(57)【要約】作業者が自ら実行することが困難な作業を作業者の指示に従って実行して多目的な単一細胞操作作業を支援する単一細胞操作支援ロボットである。このロボットは、顕微鏡１と、その顕微鏡１のステージ１ａ上にそれぞれ設けられた細胞収納用マルチマイクロウェル４および単一細胞刺激装置５と、単一細胞に試料を注入するキャピラリー６をマルチマイクロウェル４に対して相対移動させる試料注入移動装置７およびオートステージ２と、単一細胞を保持するキャピラリー８をマルチマイクロウェル４と単一細胞刺激装置５とキャピラリー６とのそれぞれに対し相対移動させる細胞移動装置９と、顕微鏡１に組み合わされた顕微分光計測装置１０と、顕微鏡１と試料注入移動装置７と細胞移動装置９とオートステージ２と単一細胞刺激装置５と顕微分光計測装置１０との内の少なくとも一つの作動を自動制御するコンピューター１１，１２と、作業者による操作に基づきコンピューター１１，１２に信号を入力して上記顕微鏡１等を作動させるマニュアル操作装置１７とを具えてなる。
2004015055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡と、
前記顕微鏡のステージ上にそれぞれ設けられた細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置と、
単一細胞に試料を注入する試料注入手段を前記細胞収納用マイクロウェルに対して相対移動させる試料注入移動手段と、
単一細胞を保持する細胞保持手段を前記細胞収納用マイクロウェルと前記単一細胞刺激装置と前記試料注入手段とのそれぞれに対し相対移動させる細胞移動手段と、
前記顕微鏡に組み合わされた単一細胞計測装置と、
前記顕微鏡と前記試料注入移動手段と前記細胞移動手段と前記単一細胞刺激装置と前記単一細胞計測装置との内の少なくとも一つの作動をあらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御する少なくとも一つのコンピューターと、
作業者による操作に基づき前記コンピューターに信号を入力して前記顕微鏡と前記試料注入移動手段と前記細胞移動手段と前記単一細胞刺激装置と前記単一細胞計測装置との内の少なくとも一つを前記操作に対応させて作動させるマニュアル操作手段と、
を具えてなる、単一細胞操作支援ロボット。
【請求項２】
前記細胞収納用マイクロウェルは、１個の単一細胞に対する専用ウェルとしてそれぞれ使用し得る複数のウェルが所定配置で並べて配置されているマルチマイクロウェルであることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の単一細胞操作支援ロボット。
【請求項３】
前記試料注入移動手段は、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の単一細胞操作支援ロボット。
【請求項４】
前記試料注入移動手段は、前記試料注入手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の単一細胞操作支援ロボット。
【請求項５】
前記細胞移動手段は、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の単一細胞操作支援ロボット。
【請求項６】
前記細胞移動手段は、前記細胞保持手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の単一細胞操作支援ロボット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この発明は、動植物細胞の単一細胞（直径が十数μｍ以上）を１個ずつ操作する作業を支援するロボットに関するものである。
【背景技術】  従来、顕微鏡ステージ上での、単一細胞の保持、移動および配置、細胞内への遺伝子や薬剤等種々の試料のインジェクション、細胞への刺激（電気的、熱、機械的、電気化学的）の印加、そして細胞応答および細胞分子動態の計測からなる一連の操作の中の多くは、繊細で熟練を要し、作業者が自ら実行することが困難な作業であった。また従来は、多くの単一細胞を個々に識別して扱うことが困難であったため、単一細胞を集団として操作するか、あるいは１個ずつ操作しても各操作の後は単一細胞を個々に識別せず集団として扱わざるをえなかった。
