(57)【要約】哺乳類細胞内で安定的に維持され、それが保持する目的遺伝子の発現が効率的に行われ得る哺乳類人工染色体を提供する。哺乳類セントロメア配列及び選択マーカー遺伝子を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターとを哺乳類宿主細胞に導入し、前記選択マーカー遺伝子を利用して形質転換細胞を選択し、選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択することにより、哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、及び機能配列を有し、環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体を構築する。
2004022741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を還択する第２工程と、及び
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。
【請求項２】
哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、及び
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。
【請求項３】
前記第１ベクターが選択マーカー遺伝子を有し、前記第２工程における形質転換細胞の選択は該選択マーカー遺伝子を利用して行われる、請求の範囲第１又項は第２項に記載の作製方法。
【請求項４】
前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の作製方法、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
【請求項５】
前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項６】
前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、請求の範囲第５項に記載の作製方法。
【請求項７】
前記哺乳類セントロメア配列のサイズは約５０ｋｂ以下である、請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項８】
前記機能配列が目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列からなる、請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項９】
前記目的遺伝子はハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子である、請求の範囲第８項に記載の作製方法。
【請求項１０】
前記目的遺伝子はヒトグアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼｌの構造遺伝子である、請求の範囲第８項に記載の作製方法。
【請求項１１】
前記機能配列はヒトβグロビン遺伝子群全領域をコードする配列である、請求の範囲第８項に記載の作製方法。
【請求項１２】
前記機能配列は、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列からなる、請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１３】
前記挿入用配列がｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、請求の範囲第１２項に記載の作製方法。
【請求項１４】
前記第１工程において導入する、前記第１ベクターと前記第２ベクターの量比はモル比で約１０：１〜約１：１０の範囲にある、請求の範囲第１項〜第１３項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１５】
前記第２ベクターとして、それに含まれる機能配列が互いに異なる複数のベクターが使用される、請求の範囲第１項〜第１４項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１６】
前記第２ベクターがインスレーター配列をさらに含む、請求の範囲第１項〜第１５項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載の作製方法によって得られ、
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、及び機能配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項１８】
請求の範囲第１項〜１６項のいずれかに記載の作製方法によって得られ、
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、並びに目的遺伝子及びその制御領域をコードする機能配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項１９】
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、並びに目的遺伝子（ハウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項２０】
前記目的遺伝子はヒトグアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼｌの構造遺伝子である、請求の範囲第１９項に記載の哺乳類人工染色体。
【請求項２１】
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、並びに目的遺伝子（ハウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項２２】
前記機能配列はヒトβグロビン遺伝子群全領域からなる、請求の範囲第２１項に記載の哺乳類人工染色体。
【請求項２３】
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項２４】
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項２５】
前記挿入用配列がｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、請求の範囲第２３項又は第２４項に記載の作製の哺乳類人工染色体。
【請求項２６】
前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第１７項〜第２５項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
【請求項２７】
前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、請求の範囲第１７項〜第２５項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
【請求項２８】
前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、請求の範囲第２７項に記載の哺乳類人工染色体。
【請求項２９】
前記機能配列又は前記挿入用配列を複数個有する、請求の範囲第１７項〜第２８項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
【請求項３０】
インスレーター配列をさらに含む、請求の範囲第１７項〜第２９項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
【請求項３１】
請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する哺乳類細胞。
【請求項３２】
請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有するヒト細胞。
【請求項３３】
請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する胚性幹細胞。
【請求項３４】
請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載の作製方法によって得られる哺乳類人工染色体又は請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する工程を含む、
ことを特徴とする、前記機能配列又は前記挿入用配列が長期間安定して維持可能な状態に導入された哺乳類細胞の作製方法。
【請求項３５】
哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から、哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第４工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する第５工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項３６】
哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第４工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する第５工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項３７】
哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から、哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させる第４工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する第５工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる第６工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
【請求項３８】
哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させる第４工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する第５工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる第６工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
【請求項３９】
請求の範囲第３７項又は第３８項に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲット細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４０】
請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞から哺乳類人工染色体を分離する工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４１】
請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞と、を融合させる工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
【請求項４２】
請求の範囲第４１項に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲット細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４３】
前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞である、請求の範囲第３４項、第３５項、第３６項、第３９項、第４０項、及び第４２項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４４】
前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞を、特定の組織の細胞へと分化するように誘導してなる細胞である、請求の範囲第３４項、第３５項、第３６項、第３９項、第４０項、及び第４２項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４５】
前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、哺乳類の受精卵である、請求の範囲第３４項、第３５項、第３６項、第３９項、第４０項、及び第４２項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４６】
哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、
サイズが約５０ｋｂ以下の哺乳類セントロメア配列、及び選択マーカー遺伝子を含むベクター。
【請求項４７】
前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第４６項に記載のベクター、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
【請求項４８】
前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、請求の範囲第４６項又は第４７項に記載のベクター。
【請求項４９】
前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、請求の範囲第４８項に記載のベクター。
【請求項５０】
哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、
ｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列と、
インスレーター配列と、を含むベクター。
【請求項５１】
哺乳類人工染色体が導入されてなる、非ヒト形質転換動物。
【請求項５２】
前記哺乳類人工染色体が、請求の範囲第１７項〜第１９項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、請求の範囲第５１項に記載の非ヒト形質転換動物。
【請求項５３】
哺乳類人工染色体が導入されてなる、ＸＯ型マウス胚性幹細胞。
【請求項５４】
前記哺乳類人工染色体が、請求の範囲第１７項〜第１９項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、請求の範囲第５３項に記載のＸＯ型マウス胚性幹細胞。
【請求項５５】
哺乳類人工染色体が導入されてなる、メスキメラマウス。
【請求項５６】
前記哺乳類人工染色体が、請求の範囲第１７項〜第１９項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、請求の範囲第５５項に記載の、メスキメラマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は哺乳類人工染色体に関する。詳しくは、哺乳類人工染色体の作製方法、哺乳類人工染色体、及び哺乳類人工染色体の利用に関する。本発明において提供される哺乳類人工染色体は、例えば所望の遺伝子を哺乳類細胞内へと運搬するためのベクターとして遺伝子治療、細胞、組織、又は哺乳類個体の形質転換等に利用することができる。
【背景技術】  有糸分裂において安定して維持されるヒト人工染色体（ＨＡＣ（ｓ））は数メガｂｐのサイズを有し、そしていくつものＣＥＮＰ−Ｂボックスを有する線状（ＹＡＣ）又は環状（ＢＡＣ又はＰＡＣ）であり、数１０キロベースのヒトαサテライト（アルフォイド）を含む前駆体ＤＮＡコンストラクトの導入によってヒト線維芽細胞株ＨＴ１０８０内でしばしばｄｅ  ｎｏｖｏに形成される（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｈｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｅｂｅｒｓｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。そのようなＨＡＣ上には必須キネトコアタンパク質が検出されるので、導入されたアルファサテライトアレイは真のヒト染色体におけるものに類似した活性型セントロメア／キネトコア構造をｄｅ  ｎｏｖｏに組み立てることができる（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｈｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｅｂｅｒｓｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＨＡＣは細胞内タンパク因子を利用して細胞周期ごとに複製されるので、ＨＡＣはアルフォイド配列内に一つ又は複数の複製起点も有する。テロメア配列を有するアルフォイドＹＡＣから調製された線状のＨＡＣはその末端に機能的テロメア構造を獲得したが、ＢＡＣ又はＰＡＣから調製された環状のＨＡＣはテロメア構造を有していなかった（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｅｂｅｒｓｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
遺伝子療法によるヒト疾患の治療は取り組む価値があり且つ将来有望な分野である。我々は、欠損ヒト遺伝子の修復やそれらの機能又は制御機構を詳細に特徴付けることに利用し得る数万もの遺伝子を手にしているが、効率的な遺伝子輸送技術の開発には依然として大きな障害が存在する。哺乳動物細胞用として現在利用可能なベクターはそのほとんどが小さなウイルス由来である（Ｍｉｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｐｆｅｉｔｅｒ  ＆  Ｖｅｒｎａ  ２００１）。これらのベクターは所望の遺伝子（導入遺伝子）を高い効率で遺伝子導入できるという利点を有するものの、そのクローニング許容サイズは限られている。これらのベクターは小さすぎるために組織特異的制御領域を含む長いゲノム断片を挿入することができない。さらには、導入遺伝子はたいていの場合、宿主細胞の染色体内へのランダムインテグレーションの後に限って安定して維持され、そのような場合の遺伝子発現は通常予測不可能であって（ほとんどの場合は抑制される）、導入遺伝子の真の制御領域による制御は行われない。更に悪いことには、このような導入遺伝子を組み込むステップは好ましくない突然変異（ミュータジェネシス）を伴うことがある。
一方ＨＡＣは、制御領域を含み、１００ｋｂを越える大きさのＤＮＡからなる大きな導入遺伝子を保持する能力を備える。導入遺伝子を含むＨＡＣは、導入遺伝子及びアルフォイド配列の両者を有する前駆コンストラクトから（Ｍｅｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、又はアルフォイド配列と導入遺伝子をそれぞれ別個に有した前駆コンストラクトからｄｅ  ｎｏｖｏに形成され得る（Ｇｒｉｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。したがって、ＨＡＣは治療用途におけるベクターとしてだけでなく、大きなゲノム断片を用いることによってはじめて可能となる、組織又は器官特異的な遺伝子発現制御を解析するモデルシステムとしても利用できると考えられる。
【発明の開示】
本発明は以上の背景の下なされたものであって、その目的は哺乳類細胞内で遺伝子などの目的とする機能配列を安定的に発現させる技術を提供することである。具体的には、本発明は哺乳類細胞内で安定的に維持され、それが保持する機能配列の発現が効率的に行われる哺乳類人工染色体、その作製方法、及びそれを利用した細胞等の形質転換方法等を提供することを目的とする。
本発明者らは以上の目的に鑑み、哺乳類人工染色体を人工染色体前駆体から形成させる過程で、機能配列としての目的遺伝子を取り込む方法を探用し、目的遺伝子（ＧＣＨ１遺伝子）が発現可能に保持される哺乳類人工染色体の作製を試みた。即ち、環状ベクターであるＢＡＣを人工染色体前駆体として使用し、ＧＣＨ１遺伝子全体及びその上流制御領域をカバーする約１８０ｋｂのゲノム領域を保持するＢＡＣ（ＧＣＨ１−ＢＡＣ）と、ヒトセントロメア配列として約５０ｋｂ又は約１００ｋｂのアルフォイド配列を含むＢＡＣ（アルフォイドＢＡＣ）をヒト線維芽細胞であるＨＴ１０８０細胞にコトランスフェクトした。その結果、ＧＣＨ１遺伝子を複数コピー有するヒト人工染色体（ＨＡＣ）を構築することに成功し、得られたＨＡＣは選択操作を行わなくともヒト細胞及びマウス細胞の両者において安定して維持されることが示された。さらに検討を行ったところ、このＨＡＣを有する形質転換株においてＧＣＨ１活性の上昇が認められ、また、その活性は染色体上に存在する場合と同様にインターフェロンγの誘導に応答性を示すものであった。即ち、構築されたＨＡＣから自然な状態のＧＣＨ１遺伝子の発現が確認された。
