(57)【要約】本発明の目的は、増殖能を有するインスリン産生細胞を検出し選抜すること、さらに、インスリン産生細胞及びその前駆細胞、あるいはそれと類縁の細胞を分化・増殖させることである。本発明は、膵β細胞の自然増殖モデルと考えられるＰＨＨＩ患者の膵臓に特異的に発現している遺伝子を検出し、塩基配列データベースを検索したところ、３種の新規遺伝子を見出したことによる。本発明によれば、これらの遺伝子、遺伝子産物、あるいは遺伝子配列を用いて、たとえば、ノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲによって増殖しているインスリン産生細胞を検出することができる。また、これらの遺伝子を適当な細胞に遺伝子工学的手法により導入し、インスリン産生細胞に分化させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項２】
配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号４、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号４、５または６で表される塩基配列の一部からなるＤＮＡであって、少なくとも、請求の範囲第５項記載のＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項７】
請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡを用いて、増殖しているインスリン産生細胞を検出する方法。
【請求項８】
請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡを組み込んだベクターより得られる形質転換体。
【請求項９】
請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡを、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して胚性幹細胞または間葉系幹細胞を分化させる方法。
【請求項１０】
請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡを、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１１】
胚性幹細胞または間葉系幹細胞が生体の生理機能を有する細胞である請求の範囲第９または１０項に記載の方法。
【請求項１２】
分化した細胞がインスリン産生細胞である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１３】
分化した細胞が神経細胞である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかの蛋白質を抗原として認識する抗体：
（ａ）請求項１記載の蛋白質
（ｂ）請求項２記載の蛋白質
（ｃ）請求項３〜６いずれか記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
【請求項１５】
請求の範囲第１４項に記載の抗体を用いた疾患の診断法。
【請求項１６】
目的の疾患が細胞増殖性の疾患である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【請求項１７】
目的の疾患が膵臓の疾患である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【請求項１８】
目的の疾患が神経系の疾患である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【請求項１９】
目的の疾患が家族性持続性過インスリン性低血糖症である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は複数の細胞種から構成される組織或いは細胞集団から増殖しているインスリン産生細胞を検出する技術に関わる。また、本発明はインスリン産生細胞である膵β細胞及びその前駆細胞、あるいは膵β細胞と類縁の細胞、たとえば神経細胞等を増殖させる技術に関わる。
背景技術
膵β細胞は血糖値を降下させる唯一のペプチドホルモンであるインスリンを産生する器官である。何らかの原因により膵β細胞のインスリン産生能が損なわれると血糖値を正常に保つことが不可能となり糖尿病を発症する。インスリン産生能が損なわれた糖尿病患者にインスリン産生能を回復させ、血糖値を正常に制御するためには、インスリン産生能を有する細胞を移植することが根本的な治療法となる。
インスリン産生細胞の供給源としては死体の膵臓、あるいは近い将来実用化されようとしている胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または間葉系幹細胞から分化させたインスリン産生能を有する細胞等が考えられる。胚性幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞でほぼすべての組織、細胞に分化する能力を有している。また、間葉系幹細胞は骨髄、血液、真皮、骨膜等に見出される多分化能を有する細胞である。近年、これらの細胞から、試験管内及び生体内で人為的にインスリン産生細胞や神経細胞、心筋細胞等の機能を有する細胞を分化させうることが示されている。しかし、これらの組織あるいは細胞集団は供給に限りがあり糖尿病患者の治療に充分な細胞数を確保することは困難であると考えられる。そこでインスリン産生細胞あるいはその供給源となる細胞を増殖させることが求められる。
