(57)【要約】試料中の微生物や細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記微生物または細胞の数を測定する方法において、微生物または細胞を含む試料を、粘着層が基材の少なくとも片面に積層されてなる粘着シートに接触させて捕捉した上で、微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差（Ｂ−Ａ）を求めるか、又は、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めるか、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、かつ測定試料中の微生物または細胞や夾雑物の位置の変動を抑制して、測定精度の向上と測定の簡便化を図る。
2003102224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の微生物や組織などの細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記微生物または細胞の数を測定する微生物または細胞の計数方法において、以下の工程を含むことを特徴とする微生物または細胞の計数方法。
１）前記微生物または細胞を含む試料を、粘着層が基材の少なくとも片面に積層されてなる粘着シートに接触させて捕捉する工程。
２）前記試料中の微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記第一画像中の輝点を計数する工程。
３）微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第二画像中の輝点を計数する工程。
４）前記第一画像中の輝点数と第二画像中の輝点数との差により、前記微生物または細胞の数を求める工程。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の計数方法において、前記２）〜４）の工程に代えて、以下の工程を含むことを特徴とする微生物または細胞の計数方法。
２）前記試料中の微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得する工程。
３）微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得する工程。
４）前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めることにより、前記微生物または細胞の数を求める工程。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載の計数方法において、前記２）〜４）の工程に代えて、以下の工程を含むことを特徴とする微生物または細胞の計数方法。
２）前記試料中の微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、かつ前記第一画像中の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識する工程。
３）微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得する工程。
４）前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記微生物または細胞の数を求める工程。
【請求項４】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の計数方法において、前記「微生物または細胞を蛍光標識する」方法として、「微生物または細胞内の代謝作用で蛍光化する試薬を用いる」ことを特徴とする生理活性を有する微生物または細胞の計数方法。
【請求項５】
前記生理活性を有する微生物または細胞が、細菌であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の微生物または細胞の計数方法。
【請求項６】
前記粘着シートに捕捉された試料に、前記蛍光試薬を添加した後、微生物または細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液により除去した後、前記第二画像を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の微生物または細胞の計数方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、微生物や組織細胞などを、試薬を用いて蛍光を発する状態とし、この蛍光画像を利用して試料中の微生物または細胞を計数する計数方法に関する。
背景技術
試料中の微生物や動植物等の組織細胞などの検出は、例えば、滅菌状態の確認や、細胞の生存状態の異常等を検出する上で、産業上極めて重要な技術である。以下の説明においては、説明の便宜上、主に細菌を対象として述べる。
