(57)【要約】本発明は、糖鎖結合タンパク質の糖鎖改変方法、及び糖鎖が改変された糖鎖結合タンパク質に関する。また本発明は、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞及びその作製方法に関する。さらに本発明は、改変型糖鎖結合タンパク質の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変することにより糖鎖結合タンパク質の糖鎖を改変することを特徴とする、糖鎖結合タンパク質の糖鎖改変方法。
【請求項２】
カーゴレセプターがＶＩＰ３６及び／又はＥＲＧＩＣ−５３である請求項１記載の糖鎖改変方法。
【請求項３】
糖鎖結合タンパク質が膜結合タンパク質又は分泌タンパク質である請求項１又は２記載の糖鎖改変方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖改変方法により糖鎖が改変された糖鎖結合タンパク質。
【請求項５】
請求項４記載の糖鎖結合タンパク質から糖鎖を切断することを特徴とする、改変された糖鎖の製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の製造方法により製造される改変された糖鎖。
【請求項７】
カーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変することにより糖鎖結合タンパク質の糖鎖を改変することを特徴とする、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞の作製方法。
【請求項８】
カーゴレセプターがＶＩＰ３６及び／又はＥＲＧＩＣ−５３である請求項７記載の作製方法。
【請求項９】
糖鎖結合タンパク質が膜結合タンパク質又は分泌タンパク質である請求項７又は８記載の作製方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の作製方法により作製される、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の細胞を培養し、得られる培養物から改変型糖鎖結合タンパク質を採取することを特徴とする、改変型糖鎖結合タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
カーゴレセプターの糖鎖認識部位にランダム突然変異を導入し、改変された糖鎖を有する糖鎖結合タンパク質を発現させることを特徴とする改変型糖鎖ライブラリーの作製方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞、又は請求項１２記載の作製方法により作製される改変型糖鎖ライブラリーを用いて、糖鎖結合タンパク質又は糖鎖結合タンパク質から切り出した糖鎖、あるいは特定の糖鎖と相互作用する被験物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、糖鎖結合タンパク質の糖鎖改変方法、及び糖鎖が改変された糖鎖結合タンパク質に関する。また本発明は、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞及びその作製方法に関する。さらに本発明は、改変型糖鎖結合タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】  ヒトゲノムの全塩基配列が明らかになりつつある今日、これら膨大な情報をもとにテーラーメイド医療が始まろうとしている。タンパク質の発現をＤＮＡチップを用いて網羅的に調べる診断法とそのデータに基づく薬物の処方は、コンピューター上で行える時代となりつつある。また組換えタンパク質が容易に生成できるようになり、さまざまなサイトカインやホルモンを医薬品として用いることも益々加速されるものと思われる。
生体内ではさまざまな糖鎖を介した識別のメカニズムがあり、糖鎖は糖タンパク質の輸送や代謝に影響するため、これらタンパク質の生物活性を大きく左右する。また糖鎖の構造変化が癌細胞の異常増殖や転移に関与している可能性が示唆されている。従って、種々のタンパク質を薬剤として用いる場合、遺伝子工学的手法を利用して産生した組換えタンパク質の糖鎖構造を規定し、さまざまなグライコフォームを作り出す技術は、それらに新たな薬効を付与する技術となりうるものと考えられる。例えば、そのような技術を利用して、糖鎖構造を改変して糖タンパク質の細胞内における局在場所を調節・決定したり、糖タンパク質の代謝を調節することが可能となる。
しかしながら糖鎖の付加（グリコシル化）は、その情報が遺伝子に直接コードされていないことから、それを制御する技術はゲノムやプロテオーム研究によっては達成されない。
糖鎖構造を規定し制御する技術は確立されておらず、現在は各種の糖転移酵素をそれぞれ反応させて糖鎖が合成されている（例えば、特開平１１−４２０９６号参照）。この場合、手作業では２〜３ヶ月、合成装置を用いても数日を必要とする。また遺伝子工学を利用して糖鎖が付加されたタンパク質を発現させることも行われているが、一般的に用いられる大腸菌はタンパク質に糖鎖を付加することができず、また酵母はヒトとは異なる糖鎖が付加されるため、医薬として有用な糖タンパク質を得ることは困難である。
一方、医薬分野における糖鎖の要求も増大している。例えば、小児代謝性疾患であるＣｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ  Ｉｂなどの疾患においては、欠損する糖鎖を投与することにより治療されている（Ａｌｐｅｒ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：２３３９，２００１）。しかしながら上述したような背景から糖鎖合成は簡便ではなく、糖鎖医薬は高価となっている。
従って、種々の糖鎖を製造し、有用な性質を有する糖鎖が付加されたタンパク質を簡便かつ迅速に検索及び生成する手法が望まれている。
【発明の開示】
本発明は、簡便かつ迅速な糖鎖改変方法、及び得られる糖鎖結合タンパク質から糖鎖を製造する方法を提供することを目的とする。また本発明は、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞の作製方法、及び糖鎖ライブラリーを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を達成するため鋭意検討した結果、細胞内で糖タンパク質が生合成され選別される過程に糖鎖構造の識別が行われることに着目し、それにかかわるカーゴレセプターの糖鎖認識特異性を改変することにより、発現される糖タンパク質の糖鎖を改変かつ制御することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、カーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変することにより糖鎖結合タンパク質の糖鎖を改変することを特徴とする、糖鎖結合タンパク質の糖鎖改変方法である。具体的には、該糖鎖改変方法は、以下のステップを含むものである：
（ａ）カーゴレセプター遺伝子の糖鎖認識部位をコードする塩基配列を改変するステップ；
（ｂ）上記カーゴレセプター遺伝子を細胞に導入するステップ；及び
（ｃ）上記細胞において糖鎖が改変された糖鎖結合タンパク質を発現させるステップ。
上記糖鎖改変方法において、カーゴレセプターは、ＶＩＰ３６及び／又はＥＲＧＩＣ−５３であることが好ましい。
また糖鎖結合タンパク質としては、例えば膜結合タンパク質及び分泌タンパク質が挙げられる。
本発明はまた、上記糖鎖改変方法により糖鎖が改変された糖鎖結合タンパク質である。
また本発明は、上記糖鎖結合タンパク質から糖鎖を切断することを特徴とする、改変された糖鎖の製造方法である。
さらに本発明は、上記製造方法により製造される改変された糖鎖である。
本発明はさらに、カーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変することにより糖鎖結合タンパク質の糖鎖を改変することを特徴とする、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞の作製方法である。具体的には、該作製方法は、以下のステップを含むものである：
（ａ）カーゴレセプター遺伝子の糖鎖認識部位をコードする塩基配列を改変するステップ；
（ｂ）上記カーゴレセプター遺伝子を細胞に導入するステップ；
（ｃ）上記細胞において上記カーゴレセプター遺伝子を発現させるステップ；及び
（ｄ）糖鎖が改変された糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を選択するステップ。
また上記作製方法は、以下の（ｅ）及び（ｆ）のステップを含むものであってよく、その場合、ステップの順序は特に限定されない：
（ｅ）細胞に所望のタンパク質の遺伝子を導入するステップ；及び
（ｆ）糖鎖が改変された所望の糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を得るステップ。
上記作製方法において、カーゴレセプターは、ＶＩＰ３６及び／又はＥＲＧＩＣ−５３であることが好ましい。
また糖鎖結合タンパク質としては、例えば膜結合タンパク質及び分泌タンパク質が挙げられる。
本発明はまた、上記作製方法により作製される、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞である。
また本発明は、上記細胞を培養し、得られる培養物から改変型糖鎖結合タンパク質を採取することを特徴とする、改変型糖鎖結合タンパク質の製造方法である。
さらに本発明は、カーゴレセプターの糖鎖認識部位にランダム突然変異を導入し、改変された糖鎖を有する糖鎖結合タンパク質を発現させることを特徴とする改変型糖鎖ライブラリーの作製方法である。具体的には、該作製方法は、以下のステップを含むものである：
（ａ）カーゴレセプター遺伝子の糖鎖認識部位をコードする塩基配列にランダム突然変異を導入するステップ；
（ｂ）上記ランダム突然変異を有する各カーゴレセプター遺伝子を複数の細胞にそれぞれ導入するステップ；
（ｃ）上記複数の細胞の各細胞において上記ランダム突然変異が導入されたカーゴレセプター遺伝子を発現させるステップ。
またさらに本発明は、上記改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を用いて、糖鎖結合タンパク質又は糖鎖結合タンパク質から切り出した糖鎖、あるいは特定の糖鎖と相互作用する被験物質をスクリーニングする方法である。具体的には、該スクリーニング方法は、以下のステップを含むものである：
（ａ）改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞と被験物質とを接触させるステップ；及び
（ｂ）糖鎖結合タンパク質又は糖鎖と被験物質との相互作用を調べるステップ。
また上記スクリーニング方法は、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を増殖させるステップをさらに含んでいてもよい。さらに上記スクリーニング方法は、所望の糖鎖結合タンパク質又は糖鎖を細胞表面に発現する細胞を選択するステップを含んでいてもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００２年８月１９日に出願された日本国特許出願第２００２−２３８５５９号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、種々の糖鎖を含む糖鎖ライブラリーを構築することを目的として完成されたものである。本発明者らは、真核細胞におけるタンパク質の分泌経路においてカーゴレセプターが糖タンパク質を認識し、その糖鎖修飾に関与していることに注目して研究を行った。それにより、カーゴレセプターの推定糖鎖認識決定部位を見出し、その部位を改変することによって、発現される糖タンパク質の糖鎖を改変することに成功した。
１．カーゴレセプター
カーゴレセプター（Ｃａｒｇｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とは、糖タンパク質の品質制御と糖タンパク質のソーティングに重要な役割を果たす動物レクチンの総称である。現在カーゴレセプターとしては、小胞体（ＥＲ）からゴルジ体への糖タンパク質の輸送に関わるＥＲＧＩＣ−５３と、ゴルジ体における糖タンパク質の品質制御に関わるＶＩＰ３６が知られている（Ｈａｕｒｉ，Ｈ−Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７６（２０００）３２−３７）。糖タンパク質は、図１に示すように、真核細胞内の小胞体（ＥＲ）で糖鎖が付加された形態で合成された後、ゴルジ体において糖鎖のプロセシングを受ける。この分泌経路と呼ばれる過程において、タンパク質は輸送小胞によって細胞内小器官を行き来する間に折りたたまれ、糖鎖が付加され、選別された後、機能すべき部位に向かうよう指定される。この輸送小胞に存在するカーゴレセプターが糖タンパク質の糖鎖を認識し、細胞外に運搬されるタンパク質の選別を行っている。
初期のタンパク質は、まずＥＲにおいて正確に折りたたまれ、オリゴマー化をうける。この過程の間にタンパク質はそのＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒペプチド配列（Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸を表す）に糖鎖が付加される（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  Ｒ  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｆｅｌｄｓ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８５，５４：６３１−６６４）。この付加された糖鎖は脂質中間体から転移したオリゴ糖であり、マンノース、グルコース及びＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる１４個の糖単位を含むものである。細胞内の中心部では、糖タンパク質の糖部分（例えば最も外側にあるグルコース残基）がレクチンにより認識されて、正しく折りたたまれたタンパク質のみがそのグルコース残基を除去されてさらなる修飾のためにゴルジ体に運ばれる（Ｔｅａｓｄａｌｅ  ＲＤ，ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＭＲ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，１９９６，１２：２７−５４）。
続いて、ＥＲとゴルジ体の間の区画（ＥＲ−Ｇｌｏｇｉ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ：ＥＲＧＩＣ）においては、カーゴレセプターの１つであるＥＲＧＩＣ−５３がＥＲからＥＲＧＩＣへの糖タンパク質の輸送において機能する。またゴルジ体においては、種々の糖転移酵素とグリコシダーゼによって糖鎖の修飾がさらに行われ、これにより主にＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、シアル酸などのより精巧なオリゴ糖が形成される。しかしながら、この修飾過程においては常に完全な糖鎖が形成されるわけではなく、生理的に機能しないと考えられる糖タンパク質も生成される。ＶＩＰ３６は、このような糖鎖修飾過程において形成される糖鎖の品質管理に機能を果たし、糖タンパク質のトランスゴルジ体からシスゴルジ体又はＥＲＧＩＣとの間の輸送において機能していると考えられている（Ｆｕｌｌｅｋｒｕｇ  Ｊ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１９９９，１１２（Ｐｔ１７）：２８１３−２１）。ＶＩＰ３６は、不完全な糖タンパク質をＥＲＧＩＣ又はシスゴルジ体における糖鎖修飾の初期段階に戻すことにより、不完全な糖タンパク質が分泌されないようにする。
上述したように、本発明において「カーゴレセプター」とは、糖鎖の修飾過程において糖タンパク質の糖鎖を認識し、生体内で必要とされる糖タンパク質の運搬に関与するものであれば特に限定されるものではなく、現在発見されているＥＲＧＩＣ−５３及びＶＩＰ３６以外にも、今後発見されるであろう同様の機能を有するカーゴレセプターも本発明の範囲に包含される。
現在発見されている２種のカーゴレセプターは既に単離されており、ＥＲＧＩＣ−５３については、ヒトＥＲＧＩＣ−５３がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７１６６１として登録されている。またこの塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。またＶＩＰ３６に関しては、ヒトＧＰ３６ｂ糖タンパク質がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ１０３６２として（塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す）、イヌ（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＶＩＰ３６がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７６３９２として登録されている。
カーゴレセプターは、その中央部分に糖鎖を認識して糖タンパク質と結合する「糖鎖認識部位」（ＣＲＤとも呼ばれる）を有することが知られている（Ｈａｕｒｉ，Ｈ−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１３：５８７−５９６，２０００）。本発明者は、カーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変することによって、細胞内においてカーゴレセプターにより認識される糖鎖が変更され、それにより糖鎖修飾過程が変化した結果、糖タンパク質として膜表面上に発現される又は細胞外に分泌されるタンパク質の糖鎖を改変できることを見出した。以下に、本発明に係る糖鎖改変方法と改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞の作製方法について説明する。
２．カーゴレセプターの糖鎖認識部位の改変
（１）糖鎖認識部位
本発明者は、マメ科レクチンとの相同性比較を行うことにより、カーゴレセプターの糖鎖認識部位の中で、特に糖鎖に対する特異性を決定するために重要な推定糖鎖認識決定部位を特定した。推定糖鎖認識決定部位は、ヒトＥＲＧＩＣ−５３の塩基配列（配列番号１、翻訳開始のａｔｇのａを１とする）の４５４〜４８０塩基、またアミノ酸配列（配列番号２）の１５２（Ａｓｐ）〜１６０（Ｌｙｓ）番目に相当する。ヒトＶＩＰ３６の推定糖鎖認識決定部位は、塩基配列（配列番号３）の４８４〜５１０塩基、またアミノ酸配列（配列番号４）の１６２（Ａｓｐ）〜１７０（Ｔｈｒ）番目に相当する。ヒト以外のカーゴレセプターも、ヒトカーゴレセプターとの相同性から糖鎖認識決定部位を推定することが可能である。
本発明は、カーゴレセプターの糖鎖認識部位、特に糖鎖認識決定部位を改変することを特徴とする。本発明において「糖鎖認識部位の改変」とは、カーゴレセプターがタンパク質として発現された際に、その糖鎖認識部位又は糖鎖認識決定部位が改変前のものと比較して配列及び／又は構造が異なる、あるいは改変前の細胞において発現されるタンパク質の糖鎖と比較して異なる糖鎖が付加されることを意味する。従って、上述した特定の配列以外にも、改変前にタンパク質に付加される糖鎖と異なる糖鎖が付加されるようなカーゴレセプターの改変もまた本発明でいう「糖鎖認識部位の改変」に包含される。
糖鎖認識部位の改変は、任意の数の任意のアミノ酸を改変することができ、特に限定されるものではないが、糖鎖認識部位を変異導入により改変する場合、糖鎖認識部位を構成するアミノ酸において、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＣａ及びＭｎに配位するアミノ酸として、アスパラギン（Ａｓｎ）は側鎖が糖との協同的水素結合を形成し、Ｃａに配位結合するアミノ酸として重要であり、カーゴレセプターの構造保持及び糖との結合親和性に大きく関与していると考えられるため、上記推定した９アミノ酸の糖鎖認識決定部位のうち、ＥＲＧＩＣ−５３ではアミノ酸１５２（Ａｓｐ）と１５６（Ａｓｎ）、ＶＩＰ３６ではアミノ酸１６２（Ａｓｐ）と１６６（Ａｓｎ）を保存し、変異を導入しないことが好ましい。
（２）糖鎖認識部位へのランダム変異導入
本発明においては、カーゴレセプターの糖鎖認識部位（又は糖鎖認識決定部位）の改変をその遺伝子への変異導入により行うことが好ましい。遺伝子の一部の領域に変異を導入して遺伝子を改変する手法は当技術分野では周知である。導入される変異と改変される糖鎖との間の相関がわからない場合には、カーゴレセプターの糖鎖認識部位をランダムに変異させ、発現される糖タンパク質の糖鎖が改変されるかどうかを確認する。
遺伝子の一部の領域にランダムに突然変異を導入するには、当技術分野で公知のランダム突然変異誘発法を採用することができる。そのような手法としては、限定されるものではないが、縮重オリゴヌクレオチド法、リンカースキャニング法、ＰＣＲに基づく方法などが挙げられる。これらの手法に関しては、例えば「分子生物学実験プロトコールＩ」Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら著，西郷薫及び佐野弓子訳，１９９７年，丸善株式会社（特に第８章）、「新  遺伝子工学ハンドブック」改訂第３版，村松正實及び山本雅編，１９９９年，株式会社羊土社（特に第２１６〜２２６頁）などを参照されたい。本発明においては、可能な限り多くの種類のランダムなオリゴヌクレオチドを大量に調製するという目的を達成するために、縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）と組み合わせてランダムな変異を導入する手法が好ましい。縮重オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法によりカーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変する手法について以下に詳細に説明する。
（２−１）原理
縮重オリゴヌクレオチド法は、オリゴヌクレオチド合成時に正常塩基以外の塩基を混入することによりランダム変異が挿入された縮重オリゴヌクレオチドを合成することができるという事象に基づいている。この手法を利用することにより、カーゴレセプターの糖鎖認識部位に相当する領域について多様な変異が導入された縮重オリゴヌクレオチドを得ることができる。縮重オリゴヌクレオチド法は、１塩基当たり１０％突然変異率を得るために９０％の正常塩基に各３．３３％の他の３塩基を混入するなど、混入比率を増減させることにより突然変異率を制御できるという利点がある。
