(57)【要約】生理活性物質、とりわけ、インターフェロンの癌又はウイルス病治療における治療効果を予測する方法を提供することを課題とし、癌又はウイルス感染細胞におけるインターフェロン関連遺伝子の発現量に基づいて、癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果を予測する方法を提供することにより課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌又はウイルス感染細胞におけるインターフェロン関連遺伝子の発現量を測定することにより、癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果を予測する方法。
【請求項２】
インターフェロン関連遺伝子がシクロオキシゲナーゼ−２遺伝子である請求の範囲第１項に記載の癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果を予測する方法。
【請求項３】
癌又はウイルス感染細胞が、治療対象の患者由来の癌又はウイルス感染細胞、又はそれらの培養株化細胞である請求の範囲第１項又は第２項に記載の癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果を予測する方法。
【請求項４】
シクロオキシゲナーゼ−２遺伝子のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果予測用キット。
【請求項５】
有効成分として、シクロオキシゲナーゼ−２遺伝子阻害剤とインターフェロン−αを含有することを特徴とする癌又はウイルス病治療剤。
【請求項６】
シクロオキシゲナーゼ−２遺伝子阻害剤が、インドメタシンである請求の範囲第５項に記載の癌又はウイルス病治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌又はウイルス病治療において、生理活性物質又は抗癌剤、とりわけ、インターフェロンによる治療効果を予測する方法に関するものである。
【背景技術】  インターフェロンは、抗ウイルス活性や腫瘍細胞増殖抑制活性を有することから、Ｃ型肝炎などのウイルス性の疾患や、腎臓癌などの癌の治療に有効であり、有力な治療方法として医療現場において利用されている。しかしながら、インターフェロンを用いた治療方法は、一部の患者に対しては満足のいく効果が発揮されないという事例が数多く報告されており、必ずしも、医療費や副作用の観点から有利な治療方法となるとは限らない。
一方、ヒトの全遺伝子解析を初めとする全世界的プロジェクトの結果としての遺伝学の発展により、ＤＮＡマイクロアレイ法などの遺伝子検索ツールの開発が急ピッチで進んでいる。エイチ・アブラタニ著、実験医学、増刊号、第１９巻、第１９号（２００１年）、２５１８乃至２５２４頁には、ＤＮＡマイクロアレイ法を用いた遺伝子の発現プロファイルの解析により、癌の診断において治療対象の癌の特性を正確に評価する試み、また、ケー・チバ等著、実験医学、増刊号、第１９巻、第１９号（２００１年）、２５０７乃至２５１２頁には、抗癌剤などの薬剤の効果の個人差を予測する試み、いわゆる薬理ゲノミクスが提案されている。これらの試みは、癌などの疾病の診断や治療において、試行錯誤的な治療を実施することなく、最初の治療から効果的な治療方法を選択することを可能とする。したがって、無駄な治療行為を減らすことで、副作用による患者の肉体的負担、及び、高価な医薬品の無駄使いを無くすことによる患者の医療費負担を軽減することができる。このような薬剤の効果を予測する方法は、インターフェロンを始めとするサイトカイン分野においては、いまだ確立していないが、もし確立されれば、インターフェロンを始めとするサイトカインを、効率的に癌又はウイルス病の治療に利用することができる。
斯かる状況に鑑み、本発明の第一の課題は、癌又はウイルス病治療において、インターフェロンの効果を予測する方法を提供することにある。また、本発明の第二の課題は、インターフェロンの効果の予測を容易に実施することを可能とするキットを提供することにある。さらに本発明の第三の課題は、癌又はウイルス病の治療方法に関し、インターフェロンをより効果的に利用する方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者等は、広く癌又はウイルス病患者由来の細胞株において、インターフェロン関連遺伝子の発現プロファイルを検索することによって、インターフェロンの感受性と関連深い遺伝子を見いだした。さらに、それらの遺伝子の発現量を調べることによって癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果を予測する方法を確立し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、上記第一の課題を、インターフェロン関連遺伝子、とりわけ、シクロオキシゲナーゼ−２遺伝子の発現量に着目して、癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果を予測する方法を提供することにより解決するものである。
さらに、本発明は、上記第二の課題を、癌又はウイルス病治療におけるインターフェロンの効果を予測することを目的とした、シクロオキシゲナーゼ−２遺伝子の発現量測定用のキットを提供することにより解決するものである。
さらに、本発明は、上記第三の課題を、インターフェロンとシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の阻害剤を含有する癌又はウイルス病治療薬を提供することにより解決するものである。
