【手続補正書】
【提出日】平成14年3月26日(2002.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】ビオロゲン結合アクリジンベースの分子およびその製造方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】以下の一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）：
【化１】
2004519516.tif 000001
（１ａでは、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））であり、
１ｂでは、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１１））であり、
１ｃでは、Ｙ＝オルトまたはパラトリル
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））であり、
１ｄでは、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１０）
Ｒ＝−Ａｃｒ＋−Ｒ１Ｘ−／２Ｘ−）であり、アクリジン主環中のＮもアルキル基：
Ｒ１＝−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３および−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｍ−（パラ）（ここでｍ＝０〜１３）により第四級化され、
ここで
【化２】
2004519516.tif 000002
である）のビオロゲン結合アクリジンベースの分子、ならびに製薬上許容可能なその誘導体。
【請求項２】以下の一般式１：
【化３】
2004519516.tif 000003
（１ａでは、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））であり、
１ｂ（では、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１１））であり、
１ｃでは、Ｙ＝オルトまたはパラトリル
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））であり、
１ｄでは、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１０）
Ｒ＝−Ａｃｒ＋−Ｒ１Ｘ−／２Ｘ−）であり、アクリジン主環中のＮもアルキル基：
Ｒ１＝−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３および−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｍ−（パラ）（ここでｍ＝０〜１３）により第四級化され、
ここで
【化４】
2004519516.tif 000004
である）のビオロゲン結合アクリジンベースの分子の製造方法であって、１：１の比でドライアセトニトリル中にω−（アクリジン−９−イル）−α−ブロモアルカンおよび／または１−アルキル−４，４’−ビピリジニウムブロミドの溶液を生成し、前記溶液を２０〜５０℃の範囲の温度で８〜２４時間撹拌して、沈殿を生成し、沈殿を濾過し、ドライアセトニトリルおよびジクロロメタンで洗浄して、あらゆる未反応出発物質を除去し、そのようにして得た固体を精製して、式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の化合物を得る方法。
【請求項３】式１の化合物が酢酸エチル、メタノール、ドライアセトニトリル、ジクロロメタンまたはそれらの任意の混合物から再結晶化される請求項２記載の方法。
【請求項４】式１の化合物が１：４の比のメタノールおよびアセトニトリルの混合物から再結晶化される請求項３記載の方法。
【請求項５】光線療法剤としての一般式１のビオロゲン結合アクリジンベースの分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
産業上の利用分野
本発明は、光線療法剤および触媒的光活性化ＤＮＡ切断剤として有用な、以下の一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）：
【０００２】
【化５】
2004519516.tif 000005
【０００３】
１ａ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））、
１ｂ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１１））、
１ｃ（式中、Ｙ＝オルトまたはパラトリル
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））、
１ｄ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１０）
Ｒ＝−Ａｃｒ＋−Ｒ１Ｘ−／２Ｘ−）
であって、アクリジン主環中のＮもアルキル基：
Ｒ１＝−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３および−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｍ−（パラ）（ここでｍ＝０〜１３）
により第四級化される）
【０００４】
【化６】
2004519516.tif 000006
【０００５】
のビオロゲン結合アクリジンベースの分子、および／または製薬上許容可能なその誘導体に関する。本発明は、式１の新規の分子の製造方法にも関する。本発明の新規の分子は、インターカレーションおよび／またはビスインターカレーション、ならびに溝結合相互作用による、二重、三重および四重構造を含めたＤＮＡの安定化に有用である。本発明の新規の分子は、二重鎖中およびＡＧ二塩基バルジ含有配列のグアニン（Ｇ）部位での選択性に伴う同時増感のみによるＤＮＡの触媒的光活性化切断のためである。
【０００６】
本発明は、一般式１（１ａ、１ｂおよび１ｃ）の一連の二機能性分子およびそれらの誘導体にも関し、工業的用途において水素を発生させる水の酸化のための光触媒としても有用である。
【０００７】
発明の背景
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）と選択的に結合する、そして二重鎖または一本鎖核酸を切断し得る機能性分子の設計は、重要な生化学的および生物医学的用途を有する活発な領域の研究である。これらの有効な作用物質のうちのいくつかは、種々の疾患の治療に、そしてＤＮＡ構造およびＤＮＡ−タンパク質相互作用を理解するためのプローブとして非常に有用である。天然制限酵素はこれらの用途の多くにおいて非常に有用である一方で、それらのサイズの大きさおよび／または配列認識能力の限定された範囲は、それらの一般的使用を妨げている。それゆえ、ＤＮＡの部位選択的または配列特異的修飾を生じ、慣用的制限酵素により認識されない部位でＤＮＡを切断する清潔且つ効率的方法を提供する合成性機能性分子が、非常に必要とされている。
【０００８】
この情況において、ＤＮＡ中の特定の配列または構造ドメインを認識し、結合する能力を有し、そして生理学的条件下（化学的ヌクレアーゼ）で、または光活性化時（フォトヌクレアーゼ）に、核溶解活性を示す多数の合成リガンドが開発されてきた。これらのいくつかの例としては、１，１０−フェナントロリン−銅、第一鉄−ＥＤＴＡ、ブレオマイシン、エネジエン，抗生物質およびアントラキノンが挙げられる。例えば、以下の参考文献に対して参照が成され得る：米国特許第５，９８５，５５７号、第６，０９０，５４３号、第５，７３９，０２２号、第５，５５６，９４９号、第５，５５２，２７８号、第５，５０４，０７５号、第４，９４２，２２７号；Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．Ｅ． Ｊ．Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇ．， １９９０， ３， １；Ｐａｐａｖａｓｓｉｌｉｏｕ， Ａ．Ｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９９５， ３０５， ３４５；Ｓｉｇｍａｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｇｒａｈａｍ， Ｄ．Ｒ．， Ｄ’Ａｕｒｏｒａ， Ｖ．， Ｓｔｅｒｎ， Ａ．Ｍ． Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９７９， ２５４， １２２６９；Ｐｏｐｅ， Ｌ．Ｅ．， Ｓｉｇｍａｎ， Ｄ．Ｓ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９８４， ８１， ３；Ｔｕｌｌｉｕｓ， Ｔ．Ｄ．， Ｄｏｍｂｒｏｓｋｉ， Ｂ．Ａ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９８６， ８３， ５４６９；Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ， Ｒ．Ｐ．， Ｄｅｒｖａｎ， Ｐ．Ｂ． Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８２， １０４， ３１３；Ｈｅｃｈｔ， Ｓ．Ｍ．， Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ， Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７９；Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ， Ｅ．Ａ．， Ｐｅｉｓａｃｈ， Ｊ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｓ．Ｂ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９７８， １７， ２７４０。しかしながら、多方面性であり、且つ従来の制限酵素を模倣する合成リガンドの開発が待たれている。
