(57)【要約】（１）ヒト唾液中に存在し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、（２）当該タンパク質が、被検者の唾液中に存在するか否かを測定し、その結果に基づいて歯周病に罹るリスクを判定することを特徴とする、歯周病リスクの判定方法、（３）当該タンパク質を標準として含んで成る、歯周病リスク判定用試薬、及び（４）歯垢から歯石への形成を抑制する薬剤及び歯槽骨吸収抑制剤を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液中に存在し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質が、被検者の唾液中に存在するか否かを測定し、その結果に基づいて歯周病に罹るリスクを判定することを特徴とする、歯周病リスクの判定方法。
【請求項２】
当該タンパク質が存在しないと歯周病に罹るリスクが高いと判定する請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質の、被験者の唾液中の濃度を測定し、その測定値を予め定められた値と比較し、測定値が当該予め定められた値よりも低い場合は歯周病に罹るリスクが高いと判定することを特徴とする、歯周病リスクの判定方法。
【請求項４】
当該予め定められた値が１μｇ／ｍｌである、請求項３記載の判定方法。
【請求項５】
唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるタンパク質を標準として含んで成る、歯周病リスク判定用試薬。
【請求項６】
更に、当該タンパク質に対する抗体を含んで成る、請求項５記載の判定用試薬。
【請求項７】
唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質。
【請求項８】
唾液中に存在し、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質。
【請求項９】
唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成る、歯垢から歯石への形成を抑制する薬剤。
【請求項１０】
唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質を含んで成る、歯槽骨吸収抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、簡便で且つ精度の高い歯周病リスク判定方法、及びそれに用いられる試薬、更には、歯垢から歯石への形成を抑制する薬剤、歯槽骨吸収抑制剤に関する。
技術背景
口腔は、体の入り口のひとつで、外部から種々の異物が最も浸入しやすい場所である。そのため、口腔を取り囲む組織には、これらの異物に対する種々の防御機構が発達している。その一つに唾液腺がある。唾液腺は口腔を取り囲む口腔粘膜のすべての場所に開口し唾液を分泌させているが、中でも耳下腺、顎下腺および舌下腺は大口腔腺といわれ、大きさも大きくまた唾液の分泌量も多い。ヒトの唾液中には、アミラーゼなど消化酵素の他に生体の防御機構に関与する種々の酵素、生理活性因子および免疫抗体など５０種類以上の物質が含まれている。これらの物質はそれぞれ適切なバランスをもって含まれることにより、口腔内の恒常性を維持している。このバランスが崩れると恒常性の維持が保たれなくなり、諸種の口腔内の疾患が発症する原因となり得る。このように、唾液および唾液腺は口腔内を健康に保つために重要な役割を担っている。しかしながら、唾液または唾液腺と口腔内の疾患との関連についての研究は現在までのところ進んでいない。
また、日常、臨床分野において「唾液の粘性が高く口を開けるたびに唾液が糸を引くような患者は歯石やプラークの付着が著しく歯周疾患を伴っている場合が多い。」、「口腔内の衛生観念が高く常に口腔の衛生に気を配り定期的に検査を受けている患者でも加齢とともに急速に歯周病が進む場合がある」、また、「歯のブラシングも適当で衛生観念も低い患者でも歯肉炎は診られるものの歯周炎はほとんど進行しない例も多い」、「家系によって齲蝕や歯周病にかかりやすいケースがたびたび認められる」などの多くの経験的な症例が聞かれる。しかしながら、多くの歯科医師が実際に経験してきたこうした現象について説明できる医学的解釈は今だ見当たらない。
発明の開示
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、簡便で且つ精度の高い歯周病リスク判定方法、及びそれに用いられる試薬、更には、歯垢から歯石への形成を抑制する薬剤、歯槽骨吸収抑制剤を提供することを目的とする。
即ち、本発明者は、上記した如き歯周疾患にかかる現象の原因を究明すべく、ヒトの全唾液を電気泳動法を用いて分析し、この結果を良く観察したところ、約５０種類の画分に別れる分画パターンは、各個人によってそれぞれ異なることが判明した。そこで、一般歯科医院に歯科治療のために訪れた外来患者の中から無作為に抽出した患者８５名からそれぞれ了解のもとで全唾液を１〜５ｍｌずつ採取し、１２％ＳＤＳを用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。泳動終了後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色あるいは銀染色を施して肉眼およびレーザデンシトメータで分析結果を検討し、更にスキャナーで取り込んだデータをコンピュータによる画像解析および泳動ゲルを乾燥させた後、カラーコピー機による拡大コピーを作成し、各個人のデータを比較検討した。その結果、注目すべきバンドを見出した。このバンドは分子量３５ｋＤａの小さな画分（以下、３５ｋＤａ蛋白と略記することがある。）で、約１０％の外来患者の唾液中に存在が確認された。
このように、３５ｋＤａ蛋白は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより３５ｋＤａに分画されるタンパク質であるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件や分子量マーカーの泳動状況によって、３５ｋＤａの前後に分画されることもあり得る。本発明に於いては、このように３５ｋＤａ付近に分画されるものであって、以下に記載するような性質を有するタンパク質を総称して３５ｋＤａ蛋白と呼んでいる。また、「３５ｋＤａのバンド」等の言い方をした場合も、同様に「３５ｋＤａ付近に生じたバンド」であって、以下に示すような性質を有するタンパク質に由来するものを意味している。
一方、歯学部学生および研究者のボランティヤ４０名の唾液を同様に採取し３５ｋＤａバンドの有無について検索したところ、何らかの歯科疾患の治療目的の外来患者のケースと同様に約１０％の被験者のサンプル中に３５ｋＤａバンドが認められたが、９０％を越す３７名にはこの蛋白は認められなかった。これらの結果から、唾液成分の一つであるこの３５ｋＤａ蛋白は約１０％の日本人の唾液腺に発現するが、約９０％の人にはほとんど合成分泌されていないことが分かった。また、同一人を約５年間にわたって、食前および食後の時間帯を含め任意の時間に採取した唾液について同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検索したところ、常に一定したバンドが認められた。このことはこの蛋白は食事とは関係なく常時唾液中に分泌されていることを示唆していた。
そこで、この蛋白の有無と歯周病との関係について鋭意研究を行った結果、この蛋白が分泌されている個人は、歯周病に罹り難いことを見出した。そこで更に検討を行った結果、この蛋白の有無の検出、或いは唾液中の濃度を調べることにより、当該個人が歯周病を罹っているか或いは歯周病となるリスクが極めて高いかを判定し得ることを見出した。
また、後述するように、３５ｋＤａ蛋白についてアミノ酸解析を行った結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質であることが判明した（以下、「配列番号２のタンパク質」と略記することがある。）。
更に、本発明者らはこれらの知見に基づき更に鋭意研究を重ねた結果、この蛋白を適当な方法で口腔内に供給してやることにより歯周病の予防、更には、歯垢から歯石の形成を抑制し得ること並びに歯槽骨が吸収されるのを抑制し得ることをも見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成よりなる。
（１）唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質が、被検者の唾液中に存在するか否かを測定し、その結果に基づいて歯周病に罹るリスクを判定することを特徴とする、歯周病リスクの判定方法。
（２）唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質の、被験者の唾液中の濃度を測定し、その測定値を予め定められた値と比較し、測定値が当該予め定められた値よりも低い場合は歯周病に罹るリスクが高いと判定することを特徴とする、歯周病リスクの判定方法。
（３）唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるタンパク質を標準として含んで成る、歯周病リスク判定用試薬。
（４）唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質。
（５）唾液中に存在し、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質。
（６）唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成る、歯垢から歯石への形成を抑制する薬剤。
（７）唾液中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３５ｋＤａに分画されるタンパク質又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るタンパク質を含んで成る、歯槽骨吸収抑制剤。
発明を実施するための最良の形態
本発明に於いて用いられる試料は、採取した唾液そのものでも良いし、採取した唾液をフェニルメチルスルホニルフルオリド等の防腐剤を加えたもの、又はこれらを遠心分離し、浮遊物を除去したものでも良い。また、その由来はヒトが好ましいが、その他のほ哺乳類の唾液でも良い。
また、本発明に於ける３５ｋＤａ蛋白としては、ヒト由来のものが好ましいが、同様の性質を有するものものであれば、他のほ乳類のものでも良い。
３５ｋＤａ蛋白の検出及び濃度の測定は、唾液試料を上記した如きＳＤＳ−ＰＡＧＥによる方法で分離、測定してもよいし、例えばその他の電気泳動法（例えば等電点電気泳動法，アガロースゲル電気泳動法，アクリルアミド電気泳動法），誘電泳動法等の電気を利用する電気的分離法、例えばカラム分析法（例えばゲルろ過カラム分析，イオン交換カラム分析法，アフィニティーカラム分析法）、マススペクトル質量分析法等を行ってもよい。なかでも、タンパク質、核酸を分離するために用いられる、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ，等電点電気泳動法，アガロースゲル電気泳動法，キャピラリー電気泳動法，アクリルアミド電気泳動法等の電気泳動法や誘電泳動法等の電気的分離法が好ましく、特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥがより好ましい。また、この３５ｋＤａ蛋白を免疫して得られる抗体を用いた抗原抗体反応を利用する免疫学的方法により行っても良い。
尚、上記した如き電気泳動法を利用する場合、通常用いられる分離装置、泳動用電源、緩衝液、充填剤、各種処理液等の試薬類等は全て使用でき、その使用濃度も自体公知の方法に従い適宜選択すればよい。また、分離の際の各種条件（例えばｐＨ、温度、印加電圧、時間等）も自体公知の方法に従い適宜選択すればよい。
泳動用緩衝液としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばトリス緩衝液，リン酸緩衝液，ベロナール緩衝液，ホウ酸緩衝液，グッド緩衝液，ＳＳＣ緩衝液，ＴＢＥ緩衝液，ＴＡＥ緩衝液等の通常この分野で用いられる緩衝液等が挙げられ、その使用濃度としては、通常０．１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜５Ｍ、より好ましくは５ｍＭ〜１Ｍである。また、当該緩衝液のｐＨとしては、物質の分離に悪影響を及ぼさないものであればよいが、通常２〜１３、好ましくは４〜１１、より好ましくは５〜９である。
また、印加電圧も、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常５〜２０００Ｖ／ｃｍ、好ましくは１０〜１０００Ｖ／ｃｍ、より好ましくは５０〜５００Ｖ／ｃｍの範囲で印加される。
例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う場合、以下のような方法で行えばよい。
防腐処理を施して保存しておいた唾液試料を、遠心処理等して不純物を除去後、タンパク質量として１０〜３０μｇを１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにアプライし、分子量マーカーと共に電気泳動する。泳動後、０．２５％  ＣＢＢ染色又は銀染色を施し、３５ｋＤａのバンドを確認し、通常のレーザーデンシトメーター等を用いる方法でバンドの分析を行えばよい。また、電気泳動後のゲルについて、標識抗３５ｋＤａ蛋白抗体を用いたウェスタンブロット法を行って、３５ｋＤａバンドを確認する方法でも良い。
免疫学的方法によって３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を検出、測定する場合において用いられる抗３５ｋＤａ蛋白抗体又は配列番号２のタンパク質に対する抗体は、常法、例えば［免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、１９８１］等に記載の方法に従って、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を免疫して作製されるポリクローナル性抗体でも、或いはまた常法、即ちケラーとミルスタイン（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻，４９５頁，１９７５）により確立された細胞融合法に従って、例えばマウスの腫瘍ラインからの細胞と３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質で予め免疫されたマウスの脾臓細胞を融合させて得られるハイブリドーマが産出する単クローン性抗体でもよい。
尚、配列番号２のタンパク質に対する抗体を作製する際に用いられる配列番号２のタンパク質は、常法に従って合成した合成タンパク質を用いても良い。
抗３５ｋＤａ蛋白抗体を用いる唾液中に含まれる３５ｋＤａ蛋白の測定、又は配列番号２のタンパク質に対する抗体を用いる唾液中に含まれる配列番号２のタンパク質の測定は、抗３５ｋＤａ蛋白抗体又は配列番号２のタンパク質に対する抗体を用いて、いわゆる酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる測定方法（特開平９−３０１９９５号公報等）等の自体公知の免疫学的測定法に準じて行えばよい。また、その測定原理も、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等のいずれにてもよい。
