(57)【要約】本発明は抗体可変領域を含むポリペプチドを発現するパラミクソウイルスベクターを提供する。抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域をコードする本発明のベクターは、これらの抗体鎖を同時に発現しＦａｂを形成した。また一本鎖抗体を高レベルで発現させることにも成功した。本発明のベクターは、インビボまたはエクスビボにより生体内に投与するための遺伝子治療ベクターとして適している。特に神経伸長阻害因子に対する抗体断片を発現するベクターは、神経損傷への遺伝子治療に有用である。また、免疫活性化シグナル伝達を阻害する抗体を発現する本発明のベクターは、ベクターからの遺伝子の長期発現を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクター。
【請求項２】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
該ポリペプチドが分泌型である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
抗体のＨ鎖可変領域を含むポリペプチド、および抗体のＬ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードしている、請求項１に記載のパラミクソウイルスベクター。
【請求項５】
抗体のＨ鎖可変領域を含むポリペプチド、および抗体のＬ鎖可変領域を含むポリペプチドが、互いに結合してＦａｂを構成する、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
抗体可変領域の少なくとも１つがリガンドまたは受容体に対する抗体に由来する、請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
抗体が神経細胞の生存、分化、または神経突起伸長を阻害する蛋白質に結合する、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
抗体がＮＯＧＯに対する抗体である、請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
抗体が免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体である、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
抗体が、Ｔ細胞または抗原提示細胞の表面に発現する受容体またはそのリガンドに対する抗体である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
該受容体またはそのリガンドが、Ｔ細胞または抗原提示細胞のコスティミュラトリーシグナルのシグナル伝達分子である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
該シグナル伝達分子が、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＰＤ−１、およびＩＣＯＳからなる群より選択される分子である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
さらに他の外来遺伝子をコードしている、請求項９に記載のベクター。
【請求項１４】
抗体可変領域を含む組み換えポリペプチドの製造方法であって、（ａ）請求項１に記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、および
（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、産生されたポリペプチドを回収する工程、を含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項１６】
神経形成を促進する方法であって、神経を形成させる必要がある部位に請求項７に記載のベクターを送達する工程を含む方法。
【請求項１７】
脊髄損傷の治療方法であって、該損傷部位に請求項７に記載のベクターを送達する工程を含む方法。
【請求項１８】
請求項９に記載のベクターを投与する工程を含む、免疫反応を抑制する方法。
【請求項１９】
免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体、あるいはＣＴＬＡ４またはその断片を投与する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ベクターからの遺伝子の発現を持続させるおよび／またはベクターの繰り返し投与によるベクターからの遺伝子の発現を増強する方法であって、請求項９に記載のベクターを投与する工程を含む方法。
【請求項２１】
免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体、あるいはＣＴＬＡ４またはその断片を投与する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
発現持続性が上昇したベクター組成物であって、請求項９に記載のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２３】
遺伝子導入キットであって、（ａ）請求項９に記載のベクター、ならびに（ｂ）免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体あるいはＣＴＬＡ４またはその断片、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗体可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関する。
背景技術
モノクローナル抗体は医薬品としてその有用性が広く認識されており、既に１０種以上のモノクローナル抗体医薬が販売もしくは販売に向けて準備が進められている状況にある（Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１１９６−１１９７，１９９８。モノクローナル抗体医薬の特徴はやはりその選択性にあり、唯一特定の抗原と結合し、阻害或いは排除等の活性を発現することから、今後も医薬品としての発展が期待されている。モノクローナル抗体医薬は、通常は哺乳動物のハイブリドーマで作製されるが、一般的には生産コストが高いこと、また通常は全身デリバリーでの投与になるため、軽微な場合でも発熱等の副作用が生じることが問題点として指摘されている。大腸菌等のバクテリア、酵母、あるいは昆虫細胞によって抗体を産生する試みもあるが、糖鎖修飾の違いなどが抗体の生物活性および抗体蛋白質の抗原性に影響を及ぼす懸念がある。
発明の開示
本発明は、抗体可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用を提供することを課題とする。
本発明者らは、現在広く利用されている、及び今後利用拡大が予想されるモノクローナル抗体医薬を、遺伝子導入ベクターを介して発現させることが可能であれば、病巣近辺での局所的な発現が可能となり、副作用の軽減とともに、モノクローナル抗体医薬の開発上必ず発生するコスト面での問題を解決する可能性が高いと考えた。
近年、遺伝子治療を目的として多様な遺伝子導入用ベクターが開発されており、ベクターの種類にもよるが、遺伝子導入細胞での局所的な発現を期待することができる。中でも本発明者らはこれまで、センダイウイルス（ＳｅＶ）を用いて遺伝子治療にも使用できる新しい遺伝子導入用および遺伝子治療用のベクターの開発を行ってきた。ＳｅＶは非分節型マイナス鎖ＲＮＡウィルスで、パラミクソウィルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）に属し、ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓの一種である。本発明者らは、モノクローナル抗体を発現するＳｅＶを新規に構築し、これを用いて生体内でモノクローナル抗体を発現させる新たな遺伝子治療を確立するため実験を行った。本発明者らは、伝播型および伝播能欠損型の２種のＳｅＶを用いて、神経軸索伸長阻害因子（ＮＯＧＯ）に対する中和抗体（ＩＮ−１）のＦａｂ（Ｈ鎖及びＬ鎖）遺伝子を搭載したベクターを構築した。両ベクターともに再構成に成功し、伝播型で２９ＨＡＵ（約５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ）、伝播能欠損型（Ｆ遺伝子欠失型）で２．７×１０７ＣＩＵ／ｍＬのベクターを回収することに成功した。このベクターを導入した細胞の培養上清からは、酸化条件で約４７ｋＤａ、還元条件で約３０ｋＤａのバンドが検出され、酸化条件ではＨ鎖及びＬ鎖が結合したＦａｂ抗体が形成されていると判断された。軸索伸長阻害因子に対する抗体を発現するベクターは、脊髄損傷への応用が想定され、本ベクターを用いた脊髄傷害に対する遺伝子治療が可能となる。
また本発明者らは、抗体を発現するパラミクソウイルスベクターは、免疫原性が抑制されたベクターとしても有用であることを見出した。ウイルスベクターの生体内投与においては導入されたウイルスに対する免疫が誘導され、これによりウイルスベクターが排除され導入遺伝子の長期発現が阻害される。このような状況では、ベクターの複数回投与も困難となる。ベクターに免疫誘導を抑制する作用を持たせれば、ベクターに対する免疫反応を抑制し、導入遺伝子の長期発現および複数回投与（繰り返し投与）が可能となる。このためには、免疫シグナル分子に対する抗体を発現するベクターが有効である。例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗原、及び組織適合性抗原（ＭＨＣ）に由来するシグナルと共同して働く、第二のシグナルであるコスティミュラトリーシグナル（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ；補助刺激）分子に対する抗体をベクターから発現させることにより、この第二のシグナルを欠如させ、Ｔ細胞を不活化させることができる。このようなパラミクソウイルスベクターは、ベクターに対する細胞性免疫を抑制し、導入遺伝子の長期発現を可能とする。
このように本発明において提供されるベクターは、特に遺伝子治療等において生体に投与するベクターとして適しており、種々の疾病および傷害への適用が期待できる。また、パラミクソウイルスベクターは哺乳動物細胞において導入遺伝子を極めて高いレベルで発現することが可能であることから、ヒトを含めた哺乳動物細胞で所望の抗体を大量に製造させることも可能である。このように、抗体を発現するパラミクソウイルスベクターは、臨床的にも産業的にも高い有用性を有している。
すなわち本発明は、抗体の可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関し、より具体的には、
（１）抗体可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクター、
（２）パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、（１）に記載のウイルスベクター、
（３）該ポリペプチドが分泌型である、（１）に記載のウイルスベクター、
（４）抗体のＨ鎖可変領域を含むポリペプチド、および抗体のＬ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードしている（１）に記載のパラミクソウイルスベクター、
（５）抗体のＨ鎖可変領域を含むポリペプチド、および抗体のＬ鎖可変領域を含むポリペプチドが、互いに結合してＦａｂを構成する、（４）に記載のウイルスベクター、
（６）抗体可変領域の少なくとも１つがリガンドまたは受容体に対する抗体に由来する、（５）に記載のウイルスベクター、
（７）抗体が神経細胞の生存、分化、または神経突起伸長を阻害する因子に結合する、（６）に記載のウイルスベクター、
（８）抗体がＮＯＧＯに対する抗体である、（７）に記載のウイルスベクター、
（９）抗体が免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体である、（６）に記載のウイルスベクター、
（１０）抗体が、Ｔ細胞または抗原提示細胞の表面に発現する受容体またはそのリガンドに対する抗体である、（９）に記載のベクター、
（１１）該受容体またはそのリガンドが、Ｔ細胞または抗原提示細胞のコスティミュラトリーシグナルのシグナル伝達分子である、（１０）に記載のベクター、
（１２）該シグナル伝達分子が、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＰＤ−１、およびＩＣＯＳからなる群より選択される分子である、（１１）に記載のベクター、
（１３）さらに他の外来遺伝子をコードしている、（９）に記載のベクター、
（１４）抗体可変領域を含む組み換えポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）（１）に記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、および
（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、産生されたポリペプチドを回収する工程、を含む方法、
（１５）（１４）に記載の方法により製造されたポリペプチド、
（１６）神経形成を促進する方法であって、神経を形成させる必要がある部位に（７）に記載のベクターを送達する工程を含む方法、
（１７）脊髄損傷の治療方法であって、該損傷部位に（７）に記載のベクターを送達する工程を含む方法、
（１８）（９）に記載のベクターを投与する工程を含む、免疫反応を抑制する方法、
（１９）免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体、あるいはＣＴＬＡ４またはその断片を投与する工程をさらに含む、（１８）に記載の方法、
（２０）ベクターからの遺伝子の発現を持続させるおよび／またはベクターの繰り返し投与によるベクターからの遺伝子の発現を増強する方法であって、（９）に記載のベクターを投与する工程を含む方法、
（２１）免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体、あるいはＣＴＬＡ４またはその断片を投与する工程をさらに含む、（２０）に記載の方法、
（２２）発現持続性が上昇したベクター組成物であって、（９）に記載のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物、
（２３）遺伝子導入キットであって、（ａ）（９）に記載のベクター、ならびに（ｂ）免疫シグナル伝達の受容体またはそのリガンドに対する抗体あるいはＣＴＬＡ４またはその断片、を含むキット、に関する。
本発明において「抗体」とは、イムノグロブリンの可変領域を含むポリペプチドを総称し、具体的にはイムノグロブリン鎖（Ｈ鎖またはＬ鎖）、その可変領域を含む断片、および該断片を含むポリペプチドが含まれる。抗体は、天然の抗体であっても人工的に作出した抗体であってもよい。例えば、２種またはそれ以上の抗体のキメラ（例えばヒトおよび他の哺乳動物のキメラ抗体）などであってもよく、Ｆｃ領域の置換あるいはＣＤＲグラフトなどで構築した組み換え抗体（例えばヒト化抗体など）は本発明において抗体に含まれる。「イムノグロブリン可変領域」とは、イムノグロブリンＨ鎖またはＬ鎖の可変領域（すなわちＶＨまたはＶＬ）またはその部分を言う。Ｌ鎖はκ鎖であってもγ鎖であってもよい。本発明において可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含むアミノ酸配列からなっていてよく、具体的にはＨ鎖またはＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のいずれかを含むものであってよい。好ましくは本発明においてイムノグロブリン可変領域は、Ｈ鎖またはＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含む領域である。本発明においてイムノグロブリンは任意のクラスに属するものが含まれ、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤを含む。
組み換えウイルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換え蛋白質は、蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。組み換え蛋白質とは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成した蛋白質または人工的に合成された蛋白質を言う。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものはリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡの遺伝子を呼ぶ。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウィルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウィルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルプラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、具体的にはセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウィルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウィルス１，２，３型等が挙げられる。より具体的には、例えばＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）、ｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ５（ＳＶ５）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）、およびＮｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）などが含まれる。より好ましくは、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）からなる群より選択されるウイルスが例示できる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミクソウイルス��科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
本発明においてベクターとは、核酸を細胞に導入する担体である。パラミクソウイルスベクターとは、パラミクソウイルスに由来する、核酸を細胞に導入する担体である。ＳｅＶなどのパラミクソウィルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない。このため染色体異常による癌化または不死化などの安全面における問題が生じない。パラミクソウィルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、ＳｅＶを連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。伝播能を有するＳｅＶベクターは、外来遺伝子を少なくとも４ｋｂまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事が可能である。これにより、抗体のＨ鎖およびＬ鎖を同一ベクターから発現させることができる（実施例１）。
また、センダイウイルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、ヒトに対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１５：５３３−５４０，１９９７）。更に特筆すべき利点として以下の２点、すなわち「高感染性」及び「高発現量」を挙げることができる。ＳｅＶベクターは細胞膜蛋白糖鎖のシアル酸に結合して感染するが、このシアル酸はほとんどの細胞で発現しており、このことが感染スペクトルを広くする、則ち高感染性に繋がっている。ＳｅＶのレプリコンをベースにした伝播型ベクターは放出されたウイルスが周囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに複製されたＲＮＰが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配されるため持続発現が期待される。また、ＳｅＶベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ。広範な感染性を有するということは、様々な種類の抗体治療（及び解析）に利用可能であることを示している。また、細胞質のみでの転写・複製するという特徴的な発現機構であることから、搭載遺伝子の発現量が非常に高いことが示されている（Ｍｏｒｉｙａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２５（１）１０５−１１１（１９９８）；ＷＯ００／７００７０）。更に、エンベロープ遺伝子を欠失して非伝播性にしたＳｅＶベクターの回収にも成功しており（ＷＯ００／７００７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））、「高感染性」及び「高発現量」を維持して、「安全性」をさらに高めるための改良が進行している。
