(57)【要約】本発明は、オリゴ核酸の分析において、ＬＣ／ＭＳで分析を行うための装置を提供することを目的としたものである。具体的には、イオンペア剤や塩を含む溶離液を送液するポンプ、測定対象試料を流路内に注入するサンプルインジェクタ、導入された溶液を成分ごとに分離するカラム、当該カラムから溶出してきた溶液を大気圧イオン源によってイオン化し検出する質量分析装置を有する液体クロマトグラフ質量分析装置であって、前記カラムと前記質量分析装置の間に、弱塩基の溶液を合流させる合流手段を備えたことを特徴とするものである。この構成により、オリゴ核酸の高効率かつ高感度な分析が可能になるものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンペア剤や塩を含む溶離液を送液するポンプ、測定対象試料を流路内に注入するサンプルインジェクタ、導入された溶液を成分ごとに分離するカラム、当該カラムから溶出してきた溶液を大気圧イオン源によってイオン化し検出する質量分析装置を有する液体クロマトグラフ質量分析装置であって、
前記カラムと前記質量分析装置の間に、弱塩基の溶液を合流させる合流手段を備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記合流後の流路に、溶液を攪拌，混合するミキシング手段を備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項３】
請求項２において、
前記カラムと前記ミキシング手段の間に、カラムから溶出した溶液の流れを所定の割合で分岐させる分岐手段を備え、当該溶液の一部を前記質量分析装置に、その他の溶液をフラクションコレクタに導入するようにしたことを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項４】
請求項３において、
前記合流手段は前記分岐手段に接続され、前記質量分析装置に導入する溶液に対して前記弱塩基の溶液を混合させることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項５】
請求項３において、
前記分岐手段は、六方バルブであり、内部に一時的に溶液を保持するサンプルループを備え、所定の周期で流路を切替えることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項６】
請求項３において、
前記フラクションコレクタは、前記質量分析装置で検出された信号に応じて動作することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項７】
請求項３において、
前記分岐手段とフラクションコレクタとの間に、ＵＶ検出器を備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項８】
請求項１において、
質量分析装置は、エレクトロスプレイイオン化法，ソニックスプレイイオン化法及びイオンスプレイでイオン化することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項９】
請求項１において、
質量分析装置は、飛行時間型，イオントラップ型、または四重極型の質量分析装置であることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１０】
イオンペア剤や塩を含む溶離液を送液する溶離液用ポンプ，測定対象試料を流路内に注入するサンプルインジェクタ、導入された溶液を成分ごとに分離する複数のカラム、当該カラムから溶出してきた溶液を大気圧イオン源によってイオン化し検出する質量分析装置を有する液体クロマトグラフ質量分析装置であって、
前記各カラムの下流の流路のそれぞれに設けられた溶液を攪拌，混合するミキシング手段と、
前記カラムと前記ミキシング手段の間に弱塩基の溶液を合流させる合流手段と、
前記各ミキシング手段からの溶液が導かれ、且つ前記質量分析装置と接続された切替えバルブと、
前記切替えバルブに対して移送液を送液する移送液用ポンプとを備え、
前記切替えバルブを切替えながら、前記移送液によって前記切替えバルブに導かれた前記各カラムからの容出液を交互に前記質量分析装置に導入することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記移送液は、弱塩基の溶液を用いることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１２】
請求項１０において、
