(57)【要約】この発明は、ヘリコバクターピロリの新規細胞障害性タンパク質（Ｍ毒素、ｍｕｃｏｕｓ  ｌａｙｅｒ  ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ）およびその利用に関する。この発明はヘリコバクターピロリで産生される細胞障害タンパク質（Ｍ毒素）、部分ペプチド、該細胞障害タンパク質からなる抗腫瘍剤を提供するものである。この細胞障害タンパク質は該タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養することによって得られる。この発明はさらに該細胞障害タンパク質の用途を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列に対する同一性を少なくとも７０％以上有するタンパク質からなることを特徴とする細胞障害タンパク質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と等しい細胞障害活性を有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド。
【請求項３】
ヘリコバクターピロリで産生される請求項１または２記載の細胞障害タンパク質。
【請求項４】
請求項１または２記載の細胞障害タンパク質をコードする配列番号２のＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養することを特徴とする請求項１または２記載の細胞障害タンパク質。
【請求項５】
形質転換体が独立行政法人産業技術総合研究所（ＩＰＯＤ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２１８で寄託されている請求項４記載の細胞障害タンパク質。
【請求項６】
請求項１または２記載の細胞障害タンパク質を用いる抗腫瘍剤。
【請求項７】
請求項１または２記載の細胞障害タンパク質を哺乳類に免疫して得られる細胞障害タンパク質に特異的なモノクローナル抗体。
【請求項８】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２２のハイブリドーマクローンを用いて産生される請求項７記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２３のハイブリドーマクローンを用いて産生される請求項７記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２４のハイブリドーマクローンを用いて産生される請求項７記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１または２記載の細胞障害タンパク質を哺乳類に免疫して得られる細胞障害タンパク質に特異的なポリクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項７から１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる請求項１または２記載の細胞障害タンパク質を検出する方法および診断法。
【請求項１３】
請求項７から１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる請求項１または２記載の細胞障害タンパク質により惹き起こされる胃癌、胃炎、胃潰瘍の予防、治療剤。
【請求項１４】
請求項１または２記載のタンパク質を用いることを特徴とする、請求項１または２記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物について、温血動物細胞を用いて陰性または陽性対照群との比較で、細胞増殖阻害活性、細胞障害活性あるいは細胞死により当該化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求項１または２記載のタンパク質を含有してなる、請求項１または２記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
請求項１４記載のスクリーニング方法または請求項１５記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項１または２記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
【請求項１７】
請求項１または２記載のタンパク質による温血動物細胞の細胞障害活性を阻害する活性を有する化合物またはその塩を含有する医薬。
【請求項１８】
胃炎、胃潰瘍、胃癌および請求項１４記載のスクリーニング方法または請求項１５記載のスクリーニング用キットによって、Ｍ毒素で惹起されることの示される疾患に対する予防・治療剤である請求項１７記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヘリコバクターピロリの産生する新規な細胞障害タンパク質であるＭ毒素（ｍｕｃｏｕｓ  ｌａｙｅｒ  ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ）及びその利用に関する。
背景技術
多くの胃炎、胃潰瘍あるいは胃癌はヘリコバクターピロリによると考えられてきているが、今日まで、それらの疾患の端緒である胃上皮細胞の破壊と不可逆的な細胞死を惹起する、明らかな直接細胞障害因子は特定されてこなかった。胃内のｐＨ環境や免疫反応を変化させる因子や、ヘリコバクターピロリの胃上皮細胞への接着因子、あるいは菌自体の運動性などが疾患成立要件として指摘されてきたが、胃炎、胃潰瘍、胃癌のすべての出発点といえる胃粘膜破壊が、いかなる過程を経るのか、またその直接的な責任因子は何かということは現在まで不明だった。唯一、細胞障害性をもつ空胞化毒素が単離されていたが、これは細胞障害活性が弱く、可逆的な細胞障害活性にとどまり、致死的細胞障害因子としては、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも病原因子としては認められてこなかった。
ヘリコバクターピロリは、上述のごとく、生体の胃内環境において、胃粘膜細胞に対する直接障害因子を分泌していることは、多くの研究者により推定され、その疾患の重要性をも鑑み、遺伝子の全配列が１９９６年には確定されたが、血清を使用してもなお困難な培養条件と、分離精製条件および評価系の未確立が、推定毒素の単離同定を阻んできた。
発明が解決しようとする課題
そこで、ヘリコバクターピロリ感染にともなう胃炎、胃潰瘍、胃癌等の原因となる責任タンパク質を見いだし、その毒素タンパク質を大量調製する方法を確立し、もって新規な毒素であるＭ毒素の同定、診断およびスクリーニング法を確立することが、１つの課題となった。またそれらを用いて、胃粘膜細胞障害の責任毒素の作用を抑制し、胃炎、胃潰瘍、胃癌等の予防・治療剤の開発の道を開き、あわせてその毒素の応用方法にまで緒をつけることが望まれた。
発明の開示
