(57)【要約】高い化学物質触媒活性を有する安定な担体を提供するとともに、この担体を利用した化学物質の分解方法・測定方法を提供する。金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマー、金属イオン、金属イオンを保持する機能を有するポリマー、電子吸引性の官能基を有するポリマーを組み合わせることにより、特定の化学物質を触媒する担体を得る。また、この担体を利用することにより特定の化学物質を分解したり、特定の化学物質を測定できるようにする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマーと、金属イオンとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体。
【請求項２】
金属イオンを保持する機能を有するポリマーと、金属イオンと、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体。
【請求項３】
請求の範囲第１項又は第２項記載の担体を用いる化学物質の分解方法。
【請求項４】
請求の範囲第１項又は第２項記載の担体を用いる化学物質の測定方法。
【請求項５】
化学物質が一酸化窒素である請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
化学物質がリン酸エステル類である請求の範囲第４項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、化学物質の化学反応を触媒する担体及びそれを用いた化学物質の分解方法・測定方法に関する。
背景技術
触媒活性を有する担体の開発は、化学物質の合成、分解等に利用されるばかりではなく、化学物質を検出したり、化学物質の濃度を測定したりするセンサーへ応用できる可能性があり、環境、医学、薬学、臨床検査、バイオ研究等の分野において、非常に重要である。しかしながら、触媒活性を有する担体をセンサー等として応用し、実用化するには、その担体が安定であり、かつ高い活性を有していなければならない。
触媒活性を有する担体として、金属イオンを配位結合させた担体が知られているが、これらの担体は、ポルフィリン環骨格やクラウンエーテル骨格やサイクラム環骨格のように、予め金属イオンが配位する構造が決定している骨格を含むポリマーを使用したものであり、金属イオンの高密度集積が困難であった。また、これら従来の担体は化学反応を触媒する活性が低く、そのため、電気化学的または光学的な検出器と組み合わせても、センサーとして利用することはできなかった。
また、近年、触媒活性が高い担体として、生体触媒である酵素等が注目されているが、これらの酵素等は不安定なものが多く、担体に固定化する際に失活してしまう場合もある。そのため、高い触媒活性を維持した状態でセンサー等に利用するのは非常に難しく、安定でかつ高い触媒活性を有する担体の開発が求められている。
化学物質のうち、一酸化窒素は、酸性雨の原因となると考えられており、環境の分野で重要な物質であると考えられている。また、一酸化窒素は細胞の情報伝達物質のひとつと考えられており、医学、薬学、バイオ研究、医薬品開発、化学安全性評価等の分野において非常に重要な物質である。
現在、一酸化窒素の測定方法には、化学発光法や一酸化窒素を二酸化窒素に変換してからジアゾ反応により測定するグリース法やオキシヘモグロビン法や電子スピン共鳴による方法等があるが、どれも簡便な方法ではなく、特異性にも問題があり、簡便かつ特異性の高い測定方法の開発が求められている。
また、一酸化窒素の情報伝達物質としての働きとして、特定の刺激に応答して細胞から一酸化窒素が放出されることが知られている。例えば、心筋細胞は筋弛緩因子、血管内皮細胞は血管弛緩因子、マクロファージ細胞はアレルギー物質、脳神経細胞は神経撹乱物質の刺激を受けると一酸化窒素を放出する。これら細胞が放出する一酸化窒素を測定することができれば、細胞刺激物質に対する各種細胞の応答性を調べることができる。さらに、これらの細胞を基板上に集積し、細胞チップとして利用することができる。しかしながら、一酸化窒素は細胞から放出されるとすぐに二酸化窒素に変化してしまうため、従来の方法では正確に一酸化窒素の量を測定することは困難であった。また、センサーの検出部表面に、直接、細胞を培養することが可能になれば、細胞が放出する一酸化窒素を瞬時に測定できるが、従来の方法では、センサー検出部表面での細胞培養は非常に困難であったため、細胞が放出する一酸化窒素を測定することはできなかった。
化学物質のうち、リン酸エステル類には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等のヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、グリセロールリン酸、グルコースリン酸等の代謝中間物質等、生体内において重要な役割を担っている物質が多く存在し、それらを測定することは、環境、医学、臨床検査、食品衛生、バイオ研究の分野において非常に重要である。