センダイウイルスのこれらの特徴は、ＳｅＶを初めとするパラミクソウィルスベクターは有効な遺伝子治療用および遺伝子導入用ベクターであり、抗体のインビボまたはエクスビボでの発現を目的とした遺伝子治療における有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。特にＨ鎖およびＬ鎖を高いレベルで共発現することが可能で、ヒトに毒性がないベクターは、臨床的に高い可能性を持つ。パラミクソウィルスベクターに治療用（及び解析用）の抗体遺伝子を搭載して機能を発揮させることで、病巣近辺での局所的な高い発現が可能となり、治療効果の確実性とともに副作用の軽減が期待される。また、モノクローナル抗体医薬の開発上必ず発生するコスト面での問題を解決する可能性も高い。これらの効果は、一過的に強発現が誘導される、ＳｅＶを初めとするパラミクソウィルスベクターだからこそ、より有効であると考えられる。
パラミクソウイルスベクターは、パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡを含んでいる。ゲノムＲＮＡとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にＲＮＰを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、該核酸が複製して娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡを言う。パラミクソウイルスは一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスであるので、このようなＲＮＡは搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般にパラミクソウィルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）−介在配列（Ｉ配列）−転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子のＯＲＦをコードするＲＮＡが別々のシストロンとして転写される。本発明のベクターに含まれるゲノムＲＮＡは、該ＲＮＡにコードされる遺伝子群の発現およびＲＮＡ自身の自律的な複製に必要なウイルス蛋白質であるＮ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、およびＬ（ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該ＲＮＡは、ウイルス粒子の形成に必要なＭ（マトリックス）蛋白質をコードしていてもよい。さらに該ＲＮＡは、ウイルス粒子の感染に必要なエンベロープ蛋白質をコードしていてもよい。パラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質としては、細胞膜融合を起こす蛋白質であるＦ（フュージョン）蛋白質および細胞への接着に必要なＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）蛋白質が挙げられる。但し、ある種の細胞では感染にＨＮ蛋白質は必要なく（Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２（４）：９７８−９８２（１９８５））、Ｆ蛋白質のみで感染が成立する。また、Ｆ蛋白質および／またはＨＮ蛋白質以外のウイルスエンベロープ蛋白質をコードさせてもよい。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、例えばパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であってよい。ＲＮＰは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このようなＲＮＰは、具体的にはパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡ、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質を含む複合体である。ＲＮＰは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムＲＮＡからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘ＲＮＰが形成される。ゲノムＲＮＡの複製は、該ＲＮＡのコピー数の増加をＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。
また本発明のパラミクソウイルスベクターは、好ましくはパラミクソウイルスのウイルス粒子である。ウイルス粒子とは、ウイルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。パラミクソウイルスのウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質を含む上記ＲＮＰが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。ウイルス粒子は、感染性を示すものであってよい。感染性とは、パラミクソウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の核酸を導入することのできる能力を言う。本発明のパラミクソウイルスベクターは、伝播能を有していてもよく、あるいは伝播能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、Ｎ遺伝子は″ＮＰ″とも表記される。
レスピロウイルス属    Ｎ    Ｐ／Ｃ／Ｖ  Ｍ  Ｆ  ＨＮ    −      Ｌ
ルブラウイルス属      Ｎ    Ｐ／Ｖ      Ｍ  Ｆ  ＨＮ  （ＳＨ）  Ｌ
モービリウイルス属    Ｎ    Ｐ／Ｃ／Ｖ  Ｍ  Ｆ  Ｈ      −      Ｌ
例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、Ｎ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、Ｎ遺伝子については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ−１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ−２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ−３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢ０１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ  Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ−１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ−３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ−１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ−３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ���Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ−１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ−２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ−３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ−４Ａ，Ｍ３４０３３；ＨＰＩＶ−４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；およびＳＶ−５，Ｓ７６８７６が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
これらのウイルス蛋白質のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ−Ｉ−Ｓ配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ−Ｉ−Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子は６つではないが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般にＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自立的にＲＮＡゲノムから遺伝子が発現し、ゲノムＲＮＡが複製される。さらにＦおよびＨＮ遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびＭ遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは伝播能を有するウイルスベクターとなる。抗体可変領域を含むポリペプチドをコードする遺伝子は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、Ｍ、Ｆ、またはＨＮ遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、本発明のウイルスベクターとして、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウイルスのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウイルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のウイルスベクターには、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。ウイルスのゲノムＲＮＡにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的として感染するベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また本発明のベクターは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率または複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウィルスベクターにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質またはＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスベクターを作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける毒性のない遺伝子導入用ウィルスベクターとして特に有用である。
本発明のベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターのゲノムに、抗体可変領域を含むポリペプチドをコードする核酸を有する。抗体可変領域を含むポリペプチドとしては、天然の抗体全長（ｆｕｌｌ  ｂｏｄｙ）であってもよく、抗原を認識する限り、抗体の可変領域を含む断片であってもよい。抗体断片としては、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖなどが例示できる。抗体断片をコードする核酸の挿入位置は、例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えば３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。また、ＦまたはＨＮ遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域に抗体断片をコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，４８２２−４８３０，１９９３）。挿入した外来遺伝子とウイルスＯＲＦとの間には、Ｅ−Ｉ−Ｓ配列が構成されるようにする。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を介して２またはそれ以上の遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。あるいは、ＩＲＥＳを介して目的の遺伝子を挿入してもよい。
本発明のベクターとしては、例えば抗体のＨ鎖可変領域を含むポリペプチド、および抗体のＬ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードしていてよい。２つのポリペプチドは、互いに結合するための１つまたは複数のアミノ酸を含んでいる。例えば、野生型抗体はＨ鎖定常領域ＣＨ１とＣＨ２の間にＨ鎖とＬ鎖がジスルフィド結合で結合するシステイン残基を持つ。このシステインを含む抗体断片をベクターから発現させることにより、Ｈ鎖とＬ鎖に由来するペプチド同士を結合させることができる（実施例１）。あるいは、互いに結合するタグペプチドを抗体断片に付加しておき、このタグペプチドを介してＨ鎖とＬ鎖に由来するペプチドを結合させてもよい。天然の抗体には、さらにＨ鎖同士を結合させる２組のジスルフィド結合を形成させるためのシステインが各Ｈ鎖に２つ存在する。これらのうち少なくとも１つのシステインを持つＨ鎖は、互いに結合して２価抗体を形成する。Ｈ鎖結合のためのシステインを欠く抗体断片は、Ｆａｂのような１価の抗体を形成する。
本発明においてＦａｂとは、抗体Ｈ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖およびＬ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖からなる複合体を言う。これらのポリペプチドは互いに結合し１つの抗原結合部位（１価）を形成する。Ｆａｂは、典型的にはイムノグロブリンをパパインで消化することにより得られるが、これと同等の構造を有するものも本発明においてＦａｂと称す。具体的には、ＦａｂはイムノグロブリンＬ鎖と、Ｈ鎖可変領域（Ｖｈ）およびＣＨ１を含むポリペプチド鎖とが結合した二量体蛋白質であってよい。Ｈ鎖断片のＣ末端部位はパパインの切断部位でなくてもよく、他のプロテアーゼまたは薬剤により切断されたもの、あるいは人工的に設計した断片であってよい。Ｆａｂ’（イムノグロブリンをペプシン消化後、Ｈ鎖間のジスルフィド結合を切断して得られる）、およびＦａｂ（ｔ）（イムノグロブリンのトリプシン消化で得られる）なども、Ｆａｂと同等の構造を有することから、これらは本発明においてＦａｂに含まれる。イムノグロブリンのクラスは限定されず、ＩｇＧおよびＩｇＭなどを含む全てのクラスが含まれる。Ｆａｂは、典型的にはＨ鎖断片およびＬ鎖断片のＣ末端付近に、両者がジスルフィド結合を介して結合できるシステイン残基を有している。しかし本発明においてＦａｂは、ジスルフィド結合を介して結合していなくてもよく、例えば相互に結合できるペプチド断片をＬ鎖とＨ鎖断片とに付加しておき、これらのペプチドを介して両鎖を結合させＦａｂを形成させてもよい。
本発明においてＦ（ａｂ’）２とは、抗体の定常領域を欠失する抗体またはそれと同等の形態の蛋白質複合体を言い、具体的には抗体Ｈ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖およびＬ鎖可変領域を含む１つのポリペプチド鎖からなる複合体を２つ有する蛋白質複合体を言う。Ｆ（ａｂ’）２は抗原結合部が２つある二価抗体であり、典型的には抗体をｐＨ４付近でペプシンにより消化して得られ、Ｈ鎖のヒンジ領域を有している。しかし本発明においてＦ（ａｂ’）２は、他のプロテアーゼまたは薬剤により切断されたもの、あるいは人工的に設計したものであってよい。ペプチド鎖の結合は、ジスルフィド結合であってもよく、他の結合であってもよい。イムノグロブリンのクラスは限定されず、ＩｇＧおよびＩｇＭなどを含む全てのクラスが含まれる。
ｓｃＦｖとは、抗体Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域が一本のポリペプチド鎖に含まれているポリペプチドを言う。Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域は適当な長さのスペーサーを介して連結されており、互いに結合して抗原結合部を形成する。
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、ネガティブ鎖の３’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、５’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、抗体断片の高い発現が得られることが有利と考えられるため、抗体をコードする外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。具体的には、３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に挿入される。あるいは、３’に一番近いウイルス遺伝子と２番目の遺伝子のＯＲＦの間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの３’に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はＮ遺伝子であり、２番目の遺伝子はＰ遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖ゲノムのなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
Ｈ鎖可変領域を含むポリペプチドおよびＬ鎖可変領域を含むポリペプチドの２本のポリペプチドをベクターから発現させる場合は、それぞれのポリペプチドをコードする核酸をベクターのゲノムに挿入する。２つの核酸はＥ−Ｉ−Ｓ配列を介してタンデムに並べることが好ましい。Ｓ配列は転写開始効率の高い配列を用いることが好ましく、例えば５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（ネガティブ鎖，配列番号：１）を好適に用いることができる。
本発明のベクターは、このように抗体断片をコードする遺伝子を挿入した以外の位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制限はない。例えばベクターの感染をモニターするためのマーカー遺伝子であってもよく、あるいは免疫系を調節するサイトカイン、ホルモン、その他の遺伝子であってもよい。本発明のベクターは、生体における標的部位への直接（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与、および患者由来細胞またはそれ以外の細胞に本発明のベクターを導入し、その細胞を標的部位へ注入する間接（ｅｘ  ｖｉｖｏ）投与により遺伝子を導入することができる。