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヘリコバクターピロリを従来と異なる、より胃内環境に近い状態である無血清培養条件下で生育した場合に、不可逆的細胞死をもたらす新規な毒素を同定した。これは、上述の空胞化毒素の単位当たり１０００倍から１０００００倍の毒力を有し、胃上皮細胞のみならず免疫系細胞を含む広範な温血細胞に対して、不可逆的な細胞死を惹起することを見いだした。本発明者は、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対する同一性を少なくとも７０％以上有するタンパク質からなることを特徴とする細胞障害タンパク質、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列と等しい細胞障害活性を有することを特徴とする（１）記載のタンパク質の部分ペプチド、（３）ヘリコバクターピロリで産生される（１）１または（２）記載の細胞障害タンパク質、（４）（１）または（２）記載の細胞障害タンパク質をコードする配列番号２のＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養することを特徴とする（１）または（２）記載の細胞障害タンパク質、（５）形質転換体が独立行政法人産業技術総合研究所（ＩＰＯＤ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２１８で寄託されている（４）記載の細胞障害タンパク質、（６）（１）１または（２）記載の細胞障害タンパク質を用いる抗腫瘍剤、（７）（１）または（２）記載の細胞障害タンパク質を哺乳類に免疫して得られる細胞障害タンパク質に特異的なモノクローナル抗体、（８）寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２２のハイブリドーマクローンを用いて産生される（７）記載のモノクローナル抗体、（９）寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２３のハイブリドーマクローンを用いて産生される（７）記載のモノクローナル抗体、（１０）寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２４のハイブリドーマクローンを用いて産生される（７）記載のモノクローナル抗体、（１１）（１）または（２）記載の細胞障害タンパク質を哺乳類に免疫して得られる細胞障害タンパク質に特異的なポリクローナル抗体、（１２）（７）から（１１）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる（１）または（２）記載の細胞障害タンパク質を検出する方法および診断法、（１３）（７）から（１１）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる（１）または（２）記載の細胞障害タンパク質により惹き起こされる胃癌、胃炎、胃潰瘍の予防、治療剤、（１４）（１）または（２）記載のタンパク質を用いることを特徴とする、（１）または（２）記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物について、温血動物細胞を用いて陰性または陽性対照群との比較で、細胞増殖阻害活性、細胞障害活性あるいは細胞死により当該化合物をスクリーニングする方法、（１５）（１）または（２）記載のタンパク質を含有してなる、（１）または（２）記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、（１６）（１４）記載のスクリーニング方法または（１５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、（１）または（２）記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、（１７）（１）または（２）記載のタンパク質による温血動物細胞の細胞障害活性を阻害する活性を有する化合物またはその塩を含有する医薬、（１８）胃炎、胃潰瘍、胃癌および（１４）記載のスクリーニング方法または（１５）記載のスクリーニング用キットによって、Ｍ毒素で惹起されることの示される疾患に対する予防・治療剤である（１７）記載の医薬を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヘリコバクターピロリにおける細菌株、例えばＮＣＴＣ  １１６３７，ＮＣＴＣ  １１９１６，ＤＴ  ６１Ａ，ＮＣＴＣ  １１６３９，Ｒ８５−１３  ６Ｐ，Ｒ８５−１３−１２Ｆ，Ｒ８５−１３−１１Ｐ，Ｔ８１２１３−ＮＴＢ，Ｊ９９、４、Ｕ２−１、８５Ｄ０８、ＭＣ９０３、ＭＣ１２３、Ｔｘ３０ａ、２６６９５、ＵＡ  １１８２等に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。本発明の配列番号１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、細胞増殖阻害活性、細胞障害活性あるいは細胞死をもたらす活性などがあげられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。従って、細胞障害などの活性が同等（例、約０．１〜１００倍、好ましくは約０．５〜１０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。細胞増殖阻害活性、細胞障害活性あるいは細胞死をもたらす活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述するスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、本発明のタンパク質としては、例えば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５０個（好ましくは、１〜５０個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；配列番号１で表わされるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは、１〜５０個（より好ましくは、１〜３０個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列；配列番号１で表わされるアミノ酸配列に１〜５０個（好ましくは、１〜３０個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列；配列番号１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５０個（好ましくは、１〜３０個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムチンも含まれる。前記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基である。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば前記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の活性（例、細胞増殖阻害または細胞増殖阻害など）を有するものであればいかなるものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列中の少なくとも２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有し、細胞増殖阻害活性、細胞障害活性あるいは細胞死をもたらす活性を有するペプチドなどが用いられる。また、本発明の部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１〜１０個（好ましくは、１〜５個（より好ましくは、１〜３個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）（Ｒは前記と同意義を示す）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。また、本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原として用いることができるので、必ずしも細胞増殖阻害活性または細胞障害活性等を有する必要はない。
