(57)【要約】任意の配列を有する核酸を特異的に検出できる簡便で汎用性の高い方法として、電極に少なくとも核酸単鎖を結合して得られる修飾電極を、分析物核酸単鎖と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、酸化還元マーカーの酸化還元反応を測定する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極に少なくとも核酸単鎖を結合して得られる修飾電極を、分析物核酸単鎖と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、酸化還元マーカーの酸化還元反応を測定することを特徴とする核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項２】
電極は、金ディスク電極である請求項１の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項３】
修飾電極には核酸単鎖とともに、分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子を結合する請求項１または２のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項４】
核酸単鎖および分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子は、電極表面に混合単分子膜を形成している請求項３の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項５】
分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子が６−メルカプト−１−ヘキサノールである請求項３または４のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項６】
核酸単鎖がペプチド核酸単鎖である請求項１ないし５のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項７】
分析物核酸単鎖の濃度が１０−１１〜１０−２Ｍである請求項１ないし６のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項８】
分析物核酸単鎖がＤＮＡ単鎖である請求項１ないし７のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項９】
酸化還元マーカーが［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−である請求項１ないし８のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項１０】
［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の濃度が０．１〜１ｍＭである請求項９の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項１１】
酸化還元反応は、ボルタンメトリーにより測定する請求項１ないし１０のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかの方法により核酸塩基対相補性を電気化学的に検出するための修飾電極であって、金ディスク電極の表面にペプチド核酸と分析物核酸と相補性を有さない分子の混合単分子膜が形成されていることを特徴とする核酸塩基対相補性検出用修飾電極。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、核酸塩基対の相補性を電気化学的に検出する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、分析物核酸の配列を、電極に結合したプローブ核酸との塩基対相補性を電気化学的に検出することにより確認する方法に関するものである。
背景技術
近年、分子生物学分野における技術的発展により、様々な生物のゲノム構造が明らかになりつつある。また、ゲノム構造の解明により、様々な遺伝的疾患やウィルス性疾患において遺伝子の変異が関与することが明らかになっている。そのため、医学、法医学、分子生物学等の様々な分野において、特定遺伝子配列や遺伝子配列の変異を検出、解析する方法の確立が重要な課題となっている。
これまで、分光学的、生物化学的、あるいは電気化学的に遺伝子変異を検出、解析する方法が研究されている。現在のところ、一般的には、電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法が遺伝子変異の検出、解析に用いられているが、これらの従来法は、いずれも多くのサンプルを同時に解析することが困難である、解析に長時間を要する上、精度が高くないなどの問題があった。
近年になって、高い測定精度を有し、微量の試料で検出が可能で、多検体を同時に分析することが可能な電気化学的測定法が注目され、様々な修飾電極がバイオセンサーとして研究、報告されている（Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，３２８）。
具体的には、電極表面に膜状に酵素を固定化し、酵素反応により物質変化を電気信号に変換し、検出する酵素電極が初期に報告された。しかし、これを遺伝子の検出や解析に用いるためには、分析物（標的遺伝子）と特異的に反応する酵素を選択しなければならず、汎用性が低いという問題が残った。
