(57)【要約】本発明は、サポニン分解活性を有するタンパク質、詳しくはソヤサポゲノールＢをアグリコンとして有する配糖体を分解してソヤサポゲノールＢを生産することができるタンパク質、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、それを用いてソヤサポゲノールＢを大量生産することができる方法を提供する。本発明によるタンパク質は、下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に関するものである：（ａ）配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質；、または（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質。
2002101053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）  配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質、および
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）  配列番号１、３および５に示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）  前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）  前記（ｉ）の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）  前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記（ｉｉ）が（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなる、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記（ｉｉ）が（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
糸状菌由来である、請求項２〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
糸状菌が、ネオコスモスポラ属、ユーペニシリウム属またはアスペルギルス属に属する、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ネオコスモスポラ属に属する糸状菌が、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ｖａｒ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＰＦ１２２５）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）またはその変異株である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ユーペニシリウム属に属する糸状菌が、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ  ＰＦ１２２６）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６）またはその変異株である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
アスペルギルス属に属する糸状菌が、アスペルギルス  エスピーＰＦ１２２４株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＰＦ１２２４）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００４）またはその変異株である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項２〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換えベクターにより形質転換された、宿主。
【請求項１３】
微生物である、請求項１２に記載の宿主。
【請求項１４】
糸状菌である、請求項１３に記載の宿主。
【請求項１５】
糸状菌がトリコデルマ属に属する、請求項１４に記載の宿主。
【請求項１６】
トリコデルマ・ビリデＭＣ３００−１株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ  ＭＣ３００−１）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４７）またはその変異株である、請求項１５に記載の宿主。
【請求項１７】
サポニン分解酵素を発現する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の宿主を培養し、得られる培養物からサポニン分解活性を有するタンパク質を採取することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の宿主から得ることができるサポニン分解活性を有するタンパク質を含む培養物を用いて、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を分解することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のタンパク質、および請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の宿主から得ることができるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を用いて、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を分解することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造方法。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、新規なサポニン分解酵素、その遺伝子、およびこれらを用いた新規なソヤサポゲノールＢの製造方法に関する。
背景技術
ソヤサポゲノールＢ（ｓｏｙａｓａｐｏｇｅｎｏｌ  Ｂ）（１２−ｏｌｅａｎａｎｅ−３，２２，２４−ｔｒｉｏｌ）は、マメ科植物中に含まれるサポニン類のアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）の一つであり、古くから様々な生理活性が報告されている。例えば、血小板凝集抑制作用、抗補体活性、胃炎、リューマチ、全身性紅斑性狼瘡の免疫疾患、自己免疫疾患または血栓症の予防および治療作用が報告されている（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．：２４，１２１−１２９，１９７６、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．ｂｕｌｌ．：３０，２２９４−２２９７，１９８２、化学と生物２１：２２４−２３２，１９８３、特開昭６１−３７７４９号）。また、ヒト大腸癌およびヒト卵巣癌由来の細胞に対する増殖抑制作用が報告されている（特開昭６１−３７７４９号、特開平１０−２３４３９６号）。  ソヤサポゲノールＢを製造する方法としては、例えば、大豆種子に配糖体の状態で含まれるサポニン類（ソヤサポニンＩ〜Ｖ）の糖鎖を、化学的に加水分解する方法が挙げられる。しかしながら、この方法は、酸加水分解の条件によって、かなりの副生成物が生じることがあり効率的ではない。また、大豆種子は、ソヤサポゲノールＡ（ソヤサポニンＡ１〜Ａ６）やソヤサポゲノールＥをアグリコンに持つサポニン類も含むことが知られている。このため、大豆からソヤサポゲノールＢを得る場合には、ソヤサポゲノールＡやソヤサポゲノールＥが夾雑しやすく、これらの中からソヤサポゲノールＢのみを精製することは困難であった。また、大豆種子に含有されているサポニンの割合は、通常約０．２％（薬学雑誌１０４，１６２−１６８，１９８４）と少なく、より効率的に製造することが求められていた。
微生物を用いてソヤサポゲノールＢを製造する方法としては、例えば、ストレプトミセス属（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．：３２，１２８７−１２９３，１９８４）およびペニシリウム属（特開平１０−２３４３９６号）を用いる方法が知られている。しかしながら、これら微生物を用いる場合、ソヤサポゲノールＢの生産性が低く、実用的ではなかった。
また、アスペルギルス属に属する微生物が生産する酵素（グルクロニダーゼ）、またはこの酵素を含む培養物を用いて、グルクロニドサポニン類を加水分解して、グルクロン酸を還元末端とする酸性オリゴ糖を製造する方法において、副生成物としてソヤサポゲノールＢが得られることが報告されている（特公平７−３２７１４号）。しかしながら、この方法は、酸性オリゴ糖の製造方法であり、この報告では、ソヤサポゲノールＢは定性的に確認がされているに過ぎない。またこの報告では、目的の活性を有する酵素については、その分子量は判明したものの、アミノ酸配列は明らかにされていない。
一方で、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を選択的に加水分解してソヤサポゲノールＢを効率良く生産する微生物を探索した結果、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属またはユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する糸状菌が見出されている。ネオコスモスポラ属またはユーペニシリウム属に属する糸状菌を、サポニン類（ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体）を含有する培地中で培養することにより、ソヤサポゲノールＢが培養物中に高濃度で生産され、蓄積されることが見出されている（国際公開ＷＯ０１／８１６１２号参照）。
このような糸状菌としては、例えば、ネオコスモスポラ属に属するネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ｖａｒ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＰＦ１２２５株）、ユーペニシリウム属に属するユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ  ＰＦ１２２６株）が挙げられる（国際公開ＷＯ０１／８１６１２号参照）。
このような菌をそのまま利用することにより、培地に添加するサポニン類の量に依存して、目的とするソヤサポゲノールＢを生産することが可能となるが、サポニン類は界面活性作用があるため発泡し易く、培地に添加できるサポニン類の量が制限される。また、サポニン類を添加した培養物は、その界面活性作用により粘性も高くなることが予想される。このため、該培養物から目的物を生産する場合には、回収率を向上させるために、抽出操作を複数回繰り返す必要がある。さらに、効率的にサポニン類を供給できる天然資源としては大豆抽出物が一般的であるが、この大豆抽出物には、通常、サポニン類以外の成分、例えば油脂、タンパク質および多糖類等が含まれている。このため、培地に添加できるサポニン類の量は、最終的にはこの大豆抽出物の純度に依存することになり、効率的な生産を行うことは必ずしも容易ではない。
従来の方法のように大豆抽出物中のサポニン含量に依存せず、効率的にソヤサポゲノールＢを生成させ、さらに高い回収率を維持するための方策として、サポニン分解酵素を用いた酵素反応によるソヤサポゲノールＢの大量製造方法が必要とされた。
［発明の概要］
本発明者らは今般、サポニン分解活性を有する微生物からサポニン分解活性を有するタンパク質（以下において「サポニン分解酵素」ということがある）を単離精製し、これをコードする遺伝子を同定することに成功した。本発明者等はまた、得られた遺伝子を用いて、これを異種の宿主において発現させて、高活性なサポニン分解酵素を得ることができた。さらにこの得られたサポニン分解酵素を用いて酵素反応を行うことにより、ソヤサポゲノールＢを効率的に製造することができた。本発明はこれら知見に基づくものである。
したがって、本発明は、サポニン分解活性を有するタンパク質、詳しくはソヤサポゲノールＢをアグリコンとして有する配糖体を分解してソヤサポゲノールＢを生産することができるタンパク質、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、それを用いて、ソヤサポゲノールＢを大量生産することができる方法を提供することを目的とする。
