(57)【要約】ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する、特にＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有し、かつＩＬ４による細胞応答は阻害しない新規な抗ＩＬ１３レセプターα１抗体、その可変領域の特徴的アミノ酸配列およびそれらを用いた試料中のＩＬ１３レセプターα１の検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項２】
ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有し、かつＩＬ４による細胞応答は阻害しないことを特徴とする抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項３】
少なくとも１０ｎＭの解離定数でＩＬ１３レセプターα１と結合する請求項１または請求項２に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項４】
ＩＬ１３による細胞応答がＴＦ−１細胞の細胞増殖であり、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性が下記（ａ−１）〜（ａ−３）からなる群より選択される少なくとも１つの活性である、請求項１〜３のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体；
（ａ−１）ＩＬ１３による細胞応答におけるＩＬ１３の用量作用曲線を、２倍高濃度側へシフトさせるのに必要な抗体濃度が、１０μｇ／ｍＬ以下である；
（ａ−２）ＩＬ１３濃度１ｎｇ／ｍＬ存在下における細胞応答に対するＩＣ５０が、１０μｇ／ｍＬ以下である；
（ａ−３）ＩＬ１３濃度１ｎｇ／ｍＬ存在下における細胞応答を抗体濃度１０μｇ／ｍＬで５０％以上阻害する。
【請求項５】
モノクローナル抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれか１つの重鎖可変領域を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体；
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域。
【請求項７】
軽鎖可変領域として、配列番号４、９および１５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号５、１０および１６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域、および配列番号１１および１７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を有することを特徴とする請求項６に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項８】
ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１により産生される抗体。
【請求項９】
ヒト化抗体である請求項１〜７のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体である請求項９に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項１１】
ヒト型キメラ抗体が、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域とからなるヒト型キメラ抗体である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１により産生される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
ヒト化抗体が、ヒト型相補性決定領域移植抗体である請求項９に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項１４】
ヒト型相補性決定領域移植抗体が、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体の重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域とヒト抗体の重鎖定常領域、軽鎖定常領域およびフレームワーク領域とからなるヒト型相補性決定領域移植抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列が、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１により産生される抗体の重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域と同じアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られるヒト抗体である請求項１〜７のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
【請求項１７】
ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有し請求項１〜８のいずれかに記載の抗体の一部を含有する抗ＩＬ１３レセプターα１抗体断片。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１９】
ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体または抗体断片を用いて、被検試料中のＩＬ１３レセプターα１を検出する方法。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体または抗体断片を用いて、ＩＬ１３のＩＬ１３レセプター発現細胞に対する作用を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する新規な抗ＩＬ１３レセプターα１抗体に関する。
背景技術
ＩＬ１３はＴｈ２タイプのサイトカインであり、多くの部分においてＩＬ４と重複する生理活性を有していることが知られている。ＩＬ４と重複する生理活性としては、活性化Ｂ細胞におけるＩｇＥおよびＩｇＧ４産生誘導活性、Ｂ細胞におけるＣＤ２３およびＭＨＣ発現誘導活性（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ  Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：３７３０−３７３４（１９９３）、Ｄｅｆｒａｎｃｅ  Ｔ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１７９：１３５−１４３（１９９４））、単球に対する抗炎症作用（Ｍｉｎｔｙ  Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６２：２４８−２５０（１９９３））が知られている。しかし、ＩＬ−４で認められるようなｎａｔｉｖｅＴ細胞のＴｈ２への分化誘導作用はＩＬ−１３には認められない。このことはＴ細胞はＩＬ４レセプターは発現しているがＩＬ１３レセプターは発現していないためと考えられている（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，Ｖｏｌ．１５：１９−２６（１９９４））。ＩＬ１３レセプターは、ＩＬ１３レセプターα１およびＩｌ４レセプターαという２つのポリペプチドからなるヘテロダイマーである。ＩＬ４レセプターαはＩＬ１３レセプターα１がＩＬ１３に実質的に結合する活性を発揮するのに必須である（Ａｍａｎ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１：２９２６５（１９９６））。ＩＬ４レセプターはＩＬ４レセプターαおよびγ鎖という２つのポリペプチドからなるヘテロダイマーである。このように、ＩＬ１３レセプターとＩＬ４レセプターはＩＬ４レセプターαというポリペプチドを共通して構成要素として含むため、ＩＬ４はどちらの受容体にも結合し、細胞応答を惹起することができる。一方、ＩＬ１３はＩＬ１３レセプターには結合するがＩＬ４レセプターには結合しない。
ＩＬ１３は標的細胞上に発現されているＩＬ１３レセプターに結合することにより活性を発揮する。これまでに、ＩＬ１３レセプターα１とＩＬ１３レセプターα２の２つのＩＬ１３結合ユニットが同定されている。ＨｉｌｔｏｎらがＩＬ１３と低い親和性で結合する（Ｋｄ＝２−１０ｎＭ）マウスＩＬ１３レセプターα１を同定した（Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３：４９７（１９９６））。やはり低い親和性でＩＬ１３と結合するヒトＩＬ１３レセプターα１も同定された（Ａｍａｎ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１：２９２６５（１９９６））。ＣａｐｕｔらはＩＬ１３と高い親和性で結合する（Ｋｄ＝０．２５ｎＭ）ヒトＩＬ１３レセプターα２を同定した（Ｃａｐｕｔ  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１：１６９２１（１９９６））。
ＩＬ１３レセプターを介したシグナル伝達については、Ｊａｋ（Ｊａｎｕｓｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）ファミリーのＴｙｋ２およびＳＴＡＴ６がＩＬ１３により活性化されることが示されている（Ｉｚｕｈａｒａ  Ｋ．ら、Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．，Ｖｏｌ．４８：５０２−５１２（２０００））。ＩＬ４レセプターαはＪａｋ１とアソシエートし、ＳＴＡＴ６を活性化する。ＩＬ１３レセプターα１はタイプＩサイトカイン受容体ファミリーの一員であり、細胞外ドメインにＷＳＸＷＳモチーフを有し、細胞内ドメインに保存されたＢｏｘ１、Ｂｏｘ３モチーフを有する。Ｂｏｘ１とＢｏｘ３はそれぞれＪａｋとＳＴＡＴのリクルートに関与している（Ｓｔａｈｌ  Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６７：１３４９−１３５３（１９９５））。最近の研究によりＩＬ１３レセプターα１の細胞内ドメインはＴｙｋ２およびＳＴＡＴ３とアソシエートしており、ＩＬ４およびＩＬ１３の結合はＳＴＡＴ３のリン酸化を引き起こすことが示された（Ｏｒｃｈａｎｓｋｙ  Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７４：２０８１８−２０８２５（１９９９））。一方、ＩＬ１３レセプターα２は短い細胞内ドメインを有するためシグナル伝達に寄与することはできず、デコイ受容体として働くと考えられているが詳細な機能は解明されていない。
ＩＬ１３と病態の関連については、ＩＬ１３が様々なタイプのアレルギー性疾患に関与しているという証拠が蓄積されてきている。気管支喘息（Ｈｕａｎｇ  ＳＫ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１５５：２６８８−２６９４（１９９５）、Ｋｏｔｓｉｍｂｏｓ  ＴＣ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，Ｖｏｌ．１０８：３６８−３７３（１９９６））、アトピー性皮膚炎（Ｈａｍｉｄ  Ｑ．ら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９８：２２５−２３１（１９９６）、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  Ｉ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１０９：５２６−５３２（１９９７））、ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ（Ｐａｗａｎｋａｒ  ＲＵ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１５２：２０５９−２０６７（１９９５）、Ｇｈａｆｆａｒ  Ｏ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１７：１７−２４（１９９７））、ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ（Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ  Ｈ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３８：１３５０−１３５７（１９９７））の患者の病変部位や末梢血でＩＬ１３の発現がアップレギュレートされていることが報告されている。
ＩＬ１３は、Ｔ細胞以外にマスト細胞、好塩基球などから産生されるサイトカインであるが、マウスの気道過敏性モデルやアレルギー性喘息モデルから気管収縮の強力な制御因子であることが明らかになっている。ＩＬ１３の喘息病態における役割は、ＩｇＥや好酸球を介した生理作用とは独立に気道過敏性亢進や気道上皮細胞からの粘液分泌をも引き起こすと考えられている（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  Ｍ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８２：２２５８−２２６１（１９９８）、Ｇｒｕｎｉｇ  Ｇ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８２：２２６１−２２６３（１９９８））。ＩＬ４受容体欠損マウスへのＩＬ１３欠損マウス由来のＯＶＡ感作ヘルパーＴ細胞の移入による喘息発症モデルの試験から、ＩＬ１３はＩＬ４受容体αからのシグナルとは別に未知のシグナルにより気道過敏性、好酸球浸潤、肺におけるエオタキシン濃度を上昇させていることが明らかにされた（Ｍａｔｔｅｓ  Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６７：１６８３−１６９２（２００１））。ＩＬ１３を気道上皮に特異的に発現させたトランスジェニックマウスの解析により、単核球、好酸球浸潤増加、杯細胞過形成、気道粘液分泌亢進、気道粘膜下の線維化などが生じ、気道過敏性亢進といった喘息病態が観察された（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｖｏｌ．１０３  ７７９−７８８（１９９９））。気道上皮細胞、および気道平滑筋にはＩＬ１３レセプターα１、およびＩＬ４レセプターαが強発現しているが、ＩＬ４レセプターγ鎖はほとんど発現していないことから、ＩＬ１３レセプターが気道組織で発現しており、これら発現細胞がＩＬ１３の標的になっていること、および、ＩＬ４レセプターは気道組織では発現がほとんど認められないことが考えられる（臨床病理  ｖｏｌ．４９  ３６０−３６４（２００１））。このことから、喘息の病態局所においてはＩＬ１３がＩＬ４よりも主要な役割を担っていることが示唆される。