自然環境中には、生きているが通常の方法では培養が困難な状態にある細菌が高い割合で存在する。これらの細菌は、一般的な寒天平板培地上にコロニーを形成せず、また液体培地中でも増殖しないことが多い。このため、従来の培養を基本とする方法では検出できない恐れがある。
こうした問題を解決する方法として、細菌内で代謝されて蛍光性となるフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）、カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）、５−シアノ−２，３−ジトリル  テトラゾリウム  クロライド（ＣＴＣ）などを用いて生理活性を維持している細菌を検出する方法があり、それ以外にも、例えばＤＮＡに結合するジアミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）やアクリジンオレンジ（ＡＯ）を用いて遺伝子を標識することで細菌を検出する方法が提案されている。
前記ＦＤＡやＣＦＤＡは、細菌などの微生物または細胞内にある酵素（エステラーゼ）の働きで加水分解されて蛍光性となる。また、ＣＴＣは、微生物または細胞の呼吸に伴って還元されると蛍光性となる。前記いずれの試薬も、溶液として測定対象となる試料中の微生物または細胞に接触させ、微生物または細胞内に取り込まれて反応することにより、蛍光を発する状態となり、この蛍光によって細菌等の微生物または細胞を検出する。
しかしながら、蛍光によって細菌を検出する方法では、試料中に蛍光性の夾雑物が共存した場合、それを検出すべき細菌と誤認し、計数結果の誤差になるという問題があった。
後述する特許文献１は、この問題を解消すべく発明された細菌の検出方法として、以下の方法を開示している。即ち、「（ａ）蛍光性酵素基質で媒体を染色し、その蛍光画像を記録し、（ｂ）染色された媒体に光照射して光退色させた後、その蛍光画像を記録し、（ｃ）上記（ａ）で得られた蛍光画像と、上記（ｂ）で得られた蛍光画像との差画像を取ることを特徴とする生細胞の検出方法。」を開示している。
前記特許文献１に記載の発明においては、要するに、蛍光試薬によって標識した細菌が元々試料に含まれる蛍光性夾雑物よりも光退色しやすいという点に着目し、前記のような手順により蛍光性夾雑物の影響を除去するようにしている。
しかしながら、上記特許文献１に記載の発明においても、下記のような問題がある。
蛍光試薬によって標識した微生物または細胞は、試料に含まれる蛍光性夾雑物よりも光退色しやすいものの、夾雑物の蛍光特性は制御し得ないため、必ずしも、染色された微生物または細胞だけが退色して、夾雑物の蛍光が全て退色しない状態を維持するとは限らない。
夾雑物の蛍光が蛍光標識した微生物または細胞と同様に退色した場合には、その分測定誤差となる。従って、常に、精度の高い微生物または細胞の計数が可能というわけにはいかず、試料の性状が変わった場合には、計測値の精度確保が難しい問題がある。
また、特に液状試料の場合、蛍光標識時や光照射して光退色させる際に、微生物または細胞や夾雑物の位置が変化するため、精度よく計数するためには、測定対象試料の全面観察が必要となる。一般に、顕微鏡観察視野のサイズは小のため、広範囲のスキャンが必要で、測定に長時間を要する問題がある。さらに前記全面観察をしない場合には特に、フィルタ上に試料を捕捉する際に、吸引ろ過を行なって蛍光標識を行なう必要があり、この場合にも手間と時間とを要する問題がある。
〔特許文献１〕
特開平１０−２１５８９４号公報
本発明は上記のような点に鑑みなされたもので、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、かつ測定試料中の微生物または細胞や夾雑物の位置の変動を抑制することにより、測定精度の向上と測定の簡便化を図った微生物または細胞の計数方法を提供することを目的とする。
発明の開示
上記のような課題を解決するため、請求の範囲第１項の発明では、試料中の微生物や組織などの細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記微生物または細胞（両者共存の場合を含む）の数を測定する微生物または細胞の計数方法において、以下の工程を含むことを特徴とする。
１）前記微生物または細胞を含む試料を、粘着層が基材の少なくとも片面に積層されてなる粘着シートに接触させて捕捉する工程。
２）前記試料中の微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記第一画像中の輝点を計数する工程。
３）微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第二画像中の輝点を計数する工程。
４）前記第一画像中の輝点数と第二画像中の輝点数との差により、前記微生物または細胞の数を求める工程。
