【手続補正書】
【提出日】平成14年1月22日(2002.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】電気泳動移動度を変化させる分子を用いた酵素活性を検出するための方法および装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】細胞における細胞内化学反応の活性を測定するための方法であって、
標識を含有する基質分子、すなわち、その活性が測定される化学反応に対して特異的な標識された基質分子を提供すること；
前記基質分子を単一細胞内に配置すること；
前記単一細胞内の前記基質分子を化学反応に関与させて、変化した基質分子を生成させること；
前記基質分子および前記変化した基質分子を単一細胞から遊離させること；
前記標識を検出して、単一細胞からの前記基質分子および前記変化した基質分子を同定すること；および
検出された変化した基質分子と検出された基質分子とを比較することにより前記化学反応の活性を決定すること、
を包含する、方法。
【請求項２】検出された変化した基質分子および検出された基質分子の量を定量することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記細胞における前記細胞内化学反応が酵素触媒作用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記変化した基質分子が、基質分子と比較して電気泳動移動度の変化を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記基質分子および前記変化した基質分子を検出することが電気泳動を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】検出された変化した基質分子および検出された基質分子の量を定量することが、電気泳動によって分離された後で蛍光による前記標識の検出を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】前記基質分子を単一細胞内に配置することが、前記細胞内に天然に存在する基質分子を使用すること、前記細胞内において産生される前記基質分子を誘導すること、または前記基質分子を前記細胞内に前記細胞外から導入することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記基質分子を前記細胞内に前記細胞外から導入することが、前記基質分子を膜透過性ペプチドとともにマイクロインジェクションすること、エレクトロポレーションすること、オプトポレーションすること、小胞融合すること、飲細胞負荷すること、または会合させることを包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記基質分子および前記変化した基質分子を単一細胞から遊離させる前に、前記基質分子を細胞内に存在させながら前記細胞を刺激することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記化学反応の活性を、刺激されていない単一細胞から測定された類似する活性と比較することをさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記基質分子および前記変化した基質分子を単一細胞から遊離させることが、前記単一細胞の化学的破壊、前記単一細胞の機械的破壊、あるいは電気泳動またはそれらの組合せによって前記基質分子および前記変化した基質分子を分離することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記標識が、蛍光標識、同位体、光学的吸収を示す標識、および電子スピン共鳴標識からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記基質分子がポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記ポリマーが、ペプチド、多糖および核酸からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記ポリマーが蛍光標識によって修飾されたものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記ペプチドが、それぞれのペプチド内の特定のアミノ酸にリン酸基部分を付加することによって前記修飾ペプチドを変化させるキナーゼの基質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】前記ペプチドが蛍光性基の共有結合的付加によって修飾されたものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記基質分子が、細胞内に通常は見出されない炭水化物、リン脂質、完全なタンパク質、または有機化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記標識を検出することが、ボルタ計測または質量分析を行うことを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】それぞれが単一細胞内の特異的な化学反応についてレポートする多数の異なる基質分子を用いて前記工程のそれぞれを同時に行うことをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】数１０ｐｌ以下の微小容量における化学反応の活性を測定するための方法であって、
標識を含有する基質分子を提供すること；
前記化学反応が行われる前記微小容量内に前記基質分子を配置して、変化した基質分子を前記微小容量内において産生させること；
前記化学反応を停止させること；
前記標識を検出して、前記基質分子および前記変化した基質分子を同定し、化学反応の活性を決定すること、
を包含する、方法。
【請求項２２】前記基質分子および前記変化した基質分子の量の変化を定量することをさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】細胞内分子の化学反応の活性を測定するための装置であって、
標識された基質分子を前記細胞内に配置して、変化した標識基質分子を前記細胞内において生成させるための手段；および
前記基質分子および前記変化した基質分子の何らかの実質的な変化が生じる前に単一細胞から前記基質分子および前記変化した基質分子を検出するための手段、
を含む、装置。
【請求項２４】前記基質分子および前記変化した基質分子の量の変化を定量するための手段をさらに包含する、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】検出するための前記手段により、酵素の触媒作用が検出される、請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】検出するための前記手段により、前記変化した基質分子に対して前記基質分子の電気泳動移動度の変化が検出される、請求項２３に記載の装置。
【請求項２７】検出するための前記手段がキャピラリー電気泳動を含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項２８】前記基質分子および前記変化した基質分子の量の変化を定量するための前記手段が、前記基質分子および前記変化した基質分子をキャピラリー電気泳動によって分離した後に前記基質分子および前記変化した基質分子の蛍光を定量するための手段を含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】配置させるための前記手段が、前記細胞内に産生される前記基質分子を誘導するための手段、または前記基質分子を前記細胞内に前記細胞外から導入するための手段を含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項３０】前記基質分子を前記細胞内に前記細胞外から導入するための前記手段が、前記基質分子を膜透過性ペプチドとともにマイクロインジェクションするための手段、エレクトロポレーションするための手段、オプトポレーションするための手段、小胞融合するための手段、飲細胞負荷するための手段、または会合させるための手段を含む、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】前記基質分子を配置するための前記手段が、天然に生じる化合物または合成的に誘導された化合物に由来する前記基質分子を提供するための手段を含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項３２】前記基質分子および前記変化した基質分子を検出する前に、前記基質分子を細胞内に存在させながら前記細胞を刺激するための手段をさらに含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項３３】検出するための前記手段が、前記細胞の内容物を得るための手段と、キャピラリー電気泳動によって前記内容物の一部またはすべてを分離するための手段とを含む、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】内容物を得るための前記手段が、破壊するための化学的手段、破壊するための物理的手段、電気泳動による分子の分離、またはそれらの組合せを含む、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】配置するための前記手段により、特定の細胞内化学反応に対して特異的な基質分子が提供される、請求項２３に記載の装置。
【請求項３６】配置するための前記手段により、蛍光性の基質分子が提供される、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】配置するための前記手段により、修飾されたペプチドである基質分子が提供される、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】前記修飾されたペプチドが、前記ペプチドのそれぞれ内の特定のアミノ酸にリン酸部分を付加することによって前記修飾ペプチドを変化させるキナーゼの基質である、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】前記ペプチドが、蛍光による検出を可能にする蛍光性基を共有結合的に付加することによって修飾されたものである、請求項３７に記載の装置。
【請求項４０】配置するための前記手段により、細胞内に通常は見出されない核酸、炭水化物、リン脂質、完全なタンパク質、または化合物を含む基質分子が提供される、請求項２３に記載の装置。
【請求項４１】検出するための前記手段が、前記基質分子および前記変化した基質分子に対するボルタ計測を行うための手段または質量分析手段を含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項４２】それぞれが特定の化学反応についてレポートする多数の異なる基質分子を同時に配置し、かつ検出するための手段をさらに含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項４３】数１０ｐｌ以下のオーダーの微小容量における分子の化学反応の活性を測定するための装置であって、
標識を有する基質分子を、化学反応が行われる前記微小容量内に配置して、変化した基質分子を生成させるための手段；および
前記標識を検出して、前記基質分子および前記変化した基質分子を同定し、化学反応の活性を決定するための手段、
を含む、装置。
【請求項４４】前記基質分子および前記変化した基質分子の量の変化を定量するための手段をさらに含む、請求項４３に記載の装置。
【請求項４５】変化した標識基質分子が形成されるインビボ反応が可能であるように標識基質分子が配置されている細胞内における分子の細胞内化学反応の活性を測定するための装置であって、
前記標識基質分子および前記変化した標識基質分子の検出器；および
前記検出器とつながっている細胞溶解デバイスであって、前記基質分子および前記変化した基質分子を前記細胞から抽出し、かつ何らかの実質的な変化が生じる前に、前記基質分子および前記変化した基質分子を集めて、それらを前記検出器に移す細胞溶解デバイス、
を含む、装置。
【請求項４６】前記基質分子および前記変化した基質分子の量の変化を定量するために前記検出器に接続されたデータ処理装置をさらに含む、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】変化した標識基質分子が形成されるインビボ反応が可能であるように標識基質分子が配置されている細胞内における分子の細胞内化学反応の活性を測定するための装置であって、
前記細胞を保持するための手段；
保持するための前記手段に連続しているが、前記手段と流体的に接触していない電気泳動リザーバー；
細胞に穴をあけて細胞サンプルを取り出すための尖った電気泳動キャピラリー；
前記電気泳動キャピラリーを移動させて、前記細胞に穴をあけるための手段；
前記細胞サンプルを取り出した後、前記キャピラリーによる前記細胞サンプルの電気泳動が開始されるように、前記キャピラリーを迅速に移動させて前記電気泳動リザーバーと接触させるための手段；および
前記標識基質分子および前記変化した標識基質分子を電気泳動時または電気泳動後に検出するための検出器、
を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は１９９８年３月６日に出願した、「分析用の細胞の高速制御レーザー溶解」という発明の名称を有する出願、第０９／０３６，７０６号の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、細胞生化学および生物医学的分析の領域における微量分析化学の分野、特に、単一細胞または選択された細胞の内部の化学的活性を分析するための或るクラスの化学物ならびに方法および装置に関する。
２．従来技術の説明
生物学においては、個々の細胞は、生命の基本的な単位として考えられ得る。究極的には、単一細胞の内部で起きる化学的プロセスは、我々が生きた生物体内で観察する全ての現象を生じる。細胞内の化学的プロセスの殆どは、タンパク質によって仲介される。典型的にはこのようなタンパク質は、特異的な化学反応の速度を触媒的に増大させる酵素である。非常にしばしば、細胞内の酵素は、シグナル変換経路として知られる化学反応のカスケードに関与する。これらのシグナル変換経路の各々は、しばしばキナーゼとして知られるクラスの、連続的に作用する酵素から成る。これらの酵素は、同一経路内の他のタンパク質と相互作用し、その挙動を修正するのみでなく、他のシグナル変換経路の動作にも影響を及ぼす。シグナリング分子および化学反応生成物のこれらの相互作用するカスケードは、究極的には、細胞の成長、増殖、休止、プログラム細胞死のプロセスを調整する複雑なネットワークを形成する。
【０００３】
細胞内の不適切なシグナリングは、これらのプロセスのいずれかに欠陥を生じ得、多くの形状の癌の基礎として関係づけられる。さらに事態を複雑にしているのは、個々の細胞が、それらの内部の生化学的シグナリングにおいて高度の異質性を示すことである。悪性腫瘍は、典型的にはかかる異質な細胞群から構成されており、同一腫瘍内の細胞は、しばしば異種の異常な増殖シグナリング経路を利用する。この異質性は、シグナリングにおけるそれらの固有なエラーを解明するために、個々の細胞を分析することを必要とする。少数の細胞のみが異常なシグナリングを示す場合、集団全体の分析は、任意の個々の異常な細胞よりも大多数をより反映した平均的なシグナルを生じるであろう。従って、測定は、検出しようとしている正にエラーを「平均化」してしまう。
【０００４】