ＩＬ１３レセプターα１に対する抗体としては、ＷＯ９７／１５６６３号公報においてウサギ抗血清が作成されている。モノクローナル抗体としては、Ｐｏｕｄｒｉｅｒ  Ｊ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３０：３１５７−３１６４（２０００））、Ｇｒａｂｅｒ  Ｐ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２８：４２８６−４２９８（１９９８））、Ａｋａｉｗａ  Ｍ．ら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，Ｖｏｌ．１３：７５−８４（２００１））の報告があるが、中和活性のある抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は得られていない。ＩＬ４レセプターに対する抗体はＩＬ１３およびＩＬ４に対するＴＦ１細胞及び単球の反応を阻害することが示されている（ＺｕｒａｗｓｋｉＳ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７０：１３８６９−１３８７８（１９９５））。この抗体の阻害作用のＩＬ１３作用とＩＬ４作用に対する非特異性は、ＩＬ１３レセプターとＩＬ４レセプターがＩＬ４レセプターαを構成要素として共有しているためと考えられている。
発明の開示
上述のように、ＩＬ１３は炎症性疾患の病態局所において発現の増大が観察されているため、ＩＬ１３とＩＬ１３レセプターの結合を阻害し、ＩＬ１３の作用を中和する抗体が得られれば、炎症性疾患の効果的な治療剤となることが期待される。ＩＬ４とＩＬ１３は重複する生理活性を有するが、ＩＬ１３は病態局所において多く存在し、炎症反応に関与する一方、ＩＬ４は抗体産生のクラススイッチや免疫細胞のＴｈ２分化のような恒常的な役割を担っているものと予想される。ＩＬ１３とＩＬ４を非選択的に阻害した場合、ＩＬ１３の作用を抑制することにより局所炎症反応を抑制するという本来の目的に加えて、ＩＬ４の作用の阻害に伴い予期せぬ副作用を引き起こす可能性がある。ＩＬ１３の作用を選択的に阻害することができれば、局所炎症反応を副作用なく効率的に抑制できるものと考えられる。しかしながら、中和活性を有する抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は現在まで取得されていない。更に、ＩＬ１３レセプターに対するＩＬ１３とＩＬ４の作用のうち、ＩＬ１３による作用を阻害し、ＩＬ４による作用は阻害しないという選択的な中和活性を有する抗体についても取得されていなかった。
本発明は、上記の従来技術における問題点を解決するために以下の本件発明を提供する。
１．ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
２．ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有し、かつＩＬ４による細胞応答は阻害しないことを特徴とする抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
３．少なくとも１０ｎＭの解離定数でＩＬ１３レセプターα１と結合する上記１または上記２に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
４．ＩＬ１３による細胞応答がＴＦ−１細胞の細胞増殖であり、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性が下記（ａ−１）〜（ａ−３）からなる群より選択される少なくとも１つの活性である、上記１〜３のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体；
（ａ−１）ＩＬ１３による細胞応答におけるＩＬ１３の用量作用曲線を、２倍高濃度側へシフトさせるのに必要な抗体濃度が、１０μｇ／ｍＬ以下である；
（ａ−２）ＩＬ１３濃度１ｎｇ／ｍＬ存在下における細胞応答に対するＩＣ５０が、１０μｇ／ｍＬ以下である；
（ａ−３）ＩＬ１３濃度１ｎｇ／ｍＬ存在下における細胞応答を抗体濃度１０μｇ／ｍＬで５０％以上阻害する。
５．モノクローナル抗体である上記１〜４のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
６．以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれか１つの重鎖可変領域を有することを特徴とする上記１〜５のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体；
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域。
７．軽鎖可変領域として、配列番号４、９および１５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号５、１０および１６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域、および配列番号１１および１７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を有することを特徴とする上記６に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
８．ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１により産生される抗体。
９．ヒト化抗体である上記１〜７のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
１０．ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体である上記９に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
１１．ヒト型キメラ抗体が、上記１〜７のいずれかに記載の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域とからなるヒト型キメラ抗体である、上記１０に記載の抗体。
１２．重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１により産生される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列を有する、上記１０に記載の抗体。
１３．ヒト化抗体が、ヒト型相補性決定領域移植抗体である上記９に記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
１４．ヒト型相補性決定領域移植抗体が、上記１〜７のいずれかに記載の抗体の重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域とヒト抗体の重鎖定常領域、軽鎖定常領域およびフレームワーク領域とからなるヒト型相補性決定領域移植抗体である、上記１３に記載の抗体。
１５．重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列が、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１により産生される抗体の重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域と同じアミノ酸配列を有する、上記１４に記載の抗体。
１６．ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られるヒト抗体である上記１〜７のいずれかに記載の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体。
１７．ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有し上記１〜８のいずれかに記載の抗体の一部を含有する抗ＩＬ１３レセプターα１抗体断片。
１８．上記１〜７のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
１９．ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１。
２０．上記１〜１７のいずれかに記載の抗体または抗体断片を用いて、被検試料中のＩＬ１３レセプターα１を検出する方法。
２１．上記１〜１７のいずれかに記載の抗体または抗体断片を用いて、ＩＬ１３のＩＬ１３レセプター発現細胞に対する作用を阻害する方法。
発明を実施するための最良の形態
抗ＩＬ１３レセプターα１抗体とは、ＩＬ１３レセプターα１を特異的に認識する抗体である。本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、ＩＬ１３による細胞応答を阻害することを特徴とする。すなわち、本発明の抗体はＩＬ１３レセプターα１中和抗体である。ＩＬ１３による細胞応答とは、ＩＬ１３レセプター発現細胞にＩＬ１３を作用させた際に生じる細胞の生理学的変化のことである。本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、ＩＬ１３レセプター発現細胞に対するＩＬ１３の作用を阻害および／または中和する活性を有する。ここでいうＩＬ１３レセプター発現細胞は、生体中の細胞、生体由来の細胞または培養細胞株のうち天然にＩＬ１３レセプターを発現しているものでもよいし、遺伝子工学的にＩＬ１３レセプターを発現させた細胞であってもよい。ＩＬ１３レセプター発現細胞の具体例としては、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、単球、ＴＦ−１細胞、カルシノーマ細胞株、グリオーマ細胞株、気道上皮細胞および気管支平滑筋細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ＩＬ１３とＩＬ１３レセプターはいずれの動物種由来のものであっても良いが、同種由来の組み合わせで用いることが好ましい。特に好ましくはヒト由来である。ＩＬ１３が細胞膜上のＩＬ１３レセプター（ＩＬ１３レセプターα１とＩＬ４レセプターαからなるヘテロダイマー）に結合すると、ＩＬ１３レセプターの活性化が起こる。ＩＬ１３レセプターの活性化により、ＳＴＡＴ６やＳＴＡＴ３のリン酸化がおこり、シグナル伝達の結果として遺伝子発現の質的量的変化、発現蛋白の質的量的変化、細胞形態の変化、細胞の増殖等の細胞の生理学的変化が生ずる。本明細書中において、「ＩＬ１３による細胞応答」とは、このようなＩＬ１３レセプター発現細胞にＩＬ１３を作用させた際に生じる細胞の生理学的変化のうち、当業者が通常用い得る実験的手段において検出可能な変化であればいずれのものでも良い。実験的手段としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系が好ましい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系の例を以下に示す。
例えば、ヒト赤芽球系ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２００３、Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．３：５７１−５７７（１９９１））にＩＬ１３を作用させた場合は、ＩＬ１３用量依存的な細胞増殖という細胞応答がおこる。細胞増殖はＭＴＴアッセイ（生細胞がＭＴＴを分解することを利用した色変化による生細胞数の測定法）により吸光度の増加として検出できるほか、放射性同位体標識チミジン取り込みによっても検出できる。また、ヒト単球にＣＤ４０リガンドもしくはＣＤ４０アゴニスト抗体共存下でＩＬ１３を作用させた場合は、ＩｇＥの産生量増加という細胞応答がおこる（Ｄｅｆｒａｎｃｅ  Ｔ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１７９：１３５−１４３（１９９４））。ＩｇＥの産生量増加は、抗ＩｇＥ抗体を用いた酵素免疫測定法等により測定できる。また、ヒト単球にＬＰＳ共存下でＩＬ１３を作用させた場合には、ＣＤ２３発現量増加という細胞応答が起こる（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７０：１３８６９−１３８７８（１９９５））。また、ＴＦ−１細胞やヒト単球のような天然にＩＬ１３レセプターを発現している細胞にＩＬ１３を作用させた場合は、ＳＴＡＴ６のリン酸化がおこる。ＳＴＡＴ６のリン酸化は、細胞破砕液を抗ＳＴＡＴ６抗体により免疫沈降した後ＰＡＧＥを行い、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロット法により検出できる（Ａ．Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６６：５７９２−５８００（２００１））。本発明の抗体は、上述のようなＩＬ１３による細胞応答のうち、少なくとも１つについて阻害する活性を有すればよい。
ＩＬ１３による細胞応答を阻害するとは、ＩＬ１３による細胞応答が、本発明の抗体添加群では、対照群例えば本発明の抗体無添加群と比べて低値であることをいう。たとえば、下記の式で計算される細胞応答阻害率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
細胞応答阻害率（％）＝（対照群の細胞応答値−抗体添加群の細胞応答値）の絶対値／対照群の細胞応答値＊１００
ここで、細胞応答値は測定する細胞応答の種類によって適宜定められる。たとえば、細胞応答が細胞増殖である場合には、ＭＴＴアッセイによる吸光度を用いることができる。細胞応答がＩｇＥ産生である場合には、たとえば産生ＩｇＥ量を用いることができる。細胞応答がＣＤ２３発現である場合には、たとえばフローサイトメトリーによる蛍光強度を用いることができる。
より具体的には、本発明の抗体の中和活性は、ＴＦ−１細胞のＩＬ１３依存的細胞増殖の阻害アッセイ系において、以下の表現で表すことができる。
抗体濃度が１０μｇ／ｍＬで、ＩＬ１３濃度１ｎｇ／ｍＬ存在下における細胞増殖を１０％以上阻害する活性を有することが好ましい。より好ましくは３０％以上、特に好ましくは５０％以上阻害する活性を有する抗体である。
別の表現においては、ＩＬ１３による細胞応答を阻害するとは、ＴＦ−１細胞のＩＬ１３依存的細胞増殖の阻害アッセイ系において、ある一定濃度のＩＬ１３の条件下、本発明の抗体の細胞応答阻害用量作用曲線を得たとき、ＩＣ５０＝１５μｇ／ｍＬ以下、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは７μｇ／ｍＬ、更に好ましくは３μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは１μｇ／ｍＬであることをいう。典型的なＩｇＧ抗体の分子量を１５０ｋＤａとしたとき、１５μｇ／ｍＬ＝１×１０−７Ｍに相当し、１×１０−７Ｍにおいて５０％以上の阻害活性を有すれば中和活性として十分と考えられる。
より具体的には、本発明の抗体は、ＴＦ−１細胞のＩＬ１３依存的細胞増殖の阻害アッセイ系において、ＩＬ１３濃度１ｎｇ／ｍＬ存在下における細胞増殖に対するＩＣ５０値が１５μｇ／ｍＬ以下である活性を有することが好ましい。より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは７μｇ／ｍＬ以下の活性を有する抗体である。
