(57)【要約】本発明は、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞に関する。本発明は、従来エクスビボの遺伝子治療に用いられてきた骨髄細胞や肝臓細胞に代わる、遺伝子治療に適した細胞を提供する。本発明により、採取及び移植が容易で移植後に取り除くことも可能な、エクスビボでの遺伝子治療に適した初代培養脂肪細胞に、外来遺伝子を導入する方法、特にレトロウイルスベクターを用いる方法が確立され、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養遺伝子治療用脂肪細胞が確立された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞。
【請求項２】
該遺伝子がレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターにより該細胞に導入された、請求項１に記載の脂肪細胞。
【請求項３】
体内で少なくとも２０日以上にわたって該蛋白質を有意に発現する能力を有する、請求項１に記載の脂肪細胞。
【請求項４】
該蛋白質を血中に放出させるために用いる、請求項１に記載の脂肪細胞。
【請求項５】
該蛋白質がインスリンまたはＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程、
（１）脂肪細胞を初代培養する工程、
（２）細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入し、安定に保持させる工程、
を含んでなる遺伝子治療用脂肪細胞を製造する方法。
【請求項７】
該外来遺伝子をレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターにより導入する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法により製造された遺伝子治療用脂肪細胞。
【請求項９】
細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞、および薬学的に許容される担体を含む、遺伝子治療用の移植組成物。
【請求項１０】
さらに細胞外基質成分を含む、請求項９に記載の移植用組成物。
【請求項１１】
さらに血管新生因子を含む、請求項９に記載の移植用組成物。
【請求項１２】
細胞外に分泌される所望の治療蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む、遺伝子治療方法。
【請求項１３】
蛋白質を血中に放出させる方法であって、細胞外に分泌される蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
該蛋白質を血中２０日以上にわたって血中に放出させる方法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血糖を低下させる方法であって、インスリンまたはＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １）をコードする遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
細胞外に分泌される蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞が体内に移植された動物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、外来遺伝子を導入した初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞に関する。
背景技術
現在行われている遺伝子治療（豊岡ら、Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．１１６：１５８−１６２，２０００）は、（１）治療用遺伝子をコードするウイルスベクターまたはｎａｋｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ等を直接患者に投与して遺伝子導入する方法（インビボ）、（２）患者から細胞を一旦取り出し、その細胞に遺伝子を導入して患者に戻す方法（エクスビボ）、の２種類に大別することができる。
このうち、インビボの方法は、導入効率や発現の持続、標的細胞への選択的な遺伝子導入という点に大きな課題を残している。一方、エクスビボの方法はこれらの課題をクリアしうる可能性がある。エクスビボにおいては、採取と移植が比較的に容易で患者への負担が少ないことから血液系の細胞（抹消血リンパ球、骨髄細胞）を使った例が大多数を占め（谷ら、最新医学，５６：２５８−２６７，２００１）、また、血液系以外の細胞では肝臓細胞に遺伝子導入し戻す方法（Ｒａｐｅｒ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２（５）：３８１−４００，１９９３）が行われているが、そのほとんどが導入細胞自体の機能回復・維持・増強に主眼が置かれている。
発明の開示
エクスビボの遺伝子治療に適した細胞を探し出す過程で、本発明者らは、初代培養の脂肪細胞を用いることを考えた。脂肪細胞を用いる利点として、以下の点が挙げられる。
（１）脂肪細胞から分泌される液性因子が複数報告され、脂肪細胞がホルモン産生・分泌臓器としての機能を有している（Ｂｒａｄｌｅｙ  ＲＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ，２００１；５６，３２９−３５８）。
（２）皮下にも存在するために採取が容易であり、更に形成外科・美容整形分野等で摘出に関する技術が発達しつつある。また、容易に移植可能である皮下に移植した場合でも、本来そこに存在する細胞であるため異所にならない。
（３）単離した初代培養脂肪細胞はインビトロでも活発に増殖するため、遺伝子導入などの操作に適している。
（４）移植後に局所に生着すると予想されるため、移植後に移植細胞を取り出したい場合（すなわち、遺伝子発現を消去したい場合）でも対応可能である。
（５）脂肪細胞自身が血管新生因子を産生する（Ｍｉｃｋ  ＧＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２００２；１４３（３）：９４８−５３）ので、移植後の高い生着が期待できる。
（６）成体において大きく重量を変動させる臓器であり、摘出／移植による人体への影響が少ない。
（７）脂肪細胞は余分なもの・邪魔なものという認識が強く、採取の同意を得やすいと予想される。
現在、同様の試みとしてケラチノサイトを用いた検討が行われている（Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２００１  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；３（１）：２１−３１、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１  Ｊａｎ；１１５（１）：７３−８２）が、初代培養を単離する過程で生体バリアである皮膚を除去することは、感染リスクの点などから問題がある。除去・移植に伴う患者の苦痛も強いと予想され、発現を消すための再摘出（上記４）なども容易ではない。また、２次元でしか移植できないケラチノサイト／皮膚は、移植量の増加を移植平面の面積増加でしか達成できず、立体的に移植可能な脂肪細胞がより有用であると考えられる。
本発明者らは、初代培養した脂肪細胞に効率よく遺伝子を導入する方法を考案し、更に導入した遺伝子が移植後も機能していることを確認して、脂肪細胞が遺伝子治療に有効に活用できることを見出した。しかも本発明の方法によれば、導入した外来遺伝子を体内で長期間安定して発現する脂肪細胞を得ることが可能である。移植した成熟脂肪細胞は１年以上にわたって外来遺伝子の発現を持続することができる。また、脂肪細胞を移植後に、外来遺伝子の発現が不要となれば、移植片を取り出すことで外来遺伝子の発現を停止させることも可能である。
すなわち本発明は、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞、該細胞の製造方法、該細胞を含む移植組成物、および該細胞の利用等に関し、より具体的には
〔１〕細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞、
〔２〕該遺伝子がレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターにより該細胞に導入された、〔１〕に記載の脂肪細胞、
〔３〕体内で少なくとも２０日以上にわたって該蛋白質を有意に発現する能力を有する、〔１〕に記載の脂肪細胞、
〔４〕該蛋白質を血中に放出させるために用いる、〔１〕に記載の脂肪細胞、
〔５〕該蛋白質がインスリンまたはＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １）である、〔１〕に記載の方法、
〔６〕以下の工程、
（ｉ）脂肪細胞を初代培養する工程、
（ｉｉ）細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入し、安定に保持させる工程、
を含んでなる遺伝子治療用脂肪細胞を製造する方法、
〔７〕該外来遺伝子をレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターにより導入する、〔６〕に記載の方法、
〔８〕〔６〕または〔７〕に記載の方法により製造された遺伝子治療用脂肪細胞、
〔９〕細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞、および薬学的に許容される担体を含む、遺伝子治療用の移植組成物、
〔１０〕さらに細胞外基質成分を含む、〔９〕に記載の移植用組成物、
〔１１〕さらに血管新生因子を含む、〔９〕に記載の移植用組成物、
〔１２〕細胞外に分泌される所望の治療蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む、遺伝子治療方法、
〔１３〕蛋白質を血中に放出させる方法であって、細胞外に分泌される蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む方法、
〔１４〕該蛋白質を血中２０日以上にわたって血中に放出させる方法である、〔１３〕に記載の方法、
〔１５〕血糖を低下させる方法であって、インスリンまたはＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １）をコードする遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む方法、
〔１６〕細胞外に分泌される蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞が体内に移植された動物、に関する。
以下に本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、まず、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞を提供する。
