(57)【要約】ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を用いて患者血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの濃度を測定し、その測定結果に基づいて、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ測定用キット、および動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキットを開示する。本発明に係る判定方法は、動脈硬化症の新規な危険予知因子である血液試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定することにより判定する方法であるため、従来の心臓カテーテル法等に比較して患者の負担が少ない非観血法である。また、現在のところ一見健常者であっても動脈硬化が進行しており、将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定することが出来る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体を用いて患者血液由来試料中の可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａの濃度を測定し、その測定結果に基づいて、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
【請求項２】
測定結果を、予め定められた量と比較して、その結果に基づいて判定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
予め定められた量が、健常者検体血液由来試料中の可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａの濃度に基づいて定められたものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＦｃγレセプターＩＩＩａがマクロファージ由来の可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφである、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
ＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体が、マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体である、請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
ｉ）ＦｃγレセプターＩＩＩに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中の総可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩの濃度を測定し、
ｉｉ）マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφ特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中のマクロファージ由来可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφの濃度を測定し、
ｉｉｉ）マクロファージ由来可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφ濃度の、総可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩ濃度に対する比率を求め、その結果に基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
【請求項７】
ｉ）ＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中の可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａの濃度を測定し、
ｉｉ）マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中のマクロファージ由来可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφの濃度を測定し、
ｉｉｉ）マクロファージ由来可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφ濃度の、可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａ濃度に対する比率を求め、その結果に基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
【請求項８】
マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、およびＦｃγレセプターＩＩＩまたはＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体の標識物を含んでなる、マクロファージ由来可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφ濃度の測定用キット。
【請求項９】
マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγレセプターＩＩＩまたはＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体の標識物、ＦｃγレセプターＩＩＩに特異的な抗体を固定化した固相、およびＦｃγレセプターＩＩＩに特異的な抗体の標識物を含んでなる、マクロファージ由来可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφ濃度と総可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩ濃度の測定用キット。
【請求項１０】
マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγレセプターＩＩＩまたはＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体の標識物および可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、マクロファージ由来可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφ濃度と可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａ濃度の測定用キット。
【請求項１１】
マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、およびＦｃγレセプターＩＩＩまたはＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体の標識物を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
【請求項１２】
マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγレセプターＩＩＩまたはＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体の標識物、ＦｃγレセプターＩＩＩに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
【請求項１３】
マクロファージ型ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγレセプターＩＩＩまたはＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体の標識物およびＦｃγレセプターＩＩＩａに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、可溶性ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφを測定することによる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度（発症の危険度）を判定する方法に関するものである。
技術背景
近年、先進諸国では、社会の高齢化に伴って動脈硬化性合併症が多発し、労働力を削がれることで重要な社会問題ともなっている。すなわち、健康寿命と死亡との間で苦しむ期間の大半は、例えば脳卒中、心筋梗塞等の冠動脈疾患、網脈疾患による視力低下、閉塞性動脈硬化症、などの脈管疾患（動脈硬化性合併症）であり、労働力の低下のみならず生活の質（ＱＯＬ）を低下させて生きることになる。一方、動脈硬化症の発生メカニズムが徐々に解明され、従来から知られていた糖尿病、高血圧、高脂血症などの危険因子の重要性が再認識され、それぞれに対するＥＢＭに基づいた治療法が開発され、明確な成果を上げている。しかし、ある時点での動脈硬化症の程度を明確に評価する指標があれば、それに応じた治療法を適応することでテイラーメイド医療が実現できる。特に、動脈硬化症の初期病変を検体検査で明らかにすることは合併症予防のために有用であると考える。
動脈硬化症をきたすプロセスでは、特に酸化変性ＬＤＬがマクロファージのスカベンジャー受容体を介して細胞質内に際限なく取り込まれ、動脈硬化の初期病変である泡沫細胞の集積をもたらす。さらには血管平滑筋細胞の増殖、動脈硬化病変部位への遊走と分泌型への形質転換、泡沫細胞の壊死とともに形成される脂質コア、活性化マクロファージや形質転換した血管平滑筋細胞から放出される増殖因子や炎症性サイトカインなどにより、血管炎の病像が昂じて、動脈硬化病変は多量の脂質を含む不安定なプラークとなる。そして血圧上昇やストレスに際する血管収縮は血流速度を増し、その際の壁応力（Ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ）の増大が不安定プラークの破裂またはびらんを引き起こし、血管内皮下のマトリックスを血管内腔に露出することになり、これが血小板凝集を促して血栓形成をもたらす。その結果、血管は閉塞したり、内腔の狭窄をきたしたりして臓器の機能障害に至る。しかも重要な臓器ほど症状が現われ易く、脳、心臓、腎臓がその代表的な臓器である。厚生労働省患者調査概要によると、急性心筋梗塞を発症する患者数は年間１１万人（男性７．９万人、女性３．１万人）で、その他の虚血性心疾患は年間８０．４万人（男性３７．５万人、女性４２．９万人）で、毎年増加している。加えて食生活の高カロリー化による飽和脂肪酸の摂取量増加、自動車の普及による運動量の減少などは、動脈硬化性合併症の増加を予見させ、さらに、これらを反映して増加し続けている糖尿病は冠動脈疾患に最も影響力のある危険因子である。このような背景から、日本人でも冠動脈疾患が将来欧米人と同様のレベルにまで増加して、医療経済を脅かすことが予測されている。しかも日本では、心筋梗塞患者一人当たり平均３５０万円の医療費がかかる。心筋梗塞の発症を３０％でも未然に防ぐことが出来れば、年間で１，１５５億円もの医療費を削減することが可能である。
このような疾病のリスクを減少させるためには、医療分野における簡便で感度の高い動脈硬化症を検出する検査手法の確立が急務である。
一方、組織染色法によって、動脈硬化部位で、Ｆｃγレセプターが発現していることが証明されている（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ７７，１６９−１７４，２００１）。
Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲｓ）は、ＩｇＧのＦｃ部分に対するレセプターで、三つのサブグループ、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩに分類される。
このうち、ＦｃγＲＩＩＩには、ＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩＩｂの２型が存在する。ＦｃγＲＩＩＩａは、ナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球の一部、単球の一部、およびマクロファージに発現する膜貫通型の糖蛋白である（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０，４８１−４９７，１９８９）。ＮＫ細胞に発現しているＦｃγＲＩＩＩａ（以下、ＦｃγＲＩＩＩａＮＫと略記する。）と、マクロファージに発現しているＦｃγＲＩＩＩａ（マクロファージ型ＦｃγＲＩＩＩａ。以下、ＦｃγＲＩＩＩａＭφと略記する。）は、修飾糖鎖に違いがあると考えられている（ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，９００−９０７，１９９４）。ＦｃγＲＩＩＩａＭφとＦｃγＲＩＩＩａＮＫは、細胞の活性化によって細胞表面から、可溶型［可溶性ＦｃγＲＩＩＩａＭφ（以下、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ）ならびに可溶性ＦｃγＲＩＩＩａＮＫ（以下ｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫ）とそれぞれ略記する。］として放出されることが試験管内で認められている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，，１４７，３４５９−３４６５，１９９１、Ｌｅｖｙ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３０７−３１４，１９９１）。
また、ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）−アンカー型の糖蛋白であり、専ら好中球に発現しているが、好酸球にも発現させることが出来る（Ｈｕｉｚｉｎｇａ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３３，６６７−６６９，１９８８）。ＦｃγＲＩＩＩｂにはＮＡ１とＮＡ２の２つのアロタイプがあり、好中球の活性化およびアポトーシス時に可溶性ＦｃγＲＩＩＩｂ（以下、ｓＦｃγＲＩＩＩｂと略記する。）として放出される（Ｈｕｉｚｉｎｇａ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７５，２１３−２１７，１９９０、Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｃ．Ｈ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８５，５３２−５４０，１９９５）。
現在までのところ、総可溶性ＦｃγＲＩＩＩ（以下、総ｓＦｃγＲＩＩＩと略記する。）は、唾液、滑液、精液、血清および血漿中で検出されているが（ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，９００−９０７，１９９４、Ｈｕｉｚｉｎｇａ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７５，２１３−２１７，１９９０、Ｈｕｉｚｉｎｇａ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，８７，４５９−４６３，１９９４、Ｓａｕｔｅｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，１８５，２０７−２２１，１９９２、Ｇａｌｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，２１０１−２１０７，１９９８、Ｋｏｅｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９３，２３５−２４１，１９９６）、ｓＦｃγＲＩＩＩａとｓＦｃγＲＩＩＩｂ、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφとｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫを別々に測定した報告はない。血漿ｓＦｃγＲＩＩＩは主に好中球由来のＦｃγＲＩＩＩｂであり、ＮＫ細胞由来のｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫは微量と考えられている（ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，９００−９０７，１９９４、Ｈｕｉｚｉｎｇａ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，８７，４５９−４６３，１９９４）が、マクロファージ由来のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφは、血漿中で検出されたことがない。
発明の開示
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、血液中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの濃度を測定することによる、新規でかつ患者の負担が軽い動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的なモノクローナル抗体を作成した。そして、このモノクローナル抗体ならびに公知のＦｃγＲＩＩＩａを認識するモノクローナル抗体を用いてヒト血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度ならびにｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定し、動脈硬化症との関連についてさらに研究を重ねた結果、ｓＦｃγＲＩＩＩａならびにｓＦｃγＲＩＩＩａＭφが動脈硬化症の危険予知因子となりうることを見出した。さらに、特にｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定することにより、動脈硬化症の診断のみならず、一見健常者であっても、将来動脈硬化性合併症となる危険性があるか否かを判定することが出来ることをも見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は以下の構成よりなる。
（１）ＦｃγＲＩＩＩａ（特にＦｃγＲＩＩＩａＭφ）に特異的な抗体を用いて患者血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａ（特にＦｃγＲＩＩＩａＭφ）の濃度を測定し、その測定結果に基づいて、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
（２）ｉ）ＦｃγＲＩＩＩに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中の総ｓＦｃγＲＩＩＩの濃度を測定し、
ｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの濃度を測定し、
ｉｉｉ）ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対する比率を求め、その結果に基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
（３）ｉ）ＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａの濃度を測定し、
ｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの濃度を測定し、
ｉｉｉ）ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の、ｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度に対する比率を求め、その結果に基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
（４）ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、およびＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体の標識物を含んでなる、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定用キット。
（５）ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体の標識物、ＦｃγＲＩＩＩに特異的な抗体を固定化した固相、およびＦｃγＲＩＩＩに特異的な抗体の標識物を含んでなる、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度と総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度の測定用キット。
（６）ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体の標識物およびｓＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度とｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度の測定用キット。
（７）ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、およびＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体の標識物を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
