(57)【要約】リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを有効成分とし、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１等のサイトカインを抑制する作用を有する医薬を提供する。また、優れたサイトカイン抑制作用を有し、高サイトカイン血症を伴う炎症性疾患の予防又は治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを有効成分とし、サイトカイン抑制作用を有する医薬。
【請求項２】
高サイトカイン血症の予防又は治療に用いられる請求項１記載の医薬。
【請求項３】
全身性炎症反応症候群の予防又は治療に用いられる請求項１記載の医薬。
【請求項４】
前記全身性炎症反応症候群は、感染に起因しないものである請求項３記載の医薬。
【請求項５】
前記全身性炎症反応症候群は、外傷、熱傷、膵炎、肝障害、虚血／再灌流障害、又は手術に起因するものである請求項４記載の医薬。
【請求項６】
前記サイトカイン抑制作用は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、又はＭＣＰ−１のうちの少なくとも一つを抑制するものである請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを有効成分とする、感染に起因しない全身性炎症反応症候群の予防又は治療に用いられる医薬。
【請求項８】
前記全身性炎症反応症候群は、外傷、熱傷、膵炎、肝障害、虚血／再灌流障害、又は手術に起因する請求項７記載の医薬。
【請求項９】
前記リボフラビン誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、リボフラビンテトラブチレイト、リン酸リボフラビンナトリウム、リン酸リボフラビンのモノジエタノールアミン塩、ロイコフラビン、モノハイドロフラビン、ロイコフラビンリン酸エステル、ロイコフラビンモノヌクレオチド、ロイコフラビンアデニンジヌクレオチド、又はこれらの薬理学的に許容される塩である請求項１記載の医薬。
【請求項１０】
前記リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを、注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、又は経口液剤の形で含有する請求項１記載の医薬。
【請求項１１】
前記サイトカイン抑制作用は、活性酸素の消去作用を機序の一つとする請求項１記載の医薬。
【請求項１２】
高サイトカイン血症の予防剤又は治療剤を製造するための、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つの使用。
【請求項１３】
高サイトカイン血症の予防剤又は治療剤としての、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つの使用。
【請求項１４】
リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを有効成分とするサイトカイン抑制剤。
【請求項１５】
リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを対象物に有効量投与する、高サイトカイン血症の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩（以下、リボフラビン系化合物ということがある）を有効成分とし、サイトカイン抑制作用を有する医薬に関する。また、本発明は、リボフラビン系化合物を有効成分とし、感染に起因しない全身性炎症反応症候群の予防又は治療に有用な医薬に関する。
関連技術
多くの疾患において炎症反応が関与しており、いわゆる炎症性疾患だけではなく、アルツハイマー痴呆症や心臓疾患等においても炎症反応が重要な影響を持つことが分かってきている。
炎症反応が関与する疾患の中でも、とりわけ全身性の炎症兆候を伴う病態である全身性炎症反応症候群は、侵襲を受けた生体の反応を把握するサインとして重要である。また、この全身性炎症反応症候群となっている状態において、症状が進行したり合併症が起こると、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ；ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、播種性血管内血液凝固（ＤＩＣ；ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）、多臓器不全（ＭＯＦ；ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ）等の機能不全（ＭＯＤＳ；ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に陥り、意識障害、呼吸困難、血圧低下等の症状を示し、ショック状態となり死に至る場合もある。この全身性炎症反応症候群を引き起こす原因としては、感染症のほか、外傷、熱傷、膵炎、手術等の様々な侵襲がある。
従来から、全身性炎症反応症候群の病態には、蛋白質性シグナル伝達物質であるサイトカインの過剰誘導が関与していることが知られている。これに関して、全身性炎症反応症候群の進行度とサイトカインの血中濃度との間には一定の相関関係があることが報告されている（小川道雄：新・侵襲とサイトカイン．生体防御と生体破壊という諸刃の剣，メジカルセンス，東京，１９９９，Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．：Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｔｈｅｏｒｙ  ｒｅｇａｒｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｗｈａｔ  ｗｅ  ｄｏ  ａｎｄ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｋｎｏｗ  ａｂｏｕｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２４，１６３−１７２，１９９６）。このことから、全身性炎症反応症候群は高サイトカイン血症の一つであるということができる。
現在まで、高サイトカイン血症の予防又は治療のために、サイトカインの誘導や発現を抑制する試みがなされている。
例えば、副腎皮質ステロイド剤を投与してサイトカインの誘導を抑制する試みがなされている（Ｌｕｃｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３８，６２−６８，１９８８）。
