(57)【要約】７回膜貫通型Ｇ蛋白質結合受容体の内部ドメイン３はＧ蛋白質の結合また受容体の活性に重要でありよく保存されている。Ｈ３受容体はＧ蛋白質共役型受容体の一種であり、同様にこの領域は保存されていた。そこで、ＰＣＲ法を用いてＨ３受容体ｃＤＮＡにおける該領域をコードする配列に点変異を導入した結果、非常に強い常活性をもつ変異型Ｈ３受容体の作製に成功した。さらに、Ｈ３受容体の常活性変異体を用いることにより、Ｈ３受容体のインバースアゴニストなどの医薬品候補化合物をより容易に、かつ、効率的にスクリーニングできることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ３受容体の常活性変異体。
【請求項２】
Ｈ３受容体の内部ドメイン３のＣ末端側に存在する活性化調節部位の少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した、請求項１に記載の常活性変異体。
【請求項３】
配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３５２番目、３５３番目、３５４番目または３５７番目の少なくとも一つの部位に相当する部位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した、請求項１または２に記載の常活性変異体。
【請求項４】
Ｈ３受容体の活性化調節部位のアミノ酸残基の置換が、下記（ａ）または（ｂ）である、請求項１または２に記載の常活性変異体。
（ａ）ヒトＨ３受容体において、ＲＤＲＫＶＡＫから、ＫＤＨＫＶＬＫ、ＲＡＲＫＶＡＫ、ＲＤＲＫＶＩＫ、または、ＲＤＲＫＶＫＫへの置換
（ｂ）マウス、ラットまたはモルモットＨ３受容体において、ＲＤＫＫＶＡＫから、ＫＤＨＫＶＬＫ、ＲＡＫＫＶＡＫ、ＲＤＫＫＶＩＫ、もしくは、ＲＤＫＫＶＫＫへの置換
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、請求項１または２に記載の常活性変異体。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５７番目のＡからＫまたはＩへの置換
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５３番目のＤからＡへの置換
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５２番目のＲからＫ、３５４番目のＫからＨ、および、３５７番目のＡからＬへの置換
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、請求項１または２に記載の常活性変異体。
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５７番目のＡからＫまたはＩへの置換
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５３番目のＤからＡへの置換
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５２番目のＲからＫ、３５４番目のＫからＨ、および、３５７番目のＡからＬへの置換
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の常活性変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のＤＮＡまたは請求項８に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項１０】
被験化合物がＨ３受容体の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する方法であって、
（ａ）Ｈ３受容体の常活性変異体を発現している細胞に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞における常活性変異体の活性を検出する工程、
を含み、上記活性が、被験化合物を接触させないときに比べ増加または減少している場合に、被験化合物が、上記常活性変異体の活性を変化させると判定される方法。
【請求項１１】
ｃＡＭＰ濃度の変化、カルシウム濃度の変化、Ｇ蛋白質の活性の変化、ホスホリパーゼＣの活性の変化、または、ｐＨの変化を指標に常活性変異体の活性を検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、Ｈ３受容体の常活性変異体の活性を変化させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１０または１１に記載の方法により、複数の被験化合物について、Ｈ３受容体の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験化合物から、該常活性変異体の活性を変化させると評価された化合物を選択する工程
【請求項１３】
医薬品候補化合物がＨ３受容体のインバースアゴニストである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒスタミン受容体Ｈ３常活性変異体およびその利用に関する。
背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は、細胞膜に存在する特異的な受容体を通して生体の機能を調節している。これらの受容体の多くは共役しているグアノシン三リン酸結合蛋白質（Ｇ蛋白質）の活性化を通して細胞内のシグナル伝達を行っている。このため、この受容体はＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と総称されている。あるいは７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、７回膜貫通型受容体とも総称されている。
