(57)【要約】本発明は、非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供することを目的とする。本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有する。好ましくは、前記塩基の５位が、以下の  １）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；  ２）アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；  ３）ビオチン又はその誘導体；あるいは  ４）フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子からなるグループから選択される置換基によって置換されている。
2004007713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項２】
前記塩基の５位が、以下の
１）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；
２）アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；
３）ビオチン又はその誘導体；あるいは
４）フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子
からなるグループから選択される置換基によって置換されている、請求項１に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項３】
前記塩基の５位が、１）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基、、２）アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体、又は３）ビオチン又はその誘導体で置換されている、請求項１又は２に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項４】
前記塩基の５位がヨウ素又はビオチン誘導体で置換されている、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヌクレオチドと、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基が２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（ジメチルアミノ）プリン−９−イル基である、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして使用される、請求項５に記載の核酸。
【請求項９】
タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードする、請求項５に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸を調製する方法であって、
６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、前記６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヌクレオチドを組み込むことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用に関する。
【背景技術】  生体高分子である核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か４種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼにより自己複製し、さらにＲＮＡポリメラーゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、ＤＮＡからＤＮＡへ、ＤＮＡからＲＮＡへ、ＲＮＡからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成（Ａ・Ｔ／Ｕ、Ｇ・Ｃ）のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によって、アプタマーやリボザイムの機能を有する新規核酸がこれまでに多数見つかってきたこともその一つである。
しかし、２０種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には４種類の塩基（２種類の塩基対）しかないという事実は、核酸の化学的・物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中のｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の機能性ＲＮＡは自分自身の構造を安定化したりＲＮＡ・ＲＮＡ間、ＲＮＡ・タンパク質問相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基（対）のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。
核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基（もしくは非天然型塩基）を導入する手法として、１）化学合成により直接導入する方法、２）核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。１）の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。２）の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅・調製が可能となるが、そのような基質や塩基対（非天然型ヌクレオチド）も未だ開発途中である。
非天然型人工塩基対の背景
天然の二本鎖ＤＮＡ中のＡとＴおよびＧとＣは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している（図１ａ）。Ｂｅｎｎｅｒのグループはこの水素結合の様式に着目し、天然型塩基対の水素結合の組み合わせとは異なる新たな塩基対をデザインした。中でもｉｓｏＧ・ｉｓｏＣおよびк・Ｘ塩基対（図１ｂ）は、いろいろな核酸合成酵素によるＤＮＡ、ＲＮＡ分子中への取り込みについての解析が報告されている［Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３］。
しかしながら、１）ｉｓｏＧは１位と２位の間でケト・エノールの互変異性をおこすため、Ｔとも塩基対を形成してしまうこと、２）最近の核酸合成酵素のＸ線結晶構造解析から核酸合成酵素との相互作用に重要である２位のケト基がｉｓｏＣやＫではアミノ基となっているため、核酸合成酵素の種類によっては基質として認識されないこと、３）ｉｓｏＣのヌクレオシド誘導体が化学的に不安定であること等の問題があり、これらの非天然型塩基対は現在ではほとんど使われていない。
一方、塩基の疎水性に着目して、水素結合をなくした疎水性塩基対がアメリカのグループから新たにデザインされた。まずＫｏｏｌらのグループは、水素結合のドナーやアクセプターとなる原子および官能基を含まないアデニン誘導体とチミン誘導体をそれぞれ合成し、ＤＮＡへの取り込みを調べた。アデニン誘導体に相当するのが、４−メチルベンズイミダゾール（Ｚ）あるいは９−メチル−１−Ｈイミダゾ［（４，５）−ｂ］ピリジン（Ｑ）であり、チミン誘導体に相当するのが、２，４−ジフルオロトルエン（Ｆ）である（図１ｃ）。これらの疎水性塩基対は対合する塩基間で水素結合をもたないが、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントにより相補的にＤＮＡ中に取り込まれ、またＡ・Ｆ、Ｑ・Ｔ、Ｚ・Ｔといった塩基対もそれぞれ相補的に取り込まれることが示された［Ｍｏｒａｌｅｓ  ＆  Ｋｏｏｌ，１９９９］。
その後、ＲｏｍｅｓｂｅｒｇとＳｃｈｕｌｔｚらのグループは、疎水性の塩基対を数多く合成し、それらの塩基対のＤＮＡ中への取り込みを網羅的に調べた。彼らの結果は疎水性の塩基同士が効率よく対合することを示しており、その一つの例がピロロピリジン（ＰＰ）とＣ３−メチルイソカルボステリル（ＭＩＣＳ）の塩基対である（図１ｄ）［Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００］。しかしながら、疎水性塩基はシェイプフィッティングとは関係なく対合する性質があり、ＰＰ同士やＭＩＣＳ同士の組み合わせでも効率よくＤＮＡ中に取り込まれてしまうという問題点がある。そして、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いた場合、シェイプフィッティングしていないこのような組み合わせの塩基を取り込んだ後では伸長反応がほとんど進行しない。
最近、７−アザインドール（７ＡＩ）同士の自己相補塩基対（図１ｄ）は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントと真核細胞由来のＤＮＡポリメラーゼβを組み合わせて用いると伸長反応が進行することが示されたが［Ｔａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１］、現段階ではこの方法も実用化には至っていない。
さらに、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出の研究が行われている。例えば、Ｏｈｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＨｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２では、プリンの６位にかさ高い置換基を導入した２−アミノ−６−ジメチルアミノプリン（ｘ）と２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもったピリジン２−オン（ｙ）をデザインし、このｘ・ｙ、ｓ・ｙ塩基対形成をＫｌｅｎｏｗフラグメントによるＤＮＡ中への取り込み効率により調べている（図２）。その結果、鋳型中のｘに対するｙの取り込みは低い選択性しか示さなかったが、ｓに対するｙの取り込みは、比較的選択性も効率も良いことが示されている。
上記ｓ−ｙ塩基対の開発によって、ＲＮＡ中に選択的にｙを導入することが可能になったので、ｙに機能性の置換基が結合した物質が得られれば、アプタマーやリボザイム等の新規機能性分子が創製可能になる。したがって、そのようなｙの誘導体の創製が希望されている。
【発明の開示】
本発明は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供することを目的とする。
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、好ましくは前記塩基の５位が、以下の
１）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；
２）アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；
３）ビオチン又はその誘導体；あるいは
４）フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子
からなるグループから選択される置換基によって置換されている。５位の置換基は、最も好ましくはヨウ素又はビオチン誘導体である。
本発明はまた、前記ヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸は一態様において、前記ヌクレオチドと、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している。
本発明はさらにまた、前記ヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、
６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、前記６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、前記５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む。
本発明はさらに、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸が、前記５位の置換基を介して共有結合している、核酸と１またはそれより多くの他分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体分子がより好ましくは例示される）との多量体を提供することを目的とする。
本発明はまた、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を近接させて、前記５位の置換基を介して前記ＤＮＡ同士、ＲＮＡ同士、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／タンパク質又はＲＮＡ／タンパク質を共有結合させる、ことを含む、前記核酸と他分子（より好ましくは生体分子）との多量体の形成方法を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】  図１は、既知の天然型塩基対と人工塩基対を示す。ａ）ワトソン・クリック塩基対。ｂ）Ｂｅｎｎｅｒらによって報告された水素結合様式を変えた塩基対。ｃ）Ｋｏｏｌらによって報告された水素結合を持たない塩基対。ｄ）ＲｏｍｅｓｂｅｒｇとＳｃｈｕｌｔｚらによって報告された疎水性塩基対。Ｒはｓｕｇａｒを示す。
図２は、水素結合様式の違いと立体障害（シェイプフィッティング）の概念をもとにデザインされた人工塩基対を示す。ａ）２−アミノ−６−ジメチルアミノプリン（ｘ）とピリジン−２−オン（ｙ）の塩基対。ｂ）ｘと天然型ピリミジン塩基との塩基対。ｃ）２−アミノ−６−チェニルプリン（ｓ）とｙの塩基対。ｄ）ｓと天然型ピリミジン塩基との塩基対。
図３は、本発明の化合物、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステル及び３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−（２−フェニルエチニル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステルの合成スキームを示す。
図４は、本発明の化合物、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステル（５ＩｙＴＰ）の構造及びＵＶ吸収を示す。