一方、線状ベクターであるＹＡＣを前駆体として使用し、ＢＡＣの場合と同様の方法でヒトβグロビン遺伝子群全領域を保持するヒト人工染色体の構築に成功した。
更に、構築されたＨＡＣをマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に移入することに成功するとともに、得られたＥＳ細胞を利用してキメラマウス（ＨＡＣ保有マウス）の作出にも成功した。このことは、個体レベルでの遺伝子導入ツールとして人工染色体を利用できることが実験的に確認されたという、極めて重要な意味をもつ。また、ＸＹ核型に加えてＸＯ核型ＥＳ細胞に対してもＨＡＣの移入に成功し、さらにそれを用いてＨＡＣ保有のメスキメラマウスの作出にも成功した。尚、メスキメラマウスが利用できれば哺乳類人工染色体の伝達が容易になると考えられている。
また、遺伝子挿入部位を備える哺乳類人工染色体を作製する際に、後に導入される遺伝子の発現を促進する目的でインスレーター配列を組み込んで哺乳類人工染色体の構築を行ったことろ、驚くべきことに哺乳類人工染色体への遺伝子導入効率が高くなった。つまり、インスレーター配列を用いることによって、目的遺伝子を保持する哺乳類人工染色体を高効率で作製できることが判明した。
本発明は以上の検討の結果得られた知見に基づいてなされたものであって、以下の構成を提供する。
［１］  哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、及び
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。
［２］  哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、及び
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。
［３］  前記第１ベクターが選択マーカー遺伝子を有し、前記第２工程における形質転換細胞の選択は該選択マーカー遺伝子を利用して行われる、１又は２に記載の作製方法。
［４］  前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、１〜３のいずれかに記載の作製方法、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
［５］  前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、１〜４のいずれかに記載の作製方法。
［６］  前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、５に記載の作製方法。
［７］  前記哺乳類セントロメア配列のサイズは約５０ｋｂ以下である、１〜６のいずれかに記載の作製方法。
［８］  前記機能配列が目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列からなる、１〜７のいずれかに記載の作製方法。
［９］  前記目的遺伝子はハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子である、８に記載の作製方法。
［１０］  前記目的遺伝子はヒトグアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼｌの構造遺伝子である、８に記載の作製方法。
［１１］  前記機能配列はヒトβグロビン遺伝子群全領域をコードする配列である、８に記載の作製方法。
［１２］  前記機能配列は、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列からなる、１〜７のいずれかに記載の作製方法。
［１３］  前記挿入用配列がｌｏＸＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、１２に記載の作製方法。
［１４］  前記第１工程において導入する、前記第１ベクターと前記第２ベクターの量比はモル比で約１０：１〜約１：１０の範囲にある、１〜１３のいずれかに記載の作製方法。
［１５］  前記第２ベクターとして、それに含まれる機能配列が互いに異なる複数のベクターが使用される、１〜１４のいずれかに記載の作製方法。
［１６］  前記第２ベクターがインスレーター配列をさらに含む、１〜１５のいずれかに記載の作製方法。
［１７］  １〜１６のいずれかに記載の作製方法によって得られ、
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、及び機能配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
［１８］  １〜１６のいずれかに記載の作製方法によって得られ、
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、並びに目的遺伝子及びその制御領域をコードする機能配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
［１９］  哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、並びに目的遺伝子（ハウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
［２０］  前記目的遺伝子はヒトグアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼｌの構造遺伝子である、１９に記載の哺乳類人工染色体。
［２１］  哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、並びに目的遺伝子（ハウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
［２２］  前記機能配列はヒトβグロビン遺伝子群全領域からなる、２１に記載の哺乳類人工染色体。
［２３］  哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
［２４］  哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
［２５］  前記挿入用配列がｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、２３又は２４に記載の作製の哺乳類人工染色体。
［２６］  前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、１７〜２５のいずれかに記載の哺乳類人工染色体、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
［２７］  前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、１７〜２５のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
［２８］  前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、２７に記載の哺乳類人工染色体。
［２９］  前記機能配列又は前記挿入用配列を複数個有する、１７〜２８のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
［３０］  インスレーター配列をさらに含む、１７〜２９のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
［３１］  １７〜３０のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する哺乳類細胞。
［３２］  １７〜３０のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有するヒト細胞。
［３３］  １７〜３０のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する胚性幹細胞。
［３４］  １〜１６のいずれかに記載の作製方法によって得られる哺乳類人工染色体又は１７〜３０のいずれかに記載の哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する工程を含む、
ことを特徴とする、前記機能配列又は前記挿入用配列が長期間安定して維持可能な状態に導入された哺乳類細胞の作製方法。
［３５］  哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から、哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第４工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する第５工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
［３６］  哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第４工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する第５工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
［３７］  哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から、哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させる第４工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する第５工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる第６工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
［３８］  哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させる第４工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する第５工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる第６工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
［３９］  ３７又は３８に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲット細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
［４０］  １７〜３０のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞から哺乳類人工染色体を分離する工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
［４１］  １７〜３０のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞と、を融合させる工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
［４２］  ４１に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲット細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
［４３］  前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞である、３４、３５、３６、３９、４０、及び４２のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
［４４］  前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞を、特定の組織の細胞へと分化するように誘導してなる細胞である、３４、３５、３６、３９、４０、及び４２のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
［４５］  前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、哺乳類の受精卵である、３４、３５、３６、３９、４０、及び４２のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
［４６］  哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、
サイズが約５０ｋｂ以下の哺乳類セントロメア配列、及び選択マーカー遺伝子を含むベクター。
［４７］  前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、４６に記載のベクター、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
［４８］  前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、４６又は４７に記載のベクター。
［４９］  前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、４８に記載のベクター。
［５０］  哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、
ｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列と、
インスレーター配列と、を含むベクター。
［５１］  哺乳類人工染色体が導入されてなる、非ヒト形質転換動物。
［５２］  前記哺乳類人工染色体が、１７〜１９のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、５１に記載の非ヒト形質転換動物。
［５３］  哺乳類人工染色体が導入されてなる、ＸＯ型マウス胚性幹細胞。
［５４］  前記哺乳類人工染色体が、１７〜１９のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、５３に記載のＸＯ型マウス胚性幹細胞。
［５５］  哺乳類人工染色体が導入されてなる、メスキメラマウス。
［５６］  前記哺乳類人工染色体が、１７〜１９のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、５５に記載の、メスキメラマウス。
【図面の簡単な説明】  図１は、形質転換株内におけるコトランスフェクトＢＡＣの運命についてまとめた表である。ＧＣＨ１−ＢＡＣに加えてＣＭＶ／α１００ＢＡＣ又はＳＶ／α５０ＢＡＣを用いたコトランスフェクションによって得られたＢＳ耐性細胞株をＦＩＳＨで解析した結果が示される。「ＨＡＣ上」は、α２１−ＩアルフォイドＤＮＡプローブとＢＡＣベクタープローブの両方で検出された人工染色体を保有する細胞株を示す。これらの細胞株のメタフェイズ・スプレッドの９５％以上においてそれぞれ一つのＨＡＣが検出された。残りの細胞では、導入されたＢＡＣはＨＴ１０８０の染色体に組込まれたか（染色体上）、又はＦＩＳＨ解析においてシグナルが検出できなかった（検出されず）。「ＧＣＨを保有するＨＡＣ」は、ＧＣＨ１遺伝子のシグナルが認められたＨＡＣを保有する細胞株を示す。
図２は、ＨＡＣ保有細胞株におけるＧＣＨ１活性の測定結果をまとめた表である。ＩＦＮ−γ誘導の存在下、及び非存在下においてＨＴ／ＧＣＨ２−１０、ＨＴ／ＧＣＨ５−１８及びＨＴ１０８０細胞におけるＧＣＨ１活性を測定した結果が示される。表中の各データはこれら三つの独立した実験から得られた平均値±標準偏差で表されている。
図３は、アルフォイドＢＡＣ及びＧＣＨ１−ＢＡＣのコンストラクトを示す図である。ＣＭＶ／α１００  ＢＡＣは、ＢＡＣベクター内にヒト２１番染色体由来の１００ｋｂのα２１−Ｉアルフォイド配列、及び哺乳類細胞を選択するためのＣＭＶ−Ｂｓｄ（アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳデアミナーゼ遺伝子）選択マーカーを含む。ＳＶ／α５０ＢＡＣは、５０ｋｂのα２１−Ｉアルフォイド配列、及びＳＶ２−Ｂｓｒ（バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来のＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳデアミナーゼ遺伝子）選択マーカーを含む。ＧＣＨ１−ＢＡＣはＧＣＨ１遺伝子を含む１８０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を含む。ＦＩＳＨ解析用、サザン解析用、及びＧＣＨ１遺伝子のエクソン（１〜６）用のプローブとして使用された領域は、それぞれハッチングを施したボックス、黒塗りのボックス、及び白抜きのボックスで表される。ＢＡＣベクターはＥ．ｃｏｌｉ内での選択のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ）を含む。
図４は、ＨＡＣ上のＧＣＨ１シグナルを検出するためのＦＩＳＨ解析の結果を示す図である。ＨＴ／ＧＣＨ２−１０細胞株（ＣＭＶ／α１００ＢＡＣとＧＣＨ１−ＢＡＣのコトランスフェクションによって形成された）、及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８（ＳＶ／α５０ＢＡＣとＧＣＨ１−ＢＡＣのコトランスフェクションによって形成された）にＧＣＨ１エクソン１プローブ（緑）及びＢＡＣベクタープローブ（赤）を（左欄）、又はＧＣＨ１エクソン４５６（緑）及びＧＣＨ１エクソン１（赤）を（右欄）ハイブリダイズさせている。矢じりはＨＡＣを示す。
図５は、ＧＣＨ１−ＨＡＣの構造解析の結果を示す図である。ＨＡＣ内のＧＣＨ１遺伝子を制限酵素分析した結果が示される。ＨＴ／ＧＣＨ２−１０、ＨＴ／ＧＣＨ５−１８、及びトランスフェクションを行っていないＨＴ１０８０から調製したゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ（Ａ）又はＳｔｕＩ（Ｂ）で消化し、常法的なゲル電気泳動で分画した。内在性ＧＣＨ１遺伝子座及びＧＣＨ１−ＢＡＣを使用した場合に、ＵＳプローブ（Ａ）及びエクソン６プローブ（Ｂ）によって検出されるＢａｍＨＩ断片及びＳｔｕＩ断片の予想されるサイズが上段に示される。
図６は、ドットハイブリダイゼーションによるＨＡＣ内のＧＣＨ１−ＢＡＣ及びアルフォイドＢＡＣのコピー数の推定に用いたグラフ図である。左欄はＧＣＨ１エクソン６プローブで得られた強度値である。ＧＣＨ１−ＢＡＣ（０．４，０．２，０．１ｎｇ）の入力ＤＮＡと、ＨＴ１０８０、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８からそれぞれ調製したゲノムＤＮＡ（１．０，０．５μｇ）とをＧＣＨ１エクソン６プローブとハイブリダイズさせた。０．１ｎｇのＧＣＨ１−ＢＡＣ  ＤＮＡの強度値を基準値として使用した。右欄はＢＡＣベクタープローブで得られた強度値である。ＧＣＨ１−ＢＡＣ（０．５，０．１，０．０５ｎｇ）と、ＨＴ１０８０、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８からそれぞれ調製したのゲノムＤＮＡ（０．５，０．２５μｇ）とをＢＡＣベクタープローブとハイブリダイズさせた。各プローブで得られたシグナル強度はフジ・イメージアナライザーＢＡＳ１０００を使用して決定した。
図７は、ＨＡＣ保有細胞株とマウスＡ９細胞との細胞融合によって得られたハイブリッド細胞をＦＩＳＨ解析した結果を示す図である。ＨＴ／ＧＣＨ５−１８細胞株をＰＥＧを利用してＡ９細胞と融合させた。ＢＳ耐性及びウワバイン耐性の細胞株をＦＩＳＨで解析した。メタフェイズ・スプレッドをＢＡＣベクタープローブ（赤）及びＡｌｕ反復配列プローブ（緑）と（Ａ）、又はＢＡＣベクタープローブ（緑）及びマウス・マイナーサテライトプローブ（赤）と（Ｂ）ハイブリダイズさせた。矢印はＨＡＣを示す。
図８は、ＨＡＣを移入したＥＳ細胞をＦＩＳＨ解析した結果を示す図である。ＡはアルフォイドＤＮＡ及びＢＡＣベクターをプローブとして検出した結果であり、ＢはＧＣＨ１のエクソン１領域及びＢＡＣベクターをプローブとして検出した結果であり、ＣはマウスマイナーサテライトＤＮＡとＢＡＣベクターをプローブとして検出した結果である。
図９は、ＥＳ細胞中でのＨＡＣの安定性を解析した結果を示す図である。黒塗りのボックスはブラストサイジンＳ存在下（ｂｓ＋）で培養した場合におけるＨＡＣ保有細胞の割合であり、白抜きのボックスはブラストサイジンＳ非存在下（ｂｓ−）で培養した場合におけるＨＡＣ保有細胞割合である。