ここで外来遺伝子とは、初代培養脂肪細胞に外から導入された遺伝子を言い、初代培養脂肪細胞が産生していない蛋白質をコードする遺伝子などが含まれる。また初代培養の細胞とは、生体から取り出された組織から培養された細胞で、株化していない細胞を言う。また脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）とは成熟脂肪細胞（ｍａｔｕｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）ならびに前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）などの脂肪に分化する能力を有する細胞をいう。すなわち、特に″成熟″脂肪細胞と断らない限り、脂肪細胞には前脂肪細胞も含まれる。成熟脂肪細胞は球形で脂肪を蓄えた細胞であり油滴を含んでいる。成熟脂肪細胞に蓄えられた脂肪はｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色によって確認することができる。成熟脂肪細胞は、一般的にインスリンに応答してレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）を分泌する。前脂肪細胞は、本来、成熟脂肪細胞に分化する前の間質（ｓｔｒｏｍａｌ）細胞として存在する。前脂肪細胞は、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ）をコラゲナーゼ処理して単離することができるが、後述する天井培養法によって成熟脂肪細胞が分裂した結果生じる前脂肪細胞を単離することもできる（杉原ら、日本臨床１９９５、５３；１１５−１２０、Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９８７，２８；１０３８−１０４５、Ｚｈａｎｇ  ＨＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｎｄｃｒｉｎｉｏｌ．２０００，１６４；１１９−１２８）。また、脂肪細胞特異的な表面抗原の存在は確認されてはいないが、ＣＤ３６などは成熟脂肪細胞に強く発現が認められる（Ａｂｕｍｒａｄ  ＮＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３  Ａｕｇ  ２５；２６８（２４）：１７６６５−８．）。よってこのような分子をマーカーにしてより高い純度で脂肪細胞を回収することも考えられる。前脂肪細胞は、後述する分化誘導によって数日から数週間の間に成熟脂肪細胞に分化することができる（Ｈａｕｎｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４，１６６３−１６７０，１９８９；Ｍａｒｋｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，４５８２−４５８８，１９９４）。初代脂肪細胞は所望の組織から単離してもよく、例えば皮下脂肪組織、副睾丸周囲または腸間膜などの内臓脂肪組織から得ることができる。
遺伝子治療用とは、外来遺伝子がコードする蛋白質を、その効果を期待して体内において発現させる用途に用いることを言う。また遺伝子治療用細胞とは、エクスビボ投与により外来遺伝子を体内に投与する用途に用いる、さらにエクスビボで投与された体内で該蛋白質を発現する能力を有する、該外来遺伝子を保持する細胞のことを言う。エクスビボ投与とは、脂肪組織または脂肪細胞を個体より取り出し、インビトロで遺伝子導入を行った後、同一または別の個体に移植することを言う。
遺伝子治療用細胞は、より好ましくは、ある特定の蛋白質を産生する細胞を移入して疾患を治療するために用いる細胞を言う。好ましくは、ある特定の蛋白質による治療は、その物理的もしくは機能的な不足あるいは欠如により疾患が引き起こされる蛋白質による補充療法、ないしはある病態の発症・悪性化をきたす因子を中和しうる作用を有する蛋白による中和療法が挙げられる。ある特定の蛋白質とは、血流中で活性を示す、もしくは血流中から対象組織に供給され、該組織の細胞表面で作用する蛋白質であり、一定の期間（例えば数日から数週間、またはそれ以上にわたって）持続的な供給を必要とするものが望ましい。すでに蛋白補充療法が施行されている、もしくは有効性が予測されている因子および疾患はすべて対象となり得る。
以下に、代表的な対象を分類別に記載するが、用途はこれに限定されるものではなく、類似の目的により類似の因子を使用することは本発明の範疇に含まれる。
補充療法には、ホルモンまたはサイトカインの不足・機能低下により発症・増悪する疾患に対する補充、先天性の遺伝子欠損による疾患に対する補充、病態改善因子の補充、などが含まれる。
インスリン／糖尿病、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）／糖尿病・肥満・摂食障害、ＧＬＰ−２／炎症性腸疾患・癌化学療法などに伴う消化管障害、レプチン／肥満症・脂肪萎縮性糖尿病、アディポネクチン／糖尿病・血管障害、血液凝固第ＶＩＩＩ・第ＩＸ因子／血友病、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）／ＬＰＬ欠損症・高トリグリセリド血症、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）／ＬＣＡＴ欠損症、エリスロポエチン／赤血球減少症、アポＡ−Ｉ／低ＨＤＬ血症、アルブミン／低蛋白血症、心房性ナトリウムペプチド（ＡＮＰ）／高血圧・心不全、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）／乳がん・前立腺ガン、アンギオスタチン・エンドスタチン／血管新生・転移阻害、モルヒネ受容体作動ペプチド（内因性オピオイドペプチド（エンケファリン等）やダイノルフィン（ｄｙｎｏｌｐｈｉｎ）等）／疼痛緩和、カルシトニン・骨形成因子（ＢＭＰ）／骨粗しょう症、インターフェロン−α・−β／悪性腫瘍、インターフェロン−γ／悪性腫瘍・肝炎・アレルギー、インターフェロン−β１／多発性硬化症、インターロイキン−１α・−１β／悪性腫瘍、インターロイキン−４／乾癬、インターロイキン−１０／自己免疫疾患、インターロイキン−１２／悪性腫瘍、膵分泌性トリプシンインヒビター／膵炎、スーパーオキサイドディスムターゼ／虚血性心疾患・血管障害、など
病態形成因子もしくは悪性化因子の中和療法には、可溶化受容体や中和抗体の部分ペプチド、ドミナントネガティブ型蛋白の産生がこれに含まれる。
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）可溶化受容体／慢性関節リュウマチ、可溶化ＩｇＥ受容体／アレルギー、可溶化ＩｇＡ受容体／食物アレルギー、可溶化細胞障害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ４）／自己免疫疾患、可溶化ＣＤ４０リガンド／免疫疾患、ドミナントネガティブ型血液凝固第ＶＩＩａ因子／血栓症、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）可溶化受容体／血管内膜肥厚、など
また、本発明の脂肪細胞は、いわゆる「治療」に用いるものに限定されず、所望の分泌蛋白質を体内において発現させるために用いられる細胞が含まれる。例えば、本発明の方法により、ある特定の蛋白質を後天的に発現させてモデル動物とすることが可能である。該方法を用いれば、病態発症因子もしくは悪性化因子を後天性に発現する病体モデル動物の作製が可能であり、該動物を用いて薬物をスクリーニングすることも可能となる。また、病態改善因子を発現させれば、当該因子が病態を改善するという新薬探索の作業仮説の証明にも利用できる。動物としては、所望の非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物（げっ歯類、霊長類などを含む）が用いられる。
本発明の初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞は、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持している。「安定に保持する」とは、細胞分裂に伴い、外来遺伝子が娘細胞に受け継がれることを言い、より具体的には外来遺伝子が細胞の染色体に組み込まれていることを言う。本発明の遺伝子治療用脂肪細胞は、好ましくは外来遺伝子が染色体組み込み型のウイルスベクターにより安定に導入されている。より好ましくは、外来遺伝子がレトロウイルスベクターにより導入されている。
レトロウイルスベクターは、細胞の染色体に安定にインテグレートされ導入遺伝子を長期間にわたって発現する能力を有しているが、導入効率および導入遺伝子の発現の持続性は細胞種に依存している。例えば、レトロウイルスベクターにより導入した遺伝子は、細胞が増殖している間は発現が持続するが、細胞の増殖が止まると発現が停止することがある（Ｌｕｎｄ  ＡＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  １９９６；３：３６５−３７８；Ｎｉｗａ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ，３２：１１０５−１１１３）。外来遺伝子の発現の抑制は、特にインビボまたはエクスビボにより体内に遺伝子を導入した後にしばしば観察される。このような発現抑制には、導入遺伝子のプロモーターまたはコード配列のｄｅ  ｎｏｖｏのメチル化が関与しているといわれている（Ｊａｈｎｅｒ  Ｄ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９４−５９７，１９８５；Ｃｈａｌｌｉｔａ  Ｐ−Ｍ  ａｎｄ  Ｋｏｈｎ  ＤＢ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：２５６７−２５７１，１９９４；Ｈｏｅｂｅｎ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：９０４−９１２，１９９１）。また導入遺伝子のサイレンシングにはヒストンの脱アセチル化も関与している（Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３７７−３８２，２０００；Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５７９８−５８０３，１９９７）。しかしながら、本発明者らがレトロウイルスベクターを介して初代培養の脂肪細胞に外来遺伝子を導入したところ、驚くべきことに導入遺伝子の発現はインビトロおよびインビボの両方において、極めて安定に持続することが判明した。導入遺伝子の発現は、分化前の脂肪細胞でも、成熟脂肪細胞でも安定しており、インビトロ培養においては実験の全期間である８０日以上にわたって、また体内に移植された場合は実験の全期間である３６０日以上にわたって発現が持続することが確認された。従って、外来遺伝子が安定に導入された初代培養の脂肪細胞は、長期間安定して該遺伝子を発現するインプラントとして利用できることが判明した。
本発明の遺伝子治療用脂肪細胞は、インビトロで、さらに好ましくはインビボにおいて、少なくとも２０日以上にわたって外来遺伝子がコードする蛋白質を有意に発現する能力を有する。有意に発現するとは、例えば外来遺伝子を導入しない場合に比べ、統計学上有意に（例えば有意水準５％またはそれより高い有意性をもって）発現が検出されることである。より好ましくは、本発明の脂肪細胞は、体内に移植された場合、体内において少なくとも３０日以上、より好ましくは４０日以上、より好ましくは５０日以上、より好ましくは６０日以上、より好ましくは８０日以上、より好ましくは１００日以上、より好ましくは１５０日以上、より好ましくは２００日以上、より好ましくは２５０日以上、より好ましくは３００日以上、より好ましくは３５０日以上にわたって、外来遺伝子がコードする蛋白質を有意に発現する能力を有する。
また本発明の遺伝子治療用脂肪細胞は、該細胞が保持する外来遺伝子がコードする蛋白質を、血中に放出させるための細胞として特に有用である。血中に放出させる蛋白質としては、血流中または対象組織の細胞表面で活性を示す所望の分泌蛋白質が含まれ、例えばホルモンおよびサイトカインなどの所望の液性因子および抗体などが例示できる。具体的には、上記のように糖尿病などの治療においてはインスリンおよび／またはグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １；ＧＬＰ−１）等の血糖降下ホルモン、血友病などの治療においては血液凝固因子、ＴＮＦ−αが亢進する慢性関節リュウマチなどの治療においてはＴＮＦ−α受容体の可溶化断片または抗ＴＮＦ−α抗体（ＦａｂおよびｓｃＦｖ等の抗体可変領域を含む抗体断片を含む）人工可溶化などが挙げられる。例えばインスリンであれば、効率よく成熟型インスリンを産生できるように開裂部位（ｓｉｔｅ１およびｓｉｔｅ２）を脂肪細胞内で発現するプロテアーゼの開裂配列に置換することができる（例えばＧｒｏｓｋｒｅｕｔｚ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ，１９９４，２６９（８），６２４１）。また、単鎖型に改変したインスリンアナログを使用することもできる（Ｌｅｅ  ＨＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００  Ｎｏｖ  ２３；４０８（６８１１）：４８３−８．）。ＧＬＰ−１としては、ＧＬＰ−１受容体（ＮＰ＿００２０５３，Ｔｈｏｒｅｎｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４２，１６７８−１６８２（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３，１９０７−１９１０（１９９３）；Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６，１４１−１４６（１９９３）；Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４２，１２１５−１２１８（１９９３））のリガントとして作用する所望のペプチドを用いることができるが、例えばＧＬＰ−１（７−３７）などが挙げられる（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９８，４７：１５９−６９；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００１，１４２：５２１−７，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．，２００１，７：１３９９−４１２，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００２，１２２：５３１−４４）。