本発明のベクターに搭載される抗体は、宿主の可溶性蛋白質、膜蛋白質、構造蛋白質、酵素などに対する抗体であってよい。好ましくは、シグナル伝達に関与する分泌性蛋白質、その受容体、または細胞内シグナル伝達分子などに対する抗体が挙げられる。例えば受容体の細胞外領域に対する抗体、または受容体のリガンドに対する抗体（例えばリガンドの受容体結合部位に対する抗体）が挙げられる。この抗体を発現するベクターを投与することにより、リガンドと受容体との結合が阻害され、この受容体を介したシグナル伝達を遮断することができる。特に本発明のベクターに搭載させる抗体としては、疾患または傷害に対して治療効果を有する抗体が好ましい。抗体遺伝子を搭載した遺伝子導入ベクターについて、幾つかの報告がなされている。そのほとんどは、ベクターのターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を目的としたものである。例えばレトロウイルス（Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１６）７５７０−７５７４（１９９５）；Ｍａｒｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（５）２９５７−２９６２（１９９６）；Ｃｈｕ，Ｔ．Ｈ．＆  Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１）７２０−７２５（１９９７）；Ａｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（１７）２１５７−２１６７（１９９７）；Ｊｉａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）１０１４８−１０１５６（１９９８）；Ｊｉａｎｇ，Ａ．＆  Ｄｕｒｎｂｕｒｇ，Ｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（１２）１９８２−１９８７（１９９９）；Ｋｕｒｏｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０（６Ａ）４０６７−４０７１（２０００）；Ｐｉｚｚａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（１４）１０８８−１０９６（２００１）；Ｋｈａｒｅ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（１）３７０−３７５（２００１））、アデノウイルス（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１１）１５７４−１５７８（１９９６）；Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８６  １５８−１７１（１９９９）；Ｈａｉｓｍａ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（６）９０１−９０４（２０００）；Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７２（２）４９７−５０４（２０００）；Ｋａｓｈｅｎｔｓｅｖａ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（２）６０９−６１６（２００２））、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（４）３９３（１９９９））、ＭＶＡ（Ｐａｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１（１０）１４１７−１４２８（２０００））、及び麻疹ウイルス（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ａ．Ｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（５）２０８７−２０９６（２００１））等でターゲッティングを目的として抗体遺伝子を搭載した遺伝子導入ベクターの実施例が報告されている。ほとんどのケースでｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（��ｃＦｖ）を利用しており、また癌細胞へのターゲッティング例が多い。本発明のベクターを利用して、これらの抗体をエンベロープ表面に持つパラミクソウイルスを作製すれば、特定の細胞に感染するターゲッティングベクターを構築することも可能である。例えばｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−６またはｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｕｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）などの炎症性サイトカインに対する抗体遺伝子を搭載させることで、本発明のベクターを慢性関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患および癌などのターゲッティングベクターとして使用することができる。自殺遺伝子または癌ワクチン蛋白質を発現するこれらのターゲッティングベクターを用いた癌治療への応用が期待される。
しかしながら本発明のベクターは、上記のようなターゲッティング以外の用途へ適用することができる点でも優れている。例えば本発明は、疾患または傷害に対して治療効果を有する抗体をコードするパラミクソウイルスベクターを提供する。これまでに、例えばアデノウイルスベクターに抗ｅｒｂＢ−２のｓｃＦｖ遺伝子をｉｎｔｒａｂｏｄｙ（細胞内で機能する抗体）として搭載し、癌治療を目的とした例（Ｋｉｍ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（２）１５７−１７０（１９９７）；Ｄｅｓｈａｎｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６４（３）３７８−３８５（１９９７））について臨床研究が行われている（Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．Ｄ．＆  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（２）２２９−２４２（１９９７）；Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６（８）３０８１−３０８７（２０００））。同様の癌治療へ向けたアデノウイルスベクターのｓｃＦｖ遺伝子に関しては、同じ抗ｅｒｂＢ−２をｉｎｔｒａｂｏｄｙではなく分泌型で検討した例（Ａｒａｆａｔ，Ｗ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（４）２５６−２６２（２００２））、抗４−１ＢＢ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）で検討した例（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（４）３４３−３４８（２００２））、及び抗ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）で検討した例（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ，Ｈ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（６）７７０−７７７（１９９８））等が報告されている。これらは主にｓｃＦｖを利用したものである。本発明のベクターを利用して、これらの抗体をコードするパラミクソウイルスを作製すれば、インビボで投与できる治療用ウイルスベクターとして有用である。本発明のベクターは宿主染色体に組み込まれないため安全であり、通常、搭載遺伝子を数日〜数週間以上にわたって発現可能であるため、種々の疾患または傷害の治療のために適用される。また本発明のベクターは、上記のようなｓｃＦｖのみならず、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｆｕｌｌ  ｂｏｄｙ（全長抗体）といった多量体を発現させるためにＨ鎖とＬ鎖の両鎖の遺伝子を搭載でき、これにより複数の鎖を含む抗体複合体を産生することができる点で極めて優れている。Ｆａｂまたは抗体のｆｕｌｌ  ｂｏｄｙ（全長抗体）などを構成するＨ鎖およびＬ鎖またはそれらの断片をコードするベクターは、ｓｃＦｖを発現するベクターよりも高い治療効果を期待することができる。
本発明のベクターは、上記に例示したような癌に対する適用以外にも、さまざまな用途が想定される。例えば癌以外の疾患に対しては、ＨＩＶの治療を目的として、抗ＲＥＶ、抗ｇｐ１２０或いは抗ｉｎｔｅｇｒａｓｅをターゲットにして、レトロウイルスベクター（Ｈｏ，Ｗ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｓ  １４（１７）１５７３−１５８０（１９９８））、ＡＡＶベクター（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｒ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（５）４０７１−４０７８（１９９７））、ＳＶ４０（ＢｏｕＨａｍｄａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（４）６６０−６６６（１９９９））或いはプラスミド（Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（５）５９５−６０１（１９９４））での検討が報告されている。上記例は全てｓｃＦｖを利用している。他の感染症に対しても、抗狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）抗体のｆｕｌｌ  ｂｏｄｙを狂犬病ウイルスのワクチン株に搭載した例（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５２（１−２）１９９−２０６（２００１））、及び抗シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）抗体のｆｕｌｌ  ｂｏｄｙをＨ鎖とＬ鎖を別個のシンドビスウイルスに搭載した例（Ｌｉａｎｇ，Ｘ．Ｈ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４（１２−１３）９０７−９１７（１９９７））が報告されている。後者２例に関しては、抗体のｆｕｌｌ  ｂｏｄｙをウイルスベクターに搭載し、活性型として大量に分泌することに成功している。但し、両報告は共にモノクローナル抗体の生産系に関するものであり、感染症治療のために直接ベクターを投与することに関しては全く想定されていない。安全性等の観点からも、実際に治療用として投与してｉｎ  ｖｉｖｏ（臨床応用）で局所的に高発現させることは期待できない。これに対して本発明のベクターは、抗体の製造における使用、および遺伝子治療における使用の両面で好適に使用できる点でも優れている。本発明のベクターは、特にヒトに対して病原性がないことから、ヒトを対象とする安全性の高い遺伝子治療用の抗体遺伝子搭載ベクターとして高い有用性を持っている。本発明のベクターを治療用として局所投与すれば、ｉｎ  ｖｉｖｏ（臨床応用）での局所的な高発現を期待できる。
特に本発明のベクターから発現させるのに有用な抗体は、細胞内外のシグナル伝達に関与する分子に対する抗体である。中でも、神経の生存、分化、または神経突起伸長（ａｘｏｎａｌ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を抑制するリガンドまたは受容体に対する抗体は、本発明において好適に適用される。このようなシグナル分子としては、ＮＯＧＯなどの神経伸長阻害因子が挙げられる。神経伸長阻害因子に対する抗体を発現するベクターは、神経損傷に対する新しい遺伝子治療を可能にする。
多くの組織は損傷後も自己再生能力を有しており、神経系でも末梢神経は切断或いは坐滅等の損傷後も、軸索が進展し再生可能である。しかしながら、脳および脊髄等の中枢神経系の神経細胞は、損傷後の軸索の進展は観察されず、再生能を有さない（Ｒａｍｏｎ  ｙ  Ｃａｊａｌ  Ｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｈａｆｎｅｒ（１９２８）；Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｈｏｌｄｉ，Ｄ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６，３１９−３７０（１９９６））。しかし、中枢神経系の神経細胞でも末梢に移植すると軸索の進展が生じることが示されたことから（Ｄａｖｉｄ，Ｓ．ａｎｄ  Ａｇｕａｙｏ，Ａ．Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４，９３１−９３３（１９８１））、中枢神経系の神経細胞も元来は軸索の再生能を有しているが、中枢神経系の環境が軸索の進展を阻害している、則ち中枢神経系には神経細胞の再生（軸索の進展）を阻害する因子が存在すると予想された。
そして実際に、その一つとしてＮＯＧＯが同定された（Ｐｒｉｎｊｈａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，３８３−３８４（２０００）；Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３４−４３９（２０００）；ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３９−４４４（２０００））。ＮＯＧＯはＮｏｇｏ−Ａ（Ａｃ．Ｎｏ．ＡＪ２４２９６１，（ＣＡＢ７１０２７）），Ｎｏｇｏ−Ｂ（Ａｃ．Ｎｏ．ＡＪ２４２９６２，（ＣＡＢ７１０２８））及びＮｏｇｏ−Ｃ（Ａｃ．Ｎｏ．ＡＪ２４２９６３，（ＣＡＢ７１０２９））の３つのｉｓｏｆｏｒｍが知られておりｓｐｌｉｃｅｖａｒｉａｎｔｓであると予想されている。軸索進展阻害活性は最も大きなＮｏｇｏ−Ａ（分子量約２５０ｋＤａ）が強いが、活性部位は、３種全てに共通に存在している６６アミノ酸の細胞外ドメインであると予想されている（ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３９−４４４（２０００））。従って、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ、またはＮｏｇｏ−Ｃに結合する抗体をコードするパラミクソウイルスベクターは、神経形成を促進するために好適に用いることができる。このＮＯＧＯに対するモノクローナル抗体としてＩＮ−１が知られている。ＩＮ−１はオリゴデンドロサイト及びミエリンによる軸索進展の阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和すると報告されており（Ｃａｒｏｎｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．Ｎｅｕｒｏｎ  １，８５−９６（１９８８））、更には、機械的に脊髄損傷を生じさせるラットのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、損傷部位にＩＮ−１を投与することにより、５％の軸索が損傷部位を越えて進展し、著しい機能回復が達成されたことが報告されている（Ｂｒｅｇｍａｎ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，４９８−５０１（１９９５））。このように、中枢神経において軸索進展阻害活性を有する生体内の因子に対する中和抗体は、中枢神経系の神経細胞再生に有効な可能性が高い。ＮＯＧＯ以外に類似活性（軸索進展阻害活性）を有する因子としては、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ及びＳｌｉｔ等（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏｓ．ＮＭ＿００６０８０（ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００６０７１），Ｌ２６０８１（ＡＡＡ６５９３８）；Ｅｐｈｒｉｎ：Ａｃ．Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１４０５（ＮＰ＿００１３９６），ＮＭ＿００５２２７（ＮＰ＿００５２１８），ＮＭ＿００１９６２（ＮＰ＿００１９５３），ＮＭ＿００４０９３（ＮＰ＿００４０８４），ＮＭ＿００１４０６（ＮＰ＿００１３９７）；Ｓｌｉｔ：Ａｃ．Ｎｏｓ．ＡＢ０１７１６７（ＢＡＡ３５１８４），ＡＢ０１７１６８（ＢＡＡ３５１８５），ＡＢ０１７１６９（ＢＡＡ３５１８６））が知られており（Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ａ．ａｎｄ  Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９，６０３−６１５（１９９９））、それぞれの役割が異なるにせよ、これらの因子に対する抗体は、再生しないと言われていた中枢神経においても軸索の進展を可能にし、ＩＮ−１で示されている脊髄損傷に限らず、種々の神経変性疾患に応用出来る可能性を有している。
また、ＮＯＧＯと同様の軸索伸長阻害活性を持つ因子であるｍｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＧ）（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００２３６１（ＮＰ＿００２３５２），ＮＭ＿０８０６００（ＮＰ＿５４２１６７），Ａｂｏｕｌ−Ｅｎｅｉｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２（１），２５−３３（２００３）；Ｓｃｈｎａａｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４５，９２−１０５（１９９８）；Ｓｐａｇｎｏｌ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２４（２），１３７−１４２（１９８９）；Ｓａｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３（３），１４７３−１４８０（１９８９）；Ａｔｔｉａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５（５），７１７−７２０（１９８９）；Ｑｕａｒｌｅｓ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ５（１），１−２８（１９８９）；Ｂａｒｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １（２），１０７−１１２（１９８７）；ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｍｙｅｌｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｎｅｕｒｏｎ  １３：８０５−８１１；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈａｙ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍｙｅｌｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｘｏｎａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ  １３：７５７−７６７；Ｔａｎｇ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＧ）ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｘｏｎａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ９：３３３−３４６、ＮＯＧＯおよびＭＡＧの共通の受容体であるＮｏｇｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｎｏｇｏ−６６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿０２３００４（ＮＰ＿０７５３８０，Ｑ９ＢＺＲ６），Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４５３（３），２９２−３０４（２００２）；Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０（６９１１），７４−７８（２００２）；Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７（６８９２），９４１−９４４（２００２）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９（６８１８），３４１−３４６（２００１）；Ｄｕｎｈａｍ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２（６７６１），４８９−４９５（１９９９）；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６），１６８９９−１６９０３（２００２）；ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７（６８８８），５４７−５５１（２００２）；Ｌｉｕ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７（５５８４），���１９０−１１９３（２００２）；Ｗｏｏｌｆ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｌｏｅｃｈｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７（５５８４），１１３２−１１３４（２００２）；Ｎｇ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ  Ｔａｎｇ，Ｂ．Ｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６７（５），５５９−５６５（２００２））、軸索伸長に阻害作用を及ぼすコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）などのグリア周辺の細胞外マトリクス（Ｒｕｄｇｅ  ＪＳ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｊ（１９９０）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ  ｓｃａｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０：３５９４−３６０３；ＭｃＫｅｏｎ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｎｅｕｒｏｃａｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｃａｎ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ＣＮＳ  ｇｌｉａｌ  ｓｃａｒ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９：１０７７８−１０７８８；Ｓｍｉｔｈ−Ｔｈｏｍａｓ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｘｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０８：１３０７−１３１５；Ｄａｖｉｅｓ  ＳＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ａｘｏｎｓ  ｉｎ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：６８０−６８３；Ｆｉｄｌｅｒ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｏｒ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｆｏｒ  ａｘｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ：ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ａｘｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｉｓ  ＮＧ２．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９：８７７８−８７８８）、特にＮＧ２（Ｌｅｖｉｎｅ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．Ｇｌｉａ  ７：３０７−３２１）、ｎｅｕｒｏｃａｎ（Ａｓｈｅｒ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｃａｎ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０：２４２７−２４３８；Ｈａａｓ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｎｅｕｒｏｃａｎ  ｉｎ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９：９９５３−９９６３）、ｐｈｏｓｐｈａｃａｎ（ＭｃＫｅｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏ��ｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｎｅｕｒｏｃａｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｃａｎ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ＣＮＳ  ｇｌｉａｌ  ｓｃａｒ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９：１０７７８−１０７８８）、ｖｅｒｓｉｃａｎ（Ｍｏｒｖｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ（２００１）３０５：２６７−２７３）などに対する抗体も有用である（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏｓ．ＮＭ＿０２１９４８（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＰ＿０６８７６７），ＮＭ＿００４３８６（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＰ＿００４３７７））（ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  Ｌ  ａｎｄ  Ｅｌｌｅｚａｍ  Ｂ．（２００２）Ｐｕｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｒａｋｅｓ  ｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１８１９−２０；ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  Ｌ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｏｎ  ＭＪ（２００２）Ｎｏｇｏ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｏ．Ｎｅｕｒｏｎ  ３６，３４５−８）。
それぞれの因子間での役割が明らかになるに従って、それぞれの神経変性疾患により適合するリガンドが選択され、その因子に対する抗体が特定の神経変性疾患に利用されるようになるかも知れない。
例えば、これらの抗体遺伝子を搭載したパラミクソウィルスベクターについて脊髄損傷への治療応用を想定した場合、ベクターを損傷部位へ直接投与する方法が可能である。また当該ベクターは発現量が非常に高いことから、損傷部位近傍の脊髄腔内への投与も可能であると予想される。また、損傷を受け軸索が変性した後に、再生のフェーズになるまでには数日間が必要であることから、投与を判断するまでの時間的余裕もあると考えられ、更には損傷直後は変性に伴う炎症反応が盛んに生じることから、実際には損傷数日後、具体的には３日〜１０日後に投与する可能性が高い。また、当該の軸索進展阻害活性を有する因子に対する中和抗体遺伝子のみではなく、積極的に軸索進展を促進する因子の遺伝子を搭載したベクター、蛋白或いは類似活性を有する化合物との併用を想定することもできる。軸索進展を促進する因子としては、ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）等の神経栄養因子を挙げることができる。
また本発明は、免疫反応を抑制する抗体の可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクターに関する。本発明者らは、免疫反応を抑制する抗体遺伝子を搭載することで、ベクター自身が有する免疫原的な性質を減弱することが可能であることを見出した。例えば免疫細胞の補助刺激因子に対する抗体またはその受容体に対する抗体を発現するベクターを用いて、補助刺激因子によるシグナル伝達を抑制することにより免疫系活性化を抑制し、ベクターからの搭載遺伝子の長期発現が可能となる。このような改変ベクターは、生体への遺伝子導入用ベクターとして特に有用である。抗体により阻害する対象となる分子としては、免疫活性化シグナルを伝達する所望のシグナル分子が挙げられ、増殖因子またはサイトカインなどの液性因子または受容体であってよい。
ウィルスに対する生体防御機構は複雑で何重にも防御されていることが知られている。このことは生体防御という観点からはなくてはならない重要なシステムであるが、ウィルスベクターを利用した遺伝子治療という観点からは回避したい項目である。その一つが、ＲＮＡウィルスの感染依存的に生成する二本鎖ＲＮＡにより活性化されると言われているＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３（ＩＲＦ−３：Ｌｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（５）２９８６−２９９６（１９９８）；Ｈｅｙｌｂｒｏｅｃｋ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（８）３７８１−３７９２（２０００），Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００１５７１（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＰ＿００１５６２））及びｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＫＲ：Ｄｅｒ，Ｓ．Ｄ．＆  Ｌａｕ，Ａ．Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，８８４１−８８４５（１９９５）；Ｄｅｊｕｃｑ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９（４）８６５−８７３（１９９７），Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＨ００８４２９（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＡＦ１３１５６））等の活性化であり、その下流の転写因子を活性化しＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）等の発現を亢進する。例えば、ｉｎｔｒａｂｏｄｙのような細胞内で機能する形で、ＩＲＦ−３或いはＰＫＲの活性を抑制する抗体をベクターに搭載すれば、自然免疫反応の一部を抑制し感染の持続化による搭載遺伝子の持続的発現が出来る可能性がある。実際に、ＰＫＲのａｎｔｉｓｅｎｓｅを高発現しＰＫＲ活性を抑制した細胞においては、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏレベルでのｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓの持続的感染が生じることが示されている（Ｙｅｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２１）１１８６０−１１８６５（１９９９））。また、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）ファミリーの中の、ＴＬＲ−３がｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡを認識してウィルス感染による自然免疫を発動することが示されており（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，７３２−７３８（２００１））、ＴＬＲ−４もｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ感染による同作用への関わりが示されている（Ｈａｙｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２２）１０７３０−１０７３７（２００１））。これらＴＬＲ−３或いはＴＬＲ−４（ＴＬＲ−３：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００３２６５（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＰ＿００３２５６）；ＴＬＰ−４：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＨ００９６６５（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＡＦ８９７５３））に対する中和抗体もウィルスベクターによる持続発現に寄与する可能性がある。
同様に、ウィルスベクターの免疫原的な性質を減弱することを目的として、臓器移植で試みられている方法を応用することも可能である。則ち、末梢性の免疫寛容を目的とした抗体遺伝子の搭載である。Ｔ細胞の活性化に関して次のようなモデルが提唱されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．２，６０５−６１０（１９８９））。休止期のＴ細胞の活性化にはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗原、及び組織適合性抗原（ＭＨＣ）に由来するシグナルに加えて、第二のシグナルであるコスティミュラトリーシグナル（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ；補助刺激）が必要であり、第二のシグナルが欠如した状態で抗原刺激が起きるとＴ細胞の不活化から寛容が誘導されるというものである。もし、この様式でウィルスベクター感染細胞の免疫寛容が誘導されれば、他への免疫反応を抑制することなく、ウィルスベクターに対してのみ免疫反応を回避することが出来るようになり、理想的な手法となり得る。Ｔ細胞上の補助刺激因子としてＣＤ２８（Ａｃ．Ｎｏ．Ｊ０２９８８（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＡＡ６０５８１），ＡＦ２２２３４１（ＡＡＦ３３７９２），ＡＦ２２２３４２（ＡＡＦ３３７９３），ＡＦ２２２３４３（ＡＡＦ３３７９４））が同定されており、抗原提示細胞上のＣＤ８０（Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５１９１（ＮＰ＿００５１８２）），ＣＤ８６（Ａｃ．Ｎｏ．Ｕ０４３４３（ＡＡＢ０３８１４），ＮＭ＿００６８８９（ＮＰ＿００８８２０））と相互作用することによりＴＣＲからの刺激を増幅させ、ＩＬ−２などの産生によりＴ細胞を更に活性化する。一方、ＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４：ＣＤ１５２）（Ａｃ．Ｎｏ．Ｌ１５００６，（ＡＡＢ５９３８５））はＣＤ２８と共通のリガンド（ＣＤ８０，ＣＤ８６）に高親和性で結合し、Ｔ細胞を抑制する作用がある（Ｗａｌｕｎａｓ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙｌ（５）４０５−４１３（１９９４））。同様の活性化リガンドとしてＰＤ−１Ｌ、およびその受容体ＰＤ−１が知られている（ＰＤ−１：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｕ６４８６３（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＡＣ５１７７３），ＰＤ−１Ｌ：ＡＦ２３３５１６（ｐｒｏｅｉｎ  ＡＡＧ１８５０８；本明細書においてはこれらをＰＤ−１と総称する））（Ｆｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９７，１７７−１８７（１９９７）；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１０２７−１０３４（２０００））。また、Ｔ細胞上のＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＬＦＡ−１）（Ａｃ．Ｎｏ．Ｙ０００５７（ＣＡＡ６８２６６））は抗原提示細胞上のＩｎｔｅｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＩＣＡＭ−１：ＣＤ５４）（Ａｃ．Ｎｏ．Ｊ０３１３２（ＡＡＡ５２７０９），Ｘ０６９９０（ＣＡＡ３００５１））と結合し、同様に補助刺激に関わっていると言われている。以上の観点から、ＣＤ２８を抑制する抗体及びＣＴＬＡ−４の活性をｍｉｍｉｃする抗体遺伝子、および／またはＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１間の結合を阻害する抗体遺伝子を搭載したウィルスベクターは、感染細胞における末梢性免疫寛容を獲得し、長期の遺伝子発現または複数回投与を達成する可能性があると予想される。実際に、臓器移植の場合の検討において、該当する抗体の短期投与によって寛容が誘導出来ることが示されている。例えば、補助刺激因子であるＣＤ２８の結合を阻害する抗ＣＤ２８抗体を利用した効果（Ｙｕ，Ｘ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（９）４５６４−４５６８（２０００）；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３（２）５１９−５２７（２００２））、逆にＴ細胞活性化に対して抑制的に機能するＣＴＬＡ−４そのものをＩｇＧ１  Ｆｃに結合した蛋白（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）を利用した効果（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７（１２）１７０１−１７０６（１９９４；Ｂｌａｚｚｅｒ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５（９）２６０７−２６１８（１９９５）；Ｈａｋｉｍ，Ｆ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（４）１７５７−１７６６（１９９５）；Ｇａｉｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３（７）１０１７−１０２１（１９９７）；Ｋｉｒｋ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１６）８７８９−８７９４（１９９７）；Ｃｏｍｏｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２７（１２）１２６３−１２７３（２００１））、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１間の結合を阻害する抗体を利用した効果（Ｈｅａｇｙ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ３７（５）５２０−５２３（１９８４）；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７７（２）２４９−２５６（１９９１）；Ｇｕｅｒｅｔｔｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（５）２５２２−２５３１（１９９７）；Ｎｉｃｏｌｌｓ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（７）３６２７−３６３４（２０００）；Ｐｏｓｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９（１０）２００５−２０１３（２０００）；Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７１（１１）１６１６−１６２１（２００１）；Ｄａ  Ｓｉｌｖａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６６（５）１９１５−１９１９（２００１））等多くの報告がなされている。更には、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４と構造的・機能的な類似性があり最近同定されたｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＩＣＯＳ：Ｗａｌｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（１）１３２−１３９（２００１）；Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，Ａ．Ｉ．＆  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（７）５７３−５７４（２００１）；Ｏｚｋａｙｎａｋ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ，，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（７）５９１−５９６（２００１）；Ａｃ．Ｎｏ．ＡＪ２７７８３２（ＣＡＣ０６６１２））についても同様の検討がなされており、抗ＩＣＯＳ抗体での効果が確認されている（Ｏｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（１０）５７４１−５７４８（２００１）；Ｇｕｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７３（７）１０２７−１０３２（２００２））。ウィルスベクターを利用した方法においても報告があり、臓器移植の時にＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子搭載アデノウィルスベクターの応用検討がなされている（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７（１２）１７０１−１７０６（１９９４）；Ｌｉ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７２（１２）１９８３−１９８５（２００１））。