ａ）  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステル（５ＩｙＴＰ）。
ｂ）  １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中での５ＩｙＴＰのＵＶ吸収。λｍａｘ＝３１８ｎｍ。
図５は、ＲＮＡ  ９Ａに５Ｉｙを位置選択的導入するための鋳型ＤＮＡを調製する際に用いたプライマー（ａ）とＲＮＡ  ９Ａの配列（ｂ）を示す。（ａ）において、非天然型塩基ｓを含む箇所はｓで示した。（ｂ）において、ＲＮＡ  ９Ａ中の５Ｉｙに導入する配列部分を下線で示した。
図６は、ＲＮＡ  ９Ａへの５Ｉｙの位置選択的導入を示す。
ａ）０．２５ｍＭの５Ｉｙが存在下（＋）もしくは非存在下（−）で転写反応を行い、その反応産物を電気泳動した場合のオートラジオグラム。５Ｉｙが導入される位置および全長の位置を左横に示した。
ｂ）ＲＮＡ  ９Ａの二次構造上に、５Ｉｙが導入される箇所を黒丸で示した。
図７は、転写反応産物の塩基組成分析を示す。０．２５ｍＭ  ５Ｉｙの存在下（ｃ−ｅ，ｈ−ｊ）もしくは非存在下（ｂ，ｇ）で転写された反応産物（全長；図６参照）をＲＮａｓｅ  Ｔ２で完全分解した後、２Ｄ−ＴＬＣで解析した。それぞれの塩基に相当するスポットの位置をａ）、ｆ）に示した。ｂ−ｅ）［α−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて標識した場合。ｇ−ｊ）［α−３２Ｐ］ＧＴＰを用いて標識した場合。それぞれのスポットを定量した結果は、表１に示した。
図８は、５Ｉｙを位置選択的に含むＲＮＡの架橋反応を示す。各ＲＮＡとＧＳＴ−ＲＢＤを混合して３７℃で３０分間インキュベートした後、氷上でＵＶトランスイルミネーターを用いて、ＵＶ（３１２ｎｍ）を１時間照射した。そのサンプルを電気泳動した場合のオートラジオグラム。ＲＮＡ  ９Ａ（５Ｉｙ８４）、９Ａ（５Ｉｙ８７）、９Ａ（５Ｉｙ９２）、９Ａ（５Ｉｙ８４／９２）は、塩基が８４、８７、９２、８４と９２の位置に５Ｉｙが導入されたＲＮＡ。９Ａ（５Ｉｙ）、９Ａ（５ＩＵ）については、表２参照。ＵＶ照射により生じた架橋反応産物のバンドの位置を左横に示した。
図９は、ＲＮＡ  ９Ａ（５Ｉｙ８４）と９Ａ（５Ｉｙ８７）の架橋反応を示す。各ＲＮＡをＧＳＴ−ＲＢＤの存在下（レーン２−４，６−８）もしくは非存在下（レーン１，５）でＵＶを照射した。照射後にプロテナーゼ  Ｋ処理（ＰＫ）もしくはフェノール・クロロホルム抽出（ｐｈｅｎｏｌ）によりタンパク質を除去したが、架橋反応産物のバンドに変化はなかった（レーン３，４，７，８）。
図１０は、ＲＮＡ（５Ｉｙ８７）の架橋反応産物ＸＬは９Ａが二量化したもので、２分子のＧＳＴ−ＲＢＤと結合することを示す。ａ−ｄ）各ＲＮＡとＧＳＴ−ＲＢＤとの結合をゲルシフトアッセイにより解析した。ｃ）各ＲＮＡ（ａ−ｄ）の配列を示した。ＲＮＡ  ９Ａの配列と異なる部分を太字・下線で示した。
図１１は、Ｒａｆ−１  ＲＢＤに結合するＲＮＡアプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクションの概略を示す。タンパク質がニトロセルロースフィルターに吸着することを利用したフィルター結合法によるセレクションを用いた。ランダム配列を含んだＲＮＡプールからＲａｆ−１  ＲＢＤに結合したＲＮＡを選別し、ＲＴ−ＰＣＲと転写反応により次のラウンドのＲＮＡプールが増幅される。この一連の操作を繰り返すことで、Ｒａｆ−１  ＲＢＤに結合するＲＮＡ分子が濃縮される。
図１２は、各ＲＮＡアプタマーのタンパク質への結合曲線を示す。各ＲＮＡアプタマー（２ｎＭ）が種々の濃度のタンパク質へ結合する効率（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ％）をフィルター結合法により求めてプロットした。
ＲＮＡ  ９ＡのＲａｆ−１  ＧＳＴ−ＲＢＤへの結合：  黒丸
ＲＮＡ  ９ＡのＢ−Ｒａｆ  ＧＳＴ−ＲＢＤへの結合：  白丸
ＲＮＡ  ９ＡのＲＧＬ  ＧＳＴ−ＲＢＤへの結合：  ×
ＲＮＡ  ９ＢのＲａｆ−１  ＧＳＴ−ＲＢＤへの結合：  黒四角
ＲＮＡ  ２１．０１のＲａｆ−１  ＧＳＴ−ＲＢＤへの結合：  黒三角
図１３は、  ＲＮＡ  ９Ａの二次構造を示す。ＲＮａｓｅによる限定分解と化学修飾を用いて、ＲＮＡ  ９Ａの二次構造を予測した。固定領域を小文字で、ランダム領域を大文字で示した。ＲＮａｓｅによる切断パターンとアルキル化剤（ＤＭＳとＣＭＣＴ）による修飾パターンを二次構造上にそれぞれマッピングした。Ｒａｆ−１  ＧＳＴ−ＲＢＤの存在下、化学修飾がフットプリントされた配列部分を白丸で示した。
図１４は、ビオチン−アビジンの相互作用を利用したＲＮＡの固定化法を示す。図の左側は従来技術の説明であり、ビオチンを結合したＤＮＡをアビジン化担体に結合し、これにＲＮＡをハイブリダイズさせる方法（従来法１）、並びに、ビオチンを５位に結合したウリジンを転写によりＲＮＡ中にランダムに導入し、これをアビジン化担体に結合させる方法（図１４、従来法２）を図示したものである。図の右側は、ビオチンを結合した第５番目の塩基を、人工塩基対を介して、転写によりＲＮＡ中の特定部位に導入させる、本発明の方法を図示したものである。
図１５は、エチレン型リンカーを介してビオチンを結合させた本発明のｙ誘導体の合成を示す。
図１６は、エチレン型リンカーを介してビオチンを結合させた本発明のｙの誘導体の三リン酸化を示す。
図１７は、アセチレン型リンカーを介してビオチンを結合させた本発明のｙ誘導体の合成を示す。
図１８は、アセチレン型リンカーを介してビオチンを結合させた本発明のｙの誘導体の三リン酸化を示す。
図１９は、ＲＮＡへのＢｉｏ−ｙＴＰ（化合物６）およびＢｉｏ２−ｙＴＰ（化合物１３）の位置選択的導入を示す。１ｍＭ  Ｂｉｏ−ｙＴＰ又はＢｉｏ２−ｙＴＰの存在下（＋）、若しくは非存在下（−）で転写反応を行い、その反応産物を電気泳動した場合のオートラジオグラムを示した。Ｂｉｏ−ｙＴＰ又はＢｉｏ２−ｙＴＰが導入された場合の産物の長さを右横に、導入されていない場合の産物の長さを左横に、それぞれ矢印で示した。
【発明を実施するための最良の形態】  非天然型塩基対ｓ・ｙを利用した場合には間違ったＵの取り込みは無視できるほどの選択性を示し、ｍＲＮＡ中の特定の位置にｙを導入して、ｓ・ｙ塩基対を新たなコドン・アンチコドン相互作用に利用できることが示された［Ｈｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２］。本発明者らは、５位に置換基をもつｙ誘導体をＲＮＡ中に位置選択的に導入し、新たな機能をもつＲＮＡの創製取り組み、本発明を想到した。
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド
本発明は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明の５位置換ピリジン塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、ピリジン塩基の１，２又は６位に置換基を導入したヌクレオシド又はヌクレオチドと比較して、塩基間の不要な干渉（塩基対形成時の立体障害や不要な結合形成）が起こりにくいという利点を有する。
本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基に相当する塩基や、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基に相当する塩基、などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、１ないし３リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２’位に有する２’−置換リボフラノシルであってもよく、また、リン酸部分は、チオリン酸であってもよい。つまり、糖部分およびリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはＲＮＡの構成成分となり、デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはＤＮＡの構成成分となる。
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、好ましくは前記塩基の５位が、以下の
１）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；
２）アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；
３）ビオチン又はその誘導体；あるいは
４）フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子
からなるグループから選択される置換基によって置換されている。
１）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基は、光照射することによりラジカルを発生させ、隣接する分子を共有結合する。限定されるわけではないが、例えば、ヨウ素の場合（５−ヨードｙ）、好ましくは約３１８ｎｍＵＶを約１時間照射する。
限定されるわけではないが、５位の置換基は最も好ましくはヨウ素である。３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オンの５’−三リン酸誘導体（５ＩｙＴＰ）の構造式は、図４ａ）に記載されている。
２）本発明のヌクレオシド又はヌクレオチド中の塩基は、５位の置換基として、アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体を有することも可能である。
アルケニル、アルキニル、アミノ基、又はその誘導体は、他分子と疎水的あるいは親水的な相互作用に役立ち、例えば、アプタマーとそのターゲットとなる分子との間の相互作用を強めることができる。また、リボザイムの場合には、新たな活性部位を創製することが出来る。さらに、アミノ基の誘導体は、このものからビオチンや蛍光色素の結合した誘導体の合成中間体にもなる。
アルケニル基又はアルキニル基は、好ましくは、炭素数２ないし５、より好ましくは、炭素数２ないし３である。誘導体としては、例えば、−Ｃ≡ＣＣ６Ｈ５、−Ｃ≡ＣＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ２が含まれる。好ましくは、−Ｃ≡ＣＣ６Ｈ５（２−フェニルエチニル基）である。
３）ビオチンは補酵素Ｒとも呼ばれ、ビタミンＢ群の１種である。ビオチンは、卵白中に含まれる糖タンパク質であるアビジンと特異的に結合し、複合体を形成することが知られている。よって、５位の置換基としてビオチンを有する本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、アビジンタンパク質に特異的に結合する。このため、ビオチンが結合した本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドを含む核酸は、アビジンを結合した担体と結合させることができるので、核酸を固定化することができ、特定の分子に結合する核酸（アプタマーなど）を固定化すれば、例えば、特定物質の検出や単離に、また、診断試薬として利用できる。
ビオチンを核酸に結合させるための従来技術としては、第一にビオチンを結合した短いＤＮＡを化学合成により調製し、これをアビジン化担体に結合し、これに相補性を有する核酸をハイブリダイズさせる方法がある（図１４、従来法１）。ＤＮＡの合成とハイブリダイゼーションが含まれ、操作が煩雑になり、また、核酸の固定化の効率も、ビオチン−アビジンの結合ではなく、ビオチンを結合した短いＤＮＡと、標的配列を含む相補配列とのハイブリダイゼーションに依存してしまう。
また、ビオチンを５位に結合したウリジンを用い、転写によりＲＮＡ中に（鋳型ＤＮＡ中のＡに相補して）ランダムにビオチンを導入し、これをアビジン化担体に結合させる方法も知られている（図１４、従来法２）。この方法に関しては、Ｒｏｃｈｅ／Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｅｎｚｏ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒの各社からビオチンを結合したウリジン（Ｕ）（Ａ、Ｇ、Ｃの誘導体もある）の基質が販売されている。しかしながら、鋳型ＤＮＡ中のＡに相補してＲＮＡ中に「ランダムに」ビオチンが結合したウリジンが導入されるという本質的な問題がある。その結果、固定化されたＲＮＡの機能が失われたり、固定化の効率が低くなることがある。
従来技術に対して、ビオチンを結合した第５番目の塩基を人工塩基対を介して、転写により核酸中の特定部位に導入できれば、核酸のビオチン化、そして、それによる核酸の固定化が非常に簡便になる。本発明ではｓ−ｙという人工塩基対を用いて、これを可能にした。なお、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドの５位の置換基としてビオチンを導入するためには、ビオチンを直接導入してもよいが、アミノアルキル基、アミノアルケニル基、アミノアルキニル基等から選択されるリンカーを介することが好ましい。例えば、本実施例１１−１５（図１５−１８）では、エチレン型又はアセチレン型の２種類のリンカーを介して、ビオチンをｙの５位に導入させた。本明細書において「ビオチン誘導体」とは、このようにヌクレオシド又はヌクレオチドに導入するために、リンカーを結合させたビオチンを含む。
４）５位置換基として、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子を有する場合、蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、５位に蛍光分子を有する本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。
限定されるわけではないが、例えば、フルオレセインの吸収極大波長は５１３ｎｍ、蛍光極大波長は５３２ｎｍである。また、６−カルボキシフルオレセインの吸収極大波長は４９５ｎｍ、蛍光極大波長は５２１ｎｍ、テトラメチル−６−カルボキシローダミンの吸収極大波長は５５５ｎｍ、蛍光極大波長は５８０ｎｍである。それぞれの物質によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。