縮重オリゴヌクレオチドを作製するためのキットも多数市販されており、例えば、ＥｘＳｉｔｅＴＭＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＬＡ  ＰＣＲＴＭｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ＴａＫａＲａ）などを用いることができる。このようなキットを利用した場合、プライマーの設計を変更することにより、点突然変異、数塩基の欠失・挿入など、多様な変異体を簡便に作製することが可能である。
（２−２）ランダムライブラリーの作製
最初に、多様な変異を有する糖鎖認識部位を含むカーゴレセプター遺伝子を得るために、上述した縮重オリゴヌクレオチドからなるランダムプライマーを用いて、ランダムに変異が導入された糖鎖認識部位を含むカーゴレセプター遺伝子のランダムライブラリーを作製する。
ランダムプライマーとしては、糖鎖認識部位の周辺の領域にハイブリダイズする縮重オリゴヌクレオチドを用いる。ランダムプライマーの設計方法は、当技術分野で公知であり、ＰＣＲ反応条件などと共に当業者であれば容易に決定することができる。
以下のものに限定されるものではないが、本発明において利用可能なランダムプライマーを以下に示す：
・ＶＩＰ３６の糖鎖認識部位を含む３’末端側の後半断片を増幅するためのプライマー
2004016789.tif 000002
・ＥＲＧＩＣ−５３の糖鎖認識部位を含む３’末端側の後半断片を増幅するためのプライマー（配列中、下線の部位は制限酵素部位を表す）
2004016789.tif 000003
上述のように設計したプライマーの合成法は、当技術分野で周知である。例えば、ホスホアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。
続いて、上記設計したプライマーを用いて、カーゴレセプターｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー若しくはｍＲＮＡを鋳型として増幅反応を行う。増幅反応としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。ｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成した後、該一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成する。ＰＣＲ法の場合は二本鎖ＤＮＡが得られる。次に、得られた二本鎖ＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ランダムライブラリーを得ることができる。
次に、得られたクローンから目的のカーゴレセプター遺伝子を含む部分をクローニングする。ＤＮＡのクローニングには、例えばＴＡクローニング法が用いられる。ＴＡクローニング法は、市販のキット、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡクローニングキットを用いて行うことができる。
上記スクリーニングにおいて得られたＤＮＡの単離クローンについて、増幅産物をテンプレートにしてＤＮＡの塩基配列を決定する。
塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＬＩ−ＣＯＲ社製  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＬＯＮＧＲＥＡＤＥＲ  ４２００等）を用いて配列決定が行われる。
上述した以外にも、カーゴレセプター遺伝子の塩基配列を基にして、当該塩基配列から１〜数個の塩基の欠失、置換若しくは挿入を人為的に行う技術、例えば部位特異的突然変異誘発法により、カーゴレセプターとしての機能を維持させつつ糖鎖認識部位の配列の異なる変異体を作製することができる。例えば１〜数個の塩基が置換されるような部位特異的突然変異誘発については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１（１９８４）５６６２−５６６６；ＷＯ８５／００８１７号公報；Ｎａｔｕｒｅ３１６（１９８５）６０１−６０５；Ｇｅｎｅ３４（１９８５）３１５−３２３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５）４４３１−４４４２；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９（１９８２）６４０９−６４１３；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４（１９８４）１４３１−１４３３等に記載の技術に従って変異体を取得し、これを利用することができる。また、市販のキット（Ｍｕｔａｎ−Ｇ、Ｍｕｔａｎ−Ｋ（Ｔａｋａｒａ））を用いてこれらの変異体を作製することができる。さらに、誤りを起こしやすいポリメラーゼ連鎖反応（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）もまた変異体作製方法として知られており、複製の厳密度の低い条件を選択することによって１〜数塩基の変異を導入することができる（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ２（１９９２）２８−３３；Ｍａｌｂｏｅｕｆ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３０（２００１）１０７４−８；Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．ａｎｄ  Ｍａｒａｎａｓ  Ｃ．Ｄ．Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．７；２０５（２０００）４８３−５０３）。
ランダム突然変異は、例えばＶＩＰ３６の糖鎖認識部位に相当する、１４ヌクレオチドがＡ、Ｔ、Ｇ又はＣのいずれかであり、７ヌクレオチドがＧ又はＴのいずれかであるため、ランダムに変異導入された配列には、少なくとも４１４×２７（すなわち３．４×１０１０）の組合せが可能である。また例えばＥＲＧＩＣ−５３の糖鎖認識部位に相当する９アミノ酸のうち７アミノ酸に変異を導入することが可能であり、従って、１４ヌクレオチドがＡ、Ｔ、Ｇ又はＣのいずれがであり、７ヌクレオチドがＧ又はＴのいずれかであるため、ランダムに変異導入された配列には、ＶＩＰ３６と同様に、少なくとも４１４×２７（すなわち３．４×１０１０）の組合せがある。さらに、欠失・挿入などの変異を導入することによって、ランダムライブラリーには多様な配列がより多く含まれることになる。
（２−３）ランダムベクター
上述のようにして得た多様な変異を有する糖鎖認識部位を含むカーゴレセプター遺伝子のランダムライブラリーを用いて、細胞をトランスフェクトするためのベクターを作製する。
細胞にトランスフェクトするためのランダムベクターは、上記ランダムライブラリーのＤＮＡを適当なベクターに連結することにより得ることができ、トランスフェクト細胞は、上記ランダムベクターを、目的のカーゴレセプター遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
ベクターとしては、トランスフェクション用のベクターとして当技術分野で公知のベクターが使用され、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが挙げられる。
ベクターにランダムライブラリーのカーゴレセプター遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
カーゴレセプター遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター、カーゴレセプター遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後に連結させ、ランダムベクターを作製する。
（２−４）細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションに使用する宿主としては、真核細胞であれば特に限定されるものではない。例えば、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞等）、昆虫細胞などが挙げられる。本発明をヒトなどの動物に由来するタンパク質の産生に適用する場合は、特に動物細胞を用いることが好ましい。
酵母を宿主細胞とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、Ｍａｒｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ細胞）等が用いられる。プロモーターとしてはＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。動物細胞へのベクター導入方法は、市販のキット、例えばＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って用いることにより簡便に行うことができる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
トランスフェクト細胞は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
目的のカーゴレセプター遺伝子が細胞に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法などにより行うことができる。例えば、トランスフェクト細胞からＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、導入ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などにより染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、導入ＤＮＡを確認することができる。また、予め蛍光色素などにより標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などにより増幅産物を確認する方法も採用することができる。
（３）分離
上述のとおりカーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変した後、特定の改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞は、その糖鎖に基づいて分離することができる。
特定の糖鎖に基づいてトランスフェクト細胞を分離する方法としては、当技術分野で公知の糖鎖識別手法に基づくものであれば特に限定されるものではない。本発明においては、その簡便な点から、糖鎖結合特異性を有する複数種の植物レクチンを利用してトランスフェクト細胞の細胞表面上で発現されている糖鎖結合タンパク質の糖鎖を識別し、細胞を分離することが好ましい。
植物レクチンとしては、マッシュルーム（ＡＢＡ）レクチン、タチナタマメ（ＣｏｎＡ）レクチン、洋種チョウセンアサガオ（ＤＳＡ）レクチン、レンズマメ（ＬＣＡ）レクチン、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ）レクチン、イヌエンジュマメ（ＭＡＭ）レクチン、ホモ四量体Ｅ−サブユニットを持つインゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｅ４）、ホモ四量体Ｌ−サブユニットを持つインゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｌ４）、ヒママメ（ＲＣＡ１２０）レクチン、及びコムギ胚芽（ＷＧＡ）レクチンなどが挙げられる。
植物レクチンに関しては詳細な研究が行われており、例えば下記表１に示すように、その糖特異性が正確に解析されている。
2004016789.tif 000004
植物レクチンは、例えばビオチン標識レクチンとして、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｅｃｔｉｎ  ｓｅｔ  Ｉ、ＩＩ（ホーネンコーポレーション）が市販されている。
植物レクチンと糖鎖との研究に関しては、ホーネンコーポレーションのホームページにおいて、糖鎖分析プロトコール・レクチン関連情報として、表１に記載した以外の植物レクチン、それらの糖特異性、糖タンパク質精製手法などが掲載されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｎｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｆｉｎｅｃｈｅｍ／参照）。
上記植物レクチンの糖特異性を利用して、改変された糖鎖の種類を決定することができる。特定の植物レクチンと結合した糖鎖を有する細胞を検出する方法は、当技術分野で公知の手法であれば特に限定されず、例えば、標識した植物レクチンを検出する手法などにより行うことができる。
好ましくは、標識した植物レクチンと結合した糖鎖を有する細胞を分離するために、磁気ビーズを用いて２次標識し、その磁性を利用して細胞を分離する手法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ法）、また標識の情報に基づいてフローサイトメトリーにより分取する手法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ法）を採用することができる。フローサイトメトリーを利用した場合には、個々の細胞の標識を解析して細胞を分取することが可能であり、特定の糖鎖を有する細胞の１つ１つを正確に分離することができる。一方、ＭＡＣＳは、操作が簡便で短時間で行えることから細胞に対するダメージが少なく、また細菌の混入などの危険性が少ない。また、上記細胞を分離する手法は、１種類の手法を１回又は複数回行ってもよいし、２種以上の手法を組み合わせてそれぞれ１回又は複数回行ってもよい。
上述のようにして分離された細胞を継代培養することによって、特定の糖鎖を有する細胞を濃縮（富化）することができる。
３．改変部位と改変型糖鎖の確認
上述のようにして、カーゴレセプターの糖鎖認識部位にランダムに変異を導入し、得られた糖鎖結合タンパク質の糖鎖構造を調べることにより、改変部位と改変型糖鎖との相関関係を知ることができる。
従って、特定の改変型糖鎖を得るために特定の改変を行う場合には、カーゴレセプターの糖鎖認識部位に部位特異的に変異を導入する。そのような手法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法などの公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｒａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて簡便に変異を導入することができる。
上述のようにカーゴレセプターの糖鎖認識部位に特定の変異を導入する、あるいはカーゴレセプターの糖鎖認識部位にランダムに変異を導入した後、所望の糖鎖を有するタンパク質を発現する細胞を選択することによって、所望の改変型糖鎖を有するタンパク質を細胞において発現させ、簡便に大量の改変型糖鎖を得ることが可能となる。
４．改変型糖鎖を有する糖鎖結合タンパク質を発現する細胞の作製
上述のように、変異部位と改変型糖鎖との相関が決定された場合には、特定の改変型糖鎖を有する糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を作製することができる。あるいは、カーゴレセプターの糖鎖認識部位にランダムに変異を導入した細胞の中から特定の改変型糖鎖を有する糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を選択することにより得ることも可能である。本発明において「改変された糖鎖」又は「改変型糖鎖」とは、カーゴレセプターを改変する前の糖鎖と比較してその配列及び／又は構造が異なるものを指す。また本発明において「糖タンパク質」又は「糖鎖結合タンパク質」とは、糖とタンパク質から構成され、それらが共有結合している物質を指す。
特定の改変型糖鎖を結合させようとするタンパク質は、慣例的な遺伝子工学的手法により、上記作製した細胞において発現させ、糖鎖を結合させることができる。そのようなタンパク質としては、以下に限定するものではないが、医薬品として使用するタンパク質、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン、抗体などが挙げられる。ＥＰＯは、糖鎖を改変することにより当該タンパク質の血中半減期が延長することが既に報告されている。また、抗体も糖鎖を改変することによって当該タンパク質の活性が増強することが報告されている。従って、糖鎖改変によって、タンパク質が有する性質（効果）と同じ効果若しくはそれ以上の効果、又はその他の医薬上有用な性質（効果）をタンパク質に付与することができる可能性がある。また特定の改変型糖鎖を結合させようとするタンパク質は医薬用タンパク質に限定されるものではなく、例えば生体内における糖鎖の影響を研究するための対象となるタンパク質、細胞間認識に関わるＴ細胞レセプター、ＮＫ細胞レセプター、ケモカインレセプター、ＭＨＣクラスＩ、ＩＩ分子、接着分子であるＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）、カドヘリン、インテグリン、ＬＦＡ−１（リンパ球機能関連抗原１）、ＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子１）、ＧｌｙＣＡＭ−１、発生に関わるアクチビン、Ｎｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、細胞外マトリクスであるムチン、コラーゲンなども本発明に包含される。
上記作製した細胞において所望のタンパク質を発現させるには、例えば、「２．カーゴレセプターの糖鎖認識部位の改変」の項の（２−３）及び（２−４）に記載のように、当該タンパク質をコードする遺伝子を組換えベクターに挿入し、そのベクターを細胞に形質転換又はトランスフェクトする。その際、当該タンパク質を膜結合タンパク質として発現させようとする場合には、タンパク質をコードする遺伝子の他、細胞表層にタンパク質を輸送させる分泌シグナル配列及び細胞表層局在タンパク質の膜貫通ドメイン又はＧＰＩアンカー結合配列などの配列を同一の遺伝子上にコードする融合遺伝子を構築し、その融合遺伝子を細胞において発現させる。また、当該タンパク質を分泌タンパク質として発現させようとする場合には、タンパク質をコードする遺伝子と分泌シグナル配列を同一の遺伝子上にコードする融合遺伝子を構築し、その融合遺伝子を細胞において発現させる。
分泌シグナル配列（分泌シグナル又は分泌シグナルペプチドともいう）は、一般に細胞外に分泌されるタンパク質のＮ末端に結合している。通常、細胞外に分泌されるタンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。本発明においては、所望のタンパク質を細胞外に移動及び発現させることができる分泌シグナル配列であれば、いずれのものも使用することができる。
細胞表層局在タンパク質は、宿主細胞の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。細胞表層とは、宿主細胞の最も外側の膜（例えば細胞壁、細胞膜など）の内部、細胞膜の最外層と外界との境界面、及び細胞の最外層からリンカー又はアンカーを介して突き出た領域のいずれをも意味する。細胞表層局在タンパク質としては、所望のタンパク質を細胞表層に固定化可能なものであれば特に限定されない。
本発明に係る改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を用いて所望のタンパク質を発現させた場合には、当該タンパク質に改変型糖鎖が付加される。従って、本発明により、特定の糖鎖を所望のタンパク質に結合させることが可能である。
５．改変型糖鎖結合タンパク質
本発明においては、上記「２．カーゴレセプターの糖鎖認識部位のランダム変異導入」又は「４．改変型糖鎖を有する糖鎖結合タンパク質を発現する細胞の作製」の項に記載のようにして作製された細胞を用いて、改変型糖鎖結合タンパク質を製造することが可能である。
本発明において、改変型糖鎖結合タンパク質は、上記作製した細胞を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養細胞又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。トランスフェクトした細胞を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。ここで、培地に添加される炭素源、窒素源、無機物などについては当技術分野で公知である。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約２８〜４０℃で約１８時間〜１０日間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近、例えばｐＨ７．４に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られたトランスフェクト細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＨＡＭ  Ｆ１０培地などに５〜２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したもの、あるいは市販の種々の無血清培地などが用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で約１８時間から１０日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、目的の改変型糖鎖結合タンパク質は、通常のタンパク質精製手段等を用いて得ることができる。当該タンパク質が膜結合タンパク質である場合には細胞表面上に生産されるため、細胞を破砕・可溶化することによりタンパク質を抽出する。また当該タンパク質が分泌タンパク質である場合には、培養上清からタンパク質を採取する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