前記カラムの数と同数のフラクションコレクタを備え、
前記カラムと前記ミキシング手段の間のそれぞれの流路に、カラムから溶出した溶液の流れを所定の割合で分岐させる分岐手段を備え、
当該複数の分岐手段は、前記切替えバルブと各フラクションコレクタに接続されることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１３】
請求項１２において、
前記合流手段は前記各分岐手段に接続され、前記切替えバルブに導入する溶液に対して前記弱塩基の溶液を混合させることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項１４】
請求項１０において、
前記切替えバルブに接続され、且つ前記カラムの数と同数のフラクションコレクタを備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、液体クロマトグラフ（以下、ＬＣ）と質量分析装置（以下、ＭＳ）が結合された液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）に係り、特に、オリゴ核酸をＭＳで高感度に測定するための装置に関する。
背景技術
合成したオリゴ核酸を精製するためには、現在は、ＬＣを用いて目的とするオリゴ核酸と夾雑物を分離する方法が一般的である。この際、逆相、またはイオン交換カラムで分離させるためには、アナリティカル・ケミストリー，１９９７年６９巻の１３２０頁〜１３２５頁（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６９，１３２０−１３２５）で論じられているように、適量のイオンペア剤（例えば、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ），酢酸トリブチルアンモニウム（ＴＢＡＡ），酢酸ジブチルアンモニウム（ＤＢＡＡ）等の塩）を溶離液に添加する必要がある。
また、精製したオリゴ核酸のマススペクトルを得るには、オリゴ核酸の質量数は数千から数万と大きいために、質量数数万程度まで測定可能なマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で測定していた。しかしながら、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた場合、イオン化が高真空化で行われるため、ＬＣで分離した試料をイオン化用に再調製する作業が必要であった。即ち、ＬＣからの試料を直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに導くことは不可能であり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた分析能率は大変悪かった。従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで得たマススペクトルの情報に基づいて目的とするオリゴ核酸を分取する事も不可能であった。
一方、ＬＣからの試料を直接導入して質量分析できるＭＳとしては、大気圧イオン源を備えた四重極型質量分析装置（Ｑ−ＭＳ）やイオントラップ型質量分析装置（ＩＴ−ＭＳ）が知られている。そこで、ＬＣからの試料がオンラインでＭＳに導かれた装置、即ちＬＣ／ＭＳでオリゴ核酸の分離と質量分析を行おうとした場合、上記に示すような大気圧イオン源を備えたＭＳを用いる必要がある。また、大気圧イオン源としては、エレクトロスプレイイオン化法（ＥＳＩ），ソニックスプレイイオン化法（ＳＳＩ）又はイオンスプレイ（ＩＳ）等が一般的に用いられる。
発明の開示
しかしながら大気圧イオン源を備えたＱ−ＭＳやＩＴ−ＭＳは、測定可能な質量数上限が数千程度であるため、質量数の大きなオリゴ核酸は上限を超えてしまう。そのため、オリゴ核酸をＱ−ＭＳやＩＴ−ＭＳで測定するには、多価イオンを用いなければならない。
また、オリゴ核酸のＬＣでの分離に必要なイオンペア剤がＭＳに導入される試料に混入していると、ＥＳＩ，ＳＳＩ又はＩＳ等の大気圧イオン源でのイオンの生成が妨害され（イオンサプレッション）、著しいＭＳの感度低下を招く。
このような状況を防ぐための方法として、例えば、ＲＡＰＩＤ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＯＲＹ，ＶＯＬ．９，９７−１０２（１９９５）に開示されているように、ＭＳに導入される試料にイミダゾール溶液等の弱塩基の溶液を混ぜ、ＥＳＩ−ＭＳで測定することが提案されている。