（８）ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体の標識物、ＦｃγＲＩＩＩに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
（９）ＦｃγレセプターＩＩＩａＭφに特異的な抗体を固定化した固相、ＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体の標識物およびＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定に用いられるＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体（以下、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体という。）は、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφとの反応性を有する（ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφを認識する）ものであって、ｓＦｃγＲＩ、ｓＦｃγＲＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩｂ、ｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫ等に対して実質上反応性を有さない（ｓＦｃγＲＩ、ｓＦｃγＲＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩｂ、ｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫ等を認識しない）ものである。
本発明において、ｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度の測定に用いられるＦｃγＲＩＩＩａに特異的な抗体（以下、抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体という。）は、ｓＦｃγＲＩＩＩａ（ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφおよびｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫ）との反応性を有する（ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφおよびｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫを認識する）ものであって、ｓＦｃγＲＩやｓＦｃγＲＩＩ等に対して実質上反応性を有さない（ｓＦｃγＲＩやｓＦｃγＲＩＩ等を認識しない）ものである。
また、本発明に用いられるＦｃγＲＩＩＩに特異的な抗体（以下、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体という。）は、ｓＦｃγＲＩＩＩ（ｓＦｃγＲＩＩＩａおよびｓＦｃγＲＩＩＩｂ）との反応性を有する（ｓＦｃγＲＩＩＩａおよびｓＦｃγＲＩＩＩｂを認識する）ものであって、ｓＦｃγＲＩ、ｓＦｃγＲＩＩ等に対して実質上反応性を有さない（ｓＦｃγＲＩ、ｓＦｃγＲＩＩ等を認識しない）ものである。
また、これらの抗体の由来については特に限定されず、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも何れにても良い。また、適当な性質を有するファージ抗体やアダプタマーなど進化分子工学を利用して作製された標的特異的な結合分子を上記した如き抗体の代わりに用いることも可能である。これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。
なお、均一の性質を有する抗体の特異性を考慮すると、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体の方が好ましい。
本発明に使用されるポリクローナル抗体を得る方法としては、測定対象物を［免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、１９８１］等に記載の方法に従って、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、モルモット、ラット、マウス等の動物に免役する常法により作製すればよい。
また、本発明のモノクローナル抗体を得る方法としては、測定対象物を免疫原として免疫した、例えばラット、マウス等の動物の、例えば脾細胞、リンパ球等の免疫感作された細胞と、例えば骨髄腫細胞等の永久的に増殖する性質を有する細胞とを、ケラーとミルシュタインらにより開発された自体公知の細胞融合技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）により融合させてハイブリドーマを作製し、測定対象物に特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマを培地中で培養するか、動物の腹腔内に投与して腹水中に抗体を産生させて、該培養物または腹水より目的のモノクローナル抗体を採取する方法、例えば遺伝子組換え技術等を応用した自体公知の方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１，１９７６）により上記した如き性質を有する抗体を産生する細胞を作製し、この細胞を培養することにより目的のモノクローナル抗体を採取する方法等が挙げられる。
また、これら抗体は、市販品を用いても良いし、必要であればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂとして使用してもよい。
また、アダプタマーの作製には、米国特許第，２７０，１６３号に記載の方法を用いることができる。
本発明に使用されるモノクローナル抗体の取得方法を、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体およびそれを産生するハイブリドーマを取得する方法を例にとって説明すると、免疫原としてＦｃγＲＩＩＩａＭφを用い、モノクローナル抗体などを取得する常法を適用すればよい。
すなわち、先ず免疫原として用いられるＦｃγＲＩＩＩａＭφは、例えば、ヒトのクエン酸加血液からパーコール密度勾配遠心処理と向流遠心溶出法（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）により単離した単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を培養し、それを溶解したものから調製することが出来る。蛋白質の精製は、自体公知の方法、例えば抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体をコートしたセファロースビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィー等の幾つかのクロマトグラフィー技術を組み合わせて行えばよい。
上記の如き方法で得られたＦｃγＲＩＩＩａＭφを用いて、本発明に係る抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体を得る方法をより具体的に述べれば、例えば以下のごとくとなる。
すなわち、上記の如き方法により得られたＦｃγＲＩＩＩａＭφと、不完全フロイントアジュバント等のアジュバントとを混合して懸濁液を作製する。この懸濁液を前述の如き適当な動物に適当量、例えばＦｃγＲＩＩＩａＭφ量として、通常１回量０．１〜１００μｇ、好ましくは０．１〜１０μｇとなる量で、通常１〜５週間毎に、好ましくは２〜５週間毎に、通常３〜１０回、好ましくは３〜８回、皮下、静脈内あるいは腹腔内に投与して免疫する。免疫後、該動物より採血し、その血清がＦｃγＲＩＩＩａＭφと反応することを、例えばＦｃγＲＩＩＩａＭφを固相に用いた固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等の自体公知の方法により確認する。確認後、最終免疫から３〜４日後に免疫化動物から脾臓を摘出し、脾細胞を常法により調製する。得られた脾細胞と、例えばＮＳ−１，Ｓｐ２，Ｘ６３等の骨髄腫細胞とを常法に従い細胞融合し、常法に従って、融合細胞をＨＡＴ選択する。選択された融合細胞を培養し、培養上清を、通常のＥＬＩＳＡ法、間接免疫蛍光法や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を用いるウェスタンブロット免疫染色法等に供して、上記の如き性質を有する抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を産生する細胞をさらに選択する。次いで、限界希釈法によるクローニングを数回行い、安定して高力価の抗体を産生することが認められたものを抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
次いで常法に従い、得られたハイブリドーマを動物の腹腔内に注射し、腹水中に抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を産生させる。この腹水を採取し、例えば硫酸アンモニウム塩析、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液を用いた透析、例えばＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、ＦｃγＲＩＩＩａＭφアフィニティークロマトグラフィー等の通常この分野で使用される精製方法に従い精製し、精製した抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体とする。
なお、モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、二重免疫拡散法（臨床検査法提要，第３０版，Ｐ．８４２−８４３，金原出版株式会社）等の自体公知の方法によって行えばよい。
本発明に用いられる具体的な抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体の例としては、例えばＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩ、ＣＬＢ−ＬＭ６．３０、ＧＲＭ１等が挙げられる（ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ，Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，８１１−８１７，１９９５）。なお、ＧＲＭ１はＦｃγＲＩＩＩａとＮＡ２−ＦｃγＲＩＩＩｂを認識し、ＮＡ１−ＦｃγＲＩＩＩｂとは反応しない。
また、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体としては、例えばハイブリドーマ細胞株ＭＫＧＲ１４の産生するモノクローナル抗体ＭＫＧＲ１４が挙げられる。ハイブリドーマＭＫＧＲ１４は、２００２年１月２９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６６として寄託してある。
本発明に係る血液由来試料中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩａまたはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの濃度は、例えば自体公知の酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）等の免疫学的方法で測定すればよい。しかし、健常者由来血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度やｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度は非常に低いので、例えば化学発光免疫測定法（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＬＥＩＡ）、イムノＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（Ｆｕｒｕｙａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３８，１７３−１８０，２０００）等の感度の高い測定方法を用いることが好ましい。
ＥＬＩＳＡ法による、本発明の総ｓＦｃγＲＩＩＩまたはｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度の測定方法を、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度の測定方法を例にとって示すと、以下のごとくになる。
すなわち、血液由来試料を抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体（一次抗体）を固定化した固相と接触させ、４〜４０℃で０．５〜１６時間反応させて固相上に抗原抗体複合物（固定化抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体−ｓＦｃγＲＩＩＩ複合物）を生成させる。次に、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体の標識物（二次抗体）と４〜４０℃で０．５〜１６時間反応させて標識抗原抗体複合物（固定化抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体−ｓＦｃγＲＩＩＩ−標識抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体複合物）を生成させ、該固相上の標識抗原抗体複合物中の標識量を測定する。得られた標識量を、予め濃度既知の総ｓＦｃγＲＩＩＩ溶液について上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、標識量と総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度を求めることができる。なお、適当な標準（例えば健常者プール血漿）を１００ＡＵ（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ）の濃度とした相対値として求めてもよい。
標識抗体（二次抗体）がビオチン標識抗体である場合には、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識したストレプトアビジンを用い、ビオチン標識抗原抗体複合物と酵素標識ストレプトアビジンを反応させ、該固相上に酵素標識ストレプトアビジン−ビオチン標識抗原抗体複合物を生成させる。次いで標識酵素に対する基質を反応させて、該固相上の酵素標識ストレプトアビジン−ビオチン標識抗原抗体複合物中の標識酵素量を測定する。続いて上記と同様の方法で、検量線から試料中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度を求めることが出来る。
本発明に係るビオチン標識二次抗体を用いる総ｓＦｃγＲＩＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩａまたはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度のＥＬＩＳＡ法による測定方法を、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度を測定する方法を例にとって説明すると、概略以下の通りである。
すなわち、血液由来試料を抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体（一次抗体）を固定化した固相と接触させ、固相上に抗原抗体複合物を生成させる。次に、ビオチン標識ウサギ抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体（二次抗体）と反応させてビオチン標識抗原抗体複合物を生成させる。続いて、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応させてペルオキシダーゼ標識抗原抗体複合物を生成させた後、基質としてテトラメチルベンジジンとＨ２Ｏ２を用い、該固相上の標識抗原抗体複合物中の標識活性を測定する。得られた標識活性を、予め濃度既知の総ｓＦｃγＲＩＩＩ溶液について上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、標識活性と総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度を求めることができる。
また、ＥＬＩＳＡ法によりｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定する場合には、例えば下記の通りにして行えばよい。
すなわち、血液由来試料を抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体（一次抗体）を固定化した固相と接触させ、４〜４０℃で０．５〜１６時間反応させて固相上に抗原抗体複合物（固定化抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体−ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ複合物）を生成させる。次に、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体の標識物または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体の標識物（二次抗体）と４〜４０℃で０．５〜１６時間反応させて標識抗原抗体複合物（固定化抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体−ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ−標識抗体複合物）を生成させ、該固相上の標識抗原抗体複合物中の標識量を測定する。得られた標識量を、予め濃度既知のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ溶液について、上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、標識量とｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を求めることができる。
標識抗体（二次抗体）がビオチン標識抗体である場合には、ビオチン標識抗体を用いて総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度を測定する場合と同様の方法で測定を行えばよい。
また、上記した方法とは逆に、一次抗体として抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体を用い、これを固定化した固相と、二次抗体として抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体の標識物を用いても、同様にｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定を行うことが出来る。
また、ＥＬＩＳＡ法によるｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度の測定は、上記した方法に準じて行えばよい。
なお、以上のＥＬＩＳＡ法による総ｓＦｃγＲＩＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩａおよびｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定法の例は、抗体を結合した固相を用いた非競合法の原理に基づく測定法、いわゆるサンドイッチ法による測定法の例であるが、固相を用いずに、遊離の一次抗体、および二次抗体を用いても、本発明の測定法を実施することができることは言うまでもない。
上記の如き測定法で使用される固相としては、通常のＥＬＩＳＡ等の免疫学的測定法で用いられるものであれば何れも使用可能であるが、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー等の合成高分子化合物、例えば多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等が好ましく挙げられる。また、これら固相は、チューブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子（ラテックス粒子）、マイクロプレート等多種多様の形態で使用し得る。なかでもマイクロプレートは、洗浄の容易さおよび多数の試料を同時処理する際の操作性等の点から特に好ましい。
また、このような固相に、上記抗体を固定化させる方法としては、自体公知の固定化方法、例えば共有結合により固定化する方法あるいは物理的に吸着させて固定化する方法（特公平５−４１９４６号公報等）等の固定化方法を利用すればよい。
より具体的には、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体，抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を通常０．１μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの範囲で含む溶液と固相とを接触させ、適当な温度で所定時間反応させて抗体結合固相を得る方法が挙げられる。
抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体，抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体の溶液を調製するための溶媒としては、該抗体が固相上に吸着あるいは結合するのを妨げる性質を有するものでなければ良く、例えば精製水、例えばｐＨ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．５〜８．５の中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常１０〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜３００ｍＭの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、該抗体が固相上に吸着あるいは結合するのを妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質等が含まれていても良い。
なお、通常この分野で行われているブロッキング処理、すなわち、上述のごとくして得られた抗体結合固相を、さらに該抗体とは無関係のタンパク質、例えば牛血清アルブミン、スキムミルク等の乳タンパク質、卵白アルブミン等を含有する溶液中に浸漬する処理を行うことは、測定時の非特異的反応を防ぐ点から望ましい。
本発明において、総ｓＦｃγＲＩＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩａまたはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定する場合に用いられる抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体、抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩＭφ抗体を標識するために用いられる標識物質としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において用いられるアルカリホスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばＲＩＡで用いられる９９ｍＴｃ，１３１Ｉ，１２５Ｉ，１４Ｃ，３Ｈ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミンあるいはこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセンあるいはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル，３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル，２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等の標識物質等、通常この分野で用いられている標識物質が全て挙げられる。
また、上記した如き標識物質を抗体に結合させる（標識する）には、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡあるいはＦＩＡ等において一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説  蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第２版、医学書院、１９８２等］を適宜利用して行えばよい。また、標識方法として、アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法を利用しても良いことは言うまでもない。
アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用する場合、抗体にビオチンを結合させる方法としては、例えば市販のビオチン化試薬、より具体的には例えばスクシンイミド基が導入されたビオチン（例えば、ＮＨＳ−ビオチン）やＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とビオチンをスペーサーを介して結合したもの等を、抗体または抗原蛋白のアミノ基に反応させる方法（例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２７２−２７９，１９８９等）、例えば市販のＮ−［６−（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｅ）ｈｅｘｙｌ］−３’−（２’−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ（ビオチン−ＨＰＤＰ）やＮ−Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ−Ｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌｈｅｘｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎを、抗原または抗体のチオール基に反応させる方法（例えばＡｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２５４，２０３，１９７５等）、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを、アルデヒド化された抗原または抗体のアルデヒド基に反応させる方法（例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１７２，７１，１９４８、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９，４８８−４９６，１９８７等）等が挙げられる。
また、ビオチンによる抗原または抗体の修飾の程度としては、抗原または抗体に対してモル比で０．２〜１０倍程度、好ましくは１〜５倍程度が挙げられる。ビオチンによる修飾量が多い場合は抗原または抗体の不溶性が高くなったり、抗原抗体反応が妨げられる等問題が生じ、逆に修飾量が少ない場合は感度が所期の目標に達しない等の問題が生じるため、注意が必要である。
酵素標識したアビジンまたはストレプトアビジンは市販されているものをそのまま用いることが可能であり、特に品質、精製度を限定するものではない。また、その使用量は、測定対象に対する抗原（または抗体）に修飾されたビオチン量や測定項目によって異なり、特に限定されるものではないが、反応液中の濃度として通常０．０１〜５０００μｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０００μｇ／Ｌ、より好ましくは５〜１０００μｇ／Ｌの範囲から適宜選択される。
なお、この溶液中には、通常この分野で安定化剤として使用されているもの、例えば糖類、蛋白質、界面活性剤等が、通常この分野で使用される濃度範囲内で含有されていても良い。
また、抗原抗体反応の結果生成する一次抗体−抗原−二次抗体複合物中の標識量を測定する方法としては、標識物質の種類により異なるが、標識物質が有している何らかの方法により検出し得る性質に応じて、それぞれ所定の方法に従い実施すればよい。例えば、標識物質が酵素の場合にはＥＩＡの常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質  核酸  酵素  別冊  Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、５１〜６３，共立出版（株）、１９８７）等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合にはＲＩＡの常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応じて液浸型ＧＭカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸型シンチレーションカウンター、ＨＰＬＣ用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１等）。また、標識物質が蛍光性物質の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いるＦＩＡの常法、例えば「図説  蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が発光性物質の場合にはフォトカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質  核酸  酵素  別冊  Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、２５２〜２６３、共立出版（株）、１９８７）等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。さらに、標識物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有する場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質  核酸  酵素  別冊  Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、２６４〜２７１、共立出版（株）、１９８７）等に記載された方法に準じてそれぞれ測定を行えばよい。
より具体的には、例えば標識物質が酵素である場合は、これを発色試薬と反応させて発色反応に導き、その結果生成する色素量を分光光度計等により測定する方法等の自体公知の方法が挙げられる。
このような目的で用いられる発色試薬としては、例えばテトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、ｐ−ニトロフェニルリン酸等、通常この分野で用いられる発色試薬が挙げられる。
また、発色反応を停止させるには、例えば反応液に１〜６Ｎの硫酸等の酵素活性阻害剤を添加する等、通常この分野で行われている反応停止方法を利用すればよい。
本発明において用いられる血液由来試料としては、血液、血清、血漿等が挙げられる。しかし、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ等は、それぞれの該白血球より活性化等により放出されるため、採血後の影響が少ないＥＤＴＡ加血漿が望ましい。ＥＤＴＡ加血漿中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度については、室温での放置や凍結融解のくり返しによる影響を受けないと報告されている（Ｋｏｅｎｅ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９３，２３５−２４１，１９９６）。
イムノＰＣＲ法によるｓＦｃγＲＩＩＩａおよびｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定は、Ｆｕｒｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３８，１７３−１８０，２０００）に従って行えばよいが、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの測定を例にとって具体的に説明すると、概略以下の通りである。
まず、プラスミド  ブルースクリプト（２．９６ｋＢ、東洋紡）等の適当なテンプレートと例えばビオチン等で標識したプライマーと標識していないリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物を精製してビオチン化ＤＮＡを得る。
血液由来試料を抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体（一次抗体）をコートしたＰＣＲ用プレートに加え、抗原抗体複合物を生成させる。次に、ビオチン標識抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体（二次抗体）と反応させてビオチン標識抗原抗体複合物を生成させる。続いてアビジンを反応させてアビジン標識抗原抗体複合物を生成させ、さらに上記で用意したビオチン化ＤＮＡを反応させて、ＤＮＡ標識抗原抗体複合物を生成させる。標識ＤＮＡは、適切な組み合わせのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させる。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離，定量し、この値に基づいて試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を求めればよい。各ウェル中の標識ＤＮＡ量を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００シークエンス  デティクション  システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ  ジャパン（株））等の機器を用いたリアルタイムＰＣＲで測定することも可能である。
イムノＰＣＲ法に用いられるテンプレートとしては、この分野で常用される各種ベクターが、また、プライマー、ビオチン標識プライマー等も通常この分野で使用されるものであれば用いることが出来、市販されているものを用いても良い。また、使用する機器等も、通常この分野で常用される機器を用いればよい。またＰＣＲの変成温度や時間、アニーリング温度や時間、伸長反応の温度や時間は、用いるプライマーの組み合わせによって最適化可能である．
本発明の測定方法を実施するに際して使用するその他の試薬や、測定条件等（反応温度、反応時間、測定波長、測定装置等）はすべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法におけるそれらに準じて選択すれば足り、自体公知の免疫学的測定法の測定操作法に準じて実施すれば良く、使用する自動分析装置、分光光度系等も通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。
本発明の測定法において用いられる緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等通常抗原抗体反応を利用した測定法に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのｐＨとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常５〜９の範囲が好ましい。
本発明に係る動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法において用いられる「予め定められた量」としては、本発明の方法を用いて測定して得られた健常者検体の血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａの濃度、中でもｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの濃度、または本発明の方法を用いて測定して得られた健常者検体の血液由来試料中の、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対する比率、またはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度に対する比率が挙げられる。
本発明に係る動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度の判定方法としては、まず本発明の方法を用いて健常者検体の血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａ（好ましくはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ）の濃度を測定する。この値を標準値として用い、同様の方法で診断すべき試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａ（好ましくはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ）の濃度を測定し、その値が標準値と比較して有意に高い場合を動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度が高いと判断する方法が挙げられる。
また、本発明の方法を用いて健常者検体の血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａ（好ましくはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ）濃度を測定し、その値を基準値（１００ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ（ＡＵ））とする。別に同様の方法で診断すべき試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａ（好ましくはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ）の濃度を測定し、基準値に対する比率を求める。この値が基準値と比較して有意に高い場合を動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度が高いと判断する方法でも良い。
さらに、本発明の方法を用いて、健常者検体の血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度と総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度またはｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度を測定し、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対する比率、またはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度のｓＦｃＲＩＩＩａ濃度に対する比率を求め、別に同様の方法で診断すべき検体の血液由来試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度と総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度またはｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度を測定し、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対する比率またはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度に対する比率を求める。得られた値（比率）が健常者検体の血液由来試料から得られた値（比率）と比較して有意に高い場合を動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度が高いと判断する方法も挙げられる。
上記の比率を用いる方法であれば、特殊な動脈硬化形成過程を経る糖尿病より発症した場合であっても、値（比率）に及ぼす影響が軽減されるためより好ましい。また、比率を用いる方法の中でも、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対する比率を用いる方法がより好ましい。
動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険性が高いか否かの判定には、ｓＦｃγＲＩＩＩａ（好ましくはｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ）の濃度を測定するだけでも判定可能であるが、上記の如き比率をもとに判別してもよい。この際、標識抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体、標識抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体および標識抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体由来の標識物質の測定値はそれぞれ総ｓＦｃγＲＩＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩａ、ｓＦｃγＲＩＩＩａの値に比例しているので、それぞれの絶対量を求める必要はなく、標識物質の測定値を用いて、その比率を求めても良い。
本発明のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφと総ｓＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩａの測定用キットは、少なくとも先述した如き▲１▼抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を固定化した固相、および抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体の標識物を含んでなるもの、▲２▼抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を固定化した固相、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体の標識物、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を固定化した固相、および抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体の標識物を含んでなるもの、または▲３▼抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を固定化した固相、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体の標識物および抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体を固定化した固相を含んでなるものであり、その構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。なお、上記▲２▼のキットは、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対するｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の比率を測定するために用いられるもの、▲３▼のキットは、ｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度に対するｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の比率を測定するために用いられるものである。