以上のような臓器移植の場面での末梢性免疫寛容を目的とした手法は、遺伝子導入用ウィルスベクター利用時においても、免疫寛容を誘導する有効な手法としてそのまま応用することが可能であり、該当する抗体遺伝子（或いはＣＴＬＡ４−Ｉｇ）の搭載によって長期遺伝子発現或いは繰返し投与を実現することができる。この観点ではアデノウィルスベクターについて報告がなされており、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を搭載したアデノウィルスベクターを、別のマーカー遺伝子（ｌａｃＺ）を搭載したベクターと同時に投与することで、免疫反応が抑制され、マーカー遺伝子の発現が延長されることが示されている（Ａｌｉ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（１１）１５６１−１５６５（１９９８）；Ｉｄｅｇｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９５（１）２１７−２２６（２０００）；Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９８（２）２７２−２８０（２００１））。この系では唯一、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を用いており、マーカー遺伝子は別のベクターへ搭載した単純な系での検討であり、同じベクターに搭載した例、他の補助刺激因子を抗体遺伝子で抑制した例、また特にパラミクソウィルスベクターでの効果を見た例は無く、詳細な検討はなされていない。本発明においては、上記のような種々のシグナル分子に対する抗体遺伝子を用いてよく、さらに免疫寛容を誘導する抗体遺伝子と治療遺伝子（またはマーカー遺伝子）などの複数の遺伝子を単一ベクターから発現させることが可能である。特にＴ細胞活性化の補助刺激因子の作用を抑制する抗体遺伝子を用いることにより、例えば投与部位局所の免疫系に限局して作用する長期遺伝子発現および繰り返し（複数回）投与が可能なベクターを構築することができる。
これらの因子または受容体に対する抗体遺伝子を搭載したパラミクソウィルスベクターは、さらに治療用遺伝子を搭載させ治療用ベクターとして用いられる。あるいは、治療遺伝子を搭載した別のベクターとともに投与することにより、治療遺伝子の長期発現および／または繰り返し投与を可能にする。疾患としては遺伝子治療の対象となりうる任意の疾患が挙げられる。ベクターの投与方法などについては、それぞれの治療用遺伝子を用いた遺伝子治療に則った治療方法を適用すればよい。
免疫寛容を誘導する抗体をコードする本発明のベクターは、この抗体をコードしない対照ベクターに比べ、投与後の生体における発現の持続性が上昇している。発現の持続性は、例えば本発明のベクターと対照ベクターとを同じ力価で同じ部位（例えば左右対称の部位）に投与し、投与直後を１００とした時の相対発現レベルの経時的変化を測定することにより評価することができる。例えば投与後に、相対発現レベルが５０、３０、または１０となるまでの期間、あるいは投与から一定期間後の相対発現レベルを測定すればよい。本発明のベクターは、対照に比べ統計学的有意（例えば有意水準５％またはさらに有意）に発現持続性が上昇している。統計学的解析は、例えばｔ検定などにより行うことができる。
また、このとき、コスティミュラトリーシグナルのシグナル分子に対する抗体、あるいはＣＴＬＡ４またはその断片を投与することによって、ベクターからの遺伝子発現の持続性をさらに延長させることができる。コスティミュラトリーシグナルのシグナル分子に対する抗体としては上記したＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、またはＩＣＯＳなどに対する抗体を用いることができる。このような抗体断片は、例えば「日本生化学会編  新生化学実験講座１２  分子免疫学ＩＩＩ  １８５−１９５ページ（東京化学同人）」および／または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）」の記載に従って作製することができる。抗体断片は、例えば抗体をペプシン、パパイン、トリプシン等の蛋白質分解酵素で消化することにより得ることができる。あるいは可変領域のアミノ酸配列を解析し、組み換え蛋白質として発現させ調製することが可能である。また抗体には、ヒト型抗体もしくはヒト抗体なども含まれる。抗体は、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ＣＴＬＡ４またはその断片としては、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０／ＣＤ８６結合部位を含み、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と結合してＣＤ２８との相互作用を阻害するポリペプチドであれば所望のポリペプチドを用いることができるが、例えばＣＴＬＡ４の細胞外ドメインにＩｇＧ（例えばＩｇＧ１）のＦｃ断片を融合させた可溶性ポリペプチドを好適に用いることができる。これらのポリペプチドおよび抗体は、凍結乾燥して製剤化したり、あるいは所望の薬学的に許容される担体、具体的には生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などと共に水性組成物とすることができる。本発明は、これらのポリペプチドまたは抗体、および本発明のベクターを含む遺伝子導入キットに関する。このキットは、ベクターの投与後の発現期間を延長させるために使用することができる。特に繰り返し投与におけるベクターからの遺伝子発現の持続性を上昇させるために使用される。
本発明のベクターを製造するには、哺乳動物細胞においてパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＰの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、本発明のパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウイルスＲＮＰを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウイルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の３’端を制御するには、例えば転写産物の３’端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に３’端が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。
例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、目的の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、ＮｏｔＩ部位を利用してウィルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅し回収する。２つのプライマーの５’部分にＮｏｔＩ部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のＯＲＦとその両側のウイルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列が１つずつ配置されるように、プライマー中にＥ−Ｉ−Ｓ配列またはその部分を含めるようにする。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、付加したＥ−Ｉ−Ｓ配列を含む最終的なＰＣＲ増幅産物のＮｏｔＩ断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ  ｏｆ  ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。このプライマーにＥ−Ｉ−Ｓ配列を付加する場合には、挿入断片のオリゴＤＮＡの３’側にセンダイウィルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、Ｉ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成ＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼまたはその他のＤＮＡポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等のプラスミドベクターのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウィルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、ＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ蛋白質のＯＲＦとの間に挿入し、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）。ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記のウイルス蛋白質（Ｌ、Ｐ、およびＮ）存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウィルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの使用に関する。組み換えウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダーペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウィルスをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
具体的な手順は、（ａ）パラミクソウィルスゲノムＲＮＡ（ネガティブ鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞またはその培養上清から該ゲノムＲＮＡを含む複合体を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノムＲＮＡはＮ、Ｌ、およびＰ蛋白質の存在下で複製されＲＮＰ複合体を形成する。そしてＭ、ＨＮ、およびＦ蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウイルス粒子が形成される。ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えばＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモーターとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡを細胞にトランスフェクトしてもよい。
ＤＮＡからのゲノムＲＮＡの最初の転写に必要なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドベクターまたはウイルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えば細胞の染色体にこの遺伝子を、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムＲＮＡ、およびベクター再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを用いることもできるが、これらのウイルスの混入を招くため好ましくない。
ゲノムＲＮＡを発現するＤＮＡを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ−９８８５  Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼および▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ  Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２をほぼ１００％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ  ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）を２ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの組換えセンダイウィルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウィルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．２５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は２：１：２とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。
トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物をＬＬＣ−ＭＫ２細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。ＲＮＰが導入された細胞では、ＲＮＰからのウイルス遺伝子の発現およびＲＮＰの複製の過程が進行しベクターが増幅する。得られたウイルス溶液を希釈（例えば１０６倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウィルスｖＴＦ７−３は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたベクターは−８０℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した伝播能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞を重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
回収されたウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。
ウィルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウィルスベクター等の再構成においては、サル腎由来のＬＬＣＭＫ２細胞およびＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウィルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
例えば、Ｆ遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
〈１〉Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ遺伝子欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いて例えばａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：４）で連結し、Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆの上流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：５，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：６］、Ｆ遺伝子の下流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：７，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：８］のプライマー対を用いたＰＣＲの産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ遺伝子欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＦを得る。
外来遺伝子は、例えばｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ遺伝子欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏＭＩＶ部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、ＮｓｉＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーおよびＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーで増幅すればよい。
〈２〉ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築はＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ遺伝子欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ  １枚、２ｍｌ  ２枚、０．２ｍｌ  ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）：Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２，１１１５−１１２１（１９９８））により例えばｍｏｉ＝３で感染させて行う。