中でも、最も感度が高く簡便な方法としてはＥＬＩＳＡ法が挙げられる。
上記した如き自体公知の免疫学的測定法に於いて、３５ｋＤａ蛋白や抗３５ｋＤａ蛋白抗体、配列番号２のタンパク質や配列番号２のタンパク質に対する抗体を固定化するために用いられる不溶性担体としては、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用いられるものでよく、例えば金属、ガラス、セラミック、シリコンラバー、例えばポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリプロピレン，アクリル樹脂，ポリメチルメタクリレート等の合成高分子等で調製された、ビーズ、チューブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、マイクロタイタープレート等が挙げられ、固定化方法としても、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用いられる、例えば物理的吸着法、化学的結合法等が挙げられる。
３５ｋＤａ蛋白や抗３５ｋＤａ蛋白抗体、配列番号２のタンパク質や配列番号２のタンパク質に対する抗体を標識するために用いられる標識物質としては、例えばＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）に於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばＲＩＡで用いられる９９ｍＴｃ，１３１Ｉ，１２５Ｉ，１４Ｃ，３Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル，３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル，２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
また、上記した如き標識物質を、３５ｋＤａ蛋白や抗３５ｋＤａ蛋白抗体、配列番号２のタンパク質や配列番号２のタンパク質に対する抗体に結合させる（標識する）方法としては、自体公知のＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ或はＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法に準じて行えばよい。また、標識方法として、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法を利用しても良い。
３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を、上記した自体公知のＨＰＬＣを利用する測定法により行う場合に用いられるＨＰＬＣ用装置も、通常この分野で用いられるものであればよい。
自体公知のＨＰＬＣを利用する測定法に於いては、複合体と遊離の標識抗３５ｋＤａ蛋白抗体（或いは標識３５ｋＤａ蛋白、又は標識した配列番号２のタンパク質に対する抗体或いは標識した配列番号２のタンパク質）とをより明確に分離するために、例えば特開平７−１９１０２７号公報、特開平９−３０１９９５号公報等に開示された、これらの分離を向上させるための物質（以下、「分離向上物質」と略記する。）を結合させた、３５ｋＤａ蛋白や抗３５ｋＤａ蛋白抗体、配列番号２のタンパク質や配列番号２のタンパク質に対する抗体等を用いてもよい。
このような目的に用いられる分離向上物質としては、例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸、α−キモトリプシノーゲン，β−ガラクトシダーゼ，リゾチーム，チトクロームＣ，トリプシンインヒビター等のタンパク質、例えばフェニルアラニン，プロリン，アルギニン，リジン，アスパラギン酸，グルタミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例えば臭素，塩素，沃素等のハロゲン原子、例えばポリエチレングリコール等の合成高分子、例えばポリグルタミン酸，ポリアスパラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニン，ポリフェニルアラニン，ポリチロシン等のポリアミノ酸、炭素数３〜１０のアルキル鎖、例えばパルミチン酸，オレイン酸，ステアリン酸等の脂肪酸、例えばＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド［Ｎ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ］（ＥＭＣＳ），Ｎ−スクシンイミヂル−６−マレイミドヘキサノエイト（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏａｔｅ），ビスマレイミドヘキサン（Ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅ）（ＢＭＨ），オクチルアミン等のＴｇ結合タンパク質や特定糖鎖結合タンパク質に結合し得る反応基を有し且つ疎水性若しくはイオン性を有する化学物質、例えば特開平９−３０１９９５号公報に記載された４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリルＡｌａ−（Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ））５、４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリルＡｌａ−（Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ））８等の強酸残基含有ペプチド等が好ましく挙げられる。尚、分離向上物質は、３５ｋＤａ蛋白や抗３５ｋＤａ蛋白抗体、配列番号２のタンパク質や配列番号２のタンパク質に対する抗体の性質（例えばｐＨ安定性，疎水度，水溶液への溶解度，等電点等）を考慮した上で適宜選択して用いればよい。
分離向上物質と、３５ｋＤａ蛋白や抗３５ｋＤａ蛋白抗体との結合方法又は、配列番号２のタンパク質や配列番号２のタンパク質との結合方法も、
（１）自体公知のＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等において一般に行われている自体公知の標識物質と抗体との結合方法（例えば、医学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説  蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、１９８２、等）、
（２）自体公知の物質の修飾および結合方法（例えば、タンパク質の化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、志村憲助、中村道徳、船津勝編集、第１版、（株）学会出版センター、１９８１；ポリエチレングリコール修飾タンパク質、稲田祐二他、生化学、第６２巻、第１１号、Ｐ１３５１−１３６２、（社）日本生化学会、１９９０；ＤＮＡ  ＰＲＯＢＥＳ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｈ．Ｋ．ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｍ．Ｍ．ＳＴＯＣＫＴＯＮ  ＰＲＥＳＳ，１９８９、等）等に準じて行えばよい。
また、免疫学的測定法による測定に於いて、例えば各濃度に希釈した抗３５ｋＤａ蛋白抗体又は配列番号２のタンパク質に対する抗体を吸収性担体しみこませておいたものと、上記した如き標識物質で標識した抗３５ｋＤａ蛋白第二抗体又は配列番号２のタンパク質に対する抗体を用い、試験紙片を採取した唾液に浸した後、第二抗体溶液と反応させ、標識の発色等を検出することによっても、３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質の検出を行うことが出来る。この場合、用いられる吸収性担体としては、ドライケミストリーの分野で通常用いられている例えば濾紙、不織布、ガラス繊維等が好ましく挙げられ、フィルムとしては厚さ３００μｍ前後のポリスチレンシート等が好ましい。
上記した如き方法により３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を検出し、当該測定方法により得られた３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質の値に基づいて、試料提供者が将来歯周病に罹るリスクが高いか否かを判定することが可能である。
即ち、被験者の唾液中の３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を検出し、当該タンパク質が存在しない場合には、歯周病に罹るリスクが高いと判定する。一方、本発明者が調査したところ、３５ｋＤａ蛋白を分泌するヒトの唾液中の３５ｋＤａ蛋白の濃度は１〜１７μｇ／ｍｌであったので、３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質が検出され、その量が唾液中の量として１μｇ／ｍｌ以下である場合には、歯周病に罹るリスクが高いと判定される。
尚、本発明に於いて「歯周病に罹るリスク」とは、現在歯周病でなくても将来歯周病に罹る危険性をいい、歯周病になりやすい体質、即ち歯周病罹患体質である場合をも指す。従って、本発明に於いて「歯周病に罹るリスクが高い。」とは、将来歯周病に罹る危険性が高いこと、又はが歯周病になりやすい体質であること、即ち歯周病罹患体質であることを意味する。
また、既に歯周病に罹っている患者については、目視等によりその確認が容易であるので、本発明の歯周病リスク判定方法によっても歯周病であるか否かの判定をする必要はそれほどない。しかし既に歯周病に罹っている患者について本発明の３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質の有無を調査することにより、歯周病治療後の再発の可能性について予測することは可能である。
本発明の方法によれば、歯周病が発症する以前の若年層のヒトに対しても、唾液中にこの蛋白が分泌されているか否かを検査することにより、歯周病の進行を防止することが出来る。即ち、本発明の方法により、３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質の検出を行い、陰性の場合には歯周病が発症する以前あるいは進行する前に専門家による定期的な検査、予防処置を進めることにより歯周病の進行を防止させることができる。
本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質は、以下のようにして大量に取得することが可能である。
即ち、先ず、この蛋白をコードする遺伝子を以下のような方法で採取する。
（１）３５ｋＤａ蛋白断片のアミノ酸配列の決定
唾液試料を電気泳動終了後、ゲルプレートより３５ｋＤａバンド相当部分を切り出し、常法によりゲルから３５ｋＤａ蛋白を抽出し、例えばリシルエンドペプチダーゼ等の蛋白分解酵素で分解する。分解されたタンパク質をＨＰＬＣにて分析し、コンタミンの最も少ないと推察されるシャープなフラクション適当箇所を選び、アミノ酸分析装置を用いアミノ酸配列を決定する
（２）塩基配列の決定
３５ｋＤａ蛋白の塩基配列の決定は、例えば次のように行えばよい。
まず、手術によって得られた唾液腺組織片試料をホモジナイズし、遠心分離後、上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色で３５ｋＤａバンドの有無をチェックする。
３５ｋＤａの位置に明瞭にバンドが確認できた試料、即ち、３５ｋＤａ蛋白を合成している唾液腺組織試料から常法によりｍＲＮＡを収集する。次いで適当なプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得、制限酵素処理、宿主細胞への形質導入とｃＤＮＡの増幅を行う常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
目的のＤＮＡを検索するにあたっては、まず上記で決定した、３５ｋＤａ蛋白を酵素処理して得られた各断片のアミノ酸配列に対応するプローブを作製し、これを用いて常法によりｃＤＮＡライブラリーから目的のｃＤＮＡを釣り上げ、ＰＣＲ法によって増殖させ、これを細菌プラスミド又はベクターに組み込み、最終的に３５ｋＤａ蛋白を発現する遺伝子配列の全シーケンスを決定することができる。
また、次のような方法によっても、目的のＤＮＡを釣り上げることができる。
即ち、上記した如き３５ｋＤａ蛋白を分泌することが確認された唾液腺からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを、例えば常法に従いベクターＤＮＡに組み込む。用いられるベクターＤＮＡとしては、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドベクター、λＥＮＢＬ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λＤＡＳＨＩＩ（フナコシ社製）等のバクテリオファージベクター、Ｃｈａｒｏｍｉｄ  ＤＮＡ（和光純薬工業（株）製）、Ｌｏｒｉｓｔ６（和光純薬工業（株）製）等のコスミドベクター等が挙げられる。
得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ））、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（（株）ニッポンジーン社製）、ＤＨ５α（（株）ニッポンジーン社製）、ＶＣＳ２５７等を形質転換又は形質導入して夫々の形質転換体又は形質導入体を得る。
形質転換は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６−３３１，１９７９）等により行うことができ、又、形質導入は、例えば、Ｂ．Ｈｏｈｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，２９９−３０９，１９７９）や、Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，Ｅ．Ｍ．，Ｇｖｉｌｄ，Ｇ．Ｈ．，Ｐｒｅｓｔｉｄｇｅ，Ｌ．Ｓ．ａｎｄ  Ｈｏｎｅｓｓ，Ｓ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ，１１，２７１（１９８０）に記載のパッケージング法等により行うことができる。
一方、目的のベクターが導入された形質転換体又は形質導入体を選別するには、例えば、プローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーションを行えばよい。
この際に用いられるプローブとしては、例えば上記した如き方法により決定された、３５ｋＤａ蛋白中のアミノ酸配列に基づいて合成ＤＮＡを設計し合成したもの、又は、これをＰＣＲにより増幅した断片等が用いられる。
更に、ハイブリダイゼーションを行って得られた、目的のＤＮＡが結合したベクターを有する形質転換体又は形質導入体から当該ベクターを得るには、例えばアルカリミニプレップ法等の常法により行えばよい。その後、得られた当該ベクターを適当な制限酵素で部分消化した後、常法により精製し、得られたＤＮＡ断片について塩基配列を求めることによって、３５ｋＤａ蛋白をコードするＤＮＡの塩基配列を決定する。
