(57)【要約】動物の胚または組織において、ホールマウントで以下の処理を行い、遺伝子発現を検出する。まず、胚または組織等のサンプルを固定し、無水酢酸を用いたアミンのアセチル化、及びキシレンを用いた脂質の除去を含むサンプルの前処理を行う。次に、ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡの商標）中のｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅとｄｉｇ−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅの商標）とを用いて、変性条件を８５℃にして，ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲを行うと、ゲノムＤＮＡは増幅されず、ｍＲＮＡ由来のＤＮＡが特異的に増幅され、標識される。最後に、ジゴキシゲニンを指標に、増幅されたＤＮＡを検出する。このようにして、動物の胚または組織において、検出感度が良く、作業が簡便で、三次元での結果が得られる遺伝子発現検出方法と、その方法に用いるキット及び装置を提供することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の胚または組織において遺伝子発現を検出する遺伝子発現検出方法であって、
ホールマウントの胚または組織内において、
ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するステップと、
前記ｃＤＮＡを合成するステップによって合成されたｃＤＮＡを鋳型にして核酸を増幅するステップと、
前記核酸を増幅するステップによって増幅された核酸を検出するステップと、
を行うことを特徴とする遺伝子発現検出方法。
【請求項２】
前記動物が脊椎動物であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項３】
前記脊椎動物が、アフリカツメガエルであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項４】
前記脊椎動物が、マウスであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項５】
前記核酸を増幅するステップが、
核酸の二重鎖を一本鎖に変性する変性過程と、
前記変性過程で一本鎖になった核酸にプライマーがハイブリダイズするアニーリング過程と、
前記一本鎖になった核酸を鋳型とし、前記プライマーから伸長することにより、前記一本鎖になった核酸に相補的な配列を持つ核酸が合成される伸長過程と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項６】
前記核酸を増幅するステップがＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって行われることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項７】
前記核酸を増幅する際、前記ホールマウントの胚または組織を振動させることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項８】
前記核酸を増幅するステップにおいて、
前記変性過程で、実質的にゲノムＤＮＡを変性させることなく、
前記伸長過程で、前記合成されたｃＤＮＡを特異的に鋳型にして、核酸を増幅することを特徴とする請求項５に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項９】
前記核酸を増幅するステップにおいて、前記変性過程が９０℃以下で行われることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項１０】
前記核酸を増幅するステップにおける反応系がｄＮＴＰアナログを含み、前記伸長過程で生成された、ｃＤＮＡとその相補鎖からなる二重鎖が前記ｄＮＴＰアナログを含むことにより、
該ｃＤＮＡとその相補鎖からなる二重鎖の解離温度が、９０℃以下になることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項１１】
前記ｄＮＴＰアナログが、ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡの商標）中のｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅに由来することを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項１２】
前記ホールマウントの胚または組織をプロテアーゼ処理するステップをさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項１３】
前記ホールマウントの胚または組織内において、アミンをアセチル化するステップをさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現検出方法
【請求項１４】
前記アミンをアセチル化するステップが、前記ホールマウントの胚または組織を無水酢酸で処理することを含むことを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項１５】
前記ホールマウントの胚または組織内において、脂質を除去するステップをさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項１６】
前記脂質を除去するステップが、前記ホールマウントの胚または組織をキシレンで処理することを含むことを特徴とする請求項１５に記載の遺伝子検出方法。
【請求項１７】
前記遺伝子発現検出方法が、微小遠心チューブ中で、又は多穴プレートを用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現検出方法。
【請求項１８】
脊椎動物胚または組織において、遺伝子発現を検出するためのキットであって、
ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素と、
核酸を重合する核酸重合酵素と、
