(57)【要約】ＥＳ細胞中に含まれる成分を体細胞に対して作用させ、その活性を検出することにより、このような再プログラム化因子をスクリーニングすることができる。また、再プログラム化因子を含む成分、または、単離された再プログラム化因子を体細胞に作用させることにより、体細胞を再プログラム化することができる。また、本発明は、上記４倍体細胞が増殖能、及び多分化能を有することから、該細胞を分化させ、移植に用いることができる細胞、組織または臓器を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞に対して胚性幹（ＥＳ）細胞由来の成分を作用させる工程、該成分の体細胞を再プログラム化する活性を検出する工程、及び、再プログラム活性を有する成分を選択する工程を含む、体細胞核を再プログラム化する因子をスクリーニングする方法。
【請求項２】
体細胞、および／または、ＥＳ細胞由来の成分が、ヒト由来の細胞または成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＳ細胞中に含まれる再プログラム化因子。
【請求項４】
請求項３に記載の再プログラム化因子を作用させ、体細胞を再プログラム化する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の再プログラム化因子を体細胞に作用させ、体細胞を再プログラム化させる工程、及び、再プログラム化された細胞を分化させる工程を含む細胞、組織または臓器の製造方法。
【請求項６】
ＥＳ細胞および体細胞の未分化融合細胞を作製し、該融合細胞を分化させる工程を含む細胞、組織または臓器の製造方法。
【請求項７】
体細胞がリンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＳ細胞、および／または、体細胞がヒト由来の細胞である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６乃至８に記載の方法により得られた細胞、組織または臓器。
【請求項１０】
該細胞、組織または臓器が移植に用いられるもので請求項９に記載の細胞、組織または臓器。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、体細胞に対して胚性幹（ＥＳ）細胞由来の成分を作用させる工程、該成分の体細胞を再プログラム化する活性を検出する工程、及び、再プログラム活性を有する成分を選択する工程を含む、体細胞核を再プログラム化する因子をスクリーニングする方法、該方法により得られる再プログラム化因子、および、該因子を用いた体細胞を再プログラム化する方法に関する。さらに、該因子を用いて体細胞を再プログラム化した後、再プログラム化された細胞を分化させ、細胞、組織または臓器を得る方法に関する。また、胚性幹（ＥＳ）細胞および体細胞の未分化融合細胞を作製し、該細胞を分化させ細胞、組織または臓器を製造する方法、および、該方法により得られる細胞、組織または臓器に関する。
背景技術
胚性幹（ＥＳ）細胞は、初期の胚から誘導される迅速に増殖する未分化の全能性細胞であり、胚性腫瘍細胞と類似の性質を示す。ＥＳ細胞は最初、マウス胚盤胞の内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ；ＩＣＭ）をマウス繊維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養することにより確立された。ＥＳ細胞は、フィーダー細胞層および／または白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下のその未分化の状態を維持するような条件下で無限の寿命を有する［Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６８４−６８７（１９８８）］。また、高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化能を有し、集合塊として培養するだけで多種類の細胞に分化させることができることが知られている。ＥＳ細胞は、着床前の段階の胚より確立され、外胚葉、中胚葉および内胚葉の３胚葉由来の種々の細胞型へ分化する多分化能を有する細胞である［Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６（１９８１）；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ７８：７６３４−７６３８（１９８１）］。即ち、ＥＳ細胞は成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を有し、例えば、正常な初期の胚中に導入しキメラ胚を形成させることによりキメラ動物の体細胞、および生殖細胞の両方へ分化させることができる［Ｒ．Ｌ．Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １４０：１９４９−１９５６（１９７４）；Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５６（１９８４）］。精巣や卵巣等の生殖細胞にＥＳ細胞由来の細胞が導入されたキメラ動物を親として交配することにより、ＥＳ細胞由来の細胞のみで構成される子孫を得ることができる。これは即ち、遺伝学的に十分制御された人為的素質を有する動物を獲得できるということである。このような動物により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに限らず個体レベルにおいても発生や分化のメカニズムについての研究が可能となる。ＥＳ細胞は、胚性腫瘍細胞とは異なり、その多くが正常二倍体の核型を保持した正常細胞であり、キメラ形成率が高く、生殖系列の細胞へ分化する確立も高く［Ａ．Ｂｒｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５６（１９８６）］、発生学分野以外でもＥＳ細胞の利用範囲は広がりつつある。
例としては、ＥＳ細胞は、細胞研究や細胞分化を決定する遺伝子研究にとってこのうえない材料といえる。例えば、配列の知られた遺伝子の機能解析のため、マウスＥＳ細胞は遺伝的改変を導入し、遺伝子の破壊されたマウス株の産生に用いられてきた。未分化ＥＳ細胞の使用は、ヒトゲノム解読後の機能解析作業においてきわめて効率がよく有効であろう。また、ＥＳ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、広い範囲にわたる種々の細胞型へ分化することができるため、胚発生の際の細胞分化機構を研究するために使用されてきた。ＥＳ細胞を成長因子の添加、または胚様体を形成することにより造血細胞、心筋、および、幾つかの型のニューロン等の臨床的に有用な細胞へと分化するよう促すことが可能となってきた［Ｍ．Ｗｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１１：２５９−２６７（１９９１）；Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ−Ｈａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２５２４４−２５２５２（１９９３）；Ｖ．Ａ．Ｍａｌｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ． ４４：４１−５０（１９９３）；Ｇ．Ｂａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １６８：３４２−３５７（１９９５）］。有用な細胞へと分化させるマウスＥＳ細胞についての誘導の試みは、造血細胞、心筋、特異的ニューロン、および、血管の製造について成功している［Ｔ．Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０９８−１１０１（１９９４）；Ｒ．Ｐａｃａｃｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７５３０−７５３４（１９９５）；Ｖ．Ａ．Ｍａｌｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ． ４４：４１−５０（１９９３）；Ｓ．Ｈ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：６７５−６７９（１９９９）；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ２８：３１−４０（２０００）；Ｓ．−Ｉ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：１７４７−１７５７（１９９８）；Ｍ．Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９３：１２５３−１２６３（１９９９）］。