そこで、最近では、電極上に固定化されたプローブと標的遺伝子のハイブリダイゼーションを電気信号として検出するＤＮＡバイオセンサーに関する研究が盛んに行われている。例えば、Ｐａｔｏｌｓｋｙらは金電極上にホスホチオレート基を介してビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを固定化し、プローブとターゲットＤＮＡ単鎖を接触させることによりハイブリッドを形成させ、さらにビオチンと特異的に相互作用するアビジンを結合した酵素を反応させてその酵素反応に基づく電気信号からＤＮＡを検出する方法を報告している（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９９，１５，３７０３）。しかし、このような方法は、プローブの固定化、ハイブリダイゼーション、タンパク質相互作用、酵素反応、生成物の電極上への析出という多くの操作を必要とし、簡便とは言い難かった。
また、Ｔａｋｅｎａｋａらは、金電極上にチオールアンカーを介して化学吸着させたオリゴヌクレオチドプローブを用いてナフタレン−フェロセン酸化還元インターカレーターによってＤＮＡを検出する方法を報告している（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，１３３４）。しかし、インターカレーターを電極活性プローブとして用いる方法では、一般的に単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡの識別は可能なものの、インターカレーターの結合領域の配列依存性があるため、分析物に対応したインターカレーターを選択する必要があるという問題があった。
さらに、Ｄｅ  Ｌｕｍｌｅｙ−Ｗｏｏｄｙｅａｒらはガラス状カーボン電極上に導電性酸化還元高分子膜を形成し、酵素（ＨＲＰ）でラベルした（ｄＴ）２５−３０または（ｄＡ）２５−３０を共有結合させ、相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって起こる酵素反応に基づく電気信号を検出する方法を報告している（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，３９４）。しかし、このような酵素ラベルを用いる方法では、オリゴヌクレオチドを酵素でラベルする際に煩雑な操作を必要とする上、過剰なラベル酵素を洗浄除去する必要があり、測定精度が必ずしも安定しないという問題があった。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、任意の配列を有する核酸を特異的に検出できる簡便で汎用性の高い方法を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、電極に少なくとも核酸単鎖を結合して得られる修飾電極を、分析物核酸単鎖と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、酸化還元マーカーの酸化還元反応を測定することを特徴とする核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を提供する。
第２には、この出願の発明は、電極が金ディスク電極である核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を提供する。
この出願の発明は、さらに、第３には、修飾電極に核酸単鎖とともに分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子が結合されている核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を、また、第４には、核酸単鎖および分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子が電極表面に混合単分子膜を形成している核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を、そして、第５には、分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子が６−メルカプト−１−ヘキサノールである核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を提供する。
この出願の発明は、第６には、核酸単鎖がペプチド核酸単鎖であること、第７には、分析物核酸単鎖の濃度が１０−１１〜１０−２Ｍであることを前記のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法の態様として提供する。
さらに、第８には、この出願の発明は、分析物核酸単鎖がＤＮＡ単鎖である前記のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法をも提供する。
この出願の発明は、第９には、インターカレーターを用いず水溶性酸化還元マーカー［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−を用いること、および第１０には、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の濃度が０．１〜１ｍＭであることをこの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法の態様として提供する。
さらに、第１１には、この出願の発明は、酸化還元反応を、ボルタンメトリーにより測定することを上記の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法の態様として提供する。
そして、この出願の発明は、第１２には、上記のいずれかの方法により核酸塩基対相補性を電気化学的に検出するための修飾電極であって、金ディスク電極の表面にペプチド核酸と分析物核酸と相補性を有さない分子の混合単分子膜が形成されていることを特徴とする核酸塩基対相補性検出用修飾電極をも提供する。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は、核酸塩基対の相補性を電気化学的に検出する方法に関するものであるが、具体的には、電極表面に固定化されたレセプターに分析物が結合することにより、酸化還元マーカーの電極への移動が物理的および／または静電的に抑制され、酸化還元マーカーと電極間の電子移動が阻害され、電気信号が現れるという原理に基づく、いわゆるイオンチャンネルセンサーによる検出方法といえる。