特に、ピロリン酸は、遺伝子診断等においてＤＮＡポリメラーゼ反応の反応量を示す指標となっており、それらを簡便に測定する方法の開発が求められている。ピロリン酸の検出方法としては、カルシウムやマグネシウムイオンとの沈殿反応や酵素を組み合わせた発色、発光反応を用いて測定する方法等があるが感度が低い。したがって、ＤＮＡの伸張を確かめるには、前処理としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行わなければならず、作業が複雑であり、検出装置の自動化や連続モニタリング化には適した方法ではなかった。
また、リン酸エステル類は、微生物や食物残渣等の汚れにも多く含まれているので、食品工場や厨房等における汚染度の指標としても適している。現在、汚染度の検査の指標には、タンパク質、糖、ＡＴＰ等が用いられているが、タンパク質、糖は感度が不十分であり、タンパク質、糖をほとんど含まない汚れも多く存在する。一方、ＡＴＰは微生物や食品残渣等に広く存在する物質であり、発光酵素のルシフェラーゼとその発光基質のルシフェリンを用いて高感度に検出できるので、汚染度の指標として適している。しかしながら、ルシフェラーゼやルシフェリンは高価であり、その測定には高価な検出器が必要であるという問題点があり、微生物や食品残渣に広く存在する指標を用い、かつ低コストな測定方法が求められている。リン酸エステル類を指標にした場合、ＡＴＰ以外のリン酸エステル類も検出できるため高感度化できるが、リン酸エステル類を幅広く、簡便に測定できる安価な測定方法はない。
化学物質のうち、テトラエチルピロリン酸等、有機リン系農薬もリン酸エステルを含んでいる。また、パラチオン、マラチオン等有機リン系農薬等もリン酸エステルに類似した構造であり、これらの有機リン系農薬も検査対象として非常に重要な物質であり、それらを測定する方法やセンサーは非常に有用であると言える。現在は、ガスクロマトグラフィや液体クロマトグラフィ等を用いて測定されるが、高価で大掛かりな装置が必要であり、安価で簡便なセンサー、測定方法の開発が求められている。
発明の開示
本発明の課題は、高い化学物質触媒活性を有する安定な担体を提供するとともに、この担体を利用した化学物質の分解方法・測定方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題について鋭意研究を重ねた結果、金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマー、金属イオン、金属イオンを保持する機能を有するポリマー、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを組み合わせることにより、化学物質の分解反応を触媒する担体が得られること、また、これらの担体を利用することにより特定の化学物質を分解できること、さらに特定の化学物質を測定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の担体および方法に関する。
１．金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマーと、金属イオンとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体。
２．金属イオンを保持する機能を有するポリマーと、金属イオンと、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体。
３．上記１または２に記載の担体を用いる化学物質の分解方法。
４．上記１または２に記載の担体を用いる化学物質の測定方法。
５．化学物質が一酸化窒素である上記４記載の方法。
６．化学物質がリン酸エステル類である上記４記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマーと、金属イオンとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体
本発明の担体に含まれる金属イオンとしては、マグネシウムイオンや亜鉛イオン、チタニウムイオン等の典型金属イオンや鉄イオンやニッケルイオンやマンガンイオン等の遷移金属イオンが挙げられるが、その種類や荷電数を限定するものではない。金属イオンの種類を変えることにより、触媒活性の基質特異性を変えることができることが本発明の大きな特徴であり、例えば、鉄イオンを用いることにより一酸化窒素の分解を触媒することが可能となり、銅イオンを用いることによりリン酸エステル類の分解を触媒することが可能になる。
本発明の担体に含まれるポリマーとは、単量体が二以上重合反応させて得られる高分子化合物であればよく、単量体の種類や重合している分子数を問わない。また、一つのポリマーに単量体が一種類の場合だけでなく、二種類以上であるものも含まれる。ポリマーの種類を変えることにより、ポリマーの粘度や強度等を自由に変えることができ、用途にあわせたポリマーを選択することが可能になる。