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質またはその塩は、前述したヘリコバクターピロリの種々の菌株の菌体より自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後述するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。ヘリコバクターピロリの種々の菌株の菌体から製造する場合、菌体を超音波破砕などにより菌体内タンパク質を遠心分離した後、硫安沈殿などで抽出を行ない、該抽出液をイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、部分ペプチド、もしくはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質またはそれらのアミド体を取得する。前記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｓ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。前記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は前記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を前記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については前記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、前記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下に記載された方法があげられる。Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）；ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）；泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）；矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）；矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店。また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。前記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性（例、細胞障害活性など）を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何でもよい。
より具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明のタンパク質または部分ペプチド（以下、これらタンパク質等をコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらタンパク質等を単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（宝酒造（株）製）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株）製）などを用いて、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐＥＴ３０）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）、カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、組換え体細胞をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１・ＤＨ５α（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６０，１６０（１９６８））、ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．９，３０９（１９８１））、ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２０，５１７（１９７８））、ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４１，４５９（１９６９））、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３９，４４０（１９５４））などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２４，２５５（１９８３），２０７−２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．９５，８７（１９８４））などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピヒア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７（１９７７））などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１５，５９２（１９８５）〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。さらに、各種の正常ヒト細胞、例えば肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）などを用いることも可能である。エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６９，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，Ｖｏｌ．１７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９４，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７５，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール、２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２）が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），Ｖｏｌ．７７，４５０５（１９８０））や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，５３３０（１９８４））があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，３９６（１９５９））、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１９９，５１９（１９６７））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．７３，１（１９５０））などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
