(57)【要約】８−ニトログアノシンがその糖部分を介してウシ血清アルブミンなどの血清蛋白質に結合した抗原などを用いて製造することができる８−ニトログアニンを認識する抗体、及び該抗体を用いて生体試料中に含まれる８−ニトログアニンを測定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−ニトログアニンを認識する抗体。
【請求項２】
ポリクローナル抗体である請求の範囲第１項に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求の範囲第１項に記載の抗体。
【請求項４】
８−ニトログアニンを認識する抗体の製造のために用いる抗原であって、８−ニトログアノシンが結合した血清蛋白質を含み、８−ニトログアノシンがその糖部分を介して血清蛋白質に結合した抗原。
【請求項５】
血清蛋白質がウシ血清アルブミンである請求の範囲第４項に記載の抗原。
【請求項６】
８−ニトログアノシンが血清蛋白質１分子あたり３個〜１０個結合した請求の範囲第４項又は第５項に記載の抗原。
【請求項７】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の抗体を用いて生体試料中に含まれる８−ニトログアニンを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、８−ニトログアニンを認識することができる抗体に関する。
背景技術
生体内の炎症部位においては、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）によって一酸化窒素が大量に産生され、これが活性酸素であるスーパーオキシドと反応してパーオキシナイトライトが産生される。このパーオキシナイトライトは強力なニトロ化剤であり、生体内の蛋白質のチロシン残基をニトロ化して３−ニトロチロシンを生成し組織に傷害を与えることが知られている。同時にパーオキシナイトライトは核酸塩基にも反応し、特にグアニン塩基をニトロ化する。ニトロ化されたグアニン塩基はヌクレオチドより容易に脱離し、残った脱塩基部位（ＡＰ部位：ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｃ  ｓｉｔｅ）は、突然変異や細胞死の原因となることが知られている。
従来、モデル実験系において、亜硝酸ナトリウムと過酸化水素水から調製したパーオキシナイトライトをグアノシンに作用させて８−ニトログアノシンを作製する方法が知られている。またパーオキシナイトライトをＤＮＡ溶液に作用した後に８−ニトログアニンを検出する方法として、ＤＮＡ溶液を９０℃で加熱し、ＤＮＡから８−ニトログアニンを遊離させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：液体クロマトグラフィー陰イオンスプレーイオン化質量分析）を用いて分析する方法（ＮＹ．Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａ、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４４７、２８７（２０００））やＵＶ検出−ＨＰＬＣによる方法（Ｂ．Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，９、１１５２（１９９６））、パーオキシナイトライト発生剤であるＳＩＮ−１をウシ肝臓ＲＮＡに作用させ、ＲＮＡを分解してＥＣＤ−ＨＰＬＣ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：電気化学検出高速液体クロマトグラフィー）で検出する方法（Ｈ．Ｏｈｓｈｉｍａ、Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．１３９、１８７（２０００））が知れらている。
尿や生体試料中に遊離した８−ニトログアニンを検出する場合には、これら蛋白質を加水分解して逆相ＨＰＬＣで分析することが有効な方法であると考えられるが、実際の生体試料で検出した報告はない。また、８−ニトログアニンの分析に採用されていた従来の化学的な検出方法では、８−ニトログアニンが生体内のどの組織部位に存在するかという局在性を明らかにすることは困難であり、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析は高価な機器を必要とするうえ、煩雑な蛋白質加水分解処理や、ＨＰＬＣ分析が長時間を要するため多検体処理に不向きであるという問題点があった。なお、８−ニトログアニンが抗原性を有することは従来知られておらず、８−ニトログアニンを認識する抗体は提供されていない。
発明の開示
本発明の課題は、８−ニトログアニンを高感度に検出するための手段を提供することにある。より具体的には、８−ニトログアニンを簡便かつ確実に測定することができ、生体内における８−ニトログアニンの局在性を明らかにすることができる手段として、８−ニトログアニンを認識する抗体を提供することが本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、８−ニトログアノシン残基を含む特定の抗原蛋白を用いることにより８−ニトログアニンを認識するポリクローナル抗体を製造できることを見出した。また、上記の抗原蛋白を用いて８−ニトログアニンを特異的に認識するポリクローナル抗体を製造することに成功した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、８−ニトログアニンを認識する抗体を提供するものである。本発明の好ましい態様によれば、８−ニトログアニンを認識するポリクローナル抗体、８−ニトログアニンを特異的に認識するポリクローナル抗体、及び８−ニトログアニンを特異的に認識するモノクローナル抗体が提供される。また、上記の抗体を用いて生体試料中の８−ニトログアニンを測定する方法が本発明により提供される。