また本発明は、以下の工程、
（１）脂肪細胞を初代培養する工程、
（２）細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入、好ましくはレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターにより導入し、安定に保持させる工程、
を含んでなる遺伝子治療用脂肪細胞を作製する方法、および、この方法により作製された遺伝子治療用脂肪細胞、に関する。安定に保持させるとは、外来遺伝子が細胞分裂に伴って娘細胞に受け継がれるように遺伝子を導入することを言い、より具体的には外来遺伝子を細胞の染色体に組み込むことである。外来遺伝子が染色体に組み込まれ安定発現を獲得したことを分子生物学的に証明するためには、サザンブロット法やゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法などを行うことが出来る。また、安定導入細胞をより濃縮するためには、例えば細胞に目的遺伝子と共に発現させたＧＦＰなどを認識させて濃縮するＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ）などの方法を用いることが出来る。
１．初代培養の脂肪細胞を採取する方法
初代培養の脂肪細胞は杉原らの報告（Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，３１：４２−４９，１９８６）に記載の方法により採取できる。具体的には脂肪組織、好ましくは移植レシピエント自身の皮下脂肪組織、あるいは副睾丸周囲または腸間膜などの内臓脂肪組織より脂肪組織を無菌的に摘出し、例えばＰＢＳで洗浄した後、ハサミあるいは手術用ナイフを用いて細切する。この細切組織を適量の、好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含む培地で３７℃、適当な時間、好ましくは２０〜６０分間震盪消化した後、遠心により沈査と浮遊層に分離する。
浮遊層を、好ましくは更に１〜２回の遠心により洗浄した後、培地を充満した培養フラスコに加える。泡を除き、通常の培養面が天上になるようにＣＯ２インキュベータ内に静置して培養する（天井培養）。適当な期間、好ましくは１０〜１４日間培養後、トリプシン処理によって天井面に接着した細胞を回収し、以降、通常通りの培養系で継代培養する。
初代培養脂肪細胞は遺伝子導入前または後に凍結保存してもよい。これにより、脂肪細胞を一回採取するだけで頻回使用が可能である。
２．脂肪細胞への遺伝子導入
遺伝子導入は、遺伝子導入試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  ６：Ｒｏｃｈｅ社製、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｃｅｌｌｐｈｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（リン酸−カルシウム法）：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製など）、電気的穿孔法（エレクトロポレーション法、Ｃｈｅｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７：２７２（１２），８０２６−３１）、ウイルスベクター（Ｋａｙ  ＭＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００１，７，３３−４０）により行うことが出来る。好ましくはウイルスベクターによる導入であり、更に好ましくはレトロウイルスベクター（Ａｒａｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８：７２，ｐｐ１１１５−２１など）による導入である。
プラスミドにより導入する場合は、プラスミドを脂肪細胞にトランスフェクションした後、導入した外来遺伝子を安定に保持する脂肪細胞を選択することができる。このような選択は、例えば外来遺伝子をコードするプラスミドに薬剤耐性遺伝子を保持させておくか、あるいは薬剤耐性遺伝子を持つプラスミドと共にトランスフェクションを行い、トランスフェクトした細胞を薬剤で選択することにより実施することができる。あるいは、トランスフェクトした細胞を限界希釈によりクローン化することによって得ることができる。またプラスミドにより導入する場合は、染色体への挿入効率を高めるために、ファージ由来のインテグラーゼを一過性に発現させる方法を用いてもよい（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ；２１（１２）：３９２６−３４）。
ウイルスベクターを用いた脂肪細胞への遺伝子導入としては、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）を用いる方法が挙げられる。ＡＡＶとは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルスであり、導入遺伝子が染色体に組み込まれる性質を持つ。２つのｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＩＴＲｓ）の間に外来遺伝子を組み込み、アデノウイルスＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４蛋白質の存在下、ＡＡＶのパッケージング蛋白質（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物）を発現させることで外来遺伝子が取り込まれた組み換えＡＶＶベクターを作製することができる（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，９７−２９；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８，１４８−５４；Ｘｉａｏ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，８０９８−１０８；Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１４０８２−４０８７；Ｘｉａｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０２２２−０２２６）。
本発明においては、より好ましくはレトロウイルスベクターにより外来遺伝子を脂肪細胞に導入する。レトロウイルスとはレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスを言い、オンコウイルス、Ｆｏａｍｙウイルス（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９６；７０：２１７−２２２；Ｗｕ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９；７３：４４９８−４５０１）、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６；２７２：２６３−２６７；Ｐｏｅｓｃｈｌａ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６；９３：１１３９５−１１３９９；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｋｕｍａｒ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７；７１：５８４１−５８４８；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７；１５：８７１−８７５；Ｋｉｍ  ＶＮ，ｅ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８；７２：８１１−８１６）およびネコ免疫不全ウイルス（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９；７３：４９９１−５０００；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９；７３：２４９１−２４９８；Ｐｏｅｓｃｈｌａ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９８；４：３５４−３５７）等）などが含まれる。本発明において用いるレトロウイルスベクターは、好ましくはＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ；ＭｏＭＬＶ）ベクターである（Ｔ．Ｍ．Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９３，５４３−５４８，１９８１）。
レトロウイルスは、自己不活性化型（ｓｅｌｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ；ＳＩＮ）ベクターであってもよい。ＳＩＮベクターは、ウイルスのパッケージングの際に、３’ＬＴＲの一部を欠失させておくことにより作製することができる（Ｙｕ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：３１９４；Ｙｅｅ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５１９７−５２０１；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，９８７３−９８８０）。レトロウイルス中の外来遺伝子はＬＴＲにより転写させることもできるし、ベクター内部の別のプロモーターから発現させてもよい。例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＣＡＧプロモーターなどの構成的発現プロモーター、または所望の誘導性プロモーターを利用することができる。また、ＬＴＲの一部を他のプロモーターに置換したキメラプロモーターを利用してもよい。
レトロウイルスにより遺伝子を導入するには、具体的には、パッケージ細胞、例えば２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、導入したい遺伝子を挿入したプラスミド、例えばｐＢａｂｅ  ＣＬ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを、遺伝子導入試薬等を使って遺伝子導入し、適当な期間、好ましくは１〜３日間培養後、上清中に産生された組換えウイルスを集めて、導入したい脂肪細胞に感染させる。
