(57)【要約】本発明によれば、１）  タンパク質含有試料をタンパク質活性化物質で処理してＤＮＡ結合能を有する活性化タンパク質含有試料を得て、２）  担体に抗ハプテン抗体を固相化し、３）  ハプテン化ＤＮＡプローブを抗ハプテン抗体に結合させ、４）  １）の活性化タンパク質含有試料を３）のハプテン化ＤＮＡプローブと反応させて、活性化タンパク質／ハプテン化ＤＮＡプローブの複合体を形成し、５）  特異抗体を加えて、複合体を特異的に認識させ、６）  発色用酵素標識二次抗体を加え、７）  発色試薬を加えて発色反応を生じさせ、発色の度合いを吸光度により測定し、８）  非活性化タンパク質含有試料について測定される吸光度との比較から、タンパク質の活性レベルを測定することからなる、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
１）  タンパク質含有試料をタンパク質活性化物質で処理してＤＮＡ結合能を有する活性化タンパク質含有試料を得て、
２）  担体に抗ハプテン抗体を固相化し、
３）  ハプテン化ＤＮＡプローブを抗ハプテン抗体に結合させ、
４）  １）の活性化タンパク質含有試料を３）のハプテン化ＤＮＡプローブと反応させて、活性化タンパク質／ハプテン化ＤＮＡプローブの複合体を形成し、
５）  特異抗体を加えて、複合体を特異的に認識させ、
６）  発色用酵素標識二次抗体を加え、
７）  発色試薬を加えて発色反応を生じさせ、発色の度合いを吸光度により測定し、
８）  非活性化タンパク質含有試料について測定される吸光度との比較から、タンパク質の活性レベルを測定すること
からなる、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定方法。
【請求項２】
６）の工程で、ビオチンおよびストレプトアビジンが二段階に分けて用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質含有試料がダイオキシン類の毒性発現に関与するタンパク質を含み、タンパク質活性化物質がダイオキシン類または多環性芳香族炭化水素である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質活性化物質が、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、３−メチルコランスレン、インディゴ、インディルビン及びイソインディゴからなる群から選択される請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
タンパク質含有試料がＡｈＲ−Ａｒｎｔを含み、ハプテン化ＤＮＡプローブがＴＮＧＣＧＴＧ（Ｎは任意の塩基）の７塩基を含み、かつ特異抗体がＡｒｎｔタンパク質のＣ末端部分またはＡｈＲタンパク質のＮ末端部分を構成するペプチドを合成し免疫感作にて得られる抗体である請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
活性化タンパク質含有試料中のタンパク質濃度が４〜３０ｍｇ／ｍｌである請求項３〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載される１）の工程で、タンパク質含有試料が、タンパク質活性化物質での処理の前もしくは後に、タンパク質活性化物質とは異なる被験化学物質を用いて処理されるか、または被験化学物質とタンパク質活性化物質を同時に用いて処理されることにより、被験化学物質の活性化抑制作用を検定することからなる、タンパク質の活性化抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１に記載される１）の工程で、タンパク質含有試料が、タンパク質活性化物質および該物質とは異なる被験化学物質それぞれを用いて個別に処理され、両者を比較することにより、被験化学物質の活性化作用を検定することからなる、タンパク質の活性化剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
抗ハプテン抗体を固相化した担体、ハプテン化ＤＮＡプローブ、プローブと活性化タンパク質との複合体を特異的に認識する特異抗体、検出用試薬および発色試薬からなる、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定用キット。
【請求項１０】
担体が、抗ハプテン抗体にハプテン化ＤＮＡプローブを結合してなる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
検出用試薬として、ビオチン化二次抗体含有試薬およびストレプトアビジン含有試薬が含まれる請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
活性化タンパク質がダイオキシン類または多環性芳香族炭化水素を用いて得られる、ダイオキシン毒性の発現に関与するタンパク質の活性を測定するための請求項９〜１１のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１３】
活性化タンパク質が、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、３−メチルコランスレン、インディゴ、インディルビン及びイソインディゴからなる群から選択される少なくとも１つを用いて得られる、請求項９〜１２のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１４】
ＴＮＧＣＧＴＧ（Ｎは任意の塩基）の７塩基を含むハプテン化ＤＮＡプローブおよびＡｒｎｔタンパク質のＣ末端部分またはＡｈＲタンパク質のＮ末端部分を構成するペプチドを合成し免疫感作にて得られる特異抗体が用いられる、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性を測定するための請求項９〜１３のいずれか１つに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定方法に関する。詳しくは、本発明は、サウスウエスタン・ケミストリーと称される生化学的手法にＥＬＩＳＡ法を組合せた方法をさらに改変することにより開発された、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定方法に関し、該タンパク質の活性化剤および活性化抑制剤のスクリーニング方法ならびにＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定用キットに関する。
背景技術
生物には、化学物質との反応によって活性化され、特定のＤＮＡ配列（コンセンサス配列）に対する結合能を生じて該配列に結合することにより、種々の作用を発揮するＤＮＡ結合性タンパク質の介在する機序が多く存在する。
例えば、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）および３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）などの多環性芳香族炭化水素化合物（アリール炭化水素化合物）は、ＤＮＡ結合性タンパク質であるアリール炭化水素受容体（Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＡｈＲと称する、分子量  約１００ｋＤ）と結合し、これがさらにＡｒｎｔ（ＡｈＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓ−ｌｏｃａｔｏｒ、分子量  約９０ｋＤ）と結合することで、これらのタンパク質のコンフォメーションを変化させてダイオキシン−ＡｈＲ−Ａｒｎｔの複合体を形成し、ＴＮＧＣＧＴＧ（Ｎは任意の塩基）の７塩基からなるＤＲＥ（Ｄｉｏｘｉｎｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）配列を含むＤＮＡに対する結合能を生じて、前記複合体をこのＤＮＡ配列に結合させることで毒性を発現することが知られている。
従来、ダイオキシン類の分析には、ガスクロマトグラフィー・質量分析法（ＧＣＭＳ法）が公定法として定められている。この方法によれば、ダイオキシン類が試料中に低濃度で存在する場合でも、その分析結果が感度および精度の両面において満足できる。
しかしながら、この方法では、既知物質のみが分析の対象となり、ダイオキシン様の生理活性、すなわちダイオキシンに似た毒性を有する新規な化学物質を分析できない。また、この方法では、試料に対して非常に複雑な化学的前処理が必要であり、しかも分析機器が高価であるという難点がある。