現在、ハムスター［Ｄｏｅｔｓｈｍａｎ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １２７：２２４−２２７（１９８８）］、ブタ［Ｅｖａｎｓ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３３：１２５１２８（１９９０）；Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３４：８７９−８９１（１９９０）；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ． ４０：５１−５６（１９９０）；Ｔａｌｂｏｔ  Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． ２９Ａ：５４６−５５４（１９９３）］、ヒツジ［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ． ４３：２５５−２６０（１９９１）］、ウシ［Ｅｖａｎｓ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３３：１２５−１２８（１９９０）；Ｓａｉｔｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｕｘ．Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． ２０１：１３４−１４１（１９９２）］、ミンク［Ｓｕｋｏｙａｎ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ． ３３：４１８−４３１（１９９３）］、ウサギ［特表２０００−５０８９１９号］並びに、アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類［Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４−７８４８（１９９５）；Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ． ５５：２５４−２５９（１９９６）］等のＥＳ細胞が確立されている。ヒトＥＳ細胞も確立されており、それらはマウスＥＳ細胞と類似した分化能を示した［Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７（１９９８）；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． ３８：１３３−１６５（１９９８）；Ｂ．Ｅ．Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：３９９−４０４（２０００）］。主に、マウスＥＳ細胞を用いて得られた分化誘導調節について蓄積された膨大な知識を適用することにより、ヒトＥＳ細胞が心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病および白血病を含む多数の疾病における移植治療用の種々の細胞・組織の無限の材料となり、移植治療におけるドナー不足問題が解消されることが期待されている。２０００年の６月２３日には、豪・米・独による３つの研究チームが、国際幹細胞生物シンポジウムにおいて、ヒトＥＳ細胞から神経細胞や筋肉細胞を初めて作り出すことに成功したことを報告した。また、最近、ヒトＥＳ細胞からの造血細胞を分化させる方法についても報告されている。しかしながら、移植治療においてＥＳ細胞を用いる場合にも、今日の臓器移植と同様に免疫的拒絶反応は生じるという問題は残されている。
現在、除核した卵細胞への体細胞核の導入により、体細胞核が全能性に再プログラム化されることが哺乳動物でも示され、クローンヒツジ、クローンウシ、クローンマウス、およびクローンブタ等が作成されている［Ｗｉｌｍｕｔ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）；Ｋａｔｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２０９５−２０９８（１９９８）；Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：３６９−３７４（１９９８）；Ｏｎｉｓｈｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１１８８−１１９０（２０００）；Ｐｏｌｅｊａｅｖａ  Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：８６−９０（２０００）］。この技術を利用し、移植を受ける宿主由来の体細胞の核を卵細胞を用いて再プログラム化し、全能性の細胞を作製することにより免疫的拒絶反応を惹起しない移植片を作製することができると考えられる。また、このような細胞培養の方法によれば、ドナー不足をも解消することができると思われる。しかしながら、この方法では卵細胞を用いる必要あることが倫理的な観点で問題となっている。
また、体細胞核を用いた動物クローンの作製では、成体となるまで生き延びるクローンの割合が非常に低い。移植前に起こる胚の喪失は、部分的には、核−細胞質相互作用の欠落によるのかもしれない［Ｋａｔｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２０９５−２０９８（１９９８）；Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：３６９−３７４（１９９８）］。さらに、妊娠中および誕生直後に、多くのクローン化された胎児が失われるが、この発達段階における失敗の理由の１つとしては、体細胞核の有効な再プログラム化の欠如が考えられる。体細胞特異的な対立遺伝子のメチル化パターンとしてＨ１９およびＩｇｆ２ｒ遺伝子座について調べられている。通常、この対立遺伝子特異的メチル化は、受精後の発達では維持されているが、生殖細胞発達では保持されない［Ｔｒｅｍｂｌａｙ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ． ９：４０７−４１３（１９９５）；Ｓｔｏｇｅｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：６１−７１（１９９３）］。生殖性幹細胞（ＥＧ）−胸腺細胞融合細胞では、Ｉｇｆ２ｒを含む幾つかの刷り込まれた遺伝子の体細胞メチル化パターンは妨害され、両方の対立遺伝子がメチル化されなかった［Ｔａｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ． １６：６５１０−６５２０（１９９７）］。その結果、ＥＧ細胞を用いた場合では、体細胞の異常な再プログラム化が起こる可能性がある。