ヒトを含む哺乳動物の脂肪細胞に広く感染するように、レトロウイルスベクターは広いトロピズムを持つエンベロープ蛋白質を有することが好ましい。例えば、アンフォトロピックエンベロープ蛋白質（例えば４０７０Ａなど）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｋ０２７２９；Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４（９），１７３０−１７３７（１９８４））を用いることができる。本発明においてレトロウイルスは、好ましくは水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）（Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｇａｌｌｉｏｎｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３９（２），５１９−５２８（１９８１））によりシュードタイプ化されている（Ｅｍｉ，Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋ．Ｙｅｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５（３），１２０２−１２０７（１９９１）；Ｙｅｅ，Ｊ．−Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３  ４３：９９−１１２；Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ９０：８０３３−８０３７）。ＶＳＶ−Ｇによりシュードタイプ化することにより、脂肪細胞に高率に遺伝子を導入することができる。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ベクターは、パッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇを発現させることにより作製することができる。具体的には、例えばＶＳＶ−Ｇを誘導発現できるパッケージング細胞（Ａｒａｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８：７２，ｐｐ１１１５−２１など）を好適に利用することができる。
作製したウイルスのタイター測定については、段階希釈したウイルス溶液を感染させ、感染細胞のコロニー数を計数することによって決定することができ、詳細にはＡｕｓｕｂｅｌら（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ））を参照することができる。あるいは、Ｂｙｕｎら（Ｂｙｕｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３３３３３：１０１８−１０２０）、Ｔａｆｕｒｏら（Ｔａｆｕｒｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３３３３３：６７９−６８４）、Ｍｉｙａｏら（Ｍｉｙａｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２０  ２０：１７７−１８３）、Ｃｌａｕｄｉｏら（Ｃｌａｕｄｉｏ，Ｐ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９１：９６−１０１）、またはＣａｓｈｉｏｎら（Ｃａｓｈｉｏｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６  ２６：９２４−９３０）の方法によって決定することもできる。
ウイルスベクターを初代培養脂肪細胞へ導入するには、該ベクターを該細胞に接触させればよい。例えば、ウイルスベクターを含む培養液中で初代培養脂肪細胞をインキュベートする。脂肪細胞は、好ましくは前脂肪細胞の状態で感染させる。０．５〜８μｇ／ｍｌ程度のｐｏｌｙｂｒｅｎｅを添加することで感染効率を上げることができる。多重感染度（ＭＯＩ）は特に制限はないが、０．１〜１００の間で適宜調節できる。遺伝子導入細胞は、例えばマーカー遺伝子を利用して選択してもよいが、ＭＯＩを約２以上、好ましくは約３、４、または５以上で感染させれば、選択しなくても大半の細胞に遺伝子を導入することが可能である。遺伝子導入した脂肪細胞は、そのまま移植に用いることもできるし、場合によっては３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、およびインスリンを含む培地で培養し成熟脂肪細胞とすることも許される。この場合、ＩＢＭＸやＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅは、主に脂肪細胞のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体−γ（ＰＰＡＲ−γ）を活性化するために用いられるので、同受容体を直接活性化する薬剤（例えばチアゾリジン誘導体であるピオグリタゾン／武田薬品やロジグリタゾン／グラクソ・スミスクラインなど）を同時に添加することも許される。
所望の治療遺伝子を持つ本発明の初代培養の脂肪細胞を、免疫学的に適合するレシピエントの体内に移植することにより、該治療遺伝子がコードする分泌蛋白質を体内で発現させることによる遺伝子治療が可能となる。移植する初代培養の脂肪細胞は、好ましくはレシピエントと同一宿主の細胞である。本発明の初代培養の脂肪細胞の移植による遺伝子治療方法は、所望の分泌蛋白質を、その効果を期待して体内において発現させるために適用することができる。例えば疾患に対する治療または予防効果を有する蛋白質をコードする外来遺伝子を保持する本発明の脂肪細胞を移植することにより、該疾患の治療または予防を実施することができる。また本発明は、蛋白質を血中に放出させる方法であって、本発明の初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む方法に関する。本方法によって、少なくとも２０日以上にわたって、好ましくは３０日以上、より好ましくは４０日以上、より好ましくは５０日以上、より好ましくは６０日以上、より好ましくは８０日以上、より好ましくは１００日以上、より好ましくは１５０日以上、より好ましくは２００日以上、より好ましくは２５０日以上、より好ましくは３００日以上、より好ましくは３５０日以上にわたって、外来遺伝子がコードする蛋白質を血中に有意に分泌させることができる。体内で発現した外来蛋白質は、ＥＩＡなどのイムノアッセイ等により検出および／または定量することができる。なお、移植した細胞を取り出すことによって、所望の時期に投与した外来遺伝子の発現を停止させることが可能である。また場合によっては、誘導型自殺遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋなど）を移植細胞に導入しておくことにより、例えばガンシクロビルを投与することによって移植細胞を消去することも可能である。
また本発明は、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞、および薬学的に許容される担体を含む、遺伝子治療用の移植組成物を提供する。用いられる担体としては、例えば生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液、血清、および体液などが挙げられる。また、細胞の足場となる固体またはゲル状の支持体などと組み合わせてもよい。
本発明の移植組成物は、好ましくは細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）成分を含んでいる。細胞外基質成分とは、細胞間に蓄積する不溶性の網状または繊維状構造物に含まれる蛋白質またはムコ多糖などの成分を言い、生物から分離されたもの、および人工的に再構成したものであってよい。好ましくは本発明で用いられるＥＣＭ成分としてはコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、エラスチン、またはその２種以上の組み合わせを挙げることができる。これらのＥＣＭ成分はゲル化させて脂肪細胞と混合させることが好ましい。本発明に用いられるＥＣＭゲルは、上記成分の少なくとも１種以上が含まれていれば特に限定されないが、好ましくは、少なくともＩＶ型コラーゲン、ラミニン、およびヘパラン硫酸を含んでいる。このようなＥＣＭとしては、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍から抽出した基質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社）が挙げられる（米国特許第４，８２９，０００号）。本発明に用いられるＥＣＭ成分および脂肪細胞を含む組成物の構造は特に限定されず、例えばゲル状またはペースト状の網構造、繊維状構造、平板（ディスク）状構造、ハニカム状、スポンジ様構造としてよい。ＥＣＭ成分のゲル化は、常法に従って行うことができる。例えば０．３〜０．５％程度のコラーゲン水溶液を３７℃で１０〜３０分間インキュベーションすることによりゲル化させることができる。あるいは、ゲル化剤を用いてＥＣＭ成分をゲル化させることもできる。
また、本発明の移植組成物は、好ましくは血管新生因子を含んでいる。血管新生因子を含む本発明の移植組成物は、移植後に周囲に血管が形成され、より高い効率で外来蛋白質を血中に分泌することができる。血管新生因子としては、生体内で血管新生を誘導し得る因子であれば特に限定されないが、例えば血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、オステオネクチン（Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）、アンジオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などが例示できる。最も好ましくは、ｂＦＧＦが挙げられる。ｂＦＧＦはＦＧＦ２とも呼ばれ、線維芽細胞の増殖因のみならず、血管内皮細胞、軟骨、骨芽細胞、表皮細胞など様々な細胞の増殖を促進する活性有する（Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５，２５２３−２５２８，１９８６；Ｐｒａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１８３６−１８４０，１９８９）。本発明において用いられるｂＦＧＦとしては、天然の蛋白質のみならず、組み換えＤＮＡ技術により遺伝子工学的に製造されたもの、およびそれらの修飾体であってもよい。ｂＦＧＦとしては、例えばＷＯ８７／０１７２８、ＷＯ８９／０４８３２、ＷＯ８６／０７５９５、ＷＯ８７／０３８８５、欧州特許出願公開第２３７９６６号、欧州特許出願公開第２８１８２２号、欧州特許出願公開第３２６９０７号、欧州特許出願公開第３９４９５１号、欧州特許出願公開第４９３７３７号などに記載のものを例示することができる。あるいは、血管新生因子を一過的に発現する別の発現ベクターを脂肪細胞に導入してもよい（ＷＯ９７／４９８２７参照）。このように用いられる血管新生因子は、本発明の脂肪細胞から外来蛋白質を効率的に血中に分泌させるために、移植細胞周辺に血管を形成されることが主要な目的であるので、血管誘導因子をコードするベクターを用いて脂肪細胞から血管誘導因子を発現させる際には、一過的に発現するベクター（すなわち染色体に組み込まれないベクター）を用いることが好ましい。脂肪細胞から血管誘導因子を長期間発現させると、移植した脂肪細胞周囲に過剰な血管が形成されたり、全身に副作用を及ぼす懸念があるため、本発明の初代培養の脂肪細胞には血管新生因子をコードする外来遺伝子が安定に導入されていないことが好ましい。
３．脂肪細胞の移植
遺伝子導入した脂肪細胞は、適当な細胞濃度、好ましくは０．２ｘ１０７〜２ｘ１０７／ｍｌ、レトロウイルスベクターで導入した場合は０．２ｘ１０６〜５ｘ１０６／ｍｌに調整し、単体のまま、ないしは効果的な媒体、好ましくはコラーゲンなどの細胞外基質を含む溶液などと混合し、皮下組織や脂肪組織、好ましくは皮下組織内に注入する。脂肪組織への注入は切開して脂肪組織を露出させて行っても良い。成熟脂肪細胞に最終分化させた細胞は、移植後に増殖することなく外来遺伝子を長期間一定のレベルで発現する。移植した体内における外来遺伝子の発現レベルは、移植細胞数に比例することから、移植にあたっては、あらかじめインビトロで測定した外来遺伝子の発現レベルに従って移植する脂肪細胞量を調節すれば、移植した体内で望みの発現量を長期間維持することが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］マウス脂肪細胞の初代培養
［方法］