【０００９】
報告されたいくつかの種類のＤＮＡ切断系のうち、光活性化切断剤は、熱条件下でＤＮＡを切断する試薬を上回る有意の実際的利点を保有することが判明している。光活性化ＤＮＡ切断剤の興味深い局面は、照射前に反応混合物の構成成分の全てを併合することにより、それが反応を空間的、時間的に制御し得ることである。適切な光源による反応混合物の励起は、反応を開始させ、これは光が遮断されるまで続く。空間的および時間的な両方の意味で光を制御する能力は、転写および翻訳のような種々の生化学的過程の時間解決性プローブから、ゲノム分析および治療剤までの範囲の用途に有益であり得る。実例を選定するためには、以下の文献に対する参照が成され得る：米国特許第５，９９４，４１０号、第５，７３４，０３２号、第５，６５０，３９９号、第５，６０７，９２４号、第６，０８７，４９３号、第６，０５７，０９６号、第５，７６７，２８８号、第５，４３９，７９４号；Ａｒｍｉｔａｇｅ， Ｂ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １９９８， ９８， １１７１およびその中に引用された参考文献；Ｋｏｃｈｅｖａｒ， Ｉ．Ｅ．， Ｄｕｎｎ， Ｄ．Ａ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． １９９０， １， ２７３およびその中に引用された参考文献；Ｐａｉｌｌｏｕｓ， Ｎ．， Ｖｉｃｅｎｄｏ， Ｐ． Ｊ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， Ｂ １９９３， ２０， ２０３；Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．Ｅ．， Ｊｅｐｐｅｓｅｎ， Ｃ．， Ｂｕｃｈａｒｄｔ， Ｏ． ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ． １９８８， ２３５， １２２；Ｃｈｏｗ， Ｃ．Ｓ．， Ｂａｒｔｏｎ， Ｊ．Ｋ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９９２， ２１２， ２１９；Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｈ．， Ｍｅａｒｅｓ， Ｃ．Ｆ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８２， ２１， ６３３２；Ｒｉｏｒｄａｎ， Ｃ．Ｇ．， Ｗｅｉ， Ｐ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１９９４， １１６， ２１８９；Ｔｈｏｒｐ， Ｈ．Ｈ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇ． １９９１， ３０， １５１７；Ａｒｍｉｔａｇｅ， Ｂ．， Ｙｕ， Ｃ．， Ｄｅｖａｄｏｓｓ， Ｃ．， Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｇ．Ｂ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９４， １１６， ９８４７；Ａｄａｍ， Ｗ．， Ｃａｄｅｔ， Ｊ．， Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ， Ｆ．， Ｅｐｅ， Ｂ．， Ｒａｍａｉａｈ， Ｄ．， Ｓａｈａ−Ｍｏｌｌｅｒ， Ｃ．Ｒ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９５， ３４， １０７；Ｕｅｓａｗａ， Ｙ．， Ｋｕｗａｈａｒａ， Ｊ．， Ｓｕｇｉｕｒａ， Ｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８９， １６４， ９０３；Ｉｔｏ， Ｋ．， Ｉｎｏｕｅ， Ｓ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ．， Ｋａｗａｎｉｓｈｉ， Ｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ２６８， １３２２１；Ｓａｉｔｏ， Ｉ．， Ｔａｋａｙａｍａ， Ｍ．， Ｍａｔｓｕｕｒａ， Ｔ．， Ｍａｔｓｕｇｏ， Ｓ．， Ｋａｗａｎｉｓｈｉ， Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９０， １１２， ８８３；Ｓａｋｏ， Ｍ．， Ｎａｇａｉ， Ｋ．， Ｍａｋｉ， Ｙ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９３， ７５０。
【００１０】
これらの光活性化切断剤は、（ｉ）拡散性（一重項酸素）および非拡散性（ヒドロキシルラジカル）反応性中間物質の生成、（ｉｉ）水素原子引抜き反応、ならびに（ｉｉｉ）電子伝達によりＤＮＡを切断することが判明している。これまでに報告された系のほとんどが、１つより多いメカニズムにより光切断を開始する。これらのメカニズム全てにより誘導される損傷は糖または核塩基の初期修飾をもたらし、これが次にホスホジエステル切断を生じるが、１つのメカニズムだけによりＤＮＡを切断する試薬を開発するための、そしてＤＮＡ中の特定の配列またはドメインに対してこれらの切断試薬を標的にするための真剣な努力が進行中である。参考文献を以下に挙げる：Ｃａｄｅｔ， Ｊ．， Ｔｅｏｕｌｅ， Ｒ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． １９７８， ２８， ６６１；Ｃｒｏｋｅ， Ｄ．Ｔ．， Ｐｅｒｒｏｕａｕｌｔ， Ｌ．， Ｓａｒｉ， Ｍ．Ａ．， Ｂａｔｔｉｏｎｉ， Ｊ．Ｐ．， Ｍａｎｓｕｙ， Ｄ．， Ｍａｇｄａ， Ｄ．， Ｗｒｉｇｈｔ， Ｍ．Ｍ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ．， Ｓｅｓｓｌｅｒ， Ｊ．Ｌ．， Ｓａｎｓｏｍ， Ｐ．Ｉ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９５， １１７， ３６２９；Ｔｅｏｄｏｒａｋｉｓ， Ｅ．， Ｗｉｌｃｏｘｅｎ， Ｋ．Ｍ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９６， １９２７；Ｓｕｅｎａｇａ， Ｈ．， Ｎａｋａｓｈｉｍａ， Ｋ．， Ｈａｍａｃｈｉ， Ｉ．， Ｓｈｉｎｋａｉ， Ｓ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９７， ３８， ２４７９；Ｃｕｌｌｉｓ， Ｐ．Ｍ．， Ｍａｌｏｎｅ， Ｍ．Ｅ．， Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ， Ｌ．Ａ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９６， １１８， ２７７５；Ｓｉｅｓ， Ｈ．， Ｓｃｈｕｌｚ， Ｗ．Ａ．， Ｓｔｅｅｎｋｅｎ， Ｓ． Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｂ１９９６， ３２， ９７；Ｓａｉｔｏ， Ｉ．， Ｔａｋａｙａｍａ， Ｍ．， Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｈ．， Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｔ． Ｉｎ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ； Ｍｅｕｎｉｅｒ， Ｂ．， Ｅｄ．， Ｋｌｕｗｅｒ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， １９９６， ｐｐ１６３−１７６。
【００１１】
近年、核塩基の酸化によるだけを含む光誘導性電子伝達メカニズムにより有効にＤＮＡを切断する分子の設計における関心が増大してきた。このメカニズムの独特の特徴は、切断を合理的に制御し得ることである。グアニンは、その低イオン化能力のために核酸の最も容易に酸化される塩基であるため、このメカニズムによるＤＮＡ切断はグアニン（Ｇ）で起こる、ということが観察されている。光誘導性電子伝達メカニズムによりＤＮＡ切断を引き起こす多数の有機物質ならびに無機物質系が報告されている。しかしながら、これらの試薬のほとんどが低効率性であり、１０−８のオーダーの切断効率を有することが判明した。参考文献を以下に示す：Ｓｅｖｉｌｌａ， Ｍ．Ｄ．， Ｄ’Ａｒｃｙ， Ｊ．Ｂ．， Ｍｏｒｅｈｏｕｓｅ， Ｋ．Ｍ．， Ｅｎｇｌｅｈａｒｄｔ， Ｍ．Ｌ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． １９７９， ２９， ３７；Ｂｌａｕ， Ｗ．， Ｃｒｏｋｅ， Ｄ．Ｔ．， Ｋｅｌｌｙ， Ｊ．Ｍ．， ＭｃＣｏｎｎｅｌ， Ｄ．Ｊ．， ＯｈＵｉｇｉｎ， Ｃ．， Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ， Ｗ．Ｊ．Ｍ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８７， ７５１；Ｓａｇｅ， Ｅ．， ＬｅＤｏａｎ， Ｔ．， Ｂｏｙｅｒ， Ｖ．， Ｈｅｌｌａｎｄ， Ｄ．Ｅ．， Ｋｉｔｔｌｅｒ， Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ．， Ｍｏｕｓｔａｃｃｈｉ， Ｅ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８９， ２０９， ２９７；Ｂｒｕｎ， Ａ．Ｍ．， Ｈａｒｒｉｍａｎ， Ａ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１， １１３， ８１５３；Ｌｙ， Ｄ．， Ｋａｎ， Ｙ．， Ａｒｍｉｔａｇｅ， Ｂ．， Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｇ．Ｂ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９６， １１８， ８７４７；Ｈａｌｌ， Ｄ．Ｂ．， Ｈｏｌｍｌｉｎ， Ｒ．Ｅ．， Ｂａｒｔｏｎ， Ｊ．Ｋ． Ｎａｔｕｒｅ １９９６， ３８２， ７３１；Ｇａｓｐｅｒ， Ｓ．Ｍ．， Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｇ．Ｂ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９７， １１９， １２７６２．したがって、電子伝達メカニズムを基礎にした効率的光活性化ＤＮＡ切断剤が、生物学的用途のために非常に望ましい。
