(57)【要約】ササニシキ・ハバタキの交配後代集団を用いたポジショナルクローニングにより、イネの半わい性遺伝子ｓｄ−１を単離・同定した。その過程で、イネ第１染色体上のｓｄ−１周辺部分に、ササニシキ・ハバタキ間での一塩基置換多型を含む多型を多数見出した。得られた多型のいくつかについて、ＣＡＰＳまたはｄＣＡＰＳ法でジェノタイピングが可能となるようマーカー化を行った結果、該マーカーを用いることで、イネの半わい性形質の検査が可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する多型であって、以下の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法。
（Ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の１０３位、１４４位、１９９位、２０３位、２０４位、または、３４７位。
（Ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列の２位、５９位、１０５／１０６位、１１０位、１５１位、３０４位、３７５位、４３９位、５６８／５６９位、５７７位、６０４位、６１４位、６１６位、１５６２位、１６７５〜１６７６位、１７３２位、１８５２位、１８７８位、１９３５位、２１２１位、２１２５／２１２６位、２５０３〜２８８５位、または、３１０４位。
（Ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列の５８位。
（Ｄ）配列番号：４に記載の塩基配列の８６位、または、２７７〜３０６位。
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列の７８位、３３１位、３３７位、３６４位、３７３位、４０５位、４２３位、４８１位、５３９〜５５１位、５８３位、５９３位、６６１位、６８５位、または、７０１位。
（Ｆ）配列番号：６に記載の塩基配列の２０１〜２１３位、３５１位、５４７位、または、８４０位。
（Ｇ）配列番号：７に記載の塩基配列の１０３位、２２１位、または、２６４位。
（Ｈ）配列番号：８に記載の塩基配列の５９位。
（Ｉ）配列番号：９に記載の塩基配列の２８８位、３０１位、または、５２５〜５６０位。
（Ｊ）配列番号：１０に記載の塩基配列の１２４〜３４２位。
（Ｋ）配列番号：１１に記載の塩基配列の２２３位、または、２２４／２２５位。
（Ｌ）配列番号：１２に記載の塩基配列の３１４位。
（Ｍ）配列番号：１３に記載の塩基配列の３２０位。
（Ｎ）配列番号：１４に記載の塩基配列の７０位、１３７位、１７０位、または、６９１位。
（Ｏ）配列番号：１５に記載の塩基配列の２１０位。
（Ｐ）配列番号：１６に記載の塩基配列の３８０位、または、４０５位。
（Ｑ）配列番号：１７に記載の塩基配列の４３位、８４位、１３９位、１４３位、１４４位、または、２８７位。
（Ｒ）配列番号：１８に記載の塩基配列の１０１位、１６１位、１９６位、または、６５３位。
（Ｓ）配列番号：１９に記載の塩基配列の３１９／３２０位。
（Ｔ）配列番号：２０に記載の塩基配列の２１４位、６７０位、または、９２６位。
（Ｕ）配列番号：２１に記載の塩基配列の１９４位。
（Ｖ）配列番号：２２に記載の塩基配列の１７０位。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光の２つを標識したプローブを２種類合成する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で合成したプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む３’側塩基配列と相補的な配列、および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する工程
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から５’末端側が相補的なプローブを合成する工程
（ｄ）工程（ｃ）で合成したプローブと工程（ａ）で調製したＤＮＡとハイブリダイズさせる工程
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、工程（ｂ）で合成したプローブの一部を遊離させる工程
（ｆ）工程（ｅ）で遊離したプローブと、検出用プローブとをハイブリダイズさせる工程
（ｇ）工程（ｆ）でハイブリダイズしたＤＮＡを酵素的に切断し、その際に発生する蛍光の強度を測定する工程
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程
（ｅ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）シーケンサーを利用して、工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを質量分析器にかけ、分子量を測定する工程（ｄ）工程（ｃ）で測定した分子量を対照と比較する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
（ｄ）工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｃ）の基板を接触させる工程
（ｅ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出された強度を対照と比較する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程
（ｄ）工程（ｃ）で合成したプライマーが固定された基板を提供する工程
（ｅ）工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｄ）の基板を接触させる工程
（ｆ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｄ）で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｇ）スキャナーを用いて、工程（ｆ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
【請求項１４】
植物がイネである、請求項１〜１３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１５】
植物の半わい性形質の検査方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の判定方法により多型が検出された場合に、植物が半わい性形質を有するものと判定される方法。
【請求項１６】
植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのＰＣＲプライマーであって、該領域に存在する、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する、請求項１に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域とハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有する、ｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
植物がイネである、請求項１６または１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬。
【請求項２０】
請求項１６または１７に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物の半わい性形質検査用試薬。
【請求項２１】
植物がイネである、請求項１９または２０に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法に関する。
背景技術
半わい性はイネをはじめとする穀類の最も重要な形質の一つである。イネの半わい性遺伝子ｓｄ−１は、「緑の革命」遺伝子としてよく知られており、１９６０〜１９７０年代の、とくにアジア地域における穀物の著しい増収に貢献したものである（Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｆ．１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｐｌａｎｔ，ｖｏｌ．３．Ｍａｔｓｕｏ，Ｔ．，Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｆ．＆  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３００−３１８．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ．）。元来、中国の品種である低脚烏尖Ｄｅｅ−Ｇｅｏ−Ｗｏｏ−Ｇｅｎ（ＤＧＷＧ）に由来するこの遺伝子は、イネ品種に短く、太い茎をもたらし、収穫量指数を増加させ、冠水への抵抗性と窒素肥料応答性を増し、穂あるいは穀粒に負の影響を与えることなく収量を増加させることができる（Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｆ．１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｐｌａｎｔ，ｖｏｌ．３．Ｍａｔｓｕｏ，Ｔ．，Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｆ．＆  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３００−３１８．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ．）。