不適切なシグナリングには、しばしば、シグナリングタンパク質の遺伝子に関する突然変異という形態の遺伝的基盤がある。シグナリングタンパク質の遺伝子に関する突然変異は、構造的に変化した、異常に作用する、シグナリングタンパク質を生じる。現在、単一細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを分析してシグナリングタンパク質の突然変異の存在を検出し、それにより突然変異体シグナリングタンパク質の存在を推論するための方法が存在する。しかしながら、純粋に、腫瘍内で生じる遺伝子または遺伝子内突然変異についての知識から、シグナリングにおけるエラーを予測または理解することは現在可能でない。例えば、１つの経路における突然変異体シグナリングタンパク質の異常な活性は、他の経路に関与している、突然変異体または正常な、他のタンパク質の活性によって妨害または修飾され得る。このことは、腫瘍細胞の内部が、同時に存在しかつしばしば互いに影響し合う経路に関与している、一般に何百から何千という異なる種類を有するシグナリングタンパク質の複雑な混合物であるので、非常にありそうなことである。任意の１種類のシグナリングタンパク質の機能を評価するためには、その正味の活性は、単一の生きている細胞内から測定されなければならない。
【０００５】
さらに、経路全体の機能を完全に記述するには、経路内で関与する全てのシグナリングタンパク質の活性の測定が必要である。シグナリングタンパク質は、しばしば治療的薬物介入の主要なターゲットであることから、かかる知識は、欠陥のある細胞内シグナリングに関連する疾病についての個別化された診断および治療において非常に有用であろう。
【０００６】
さらに、このような可能性は、基本的な細胞生理学に関する研究を行なう能力に変革を起すであろう。言及したように、キナーゼは一般に、細胞内シグナリングにおいて主要な役割を果たす典型的なクラスのタンパク質酵素を代表する。事実、増殖を促進するキナーゼの異常な活性化は、腫瘍細胞の一般的な特徴である。従って、プロテインキナーゼは癌治療にとって有望なターゲットであり、キナーゼ・アンタゴニスト薬の開発は熱心な研究領域である。これらの酵素は、リン酸基と、しばしば別のタンパク質である分子状の基質分子との間に、共有化学結合が形成される速度を触媒的に増大させる。このプロセスは、「リン酸化」と呼ばれる。基質自体が酵素であるとき、かかるリン酸化は一般に、当該基質酵素の化学的な活性を増強するか、または抑制する。
【０００７】
キナーゼは、一般に基質特異性を示し、その結果、１種類のキナーゼの好ましい基質は他の種類のキナーゼによって効率的にはリン酸化されない。しばしば、キナーゼの好ましい基質は、別のキナーゼであり、従って、１つのキナーゼの不適切な活性は、１つのシグナリング経路内における複数の下流キナーゼの活性に変化を生じ得る。
【０００８】
キナーゼ活性を１つの細胞内で測定する一般的な方法は、多くの例において、シグナリング経路全体に関する豊富な情報をもたらし得た。しかしながら、かかる測定を行なうには、厳密な基準が満たされなければならない。まず第１に、キナーゼおよびキナーゼの基質のような多くの酵素性のタンパク質に関する細胞あたりのコピー数は、１００〜１０００，０００分子といった低さであるか、または体積１ｐｌの典型的な哺乳類細胞における濃度では、約１５０ｐＭ〜１．５μＭである。モルに換算すれば、これは約１．７×１０−１８〜１．７×１０−２２という、必要最低限の範囲に等しい。
【０００９】
さらに、細胞におけるリン酸化された基質の濃度は、秒のオーダーでの時間スケールで変化するため、１つの細胞から当該内容物が得られた瞬間からその生化学反応が終結される時点までの、測定の時間分析（ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は秒より小さい（ｓｕｂ−ｓｅｃｏｎｄ）はずである。殆どの通常の生化学的検定法は、このような単一細胞の測定に必要とされる時間分析にも、感度の限界にも応じられない。時間分析の要件は、１９９８年３月６日出願の、「分析用の細胞の高速制御レーザー溶解」という発明の名称を有する出願、第０９／０３６，７０６号に記載した装置の使用により満たされ得るが、この一部係属出願はそれに関連したものであり、その特許出願は本明細書中に参考として援用されている。必要とされる感度の程度は、伝統的なキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法を用いて達成され得る。現在まで欠けていたのは、１つ以上のキナーゼ種または他の酵素の細胞内活性を正確に測定するための分子的手段であった。
【００１０】
キナーゼ測定のための今日の技術は、一般に３つの方法論に分けられ得る。第１の方法は、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞内で起きるキナーゼ活性を推定すべく、細胞抽出物によるキナーゼ基質のリン酸化を利用する。かかる方法については、多くの重要な欠点がある。それは鋭敏でないため、多数の細胞の内容物がプールされなければならない。細胞は、それらの活性化状態については同調していないため、実際にはキナーゼ活性についての時間平均されたレベルが測定される。さらに、細胞抽出物を生成するために必要とされる何十秒から何分にもおよぶ時間の間に、多くの化学反応が進行し続ける。この結果、反応物と生成物との相対量についての高度に歪められた表示が、実際の細胞内で起っていることとして表示されることになる。
【００１１】
これらの困難を乗り越えたとしても、細胞内で起る固有の化学的な微小環境を再現することは実際的に不可能である；従って、抽出物中に観察された化学的活性は、無傷の細胞内で実際に起きていることから大きく異なり得る。
【００１２】
第２の方法論は、特異抗体、キナーゼ阻害剤、または蛍光標識を用いて細胞内のキナーゼを標識すること、および次いで、蛍光顕微鏡により当該細胞を観察することに依拠する。不活性および活性キナーゼの両方の分子とも、この方法により標識され、次に細胞内のその実際の位置から、キナーゼの活性レベルを推論する試みが為される。しかしながら、その細胞内局在性のみから、酵素の活性化状態を測定しようとする試みは、極めて危険である。これは、細胞内に遊離している時も細胞内構造物に結合している時も共に活性である、多くのキナーゼに関して特にそうである。
【００１３】
第３の方法は、いまだ開発中である、キナーゼ活性を実際に測定するための蛍光性の指示薬の使用である。同様の戦略は、種々の細胞内イオン濃度（即ち、Ｃａ２＋）の測定には良好に作用するが、これまでのところキナーゼ活性の測定には一般に適用されていない。このアプローチの１つの欠点は、手早い検出のために充分なシグナルを生成するための、生理的濃度を越える蛍光体レポーターの必要性であり、典型的には、蛍光顕微鏡による検出用に、細胞内に１０μＭ〜１００μＭの蛍光性指示薬が必要である。これは、代表的な生理的キナーゼ基質の濃度の１０〜１，０００，０００倍である。このような高い濃度においては、蛍光性レポーター分子は阻害剤として挙動するか、または異常なシグナリング経路の活性化などの他の意図されない細胞応答を誘発し得る。もう１つの難点は、粘着性の高度に濃縮された細胞内の環境が、レポーター分子の蛍光特性を変化させ、その検出を信頼できないものにすることであった。
【００１４】
最後に、１つの特異的なキナーゼに関する蛍光性の環境感受性のプローブの設計は、一般に他のキナーゼに適用可能でないかもしれない。所与の細胞または細胞群は、多数の異なるキナーゼを含み得るため、このことは深刻な問題を生じ得る。広く適用可能な、実際的で感度のよい細胞測定技術に対する要性は大きい。
【００１５】
必要とされるのは、上記のアプローチに対する、代替的で更に補足的な戦略である。さらに、この新規なアプローチは、キナーゼ測定に限定されるものではなく、全てではないにしても他の種類の細胞内酵素および化学的活性の多くの測定に広く適用され得る。
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、細胞内の化学的活性を測定するための方法である。代表的には、興味ある分子は、細胞内の生化学的反応を触媒する細胞内酵素、タンパク質である。酵素による触媒作用は、基質分子の化学構造の変化を生じる。本発明は、化学的活性についての細胞内レポーターとして酵素的に作用された場合、電気泳動移動度に変化を受ける基質分子の使用を含む。この戦略は、基質分子の構造における変化を測定することによって酵素活性を検出および定量する一般的な方法を提供する。電気泳動移動度の変化は、酵素的に変化された基質分子を、分離に続く高感度の検出および定量法を用いた電気泳動により、未変化の基質分子からの分離を可能にする。化学構造におけるごく小さい変化であっても、電気泳動移動度における測定可能な差異を生じ得る。例えば、キャピラリー電気泳動は、化学的な化合物の立体異性体形態を分離すべく、日常的に用いられている。
【００１７】
最も一般的には、基質分子は１つの特異的な酵素または或るクラスの酵素の活性についてレポートするように選択される。このようなレポーター基質分子は、細胞内において天然に生じるか、オペロンによる制御下または同様な遺伝的制御メカニズム下にある場合のように細胞内で誘導されるか、またはマイクロインジェクション、電気穿孔、オプトポレーション、小胞融合、飲作用による負荷、を含むがこれに制限されない種々の方法により、または膜透過ペプチドとの会合を含む様々な確立された方法により細胞内へ導入され得る。レポーター基質分子は、天然に生じる化合物であるか、または合成的に誘導され得る。測定は、かかる基質分子の細胞内の存在について、興味ある時点で、代表的には細胞を刺激剤に暴露した後に、行なわれる。興味ある時点においては、単一の細胞または細胞群の一部または全ての内容物が、キャピラリー電気泳動による分離のために回収される。測定の精度を確実にするために、このプロセスは、興味ある時点に続いて起こる化学反応を最小限にすべく、タイムリーな様式で行なわれなければならない。実際にはこのことは、もし測定が１％以内の正確さで行なわれることになっているのであれば、興味ある時点から化学反応の終結時間までに、反応の進行が１％変化するのに必要とされるよりも短い時間が経過すべきことを意味する。代表的には、化学反応は、界面活性剤、激しい混合、希釈などによる物理的破壊により、または電気泳動による分子の分離、あるいはこれらのプロセスの組合せにより終結される。高速制御レーザー溶解は、レポーター基質分子がそれに導入されている単一細胞の内容物を、秒より小さい（ｓｕｂ−ｓｅｃｏｎｄ）タイムスケールで回収するための優れた方法である。
【００１８】
特定の細胞内反応に特異的なレポーター分子は、電気泳動移動度における予測可能な変化を受けるよう設計され得る。これらの分子はまた蛍光性となるよう、および従って、単一な細胞という非常に小さな体積の中で起こる、微少な量および低い濃度において検出可能となるべく修飾され得る。例示された実施態様においては、修飾されたペプチドは、代表的なレポーター分子として用いられる。修飾されたペプチドは、幾つかの理由から、特に有用なクラスのそのような可能なレポーター分子である。一番に重要なこととして、ペプチドは天然の、内在性のタンパク質基質を厳密に模しており、それらが関与している反応における高度の特異性をしばしば明示し、かつそのようにレポートする。このことは、多くの場合に、これらのペプチドの固有の一次配列構造の結果であると理解され得る。所与のペプチドを含むアミノ酸残基の特定の順序は、固有の化学的性質を、特に、特定の酵素により基質として認識され作用されることについて当該分子に伝える。典型的には、その天然の基質がタンパク質である酵素は、アミノ酸残基の特定の順序またはパターンを示している分子を含む反応のみを有効に触媒するであろう。
【００１９】
ペプチドは、レポーター基質として用いられる場合、極めて多方面な（ｖｅｒｓａｔｉｌｅ）化合物である。このような化合物の、大きくて多様なライブラリーは、所与のペプチドを含むアミノ酸残基の配列および数を単純に変化することによって生成され得る。さらに、基本的なペプチド構造の修飾は、多くの方法で為され得る。例えば、Ｄ−異性体アミノ酸は、より一般的に見られるＬ−異性体形態に代えて、ペプチド内に取り込まれ得る。また、異常または代替の、非天然に生じるアミノ酸も、ペプチドに取り込まれ得る。実例は、アルギニンおよびリシンをそれぞれ代替する、ホモアルギニンおよびホモリシンを含む。バックボーンペプチドでさえも、変化されてよい。このような修飾が行なわれた後、生じたペプチドは、酵素反応のための基質として働くことが証明された。
【００２０】
例示された実施態様において、修飾されたペプチドは、当該ペプチド内の特異的アミノ酸にリン酸部分を添加することによってペプチドを変化させる、キナーゼとして公知の酵素の基質である。リン酸化は、インビトロで、細胞の不在下に生じることが可能であり、ペプチドの化学的構造および電気泳動移動度についての明白な変化をもたらす。
【００２１】
さらに、例示された実施態様において用いられたペプチドは、少なくとも１点において、しばしば末端において、フルオレセイン基（または他の蛍光性の基）の共有結合的付加により修飾され、レーザーに誘起される蛍光の検出を可能にする。蛍光性の標識は、当業者には周知の化学的技術により、アミノまたはカルボキシル末端のいずれか、あるいは特異的なアミノ酸残基へ添加され得る。容易に修飾可能な残基は、システインのスルフヒドリル基、アルギニンおよびリシンのアミノ基、およびアスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基を含む。スルフヒドリル基と反応する代表的な化学基は、マレイミド、ヨードアセトアミド、アルキルハライド、アジリジン、およびエポキシドを含む。アミンと反応する化学基は、スクシンイミジルエステル、スルホニルハライド、イソチオシアネート、およびアルデヒドを含む。カルボキシルと反応する化学基は、カルボジイミド、ヒドラジン、アルキルハライド、アミン、およびジアゾアルカンを含む。反応基を有する豊富な異なる発蛍光団は、これらの基でのペプチドに対する共有結合性連結のために市販されている。市販されている異なる発蛍光団の例は、モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン州）により製造されたオレゴン・グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）、アマシャム／ファルマシア・バイオテク（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により製造されたテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）およびテトラメチルローダミンなどのローダミン誘導体、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３，ジアゾール）誘導体、クマリン、ダンシル誘導体、ピレン、およびシアニン色素（Ｃｙ−３／Ｃｙ−５）などのフルオレセイン誘導体を含む。この多様性は、紫外線から可視光を経て赤外部のスペクトルにおよぶ波長の光を、吸収および発光するペプチドの調整を可能にする。これは、異なるスペクトル特性をもつ非常に多様なレポーター基質ペプチドを製造すべく利用され得る他の道筋である。
【００２２】
例示であるとはいえ、本発明は修飾されたペプチドのみの使用、またはその範囲内において細胞内キナーゼのみによる反応をモニターすることに制限されることも意図しない。このアプローチにより、より広い範囲の細胞内化学反応がモニターされ得ることが意図される。例えば、ペプチドに基づくレポーター基質は、ホスファターゼ、グリコシラーゼ、アセチラーゼ、プロテアーゼならびにカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）、およびイソメラーゼの活性についてレポートすべく設計され得る。また、分子レポーターは核酸、炭水化物、リン脂質、および全タンパク質といった、細胞において共通して見つかる他の化学種に基づき得るか、あるいは通常には細胞内に見られない化合物（しばしばポリマー）に基づき得ることも意図される。核酸に基づくレポーター分子は、ヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、メチラーゼ、ジメチラーゼ、およびヌクレオチドトランスフェラーゼのための優れた基質として役立ち得た。脂質に基づくレポーター基質は、リパーゼをモニターするために役立ち得た。炭水化物に基づくレポーターは、オキシドレダクターゼ、グリコシラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、およびイソメラーゼをモニターするべく役立ち得た。最後に、タンパク質全体はしばしば細胞内の化学反応にとっては天然の基質であるため、これらに基づくレポーターは、細胞内の生理学について極めて正確な情報をもたらすことを証明できた。