本発明によるタンパク質は、下記からなる群より選択されるものである：
（ａ）  配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質、または
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質。
本発明によるポリヌクレオチドは、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）  配列番号１、３および５に示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）  前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）  前記（ｉ）の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）  前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
本発明による組換えベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる。
また本発明による宿主は、前記組換えベクターにより形質転換されたものである。
本発明の目的タンパク質の製造方法は、前記の形質転換された宿主を培養し、得られる培養物からサポニン分解活性を有するタンパク質を採取することを含んでなるものである。
本発明によれば、高活性なサポニン分解酵素を得ることができる。また、これを用いることにより、サポニンからソヤサポゲノールＢを大量かつ効率的に得ることが可能となる。この方法によれば、例えば大豆抽出物中のサポニン含量に依存することなく、ソヤサポゲノールＢを得ることができる。
［発明の具体的説明］
微生物の寄託
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ｖａｒ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＰＦ１２２５）は、２０００年３月１３日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５である。
ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ  ＰＦ１２２６）は、２０００年３月１３日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６である。
アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＰＦ１２２４）は、２００１年５月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００４である。
トリコデルマ・ビリデ・ＭＣ３００−１株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ  ＭＣ３００−１）は、１９９６年９月９日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４７である。
サポニン分解活性を有するタンパク質
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）より単離、精製されたサポニン分解酵素は、これまで明らかにされているいずれのサポニン分解酵素とも相同性を有さず、またグルクロニドサポニンを分解するアスペルギルス属に属する微生物由来のグルクロニダーゼ（特公平７−３２７１４号に記載の分子量３５，０００と４５，０００のサブユニットからなる約１５８，０００の糖タンパク質）と、サブユニット構造および分子量が異なることから、新規な酵素系であることが明らかとなった。
また、本発明によるタンパク質と該公報に開示されたグルクロニダーゼとの同一性、類似性について検討を行なった。該公報に記載のアスペルギルス属に属する微生物を容易に入手することができなかったため、他のアスペルギルス属に属する微生物を用いて検討した。用いたアスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＰＦ１２２４株）は、下記の菌学的性状により不完全菌類アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌と同定された。
（１）コロニーの性状
ツァペック酵母エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は８０ｍｍに達する。黄色〜黄緑色、羊毛状のコロニーとなり、分生子、菌核を豊富に形成する。裏面は淡茶色となる。麦芽エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は８０ｍｍに達する。黄色〜黄緑色、羊毛状のコロニーとなり、分生子、菌核を豊富に形成する。裏面は黄土色となる。３７℃の培養では、どの培地上でも生育はやや抑制的である。
（２）形態的性状
分生子頭は黄色〜黄緑色、放射状〜ゆるい円筒状となる。分生子柄は粗面、無色、頂のうは棍棒形〜亜球形、ほぼ全面にアスペルジラを形成する。アスペルジラは１列、２列のものが混在するが、通常２列である。メトレは８〜１２×４〜５μｍ、フィアライドは８〜１２×３〜４μｍである。分生子は球形〜亜球形、滑面、４〜６μｍである。
アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株を用いてグルクロニダーゼと称される酵素の確認を行なったところ、本発明者らがアスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株から単離、精製したサポニン分解酵素は、分子量９０ｋＤａ、至適ｐＨ５〜６、至適温度４５〜５０℃であった（参考例参照）。
さらに、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株から単離、精製したサポニン分解酵素は、分子量９０ｋＤａ、至適ｐＨ５〜６、至適温度４０〜４５℃であることが明らかとなった。
該公報ではグルクロニダーゼのアミノ酸配列等の情報が開示されていないことからアミノ酸配列等の相同性の比較ができなかったため、タンパク質の分子量およびサブユニット構造から比較判断を行なった。その結果、本発明によるタンパク質は、該公報に記載されたグルクロニダーゼとは異なるタンパク質であった。
前記したように、本発明によれば、下記からなる群より選択されるタンパク質が提供される。
（ａ）  配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質、または
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質。
すなわち、本発明によるタンパク質は、配列番号２、４または６に示されるアミノ酸配列と同一であるか、または実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。
ここで、配列番号２、４または６に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列とは、これら配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列との相同性が、典型的には５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列をいう。
なお、本明細書において示したこの相同性の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
例えば、相同性検索プログラムＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティックス社製）においてデフォルトのパラメータを用いることにより算出された相同性の数値は、
ＳＤＮとＳＤＡとの間の相同性は５１％であり、
ＳＤＡとＳＤＥとの間の相同性は５２％であり、
ＳＤＥとＳＤＮとの間の相同性は５１％である。
また、配列番号２、４または６に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質とは、これらのいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をいう。
ここで、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよいアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。
本発明の一つのより好ましい態様においては、前記（ｂ）のタンパク質は、前記アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列からなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質である。
ここで「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように、１もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
本発明において、「サポニン分解活性を有するタンパク質」とは、当業者によりサポニンを分解することができる活性が認められたと評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例５と同様の条件において測定した場合にサポニン分解活性が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。このタンパク質は、後述する「サポニン分解活性を有する生物」から単離、精製して得ることができる。
本発明によるタンパク質は、例えば下記のようにして得ることができる。
サポニン分解活性を有する生物を培養し、その培養液からサポニン分解活性を指標に、サポニン分解活性を有するタンパク質を単離して、精製する。得られた精製タンパク質のアミノ酸配列を解析し、これをコードするオリゴヌクレオチドを合成して、該生物のＤＮＡをテンペレートにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い長鎖プローブを合成する。このプローブを用いてインバースＰＣＲやＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法を用いてサポニン分解酵素遺伝子の翻訳領域のＤＮＡ配列を解析する。このようにして得られたサポニン分解酵素の翻訳領域を、発現に用いる宿主内で機能する制御配列に連結して、発現ベクターを得る。この発現ベクターを用いて、該宿主を形質転換して、この形質転換体を培養することによって、サポニン分解酵素を得ることができる。
ここで「サポニン分解活性を有する生物」とは、サポニン分解活性を有するものであれば特に制限はなく、微生物、植物等が包含される。そのような微生物には、例えば、ネオコスモスポラ属、アスペルギルス属またはユーペニシリウム属等に属する糸状菌が包含される。これらの菌は、味噌や醤油の醸造において用いられ、サポニン分解活性を有することが知られている。また該微生物には、放線菌およびバクテリア等にもサポニン分解活性を有するものが存在することが予測されることから、そのような生物も包含される。該植物としては、例えばマメ科植物のサポニン類の糖転移酵素に可逆反応を触媒するものが存在することが予測されることから、そのような植物体、植物細胞、そのような植物由来のカルス、または培養細胞が包含される。
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明によるタンパク質またはポリヌクレオチドは、微生物由来であり、より好ましくは糸状菌に属する微生物である。このような糸状菌に属する微生物は、好ましくは、ネオコスモスポラ属、アスペルギルス属、またはユーペニシリウム属に属する糸状菌である。
ここで、ネオコスモスポラ属に属する糸状菌としては、例えば、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）またはその変異株が挙げられる。アスペルギルス属に属する糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００４）またはその変異株が挙げられる。また、ユーペニシリウム属に属する糸状菌としては、例えば、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６）またはその変異株が挙げられる。
ポリヌクレオチド