ｓｄ−１遺伝子の導入は従来の育種法により行われてきたが、この遺伝子が非常に重要であることから、遺伝子工学を介した多収品種の育成のためにも該遺伝子の同定が強く望まれてきた。ｓｄ−１遺伝子については、第１染色体のいくつかのタンパク質遺伝子座（Ｃｈｏ，Ｙ．Ｇ．，Ｅｕｎ，Ｍ．Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｋ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｔ．Ｙ．ａｎｄ  Ｃｈａｅ，Ｙ．Ａ．１９９４，Ｔｈｅ  ｓｅｍｉｄｗａｒｆ  ｇｅｎｅ，ｓｄ−１，ｏｆ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）．Ｉ．Ｌｉｎｋａｇｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｌｏｃｕｓ，Ｅｓｔｌ−２，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８９，４９−５３．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．，Ｈｉｒａｎｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｆ．１９９１，Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｓｒｐ（ｔ）  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｍｉｄｗａｒｆｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｓｄ−１  ｉｎ  ｒｉｃｅ，Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．，４１，５１７−５２１．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．，Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｓ．，Ｘｉａ，Ｂ．−Ｓ．ａｎｄ  Ｈｉｒａｎｏ，Ｈ．１９９５，Ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  Ｉｏｃｉ  ｆｏｒ  ｓｅｅｄ  ｇｌｕｔｅｌｉｎ（Ｇｌｕ−１），ｓｅｍｉｄｗａｒｆｉｓｍ（ｓｄ−１）ａｎｄ  ｓｈａｔｔｅｒｉｎｇ  ｈａｂｉｔ（ｓｈ−２）ｉｎ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．），Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉ．，４５，１８５−１８８．，Ｙｏｋｏｏ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，Ｓ．１９８６，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｒａｉｎ  ｓｈａｔｔｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｍｉｄｗａｒｆｎｅｓｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ，Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，３，６３−６５．）およびいくつかの分子マーカー（Ｃｈｏ，Ｙ．Ｇ．，Ｅｕｎ，Ｍ．Ｙ．，ＭｃＣｏｕｃｈ，Ｓ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈａｅ，Ｙ．Ａ．１９９４ｂ，Ｔｈｅ  ｓｅｍｉｄｗａｒｆ  ｇｅｎｅ，ｓｄ−１，ｏｆ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）．ＩＩ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８９，５４−５９．，Ｍａｅｄａ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｔ．，Ｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｐ  ｏｆ  ｓｅｍｉｄｗａｒｆｉｎｇ  ｇｅｎｅ，ｓｄ−１，ｉｎ  ｒｉｃｅ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉ．，４７，３１７−３２０．，Ｏｇｉ，Ｙ．，Ｋａｔｏ，Ｈ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｆ．１９９３，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＦＬＰ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｄｗａｒｆｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｄ−１  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ，Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．，４３，１４１−１４６．）に連鎖することが報告されている。しかしながら、これらの研究における遺伝解析の精度は不十分であり、本遺伝子の同定には到っていない。
ポジショナルクローニングは、自然に起こる遺伝的組換えを利用して遺伝子の単離・同定を行う戦略である。有性生殖を行う生物種の染色体上にコードされている観察可能な形質であれば、理論上全てポジショナルクローニングの対象とすることができる。形質遺伝子のポジショナルクローニングを行った例は、アラビドプシス（Ｌｕｋｏｗｉｔｚ，Ｗ．，Ｇｉｌｌｍｏｒ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｂｌｅ，Ｗ．Ｒ．２０００，Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｗｈｙ  ｉｔ  ｆｅｅｌｓ  ｇｏｏｄ  ｔｏ  ｈａｖｅ  ａ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｆｏｒ  ｙｏｕ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２３，７９５−８０５．）、トマト（Ａｌｐｅｒｔ，Ｋ．Ｂ．ａｎｄ  Ｔａｎｋｓｌｅｙ  Ｓ．Ｄ．１９９６，Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｔｉｇ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｗ２．２：Ａ  ｍａｊｏｒ  ｆｒｕｉｔ  ｗｅｉｇｈｔ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２４，１５５０３−１５５０７．）、およびイネ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ．，Ｓｈｏｍｕｒａ  Ａ．，Ｓａｓａｋｉ  Ｔ．ａｎｄ  Ｙａｎｏ  Ｍ．２００１，Ｈｄ６，ａ  ｒｉｃｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＣＫ２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１４），７９２２−７９２７．，Ｙａｎｏ，Ｍ．，Ｋａｔａｙｏｓｅ，Ｙ．，Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｍ．２０００，Ｈｄ１，ａ  ｍａｊｏｒ  ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ，ｉｓ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ｇｅｎｅ  ＣＯＮＳＴＡＮＳ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１２，２４７３−２４８３．）などの高等植物で報告がある。
ポジショナルクローニングには、大規模な分離集団の解析が必須である。近年、ｃｌｅａｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＡＰＳ）（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ  Ａ．ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．１９９３，Ａ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｃｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４：４０３−４１０．）あるいはｄｅｒｉｖｅｄ−ＣＡＰＳ（ｄＣＡＰＳ）（Ｎｅｆｆ  Ｍ．Ｍ．，Ｎｅｆｆ  Ｊ．Ｄ．，Ｃｈｏｒｙ  Ｊ．ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｒ  Ａ．Ｅ．１９９８，ｄＣＡＰＳ，ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１４：３８７−３９２．）といったＰＣＲを基盤としたマーカー技術の進展により、多数の植物個体を生育初期のうちに短期間で解析することが可能となった。
また、イネに関して以下のような関連特許が知られている。
・「イネ雑種不稔座Ｓ−５座近傍に位置するＤＮＡマーカーおよびこれを用いたＳ−５座の遺伝子型の判別方法」（特開２０００−３４２２６７）
・「イネ雑種不稔座近傍に位置するＤＮＡマーカー及びこれを用いた雑種不稔座の遺伝子型の判別方法」（特開２０００−３４２２６６）
・「イネの穂いもち抵抗性を間接的に識別できる分子マーカー」（特開２０００−２７９１７０）
・「イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子近傍に位置するＤＮＡマーカーおよびこれを用いた細胞質雄性不稔回復遺伝子の判別方法」（特開２０００−１３９４６５）
・「半矮性遺伝子の近傍に位置するマイクロサテライトマーカーおよびこれを用いた半矮性遺伝子の検定方法」（特開平１１−２５３１６７）
・「イネのトビイロウンカ抵抗性の検定方法、ＤＮＡ断片及びＰＣＲマーカー」（特開平１１−２０６３７６）
・「イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するＤＮＡマーカーおよびＤＮＡ診断法」（特開平０９−３１３１８７）
・「イネのいもち病抵抗性遺伝子の核酸マーカーと、このマーカーによって得られるイネいもち病抵抗性遺伝子」（特開平０７−１６３３７１）
・「イネのいもち病抵抗性遺伝子の核酸マーカーと、このマーカーによって得られるイネいもち病抵抗性遺伝子」（特開平０７−１６３３５７）
・「イネの開頴角度に関与する染色体領域、該領域を含む栽培イネ及び該領域の識別法」（特開２０００−２７０８６４）
・「イネのツマグロヨコバイ耐虫性を識別するための方法」（特開平１１−１０３８９３）