しかしながら、上記文献には、ＬＣとＭＳをオンラインで接続した装置において、ＭＳに導入される試料に弱塩基溶液を効率よく混合させるための構成は何等示されていない。
従って、ＬＣ／ＭＳでオリゴ核酸を分離，精製し、かつ感度良くマススペクトルを検出することは従来では行われておらず、オリゴ核酸の分離と質量分析をオンラインで行う事は不可能であった。
本発明は、オリゴ核酸の分析において、ＬＣ／ＭＳで分析を行うための装置を提供することを目的としたものである。
本発明の特徴的な構成は、イオンペア剤や塩を含む溶離液を送液するポンプ、測定対象試料を流路内に注入するサンプルインジェクタ、導入された溶液を成分ごとに分離するカラム、当該カラムから溶出してきた溶液を大気圧イオン源によってイオン化し検出する質量分析装置を有する液体クロマトグラフ質量分析装置であって、前記カラムと前記質量分析装置の間に、弱塩基の溶液を合流させる合流手段を備えたことである。
本発明においては、ＬＣからの溶出液をオンラインでＭＳに導入するＬＣ／ＭＳにおいて、オリゴ核酸の分析時に必要なイオンペア剤が溶離液に混入されている場合であっても、感度良くＭＳにて分析することか可能になるものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例を説明する。
（実施例１）
第１図に、第１の実施例の概略構成図を示す。本実施例のＬＣ／ＭＳは、複数の溶液（バッファを含む有機溶媒Ａ，Ｂ）１，２を選択し、時間と共にそれらを混合しながら溶液の組成を変えて送液できる機能（いわゆるグラジェント溶出）を持ったポンプ４，オリゴ核酸試料を流路内に導入するサンプルインジェクタ６，成分毎の分離を行うカラム７，更に弱塩基溶液（例えばイミダゾール溶液）３を合流させるためのポンプ５，合流した溶液を攪拌，混合させるミキサ（コイルまたはカラム）８，ＬＣから導入された溶出液をイオン化し検知するＭＳ９，コントローラ１０から構成されている。本発明で用いられるＭＳ９は、イオン源にＥＳＩ，ＳＳＩやＩＳ等の大気圧イオン源を用いる。また、質量分析部には、イオントラップ型，飛行時間型，四重極型の各装置を用いることができる。
サンプルインジェクタ６から流路に注入されたオリゴ核酸試料は、カラム７によって単一成分に分離された後、ポンプ５により送られる弱塩基溶液３と合流する。合流した溶液はミキサ８によって攪拌，混合され、ＭＳ９に導入され、オリゴ核酸の質量情報を得ることができる。本発明で用いられる弱塩基溶液３は、イミダゾール溶液以外にピペリジン溶液等、ｐＫｂ５．０以上の塩基を用いても効果がある。
また、上記のポンプ４，サンプルインジェクタ６，ポンプ５，ＭＳ９はすべてコントローラ１０で制御することが可能である。
第２図は、ＭＳ９によって得られる全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）の例である。第２図（ａ）のＴＩＣは、ポンプ５の流量を０．０ｍＬ／ｍｉｎとして弱塩基溶液３を加えない場合の結果であり、即ち、従来の方法と同様の条件の分析結果である。第２図（ｂ）のＴＩＣは、ポンプ５の流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎとして弱塩基溶液３を加えて得られた結果である。
第２図の分析条件は、溶液１は０．１ｍｏｌ／  Ｌ酢酸トリエチルアミン含有１０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）、溶液２は０．１ｍｏｌ／  Ｌ酢酸トリエチルアミン含有２０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）で、分離カラム７にカラムサイズ４．６×１５０ｍｍ（５μｍ充填材）のＯＤＳ（オクタデシルシラン）カラム、弱塩基溶液３に０．１ｍｏｌ／Ｌイミダゾールのアセトニトリル溶液を用いた。ポンプ４の流量は０．５ｍＬ／ｍｉｎで、溶液１と２の組成を、溶液１／溶液２＝１００／０から始めて２０分かけて溶液１／溶液２＝５０／５０まで変化させる直線グラジェント溶出を行った。オリゴ核酸試料は、塩基数が２０，３０，４０の３試料の混合水溶液で、それぞれの濃度を２０塩基試料が２４μｍｏｌ／Ｌ、３０塩基試料が４０μｍｏｌ／Ｌ、４０塩基試料が２９μｍｏｌ／Ｌとした。このオリゴ核酸試料３０μＬをサンプルインジェクタ６より注入した。ちなみに、２０塩基試料の質量数（ｍ）は６０９６、３０塩基試料は９２００、４０塩基試料は１２３６０である。
第２図（ａ）のＴＩＣでは、２０塩基試料のピークのみを検出することができた。３０塩基試料，４０塩基試料はノイズ成分に埋もれてしまい、ＴＩＣ上では特定することが出来ない。