それゆえこの発明は、作業者が自ら実行することが困難な作業を作業者の指示に従って実行することによって多目的な単一細胞操作作業を支援するロボットを提供することを目的とする。またこの発明は、多くの単一細胞をナンバリングして識別可能にするロボットを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記目的を達成する、この発明の単一細胞操作支援ロボットは、顕微鏡と、前記顕微鏡のステージ上にそれぞれ設けられた細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置と、単一細胞に試料を注入する試料注入手段を前記細胞収納用マイクロウェルに対して相対移動させる試料注入移動手段と、単一細胞を保持する細胞保持手段を前記細胞収納用マイクロウェルと前記単一細胞刺激装置と前記試料注入手段とのそれぞれに対し相対移動させる細胞移動手段と、前記顕微鏡に組み合わされた単一細胞計測装置と、前記顕微鏡と前記試料注入移動手段と前記細胞移動手段と前記単一細胞刺激装置と前記単一細胞計測装置との内の少なくとも一つの作動をあらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御する少なくとも一つのコンピューターと、作業者による操作に基づき前記コンピューターに信号を入力して前記顕微鏡と前記試料注入移動手段と前記細胞移動手段と前記単一細胞刺激装置と前記単一細胞計測装置との内の少なくとも一つを前記操作に対応させて作動させるマニュアル操作手段と、を具えてなるものである。
かかる単一細胞操作支援ロボットにあっては、顕微鏡と、単一細胞に試料を注入する試料注入手段を顕微鏡のステージ上に設けられた細胞収納用マイクロウェルに対して相対移動させる試料注入移動手段と、単一細胞を保持する細胞保持手段を顕微鏡のステージ上にそれぞれ設けられた細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置と試料注入手段とのそれぞれに対し相対移動させる細胞移動手段と、単一細胞刺激装置と、顕微分光計測装置等の単一細胞計測装置との内の少なくとも一つの作動を、少なくとも一つのコンピュータが、あらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御するとともに、それら顕微鏡と試料注入移動手段と細胞移動手段と単一細胞刺激装置と単一細胞計測装置との内の少なくとも一つを、マニュアル操作手段がコンピューターに信号を入力して作動させる。
従って、この発明の単一細胞操作支援ロボットによれば、高い位置精度と迅速な移動とが要求される、単一細胞の保持・移動や、単一細胞に近接する位置への試料注入手段の移動や、それらの作業の間の顕微鏡の倍率変更や、単一細胞の刺激や、その後の、顕微分光計測装置等の単一細胞計測装置による計測を自動的に行うことができるので、所要に応じてそれらの操作の一部または全てを自動化し得て、作業者の負担を大幅に削減することができ、これにより作業者は、特に注意を要する単一細胞内への試料の注入や計測結果の分析判断等の作業に専念することができる。
なお、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記細胞収納用マイクロウェルが、１個の単一細胞に対する専用ウェルとしてそれぞれ使用し得る複数のウェルが所定配置で並べて配置されているマルチマイクロウェルであると好ましい。一連の細胞操作を通じて複数のウェルをそれぞれ１個の単一細胞に対する専用ウェルとして使用でき、しかも複数のウェルが所定配置で並べて配置されているので、複数の単一細胞をそれらを収納するウェルの位置に基づきナンバリングして識別し得て、より条件設定の細かい細胞操作を行い得るからである。
また、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記試料注入移動手段が、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有していると好ましい。試料注入手段側の移動範囲を狭め得て、細胞移動手段との干渉を容易に防止し得るからである。
さらに、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記試料注入移動手段が、前記試料注入手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有していると好ましい。より細かい注入操作ができるからである。