別の表現においては、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性とは、ＩＬ１３による細胞応答におけるＩＬ１３の用量作用曲線を、２倍高濃度側へシフトさせるのに必要な抗体濃度として表すこともできる。この方法による表現は、細胞応答がＩＬ１３の用量依存的である場合、広い用量範囲の特性を数値化できるので効果的である。また、場合によっては実験条件によって左右されるＩＣ５０や阻害率のような値と違い、実験条件に左右されずアンタゴニスト活性を表現する上で信頼性が高い数値である。ＩＬ１３による細胞応答におけるＩＬ１３の用量作用曲線を、２倍高濃度側へシフトさせるのに必要な抗体濃度の値は、測定する細胞応答によって異なるが、例えばＴＦ−１細胞のＩＬ１３依存的細胞増殖の阻害アッセイ系では、本発明の抗体は、ＩＬ１３による細胞応答におけるＩＬ１３の用量作用曲線を、２倍高濃度側へシフトさせるのに必要な抗体濃度が１０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは７μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは３μｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは１．５μｇ／ｍＬ以下である。
上述のＴＦ−１細胞のＩＬ１３依存的細胞増殖の阻害アッセイ系は、具体的には実施例４に示す方法の他、Ｌａｋｋｉｓ  ＦＧ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．２３５：５２９−５３２（１９９７）の方法，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｖｏｌ．１４０：３２３（１９８９））らの方法などを適宜用いることができる。
本発明の抗体は、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有することを特徴とするが、そのメカニズムはＩＬ１３とＩＬ１３レセプターα１の結合を阻害することによるものと説明できる。ＩＬ１３とＩＬ１３レセプターα１の結合を阻害する抗体が、必ず中和活性を有するとは限らない（Ｇｒａｂｅｒ  Ｐ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２８：４２８６−４２９８（１９９８））。抗体と抗原の結合の性質は、結合の強さおよび抗体が抗原のどの部位に結合するかにより決まるものと考えられる。ＩＬ１３とＩＬ１３レセプターα１の結合を阻害する抗体であっても、適切な結合の強さと適切な抗原結合部位（エピトープ）を有さなければ、中和活性を持つことはない。よって、本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有すると共に、（ａ）ＩＬ１３レセプターα１と本発明の抗体の結合の強さおよび／または（ｂ）本発明の抗体がＩＬ１３レセプターα１のどこに結合するかを定めることにより定義することもできる。例えば、（ａ）としては、少なくとも１０ｎＭ以下、好ましくは５．０ｎＭ以下、より好ましくは３．０ｎＭ以下、更に好ましくは１．５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）でＩＬ１３レセプターα１と結合することである。解離定数は表面プラズモン共鳴により測定することができる。（ｂ）としては、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識することである。エピトープは抗体の相補性決定領域により特異的に認識されるので、エピトープに代えて抗体の相補性決定領域により本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体を定義することも可能である。表面プラズモン共鳴による解離定数は例えば実施例２に示す方法により測定することができる。ＩＬ１３レセプターα１上のハイブリドーマＦ９９７−１３−１、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１が産生する抗体によって認識されるエピトープは、ＩＬ１３レセプターα１の断片ペプチドを適宜作成し、その断片に対して抗体が反応性を有するかをＥＬＩＳＡ法などを用いて決定することができる。
本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有し、かつ以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれか１つの重鎖可変領域を有することを特徴とする；（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域、（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域、（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする重鎖可変領域。さらに、上記重鎖可変領域を有することに加えて、軽鎖可変領域として、配列番号４、９および１５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号５、１０および１６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域、および配列番号１１および１７からなる群より選択されるいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を有することを特徴とする。または、上記重鎖可変領域を有することに加えて、軽鎖可変領域として、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれか１つの軽鎖可変領域を有することを特徴とする；（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域および配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域を有することを特徴とする軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする軽鎖可変領域、（ｃ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる第１の相補性決定領域、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる第２の相補性決定領域および配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなる第３の相補性決定領域を有することを特徴とする軽鎖可変領域。より好ましくは、本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有し、かつ重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列が、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１により産生される抗体の重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域と同じアミノ酸配列を有することを特徴とする。
本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、好ましくは、ＩＬ１３による細胞応答を阻害することに加え、ＩＬ４による細胞応答は阻害しないことを特徴とする。ＩＬ４による細胞応答とは、ＩＬ１３レセプター発現細胞にＩＬ４を作用させた際に生じる細胞の生理学的変化のことである。本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、ＩＬ１３レセプター発現細胞に対するＩＬ１３の作用を阻害および／または中和する活性を有し、かつＩＬ１３レセプター発現細胞に対するＩＬ４の作用は阻害および／または中和しない。ＩＬ４による細胞応答は阻害しないとは、ＩＬ４による細胞応答が、対照群例えば本発明の抗体無添加群と抗体添加群を比べて実質的に同等であることをいう。具体的には、ある一定濃度のＩＬ４の条件下、本発明の抗体の細胞応答阻害用量作用曲線を得たとき、ＩＣ５０＞１５μｇ／ｍＬ、より好ましくはＩＣ５０＞１０μｇ／ｍＬであることを言う。
本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体は、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する限り、いかなる動物種のＩＬ１３レセプターα１を認識するものであっても良い。ヒトＩＬ１３レセプターα１を特異的に認識するものが好ましいが、マウスヒトＩＬ１３レセプターα１に交差反応性を有しても良い。マウスＩＬ１３レセプターα１に交差反応性を有する場合、病態モデルマウスに投与することにより抗体の薬理活性を試験することが可能であり、有用である。
本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体には、ＩＬ１３レセプターα２と交差反応性を有するものも有しないものも含まれる。しかし好ましくは、ＩＬ１３レセプターα２との交差反応性を有しないものである。
交差反応性は、実施例２に示されるような、交差反応性を試験したい抗原を固相化したＥＬＩＳＡ法や、ＢＩＡＣＯＲＥ装置を用いた方法により適宜試験することができる。例えば実施例２に示すＢＩＡＣＯＲＥ装置を用いた方法では、ＲＵ値が５０未満の場合は交差反応性を有しないと判断することができる。
本発明の抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体の有する機能を明確にするため、若しくは明確に発揮させるためには、モノクローナル抗体が好ましい。本発明の抗体はその分子種は特に限定されない。抗体、すなわち免疫グロブリンの構造は重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）とからなり、重鎖のクラス（γ、α、μ、δ、ε）により５つのイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）に分けられる。このうちＩｇＧとＩｇＡは重鎖の違い（例えばヒトの場合、γ１、γ２、γ３、γ４、α１、α２）によりサブクラス（例えばヒトの場合ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかのタイプに分類される。本発明の抗体はいずれのクラス、サブクラスまたはイソタイプに分類される抗体であってもよい。
重鎖および軽鎖のＮ末端側には可変領域が存在し、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）と呼ばれる。可変領域内には相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）が存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖のＣ末端側には定常領域が存在し、それぞれ重鎖定常領域（ＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）と呼ばれる。
重鎖可変領域中には、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補性決定領域と呼ぶ。軽鎖可変領域中にも同様に、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。
ＩＬ１３に対する細胞応答を阻害する活性を有し、中和抗体の一部を含有する本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１中和抗体断片またはペプチドとしては、上記で説明した本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１中和抗体のＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ：ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ：ｄｓＦｖ）、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分のアミノ酸とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＩＬ１３レセプターα１に特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結したポリペプチドのことである。本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。本発明のｓｃＦｖは、本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは本発明のハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体には、本発明のハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらの抗体断片に放射性同位元素、蛋白質または低分子の化合物などを結合させた抗体も含まれる。本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体または抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質あるいは低分子の化合物などを化学的手法［抗体工学入門（金光修著１９９４年（株）地人書館）］により結合させることにより製造することができる。
本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる。
抗原は、ＩＬ１３レセプターα１蛋白質またはその断片ペプチドを用いる。抗原とする蛋白質の由来動物は、抗体の使用目的に応じて適宜選択し得るが、好ましくはヒトＩＬ１３レセプターα１蛋白質またはその断片ペプチドである。また抗原はＩＬ１３レセプターα１としての活性を有していても有していなくてもよく、天然物由来のもの、遺伝子工学的に作成したもの、化学的に合成したもの、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白質等、いずれでも良い。ここでいうＩＬ１３レセプターα１としての活性とはＩＬ１３との結合能を意味する。ＩＬ１３との結合能は、実施例３に示される方法のほか、抗原を固相化し、ＩＬ１３を添加後、抗ＩＬ１３抗体により抗原に結合したＩＬ１３を検出するＥＬＩＳＡ系など公知の方法を用いて検出することが可能である。最も好ましい抗原は、ヒトＩＬ１３レセプターα１の細胞外領域と免疫グロブリンのＦｃフラグメントとの融合蛋白質である。具体的には実施例１に示されるプラスミドｐＭ１７０１は、平成１３年１１月２６日付で日本国茨城県つくば市東一丁目１番１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ  ｐ−１８６３２）、平成１４年１１月２０日付にてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管された（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３８）、を用いて産生することができる可溶型ＩＬ１３レセプターα１−Ｆｃが好ましい抗原である。当該抗原は、ＩＬ１３に対する結合活性を有しない。しかし、当該抗原を用いることにより初めて中和活性を有する抗体を取得することが可能となった。このことは、当該抗原が、中和活性に関係するエピトープを効果的に提示する抗原であることを意味する。