第２図（ｂ）のＴＩＣでは、第２図（ａ）の場合に比べて相対強度が約１０倍の感度向上を確認することができ、オリゴ核酸試料に含まれるすべてのオリゴ核酸のピークが検出することができた。
また、第２図（ａ）および（ｂ）において検出された各塩基試料ピークの保持時間におけるマススペクトルを第３図に示す。
弱塩基溶液３を加えていない場合の第３図（ａ）のマススペクトルでは、ＴＩＣでピークを確認できた２０塩基試料は質量対電荷比（ｍ／ｚ）１５２３に４価の多価イオンを与えた。また、３０塩基試料もｍ／ｚ１８３９の５価の多価イオンを与えている。一方、弱塩基溶液３を加えた場合の第３図（ｂ）のマススペクトルでは２０塩基試料、３０塩基試料ともに検出感度が向上し、Ｓ／Ｎ比が弱塩基溶液３を加えていない場合に比べ約１０倍向上した。また弱塩基溶液３を加えることにより、生成するイオンの価数が増加し、２０塩基試料では５価のイオンであるｍ／ｚ１２１８のイオン、３０塩基試料では６価のｍ／ｚ１５３２と７価のｍ／ｚ１３１３のイオンが検出され、より低質量数側で検出することができた。さらに、弱塩基溶液３を加えていない場合は全く検出できなかった４０塩基試料のマススペクトルも第４図に示したように７価のｍ／ｚ１７６４から１０価のｍ／ｚ１２３５のイオンまでを感度良く検出する事ができた。
（実施例２）
第５図に、第２の実施例を示す。本実施例では、第１の実施例の構成に、カラム７からの溶出液をスプリットするスプリッタ１１を介してフラクションコレクタ１２を接続した、オリゴ核酸の分取システムの例である。フラクションコレクタ１２もまた、ポンプ４，サンプルインジェクタ６，ポンプ５，ＭＳ９と共にコントローラ１０で制御することが可能である。
スプリッタ１１は、第６図に示した構造を持ち、内部に長さの異なる二つの抵抗コイルを備えている。このコイルの抵抗値の違いによって、カラム７からの溶出液の１／１０から１／１００程度の一定量をＭＳ９側へ流出させ、ポンプ５から送られた弱塩基溶液３と合流させる。こうしてＭＳ９への流路のみに弱塩基溶液３を合流させることが可能である。合流した溶液はミキサ８によって攪拌され、ＭＳ９に導入される。
コントローラ１０には、あらかじめ分取したいオリゴ核酸の質量数や多価イオンの質量数を入力しておく。ＭＳ９が、これらの質量数を持つイオンに対応したクロマトグラムピークを検出したらコントローラ１０はフラクションコレクタ１２に信号線を通して信号を送る。この信号を受けて、フラクションコレクタ１２は目的のオリゴ核酸試料を試験管等の容器に分取する。
また、スプリッタ１１とフラクションコレクタ１２との間にＵＶ検出器（図示せず）を接続し、ＵＶクロマトグラムのピーク面積値からオリゴ核酸試料の定量情報を得ることも可能である。また、ＵＶ検出器が検出したピーク信号に基づき、フラクションコレクタ１２が試料を分取することができる。この場合、分取と同時にＭＳが分析を行っているので、分取した試料をその質量数情報によって同定することができる。
また、第２の実施例において、オリゴ核酸試料の量が少なくＭＳ９での検出が困難な場合、または第６図のスプリッタ１１で試料溶液を分けることすら困難な場合は、第７図に示すように、一定時間間隔で実線流路と点線流路を交互に切替える六方バルブ１３をカラム７とＭＳ９およびフラクションコレクタ１２間に接続する。カラム７からの溶出液は、六方バルブ１３の切替えによってＭＳ９とフラクションコレクタ１２とに交互に流出する。第２図に示すように、１成分のオリゴ核酸試料のピーク幅は約３０秒程度あるため、六方バルブ１３の流路の切替えは、例えば１秒間隔で行うようにする。
カラム７からの溶出液がＭＳ９へ流出する場合は、一度、六方バルブ１３内のサンプルループ１３０に保持され、その後ポンプ５の送る弱塩基溶液３によってＭＳ，９へ送られる。
第７図の構成においても、第５図の例と同様に、ＭＳ９が目的とするオリゴ核酸試料の質量数を持つイオンに対応したクロマトグラムピークを検出すると、コントローラ１０はフラクションコレクタ１２に信号を送り、フラクションコレクタ１２は目的のオリゴ核酸試料を分取する。
（実施例３）
第８図に、第３の実施例を示す。本実施例では、第１の実施例の構成に対して、カラムを追加し、二種類のオリゴ核酸試料を同時に分析できるように拡張した例である。追加流路であるカラム１５，ミキサ１６以外に、カラム７，１５からの二つの流路に弱塩基溶液３を等分するためのスプリッタ１７，カラム７，１５の出口からの二つの流路を一つのＭＳへ導入するための切替えを行う十方バルブ１８，十方バルブ１８に到達した溶出液をＭＳ９へ送るための移送液１９、および送液ポンプ２０を追加している。十方バルブ１８とポンプ２０も、ポンプ４と１４，サンプルインジェクタ６，ポンプ５，ＭＳ９と同一のコントローラ１０で制御可能である。また、サンプルインジェクタ６はいずれの流路に対しても試料を注入することが可能である。