【００２３】
タンパク質全体を含むレポーター分子は、クラゲであるエクオレア・ヴィクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）からの緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）に基づき得る。このタンパク質は本質的に蛍光性であり、基礎的な生物学の研究において広く用いられてきた。このタンパク質の遺伝子はクローン化されており、固有の吸収および発光スペクトルを有する多様なＧＦＰ様の蛍光性タンパク質を産生するよう突然変異されてきた。ＧＦＰ様タンパク質の遺伝子は、ペプチドまたはタンパク質全体に関する遺伝子配列に連結されることができる。細胞内で発現されると、かかるキメラ分子は、連結されたペプチドまたはタンパク質の特性とともに、ＧＦＰの蛍光特性を有する。連結されたペプチドまたはタンパク質が基質であるとき、結果は、タンパク質に基づく蛍光性の分子基質である。かかるキメラ分子は、細菌または培養された真核細胞において産生され得、外来性のレポーター基質としての使用のために精製されるか、またはレポーター基質の内在性の産生のために、当該遺伝子が興味ある細胞内へ導入され得る。事実、かかる遺伝子は細胞系へ導入され得、当該遺伝子を１つの世代から次の世代に運ぶ新しい細胞系を産生する。細胞内での代謝回転および細胞下サンプリングの後、ＧＦＰの連結された代謝回転された基質分子を、ＧＦＰの連結された代謝回転されていない基質分子から分離するべく、電気泳動が使用され得る。蛍光性タンパク質の遺伝子が、ウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）などの他の生物体に存在することは明らかであり、それはクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）からのＧＦＰとは同等でなく、またこれらの遺伝子がクローン化される場合にはそれらも同様に利用されることが期待される。
【００２４】
細胞内から得られた分子状のレポーター分子の検出は、蛍光法によってのみ成し遂げられる必要はない。蛍光法は、それらが提供する極めて低い検出限界のため、一般的に利用されている。事実、単一の分子の検出を可能にし得る、蛍光に基づく方法が開発されてきた。表１に示されるように、生理学的に正常な濃度が１μＭである、１ｐｌ（ピコリットル）の哺乳類細胞において検出される基質の量を観察するために必要な検出限界は、１０−１８モル、または６００，０００分子である。リン光、または化学発光に基づく代替的な定量的光学分光検出法もまた、この低い検出限界を達成し得る。また、電流滴定やボルタ計測のような幾つかの電気分析法も、単一細胞から得られる変化された、および未変化のレポーター分子を検出および定量すべく用いられるのに充分な鋭敏性がある。感度のよい検出および定量は、電子イオンスプレイ質量分析法をキャピラリー電気泳動分離法と結合することによっても達成された。生物系には稀な元素からの、または異常な同位体の形状のいずれかでの、レポーター分子への重い原子の取り込みは、かかる質量分析法の活用を大いに増加させ得た。
【００２５】
【表１】
2003524409.tif 000001
各々が特異的な化学反応についてレポートする多数のレポーター基質が、所与の細胞内において同時に利用可能と予測される。
【００２６】
最終的には、本明細書中に開示されたようなレポーター分子の使用は、それらがもっぱら細胞内性であるというわけではない情況において、用途を有することが予想される。このアプローチは、微少な体積、低い濃度、およびごく少量を生じる環境における化学活性の測定に一般に適用されるであろう。かかるレポーター分子を用いて分析され得た非細胞体積の実例は、レポーソームまたは小胞の内部、または典型的には脂質分子によって取り囲まれている、単一の細胞サイズの、またはより小さい区画である。
【００２７】
ここに要約された本発明およびその種々の実施態様は、同様の要素が同様の番号によって参照されている以下の図面を見ることにより、さらに理解されるであろう。
【００２８】
（好適な実施形態の詳細な説明）
第１に例示される実施形態において、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）として知られている細胞内酵素の正味の活性は、マイクロインジェクションによって１ｐｌ容量までの単一哺乳動物細胞に、ＰＫＣによるリン酸化のための基質である合成蛍光ペプチドをまず導入することによって測定される。ＰＫＣによるリン酸化に際して、蛍光ペプチド基質の正味の電荷は＋５から＋３に変化する。より重要なことには、ペプチド基質の電荷対質量比率はこの化学的変化の結果として変化する。
【００２９】
結果として、単一細胞の内容物が、速くて制御可能なレーザー分解によって得られ、キャピラリー電気泳動によって分離され、次いでレーザー誘導蛍光によって検出されると、分子の１または２の同定可能な集団が観察され、定量できる。該集団は、キャピラリー電気泳動に個々に付した場合に各分子種で観察される特徴的な移動時間を参照することによって同定される。光電子増倍管によって誘導蛍光のピークとして観察される分子のより速く移動する集団は、リン酸化されていない基質に対応する。やはり誘導蛍光のピークとして観察されるより遅い集団は、リン酸化されている基質に対応する。キャピラリー２２を通っての移動速度のこの差は、電気泳動移動度の変化という。分子の２つの集団の間の電気泳動移動度の差は、各集団における分子の電荷対質量比率および電荷泳動を行うのに用いた特定の条件の差の結果である。
【００３０】
この場合、基質分子のサブセットのＰＫＣリン酸化はそれらの特徴的な電気泳動移動度を変化させた。２つの集団内の分子の相対的量は、溶解の時点までに単一細胞内で起こった正味のＰＫＣの活性の尺度を与える。細胞を処理してそのＰＫＣを活性化させない場合、検出可能な基質ペプチドのほとんどは非リン酸化形態である。ＰＫＣのアクチベーターである化学物質に細胞を５分間暴露させると、ほぼ半分の測定された基質ペプチドはリン酸化形態のものである。これらの測定は、２つの関係しない哺乳動物細胞系、ラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞、培養された顆粒球細胞系、およびＮＩＨ／３Ｔ３細胞、マウス（ネズミ）繊維芽細胞細胞系の個々の細胞から行った。さらに、この実施形態において、２つの区別されるキナーゼの活性に対するレポーターである２つの異なる蛍光ペプチドは、単一ＲＢＬ細胞の内容物から同時に検出し同定することができるのが示される。
【００３１】
もう１つの実施形態において、単一カエル（アフリカツメガエル）卵母細胞４６’（直径が１ｍｍ、用量が１μｌ、非哺乳動物細胞）が測定される。この場合、同一の合成蛍光ペプチド基質がインジェクションによって細胞に導入される。引き続いて、細胞の内容物の一部を、圧電モーターによってガイドされる鋭いキャピラリー先端で取り出す。この場合、卵母細胞４６’の内容物はレーザー溶解によって採取される必要はない。なぜならば卵母細胞４６’は機械的にサンプリングするのに十分大きいからである。一旦内容物の一部がキャピラリー２２内に入ると、卵母細胞サイトゾル成分の分離に経験的に最適化された電気泳動条件下でそれらを分離する。異なる細胞および電気泳動条件が第１の実施形態と比較して用いられるが、リン酸化および非リン酸化ＰＫＣ基質分子の同定可能かつ定量可能集団が依然として得られる。複数の時点における卵母細胞４６’からのさらなる測定は、刺激された基質リン酸化の平均速度が、ＰＫＣの２つの異なる化学的アクチベーターでの卵母細胞４６’の処理で測定されるのを可能とした。
【００３２】
最終的に、この実施形態において、３つの異なり区別されるキナーゼに対するレポーターである３つの異なる蛍光基質ペプチドを、単一カエル卵母細胞４６’の内容物の一部から検出し同定することができるのが示される。
【００３３】
２つの例示的な実施形態の共通する態様
２つの好ましい実施形態が示される。第１のものは、典型的には直径が５−１０μｍであって容量が約１ｐｌである単一の哺乳動物小細胞における細胞内化学的活性の測定に関する。これは、細胞系ＲＢＬ−２Ｈ３の個々のラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞から、および個々のネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞から成された測定によって説明される。第２のものは、比較的大きな単一細胞における細胞内化学的活性の測定に関する。この第２の実施形態において、測定は、直径が約１ｍｍであって容量が約１μｌである個々のアフリカツメガエルカエル卵母細胞４６’からなされる。両方の例示的実施形態において、細胞内プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性の測定は個々の細胞からなされる。両方の実施形態において、「ＰＫＣの蛍光基質」として、Ｆｌ−ｓＰＫＣと呼ばれる同一のレポーター基質分子が用いられる。ＰＫＣによるリン酸化に際して、Ｆｌ−ｓＰＫＣの正味の電荷は＋５から＋３まで変化する。より重要なことには、電荷対質量の比率はこの化学的変化の結果として変化する。引き続いて、単一細胞の内容物が得られ、キャピラリー電気泳動によって分離され、次いでレーザー誘導蛍光によって検出すると、非リン酸化および／またはリン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応する分子の１または２の同定可能な集団が観察され、定量できる。これらのＰＫＣ測定における、および通常のラジオグラフィー方法における関与する量（アッセイされた容量、基質の濃度および全量）の比較が表１に提供される。
【００３４】
このレポーターペプチドを含むアミノ酸残基の配列はＰＫＣ蛋白質配列の領域から得られる。より大きなＰＫＣ配列、Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌで見出されるペプチド配列は酵素を阻害することが知られているが、下線を施したアラニン残基がセリン残基で置換されると、得られた配列はＰＫＣに対する比較的特異的基質として働くことが知られている。かくして、Ｆｌ−ｓＰＫＣの配列はＦｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌであり、ここに、「Ｆｌ」は、標準的なペプチド合成によりペプチドのアミノ末端に共有結合した蛍光部位を表す。下線を施したセリン残基Ｓｅｒはリン酸化部位である。樹脂結合した非蛍光ｓＰＫＣペプチドはＳｔａｎｆｏｒｄ  ＰＡＮ機構から得られ、通常の合成方法によって生じたものである。フルオレセインがアミノ末端に共有結合したペプチドは、回転ミキサーにてジメチルホルムアミド中の樹脂結合非蛍光ペプチド（３０ｍｇ／ｍｌペプチド）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５７ｍｇ／ｍｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソピルエチルアミン（５５ｍｇ／ｍｌ）と共に５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（１００−２００ｍｇ／ｍｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を１２時間インキュベートすることによって調製された。ペプチドをジメチルホルムアミドおよび酢酸エチルで洗浄し、ついで、あらかじめアルゴンまたは窒素を散布したトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／フリーラジカルスカベンジャーミックス（トリフルオロ酢酸（８４％，ｖ／ｖ）、フェノール（０．２％，ｗｔ／ｖ）、チオアニソール（５％，ｖ／ｖ）、エタンジオール（２．５％，ｖ／ｖ）、水（８．５％，ｖ／ｖ））と共に２時間インキュベートすることによって樹脂から切断した。焼結ガラスフィルターを通すことによってペプチドを樹脂から分離した。次いで、氷冷エーテルの添加によってペプチドを沈殿させ、酢酸（５％）に溶解させ、引き続いて凍結乾燥した。水中の０．１％トリフルオロ酢酸水溶液および０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を用いるセミプレパラティブＣ１８カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）での逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってペプチドを精製した。緩衝液Ａ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ＣａＣｌ２）に溶解させた蛍光標識ペプチドＦｌ−ｓＰＫＣの濃度は、その蛍光を加水分解されたカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルの標準のそれと比較することによって測定した。Ｆｌ−ｓＰＫＣの純度は、分析用Ｃ１８カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ）での逆相高圧液体クロマトグラフィーによって、およびキャピラリー電気泳動によって評価した。ペプチドを２μｌずつ分注し、−７０℃において保存した。
【００３５】
両方の実施形５において、図２Ａ、３Ａ、４Ａおよび４Ｂに示した、レポーター基質ペプチドＦｌ−ｓＰＫＣ、およびそのリン酸化形態のＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの参照分離は緩衝液中で行った。この目的でのＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの生成はイン・ビトロでのリン酸化によって達成された。ジオクタノイルグリセロール（２５μｇ／ｍｌ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、ホスファチジルセリン（２５０μｇ／ｍｌ）ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、トリスＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、アデノシン三リン酸（１ｍＭ）および（Ｃａ２＋〜１０μＭ）の存在下でＦｌ−ｓＰＫＣ（４−４０μＭ）をラット脳ＰＫＣ（１．２μｇ／ｍｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によってリン酸化した。遊離Ｃａ２＋の濃度は１０ｍＭカルシウムと共に１０ｍＭ  ＥＧＴＡを添加することによって設定した。反応混合物を室温で１時間インキュベートし、リン酸化ペプチドをさらに精製することなく用いた。
【００３６】
両方の実施形態における測定の一般的概要を図１Ａ−Ｈに示す。図１Ａ−Ｈは工程ごとの概要の説明であり、本発明による細胞内キナーゼの測定を示す。脚注を図１Ａに含めて、示された分子種を確認する。図１Ａは測定に先立っての可能な状態における細胞４６の模式図であり、ここに、細胞は不活性なキナーゼ分子１１２を含有する。
【００３７】
測定
測定の手順は、図１Ｂに示すように、Ｆｌ−ｓＰＫＣの注目する細胞への導入で開始される。この場合、マイクロピペット１１６によるレポーター基質１１４のマイクロインジェクションが示される。
【００３８】
細胞４６を刺激剤１１８で処理して細胞内ＰＫＣを活性化する測定において、刺激剤１１８は図１Ｃに示すように細胞４６の周りの溶液１２０に添加される。
【００３９】