免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を作製する場合は、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはＰ３、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ、ＮＳ−１、ＹＢ２／０及びＹ３−Ａｇ１，２，３等の骨髄腫細胞が含まれる。
免疫は公知の方法により行なうことができる。例えば、抗原を腹腔内、皮下、静脈内またはフットパッド内に投与して行なう。この抗原の投与はアジュバントを併用してもよく、また複数回投与することが好ましい。免疫細胞は抗原の最終投与の数日後、例えば３日後、に摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ましい。
免疫細胞とミエローマ細胞との融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３巻３頁）等の公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する方法または電気融合法等が挙げられる。免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、免疫細胞に対し、ミエローマ細胞を１／１０量ないし等量を使用することが好ましい。細胞融合をＰＥＧ（平均分子量１，０００〜４，０００）を使用して行なう方法ではＰＥＧ濃度は特に限定されないが５０％で行なうことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を添加してもよい。融合は３７℃に加温したＰＥＧ溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、１〜５分間反応後、培地を添加することにより終了する。
この融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。ここで抗体の活性は、第一段階として、ＩＬ１３レセプターα１抗原への結合能を、第二段階として、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を検出する。第二段階の活性の検出方法は前述のとおりである。第一段階の活性の検出方法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
樹立したハイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクロナール抗体を得ることができる。また、ハイブリーマをこれと適合性を有する哺乳動物に投与して増殖し、その腹水より得ることができる。
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。
本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体の抗原結合性を確認する方法、または本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体を用いて生物試料中のＩＬ１３レセプターα１を検出する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、上記に記した酵素免疫測定法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法［単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）］などを用いることができる。
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体などがあげられる。ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体を意味する。ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に遺伝子工学的に挿入して作製した抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、公知の方法（それぞれＮａｔｕｒｅ，３１２：６４３，１９８４、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２，１９８６以来、多くの方法が開発されている）を用いて作製できる。簡単に説明すると、まず、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する抗ＩＬ１３レセプターα１モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、塩基配列およびアミノ酸配列を決定する。次に、ヒト型キメラ抗体の場合は、取得したＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の場合は、先に決定したヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列と置き換えたＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。
ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に用いるヒト抗体の定常領域としては、例えば、ヒト抗体重鎖定常領域としてはＣγ１やＣγ４、ヒト抗体軽鎖定常領域としてはＣκ等の任意のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に用いるヒト抗体のＶ領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列であればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋに登録されているヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）があげられるが、充分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を創製するためには、ＣＤＲのドナーとなるのヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列と高い相同性、好ましくは６５％以上の相同性を有することが望ましい。
ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作成に用いるヒト抗体の定常領域やフレームワーク領域は、既存の方法に従って用意することが可能である（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９（１９８９）、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９２／１１０１８、Ｃｏ等Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９（１９９１）、ＣｏおよびＱｕｅｅｎＮａｔｕｒｅ、３５１巻、５０１頁、１９９１年、ならびに、Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２））。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、石田らが開発した方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７：７２２−７２７（２０００））を用いて作製できる。すなわち、まず、Ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（Ｔｃ）マウスは石田らの方法に従い、ヒト２番染色体断片（Ｉｇ軽鎖κ）と１４番染色体断片（Ｉｇ重鎖）をミクロセル融合法によりマウスＥＳ細胞に導入し、Ｊｏｙｎｅｒらの方法（ジーン  ターゲティング、実験法シリーズ、メディカル・サイエンス・インターナショナル）にしたがい、それぞれの染色体断片を有するキメラマウスを作製する。次に、作製した２種類のキメラマウスを交配することによりヒト２番染色体断片（Ｉｇ軽鎖κ）と１４番染色体断片（Ｉｇ重鎖）の両者を有するキメラマウスを作製する。マウス由来の内因性のマウス抗体の産生を失わせる為、Ｃａｐｅｃｃｈｉらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２９１９−２９２３、１９９２）に従い内因性のＩｇ重鎖とκ鎖をノックアウトしたダブルＫＯマウスを作製し、ヒト染色体断片を導入したキメラマウスと交配させ、ヒト２番染色体断片（Ｉｇ軽鎖κ）と１４番染色体断片（Ｉｇ重鎖）を含み、内因性のＩｇ重鎖とκ鎖をノックアウトしたトランスクロモソームマウスを作製する。作製したＴｃマウスは血中にヒト由来の抗体を産生し、マウスＩｇ重鎖およびマウスＩｇ軽鎖κは検出されない。得られたＴｃマウスは数代経っても染色体は維持され、その子孫を以下の抗ＩＬ１３レセプターα１ヒトモノクローナル抗体の作製に使用できる。
Ｔｃマウスに精製したＩＬ１３レセプターα１抗原５０μｇを、タイターマックスゴールド（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ，ＣｙｔＲｘ社）と混合後、皮下に投与し、３週間後同様に追加投与を行う。抗体価の上昇は、抗原を固相化したプレートに希釈した抗血清を反応させ、続いて抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて結合した血清中のヒト抗体を検出する。細胞融合は、抗体価の上昇したマウスの腹腔に抗原を５０μｇ投与し、３日後に行う。具体的には、採取した脾細胞をマウスミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４）と混合後、ＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）により融合し、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択する。出現したハイブリドーマを抗ヒトＩｇＧκ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＧ２抗体、抗ＩｇＧ３抗体または抗ＩｇＧ４抗体を２次抗体としてスクリーニングし、ＩＬ１３レセプターα１と結合するヒト抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
本発明のハイブリドーマは、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する抗ＩＬ１３レセプターα１抗体を産生するハイブリドーマである。本発明のハイブリドーマは、上述の方法により作製することができる。本発明のハイブリドーマの好ましい例は、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１またはハイブリドーマＦ９９７−１０−１である。
本発明の抗体または抗体断片を用いて、被検試料中のＩＬ１３レセプターα１を検出する方法は、被験試料と本発明の抗体または抗体断片を接触させる工程、本発明の抗体または抗体断片に結合した被検試料中のＩＬ１３レセプターα１を検出する工程を含み得る。被検試料中のＩＬ１３レセプターα１を定量する工程を更に含んでも良い。
本発明の抗体を用いて、被検試料中のＩＬ１３レセプターα１を検出する方法としては、実施例５および６に示されるサンドイッチＥＬＩＳＡ系の他、インヒビションＥＬＩＳＡ系、蛍光抗体法、免疫組織化学染色法、放射性物質標識免疫抗体法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法などがあげられるが、これらに限定されるものではない。対象となる被検試料は限定されないが生物試料が用いられ、動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片が挙げられるが、体液であることが好ましい。より好ましくは、血液、血漿、血清、尿、髄液、リンパ液、唾液、胸水より選ばれる試料である。
インヒビションＥＬＩＳＡ系では、まず、抗原を固相化したプレートを準備し、第一抗体として抗ＩＬ１３レセプターα１モノクローナル抗体を反応させる。同時にＩＬ１３レセプターα１濃度を測定したい培養上清や血清などの被検体を適当に希釈して加え競合反応させる。濃度既知のＩＬ１３レセプターα１蛋白質を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプルの濃度を算出する。その量を健常者と被験者とで比較し、発現量が上昇しているかどうかを調べることにより、被験者がアレルギー性疾患に罹病しているか否かを診断することができる。
蛍光抗体法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６），単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。具体的には、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清などに、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリンなどの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６），単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック，１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）は、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清などに、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）は、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清などに、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法は、細胞または組織などに、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
ウェスタンブロッティング法は、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清などをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する。