・「イネ縞葉枯病抵抗性を間接的に識別できる分子マーカー」（特開平１１−０８９５８３）
・「オリゴヌクレオチドを用いるイネ品種の識別方法」（特開平０６−１１３８５２）
・「オリゴヌクレオチドを用いるイネ品種の識別方法」（特開平０６−１１３８５１）
発明の開示
本発明の目的は、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法を提供することにある。
本発明者らは、ササニシキ（正常な草丈をもつ日本型イネ品種）・ハバタキ（ｓｄ−１に起因する半わい性の草丈をもつインド型イネ品種）の交配後代集団を用いたポジショナルクローニングにより、イネの半わい性遺伝子ｓｄ−１を単離・同定した（Ｍｏｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）９：１１−１７）。その過程で、イネ第１染色体上のｓｄ−１周辺部分に、ササニシキ・ハバタキ間での一塩基置換多型を含む多型を多数見出した。得られた多型のいくつかについて、ＣＡＰＳまたはｄＣＡＰＳ法でジェノタイピングが可能となるようマーカー化を行った。次いで、コシヒカリに半わい性形質を導入するモデル実験を行った。その結果、該マーカーを用いることで、イネの半わい性形質を検査できることが明らかになった。
即ち、本発明は、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法に関し、より具体的には、
〔１〕  植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する多型であって、以下の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法、
（Ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の１０３位、１４４位、１９９位、２０３位、２０４位、または、３４７位、
（Ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列の２位、５９位、１０５／１０６位、１１０位、１５１位、３０４位、３７５位、４３９位、５６８／５６９位、５７７位、６０４位、６１４位、６１６位、１５６２位、１６７５〜１６７６位、１７３２位、１８５２位、１８７８位、１９３５位、２１２１位、２１２５／２１２６位、２５０３〜２８８５位、または、３１０４位、
（Ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列の５８位、
（Ｄ）配列番号：４に記載の塩基配列の８６位、または、２７７〜３０６位、
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列の７８位、３３１位、３３７位、３６４位、３７３位、４０５位、４２３位、４８１位、５３９〜５５１位、５８３位、５９３位、６６１位、６８５位、または、７０１位、
（Ｆ）配列番号：６に記載の塩基配列の２０１〜２１３位、３５１位、５４７位、または、８４０位、
（Ｇ）配列番号：７に記載の塩基配列の１０３位、２２１位、または、２６４位、
（Ｈ）配列番号：８に記載の塩基配列の５９位、
（Ｉ）配列番号：９に記載の塩基配列の２８８位、３０１位、または、５２５〜５６０位、
（Ｊ）配列番号：１０に記載の塩基配列の１２４〜３４２位、
（Ｋ）配列番号：１１に記載の塩基配列の２２３位、または、２２４／２２５位、
（Ｌ）配列番号：１２に記載の塩基配列の３１４位、
（Ｍ）配列番号：１３に記載の塩基配列の３２０位、
（Ｎ）配列番号：１４に記載の塩基配列の７０位、１３７位、１７０位、または、６９１位、
（Ｏ）配列番号：１５に記載の塩基配列の２１０位、
（Ｐ）配列番号：１６に記載の塩基配列の３８０位、または、４０５位、
（Ｑ）配列番号：１７に記載の塩基配列の４３位、８４位、１３９位、１４３位、１４４位、または、２８７位、
（Ｒ）配列番号：１８に記載の塩基配列の１０１位、１６１位、１９６位、または、６５３位、
（Ｓ）配列番号：１９に記載の塩基配列の３１９／３２０位、
（Ｔ）配列番号：２０に記載の塩基配列の２１４位、６７０位、または、９２６位、
（Ｕ）配列番号：２１に記載の塩基配列の１９４位、
（Ｖ）配列番号：２２に記載の塩基配列の１７０位、
〔２〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する工程、
〔３〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）調製したＤＮＡを制限酵素により切断する工程、
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程、
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程、
〔４〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程、
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程、
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程、
〔５〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程、
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程、
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程、
〔６〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光の２つを標識したプローブを２種類合成する工程、
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で合成したプローブをハイブリダイズさせる工程、
（ｄ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程、
〔７〕  以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む３’側塩基配列と相補的な配列、および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する工程、
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から５’末端側が相補的なプローブを合成する工程、（ｄ）工程（ｃ）で合成したプローブと工程（ａ）で調製したＤＮＡとハイブリダイズさせる工程、
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、工程（ｂ）で合成したプローブの一部を遊離させる工程、
（ｆ）工程（ｅ）で遊離したプローブと、検出用プローブとをハイブリダイズさせる工程、
（ｇ）工程（ｆ）でハイブリダイズしたＤＮＡを酵素的に切断し、その際に発生する蛍光の強度を測定する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程、
〔８〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程、
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程、
（ｅ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程、
〔９〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程、
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程、（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程、
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程、
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程、
（ｅ）シーケンサーを利用して、工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程、
〔１１〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを質量分析器にかけ、分子量を測定する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で測定した分子量を対照と比較する工程、
〔１２〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程、
（ｄ）工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｃ）の基板を接触させる工程、
（ｅ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で検出された強度を対照と比較する工程、
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検植物体からＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程、
（ｃ）ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で合成したプライマーが固定された基板を提供する工程、
（ｅ）工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｄ）の基板を接触させる工程、
（ｆ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｄ）で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程、
（ｇ）スキャナーを用いて、工程（ｆ）で反応に使われた塩基種を判定する工程、
〔１４〕  植物がイネである、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の判定方法、
〔１５〕  植物の半わい性形質の検査方法であって、〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の判定方法により多型が検出された場合に、植物が半わい性形質を有するものと判定される方法、