上記計数方法によれば、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除でき、精度よく微生物または細胞を計数することができる。また、粘着シートに測定試料を粘着固定するので、微生物または細胞の位置の変動誤差要因を排除して、かつ簡便に測定できる。
本発明において微生物とは、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、ウイルスなどが含まれ、細胞とは、動植物由来の培養細胞及びスギやヒノキなどの花粉などが含まれる。
本発明における「生理活性」とは、主に細胞内エステラーゼ活性あるいは呼吸活性を意味しており、本発明ではこれらの活性により蛍光化可能な蛍光試薬にて染色を行なう。そしてこの染色の結果、蛍光標識された微生物または細胞を、「生理活性を有する微生物または細胞」と称する。
前記粘着シートとしては、被験面上の微生物を捕捉するに十分な粘着性を有するとともに平滑な表面構造を有する粘着層が基材上に積層された構造からなる。
該粘着層は、被験面上の微生物または細胞を捕捉するに十分な粘着性を有すればとくに限定されないが、微生物または細胞を蛍光標識する際、蛍光物質が粘着層に含侵し難いこと及び粘着層が溶けて捕捉した微生物または細胞が移動し難いことから、粘着層は非水溶性粘着剤を用いるのが好ましい。
非水溶性粘着剤としては、例えば、アクリル系粘着剤やゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤を用いることができ、蛍光画像取得に際して光学特性に影響が少ないという観点から、透明性が高く、自発蛍光の少ないアクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤が好ましい。
アクリル系粘着剤としては、モノマーとして（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシルなどの（メタ）アクリル酸アルキルエステルを主成分として少なくとも一種類用い、これに共重合性モノマーとして、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸エトキシエチル、（メタ）アクリル酸ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸エチレングリコールなどの親水性モノマーを一種もしくは二種以上共重合させたものを用いることができる。
さらに、このような粘着剤からなる粘着層は、その粘着特性をより良好にするために、イソシアネート化合物、有機過酸化物、エポキシ基含有化合物、金属キレート化合物といった熱架橋剤による処理や、紫外線、γ線、電子線などの放射線照射による処理を行って架橋を施すことが保形性の維持の点から好適である。
ゴム系粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリイソプレン、ポリブテン、スチレン−イソプレン系ブロック共重合体、スチレン−ブタジエン系ブロック共重合体などの主ポリマーに、粘着付与樹脂としてロジン系樹脂やテルペン系樹脂、クロマン−インデン系樹脂、テルペン−フェノール系樹脂、石油系樹脂を配合したものを用いることができる。
シリコーン系粘着剤としては、ジメチルポリシロキサンを主成分とする粘着剤が例示される。
このような粘着層の厚みは、被験面上への接着性や追従性、微生物捕捉性の観点から５〜１００μｍとするのが好ましい。また、捕捉した微生物または細胞の蛍光画像の取得に際しては、粘着層表面の平滑度（凹凸差）は画像取得手段が持つ焦点深度以内、実用上は例えば２０μｍ以下であることが好ましい。平滑度が２０μｍ以下であれば、蛍光画像取得手段の焦点の合致範囲が広くなり、より正確な画像処理ができる。平滑度は表面粗さ計あるいは電子顕微鏡などで粘着シートの断面を観察し、粘着剤表面の凸部の頂点から凹部の最低点までの平均高さを測定して求めることができる。
粘着シートの基材は、粘着層表面に大きな凹凸を形成させず、また、曲面や狭所表面にも自在に圧着しえる柔軟な材質であれば特に限定されないが、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、織布、不織布、紙、ポリエチレンラミネート紙などが例示される。中でも、平滑性の高いポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタンが好ましく用いることができる。また、基材の厚みは、支持体として十分な強度があれば特に制限はないが、５〜２００μｍ程度が好ましい。
粘着シートは、上記粘着剤からなる粘着層を従来から公知の方法によって上記基材上に形成して製造することができる。このようにして得られた粘着シートは任意の形状に裁断して使用に供することができる。
前記請求の範囲第１項の発明と同様の目的を達成するために、下記請求の範囲第２〜４項の発明の方法とすることもできる。即ち、請求の範囲第１項に記載の計数方法において、前記２）〜４）の工程に代えて、以下の工程を含むこととする（請求の範囲第２項の発明）。