〈３〉Ｆ遺伝子欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦの外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播く。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、細胞培養２４時間後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））をＭＯＩ  ２程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることができる。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびパラミクソウイルスのそれぞれＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド適当なリポフェクション試薬と用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に６：２：１：２：２：２とすることができる。例えば、１２μｇのゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、並びにＮ、Ｐ、Ｌ、およびＦプラスＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド（ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ；ＷＯ００／７００７０，Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））を、それぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないＭＥＭで細胞を２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ  ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ  ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。Ｆ以外の遺伝子、例えばＨＮまたはＭ遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。
ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウィルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウィルス遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。例えば抗体Ｈ鎖をコードするベクターとＬ鎖コードするベクターとを互いに相補できるように別々に構築し、これらの共感染させることも考えられる。本発明は、抗体のＨ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクター、および抗体のＬ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクターを含む組成物を提供する。また本発明は、抗体のＨ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクター、および抗体のＬ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするパラミクソウイルスベクターを含むキットを提供する。これらの組成物およびキットは、同時に感染させることでＨ鎖およびＬ鎖からなる抗体を形成させるために使用できる。
なお、伝播性のパラミクソウイルスベクターを個体または細胞に投与後、治療が完了するなどウイルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止することもできる。
本発明の方法によれば、本発明のウイルスベクターは、例えば１×１０５ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７（１），６５−７４（１９９０）；ＷＯ００／７００７０）。
回収したパラミクソウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、脊髄腔内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。また局所あるいは全身に投与し得る。投与されるベクター量は好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０５ＣＩＵ〜２×１０１０ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。本発明のベクターを用いて製造された蛋白質製剤であれば、蛋白質の投与量は例えば、１０ｎｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｎｇ／ｋｇから５０μｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ／ｋｇから５μｇ／ｋｇの範囲であるとよい。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］Ｆａｂ遺伝子を搭載したＳｅＶベクターの構築
ＳｅＶベクターの脊髄損傷への応用の一つとして、軸索伸長阻害因子（ＮＯＧＯ等）の阻害を目的とする治療ベクターを例示する。ＮＯＧＯの中和抗体として、ＩＮ−１（ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭ  κ型）が知られていることから（Ｂｒｏｓａｍｌｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（２１），８０６１−８０６８（２０００）等）、このＩＮ−１を搭載した伝播型ＳｅＶベクターの構築を行った。また、Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（伝播能欠損型）についても構築を行った。
１）遺伝子の全合成
ＩＮ−１のＦａｂ（Ｈ鎖及びＬ鎖）遺伝子を搭載したＳｅＶベクターを構築するため、ＩＮ−１のＦａｂ遺伝子の全合成を実施した。ＩＮ−１のｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆａｂ部分の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｙ０８０１１；Ｂａｎｄｔｌｏｗ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４１（２）４６８−４７５（１９９６））を元に、Ｈｉｓ−ｔａｇは除き、両端にＮｏｔＩ認識配列を含み、Ｈ鎖（配列番号：１０）及びＬ鎖（配列番号：１１）がＳｅＶのＥＩＳ配列を挟んでｔａｎｄｅｍに結合するよう配列をデザインした（図１；配列番号：９）。合成に使用したｏｌｉｇｏ  ＤＮＡの配列および名称を図２に示し、その配置を図３に示した。ＮｏｔＩ断片の全長は６ｎ（６の倍数）となるようにした。
２）ＩＮ−１（Ｆａｂ）搭載ＳｅＶ  ｃＤＮＡの遺伝子構築
上記で合成したＮｏｔＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）へ挿入した。遺伝子配列を確認した後、このプラスミドから、ＥＩＳを有するＮｏｔＩ断片をＮｏｔＩ切断により切り出し、伝播型（ｐＳｅＶ１８＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）及びＦ遺伝子欠失型（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））のセンダイウイルスゲノムをコードするプラスミドの＋１８位（ＮｏｔＩ部位）へ挿入し、それぞれｐＳｅＶ１８＋ＩＮ−１およびＳｅＶ１８＋ＩＮ−１／ΔＦとした。
３）ＳｅＶ再構成（伝播型：ＳｅＶ１８＋ＩＮ−１）
ウィルスの再構成はＫａｔｏらの報告（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））に従って行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで直径１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））を３７℃で１時間感染させた（ＭＯＩ＝２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋ＩＮ−１，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ及びｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））をそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ２００μＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に懸濁し、１μｇＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒ  Ｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで３日間培養した（Ｐ０）。
これらの細胞を回収し、ペレットを１ｍｌ／ｄｉｓｈあたりのＰＢＳに懸濁した。凍結融解を３回繰り返した後、胎生１０日齢の有性卵に、前記ライゼートを１００μＬ／ｅｇｇあたり接種した。その後、転卵しながら３５．５℃で３日間培養した（Ｐ１）。４℃に４〜６時間放置後、漿尿液を回収し、赤血球凝集活性（ＨＡ活性）測定を行い、ウイルス回収の有無を検定した。
ＨＡ活性はＫａｔｏらの方法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  １，５６９−５７９（１９９６））に倣って行った。即ち、丸底の９６穴プレートを使用し、ウィルス液を段階的にＰＢＳで希釈し各ｗｅｌｌ  ５０μＬの２倍希釈系列を作製した。その５０μＬに１％濃度にＰＢＳで希釈したニワトリ保存血（コスモバイオ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）５０μＬを混合し、４℃で３０分間放置し赤血球の凝集を観察し、凝集したもののうち最もウィルス希釈率の高いものの希釈率をＨＡ活性として判定した。また、１ＨＡＵを１×１０６ウィルスと換算して、ウィルス数として算出することができる。
回収したＰ１の漿尿液を、（ＨＡＵが観測された場合には）ＰＢＳにて１０−５及び１０−６希釈し、（ＨＡＵが観測されなかった場合には）希釈率を下げて、胎生１０日齢のニワトリ有性卵に、前記希釈液を１００μＬ／ｅｇｇあたり接種し、その後、転卵しながら３５．５℃で３日間培養した（Ｐ２）。漿尿液を回収後、ＨＡ活性を測定してウイルス回収の有無を検定した。回収したＰ２の漿尿液を１０−５及び１０−６希釈後、同様の操作を行い（Ｐ３）、Ｐ３の漿尿液を回収し、ＨＡ活性を測定した。ＨＡ活性の上昇が観察され、ウィルスの再構成に成功したと判断された。回収した漿尿液のＨＡ活性値（ＨＡＵ）を下記に示した。タイターは、Ｐ４の試料で２９ＨＡＵ（約５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ）と計算された。
2003102183.tif 000002
４）ＳｅＶ再構成（Ｆ遺伝子欠失型：ＳｅＶ１８＋ＩＮ−１／ΔＦ）
ウィルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。Ｆ遺伝子欠失型ウイルスを再構成させるため、Ｆ蛋白のヘルパー細胞を利用した。当該ヘルパー細胞作製にはＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用している。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ，２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））で感染させて挿入遺伝子を発現させる。ＳｅＶ−Ｆ蛋白の場合、Ｆ遺伝子を有する同トランスフォーマント細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７と記載し、ＡｘＣＡＮＣｒｅで誘導後Ｆ蛋白を持続発現している細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａと記載することにする。
Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＩＮ−１／ΔＦ）の再構成は、以下のようにして行った。則ち、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで直径１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７を室温で１時間感染させた（ＭＯＩ＝２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋ＩＮ−１／ΔＦ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮをそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、凍結融解を３回繰り換えしてＰ０  ｌｙｓａｔｅを調製した。一方で、ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを２４ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの時に３２℃に移し１日間培養した細胞を準備した。この細胞にＳｅＶ１８＋ＩＮ−１／ΔＦのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各２００μＬ／ｗｅｌｌでトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した。Ｐ１培養上清を用いてＰ２以降、６ｗｅｌｌプレートに播いたＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ細胞を用いて、同様の培養をＰ３までくり返した。
ＨＡ活性にてウィルスの増殖を確認したところ、Ｐ１以降のサンプルでＨＡ活性の上昇が見られた。タイターは、Ｐ３の４日目の試料（Ｐ３ｄ４）で２．７×１０７ＣＩＵ／ｍＬであった。
５）ＲＴ−ＰＣＲによるウィルスゲノムの確認
伝播型（ＳｅＶ１８＋ＩＮ−１）のウィルス溶液（Ｐ２  ｓａｍｐｌｅ）からのウィルスＲＮＡの回収は、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を利用して行い、ＲＴ−ＰＣＲは１ｓｔｅｐでＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を利用して行った。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳＹＮ８０Ｆ１２／ＳＹＮ８０Ｒ１の組み合わせをプライマー対として使用して行った。目的の大きさの遺伝子の増幅が確認され、ウィルス遺伝子上にＩＮ−１の遺伝子を搭載していることが確認された（図４パネルＡ）。
Ｆ遺伝子欠失型（ＳｅＶ１８＋ＩＮ−１／ΔＦ）についても同様の方法で行った。Ｐ３ｄ４のサンプルを用いて、プライマーは、ＳＹＮ８０Ｆ１２／ＳＹＮ８０Ｒ１の組み合わせで行った。この場合も目的の大きさの遺伝子の増幅が確認され、ウィルス遺伝子上にＩＮ−１の遺伝子を搭載していることが確認された（図４パネルＢ）。
６）ＳｅＶ搭載遺伝子に由来する蛋白質発現の確認
ＩＮ−１は、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭのκ型であるため、蛋白発現の確認にはＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの２次抗体であるＨＲＰ−ｃｏｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｇｏａｔ  Ｆ（ａｂ’）２  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＡＭ１４０７４）：ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用したＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇでの検出を試みた（１次抗体無し）。
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったＬＬＣ−ＭＫ２にＭＯＩ５でＳｅＶ１８＋ＩＮ−１或いはＳｅＶ１８−ＩＮ−１／ΔＦを感染した。感染２日後或いは４日後に培養上清を回収し、そのサンプルについては、ＰＡＧＥ  ｐｒｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を利用して濃縮と不純物の除去を行った。ネガティブコントロール（ＮＣ）として、ＧＦＰ遺伝子を搭載した伝播型ＳｅＶベクターを同条件で感染し、回収した培養上清について上記と同様に調製しアプライした。３００μＬの培養上清を処理し４０μＬのＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅとして回収しその中の１０μＬ／ｌａｎｅでアプライしている。結果を図５に示したが、酸化条件で約４７ｋＤａ、還元条件で約３０ｋＤａのバンドが検出された。アミノ酸配列から予想される分子量はＨ鎖が２４．０ｋＤａ、Ｌ鎖が２３．４ｋＤａである。酸化条件ではＨ鎖及びＬ鎖の結合状態で、還元条件では解離状態のＨ鎖及びＬ鎖の何れか一方のみが検出されていると判断され、Ｆａｂが形成されていることが確認された。
［実施例２］ＩＮ−１遺伝子搭載ＳｅＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能評価
ＩＮ−１は軸索伸長を抑制する因子ＮＯＧＯに対する中和抗体であることが知られている（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３４−４３９（２０００））。そこで、ＩＮ−１のＦａｂ遺伝子を搭載したＳｅＶの機能評価を行うには、軸索伸長の阻害を抑制する条件、則ち軸索伸長の阻害因子の存在下で伸長を促進する活性を観察する必要がある。阻害因子を含む脊髄抽出液をｑ−ｐｏｏｌと呼び、その調製方法はＳｐｉｌｌｍａｎｎらが報告している方法（Ｓｐｉｌｌｍａｎｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１９２８３−１９２９３（１９９８））に従って行った。成体ラット３体より脊髄を摘出し、１．５ｍｇのｑ−ｐｏｏｌを得た。ＩＮ−１活性の評価はＣｈｅｎ及びＳｐｉｌｌｍａｎｎらの方法（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３４−４３９（２０００）、Ｓｐｉｌｌｍａｎｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１９２８３−１９２９３（１９９８））に従った。方法としては２種の方法を採用し、マウス繊維芽細胞株（ＮＩＨ−３Ｔ３）の広がりとラット胎児後根神経節（ＤＲＧ：Ｄｏｒｓａｌ  Ｒｏｏｔ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ）初代培養系における突起進展で評価した。
ＮＩＨ−３Ｔ３を利用した評価のために、まずｑ−ｐｏｏｌを約３０μｇ／ｃｍ２相当となるようにＰＢＳに希釈し９６ｗｅｌｌ培養プレートに添加後、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳにて２回洗浄後細胞培養に使用した。ｑ−ｐｏｏｌで処理した（或いはｑ−ｐｏｏｌで処理していない）９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合でＮＩＨ−３Ｔ３細胞を播き、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて培養を開始した。培養開始１日後に各種タイターでＳｅＶを感染し、感染２日後に形態学的観察と細胞数の評価を行った。細胞数評価にはＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．：Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を利用した。形態学的に見ると、ｑ−ｐｏｏｌ処理をしていないプレートで培養した細胞は、いわゆる繊維芽細胞様の形態をしているが、ｑ−ｐｏｏｌ処理をしたプレートで培養した場合、球形の細胞が多く見られた（図６（Ｂ））。コントロールのＳｅＶベクターであるＧＦＰ遺伝子を搭載したＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ）をｑ−ｐｏｏｌ処理した細胞に感染した場合も、同様に球形の細胞が多く見られたが（図６（Ｃ））、ＩＮ−１遺伝子を搭載したＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＩＮ１）をｑ−ｐｏｏｌ処理した細胞に感染した培養系においては、球形のものは少なく繊維芽細胞様の形態のものが多く見られた（図６（Ｅ））。則ち、既に報告されているように、ｑ−ｐｏｏｌによるＮＩＨ−３Ｔ３の形態変化を抑制するＩＮ−１の機能が確認され、ＳｅＶベクター搭載遺伝子由来のＩＮ−１が機能を有していると判断された。また、同系において、細胞数（細胞増殖）の観点からの評価を行った。ｑ−ｐｏｏｌでの処理を行っていないプレート、及び低濃度のｑ−ｐｏｏｌで処理をしたプレートを用いた場合、ＳｅＶ１８＋ＩＮ１を高ＭＯＩで感染した時（ＭＯＩ＝３，１０，３０）のみ、ＮＩＨ−３Ｔ３の増殖を抑制する効果が観察された（図７（Ａ）−（Ｃ））。形態観察において細胞に明らかな傷害が観察されないので、細胞傷害ではなく増殖抑制が観察されていると判断される。この観点では今までに報告はないが、ＩＮ−１の濃度が極端に高い場合にはこのような活性が表れる可能性は考えられる。また、この増殖抑制効果は、高濃度のｑ−ｐｏｏｌで処理した場合には観察されなかった（図７（Ｄ））。則ち、この場合はＩＮ−１の活性をｑ−ｐｏｏｌが阻害したことになり、ＩＮ−１がｑ−ｐｏｏｌの活性を阻害することを更に補完する結果になっていると考えられる。