Ｇ蛋白質共役型受容体は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。このため、Ｇ蛋白質共役型受容体は医薬品開発の標的として非常に注目されている。いくつかのＧ蛋白質共役型受容体は常活性体であることが知られている（Ｃｏｓｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４１，５４９−５６０，１９９２；Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｓｃｉ．，１４，３０３−３０７，１９９３）。また、Ｇ蛋白質共役型受容体に変異を導入すると、さらに活性が上昇する場合があることが知られている。例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体の一種であるａｌＢ−アドレナリン受容体の常活性変異体が知られている（Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１４３０−３３，１９９２）。また、ＷＯ０１／７７１７２には、種々のＧ蛋白質共役型受容体の常活性変異体が開示されている。
また、近年、アンダゴニストの一部にアゴニストの薬理作用と反対の作用を示すもの（インバースアゴニスト）が見出され、Ｇ蛋白質共役型受容体を標的とした医薬品候補化合物になりうることが指摘された（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｓｃｉ．，１６，１０−１３，１９９５）。Ｇ蛋白質共役型受容体にインバースアゴニストが作用すると、Ｇ蛋白質共役型受容体のコンフォメーションの変化が生じ、不活性型の割合が増加すると考えられている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｓｃｉ．，１６，１０−１３，１９９５）。
一方、Ｇ蛋白質共役型受容体の一種としてヒスタミン受容体Ｈ３（Ｈ３受容体）が知られている。該受容体をコードする遺伝子は、ヒトをはじめとする種々の生物において報告されている（Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５５：１１０１−１１０７，１９９９；Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９３：７７１−７７８，２０００；Ｔａｒｄｉｖｅｌ−Ｌａｃｏｍｂｅ  Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１：７５５−７５９，２０００；ＷＯ２００３００４６３７）。Ｈ３受容体遺伝子ノックアウトマウスは、体重、摂食量、血中インスリン量、または、血中レプチン量の増加を呈することが見出されており、Ｈ３受容体と体重、摂食量、血中インスリン量、または、血中レプチン量の変化を特徴とする疾患との関連が明らかとなっている（ＷＯ２００３００４６３７）。また、Ｈ３受容体は、天然の状態でも常活性状態にあり、また常活性なコンフォメーションをとりやすいことが報告されている（Ｍｏｒｉｓｓｅｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０８，８６０−８６４，２０００）。しかしながら、これまでに、Ｈ３受容体の常活性変異体についての報告例は皆無である。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｈ３受容体の常活性変異体を作製し、該常活性変異体を用いた医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。７回膜貫通型Ｇ蛋白質共役型受容体の内部ドメイン３はＧ蛋白質の結合または受容体の活性に重要でありよく保存されている。Ｈ３受容体はＧ蛋白質共役型受容体の一種であり、同様にこの領域は保存されていた。そこで、Ｈ３受容体の常活性変異体の作製を試みた。まず、ＰＣＲ法を用いてマウスＨ３受容体ｃＤＮＡにおける該領域をコードする配列に点変異を導入し、ＭＴ１、ＭＴ２、ＭＴ３、ＭＴ５、および、ＭＴ６クローンを作製した。次いで、ワイルドタイプのマウスＨ３受容体ｃＤＮＡおよび５つの変異型マウスＨ３受容体ｃＤＮＡをそれぞれＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクションした。次いで、ＥＬＩＳＡ法によってｃＡＭＰ量の測定を行った。検討の結果、１０μＭフォルスコリン存在下、すべてのクローンでヒスタミンにより用量依存的にｃＡＭＰ量が減少することを見出した。また、１０μＭフォルスコリン存在下、Ｈ３インバースアゴニストであるチオペラミドにより用量依存的にｃＡＭＰ量が増加することを見出した。さらに、ｃＡＭＰ量はＭＴ１クローンを除き、天然型Ｈ３受容体に比べ増加することを見出した。以上の結果は、本発明者らが、非常に強い常活性をもつ変異型Ｈ３受容体の作製に成功したことを示すものである。また、Ｈ３受容体の常活性変異体を用いることにより、Ｈ３受容体のインバースアゴニストなどの医薬品候補化合物をより容易に、かつ、効率的にスクリーニングすることができることを示すものである。
即ち、本発明は、
〔１〕Ｈ３受容体の常活性変異体、
〔２〕Ｈ３受容体の内部ドメイン３のＣ末端側に存在する活性化調節部位の少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した、〔１〕に記載の常活性変異体、
〔３〕配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３５２番目、３５３番目、３５４番目または３５７番目の少なくとも一つの部位に相当する部位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した、〔１〕または〔２〕に記載の常活性変異体、
〔４〕Ｈ３受容体の活性化調節部位のアミノ酸残基の置換が、下記（ａ）または（ｂ）である、〔１〕または〔２〕に記載の常活性変異体、