前記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、疎水性クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその塩の存在または活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらタンパク質等を単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製：本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクロナール抗体の精製：モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチド等を含有する治療剤および本発明のタンパク質等は癌細胞障害活性を有しているので、疾患組織摘出（全摘出・部分摘出の双方を含むが、部分摘出が好ましい）とくに固定癌に対する治療医薬として使用することができる。本発明のタンパク質等を上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質等の癌細胞増殖阻害活性は、自体公知の方法あるいは、細胞障害活性または細胞死をもたらす活性を、自体公知の方法等それに準じる方法などに従って測定することができ、後述の実施例に記載の方法で行なうことが好ましい。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の細胞障害活性を阻害する活性あるいは癌細胞増殖阻害を阻害する活性を有する化合物である。該化合物の塩としては、上記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング：本発明のタンパク質等は細胞障害活性を有するため、本発明のタンパク質等の機能（例、細胞障害活性など）を促進する化合物またはその塩は、例えば、癌治療剤などの医薬として使用できるが、一方、本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物またはその塩は、例えば、胃炎、胃潰瘍の治療・予防剤などの医薬として使用できる。従って、本発明のタンパク質等は、本発明のタンパク質等の機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、（１）本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の機能（例えば、細胞障害活性など）を促進する化合物もしくはその塩（「（３）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング」において促進剤と略記する場合がある）、または本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の機能（例えば、細胞障害活性など）を阻害する化合物（「（３）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング」において阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法；本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、促進剤または阻害剤のスクリーニング用キット（「（３）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング」において本発明のスクリーニング用キットと称することもある）を提供し、より具体的には、例えば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に細胞（例、上記の各種温血動物組織（好ましくはヒトなど）由来の血球細胞を含む正常細胞または上記の癌細胞など）を接触させた場合と（ｉｉ）本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に細胞（例、上記の各種温血動物組織（好ましくはヒトなど）由来の血球細胞を含む正常細胞または上記の癌細胞など）および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法；本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および細胞（例、上記の各種温血動物組織（好ましくはヒトなど）由来の血球細胞を含む正常細胞または上記の癌細胞など）を含有することを特徴とする、促進剤または阻害剤のスクリーニング用キットを提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、本発明のタンパク質等の細胞障害活性などを測定して、比較することを特徴とするものである。
本発明のタンパク質等の細胞障害活性、細胞増殖阻害活性あるいは細胞死を導く活性は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法などに従って測定することができる。しかし、さらに具体的には、樹立された細胞株等を用いて、試験化合物を含む基質と、試験化合物を含まない基質である陰性コントロールと、Ｍ毒素を含む基質としての陽性コントロールの３者すべて、あるいはこれらのうち２者を用いた方法によって、細胞数は統計的有意を満たしうる条件下で比較して、これらの活性の有無、あるいは増減において、細胞障害活性や細胞増殖活性の阻害活性、あるいは細胞増殖活性や細胞障害活性の阻害活性をもつ特定の試料を検出しうる。用いる細胞としては、例えば、上記の各種温血動物組織（好ましくはヒトなど）由来の血球細胞を含む正常細胞または上記の各種温血動物癌細胞（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、悪性黒色腫、舌癌、歯肉癌、マウス線維芽細胞、ミドリザル腎細胞、ラット肝癌等）などが用いられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質等を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより本発明のタンパク質等の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパク質等と試験化合物との反応を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
具体的スクリーニング方法としてはスクリーニング検査後、▲１▼細胞変化を顕微鏡下で直接観察し血球計算盤等をもちいて数える方法、▲２▼細胞死により細胞内より溶液中に溶出するカリウム、ヘモグロビン等の変化をとらえる方法、▲３▼反応後残った生細胞数をテトラゾリウム塩等をもちいて計測する方法、▲４▼放射性標識物質をもちいて残った生細胞数を計測する方法、▲５▼細胞のアポトーシスの誘導により細胞死を確認する方法等が挙げられる。例えば、上記（ｉｉ）の場合における細胞障害活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇させる試験化合物を本発明のタンパク質等の細胞障害活性を促進する化合物として、一方、上記（ｉｉ）の場合における細胞障害活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質等の細胞障害活性を阻害する化合物として選択することができる。これらは多種大量スクリーニング方法としても行いうる。以下に▲２▼として赤血球の溶血反応によるヘモグロビン測定法と▲３▼としてＷＳＴ法をそれぞれ用いて、活性炭、ＣＭセルロース、アルギン酸カルシウムが吸着剤として抗Ｍ毒素作用を示す化合物として選択された方法を示す。