このようにして求められた結果から推定される、３５ｋＤａ蛋白活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
配列番号１の塩基配列に於いて、４４位〜７９０位は蛋白発現部位（プレプロ体）（このうち４４位〜１２１位がシグナル配列と推定される。）、１２２位〜７９０位が成熟蛋白部位（３５ｋＤａ蛋白）である。
また、配列番号１が発現するタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
尚、配列番号２で示されるタンパク質の分子量を計算すると、３５ｋＤａよりも小さい（２８ｋＤａ）。これは、実際にはヒト唾液腺細胞で産生された３５ｋＤａは、糖鎖で修飾された糖タンパク質として分泌されるために、配列番号２で示されるタンパク質の分子量は、３５ｋＤａよりも小さいのだと推察される。
配列番号１に示される塩基配列に於いて、１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたものであっても、３５ｋＤａ蛋白活性をもたらすアミノ酸配列をコードする遺伝子は、全て本発明にかかる３５ｋＤａ蛋白を製造するために用いることのできるものに含まれる。この欠失、置換若しくは付加については、特に限定はされないが、その数は１〜１０個程度、好ましくは１又は２個程度である。置換の場合には、その結果、配列が終止コドン配列とならないよう注意が必要である。
そして、配列番号１に示される塩基配列に於いて、１若しくは複数、好ましくは、数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されており、且つ、３５ｋＤａ蛋白活性をもたらす塩基配列をコードする遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法、オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
また、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子とストリンジェント又はハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子も本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を製造するために用いることのできる遺伝子であり、このような遺伝子としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。
尚、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、例えば通常のストリンジェントな条件としては、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜７０℃の温度の条件下で１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で洗浄を行うことにより実施できる。また、ハイストリンジェントな条件としては、前記において、洗浄を０．０１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中行うことにより実施できる。
また、配列番号２に示されるアミノ酸配列に於いて、１若しくは複数、好ましくは、数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つ、３５ｋＤａ蛋白の活性を有するタンパク質も本発明の目的に使用可能であり、当該タンパク質をコードする遺伝子を得るにも、同様に常法に従って行えばよい。このアミノ酸の欠失、置換若しくは付加については、特に限定はされないが、その数は１〜１０個程度、好ましくは１又は２個程度である。置換の例としては、セリン、スレオニン、システイン間の相互置換、グリシンとアラニンの置換等が挙げられる。
本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を製造するために用いられる組み換え体ＤＮＡは、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子を挿入したベクターＤＮＡである。
当該ベクターＤＮＡとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクター，ファージベクター及びウイルスベクターが包含される。
このような組み換え体ＤＮＡは、簡便に当業界に於いて入手可能なベクター、好ましくはプラスミドベクター，バクテリオファージベクター又はウイルスベクターに、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子を常法により組み込むことにより調製することもできる。かかるベクターとして、具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ、ｐＧＥＸ、ｐＵＣなど、酵母由来プラスミドとして例えばｐＢ４２ＡＤ、ｐＥＳＰ、ｐＥＳＣなど、枯草菌由来プラスミドとして例えばｐＨＴ９２６、ｐＴＢ５１、ｐＨＹ４８１などが挙げられる。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、更にレトロウィルス、ワクシニヤウィルス、核多角体ウィルスなどの動物や昆虫のウィルスが例示される。
本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子を発現させ、これらタンパク質を生産させる目的に於いては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子を発現し、これらタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に制限されないが、例えば宿主大腸菌に対しては、ｐＱＥ−ＴＲＩプラスミド（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＳ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＸ、ｐＭＡＬなど、ほ乳動物細胞に対してはｐＣＡＴ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＭＶ等が挙げられる。
宿主細胞として細菌、特にＥ．ｃｏｌｉを用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子、終始コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位から構成される。
宿主として酵母または動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位なども発現ベクターに組み込むことが可能である。
細菌中で本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモータ、バクテリオファージ由来のＴ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、λＰＬプロモーターなどを含むものが挙げられる。
酵母中で本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーターなどが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、ＣＭＶ由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、核多角体ウィルスの有するポリヘドリンプロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
終止コドンとしては常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が例示される。ターミネーター領域としては、天然または合成のターミネーターが挙げられる。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することが出来る機能を持つＤＮＡをいい、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）及び合成プラスミド等が含まれる。
エンハンサー配列としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノ、パピローマ等のＤＮＡ主要ウィルスのエンハンサー配列、レトロウィルスＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）、免疫グロブリンＨ鎖、Ｌ鎖遺伝子のエンハンサー配列などが例示される。
発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白遺伝子、終止コドン、及びターミネーター領域を連続的且つ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することが出来る。また、この際、所望により制限酵素での消化やＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
本発明に係る形質転換体は、上述の組み換えＤＮＡを宿主細胞に導入することにより調製することが出来る。
宿主細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス属菌）、酵母（例えばサッカロマイセス属など）、動物細胞及び昆虫細胞など〕が挙げられる。具体的には、エシェリキア属菌では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．ＢＬ２１，ＢＬ２１（ＤＥ３），ＤＨ１，ＤＨ５，ＤＨ５α，Ｍ１５，ＨＢ１０１，Ｃ６００，ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ，ＪＭ１０９，ＪＭ１０５，ＪＭ１２７，ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）などが、バチルス属菌では、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ，Ｂ．ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｉｓなどが挙げられる。酵母としてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓｃｉｚｏ．ｐｏｍｂｅ，Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉａなど、或いはＡｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌も挙げられる。動物細胞としては、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞，ＦＬ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはＢｍＮ４，Ｓｆ９などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
宿主細胞として、一般にＤＮＡ配列のクローニング及びベクターの組立のためには原核細胞が好ましい。組み立てられたベクターは、次に適当な宿主細胞に形質転換され、発現系を構築する場合には、原核細胞及び真核細胞を使用することができる。
発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は従来公知の方法を用いて行うことが出来る。
細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉやＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の場合は、たとえばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９７２）９，２１１０）プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９７９）１６８，１１１）またはコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９７１）５６，２０９）等によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９７８）７５，１９２７）やリチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８３）１５３，１６３）等によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９７３）５２，４５６）等によってそれぞれ形質転換することが出来るが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質は、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって製造することが出来る。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。また所望により他の栄養素〔例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム〕、ビタミン類、抗生物質を含んでいても良い。
培養は当業界に於いて知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び発酵時間は本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質の最高力価が得られるように選択される。
尚、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地及び培養条件を例示するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。その際、ｐＨが５〜８であることが望ましい。
宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、２ＹＴ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、Ｍ９培地〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２．２（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ〕が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、攪拌をしながら、通常１４〜４２℃、好ましくは２８〜３９℃、約３〜２４時間行うことができる。
宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、攪拌をしながら、通常１４〜４２℃、好ましくは２８〜３９℃、約３〜９６時間行うことが出来る。