本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることなく、置換基の種類に応じて合成することができる。例えば、本明細書の実施例１に記載したように、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オンに、先ず５位に置換基を導入し、次いで、３リン酸を導入してもよい。あるいは、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オンに、先ず３リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。また、２）アルケニル、アルキニル、アミノ基、又はその誘導体のような大きな基を導入する場合、先ず、ヨード等の光反応性基を導入して活性化してから、置換してもよい。また、置換基を導入する際の反応条件などは、ピリジンにこれら置換基を導入する反応の場合を参照して行うことができる。
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸
本発明は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。あるいは、核酸は３本鎖、４本鎖等も形成しうる。
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドとが塩基対を形成することが可能である。図２ｃ）に示されたｙとｓ（２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基）と同様に、木発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基は、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基と、２箇所で水素結合を生じる。６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基は、好ましくは２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）又は２−アミノ−６−（ジメチルアミノ）プリン−９−イル基（ｘ）である。より好ましくは、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）である。
本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基は、立体構造上、天然型プリン塩基Ａ（アデニン）及びＧ（グアニン）とは塩基対を形成できない。そして、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基は立体障害のため、天然型Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル）及びＣ（シトシン）とは塩基対を形成できない。よって、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基は、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基と特異的に塩基対を形成することが可能である。
よって、本発明の核酸は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、態様を含む。６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基は、好ましくは、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（ジメチルアミノ）プリン−９−イル基である。
本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に取り込むことが可能である。
限定されるわけではないが、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、  ６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、前記６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、本発明の核酸を組み込む
ことを含む、方法によって調製することが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってＤＮＡ又はＲＮＡに取り込んでもよい。
例えば、５位にヨウ素原子をもつウリジン（Ｕ）誘導体、５−ヨードＵ（５ＩＵ）を転写反応によりＲＮＡ中に導入する場合には、ＵＴＰと５ＩＵＴＰの存在比を変えて転写反応を行い、Ｕの位置をランダムに５ＩＵで置換するか、あるいはＵＴＰの代わりに５ＩＵＴＰだけを転写反応に用いてＵの位置を全て５ＩＵに置換するしかない。この場合、５ＩＵの導入によってＲＮＡの高次構造が変化してしまったり、ＲＮＡの機能に支障をきたすこともある［Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５］。これに対し、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基は、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基と特異的に塩基対を形成する。よって、所望の位置に６位置換−２−アミノ−プリン−９−イル基が導入されているＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、転写、複製又は逆転写反応を行うことにより、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的に導入することが可能となった。
転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ等）、複製反応は、クレノウフラグメント（ＫＦ）、逆転写反応はＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（ＡＭＶ−ＲＴ）（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用することが可能である。複製反応は、反応中に６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基が除去されてしまうのを防ぐために、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  ＴａｑＴＭ）を用いてｓを含むプライマーによる鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅も可能である。
なお、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、公知の方法、例えば、［Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１］に記載の方法で合成可能である。
本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして使用されうる。アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるＤＮＡ又はＲＮＡである。標的とする遺伝子配列（センス鎖）の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称であり、広義のアンチセンスＲＮＡに含まれる。アプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によって得られた、特定の分子に結合する機能を有する核酸である。
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクションによって得られる５位置換された２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を含むアプタマーは、標的タンパク質と架橋反応する等の新機能を持つＲＮＡ分子を創製することも可能となる。
まず、例えばｓを含むプライマーを用いて鋳型ＤＮＡプールをＰＣＲにより増幅し、これを転写して３’末端側の特定部位に５Ｉｙを含むＲＮＡプールを調製する。このＲＮＡプールから、光架橋反応を指標にしてｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクションを行い、特定のアプタマーを得ることができる。また、５ＩｙはＲＮＡアプタマー中の３’側に位置しているので、セレクションにおける逆転写反応の効率に悪影響を及ぼすことも少ない。さらに、疎水的な置換基を導入して、ターゲットとする物質とアプタマーとの疎水−疎水結合を強めるセレクションも可能である。
また、５位の置換基としてビオチンを導入した核酸分子の調製も、転写反応で可能である。これは、アビジンとの相互作用を利用した例えばＲＮＡの固相化や、多量体化に適用可能である．本明細書中で後述する実施例１６では、人工塩基ｓを含む鋳型ＤＮＡを調製し、これに対して転写反応を行うことにより、その転写産物にビオチン化されたヌクレオシド又はヌクレオチドを部位特異的に取り込むことに成功した。
なお、実施例１６では、１７−ｍｅｒの配列中に、本発明の５位の置換基としてビオチンを導入した塩基を一つ導入する場合、その合成効率は、天然塩基対（ＧＣ塩基対、又はＡＴ塩基対）における効率と比較して約５０％であった（図１９）。
さらに、蛍光分子をＲＮＡアプタマー中に導入してアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）として活用する例も報告されている［Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１］。
これまでに、修飾塩基のヌクレオシドフルオレセイン−１２−ウラシル（Ｆ−１２−Ｕ）［Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００］、５−（１−ペンチニル）ウラシル［Ｌａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４］、５−（３’’−アミノプロピニル）ウラシル［Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９］、５−ヨードウラシル（５ＩＵ）［Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５］、５−ブロモウラシル（５ＢｒＵ）［Ｇｏｌｄｅｎ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００］をｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクションで利用した例が報告されている。しかしながら、これらの例では全て、ＤＮＡもしくはＲＮＡプールの調製の段階から修飾塩基を天然型塩基（ＴもしくはＵ）と置換している。本発明では、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基の、６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基との特異的な塩基対を利用して、転写反応の１段階で位置選択的に本発明のヌクレオチドをＲＮＡに取り込むことが可能になった。本発明の非天然型の塩基を含む５種類の塩基からなるＲＮＡを任意に調製出来れば、その有用性・汎用性は非常に高い。
また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれたＤＮＡ又はＲＮＡは、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。
本発明のヌクレオチドを含む核酸と他分子（核酸、タンパク質等）含む多量体
本発明はさらに、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸が、前記５位の置換基を介して共有結合している、核酸と１またはそれより多くの他分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体分子がより好ましくは例示される）との多量体を提供することを目的とする。
本発明はまた、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を近接させて、前記５位の置換基を介して前記ＤＮＡ同士、ＲＮＡ同士、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／タンパク質又はＲＮＡ／タンパク質を共有結合させる、ことを含む、前記核酸と他分子（より好ましくは生体分子）との多量体の形成方法を提供することを目的とする。
上述したように、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチド中の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基において、５位の置換基の種類によっては、近接する他分子と共有結合を結合しうる。
例えば、具体的には、５位置換基が１）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基の場合、反応基の種類に応じた適当な波長の光照射を行うことにより、近接する他分子と共有結合を形成する。例えば、本明細書中の実施例で、参考例１で得られたａｎｔｉ−（Ｒａｆ−１）アプタマー（ＲＮＡ  ９Ａ）に５Ｉｙを位置選択的に導入して、ターゲットタンパク質（Ｒａｆ−１  ＲＢＤ）の存在下で架橋反応を行い、本発明の非天然型塩基の有用性を調べた。ＲＮＡ  ９Ａ中の５Ｉｙの導入部位として、ＲＮＡの高次構造の変化やピリミジンダイマー等の形成を出来る限り避けるため、ＲＢＤとの相互作用に重要でないとわかっている３’末端側の領域のうち、プリン塩基に挟まれたＣ８４、Ｃ８７、Ａ９２を選んだ。そして、それぞれの位置に５Ｉｙが選択的に導入された各ＲＮＡとＮ末端にＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）を融合させたＲａｆ−１  ＲＢＤ（ＧＳＴ−ＲＢＤ）の存在下で光照射による架橋反応を行った。その結果、８４又は８７残基に５Ｉｙを含むＲＮＡは、架橋反応によりＲＮＡ同士の二量体を形成することがわかった。ＧＳＴタンパク質は溶液中で二量体を形成することから、ＧＳＴ−ＲＢＤも溶液中で二量体を形成し、ＲＮＡ  ９ＡがＲａｆ−１  ＲＢＤに結合して５Ｉｙを含む配列部分が近接したときに、ＲＮＡ分子間の架橋反応が進行したと考えられる。この結果は、５ＩｙがＲＮＡ間相互作用の解析に利用できることを示している。本発明において、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有する核酸と他分子が近接するとは、５位の置換基と他分子が共有結合を形成しうるくらい、物理的に近位に配置されることを意味する。