本発明の動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキットは、少なくとも上記した如き▲１▼抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を固定化した固相、および抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体の標識物を含んでなるもの、▲２▼抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体を固定化した固相、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体の標識物、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を固定化した固相、および抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体の標識物を含んでなるもの、または▲３▼抗ＦｃγＲＩＩＩａ当抗体を固定化した固相、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体または抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体の標識物および抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体を固定化した固相を含んでなるものであり、その構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。なお、上記▲２▼のキットは、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対するｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の比率、▲３▼のキットは、ｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度に対するｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の比率をそれぞれ測定し、それに基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するために用いられるものである。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。
実施例
以下の参考例および実施例１〜５で用いた、ＣＡＤ患者血漿と健常者血漿、および以下の参考例および実施例１〜６で用いた抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体は下記の通りであり、データについての統計分析方法も下記の通りである。
［血漿］
虚血性心疾患（Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）患者血漿は、１９９９年５月から２０００年２月までの関西医科大学病院循環器科の来院患者で、米国心臓学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の基準において冠動脈疾患と認定された患者のうちＮＡ（１＋，２−）表現型を示す患者（ｎ＝４５、６３．０±１０．０歳）から得た。ＣＡＤ患者は、腎臓機能障害、肝臓機能障害、感染症、炎症性疾患および糖尿病のいずれの徴候もないものである。
ＮＡ（１＋，２−）表現型を示す健常者の血漿１０７例は任意に病院のスタッフから選んだ者（１９−７５歳、４２．９±１４．３歳）から得た。健常者は腎臓機能障害、肝臓機能障害、高脂血症、感染症、炎症性疾患、および糖尿病のいずれの徴候もなく、かつ投薬治療を受けていないものである。また、これをｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ等の濃度を測定する際に、１００ＡＵを設定するためのプール血漿としても用いた。さらにこのうちＣＡＤ患者群と年齢の一致する２７例を、健常者のコントロールとして用いた。両群の臨床背景を表１に示す。
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［抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体］
抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩおよびＣＬＢ−ＬＭ６．３０はＤｒ．Ｍ．ｄｅ  Ｈａａｓ（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より、ＧＲＭ１はＤｒ．Ｆ．Ｇａｒｒｉｄｏ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｒｇｅｎ  ｄｅ  ｌａｓ  Ｎｉｅｖｅｓ，Ｇｒａｎａｄａ，Ｓｐａｉｎ）より供与された。
［統計分析］
２群間の総ｓＦｃγＲＩＩＩ、ｓＦｃγＲＩＩＩａおよびｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの値および臨床データの差は、フィッシャーの最小有意差法（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ）による分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行い、相関性の検定は、バートレットの検定法（Ｂａｒｔｌｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって行った。
参考例１．ＦｃγＲＩＩＩａＭφの調製
ＦｃγＲＩＩＩａＭφは、４日間培養した単球のＮＰ−４０［ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業（株）製］溶解液から精製した。
すなわち、Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，７１８８−７１９５，１９９３）に従い、健常者のクエン酸加血液から調製したバフィーコートよりパーコール密度勾配遠心法によって単核白血球分画を調製し、この分画より向流遠心溶出法（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｏｒｉａｔｉｏｎ）によって、単球を単離した。単離した単球を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ改変タルベッコ培地（ＩＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ社製）で４日間培養した。培養単球を、５０μｇ／Ｌのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  Ｎａ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトンおよび４０μｇ／ｍＬ大豆トリプシンインヒビター存在下、１％ＮＰ−４０［１１０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）］にて、４℃で１５分間処理した。溶解物をレンチルレクチン−セファロース（アマシャム  ファルマシア  バイオテク（株））を用いたアフィニティークロマトグラフィーで粗精製した後、抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩ結合セファロースＣＬ−４Ｂビーズを用いたアフィニティクロマトグラフィーで、ＦｃγＲＩＩＩａＭφを精製した。
参考例２．ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的なモノクローナル抗体の調製
参考例１で精製したＦｃγＲＩＩＩａＭφのＰＢＳ溶液（濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬを、フロイントの不完全アジュバントと混合したものをＢａｌｂ／ｃマウス（６週令、雌）に１週間毎に３回腹腔内免役した。３回目の免疫から４日後に、その脾臓を集めた。得られた脾臓細胞と、ＮＳ−Ｉマウスミエローマ細胞を用いて、公知の方法でハイブリドーマを得た。得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＦｃγＲＩＩＩａＭφに対する特異性を、一般的なＥＬＩＳＡ法によって調べた。同時に、間接免疫蛍光法により、好中球、ナチュラルキラー細胞、単球、培養単球、および腹腔単球／マクロファージに対する反応性を調べた。以上により、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＭＫＧＲ１４を得、それが産生する抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体ＭＫＧＲ１４をＦｃγＲＩＩＩａＭφ特異抗体として選択した。
なお、上記ハイブリドーマＭＫＧＲ１４は、２００２年１月２９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６６として寄託してある。
参考例３．ＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的なモノクローナル抗体の特異性評価
（１）フローサイトメトリー解析
ＦＩＴＣ標識したＭＫＧＲ１４およびＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩを用い、４日培養した単球、末梢血白血球または腹膜細胞と氷上で反応させた。反応後、フローサイトメトリー解析を行った。
（２）免疫沈降解析
４日間培養した単球、好中球、ＮＫ細胞に５０μｇ／Ｌのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  Ｎａ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトンおよび４０μｇ／ｍＬ大豆トリプシンインヒビターの存在下、１％ＮＰ−４０（１１０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５））をそれぞれ加えて溶解した。得られた溶解液を、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体ＭＫＧＲ１４を固定化したセファロースＣＬ−４Ｂビーズまたは抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩを固定化したプロテインＧセファロース４ファーストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ製）に加えて、４℃で１時間反応させた。次いで５０μｇ／Ｌのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  Ｎａ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトンおよび４０μｇ／ｍＬ大豆トリプシンインヒビターの存在下、１％ＮＰ−４０（１１０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５））で同ビーズを洗浄したのち、還元剤を含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル調製用緩衝液に懸濁して６５℃、５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動後、ニトロセルロース膜にゲル中の蛋白を転写した後、抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＬＭ６．３０とペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を順次反応させた。膜上のペルオキシダーゼ活性の検出は、ＥＣＬ検出システム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ社（ドイツ）製）を用いた。
（３）結果
フローサイトメトリー解析結果によれば、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体ＭＫＧＲ１４は培養単球および腹腔マクロファージには結合したが、好中球やＮＫ細胞とは反応しなかった。一方、ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢＦＣＲｇｒａｎＩは，検討した全ての細胞種と反応した。
また、免疫沈降解析結果によれば、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体ＭＫＧＲ１４は培養単球に発現しているＦｃγＲＩＩＩａＭφとは反応したが、ＮＫ細胞や好中球のＦｃγＲＩＩＩとは反応しなかった。一方、ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩは、単球、ＮＫ細胞、好中球のいずれのＦｃγＲＩＩＩとも反応した。
以上の結果から、抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφモノクローナル抗体ＭＫＧＲ１４はＦｃγＲＩＩＩａＭφに特異的な抗体であることが分かった。
実施例１．健常者およびＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩ類の濃度の比較
（１）総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度の測定
健常者およびＣＡＤ患者血漿中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定した。
すなわち、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレートを抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩでコートし、非結合部分を２％ミルク含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でブロックした後、Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｅｌｉｓａ  ｂｕｆｆｅｒ（ＨＰＥ緩衝液，ＣＬＢ社、アムステルダム、オランダ）で希釈したＥＤＴＡ加血漿１００μＬを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳで洗浄後、各ウェルに１００μＬのビオチン標識ウサギ抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を加えてインキュベートした。なお、ビオチン標識に用いたウサギ抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体は、好中球より精製したＦｃγＲＩＩＩｂで常法によりウサギを免疫して得た。１００μＬの西洋わさび由来ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加えてインキュベートした後、基質としてテトラメチルベンジジンとＨ２Ｏ２を用いる方法で総ｓＦｃγＲＩＩＩの濃度を測定した。
当該測定に用いた、吸光度を縦軸、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度（ＡＵ）を横軸にプロットした検量線を図１に示す。
（２）ｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度およびｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定
健常者およびＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度およびｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの濃度は、イムノＰＣＲ法によって測定した。
ビオチン化ＤＮＡ（２２７ｂｐ）は、ビオチン標識Ｍ１３−２０プライマー（ｂｉｏｔｉｎ−５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’、配列番号１）と、無標識Ｍ１３リバースプライマー（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’、配列番号２）を用い、プラスミド  ブルースクリプト（２．９６ｋＢ、東洋紡）をテンプレートとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ９６００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（（株）パーキンエルマージャパン）によるＰＣＲ増幅を行った。３０サイクル増幅させた後、ＰＣＲ産物をＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ  ＴＥ−２００カラム（クロンテックラボラトリー社、パロアルト、カリフォルニア）を用いて精製した。
ＰＣＲ用９６穴ポリプロピレンプレート（Ｂｉｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）をｓＦｃγＲＩＩＩａを認識する抗体であるＧＲＭ１または抗ＦｃγＲＩＩＩａＭφ抗体であるＭＫＧＲ１４でそれぞれコートし、非結合部位を１ｇ／Ｌサケ精子ＤＮＡ、１％ＦＣＳ、５％ミルクおよび１％ゼラチンを含有するＰＢＳでブロックした後、ＨＰＥ緩衝剤で希釈したＥＤＴＡ加血漿２０μＬを各ウェルに加えて４℃で一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳで５回洗浄後、各ウェルに２０μＬのビオチン標識抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢＦｃＲｇｒａｎＩまたはＧＲＭ１をそれぞれ加え、室温で１時間インキュベートした。５回洗浄後、１ｍｇ／Ｌのアビジン（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ登録商標  ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ登録商標，Ｐｉｅｒｃｅ社製、１ｇ／Ｌサケ精子ＤＮＡ加ＨＰＥ緩衝液）を各ウェルに加えて室温で１時間インキュベートした。５回洗浄後、上記で用意したビオチン化ＤＮＡ５ｎＭ（ＨＰＥ緩衝液）を各ウェルに加え、室温でさらに１時間インキュベートした。各ウェル中のビオチン化ＤＮＡの量を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ登録商標  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ  ジャパン（株））を用いたリアルタイムＰＣＲで測定した。当該測定に用いた、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ（一定の増幅産物量になるサイクル数、Ｃｔ値）を縦軸に、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度（ＡＵ）を横軸にプロットした検量線を図２に示す。
（３）結果
健常者プール血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を基準値、すなわち１００ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ（ＡＵ）に設定し、健常者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度またはＣＡＤ患者血漿中のそれとを比較した結果を図３（ａ）に示す。同様に、健常者プール血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度および総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度をそれぞれ１００ＡＵに設定し、健常者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度または総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度、およびＣＡＤ患者血漿中のそれらとを比較した結果をそれぞれ図３（ｂ）、（ｃ）に示す。健常者の値に対するＣＡＤ患者の値の有意水準は図３（ｃ）においてｐ＜０．０５であり、図３（ａ）および図３（ｂ）においてｐ＜０．０１である。
図３より明らかなごとく、総ｓＦｃγＲＩＩＩ（ｓＦｃγＲＩＩＩａ＋ｓＦｃγＲＩＩＩｂ）濃度およびｓＦｃγＲＩＩＩａ（ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ＋ｓＦｃγＲＩＩＩａＮＫ）濃度は、ＣＡＤ患者の方が健常者よりも高値を示した（図３（ｂ）および（ｃ））。ＣＡＤ患者のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφは、健常者よりも約３倍の高値を示し、両グループ間のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度範囲は重複しなかった（図３（ａ））。