【００１２】
電子伝達メカニズムによる光活性化ＤＮＡ切断剤の場合、反応の効率は、他の条件のほかに、切断剤の還元能力、励起状態エネルギーおよび基底状態塩基の酸化能力によっている。効率的反応が起こるためには、供与体から受容体への正電子伝達の速度は、逆電子伝達過程より大きくなければならない。したがって、光活性化ＤＮＡ切断剤に関連した非効率性は、結果として生じる酸化塩基および還元増感剤間の効率的逆電子伝達の存在によるものであり得る。このような系に関連した逆電子伝達過程の欠点を克服するために、同時増感メカニズムに基づいた２〜３の例が開発された（Ｄｕｎｎ， Ｄ．Ａ．， Ｌｉｎ， Ｖ．Ｈ．， Ｋｏｃｈｅｖａｒ， Ｉ．Ｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２， ３１， １１６２０； Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｓ．Ｊ．， Ｂｅａｕｍｏｎｔ， Ｐ．Ｃ． Ｊ．Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． １９８７， ９１， ３９９３； Ｆｒｏｍｈｅｒｚ， Ｐ．， Ｒｉｎｇｅｒ， Ｂ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８６， １０８， ５３６１）。これらの系は、ＤＮＡの表面と結合する補助増感剤（電子受容体）に光活性化により電子を伝達する挿入剤でもある増感剤から成る。増感剤から遠く離れて結合する補助増感剤を包含する光増感は、逆電子伝達を抑制し、それによりＤＮＡ切断を増大すると予測される。しかしながら、実際は、増感剤および補助増感剤の濃度、距離およびＤＮＡ結合親和性に関する複雑化のために、ＤＮＡ切断効率のほんのわずかな改善（１０−７のオーダーで）のみがこれらの系では観察された。
【００１３】
したがって、水性媒質中で可溶性であり、逆電子伝達による非効率性を克服し、ＤＮＡとの強力な結合相互作用を受け、電子伝達メカニズムだけによるＤＮＡ切断を誘導するのに選択的且つ有効である小化合物の開発は、慣用的制限酵素により認識されない部位でのＤＮＡ切断の明確且つ効率的方法を含めた生物学的用途のために、非常に望まれる。
【００１４】
ＤＮＡと強力に且つ選択的に結合し、同時増感メカニズムのみにより機能する選択的且つ有効な光活性化ＤＮＡ切断剤として作用する機能性分子を提供することが、本発明の目的である。
【００１５】
発明の目的
本発明の主な目的は、光療法剤および触媒的光活性化ＤＮＡ切断剤として用いられ得るビオロゲン結合アクリジンを基礎にした新規の二機能性分子またはそれらの誘導体を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、生物学的意義を有し、且つ高選択性を有する種々のＤＮＡ構造（一重鎖、二重鎖、三重鎖および四重鎖）のためのプローブとして作用し得るビオロゲン結合アクリジンを基礎にした二機能性分子またはそれらの誘導体を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、同時増感メカニズムのみによる、二重鎖及び塩基バルジ含有ＤＮＡの触媒的光活性化ＤＮＡ切断剤として作用し得るビオロゲン結合アクリジンを基礎にした二機能性分子またはそれらの誘導体を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、工業的用途における水の酸化のための光触媒として作用し得るビオロゲン結合アクリジンを基礎にした二機能性分子またはそれらの誘導体を提供することである。
【００１９】
発明の要約
したがって、本発明は、以下の一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）：
【００２０】
【化７】
2004519516.tif 000007
【００２１】
１ａ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））、
１ｂ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１１））、
１ｃ（式中、Ｙ＝オルトまたはパラトリル
Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または
−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−（ここで、ｍ＝１〜１３））、
１ｄ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１０）
Ｒ＝−Ａｃｒ＋−Ｒ１Ｘ−／２Ｘ−）
であって、アクリジン主環中のＮもアルキル基：
Ｒ１＝−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３および−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｍ−（パラ）（ここでｍ＝０〜１３）
により第四級化される）
【００２２】
【化８】
2004519516.tif 000008
【００２３】
のビオロゲン結合アクリジンベースの分子に関する。
【００２４】
本発明は、前記の一般式（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）のビオロゲン結合アクリジン、ビスアクリジンおよびアクリジニウム塩を基礎にした新規の二機能性分子の製造方法であって、１：１の比でドライアセトニトリル中にω−（アクリジン−９−イル）−α−ブロモアルカンおよび／または１−アルキル−４，４’−ビピリジニウムブロミドの溶液を生成し、その溶液を２０〜５０℃の範囲の温度で８〜２４時間撹拌して、沈殿を生成し、沈殿を濾過し、ドライアセトニトリルおよびジクロロメタンで洗浄して、あらゆる未反応出発物質を除去し、そのようにして得た固体を精製して、式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の化合物を得る方法にも関する。
【００２５】
本発明の一実施態様では、式１の化合物は、好ましくは、メタノールおよびアセトニトリルの混合物（１：４）から再結晶化される。
【００２６】
本発明のさらに別の実施態様は、二重鎖およびＡＧ二塩基バルジ含有ＤＮＡのＧ部位の同時増感メカニズムのみによるＤＮＡの触媒的光活性化切断のための、一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の二機能性分子およびそれらの製薬上許容可能な誘導体に関する。
【００２７】
本発明の別の実施態様では、一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の二機能性分子およびそれらの製薬上許容可能な誘導体は、ＤＮＡ標的か診断剤または光療法剤として用いられる。
【００２８】
本発明の別の実施態様では、本発明の二機能性分子は、インターカレーション、ビスインターカレーションおよび溝結合による、二重鎖、三重鎖および四重鎖構造を含めたＤＮＡの安定化のために用いられる。
【００２９】
本発明のさらに別の実施態様は、二重鎖およびＡＧ二塩基バルジのＧ部位での選択性を有するＤＮＡの光触媒的切断のための、ならびにこれらの構造のためのプローブとしての一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の二機能性分子の使用である。
【００３０】
本発明のさらに別の実施態様は、一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の二機能性分子およびそれらの誘導体が工業的用途における水の酸化のための光触媒として用いられることである。
【００３１】
本発明の詳細な説明
本発明においては、新規の二機能性分子は、ＤＮＡ挿入剤および剛性〜柔軟性スペーサー基により結合される補助増感剤を含む。アクリジン部分のような挿入剤は、可視領域での吸収を可能にし、励起状態で電子供与体（増感剤）として作用する。他方、補助増感剤、即ちメチルビオロゲン部分は非常に良好な電子受容体であり、ＤＮＡとの溝結合相互作用を受けるのを可能にする。剛性〜柔軟性スペーサー基は、挿入剤と補助増感剤との間の距離および相対的配向の変化によりこれらの系における電子伝達速度を制御するのに主要な役割を演じる。
【００３２】
本発明においては、柔軟性〜剛性スペーサー基ならびに異なる条件下で検査されたそれらの光物理学的特性を有する一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の一連の新規のビオロゲン結合アクリジン、ビスアクリジンおよびビスアクリジニウム塩が合成された。さらに、これらの分子のＤＮＡ結合およびＤＮＡ安定化特性が、仔ウシ胸腺ＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチドを用いて検査された。光活性化ＤＮＡ切断特性が調べられ、そしてプラスミドＤＮＡ、合成二重鎖および塩基バルジ含有ＤＮＡ配列を用いることによりこれらの化合物により誘導される配列特異的切断も分析された。さらに、それらの生物学的および触媒的活性のメカニズムが評価された。