〔１６〕  植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのＰＣＲプライマーであって、該領域に存在する、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド、
〔１７〕  植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する、〔１〕に記載の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域とハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有する、ｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのオリゴヌクレオチド、
〔１８〕  植物がイネである、〔１６〕または〔１７〕に記載のオリゴヌクレオチド、
〔１９〕  〔１６〕または〔１７〕に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬、
〔２０〕  〔１６〕または〔１７〕に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物の半わい性形質検査用試薬、
〔２１〕  植物がイネである、〔１９〕または〔２０〕に記載の試薬、を提供するものである。
本発明者らは、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する多型であって、下記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位の多型を見出した。さらに、これらの多型を検出することにより、植物について半わい性形質の有無を検査することが可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいたものである。
（Ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の１０３位、１４４位、１９９位、２０３位、２０４位、または、３４７位。
（Ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列の２位、５９位、１０５／１０６位、１１０位、１５１位、３０４位、３７５位、４３９位、５６８／５６９位、５７７位、６０４位、６１４位、６１６位、１５６２位、１６７５〜１６７６位、１７３２位、１８５２位、１８７８位、１９３５位、２１２１位、２１２５／２１２６位、２５０３〜２８８５位、または、３１０４位。
（Ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列の５８位。
（Ｄ）配列番号：４に記載の塩基配列の８６位、または、２７７〜３０６位。
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列の７８位、３３１位、３３７位、３６４位、３７３位、４０５位、４２３位、４８１位、５３９〜５５１位、５８３位、５９３位、６６１位、６８５位、または、７０１位。
（Ｆ）配列番号：６に記載の塩基配列の２０１〜２１３位、３５１位、５４７位、または、８４０位。
（Ｇ）配列番号：７に記載の塩基配列の１０３位、２２１位、または、２６４位。
（Ｈ）配列番号：８に記載の塩基配列の５９位。
（Ｉ）配列番号：９に記載の塩基配列の２８８位、３０１位、または、５２５〜５６０位。
（Ｊ）配列番号：１０に記載の塩基配列の１２４〜３４２位。
（Ｋ）配列番号：１１に記載の塩基配列の２２３位、または、２２４／２２５位。
（Ｌ）配列番号：１２に記載の塩基配列の３１４位。
（Ｍ）配列番号：１３に記載の塩基配列の３２０位。
（Ｎ）配列番号：１４に記載の塩基配列の７０位、１３７位、１７０位、または、６９１位。
（Ｏ）配列番号：１５に記載の塩基配列の２１０位。
（Ｐ）配列番号：１６に記載の塩基配列の３８０位、または、４０５位。
（Ｑ）配列番号：１７に記載の塩基配列の４３位、８４位、１３９位、１４３位、１４４位、または、２８７位。
（Ｒ）配列番号：１８に記載の塩基配列の１０１位、１６１位、１９６位、または、６５３位。
（Ｓ）配列番号：１９に記載の塩基配列の３１９／３２０位。
（Ｔ）配列番号：２０に記載の塩基配列の２１４位、６７０位、または、９２６位。
（Ｕ）配列番号：２１に記載の塩基配列の１９４位。
（Ｖ）配列番号：２２に記載の塩基配列の１７０位。
本発明において、「／」は、塩基部位と塩基部位との間を意味する。例えば、上記において「１０５／１０６位」とは、１０５番目の塩基と１０６番目の塩基との間に塩基が挿入されるような変異（挿入変異）を特徴とする多型部位を表す。
本発明の好ましい態様として、上記の（Ａ）〜（Ｖ）に記載の部位の多型は、具体的には、下記（Ａ’）〜（Ｖ’）のような変異を示すことができる。
（Ａ’）配列番号：１に記載の塩基配列において、１０３位の多型はｃからｔ、１４４位の多型はｃからｔ、１９９位の多型はｇからａ、２０３位の多型はｔからｃ、２０４位の多型はｃからｔ、３４７位の多型はｃからａへの変異である。（Ｂ’）配列番号：２に記載の塩基配列において、２位の多型はａからｔ、５９位の多型はｃからｇ、１１０位の多型はｇからｔ、１５１位の多型はｔからｇ、３０４位の多型はａからｔ、３７５位の多型はａからｔ、４３９位の多型はｇからａ、５７７位の多型はｃからｔ、６０４位の多型はｇからｔ、６１４位の多型はｃからａ、６１６位の多型はｇからａ、１５６２位の多型はｔからａ、１６７５〜１６７６位の多型はｇｇからｔａ、１７３２位の多型はｃからｔ、１８５２位の多型はａからｇ、１８７８位の多型はｇからａ、１９３５位の多型はｔからｃ、２１２１位の多型はｃからｇ、３１０４位の多型はｃからｔへの変異である。なお、３１０４位のｃからｔへの変異は、ｃａｌｒｏｓｅ７６において検出される変異である。また、１０５／１０６位の多型は１０５位と１０６位の間のａｇｇの挿入、５６８／５６９位の多型は５６８位と５６９位の間のａｔｃａｇｇｇｃａｇａｇｇｇｔｔｔａｃａｔａａｃｃａｃａｃｇｇｔｔａｔｃｇｔａｃ（配列番号：２５）の挿入、２１２５／２１２６位の多型は２１２５位と２１２６位の間のｃａの挿入変異である。さらに、２５０３〜２８８５位の多型は２５０３位から２８８５位までの３８３ｂｐの欠失変異である。
（Ｃ’）配列番号：３に記載の塩基配列において、５８位の多型はａからｇへの変異である。
（Ｄ’）配列番号：４に記載の塩基配列において、８６位の多型はｃからｔ、２７７〜３０６位の多型はｃｔｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ（配列番号：２６）からｃｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔ（配列番号：２７）への変異である。
（Ｅ’）配列番号：５に記載の塩基配列において、７８位の多型はａからｇ、３３１位の多型はｔからｃ、３３７位の多型はａからｇ、３６４位の多型はｃからｔ、３７３位の多型はａからｇ、４０５位の多型はｔからｃ、４２３位の多型はｇからａ、４８１位の多型はａからｇ、５８３位の多型はｇからｔ、５９３位の多型はｔからｃ、６６１位の多型はｃからｇ、６８５位の多型はｇからａ、７０１位の多型はａからｇへの変異である。また、５３９〜５５１位の多型は５３９位から５５１位までのｃａｃｃｔｇｔｇａｔｇａｔ（配列番号：２８）の欠失変異である。
（Ｆ’）配列番号：６に記載の塩基配列において、３５１位の多型はａからｇ、５４７位の多型はａからｃ、８４０位の多型はｔからａへの変異である。２０１〜２１３位の多型は２０１位から２１３位までのｔｇｔｇａａａａｔｔｃａｃ（配列番号：２９）の欠失変異である。
（Ｇ’）配列番号：７に記載の塩基配列において、１０３位の多型はａからｔ、２２１位の多型はｔからｇ、２６４位の多型はａからｇへの変異である。
（Ｈ’）配列番号：８に記載の塩基配列において、５９位の多型はｃからｔへの変異である。
（Ｉ’）配列番号：９に記載の塩基配列において、２８８位の多型はａからｇ、３０１位の多型はｔからｃ、５２５〜５６０位の多型はａｔｇａａｔからｔｔｃａｔｔｔｔａｃｃａａｔａｔｇａｃａｃｃｔａｃａｔｇａａａａ（配列番号：３０）への変異である。
（Ｊ’）配列番号：１０に記載の塩基配列において、１２４〜３４２位の多型は１２４位から３４２位までの２１９ｂｐの欠失変異である。
（Ｋ’）配列番号：１１に記載の塩基配列において、２２３位の多型はｃからｇへの変異である。また、２２４／２２５位の多型は２２４位と２２５位の間のａｔｃｇの挿入変異である。
（Ｌ’）配列番号：１２に記載の塩基配列において、３１４位の多型はｔからｇへの変異である。
（Ｍ’）配列番号：１３に記載の塩基配列において、３２０位の多型はｔからｇへの変異である。
（Ｎ’）配列番号：１４に記載の塩基配列において、７０位の多型はｃからｔ、１３７位の多型はｇからｔ、１７０位の多型はｇからｔ、６９１位の多型はｔからｃへの変異である。
（Ｏ’）配列番号：１５に記載の塩基配列において、２１０位の多型はａからｃへの変異である。
（Ｐ’）配列番号：１６に記載の塩基配列において、３８０位の多型はａからｇ、４０５位の多型はａからｃへの変異である。
（Ｑ’）配列番号：１７に記載の塩基配列において、４３位の多型はｃからｔ、８４位の多型はｃからｔ、１３９位の多型はｇからａ、１４３位の多型はｔからｃ、１４４位の多型はｃからｔ、２８７位の多型はｃからａへの変異である。
（Ｒ’）配列番号：１８に記載の塩基配列において、１０１位の多型はｔからｃ、１６１位の多型はｔからｇ、１９６位の多型はｔからｃ、６５３位の多型はａからｇへの変異である。
（Ｓ’）配列番号：１９に記載の塩基配列において、３１９／３２０位の多型は３１９位と３２０位の間のｇの挿入変異である。
（Ｔ’）配列番号：２０に記載の塩基配列において、２１４位の多型はｔからｃ、６７０位の多型はｇからｃ、９２６位の多型はｔからａへの変異である。
（Ｕ’）配列番号：２１に記載の塩基配列において、１９４位の多型はｇからａへの変異である。
（Ｖ’）配列番号：２２に記載の塩基配列において、１７０位の多型はｃからａへの変異である。
本発明は、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する多型であって、上記（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法を提供する。
本発明において、上記判定方法を実施することができる植物としては、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ、ジャガイモ、レタス、トマト等を例示することができるが、これらの植物に特に制限されない。