正常な胚発達のための能力を導く、体細胞核のエピジェネティクスの再プログラム化に関わる機構は、多くが未調査のままである。最近、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２へリカーゼ／ＡＴＰａｓｅファミリーのメンバーであるＡＴＲＸ遺伝子における変異が、哺乳動物中の何度も繰り返される配列のメチル化プロフィールを変えることが示された［Ｇｉｂｂｏｎｓ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ． ２４：３６８−３７１（２０００）］。この結果、脱メチル化は、染色体再構築の結果として起こる可能性が示唆された。ヌクレオソーム依存性ＡＴＰａｓｅであるＩＳＷＩの母系の活性が、カエルのクローン化された体細胞における核の再プログラム化の過程で、染色体リモデラーとして機能するかもしれないことも報告されている［Ｋｉｋｙｏ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：２３６０−２３６２（２０００）］。Ｘｅｎｏｐｕｓの卵中で短時間インキュベートしたＸｅｎｏｐｕｓ  ＸＴＣ−２上皮細胞から抽出された核は再構築され、基礎転写複合体の鍵となる成分ＴＢＰが失われる。
一度、体細胞核の正常な再プログラム化を導く再プログラム化因子がスクリーニングされれば、それらの因子を利用することによってエピジェネティクスを操作できるようになると考えられる。そのような因子のスクリーニングにより、哺乳動物の胚を使用することなく、成人体細胞からのクローン化、または組織特異的幹細胞の産生が可能となる。このような技術は、細胞または組織の移植を必要とする多数の臨床適用におけるドナー細胞の産生を可能とすると考えられる。
発明の開示
本発明は、体細胞を再プログラム化できる因子をスクリーニングすることを目的とする。また、細胞、組織および臓器の移植を必要とする多数の疾病に対して用いることができる細胞、組織および臓器を提供することを目的とする。
本発明者らは、ＥＳ細胞と体細胞を融合した４倍体細胞を作製し、該細胞がｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることができ、また、体細胞核が再プログラム化されており、多分化能を有することを明らかにした。この結果より、ＥＳ細胞が体細胞核の正常な再プログラム化を行う因子を有することが明らかとなった。ＥＳ細胞中に含まれる成分を体細胞に対して作用させ、その活性を検出することにより、このような再プログラム化因子をスクリーニングすることができると考えられる。また、再プログラム化因子を含む成分、または、単離された再プログラム化因子を体細胞に作用させることにより、体細胞を再プログラム化することができると考えられる。
また、本発明は、上記４倍体細胞が増殖能、及び多分化能を有することから、該細胞を分化させることにより、移植に用いることができる細胞、組織または臓器が製造できることに着目した。特に将来的には、該４倍体細胞からＥＳ細胞由来の染色体を除き、体細胞由来の染色体のみを残した未分化細胞とすることにより、種々の疾病を処置するためのドナーとなる細胞、組織および臓器を確立するための理想的な材料となると考えられる。発明は具体的には、
（１）  体細胞に対して胚性幹（ＥＳ）細胞由来の成分を作用させる工程、該成分の体細胞を再プログラム化する活性を検出する工程、及び、再プログラム活性を有する成分を選択する工程を含む、体細胞核を再プログラム化する因子をスクリーニングする方法、
（２）  体細胞、および／または、ＥＳ細胞由来の成分が、ヒト由来の細胞または成分である、上記（１）に記載の方法、
（３）  ＥＳ細胞中に含まれる再プログラム化因子、
（４）  上記（３）の再プログラム化因子を作用させ、体細胞を再プログラム化する方法、
（５）  上記（３）の再プログラム化因子を体細胞に作用させ、体細胞を再プログラム化させる工程、及び、再プログラム化された細胞を分化させる工程を含む細胞、組織または臓器の製造方法、
（６）  ＥＳ細胞および体細胞の未分化融合細胞を作製し、該融合細胞を分化させる工程を含む細胞、組織または臓器の製造方法、
（７）  体細胞がリンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞である、上記（６）に記載の方法、
（８）  ＥＳ細胞、および／または、体細胞がヒト由来の細胞である、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）  上記（６）〜（８）に記載の方法により得られた細胞、組織または臓器、
（１０）  該細胞、組織または臓器が移植に用いられるもので上記（９）に記載の細胞、組織または臓器、
に関する。
本発明は体細胞核を再プログラム化する因子をスクリーニングする方法に関する。該方法は、適当な体細胞に対して、ＥＳ細胞由来の成分を作用させ、該成分の体細胞を再プログラム化する活性を検出し、そして、再プログラム活性を有する成分を選択することにより達成され得る。ここで用いられ得る体細胞としては、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞等を例示することができる。特に、これらに限定されるわけではなく、正常な染色体を有した体細胞であり、安定に増殖させることができ、再プログラム化因子の作用により多分化能を有する未分化細胞様に変化することができれば特に限定されない。特に、作用させるＥＳ細胞由来の成分が由来する種由来であることが好ましい（例えば、ＥＳ細胞由来の成分がヒト由来である場合、ヒト由来の体細胞）。既に確立されているセルラインを用いることも可能である。
本発明の「再プログラム化因子」または「再プログラム化する因子」とは、体細胞に作用し、体細胞を未分化細胞化する因子である。以下の実施例において示されるように、ＥＳ細胞は体細胞核のインプリントを再プログラム化することはできないが、生殖細胞の発達は可能とするよう、体細胞核のエピジェネティクス状態を再プログラム化した。従って、ＥＳ細胞中にそのような再プログラム化因子が含まれることは明らかである。体細胞に作用させるＥＳ細胞由来の成分としては、ＥＳ細胞中に含まれる成分であれば特に限定されないが、細胞質成分、核成分等、また個々のＲＮＡ及びタンパク質等が考えられる。雑多な分子を含む細胞質成分や核成分を作用させる場合、慣用な手段により（例えば、クロマトグラフィー等）ある程度の分画を行い、分画された各画分を体細胞に対して作用させても良い。特定の画分が再プログラム化因子を含むことが明らかとなった場合には、該画分を更に精製し、最終的には一つの分子として特定することもできる。また代わりに、該因子が含まれる画分をそのまま、何ら精製することなく体細胞の再プログラム化に用いることも可能である。また、再プログラム化因子は、一分子が単独でそのような作用を示す場合も考え得るが、複数の分子が相互作用により、体細胞を未分化様細胞へと変化させることも考えられる。従って、本発明の「再プログラム化因子」には、単一分子からなる因子、複数分子からなる因子、及び、前記単一分子または複数分子が含まれる組成物が包含されるものである。
本発明の再プログラム化因子のスクリーニング方法としては、ＥＳ細胞由来の成分を体細胞に接触、注入等の手段により作用させ、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマーカー遺伝子の発現、Ｘ染色体の活性化等の再プログラム化の指標となる活性を基にその作用を検出し、そして、再プログラム化活性を有していた成分を選択することにより行うことができる。
本発明の「ＥＳ細胞中に含まれる再プログラム化因子」は、上述のようなスクリーニング方法によりスクリーニングし、取得することができる。また、このような成分がＥＳ細胞以外にも含まれる可能性があるが、一度、ＥＳ細胞から上述の方法によって、再プログラム化因子が特定されれば、その再プログラム化因子を基に、その他の材料より該因子を得ることも、製造することも可能となる。例えば、上述の方法により得られた再プログラム化因子がＲＮＡであれば、該ＲＮＡの配列決定を行い、同じ配列のＲＮＡを周知の手法により合成することが可能である。また、再プログラム化因子がタンパク質であった場合には、該タンパク質に対する抗体を作製し、抗体への結合性を利用してその他、そのような因子が含まれ得る材料より再プログラム化因子を取得することができる。また代わりに、該タンパク質の部分アミノ酸配列決定を行い、該アミノ酸をコードする遺伝子とハイブリダイズするようなプローブを作製し、ハイブリダイズ法により該タンパク質をコードするｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを得ることもできる。また、プライマーを作製し、ＰＣＲ法により、そのような遺伝子を増幅して取得することも考え得る。前述のいずれの方法を含む種々の方法により得られた再プログラム化因子をコードする遺伝子を用いて、周知の遺伝子組換えの手法により目的とする再プログラム化因子を製造することができる。従って、本発明の「ＥＳ細胞中に含まれる再プログラム化因子」は、必ずしもＥＳ細胞から得る必要はなく、体細胞を再プログラム化させ得るような全ての因子が包含される。