そのような効果を期待できる手法としてＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｒｅｇ蛋白質、ベータセルリン等の細胞分化・増殖因子を供給源となる細胞に作用させることが考えられる（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３巻、９４７−９５３頁、１９９４年、Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１巻、３５８９−３５９２頁、１９９４年、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９巻、２０２１−２０２７頁、２０００年）が、現在までのところ実際の治療に適用できるような因子は見出されていない。
また、このような細胞分化・増殖因子を用いてインスリン産生細胞を含む細胞集団を増殖させてもその中から真に有効な細胞、すなわち増殖能を有するインスリン産生細胞だけを治療に用いることが望まれるが、このような細胞を選抜するための有効な方法は今までのところ明らかにされていない。
発明の要約
本発明が解決しようとしている課題は、細胞分化・増殖因子等を用いて治療に必要な数のインスリン産生細胞を含む細胞集団から目的の細胞、すなわち増殖能を有するインスリン産生細胞を検出する方法、さらにはそれらを選抜するための方法を提供すること、及び糖尿病等生体が産生する生理活性物質の絶対的不足に起因する疾患の治療のためにインスリン産生細胞である膵β細胞、あるいはそれと類縁の細胞、たとえば神経細胞等をより効率的に分化・増殖させる方法を提供することにある。
本発明は、ＰＨＨＩ患者の膵臓で特異的に発現している新規な遺伝子、およびその遺伝子から翻訳される蛋白質、そしてその利用法に関する。
本発明の蛋白質は、（１）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または、（２）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である。
本発明の新規な遺伝子は、（１）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、（２）配列番号４、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、（３）配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡ若しくは配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、または、（４）配列番号４、５または６で表される塩基配列の一部からなるＤＮＡであって、少なくとも、（３）の部分配列領域のＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡである。
本発明の新規な遺伝子及び蛋白質の利用法は、（１）本発明の新規なＤＮＡを用いて、増殖しているインスリン産生細胞を検出する方法、（２）新規なＤＮＡを組み込んだベクターより得られる形質転換体、（３）新規なＤＮＡを、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して胚性幹細胞または間葉系幹細胞を分化させる方法、（４）新規なＤＮＡを、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を増殖させる方法である。（３）の方法、及び（４）の方法においては、胚性幹細胞または間葉系幹細胞が生体の生理機能を有する細胞であることが好ましい。更に、（３）の方法においては、分化した細胞がインスリン産生細胞や神経細胞であることが好ましい。
また、本発明の蛋白質または新規な遺伝子がコードする蛋白質を抗原として認識する抗体もまた、本発明の１つである。
更に、該抗体を用いた疾患の診断法もまた、本発明の１つである。本発明の診断法における目的の疾患としては、細胞増殖性の疾患、膵臓の疾患、神経系の疾患、家族性持続性過インスリン性低血糖症等が挙げられる。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
本発明者らは、増殖しているインスリン産生細胞、または膵β細胞で特異的に発現している遺伝子の検索を行うため、このような遺伝子が発現している可能性の高い組織として家族性持続性過インスリン性低血糖症（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｃｙ；ＰＨＨＩ）患者の膵臓を選んだ。ＰＨＨＩはｎｅｓｉｄｉｏｂｌａｓｔｏｓｉｓとも呼ばれるヒトの遺伝性疾患であり、膵β細胞上のカリウムチャネルの一部に変異があることが知られている。このため、この疾患の患者の膵β細胞は、常にインスリンの分泌が促されている状態になっており、重篤な低血糖症状を呈する（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，４２６（１９９５））。また、ＰＨＨＩ患者では高い血中インスリン濃度とともにランゲルハンス島、特にβ細胞の過形成が見られるが、これは癌細胞のように形質転換した細胞とは明確に区別される。このため、ＰＨＨＩ患者の膵臓は膵β細胞の自然増殖モデルであるとされている。
したがって、本発明者らは、ＰＨＨＩ患者の膵臓で特異的に発現している遺伝子を同定すれば、それは増殖している膵β細胞を検出するためのマーカーとなり得る上、前駆体の細胞から膵β細胞に分化させるあるいは膵β細胞を増殖させる分子をコードしていることも期待できると考え、ＰＨＨＩ患者の膵臓及び健常人の膵臓からＲＮＡを抽出し、それぞれの組織で発現している遺伝子のｃＤＮＡを合成して遺伝子サブトラクションを行い、ＰＨＨＩ患者の膵臓で特異的に発現している新規な遺伝子を取得することに成功した。
すなわち本発明は、ＰＨＨＩ患者の膵臓で特異的に発現している新規な遺伝子、およびその遺伝子から翻訳される蛋白質、そしてその利用法に関する。