細胞を利用して改変型糖鎖結合タンパク質を製造する方法について詳述したが、当業者には周知のように、無細胞系において糖鎖を改変し、改変型糖鎖結合タンパク質を製造することも可能である。無細胞系（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系）を利用してタンパク質を製造するためのキットが市販されており、このようなキットを利用することによって本発明を実施することができる。簡単に説明すると、例えばＰｒｏｍｅｇａ社より販売されている  ＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ウサギ網状赤血球）、ＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（コムギ胚芽）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を利用して、糖鎖認識部位を改変したカーゴレセプター及び所望のタンパク質を発現させることにより、その所望のタンパク質に改変型糖鎖が結合される。Ｐｒｏｍｅｇａ社のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系の詳細に関しては、Ｐｒｏｍｅｇａ社のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｕｉｄｅｓ／ｉｖｅ＿ｇｕｉｄｅ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ）を参照されたい。
上述したように、本発明は特定の細胞系における改変型糖鎖結合タンパク質の製造に限定されるものではない。
６．糖鎖の製造
上述のように改変型糖鎖結合タンパク質を得た後、当該タンパク質から糖鎖を切断することにより、改変された糖鎖を得ることができる。糖鎖の切断は、ヒドラジン分解法、酵素による分解など、当技術分野で公知の手法により行うことができる。ヒドラジン分解法については、ヒドラクラブヒドラジン分解試薬Ｃ（ホーネンコーポレーション）が市販されており、取扱説明書に従って糖鎖を切断することができる。また酵素による分解は、例えば、Ｎ−グリコペプチダーゼ、Ｏ−グリカナーゼを糖鎖結合タンパク質と反応させることにより、糖鎖を切断することができる。
本発明により、所望の糖鎖を簡便かつ大量に製造することができる。糖鎖は、生物及び化学分野を含む多くの分野で必要とされているが、その製造に時間的及び経済的にコストがかかっていた。本発明は、そのような糖鎖を必要とするあらゆる分野において非常に有用である。
７．糖鎖ライブラリー
上記（２−２）で示したように、カーゴレセプターにランダムに変異を導入した配列を含むランダムライブラリーは、非常に大きなものである。従って、このカーゴレセプターのランダムライブラリーを用いて細胞をトランスフェクトすることにより、細胞表面上に改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞のライブラリーを作製することができる。また本ライブラリーは、本発明に従って作製された改変型糖鎖又は改変型糖鎖結合タンパク質から構成されるものであってもよい。
糖鎖の構造は生体内の機能に関与していると考えられるため、糖鎖を研究する上で本糖鎖ライブラリーは有用である。例えば、種々の糖鎖を含む糖鎖ライブラリーの中から重要な機能を有する糖鎖を検索することが可能となる。
本糖鎖ライブラリーから特定の構造又は機能を有する糖鎖を選択するには、例えば、植物レクチン、抗体、レセプターに対する結合性により選別する手法、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、放射性標識した細胞を器官集積性（ターゲティング）について選別する手法などを用いることができる。
また本糖鎖ライブラリーは、多種多様な糖鎖結合タンパク質を発現する細胞又は糖鎖若しくは糖鎖結合タンパク質をチップ上に固定化して用いることも可能であり、そのようなチップは、特定の構造又は機能を有する糖鎖を網羅的に検出（スクリーニング）するために有用である。逆に、糖鎖ライブラリーの中からあらかじめ特定の糖鎖構造をもつ糖鎖又は糖鎖結合タンパク質若しくは細胞を選別し、それぞれ種々の蛍光ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）又はチップ上に固定化して用いることも可能であり、そのような蛍光ビーズ又はチップは、特定の糖鎖構造を認識する物質（タンパク質等）又は細胞などの網羅的検出（スクリーニング）に有用である。本発明において「スクリーニング」とは、特定の糖鎖構造を持つ物質又は特定の糖鎖構造と特異的に相互作用する物質などの候補を選択する工程を意味し、糖鎖ライブラリー中の無数の糖鎖構造をふるい分けて候補物質を絞りこむこと、又は糖鎖ライブラリー中の特定の構造を持つ糖鎖結合タンパク質を発現する細胞と相互作用をする候補物質を絞り込むことを指す。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、例えば以下のステップを含むものである：
（ａ）改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞又は改変型糖鎖若しくは改変型糖鎖結合タンパク質と被験物質とを接触させるステップ；及び
（ｂ）糖鎖結合タンパク質又は糖鎖と被験物質との相互作用を調べるステップ。
ステップ（ａ）において、接触の方法は特に限定されるものではない。例えば、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞又は改変型糖鎖若しくは改変型糖鎖結合タンパク質と被験物質とを混合することにより、両者を接触させることができる。また、ステップ（ｂ）において、相互作用を調べる方法も特に限定されるものではなく、当業者に公知の種々の方法を利用して相互作用を調べることができる。
また上記スクリーニング方法は、改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞を増殖させるステップ、及び／又は所望の糖鎖結合タンパク質又は糖鎖を細胞表面に発現する細胞を選択するステップを含んでいてもよい。例えば、糖鎖ライブラリーに含まれる改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞は、通常の細胞増殖法に従って増殖させることにより、改変型糖鎖の量を増やすことも可能である。また、本発明においては、細胞上に糖鎖結合型タンパク質が発現されることから、フローサイトメトリーなどの手法を利用して、特定の糖鎖を研究することも可能である。
特定の糖鎖を認識するタンパク質は、ウイルスや細菌などの感染を含む種々の疾患に関わっている例も多く、そのようなタンパク質をスクリーニングして見出すことが望まれる。また、特定の糖鎖をもつウイルスや細菌上の特定の糖鎖が細胞と結合することにより感染が成立したり、特定の糖鎖が抗体または細胞と接触することにより抗体又は細胞の機能を調節することも知られており、その調節機構を調べることも望まれている。従って、本発明に従って特定の糖鎖を認識するタンパク質又は特定の糖鎖の生体内調節機構を見出すことによって、疾患の薬剤や診断糖の標的分子が明確となり、副作用のない薬剤を効率的に設計したり、疾患のより高度な診断が可能となることが期待される。
【図面の簡単な説明】  図１は、糖タンパク質の糖鎖修飾と糖の品質管理に関与するカーゴレセプター（ＥＲＧＩＣ−５３及びＶＩＰ３６）と、分泌経路の概要を示す図である。
図２は、ＶＩＰ３６ライブラリー構築の概要を示す図である。
図３は、ＶＩＰ３６へのランダム突然変異導入結果を示す図である。Ａに変異ＶＩＰ３６の推定糖鎖認識決定部位の塩基配列を、Ｂにそのアミノ酸配列を示す。
図４は、ＭＤＣＫ細胞における改変ＶＩＰ３６の過剰発現を示す写真である。
図５は、レクチン陽性（赤）及び陰性（黒）ＭＤＣＫ細胞に対する植物レクチンの結合を示す図である。上段が非トランスフェクト細胞、中段が変異ＶＩＰ３６トランスフェクト細胞、下段が非トランスフェクト対照ＭＤＣＫ細胞を示す。
図６は、レクチン陽性（赤）及び陰性（黒）ＭＤＣＫ細胞に対するＰＨＡ−Ｅ４及びＷＧＡの結合を示す図である。最上段が野生型細胞、上から２段目が変異ＶＩＰ３６トランスフェクト細胞の１回目の分離後、下から２段目が変異ＶＩＰ３６トランスフェクト細胞の２回目の分離後、最下段が変異ＶＩＰ３６トランスフェクト細胞の３回目の分離後の結果を示す。
図７は、レクチン結合にトリプシン処理が及ぼす影響を示す図である。ＰＢＳ−ＥＤＴＡ処理を赤、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を青で示す。
図８は、ＥＲＧＩＣ−５３の糖鎖認識決定部位にランダムな改変を導入するためのランダムプライマーの設計を示す概要図である。
図９Ａは、１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体を、２次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣを用いてサンプルを作製し、蛍光顕微鏡で観察した写真を示す図である。ネガティブコントロールとして、野生型ＭＤＣＫ細胞を観察した。
図９Ｂは、１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体を、２次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣを用いてサンプルを作製し、蛍光顕微鏡で観察した写真を示す図である。ポジティブコントロールとして、ＶＩＰ３６−ＦＬＡＧ  ｃｌｏｎｅ８（恒常的な発現か確認されているクローン）を観察した。
図９Ｃは、１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体を、２次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣを用いてサンプルを作製し、蛍光顕微鏡で観察した写真を示す図である。ＭＤＣＫ細胞にＥＲＧＩＣランダムライブラリーをトランスフェクトし、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で１０日間選択を行った後の細胞の観察を行った。
図１０は、ＭＡＣＳによる選別後の細胞を１次抗体に各種ビオチン標識レクチン、２次抗体にＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを用いて解析したヒストグラムを示す図である。黒線はコントロールのＭＤＣＫ細胞、赤線はＭＡＣＳ後の（−）画分、緑線は（＋）画分を示す。
図１１は、ＰＮＡレクチンを用いたＭＡＣＳにより分画したＭＤＣＫ細胞をＦＡＣＳにて解析したヒストグラムを示す図である。ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）のＰＮＡに対する結合強度を比較した。
図１２は、ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）について、５種類のビオチン標識レクチンを１次抗体、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼを２次抗体として用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す写真である。
図１３は、対照、ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、及びＰＮＡ２（＋）について、ＭＡＭ又はＰＮＡを１次抗体、ストレプトアビジンＦＩＴＣを２次抗体として用いてＦＡＣＳを行い、各細胞画分の糖結合特異性を解析した結果を示す図である。
図１４は、フローサイトメトリー又は磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）を利用して、標識したレクチンを用いて特定の糖鎖を有する細胞を分離する手法の概要を示す図である。
図１５は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用して、ＰＮＡレクチンと特異的に結合する糖鎖を有する細胞を分離し、濃縮する過程における、ＰＮＡレクチンに標識された蛍光の強度を示す図である。
図１６は、クローン１２及び対照ＣＨＯ細胞における改変ＶＩＰ３６とＰＮＡレクチンに認識される糖鎖の発現を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
〔実施例１〕ＶＩＰ３６ランダムライブラリーの作製
（１）プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＡｆｌＩＩ
本実施例においては、図２に示すようにＶＩＰ３６の糖鎖認識決定部位をコードしているｃＤＮＡ部分にランダム突然変異を導入するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って増幅されるｃＤＮＡ断片（ＶＩＰｔと呼ぶ。全長１４０７ヌクレオチドのうち４８１から１０７１までのヌクレオチド）にランダムに突然変異が導入された糖鎖認識決定部位が含まれるように、糖鎖認識決定部位をコードしているｃＤＮＡと重複するランダム化オリゴヌクレオチドとして、下記のプライマーを設計した。
ＶＩＰ３６ランダムライブラリーを構築するために下記の４つのプライマーを用いた（図２Ａ）。すなわち、ＶＩＰｒａｎ１：５’−ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＴＧ−３’（配列番号５：ヌクレオチドの５’末端に制限酵素認識決定部位ＨｉｎｃＩＩ：ＧＴＣ  ＧＡＣを含む）、ＶＩＰｒａｎ２：５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＴＡＡ  ＧＣＣ  ＧＴＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号６：５’末端にＸｂａＩ部位：ＴＣＴ  ＡＧＡを持つ）、ＶＩＰｒａｎ３：５’−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＡＡＴ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＴＡ−３’、（配列番号７：配列中、ＮはＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃの、ＫはＧ／Ｔの混合物であり、５’末端にＸｂａＩ部位を持つ）、及びＶＩＰｒａｎ５：５’−ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＴＴＧ−３’（配列番号８：５’末端にＢｆｒＩ部位：ＣＴＴ  ＡＡＧを持つ）。
ＶＩＰｒａｎ１及びＶＩＰｒａｎ２プライマーはＶＩＰ３６遺伝子の５’末端側半分（ＶＩＰｈ断片、全長１４０７のうち１３３−４８０ヌクレオチド）を構築するためのＰＣＲに用いた。最初に、プライマーを１０μｌのＶＩＰｒａｎ１（２μｇ／μｌ）、１０μｌのＶＩＰｒａｎ２（２μｇ／μｌ）、２μｌの１０×Ｋｉｎａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、１．５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、６μｌの水、１．５μｌのＴ４キナーゼの混合物中で、リン酸化した。溶液は３７℃で２時間保温した。ＰＣＲは、１．５μｌの各リン酸化プライマー、５μｌの１０×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、２μｌのＭｇＳＯ４（ＴＯＹＯＢＯ）、２μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、２μｌのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＶＩＰ３６（鋳型として、１０ｎｇ／μｌ）、３．５μｌの水、及び１μｌのＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）からなる反応溶液で行った。ＰＣＲプログラムはＰＣＲｅｘｐｒｅｓｓ（Ｈｙｂａｉｄ）又はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のいずれかで行い、９４℃２分間で開始、次いで９４℃２０秒、５２℃３０秒、６８℃１分間を３０サイクル行い、その後６８℃で５分間ホールドとした。
増幅されたＶＩＰｈ断片を１％アガロースゲル電気泳動によって回収し、次いでゲル抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）を行い、ＴＥバッファー中に保存した（図２Ｂ）。ＳｍａＩ消化に次いでアルカリホスファターゼ処理を行った後、ＶＩＰｈ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））と１５℃で一晩ライゲーションした。このように調製された混合物を、ヒートショック法によってＣａＣｌ２処理した大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、色で選抜するために５０μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−βガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）と４μｌのイソプロピル−１−チオ−βガラクトシド（ＩＰＴＧ）とともにＬＢ−Ａｍｐプレート上で一晩培養した。白色のコロニーを選抜し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下でのＬＢ培地（ＬＢ−Ａｍｐ培地）中で一晩培養した。Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、一晩培養した培地からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＴＥバッファー中に保存した。その後、ＰＢＳ−ＶＩＰｈベクターを、ＶＩＰｈ断片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＨｉｎｃＩＩ及びＮｏｔＩで消化して得た。消化したＶＩＰｈ断片（それぞれの末端がＨｉｎｃＩＩ及びＮｏｔＩで切断され３’末端にいくつかのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔヌクレオチドを持つＶＩＰｈ’）を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出し、ＴＥバッファー中に保存した。ＶＩＰｈ’断片を、ＨｐａＩ及びＮｏｔＩ（ＨｐａＩ部位及びＮｏｔＩ部位はそれぞれｆｌａｇタグ付きｐＲｃ／ＣＭＶ２に存在する）で消化されたｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇと１５℃で一晩ライゲーションした。ｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ（５６４１ｂｐ）は、ｆｌａｇ配列５’−ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＡＡＧ−３’（配列番号９）がｐＲｃ／ＣＭＶ２のＨｉｎｃＩＩ（５６４１ｂｐのうち１９８１塩基対）及びＨｐａＩ制限酵素認識部位の間に挿入された改変ｐＲｃ／ＣＭＶ２（カタログ番号Ｖ７５０−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ライゲーションされた混合物を大腸菌に形質転換し、３７℃で一晩ＬＢ−Ａｍｐ寒天プレート上で培養した。４つのコロニーを選抜し、それぞれ３７℃で一晩ＬＢ−Ａｍｐ培地中で培養した。その後、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて回収したｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈを配列決定した。
ｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈの配列決定は、０．７５μｌのｐＲｃ／ＣＭＶ２Ｆ（フォーワードダイプライマー）、０．７５μｌのｐＲｃ／ＣＭＶ２Ｒ（リバースダイプライマー）及び０．５μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌのＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（ｕｓｂ）、１μｌのＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ反応バッファー（ｕｓｂ）、１．５μｌのｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ及び１．５μｌの水を含む、全８．５μｌの溶液によるダイデオキシ法を適用した。その後、１６μｌの混合物をそれぞれ４つの０．２ｍｌチューブに加え、それぞれ同量（１６μｌ）のｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＤＰ、及びｄｄＣＴＰを加えた。ＰＣＲは混合液を用いて、標準的な方法によって、最初に９５℃５分間、次いで９４℃３０秒、５０℃３０秒、７０℃５０秒を３０サイクル行い、最後に７０℃にて５０秒間とした。
ＶＩＰｔランダム断片を挿入するために、ＡｆｌＩＩリンカーを構築した。ＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位（ＡｆｌＩＩリンカー）を持つオリゴＤＮＡ断片をプラスミドベクターに導入した場合には、ＶＩＰｈ及びＶＩＰｔ断片を順番に挿入することが可能となる。リンカーの２つの相補的なオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＣＧＧ  ＧＣＣ−３’（配列番号１０：ＡｆｌＩＩリンカー１）及び５’−ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  Ｔ−３’（配列番号１１：ＡｆｌＩＩリンカー２）とした。ＡｆｌＩＩリンカーには、５’及び３’末端のそれぞれに、ＸｂａＩ及びＡｐａＩ（ＧＧＧＣＣＣ）部位に適した粘着末端が形成された。
最初に、２０μｌのＡｆｌＩＩリンカー１、２０μｌのＡｆｌＩＩリンカー２及び０．５μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５の混合物を１００℃で煮沸し、その後、互いにアニーリングするよう、その温度が室温に達するまで冷却した。次に、ｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈベクターを適切な酵素によってＸｂａＩ及びＡｐａＩ制限酵素認識部位で消化し、その後、１％アガロースゲル電気泳動によってベクターを回収し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出を行った。その後、リンカーとｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ（ＶＩＰｈの３’末端のＸｂａＩ部位、及びｐＲｃ／ＣＭＶ２のＡｐａＩ部位で消化した）を以下のような組成でライゲーションした。すなわち、３μｌの３２ｎＭ  ｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ、３μｌの約１７２μＭ  ＡｆｌＩＩリンカー、６μｌのＴａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ）であった。ライゲーション混合物を１５℃で６時間又は一晩保温した。