本発明の体細胞、または、ＥＳ細胞および／または体細胞の未分化融合細胞より細胞、組織または臓器を製造する方法における、細胞を分化させる方法とは、該細胞の核型が保持されるような状態で細胞、組織または臓器が分化され得るのであれば特に限定されない。例えば、本実施例において示すように、胚盤胞への導入、マウス等の動物への皮下注射によりテラトーマを形成させること等により細胞、組織、及び臓器へと分化させることが可能である。所望の細胞、組織または臓器は、それらの分化された胚盤胞またはテラトーマから単離することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで目的とする種類の細胞を得るために必要とされる細胞増殖因子、成長因子等を添加し、細胞から所望の細胞、組織または臓器を誘導してもよい。現在まで、血管、神経細胞、筋肉細胞、造血細胞、皮膚、骨、肝臓等のＥＳ細胞からの誘導が報告されており、本発明の融合細胞からの移植個体に対応する細胞、組織または臓器の製造においても、それらの技術が適用できるものと考えられる。
本発明の未分化融合細胞からの細胞、組織または臓器の製造方法におけるＥＳ細胞としては、適当な個体からＥＳ細胞を確立して用いることも可能であるが、既に確立されている、種々の生物由来のＥＳ細胞を利用することが好ましい。例えば、マウス、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ミンク、ウサギ、アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類、およびヒトのＥＳ細胞を挙げることができる。好ましくは、使用する体細胞と同じ種由来のＥＳ細胞を用いる。
本発明の未分化融合細胞からの細胞、組織または臓器の製造方法における体細胞としては、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞等を例示することができる。特に、これらに限定されるわけではなく、正常な染色体を有した体細胞であり、ＥＳ細胞と融合された際に融合細胞として安定に増殖させることができ、多分化能を有する未分化細胞様に変化することができれば特に限定されない。該方法により製造された細胞、組織または臓器を移植用とする場合には、移植個体より得られた体細胞を用いることが好ましい。
本明細書中の融合細胞とは、上述のようなＥＳ細胞、および、体細胞との融合により作製されるものであり、安定に増殖させることができ、多分化能を有する未分化細胞のことである。このような融合細胞から、宿主ＥＳ細胞由来の染色体をうまく除けた場合、該細胞は体細胞由来の染色体のみを有する２倍体未分化細胞とすることができ、より理想的な種々の疾病を処置するためのドナーとなり得る。ＥＳ細胞由来の染色体を除く方法としては、放射線照射、薬剤処理、及び遺伝子操作等を利用した方法が考えられる。例えば、ＥＳ細胞の体細胞との融合処理を行う前に、放射線または薬剤により処理することにより、融合された後にＥＳ細胞由来の染色体のみが壊れるようにすることができると思われる。染色体を除く際に用いる薬剤としては例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を挙げることができる。ＢｒｄＵを用いた染色体の処理方法では、まずＥＳ細胞を該薬剤により処理し、体細胞と融合した後にＵＶ照射を行う。この照射によりＢｒｄＵ処理されたＥＳ細胞由来の染色体のみが除かれる。また、遺伝子操作により融合細胞中のＥＳ細胞由来の染色体を除去する方法としては、次のような方法が考えられる。まず、予めＥＳ細胞のゲノム中にランダムにＬｏｘＰ配列を導入する。体細胞との融合後に、強制的にＣｒｅ蛋白質を発現させることによりＥＳ細胞由来の染色体のみが除かれる。
本発明において、未分化融合細胞から細胞、組織または臓器を製造する際に、ＥＳ細胞と体細胞とを融合させる方法は、ＥＳ細胞と体細胞とが接触により融合し、融合細胞を形成するような方法であれば特に限定されない。例えば、実施例に記載されるようにＥＳ細胞と体細胞とを、一定の割合、例えばＥＳ細胞と胸腺細胞の融合細胞を作る場合には１：５の割合で混合し、洗浄する。細胞をマンニトール緩衝液等の適当な緩衝液中に懸濁し、電気融合させることにより作製することができる。このような電気刺激による細胞膜の構造変化を利用した高電圧パルス細胞融合法（エレクトポレーション）［例えば、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５（１９８２）］の他に、センダイウイルスや、リゾレシチン、グリセロール、オレイン酸エステル、ポリエチレングリセロール等の化学的な細胞融合促進物質を用いた細胞融合法が公知である。いかなる融合方法であれ、ＥＳ細胞と体細胞の融合により形成された細胞が、融合細胞として安定に増殖させることができ、体細胞由来の核が多分化能を有する未分化細胞様に変化することができれば特に限定されない。
本発明の細胞、組織または臓器を移植に用いる場合には、単独で用いることも可能であるが、既存の免疫抑制法と組み合わせて使用することもできる。例えば、免疫抑制剤、外科的手術、放射線照射等が挙げられる。まず、免疫抑制剤として主なものとして副腎皮質ステロイド薬、シクロスポリン、ＦＫ５０６等がある。次に外科的手術としては、例えば、リンパ節摘出、脾臓摘出、胸腺摘除、胸菅ろうとが挙げられる。放射線照射には全身照射と移植片照射がある。これらを適宜組み合わせることにより、レシピエントにおける移植片に対する拒絶反応をより効率的に抑制することが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
１．キメラ胚の作製
（１）ＥＳおよびＥＧセルライン
ＥＳセルラインとしては、Ｅ３．５雄１２９／Ｓｖ胚盤胞より確立したＥＳセルラインＴＭＡＳ−５［Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ（ｐｐ２５４−２９０），ｉｎ″Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ″ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｓｔａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ）（１９９４）］、およびｎｅｏ／ｌａｃＺレポーター遺伝子を運ぶＲｏｓａ２６胚盤胞由来Ｇ４１８−耐性ＥＳセルラインＮＲ−２［Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｇ．ａｎｄ  Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｐ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ． ５：１５１３−１５２３（１９９１）］を用いた。また、ＥＧセルラインとしては、Ｅ１２．５雌ＰＧＣ［Ｔａｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅ．Ｅｖｏｌ． ２０７：５５１−５６１（１９９８）］から確立したＥＧセルラインＴＭＡ−５８Ｇ［Ｔａｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ． １６：６５１０−６５２０（１９９７）］、および、薬剤耐性遺伝子ｐＳＶ２ｂｓｒのＴＭＡ−５８Ｇ細胞へのトランスフェクションにより産生し