ＤＮＡ結合性タンパク質ＡｈＲ−Ａｒｎｔの性質を利用する分析方法としては、ゲルシフトアッセイ法があり、ダイオキシン−ＡｈＲ−Ａｒｎｔ複合体を、予め３２Ｐ−ＡＴＰで放射性同位元素標識したＤＲＥ配列を含むＤＮＡプローブと反応させて、ダイオキシン−ＡｈＲ−ＡｒｎｔとＤＮＡプローブとの複合体を形成させ、この複合体を電気泳動で分離し解析する。
しかし、この方法によるダイオキシンの解析は、バンドの移動度および濃度を指標とするため定量性に劣り、その結果は、一般的に定性もしくは半定量解析に留まる。また、正確に定量を行うためにはバンドの放射性同位元素量を測定するための高価な機器が必要となるのみならず、ＧＣＭＳ法と同様に多種類の被験物質を一度に処理、解析することが困難である。
３２Ｐ−ＡＴＰでの標識に代えて、ビオチン等を用いてハプテン標識を行う方法もあるが、放射性同位元素を用いる方法と同様に多種類の被験物質を一度に処理、解析することが困難であることは変わりがない。また、このような方法では、最終的に酵素発色を用いるため、感度が低くなる面において問題がある。
最近では、Ａｈイムノアッセイ法と呼ばれる新たな分析方法が実用化されている（産業と環境、平成１２年４月号（２９巻４号））。
この方法は、ＤＮＡプローブを予めマイクロタイタープレートに固定化することによりＡｈＲ−Ａｒｎｔを介してダイオキシン類を結合させ、ＡｈＲ−Ａｒｎｔに特異的に反応する一次抗体、発色反応を生じる二次抗体および発色試薬を順次添加して、発色の度合いを吸光度で測定することにより、ＡｈＲ−Ａｒｎｔに結合したダイオキシン類を定量分析するものである。
この方法では、ストレプトアビジン−ビオチンがＤＮＡプローブと担体との固定化に用いられていると考えられることから、最終的な発色段階でストレプトアビジン−ビオチンを感度向上（増感）に用いることができないため、この方法によってダイオキシン様の活性を有する化学物質が検出されたとしても、その感度は満足できるものではない。さらに、肝臓、腎臓、脳など内在性ビオチンを多く含む組織、あるいはこれら組織に由来する培養細胞や株化細胞などよりタンパク質含有試料を作製し、これらを、ストレプトアビジン−ビオチン反応をＤＮＡプローブの固定化に利用した測定系に添加した場合、試料中に含まれるビオチンによる影響が懸念される。
発明の開示
このような状況下、本発明者らは、従来は放射性同位元素を使用しないサザンブロッティング法などのハプテン化分子の生化学的および組織化学的検出法に適用されている抗ハプテン抗体をＤＮＡの担体への固定化に用いることにより良好な検出感度が得られ、特にストレプトアビジン−ビオチンによる増感が可能になることから、目的のＤＮＡ結合性タンパク質に特有のタンパク質活性化物質および結合ＤＮＡ配列を用いることにより、いずれのＤＮＡ結合性タンパク質の活性も簡便、迅速かつ高精度に多検体を同時に測定できること、また、当該タンパク質のみならず、その活性化剤および活性化抑制剤のスクリーニングも可能であることを見出し、この発明を完成した。
したがって、この発明によれば、次の工程：
１）  タンパク質含有試料をタンパク質活性化物質で処理してＤＮＡ結合能を有する活性化タンパク質含有試料を得て、
２）  担体に抗ハプテン抗体を固相化し、
３）  ハプテン化ＤＮＡプローブを抗ハプテン抗体に結合させ、
４）  １）の活性化タンパク質含有試料を３）のハプテン化ＤＮＡプローブと反応させて、活性化タンパク質／ハプテン化ＤＮＡプローブの複合体を形成し、
５）  特異抗体を加えて、複合体を特異的に認識させ、
６）  発色用酸素標識二次抗体を加え、
７）  発色試薬を加えて発色反応を生じさせ、発色の度合いを吸光度により測定し、
８）  非活性化タンパク質含有試料について測定される吸光度との比較から、タンパク質の活性レベルを測定すること
からなる、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定方法（以降、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法と称する）、該タンパク質の活性化剤ならびに活性化抑制剤のスクリーニング方法およびＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定用キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、ＤＮＡ結合性タンパク質を含むものであれば、動物もしくは植物の組織、細胞もしくはそれらの抽出物、または水もしくは土壌などの自然環境中に見出されるあらゆるタンパク質含有試料、さらには該ＤＮＡ結合性タンパク質を含む食品などの人為的操作が加わった試料について適用することができる。
そのようなタンパク質としては、ダイオキシン類の毒性発現に関与するタンパク質、具体的にはＡｈＲ−Ａｒｎｔ、内分泌攪乱作用に関するタンパク質、具体例としてエストロジェン受容体（ＥＲ）、免疫機能に関与する転写因子、具体例としてＮｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ  Ｂ（ＮＦ−κＢ）、発がんに関与する転写因子、具体例としてＡｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＡＰ−１）などが挙げられ、それぞれに適当なタンパク質活性化物質で当該タンパク質、または当該タンパク質を含む細胞、組織、動物個体などを処理することにより、コンセンサス配列に対するＤＮＡ結合能を生じさせることができる。
例えば、ＡｈＲ−Ａｒｎｔ含有試料は、様々な哺乳動物およびそれらに由来する培養細胞や株化細胞などから調製される組織および細胞溶解液の細胞質画分を調製して得ることができ、その活性化物質としてＴＣＤＤなどのダイオキシン類、またはＡｈＲのリガンドとなりえる、３−ＭＣ、インディゴ、インディルビン及びその構造類縁体であるイソインディゴなどの多環性芳香族炭化水素を用いることによりＤＮＡ結合能を有する活性型となる。
具体例としては、断頭屠殺したラットから摘出した肝臓を試料として用い、これを予め氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流して脱血し、次いでこの肝臓を２倍量の組織破砕用緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０ｍＭジチオスレイトール、１０％  グリセロール；以下ＨＥＤＧ緩衝液と記す）で破砕処理した後、１０５，０００ｘｇ、７０分間、４℃で遠心分離し、上清（細胞質画分）を得ることにより、ＡｈＲ−Ａｒｎｔが得られる。これは、必要に応じて−８５℃で保存することができる。
次に、ＡｈＲ−Ａｒｎｔを４〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調製し、これに０〜１０ｎＭ（終濃度）のＴＣＤＤ、０〜５０ｎＭ（終濃度）の３−ＭＣあるいは０〜５０ｎＭ（終濃度）のインディゴなどのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を加え、２０℃で２時間暗所にて反応させることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを得ることができる。
また、上記の活性化と同時に、対照となる非活性化タンパク質含有試料、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの場合には溶媒のＤＭＳＯのみで処理したＡｈＲ−Ａｒｎｔを調製し、以降の処理を活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔと同様に行う。
ＴＣＤＤなどのＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化物質の溶液をコーンオイルなどの溶媒で作製して任意の動物に投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性化したＡｈＲ−Ａｒｎｔを、動物組織の核タンパク質画分を調製して得ることも可能である。この場合、コーンオイルなどの溶媒を任意の動物に投与して対照となるＡｈＲ−Ａｒｎｔを得ることができる。