金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーとは、ポリマー内に含まれる複数の配位子が金属イオンを中心に配位結合することにより、金属イオンを保持し、錯体構造が決定するポリマーを意味するものである。より詳細に説明すると、主鎖及び／又は側鎖に複数の配位子を有するポリマーであって、金属イオンが存在すると該配位子が金属イオンに配位可能なようにポリマー鎖のコンホメーション・立体構造が変化し、このようにしてポリマー鎖が変化することによりその錯体構造が決定・保持されるようなものをいう。よって、ポルフィリン環骨格やクラウンエーテル骨格やサイクラム環骨格等のように、金属イオンが配位する構造（例えば、空孔を有する環構造等）が予め決定又は固定された骨格を持つポリマーは含まれない。このような金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーは、該ポリマーの主鎖及び／又は側鎖に金属イオンと親和性のある官能基を含んでおり、金属イオンと親和性のある官能基として、チエニル基、テニル基、テノイル基、ピリジル基、ピペリジノ基、ピペリジル基、キノリル基、ピリダジル基、イミダゾール基、ピラゾール基、ピラジン基、ピリダジン基等の複素環、その他アミノ基、水酸基、メルカプト基及びカルボキシル基（カルボン酸イオン）等が挙げられるが、これら以外にも数多く存在し、その種類は限定されない。金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーは、金属イオンを中心として、高配位数の錯体構造を形成し、極めて密な構造を形成することができる。この高密度な集積により、高い触媒活性を獲得することができる。このような金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーとして、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリシステイン、ポリピリジン、ポリピリミジン、ポリチオフェン、ポリピロール等及びこれらの２種以上の共重合体等が挙げられるが、その種類を限定されるものではなく、用途に適したポリマーを選択することができる。
本発明の担体は、ポリマーと金属イオンを混合することにより、容易に作製することができる。ポリマーと金属イオンを混合する方法としては、例えば、試験管等に入れてボルテックスミキサーで混和する方法や、ビーカー等に入れて攪拌子と攪拌装置等を用いて混和する方法が挙げられるが、ポリマーと金属イオンとが接触していれば良く、ここで挙げた方法に限定されない。分子量、ポリマー全体に対する官能基の密度、官能基の種類等ポリマーの種類やポリマーの濃度、金属イオンの種類、濃度等を変えることにより、担体の基質特異性、触媒活性の強さ、担体の強度、粘度等自由に変えることができ、用途に合わせた担体の設計を自由に行うことが可能である。
本発明の担体が触媒する化学物質としては、一酸化窒素、リン酸エステル類が挙げられるが、その種類は限定されない。本発明の担体は、ポリマーと金属イオンの組み合わせを変えることにより、触媒の対象となる化学物質を変えることができる。
２．金属イオンを保持する機能を有するポリマーと、金属イオンと、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体
本発明の担体に含まれる金属イオンを保持する機能を有するポリマーとは、ポリマー内もしくはポリマー表面に金属イオンを留めておくことができるポリマーであり、上述の金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーのほかに、ポルフィリン環骨格やクラウンエーテル骨格やサイクラム環骨格等、金属イオンが配位する構造が予め決定された骨格を持つポリマーも含まれる。金属イオンを保持する結合の様式は配位結合が好ましいが、配位結合以外の結合でもよい。
本発明の担体に含まれる電子吸引性の官能基を有するポリマーのうち電子吸引性の官能基とは、分子内で水素を標準としたとき、他の電子を引きつける傾向がある官能基であり、ニトロ基、ニトリル基、シアノ基、アンモニオ基、アルデヒド基、カルボニル基、カルボキシル基、エトキシカルボニル基、スルホン基、メタンスルホニル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基等が挙げられるが、そのほかにも数多く存在し、その種類を問わない。
本発明の担体に含まれる電子吸引性の官能基を有するポリマーとしては、ポリスチレンスルホン酸、ポリスチレンアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン及びポリマレイン酸等及びこれらの２種以上の共重合体等が挙げられるが、その種類を限定されるものではなく、用途に適したポリマーを選択することができる。