本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明によるポリヌクレオチドは、典型的には、前記した（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択されるものである。
すなわち、本発明の一つの態様によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３および５に示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる。
本発明の別の一つの態様によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードしてなるものである。配列番号１、３または５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとの相同性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
なお、本明細書において示した相同性の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
本発明の別の一つの態様によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５に示される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードしてなるものである。
ここで、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよい塩基の数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。
本発明のさらに別の一つの態様によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつサポニン分解活性を有するタンパク質をコードしてなるものである。また本発明によれば、ポリヌクレオチドには、このようなサポニン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドも包含される。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、本発明によるタンパク質のアミノ酸配列の一部または全部をコードする塩基配列を含んでなるプローブと、相同体をコードする遺伝子とがハイブリダイズする一方で、このプローブが、特公平７−３２７１４号に記載された分子量を有するグルクロニダーゼとはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する。具体的には、例えば、プローブとして標識化した配列番号１、３または５で示されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全長を有するものを用いて、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の方法に従って、まず１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）させた後に、前記プローブを添加して、１５時間のハイブリダイゼーション（４２℃）を行い、次いで、０．４％  ＳＤＳおよび６Ｍ尿素を添加した０．５倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ；１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）を用いて４２℃で２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣを用いて室温（約２５℃）で１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
組換えベクター
本発明によれば、前記したポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターが提供される。
本発明による組換えベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明において使用できる発現ベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられる。例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在する遺伝子のコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
組換えベクターの制御配列には、宿主で機能する制御配列であれば特に制限はなく、例えばプロモーターおよびターミネーター等を用いることができる。このような制御配列は、サポニン分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と連結させ発現させることができる。
制御配列への連結は、例えば、常法に従い、目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）の翻訳領域をプロモーターの下流に順方向に挿入することによって行うことができる。この場合、目的遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させることもできる。
発現させたサポニン分解活性を有するタンパク質または該活性を有する融合タンパク質は、発現に用いる宿主細胞内で産生させてもよく、培地中に分泌させてもよい。
例えば、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）由来サポニン分解酵素は、ＤＮＡ配列の解析およびＮ末端アミノ酸配列の解析からＮ末端側に２６アミノ酸残基のシグナルペプチド配列を有することが明らかとなった（実施例参照）。同様に、アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来サポニン分解酵素、およびユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素はそれぞれ、Ｎ末端側に２８アミノ酸残基、および１７アミノ酸残基のシグナルペプチド配列を有することが明らかとなった。
したがって、例えばトリコデルマ属およびアスペルギルス属等の糸状菌を宿主として使用する場合、本配列に含まれるシグナル配列をそのまま利用し培地中に分泌させることも可能である。
また、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株由来サポニン分解酵素の分子量約７７ｋＤａは、推定アミノ酸組成からの予測分子量６８ｋＤａと大腸菌およびトリコデルマ・ビリデ株で発現させたタンパク質の分子量約６８ｋＤａから、糖タンパク質であることが予測される。同様に、アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来サポニン分解酵素の分子量約９０ｋＤａ及びトリコデルマ・ビリデ株で発現させたタンパク質の分子量約８０ｋＤａは、推定アミノ酸組成からの予測分子量６５ｋＤａから、糖タンパク質であることが予測される。また、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素の分子量約９０ｋＤａは、推定アミノ酸組成からの予測分子量６５ｋＤａから、糖タンパク質であることが予測される。
これらの糖鎖は活性発現には大きな影響を与えないことが予測されるが、耐熱性や至適ｐＨの変更、保存安定性等に寄与する効果を期待して、様々な糖鎖の付加等の翻訳後修飾を行ってもよい。
本発明による組換えベクターはさらに、薬剤耐性遺伝子および／または栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結して作製することができる。
遺伝子マーカーは形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できる。例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラフォス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、例えば、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。また、各種アミノ酸合成系、ビタミン合成系、核酸合成系等のような発現に用いる宿主が元来有する栄養要求性を相補する遺伝子マーカー、または、各種変異処理を加えて要求性を付与し、それに対する栄養要求性を相補する遺伝子マーカーを含んでもよい。
形質転換体および目的タンパク質の生産
本発明によれば、前記組換えベクターにより形質転換された宿主が提供される。
本発明において使用できる宿主としては、サポニン分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を正しく転写および翻訳することができる生物であれば、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌およびバチルス属等のバクテリア、放線菌、酵母、トリコデルマ属等の糸状菌、またはそれらに属する微生物の変異株等が挙げられる。
宿主への遺伝子発現用の組換えベクターの導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。
形質転換体（形質転換された宿主細胞）の培養は、常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。
培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、セルロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイヨン、ペプトン、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、硫酸マグネシウム、燐酸一カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅等を添加することも有効である。また、必要に応じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、形質転換体の発育を助け、導入遺伝子の発現を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
培養は、これらの成分を選択的に含む培地で行うことができる。
培養方法としては、例えば液体培地による場合には、好気的条件での培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法または深部培養法が挙げられる。培地のｐＨは、例えばｐＨ５〜ｐＨ８程度である。培養温度は通常の条件、例えば温度１４℃〜４０℃、好ましくは２６℃〜３７℃である。培養日数は、１日〜２５日間程度の条件で行うことができる。
本発明による目的タンパク質の製造方法においては、形質転換された細胞の培養物から、目的とする遺伝子発現産物であるサポニン分解活性を有するタンパク質を取得することができる。培養物から目的タンパク質の取得は、常法にしたがって行うことができ、例えば、培養物からの抽出（磨砕処理、加圧破砕等）、回収（ろ過、遠心分離等）、および／または精製（塩析法、溶媒沈殿法等）等の手段を適宜組みあわせて行うことができる。また、これらの過程において、必要に応じてフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ベンズアミジンまたはロイペプチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
本発明の別の態様によれば、サポニン分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、サポニン類を生成する植物体、例えば大豆、インゲン、ササゲ、エンドウ、落花生、ソラマメ、またはアルファルファ等において発現させることによって、ソヤサポゲノールＢを含む植物体を創生し、そこからソヤサポゲノールＢを直接得ることも可能である。この場合、アクチン、ユビキチン、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等、または種子等の部位で特異的に発現する遺伝子の制御配列を用いることができる。
このような制御配列に、サポニン分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を正しく連結し、さらにビアラフォス、カナマイシンまたはブラストサイジンＳ等の薬剤耐性マーカー遺伝子を必要に応じて連結する。これを、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法等の直接導入法、またはアグロバクテリウムのＴｉプラスミドベクターによる間接導入法等によって植物細胞に導入し、形質転換植物細胞を作出することができる。植物細胞または植物への遺伝子導入法は、例えば、Ｖａｅｃｋ  Ｍ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ：３２８，３３−３７，１９８７）の記載に従って、実施することができる。