以上のことより、特にｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの値が、動脈硬化症の診断においてマーカーとなり得ることがわかる。
実施例２．ＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定１
実施例１で得られたＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定結果（図３（ａ））を、主要冠動脈の狭窄数によって、４つのグループ、すなわち、狭窄なし（０ＶＤ）、一枝狭窄（１ＶＤ）、２枝狭窄（２ＶＤ）、３枝狭窄（３ＶＤ）に分類した。結果を図４に示す。図４において、健常者の値に対する０ＶＤ〜３ＶＤの値の有意水準はｐ＜０．０１、０ＶＤの値に対する１ＶＤの値の有意水準はｐ＜０．０５、０ＶＤの値に対する２ＶＤおよび３ＶＤの値の有意水準はｐ＜０．０１、１ＶＤの値に対する２ＶＤの値の有意水準はｐ＜０．０１である。
図４から明らかなごとく、ＣＡＤ患者のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφレベルは、心臓血管に多くの狭窄を持つ患者の方が高い値を示した。
以上のことからｓＦｃγＲＩＩＩａＭφの値が、ＣＡＤの重篤度を反映することがわかる。
実施例３．加齢との関係
実施例１と同様に測定した、健常者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度（ＡＵ）と年齢との関係を図５に示す。
図５から明らかなごとく、一見健常者であっても、加齢とともに血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度が増加することがわかる（ｎ＝１０７、ｙ＝７２．５＋０．３２６ｘ、ｒ＝０．３４４）。また、若年層でもｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度が高い検体もあった。このように、血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度は加齢とともに増加するが、その増加の程度は個人差がある。例えば、若年でもｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度が通常より高いか、増加傾向のある者は、それだけ、若い段階で動脈硬化が進行し、動脈硬化性合併症を発症する可能性が高いということである。以上のことより、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定することにより早期にその危険度を判定することが出来ることが判った。
実施例４．ＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定２
実施例１で得られた健常者およびＣＡＤ患者血漿中の、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度と総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度の値を用いて、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対するｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の比率（ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比）を求めた。結果を図６に示す。図６において、健常者の値に対するＣＡＤ患者の値の有意水準はｐ＜０．０１である。
図６から明らかなごとく、ＣＡＤ患者のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ＦｃγＲＩＩＩ比は、健常者のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比よりも有意に高く、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比が、動脈硬化症、さらには動脈硬化性合併症の危険度を判定する基準となりうることがわかる。
実施例５．ＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定３
実施例１で得られた健常者およびＣＡＤ患者血漿中の、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度とｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度の値を用いて、ｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度に対するｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の比率（ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／ｓＦｃγＲＩＩＩａ比）を求めた。結果を図７に示す。図７において、健常者の値に対するＣＡＤ患者の値の有意水準はｐ＜０．０１である。
図７から明らかなごとく、ＣＡＤ患者のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／ｓＦｃγＲＩＩＩａ比は、健常者のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／ｓＦｃγＲＩＩＩａ比よりも有意に高く、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／ｓＦｃγＲＩＩＩａ比が、動脈硬化症、さらには動脈硬化性合併症の危険度を判定する基準となりうることがわかる。
実施例６．ＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定４
ＣＡＤ患者について、特殊な動脈硬化形成過程を経る糖尿病併発の有無とｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度との関係を調べた。
実施例１の、ＣＡＤと診断され、腎臓機能障害、肝臓機能障害、感染症および炎症性疾患のいずれの徴候もない患者１３７例を、正常血糖群（ｎ＝７７、６１．９±９．８歳）と、糖尿病併発群（ｎ＝６０、６３．１±１０．１歳）とに分類した。ＮＡ表現型は考慮しなかった。健常者の血漿も、ＮＡ表現型に関係なく得た（ｎ＝７８、５９．８±６．７歳）。
実施例１（２）と同様の方法で各血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定した。結果を図８に示す。図８において、健常者の値に対するＣＡＤ患者の正常血糖群の値および糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜０．０１、ＣＡＤ患者の正常血糖群に対する糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜０．０１である。
実施例１（１）と同様の方法で、各血漿中の総ｓＦｃγＲＩＩＩの濃度を測定した。結果を図９に示す。図９において、健常者の値に対するＣＡＤ患者の正常血糖群の値および糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜０．０１であり、ＣＡＤ患者の正常血糖群に対する糖尿病併発群の値に有意な差は認められない。
さらに、健常者、ＣＡＤ患者の正常血糖群、糖尿病併発群のそれぞれについて、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度に対するｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の比率（ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比）を求めた。結果を図１０に示す。図１０において、健常者の値に対するＣＡＤ患者の正常血糖群の値および糖尿病併発群の有意水準はｐ＜０．０１、正常血糖群に対する糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜０．０５である。
図８から明らかなごとく、ＣＡＤ患者のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度は、健常者に比して高値であり、正常血糖群も糖尿病併発群も、健常者と有意な差が認められた。しかし、正常血糖群のＣＡＤ患者と、糖尿病を併発しているＣＡＤ患者（糖尿病併発群）を比較したところ、糖尿病併発群における増加は軽度であった。
また、図９から明らかなごとく、総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度は、正常血糖群に対する糖尿病併発群の値は増加の程度が低い傾向が認められるものの、健常者との差は何れもそれほど大きくないことがわかる。
一方、図１０から明らかなごとく、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比で比較したところ、正常血糖群も糖尿病併発群も、健常者に比較して有意に高値を示し、かつ糖尿病併発の有無による差は軽減された。すなわち、正常血糖群の値と糖尿病併発群の値との差が軽減された。
以上のことから、ｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比は、動脈硬化症および動脈硬化性合併症発症の危険度を判定する基準として有用であることがわかる。
産業上の利用の可能性
本発明に係る判定方法は、動脈硬化症の新規な危険予知因子である血液試料中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度を測定することにより判定する方法であるため、従来の心臓カテーテル法等に比較して患者の負担が少ない。また、現在のところ一見健常者であっても動脈硬化が進行している、すなわち将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定することが出来る。
実施例は、動脈硬化の程度を定量化できる心臓カテーテル（冠動脈造影）実施例に限って呈示したものである。現在、この他に動脈硬化を定量化する方法はいくつか考えられているが、明確なものはない。すなわち、実施例は冠動脈硬化例であるが、全身の動脈硬化（例えば脳動脈硬化、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症）の判定にも応用できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は実施例１でＥＬＩＳＡによる総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度の測定に用いられた検量線を示す図である。
図２は、実施例１でイムノＰＣＲによるｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度の測定に用いられた検量線を示す図である。
図３（ａ）は、実施例１において得られた、健常者血漿と虚血性心疾患（Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩＭφ濃度を比較した結果を示す図である。
図３（ｂ）は、実施例１において得られた、健常者血漿とＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａ濃度を比較した結果を示す図である。
図３（ｃ）は、実施例１において得られた、健常者血漿とＣＡＤ患者血漿中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度を比較した結果を示す図である。
図４は、実施例２において得られた、ＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度と冠動脈疾患の重篤度との関係を示す図である。
図５は、実施例３において得られた、健常者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ濃度と年齢との関係を示す図である。
図６は、実施例４において得られた、ＣＡＤ患者血漿のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比と、健常者血漿のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比を比較した結果を示す図である。
図７は、実施例５において得られた、ＣＡＤ患者血漿のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／ｓＦｃγＲＩＩＩａ比と、健常者血漿のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／ｓＦｃγＲＩＩＩａ比を比較した結果を示す図である。
図８は、実施例６において得られた、健常者血漿とＣＡＤ患者血漿中のｓＦｃγＲＩＩＩＭφ濃度を比較した結果を示す図である。
図９は、実施例６において得られた、健常者血漿とＣＡＤ患者血漿中の総ｓＦｃγＲＩＩＩ濃度を比較した結果を示す図である。
図１０は、実施例６において得られた、ＣＡＤ患者血漿のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比と、健常者血漿のｓＦｃγＲＩＩＩａＭφ／総ｓＦｃγＲＩＩＩ比を比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2003091733.tif 000009
【図６】
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【図７】
2003091733.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月10日(2005.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i）FcγレセプターIIIまたはFcγレセプターIIIaに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中の総可溶性FcγレセプターIIIまたは可溶性FcγレセプターIIIaの濃度を測定し、
ii）マクロファージ型FcγレセプターIIIaMφに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中のマクロファージ由来可溶性FcγレセプターIIIaMφの濃度を測定し、
iii）マクロファージ由来可溶性FcγレセプターIIIaMφ濃度の、総可溶性FcγレセプターIII濃度または可溶性FcγレセプターIIIa濃度に対する比率を求め、その結果に基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
【請求項２】
比率が、マクロファージ由来可溶性FcγレセプターIIIaMφ濃度の総可溶性FcγレセプターIII濃度に対する比率である、請求項１に記載の危険度を判定する方法。
【請求項３】
マクロファージ型FcγレセプターIIIaMφに特異的な抗体を固定化した固相、およびFcγレセプターIIIまたはFcγレセプターIIIaに特異的な抗体の標識物を含んでなる、マクロファージ由来可溶性FcγレセプターIIIaMφ濃度の測定用キット。
【請求項４】
総可溶性FcγレセプターIIIの濃度を測定するために、さらにFcγレセプターIIIに特異的な抗体を固定化した固相、およびFcγレセプターIIIに特異的な抗体の標識物を含んでなる、請求項３に記載の測定用キット。
【請求項５】
可溶性FcγRIIIaの濃度を測定するために、さらにFcγレセプターIIIaに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、請求項３に記載の測定用キット。
【請求項６】
マクロファージ型FcγレセプターIIIaMφに特異的な抗体を固定化した固相、およびFcγレセプターIIIまたはFcγレセプターIIIaに特異的な抗体の標識物を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
【請求項７】
さらに、FcγレセプターIIIに特異的な抗体を固定化した固相、およびFcγレセプターIIIに特異的な抗体の標識物を含んでなる、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
さらに、FcγレセプターRIIIaに特異的な抗体を固定化した固相を含んでなる、請求項６に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】          明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性FcγレセプターIIIaMφを測定することによる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度（発症の危険度）を判定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、先進諸国では、社会の高齢化に伴って動脈硬化性合併症が多発し、労働力を削がれることで重要な社会問題ともなっている。すなわち、健康寿命と死亡との間で苦しむ期間の大半は、例えば脳卒中、心筋梗塞等の冠動脈疾患、網脈疾患による視力低下、閉塞性動脈硬化症、などの脈管疾患（動脈硬化性合併症）であり、労働力の低下のみならず生活の質（QOL）を低下させて生きることになる。一方、動脈硬化症の発生メカニズムが徐々に解明され、従来から知られていた糖尿病、高血圧、高脂血症などの危険因子の重要性が再認識され、それぞれに対するEBMに基づいた治療法が開発され、明確な成果を上げている。しかし、ある時点での動脈硬化症の程度を明確に評価する指標があれば、それに応じた治療法を適応することでテイラーメイド医療が実現できる。特に、動脈硬化症の初期病変を検体検査で明らかにすることは合併症予防のために有用であると考える。
【０００３】
動脈硬化症をきたすプロセスでは、特に酸化変性LDLがマクロファージのスカベンジャー受容体を介して細胞質内に際限なく取り込まれ、動脈硬化の初期病変である泡沫細胞の集積をもたらす。さらには血管平滑筋細胞の増殖、動脈硬化病変部位への遊走と分泌型への形質転換、泡沫細胞の壊死とともに形成される脂質コア、活性化マクロファージや形質転換した血管平滑筋細胞から放出される増殖因子や炎症性サイトカインなどにより、血管炎の病像が昂じて、動脈硬化病変は多量の脂質を含む不安定なプラークとなる。そして血圧上昇やストレスに際する血管収縮は血流速度を増し、その際の壁応力（Shear stress）の増大が不安定プラークの破裂またはびらんを引き起こし、血管内皮下のマトリックスを血管内腔に露出することになり、これが血小板凝集を促して血栓形成をもたらす。その結果、血管は閉塞したり、内腔の狭窄をきたしたりして臓器の機能障害に至る。しかも重要な臓器ほど症状が現われ易く、脳、心臓、腎臓がその代表的な臓器である。厚生労働省患者調査概要によると、急性心筋梗塞を発症する患者数は年間11万人（男性7.9万人、女性3.1万人）で、その他の虚血性心疾患は年間80.4万人（男性37.5万人、女性42.9万人）で、毎年増加している。加えて食生活の高カロリー化による飽和脂肪酸の摂取量増加、自動車の普及による運動量の減少などは、動脈硬化性合併症の増加を予見させ、さらに、これらを反映して増加し続けている糖尿病は冠動脈疾患に最も影響力のある危険因子である。このような背景から、日本人でも冠動脈疾患が将来欧米人と同様のレベルにまで増加して、医療経済を脅かすことが予測されている。しかも日本では、心筋梗塞患者一人当たり平均350万円の医療費がかかる。心筋梗塞の発症を30％でも未然に防ぐことが出来れば、年間で1,155億円もの医療費を削減することが可能である。
【０００４】
このような疾病のリスクを減少させるためには、医療分野における簡便で感度の高い動脈硬化症を検出する検査手法の確立が急務である。
【０００５】
一方、組織染色法によって、動脈硬化部位で、Fcγレセプターが発現していることが証明されている（例えば、非特許文献１等）。
【０００６】
Fcγレセプター（FcγRs）は、IgGのFc部分に対するレセプターで、三つのサブグループ、すなわちFcγRI、FcγRII、FcγRIIIに分類される。
【０００７】
このうち、FcγRIIIには、FcγRIIIaとFcγRIIIbの2型が存在する。FcγRIIIaは、ナチュラルキラー（natural killer，NK）細胞、Tリンパ球の一部、単球の一部、およびマクロファージに発現する膜貫通型の糖蛋白である（例えば、非特許文献２等）。NK細胞に発現しているFcγRIIIa（以下、FcγRIIIaNKと略記する。）と、マクロファージに発現しているFcγRIIIa（マクロファージ型FcγRIIIa。以下、FcγRIIIaMφと略記する。）は、修飾糖鎖に違いがあると考えられている（例えば、非特許文献３等）。FcγRIIIaMφとFcγRIIIaNKは、細胞の活性化によって細胞表面から、可溶型 [可溶性FcγRIIIaMφ（以下、sFcγRIIIaMφ）ならびに可溶性FcγRIIIaNK（以下ｓFcγRIIIaNK）とそれぞれ略記する。]として放出されることが試験管内で認められている（例えば、非特許文献４及び５等）。
【０００８】
また、FcγRIIIbは、GPI（glycosyl-phosphatidyl-inositol）-アンカー型の糖蛋白であり、専ら好中球に発現しているが、好酸球にも発現させることが出来る（Huizinga,T.W.J. et al., Nature, 333, 667-669, 1988）。FcγRIIIbにはNA1とNA2の2つのアロタイプがあり、好中球の活性化およびアポトーシス時に可溶性FcγRIIIb（以下、sFcγRIIIbと略記する。）として放出される（Huizinga,T.W.J. et al., Blood, 75, 213-217, 1990、Homburg,C.H.E., et al., Blood, 85, 532-540, 1995）。
【０００９】