また、抗ＴＮＦ−α抗体やインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）等を投与してサイトカインの機能発現を抑制する試みがなされている（Ａｂｒａｈａｍ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ：Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｐｓｉｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．２７３，９３４−９４１，１９９５，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｐｓｉｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．２７１，１８３６−１８４４，１９９４，Ｄｈａｉｎａｕｔ，Ｊ−Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ＢＮ  ５０２１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｓｅｐｓｉｓ：Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２２，１７２０−１７２８，１９９４，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ−Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４，１６９７−１７０２，１９９６，Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．：Ｓｉｒ  Ｉｓｓａｃ  Ｎｅｗｔｏｎ，ｓｅｐｓｉｓ，ＳＩＲＳ，ａｎｄ  ＣＡＲＳ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２４，１１２５−１１７８，１９９６）。
また、特開平１１−３２２６０１号公報には、Ｎ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル］−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸を有効成分とするサイトカイン産生反応の制御による抗炎症性薬剤組成物が開示されている。
また、特表平８−５０６３２２号公報には、カルボキシル化および／または硫酸化オリゴ糖を含有する活性ＴＮＦ−αの生産を阻害するための医薬組成物が開示されている。
発明の開示
しかしながら、上記の高サイトカイン血症の予防又は治療剤では、病態やその進行情況によっては十分な薬効を期待できない場合があり、より高い薬効を有し予後の改善効果についても優れた医薬の提供が望まれている。
なお、特開平５−２０１８６４号公報及び特開平１０−２９９４１号公報には、リボフラビン系化合物が免疫賦活・感染防御剤やトキシンショック予防治療剤として有用である旨が開示されているが、これらにおいてはリボフラビン系化合物とサイトカインとの関係については開示されていない。
したがって、本発明の目的は、高サイトカイン血症の予防又は治療のための優れた医薬を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、リボフラビン系化合物が優れたサイトカイン抑制作用を有することを見出した。すなわち、リボフラビン系化合物を有効成分とする医薬を投与することにより、サイトカインの誘導や発現を抑制することができ、炎症反応が関与する様々な疾患、特に、過度の侵襲が加わった生体の高サイトカイン血症の治療において、優れた薬効を示すことが分かった。
これは、侵襲により生体内において炎症性サイトカインが誘導又は発現された際に、リボフラビン系化合物がこの炎症性サイトカインの誘導や発現を抑制して、生体の恒常性を保つ働きをすることによるものと考えられる。
このように、リボフラビン系化合物がサイトカイン抑制作用を有することを初めて見出したことにより、本発明では、より薬効に優れた高サイトカイン血症の予防又は治療剤を提供することが可能となった。
すなわち、本発明は、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを有効成分とし、サイトカイン抑制作用を有する医薬を提供するものである。
換言すれば、本発明は、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを有効成分とする、サイトカイン抑制剤を提供するものである。
「少なくとも一つを有効成分」とは、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩のいずれか単独を有効成分としてもよく、あるいはこれらのうち複数を有効成分としてもよい、との意味である。
本発明の医薬は、高サイトカイン血症の予防又は治療に有用である。また、本発明の高サイトカイン血症の予防又は治療方法は、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを対象物に有効量投与する、ことを特徴とする。
高サイトカイン血症とは、血中のサイトカイン濃度が高くなる状態を伴う疾患であり、例えば、アルツハイマー痴呆症、パーキンソン病、キャッスルマン病（Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病）、関節リウマチ、多発性筋炎、全身性硬化症、混合性結合組織病、フェルテイ症候群、回帰性リウマチ、サルコイドーシス、変形性関節症、多発性硬化症、ベーチェット病、エリテマトーデス、アテローム硬化症、心臓疾患、心房粘液腫、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、痛風、接触性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、乾癬症、肺繊維症、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、胸膜炎、糸球体腎炎、急性糸球体腎炎、メサンギウム増殖腎炎、ループス腎炎、ＩｇＡ腎炎、糖尿病性腎症、粥状動脈硬化症、結節性動脈硬化症、脈管炎、気管支喘息、慢性歯肉炎、歯周病、出血性ショック、外傷性ショック、アナフィラキシー等のショック、火傷、脳腫瘍、悪性腫瘍、多発性骨髄腫、骨粗鬆症、痔、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎等のアレルギー、敗血症、敗血症性ショック、多臓器不全、一酸化炭素中毒、薬物等の中毒、急性放射線障害、くも膜下出血、全身性炎症反応症候群、インシュリン依存性糖尿病、ブドウ膜炎、慢性炎症、血液疾患、白血病、膠原病、筋萎縮性側索硬化症、脳浮腫、てんかん、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、神経痛、ギラン・バレー症候群、ニューロパチー、脊髄損傷、花粉症等の自己免疫疾患、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血・再灌流障害、動脈硬化、慢性心不全、心筋炎、光過敏症、蓄膿症、強直性脊椎炎、ウエゲナー肉芽腫症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーングレン症候群、側頭動脈炎、ＳＡＰＨＯ症候群、慢性疲労症候群、全身性若年性突発性関節炎、成人ステイル病、子宮内膜症、子宮蓄膿症、中耳炎、腹膜炎、心内膜炎、急性腎不全、急性肝障害、下痢、白内障が挙げられる。
ここでいう敗血症とは、血中のサイトカイン濃度が通常値よりも高くなった状態を伴う敗血症を意味する。敗血症性ショックとは、当該敗血症が進行した結果、心、肺、肝、腎、脾、脳、脊髄等の内臓器のうち１以上の臓器の機能不全が起きた状態、または臓器の機能不全の結果、脱力感、めまい、起立困難、血圧低下、体温低下、不整脈、心室細動、呼吸困難、体温低下、痙攣、意識混濁、意識不明等の症状を示す状態を意味する。