さらに、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記細胞移動手段が、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有していると好ましい。細胞保持手段側の移動範囲を狭め得て、試料注入移動手段との干渉を容易に防止し得るからである。そして、そのオートステージは前記試料注入移動手段と共用すると、移動のための機構を簡略化し得て、スペース効率上および製作コスト上、より好ましい。
そして、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記細胞移動手段が、前記細胞保持手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有していると好ましい。より細かい移動操作ができるからである。
【図面の簡単な説明】  図１は、この発明の単一細胞操作支援ロボットの一実施例を模式的に示す構成図である。図２は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した遺伝子発現実験に用いたプラスミドを示す説明図である。図３は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した遺伝子発現実験における遺伝子注入の操作を示す説明図である。図４は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した遺伝子発現実験におけるＣａ２＋注入の操作を示す説明図である。図５は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した遺伝子発現実験における顕微蛍光計測の方法を示す説明図である。図６は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した他の遺伝子発現実験における遺伝子注入の操作を示す説明図である。図７は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した上記他の遺伝子発現実験における電気的刺激印加の操作を示す説明図である。図８は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットにおける単一細胞刺激装置の構成を示す説明図である。そして図９は、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した上記他の遺伝子発現実験における電気的刺激印加後の操作を示す説明図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、この発明の実施の形態を実施例によって、図面に基づき詳細に説明する。ここに、図１は、この発明の単一細胞操作支援ロボットの一実施例を示す構成図であり、この実施例の単一細胞操作支援ロボットは、図示のように、顕微鏡１と、その顕微鏡１のステージ１ａ上に設けられたオートステージ２上に固定された培養ディッシュ３内にそれぞれ設けられた細胞収納用マイクロウェルとしての細胞収納用マルチマイクロウェル４および単一細胞刺激装置５と、単一細胞に試料を注入する試料注入手段としてのガラスキャピラリー６を細胞収納用マルチマイクロウェル４に対して相対移動させる試料注入移動手段を構成する試料注入移動装置７と、単一細胞を保持する細胞保持手段としてのもう一つのガラスキャピラリー８を細胞収納用マルチマイクロウェル４と単一細胞刺激装置５と先のガラスキャピラリー６とのそれぞれに対し相対移動させる細胞移動手段を構成する細胞移動装置９と、顕微鏡１に組み合わされた単一細胞計測装置としての顕微分光計測装置１０と、これも試料注入移動手段と細胞移動手段とに共用されてそれらを構成する上記オートステージ２と、を具えている。