現在までのところ、総可溶性FcγRIII（以下、総sFcγRIIIと略記する。）は、唾液、滑液、精液、血清および血漿中で検出されているが（例えば、非特許文献６〜１１等）、sFcγRIIIaとsFcγRIIIb、sFcγRIIIaMφとsFcγRIIIaNKを別々に測定した報告はない。血漿sFcγRIIIは主に好中球由来のFcγRIIIbであり、NK細胞由来のsFcγRIIIaNKは微量と考えられている（例えば、非特許文献１２及び１３等）が、マクロファージ由来のsFcγRIIIaMφは、血漿中で検出されたことがない。
【００１０】
【非特許文献１】Ratcliffe et al., Immunology letters, 2001, 77, 169-174
【非特許文献２】Ravetch,J.V. et al., J.Exp.Med., 1989, 170, 481-497
【非特許文献３】de Haas,M. et al., J.Immunol., 1994, 152, 900-907
【非特許文献４】Harrison,D. et al., J.Immunol., 1991, 147, 3459-3465
【非特許文献５】Levy,P.C. et al., Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol., 1991, 5, 307-314
【非特許文献６】de Haas,M. et al., J.Immunol., 1994, 152, 900-907
【非特許文献７】Huizinga,T.W.J. et al., Blood, 1990, 75, 213-217
【非特許文献８】Huizinga,T.W.J. et al., Br.J.Haematol., 1994, 87, 459-463
【非特許文献９】Sautes,C. et al., Immunobiol., 1992, 185, 207-221
【非特許文献１０】Galon,J. et al., Eur. J. Immunol., 1998, 28, 2101-2107
【非特許文献１１】Koene,H.R. et al., Br. J. Haematol., 1996, 93, 235-241
【非特許文献１２】de Haas,M. et al., J. Immunol., 1994, 152, 900-907
【非特許文献１３】Huizinga,T.W.J. et al., Br. J. Haematol., 1994, 87,459-463
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、血液中のsFcγRIIIaMφの濃度を測定することによる、新規でかつ患者の負担が軽い動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、FcγRIIIaMφに特異的なモノクローナル抗体を作成した。そして、このモノクローナル抗体ならびに公知のFcγRIIIaを認識するモノクローナル抗体を用いてヒト血漿中のsFcγRIIIa濃度ならびにsFcγRIIIaMφ濃度を測定し、動脈硬化症との関連についてさらに研究を重ねた結果、sFcγRIIIaならびにsFcγRIIIaMφが動脈硬化症の危険予知因子となりうることを見出した。さらに、特にsFcγRIIIaMφ濃度を測定することにより、動脈硬化症の診断のみならず、一見健常者であっても、将来動脈硬化性合併症となる危険性があるか否かを判定することが出来ることをも見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の構成よりなる。
（１）i）FcγRIIIまたはFcγRIIIaに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中の総sFcγRIIIまたはsFcγRIIIaの濃度を測定し、
ii）FcγRIIIaMφに特異的な抗体を用いて、患者血液由来試料中のsFcγRIIIaMφの濃度を測定し、
iii）sFcγRIIIaMφ濃度の、総sFcγRIII濃度またはsFcγRIIIa濃度に対する比率を求め、その結果に基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法。
（２）FcγRIIIaMφに特異的な抗体を固定化した固相、およびFcγRIIIまたはFcγRIIIaに特異的な抗体の標識物を含んでなる、sFcγRIIIaMφ濃度の測定用キット。
（３）FcγRIIIaMφに特異的な抗体を固定化した固相、およびFcγRIIIまたはFcγRIIIaに特異的な抗体の標識物を含んでなる、動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る判定方法は、動脈硬化症の新規な危険予知因子である血液試料中のsFcγRIIIa濃度又はsFcγRIIIaMφ濃度を測定することにより判定する方法であるため、従来の心臓カテーテル法等に比較して患者の負担が少ない。また、現在のところ一見健常者であっても動脈硬化が進行している、すなわち将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、sFcγRIIIaMφ濃度の測定に用いられるFcγRIIIaMφに特異的な抗体（以下、抗FcγRIIIaMφ抗体という。）は、sFcγRIIIaMφとの反応性を有する（sFcγRIIIaMφを認識する）ものであって、sFcγRI、sFcγRII、sFcγRIIIb、sFcγRIIIaNK等に対して実質上反応性を有さない（sFcγRI、sFcγRII、sFcγRIIIb、sFcγRIIIaNK等を認識しない）ものである。
【００１６】
本発明において、sFcγRIIIa濃度の測定に用いられるFcγRIIIaに特異的な抗体（以下、抗FcγRIIIa抗体という。）は、sFcγRIIIa（sFcγRIIIaMφおよびsFcγRIIIaNK）との反応性を有する（sFcγRIIIaMφおよびsFcγRIIIaNKを認識する）ものであって、sFcγRIやsFcγRII等に対して実質上反応性を有さない（sFcγRIやsFcγRII等を認識しない）ものである。
【００１７】
また、本発明に用いられるFcγRIIIに特異的な抗体（以下、抗FcγRIII抗体という。）は、sFcγRIII（sFcγRIIIaおよびsFcγRIIIb）との反応性を有する（sFcγRIIIaおよびsFcγRIIIbを認識する）ものであって、sFcγRI、sFcγRII等に対して実質上反応性を有さない（sFcγRI、sFcγRII等を認識しない）ものである。
【００１８】
また、これらの抗体の由来については特に限定されず、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも何れにても良い。また、適当な性質を有するファージ抗体やアプタマーなど進化分子工学を利用して作製された標的特異的な結合分子を上記した如き抗体の代わりに用いることも可能である。これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。
【００１９】
なお、均一の性質を有する抗体の特異性を考慮すると、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体の方が好ましい。
【００２０】
本発明に使用されるポリクローナル抗体を得る方法としては、測定対象物を［免疫実験学入門、第2刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981］等に記載の方法に従って、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、モルモット、ラット、マウス等の動物に免役する常法により作製すればよい。
【００２１】
また、本発明のモノクローナル抗体を得る方法としては、測定対象物を免疫原として免疫した、例えばラット、マウス等の動物の、例えば脾細胞、リンパ球等の免疫感作された細胞と、例えば骨髄腫細胞等の永久的に増殖する性質を有する細胞とを、ケラーとミルシュタインらにより開発された自体公知の細胞融合技術（Nature, 256, 495, 1975）により融合させてハイブリドーマを作製し、測定対象物に特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマを培地中で培養するか、動物の腹腔内に投与して腹水中に抗体を産生させて、該培養物または腹水より目的のモノクローナル抗体を採取する方法、例えば遺伝子組換え技術等を応用した自体公知の方法（Eur.J.Immunol., 6, 511, 1976）により上記した如き性質を有する抗体を産生する細胞を作製し、この細胞を培養することにより目的のモノクローナル抗体を採取する方法等が挙げられる。
【００２２】
また、これら抗体は、市販品を用いても良いし、必要であればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してF（ab'）２、Fab'、あるいはFabとして使用してもよい。
【００２３】
また、アプタマーの作製には、米国特許第5,270,163号に記載の方法を用いることができる。
【００２４】
本発明に使用されるモノクローナル抗体の取得方法を、抗FcγRIIIaMφ抗体およびそれを産生するハイブリドーマを取得する方法を例にとって説明すると、免疫原としてFcγRIIIaMφを用い、モノクローナル抗体などを取得する常法を適用すればよい。
【００２５】
すなわち、先ず免疫原として用いられるFcγRIIIaMφは、例えば、ヒトのクエン酸加血液からパーコール密度勾配遠心処理と向流遠心溶出法（counterflow centrifugal elutriation）により単離した単球（monocyte）を培養し、それを溶解したものから調製することが出来る。蛋白質の精製は、自体公知の方法、例えば抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体をコートしたセファロースビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィー等の幾つかのクロマトグラフィー技術を組み合わせて行えばよい。
【００２６】
上記の如き方法で得られたFcγRIIIaMφを用いて、本発明に係る抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体を得る方法をより具体的に述べれば、例えば以下のごとくとなる。
【００２７】
すなわち、上記の如き方法により得られたFcγRIIIaMφと、不完全フロイントアジュバント等のアジュバントとを混合して懸濁液を作製する。この懸濁液を前述の如き適当な動物に適当量、例えばFcγRIIIaMφ量として、通常1回量0.1〜100μg、好ましくは0.1〜10μgとなる量で、通常1〜5週間毎に、好ましくは2〜5週間毎に、通常3〜10回、好ましくは3〜8回、皮下、静脈内あるいは腹腔内に投与して免疫する。免疫後、該動物より採血し、その血清がFcγRIIIaMφと反応することを、例えばFcγRIIIaMφを固相に用いた固相酵素免疫測定法（ELISA法）等の自体公知の方法により確認する。確認後、最終免疫から3〜4日後に免疫化動物から脾臓を摘出し、脾細胞を常法により調製する。得られた脾細胞と、例えばNS-1，Sp2，X63等の骨髄腫細胞とを常法に従い細胞融合し、常法に従って、融合細胞をHAT選択する。選択された融合細胞を培養し、培養上清を、通常のELISA法、間接免疫蛍光法や、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜を用いるウェスタンブロット免疫染色法等に供して、上記の如き性質を有する抗FcγRIIIaMφ抗体を産生する細胞をさらに選択する。次いで、限界希釈法によるクローニングを数回行い、安定して高力価の抗体を産生することが認められたものを抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００２８】
次いで常法に従い、得られたハイブリドーマを動物の腹腔内に注射し、腹水中に抗FcγRIIIaMφ抗体を産生させる。この腹水を採取し、例えば硫酸アンモニウム塩析、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液を用いた透析、例えばDEAE-セルロースクロマトグラフィー、FcγRIIIaMφアフィニティークロマトグラフィー等の通常この分野で使用される精製方法に従い精製し、精製した抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体とする。
【００２９】
なお、モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、二重免疫拡散法（臨床検査法提要, 第30版, P.842-843,金原出版株式会社）等の自体公知の方法によって行えばよい。
【００３０】
本発明に用いられる具体的な抗FcγRIII抗体の例としては、例えばCLBFcRgranI、CLB-LM6.30、GRM1等が挙げられる（de Haas, M. et al., Leukocyte typing V, S.F. Schlossmann et al. eds. Oxford University Press, 811-817, 1995）。なお、GRM1はFcγRIIIaとNA2-FcγRIIIbを認識し、NA1-FcγRIIIbとは反応しない。
【００３１】
また、抗FcγRIIIaMφ抗体としては、例えばハイブリドーマ細胞株MKGR14の産生するモノクローナル抗体MKGR14が挙げられる。ハイブリドーマMKGR14は、2002年1月29日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号  305-8566、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託番号FERM BP-7866として寄託してある。
【００３２】
本発明に係る血液由来試料中の総sFcγRIII、sFcγRIIIaまたはsFcγRIIIaMφの濃度は、例えば自体公知の酵素免疫測定法（Enzyme linked immunosorbent assay、ELISA）、放射性免疫測定法（Radioimmunoassay、RIA）等の免疫学的方法で測定すればよい。しかし、健常者由来血漿中のsFcγRIIIa濃度やsFcγRIIIaMφ濃度は非常に低いので、例えば化学発光免疫測定法（chemiluminescence immunoassay、CLEIA）、イムノPCR（immuno-polymerase chain reaction）法（Furuya, D. et al., J. Immunol. Methods, 238, 173-180, 2000）等の感度の高い測定方法を用いることが好ましい。
【００３３】
ELISA法による、本発明の総sFcγRIIIまたはsFcγRIIIa濃度の測定方法を、総sFcγRIII濃度の測定方法を例にとって示すと、以下のごとくになる。
【００３４】
すなわち、血液由来試料を抗FcγRIII抗体（一次抗体）を固定化した固相と接触させ、4〜40℃で0.5〜16時間反応させて固相上に抗原抗体複合物（固定化抗FcγRIII抗体-sFcγRIII複合物）を生成させる。次に、抗FcγRIII抗体の標識物（二次抗体）と4〜40℃で0.5〜16時間反応させて標識抗原抗体複合物（固定化抗FcγRIII抗体-sFcγRIII-標識抗FcγRIII抗体複合物）を生成させ、該固相上の標識抗原抗体複合物中の標識量を測定する。得られた標識量を、予め濃度既知の総sFcγRIII溶液について上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、標識量と総sFcγRIII濃度との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の総sFcγRIII濃度を求めることができる。なお、適当な標準（例えば健常者プール血漿）を100AU（arbitrary units）の濃度とした相対値として求めてもよい。
【００３５】
標識抗体（二次抗体）がビオチン標識抗体である場合には、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識したストレプトアビジンを用い、ビオチン標識抗原抗体複合物と酵素標識ストレプトアビジンを反応させ、該固相上に酵素標識ストレプトアビジン-ビオチン標識抗原抗体複合物を生成させる。次いで標識酵素に対する基質を反応させて、該固相上の酵素標識ストレプトアビジン-ビオチン標識抗原抗体複合物中の標識酵素量を測定する。続いて上記と同様の方法で、検量線から試料中の総sFcγRIII濃度を求めることが出来る。
【００３６】
本発明に係るビオチン標識二次抗体を用いる総sFcγRIII、sFcγRIIIaまたはsFcγRIIIaMφ濃度のELISA法による測定方法を、総sFcγRIII濃度を測定する方法を例にとって説明すると、概略以下の通りである。
【００３７】
すなわち、血液由来試料を抗FcγRIII抗体（一次抗体）を固定化した固相と接触させ、固相上に抗原抗体複合物を生成させる。次に、ビオチン標識ウサギ抗FcγRIII抗体（二次抗体）と反応させてビオチン標識抗原抗体複合物を生成させる。続いて、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応させてペルオキシダーゼ標識抗原抗体複合物を生成させた後、基質としてテトラメチルベンジジンとH2O2を用い、該固相上の標識抗原抗体複合物中の標識活性を測定する。得られた標識活性を、予め濃度既知の総sFcγRIII溶液について上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、標識活性と総sFcγRIII濃度との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の総sFcγRIII濃度を求めることができる。
【００３８】
また、ELISA法によりsFcγRIIIaMφ濃度を測定する場合には、例えば下記の通りにして行えばよい。
【００３９】
すなわち、血液由来試料を抗FcγRIIIaMφ抗体（一次抗体）を固定化した固相と接触させ、4〜40℃で0.5〜16時間反応させて固相上に抗原抗体複合物（固定化抗FcγRIIIaMφ抗体-sFcγRIIIaMφ複合物）を生成させる。次に、抗FcγRIII抗体の標識物または抗FcγRIIIa抗体の標識物（二次抗体）と4〜40℃で0.5〜16時間反応させて標識抗原抗体複合物（固定化抗FcγRIIIaMφ抗体-sFcγRIIIaMφ-標識抗体複合物）を生成させ、該固相上の標識抗原抗体複合物中の標識量を測定する。得られた標識量を、予め濃度既知のsFcγRIIIaMφ溶液について、上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、標識量とsFcγRIIIaMφ濃度との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中のsFcγRIIIaMφ濃度を求めることができる。
【００４０】
標識抗体（二次抗体）がビオチン標識抗体である場合には、ビオチン標識抗体を用いて総sFcγRIII濃度を測定する場合と同様の方法で測定を行えばよい。
【００４１】
また、上記した方法とは逆に、一次抗体として抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体を用い、これを固定化した固相と、二次抗体として抗FcγRIIIaMφ抗体の標識物を用いても、同様にsFcγRIIIaMφ濃度の測定を行うことが出来る。
【００４２】
また、ELISA法によるsFcγRIIIa濃度の測定は、上記した方法に準じて行えばよい。
【００４３】
なお、以上のELISA法による総sFcγRIII、sFcγRIIIaおよびsFcγRIIIaMφ濃度の測定法の例は、抗体を結合した固相を用いた非競合法の原理に基づく測定法、いわゆるサンドイッチ法による測定法の例であるが、固相を用いずに、遊離の一次抗体、および二次抗体を用いても、本発明の測定法を実施することができることは言うまでもない。
【００４４】
上記の如き測定法で使用される固相としては、通常のELISA等の免疫学的測定法で用いられるものであれば何れも使用可能であるが、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー等の合成高分子化合物、例えば多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等が好ましく挙げられる。また、これら固相は、チューブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子（ラテックス粒子）、マイクロプレート等多種多様の形態で使用し得る。なかでもマイクロプレートは、洗浄の容易さおよび多数の試料を同時処理する際の操作性等の点から特に好ましい。
【００４５】
また、このような固相に、上記抗体を固定化させる方法としては、自体公知の固定化方法、例えば共有結合により固定化する方法あるいは物理的に吸着させて固定化する方法（特公平5-41946号公報等）等の固定化方法を利用すればよい。
【００４６】
より具体的には、抗FcγRIII抗体，抗FcγRIIIa抗体または抗FcγRIIIaMφ抗体を通常0.1μg／mL〜20mg／mL、好ましくは1μg／mL〜5mg／mLの範囲で含む溶液と固相とを接触させ、適当な温度で所定時間反応させて抗体結合固相を得る方法が挙げられる。
【００４７】
抗FcγRIII抗体，抗FcγRIIIa抗体または抗FcγRIIIaMφ抗体の溶液を調製するための溶媒としては、該抗体が固相上に吸着あるいは結合するのを妨げる性質を有するものでなければ良く、例えば精製水、例えばpH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10〜300mMの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、該抗体が固相上に吸着あるいは結合するのを妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質等が含まれていても良い。
【００４８】