図１０（Ａ）は、Ａ２０１Ｆ４．３（１レーン及び２レーン）及び７ｃ５ｈＴＥＬ（３レーン及び４レーン）をＰＥＧＥで分析した結果を示す図である。宿主の染色体に加えて１５０ｋｂ又は１００ｋｂにグロビン又はアルフォイドＹＡＣが存在するのが認められる（１レーン及び３レーン）。ＹＡＣを精製、濃縮し（２レーン及び４レーン）、混合したＹＡＣ（５レーン）をＨＴ１０８０細胞に導入した。図中のＭは分子量マーカーを示す。図１０（Ｂ）は、ＹＡＣの導入によって得られた形質転換株に対するＦＩＳＨ解析の結果を示す図である。形質転換株に認められたミニ染色体が矢印で示される（上段）。また、ＹＡＣの腕部（緑色：矢じり）とアルフォイド（赤色：矢印）のシグナルが存在する（下段）。ＤＡＰＩで染色している（青色）。
図１１は、ミニ染色体を保有する形質転換株に対するＦＩＳＨ解析の結果を示す図である。プローブとしてＹＡＣの腕部（緑色、矢じり）及びアルフォイド（赤色、矢印）を用いた結果（左上）、同図下段に示されるβグロビンのＡ（緑、矢じり）及びアルフォイド（赤、矢印）を用いた結果（右上）、βグロビンのＢ（緑、矢じり）及びアルフォイド（赤、矢印）を用いた結果（左下）、βグロビンのＣ（緑、矢じり）及びアルフォイド（赤、矢印）を用いた結果（右下）である。
図１２は、ミニ染色体を保有する形質転換株である二つのクローン（Ｃ１１及びＣ２９）に対してヒトβグロビンプローブ（配列番号５、配列番号６、及び配列番号９）又はテロメア反復配列（配列番号８の配列が繰り返されてなる約５００ｂｐの配列）をプローブとして行ったＦＩＳＨ解析の結果を示す図である。青、緑、赤はそれぞれＤＡＰＩ、ヒトβグロビン、テロメアのシグナルである。
図１３は、Ａ９細胞とミニ染色体保有細胞の融合により得られた形質転換細胞のＦＩＳＨ解析結果を示す図である。左上欄はＤＡＰＩ（青）による染色結果、右上欄はヒトβグロビンプローブ（配列番号５、配列番号６、及び配列番号９の混合）によるシグナル（緑）を検出した結果、左下欄はアルフォイドプローブ（配列番号３）によるシグナル（赤）を検出した結果、右下欄はこれらを重ね合わせたものである。アルフォイドのシグナルはミニ染色体にのみ認められる。
図１４は、ミニ染色体のファイバーＦＩＳＨ解析の結果を示す図である。上段はβグロビンプローブ（配列番号５、配列番号６、及び配列番号９の混合）を用いた結果、中段はアルフォイドプローブ（配列番号３）を用いた結果、下段は以上の二つの結果を重ね合わせたものである。アルフォイド及びβグロビンの各シグナルはそれぞれ赤及び緑で表される。
図１５は、ＨＡＣ保有細胞におけるグロビン遺伝子の転写量を解析した結果を示す図である。上段はＲＴ−ＰＣＲ法による解析結果、下段はリアルタイムＰＣＲ法による解析結果である。図中の＋及びはそれぞれＨＡＣ保有及びＨＡＣ非保有を表す。
図１６（ａ）は、ＨＡＣ保有ＥＳ細胞株を用いて作出されたキメラマウスを示す図である。図１６（ｂ）は、ＨＡＣ保有ＥＳ細胞を導入した胚を移植したマウス（仮親）から自然分娩により得られた仔マウス（生後２４時間）の各種臓器由来ＤＮＡに対するＰＣＲ解析の結果である。ＴＴ２はＥＳ細胞を、ＴＴ２／ＧＣＨ２−１０はＨＡＣ保有ＥＳ細胞を、ｂｒａｉｎは脳を、ｈｅａｒｔは心臓を、ｔｈｙｍｕｓは胸腺を、ｌｉｖｅｒは肝臓を、ｓｐｌｅｅｎは脾臓を、ｋｉｄｎｅｙは腎臓をそれぞれ表す。また、ｃ１〜ｃ１５は各個体を表す。図１６（ｃ）は、ＥＳ細胞を用いて作出したマウス個体に対するＦＩＳＨ解析の結果を示す図である。アルフォイド配列のシグナル及びＢＡＣベクターのシグナルが観察される（矢じり）。
図１７は、ＨＡＣ保有のＸＯ核型ＥＳ細胞株を用いて作出されたキメラマウスを示す図である。
図１８は、哺乳類人工染色体の構築に使用したアクセプター前駆体ＢＡＣ−ＬＣＲ−ｌｏｘ７１の特徴部分を示す図である。
図１９は、ヒトβグロビンＬＣＲ及びｌｏｘ部位を含む前駆体を使用して構築された人工染色体において、ＥＧＦＰ強度を測定した結果の図である。ＨＡＣ：ヒトβグロビンＬＣＲ及びｌｏｘ部位を含む前駆体を使用して構築された人工染色体、ＩＮＴ１及びＩＮＴ２：ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を染色体上のランダムな場所に組み込んだ安定株の中から、ＥＧＦＰの蛍光強度の高い順に選択した二つの細胞株。右下のグラフは、各測定結果をグラフ化したものである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の第１の局面は哺乳類人工染色体（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）の作製方法に関し、環状ベクターを前駆体として用いる方法と線状ベクターを前駆体として用いる方法を包含する。尚、以下の説明において哺乳類人工染色体をＭＡＣともよび、これにはヒト人工染色体（ｈｕｍａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；以下、「ＨＡＣ」ともいう）が含まれる。
（哺乳類人工染色体の前駆体としてのベクター）
本発明では哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）前駆体として第１ベクター（環状ベクター又は酵母人工染色体）と第２ベクター（環状ベクター又は酵母人工染色体）が用いられる。第１ベクターは哺乳類セントロメア配列を含み、ＭＡＣの複製及び安定的な維持に必要なセントロメアを供給し、他方、第２ベクターは機能配列を含み、ＭＡＣに組込まれる機能配列の供給源となる。それに含まれる機能配列が互いに異なる複数種類の第２ベクターを使用することもできる。即ち、例えば第１ベクターと、それに含まれる機能配列が異なるベクターを２種類使用して本発明のＭＡＣを作製することができる。このように複数種類の第２ベクターを使用すれば、複数の機能配列が発現可能に保持されたＭＡＣを構築することが可能となる。このことは例えば、協同的に作用する複数の遺伝子などを同時に導入するためのツールとして本発明のＭＡＣを利用できることを意味する。
第１ベクター及び第２ベクターとして環状ベクター又は線状ベクターが使用される。環状ベクターとしては細菌（大腸菌など）において自律複製できるＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）又はＰＡＣ（Ｐ１  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）を用いることができる。ＢＡＣ又はＰＡＣを使用することは、導入操作、増幅、維持などの取り扱いが容易であり、また様々な種類のものを入手可能であるといった利点を有する。
本発明で使用される環状ベクターは公知のＢＡＣ又はＰＡＣに必要な改変を施すことにより構築され得る。例えば、Ｂｅｌｏ−ＢＡＣ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ  ０１９１５−５５９９）を出発材料として、これに制限酵素処理等によって哺乳類セントロメア配列の挿入部位を作製し、この挿入部位に別途用意した哺乳類セントロメア配列を挿入することにより、哺乳類セントロメア配列を含む環状ベクター（第１ベクター）を構築することができる。一方、機能配列を含むベクター（第２ベクター）は、そのクローンを含むライブラリーが提供されている場合には当該ライブラリーから調製することができる。勿論のこと、第１ベクターと同様に、公知のベクターに遺伝子工学的手法を用いて第２のベクターを作製してもよい。
線状ベクターとしては酵母内で染色体として機能するＤＮＡコンストラクト（酵母人工染色体、以下、「ＹＡＣ」ともいう）が使用される。この場合の第１ベクターは哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列を少なくとも含む。ここで、「哺乳類テロメア」とは哺乳類の染色体のテロメア領域に存在する繰り返し配列をいう。ヒトテロメアは５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’が繰り返されて構成されており、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を作製する場合にはこの配列の繰り返しを含んでいるセントロメア配列を用いることが好ましい。
第１ベクター及び／又は第２ベクターが選択マーカー遺伝子を含んでいることが好ましい。これらのベクターを用いてトランスフォーメーション（トランスフェクション）を行った際に、選択マーカー遺伝子を利用して形質転換細胞を容易に選択することが可能となるからである。いずれかのベクターのみが選択マーカー遺伝子を含んでいることがさらに好ましい。選択マーカーの使用数を削減することにより、ＭＡＣの作製あるいはその利用の過程において必要な各選択操作がより簡便化されるからである。
さらに、第１ベクターのみが選択マーカー遺伝子を含んでいることが特に好ましい。かかる構成によれば、選択マーカー遺伝子を利用して哺乳類セントロメア配列が適切に導入された形質転換細胞を選択することができ、即ち染色体として機能するＤＮＡコンストラクトを保有する可能性の高い形質転換細胞を効率的に選択することが可能となる。その一方で、機能配列を含むベクター（第２ベクター）に選択マーカーを挿入する必要がなくなることから、選択マーカー遺伝子を含まないクローンの集合からなる市販のライブラリーから調製したベクターをそのままの状態で（即ち、選択マーカー遺伝子を挿入する操作を経ることなく）第２ベクターとして使用できるという利点も有する。加えて、第２ベクターが選択マーカー遺伝子を含む必要がないことは、その分だけ第２ベクターに挿入できるインサートＤＮＡのサイズに余裕ができ、結果としてより大きなサイズの機能配列を保持するＭＡＣの構築が可能となる。
（哺乳類セントロメア配列）
本発明において「哺乳類セントロメア配列」とは、哺乳類細胞内においてセントロメアとして機能する配列をいう。哺乳類セントロメア配列としては、例えばヒト染色体のアルファサテライト領域由来の配列を用いることができる。ここでの「アルファサテライト領域由来の配列」とはアルファサテライト領域の一部又は全部の配列、又はこれらいずれかの配列の一部に改変を施した配列を意味する。ここでの「一部に改変」とは、対象となる配列において１若しくは複数の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加することをいう。このような改変は複数の領域になされていてもよい。
ヒト染色体のアルファサテライト領域には一般に、５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’（配列番号１）からなるＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘと呼ばれる配列が規則的間隔で複数個配置されている（Ｍａｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ．ｖｏｌ．Ｈ７２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．ｐｐ３１−４３，１９９３；Ｙｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，５１６９−５１７７，１９９６）。本発明における哺乳類セントロメア配列は、好ましくはこのＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘを高頻度に有する領域を含んでいる。
ヒト２１番染色体のアルファサテライト領域由来の配列を用いることが好ましい。ヒト２１番染色体のアルファサテライト領域については詳細な検討がされておりα２１−Ｉと呼ばれる領域が存在する。α２１−Ｉ領域はアルフォイド１１量体繰り返しユニットと呼ばれる配列を備え、この繰り返しユニットでは５’−ＮＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ−３’（配列番号２）なるＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘが規則的間隔で複数個配置されている（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，３，１２４５−１２４７，１９９４）。
好ましくは、本発明における哺乳類セントロメア配列はこのようなアルフォイド１１量体繰り返しユニットを複数有する。ヒト２１番染色体のアルフォイド領域から分離され、同定された配列を配列番号３（約２５ｋｂのアルフォイド断片）に示す。
セントロメア配列は、構築された哺乳類人工染色体において適切な機能を有するセントロメアが形成されるのに十分な長さを有する。例えば約２５ｋｂ〜約１５０ｋｂのサイズ（例えば約５０ｋｂ、約８０ｋｂ、約１００ｋｂ）のセントロメア配列を用いる。好ましくは約８０ｋｂ以下、さらに好ましくは約５０ｋｂ以下のセントロメア配列を用いる。サイズの小さなセントロメア配列を用いることは、これを含む第１ベクターの分離、精製などの操作を容易とし、またクローニング及び／又は増殖時に生じ得る脱落、改変などの確率を低下させる。ここで、後述の実施例で示されるように、環状ベクター（ＢＡＣ）を用いた例において約５０ｋｂのアルフォイドＤＮＡをセントロメア配列として用いた場合においてもセントロメア／キネトコア構造を適切に形成可能な人工染色体が構築されることが確認されている。同様に、線状ベクター（酵母人工染色体）を用いた例において約８０ｋｂのアルフォイドＤＮＡをセントロメア配列として用いた場合においてもセントロメア／キネトコア構造を適切に形成可能な人工染色体が構築されることが確認されている。
哺乳類セントロメア配列は、適当なヒト細胞や、ＷＡＶ１７等のヒト染色体を保有する融合細胞、又はヒト以外の哺乳類細胞から調製され得る。例えば、これらの中のいずれかの細胞をアガロースプラグとして固定した後、制限酵素処理、パルスフィードゲル電気泳動（以下、「ＰＥＧＥ」ともいう）等によって目的のセントロメア配列を含むＤＮＡ断片を精製、濃縮する。その後、適当なベクターにクローニングし、使用に供する。
一方、哺乳類セントロメア配列を保有するクローンを含むライブラリーを利用できる場合には、これから適宜制限酵素処理等を用いて哺乳類セントロメア配列を取得することができる。たとえば、ＬＬ２１ＮＣ０２ライブラリー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用してα２１−Ｉアルフォイド断片を取得し、この断片を哺乳類セントロメア配列として使用することができる。この場合、取得したα２１−Ｉアルフォイド断片を複数用いて哺乳類セントロメア配列を構築してもよい。さらには、互いに大きさの異なるα２１−Ｉアルフォイド断片を複数取得し、これらを組合わせて哺乳類セントロメア配列を構築してもよい。
（哺乳類複製起点）
一般に哺乳類セントロメア配列内には一つ以上の複製起点が存在する。従って、通常、哺乳類セントロメア配列を含む第１ベクターには哺乳類複製起点が含まれる。使用する哺乳類セントロメア配列が哺乳類複製起点を含んでいない場合には、別途、哺乳類複製起点を第１ベクター又は第２ベクターに含有させる。但し、第２ベクターが保持する機能配列が既に哺乳類複製起点を含んでいる場合にはこの限りでない。
（機能配列）
機能配列はそれが発現することによって特定の作用が奏される配列をいい、典型的には目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列からなる。本発明の機能配列として、それが発現することによって特定の遺伝子発現の抑制や特定のＲＮＡの働きを抑制する等の機能を有する配列、例えばいわゆるアンチセンスＲＮＡやリボザイムＲＮＡ等をコードする配列を用いることもできる。
目的遺伝子としては種々の遺伝子を採用することができ、ヒトグアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼｌ（ＧＣＨ１）遺伝子、ヒトβグロビン遺伝子群、ＲＢやｐ５３などの癌抑制遺伝子、ｃ−ｍｙｃやｐ５３などのアポトーシス誘導遺伝子、サイトカイン、各種増殖因子、抗体、腫瘍抗原等をコードする遺伝子等をその例として挙げることができる。目的遺伝子をコードする配列はゲノムＤＮＡであってもｃＤＮＡであってもよい。
機能配列として、複数の目的遺伝子をコードする配列を含むものを用いることができる。このような配列としては、複数のタンパク質が相互作用して特定の効果が得られる場合において当該複数のタンパク質に対応する塩基配列を含むものや、一連の反応系に必要な複数の酵素に対応する塩基配列を含むものを例示することができる。このような場合には、各発現産物に対応する配列ごとにその発現を制御する配列を使用することも可能であるが、全ての発現産物或は一部（二つ以上）の発現産物の発現を一括して制御することが可能な配列を使用してもよい。例えば、複数の発現産物に対応する配列を一つのプロモーター配列の制御下に配置して構成したコンストラクトを使用することができる。
目的遺伝子の配列は例えば公知のライブラリーから調製することができる。目的遺伝子（及びその制御領域）の配列を含むベクタークローンからなるライブラリーを利用可能な場合には、これから調製される目的遺伝子（及びその制御領域）の配列を含むベクターを本発明の第２ベクター（又はその作製材料）として用いることもできる。例えば、ＣＩＴＢ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎ  ＢＡＣ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＲＰＣＩ−１１（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）Ｈｕｍａｎ  ＢＡＣ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｋｅｉｏ  Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ）、ＣＩＴＢ  Ｍｏｕｓｅ  ＢＡＣ  Ｌｉｂｒａｒｙ、ＲＰＣＩ−２２  Ｍｏｕｓｅ  ＢＡＣ  ＬｉｂｒａｒｙなどのＢＡＣライブラリーや、ＲＰＣＩ  Ｈｕｍａｎ  ＰＡＣ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＲＰＣＩ−２１  Ｍｏｕｓｅ  ＰＡＣ  ＬｉｂｒａｒｙなどのＰＡＣライブラリー、又はＣＥＰＨ  Ｈｕｍａｎ  ＹＡＣ  Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  ＹＡＣ  ｌｉｂｒａｒｙ、ＷＩ／ＭＩＴ  ８２０  ＹＡＣ  Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＹＡＣ  ＬｉｂｒａｒｙなどのＹＡＣライブラリー（以上、Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社、２１３０  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｐａｒｋｗａｙ  ＳＷ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ  ３５８０１，ＵＳ）を利用することができる。
本発明ではクローニング許容サイズの大きなベクターを使用することから、構造遺伝子に加えてその制御領域を含む大きなサイズのＤＮＡ断片を機能配列として用いることができる。ここでの制御領域は、原則的には目的遺伝子自身の制御配列（染色体で目的遺伝子の制御に直接関与している領域の配列）を意味するが、その機能が維持される限度においてこれに一部の改変を施した配列であってもよい。ここでの「一部の改変」とは、対象となる配列において１若しくは複数の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加することをいう。このような改変は複数の領域になされていてもよい。
所望の配列を特異的に挿入するための配列（本発明において、「挿入用配列」という）を機能配列として含む第２ベクターを用いることができる。このような第２ベクターを用いれば所望の配列を後から挿入可能な、汎用的な哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）を構築することができる。ここでの所望の配列とは、典型的には所望の遺伝子をコードする配列（好ましくは併せてその制御領域コードする配列を含む配列）であるがこれに限定されるものではなく、それが発現することによって特定の遺伝子発現の抑制や特定のＲＮＡの働きを抑制する等の機能を有する配列、例えばいわゆるアンチセンスＲＮＡやリボザイムＲＮＡ等をコードする配列であってもよい。
挿入用配列の種類は特に限定されるものではないが、ｌｏｘＰサイト又はＦＲＴ（Ｆｌｐ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔａｒｇｅｔ）サイト等を好適に用いることができる。例えばｌｏｘＰサイトを用いれば、まずｌｏｘＰサイトを有するＭＡＣが作製され、これにＣｒｅリコンビナーゼを作用させることによって部位特異的に所望の配列を導入することができ、最終的に所望の配列を含むＭＡＣが構築される。同様に、ＦＲＴサイトを有するＭＡＣを作製した場合にはＦｌｐリコンビナーゼを利用して最終的に所望の配列を含むＭＡＣを構築することができる。尚、ｌｏｘＰサイト又はＦＲＴサイト等の一部を改変した配列であっても所望の配列を挿入する機能を有する限りにおいて挿入用配列として使用することができる。改変の例としては、その一部を削除、追加、或は置換などして導入効率を高めたり又は導入反応のみが特異的に行われるようにすることが挙げられる。