本発明の担体に含まれる電子吸引性の官能基を有するポリマーと金属イオンを保持する機能を有するポリマーとは、異なるポリマーであることが好ましいが、電子吸引性の官能基と金属イオンを保持する機能を同時に有するポリマーを単独で用いてもよい。また、電子吸引性の官能基が金属イオンを保持する機能を同時に有するものでもよい。
本発明の担体は、ポリマーと金属イオンを混合することにより、容易に作製することができる。まず、金属イオンを保持する機能を有するポリマーと金属イオンを混和し、予め金属イオンを保持させ、その後、電子吸引性の官能基を有するポリマーを添加することにより、金属イオンが高密度に集積した安定なポリマーを作製することができるが、混合する順序は限定されない。ポリマーと金属イオンを混合する方法としては、例えば、試験管等に入れてボルテックスミキサーで混和する方法や、ビーカー等に入れて攪拌子と攪拌装置等を用いて混和する方法が挙げられるが、ポリマーと金属イオンとが接触していれば良く、ここで挙げた方法に限定されない。分子量、ポリマー全体に対する官能基の密度、官能基の種類等ポリマーの種類やポリマーの濃度、混合するポリマーの比率、金属イオンの種類、濃度等を変えることにより、担体の基質特異性、触媒活性の強さ、担体の強度、粘度、担体全体の電荷等自由に変えることができ、用途に合わせた担体の設計を自由に行うことが可能である。特に、担体全体の電荷の微調整については、金属を保持する機能を有するポリマーと電子吸引性の官能基を有するポリマーの混合比を調整することにより、容易に変えることができる。これにより、対象となる化学物質が担体に接近しやすくしたり、また対象となる化学物質以外の夾雑物質の接近を抑制したりすることが可能になり、担体の基質特異性を制御することが可能となる。
また、担体全体の電荷調整が容易であることから、担体を細胞培養に適した電荷に調整するができ、担体表面での細胞培養が可能になり、センサーの検出部と密接した状態で細胞培養が可能になる。これにより、特に、細胞が放出する化学物質が一酸化窒素やドーパミン等のように分解されやすい物質である場合でも、これらをより正確に検出することができる。
３．本発明の担体を用いる化学物質の分解方法
本発明の担体を用いる化学物質の分解方法としては、例えば、化学物質を含む測定試料と担体とを溶液中で接触させて反応させる方法や、フィルター等に固定化した担体に試料を接触させる方法などが挙げられるが、本発明の担体と化学物質とが接触した状態であればよく、また、基質となる化学物質は気体内、溶液内どちらに存在していてもよい。
本発明の担体を用いる化学物質の分解方法においては、担体に含まれるポリマーと金属イオンの組み合わせを変えることにより、分解対象となる化学物質を自由に変えることが可能である。例えば、金属イオンとして鉄イオンを用いることにより一酸化窒素を分解することができ、銅イオンを用いることによりリン酸エステル類を分解することができる。
本発明の分解方法は、測定試料を回収する必要がある場合に、遠心分離等することにより簡単に担体と分けることができ、試料の回収が可能である。
また、本発明の担体をフィルター等に固定化し、それに試料を通すことにより、効率よく化学物質を分解することが可能となる。そのため、空気清浄機やエアコン等のフィルターに担体を固定化することにより、空気の浄化を行うことも可能である。
本発明の分解方法は、化学物質の測定における前処理として測定試薬等、測定系に含まれる試薬ブランクの原因となる化学物質の分解に利用することができ、測定感度を高くすることができる。例えば、ＡＴＰを測定するためのルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬の場合、ＡＴＰが試薬中に混入していると試薬ブランクが高くなり、測定感度が低くなる。この場合、試薬中のＡＴＰを分解する目的で、リン酸エステル類を分解する担体を用いることができる。また、本発明の分解方法は、遠心分離等により担体を別回収することが可能であるため、化学物質の測定時に影響を与えないで試薬ブランクを下げることが可能となる。
さらに、本発明の分解方法に用いられる担体は、化学反応における励起状態を引き下げることが可能であるため、測定試料中の化学物質の濃度、ｐＨ、温度等の反応条件を最適化すれば、化学物質の分解だけでなく、合成も可能になる。
４．本発明の担体を用いる化学物質の測定（検出）方法
本発明の担体を用いる化学物質の測定方法における検出装置としては、電気化学的または光学的な検出装置を用いることが好ましいが、その検出装置は限定されない。
電気化学的な検出装置としては、電気化学測定装置や簡易化した電気回路を用いた装置等が挙げられる。また、光学的な検出装置としては、比色計、発光光度計、蛍光光度計、吸光光度計、ラマン光光度計等の装置等が挙げられる。また、光学的な検出装置としては、目視による確認も含まれる。いずれの装置も、電気化学的または光学的に検出できれば良く、限定されない。
電気化学測定装置を用いた測定としては、電極表面等に本発明の担体を展開し、試料中で二電極系あるいは三電極系を形成させ、定電位を印加した場合の電流値を測定する方法が挙げられる。