二重鎖核酸中に存在した場合、該核酸の解離温度がｄＮＴＰを用いたときより低下するｄＮＴＰアナログと、
標識ｄＮＴＰと、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
前記標識ｄＮＴＰ中の標識物を認識し、該標識物の局在を検出するための酵素に結合した抗体と、
前記局在を検出するための酵素の基質と、
をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
固定された動物の胚または組織をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記ｄＮＴＰアナログとして、ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡの商標）中のｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅを含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記標識ｄＮＴＰが、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｇｅｎｉｎ；Ｒｏｃｈｅの商標）によって標識されたｄＮＴＰであることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
請求項１に記載の遺伝子発現検出方法を行うための装置。
【請求項２４】
請求項２３に記載の遺伝子発現検出方法を行うための装置であって、
前記核酸を増幅する際、前記ホールマウントの胚または組織を振動させるための装置を備えることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動物胚または組織において遺伝子発現を検出する遺伝子発現検出方法、それに用いるためのキット及び装置に関する。
用語の定義
遺伝子とは、ゲノムＤＮＡ上で一つの転写単位とその発現制御領域を含む領域をいい、主に、タンパク質をコードしている翻訳領域及びその両端にある非翻訳領域を含むエクソンとそれらに介在するイントロンとを含む転写領域、及びその転写領域の発現を制御するエンハンサー／プロモーター領域から成る。ｍＲＮＡは、転写されてできたＲＮＡから、イントロン部分が除去され、エクソン部分が結合して形成される。
ｃＤＮＡとは、ｍＲＮＡの全部または一部と相補的な配列を有するＤＮＡをいう。ｍＲＮＡを逆転写して合成したものだけではなく、ｍＲＮＡを鋳型にして相補的なポリヌクレオチドを合成し、今度はそれを鋳型にして合成した相補的なポリヌクレオチドも含む。
ホールマウントとは、ミクロトームなどを用いて薄切切片（通常、厚さ数μｍ〜数十μｍ）を作ることはしない、ということであり、ホールマウントの胚または組織とは、取り出した胚丸ごと、というだけでなく、胚の頭部だけ、頭部を切り落とした胴体部、個体から取り出したままの組織全体、分割した組織ブロックなども指し、また、単数または複数の組織からなっていてもよく、器官を形成していても良い。カミソリなどを用いて組織を切ったものではあっても、薄切切片用のプロトコールでは、プローブなどが中まで浸透しない程度に厚みのあるものも、これに含まれる。
ＰＣＲとは、一般に、米国特許第４６８３１９５号明細書に記載されたような方法を指し、対象となるヌクレオチド配列を酵素的に増幅するための方法のことをいい、ＤＮＡの二重鎖が解離する変性過程と、プライマーが一本鎖ＤＮＡに水素結合によってハイブリダイズするアニーリング過程と、ポリメラーゼが一本鎖ＤＮＡを鋳型にしてプライマーからＤＮＡを合成する伸長過程からなるサイクルを複数回、通常１０回から４０回行う反応のことである。
背景技術
様々な動物のゲノムプロジェクトが進められている中、ゲノム情報あるいはｃＤＮＡ情報から、機能が未知の遺伝子が多数同定されつつある。従来の方法論でも、例えばガン遺伝子など、正常な生体内での機能が明らかになる前に遺伝子やｃＤＮＡが単離されることも多い。生体内での機能が未知であるこのような遺伝子を機能解析する際、その遺伝子の発現パターンは大きな手がかりとなる。
ある遺伝子の発現を、動物胚または組織において調べる方法として、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがある。
この方法は、目的とする遺伝子のｃＤＮＡを直接ラベルしたＤＮＡプローブ、あるいはそのｃＤＮＡを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、ラベルしたＲＮＡプローブを、胚または組織で転写されているｍＲＮＡと、その胚または組織の切片上でハイブリダイズさせ、プローブに含まれるラベルを検出する方法である。しかし、この方法では、サンプルが増えると、何百枚もの薄切切片を作製するという繁雑な作業が必要になる。しかも、解析結果は切片上での情報であり、胚または組織中で三次元的にどのように発現しているかを知るためには、連続切片を用いた実験を行い、その後で三次元立体構成をして、切片上での結果を三次元に再構築しなければならない。
そこで、ホールマウントの胚または組織を用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うという方法が開発された。しかし、ホールマウントのサンプルは厚みがあるため、プローブや試薬の浸透性が悪いことや核酸の非特異的結合が多いこと等技術的問題が多く、それらの問題を解決するため、ホールマウントの胚または組織に対する技術開発には、世界中で研究されながらも、切片での技術が開発後５年以上の時間が必要であった。
しかし、対象が切片であってもホールマウントの胚または組織であっても、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡを直接検出するため、検出感度に限界があり、とくに発現レベルの低いｍＲＮＡの検出に大きな問題がある。