本発明では５位の置換基間で水素結合等よりも強い共有結合が形成され架橋されるため、分離、精製等が可能であり、核酸と他分子の相互作用をより直接的に調べることが可能となった。架橋反応産物の解析は公知の方法、例えばゲルシフトアッセイ、クロマトグラフ、マススペクトル等によって行うことが可能である。なお、本発明の核酸と他分子は二量体のみならず、３又はそれより多くの多量体を形成することも可能である。
あるいは、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するＤＮＡ又はＲＮＡが結合しているタンパク質間相互作用を観察することも可能である。例えば、本明細書中の実施例では、Ｒａｆ−１  ＲＢＤに結合するＲＮＡアプタマーであるＲＮＡ  ９Ａについて、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的に導入すると、ＲＮＡ分子間の二量体化が観察された。これは、実施例で使用したＧＳＴ−ＲＢＤが溶液中で二量体を形成し、ＲＢＤ部分に結合したＲＮＡ  ９Ａが近接したときにＲＮＡ分子間の架橋反応が進行したためと考えられる。ＧＳＴタンパク質は二量体を形成しやすく、実際にタンパク質を二量体化させるドメインとして利用されている。よって、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するＤＮＡ又はＲＮＡの架橋反応を利用して、架橋反応物の解析を行えば、当該ＤＮＡ又はＲＮＡが結合しているタンパク質同士の相互作用の解析も可能である。
あるいは核酸分子とタンパク質間の相互作用を強固にして、アプタマーによるターゲットタンパク質の活性の阻害や核酸・タンパク質の相互作用の解析などに有用な手法を提供することになる。例えば、ターゲットタンパク質の活性を阻害する既存のアプタマーは、共有結合でターゲットタンパク質と結合しているわけではないので、そのタンパク質の活性を完全に阻害することはできない。しかし、５Ｉｙを含むアプタマーを用いて、光照射によりターゲットタンパク質にアプタマーを共有結合させることにより、そのタンパク質の活性を完全に阻害することも可能である。
【実施例】    以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステルの合成
（１）３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オンの合成（図３の１→２）
３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン３４２ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ，Ｊ．，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，Ｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９７，３８，ｐ．２０３−２０６．；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４１，ｐ．３９３１−３９３４）、ヨウ素５７３ｍｇ（２．３ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）６５７ｍｇ（７．９ｍｍｏｌ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム３６ｍｌに加え、１１０℃で１２時間加熱した。反応後にジクロロメタンを加え、水層を分離し、ジクロロメタンで洗浄した。水層を減圧濃縮後Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製し、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン１５５ｍｇを得た。
（２）３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステルの合成（図３の２→４）
上記（１）の３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン０．１ｍｍｏｌ、プロトンスポンジ４８ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）をトリメチルホスフェート５００μｌに溶解し、０℃に冷却した。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）１３μｌ（１．３当量）を加え、０℃で４−５時間撹拌した。トリ−ｎ−ブチルアミン１１９μｌ（５．０当量）、次いで０．５μＭビストリブチルアンモニウムピロホスフェート（ジメチルホルムアミド溶液）１．０ｍｌ（５．０当量）（Ｌｕｄｗｉｇ．Ｊ．，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５４，ｐ．６３１−６３５）を加える。３０分後０．５Ｍトリエチルアンモニウムビカーボネート５００μｌを撹拌する。反応液をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５、次いで、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製し、標題化合物３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステル（本明細書において、場合により「５ＩｙＴＰ」と呼称する）を得た。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ
計算値：５９３．０５、実測値：５９１．７０（Ｍ−Ｈ）
実施例２  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−（２−フェニルエチニル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステルの合成
（１）３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−（２−フェニルエチニル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オンの合成（図３の２→３）
実施例１（１）の３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨードピリジン−２（１Ｈ）−オン７１ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１．０ｍｌに溶解した。次いで、ＣｕＩ６ｍｇ（０．０３２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン４２μｌ（０．３０ｍｍｏｌ）、フェニルアセチレン３３μｌ（０．３０ｍｍｏｌ）及びＰｄ（Ｐｈ３Ｐ）４１１ｍｇ（０．０１０ｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で６時間撹拌した。酢酸エチル１０ｍｌを加えた後、水１０ｍｌづつで３回抽出した。水層を合わせ、減圧下で濃縮した。逆相ＨＰＬＣで精製し、白色の３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−（２−フェニルエチニル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン６０ｍｇ（９２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．１６ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）；δ７．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．８、２．４Ｈｚ，６），７．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．３、２．４Ｈｚ，４），７．４６（ｍ，２Ｈ，フェニル），７．３５（ｍ，３Ｈ，フェニル），４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１’），４．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、３’），４．００−４．０７（ｍ，２Ｈ，２’，４’），３．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．２Ｈｚ、５’），３．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８，１２．２Ｈｚ、５’）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）；３２５．８５［Ｍ−Ｈ］。λｍａｘ＝２８７ｎｍ（ε＝７．７×１０３）
（２）３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−（２−フェニルエチニル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステルの合成（図３の３→５）
上記（１）の５−（２−フェニルエチニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン１４ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）および１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン１４ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）を、トリメチルホスフェート０．４３ｍｌに溶解した。氷冷下オキシ塩化りん５．２μｌ（０．０５６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２時間撹拌した。トリブチルアミン５２μｌ及び０．５Ｍビストリブチルアンモニウムピロホスフェート（ジメチルホルムアミド溶液）０．４３ｍｌの混合液を加え、０℃で１０分間撹拌した。ＴＥＡＢ５ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）を加え、４℃で、ＤＥＡＥセファデックス陰イオン交換カラムで０．０５−１ＭグラディエントＴＥＡＢで精製した。標題化合物３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−（２−フェニルエチニル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステルを含む画分を凍結乾燥し、２７ｍｇ（６５％）の目的化合物を得た。最終物をさらに逆相ＨＰＬＣで精製した。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）；５６５．５８［Ｍ−Ｈ］
実施例３  非天然型塩基を含むヌクレオシド三リン酸の濃度およびモル吸光係数の決定
本願発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド等の、非天然型塩基を含む各ヌクレオチド（ｄＮＴＰ／ＮＴＰ）の濃度は、アルカリフォスファターゼによりリン酸エステル結合を分解後、無機リン酸の含有量を求めることで決定した。また、各ヌクレオシド三リン酸のモル吸光係数イプシロン（ε）の値は、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７）中での極大吸収波長および波長２６０ｎｍにおける吸光度Ａｂｓ（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定して、計算式ε＝Ａｂｓ／Ｃｏｎｃ（Ｃｏｎｃ：ｄＮＴＰ／ＮＴＰ濃度）からεを決定した。
実施例１で作成した５ＩｙＴＰのＵＶ吸収について図４に示した。５ＩｙＴＰは、吸収極大波長が３１８ｎｍ付近である。
アルカリフォスファターゼによるリン酸エステル結合の分解反応は、ヌクレオシド５’−三リン酸、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０単位のウシの腸由来のアルカリフォスファターゼ（ＴａＫａＲａ）を含む反応溶液（４０μｌスケール）を４２℃で１時間インキュベートすることにより行った。リンの定量は、Ｃｈｅｎの方法に従って行った［Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９５６］。反応溶液の半量２０μｌを４ｍｌの水と４ｍｌの試薬Ｃ（６Ｎ硫酸、蒸留水、２．５％モリブデン酸アンモニウム溶液、１０％  Ｌ−（＋）アスコルビンを体積比１：２：１：１で混合した溶液）に加えて、３７℃で２時間振盪しながら反応させた、反応後のサンプルを室温に戻してから８２０ｎｍの吸光度を測定して、検量線からリンの含有量を算出した。
実施例４  ＲＮＡ９Ａに５ＩｙＴＰを位置選択的に導入するための鋳型ＤＮＡの調製
上述した２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもったピリジン−２−オン（ｙ）からなるｓ・ｙ塩基対はＰＣＲによるＤＮＡの増幅に耐えられるほどの選択性がない。しかしながら、ｓを含むプライマーを用いたＰＣＲで鋳型ＤＮＡを増幅することができる。そこで、参考例１で得られたＲＮＡ  ９Ａ（全長１００ヌクレオチド）中のＲａｆ−１  ＲＢＤとの相互作用に重要でないとわかっている３’末端側の領域のうち、プリン塩基に挟まれたＣ８４、Ｃ８７、Ａ９２を５Ｉｙの導入部位として選んだ。
具体的には、先ずＰＣＲ反応の鋳型には、参考例１で得られたベクターＴＯＰＯ−９Ａ（アプタマーＲＮＡ  ９Ａがサブクローニングされたベクター）をＢａｍＨＩで１箇所切断して直鎖状にした二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を用いた。ＲＮＡ９Ａは、本明細書中の配列番号１及び図５ｂ）に示した１００塩基からなる配列を有する。図５ｂ）中下線で示した、８４、８７及び９２は、５Ｉｙを導入する部分である。ＰＣＲ用のプライマーとしては、配列番号２の塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号３−７のいずれかの塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いた。
センスプライマー
2004007713.tif 000003
アンチセンスプライマー
2004007713.tif 000004