宿主が酵母である場合、培地としては、例えばＹＰＤ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２．２（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常１４〜４２℃、好ましくは２０〜３５℃、約１２時間〜１０日間行われ、必要により通気、攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９５２）１２２，５０１〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９５９）８，３９６〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，（１９６７）１９９，５１９〕、１９９培地〔ｐｒｏｃ．ＳＳｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，（１９５０）７３，１〕、ダイゴＴ▲２▼培地（和光純薬工業（株）製）等を用いることが出来る。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃、好ましくは３４〜３８℃で約１２〜７２時間行われ、必要に応じて通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８５）８２，８４０４〕等が挙げられ、そのｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃、約１２時間〜１０日間行われ、必要により通気、攪拌を行うこともできる。
本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得できる。
即ち本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質が、培養物のうち培液中に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液または培養上清を得、当該培養濾液または培養上清から、天然または合成タンパク質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を精製、単離する。
単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈殿法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
一方、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質が培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体或いは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁及び／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法で本発明に係る３５ｋＤａ蛋白を含有する粗抽出液を得る。そして、当該粗抽出液を、先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。
本発明の歯周病リスク判定用試薬は、例えば本発明者の見出した３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を標準として含んで成り、要すれば抗３５ｋＤａ蛋白抗体又は配列番号２のタンパク質に対する抗体を含有して成る。
また、例えば▲１▼所定濃度の抗３５ｋＤａ蛋白抗体溶液の一定量を吸収性担体にしみこませておいたもの一又は複数と、検出されうる標識を結合した抗３５ｋＤａ蛋白第二抗体の溶液を含有して成るもの、又は▲２▼所定濃度の配列番号２のタンパク質に対する抗体溶液の一定量を吸収性担体にしみこませておいたもの一又は複数と、検出されうる標識を結合した配列番号２のタンパク質に対する第二抗体の溶液を含有して成るもの、も挙げられる。
これら試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したり、３５ｋＤａ蛋白と抗３５ｋＤａ蛋白抗体との反応、又は配列番号２のタンパク質と配列番号２のタンパク質に対する抗体との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
本発明の試薬に於いて用いることのできる緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等、通常電気泳動法、免疫比濁法、免疫比ろう法、ＲＩＡ、ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）に用いられている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとしては抗原抗体反応を阻害したり、３５ｋＤａ蛋白の安定性を阻害しない範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０である。
本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質は、自体公知の方法により、所望の他の有効成分、例えば抗菌剤等と合し、錠剤、粉剤、顆粒剤、液剤等の経口剤、あるいはゲル剤、パスタ剤及び軟膏剤といった局所外用剤の形態で提供できる。
このような、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を含有する経口或は局所外用医薬組成物は、本発明の、歯垢から歯石への形成を抑制する薬剤或いは歯槽骨吸収抑制剤として使用される。
このような経口或は局所外用医薬組成物中における３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質の含有量は、適用対象により異なり一概には規定できないが、通常、成人１日の唾液の分泌量は５００ｇ〜２０００ｇであることから、成人の１日当たり経口投与量は有効成分である３５ｋＤａ蛋白量又は配列番号２のタンパク質量にして５０〜２００ｍｇが望ましい。また、局所外用剤においては、一歯につき１〜２．５ｍｇ／回の用量により所望の歯垢から歯石への形成を抑制する効果或いは歯槽骨吸収抑制効果、言い換えれば歯周病治療効果が発揮される。
歯周病という局部の疾患に対し、患部への薬剤到達量が高く、効果的な剤型を考えると、本発明の、歯垢から歯石への形成を抑制する薬剤或いは歯槽骨吸収抑制剤（以下、これらを総称して、単に「本発明の薬剤」と略記する場合がある。）としては、局所外用剤、特に軟膏剤が唾液により洗い流されにくいので上記の中でも好ましい。
その構成物としては、油脂性基剤、乳剤性基剤、リオゲル基剤に含まれるワセリン、パラフィン類、プラスチベース、シリコン、ラノリン、高級脂肪酸エステル、高級アルコール、多価アルコール、エタノール等、ポリアクリル酸塩、キトサン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどの天然または合成高分子等の増粘剤や粘着剤、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリルモノ脂肪酸エステルなどの界面活性剤、香味剤等が使用される。
また、本発明の薬剤は、歯磨剤、洗口剤、トローチ剤などの口腔用組成物の形態でも提供できる。口腔用組成物においては、３５ｋＤａ蛋白の濃度は、通常、成人１日の唾液の分泌量は５００ｇ〜２０００ｇであることから、成人の１日当たり経口投与量は有効成分である３５ｋＤａ蛋白量又は配列番号２のタンパク質量にして５０〜２００ｍｇ投与されるような量にしておくことが望ましい。口腔用組成物の形態とした本発明の薬剤には上記した如き諸成分に加えて、さらに組成物の形態に応じた以下のような適当な成分を本発明の効果を損なわない範囲で配合することができる。
例えば、界面活性剤として、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アシルアミノ酸塩などのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどのポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、マルトース脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなど非イオン性界面活性剤を配合することができる。これらの界面活性剤は単独でも２種以上を併用してもよく、その配合量は組成物全量に対して０．０１〜５０重量％である。
更に、例えば、Ｎ−ラウリルジアミノエチルグリシン、Ｎ−ミリスチルジエチルグリシンなどのＮ−アルキルジアミノエチルグリン、Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニウムベタイン、２−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリンベタインナトリウム等の両性界面活性剤から選ばれるものが配合できる。これらは、単独または２種以上を組み合わせて配合することができ、その配合量は、通常、組成物全量に対して０．０１〜５重量％、好ましくは０．０１〜０．２重量％である。
更に、口腔用組成物の形態の本発明の薬剤においては、メントール、カルボン酸、アネトール、オイゲノール、サリチル酸メチル、リモネン、オシメン、ｎ−デシルアルコール、シトロネール、α−テルビネオール、メチルアセタート、シトロネニルアセタート、メチルオイゲノール、シネオール、リナロール、エチルリナロール、チモール、スペアミント油、ペパーミント油、レモン油、オレンジ油、セージ油、ローズマリー油、珪皮油、シソ油、冬緑油、丁子油、ユーカリ油、ピメント油などの香料を、単独または２種以上を組み合わせて組成物全量に対して０．１〜重量％、好ましくは０．５〜５重量％程度の割合で、また、サッカリンナトリウム、アセスルファームカリウム、ステビオサイド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、グリチルリチン、ペリラルチン、タウマチン、アスパラチルフェニルアラニルメチルエステル、ｐ−メトキシンナミックアルデヒドなどの甘味剤を、組成物全量に対して０．０１〜１重量％、好ましくは０．０５〜０．５重量％の割合で配合することができる。更にまた、カチオン化ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸プロピレングリコールエステル、キサンタンガム、トラガントガム、カラヤガム、アラビヤガム、カラギーナンなどのガム類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの合成粘結剤、シリカゲル、アルミニウムシリカゲル、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、合成ケイ酸ナトリウムマグネシウムなどの無機粘結剤などの１種または２種以上を組成物全量に対して０．３〜５重量％、また、湿潤剤として、ソルビット、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、キシリット、マルチット、ラクチットなどを単独または２種以上を組み合わせて、組成物全量に対して５〜７０重量％配合することができる。
また、歯磨類の形態とする場合には、研磨剤としては、第二リン酸カルシウム・二水和物および無水物、第一リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、無水ケイ酸、シリカグル、ケイ酸アルミニウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、第三リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、ポリメタクリル酸メチルベントナイト、ケイ酸ジルコニウムおよび合成樹脂などを、単独また２種以上を組み合わせて、組成物全量に対して、通常、５〜７０重量％、好ましくは、１０〜５０重量％の割合で配合することができる。
尚、口腔用組成物形態の本発明の薬剤には、塩化セチルピリジニウム、ヘキシジン以外の薬効成分として、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸トコフェロール、またはニコチン酸トコフェロールなどのビタミンＥ類、ドデシルジアミノエチルグリシンなどの両性殺菌剤、トリクロサン、イソプロピルメチルフェノールなどの非イオン系殺菌剤、デキストラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ムタナーゼ、リゾチーム、溶菌酵素（リテックエンザイム）などの酵素、モノフルオロリン酸ナトリウム、モノフルオロリン酸カリウムなどのアルカリ金属モノフルオロフォスフェート、フッ化ナトリウム、フッ化第一錫などのフッ化物、トラネキサム酸やイプシロンアミノカプロン酸、アルミニウムクロルヒドロキシルアラントイン、ジヒドロコレステロール、グリチルリチン塩類、グリチルレチン酸、グリセロフォスフェート、クロロフィル、塩化ナトリウム、カロペプチド、水溶性無機リン酸化合物などを、単独または２種以上を組み合わせて配合することもできる。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限を受けるものではない。
実施例
・全唾液の採取方法
唾液採取に協力してくれたボランティアの人達および患者の全員には予め唾液採取の目的と研究目的を説明した後に採取を行った。
採取方法は、まず口腔内を出血しないように良く歯ブラシで清掃し、良く水道水で漱いさせた後に、１０−２０ｍｌのガラスビーカーを下唇にあてがい頭を下方に向けさせて、しばらく舌や唇を動かせないようにして、自然に唾液がピーカー内に貯まるのを待った。貯まった唾液を１ｍｌずつ試験管に小分けし、０．１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を１０μｌ加え、直ちに−２０℃にて凍結させた。凍結させた唾液試料はさらに−４５℃のディープフリーザー内に保存した。
実施例１．３５ｋＤａ唾液蛋白の発見
（１）試料
一般歯科医院に歯科治療のために訪れた外来患者の中から無作為に抽出した患者８５名からそれぞれ了解のもとで上記の方法で全唾液を１〜５ｍｌずつ採取し、防腐処理を行ったのち−４５℃で凍結保存した。実験に先立ち４℃で解凍し、１０，０００ｇで３０分遠心分離し、浮遊物を除去したものを試料とした。
（２）電気泳動
試料の蛋白量を測定した。
次いでＢＩＯ−ＲＡＤ  ３６０ｍｉｎｉおよびＰＲＯＴＥＩＮ  ＩＩ  ２０ｃｍスラブゲル（ＢｉｏＲａｄ）電気泳動装置にて、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。夫々のセルには蛋白量として１０μｇあるいは５０μｇを添加し、分子量マーカとともに泳動した。泳動後、０．２５％  ＣＢＢＲ−２５０にて３０分染色した
（３）試料の電気泳動結果の解析
染色後、肉眼及びデンシトメーター（Ｕｌｔｒａ  Ｓｃａｎ  ＸＬ，Ｐｈａｍａｃｉａ  ＬＫＢ）を用いて分析結果を検討した。更に、スキャナーで取り込んだ泳動ゲルのデータをコンピュータによる画像解析および泳動ゲルを乾燥させた後、カラーコピー機による拡大コピーを作成し、各個人のデータを比較検討した。泳動ゲルのコピーを図１に示す。
その結果、注目すべきバンドを見出した。このバンドは分子量３５ｋＤａをもつ小さな画分で、約１０％の外来患者の唾液中に含有されていた。
また、表１に、この３５ｋＤａ蛋白の存在の有無を各年代毎に男女に分けて示す。表１に於いて、３５ｋＤａバンドが求められたものを陽性と、３５ｋＤａバンドが認められなかったものを陰性とした。