その後、ライゲーション混合物を大腸菌細胞（ＪＭ１０９）に形質転換した。具体的には、４μｌの反応混合物を５０μｌのＣａＣｌ２処理した大腸菌に加え、事前に１５ｍｌチューブ中で冷却した。それを３０分間氷上に置き、次いで４２℃で１分間、振とうせずに保温した。直ちに氷上で２分間冷却した。形質転換した細胞を３７℃で１時間ＳＯＣ培地（１０ｍｌの２Ｍグルコースを添加したＳＯＢ培地：５００ｍｌ当たり、バクトトリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物２．５ｇ、ＮａＣｌ  ０．２９ｇ、ＫＣｌ  ０．０９ｇ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２＋１Ｍ  ＭｇＳＯ４の混合物１０ｍｌを含む）で培養した後、細胞をＬＢ−Ａｍｐプレートに塗布し、コロニーを成長させるために３７℃で一晩培養した。
４つのコロニーを選抜してＬＢ−Ａｍｐ培地で一晩培養し、次いでプラスミド抽出を行った。これらの４つのコロニーのうち、少なくとも１つのコロニーについて、ＡｆｌＩＩによる消化とそれに次ぐ電気泳動によって、プラスミドを包含することを確認した（図２Ｃ）。プラスミド（ｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＡｆｌＩＩ）を配列決定し、１００μｌのＴＥバッファー（３５０ｎｇ／μｌ）中に保存した。
（２）ＶＩＰｔのｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＡｆｌＩＩへの挿入
ＶＩＰｒａｎ３及びＶＩＰｒａｎ５プライマーはＶＩＰ３６遺伝子の３’末端側半分（ＶＩＰｔ断片、全長１４０７のうち４８１−１０７１ヌクレオチド、突然変異導入）を構築するためのＰＣＲに用いた（図２Ａ）。ＶＩＰｔ断片は、ランダムに変異したヌクレオチドを含むようにするため、ＰＣＲを行うために比較的厳密でない校正活性を持つＫＯＤ  ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を選択した。ランダムライブラリー構築のため大量で広い多様性を持つ変異ＶＩＰｔ断片が得られるよう、反応条件を最適化するために様々なＰＣＲ条件を試した。その結果、ランダム化プライマー（ＶＩＰｒａｎ３プライマー）の最適濃度は３０ｐｍｏｌ／μｌと決定した。これに対し、ＶＩＰｒａｎ５プライマーは、１０ｐｍｏｌ／μｌと決定した。特に、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含むＰＣＲを選択した。
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）ＤＮＡポリメラーゼをもまたＰＣＲ増幅のために使用し、最適化のための実験を行った。
ＶＩＰｔ断片（図２Ｂ）をＡｆｌＩＩ（断片の３’末端）及びＸｂａＩ（５’末端）で消化した。小さい消化断片を除去するため電気泳動し、その後ＶＩＰｔ断片を、ｐＲｃ／ＣＭＶ２−ＶＩＰｈ−ＡｆｌＩＩのＶＩＰｈの３’末端のＸｂａＩ部位及びＡｆｌＩＩリンカーのＡｆｌＩＩ部位が消化されたｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＡｆｌＩＩにライゲーションした（図２Ｄ）。ライゲーション溶液を１５℃で一晩保温した。制限酵素認識部位ＡｆｌＩＩは２つの理由から制限酵素ＢｆｒＩによって消化されることが重要であった。第一の理由は、それがＡｆｌＩＩ酵素と同じ配列を認識すること、第二の理由は、ＡｆｌＩＩ酵素によって消化された部位は低いライゲーション反応効率を生じることが製造メーカーによって報告されており、それはライブラリーの構築にとって重大であったからである。
大腸菌ＪＭ１０９への形質転換は、上述と同様に標準的な手法により行った。
ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＴＭＤＨ５α−ＥＴＭ細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：カタログ番号１１３１９−０１９）を用いたエレクトロポレーションも行った。エレクトロポレーションを行う前に、ライゲーション溶液を精製し、標準的な方法でエタノール沈殿によって濃縮した。また、１５ｍｌ試験管で１ｍｌのＳＯＣ培地を３７℃で前もって保温し、キュベットを氷上で冷却し、別の新しい１５ｍｌ中１μｌのｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＶＩＰｔ  ＤＮＡを氷上で冷却した。２０μｌのＤＨ５α−ＥＴＭ細胞をｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＶＩＰｔ  ＤＮＡを含む上記の試験管に添加した。２回穏やかにピペットで懸濁した後、プラスミドー大腸菌混合物を先に冷却しておいたキュベットに移した。その後、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（登録商標）６００（ＢＴＸ）によって２．４５ｋＶ及び１２９Ωの条件下でエレクトロポレーションを行った。上記の条件は、いくつかの電圧条件の簡単な試験の後に選択された。１．５、２．０及び２．４５ｋＶの電圧を試験した。直ちに（１分以内に）、１ｍｌの予め保温したＳＯＣ培地を添加し、穏やかに混合した。溶液を新しい１５ｍｌ試験管に移し、３７℃で１時間培養した。その後、１時間培養した溶液各１００μｌをＬＢ−Ａｍｐ寒天プレートに塗布した。プレートを３７℃で一晩培養した。形成されるコロニー数が１×１０６に達するまでエレクトロポレーションを繰り返した。いくつかのコロニーを配列決定のために選抜し、ｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＶＩＰｔのランダムな突然変異が導入されたかどうかを確認した（図３）。塩化カルシウム法とエレクトロポレーションの両方によって形質転換された、ベクターへの挿入断片の数は、ＸｂａＩ及びＢｆｒＩによる制限消化によって決定した。
（３）ＶＩＰ３６ランダムライブラリーの回収
まず最初に、５０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地をコロニーを培養しているＬＢ−Ａｍｐ寒天プレートに加えた。コンラージ棒（ＴＧＫ）を用いてコロニーを添加した培地と穏やかに混合することによって、コロニーを寒天から物理的に分離した。その後、懸濁液を新しい５０ｍｌチューブに移した。懸濁液はその後、細胞増殖のため更に培地を与えるために、ＬＢ−Ａｍｐ培地で５０ｍｌにそろえた。培地中の懸濁液は３７℃で一晩培養した。培養の間は空調に注意した。一晩培養した大腸菌懸濁液５００μｌを保存用として回収し、−８０℃で１７％グリセロール中に保存した。上記の方法を各々の寒天プレートについて行った。懸濁液からプラスミドを抽出するために、１０枚の異なる寒天プレート由来の懸濁液を一緒に適切な量混合した。各プレートから混合する懸濁液の量は、各プレートのコロニー数の比率によって決定した。これは特定の突然変異を持つＶＩＰ３６  ＤＮＡが他のものより優勢になることを避けるためである。混合物からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔによってプラスミドを回収し、１００μｌのバッファー中で保存した。その後、プラスミド（ランダム化されたＶＩＰｔの糖鎖認識部位を有すると推定されるｐＲｃ／ＣＭＶ２−ｆｌａｇ−ＶＩＰｈ−ＶＩＰｔの混合物）を３２本の１５ｍｌチューブにプールし、以後の実験に使用した。
プラスミドに導入されたインサートを調べるために、数個のコロニーを拾い上げ、大腸菌細胞から抽出されたプラスミドをＸｂａＩ及びＢｆｒＩで消化した。培養された総コロニー数の少ないプレート（通常４０〜２００コロニー）では、調べた１２のうち１０コロニー（８３％）が目的のプラスミドを含んだのに対して、総コロニー数の多いプレート（１０００〜６０００コロニー）では、６のうち４コロニー（６７％）が目的のプラスミドを持っていた。従って、概算されたライブラリーのサイズは、８×１０５、又は６×１０５であった。ランダムに突然変異させた糖鎖認識部位をコードする遺伝子は、配列解析によって確認した（図３）。
〔実施例２〕細胞へのトランスフェクション
（１）ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭによる安定なトランスフェクション
実施例１において構築されたＶＩＰ３６ライブラリーは、３２本の１５ｍｌチューブに保存されているため、まず、３２本の個別のプールに別々に保存されているライブラリー溶液の一部を混合することによって、ＴＥバッファー１１７．４μｌ中にプラスミドを調製した。混合する溶液の割合は、各ライブラリープールに含まれる個々のクローンの規模に従って決定した。この計算は、ランダム化された糖鎖認識部位（ＣＲＤ）の多様性を等しく保つようにした。具体的には、５００クローン規模のライブラリーから２．５μｌ（０．５μｌ×５チューブ）、６０００クローン規模のライブラリーから５．４μｌ（０．６μｌ×９）、１０００クローン規模のライブラリーから０．１μｌ（０．１μｌ×１）、１×１０４クローン規模のライブラリーから１．０μｌ（１μｌ×１）、６×１０４クローン規模のライブラリーから６６．０μｌ（６μｌ×１１）、１．５×１０４クローン規模のライブラリーから１．５μｌ（１．５μｌ×１）が、８×１０４クローン規模のライブラリーから３２．０μｌ（８μｌ×４）を分取した。
上述のように調製したプラスミド（ＶＩＰ３６ｍｉｘと称する）をＢｇｌＩＩによる消化によって直鎖状にし、３７℃で一晩保温した。その後、直鎖状にしたＶＩＰ３６ｍｉｘを１％アガロースゲル電気泳動し、ゲルから抽出した。消化後のＤＮＡ濃度は４７５ｎｇ／μｌであった。
トランスフェクション当日に８０〜９０％コンフルエントとなるよう、トランスフェクションの１日前に、Ｍａｒｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ細胞；ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−３４）を継代培養した。
製造メーカーによって提供された手順に従って、ＶＩＰ３６ｍｉｘプラスミドをＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。４μｇ（すなわち、８．４２μｌ）のＶＩＰ３６ｍｉｘを１５ｍｌチューブに加えた。その後、３００μｌのＥＣバッファー（ＱＩＡＧＥＮ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬のキットに添付されている）を加え、ボルテックスミキサーを用いて１秒間だけ穏やかに混和した。その混合物を室温に４分間静置した。上記の混合物に４８μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を加え、１０秒間穏やかにボルテックスにかけた。その混合物を再度室温で９分間静置した。ＤＮＡ調製の間に、Ｄ１０培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及びペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）をデカンテーションし、プラスチックディッシュ（φ１００ｍｍ）中で培養したＭＤＣＫ細胞を５ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄した。その細胞を７ｍｌの新しいＤ１０培地に懸濁した。他方のチューブ内で、３ｍｌのＤ１０培地を上述のように調製したＤＮＡ−試薬混合物に加え、２回のピペッティングによって穏やかに混和した。その混合物を、直ちに、上記で準備したＭＤＣＫ細胞に一滴ずつ滴下した。その細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で２日間３７℃で培養した後、Ｄ１０培地を新しく取りかえ、うまくトランスフェクトされた細胞を選択するために、Ｇ４１８を添加した（最終濃度２．０ｍｇ／ｍｌ）。ネオマイシン耐性細胞が増殖するまで、細胞を１４日間静置した。ｐＲｃ／ＣＭＶ２ベクターは、うまくトランスフェクトされた時に発現するネオマイシン耐性遺伝子を持っていた。トランスフェクションから１４日後、２．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で、約１００のコロニーが形成された。
（２）ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ２０００による安定なトランスフェクション
等量のＶＩＰ３６ｍｉｘを上述のようにして調製した。トランスフェクションを行う際に９５％コンフルエント以上になるよう、トランスフェクションの２日前に細胞を準備した。細胞は１０ｍｌのＤ１０培地中で培養した。
トランスフェクション当日、２４μｇのＶＩＰ３６ｍｉｘ  ＤＮＡ（すなわち、５５μｌの４３９μｇ／μｌ  ＤＮＡ）を１５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に希釈した。同時に、別の１５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地に７５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、室温に５分間静置した。その後、別々の培地中のＶＩＰ３６ｍｉｘ  ＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ２０００試薬との両方を混合し、室温に３０分間静置した。ＶＩＰ３６ｍｉｘＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ２０００試薬が複合体を形成している間に、ＭＤＣＫ細胞を５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１３ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地を加えた。用意ができたら、３ｍｌのＶＩＰ３６ｍｉｘ  ＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ２０００試薬の混合物を、直接、ＭＤＣＫ細胞に一滴ずつ添加した。プレートを前後に振とうした。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間３７℃で培養した。
２４時間の培養後、ＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地を除去し、２つのφ１５０ｍｍディッシュに、Ｄ１０培地２２．５ｍｌで、標準的な継代培養法を用いて継代培養した。２４時間後、２つの１５ｃｍディッシュにＧ４１８を添加した（最終濃度２．０ｍｇ／ｍｌ）。Ｇ４１８耐性細胞を増殖させるため、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で１０日間３７℃で培養した。トランスフェクションから１０日後、２．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で、細胞は約８０％コンフルエントであった。
（３）蛍光顕微鏡による変異ＶＩＰ３６の観察
ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクション率を推定するために、蛍光顕微鏡のためのサンプルを作製した。マイクロカバーグラス（１８×１８ｍｍ、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を１００％エタノール及びガスバーナーによって滅菌し、細胞を培養する前に、６ウェルプレートの各ウェルの底に置いた。サンプルあたり４×１０４細胞を６ウェルプレート中で２４時間培養した後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。その後、細胞を固定するために、ＰＢＳ中４．０％のホルムアルデヒドを１ｍｌ添加し、室温に１時間静置した。固定された細胞をＰＢＳで１回洗浄し、抗体が細胞膜から浸透して細胞内の抗原に結合できるよう、それらをＰＢＳ中０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）１ｍｌで処理した。その後、細胞を２０分間室温で静置し、続いて、ＰＢＳによる５分間の洗浄を３回行った。次に、ＰＢＳ中５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｌを添加することによってブロッキングを行い、室温に１５分間静置した。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄した。カバーグラス周囲のＰＢＳを拭き取った後、３ｍｇ／ｍｌ抗ｆｌａｇ  Ｍ２抗体（ＩＢＩ）から調製した５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中の抗ｆｌａｇ抗体（２μｇ／ｍｌ）２００μｌを、観察のために細胞を培養したカバーグラスに重層した。抗ｆｌａｇ抗体を変異ＶＩＰ３６のｆｌａｇタグに結合させるため、細胞を１時間室温に置いた。１０分間３回洗浄し、上述のようにブロッキングを行った。次に、ＰＢＳで５分間３回洗浄し、２００μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗マウスＩｇＧ１（ＧＡＭ−ＦＩＴＣ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製；１０μｇ／ｍｌ）をカバーグラスに重層し、ＧＡＭ−ＦＩＴＣを抗ｆｌａｇ抗体に結合させるため、１時間室温で静置した。その後、細胞をＰＢＳで１０分間３回洗浄した。最後に、マイクロスライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）に、３μｌの１００ｍＭ  ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）及び３μｌのＳｌｏｗｆａｄｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の成分Ａ（グリセロールバッファー中の退色防止剤）を添加し、作製したカバーグラスを、細胞培養面をスライドグラスに伏せて、スライドグラス上に置いた。サンプルはマニキュア（Ｋａｎｅｂｏ）によって密閉し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５２、図４Ａ〜Ｆ）で観察した。
顕微鏡で捉えられた細胞のうち、７９２細胞中５０細胞（６．３％）が変異ＶＩＰ３６を過剰発現したことが示された。従って、推定トランスフェクト細胞数は２．０×１０６細胞あたり１．２６×１０５細胞であった。２．０×１０６という数は、φ１００ｍｍディッシュ上のコンフルエント細胞を２〜３回数えることによって得られた。位相差像（図４Ａ又はＤ）、蛍光像（図４Ｂ又はＥ）及び両者を重ねた像（図４Ｃ又はＦ）の中の代表的な写真を、トランスフェクト細胞及び野生型ＭＤＣＫ細胞それぞれに対して示す。
〔実施例３〕糖鎖に基づくトランスフェクト細胞の分離
（１）植物レクチン
細胞表面に現れるオリゴ糖の独特の構造に基づいてトランスフェクトＭＤＣＫ細胞を分離するために、いくつかの植物レクチンを用いた。様々なタイプのオリゴ糖を区別するために、１０種類の植物レクチンを用いた。用いられたレクチンの糖質特異性は、上記表１に示すように正確に解析されている。
レクチンに結合した細胞をストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ストレプトアビジンと結合したコロイド状常磁性マイクロビーズ）によって認識できるように、ビオチン化レクチン（Ｈｏｎｅｎ  Ｃｏ．）を選択した。用いたレクチンは、ＡＢＡレクチン、ＣｏｎＡレクチン、ＤＳＡレクチン、ＬＣＡレクチン、Ｌｏｔｕｓレクチン、ＭＡＭレクチン、ホモ四量体Ｅ−サブユニットを持つＰＨＡ−Ｅ４レクチン、ホモ四量体Ｌ−サブユニットを持つＰＨＡ−Ｌ４レクチン、ＲＣＡ１２０レクチン、及びＷＧＡレクチンとした。数ある中からこれらのレクチンを選択したのは、これらのほとんどがＮ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖を認識することが知られているからであった。Ｎ−結合型オリゴ糖は本来のＶＩＰ３６レクチンによって認識されると考えられた。磁気細胞分離法のために、１ｍｇ／ｍｌのレクチンをＰＢＳで希釈し（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、２５ｍＭ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター０．２μｍ（Ｐａｌｌ  Ｃｏ．）を用いて濾過滅菌した。
（２）変異ＶＩＰ３６トランスフェクトＭＤＣＫ細胞の磁気細胞分離法
細胞表面に提示される糖質に基づいて細胞を回収するために、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、すなわち磁気で標識した細胞を標識されていない細胞と分離するシステムを選択した。ＭｉｎｉＭＡＣＳ、細胞及び高分子の分離のためのＭＡＣＳ分離装置は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから購入した。ＭｉｎｉＭＡＣＳは、１０７個の磁気標識細胞までの分離に適しており、ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離ユニット、ＭＡＣＳマルチスタンド、及びＭＳカラムを一式を包含する。ビオチン化レクチン結合細胞の間接的な標識のために、ストレプトアビジンマイクロビーズ（ストレプトアビジンと結合したコロイド状常磁性マイクロビーズ）を用いた。
この実験に用いたバッファーは、製造メーカーによって記載されている、標識バッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＰＢＳ）及び分離バッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ）とした。両バッファーは、２５ｍＭ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター０．２μｍを用いて濾過滅菌した。φ１００ｍｍディッシュで培養した細胞を懸濁するために、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ又はトリプシン−ＥＤＴＡを用いた。