（ａ）ヒトＨ３受容体において、ＲＤＲＫＶＡＫから、ＫＤＨＫＶＬＫ、ＲＡＲＫＶＡＫ、ＲＤＲＫＶＩＫ、または、ＲＤＲＫＶＫＫへの置換
（ｂ）マウス、ラットまたはモルモットＨ３受容体において、ＲＤＫＫＶＡＫから、ＫＤＨＫＶＬＫ、ＲＡＫＫＶＡＫ、ＲＤＫＫＶＩＫ、もしくは、ＲＤＫＫＶＫＫへの置換
〔５〕下記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、〔１〕または〔２〕に記載の常活性変異体、
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５７番目のＡからＫまたはＩへの置換
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５３番目のＤからＡへの置換
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５２番目のＲからＫ、３５４番目のＫからＨ、および、３５７番目のＡからＬへの置換
〔６〕下記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、〔１〕または〔２〕に記載の常活性変異体、
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５７番目のＡからＫまたはＩへの置換
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５３番目のＤからＡへの置換
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも、３５２番目のＲからＫ、３５４番目のＫからＨ、および、３５７番目のＡからＬへの置換
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の常活性変異体をコードするＤＮＡ、
〔８〕〔７〕に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
〔９〕〔７〕に記載のＤＮＡまたは〔８〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
〔１０〕被験化合物がＨ３受容体の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する方法であって、
（ａ）Ｈ３受容体の常活性変異体を発現している細胞に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞における常活性変異体の活性を検出する工程、
を含み、上記活性が、被験化合物を接触させないときに比べ増加または減少している場合に、被験化合物が、上記常活性変異体の活性を変化させると判定される方法、
〔１１〕ｃＡＭＰ濃度の変化、カルシウム濃度の変化、Ｇ蛋白質の活性の変化、ホスホリパーゼＣの活性の変化、または、ｐＨの変化を指標に常活性変異体の活性を検出する、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、Ｈ３受容体の常活性変異体の活性を変化させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）〔１０〕または〔１１〕に記載の方法により、複数の被験化合物について、Ｈ３受容体の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験化合物から、該常活性変異体の活性を変化させると評価された化合物を選択する工程
〔１３〕医薬品候補化合物がＨ３受容体のインバースアゴニストである、〔１２〕に記載の方法、
を提供するものである。
Ｈ３受容体は、常活性体であることが知られている。これに対し、本発明者らは、天然型常活性体と比較して、さらに活性が上昇しているＨ３受容体の常活性変異体を作製した。さらに、該常活性変異体を用いることにより、医薬品候補化合物をより容易に、かつ、効率的にスクリーニングできることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
本発明は、Ｈ３受容体の常活性変異体を提供する。本発明におけるＨ３受容体の常活性変異体は、好ましくは実質的に精製されたものである。本発明において、「実質的に精製された」とは、外部の環境から切り離されて、他の成分が多くとも４０％、好ましくは２５％、より好ましくは１０％以下であることを意味する。また、本発明において、「常活性」とは、リガンドの非存在下での活性（リガンド非存在下でも活性を有する状態）を意味する。
本発明の常活性変異体において、その変異部位、変異タイプ、変異数に特に制限はないが、変異部位は、Ｈ３受容体の内部ドメイン３のＣ末端側の活性化調節部位に存在することが好ましい。また、変異タイプとしては、置換変異、欠失変異、挿入変異などが例示できるが、好ましくは置換変異である。このような変異を有する常活性変異体としては、例えばＨ３受容体の内部ドメイン３のＣ末端側に存在する活性化調節部位の少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した常活性変異体が挙げられる。より具体的には、活性化調節部位が、ＫＤＨＫＶＬＫ（配列番号：４）、ＲＡＲＫＶＡＫ（配列番号：５）、ＲＤＲＫＶＩＫ（配列番号：６）、ＲＤＲＫＶＫＫ（配列番号：７）、ＲＡＫＫＶＡＫ（配列番号：８）、ＲＤＫＫＶＩＫ（配列番号：９）、または、ＲＤＫＫＶＫＫ（配列番号：１０）配列である常活性変異体が例示できるが、本発明の常活性変異体における活性化調節部位の配列としては、これら配列に限定されるものではない。