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一方、歯学部学生および研究者のボランティヤ４０名の唾液を同様に採取し３５ｋＤａバンドの有無について検索したところ、何らかの歯科疾患の治療目的の外来患者のケースと同様に約１０％の被験者のサンプル中に３５ｋＤａバンドが認められたが、９０％を越す３７名にはこの蛋白は認められなかった。
これらの結果から、唾液成分の一つである３５ｋＤａ蛋白は約１０％の日本人の唾液腺に発現するが、約９０％の人にはほとんど合成分泌されていないことが分かった。
また、同一人を約５年間にわたって、食前および食後の時間帯を含め任意の時間に採取した唾液について同様に電気泳動法によって検索したところ、常に一定したバンドが認められた。このことはこの蛋白は食事とは関係なく常時唾液中に分泌されていることを示唆している。
実施例２．３５ｋＤａ蛋白と歯周疾患との関連
実施例１と同じ８５名の歯科外来患者の全員について、さらに臨床的データ（特にＸ線フィルム診断）を比較検討したところ、非常に注目すべき結果が得られた。
即ち、３５ｋＤａ蛋白をもつ患者の口腔内の状態は一部の歯に齲蝕が認められるものの歯周組織の状態は健常な人と比較しほぼ同様であった。これに対して３５ｋＤａ蛋白ネガティブだった患者の多くは歯槽骨に大なり小なり何らかの問題点が認められた。
これらの結果から、３５ｋＤａ唾液蛋白が歯周病の発症に何らかの影響を与えていることが示唆された。
実施例３．長期にわたって定期的に管理されている患者と３５ｋＤａ蛋白との関連
（１）歯周病患者の診断とグループ分け
実施例２の結果に基づき、更にこのタンパク質と歯周病との関連を詳細に検索するため、２〜１０年に亘って約１月間隔で歯周病の管理指導を行っている患者の中で歯周病がほとんど認められないグループと幾ら管理指導しても歯周病の進行が認められる患者のグループより、それぞれ了解のもとに唾液を採取し同様に電気泳動法による３５ｋＤａバンドの有無について検索した。
即ち、患者９４名については、２年から１０年間にわたって毎月１回、来院してもらいプロビングディブス、ブロピング時の出血の有無および各歯牙における４分割によるプラークスコアを調べた後に通常の歯ブラシおよび歯間ブラシによるプラークコントロール後、歯肉縁下および縁上の歯垢や歯石を除去し、更にルートブランニングを行いＷＨＯペリオドンタループロープを用いポケットの深さを測定し、ＰＳＲシステム（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｎｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ），（Ｃａｒｒａｎｚａ，ＦＡ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，ＭＧ：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ；  ８ｔｈ  ｅｄ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９６，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｃａｒｒａｎｚａ，ＦＡ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｐｐ．３４３−３６２）に従い、記録、歯周病の程度の判定を行った。判定の緒果、コード３および４以上の患者にはさらに精密検査を行い適切な治療を行った。さらに年一度のＸ腺写真を撮影し歯周病の進行の程度を観察した。
こうしたチェックを定期的に長期にわったて行い、上記した如き長期に亘る定期的な歯周検査、歯垢や歯石の沈着状態などの総合観察結果およびメンテナンスの結果から、歯周病の進行が殆ど見られないグループ（４６名）と歯周病の治療を施しても症状の改善が見られなく予後が不良なグループ（４８名）とに区分した。
（２）歯周病に罹り難い患者についての検討
（１）で歯周病に罹り難いと診断された者４６名から採取した唾液試料を実施例１と同様の方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結果の一部を図２に示す。
図２の結果から明らかな如く、ほとんどの被験者の唾液中に濃淡様々であるが３５ｋＤａ蛋白のバンドが検出された。また、表２に、この３５ｋＤａ蛋白の存在の有無を各年代毎に男女に分けて示す。表２に於いて、３５ｋＤａバンドが求められたものを陽性と、３５ｋＤａバンドが認められなかったものを陰性とした。
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比較的年齢の若い者は一般に口腔衛生観念も発達し日常の手入れも良く行き届いている人が多いためか、歯周病になり易い体質か否かを診断することは非常に困難ではあったが、歯垢や歯石の沈着状態、Ｘ線検査による診断などを総合し、この人ならなり難い体質だと推定された若年層もこのグループに加えてある。
ところで、種々の臨床検査の結果、歯周病になり難いと推測された４６名の被験者のうち４４名、すなわち約９５％の人の唾液中に３５ｋＤａ蛋白が認められたことから、この蛋白が歯周病の発症の防止に密接な関連があるものと推察された。
（３）歯周病患者についての検討
（１）で典型的な歯周病と診断され、適切な治療後、長期に亘る定期的な歯周病の検査やメンテナンス、および歯周病と診断されない人達と同様に日常のブラシングのための指導を行い、当人も一所懸命努力しており、一時的には良好な経過をとり完治したように観察される患者を対象として検討を行った。
このグループの患者の特徴の一つとして、歯垢や歯石の沈着が早く、また歯垢からブラッシングでは除去出来ないほどに石灰沈着の進行が著しく早いことが挙げられる。このような患者を２−４週間おきにメンテナンスを行い、さらに２−１０年に亘る長期管理を継続しているが、この間にも数回にわたって治療を行ったが予後は好ましくはない。
同グループの患者から採取した唾液試料を、実施例１と同様の方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結果の一部を図３に示す。また、表３に、この３５ｋＤａ蛋白の存在の有無を各年代毎に男女に分けて示す。表３に於いて、３５ｋＤａバンドが求められたものを陽性と、３５ｋＤａバンドが認められなかったものを陰性とした。
これらの大部分の患者は高い口腔衛生観念を持ち積極的に定期的な検診とメンテナンスを受けているが、比較的低年齢層のものであるが慢性症状の見られる者もこのグループに加えてある。
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表３から明らかな如く、このグループにおいては、４８名中５名と、わずかに１０％の人にしか３５ｋＤａ蛋白が認められなかった。
（４）結論
上記（２）及び（３）の結果から、唾液中の３５ｋＤａ蛋白は歯垢や歯石の沈着・発達、さらに歯周病の発症や進行と密接な関連があるものと推察された。
実施例４．３５ｋＤａ蛋白の遺伝子解析
この蛋白の詳細な遺伝子構造を解析するため次のような過程で実験を行った。
（１）３５ｋＤａ蛋白断片のアミノ酸配列の決定
３５ＫＤａ蛋白を明確に同定出来る唾液試料の電気泳動終了後のゲルから３５Ｋｄａバンド相当部分をカミソリで注意深く切り出した。ゲル破片を０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５、ＩＣＮバイオメディカル社製）にて２回洗浄後、リシルエンドペプチダーゼ（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ８．５、ＩＣＮバイオメディカル社製）で３５℃で２０時間分解させた後、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｓ（Ｔｏｓｈｏ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、０．１％から０．０９％の、アセトニトリルの密度勾配（Ａ液：０．１％ＴＦＡ、Ｂ液０．９％ＴＦＡ＋９０％アセトニトリル）をかけたＨＰＬＣにて、分離し、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長で分析した。分析結果を図４に示す。
図４の結果から、コンタミンの最も少ないと推察されるシャープなフラクション３ケ所、即ちフラクション５７，フラクション６８，フラクション８２（図４中、夫々ｆｒ．５７，ｆｒ．６８，ｆｒ．８２のピーク）を選び、アミノ酸シーケンサーＨＰ  Ｇ１００５Ａプロティンシーケンシング，システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いアミノ酸配列を決定した。夫々のピークのアミノ酸配列を表４に示す（Ｆｒ．５７：配列番号３、Ｆｒ．６８：配列番号４、ｆｒ．８２：配列番号５）。表４に於いて、アミノ酸は１文字の略号で示す。
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（２）アミノ酸分析の結果得られたペプチドに対する抗体作製
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（１）で得られた上記３種類のペプチドに対する合成ペプチドを固相法（Ａｔｈｏｒｔｏｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）により作製し、それぞれの端末にＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル）法（文献：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｌｉｇａｎ，ＪＥ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ  ＡＭ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＤＨ，Ｓｈｅｖａｃｈ，ＥＭ，Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）によって結合させたものを、Ｆｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバンドとともに家兎に注射し、ポリクロナール抗体を作製した。１４，２８，４２日後に追加免疫後、更に７日後、抗血清を採取し、プロテイン−Ａ−アフィニティカラムを用いてそれぞれのペブチドに対する特異免疫抗体を精製した。
次いで、得られた抗体を用いてウェスタンブロティングを行った。すなわち、３５ｋＤａ蛋白を含有する唾液試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロティング膜（ニトロセルロース膜、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）に転写した。上記で得られた３種類の特異抗体をペルオキシダーゼで標識したものを用い、免疫反応を行った。その結果、３種類の抗体はすべて、３５ｋＤａバンドの位置に免疫反応が認められた。
この結果は、（１）で得られたフラクション５７，６８、およぴ８２のペプチドは、すべて３５ｋＤａ蛋白の構成に与っている可能性が非常に高いことを意味している。そこでこのペプチドを用い、遺伝子の塩基配列を決定した。
（３）塩基配列の決定
以下のようにして、塩基配列の決定を行った。
（３−１）３５ｋＤａ  ｍＲＮＡが発現している唾液腺組織の選択
目的とする、３５ｋＤａのｍＲＮＡが発現している唾液腺組織を得るため、それぞれの患者の了解のもとに、手術により摘出された唾液腺組織１５例から唾液腺組織の一部を切り出し、直ちに液体窒素中で凍結させ−８０℃で保存した。それぞれの凍結唾液腺組織の一部を解凍し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加えホモジナイズした後、遠心分離を行い、上澄について１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。泳動後のゲルについて通常のＣＢＢ染色を行った。
その結果、１５例中２例に、３５ｋＤａの位置に明瞭にバンドが確認でき、３５ｋＤａ蛋白が発現していることが確認された。残りの１３試料からは明瞭なバンドは認められなかった。
これらの結果は、１５人中２人、すなわち約１０％の人の唾液腺にしか３５ｋＤａ蛋白の合成が明瞭に行われていないことを示している。この結果は、これまでの唾液試料についての電気泳動結果のデータとほぼ一致することが判る。
更に、これらの結果から、唾液中の３５ｋＤａ蛋白は唾液腺細胞で合成され、唾液中に分泌されることをも意味していると考えられる。
（３−２）目的のＤＮＡの検索
（３−２−１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
（３−１）で選択した３５ｋＤａ蛋白を合成している２つの唾液腺組織試料から下記の方法によりｍＲＮＡを収集し、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。
１）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
（３−１）で選択した上記２例の唾液腺組織から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの収量は３．７ｍｇであった。
２）ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡの調製
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ約２５０μｇより、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（Ｓｕｐｅｒ）ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製した。Ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡの収量は約４．９μｇであった。
３）ｃＤＮＡライブラリーの作製
Ｇｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ法（文献：Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９，１９８３）に基づいてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
即ち、上記で得られたｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ  ３．５μｇと、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ＭＩＸ１プライマー（ＧＡ）１０ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）２５（Ａ／Ｃ／Ｇ）（配列番号６）、ＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄを合成した。続いて２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ合成後、末端を平滑化し、ＢａｍＨＩ（ＢｇＩＩＩ）−Ｓｍａｌアダプターをライゲーションした。次いで制限酵素ＮｏｔＩで処理した後、スピンカラムを用いて低分子量ＤＮＡを除去し、ｐＡＰ３ｎｅｏ（ＢｇＩＩＩ−ＮｏｔＩ切断）ベクターとベクターライゲーションを行って、ｃＤＮＡインサートを調製した。