このようにして形質転換された植物細胞は、当業者には自明な手法で再分化させることにより、完全な植物体として形質転換植物を得ることができる。さらに、これら形質転換植物を栽培し、この植物体全体および／またはサポニン分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現させた器官、例えば種子等を収穫し、そこからソヤサポゲノールＢを、その性状に由来する方法、例えば溶媒抽出法等で取得することができる。
ソヤサポゲノールＢの生産
本発明の別の態様によれば、前記の形質転換された宿主から得ることができるサポニン分解活性を有するタンパク質を含む培養物を用いて、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を分解することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造方法が提供される。
また本発明のさらに別の態様によれば、前記タンパク質、および前記の形質転換された宿主から得ることができるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を用いて、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を分解することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造方法も提供される。
ここで、「ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体」は、主にマメ科の植物体に含有されていものであって、例えば、ソヤサポニンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ（ｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ）、アズキサポニンＩＩ、Ｖ（ａｚｕｋｉｓａｐｏｎｉｎ  ＩＩ、Ｖ）、アストラガロシドＶＩＩＩ（ａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅ  ＶＩＩＩ）、ソフォラフラボシドＩ（ｓｏｐｈｏａｒａｆｌａｖｏｓｉｄｅ  Ｉ）等が挙げられる。
また、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含有する物質としては、例えば大豆または脱脂大豆（大豆粕）から熱水、アルコールまたは含水アルコールで抽出される物質、より好ましくは、常法に従いタンパク質、糖質、脂質糖の夾雑物を除去した物質が挙げられる。
本発明によれば、このようなソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含有する物質、および／または該配糖体に、サポニン分解活性を有するタンパク質を含む培養物、本発明によるタンパク質、または本発明による宿主から得ることができるタンパク質を作用させて、ソヤサポゲノールＢを得ることができる。
具体例を挙げると、例えば、サポニン（小城製薬社製）を１重量％〜１０重量％程度の水または緩衝液、例えば酢酸緩衝液またはリン酸緩衝液等に溶解し、これにサポニン分解酵素を添加する。これを適当な温度、例えば２０℃〜５０℃で反応させ、この反応液を酢酸エチル等のような有機溶媒で抽出することにより、ソヤサポゲノールＢを得ることができる。
［実施例］
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１：  アスペルギルスのサポニン分解酵素の確認
アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００４）のＰＤＡスラント約１ｃｍ２を、１００ｍｌのＴＳ培地（２．０％可溶性澱粉、１．０％グルコース、０．５％ポリペプトン、０．６％小麦胚芽、０．３％イーストエキス、０．２％大豆粕、および０．２％炭酸カルシウム（殺菌前ｐＨ７．０））が分注された５００ｍｌ容三角フラスコに植菌して、２５℃で３日間振とう培養した。これを、１００ｍｌのＭＹ培地（４．０％モルトエキス、２．０％イーストエキス、０．２％リン酸二水素カリウム、０．２％硫酸アンモニウム、０．０３％硫酸マグネシウム七水和物、０．０３％塩化カルシウム二水和物（ｐＨ７．０））に４．０％大豆サポニン（小城製薬社製）を加えたものが分注された５００ｍｌ容三角フラスコに、４ｍｌ植菌して、３日間振とう培養した。
なお、以降のアスペルギルス由来サポニン分解酵素の精製では、試験例１で示されるサポニン分解活性を指標とした。
この培養液約８００ｍｌを、ガラスフィルター（Ｇ３）でろ過した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分）を行って、菌体残渣を除去した。この培養上澄約５７０ｍｌに対し、２９４ｇの硫酸アンモニウムを加え、生じた沈殿を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）により回収した。この沈殿を、約１２０ｍｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ５．８））に溶解させ、ＢｕｔｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（２６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ  ３３０ｍｍ）（東ソー社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｂ（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ５．８））から０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）の濃度勾配で行って、非吸着画分および硫酸アンモニウム濃度１Ｍから０．５Ｍで溶出される画分を回収した。
回収された画分をＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（分画分子量１０，０００）（ミリポア社製）を用いて濃縮後、緩衝液Ｃ（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５））と同じ濃度になるように、ここに１Ｍのトリス−塩酸緩衝液および硫酸アンモニウムを加えて、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＰＨＥ、６ｍｌ（アマシャムバイオサイエンス社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は緩衝液Ｃから５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）の濃度勾配で行い、非吸着画分を回収した。
得られた画分を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  １５（分画分子量５，０００）（ミリポア社製）を用いて濃縮して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（１６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ  ６００ｍｍ）（アマシャムバイオサイエンス社製）のゲルろ過クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｄ（２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５．８））で行い、分画分子量約９０ｋＤａの画分を回収した。
この画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約９０ｋＤａに単一のバンドが観察された。
試験例１：  サポニン分解活性の測定
目的とする酵素を含む酵素液を、ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）で脱塩した後、等量の２％サポニン溶液と混和して、３７℃で約１６時間反応させた。これを、等量の酢酸エチルで抽出し、この抽出液をＴＬＣによって（使用した溶媒系は、クロロホルム：メタノール＝９５：５）展開させた。バニリン硫酸の呈色反応を利用して、Ｒｆ値０．３５のソヤサポゲノールＢを検出することによって、目的とする酵素液の酵素活性を測定した。
試験例２：  サポニン分解活性の定量分析
５０μｌの２％サポニン溶液に、希釈した酵素を加えて１００μｌとし、これを３０分間反応させた。次いで、これを、等量の酢酸エチルで抽出し、そのうちの５０μｌを４５０μｌの移動相で希釈した。このうち１０μｌを、下記条件の高速液体クロマトグラフィーに供して、保持時間約７．５分のピーク高を測定した。これをａｕｔｈｅｎｔｉｃなソヤサポゲノールＢのピーク高と比較することにより、この酵素のサポニン分解活性を定量的に評価した。
移動相流速：  ０．８ｍｌ／ｍｉｎ実施例１：  ネオコスモスポラ属由来サポニン分解酵素（ＳＤＮ）の単離精製
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）のＰＤＡスラント約１ｃｍ２を、１００ｍｌのＴＳ培地が分注された５００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２５℃で３日間振とう培養した。これを、１００ｍｌのＭＹ培地に４．０％大豆サポニン（小城製薬社製）を加えたものが分注された５００ｍｌ容三角フラスコに、４ｍｌ植菌して、３日間振とう培養した。
なお、以降のネオコスモスポラ属由来サポニン分解酵素の精製では、試験例１で示されるサポニン分解活性を指標とした。
この培養液約８００ｍｌを約２倍の水で希釈して、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）により菌体を除去した。これに、硫酸アンモニウム１７１ｇを加え、生じた沈殿を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）により除去した。この上澄に、さらに硫酸アンモニウム５７３ｇを加え遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）により沈殿を回収し、これを７０ｍｌの緩衝液Ｃに溶解させた。これをＢｕｔｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（２６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ  １１０ｍｍ）（東ソー社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｃから５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）の濃度勾配で行い、非吸着画分を回収した。
この画分約５００ｍＬに、硫酸アンモニウム約２３９ｇ加えて、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。次いで、回収された沈殿物を、４ｍｌの緩衝液Ｂに溶解して、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（１６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ  １００ｍｍ）（アマシャムバイオサイエンス社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｂから０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）の濃度勾配で行い、硫酸アンモニウム濃度約０．４Ｍの画分を回収した。
次に回収された画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（１６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ  ６００ｍｍ）（アマシャムバイオサイエンス社製）のゲルろ過クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｅ（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５））で行い、分画分子量約７６，０００の画分を回収した。