分離の当日に約８０〜９０％コンフルエントになるよう、分離の１日前に、変異ＶＩＰ３６トランスフェクトＭＤＣＫ細胞を増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ又はＰＢＳ−ＥＤＴＡのいずれかで２０分間処理した。回収した後、細胞数を数えるため、細胞を２ｍｌのＤ１０培地に懸濁した。１９Ｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心した後（以下のすべての遠心分離において同一の遠心条件を適用した）、細胞を１０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。再度遠心し、その後、細胞を１５ｍｌのレクチン溶液（５μｌ／ｍｌ）に希釈した。氷上に３０分間置いた後、レクチン結合細胞を遠心分離によって回収した。上清は、注意深く完全に吸引した。２次抗体の結合を最大限にするため、細胞の洗浄のために、３００μｌ（又は１ｍｌ）のラベリングバッファーを加えた。細胞は２回洗浄した。ビオチン化レクチンを結合させるために、１０μｌのストレプトアビジンマイクロビーズを加えた。溶液をよく混合し８℃で１５分間静置した。その後、マイクロビーズ結合細胞を遠心分離によって回収して、５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、以下の分離のために氷上に静置した。
分離過程を始める前に、ＭＡＣＳマルチスタンドに付いているＭｉｎｉＭＡＣＳ分離ユニットにＭＳカラムを用意し、両方を７０％エタノールで滅菌した。
細胞を分離するために、初めに５００μｌの分離バッファーを添加したＭＳカラムを用意した。その後、５００μｌの分離バッファー中のマイクロビーズ結合細胞をカラムに添加した。添加した溶液は自然流出によって通過させた。陰性細胞を含む通過画分を１５ｍｌチューブに採取した。カラムを５００μｌの分離バッファーで３回洗浄した。洗浄過程においてカラムを通過した分離バッファーもまた、同じ１５ｍｌチューブに回収した。その後、陽性細胞の回収のため、ＭＳカラムをＭＡＣＳマルチスタンドから移動させた。１ｍｌの分離バッファーの添加によって、カラム中の陽性細胞を新しい１５ｍｌチューブに採取し、続いて直ちに、製造メーカーによって提供されたプランジャーを用いて陽性細胞を完全に洗い出した。陽性及び陰性の採取細胞は、血球計算板（Ｅｒｍａ）によって数え、その結果を表２Ａ及びＢに示す。表中、トランスフェクトＭＤＣＫ（Ａ）及び（Ｂ）の欄に記載の数値は、それぞれ独立して（２回）トランスフェクションを行った結果である。
2004016789.tif 000005
上述のすべての手順を、検査される１０種類のレクチン、すなわち、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ４、ＷＧＡ、ＡＢＡ、ＰＨＡ−Ｌ４、ＭＡＭ、ＲＣＡ１２０、Ｌｏｔｕｓ及びＤＳＡレクチンの各々に適用した。これらのうち初めの７種類のレクチンに対しては、実験は独立に２回行った。
分離された細胞は、レクチン陽性又はレクチン陰性分画として回収した。陽性と陰性の両分画で回収された細胞の数を血球計算板（表２Ａ）で数え、分離の比率は表２Ｂに示した。計算された比率は、１回目の実験におけるＰＨＡ−Ｅ４の分離比は２回目で逆になることを示した（表２Ｂの３列目）。ＭＡＭによる陽性分画の比率は、２回目の実験では回収された全細胞の４５．５％から１．７％にまで減少した（表２Ｂの８列目）。野生型ＭＤＣＫの分離比と比較すると、Ｌｏｔｕｓによる陽性分画は、トランスフェクト細胞及び野生型ＭＤＣＫ細胞表面の分離において、回収された全細胞の２．９％及び３．９％という結果であった（表２Ｂの下から２列目）。これは、フコース残基が細胞上にほとんど現れていないことを示唆する可能性がある。ＤＳＡレクチンによる分離は、陽性に回収されたトランスフェクト細胞が野生型のものより少ないことを示している（表２Ｂの最下列）。
１回目の実験が行われた時（表２Ａ及びＢ中の（Ａ）の結果）、ＰＨＡ−Ｅ４レクチンは全回収分の３．５％を共有した陽性分画として選ばれた。陽性分画の糖質の特異性はまた、フローサイトメトリー解析（実施例４参照）によっても観察された。
（３）ＰＨＡ−Ｅ４及びＷＧＡ陽性トランスフェクト細胞の多重磁気細胞分離法
上記（２）の分離法よりも更に大規模に各細胞グループを分離するために、２つのグループの変異ＶＩＰ３６トランスフェクトＭＤＣＫ細胞を２回目、３回目の磁気細胞分離法に進めた。選択したトランスフェクト細胞の１つのグループはＰＨＡ−Ｅ４レクチン陽性細胞であり、他方はＷＧＡ陰性細胞であった。これらの２つの細胞グループを、上述の手順で３回、ＭｉｎｉＭＡＣＳによる分離にかけ、前者は陽性細胞の後者は陰性細胞のそれぞれ濃縮を行った。同様に、３回の磁気細胞分離を行った。細胞グループの両方を血球計算板によって数えた（表３）。
2004016789.tif 000006
（４）野生型ＭＤＣＫ細胞の磁気細胞分離法
野生型のＭＤＣＫ細胞を上述の手順によってＭｉｎｉＭＡＣＳで調べた。細胞は上述のように数え、表２に示した。使用したビオチン化レクチンは、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ４、ＷＧＡ、ＡＢＡ、ＰＨＡ−Ｌ４、ＭＡＭ、Ｌｏｔｕｓ及びＤＳＡレクチンであった。
〔実施例４〕フローサイトメトリーによる細胞表面の糖鎖解析
（１）トランスフェクト及び野生型ＭＤＣＫ細胞の両分離細胞のフローサイトメトリー
本実施例では、変異ＶＩＰ３６遺伝子の過剰発現に伴う細胞の糖鎖構造を研究するため、フローサイトメトリー解析を行った。ビオチン化レクチンとそれに次ぐストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した細胞の蛍光強度を測定し、ヒストグラムに記録した。ＭｉｎｉＭＡＣＳによって、１回目、２回目又は３回目に陽性に分離されたトランスフェクト細胞、及び１回目、２回目又は３回目に陰性に分離されたトランスフェクト細胞を解析した。ＭｉｎｉＭＡＣＳによって陽性又は陰性に分離された２つのグループの野生型ＭＤＣＫ細胞もまた、これらのトランスフェクト細胞と比較するために解析した。ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離によって調製した、合計５３個の独立したＭＤＣＫ細胞グループを用いた。各レクチン（９種類のレクチン；ＡＢＡ、ＣｏｎＡ、ＤＳＡ、ＬＣＡ、Ｌｏｔｕｓ、ＭＡＭ、ＰＨＡ−Ｅ４、及びＷＧＡ）に対して、トランスフェクト細胞と野生型ＭＤＣＫ細胞との両方（２つの細胞型）の、レクチン陽性及び陰性グループ（２つのグループ）の小計が３６グループとなった。多重磁気分離法によって得られた濃縮細胞グループの小計は８グループであった。９種類のレクチンに対する対照ＭＤＣＫ細胞の小計が９グループとなった。
解析時に細胞がコンフルエントに達しないよう、フローサイトメトリー解析の前日、各グループのＭＤＣＫ細胞を６ｃｍディッシュにおいて４ｍｌのＤ１０培地中で培養した。
解析の当日、各ディッシュの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃３０分間、５００μｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ（又はトリプシン−ＥＤＴＡ）で処理した。懸濁した２５０μｌの細胞を９６ウェルプレートに移し、５１Ｇ（１８００ｒｐｍ）で１分間遠心した（以下のすべての遠心分離において同一の遠心条件を適用した）。その後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファー（０．１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））で洗浄した。１次染色のため、５０μｌの各レクチン（１０μｇ／ｍｌ）を各々の適切なウェルに添加し、氷上に３０分間静置した。レクチン結合反応後、１００又は２００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、遠心及びデカンテーションを３回行った。雑菌混入を避けるため、ＦＡＣＳバッファーのデカンテーションは慎重に素早く９６ウェルプレートを転倒することによって行った。２次抗体の結合は、５０μｌのストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（２０μｇ／ｍｌ）の添加と氷上での正確に３０分間の静置によって行った。１５０又は２００μｌのＦＡＣＳバッファーによる洗浄の後、各細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、１．２ｍｌチューブ（Ｍａｒｓｈ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に移した。３μｇ／ｍｌのヨードプロピジウム（ＰＩ，Ｓｉｇｍａ）１００μｌの添加後、細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）によって解析した。コンピューターによるデータ解析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）プログラムを用いて行った。結果を図５及び６に示す。
変異ＶＩＰ３６トランスフェクト細胞の場合には、大部分の分離細胞は、１回目の実験に対する分離比に有意差を示さなかった。この結果は、同じレクチンを用いたフローサイトメトリー解析によって裏付けられた（図５）。本実施例においては、上記表３から陰性と陽性の細胞の割合に差がわずかしかないレクチンに関してはＭＡＣＳを用いた細胞の選別は非常に良好とはいえなかったため、実施例１２に記載するようにＦＡＣＳを利用したところ、細胞を良好に選別することができた。しかし、ＭＡＣＳを用いた場合でもＰＨＡ−Ｅ４＋及びＴＦＰＨＡ−Ｅ４−細胞は明らかに固有の分離比で分離した。測定した相対的蛍光強度の平均直は、ＴＦＰＨＡ−Ｅ４＋で１７８６．００、ＴＦＰＨＡ−Ｅ４−で６４９．３０であった。一方、野生型ではそれぞれ、１０３４．２０及び１１２７．６８であった。非分離野生型ＭＤＣＫ細胞の平均値は８５２．７６であった。本明細書中、「ＴＦ」とはトランスフェクトした細胞から分取したものを表す。ＴＦＰＨＡ−Ｅ４＋及びＴＦＰＨＡ−Ｅ４−細胞の両方は更にＭｉｎｉＭＡＣＳ分離によって濃縮し、フローサイトメトリーによって解析した。結果は、ＴＦＰＨＡ−Ｅ４＋＋（２回のＭｉｎｉＭＡＣＳ分離後回収された陽性細胞、同一の省略形を以下に適用する）及びＴＦＰＨＡ−Ｅ４−−の平均値が、それぞれ１１３５及び６６０であることが示された（図６）。
（２）ＰＢＳ−ＥＤＴＡ又はトリプシン−ＥＤＴＡ処理の影響
細胞を１次染色のために懸濁する際、細胞表面の糖鎖形成へのトリプシンの影響を調べるために、２つの独立の野生型ＭＤＣＫ細胞グループをそれぞれＰＢＳ−ＥＤＴＡ又はトリプシン−ＥＤＴＡで処理した。フローサイトメトリーの手順は上記（１）と同様に行った。結果を図７に示す。
用いられた９つのレクチンのうち８つのレクチンは結合親和性において有意差を示さなかったが、一方、Ｌｏｔｕｓレクチンで染色された細胞はトリプシン処理された細胞により高い結合親和性を示した（図７）。加えて、トリプシン処理した細胞はＰＩでほとんど染色されず、大部分の細胞が実験中に死ななかったことを示唆している（図７の右下枠内）。
上記実施例１〜４においては、分泌経路において糖タンパク質輸送を担うＶＩＰ３６にランダム突然変異を導入することによって、細胞表面の糖鎖形成を改変する実験を行った。
フローサイトメトリー解析でのレクチンの使用によって、ＭＤＣＫ細胞は高度に多様なオリゴ糖を持つことが示された。ＰＨＡ−Ｅ４レクチンによって分離されたトランスフェクトＭＤＣＫ細胞は明らかにレクチン結合活性に有意差を示し、レクチンによる選択を繰り返すことにより特定の糖鎖に対する特異性が増強した細胞のクローンを濃縮可能であることが示された。
〔実施例５〕ＥＲＧＩＣ−５３のためのランダム変異導入用ＰＣＲプライマーの設計
ＥＲＧＩＣ−５３の推定糖鎖認識決定部位にランダムな改変を導入するにあたって、実施例１に記載のＶＩＰ３６の場合と同様に二段階に分けて行うＰＣＲ法を用いることとした。図８が、設計したプライマーとＥＲＧＩＣ−５３との相関図である。▲３▼は推定糖鎖認識決定部位をランダマイズするランダムプライマーとして設計した。▲１▼と▲２▼のプライマーを用い、ＥＲＧＩＣ−５３を鋳型としてＰＣＲを行い、生成されるＤＮＡフラグメント（ＥＲＧＩＣ−５３の糖鎖認識決定部位を含まない前半部分、以下ＥＲＧＩＣ−Ｆと呼ぶ）をｐＲＣ−ＣＭＶ２−ＣＤ８−ＦＬＡＧ（ｐＲＣ−ＣＭＶ２にＣＤ８のシグナル配列とＦＬＡＧタグを付けたベクター）に組み込む。その後、▲３▼のランダムプライマーと▲４▼のプライマーを用い、ＥＲＧＩＣ−５３を鋳型としてＰＣＲを行うことにより生成されるＤＮＡフラグメント（ＥＲＧＩＣ−５３の糖鎖認識決定部位を含む後半部分、以下ＥＲＧＩＣ−Ｂ−ｒａｎｄｏｍと呼ぶ）をＥＲＧＩＣ−Ｆが挿入されているｐＲＣ−ＣＭＶ２−ＣＤ８−ＦＬＡＧに導入する、という手法でＥＲＧＩＣ−５３ランダムライブラリーを作製した。この手法においてランダム変異導入した部位はＰＣＲで増幅されることはないため、片寄りなく多種の変異を導入することが可能である。
作製したプライマーの名称及び塩基配列は、以下の通りである：
▲１▼ＥＲＧＩＣ−ＦＦ（下線部分はＨｉｎｃＩＩサイト）
2004016789.tif 000007
▲２▼ＥＲＧＩＣ−ＦＲ（下線部分はＸｂａＩサイト）
2004016789.tif 000008
▲３▼ＥＲＧＩＣ−ＢＦ（下線部分はＸｂａＩサイト、ＫはＧ若しくはＴ、ＸはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかに相当する）
2004016789.tif 000009
2004016789.tif 000010
▲４▼ＥＲＧＩＣ−ＢＲ（下線部分はＢｆｒＩサイト）
2004016789.tif 000011
〔実施例６〕ＥＲＧＩＣ−５３ランダムライブラリーの作製
（１）プラスミドｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｆの作製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込まれたＥＲＧＩＣ−５３を鋳型としてＰＣＲ法を行い、ＥＲＧＩＣ−５３の糖鎖認識部位を含まない前半部分、ＥＲＧＩＣ−Ｆの遺伝子の増幅を行った。プライマーは、上記実施例５で設計したものを用い、フォーワードプライマーにはＥＲＧＩＣ−ＦＦ、リバースプライマーにはＥＲＧＩＣ−ＦＲを用いた。ＰＣＲ反応液は、フォーワードプライマーＥＲＧＩＣ−ＦＦ２μｌ、リバースプライマーＥＲＧＩＣ−ＦＲ２μｌ、テンプレートＥＲＧＩＣ−５３（１ｎｇ／μｌ）２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ＴＯＹＯＢＯ）３．２μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ）４μｌ、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＤＤ−ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ）４μｌ、ＫＤＤ−ＰＬＵＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）０．８μｌ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水２２μｌを混合したものである。ＰＣＲ反応は、９４℃にて２分間、（９４℃にて１５秒、５２℃にて３０秒、及び６８℃にて１分間）×３０サイクル、６８℃にて７分間の条件で行った。なお、両プライマーはあらかじめリン酸化しておいたものを用いた。ＰＣＲ産物から、１％アガロースゲルを用いた電気泳動（Ｍｕｐｉｄ−２１ミニゲル泳動槽：コスモバイオ株式会社）により目的のフラグメントＥＲＧＩＣ−Ｆを分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）で精製したものをインサートフラグメントとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）をＳｍａＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で制限酵素処理し、これを脱リン酸化（大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）処理）した後、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出し、エタノール沈殿して得たものをベクターとして使用した。
上記ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ＳｍａＩカット済と、インサートＤＮＡフラグメントＥＲＧＩＣ−Ｆをモル比１：１０の割合で混ぜ、ライゲーションを行った。ライゲーション後の反応液を、ＣａＣｌ２法によりコンピテントセルＪＭ１０９に形質転換（トランスフォーメーション）し、ＬＢ−Ａｍｐプレートにまいた。
プレートに生えてきた青と白のコロニーのうち、白色のコロニーのみを数個選んでＬＢ液体培地３ｍｌ（終濃度１００μｇ／ｍｌアンピシリン入り）で終夜培養し、アルカリプレップ法によりプラスミドを抽出した。これに対してインサートチェックを行った結果、インサートＤＮＡフラグメントがベクターに入っていることが分かったコロニーに対し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて再度プラスミド抽出を行い、ＤＮＡシークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ）にてインサートＤＮＡフラグメントの配列を確認した。
得られたＤＮＡフラグメント６個中３個は正しい塩基配列であることが確認できた。そのうちの１つを、本実施例において得ることを目指したベクターとし、以降の実験に用いた。
正しい配列のインサートＤＮＡフラグメントがベクターに入っているプラスミドを選択し、ＨｉｎｃＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）とＸｂａＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で制限酵素処理した後、１％アガロースゲルに電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて目的のＤＮＡフラグメントＥＲＧＩＣ−Ｆを精製した。
ＲＣ−ＣＭＶ２−ＣＤ８−ＦＬＡＧ（ｐＲＣ−ＣＭＶ２にＣＤ８のシグナル配列とＦＬＡＧタグを付けたベクター）をＨｐａＩ（ＴＯＹＯＢＯ）とＸｂａＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で制限酵素処理した後、１％アガロースゲルに電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。
前述のベクターｐＲＣ−ＣＭＶ２−ＣＤ８−ＦＬＡＧ（ＨｐａＩ、ＸｂａＩカット済）と、上記ＤＮＡフラグメントＥＲＧＩＣ−Ｆをモル比１：１０の割合で混ぜ、ライゲーションを行った。ライゲーション後の反応液を、ＣａＣｌ２法によりコンピテントセルＪＭ１０９に形質転換（トランスフォーメーション）し、ＬＢ−Ａｍｐプレートにまいた。
プレートに生えてきたコロニーのうち数個を選び、コロニーＰＣＲ法によりインサートチェックを行った。その結果インサートが入っていることが分かったものが、ベクターｐＲＣ−ＣＭＶ２−ＣＤ８−ＦＬＡＧにＥＲＧＩＣ−Ｆが組み込まれた目的物であった。これを今後ｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｆと呼ぶことにした。以降の実験に用いるために、ｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−ＦをＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。また、ｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｆのグリセロールストックを作製し、−８０℃の冷蔵庫で保管した。
（２）ｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｒａｎｄｏｍの作製
上記（１）に記載の方法と同様に、ＥＲＧＩＣ−５３を鋳型としたＰＣＲ法を行って、ＥＲＧＩＣ−５３の糖鎖認識部位を含む後半部分、ＥＲＧＩＣ−Ｂランダムの遺伝子を増幅した。フォーワードプライマーにはＥＲＧＩＣ−ＢＦ、リバースプライマーにはＥＲＧＩＣ−ＢＲを用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃にて２分間、（９４℃にて１５秒、５４℃にて３０秒、及び６８℃にて１分間）×３０サイクル、６８℃にて７分間の条件で行った。
目的のフラグメントＥＲＧＩＣ−Ｂランダムを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。
この後、ＸｂａＩ（ＴＯＹＯＢＯ）とＢｆｒＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で制限酵素処理し、１％アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これをインサートＤＮＡフラグメントとした。
上記（１）において作製したベクターｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｆを、ＸｂａＩ（ＴＯＹＯＢＯ）とＢｆｒＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で制限酵素処理し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動により目的のフラグメントを分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。以降、これをベクターとして用いた。
前述のベクターｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｆ（ＸｂａＩ、ＢｆｒＩカット済）と、インサートＤＮＡフラグメントＥＲＧＩＣ−Ｂ−ｒａｎｄｏｍをモル比１：６の割合で混ぜ、ライゲーションを行った。ライゲーション後の反応液を、ＣａＣｌ２法によりコンピテントセルＪＭ１０９に形質転換（トランスフォーメーション）し、ＬＢ−Ａｍｐプレートにまいた。
プレートに生えてきたコロニーから２４個を無作為に選択し、３ｍｌのＬＢ液体培地（終濃度１００μｇ／μｌになるようにアンピシリンを添加）中で終夜培養し、アルカリプレップ法によりプラスミド抽出を行った。その後、ＡｐａＩ（ＴＯＹＯＢＯ）とＨｉｎｄＩＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）の２つの制限酵素でプラスミドを切断し、１％アガロースゲルで電気泳動することによりインサートチェックを行った。選択した２４個中２１個にインサートが入っていた。
