法は、これに限定されるものではない。例えば、２４種類の抗体が結合した抗体チップを用意する（図２Ａ）。次いで、配列の異なるペプチド抗原１２７種を用意し、蛍光物質等で標識し、抗原ミックス（ＭＡ，Ｍ１〜Ｍ７）を作製する。ＭＡはすべてのペプチド抗原を混合したもの、Ｍ１〜Ｍ７はデジタル化されたペプチド抗原ミックスである。図２Ｂの０，１は抗原ミックスに各ペプチド抗原が含まれている（混合した）・いないを表している。これら抗原ミックスを用いて、別々に抗体チップと反応（接触）させ、結合した抗体チップ上のスポットを蛍光等を目印に同定する（図２Ｃ）。その結果を抗体チップ上のスポットごとにデジタル化する。
例えば、スポット１（抗体１）は、ＭＡ・Ｍ７・Ｍ５・Ｍ４にのみ結合したので「１１０１１０００」となり、これは抗原ペプチド８８のデジタル表示（抗原ミックスへの混合様式）であるから、抗体１には抗原ペプチド８８が結合したことと判明する（図２Ｄ）。同様にすればすべての抗原ペプチドが結合する抗体が同定できる。個々のペプチドのアミノ酸配列は質量分析機で解析することができる。ペプチドのアミノ酸配列をデータベース化することにより、その配列をゲノムデータベース等で検索することによりペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質と対応付けも可能である。
質量分析機を利用した方法（図３）は、抗体チップにランダムペプチドを反応（接触）させ、個々のスポット（抗体）に結合したペプチドを尿素等で抗体より解離させ、ペプチドのアミノ酸配列を質量分析機で解析する。ペプチドはタンパク質の断片やタンパク質そのものや低分子化合物・ＲＮＡアプタマーなどの核酸重合体でもよく、ランダムペプチドは、それらの混合物や限定された配列をもつペプチドでも構わない。
それぞれのビーズに異なる単一ペプチドが結合したビーズの集団（ランダムペプチドビーズ：Ｍｅｔｈｏｄ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９６，９：４８２−４９３）に結合するファージを一本鎖抗体のライブラリーから選別し、ファージが結合したビーズを単離し、個々のビーズからファージを別々に回収した後、ペプチド配列を決定する（図４）。この場合、図３の例と異なり、抗体（ファージ）は同一のペプチドに結合する複数種類の混合物でも構わない。または、大膓菌表面にペプチドを提示する大腸菌ディスプレイ法（Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，３０１：８９３−９０４）を用いて、それに結合するファージを抗体ライブラリーから選別する。同時に結合する大腸菌を回収し、ペプチドディスプレイのベクター内のペプチド遺伝子領域を塩基配列決定し、抗体と結合するペプチド配列を決定する。そしてまた、回収したファージを抗体発現用大腸菌に感染させ、発現誘導し、可溶化一本鎖抗体を調製する。これを、抗体Ｃ末にあるＨｉｓタグを用いて、金属キレート官能基を表面にもつスライド硝子を作製し、抗体を固相化して作製することができる。
また、本発明において、抗体と抗原との結合を検出する方法としては、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光抗体法等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の抗原特異的抗体やエピトープ特異的抗体のスクリーニング方法としては、例えば、ビーズ又はフィルターに結合した抗原やかかる抗原エピトープを、本発明の一本鎖抗体ライブラリーと結合させ、結合した抗体の質量分析、抗体のアミノ酸配列の同定、データーベース検索を行う方法を具体的に挙げることができ、本発明の抗体特異的抗原のスクリーニング方法としては、本発明の一本鎖抗体の全部又は一部をビーズ又はフィルターに結合させ、その後、抗原と反応させた後、結合した抗原の質量分析およびアミノ酸配列の同定、抗体のアミノ酸配列の同定、データーベース検索を行う方法などを例示することができる。
また、本発明の抗原に対するリガンドのスクリーニング方法としては、例えば、既存の抗原をビーズ又はフィルターに結合させ、かかる抗原に特異的に結合するリガンドを一本鎖抗体ライブラリーの中から探索する方法を挙げることができる。また、本発明の抗原（ペプチド）に対するリガンド（より長いペプチドないし全長タンパク）のスクリーニング方法としては、例えば、抗体をビーズまたはフィルターに結合させ、または抗体チップを作製し、かかる抗体に結合するリガンドを、混合物あるいは生体抽出物から網羅的に検索する方法を挙げることができる。また、上記抗原に対するリガンドのスクリーニング方法により得られたデーターを蓄積したデーターベースも本発明に含まれる。かかるデーターベースを用いて、試験用サンプルとして数種の精製タンパク混合物、又は培養細胞抽出液及び血清を蛍光標識し、それらを抗体チップと反応させた後、洗浄後、蛍光シグナルが残存したスポットに対応するペプチド配列から目的タンパク質の同定を行うことができる（図５）。例えば血清タンパクが結合したビーズ等を利用し、抗体ライブラリより血清タンパク特異抗体を単離し、チップ化する。抗体チップに被験者の血清を結合させ、抗体ライブラリより単離したチップ上の抗体とは別の特異抗体を蛍光等で標識してさらに抗体チップと反応させることにより結合した各血清タンパク量を定量することができる。
本発明のタンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用を解析・評価する方法としては、例えば、本発明の一本鎖抗体やそれをコードするＤＮＡ等を用いて、癌、アレルギー、糖尿病、高血圧症等の各種疾病に関与する抗原タンパク質との相互作用を解析・評価する方法等を具体的に挙げることができる。また、本発明のデジタルスクリーニングシステムとは、既知の抗体あるいは抗原を用いて、抗原に対して特異的な抗体や、エピトープに対して特異的な抗体や、抗体に対して特異的な抗原、抗原に対するリガンド等のスクリーニング、さらには、タンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用の解析・評価から得られたデーターを蓄積し、かかるデーターベースを用いて上記のスクリーニング方法や解析・評価する方法を早期に実施するシステムを意味する。