２）前記試料中の微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得する工程。
３）微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得する工程。
４）前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めることにより、前記微生物または細胞の数を求める工程。
また、請求の範囲第１項に記載の計数方法において、前記２）〜４）の工程に代えて、以下の工程を含むこととする（請求の範囲第３項の発明）。
２）前記試料中の微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、かつ前記第一画像中の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識する工程。
３）微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得する工程。
４）前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記微生物または細胞の数を求める工程。
上記不感領域設定は、計測状況や試料の状態によって異なるが、例えば「第一画像で得られた輝点の存在位置に対して半径１０μｍの領域」あるいは「画像として縦横とも±５ピクセルの領域」といった設定ができる。この不感領域を適切に設定することによって、微生物数や細胞数を適正に計測することが可能となる。
さらに、前記請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の計数方法において、前記微生物または細胞を蛍光標識する方法として、微生物または細胞内の代謝作用で蛍光化する試薬を用いる生理活性を有する微生物または細胞の計数方法とすることもできる（請求の範囲第４項の発明）。微生物または細胞内の代謝により蛍光性となる試薬としては、前述のＦＤＡ，ＣＦＤＡ，ＣＴＣ等が使用できる。
また、適用メリットの観点から、前記請求の範囲第４項に記載の計数方法において、前記生理活性を有する微生物または細胞が、細菌であること（請求の範囲第５項の発明）が好適である。
さらに、前記請求の範囲第１〜４項の発明の実施態様としては、測定精度向上の観点から、下記請求の範囲第６項の発明が好ましい。即ち、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の計数方法において、前記粘着シートに捕捉された試料に、前記蛍光試薬を添加した後、微生物または細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液により除去した後、前記第二画像を取得する（請求の範囲第６項の発明）。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例について、図１ないし図４に基づき詳細に説明する。
（実施例１：輝点数の差による方法）
図１に基づき、主として請求の範囲第１，５および６項に関わる実施例について以下に述べる。本実施例は、固形試料に含まれる細菌の計数であって、第一画像と第二画像との間の輝点数の差を求めることを利用する細菌数の計測方法に関する実施例である。
まず、細菌（夾雑物を含む）を含む固形試料１を、前記粘着シート２によって捕捉する。前記粘着シートを利用しない場合は、ふき取りやストマッキングによって細菌を捕捉し滅菌水に展開するのが一般的であるが、粘着シートによって、そのサンプリング操作が簡略化される。
次に、蛍光画像取得手段３を用いて、細菌を含む前記粘着シート上の試料の蛍光画像（第一画像）を取得する。取得した画像を画像・演算処理部４で画像処理し、画像中に存在する蛍光輝点数Ａを求める。蛍光標識前に既に存在する輝点は夾雑物である。
画像処理としては、具体的に次のような処理を行う。
▲１▼同一視野で複数画面を取込み、それらを平均化してランダムノイズを低減
▲２▼シェーディング（濃淡）補正
▲３▼エッジ検出により輝点を抽出
▲４▼ラベリングにより、どこまでがひとつながりの個別の輝点かを認識
▲５▼面積が予め設定した範囲に該当する輝点を選別
▲６▼▲５▼で選別された輝点を計数
前記▲５▼で予め設定する面積は、計数すべき細菌のサイズと検出に用いる装置の特性とから決まる数値である。事前に実験検討を行うことにより、例えば「直径０．２〜１０μｍ相当の面積」といった設定が可能である。