また、本発明の医薬は、特に、全身性炎症反応症候群の予防又は治療に有用である。
高サイトカイン血症の一つである全身性炎症反応症候群は、炎症性サイトカインが血中で優位となり炎症反応が起こるＳＩＲＳ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と、抗炎症性サイトカインが血中で優位となり免疫抑制状態となって抗炎症反応（例えば、重症感染症）が起こるＣＡＲＳ（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）という二つの病態があると考えられている。本発明のリボフラビン系化合物を有効成分とする医薬を投与すると、そのサイトカイン抑制作用によって、ＳＩＲＳの症状を予防又は治療する効果があることが分かった。また、ＳＩＲＳとＣＡＲＳとは互いに関連しているため、ＳＩＲＳを予防又は治療することにより、本発明の医薬が有するサイトカイン抑制作用によって、ＣＡＲＳについても予防又は治療をすることができる。
本発明の「全身性炎症反応症候群の予防又は治療」とは、上記のＳＩＲＳやＣＡＲＳの症状が進行して引き起こされる成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、播種性血管内血液凝固（ＤＩＣ）、多臓器不全（ＭＯＦ）等の機能不全（ＭＯＤＳ）の予防又は治療も含む意味であり、本発明の医薬はＳＩＲＳやＣＡＲＳが進行した病態の予防又は治療にも極めて有用である。
さらに、本発明者らは鋭意研究の結果、本発明のリボフラビン系化合物を有効成分とする医薬が、感染に起因しない全身性炎症反応症候群の予防又は治療においても顕著な効果を有することを見出した。
「感染に起因しない全身性炎症反応症候群」としては、外傷、熱傷、急性又は慢性の膵炎、アルコール性肝傷害、薬物性肝傷害、肝障害、肝炎、肝硬変、虫垂炎、胃潰瘍、虚血／再灌流障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病の悪化、腹膜透析後の後遺症の予防・治療、又は手術に起因する全身性炎症反応症候群が好適に挙げられる。
前記サイトカイン抑制作用は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、又はＭＣＰ−１のうちの少なくとも一つを抑制するものであることが好ましい。
本発明にいう「サイトカイン抑制作用」は、サイトカインの一種であるケモカインの抑制作用も含む意味である。ケモカインは、分子量約１万の保存された位置にシステイン残基を保有する、５０を越えるサイトカインの総称であり、白血球に対して走化活性を示す。ＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；インターロイキン１β）、ＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０）、ＩＮＦ−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ；インターフェロンγ）、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α；腫瘍壊死因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）はサイトカイン、ＩＬ−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）、ＭＣＰ−１（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）はケモカイン（サイトカインの一種）である。
また、本発明は、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを有効成分とする、感染に起因しない全身性炎症反応症候群の予防又は治療に用いられる医薬を提供する。
「感染に起因しない全身性炎症反応症候群」としては、外傷、熱傷、膵炎、肝障害、虚血／再灌流障害、又は手術に起因する全身性炎症反応症候群が好適に挙げられる。
上記において、前記リボフラビン誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、リボフラビンテトラブチレイト、リン酸リボフラビンナトリウム、リン酸リボフラビンのモノジエタノールアミン塩、ロイコフラビン、モノハイドロフラビン、ロイコフラビンリン酸エステル、ロイコフラビンモノヌクレオチド、ロイコフラビンアデニンジヌクレオチド、又はこれらの薬理学的に許容される塩であることが好ましい。
前記サイトカイン抑制作用は、活性酸素の消去作用を機序の一つとするものであってもよい。換言すれば、上記のリボフラビン系化合物投与による前記サイトカイン抑制作用は、活性酸素による組織の機能障害を防御する作用、すなわち活性酸素の消去作用を機序の一つとするものであってもよい。
本発明に係る医薬を投与する対象物は、ヒトまたは動物である。本発明の医薬は特にヒトにおける予防又は治療に有用である。
本発明において動物とは産業動物、伴侶動物および実験動物を指す。産業動物とはウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の家畜、ニワトリ、アヒル、ウズラ、七面鳥、ダチョウ等の家禽、ブリ、ハマチ、マダイ、マアジ、コイ、ニジマス、ウナギ等の魚類など産業上飼養することが必要とされている動物である。また、伴侶動物とはイヌ、ネコ、マーモセット、小鳥、ハムスター、金魚などのいわゆる愛玩動物、コンパニオン・アニマルを指し、実験動物とはラット、モルモット、ビーグル犬、ミニブタ、アカゲザル、カニクイザルなど医学、生物学、農学、薬学等の分野で研究に供用される動物を示す。
本発明に係る医薬の投与形態としては、特に限定されず病態やその進行状況、その他の条件によって異なるが、前記リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを、注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、又は経口液剤（シロップ剤を含む）の形で含有することが好ましい。サイトカイン抑制作用のさらなる向上の観点からは、注射剤により投与することが好ましい。
注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与（ｂｏｌｕｓ）のいずれであってもよい。
投与量（有効成分量）は、特に限定されず病態やその進行状況、その他の条件（投与する対象の種類、症状、年齢、体重、性別、合併症、投与時間、投与方法、剤型、感受性差等）によって異なるが、注射剤を静脈内に点滴投与する場合には、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｈにて、数分〜１週間投与することが好ましい。静脈内にボーラス投与する場合には、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．３〜２０ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは２〜２０ｍｇ／ｋｇである。腹腔内投与する場合には０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．３〜２０ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは２〜２０ｍｇ／ｋｇである。筋肉内投与する場合には０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２〜２０ｍｇ／ｋｇである。経口投与する場合には１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは３０〜２００ｍｇ／ｋｇである。