また、本発明のＨ３受容体の常活性変異体としては、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３５２番目、３５３番目、３５４番目または３５７番目の少なくとも一つの部位に相当する部位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した常活性変異体が例示できるが、これらの常活性変異体に限定されるものではない。例えば、上記部位に加え、さらに、その他の部位にも変異が生じている常活性変異体もまた、本発明の常活性変異体に含まれる。
本発明において、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３５２番目、３５３番目、３５４番目または３５７番目に相当する部位としては、例えば、ラットＨ３受容体（Ｑ９ＱＹＮ８）では、マウスやヒトＨ３受容体と同様に３５２番目、３５３番目、３５４番目または３５７番目のアミノ酸部位である。
また、本発明のＨ３受容体の常活性変異体としては、好ましくは、ヒト、マウス、ラットまたはモルモット（ギニアピッグ）Ｈ３受容体の常活性変異体であるが、該常活性変異体が由来する生物種は特に制限されない。
本発明におけるヒトＨ３受容体とは、ＲＤＲＫＶＡＫ配列（配列番号：１１）を有するＨ３受容体を意味する。本発明におけるヒトＨ３受容体の具体例としては、４４５ＡＡのＱ９Ｙ５Ｎ１（配列番号：３）、４５３ＡＡのＢＡＢ２００９０、および、３６５ＡＡのＡＡＫ５００４０などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明におけるマウス、ラットまたはモルモットＨ３受容体とは、ＲＤＫＫＶＡＫ配列（配列番号：１２）を有するＨ３受容体を意味する。具体的には、マウスＨ３受容体として配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するＨ３受容体、ラットＨ３受容体として４４５ＡＡのＱ９ＱＹＮ８、４４９ＡＡのＢＡＡ８８７６５、４１３７ＡＡのＢＡＡ８８７６７、および、３９７ＡＡのＢＡＡ８８７６８、モルモットＨ３受容体として４４５ＡＡのＱ９ＪＩ３５が例示できるが、これらに限定されるものではない。上記の具体的な配列を有するＨ３受容体が、全て同様の構造的特徴、活性、および、活性化調節部位の配列（ヒトではＲＤＲＫＶＡＫ（配列番号：１１）、マウス、ラットおよびモルモットではＲＤＫＫＶＡＫ（配列番号：１２））を有することが報告されている。
また、本発明におけるヒトＨ３受容体の常活性変異体の活性化調節部位の配列は、ＫＤＨＫＶＬＫ（配列番号：４）、ＲＡＲＫＶＡＫ（配列番号：５）、ＲＤＲＫＶＩＫ（配列番号：６）、または、ＲＤＲＫＶＫＫ（配列番号：７）であることが好ましいが、これらの配列に限定されるものではない。また、本発明におけるマウス、ラットおよびモルモットＨ３受容体の常活性変異体の活性化調節部位の配列は、ＫＤＨＫＶＬＫ（配列番号：４）、ＲＡＫＫＶＡＫ（配列番号：８）、ＲＤＫＫＶＩＫ（配列番号：９）、または、ＲＤＫＫＶＫＫ（配列番号：１０）であることが好ましいが、これらの配列に限定されるものではない。
本発明におけるマウスＨ３受容体の常活性変異体としては、好ましくは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３５７番目のＡがＫまたはＩに置換した常活性変異体、３５３番目のＤがＡに置換した常活性変異体、または、３５２番目のＲがＫ、３５４番目のＫがＨ、および、３５７番目のＡがＬに置換した常活性変異体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、上記置換変異の組み合わせが多数考え得る。
また、ヒトＨ３受容体の常活性変異体としては、好ましくは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３５７番目のＡがＫまたはＩに置換した常活性変異体、３５３番目のＤがＡに置換した常活性変異体、または、３５２番目のＲがＫ、３５４番目のＫがＨ、および、３５７番目のＡがＬに置換した常活性変異体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、上記置換変異の組み合わせが多数考え得る。
本発明のＨ３受容体の常活性変異体は、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡに対し、該蛋白質の活性がより上昇するような変異を導入することで作製することができる。
「配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ」としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等をコードするＤＮＡが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質が、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と同等の生物学的機能（役割）や生化学的機能（性質）を有することを指す。本発明において、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質の生物学的機能（役割）としては、例えば、細胞内シグナル伝達機能（例えば、ｃＡＭＰ濃度の変化、カルシウム濃度の変化、Ｇ蛋白質の活性の変化、ホスホリパーゼＣの活性の変化、または、ｐＨの変化）、または、体重、摂食量、血中インスリン量、もしくは、血中レプチン量を制御する機能が挙げられる。また、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質の生化学的機能（性質）としては、ヒスタミンやそのアナログなどと結合する性質が挙げられる。