得られたライゲーション産物を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、ニッポンジーン社製）を加えて全量を１００μｌとし、等量のフェノール・クロロホルム（１：１）を加えて、ボルテックスにて攪拌した。１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、水層を新しいチューブに移して、１００μｌ（等量）のクロロホルムを加えてボルテックスにて攪拌した。水層のみをＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０（ミリポア）限外ろ過フィルターに写し、７，０００ｒｐｍで約１０分間遠心し、フィルター内の溶液を落とした。フィルター内に１００μｌのＴＥ緩衝液を加え同様に遠心して、溶液を落とした。再度同様の作業を繰り返した。フィルター内に２５μｌのＴＥ緩衝液を加えて、軽くボルテックスにて攪拌した後、フィルターを逆さまにし、新しい回収チューブに装着して、７，０００ｒｐｍで約５分間遠心した。回収したものを３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ｃＤＮＡライブラリーとして使用した。ライゲーション産物のうち１μｌをエレクトロポレーション法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦに導入し、形質転換を行った。一部をＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートにプレーティグしてプライマリーライブラリーのサイズを検定した。
次いで、Ｉｎｓｅｒｔ  ｓｉｚｅ  ｒａｎｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ、即ち、ランダムに拾ったＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ８個のコロニーについて、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲの分布の確認を行った（λ／ＥｃｏＴ１４１  ｄｉｇｅｓｔ  Ｍａｒｋｅｒ，ｐＨＹ  Ｍａｒｋｅｒ）。
本ライブラリーを使用したＰＣＲスクリーニングで、期待される増幅産物が得られた。
（３−２−２）ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子の内部領域のＰＣＲスクリーニング
１）プライマー設計
（１）で決定した３種類のアミノ酸配列を元に、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ８種類と、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ８種類の、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒを設計合成した。尚、プライマー配列中、ＤはＡ，Ｔ又はＧ、ＨはＡ，Ｔ又はＣ、ＮはＡ，Ｃ，Ｇ又はＴ、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、Ｉはデオキシイノシンを夫々示す。
アミノ酸配列
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プライマー配列（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）
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プライマー配列（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）
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２）目的遺伝子のＰＣＲスクリーニング
（３−２−２）の１）で得られたプライマーを、以下の組み合わせで用い、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。
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先ず、それぞれ以下のように反応液を調製した。
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ＰＣＲはＴｈｅｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００，アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、９４℃  １分、９４℃  ３０秒、５０℃  ３０秒、７２℃  ２分／３０サイクル、７０℃  ３分行った。
次いで得られた反応液５μｌを１％アガロースゲル電気泳動を行って増幅断片を検出した。その結果表５記載のプライマー対のうち、プライマー対５とプライマー対６において、増幅断片が得られた。
３）ＰＣＲ増幅産物のサブクローニング
（３−２−２）の２）のＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ増幅産物のうち、プライマー対５の増幅産物が顕著であったため、このプライマー対５の増幅断片をアガロースゲルから回収し、精製した後、ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ法を用いてサブクローニングを行った。
４）塩基配列の解析
（３−２−２）の３）により得られたクローンについて、ＲＶ−Ｍ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’、（配列番号２３，コード番号３８８０、ｔａｋａｒａ社製）を用いて塩基配列の解析を行った（ＡＢＩ３７７シークエンサー、アプライド・バイオシステムズ社製）。塩基配列データならびに塩基配列データから予想されるアミノ酸配列を得られたペプチドと比較したところ、一致したことから、ＰＣＲ増幅産物は、目的遺伝子の内部配列であることが期待できた。ここでは、３５ｋＤａ蛋白の塩基配列の３２６番目〜５２５番目が確認された。
（３−２−３）ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子の３’末端領域のスクリーニング
１）プライマー設計
（３−２−２）の４）で新たに明らかとなった塩基配列をもとに、プライマーを設計、合成した。
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また、ベクタープライマーとして以下のプライマーを用いた。
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２）ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子の３’未端のスクリーニング
ベクター内のプライマーと１）で設計したプライマーを用いて、以下の条件でＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、目的遺伝子の３’末端側のスクリーニングを行った。テンプレートには、先に得たｃＤＮＡライブラリーを使用した。
先ず、それぞれ以下のように反応液を調製した。
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ＰＣＲはＴｈｅｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００を用い、９４℃  １分、９４℃  ３０秒、５５℃３０秒、７２℃  ６０秒／３０サイクル、７２℃  ３分行った。
次いで得られた反応液５μｌを１％アガロースゲル電気泳動を行って増幅断片を検出した。この条件で得られたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより約６００ｂｐの増幅断片を得た。
３）目的遺伝子の３’末端側ＰＣＲ増幅断片の塩基配列解析
得られた約６００ｂｐの断片をゲルから回収し、精製した後、ＰＣＲ５  Ｆ３をプライマーに用いてダイターミネーター反応を行い、ＡＢＩ３７７シークエンサーを用いてダイレクトシークエンスにより塩基配列の解析を行った結果、増幅したｃＤＮＡは、目的遺伝子由来であることが示唆された。また、終止コドンやＰｏｌｙＡサイトと思われる部位が見られたことから、増幅したｃＤＮＡはその３’末端側であることが確認された。ここでは、目的とする３５ｋＤａ蛋白の塩基配列の４９３番目〜３’末端終止コドンが確認された。
（３−２−４）ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子の５’末端領域のスクリーニング
１）プライマー設計
（３−２−２）の４）で新たに明らかになった塩基配列をもとに次のプライマーを設計、合成した。
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また、ベクタープライマーとして以下のプライマーを用いた。
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２）ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子の５’末端のスクリーニング
ベクター内のプライマーと１）で設計したプライマーを、ＰＣＲ５  Ｒ２とｐＡＰ３  Ｆ２、ＰＣＲ５  Ｒ３とｐＡＰ３  Ｆ１の組合せで用いて、以下の条件でＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、目的遺伝子の５’末端側のスクリーニングを行った。テンプレートには、先に得たｃＤＮＡライブラリーを使用した。
先ず、それぞれ以下のように反応液を調製した。
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ＰＣＲはＴａｋａｒａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰを用い、９４℃  １分、９４Ｃ  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ６０秒／３０サイクル、７２℃  ３分行った。
次いで、得られた反応液５μｌを１％アガロースゲル電気泳動を行って、増幅断片を検出した。この条件で得られたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより約６００ｂｐの増幅断片を得た。
３）目的遺伝子の５’末端側ＰＣＲ増幅断片の塩基配列解析
目的遺伝子の５’末端側のＰＣＲスクリーニングにより増幅した約６００ｂｐの断片についてゲルから回収し精製した後、ＰＣＲ５  Ｒ３及びｐＡＰ３Ｆ１をプライマーに用いてダイレクトシークエンスにより塩基配列の解析を行った。ダイターミネーター反応を行い、ＡＢＩ３７７シークエンサーを用いて塩基配列を決定した。増幅したｃＤＮＡは、目的遺伝子由来であることが期待できた。また、初めに得られたＦｒ．５７，Ｆｒ．６８，Ｆｒ．８２のペプチドをコードする塩基配列をこのｃＤＮＡ中に探して当てはめて読んだところ、それと同じ読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）でこのｃＤＮＡ中に開始コドンが読みとれたので、増幅したｃＤＮＡは目的遺伝子の５’末端側で、ここが目的遺伝子の翻訳開始部位であることが予想された。ここでは、目的とする３５ｋＤａ蛋白の塩基配列の５末端開始コドン〜４５５番目が確認された。
（３−２−５）ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子のＰＣＲスクリーニング１）プライマー設計
（３−２−３）及び（３−２−４）で、目的遺伝子の５’側およぴ３’側のＰＣＲスクリーニングより得られた塩基配列をもとに以下のプライマーを設計、合成した。
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２）ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニング
（３−２−５）の１）で設計したプライマーを用いて以下の条件でＰＣＲを行い、目的遺伝子のＰＣＲスクリーニグを行った。テンプレートには、先に作製したｃＤＮＡライブラリーを用いた。
先ず、以下のように反応液を調製した。
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ＰＣＲは、Ｔａｋａｒａ  Ｔｈｅｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰを用い、９４℃  １分、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ９０秒／３０サイクル、７２℃  ３分行った。
次いで、得られた反応液５μｌをアガロースゲル電気泳動を行って、増幅断片を検出し、期待されるサイズの増幅産物を得た。
３）サブクローニングと塩基配列解析
（３−２−５）の２）で得られたＰＣＲ増幅断片を、アガロースゲルより回収し、精製した後、Ｔａｋａｒａ  ＢＫＴ  Ｋｉｔ（ｃｏｄｅ  ６１２６）を用いて、ｐＵＣ１１８（ＨｉｎｃＩＩ／Ｂａｐ処理）ベクターにサブクロニーングを行った。得られたクローンについて、ベクターのＦｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＴＫＮ  ＬＰ  Ｎｅｗプライマー、ＰＣＲ５  Ｆ１プライマーを用いて、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法により塩基解析を行った。ダイターミネター反応を行い、ＡＢＩ３７７シークエンサーを用いて塩基配列を次の通り決定した，
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得られたクローンは、目的とするｃＤＮＡであることが示唆された。ここで、目的遺伝子の全塩基配列（１番目〜１０１８番目）が確認された。
以上の過程を経て唾液腺細胞内で合成している３５ｋＤａ蛋白のｃＤＮＡの全塩基配列を別紙のとおり決定した（配列番号１）。このシーケンスは２４９アミノ酸で（配列番号２）、先に（１）で決定した三つのアミノ酸配列は、それぞれｆｒ．５７は、６２９−６５８（アミノ酸配列１９６〜２０５番目）、ｆｒ．６８は３１７−３４６（アミノ酸配列９２〜１０１）、ｆｒ．８２は４８５−５２９（アミノ酸配列１４８〜１６２番目）の塩基配列の中にすべて正確に組み込まれていた。
本発明の３５ｋＤａ蛋白のｃＤＮＡの全塩基配列及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を図５に示す。
実施例５．３５ｋＤａ蛋白遺伝子の遺伝子バンクによるホモロジー検索
（１）ＢＬＡＳＴによるアミノ酸配列の検索
ＢＬＡＳＴによるアミノ酸配列の検索から、配列番号１に対して、２つのデータがホモロジーが同じものと判断された。一つ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＡＸＯ６１６２１−１，ＰＲＯＴＥＩＮ−ＩＤＣＡＣ２４９８２，１、であり、他の一つは、ｄａｄ  ＡＬ１２１９０１−１，ＣＡＣＯ３５４６．１である。しかしながら、これら二つの登録はヒト遺伝子解明プロジェクトチームによる結果である。したがって、機能や疾病の原因追及から発展したものではないので、この蛋白の機能や疾病との関連については何らの記載がない。すなわち、この遺伝子の機能並びに発現された３５ｋＤａ蛋白の機能については、現在のところ全く報告されていない。