別の観点からは、８−ニトログアニンを認識する抗体の製造のために用いる抗原であって、８−ニトログアノシンが結合した血清蛋白質を含む抗原が提供される。この発明の好ましい態様によれば、血清蛋白質がアルブミン、好ましくはウシ血清アルブミンである上記抗原、及び８−ニトログアノシンが血清蛋白質１分子あたり３個以上、好ましくは３個〜１０個、より好ましくは４〜６個結合した上記抗原が提供される。さらに、上記抗原を用いて哺乳類動物を免疫する工程を含む８−ニトログアニンを認識する抗体の製造方法が本発明により提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の抗体の製造方法は特に限定されないが、例えば、８−ニトログアノシンが結合した血清蛋白質、好ましくは８−ニトログアノシンが結合した血清アルブミンを含む抗原抗原を用いることが望ましい。この抗原の製造方法は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液中で過ヨウ素酸ナトリウム及びシアノホウ素化ナトリウムを用いて、例えば血清アルブミンなどの血清蛋白質に８−ニトログアノシンを結合させることにより容易に製造できる。８−ニトログアノシンは、ジメチルホルムアミド中で８−ブロモグアノシンを亜硝酸ナトリウムでニトロ化することにより容易に得られるが、血清蛋白質への結合の前に高速液体クロマトグラフィーで精製することが望ましい。
８−ニトログアノシンを結合するための蛋白質としては、一般的に抗原性のない血清蛋白質であればいかなるものを用いてもよい。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のほか、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）など他の哺乳動物の血清アルブミン、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などを用いることができるが、これらに限定されることはない。これらのうち、ＢＳＡがもっとも好ましい。
核酸塩基である８−ニトログアニンは、その構造上化学修飾できる部位が限られている。容易に反応できる３位のアミノ基は水素結合によって核酸塩基の認識部位としての重要な役割を担っていると考えられるため、８−ニトログアニンの３位のアミノ基を介して血清アルブミンに結合させた抗原を用いても、８−ニトログアニンを認識する抗体を製造するのは困難である。一方、８−ニトログアニンの配糖体である８−ニトログアノシンを用いて、８−ニトログアノシンの糖部分を血清蛋白質に結合させることにより、８−ニトログアニン残基がそのまま保存された抗原を得ることができ、これを用いて哺乳類動物を免疫することにより、８−ニトログアニンを認識する抗体を効率よく得ることができる。血清蛋白質への８−ニトログアノシンの導入率は特に限定されないが、血清蛋白質１分子当たり８−ニトログアノシンが少なくとも３個以上導入されていることが望ましい。
本発明の抗体は、前記の抗原をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することによりに容易に製造できる。必要に応じて上記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどのアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
免疫に用いる動物の種類も特に限定されず、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができるが、好ましくは日本白色種ウサギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ）を用いることができ、この他にも、ＮＺＷウサギ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ）など抗体作成用に用いられているウサギなど種々の動物を用いることが可能である。動物の免疫は当業界で利用可能な方法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される哺乳動物の種類および系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定ことが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
例えば、初回免疫として前記抗原をＰＢＳに溶解させた溶液とフロイント完全アジュバントとを混合することによって得られたエマルジョンを用いて行い、２回目以降の免疫は、前記抗原をＰＢＳに溶解させた溶液とフロイント不完全アジュバントとを混合することによって得られたエマルジョンを用いて行うことが望ましい。初回免疫では免疫反応を誘発させるため菌体が含まれているフロイント完全アジュバントを用いることが有利であり、２回目以降の追加免疫は、新たに抗体を作るのではなく初回免疫の時にすでに発現しＢ細胞に記憶されている抗体を増やすことを目的とするものであるためフロイント不完全アジュバントを用いることが有利であるからである。初回免疫から追加免疫の間の間隔、追加免疫と追加免疫との間の間隔も特に限定されない。例えば、初回免疫は抗体を産出させるためのものであり、通常、最初に抗原を注射してから４〜５日で抗体が血中に表れ、次第に量が増大して１０日前後にピークとなることから、初回免疫から最初の追加免疫までは２週間以上おくことが好ましい。
免疫された動物の血清から本発明の抗体を取得することができるが、その方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法であればいかなる方法を用いてもよい。抗体の精製は、例えば、抗体の精製はＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。抗体が８−ニトログアニンを認識するか否か、あるいはその反応が特異的であるか否かについても当業者に周知の方法を利用して容易に確認することが可能である。本明細書の実施例には本発明のポリクローナル抗体の製造方法について、動物の免疫方法、抗体の精製方法、及び抗体の特性の確認方法が具体的に説明されているので、当業者は上記の一般的説明及び実施例の具体的方法を参照しつつ、必要に応じて該方法に適宜の修飾ないし改変を加えることにより、本発明の抗体を容易に製造することが可能である。