本発明のＤＮＡとしては、（１）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、（２）配列番号４、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、（３）配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ。（４）配列番号４、５または６で表される塩基配列の一部からなるＤＮＡであって、少なくとも、上記（３）のＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡ、が挙げられる。
ここで、（２）の配列番号４、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡはいずれも、本発明において初めて見いだされた新規な遺伝子である。これら新規な遺伝子は、以下に述べる方法によって取得できた。
ＰＨＨＩ患者の膵臓及び健常人の膵臓から酸性フェノール法によりＲＮＡを抽出し、ポリＡ（＋）ＲＮＡを精製した後、逆転写酵素を用いてそれぞれの組織に由来するｃＤＮＡを合成する。これらのｃＤＮＡを材料としてＨｕｂａｎｋとＳｃｈａｔｚの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，５６４０（１９９３））により遺伝子サブトラクションを行い、ＰＨＨＩ患者の膵臓で特異的に発現している遺伝子を検出する。今回、特異的遺伝子の塩基配列を決定し、塩基配列データベースを検索したところ、特異的遺伝子のうち少なくとも３種類の遺伝子は新規遺伝子、即ち機能が明らかになっていない遺伝子であることが確認された。
データベース検索により新規遺伝子であることが確認された３種類の遺伝子をそれぞれＮＣ１、ＮＣ２、及びＮＣ３と名づけ、それらの塩基配列を配列番号４（ＮＣ１）、５（ＮＣ２）、及び６（ＮＣ３）に示した。また、それらの遺伝子から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を塩基配列から予測し、配列番号１（ＮＣ１）、２（ＮＣ２）、及び３（ＮＣ３）に示した。
本発明においては、上記新規遺伝子の塩基配列の一部分のＤＮＡを用いても、後述する目的に利用できる。ここでいう、一部分の塩基配列を有するＤＮＡとは目的を達することができれば特に限定されるものではないが、具体的には、配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられ、また該部分配列領域を含む配列番号４，５または６の塩基配列の一部分からなるＤＮＡが挙げられる。
本発明のＤＮＡを得る方法は特に限定されず、上記新規遺伝子の取得方法によって得た遺伝子をそのまま、あるいはその一部のみを用いても良いし、該配列を有するＤＮＡを化学合成によって作製しても良い。
本発明の蛋白質としては、（１）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、（２）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、が挙げられる。これら蛋白質を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子工学的に大腸菌、動物細胞等を宿主とし、先の本発明のＤＮＡをベクターに組み込んで形質転換し、該形質転換体を培養して得ることができる。ここでのベクターへの組み込みや形質転換方法、その培養方法などは、公知の方法を用いることができる。
本発明において、これらのＰＨＨＩ患者の膵臓で特異的に発現している遺伝子から由来するＤＮＡ、及びそのＤＮＡから翻訳される蛋白質を用いれば、次に述べるような方法で様々な細胞種を含む組織あるいは細胞集団から、増殖しているインスリン産生細胞／膵β細胞を検出し、それを選抜することができる。
目的の組織または細胞集団からＲＮＡを抽出し、特異的遺伝子に由来する本発明のＤＮＡを適当な方法、たとえば放射性同位元素３２ＰとＤＮＡ修飾酵素を用いて標識したものをプローブとしてノーザン解析を行う。目的の組織または細胞集団に増殖しているインスリン産生細胞／膵β細胞が存在すればオートラジオグラフィーにより検出される。また、目的の組織または細胞集団から抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、増殖しているインスリン産生細胞／膵β細胞を検出することができる。
また本発明の蛋白質を抗原として認識する抗体を作製し、この抗体を用いて、免疫学的手法、たとえば組織免疫染色により、目的の組織または細胞集団から、増殖しているインスリン産生細胞／膵β細胞を検出することができる。また、この抗体を用いて、インスリン産生細胞／膵β細胞の増殖が関与する疾患を診断することができる。このような疾患としては、例えば、細胞増殖性の疾患、膵臓の疾患、神経の疾患等が挙げられ、なかでも、上記抗体は家族性持続性過インスリン性低血糖症の診断に好適に用いられる。
また、本発明の遺伝子は膵β細胞の自然増殖モデルであるＰＨＨＩ患者の膵臓に特異的に発現していることから、膵β細胞或いはそれと類縁の細胞の増殖または分化に関与していると考えられる。したがって、該遺伝子を由来とする本発明のＤＮＡをインスリン産生細胞／膵β細胞及び、例えば神経細胞等のそれと類縁の細胞の前駆細胞、あるいは前駆細胞に相当する培養細胞、例えば胚性幹細胞や間葉系幹細胞等に導入し、発現させることによりそれらの細胞の増殖を促進させることができると考えられる。また、同様に本発明のＤＮＡをインスリン産生細胞／膵β細胞及び、例えば神経細胞等のそれと類縁の細胞の前駆細胞、あるいは前駆細胞に相当する培養細胞、例えば胚性幹細胞や間葉系幹細胞等に導入し、発現させることによりそれらの細胞のインスリン産生細胞や神経細胞への分化を誘導させることができると考えられる。これらの胚性幹細胞や間葉系幹細胞は、生体の生理機能を有する細胞であることが好ましい。ここで、生体の生理機能とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける高い分化能を意味する。これら導入発現の方法に関しては、通常行われる公知の方法を用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）新規遺伝子ＮＣ１，ＮＣ２及びＮＣ３の取得方法