サンプルインジェクタ６より二つの流路に注入された二種類のオリゴ核酸試料は、それぞれのカラム７，１５により単一成分に分離される。ポンプ５によって送られた弱塩基溶液３は、スプリッタ１７によって二つの流路に等量に分けられる。分けられたそれぞれの弱塩基溶液３は、カラム７，１５からの溶出液とそれぞれ合流し、ミキサ８，１６によって攪拌され十方バルブ１８に送られる。十方バルブ１８は一定時間間隔（例えば１秒）で実線流路と点線流路を切替え、ポンプ２０の送る移送液１９によってＭＳ９に対して二つのカラムからの溶出液が交互に導入される。ＭＳ９はバルブ１８の切替え時間間隔に基づき、検出した信号が二つの流路のどちらに起因するものかを判断し、二種類の信号を別個に処理する。これにより、一台のＭＳ９で二つのカラム７，１５から溶出したオリゴ核酸試料の質量情報を得ることができる。
ここで移送液１９は、二つの流路からの溶出液を送る役割と同時に、ＭＳのイオン源内での二つの溶出液の混合を防ぐ役割を持つ。したがって移送液１９は、ＭＳ９での分析に影響を与えないものが良く、既に溶離液に加えられている弱塩基溶液３を用いることがＭＳ９の感度を上げることもでき、最も良い結果を与える。弱塩基溶液３以外ではメタノール等を用いることが出来る。
第９図及び第１０図に本実施例の変形例を示す。
第９図の例は、スプリッタ１１と２１、一つのコントローラ１０で制御可能なフラクションコレクタ１２，２２を接続し、流路の数に応じたオリゴ核酸試料分取システムを実現するものである。スプリッタ１１，２１は、第６図で示したものを使用する。
また、第１０図の例は、オリゴ核酸試料の量が少ない場合の概略構成図である。スプリッタ１１，２１を用いずに、カラム７，１５からの溶出液の全量に弱塩基溶液３を合流させて、十方バルブ１８によってカラム７，１５から溶出した試料のうちＭＳ９に導入するもの以外のオリゴ核酸試料を全量分取するものである。
第９図及び第１０図の例によれば、容量の少ない試料の場合でも、ＭＳで分析する用途以外は、漏れなく分取することが出来る。
上記に示した各実施例に拠れば、ＬＣからの溶出液がオンラインでＭＳへ導入されるＬＣ／ＭＳを用いて、オリゴ核酸の高感度分析が可能になる。従って、分析の効率を向上させることが可能となる。
さらに、弱塩基溶液の作用により、多価イオンが生成しやすくなるため、ＴＯＦ−ＭＳよりも測定可能質量数の上限が低いイオントラップ型や四重極型の質量分析装置での測定が可能になる。また、ＴＯＦ−ＭＳを用いた分析においても分析の効率を大きく上げる事ができる。
また、マススペクトルが感度良く検出できるようになるため、目的とするオリゴ核酸の質量数や、その多価イオンの質量数を信号として、オリゴ核酸の分取を行う事が可能になる。この時、マススペクトルを取りながら分取を行うため、分取したオリゴ核酸試料のマススペクトルを試料の品質データとして分離と同時に記録することが可能である。
さらに、同時に複数のカラムによる分離を行いながら、それより少ないＭＳによる複数のオリゴ核酸の高感度分析および分取が可能になる。また、ＭＳによる複数のオリゴ核酸の分析時に、切替えバルブからＭＳへの送液を独立したポンプで行うため、試料同士のイオン源内での混合を防ぐ事ができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、第１の実施例の概略構成図である。
第２図は、ＭＳ９で得られた全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）である。
第３図は、第２図の各塩基試料ピークの保持時間におけるマススペクトルである。
第４図は、４０塩基のオリゴ核酸試料のマススペクトルである。
第５図は、第２の実施例の概略構成図である。
第６図は、スプリッタ１１の構造を示した模式図である。
第７図は、第２の実施例の変形例の概略構成図である。
第８図は、第３の実施例の概略構成図である。
第９図は、第３の実施例の変形例の概略構成図である。
第１０図は、第３の実施例の変形例の概略構成図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2003038425.tif 000014
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