また、これらの陰性コントロール、陽性コントロールおよび試験化合物を含む溶液を動物モデルで検討比較し、抗Ｍ毒素物質の動物レベルでの効果を確認することも可能であり、その場合、ひろく温血動物が使用可能である。とくにマウス、ラット、イヌ、サルが用いられるが、感染モデルとしてスナネズミ、マウス、サルは有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、上記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、疾患組織摘出後の組織再生剤として、本発明のタンパク質等の機能を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量：本発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法、および（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法を提供する。上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、  同書  Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書  Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書  Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書  Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書  Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量することができる。さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質等の濃度の増加がヘリコバクターピロリ感染者において検出された場合、例えば、胃炎、胃潰瘍、胃癌、心臓弁膜症、糖尿病、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、黒色腫等）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
本発明の抗体を含有する医薬本発明のタンパク質等の活性を中和する作用を有する本発明の抗体（中和抗体）は、例えば、胃炎、胃潰瘍、胃癌、心臓弁膜症、糖尿病、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、黒色腫等）などの疾病の治療・予防剤などの医薬として使用することができる。本発明のタンパク質等に対する本発明のヒト化抗体は、例えば、胃炎、胃潰瘍、胃癌、心臓弁膜症、糖尿病、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、黒色腫等）などの疾病の治療・予防剤などの医薬として使用することができる。該ヒト化抗体は、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４，８４５−８５１．（１９９６）、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５，１４６−１５６．（１９９７）、ＰＮＡＳ，９７（２），７２２−７２７（２０００）等に記載の方法に準じて作製することができる。以下、「（５）本発明の抗体を含有する医薬」において、本発明の中和抗体およびヒト化抗体を本発明の抗体と総称する。本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の子宮内膜腫瘍患者の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
後述の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号１〕本発明のヘリコバクターピロリ６０１９０由来タンパク質（Ｍ毒素）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号２〕配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヘリコバクターピロリ６０１９０由来タンパク質（Ｍ毒素）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号３〕実施例３で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号４〕実施例３で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基配列を示す。
後述の実施例３で得られた形質転換体エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｍ  ｔｏｘｉｎ／ｐＥＴ３０ＥＫ／ＬＩＣ／ＤＨ５αは、平成１４年１０月１７日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所（ＩＰＯＤ）特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２１８として寄託されている。また、後述の実施例４で得られたハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）クローンＮｏ．４はＢＡＬＢ−ｃ／Ｐ３Ｕ１／００４−１Ｇ９として、平成１４年１０月２３日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所（ＩＰＯＤ）特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２２として寄託されている。またハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）クローンＮｏ．１０１はＢＡＬＢ−ｃ／Ｐ３Ｕ１／１０１−１Ｃ１０として、平成１４年１０月２３日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所（ＩＰＯＤ）特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２３として寄託されている。またハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）クローンＮｏ．１１６はＢＡＬＢ−ｃ／Ｐ３Ｕ１／１１６−５Ｄ７として、平成１４年１０月２３日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所（ＩＰＯＤ）特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２４として寄託されている。
実施例
以下に、実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
実施例１  ヘリコバクターピロリから本発明の毒素を精製抽出する方法
ヘリコバクターピロリはすでに確立されている分離株を入手（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）するか、または臨床検体から分離培養することができる。本実施例ではヘリコバクターピロリ６０１９０の分離株を用いた。この分離株を、まずＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に５％牛血清（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した寒天培地を用いて、温度３７℃、湿度９０％以上の微好気性条件下（ＣＯ２５−１０％）において２−５継体（約１−２週間）培養した。顕微鏡下で死滅またはココイド化していないことを確認し、良好な増殖を確認した後、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に血清を添加せず５％２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンを添加したものに移植した。前記と同じ条件下で培養と生育状態を確認した後、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン濃度を漸次２％、１％、０．５％としたものに移植していく。