また、本発明の担体と酸化還元系発色色素と組み合わせることにより、吸光光度計や目視による測定も可能になる。例えば、試験管等に入った試料に本発明の担体と酸化還元系発色色素を加え、攪拌する。その後、遠心分離装置を用いて、担体と試料により発色した発色色素を分離し、目視あるいは吸光光度計を用いて測定する方法等がある。
測定対象となる化学物質は、ポリマーと金属イオンの組み合わせを変えることにより変えることが可能である。例えば、金属イオンとして鉄イオンを用いた場合は、測定対象となる化学物質は一酸化窒素となり、銅イオンを用いた場合は、リン酸エステル類となる。
試料を測定する場合、測定対象以外の夾雑物質が含まれる場合が多い。これら夾雑物質は酵素的または電気化学的に検出されない物質に分解したり、担体全体の電荷を調整して夾雑物質の接近を抑制したり、イオン交換膜や分子ふるい膜等の選択層を追加して標的物質への選択性を高めたりすることにより、基質特異性を高めることが可能である。
５．本発明の化学物質の測定方法による一酸化窒素の測定
一酸化窒素を測定する場合、金属イオンとして鉄イオンを用いる。測定対象である一酸化窒素は、気体中、溶液中のどちらに存在しても測定することができる。
本発明の化学物質の測定方法においては、酸性雨の原因物質となる大気中の一酸化窒素を測定することができる。また、溶液中に含まれる一酸化窒素の測定にも用いることができる。さらに、細胞が放出する一酸化窒素の測定に用いることができる。
細胞が放出する一酸化窒素の測定は、以下のように行う。まず、電気化学測定装置の電極表面に一酸化窒素分解活性を有する担体を集積させる。担体全体の電荷は、細胞が吸着し、かつ細胞が生育できる電荷に調整する。その表面に、心筋細胞、血管内皮細胞、マクロファージ細胞、脳神経細胞等、細胞刺激物質に応答して一酸化窒素を放出する細胞を培養し、細胞チップを作製する。次に、筋弛緩因子、血管弛緩因子、アレルギー物質、神経撹乱物質等の細胞刺激物質を添加し、放出された一酸化窒素に伴う電流値を測定する。これにより、細胞刺激因子に対する各種細胞の応答性を調べることができる。
６．本発明の化学物質の測定方法によるリン酸エステル類の測定
本発明の測定対象となる化学物質のうちリン酸エステル類とは、リン酸とアルコール性ヒドロキシル基とのエステル結合を含む化合物であり、エステル結合の数、エステル結合以外の分子構造等を問うものではない。また、リン酸エステル部分の酸素原子が硫黄原子に置き換わった物質等リン酸エステル結合に類似した物質も測定対象になる。ピロリン酸等のポリリン酸類、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）等のアデノシンリン酸エステル類、そのほかのヌクレオチド類、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸類、グルコース６−リン酸、リン脂質、有機リン系農薬等が測定対象として挙げられる。
リン酸エステル類を測定する場合、金属イオンとして銅イオンを用いる。
測定試料中には、測定対象以外のリン酸エステル類が夾雑しているが、夾雑物質を酵素的な手法や電気化学的な手法を用いる等して検出されない物質に分解することにより、特定のリン酸エステル類を選択的に測定することができる。また、担体全体の電荷を調整して夾雑物質の接近を抑制したり、担体表面に分子選択層を追加したりすることにより、選択性が高めることができる。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、ＤＮＡのポリメラーゼ反応の生成物であるピロリン酸を指標に、ポリメラーゼ反応の反応量を測定する場合、ＤＮＡや未反応のデオキシヌクレオチド等のリン酸エステル類が夾雑している。このような場合、前処理として、試料中のＤＮＡを核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）により、デオキシヌクレオチドをアピラーゼ等デオキシヌクレオチド脱リン酸酵素により分解し、測定に影響がない程度に下げることができる。また、試料をイオン交換樹脂や分子ふるい樹脂等で処理することにより、ＤＮＡやデオキシヌクレオチドを除去し、測定に影響がないレベルに抑えることができる。あるいは、イオン交換膜や分子ふるい膜等の分子選択層で担体表面を被覆することにより、ピロリン酸以外の物質の担体表面への接近を防ぎ、測定に影響がないレベルに抑えることができる。
リン酸エステル類は、細胞中にも多く含まれており、細胞中に含まれるこれらリン酸エステル類の量を測定することにより、試料中の細胞数を推定することができる。
試料中の細胞数を推定する方法を以下に示す。
（１）トリクロロ酢酸、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等を用いて細胞内のリン酸エステル類を抽出した試料を調製する。