図１Ｄは、活性なキナーゼ分子によって触媒されるレポーター基質リン酸化の模式図である。全ての時点において通常は細胞４６内にあるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）１２４は、この反応のためのリン酸基の細胞内源である。活性なキナーゼ１２２は、非リン酸化レポーター基質１１４とＡＴＰ１２４との反応を触媒する。リン酸化の後、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）１２６は、リン酸化レポーター基質１２８と共に放出される。
【００４０】
図１Ｄに一般に模式的に示されるように、Ｆｌ−ｓＰＫＣのリン酸化は、刺激剤１１８で処理した細胞で最大限に起こり、その結果、図１Ｅに示されたように細胞内内容物を含む細胞４６が得られる。図１Ｃは、いくらかの量のレポーター基質がリン酸化された後の図１Ｃの細胞４６の模式図である。与えられた時間間隔の後、刺激剤処理を行ったかまたは行わないかの両方の場合において、細胞４６の細胞内内容物すべてまたは一部が、分離および検出のためにキャピラリー３０にローディングされる。図１Ｆは、図１Ｇにおけるキャピラリー２２での分析および分離のために細胞内容物を放出させるために、その原形質膜の破壊後（破線で示される）の図１Ｅの細胞４６の模式図である。図１Ｇは、キャピラリー３０内の、非リン酸化基質分子１１４およびリン酸化基質分子１２８の間の分離距離を模式的に示すキャピラリー電気泳動（ＣＥ）による、各々、非リン酸化およびリン酸化基質分子１１４および１２８の分離を模式的に示す。
【００４１】
キャピラリー３０の末端側端部における光学ウインドウ３８は、破壊された原形質膜を持つ細胞４６からの物質のキャピラリー３０への流動として図１Ｆ−Ｇの組合せで表されるレーザーによる応答（示さず）およびレーザー誘導蛍光の収集を可能とする。
【００４２】
両方の実施形態において、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの存在および量を検出するためにアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）誘導蛍光を収集する。用いた光収集系はわずかに異なるが、両方の実施形態において、光電子増倍管電流を増幅し、プレアンプリファイアーで電圧に変換し、この信号をパーソナルコンピューター中でのデータ収集ボードによってデジタル化した。出力を模式的に図１Ｈに示した。これは、非リン酸化レポーター基質分子１１４がリン酸化レポーター基質分子１２８の集団から分離されている典型的な電気泳動図を示す。
【００４３】
図９は、キャピラリー電気泳動によって高速制御細胞溶解が分析と組み合わされて行われる例示的実施形態で用いられる高速溶解装置の模式図である。該システムは一体化させる親出願に記載されるが、基本的な記載を便宜のために再度掲げる。現在知られていないまたは後に工夫された多くの構成要素を図１Ａのシステムに置き換えて、同等の機能を行うことができるのは理解されなければならない。例えば、例示的な実施形態では電気泳動カラム中の分析物のレーザー誘導蛍光検出が考えられるが、分析物の検出または分析が可能ないずれの測定デバイスまたは検出メカニズムも、電荷、または電荷対質量比率に基づいてレポーター分子を分離することができるいずれの分離システムでも用いることができる。
【００４４】
一般に参照１０に示されるシステムは、ＣＲＴスクリーン１６に表示される、またはビデオテープレコーダーまたはデジタルレコーダー（示さず）によって記録されるビデオ接眼レンズ読み取り部１４を有する顕微鏡１２よりなる。特に、後記するように、自動細胞処理および分析のためのコンピューターシステムへのイメージおよびパターン処理のデジタル貯蔵は特に本発明の範囲内にあると考えられる。ＣＣＤ（電荷結合デバイス）ビデオカメラシステム１４、１６は３３ミリ秒毎に細胞４６のリアルタイムの明視野像を記録した。溶解は、レーザーパルス後に細胞の外観から決定した。ほとんどの場合、細胞膜は全体が破壊され、（以前の）細胞に直ぐ近接に、懸濁した細胞内容物内とカバーガラス３６に付着した膜の痕跡のみが後に残る。例示的実施形態において、オペレーター始動発射およびその結果としての溶解の時点にレーザーによって送られる電圧パルスによって電気泳動が開始された。コンピューター制御パターン認識は、オペレーターの観察に置き換えることができ、発射は同様に自律的にトリガーできることははっきりと理解されるべきである。
【００４５】
パルスＮｄ：ＹＡＧレーザー１８は、顕微鏡１２の顕微鏡対物レンズ２０を通して向けられる。細胞溶解実験で用いられたレーザーシステムは、Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｏｆ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  によってＳｕｒｅｌｉｔｅとして製造されたような周波数倍化ＱスイッチドＮｄ：ＹＡＧレーザーを含んだ。該レーザーを用いて、５３２ｎｍ波長で５ｎ秒パルスの１乃至２５μＪの単一レーザーパルスを生じさせた。レーザー１８からのレーザービームは顕微鏡１２、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹのＺｅｉｓｓによって製造されたＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５に向けられた。細胞チャンバーカバーグラス３６および緩衝液５４の界面において顕微鏡対物レンズ２０（１００×、１．３ｎ．ａ．  Ｚｅｉｓｓ）を用い、図１Ｂに示すように、レーザーパルスをそのウエスト５０においてほぼ０．３乃至０．４μｍに焦点を結ばせた。溶解させるべき細胞４６をレーザーパルスの焦点５０に対して１０−２０μｍ横に位置させた。溶解、細胞の外膜の破壊は、レーザーパルスによって生じる衝撃波によって行われる。しかしながら、もう１つの実施形態においては、レーザーパラメーターを調整して、細胞膜中に孔を開け、細胞質の内容物を追い出し、中に核物質を残す場合のように、直接的相互作用をなすことができるのははっきりと理解されるべきである。ここに説明した１つ以外の他のタイプのレーザーを用いて衝撃波を発生させることもできるのは理解されなければならない。細胞の溶解に加えて、細胞から単離されまたは取り出された細胞の核を操作して、ＤＮＡまたは他の核物質を回収することができる。
【００４６】
溶融シリカキャピラリーカラム２２は、キャピラリー２２の基部側流入口２６を顕微鏡ステージ３０上に位置するカバーグラス２８上方に位置させるマイクロマニュピュレーター２４によって位置させる。細胞の回りおよびカバーグラス上方の緩衝液は電気的に接地されている。Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ｏｆ  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹによって製造された高電圧電源モデルＣＺＥ１０００Ｒを用いて、カラムまたはキャピラリー２２中で電気泳動を行った。溶融シリカキャピラリー２２は５０μｍの内径および３６０μｍの外径を有した。キャピラリー２２の全長は９０乃至１００ｃｍであった。検出ウインドウ３８は流入口端部２６から約７５ｃｍであった。電気泳動は生物学的に適合する緩衝液中で行った。図１０の細胞チャンバー１９９は流入口貯蔵器として働き、接地電圧に維持された。流出口貯蔵器は１０乃至１８ｋＶに保持された。キャピラリー２２の流出口端部２６は、細胞内容物を細胞溶解後にキャピラリー２２に導入するためのマイクロピペットとして用いられた。
【００４７】
流入口端部２６上方のキャピラリー２２から５ｍｍのポリイミドコーティングを除去した後、流入口端部２６をマイクロマニュピュレーター２４上のカバーグラス３６に垂直に接地した。マイクロマニュピュレーター２４は、溶解させ、キャピラリー２２にローディングすべき細胞４６に対してキャピラリー内腔５２を正確に位置決定することを可能とした。キャピラリー２２は各泳動の後に洗浄した。重力サイフォン流体流動を用いて、キャピラリー２２にリン酸化／非リン酸化ペプチド標準をローディングした。ローディングした容量はポワズイユの方程式から計算した。
【００４８】
キャピラリー２２は、アルゴンレーザー４０からの励起ビームが目的とする光学検出ウインドー３８を含む。蛍光データは、Ｎｉｋｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹによって製造された０．７５ｎ．ａ．，Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒを備えた４０×顕微鏡対物レンズによって、キャピラリー２２に対しておよびレーザー４０からのレーザービームに対して直角に収集した。収集された光は、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  のＫａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって製造された４８８ｎｍノッチフィルター、およびＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｏｆ  Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖｅｒｍｏｎｔによって作成されたバンドパスフィルター５３５ＤＦ５５によるスペクトルフィルター後、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙのＨａｍａｍａｔｓｕによって作成された光電子増倍管ＰＭＴ  Ｒ９２８によって測定された。光電子増倍管電流を増幅し、プレアンプリファイアーで電圧に変換し、次いで、パーソナルコンピューター４４においてデータ収集ボードによってデジタル化した。Ｍｉｃｒｏｃａｌｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｍａｓｓａｔｈｕｓｅｔｔｓによって書かれたＯｒｉｇｉｎを用い、データをプロットし、ピーク面積を計算した。誘導された蛍光データを用いて、図２Ａ−Ｃ、３Ａ−Ｃおよび４Ａ−Ｄ、５．７および１１の電気泳動図を得た。浴３４を高電圧源３６に電気的に結合させて、キャピラリー２２中で分析物の分離を引き起こす電気泳動力を供した。
【００４９】
第１の実施形態に特異な条件および結果
用いた細胞
図２Ａ−Ｃおよび３Ａ−Ｃは、全てが同一日に同一の電気泳動条件下で作成されたレポーター基質分子の分離の３つの重ねた電気泳動図のグラフの２つの組である。図２Ａ−Ｃおよび図３Ａ−Ｃによって示される最初の実施形態において、腫瘍肥満細胞系ＲＢＬ−２Ｈ３からのラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞を用いた。これらの細胞は、１０％胎児牛血清およびＬ−グルタミン（５８４ｇ／ｌ）を補充したダルベッコウの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を培地に添加して、細菌の増殖を阻害した。Ｓｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）を用いて作成したチャンバー１９９中で細胞４６を増殖させて、シリコン「Ｏ」リング（外径が１５／１６インチ−示さず）を２５ｍｍの丸いｎｏ．１カバーグラス（示さず）に付着させた。ガラス表面への細胞の付着は、細胞４６を細胞チャンバー１９９に添加するに先立ってカバーグラスをＣｅｌｌ−Ｔａｋ／Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でコーティングすることによって増強させた。使用に先立って、細胞チャンバー１９９中で平板培養した後１２−２４時間、細胞４６を追加した培地中で増殖させた。細胞４６を経験的に決定した濃度で平板培養して、測定日に１００×視野当たりほぼ１つの細胞を生じさせた。組織培養物質はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から得た。図１２で用いたネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋの使用を省略し、細胞を典型的には細胞チャンバー１９９中で平板培養した後に２４−４８時間増殖させた以外は、同一の条件下で増殖させた。ネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞はＲＢＬ細胞と同様にほぼ同一寸法まで増殖する。
【００５０】
顕微鏡観察および細胞のサンプリング
第１の実施形態において、細胞溶解で用いた図９の顕微鏡観察システムは、「Ｆａｓｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と題された一体化させる出願に既に記載されたものと同様であった。周波数倍化ＱスイッチドＮｄ：ＹＡＧレーザー１８（Ｍｉｎｉｌｉｔｅ  ＩＩ，Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａ；Ｍｉｎｉｌａｓｅ  ＩＩ−２０，Ｎｅｗ  Ｗａｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、蛍光顕微鏡１２（Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５，Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）に向けられた単一パルス（１−２５μＪ，５−ｎｓパルス幅，５３２ｎｍ）を生じさせた。緩衝液を含むこの界面に隣接するカバーグラス３６内の顕微鏡対物レンズ２０（１００ｘ，１．３ｎ．ａ．，Ｆｌｕｏｒ，Ｚｅｉｓｓ）でパルスを焦点合わせした（そのウエストにおいて〜０．３−０．４μｍ）。この同じ顕微鏡対物レンズ２０を、細胞のマイクロインジェクションおよび選択の間の肉眼での観察で用いた。レーザービームと細胞４６との直接的相互作用が起こらないように、溶解すべき細胞４６をレーザーパルスの焦点に対して１０μｍ横に位置させた。溶解は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーパルスの手動トリガリングによって行った。ほとんどの場合、細胞膜は完全に破壊され、カバーグラスに付着した細胞膜の痕跡のみが後に残った。
【００５１】
分離条件
第１の実施形態において、緩衝液Ａ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ＣａＣｌ２よりなり，ＮａＯＨｐＨ７．４に調整した生理学的に適合する細胞外緩衝液を用い、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）からの５０−７５ｃｍの長い溶融シリカ非被覆キャピラリー２２（３６０μｍ外径、５０μｍ内径）にて電気泳動を行った。細胞チャンバー１９９は流入口貯蔵器として働き、接地電位に保持した。流出口貯蔵器は高電圧電源（ＣＺＥ１０００Ｒ，Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）で１０．８−１３．４ｋＶの負の電圧に保持した。電気泳動電流は５０−７０μＡであった。キャピラリー２２の流入口２６を、細胞溶解後に細胞内容物をキャピラリー２２に導入するためのマイクロピペットとして用いた。レーザーパルスからの電圧の差を電気的にトリガーすることによって、電気泳動を溶解と同時に開始させた。キャピラリー２２の、各々、流入口および流出口端部２６および３２を、細胞溶解、ローディングおよび電気泳動の間に同一の高さに保持して、重力による流動を排除した。電気泳動と電気泳動の間に、キャピラリー２２は以下の方法によって洗浄した：
（１）緩衝液Ａを手で保持したシリンジでキャピラリー２２に３０秒間で手動により通した（ほぼ１０カラム用量）；
（２）２回蒸留した逆浸透圧処理水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）を３０秒間で通した；
（３）１Ｎ  ＮａＯＨを５分間通した；
（４）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を３０秒間通した；
（５）０．１Ｎ  ＨＣｌを３分間通した；