この画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約７７ｋＤａに単一のバンドが観察された。
実施例２：  サポニン分解酵素（ＳＤＮ）のアミノ酸配列解析
２ａ）  Ｎ末端側アミノ酸配列
実施例１のように調製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（イモビロン−ＰＳＱ）（ミリポア社製）にブロットした後、水洗いして風乾させた。これをプロテインシーケンサーｍｏｄｅｌ  ４９２（アプライドバイオシステムズ社製）に供して、そのアミノ酸配列を解析した。
解析により得られたアミノ酸配列は下記のとおりであった。
2002101053.tif 000003
２ｂ）  内部アミノ酸配列の解析（ペプチドマッピング）
実施例１で調製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーＲ２５０を用いてタンパク質を染色した。ここで染色される分子量約７７ｋＤａに示される単一のバンドを切り出し、５０％アセトニトリルに調製した０．２Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて脱色し、室温で約２時間風乾させた。
次にこのゲル片を、０．０２％ツイーン２０を含む０．２Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）で浸漬した後、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて、３７℃で２日間反応させた。反応後の上澄を回収し、ゲル片はさらに６０％アセトニトリル、および０．１％トリフルオロ酢酸で３回洗浄した。この洗液と反応上澄とを併せて、濃縮し、Ｍｏｄｅｌ１７２μプレパラティブＨＰＬＣシステム（アプライドバイオシステムズ社製）（ＲＰ−３００アクアポアＣ１８、２２０×２．１ｍｍ、０．１％トリフルオロ酢酸、３５％アセトニトリルから０．０８５％トリフルオロ酢酸、３５％アセトニトリルの濃度勾配）に供し、以下に示される５種のペプチドを分取した。
2002101053.tif 000004
実施例３：  サポニン分解酵素（ＳＤＮ）のクローニングと配列解析
３ａ）  ＰＣＲを用いた長鎖プローブの調製
ＰＣＲ用のテンペレートは、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）培養菌体からゲノムＤＮＡを調製し、これを用いた。
ゲノムＤＮＡの単離はＨｏｒｉｕｃｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．：１７０，２７２−２７８，１９８８）に従った。まず、ＴＳ培地で培養された菌体を遠心分離（７，５００ｒｐｍ、１０分）によって回収した。得られた菌体を凍結乾燥後、ＴＥ（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に懸濁し、３％ＳＤＳ溶液中で、６０℃で３０分間処理した。次いで、ＴＥ飽和フェノール抽出により、そこから菌体残渣を除去した。
抽出液はエタノール沈澱化後、リボヌクレアーゼＡ（ニッポンジーン社製）およびプロテイナーゼＫ（和光純薬社製）で処理し、さらに１２％ポリエチレングリコール６０００により核酸を沈殿させた。これをＴＥ飽和フェノール抽出、エタノール沈殿化を行い、同沈殿物をＴＥに溶解し、これをゲノムＤＮＡとした。
ＰＣＲ用プライマーは、実施例２において得られたペプチド配列に基づいて、それらをコードする以下に示されるオリゴヌクレオチドを合成して、用いた。
2002101053.tif 000005
ＰＣＲは、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて行い、９４℃で１分間の熱変性処理後、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、および５５℃で３分からなる一連のステップを、１０サイクル行い、次いで、９４℃で３０秒、４７℃で３０秒、および６０℃で３分からなる一連のステップを２０サイクル行うことによって、断片を増幅した。その結果、ｐｒｉｍｅｒＮ１とｐｒｉｍｅｒ４Ａの組み合わせにおいて特異的な約０．８ｋｂの断片が増幅された。これをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した（ｐＣＲ２．１−２）。
ＤＮＡ配列の解析を、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステムズ社製）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、ｐＣＲ２．１−２にクローン化されているＰＣＲ産物を解読したところ、この断片は、配列番号１に示す配列のうち８８番目から８１２番目の領域が増幅されたものであることが判明した。
３ｂ）  サザン解析とＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを用いた配列の解読
サザン解析では、ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、Ｈｉｂｏｎｄ  Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットした。ハイブリダイゼーションは、ＥＣＦ  ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、バンドの検出はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いた。
プローブとして、実施例３の３ａ）で得られたＰＣＲ産物を用いたところ、約２ｋｂのバンドが検出された。
次に、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、約２ｋｂの断片を回収し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用い環化した。これをテンペレートとしてＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用い、下記に示されるインバースＰＣＲ用プライマーを用いて、９４℃で１分間の熱変性処理後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で４分３０秒からなる一連のステップを、２５サイクル繰り返すことにより、断片を増幅させた。ここで増幅された約２ｋｂの断片は、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローン化し、プライマーウォーキングによりその配列を解析した。
2002101053.tif 000006
３ｃ）  ３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ法を用いた翻訳領域の決定
翻訳領域の決定は、ｃＤＮＡをテンペレートに３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ法を用いた。ｃＤＮＡの調製は、以下のとおりに行なった。
実施例１と同様にして、ＴＳ培地で培養した１ｍｌのネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）の培養液を、１００ｍｌの１％大豆サポニンを含むＭＹ培地が分注された５００ｍｌ容三角フラスコに植菌した。これを２５℃で３２時間振とう培養した後、ナイロンメッシュ（５０μｍ）にて菌体をろ過し、ろ過菌体を液体窒素で凍結した。乳鉢と乳棒を用いて凍結菌体を磨砕し、磨砕菌体からの全ＲＮＡの抽出を行った。全ＲＮＡの抽出は、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用い、添付のプロトコールに従った。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの精製は、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。
このｍＲＮＡについて、５’／３’ＲＡＣＥキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を適用し、３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥを添付のプロトコールに従って、３’および５’領域の増幅を行った。このとき、３’ＲＡＣＥ法の１次ＰＣＲでは、ＡｍｐｒｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、２次ＰＣＲでは、ＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ライフテックオリエンタル社製）を用いた。５’ＲＡＣＥ法の１次および２次ＰＣＲでは、ＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ライフテックオリエンタル社製）を用いた。
３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ特異的プライマーの配列はを以下に示すとおりであった。
2002101053.tif 000007
以上のようにして配列番号１に示されるＳＤＮ遺伝子の翻訳領域を決定した。ここで、実施例２ａ）の結果から、ＳＤＮアミノ酸配列の成熟タンパク質のＮ末端は、翻訳開始点のＭｅｔから数えて２７番目であった。
なお、翻訳領域中のイントロンの存在の確認は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの塩基配列を比較することによって行った。この翻訳領域には、イントロンは存在しないことが判明した。
実施例４：  サポニン分解酵素（ＳＤＮ）の大腸菌における発現
実施例３で得られたｃＤＮＡを鋳型として、下記に示される大腸菌発現用プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ライフテックオリエンタル社製）を用い、９４℃で１分間の熱変性処理後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で２分からなる一連のステップを、２５サイクル繰り返すことによって、ＳＤＮ遺伝子の翻訳領域を増幅させた。これを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した断片と、同様の制限酵素で消化したプラスミドｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とを、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結させた。これを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を常法に従って形質転換させ、アンピシリン耐性を有するコロニーを得た。
2002101053.tif 000008
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得られたコロニーを以下の実験に供した。
コロニーから採取した菌を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌのＬＢ培地が分注された２５０ｍｌ容三角フラスコで、３７℃で一晩振とう培養し、このうち２ｍｌをさらにアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌのＬＢ培地が分注された２５０ｍｌ容三角フラスコに植菌し、３７℃で３時間振とう培養した。これにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを、終濃度０．４ｍＭとなるよう加えて、さらに３時間誘導培養した。
得られた培養菌体は、遠心分離により集菌し、緩衝液Ｆ（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で菌体を懸濁した後、再度遠心分離により菌体を回収した。この菌体は、−８０℃で凍結後、緩衝液Ｆ  ５ｍｌに懸濁して、ここにリゾチームとトリトンＸ１００をそれぞれ終濃度１００μｇ／ｍｌおよび０．１％となるよう添加し、これを室温で約２０分間静置した。これを氷冷下、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて５０％ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅで３０秒間の超音波処理を２回繰り返すことにより細胞を破砕し、遠心分離により菌体残渣を除去した。