このような蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ヒト（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０７２８０、Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５５：１１０１−１１０７，１９９９）、ラット（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０７２８０、Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９３：７７１−７７８，２０００）、ギニアピッグ（Ｔａｒｄｉｖｅｌ−Ｌａｃｏｍｂｅ  Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１：７５５−７５９，２０００）、マウス（ＷＯ２００３００４６３７）由来のＤＮＡが知られており、すでにその配列が開示されている。
その他の配列を有するＤＮＡを調製するためには、例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５，１９９５；Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００，１９８３；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６，１９８４；Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７，１９８７；Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２，１９８５；Ｋｕｎｋｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６，１９８８）、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３２９−３５０，１９８７）、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４，３１５−２３，１９８５）、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８，４０４−４０７，１９９０）などを用いて、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡに適宜変異を導入することにより、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。なお、変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）である。
また、ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ配列（例えば配列番号：２）もしくはその一部を利用して、これと相同性の高いＤＮＡを単離すること、さらに、該ＤＮＡから配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質を単離することは、周知の技術である。
配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：２）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ＰＣＲ法を利用して、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、通常、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、合成ＤＮＡも含まれる。ｃＤＮＡは、例えば、配列番号：２に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡが発現している組織（例えば、脳、視床、視床下部）由来のｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、ｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織（例えば、脳、視床、視床下部）由来のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応により増幅し、クローニングすることもできる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：２に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、ゲノムＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、ｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応により増幅し、クローニングすることもできる。一方、合成ＤＮＡは、例えば、配列番号：２に記載のｃＤＮＡの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、ＤＮＡリガーゼで結合させることにより調製することができる（Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５−５７０，１９７６；Ｇｏｅｄｄｅｌ  Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，１０６−１０，１９７９）。
本発明においては、このようにして得られた配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡに対し、該蛋白質の活性がより上昇するような変異を導入する。ＤＮＡに変異が導入された結果、アミノ酸が変異する部位としては、好ましくは配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３５２番目、３５３番目、３５４番目または３５７番目の少なくとも一つの部位に相当する部位であるが、これら部位に限定されるものではない。また、変異タイプとしては、好ましくはアミノ酸置換を伴うタイプが挙げられるが、これに制限されず、具体的には、例えばアミノ酸の欠失、挿入を伴うタイプが挙げられる。