ＰＨＨＩ患者の膵臓及び健常人の膵臓からＲＮＡｚｏｌＢ（バイオテックス・ラボラトリーズ製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）によりポリＡ（＋）ＲＮＡを精製した。このポリＡ（＋）ＲＮＡからＲｉｂｏｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＨＨＩ患者の膵臓由来及び健常人の膵臓由来の２本鎖ｃＤＮＡをそれぞれ制限酵素ＤｐｎＩＩ（ニューイングランド・バイオラボ製）で完全切断し、フェノール処理により反応を停止した後、エタノール沈殿により切断したｃＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を滅菌蒸留水に縣濁し、１．２μｇのｃＤＮＡ断片に対して８μｇのＲ−Ｂｇｌ−２４（ａｇｃａｃｔｃｔｃｃａｇｃｃｃｔｃｔｃａｃｃｇｃａの塩基配列を有するオリゴＤＮＡ）と４μｇのＲ−Ｂｇｌ−１２（ｇａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａ）を５０μｌのスケールでＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ製）を用いて１４℃、１６時間の反応により結合させた。反応産物のＤＮＡ濃度を６μｇ／ｍｌとなるように調製し、このうち１μｌ分を分取してＲ−Ｂｇｌ−２４をプライマーとしてＰＣＲ反応により増幅させた。ＰＨＨＩ患者膵臓由来の増幅産物をテスター、健常人膵臓由来の増幅産物をドライバーと呼ぶ。テスター及びドライバーをＤｐｎＩＩで切断することによりＲ−Ｂｇｌ−２４、Ｒ−Ｂｇｌ−１２オリゴＤＮＡを除去し、テスターのみに別のオリゴＤＮＡＪ−Ｂｇｌ−２４（ａｃｃｇａｃｇｔｃｇａｃｔａｔｃｃａｔｇａａｃａ）、Ｊ−Ｂｇｌ−１２（ｇａｔｃｔｇｔｔｃａｔｇ）を結合させた。オリゴＤＮＡを結合させたテスター０．４μｇに対し１００倍量（４０μｇ）のドライバーを加え、エタノール沈殿させた後４μｌのＥＥ×３緩衝液［３０ｍＭ  Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−３−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（シグマ製）；３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］に縣濁した。このＤＮＡ溶液を９８℃  ５分間の熱処理で変性した後、６７℃で２０時間保持してアニールさせ、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ（シグマ製）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］を加えて４００μｌとした。このうち１０μｌを分取し、７２℃で３分間保持してＪ−Ｂｇｌ−１２をｃＤＮＡからはずし、５単位のＴａｑポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラボ製）を添加してさらに５分間反応させて１本鎖になった部分を２本鎖にした。この反応産物を鋳型として９５℃  １分間／７０℃  ３分間  １０サイクルのＰＣＲ反応を行い、増幅産物をフェノール処理、エタノール沈殿し、４００μｌの０．２倍濃度ＴＥ緩衝液に縣濁し、４０単位のＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ニューイングランド・バイオラボ製）を加え、３０℃で３５分間反応させた。この反応産物をＤＰ１と呼ぶ。１０μｌのＤＰ１にプライマーとして２μｇのＪ−Ｂｇｌ−２４を加え、９５℃  １分間／７０℃  ３分間  １８サイクルのＰＣＲ反応を行って得られた増幅産物をＤｐｎＩＩで切断し、１．２μｇのｃＤＮＡ断片に対し８μｇのＮ−Ｂｇｌ−２４（ａｇｇｃａａ���ｔｇｔｇｃｔａｔｃｇａｇｇｇａａ）、４μｇのＮ−Ｂｇｌ−１２（ｇａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｇ）を結合し、以下ＤＰ１を得た手法に準じてＤＰ２を得た。ＤＰ２をＮ−Ｂｇｌ−２４をプライマーとしたＰＣＲ反応により増幅し、ＤｐｎＩＩ切断後Ｊ−Ｂｇｌ−２４、Ｊ−Ｂｇｌ−１２を結合し、同様にしてＤＰ３を得た。Ｊ−Ｂｇｌ−２４をプライマーとしたＰＣＲ反応（９５℃  １分間／７０℃  ３分間  ２２サイクル）によりＤＰ３を増幅し、得られた増幅産物をＤｐｎＩＩで切断後、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し、ＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースを検索したところ、それらのうち３個のクローンがデータベース上のあらゆる塩基配列と一致しなかった。さらにこれらのクローンをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、全長ｃＤＮＡを得、それぞれＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３とした。