さらに、この実施例の単一細胞操作支援ロボットは、顕微鏡１と顕微分光計測装置１０との内の少なくとも一つの作動をあらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御するパーソナルコンピューター（ＰＣ）１１と、単一細胞刺激装置５と試料注入移動装置７と細胞移動装置９とオートステージ２との内の少なくとも一つの作動をあらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御するもう一つのパーソナルコンピューター（ＰＣ）１２と、作業者による操作に基づきＰＣ１１，１２に信号を入力して顕微鏡１と単一細胞刺激装置５と試料注入移動装置７と細胞移動装置９と顕微分光計測装置１０とオートステージ２との内の少なくとも一つを上記操作に対応させて作動させるマニュアル操作手段としての、二つのジョイスティック型コントローラー１３，１４およびキーボード１５とインターフェース１６とを有するマニュアル操作装置１７と、を具えている。なお、作業者Ｐは、顕微鏡１を覗きながらあるいは顕微鏡像のモニター画像を見ながら、ジョイスティック型コントローラー１３，１４を操作することで、オートステージ２、試料注入移動装置７および細胞移動装置９の作動を制御することができる。そしてＰＣ１１，１２は、インターフェース１６を介した上記各要素の監視、自動制御およびマニュアル制御、計測データの記録および画像処理等に必要な演算や解析を行う。
この実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、顕微鏡１には、オリンパス光学工業株式会社製の、落射蛍光装置（励起光照射装置）付きの倒立型蛍光顕微鏡ＩＭＴ−２を用いる。また、オートステージ２は、中央精機株式会社製の通常の２軸直交座標型移動テーブル（２軸電動制御）からなる。さらに、試料注入移動装置７は、エッペンドルフ社製の３自由度マニピュレーター（ｘ，ｙ，ｚ軸、ｘｙ平面からの角度θの内の３自由度を電動制御）で株式会社ナリシゲ製の１軸直線作動型マイクロマニピュレーター（手動操作油圧作動式）を支持し、その１軸直線作動型マニピュレーターで通常のインジェクションホルダーを支持してなり、単一細胞に試料を注入するガラスキャピラリー６は、そのインジェクションホルダーに取り付けて４自由度で移動可能としている。
またこの実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、細胞移動装置９は、通常の３軸直交座標型マニピュレーターで１軸直線作動型マニピュレーターを支持し、その１軸直線作動型マニピュレーターで通常のインジェクションホルダーを支持してなり、単一細胞を保持するもう一つのガラスキャピラリー８は、そのインジェクションホルダーに取り付けて４自由度で移動可能としている。
さらにこの実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、細胞収納用マルチマイクロウェル４は、顕微鏡視野内において、ウェル内溶液中への細胞１個の収納、ウェル内での刺激印加の操作、細胞の光学的・電気的・電気化学的・物理的測定、ウェルから他の場所への移送等を行うため、塩化ビニル板の表面に単一細胞の収納用の直径約１００μｍの窪みであるウェル４ａを所定の２箇所に所定間隔で縦５個×横１０個ずつ合計１００個並べて形成したマルチマイクロウェルであり、また単一細胞刺激装置５は、細胞収納用マルチマイクロウェルから取り出した細胞に、顕微鏡視野内の他所で、電気的・熱的・機械的あるいは化学的刺激を印加する微小デバイスであり、図１に示す例では、細胞に電気的刺激を印加するために、図８に示すように２枚のＰｔ（プラチナ）板電極５ａをそれぞれアクリル板５ｂと透析膜５ｃとで挟み、各Ｐｔ板電極５ａにＰｔリード線５ｄを設けてなるものである。なお、ここでは試料注入移動装置７も、細胞収納用マルチマイクロウェル内に挿入されて細胞に電気的，熱的，機械的または化学的刺激を印加する微小デバイスとなり、単一細胞刺激装置を構成する。
そして、この実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、顕微分光計測装置１０には、東京農工大学と株式会社ジェネシアとが共同で開発し、既に公知にした、空間解像度が１μｍ×１μｍ以上、波長分解能が４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で５ｎｍ以上、時間分解能が５秒毎に１画像記録可能、という性能を有するスペクトロイメージング装置を用いる。
次に、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した、イネ単一細胞への遺伝子導入とＣａ２＋導入刺激による遺伝子発現実験について説明する。
〔細胞の培養〕
イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の種籾を培養し、カルス化させたものを１．０ｍｍメッシュの金網で濾別して用いた。１００ｍｌフラスコに２７ｍｌの専用培地を入れ、そこで回転培養（１００ｒｐｍ、２５℃、暗所）した。一週毎に継代して培養を続け、最終の継代後、４日目の培養細胞を以下の実験に用いた。
〔プラスミドの調製（プラスミドとは環状ＤＮＡで、このリングの中に遺伝子を組み込むことができる）〕
クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社より購入したプラスミド３５Ｓ−ＧＦＰは、植物細胞の中ではいつでも遺伝子発現をさせることができる「３５Ｓ」と呼ばれるプロモーターにグリーン蛍光タンパク（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）の遺伝子を結合させたものが組み込まれている。従って、これを植物細胞に導入すれば細胞内にＧＦＰが生成し緑色の蛍光を発するようになる。
このプラスミドの３５Ｓプロモーターの部分を、イネキチナーゼ（ＣＨＩ）遺伝子のプロモーターと入れ換えたものである、図２に示す如きｐＣＨＩ−ＧＦＰを作成し、以後の実験で使用した。これを導入した細胞では、エリシター（カビの細胞壁の構成成分であるキチンの構造をもったオリゴ糖）を作用させると、元々キチナーゼ遺伝子が発現するはずであるが、キチナーゼの代わりにＧＦＰの遺伝子が組み込まれているので、「キチナーゼ遺伝子発現」の情報が「ＧＦＰ」の生成によって可視化できる。これを顕微蛍光計測する。
〔イネプロトプラストの調製〕
植え継ぎ後４日のイネカルスを用いてプロトプラストを調製した。即ち、カルス懸濁液から上清を除去した後、洗い液（０．４Ｍマンニトール溶液）を加え洗浄した。これに、酵素液１０ｍｌを加え、３０℃、３０ｒｐｍ、暗所で一時間振とうし、引き続き２時間、３０℃で静置培養した。培養後、プロトプラストは、４０μｍφのナイロンメッシュを通して、５０ｍｌ遠心管に回収した。次に、遠心管を再度、１０００ｒｐｍで６０秒遠心し、プロトプラストを沈殿させた。上清の酵素液を除去した後、プロトプラスト用培地を５ｍｌ加えてプロトプラストを懸濁させた。プロトプラストとは細胞壁を除去した細胞であるが、以下では単に「細胞」と表記することとする。
なお、上記洗い液と酵素液の組成は次の通りである。
ａ．洗い液（０．４Ｍマンニトール溶液）
マンニトール                ３６．４３ｇ
蒸留水                      ５００ｍｌ
ｂ．酵素液（ｐＨ５．６）
ペクトリアーゼ  Ｙ−２３    ０．０５ｇ
セルラーゼ  オノズカ  ＲＳ  ２．０ｇ
ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ        ０．２３ｍｌ
Ｋデキストランサルフェート  ０．１ｇ
マンニトール                ９．０ｇ
蒸留水                      ２００ｍｌ
〔細胞の保持および移動に用いるガラスキャピラリー６の作製〕
一本型ガラスキャピラリー（直径１ｍｍ）（ＧＤ−１、株式会社ナリシゲ製）をエタノールで洗浄し、３時間乾熱機で滅菌した。これを二段引きプラー（ＰＰ８３、株式会社ナリシゲ製）で引き、さらにマイクロフォージ（ＭＦ−８３、株式会社ナリシゲ製）で先端を丸めた。最終的にキャピラリーの先端部は外径＝約５０μｍ、内径＝約２０μｍになるようにした。
〔細胞の刺入に用いるガラスキャピラリー８の作製〕
滅菌したガラスキャピラリーをレーザープラー（Ｐ−２０００、ＳＵＴＴＥＲ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ  Ｃｏ．）で引き、先端径が１μｍ以下になるようにした。
〔プラスミドのインジェクション〕
図３に示すように、先ず、１．０μｇ・μｌ−１に調整したプラスミド３５Ｓ−ＧＦＰ溶液を、細胞刺入用のガラスキャピラリー８内に注入した。このガラスキャピラリー８を前記インジェクションホルダーに保持させるとともにピコポンプに接続して、窒素ガスの圧力をかけてＧＦＰの遺伝子Ｇｅを注入できるようにした。一方、細胞保持用のガラスキャピラリー６は、もう一方の前記インジェクションホルダーに固定し、内部を純水で充填するとともにインジェクターに接続して、そのインジェクターで細胞Ｃｅを吸引保持できるようにした。