【００３３】
その結果、一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の化合物およびそれらの誘導体は生理学的ｐＨ条件で良好な溶解性を有し、良好な吸収特性を示す、ということが観察された。さらに、アクリジン環のプロトン付加は、全く異なる且つ興味深い光物理的およびレドックス特性を示す対応するアクリジニウム塩の生成を導く。吸収および蛍光試験は、ビオロゲンおよびアクリジン部分間の結合による及び空間相互作用による実在を確証する。さらに、蛍光収率の効率的制止が観察されたが、これは制止のメカニズムが１０１０のオーダーの速度を有する電子伝達メカニズムによるものであることを示す。
【００３４】
面白いことに、これらの二機能性分子は、インターカレーションおよび／またはビスインターカレーションならびに溝結合相互作用によるＤＮＡとの強力な結合を示し、通常はポリ（ｄＡ）ポリ（ｄＴ）配列に対する高親和性を有する。励起すると、これらの分子は非常に効率的に、且つグアニン（Ｇ）部位に高選択的に、そしてＧＧステップの５’−Ｇを優先して、ＤＮＡを切断した。さらに、これらの分子は、塩基バルジを含有する配列に対して非常に誘引性であり、特にＡＧ塩基バルジのＧ部位で、光活性化時に切断する。これらの化合物により誘導されるＤＮＡ切断は、電子伝達メカニズムだけによるものであり、この場合、励起アクリジン部分は電子をメチルビオロゲンに伝達して（ＭＶ２＋）、アクリジンのラジカルカチオンおよびメチルビオロゲンのラジカルカチオン（ＭＶ＋）を生じる。一旦生成されたアクリジンのラジカルカチオンは、結合の部位でＤＮＡ塩基を酸化し得る。そして最後に、予測どおり、Ｇ部位でのＤＮＡの効率的切断を引き起こした。さらに、これらの分子は、再利用可能であり、犠牲電子供与体の存在下で触媒として作用することが判明している。したがって、本発明の系は、興味深い光物理的特性を有する二機能性だけでなく、再利用可能で、有効な光活性化ＤＮＡ切断剤および光療法剤として、ならびに工業的用途における水の酸化のための光触媒として作用する。
【００３５】
表１は、１ｍＭのＥＤＴＡおよび２または１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中の式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ、ならびにｎ＝１１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）のビオロゲン結合アクリジン化合物、およびビスアクリジン系（式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ）の化合物）を基礎にした二機能性分子のＤＮＡ会合定数を示す。
【００３６】
表２は、ＤＮＡ溶融試験のために用いられるオリゴヌクレオチドの構造を示す。
【００３７】
表３は、ＤＮＡ切断試験のために用いられるオリゴヌクレオチドの構造を示す。
【００３８】
したがって本発明は、式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の化合物により代表される二機能性分子およびそれらの誘導体の製造方法を提供する。
【００３９】
一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の二機能性分子およびそれらの製薬上許容可能な誘導体は、二重鎖、三重鎖および四重鎖ＤＮＡを含めたＤＮＡ構造の安定化のために有用である。一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の二機能性分子およびそれらの製薬上許容可能な誘導体は、同時増感メカニズムのみによる、二重鎖およびＡＧ二塩基バルジ含有ＤＮＡのＧ部位でのＤＮＡの光触媒的切断のためにも有用である。本発明の新規の分子およびそれらの製薬上許容可能な誘導体は、ＤＮＡ標的化診断剤または光療法剤として有用である。これらの増感剤は、ヒトまたは動物の診断または治療のために用いられ得る。
【００４０】
本発明の二機能性分子は、インターカレーション、ビスインターカレーションおよび溝結合による、二重、三重および四重構造を含めたＤＮＡの安定化のために用いられる。一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の二機能性分子は、二重鎖中およびＡＧ二塩基バルジのグアニン（Ｇ）部位での選択性を有するＤＮＡの触媒的光活性化切断のためにも用いられ、それゆえこれらの構造のためのプローブとして用いられ得る。一般式１（１ａ、１ｂおよび１ｃ）の二機能性分子およびそれらの誘導体は、工業的用途における水の酸化のための光触媒としても用いられる。
【００４１】
以下の実施例は説明のために示されるものであり、したがって本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。
【００４２】
実施例１〜４は、一般式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）の化合物の典型的合成を示し、実施例５〜１１は、二機能性ビオロゲン結合アクリジンベースの分子の光物理的、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏＤＮＡ結合および切断特性を示す。
【００４３】
実施例１
式１ａ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−）の化合物により代表される処方物の調製のための一般手法。１：１の比でのドライアセトニトリル（３０〜５０ｍＬ）中のω−（アクリジン−９−イル）−α−ブロモアルカン（１〜１０ ｍｍｏｌ）および１−アルキル−４，４’−ビピリジニウムブロミド（１〜１０ｍｍｏｌ、これは、３：１のモル比で４，４’−ピリジンを対応するα−ブロモアルカンと反応させることにより、９３〜９８％の収率で得た）の溶液を、２０℃で１０時間撹拌した。このようにして得た沈殿固体を濾過し、ドライアセトニトリルおよびジクロロメタンで洗浄して、あらゆる未反応出発物質を除去した。ジクロロメタンを用いたソックスレー抽出により固体を精製して、式１ａの化合物を収率７０〜９５％で得た。これらの化合物を、メタノールおよびアセトニトリルの混合物（１：４）から再結晶化した。
【００４４】
１−［（アクリジン−９−イル）メチル］−１’−ブチル−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物）の物理化学的特性：融点：２６０〜２６１℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ４８４（Ｍ＋Ｂｒ―）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝０．９１（ｔ，３Ｈ）， １．２６−１．３３（ｍ，２Ｈ）， １．８９−１．９４（ｍ，２Ｈ）， ４．６６（ｔ，２Ｈ）， ７．１１（ｓ，２Ｈ）， ７．７７（ｔ，２Ｈ）， ７．９７（ｔ，２Ｈ）， ８．３１（ｄ，２Ｈ）， ８．５３（ｄ，２Ｈ）， ８．５９（ｄ，２Ｈ）， ８．６６（ｄ，２Ｈ）， ９．１９（ｄ，２Ｈ）， ９．３１（ｄ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１４９．７８−１２１．４１， ６１．０５， ５５．４４， ３３．０１， １９．１０， １３．６６；性質：真珠光沢黄色粉末。
【００４５】
１−［３−（アクリジン−９−イル）プロピル］−１’−ブチル−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ａ（式中、ｎ＝３、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物）の物理化学的特性：融点：２５３〜２５４℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ４３３（Ｍ＋）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝０．９５（ｔ，３Ｈ）， １．２８−１．４０（ｍ，２Ｈ）， １．９２−２．０２（ｍ，２Ｈ）， ２．４６−２．５１（ｍ，４Ｈ）， ３．９５（ｔ，２Ｈ）， ４．７４（ｔ，２Ｈ）， ７．７９（ｔ，２Ｈ）， ８．０５（ｔ，２Ｈ）， ８．２８（ｄ，２Ｈ）， ８．８３−８．８６（ｍ，６Ｈ）， ９．４５（ｄ，２Ｈ）， ９．５７（ｄ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１４９．４５−１２４．９６， ６１．４４， ６０．７３， ３３．２１， ３３．１５， ２４．９７， １９．２７， １３．８０；性質：真珠光沢黄色粉末。
【００４６】
１−［１１−（アクリジン−９−イル）ウンデシル］−１’−ブチル−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ａ（式中、ｎ＝１１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物）の物理化学的特性：融点：２４８〜２４９℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ５４５（Ｍ＋Ｂｒ―）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝０．９５（ｔ，３Ｈ）， １．２３−１．７１（ｍ，１８Ｈ）， １．９５−１．９８（ｍ，４Ｈ）， ３．６５（ｔ，２Ｈ）， ４．７３（ｔ，４Ｈ）， ７．６５（ｔ，２Ｈ）， ７．８５（ｔ，２Ｈ）， ８．１４（ｄ，２Ｈ）， ８．３８（ｄ，２Ｈ）， ８．８２（ｄ，４Ｈ）， ９．４３（ｄ，４Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１４８．９７−１２４．７１， ６１．２５， ６１．０４， ３３．０７， ３１．６４， ３１．１５， ２９．６８， ２９．２６， ２９．１３， ２８．７６， ２７．１３， ２５．７９， １９．１５， １３．７１；性質：真珠光沢黄色粉末。