センスプライマー（配列番号２）の塩基１９−３９は、ＲＮＡ９Ａ（配列番号１）の塩基１−２０に相当する。配列番号２の３−１８は、Ｔ７プロモーターに相補的な配列を含む。
３’末端側のアンチセンスプライマーとして、ＲＮＡ  ９Ａ（配列番号１）の固定領域（７２−１００）に相補的な配列をもつ２９．４５、ｓを１箇所だけ含む２９．４５ｓ８４、２９．４５ｓ８７、２９．４５ｓ９２、ｓを２箇所含むプライマー２９．４５ｓ８４／９２を化学合成した。（図５ｂ）、これらのプライマーを用いた以下のＰＣＲによりｓを含む鋳型ＤＮＡを増幅した。
なお、プライマーに使用される２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）のフォスフォアミダイトは、公知の方法、例えば、［Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１］に記載の方法で合成可能である。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ中にｓが除去されてしまうことを防ぐため、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＴａｑＴＭ）を用いて行った。反応組成は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭの各プライマー、１ｎｇ／μｌ  鋳型  ｄｓＤＮＡ、０．０２５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。反応はＰＴＣ−１０００ＴＭＰｒｏｇｒａｍ  Ｔｈｅｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて［９４℃、３０秒−４０°Ｃ、３０秒−６０℃、１分］×１５もしくは２０サイクル、６０℃５分の条件で行われた。
反応溶液をフェノールークロロホルム抽出した後、上清をエタノール沈殿してＰＣＲ産物を回収した。ｓがプライマー中で比較的３’末端側に位置する２９．４５ｓ８４および２９．４５ｓ８４／９２を用いた場合、ＰＣＲの増幅効率が若干低下したが、転写反応に十分な純度のＰＣＲ産物を得ることができた（図省略）。ＰＣＲ産物を１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に溶かして保存し、以降のＴ７転写反応の鋳型とした。
実施例５  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応
本実施例では、実施例４で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応によって、実施例１で作成した５Ｉｙを３’末端側の特定の位置に導入した種々のＲＮＡ  ９Ａ変異体を作成した。
Ｔ７転写反応の組成はＯｈｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に記載されたものと同様である。具体的には、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  ＧＭＰ、１ｍＭ  ＮＴＰｓ、０−０．２５ｍＭ  ５ＩｙＴＰ、０．２μｌ／μｌ鋳型ＤＮＡ、２．５Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）である。３７℃で６時間酵素反応を行い、反応産物を８％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動して精製した。
図６ａ）は、０．２５ｍＭの５Ｉｙが存在下（＋）又は非存在下（−）で転写反応を行い、その反応産物を電気泳動した場合のオートラジオグラムを示す。図６ｂ）は、ＲＮＡ９Ａの２次構造上に、５Ｉｙが導入される箇所を黒丸で示したものである。図６に示されたように、０．２５ｍＭの５Ｉｙリボヌクレオシド三リン酸（５ＩｙＴＰ）の存在下、効率よく転写反応が進行し、全長１００ヌクレオチドの産物をゲル電気泳動により確認できた。
なお、５ＩｙＴＰの代わりに実施例２で作成した３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−（２−フェニルエチニル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オン  ５’−三リン酸エステルを用いた場合にも、同様に転写反応が行われることが確認された。
実施例７  転写反応産物の塩基組成分析
実施例６で得られた全長の反応産物中に５Ｉｙがどれだけ選択的に導入されているかを調べるため、ＲＮＡの塩基組成分析を行った。［α−３２Ｐ］ＡＴＰもしくは［α−３２Ｐ］ＧＴＰ存在下でＴ７転写反応を行った場合、ＡもしくはＧの５’側に隣接するヌクレオシド３’−リン酸（Ｎｐ）がそれぞれ３２Ｐで標識される。したがっで、ゲルから精製されたＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ｔ２（Ｓｉｇｍａ）を用いてＮｐに完全分解した。８４、９２残基の位置に５Ｉｙが導入されていれば５Ｉｙのヌクレオシド３’−リン酸（５ＩｙＴｐ）が［α−３２Ｐ］ＧＴＰにより３２Ｐで標識され、８７残基の位置であれば［α−３２Ｐ］ＡＴＰにより標識される（図５、図６−ｂ）。完全分解された産物を２Ｄ−ＴＬＣで分離してそれぞれのヌクレオチドを定量した５Ｉｙを含むＲＮＡの塩基組成分析を行った。
具体的には、ＲＮＡの完全分解では、ラベルされたＲＮＡと０．２５ＯＤのＥ．ｃｏｌｉ由来ｔＲＮＡ混合物（Ｓｉｇｍａ）を含む水溶液４．２５μｌに０．７５μｌのＲＮａｓｅ  Ｔ２溶液（５単位／μｌ；１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．５、１０％グリセロール）を加えて、３７℃で一晩酵素反応を行った。反応溶液の一部を１０ｃｍ×１０ｃｍのＴＬＣ板（フナセルＳＦ；フナコシ）にスポットして二次元に展開した。一次元目および二次元目の展開液の組成は、イソ酪酸６６：アンモニア１：水３３（体積比）、および２−プロパノール７０：塩酸１５：水１５（体積比）である。展開後のスポットをバイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士フィルム）で検出して、それぞれ定量した。
結果を図７及び表１に示す。
2004007713.tif 000005
各数値は以下の式により算出された。かっこ内は理論上のヌクレオチドの数を示す。
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＊  ［５Ｉｙｐの数値］／［ＡもしくはＧ＊＊の５’末端のヌクレオチドの総数］×１００（％）。
＊＊Ｇの場合は、ｐＧｐのカウントを除いて計算した。
その結果、鋳型中のｓに対して５Ｉｙが高い選択性で取り込まれ（９７％以上）、誤った５Ｉｙの取り込みは全体の僅か０．５％以下であった。以上より、ｓを含むプライマーを用いてプラスミド中の配列からＰＣＲで鋳型を調製することにより、５ＩｙをＲＮＡ中に位置選択的に導入できることがわかった。
実施例８  ５Ｉｙが導入された各ＲＮＡのＲａｆ−１  ＲＢＤへの結合効率
本実施例では、５Ｉｙが位置選択的に導入された各ＲＮＡのＲａｆ−１  ＲＢＤに対する結合活性の変化を調べるために、フィルター結合法により結合効率を求めた（表２）。１箇所に５Ｉｙが導入された９Ａ（５Ｉｙ８４）、９Ａ（５Ｉｙ８７）、９Ａ（５Ｉｙ９２）は５Ｉｙを含まないＲＮＡ  ９Ａと同程度の結合効率を示した。２箇所に５Ｉｙが導入された９Ａ（５Ｉｙ８４／９２）では結合効率が低下した。一方、５−ヨードＵ（５ＩＵ）が１分子あたり平均５〜６塩基分ランダムに導入されたＲＮＡ  ９Ａ（５ＩＵ）でも結合能が落ちた．以上の結果から、少なくとも５ＩｙをＲＮＡ  ９Ａの８４、８７、９２残基の１箇所にのみ導入した場合はアプタマーの結合活性に与える影響がほとんどなく、位置選択的に５Ｉｙを導入できる本手法が有益であることがわかった。
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各ＲＮＡのＲａｆ−１  ＲＢＤへの結合効率をフイルター結合法により求めた（Ｒａｆ−１  ＲＢＤ／ＲＮＡ  ＝  ３００：５ｎＭ）。実験は３回行い、その平均値を示した。かっこ内の数値は標準偏差。ａ０．４ｍＭの５ＩＵＴＰ存在下、ｓを含まない鋳型ＤＮＡから転写されたＲＮＡ  ９Ａ。ｂ０．２５ｍＭの５ＩｙＴＰ存在下、ｓを含まない鋳型ＤＮＡから転写されたＲＮＡ  ９Ａ。
実施例９  ＵＶ照射による架橋反応
本実施例では、５Ｉｙを位置選択的に含む各ＲＮＡを用いて、光照射による架橋反応性を調べた。
先ず、５’末端が３２Ｐで標識されたＲＮＡを緩衝液Ａ中で７５℃で３分加温した後に室温で１０分以上放置して、ＲＮＡの二次構造を形成させた。一方、Ｒａｆ−１  ＲＢＤは、ヒト  Ｒａｆ−１のＲＢＤ（アミノ酸残基５１−１３１番）をＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）融合タンパク質として大腸菌内で発現し、菌体を破砕後の上清からカラムクロマトグラフィーで精製した。ｒａｔ  ＲＧＬのＲＢＤ（アミノ酸残基６３２−７３４番）［Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６］およびｈｕｍａｎ  Ｂ−ＲａｆのＲＢＤ（アミノ酸残基１４９−２２６番）もＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌内で発現し、同様に精製した。
二次構造を形成させたＲＮＡの溶液に等容量のＲａｆ−１  ＧＳＴ−ＲＢＤ溶液（ＲＢＤの他、ＢＳＡ  １６０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、７．３％グリセロールを緩衝液Ａに溶かしたもの）を加えて３７℃で３０分間インキュベーションしてＲＮＡ・ＲＢＤの複合体を形成させた。そして、氷上にセットした９６穴のマルチウェルプレート（ＣＯＡＳＴＡＲ社）のウェルにそのサンプルを４０−１２０μｌずつ分注した。３００ｎｍ以下の波長のＵＶを減少させるためにポリスチレンの蓋をしてからＵＶトランスイルミネーター（ＴＶＣ−３１２Ｒ／Ｊ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、ＵＶ波長３１２ｎｍ）を用いて約１ｃｍの距離からＵＶを１時間照射した。
光源に用いたＵＶの波長は、５ＩｙＴＰの吸収極大波長が３１８ｎｍ付近であることを考慮して選択された（図４）。一方、ＵＶトランスイルミネーターを用いた場合には、照射波長が２７０−４００ｎｍと広がってしまう（８／１５Ｗ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗａｖｅ  ＵＶ−Ｂ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｕｂｅのスペクトル表より。図省略）［Ｍｅｉｓｅｎｈｅｉｍｅｒ  ＆  Ｋｏｃｈ，１９９７］。そこで本実施例では、天然型塩基の吸収波長と重なる３００ｎｍ以下の光を出来る限り減少させるため、サンプルにポリスチレン製の蓋をしてＵＶを照射した。
反応溶液を８％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動して、生成物を解析した。また、架橋反応産物を回収する際には、反応溶液をフェノール・クロロホルム抽出した後、電気泳動で分離してゲルから抽出た。その結果、８４又は８７残基に５Ｉｙを含むＲＮＡ  ９Ａ（５Ｉｙ８４）と９Ａ（５Ｉｙ８７）において、未反応のＲＮＡ（１００ヌクレオチド）と異なる位置に、架橋反応産物のバンドがはっきり検出された（図８  レーン６及び８）。
架橋反応産物が何であるかを同定することにした。ＲＮＡ  ９ＡはＲａｆ−１ＲＢＤに結合するアプタマーなのでＲＮＡとＧＳＴ−ＲＢＤ間の架橋反応が一つの反応機構として考えられる。ＧＳＴ−ＲＢＤ非存在下でＵＶを照射したところ、架橋反応産物のバンドが僅かではあるが検出された（図９  レーン１及び５）。そこで、ＧＳＴ−ＲＢＤ存在下でＵＶを照射した後にｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理（ＰＫ）やフェノール・クロロホルム抽出（ｐｈｅｎｏｌ）によってタンパク質を除去してみたが、そのバンドに変化はなかった（図９  レーン２−４，及び６−８）。
以上の結果から、架橋反応産物はＲＮＡ・タンパク質（ＧＳＴ−ＲＢＤ）間の架橋反応に由来するものではないことがわかった。そして、ＲＮＡだけで架橋反応産物が検出されることと、架橋反応産物のバンドの移動度がほぼＲＮＡ  ９Ａ二量体分に相当すること（図省略）から、ＧＳＴ−ＲＢＤ存在下でＲＮＡが二量化したものが架橋反応より得られたと考えられる。そして、タンパク質共存下で、このアプタマーの２量化が促進されることもわかった。
実施例１０  ＲＮＡ  ９Ａの架橋反応による２量体化
ＧＳＴタンパク質は二量体を形成しやすく、実際にタンパク質を二量体化させるドメインとして利用されている［Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００］。したがって、本実施例で用いたＧＳＴ−ＲＢＤも溶液中で二量体を形成し、ＲＢＤ部分に結合したＲＮＡ  ９Ａが近接したときにＲＮＡ分子間の架橋反応が進行したと考えられる。その場合には、架橋反応産物はＲａｆ−１  ＲＢＤとの結合活性も保持したままである可能性がある。
そこで、９Ａ（５Ｉｙ８７）とＲａｆ−１  ＲＢＤを等濃度０．１μＭで混合させた条件で架橋反応させた産物（ＸＬ）をゲルから精製して、ＸＬとＧＳＴＲＢＤとの結合をゲルシフトアッセイにより調べた。また、ＲＮＡ  ９Ａの二量体のコントロールとして、ＲＮＡ  ９Ａをタンデムに連結させたＲＮＡ  ９Ａ×２（全長２００ヌクレオチド）も新たに調製し、ゲルシフトアッセイを行った。ＲＮＡ  ９Ａ×２は、ＲＮＡ  ９Ａの必須領域（１−８０残基部分）を分子内に２つもつ全長２００ヌクレオチドのＲＮＡであり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いた転写反応により調製し、ベクターｐＣＲ登録商標ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングされている。
ゲルシフトアッセイ
５’末端が３２Ｐで標識されたＲＮＡ（０．８ｐｍｏｌ）を２０μｌの緩衝液Ａ中で７５℃で３分加温した後に室温で１０分以上放置して、ＲＮＡの二次構造を形成ざせた。このＲＮＡ溶液に、２０μｌの緩衝液Ａに溶かしたＥ．ｃｏｌｉ由来ｔＲＮＡ混合物の溶液（１００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａから購入したサンプルをゲル精製したもの）を加えて、５分以上室温で放置した後、その溶液を５μｌずつ分注した。これに５μｌのＲａｆ−１  ＧＳＴ−ＲＢＤ溶液（ＲＢＤの他、ＢＳＡ  １６０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロールを緩衝液Ａに溶かしたもの）を加えて、３７℃で３０分間インキュベートした後、非変性５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３９：１）電気泳動により解析した。