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らの細胞を、マイトマイシンＣで不活性化したマウスＧ４１８−耐性始原胚性繊維芽細胞（ＰＥＦ）フィーダー細胞（Ｒｏｓａ２６の１２．５日齢胚の初代培養線維芽細胞より通常の方法により作製）上のＥＳ培地（１５％ウシ胎児血清、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール、および１０００ユニット／ｍｌ組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ；ＥＳＧＲＯ）を補ったダルベッコ
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有するＥＳ培地で培養した。以下の細胞融合実験では、ＥＳセルラインおよびＥＧセルラインは、それぞれ１０継代以内のものを用いた。
（２）細胞融合によるハイブリッドクローンの作製
（２）−１．  ＥＳ融合細胞
胸腺細胞は次の３種類の６〜８週齢のマウスのものを使用した：
（Ａ）  １２９／Ｓｖ−ＴｇＲ（Ｒｏｓａ２６）２６Ｓｏｒ（Ｒｏｓａ２６と呼ぶ）［Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｇ．ａｎｄ  Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｐ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ． ５：１５１３−１５２３（１９９１）］；ｎｅｏ／ｌａｃＺレポーター遺伝子を全身の細胞で発現している
（Ｂ）  ＧＯＦ−１８／ＧＦＰ（Ｏｃｔ４−ＧＦＰと呼ぶ）［Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ． ４１：６７５−６８４（１９９９）］；全能性および多分化性細胞でＧＦＰを特異的に発現している
（Ｃ）  （Ｒｏｓａ２６×Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）Ｆ１トランスジェニックマウス（Ｒｏｓａ２６マウスの雌に、雄Ｏｃｔ４−ＧＦＰトランスジェニックマウス［Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ． ４１：６７５−６８４（１９９９）］を交配した雑種マウス）；ｎｅｏ／ｌａｃＺ遺伝子、およびＯｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子の両方を含む。
Ｒｏｓａ２６マウスは尻尾の先端をＸ−ｇａｌ染色することにより同定した。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウスは、次のプライマーを用いた尻尾のＤＮＡのＰＣＲ分析により確認した：ＯＣＧＯＦＵ３５，５’−ＣＴＡＧＧＴＧＡＧＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡ−３’（配列番号：１）、およびＥＧＦＰＵＳ２３，５’−ＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＣ  ＧＴＡ−３’（配列番号：２）。トランスジェニックマウスより得た胸腺を１８ゲージの針に数回通すことにより、単一細胞の懸濁液とした。ＥＳ細胞としてＴＭＡＳ−５細胞を用い、前述の３種類の胸腺細胞とを、各々、ＥＳ細胞と胸腺細胞の割合が１：５となるよう混合し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度で０．３Ｍマンニトール緩衝液中に懸濁した。１ｍｍの電極ギャップを持つスライドグラスとＥｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ２０００（ＢＴＸ）を用いた電気融合（Ｅ＝２．５〜３．０ＫＶ／ｃｍ）により融合細胞を作製した。ＥＳ培地中で１日培養した後、７〜１０日かけて、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有するＥＳ培地中で、不活性化Ｇ４１８−耐性ＰＥＦについて選択した。融合細胞クローンを採取し、広げ（継代１）、Ｇ４１８を補ったＥＳ培地中で３〜４日培養した。ＥＳハイブリッドクローンは、２日毎に新しい培地へサブカルチャーした。
（２）−２．  ＥＳ×ＥＧ融合細胞
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合で混合し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で０．３Ｍマンニトール緩衝液中に懸濁した。ＥＳ×ＥＧ融合細胞を２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および３〜４μｇ／ｍｌ  ＢＳを含むＥＳ培地中で７〜１０日かけて選択した。
ＥＳハイブリッドクローンは、以前の我々の研究で作成されたＥＧハイブリッドクローン［Ｔａｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ． １６：６５１０−６５２０（１９９７）］と同じような割合（２．８×１０−４）で得つことができた。全ての型の融合細胞は親のＥＳ細胞に類似し、培養における形態的な変化は見られなかった。Ｇ−バンド法による細胞遺伝学的な分析により、試験した全１３個のＥＳ融合細胞および２個のＥＳ×ＥＧハイブリッドクローンにおいて、３つのＸ染色体および１つのＹ染色体を含む完全な染色体セットが示された。さらに、ＥＳハイブリッドおよびＥＳ×ＥＧハイブリッドセルラインの２〜４継代目を分子分析において用いた。
（３）融合の確認
ＥＳ細胞が分化した細胞と融合されたことを確認するため、Ｔ細胞受容体（Ｔｃｒ）βのＤ−Ｊ領域、免疫グロブリン（Ｉｇ）ＨのＤ−Ｊ領域、並びに、ＴｃｒδおよびＴｃｒγのＶ−Ｊ領域に特異的な４つのプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅を、胸腺細胞とのＥＳ融合細胞から抽出したＤＮＡを鋳型として行った。成人胸腺、ＥＳ細胞およびＥＳハイブリッドクローンからのゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）について、次のプライマーセットを用いて、各々の遺伝子の再配列の検出のためＰＣＲ増幅した。
（Ａ）Ｔｃｒβ遺伝子のＤβ２−Ｊβ２再配列：Ｄβ２，５’−ＧＴＡＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴ−３’（配列番号：３）；Ｊβ２，５’−ＴＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＧＡＴＴ−３’（配列番号：４）［Ｌｅｖｉｎ  Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ． １２：１６７１−１６８０（１９９３）］
（Ｂ）ＩｇＨ遺伝子のＤ−Ｊ再配列：Ｄμ，５’−ＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＴ−３’（配列番号：５）；Ｊμ，５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号：６）［Ｇｕ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６５：４７−５４（１９９１）］
（Ｃ）Ｔｃｒγ遺伝子のＶγ７−Ｊγ１再配列：Ｖγ７，５’−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号：７）；Ｊγ１，５’−ＡＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号：８）［Ｌｉｖａｋ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：２５７５−２５８０（１９９９）］