このようにして得られた菌体抽出液を粗酵素液として、試験例１にしたがってサポニン分解活性の測定を行った。
その結果、ＴＬＣにおいて分解産物であるソヤサポゲノールＢのスポットが、サポニン分解酵素の翻訳領域がクローン化された菌体抽出液からのみ観察された。
実施例５：  トリコデルマ・ビリデを用いたサポニン分解酵素（ＳＤＮ）の発現 ５ａ）  形質転換用ベクターの構築
実施例３で得られたｃＤＮＡを鋳型にして、下記に示されるトリコデルマ発現用プライマーを用いて、実施例４と同様にしてＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｍａＩおよびＰｓｔＩで消化した断片と、ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩで消化しておいたプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２（国際公開第ＷＯ９８／１１２３９号の実施例５参照）とを、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結させた。これをＸｂａＩで消化し、脱リン酸後、ノイロスポーラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来ｐｙｒ４遺伝子のＸｂａＩカセットと連結させて、プラスミドｐＣＢ−ＳＢｅ（図１）を構築した。
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なお、ｐｙｒ４遺伝子のＸｂａＩカセットの構築方法は、以下の通りであった。
まず、ｐＦＢ６（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．：１１２，２８４−２８９，１９８３）をＢｇｌＩＩで消化後、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化して、約１．９ｋｂの断片を回収した。これをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に連結した。次にこれをＢｇｌＩＩで消化した後、ＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑化し、リン酸化リンカーｐＸｂａＩ（宝酒造社製）を連結させて、ｐｙｒ４遺伝子のＸｂａＩカセットとした。
５ｂ）  トリコデルマ・ビリデ由来ウラシル要求株の取得
トリコデルマ・ビリデＭＣ３００−１株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ  ＭＣ３００−１）の１．０×１０９ＣＦＵ／ｍｌ程度の胞子懸濁液を、ＵＶ灯２灯を３０ｃｍの高さで点灯させた下で、緩やかに混和しながら、該懸濁液にＵＶを照射した。これを選択培地に塗布し、２８℃で７日間培養した後、生育した株を選抜した。
選択培地としては、最小培地（０．２％リン酸二水素カリウム、０．４％硫酸アンモニウム、０．０３％尿素、０．０３％硫酸マグネシウム七水和物、０．０３％塩化カルシウム、０．５％グルコース、２．５％寒天、０．０１％トレースエレメント（５ｍｇ硫酸鉄七水和物、１．５６ｍｇ硫酸マンガン七水和物、１．４ｍｇ硫酸亜鉛七水和物、２．０ｍｇ塩化コバルトを１Ｌの水に溶解したもの））に、１０ｕｇ／ｍｌのウリジンおよび１．０ｍｇ／ｍｌの５−フルオロオロチン酸を添加したものを用いた。
５ｃ）  トリコデルマ・ビリデの形質転換と各組換え体のサポニン分解活性の検出
実施例５の５ｂ）で得られたウラシル要求性トリコデルマ・ビリデ株を、５０ｍｌの菌体形成培地（１．０％イーストエキス、１．０％モルトエキス、２．０％ポリペプトン、２．５％グルコース、０．１％リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物（滅菌前ｐＨ７．０））が分注された２００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により菌糸体を回収した。次に、該菌糸体からプロトプラストを調製した後、プラスミドｐＣＢ−ＳＢｅのＤＮＡ溶液を加えて、形質転換を行なった（国際公開第ＷＯ９８／１１２３９号の実施例７参照）。
なお、形質転換体の再生の際には、最少培地に０．５Ｍのシュークロースを加えたものを用いた。生育したコロニーは再度最少培地に移植し、ここで生育したコロニーを形質転換体とした。
プラスミドｐＣＢ−ＳＢｅをウラシル要求性トリコデルマ・ビリデ株に導入した結果、１μｇのｐＣＢ−ＳＢｅ当り３個の形質転換体が得られた。この形質転換体２５株を培養後（国際公開第ＷＯ９８／１１２３９号の実施例１参照）、培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約６８ｋＤａを示すバンドが、形質転換体にのみ観察された。
この培養上澄を用いて試験例１にしたがってサポニンの分解活性を測定したところ、ＴＬＣで分解産物であるソヤサポゲノールＢのスポットが観察された。一方、親株であるウラシル要求性トリコデルマ・ビリデ株からはこのスポットは観察されなかった。
５ｄ）  組換えサポニン分解酵素（組換型ＳＤＮ）の精製、およびそれとネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株由来サポニン分解酵素（野生型ＳＤＮ）との活性比較
実施例５の５ｃ）で得られた培養液約７００ｍｌを遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）して、その菌体残渣を除去した。この培養上澄約５６０ｍｌに、６４ｇの硫酸アンモニウムを加えて、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）によって沈殿を除去した。さらに、この上澄約６００ｍｌに７４ｇの硫酸アンモニウムを加えて、遠心分離により沈殿を回収した。得られた沈殿に、１００ｍｌの０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と１６ｇの硫酸アンモニウムとを加え、ＢｕｔｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（２６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ３３０ｍｍ）（東ソー社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｃから５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）の濃度勾配で行い、非吸着画分および硫酸アンモニウム濃度１Ｍから０．６Ｍで溶出される画分を回収した。
得られた画分はミリポア社製Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（分画分子量１０，０００）を用いて濃縮した。この濃縮液約８ｍｌに対して、１．３ｇの硫酸アンモニウムと２ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）とを加え、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＰＨＥ、６ｍｌ（アマシャムバイオサイエンス社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｂから０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）の濃度勾配で行い、非吸着画分を回収した。
得られた画分は、ミリポア社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  １５（分画分子量５，０００）を用いて濃縮した。この濃縮液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（１６ｍｍｉ．ｄ．Ｘ６００ｍｍ）（アマシャムバイオサイエンス社製）のゲルろ過クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｇ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））で行い、分画分子量約６８，０００の画分を回収した。
この画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約６８ｋＤａに単一のバンドが観察された。
以上のようにして精製した組換えサポニン分解酵素（以下において「組換型ＳＤＮ」ということがある）と、実施例１で精製して得られたサポニン分解酵素（以下において「野生型ＳＤＮ」ということがある）とについて、試験例２にしたがってその至適ｐＨおよび至適温度を測定した。
至適ｐＨの測定では、まず、５０μｌの２％サポニン溶液に、２０μｌの０．５Ｍの各緩衝液（酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．８）、リン酸ナトリウム（ｐＨ５．０、ｐＨ５．８、ｐＨ７．０）、トリス−塩酸（ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０））と、希釈した酵素液とを加えて、合計１００μｌとした。これらを、３７℃で３０分間反応後、生成したソヤサポゲノールＢ量を定量した。
結果は図２示されるとおりであった。
至適温度の測定では、まず、５０μｌの２％サポニン溶液に、２０μｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）と、希釈した酵素液とを加えて、合計１００μｌとした。これを、所定の各温度で３０分間反応させた後、精製したソヤサポゲノールＢ量を定量した。
結果は図３示されるとおりであった。
これら結果からわかるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の差異は認められたものの、活性に大きな差異は認められなかった。
実施例６：  アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来のサポニン分解酵素（ＳＤＡ）のアミノ酸配列解析
アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００４）から精製されたサポニン分解酵素（ＳＤＡ）（参考例１）を、実施例２の２ｂ）と同様にして、約９０ｋＤａのバンドを切り出した後、断片化した。これを実施例２の２ｂ）と同様にしてＨＰＬＣに供し、下記に示される４種のペプチドを分取した。
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実施例７：  ＳＤＡ遺伝子のクローニングと配列解析
７ａ）  ＰＣＲを用いた長鎖プローブの調製
ゲノムＤＮＡは、参考例１のように培養された菌体から、実施例３と同様にして単離した。
ＰＣＲ用プライマーは、実施例６において得られたペプチド配列に基づいて、それらをコードする以下に示されるオリゴヌクレオチドを合成して、用いた。
2002101053.tif 000012
ＰＣＲは、実施例３の３ａ）の方法と同様にして行った。
その結果、上記のプライマーのうちｐｒｉｍｅｒ２４．０ｓとｐｒｉｍｅｒ３８．０５ａ１の組み合わせにおいて約１ｋｂの断片が特異的に増幅されたことから、これをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した（ｐＳＤＡＰＣＲ１）。
ｐＳＤＡＰＣＲ１にクローン化された断片は、配列解析の結果、配列番号３に示す配列のうち第７０９番目から第１７４８番目の領域が増幅されたものであることが判明した。
７ｂ）  サザン解析と大腸菌コロニーライブラリーを用いたスクリーニング
サザン解析では、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたゲノムＤＮＡをアガロースゲルにおいて電気泳動し、これをＨｉｂｏｎｄ  Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットした。ハイブリダイゼーションは、ＥＣＦ  ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、バンドの検出は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いた。
プローブとして前記７ａ）で得られたＰＣＲ産物を用いたところ、約１０ｋｂのＢａｍＨＩ、約２０ｋｂのＥｃｏＲＩ、約５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片のバンドが検出された。