哺乳類セントロメア配列を含む第１ベクターと、機能配列としての挿入用配列を含む第２ベクターの使用割合を調整することにより、作製される哺乳類人工染色体内に組込まれる挿入用配列の数を変えることが可能である。また、このような第１ベクターと第２ベクターとの共導入によって哺乳類人工染色体を作製すれば、作製される哺乳類人工染色体においてそのセントロメアから離れた位置（即ちセントロメアに挟まれない位置）に挿入用配列を組込むことが可能であり、適切に機能する挿入配列を保持した哺乳類人工染色体が構築される。
本発明で使用される第２ベクターがインスレーター配列を有していることが好ましい。ここにインスレーター配列とは、エンハンサーブロッキング効果（隣会う遺伝子の発現が互いに影響を受けない）又は染色体バウンダリー効果（遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別する）を発揮することによって特徴付けられた塩基配列のことをいう。インスレーター配列を使用することによって、哺乳類人工染色体が保持する目的遺伝子の発現が促進されることを期待できる。一方、後述の実施例に示されるように、上記のｌｏｘＰ等の挿入用配列を使用する際にインスレーター配列を併用すれば、哺乳類人工染色体への目的遺伝子の導入効率が高くなることが判明した。このように、インスレーター配列を使用すれば哺乳類人工染色体への遺伝子導入効率を高めるという効果も奏され、効率的且つより確実に、目的遺伝子を保持した哺乳類人工染色体の構築が可能となる。使用できるインスレーター配列は特に限定されず、既にインスレーターとして同定されている配列は勿論のこと、期待される効果（目的遺伝子の発現促進又は遺伝子導入効率の上昇）を減殺しない限度でそれらの配列に改変を加えた配列などを本発明におけるインスレーター配列として用いることができる。複数のインスレーター配列を併用してもよい。複数のインスレーター配列を併用する場合には、一種類のインスレーター配列のみを使用しても、複数種類のインスレーター配列を組み合わせて使用してもよい。尚、これまでにインスレーター配列として、ヒトβグロビンＨＳ１〜５、ニワトリβグロビンＨＳ４（ｃｈｉｃｋｅｎ  β−ｇｌｏｂｉｎ  ＨＳ４）、ショウジョウバエ・ジプシーレトロトランスポゾン（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｇｙｐｓｙ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）、ウニ・アリールスルファターゼ５’フランキング領域（ｓｅａ  ｕｒｃｈｉｎ  ５’ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ）、ヒトＴ細胞受容体α／δの阻害因子α／δ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  α／δ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α／δ）、アフリカツメガエル・４０ＳリボソームＲＮＡ遺伝子リピートオーガナイザー（ｒｅｐｅａｔｏｒｇａｎｉｚｅｒ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ４０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ）等が知られている。
インスレーター配列を使用する場合に用いられる哺乳類人工染色体前駆体（第２ベクター）の具体例としては、機能配列としてｌｏｘＰ等の挿入用配列を有し、当該挿入用配列の５’側にインスレーター配列を有するものを挙げることができる。
挿入用配列の５’側ではなく３’側にインスレーター配列を配置した哺乳類人工染色体前駆体（第２ベクター）としてもよく、或いは、挿入配列を挟むように両側にインスレーター配列を配置した哺乳類人工染色体前駆体（第２ベクター）としてもよい。さらに、いずれの位置に配置する場合においても、複数のインスレーター配列を連続的に又は他の配列を介在させて配置することとしてもよい。
（宿主細胞）
第１ベクター及び第２ベクターを導入する宿主細胞としては、その中で両ベクター間の組換えが行われるものが使用される。例えばヒト線維芽肉腫細胞株であるＨＴ１０８０細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｋ−５６２細胞等を宿主細胞として使用することができる。
（哺乳類染色体の作製方法）
本発明の哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）の作製方法は、（１）哺乳類セントロメア配列を含む第１ベクターと、機能配列を含む第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程、（２）形質転換細胞を選択する第２工程、及び（３）選択された形質転換細胞の中からＭＡＣを保有する細胞を選択する第３工程を含む。
第１工程における第１ベクターと第２ベクターの導入方法は特に限定されるものではないが、これら二つのベクターを同時に哺乳類宿主細胞に導入することが好ましい。哺乳類宿主細胞内でのベクター間の組換えを効率的に行うためである。また、導入操作が簡便化されるからである。二つのベクターを同時に導入するためには、例えば導入操作に先立って両ベクターを混合しておき、そして宿主細胞への導入を行えばよい。
導入に供する第１ベクターと第２ベクターの量比は、機能配列を発現可能に保持したＭＡＣが適切に形成されるように、例えば第１ベクター：第２ベクターをモル比で約１０：１〜約１：１０とする。好ましくは第１ベクター：第２ベクターを約１：１とする。ここで、第１ベクターが少な過ぎる場合には活性のあるセントロメアを含むＭＡＣが形成されないおそれがあり、他方第２ベクターが少な過ぎる場合にはＭＡＣに機能配列が取り込まれないおそれがある。一方で、第２ベクターの量を多くすることで効率的に機能配列を取り込ませ、その結果、機能配列を複数コピー保持するＭＡＣが構築されることを期待できる。後述の実施例で示されるように、本発明の作製方法によれば目的遺伝子を複数コピー保持する哺乳類人工染色体の構築に成功している。目的遺伝子を複数コピー有するＭＡＣでは必然的に目的遺伝子の発現トータル量が多くなる。従って、本発明のＭＡＣを目的遺伝子の導入用ベクターとして使用する場合において、導入細胞内での高い発現効果が得られる。このことは本発明のＭＡＣを遺伝子治療用のベクターとして用いる場合に特に有益である。薬剤又は薬剤の候補化合物の作用・効果を評価するための材料として用いる場合においても同様に有益である。
宿主細胞への各ベクターの導入方法は特に限定されず、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，７４１３−７４１７（１９８４））、リン酸カルシウムを利用したトランスフェクション、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ｍ．＆  Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７３，３６６−３７０（１９７６））、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，７１６１−７１６５（１９８４））等の方法を採用することができる。
宿主細胞内では第１ベクターと第２ベクターとの間で組換えが生じ、その結果として第１ベクター由来のセントロメア配列と第２ベクター由来の機能配列とを備えたＭＡＣが形成される。
第１ベクターと第２ベクターを導入した後に形質転換細胞（形質転換体）が選択される（第２工程）。形質転換細胞の選択は、第１ベクター又は第２ベクターに予め挿入しておいた選択マーカー遺伝子を利用してベクター導入後の細胞を選択的に培養することにより行うことができる。尚、両ベクターを導入後の細胞群から任意に細胞を分離した結果、分離した細胞が形質転換細胞である場合における当該分離する操作も本発明にいう「形質転換細胞の選択」に含まれる。
形質転換細胞を選択した後にＭＡＣを保有する細胞が選択される（第３工程）。かかる選択操作はＭＡＣに特異的なプローブや抗体などを用いた検出法によって行うことができる。具体的には、例えば第１ベクターが含む哺乳類セントロメア配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズするプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によって行うことができる。この工程において第２ベクターが適切に組込まれてＭＡＣが形成されていることを確認するために、第２ベクターに特異的な配列（例えば機能配列）の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズするプローブを用いて同様のハイブリダイゼーション分析を併せて行うことが好ましい。以上において使用される各プローブの検出には蛍光物質、放射性物質などを利用できる。プローブの標識に蛍光物質を用いる方法はＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法と呼ばれ、安全かつ簡便にＭＡＣを検出できる（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ５２：５１−６１，１９９８；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３０７−３１１，１９８９）。
第３工程に加えて、機能配列が適切に組込まれたＭＡＣが形成されていることを確認する工程を行うことが好ましい。かかる確認工程は、例えば機能配列が目的遺伝子を含む場合には当該遺伝子の発現産物を検出することによって行うことができる。
以上の作製方法で得られる哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）は非選択条件下においても極めて安定的に維持される。尚、ここでの「非選択条件」とは、ＭＡＣが存在する細胞のみの生存を可能にするような選択操作を行わない条件をいう。
使用する前駆体ベクター及び宿主細胞の種類等によっても異なるものと予想されるが、本発明の作製方法によれば宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト（第１ベクター及び第２ベクター）の導入操作後、非選択条件下、約３０日経過後（約３０継代後）に細胞（集団）の約９５％以上にＭＡＣを保有させることが可能であり、しかもＭＡＣが１コピーのみ存在する状態を維持できる（後述の実施例を参照）。
最終的に得られる形質転換細胞（哺乳類細胞）が保有するＭＡＣの数は少ないほど好ましく、核あたり一つのＭＡＣを保有していることが特に好ましい。本発明の作製方法によれば、効率的に核あたり一つの哺乳類人工染色体を保有する形質転換細胞を得ることが可能である。
本発明の他の局面は、以上の方法によって作製される哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）を保有する形質転換細胞（形質転換体）を提供する。かかる形質転換細胞はＭＡＣを他の細胞に移入する際の供給源として利用することができる。また、それ自身を生体に導入するなど、哺乳類人工染色体を生体内に導入するための運搬体として利用することもできる。
（哺乳類人工染色体の性質）
本発明において構築される哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）は以下の性質を備える。即ち、（１）哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、及び機能配列（目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列又は所望の配列を挿入するための挿入用配列）を有する、（２）哺乳類細胞中で複製される、（３）宿主細胞の染色体外に維持される、（４）細胞分裂の際に娘細胞に伝達される、及び（５）環状又は線状である。ＭＡＣの形態は、環状ベクター（ＢＡＣ又はＰＡＣ）を前駆体として作製した場合はテロメア配列を含まないために環状となる。他方、線状ベクター（酵母人工染色体）を前駆体として作製した場合は、十分に機能するテロメア配列がその両端に備えられれば線状形態をとり、それ以外の場合には環状形態をとるものと考えられる。尚、哺乳類複製起点は哺乳類セントロメア配列内に存在していてもよい。
以上の諸性質を備えることにより、本発明のＭＡＣはそれが導入される哺乳類細胞内で染色体として機能しつつ、細胞分裂の際に実質的な構造変化を伴うことなく娘細胞へと適切に分配されて維持される。
また、本発明のＭＡＣでは所望の目的遺伝子をその制御領域とともに保持させることができ、目的遺伝子を導入細胞内で効率よく発現させることができる。尚、後述の実施例で示されるように、目的遺伝子としてＧＣＨ１遺伝子を使用した例において、染色体上に存在している場合と同様の発現制御が実現されている。
本発明の哺乳類人工染色体は、哺乳類細胞以外の細胞（例えば酵母細胞、大腸菌などの細菌）で自律的に複製し分配されることを可能にするＤＮＡ配列を有していてもよい。このようなＤＮＡ配列を有することにより、本発明のＭＡＣは哺乳類細胞以外の細胞においても染色体として機能する。従って、本発明のＭＡＣをシャトルベクターとして利用し得る。
哺乳類セントロメア配列はＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘ配列を含んでいることが好ましい。ＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘを高頻度に有する領域を含んでいることが特に好ましい。さらには、哺乳類セントロメア配列がヒト２１番染色体のアルファサテライト領域由来の配列、特にα２１−Ｉアルフォイド領域の配列を含んでいることが好ましい。
後述の実施例に示されるように、本発明者らはＢＡＣを前駆体として用いた系においてヒトＧＣＨ１（ＥＣ  ３．５．４．１６；ＧＣＨ１）をコードする約１８０ｋｂの遺伝子を発現可能に保持するヒト人工染色体（ｈｕｍａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＨＡＣ）の作製に成功している。ヒトＧＣＨ１遺伝子の一つは染色体上で１４ｑ２２．１−ｑ２２．２に位置し、６０ｋｂ以上に亘る６個のエクソンから構成される（図１）（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。ＧＣＨ１は後述の各種酵素反応での必須コファクターであるテトラヒドロビオプテリンの生合成経路における第１段階酵素であり、種々の高等生物に存在している（Ｎｉｃｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８５；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９；Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。テトラヒドロビオプテリンはＧＣＨ１、６−ピルボイル−テトラヒドロプテリン合成酵素（ＥＣ  ４．６．１．１０；ＰＴＰＳ）及びセピアプテリン還元酵素（ＥＣ  １．１．１．１５３  ＳＲ）による三段階の反応によってＧＴＰから合成される。これらの酵素の中で主要な制御ポイントはＧＣＨ１であって、その発現は転写段階においてはサイトカイン誘導の支配下にあり（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）、翻訳後段階においてはフィードバック制御タンパク質であるＧＦＲＰの支配下にある。テトラヒドロビオプテリンは芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ、即ち、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＥＣ  １．１４．１６．２；ＰＡＨ）、ドーパミン合成における第１段階かつ律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＥＣ  １．１４．１６．３；ＴＨ）、セロトニン生合成に関与するトリプトファン５−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ  １．１４．１６．４；ＴＰＨ）のナチュラル・コファクターとして機能する。テトラヒドロビオプテリンは一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の三つの分子形のすべてに必須でもある（Ｋａｕｆｍａｎ  １９９３）。ＧＣＨ１活性、テトラヒドロビオプテリンレベル、及び／又はＴＨ活性の低下が黒質線状体（ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔｕｍ）ドーパミンニューロンにおけるドーパミン欠乏の原因となり、そして遺伝的ドーパ応答性ジストニー（ｄｏｐａ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｙｓｔｏｎｉａ：ＤＲＤ、セガワ症候群）（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）やパーキンソニズムのようないくつかの有名な臨床的症状を引き起こす。したがって、その真の制御領域を含んだＧＣＨ１遺伝子を保持する哺乳類人工染色体はＧＣＨ１遺伝子の欠損を修復することに間違いなく有用であって、同時にｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＣＨ１の複雑な制御メカニズムについての詳細な研究を容易にするであろう。
（哺乳類人工染色体の移入）
哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）の哺乳類細胞への導入は例えば次の方法で行うことができる。
まず、ＭＡＣを保有する宿主細胞からＭＡＣを分離し、分離されたＭＡＣを哺乳類細胞（ターゲット細胞）に導入する。ＭＡＣの分離は、例えば次の方法によって行うことができる。まずＭＡＣを保有する宿主細胞の懸濁液を調製し、そして核酸成分を抽出する。その後フィコールなどを用いた密度勾配遠心法によって染色体が含まれる画分を取得する。続いて、フィルター等を用いて分子量の小さい人工染色体を分離する。
分離されたＭＡＣを哺乳類細胞へ導入する方法としてはリポフェクション、リン酸カルシウムを利用したトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポーレーションなどから適宜好適な方法を選択することができる。
細胞融合を利用した以下の方法でＭＡＣを哺乳類細胞へ導入することもできる。まず、ＭＡＣを保有する宿主細胞と微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させ、続いて融合細胞の中から微小核形成能を有し且つＭＡＣを保有するハイブリッド細胞（雑種細胞）を選択する。ここで、微小核形成能を有する哺乳類細胞としては、例えばマウスＡ９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）、マウスＥＳ細胞、ＣＨＯ細胞等を用いることができる。細胞融合はＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）を用いて行うことができる。目的のハイブリッド細胞の選択は、マウスＡ９を使用した場合を例に採れば、融合に使用した宿主細胞に特異的な選択マーカーとウワバインとを利用した選択培養によって行うことができる。
次に、選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる。一般的にはコルセミド処理をして微小核多核細胞を形成させ、続いてサイトカラシンＢ処理及び遠心処理をして微小核体を得る。
微小核体は、ＰＥＧを利用した融合法等によって哺乳類細胞（ターゲット細胞）と融合される。以上の工程によって哺乳類細胞へのＭＡＣの移入（導入）が行われ、ＭＡＣを保有する哺乳類細胞が得られる。
ここでのターゲット細胞としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物（マウス、ラットなど）の特定組織を形成する細胞（線維芽細胞、内皮細胞、心筋細胞）、生殖細胞（受精卵を含む）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、組織幹細胞（造血系幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨系幹細胞、軟骨系幹細胞、上皮系幹細胞、肝幹細胞など）などが用いられる。これらの幹細胞に対して特定の組織の細胞へと分化するように誘導処理を施した細胞をターゲット細胞として用いることもできる。このようなターゲット細胞としては、例えば神経系幹細胞に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、毛様体由来神経栄養因子（ＤＮＴＦ）及びトリヨードサイロニン（Ｔ３）を用いてそれぞれニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトへと分化誘導した細胞、間葉系幹細胞にデキサメタゾン及びアスコルビン酸をなどを用いて骨芽細胞へと分化誘導した細胞、間葉系幹細胞をＴＧＦ−βの存在下で培養して軟骨細胞へと分化誘導した細胞が挙げられる。