イオンチャンネルセンサーについては、発明者らが１９８７年に提案して以来、数多くの報告がなされている。これまでにも、例えば、水素イオン（Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐ．１０９；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，８７２０）や抗体（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９７，１３，１７８３）等をイオンチャンネルセンサーで検出する方法が報告されている。また、発明者らも、金属カチオン（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５９，２８４２；Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，４０１，６５；Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９９，１３２，５５）、ヌクレオチド（Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  １９８９，１８０，１２９；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０，６２，１２５２他）、無機アニオン（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，１１８３）、アミン（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４７３，１０５）等の種々のイオンや分子をイオンチャンネルセンサーを用いて検出する方法を報告している。さらに、発明者等は、イオンチャンネルセンサーを用いて親水性の高いリン酸の選択的検出や、プロタミン（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，５１０９）、ヘパリン（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２０００，４１１，１６３）等の多価イオンの検出が可能であることを明らかにしている。
そこで、発明者等は、以上のとおりの知見に基づき、ＤＮＡ等の核酸がこれらのプロタミンやヘパリンと同様に多価イオンであることに着目し、核酸の検出や分析においてイオンチャンネルセンサーを用いることを検討した。そして鋭意研究の成果として、本願発明に至ったのである。
すなわち、この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法は、電極に核酸単鎖を結合させ、修飾電極とした後、この修飾電極を当該核酸単鎖との相補性を確認したい分析物核酸と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、電気化学的に酸化還元マーカーの酸化還元反応を測定するというものである。この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法をより具体的に説明するために、図１に概略図を示した。
つまり、この出願の発明では、電極（１）上に少なくとも核酸単鎖（２）を結合し、修飾電極（１１）として用いる  （ステップ▲１▼）。電極（１）上に結合された核酸単鎖（２）はプローブ分子として作用し、溶液中の分析物核酸単鎖（３）がこのプローブ核酸単鎖（２）と相補性を有すれば、電極（１）上で相補核酸間のハイブリダイゼーションが起こる（ステップ▲３▼）。このようなハイブリダイゼーションは、溶液中の酸化還元マーカー（５）を物理的に電極に近づけにくくするだけでなく、分析物核酸単鎖（３）表面の負荷電（３１）が酸化還元マーカー（５）からの電子移動をも阻害する。
一方、分析物核酸単鎖（３）が電極（１）上のプローブ核酸単鎖（２）と相補性を示さない場合（ステップ▲２▼）には、酸化還元マーカー（５）からの電子移動が阻害されないため、電極反応がスムーズに進行する。そのため、酸化還元マーカー（５）のみを含有し、分析物核酸単鎖（３）を有さない溶液における酸化還元マーカー（５）の酸化還元電位と、分析物核酸単鎖（３）を含有する溶液での酸化還元マーカー（５）の酸化還元電位を比較すれば、分析物核酸単鎖（３）が電極（１）上のプローブ核酸単鎖（２）と相補性を有するものであるか否かが明確に示されるのである。
この出願の発明において、電極（１）材料は、プローブとしての核酸単鎖（２）を結合できるものであればよく、とくに限定されない。好ましくは硫黄原子等を介した化学吸着方法が確立されている金電極である。また、電極（１）の形状もとくに限定されない。しかし、後述するように、電極（１）上のプローブ核酸単鎖（２）が分子間にある程度の間隔を有した単分子層となっていることが好ましいことから、ディスク電極とすることが好ましい。このとき、ディスク電極の電極面積はとくに限定されないが、少量の分析物でも高い精度で測定を可能とするためには、電極面積を５ｍｍ２以下とすることが好ましい。
この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法においては、プローブ核酸単鎖（２）は、単独で電極（１）表面に結合させてもよいが、合わせてプローブ核酸単鎖（２）の分子間隔を調整するためのプローブ分子間充填用分子（４）を結合させてもよい。これは、後述の実施例からも示されるように、プローブ核酸単鎖（２）が電極上に垂直に配向し、単分子膜を形成していることが好ましいためである。すなわち、プローブ核酸単鎖（２）があまり緻密に電極（１）を被っている場合には、分析物核酸単鎖（３）がプローブ核酸単鎖（２）間に入り込めず、ハイブリダイゼーションが十分に行われない場合があるためである。しかし、一方で、プローブ核酸単鎖（２）の単分子膜に隙間を持たせる目的で、インキュベーションの時間を短縮しただけでは、プローブ核酸単鎖（２）が電極（１）表面に垂直に配向せず、横たわってしまい、十分なハイブリダイゼーションが行われないことが考えられる。