【００４７】
実施例２
式１ｂ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−）の化合物により代表される処方物の調製のための一般手法。２：１の比でのドライアセトニトリル（５０〜１５０ｍＬ）中のω−（アクリジン−９−イル）−α−ブロモアルカン（２〜１０ ｍｍｏｌ）および４，４’−ビピリジン（１〜５ｍｍｏｌ）の溶液を、３５℃で２０時間撹拌した。沈殿固体を濾過し、ジクロロメタンおよびアセトニトリルで洗浄した。ジクロロメタンを用いた固体のソックスレー抽出は、式１ｂの化合物を収率６５〜９０％で得た。
【００４８】
ビス−１，１’−［（アクリジン−９−イル）メチル］−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ））の物理化学的特性：融点：＞４００℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ６１９（Ｍ＋Ｂｒ―）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．０９（ｓ，４Ｈ）， ７．７７−７．９５（ｍ，８Ｈ）， ８．２１−８．５５（ｍ，１６Ｈ）， ９．０５−９．１６（ｍ，８Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１５０．８５−１２４．５１， ５８．５２；性質：真珠光沢黄色粉末。
【００４９】
ビス−１，１’−［３−（アクリジン−９−イル）プロピル］−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ｂ（式中、ｎ＝３、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ））の物理化学的特性：融点：２２４℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ５９６（Ｍ＋）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝２．５０−２．６０（ｍ，４Ｈ）， ３．９５（ｔ，４Ｈ）， ４．９（ｔ，４Ｈ）， ７．７９−７．８３（ｍ，６Ｈ）， ８．０１−８．０７（ｍ，８Ｈ）， ８．２６（ｄ，２Ｈ）， ８．４６−８．４８（ｍ，４Ｈ）， ８．６９（ｄ，２Ｈ）， ８．９３（ｄ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１５０．８２−１２１．８６， ６０．２６， ３２．３６， ２４．３０；性質：真珠光沢黄色粉末。
【００５０】
ビス−１，１’−［１１−（アクリジン−９−イル）ウンデシル］−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ｂ（式中、ｎ＝１１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）１１−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ））の物理化学的特性：融点：１５２−１５３℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ８２０（Ｍ＋）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．２２−１．９４（ｍ，３６Ｈ）， ３．６３（ｔ，４Ｈ）， ４．６４（ｔ，４Ｈ）， ７．６５（ｔ，４Ｈ）， ７．８５（ｔ，４Ｈ）， ８．０４（ｄ，４Ｈ）， ８．１５（ｄ，４Ｈ）， ８．３７（ｄ，２Ｈ）， ８．６３（ｄ，２Ｈ）， ８．８７（ｄ，２Ｈ）， ９．２４（ｄ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１５１．３６−１２２．３０， ６０．８３， ３１．６３， ３１．０７， ２９．６９， ２９．２６， ２９．１１， ２８．７５， ２７．１３， ２５．７９；性質：真珠光沢黄色粉末。
【００５１】
実施例３
式１ｃ（式中、Ｙ＝オルトまたはパラトリル；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−）の化合物の合成。１：１の比でのドライアセトニトリル（３０〜１２０ｍＬ）中の９−（２−ブロモメチルフェニル）アクリジン（１〜５ ｍｍｏｌ）および１−ブチル−４，４’−ビピリジニウムブロミド（１〜５ｍｍｏｌ）の溶液を、５０℃で１５時間撹拌した。このようにして得た沈殿固体を濾過し、ドライアセトニトリルおよびジクロロメタンで洗浄して、あらゆる未反応出発物質を除去した。ジクロロメタンを用いたソックスレー抽出により固体をさらに精製して、式１ｃ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ。アクリジンはオルト位置にある）の化合物を収率３５〜５５％で得て、生成物を、酢酸エチルからの再結晶化によりさらに精製した。同様に、１：１の比でのドライアセトニトリル（３０〜１２０ｍＬ）中の９−（４−ブロモメチルフェニル）アクリジン（１〜５ ｍｍｏｌ）および１−ブチル−４，４’−ビピリジニウムブロミド（１〜５ｍｍｏｌ）の溶液は、式１ｃ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３、Ｘ＝Ｂｒ。アクリジンはパラ位置にある）の化合物を収率５５〜７０％で得て、生成物を、酢酸エチルからの再結晶化によりさらに精製した。
【００５２】
１−［（２−（アクリジン−９−イル）−１−メチル）フェニル］−１’−ブチル−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ｃ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３、Ｘ＝Ｂｒおよびアクリジンはオルト位置にある））の物理化学的特性：融点：２２４〜２２５℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ５６１（Ｍ＋Ｂｒ―）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝０．９５（ｔ，３Ｈ）， １．３１−１．３９（ｍ，２Ｈ）， １．９５−２．００（ｍ，２Ｈ）， ４．７３（ｔ，２Ｈ）， ５．５６（ｓ，２Ｈ）， ７．２１（ｄ，２Ｈ）， ７．４２（ｔ，２Ｈ）， ７．５（ｄ，２Ｈ）， ７．７５−７．８９（ｍ，４Ｈ）， ８．２０−８．２３（ｍ，４Ｈ）， ８．４１（ｄ，２Ｈ）， ８．５５（ｄ，２Ｈ）， ９．４（ｄ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１４８．４９−１２４．２４， ６２．０１， ６０．６４， ３２．６７， １８．７８， １３．３５；性質：黄色粉末。
【００５３】
１−［（４−（アクリジン−９−イル）−１−メチル）フェニル］−１’−ブチル−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（式１ｃ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３、Ｘ＝Ｂｒおよびアクリジンはパラ位置にある））の物理化学的特性：融点：２６８〜２６９℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ５６１（Ｍ＋Ｂｒ―）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝０．９４（ｔ，３Ｈ）， １．３１−１．３８（ｍ，２Ｈ）， １．９０−１．９５（ｍ，２Ｈ）， ４．７２（ｔ，２Ｈ）， ６．１８（ｓ，２Ｈ）， ７．５７−７．６５（ｍ，６Ｈ）， ７．８８−７．９２（ｍ，４Ｈ）， ８．２４（ｄ，２Ｈ）， ８．８６（ｄ，２Ｈ）， ８．８８（ｄ，２Ｈ）， ９．４３（ｄ，２Ｈ）， ９．６９（ｄ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１４９．２３−１２４．２２， ６２．８６， ６０．６３， ３２．７０， １８．７６， １３．３２；性質：黄色粉末。
【００５４】
実施例４
式１ｄ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１０）；Ｒ＝−Ａｃｒ＋−Ｒ１Ｘ−／２Ｘ−であって、アクリジン主環中のＮもアルキル基：Ｒ１＝−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３および−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｍ−（パラ）（ここでｍ＝０〜１３）により四級化されている）の化合物により代表される処方物の調製のための一般手法。１：３の比でのドライアセトニトリル（３０〜１５０ｍＬ）中のα，ω−ビス（９−アクリジニル）アルカン（１〜５ ｍｍｏｌ）およびハロゲン化アルキル（３〜１５ｍｍｏｌ）の溶液を、８〜２４時間還流した。沈殿固体を濾過し、小部分ずつのドライアセトニトリルおよびジクロロメタンで洗浄して、未反応出発物質を除去した。酢酸エチルおよびアセトニトリルの混合物（１：４）からの再結晶化により固体をさらに精製して、式１ｄの化合物を収率６５〜９５％で得た。
【００５５】
式１ｄ（式中、ｎ＝５、Ｒ＝−Ａｃｒ＋−ＣＨ３およびＸ＝１）の化合物の物理化学的特性：融点：２２２〜２２３℃；分子量：ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ５６１（Ｍ＋Ｂｒ―）；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．８８（ｍ，６Ｈ）， ３．９９（ｔ，４Ｈ）， ４．８２（ｓ，６Ｈ）， ８．０１（ｔ，４Ｈ）， ８．３５（ｔ，４Ｈ）， ８．７８（ｄ，４Ｈ）， ８．８７（ｄ，４Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１６４．３８−２０．０１， ３２．６０， ３２．２２， ３０．１９， ２９．３７；性質：黄色粉末。