（２）類似したアミノ酸配列をもつタンパク質について
類似したアミノ酸配列を持つタンパク質について調査を行ったところ以下のようなものが抽出された。
（ａ）ＰＳＰ（マウス耳下腺分泌蛋白）（ＰＯ７７４３）
・Ｈａｎｓ  Ｏ．Ｍａｄｓｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｐｅｔｅｒ  Ｈｊｏｒｔｈ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ＰＳＰ  ｍＲＮＡ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｖｏｌ．１３，１−１３，１９８５．
・Ｋｎｕｄ  Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  ｅｔ．ａｌ．：Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｒｏｔｉｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓａｌｉｖａｒｙ  ａｍｙｌａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｖｏｌ．５：１８９１−１８９６，１９８６．  ＰＳＰ（Ｐａｒｏｔｉｄ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）はマウス耳下腺から分泌される蛋白で、２０個のシグナルペプチドと２１５個のアミノ酸から成る。機能は不明であるがアミラーゼの合成との関連性が高い蛋白で、アミラーゼの前駆蛋白と推定されている。
（ｂ）ＢＳＰ３０蛋白（Ｕ７９４１３−１，ＡＡＢ３８２８２．１），（Ｕ７９４１４−１，ＡＡＢ３８２８３．１）
・Ｒａｊａｎｔ  ＧＨ  ａｎｄ  ｅｔ．ａＬ：Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔ  ＶＯｌ．２７：４０７−４１４，１９９６
牛の唾液蛋白から抽出した３０ｋＤａの蛋白で、機能は不明である。プロリンリッチ蛋白のグループではないが、牛の腹部膨化に関する病因との関連が示唆される。
（ｃ）Ｂ１−ＩＰｓ蛋白
・Ｍｉｒｅｌｓ  Ｌ，Ｍｉｒａｎｄａ  ＡＪ，ａｎｄ  Ｂａｌｌ  ＷＤ：Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．Ｆｅｂ１５；３３０（Ｐｔ１）：４３７−４４４，１９９８．
Ｂ１−ＩＰｓ（Ｂ１−ＩｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅＰｒｏｔｅｉｎｓ）はラット顎下腺腺房細胞の前駆細胞や胎児および成獣の唾液腺から分泌される蛋白で、ＰＳＰおよびＺＺ３からの転写蛋白として単離された。分子量２６Ｋ−２８Ｋで、唾液腺細胞の分化に関与する蛋白と推定される。
以上、遺伝子および蛋白バンクによるデータ照合では３５ｋＤａ蛋白と同じ配列のヒト遺伝子や類似したアミノ酸配列をもつデータがすでに報告されている。しかしながら、これらの報告はすべて唾液腺や唾液に関連するものである。ヒトの場合は機能については全く不明であり、単にシグナルペプチドを含む蛋白であること以外は報告されていない。一方、ラットの場合は具体的な研究が進み唾液腺腺房細胞の分化との関連が推察されている。
いずれにせよ、これらの報告は、機能や病気が分かっていて、そこからさらに詳細な機能や病気との関りを追及するためにアミノ酸配列や塩基配列を決定したというものではないので、これら報告に開示されたタンパク質の機能は、当然のことながら何ら言及も示唆もなされておらず不明である。
（３）３５ｋＤａ蛋白の推定される機能
この蛋白の生化学的な機能については、今のところ明確ではないが培養中の骨芽細胞の増殖にはそれほど強い影響は与えていない。しかし、臨床的なデータと付き合わせると次のような機能が推論された。
（ａ）歯垢から歯石への形成を抑制する機能
３５ｋＤａ蛋白陰性の患者を長期にわたってブラシング指導および歯周病治療後のメンテナンスを行っても、多くの人は、歯垢や歯石の沈着が著しく、特に下顎前歯の舌側部の沈着は著しい。ひどい場合は、歯科医師によるメンテナンス後、１日数回の手入を行うよう指示し２週間後に再度検診すると、歯垢はすでに歯ブラシでは除去困難な程度まで成長している。一方、３５ｋＤａ蛋白陽性の患者はメンテナンス後、数ヶ月から１年後でも殆ど歯石の沈着が認められない。
以上の臨床的結果から、３５ｋＤａ蛋白は歯垢から歯石への形成を抑制する機能を有するものと推察された。
（ｂ）歯槽骨吸収抑制作用
２−１０年以上にわたる隔月ごとにメンテナンスおよび検診を行い、さらに２−４年ごとに歯槽骨の状態を観察するためパントモ撮影によるＸ−線検査の結果、３５ｋＤａ蛋白陰性の患者の多くは、大なり小なりの歯槽周辺の骨吸収が認められた。
特に骨吸収の著しい４０代の患者の場合、約１０年間で歯根の４分の３まで歯槽全体にわたって水平的な骨吸収が認められる例も観察された。
これに対し、陽性の患者はこの程度の期間では骨吸収はほとんど認められなかった。これらの症例から３５ｋＤａ蛋白は歯周病による歯槽骨の吸収を抑制する機能を持つものと推定される。ただし、この蛋白が直接骨吸収を抑制するものか、歯石形成を防止する作用の結果、歯周組織の炎症の発症を予防するため歯槽骨の吸収が起こらないことも考えられる。
３５ｋＤａ蛋白が、歯周病の進行の抑制にあたって直接的にどのような作用によるものかは今のところ完全には解明されていないが、歯周病の予防や進行に重要な役割を担っていることは本研究で明白になった。やがて多くの研究者によってそのメカニズムは解明されるであろう。
実施例６．３５ｋＤａ蛋白の発現（３５ｋＤ蛋白の活用）
実施例４，（３−２−５）の３）でサブクローンされたものからプラスミドを常法により取り出し、発現ベクターが組み込まれたプラスミドに次の方法で組み替えた。
即ち、実施例４，（３−２−５）の３）でサブクローンされたものからプラスミドを少量とり、これを鋳型にして翻訳開始部位の両端に制限酵素認識配列を結合させるため、またコドンの読み取り枠を一致させるために、得られたＦｏａｗａｒｄのプライマーとして、ＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴ（配列番号３６）およびＲｅｖｅｒｓｅのプライマーとしてＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴ（配列番号３７）を合成し、ＰＣＲを行い増幅させた。これを電気泳動し、バンドを切り出し、プラスミドＰＣＲ２・１−ＴＯＰＯ（ＴＯＰＯクローニング・キット、インビトロジェン社製）を用い、プラスミドに組み込み、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）に形質転換した。これを寒天培地に蒔き培養した。生じたコロニーのうち５個を拾い上げた。次いで３５ｋＤａ蛋白のｃＤＮＡが組み込まれたことを碓認するため、電気泳動及びサザンブロッティングを行ったところ、コロニー３とコロニー４に強いバンドが認められた。そこで、このコロニーをミニプレップしてプラスミドを収集した。これについて更に配列を確認し、３５ｋＤａ蛋白のｃＤＮＡが組み込まれていることを確認した。
次いで、このプラスミドをＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断し、発現ベクターであるｐＱＥ−Ｔｒｉプラスミド（Ｑｉａｇｅｎ社製）に組み込んだ。この発現ベクターｐＱＥ−Ｔｒｉは大腸菌、昆虫細胞、動物細胞のいずれにも発現可能といわれているプラスミドである。この組み換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）に形質導入させ、培養し、目的の３５ｋＤａ蛋白を発現させた。
細胞内で合成され、細胞外へ分泌された３５ｋＤａ蛋白を収集して、この蛋白の機能や歯周病の原因菌との関連、歯周組織との影響さらに骨芽細胞および破骨細胞に与える影響について目下検索している。
実施例７．３５ｋＤａ蛋白の発現（ホ乳類細胞での発現）
（１）３５ｋＤａ蛋白遺伝子のクローニング
Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｓａｌｉｖａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ）を鋳型として得られたｃＤＮＡの塩基配列をもとにして、合成した２種類のオリゴヌクレオチドｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧ）（配列番号３８）とｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（ＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ）（配列番号３９）を用い、ＰＣＲ（９４℃、１２０秒：９４℃、２０秒，４２℃、２０秒，７２℃、９０秒を２５サイクル）を行うことにより、３５ｋＤａ蛋白の遺伝子（配列１中の蛋白発現部位：４４位から７９０位、終止コドンを含まない）を増幅させた。得られた断片をＢａｍＨＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩサイトに挿入した。これにより、３５ｋＤａ蛋白遺伝子に続いて、その下流にｍｙｃエピトープタグ遺伝子が配列されることになる。続いてＥ．ｃｏｌｉ．（ＪＭ１０９）に形質転換させ、多数の形質転換体を得た。得られた形質転換体を大量培養後、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）によりプラスミドを回収した。
（２）ホ乳類培養細胞への遺伝子導入、発現
ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、上記（１）で得られたプラスミドをＣＨＯ細胞及びＨｅＬａ細胞へ導入した。導入から４８時間後に培養細胞を回収し、１％  ＮＰ−４０（１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  ＤＴＴ）／ＰＢＳ（−）により溶解し、３５ｋＤａを含有する細胞の溶解物を得た。
（３）３５ｋＤａ蛋白発現の検出
上記（２）で得られた各細胞の溶解物について、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒａｐｉｄ  Ｋｉｔｗａｋｏ（和光純薬工業（株）製）を用いてタンパク質濃度を定量後、各レーン共に１５μｇ泳動を行い、一次抗体としてＭｙｃ認識Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌＩｇＧ（ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）［ヤギ，ＩｇＧ分画，アルカリフォスファターゼ結合（和光純薬工業（株）製）］を用いてウエスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現の確認をした。即ち、上記（１）で３５ｋＤａ蛋白遺伝子に続く下流側にｍｙｃエピトープタグ遺伝子があるので、３５ｋＤａ蛋白は、ｍｙｃエピトープと結合した融合タンパク質（３５ｋＤａ蛋白−ｍｙｃエピトープ）として発現する。従って、このｍｙｃエピトープの発現が確認されれば、その上流域の３５ｋＤａ蛋白遺伝子の発現も確認されることになる。また、対照として形質導入していないＨｅＬａ細胞及びＣＨＯ細胞を、（２）と同様の方法で溶解し、同様に泳動、ウェスタンブロッティングを行った。
結果を図６に示す。図６に於いて、レーン１はカラーマーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、レーン２及びレーン７は分子量マーカーを示す。レーン３は蛋白量１５μｇ，レーン４は蛋白量３０μｇ，レーン５は蛋白量６０μｇの形質導入したＨｅＬａ細胞の溶解物を用いた場合の結果を夫々示す。また、レーン８は蛋白量１５μｇ，レーン９は蛋白量３０μｇ，レーン１０は蛋白量６０μｇの形質導入したＣＨＯ細胞の溶解物を用いた場合の結果を夫々示す。更に、レーン６はＨｅＬａ細胞の溶解物を用いた場合（対照）、レーン１１はＣＨＯ細胞の溶解物を用いた場合（対照）の結果を夫々示す。
図６から明らかな如く、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞の両方の細胞を用いた場合で３５ｋＤａ蛋白−ｍｙｃエピトープ融合タンパク質のバンドが確認された。尚、形質導入していないＨｅＬａ細胞及びＣＨＯ細胞の溶解物を用いた場合にはタンパク質のバンドが認められなかった。以上のことより、哺乳類の細胞を用い、目的の３５ｋＤａ蛋白を発現させることが出来た。
実施例８．抗３５ｋＤａ蛋白モノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
実施例７で得られた、３５ｋＤａ蛋白を発現するＣＨＯ細胞を、３ＬのダイゴＴ▲２▼培地（和光純薬工業（株）製）と１００ｍＬのＣｙｔｏｌｉｎｅ  ２（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（株）製）の混合液を培地として、１週間間隔で培地交換を行いながら、回転培養させた。
上記培養によって得られた３Ｌの培養上清を、３，０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心分離し、その上清を限外ろ過により、約５０ｍＬにまで濃縮した。該濃縮液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ），４０ｍＭイミダゾール含有）で平衡化した５ｍＬのＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（株）製）カラムに供して目的の組み換え３５ｋＤａ蛋白を吸着させた。同カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１００ｍＭイミダゾール含有）で十分洗浄した後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３００ｍＭイミダゾール含有）を通液して、組み換え３５ｋＤａ蛋白を溶出させ、組み換え３５ｋＤａ蛋白を含む画分を得た。
得られた３５ｋＤａ蛋白溶出画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（アミコン社製）を用いて約１ｍＬまで濃縮後、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（和光純薬工業（株））を結合させたＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰカラム（和光純薬工業（株））を使用したアフィニティークロマトグラフィーに供し、約５０μｇの精製組み換え３５ｋＤａ蛋白を得た。
（２）抗３５ｋＤａ蛋白モノクローナル抗体の作製