（Ｄ）Ｔｃｒδ遺伝子のＶδ５−Ｊδ１再配列：Ｖδ５，５’−ＣＡＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣ−３’（配列番号：９）；Ｊδ１，５’−ＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡＣＴＴＧＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：１０）［Ｗｉｌｓｏｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３７−４５（１９９６）］
ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。ＰＣＲ産物の特異性は、Ｔｃｒβについてはビオチン化したＪβ２−特異的オリゴプローブ：５’−ＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＣＴＡＡ−３’（配列番号：１１）［Ｌｅｖｉｎ  Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ． １２：１６７１−１６８０（１９９３）］、ＩｇＨについてはビオチン化したＪＨ４オリゴプローブ：５’−ＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧ−３’（配列番号：１２）［Ｅｈｌｉｃｈ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７２：６９５−７０４（１９９３）］を用いてサザンハイブリダイゼーションを行うことにより確認した。
ＤＮＡの再配列は、胸腺細胞がリンパ系細胞へ分化したことを示す明確な証拠の一つである［Ｆｏｗｌｋｅｓ  Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｐａｒｄｏｌｌ  Ｄ．Ｍ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４：２０７−２６４（１９８９）］。ハイブリッドクローンのうち４５％で、Ｔｃｒβ  Ｄ−Ｊβ２．１、２．２、２．３、２．４、２．５または２．６に特異的な再配列が見られた（図１ａ）。また、幾つかのクローンにおいてＩｇＨ  Ｄ−Ｊ領域（図１ｂ）、並びに、ＴｃｒδおよびＴｃｒγのＶ−Ｊ領域（各々、図１ｃおよび１ｄ）の同様な再配列が見られた。３１のＥＳハイブリッドクローンのうち全部で１７個（５５％）が、少なくとも研究された再配列の一つを有していた。これらの場合、ＥＳ細胞は、リンパ系細胞に胸腺細胞核が分化した後に融合されたと考えられる。
（４）Ｘ染色体活性
雌の体細胞では、２個のＸ染色体のうちの１つがＸ連結遺伝子の用量補償作用（ｄｏｓａｇｅ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）によりランダムに不活性化されている。Ｘ染色体の不活性化は初期細胞分化の間に起こり、後期Ｓ期へのＤＮＡ複製の移行の遅れ、ＤＮＡの超メチル化およびヒストンＨ４の低アセチル化を含むエピジェネティクス変化を誘導する。体細胞核の卵母細胞への核移植により作ったクローン化胚では、雌体細胞の不活性化Ｘ染色体が再活性化される［Ｅｇｇａｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５７８−１５８１（２０００）］。従って、両Ｘ染色体の活性化は、核の再プログラム化が起こったことを示す指標となる。Ｘ染色体活性について分析するため、我々は、複製分染法［Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ８８：１３３−１３８（１９８３）］を用いて研究を行った（図２ａ）。
（４）−１．  Ｘ染色体複製のタイミング
上記（２）に記載のＥＳ融合細胞およびＥＳ×ＥＧ融合細胞の染色体調製物を、細胞を１５０μｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）と一緒に７時間培養し、最後の１時間は０．３μｇ／ｍｌコルセミド存在下で培養することにより製造した。０．０７５Ｍ  ＫＣｌによる室温で８分間の低浸透圧処理後、細胞をメタノール：酢酸（３：１）溶液に３回浸漬して固定し、風乾し、新しく調製したアクリジンオレンジ溶液で染色した。標準Ｂフィルターの蛍光顕微鏡下でスライドを観察した。Ｓ期後期におけるＢｒｄＵの持続的な編入、およびアクリジンオレンジ染色の後、活性Ｘ染色体および常染色体は、赤および緑に分染された因子として観察された。不活性なＸ染色体は、複製の遅れにより、雌の体細胞中では均一に鈍い赤色である（図２ｂ）。核型を決定した全３２個の細胞（４ｎ＝８０）で、ＸＹ雌ＥＳ細胞、およびＸＸ雌胸腺細胞の６個の融合細胞クローンは、３つの同時に複製するＸ染色体を運んでいた（図２ｃ）。
（４）−２．  ＸｉｓｔのＲＮＡ  ＦＩＳＨ
一連のエクソン１〜７を含むＸｉｓｔ  ｃＤＮＡクローンの混合物由来のｃｙ３−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるニックトランスレーションにより調製したプローブ［Ｓａｄｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２８：１２７５−１２８６（２００１）］を用いて、４−１と同様に得た染色体調製物をハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション、および、それに続いての洗浄は以前、記述されているように行った［Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５７：４９３−５０２（１９８９）］。（４）−１で得られた結果と一致し、Ｘｉｓｔ（Ｘ−不活性特異的転写物）ＲＮＡが、ＲＮＡ  ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）で試験した２つのＥＳハイブリッドセルラインの３つのＸ染色体常に不安定に蓄積（斑点）していた（図２ｄ）。Ｘｉｓｔ蓄積はまた、雄ＥＳ細胞の活性Ｘ染色体上でも不安定であったが、雌胸腺細胞上の不活性Ｘ染色体上では安定であった（彩色シグナル）。体細胞核由来の不活性Ｘ染色体は、ハイブリダイゼーション後、活性Ｘ染色体の幾つかの特性を帯び、複製、およびＸｉｓｔ発現パターンが、未分化細胞で見られるパターンと似ている。（４）−１、および（４）−２で示されたＥＳ融合細胞における、複製のタイミングの変化、および体細胞Ｘ染色体上のＸｉｓｔ  ＲＮＡ集積は、細胞融合後、体細胞核が再プログラム化されたことを示唆する。
（５）体細胞核の再プログラム化
体細胞核の再プログラム化を視覚化するために、Ｏｃｔ４−ＧＦＰトランス遺伝子を持つマウス株を使用した（図３）。Ｏｃｔ４発現は生殖細胞、移植前の胚、および移植前の初期胚の原外胚葉に特異的に観察される。従って、Ｏｃｔ４の活性は、全能性および／または多分化能細胞の同定のための理想的なマーカーとなる。Ｏｃｔ４−ＧＦＰの発現パターンは内因性のＯｃｔ４の発現パターンに匹敵することが知られている［Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ． ４１：６７５−６８４（１９９９）］。Ｏｃｔ４−ＧＦＰトランスジェニックマウスの胸腺および卵巣についてＯｃｔ４−ＧＦＰの発現を観察した。ＧＦＰは胸腺では検出されなかったが、生育中の卵巣中では検出された（図３ａ〜ｄ）。
Ｏｃｔ４−ＧＦＰトランスジェニックマウスの胸腺細胞をＥＳ細胞と融合し、選別することなく培養し、１２時間おきにＧＦＰ発現について観察した。培養皿上の生きたＥＳ融合細胞中のＧＦＰ発現は、ＧＦＰ励起源およびＧＦＰフィルターを備えた解剖顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で調べることにより行った。４８時間後に初めて、より大きな非発現性のコロニーの縁に、１６個の細胞からなるＧＦＰ陽性のコロニーを観察した（図３ｅ、ｆ）。続いて、コンフルエントに達する前に、同じ培養プレート上で幾つか別のＧＦＰ陽性コロニーを観察した。同じ条件下で培養した未融合の胸腺細胞ではＧＦＰ陽性細胞は観察されなかった。全てのＥＳ融合細胞において体細胞核の再プログラム化が起こるかどうか調べるため、Ｇ４１８選抜に対して耐性の（Ｒｏｓａ２６×Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）Ｆ１マウスの胸腺細胞を用いた。選別の後、得られた３７クローンのうち３６個がＧＦＰを発現していた（９７％）。この発現は、サブカルチャーを幾代か続けても安定に維持され（図３ｇ、ｈ）、ＥＳ融合細胞の大部分において胸腺細胞核が再プログラム化されることが示された。細胞融合前の胸腺細胞において抑制されていたＯｃｔ４−ＧＦＰトランス遺伝子が、ＥＳ融合細胞において再活性化されたということは、細胞融合後、体細胞核が再プログラム化されたという（４）の結果をさらに裏付けるものである。