電気泳動は、室温、定電圧（１５０Ｖ）で約２時間行った（ゲルサイズ１６ｃｍ×１６ｃｍ×１ｍｍ）。泳動用緩衝液の組成は、１２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１２５ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅである。泳動後のゲルはゲルドライヤーを用いて乾燥させ、バイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士フィルム）で解析した。
その結果、予想通り、ＲＮＡ  ＸＬ  １分子とＧＳＴ−ＲＢＤ  ２分子は効率よく複合体を形成することがゲルシフトのバンドパターンからわかった（図１０ｃ）また、ＧＳＴ−ＲＢＤ非存在下のＲＮＡ  ＸＬのバンド移動度はＲＮＡ  ９Ａ×２とほぼ同じだったことからも、ＸＬはＲＮＡ  ９Ａが二量化したものであることが確認できた（図１０ｃ及びｄ）。また、２分子のＧＳＴ−ＲＢＤとの結合活性は、ＲＮＡ  ２×９ＡよりもＲＮＡ  ＸＬの方が高いことがゲルシフトのパターンから示唆された。これは、ＧＳＴ  ｔａｇで二量体化したＲａｆ−１ＲＢＤの配向とＲＮＡ  ＸＬのＲＢＤへの結合部分がうまく合致しているためと考えられる。それに対してＲＮＡ  ９ＡはＧＳＴ−ＲＢＤと１：１で結合した複合体を形成した（図１０ａ）。また、Ｒａｆ−１  ＲＢＤへの結合が無視できるほど弱いＲＮＡ  ０Ｃは、ＧＳＴ−ＲＢＤ濃度を増やしてもゲルシフトは認められなかった（図１０ｂ）。
以上の結果から、５Ｉｙを位置選択的にＲＮＡ  ９Ａに導入することによりＧＳＴ−ＲＢＤに依存したＲＮＡ間での架橋反応性を付与できることが明らかとなり、５Ｉｙが分子間相互作用の解析に応用できること、そして、新たな機能をもつ核酸の創製において人工塩基対ｓ・５Ｉｙが有用であることがわかった。
参考例１  Ｒａｆ−１タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ  アプタマーの単離
本参考例では、Ｒａｆ−１タンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーをｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法により単離した。このＲＮＡ分子は、タンパク質問相互作用を制御する細胞情報分子として機能することを示した。
Ｒａｆ−１タンパク質は、細胞質に発現される分子量７４ｋＤａのセリン／トレオニンプロテインキナーゼであり、がん遺伝子として発見されたｃ−ｒａｆ−１の遺伝子産物である［Ｒａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８］。哺乳類細胞では、Ｒａｆ−１のアイソフォームとしてＡ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆが存在することが知られている。Ｒａｆ−１の活性化は、膜結合型タンパク質であるＲａｓとの相互作用により引き起こされ、そしてＲａｓ以外のタンパク質もその制御機構に関与していることがわかってきている［Ｋｏｌｃｈ、２０００］。Ｒａｓタンパク質は、がん遺伝子として発見されたｒａｓの遺伝子産物であり、ＧＤＰまたはＧＴＰと結合する低分子量Ｇタンパク質である［Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８］。他のＧタンパク質と同様に、ＲａｓはＧＴＰと結合した状態が活性化型である。このＧＴＰ結合型Ｒａｓは、Ｒａｆ−１のアミノ酸残基５１−１３１番からなるドメイン（Ｒａｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）と結合することが同定されている。Ｒａｆ−１の活性化には、Ｒａｓ・Ｒａｆ相互作用によって引き起こされる膜上での何らかの構造変化や、他の因子とのさらなる相互作用等が必要であると考えられている。
本参考例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法を用いて、Ｒａｓ・Ｒａｆ相互作用のみを選択的に阻害する制御分子の創製を試みた。核酸との相互作用が知られていないタンパク質に対しても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法を用いることで、そのタンパク質に特異的に結合するＤＮＡやＲＮＡ分子（アプタマー）を人工的に得ることができる。このｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法は、選択・増幅の一連の操作（ラウンド）を繰り返すことにより、ランダムな配列を含んだ核酸のライブラリー（プール）から特定の機能を有する分子種を選別する手法である（図１１）［Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９０］。
本参考例では、細胞情報伝達におけるＲａｓとＲａｆ−１の相互作用を選択的に制御する新規ＲＮＡ分子の創製をめざし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によりＲａｆ−１  ＲＢＤに特異的に結合するＲＮＡアプタマーを単離した。６０ヌクレオチド（Ｎ６０）のランダム配列を含むプールから得られたＲＮＡアプタマーは、Ｒａｆ−１  ＲＢＤとＲａｓの相互作用を阻害した。しかし、このＲＮＡアプタマーの阻害能は弱く、Ｒａｓに対して大過剰のＲＮＡが阻害に必要となった。そこでセレクション法を一部改良し、新たにデザインした４５ヌクレオチド（Ｎ４５）のＲＮＡランダム配列を含むプールを用いてセレクションを行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｄｕａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＴＡクローニングベクターｐＣＲ登録商標ＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、個々のクローンの塩基配列を、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果、さらに阻害能の高い二種類のＲＮＡアプタマー（ＲＮＡ  ９Ａ、ＲＮＡ  ９Ｂ）が得られた。
とりわけ阻害能の高かったＲＮＡ  ９Ａは、ＲａｓおよびＲａｆ−１を発現させたＳｆ９細胞の膜画分およびＨＥＫ２９３細胞の細胞質画分を用いた無細胞系で、ＲａｓによるＲａｆ−１の活性化を強く阻害し、人為的制御分子として機能することがわかった。またＲＮＡ  ９Ａは、Ｒａｆ−１のアイソフォームであるＢ−ＲａｆのＲＢＤに結合するにも関わらず（図１２）、Ｂ−Ｒａｆ  ＲＢＤとＲａｓの相互作用は阻害せず、Ｒａｓ・Ｒａｆ−１相互作用に対する阻害は特異的であることがわかった。また、ＲＮａｓｅによる限定分解、化学修飾を用いたＲＮＡの二次構造解析、そしてＲＮＡを切り詰めたＲＮＡバリアントでの実験結果から、ＲＮＡ  ９Ａはシュードノット構造を形成することが予測された（図１３）。また、化学修飾を用いたフットプリンティングによりＲａｆ−１  ＲＢＤと相互作用するＲＮＡ  ９Ａの領域を調べた結果、特定のループ部分がＲａｆ−１  ＲＢＤとの結合表面に位置することが示唆された。
実施例１１  エチレン型リンカーを介してビオチンを結合させたｙ誘導体の合成（図１５）
Ｎ−アリルビオチンアミド（図１５の化合物２）の合成
アルゴン置換した１００ｍｌフラスコ中で２５１ｍｇ（０．７３５ｍｍｏｌ）のｂｉｏｔｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（化合物１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２６．７ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解させたものに５０μｌ（０．６６８ｍｍｏｌ）のａｌｌｙｌａｍｉｎｅ（ナカライテスク）を加え、アルミホイルで遮光し、室温で撹拌した。反応の進行はＣ１８逆相ＨＰＬＣでモニターした（ＨＰＬＣ条件；カラム、μ−Ｂｏｎｄｓｐｈｅｒｅ  φ１９ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；移動相、Ｈ２Ｏ中、２０％  アセトニトリル；溶出速度、１０ｍｌ／分；検出方法、ＵＶ吸収（２００ｎｍ））。反応開始から３時間後で原料のｂｉｏｔｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅがほぼ完全に化合物２に変化していることが確認された。この反応溶液をそのまま次の反応に用いた。
ビオチニル化５−（３−アミノ−１−プロペニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリドン（図１５の化合物４）及びビオチニル化５−（３−アミノ−１−プロペン−２−イル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリドン（図１５の化合物５）の合成
化合物２の反応溶液（０．６６８ｍｍｏｌの化合物２が２６．７ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解しているもの）に、１１８ｍｇ（０．３３４ｍｍｏｌ）の５−ｉｏｄｏ−３−（β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）−２−ｐｙｒｉｄｏｎｅ（Ｉ−ｒｙ，化合物３）と９８．３ｍｇ（０．３３４ｍｍｏｌ）のｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２６．７ｍｌの０．１Ｍ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）に溶解させたものを加え、アルゴン雰囲気中、室温で２０時間撹拌した。反応終了後、溶媒を蒸留によって除き、残渣をＨ２Ｏに懸濁させた。これを逆相カラム（固定相、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  １４０  Ｃ１８−ｐｒｅｐ（ナカライテスク）；移動相、Ｈ２Ｏ中、４０％  アセトニトリル）に通した後、生成物を含むフラクション（ＵＶ吸収（２６０ｎｍ）で検出）を回収し、エバポレートした。得られた残渣をＨ２Ｏに溶かし、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで生成物の精製を行った（ＨＰＬＣ条件；カラム、μ−Ｂｏｎｄｓｐｈｅｒｅ  φ１９ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；移動相、溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ、溶媒Ｂ＝Ｈ２Ｏ中５０％  アセトニトリル、０−１５分、１０−８０％  Ｂ、１５−１５．５分、８０−１００％  Ｂ、１５．５−１８分、１００％  Ｂ、１８−１９分、１００−１０％  Ｂ、１９−２４分、１０％  Ｂ；溶出速度、１０ｍｌ／分；検出方法、ＵＶ吸収（２６０ｎｍおよび３１８ｎｍ））。生成物のＨＰＬＣ精製後の収率は４７．４ｍｇ（０．０９３ｍｍｏｌ、化合物３より２７．９％）であった。
ここで精製したものは４と５の化合物の混合物となっていた。化合物４と５を分離するために、別の条件で再度ＨＰＬＣ精製を行った（ＨＰＬＣ条件；カラム、μ−Ｂｏｎｄｓｐｈｅｒｅ  φ１９  ｘ  １５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；移動相、９％  アセトニトリル  ｉｎ  Ｈ２Ｏ；溶出速度、１０ｍｌ／分；検出方法、ＵＶ吸収（２６０ｎｍおよび３１８ｎｍ））。得られた４と５の量の比はそれぞれの化合物の１Ｈ−ＮＭＲにおけるエチレンプロトン（化合物４に関しては−ＣＨ＝ＣＨ−、化合物５に関しては＞Ｃ＝ＣＨ２）の積分値の比から求め、４：５＝０．５３：０．４７であった。
化合物４に関する構造解析データ；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）１．１９−１．６８（６Ｈ，ｍ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−），２．１０（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．５７（１Ｈ，ｄ，−ＣＨＣＨ２Ｓ−，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），２．８１（１Ｈ，ｄｄ，−ＣＨＣＨ２Ｓ−，Ｊ＝４．７，１２．４Ｈｚ），３．０６−３．１２（１Ｈ，ｍ，−ＣＨＣＨＳ−），３．３４−３．６６（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，５’’），３．７６−３．９３（５Ｈ，ｍ，Ｈ２’，３’，４’，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−），４．０９−４．１４（１Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨＣＨＳ−），４．２７−４．３２（１Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨＣＨ２Ｓ−），４．６６−４．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ１’，３’−ＯＨ），５．０４−５．１３（２Ｈ，ｍ，２’−ＯＨ，５’−ＯＨ），５．９３（１Ｈ，ｄｔ，−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−，Ｊ＝５．５，１６．０Ｈｚ），６．２５（１Ｈ，ｄ，−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−，Ｊ＝１５．８Ｈｚ），６．３６（１Ｈ，ｓ，−ＮＨＣＨＣＨ２Ｓ−），６．４２（１Ｈ，ｓ，−ＮＨＣＨＣＨＳ−），７．３２（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），７．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ４），７．９６（１Ｈ，ｔ，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−，Ｊ＝５．１Ｈｚ），１１．７２（１Ｈ，ｂｓ，Ｈ１）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）２５．３，２８．２，３５．１，５５．４，５９．２，６１．１，７０．７，７４．４，８１．０，８３．６，１１５．２，１２３．６，１２５．７，１３０．７，１３１．７，１３４．１，１６０．９，１６２．５，１７１．６；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，［Ｍ−Ｈ］−（ｎｅｇａｔｉｖｅ）＝５０７．３０（ｆｏｕｎｄ），５０７．１９（ｃａｌｃｄ．），［Ｍ＋Ｎａ］＋（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝５３１．２８（ｆｏｕｎｄ），５３１．１９（ｃａｌｃｄ．）；ＵＶ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｈ２Ｏ），λｍａｘ＝２６２ｎｍ，３２５ｎｍ，λｍｉｎ＝２９１ｎｍ．