もう一つのＩＮ−１活性の評価として、ラットＤＲＧ初代培養系における突起進展への影響で評価した。この場合も、まずｑ−ｐｏｏｌを約２５μｇ／ｃｍ２相当となるようにＰＢＳに希釈し２４ｗｅｌｌのｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ培養プレート（旭テクノグラス，千葉）に添加後、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳにて２回洗浄後細胞培養に使用した。胎生１４日齢のＳＤラット（日本チャールスリバー、神奈川）より後根神経節を取り出し、終濃度１００ｎｇ／ｍｌ濃度の神経成長因子（ＮＧＦ：Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ，Ｕ．Ｋ．）及び１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地でｅｘｐｌａｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅを行った。培養開始２４時間後にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＩＮ１を１ｘ１０５ＣＩＵ／５００μＬ／ｗｅｌｌで感染した。感染３６時間後に顕微鏡下で形態観察を行った。ｑ−ｐｏｏｌの処理をしないプレートにおいては、コントロールＳｅＶであるＳｅＶ１８＋ＧＦＰ感染細胞において突起伸展が見られたが（図８（Ａ））、ｑ−ｐｏｏｌ処理を行ったプレートにおいては、非常に僅かな突起進展しか観察されなかった（図８（Ｃ））。図８（Ｂ）及び図８（Ｄ）にはそれぞれ図８（Ａ）及び図８（Ｃ）におけるＳｅＶ１８＋ＧＦＰ感染の程度を視覚的に表すために、同視野におけるＧＦＰ蛍光写真を並記している。一方、ｑ−ｐｏｏｌ処理を行ったプレートにおいても、ＳｅＶ１８＋ＩＮ１感染細胞においては非常に顕著な突起進展が観察された（図８（Ｅ），（Ｆ））。則ち、突起進展の観点からも、ｑ−ｐｏｏｌによる神経細胞の突起進展阻害活性を抑制するＩＮ−１の機能が確認され、ＳｅＶベクター搭載遺伝子由来のＩＮ−１が機能を有していると判断された。
［実施例３］ベクター発現持続性及びくり返し投与後発現評価のためのｉｎ  ｖｉｖｏ評価系
ベクター発現持続性及びくり返し投与の可能性評価のためには、より効率的で確実なｉｎ  ｖｉｖｏ評価系の確立が重要である。本実施例においては、新たに開発したマウス耳介投与による評価法を開示する。ＧＦＰ遺伝子を有する伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ：５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）或いはＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ：５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与すると、感染細胞に発現しているＧＦＰ蛋白の蛍光を非侵襲的に外部から観察可能であることが判明した（図９）。非侵襲的であるため、同一個体を利用して経時的にＳｅＶベクター由来蛋白（ＧＦＰ）の発現が観察でき、発現持続性の評価に非常に適していると考えられる。また、同一個体での経時変化を追えることは、実験に使用する動物個体数をかなり減少させることができる。実際の経時変化として、ＧＦＰ蛋白の蛍光は投与２日目をピークに投与４日目まで観察可能であるが、投与５日目から６日目にほとんど消失した（図９）。
このＧＦＰ蛍光の変化が、ＳｅＶによる発現のＫｉｎｅｔｉｃｓを定量的に反映しているか否かを判定するために、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を搭載している伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋Ｌｕｃｉ：Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８，９７０−９７３（２０００））について同様に耳介投与を行った。まず、投与タイター依存的にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛋白の活性の変化が見られることを確認した（図１０（Ａ））。次に、耳介内Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛋白発現の経時的変化について定量し、投与２日目をピークに投与４日目に少し減少し、投与７日目及び１１日目にほとんどベースラインレベルになることを確認した（図１０（Ｂ））。この時、同タイプのＧＦＰ遺伝子搭載ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ）を投与した実験を同時に行い、ＧＦＰ蛍光の経時変化を調べた。ＧＦＰ蛍光の写真（図１１（Ａ））から、画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）にて蛍光強度の定量（図１１（Ｂ））を行った。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性から求めた経時変化（図１０（Ｂ））と蛍光強度から求めた経時変化（図１１（Ｂ））に非常に良い相関が見られた。則ち、ＧＦＰ蛍光の変化はＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の変化に良く一致しており、ＧＦＰ蛍光の強度変化を追うことで、相対的定量性を議論できると判断された。
くり返し投与後の発現評価という観点からも検討を行った。右耳の耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、発現を確認した後に、各種投与時期をずらして、左耳耳介への同じＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、発現の有無を調べた（図１２（Ａ））。また、この場合もＧＦＰ蛍光強度を定量化して表した（図１２（Ｂ））。右耳耳介感染１日後、及び２日後であれば、左耳耳介での感染及び発現が確認された。しかし、右耳感染４日後であれば、左耳耳介での感染程度がかなり減少し、右耳感染６日後であれば、左耳耳介での感染はほとんど成立しなかった。右耳感染８日後でも、左耳耳介での感染はほとんど成立しなかったが、感染６２日後に僅かな感染が確認された。これらの現象については、ＳｅＶベクターの免疫系への影響を調べる良い材料になるとともに、くり返し投与後の発現を評価する非常に良い実験系になっていると考えられた。
次に、マウス耳介に投与した場合の感染細胞について調べた。マウス耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、感染２日後に耳介を切除し、凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡下ＧＦＰ蛍光を観察するとともに、抗ＧＦＰ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ，ＵＳＡ）で染色した。ＧＦＰ蛍光と抗ＧＦＰ抗体での陽性細胞が重なったのは真皮の細胞であった（図１３）。他の個体の耳介組織で観察したところ、軟骨膜周辺（図１４（Ａ））、軟骨膜に近い真皮（図１４（Ｂ））、表皮に近い真皮（図１４（Ｃ））等への感染が確認され、表皮及び弾性軟骨への感染はなかった。従って、本投与法にて感染する細胞は、耳介真皮及び軟骨膜（繊維芽細胞含む）であると判断された。
［実施例４］抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８）遺伝子を搭載したＳｅＶベクターの構築
Ｔ細胞の活性化は抗原提示細胞のＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ（あるいはｃｌａｓｓＩ）／抗原ペプチド複合体とＴ細胞レセプターの反応（第１シグナル）及びＣＤ８０（ＣＤ８６）とＣＤ２８等の補助刺激分子の反応（第２シグナル（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ））により生じ、その後活性化したＴ細胞はＣＤ８０（ＣＤ８６）とＣＴＬＡ４等の抑制性補助刺激分子の反応により鎮静化される。これらｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌをブロックすることにより末梢で免疫寛容が誘導されることが知られている。そこで生体内における治療用ＳｅＶベクターの搭載遺伝子産物の長期発現を実現するために、末梢での免疫寛容を誘導するｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ関連遺伝子を阻害する抗体遺伝子搭載ベクターを例示する。ＣＤ２８に対する抗体によってＴ細胞の活性化を阻害することにより免疫寛容を誘起するため、当該ＣＤ２８に対する一本鎖抗体（αＣＤ２８）遺伝子を搭載したＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（非伝播型）の構築を行った。
１）遺伝子の全合成
αＣＤ２８遺伝子を搭載したＳｅｖベクターを構築するため、当該遺伝子の全合成を実施した。Ｇｒｏｓｓｅ−Ｈｏｖｅｓｔ，Ｌ．らの報告しているαＣＤ２８遺伝子配列（ＤＤＢＪ  ｄａｔａｂａｓｅ  ＳＹＮ５０７１０７）に基づき、αＣＤ２８（ＬＶ鎖及びＨＶ鎖の一本鎖抗体）の遺伝子配列の両端にＸｂａＩ  ｓｉｔｅを設けて全合成を行い、この合成ＸｂａＩ断片（配列番号：４３）（この断片をＳＹＮ２０５−１３と呼ぶ。両端の各６塩基はＸｂａＩ部位とした。αＣＤ２８アミノ酸配列は配列番号：４４に示した）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターに導入した（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／αＣＤ２８）。合成に使用したｏｌｉｇｏ  ＤＮＡの配列および名称を以下に示し、その配置を図１５に示した。また、ベクター構築の概略図を図１６に示した。一方、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  κ  Ｌ  ｃｈａｉｎのシグナルペプチド（配列番号：４６）とＳｅＶのＥＩＳ配列との間にＸｂａＩ  ｓｉｔｅを有し、その両端にＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ  ｓｉｔｅを設けたＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片のＮｈｅＩ  ｓｉｔｅとｐＧＥＭ−４Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｂａＩ  ｓｉｔｅをライゲーションさせたカセットプラスミド（ｐＧＥＭ−４Ｚｃｓｔ）を構築した（配列番号：４５、ＥＩＳ配列を含むＮｏｔＩ断片のみ示した）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／αＣＤ２８のαＣＤ２８遺伝子を含むＸｂａＩ断片をｐＧＥＭ−４ＺｃｓｔベクターのＸｂａＩ  ｓｉｔｅに導入し、上記シグナルペプチドとＳｅＶのＥＩＳ配列を有するαＣＤ２８遺伝子（αＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子）を構築した。ここで得られるαＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片の全長は６の倍数（６ｎ）となるようにデザインしている。
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２）αＣＤ２８搭載Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶ  ｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）の遺伝子構築
上記で構築したＮｏｔＩ断片の遺伝子配列を確認した後、このプラスミドから、同ＮｏｔＩ断片を切り出し、ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を搭載したＦ遺伝子欠失型ＳｅＶ  ｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））の＋１８位（ＮｏｔＩ部位）へ挿入し、ｐＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰを構築した。
３）αＣＤ２８搭載Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）の再構成
ウイルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。Ｆ遺伝子欠失型ウイルスを再構成させるため、Ｆ蛋白のヘルパー細胞を利用した。当該ヘルパー細胞作製にはＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用している。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））で感染させて挿入遺伝子を発現させた。ＳｅＶ−Ｆ蛋白の場合、Ｆ遺伝子を有する同トランスフォーマント細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７と記載し、ＡｘＣＡＮＣｒｅで誘導後Ｆ蛋白を持続発現している細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａと記載することにする。
ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰの再構成は、以下のようにして行った。則ち、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで直径１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７を室温で１時間感染させた（ＭＯＩ＝２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮをそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１μｇＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、凍結融解を３回繰り換えしてＰ０  ｌｙｓａｔｅを調製した。一方で、ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを２４ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの時に３２℃に移し１日間培養した細胞を準備した。この細胞にＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各２００μＬ／ｗｅｌｌでトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した。Ｐ１培養上清を用いてＰ２以降、６ｗｅｌｌプレートに播いたＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ細胞を用いて、同様の培養をＰ３までくり返した。
Ｐ３の５日目の試料（Ｐ３ｄ５）のウイルス力価は７×１０６ＣＩＵ／ｍＬであった。
４）ＲＴ−ＰＣＲによるウイルスゲノムの確認
Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶであるＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰのウイルス溶液（Ｐ３  ｓａｍｐｌｅ）からのウイルスＲＮＡの回収は、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を利用して行い、ＲＴ−ＰＣＲは１ｓｔｅｐでＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を利用して行った。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｆ６（５’−ＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＧＧ−３’）／Ｒ１９９（５’−ＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧＡＣＴ−３’）（それぞれ配列番号：６２および６３）の組み合わせをプライマー対として使用して行った。目的の大きさの遺伝子の増幅が確認され、ウイルス遺伝子上にαＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子が搭載されていることが確認された（図１７）。
５）ＳｅＶ搭載遺伝子に由来する蛋白質発現の確認
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったＬＬＣ−ＭＫ２にＭＯＩ  １でＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰを感染し、血清を含まないＭＥＭ培地１ｍｌを添加して３７℃（５％ＣＯ２存在下）で培養した。感染１日後にＭＥＭ培地を交換し、４日後に培養上清を回収して試料とした。ネガティブコントロール（ＮＣ）として、ＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ）を同条件で感染して、培養上清を回収した。試料は、ＰＡＧＥ  ｐｒｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、３００μＬの培養上清を４０μＬに濃縮し、これをＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動用の試料としてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇは５μＬ／ｌａｎｅでアプライした。一方、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色には、同様の操作で６００μＬの培養上清を４０μＬに濃縮し、これを１０μＬ／ｌａｎｅでアプライして試験を行った。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの検出用の抗体にはＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ，ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｆｒｏｍ  ｓｈｅｅｐ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。結果を図１８に示す。約２９ｋＤａのバンドが検出され、アミノ酸配列から予想される分子量と一致した。
［実施例５］抗ＣＤ２８抗体遺伝子搭載ＳｅＶのｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現持続性の評価