インサートチェックの結果、インサートＤＮＡフラグメント（ＥＲＧＩＣ−Ｂランダム）がきちんと入っていたものに対して、再度プラスミド抽出（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）使用）を行った。ｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｆに導入されたインサートＤＮＡフラグメント（ＥＲＧＩＣ−Ｂ−ｒａｎｄｏｍ）の部分に対し、ＰＣＲによるランダマイズが確実に行われているかを確認するためにＤＮＡシークエンス解析を行った。今回解析したいＤＮＡ塩基配列はＥＲＧＩＣ−５３の推定糖鎖認識決定部位であり、９アミノ酸分と短いものであったので、ＡＢＩシークエンサーで解析した。配列解析の結果、全てのプラスミドの推定糖鎖認識決定部位の塩基配列が異なっていた。
（３）ＥＲＧＩＣ−５３ランダムライブラリーの構築
上記（２）においてｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｒａｎｄｏｍ、正確には推定糖鎖認識決定部位にランダム変異が導入されたＥＲＧＩＣ−５３が、ベクターｐＲＣ−ＣＭＶ２−ＣＤ８−ＦＬＡＧに組み込まれたもの、を作製した。推定糖鎖認識決定部位の９アミノ（ＤＴＦＤＮＤＧＫＫ）のうち７アミノ酸をランダマイズ（ＤＸＸＸＮＸＸＸＸ、Ｘは任意のアミノ酸を表す）したが、本発明においてはこの推定糖鎖認識決定部位に種々のアミノ酸を持つものを多数作る必要があった。そこで、ｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｒａｎｄｏｍライブラリーを作製した。なお、以降このライブラリーを、ＥＲＧＩＣランダムライブラリーと呼ぶこととした。
（３−１）ＥＲＧＩＣランダムライブラリー作製にあたっての条件検討
上記（１）で作製したベクターｐＲＣ／ＥＲＧＩＣ−Ｆと上記（２）で作製したインサートＤＮＡフラグメントＥＲＧＩＣ−Ｂ−ｒａｎｄｏｍをライゲーションする時に、ベクター：インサートのモル比を１：２、１：３、１：６、及び１：１０と４段階に設定し、コンピテントセルＪＭ１０９に形質転換（トランスフォーメーション）した。なお、ベクター（約６Ｋｂ）は２６５ｎｇ／μｌ、インサート（約１Ｋｂ）は５２０ｎｇ／μｌの濃度のものを使用した。
形質転換時に、コンピテントセルに入れるライゲーション後のＤＮＡの量を、コンピテントセル５０μｌに対し、２μｌ、３μｌ、５μｌと変更した。
形質転換に用いるコンピテントセルを、ＪＭ１０９とＤＨ５αの２種類用いて、効率の比較を行った（両方ともＣａＣｌ２法のコンピテントセルである）。なお、ライゲーション時のベクター：インサートのモル比は１：６で行った。
実験の結果、コロニーが生えてきた個数は、ベクター：インサートが１：１０のものが一番多かったため、ベクター：インサートが１：１０を最適モル比とした。また、ＤＮＡの量を検討したところ、５０μｌのコンピテントセルに対し、５μｌの場合が一番コロニー数が多かった。従って本実験では、コンピテントセル５０μｌにつき５μｌのライゲーション後のＤＮＡを用いることとした。さらに、ＤＨ５αを用いた場合の方がＪＭ１０９を用いた場合と比較して５倍の数のコロニーが生えた。ゆえに、ＤＨ５αを用いることとした。
（３−２）ＥＲＧＩＣランダムライブラリーの回収
ＬＢ−Ａｍｐプレート上に生えてきたコロニーの個数を、１枚のプレートごとに数えた。
個数をカウントしたプレートに生えているコロニーの中から、無作為に２４個のコロニーを確認用にピックアップした。この確認用コロニーは、３ｍｌのＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン入り）で終夜培養し、プラスミド抽出を行い、インサートチェック（ＡｐａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で処理し、１％アガロースゲルにて電気泳動）を行った。インサートが入っていると確認されたプラスミドのうち、無作為に６個を選び、ＤＮＡシークエンサーによるシークエンス確認（糖鎖認識決定部位にランダム変異が導入されているかどうかの確認）を行った。インサートチェックとＤＮＡシークエンスの結果から、プレートに生えてきたコロニーのうちの有効コロニーの確率を計算した。
確認用コロニー以外のものは、すぐさま回収を行った。この回収したもののうち、上記方法で算出した有効数のものをＥＲＧＩＣランダムライブラリーとした。回収の具体的な方法は後述する。
ＬＢ−Ａｍｐプレート１枚あたり１５ｍｌのＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン入り）を加え、コンラージ棒で物理的にコロニーを剥がし取り、３７℃で終夜振とう培養した。その後、培養液の一部（４００μｌ）はグリセロールストックとしてプレート１枚ごとに保存した。残りの培養液はＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてプラスミド抽出した。なお、プラスミド抽出は数枚のプレートをまとめて行ったが、この際各プレートに生えたコロニーの個数に比例するように培養液を混合した（１枚に１０００個のコロニーが生えたプレートの回収後培養液と、１００個のコロニーが生えたものの回収後培養液の場合、前者は後者の１０倍の液量を用い、プラスミドを抽出した）。
回収されたコロニー数は約２３８，０００であった。この中から、回収時に無作為に選んだ確認用コロニーをインサートチェック及びＤＮＡシークエンスで確認したところ、平均して２４個中２０個にインサートが含まれ、推定糖鎖認識決定部位はＤＮＡシークエンスで確認したプラスミドに関してはそれぞれ異なる塩基配列になっていた。そのため、有効コロニー数は、回収したコロニー２３８，０００のうち２０／２４、約２００，０００とした。したがって、今回作製したＥＲＧＩＣランダムライブラリーのサイズは２×１０５であった。これらのライブラリーは、プレート１枚ごとに一本グリセロールストックを作製し、−８０℃の冷蔵庫で保存した。また、約５０００個を一つにまとめてプラスミド抽出を行い、−２０℃に保存した。以降の実施例においては、このプラスミドを実験に使用した。
〔実施例７〕ＥＲＧＩＣランダムライブラリーのＭＤＣＫ細胞を用いた発現
本実施例においては、実施例６で作製したＥＲＧＩＣランダムライブラリーを、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションし、発現させた。その後、ウエスタンブロッティング法（実施例８）、間接蛍光抗体法（実施例９）により発現確認を行った。
（１）トランスフェクション効率の検討
ＭＤＣＫ細胞にＥＲＧＩＣランダムライブラリーをトランスフェクションする前に、条件検討を行った。具体的には、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトし、ＥＧＦＰ遺伝子を一過的に発現させた。その後、蛍光標示式細胞分取器（以下ＦＡＣＳという）を用いて蛍光強度を測定することによりトランスフェクションの効率を検討した。
（１−１）Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用いた効率検討
０．５２６μｇ／μｌのｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ）の発現効率を検討した。
具体的には、トランスフェクションの前日に６ウエルプレート（ＦＡＬＣＯＮ３０４６）に４×１０５の細胞をまき、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。当日、プレートから培地（ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）５００ｍｌ、非動化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＩＮＴＥＲＧＥＮ）５５．５ｍｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ５ｍｌ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）５ｍｌを混合したもの）を吸い取り、一回１×ＰＢＳ（１ｍｌ）で細胞を洗い、新しい培地を１．６ｍｌ加えた（▲１▼）。
一方、１５ｍｌチューブにプラスミドＤＮＡを加え、バッファーＥＣで合計１００μｌにした。これに促進剤（ＱＩＡＧＥＮ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬のキットに添付されている）を加え、１秒間ボルテックスで攪拌し、２〜５分室温に置いたあとスピンダウンした。次に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を加え、１０秒間ボルテックスし、５〜１０分室温で放置し、その後６００μｌの培地を加え、ピペッティングした（▲２▼）。
上記▲１▼に▲２▼を加え、３７℃で４８時間培養した。薬剤での選択を行う場合は、トランスフェクション後４８時間経過してから添加した。
また、トランスフェクションの４８時間後に、ＦＡＣＳにて発現効率を比較した。具体的には、トランスフェクション後４８時間経過した細胞をＰＢＳで２回洗浄したのち、ＰＢＳ−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを２ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２で培養することにより細胞をはがした。細胞がはがれたらＦＡＣＳバッファー（ＨＢＳＳ（ハンクス平衡化塩溶液、日水製薬株式会社）９．８ｇをＭｉｌｌｉＱに溶かし、ＮａＨＣＯ３０．３５ｇ、１０％ＮａＮ３１０ｍｌ、２０％ＢＳＡ／ＮａＮ３溶液５ｍｌを加えて１Ｌに調整した）を２ｍｌ加え、１５ｍｌチューブに移し、１９０×ｇで１０分間遠心した後、上清を捨てた。さらにＦＡＣＳバッファー２ｍｌで細胞を一回洗浄し、細胞数を測定した後、１９０×ｇで１０分間遠心し、上清を捨てた。
細胞が８×１０６個／ｍｌになるようにＦＡＣＳバッファーで希釈し、希釈液をＦＡＣＳチューブへ移した。３μｇ／ｍｌのヨードプロピジウム（ＳＩＧＭＡ）を細胞希釈液の１／２量加え、死細胞を染色した。細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いたＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した。前方散乱光、側方散乱光、ヨードプロプジウム（ＳＩＧＭＡ）の染色により生細胞を選別し、１００００個の生細胞の情報を収集、解析した。なお、今回は導入したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が持つ蛍光を検出し、解析を行った。
その結果、０．８μｇ／ＤＮＡ、６．４μｌ促進剤、８μｌ  Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬、９９．５μｌバッファーＥＣの試薬量を用いた際の効率（３．６５％）が最も良い効率であることがわかった。
（１−２）ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬を用いた効率検討
０．５２６μｇ／μｌの濃度のｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）４μｇ／分を用いて、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の発現効率を検討した。
具体的には、トランスフェクション前日に６ウエルプレート（ＦＡＬＣＯＮ  ３０４６）に４×１０５の細胞をまき、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養し、当日９０〜９５％コンフルエントになるようにした。
一方、プラスミドＤＮＡ  ４μｇを、２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬キットの中に添付されているもの）に希釈した（▲１▼）。１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬を２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈し、室温で５分培養した（▲２▼）。▲１▼と▲２▼を混合し、室温で２０分静置培養することにより、ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬複合体が形成されるので、これを細胞に添加し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
トランスフェクション後２４時間経過した後、培地を新しいものに交換し、さらに２４時間培養した。薬剤での選択を行う場合は、トランスフェクション後４８時間経過してから添加した。
また、トランスフェクションの４８時間後に、上記（１−１）と同様にＦＡＣＳで解析を行った。
その結果、トランスフェクション効率は８．２０％であった。従って、以降のトランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行うこととした。
（２）ＥＲＧＩＣランダムライブラリーの発現
本実施例では、実施例６で作製したＥＲＧＩＣランダムライブラリーをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションを行った。この際、ＥＲＧＩＣランダムライブラリーは制限酵素処理により線状化したものをトランスフェクションした。
実施例６で作製したＥＲＧＩＣランダムライブラリー全て（２×１０５）をＳｃａＩで制限酵素処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。なお、ＥＲＧＩＣランダムライブラリーであるが、全てのコロニーが同じ割合で含まれるように計算して混ぜ合わせたものを使用した（５００個のコロニーを回収して得たプラスミドと、５０００個のコロニーを回収して得たプラスミドの場合、それぞれの濃度を測定し、後者が前者の１０倍のＤＮＡ量になるようにした）。精製後、分光光度計（ＪＡＳＣＯ、Ｖ−５５０）を用いて濃度を測定した。
トランスフェクション前日に６ウエルプレート（ＦＡＬＣＯＮ、３０４６）にＭＤＣＫ細胞を４×１０５個まき、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。上記細胞にＥＲＧＩＣランダムライブラリー（ＳｃａＩカット済）を１ウエルあたり４μｇ  ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトし、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
トランスフェクションから２４時間後、培地を新しいものに交換し、さらに２４時間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
トランスフェクションから４８時間後、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、選択を開始した。選択開始後、一日一回は細胞を観察し、選択の進み具合を確かめた。
選択開始から１０日後、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中で増殖してきた細胞を、トランスフェクションが確認された細胞であるとして、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ）処理して細胞をプレートからはがした後、細胞数を数えた。
Ｇ４１８添加後１０日目にはプレート一面が細胞に覆われていた。そこで、細胞数を計算したところ、６ウエルプレート１枚で９．５×１０６個であった。以降、この細胞の一部を用いて、ウエスタンブロッティング法（実施例８）及び間接蛍光抗体法（実施例９）による発現確認を行うこととした。
〔実施例８〕ウエスタンブロッティング法を用いた発現確認
上記実施例７においてＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８で選択を行って得たものに、ＥＲＧＩＣランダムライブラリーが正しく発現しているかどうかを、ウエスタンブロッティング法を用いて確認した。なお、コントロールには何もトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞を用いた。
実施例７においてＧ４１８での選択後１０日目の細胞の一部を２４ウエルプレート（ＦＡＬＣＯＮ、３０４７）に移し、ウエルが細胞でいっぱいになるまで３７℃、５％ＣＯ２で培養した。また、コントロールに使用するＭＤＣＫ細胞も２４ウエルプレート（ＦＡＬＣＯＮ、３０４７）にまき、同様に培養した。
ウエルが細胞でいっぱいになったらトリプシン−ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ）５０μｌを加え、３７℃、５％ＣＯ２で２０分程度培養することにより細胞をはがした。はがれた細胞に培地を５００μｌ加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。残ったペレットを１×ＰＢＳで２〜３回洗浄した。
洗浄済みの細胞のペレットを５０μｌの１×ＰＢＳで懸濁し、そこに２×ＳＤＳ可溶化バッファー（還元）を２５μｌ加え、１００℃で５分間熱処理し、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを使用して、２００Ｖで４５分間電気泳動した。なお、マーカーとして、タンパク質分子量マーカー「第一」ＩＩＩ（第一化学薬品）を使用した。
ウエスタンブロッティング法を用いて、上述の通り電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ１００Ｖで６０分間かけて転写した。転写後、マーカー部分を切り取り、ＣＢＢで染色、脱染色を行った。残りの膜はブロッキング溶液に浸して４℃で一晩放置した（膜が均一にブロッキング溶液に浸るように、振とうした）。
ブロッキング後の膜をハイブリバッグソフト（コスモバイオ）に入れ、抗体と反応させた。１次抗体としては、抗ＦＬＡＧ抗体（ｍ２Ａｂ、ＩＢＩ）を１μｇ／ｍｌの濃度にブロッキング溶液で希釈した溶液（４．５ｍｌ）を用い、室温で２時間反応させた。その後、洗浄バッファーで５分間×３回洗浄し、２次抗体と反応させた。２次抗体にはヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＢＩＯＲＡＤ）を３０００倍希釈の濃度にブロッキング溶液（５％スキムミルクをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を用いて調整したもの）で希釈した溶液（４．５ｍｌ）を用い、室温で３０分間反応させた。その後、洗浄バッファーで１５分間、５分間×２回の計３回洗浄した。洗浄後、膜を発色基質溶液に浸し、膜にバンドが見えるまで放置した。発色基質溶液は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ中、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むアルカリホスファターゼ基質バッファー５ｍｌにＮＢＴストック溶液（ＮＢＴ  ５０ｍｇを７０％ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）１ｍｌに溶解して−２０℃で保存したもの）３３μｌ及びＢＣＩＰストック溶液（ＢＣＩＰ  ２５ｍｇを５０％ＤＭＦ  １ｍｌに溶解して−２０℃で保存したもの）３４μｌを添加して調製した。発色をとめたいところで水道水で膜を洗い、風乾した。
ＭＤＣＫ細胞にＥＲＧＩＣランダムライブラリーをトランスフェクトし、Ｇ４１８で１０日間選択した後の細胞をウエスタンブロッティングで発現確認した。コントロールのＭＤＣＫ細胞と比較してみると、分子量マーカーの６６ＫＤａと４２ＫＤａの間にコントロールには見られないバンドがあった。ＥＲＧＩＣ−５３は、その名の通り分子量は５３ＫＤａであり、このバンドの位置とほぼ一致していた。ゆえに、ＥＲＧＩＣランダムライブラリーがＭＤＣＫ細胞に発現していることが確認された。
〔実施例９〕間接蛍光抗体法を用いた発現確認
上記実施例８において、ＭＤＣＫ細胞にＥＲＧＩＣランダムライブラリーをトランスフェクションし、Ｇ４１８での選択を１０日間行った細胞が、ＥＲＧＩＣランダムライブラリーを発現していることはウエスタンブロッティングによって確認された。つぎに、間接蛍光抗体法を用いた観察により、トランスフェクションした細胞のうち何％の細胞がＥＲＧＩＣランダムライブラリーを過剰発現しているかを確認した。間接蛍光抗体法とは非標識抗体を抗原と反応させ、ついで蛍光標識した２次抗体を１次抗体に結合させ抗原を追跡する方法である。１次抗体は２次抗体の抗原として働き、２次抗体として蛍光標識免疫グロブリン抗体が用いられることにより、組織や細胞の抗原物質の存在又は分布の分析を感度良くおこなうことができる。ライブラリーを構成するＥＲＧＩＣにはＦＬＡＧタグがついているので、１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（ｍ２Ａｂ、ＩＢＩ）を、２次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を用い、蛍光顕微鏡で観察を行った。なお、ネガティブコントロールには何もトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞を、ポジティブコントロールにはＶＩＰ３６−ＦＬＡＧ  ｃｌｏｎｅ８（ＦＬＡＧタグ付のＶＩＰ３６が恒常的に発現している事が確認されている細胞株）を使用した。
６ウエルプレート（ＦＡＬＣＯＮ、３０４６）に高圧加熱滅菌済のカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）をしき、その上に実施例７においてＧ４１８での１０日間の選択後の細胞の一部（２×１０５個）をまき、ウエルが細胞で９０％ほど覆われるまで３７℃、５％ＣＯ２で培養した。また、コントロールに使用するＭＤＣＫ細胞、ＶＩＰ３６−ＦＬＡＧ  ｃｌｏｎｅ８も同様に培養した。
サンプル作製当日、カバーガラスがある程度細胞で覆われていることを確認した。培地を捨て、ＰＢＳで一回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを１ｍｌ添加し、室温で６０分間処理をして細胞を固定した。その後、１回ＰＢＳで洗浄した。
０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ（１ｍｌ）で室温で３０分間処理して細胞膜を壊した。その後、ＰＢＳで５分間×３回洗浄した。
ブロッキング溶液（１ｍｌ）を用いて室温で１５分間ブロッキングした。その後、ＰＢＳで５分間×３回洗浄した。
２μｇ／ｍｌの濃度にブロッキング溶液を用いて希釈した抗ＦＬＡＧ抗体（ｍ２Ａｂ、ＩＢＩ）を２００μｌカバーグラス上に添加して、室温で６０分間反応させた後、ＰＢＳで１０分間×３回洗浄した。