（６）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を３０秒間通した；および
（７）緩衝液Ａを１分間通した。
【００５２】
検出
検出の目的で、５ｍｍ長さのポリイミドコーティングを、流出口端部３２から１２．５ｃｍの位置においてキャピラリー２２の外側表面から除去してウインドウ３８を作成した。コーティングは、ディスポーザブルブタンライターで軽く加熱することによって除去し、引き続いて７０％エタノール溶液で洗浄した。アルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍ，Ｕｎｉｐｈａｓｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の焦点を合わせたビームによって、キャピラリー２２内腔を光学ウインドウ３８を通した。レーザービームは焦点長さ３．８ｃｍを持つレンズ（示さず）（ＣＶＩ，Ａｌｂｕｑｕｅｑｕｅ，ＮＭ）によって焦点を合わせた。蛍光データは、キャピラリー２２および顕微鏡対物レンズでのレーザービーム（示さず）、しかし検出器４２に含めた−４０×，０．７５ｎ．ａ．，Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ，Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）に対して直角にて検出器４２によって収集し、４８８ｎｍノッチフィルター（Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）（示さず、しかし検出器４２に含めた）および５３５ＤＦ５５バンドパスフィルター（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）（示さず、しかし検出器４２に含めた）でスペクトルフィルター後、光電子増倍管（示さず、しかし検出器４２に含めた−ＰＭＴ，Ｒ９２８，Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）で光を測定した。光電子増倍管電流を増幅し、モデル１２１２プレアンプリファイアー（ＤＬ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｒｙｄｅｎ，ＮＹ）（示さず、しかし検出器４２に含めた）で電圧に変換した。信号はパーソナルコンピューター４４（Ｇａｔｅｗａｙ  Ｓｉｏｕｘ  Ｃｉｔｙ，ＳＤ）中でデータ収集ボード（ＤＡＳ−１８００，Ｋｅｉｔｈｌｙ  Ｍｅｔｒａｂｙｔｅ，Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ）によってデジタル化した。
【００５３】
Ｏｒｉｇｉｎ  （Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｎｏｒｔｈｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてデータをプロットし、ピーク面積を計算した。該システムは〜６×１０−２１モル（約３６００分子）のＦｌ−ｓＰＫＣを容易に検出でき、これは生理学的に関連する測定に必要な検出限界未満である（表１参照）。
【００５４】
電気泳動移動標準
図２Ａおよび３Ａは、双方の種の電気泳動移動度についての参照として考えられる、緩衝液中の混合物からの非リン酸化およびイン・ビトロリン酸化レポーター基質分子の分離を示す電気泳動図の２つのグラフである。図２Ａおよび３Ａに示された電気泳動移動標準を得るために、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの希釈した混合物を、重力流体流動によってキャピラリー２２にローディングし、ローディングされた容量をポアズイユの方程式によって計算した。これらの混合物は、図２Ａにおける双方の種の濃度はほぼ１ｎＭであり、図３Ａにおいて双方の種の濃度はほぼ１００ｐＭであった。図２Ａおよび図３Ａは各々、標準のための非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣピーク１３６およびリン酸化Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣピーク１３８を示す。
【００５５】
また、図１１Ａは、緩衝液中の混合物からの非リン酸化およびイン・ビトロリン酸化レポーター基質分子の分離を示す電気泳動図のグラフである。図１１Ａに示された電気泳動移動標準を得るために、Ｆｌ−ｓＰＫＣ、Ｆｌ−ｓＰＫＡおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの希釈した混合物（各々、濃度はほぼ１ｎＭ）を、重力流体流動によってキャピラリー２２にローディングし、ローディングされた容量はポアズイユの方程式から計算した。図１１Ａは、標準としての非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣピーク１３６、非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＡピーク１３７、およびリン酸化Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣピーク１３８を示す。
【００５６】
図２Ａ−Ｃにおける測定の技術的態様
図２Ａ−Ｃによって示される測定において、室温（２０−２３℃）でのマイクロインジェクションおよび分析のための顕微鏡ステージに設置する前に、Ｐｉｐｅｔｍａｎ（Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｍ，ＭＡ）を用いて穏やかに手動でヒペット混合しつつ、緩衝液Ａ中の１０μｌの１０ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の添加によって各細胞チャンバー１９９を処理した。
【００５７】
これは、２００μＭの最終Ｐｅｆａｂｌｏｃ濃度を生じた。Ｐｅｆａｂｌｏｃはセリンプロテアーゼの可溶性の生理学的に許容された阻害剤、ペプチドを分解する傾向がある細胞内酵素のサブセットである。Ｐｅｆａｂｌｏｃを誘導して、Ｆｌ−ｓＰＫＣの細胞内分解を最小化した。図２ＣのようにＰＫＣを活性化する場合、２００μＭストック溶液から新たに蒸留した１０μｌの５μＭフォルボールミリスチン酸（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入）を緩衝液Ａに添加し、Ｐｅｆａｂｌｏｃと同時に穏やかに混合した。ストック溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させたＰＭＡよりなるものであった。細胞チャンバー１９９をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に５分間戻した。顕微鏡ステージに設置した直後に、１０ｍＭグルコースおよび２００μＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃを添加した室温（２０−２３℃）緩衝液Ａの連続的流動および除去（２ｍｌ／分、ほぼ４細胞チャンバー容量／分）によって、細胞チャンバー１９９中の培養培地を置き換えた。マイクロインジェクションおよび回収を通じて流動を維持した。これは、典型的には、２０−３０分続いた。流動は溶解の間は短く停止させ、溶解およびキャピラリーローディングの１分後に再度開始させ、電気泳動を通じて継続した。
【００５８】
図２Ａ−Ｃによって示される測定において、Ｆｌ−ｓＰＫＣを緩衝液Ｂ、すなわちｐＨ７．４の、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１４０ｍＭ  ＫＣｌよりなる生理学的に適合する細胞内緩衝液に希釈した。Ｆｌ−ｓＰＫＣの最終濃度は〜８００μＭであった。Ｆｌ−ｓＰＫＣと混合したのは、５００μＭの濃度のＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）であった。０．２秒間の８０ｈＰａの圧力にて、Ｉｎｊｅｃｔｍａｎ５１７１マイクロマニピュレーターおよびＴｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５３４６システムを備えたＦｅｍｔｏｔｉｐ  １ガラスマイクロインジェクションニードル１１６を通じて、この混合物を、同一細胞チャンバー中のいくつかの細胞にマイクロインジェクションした（Ｆｅｍｔｏｔｉｐ、ＩｎｊｅｃｔｍａｎおよびＴｒａｎｓｊｅｃｔｏｒはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ国の製品である）。細胞内濃度は８μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣおよび５μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅであると見積もられる。インジェクションは、細胞の選択および分析で使用する同一顕微鏡１２、すなわち、Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５（Ｚｅｉｓｓ）で行った。首尾よくマイクロインジェクションされた細胞４５は、Ｆｌ−ｓＰＫＣ上のフルオレセイン部位の光破壊を最小化するためのＴＲＩＴＣフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）（示さず、しかし顕微鏡１２に含めた）の組によって同定した。均一な蛍光性均質細胞質および平滑原形質膜によって判断して健康に見える細胞４６のみを分析のために選択した。マイクロインジェクションした細胞の大部分がこの要件を満たさず、これは、膜の欠損、点状の蛍光、または過剰に明るい核を示した。
【００５９】
図２Ａ−Ｃにおける測定の結果
図２Ｂは、酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）が特異的に活性化されないラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞４６の内容物から分離を示す電気泳動図のグラフである（〜１２００秒のピーク１４４は細胞内蛋白質分解の副産物であると考えられる）。特に、図２Ｂは、細胞外刺激剤の非存在下において、前記したように、マイクロインジェクションしたＲＢＬ細胞４６の内容物の電気泳動図である。図２Ｂは、図２Ａに示されたＦｌ−ｓＰＫＣピーク１３６に対して移動時間に対応するサイズ可能非リン酸化ピーク１４０を示す。対照的に、リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣに対して移動時間に対応する非常に小さなピーク１４２のみが観察される。マイクロインジェクションの時間から処理された細胞４６内では、実質的に正味の細胞内ＰＫＣ活性は起こらなかった。
【００６０】
図２Ｃは、ＲＢＬ細胞４６の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフであり、ここに、ＰＫＣは１００ｎＭフォルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）での処理によって特異的に活性化された。図２Ｂの結果とは対照的に、細胞外膜透過性刺激剤ＰＭＡに暴露されたＲＢＬ細胞４６の内容物の図２Ｃ中の電気泳動図は、かなりの正味のＰＫＣ活性の証拠を示す。Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１４６およびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１４８はほとんど等しい大きさである。
【００６１】
明らかに、潜在的薬理学的アクチベータによる細胞内キナーゼの活性化はこのアプローチによって測定することができる。さらに、図２Ｂおよび２Ｃにおける両方の電気泳動図は、容易に同定できないピークの存在を示す。これらのピークは、細胞内プロテアーゼによって部分的に分解された、あるいは他の細胞内非キナーゼ酵素によって共有結合的に修飾されたＦｌ−ｓＰＫＣの形態に対応すると考えられる。区別されよく規定されたピークとしてのこれらの分子産物の発生は、それらは区別される分子種を表し、限定された数の特異的副反応の産物であることを示唆する。Ｆｌ−ｓＰＫＣ分子は、これらの副反応によって圧倒的には消費されない。というのは、図２Ｂおよび２Ｃ双方においては、副産物は収集された蛍光の約５０％のみを占めるからである。ピーク１５２として示された図２Ｃにおいて最も遅く移動する特異な種は、Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの修飾されたバージョンに対応し得る。
【００６２】
図３Ａ−Ｃにおける測定の技術的態様
図３Ａは、双方の種の電気泳動移動度に対する参照と考えられる、緩衝液中の混合物からの非リン酸化およびイン・ビトロリン酸化レポーター基質分子の分離を示す電気泳動図のグラフである。図３Ｂは、ラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞４６の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフであり、ここに、酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は特異的に活性されなかった。図３Ｃは、ＲＢＬ細胞４６の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフであり、ここに、ＰＫＣは細胞の細胞外ＡＴＰの処理の結果として活性化された。
【００６３】
図３Ａ−Ｃによって示される測定において、事象の配列は以下の通りである。まず、細胞チャンバー１９９をインキュベーターから取り出し、培養培地を、さらに１０ｍＭグルコースを含有する緩衝液Ａの２つの手動によりピペット操作で置き換え、チャンバー１９９内の細胞４６に、緩衝液Ｂ中の１００μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣおよび５００μＭ  ｒｈｏｄ−２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の混合物を前記したようにマイクロインジェクションした。細胞内濃度は１μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣおよび５μＭ  ｒｈｏｄ−２であったと見積もられる。次いで、チャンバー１９９を１５分間インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻した。この回収時間の後に、全てのさらなる操作は室温（２０−２３℃）で行った。細胞チャンバー１９９内の緩衝液を、さらに１０ｍＭグルコースを含有する手動によりピペット操作した緩衝液Ａの５回の交換で置き換え、細胞の選択および分析のために顕微鏡ステージ上に戻した。首尾よくマイクロインジェクションされた細胞４６は、Ｆｌ−ｓＰＫＣ上の蛍光部位の光破壊を最小化するためのＴＲＩＴＣフィルター（Ｃｈｒｏｍａ）の組を通じての内部ローダミンエピ蛍光の肉眼による観察によって同定した。均一な蛍光の均質細胞質および平滑な原形質膜の存在によって判断して健康なように見える細胞４６の細胞のみを分析のために選択した。既に述べたように、マイクロインジェクションした細胞の大部分はこの要件を欠いており、膜の欠損、点状の蛍光、または過剰に明るい核を示した。
【００６４】
図３Ｃにおけ４ようにＰＫＣが活性化されるべきであった場合、緩衝液Ａ中の１０μｌ用量の５００μＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、その表面に膜貫通プリン作動性受容体を発現する注目するＲＢＬ−２Ｈ３細胞４６の細胞上に手動で直接的にピペットで乗せた。これらの受容体はＡＴＰに結合する場合、細胞内Ｇタンパク質連結シグナル変換カスケードは活性化され、これは細胞内ＰＫＣ活性化を生起することができる。最終的に、図３Ｂのように細胞を選択し、さらに処理しなかった後、または図３ＣにおけるようにＡＴＰで処理した後、溶解はＮｄ：ＹＡＧレーザー１８を手動で発射することによってトリガーされ、前記したように電気泳動を同時に開始した。