化合物５に関する構造解析データ；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）１．１２−１．６４（６Ｈ，ｍ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−），２．０８（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５５（１Ｈ，ｄ，−ＣＨＣＨ２Ｓ−，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），２．８１（１Ｈ，ｄｄ，−ＣＨＣＨ２Ｓ−，Ｊ＝５．１，１２．４Ｈｚ），２．９９−３．０６（１Ｈ，ｍ，−ＣＨＣＨＳ−），３．４６−３．６７（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，５’’），３．７９−４．１０（６Ｈ，ｍ，Ｈ２’，３’，４’，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−，−ＮＨＣＨＣＨＳ−），４．２６−４．３１（１Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨＣＨ２Ｓ−），４．６７−４．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ１’，３’−ＯＨ），５．０４−５．１３（３Ｈ，ｍ，２’−ＯＨ，５’−ＯＨ，＞Ｃ＝ＣＨ２），５．３８（１Ｈ，ｓ，＞Ｃ＝ＣＨ２），６．３６（１Ｈ，ｓ，−ＮＨＣＨＣＨ２Ｓ−），６．４１（１Ｈ，ｓ，−ＮＨＣＨＣＨＳ−），７．３４（１Ｈ，ｄ，Ｈ６，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．９６（１Ｈ，ｄ，Ｈ４，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｔ，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１１．７９（１Ｈ，ｂｓ，Ｈ１）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）２５．４，２８．１，３５．１，４１．０，５５．４，５９．１，６１．０，７０．４，７４．４，８１．０，８３．４，１１０．５，１１５．５，１２９．９，１３０．２，１３５．４，１３９．９，１６０．８，１６２．５，１７１．８；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，［Ｍ−Ｈ］−（ｎｅｇａｔｉｖｅ）＝５０７．２９（ｆｏｕｎｄ），５０７．１９（ｃａｌｃｄ．），［Ｍ＋Ｎａ］＋（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝５３１．２５（ｆｏｕｎｄ），５３１．１９（ｃａｌｃｄ．）；ＵＶ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｈ２Ｏ），λｍａｘ＝２５９ｎｍ，３１４ｎｍ，λｍｉｎ＝２８６ｎｍ．
実施例１２  エチレン型リンカーを介してビオチンを結合させたｙの誘導体の三リン酸化（図１６）
ビオチニル化５−（３−アミノ−１−プロペニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリドン  ５’−トリホスフェート（Ｂｉｏ−ｙＴＰ，図１６の化合物６）の合成
アルゴン置換した５ｍｌフラスコに３７．３ｍｇ（０．０７３ｍｍｏｌ）の化合物４と２３．６ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）のＰｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れ、７３４μｌのｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ナカライテスク）に懸濁させ、氷水中で１５分間撹拌した。ここに８．９μｌ（０．０９５ｍｍｏｌ）のｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ（ナカライテスク）を加え、４℃で２９時間撹拌した後、７３３μｌ（０．３６７ｍｍｏｌ）の０．５Ｍ  ｂｉｓ（ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＤＭＦ溶液と８７μｌ（０．３６７ｍｍｏｌ）のｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを加えさらに３０分間撹拌した。その後、３６７μｌの０．５Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）を加え反応を停止させた。この溶液からＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５  ｃｏｌｕｍｎ（カラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）φ１５ｍｍｘ３００ｍｍ、移動相；５０ｍＭ−１Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）によって化合物６を精製した。
ビオチニル化５−（３−アミノ−１−プロペン−２−イル）−３−（β−Ｄ−リボルラノシル）−２−ピリドン  ５’−トリホスフェート（図１６の化合物７）の合成
アルゴン置換した５ｍｌフラスコに３３．１ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）の化合物５と２０．９ｍｇ（０．０９８ｍｍｏｌ）のＰｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れ、３２５μｌのｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ナカライテスク）に懸濁させ、氷水中で１５分間撹拌した。ここに７．９μｌ（０．０８５ｍｍｏｌ）のｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ（ナカライテスク）を加え、４℃で２３時間撹拌した後、６５０μｌ（０．３２５ｍｍｏｌ）の０．５Ｍ  ｂｉｓ（ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＤＭＦ溶液と７７μｌ（０．３２５ｍｍｏｌ）のｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを加えさらに３０分間撹拌した。その後、３２５μｌの０．５Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）を加え反応を停止させた。この溶液からＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５  ｃｏｌｕｍｎ（カラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）φ１５ｍｍ  ｘ  ３００ｍｍ、移動相；５０ｍＭ−１Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）によって化合物７を精製した。
実施例１３  アセチレン型リンカーを介してビオチンを結合させたｙ誘導体の合成（図１７）
Ｎ−プロパルギル−ジクロロアセトアミド（図１７の化合物９）の合成
アルゴン置換した１００ｍｌフラスコ中で１．３７ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）のｐｒｏｐａｒｇｙｌａｍｉｎｅ（化合物８）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と２．０２ｇ（２４ｍｍｏｌ）のＮａＨＣＯ３（ナカライテスク）を４０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に加え、氷上で撹拌した。ここにｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌｃｈｌ  ｏｒｉｄｅ（ナカライテスク）２．１２ｍｌ（２２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。この溶液を５％  ＮａＨＣＯ３水溶液４０ｍｌで１回、飽和ＮａＣｌ水溶液４０ｍｌで２回洗浄した後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。これをろ過した後、エバポレートし、化合物９を得た。得られた化合物９は２．６０ｇ（１５．７ｍｍｏｌ、７８．３％）であった。
化合物９に関する構造解析データ；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）２．２６（１Ｈ，ｔ，−Ｃ≡ＣＨ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），４．０６（２Ｈ，ｄｄ，−ＣＨ２−，Ｊ＝２．６，５．３Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｓ，Ｃｌ２ＣＨ−），６．６２（１Ｈ，ｂｓ，−ＮＨ−）．
５−（ジクロロアセチル−３−アミノ−１−プロピニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリドン（図１７の化合物１０の合成）
５ｍｌフラスコに７１ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）の５−ｉｏｄｏ−３−（β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）−２−ｐｙｒｉｄｏｎｅ（Ｉ−ｒｙ、化合物３）を入れ、乾燥アセトニトリルで２回共沸した。これを１ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解させ、６．１ｍｇ（０．０３２ｍｍｏｌ）のＣｕＩ（ナカライテスク）、４２μｌ（０．３０ｍｍｏｌ）のｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ナカライテスク）、５０ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）の化合物９、および１２ｍｇ（０．０１０ｍｍｏｌ）のＰｄ（ＰＰｈ３）４（ナカライテスク）を加え、アルゴン雰囲気中室温で１９時間撹拌した。反応終了後、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏで抽出を行い、有機層を１０ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄した。水層をエバポレートし、０．２２μｍのフィルターユニットでろ過した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで生成物の精製を行った（ＨＰＬＣ条件；カラム、μ−Ｂｏｎｄｓｐｈｅｒｅ  φ１９ｘ  １５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；移動相、溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ、溶媒Ｂ＝アセトニトリル、０−１０分、５−２０％  Ｂ、１０−１８分、２０％  Ｂ、１８−１９分、２０−５％  Ｂ、１９−２４分、５％  Ｂ；溶出速度、１０ｍｌ／分；検出方法、ＵＶ吸収（２６０ｎｍおよび３１８ｎｍ））。生成物（１０）のＨＰＬＣ精製後の収率は２５．２ｍｇ（０．０６４ｍｍｏｌ、３２．２％）であった。
化合物１０に関する構造解析データ；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）３．４５−３．７５（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，５’’），３．７８−３．８７（３Ｈ，ｍ，Ｈ２’，３’，４’），４．１６（２Ｈ，ｄ，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−，Ｊ＝５．３Ｈｚ），４．６４（１Ｈ，ｄ，Ｈ１’，Ｊ＝４．３Ｈｚ），４．７０（１Ｈ，ｄ，３’−ＯＨ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．９０（１Ｈ，ｔ，５’−ＯＨ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｂｓ，２’−ＯＨ），６．４７（１Ｈ，ｓ，Ｃｌ２ＣＨ−），７．５４−７．５７（２Ｈ，ｍ，Ｈ４，６），９．０９（１Ｈ，ｔ，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−，Ｊ＝５．１Ｈｚ），１２．０２（１Ｈ，ｂｓ，Ｈ１）；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，［Ｍ−Ｈ］−（ｎｅｇａｔｉｖｅ）＝３８９．１６（ｆｏｕｎｄ），３８９．０３（ｃａｌｃｄ．），［Ｍ＋Ｈ］＋（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝３９１．２０（ｆｏｕｎｄ），３９１．０５（ｃａｌｃｄ．）；ＵＶ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｈ２Ｏ），λｍａｘ＝２５９ｎｍ，３１６ｎｍ，λｍｉｎ＝２８０ｎｍ．