ブロッキング溶液（１ｍｌ）を用いて室温で１５分間再度ブロッキングした。その後、ＰＢＳで５分間×３回洗浄した。
２μｇ／ｍｌの濃度にブロッキング溶液を用いて希釈した抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（ＣＢＬ１０００Ｆ）を２００μｌカバーグラス上に添加して、遮光し、室温で６０分間反応させた後、ＰＢＳで１０分間×３回洗浄した。
ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）３μｌとｓｌｏｗ  ｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）溶液Ａ３μｌをスライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）にたらした。その上にカバーガラスを細胞が接着している面が下になるように置き、マニキュアで封入してサンプルとした。サンプルは遮光し、４℃で保管した。
作製したサンプルを蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ、ＢＸ５２）で観察した。まず、ネガティブコントロールのＭＤＣＫ細胞を、次にポジティブコントロールのＶＩＰ３６−ＦＬＡＧ  ｃｌｏｎｅ８を観察し、抗体反応がうまくいっているかどうかを確認した。次に、ＭＤＣＫ細胞にＥＲＧＩＣランダムライブラリーをトランスフェクトして発現させた細胞の観察を行った。具体的には、サンプルの左右両側から無作為に数箇所を選択して撮影し、その写真に写っている全細胞数及びＦＩＴＣ陽性細胞数を計数し、何個に発現が見られるかを数値化した。
蛍光顕微鏡用サンプルの写真を結果として図９Ａ〜Ｃに示す。図９Ａ〜Ｃは、細胞の位相差像（グレー）とＦＩＴＣで染色した像（緑色）を重ね合わせたものである。ネガティブコントロールのＭＤＣＫ細胞の写真を図９Ａに、ポジティブコントロールのＶＩＰ３６−ＦＬＡＧ  ｃｌｏｎｅ８の写真を図９Ｂに示す。ポジティブコントロールは、各細胞が非常に強い緑色を発している、つまり２次抗体であるＦＩＴＣで染まっているのが見て取れる。
ＭＤＣＫ細胞にＥＲＧＩＣランダムライブラリーをトランスフェクトし、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で１０日間選択を行った後の細胞の観察を行ったものを図９Ｃに示す。これは、１枚の写真あたり１個若しくは２個の細胞が非常に強い緑色を発している、つまり２次抗体であるＦＩＴＣに強く染まっている。撮影した８枚の写真に写っている細胞の数の総計は３８７個であり、そのうちＦＩＴＣに強く染まっている細胞は１２個であった。つまり、今回観察したサンプルのうち、１２個／３８７個、３．１％が発現している細胞であると言える。
〔実施例１０〕植物レクチンの糖結合特異性に基づいたＭＡＣＳによるＥＲＧＩＣランダムライブラリー発現細胞の選別、及びＦＡＣＳによる解析
本実施例においては、植物レクチンの糖結合特異性に着目し、ＭＡＣＳによるＥＲＧＩＣランダムライブラリー発現細胞の選別を行った。具体的には、ＥＲＧＩＣランダムライブラリー発現細胞を、ビオチン標識してあるマメ科レクチン数種類で１次標識した後、ストレプトアビジンマイクロビーズを用いて磁気標識し、磁気細胞分離システム（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、以下ＭＡＣＳと略す）で選別した。その後、ＦＡＣＳで選別後の細胞の解析を行った。
（１）ＥＲＧＩＣランダムライブラリー発現細胞のＭＡＣＳによる選別
ビオチン標識レクチンとして、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｅｃｔｉｎ  ｓｅｔ  Ｉ、ＩＩ（ホーネンコーポレーション）を使用した。ＣｏｎＡ、ＢＰＡ、ＡＢＡ、ＷＧＡ、ＳＢＡ、ＳＳＡ、ＤＢＡ、ＤＳＡ、ＲＣＡ１２０、ＬＣＡ、ＰＮＡ、ＰＨＡ−Ｌ４、ＰＨＡ−Ｅ４、Ｌｏｔｕｓ、ＵＥＡ−Ｉ、及びＭＡＭをそれぞれ１ｍｇ／ｍｌのものをＰＢＳで希釈し、１０μｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍのフィルター（ＭＩＬＬＥＸＯＲ−ＨＶ）を用いて滅菌した。
ＭＡＣＳによる選別を行う２日前に、１０ｃｍディッシュ１６枚に細胞を４×１０５個まき、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
当日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養することにより細胞をはがした。１９０×ｇで５分間遠心し、上清を捨てた。
細胞に各レクチン（１０μｇ／ｍｌ、２ｍｌ）を加え、氷上で３０分間反応させた後、３０×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。３００μｌのラベリングバッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．２、２ｍＭ  ＥＤＴＡをＭｉｌｌｉ−Ｑで調製し、フィルター滅菌したもの）で洗浄後、３００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。
細胞を９０μｌのラベリングバッファーで懸濁し、そこにストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を１０μｌ加え、６〜１２℃で１５分間反応させた。５００μｌの分離バッファー（ＰＢＳｐＨ７．２、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で調整し、フィルター滅菌したもの）で洗浄、３００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた後、５００μｌの分離バッファーで懸濁した。
ＭｉｎｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）の磁石にＭＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍＢＨ）をセットし、５００μｌの分離バッファーを流した。その後、上記細胞懸濁液をＭＳ分離カラムにかけ、カラムから流出してきた細胞を陰性細胞（素通り）として回収した。５００μｌの分離バッファーを３回ＭＳ分離カラムにかけ、ここで流出してきた細胞も陰性細胞（素通り）として回収した。
カラムを磁石から外し、分離バッファー１ｍｌをカラムに載せ、注射器のプランジャーで押し出すことにより流出してきた細胞を陽性細胞として回収した。
得られた陽性細胞と陰性細胞（素通り）を３００×ｇで１０分間遠心した後、上清を取り除いた。適当量の培地（１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８添加済）にペレットを懸濁し、適当なサイズのプレート（６ｃｍディッシュ若しくは１０ｃｍディッシュ）ににまき、再培養した。
本実験は、レクチンの持つ糖結合特異性を利用して、細胞表面の膜タンパク質に付加している糖鎖の種類によって細胞を選別する、という意図で行ったものである。ビオチン標識レクチンで標識しＭＡＣＳにかけた細胞は、全て陰性細胞（素通り）と陽性細胞に分けられた。ＭＡＣＳを行った直後の細胞は、かなりのダメージを受けていると考え、ＭＡＣＳによる選別の翌日に細胞数を数え、どのような比率で分けられたかを確認した。その結果を下記表４に示す。ただし、ビオチン標識ＲＣＡ１２０を１次標識として用いてＭＡＣＳにかけた細胞は、陰性細胞（素通り）・陽性細胞ともに全て死滅した。
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上記表４からも分かるとおり、本実施例においてＭＡＣＳで選別した細胞のほとんどは素通りに回収され、用いたレクチンによる差異はあまり見られなかった。
今回得た細胞画分のうち、陰性細胞（素通り）を−（マイナス）、陽性細胞識したのちＭＡＣＳで選別し、素通りに出てきた細胞はＣｏｎＡ（−）、最終的に陽性細胞として回収した細胞をＣｏｎＡ（＋）と名づけ、他のレクチンに関しても同様に標記する。これらの計３０種類の細胞に対し、下記の実験でＦＡＣＳによる解析を行うこととした。
（２）ＦＡＣＳによる解析
上記（１）でＭＡＣＳによる選別を行い、その後順調に増殖した３０種類の細胞に対して、ＦＡＣＳによる解析を行った。具体的には、１次抗体としてビオチン化レクチン１５種類、２次抗体にはＦＩＴＣ標識されたストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ）を反応させて、ＦＡＣＳを用いて蛍光強度の変化をみた。なお、コントロールとして何もトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞を用いた。
ＦＡＣＳを行う前日に、解析したい細胞を６ｃｍに２×１０５個まいた。当日に各々の細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを２．５ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２で培養することにより細胞をはがした。細胞がはがれたら、ＦＡＣＳバッファー（ＨＢＳＳ（日水製薬株式会社）９．８ｇをＭｉｌｌｉＱに溶かし、ＮａＨＣＯ３０．３５ｇ、１０％ＮａＮ３１０ｍｌ、２０％ＢＳＡ／ＮａＮ３溶液５ｍｌを加えて１Ｌに調整したもの）を２．５ｍｌ加え、１５ｍｌチューブに移し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した後上清を捨てた。さらにＦＡＣＳバッファー５ｍｌで細胞を一回洗浄し、細胞数を測定した後、１９０×ｇで１０分間遠心し、上清を捨てた。
細胞が８×１０６個／ｍｌ（４×１０５個／５０μｌ）になるようにＦＡＣＳバッファーで希釈し、希釈液を５０μｌずつ９６ウエルＵ底プレート（３０７７、ＦＡＬＣＯＮ）に移した。各ウエルに１次抗体として、１０μｇ／ｍｌのビオチン標識レクチンを５０μｌずつ加え、穏やかに混ぜた後、氷上で３０分間反応させた。
１００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、５８０×ｇで３分間遠心し、上清を捨てキムタオルに押し当て水分を除いた後、ペレットをボルテックスにかけてほぐした。同様の洗浄操作をさらに２回繰り返した（なお、ＦＡＣＳバッファーは２００μｌずつ加えて洗浄した）。
２次抗体として、ストレプトアビジンＦＩＴＣ（２０μｇ／ｍｌになるようにＦＡＣＳバッファーで希釈した）を５０μｌ加え、軽く混ぜ遮光して氷上で２０〜３０分間反応させた。
１５０μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、５８０×ｇで３分間遠心し、上清を捨てキムタオルに押し当て水分を除いた後、ペレットをボルテックスにかけてほぐした。同様の洗浄操作をさらにもう１回繰り返した。
ウエルに２００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、ピペッティングをしてＦＡＣＳチューブへ移した。３μｇ／ｍｌのヨードプロピジウム（ＳＩＧＭＡ）を１００μｌ加え、死細胞を染色した。細胞は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いたＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した。前方散乱光、側方散乱光、ヨードプロピジウム（ＳＩＧＭＡ）の染色により生細胞を選別し、１００００個の生細胞の情報を収集、解析した。
ＥＲＧＩＣランダムライブラリーは、ＥＲＧＩＣ−５３の推定糖鎖認識決定部位にあたるアミノ酸にランダム変異を導入してある。ＥＲＧＩＣ−５３は小胞体（ＥＲ）とシスゴルジの間を行き来する輸送小胞に存在し、糖タンパク質の選別輸送（糖鎖認識部位がもつ糖結合特異性のため、Ｃａ２＋依存的にマンノースと結合する）を行っている分子である。つまり、糖鎖認識部位又は糖鎖認識決定部位にランダム変異導入することにより、ＥＲＧＩＣランダムライブラリーにはＥＲＧＩＣ−５３が本来持っているものとは異なる糖結合特異性が生じ、様々な糖鎖を持った糖タンパク質と結合するようになるので、細胞膜表面上に運ばれてくる糖タンパク質の糖鎖の種類にも多様性が生じると思われる。実施例１０で行ったＭＡＣＳでは、用いた各種ビオチン標識レクチンの糖結合特異性（下記表５参照）に基づいて細胞を分取し、それぞれの画分に回収した。一般にレクチンが糖鎖に結合する際、三糖前後の大きさを認識し、その立体構造を識別している。ＦＡＣＳを用いた解析では、ビオチン標識レクチンで染めることにより、どのような種類の糖鎖が、どのような割合で細胞表面に存在するかがわかることになる。
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ＦＡＣＳ解析の結果を図１０に示す。図１０では、ＭＡＣＳでの選別後の細胞とコントロール（野生型ＭＤＣＫ細胞）を比較して、平均蛍光強度にどれほどの差が生じるかを見た。図１０において、黒線はコントロールのＭＤＣＫ細胞、赤線はＭＡＣＳ後の（−）画分、緑線は（＋）画分を示す。（＋）及び（−）の平均蛍光強度がコントロールよりも高くなっていたものは、ＰＮＡ及びＡＢＡで１次標識した後ＭＡＣＳで選別して得られた細胞のみであった。つまり、ＥＲＧＩＣランダムライブラリー発現細胞のなかで、ＰＮＡレクチンに特異的に結合する糖鎖を細胞表面に提示している細胞がＭＡＣＳで選別されたといえる。
ＳＢＡ、ＤＢＡ、ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｌ４及びＢＰＡはいずれもＤ−ＧａｌＮＡｃに対して特異的に結合するレクチンである。図１０のＦＡＣＳの結果を見てみると、どのレクチンの場合でも、コントロールと（＋）（−）の平均蛍光強度差は殆ど見られなかった。
〔実施例１１〕ＰＮＡレクチンに特異的な細胞の解析
本実施例においては、実施例１０で得られたＰＮＡ（＋）の細胞をさらにＭＡＣＳで選別することにより、ＰＮＡレクチンに特異的に結合する糖鎖をより多く細胞表面に提示している細胞の分離・取得を試みた。また、ＦＡＣＳ及びウエスタンブロッティング法を用いたレクチン染色による解析を行った。
（１）ＰＮＡ（＋）のＭＡＣＳによる分離及びＦＡＣＳによる解析
実施例１０で得た、ＰＮＡ（＋）の細胞に関して、さらにＭＡＣＳで選別し、ＦＡＣＳで解析を行った。なお、ＦＡＣＳの際のコントロールとして、何もトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞を用いた。
（１−１）ＭＡＣＳによるＰＮＡ（＋）の選別
１０ｃｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ、３００３）に細胞（ＰＮＡ（＋））を４×１０５個まき、３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した。
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを５ｍｌ添加することにより、細胞をはがした。１９０×ｇで５分間遠心し、上清を捨てた。
細胞にビオチン標識ＰＮＡレクチン（１０μｇ／ｍｌ、２ｍｌ）を加え、氷上で３０分間反応させた後、３００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。３００μｌのラベリングバッファーで洗浄後、３００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。
細胞を９０μｌのラベリングバッファーで懸濁し、そこにストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を１０μｌ加え、６〜１２℃で１５分間反応させた。５００μｌの分離バッファーで洗浄、３００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた後、５００μｌの分離バッファーで懸濁した。
ＭｉｎｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）の磁石にＭＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）をセットし、５００μｌの分離バッファーを流した。その後、上記細胞懸濁液をＭＳ分離カラムにかけ、カラムから流出してきた細胞を陰性細胞（素通り）として回収した。５００μｌの分離バッファーを３回ＭＳ分離カラムにかけ、ここで流出してきた細胞も陰性細胞（素通り）として回収した。
カラムを磁石から外し、分離バッファー１ｍｌをカラムに載せ、注射器のプランジャーで押し出すことにより流出してきた細胞を陽性細胞として回収した。
得られた陽性細胞と陰性細胞（素通り）を３００×ｇで１０分間遠心した後上清を取り除いた。適当量の培地（１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８添加済）にペレットを懸濁し、適当なサイズのプレート（６ｃｍディッシュ若しくは１０ｃｍディッシュ）にまき、再培養した。
その結果、陰性細胞（素通り）に６５％、陽性細胞に３５％の細胞が回収された。以降ＰＮＡ（＋）をＭＡＣＳにかけて回収した陰性細胞をＰＮＡ２（−）、陽性細胞をＰＮＡ２（＋）と呼ぶこととした。１回目のＭＡＣＳ（実施例１０）時には、ＰＮＡ（−）が９５％、ＰＮＡ（＋）が５％の割合で分かれたが、２回目には（＋）の画分として回収された細胞の比率が高くなっていた。
（１−２）ＦＡＣＳによる解析
ＦＡＣＳを行う前日に、解析対象の細胞を６ｃｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ、３００２）に２×１０５個まいた。当日に各々の細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを５ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２で培養することにより細胞をはがした。細胞がはがれたら、ＦＡＣＳバッファーを５ｍｌ加え、１５ｍｌチューブに移し、１９０×ｇで１０分間遠心した後上清を捨てた。さらにＦＡＣＳバッファー５ｍｌで細胞を一回洗浄し、細胞数を測定した後、１９０×ｇで１０分間遠心し、上清を捨てた。
細胞が８×１０６個／ｍｌ（４×１０５個／５０μｌ）になるようにＦＡＣＳバッファーで希釈し、希釈液を５０μｌずつ９６ウエルＵ底プレート（３０７７、ＦＡＬＣＯＮ）に移した。各ウエルに１次抗体として、１０μｇ／ｍｌのビオチン標識ＰＮＡレクチンを５０μｌずつ加え、穏やかに混ぜた後、氷上で３０分間反応させた。
１００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、５８０×ｇで３分間遠心し、上清を捨てキムタオルに押し当て水分を除いた後、ペレットをボルテックスにかけてほぐした。同様の洗浄操作をさらに２回繰り返した。
２次抗体として、ストレプトアビジンＦＩＴＣ（２０μｇ／ｍｌになるようＦＡＣＳバッファーで希釈した）を５０μｌ加え、軽く混ぜ遮光して氷上で２０〜３０分間反応させた。
１５０μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、５８０×ｇで３分間遠心し、上清を捨てキムタオルに押し当て水分を除いた後、ペレットをボルテックスにかけてほぐした。同様の洗浄操作をさらにもう１回繰り返した（なお、ＦＡＣＳバッファーは２００μｌずつ加えて洗浄した）。
ウエルに２００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、ピペッティングをしてＦＡＣＳチューブへ移した。３μｇ／ｍｌのヨードプロピジウム（ＳＩＧＭＡ）を１００μｌ加え、死細胞を染色した。細胞は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いたＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した。前方散乱光、側方散乱光、ヨードプロピジウム（ＳＩＧＭＡ）の染色により生細胞を選別し、１００００個の生細胞の情報を収集、解析した。
その結果を図１１に示す。ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）の比較を行った。コントロールとしては何もトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞を用いた。図１１から、ＰＮＡ２（＋）の平均蛍光強度はＰＮＡ（＋）よりも高くなっており、ＰＮＡに特異的に結合する糖鎖を細胞表面により多く提示している細胞がＰＮＡ２（＋））には回収されたことが示唆される。
（２）ウエスタンブロッティング法を用いたレクチン染色
上記（１）の結果より、ＰＮＡ２（＋）はＰＮＡ（＋）やＰＮＡ（−）よりＰＮＡレクチンに特異的に結合する糖鎖をより多く細胞表面に提示している細胞群であると考えられた。そこで、本実施例では、ウエスタンブロッティング法を用い、ＰＮＡレクチンによるレクチン染色を行い、ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）の染色度合の差を見た。また、ＣｏｎＡ、ＭＡＭ、ＰＨＡ−Ｅ４及びＰＨＡ−Ｌ４の４種類を用いて、ＰＮＡとは糖結合特異性が異なるレクチンでもウエスタンブロッティング法を用いたレクチン染色を行い、比較を行った。なお、コントロールとして何もトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞を用いた。
６ウエルプレート（ＦＡＬＣＯＮ、３０４６）に細胞をまき、ウエルが細胞で９０％程度埋め尽されるまで、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
細胞が十分増殖したら、細胞溶解バッファー（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチンをＰＢＳで調整したもの）を５００μｌ加え、氷上に１〜１．５時間置くことにより細胞を溶解させた。
ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ）を使用して溶解バッファーで処理後の細胞溶解液のタンパク質定量を行った。濃度が最も低かった溶液に合わせて細胞溶解液をＰＢＳを用いて希釈した。タンパク質濃度をそろえた各細胞溶解液から１０μｌを１．５ｍｌチューブに移し、２μｌの６×ＳＤＳ可溶化バッファー（還元）を加え、１００℃で５分間熱処理した。その後、１２．５％アクリルアミドゲルを使用して２００Ｖで４５分間電気泳動した。
ウエスタンブロッティング法を用いて、上記電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ１００Ｖで６０分間転写した。転写後、マーカー部分を切り取り、ＣＢＢで染色、脱染色を行った。残りの膜はブロッキング溶液に浸して４℃で一晩放置した（膜が抗体溶液に均一にブロッキング溶液に浸るように、振とうした）。