本発明のｓｄ−１遺伝子としては、例えば、イネｓｄ−１遺伝子を挙げることができる。該遺伝子の塩基配列を配列番号：２３に、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２４に記載する。
また、本発明におけるｓｄ−１遺伝子には、上記遺伝子のホモログも含まれる。このような遺伝子は、当業者においては公知の方法、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１，１９８８）を利用して、同定することが可能である。例えば、配列番号：２３に記載の塩基配列、もしくはその一部をプローブとして用いるハイブリダイゼーション技術、または配列番号：２３に記載の塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ技術により、所望の植物から上記の遺伝子と高い相同性を有するＤＮＡを単離することが可能である。
このようなＤＮＡを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示することができる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。単離したＤＮＡの配列の決定は、公知の方法で行うことができる。
単離されたＤＮＡが、ｓｄ−１遺伝子であるかは、通常、配列の相同性から判定する。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴｎ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴｘ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴｎによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴｘによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明において、ｓｄ−１遺伝子周辺領域とは、上記ｓｄ−１遺伝子の５’側および３’側の、通常３ｃＭ、好ましくは２ｃＭ、より好ましくは１ｃＭ、最も好ましくは１５０ｋｂのＤＮＡ領域を意味する。
本発明において、多型とは、遺伝学的には、母集団中１％以上の頻度で存在している１遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含む。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられるが、これらに特に制限はされない。
本発明の遺伝子型判定方法の好ましい態様においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する。本発明において、被検植物体としては、例えば、上記植物の葉、根、種子、カルス、葉鞘、培養細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、当業者であれば、ＤＮＡを上記被検植物体から抽出した染色体ＤＮＡを基に調製することができる。
本方法においては、次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する。本発明において、ＤＮＡの増幅方法としては、ＰＣＲ法が挙げられるが、ＤＮＡを増幅できる方法であれば特に制限されない。
本方法においては、次いで、増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する。ＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、通常、野生型ｓｄ−１遺伝子であり、当業者においては、各種遺伝子データベースまたは文献等から野生型ｓｄ−１遺伝子の塩基配列情報を取得することができる。
本発明の遺伝子型判定方法は、上記の如く直接被検植物体由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。例えば、本発明の遺伝子型判定方法は、以下のような方法によって行うことも可能である。
まず、被検植物体からＤＮＡを調製する。次いで、調製したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または、該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のオリゴヌクレオチドを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて当業者においては適宜選択することができる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２  Ｊａｎ  １；１２（１）：１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１  Ａｕｇ  １；６（８）：１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ａｐｒ  １；４（５）：２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
具体的には、まず、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光の２つを標識したプローブを２種類合成する（工程（ｂ））。次いで、工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で合成したプローブをハイブリダイズさせる（工程（ｃ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する（工程（ｄ））。次いで、レポーター蛍光の発光を検出する（工程（ｅ））。次いで、工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する（工程（ｆ））。
上記方法としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ．（１９９９）１４：１４３−１４９）等を挙げることができる。具体的には、まず、プローブの５’末端にレポーター蛍光を標識する。本発明において、レポーター蛍光としては、ＦＡＭやＶＩＣなどが例示できるが、これらに限定されない。さらに、上記プローブの３’末端にクエンチャー蛍光を標識する。本発明において、クエンチャー蛍光としては、レポーター蛍光を消光できる物質であれば特に制限されない。次いで、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光を標識したプローブを、調製したＤＮＡにハイブリダイズさせる。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する。その結果、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光を標識したプローブのレポーター蛍光標識部分が切断され、レポーター蛍光が遊離する。本発明において、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、好適にはＴａｑＤＮＡポリメラーゼが例示できるが、これに限定されるものではない。本方法においては、次いで、遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、該レポーター蛍光の発光を対照と比較する。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む３’側塩基配列と相補的な配列、および全く無関係な配列を合わせたプローブを合成する（工程（ｂ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から５’末端側が相補的なプローブを合成する（工程（ｃ））。次いで、工程（ｃ）で合成したプローブと工程（ａ）で調製したＤＮＡとハイブリダイズさせる（工程（ｄ））。次いで、工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、工程（ｂ）で合成したプローブの一部を遊離させる（工程（ｅ））。本発明において、一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えば下記のｃｌｅａｖａｓｅが例示できる。本方法においては、次いで、工程（ｅ）で遊離したプローブと、検出用プローブとをハイブリダイズさせる（工程（ｆ））。次いで、工程（ｆ）でハイブリダイズしたＤＮＡを酵素的に切断し、その際に発生する蛍光の強度を測定する（工程（ｇ））。次いで、工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する（工程（ｈ））。
上記方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）１０：３３０−３４３）等が挙げられる。具体的には、まず、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から３’側が鋳型と相補的な配列であり、５’側が鋳型配列と無関係な配列（フラップ）を有するプローブ（プローブＡ）を合成する。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から５’側が鋳型と相補的な配列を有するプローブ（プローブＢ）を合成する。プローブＢにおいては、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位に対応する塩基は任意でよい。次いで、これらプローブを調製した鋳型ＤＮＡにハイブリダイズさせる。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位に対応するプローブＢの塩基が侵入することで、５’末端がフラップ状になっている部分を認識して、該部位に対応するプローブＡの塩基の３’側を切断するエンドヌクレアーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）を用いてハイブリダイズしたＤＮＡを切断する。これにより、フラップ部分が遊離する。次いで、遊離したフラップ部分と検出用プローブをハイブリダイズさせる。該検出用プローブは、一般的にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）プローブとよばれる。該プローブにおいて、５’側は自身で相補的に結合できる。また、３’側はフラップと相補的な配列を有している。