３週齢のＩＣＲ系雄性マウスあるいは４−５週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（いずれもチャールズリバー）をジエチルエーテルで麻酔し、心臓からの全採血により脱血死させた。ついで、鼠蹊部皮下脂肪、あるいは副睾丸周囲脂肪、腸管膜脂肪組織をそれぞれ無菌的に摘出した。摘出した組織をＰＢＳで洗浄した後、ハサミあるいは手術用ナイフを用いて細切し、この細切組織を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓ１  ｆｒｕｃｔｉｏｎ／新田ゼラチン）を含む通常培地（ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ／ＳＩＧＭＡ，１０％ＦＣＳ）で３７℃、２０−６０分間震盪消化した後、遠心（３００ｇ，５ｍｉｎ．）により沈査と浮遊層に分離した。
浮遊層はさらに１〜２回の遠心によりコラゲナーゼを希釈除去後、培地を充満したＴ−２５フラスコ（ＩＷＡＫＩ）に加えた。泡を除き、通常の培養面が天上になるようにＣＯ２インキュベータで３７℃、５％ＣＯ２で培養した（天井培養）。１０〜１４日間培養後、トリプシン処理により天井面に接着した細胞を回収し、通常通りの培養系に移した。以後、１：３〜１：１０のｒａｔｉｏで継代培養をおこなった。
分化誘導は、６ｗｅｌｌプレートでコンフルエントに培養した細胞を誘導培地（０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ，０．２５μＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，１０μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎを添加した通常培地）に交換し４８時間刺激した。ついで、成熟培地（１０μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎを添加した通常培地）で培養することにより分化を誘導した。成熟培地は３日置きに交換した。
Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色液は、０．３ｇのＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏを１００ｍｌのイソプロパノール（９９％）に混和した保存溶液と蒸留水を３：２の割合で使用時に混和した。細胞はＰＢＳで洗浄した後に１０％中性ホルマリン液（ＷＡＫＯ）で固定した。ＰＢＳで再度洗浄後、Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色液により室温で１０分間染色した。ＰＢＳにて再度洗浄後に検鏡した。
［結果］
３週齢のＩＣＲマウス皮下脂肪より単離した初代培養脂肪細胞の顕微鏡写真を図１に示す。天井培養１４日後の天井側培養面に脂肪滴を有する脂肪細胞の接着を認めた（Ａ）。これを通常培養系に移すと（Ｂ）のように繊維芽細胞様に増殖するが、ＩＢＭＸ、デキサメサゾン、インスリンにより分化を誘導すると再び脂肪滴を有する成熟脂肪細胞に分化した（Ｃ）。貯留された脂肪はＯｉｌｒｅｄ  Ｏ染色によって赤色に染色された（Ｄ）。本手段により単離される細胞が、分化能を有する初代培養脂肪細胞であることを示した。
［実施例２］初代培養脂肪細胞への耐熱性分泌型アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）遺伝子の一過性導入と、導入脂肪細胞のマウスへの移入
遺伝子発現のモデル系として、ＡＰ遺伝子、すなわちＳＥＡＰ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＰＬＡＰ遺伝子（Ｇｏｔｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｖｏｌ．４９  ８６０−８７３（１９９６））を初代培養脂肪細胞に導入しＡＰ活性の推移を検討した。（両ＡＰ遺伝子産物は耐熱型で、熱処理後することにより、内在性アルカリフォスファターゼと容易に区別することができる。）
［方法］
（１）ＳＥＡＰ遺伝子を一過性に導入した初代培養脂肪細胞の作製
ＡＰを発現するｐｌａｓｍｉｄ（ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＥＡＰｍｈ）は、ｐＳＥＡＰ２−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｘｂａ  Ｉで二重消化して得られるＳＥＡＰ配列を、哺乳類細胞発現用ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｘｂａ  Ｉ部位に挿入して構築した。
１０ｃｍ  ｄｉｓｈへの遺伝子導入あたり５００μｌのＦＣＳ−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ培地と１５μｌのＦｕｇｅｎｅ  ６試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）を混合し、ついで５μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＳＥＡＰｍｈを加え、室温にて１５分間静置した。この混合液を、１０ｃｍ  ｄｉｓｈで７０〜８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに培養した初代培養細胞（ＩＣＲ皮下脂肪由来）に加え、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
（２）アルカリフォスファターゼ遺伝子を導入した初代培養脂肪細胞のマウスへの移入
遺伝子導入した細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで２回遠心洗浄後１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した。動物（ＩＣＲ系ヌードマウス、術時５週齢）は、ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール・大日本製薬）５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与により麻酔した。術部付近を希釈ヒビテン液（住友製薬）にて消毒後、右後肢付け根付近の皮膚を３〜５ｍｍ程度切開し、鼠蹊部皮下脂肪を露出させた。調製した細胞懸濁液０．５５ｍｌ（５．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ）を１ｍｌシリンジにて準備し、２２Ｇ注射針を用いて皮下脂肪内に注入した。対照として、コントロールにはＰＢＳを同部位に注入した。また、蛋白補充法と比較するため、精製ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）１μｇをＰＢＳに無菌的に溶解し、同様に注入した。切開した皮膚を縫合し、術部を手術用イソジン（明治製菓）で消毒した。
移植前（０日）、及び移植後経日的にヘパリンコートのキャピラリー（Ｄｒａｍｏｎｄ）を用いて眼底静脈叢より採血した。全血から２０００ｇ、１５分間の遠心によりｐｌａｓｍａを得た。このｐｌａｓｍａ中のＡＰ活性を、測定キット（ＳＥＡＰ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って測定した。
［結果］
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＥＡＰｍｈを一過性に導入した初代培養細胞をマウスに移植して得られた血漿中ＡＰ活性を図２に示す。比較対照として投与した１μｇの精製ＡＰ蛋白（Ｒｏｃｈｅ）の注入では、血中ＡＰ活性は投与後７日の時点で対照レベルまで低下した。一方、一過性遺伝子導入細胞移植マウスでは、移植後４日目をピークとした血中ＡＰ活性が確認され、発現期間は１４日間であった。一過性に遺伝子導入された細胞移植によるインビボでの発現は、蛋白の注入よりもやや持続するものの期間が短く、血中濃度の変動も大きいことを明らかにした。
［実施例３］ウィルスベクターを用いた、ＡＰを安定に発現する脂肪細胞の作製
［方法］
（１）ＡＰ、および対照であるＧＦＰ発現ベクターの構築
ＰＬＡＰ遺伝子は文献（Ｇｏｔｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｖｏｌ．４９  ８６０−８７３（１９９６））に記載のｐＴＫ−ＰＬＡＰからＨｉｎｄ  ＩＩＩ，Ｂｇｌ  ＩＩを用いて切り出した。ＳＥＡＰ遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１−ＳＥＡＰｍｈをＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｐｍｅ  Ｉで二重消化して得た。ＧＦＰ遺伝子はｐＥＧＦＰ−Ｎ２からＮｏｔ  Ｉ−Ｎｃｏ  Ｉにより切り出した。
ウィルスベクター作製に用いるプラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇは、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１８  ３５８７−３５９６（１９９０））を基として、そこからＳＶ４０プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子をＳａｌ  Ｉ−Ｃｌａ  Ｉにより切り出した後Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化し、そこへｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰよりＨｉｎｃ  ＩＩ−Ｈｉｎｃ  ＩＩにより切り出した脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＥＭＣＶ））のＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｒｅ−ｒｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）とＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に置換するとともに、さらにそのＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）から外来遺伝子挿入部分（マルチクローニングサイト）までの部分（Ｓｓｐ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ）をｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ）の相当する配列（Ｓｓｐ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ）と置換することにより作成したものである。またｐＢａｂｅＣＬＸＩ２ＧのＩＲＥＳ−ＧＦＰの部分をＩＲＥＳ−ピューロマイシン耐性遺伝子に置換したｐＢａｂｅＣＬＸＩＰも用いた。
上述したＰＬＡＰ、ＳＥＡＰ、ＧＦＰそれぞれのＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ  ｇｒａｇｍｅｎｔによる平滑処理後、Ｈｐａ  Ｉにより切断したｐＢａｂｅＣＬＸＩＰベクターないしはｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇに挿入し、それぞれｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ、ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＥＡＰｍｈ）Ｉ２Ｇ、ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＦＰ）ＩＰを得た。
（２）ウィルスベクターの作製
１０ｃｍ  ｄｉｓｈへの遺伝子導入あたり以下のように行った。５００μｌのＦＣＳ−ｆｒｅｅのＤＭＥＭ培地にｐｌａｓｍｉｄ導入試薬ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ）３０μｌを混合し室温にて５分間放置した（ＤＭＥＭ／ＴｒａｎｓＩＴ混合液）。また別のｔｕｂｅにＶＳＶ−Ｇをコードするベクター（ｐＣＡＬＧ、Ａｒａｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８：７２，ｐｐ１１１５−２１より改変）３．３μｇ、Ｇａｇ・Ｐｏｌをコードするベクター（ｐＣＬＡｍｐｈｏ／ＲｅｔｒｏＭａｘ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＥＮＥＸ））３．３μｇ、及びパッケージシグナルと導入遺伝子を含むベクター（ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ、あるいはｐＢａｂｅＣＬ（ＳＥＡＰｍｈ）Ｉ２Ｇ、あるいはｐＢａｂｅＣＬ（ＧＦＰ）ＩＰ）３．３μｇの合計９．９μｇを混合した（ｐｌａｓｍｉｄ液）。ＤＭＥＭ／ＴｒａｎｓＩＴ混合液にｐｌａｓｍｉｄ液を加えよく混合した後に、さらに室温にて１５分放置した後、前日に２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈで用意し一晩培養した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加した。