【００６５】
図３Ａ−Ｃにおける測定の結果
図３Ｂは、前記したようにマイクロインジェクションし、ＡＴＰでの処理を受けなかったＲＢＬ細胞４６の内容物の電気泳動図である。蛍光ピークの分布は図２Ｂで観察されたものと非常に似ている。Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１５４は、Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１５６よりも面積が６倍大きい。これは、リン酸化と比較して、６倍を超えるレポーター基質がリン酸化されていないことを示す。図２ＢにおけるようにＰＫＣを活性化する処理の非存在下では、ＰＫＣの正味の活性は低い。
【００６６】
図３Ｃは、同様にマイクロインジェクションされたが、引き続いて２用量のＡＴＰに暴露されたＲＢＬ細胞４６の内容物の電気泳動図である。該用量は、溶解に約２分先立って添加された最後の用量とは３分間離して投与した。図３Ｃは、ピーク１５８下で積分したＦｌ−ｓＰＫＣおよびピーク１４６下で積分したＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣのほとんど１：１の比率が、ＰＫＣの生理学的アクチベータであるＡＴＰでの細胞内処理に続いて細胞４６内で起こったことを示す。
【００６７】
図１１Ａ−Ｃにおける測定の技術的態様
図１１Ａは、各種Ｆｌ−ｓＰＫＣ、Ｆｌ−ｓＰＫＡおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの電気泳動移動度に対する参照と考えられる、緩衝液中の混合物からの非リン酸化およびイン・ビトロリン酸化レポーター基質分子の分離を示す電気泳動図のグラフである。この分析の時点においては、イン・ビトロリン酸化Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣは移動標準として用いるのに利用できなかった。図１１Ｂは、ＲＢＬ細胞４６の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフであり、ここに、酵素ＰＫＣおよびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は特異的に活性化されなかった。図１１ＣはＲＢＬ細胞４６のグラフであり、ここに、ＰＫＣは、細胞の細胞外ＰＭＡの処理の結果として活性化された。
【００６８】
図１１Ｂ−Ｃによって示される測定において、以下の化合物を緩衝液Ｂ中で混合した：１２０μＭのＦｌ−ｓＰＫＣ、ほぼ１００μＭのＦｌ−ｓＰＫＡ、および６５０μＭのＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。０．２秒間の８０ｈＰａの圧力にて、Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｎａｔｏｒ５１７１およびＴｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６システム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を備えたＦｅｍｔｏｔｉｐ１ガラスマイクロインジェクションニードル１１６（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ国）を通して、混合物を同一細胞チャンバー中のいくつかの細胞に室温（２０−２３℃）にてマイクロインジェクションした。細胞内濃度は１．２μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣ、１μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＡおよび６．５μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅであると見積もられる。細胞の選択および分析で用いられる同一の顕微鏡１２、すなわち、Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５（Ｚｅｉｓｓ）で注入を行った。首尾よくマイクロインジェクションされた細胞４６を、レポーター基質分子上のフルオレセイン部位の光破壊を最小化するためのＴＲＩＴＣフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）（示さず、しかし顕微鏡に含めた）の組を通じて内部Ｃａｌｕｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅエピ蛍光の肉眼での観察によって同定した。均一な蛍光の均質細胞質および平滑な原形質膜の存在によって判断して健康なように見える細胞のみを分析のために選択した。マイクロインジェクションした細胞の大部分はこの要件を欠き、これは、膜の欠損、点状の蛍光または過剰に明るい核を示した。
【００６９】
インジェクションに先立って図１１Ｃにおけるように細胞をＰＭＡで刺激すべき場合、細胞チャンバー１９９中の培養培地を、１０ｍＭグルコースを含有する緩衝液Ａ中の１μＭ  ＰＭＡの溶液によって置き換えた。細胞チャンバーを１０分間インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）に戻した。
【００７０】
全ての場合において、インキュベーターからの除去の直後に、細胞チャンバー１９９を顕微鏡ステージ３０上に設置し、細胞チャンバー中の溶液を、１０ｍＭグルコースを添加した室温の緩衝液Ａの連続的な流れおよび除去（２ｍｌ／分、ほぼ４の細胞チャンバー用量／分）によって置き換えた。流動はマイクロインジェクションおよび回収を通じて維持された。これは、典型的には、５−１５分続けた。流動は溶解の間に短く停止し、溶解およびキャピラリーローディングの後に１分内に再度開始し、電気泳動の間を通じて継続した。
【００７１】
図１１Ａ−Ｃにおける測定の結果
図１１Ｂは、ＲＢＬ細胞４６の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフであり、ここに酵素ＰＫＣおよびＰＫＡは特異的に活性化されなかった。特に、図１１Ｂは、細胞外ＰＭＡの非存在下で前記したようにマイクロインジェクションしたＲＢＬ細胞の内容物の電気泳動図である。図１１Ｂは、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＦｌ−ｓＰＫＡに対して移動時間で対応する大きなピークを示す。レポーター基質ペプチドのリン酸化形態Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣまたはＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＡとして積極的に同定できたピークはこの追跡では起こらなかった。マイクロインジェクションの時間から、細胞４６内では、測定可能な正味の細胞内ＰＫＣまたはＰＫＡ活性は起こらなかった。
【００７２】
図１１Ｃは、ＲＢＬ細胞４６の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフであり、ここに、酵素ＰＫＣは特異的にＰＭＡで活性化された。ＰＭＡは、ＰＫＡではなくＰＫＣの特異的アクチベーターをしてよく特徴付けられている。前記したように、この細胞はＰＭＡでの処理の後にマイクロインジェクションした。図１１Ｃは、Ｆｌ−ｓＰＫＣ、Ｆｌ−ｓＰＫＡ、およびＦｌ−ｓＰＫＣ、Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣのリン酸化形態にマッチする移動時間が中央のより小さなピークのクラスターに対して移動時間において対応する大きなピークを示す。図１１Ａにおける緩衝液中の混合物から分離された全ての３つの化学種は、図１１Ｃにおける小さな哺乳動物細胞の内容物から分離されて示される。Ｆｌ−ｓＰＫＡのリン酸化形態に対する移動標準はこの測定の時点で利用できなかったので、これらのピークのいずれがＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＡに対応するかは確かでない。前記したように、ＰＭＡでの刺激の非存在下では、匹敵する大きさにおいて９１０秒当たりが中心のクラスター中にピークは観察されない。小さいが測定可能な量のＰＫＣ活性化が図１１Ｃで分析した細胞内で起こった。
【００７３】
図１２における測定の技術的態様
図１２は、１００ｎＭ  ＰＭＡ、すなわち、ＰＫＣの潜在的かつ特異的薬理学的アクチベータでのネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞の細胞外処理に応答してのＰＫＣによるレポーター基質の細胞内リン酸化の進行を示す時間の関数としてのリン酸化の程度のグラフである。各点は、３以上の測定の平均を表し、誤差棒線は単一標準偏差を表す。
【００７４】
図１２に示される測定において、３００μＭのＦｌ−ｓＰＫＣおよび９００μＭのＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｎｅ，ＯＲ）を緩衝液Ｂ中で混合した。０．２秒間の８０ｈＰａの圧力にて、Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ５１７１およびＴｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６システム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を備えたＦｅｍｔｏｔｉｐ１ガラスマイクロインジェクションニードル１１６（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ国）を通じて、混合物を同一細胞チャンバー中のいくつかの細胞に室温（２０−２３℃）でマイクロインジェクションした。最終細胞内濃度は、Ｆｌ−ｓＰＫＣでは３μＭ、およびＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅでは９μＭであったと見積もられる。マイクロインジェクションに続き、１０ｍＭグルコースを添加した緩衝液Ａを連続的に流しつつ（２ｍｌ／分）、細胞４６を室温にて１０−１５分間、顕微鏡ステージ３０上で回収した。
【００７５】
ＰＫＣを刺激すべき場合、使用直前に、さらに１０ｍＭグルコースを含有する緩衝液Ａに、ＰＭＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のストック溶液から希釈した。手で保持したＰｉｐｅｔｍａｎ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｗｏｂｕｍ，ＭＡ）を手動で用いて、この溶液（ほぼ５００μｌ）を細胞チャンバー１９９内の溶液に変えて交換した。交換緩衝液の流動を停止した後、細胞チャンバー１９９を顕微鏡ステージ３０上に設置しつつ、これを行った。緩衝液の流動は、ＰＭＡ含有溶液でのインキュベーションの時間を通じて停止させた。ＰＭＡ刺激の間、Ｃａｌｕｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ  エピ蛍光の観察によって健康な細胞を選択した。適切な時点において、２．５分または５分後いずれかに、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー１８の遠隔トリガリングによって細胞を溶解させ、電気泳動の同時開始によってキャピラリー２２の流入口２６にローディングした。
【００７６】
Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク面積を、ソフトウェア分析パッケージＯｒｉｇｉｎ  ５．０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて測定した。
【００７７】
図１２における測定の結果
図１２は、ＰＭＡ、すなわちＰＫＣの潜在的かつ特異的アクチベータでのネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞の細胞外処理に応答してのＰＫＣによるレポーター基質の細胞内リン酸化のタイムコースを示す時間の関数としてのリン酸化の程度のグラフである。図１２は、室温（２０−２３℃）での１００ｎＭ  ＰＭＡへの暴露による活性化に応答してのＮＩＨ／３Ｔ３細胞における細胞内レポーター基質リン酸化のタイムコースを測定するように実行した多数の実験の定量的結果を示す。５０％リン酸化レベルへの５分の時点の近似した対応から、６＋／−２ｎＭ／ｓのＦｌ−ｓＰＫＣリン酸化の速度は、これらの条件下でＮＩＨ／３Ｔ３細胞内で起こると見積もられる。この速度にて、レーザー誘導細胞溶解および電気泳動分離の開始の間の保存的に見積もられた３３ｍ秒間隔で、レポーター基質ペプチドの０．００７％のみがリン酸化された。かくして、細胞の内容物が得られ分離される速度は、得るべき細胞内化学反応の例学的に正確なスナップショットを可能とする。図２は、さらに、第２の哺乳動物細胞型、すなわちＮＩＨ３Ｔ３細胞から、並びにＲＢＬ細胞から測定を成すことができることを示す。
【００７８】
第２の実施形態に特異な条件および結果
要約
図４Ａ−８Ｂによって示される第２の実施形態において、アフリカツメガエル卵母細胞４６’を注目する細胞として用いた。図４Ａ−６Ｂによって示されるＰＫＣ活性化の測定において、Ｆｌ−ｓＰＫＣを卵母細胞４６’にマイクロインジェクションした。次いで、卵母細胞４６’からの細胞質（〜２２ｐｌ）をキャピラリー２２にローディングし、電気泳動に付した。Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣを分離し、それらの蛍光から定量した。Ｆｌ−ｓＰＫＣに対するＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの比率はＰＫＣの相対的活性化、すなわち、ＰＫＣおよびホスファターゼの間の細胞内バランスを測定する。ホスファターゼはキナーゼによって触媒される反応の逆、すなわち、基質分子からのリン酸基の除去を触媒する。
【００７９】
図７は〜１μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣ、〜３３０ｎＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＡおよび〜１０ｎＭ  Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋを含有する、既にマイクロインジェクションされたアフリカツメガエル卵母細胞４６’の内容物の試料からの３つの異なる特異的キナーゼレポーター基質の分離を示す時間の関数としてのリン酸化のグラフである。Ｆｌ−ｓＰＫＡ、すなわちプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性に対する特異的レポーターは配列Ｆｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを有し、これはＣＲＥＢ蛋白質から得られた。Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋ、すなわちｃｄｃ２キナーゼ（細胞分裂周期突然変異体２（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔ２）として遺伝子的に元来同定された）に対する特異的レポーターは配列Ｆｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓを有し、いくつかの蛋白質に由来する共通リン酸化部位を含む。下線を施したセリン残基はリン酸化の部位である。ペプチドを合成し、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（１００−２００ｍｇ／ｍｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の混合された５−および６−異性体で標識した以外は、Ｆｌ−ｓＰＫＣについて記載したようにフルオレセインで標識した；かくして、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは２つの異性体形態よりなるものであった。ピーク１６２およびピーク１７２は、卵母細胞４６単独に注入した場合に観察されるそれらの移動時間によって同定した（示さず）。最初のダブレット、ピーク１６２および１６４はリン酸化または非リン酸化Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋいずれかの２つの異性体に対応する。第２のダブレット、ピーク１６６および１６８は、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの他の形態の２つの異性体に対応する。１つのピーク１７０は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣを表し、１つのピーク１７２は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＡを表す。