具体例としては、ＴＣＤＤのコーンオイル溶液を１μｇ／Ｋｇ体重となるように腹腔内投与したモルモット、あるいは３−ＭＣのコーンオイル溶液を１０ｍｇ／Ｋｇ体重となるように腹腔内投与したラットから摘出した肝臓を試料として用い、これを予め氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流して脱血する。次いで、この肝臓を１０倍量の組織破砕用緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．５ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５μｇ／ｍｌアプロチニン、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２０μｇ／ｍｌロイペプチン）で破砕処理した後、１，５００ｘｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、得られた沈殿の２倍量の核抽出用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオスレイトール、２５％グリセロール、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５μｇ／ｍｌアプロチニン、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２０μｇ／ｍｌロイペプチン）で懸濁する。さらに、得られた溶液を１時間回転攪拌した後、１８，０００ｘｇ、２０分間、４℃で遠心分離し、上清（核タンパク質画分）を得ることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性化したＡｈＲ−Ａｒｎｔが得られる。これは、必要に応じて−８５℃で保存することができる。
ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法で使用される抗ハプテン抗体は、一般的な免疫学的手法に用いられるハプテン分子、例えばビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を、通常の方法（Ａ．Ｋａｍｂｅｇａｗａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ，Ｖｏｌ．５３（９），ｐ２１６０−ｐ２１６７（１９９５））に従って処理して得られる抗体であり、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよい。
例えば、ポリクローナル抗体は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；分子量６６ｋＤ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ；分子量５８ｋＤ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ；分子量６８ｋＤ）、ヤギ血清アルブミン（ＧＳＡ；分子量６８ｋＤ）などの哺乳動物の血清アルブミン、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ；分子量４５ｋＤ）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ；分子量約１０００ｋＤ）などのキャリア・プロテインにハプテン分子を化学結合させた結合体を免疫原（抗原）として、通常の免疫感作法（Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗｓｏｍｅら、Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｏｆｆ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７０，ｐ１０２５−ｐ１０２７（１９８７））に従って得ることができる。
免疫感作に用いられる動物としては、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、イヌ等の哺乳動物が挙げられ、動物から採取した血液を、遠心分離；硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる沈殿法；ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーなどの通常の方法による分離・精製を経てポリクローナル抗体とすることができる。
高度の特異性および親和性を有するモノクローナルの抗ハプテン抗体は、上記の免疫感作を受けた哺乳動物から、免疫原に対する抗体の産生能を獲得したＢ細胞を複数分離し、該細胞を連続的かつ無限的に細胞分裂・増殖し得るミエローマ細胞のような腫瘍細胞とそれぞれ融合させたのち、生成する複数の融合細胞（ハイブリドーマ細胞）の中から所望の抗体を効率的に産生するハイブリドーマ細胞を単離・クローン化し、試験管内または動物生体内で培養することにより製造することができる。
上記のようにして得られる抗ハプテン抗体のなかでも、ハプテン分子にＦＩＴＣを用いて得られるポリクローナル抗ハプテン抗体が好ましく、ウサギ由来のポリクローナル抗ハプテン抗体が特に好ましい。
抗ハプテン抗体の固相化に使用される担体としては、ＥＬＩＳＡ法において通常用いられる担体を使用することができ、たとえば、マイクロタイタープレート、試験管のプラスティック表面、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ガラスもしくはプラスティック等からなるビーズ表面、デキストラン、セルロース、ニトロセルロースもしくはその他タンパク質結合性素材の細片の表面等が挙げられる。これらの担体は、意図された目的に応じて種々の形状を有していてもよく、例えば、皿状、球状、穴状、プレート状、小型ロッド状、セル状、小型チューブ状、小型ボトル状、ファイバー状、ネット状などの形状であってもよい。
担体の具体的な例としては、透明プラスティック材料、例えばポリ塩化ビニルまたはポリスチレンからなるマイクロタイタープレート、ポリスチレンおよびポリスチレンラテックスからなる小球、チューブまたはロッド等が挙げられる。これらのうち、ポリスチレンの９６穴マイクロタイタープレートは、取り扱いが容易であり、特に好ましい。
抗ハプテン抗体の担体への固相化は、ＥＬＩＳＡ法において通常用いられるグルタルアルデヒドまたは臭化シアンなどにより担体表面を活性化し、これに抗ハプテン抗体を含有する溶液を添加し、反応させることにより行うことができるが、この方法に限定されるものではない。
例えば、担体としてポリ塩化ビニルまたはポリスチレンからなるマイクロタイタープレートを使用する場合は、抗ハプテン抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）とともに担体に添加するのが最適であり、担体に対する抗体の吸着は１〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で平衡化することから、抗ハプテン抗体の最終濃度を０．１〜１０μｇ／ｍＬの範囲内にするのが望ましい。こうして得られる抗ハプテン抗体含有溶液は、例えば穴状のマイクロタイタープレートでは約０．１ｍＬ／穴の容量で用いることができ、約４℃で約６〜２４時間反応させた後、洗浄用緩衝液（例えば０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水；以下ＰＢＳＴと記す）を用いて未反応の抗ハプテン抗体を除去することにより、担体に抗ハプテン抗体を固相化することができる。
固相化後の担体表面にタンパク質等に対する吸着能が残存している場合は非特異的結合の生じる恐れがあるため、本発明の方法で使用されるいずれの抗体とも反応性を示さないタンパク質の高濃度溶液、例えば１％ＢＳＡ溶液、３％スキムミルク溶液、市販のブロッキング専用試薬を非特異結合のブロッキング試薬として用い、ブロッキング操作終了後は、ＰＢＳＴにより担体を洗浄するのが望ましい。得られた抗ハプテン化抗体固相化担体は、必要に応じて冷蔵または冷凍での保存が可能である。
抗ハプテン抗体固相化担体には、次いで、コンセンサス配列を有し、ハプテン化されたＤＮＡプローブを添加する。
かかるＤＮＡプローブは、コンセンサス配列を１〜数ヶ所含む２本鎖ＤＮＡであればよく、その製造法等は限定されず、その５’や３’末端を化学的あるいは酵素的にハプテン標識してハプテン化ＤＮＡプローブとすることができる。
例えば、ＡｈＲ−Ａｒｎｔのコンセンサス配列は前記のとおり７塩基のＤＲＥ配列からなるため、当該配列を含む２６塩基からなるセンス鎖一本鎖オリゴＤＮＡ（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＣＡ−３’）、およびその相補配列であるアンチセンス鎖一本鎖オリゴＤＮＡ（５’−ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＣＧ−３’）を合成した後、それぞれを化学的にＦＩＴＣ標識し、精製し、次いで一本鎖オリゴＤＮＡをアニーリングし、二本鎖ＤＮＡプローブを作製することにより、ＡｈＲ−Ａｒｎｔ用のハプテン化ＤＮＡプローブを得ることができる。こうして得たハプテン化ＤＮＡプローブは、担体に結合させた状態で、必要に応じて冷蔵または冷凍での保存が可能である。