本発明に係る医薬は、そのまま投与してもよく、また通常用いられる製剤添加剤を加えて、公知の方法により注射剤（静脈内投与用（点滴用、ボーラス投与用）、腹腔内投与用、筋肉内投与用、皮下投与用等）、経口剤（錠剤、顆粒剤、散在、細粒剤、カプセル剤、丸剤、経口液剤、シロップ剤等）、経皮吸収製剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤、吸入剤（エアゾール剤、粉末状吸入剤、液状吸入剤等）、外用剤（軟膏剤、クリーム剤、液剤等）とすることができる。また、食品や飼料、飲水等に混合することもできる
注射剤を製造する場合には、リボフラビン系化合物に、必要に応じて、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、懸濁化剤、抗酸化剤、保存剤、等張化剤などを添加し、常法により製造することができる。溶解補助剤等を輸液として点滴剤を構成してもよく、あるいはこれらに薬理学的に許容される改変を加えたものを輸液として点滴剤を構成してもよい。これらの注射剤は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等に投与することができる。あるいは、凍結乾燥して、用時溶解型の凍結乾燥製剤としてもよい。
経口用固形製剤を製造する場合には、リボフラビン系化合物に、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、抗酸化剤、溶解補助剤、安定化剤などを添加し、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤）、丸剤等にすることができる。
溶解補助剤としては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、乳酸化リンゲル溶液、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等が挙げられる。
ｐＨ調整剤や緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、有機酸又は無機酸及び／又はその塩や、水酸化ナトリウム、メグルミン等が挙げられる。
懸濁化剤としては、特に限定されないが、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、トラガント末等が挙げられる。
抗酸化剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、α−トコフェロール、エトキシキン、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール等が挙げられる。
保存剤としては、特に限定されないが、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等が挙げられる。
等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム等が挙げられる。
賦形剤としては、特に限定されないが、例えば、デンプン、コーンスターチ、デキストリン、ブドウ糖、乳糖、白糖、糖アルコール（マンニトール、エリスリトール、キシリトール等）、硬化油、結晶セルロース、無水珪酸、珪酸カルシウム、第二リン酸水素カルシウム等が挙げられる。
結合剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース、メチルセルロース、α化デンプン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロピレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
崩壊剤としては、特に限定されないが、例えば、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等が挙げられる。
滑沢剤としては、特に限定されないが、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ポリエチレングリコール６０００等が挙げられる。
錠剤、顆粒剤、散剤の場合には必要に応じてヒドロキシプロピルメチルセルロース等の皮膜コーティングを施しても良い。
経口液剤を製造する場合には、リボフラビン系化合物に、必要に応じて、着色剤、矯味矯臭剤、抗酸化剤、溶解補助剤、安定化剤などを添加し、常法により製造することができる。
また、本発明は、高サイトカイン血症の予防剤又は治療剤を製造するための、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つの使用を提供するものである。換言すれば、本発明は、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つの使用による高サイトカイン血症の予防剤又は治療剤の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、高サイトカイン血症の予防剤又は治療剤としての、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つの使用を提供するものである。
また、本発明は、リボフラビン、リボフラビン誘導体、又はこれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも一つを対象物（例えば、動物）に投与することを特徴とするサイトカイン抑制を行う必要のある疾患（例えば、炎症性疾患、高サイトカイン血症、全身性炎症反応症候群）の治療方法を提供するものである。
実施例
次に、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実験で用いた材料〕
５’−リボフラビンナトリウムリン酸エステル（リン酸リボフラビンナトリウム）は、日本薬局方品のリボフラビンナトリウムリン酸エステル（５’−ＦＭＮ−Ｎａ）を合成し、これを生理食塩水（Ｏｔｓｕｋａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に溶解（３ｍｇ／ｍＬ）したものを用いた。
ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：リポポリサッカライド）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１１１：Ｂ４由来リポポリサッカライドをシグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入し、これを生理食塩水に溶解したものを用いた。