添加８時間後に培地を交換し、さらに２日間培養後に培養上清を回収した。回収した培養上清は、夾雑物を除去するため遠心（３００ｇ、５ｍｉｎ）ないしは０．４５μｍシリンジフィルター（ミリポア社製）により濾過し、この上清をウィルス液として使用した（それぞれ、ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ、ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＥＡＰｍｈ）Ｉ２Ｇ、ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＦＰ）ＩＰ）。一部のウィルス液は超遠心（１９，５００ｒｐｍ、１００分）により濃縮して使用した。
（３）初代培養脂肪細胞への遺伝子導入と培養
遺伝子導入に用いる脂肪細胞（ＩＣＲマウス皮下脂肪由来、同副睾丸周囲脂肪由来、同腸間膜脂肪由来、Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下脂肪由来）は、導入前日に５０−８０％コンフルエントになるよう６ｗｅｌｌまたは９６ｗｅｌｌのプレートに準備した。培地をすて、４μｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（ＳＩＧＭＡ）液とウィルス液を等量ずつ細胞に添加することによりウィルスベクターを導入した。導入８時間後に通常培地に交換しさらに培養および継代培養を行った。一部の細胞については、導入４日目の時点で２４時間の培養上清を回収しＡＰ活性を測定した（図３）。
継代培養は１０ｃｍ  ｄｉｓｈスケールで実施例１に記載した方法に準じて行い、４〜７日間培養してコンフルエントに達したら培地を替え、１７時間後の培養上清中のＡＰ活性を測定した。この細胞を継代し続け、適宜同様の操作を行って発現の持続を検討した（図５、６）。なおすべての継代日にＡＰ活性を測定したわけではない。
分化誘導は６ｗｅｌｌプレートで実施例１に記載した方法に準じて行った。ただし、誘導培地で３日間処理し、以後成熟培地を３日ごとに交換した。培養上清中のＡＰ活性は各３日間ごとの培養上清を用いて測定し、図の横軸は上清を回収した日で表した。ＧＦＰ導入細胞については適宜ＧＦＰ光下での顕微鏡写真を撮影した（図４、６）。なお、非分化誘導条件とは、誘導培地・成熟培地のかわりに通常培地で培養しつづけた条件を意味する。
［結果］
図３は、レトロウィルスベクターを用いた場合の、組織由来細胞ごとの遺伝子導入効率の比較を示す図である。ＩＣＲマウスの鼠蹊部皮下、副睾丸周囲、腸間膜に存在する各脂肪組織からそれぞれ単離した初代培養脂肪細胞に遺伝子導入を行ったところ、いずれの細胞においても培養上清中にＡＰ活性を認めた。該レトロウィルスベクターによる遺伝子導入は、由来部位に依存せず可能であることを明らかにした。
図４は、ＧＦＰ発現レトロウィルスベクターを導入した細胞の分化誘導像を示す顕微鏡像である。遺伝子導入１３日後に分化誘導を開始し、３週間経過後に写真を撮影した。脂肪滴を含む細胞にＧＦＰの蛍光が観察され、該ウィルスベクターが分化能を有する前脂肪細胞に遺伝子導入可能であること、かつ該ベクターによる遺伝子導入が分化能に影響をおよぼさないことを明らかにした。
図５は、ＡＰ発現ウィルスベクターを導入した初代培養脂肪細胞の継代培養における発現の持続性を示す図である。１０ｃｍ  ｄｉｓｈでコンフルエントに達した細胞の、１７時間後の培養上清中のＡＰ活性を測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下脂肪由来の初代培養脂肪細胞（Ａ）では検討した８７日間にわたって、ＩＣＲマウス皮下脂肪由来の初代培養脂肪細胞（Ｂ）では検討した６３日間にわたって、持続的なＡＰ産生を認めた。これらの結果から、該ウィルスベクターの初代培養脂肪細胞への導入により、分裂後の娘細胞にも外来遺伝子が保持される安定発現細胞の作製が可能であることを明らかにした。
図６は、分化誘導した遺伝子導入脂肪細胞における発現の変化を示す写真および図である。ＩＣＲ皮下脂肪由来のＧＦＰ発現脂肪細胞は、通常培養下（Ａ）および分化誘導下（Ｂ）のどちらでも強いＧＦＰ発現が観察された。また、ＩＣＲ皮下脂肪由来のＡＰ発現脂肪細胞は、非分化誘導下（非分化）および分化誘導下（分化）のいずれにおいても、持続的なＡＰの発現が検出された（Ｃ）。該ウィルスベクターにより遺伝子導入された初代培養脂肪細胞は、図５に明示した増殖下のみならず、非分化誘導下すなわち非増殖状態や成熟下といったいずれのフェーズにおいても安定に遺伝子発現を示すことを明らかにした。
［実施例４］プラスミドベクターを用いたインスリン安定発現脂肪細胞の作製
遺伝子の導入法は、プラスミドベクターを用いた方法も許容される。
［方法］
（１）ヒトインスリン遺伝子の単離と修飾
ヒト膵臓由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対し、表１に示したプライマー（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＦｗおよびＲｖ）を用いてＰＣＲ反応を行い、ヒトインスリン遺伝子断片を得た。得られた３５４ｂｐの断片について塩基配列を同定し、ｎａｔｉｖｅインスリンとして、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。
2003106663.tif 000002
ついで、脂肪細胞で成熟インスリンを発現させるために、文献（ＪＢＣ，１９９４，２６９（８），６２４１−）に基づいて遺伝子改変を行った。具体的には、ヒトインスリンＢ鎖とＣペプチドの結合部（ｓｉｔｅ１）および同ＣペプチドとＡ鎖の結合部（ｓｉｔｅ２）、およびＢ鎖１０番目のヒスチヂン残基（Ｂ１０）それぞれの変異をふくむ両方向のプライマーをそれぞれ合成し（表１）、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により変異体を得た。この反応をｓｉｔｅ１およびｓｉｔｅ２に対して行ったものをｓ１ｓ２変異体、ｓｉｔｅ１、ｓｉｔｅ２およびＢ１０に対して行ったものをｓ１ｓ２Ｂ１０変異型インスリンとした。得られた改変型ヒトインスリン遺伝子について塩基配列を確認し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに組み込んで遺伝子導入に用いた。
（２）初代培養脂肪細胞への遺伝子導入
５００μｌのＦＣＳ−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ培地と１５μｌのＦｕｇｅｎｅ  ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を混合し、ついで導入プラスミド５μｇを加え、室温にて１５分間静置した。この混合液を、１０ｃｍ  ｄｉｓｈで７０〜８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに培養した初代培養細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス副睾丸周囲脂肪組織由来）に加え、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。遺伝子導入４日後に細胞をＴ２２５フラスコに継代し、一晩培養した後に０．２ｍｇＵ／ｍｌのＧ４１８（ＳＩＧＭＡ）を含む培地に交換し３週間培養して遺伝子導入細胞を選択した。得られたＧ４１８耐性細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈにまき、培養上清中のインスリンを超高感度インスリンＥＩＡキット（森永）により測定した。なお、本ＥＩＡキットは、プロセシングされる前のプロインスリンと成熟インスリンをともに検出する。
［結果］
図７は、初代培養脂肪細胞へのプラスミド導入による（プロ）インスリン産生を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス副睾丸周囲脂肪組織由来の脂肪細胞に、ｎａｔｉｖｅヒトインスリン遺伝子（ｎａｔｉｖｅ）、あるいはｓｉｔｅ１／ｓｉｔｅ２／Ｂ１０改変型（ｓ１ｓ２Ｂ１０）をそれぞれ組み込んだｐｅＤＮＡ３．１Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターまたは空ベクター（ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした。Ｇ４１８選択して得られた耐性細胞の培養上清中にヒト（プロ）インスリンが検出された。初代培養脂肪細胞に対する安定遺伝子導入は、プラスミドベクターによっても可能であることを示した。
［実施例５］アデノ随伴ウィルスを用いた、ＡＰ安定発現脂肪細胞の作製
遺伝子の導入法は、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）を用いた方法も許容される。
［方法］
ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて検討した。実施例２に記載したＰＬＡＰ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＢｇｌＩＩを用いて切り出した断片）をｐＡＡＶ−ＭＣＳベクターの同制限酵素サイトに挿入しｐＡＡＶ−ＰＬＡＰを得た。
ＡＡＶベクターの作製は以下のように行った。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．７５ｍｌとｐｌａｓｍｉｄ導入試薬Ｆｕｇｅｎｅ  ２２０μｌを混合し、ついでｐＡＡＶ−ＰＬＡＰ、ｐＡＡＶ−ＲＣ、ｐＨｅｌｐｅｒをそれぞれ２５μｇずつ混合して、室温にて１５分放置した（Ｆｕｇｅｎｅ／ｐｌａｓｍｉｄ液）。一方２９３−ＥＢＮＡ細胞を、１５ｃｍ  ｄｉｓｈで６０−７０％コンフルエント状態になるよう用意した。培養液をＦＣＳ−ｆｒｅｅのＤＭＥＭに置換し、そこにＦｕｇｅｎｅ／ｐｌａｓｍｉｄ液を均等に滴下して２−３時間培養した。ついで終濃度１０％となるようＦＣＳを添加し、さらに２日間培養した。細胞をトリプシン処理にて回収し遠沈させた後、最終用量が３ｍｌになるよう５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に懸濁した。この懸濁液に対しドライアイス−エタノール／３７℃の凍結／融解を３サイクル行うことで細胞を破砕した。さらにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）により宿主ゲノムＤＮＡを分解した後に９，０００ｒｐｍ、３０分の遠心を行い、上清をフィルターろ過してウィルス液とした。
初代培養脂肪細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下脂肪由来）は、遺伝子導入前日に１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまき、一晩培養後、４０ｍＭのＨｙｄｒｏｘｙｕｒｅａおよび１ｍＭのＢｕｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（いずれもＳＩＧＭＡ）を含む培地で６時間処理した。この培地を除いた後、ＦＣＳ−ｆｒｅｅのＤＭＥＭで１／１００に希釈したウィルス液を０．５ｍｌ／ｗｅｌｌで添加した。１時間培養後、終濃度１０％となるようＦＣＳ含有培地を添加し、一晩培養した。以後、通常の培地交換を行い、２４日目に継代した。