（６）胚盤胞への導入
ＥＳ融合細胞とのキメラ胚を作成するために正常な二倍体胚盤胞を用いた。ＩＣＲ雄と自然にかけ合わせたＩＣＲ雌の子宮より妊娠の３．５日目に二倍体胚盤胞を得た。上述の、（Ｒｏｓａ２６×Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）Ｆ１マウス由来の（分化した）胸腺細胞とのハイブリッドクローン、および、Ｒｏｓａ２６マウス由来の胸腺細胞とのハイブリッドクローンを四倍体融合細胞として用いた。十分に拡張した胚盤胞の割腔孔に四倍体融合細胞をマイクロインジェクションした（図４ａ）。これらの胚盤胞を偽妊娠ＩＣＲ雌の子宮に移した。Ｅ７．５において子宮よりキメラ胚を取り出し、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ膜を除き、β−ガラクトシダーゼ染色および組織学的分析を行った。
（６）−１．  β−ガラクトシダーゼ活性染色
β−ガラクトシダーゼ活性染色により、各キメラにおける融合細胞の相対的な寄与について確認した。培養細胞をＰＢＳで洗浄し、１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド、０．０２％ＮＰ４０および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳを用い、４℃で５分間固定した。同じ固定液を使用して胚、および、マウスの尻尾を４℃で３〜４時間かけて固定した。試料をＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ  ４−Ｃｌ−５−Ｂｒ−インドリル−β−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）をＰＢＳ中のジメチルホルムアミド、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化カリウムおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に含む反応混合物により室温で２４〜４８時間染色した。
（６）−２．  組織学的分析
Ｘ−ｇａｌで染色したＥ７．５胚を上昇アルコール系列（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｅｒｉｅｓ）で脱水し、ＪＢ−４プラスチック樹脂（ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）中に包埋した。２〜４μｍの極薄切片を０．２５％エオシンＹで逆染色した。パラフィンに固定および包埋した４週齢の奇形腫を８μｍの厚さの切片にした。連続的な切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
その結果、２０個のＥ７．５胚のうち８個が陽性であり、融合細胞の限定的な寄与が示された（図４ｂ、ｃ）。詳細な分析により、胚性外胚葉、胚性中胚葉、および内臓内胚葉において融合細胞からの派生物が明らかにされた（図４ｄ、ｅ）。以上のように、ＥＳ融合細胞は、移植前の初期胚の３つの始原胚芽層（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する発達能を有していた。
（７）ＤＮＡのメチル化
次に、胸腺細胞の核の再プログラム化がインプリントされた遺伝子座におけるメチル化に影響するかどうかを胸腺細胞、ＥＳ細胞および作製したハイブリッドクローンのＤＮＡについて、サザンブロットハイブリダイゼーションにより調べた。サザンブロットハイブリダイゼーションは、制限酵素により消化したゲノムＤＮＡを０．８％アガロースを用いて分画し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にアルカリブロットにより移し、ＤＮＡを３２Ｐ−ｄＣＴＰにより標識したプローブとハイブリダイズさせることにより行った。
（７）−１．  Ｈ１９遺伝子座
発現される母系のＨ１９遺伝子座の上流には、父系のメチル化された領域が含まれ、始原メチル化インプリントが維持されていると考えられる［Ｔｒｅｍｂｌａｙ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ． ９：４０７−４１３（１９９５）］。胸腺細胞、ＥＳ細胞、および作製したハイブリッドクローンのＤＮＡ試料をＢａｍＨＩ、およびメチル化感受性制限酵素ＨｈａＩにより消化した。３．８ｋｂ  ＳａｃＩプローブ、および２．７ｋｂ  ＢａｍＨＩプローブにより父系のメチル化された１０ｋｂおよび２．７ｋｂの断片、並びに、母系の未メチル化７．０ｋｂおよび１．８ｋｂ断片が胸腺細胞およびＥＳ細胞の両方からのＤＮＡで検出された。同じパターンがハイブリッドクローンで見られ、メチル化された（ＲＩ＝０．６０）、および未メチル化（ＲＩ＝０．４０）バンドの相対的強度（ＲＩ）に差違はなかった（図５ａ）。父系のメチル化断片が２．７ｋｂに、そして母系の未メチル化断片が１．８ｋｂおよび０．８ｋｂに同定されるＢａｍＨＩプローブを用いても同様の結果が観察された。全ての試料において、メチル化された（ＲＩ＝０．５５）、および未メチル化（ＲＩ＝０．４５）バンドが同じように検出された（図５ａ）。
（７）−２．  Ｉｇｆ２ｒ遺伝子座
Ｉｇｆ２ｒ領域２のメチル化分析のためのプローブを、次のプライマーを用いてＰＣＲにより作成した：５’−ＡＡＴＣＧＣＡＴＴＡＡＡＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＣＣＴ−３’（配列番号：１３）および５’−ＴＡＧＣＡＣＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号：１４）［Ｓｔｏｇｅｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：６１−７１（１９９３）］。メチル化がインプリントされることが知られるＩｆｇ２ｒ遺伝子のイントロンのＣｐＧアイランドは、発現されたアレル上でのみメチル化される［Ｓｔｏｇｅｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：６１−７１（１９９３）］。上述の（７）−１と同様に、各ＤＮＡ試料をＰｖｕＩＩ、およびメチル化感受性制限酵素ＭｌｕＩで消化した。３３０ｂｐのＩｇｆ２ｒＣｐＧアイランドプローブにより２．９ｋｂの母系由来のメチル化断片、および２．０ｋｂの父系由来の未メチル化断片が、胸腺細胞およびＥＳ細胞の両方からのＤＮＡ中で検出された（図５ｂ）。同じパターンがハイブリッドクローンでも見られ、メチル化された（ＲＩ＝０．５５）、および未メチル化（ＲＩ＝０．４５）バンドの相対的強度（ＲＩ）に差違はなかった（図５ａ）。
（７）−１および（７）−２より、胸腺細胞ゲノム中のＨ１９上流領域、およびＩｇｆ２ｒイントロン領域の両方の始原メチル化が、ＥＳ細胞との融合による影響を受けないことが示された。この結果は、以前、Ｉｇｆ２ｒの母系特異的メチル化が消失したＥ１２．５マウス胚の生殖細胞ＰＧＣ由来のＥＧ細胞と胸腺細胞とのハイブリッドクローンにおける観察［Ｔａｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ． １６：６５１０−６５２０（１９９７）］と異なっている。ＥＳ融合細胞における体細胞メチル化パターンの維持は、インプリント遺伝子のＤＮＡメチル化を調節する制御機構がＥＳ細胞とＥＧ細胞とで異なっていることを示唆する。ＥＳ細胞中ではＩｇｆ２ｒの母系アレル特異的メチル化が観察されたが、ＥＧ細胞、および１：１のＥＳ細胞ＤＮＡおよびＥＧ細胞ＤＮＡのコントロール混合物中では約１：３の割合（メチル化／ＲＩ＝０．２７、未メチル化／ＲＩ＝０．７３）では観察されなかった。ＥＳ×ＥＧハイブリッドではメチル化バンドは消失し（図５ｃ）、ＥＧ細胞中の脱メチル化活性が、ＥＳ細胞中のメチル化インプリント維持に対して優性であることが示された。