【００５６】
式１ｄ（式中、ｎ＝１０、Ｒ＝−Ａｃｒ＋−ＣＨ３およびＸ＝１）の化合物の物理化学的特性：融点：２３０〜２３２℃；１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．２６−１．７４（ｍ，１６Ｈ）， ３．９７（ｔ，４Ｈ）， ４．８２（ｓ，６Ｈ）， ８．０３（ｔ，４Ｈ）， ８．４３（ｔ，４Ｈ）， ８．７７（ｄ，４Ｈ）， ８．９（ｄ，４Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１６４．６５−１２０．０３， ３３．７５， ３３．０５， ２９．９４， ２９．４４， ２９．３２， ２４．９７；性質：黄色粉末。
【００５７】
実施例５
ＤＮＡ結合効率：式１ａおよび１ｄの化合物により代表されるアクリジン−ビオロゲン二機能性分子のＤＮＡ結合親和性を、異なる塩濃度（２ｍＭおよび１００ｍＭ）のＮａＣｌ緩衝液中の仔ウシ胸腺ＤＮＡを用いて分析した。ＮａＣｌ中に異なる濃度の仔ウシ胸腺ＤＮＡを含有する試験溶液を室温で１時間インクとして、複合体生成を完了し、吸収および蛍光技法を用いて分析した。ビオロゲン結合アクリジンの蛍光発光収率の吸収および有効クエンチングにおける強い淡色効果が、ＤＮＡの存在下で観察された。ビオロゲン結合アクリジンのＤＮＡとの結合定数を、報告された手法にしたがって確定した。参考文献を以下に示す：Ａ．Ｒ．，Ｓｋｅｒｒｅｔｔ， Ｊ．Ｎ．Ｈ． Ｔｒａｎｓ． Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏｃ． １９５６， ５２， ２６１；ＭｃＧｈｅｅ， Ｊ．Ｄ．， ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ， Ｐ．Ｈ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７４， ８６， ４６９；Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ． Ａｍ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９４９， ５１， ６６０；Ａｄａｍ， Ｗ．， Ｃａｄｅｔ， Ｊ．， Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ， Ｆ．， Ｅｐｅ， Ｂ．， Ｒａｍａｉａｈ， Ｄ．， Ｓａｈａ−Ｍｏｌｌｅｒ， Ｃ．Ｒ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９５， ３４， １０７。これらの分子は、仔ウシ胸腺ＤＮＡに対する明らかな結合親和性（１０６のオーダー）を示し、高塩濃度では１オーダー低いことが判明した（表１）。さらにこれらの化合物の蛍光寿命も，ＤＮＡの存在下および非存在下で検査した。
【００５８】
【表１】
2004519516.tif 000009
【００５９】
これらの結果は、螺旋軸に対して垂直な位置で仔ウシ胸腺ＤＮＡの塩基対の間に平らなアクリジン環が挿入され得ることを示す。同時に、ビオロゲン部分は、ＤＮＡのリン酸塩主鎖と静電的に相互作用する。緩衝媒質のイオン強度に関する結合定数の強い依存性は、これらの系がインターカレーションにより、ならびに溝結合によってＤＮＡと相互作用することを強く示すものであって、これはそれらの二機能性を示す。
【００６０】
実施例６
ポリ（ｄＡ）ポリ（ｄＴ）に対する特別な親和性の実証。
ＤＮＡ中のビオロゲン結合アクリジン中のアクリジン発色団の結合部位に関する良好な理解を得るために、これらの分子の吸収および蛍光特性を、種々のポリヌクレオチドの存在下で調べた。ビオロゲン結合アクリジンの緩衝化溶液へのポリ（ｄＡ）ポリ（ｄＴ）の漸進的付加は、それらの蛍光発光収率の強度の増強を伴って、吸収強度の漸減を生じた（図１）。しかしながら、ポリ（ｄＧ）ポリ（ｄＣ）の溶液を付加した場合、有意の変化は観察されなかった。これらの結果は、本明細書中で検査したビオロゲン結合アクリジンがＡ、Ｔ配列に対する特別な親和性を保有し、それゆえＤＮＡ中のこれらの配列の検出のためのプローブとしての潜在的用途を有し得るという事実を示す。
【００６１】
実施例７
ＤＮＡの熱安定性の増強。
ＤＮＡ二重鎖中への小リガンドのインターカレーションは、ＤＮＡ溶融温度（Ｔｍ）、即ち二重螺旋が一本鎖ＤＮＡに変性する温度を増大することが知られている（Ｇａｓｐａｒｒｏ， Ｆ．Ｐ． Ｐｓｏｒａｌｅｎ ＤＮＡ ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， １９８８；Ｐａｔｅｌ， Ｄ．Ｊ．， Ｃａｎｎｅｌ， Ｌ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９７６， ７３， ６７４）。ＤＮＡの熱変性に及ぼす本発明の系の作用を検査するために、仔ウシ胸腺ＤＮＡおよび表２に列挙した合成オリゴヌクレオチドを用いて、実験を実行した。
【００６２】
【表２】
2004519516.tif 000010
【００６３】
１０ｍＭリン酸塩緩衝液中で、式１ａおよび１ｂ（それぞれ、式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−および式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−）の化合物はともに、ＤＮＡを安定化し、安定化の程度は、図２に示すように、ビオロゲン結合アクリジンの濃度の増大に伴って増大することが判明した。リガンドの全ての濃度で、転移温度は１つだけ観察され、各々の場合、それは、ＤＮＡとの１種類の結合のみがこのような振る舞いに関与することを示す。安定化の程度は、式１ａ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−）の４０μＭの化合物の場合に、ほぼ２０℃であることが見出されたが、一方、式１ｂ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−）の２０μＭの化合物は、ほぼ１８℃安定性を示した。
【００６４】
有意の熱安定性のほかに、図３に示すように、これらの分子のＤＮＡとの結合時に、通常大淡色効果（約８０％）が観察された。これらの結果は、リガンド分子およびＤＮＡ塩基間の強力なπスタッキング相互作用の存在を示す。これは、溶融時のＤＮＡ鎖の部分的にすぎない分離を生じ、吸収変化の低減をもたらす。式１ａおよび１ｂの構造により提供される大きな安定性および有意の淡色効果はさらに、それらのＤＮＡとの強力な相互作用、ならびに種々のＤＮＡ構造の検出、三重鎖およびＧ四重鎖構造の安定化に関する生物学における潜在的使用を提供する。
【００６５】
実施例８
光活性化ＤＮＡ切断剤としての実証。
プラスミドＤＮＡを切断し、その後のスーパーコイル（形態Ｉ）ＤＮＡの、開環緩和（形態ＩＩ）および線状（形態ＩＩＩ）への変換をモニタリングした。プラスミドＤＮＡ切断は高感度技法であって、いくつかの修復エンドヌクレアーゼと組合せて用いる場合、それは、損傷に直接関与する種のフィンガープリントの一種として役立ち得る。化合物による一本鎖破断（ＳＳＢ）の誘導は、形態Ｉを形態ＩＩへと変換し、その定量は、ＤＮＡ切断のその効率を示す。ＤＮＡ緩和検定は、ＳＳＢおよびエンドヌクレアーゼ感受性修飾を定量するために用いた（Ｅｐｅ， Ｂ．， Ｈｅｌｇｅｒ， Ｊ．， Ｗｉｌｄ， Ｄ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １９８９， １０， ２０１９およびＥｐｅ， Ｂ．， Ｍｆｔｚｅｌ， Ｐ．， Ａｄａｍ， Ｗ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ １９８８， ６７， １４９）。この検定は、形態Ｉが、一本鎖破断（ＳＳＢ）または修復エンドヌクレアーゼによる切開により形態ＩＩへと変換され、これはアガロースゲル電気泳動において別々に移動するという事実を用いる。
【００６６】
０℃のＰＭ２  ＤＮＡ（１０μｇ／ｍＬ）のリン酸塩緩衝化（ｐＨ７．０）空気飽和溶液を、式１ａおよび１ｂ（それぞれ、式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−および式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−））により示される種々の濃度のアクリジン−ビオロゲン二機能性分子の存在下で、３６０ ｎｍの近ＵＶ線を照射した。その後、以下の種類の修飾に関して、ＤＮＡを分析した：（ｉ）ＤＮＡ一本鎖および二本鎖破断、（ｉｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩにより認識される塩基損失の部位（ＡＰ部位）、（ｉｉｉ）Ｔ４エンドヌクレアーゼＶに感受性の塩基修飾＋ＡＰ部位、（ｉｖ）エンドヌクレアーゼＩＩＩに感受性の塩基修飾＋ＡＰ部位、ならびに（ｖ）ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧタンパク質）に感受性の塩基修飾＋ＡＰ部位。アクリジン−ビオロゲン二機能性分子により誘導されるＤＮＡ損傷プロフィールを，図４に示す。
【００６７】
両化合物は、エンドヌクレアーゼＩＩＩに感受性の非常に少数のＡＰ部位および少数の修飾を誘導したが、しかしＦＰＧタンパク質に感受性の多数の塩基修飾が観察されたことは、損傷プロフィールから明白である。さらに、ＰＭ２ＤＮＡ単独の照射により、あるいは最高濃度のビオロゲン結合アクリジンの存在下で暗所で、有意のＤＮＡ損傷は観察されなかったが、それは、観察された損傷がこれらの化合物の光活性化によってのみ開始されたことを示す。それゆえ、これらの化合物は、効率的光活性化ＤＮＡ切断剤として用いられ得る。
【００６８】
実施例９
ＤＮＡ切断の効率。