本発明の抗体としては、８−ニトログアノシン、８−ニトログアニン、及びこれらを結合した蛋白質に反応し、グアニン、グアノシン、８−ヒドロキシグアノシン、８−ヒドロシキグアニンやその他の核酸塩基及びその誘導体、並びにそれらを結合した蛋白質に反応しない抗体や、例えば、ニトロ基の置換位置の異なるニトログアニンの異性体と８−ニトログアニンとを識別できる抗体などを好ましく用いることができる。本発明の抗体が８−ニトログアニンを「特異的」に認識するとは、上記に一例を示したように、抗体が他の物質に比べて８−ニトログアニンに対して部分的ないし実質的に完全な選択性を有することを意味しているが、この語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明の抗体としては、免疫した動物のリンパ球を用いて製造したハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を本発明の抗体として用いてもよい。本発明の抗体としては、上記の性質を有するポリクローナル抗体を好適に用いることができるが、上記の性質を有するモノクローナル抗体も好ましい。
モノクローナル抗体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されているので当業者は上記の抗原を用いることによって８−ニトログアニンを認識するモノクローナル抗体を容易に製造することが可能である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）第６章などを参照のこと）。抗体産生細胞の調製に用いる哺乳類動物の種類は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等が挙げられ、好ましくはマウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類であり、より好ましくはマウスを用いることができる。例えば、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスはハイブリドーマ作製時に同系統で確立された骨髄腫由来細胞株を用いることができるので好ましい。
最終免疫後、免疫した哺乳動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞株と細胞融合することによりハイブリドーマを産生することができる。細胞融合には増殖能力の高い免疫産生細胞株を用いることが好ましく、また骨髄腫由来の細胞株は融合する免疫産生細胞の由来する哺乳類動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは当業界で汎用の条件に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの周知の方法により行うことが可能である。
所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、産生される抗体と８−ニトログアニンの結合能をＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイすることにより確認することができる。上記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、８−ニトログアニンに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製はＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
本発明の抗体としては、抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられ、これらは抗体を蛋白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理することにより製造できる。また、本発明のモノクローナル抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体はいずれも本発明の範囲に包含される。
例えば、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合させることにより固定化抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、板状、ビーズ状など任意の形状を選択できる。
標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体等が挙げられ、標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができる。もっとも、固定化抗体や標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は上記の例に限定されることはない。例えば、標識抗体の検出のために、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンをさらに１種以上の他の物質と反応させることにより生じるシグナルを検出する方法は当業者に周知であり、本発明の抗体の検出のために好ましく用いられる。例えば、酵素の場合には基質を用いて酵素活性を測定する方法を用いることができ、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
本発明の抗体を用いて８−ニトログアニンを測定することができる。例えば、本発明の抗体を用いて生体組織中に生成した８−ニトログアニンを測定することができ、８−ニトログアニンが存在している生体内でパーオキシナイトライトによる遺伝子損傷部位を容易に特定することが可能になる。本明細書において「測定」という用語は検出及び定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