なお、通常この分野で行われているブロッキング処理、すなわち、上述のごとくして得られた抗体結合固相を、さらに該抗体とは無関係のタンパク質、例えば牛血清アルブミン、スキムミルク等の乳タンパク質、卵白アルブミン等を含有する溶液中に浸漬する処理を行うことは、測定時の非特異的反応を防ぐ点から望ましい。
【００４９】
本発明において、総sFcγRIII、sFcγRIIIaまたはsFcγRIIIaMφ濃度を測定する場合に用いられる抗FcγRIII抗体、抗FcγRIIIa抗体または抗FcγRIIIMφ抗体を標識するために用いられる標識物質としては、例えば酵素免疫測定法（EIA）において用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばRIAで用いられる99mTc，131I，125I，14C，3H等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（FIA）で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミンあるいはこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセンあるいはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-（3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン）-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等の標識物質等、通常この分野で用いられている標識物質が全て挙げられる。
【００５０】
また、上記した如き標識物質を抗体に結合させる（標識する）には、例えば自体公知のEIA、RIAあるいはFIA等において一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971；図説  蛍光抗体、川生明著、第1版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第2版、医学書院、1982等］を適宜利用して行えばよい。また、標識方法として、アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法を利用しても良いことは言うまでもない。
【００５１】
アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用する場合、抗体にビオチンを結合させる方法としては、例えば市販のビオチン化試薬、より具体的には例えばスクシンイミド基が導入されたビオチン（例えば、NHS-ビオチン）やN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）とビオチンをスペーサーを介して結合したもの等を、抗体または抗原蛋白のアミノ基に反応させる方法（例えばJ.Biol.Chem., 264, 272-279,1989等）、例えば市販のN-[6-（Biotinamide）hexyl]-3'-（2'-pyridyldithio） propionamide（ビオチン-HPDP）やN-Iodoacetyl-N-biotinylhexylenediaminを、抗原または抗体のチオール基に反応させる方法（例えばAnn. New York Acad. Sci., 254, 203 ,1975等）、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを、アルデヒド化された抗原または抗体のアルデヒド基に反応させる方法（例えばJ. Biol. Chem., 172, 71, 1948、 Biotech. Appl. Biochem., 9, 488-496, 1987 等）等が挙げられる。
【００５２】
また、ビオチンによる抗原または抗体の修飾の程度としては、抗原または抗体に対してモル比で0.2〜10倍程度、好ましくは1〜5倍程度が挙げられる。ビオチンによる修飾量が多い場合は抗原または抗体の不溶性が高くなったり、抗原抗体反応が妨げられる等問題が生じ、逆に修飾量が少ない場合は感度が所期の目標に達しない等の問題が生じるため、注意が必要である。
【００５３】
酵素標識したアビジンまたはストレプトアビジンは市販されているものをそのまま用いることが可能であり、特に品質、精製度を限定するものではない。また、その使用量は、測定対象に対する抗原（または抗体）に修飾されたビオチン量や測定項目によって異なり、特に限定されるものではないが、反応液中の濃度として通常0.01〜5000μg/L、好ましくは0.1〜1000μg/L、より好ましくは5〜1000μg/Lの範囲から適宜選択される。
【００５４】
なお、この溶液中には、通常この分野で安定化剤として使用されているもの、例えば糖類、蛋白質、界面活性剤等が、通常この分野で使用される濃度範囲内で含有されていても良い。
【００５５】
また、抗原抗体反応の結果生成する一次抗体-抗原-二次抗体複合物中の標識量を測定する方法としては、標識物質の種類により異なるが、標識物質が有している何らかの方法により検出し得る性質に応じて、それぞれ所定の方法に従い実施すればよい。例えば、標識物質が酵素の場合にはEIAの常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63,共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合にはRIAの常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応じて液浸型GMカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸型シンチレーションカウンター、HPLC用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971等）。また、標識物質が蛍光性物質の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いるFIAの常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、（株）ソフトサイエンス社、1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が発光性物質の場合にはフォトカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252〜263、共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。さらに、標識物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有する場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質  核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271、共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じてそれぞれ測定を行えばよい。
【００５６】
より具体的には、例えば標識物質が酵素である場合は、これを発色試薬と反応させて発色反応に導き、その結果生成する色素量を分光光度計等により測定する方法等の自体公知の方法が挙げられる。
【００５７】
このような目的で用いられる発色試薬としては、例えばテトラメチルベンジジン、ｏ-フェニレンジアミン、ｏ-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド、2，2’-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）、N-エチル-N-スルホプロピル-m-アニシジン（ADPS）、p-ニトロフェニルリン酸等、通常この分野で用いられる発色試薬が挙げられる。
【００５８】
また、発色反応を停止させるには、例えば反応液に1〜6Nの硫酸等の酵素活性阻害剤を添加する等、通常この分野で行われている反応停止方法を利用すればよい。
【００５９】
本発明において用いられる血液由来試料としては、血液、血清、血漿等が挙げられる。しかし、sFcγRIIIaMφ等は、それぞれの該白血球より活性化等により放出されるため、採血後の影響が少ないEDTA加血漿が望ましい。EDTA加血漿中の総sFcγRIII濃度については、室温での放置や凍結融解のくり返しによる影響を受けないと報告されている（Koene,H.R. et al.,Br.J.Haematol., 93, 235-241, 1996）。
【００６０】
イムノPCR法によるsFcγRIIIaおよびsFcγRIIIaMφ濃度の測定は、Furuya et al.の方法（J. Immunol. Methods, 238, 173-180,2000）に従って行えばよいが、sFcγRIIIaMφの測定を例にとって具体的に説明すると、概略以下の通りである。
【００６１】
まず、プラスミド ブルースクリプト（2.96kB、東洋紡）等の適当なテンプレートと例えばビオチン等で標識したプライマーと標識していないリバースプライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物を精製してビオチン化DNAを得る。
【００６２】
血液由来試料を抗FcγRIIIaMφ抗体（一次抗体）をコートしたPCR用プレートに加え、抗原抗体複合物を生成させる。次に、ビオチン標識抗FcγRIII抗体（二次抗体）と反応させてビオチン標識抗原抗体複合物を生成させる。続いてアビジンを反応させてアビジン標識抗原抗体複合物を生成させ、さらに上記で用意したビオチン化DNAを反応させて、DNA標識抗原抗体複合物を生成させる。標識DNAは、適切な組み合わせのプライマーを用いてPCRにより増幅させる。得られたPCR産物を、アガロースゲル電気泳動により分離，定量し、この値に基づいて試料中のsFcγRIIIaMφ濃度を求めればよい。各ウェル中の標識DNA量を、ABI PRISM 7700シークエンス デティクション システム（Sequence Detection System、アプライドバイオシステムズ ジャパン（株））等の機器を用いたリアルタイムPCRで測定することも可能である。
【００６３】
イムノPCR法に用いられるテンプレートとしては、この分野で常用される各種ベクターが、また、プライマー、ビオチン標識プライマー等も通常この分野で使用されるものであれば用いることが出来、市販されているものを用いても良い。また、使用する機器等も、通常この分野で常用される機器を用いればよい。またPCRの変成温度や時間、アニーリング温度や時間、伸長反応の温度や時間は、用いるプライマーの組み合わせによって最適化可能である。
本発明の測定方法を実施するに際して使用するその他の試薬や、測定条件等（反応温度、反応時間、測定波長、測定装置等）はすべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法におけるそれらに準じて選択すれば足り、自体公知の免疫学的測定法の測定操作法に準じて実施すれば良く、使用する自動分析装置、分光光度系等も通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。
【００６４】
本発明の測定法において用いられる緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等通常抗原抗体反応を利用した測定法に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。
【００６５】
本発明に係る動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定する方法において用いられる「予め定められた量」としては、本発明の方法を用いて測定して得られた健常者検体の血液由来試料中のsFcγRIIIaの濃度、中でもsFcγRIIIaMφの濃度、または本発明の方法を用いて測定して得られた健常者検体の血液由来試料中の、sFcγRIIIaMφ濃度の総sFcγRIII濃度に対する比率、またはｓFcγRIIIaMφ濃度のsFcγRIIIa濃度に対する比率が挙げられる。
【００６６】
本発明に係る動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度の判定方法としては、まず本発明の方法を用いて健常者検体の血液由来試料中のsFcγRIIIa（好ましくはsFcγRIIIaMφ）の濃度を測定する。この値を標準値として用い、同様の方法で診断すべき試料中のsFcγRIIIa（好ましくはsFcγRIIIaMφ）の濃度を測定し、その値が標準値と比較して有意に高い場合を動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度が高いと判断する方法が挙げられる。
【００６７】
また、本発明の方法を用いて健常者検体の血液由来試料中のsFcγRIIIa（好ましくはsFcγRIIIaMφ）濃度を測定し、その値を基準値（100 arbitrary units（AU））とする。別に同様の方法で診断すべき試料中のsFcγRIIIa（好ましくはsFcγRIIIaMφ）の濃度を測定し、基準値に対する比率を求める。この値が基準値と比較して有意に高い場合を動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度が高いと判断する方法でも良い。
【００６８】
さらに、本発明の方法を用いて、健常者検体の血液由来試料中のsFcγRIIIaMφ濃度と総sFcγRIII濃度またはsFcγRIIIa濃度を測定し、sFcγRIIIaMφ濃度の総sFcγRIII濃度に対する比率、またはsFcγRIIIaMφ濃度のsFcγRIIIa濃度に対する比率を求め、別に同様の方法で診断すべき検体の血液由来試料中のsFcγRIIIaMφ濃度と総sFcγRIII濃度またはsFcγRIIIa濃度を測定し、sFcγRIIIaMφ濃度の総sFcγRIII濃度に対する比率またはsFcγRIIIaMφ濃度のsFcγRIIIa濃度に対する比率を求める。得られた値（比率）が健常者検体の血液由来試料から得られた値（比率）と比較して有意に高い場合を動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度が高いと判断する方法も挙げられる。
【００６９】
上記の比率を用いる方法であれば、特殊な動脈硬化形成過程を経る糖尿病より発症した場合であっても、値（比率）に及ぼす影響が軽減されるためより好ましい。また、比率を用いる方法の中でも、sFcγRIIIaMφ濃度の総sFcγRIII濃度に対する比率を用いる方法がより好ましい。
【００７０】
動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険性が高いか否かの判定には、sFcγRIIIa（好ましくはsFcγRIIIaMφ）の濃度を測定するだけでも判定可能であるが、上記の如き比率をもとに判別してもよい。この際、標識抗FcγRIII抗体、標識抗FcγRIIIa抗体および標識抗FcγRIIIaMφ抗体由来の標識物質の測定値はそれぞれ総sFcγRIII、sFcγRIIIa、sFcγRIIIaMφの値に比例しているので、それぞれの絶対量を求める必要はなく、標識物質の測定値を用いて、その比率を求めても良い。
【００７１】
本発明のsFcγRIIIaMφと総sFcγRIIIまたはsFcγRIIIaの測定用キットは、少なくとも先述した如き（１）抗FcγRIIIaMφ抗体を固定化した固相、および抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体の標識物を含んでなるもの、（２）抗FcγRIIIaMφ抗体を固定化した固相、抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体の標識物、抗FcγRIII抗体を固定化した固相、および抗FcγRIII抗体の標識物を含んでなるもの、または（３）抗FcγRIIIaMφ抗体を固定化した固相、抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体の標識物および抗FcγRIIIa抗体を固定化した固相を含んでなるものであり、その構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。なお、上記（２）のキットは、総sFcγRIII濃度に対するsFcγRIIIaMφ濃度の比率を測定するために用いられるもの、（３）のキットは、sFcγRIIIa濃度に対するsFcγRIIIaMφ濃度の比率を測定するために用いられるものである。
【００７２】
本発明の動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するのに用いられるキットは、少なくとも上記した如き（１）抗FcγRIIIaMφ抗体を固定化した固相、および抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体の標識物を含んでなるもの、（２）抗FcγRIIIaMφ抗体を固定化した固相、抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体の標識物、抗FcγRIII抗体を固定化した固相、および抗FcγRIII抗体の標識物を含んでなるもの、または（３）抗FcγRIIIaMφ抗体を固定化した固相、抗FcγRIII抗体または抗FcγRIIIa抗体の標識物および抗FcγRIIIa抗体を固定化した固相を含んでなるものであり、その構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。なお、上記（２）のキットは、総sFcγRIII濃度に対するsFcγRIIIaMφ濃度の比率、（３）のキットは、sFcγRIIIa濃度に対するsFcγRIIIaMφ濃度の比率をそれぞれ測定し、それに基づいて動脈硬化症または将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定するために用いられるものである。
【００７３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００７４】
以下の参考例および実施例1〜5で用いた、CAD患者血漿と健常者血漿、および以下の参考例および実施例1〜6で用いた抗FcγRIII抗体は下記の通りであり、データについての統計分析方法も下記の通りである。
[血漿]
虚血性心疾患（Coronary Artery Disease, CAD）患者血漿は、1999年5月から2000年2月までの関西医科大学病院循環器科の来院患者で、米国心臓学会（American Heart Association）の基準において冠動脈疾患と認定された患者のうちNA（1+,2-）表現型を示す患者（n=45、63.0±10.0歳）から得た。CAD患者は、腎臓機能障害、肝臓機能障害、感染症、炎症性疾患および糖尿病のいずれの徴候もないものである。
【００７５】
NA（1+,2-）表現型を示す健常者の血漿107例は任意に病院のスタッフから選んだ者（19-75歳、42.9±14.3歳）から得た。健常者は腎臓機能障害、肝臓機能障害、高脂血症、感染症、炎症性疾患、および糖尿病のいずれの徴候もなく、かつ投薬治療を受けていないものである。また、これをsFcγRIIIaMφ等の濃度を測定する際に、100AUを設定するためのプール血漿としても用いた。さらにこのうちCAD患者群と年齢の一致する27例を、健常者のコントロールとして用いた。両群の臨床背景を表1に示す。
【００７６】
【表１】
2003091733.tif 000015
【００７７】
[抗FcγRIII抗体]
抗FcγRIIIモノクローナル抗体CLBFcRgranIおよびCLB-LM6.30はDr. M. de Haas（CLB, Amsterdam, The Netherlands）より、GRM1はDr. F. Garrido（Hospital Virgen de las Nieves, Granada, Spain）より供与された。
【００７８】
[統計分析]
2群間の総sFcγRIII、sFcγRIIIaおよびsFcγRIIIaMφの値および臨床データの差は、フィッシャーの最小有意差法（Fisher's PLSD）による分散分析（ANOVA）によって行い、相関性の検定は、バートレットの検定法（Bartlettt's test）によって行った。
【００７９】
参考例１．FcγRIIIaMφの調製
FcγRIIIaMφは、4日間培養した単球のNonidet P-40［NP-40、ポリオキシエチレン（9）オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業（株）製］溶解液から精製した。
【００８０】
すなわち、Masuda et al.の方法（J. Immunol., 151, 7188-7195, 1993）に従い、健常者のクエン酸加血液から調製したバフィーコートよりパーコール密度勾配遠心法によって単核白血球分画を調製し、この分画より向流遠心溶出法（counterflow centrifugal elutoriation）によって、単球を単離した。単離した単球を10％ウシ胎児血清 （FCS） を含有するIscove's改変タルベッコ培地（IMDM、GIBCOTM、インビトロジェン社商品名）で4日間培養した。培養単球を、50μg／Lのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）、1 mM Na-p-トシル-L-リシンクロロメチルケトンおよび40μg／mL大豆トリプシンインヒビター存在下、1% NP-40[110 mM NaCl，50 mMトリス緩衝液（pH 7.5）]にて、4℃で15分間処理した。溶解物をレンチルレクチン-セファロース（アマシャム ファルマシア バイオテク（株））を用いたアフィニティークロマトグラフィーで粗精製した後、抗FcγRIIIモノクローナル抗体CLBFcRgranI結合セファロース CL-4Bビーズを用いたアフィニティクロマトグラフィーで、FcγRIIIaMφを精製した。
【００８１】
参考例２．FcγRIIIaMφに特異的なモノクローナル抗体の調製