本発明のＭＡＣを導入する細胞として、魚類（メダカ、ゼブラフィッシュなど）、両生類（アフリカツメガエルなど）、鳥類（ニワトリ、ウズラなど）など、哺乳類以外の脊椎動物の細胞を用いることもできる。
ターゲット細胞へのＭＡＣの移入はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。例えば生体内の細胞に対して直接、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）の移入を行うことにより、又は生体外でＭＡＣを移入した細胞を生体に導入することにより、生体を構成する所望の部位（例えば、心臓、肺等の特定の組織）にＭＡＣを導入できる。その結果、導入部位においてＭＡＣに保持された機能配列からの発現が行われる。このように、ＭＡＣを外来遺伝子を生体内へと導入するためのベクターとして利用できる。ＭＡＣはクローニング許容サイズが大きいことから、特に制御領域を含む大きな外来遺伝子を導入するためのベクターとして好適に利用することができる。
より具体的には、本発明の哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）は例えば遺伝子治療用のベクターとして利用され得る。即ち、欠損遺伝子の機能補填を目的として外来遺伝子を導入することや、異常遺伝子の発現を抑制又はその発現産物の作用を抑制する目的で外来遺伝子を導入すること等に本発明のＭＡＣを利用することができる。本発明のＭＡＣはそれを導入した細胞内で安定して維持されることから、導入遺伝子が安定的、かつ長期的に発現され、優れた治療効果が期待される。また、本発明のＭＡＣを利用すれば制御領域を含んだ、サイズの大きな外来遺伝子を導入可能であるから、それを導入した細胞内で本来の制御領域に支配された遺伝子発現を行うことができる。この観点からも優れた治療効果が期待される。
また、本発明のＭＡＣは所望の遺伝子の機能又はその作用メカニズムを解明するための手段をも提供する。特に、サイズが大きいがために従来のベクターでは遺伝子導入を行うことができなかった遺伝子の機能又は作用メカニズムを解明するための手段を提供する点で有用である。即ち、機能が未知の又は作用メカニズムが未知の遺伝子の研究手段も提供する。特に本発明のＭＡＣは、外来遺伝子をその本来の制御領域に支配された発現が可能なように保持できることから、組織特異的発現機構の解析や、マウスなどモデル動物個体に導入したヒト遺伝子の発現解析、阻害剤や促進剤の開発などに威力を発揮すると考えられる。
後述の実施例で示されるように、本発明者らは、ＥＳ細胞を利用して上記本発明の哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）が導入されたマウス個体（キメラマウス）の作出に成功した。尚、ＸＹ核型のＥＳ細胞を用いたキメラマウス（オス）の作出に加え、ＸＯ核型のＥＳ細胞を用いたキメラマウス（メス）の作出にも成功した。これによって、本発明の哺乳類人工染色体を形質転換動物の作出にも利用できることが確認された。このような成果に基づいて本発明の他の局面では、哺乳類人工染色体が導入されてなる非ヒト形質転換動物及びその作出方法が提供される。本発明における非ヒト形質転換動物にはマウス、ラット等の齧歯目動物が含まれるがこれらに限定されるものではない。
本発明の非ヒト形質転換動物はその発生段階でＭＡＣを導入することにより作出される。作出方法としては、ＥＳ細胞を利用する方法や受精卵の前核に直接核酸コンストラクト（ＭＡＣ）の注入を行うマイクロインジェクション法などを用いることができる。以下、本発明の非ヒト形質転換動物の作出方法の具体例として、マウスＥＳ細胞を用いた方法を説明する。この方法ではまず、ＭＡＣを保有するＥＳ細胞を調製する。かかるＥＳ細胞の調製は上述の微小核融合法を利用して行うことができる。即ち、まず所望の構成のＭＡＣを保有する細胞（例えばＨＴ１０８０）を用意し、これを微小核融合能を有する細胞（例えばマウスＡ９細胞）に融合してＭＡＣの移入を行う。その後、適切にＭＡＣが移入された細胞からコルセミド処理等によって微小核を形成させる。得られた微小核を、ＰＥＧなどを利用してＥＳ細胞と融合させる。そして融合細胞の中からＭＡＣを保有するものを選択する。以上のようにして調製されたＭＡＣ保有ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。即ち、まず交配後の雌マウスから卵巣ごと子宮全体を取り出した後、子宮内より胚盤胞を採取し、この胚盤胞の胚胞腔内にマイクロインジェクションによってＨＡＣ保有ＥＳ細胞を導入する。続いてインジェクションの終了した胚盤胞を子宮偽妊娠マウス（仮親）に移植し、自然分娩又は帝王切開により仔マウス（胎仔）を得る。
尚、得られた仔マウスにＭＡＣが導入されていることは、仔マウスの毛色の観察や、使用したＭＡＣに特異的な配列を有するプローブを用いたＤＮＡ解析などによって確認できる。
＜実施例１＞  アルフォイド−ＢＡＣの構築
Ｂｅｌｏ−ＢＡＣのＸｈｏｌサイトにＭｌｕＩ−ＳｆｉＩ−ＳａｃＩＩリンカーを挿入してｐＢＡＣ−ＴＡＮを作製した。ｐＢＡＣ−ＴＡＮのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、ともにブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）Ｓ耐性遺伝子を含む断片である、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（インビトロゲン）のＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（１．３ｋｂ）又はｐＳＶ２ｂｓｒ（科研製薬）のＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２．６ｋｂ）を挿入することによりｐＢＡＣ−ＣＭＶとｐＢＡＣ−ＳＶを作製した。ＬＬ２１ＮＣＯ２ライブラリー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から得られたコスミドクローンであるＱ２５Ｆ１２をＳｆｉＩ消化及びｐＢＡＣ−ＴＡＮのＳｆｉＩサイトへクローニングすることによって約２５ｋｂのα２１−Ｉアルフォイド断片（α２５：配列番号３）を単離した。その結果得られた、アルフォイド配列がタンデム状に配列されてなる５０ｋｂ又は１００ｋｂのアルフォイドインサートを含んだアルフォイド−ＢＡＣをＭｌｕＩ及びＳａｃＩＩで消化し、続いてアルフォイド断片をｐＢＡＣ−ＣＭＶ又はｐＢＡＣ−ＳＶのＭｌｕＩ−ＳａｃＩＩサイトにそれぞれ挿入することにより、５０ｋｂ又は１００ｋｂのアルフォイド断片を含むアルフォイド−ＢＡＣであるＳＶ／α５０及びＣＭＶ／α１００を構築した（図３）。
＜実施例２＞  ＧＣＨ１遺伝子座を含むＨＡＣの形成
ヒト２１番染色体由来の１１量体高次繰り返しユニット（１１  ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ：モノマー繰り返しユニット）（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）からなるα２１−ＩアルフォイドをＨＴ１０８０細胞に導入することによって効率的にＨＡＣを作製することが可能である（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。本実施例ではアルフォイド−ＢＡＣ及びＧＣＨ１−ＢＡＣを利用して、ＧＣＨ１遺伝子座を含み、正常に制御された遺伝子発現をする複数のＨＡＣを作製した。本実施例で使用したＢＡＣを図３に示した。ＣＭＶ／α１００は１００ｋｂのα２１−Ｉアルフォイド配列と選択マーカーとしてのＣＭＶ−Ｂｓｄを含み、そしてＳＶ／α５０は５０ｋｂのα２１−Ｉアルフォイド配列とＳＶ２−Ｂｓｒ選択マーカーを含み、上述の方法でそれぞれ構築された。ＧＣＨ１−ＢＡＣはＢＡＣライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）から取得され、それはＧＣＨ１遺伝子を含む１８０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を有する。尚、ＢＡＣ−ＤＮＡの精製はＣｓＣｌ密度勾配遠心法により行った。
いずれかのアルフォイド−ＢＡＣとＧＣＨ１−ＢＡＣをモル比で１：１となるようにＨＴ１０８０細胞にリポフェクションでコトランスフェクトし、形質転換細胞を選択した。具体的には、リポフェクタミン（ギブコ  ＢＲＬ）を使用して０．５μｇのアルフォイド−ＢＡＣと１．０μｇのＧＣＨ１−ＢＡＣ（１８６ＬＯ９、ゲノムシステム）をＨＴ１０８０（５ｘ１０５）にコトランスフェクションした。尚、この操作は製品使用説明書に従って行った。形質転換した細胞を４μｇ／ｍｌのブラスチシジンＳ（ＢＳ、科研製薬）で選択し、１０日後にコロニーを採取した。
染色体外分子としてＨＡＣが存在していることを検出するために、α２１−ＩアルフォイドＤＮＡとＢＡＣベクターをプローブとして用いたＦＩＳＨ法でＢＳ−耐性細胞株を分析した。具体的には、メタノール／酢酸（３：１）による固定化後のメタフェイズ・スプレッド（分裂中期染色体）をスライドガラス上に調製し、常法にしたがってＦＩＳＨを行った。ＨＡＣを検出するために、プローブとしてビオチン標識α２１−ＩアルフォイドＤＮＡ（１１−４）（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）及びジゴキシゲニン標識Ｂｅｌｏ−ＢＡＣを用いた。この二色ＦＩＳＨにおいてはビオチン標識ＤＮＡをＦＩＴＣ結合アビジンによって可視化し、他方ジゴキシゲニン標識ＤＮＡをＴＲＩＴＣ結合抗ジゴキシゲニン（ベーリンガー  マンハイム）によって可視化した。ツアイス顕微鏡に設置したＣＣＤカメラを用いて写真撮影したＩＰＬａｂ及びＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ６．０を用いてイメージ加工した。
ＦＩＳＨの結果、ＣＭＶ／α１００及びＧＣＨ１−ＢＡＣのコトランスフェクションによって得られた１６の形質転換細胞株の中の１つ（ＨＴ／ＧＣＨ２−１０）、及びＳＶ／α５０及びＧＣＨ１−ＢＡＣのコトランスフェクションによって得られた１７の形質転換細胞株の中の３つ（その中の一つはＨＴ／ＧＣＨ５−１８）は、分析した細胞の９５％以上においてＨＡＣのコピーを核あたり一つ有していた。残りの細胞株では、導入されたＢＡＣがＨＴ１０８０の染色体に組込まれるか、又はＦＩＳＨ解析においてシグナルが検出できないものであった。
構築されたＨＡＣがＧＣＨ１遺伝子のゲノム断片を含むか否かを検討するために、ＨＡＣを含む４つの細胞株に対してＧＣＨ１遺伝子のエクソン１及びエクソン４〜６に対するプローブ（図３）をハイブリダイズさせた。エクソン１用のプローブにはエクソン１を含む１３ｋｂのビオチン標識断片を、エクソン４〜６用のプローブにはエクソン４、５及び６を含む８ｋｂのジゴキシゲニン標識断片を用いた。
ＣＭＶ／α１００及びＧＣＨ１−ＢＡＣのコトランスフェクションによって得られたＨＴ／ＧＣＨ２−１０細胞株内のＨＡＣ上、及びＳＶ／α５０及びＧＣＨ１−ＢＡＣのコトランスフェクションによって得られたＨＴ／ＧＣＨ５−１８細胞株内のＨＡＣ上において両プローブのシグナルがそれぞれ検出された（図４）。これらのＨＡＣ上に検出されたＧＣＨ１シグナルはＨＴ１０８０の染色体上の内在性遺伝子のそれよりも強いものであった。ＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８のいずれにおいても導入遺伝子がＨＴ１０８０の染色体内に組込まれたのは少数の細胞（５％未満）であったので、これらの細胞株は核あたり一コピーのＨＡＣを保有するようにサブクローニングして、それ（サブクローニングした細胞株）を更なる検討の対象として用いた。
＜実施例３＞  ＨＡＣのセントロメア／キネトコア構造及び有糸分裂における安定性
ＨＡＣのセントロメア／キネトコア構造を調べるために、必須セントロメア／キネトコアタンパク質であるＣＥＮＰ−Ａ及びＣＥＮＰ−Ｅ（Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｈｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）の存在をＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８のメタフェイズ・スプレッドを用いて間接免疫蛍光法で調べた。尚、間接免疫蛍光法は次のように行った。まず、低張処理及び１％パラホルムアルデヒド固定化細胞を抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体（Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）又は抗ＣＥＮＰ−Ｅ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体とともにインキュベートした。各抗体の局在についてはＦＩＴＣ結合抗マウスｌｇＧで可視化した。次のＦＩＳＨ解析分析のために、処理後の細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、続いてメタノール／酢酸（３：１）で固定した。
間接免疫蛍光法による分析の結果、一対の姉妹染色分体に対応して対を形成するようにＣＥＮＰ−Ａシグナル及びＣＥＮＰ−Ｅシグナルが各ＨＡＣ上に検出され、そしてそのようなシグナルはすべての内在性染色体のセントロメアにおいても同様に検出された（データ示さず）。
次に、選択を行わない条件下におけるＨＴ／ＧＣＨ２−１０細胞株及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８細胞株が保有するＨＡＣの有糸分裂における安定性を検討した。ＨＡＣの安定性は、それを保有する細胞を非選択条件下で約３０日間培養することにより評価した。具体的には、ＢＳ選択を行わない条件下、培養１０日後、２０日後及び３０日後の各細胞株からメタフェイズ・スプレッドを調製し、ＨＡＣの存在をＦＩＳＨで分析した。サンプル日毎に各細胞株から調製された５０個の伸展染色体を分析し、ＨＡＣを保有する細胞の割合を決定した。ＨＡＣの損失割合は次の式によって計算した。即ち、Ｎｎ＝Ｎ０×（１−Ｒ）ｎ、但し、Ｎ０は選択条件下においてＨＡＣを保有するメタフェイズ・スプレッドの数、Ｎｎは非選択条件下、培養ｎ日後においてＨＡＣを保有するメタフェイズ・スプレッドの数である。尚、ＦＩＳＨ解析は上述の方法と同様に行った。
非選択条件下、培養３０日後において、ＨＴ／ＧＣＨ５−１８の分裂中期細胞の９５％が、またＨＴ／ＧＣＨ２−１０の分裂中期細胞の８０％がＨＡＣを保有しており、ＨＡＣのコピー数が非選択条件下で一つに維持された。いずれも細胞株においても宿主染色体への組み込みは観察されなかった。非選択条件下、培養３０日後においてＨＡＣを保有する細胞の割合を基に一日当たりの染色体損失を算出した。ＨＴ／ＧＣＨ５−１８及びＨＴ／ＧＣＨ２−１０におけるその値は、それぞれ０．２％及び０．５％であった。これらの結果は、各細胞株においてＨＡＣ上に活性のあるセントロメア／キネトコア構造が形成され、各ＨＡＣが有糸分裂を通して安定に維持されたことを示すものである。
＜実施例４＞  ＨＡＣのＤＮＡ構造
ＨＴ／ＧＣＨ２−１０内及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８内の各ＨＡＣが環状であるか線状であるかを決定するために、プローブとしてテロメア配列及びＢＡＣベクターを用いてＦＩＳＨを行った。ＨＡＣ上にテロメアシグナルは検出されず、他方でＢＡＣベクターのプローブでは染色された。これに対して、宿主細胞であるＨＴ１０８０由来の染色体の末端ははっきりとした斑点状に染色された。予想された通り、ＢＡＣ由来ＨＡＣは環状構造であると考えられた。
次に、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０、ＨＴ／ＧＣＨ５−１８、及びトランスフェクションを行っていないＨＴ１０８０細胞からそれぞれ単離したＤＮＡを制限酵素処理することによりＨＡＣのＤＮＡ構成を分析した。各ゲノムＤＮＡサンプル（５μｇ）をＢａｍＨＩ又はＳｔｕＩで４時間消化した後、常法に従ってゲル電気泳動に供した。そしてゲル内のＤＮＡをナイロン膜に転写した後、ＧＣＨ１エクソン６（２．１ｋｂ）から調製された３２Ｐ標識ＤＮＡプローブ（エクソン６ブローブ）及びＧＣＨ１の上流領域（１．４ｋｂ、ＧＣＨ１−ＢＡＣでの位置５９５−１９５９）から調製された３２Ｐ標識ＤＮＡプローブ（ＵＳプローブ）をハイブリダイズさせた。
その結果、ＵＳプローブによって検出されたＢａｍＨＩ断片のサイズは、内在性ＧＣＨ１遺伝子由来のものが５．０ｋｂ、ＧＣＨ１−ＢＡＣ由来のものが３．５ｋｂであった。これら５．０ｋｂ及び３．５ｋｂ断片はＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８から調製されたＤＮＡにおいてほぼ等しいシグナル強度で検出された（図５（Ａ））。一方、エクソン６プローブによって検出されたＳｔｕＩ断片のサイズは、内在性ＧＣＨ１由来のものが２４．５ｋｂ．ＧＣＨ１−ＢＡＣ由来のものが１４．４ｋｂであった。これら２４．５ｋｂ及び１４．４ｋｂ断片はＨＴ／ＧＣＨ５−１８から調製されたＤＮＡにおいてほぼ等しいシグナル強度で検出されたが、一方でＨＴ／ＧＣＨ２−１０から調製されたＤＮＡについては内在性ＧＣＨ１由来の断片に加えてサイズが異なる３種類の断片が検出された（図５（Ｂ））。これらの結果は、本実施例において使用したＨＴ１０８０細胞の核型が３ｎであるので、ＨＴ／ＧＣＨ５−１８内のＧＣＨ１保有ＨＡＣがトランスフェクトされたＧＣＨ１−ＢＡＣ  ＤＮＡの約３コピーの集合によって構築されたことを示唆するものであり、一方でＨＴ／ＧＣＨ２−１０ではＧＣＨ１エクソン６の末端領域において再配列が生じ、しかしＵＳプローブによって認識されたバンドの強度によって判断されるように、おそらくＧＣＨ１−ＢＡＣを３コピー保有していることを示唆するものである。ＨＴ／ＧＣＨ２−１０内のＧＣＨ１転写産物をＲＴ−ＰＣＲで分析したところ、ＧＣＨ１遺伝子の内部再配列が確認された（データ示さず）。
ＨＴ／ＧＣＨ２−１０とＨＴ／ＧＣＨ５−１８内のＧＣＨ１−ＢＡＣ及びアルフォイドＢＡＣのコピー数をＧＣＨ１エクソン６及びＢＡＣベクターをそれぞれプローブとして用いたドットハイブリダイゼーションによって決定した。ＨＡＣに含まれる各ＢＡＣの相対コピー数についてはハイブリダイゼーションのシグナル強度値から推定した。ここでの各シグナル強度値については各ＤＮＡプローブを用いて決定し、０．１ｎｇのＧＣＨ１−ＢＡＣ  ＤＮＡのシグナル強度値を基準にして標準化した（図６）。ＧＣＨ１エクソン６をプローブとして用いた場合には、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８から調製されたＤＮＡでは０．５μｇで、またＨＴ１０８０から調製されたＤＮＡでは１μｇで０．１ｎｇのＧＣＨ１−ＢＡＣ  ＤＮＡと等しいハイブリダイゼーション強度値を示した（図６左欄）。本研究で使用したＨＴ１０８０の核型が３ｎであるのでＨＴ１０８０の染色体内においてＧＣＨ１遺伝子が３コピー存在し、そしてＨＴ１０８０から調製したＤＮＡのシグナル強度値と等しい値がＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８から調製した場合には半量のＤＮＡで得られたという結果を考えれば、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８はＧＣＨ１遺伝子を６コピー（即ち、染色体上及びＨＡＣ上にそれぞれ３コピー）含有しなければならない。ＢＡＣの合計コピー数をＢＡＣベクタープローブを用いて得られた強度値から推定した。ＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８から調製されたＤＮＡでは０．３３μｇで０．１ｎｇのＧＣＨ１−ＢＡＣ  ＤＮＡと等しいハイブリダイゼーション強度値を示した。一方予想されたように、ＨＴ１０８０から調製されたＤＮＡではシグナルが検出されなかった（図６右欄）。それ故に、両ＨＡＣはＧＣＨ１遺伝子のコピー数のおおよそ３倍のＢＡＣベクターのコピー数を有する。したがって、全ＢＡＣベクターのコピー数は細胞あたり約９のはずである。即ち、ＧＣＨ１遺伝子の３コピーはＧＣＨ１−ＢＡＣのかたちで存在し、ＢＡＣの残りの６コピーは両ＨＡＣにおいてアルフォイドＢＡＣのかたちで存在しているはずである。
＜実施例５＞  ＨＡＣ保有細胞株のマウスＡ９細胞への導入
クローン化したアルフォイドＤＮＡを使用することによる、ＨＡＣのｄｅ  ｎｏｖｏ形成がヒト線維芽細胞株であるＨＴ１０８０内で成功している。神経細胞株におけるＧＣＨ１遺伝子の正常な発現を確認するためには、ＨＴ１０８０内に構築されたＨＡＣを神経細胞株内に導入する必要がある。