構築した抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８ｃｓｔ）遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）の機能評価の一環として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現持続性を評価した。この時、抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載せずＧＦＰ遺伝子を搭載しているＦ遺伝子欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ）をコントロールとして持続性の差を調べた。またこの時、感染初期にはαＣＤ２８ｃｓｔ蛋白の発現はない（非常に少ない）ことからその時期の蛋白の発現を補うことを目的として、αＣＤ２８ｃｓｔ蛋白と同様の機能が期待されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を、ＳｅＶ投与当日に投与した系も評価した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質は市販されており（Ａｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）使用可能であるが、今回は既に報告されているものと類似の方法で調製したものを使用した（Ｉｗａｓａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７３（３）３３４−３４０（２００２）；Ｈａｒａｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２８（１）６９−７４（２０００）；Ｉｗａｓａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７３（３）３３４−３４０（２００２）；Ｇｌｙｓｉｎｇ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６４（１２）１６４１−１６４５（１９９７））。
発現持続の評価は、実施例３に示したマウス耳介投与による評価法にて行った。ＧＦＰ遺伝子を有するＳｅＶベクターをマウス耳介に投与すると、感染細胞に発現しているＧＦＰ蛋白の蛍光を非侵襲的に外部から観察可能である。この系を用いることにより、同一個体を利用して経時的にＳｅＶベクター由来発現蛋白（ＧＦＰ）の発現が観察でき、発現持続性の評価に非常に適している。ＧＦＰ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ：５ｘ１０６ＣＩＵ／５μＬ）或いはＧＦＰ遺伝子とともに抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載しているＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ：５ｘ１０６ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、経時的にＧＦＰ蛋白の発現を観察した。更に、両投与群の一部のマウスには、ＳｅＶ感染１時間後及び１０時間後に、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を０．５ｍｇ／ｂｏｄｙで腹腔内に投与した（それぞれｎ＝２）。まず、補助刺激因子抑制を目的とした抗体遺伝子（この場合はαＣＤ２８ｃｓｔ）を搭載したＳｅＶベクターがｉｎ  ｖｉｖｏでも感染することが確認された（図１９）。ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦとはＧＦＰ発現量に差が見られるが、この点については後述する。持続性に関しては、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群で、非常に僅かながら対照に比べＧＦＰ蛋白の発現持続が観察された。則ち、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群では、投与５日後までは明らかなＧＦＰ発現が見られるものの、投与６日後にほとんど見えなくなる様な急激な消失が観察されるのに対して、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群では、その減少が僅かながら緩やかであり、投与６日後でもＧＦＰ蛋白の蛍光が観察された（図１９）。ＳｅＶ感染当日のＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質の投与効果もはっきりと表れた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を投与することにより、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群ともにＧＦＰ蛋白発現の増強が観察され、更にＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群においては、感染６日後でも比較的はっきりとしたＧＦＰ蛋白の蛍光が観察された（図２０）。ＧＦＰ蛍光の写真から、画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）にて蛍光強度を定量化した結果を図２１に示した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を投与した場合のＧＦＰ蛋白発現の増強ととともに、僅かではあるがαＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子を搭載することによるＳｅＶ搭載遺伝子由来蛋白（この場合はＧＦＰ）発現持続への効果が確認された。この結果は、補助刺激因子活性を抑制することによるＳｅＶ感染及びその持続性への効果を表すものであり、当該コンセプトの確かさを意味している。また、ＳｅＶベクターの感染だけでは発現の持続への影響は少なくても、感染初期に同メカニズムを期待する蛋白を同時投与することで、発現の持続を延長し得る可能性を示している。
ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群において、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群よりもＧＦＰ蛋白の蛍光が弱かったことについて、以下ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で確認を行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ或いはＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰをＭＯＩ＝５で感染し、経時的に蛍光顕微鏡下でＧＦＰ蛋白の発現を観察した（図２２）。感染１６時間後ではＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ感染細胞ではＧＦＰが観察されるのに対して、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞では観察されなかった。ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞では、感染２４時間後以降発現したＧＦＰ蛋白の蛍光が観察されるものの、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ感染細胞よりも常に弱く、発現量が低いことが確認された。ＳｅＶにおいてはゲノム搭載遺伝子の発現量の違いについて、極性効果が知られている（Ｇｌａｚｉｅｒ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２１（３），８６３−８７１（１９７７）；Ｈｏｍａｎｎ，Ｈ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７（１），１３１−１４０（１９９０））。則ち、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのｒｅｓｔａｒｔ効率が高くないために、ゲノムの３’端に搭載した遺伝子ほど発現量が高く、５’端のものほど発現量は低くなる。実際に同じマーカー遺伝子を様々な位置に搭載することで、極性効果を証明するとともに発現量制御のデザインが示されている（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８６，３３−３８（２００２））。今回検出に利用しているＧＦＰ遺伝子は、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦでは３’端に、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰでは欠失しているＦ遺伝子の位置に搭載しており、ＧＦＰ蛋白量はＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦで高く、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰでは相対的に低くなるデザインになっている。但し、他のＳｅＶ蛋白は両ベクターで同様に（同量程度）発現していると予想されることから、免疫原性の原因となる蛋白は同量程度で、検出蛋白（ＧＦＰ）のみＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞で少なくなっていると考えられる。以上のことを考慮すると、耳介投与系において、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群で確認された僅かながらの遺伝子発現の延長に関して、実際にはＧＦＰ観察で予想されるよりも更に延長効果があることが示唆される。
産業上の利用の可能性
本発明により、抗体可変領域を含むポリペプチドを発現するパラミクソウイルスベクターが提供された。本発明のベクターは、インビボまたはエクスビボにより生体内に投与するための遺伝子治療ベクターとして適している。特に神経伸長阻害因子に対する抗体断片を発現するベクターは、神経損傷への遺伝子治療に有用である。また、免疫活性化シグナル伝達を阻害する抗体を発現する本発明のベクターは、ベクターからの遺伝子の長期発現および繰り返し投与を可能にする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＮＯＧＯの中和抗体のＦａｂ（Ｈ鎖及びＬ鎖）をコードするＮｏｔＩ断片の塩基配列を示す図である。蛋白質コード配列は大文字で示した。また、ＳｅＶのＥシグナル、介在配列、Ｓシグナルの塩基配列を、実線下線−点線下線−実線下線で示した。波線はＮｏｔＩと同じ接着末端となる部位を示し、この配列を利用して、Ｈ鎖およびＬ鎖のコード配列を例えば別々のベクターのＮｏｔＩ部位にクローニングすることもできる。
図２は、図１に示したＦａｂをコードする断片の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。ＳＹＮ８０  Ｆ１〜ＳＹＮ８０  Ｒ１６までを順に配列番号：１２〜４２とした。
図３は、図２に示したオリゴヌクレオチドの配置を示す図である。
図４は、ＮＯＧＯの中和抗体のＦａｂ遺伝子を搭載した伝播型ウィルス（ＳｅＶ１８＋ＩＮ−１）（パネルＡ）および伝播能欠損型ウイルス（ＳｅＶ１８＋ＩＮ−１／ΔＦ）（パネルＢ）の構造およびＲＴ−ＰＣＲによるウィルスゲノムの確認を示す写真および図である。
図５は、ＮＯＧＯの中和抗体のＦａｂ遺伝子を搭載した伝播型またはＦ遺伝子欠失型ウィルスからのＦａｂの発現を示す写真である。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてＧＦＰ遺伝子を搭載した伝播型ＳｅＶベクターを用いた。感染の２日後（ｄ２）または４日後（ｄ４）の抗体の発現を示す。
図６は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の形態に影響するｑ−ｐｏｏｌの活性に対するＩＮ−１遺伝子搭載ＳｅＶの作用を示す写真である。各条件での培養開始３日後（ＳｅＶ感染２日後）のＮＩＨ−３Ｔ３細胞の顕微鏡写真を示した。（Ａ）：ｑ−ｐｏｏｌ未処理プレートを使用、（Ｂ）：ｑ−ｐｏｏｌ処理プレートを使用、（Ｃ）：ｑ−ｐｏｏｌ処理プレートを使用しＳｅＶ１８＋ＧＦＰをＭＯＩ＝１で感染、（Ｄ）：（Ｃ）と同一視野でＧＦＰ蛍光写真を撮影・重ね合わせ（ＳｅＶ感染細胞の割合の指標）、（Ｅ）：ｑ−ｐｏｏｌ処理プレートを使用しＳｅＶ１８＋ＩＮ１をＭＯＩ＝１で感染。
図７は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の細胞増殖に対するＩＮ−１遺伝子搭載ＳｅＶの作用を示す図である。各条件での培養開始３日後（ＳｅＶ感染２日後）のＮＩＨ−３Ｔ３細胞の細胞数比率をＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅを用いたミトコンドリア活性を元に測定した。（Ａ）：ｑ−ｐｏｏｌ未処理プレートを使用、（Ｂ）：ｑ−ｐｏｏｌ処理（１μｇ／ｃｍ２）プレートを使用、（Ｃ）：ｑ−ｐｏｏｌ処理（１０μｇ／ｃｍ２）プレートを使用、（Ｄ）：ｑ−ｐｏｏｌ処理（３０μｇ／ｃｍ２）プレートを使用しＳｅＶ１８＋ＩＮ１をＭＯＩ＝１で感染。
図８は、ラット後根神経節神経細胞の突起伸展に影響するｑ−ｐｏｏｌの活性に対するＩＮ−１遺伝子搭載ＳｅＶの作用を示す写真である。各条件でのＳｅＶ感染３６時間後（培養開始６０時間後）のラット後根神経節神経細胞の顕微鏡写真を示した。（Ａ）ｑ−ｐｏｏｌ未処理プレートを使用しＳｅＶ１８＋ＧＦＰを１ｘ１０５ＣＩＵ／５００μＬ／ｗｅｌｌで感染した細胞。（Ｃ）ｑ−ｐｏｏｌ処理プレートを使用しＳｅＶ１８＋ＧＦＰを１ｘ１０５ＣＩＵ／５００μＬ／ｗｅｌｌで感染した細胞。（Ｂ）及び（Ｄ）はそれぞれ（Ａ）及び（Ｃ）と同視野のＧＦＰ蛍光写真。（Ｅ）及び（Ｆ）ｑ−ｐｏｏｌ処理プレートを使用しＳｅＶ１８＋ＩＮ１を１ｘ１０５ＣＩＵ／５００μＬ／ｗｅｌｌで感染した細胞。
図９は、ＧＦＰ遺伝子搭載ＳｅＶベクターマウス耳介投与後のＧＦＰ由来蛍光の経時変化を示す写真である。ＧＦＰ遺伝子を有する伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ：５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）或いはＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ：５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した。
図１０は、耳介投与法の定量性評価（１）を示す図である。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子搭載ＳｅＶベクターでの評価：（Ａ）投与タイター依存性。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を搭載している伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋Ｌｕｃｉ）の投与タイターを変えてマウス耳介に投与し（５ｘ１０４，５ｘ１０５，５ｘ１０６ＣＩＵ／５μＬ）、投与２日後に耳介を切除後、組織をホモジナイズし、Ｌｅｃｉｆｅｒａｓｅ活性を調べた（ｎ＝３）。投与タイター依存的なＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の変化が見られた。（Ｂ）経時変化。ＳｅＶ１８＋Ｌｕｃｉ（５ｘ１０６ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、経時的にそれぞれの耳介を切除後、組織をホモジナイズし、Ｌｅｃｉｆｅｒａｓｅ活性を調べた（ｎ＝３）。
図１１は、耳介投与法の定量性評価（２）を示す写真および図である。ＧＦＰ遺伝子搭載ＳｅＶベクターでの評価：ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ（５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した（ｎ＝４）。（Ａ）ＧＦＰ蛍光写真。（Ｂ）ＧＦＰ蛍光強度の定量化。画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅにて蛍光強度の定量を行った。
図１２は、繰り返し投与での評価法という観点からの耳介投与法の有用性を示す写真および図である。マウス右耳の耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し（一回目投与）、次に投与１，２，４，６，８，２８，６２日後に、左耳耳介へＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与した（二回目投与）。それぞれの投与後、経時的にＧＦＰ蛍光の強度変化を調べた。（Ａ）ＧＦＰ蛍光写真。（Ｂ）ＧＦＰ蛍光強度の定量化。
図１３は、耳介投与法による感染細胞の同定（１）を示す写真である。マウス耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、感染２日後に耳介を切除し、凍結切片を作成、蛍光顕微鏡下ＧＦＰ蛍光を観察した（Ａ）。同連続切片を抗ＧＦＰ抗体で染色した（Ｃ）。（Ｂ）はこれらの重ね合わせを示す。
図１４は、耳介投与法による感染細胞の同定（２）を示す写真である。マウス耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、感染２日後に耳介を切除し、凍結切片を作成、蛍光顕微鏡下ＧＦＰ蛍光を観察した（図１３とは別の個体）。
図１５は、抗ＣＤ２８抗体遺伝子断片（ＳＹＮ２０５−１３）の合成に使用したｏｌｉｇｏ  ＤＮＡの配置を示す図である。
図１６は、抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載するＳｅＶベクターｃＤＮＡ構築の概略を示す図である。
図１７は、抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載するＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）のＲＴ−ＰＣＲによるウイルスゲノムの確認を示す写真である。
図１８は、αＣＤ２８遺伝子を搭載するＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）からの抗体の発現を示す写真である。
図１９は、抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８ｃｓｔ）ＧＦＰ遺伝子搭載ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）のマウス耳介投与後のＧＦＰ由来蛍光の経時変化を示す写真である。５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬをマウス耳介に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した。ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群との比較を行った。
図２０は、感染初期のＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白投与を併用した場合のＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰのマウス耳介投与後のＧＦＰ由来蛍光の経時変化を示す写真である。５ｘ１０６ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬをマウス耳介に投与し、投与１時間後及び１０時間後にＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白を０．５ｍｇ／ｂｏｄｙで腹腔内に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した。同じ処理をしたＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群との比較を行った。
図２１は、ＧＦＰ蛍光強度の定量化を示す図である。図１９及び図２０の蛍光写真を基に、画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅにて蛍光強度の定量を行った。
図２２は、ＧＦＰ遺伝子の搭載位置の違いによるＧＦＰ由来蛍光強度の違いを示す写真である（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの確認）。ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ或いはＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＭＯＩ＝３で感染し、経時的にＧＦＰ蛍光を観察した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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