（２）（１）で調製した試料中のリン酸エステル類の量を、リン酸エステル類分解活性を有する触媒担体を展開した電極を用いて電気化学的な手法で測定する。あるいは、リン酸エステル類分解活性を有する触媒担体と酸化還元系発色試薬を共存させた試薬と（１）で調製した試料を反応させることにより、試料中のリン酸エステル類の量を、目視や吸光光度計等光学的な手法で測定する。
（３）（２）で測定したリン酸エステル類の値から、試料中の細胞数を推定する。
また、細胞表面のリン脂質を指標とする場合には、トリクロロ酢酸等により細胞内のリン酸エステル類を抽出する必要はなく、細胞が生きた状態で測定することができる。そのため、試料中の細胞数を推定した後に、食中毒菌等細胞の種類を同定することも可能である。
さらに、より正確に細胞数を測定するためには、測定試料を細胞の捕捉が可能な口径のろ過フィルターでろ過し、フィルター上に細胞を捕捉し、捕捉された細胞数を計測することができる。
捕捉した細胞を検出する方法の例として、一辺５０μｍ程度の電極が束状になったマイクロアレイ電極にリン酸エステル類分解活性を有する担体を集積したリン酸エステル類センサーを作製し、細胞を捕捉したフィルターをそのマイクロアレイリン酸エステル類センサー上にのせ、細胞中のリン酸エステル類を検出し、規定値以上の電流が流れた電極数を細胞数とみなす方法が挙げられる。あるいは、酸化還元系色素とリン酸エステル類用触媒担体を組み合わせた発色試薬を用いて、細胞中、細胞表面のリン酸エステル類を発色させて、その発色点の数を細胞数とみなす方法も挙げられる。
抗体を用いることにより、食中毒菌等特定細胞を特異的に検出することができる。例えば、一辺５０μｍ程度の電極が束状になったマイクロアレイ電極にリン酸エステル類分解活性を有する担体と標的細胞に特異的に結合する抗体を集積したリン酸エステル類センサーを作製し、それに試料液体を流し、標的細胞を捕捉し、細胞表面のリン脂質のリン酸エステル類を検出することにより、検出された電極数を細胞の個数とみなすことができる。
リン酸エステル類測定方法は、食品工場や厨房等における汚染度検査にも応用することができる。リン酸エステル類は食物残渣や微生物等の汚染原因物質にも広く含まれる。これら汚染原因物質中のリン酸エステル類を測定することにより、検査箇所の汚染度検査が可能になる。
例えば、検査箇所を綿棒、スタンプ等でふき取り、それを酸化還元系発色試薬と本発明の触媒担体を混合した試薬に懸濁し、遠心後上清の発色量を吸光度計や目視により光学的に測定し、汚染度を検査できる。あるいは、ふき取った綿棒等を水や生理的食塩水や緩衝液等に懸濁し、その溶液にリン酸エステル類分解活性を有する触媒担体を用いた電気化学的リン酸エステル類センサーの検出部を入れたり、検出部に溶液を滴下したりして、その電流値を測定することにより、汚染度を検査できる。
リン酸エステル類測定方法を用いて、食物等に残留した有機リン系農薬を測定することもできる。本発明において測定可能な有機リン酸系の農薬としては、リン酸エステルを含むテトラエチルピロリン酸が挙げられ、また、酸素原子が硫黄に置き換わったリン酸エステル類似構造を含むパラチオンやマラチオン等が挙げられる。
有機リン系農薬の検出方法としては、例えば、農作物の検体をストマッキング処理等により均一化したり、表面を水ですすいだりして調製した試料を、リン酸エステル類センサーを用いて、簡便かつ迅速に測定する方法が挙げられる。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００２−７３１５０号の明細書に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
次に、以下実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕（ＡＴＰを分解する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭ  ＣｕＣｌ２を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。
この担体を含む溶液を遠心分離し得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ／ＮａＯＨ緩衝液に溶解して使用した。十分攪拌して均一化した担体溶液と１０μＭ  ＡＴＰ溶液を１：１の割合で混合し、ボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、分解を行った。また、上記のＣｕＣｌ２のかわりにＦｅＣｌ３、ＺｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２を用いて得られた担体を使用して同様にＡＴＰの分解を行った。
ＡＴＰ濃度の測定は、上記分解反応液を遠心することにより、担体とＡＴＰ溶液を分離したのち、上清のＡＴＰ溶液の濃度をルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬（ルシフェール２５０、キッコーマン社製）により測定した。