このようにして得られたＨ３受容体の常活性変異体をコードするＤＮＡから該常活性変異体を調製することは、当業者に周知の方法で実施することができる。
また、本発明は上記Ｈ３受容体の常活性変異体をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、好ましくは単離されたものである。ここで「単離された」とは、本来の環境から取り出され、実質的に精製されている状態を意味する。
このようなＤＮＡは、組換え蛋白質の生産に有用である。即ち、上記常活性変異体をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させた蛋白質を精製することにより、本発明の常活性変異体を調製することが可能である。また、本発明の常活性変異体は受容体であるため、細胞膜に発現させて調製することが可能である。
具体的には、宿主が大腸菌エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合、プラスミドベクターｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６，１２５−３５，１９８７）、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ  ６７，３１−４０，１９８８）などが用いられる。大腸菌の形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０，１９８３）、電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，６１２７−６１４５，１９８８）などで行う。宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の場合には、プラスミドベクターｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００，１３５−１４４，１９９７）などが用いられる。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法（Ｂｅａｃｈ，Ｄ．ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０，１４０，１９８１）、酢酸リチウム法（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，６４８５−６４８９，１９９０）などにより行なわれる。
一方、宿主がほ乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、ヒトＨｅＬａ細胞などの場合、ｐＭＳＧ（クロンテク社）などのベクターが用いられる。また、ＨＥＫ２９３細胞の場合、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）が用いられる。ほ乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７，１９７３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３，１９８４）、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７，１９８７）、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，８４１−８４５，１９８２）などで行われる。
宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（クロンテク社）などが用いられる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５，１９８０）などに記載の方法に従って行なうことができる。
宿主細胞において発現させた組換え蛋白質は、公知の方法により精製することができる。また、例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合蛋白質の形で合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１−７２１５，１９８８）。例えば、ベクターとしてｐＥＳＰ−１を用いた場合、目的の蛋白質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として合成されるため、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることより組換え蛋白質を精製できる。融合蛋白質から目的蛋白質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａなどで切断する。
また、本発明は、被験化合物が本発明の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する方法を提供する。本方法においては、まず、本発明の常活性変異体を発現している細胞に被験化合物を接触させる。本方法に用いる被験化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、リガンドが存在していることが予想される組織もしくは細胞（例えば、脳、視床、視床下部）の抽出液、等が挙げられるが、それらに限定されない。
また、本発明の常活性変異体を発現している細胞は、例えば、本発明の常活性変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。
また、本発明において「接触」は、例えば、細胞の培養液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物が蛋白質の場合には、例えば、該蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターを、常活性変異体が発現している細胞へ導入することも可能である。