アクリジン−ビオロゲンに誘導される主な損傷はＦＰＧタンパク質により認識される（図４）ため、ＦＰＧ感受性修飾およびＳＳＢの形成に及ぼすこれらの系の照射時間および濃度の作用をわれわれは調べた。図５および図６は、それぞれ式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ、ならびにｎ＝１１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）のアクリジン−ビオロゲン二機能性誘導体化合物により誘導される一本鎖破断（ＳＳＢ）およびＦＰＧ感受性修飾の照射時間依存性生成を示す。これらの図からわかるように、ＦＰＧタンパク質に感受性の損傷は、各々の場合、照射時間の増大に伴って増大し、このことはこれらの化合物の触媒特性を示す。ＳＳＢの生成の有意の増大は、３０分間照射後でさえ、観察されなかった。同様に、ＤＮＡ損傷の増大は、図６の挿入図に示したように濃度の増大に伴って観察された。
【００６９】
これらの結果は、アクリジン−ビオロゲン二機能性誘導体が、修復エンドヌクレアーゼＦＰＧタンパク質に感受性の多数の塩基修飾を誘導し、修復エンドヌクレアーゼＩＩＩにより認識される損傷はほとんどない、ということを明瞭に実証する。ＦＰＧタンパク質は、８−オキソグアノシンおよびホルムアミド−ピリミジン、プリンの開環生成物のような修飾を認識することが知られている（Ｂｏｉｔｅｕｘ， Ｓ．， Ｇａｊｅｗｓｋｉ， Ｅ．， Ｌａｖａｌ， Ｊ．， Ｄｉｚｄａｒｏｕｇｈ， Ｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９２， ３１， １０６）。８−オキソグアノシンおよびホルムアミドピリミジンは、ヒドロキシルラジカルにより（Ｅｐｅ， Ｂ．， Ｈａｒｉｎｇ， Ｍ．， Ｒａｍａｉａｈ， Ｄ．， Ｓｔｏｐｐｅｒ， Ｈ．， Ａｂｏｕ−Ｅｌｚａｈａｂ， Ｍ．， Ａｄａｍ， Ｗ．， Ｓａｈａ−Ｍｏｌｌｅｒ， Ｃ．Ｒ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １９９３， １４， ２２７１； Ｅｐｅ， Ｂ．， Ｐｆｌａｕｍ，Ｍ．， Ｈａｒｉｎｇ， Ｍ．， Ｈｅｇｌｅｒ， Ｊ．， Ｒｕｄｉｇｅｒ， Ｈ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９９３， ６７， ５７）、一重項酸素により、そして電子伝達メカニズムにより（ｖｏｎ Ｓｏｎｎｔａｇ， Ｃ． Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ； Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）、ＤＮＡ中に生成され得る。
【００７０】
ヒドロキシルラジカルおよび一重項酸素の両方の関与は、図４に示した損傷プロフィールが電離放射線および１，４−エテノ−２，３−ベンズオキシリオキシン−１，４−ジプロパン酸の二ナトリウム塩により誘導されるものとは異なるため、除外され得る（Ａｒｕｏｍａ， Ｏ．Ｉ．， Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ．， Ｄｉｚｄａｒｏｇｌｕ， Ｍ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８９， ２６４， １３０２４；Ｍｕｌｌｅｒ， Ｅ．， Ｂｏｉｔｅｕｘ， Ｓ．， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｒ．Ｐ．， Ｅｐｅ， Ｂ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０， １８， ５９６９）。さらに、ＤＮＡ切断試験は、種々の添加剤の存在下で検査した。これらの試験結果は、アクリジン−ビオロゲン二機能性分子が、特にＤＮＡ中のグアニン塩基の修飾（酸化）のために光誘導化電子伝達のみによるＤＮＡ損傷の誘導のための試薬として用いられ得ることを示す。
【００７１】
実施例１０
グアニン（Ｇ）での切断の実証。ＧＧ配列の５’−ＧおよびＡＧバルジのＧの）優先的切断。
切断における選択性を調べるために、そして塩基バルジに対するビオロゲン結合アクリジンの任意の優先的反応が存在するか否かを見出すために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、２〜３の末端標識化合成オリゴヌクレオチド（表３）を用いて、われわれは切断反応を分析した。
【００７２】
【表３】
2004519516.tif 000011
【００７３】
標準手法にしたがって［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよび細菌Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５’−ＯＨで、オリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）、ＤＮＡ（５）（ＣＣ−バルジ）およびＤＮＡ（６）（ＡＧ−バルジ）を放射能標識し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）、報告された手法にしたがって、ＤＮＡ（４）でハイブリダイズし、種々の濃度のビオロゲン結合アクリジンとともにインキュベートして、８つの３５０ ｎｍランプを含入するＲａｙｏｎｅｔ光反応器（ＲＰＲ）中の微小遠心管中で光源を照射した（Ｒａｍａｉａｈ， Ｄ．， Ｋａｎ， Ｙ．， Ｋｏｃｈ， Ｔ．， Ｑｒｕｍ， Ｈ．， Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｇ．Ｂ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９８， ９５， １２９０２；Ｒａｍａｉａｈ， Ｄ．， Ｋａｎ， Ｙ．， Ｋｏｃｈ， Ｔ．， Ｑｒｕｍ， Ｈ．， Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｇ．Ｂ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８， ２６， ３９４０）。照射後、試料を緩衝液で沈殿させ、冷７０％水性エタノールで２回洗浄し、温ピペリジンで９０℃で３０分間処理し、真空下で凍結乾燥して、ＰＡＧＥにより分析した。ルーチンプロトコールにより、マクサム−ギルバートＡ／Ｇ、ＴおよびＣ特異的反応を実施した（Ｍａｘａｍ， Ａ．Ｍ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｗ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８０， ６５， ４９９；Ｒａｍａｉａｈ， Ｄ．， Ｋａｎ， Ｙ．， Ｋｏｃｈ， Ｔ．， Ｑｒｕｍ， Ｈ．， Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｇ．Ｂ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９８，  ９５， １２９０２）。
【００７４】
式１ａおよび１ｂ（それぞれ、式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−および式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−）の化合物の二機能性アクリジン−ビオロゲン誘導体により生じた５’−標識化ＤＮＡ（３）、ＤＮＡ（５）およびＤＮＡ（６）の切断パターンの選択性を、図７に示す。これらの化合物はともに、３’−Ｇを上回って５’−Ｇに関して有意の優先で、ＧＧ部位でＤＮＡ（３）を切断することが判明した（図７のレーン２および３）。少量の切断もＧ部位で観察された。同様の観察を、式１ａおよび１ｂの化合物の両方により、ＤＮＡ（５）（ＣＣ−バルジ）に関しても行なった（図７のレーン４および５）。実際には、ＣＣバルジ部位での切断は観察されなかった。式１ａおよび１ｂ（それぞれ、式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−および式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−）の化合物存在下でのＤＮＡ（６）（ＡＧ−バルジ）の照射は、ＡＧバルジのＧでの顕著な選択的切断を生じた（図７のレーン６および７）。式１ａ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−）の化合物は、二重鎖ＤＮＡ構造そして塩基バルジを含有する二重鎖の切断においてもより効率的であることが判明した。これらの結果は、これらの分子がＤＮＡ中のＧＧ部位の５’−ＧおよびＡＧ２塩基バルジのＧの光活性化選択的切断のために、ならびにそれらの認識のためにも用いられ得ることを示す。
【００７５】
実施例１１
触媒活性の実証。