その結果、図１に示すように、ＣｕＣｌ２の場合は２分でＡＴＰが１００％分解したが、それ以外の金属イオンを用いて得られた担体を使用した場合では分解量は５〜４０％であった。ＣｕＣｌ２を用いて得られた担体を用いることにより、効率的にＡＴＰを分解できることが明らかになった。
〔実施例２〕（電気化学的センサーを用いて一酸化窒素を測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭ  ＦｅＣｌ３を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下した後、風乾し、一酸化窒素センサー電極として用いた。
水溶液溶存一酸化窒素は、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記一酸化窒素センサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。０〜０．１ｍＭの各濃度の一酸化窒素水溶液に上記一酸化窒素センサーを浸漬し、電流値測定した。
その結果、図２に示すのように一酸化窒素量に依存した電流値の変化が見られた。
〔実施例３〕（細胞チップ集積した培養細胞が産生する一酸化窒素を測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭ  ＦｅＣｌ３を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を底面が金属薄膜でコートされた培養ディッシュ面に展開し、風乾することにより膜化した。これに対極、参照極を加え三電極系とし、一酸化窒素検出細胞チップ（以下、細胞チップという。図３に示す。）として用いた。細胞チップをアルコール噴霧により滅菌処理した後、細胞チップ上で直接血管内皮細胞を培養した細胞チップを作製した。培養ディッシュ内に血管弛緩因子を細胞に添加し、そのときの電流値を連続的に測定した。
その結果、図４に示すように、血管弛緩因子に応答して細胞が一酸化窒素を産生する挙動が連続的に測定できた。
〔実施例４〕（電気化学的センサーを用いてＡＴＰ、ＡＤＰを測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭ  ＣｕＣｌ２を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下し多後、風乾し、ＡＴＰ、ＡＤＰ測定用センサー電極として用いた。
ＡＴＰ、ＡＤＰは、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記一酸化ＡＴＰ、ＡＤＰセンサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。０〜２００ｍＭの各濃度のＡＴＰ、ＡＤＰ水溶液に上記ＡＴＰ、ＡＤＰセンサーを浸漬し、電流値測定した。
その結果、図５、図６に示すようにＡＴＰ、ＡＤＰ量に依存した電流値が得られた。
〔実施例５〕（電気化学的センサーを用いてピロリン酸を測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭ  ＣｕＣｌ２を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。
この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下した後、風乾し、ピロリン酸測定用センサー電極として用いた。
ピロリン酸は、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記ピロリン酸センサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。０〜２００ｍＭの各濃度のピロリン酸水溶液に上記ピロリン酸センサーを浸漬し、電流値を測定した。
その結果、図７に示すようにピロリン酸量に依存した電流値が得られた。
〔実施例６〕（電子吸引性官能基（ベンゼンスルホン基）の導入効果を示す実験）
ポリマーを作製する際、電子吸引性の官能基として、側鎖に電子吸引性がより強いスルホン基が結合したベンゼンスルホン基と比較的吸引性の弱いカルボキシル基を各比率で導入した以下の（１）〜（４）のポリマーを用いた。
（１）ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ｐｏｌｙ（ｓｏｄｉｕｍ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ））（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基１００％、カルボキシル基０％）
（２）ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸−マレイン酸）共重合体ナトリウム塩（ｐｏｌｙ（４−ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏ−ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）（スチレン／マレイン酸モル比３：１）（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基６０％、カルボキシル基４０％）