２．テラトーマの作製
１のキメラ胚の作製と同様の方法により作製したＴＭＡＳ−５ＥＳ細胞とＲｏｓａ２６由来の胸腺細胞の融合細胞を四倍体融合細胞として用いた。およそ１００万〜５００万個の四倍体融合細胞を、ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の後肢そけい部に皮下注射した。皮下注射から４週目に奇形腫を集めた。奇形腫が融合細胞由来であることをＸ−ｇａｌ染色により確認した。次に、奇形腫をブワン固定液を用いて固定し、Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色により、核および細胞質の両方を染色した。ＨＥ染色の結果、筋肉、軟骨、上皮細胞、神経細胞が観察された（図６）。
産業上の利用の可能性
本発明により再プログラム化に関連する分子機構について研究できるように操作できる実験系が提供された。これは、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞を作成することにより初めて観察することができた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＥＳ細胞の体細胞核の少なくとも一部を再プログラム化する能力を利用するものである。ＥＧ細胞と異なりＥＳ細胞は父系インプリントを再プログラム化することはできない。ＥＳ×ＥＧ融合細胞中のＩｇｆ２ｒのメチル化分析により、ＥＧ細胞がより強力なエピジェネティクスの再プログラム化に関与する付加的な優性因子を持っていることが示唆された。実際に、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞は、それぞれの細胞起源の特性を反映しているようである。よって、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞の両方が、エピジェネティクスの再プログラム化、並びに、初期生殖細胞および生殖腺ＰＧＣ中の脱メチル化に関与する因子をスクリーニングするための有用な材料となる。
このような観察により確立された、本発明の体細胞核を再プログラム化する因子をスクリーニングする方法により得られる再プログラム化因子を体細胞に作用させることにより、体細胞を未分化細胞化することができる。このような体細胞由来の未分化細胞は、もととなった体細胞と同じ核型を有し、種々の疾病を処置するためのドナーとなる細胞、組織および臓器を確立するための理想的な材料となり得る。
また、本発明者らは、ＥＳ細胞と体細胞を融合した４倍体細胞を作製し、該細胞がｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることができ、また、体細胞核が再プログラム化されており、多分化能を有することを明らかにした。該４倍体細胞自体、ＥＳ細胞と同様に種々の疾病を処置するためのドナーとなる細胞、組織及び臓器の製造において利用することが可能であるが、さらに、このような４倍体細胞から、宿主ＥＳ細胞由来の染色体をうまく除けた場合、該細胞は体細胞由来の染色体のみを有する２倍体未分化細胞とすることができ、より理想的な種々の疾病を処置するためのドナーとなり得る。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＳ融合細胞中の胸腺細胞由来Ｔｃｒβ、Ｔｃｒδ、ＴｃｒγおよびＩｇＨ遺伝子のＤＮＡ再配列を示すＰＣＲ分析の結果を示す写真である。（ａ）〜（ｄ）の写真は各々、次の領域に対して特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲ分析の結果である：（ａ）ＴｃｒβのＤ−Ｊ領域、（ｂ）ＩｇＨのＤ−Ｊ領域、（ｃ）ＴｃｒδのＶ−Ｊ領域、（ｄ）ＴｃｒγのＶ−Ｊ領域。用いたＤＮＡ試料は次の通りである：Ｔ；（Ｒｏｓａ２６×Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）Ｆ１マウスの胸腺細胞由来、ＥＳ；ＥＳ細胞由来、Ｍ；λ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡおよび１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ  ＤＮＡのマーカー混合物、１〜７；ＥＳハイブリッドクローン由来。
図２は、ＥＳ融合細胞中の胸腺細胞由来Ｘ染色体の再活性化を示す写真である。（ａ）ＥＳ融合細胞中のＸ染色体複製のタイミングのＲ分染分析の結果を示す。ＥＳ融合細胞では、３本のＸ染色体（雌胸腺細胞より２本のＸ染色体、そして雄ＥＳ細胞より１本のＸ染色体）が赤、および緑に検出され、活性であることが示された。（ａ）において、同時に複製する３本のＸ染色体が、（ｃ）で拡大して示される（矢印）。雌体細胞中のＸ染色体（（ｂ）中矢印で示す）、およびＹ染色体（（ａ）中）は、均一に赤色に染色され、不活性であることが示された。（ｄ）Ｘｉｓｔ  ＲＮＡは、雄ＥＳ細胞の活性Ｘ染色体上に斑点状の赤いシグナルとして検出されるのに対して、大きな赤いシグナルとして雌胸腺細胞の不活性Ｘ染色体は全体を覆う。調べた２つのＥＳハイブリッドセルライン（ＥＳ×Ｔ１およびＥＳ×Ｔ２）中で、各核について３つの斑点状の赤いシグナルが検出された。
図３は、ＥＳ融合細胞中の再活性化を示す顕微鏡写真である。ＥＳ融合細胞の作製に用いた（Ｒｏｓａ２６×Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）Ｆ１マウスの胸腺（ａ，ｂ）、および卵巣（ｃ，ｄ）のＧＦＰ蛍光像、および明視野像である。（ｅ）融合２日後のコロニーの明視野像であり、矢印は（ｆ）により示されたＧＦＰ−陽性コロニーを指し示す。（ｆ）融合２日後のＧＦＰ蛍光像である。小さなＧＦＰ陽性のコロニーが、非発現ＥＳ細胞コロニーの横に出現している。陽性コロニーの写真を上部に拡大して示す。（ｇ）（ｈ）についての明視野像である。（ｈ）Ｇ４１８選択後のコロニーより拡張したＧＦＰ陽性細胞についての写真である。
図４は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＳ融合細胞の発達能を示す図および写真である。（ａ）ＥＳ融合細胞、およびキメラ胚の作製方法を模式的に示す図である。（ｂ）ＥＳ融合細胞のＥ７．５キメラ胚のβ−ガラクトシダーゼ活性染色の結果を示す写真である。融合細胞由来の細胞は青色に示される。（ｃ）Ｅ７．５キメラ胚を縦軸方向に切断した切片について組織学的分析を行った結果を示す写真である。（ｄ，ｅ）より高倍率でのキメラ胚切片の写真である。Ｅｃｔ；外胚葉、Ｍｅｓ；中胚葉、Ｅｎｄ；内胚葉。
図５は、ＥＳハイブリッドおよびＥＳ×ＥＧ融合細胞中のＨ１９遺伝子、およびＩｇｆ２ｒ遺伝子のメチル化についての分析に関連した図、並びに分析結果の写真である。（ａ）はＨ１９遺伝子、（ｂ）および（ｃ）はＩｇｆ２ｒ遺伝子についての分析結果を示す。矢印はメチル化ＤＮＡ断片を指し、○は未メチル化ＤＮＡ断片を表す。実験方法のまとめを（ｃ）に図示する。各レーンの表示は次の通りである：Ｔ；胸腺細胞、ＥＳ／Ｔ；ＥＳおよび胸腺細胞ＤＮＡの１：１混合物、ＥＳ／ＥＧ；ＥＳおよびＥＧ  ＤＮＡの１：１混合物、ＥＳ×Ｔ；ＥＳ細胞およびＲｏｓａ２６胸腺細胞のＥＳハイブリッドクローン。
図６は、テラトーマの形成、およびキメラ胚の作製についての模式図、並びに、キメラ胚およびテラトーマの顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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