免疫沈降法とは、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清などを本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等のイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させるものである。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片で、抗原認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体のうち、あらかじめ一方のモノクローナル抗体または抗体断片はプレートに吸着させ、もう一方のモノクローナル抗体または抗体断片はＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておく。抗体吸着プレートに、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清などを反応後、標識したモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
本発明の抗体または抗体断片を用いて、ＩＬ１３のＩＬ１３レセプター発現細胞に対する作用を阻害する方法は、ＩＬ１３レセプター発現細胞と本発明の抗体または抗体断片を接触させる工程、ＩＬ１３とＩＬ１３レセプター発現細胞を接触させる工程、本発明の抗体または抗体断片によるＩＬ１３のＩＬ１３レセプター発現細胞に対する作用の阻害を検出する工程の少なくとも一つを含み得る。本発明の抗体または抗体断片によるＩＬ１３のＩＬ１３レセプター発現細胞に対する作用の阻害を検出する工程は、前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系の他、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系を用いることも可能である。ここでいうｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系とは、生体に本発明の抗体または抗体断片を投与し、当該抗体または抗体断片が生体の機能やステータスに与える影響を検出する評価系を意味する。たとえば、病態モデル動物に本発明の抗体または抗体断片を投与し、病態の重篤度の指標に与える影響を評価する系が例として挙げられる。
本発明は、本発明の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、被検試料中のＩＬ１３レセプターα１を検出または測定するための試薬またはキットを提供する。当該試薬またはキットは、上述した検出方法の構成等に準拠することができる。
実施例
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
（実施例１）  抗ヒト可溶型ＩＬ１３レセプターα１抗体の作製
［投与抗原の調製］
可溶型ＩＬ１３レセプターα１−Ｆｃ及びＩＬ１３レセプターα１−Ｈｉｓの発現
抗体作製用の投与抗原及びスクリーニング用抗原として用いるため、ヒトＩＬ１３レセプターα１（以下ＩＬ１３Ｒα１と略することがある）の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントとの融合タンパク質（ＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ）およびＩＬ１３Ｒα１の細胞外ドメインのＣ末端にヘキサヒスチジンタグを付加したタンパク質（ＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓ）を作製した。なお、ＤＮＡ操作は特に断りのない限り、モレキュラークローニング第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））にしたがって行った。
ＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ発現プラスミドは、以下の手順により遺伝子工学的に作製した。まず、ＤＮＡデータバンクＥｍｂｌに登録されているヒトＩＬ１３Ｒα１遺伝子の配列Ｙ１０６５９の情報をもとに、センスプライマー１（５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を含む）およびアンチセンスプライマー１（５’末端側に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を含む）を合成し、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリ（クロンテック社）を鋳型としてＰＣＲを行い、ＩＬ１３Ｒα１細胞外ドメイン−−３４３アミノ酸）をコードするｃＤＮＡを含むＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られるＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片）をｐＵＣ１１９（宝酒造株式会社）にサブクローニングした。一方、ヒトＩｇＧ１ＦｃドメインｃＤＮＡが含まれるプラスミドｐＭ１３０４（ＷＯ９７／４２３１９号公報に記載）を鋳型としＰＣＲを行い、あらためてＩＬ１３Ｒα１細胞外ドメインにインフレームで連結可能となるヒトＩｇＧ１ＦｃドメインｃＤＮＡを得た。このＰＣＲのためのセンスプライマー２は、ヒトＩｇＧ１ＦｃドメインＮ末端側をコードするｃＤＮＡ配列を含み、さらにその５’末端側に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を配置して設計し、またアンチセンスプライマー２はヒトＩｇＧ１ＦｃドメインＣ末端側に制限酵素ＫｐｎＩ認識配列を配置して設計したものを使用した。このＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化して得られるＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ）をｐＵＣ１１９にサブクローニングした。ついで、あらためてそれぞれのプラスミドより当該ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片および当該ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を切り出してライゲーションし、哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＦＮのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩインサートと入れ替えて導入し、ＥＦプロモーター下流にＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ遺伝子を連結した発現ベクタープラスミドｐＭ１７０１を作製した。本発明者は、プラスミドｐＭ１７０１を平成１３年１１月２６日付で日本国茨城県つくば市東一丁目１番１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６３２）。また、平成１４年１１月１８日付にてブタペスト条約に基づく国際寄託へ移管した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３８）。
また、前述のセンスプライマー１、およびＣ末端にヘキサヒスチジンを付加したＩＬ１３Ｒα１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡのアンチセンス配列を含むプライマー（５’末端側に制限酵素ＫｐｎＩ認識配列を含む）を用いてＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ発現プラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ＩＬ１３Ｒα１細胞外ドメインＣ末端にヒスチジンタグが付加したタンパク質ｃＤＮＡを含む産物を得た。このＰＣＲの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩの消化断片をＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ発現プラスミドのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩインサートと置き換えることによりＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓ発現プラスミドとした。
得られた発現プラスミドは、以下の方法でＣＯＳ細胞に導入した。即ち、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌと上記各プラスミドＤＮＡ１２．５μｇとを添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間培養した後に培養上清を回収した。ＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓはニッケルカラム（Ｈｉｔｒａｐ−ｃｈｅｌａｔｅ、アマシャムファルマシア）を用いて培養上清より精製し、ＩＬ１３Ｒα１−ＦｃはＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）を用いて精製した。蛋白濃度はＢＳＡを標準品としてバイオラド社のプロテインアッセイ法により濃度を算出した。
［抗ＩＬ１３Ｒα１抗体の調製］
Ｗｉｓｔａｒラット（ＳＬＣより購入）メス８週令のフットパッドに１００μｇの精製可溶型ＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃとフロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）とを１対１で混合したものを投与し、３週間後腸骨リンパ節を摘出し、無菌的にリンパ球を採取した。
得られたリンパ球をマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）と５対１で混合しポリエチレングリコール１５００（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞融合を行った。融合後、細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む１０％胎児血清／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養し、増殖してくるハイブリドーマが確認できた段階でアミノプテリンを除いた培地に交換した。
細胞融合から１週間後に培養上清をサンプリングし、精製可溶型ＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓを固相化したプレートでＩＬ１３Ｒα１に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。すなわち、精製可溶型ＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓを１μｇ／ｍＬでプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に固相化し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。次に培養上清を添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．９％生理食塩水で洗浄した。
各ウエルにペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を添加し、３７℃で１時間反応させ、洗浄後０．０２％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、１０分間反応後０．５Ｍ硫酸で反応を停止した。
プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で吸光度を４５０ｎｍの波長で測定し、吸光度が０．２以上のウエルを抗ＩＬ１３Ｒα１抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
選択したハイブリドーマは限界希釈法（単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛・千葉丈／著、講談社）によりクローニングし、１０日後に同様にスクリーニングを行い、抗ＩＬ１３Ｒα１抗体産生ハイブリドーマ１３ローンを得た。
次にハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０で培養した後、細胞を回収しＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抗体産生を行い、モノクローナル抗体を含む培養上清を得た。培養上清からろ紙で細胞を除いた後、プロテインＧカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ、ミリポア）で精製し、１３種類の精製ヒトＩＬ１３Ｒα１抗体を得た。得られた精製抗体の中より反応性の高いもののサブタイプをＺＹＭＥＤ社のラットタイピングキットを用いて決定したところＦ９９７−２０−１抗体はＩｇＧ１・κ、Ｆ９９７−１３−１抗体はＩｇＧ１・κ、Ｆ９９７−１０−１抗体はＩｇＧ２ｂ・κ、Ｆ９９４−７−２抗体はＩｇＧ２ａ・κ、Ｆ９９７−１８−３抗体はＩｇＧ２ｂ・κ、Ｆ９９７−１７−１抗体はＩｇＧ２ａ・κ，Ｆ９９７−８−１抗体はＩｇＧ２ａ・κであった。
なおＦ９９７−１３−１抗体、Ｆ９９７−２０−１抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマＦ９９７−１３−１、ハイブリドーマＦ９９７−２０−１は、それぞれ、平成１３年１１月２６日付で日本国茨城県つくば市東一丁目１番１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され（それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６３３及び受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６３４）、平成１４年１１月２０日付にてブタペスト条約に基づく国際寄託へ移管された（それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４１及び受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４２）。Ｆ９９７−１０−１抗体を産生するハイブリドーマＦ９９７−１０−１は、平成１４年１１月１３日付で同センターに国際寄託された（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３７）。
（実施例２）  ＢＩＡＣＯＲＥによる抗ＩＬ１３Ｒα１抗体の特異性、親和性の測定
［特異性の検討］