続いて、前記粘着シート上に蛍光標識試薬５を添加する。蛍光標識試薬５としては、遺伝子に親和性のあるＤＡＰＩやＡＯを用いれば全細菌を標識できる。死菌の標識にはプロピジウム  イオダイド（ＰＩ）が適している。酵素反応や呼吸など細菌の生理活性によって蛍光を発現するＣＦＤＡやＣＴＣを用いれば、生菌だけを選択的に標識できる。特定の細菌を標識する場合は、抗原抗体反応や特定の遺伝子配列を認識する手法を利用する。前者の場合、目的とする細菌の抗原に特異的に結合する抗体を予め蛍光標識しておき、この蛍光標識抗体を試料と反応させることで特定種の細菌だけを標識する。後者の場合、ＦＩＳＨ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲといった手法を用いて特定の遺伝子をターゲットとして目的の細菌を標識できる。
細菌と反応しなかった蛍光標識試薬が計測上のノイズとなる場合がある。この場合には、細菌に取り込まれなかった試薬を洗浄液１６により除去することが有効である。このとき、細菌や蛍光性夾雑物は、粘着固定されているために流れ去らず、計測上の誤差を生じない。
洗浄液としては、蛍光標識発現に適した組成、ｐＨを有する緩衝液が適している。例えば、ＡＯやＣＦＤＡは中性〜アルカリ性で蛍光発現効率が良好で、このようなｐＨを有する緩衝液を用いることによりコントラストの高い蛍光画像を得られる。具体的にはｐＨが６．５〜９．０の範囲が好ましく、非特異的な染色を軽減させるという観点から、７．０〜８．５、さらには７．０〜８．０の範囲にあることがさらに好ましい。
このような緩衝液の成分には、上記ｐＨにて安定な緩衝成分を含むことが望ましく、具体的にはリン酸塩、ホウ酸塩、トリス塩などが好適に用いられ、リン酸塩が特に好適に用いられる。このような緩衝成分の濃度は種類によって適宜選択すればよいが、安定な染色結果を得る観点から１〜５００ｍＭの間にあることが望ましく、とくに５〜３００ｍＭの範囲が好適である。また、これらの緩衝液は、微生物または細胞との等張性を維持する目的から塩化ナトリウムや糖類などを含んでいてもよい。
蛍光標識の後、再び前記粘着シート上の試料の蛍光画像（第二画像）を取得する。取得した第二画像に第一画像と同様の画像処理を行い、画像中に存在する蛍光輝点数Ｂを求める。そして、第一画像と第二画像との間で輝点数の差（Ｂ−Ａ）すなわち、蛍光標識によって現れた輝点数を求め、これを細菌数とする。
（実施例２：差分画像の利用による方法）
図２に基づき、本発明の請求の範囲第２項に係る実施例について説明する。この実施例は、第一画像と第二画像との間で差分画像を求めることを利用する細菌数の計測方法である。
手順としては、まず、実施例１と同じく、細菌を含む試料を、前記粘着シート上に捕捉する。次に、細菌を含む粘着シート上の試料の蛍光画像（図２の中央部に示す第一画像６）を取得する。続いて、粘着シート上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。細菌に取り込まれなかった蛍光標識試薬を洗浄液で洗い流した後、再び粘着シート上の試料の蛍光画像（図２の左側に示す第二画像７）を取得する。そして、前記第二画像７と第一画像６とにより、図２の右側に示す差分画像８を求める。
差分画像８中に存在する輝点が蛍光標識によって現れた輝点であり、これを細菌数として計数する。前述のように、細菌を粘着シートで保持しない場合には、蛍光標識や洗浄の操作によって、細菌を含む輝点が移動してしまい、理想的に差分画像を得るのは困難であった。そのため、蛍光標識や洗浄による細菌の移動を防ぐために、吸引ろ過を行ったままで蛍光標識や洗浄を行っていたが、本実施例によれば、これらの問題を解消し、簡便な操作で細菌の計数を行うことができる。
なお、実際に画像間で差分を行う際は、上述の処理で理想的な結果が得られないケースがある。具体的には、次のような場合、単純な差分画像では適正な輝点数を得るのが難しい。
▲１▼第一画像と第二画像とで画像取得位置がずれた場合
▲２▼蛍光標識操作の影響や、画像取得時の光学的な条件の違いから、第一画像と第二画像とで画像全体（背景）の輝度が異なった場合
▲３▼画像取得時のピントの合い方や、画像処理時の条件設定の違いによって、第一画像と第二画像とで、各々対応する輝点に由来する画像の形状やサイズが異なった場合
▲４▼第一画像と第二画像とで輝点自体が移動してしまった場合
前記▲１▼の場合は、パターンマッチングという画像処理で二つの画像の位置関係を認識し、対応する位置の差分画像を求めれば正しい結果を得ることができる。
前記▲２▼の場合は、二値化やエッジ検出という画像処理で輝点に由来する信号と背景に由来する信号との区別を明らかにする手法によって対応できる。▲３▼の場合は、本実施例での対応が難しいが、後述の実施例３によれば有効に対応が可能である。▲４▼の場合、画像どうしの差分処理は困難であるが、前述の実施例１で対応できる。
（実施例３：位置情報の利用による方法）
図３に基づき、本発明の請求の範囲第３項に係る実施例について説明する。この実施例は、蛍光輝点の位置情報を利用する細菌数の計測方法である。