【００８０】
図７に示すように、複数のまたは混合物の異なるキナーゼ特異性のペプチドを卵母細胞４６’にローディングした場合、異なるペプチドの各々が検出できた。これは、単一卵母細胞４６’から、単一経路内または異なる経路において複数キナーゼの活性化を同時に定量でき、この技術を細胞シグナル変換カスケードを研究するための強力なツールとする。
【００８１】
用いた細胞
卵母細胞４６’は着色またはアルビノアフリカツメガエルから外科的に得られ、前記したように培養した。緩衝液Ｂ中の５０ｎｌのレポーター基質ペプチド（０．５−２００μＭ）を用いる低出力解剖顕微鏡（示さず）に設置したインジェクターによって卵母細胞４６’をマイクロインジェクションし、次いで、３０分間インキュベートして、卵母細胞４６を通ってペプチドを拡散させた。測定では、卵母細胞４６’を緩衝液Ｃ（９６ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＫＣＬ，１．８ｍＭ  Ｃａｃｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．６）中に入れた。ＬＰＡ（１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）を卵母細胞４６’に添加した場合、前記したように、無脂肪酸ウシ血清アルブミン（５％）をキャリアーとして用いた。
【００８２】
分離条件
卵母細胞４６’からの全ての試料が得られ、圧電サンプリング／高速翻訳／キャピラリー電気泳動（ｐｉｅｚｏｅ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓａｍｐｌｉｎｇ／ｒａｐｉｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＰＥＲＴ  ＣＥ）という方法によって電気泳動に付した。ＰＥＲＴ  ＣＥで用いられる装置を図８Ａ−Ｂに示す。図８ＡおよびＢは、単一アフリカツメガエル卵母細胞４６’からの細胞内酵素活性の測定をなすのに用いられる装置の構成要素の模式図である。図８Ａは、卵母細胞４６’および電気泳動緩衝液のための慣用的デザインのホルダー１３０を示す。該ホルダーは、卵母細胞細胞質を自動的にサンプリングし、次いで、基質分子のいずれかの実質的変化が起こり得る前にこの試料を電気泳動に迅速に付すための完全な装置の一部である。これは、高速翻訳システムに付着した鋭い電気泳動キャピラリー２２を供して、キャピラリーを細胞に押し込み、細胞質のプラグを捕獲することによって達成される。次いで、キャピラリーを卵母細胞から自動的に引き抜き、いずれかのさらなる化学反応が起こる前に「プラグ」内の基質分子の電気泳動が開始されるように、迅速に移動させて、電気泳動緩衝液の貯蔵器１３４と電気的に接触させる。好ましいデバイスにおいては、圧電要素はキャピラリーを上下（垂直軸）に移動させて試料をサンプリングし、他方、リニアモーターはキャピラリーを水平方向に迅速に移動させて、卵母細胞から貯蔵器１３２に移す。
【００８３】
図８Ａにおいて、矢印は、圧電要素ＰおよびリニアモーターＬＭによるキャピラリー２２の移動の軸を示す。卵母細胞４６’を含む貯蔵器１３２は生理学的に適合する緩衝液Ｃ（９６ｍＭ  Ｎａｃｌ，２ｍＭ  ＫＣｌ，１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．６）を含有し、他方、第２の貯蔵器１３４は電気泳動緩衝液を含有する。図８Ｂは、図９と同様な顕微鏡、キャピラリーおよび蛍光検出の模式図を示す。図８Ａのホルダー１３０は、直立顕微鏡１７６のステージ１７４の上、または解剖顕微鏡の下方に設置した。簡単のために、圧電要素およびリニアモーターは示さない。卵母細胞４６’は、テフロン（登録商標）またはポリカーボネート１８０のブロックにドリルで入れられた貯蔵器１３２中の「Ｖ」形状のウェルに入れる。貯蔵器１３２は生物学的に適合する緩衝液である緩衝液Ｃで満たした。分離キャピラリー２２（５０μｍ  Ｉ．Ｄ．，３６０μｍ  Ｏ．Ｄ．）の先端１８２を、フッ化水素酸での処理によって〜７０μｍの外径までエッチングした。キャピラリー先端１８２を圧電モーター要素（Ｐｉｅｚｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、示さず）のエッジに設置して、図８Ａ中の方向Ｐで示される先端１８２の制御された垂直運動を可能とした。圧電デバイスおよびキャピラリー２２を保持したマイクロマニピュレーター（示さず）をリニアモーター（示さず）に設置して、図８Ａ中で方向ＬＭによって示される制御された水平運動を可能とした。マイクロマニピュレーターを用い、キャピラリー２２のエッチングされた先端を卵母細胞の原形質膜の上方およびそれに隣接して置いた。
【００８４】
細胞質を得るために、圧電要素によって６０μｍを卵母細胞４６’に駆動した。この結果、キャピラリー２２の先端１８２がサンプリングした細胞質の「プラグ」で満たされた。次いで、キャピラリー２２を自動的に細胞質から引き抜いた。キャピラリー２２を卵母細胞４６’から引き抜いた直後に、リニアモーターによってキャピラリー２２を水平方向に移動させ（６ｃｍ／ｓの速度で１．２ｃｍ）、次いで、電気泳動緩衝液を含有する第２の貯蔵器１３４に圧電要素によって迅速に下降させた。この全手順はコンピューターで制御し、３５０ｍ秒内に達成された。リニアモーター（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｍｏｔｏｒ  Ｃｏ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）は、固体状態リレーボードおよびアナログ出力ボード（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ，Ｃｌｅｖｅｔａｎｄ，ＯＨ）（示さず）によって制御された。
【００８５】
卵母細胞細胞質からの電気泳動分離は、２つの区別される組の条件下で行った。図４Ａ−Ｄに示された測定において、特許中性コーティング（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を施したキャピラリーを用いた。図５および６Ａ−Ｂに示された測定において、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）被覆キャピラリーを用い、これは以下のように調製した。溶融シリカキャピラリー２２（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｅｎｉｘ，ＡＺ）を１Ｍ  ＮａＯＨまたはＫＯＨで３０分間連続的に洗浄し、続いて水で１５分間洗浄した。次いで、各キャピラリー２２にＰＥＩ（５％）を連続的に６０分間流し、あるいは各キャピラリー２２にＰＥＩ（５％）をローディングし、次いで、ＰＥＩローディングキャピラリーを６０分間インキュベートすることによって、キャピラリー２２を被覆した。ＰＥＩの溶液を窒素でキャピラリー２２から追い出した。各キャピラリー２２を水で１５分間リンスし、次いで、電気泳動緩衝液で１５分間リンスした。
【００８６】
図４Ａ−７に示された全ての電気泳動分離は、ミセル電気動態クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）の使用の例として最良に理解される。この用語は、洗剤ミセルを用いて再現性がある効果的な分離を促進する電気泳動緩衝液の使用をいう。これらの分離におけるミセルの使用は必要であることが証明されている。なぜならば、アフリカツメガエル卵母細胞細胞質は、特にかなり負に荷電した蛋白質フォスビチンの形態である比較的多量の両親媒性分子を含有するからである。電気泳動は５０−１００ｃｍ長さのキャピラリー２２（３６０μｍ外径、５０μｍ内径）で行った。電気泳動電圧は１０−１５ｋＶであった（電流、３０−６０ｐＡ）。電気泳動は緩衝液Ｂ（４５ｍＭ  ＮａＣｌ，１．６ｍＭ  ＫＣｌ，０．６  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  （ｐＨ７．４））または緩衝液Ｅ（６４５ｍｇ／ｍｌコール酸を含む緩衝液Ｄ）中で行った。電気泳動と電気泳動の間に、キャピラリー２２を電気泳動緩衝液で２５分間洗浄した。キャピラリー２２を通って移動する分析物バンドの蛍光を、前記したようにキャピラリー２２の流出口端部から１５−２５ｃｍの箇所で測定した。重力流体流動によって、ペプチド標準をキャピラリー２２にローディングし、ローディングされた用量はポアズイユの方程式から計算した。
【００８７】
検出
検出目的では、流入口先端１８２から５０ｃｍの位置において、５ｍｍ長さのポリイミドコーティングをキャピラリー２２の外側表面から除去した。ディスポーザブルブタンライターで軽く加熱することによってコーティングを除去し、引き続いて、７０％エタノール溶液で洗浄した。光学ウインドウ３８を通じて、（４８８ｎｍで動作する）アルゴンイオンレーザー（Ｕｎｉｐｈａｓｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の焦点を合わせたビームによってキャピラリー内腔を応答させた。集光レンズ（示さず）によって、キャピラリー２２およびレーザービームに直角に蛍光を収集し、５３３ＤＦ５６スペクトルフィルター（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）（示さず）を備えたＲ９２８光電子増倍管（ＰＭＴ）（Ｈａｍｍａｔｓｕ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）（示さず）で光を測定した。光電子増倍管電流を増幅し、プレアンプリファイアー（示さず、しかし検出器４２に含めた）で電圧に変換した。パーソナルコンピューター４４（Ｇａｔｅｗａｙ，Ｓｉｏｕｘ  Ｃｉｔｙ，ＳＤ）中のデータ収集ボード（ＤＡＳ−１８０２ＳＴ−ＤＡ  またはＤＡＳ−１８０２ＨＲ−ＤＡ，Ｋｅｉｔｈｌｙ  Ｍｅｔｒａｂｙｔｅ，Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ）によってシグナルをデジタル化した。Ｏｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用い、データをプロットし、ピーク面積を計算した。この配置の検出限界はほぼ１０−１９モル、約６０，０００分子であり、これは生理学的に関連する測定に対する検出限界をかなり下回る（表１参照）。
【００８８】
図４−Ｄにおける測定の技術的態様
図４Ａは、ピーク１８４における、緩衝液中のレポーター基質の非リン酸化形態の移動度を示す電気泳動図のグラフである。図４Ｂは、ピーク１８６における、緩衝液中のレポーター基質のリン酸化形態の移動度を示す電気泳動図のグラフである。図４Ａおよび４Ｂにおいて、重力流体流動によってレポーター基質標準をキャピラリー２２にローディングし、ポアズイユ方程式からローディングされた用量を計算した。図４Ｃおよび４Ｄで示される測定において、前記したように、個々の卵母細胞４６’を５０ｎｌの２００μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣでマイクロインジェクションし、緩衝液Ｃ中で３０分間インキュベートして、レポーター基質を拡散させた。レポーター基質の見積もられた最終細胞内濃度は〜１０μＭであった。分離は、ＰＥＲＴ  ＣＥサンプリング、続いての、特許中性内部コーティング（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を備えたキャピラリーを通す緩衝液ＥでのＭＥＫＣで達成された。測定において、卵母細胞４６’を含有する貯蔵器１３２を緩衝液Ｃで満たし、他方、キャピラリー２２、電気泳動用の流入口として働く第２の貯蔵器１３４および流出貯蔵器３４は緩衝液Ｅを含有した。
【００８９】
図４Ａ−Ｄにおける測定の結果
図４Ｃは、〜１０μＭレポーター基質を含有する、既にマイクロインジェクションされたアフリカツメガエル卵母細胞の内容物の試料の分離を示す電気泳動図のグラフである。この場合、卵母細胞４６’を処理して細胞内ＰＫＣを活性化させなかった。図４Ｃは、細胞外刺激剤で処理しなかった卵母細胞４６’からの細胞質の試料の電気泳動図である。緩衝液からローディングされたＦｌ−ｓＰＫＣの電気泳動図である、図４Ａのピーク１８４に対して参照することによってわかるように、実質的に全ての収集されたピーク１８８における蛍光は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応した。
【００９０】
図４Ｄは、〜１０μｍレポーター基質を含有する、既にマイクロインジェクションされたアフリカツメガエル卵母細胞の内容物の試料の分離を示す電気泳動図のグラフである。この場合、卵母細胞４６’は、特異的に細胞内ＰＫＣを活性化させるサンプリングに先立って、１０μＭ  ＰＭＡで細胞外にて１０分間処理した。図４Ｄは、１０μＭ  ＰＭＡに１０分間暴露された卵母細胞４６’からの試料の電気泳動図である。この場合、緩衝液からローディングされたＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの電気泳動図である、図４Ｂのピーク１８６に対して参照することによってわかるように、実質的に全ての収集されたピーク１９０における蛍光はＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応した。
【００９１】
これらの結果は、潜在的薬理学的刺激剤ＰＭＡに応答してのＰＫＣの正味の活性化を単一アフリカツメガエル卵母細胞から測定することができることを示す。さらに、これは、刺激の非存在下で、正味のＰＫＣ活性が卵母細胞で比較的低いことを示す。
【００９２】
図５および６Ａ、６Ｂにおける測定の技術的態様
図５は、〜１０μＭレポーター基質を含有する、既にマイクロインジェクションされたアフリカツメガエル卵母細胞４６’の内容物の試料の分離を示す時間の関数としての蛍光のグラフである。この場合、サンプリングに先立って卵母細胞４６’を１０μＭ  ＰＭＡで３分間処理して、細胞内ＰＫＣを特異的に活性化させた。レポーター基質の非リン酸化およびリン酸化形態の双方が存在し、これは、基質の代謝回転が３分後に不完全であることを示す。
【００９３】
図６Ａは、１０μＭ  ＰＭＡ、ＰＫＣの潜在的薬理学的特異的アクチベーターでのアフリカツメガエル卵母細胞の細胞内処理に応答してのＰＫＣによるレポーター基質の細胞内リン酸化のタイムコースを示す時間関数としてのリン酸化のグラフである。各点は３以上の測定の平均を表し、誤差棒線は単一標準偏差を表す。
【００９４】