実施例１で作製したヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ及びヒトＩＬ１３Ｒ−Ｈｉｓ、ネガティブコントロールとしてヒトガンマグロブリン（Ｃａｐｐｅｌ社）を１μｇ／ｍｌで９６穴プレートに固定化し、洗浄後０．１％ＢＳＡ／リン酸緩衝液（ｐＨ６．４）でブロッキングを行った。次に各抗体を１μｇ／ｍｌを０．１％ＢＳＡ／リン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で希釈したものを固定抗原なし（ＰＢＳと略す場合がある）、ヒトガンマグロブリン（ＩｇＧと略す場合がある）、ヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ（Ｆｃと略す場合がある）、ヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓ（Ｈｉｓと略す場合がある）の４箇所に添加し３７℃で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇｓ抗体（ＤＡＫＯ）を添加し同様に反応した。プレートを洗浄し、０．０２％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加後、１０分間反応させ０．５Ｍ硫酸で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。結果を図１に示す。図１に示すように１３種類の抗体は全て、ＰＢＳ，ＩｇＧに対する場合に比べて、ヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ、ヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓに対して特異的であり、ヒトＩＬ１３Ｒα１と特異的に結合した。
次にＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ビアコア社）を用いてヒトＩＬ１３Ｒα２に対する特異性を検討した。すなわち、流速２０μｌ／ｍｉｎでＮＴＡチップ（ビアコア社）を３５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液５μｌで処理後５００μＭのニッケル溶液を５μｌ添加した。その後、５０μｇ／ｍｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ１３Ｒα２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ社）を５μｌ添加し結合させた。さらに続けて５０μｇ／ｍｌに希釈した各抗体を５μｌ添加しその結合を解析した。同様にＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１３Ｒα１／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ社）を用いてマウスＩＬ１３Ｒα１との交差反応性を検討したところ、検討した抗体のうちＦ９９７−２０−１抗体はヒトＩＬ１３Ｒα２に対して交差反応性を示した。また、マウスＩＬ１３Ｒα１との交差反応性はＦ９９７−２０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、Ｆ９９７−１０−１抗体で確認された。ここでＲＵはＢＩＡＣＯＲＥ装置で使用されるレスポンスを表す単位であり、１０００ＲＵは約１．２ｎｇの物質が結合したことを示す。
2003046009.tif 000002
［親和性の検討］
作製した抗ＩＬ１３Ｒα１抗体の結合定数をＢＩＡＣＯＲＥを用いて測定した。すなわち、ＣＭ５チップ（ビアコア社）をビアコア社のマニュアルに従い７分間活性化し実施例１で作製したヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃを１００μｇ／ｍｌで固定化した。流速２０μｌ／ｍｉｎでＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ビアコア社）を流し同一緩衝液で２、１０、５０μｇ／ｍｌに希釈した抗体４種類の結合定数を求めた。結合した抗体は０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で解離しチップを再使用した。得られたデータはビアコア社解析ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて解析し、解離定数（Ｋｄ）を算出した。その結果、検討したＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９４−７−２抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、Ｆ９９７−２０−１抗体の４種類の解離定数は表２に示す通りであり、ヒトＩＬ１３Ｒα１に対して十分強い親和性を有していた。
2003046009.tif 000003
（実施例３）  抗ＩＬ１３Ｒα１抗体によるＩＬ１３結合阻害
作製した抗体がＩＬ１３のＩＬ１３レセプターα１への結合を阻害するかを明らかにするため、ＢＩＡＣＯＲＥを用いて結合の解析を行った。すなわち、流速２０μｌ／ｍｉｎでＮＴＡチップ（ビアコア社）を３５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液５μｌで処理後５００μＭのニッケル溶液を５μｌ添加した。その後、５０μｇ／ｍｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３Ｒα１／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ社）を５μｌ添加し結合させた。続けて５０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ１３Ｒα１抗体を５μｌ添加し結合させ、さらに１０μｇ／ｍｌに希釈したヒトＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ社）を５μｌ添加しその結合を解析した。また、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１３Ｒα１／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ社）、マウスＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ社）を用いて実施例２でマウスＩＬ１３Ｒα１と結合が見られた抗体を用いて同様にその結合を解析した。その結果、表３に示すようにヒトＩＬ１３の結合阻害活性を検討した７種類の抗体では４種類の抗体がヒトＩＬ１３とヒトＩＬ１３レセプターα１の結合を阻害した。一方、マウスＩＬ１３のマウスＩＬ１３レセプターα１への結合阻害活性を検討した６種類の抗体ではＦ９９７−１３−１、Ｆ９９７−１０−１、Ｆ９９７−２０−１抗体がマウスＩＬ１３とマウスＩＬ１３レセプターα１の結合を阻害した。表３の％は、コントロール抗体添加時にＩＬ１３とＩＬ１３レセプターα１が結合したときの値を０％とし、完全に結合が阻害された場合を１００％とした測定値を示す。なお、コントロール抗体は、ラットＩｇＧを添加した場合の測定値である。
2003046009.tif 000004
（実施例４）  インビトロアッセイによる中和活性の測定
ＴＦ−１細胞は通常１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ１６４０、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で培養し、１０５から１０６／ｍｌの範囲で細胞密度を維持した。この細胞を１日ＧＭ−ＣＳＦを除いた培地で培養し実験に用いた。
１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０で実施例１により得られた抗ＩＬ−１３レセプターα１抗体を終濃度（０．３−１０μｇ／ｍｌ）の２倍に調製し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した後、ＴＦ−１細胞を１×１０５／１００μｌ、２×１０４／１００μｌ播種した。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−４に対する中和活性を測定する場合は抗体の終濃度を１０μｇ／ｍｌとした。３７℃ＣＯ２インキュベーターで３時間培養し、１×１０５／１００μｌずつ播種したｐｌａｔｅには２０倍濃度に調製したＩＬ−１３（２〜２０００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−４（２〜２０００ｎｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。２×１０４／１００μｌずつ播種したｐｌａｔｅには２０倍濃度に調製したＧＭ−ＣＳＦ（０．２〜２００ｎｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。培養４８時間後、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ；同仁化学）（５ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＰＢＳ）を２５μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３時間インキュベートした後、培養上清を除去し溶解液１００μｌ／ｗｅｌｌにてフォルマザンを溶解させ、ＯＤ５７０ｎｍを測定した。溶解液は５０ｇ  ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を４００ｍｌの純水で溶解させ、０．１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．７に調製後、４００ｍｌのＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）と混合して調製した。各群３例で実施した。
各抗体の中和活性を、ＩＬ１３による細胞応答におけるＩＬ１３の用量作用曲線を、２倍高濃度側へシフトさせるのに必要な抗体濃度として表４にあらわす。ＩＬ１３による細胞応答におけるＩＬ１３の用量作用曲線を、２倍高濃度側へシフトさせるのに必要な抗体濃度は、各抗体濃度におけるＩＬ１３のＥＤ５０を算出し、Ｘ軸に−ｌｏｇ（Ａｂ）；Ａｂ＝ｇ／ｍｌで表す抗体濃度、Ｙ軸にｌｏｇ〔（Ａ）／（Ａｏ）−１〕；Ａ＝抗体存在下のＥＤ５０，Ａｏ＝抗体非存在下のＥＤ５０をプロットし、その回帰直線がｙ＝０となるときのｘの値＝ｐＡ２より、１０−ｐＡ２（ｇ／ｍＬ）として求められる。
2003046009.tif 000005
Ｆ９９７−１３−１、Ｆ９９７−２０−１およびＦ９９４−７−２については、ＩＬ１３添加群の具体的な実験結果を図２に、ＩＬ４またはＧＭ−ＣＳＦ添加群の具体的な実験結果を図３および図４に示す。図中、コントロールとは抗体無添加群を表す。
Ｆ９９７−１３−１、Ｆ９９７−２０−１およびＦ９９４−７−２について、ＩＬ１３による細胞応答に対する阻害活性およびＩＬ４、ＧＭ−ＣＳＦによる細胞応答に対する阻害活性についてまとめた結果を表５に示す。
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図３、図４および表５に示すように、ＩＬ４、ＧＭ−ＣＳＦを増殖刺激として同様の実験をおこなった場合、これらの抗体は１０μｇ／ｍｌ添加しても増殖抑制はほとんど認められなかった。すなわち、これらの抗体はＩＬ１３による細胞応答は阻害するが、ＩＬ４による細胞応答は阻害しないことが示された。
（実施例５）  可溶型ＩＬ１３レセプターの測定系の作製
［サンドイッチＥＬＩＳＡ系の作製］
（１）組み合わせが可能な抗体の検索
作製した抗ＩＬ１３Ｒα１抗体のうちサンドイッチＥＬＩＳＡを作製可能な組み合わせを検索するため、実施例１で作製した各精製抗体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１０μｇ／ｍＬに希釈しイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加後４５℃３０分間処理し抗体を固相化した。イオン交換水で洗浄後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加することによりブロッキングを行った。ブロッキング液を廃棄し、次に０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで精製可溶型ＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓを１、１０、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したものを２５μＬ添加した。ブランクには０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを使用した。続いて中根らの過ヨウ素酸法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２，１０８４，１９７４）による調製した各ペルオキシダーゼ標識抗ＩＬ１３Ｒα１抗体を１０％ウサギ血清、１％ラット血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．９％ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）により３μｇ／ｍＬに希釈したものを各ウエルに２５μＬ添加した。３７℃で２時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌでプレートを５回洗浄し０．０２％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図５に示すようにサンドイッチＥＩＡ系が作製可能な抗体の組み合わせとしてＦ９９７−１３−１抗体固相／Ｆ９９７−１７−１標識抗体、Ｆ９９４−７−２抗体固相／Ｆ９９７−２０−１標識抗体、Ｆ９９７−１８−３抗体固相／Ｆ９９７−８−１標識抗体の３種類の組み合わせが得られた。
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡ系の確立
得られた組み合わせのうちＦ９９４−７−２抗体固相／Ｆ９９７−２０−１標識抗体を用いて以下のようにサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。精製Ｆ９９７−７−２抗体をＰＢＳ（ｐＨ６．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４５℃で３０分間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加することによりブロッキングを行った。精製ヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓをウサギ血清で１．２５、２．５、５、１０、２０、４０ｎｇ／ｍｌに希釈し標準品を調製した。ブランクはウサギ血清を使用した。プレートのブロッキング剤を廃棄し調製した標準品及びブランクのウサギ血清を２５μｌ分注した。続けて１０％ウサギ血清、１％ラット血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．９％ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）により４μｇ／ｍｌに希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ９９７−２０−１抗体を２５μｌ分注し、３７℃で２時間反応させた。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄し、０．０２％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線を作成した。図６に作成した標準曲線を示した。標準曲線が示すように高感度で簡便な測定系が実現された。