次に、ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約４ｋｂ〜６ｋｂの断片を回収した。これを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化および脱リン酸化処理しておいたｐＵＣ１８に連結させ、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換させた。この大腸菌を、アンピシリン添加ＬＢ寒天培地においてコロニー形成させ、得られた約１，０００コロニーをＨｉｂｏｎｄ  Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットした。ここで、前記７ａ）で得られたＰＣＲ産物をプローブとして、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に従い、１種の陽性クローンを得た（ｐＳＤＡＨｉｎｄ５／１８）。このクローンは約５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含んでいた。
７ｃ）  ３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ法を用いた翻訳領域の決定
参考例１で調製されたアスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００４）の培養菌体から、実施例３の３ｃ）と同様にして全ＲＮＡを抽出し、さらにＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて添付のプロトコールに従いｍＲＮＡを単離した。
このｍＲＮＡについて、５’／３’ＲＡＣＥキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を適用し、３’および５’領域の増幅を行った。また、それぞれのＰＣＲはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いた。
３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ特異的プライマーの配列は以下に示すとおりであった。
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以上のようにして、配列番号３に示されるＳＤＡ遺伝子の翻訳領域を決定した。ここで、参考例１のように精製されたＳＤＡタンパク質を実施例２ａ）と同様にして成熟Ｎ末端のアミノ酸配列を解析した結果、ＳＤＡアミノ酸配列の成熟タンパク質のＮ末端は、翻訳開始点のＭｅｔから数えて２９番目であった。
なお、翻訳領域中のイントロンの存在の確認は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの塩基配列を比較することにより行なった。この翻訳領域にはイントロンは存在しないことが判明した。
実施例８：  トリコデルマ・ビリデを用いたアスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来サポニン分解酵素（ＳＤＡ）の発現
８ａ）  形質転換用ベクターの構築
まず、実施例７ｂで得られたｐＳＤＡＨｉｎｄ５／１８を鋳型として、下記に示されるトリコデルマ発現用プライマーを用いて、実施例４と同様にしてＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｔｕＩおよびＸｈｏＩで消化した断片と、予めＳｔｕＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２（国際公開第ＷＯ９８／１１２３９号の実施例５参照）とを、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）で連結させて、ｐＣＢ−ＳＤＡｅ（図４）を構築した。
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８ｂ）  トリコデルマ・ビリデの形質転換と各組換体のサポニン分解活性の検出
実施例５の５ｂ）で得られたウラシル要求性トリコデルマ・ビリデ株を宿主に、ｐＣＢ−ＳＤＡｅとｐｙｒ４カセットがｐＬＩＴＭＵＳ２８に連結されたベクターｐＰＹＲ４（実施例５の５ａ）参照）とをコトランスフォーメーション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）法で、実施例５の５ｃ）と同様にして形質転換を行なった。その結果、１μｇのＤＮＡあたり約１２株の形質転換体が得られた。
このようにして得られた形質転換体を培養した後（国際公開第ＷＯ９８／１１２３９号の実施例１参照）、その培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約８０ｋＤａを示すバンドが、形質転換体にのみ観察された。
この培養上澄を用いて試験例１にしたがってサポニンの分解活性を測定したところ、ＴＬＣで分解産物であるソヤサポゲノールＢのスポットが観察された。
８ｃ）  組換アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来サポニン分解酵素（組換型ＳＤＡ）の精製、およびそれと野生型アスペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来サポニン分解酵素（野生型ＳＤＡ）との活性比較
前記８ｂ）で得られた培養液約６００ｍｌを遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）して、その菌体残差を除去した。得られた上澄約５００ｍｌに、５７ｇの硫酸アンモニウムを加えて、遠心分離により不溶化した残差を除去した。さらに、この上澄に、６４ｇ（４０％飽和画分）、および、７０ｇ（６０％飽和画分）の硫酸アンモニウムを順次加え、得られた沈殿を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）に溶解した。このうち得られた６０％飽和画分に硫酸アンモニウムを１Ｍとなるように加え、ＢｕｔｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（２６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ  ２５０ｍｍ）（東ソー社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ａから０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）への濃度勾配で行い、硫酸アンモニウム濃度０．９Ｍから０．２Ｍの画分を回収した。
得られた画分は、ミリポア社製のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（分画分子量１０，０００）およびＵｌｔｒａｆｒｅｅ１５（分画分子量１０，０００）を用いて濃縮し、ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）で脱塩し、Ｒｅｓｏｕｃｅ  Ｑ，６ｍｌ（アマシャムバイオサイエンス社製）のイオン交換クロマトグラフィーに供した。溶出は、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）から５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）の濃度勾配で行い、非吸着画分および０．０８Ｍの塩濃度で溶出される画分を回収した。
得られた画分を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ１５（分画分子量１０，０００）（ミリポア社製）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（１６ｍｍｉ．ｄ，Ｘ６００ｍｍ）（アマシャムバイオサイエンス社製）のゲルろ過クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｇで行い、分画分子量約５０ｋＤａの画分を回収した。
この画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約８０ｋＤａに単一なバンドが観察された。なお、ゲルろ過の分画分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量と異なるのは、本タンパク質が担体と非特異的な吸着をしたためと考えられた。
以上のように精製した組換型ＳＤＡと、参考例１で精製したサポニン分解酵素（野生型ＳＤＡ）とについて、試験例２にしたがってその至適ｐＨおよび至適温度を測定した。
至適ｐＨおよび至適温度の測定は実施例５の５ｄ）と同様に行った。
結果はそれぞれ、図５および図６に示されるとおりであった。
その結果、組換型ＳＤＡは、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液での比活性が野生型ＳＤＡの場合より低下したものの、トリス−塩酸緩衝液中での比活性が向上が向上していることが明らかとなった。
実施例９：  ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素（ＳＤＥ）の単離精製
ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６）のＰＤＡスラント約１ｃｍ２を、１００ｍｌのＴＳ培地が分注された５００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２５℃で３日間振とう培養した。これを１００ｍｌのＭＹ培地に１．０％大豆サポニン（小城製薬社製）を加えたものが分注された５００ｍｌ容三角フラスコに、４ｍｌ植菌し、７日間振とう培養した。
この培養液約１，０００ｍｌをガラスフィルター（Ｇ３）でろ過し、菌体残渣を除去した。この培養上澄約６４０ｍｌに対し、７３ｇの硫酸アンモニウムを加え、生じた沈殿を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）により除去した。さらに、この上澄約６７０ｍｌに対し、２５６ｇの硫酸アンモニウムを加え、生じた沈殿を遠心分離により回収した。この沈殿は、約５０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）に溶解させ、１３．２ｇの硫酸アンモニウムを加えて、最終的に１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液濃度になるよう水を加えた。
この溶液を遠心分離した後、ＢｕｔｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（２６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ  ３３０ｍｍ）（東ソー社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｃから５０ｍＭトリス−塩酸への濃度勾配で行い、硫酸アンモニウム濃度０．７Ｍから０．５Ｍの画分を回収した。
これをＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（分画分子量１０，０００）（ミリポア社製）を用いて濃縮後、緩衝液Ａの組成になるようリン酸ナトリウム緩衝液および硫酸アンモニウムを加え、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＰＨＥ、６ｍｌ（アマシャムバイオサイエンス社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ａから０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）の濃度勾配で行い、硫酸アンモニウム濃度１Ｍから０．３Ｍで溶出される画分を回収した。
この画分はＵｌｔｒａｆｒｅｅ  １５（分画分子量１０，０００）（ミリポア社製）を用いて濃縮し、ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）で脱塩後、Ｒｅｓｏｕｃｅ  Ｑ，６ｍｌ（アマシャムバイオサイエンス社製）のイオン交換クロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）から２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）の濃度勾配で行い、非吸着画分を回収した。
この画分をＵｌｔｒａｆｒｅｅ１５（分画分子量１０，０００）（ミリポア社製）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（１６ｍｍｉ．ｄ．Ｘ６００ｍｍ）（アマシャムバイオサイエンス社製）のゲルろ過クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｇで行い、分画分子量約９０ｋＤａの画分を回収した。