また本発明の一本鎖抗体ライブラリー、抗体チップ、又は抗体フィルターは、癌、アレルギー、糖尿病、高血圧症等の各種疾病の抗原にも反応することから、各種疾病の診断薬などの有効成分として用いることができ、また、ミサイル療法や、種々の標識を施したのち人体でのイメージングにも応用することもできる。さらに、本発明の一本鎖抗体ライブラリー、抗体チップ、又は抗体フィルターは、癌、アレルギー、糖尿病、高血圧症等の各種疾病の治療等に用いることができ、かかる治療薬は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコール等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（ＶＨベクターの作製）
ＶＨベクターの作製には、基本ベクターとしてＡｍｐ−Ｒ部分に変異導入を加えたｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。すなわち、Ａｆｌ  ＩＩＩ−Ｓａｐ  Ｉ部位に合成したｔＨＰ（ｔＨＰ：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ｇｅｎｅ，１９９４，１４５：１４５））を含む断片を、Ｓａｐ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｖ部位にｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＰ−ｌａｃ（ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｏｐｅｒａｔｏｒ）を含む断片を、ＥｃｏＲ  Ｖ−Ｘｈｏ  Ｉ部位に合成したｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１を含む断片を、Ｘｈｏ  Ｉ−Ｐｖｕ  ＩＩ部位にＰＣＲ法で増幅したＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）のＸｈｏ  Ｉ−Ｐｖｕ  ＩＩ断片［ｃｃｄＢを含む断片］を、Ｐｖｕ  ＩＩ−Ｐｖｕ  ＩＩ部位に合成した６×Ｈｉｓ、Ｅ−ｔａｇ、Ａｍｂｅｒ  ＳＴＯＰ  ７９、及びｇ３タンパク質を含む断片をそれぞれ挿入し、ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２を作製した（図６）。また、発現効率を上げるために、上記ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２のＥｃｏＲ  Ｖ−Ｘｈｏ  Ｉ部位に合成したｌｏｘＰ、ｒｒｎＢ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、及びｌｏｘ５１７１を含む断片を、Ｐｖｕ  ＩＩ−Ｐｖｕ  ＩＩ部位に合成した６×Ｈｉｓ、Ｅ−ｔａｇ、アンバー翻訳終了コドン（Ａｍｂｅｒ  ＳＴＯＰ  ｃｏｄｏｎ）、ｇ３タンパク質、ｔＴｒｐ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、及びＰｕｒｏ−Ｒ（ｐｕｒｏｍｙｓｉｎ耐性遺伝子）ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｎｉｔを含む断片を挿入し、ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３を作製した（図７）。
実施例２（ＶＬベクターの作製）
ＶＬベクターの作製においても、基本ベクターとしてＡｍｐ−Ｒ部分に変異導入を加えたｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。すなわち、Ａｆｌ  ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に合成したｔＨＰ及びｌｏｘＰを含む断片を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位にＰＣＲ法で増幅したＢＡＣ（ＳＩＭ２遺伝子を含む）由来のＣｈｌｏｒｍａｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ＳＤ配列部位は改変してある）断片［ｅＣＡＴ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｌｅｓｓ）を含む断片］を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｆｉ  ＩにＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｆｉ  Ｉ部位にｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｆｉ  Ｉ断片［ｇ３シグナル配列を含む断片］を、Ｓｆｉ  Ｉ−Ｓａｌ  Ｉ部位にＰＣＲ法で増幅したＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍのＳｆｉ  Ｉ−Ｓａｌ  Ｉ断片［ｃｃｄＢを含む断片］を、Ｓａｌ  Ｉ−Ｎｄｅ  Ｉ部位に合成したｌｏｘ５１７１を含む断片を、Ｎｄｅ  Ｉ−Ｐｖｕ  Ｉ部位にｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＮｄｅ  Ｉ−Ｐｖｕ  Ｉ断片をそれぞれ挿入し、ＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２を作製した（図８）。また、以下の実施例においてＶＨベクターとＶＬベクターとが大腸菌に組み込まれているか否かを確認するために、上記ＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２のＰｖｕ  Ｉ／ＢｓｐＥ  Ｉ−Ａｆｌ  ＩＩＩ部位をｐＥＴ２４ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮＥ社製）のＫａｎ−Ｒを含むＢｓｐＥ  Ｉ−Ａｆｌ  ＩＩＩ断片に置換したＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋを作製した（図９）。
実施例３（ＶＨライブラリーの作製）