導入１、７、２５日目に培地を交換し、それぞれ２日後の培養上清をＡＰ測定に用いた。６５℃で２０分間加温し、必要に応じて希釈した培養上清１０μｌに、５０μｌのアッセイバッファー（１６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３，０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４）と、５０μｌのルミステイン試薬（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  ＳａｐｐｈｉｅｒＩＩ，ＴＲＯＰＩＸ）を混和し遮光下で３０分間反応させ、ルミノメーターで測定した。
［結果］
図８は、ＡＰ発現ＡＡＶを導入した初代培養脂肪細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下脂肪由来）における、ＡＰの安定発現を示す図である。培養上清中のＡＰ活性は、全試験期間を通して持続的に検出された。初代培養脂肪細胞に対する安定遺伝子導入は、ＡＡＶベクターによっても得られることを示した。
［実施例６］ヒトインスリンを発現するレトロウィルスベクターの構築と脂肪細胞への導入
［方法］
実施例４で構築したヒト改変型インスリン遺伝子（ｓ１ｓ２Ｂ１０Ｉｎｓ）を、実施例３の方法に準じてｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇベクターに挿入した（ｐＢａｂｅＣＬ（ｓ１ｓ２Ｂ１０Ｉｎｓ）Ｉ２Ｇ）。このプラスミドを、ＶＳＶ−Ｇをコードするベクター（ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ／Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｇａｇ・Ｐｏｌをコードするベクター（ｐＶＰａｃｋ−ｇｐ／Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより改変）とともに、２９３−ＥＢＮＡ細胞に実施例３の方法に準じて導入し、改変型インスリン発現レトロウィルスベクターを作製した（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ｓ１ｓ２Ｂ１０Ｉｎｓ）Ｉ２Ｇ）。１０ｃｍ  ｄｉｓｈ  ２２枚の２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養上清（約２００ｍｌ）を回収し、遠心／フィルター処理により不溶物を除いた後に超遠心（１９，５００ｒｐｍ、１００分）により濃縮ウィルス液を得た。これを、前日に６ｗｅｌｌプレートにまいた初代培養脂肪細胞（Ｃ５７ＢＬ／６皮下脂肪由来）に導入した。
遺伝子導入細胞を６ｗｅｌｌプレートにまきなおし、実施例１の方法に準じて分化を誘導した。誘導前３日から誘導開始日の３日間（誘導前）、および誘導１４日目から１７日目の３日間（誘導後）の培養上清をそれぞれ回収して、実施例４と同じ方法でインスリン量を測定した。また、目的の部位でプロセシングが起こり成熟インスリンが生成されていることを確認するために、成熟インスリンのみを認識するインスリンＥＩＡキット（ＩＢＬ）の測定も行った。対照は、同時に分化誘導した非遺伝子導入細胞の培養上清を用いた。
［結果］
図９は、ｓ１ｓ２Ｂ１０インスリン発現レトロウィルスベクターを導入した初代培養脂肪細胞における、分化誘導時のインスリン発現を示す図である。（Ａ）森永製ＥＩＡによる結果、（Ｂ）ＩＢＬ製ＥＩＡによる結果、をそれぞれ示す。インスリンは、分化誘導前または分化誘導後のいずれにおいても安定に分泌されること、変異型インスリン遺伝子導入によって脂肪細胞から成熟インスリンを産生し得ること、を明らかにした。
［実施例７］ヒトｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１（ＧＬＰ−１）を発現するレトロウィルスベクターの構築と脂肪細胞への導入
ＧＬＰ−１は摂食時に小腸Ｌ細胞から産生され、膵β細胞に作用してインスリン分泌を刺激する作用を有するペプチドである。その他にも、膵β細胞の再生作用や食欲抑制作用、胃排泄抑制作用など、抗糖尿病・抗肥満の多様な作用を有することが明らかにされている（Ｍｅｉｅｒ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，１２；４４０（２−３）：２６９−７９、Ｄｒｕｃｋｅｒ  ＤＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００２；１２２（２）：５３１−５４４）。このペプチドはプレプログルカゴン遺伝子から産生されるポリペプチドから組織特異的プロセシングにより生じる、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列として７番から３７番（ないし３６番のアミド体）のペプチドが主な薬理活性を有することが知られている（Ｄｒｕｃｋｅｒ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７  Ｍａｙ；８４（１０）：３４３４−３４３８、Ｋｒｅｙｍａｎｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９８７，５；２（８５７１）：１３００−１３０４、Ｍｏｊｓｏｖ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７  Ｆｅｂ；７９（２）：６１６−６１９）。この因子を脂肪細胞から産生させるべく以下のような検討を行った。
［方法］
実施例３で用いたＰＬＡＰ遺伝子のシグナルペプチド（１７アミノ酸）にヒトＧＬＰ−１（７−３７）とストップコドンをつないだ配列（コード配列を配列番号：１０に示す）を含む計１５６ｂａｓｅ  ｐａｉｒの塩基の配列を設計し、中央に２２ｍｅｒのオーバーラップを持つようにヌクレオチドを合成した（表１中  ｓＰＬ−ＧＬＰ−１ＦｗおよびｓＰＬ−ＧＬＰ−１Ｒｖ）。これをアニーリングさせＰｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により二重鎖にさせた後、５’端、３’端のプライマー（表１のＧＬＰ−５’およびＧＬＰ−３’）を用いたＰＣＲにより目的断片を増幅した。この断片をｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングした後に制限酵素で切り出し、実施例３と同様にｐＢａｂｅＣＬＸＩ２Ｇベクターに挿入した（ｐＢａｂｅＣＬ（ｓＰＬ−ＧＬＰ１）Ｉ２Ｇ）。これを実施例６と同様の方法で２９３−ＥＢＮＡ細胞に導入して、ＧＬＰ−１発現レトロウィルスベクターを作製した（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ｓＰＬ−ＧＬＰ−１）Ｉ２Ｇ）。１０ｃｍ  ｄｉｓｈ９枚の２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養上清（約９０ｍｌ）を回収し、遠心／フィルター処理により不溶物を除いた後に超遠心（１９，５００ｒｐｍ、１００分）により濃縮ウィルス液を得た。これを、前日に６ｗｅｌｌプレートにまいた初代培養脂肪細胞（Ｃ５７ＢＬ／６皮下脂肪由来）に導入した。導入した脂肪細胞を１２ｗｅｌｌプレートにまきなおし、実施例１の方法に準じて分化誘導した。非誘導とは、誘導培地・成熟培地のかわりに通常培地で培養しつづけた条件を意味する。７日後に、１ｍＭのＶａｌｉｎｅ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ（ＧＬＰ−１分解酵素阻害剤、エーザイ（株）にて合成）を含むＦＣＳ−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ培地に交換した。１８時間後に培養上清を回収し、活性型ＧＬＰ−１（７−３７）量をＥＬＩＳＡ法（ＬＩＮＣＯ）により測定した。
［結果］
図１０は、ＧＬＰ−１（７−３７）発現レトロウイルスベクターを導入した初代培養脂肪細胞における発現を示す図である。非分化誘導および分化誘導後の脂肪細胞の培養上清に、ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍであるＧＬＰ−１（７−３７）の発現が認められた。プレプロタイプで産生されプロセシングによって切り出されるような因子であっても、本法によって、その因子のみを脂肪細胞から産生させ得ることを明らかにした。
［実施例８］ＡＰ安定発現細胞のマウスへの移植（試験１）
［方法］
実施例３の方法で作製したＡＰ発現脂肪細胞（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ導入、Ｃ５７ＢＬ／６皮下脂肪由来）をコンフルエントに培養した後、トリプシン処理により回収しＰＢＳで洗浄した後に、５ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように氷温下のマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に懸濁した。これをＣ５７ＢＬ／６マウス（術時８週齢、チャールズリバー）の背部皮下（Ｓｃ）にマウス一匹あたり０．２ｍｌの用量（１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ）を注入することにより移植した（分化誘導なし）。一方、同細胞をコンフルエントに培養した後、実施例１に示す誘導培地で３日間培養後、同様の処理を行い移植した（分化誘導あり）。実施例２に示す方法で経日的に採血を行い、血漿中のＡＰ活性を測定した。
［結果］
図１１は、ＡＰ発現初代培養脂肪細胞を移植したマウスにおける、血漿中ＡＰ活性の推移を示す図である。いずれの移植法によっても約５０日間の全試験期間にわたって発現の持続を認めたが、移植前に３日間の分化誘導刺激を与えてから移植した個体（分化誘導あり）の方が、誘導なしで移植した個体に比べ、少ない変動幅で持続した。分化誘導刺激を与えることによって、移植後の生存率を改善し得る可能性を示した。
［実施例９］ＡＰ安定発現細胞のマウスへの移植（試験２）
［方法］
（１）移植
実施例３で作製したＡＰ発現脂肪細胞（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ導入、ＩＣＲ皮下脂肪由来）をコンフルエントに培養した後、トリプシン処理により回収しＰＢＳで洗浄した後に、５ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように１μｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ）を添加した氷温下のマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に懸濁した。これをＩＣＲ系ヌードマウス（術時６週齢、チャールズリバー）の背部皮下（Ｓｃ）、鼠蹊部皮下脂肪内（ｆａｔ）、腹腔内（ｉｐ）の各部位にマウス一匹あたり０．２ｍｌの用量（１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ）を注入することにより移植した。対照として、ＧＦＰ発現脂肪細胞を同様に処理し皮下に移植した。
またＡＰ発現細胞の一部は、実施例１に示す誘導培地で３日間培養した後に、同様に回収し移植した（Ｄｉｆ）。また一部は誘導培地の後さらに成熟培地で４日間培養し、同様に回収して移植した（Ｍａｔ）。
またＡＰ発現細胞の一部は、移植と同条件（１ｘ１０６／０．２ｍｌマトリゲル−ｂＦＧＦ添加）で８ｗｅｌｌ−Ｌａｂｔｅｃｋチャンバー（Ｎｕｎｃ）にまき、３７℃で加温することによって固形化した。この固形化ゲルをマウスの皮下に挿入することで移植した。このとき、固形化後に通常培地で培養したものをｐｒｅ−ｆｉｘｅｄ（ｐｆ）／ｇｒ、分化誘導培地で培養したものをｐｆ／ｄｉｆとし、７日間培養後に移植を行った。
移植前（０日）、及び移植後経日的に実施例２の方法に準じてｐｌａｓｍａ中のＡＰ活性を測定した。
（２）摘出
分化誘導後に移植した群（Ｄｉｆ／Ｓｃ）のうち、個体Ａについては移植５週後に、個体Ｂについては移植４３週目に、それぞれ移植細胞塊をマトリゲルごと摘出した。対照群の一例についても、移植５週目に摘出した。それぞれ、５０ｍｇ／ｋｇのネンブタールを腹腔内投与して麻酔した後に皮膚を切開して、肉眼的に確認しえた移植マトリゲル片を切除した。手術部位は縫合しイソジン（明治）にて消毒し、以後同様に飼育し経日的に採血を行った。
［結果］