次いで、マルチマイクロウェル４を装着した培養ディッシュ３を、顕微鏡１のステージ１ａ上に載せて固定し、図３中▲１▼で示すように、ディッシュ３の底に分散された細胞（直径約２０〜３０μｍ）Ｃｅ１個を選び、これを図３中▲２▼で示すように、細胞保持用のガラスキャピラリー６で吸引保持した。この細胞Ｃｅの原形質内に試料注入移動装置７を用いて、図３中▲３▼で示すように細胞刺入用のガラスキャピラリー８を刺入し、ピコポンプでガラスキャピラリー８内に圧力をかけて遺伝子Ｇｅを細胞内部に注入した。遺伝子注入（マイクロインジェクション）を行った細胞Ｃｅは、ＰＣ１２で自動制御したオートステージ２と細胞移動装置９の各マニピュレーターとにより、図３中▲４▼，▲５▼で示すように移動させて、マルチマイクロウェル４の所定番地のウェル４ａ内に収納し、ナンバリング（番号付け）した。このようにして５０個あるいは１００個の細胞に対するマイクロインジェクション及び細胞収納操作を終了した後、図３中▲６▼で示すように、それらの細胞Ｃｅを２５℃で２４時間静置培養した。
〔Ｃａ２＋の細胞内インジェクション〕
２４時間の培養によって、細胞Ｃｅはウェルの底面に接着した。この細胞Ｃｅに試料注入移動装置７を用いて、図４に示すように、ＣａＣｌ２（１μＭ，１０μＭ，または１００μＭ）を充填した細胞刺入用のガラスキャピラリー８を刺入し、Ｃａ２＋を注入した。その後さらに２４時間２５℃で培養を続けた後、図５に示すように、顕微鏡１及び顕微分光分析装置１０を用いて細胞Ｃｅを撮影し、ＧＦＰの生成の有無を顕微蛍光計測で調べた。なお、図中符号１８はグリズム、１９はＣＣＤカメラを示す。
〔キチナーゼ遺伝子の発現測定〕
Ｃａ２＋のインジェクションによってキチナーゼ遺伝子が発現した頻度は、ＣａＣｌ２の濃度が１μＭ，１０μＭ，１００μＭのときそれぞれ、１８％（５０細胞中９個），１２％（５０細胞中６個），０％（５０細胞中０個）であった。
最後に、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した、イネ単一細胞への遺伝子導入と電気的刺激による遺伝子発現実験について説明する。なお、細胞の培養と、プラスミドの調製と、イネプロトプラストの調製と、細胞の保持および移動に用いるキャピラリー６の作製と、細胞刺入用のキャピラリー８の作製との手順は、先の実験と同様ゆえ説明を省略する。
〔プラスミドのインジェクション〕
図６に示すように、各ウェル４ａの直径が１００〜２００μｍであるマルチマイクロウェル４に細胞Ｃｅを収納する以外は、先の実験と同様である。
〔Ｆｕｒａ２の細胞内への導入〕
マルチマイクロウェル４で培養した細胞に対して、ＤＭＳＯに溶解させたＦｕｒａ２−ＡＭ（ＤＯＪＩＮＤＯ）を終濃度４μＭになるように添加し、これを３０℃、暗所、静置にて１時間取り込ませた。そして細胞外液を新鮮な培地と交換した後、以下の電気刺激実験を行った。
〔電気刺激の印加〕
図７中▲１▼で示すように、マルチマイクロウェル４内の細胞Ｃｅを、ホールド用のキャピラリー６で保持し、図７中▲２▼〜▲４▼で示すように、図８に示す如き単一細胞刺激装置５のＰｔ板電極５ａ間に移動して、図７中▲５▼で示すように静置し、Ｐｔ電極５ａ間にパルサー５ｅからアイソレーター５ｆおよびＰｔリード線５ｄを介して３０Ｖの直流パルス電圧を３０秒間印加した。この電気的刺激の印加後、図９中▲１▼〜▲５▼で示すようにして細胞Ｃｅを再び元のウェル４ａに収納し、２５℃で２４時間培養した。
〔キチナーゼ遺伝子の発現測定〕
先の実験と同様にして顕微蛍光計測で１００個の細胞を調べた結果、電気的刺激によって細胞内Ｃａ２＋濃度の一過性の上昇（２５秒程度でピークに達し、５０秒後に元のレベルにもどった）が見られた細胞が６個あった。これらの細胞は全て遺伝子も発現した。次のケースは、徐々に増大するパターン（１００秒くらいでピークに達し、その後徐々に減少したが元のレベルには戻らなかった）を示した細胞が２個認められた。この細胞でも遺伝子発現が認められた。一方、Ｃａ２＋濃度変化の見られなかった細胞では、遺伝子発現が認められなかったが、最後にエリシターを作用させたところ、遺伝子発現がみとめられたものが６個あった。以上の結果、電気的刺激によってＣａ２＋の細胞内への流入を介してキチナーゼ遺伝子発現が誘導されることが示された。
かくしてこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、高い位置精度と迅速な移動とが要求される、単一細胞Ｃｅの保持・移動や、単一細胞Ｃｅに近接する位置への細胞刺入用ガラスキャピラリー８の移動や、単一細胞Ｃｅの刺激や、その後の顕微分光計測等を自動的に行うことができるので、所要に応じてそれらの操作の一部または全てを自動化し得て、作業者の負担を大幅に削減することができ、これにより作業者は、特に注意を要する単一細胞Ｃｅ内への試料（遺伝子やＣａ２＋）の注入や計測結果の分析判断等の作業に専念することができる。
しかもこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、細胞収納用マイクロウェルが、１個の単一細胞に対する専用ウェルとしてそれぞれ使用し得る複数のウェル４ａが所定配置で並べて配置されたマルチマイクロウェル４であることから、一連の細胞操作を通じて複数のウェル４ａをそれぞれ１個の単一細胞に対する専用ウェルとしで使用でき、しかも複数のウェル４ａが所定配置で並べて配置されているので、複数の単一細胞をそれらを収納するウェル４ａの位置に基づきナンバリングして識別し得て、より条件設定の細かい細胞操作を行うことができる。
またこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、試料注入移動手段が、顕微鏡１のステージ１ａ上に設けられて細胞収納用マルチマイクロウェル４および単一細胞刺激装置５をステージ１ａに対し移動させるオートステージ２を有しているので、試料注入移動装置７によるガラスキャピラリー８の移動範囲を狭め得て、細胞移動装置９との干渉を容易に防止することができる。
さらにこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、試料注入移動手段を構成する試料注入移動装置７が、ガラスキャピラリー８をステージ１ａに対し移動させるマニピュレーターを有しているので、より細かい注入操作ができる。
さらにこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、細胞移動手段が、顕微鏡１のステージ１ａ上に設けられて細胞収納用マルチマイクロウェル４および単一細胞刺激装置５をステージ１ａに対し移動させるオートステージ２を有しているので、細胞移動装置９によるガラスキャピラリー６の移動範囲を狭め得て、試料注入移動装置７との干渉を容易に防止することができる。そして細胞移動手段が、そのオートステージ２を試料注入移動手段と共用しているので、移動のための機構を簡略化し得て、スペース効率を高め得るとともに製作コストを削減することができる。
そしてこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、細胞移動手段を構成する細胞移動装置９が、ガラスキャピラリー６をステージ１ａに対し移動させるマニピュレーターを有しているので、より細かい移動操作ができる。
以上、図示例に基づき説明したが、この発明は上述の例に限定されるものでなく、例えば、試料注入移動手段及び細胞移動手段をオートステージ２なしでマニピュレータのみで構成しても良く、また試料を注入するインジェクターの操作も電磁ソレノイド等で行ってコンピューター制御で自動化しても良い。さらにマニュアル操作手段は押しボタンスイッチや足踏みスイッチ等を有していても良い。また顕微鏡１はパーソナルコンピューター１１により自動制御またはマニュアル制御される対物レンズ倍率電動切換え装置を具えていても良い。そして単一細胞計測装置は顕微分光計測装置以外のものでも良い。
【産業上の利用可能性】  以上のようにこの発明の単一細胞操作支援ロボットによれば、高い位置精度と迅速な移動とが要求される、単一細胞の保持・移動や、単一細胞に近接する位置への試料注入手段の移動や、それらの作業の間の顕微鏡の倍率変更や、単一細胞の刺激や、その後の、顕微分光計測装置等の単一細胞計測装置による計測を自動的に行うことができるので、所要に応じてそれらの操作の一部または全てを自動化し得て、作業者の負担を大幅に削減することができ、これにより作業者は、特に注意を要する単一細胞内への試料の注入や計測結果の分析判断等の作業に専念することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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