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ−ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）キットとしては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、の各濃度の測定にはバイオソースインターナショナル社（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入したキットを用いた。ＭＩＰ−２濃度の測定にはテクネ社（ＴＥＣＨＮＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入したキットを用いた。なお、ＭＩＰ−２は、マウスのケモカインであり、好中球の走化因子である。ヒトではＩＬ−８に相当する。
ＮＯ２／ＮＯ３アッセイキットは、同仁化学研究所（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）から購入したものを用いた。
ＳＥＢ（黄色ブドウ球菌毒素）は、スタフィロコッカス・アウレウス・エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ，ＢＴ−２０２を用いた。
ＴＮＦ−αは、ペプロテック社（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋ  Ｈｉｌｌ  ＮＪ，ＵＳＡ）からヒトＴＮＦ−α  Ｋ０５１を購入し、これを生理食塩水（Ｏｔｓｕｋａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に溶解（１５μｇ／ｍＬ）したものを用いた。
Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）は、和光純薬工業株式会社（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から塩酸Ｄ−ガラクトサミンを購入し、これを生理食塩水（Ｏｔｓｕｋａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に９０ｍｇ／ｍＬにて溶解したものを用いた。
ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジハイドロクロライド；２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）は、和光純薬工業株式会社から購入し、これを生理食塩水に溶解（１８．７５ｍｇ／ｍＬ）したものを用いた。ＡＡＰＨはフリーラジカル開始剤であり、熱分解によってフリーラジカルを発生する水溶性のアゾ化合物である。
〔実施例１：エンドトキシン誘発ショックマウスモデルに対する効果〕
雄ＩＣＲマウスは、５週齢のものをＪａｐａｎ  ＳＬＣ  Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）から購入し、２３℃（許容範囲：２０〜２６℃）、相対湿度５５％（許容範囲：４０〜７０％）の条件下で、１２時間毎の明暗サイクル（午前７時にライトオンし、午後７時にライトオフする）において収容したものを用いた。この際、マウスは、滅菌水道水や通常のえさ（ＭＦ，Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にアクセス自由な状態で収容した。この環境に１週間順応させた後、実験に供した。
まず、ＬＰＳ１２ｍｇ／ｋｇを雄ＩＣＲマウス（６週齢）に静脈内投与して、エンドトキシン誘発ショックマウスを作成した。
コントロールグループにおいては、ＬＰＳの投与時（０時間）から、１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、及び２４時間経過後にそれぞれ採血を行った。５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループにおいては、ＬＰＳの投与時から６時間経過後に、２０ｍｇ／ｋｇの５’−ＦＭＮ−Ｎａを静脈内に１回注入により投与して、ＬＰＳの投与時から９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、及び２４時間経過後にそれぞれ採血を行った。いずれの採血ポイントにおいても各グループ５例で構成した。実験の途中で死亡した個体はデータとして使用しなかった。採血にはＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を含むプラスチック製注射器を用い、腹部の静脈から採取した。採取した各血液を遠心分離機（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）にかけ血漿を分離した後、−８０℃にて保存した。
次に、採取した各血漿中のサイトカイン濃度、ケモカイン濃度、及びＮＯ（一酸化窒素）濃度を測定した。
血漿中のサイトカイン濃度及びケモカイン濃度は、上記ＥＬＩＳＡキットを用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。プレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  ２５０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により４５０ｎｍにてプレートを読み取り、得られたデータをＳＯＦＴ  ｍａｘ  ＰＲＯ  １．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて分析した。
上記測定においては、測定限界は、ＭＩＰ−２については１．５ｐｇ／ｍＬ以下、ＩＬ−６については３．０ｐｇ／ｍＬ以下、ＩＬ−１βについては７．０ｐｇ／ｍＬ以下、ＩＮＦ−γについては１．０ｐｇ／ｍＬ以下、ＴＮＦ−αについては３．０ｐｇ／ｍＬ以下、ＭＣＰ−１については９．０ｐｇ／ｍＬ以下、ＩＬ−１０については０．９ｐｇ／ｍＬ以下、ＧＭ−ＣＳＦについては１．０ｐｇ／ｍＬ以下、とし、測定限界以下の値については０ｐｇ／ｍＬとした。
血漿中のＮＯ濃度は、ＮＯ２／ＮＯ３アッセイキットを用い、ＮＯ２とＮＯ３の合計量を検出することにより測定した。各血漿は、それぞれマイクロコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ：Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって濾過した後、遠心分離機（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）にかけた。遠心分離機にかけた血漿サンプルに、ＮＯ３還元酵素を添加し、ＮＯ３をＮＯ２に転換させ、グリス試薬（Ｇｒｅｓｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて総ＮＯ２量を測定した。プレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  ２５０）により５４０ｎｍにてプレートを読み取り、得られたデータについて上記ＳＯＦＴ  ｍａｘ  ＰＲＯ  １．１を用いて分析した。
コントロールグループと５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループとの差異を対応のないｔ検定により分析した。統計学的分析は、ＳＡＳ  ６．１２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行い、Ｐ値が０．０５（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ）より小さい場合に統計学的に有意であると判断した。