研究中の系は高ＤＮＡ会合定数を有し、照射時にＤＮＡ二重鎖および塩基バルジのＧ部位で効率的に切断することを見出したため、それらが生物学および工業における潜在的用途を有し得るよう、それらの触媒特性をわれわれはさらに実証した。水または緩衝液中の式１ａ、１ｂおよび１ｃ（それぞれ、式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−；式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−Ａｃｒ２Ｘ−および式中、Ｙ＝オルトまたはパラトリル；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−）のビオロゲン結合アクリジンの直接レーザー励起は、過渡的中間物質に指定可能な吸収を示さなかった。しかしながら、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（１０ｍＭ）またはグアノシン（１．８ｍＭ）のような外部電子供与対の存在下で水または緩衝液中で、式１ａ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−）のビオロゲン結合アクリジンのレーザー励起を実行した場合、３９５および６１０ ｎｍで吸収最大を有する過渡的種が観察された。この過渡的物質のスペクトル特徴は、文献で報告されたメチルビオロゲンラジカルカチオン（ＭＶ＋）の特徴と類似した（Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｔ．， Ｈｏｎｄａ， Ｋ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． １９８２， ８６， ３６６１；Ｋｅｌｌｙ， Ｌ．Ａ．， Ｒｏｄｇｅｒｓ， Ｍ．Ａ．Ｊ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ９８， ６３７７）。同様に、水または緩衝液中でのＤＮＡ存在下での式１ａ（式中、Ｙ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝１〜１１）；Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−または−Ｐｙｒ２＋−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３２Ｘ−）のビオロゲン結合アクリジンのレーザー励起は、還元メチルビオロゲンに指定可能な過渡的種を生じた（図８）。
【００７６】
これらの結果は、励起アクリジン発色団が電子をビオロゲン部分に伝達して、アクリジンおよび還元メチルビオロゲンのラジカルカチオンを生成することを明瞭に示す。一旦生成されたアクリジンのラジカルカチオンは、媒質中に存在する電子供与体を酸化し（メチルビオロゲンラジカルカチオン（ＭＶ＋）の生成は、外部犠牲電子供与体により促進される）、光子の再吸収のためにアクリジンに戻る。還元メチルビオロゲンは次に、電子を分子酸素に伝達し、それによりメチルビオロゲンに戻って、スーパーオキシドラジカルカチオンを生成する。したがって、これらの二機能性分子およびそれらの誘導体は、犠牲電子供与体の存在下で触媒的光活性化ＤＮＡ切断剤として、そして工業的用途において水素を発生するために適切な条件下で水の酸化のための触媒として機能し得る。
【００７７】
本発明の二機能性分子は、光療法ならびに触媒的光活性化ＤＮＡ切断および工業的用途のための光増感剤の優れた特性を保有する。本発明の系の主な利点を以下に挙げる：
１．式１（１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄ）により表される化合物は、純粋な単一物質である。
【００７８】
２．それらの合成方法は非常に経済的である。
【００７９】
３．それらは非常に安定で、水性媒質中に高溶解性で、そして生理学的条件下で中性形態で存在する。
【００８０】
４．これらの化合物は良好な吸収特性を有し、暗所および照射条件下で非常に安定である。
【００８１】
５．それらは有効な供与体−受容体系を構成し、それらのレドックス特性はｐＨおよびスペーサー基の一関数として整調され得る。
【００８２】
６．それらは、ＤＮＡに対する高親和性を有する新規の種類の化合物を生成し、インターカレーション、ビスインターカレーションおよび溝結合によりＤＮＡと相互作用する。
【００８３】
７．これらの系は、二重鎖ＤＮＡ、塩基バルジ、三重鎖および四重鎖ＤＮＡ構造を含めたＤＮＡの種々の構造を安定化する。
【００８４】
８．これらの系は、三重鎖ＤＮＡの安定化のために、そしてＤＮＡの選択的光切断のためにも、オリゴヌクレオチドと容易に共有結合し得る。
【００８５】
９．これらの系は、ＡＴ配列に対する特別な親和性を保有し、それゆえＤＮＡ中のこのような配列の検出のためのプローブとしての潜在的用途を有し得る。
【００８６】
１０．それらは、照射条件下で触媒的方法でＤＮＡを切断し、そして触媒的光活性化ＤＮＡ切断剤として作用する新規の種類の化合物を生成する。
【００８７】
１１．それらは、光誘導化電子伝達メカニズムのみにより、そして選択的にグアニン部位でＤＮＡを切断し、そしてＤＮＡ中のＧＧ配列の５’−Ｇでの優れた選択性を有する。
【００８８】
１２．それらはＧ部位で選択的に、ＡＧ塩基バルジを含有する二重鎖ＤＮＡを切断し、それゆえ、ＡＧバルジ含有ＤＮＡ配列の検出のためのプローブとして作用する。
【００８９】
１３．これらの系は、外部供与体の存在下での照射時に、有効電荷分離を生じる新規の種類の光増感剤を生成し、それゆえこれらの系およびそれらの誘導体は、水からの光誘導化水素生成を含めた工業的用途における光触媒として作用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
種々の濃度のポリ（ｄＡ）ポリ（ｄＴ）の存在下での式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物の蛍光増強を示す。
【図２】
種々の濃度の式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）および式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ）の化合物によるＤＮＡ二重鎖の熱変性温度に及ぼす作用を示す。
【図３】
種々の濃度の式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）および式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ）の化合物の存在下でのＤＮＡ二重鎖吸収において観察された淡色効果を示す。
【図４】
式１ａ（（２５０ ｎＭ， １８ ｋＪ／ｍ２）式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ、（１ μＭ， ９ ｋＪ／ｍ２）式中、ｎ＝１１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物によりＰＭ２  ＤＮＡにおいて誘導された一本鎖破断を示すＤＮＡ損傷プロフィールおよび種々のエンドヌクレアーゼ感受性修飾を示す。
【図５】
３６０ ｎｍ光（４．６ ｋＪ／ｍ２）でのＵＶ照射時に式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物（０．２５ μＭ、０℃）によりＰＭ２ＤＮＡにおいて誘導されたＤＮＡ修飾、一本鎖破断（ＳＳＢ）（○）およびホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧタンパク質）感受性修飾（△）の時間依存性を示す。
【図６】
３６０ ｎｍ光（４．６ ｋＪ／ｍ２）でのＵＶ照射時に式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物（０．３０ μＭ、０℃）によりＰＭ２ＤＮＡにおいて誘導されたＤＮＡ修飾、一本鎖破断（ＳＳＢ）（○）およびホルムアミドグリコシラーゼ（ＦＰＧタンパク質）感受性修飾（△）の時間依存性を示す。
【図７】
ピペリジン処理（９０℃、３０分）による式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）および式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ）の化合物により誘導された二重鎖ＤＮＡ（１０ μＭ）の光切断を示す１０％変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。レーン１：ＤＮＡ（３）（対照）、レーン２：ＤＮＡ（３）および５０μＭの式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物、レーン３：ＤＮＡ（３）および５０μＭの式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ）の化合物、レーン４：ＤＮＡ（５）および５０μＭの式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物、レーン５：ＤＮＡ（５）および５０μＭの式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ）の化合物、レーン６：ＤＮＡ（６）および５０μＭの式１ａ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物、レーン７：ＤＮＡ（６）および５０μＭの式１ｂ（式中、ｎ＝１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−ＣＨ２−ＡｃｒおよびＸ＝Ｂｒ）の化合物。マクサム−ギルバートシーケンシングレーンは、Ａ／ＧおよびＴでマークされる。
【図８】
ＤＮＡ（犠牲電子供与体）の存在下での式１ａ（式中、ｎ＝１１、Ｒ＝−ＭＶ２＋−（ＣＨ２）３−ＣＨ３およびＸ＝Ｂｒ）の化合物の、照射と基の還元かメチルビオロゲンの生成を示すが、これは、ビオロゲン結合アクリジンの触媒特性を実証する。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004519516.tif 000012
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2004519516.tif 000013
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2004519516.tif 000014
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2004519516.tif 000015
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2004519516.tif 000016
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2004519516.tif 000017