（３）ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸−マレイン酸）共重合体ナトリウム塩（ｐｏｌｙ（４−ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏ−ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）（スチレン／マレイン酸モル比１：１）（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基３３％、カルボキシル基６７％）
（４）ポリマレイン酸（ｐｏｌｙ（ａｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基０％、カルボキシル基１００％））
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭ  ＦｅＣｌ３を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した。上記（１）〜（４）のポリマーをそれぞれ添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下した後、風乾して一酸化窒素センサー電極として用いた。
水溶液溶存一酸化窒素は、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記一酸化窒素センサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。２ｍＭの各濃度の一酸化窒素水溶液に上記一酸化窒素センサーを浸漬して電流値を測定した。得られた電流値からベース電流値（ＮＯの無い環境での電流値）を差し引いた値を応答電流とし、ベンゼンスルホン基の導入率が０％の応答電流を１００％とし、それぞれ示した。その結果を図８に示す。
図８に示されるように、カルボキシル基よりも電子吸引性が強いベンゼンスルホン基がより多いほど、得られる応答電流が増大することが明らかになった。この結果から、本発明において、より電子吸引性が強い官能基を多く導入することにより、応答電流を増幅させる効果があると言える。また、ベンゼンスルホン基の導入により、分子環境が疎水的になることにより、よりＮＯが反応しやすい環境になり、触媒効率を上げることによる応答電流増大効果も考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーと、金属イオンを組み合わせた担体により、金属イオンの高密度集積が可能になり、安定で、かつ高い触媒活性を有する担体を得ることができる。また、金属イオンを保持する機能を有するポリマーと金属イオンと電子吸引性の官能基を持つポリマーを組み合わせた担体により、金属イオンの酸化還元電位を下げることが可能になり、安定で、かつ高い触媒活性を有する担体を得ることことができる。さらに、本発明で得られる担体は、金属イオンを変えることにより基質に対する特異性を変えることが可能となり、様々な化学物質の分解反応を触媒することができる。そのため、広い分野において利用できる化学物質の分解方法を提供することが可能となり、様々な化学物質を分解することができる。また、本発明で得られる担体を電気化学的または光学的な検出系と組み合わせることにより、様々な化学物質を測定することが可能になる。これにより、広い分野において利用可能なセンサーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、リン酸エステル類分解活性を触媒する担体を用いた時のＡＴＰの分解率を示すグラフである。
図２は、一酸化窒素濃度と応答電流値を示すグラフである。
図３は、一酸化窒素分解活性を触媒する担体を用いた細胞チップを示す概略図である。なお、対極、参照極は図中より省略してある。
図４は、細胞チップに細胞刺激物質を添加した時の応答電流の経時的変化を示すグラフである。図中の（Ａ）の時点で薬剤を添加した。図中、（ａ）は２５０μＭ量の血管拡張剤を添加した場合であり、（ｂ）は１００μＭ量の血管拡張剤を添加した場合であり、（ｃ）は何も添加していない場合である。
図５は、各ＡＴＰ濃度におけるリン酸エステル類センサーの応答電流値を示すグラフである。
図６は、各ＡＤＰ濃度におけるリン酸エステル類センサーの応答電流値を示すグラフである。
図７は、各ピロリン酸濃度におけるリン酸エステル類センサーの応答電流値を示すグラフである。
図８は、ベンゼンスルホン基の導入率と応答電流との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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