微小核体介在性染色体導入（ＭＭＣＴ）（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）を可能とするためにＨＡＣ保有細胞株（ＨＴ／ＧＣＨ５−１８）とマウスＡ９細胞株をＰＥＧを用いて融合した。即ち、ＨＡＣ保有細胞株（５ｘ１０５）及びマウスＡ９細胞（５ｘ１０５）を共培養し、そしてＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液（シグマ）内で融合させた。続いてＢＳ及びウワバイン（Ｏｕａｂａｉｎ）耐性細胞をそれぞれＢＳ（２．５μｇ／ｍｌ）及びウワバイン（３μＭ）で選択し、ＢＳ及びウワバイン耐性細胞株をＦＩＳＨで分析した。ＨＡＣ及びヒト染色体を同定するためにそれぞれＢＡＣベクタープローブ及びＡｌｕ反復配列プローブをメタフェイズ・スプレッドにハイブリダイズさせた（図７（Ａ））。結果、融合細胞株の一つであるＦ／ＧＣＨ５−１８は８−１０個のヒト染色体とともにＨＡＣのコピーを１又は２以上含んでいた。
各融合細胞内のＨＡＣは非選択条件下で有糸分裂を通して安定して維持され、一日あたりの染色体損失は約１％であった（データ示さず）。マウス細胞株内でのヒト染色体の有糸分裂における安定性は時として、マウス染色体のセントロメアに位置し、機能的セントロメア配列として作用すると考えられているマイナーサテライトＤＮＡを融合に供されるマウス細胞から獲得することによって得られる（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。そこで、ＨＡＣ上のマウスマイナーサテライトＤＮＡの存在の有無をＦＩＳＨで調べた。ＨＡＣ上にマイナーサテライトＤＮＡのシグナルは検出されず、一方でマウス染色体のセントロメアでは強いシグナルが検出された（図７（Ｂ））。融合細胞株はコルセミド処理の条件で微小核体（マイクロセル）を形成することが可能であった（データ示さず）。それ故に、ＨＡＣは神経細胞株に導入可能であると考えられる。
【実施例６】  ＨＡＣが保有する大きなゲノム断片内の導入遺伝子からの正常に制御された遺伝子発現が期待された。ＨＡＣ形成に使用されたＧＣＨ１−ＢＡＣはＧＣＨ１エクソン１の５’側上流領域から始まる１００ｋｂを越えるゲノム配列を含んでいた。そこで、ＨＴ１０８０及びＨＡＣを保有するその派生株におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）活性を測定した。先の報告によれば、線維芽細胞株におけるＧＣＨ１活性はほとんど検出されないが、ＩＦＮ−γの誘導によってその活性は上昇するであろうと予測された（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。そこで、ＨＴ１０８０、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０及びＨＴ／ＧＣＨ５−１８におけるＧＣＨ１活性をＩＦＮ−γの存在下及び非存在下で分析した（図２）。尚、ＧＣＨ１活性の測定手順は次の通りとした。ＩＦＮ−γ非含有又は含有（２５０Ｕ／ｍｌ）の培養液を用いて４８時間各細胞を培養した。培養後の細胞をトリプシン処理し、その後ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、続いて０．３Ｍ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１０％グリセロールを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。ＧＣＨ１活性の測定は既述の方法（Ｈｉｂｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）に従った。
ＧＣＨ１−ＨＡＣを保有しないＨＴ１０８０ではＩＦＮ−γ誘導をしない条件においてＧＣＨ１活性はかろうじて検出できるレベルであった。一方、その活性はＩＦＮ−γの添加によって１５倍に上昇した。ＨＴ／ＧＣＨ２−１０細胞株ではＩＦＮ−γ誘導をしない条件において、ＨＡＣを保有しないＨＴ１０８０の検出値の３倍のＧＣＨ１活性が認められた。ＩＦＮ−γ誘導後は３０倍近くの活性の上昇がみられた。これに対してＨＴ／ＧＣＨ５−１８ではＩＦＮ−γの非存在下においてＧＣＨ１活性は７０倍にまで上昇し、ＩＦＮ−γを添加することで更に約５倍の活性の上昇がみられた。いずれのＨＴ／ＧＣＨ−ＨＡＣ細胞株においてもその程度は異なるもののＧＣＨ１活性の上昇が認められ、これは染色体構造及び／又はＨＡＣ内のＤＮＡ再配列における相違を反映したものであると考えられる。また、両ＨＴ／ＧＣＨ−ＨＡＣ細胞株は依然としてＩＦＮ−γ誘導に感受性であって、それは真の染色体上のＧＣＨ１遺伝子の発現における応答性と同様であった。
以上の実施例で示したように、アルフォイド−ＢＡＣ及びＧＣＨ１−ＢＡＣを約１：１のＤＮＡ割合で用いた簡易なコトランスフェクション法によって、ＧＣＨ１遺伝子（ＧＣＨ１−ＨＡＣ）を含む大きなＤＮＡ断片を含有したＨＡＣを得ることに成功した。このＧＣＨ１−ＨＡＣはテロメアを含まない環状構造にも拘わらず、非選択条件下、３０継代以上の後においても１コピーが存在する状態に維持された。これはＨＡＣが細胞周期ごとに一度複製され、そして正確に娘細胞に分配されることを示唆するものである。ＨＡＣはサイズがメガベース（ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｍｅｇａｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｓｉｚｅ）であって、トランスフェクトされたＢＡＣ  ＤＮＡよりも約１０倍大きい。
ＨＡＣの特性及びそのｄｅ  ｎｏｖｏ形成のメカニズムを調べるためにＨＡＣのＤＮＡ構造を分析した。ＢＡＣコンストラクトではレアカッター（制限酵素）切断部位のほとんど全てがメチル化されること、及び使用される細胞株が内在性のＧＣＨ１遺伝子座を含むことから、ＧＣＨ１遺伝子の全領域を対象とした制限酵素分析は困難であった。それ故に、我々はＢＡＣベクターとＧＣＨ１遺伝子座との連結部位に相当する領域を対象に制限酵素分析を行った。その結果、得られた二つの細胞株内のＧＣＨ１−ＨＡＣはその構成分子としてＧＣＨ１−ＢＡＣを３コピーとアルフォイド−ＢＡＣを６コピー含有していた（図５、６）。ＨＡＣ形成の正確なメカニズムは不明であるが、ＧＣＨ１−ＨＡＣは導入したＤＮＡの多量体から構成され、これは導入分子としてアルフォイド−ＹＡＣ又はアルフォイド−ＢＡＣのみ（データ示さず）を用いて形成されたＨＡＣ（Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）に類似するものであった。ＨＡＣの形成の際に別個のＢＡＣの会合（集合）を伴うという事実は、ＢＡＣ分子の多量体化がＢＡＣ  ＤＮＡ自身の増幅に加えて非特異的組換えに媒介され得ることを示唆した。
大きなヒトゲノムＤＮＡを含むＨＡＣの形成については、過去に１４０ｋｂ又は１６２ｋｂのＨＰＲＴ遺伝子座を使用した例が報告されている（Ｇｒｉｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｍｅｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。彼らは相補性に依存するＨＡＴ培地内においてＨＰＲＴ遺伝子欠損ＨＴ１０８０細胞株内にＨＰＲＴ遺伝子を含むＨＡＣを得ている。組織及びステージ特異的な発現をする遺伝子（即ちハウスキーピング遺伝子ではない遺伝子）に対してはこのようなアプローチのＨＴ１０８０細胞における実現性は低いであろう。本実施例によればＢＡＣに挿入された５０ｋｂ程度の小さなα２１−ＩアルフォイドＤＮＡによってＨＡＣ（セントロメア／キネトコア）を形成できることが示され、一方で５０％のＨＡＣが導入遺伝子を含んでいたことから、選択マーカーを有しない大きな導入遺伝子を含有するＢＡＣを効率的にＨＡＣに組込むことができることが示された。したがって、５０ｋｂのアルフォイドＤＮＡを含むアルフォイド−ＢＡＣと、直ちに利用可能なＢＡＣライブラリーをそのまま利用することにより、大きな所望のゲノム領域を含むＨＡＣを形成することが可能であるといえる。導入遺伝子が完全な状態であることはＨＡＣの形成の後に確認されるであろう。
ＣＭＶプロモーター支配下のＢｓｄ遺伝子を有する形質転換細胞の選択はＢＳ耐性細胞の数を増加させるが、ＨＡＣ又は宿主染色体上への組込みに対するＦＩＳＨシグナルは多くの形質転換細胞で検出されなかった（図１）。アルフォイド及びＢＡＣベクター配列をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーション分析によって、これらの細胞株は染色体のみに組込まれたＢｓｄ遺伝子を保有することが示唆された。したがって、高発現プロモーターによって発現される様に組込まれた選択マーカーは、ＨＡＣ保有細胞株のスクリーニング用としては好ましいものではないと言える。
遺伝子発現は染色体構造の影響を受ける。染色体への導入遺伝子の組み込みの結果、位置効果による斑入り（ＰＥＶ）（Ｋａｒｐｅｎ  １９９４）として一般に知られている現象であるジーンサイレンシングがしばしば起こる。最近の分子学的解析によって、リジン９上のヒストンＨ３のメチル化がＨＰ１のクロマチンへのターゲティングの原因となり、そしてヘテロクロマチン化及び遺伝子発現の抑制が引き起こされることが報告されている（Ｐｌａｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｌａｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。酵母及びハエにおいてセントロメア／キネトコア又はその近隣におけるジーンサイレンシングも報告されており（Ｋａｒｐｅｎ  ＆  Ａｌｌｓｈｉｒｅ  １９９７）、このようなジーンサイレンシングは哺乳類細胞でも生ずるものと予測された。最近本発明者らは、ＨＡＣのアルフォイド配列内にひとたびセントロメア／キネトコア構造が形成されると、たとえ高発現プロモーターの制御下であってもＨＡＣ内に組込まれた短いマーカー遺伝子の発現が強く抑制されることを示した（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．投稿中）。したがって、ＨＡＣ内で導入遺伝子を発現させようと思えば、セントロメア／キネトコア構造との関係においてトポロジー的な問題を解決する必要がある。
ＨＡＣからのＧＣＨ１遺伝子の発現はＧＣＨ１遺伝子座又はその近隣のクロマチン構造と相互に関連しているのかもしれない。そこで本発明者らはセントロメア／キネトコア構造がアルフォイド配列部分にのみ形成されたのか、それともＧＣＨ１遺伝子座内へと拡がったのかを検証した。ＣＥＮＰ−Ａは機能的セントロメア／キネトコアに必須のタンパク質であって、セントロメア特異的ヌクレオソームのヒストン成分を構成するので（Ｐａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｈｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、我々はＨＡＣのクロマチン構造を抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈｌＰ）法（Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）で分析した。ＣｈｌＰ法は次のように行った。まず、ＨＴ／ＧＣＨ５−１８細胞株（５ｘ１０７）の核を単離し、ＷＢ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオスレイトール、０．０５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド）に溶解した。ＭＮａｓｅ消化後、可溶化されたクロマチンを既述の方法（Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）に従い抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体で免疫沈降した。
ＨｅＬａ細胞及びＨＴ１０８０細胞を使用したそのような分析において全免疫沈降ＤＮＡ中の６０〜８０％がアルフォイド配列に富んでいた。抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いた分析の結果、全免疫沈降ＤＮＡ中においてＧＣＨ１−ＨＡＣ内のアルフォイド配列は豊富に存在することが認められたが、ＧＣＨ１領域はほとんど存在していなかった。これに対してアルフォイド配列からおよそ３ｋｂ離れて存在するＢＡＣベクター配列もまた免疫沈降され、これによってアルフォイド配列部分にセントロメア／キネトコア構造が形成され、周囲のアルフォイド配列でない領域に拡がったことが示唆された（データ示さず）。セントロメア／キネトコア構造がＨＡＣ内のＧＣＨ１遺伝子座に侵入することは、おそらく上流制御配列に備えられる未知の制御メカニズムによって阻止されたものと考えられる。
ＧＣＨ１遺伝子はテトラヒドロビオプテリンの生合成経路における、第１段階かつ律速酵素をコードし（Ｎｉｃｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）、当該酵素は芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ、ＴＨ、ＴＰＨ）及び一酸化窒素シンターゼのコファクターであって高等生物に存在する（Ｋａｕｆｍａ  １９９３）。ＧＣＨ１遺伝子はドーパ応答性ジストニア（ＤＲＤ／セガワ病）（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）におけるドーパミン欠損の原因遺伝子である。ＴＨ遺伝子の突然変異とともにＧＣＨ１遺伝子の欠損が生ずると重篤な初期段階ジストニア／パーキンソニズムが引き起こされる（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
ヒト及びマウスのＧＣＨ１遺伝子の上流制御配列についてはこれまでのところ限られた数の解析が行われたにすぎないが、ＣＣＡＡＴボックス及びＴＡＴＡボックスが保存されていることが報告されている（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。様々なげっ歯類及びヒト細胞においてＧＣＨ１遺伝子の発現がＩＦＮ−γによって誘導され得ることが確認されている（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。しかしながら、ＩＦＮ−γのシグナル伝達を含んだ正確なメカニズムは未知のままである。
ヒトβグロビン等いくつかの遺伝子の発現は、安定した組織特異的な開クロマチン構造の開始及び維持を担う遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）によって制御されることが知られている（Ｆｅｓｔｅｎｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｍｉｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。本実施例で使用したＧＣＨ１−ＨＡＣはＧＣＨ１遺伝子を含む１８０ｋｂのゲノム断片を保持し、それ故に組織特異的発現のため及び近隣セントロメアによる発現抑制効果を防ぐために必要な制御配列を含んでいると考えられる。上述のように、本発明者らはＩＦＮ−γの存在下及び非存在下においてＨＡＣからのＧＣＨ１遺伝子の発現をＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を指標に測定した（図２）。ＩＦＮ−γの非存在下では、ＨＡＣ保有細胞株であるＨＴ／ＧＣＨ２−１０のＧＣＨ１活性はＨＴ１０８０のそれよりもほんの少し高いものであった。また、ＩＦＮ−γの添加によってＧＣＨ１活性は約３０倍上昇した。もう一つの細胞株であってＨＴ１０８０の２倍の数のＧＣＨ１遺伝子を保有するＨＴ／ＧＣＨ５−１８のＧＣＨ１活性はＩＦＮ−γ非存在下においてＨＴ１０８０のそれよりも７０倍高いものであった。そしてその活性はＩＦＮ−γ誘導によってさらに５倍上昇した。上述のようにＧＣＨ２−１０ＨＡＣ上のＧＣＨ１遺伝子のいくつかは構造的異常を有することが示唆されたので、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０とＨＴ１０８０との間の僅かな活性の相違は完全なＧＣＨ１遺伝子のコピー数が少ないことに対応するものであると考えられる。これらの結果によって、ＧＣＨ１の遺伝子発現はＨＡＣにおけるＧＣＨ１遺伝子座に構築されるクロマチン構造の違いに影響を受ける一方で、ＧＣＨ１遺伝子の発現は依然としてＩＦＮ−γに応答性を有することが示された。しかしながら、ＩＦＮ−γ誘導後の最終ＧＣＨ１活性レベルは細胞株間で同等であった。このことはＧＣＨ１活性を適当な範囲内に維持するための複雑な細胞内制御システムが存在することを示唆するものである。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＣＨ１発現の複雑な制御メカニズムを理解するためにＧＣＨ１−ＨＡＣは好適なシステムであると言える。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターはヘルパーウイルス依存的増殖感染による遺伝子治療用として頻用される。ＡＡＶベクターのクローニング許容サイズは通常、遺伝子発現に必要なそれ自身の制御配列を含まないｃＤＮＡを運搬するために十分なものに限られている（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。ＧＣＨ１はチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及び芳香族Ｌアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）とともに効率的なドーパミン生産に必須の酵素である。線状体においてＡＡＶからこれら三つの酵素を発現させることによって、霊長類パーキンソン病モデルにおいて比較的長期の行動回復が認められている（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
最近、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソーム状ベクターは限られた哺乳類細胞株に対してＨＰＲＴ遺伝子（１１５ｋｂ）を導入する能力があり、導入された遺伝子の発現は抑止されなかったとの報告がなされた（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。しかしながらＥＢＶベースのベクターは非選択条件下ではＨＡＣよりも急速に失われていき、その複製はウイルストランスアクチベータであるＥＢＮＡ１の存在に依存する。したがって、臨床的遺伝子治療におけるＥＢＶベクターの安全性についてはさらなる検討が必要である。ＨＡＣは上記の遺伝子導入用ベクターについての問題を解決し得るものであり、さらに安全性の面でも有利なものである。本実施例において大きなゲノム遺伝子座を保持したＨＡＣは染色体外において維持され、調節された遺伝子発現を長期にわたって示した。それ故にＴＨ、ＡＡＤＣ及びＧＣＨ１を含有するＨＡＣはパーキンソン病の有望な治療戦略を提供し得る。
しかしながら、ＢＡＣを利用したＨＡＣのｄｅ  ｎｏｖｏ形成がそれほど効率的に行われないこと、ＨＡＣ形成のための特定の細胞株が必要であること、及びＨＡＣのサイズが大きいことから、細胞又は組織の必要な部位にＨＡＣを輸送することには困難が伴う。ＨＡＣを遺伝子導入ベクターとして簡便に利用するためにはＨＴ１０８０内に構築されたＨＡＣが適当な細胞株内へと導入されなければならない。ＨＡＣは微小核体（ミクロセル）の形成を可能とするマウスＡ９細胞を用いたＭＭＣＴによって導入することができる（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。上述の実施例に示したように、本発明者らは非選択条件下でＨＡＣの検出し得る構造変化を伴うことなく有糸分裂においてＨＡＣを安定的に維持するマウスＡ９細胞株を樹立することに成功した。このＨＡＣはＡ９細胞株から他の細胞株へと容易に導入可能であると考えられる。
以上の実施例により、ＧＣＨ１遺伝子をそれ自身の制御領域とともに保持するＨＡＣをＧＣＨ１−ＢＡＣ及びアルフォイド−ＢＡＣのコトランスフェクションによって構築できることが示された。このＧＣＨ１−ＨＡＣは制御された状態でＧＣＨ１遺伝子を発現し、したがってｉｎ  ｖｉｖｏでＧＣＨ１の制御メカニズムを研究するための好適なシステムであることが証明された。ＧＣＨ１−ＨＡＣについての更なる研究によって、セントロメア／キネトコアを構築するのに最低限必要なアルフォイド配列の数、ＧＣＨ１遺伝子の制御された状態での発現に必要な上流領域の構造、及び制御領域における転写因子の活性部位が明らかにされるであろう。本実施例で得られた結果はモデル動物又は臨床試験において将来ＧＣＨ１−ＨＡＣが遺伝子運搬ツールとして有用であることをも示すものである。