この問題を解決するため、胚または組織の切片上で、ｍＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを増幅して得られた核酸を検出する方法が開発された。この方法はｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ＲＴ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、あるいはｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲなどと呼ばれることもあるが（本明細書では、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲと呼ぶ）、転写産物であるｍＲＮＡを増幅して検出するため、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに比して、発現検出感度は大きく改善された。
しかし、この方法は薄切切片上で行う技術しか開発されていない。また、上記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと同様、薄切切片作製や三次元立体構成が必要であり、作業が繁雑で、結果を得るための効率が悪いという問題点がある。しかも、この方法は、切片上であっても、技術的困難さのために未だに最適条件の確立が困難で、確実なプロトコールは数少ないという、開発途上の技術である。
そこで、本発明は、検出感度が良く、作業が簡便で、三次元の結果が得られる遺伝子発現検出方法と、その方法に用いるためのキット及び装置を提供することを目的としてなされた。
発明の開示
本発明の遺伝子発現検出方法は、動物胚または組織において遺伝子の発現を検出する遺伝子発現検出方法であって、ホールマウントの胚または組織内において、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するステップと、前記ｃＤＮＡを合成するステップによって合成されたｃＤＮＡを鋳型にして核酸を増幅するステップと、前記核酸を増幅するステップによって増幅された核酸を検出するステップと、を行うことを特徴とする。
また、前記動物が脊椎動物であることを特徴としてもよい。
また、前記脊椎動物が、アフリカツメガエルまたはマウスであることを特徴としてもよい。
また、前記核酸を増幅するステップが、核酸の二重鎖を一本鎖に変性する変性過程と、前記変性過程で一本鎖になった核酸にプライマーがアニールするアニーリング過程と、前記一本鎖になった核酸を鋳型とし、前記プライマーから伸長することにより、前記一本鎖になった核酸に相補的な配列を持つ核酸が合成される伸長過程と、を含むことを特徴としてもよい。
また、前記核酸を増幅するステップがＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって行われることを特徴としてもよい。
また、前記核酸を増幅する際、前記ホールマウントの胚または組織を振動させることを特徴としてもよい。
また、前記核酸を増幅するステップにおいて、前記変性過程で、実質的にゲノムＤＮＡを変性させることなく、前記伸長過程で、特異的に前記合成されたｃＤＮＡを鋳型にして、核酸を増幅することを特徴としてもよい。
また、前記核酸を増幅するステップにおいて、前記核酸変性過程が９０℃以下で行われることを特徴としてもよい。
また、前記核酸を増幅するステップにおける反応系がｄＮＴＰアナログを含むことにより、前記伸長過程で生成された、ｃＤＮＡとその相補鎖からなる二重鎖の解離温度が、９０℃以下であることを特徴としてもよい。
また、前記ｄＮＴＰアナログが、ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡの商標）中のｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅに由来することを特徴としてもよい。
また、前記ホールマウントの胚または組織をプロテアーゼ処理するステップをさらに行うことを特徴としてもよい。
また、前記ホールマウントの胚または組織内において、アミンをアセチル化するステップをさらに行うことを特徴としてもよい。
また、前記アミンをアセチル化するステップが、前記ホールマウントの胚または組織を無水酢酸で処理することを含むことを特徴としてもよい。
また、前記ホールマウントの胚または組織内において、脂質を除去するステップをさらに行うことを特徴としてもよい。
また、前記脂質を除去するステップが、前記ホールマウントの胚または組織をキシレンで処理することを含むことを特徴としてもよい。
また、前記遺伝子発現検出方法が、微小遠心チューブ中で、又は多穴プレートを用いて行われることを特徴としてもよい。
さらに、脊椎動物胚または組織において、遺伝子発現を検出するためのキットであって、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素と、核酸を重合する核酸重合酵素と、二重鎖核酸中に存在した場合、該核酸の解離温度がｄＮＴＰを用いたときより低下するｄＮＴＰアナログと、標識ｄＮＴＰと、を含むことを特徴とするキットを用いることとしてもよい。
また、前記標識ｄＮＴＰ中の標識物を認識し、該標識物の局在を検出するための酵素に結合した抗体と、前記局在を検出するための酵素の基質と、をさらに含むことを特徴としてもよい。
また、固定された動物の胚または組織をさらに含むことを特徴としてもよい。
また、前記ｄＮＴＰアナログとして、ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ中のｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅを含むことを特徴としてもよい。
また、前記標識ｄＮＴＰが、ジゴキシゲニンによって標識されたｄＮＴＰであることを特徴としてもよい。
さらに、以上に記載した遺伝子発現検出方法を行うための装置であってもよい。
また、その装置が、前記核酸を増幅する際、前記ホールマウントの胚または組織を振動させるための装置を備えていてもよい。
発明を実施するための最良の形態
本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであろう。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書に記した記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者には明らかである。
＝＝  ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ法  ＝＝