手順としては、実施例１および実施例２と同様に、まず、細菌を含む試料を、前記粘着シート上に捕捉する。次に、細菌を含む粘着シート上の試料の蛍光画像（第一画像６）を取得する。画像取得の際、基準点９（図中、白抜きの矢印で示す）を利用し、これを基準に粘着シート上の試料の位置を把握して、第一画像中の輝点の位置情報１０を認識する。続いて、粘着シート上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。その後、再び粘着シート上の試料の蛍光画像（第二画像７）を取得する。第一画像と同様に、画像取得の際、基準点９（図中矢印）を利用し、これを基準に粘着シート上の試料の位置を把握して、第二画像中の輝点の位置情報１１を認識する。
図３に示す第一画像６および第二画像７は、微小ではあるが、平行移動と回転が起きている例を示す。このように、画像取得位置がずれた場合でも、基準点からの相対位置として輝点の位置を正しく認識できる。そして、第二画像７と第一画像６とで輝点の位置情報を比較し、第二画像７になってから初めて現れた輝点情報１２を求める。輝点情報１２で求められた輝点数が、細菌数である。
実際には、面積を持たない点どうしの一致不一致を求めることは難しい。そこで、第一画像６で得られた輝点の存在位置に対して、予め設定した所定の領域を各々の輝点に付随する不感領域として認識させる。不感領域設定は、前述のように、例えば、「第一画像で得られた輝点の存在位置に対して半径１０μｍの領域」あるいは「画像として縦横とも±５ピクセルの領域」と設定する。この不感領域を適切に設定することによって、前述の実施例２で課題となっていた▲３▼の場合にも、細菌数を適正に計測することが可能となる。
（実施例４：液状試料の実施例）
図４に基づき、液状試料中に含まれる細菌を計数する方法について説明する。
はじめに、細菌を含む液状試料１７を、ろ過によってフィルタ１８上に捕捉する。フィルタ１８としては、ポアサイズの均一性が高いメンブレンフィルタが好ましい。用いるメンブレンフィルタのポアサイズは、計測しようとする細菌のサイズによって選択が必要である。細菌を計数する場合は、通常０．２〜０．６μｍ程度が適当である。
次に、フィルタ１８上に捕捉されている細菌（夾雑物を含む）を含む試料を粘着シート２によって捕捉する。以下の操作は上述の実施例１と同様のため説明を省略する。
産業上の利用の可能性
この発明は、前述のように、微生物や組織細胞などを、試薬を用いて蛍光を発する状態とし、この蛍光画像を利用して試料中の微生物または細胞を計数する計数方法に利用できる。前記微生物としては、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、ウイルスなどが含まれ、組織細胞としては、動植物由来の培養細胞及びスギやヒノキなどの花粉などが含まれる。本計数方法の利用分野としては、医療，食品製造，上下水などがある。
この発明によれば、試料中の微生物や細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記微生物または細胞の数を測定する微生物または細胞の計数方法において、前記微生物または細胞を含む試料を、粘着層が基材の少なくとも片面に積層されてなる粘着シートに接触させて捕捉した上で、微生物または細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記微生物または細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差を求めるか、又は、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めるか、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることとしたので、
試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、かつ測定試料中の微生物または細胞や夾雑物の位置の変動を抑制することにより、測定精度の向上と測定の簡便化を図った微生物または細胞の計数方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の実施例に関わる微生物または細胞の計数方法の手順を示す図。
図２は、この発明の実施例に関わる差分画像を利用する方法の模式的説明図。
図３は、この発明の実施例に関わる輝点の位置情報を利用する方法の模式的説明図。
図４は、この発明の実施例に関わる液状試料の微生物または細胞の計数方法の手順を示す図。
〔符号の説明〕
１：固形試料、２：粘着シート、３：蛍光画面取得手段、４：画像、５：蛍光標識試薬、１６：洗浄液。
【図１】
2003102224.tif 000003
【図２】
2003102224.tif 000004
【図３】
2003102224.tif 000005
【図４】
2003102224.tif 000006
【国際調査報告】
2003102224.tif 000007
2003102224.tif 000008
2003102224.tif 000009
2003102224.tif 000010