上記のようにして得られるハプテン化ＤＮＡプローブは、そのコンセンサス配列を介して、タンパク質活性化物質で処理されることによりＤＮＡ結合能を生じた活性化タンパク質と結合し、活性化タンパク質／ハプテン化ＤＮＡプローブの複合体を形成する。
例えば、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの場合、予め調製された活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを含むタンパク質試料４０μＬを、１５０ｍＭ塩化カリウム（終濃度）を含むＨＥＤＧ緩衝液１０μＬと混合させ、この混合液を坑ハプテン化抗体とハプテン化ＤＮＡプローブを固相化したマイクロタイタープレートに添加し、約４℃で２時間反応させることにより、活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔ／ハプテン化ＤＮＡプローブの複合体が担体上で形成される。
次いで、活性化タンパク質／ハプテン化ＤＮＡプローブの複合体に対し、複合体を特異的に認識する特異抗体をさらに加える。
特異抗体は、活性化タンパク質の構成分子に対する特異抗体であればよく、その範囲等は限定されない。例えば、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの場合は、ＡｈＲタンパク質の全体やその部分ペプチド、またはＡｒｎｔタンパク質の全体やその部分ペプチドのいずれかに対する抗体であること、さらにはそれがＡｈＲ−Ａｒｎｔの二量体を認識することのできる抗体でもあることが要件となり、これら構成分子を利用する以外は抗ハプテン抗体と同様にして特異抗体を得ることができる。具体的には、Ａｒｎｔタンパク質のＣ末端部分またはＡｈＲタンパク質のＮ末端部分を構成するペプチドを合成し、免疫感作にて得られる特異抗体が好ましく、なかでもヒトまたはマウス由来の該タンパク質に対する抗体が好ましい。
なお、抗ハプテン抗体を産生する免疫動物種と特異抗体を産生する免疫動物種とが同種であることは望ましくない。
次に、特異抗体を発色用酵素標識二次抗体により検出する。したがって、二次抗体は、抗ハプテン抗体に反応性を示さず特異抗体のみに反応性を示すものでなければならず、抗ハプテン抗体の由来動物と同種の動物種を用いて、抗ハプテン抗体と同様にして調製することが望ましい。
また、増感のため検出工程を二段階に分けて行うことにより、良好な検出感度を得ることができる。この場合、特にビオチン−ストレプトアビジン反応を二段階に分けて用いるのが好ましく、例えば、ビオチン化二次抗体含有溶液および酵素標識ストレプトアビジン含有溶液を組み合わせて使用するか、あるいはビオチン化二次抗体およびストレプトアビジンと発色用酵素が共に分子内に多数結合した構造をもつポリマー試薬を各段階で利用することができる。
発色用の酵素としては、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
二次抗体と反応させた特異抗体は、一般的な方法、例えば、発色用酵素にパーオキシダーゼを用いる場合には基質として過酸化水素とｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）あるいは３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）との組み合わせを最終容量１００μＬになるように添加し、室温で約２０〜３０分間反応させることによって発色させることができ、その度合いは、４５０〜４９０ｎｍ、好ましくは４５０ｎｍの波長で、マルチプレートリーダーのような測定装置を用いて吸光度として測定することができる。吸光度の測定は、１Ｎ硫酸水溶液を添加するなどして、発色反応を停止させてから行った方が好ましい。
ＤＮＡ結合性タンパク質の活性レベルは、上記のようにして測定した吸光度を、非活性化タンパク質含有試料について得られる吸光度と比較することにより判定することができる。また、既知のタンパク質活性化物質を用いて、得られた吸光度値から標準曲線を作成し、試料中の未知のタンパク質の活性化物質濃度を既知の活性化物質相当濃度として定量することができる。さらに、タンパク質活性化物質を種々の濃度で使用してＳＷ−ＥＬＩＳＡ法を実施することにより、当該物質のＳＷ−ＥＬＩＳＡ法における定量範囲を明らかにすることができる。
本発明者らの実験によれば、タンパク質がＡｈＲ−Ａｒｎｔである場合、本発明によるＳＷ−ＥＬＩＳＡ法は、タンパク質濃度が低い値、例えば４ｍｇ／ｍｌの場合にはゲルシフトアッセイ法と同程度の定量範囲および検出限界値を示すが、濃度が高い値、例えば２０ｍｇ／ｍｌの場合には、検出限界値を維持する一方で、定量範囲を拡大する。
したがって、本発明によるＳＷ−ＥＬＩＳＡ法は、従来法と比較して、簡便、迅速かつ高精度にＤＮＡ結合性タンパク質の活性を多検体について同時に測定することができ、さらには当該タンパク質の活性化剤および活性化抑制剤をスクリーニングすることも可能である。
活性化抑制剤のスクリーニングの場合には、タンパク質の活性化の際に、比較検討の対象となる、既知タンパク質活性化物質とは異なる被験化学物質で処理した後に、既知のタンパク質活性化物質を用いて活性化処理を行うか、または被験化学物質をタンパク質活性化物質と同時に用いて活性化処理することにより、被験化学物質の活性化抑制作用を検定することができる。さらには、既知のタンパク質活性化物質を用いて活性化処理した後に、被験化学物質を処理することで活性化抑制効果を評価することも可能である。
また、活性化剤のスクリーニングの場合には、被験化学物質を、既知のタンパク質活性化物質による活性化処理と同様にしてタンパク質の処理に用い、これを、既知のタンパク質活性化物質を用いて行った活性化処理と比較することにより、被験化学物質の活性化作用を検定することができる。
被験化学物質は、目的となるタンパク質に対する作用を検討したい化学物質が含まれているものであれば、精製化合物を溶解した溶液；液状食品、固形食品や土壌からの抽出液；あるいは水質調査用試料などに代表される多成分・多化学物質を含む未精製溶液などのいずれであってもよい。
例えば、ＡｈＲ−Ａｒｎｔに対する活性化抑制作用の有無を液状食品について検討する際には、ＡｈＲ−Ａｒｎｔ含有試料を液状食品自体で予め処理するか、あるいは試料をＴＣＤＤなどのＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化物質と液状食品の双方で同時に処理し、得られる吸光度を該ＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化物質単独で処理することで得られる吸光度と比較することによって、ＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化に拮抗する化合物、すなわちＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化抑制剤が液状食品中に含まれているかどうかを検定することができる。
さらに、ＡｈＲ−Ａｒｎｔに対する活性化抑制作用の有無を固形食品について検討する際には、予め固形食品をエタノールなどの溶媒を用いて抽出し得られた抽出液を濃縮乾燥後、水などの溶媒にて溶解もしくは懸濁しＡｈＲ−Ａｒｎｔ含有試料に対して上記と同様に処理することにより、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化抑制剤が固形食品中に含まれているかどうかを検定することができる。
また、本発明によれば、前記のようにして得られる抗ハプテン抗体を固相化した担体、ハプテン化ＤＮＡプローブ、プローブと活性化タンパク質との複合体を特異的に認識する特異抗体、検出用試薬および発色試薬からなる、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定用キットが提供される。
担体は、抗ハプテン抗体にハプテン化ＤＮＡプローブを結合させていてもよい。また、検出用試薬とは、特異抗体に対する二次抗体反応、および所望の場合には、酵素標識反応に関わる試薬を意味し、ビオチン化二次抗体含有試薬、例えばビオチン化二次抗体自体、およびストレプトアビジンが分子内に多数結合したポリマー試薬のようなストレプトアビジン含有試薬が含まれていてもよい。
このようなキットは、タンパク質活性化物質がＴＣＤＤのようなダイオキシン類または３−ＭＣ、インディゴ、インディルビン、イソインディゴのような多環性芳香族炭化水素である場合に、ダイオキシン毒性の発現に関与するタンパク質の活性測定に用いることができる。