ヒト末梢血ｃＤＮＡを鋳型としてイムノグロブリン（抗体）遺伝子をＶＨ・ＶＬ領域を別個に増幅し、その際、生体内にないレパートリーを合成するため、抗原認識部位（超可変領域３：ＣＤＲ３）のシャッフリングを行った（図１０）。ヒト末梢血ｃＤＮＡ及びヒト脾臓ｃＤＮＡを鋳型にして、以下のプライマーの組み合わせでＶＨ遺伝子断片の増幅をＰＣＲで行った。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む遺伝子断片（約２５０ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号１〜７に示される〈ＶＨ−Ｆｏｒｗａｒｄ１〉、及び配列番号８又は９に示される〈ＶＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ２〉を用い、ＣＤＲ３領域を含む遺伝子断片（１００ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号１０又は１１に示される〈ＶＨ−Ｆｏｒｗａｒｄ２〉、及び配列番号１２〜１７に示される〈ＶＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉を用いてＰＣＲを行い、約２５０ｂｐの遺伝子断片１４種類と、１００ｂｐの遺伝子断片１２種類を作製した（図１１）。なお、ＰＣＲ反応は、９４℃２分間後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３０秒間というサイクルを３０サイクル行った。上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出してＤＮＡ断片を精製した。精製ＤＮＡ断片を〈ＶＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉及び〈ＶＨ−Ｆｏｒｗａｒｄ２〉の各プライマーごとに混合し、それぞれをＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プール、ＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プール、ＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールとした。ＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールとＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールとＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールをそれぞれ混合し、ＶＨ１プール及びＶＨ２プールを作製した。かかるＶＨ１プール又はＶＨ２プールを鋳型とし、プライマー対〈ＶＨ−Ｆｏｒｗａｒｄ１〉と〈ＶＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉（７×６＝４２通り）で完全長ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅し、８４種類（４２種類×２種類のプール）の増幅産物を個々にアガロースゲル電気泳動し（図１１）、ゲルから切り出して精製した。なお、ＰＣＲ反応は、プライマーをいれないで９４℃２分間の後、９４℃１分間、６３℃４分間というサイクルを７サイクル行った後プライマーを添加し、９４℃１分間、５５℃３０秒間、７２℃１分間というサイクルを１０サイクル行い、その後、９４℃１５秒間、６０℃３０秒間、７２℃４５秒間というサイクルを１０サイクル行い、７２℃で７分間伸長させた。上記精製した完全長ＶＨ遺伝子断片を混合した後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで二重消化し、実施例１で作製したＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２又はｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３でＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで二重消化し挿入・連結した。かかるＶＨベクターを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ又はＸＬ２−Ｂｌｕｅ）に遺伝子導入し、１％のグルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有した寒天培地でコロニーを形成させ、ＶＨライブラリー（１０６個以上）を作製した。かかるＶＨライブラリーを１０％のグリセロールにより回収し、−８０℃で凍結保存した。
実施例４（ＶＬライブラリーの作製）
次に、ＶＬライブラリーを作製するために、実施例３の方法と同様にＶκ遺伝子断片を作製した。ヒト末梢血ｃＤＮＡ及びヒト脾臓ｃＤＮＡを鋳型にして、ＶκのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む遺伝子断片（約２５０ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号１８〜２１に示される〈Ｖｋａｐｐａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１〉、及び配列番号２２又は２３に示される〈Ｖｋａｐｐａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ２〉を用い、ＶκのＣＤＲ３領域を含む遺伝子断片（１００ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号２４又は２５に示される〈Ｖｋａｐｐａ−Ｆｏｒｗａｒｄ２〉、及び配列番号２６〜２９に示される〈Ｖｋａｐｐａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉を用いてＰＣＲを行い、約２５０ｂｐの遺伝子断片８種類と、１００ｂｐの遺伝子断片８種類を作製した。なお、ＰＣＲ反応は、９４℃２分間後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３０秒間というサイクルを３０サイクル行った。上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出してＤＮＡ断片を精製した。精製ＤＮＡ断片を〈Ｖｋａｐｐａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉及び〈Ｖｋａｐｐａ−Ｆｏｒｗａｒｄ２〉の各プライマーごとに混合し、それぞれをＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プール、ＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プール、ＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールとした。ＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールとＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールとＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールをそれぞれ混合し、Ｖκ１プール及びＶκ２プールを作製した。かかるＶκ１プール又はＶκ２プールを鋳型とし、プライマー対〈Ｖｋａｐｐａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１〉と〈Ｖｋａｐｐａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉（４×４＝１６通り）で完全長ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅し、３２種類（１６種類×２種類のプール）の増幅産物を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出して精製した。なお、ＰＣＲ反応は、プライマーをいれないで９４℃２分間の後、９４℃１分間、６３℃４分間というサイクルを７サイクル行った後プライマーを添加し、９４℃１分間、５５℃３０秒間、７２℃１分間というサイクルを１０サイクル行い、その後、９４℃１５秒間、６０℃３０秒間、７２℃４５秒間というサイクルを１０サイクル行い、７２℃で７分間伸長させた。
また、実施例３の方法と同様にＶλ遺伝子断片を作製した。ヒト末梢血ｃＤＮＡ及びヒト脾臓ｃＤＮＡを鋳型にして、ＶλのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む遺伝子断片（約２５０ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号３０〜３８に示される〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１〉、及び配列番号３９〜４２に示される〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ２〉を用い、ＶλのＣＤＲ３領域を含む遺伝子断片（１００ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号４３〜４６に示される〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｆｏｒｗａｒｄ２〉、及び配列番号４７又は４８に示される〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉を用いてＰＣＲを行い、約２５０ｂｐの遺伝子断片３６種類と、１００ｂｐの遺伝子断片８種類を作製した。なお、ＰＣＲ反応は、９４℃２分間後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３０秒間というサイクルを３０サイクル行った。上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出してＤＮＡ断片を精製した。精製ＤＮＡ断片を〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉及び〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｆｏｒｗａｒｄ２〉の各プライマーごとに混合し、それぞれをＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プール、ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プール、ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールとした。ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールとＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールとＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールをそれぞれ混合し、Ｖλ１プール及びＶλ２プールを作製した。かかるＶλ１プール又はＶλ２プールを鋳型とし、プライマー対〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１〉と〈Ｖｌａｍｂｄａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１〉（９×２＝１８通り）で完全長ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅し、７２種類（１８種類×４種類のプール）の増幅産物を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出して精製した。なお、ＰＣＲ反応は、プライマーをいれないで９４℃２分間の後、９４℃１分間、６３℃４分間というサイクルを７サイクル行った後プライマーを添加し、９４℃１分間、５５℃３０秒間、７２℃１分間というサイクルを１０サイクル行い、その後、９４℃１５秒間、６０℃３０秒間、７２℃４５秒間というサイクルを１０サイクル行い、７２℃で７分間伸長させた。
上記作製した完全長Ｖκ笈びＶλ遺伝子断片を混合した後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで二重消化し、実施例２で作製したＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２又はｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２ＫをＮｃｏＩ及びＳａｌＩで二重消化し挿入・連結した。かかるＶＨベクターを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ又はＸＬ２−Ｂｌｕｅ）に遺伝子導入し、１％のグルコースと、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン又は５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有した寒天培地でコロニーを形成させ、ＶＬライブラリー（１０５以上）を作製した。かかるＶＬライブラリーを１０％のグリセロールにより回収し、−８０℃で凍結保存した。
実施例５（ＶＨ・ＶＬベクター間の組換えによる抗体ライブラリの作製；図１２、１３）