例えば、本発明の抗体を用いて、ヒトから分離・採取した生体試料に含まれる８−ニトログアニンを測定することができる。ヒトから分離した生体試料の種類は特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、羊水、又は細胞若しくは臓器の抽出液などの液体試料のほか、手術により切除された組織や細胞などを測定対象とすることができる。測定は公知の方法（例えば、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年，北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年などに記載の方法）により行うことができる。もっとも、本発明の抗体を用いた８−ニトログアニンの測定方法は上記に例示したものに限定されることはなく、当業者が目的に応じて適宜選択可であることは言うまでもない。本明細書の実施例には具体的測定方法が示されているので、当業者は実施例の方法を参照しつつ、必要に応じて該方法に適宜の修飾ないし改変を加えることにより、生体試料に含まれる８−ニトログアニンを簡便かつ確実に測定することができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
８−ブロモグアノシン（０．５ｇ）、亜硝酸ナトリウム（０．１４３ｇ）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中で室温にて３時間撹拌して溶解させた後、３７℃で３日間、その後さらに室温で２週間静置して反応させた。６００μｌの反応液を６％アセトニトリル、０．０１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液４．０４ｍｌで希釈し、同じく６％アセトニトリル、０．０１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液を移動相とした分取用ＨＰＬＣを用いて、目的物である８−ニトログアノシンを分離し、８−ニトログアノシンを含む水溶液を凍結乾燥した。Ｈ−ＮＭＲによって構造を確認したところ通常のグアノシンで７．９８ｐｐｍに出現する８位の芳香族プロトンが消失しており、ＩＲ分析によってもニトロ基に特徴的な伸縮振動が１２８０ｃｍ−１に観察された。また、本品の水溶液は、ニトロ基に由来する３８５ｎｍに吸収極大を持つＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示した。さらに、本品の水溶液を亜ニチオン酸ナトリウムで還元し、８−アミノグアノシンに変換して分析したＨＰＬＣ分析では、市販の８−アミノグアノシンと一致した。以上のことから８−ニトログアノシンが単一の物質として精製できたことが確認された。
前記で得た８−ニトログアノシン（５ｍｇ）を超純水０．５ｍｌに溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（１０．７ｍｇ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応液にエチレングリコール１μｌを加えて、さらに３０分撹拌して過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを分解した。ＢＳＡ（５ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したものに前記のニトログアノシン水溶液を加えた。室温で１時間インキュベートした後、シアノホウ素化ナトリウム２．５ｍｇを加えて、そのまま４℃で一晩撹拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃で透析し、さらにセファデックスＧ−２５を充填したゲル濾過カラム（２×３０ｃｍ）を通して濾過し、ＰＢＳで溶出し、２ｍｌずつの画分に分離した。得られたフラクションの２８０ｎｍ及び３９５ｎｍの吸光度を測定して目的物の含まれるフラクションを集め、超純水に対して透析してこの発明の抗原を得た。（８−ニトログアノシン結合ＢＳＡ；８−ＮＯ２−Ｇｕａ−ＢＳＡ）
８−ニトログアノシン結合ＢＳＡ０．５ｍｇを５０μｌの純水に溶解した。この溶液３５μｌに１Ｎ塩酸３５μｌを加え、９８℃で３０分間加熱し加水分解を行った。加水分解物５μｌを高速液体クロマトグラフィで分析し遊離した８−ニトログアニンの量を定量した。高速液体クロマトグラフィによる分析は以下の条件で行った。カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ８０Ｔｓ、４．６×２５０ｍｍ、溶離液：０．０１％トリフルオロ酢酸を含む６％アセトニトリル水溶液、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：３９５ｎｍ。８−ニトログアノシン結合ＢＳＡ０．５ｍｇを５０μｌの純水に溶解した。この溶液を２倍に希釈し蛋白定量を行い、高速液体クロマトグラフィで検出した８−ニトログアニン量から蛋白量当たりの８−ニトログアノシン導入量は４．３個／ＢＳＡ１分子であることを決定した。
例２
例１で得た抗原を１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解させたもの５００μｌを注射器にとり、さらにフロイント完全アジュバント７５０μｌをとり、別の注射器と連結させて交互に動かすことによりエマルジョンを作成した。抗体作成用の動物として日本白色種ウサギ２羽を採用し、当該ウサギの背部皮下に数カ所、このエマルジョンを注射した（初回免疫）。２週間後、例１の抗原を１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解させたもの５００μｌとフロイント不完全アジュバント７５０μｌとを用い、前記のように注射器を交互に動かすことによってエマルジョンを作成して注射し、追加免疫とした。この追加免疫を２週間ごとに繰り返した。２回免疫及び３回免疫の各１週間後に少量採血し、抗体の産生を８−ニトログアノシン結合ＢＳＡ（８−ＮＯ２−Ｇｕａ−ＢＳＡ）に対して抗体が反応するか否かをＥＬＩＳＡ法によって確認した。