図１２（Ａ）は、ＡＰ発現初代培養脂肪細胞を、分化刺激有り・かつｂａｓｉｃ  ＦＧＦ添加マトリゲルを用いて移植した際（Ｄｉｆ／Ｓｃ群）の、血漿中ＡＰ活性の推移を５０日間検討した結果である。血中ＡＰ活性は約５倍の範囲で４９日間にわたって安定に推移した。移植時のｂＦＧＦ添加により、移植後の生着率をより改善し得ることを示した。また（Ｂ）は、同期間内において、移植マトリゲルの摘出による血漿中ＡＰ活性の消失（個体Ａ）を示す図である。ＰＬＡＰ導入群の平均値に比べ、摘出個体では著明なＡＰ活性の低下が認められ、血中ＡＰは移植細胞由来であること、また移植片の摘出により遺伝子発現は速やかに消去可能であること、を明らかにした。このとき、対照であるＧＦＰ導入細胞移植群からも一部摘出を行ったところ、摘出マトリゲル中にＧＦＰ陽性細胞を認め、かつその多くは図６（Ｂ）のように空胞像を呈した（Ｃ）。該方法により移植した初代培養脂肪細胞が、成熟脂肪としてインビボで生着する可能性を示した。
図１３は、図１２（Ａ）における移植マウス、およびその他さまざまな方法で移植したマウスの血中ＡＰ活性をより長期にわたって検討した結果である。ＰＬＡＰ導入細胞の移植群では、いずれの移植部位・移植法によっても明確な血中ＡＰ活性の上昇を認めた。血中ＡＰ活性は長期にわたって持続し、特ににＤｉｆ／Ｓｃ群（図１２（Ａ）に例示した群）は試験期間の１年にわたって安定なＡＰ発現が認められた。その他の移植法においても、いずれも試験期間内（ｉｐ群では３１６日、ｆａｔ群では５４日、Ｓｃ群では２２５日、Ｍａｔ／Ｓｃ群では３１７日、ｐｒｅ−ｆｉｘの２群では３１４日）において持続的にＡＰ産生が認められた。移植後１週以内に認められる活性のピークはｉｐ群が最も高く、以下、Ｓｃ＞ｆａｔ＞Ｄｉｆ／Ｓｃ≒ｐｆ−ｄｉｆ＞ｐｆ−ｇｒ≒Ｍａｔ／Ｓｃの順で高値であった。また、移植後の変動幅については全群比較可能な１３週経過時とピークとの比で見ると、ｐｒｅ−ｆｉｘの２群で約３倍ともっとも変動が少なく、ｉｐ群やＤｉｆ／Ｓｃ、Ｍａｔ／Ｓｃ群で約５倍、Ｓｃ群やｆａｔ群では約１０倍であった。各移植法では移植直後のピーク値や移植後の変動幅が異なっており、これらは用いる遺伝子産物や病態の特徴、手技の簡便性などに応じて使い分けることが可能である。体外で遺伝子を安定導入した初代培養脂肪細胞の移植は、多様な方法で移植可能であること、また移植後は長期に安定なインビボ遺伝子発現が可能であることを明らかにした。
図１４は、図１２（Ｂ）に例示したのと同様の摘出試験を、移植後期に行った結果を示す図である。移植初期に摘出した個体（個体Ａ）のみならず、移植後期に摘出した個体（個体Ｂ）においても、摘出後速やかな血中ＡＰ活性の消失を認めた。本法により移植された脂肪細胞は移植後長期間にわたって移植部位に局在し、時期によらず必要に応じて摘出することにより遺伝子発現を消去できることを明らかにした。
［実施例１０］ＡＰ安定発現細胞のマウスへの移植（試験３）
移植細胞数の用量依存性を確認するために、次の検討を行った。
［方法］
実施例３で作製したＡＰ発現脂肪細胞（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ導入、ＩＣＲ皮下脂肪由来）をコンフルエントに培養した後、実施例１に示す誘導培地で３日間培養した後に、トリプシン処理により回収した。ＰＢＳで洗浄した後に、５ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにマトリゲルに懸濁した。ＡＰ細胞懸濁液についてはマトリゲルにより５倍ずつの段階希釈を行い、それぞれ１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ溶液を調製した。これらに終濃度１μｇ／ｍｌになるようｂＦＧＦを添加し、ＩＣＲ系ヌードマウスの背部皮下にマウス一匹あたり０．２ｍｌの用量で移植した（それぞれ高用量：１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ、中用量：２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ、低用量：４ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ）。コントロールとして、ＧＦＰ発現脂肪細胞を同様に処理し高用量と同条件（１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ）で皮下に移植した。
［結果］
図１５は、ＡＰ発現脂肪細胞の移植における、移植細胞数依存的な血中ＡＰ活性を示す図である。移植細胞数を変えることにより、持続期間に影響せずに用量依存的な血中ＡＰ活性が認められた。特に、中・低用量群では高用量群に見られていた移植早期のピークを示さず、より少ない変動幅で推移した。インビボの発現量が、移植細胞数によって容易に調整し得ること、至適細胞数を整えることで移植後の血中濃度（発現量）をより安定させ得ることを明らかにした。
［実施例１１］インスリン発現脂肪細胞の移植による、糖尿病モデルマウスの血糖低下作用
［方法］
糖尿病マウスは、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し１７０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、ＳＩＧＭＡ）を１０ｍｌ／ｋｇで静脈内投与することにより作製した。ＳＴＺ投与１、２週後にそれぞれ空腹時血糖値（ＦＢＧ）を測定し、ともに３００ｍｇ／ｄｌ以上のＦＢＧを呈した個体を糖尿病とした。なお血糖値は全血を採取直後に過塩素酸処理してグルコーステスト−ＩＩ（ＷＡＫＯ）を用いて測定した。
実施例６で作製したＭＬＮ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ｓ１ｓ２Ｂ１０Ｉｎｓ）Ｉ２Ｇ導入脂肪細胞を、実施例１０と同様の方法で分化誘導刺激後、５ｘ１０７／ｍｌになるように１μｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したマトリゲルに懸濁した。この懸濁液を、一箇所あたり０．２ｍｌずつ、糖尿病マウスの背部皮下に計４箇所（４ｘ１０６／ｈｅａｄ）個移植した。対照群には、非遺伝子導入の脂肪細胞を同様の方法により移植した。移植はＳＴＺ処置１９日後に行い、以後経時的にＦＢＧを測定した。統計解析は対照群との比較（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）により行った。
［結果］
図１６はＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する、ｓ１ｓ２Ｂ１０インスリン発現脂肪細胞の移植による効果を示した図である。対照には非遺伝子導入細胞を移植した。インスリン発現細胞移植群の血糖値は移植７日目から低下傾向を示し、移植１３、２１日目には有意な血糖低下作用を示した（Ａ）。また、移植２０日後の体重はインスリン発現細胞移植群が対照群に比べて有意に高く、糖尿病による体重減少を回復させた（Ｂ）。ＡＰを用いた検討結果より、この血糖低下作用は長期に持続することが推測される。このように、移植した初代培養脂肪細胞から産生された外来遺伝子産物が、レシピエントの病態修飾に寄与しうることを明らかにしたと同時に、本法による糖尿病治療の可能性が示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、エクスビボでの遺伝子治療に適した初代培養脂肪細胞に外来遺伝子を導入する方法が確立され、外来遺伝子を安定に保持する初代培養脂肪細胞が確立された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、３週齢のＩＣＲマウス皮下脂肪より単離した初代培養脂肪細胞の顕微鏡写真である。（Ａ）天井培養１４日後の天井側培養面に接着した脂肪細胞、（Ｂ）通常培養系で増殖させた初代培養脂肪細胞、（Ｃ）分化誘導により脂肪滴を貯留した成熟脂肪細胞、（Ｄ）分化誘導細胞のＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色像、をそれぞれ示す。
図２は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＥＡＰｍｈを一過性に導入した初代培養脂肪細胞（ＩＣＲ皮下脂肪由来）をＩＣＲ系ヌードマウスに移植して得られた血漿中ＡＰ活性を示す図である。
図３は、レトロウィルスベクターＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰを、各脂肪組織由来の初代培養脂肪細胞に導入したときの、遺伝子導入効率の比較を示す図である。
図４は、ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＦＰ）ＩＰを導入した初代培養脂肪細胞の分化誘導像を示す顕微鏡写真である。（Ａ）光学顕微鏡写真、（Ｂ）Ａと同一視野のＧＦＰ蛍光写真、をそれぞれ示す。
図５は、ＡＰ発現ウィルスベクターを導入した初代培養脂肪細胞の継代培養におけるＡＰ発現の持続性を示す図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下脂肪由来の細胞にＳＥＡＰ遺伝子（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＥＡＰｍｈ）Ｉ２Ｇ）またはＰＬＡＰ遺伝子（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ）を導入した結果、（Ｂ）ＩＣＲマウス由来脂肪細胞の細胞にＰＬＡＰ遺伝子（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ）またはＧＦＰ遺伝子（ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＦＰ）ＩＰ）を導入した結果、をそれぞれ示す。
図６は、分化誘導した遺伝子導入脂肪細胞における発現の変化を示す写真および図である。（Ａ）ＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＦＰ）ＩＰを導入したＩＣＲ皮下脂肪由来初代培養脂肪細胞の非分化誘導下におけるＧＦＰ光顕微鏡像、（Ｂ）同、分化誘導下におけるＧＦＰ顕微鏡像、（Ｃ）非分化誘導下（非分化）および分化誘導下（分化）におけるＭＬＶ（ＶＳＶ）／ｐＢａｂｅＣＬ（ＰＬＡＰ）ＩＰ導入初代培養脂肪細胞（ＩＣＲ皮下脂肪由来）のＡＰ産生、をそれぞれ示す。
図７は、初代培養脂肪細胞へのプラスミド導入による（プロ）インスリン産生を示す図である。
図８は、ＡＰ発現ＡＡＶを導入した初代培養脂肪細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下脂肪由来）における、ＡＰの安定発現を示す図である。
図９は、ｓ１ｓ２Ｂ１０インスリン発現レトロウィルスベクターを導入した初代培養脂肪細胞における、分化誘導時のインスリン発現を示す図である。（Ａ）森永製ＥＩＡによる結果、（Ｂ）ＩＢＬ製ＥＩＡによる結果、をそれぞれ示す。
図１０は、ＧＬＰ−１（７−３７）発現レトロウイルスベクターを導入した初代培養脂肪細胞における、ＧＬＰ−１（７−３７）の発現を示す図である。各々３点の測定を行い、平均値と標準偏差で示した。
図１１は、ＡＰ発現初代培養脂肪細胞の移植におけるインビボＡＰ発現に及ぼす、移植前分化誘導刺激の有無による効果を示した図である。
図１２は、（Ａ）ＡＰ発現初代培養脂肪細胞の、分化刺激有り・かつｂａｓｉｃ  ＦＧＦ添加マトリゲルを用いて移植した際の、血漿中ＡＰ活性の推移、（Ｂ）移植マトリゲルの摘出による血漿中ＡＰ活性の消失（個体Ａ）、（Ｃ）対照であるＧＦＰ導入細胞移植群から摘出したマトリゲルのＧＦＰ光顕微鏡像、をそれぞれ示す図および写真である。（Ａ）のＰＬＡＰ移植群３２日目までは、個体別測定値の群平均と標準偏差で、他は平均値で示した。
図１３は、図１２（Ａ）、およびその他さまざまな方法で移植したマウスの血中ＡＰ活性をより長期にわたって検討した結果を示す図である。
図１４は、図１２（Ｂ）に例示したのと同様の摘出試験を、移植後期に行った結果を示す図である。
図１５は、ＡＰ発現脂肪細胞の移植における、移植細胞数依存的な血中ＡＰ活性を示す図である。個体別測定値の群平均と標準偏差で示した。
図１６は、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対する、ｓ１ｓ２Ｂ１０インスリン発現脂肪細胞の移植による効果を示した図である。（Ａ）空腹時血糖値に及ぼす効果、（Ｂ）体重に及ぼす効果をそれぞれ示す。個体別測定値の群平均と標準偏差で示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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