ブロッキング後の膜をハイブリバッグソフト（コスモバイオ）に入れ、抗体と反応させた。１次抗体としては、ビオチン標識レクチンを１μｇ／ｍｌの濃度にブロッキング溶液で希釈した溶液（４．５ｍｌ）を用い、室温で２時間反応させた。その後、洗浄バッファーで５分間×３回洗浄し、２次抗体と反応させた。２次抗体にはストレプトアビジンアルカリホスファターゼを１μｇ／ｍｌの濃度にブロッキング溶液で希釈した溶液（４．５ｍｌ）を用い、室温で３０分間反応させた。その後、洗浄バッファーで１５分間、５分間×２回の計３回洗浄した。洗浄後、膜を発色基質溶液に浸し、膜にバンドが見えるまで放置した。発色をとめたいところで水道水で膜を洗い、風乾した。
結果を図１２に示す。ＰＮＡを用いたウエスタンブロッティングでは、ＰＮＡ２（＋）＞ＰＮＡ（＋）＞ＰＮＡ（−）＞コントロールの順番でバンドの濃さが濃くなっていたように見えたが、顕著な差は見られず、ＰＮＡへの特異性が今回解析した細胞画分すべてで同程度であることが示唆された。また、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｌ４を用いたウエスタンブロッティングの結果では、コントロールとＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）の染まり方に大きな差は見られなかった。ＭＡＭを用いたウエスタンブロッティングの結果では、わずかながらコントロール＞ＰＮＡ（−）＞ＰＮＡ（＋）＞ＰＮＡ２（＋）の順番でバンドが濃くなっているように見えた。
次に、各レクチンによる染色度合を比較してみた場合、コントロール、ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）いずれもＣｏｎＡ＞ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｌ４＞ＰＮＡ＞ＭＡＭという順番で濃く染まっていた。
ここで、本実験のウエスタンブロッティングに用いた各レクチンの糖結合特異性について説明する。ＣｏｎＡは、α−Ｄ−Ｍａｎ及びα−Ｄ−Ｇｌｃに対して親和性を示し、アスパラギン結合型糖鎖の２本鎖複合型、高マンノース型、混成型糖鎖と結合するレクチンである。また、ＰＨＡ−Ｌ４とＰＨＡ−Ｅ４はいずれもＤ−ＧｌｃＮＡｃに対して親和性を示し、アスパラギン結合型糖鎖のなかでも複合型糖鎖に結合する。ＰＮＡはＤ−Ｇａｌに対して親和性を有し、特にＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃに対して強く結合する、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ型糖鎖に特異的なレクチンである。そして、ＭＡＭはＳＡα２−３Ｇａｌに特異性を持ち、結合にはＳＡα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃに強く結合する、シアル酸特異的なレクチンである。糖鎖の生合成過程から見ると、高マンノース型糖鎖はシスゴルジで、複合型糖鎖はメディアルゴルジで、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ型糖鎖はトランスゴルジで付加される。そして、シアル酸を持った糖鎖はトランスゴルジの中でもプロセシングの最終過程で付加される。以上のことと、本実験のウエスタンブロッティングでＣｏｎＡ＞ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｌ４＞ＰＮＡ＞ＭＡＭの順に濃いバンドが検出されたことには、相関関係があると考えられる。すなわち、糖鎖のプロセシングにおいて早い段階で付加される糖鎖に特異的なレクチンを用いたウエスタンブロッティングほど、よく染まっている、ということである。このことは、生合成途中の細胞内糖タンパク質が大部分を占め、細胞表面に発現された糖タンパク質の差異が相対的に小さかった可能性が考えられる。
（３）トランスゴルジにおける糖鎖付加について
上記（２）で行ったウエスタンブロッティングの結果、ＭＡＭとＰＮＡを用いたウエスタンブロッティングではコントロール、ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）の各サンプルのバンドの濃さ（染色度合）にほんのわずかではあるが差異が見られるようであった。そこで本実施例では、ウエスタンブロッティングのバンドの濃さを定量化を行った。また、ウエスタンブロッティングでは細胞内外のタンパク質をまとめて溶解して解析するので、生合成過程の細胞内糖タンパク質が大部分を占め、ＰＮＡに対する結合特異性を持った膜糖タンパク質との差異をはっきりと見ることが出来ないと考え、フローサイトメトリーによる解析も行った。
（３−１）イメージアナライザーによる解析
上記（２）で得たウエスタンブロッティングの膜をイメージアナライザー（ＬＡＳ−１０００、富士フィルム）を用いて定量化し、バンドの濃さを比較した。
イメージアナライザーを用いての解析は、定量化対象のバンドの濃さの単位面積あたりの平均値を求め、比較した。その結果を下記表６に示す。
2004016789.tif 000014
上記表６に示すように、ＰＮＡを用いたウエスタンブロッティングではコントロール＜ＰＮＡ（−）＜ＰＮＡ（＋）＜ＰＮＡ２（＋）、ＭＡＭを用いたウエスタンブロッティングではコントロール＞ＰＮＡ（−）＞ＰＮＡ（＋）＞ＰＮＡ２（＋）の順でバンドが濃くなっていた。しかし、その差はそれぞれ１％程度であり、微妙な差でしかなかった。
（３−２）ＦＡＣＳによる解析
次に、ＦＡＣＳを用い、細胞表面の膜糖タンパク質に焦点をあてて解析を行った。ＦＡＣＳを行う前日に、解析対象の細胞（コントロールのＭＤＣＫ細胞、ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋））を６ｃｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ、３００２）に２×１０５個まいた。当日に各々の細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを５ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２で培養することにより細胞をはがした。細胞がはがれたら、ＦＡＣＳバッファーを５ｍｌ加え、１５ｍｌチューブに移し、１９０×ｇで１０分間遠心した後上清を捨てた。さらにＦＡＣＳバッファー５ｍｌで細胞を一回洗浄し、細胞数を測定した後、１９０×ｇで１０分間遠心し、上清を捨てた。
細胞が８×１０６個／ｍｌ（４×１０５個／５０μｌ）になるようにＦＡＣＳバッファーで希釈し、希釈液を５０μｌずつ９６ウエルＵ底プレート（３０７７、ＦＡＬＣＯＮ）に移した。各ウエルに１次抗体として、１０μｇ／ｍｌのビオチン標識ＰＮＡレクチン若しくはＭＡＭレクチンを５０μｌずつ加え、穏やかに混ぜた後、氷上で３０分間反応させた。
１００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、５８０×ｇで３分間遠心し、上清を捨てキムタオルに押し当て水分を除いた後、ペレットをボルテックスにかけてほぐした。同様の洗浄操作をさらに２回繰り返した。
２次抗体として、ストレプトアビジンＦＩＴＣ（２０μｇ／ｍｌになるようＦＡＣＳバッファーで希釈した）を５０μｌ加え、軽く混ぜ遮光して氷上で２０〜３０分間反応させた。
１５０μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、５８０×ｇで３分間遠心し、上清を捨てキムタオルに押し当て水分を除いた後、ペレットをボルテックスにかけてほぐした。同様の洗浄操作をさらにもう１回繰り返した。
ウエルに２００μｌのＦＡＣＳバッファーを加え、ピペッティングをしてＦＡＣチューブへ移した。３μｇ／ｍｌのヨードプロピジウム（ＳＩＧＭＡ）を１００μｌ加え、死細胞を染色した。細胞は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いたＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した。前方散乱光、側方散乱光、ヨードプロピジウム（ＳＩＧＭＡ）の染色により生細胞を選別し、２００００個の生細胞の情報を収集、解析した。
１次抗体としてビオチン標識レクチン（ＭＡＭ、ＰＮＡ）、２次抗体としてストレプトアビジンＦＩＴＣを用い、コントロールのＭＤＣＫ野生型細胞、ＰＮＡ（−）、ＰＮＡ（＋）、ＰＮＡ２（＋）の４つの細胞画分の蛍光強度を測定し、その平均値を比較した。その結果を図１３に示す。図１３において、ＰＮＡを１次抗体として用いたＦＡＣＳの結果ではコントロール＜ＰＮＡ（−）＜ＰＮＡ（＋）＜ＰＮＡ２（＋）の順で平均蛍光強度が高くなっている。一方、ＭＡＭを１次抗体として用いたＦＡＣＳの結果ではコントロール＞ＰＮＡ（−）＞ＰＮＡ（＋）＞ＰＮＡ２（＋）の順で平均蛍光強度が低くなっており、ＭＡＭとＰＮＡを用いたＦＡＣＳの結果が逆相関を示していた。また、ウエスタンブロッティングにおける染色度合をイメージアナライザーで解析した結果とも一致していた。ここで、糖鎖のプロセシングという観点からこの結果を考察してみた場合、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ結合型糖鎖には、まずＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ→Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ→ＳＡα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの順に糖鎖が付加されていく。ＰＮＡはＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを特異的に認識し結合するが、これにＳＡ（シアル酸）が付加されると全く認識しない。一方、ＭＡＭはＳＡα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを特異的に認識し結合するレクチンであり、シアル酸が付加されていない段階の糖鎖は認識しない。以上のことと、図１３に示した結果をあわせて考えると、ＰＮＡ２（＋）にはＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを細胞表面により多く提示している細胞画分が回収されていると考えられる。
以上の実施例５〜１１においては、ＥＲＧＩＣ−５３の推定糖鎖認識決定部位に相当する９アミノ酸（ＤＴＦＤＮＤＧＫＫ）のうち７アミノ酸にランダム変異導入（ＤＸＸＸＮＸＸＸＸ、Ｘは任意のアミノ酸を表す）し、ベクターであるｐＲｃ−ＣＭＶ２に導入した、ＥＲＧＩＣ−５３ランダムライブラリーを作製し、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトし、組換体ＥＲＧＩＣ−５３を強制発現させた。これを本明細書中では「ＥＲＧＩＣランダムライブラリー発現細胞」と称している。トランスフェクト後、Ｇ４１８によるセレクションを行い、細胞表面に多種多様な糖鎖を持った糖タンパク質を発現する細胞を選別するために、この細胞を各種ビオチン標識レクチンで１次標識し、その後ストレプトアビジン・マイクロビーズで磁気標識して、磁気細胞分離システム（ＭＡＣＳ）を用いた選別を行った。その結果、数種のレクチンと反応するＭＤＣＫ細胞を分離することができ、特異的なレクチン結合活性を有する（すなわち特異的に糖鎖を認識する）細胞を得ることができた。
〔実施例１２〕変異ＶＩＰ３６トランスフェクト細胞のＦＡＣＳを用いた細胞選別、及び改変型糖鎖結合タンパク質を発現する細胞の濃縮
（１）改変ＶＩＰ３６発現ＣＨＯ細胞ライブラリーの調製
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０で５％ＣＯ２存在下にて、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞（東北大学細胞バンクから供与）を培養した。コンフルエントになるまで培養したＣＨＯ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにより回収し、１／１０に希釈して更に一晩培養した。２．４×１０６個の細胞に対して、実施例１において作製した改変ＶＩＰ３６遺伝子ライブラリーのプラスミド１２μｇ（線状）を用い、リポフェクトアミン２０００（ＧＩＢＣＯ）を用いた常法に従ってＣＨＯ細胞にトランスフェクションを行った。４８時間にわたり１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中、５％ＣＯ２存在下で培養後、１．２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ）を含む同培養液で１０〜１４日間培養を行い、恒常的に改変ＶＩＰ３６を発現している細胞株のみを選別した。
（２）フローサイトメトリーによる改変ＶＩＰ３６発現細胞のスクリーニング
上記（１）で調製を行った改変ＶＩＰ３６発現ＣＨＯ細胞を１０ｃｍディッシュに１０％コンフルエントになるように細胞を希釈し、培養を行った。４８時間後、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液，ｐＨ７．４（ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）により細胞をはがし回収して０．５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。次に１次抗体としてビオチン化ＰＮＡレクチンを５μｇ／ｍｌになるように加え、氷上３０分間放置した。ＦＡＣＳ緩衝液（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で過剰なビオチン化ＰＮＡレクチンを洗浄後、２次抗体としてＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを１０μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、同様に２０分間氷上で反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、さらにナイロンメッシュを通して凝集した細胞塊を除いた。１０５個／ｍｌの濃度になるように細胞をＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ソーティング時まで氷上で保存した。
細胞の選別は、実施例３記載のＭＡＣＳを利用した方法に代えて、フローサイトメトリーを用いることにした（図１４）。フローサイトメトリーはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いて行った。光軸調製、流路の無菌化の後、マニュアルに従って、上述の通り調製した細胞の分取を行った。ＰＮＡレクチン陽性細胞画分を約０．１％前後になるように選別のウインドウを設定した。１．４×１０６個の細胞をソーティングし、１，１８７個のＰＮＡレクチン陽性細胞画分を得た。回収のチューブには、予めＰＮＡのハプテン糖であるラクトースを２０μＭの濃度でＦＡＣＳに加えておいた。陽性細胞を２４ウエルディッシュにまき、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で５％ＣＯ２存在下で培養を行った。ラクトースは、細胞に結合したＰＮＡレクチンが細胞毒性を与える可能性があるため、ＰＮＡレクチン陽性細胞から遊離させるために使用した。２週間後、ＰＮＡレクチンで細胞を染色し、ＰＮＡ陽性細胞の割合を調べた（図１５、１ｓｔ  ＰＮＡ（＋））。
２回目のソーティングはＰＮＡレクチン陽性細胞画分を約０．２５％前後になるように選別のウインドウを設定し、１回目と同様の方法により行った（２，３５２個／６．３×１０５個）。２週間培養後、ＰＮＡレクチンで細胞を染色し、ＰＮＡ陽性細胞の割合を調べた（図１５、２ｎｄ  ＰＮＡ（＋））。
（３）ＰＮＡレクチン陽性細胞のクローン化
２回目のソーティングで回収したＰＮＡレクチン陽性細胞を、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で懸濁した。平底９６ウエルプレートに２００μｌずつ５０ウエルにまき、培養を行った。ウエル内のコロニーが肉眼で確認できるようになった時点で、１コロニー／ウエルとなったウエルを選び、ＥＤＴＡ／ＰＢＳで回収し、２４ウエルプレートに継代培養した。１コロニー／ウエルとなったものは、５０ウエル中１９ウエルであった。２４ウエルプレートでの培養がコンフルエントになった時点で、それぞれのクローン細胞のＰＮＡレクチンとの結合性を調べた。１９ウエル中、１３ウエルの細胞がＰＮＡで強く染色され、ＰＮＡレクチン陽性細胞クローンが複数得られた。その一つのクローン２３について図１５に示す（ｃｌｏｎｅ２３）。図１５はの上段は、分取（ソーティング）前、１回目のソーティング後、及び２回目のソーティング後の蛍光強度を示す。また図１５の下段に、２回目のソーティング後に得られたクローン２３の蛍光強度を示す。図１５の右下に示すグラフより、ＦＩＴＣの蛍光強度は、親株のＣＨＯ細胞では３．２であるのに対し、クローン２３では約１００倍の２６８．５であることが示された。
（４）ＰＮＡレクチン陽性細胞クローン１２のＦＬＡＧタグ発現の検討
上記（３）で得られたクローンの一つ（クローン１２）について、外来遺伝子産物である改変ＶＩＰ３６が発現しているか否かを、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検討した。改変ＶＩＰ３６遺伝子を作製する際に、そのＮ末端にＦＬＡＧタグ配列を付加するように設計してあるため、改変ＶＩＰ３６は抗ＦＬＡＧ抗体で染色することによりその発現を調べることができる。そこで、７０％コンフルエントに培養したＰＮＡレクチン陽性細胞クローン１２をＥＤＴＡ／ＰＢＳで回収した後、抗ＦＬＡＧ抗体（３．３μｇ／ｍｌ）及びビオチン化ＰＮＡ（３．３μｇ／ｍｌ）で同時に氷上にて３０分間にわたり反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、さらにＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）、ＰＥ（フィコエリスリン）標識ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ）で氷上にて２０分間反応させ、アナライザー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）で細胞の染色強度を解析した（図１６）。図１６において、「なし」は一次抗体に相当するものをなにも加えていない場合を、「対照抗体」はＣＨＯ細胞に結合しないことがわかっている抗ラットＩｇＧ抗体を、「ＰＮＡ」はビオチン化ＰＮＡレクチンを、「抗ＦＬＡＧ抗体」は抗ＦＬＡＧ抗体を、それぞれ一次抗体として反応させ細胞を染色した結果を表す。クローン１２細胞は、発現量は少ないながら、明らかにＦＬＡＧ陽性であった。
（５）クローン細胞に発現した改変ＶＩＰ３６遺伝子解析
種々のＰＮＡレクチン陽性細胞クローンからのｍＲＮＡの抽出は、μＭＡＣＳシステム（第一化学薬品）を用いて行った。１０ｃｍディッシュ４枚に５０〜６０％コンフルエントになるまで培養した細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、溶解／結合バッファー（第一化学薬品、キット内に添付されているもの）に懸濁させたのち細胞を破壊した。オリゴ（ｄＴ）マイクロビーズ（第一化学薬品）にｍＲＮＡをアニールさせ、ＭＡＣＳカラムにアプライした。カラムをさらに溶解／結合バッファー、洗浄バッファー（第一化学薬品、キット内に添付されているもの）で洗浄した後、溶出バッファー（第一化学薬品、キット内に添付されているもの）を加えて、カラムからｍＲＮＡを溶出させた。１．１×１０７個の細胞から、６．３ｍｇのｍＲＮＡを得た。
１ｍｇのｍＲＮＡを２０μｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶かし、オリゴ（ｄＴ）１μｇ加え、７０℃にて１０分間加熱後、氷上に戻した。１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μｌ、０．１Ｍ  ｄＴＴ  ４μｌ、４０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅインヒビター２μｌ、５×ファーストストランドバッファー８μｌ加え、４２℃で暖めた後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ２μｌ加え、４２℃にて５０分間反応させた。この反応液を次のＰＣＲ反応の鋳型に用いた。ライブラリー作製の際に用いたＶＩＰ３６遺伝子５’末端と３’末端のオリゴＤＮＡプライマー（実施例１、ＶＩＰｒａｎ１，５）を使って、ＰＣＲ反応を行った。反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、変性９４℃にて１５秒間、アニーリング５１℃にて３０秒間、伸長６８℃にて１分間の条件で３５サイクル行った。アガロース電気泳動により、約９６０塩基対に相当するバンドが確認され、このバンドのＤＮＡを回収した。回収した遺伝子はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫのＳｍａＩサイトに組み込み、大腸菌内で増幅後抽出して、その塩基配列を決定した。クローン１２に導入されていた改変ＶＩＰ３６をコードする遺伝子を解析した結果、改変したループをコードする塩基配列が５’ＧＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴ３’（配列番号１６）であり、予想されるアミノ酸配列はＡｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号１７）であった。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明により、糖鎖改変方法及び改変型糖鎖を有するタンパク質を発現する細胞が提供される。特定の構造を有する糖鎖及びそのような糖鎖を有するタンパク質は、医薬分野において必要とされており、それらを簡便かつ迅速に製造できるため、本発明に係る糖鎖改変方法及び改変型糖鎖を有するタンパク質を発現する細胞は有用である。
また、本発明により、多様な糖鎖を発現する細胞からなる糖鎖ライブラリーを作製することができ、未知の糖鎖を生成し、その有用性を検討することも可能となる。
配列フリーテキスト
配列番号５〜１６：合成オリゴヌクレオチド（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ又はＣ）
配列番号１７：合成ペプチド
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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