（実施例６）  血中可溶型ＩＬ１３レセプターα１の測定
正常人３２例（男性２４例、女性８例）、アレルギー患者８例について実施例５に記載の測定系を用いて血清測定を行った。また、抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｆ２７１−１５抗体及びペルオキシダーゼ標識Ｆ２７１−１５抗体、持田製薬（株））を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系により血清中のＩｇＥ濃度を測定した。測定結果を図７に示した。また、正常人及びアレルギー患者を血清中のＩｇＥ濃度４００Ｕ／ｍＬをカットオフ値として分類した各群の平均値＋／−ＳＤを表６に示した。ＩｇＥ濃度４００Ｕ／ｍＬ以下（図７では、４００以下のように略記する）の正常人の可溶型ＩＬ１３レセプターα１濃度は１２．８＋／−３．２ｎｇ／ｍｌであり、ＩｇＥ濃度４００Ｕ／ｍＬ以上の正常人の可溶型ＩＬ１３レセプターα１濃度１１．９＋／−２．９ｎｇ／ｍｌとの間に差は認められなかった。アレルギー患者ではＩｇＥ濃度４００Ｕ／ｍＬ以下の人の可溶型ＩＬ１３レセプターα１濃度は１３．０＋／−１．６ｎｇ／ｍｌであり、正常人の濃度との間に差は認められなかった。アレルギー患者ではＩｇＥ濃度４００Ｕ／ｍＬ以上の人の可溶型ＩＬ１３レセプターα１濃度１６．４＋／−４．６ｎｇ／ｍｌが他の群と比較して高値傾向を示し、血清中のＩｇＥ濃度が上昇しているアレルギー患者では可溶型のＩＬ１３レセプターα１濃度も上昇していることが推定された。以上の結果は作製した測定を用いて、血清中の可溶型ＩＬ１３レセプターα１濃度を測定することがアレルギー患者の病態の把握さらには治療法の選択に有用であることを示すものである。
2003046009.tif 000007
（実施例７）  抗ＩＬ１３レセプターα１抗体によるＳＴＡＴ６のリン酸化抑制
実施例１で作製した２種類の抗体（Ｆ９９７−１０−１、Ｆ９９７−１３−１）がマウス脾臓単核細胞のＩＬ１３レセプターと結合し、ＩＬ１３刺激下でのＳＴＡＴ６のリン酸化を抑制するか検討した。まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス（オス、８週齢、ＳＬＣ）より脾臓を摘出し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、単核球細胞から赤血球を除くためＴｒｉｓ−ＮＨ４溶液（右田俊介他編集、免疫実験操作法、南江堂、ｐ５６０）に再浮遊し、赤血球を溶血させた。再度１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）培地で２回洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で再浮遊させ細胞濃度を計測した。細胞濃度を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、２４穴プレートに各１ｍｌを分注した。続けて、抗ＩＬ１３Ｒ抗体２種類を各々最終濃度０、１０、３０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また、ネガティブコントロールとしてラットＩｇＧを最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように添加した。室温で３０分間静置後、マウス脾臓単核細胞を含む溶液を回収し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。氷上にて沈殿に５０μｌのフォスファターゼ阻害剤を含むＳＤＳ緩衝液（５ｍＭＮａＶＯ３、１０ｍＭＮａＦ／Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ−βメルカプトエタノール）を添加し細胞を溶解した。次に５０Ｈｚの超音波で１５秒間処理し、続けて９９℃で５分間熱変性した。更に、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇに使用した。上清を還元用電気泳動バッファー（ＯＷＬ）と等量混合し、ｅ−ＰＡＧＥＬ（５〜２０％、ＡＴＴＯ）にアプライし、室温にて４０ｍＡ／ゲルで５０分間泳動した。泳動後、ミリポアのマニュアルに従い４℃でＰＶＤＦ膜（ミリポア）に１５０ｍＡ／ゲルで蛋白を転写し、５％スキムミルク／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）液（以下、ＴＢＳと記載する）で室温にて６０分間ブロッキングを行った。メンブレンに抗リン酸化ＳＴＡＴ６抗体（第一化学、９３６１Ｓ）を抗体希釈液（５％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５０ｍＭ  ＴＢＳ）で６６７倍に希釈したものを添加し、４℃で一晩反応させた（一次反応）。翌日、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５０ｍＭ  ＴＢＳで３回洗浄し、洗浄したメンブレンにペルオキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ、Ｐ０４４８）を抗体希釈液（５％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５０ｍＭ  ＴＢＳ）で２０００倍に希釈したものを添加し、室温で３０分間反応させた（二次反応）。メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ／５０ｍＭ  ＴＢＳで３回洗浄し、ＥＣＬキット（アマシャムバイオサイエンス）で発光させ、ＨｙｐｅｒＦｉｌｍ（アマシャムバイオサイエンス）に露光し現像した。その結果、表７に示すようにＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体を３０、１００μｇ／ｍｌ添加時にネガティブコントロール抗体添加に比較して、リン酸化ＳＴＡＴ６の強度が低下していることより、Ｆ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体がＩＬ１３レセプターと結合し、ＩＬ１３刺激によるＳＴＡＴ６のリン酸化を抑制するこ���が示された。
2003046009.tif 000008
（実施例８）  抗ＩＬ１３レセプターα１抗体可変領域のＣＤＲ配列の決定
実施例１で作製した抗ＩＬ１３レセプターα１抗体３種類の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと記載する）を決定した。すなわち、Ｆ９９７−１０−１抗体産生ハイブリドーマ、Ｆ９９７−１３−１抗体産生ハイブリドーマ、Ｆ９９７−２０−１抗体産生ハイブリドーマを実施例１にしたがって培養した。細胞濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになった段階で培養液各５０ｍｌを回収し、ダルベッコ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ）（以下、ＰＢＳ−と記載する）で洗浄し、回収した細胞よりＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを抽出した。次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに従って、ｍＲＮＡからオリゴｄＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とアンチセンスプライマー（Ｈ鎖用：ＨＡＳ−１（配列番号１８）、Ｌ鎖用：ＫＡＳ−１（配列番号１９））を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＨ鎖はＨｅａｖｙ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｈｅａｖｙ  Ｐｒｉｍｅｒ２（アマシャムバイオサイエンス）を、Ｌ鎖はＬｉｇｈｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（アマシャムバイオサイエンス）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、９４℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−１分、３０サイクルの条件で行い、ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｅｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。増幅されたＤＮＡのバンドを２％アガロースを用いて確認後、ＰＣＲ産物をスピンカラム（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物とｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を混和し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１６℃、３０分でライゲーション反応を行った。その反応液を用いてコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９、ＴＡＫＡＲＡ）にトランスフォーメーションを行い、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬＢプレートに播種し、１晩培養した。出現した白コロニーをピックアップし、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）、Ｕ−１９ｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２１）、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２０、Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、コロニーダイレクトＰＣＲでインサートがベクターに挿入されていることを確認した。次に、インサートが確認されたコロニーをＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡＧＥＮｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドはＵ−１９ｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒを用いてＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）により反応後、シークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００（アプライドバイオシステムズ）を用いて解析を行った。
Ｆ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体およびＦ９９７−２０−１抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を配列番号２２（Ｆ９９７−１０−１重鎖）、配列番号２３（Ｆ９９７−１０−１軽鎖）、配列番号２４（Ｆ９９７−１３−１重鎖）、配列番号２５（Ｆ９９７−１３−１軽鎖）、配列番号２６（Ｆ９９７−２０−１重鎖）、配列番号２７（Ｆ９９７−２０−１軽鎖）に示した。また、翻訳したアミノ酸配列を図８および配列番号２８（Ｆ９９７−１０−１重鎖）、配列番号２９（Ｆ９９７−１０−１軽鎖）、配列番号３０（Ｆ９９７−１３−１重鎖）、配列番号３１（Ｆ９９７−１３−１軽鎖）、配列番号３２（Ｆ９９７−２０−１重鎖）、配列番号３３（Ｆ９９７−２０−１軽鎖）に示した。決定したＣＤＲ配列を表８に示した。Ｆ９９７−１０−１軽鎖可変領域の第３のＣＤＲは塩基配列が未確定である。
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（実施例９）  ヒト型キメラ抗体の作製
抗原結合活性を有するＶ領域がＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、またはＦ９９７−２０−１抗体由来、すなわちラット抗体由来であり、Ｃ領域をヒト由来の抗体（キメラ抗体）を作製することにより、ヒトへの抗原性が少ない抗体を得ることが出来る。Ｖ領域のドナーとしては、上記抗体に限定されるものではなく、ＩＬ１３による細胞応答を阻害する活性を有する本発明の抗ＩＬ１３レセプターα１抗体であれば、いずれを用いても良い。キメラ抗体は１９８４年のＭｏｒｒｉｓｏｎら（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１，１９８４）の報告以来多くのものが開発されている。
（１）抗体遺伝子のクローニング
ハイブリドーマＦ９９７−１０−１、ハイブリドーマＦ９９７−１３−１、またはハイブリドーマＦ９９７−２０−１を培養し、細胞を調製する。得られた細胞をＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）で洗浄後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎｅ（日本ジーン）を用いて単離精製する。次にＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成する。重鎖及び軽鎖のアミノ末端のアミノ酸配列に基づきセンスプライマーを合成する。また、重鎖アンチセンスプライマーはフレームワーク４の配列に基づき、軽鎖アンチセンスプライマーはＶκ配列に基づき作製する。ＰＣＲ後、ＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、シークエンスを解析する。
（２）ラット−ヒト重鎖及び軽鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトイムノグロブリンＧ１のＣＨ１領域のＮ末端側をコードする塩基配列をセンスプライマーとして合成し、アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンＧ１の３’非翻訳領域の配列を含む領域を合成する。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて、ＨｕｍａｎＳｐｌｅｅｎ５’−ＳｔｒｅｔｃｈｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ（クローンテック社製）よりＰＣＲ反応によりヒトイムノグロブリンＣＨ領域を増幅する。また、重鎖センスプライマーは上記（１）の重鎖領域をコードする塩基配列とヒトイムノグロブリンＧ１のＣＨ１領域のＮ末端側をコードするアミノ酸配列にＥｃｏＲＩサイトをコードする配列を含むように作製する。アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンＧ１のＣＨ３領域のＣ末端側に位置するアミノ酸配列をコードする塩基配列とＢａｍＨＩサイトを含むように作製する。これらキメラのプライマーを組み合わせて、ラットＶＨ領域にオリエンテーションが一致するようにヒトイムノグロブリンＣＨ領域を組み込む。得られたＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、ＤＮＡ断片を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、ラット−ヒト重鎖発現プラスミドを作製する。同様にヒトのＣＬ領域とラット由来の軽鎖領域を有するキメラ抗体遺伝子を含む発現プラスミドを構築する。