参考例1で精製したFcγRIIIaMφのPBS溶液（濃度0.1 mg/mL） 0.1 mLを、フロイントの不完全アジュバントと混合したものをBalb/cマウス（6週令、雌）に1週間毎に3回腹腔内免役した。3回目の免疫から4日後に、その脾臓を集めた。得られた脾臓細胞と、NS-Iマウスミエローマ細胞を用いて、公知の方法でハイブリドーマを得た。得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のFcγRIIIaMφに対する特異性を、一般的なELISA法によって調べた。同時に、間接免疫蛍光法により、好中球、ナチュラルキラー細胞、単球、培養単球、および腹腔単球／マクロファージに対する反応性を調べた。以上により、抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマMKGR14を得、それが産生する抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体MKGR14をFcγRIIIaMφ特異抗体として選択した。
【００８２】
なお、上記ハイブリドーマMKGR14は、2002年1月29日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-7866として寄託してある。
【００８３】
参考例３．FcγRIIIaMφに特異的なモノクローナル抗体の特異性評価
(1)フローサイトメトリー解析
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識したMKGR14およびCLBFcRgranIを用い、4日培養した単球、末梢血白血球または腹膜細胞と氷上で反応させた。反応後、フローサイトメトリー解析を行った。
【００８４】
(2)免疫沈降解析
4日間培養した単球、好中球、NK細胞に50μg／Lのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）、1 mM Na-p-トシル-L-リシンクロロメチルケトンおよび40μg／mL大豆トリプシンインヒビターの存在下、1% NP-40（110 mM NaCl，50 mMトリス緩衝液（pH 7.5））をそれぞれ加えて溶解した。得られた溶解液を、抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体MKGR14を固定化したセファロースCL-4Bビーズまたは抗FcγRIIIモノクローナル抗体CLBFcRgranIを固定化したプロテインGセファロース4ファーストフロー（Amersham Pharmacia Biotech AB製）に加えて、4℃で1時間反応させた。次いで50μg／Lのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）、1 mM Na-p-トシル-L-リシンクロロメチルケトンおよび40μg／mL大豆トリプシンインヒビターの存在下、1% NP-40（110 mM NaCl，50 mMトリス緩衝液（pH 7.5））で同ビーズを洗浄したのち、還元剤を含まないSDS-PAGEサンプル調製用緩衝液に懸濁して65℃、5分間加熱し、SDS-PAGEに供した。電気泳動後、ニトロセルロース膜にゲル中の蛋白を転写した後、抗FcγRIIIモノクローナル抗体CLB-LM6.30とペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（Jackson Immuno Research社製）を順次反応させた。膜上のペルオキシダーゼ活性の検出は、ECL検出システム（Boehringer Mannheim GmbH社（ドイツ）製）を用いた。
（３）結果
フローサイトメトリー解析結果によれば、抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体MKGR14は培養単球および腹腔マクロファージには結合したが、好中球やNK細胞とは反応しなかった。一方、FcγRIIIモノクローナル抗体CLBFCRgranIは，検討した全ての細胞種と反応した。
【００８５】
また、免疫沈降解析結果によれば、抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体MKGR14は培養単球に発現しているFcγRIIIaMφとは反応したが、NK細胞のFcγRIIIaNKや好中球のFcγRIIIbとは反応しなかった。一方、FcγRIIIモノクローナル抗体CLBFcRgranIは、培養単球、NK細胞、好中球のいずれのFcγRIIIとも反応した。
【００８６】
以上の結果から、抗FcγRIIIaMφモノクローナル抗体MKGR14はFcγRIIIaMφに特異的な抗体であることが分かった。
【００８７】
実施例１．健常者およびCAD患者血漿中のsFcγRIII類の濃度の比較
（１）総sFcγRIII濃度の測定
健常者およびCAD患者血漿中の総sFcγRIII濃度は、ELISAによって測定した。
【００８８】
すなわち、96穴のELISA用プレートを抗FcγRIIIモノクローナル抗体CLBFcRgranIでコートし、非結合部分を2%ミルク含有リン酸緩衝食塩水（PBS）でブロックした後、High Performance Elisa buffer（HPE緩衝液，CLB社、アムステルダム、オランダ）で希釈したEDTA加血漿100μLを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。ウェルを0.05％ Tween20加PBSで洗浄後、各ウェルに100μLのビオチン標識ウサギ抗FcγRIII抗体を加えてインキュベートした。なお、ビオチン標識に用いたウサギ抗FcγRIII抗体は、好中球より精製したFcγRIIIbで常法によりウサギを免疫して得た。100μLの西洋わさび由来ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加えてインキュベートした後、基質としてテトラメチルベンジジンとH2O2を用いる方法で総sFcγRIIIの濃度を測定した。
当該測定に用いた、吸光度を縦軸、総sFcγRIII濃度（AU）を横軸にプロットした検量線を図1に示す。
【００８９】
（２）sFcγRIIIa濃度およびsFcγRIIIaMφ濃度の測定
健常者およびCAD患者血漿中のsFcγRIIIa濃度およびsFcγRIIIaMφの濃度は、イムノPCR法によって測定した。
【００９０】
ビオチン化DNA（227bp）は、ビオチン標識M13-20プライマー（biotin-5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3’、配列番号1）と、無標識M13リバースプライマー（5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’、配列番号2）を用い、プラスミド ブルースクリプト（2.96kB、東洋紡）をテンプレートとしてPerkin-Elmer Cetus 9600 instrument（（株）パーキンエルマージャパン）によるPCR増幅を行った。30サイクル増幅させた後、PCR産物をCHROMA SPIN TE-200カラム（クロンテックラボラトリー社、パロアルト、カリフォルニア）を用いて精製した。
【００９１】
PCR用 96穴ポリプロピレンプレート（Bio Medical Equipment）をsFcγRIIIaを認識する抗体であるGRM1または抗FcγRIIIaMφ抗体であるMKGR14でそれぞれコートし、非結合部位を1 g／Lサケ精子DNA、1% FCS、5%ミルクおよび1%ゼラチンを含有するPBSでブロックした後、HPE緩衝剤で希釈したEDTA加血漿20μLを各ウェルに加えて4℃で一晩インキュベートした。0.05％ Tween20加PBSで5回洗浄後、各ウェルに20μLのビオチン標識抗FcγRIIIモノクローナル抗体CLBFcRgranIまたはGRM1をそれぞれ加え、室温で1時間インキュベートした。5回洗浄後、1 mg／Lのアビジン（ImmunoPureTM NeutrAvidinTM, Pierce社製、1 g／Lサケ精子DNA加HPE緩衝液）を各ウェルに加えて室温で1時間インキュベートした。5回洗浄後、上記で用意したビオチン化DNA 5 nM（HPE緩衝液）を各ウェルに加え、 室温でさらに1時間インキュベートした。各ウェル中のビオチン化DNAの量を、ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ ジャパン（株））を用いたリアルタイムPCRで測定した。当該測定に用いた、threshold cycle（一定の増幅産物量になるサイクル数、Ct値）を縦軸に、sFcγRIIIaMφ濃度（AU）を横軸にプロットした検量線を図2に示す。
【００９２】
（３）結果
健常者プール血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度を基準値、すなわち100 arbitrary units（AU）に設定し、健常者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度またはCAD患者血漿中のそれとを比較した結果を図3（a）に示す。同様に、健常者プール血漿中のsFcγRIIIa濃度および総sFcγRIII濃度をそれぞれ100AUに設定し、健常者血漿中のsFcγRIIIa濃度または総sFcγRIII濃度、およびCAD患者血漿中のそれらとを比較した結果をそれぞれ図3（b）、（c）に示す。健常者の値に対するCAD患者の値の有意水準は図3（c）においてp＜0.05であり、図3（a）および図3（b）においてp＜0.01である。
【００９３】
図3より明らかなごとく、総sFcγRIII（sFcγRIIIa＋sFcγRIIIb）濃度およびsFcγRIIIa（sFcγRIIIaMφ＋sFcγRIIIaNK）濃度は、CAD患者の方が健常者よりも高値を示した（図3（b）および（c））。CAD患者のsFcγRIIIaMφは、健常者よりも約3倍の高値を示し、両グループ間のsFcγRIIIaMφ濃度範囲は重複しなかった（図3（a））。
以上のことより、特にsFcγRIIIaMφの値が、動脈硬化症の診断においてマーカーとなり得ることがわかる。
【００９４】
実施例２．CAD患者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度の測定１
実施例1で得られたCAD患者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度の測定結果（図3（a））を、主要冠動脈の狭窄数によって、4つのグループ、すなわち、狭窄なし（0VD）、一枝狭窄 （1VD）、2枝狭窄（2VD）、3枝狭窄（3VD）に分類した。結果を図4に示す。図4において、健常者の値に対する0VD〜３VDの値の有意水準はp＜0.01、0VDの値に対する1VDの値の有意水準はp＜0.05、0VDの値に対する2VDおよび３VDの値の有意水準はp＜0.01、1VDの値に対する2VDの値の有意水準はp＜0.01である。
【００９５】
図4から明らかなごとく、CAD患者のsFcγRIIIaMφレベルは、心臓血管に多くの狭窄を持つ患者の方が高い値を示した。
以上のことからsFcγRIIIaMφの値が、CADの重篤度を反映することがわかる。
【００９６】
実施例３．加齢との関係
実施例1(2)と同様に測定した、健常者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度（AU）と年齢との関係を図5に示す。
【００９７】
図5から明らかなごとく、一見健常者であっても、加齢とともに血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度が増加することがわかる（n=107、y＝72.5+0.326x、r＝0.344）。また、若年層でもsFcγRIIIaMφ濃度が高い検体もあった。このように、血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度は加齢とともに増加するが、その増加の程度は個人差がある。例えば、若年でもsFcγRIIIaMφ濃度が通常より高いか、増加傾向のある者は、それだけ、若い段階で動脈硬化が進行し、動脈硬化性合併症を発症する可能性が高いということである。以上のことより、sFcγRIIIaMφ濃度を測定することにより早期にその危険度を判定することが出来ることが判った。
【００９８】
実施例４．CAD患者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度の測定２
実施例1で得られた健常者およびCAD患者血漿中の、sFcγRIIIaMφ濃度と総sFcγRIII濃度の値を用いて、総sFcγRIII濃度に対するsFcγRIIIaMφ濃度の比率（sFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比）を求めた。結果を図6に示す。図6において、健常者の値に対するCAD患者の値の有意水準はp＜0.01である。
【００９９】
図6から明らかなごとく、CAD患者のsFcγRIIIaMφ／総FcγRIII比は、健常者のsFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比よりも有意に高く、sFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比が、動脈硬化症、さらには動脈硬化性合併症の危険度を判定する基準となりうることがわかる。
【０１００】
実施例５．CAD患者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度の測定３
実施例1で得られた健常者およびCAD患者血漿中の、sFcγRIIIaMφ濃度とsFcγRIIIa濃度の値を用いて、sFcγRIIIa濃度に対するsFcγRIIIaMφ濃度の比率（sFcγRIIIaMφ／sFcγRIIIa比）を求めた。結果を図7に示す。図7において、健常者の値に対するCAD患者の値の有意水準はp＜0.01である。
【０１０１】
図7から明らかなごとく、CAD患者のsFcγRIIIaMφ／sFcγRIIIa比は、健常者のsFcγRIIIaMφ／sFcγRIIIa比よりも有意に高く、sFcγRIIIaMφ／sFcγRIIIa比が、動脈硬化症、さらには動脈硬化性合併症の危険度を判定する基準となりうることがわかる。
【０１０２】
実施例６．CAD患者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度の測定４
CAD患者について、特殊な動脈硬化形成過程を経る糖尿病併発の有無とsFcγRIIIaMφ濃度との関係を調べた。
【０１０３】
CADと診断され、腎臓機能障害、肝臓機能障害、感染症および炎症性疾患のいずれの徴候もない患者137例を、正常血糖群（ｎ＝77、61.9±9.8歳）と、糖尿病併発群（ｎ＝60、63.1±10.1歳）とに分類した。NA表現型は考慮しなかった。健常者の血漿も、NA表現型に関係なく得た（ｎ＝78、59.8±6.7歳）。
【０１０４】
実施例1（2）と同様の方法で各血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度を測定した。結果を図8に示す。図8において、健常者の値に対するCAD患者の正常血糖群の値および糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜0.01、CAD患者の正常血糖群に対する糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜0.01である。
【０１０５】
実施例1（1）と同様の方法で、各血漿中の総sFcγRIIIの濃度を測定した。結果を図9に示す。図9において、健常者の値に対するCAD患者の正常血糖群の値および糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜0.01であり、CAD患者の正常血糖群に対する糖尿病併発群の値に有意な差は認められない。
【０１０６】
さらに、健常者、CAD患者の正常血糖群、糖尿病併発群のそれぞれについて、総sFcγRIII濃度に対するsFcγRIIIaMφ濃度の比率（sFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比）を求めた。結果を図10に示す。図10において、健常者の値に対するCAD患者の正常血糖群の値および糖尿病併発群の有意水準はｐ＜0.01、正常血糖群に対する糖尿病併発群の値の有意水準はｐ＜0.05である。
【０１０７】
図8から明らかなごとく、CAD患者のsFcγRIIIaMφ濃度は、健常者に比して高値であり、正常血糖群も糖尿病併発群も、健常者と有意な差が認められた。しかし、正常血糖群のCAD患者と、糖尿病を併発しているCAD患者（糖尿病併発群）を比較したところ、糖尿病併発群における増加は軽度であった。
【０１０８】
また、図9から明らかなごとく、総sFcγRIII濃度は、正常血糖群に対する糖尿病併発群の値は増加の程度が低い傾向が認められるものの、健常者との差は何れもそれほど大きくないことがわかる。
【０１０９】
一方、図10から明らかなごとく、sFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比で比較したところ、正常血糖群も糖尿病併発群も、健常者に比較して有意に高値を示し、かつ糖尿病併発の有無による差は軽減された。すなわち、正常血糖群の値と糖尿病併発群の値との差が軽減された。
【０１１０】
以上のことから、sFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比は、動脈硬化症および動脈硬化性合併症発症の危険度を判定する基準として有用であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明に係る判定方法は、動脈硬化症の新規な危険予知因子である血液試料中のsFcγRIIIaMφ濃度を測定することにより判定する方法であるため、従来の心臓カテーテル法等に比較して患者の負担が少ない。また、現在のところ一見健常者であっても動脈硬化が進行している、すなわち将来動脈硬化性合併症を引き起こす危険度を判定することが出来る。
【０１１２】
実施例は、動脈硬化の程度を定量化できる心臓カテーテル（冠動脈造影）実施例に限って呈示したものである。現在、この他に動脈硬化を定量化する方法はいくつか考えられているが、明確なものはない。すなわち、実施例は冠動脈硬化例であるが、全身の動脈硬化（例えば脳動脈硬化、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症）の判定にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】実施例1でELISAによる総sFcγRIII濃度の測定に用いられた検量線を示す図である。
【図２】実施例1でイムノPCRによるsFcγRIIIaMφ濃度の測定に用いられた検量線を示す図である。
【図3】（ａ）は、実施例1において得られた、健常者血漿と虚血性心疾患（Coronary Artery Disease, CAD）患者血漿中のsFcγRIIIMφ濃度を比較した結果を示す図である。（ｂ）は、実施例1において得られた、健常者血漿とCAD患者血漿中のsFcγRIIIa濃度を比較した結果を示す図である。（ｃ）は、実施例1において得られた、健常者血漿とCAD患者血漿中の総sFcγRIII濃度を比較した結果を示す図である。
【図4】実施例2において得られた、CAD患者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度と冠動脈疾患の重篤度との関係を示す図である。
【図５】実施例3において得られた、健常者血漿中のsFcγRIIIaMφ濃度と年齢との関係を示す図である。
【図６】実施例4において得られた、CAD患者血漿のsFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比と、健常者血漿のsFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比を比較した結果を示す図である。
【図７】実施例5において得られた、CAD患者血漿のsFcγRIIIaMφ／sFcγRIIIa比と、健常者血漿のsFcγRIIIaMφ／sFcγRIIIa比を比較した結果を示す図である。
【図８】実施例6において得られた、健常者血漿とCAD患者血漿中のsFcγRIIIMφ濃度を比較した結果を示す図である。
【図９】実施例6において得られた、健常者血漿とCAD患者血漿中の総sFcγRIII濃度を比較した結果を示す図である。
【図10】実施例6において得られた、CAD患者血漿のsFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比と、健常者血漿のsFcγRIIIaMφ／総sFcγRIII比を比較した結果を示す図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING                               
<110> Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
<120> Method for determining atherosclerosis
<130> atherosclerosis
<140>
<141>
<160> 2                             
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<221> misc_binding
<222> (1)
<400> 1
gtaaaacgac ggccagt                                                17    
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggaaacagct atgaccatg                                              19    
【国際調査報告】
2003091733.tif 000016
2003091733.tif 000017