具体的には、ＴＮＧＣＧＴＧ（Ｎは任意の塩基）の７塩基を含むハプテン化ＤＮＡプローブ、およびＡｒｎｔタンパク質のＣ末端部分またはＡｈＲタンパク質のＮ末端部分を構成するペプチドを合成し免疫感作にて得られる特異抗体を備えるキットにより、ＤＮＡ結合性タンパク質ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性レベルを測定することができる。
実施例
以下、ＡｈＲ−Ａｒｎｔに関する予備試験および実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではなく、当該技術分野における通常の変更を加えたものも本発明の範囲に含まれる。
予備試験：抗ハプテン抗体の特異性確認
９６穴マイクロタイタープレート（ナルジェヌンクインターナショナル社製）に抗ハプテン抗体である抗ＦＩＴＣウサギポリクローナル抗体（ダコ社製）の固相化を行った。
すなわち、抗ＦＩＴＣ抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で０．４６μｇ／ｍＬ（１：５０００，ｖ／ｖ）に希釈したのち、プレート内の各穴へ１００μＬずつ分注し、４℃で８時間反応させた。該抗ＦＩＴＣ希釈液を除去し、１００μＬのＰＢＳＴで各穴を３回洗浄した。ブロッキング溶液（ナカライテスク製）をＰＢＳＴで５倍に希釈し、プレート内の各穴に１００μＬずつ加えて室温で２時間ブロッキングを行った。
１００μＬのＰＢＳＴで各穴を３回洗浄した後、ブロッキング溶液をＰＢＳＴで１０倍に希釈した緩衝液（抗体希釈用緩衝液）で０．０１〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度にＦＩＴＣ標識ヤギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）タンパク質を希釈し、各穴に１００μＬずつ加え室温で２時間反応させた。１００μＬのＰＢＳＴで各穴を３回洗浄した後、次いで西洋わさび由来パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識した抗ヤギＩｇＧ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）を抗体希釈用緩衝液で１．５μｇ／ｍＬ（１：１０００，ｖ／ｖ）の濃度に希釈し、各穴へ１００μＬずつ添加し、室温で２時間反応させた。プレート内の各穴をそれぞれ４回ずつ洗浄した後、各穴にＴＭＢ発色試薬（ダコ社製）を１００μＬずつ加えて発色反応を開始し、３０分後に１Ｎ硫酸を５０μＬ加えることで発色を停止させた。
プレートを攪拌後、マルチプレートリーダー（ワラック社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、抗ＦＩＴＣ抗体の特異性とＥＬＩＳＡ法における固相化用抗体としての適用性を確認した（図１）。
実施例１：ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法における特異抗体の適用性確認
活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔは、終濃度として１．６１ｎｇ／ｍＬ（５ｎＭ）のＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液を、タンパク質量として１５ｍｇ／ｍＬに調製したラット肝細胞質画分に添加した後、２０℃下で２時間暗所にて反応させることにより予め調製した。また、コントロールとして、同量のＤＭＳＯのみを添加したラット肝細胞質画分を同様に２０℃下で２時間暗所にて反応させた。
９６穴マイクロタイタープレートへの抗ＦＩＴＣウサギポリクローナル抗体の固相化およびブロッキングは、予備試験に記載のように行った。
１００μＬのＰＢＳＴで各穴を３回洗浄した後、あらかじめ合成したＦＩＴＣ標識ＤＲＥ配列を含むＤＮＡプローブ（以下、ＤＲＥプローブとする。センス鎖；５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＣＡ−３’、アンチセンス鎖；５’−ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＣＧ−３’）をＰＢＳＴで２５ｆｍｏｌｓ／１００μＬに希釈し、各穴に１００μＬずつ加えて室温で２時間反応させ、１００μＬのＰＢＳＴで各穴を３回洗浄した。さらに上述の活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔ  ４０μｌと１５０ｍＭ塩化カリウム（終濃度）含有ＨＥＤＧ緩衝液１０μｌとの混合液を各穴あたり５０μＬずつ添加（タンパク質量として１２０μｇ）し、室温で２時間反応させた。
１００μＬのＰＢＳＴで各穴を４回洗浄した後、抗体希釈用緩衝液で特異抗体４種；すなわち（ａ）ヒトＡｒｎｔタンパク質のＣ末端部分を構成するペプチドを合成し免疫感作にて得られる抗体（抗−Ａｒｎｔ  Ｃ−１９）、（ｂ）マウスＡｒｎｔタンパク質のＣ末端部分を構成するペプチドを合成し免疫感作にて得られる抗体（抗−Ａｒｎｔ  Ｍ−２０）（いずれもサンタクルーズ・バイオテクノロジー社製）、（ｃ）マウスＡｈＲタンパク質のＮ末端部分を構成するペプチドを合成し免疫感作にて得られる抗体（抗−ＡｈＲ  ＭＡ１−５１４）（アフィニティー・バイオリージェント社製）及び（ｄ）マウスＡｈＲタンパク質のＮ末端部分を構成するペプチドを合成し免疫感作にて得られる抗体（抗−ＡｈＲ  ＮＢ１００−１２８）（ノーバス・バイオロジカルス社製）を、（ａ）及び（ｂ）は１：１００００、（ｃ）は１：１５００、（ｄ）は１：２０００に希釈し、１００μＬずつを各穴に加えて室温で１時間反応させた。
１００μＬのＰＢＳＴで各穴を３回洗浄した後、次いで二次抗体としてビオチン標識した抗ヤギＩｇＧ抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー社製）あるいは抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー社製）を抗体希釈用緩衝液でそれぞれ０．３４μｇ／ｍＬ（１：５０００）、０．３３μｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度に希釈し、各穴へ１００μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。
１００μＬのＰＢＳＴで各穴を３回洗浄した後、さらにＰＢＳＴでＨＲＰとストレプトアビジンの両方を結合した標識ポリマー試薬（ダコ社製）を０．３３μｇ／ｍＬ（１：２０００）の濃度に希釈し、各穴へ１００μＬずつ添加し、室温で３０分間反応させた。
プレート内の各穴をそれぞれ４回ずつ洗浄した後、各穴にＴＭＢ発色試薬（ダコ社製）を１００μＬずつ加えて発色反応を開始し、３０分後に１Ｎ硫酸を５０μＬ加えることで発色を停止させた。
プレートを攪拌後、マルチプレートリーダー（ワラック社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、図２に示す結果を得た。
この結果、Ａｒｎｔタンパク質ではＣ末端部分、ＡｈＲタンパク質ではＮ末端部分を構成するペプチドに対して調製された抗体がＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化を良好に捉えることが確認された。
実施例２：検出工程の違いによる検出の感度差の確認
ビオチン標識した抗ヤギＩｇＧ抗体とＨＲＰ・ストレプトアビジン標識ポリマー試薬とを用いる実施例１の二段階検出を、抗体希釈用緩衝液で１．５μｇ／ｍＬ（１：１０００）の濃度に希釈したＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）のみを使用する一段階検出と比較した。
特異抗体として抗−Ａｒｎｔ  Ｃ−１９抗体のみを用いる以外は実施例１に準じて行い、一段階検出よりもビオチン−ストレプトアビジンによる二段階増感検出の感度が良好であることを確認した（図３）。
実施例３：ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法との相関性の確認
ゲルシフトアッセイ法は、活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを含む細胞質画分を１５０ｍＭ塩化カリウム（終濃度）を含むＨＥＤＧ緩衝液と混合し、これまでに報告した方法（Ｈ．Ａｓｈｉｄａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．４７６，ｐ２１３−２１７（２０００））に従い行った。なお、ＤＮＡプローブには、実施例１に記載するＤＲＥプローブと同一のＤＮＡ配列を用い、未標識（ＦＩＴＣ標識していないもの）ＤＲＥプローブを３２Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端を３２Ｐラベルし、一反応液量（１２μＬ）あたり０．５μＬのＤＲＥプローブ溶液を添加した。ＡｈＲ−Ａｒｎｔ／ＤＲＥ複合体は、Ｘ線フィルムに露光させた（図４Ａ）。