前記の確認によってポリクローナル抗体の産出が一定になったところで（２週間前と比較してポリクローナル抗体の産出に変動が生じなくなったところで、すなわち、ある追加免疫の１週間後に確認された抗体の産出と、当該追加免疫の２週間後に行われた次の追加免疫の１週間後に確認された抗体の産出が同一になったところで）、該当ウサギ２羽から採血し、この血液より血清を得た後、当該血清より本発明のポリクローナル抗体を得た。本発明のポリクローナル抗体を得る工程は以下のように行った。まず日本白色種ウサギの心臓より大量採血を行い、３７℃で１時間保温した後、４℃で一晩静置した。これを毎分３０００回転で１０分間遠心し、得られた上清を滅菌フィルターを通した。その後以下に述べるアフィニティカラムを用いて抗体を精製した。
まず生化学工業株式会社のプロテインＡセルロファイン（５ｍｌ容量）を用い、同社のプロトコールに従ってＰＢＳで希釈した血清を通し、結合した抗体を１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．０）で溶出させ、直ちに中和してＩｇＧ画分を得た。さらに、同社のホルミルセルロファイン（５ｍｌ容量）にＢＳＡを結合したＢＳＡセルロファインカラムを同社のプロトコールに従って作成し、これに前記のＩｇＧ画分を通して、ポリクローナル抗体中に混在する抗ＢＳＡ抗体を吸着除去した。また、同社のアミノセルロファイン（５ｍｌ容量）に８−ニトログアノシンを結合した８−ニトログアノシンセルロファインカラムを作成し、これに前記抗体を通して、８−ニトログアニンに反応する抗体を結合させ、結合した抗体を１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．０）で溶出させ、直ちに中和した後、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析して抗８−ニトログアニン抗体を精製した。なお、１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．０）での溶離操作によってセルロファインカラムに結合させた８−ニトログアノシンは酸によって核酸塩基の切断を受けて抗体と共に溶出してくるので、本カラムは一度しか使えない。また、抗体と共に遊離してきた８−ニトログアニンを除去するために、透析操作が必要である。
試験例１
８−ニトログアニンに対する抗体が生成していることの証明として、蛋白としてＢＳＡではなくＫＬＨに８−ニトログアノシンを結合させた８−ニトログアノシン結合ＫＬＨ（ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＫＬＨ）に対しても抗体が結合することを直接法ＥＬＩＳＡによって確認した。また、ニトロ化されていない通常のグアノシンを前述の方法と同様に過ヨウ素酸ナトリウムとエチレングリコールでタンパク質に結合させたグアノシン結合ＢＳＡ（Ｇｕｏ−ＢＳＡ）、及びニトログアノシンの糖構造部分であるリボースのみをタンパク質に結合させたリボース結合ＢＳＡ（Ｒｉｂ−ＢＳＡ）に対して抗体が結合しないことを確認した。さらに陰性対照として過ヨウ素酸ナトリウムとエチレングリコールだけでＢＳＡを処理した過ヨウ素酸ナトリウム処理ＢＳＡ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＢＳＡ）及び非処理のＢＳＡに対して反応しないことを確認した。
ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＫＬＨの調製は、ＢＳＡをＫＬＨに代えて、またＧｕｏ−ＢＳＡの調製は８−ニトログアノシンを通常のグアノシンに代えて、Ｒｉｂ−ＢＳＡの調製は８−ニトログアノシンをリボースに代えて前記と同様に行った。ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＢＳＡ、ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＫＬＨ、Ｇｕｏ−ＢＳＡ、Ｒｉｂ−ＢＳＡ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＢＳＡ、非処理ＢＳＡを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）に溶解してそれぞれ５μｇ／ｍｌとした。これをそれぞれ１００μｌずつ９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに入れ、４℃で一晩静置して固相化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）０．４ｍｌで３回洗浄した後、各ウェルに０．５％ゼラチン酵素分解物を含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）２００μｌを加え室温で１時間静置し、以後の非特異的な抗体の吸着を防ぐためにブロックした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄しポリクローナル抗ニトログアニン抗体（１次抗体）をＰＢＳ−Ｔで１０．０μｇ／ｍｌから、０．３μｇ／ｍｌまで順次３分の１に希釈したもの０．１ｍＬを加え、室温で１時間静置した。ウェルを同様にＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗体）をＰＢＳ−Ｔで１万倍希釈したもの１００μｌを加えてさらに１時間静置した後、過酸化水素水０．６μｌを含む１，２−フェニレンジアミン塩酸塩０．５５ｍｇ／ｍｌクエン酸−りん酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌで発色させた。１００μｌの１Ｍ硫酸を加えて反応を停止し、４８５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。