上記のようにして測定したサイトカイン濃度の測定結果を図１〜図６に、ケモカイン濃度の測定結果を図７及び図８に、ＮＯ濃度の測定結果を図９に示す。
なお、図１〜９においては、各プロットは平均値±標準誤差で示した。白抜きされたプロットはコントロールグループを示し、白抜きされていないプロットは５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループを示す。
図１に示すように、血漿中のＩＬ−１β濃度は、ＬＰＳの投与時から９時間経過後にピークを示し、その後徐々に減少した。一方、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループ（ＬＰＳ投与時から６時間経過後に５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与）においては、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与直後からＩＬ−１β濃度が減少し初め、ＬＰＳ投与から９時間〜１２時間経過の間においてＩＬ−１β濃度がすみやかに低減した。
図２に示すように、血漿中のＩＮＦ−γ濃度は、ＬＰＳの投与時から６時間経過後にピークを示し、その後徐々に減少した。一方、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループにおいては、９時間〜１８時間経過の間においてＩＮＦ−γ濃度がすみやかに低減した。
図３に示すように、血漿中のＩＬ−６濃度は、ＬＰＳの投与後急増し１時間経過後にピークを示した後、徐々に減少した。コントロールグループにおいては、ＩＬ−６濃度はＬＰＳ投与時から２４時間経過後においても依然として高い値を示した。５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループにおいては、６時間経過後に５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与したことにより、ＩＬ−６濃度がすみやかに減少し、その状態が２１時間経過後まで維持された。
図４に示すように、血漿中のＧＭ−ＣＳＦ濃度は、１時間〜６時間経過の間においてピークを示し、９時間経過後までにはもとの値まで減少した。その後、ＬＰＳ投与時から２１時間経過後において、２回目のピークが観察された。一方、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループにおいては、６時間経過後に５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与したことにより、ＬＰＳ投与時から２１時間経過後においてＧＭ−ＣＳＦ濃度を減少させる傾向が認められた。
図５及び図６に示すように、血漿中のＩＬ−１０濃度とＴＮＦ−α濃度は、ＬＰＳ投与時から１時間経過後と２１時間経過後においてそれぞれ明確な２つのピークを示した。５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与したことにより、２回目のピーク時においてＩＬ−１０濃度及びＴＮＦ−α濃度が減少した。
図７に示すように、血漿中のＭＣＰ−１濃度は、ＬＰＳ投与後に急増し６時間経過時にピークを示した。その後、ＭＣＰ−１濃度は徐々に低減した。５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与したことにより、ＭＣＰ−１濃度は減少され、この状態が２１時間経過後まで維持された。
図８に示すように、血漿中のＭＩＰ−２濃度は、ＬＰＳ投与後に急増し１時間〜３時間経過の間においてピークを示した後減少した。その後、コントロールグループにおいては２１時間経過後において２回目のピークが観察されたが、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループにおいては９時間経過後にＭＩＰ−２濃度が減少し、この状態が２１時間経過後まで維持された。
図９に示すように、ＮＯ濃度はＬＰＳ投与後急増し９時間経過後にピークを示した。この高いＮＯ値は２４時間経過後まで続いた。ＮＯ値の増加はサイトカインの誘導に関係していると考えられる。５’−ＦＭＮ−Ｎａは９時間〜１８時間経過の間においてＮＯ値の抑制効果を示さなかったが、２１時間〜２４時間経過の間においてはＮＯ値の抑制効果を示した。
以上のように、５’−ＦＭＮ−Ｎａはエンドトキシンによって誘発された血中サイトカイン、ケモカイン、及びＮＯの濃度上昇を抑制する作用があることが分かった。
〔実施例２：エキソトキシン誘発ショックマウスモデルに対する効果〕
雄ＢＡＬＢ／ｃマウスは、５週齢のものを日本チャールスリバーから購入し、前記雄ＩＣＲマウスと同様の条件で１週間順応させたものを、実験に供した。
まず、ＳＥＢ０．７５ｍｇ／ｋｇ及びＤ−ガラクトサミン１．８ｇ／ｋｇを、雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）に腹腔内投与して、エキソトキシン（ＳＥＢ）誘発ショックマウスを作成した。
コントロールグループにおいては、ＳＥＢの投与時（０時間）から、６時間、９時間、１２時間、１５時間、及び１８時間経過後にそれぞれ採血を行った。５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループにおいては、ＳＥＢの投与時から６時間経過後に、２０ｍｇ／ｋｇの５’−ＦＭＮ−Ｎａを静脈内に１回注入により投与して、ＳＥＢの投与時から９時間、１２時間、１５時間、及び１８時間経過後にそれぞれ採血を行った。いずれの採血ポイントにおいても各グループ５例で構成した。実験の途中で死亡した個体はデータとして使用しなかった。採血にはＥＤＴＡを含むプラスチック製注射器を用い、腹部の静脈から採取した。採取した各血液を遠心分離機（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）にかけ血漿を分離した後、−８０℃にて保存した。
次に、採取した各血漿中のサイトカイン濃度及びケモカイン濃度を実施例１と同様にして測定・分析・プロットした。得られたサイトカイン濃度及びケモカイン濃度の測定結果を図１０〜図１２に示す。
図１０に示すように、血漿中のＩＮＦ−γ濃度は、ＳＥＢの投与時から９時間経過後にピークを示し、その後減少した。一方、６時間経過後に５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与したところ、１２時間経過付近においてＩＮＦ−γ濃度の抑制効果が認められた。
図１１に示すように、血漿中のＭＩＰ−２濃度は、ＳＥＢの投与時から１２時間経過後にピークを示し、その後減少した。ＳＥＢ投与から６時間経過後に５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与したところ、１２時間経過付近においてＭＩＰ−２の抑制効果が認められた。
図１２に示すように、ＩＬ−６濃度はＳＥＢの投与時から１２時間経過後にピークを示した。ＳＥＢ投与から６時間経過後に５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与したところ、９時間〜１２時間経過付近においてＩＬ−６濃度の抑制傾向が認められた。
以上のように、５’−ＦＭＮ−Ｎａはエキソトキシンによって誘発された血中サイトカイン及びケモカインの濃度上昇を抑制する作用があることが分かった。
〔実施例３：ＴＮＦ−α誘発ショックマウスモデルに対する効果〕