また、自身で相補的に結合できる５’側において、５’末端にはレポーター蛍光が標識され、該５’末端の３’側にはクエンチャー蛍光が標識されている。遊離したフラップの３’末端の塩基が、ＦＲＥＴプローブにハイブリダイズする結果、該プローブのレポーター蛍光が標識された相補結合部位に侵入することで、ｃｌｅａｖａｓｅが認識する構造が生成される。本方法においては、ｃｌｅａｖａｓｅによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する（工程（ｂ））。次いで、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる（工程（ｃ））。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する（工程（ｄ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する（工程（ｅ））。次いで、工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する（工程（ｆ））。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）１０：１０３−１１０）等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する（工程（ｂ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する（工程（ｃ））。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う（工程（ｄ））。次いで、蛍光の偏光度を測定する（工程（ｅ））。次いで、工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する（工程（ｆ））。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｗｏｋ，Ｐ．Ｙ．１９９９，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，９，４９２−９８．）等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する（工程（ｂ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する（工程（ｃ））。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う（工程（ｄ））。次いで、シーケンサーを利用して、工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する（工程（ｅ））。次いで、工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する（工程（ｆ））。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰｅ法（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２０００）１４：９５０−９５９）等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する（工程（ｂ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の１塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する（工程（ｃ））。次いで、工程（ｃ）で合成したプライマーが固定された基板を提供する（工程（ｄ））。次いで、工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｄ）の基板を接触させる（工程（ｅ））。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｄ）で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う（工程（ｆ））、次いで、スキャナーを用いて、工程（ｆ）で反応に使われた塩基種を判定する（工程（ｇ））。このような方法としては、Ａｒｒａｙｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＡＰＥＸ）法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４８：２０５１−２０５４）などが挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する（工程（ｂ））。次いで、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを質量分析器にかけ、分子量を測定する（工程（ｃ））。次いで、工程（ｃ）で測定した分子量を対照と比較する（工程（ｄ））。このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０００）：１８：７７−８４）等が挙げられる。
さらに別の方法においては、まず、被検植物体からＤＮＡを調製する（工程（ａ））。次いで、ｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡを増幅する（工程（ｂ））。次いで、ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する（工程（ｃ））。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレンを使用することができる。
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡと特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
本方法においては、次いで、工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｃ）の基板を接触させる（工程（ｄ））。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
本方法においては、次いで、該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する（工程（ｅ））。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、次いで、工程（ｅ）で検出された強度を対照と比較する（工程（ｆ））。
このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２：１６４−１６７）等が挙げられる。
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
本発明においては、上記の遺伝子型判定方法により多型が検出された場合に、植物が半わい性形質を有するものと判定される。本発明は、このような植物の半わい性形質の検査方法も提供する。
また、本発明は、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのＰＣＲプライマーであって、該領域に存在する、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドを提供する。
このようなオリゴヌクレオチドとしては、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を挟むように設計されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＰＣＲプライマーの設計および合成については、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。また、ＰＣＲプライマーの長さは、特に制限はないが、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。
さらに本発明は、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域に存在する、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域とハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有する、ｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのオリゴヌクレオチドを提供する。本発明においては、該オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。
該オリゴヌクレオチドは、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、上記の（Ａ）〜（Ｖ）のいずれかに記載の部位、または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含むＤＮＡ領域に対し、完全に相補的である必要はない。該オリゴヌクレオチドの長さは、１５ヌクレオチド以上であれば、特に制限はない。該オリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。また、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
また、該オリゴヌクレオチドは、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬として使用することができる。さらに、植物の半わい性形質検査用試薬としても使用することができる。本発明においては、このような植物のｓｄ−１遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬または植物の半わい性形質検査用試薬を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ｓｄ−１遺伝子周辺の多型の同定