本実施の形態では、ホールマウントの動物の胚または組織内で、ｍＲＮＡを逆転写し、合成されたｃＤＮＡを増幅するため、ｉｎ  ｓｉｔｕでＰＣＲを行う（以下、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲと呼ぶ）。本実施の形態は、以下の過程から成る。
（１）動物の胚または組織の固定
胚または組織を固定するために、約１０％ホルマリンまたは約４％パラホルムアルデヒドを含む緩衝液を用いる。溶媒となる緩衝液として、生理食塩水やリン酸バッファーなどを用いる。これらは、最も一般的に使用される固定液であるが、グルタールアルデヒドやＤＭＳＯ／メタノールなど、他の固定液を用いてもよい。また、それらの混合溶液を、固定液として用いてもよい。
（２）固定したサンプルの前処理
ホールマウントの胚または組織は、数μｍ〜数十μｍの薄切切片と比較して、数十〜数百倍もの厚さをもっため、遺伝子発現を検出する際、プロープや試薬などの浸透性が大きな問題となる。プローブの浸透性が悪いと、結果として得られるシグナルが弱く、特異的なシグナルが検出できない。そこで、固定したサンプルを前処理することにより、サンプルの浸透性を改善する。
本発明者らは、脂質の除去がサンプルの浸透性を改善することを見いだし、固定したサンプルの前処理として脂質の除去過程を導入した。本実施の形態では、具体的には、キシレン処理によって脂質除去を行う。
（３）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、プローブを合成する際、ｃＤＮＡなどから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法、ＰＣＲ、プライマー・エクステンション、ニック・トランスレーションなどにより、標識されたＲＮＡまたはＤＮＡを合成しなくてはならず、その際鋳型にするために解析対象の遺伝子のｃＤＮＡなどが必要であった。しかし、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲでは、解析対象の遺伝子の配列さえわかれば、それに基づいてプライマーを合成するだけでよく、その遺伝子のｃＤＮＡなどは必要がない。様々な動物において、ゲノム・プロジェクトが進行しているか、あるいは既に終了している現在、遺伝子バンクから遺伝子配列を入手するのは容易であり、本発明の実施は簡便に行える。さらに、本発明は、ホールマウントの動物胚や組織において遺伝子発現の検出を行うため、薄切切片を作成する必要もなく、この点でも簡便に遺伝子発現を調べることができる。このように、本発明の実施によれば、簡便に遺伝子発現を調べることができるのであるが、この簡便さのため、まだ研究が進んでいない遺伝子やＤＮＡ配列に関し、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）等の情報に基づいてプライマーを合成し、網羅的に多数の遺伝子またはＤＮＡ断片の発現を調べることもできる。
ホールマウントでＲＴ−ＰＣＲを行う際に特に問題となりうるのは、ゲノムＤＮＡの増幅である。導入したプライマーがゲノムＤＮＡにハイブリダイズすると、そこで遺伝子が増幅し、非特異的シグナルとして検出され、特異的シグナルの検出を阻害する。そこで、ゲノムＤＮＡからの増幅を抑制するため、切片を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲにおいては、逆転写反応の前にＤＮａｓｅ処理を行い、ゲノムＤＮＡを分解することによって、ゲノムＤＮＡの増幅を抑制していた。しかし、ＤＮａｓｅ処理は組織に対するダメージが大きく、ＤＮａｓｅ処理を受けた組織は、後のＰＣＲ段階での高温処理に耐えることができず、構造が壊れがちである。
そこで、本実施例では、核酸に取り込まれた場合、その核酸の二重鎖の解離温度が、通常のｄＮＴＰから成る核酸の二重鎖より低下するという特性をもつｄＮＴＰアナログを利用した。従って、ＰＣＲの変性過程において、ｃＤＮＡは解離するが、ゲノムＤＮＡは解離しない温度に、変性温度を設定することにより、ｃＤＮＡを特異的に増幅させることができる。この方法によると、ＰＣＲ中にゲノムＤＮＡは変性しないので、ＤＮａｓｅ処理を行わなくても、ゲノムＤＮＡを増幅させることはない。
この場合のｄＮＴＰアナログとは、例えば、相補して二重鎖を作る際一重の水素結合しか作らない分子などが考えられる。本実施例では、ＴＡＫＡＲＡのｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ中のｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅを用いた。ＰＣＲの変性温度は、通常９４℃以上に設定されるが、このｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅを用いた場合、９０℃以下に設定してもよく、より好ましくは８５℃以下に設定してもよい。また、下限の温度は、好ましくは７０℃以上、より好ましくは８０℃以上に設定してもよい。
ＰＣＲ反応中、ホールマウントの動物胚や組織の入った反応液を振動することが好ましい。それによって、胚や組織内への反応液の浸透を高めることができる。
（４）増幅したＤＮＡの標識とその標識の検出
増幅したＤＮＡを検出するため、ＤＮＡを標識し、その標識をタグとして、増幅したＤＮＡを検出する。例えば、標識したｄＮＴＰをＤＮＡにとりこませ、その標識を検出することによって、増幅したＤＮＡを検出してもよい。
本実施例では、ｃＤＮＡ合成時に、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（以下、ｄｉｇ−ｄＵＴＰと記す）を反応系に加え、合成するＤＮＡに取り込ませることによって、増幅したＤＮＡを標識する。最後に、ジゴキシゲニンに対する抗体を用い、免疫組織化学的に、増幅したＤＮＡを検出する。
以下、本発明にかかる実施例を詳細に説明する。以下の記載では、特に説明がない場合、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
＜実施例  １＞
この実施例では、心臓に特異的に発現するトロポニンＩの発現を、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲによって検出する。