一方、０〜７５ｆｍｏｌｓのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液を、タンパク質量として４ｍｇ／ｍＬに調製したラット肝細胞質画分に添加した後、２０℃下で２時間暗所にて反応させることにより活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを調製し、特異抗体として抗−Ａｒｎｔ  Ｃ−１９抗体を用いて、実施例１のＳＷ−ＥＬＩＳＡ法を行った（図４Ｂ）。
この結果、ゲルシフトアッセイ法では、活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔのバンドの濃さが２５ｆｍｏｌｓまで濃度依存的に増加し、ＴＣＤＤの定量範囲が０．２５〜２５ｆｍｏｌｓであることが示された（矢印）。また、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法では、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化がＴＣＤＤの濃度に依存して増し、定量範囲が０．３〜７５ｆｍｏｌｓ（約０．１〜２０ｐｇ）であった。ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法による検出限界値（０．３ｆｍｏｌｓ）は非常に高感度であり、本方法は、ゲルシフトアッセイ法と同程度の検出感度を有することが確認された。
実施例４：ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化を抑制する化合物のスクリーニングにおけるＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法との相関性の確認
１ｎＭのＴＣＤＤによって誘導されるＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化に対し抑制効果を有する化合物のスクリーニングを目的として、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法（実施例１）およびゲルシフトアッセイ法（実施例３）をそれぞれ行った。
被験物質には、フラボノイドであるアピゲニン、ヘスペレチン、ミリセチン（シグマ社製）、ガランジン、ケンフェロール、タンゲレチン（共にＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）、ケルセチン、ルチン（共に和光純薬工業社製）、ナリンゲニン（ナカライテスク社製）を用い、ＡｈＲ−Ａｒｎｔにおける各化合物含有溶液の終濃度が０．１〜５０μＭとなるように添加し、２０℃で１０分間作用させ、次いで、該反応混液に１ｎＭ  ＴＣＤＤを２０℃で２時間処理した。
ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法の測定結果は、ＴＣＤＤのみで処理したＡｈＲ−Ａｒｎｔの吸光度を１００％、ＤＭＳＯのみの時のそれを０％として算出した。一方、ゲルシフトアッセイ法の結果はＸ線フィルムに露光させ、イメージング・アナライザーでＡｈＲ−Ａｒｎｔのバンド密度を測定した後、同様に、ＴＣＤＤのみで処理した細胞質のバンド密度を１００％、ＤＭＳＯのみの時のそれを０％として算出した。いずれの方法においても被験物質の各濃度における％から１ｎＭ  ＴＣＤＤのＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化に対する半阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した（図５Ａ）。
その結果、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法の測定結果は、ゲルシフトアッセイ法の結果とよく一致し、両法で得られた半阻害濃度の間に正の相関（ｒ＝０．９５０）が得られた（図５Ｂ）。
これらの結果から、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法は、被験化学物質のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化抑制効果の評価に適用できることが確認できた。
実施例５：ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化に対し抑制活性を有する液状食品のスクリーニング
１ｎＭのＴＣＤＤによって誘導されるＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化に対し、抑制活性を示す液状食品のスクリーニングを目的として、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法（実施例１）およびゲルシフトアッセイ法（実施例３）をそれぞれ行った。
被験食品には、市販飲料１６種（緑茶３種、中国茶、烏龍茶、紅茶２種、オレンジジュース、リンゴジュース、野菜ジュース、アロエジュース、コーヒー、ミルクココア、牛乳、豆乳、ワイン）を用い、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの体積に対し５％の濃度となるよう、１ｎＭのＴＣＤＤと同時に添加した。
ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法およびゲルシフトアッセイ法の結果は、実施例４と同様にして得た（図６）。
その結果、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法で得られた市販飲料１６種のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化に対する抑制効果は、ゲルシフトアッセイ法で得られた結果と良い相関を示した。すなわち、中国茶、烏龍茶、紅茶２種、コーヒー、ミルクココア、牛乳、ワインはＴＣＤＤによるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化をほぼ完全に抑制し、オレンジジュース、リンゴジュース、野菜ジュース、アロエジュース、豆乳は、抑制効果が弱く、緑茶の抑制効果は製品間のばらつきが大きいことがわかった。
これらのことから、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法は、実施例４で示した被験化学物質の抑制効果のみならず、液状食品のような未精製溶液の抑制効果の評価にも適用できることが確認できた。
実施例６：活性化タンパク質濃度の増加による定量範囲の拡大
活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔは、終濃度１ｎＭのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液を、タンパク質量として２０ｍｇ／ｍＬに調製したラット肝細胞質画分に添加した後、２０℃下で２時間暗所にて反応させることにより予め調製した。
活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔ  ４０μＬに１５０ｍＭ塩化カリウム（終濃度）を含むＨＥＤＧ緩衝液１０μＬをそれぞれ混合し、これを各穴あたり５０μＬずつ添加（タンパク質量として８００μｇ）し、室温で２時間反応させた。以降の操作は実施例１に準じて行い、図７の結果を得た。
これによると、ＴＣＤＤの定量範囲は、タンパク質として４ｍｇ／ｍＬ濃度で活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを用いた実施例３（０．３〜７５ｆｍｏｌｓ（約０．１〜２０ｐｇ））と比較して、０．４〜４００ｆｍｏｌｓ（約０．１３〜１３０ｐｇ）に拡大した。
つまり、活性化タンパク質濃度を増加させると、検出限界値は０．４ｆｍｏｌｓで実施例３の場合とほとんど変わらない高感度を保つ一方、定量範囲が拡大されることが示された。
実施例７：特異性抗体の検出限界の比較
実施例１で良好な検出感度を有した３種の抗体（抗−Ａｒｎｔ  Ｃ−１９抗体、抗−ＡｈＲ  ＭＡ１−５１４抗体及び抗−ＡｈＲ  ＮＢ１００−１２８抗体）を用いて、ＴＣＤＤ濃度に依存したＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の検出限界を比較した。