＜実施例７＞  微小核融合法によるＨＡＣのＥＳ細胞への移入
ＧＣＨ１遺伝子を保持したＨＡＣを含有するＨＴ１０８０細胞を細胞融合法でマウスＡ９細胞へ移入した。まず実施例５と同様の手順で、ＨＡＣ保有細胞株（ＨＴ／ＧＣＨ２−１０）とマウスＡ９細胞を融合させ、ＢＳ耐性且つウワバイン耐性の細胞株を選択した。選択された細胞株Ｆ（Ａ９／２−１０）４に終濃度０．０５μｇ／ｍｌとなるようにコルセミドを加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で７２ｈｒ培養した。トリプシン処理により細胞を回収し、血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地に懸濁した。サイトカラシンＢを２０μｇ／ｍｌになるように加えて３７℃、５ｍｉｎ．放置した後、予め３７℃に保温しておいたＰｅｒｃｏｌを等量加えた。続いて遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、９０ｍｉｎ．）を行い、微小核を回収した。回収した微小核を血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地に懸濁した後、再び遠心処理（２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ．）を行い、得られた沈殿（微小核）を再度、血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地に懸濁した。この操作を２回繰り返した後、微小核を含む沈殿に、トリプシン処理により回収したＥＳ細胞ＴＴ２（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）を加えて１，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ．の遠心処理を行い、細胞と微小核を沈殿させた。上清を捨てた後、血清を含まない１ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地を加えて懸濁させた。この状態で１０分間静置（室温）した。続いて、１，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ．の遠心処理によって細胞と微小核を沈殿させ、上清を捨てた後に１ｍｌのＰＥＧ１５００（ロッシュ）を加えて懸濁させた。室温で９０秒間静置した後に血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地を５ｍｌ加え、遠心処理（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ．）し、細胞を回収した。
回収した細胞に血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地を１０ｍｌ加えた後、１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ．の遠心処理による洗浄を２回行った。洗浄後の沈殿をＥＳＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ＋非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール＋１０３Ｕ／ｍｌ  ＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）＋ヌクレオシド）に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、マイトマイシンＣ処理により増殖を停止させたフィーダー細胞ＳＬＢ（角川祐造博士（藤田保健衛生大学：Ｆｕｊｉｔａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）より供与）上に播種した。培養開始から２４時間経過した時点で、ブラストサイジンＳを終濃度４μｇ／ｍｌで含むＥＳＭ培地に交換して培養を継続した。この選択操作を開始後５日目にＥＳＭ培地（４μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ、１ｘＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ））に交換し、更に５日間培養を継続した。
得られたコロニーを単離し、マイトマイシンＣ処理により増殖を停止させたフィーダー細胞ＳＬＢ上（２４穴培養皿）に播種した。増殖した細胞の中からＰＣＲを利用してＢＡＣ  ＤＮＡを保有する細胞株を選択し、アルフォイドＤＮＡ、ＢＡＣベクター、ＧＣＨ１遺伝子、及びマウスマイナーサテライトＤＮＡをプローブ（実施例２、５を参照）として用いたＦＩＳＨ解析に供した。
図８ＡはアルフォイドＤＮＡ及びＢＡＣベクターをプローブとして用いたＦＩＳＨ解析の結果である。緑がアルフォイドＤＮＡのシグナル（矢印）、赤がＢＡＣベクターのシグナル（矢じり）を示す。単離されたＥＳ細胞はＨＡＣを１コピー保有し、かつ正常核型を維持していることがわかる。
図８ＢはヒトＧＣＨ１遺伝子のエクソン１領域とＢＡＣベクターをプローブとして用いたＦＩＳＨ解析の結果である。ＧＣＨ１遺伝子の緑のシグナル（矢印）とＢＡＣベクターの赤のシグナル（矢じり）がＨＡＣ上に同時に検出された。
図８ＣはマウスマイナーサテライトＤＮＡとＢＡＣベクターをプローブとして用いたＦＩＳＨ解析の結果である。ＨＡＣ上にはマウスマイナーサテライトＤＮＡのシグナル（一部を矢印で示す）が検出されなかった。尚、矢じりはＢＡＣベクターのシグナルを示す。
＜実施例８＞  ＥＳ細胞におけるＨＡＣの安定性
ＥＳ細胞中でのＨＡＣの安定性を、選択薬剤非存在下において長期に培養することにより解析した。実施例７で得られたＨＡＣ保有ＥＳ細胞をブラストサイジンＳの存在下と非存在下で培養（２０日間）した後、ＦＩＳＨ法を利用してＨＡＣを保有している細胞の割合をそれぞれ求めた。解析結果を図９に示す。薬剤非存在下での長期培養後においても８割以上の細胞がＨＡＣを１コピーの状態で保持していた。一回の細胞分裂あたりの染色体脱落率を計算したところ０．２％であって、ＨＴ／ＧＣＨ２−１０細胞におけるＨＡＣの場合とほぼ同程度の安定性を示した。尚、染色体脱落率Ｒは次式により求めた。
Ｎｎ＝Ｎ０×（１−Ｒ）ｎ
＜実施例９＞  酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いたヒト人工染色体（ＨＡＣ）の構築
前駆体としてＹＡＣを用いてヒト１１番染色体のβグロビン遺伝子群（クラスター）全領域を保持するヒト人工染色体を以下の手順で構築した。使用した前駆体ＹＡＣは次の通りである。
（９−１）前駆体ＹＡＣ
Ａ２０１Ｆ４．３：ヒトβグロビン遺伝子座を有する１５０ｋｂのＹＡＣであって、Ａ２０１Ｆ４の右腕部を改変しＰＧＫｎｅｏｒが挿入されている（Ｋｅｉｊｉ  Ｔａｎｉｍｏｎｏ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｅｎｇｅｌより供与、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７；３１３０−３１３７）。
７ｃ５ｈＴＥＬ：ヒト２１番染色体アルフォイド領域由来の約８０ｋｂのアルファサテライト配列（α２１−Ｉ）及びマーカー遺伝子のＳＶｂｓｒを含み、その両端に酵母テロメア配列を備えかつその内側にヒトテロメア配列を備える人工染色体前駆体ＹＡＣである。７ｃ５ｈＴＥＬを保有する酵母（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＰＹ  ３０５−５ｂ  α７Ｃ５ｈＴＥＬ）は１９９６年８月１４日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番３号  中央第６）に寄託されており（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２５）、７ｃ５Ｈｔｅｌはこの酵母株から調製される。尚、当該酵母株の作製方法については特表２０００−５１７１８２号公報を参照されたい。
Ｆ６１：ＨＴ１０８０にｐＴｅｔ−ＯＦＦ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を導入し、Ｇ４１８選択により樹立したテトラサイクリン誘導発現系細胞である。
（９−２）酵母人工染色体の精製
以下の手順でＰｕｌｓｅｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）を施行して２種類の酵母人工染色体（Ａ２０１Ｆ４．３及び７ｃ５ｈＴＥＬ）をそれぞれ分離した。ＰＦＧＥはＧｅｎｅ  Ｎａｂｉｇａｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用し、０．７％アガロースゲルにおいて０．５ｘＴＢＥ、１８０Ｖｏｌｔ及び１５ｓｅｃｏｎｄ  ｐｕｌｓｅの条件で１５時間行った。ＰＦＧＥゲルより分離したＹＡＣ  ＤＮＡを電気泳動により１％低融点アガロースゲルに移し、このゲルを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝液に１６時間浸漬した。ＹＡＣ  ＤＮＡ（０．３μｇ／０．３ｍｌ）に１００μｇのＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡを加えて７０℃で１０分間加温してゲルを融解し、続いて３０Ｕのβ  ａｇａｒａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を加えて４２℃で２ｈ反応させることによりアガロースを消化した。これらにＰＦＧＥを施行して７ｃ５ｈＴＥＬ（９０ｋｂ）及びＡ２０１Ｆ４．３（１５０ｋｂ）のバンドを確認した（図１０Ａ）。
（９−３）ＹＡＣの導入
精製した７ｃ５ｈＴＥＬ及びＡ２０１Ｆ４．３を各０．３μｇ混和した後、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を６０μｌ加えて穏やかに混和し、室温で１０分間反応させた。反応後の溶液をＦ６１細胞に添加した。培養液（１０％ＦＢＳ（Ｔｒａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．，Ｎｏｂｌｅ  Ｐａｒｋ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ｉｎ  Ｄ−ＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を９０分後に一度交換した。７２時間後より８μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）Ｓ添加培地で耐性株を選択的に培養し、形質転換株を分離した。その結果、１９個の形質転換株が得られた。
＜実施例１０＞  形質転換株に対する細胞遺伝学的解析
得られた形質転換株にα２１−Ｉプローブ（アルフォイドプローブ、配列番号３のＤＮＡ断片をジゴキシゲニン標識したもの）及びＹＡＣの腕部のプローブ（ｐＹＡＣ５ベクター（Ｄｒ．Ｍａｙｎａｒｄ  Ｖ．Ｏｌｓｏｎ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））をＸｈｏＩで切断して得られる約８ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号４）をビオチン標識したもの）を用いてＦＩＳＨ法を施行した。その結果１個の形質転換株においてミニ染色体の形成が認められ、そしてこのミニ染色体にα２１−Ｉ及びＹＡＣの腕部の両方のシグナルが確認された（図１０Ｂ）。残りのクローンでは宿主染色体上にシグナルがみられるか、又は全くシグナルが検出されないかのいずれかであった。
一方、ミニ染色体が形成された形質転換株に対してヒトβグロビンクラスター非コード領域の互いに異なる部位をそれぞれ認識する３種類のプローブ（配列番号５、配列番号６、及び配列番号７）を用いてＦＩＳＨ法を施行したところ、ミニ染色体上に各プローブからのシグナルが示された（図１１）。尚、各プローブはＡ２０１Ｆ４．３を鋳型として以下のプライマーでＰＣＲ反応（９６℃３０秒、５８℃４０秒、７２℃１０分を１サイクルとした２５サイクル）を行い、その結果増幅されたＤＮＡをビオチン標識したものである。
配列番号５のプローブ用プライマー
2004022741.tif 000003
配列番号６のプローブ用プライマー
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配列番号７のプローブ用プライマー
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また、テロメア反復配列（配列番号８の配列が繰り返されてなる約５００ｂｐの配列）をジゴキシゲニン標識したものをプローブとして行ったＦＩＳＨ法ではミニ染色体上に２点又は４点のテロメアのシグナルが認められた（図１２）。
以上の結果から、アルファサテライト配列を有する人工染色体ＹＡＣとヒトβグロビンクラスター全領域を有する人工染色体ＹＡＣとをＨＴ１０８０細胞に導入することによって、ヒトβグロビンクラスター全領域を保持するミニ染色体（ヒト人工染色体）を構築できることが確認された。
＜実施例１１＞  ファイバーＦＩＳＨを用いた、ミニ染色体のマクロ構造の解析
各１ｘ１０６個のマウスＡ９細胞とミニ染色体保有細胞を培養皿に播種し、これに５０％ＰＥＧ（ＳＩＧＭＡ）を３ｍｌ添加して１分間培養した。続いて１０μＭのウワバイン（Ｏｕｂａｉｎ），５μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）Ｓを含む選択培地で培養し、ウワバイン及びブラスチシジンＳ耐性の形質転換株を取得した。上述の方法と同様にＦＩＳＨ法を施行したところ、得られた形質転換株の中にミニ染色体を保有し、かつ残りの染色体がマウス由来である形質転換株の存在が認められた。この形質転換株に対してアルフォイドプローブ（配列番号３）及びβグロビンプローブ（配列番号５、配列番号６、及び配列番号９の混合）を用いてＦＩＳＨ解析を行った。尚、配列番号９のプローブはＡ２０１Ｆ４．３を鋳型として以下のプライマーでＰＣＲ反応（９６℃３０秒、５８℃４０秒、７２℃１０分を１サイクルとした２５サイクル）を行い、その結果増幅されたＤＮＡ断片をビオチン標識したものである。
2004022741.tif 000006
ＦＩＳＨ解析の結果、アルファサテライト配列のシグナルがミニ染色体以外の染色体上に認められなかったため（図１３）、ミニ染色体のアルファサテライト配列に対するファイバーＦＩＳＨ解析が可能であった。そこで、ファイバーＦＩＳＨ解析を行ったところ、ミニ染色体上にグロビンとアルフォイド配列の複数のシグナルが不規則に並んでいることが確認された（図１４）。
＜実施例１２＞  ＨＡＣからの目的遺伝子の転写量の解析
次に、βグロビン遺伝子を保持したＨＡＣを保有する細胞におけるグロビン遺伝子の転写量を解析した。
実施例９と同様の手順で７ｃ５ｈＴＥＬ及びＡ２０１Ｆ４．３を白血球Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）に導入し、βグロビン遺伝子を保持したＨＡＣを保有する細胞（ＨＡＣ保有Ｋ５６２細胞）を得た。このＨＡＣ保有Ｋ５６２細胞と、実施例９で得られたＨＡＣ保有ＨＴ１０８０細胞におけるグロビン遺伝子の発現状態を、Ｇγグロビンの転写量を指標として次のように解析した。尚、７ｃ５ｈＴＥＬ及びＡ２０１Ｆ４．３の導入操作を行う前、即ちＨＡＣを保有しないＨＴ１０８０細胞及びＫ５６２細胞を比較対照（コントロール）として用いた。
まず、各細胞から常法でＲＮＡを抽出し、ＭＭＬＶの逆転写酵素及びＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。このようにして得られた各ｃＤＮＡを鋳型として次のプライマーセット（Ｇγグロビンのエクソン２及びエクソン３）を用いたＲＴ−ＰＣＲを施行した。
2004022741.tif 000007
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１５の上段に示す。尚、β−アクチン遺伝子に特異的な以下のプライマーを用いて同様にＲＴ−ＰＣＲを行った結果を併せて示した。
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一方、リアルタイムＰＣＲ法により各サンプルのＧγグロビン遺伝子の転写量を定量した。リアルタイムＰＣＲはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（ＡＢＩ  アプライドバイオシステムズ社製）及びＱｉａｇｅｎ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  ２０４１４３）を用いて行った。また、増幅反応に利用するプライマーとしては上記の各プライマーを用いた。尚、各サンプルにおけるβアクチン遺伝子の転写量を求め、これを基にサンプル間の細胞数の差を補正した。
図１５の下段にリアルタイムＰＣＲ法による解析結果を示す。尚、ＨＡＣ非保有のＨＴ１０８０の転写量を１としたときの相対値として各サンプルにおけるＧγグロビンの転写量を表した。ＨＡＣを導入したことにより、Ｇγグロビンの発現量がＨＴ１０８０をターゲット細胞とした場合では１．５倍となり、他方Ｋ−５６２をターゲット細胞として場合では５倍以上となった。このように、いずれのターゲット細胞を用いた場合においても導入されたＨＡＣからのＧγグロビンの発現、即ちＨＡＣに保持させた外来遺伝子の発現を確認できた。特に、Ｋ−５６２を用いた場合においては極めて高い活性で外来遺伝子を発現できることが示された。
＜実施例１３＞  ＨＡＣ保有マウス（キメラマウス）の作出
実施例７によって得られたＨＡＣ保有ＥＳ細胞を培養して樹立された細胞株（ＨＡＣ保有ＥＳ細胞株ＴＴ２／ＧＣＨ２−１０）を、ＩＣＲマウス（日本クレア株式会社）から採取した８細胞期胚あるいは胚盤胞期胚にインジェクション法により注入し、ＥＳ細胞導入胚を仮親に移植した。その後、自然分娩により産仔を得た。生後２４時間のマウスから各臓器（脳、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓）を単離し、それぞれについてゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡに対してＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲを行い、ＢＡＣ由来のＤＮＡを検出した。用いたプライマーの配列とサイクル（反応条件）は以下のとおりである。
2004022741.tif 000009
サイクル：９５℃、４分×１、９５℃、１５秒、５５℃、１０秒、７２℃、３０秒×３５、７２℃、９分×１
ＰＣＲ法による解析結果を図１６（ｂ）に示す。１５匹のマウスを解析した結果、この図に示されるように７匹のマウスにおいてＢＡＣ  ＤＮＡがすべての臓器において検出された。
次に、ＨＡＣ保有ＥＳ細胞を用いて作出したキメラマウス個体におけるＧＣＨ−ＨＡＣの存在を確認するために、分裂期染色体標本を作製しＦＩＳＨ解析を行った。まず、生後２４時間のキメラマウスの頭と内臓以外の部分をＰＢＳで洗った後に細片化し、０．０５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下で１ｈｒ，３７℃で保温した。トリプシン処理により細片から得られた細胞を遠心分離により回収し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で２回洗った。細胞を再度１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。コンフルエントに近く増えた状態でＴＮ１６を加え、分裂期に同調した後に分裂期染色体標本を作製した。
アルフォイド配列とＢＡＣベクター配列をプローブに用いてＦＩＳＨを行った結果、キメラマウス由来（ＥＳ細胞由来）の細胞に人工染色体（ＧＣＨ−ＨＡＣ）が確認された（図１６（ｃ））。尚、図１６（ａ）は、得られたキメラマウスを示す図であり、毛色からキメラマウスであることを確認できる。
＜実施例１４＞  ＨＡＣのＸＯ核型ＥＳ細胞への移入、及びキメラマウスの作出
実施例７と同様の手順で、微小核融合法によってＨＡＣをマウスＥＳ細胞に移入した。実施例７ではＸＹ核型マウスＥＳ細胞を用いたが、本実施例ではＸＯ核型のマウスＥＳ細胞ＴＴ２−Ｆ（相沢博士より供与）を用いた。微小核融合処理の後に得られた細胞をＦＩＳＨ解析に供したところ、いくつかの細胞が期待通りＨＡＣを保有していた（データ示さず）。このようにして得られたＨＡＣ保有ＥＳ細胞を培養して細胞株を樹立した後、この細胞株を用いて実施例１３と同様の手順でキメラマウスの作出を試みた。その結果、図１７に示すように、モザイク状の毛色のキメラマウス（メス）が得られた。
＜実施例１５＞  遺伝子挿入部位を有する哺乳類人工染色体の構築
遺伝子挿入部位と、インスレーター配列の候補としてのヒトβグロビンＬＣＲを含む人工染色体を構築し、人工染色体におけるインスレーター配列の効果を検証した。
１５−１．ＤＮＡコンストラクト
（１）ヒトβグロビンＬＣＲ