ついで、０．５％２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン添加のＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地にて温度３７℃、微好気性条件下、１００−１２０ｒｐｍにて約１６時間振蘯培養後、１００００×ｇ、２０分間遠心しペレット状の菌体を得た。これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．７（以下Ａ緩衝液と呼ぶ。ｐＨは目的タンパク質がｐＩ６．０８であるので約ｐＨ６．１以上であればよい）の緩衝液中で超音波破砕し、−８０℃に一昼夜保存後、再度、超音波破砕したものを、１０００００×ｇ、６０分間超遠心し、三層に分離した最上層部分のみを抽出した。
この抽出液に対して７０％硫安で粗精製を行った。これにより得た抽出液を比較的粒子口径の大きなビーズをもってなる陰イオン交換樹脂にてイオン交換クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｅｌ）を行った。平衡緩衝液にはＡ緩衝液、溶出液にはＡ緩衝液に濃度０．３Ｍの塩ＮａＣｌを加えたものを用いた。これらにより濃度勾配抽出を行い、各フラクションの適量を用いて、ヒーラ細胞を植えたウェルに滴下して各ウェル中の細胞の生存率を評価した。評価はＷＳＴ試薬（（株）同仁化学研究所Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用い行った。コントロールと比較して、有意に生存率の少ない数値を示した画分と、比較的蛋白量の増加曲線の一致する画分を、電気泳動の結果とも合わせて評価し、次の精製工程に用いるサンプル画分とした。
次に、次回と分離システムの異なるクロマトグラフィーである、疎水性クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ）を選択した。平衡緩衝液には１０ｍＭリン酸緩衝液に１Ｍ硫酸アンモニウムを加えたものを用い、溶出緩衝液には１０ｍＭリン酸緩衝液に４０％エチレングリコールを用いた。濃度勾配溶出を行った後、各サンプルの評価は前記と同様に行った。
さらに、前記工程より抽出されたサンプルを、再び粒子口径の比較的小さなビーズをもってなる陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢのＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ）で抽出した。平衡緩衝液にはＡ緩衝液、溶出緩衝液にはＡ緩衝液に１Ｍの塩ＮａＣｌを加えたものを用いた。これらにより最終的に分子量約４１０００の単一タンパク質のバンドを得た。なお、クロマトグラフィーの種類と順序は、上述とことなることも可能であり、また、さらに追加することも可能である。
得られた単一のバンドをクーマシーブリリアントブルー染色後、ブロッティング装置でニトロセルロース膜または（ポリビニリデンジフルオリド）膜に転写し、アミノ酸シークエンサーで解析した。その結果、先に記述したように、登録データベース（ヘリコバクターピロリ  ２２６９５）の遺伝子座ＨＰ１０３７のＮ末端アミノ酸配列と９５％（２０塩基中１９塩基）の割合で一致した。（図１）
実施例２  遺伝子工学的調整法によるアミノ酸配列およびＤＮＡ配列
本実施例ではヘリコバクターピロリ６０１９０の分離株を用いたが、上述のように、菌株の異なるヘリコバクターピロリ２２６９５の全遺伝子解析がすでにおこなわれており、ＴＩＧＲ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のデータベースを検索することにより、相同する遺伝子座を推定しうる。これによりヘリコバクターピロリ２２６９５の遺伝子座ＨＰ１０３７が相同タンパク質をコードしていることが判明した。
これをもとに本発明の毒素のクローニングを行った。すなわち、ヘリコバクターピロリ６０１９０をテンプレートとして、先ず便宜的に遺伝子座ＨＰ１０３７と、その上流の遺伝子座ＨＰ１０３６および下流の遺伝子座ＨＰ１０３８を基にした適当なプライマーを複数組（５‘側と３’側）作製してシークエンスを行った。ＤＮＡポリメラーゼは、校正機能のあるプルーフリーディングのものを使用し、各プライマーの組は十分互いのプライマー部分をも包含するように構成し、５‘側からと３’側から複数回シークエンスが行われるようにした。このようにして得られたＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２に示した。また、このアミノ酸配列を、配列番号１に示した。
実施例３
遺伝子組換えによる毒素タンパク質の発現実験、
遺伝子組換え実験には大腸菌を用いた。ベクターは、ｐＥＴ−３０ＥＫ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、発現用大腸菌はＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。挿入遺伝子は、実施例２でクローニングしたヘリコバクターピロリ６０１９０由来の毒素タンパク質をコードしているものにｓｅｎｓｅ鎖の５’側にＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧが付加された配列番号３をプライマーとして、またａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖の５’側にはＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＴＡが付加された配列番号４をプライマーとしてＰＣＲ法により作製した。この作製した挿入遺伝子を２５ｍＭｄＡＴＰと１００ｍＭ  ＤＴＴの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによりベクターのＬＩＣ  ｓｉｔｅに合うように削りこみをおこなったのち、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下で加温した。作製された組換え体を再度シーケンスし、配列番号１と同一であることを確認した後、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養した。
ＯＤ６００が約０．４ぐらいになるまで３７℃、２５０ｒｐｍで振蘯培養し、イソプロピル−ベータ−チオガラクトシドを終濃度１ｍＭとなるように加え、さらに２時間同様に振蘯する。融合タンパク質は封入体を形成していたため、この培養液から大腸菌を遠心回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ともにＮｏｖａｇｅｎ社）により当該タンパク質の封入体を得た。本タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動法で分離し、銀染色により、単一な該当するバンドを確認した後、リフォールディングしヒーラ細胞および他の温血動物細胞を用いて、ＷＳＴ試薬（（株）同仁化学研究所Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ）によりコントロールとの比較を行った。その結果、生存率に有意な差を認め、発現タンパク質においても精製タンパク質と同等の活性を認めるに至った。さらにヒト子宮頸癌であるヒーラ細胞だけでなく、正常ヒト胃細胞においても同様な活性をもつことを確認した。（図２）またヒトの他の組織のみならず、哺乳類細胞一般に広範な活性を有することも確認された。（図３、図４）
実施例４