実施例３で作製したＶＨの大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２５ｍＬ培地に植菌し、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を多重感染力価（ＭＯＩ）１０で感染させ一晩培養した後ファージに変換し、培養上清を調製し上清中のファージ感染力価を測定した。同様に実施例４で作製したｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋ由来のＶＬファージを用いて５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍＬ培地に植菌し、ファージに変換した。得られたＶＨおよびＶＬファージをＭＯＩ＝１０で組換え用大腸菌（Ｃｒｅ１０Ｆ：自家製）を含む２５ｍＬの培地中で共感染させ、一時間後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加え一晩培養し、組換え酵素によるＶＨ・ＶＬベクター間の組換えを起こさせた（図１４）。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１Ｌの新しい培地に一晩培養液全量を加え、さらにヘルパーファージＶＣＳＭ１３をＭＯＩ＝１０で感染させ一晩培養し、上清中に組換えファージを得、ファージ力価を測定した。その後、組換えファージを８Ｌ培養液中の大腸菌（ＸＬ１Ｂｌｕｅ）にＭＯＩ＝０．５で感染させ、一時間３７℃で培養後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび抗体ファージ融合タンパクの発現を誘導するためのＩＰＴＧを１ｍＭ、およびヘルパーファージＶＣＳＭ１３（ＭＯＩ＝１０）を加えてさらに３７℃で培養した。一時間後ＶＣＳＭ１３感染菌（ファージ産生菌）の選別のため５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと組換え抗体発現菌の二重選別のため１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを加え、培養温度を３０℃に下げ一晩培養し、培養上清を回収した。上清に１／６量の２．５ＭのＮａＣｌ及び３０％のＰＥＧ６０００を含む溶液を加え、抗体提示ファージを沈殿させ遠心により回収した。沈殿したファージはＳＭ培地に懸濁し、ＤＭＳＯを７％になるように加え、−８０℃で凍結保存した。抗体ファージライブラリをＬＢ培地で希釈し、大腸菌ＴＧ１株に感染させ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび１％グルコースを含む寒天培地上で３０℃一晩培養しコロニーを形成させ、コロニー数を計数することにより抗体提示ファージの力価（ｃｆｕ：コロニー形成単位）を測定したところ、１．２×１０１３ｃｆｕ／ｍｌが１８０ｍＬ、すなわち２×１０１６ｃｆｕが得られた。各クローンの菌体を極少量をＰＣＲ反応液（２０μｌ）に懸濁し、プライマー（５’−ＣＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：４９）および５’−ＡＣＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡ−３’（配列番号：５０））を用いて、９４℃１分、９４℃２０秒−５０℃１０秒−６８℃４０秒、３０サイクルで反応させ抗体遺伝子領域を増幅し１％アガロースゲル電気泳動で増幅したＤＮＡ長を検討した（図１５）。３２クローン中正常な抗体遺伝子を有していたのは２８クローンであった。また、プライマーを用いて増幅産物の塩基配列を決定し、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）にて由来ゲノム配列を検索したところ、様々なゲノム抗体遺伝子由来であった（図１５表）。
ＶＨ１０６種類、ＶＬ１０５種類の組み合わせで作製されたライブラリーは、各段階で培養量を増やし種類（レパートリー）の減少を防いでいるため、１０６×１０５すなわち１０１１種類を含んでいる。また、１ｍＬ中の組換えファージ総量は、２×１０１３×０．８＝約２×１０１２である。すなわち、１ｍＬ中には同じ抗体を提示するファージ２０ｃｆｕづつ含む計算になる。
実施例６（抗体ライブラリからの特異抗体のスクリーニング）
抗原として、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社Ａ−９７７１）、ペプチド（ＴＭ１：Ｎ’−ＴＲＶＴＳＦＬＤＷＩＨＥＱＭＥＲＤＬＫＴ−Ｃ’（配列番号：５１）、ＴＭ２：Ｎ’−ＰＡＰＳＨＬＶＥＫＩＶＹＨＳＫＹＫＰＫＲ−Ｃ’（配列番号：５２），アミノ酸配列を一文字表記した）、および大腸菌で発現・精製した組換えＰａｒｋｉｎｇタンパクを用いて、抗体ライブラリから特異抗体のスクリーニングを行った（図１６）。
抗原５０μｇを１．３ｍｌの炭酸バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．６）に溶かし、９６ウェルプレートの４８ウェルに２５μｌずつ入れた。プレートシールを貼り、抗原液をウェル底面全面に広げ４℃で一晩静置した。プレートシールを剥がし抗原液を捨て、各ウェルにＢＢ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社Ａ−７０３０），１％Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ（Ｄｉｆｃｏ社２３２１００））を１５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間静置した。ｓｃＦｖ  ｌｉｂｒａｒｙ  １ｍｌに、ＭＢＳＴ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）２ｍｌ、ＢＢ  ２ｍｌ、１０％Ｔｗｅｅｎ２０を２５０μｌ加えて混合し３７℃で１時間静置した。ＢＢを捨てＭＢＳＴで２回リンスし各ウェルにｓｃＦｖ  ｌｉｂｒａｒｙ希釈液を５０μｌずつ入れ、プレートシールを貼り、３７℃で１時間緩やかに振盪した。ｓｃＦｖ  ｌｉｂｒａｒｙ希釈液を捨て各ウェルをＭＢＳＴで１０回リンスした。抗原に結合したファージを回収するため、ＴＡＥ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎ，ｐＨ１１）１００μｌ、室温で１０分間および続いてＴＡＥ  ５０μｌ室温で２０分間処理した。回収したファージ液をＮＲ（０．６６Ｍ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０，１％ＢＳＡ）１００μｌに加え中和した。