そこで、発明者らは、鋭意研究により、電極（１）上で分子間の空隙を埋め、プローブ核酸単鎖（２）の分子間隔を調節し、プローブ核酸単鎖（２）が分析物核酸単鎖（３）とのハイブリダイゼーションを起こし易いように、分析物核酸単鎖（３）を電極（１）に対して垂直方向に配向させ、横たわりを防止するためにプローブ分子間充填用分子（４）を核酸単鎖（２）とともに結合させ、混合単分子膜を形成することが有効であることを見出したのである。
このようなプローブ分子間充填用分子（４）は、分析物核酸単鎖（３）と相補性を有さず、電極（１）に安定に結合できるものであり、酸化還元マーカー（５）の電極反応を阻害しないものであればよく、とくに限定されない。具体的には、短鎖アルカンチオールやジスルフィド等の種々の化合物から選択される。中でも６−メルカプト−１−ヘキサノールは、鎖長が短いためマーカーの酸化還元反応を阻害せず、又、末端が親水性であるので、ＰＮＡの吸着を避けることができるため効果が高く、好ましい。
さらに、この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法において、プローブ核酸単鎖（２）は、ＤＮＡであってもペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。
ＰＮＡは、ＤＮＡの類似体であり、負電荷を帯びたリン酸の代わりに中性なＮ−（２−アミノエチル）グリシンをバックボーンとして有する。ＰＮＡは、種々のミスマッチＤＮＡを高感度で区別でき、相補ＤＮＡに対してＤＮＡよりも高い結合親和性を有することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，３６５，５６６；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３，８００；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３，３９，７１５）。
例えば、ＷａｎｇらはＰＮＡ膜をＤＮＡの検出に用い、カーボンペースト電極上に析出させたＰＮＡプローブが高い選択性で相補ＤＮＡを認識することを報告した（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，７６６７）。また、Ａｌｉｎｇｈａｕｓらは固体支持体上に成形されたＰＮＡとＤＮＡプローブのアレイを比較し、ＰＮＡを使用した方が１塩基ミスマッチの区別が可能であると報告している（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６９，３７４７）。
発明者らは、鋭意研究により、プローブ核酸単鎖（２）としてＰＮＡを使用することにより、分析物核酸（３）とＰＮＡの相補性がある場合の電気信号が、ＤＮＡを使用した場合に比べて大きく、検出感度が高くなることを明らかにした（本願実施例）。したがって、プローブ核酸単鎖（２）としては、ＰＮＡを用いることがより好ましいといえる。
この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法においては、接触させる分析物核酸単鎖（３）を含有する溶液の溶媒、濃度、ｐＨ等はとくに限定されない。好ましくは、リン酸緩衝液などを含有する水溶液とし、核酸のインキュベーションに適したｐＨ７．０前後とすることが好ましい。また、精度高い検出を可能にするためには、分析物核酸単鎖（３）の濃度はあまり高くない方がよく、１０−１１〜１０−２Ｍとすることが好ましい。
以上のとおりの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法において、分析物核酸（３）としては、例えば化学合成されたポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドでもよいし、ＤＮＡやＲＮＡ等の天然ヌクレオチドであってもよい。つまり、この発明の方法により、所望の配列を有するヌクレオチドが合成されたことをプローブ核酸単鎖（２）との相補性より確認したり、天然ＤＮＡ上の変異をプローブ核酸単鎖（２）に対する相補性の有無を確認することにより遺伝的疾患やウィルス性疾患を診断することも可能となる。
さらに、酸化還元マーカー（５）は、負電荷を有し、プローブ分子の電極への結合性や、核酸塩基対の相補性に影響を与えないものであって、その電子移動が核酸塩基対の相補的作用によって抑制されるようなものであれば、とくに限定されない。好ましくは、［Ｍｏ（ＣＮ）８］４−／３−や［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−が例示される。このような酸化還元マーカー（５）の濃度は、とくに限定されないが、精度高い測定を可能とするためには、例えば［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の場合、０．１〜１ｍＭとすることが好ましい。
以上のとおりの酸化還元反応は、電極反応により検出されればよく、その方法や条件はとくに限定されない。具体的には、クーロメトリー、ファラデーインピーダンス分光法、ボルタンメトリー等が挙げられる。好ましくは酸化還元電位の変化が簡便に感度高く測定でき、誤差の原因となりうる複雑な計算等を必要としないボルタンメトリー法である。
以上のとおりの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法において、この出願の発明の修飾電極（１１）の作成方法はとくに限定されない。プローブ核酸単鎖（２）の電極（１）への結合が安定であり、酸化還元マーカー（５）の電気化学的反応や分析物核酸（３）とのハイブリダイゼーションにより脱離するようなことがなければよい。例えば、公知の方法（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９９，１５，３７０３；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，３９４；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７２，１３３４他）を用いてもよいし、種々のリンカーを介して化学的、あるいは物理的にプローブ核酸単鎖（２）を電極表面に結合させてもよい。好ましくは、後述の実施例に示すように、プローブ核酸単鎖（２）および分析物核酸（３）と相補性を有さないプローブ分子間充填用分子（４）を混合単分子膜として電極（１）表面に形成し、修飾電極（１１）とする。