本発明者らは、ササニシキ（正常な草丈をもつ日本型イネ品種）・ハバタキ（ｓｄ−１に起因する半わい性の草丈をもつインド型イネ品種）の交配後代集団を用いたポジショナルクローニングにより、イネの半わい性遺伝子ｓｄ−１の単離・同定を試みた。その結果、ｓｄ−１遺伝子は、ジベレリン−２０−オキシダーゼ（ＧＡ２０−ｏｘ）をコードしている遺伝子であることが判明した（Ｍｏｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）９：１１−１７）。ＧＡ２０−ｏｘとは、ジベレリン（ＧＡ）の生合成経路においてＣ−２０位の酸化とそれに続く脱離を触媒する酵素であり、活性型ＧＡ合成の最終段階を触媒するＧＡ３β−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡ３ｏｘ）に基質を供給する酵素である（Ｈｅｄｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ａ．Ｌ．２０００，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｒｅｖｉｅｗ），５（１２），５２３−５３０．）。すでに、アラビドプシス（Ｃｏｌｅｓ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ａ．Ｌ．，Ｃｒｏｋｅｒ，Ｊ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｌｅｐｅ，Ｒ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｅｄｄｅｎ，Ｐ．１９９９，Ｍｏｄｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｂｙ  ｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ２０−ｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１７（５），５４７−５５６．）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｄｕｌｃａｍａｒａ（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｉ．Ｓ．Ｗａｒｄ，Ｄ．Ａ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｗａｒｆｉｓｍ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｄｕｌｃａｍａｒａ  ｂｙ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ２０−ｏｘｉｄａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｕｍｐｋｉｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２３（３），３２９−３３８．）、ジャガイモ（Ｃａｒｒｅｒａ，Ｅ．，Ｂｏｕ，Ｊ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｐｒａｔ，Ｓ．２０００，Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ＧＡ  ２０−ｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｓｔｅｍ  ｌｅｎｇｔｈ，ｔｕｂｅｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｂｅｒ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２２（３），２４７−２５６．）、およびレタス（Ｎｉｋｉ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ，Ｔ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｗａｒｆ  ｌｅｔｔｕｃｅ  ｂｙ  ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｐｕｍｐｋｉｎ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ２０−ｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４２（７），６９４−７０２．）において、ＧＡ２０−ｏｘ遺伝子のアンチセンス導入または過剰発現によって半わい性植物を作出することに成功したという報告がなされている。従って、イネのｓｄ−１座に存在するＧＡ２０���ｏｘ遺伝子およびその変異型遺伝子は、収量が低いが商品価値の高い既存の品種への高収量性付与に、直接利用することができると考えられる。
本発明者らは、ｓｄ−１遺伝子を単離・同定する過程で、イネ第１染色体上のｓｄ−１周辺部分に、ササニシキ・ハバタキ間での一塩基置換多型を含む多型を多数見出した。具体的には、下記のようにして行った。
イネ品種ササニシキおよびハバタキを圃場または温室で栽培し、ＣＴＡＢ法または簡易抽出法によりＤＮＡを抽出した。Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）上で公開されているイネゲノムシーケンス情報、およびＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）に登録されているシーケンスデータを利用し、プライマー設計支援サイトＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）で、ゲノムＤＮＡから適当な長さの断片を増幅するプライマーを設計した。具体的には、ＤＤＢＪのアクセッションナンバーＡＣ０９０９７４で登録されているイネゲノムＤＮＡ塩基配列（ＯＳＪＮＢａ００２９ｆ０２、１３９０４３ｂｐ）、ＡＰ００３４０５で登録されているイネゲノム塩基配列（Ｂ１０２７Ｂ０４、１６８０３３ｂｐ）、ＡＵ０５８０８２で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｅ３０８６７、ＡＵ１０１３５８で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｅ１１７６４、ＡＵ０９５３７４で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｅ６１５７８、Ｄ２５４６１で登録されているイネゲノムＤＮＡ塩基配列Ｌ５４３、Ｄ４７６７５、ＡＵ０８９７３０で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｓ１３３１２、Ｄ４６２７７で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｓ１０８４６、ＡＵ０８９６９５、ＡＵ０８９６９６で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｃ１４３９、ＡＵ１０１３３７で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｅ１１０５５、Ｄ４７７８４で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｓ１３４７１、Ｃ２２３７９、Ｃ２２３８０で登録されているイネｃＤＮＡ塩基配列Ｃ１２７４０をもとに、５００〜１０００ｂｐを増幅するＰＣＲプライマーを多数設定した。設計したプライマーを用いて、ササニシキおよびハバタキのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ増幅を行った。反応液の一部を用いてアガロースゲル電気泳動を行い増幅断片を確認した後、残りの反応液をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ）処理して未反応のプライマーとｄＮＴＰを取り除き、シークエンス反応の鋳型を作成した。
この鋳型に対して、最初の増幅に用いたプライマーの片方をシーケンス用プライマーとして再度添加し、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＭｅｇａＢＡＣＥ（アマシャムバイオサイエンス）を用いてサイクルシークエンス反応を行い、シークエンス用サンプルを作成した。シーケンスは、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（アマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。得られたシーケンスデータをハバタキ・ササニシキで比較し、一塩基置換多型を含む多型を検索した。同一品種、同一プライマー対に対し少なくとも４回のシーケンスを行い、確実であるもののみを多型と判定した。得られた多型のいくつかについて、ＣＡＰＳまたはｄＣＡＰＳ法でジェノタイピングが可能となるようマーカー化を行った（図１および２）。表１に、本発明により見出されたＳＮＰ部位を利用したＰＣＲマーカー、ＣＡＰＳマーカー、ｄＣＡＰＳマーカー、およびＳＮＰマーカー（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｗｏｋ，Ｐ．Ｙ．１９９９，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，９，４９２−９８．）に使用するためのマーカー）の一覧を示す。
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表１は、左から、マーカー名（図１および図２に位置を示す）、利用したＳＮＰ部位、プライマー配列、増幅断片長、制限酵素（ＣＡＰＳ、ｄＣＡＰＳの場合のみ）、および多型の出方を示す。なお、Ｈはハバタキ、Ｓはササニシキを示す。
［実施例２］  半わい性形質とｓｄ−１遺伝子周辺の多型の関連
本発明によるＤＮＡマーカー（表１）を用いて、ササニシキに半わい性形質を導入するモデル実験を行った。ササニシキは、やや高い草丈を持つ日本型イネ品種であり、正常型Ｓｄ−１遺伝子を持っている。従って、このササニシキにｓｄ−１を導入すれば半わい性形質を付与することが可能であると予想された。