（実施例２）ノーザン解析による増殖しているインスリン細胞／膵β細胞の検出
実施例１で得られたＮＣ１（配列番号４）、ＮＣ２（配列番号５）及びＮＣ３（配列番号６）の遺伝子配列の一部分のＤＮＡを用いて、目的の組織中に増殖しているインスリン産生細胞が含まれているか否かをノーザン解析により検討した。
健常人の膵臓（レーン１及びレーン２、２検体）及びＰＨＨＩ患者の膵臓（レーン３、１検体）からＴＲＩｚｏｌ（ギブコ・ライフテックオリエンタル社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、精製した。これらを１．０％アガロースゲル電気泳動により分画した後、ナイロンメンブラン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム・ファルマシア社製）にキャピラリー法により転写した。配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡを、それぞれＰＣＲ法により増幅し、アガロースゲル電気泳動により分画した後、目的のＤＮＡ断片をゲルから切り出し、精製した。これらをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）と［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて放射能標識し、ノーザン解析用のプローブとした。ＲＮＡを転写したナイロンメンブランと放射能標識したプローブを混合して６５℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った後、メンブランを洗浄し、オートラジオグラフィーによりプローブと反応するＲＮＡ分画を検出した（図１）。ＮＣ１、ＮＣ２及びＮＣ３由来の部分配列のＤＮＡのいずれも、それをプローブとして用いた場合に、ＰＨＨＩ患者由来のＲＮＡからはシグナルが検出されたが、健常人由来のＲＮＡからは検出されなかった。
（実施例３）細胞の分化に伴うＮＣ３の発現の変化
ラットインシュリノーマから樹立されたＲＩＮ−ｍ細胞のインスリン産生能は低いが、酪酸ナトリウムを培養系に加えることによりインスリンを高濃度に分泌するようになり、インスリン産生細胞に分化することが示されている（Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕｓｚら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２４巻、２６８０−２６８５頁、１９８９年）。ＲＩＮ−ｍ細胞を６ｍＭの酪酸ナトリウム存在下で１６時間培養した後、全ＲＮＡを抽出し、配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、実施例２に記載したものと同様の方法でノーザン解析を行った。その結果、図２のＡに示したように、酪酸ナトリウムを加えて培養したＲＩＮ−ｍ細胞ではＮＣ３遺伝子の発現が亢進していた。
また、副腎褐色細胞腫由来のＰＣ−１２細胞は神経成長因子（ＮＧＦ）を添加することにより神経突起を伸展し、神経細胞様に分化することが知られている（Ｓａｌｔｉｅｉら、Ｂｉｏｅｓｓａｙ  １６巻、４０５−４１１頁、１９９４年）。ＮＧＦを５０ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加えた培養系で１６時間培養したＰＣ−１２細胞から全ＲＮＡを抽出し、配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、同様の方法でノーザン解析を行った。図２のＢに示したように、ＮＧＦを加えて培養したＰＣ−１２細胞ではＮＣ３遺伝子の発現が亢進していた。
（実施例４）ＮＣ１遺伝子を強制発現させたＰＣ−１２細胞の形態変化
配列番号４に記載されている塩基配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする領域である１７４〜９０４番目の塩基配列部分のＤＮＡを動物細胞用遺伝子発現ベクターであるｐＣＩｎｅｏの所定の部位に組み込み、ＮＣ１遺伝子発現ベクターを構築した。このものをリポソーム法によりＰＣ−１２細胞に導入し、強制発現させた。ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを５００μｇ／ｍｌの濃度で加えた培養系で細胞を維持し、発現ベクターを保持した細胞を選択した。図３に示したようにＮＣ１遺伝子を強制発現させたＰＣ−１２細胞の中には神経突起を伸張させた細胞が観察され、ＮＣ１遺伝子の強制発現によりＰＣ−１２細胞を神経細胞様に分化させることができることが示唆された。
産業上の利用の可能性
本発明によって見いだされた新規遺伝子は、ＰＨＨＩ患者の膵臓に特異的に発現しているだけでなく、細胞の分化・増殖に伴って発現が変化したり、未分化の細胞に遺伝子工学的手法により強制発現させることにより機能を有する細胞への分化を誘導させうるものである。したがって、これらの遺伝子、及びその一部のＤＮＡやそれらから翻訳される蛋白質を用いて、増殖能を有するインスリン産生細胞を容易に検出し、それらを選抜すること、さらにはインスリン産生細胞を分化・増殖させることが可能となる。さらにはインスリン産生細胞である膵β細胞、及びそれと類縁の細胞（たとえば神経細胞等）の分化・増殖の異常に起因する種々の疾患の新たな診断法が開発できる。
【配列表】
2003078631.tif 000002
2003078631.tif 000003
2003078631.tif 000004
2003078631.tif 000005
2003078631.tif 000006
2003078631.tif 000007
2003078631.tif 000008
2003078631.tif 000009