この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法は、公知の超小型セルを応用したり、プレート上に以上のとおりの修飾電極を複数装着することにより、小型化が可能であり、微量の試料で多検体の同時分析を行うことをも可能とする。また、高価な装置等を必要とせず、ポテンシオスタット等の一般的な電気化学測定装置を利用できるため、医療や産業等の現場でＤＮＡ診断や合成オリゴヌクレオチドの解析を精度高く行うための簡便な方法として有用性が高い。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
実施例
＜準備＞
（１）  試料
システインを末端に有する１０量体ＰＮＡプローブをＳａｗａｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。構造は、化学式１に示されるように、配列番号１のオリゴペプチドの５’側にシステインとエチレングリコール単位を連結したものである。
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末端にヘキサンチオール基を有する配列番号２の１５量体ＤＮＡプローブ（５′−ＨＳ（ＣＨ２）６−ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＡ−３′）、オリゴヌクレオチド（ｄＡ）１０、（ｄＴ）１０、ＤＮＡプローブに相補性を有する配列番号３のオリゴヌクレオチド（５′−ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＧＣＣ−３′）、ＰＮＡプローブに相補性を示す配列番号４のオリゴヌクレオチド（５′−ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＡＣＴＧ−３′）、およびＰＮＡプローブに結合するオリゴマーで、１つのミスマッチを有する配列番号５のオリゴヌクレオチド（５′−ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＣＴＧ−３′）はいずれも日清紡（株）から購入した。
また、６−メルカプト−１−ヘキサノールはＦｌｕｋａ  ＡＧ社（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。
他の試薬はすべて分析試薬グレードのものを使用した。
さらに、水溶液にはすべてＭｉｌｌｉ−Ｑ水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して脱イオン化し、活性炭処理した水（抵抗値＞１８．２ＭΩｃｍ）を用いた。
（２）  電極
金ディスク電極（面積１ｍｍ２、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＡＳ）、Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を粒径０．３および０．０５μｍのアルミナスラリー（アルファおよびガンマ  マイクロポリッシュ登録商標Ｎｏ．２、Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｌａｋｅ  Ｂｌｕｆｆ，ＩＬ）を塗布したフェルトパッド上で最低１０分間磨き、水で繰り返し洗浄した後、超音波洗浄器で洗浄した。
研磨された電極をアルゴンで１５分間パージして脱酸素化した０．５Ｍ  ＫＯＨ溶液に浸漬し、−０．４Ｖ〜−１．２Ｖ（ｖｓ．飽和カロメル電極）の間で、サイクリックボルタモグラム（ＣＶ）が変化しなくなるまで掃引した。
ＤＮＡおよびＰＮＡプローブはＴａｋｅｎａｋａらによって報告された方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，１３３４）に基いて固定化された。電極は水で洗浄し、使い捨て試験管に逆さに設置した。
４００μＭのＤＮＡまたは１００μＭのＰＮＡプローブ（水溶液）を２μＬずつ金ディスク電極上に塗布し、試験管を密閉して水の蒸発を防止し、所定の時間室温に保持した。混合単分子膜の作製では、その後電極を水洗し、１ｍＭの６−メルカプト−１−ヘキサノール溶液に室温で３０分間浸漬して得た。電極は、使用直前に繰り返し水洗した。
（３）  ハイブリダイゼーション
０．１Ｍのリン酸緩衝液（カリウム塩溶液、ｐＨ７．０）および１ＭのＮａＣｌを含有するオリゴヌクレオチド溶液１００μＬに電極を浸漬した。ＤＮＡプローブの場合には、電極を６５．０±０．１℃で４０分間インキュベートした後、室温まで徐冷した。ＰＮＡプローブについては、電極を室温、３７．０±０．１℃、または４７．０±０．１℃で４０分間インキュベートして、オリゴヌクレオチドと相互作用するようにした。
（４）  電気化学測定
測定はすべてＣＶ−５０Ｗエレクトロアナライザー（ＢＡＳ社）を用いて室温でアルゴンガスで１５分間置換して脱酸素した溶液について３電極法によりおこなった。いずれのポテンシャルもＡｇ／ＡｇＣｌ電極に対して測定され、対極はプラチナ線とした。サイクリックボルタンメトリーは、０．５ｍＭのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］および０．５ｍＭのＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］を電気化学活性マーカーとして有する０．１Ｍリン酸緩衝液（カリウム塩、ｐＨ７．０）中で測定した。電位は０〜＋５００ｍＶまで掃引され、再び０ｍＶまで掃引した。掃引速度は１００３ｍＶ／ｓとした。