ラット肝臓の細胞質画分にさまざまな濃度のＴＣＤＤを添加して２０℃で２時間作用させた後、活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを検出した（図８）。
ＴＣＤＤの濃度依存性は、抗−Ａｒｎｔ  Ｃ−１９抗体と抗−ＡｈＲ  ＭＡ１−５１４抗体を用いた場合に特によく確認でき、また、これらの抗体はベースラインが低い点で優れていた。
このため、以降の実験では、抗−Ａｒｎｔ  Ｃ−１９抗体（以降、抗Ａｒｎｔ抗体とする）または抗−ＡｈＲ  ＭＡ１−５１４抗体（以降、抗ＡｈＲ抗体とする）を用いた。
実施例８：細胞系におけるＳＷ−ＥＬＩＳＡ法の適用
本発明のＳＷ−ＥＬＩＳＡ法が細胞を用いた試験にも適用できるか否かを検討した。
まず、用いる細胞を選択するため、肝臓由来の３種の株細胞（マウス肝腫瘍由来Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞、ラット正常肝由来ＲＬ−３４細胞およびヒト肝腫瘍由来ＨｅｐＧ２細胞（それぞれ、武田食品工業株式会社より分与、ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋより購入、京都工芸繊維大学伊倉教授より分与）に陰性コントロールとしてＤＭＳＯまたは陽性コントロールとして１ｎＭ  ＴＣＤＤを３７℃で２または２４時間作用させ、各細胞に対するＴＣＤＤの感受性を調べた。
活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔは核内に移行するため、それぞれの細胞から核タンパク質を抽出し、活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを、抗Ａｒｎｔ抗体を用いて検出し、陰性コントロールの４５０ｎｍにおける吸光度に対する陽性コントロールの吸光度の比を算出し、平均値±標準偏差（ｎ＝３）であらわした（図９）。
２時間、２４時間ともに、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞において活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔが最も顕著に検出された。
そこで、ＴＣＤＤでの処理時間を０、１、２、４、８、２４時間とする以外は上記と同様にしてＨｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞中でのＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の時間依存性を抗Ａｒｎｔ抗体または抗ＡｈＲ抗体を用いて検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を求め、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を算出した。
その結果、どちらの抗体を用いた場合でも１〜２時間においてＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化は最大となり、４時間以降は最大値の半分程度に低下して横ばいとなった（図１０）。
また、ＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の濃度依存性を確認するため、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞に０、０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．５、１、５ｎＭ  ＴＣＤＤを処理して３７℃で２時間作用させ、上記と同様にして核抽出液に含まれる活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを検出したところ、どちらの抗体を用いた場合でも０．０１〜０．５ｎＭにおいて直線性が確認でき、抗ＡｈＲ抗体を用いた場合の検出限界は１ｐＭ  ＴＣＤＤであった（図１１）。
以上のことから、細胞を用いた試験でも本発明のＳＷ−ＥＬＩＳＡ法はＴＣＤＤを検出できることが確認できた。
実施例９：ＡｈＲリガンド化合物によるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化検出
ＡｈＲのリガンド化合物であるインディゴ、インディルビンおよびイソインディゴがＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化を検出できるか否かを検討した。
Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞に陰性コントロールとしてＤＭＳＯ、陽性コントロールとして１ｎＭ  ＴＣＤＤ、各１０μＭのインディゴ、インディルビンおよびイソインディゴを処理して３７℃で２時間作用させ、核抽出液中の活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを抗Ａｒｎｔ抗体用いて検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を求め、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を算出した。
その結果、これらの化合物は高濃度（１０μＭ）においてＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化を誘導した（図１２）。
したがって、本発明のＳＷ−ＥＬＩＳＡ法では、ダイオキシン類によるＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化のみならず、ＡｈＲのリガンド化合物についても、そのＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化能を評価できることが確認できた。
実施例１０：細胞系における野菜抽出物のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化抑制効果の検討
細胞系でのＳＷ−ＥＬＩＳＡ法の使用例として、野菜抽出物のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化に対する抑制効果の評価を行った。
０．０５％酢酸の存在下で９０％エタノールを用いるアルコール抽出により得たモロヘイヤ抽出物１または２ｍｇ／ｍｌをＨｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞に２０分、２時間および２４時間含浸させて前処理し、次いでこれに５００ｐＭ  ＴＣＤＤを２時間作用させて、核抽出液中の活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを抗Ａｒｎｔ抗体により検出した。
５００ｐＭ  ＴＣＤＤの吸光度を１００％、ＤＭＳＯ（陰性コントロール）を０％として、それぞれの吸光度から活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを％表示（平均値±標準偏差（ｎ＝３））したところ、モロヘイヤ抽出物は、２または２４時間前処理を行うことにより、５００ｐＭ  ＴＣＤＤが誘導するＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化を３０〜５０％抑制することがわかった（図１３）。
次に、カボチャ、ニンジンおよびパセリについても同様に試験した。
各野菜抽出物は２ｍｇ／ｍｌを用い、前処理は２０分あるいは２時間（モロヘイヤについては、さらに２４時間）行った。
カボチャ、ニンジン、パセリの抽出物が５００ｐＭ  ＴＣＤＤによるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化を２０％程度しか抑制できなかったのに対して、モロヘイヤ抽出物は２時間前処理することで約５０％、２４時間前処理では約７５％抑制し、４種の野菜の中では最も抑制効果が強いことがわかった（図１４）。
実施例１１：動物におけるＳＷ−ＥＬＩＳＡ法の適用
本発明の方法の適用性をヒトの体内により近い環境で評価するために、実験動物を用いてＳＷ−ＥＬＩＳＡ法を行った。
ＳＤ系雄性ラット（７週齢）に、コーンオイルに懸濁した３−ＭＣを１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように腹腔内投与し、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化を誘導した。０時間処理としては、溶媒であるコーンオイルのみを投与した。