ＳＢＳＭ（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，２％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１％ＮａＣｌ，）を用いて３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで培養した大腸菌ＴＧ１を１００μｌ加え、３７℃で３０分放置し回収したファージをＴＧ１に感染させた。ＬＢＧ−Ｃ寒天培地（１％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１％ＮａＣｌ，１％Ｇｌｕｃｏｓｅ，２％ＢＡＣＴＯ  Ａｇａｒ，５０μｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）に蒔き、一晩３０℃で培養し、コロニーを形成させた。
２５ｍｌのＳＢＳ（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，３％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，２％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１％ＮａＣｌ）でコロニーを懸濁させて回収した。回収した大腸菌液のうち０．５ｍｌをＳＢＳ  ４０ｍｌに懸濁し、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（５０μｇ／ｍｌ）、ＶＣＳＭ１３  ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ（１０１１ｐｆｕ）、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）加え、１時間３７℃で振盪培養した。その後、Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（１２．５μｇ／ｍｌ）加え、３７℃で１５時間振盪培養した。培養液を１５０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心し、菌体を沈殿させ、抗体提示ファージを含む上清を回収した。１／４量のＰＥＧ−ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ８０００，２．５Ｍ  ＮａＣｌ）溶液を加え混合し、氷中で１５〜３０分静置後、１５０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心し、ファージを沈殿させた。ファージ沈殿を１μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＭＥＲＣＫ社）を加えた８００μｌのＭＢＳ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し２００μｌのＢＢと５０μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０を加え、３７℃１時間で静置した。また、抗原５０μｇを１．０ｍｌの炭酸バッファーウェルに溶解した抗原液をイムノチューブに入れ、４℃で一晩振盪した。抗原液を捨てＢＢ  ３．３ｍｌいれ、３７℃１時間で静置した。イムノチューブ中のＢＢを捨て、ファージ液（３ｍｌ）いれ、３７℃１時間振盪した。イムノチューブ中のファージ液を捨て、ＭＢＳＴ  ５回洗浄した。続いてＭＢＳＳ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で５回、ＭＢＳで２回洗浄した。ＧＨ（１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２．７）３ｍｌでイムノチューブを１回リンスし、さらにＧＨをあふれるまで入れて、室温で１０分放置した。ＭＢＳで２回リンスし中和し、ＴＥＡで１回リンスし、ＴＥＡをあふれるまで入れて、室温で１０分放置した。ＴＡＥを捨て新しいＴＡＥを５００μｌ入れ、パラフィルムでシールし、液が全体に行き渡るように室温で２０分間振盪した。ＮＲを３００μｌ入れ混合し中和した。ＳＢＳＭを用いて３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで培養した大腸菌ＴＧ１を２ｍｌ入れ、パラフィルムでシールしてから混合し、１時間３７℃で静置し、回収したファージを感染させた。４０ｍｌのＳＢＳに全量移し、ＶＣＳＭ１３  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（１０１１ｐｆｕ）、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）加え、１時間３７℃で培養した。その後、Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（２５μｇ／ｍｌ）、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（１２．５μｇ／ｍｌ）加え、１５時間培養した。培養液を１５０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心し、菌体を沈殿させ、抗体提示ファージを含む上清を回収した。１／４量のＰＥＧ−ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ８０００，２．５Ｍ  ＮａＣｌ）溶液を加え混合し、氷中で１５〜３０分静置後、１５０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心し、ファージを沈殿させた。ファージ沈殿を１μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＭＥＲＣＫ社）を加えた８００μｌのＭＢＳ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し２００μｌのＢＢと５０μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０を加え���３７℃１時間で静置した。また、抗原５０μｇを１．０ｍｌの炭酸バッファーウェルに溶解した抗原液をイムノチューブに入れ、４℃で一晩振盪した。抗原液を捨てＢＢ  ３．３ｍｌいれ、３７℃１時間で静置した。イムノチューブ中のＢＢを捨て、ファージ液（３ｍｌ）いれ、３７℃１時間振盪した。