図６Ｂは、１０μＭ  ＬＰＡ（１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフェート、Ａｖａｎｔｉ  Ｂｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、ＰＫＣの生理学的アクチベーターでのアフリカツメガエル卵母細胞の細胞内処理に応答してのＰＫＣによるレポーター基質の細胞内リン酸化のタイムコースを示す時間関数としてのリン酸化のグラフである。各点は３以上の測定の平均を表し、誤差棒線は単一標準偏差を表す。
【００９５】
図５−７で示される測定において、前記したように、個々の卵母細胞４６’を５０ｎｌの２００μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣでマイクロインジェクションし、緩衝液Ｃ中で３０分間インキュベートして、レポーター基質を拡散させた。レポーター基質の見積もられた最終細胞内濃度はほぼ１０μＭであった。分離は、ＰＥＲＴ  ＣＥサンプリング、続いてのＰＥＩの内部コーティングを有するキャピラリーを通じての緩衝液ＤでのＭＥＫＣで達成された。測定において、卵母細胞４６’を含有する貯蔵器を緩衝液Ｃで満たし、他方、キャピラリー２２、電気泳動用の流入口として働く第２の貯蔵器１３４、および流入口貯蔵器３４は緩衝液Ｄを含有した。
【００９６】
図５および６Ａ、６Ｂにおける測定の結果
図５は、１０μＭ  ＰＭＡに３分間暴露した卵母細胞４６’からの細胞質の試料の電気泳動図である。２つの蛍光ピークである、Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１９２およびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１９４が起こる。これは、レポーター基質リン酸化の中間段階が刺激された卵母細胞から測定できることを示す。
【００９７】
図６Ａは、ＰＫＣの潜在的薬理学的特異的アクチベーターでのアフリカツメガエル卵母細胞の細胞内処理に応答してのＰＫＣによるレポーター基質の細胞内リン酸化のタイムコースを示す時間関数としてのリン酸化のグラフである。図６Ａは、１０μＭ  ＰＭＡへの暴露による活性化に応答しての、卵母細胞４６’における細胞内レポーター基質リン酸化のタイムコースを決定するようになされた多数の実験の定量的結果を示す。
【００９８】
図６Ｂは、ＰＫＣの生理学的アクチベーターでのアフリカツメガエル卵母細胞の細胞内処理に応答してのＰＫＣによるレポーター基質の細胞内リン酸化のタイムコースを示す時間関数としてのリン酸化のグラフである。図６Ｂは、１０μＭ  ＬＰＡへの暴露による活性化に応答しての、卵母細胞４６’における細胞内レポーター基質リン酸化のタイムコースを決定するようになされた多数の測定の定量的結果を示す。中間的時点から、各々、ＰＭＡおよびＬＰＡへの暴露の後に、平均して、図６Ａにおける地点１９６で示される２５±１５ｎＭ／ｓおよび図６Ｂにおける地点１９８で示される４３±１５ｎＭ／ｓの速度でＦｌ−ｓＰＫＣは卵母細胞４６’内でリン酸化された。これらの速度において、ペプチドの〜０．１％のみが、細胞質サンプリングの開始および電気泳動の間の３５０ｍ秒間隔でリン酸化されていた。
【００９９】
図７における測定の技術的態様
図７は、既にマイクロインジェクションされたアフリカツメガエル卵母細胞の内容物の試料からの３つの異なる特異的キナーゼレポーター基質の分離を示す電気泳動図である。図７に示された測定において、個々の卵母細胞４６’に５０ｎｌのレポーター基質ペプチドの混合物をマイクロインジェクションした。混合物は、緩衝液Ｂ中の２０μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣ、７μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＡおよび５００ｎＭ  Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋよりなるものであった。Ｆｌ−ｓＰＫＡ、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性についての特異的レポーターは配列Ｆｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを有し、これはＣＲＥＢ蛋白質から得られた。Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋ、（細胞分裂周期突然変異体２（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ２）として遺伝子的に元来は同定された）ｃｄｃ２キナーゼについての特異的レポーターは配列Ｆｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓを有し、これはいくつかの蛋白質に由来する共通リン酸化部位を含む。下線を施したセリン残基はリン酸化の部位である。ペプチドを合成し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（１００−２００  ｍｇ／ｍｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の混合された５−および６−異性体でＦｌ−ｓｃｄｃ２Ｋを標識する以外は、Ｆｌ−ｓＰＫＣについて記載したようにフルオレセインで標識した；かくして、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは２つの異性体形態よりなるものであった。各卵母細胞４６’を緩衝液Ｃ中で３０分間インキュベートしてレポーター基質を拡散させた。レポーター基質の見積もられた最終細胞内濃度は〜１μＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＣ、  〜３３０  ｎＭ  Ｆｌ−ｓＰＫＡ，および〜１０ｎＭ  Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋであった。分離は、ＰＥＲＴ  ＣＥサンプリング、続いてのＰＥＩの内部コーティングを有するキャピラリーを通じての緩衝液ＤでのＭＥＫＣで達成された。測定において、卵母細胞４６’を含有する貯蔵器を緩衝液Ｃで満たし、他方、キャピラリー２２、第２の貯蔵器１３４、および流出口貯蔵器３４は緩衝液Ｄを含有した。
【０１００】
図７における測定の結果
図７は、アフリカツメガエル卵母細胞の内容物の試料からの３つの異なる特異的キナーゼレポーター基質の分離を示す。卵母細胞４６’に単独で注入した場合に観察されたその移動時間によって、ピークを同定した（示さず）。最初のダブレット、ピーク１６２および１６４は非リン酸化Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの２つの異性体形態に対応する。第２のダブレット、ピーク１６６および１６８はリン酸化Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの２つの異性体形態に対応する。ピーク１７０は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣであり、ピーク１７２は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＡである。この測定は、複数キナーゼの正味の活性が単一卵母細胞４６’から測定できることを示す。さらに、絶妙な程度の分離は、この場合は、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２ＫおよびＰ−Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの異性体形態の観察可能な分離によって証明されるように、ＭＥＫＣによって達成される。最後に、この測定は、実質的程度のｃｄｃ２Ｋ活性が未刺激卵母細胞４６’に存在し、他方、ＰＫＣおよびＰＫＡが比較的不活性なままであることを示す。
【０１０１】
本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者は多くの改変および修飾をなすことができる。従って、例示された実施形態は例示目的のためだけに記載し、これらは前記特許請求の範囲によって規定される発明を限定するものではないと解釈されるべきであることは理解されなればならない。
【０１０２】
本発明およびその種々の実施形態を記載するために本明細書中で用いた用語は、その通常に規定される意義の意味におけるのみならず、本明細書中での特別の定義には、通常に規定される意味の範囲を超えた構造、材料または動作を含むことが理解されるべきである。かくして、もし要素が、１を超える意味を含むと本明細書の文脈で理解できれば、特許請求の範囲中のその使用は、明細書によって、および用語それ自体によって裏付けられるすべての可能な意味につき総括的であると理解されなければならない。
【０１０３】
従って、前記特許請求の範囲の用語または要素の定義は、文言中記載された要素の組合せのみならず、同一の結果を実質的に得るために実質的に同一の方法で実質的に同一の機能を実行するための全ての同等の構造、材料または動作を含むように本明細書中では定義される。この意味で、従って、２以上の要素の同等の置換が、前記特許請求の範囲における要素のいずれか１つに変えてなすことができ、単一の要素を特許請求の範囲中の２以上の要素に変えて置換できると考えられる。
【０１０４】
知られていないかまたは後に工夫された、当業者によって考えられる特許請求された主題からの実質的でない変形は、特許請求の範囲に等しくあると明示的に考えられる。従って、現在または後に当業者に知られた明白な置換は、規定された要素の範囲内にあると定義される。
【０１０５】
かくして、特許請求の範囲は、具体的に説明され、前記されたもの、概念的に同等であるもの、明白に置き換えることができるもの、および本発明の本質的考えに実質的に一体化されるものを含むと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜図１Ｈは、本発明による細胞内キナーゼの測定を示す、各段階での概略図である。示された分子種を同定するための凡例が図１Ａに含まれる。
図１Ａは、細胞が不活性なキナーゼ分子を含有する場合の、測定前の可能な状態にある細胞の概略図である。
図１Ｂは、レポーター基質分子が導入された後における図１Ａの細胞の概略図である。
図１Ｃは、細胞内キナーゼの活性化をもたらす刺激剤による細胞外処理を行っている間の図１Ｂの細胞の概略図である。
図１Ｄは、活性なキナーゼ分子によって触媒されるレポーター基質のリン酸化の概略図である。
図１Ｅは、ある程度のレポーター基質がリン酸化された後における、図１Ｃの細胞の概略図である。
図１Ｆは、図１Ｇにおける分析のための内容物を得るためにその原形質膜が破壊された後の図１Ｅの細胞である。
図１Ｇは、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による非リン酸化基質分子およびリン酸化基質分子の分離を表す。
図１Ｈは、非リン酸化レポーター基質分子の集団が、リン酸化レポーター基質分子の集団から分離されている典型的な電気泳動図を示す。
【図２】
図２Ａ〜図２Ｃは、すべてが同じ日に同一の電気泳動条件のもとで行われたレポーター基質分子の分離を３つ重ねた電気泳動図のグラフである。
図２Ａは、緩衝液溶液における混合物からの非リン酸化レポーター基質分子およびインビトロのリン酸化レポーター基質分子の分離を示す電気泳動図のグラフであり、両化学種の電気泳動移動度の参照として見られる。
図２Ｂは、マイクロインジェクションされ、そしてタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が特異的に活性化されなかった１個のラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞（腫瘍細胞）の内容物の電気泳動図のグラフである（図３Ｂは、類似する処置を示す）。
図２Ｃは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が特異的に活性化された１個のＲＢＬ細胞の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。
【図３】
図３Ａ〜図３Ｃは、すべてが同じ日に同一の電気泳動条件のもとで行われたレポーター基質分子の分離を３つ重ねた電気泳動図のグラフである。
図３Ａは、緩衝液溶液における混合物からの非リン酸化レポーター基質分子およびインビトロのリン酸化レポーター基質分子の分離を示す電気泳動図のグラフであ、両化学種の電気泳動移動度の参照が確立される。
図３Ｂは、ＰＫＣが活性化されなかった１個のラット好塩基球性白血病細胞の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。
図３Ｃは、ＰＫＣが特異的に活性化された１個のＲＢＬ細胞の内容物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。
【図４】
図４Ａ〜図４Ｄは、すべてが同じ日に同一の電気泳動条件のもとで行われたレポーター基質分子の分離を示す４つの電気泳動図を重ねたグラフである（電気泳動条件は、図２Ａ〜図２Ｃおよび図３Ａ〜図３Ｃで使用された条件とは異なる）。
図４Ａは、緩衝液におけるレポーター基質の非リン酸化形態の移動度を示す電気泳動図のグラフである。
図４Ｂは、緩衝液におけるレポーター基質のリン酸化形態の移動度を示す電気泳動図のグラフである。
図４Ｃは、レポーター基質を含有させるために該マイクロインジェクションされた１個のアフリカツメガエル卵母細胞の内容物のサンプルの分離を示す電気泳動図のグラフである。
図４Ｄは、レポーター基質を含有させるために該マイクロインジェクションされ、かつ特異的に活性化された１個のアフリカツメガエル卵母細胞の内容物のサンプルの分離を示す電気泳動図のグラフである。
【図５】
図５は、レポーター基質を含有させるために該マイクロインジェクションされた１個のアフリカツメガエル卵母細胞の内容物のサンプルの分離を示す電気泳動図である。卵母細胞は、中程度の活性化を示すように処理された。
【図６】
図６Ａは、時間を関数とするリン酸化のグラフであり、強力な薬理学的に特異的な活性化剤による細胞外処理に応答したレポーター基質の細胞内リン酸化を示す。
図６Ｂは、時間を関数とするリン酸化割合のグラフであり、生理学的活性化剤によるアフリカツメガエル卵母細胞の細胞外処理に応答したレポーター基質の細胞内リン酸化の経時変化を示す。
【図７】
図７は、該マイクロインジェクションされた１個のアフリカツメガエル卵母細胞の内容物のサンプルからの３つの異なる特異的なキナーゼレポーター基質の分離を示す電気泳動図である。
【図８】
図８Ａおよび図８Ｂは、細胞内の酵素活性を測定するために使用された装置の構成要素の概略図である。
図８Ａは、卵母細胞（または類似する細胞）を保持し、サンプリングし、そしてサンプルを電気泳動に迅速に供するための装置の略図である。
図８Ｂは、図８Ａの装置を用いる、顕微鏡、キャピラリーおよび蛍光検出の構成図である。
【図９】
図９は、例示された実施形態において使用された迅速な溶解装置の概略図である。
【図１０】
図１０は、例示された実施形態における迅速な溶解装置と一緒に使用された、哺乳動物細胞および電気泳動緩衝液を保持する細胞チャンバーの概略図である。
【図１１】
図１１Ａ〜図１１Ｃは、すべてが同じ日に同一の電気泳動条件のもとで行われたレポーター基質分子の分離の３つの電気泳動図を重ねたグラフである。
図１１Ａは、レポーター分子のすべての化学種の電気泳動移動度の基準としての、緩衝液溶液における混合物からの非リン酸化レポーター基質分子およびインビトロのリン酸化レポーター基質分子の分離を示す電気泳動図のグラフである。
図１１Ｂは、ＰＫＣが特異的に活性化されなかった１個のＲＢＬ細胞の内容物の電気泳動図のグラフである。
図１１Ｃは、ＰＫＣが特異的に活性化された１個のＲＢＬ細胞の内容物の電気泳動図のグラフである。
【図１２】
図１２は、時間を関数とするリン酸化の割合のグラフであり、ＰＫＣの強力な薬理学的に特異的な活性化剤による細胞外処理に応答した、個々のネズミ繊維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるレポーター基質の細胞内リン酸化を示す。