（Ｉ）ホールマウント胚または組織の固定
ｓｔａｇｅ２５のアフリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）胚は、透明なビテリン膜でつつまれ、さらにゼリー層によって保護されているので、ゼリーは２％システイン水溶液で溶かして除き、ビテリン膜はピンセットで剥いて除く。ゼリー層とビテリン膜を除去した胚を、４％パラホルムアルデヒド含有ＭＥＭ（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）−２ｍＭ  ＥＧＴＡ−１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）バッファー（以下、ＰＦＡ固定液と記す）に入れ、４℃、約１２時間、固定する。
アフリカツメガエル胚の場合、本実施例の方法が適用できるのは、卵からｓｔａｇｅ４５程度であるが、ｓｔａｇｅ１０からｓｔａｇｅ４０までの胚はより好ましい。
固定以降の反応は、０．５ｍｌの微量遠心チューブまたは多穴プレート（例えば９６穴プラスティックプレート）を用いて行い、反応ごとに容器を変える必要はない。これらのチューブ、あるいはプレートは、そのままＰＣＲ増幅器においてｃＤＮＡを増幅する際用いることができるように、ＰＣＲ増幅器の規格にあった物を用いるのが好ましい。
固定した胚を、以下の溶液で順次５−１０分間処理することにより、脱水する。脱水後の胚は−２０℃で数カ月以上の保存が可能である。
（１）ＭＥＭバッファー
（２）２５％エタノール含有ＭＥＭバッファー
（３）５０％エタノール
（４）７５％エタノール
（５）１００％エタノール（２回）
（ＩＩ）前処理
（Ａ）再水和
ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲの前処理として、まず、脱水した胚を、以下の溶液で、順次、特別に記載されていない限り５分間処理することにより、再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）する。
（１）７５％エタノール
（２）５０％エタノール
（３）２５％エタノール含有ＰＴｗ
（ＰＴｗとは０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳのことであり、以下ＰＴｗと表記する）
（４）ＰＴｗ（２回）
（Ｂ）アセチル化
次に、固定した胚のタンパク質がもつ正のイオンを中和し、負のイオンを持つ核酸がタンパク質、特に塩基性タンパク質に非特異的に結合することを抑制するために、塩基性の原因であるアミンをアセチル化する。ここでは、固定した胚を無水酢酸で処理することにより、アミンのアセチル化を行う。
（１）０．１Ｍトリエタノールアミン
（２）０．１Ｍトリエタノールアミン５ｍｌに対し、１２．５μｌの無水酢酸を加えた溶液
（３）（２）の処理後、さらに１２．５μｌの無水酢酸を加えた溶液
（Ｃ）脂質除去
次に、胚または組織に対してプライマーや試薬などの浸透性を良くするため、そこに含まれる脂質を除去する。ここでは、胚をキシレンで処理することにより、含まれる脂質を除去する。即ち、以下の溶液で、順次処理を行う。処理時間は、特別に記載されていない限り５分間とする。
（１）ＰＴｗ（２回）
（２）２５％エタノール含有ＰＴｗ
（３）５０％エタノール
（４）７５％エタノール
（５）１００％エタノール
（６）キシレン：１００％エタノールの１：１溶液
（７）キシレン  ２時間
（８）キシレン：１００％エタノールの１：１溶液
（９）１００％エタノール（３回）  各３分
（ＩＩＩ）逆転写反応
前処理を終えた胚や組織において、まず、解析対象の遺伝子のｍＲＮＡに対して、逆転写反応を行うことにより、その遺伝子のｃＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕで合成する。
脱水した胚を、短時間乾燥させ、半乾きの状態で、以下のＲＴバッファー３８μｌに入れ、室温で６０分放置する。その後、ＲＴバッファーを除去し、等量の新しいＲＴバッファーを入れ、４２℃で６０分放置する。５Ｕ／μｌ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬを加え、４２℃で一晩、逆転写反応をさせる。
ＲＴバッファー：
２ｘ  ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ  ２０μｌ
１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                １０μｌ
ｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ                          ５μｌ
４０Ｕ／μｌ  ＲＮＡｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ                    １μｌ
１００μＭ  ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ  １                          ２μｌ
2003095676.tif 000003
（ＩＶ）核酸増幅反応
逆転写反応後、ＲＴバッファーを除去し、以下のＰＣＲバッファーを入れる。ＰＣＲバッファー：
２ｘ  ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ  ２５μｌ
１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                １０μｌ
ｄＮＴＰ／ａｎａｌｏｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ                          ５μｌ
１２５ｍＭ  ｄｉｇ−ｄＵＴＰ                                    １μｌ
５Ｕ／μｌ  ＡＭＶ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｔａｑ                  ５μｌ