上記（１）で得られた、精製組み換え３５ｋＤａ蛋白をフロインド・コンプリート・アジュバントと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀）１匹あたり３μｇとなるように腹腔内へ投与して初回免疫を行った。初回免疫から二週間後に、精製組み換え３５ｋＤａ蛋白をフロインド・インコンプリート・アジュバントと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹あたり１０μｇとなるように腹腔内へ投与し、二回目の免疫を行い、さらに二週間後、二回目と同様の方法で腹腔内へ投与し、三回目の免疫を行った。三回目の免疫から１カ月後に、生理食塩液に溶解した２０μｇの精製組み換え３５ｋＤａ蛋白を腹腔内へ投与し、最終免疫を行った。
最終免疫から３日後に脾臓を取り出した。脾臓は滅菌したステンレスメッシュ上でほぐし、ダイゴＴ培地（和光純薬工業（株）製）に懸濁後、数回遠心分離操作を繰り返して洗浄した。採取した脾細胞１．５×１０８個と、ダイゴＴ培地で脾細胞と同様の方法で洗浄したマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）３×１０７個をダイゴＴ培地中で混合し、１４５０ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。
得られた沈査に５０％ポリエチレングリコール１５４０  １ｍＬを３７℃で１分間、徐々に加えて細胞融合させ、さらに３７℃のダイゴＴ培地９ｍＬを５分間かけて加えた後、１４５０ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心した。得られた融合細胞をＨＡＴ培地６０ｍＬに懸濁し、９６ウエルのマイクロプレートに０．２ｍＬずつ分注し、２〜３日間隔でＨＡＴ培地を交換しながら培養を続けた。細胞融合から８〜１０日後に培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いて抗３５ｋＤａ蛋白抗体活性のスクリーニングを行い、抗体活性の強いウエルの細胞について、限界希釈法によるクローニングを行った。クローニング実施から８日後、１コロニー／ウエルの培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いて抗３５ｋＤａ蛋白抗体活性のスクリーニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製した。
これらのクローンの中から、モノクローナル抗体Ｎｏ．１−７を産生するハイブリドーマ１−７及びモノクローナル抗体Ｎｏ．１−１６を産生するハイブリドーマ１−１６を選択した。
実施例９．抗３５ｋＤａ蛋白モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡの設定
下記の方法により、抗３５ｋＤａ蛋白モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系を調製した。すなわち、実施例８で得られた抗３５ｋＤａ蛋白モノクローナル抗体Ｎｏ．１−７は定法（石川栄治著、「酵素標識法」、学会出版センター、１９９１年、ｐ．６２の方法）に従いペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、Ｒｏｃｈｅ社）標識し使用した。
実施例８で得られた抗３５ｋＤａ蛋白モノクローナル抗体Ｎｏ．１−１６を、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液で１５μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロプレートへ１５０μＬずつ加え、４℃で２０〜２４時間放置し抗体の固相化を行った。次に各ウェルに２５％ブロックエース（大日本製薬（株）商品名）を含むＰＢＳを３００μＬずつ添加し、４℃で２０〜２４時間静置した。０．４Ｍ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＢＳＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液５０μＬと各濃度に調製した組み換え３５ｋＤａ蛋白１００μＬを加え、室温で１時間静置した。プレートをＰＢＳで洗浄した後に上記で得られたＰＯＤ標識Ｎｏ１−７抗体を１５０μＬずつ各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。プレートをＰＢＳで洗浄したのちにテトラメチルベンジジンを含有する発色液（ＴＭＢ溶液：和光純薬工業（株）製）１００μＬを各ウェルに加え、室温で１時間反応を行わせた後、１Ｍリン酸水溶液１００μＬを各ウェルに添加してその反応を停止させた。各ウェルの４５０ｎｍに於ける吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。得られた検量線を図７に示す。
実施例１０．ＥＬＩＳＡによる３５ｋＤａ蛋白の測定
実施例９で設定したＥＬＩＳＡ系を用いて、歯周病陰性者［男（表６及び７中Ｍで示す）４例、女（表６及び７中Ｆで示す）２例］、及び歯周病陽性者［男（Ｍ）４例、女（Ｆ）２例］より採取した唾液を検体として、検体中の３５ｋＤａ蛋白量（吸光度）を測定した。
歯周病陰性者由来検体について得られた結果を表６に、また歯周病陽性者由来検体についてられた結果を表７に夫々示す。
2003083472.tif 000025
2003083472.tif 000026
表６及び表７の結果から明らかな如く、歯周病陰性者由来検体では３５ｋＤａ蛋白が高濃度に検出されたが、歯周病陽性者由来検体では歯周病陰性者由来検体に比較してはるかに３５ｋＤａ蛋白濃度が低かった。
この結果、本発明で得られたモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ系を用いて唾液中の３５ｋＤａ蛋白量を測定すれば、唾液提供者が歯周病か否かの判定が行えることが明らかになった。
実施例１１．軟膏剤
以下の組成の軟膏剤を調製した（分量  ％）。
グリセリン                        ７７．８
トリアセチン                      １０．０
ヒドロキシエチルセルロース          ５．０
アミノアルキルメタアクリレート      ２．０
香料                                ０．２
３５ｋＤａ蛋白                      ５．０
合計                            １００．０％
実施例１２．軟膏剤
以下の組成の軟膏剤を調製した（分量  ％）。
プロピレングリコール              ４２．８
プラスチベース                    ４０．０
ヒドロキシエチルセルロース          ５．０
流動パラフィン                      ５．０
トラガント末                        ２．０
香料                                ０．２
３５ｋＤａ蛋白                      ５．０
合計                            １００．０％
実施例１３．軟膏剤
以下の組成の軟膏剤を調製した（分量  ％）。
プロピレングリコール              ３９．８
プラスチベース                    ４０．０
カルボキシビニルポリマー            ５．０
精製水                              ５．０
香料                                ０．２
３５ｋＤａ蛋白                    １０．０
合計                            １００．０％
実施例１４．軟膏剤
以下の組成の軟膏剤を調製した（分量  ％）。
プラスチベース                          ４９．８
流動パラフィン                          ２０．０
ヒドロキシプロピルメチルセルロース        ５．０
メチルセルロース                          ５．０
セタノール                                ５．０
精製水                                    ４．０
オウレンエキス                            １．０
香料                                      ０．２
３５ｋＤａ蛋白                            ０．５
合計                                  １００．０％
実施例１５．練歯磨成分
以下の組成の練歯磨成分を調製した（分量  ％）。
ポリオキシエチレン                                ３０．０
ポリオキシプロピレンブロックコポリマーグリセリン  １７．０
二水リン酸水素カルシウム                          １１．０
無水リン酸カルシウム                                ６．０
モノフルオロリン酸ナトリウム                        ０．７
塩化セチルピリジニウム                              ０．０５
サッカリンナトリウム                                ０．２５
酢酸ｄｌ−α−トコフェロール                        ０．０５
精製水                                            ３３．４５
香料                                                １．０
３５ｋＤａ蛋白                                      ０．５
合計                                            １００．０％
実施例１６．洗口剤
以下の組成の洗口剤を調製した（分量  ％）
グリセリン                              １０．０
エタノール                              １０．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油            ０．５
パラオキシ安息香酸エステル                ０．１
サッカリンナトリウム                      ０．１
塩化セチルピリジニウム                    ０．０５
香料                                      ０．３
精製水                                  ７７．９５
３５ｋＤａ蛋白                            １．０
合計                                  １００．０％
実施例１７．トローチ剤
下記の組成のトローチ剤を調製した（分量  ％）。
白糖                              ９４．７
カルボキシメチルセルロース          ２．８
ステアリン酸マグネシウム            １．５
香料                                ０．５
３５ｋＤａ蛋白                      ０．５
合計                            １００．０％
実施例１８．トローチ剤
下記の組成のトローチ剤を調製した（分量  ％）。
キシリトール                      ９３．７
カルボキシメチルセルロース          ２．８
ステアリン酸マグネシウム            １．５
塩化クロルヘキシジン                ０．５
香料                                ０．５
３５ｋＤａ蛋白                      １．０
合計                            １００．０％
産業上の利用の可能性
本発明によれば、唾液中の３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を検出することにより、歯周病に罹るリスクを判定することが出来る。また、３５ｋＤａ蛋白又は配列番号２のタンパク質を含有する薬剤は、歯周疾患に優れた予防・治療剤が得られる。
尚、本発明に係る３５ｋＤａ蛋白及び配列番号２のタンパク質は、新規物質である。
【配列表】
2003083472.tif 000027
2003083472.tif 000028
2003083472.tif 000029
2003083472.tif 000030
2003083472.tif 000031
2003083472.tif 000032
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2003083472.tif 000035
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の３５ｋＤａ蛋白を担持したポリアクリルアミドゲルを、ＣＢＢ  Ｒ−２５０で染色処理を行った結果を示す図である。
図２は、実施例３で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の３５ｋＤａ蛋白を担持したポリアクリルアミドゲルをＣＢＢ  Ｒ−２５０で染色処理を行った結果を示す図である。
図３は、実施例３で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の３５ｋＤａ蛋白を担持したポリアクリルアミドゲルをＣＢＢ  Ｒ−２５０で染色処理を行った結果を示す図である。
図４は、実施例４で得られた、３５ｋＤａ蛋白画分をリシルエンドペプチダーゼで処理したものをＨＰＬＣで分離したクロマトグラムを示す図である。
図５は、実施例４で得られた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
図６は、実施例７に於いて得られた、３５ｋＤａ蛋白遺伝子を形質導入したＨｅｌａ細胞又はＣＨＯ細胞の溶解物を電気泳動した結果を示す図である。
尚、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。
１：カラーマーカー
２：分子量マーカー
３：蛋白量１５μｇの形質導入したＨｅＬａ細胞の溶解物
４：蛋白量３０μｇの形質導入したＨｅＬａ細胞の溶解物
５：蛋白量６０μｇの形質導入したＨｅＬａ細胞の溶解物
６：ＨｅＬａ細胞の溶解物（対照）
７：分子量マーカー
８：蛋白量１５μｇの形質導入したＣＨＯ細胞の溶解物
９：蛋白量３０μｇの形質導入したＣＨＯ細胞の溶解物
１０：蛋白量６０μｇの形質導入したＣＨＯ細胞の溶解物
１１：ＣＨＯ細胞の溶解物（対照）
図７は、実施例９に於いて得られた、３５ｋＤａ蛋白濃度と吸光度との関係を示す検量線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2003083472.tif 000047
【図７】
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【国際調査報告】
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2003083472.tif 000050
2003083472.tif 000051