2003078631.tif 000010
2003078631.tif 000011
2003078631.tif 000012
2003078631.tif 000013
【図面の簡単な説明】
図１は、家族性持続性過インスリン性低血糖症患者の膵臓に特異的なＮＣ１、ＮＣ２及びＮＣ３遺伝子の発現をノーザン解析により調べた結果を示す図である。
図２は、細胞の分化に伴うＮＣ３遺伝子の発現変化をノーザン解析により調べた結果を示す図である。
図３は、ＮＣ１遺伝子を強制発現させたＰＣ１２細胞の形態変化を示す図である。
【図１】
2003078631.tif 000014
【図２】
2003078631.tif 000015
【図３】
2003078631.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月10日(2003.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
少なくとも配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号４、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、少なくとも配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列を有するＤＮＡ、少なくとも配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列を有するＤＮＡ、及び、少なくとも配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列を有するＤＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１種のＤＮＡを用いて、増殖しているインスリン産生細胞を検出する方法。
【請求項８】
請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡを組み込んだベクターより得られる形質転換体。
【請求項９】
配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号４、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、少なくとも配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列を有するＤＮＡ、少なくとも配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列を有するＤＮＡ、及び、少なくとも配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列を有するＤＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１種のＤＮＡを、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して胚性幹細胞または間葉系幹細胞を分化させる方法。
【請求項１０】
配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号４、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ、少なくとも配列番号４の１７４〜９０４番目の塩基配列を有するＤＮＡ、少なくとも配列番号５の７９〜２１１５番目の塩基配列を有するＤＮＡ、及び、少なくとも配列番号６の２８〜３８４番目の塩基配列を有するＤＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１種のＤＮＡを、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して、胚性幹細胞または間葉系幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１１】
胚性幹細胞または間葉系幹細胞が生体の生理機能を有する細胞である請求の範囲第９または１０項に記載の方法。
【請求項１２】
分化した細胞がインスリン産生細胞である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１３】
分化した細胞が神経細胞である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかの蛋白質を抗原として認識する抗体：
（ａ）請求項１記載の蛋白質
（ｂ）請求項２記載の蛋白質
（ｃ）請求項３〜６いずれか記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
【請求項１５】
請求の範囲第１４項に記載の抗体を用いた疾患の診断法。
【請求項１６】
目的の疾患が細胞増殖性の疾患である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【請求項１７】
目的の疾患が膵臓の疾患である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【請求項１８】
目的の疾患が神経系の疾患である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【請求項１９】
目的の疾患が家族性持続性過インスリン性低血糖症である請求の範囲第１５項に記載の診断法。
【国際調査報告】
2003078631.tif 000017
2003078631.tif 000018
2003078631.tif 000019
2003078631.tif 000020
2003078631.tif 000021