１００μＭ  ｕｐｐｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ                            ２μｌ
１００μＭ  ｄｏｗｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ２                          ２μｌ
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この反応系を用いて、以下の条件でＰＣＲを３０サイクル行い、ｃＤＮＡを増幅させる。
１サイクルの条件：変性過程            ８４℃  １ｍｉｎ
アニーリング過程    ４５℃  ２ｍｉｎ
伸長過程            ７２℃  ６ｍｉｎ
（Ｖ）標識検出反応
最後に、増幅した核酸に取り込まれたｄｉｇ−ｄＵＴＰを抗ジゴキシゲニン抗体（以下、抗ｄｉｇ抗体と記す）を用いて検出することにより、トロポニンＩの発現部位を特定する。
まず、ＰＣＲバッファーを除去し、以下の溶液で、記載された時間、温度、回数の条件で、順に処理する。回数は、特別に記載されていない限り、一度だけ行い、温度は特別に記載されていない限り、室温で行う。
（１）７５％エタノール                        ３分
（２）２ｘＳＳＣ                            １０分
（３）１ｘＳＳＣ                            １０分  ３回  ６５℃
（４）ＭＡＢ（１００ｍＭ  マレイン酸、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）      ５分  ２回
（５）２％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅの商標）と２０％  子ヒツジ血清とを含有したＭＡＢ              ６０分
（６）アルカリホスファターゼ結合抗ｄｉｇ抗体
（ＭＡＢで２０００分の１希釈）          ４時間
（７）ＭＡＢで洗う                          １０分  ２回
（８）ＭＡＢで洗う                            一晩          ４℃
（９）ＭＡＢで洗う                          ６０分  ２回
（１０）ホスファターゼ・バッファー            ５分  ２回
最後に、アルカリホスファターゼの基質であるＢＭ  ｐｕｒｐｌｅ（Ｒｏｃｈｅの商標）を加え、３７℃で発色させる。途中、実体顕微鏡で観察しながら、シグナルの濃さが、特異的シグナルと非特異的シグナルが区別できるくらいになったところで、ＰＦＡ固定液を加え、反応を停止する。
図１（斜線の部分が特異的なシグナル）に示すように、トロポニンＩの発現が心臓に特異的に検出された。
＜実施例  ２＞
この実施例では、予定水晶体上皮領域に特異的に発現するＸｌｅｎｓ１遺伝子の発現を、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲによって検出する。
実験方法は、逆転写反応及び核酸増幅反応に用いられるプライマー以外は実施例１と同じなので、詳しい実験方法は省略する。プライマーは、以下の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いた。
2003095676.tif 000005
その結果、図２（斜線の部分が特異的なシグナル）に示すように、Ｘｌｅｎｓ１遺伝子の発現が、眼に特異的に検出された。
＜実施例３＞
本実施例では、実施例１及び２で用いたアフリカツメガエル胚ではなく、マウス９〜１３日胚を用い、肢芽及び心臓に発現しているマウスＢＭＰ−１０遺伝子の発現を、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲによって検出する。
（Ｉ）ホールマウント胚または組織の固定
マウス１０日胚を妊娠雌マウスから取りだし、４％パラホルムアルデヒド＋０．５％グルタールアルデヒド含有ＰＢＳで、４℃で一晩固定する。固定後の胚は、実施例１同様、脱水するが、バッファーとして、ＭＥＭではなく、ＰＢＳを用いる。
（ＩＩ）前処理
固定したマウス胚を、実施例１（ＩＩ）（Ａ）と同様に再水和した後、１０μｇ／ｍｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液で、室温、５分間処理する。その後、実施例１（ＩＩ）（Ｂ）と同様にアセチル化し、実施例１（ＩＩ）（Ｃ）と同様に脂質除去する。
なお、この前処理の際、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液の濃度やｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理時間は、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫのロットやマウス胚及び組織の大きさによって、あらかじめ最適化することが望ましい。
（ＩＩＩ）逆転写反応
前処理を終えたマウス胚において、以下のプライマーを用い、実施例１と同様に逆転写反応を行うことにより、ＢＭＰ−１０遺伝子のｃＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕで合成する。
2003095676.tif 000006
（ＩＶ）核酸増幅反応
さらに、以下のプライマーを用いて、実施例１と同様、ＰＣＲを行う。
2003095676.tif 000007
（Ｖ）標識検出反応
最後に、増幅した核酸に取り込まれたｄｉｇ−ｄＵＴＰを抗ｄｉｇ抗体を用いて検出することにより、ＢＭＰ−１０遺伝子の発現部位を特定する。実施例１においてＭＡＢをＴＢＳＴに変える以外は、実施例１と同様の方法で検出する。その結果、図３に示すように、ＢＭＰ−１０遺伝子の発現が、心臓及び肢芽に特異的に検出された。
＜他の実施形態＞