イムノチューブ中のファージ液を捨て、ＭＢＳＴ  ５回洗浄した。続いてＭＢＳＳ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で５回、ＭＢＳで２回洗浄した。ＧＨ（１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２．７）３ｍｌでイムノチューブを１回リンスし、さらにＧＨをあふれるまで入れて、室温で１０分放置した。ＭＢＳで２回リンスし中和し、ＴＥＡで１回リンスし、ＴＥＡをあふれるまで入れて、室温で１０分放置した。ＴＡＥを捨て新しいＴＡＥを５００μｌ入れ、パラフィルムでシールし、液が全体に行き渡るように室温で２０分間振盪した。ＮＲを３００μｌ入れ混合し中和した。ＳＢＳＭを用いて３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで培養した大腸菌ＴＧ１を２ｍｌ入れ、パラフィルムでシールしてから混合し、１時間３７℃で静置し、回収したファージを感染させた。４０ｍｌのＳＢＳに全量移し、ＶＣＳＭ１３ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（１０１１ｐｆｕ）、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）加え、１時間３７℃で培養した。その後、Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（２５μｇ／ｍｌ）、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（１２．５μｇ／ｍｌ）加え、１５時間培養した。培養液を１５０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心し、菌体を沈殿させ、抗体提示ファージを含む上清を回収した。１／４量のＰＥＧ−ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ８０００，２．５Ｍ  ＮａＣｌ）溶液を加え混合し、氷中で１５〜３０分静置後、１５０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心し、ファージを沈殿させた。ファージ沈殿を１μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＭＥＲＣＫ社）を加えた８００μｌのＭＢＳ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し２００μｌのＢＢと５０μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０を加え、３７℃１時間で静置した。また、抗原５０μｇを１．０ｍｌの炭酸バッファーウェルに溶解した抗原液をイムノチューブに入れ、４℃で一晩振盪した。抗原液を捨てＢＢ３．３ｍｌいれ、３７℃１時間で静置した。イムノチューブ中のＢＢを捨て、ファージ液（３ｍｌ）いれ、３７℃１時間振盪した。イムノチューブ中のファージ液を捨て、ＭＢＳＴ  ５回洗浄した。続いてＭＢＳＳ（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で５回、ＭＢＳで２回洗浄した。ＧＨ（１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２．７）３ｍｌでイムノチューブを１回リンスし、さらにＧＨをあふれるまで入れて、室温で１０分放置した。ＭＢＳで２回リンスし中和し、ＴＥＡで１回リンスし、ＴＥＡをあふれるまで入れて、室温で１０分放置した。ＴＡＥを捨て新しいＴＡＥを５００μｌ入れ、パラフィルムでシールし、液が全体に行き渡るように室温で２０分間振盪した。ＮＲを３００μｌ入れ混合し中和した。ＳＢＳＭを用いて３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで培養した大腸菌ＴＧ１を２ｍｌ入れ、パラフィルムでシールしてから混合し、１時間３７℃で静置し、回収したファージを感染させた。大腸菌液をＳＢＳで希釈しＬＢＧ−Ｃ寒天培地にまき、３７℃で静置しコロニーを形成させた。得られた各コロニーを９６ウェルプレートに入れたＳＢＳＧＣ（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，３％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，２％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１％ＮａＣｌ，１％Ｇｌｕｃｏｓｅ，５０μｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）５０μｌに爪楊枝で植菌し、プレートシールを貼り、３７℃一晩培養した。ＶＳＣＭ１３  ｐｈａｇｅ（１０１１ｐｆｕ／ｍｌ）・ＩＰＴＧ（１ｍＭ）・Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（５０μｇ／ｍｌ）を含むＳＢＳを各ウェル５０μｌずつ分注し、上記培養液１０μｌと混合し、３７℃１時間振盪培養した。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）・Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（５０μｇ／ｍｌ）・Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（２５μｇ／ｍｌ）・Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（１２．５μｇ／ｍｌ）を含むＳＢＳを各ウェル５０μｌずつ加え３７℃で１５時間振盪培養した。プレートを３０００ｒｐｍ１０分間遠心し、菌体を沈殿させ、上清をＢＢ  ５０μｌと混合し３７℃で１時間静置した（ファージ液）。抗原５０μｇを２．６ｍｌの炭酸バッファーに溶かし、各ウェルに２５μｌずつ入れ４℃で一晩静置し抗原液を捨てたＥＬＩＳＡプレートを用意し、各ウェルＢＢ  １５０μｌ入れ、３７℃で１時間静置した。ＥＬＩＳＡプレートのＢＢを捨てファージ液を全量いれ、３７℃で１時間静置した。ＭＢＳＴで１０回洗浄しＭＢＳＴ＋ＢＢ（１／１０  ｖｏｌ．）で１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体、各ウェル５０μｌずつ入れ３７℃で１時間静置した。ＭＢＳＴで１０回洗浄した。発色液を各ウェル１００μｌずつ入れ、室温で２０分放置後５０μｌの停止液（２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）をいれ、プレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社ｍｏｄｅｌ５５０）で４９２ｎｍの吸光度を測定した（表１）。