３−ＭＣ投与１、３、６、１２時間後に肝臓を摘出し、核抽出物に含まれるＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化の程度を抗ＡｈＲ抗体および抗Ａｒｎｔ抗体を用いたＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法により検出した（図１５）。
ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法の結果はほぼ一致したものであり、実験動物を用いた試験でもＳＷ−ＥＬＩＳＡ法が適用できることが確認できた。
次に、雄性モルモット（７週齢）にＴＣＤＤ（１μｇ／ｋｇ体重）またはコーンオイル（陰性コントロール）を腹腔内投与し、１および３週間後の肝臓の核抽出物中に含まれる活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを、抗ＡｈＲ抗体を用いるＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法により検出した。この際、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法では、陰性コントロールに対するＴＣＤＤの吸光度の比を平均値±標準誤差（ｎ＝３）で評価した（図１６）。
その結果、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法ともに、１週間および３週間後にＴＣＤＤ投与動物で活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを検出することができた。
実施例１２：動物における液状食品のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化抑制効果の検討
動物を用いた場合のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化抑制効果の評価について検討した。
ＳＤ系雄性ラット（５週齢）に水、市販の緑茶または紅茶を１週間自由摂取させた後、３−ＭＣを実施例１１と同様に投与し、投与から２４時間後の肝臓の核抽出物に含まれる活性化ＡｈＲ−Ａｒｎｔを、抗Ａｒｎｔ抗体を用いたＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法により検出した（図１７）。
水摂取群で３−ＭＣによりＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化が誘導されたのに対して、緑茶および紅茶摂取群では活性化が低下していた。
また、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法の結果は、ほぼ一致したものであり、実験動物を用いた抑制効果の試験においても、本発明のＳＷ−ＥＬＩＳＡ法が適用できることがわかった。
本発明によれば、従来法の実施に必要とされていた特殊な実験設備および煩雑な処理を要しない、簡便、迅速かつ高精度に多検体を同時に評価できる、ＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定方法、該タンパク質の活性化剤ならびに活性化抑制剤のスクリーニング方法およびＤＮＡ結合性タンパク質の活性測定用キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗ＦＩＴＣ抗体の特異性とＥＬＩＳＡ法への適用性の確認結果を示す図である。
図２は、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法におけるＡｈＲ−Ａｒｎｔに対する特異抗体の適用性の確認を示す図である。
図３は、一段階検出と二段階検出による検出の感度差を示す図である。
図４は、ＴＣＤＤによるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の濃度依存性および定量範囲を、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法で比較した結果である。Ａ：ゲルシフトアッセイ法、Ｂ：ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法。Ａの矢印は、活性化ＡｈＲ−ＡｒｎｔとＤＲＥの複合体の特異的なバンドを示している。
図５は、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化に対し抑制活性を有する化合物のスクリーニングの結果である。Ａ：１ｎＭ  ＴＣＤＤのＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化に対する各化合物の半阻害濃度（ＩＣ５０値）を示す。白い棒はゲルシフトアッセイ法、黒い棒はＳＷ−ＥＬＩＳＡ法による。Ｂ：ゲルシフトアッセイ法とＳＷ−ＥＬＩＳＡ法それぞれの相関性を示す。
図６は、ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法とゲルシフトアッセイ法による、ＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化に対し抑制活性を有する液状食品のスクリーニング結果を示す図である。
図７は、ＴＣＤＤによる活性化タンパク質濃度の増加に伴う定量範囲の拡大を示す図である。
図８は、ＴＣＤＤによるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化に対する特異性抗体の検出限界の比較を示す図である。
図９は、様々な細胞におけるＴＣＤＤによるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の比較を示す図である。
図１０は、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞におけるＴＣＤＤによるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の時間依存性を示す図である。Ａは抗ＡｈＲ抗体、Ｂは抗Ａｒｎｔ抗体を用いて検出している。
図１１は、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞におけるＴＣＤＤによるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の濃度依存性を示す図である。Ａは抗ＡｈＲ抗体、Ｂは抗Ａｒｎｔ抗体を用いて検出している。
図１２は、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞におけるＡｈＲリガンド化合物によるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化を示す図である。
図１３は、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞におけるモロヘイヤ抽出物のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化抑制効果を示す図である。
図１４は、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞における野菜抽出物のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化抑制効果を示す図である。
図１５は、３−ＭＣを処理したラットの肝臓中におけるＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化の時間依存性を示す図である。Ａ：ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法、Ｂ：ゲルシフトアッセイ法。Ｂの矢印は、ＡｈＲ−ＡｒｎｔとＤＲＥの複合体の特異的なバンドを示している。
図１６は、ＴＣＤＤを処理したモルモットの肝臓におけるＡｈＲ−Ａｒｎｔの活性化を示す図である。Ａ：ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法、Ｂ：ゲルシフトアッセイ法。Ｂの矢印は、ＡｈＲ−ＡｒｎｔとＤＲＥの複合体の特異的なバンドを示している。
図１７は、動物における緑茶と紅茶のＡｈＲ−Ａｒｎｔ活性化抑制効果を示す図である。Ａ：ＳＷ−ＥＬＩＳＡ法、Ｂ：ゲルシフトアッセイ法。Ｂの矢印は、ＡｈＲとＤＲＥの複合体の特異的なバンドを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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