ヒトβグロビン遺伝子領域をカバーするＹＡＣクローン（Ａ２０１Ｆ４．３，Ｄｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｅｎｇｅｌ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖ．より供与）から２０８３６ｋｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａ  ｂａｓｅ  ＮＧ０００００７の４８１８から２５６５４まで）をｐＴＷＶ２２９ベクター（タカラバイオ株式会社）のマルチクローニング部位にクローン化した（ＴＷＶ−ＬＣＲ）。
（２）アクセプター前駆体
ｐＡｃ−ｌｏｘ７１−ｂｓｒ−ｐＡ（Ｄｒ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ  Ｕｎｉｖ．より供与、Ｋｉｍｉ  Ａｒａｋｉ，Ｍａｓａｔａｋｅ  Ａｒａｋｉ  ａｎｄ  Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙａｍａｍｕｒａ（１９９７））のＥｃｏＲ１−ＸｈｏＩ  １．７ｋｂ断片をｐＳＶ２−ｂｓｒのＥｃｏＲＩ部位に挿入してＳＶ−ｂｓｒ−ｌｏｘ７１を得た。ＳＶ−ｂｓｒ−ｌｏｘ７１のＡｐａＬＩ断片６ｋｂをｐＢｅｌｏＢＡＣのＳａｌＩ部位に挿入してＢＡＣ−ｂｓｒ−ｌｏｘ７１を構築した。
βグロビンＬＣＲ（Ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ、ＨＳ１〜５を含む）を加えた前駆体を構築するために、ＴＷＶ−ＬＣＲのＦｓｐＩ断片２０ｋｂをＢＡＣ−ｂｓｒ−ｌｏｘ７１のＥｃｏ０６５１部位に挿入した（ＢＡＣ−ＬＣＲ−ｌｏｘ７１、図１８を参照）。尚、この前駆体ＢＡＣ−ＬＣＲ−ｌｏｘ７１の特徴は、ｌｏｘ７１部位の５’側にＣＡＧプロモーター（各種哺乳類培養細胞、マウス個体において安定した遺伝子発現が期待できる）が配置され、組み換えの際に、プロモーターを持たない（プロモーターレス）選択マーカー遺伝子と期待通りに組み換えが生じた時のみ、ＣＡＧ−選択マーカー遺伝子が構築され、遺伝子の発現が起こるようになっている。
（３）アルフォイド前駆体
ＣＭＶ−α５０（アルフォイド配列がタンデム状に配列されてなる約５０ｋｂのアルフォイドインサート（実施例１を参照）を含む）のＳａｌＩ−ＳａｌＩ（Ｃｏｓ，ｌｏｘＰ配列）を取り除いた前駆体を構築した（Δα５０）。
（４）ドナープラスミド
ｐＧＫ−ｐｕｒｏ（ＰＧＫプロモーター、ｐｕｒｏ遺伝子、ＰＧＫ遺伝子のｐｏｌｙＡ配列、アンピシリン耐性遺伝子、複製起点（ｏｒｉ）を含む大腸菌用ベクター）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片１．２ｋｂ（ｐｕｒｏ遺伝子のｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）とｌｏｘ６６−Ｎｌａｃｚｅｏ（Ｄｒ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ  Ｕｎｉｖ．より供与、Ｋｉｍｉ  Ａｒａｋｉ，Ｍａｓａｔａｋｅ  Ａｒａｋｉ  ａｎｄ  Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙａｍａｍｕｒａ（１９９７）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片３．０ｋｂ（ｌｏｘ６６を含む）をライゲーションし、ｐｌｏｘ６６−ｐｕｒｏを得た。ｐｌｏｘ６６−ｐｕｒｏよりＳｐｅＩ−ＫｐｎＩ断片１．２ｋｂ（ｌｏｘ６６−ｐｕｒｏカセット）を平滑末端化しｐＴＷＶ２２９のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した（ＴＷＶ−ｌｏｘ−ｐｕｒｏ）。ｐＥＧＦＰ−Ｃｌ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＡｓｅＩ−ＭｌｕＩ断片１．６ｋｂを平滑末端化し、ＴＷＶ−ｌｏｘ−ｐｕｒｏのＳａｌＩ部位に挿入した（Ｄｎ−ＥＧＦＰ）。
１５−２．Ｌｏｘ部位を持つ人工染色体の構築
アルフォイド前駆体（Δα５０）とアクセプター前駆体（ＢＡＣ−ｂｓｒ−ｌｏｘ７あるいはＢＡＣ−ＬＣＲ−ｌｏｘ７１）をＨＴ１０８０細胞に共導入し、薬剤（ｂｓ）耐性細胞からＦＩＳＨにより人工染色体を保有する細胞株を選び出した。
１５−３．挿入部位を持つ哺乳類人工染色体へのＧＦＰ遺伝子の挿入
ｌｏｘ１５−１３細胞株（βグロビンＬＣＲ・ｌｏｘ７１を持つ人工染色体を保有する、２ｘ１０５）に１μｇのｐＣＡＧ−Ｃｒｅ（Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子）と１μｇのＤｎ−ＥＧＦＰ（ｌｏｘ６６配列とＥＧＦＰ遺伝子）をリポフェクトアミンプラス試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションし、ピューロマイシンにより選択後、ＦＩＳＨにより挿入したＥＧＦＰが人工染色体上に存在することを確認した。
１５−４．人工染色体からのＥＧＦＰの発現量の定量
ヒトβグロビンＬＣＲを含まないアクセプター前駆体（ＢＡＣ−ｂｓｒ−ｌｏｘ７ｌｏｘ）を使用した場合にはＤｎ−ＥＧＦＰを挿入することに成功していないので、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｄｎ−ＥＧＦＰの作製に用いたＥＧＦＰ遺伝子）を染色体上のランダムな場所に組み込んだ安定株（ｐＥＧＦＰをＨＴ１０８０に導入することによって得られる細胞株）と比較した。トリプシン処理により個別にした各細胞のＥＧＦＰの蛍光強度をＩＰＬａｂソフト（日本ローパー）により定量した結果、人工染色体に挿入したＥＧＦＰの蛍光は染色体上数倍から十倍程度のＥＧＦＰ蛍光を発していることがわかった（図１９）。
本発明は、上記発明の実施の形態の説明に何ら限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書における引用文献を以下に列挙する。
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【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、目的遺伝子に加えてその本来の制御領域をも含む巨大なＤＮＡ領域を保持する哺乳類人工染色体が提供される。従って、哺乳類人工染色体に保持された遺伝子から本来の制御様式で遺伝子発現を行うことができる。
本発明の哺乳類人工染色体は、これを他の細胞に移入したり、或は胚性幹細胞などを経て個体レベルでの研究にも使用できる。従って、組織特異的遺伝子発現、経時的遺伝子発現の研究やモデル動物を使用したヒト型遺伝子の研究、薬剤（阻害剤、促進剤など）の開発などに極めて有用なツールとなる。
例えば、本発明の方法によって得られる、目的遺伝子を保持した人工染色体を保有する胚性幹細胞を利用すれば、目的遺伝子を発現するヒト人工染色体を保有した形質転換動物（キメラ動物を含む）を作出でき、単独遺伝子の発現様式を個体レベルで解析することが可能となる。また、本発明のＨＡＣを保有するクローン動物の作出も可能と考えられる。以上のようなヒト人工染色体を保有した形質転換動物は遺伝子治療のモデルとして利用され得る。更には、目的遺伝子に対する薬剤の効果を生理的条件下で解析することにも利用され得る。
本発明の哺乳類人工染色体は遺伝子治療用のベクターとしても有用である。このように、本発明の哺乳類人工染色体は、目的遺伝子に加えてその本来の制御領域をも含む巨大なＤＮＡ領域を運搬するための単純かつ一般的な方法を提供するものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月17日(2004.3.17)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、及び
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。
【請求項２】哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、及び
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。
【請求項３】前記第１ベクターが選択マーカー遺伝子を有し、前記第２工程における形質転換細胞の選択は該選択マーカー遺伝子を利用して行われる、請求の範囲第１又項は第２項に記載の作製方法。
【請求項４】前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の作製方法、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
【請求項５】前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項６】前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、請求の範囲第５項に記載の作製方法。
【請求項７】前記哺乳類セントロメア配列のサイズは約５０ｋｂ以下である、請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項８】（削除）
【請求項９】（削除）
【請求項１０】（削除）
【請求項１１】（削除）
【請求項１２】（削除）
【請求項１３】前記挿入用配列がｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１４】前記第１工程において導入する、前記第１ベクターと前記第２ベクターの量比はモル比で約１０：１〜約１：１０の範囲にある、請求の範囲第１項〜第１３項のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１５】（削除）
【請求項１６】（削除）
【請求項１７】請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載の作製方法によって得られ、
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、並びに所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項１８】請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載の作製方法によって得られ、
哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、並びに所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項１９】（削除）
【請求項２０】（削除）
【請求項２１】（削除）
【請求項２２】（削除）
【請求項２３】哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、並びに所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を有し、
環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項２４】哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、哺乳類テロメア配列、並びに所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を有し、
線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。
【請求項２５】前記挿入用配列がｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、請求の範囲第２３項又は第２４項に記載の作製の哺乳類人工染色体。
【請求項２６】前記哺乳類セントロメア配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第１７項〜第２５項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体、
５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’：配列番号１（但し、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，及びＧのいずれかである）。
【請求項２７】前記哺乳類セントロメア配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、請求の範囲第１７項〜第２５項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
【請求項２８】前記哺乳類セントロメア配列はヒト２１番染色体由来の１１量体繰返しユニットを含む、請求の範囲第２７項に記載の哺乳類人工染色体。
【請求項２９】前記挿入用配列及び前記インスレーター配列を複数個有する、請求の範囲第１７項〜第２８項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。
【請求項３０】（削除）
【請求項３１】請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の補乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する哺乳類細胞。
【請求項３２】請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有するヒト細胞。
【請求項３３】請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する胚性幹細胞。
【請求項３４】請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載の作製方法によって得られる哺乳類人工染色体又は請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する工程を含む、
ことを特徴とする、前記機能配列又は前記挿入用配列が長期間安定して維持可能な状態に導入された哺乳類細胞の作製方法。
【請求項３５】哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から、哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第４工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する第５工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項３６】哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第４工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する第５工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項３７】哺乳類セントロメア配列を含む環状の第１ベクターと、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を含む環状の第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から、哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させる第４工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する第５工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる第６工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
【請求項３８】哺乳類セントロメア配列及び哺乳類テロメア配列を含む酵母人工染色体からなる第１ベクターと、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列及びインスレーター配列を含む酵母人工染色体からなる第２ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第１工程と、
形質転換細胞を選択する第２工程と、
選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第３工程と、
選択された細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させる第４工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する第５工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる第６工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
【請求項３９】請求の範囲第３７項又は第３８項に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲット細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４０】請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞から哺乳類人工染色体を分離する工程と、及び
分離された前記哺乳類人工染色体をターゲット細胞としての哺乳類細胞に導入する工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４１】請求の範囲第１７項〜第３０項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞と、を融合させる工程と、
融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する工程と、及び
選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる工程と、
を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。
【請求項４２】請求の範囲第４１項に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲット細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、
を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４３】前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞である、請求の範囲第３４項、第３５項、第３６項、第３９項、第４０項、及び第４２項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４４】前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞を、特定の組織の細胞へと分化するように誘導してなる細胞である、請求の範囲第３４項、第３５項、第３６項、第３９項、第４０項、及び第４２項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４５】前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は哺乳類の受精卵である、請求の範囲第３４項、第３５項、第３６項、第３９項、第４０項、及び第４２項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。
【請求項４６】（削除）
【請求項４７】（削除）
【請求項４８】（削除）
【請求項４９】（削除）
【請求項５０】哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、
ｌｏｘＰサイト若しくはＦＲＴサイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列と、
インスレーター配列と、を含むベクター。
【請求項５１】（削除）
【請求項５２】請求の範囲第１７項〜第１９項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体が導入されてなる、非ヒト形質転換動物。
【請求項５３】（削除）
【請求項５４】請求の範囲第１７項〜第１９項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体が導入されてなる、ＸＯ型マウス胚性幹細胞。
【請求項５５】（削除）
【請求項５６】請求の範囲第１７項〜第１９項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体が導入されてなる、メスキメラマウス。




【国際調査報告】
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