この画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約９０ｋＤａに単一のバンドが観察された。
実施例１０：  ＳＤＥのアミノ酸配列解析
１０ａ）  Ｎ末端側アミノ酸配列
実施例９で調製した画分を、実施例２の２ａ）と同様にして、Ｎ末端側アミノ酸配列を解析した。その結果、に示されるアミノ酸配列が得られた。
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１０ｂ）  ペプチドマッピング
実施例９で精製されたＳＤＥを、実施例２の２ｂ）と同様にして、約９０ｋＤａのバンドを切り出した後、断片化した。これを実施例２の２ｂ）と同様にしてＨＰＬＣ供し、下記に示される３種のペプチドを分取した。
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実施例１１：  ＳＤＥ遺伝子のクローニングと配列解析
１１ａ）  ＰＣＲを用いた長鎖プローブの調製
ゲノムＤＮＡは、実施例９で培養された菌体から、実施例３と同様にして単離した。
ＰＣＲ用プライマーは、実施例１０において得られたペプチドの配列に基づいて、それらをコードする下記に示されるオリゴヌクレオチドを合成し、用いた。
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ＰＣＲは、実施例３の３ａ）と同様にして行った。
その結果、以上のプライマーのうちｐｒｉｍｅｒＮｓとｐｒｉｍｅｒ２０．７３ａの組み合わせにおいて約１ｋｂの断片が特異的に増幅されたことから、これをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した（ｐＳＤＥＰＣＲ５）。
ｐＳＤＥＰＣＲ５にクローン化された断片は、配列解析の結果、配列番号５に示す配列のうち第７０番目から第１２４７番目の領域が増幅されたものであることが判明した。
１１ｂ）  サザン解析とファージライブラリーを用いたスクリーニング
サザン解析では、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＸｈｏＩで消化しておいたゲノムＤＮＡをアガロースゲルにおいて電気泳動し、Ｈｉｂｏｎｄ  Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットした。ハイブリダイゼーションは、ＥＣＦ  ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、バンドの検出はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いた。
プローブとして、前記１１ａ）で得られたＰＣＲ産物を用いたところ、約３ｋｂのＰｓｔＩ、約４ｋｂのＳｐｈＩ、約６ｋｂのＸｈｏＩ断片のバンドが検出された。
次に、ゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ１で部分的に消化した。これをラムダＥＭＢＬ３／ＢａｍＨＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結させて、ＭａｘＰｌａｘ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔキット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いてパッケージングした。このファージライブラリー約５×１０４ＰＦＵは、Ｈｉｂｏｎｄ  Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットし、ｐＳＤＥＰＣＲ５にクローン化されたＰＣＲ断片をプローブとしてＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に従って５種の陽性クローンを得た。このうち６ｋｂのＸｈｏＩ断片を含むファージＤＮＡから同ＸｈｏＩ断片を回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋にクローン化した（ｐＳＤＥＸｈｏ／ＩＩＫＳ＋１）。
ＳＤＥ翻訳領域のＤＮＡ配列は、ｐＳＤＥＸｈｏ／ＩＩＫＳ＋１をテンペレートにトランスポゾン法により、配列番号５に示されるように決定した。
ここで、実施例１０ａ）の結果から、ＳＤＥアミノ酸配列の成熟タンパク質のＮ末端は、翻訳開始点のＭｅｔから数えて１８番目であった。
なお、翻訳領域中のイントロンの存在の確認は、ゲノムとｃＤＮＡのＤＮＡ配列を比較することにより行なったが、翻訳領域にはイントロンは存在しないことが判明した。
実施例１２：  トリコデルマ・ビリデを用いたユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素（ＳＤＥ）の発現
１２ａ）  形質転換用ベクターの構築
実施例１１で得られたｐＳＤＥＸｈｏ／ＩＩＫＳ＋１を鋳型として、下記に示されるトリコデルマ分泌用プライマーを用いて、実施例４と同様にしてＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した断片と、予めＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたプラスミドｐＣＢ１−Ｍ２（国際公開第ＷＯ９８／１１２３９号の実施例５参照）とを、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）で連結させ、ｐＣＢ−ＳＤＥｓ（図７）を構築した。
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１２ｂ）  トリコデルマ・ビリデの形質転換と各組換体のサポニン分解活性の検出
実施例５の５ｂ）で得られたウラシル要求性トリコデルマ・ビリデ株を宿主に、ｐＣＢ−ＳＤＥｓとｐｙｒ４カセットがｐＬＩＴＭＵＳ２８に連結されたベクターｐＰＹＲ４（前記５ａ）参照）とをコトランスフォーメーション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）法で、実施例５の５ｃ）と同様にして形質転換を行なった。その結果、１ｕｇのＤＮＡあたり約２８株の形質転換体が得られた。
このようにして得られた形質転換体を培養した後（国際公開第ＷＯ９８／１１２３９号の実施例１参照）、その培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約６７ｋＤａを示すバンドが、形質転換体にのみ観察された。
この培養上澄を用いて試験例１にしたがってサポニンの分解活性の測定を行ったところ、ＴＬＣで分解産物であるソヤサポゲノールＢのスポットが観察された。
１２ｃ）  組換ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素（組換型ＳＤＥ）の精製および、それと野生型ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素（野生型ＳＤＥ）との活性比較
実施例１２の１２ｂ）で得られた培養液約９００ｍｌを遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）して、菌体残差を除去した。得られた上澄約６９０ｍｌに７８．７ｇの硫酸アンモニウムを加え、遠心分離により不溶化した残差を除去した。さらに、この上澄に対し、８８．６ｇ（４０％飽和画分）の硫酸アンモニウムを加え、得られた沈殿を１２０ｍｌの１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）となるように溶解した。このうち２０ｍｌをＢｕｔｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（２６ｍｍ  ｉ．ｄ．Ｘ３３０ｍｍ）（東ソー社製）の疎水クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ａから０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液への濃度勾配で行い、硫酸アンモニウム濃度０．２Ｍから０Ｍの画分を回収した。
この画分をミリポア社製のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（分画分子量１０，０００）およびＵｌｔｒａｆｒｅｅ１５（分画分子量５，０００）を用いて濃縮し、ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）で脱塩し、Ｒｅｓｏｕｃｅ  Ｑ，６ｍｌ（アマシャムバイオサイエンス社製）のイオン交換クロマトグラフィーに供した。溶出は、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）から５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）の濃度勾配で行い、０Ｍから０．１Ｍの塩濃度で溶出される画分を回収した。
この画分をＵｌｔｒａｆｒｅｅ１５（分画分子量５，０００）（ミリポア社製）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（１６ｍｍｉ．ｄ．Ｘ６００ｍｍ）（アマシャムバイオサイエンス社製）のゲルろ過クロマトグラフィーに供した。溶出は、緩衝液Ｇで溶出し、分画分子量約５０ｋＤａの画分を回収した。
この画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約６７ｋＤａに単一なバンドが観察された。なお、ゲルろ過の分画分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量と異なるのは本タンパク質が担体と非特異的な吸着をしたためと考えられた。
以上のように精製した組換型ＳＤＥと、実施例９で精製したサポニン分解酵素（野生型ＳＤＥ）とについて、試験例２にしたがって、その至適ｐＨおよび至適温度を測定した。
至適ｐＨおよび至適温度の測定は実施例５の５ｄ）と同様に行った。
結果はそれぞれ、図８および図９に示されるとおりであった。
その結果、組換型ＳＤＥは、トリス−塩酸緩衝液での活性が野生型ＳＤＥの場合より向上し、高ｐＨでの活性も向上していることが明らかとなった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＣＢ−ＳＢｅの構成および制限酵素地図を示す。
図２は、実施例５の組換えサポニン分解酵素の至適ｐＨの結果を示す。図中、野生型ＳＤＮとは、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株由来サポニン分解酵素を意味し、また組換型ＳＤＮとは、組換えサポニン分解酵素を意味する。
図３は、実施例５の組換えサポニン分解酵素の至適温度の結果を示す。図中、野生型ＳＤＮとは、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株由来サポニン分解酵素を意味し、また組換型ＳＤＮとは、組換えサポニン分解酵素を意味する。
図４は、プラスミドｐＣＢ−ＳＤＡｅの構成および制限酵素地図を示す。
図５は、実施例８の組換えサポニン分解酵素の至適ｐＨの結果を示す。図中、野生型ＳＤＡとは、アルペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来サポニン分解酵素を意味し、また組換型ＳＤＡとは、組換えサポニン分解酵素を意味する。
図６は、実施例８の組換えサポニン分解酵素の至適温度の結果を示す。図中、野生型ＳＤＡとは、アルペルギルス・エスピー・ＰＦ１２２４株由来サポニン分解酵素を意味し、また組換型ＳＤＡとは、組換えサポニン分解酵素を意味する。
図７は、プラスミドｐＣＢ−ＳＤＥｓの構成および制限酵素地図を示す。
図８は、実施例１２の組換えサポニン分解酵素の至適ｐＨの結果を示す。図中、野生型ＳＤＥとは、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素を意味し、また組換型ＳＤＥとは、組換えサポニン分解酵素を意味する。
図９は、実施例１２の組換えサポニン分解酵素の至適温度の結果を示す。図中、野生型ＳＤＥとは、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株由来サポニン分解酵素を意味し、また組換型ＳＤＥとは、組換えサポニン分解酵素を意味する。
図１０は、ＳＤＮ、ＳＤＡ、およびＳＤＥの相同性を比較した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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