本方法においては、次いで、細胞における常活性変異体の活性を検出する。常活性変異体の活性は、例えば、細胞内シグナル伝達（例えば、ｃＡＭＰ濃度の変化、カルシウム濃度の変化、Ｇ蛋白質の活性の変化、ホスホリパーゼＣの活性の変化、または、ｐＨの変化）を指標に検出することができる。細胞内シグナル伝達を指標とした常活性変異体の活性の検出は、当業者であれば、周知の方法により実施することができる。本方法においては、上記活性が、被験化合物を接触させないときに比べ増加または減少している場合に、被験化合物が、上記常活性変異体の活性を変化させると判定される。
すでに、Ｈ３受容体遺伝子ノックアウトマウスは、体重、摂食量、血中インスリン量、または、血中レプチン量の増加を呈することが見出されている。従って、上記化合物は、体重、摂食量、血中インスリン量、または、血中レプチン量の変化（増加もしくは減少）を特徴とする疾患の治療または予防のための医薬品になりうる。
また、上記評価方法を利用することにより、複数の被験化合物について、常活性変異体の活性を変化させる医薬品候補化合物をスクリーニングすることが可能となる。該医薬品候補化合物としては、Ｈ３受容体のアゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニスト（受容体と結合することにより、アゴニストの薬理作用と反対の作用を発現する反作用薬）などが例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明におけるアゴニストおよびインバースアゴニストには、完全活性を有するものだけでなく、部分活性を有するものも包含される。本発明のスクリーニング方法は、これら種々の医薬品候補化合物のうち、特にＨ３受容体のインバースアゴニストをスクリーニングすることにおいて、より有効な方法である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
７回膜貫通型Ｇ蛋白質結合受容体の内部ドメイン３（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ３）はＧ蛋白質の結合また受容体の活性に重要でありよく保存されている。Ｈ３受容体はＧ蛋白質共役型受容体の一種であり同様にこの領域は保存されていた。そこでＰＣＲ法を用いてマウスＨ３受容体ｃＤＮＡおよびヒトＨ３受容体ｃＤＮＡにおける該領域をコードする配列に点変異を導入し、マウスＨ３受容体およびヒトＨ３受容体の常活性変異体の作製を試みた。
具体的には、まず、アミノ酸変異のデザインを考えた（図１）。次いで、マウスＨ３受容体ｃＤＮＡ（発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋））を鋳型にプライマー７２２Ｆ（５’−ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＴＧＣ−３’（配列番号：１９））および１３３８Ｒ（５’−ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  Ｇ−３’（配列番号：２０））、並びに、６８３Ｆ（５’−ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号：２１））およびＭＴ１（５’−ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ−３’（配列番号：２２））、ＭＴ２（５’−ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＣＣＧ−３’（配列番号：２３））、ＭＴ３（５’−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＣＣＧ−３’（配列番号：２４））、ＭＴ５（５’−ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ−３’（配列番号：２５））、または、ＭＴ６（５’−ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＣＧ−３’（配列番号：２６））を用いてそれぞれＰＣＲを行った。サイクルコンディションは９４℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２５回繰り返した。次いで、それぞれのＰＣＲ反応により得られた断片を鋳型にプライマー６８３Ｆおよび１３３８Ｒを用いて２回目のＰＣＲを行った。サイクルコンディションは９４℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２５回繰り返した。２回目のＰＣＲによって生成した断片（６５６ｂｐ）をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。点変異が導入されることによりＭＴ１、ＭＴ５、および、ＭＴ６のＢｓｔＸＩサイトがＭＴ２およびＭＴ３のＢｓｍＦＩサイトがそれぞれ消失したことを確認した。さらにシークエンスにより点変異の導入を確認した。次いで、点変異を含むＡｏｒ５１ＨＩ−ＳｆｉＩ断片（１７４ｂｐ）をマウスＨ３受容体ｃＤＮＡにクローニングした。ＰＣＲ反応はすべてＥｘｐａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用した。
変異ＤＮＡ断片をシークエンスし、点変異が導入されたことを確認した後に、Ａｏｒ５１ＨＩ−ＳｆｉＩ断片をワイルドタイプのマウスＨ３受容体ｃＤＮＡ（発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋））にクローニングした。以上の方法によりＭＴ１、ＭＴ２、ＭＴ３、ＭＴ５、および、ＭＴ６クローンを作製した（図２）。