まず、ササニシキとｓｄ−１を持つ半わい性品種ＩＲ２４を交配し、Ｆ１を得た。さらに、このＦ１にササニシキを交配しＢＣ１Ｆ１世代を得た。ＢＣ１Ｆ１は、理論上染色体全領域の２分の１がササニシキホモ型であり、２分の１がササニシキとＩＲ２４のヘテロ型になっている。このＢＣ１Ｆ１個体群の中から、ＣＡＰＳマーカーＳ１０８４６およびｄＣＡＰＳマーカーＳ１３３１２を用いて、ｓｄ−１を含む両マーカー間がヘテロ型になっている個体を選抜し、さらにササニシキとの交配（戻し交配）を行い、ＢＣ２Ｆ１世代を得た（ヘテロの領域は全染色体の４分の１である）。なお、両マーカー間で起こる組換えを考慮して、ｓｄ−１遺伝子近傍に設定したマーカーｂおよびｉを用いて、確実にｓｄ−１領域がヘテロであることの確認も行った。同様にしてｓｄ−１領域がヘテロである個体を選抜し、さらにササニシキとの交配を重ねた。ＢＣ１Ｆ１からＢＣ２Ｆ１→ＢＣ３Ｆ１→ＢＣ４Ｆ１と戻し交配を繰り返すごとに、ＩＲ２４の持つ特徴的な形質は失われ、ササニシキに近い形質を持った個体群となった。これは、Ｓ１０８４６／Ｓ１３３１２のマーカー間の染色体領域がササニシキとＩＲ２４のヘテロ型に維持されたまま、他の染色体領域がササニシキのホモ型に徐々に置換されていっているためであると推測された。ＢＣ５Ｆ１世代ではＩＲ２４の染色体をヘテロで有する領域は理論上全体の３２分の１となり、遺伝的背景はほとんどササニシキと同一で、かつ目的の染色体領域のみにＩＲ２４型の染色体が導入された準同質遺伝子系統に近い系統が得られていると推測された。実際、ＢＣ５Ｆ１の自殖種子を展開栽培したところ、草型以外ササニシキと区別のつかない個体群が得られた。
これらの個体から、幼苗期のうちにゲノムＤＮＡを抽出し、マーカーｅでｓｄ−１（Ｓｄ−１）領域における遺伝子型を決定したところ、ｓｄ−１／ｓｄ−１ホモ、ｓｄ−１／Ｓｄ−１ヘテロ、Ｓｄ−１／Ｓｄ−１ホモの３つに分類された。そして、各個体を出穂・登熟するまで育成を続けてかん長を測定したところ、ｓｄ−１／ｓｄ−１ホモとなっている個体群ではササニシキに比べて明らかに平均かん長が短縮していることが明らかとなった。よって、上記に示したように、本発明によるマーカーを用いた選抜・交配を繰り返すことで、ｓｄ−１由来の半わい性形質を獲得した限りなくササニシキに近い品種が育成できることが確認された。
さらに、得られた個体の中で、ｓｄ−１遺伝子周辺の出来るだけ狭い領域のみがＩＲ２４ホモ型であり、その他の領域がササニシキホモ型に置換されている個体（系統）を選抜するために、本発明のマーカーを用いてｓｄ−１周辺の遺伝子型を調査した。その結果、表２に示すような遺伝子型を有する個体が１個体得られた（この個体を仮にＰＧＣササニシキとする）。
この結果より、本発明のマーカーを用いることにより、ｓｄ−１遺伝子のみを含む非常に限定された染色体領域のみがＩＲ２４型である個体を選抜することが可能であることが示された。これは、目的形質の非常に近傍に位置する遺伝子に起因する望ましくない形質が、強い連鎖のために戻し交配を繰り返しても取り除くことができない現象（いわゆる「連鎖のひきずり」）を防ぐために非常に有効である。
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ＰＧＣササニシキの育成にあたっては、ｓｄ−１周辺の遺伝子型をモニタリングしながら世代を進めたが、染色体の他の部分についてＩＲ２４の染色体領域がどの程度残っているのかが不明である。そこで、他の染色体領域にほぼ均等に設定された１００箇所のＳＮＰマーカーを用いてＰＧＣササニシキのグラフィカルジェノタイプを確認した結果、ＰＧＣササニシキは検査した全てのＳＮＰ位置においてササニシキホモ型の染色体を有することが確認された。すなわち、ＰＧＣササニシキは、ｓｄ−１遺伝子を含む非常に限定された染色体領域のみがＩＲ２４型であり、その他の染色体領域はササニシキ由来のものである、言い換えれば、ササニシキに半わい性遺伝子のみを導入した品種である。
ササニシキのように草丈が高く倒伏に弱い優良品種に半わい性形質を導入するためには、ＩＲ２４のような半わい性の系統と交配し、戻し交配を繰り返し、得られた個体を自殖して得られた種子から莫大な数の植物体を育成し、半わい性であってかつササニシキ並の品質・食味を有するものを選抜するという、多大な労力と長い期間を要する作業が必要であった。最近の研究成果により、半わい性遺伝子ｓｄ−１が単離同定され、半わい性はジベレリン合成系の酵素であるＧＡ２０オキシダーゼの機能欠損に起因することがわかったことから、原品種のもつＳｄ−１遺伝子をアンチセンス遺伝子の導入により機能阻害する方法も可能である。しかし、アンチセンス導入では、内性遺伝子を完全に破壊することはできないため、将来も機能阻害効果が続くことは保証できない。また遺伝子組換植物を食用に栽培することに対する農家や消費者の反発は大きく、品種として受け入れられる可能性が低いため、現在のところ現実的な方法とはいえない。
それに対して、本発明の方法を用いて半わい性品種を育成する方法は、交配・戻し交配を基盤としつつ、必要な個体のみを選抜しながら育成を進めることができるため、科学的根拠に基づいた、無駄なく迅速な半わい性品種育種の手段を提供する。さらに、遺伝子組換えの手法を用いることなく、それと同等以上の効力をもつ品種を育成できるという優位性がある。
［実施例３］  主要イネ品種でのＤＮＡマーカーの有用性検定
実施例１において作成した各種ＤＮＡマーカーは、マーカー作成に用いたハバタキおよびササニシキ以外のイネ品種においても広く利用することが可能であると推測された。そこで、日本国での主要イネ品種に対して、本発明のＤＮＡマーカーの有用性を確認する実験を行った。
用いた品種は以下の２３品種である。日本晴、ハツシモ、むつほまれ、ゆきの精、きらら３９７、つがるロマン、五百万石、森のくまさん、ゆめあかり、ハナエチゼン、コシヒカリ、月の光、あきたこまち、朝の光、あいちのかおり、祭り晴、ヒノヒカリ、夢つくし、ひとめぼれ、まなむすめ、ふさおとめ、どんとこい、キヌヒカリ。
各品種の幼苗から簡易抽出法でゲノムＤＮＡを抽出・精製し、ゲノミックＰＣＲの鋳型に供した。具体的には、ゲノムＤＮＡ溶液を４０ｎｇ／μｌになるように滅菌ミリＱ水で調整し、それを２０μｌのＰＣＲ溶液に１μｌ添加して、ＰＣＲを行った。各マーカーのＰＣＲに用いた条件を表３に示す。
ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを用いた場合の条件を以下に示す。
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表３中、＊１は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄがアプライドバイオシステムズ社、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑがＱＩＡＧＥＮ社の製品であることを示す。＊２は、ＰＣＲの温度条件が上記の条件を基本とし、サイクル条件、サイクル数がマーカーにより異なることを示す。＊３は、ＳＮＰ  ｐｒｉｍｅｒを用いた反応が、製造業者推奨の製品プロトコールに従ったものであることを示す。上記の条件はＭＪリサーチ社製のＰＴＣ−２２５  ＴＥＴＲＡＤおよびアプライドバイオシステムズ社製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００のサーマルサイクラーで至適化したものである。
ＰＣＲ後のサンプルを各々５μｌ分取し、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動を行い増幅産物の有無を確認した。優性マーカーに関しては、この時点で適当な濃度のゲルを用いて電気泳動を行い、多型の検出を試みた。ＣＡＰＳおよびｄＣＡＰＳマーカーは、サンプル１０〜１３μｌを表１に示した制限酵素で一晩処理した後、適当な濃度のアガロースゲルあるいはＮｕｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロースゲル（ＢＭＡ社）を用いて電気泳動を行って多型を検出した。ＳＮＰマーカーｊについては、パーキンエルマー社のアシクロプライムＦＰキットを用い、添付のプロトコールに従って反応および検出を行った。
その結果、マーカーｈにおける一部の品種を除き、すべてのマーカーにおいてハバタキ／ササニシキ間で得られる多型と同様なバンドパターンによる多型が検出された（表４）。ほとんどの品種はササニシキ型の遺伝子型と判定されたが、夢つくし、どんとこい、キヌヒカリにおいてはマーカーＳ１０８４６以外でハバタキ型の判定結果となった。これは、夢つくし、どんとこいは親系統にキヌヒカリが使われていることから、キヌヒカリに導入されたｓｄ−１を受け継いでいるためと考えられた。以上の結果から、本発明によるＤＮＡマーカーはハバタキ／ササニシキを含む多くのイネ品種におけるｓｄ−１（Ｓｄ−１）遺伝子およびその遺伝子周辺領域の遺伝子型判定においても利用可能であることが確認された。表４に主要品種で見られる多型について示す。
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表４中、「Ｈ」はハバタキ型、「Ｓ」はササニシキ型の判定結果を示し、ＮＤは増幅産物が得られなかったことを示す。
産業上の利用の可能性
一塩基置換多型（ＳＮＰｓ）を含む、ＤＮＡ上の塩基配列の差異は、さまざまなＳＮＰｓ判定法のみならず、ＲＦＬＰ法、ＣＡＰＳ法など既存の分子遺伝学的手法を用いた遺伝型判定法に利用可能である。半わい性遺伝子ｓｄ−１周辺に、正常型品種と半わい性品種との間に見出された塩基配列上の差異は、半わい性形質を有する新品種育成の過程で、交配により生じた雑種個体が半わい性形質を支配する遺伝子を含む染色体断片をどの程度の範囲で有するか、およびその染色体断片がヘテロであるのかホモであるのか、を調べる目的に有用である。通常、半わい性の検定は、イネが出穂・登熟し、穂が垂れた段階でかん長（根元から穂首までの長さ）を計測する必要があるが、ＳＮＰｓを含む多型を用いたジェノタイピングでは、個体が幼苗のうちにＤＮＡを採取して検査が可能であるため、時間が節約でき、不要な個体の栽培にかかる面積と労力を削減できる。また、かん長測定では困難であるヘテロ型の判定が、当代個体で可能であるという利点もある。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、イネ半わい性遺伝子ｓｄ−１近傍領域の遺伝地図（概略）を示す図である。縦線は第１染色体の一部を示す。横線は設定されたマーカーの位置を示す。数字は連鎖距離（単位はセンチモルガン）を示す。矢印でｓｄ−１遺伝子の位置を示す。
図２は、イネ半わい性遺伝子ｓｄ−１近傍領域の遺伝地図（詳細）および物理地図を示す図である。横線は第１染色体の一部を示す。縦線、および矢印は設定されたマーカーの位置を示す。図ａおよびｃにおいて横線の下に表示される数字は、ｎで示される個体数の分離集団より見出された、各インターバル内で組換えを生じた個体数を示す。図ｄはｓｄ−１遺伝子の同定に用いた組換え個体の遺伝子型、かん長により判定したｓｄ−１遺伝子のジェノタイプ、およびｓｄ−１遺伝子の候補領域内に予測された遺伝子とその位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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