５−（３−アミノ−１−プロピニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリドン（図１７の化合物１１）の合成
スクリューキャップ付きのガラス瓶に化合物１０を４５ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）入れ、５ｍｌのＨ２Ｏに溶解させた。ここに２８％アンモニア水を１ｍｌ加え、室温で２６時間撹拌した。
ビオチニル化５−（３−アミノ−１−プロピニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリドン（図１７の化合物１２）の合成
化合物１１の反応溶液を５ｍｌフラスコに移し、エバポレートした。得られた残渣を乾燥アセトニトリルで３回共沸した後、４３ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）のｂｉｏｔｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、１ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解させた。これを室温で２時間撹拌した後、５ｍｌのＨ２Ｏを加え、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで生成物の精製を行った（ＨＰＬＣ条件；カラム、μ−Ｂｏｎｄｓｐｈｅｒｅ  φ１９ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；移動相、溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ、溶媒Ｂ＝アセトニトリル、０−１５分、１０−４０％  Ｂ、１５−１５．５分、４０−５０％  Ｂ、１５．５−１８分、５０％  Ｂ、１８−１９分、５０−１０％  Ｂ、１９−２４分、１０％  Ｂ；溶出速度、１０ｍｌ／分；検出方法、ＵＶ吸収（２６０ｎｍおよび３１８ｎｍ））。生成物（１２）のＨＰＬＣ精製後の収率は３５．９ｍｇ（０．０７１ｍｍｏｌ、化合物１０より６１．６％）であった。
化合物１２に関する構造解析データ；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）１．２３−１．６２（６Ｈ，ｍ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−），２．０９（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．５６（１Ｈ，ｄ，−ＣＨＣＨ２Ｓ−，Ｊ＝１２．９Ｈｚ），２．８０（１Ｈ，ｄｄ，−ＣＨＣＨ２Ｓ−，Ｊ＝５．１，１２．５Ｈｚ），３．０４−３．１１（１Ｈ，ｍ，−ＣＨＣＨＳ−），３．４７−３．６２（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，５’’），３．７８−３．８７（３Ｈ，ｍ，Ｈ２’，３’，４’），４．０４（２Ｈ，ｄ，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−，Ｊ＝５．４Ｈｚ），４．０９−４．１２（１Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨＣＨＳ−），４．２６−４．３１（１Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨＣＨ２Ｓ−），４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｈ１’，Ｊ＝４．６Ｈｚ），４．７１（１Ｈ，ｄ，３’−ＯＨ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．９２（１Ｈ，ｔ，５’−ＯＨ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｂｓ，２’−ＯＨ），６．３４（１Ｈ，ｓ，−ＮＨＣＨＣＨ２Ｓ−），６．４１（１Ｈ，ｓ，−ＮＨＣＨＣＨＳ−），７．５３（２Ｈ，ｓ，Ｈ４，６），８．２７（１Ｈ，ｔ，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−，Ｊ＝５．４Ｈｚ），１１．９３（１Ｈ，ｂｓ，Ｈ１）；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，［Ｍ−Ｈ］−（ｎｅｇａｔｉｖｅ）＝５０５．２３（ｆｏｕｎｄ），５０７．１８（ｃａｌｃｄ．），［Ｍ＋Ｈ］＋（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝５０７．２６（ｆｏｕｎｄ），５０７．１９（ｃａｌｃｄ．），［Ｍ＋Ｎａ］＋（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝５２９．２６（ｆｏｕｎｄ），５２９．１７（ｃａｌｃｄ．）；ＵＶ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｈ２Ｏ），λｍａｘ＝２５９ｎｍ，３１８ｎｍ，λｍｉｎ＝２８０ｎｍ．
実施例１４  アセチレン型リンカーを介してビオチンを結合させたｙの誘導体の三リン酸化（図１８）
ビオチニル化５−（３−アミノ−１−プロピニル）−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリドン  ５’−トリホスフェート（Ｂｉｏ２−ｙＴＰ，図１８の化合物１３）の合成
アルゴン置換した５ｍｌフラスコに２５．６ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）の化合物１２と１６．２ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）のＰｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れ、２５０μｌのｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ナカライテスク）に懸濁させ、氷水中で１５分間撹拌した。ここに６μｌ（０．０６５ｍｍｏｌ）のｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ（ナカライテスク）を加え、４℃で８時間撹拌した後、５００μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）の０．５Ｍ  ｂｉｓ（ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＤＭＦ溶液と６０μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）のｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを加えさらに３０分間撹拌した。その後、２５０μｌの０．５Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）を加え反応を停止させた。この溶液からＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５  ｃｏｌｕｍｎ（カラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）φ１５ｍｍ  ｘ  ３００ｍｍ、移動相；５０ｍＭ−１Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）によって化合物１３を精製した。
実施例１５  Ｂｉｏ−ｙＴＰ（化合物６）、Ｂｉｏ２−ｙＴＰ（化合物１３）の濃度およびモル吸光係数の決定
方法
Ｂｉｏ−ｙＴＰ、Ｂｉｏ２−ｙＴＰの濃度は、アルカリフォスファターゼによりリン酸エステル結合を分解後、無機リン酸の含有量を求めることで決定した。また、ヌクレオシド５’−三リン酸のモル吸光係数、イプシロン（Ｅ）、の値は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中での極大吸収波長および波長２６０ｎｍにおける吸光度Ａｂｓ（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定して、計算式  Ｅ＝Ａｂｓ／Ｃｏｎｃ（Ｃｏｎｃ：ヌクレオシド５’−三リン酸の濃度）より決定した。
アルカリフォスファターゼによるリン酸エステル結合の分解反応は、ヌクレオシド５’−三リン酸、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｕｎｉｔｓのＣａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ由来のアルカリフォスファターゼ（ＴａＫａＲａ）を含む反応溶液（４０μｌスケール）を４２℃で１時間インキュベートすることにより行った。リンの定量は、Ｃｈｅｎの方法に従って行った［Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９５６］。反応溶液の半量２０μｌを４ｍｌの水と４ｍｌのＲｅａｇｅｎｔ  Ｃ（６Ｎ  硫酸、蒸留水、２．５％モリブデン酸アンモニウム溶液、１０％Ｌ−（＋）アスコルビンを体積比１：２：１：１で混合した溶液）に加えて、３７℃で２時間振とうしながら反応させた。反応後のサンプルを室温に戻してから８２０ｎｍの吸光度を測定して、検量線からリンの含有量を算出した。
結果
Ｂｉｏ−ｙＴＰの極大吸収波長は３２６ｎｍおよび２６２ｎｍであり、その波長でのイプシロンの値はそれぞれＥ３２６＝７．５×１０３およびＥ２６２＝２．９×１０４であった。また、Ｅ２６０＝２．８×１０４であった。Ｂｉｏ２−ｙＴＰの極大吸収波長は３１７ｎｍおよび２５８ｎｍであり、その波長でのイプシロンの値はそれぞれＥ３１７＝５．３×１０３およびＥ２５８＝１．８×１０４であった。また、Ｅ２６０＝１．８×１０４であった。
実施例１６  ＲＮＡへのＢｉｏ−ｙおよびＢｉｏ２−ｙの位置選択的導入
方法
ＲＮＡへの酵素反応によるＢｉｏ−ｙおよびＢｉｏ２−ｙの位置選択的導入は、ｓを含むＤＮＡ（ｔｅｍｐ３５ｓ；３５−ｍｅｒ）（配列番号８）を鋳型としたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応により行われた（図１９）。ｔｅｍｐ３５ｓもしくはコントロールの鋳型鎖ｔｅｍｐ３５Ａ（配列番号９）と相補的な配列を含むＤＮＡ（Ｔ７ｐｒｉｍ２８Ｎ；２８−ｍｅｒ）（配列番号１０）を、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で混合し、アニーリング操作により二本鎖とし、転写反応に用いた。
Ｔ７転写反応は２０μｌスケールで行い、その組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  ＧＭＰ、１ｍＭ  ＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｂｉｏ−ｙＴＰ、Ｂｉｏ２−ｙＴＰ）、２μＣｉ  α−３２Ｐ］ＡＴＰ、０．５μＭ  二本鎖ＤＮＡ、２．５Ｕ／μｌ  Ｔ７ＲＮＡ  ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）である［Ｏｈｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００１］。３７℃で３時間酵素反応を行い、等量の１０Ｍ尿素を含むＴＰＥ溶液を加えて７５℃で３分加温して反応を終了させた。そして、反応溶液の一部を２０％ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルで電気泳動して、［α−３２Ｐ］ＡＴＰによりラベルされた反応産物をバイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士フィルム）で解析した。
結果
１ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｂｉｏ−ｙＴＰの存在下では、鋳型中のｓに対してＢｉｏ−ｙがＲＮＡ中に取り込まれ、１５−ｍｅｒの産物をゲル電気泳動により確認できた（図１９、レーン２）。同様に、Ｂｉｏ−ｙＴＰとＡＴＰ、ＧＴＰ、さらにＵＴＰの共存下でも、Ｂｉｏ−ｙＴＰが競合して、鋳型中のｓに対して選択的に取り込まれた１５−ｍｅｒの産物（図１９、レーン４）を確認できた。また、Ｂｉｏ−ｙＴＰとＡＴＰ，ＧＴＰ及びＣＴＰ、あるいはＡＴＰ，ＧＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰの共存下でも、Ｂｉｏ−ｙＴＰが競合して、鋳型中のｓに対して選択的に取り込まれた１７−ｍｅｒの産物（図１９、レーン６、８）を確認できた。
ここでは、Ｂｉｏ−ｙを含むＲＮＡがＢｉｏ−ｙを含まない同じ長さのＲＮＡと比較して移動度が小さくなることを利用して、Ｂｉｏ−ｙが取り込まれた転写反応産物かどうかを電気泳動のバンドパターンにより区別することにより、鋳型ＤＮＡのｓに相補したＢｉｏ−ｙのＲＮＡ中への選択的な取り込みを確認した（図１９、レーン２−８）。また、図１９のレーン１０ではＢｉｏ−ｙを含むＲＮＡ  １７−ｍｅｒに相当するバンド（図１９、レーン８）が検出されず、鋳型中のｓを含まない天然ヌクレオチドに対するＢｉｏ−ｙの誤った取り込みはほとんどないことが示唆された。以上の結果から、ｓを含む鋳型ＤＮＡを用いたＴ７転写反応により、Ｂｉｏ−ｙをＲＮＡ中に位置選択的に導入できることがわかった。
Ｂｉｏ２−ｙＴＰでも、Ｂｉｏ−ｙＴＰと同様の結果を得た。１ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｂｉｏ２−ｙＴＰの存在下で、鋳型ＤＮＡ中のｓに対してＢｉｏ２−ｙＴＰがＲＮＡ中に取り込まれ（図１９、レーン１２）、ＡＴＰ及びＧＴＰに加えてＵＴＰ及び／又はもしくはＣＴＰの共存下でも、Ｂｉｏ２−ｙＴＰが競合して、鋳型中のｓに対して選択的に取り込まれた（図１９、レーン１４、１６、１８）。また、鋳型中の天然ヌクレオチドに対するＢｉｏ２−ｙの誤った取り込みは見られず（図１９、レーン２０）、Ｂｉｏ２−ｙをＲＮＡ中に位置選択的に導入できることがわかった。
なお、ｓ・Ｂｉｏ−ｙもしくはｓ・Ｂｉｏ２−ｙ塩基対を用いた転写反応効率は、全長１７−ｍｅｒのＲＮＡのバンドを比較することにより算出された。その結果、天然塩基対用いた転写反応効率を１００％とした場合、ｓ・Ｂｉｏ−ｙもしくはｓ・Ｂｉｏ２−ｙ塩基対を用いた場合で約５０％であった（図１９、レーン１８、１９、２１）。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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