結果を第１図に表す。本発明の抗体は８−ニトログアノシンをＢＳＡに結合させた「ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＢＳＡ」のみならず、８−ニトログアノシンをＫＬＨに結合した「ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＫＬＨ」に対しても有意に濃度依存的に結合することが確認できた。また、通常のグアノシンを結合した「Ｇｕｏ−ＢＳＡ」及びリボースのみを結合した「Ｒｉｂ−ＢＳＡ」、過ヨウ素酸ナトリウム処理した「ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＢＳＡ」及び非処理のＢＳＡに対しては結合しないことが明かとなった。すなわち、本発明のポリクローナル抗体は、ＢＳＡとＫＬＨという蛋白質の種類にかかわらず８−ニトログアノシンの核酸塩基部分すなわち８−ニトログアニンを認識し、通常のグアノシンを結合した蛋白質には反応しないことが示された。また、糖構造部分であるリボースを開環して修飾した蛋白質や、結合に使用した過ヨウ素酸ナトリウムによる副反応修飾構造には結合しないことが確認できた。従って、本発明のポリクローナル抗体は、８−ニトログアノシンの核酸塩基である８−ニトログアニンを認識し、正常なグアニン塩基、さらに蛋白質結合に用いた架橋構造であるリボースや反応に用いた試薬（過ヨウ素酸ナトリウムとエチレングリコール）に由来する副産物に対して認識するものではないことが確認された。
試験例２
次に競合ＥＬＩＳＡを用いて、本抗体の認識構造（エピトープ）が真に８−ニトログアニンであるのか、８−ニトログアノシンの類縁体との交差反応性を検討した。競合ＥＬＩＳＡでは、被検物質を蛋白質に結合して固相化する必要がないため、低分子の被検物質を直接ＥＬＬＳＡ系に添加することで、抗原抗体反応の有無を検出できる。このため、通常は蛋白質に結合することが難しい核酸塩基構造だけでも検討することができ、より詳細な類似構造への交差反応の有無が検出できる。従って被検物質としては８−ニトログアノシン及びその核酸塩基の遊離型としての８−ニトログアニン、正常な核酸塩基であるグアニン、活性酸素による遺伝子損傷の指標物質である８−ヒドロキシデオキシグアノシンから遊離する８−ヒドロキシグアニン、パーオキシナイトライトによる蛋白質損傷物質である３−ニトロチロシンを競合物質として用いた。
試験例１で述べた方法と同様に８−ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＢＳＡ  ５μｇ／ｍｌとしたものを１００μｌずつをＥＬＩＳＡプレートに添加し４℃で一晩静置して固相化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）０．４ｍｌで３回洗浄した後、各ウェルに０．５％ゼラチン酵素分解物を含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）２００μｌを加え室温で１時間静置し、以後の非特異的な抗体の吸着を防ぐためにブロックした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、予めポリクローナル抗ニトログアニン抗体（１次抗体）をＰＢＳ−Ｔで５．０μｇ／ｍｌに希釈したもの０．０５ｍＬと競合物質を１００μＭから順次種々の濃度でＰＢＳに溶解したもの０．０５ｍＬを混合して室温で１時間撹拌したもの各１００μｌを加え、室温で１時間静置した。ウェルを同様にＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗体）をＰＢＳ−Ｔで１万倍希釈したもの１００μｌを加えてさらに１時間静置した後、過酸化水素水０．６μｌを含む１，２−フェニレンジアミン塩酸塩０．５５ｍｇ／ｍｌクエン酸−りん酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌで発色させた。１００μｌの１Ｍ硫酸を加えて反応を停止し、４８５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。
結果を第２図に表す。添加した競合物質が本抗体と反応して、プレートに固相化した８−ニトログアノシン結合ＢＳＡ（ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＢＳＡ）と抗体との結合を阻害すれば、４８５ｎｍの吸光度は減少するが、反応しない物質は吸光度の減少を示さない。競合ＥＬＩＳＡでは８−ニトログアノシンあるいは８−ニトログアニンは濃度依存的に本抗体に結合し固相化したＮＯ２−Ｇｕｏ−ＢＳＡとの抗原抗体反応を阻害した。正常なグアノシンやグアニンは全く影響を与えず、８−ヒドロキシグアニンも影響を与えなかった。また、アミノ酸のニトロ化物である３−ニトロチロシンも反応しなかった。このことから、本発明のポリクローナル抗体は、８−ニトログアノシンの塩基構造である８−ニトログアニンに対して非常に特異性が高く、正常なグアノシンは認識しないこと、酸化ストレスによるＤＮＡ損傷の代表的な物質である８−ヒドロキシグアニンとも交差反応を示さないことが示された。これにより、本発明の抗体が、生体内で炎症などにより大量に産生される一酸化窒素と活性酸素によって生じるパーオキシナイトライトによって傷害される新たな遺伝子損傷物質である８−ニトログアニンの測定に使用できることが立証された。
試験例３
生体試料を用いて免疫組織化学的染色を行った。マウスにインフルエンザウイルスを経鼻噴霧接種して作製するインフルエンザ感染モデルにおいては、肺の気管内で大量の一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）が発現し、一酸化窒素が産生しており、同時に大量に産生されるスーパオキシドと反応してパーオキシナイトライトが産生することが知られている。従って、肺の組織内ではこのパーオキシナイトライトによって細胞内のＤＮＡあるいはＲＮＡのグアニン塩基がニトロ化され、８−ニトログアニンが生成していることが予想される。