（３）キメラ抗体の作製
形質転換体を作製するため、それぞれの発現プラスミドを制限酵素で切断し、直線化する。次に、ジーンパルサー（ＢＩＯＲＡＤ）等を用いて遺伝子をＳＰ２／Ｏ−ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）に導入し、培養後上清に産生されるラット−ヒトキメラ抗体の有無により目的の抗体を産生する細胞を選択する。具体的には直線化したＤＮＡ断片約２０μｇを１×１０７細胞に３６０Ｖ、２５μＦＤのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を９６穴プレートに植え込み、２日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、１０％ＦＣＳ、１×ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍｇ／ｍｌＧ−４１８を含むＤ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、更に２週間培養する。細胞がコンフルエントになった段階で無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、培養上清をプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）で精製し、精製キメラ抗体を得る。
得られたキメラ抗体は実施例２の方法によりＩＬ１３レセプターα１結合活性を確認し、実施例４の方法によりＩＬ１３による細胞応答を阻害する中和活性を確認する。
（実施例１０）  ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製（１）
（１）抗体可変領域のコンピューターモデリング
ヒト化抗体で高い親和性を保持するために、クイーンらの一般的な方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９，１９８９）に準じてフレームワーク残基の選択を行う。ヒト配列はＫａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）のカッパ軽鎖及び重鎖配列データベースに基づきラットＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、またはＦ９９７−２０−１抗体に高いフレームワーク相同性を有する配列を選択する。さらに、コンピューター解析により最も適したフレームワーク中のアミノ酸の改変を行う。具体的にはコンピュータープログラムＥＮＣＡＤ（レビット、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．１６８，５９５（１９８３）を用いてＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、またはＦ９９７−２０−１抗体可変領域の分子モデルの構築を行う。抗体データベースより得られたヒトＥｕ抗体分子モデル（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８５（４），６６８−６７４（１９９５）にＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、またはＦ９９７−２０−１抗体のＣＤＲ配列をＦＲ中に移植する。コンピューターモデル上でＣＤＲとＦＲが本来のヒト抗体モデルとは異なり、有意な接触を示すＦＲ領域で、アミノ酸置換を行うことによりＣＤＲとＦＲとの接触が改善されると予想される位置についてラット抗体由来のアミノ酸への置換を行う。また、ヒト抗体のデータベース中でその位置においてまれにしか現れないＦＲ中のアミノ酸残基はそれらの位置におけるヒトコンセンサンスアミノ酸に置換する。アミノ酸置換の良否は実際の活性により確認することになるため、アミノ酸置換の異なるタイプの抗体を数種類作製する。
（２）ヒト化抗体の構築
（１）で選択された配列を基に、シグナルペプチド、スプライス供与シグナル及び制限サイト（例えばＸｂａＩ）を含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を構築する。構築した遺伝子は合成ヌクレオチド（８０塩基長程度）のものを数種類オーバーラップするように調製する。すなわち、オリゴを対にしてアニールし、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で伸長し、２本鎖断片を得る。この断片を変性し１本鎖にした後、同様にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で伸長し、全長の遺伝子をコードする２本鎖断片を得る。得られる断片をＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲで増幅し、精製後に制限酵素（例えばＸｂａＩ）で切断し精製する。精製した断片をヒトγ１遺伝子のＣＨ１エクソンからＣＨ３エクソンまでを含む定常領域遺伝子をＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を有するプラスミドｐＶｇ１（Ｃｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）のＸｂａＩサイトに挿入する。同様な操作によりγ４の定常領域遺伝子を含むプラスミドにも挿入可能である。また、置換するアミノ酸の数が少ない場合は部位特異的突然変異導入により作製し、発現プラスミドに導入することも可能である。軽鎖可変領域配列は上記と同様に構築可能である。この場合ｐＶｋベクターにはヒトＣκ領域を含むものを使用する。
抗体を産生する形質転換体を作製するため、重鎖及び軽鎖プラスミドを制限酵素（ｐＶｋプラスミドの場合はＢａｍＨＩ及びＦｓｐＩ）で切断し直線化後、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）中へジーンパルサー（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて導入する。具体的には直線化したＤＮＡ断片約２０μｇを１×１０７細胞に３６０Ｖ、２５μＦＤのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を９６穴プレートに植え込み、２日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、１０％ＦＣＳ、１×ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍｇ／ｍｌＸａｎｔｈｉｎｅ、１μｇ／ｍｌＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄを含むＤ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、更に２週間培養する。培養後上清にでる抗体により目的とするヒト化Ｆ９９７−１０−１抗体、ヒト化Ｆ９９７−１３−１抗体、またはヒト化Ｆ９９７−２０−１抗体産生株を選択する。すなわち、固相化したＩＬ１３レセプターα１と結合する抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体で検出する。選択した株はコンフルエントになるまで１０％ＦＣＳを含む培地で培養し、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換する。培養上清を回収し、プロテインＡ（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）に結合させ、０．１Ｍ  グリシン塩酸（ｐＨ３．０）で溶出する。精製抗体をＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）で透析し、２８０ｎｍの吸光度より抗体濃度を算出する（ヒト抗体１ｍｇ／ｍＬは１．３の吸光度を示す）。
（３）ヒト化抗体の評価
ヒト化抗体が元のラット抗体と同様な活性を有していることを確認するため、実施例２の方法によりＩＬ１３レセプターα１結合活性を確認し、実施例４の方法によりＩＬ１３による細胞応答を阻害する中和活性を確認する。
（実施例１１）  ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製（２）
ヒト化抗体において移植するＣＤＲ配列が活性を有する適切なドメイン構造を維持させるために元のＦＲ領域の配列も合わせて移植する。ＣＤＲドメイン構造の維持にどのアミノ酸が関与しているかは、ＦＲ中のアミノ酸の性質（疎水性、親水性、酸性、塩基性、分子サイズ等）から解析し、またコンピューターを用いたモデリングにより行う。すなわち、シリコーングラフィック上で起動するソフトウエアーＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭｍあるいはＭｏｄｅｌｅｒ（モレキュラー・シュミレーションズ）を用いてモデリングを行う。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に登録されているヒト抗体配列よりＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、またはＦ９９７−２０−１抗体のＶＨ及びＶＬ領域と相同性の高い抗体の三次元構造を検索し、それに基づきＦ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体、またはＦ９９７−２０−１抗体の三次元構造を推定する。推定三次元構造上で重鎖及び軽鎖のＣＤＲに水素結合しているＦＲ領域中のアミノ酸群（第１群）を選出し、更にそれらに水素結合しているＦＲ領域中のアミノ酸群（第２群）を選出する。同様に、ＣＤＲに静電的相互作用やファンデルワルツ力等のエネルギー結合により結合していると推定されるＦＲ領域中のアミノ酸群（第１群）と更にそれらに結合していると推定されるＦＲ領域中のアミノ酸群（第２群）を選択する。このようにして選択したＦＲ領域中のアミノ酸群をＣＤＲアミノ酸と併せてヒト抗体配列上に移植するが、Ｋａｂａｔ等の分類（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）やＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等より得られるヒト抗体配列の可変領域アミノ酸には存在しないような配列が生じる場合は、そのアミノ酸は移植しない。このようにして得られた情報に基づきヒト抗体配列ＶＨ及びＶＬに移植する配列を決定し、ヒト化抗体作製に用いる遺伝子を構築する。
構築した遺伝子はアマシャムのキット（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２）とＰＣＲ法を組み合わせる方法、また数種類の長鎖合成ヌクレオチドを組み合わせて増幅する方法、キメラ抗体のＶＨあるいはＶＬ遺伝子を鋳型に数種類のプライマーを用いて増幅後、さらにそれら増幅遺伝子断片を鋳型として全長遺伝子断片を得る方法により作製する。得られた増幅遺伝子断片を実施例１０記載のプラスミドｐＶｇ１あるいはＶκを含むプラスミドｐＶｋの制限酵素サイトに導入することにより発現プラスミドを調製する。作製したプラスミドは実施例１０記載の方法により細胞に導入し、形質転換体を得、同様に精製抗体を作製する。また、同様に抗体の評価を行う。
産業上の利用可能性
ＩＬ１３は炎症性疾患の病態局所において発現の増大が観察されているため、ＩＬ１３とＩＬ１３レセプターの結合を阻害し、ＩＬ１３の作用を中和する本発明の抗体は、炎症性疾患の効果的な治療剤となる。ＩＬ４とＩＬ１３は重複する生理活性を有するが、ＩＬ１３は病態局所において多く存在し、炎症反応に関与する一方、ＩＬ４は抗体産生のクラススイッチや免疫細胞のＴｈ２分化のような恒常的な役割を担っているものと予想される。ＩＬ１３による細胞応答を選択的に阻害し、ＩＬ４による細胞応答は阻害しない本発明の抗体は、ＩＬ１３の作用を抑制することにより局所炎症反応を抑制するという本来の目的に加えて、ＩＬ４の作用の阻害に伴う予期せぬ副作用を抑制することができる。ＩＬ１３の作用を選択的に阻害する本発明の抗体は、局所炎症反応を副作用なく効率的に抑制できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、抗ＩＬ１３Ｒ（レセプター）α１モノクローナル抗体１３種類の特異性を、ヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ（図中Ｆｃと記載）、ヒトＩＬ１３Ｒα１−Ｈｉｓ（図中Ｈｉｓと記載）、ヒトＩｇＧとの反応性により、ＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示したグラフである。
図２は、ＩＬ１３刺激ＴＦ−１細胞増殖反応に対する抗ＩＬ１３レセプターα１抗体の中和活性を示す図である。
図３は、抗ＩＬ１３レセプターα１中和抗体のＩＬ４による細胞応答に対する阻害活性を示す図である。
図４は、抗ＩＬ１３レセプターα１中和抗体のＧＭ−ＣＳＦによる細胞応答に対する阻害活性を示す図である。
図５は、ＩＬ１３Ｒα１モノクローナル抗体６種類を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系の抗体の組み合わせにより作成した標準曲線を示したグラフである。
図６は、モノクローナル抗体Ｆ９９４−７−２とＦ９９７−２０−１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系の標準曲線を示したグラフである。
図７は、モノクローナル抗体Ｆ９９４−７−２とＦ９９７−２０−１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて正常人、アレルギー患者を測定した血清測定の結果を示したグラフである。
図８は、Ｆ９９７−１０−１抗体、Ｆ９９７−１３−１抗体およびＦ９９７−２０−１抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を翻訳したアミノ酸配列を示す図である。図中箱で囲んだ配列はＣＤＲ領域を示す。図中Ｘは塩基配列が未確定のため翻訳できなかったアミノ酸配列を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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