雌のＩＣＲマウスは、４週齢のものをＪａｐａｎ  ＣＲＪ  Ｉｎｃ．（Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。雄のＢＡＬＢ／ｃマウスは、５週齢のものをＪａｐａｎ  ＳＬＣ  Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。これらのマウスをそれぞれ、２３℃（許容範囲：２０〜２６℃）、相対湿度５５％（許容範囲：４０〜７０％）の条件下で、１２時間毎の明暗サイクル（午前７時にライトオンし、午後７時にライトオフする）において収容した。この際、マウスは、滅菌水道水や通常のえさ（ＭＦ，Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にアクセス自由な状態で収容した。この環境に１週間順応させた後、実験に供した。
まず、３μｇのヒトＴＮＦ−αと１８ｍｇのＤ−ガラクトサミン（０．２ｍＬ／体重３０ｇ）を、一群各１０例の雌ＩＣＲマウス（５週齢）に腹腔内注入した。ＴＮＦ−α及びＤ−ガラクトサミンを投与した直後に、マウスに２０ｍｇ／ｋｇの５’−ＦＭＮ−Ｎａ（５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループ）又は生理食塩水（コントロールグループ）を静脈内注入した。ＴＮＦ−αを注入してから７日間経過後におけるマウスの生存率（％）を観察した。その結果を表１に示す。
なお、実施例３においても、スチールテスト（Ｓｔｅｅｌ  ｔｅａｔ）によって分析した。統計学的分析は、実施例１と同様のＳＡＳ  ６．１２を用いて行い、Ｐ値が０．０５（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ）より小さい場合に統計学的に有意であると判断した。
2003075935.tif 000002
表１に示すように、コントロールグループの生存率は２０％であったのに対して、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループの生存率は７０％であった。なお、コントロールグループのマウスは８匹とも３日以内に死亡した。
次に、３μｇのヒトＴＮＦ−αと１８ｍｇのＤ−ガラクトサミン（０．２ｍＬ／体重３０ｇ）を、一群各１０例の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）に腹腔内注入した。ＴＮＦ−α及びＤ−ガラクトサミンを投与した直後に、マウスに２０ｍｇ／ｋｇの５’−ＦＭＮ−Ｎａ（５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループ）又は生理食塩水（コントロールグループ）を静脈内注入した。ＴＮＦ−αを注入してから７日間経過後におけるマウスの生存率（％）を観察した。その結果を表２に示す。
2003075935.tif 000003
表２に示すように、コントロールグループの生存率は１０％であったのに対して、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループの生存率は６０％であった。なお、コントロールグループのマウスは９匹とも３日以内に死亡した。
以上の結果から、５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与することによりＴＮＦ−α誘発ショックに対する生存率を著しく増加させることが分かった。すなわち、５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与することにより、トキシン誘発ショックだけでなく、ＴＮＦ−α誘発ショックに対する生存率を著しく増加させることが分かった。
次に、ＴＮＦ−α誘発マウス腹腔マクロファージからのＩＬ−６産生に対する５’−ＦＭＮ−Ｎａの添加による効果を検討した。雄のＩＣＲマウスをエーテル麻酔下にて頸動脈から放血させて死亡させ、４．５ｍＬ／マウスのハンクス液（ＨＢＳＳ：Ｇｉｂｃｏ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を腹腔内注入した後、腹腔液を採取した。採取した腹腔液を、冷却したＨＢＳＳとともに、遠心分離機（１０００ｒｐｍ、１０分）にかけて、腹腔マクロファージを分離した。
これらの細胞は、１５％の不活性化マウス血清を添加したイーグル培養液（Ｅａｇｌｅｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁させ、３７℃で５％のＣＯ２存在下にて、Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバー（Ｎａｌｇｅｎ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）内で培養させた。マウス腹腔マクロファージに、１．５６μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬの５’−ＦＭＮ−Ｎａ存在下で、あるいは５’−ＦＭＮ−Ｎａの非存在下で、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを反応させ、２４時間培養した。
ＩＬ−６の測定には、上記ＥＬＩＳＡキットを用いた。測定した結果を図１３に示す。
図１３に示すように、ＴＮＦ−αが１０ｎｇ／ｍＬ添加されたマウス腹腔マクロファージでは、ＩＬ−６のレベルが上がった。一方、５’−ＦＭＮ−Ｎａが１．５６μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬがさらに添加されたマウス腹腔マクロファージでは、誘導されたＩＬ−６が抑制されることが分かった。
〔実施例４：ＡＡＰＨ中毒マウスモデルに対する効果〕
実施例４においては、実施例１と同様のものを購入し、同様の条件で順応させた雄ＩＣＲマウスを用いた。
一群各１０例の雄ＩＣＲマウス（６週齢）に、１２５ｍｇ／ｋｇのＡＡＰＨ（０．２ｍＬ／体重３０ｇ）を腹腔内注入した。ＡＡＰＨの注入から２４時間前、注入直後、１時間後、の各時において、マウスに２０ｍｇ／ｋｇの５’−ＦＭＮ−Ｎａ（５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループ）又は生理食塩水（コントロールグループ）を静脈内注入した。ＡＡＰＨを注入してから７日間経過後におけるマウスの生存率（％）を観察した。その結果を表３に示す。
なお、実施例４においては、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループ及びコントロールグループ間の差異はスチールテスト（Ｓｔｅｅｌ  ｔｅｓｔ）によって分析した。統計学的分析は、実施例１と同様のＳＡＳ  ６．１２を用いて行い、Ｐ値が０．０５（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ）より小さい場合に統計学的に有意であると判断した。
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表３に示すように、コントロールグループの生存率は２０％であったのに対して、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループの生存率は６０％であった。なお、コントロールグループのマウスは８匹とも２日以内に死亡した。