上記実施例では、材料としてアフリカツメガエ及びマウスを用いているが、ゼブラフィッシュやニワトリなどの脊椎動物、ショウジョウバエなどの無脊椎動物にも適用可能である。なぜなら、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションや、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでも、これらの動物種において、ほとんど同じ方法が利用できるからである。ただし、用いる遺伝子や組織によっては、非特異的シグナルの量が異なる場合があるが、そのような場合でも、プローブのハイブリダイゼーションなどの核酸の処理過程ではなく、それより前に行われる組織の前処理を工夫することによって、非特異的シグナルを減らすことができる。本発明は、前処理を終えた核酸の処理過程（すなわち、核酸の逆転写反応、増幅反応および検出反応）および前処理の段階で、非特異的シグナルを減らす一般的方法についての発明であるため、あらゆる動物種に対して適用可能である。
上記実施例では、プロテアーゼ処理に、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを用いたが、他種のｐｒｏｔｅａｓｅやパパインなどでも構わない。
上記実施例では、逆転写反応に特異的なプライマーを用い、対象となるｍＲＮＡのみを逆転写するようにしたが、ランダムプライマーやオリゴｄＴをプライマーとして用い、ｍＲＮＡ全体を逆転写させてもよい。その場合でも、ＰＣＲにおいて対象となるｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いているので、そのｃＤＮＡだけが特異的に増幅する。
上記実施例では、核酸の増幅反応としてＰＣＲを用いたが、例えばＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法や、ＩＣＡＮ（ＴＡＫＡＲＡの登録商標）などの鎖置換増幅法のような他の核酸増幅法を利用してもよい。
上記実施例では、ｃＤＮＡの合成および増幅にｄＮＴＰアナログを用い、ｃＤＮＡの二重鎖とゲノムＤＮＡの二重鎖との変性温度の違いを利用して、ゲノムＤＮＡの増幅を防止したが、あらかじめＤＮａｓｅによってゲノムＤＮＡを分解してから、ｍＲＮＡを逆転写させ、ｃＤＮＡを増幅してもよい。ただし、ゲノムＤＮＡを不完全に分解すると、長さの短いオリゴヌクレオチドができ、ゲノムＤＮＡの変性温度が低くなる可能性があるため、ＰＣＲで増幅できない程度にゲノムＤＮＡをほぼ完全に分解するか、ＤＮａｓｅ処理を行わないほうが好ましいが、なかでもＤＮａｓｅ処理を行わないのがもっとも好ましい。
本実施例では、ｃＤＮＡの増幅時に、ｄｉｇ−ｄＵＴＰを取り込ませることによって合成するＤＮＡを標識したが、予めジゴキシゲニンなどで標識した標識プライマーを用いることによって、ＤＮＡを標識してもよい。
また、ＤＮＡの標識分子として、ジゴキシゲニンを用いたが、増幅したＤＮＡを標識するものは、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものであってもよい。例えば、ジゴキシゲニン以外に、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、３２Ｐなどの放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光物質、発色物質などが挙げられる。
＝＝  ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置  ＝＝
以上に述べたようなホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ法は、従来の実験技術と同様、手動で行うこともできるが、多数のサンプルを処理する時など、処理を自動化することによって効率化を図ることができる。例えば、図４に示すような装置が考えられるが、サンプルの入った容器を移動する、容器中の溶液を捨てる、容器に液体を注入する、容器を振動させる等、装置内の各パーツが行う動作は、例えばゲノムＤＮＡ自動抽出機やＰＣＲ前処理自動化装置等で、既に実現されており、当業者であれば設計可能であるので、ここではそれらの詳細な仕組みの記述は省略する。
図４に示した本実施の形態によるホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置１００は、胚を入れたＰＣＲプレートを、装置内のＰＣＲ用ヒートブロック１または２に設置すると、所定のプログラムに従って、最終過程である発色反応まで、自動的に反応を行う。なお、ヒートブロック１、２は、列ごと、及び行ごとに、温度や時間などの異なった反応条件を設定することができる。ここで用いるＰＣＲプレートは、微小マイクロチューブが繋がった形状をしており、熱効率が良く、薄いチューブ壁を持つ。
各ヒートブロックの隣にあるブロック３と４、及び５と６は、それぞれヒートブロック１及び２における、ＲＴ反応とＰＣＲに用いるためのプライマーを準備しておく場所である。そのためのプレートは、反応用プレートと同じ物が用いられる。
この装置はＰＣＲプレートのウエル内に液体を出し入れするためのアーム７を備える。このアーム７の先端部分８は、ＰＣＲプレート上のウエルに対応した場所にノズルを備える。先端部分８は交換可能になっており、例えば２４ウエルあるいは９６ウエルのプレートを用いる場合、２４個あるいは９６個のノズルを備えた先端部分８を取り付ける。ノズルの先端は、サンプルを傷つけないようにゴムやシリコンなどの弾力性のある素材でコートされたピペットマンチップ１０が装着可能になっており、自動でチップが着脱可能になっている。装置内のチップ置き場１１には、チップ１１が、選択した先端部分８のノズルの位置に対応して穴のあいている容器に立てられているものを設置する。チップ１１の立っている容器は積み重ねることができ、チップ１１を使用後、空になった容器を捨てることによって、次の容器に立っているチップ１１が使用可能になる。
アーム７は、縦横方向に動くことができ、ヒートブロック１、２のプレート位置のちょうど真上に位置することができる。また、アーム７は上下方向に伸び縮みすることができ、プレートの所定位置のすぐ真上まで先端を下ろすことができる。従って、アーム７によって、ヒートブロック１、２の所定位置にあるプレートに対し、プレートの有するウエルに液体を注入したり、ウエルから液体を除去したりすることができる。