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（１）はＥＬＩＳＡ陽性クローンを、（２）は調査クローン数を、（３）は塩基配列の異なる独立クローンを示す。
吸光度測定が陽性になったコロニーから抗体遺伝子ＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ反応は、プライマー（５’−ＣＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：４９），５’−ＡＣＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡ−３’（配列番号：５０））１μＭおよびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて使用説明書の処方で、反応時間は９４℃２分、９４℃３０秒−５０℃１０秒−６８℃４０秒：３０サイクル行った。増幅したＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、ＰＣＲ反応に用いたプライマーおよびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてシークエンス反応を行い、ゲル濾過精製後、３７３０ｘ１  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で塩基配列を決定した。塩基配列のうち抗体遺伝子部をアミノ酸配列に翻訳し、Ｉｇ−ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）によってゲノム上の遺伝子配列にコードされている抗体アミノ酸配列と比較した（図１７）。
産業上の利用の可能性
本発明によると、発現不能なレパートリーの混入や、抗体ライブラリーの不安定性の問題がなく、プロテオミクスの有用なツールとなる一本鎖抗体ライブラリーや、かかる一本鎖抗体ライブラリーを用いた抗体チップや抗体フィルターを提供することができる。また、上記一本鎖抗体ライブラリーや、かかる一本鎖抗体ライブラリーを用いた抗体チップや抗体フィルターは、抗原特異的抗体、エピトープ特異的抗体、抗体特異的抗原、抗原に対するリガンド等のスクリーニングや、タンパク質−タンパク質間の相互作用、又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用の解析・評価ができるだけでなく、各種疾病の診断・治療などに有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の一本鎖抗体ライブラリーを用いた抗体チップ及び抗体フィルターの作製の概略を示す図である。（Ａ）は抗体提示型ファージの産生とスクリーニング法および可溶性抗体の産生法を示している。（Ｂ）はチップフィルターへの固相化を示している。
図２は、デジタルスクリーニング法による抗体−抗原関連づけの大量処理の概略を示す図である。（Ａ）１次スクリーニングで得られた一本鎖抗体フィルターの作製を示している。（Ｂ）デジタル暗号化抗原ミックスの作製を示している。（Ｃ）抗原―抗体反応によるデジタルスクリーニングを示している。（Ｄ）デジタル暗号解除による一本鎖抗体と抗原の対応関係を示している。
図３は、質量分析機器によるペプチド抗原と一本鎖抗体ライブラリーとの検索の概略を示す図である。（１）ペプチド結合ファージの選択・クローニングを示している。（２）発現宿主株の変更によるファージ提示型抗体から分泌型抗体への変換を示している。（３）プレートへの抗体のスポット（抗体チップ）を示している。（４）抗体チップに結合したペプチドアミノ酸配列の質量分析機による解析およびデータベース解析。
図４は、質量分析機器によるペプチド抗原と一本鎖抗体ライブラリーとの検索の概略を示す図である。（１）ペプチドビーズ結合ファージの選択・クローニングを示している。（２）ペプチドビーズの単離を示している。（３）抗体提示ファージの解離を示している。（４）ビーズ上のペプチドアミノ酸配列の解析（ペプチドシークエンサーや質量分析機などによる）、および、データベース解析。
図５は、本抗体ライブラリから血清診断用抗体の単離法と抗体チップによる血清テストの概略を示す図である。（１）血清タンパク質結合ファージの選択・クローニング、および抗原の固定を示している。（２）発現宿主株の変更によるファージ提示型抗体から分泌型抗体への変換を示している。（３）血清テストの概略を示す。
図６は、本発明のＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２の構築システムを示す図である。
図７は、本発明のＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３の構築システムを示す図である。
図８は、本発明のＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２の構築システムを示す図である。
図９は、本発明のＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋの構築システムを示す図である。
図１０は、ＣＤＲ３シャッフリングについての概略を示す図である。
図１１は、ＶＨ：ＣＤＲ３シャッフリングについて示す写真および図である。
図１２は、新規ｓｃＦＶライブラリーの作製法を示す図である。
図１３は、新規ｓｃＦＶライブラリーの作製法を示す図である。図１２の続きを示している。
図１４は、本発明の一本鎖抗体ライブラリーの発現ベクターの構築を示す図である。ＶＬ−ＶＨシャッフリングを示している。
図１５は、新規ｓｃＦＶライブラリーの品質を示す写真および図である。
図１６は、スクリーニング法を示す図である。
図１７は、ｓｃＦＶアミノ酸配列例を示す図である。ＴＭ１  ｓｃＦＶのアミノ酸配列を配列番号：５３、Ｏ２（ｋａｐｐａ）のアミノ酸配列を配列番号：５４、ＶＨ４−３４のアミノ酸配列を配列番号：５５に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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