最初のＣＶを解析し、１０１ｍＶ（分析物ＤＮＡを含有しないときの［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−のピーク電位）における電流値から、ＤＮＡ濃度とセンサー感度の関係を測定した。
＜実施例１＞  ＤＮＡ単鎖修飾金電極
上記の方法で研磨した電極を３５時間かけて１５量体ＤＮＡ単鎖プローブで修飾した。この電極を用いて測定した［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−のＣＶを図２Ａに示した。
酸化還元はほぼ可逆的で、ピークセパレーションΔＥρは７５ｍＶであった。ΔＥρが未修飾の電極の場合よりも大きかったことから［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の還元反応がＤＮＡ単鎖プローブ表面の負電荷により若干阻害されていることが示された。
（同様の報告は、Ｐａｔｏｌｓｋｙらによって１８量体オリゴヌクレオチド（２０μＭ、１０時間）を金表面に結合した修飾電極にもついてなされている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９９，１５，３７０３））。
次に１５量体ＤＮＡプローブ修飾電極を、８８μＭの分析物ＤＮＡ単鎖の溶液に浸漬し、６５℃の湯浴で４０分間インキュベートし、室温まで徐冷した。このインキュベーション温度は、ＤＮＡ単鎖プローブの融点（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９８９，ｐ．７６１によれば６１．０℃）に基いて決定した。
図２Ｂに示したＣＶから、ΔＥρが９３ｍＶでハイブリダイゼーションによって１８ｍＶ大きくなったことが示された。
＜実施例２＞  ＰＮＡ単鎖修飾金電極
実施例１より、ＤＮＡ単鎖をプローブとして用いた場合にも、ＣＶにおけるΔＥρの変化から十分にハイブリダイゼーションが確認できることが示された。
しかし、ＤＮＡ単鎖は、多くの負電荷を有するため、プローブ分子間の反発力が自己集合の妨げになり、電極表面の単分子膜に欠陥が生じ易いと考えられる。また、ＤＮＡ単鎖の表面には負電荷が多く存在するため、ハイブリダイゼーションによるプローブ表面の電荷の変化が検出されにくいことも考えられる。
一方、ＰＮＡは、中性であるため、ハイブリダイゼーションによるプローブ表面の電荷の変化が大きいことが予想される。
そこで、前記の方法で研磨された電極を２４時間かけて１０量体ＰＮＡ単鎖で修飾し、修飾電極とした。
図３Ａにこの電極を用いて［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の酸化還元を測定した際のＣＶを示した。これより酸化還元マーカーと電極の間の電子移動が完全に抑制されていることが示された。これは、自己集合単分子膜（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ：ＳＡＭ）が極めて密であるためと考えられる。
そこで、ＳＡＭへの透過性を上げるために、ＰＮＡ単鎖溶液による修飾時間を短縮し、ＰＮＡ単鎖間の分子間隔を広げることを試みた。また、ＰＮＡ単鎖が電極表面に横たわり、分析物ＤＮＡ単鎖とのハイブリダイゼーションが起こりにくくなることを防ぐために、ＰＮＡ単鎖間の空隙を６−メルカプト−１−ヘキサノールで充填した。
＜実施例３＞  ＰＮＡ混合修飾金電極の作成
ＰＮＡ単鎖溶液と電極を３０分間接触させた後１ｍＭの６−メルカプト−１−ヘキサノール溶液と３０分間接触させた。図３Ｂにこの混合単分子膜で修飾した金電極を用いた［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−のＣＶを示した。
図３ＢのＣＶが準可逆的であった（ΔＥρ＝２６５）ことから、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の電子移動が実施例２のＰＮＡ単鎖修飾金電極を用いた場合ほど阻害されていないことが示された。
したがって、以下、このＰＮＡ混合修飾金電極で修飾された電極のみを使用した。
＜実施例４＞  分析物（オリゴヌクレオチド）によるハイブリダイゼーション
ＰＮＡ単鎖修飾金電極をＰＮＡ単鎖に相補性を有する１０量体ＤＮＡ溶液（１００μＭ）中、４７．０℃で４０分間インキュベートし、水洗いした後、電気化学測定を行った。このインキュベーション温度は、Ｔｍの推定値から求めた。Ｔｍは、ＤＮＡ／ＤＮＡ対の場合よりも同一配列を有するＰＮＡ／ＤＮＡ対で１℃（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，４，５）または１．５℃（Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，３６５，５６６）高くなることが知られている。対応するＤＮＡ／ＤＮＡ対のＴｍは３８．５℃であることから、ＰＮＡ／ＤＮＡ対のＴｍは４８．５℃または５３．５℃であると推定した。
図３Ｃに混合単分子膜で修飾した金電極のＰＮＡ単鎖を１０量体ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた後の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−のＣＶを示した。ＰＮＡ／ＤＮＡ修飾電極での［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−のＣＶは不可逆であった。ピークが確認されなかったことから、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−と電極の間の電子移動が効率的に抑制されていることが示された。