モノクローナル抗Ｍ毒素抗体の作製：ＢＡＬＢ／Ｃマウス２４０μｇの免疫原リフォールディング済み発現Ｍ毒素を数カ所にわけて２回皮下投与を行なった。最終免疫４日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、膵臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ  ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレントトピックスインマイクロバイオロジーアンドイムノロジー、８１、１（１９７８）〕。細胞融合は、原法〔ネイチャー、２５６、４９５（１９７５）〕に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を６．６：１になるよう混合して、７５０回転で１５分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）６０００（和光純薬（株））を０．３ｍｌ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に徐々にＭＥＭを添加し、合計１５ｍｌのＭＥＭを加えた後７５０回転１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有するＧＩＴメデイウム（和光純薬（株））（ＧＩＴ−１０％ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当リ２×１０５個になるように浮遊し、２４穴マルチディッシュ（岩城（株）製）に１ウェル１ｍｌずつ１６８ウェルに播種した。播種後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。２４時間後ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０−４Ｍ、アミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６×１０−３Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０％ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当リ１ｍｌずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始４、７日後に旧液を１ｍｌ捨てたあと、１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９日目で認められ、上清を採取した。培養上清中の抗体価は、以下の要領で測定した。すなわち、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルに培養上清１００μｌおよびバッファーＣで２００倍に希釈したＨＲＰ標識化Ｍ毒素１００μｌを加え４℃で一晩反応させた。該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まずヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、ダコ社製）を１００μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）および０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２を３００μｌずつ分注し、４℃で少なくとも２４時間処理した。上記、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＥＣ［０．２％ＢＳＡ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．４％ブロックエース、０．０５％ＣＨＡＰＳ〔３−〔（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸〕、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＮａＮ３を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０］で希釈したマウス抗血清１００μｌを加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄したのち、ＨＲＰ標識化ＴＧＣ−８３９ペプチド（２６−３４）１００μｌを加え室温で７時間反応させた。バッファーＣ［１％ＢＳＡ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ＰＨ７．０］で１００倍に希釈した上記実施例３で作製したＨＲＰ標識化リフォールディング毒素タンパクを調製した。次に、該プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ  ＆  ＰＥＲＲＹ  ＬＡＢ．フナコシ薬品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ．４５０）をプレートリーダー（ＭＴＰ−１２０、コロナ社製）で測定した。これらの方法に従い固相上の酵素活性を測定した。その結果、１２３ウェルの中から抗体価の認められた１８ウェルを選択し、ハイブリドーマを凍結保存した。さらに６ウェルのハイブリドーマ、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５３、Ｎｏ．６１、Ｎｏ．７６、Ｎｏ．１０１およびＮｏ．１１６については、希釈法によるクローニングに付した。クローニングに際しては、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当リ５×１０５個になるように加えた。クローニング後、培養上清中の抗体価を同様の方法に従って測定した。陽性クローンは、Ｎｏ．４、Ｎｏ．１０１およびＮｏ．１１６であった。これらを発現Ｍ毒素の抗体産生ハイブリドーマとした。
実施例５
モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定：
実施例４記載の方法に従い、抗ウサギＩｇＧ抗体結合マイクロプレートを作製した。すなわち、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、ダコ社製）を１００μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）および０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２を３００μｌずつ分注し、４℃で少なくとも２４時間処理した。次に、抗ウサギＩｇＧ抗体結合マイクロプレートに、バッファーＥＣ  ５０μｌおよびバイオラッド社製アイソタイプタイピングキットに含まれるサブタイプ特異的抗体１００μｌを加え、４℃で１日反応させた。プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄後、上記ハイブリドーマ培養上清を加え、４℃で１日反応させた。プレートをＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄後、バッファーＣで１００倍に希釈した上記実施例３で作製したＨＲＰ標識化リフォールディング毒素タンパク質１００μｌを加え室温で６時間反応させた。該プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄したのち、実施例４に記載の方法に従い固相上の酵素活性を測定した。その結果、これらのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のクラス・サブクラスはＮｏ．４（ＩｇＧ１）、Ｎｏ．１０１（ＩｇＧ２ｂ）、Ｎｏ．１１６（ＩｇＧ２ａ）であった。
実施例６