図５に示すように、このヒートブロック１、２は、ＰＣＲ反応中に、ベリーダンサー型シェーカーと同様の三次元的運動をすることにより、反応物を振動することができる。なお、各ヒートブロックに超音波発生装置を設けることによって、ＰＣＲ反応中に反応物を振動させることもできる。この場合は、ヒートブロック１、２の列ごと、及び行ごとに、超音波の周波数や強さ、超音波をかける時間などの振動条件を設定することができる。
反応に用いる試薬を供給する試薬瓶１２内に挿入されたチューブから装置内部に取り込まれた試薬は、アーム先端８のノズルから出るようになっている。試薬としては、蒸留水、ＰＢＳ、エタノール、ＲＴバッファー、ＰＣＲバッファー等、反応に必要な試薬瓶１２が用意される。装置内におかれた箱１３は、チップの廃棄用であり、箱１４は試薬の廃棄用である。
ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置１００は、コンピューターシステム２００とともにホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置システムを構成し、装置の動作はすべて、付属しているコンピューター１６を用いて、制御可能である。装置の動作とは、例えば、アーム７の動作、ＰＣＲの条件を含むヒートブロック１、２の温度コントロール、ヒートブロック１、２の振動の仕方、などである。そのコンピューター制御のために、例えば図６に示すようなユーザインターフェイスにおいて、アフリカツメガエル胚の前処理のための各パラメータを実験者が入力することができる。
以上の構成を持つホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置システムを用いて、ｓｔａｇｅ２５のアフリカツメガエル胚に対し、実施例１に従いホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲを行う。まず、ゼリー層とビテリン膜を除去したアフリカツメガエル胚を、ＰＢＳの入った２４ウエルのプラスティックプレートに入れ、あらかじめ４℃に設定したヒートブロック１に設置する。アーム７がプラスティックプレート上に動き、固定、脱水、再水和、アセチル化、脂質除去、の各過程に必要な溶液の注入及び除去を行う。ヒートブロック１は、各過程において、適切な温度になるように制御される。
その後、プライマーを含まず、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬを含んだＲＴバッファーが加えられ、一旦除去され、再び同じＲＴバッファーが加えられた後、各サンプル用のプライマーがブロック３上のプレートから加えられ、逆転写反応が行われる。反応後、ＲＴバッファーが除去され、プライマーを除いたＰＣＲバッファーが加えられた後、各サンプル用のプライマーがブロック４から加えられ、ＰＣＲが行われる。
最後に、アルカリホスファターゼ結合抗ｄｉｇ抗体を用いて、抗原抗体反応が行われた後、発色反応の直前で反応が停止し、ブザーが鳴る。
実験者は、プレートをホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置１００から取りだし、アルカリホスファターゼの基質であるＢＭ  ｐｕｒｐｌｅ（Ｒｏｃｈｅの商標）を加え、３７℃で発色させる。途中、実体顕微鏡で観察しながら、シグナルの濃さが、特異的シグナルと非特異的シグナルが区別できるくらいになったところで、ＰＦＡ固定液を加え、反応を停止する。
最後の発色反応は、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置１００に内蔵ＣＣＤカメラ及びモニターを設け、装置１００内で基質を加え、反応を装置１００外のモニターで観察しながら、反応停止時を決めることもできる。また、サンプルの画像を即時解析し、背景とシグナルとのコントラストが一定以上になったり、シグナルの平均の濃さあるいはシグナルの濃さの総量が一定以上になったりした時、反応が止まるようにプログラムを設計してもよい。
産業上の利用の可能性
本発明により、動物の胚または組織において、検出感度が良く、作業が簡便で、三次元の結果が得られる遺伝子発現検出方法と、その方法に用いるためのキット及び装置を提供することできる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による一実施例によってなされたトロポミオシンＩ遺伝子の発現の検出結果を示す図である。二つの胚のうち、上側の胚が検出例、下側の胚は逆転写反応時に逆転写酵素を加えていないネガティブ・コントロールである。上側の胚で、トロポミオシンＩ遺伝子の心臓特異的な発現（矢印の青いシグナル）が検出されている。
図２は、本発明による一実施例によってなされたＸｌｅｎｓ１遺伝子の発現の検出結果を示す図である。二つの胚のうち、上側の胚が検出例、下側の胚は逆転写反応時に逆転写酵素を加えていないネガティブ・コントロールである。上側の胚で、Ｘｌｅｎｓ１遺伝子の発生途中の目での発現（星印の部分）が検出されている。
図３は、本発明による一実施例によってなされたＢＭＰ−１０遺伝子の発現の検出結果を示す図である。二つの胚のうち、上側の胚が検出例、下側の胚は逆転写反応時に逆転写酵素を加えていないネガティブ・コントロールである。上側の胚で、ＢＭＰ−１０遺伝子の心臓（破線の矢印）及び肢芽（実線の矢印）に特異的な発現が検出されている。
図４は、本発明による一実施例によってなされたホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置システムの全体構成を示す概観図である。
図５は、本発明による一実施例によってなされたホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置に含まれるＰＣＲ用ヒートブロック１、２の概観図である。
図６は、本発明による一実施例によってなされたホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ自動化装置システムに含まれるモニターにおける、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ反応中の前処理段階での各設定を表示したユーザインターフェイスの一例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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