この結果から、１０量体ＤＮＡがＰＮＡ単鎖プローブにハイブリダイゼーションしたことが確認された。ＰＮＡプローブは中性なバックボーンを有するが、ＰＮＡ／ＤＮＡ対は修飾電極表面に負電荷を与える（ＰＮＡ１プローブにつき１０ｅ−（＝−１０）ずつ）。修飾電極上のＰＮＡ／ＤＮＡ対からの負電荷の静電的反発によって［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−は容易には電極表面に到達できず、酸化還元反応が抑制されたことが示唆された。
図４は、電極反応（＋１０１ｍＶにおける電流値）と分析物ＤＮＡの濃度の関係を示した図である。ＤＮＡ濃度が１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍの領域では、電流値に変化が見られず、１０−６〜１０−４Ｍでは減少することが確認された。さらに高い濃度では最も低い値となったことから、電極上のＰＮＡ単鎖プローブがほとんど分析物ＤＮＡとハイブリダイゼーションし、飽和となっていることが示唆された。
以上より、１０量体ＤＮＡ単鎖をＰＮＡ混合修飾金電極を用いたＣＶによりマイクロモルのレベルで検出できることが示された。また、パルスボルタンメトリー等のより高い精度を有する電気化学測定法を応用すれば、この修飾電極による測定限界も上昇することが期待される。
＜実施例５＞  オリゴヌクレオチドの選択的検出
実施例３で作成したＰＮＡ混合修飾金電極の分析物（オリゴヌクレオチド）選択性を確認するために、用いたＰＮＡ単鎖に対して非相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、実施例４と同様の方法でハイブリダイゼーションおよび測定を試みた。
図５ＢおよびＣは、４０μＭの（ｄＡ）１０溶液と１００μＭの（ｄＴ）１０溶液中、室温にてインキュベートされたＰＮＡ混合修飾金電極を用いて、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−を酸化還元マーカーとしたときのＣＶである。
インキュベーションが実施例４で使用された４７．０℃よりもＤＮＡ結合において有利な室温で行われ、かつ、分析物（非相補的ＤＮＡ）の濃度が実施例４の分析物（相補的ＤＮＡ）の濃度よりも大きかったにもかかわらず、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の酸化還元反応は、インキュベーション前の電極（図５Ａ）を用いた場合とほとんど変化が見られなかった。
したがって、これらのオリゴヌクレオチドがＰＮＡ単鎖プローブとハイブリダイゼーションしなかったことが示された。
さらに、上記の修飾電極の選択性を確認するために、１塩基のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを使用して、同様の測定をおこなった。
図６Ｂ、図６Ｃ、および図６Ｄに、１塩基ミスマッチオリゴヌクレオチド溶液１００μＭを室温、３７．０℃、および４７．０℃でインキュベートして得たＰＮＡ混合修飾金電極の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−を酸化還元マーカーとしたＣＶを示した。室温でインキュベーションしたＣＶからは、準可逆的なＣＶ（ΔＥρ＝３６０ｍＶ）が示されたことから、ミスマッチオリゴヌクレオチドが、ＰＮＡ単鎖プローブに若干結合していることが示された。しかし、ΔＥρは、高いインキュベーション温度で小さくなった。ΔＥρ：３０９ｍＶ（３７．０℃）、２５２ｍＶ（４７．０℃）。
４７．０℃でインキュベートされた修飾電極のΔＥρは（ｄＡ）１０および（ｄＴ）１０の溶液中でインキュベートされたものと同等であった。これより、ＰＮＡ混合修飾金電極がターゲットとするＤＮＡと１塩基のミスマッチがあるだけの非相補オリゴヌクレオチドをも区別できることが示された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、１ヌクレオチド塩基のミスマッチまでも高い精度で検出できる簡便で汎用性の高い核酸塩基対相補性の電気化学的測定法が提供される。この発明の方法を用いれば、種々の核酸の配列や変異を精度高く、かつ簡便に確認することができる。また、この発明の修飾電極を用いれば、核酸塩基対相補性検出装置の超小型化も可能となり、多検体の核酸塩基対相補性を微量の試料を用いて同時に測定することも可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法の概要を示す摸式図である。（１：電極、２：（プローブ）核酸単鎖、３：分析物核酸単鎖、４：プローブ分子間充填用分子、５：酸化還元マーカー、１１：修飾電極）
図２は、この発明の実施例においてプローブとしてＤＮＡ単鎖の単分子膜を有する修飾電極を用いた際の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の酸化還元反応を示すサイクリックボルタモグラムである。（Ａ：ＤＮＡ単鎖修飾金電極、Ｂ：ＤＮＡ単鎖修飾金電極＋分析物核酸単鎖）。
図３は、この発明の実施例において、プローブとしてＰＮＡ単鎖の単分子膜を有する修飾電極を用いた際の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の酸化還元反応を示すサイクリックボルタモグラムである。（Ａ：ＰＮＡ単鎖（２４時間）修飾金電極、Ｂ：ＰＮＡ単鎖（０．５時間）＋６−メルカプト−１−ヘキサノール（０．５時間）修飾金電極（以下、ＰＮＡ混合修飾金電極と呼ぶ）、Ｃ：ＰＮＡ混合修飾金電極＋分析物核酸単鎖）。
図４は、この発明の実施例において、ＰＮＡ混合修飾金電極を用いた際の分析物単鎖濃度と＋１０１ｍＶにおける［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の還元電流値の関係を示す図である。
図５は、この発明の分析物単鎖の選択性を確認する実施例において、ＰＮＡ混合修飾金電極を用いた際の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の酸化還元反応を示すサイクリックボルタモグラムである。（Ａ：ＰＮＡ混合修飾金電極、Ｂ：ＰＮＡ混合修飾金電極＋４０μＭ（ｄＡ）１０、Ｃ：ＰＮＡ混合修飾金電極＋１００μＭ（ｄＴ）１０）。