インフルエンザ感染マウスの肺組織を摘出し、過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）で固定、これを５〜６μｍ厚の切片にプレパラートに固定した。プレパラートを４℃のＰＢＳに５分間、３回浸漬して洗浄した。非特異的反応を抑制するために、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ９．５ｍｌにヒツジ血清０．５ｍｌを添加したもので室温２０分間インキュベートした。次に本発明の抗体１５μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ溶液）を組織標本の上に１〜２滴滴下し、室温で６０分インキュベートした。４℃のＰＢＳで５分間、５回洗浄し、ＡＬＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を滴下して、室温で４５分間インキュベートした。４℃のＰＢＳで５分間、５回洗浄後、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて室温で発色させたのち、ヘマトキシリンで対比染色した。免疫組織化学的染色では、インフルエンザ感染マウス肺の気管上皮細胞に強い陽性像が確認された。本染色像は８−ニトログアニンを添加することで完全に吸収されたことから、本抗体が肺組織で産生したニトログアニンを検出していると結論された。
例３
例１で得た抗原を２ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解させたもの５００μｌを注射器にとり、フロイント完全アジュバント７５０μｌをさらにとり、別の注射器と連結させ、これを交互に動かすことによりエマルジョンを作成した。抗体作成用の動物として雌５週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹を採用し、当該マウスの背部皮内に数カ所、このエマルジョンを注射した（初回免疫）。２週間後、同抗原を１ｍｇ／ｍｌ、５００μｌとフロイント不完全アジュバント７５０μｌとを用い、前記のように注射器を交互に動かすことによってエマルジョンを作成し、これを注射し、追加免疫とした。この追加免疫を２週間ごとに繰り返した。初回免疫から７週間後にマウス尾部より少量採血し、抗体の産生を８−ニトログアノシン結合ＢＳＡ（８−ＮＯ２−Ｇｕａ−ＢＳＡ）に対するＥＬＩＳＡ法によって確認した。
抗体の産出が一定になったところで、５０μｇ／匹の８−ＮＯ２−Ｇｕａ−ＢＳＡを腹腔内注射した。３日後、該当マウスの脾臓を摘出した。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と混合しポリエチレングリコールによって細胞融合を行い、ハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマを３日間アミノプテリン、ヒポキサンチン、チミジンを含む１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）中で培養した。１０日後に培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングの方法は８−ＮＯ２−Ｇｕａ−ＢＳＡに陽性でＧｕｏ−ＢＳＡ及びＮａＩＯ４処理ＢＳＡに陰性な細胞を２０株を選択した。さらにＨＡＴ培地中で１０日培養してスクリーニングを繰り返し、限界希釈法でサブクローニングすることで２株のモノクローナル抗体産生細胞系を樹立した。
これらの抗体産生細胞をあらかじめプリスタンを投与して免疫抑制したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に移植した。得られた腹水をジエチルアミノエチルセルロースイオン交換樹脂を用いて、５０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で分画して精製した。
試験例４
モノクローナル抗体の反応性を競合法ＥＬＩＳＡで試験した。８−ＮＯ２−Ｇｕａ−ＢＳＡを５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．７）に溶解して各１μｇ／ｍｌとし、これを０．１ｍｌずつ９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに入れ、室温で１時間インキュベートして固相化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）０．４ｍｌで３回洗浄した後、各ウェルに０．５％ｇｅｌａｔｉｎを含む５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．７）０．２ｍｌを加え室温で１時間インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、抗ニトログアニン抗体（１次抗体）２μｇ／ｍｌ、０．０５ｍｌと適当な濃度に希釈した競合物質０．０５ｍｌを加え、プレートを振盪してウェルを攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。
競合物質としては、８−ニトログアニン、８−ニトログアノシン、グアニン、グアノシン、８−ヒドロキシグアニン、８−ヒドロキシデオキシグアノシン、キサンチン、アデニン、アデノシン、チミン、デオキシチミジン、ウラシル、ウリジン、シチジン、３−ニトロチロシン、ニトロイミダゾールを検討した。
ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）０．１ｍｌを加えて１時間インキュベートした後、過酸化水素水０．６μｌを含む１，２−フェニレンジアミン０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌで発色させ、０．１ｍｌの１ｍｏｌ／ｌ硫酸で停止し、４９２ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。例３で得られたモノクローナル抗体は８−ニトログアニン、８−ニトログアノシンと強く反応したが、他の核酸塩基などとは全く反応せず、グアニンやグアノシンなどの正常な核酸塩基とは反応しないことが示された（第３図及び第４図）。
本発明のモノクローナル抗体は、８−ニトログアノシンとその遊離の核酸塩基である８−ニトログアニンを認識するが、正常なグアニン塩基、アデニン、アデノシン、チミン、チミジン、シトシン、シチジン、さらに活性酸素による遺伝子損傷の代表的指標物質である８−ヒドロキシグアニンや８−ヒドロキシデオキシグアノシンとは反応しない。またタンパク質のニトロ化産物である３−ニトロチロシンや、８−ニトログアニンと化学構造が一部類似しているニトロイミダゾールとも交差反応を示さないことから、グアニン塩基の８位がニトロ化された構造を認識しており、生体内における８−ニトログアノシンの特異的検出に有用である。
産業上の利用性
本発明の抗体は、生体内における８−ニトログアニンを簡便かつ特異的に測定するための手段として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の抗体が８−ニトログアニンと特異的に結合することを直接法ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示した図である。図中、ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＢＳＡは８−ニトログアノシン結合ＢＳＡ；ＮＯ２−Ｇｕｏ−ＫＬＨは８−ニトログアノシン結合ＫＬＨ；Ｇｕｏ−ＢＳＡはグアノシン結合ＢＳＡ；Ｒｉｂ−ＢＳＡはリボース結合ＢＳＡ；ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＢＳＡは過ヨウ素酸ナトリウム処理ＢＳＡを示す。
第２図は、競合法ＥＬＩＳＡによる本発明の抗体の８−ニトログアニン類縁物に対する交差性を示した図である。
第３図は、例３で得た本発明のモノクローナル抗体の各種核酸塩基に対する交差性を示した図である。図中、ＮＯ２−Ｇｕａは８−ニトログアニン；ＮＯ２−Ｇｕｏは８−ニトログアノシン；Ｇｕａはグアニン；Ｇｕｏはグアノシン；ＯＨ−Ｇｕａは８−ヒドロキシグアニン；ＯＨ−ｄＧｕａは８−ヒドロキシデオキシグアノシン；Ｘａｎｔｈはキサンチンを示す。
第４図は、競合法ＥＬＩＳＡによる本発明のモノクローナル抗体の各種核酸塩基に対する交差性を示した図である。図中、Ａｄｅはアデニン；Ａｄｏはアデノシン；Ｔｈｙはチミン；ｄＴｈｄはデオキシチミジン；Ｕｒａはウラシル；Ｕｒｄはウリジン；ＮＯ２−Ｔｙｒは３−ニトロチロシン；ＮＯ２−Ｉｍはニトロイミダゾール；Ｃｙｔはシチジンを示す。
【図１】
2003099869.tif 000002
【図２】
2003099869.tif 000003
【図３】
2003099869.tif 000004
【図４】
2003099869.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月24日(2003.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
８−ニトログアニンを特異的に認識する抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
グアノシン；Ｘａｎｔｈはキサンチンを示す。
第４図は、競合法ＥＬＩＳＡによる本発明のモノクローナル抗体の各種核酸塩基に対する交差性を示した図である。図中、Ａｄｅはアデニン；Ａｄｏはアデノシン；Ｔｈｙはチミン；ｄＴｈｄはデオキシチミジン；Ｕｒａはウラシル；Ｕｒｄはウリジン；ＮＯ２−Ｔｙｒは３−ニトロチロシン；ＮＯ２−Ｉｍはニトロイミダゾール；Ｃｙｔはシチジンを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の抗体の製造方法は特に限定されないが、例えば、８−ニトログアノシンが結合した血清蛋白質、好ましくは８−ニトログアノシンが結合した血清アルブミンを含む抗原抗原を用いることが望ましい。この抗原の製造方法は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液中で過ヨウ素酸ナトリウム及びシアノホウ素化ナトリウムを用いて、例えば血清アルブミンなどの血清蛋白質に８−ニトログアノシンを結合させることにより容易に製造できる。８−ニトログアノジンは、ジメチルホルムアミド中で８−ブロモグアノシンを亜硝酸ナトリウムでニトロ化することにより容易に得られるが、血清蛋白質への結合の前に高速液体クロマトグラフィーで精製することが望ましい。
８−ニトログアノシンを結合するための蛋白質としては、一般的に抗原性のない血清蛋白質であればいかなるものを用いてもよい。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のほか、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）など他の哺乳動物の血清アルブミン、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などを用いることができるが、これらに限定されることはない。これらのうち、ＢＳＡがもっとも好ましい。
核酸塩基である８−ニトログアニンは、その構造上化学修飾できる部位が限られている。容易に反応できる２位のアミノ基は水素結合によって核酸塩基の認識部位としての重要な役割を担っていると考えられるため、８−ニトログアニンの２位のアミノ基を介して血清アルブミンに結合させた抗原を用いても、８−ニト




【国際調査報告】
2003099869.tif 000006
2003099869.tif 000007