次に、ＡＡＰＨ注入から２４時間前、注入直後、の各場合において、５’−ＦＭＮ−Ｎａ又は生理食塩水を、静脈内注入に代えて腹腔内注入した以外は上記と同様にして、ＡＡＰＨを注入してから７日間経過後におけるマウスの生存率（％）を観察した結果を表４に示す。
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表４に示すように、コントロールグループの生存率は１０％であったのに対して、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与グループの生存率は７０％であった。なお、コントロールグループのマウスは９匹とも３日以内に死亡した。
以上の結果から、５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与することにより、ＡＡＰＨ中毒に対する生存率を著しく増加させることが分かった。すなわち、ＡＡＰＨはフリーラジカル開始剤であることから、５’−ＦＭＮ−Ｎａを投与することにより活性酸素による組織の機能障害を防御する効果が得られることが分かった。
また、ＴＮＦ−αが細胞膜受容体や細胞片の損傷部における活性酸素を増加させる作用があることが知られている（Ｃｈａｎｄｅｌ  ＮＳ，Ｔｒｚｙｎａ  ＷＣ，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ  ＤＳ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ  ＰＴ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，１０１３−１０２１（２０００））ことから、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与によるＴＮＦ−α抑制作用は、５’−ＦＭＮ−Ｎａ投与による活性酸素の消去作用を機序の一つとしていることが分かった。
〔実施例５：ブドウ糖高負荷時の内皮細胞の活性酸素産生に対する効果〕
プラスチックシャーレ上に培養したヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）に、５’−ＦＭＮ−Ｎａ濃度がそれぞれ６．２５μｇ／ｍＬ、１．５６μｇ／ｍＬ、０．３９μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬとなるように５’−ＦＭＮ−Ｎａを添加した後、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて、３時間培養した。次に、各シャーレにおけるブドウ糖濃度が３０ｍＭになるようにブドウ糖（グルコース）を添加した後、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて、１時間培養した。培養終了後、細胞を集め、ＢＵＲＳＴＴＥＳＴ（細胞内活性酸素測定キット；ＯＲＰＥＧＥＮ  Ｐｈａｒｍａ）を用いて、細胞内活性酸素量をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（フローサイトメトリーシステム；日本ベクトン・ディッキンソン）にて測定した。具体的には、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いＦＬ１の平均蛍光強度から細胞１００００個の活性酸素量を測定した。その結果を図１４に示す。
図１４に示すように、コントロールグループの蛍光強度（平均蛍光値）は９１．２であったが、３０ｍＭのブドウ糖を負荷すると活性酸素が産生し、蛍光強度は１４０．５に上昇した。一方、６．２５μｇ／ｍＬの５’−ＦＭＮ−Ｎａを添加すると蛍光強度は８９．５に低下し、活性酸素の産生を抑制した。さらに、１．５６μｇ／ｍＬの添加では蛍光強度は１１１．９であり、０．３９μｇ／ｍＬの添加では蛍光強度は１２５．０であり、０．１μｇ／ｍＬの添加では蛍光強度は１１４．２であった。
以上の結果から、５’−ＦＭＮ−Ｎａを添加することにより、高濃度のブドウ糖負荷による活性酸素産生を抑制することが示された。
さらに、シャーレ上に培養したＨＵＶＥＣ細胞に、５’−ＦＭＮ−Ｎａ濃度がそれぞれ２５μｇ／ｍＬ又は６．２５μｇ／ｍＬとなるように５’−ＦＭＮ−Ｎａを添加した後、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて、３時間培養した。次に、各シャーレにおけるブドウ糖濃度が３０ｍＭとなるようにブドウ糖を添加した後、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて、２時間培養した。培養終了後、培養液中のＩＬ−８をＥＬＩＳＡキットで測定した。その結果を図１５に示す。
図１５に示すように、コントロールグループにおいては、３０ｍＭのブドウ糖を負荷するとＩＬ−８を産生し、培地中のＩＬ−８濃度は１１９６ｐｇ／ｍＬに上昇した。一方、２５μｇ／ｍＬの５’−ＦＭＮ−Ｎａを添加すると培地中のＩＬ−８濃度は１６８に低下し、６．２５μｇ／ｍＬを添加すると培地中のＩＬ−８濃度は２９７ｐｇ／ｍＬに低下し、ＩＬ−８の産生を有意に抑制した（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。
以上の結果から、５’−ＦＭＮ−Ｎａの添加により高濃度のブドウ糖負荷によるＩＬ−８産生を抑制することが示された。実施例５の結果から、５’−ＦＭＮ−Ｎａを有効成分とする剤が、糖尿病や糖尿病による悪化病態に対する治療・予防剤として作用することが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明の医薬は、優れたサイトカイン抑制作用を有し、高サイトカイン血症を伴う炎症性疾患の予防又は治療剤等として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＬＰＳ投与後における血漿中１Ｌ−１β濃度の経時変化を示すグラフである。
図２は、ＬＰＳ投与後における血漿中ＩＮＦ−γ濃度の経時変化を示すグラフである。
図３は、ＬＰＳ投与後における血漿中ＩＬ−６濃度の経時変化を示すグラフである。
図４は、ＬＰＳ投与後における血漿中ＧＭ−ＣＳＦ濃度の経時変化を示すグラフである。
図５は、ＬＰＳ投与後における血漿中１Ｌ−１０濃度の経時変化を示すグラフである。
図６は、ＬＰＳ投与後における血漿中ＴＮＦ−α濃度の経時変化を示すグラフである。
図７は、ＬＰＳ投与後における血漿中ＭＣＰ−１濃度の経時変化を示すグラフである。
図８は、ＬＰＳ投与後における血漿中ＭＩＰ−２濃度の経時変化を示すグラフである。
図９は、ＬＰＳ投与後における血漿中ＮＯ濃度の経時変化を示すグラフである。
図１０は、ＳＥＢ投与後における血漿中ＩＮＦ−γ濃度の経時変化を示すグラフである。
図１１は、ＳＥＢ投与後における血漿中ＭＩＰ−２濃度の経時変化を示すグラフである。
図１２は、ＳＥＢ投与後における血漿中ＩＬ−６濃度の経時変化を示すグラフである。
図１３は、ＴＮＦ−α投与後におけるＩＬ−６濃度を示すグラフである。
図１４は、高濃度ブドウ糖負荷によって産生する活性酸素量を示すグラフである。
図１５は、高濃度ブドウ糖負荷によって誘発されるＩＬ−８濃度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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