図６は、この発明の分析物核酸単鎖の選択性を調べる実施例において、ＰＮＡ混合修飾金電極を用いた際の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−の酸化還元反応を示すサイクリックボルタモグラムである。（Ａ：ＰＮＡ混合修飾金電極、Ｂ：ＰＮＡ混合修飾金電極＋１００μＭ  １塩基ミスマッチオリゴヌクレオチド（室温）、Ｃ：ＰＮＡ混合修飾金電極＋１００μＭ  １塩基ミスマッチオリゴヌクレオチド（３７．０℃）、Ｄ：ＰＮＡ混合修飾金電極＋１００μＭ  １塩基ミスマッチオリゴヌクレオチド（４７．０℃））。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成13年11月5日(2001.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
電極に少なくとも核酸単鎖を結合して得られる修飾電極を、分析物核酸単鎖と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、修飾電極と酸化還元マーカーの反応により生じる電気信号が、修飾電極の核酸単鎖と分析物核酸単鎖が相補性を有するとき消失することを検出することを特徴とする核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
さらに、Ｄｅ  Ｌｕｍｌｅｙ−Ｗｏｏｄｙｅａｒらはガラス状カーボン電極上に導電性酸化還元高分子膜を形成し、酵素（ＨＲＰ）でラベルした（ｄＴ）２５−３０または（ｄＡ）２５−３０を共有結合させ、相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって起こる酵素反応に基づく電気信号を検出する方法を報告している（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，３９４）。しかし、このような酵素ラベルを用いる方法では、オリゴヌクレオチドを酵素でラベルする際に煩雑な操作を必要とする上、過剰なラベル酵素を洗浄除去する必要があり、測定精度が必ずしも安定しないという問題があった。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、任意の配列を有する核酸を特異的に検出できる簡便で汎用性の高い方法を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、電極に少なくとも核酸単鎖を結合して得られる修飾電極を、分析物核酸単鎖と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、修飾電極と酸化還元マーカーの反応により生じる電気信号が、修飾電極の核酸単鎖と分析物核酸単鎖が相補性を有するとき消失することを検出することを特徴とする核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を提供する。
第２には、この出願の発明は、電極が金ディスク電極である核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を提供する。
この出願の発明は、さらに、第３には、修飾電極に核酸単鎖とともに分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子が結合されている核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法を、また、第４には、核酸単鎖および分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子が電極表面に混合単


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
にしている。
そこで、発明者等は、以上のとおりの知見に基づき、ＤＮＡ等の核酸がこれらのプロタミンやヘパリンと同様に多価イオンであることに着目し、核酸の検出や分析においてイオンチャンネルセンサーを用いることを検討した。そして鋭意研究の成果として、本願発明に至ったのである。
すなわち、この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法は、電極に核酸単鎖を結合させ、修飾電極とした後、この修飾電極を当該核酸単鎖との相補性を確認したい分析物核酸と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、修飾電極と酸化還元マーカーの反応により生じる電気信号が、修飾電極の核酸単鎖と分析物核酸単鎖が相補性を有するとき消失することを検出するというものである。この出願の発明の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法をより具体的に説明するために、図１に概略図を示した。
つまり、この出願の発明では、電極（１）上に少なくとも核酸単鎖（２）を結合し、修飾電極（１１）として用いる（ステップ▲１▼）。電極（１）上に結合された核酸単鎖（２）はプローブ分子として作用し、溶液中の分析物核酸単鎖（３）がこのプローブ核酸単鎖（２）と相補性を有すれば、電極（１）上で相補核酸間のハイブリダイゼーションが起こる（ステップ▲３▼）。このようなハイブリダイゼーションは、溶液中の酸化還元マーカー（５）を物理的に電極に近づけにくくするだけでなく、分析物核酸単鎖（３）表面の負荷電（３１）が酸化還元マーカー（５）からの電子移動をも阻害する。
一方、分析物核酸単鎖（３）が電極（１）上のプローブ核酸単鎖（２）と相補性を示さない場合（ステップ▲２▼）には、酸化還元マーカー（５）からの電子移動が阻害されないため、電極反応がスムーズに進行する。そのため、酸化還元マーカー（５）のみを含有し、




【国際調査報告】
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