ワイルドタイプのマウスＨ３受容体ｃＤＮＡおよび５つの変異型マウスＨ３受容体ｃＤＮＡをそれぞれＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクションし、Ｇ４１８選別を行いそれぞれのステーブルクローン（ｓｔａｂｌｅ  ｃｌｏｎｅ）を得た。ノーザン解析により発現量のチェックを行い、同程度の発現量をもつステーブルクローンを実験に用いた。
同様な方法で、ヒトＨ３受容体の常活性変異体を作製し（図３）、該変異体を発現するクローンが得られる。
［実施例２］
Ｈ３受容体はＧｉ結合型のＧ蛋白質共役型受容体であるので、ＥＬＩＳＡ法によってｃＡＭＰ量の測定を行った。具体的には、試験前日２４−ウエルプレートに１ウエルあたり１０５細胞を培養した。試験当日、非血清存在下で１５分間培養した後、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸで１５分間処理した。フォルスコリン（１０μＭ）、ヒスタミン（１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍ）、チオペラミド（１０−１０Ｍ〜１０−５Ｍ）をそれぞれ加え１５分間処理した。ｃＡＭＰ測定にはｃＡＭＰ  ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＩＡ）ｓｙｓｔｅｍ（ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた。キットに添付されている溶解試薬１Ｂ  １５０μｌで細胞を破砕した。そのうち５μｌのセルライセート（ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ）とウサギ抗ｃＡＭＰ抗体を抗体固相化プレート中、４℃で２時間静置して反応させた。さらに酵素標識抗体を加え、４℃で１時間静置して反応させた。プレートを緩衝液で洗浄し酵素基質溶液を加え室温で約３０分間静置して反応させた。１Ｎ硫酸で反応を停止させ吸光度を測定した。標準曲線用ｃＡＭＰ溶液の吸光度より標準曲線を作成し、ｃＡＭＰ量を算出した。なお、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ（ＰＴＸ）は１００ｎｇ／ｍｌの終濃度で１８時間処理し、同様の実験を行った。検討の結果、１０μＭフォルスコリン存在下、すべてのクローンでヒスタミンにより用量依存的にｃＡＭＰ量が減少した（図４）。
［実施例３］
１０μＭフォルスコリン存在下、Ｈ３インバースアゴニストであるチオペラミドにより用量依存的にｃＡＭＰ量が特にＭＴ６クローンで増加することを見出した（図５）。Ｈ３受容体は天然の状態でも常活性状態にあり、また常活性なコンフォメーションをとりやすいことが報告されているが、ＭＴ６クローンはワイルドタイプに比べ約５倍もｃＡＭＰの増加が観察され非常に強い常活性状態にあることが示唆された。また、チオペラミドによるｃＡＭＰ量の増加はＧｉ蛋白質経路のものであるかを確かめるためにｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ（ＰＴＸ）を１００ｎｇ／ｍｌの終濃度で１８時間処理し、同様の実験を行った。その結果、ＰＴＸによりワイルドタイプＨ３、ＭＴ６クローンともにチオペラミドによるｃＡＭＰの増加が阻害された。
Ｈ３受容体はシナプス前部に存在し、自己受容体としてヒスタミンの放出を調節している。Ｈ３受容体は常活性体であり、ヒスタミン非存在下においても、ヒスタミンの放出を減少させる方向に働いている。また、ヒスタミンがＨ３受容体に結合することで、ヒスタミンの放出をさらに減少させる方向に働く。
シナプス後部にあるＨ１受容体にヒスタミンが結合すると、食欲を減少させる方向に働く。Ｈ１アゴニストは抗肥満薬になりうるが、Ｈ１の分布は、ユビキタス（Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）であるので目的以外の作用も有する。一方、Ｈ３アンタゴニストやインバースアゴニストは、中枢でのみ作用し、ヒスタミンの放出を増やすので、抗肥満薬になり得る。
インバースアゴニストは常活性体に対しても、拮抗的な効果を示す。実際、インバースアゴニストがアンタゴニストより有効であることはすでに指摘されている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＴｉＰＳ，１６，１０−１３，１９９５）。
本実施例においては、Ｈ３受容体の内部ドメイン３をコードする配列にＰＣＲ法を用いて点変異を導入することにより非常に強い常活性をもつＨ３クローンの作製に成功した。このクローンを用いることによりＨ３受容体のインバースアゴニストなどのスクリーニングがより容易、かつ、効率的になるものと考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明者らによって、Ｈ３受容体の常活性変異体が作製された。Ｈ３受容体の常活性変異体を用いることにより、Ｈ３受容体のインバースアゴニストなどの医薬品候補化合物をより容易に、かつ、効率的にスクリーニングすることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｈ３受容体の変異の導入を核酸配列で示す図である。ｍ−Ｈ３はワイルドタイプのマウスＨ３受容体を意味する。
図２は、マウスＨ３受容体の変異の導入をアミノ酸配列で示す図である。
図３は、ヒトＨ３受容体の変異の導入をアミノ酸配列で示す図である。ｈ−Ｈ３はワイルドタイプのヒトＨ３受容体を意味する。
図４は、Ｈ３常活性変異体のヒスタミンに対する応答性を示す図である。
図５は、Ｈ３常活性変異体のチオペラミドに対する応答性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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