ハイブリドーマのマウス腹水化：ハイブリドーマ、Ｎｏ．４、Ｎｏ．１０１およびＮｏ．１１６についてマウス腹水化を実施した。あらかじめミネラルオイル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、雌）に１〜３×１０６セル／匹の上記ハイブリドーマを腹腔内投与したのち、６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。モノクローナル抗体は得られた腹水よリプロテイン−Ａカラムによリ精製した。即ち、腹水約２５ｍｌを等量の結合緩衝液（３．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３を含む１．５Ｍグリシン、ｐＨ９．０）で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイン−Ａ−アガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液（０．０５％ＮａＮ３を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液はＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して４℃、２日間透析したのち、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）により除菌濾過し４℃あるいは−８０℃で保存した。
実施例７
ポリクローナル抗Ｍ毒素抗体の作製
本発明の細胞障害タンパク質Ｍ毒素４．１ｍｇをフロイント完全アジュバントと混合してウサギに皮下免疫し、１週間後さらに同量をフロイント不完全アジュバントと混合して皮下免疫した。免疫後、採血した血液は遠心によって血球成分を除去し、抗血清を得た。
実施例８  Ｍ毒素のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇによる解析：
実施例３で得た培養上清に、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えてＰｅｐｔｉｄｅ−ＰＡＧＥ（ＴＥＦＣＯ）で電気泳動し、これをＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に電気的に移した。一次抗体として、実施例４、実施例６で得た各抗体（２μｇ／ｍｌ）を用い、二次抗体にはＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ抗体（２０００倍希釈；Ｄａｋｏ）を用いた。発色はＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行なった。その結果、各１次抗体は該発現タンパク質を認識することを確認した。（図５）
実施例９
活性炭（径０．２〜０．１ｍｍ）、ＣＭセルロース、アルギン酸カルシウムをそれぞれ０．５ｍｌ体積ずつカラムに充填し、トリス緩衝液１０ｍＭ  ｐＨ７．７で平衡化後、０．５ｍｌのリフォールディングした活性を有するＭ毒素４００ｎＭをそれぞれのカラムに添加した状態でカラムを閉栓し、２５℃、６０分間静置。その間、トリス緩衝液のみと、トリス緩衝液に同様のＭ毒素を含有したものを、同条件で静置した。その後、すべてのカラムを開栓して、１００μｌづつ滴下したものを分取し、さらにトリス緩衝液を各カラムに０．５ｍｌづつ添加して１００μｌづつ分取した。赤血球は健常成人の全血を上清が透明になるまで２−３回、８００×ｇ、１０分間遠心し、沈殿した赤血球１０μｌ体積を１０ｍＭトリス緩衝液９９０μｌに添加したものを陽性コントロールとし、同じく１０μｌを０．９％食塩１０ｍＭトリス緩衝液に添加したものを陰性コントロールとし、上記のカラムより分取されたサンプルに赤血球を１００分の１体積くわえたものと比較した。比較はマルチプルプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）で溶出したヘモグロビン相対濃度を吸光度４１５ｎｍにより計測することによりおこなった。（図６）
実施例１０
実施例９でえられた各カラムからの分画にヒーラ細胞（ヒト子宮頚癌細胞）が曝され、細胞生存率をテトラゾリウム塩を用いた測定法のひとつであるＷＳＴ法により測定した。ヒーラ細胞は９６穴プレートに２４時間、一穴当たり１００００個づつ培養する。培養液のみの陰性コントロールと各被検液、および２０ｎＭの濃度をふくむ陽性コントロールのそれぞれの各穴に加え、を３７℃、１２時間培養する。その後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（株式会社同仁研究所）を用いて、ＷＳＴ法により検出される細胞生存率を４１５ｎｍ波長の吸光度で計測した。（図７、図８）
産業上の利用の可能性
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドなどは、例えば、癌の治療剤として使用することができる。また本発明の抗体は、被検患者から採取の血液、組織、尿、便中の本発明タンパク質の同定ならびにヘリコバクターピロリによる感染証明に換えることができる。また本発明のタンパク質の定量などに使用することができる。さらに、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングするための試薬として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１において得られたサンプルの陰イオンクロマトグラフィーの結果を示す。ａは各分画におけるＭ毒素の活性と、その溶出蛋白質の吸光度である。
ｂはａのクロマトグラフィー中のフラクション１６からフラクション２２の銀染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ｃはエレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写した蛋白毒素のバンドである。ｄ、ｅはコントロールと１ｎＭの抽出された細胞毒液の２４時間後のヒーラ細胞の形質変化を示す。スケールは５０μｍである。
図２は、実施例３において得られた遺伝子組換え体毒素による細胞形態変化を示す。ａはヒーラ細胞の陰性コントロールによる６時間後。ｂ、ｃは組換え体Ｍ毒素５ｎＭ添加３時間後、６時間後のヒーラ細胞。ｄは陰性コントロールの６時間後のＣＲＬ７４０７（ＡＴＣＣ）胎児正常胃細胞。ｅ、ｆは組換え体Ｍ毒素５ｎＭ添加３時間後、６時間後のＣＲＬ７４０７細胞。
図３は、実施例３における各種癌細胞のＭ毒素に対する感受性を示す。ＷＳＴ法を用いて計測した。Ｘ軸はＭ毒素の基質中の濃度、Ｙ軸は波長４１５ｎｍ光による吸光度を直接、あるいは陰性コントロールを１００％とした場合の相体割合で示す。ＨＬＦ：ラット肝癌、ｃｏｌｏｎ２６：マウス大腸癌を示す。
図４は図３と同様に、Ｔ２４：ヒト膀胱癌、ＯＶＫ１８：ヒト卵巣癌、ＫＬＭ−１：ヒト膵癌、Ａ−５４９：ヒト肺癌、Ｃａ９−２２：ヒト歯肉癌、ＣＲＬ１５００：ヒト乳癌を示す。
図５は実施例８で行われたモノクローナル抗体のウェスタンブロッティングを示す。全てハイブリドーマ細胞の培養上清の希釈倍率は２０倍である。
図６は実施例９において、吸着剤としてアルギン酸カルシウムを用いた場合のＭ毒素活性を示す。陰性コントロールは基質として１０ｍＭトリスｐＨ７．７のみ、陽性コントロールは基質とＭ毒素１０ｍＭを含む。Ｘ軸はアルギン酸カルシウムカラムを通過する各フラクションである。各フラクションのＭ毒素濃度は平均１０ｎＭであり、いずれか１つは少なくとも１０ｎＭを超える。赤血球の破壊が起こると溶液中のヘモグロビン濃度が上昇し、Ｙ軸においてその４１５ｎｍ吸光度が示される。
図７は実施例１０で得られた吸着作用によるＭ毒素阻害活性を示す活性炭のヒーラ細胞における％生存率を示す。Ｘ軸は各フラクションの溶出液を示し、Ｍ毒素濃度は平均１０ｎＭであり、いずれか１つは少なくとも１０ｎＭを超える。Ｙ軸は各フラクションの溶液の毒性をＷＳＴ法で計測したものを陽性コントロールで除したものの１００分率である。
図８は図７と同様に、実施例１０で得られた吸着作用によるヒーラ細胞におけるＭ毒素阻害活性を示すアルギン酸カルシウムおよびＣＭ−セルロースの％生存率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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