【図面の簡単な説明】  第１図は、各インターフェロン−α感受性グループにおけるｍＲＮＡレベルでのＣｏｘ−２遺伝子の相対発現量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、癌又はウイルス病の治療において、患者にインターフェロンを投与する前に、インターフェロンの治療効果を予測する方法に関するものである。本発明でいうインターフェロンとは、ヒトを含む温血動物のインターフェロン全般を含み、ヒトを含む温血動物由来の細胞を適宜の方法で培養して、適宜のインターフェロン誘発剤を作用し産生させることにより製造されたもの、ヒトを含む温血動物由来のインターフェロンの遺伝子を組み込んだ適宜の発現ベクターを、大腸菌、酵母などの微生物、動物、植物、又はそれらの培養細胞内に導入し、適宜の誘導剤を用いて産生させることにより製造されたもの、又は、化学合成法などのプロテインエンジニアリングの手法によって、全部又は一部が人為的に製造されたものであってもよい。本発明で用いるインターフェロンは、天然型、組換型の両方を含み、その製法、由来は問わない。また、インターフェロンを産生誘導する物質を患者に投与することによって、あるいは、遺伝子治療などによって体内に導入された外来性のインターフェロン遺伝子によって、患者の体内で産生されたインターフェロンであってもよい。また、本発明で用いるインターフェロンとして、インターフェロンの安定性、作用効果を調節するために、例えば、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、マンノース、キシロース、シアル酸などの単糖によって構成されたＮ−グリコシル結合型又はＯ−グリコシル結合型糖鎖、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸などの硫酸化糖質による糖鎖、又は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、プルランなどの水溶性高分子により修飾されたインターフェロン、または、インターフェロン活性を有する範囲内で部分的にアミノ酸配列が改変されたインターフェロンであってもよい。
また、インターフェロンと、インターフェロン以外の物質、例えば、腫瘍壊死因子、インターロイキン、成長ホルモンなどの生理活性物質、抗癌剤、抗生物質、ワクチン、生薬、漢方薬などとの併用の場合であっても、本発明のインターフェロンの効果予測方法は適用可能である。
本発明でいうインターフェロン関連遺伝子とは、例えば後述の表４に例示される、インターフェロンにより発現誘導される遺伝子、インターフェロンを発現誘導する遺伝子、インターフェロンの効果を増減させる遺伝子、又は、インターフェロンのシグナル伝達に関連する遺伝子であって、例えば、インターフェロン受容体遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、インターフェロンシグナル伝達関連遺伝子、多剤薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。これら遺伝子の発現量のデータは、インターフェロンの癌又はウイルス病の治療効果を予測するために極めて有利に利用できる。とりわけ、シクロオキシゲナーゼ−２（以後、本明細書において「Ｃｏｘ−２」と略記されることもある）遺伝子は、本発明によって、その発現量が少ない細胞はインターフェロンに対する感受性が高いという現象が確認され、インターフェロンの感受性を低下させる作用を持つことが明らかにされた。したがって、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量のデータは、インターフェロンの治療効果を推測するために極めて有用である。Ｃｏｘ−２遺伝子は、炎症時に過剰に発現してプロスタグランジンを産生するという作用を持つ炎症反応に関わる遺伝子であることが知られている。
本発明でいう癌又はウイルス感染細胞とは、癌又はウイルス感染組織由来の細胞であり、癌又はウイルス病の患者から採取した癌又はウイルス感染細胞であっても、それらの株化細胞であってもよく、とりわけ、治療対象の患者の組織から摘出された癌又はウイルス感染細胞であるのが好ましい。また、患者から癌又はウイルス感染細胞の採取が困難な場合は、癌又はウイルス病由来の組織などを考慮して、入手可能な株化細胞のうち、最も類似したもので代用することができる。また、ウイルス病モデルとして、人為的にウイルスを感染させた正常細胞を用いることもできる。なお、本発明は、検査対象の細胞が癌細胞又はウイルス感染細胞に限定されず、正常細胞のインターフェロンの感受性を調べることに適用することができる。
インターフェロン関連遺伝子の発現量を調べる方法としては、インターフェロン関連遺伝子のタンパク質レベルでの発現量を測定する方法、すなわち、癌又はウイルス感染細胞により産生されたインターフェロン関連タンパク質を適宜な方法により抽出するか、あるいは、細胞そのままを使用して、遺伝子発現しているタンパク質の量を調べる方法であり、例えば、常法の、エンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫沈降法、免疫細胞染色法、電気泳動法、ウエスタンブロッティング法、パニング法、ＨＰＬＣ法、ペプチドシークエンス法、フローサイトメトリー法、マススペクトル法などが挙げられ、これらを適宜組み合わせて用いることができる。
また、インターフェロン関連遺伝子の発現量を調べる方法としては、インターフェロン関連遺伝子のｍＲＮＡレベルによる発現量を、例えば、癌又はウイルス感染細胞からｍＲＮＡを適宜の方法により単離するか、あるいは単離操作を省いて細胞中に存在したままのｍＲＮＡを、所望により逆転写酵素反応処理によりｃＤＮＡに変換した後、インターフェロン関連遺伝子に特異的な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡを用いて目的の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量を測定する方法が挙げられ、ｍＲＮＡの測定方法としては、例えば、常法の、ノーザンブロッティング法、サザンブロッティング法、ハイブリダイゼーション法、マグネットビーズ法、電気泳動法、ＰＣＲ法、ＤＮＡシークエンシング法などが挙げられ、これらを適宜組み合わせて行うことができる。本発明においては、ＰＣＲ法の変法である後述のリアルタイムＰＣＲ法が、処理速度及び定量精度が優れるので最も有利に用いられる。また、使用可能なｍＲＮＡ又はそれに対応するｃＤＮＡとしては、治療対象の患者の癌又はウイルス感染細胞から抽出したものを用いることが好ましいが、他の患者の細胞、臓器あるいは組織由来のものを代用することも可能である。さらに、プレブロッテング膜、ＤＮＡマイクロアレイなどの加工品も利用することができ、それらの市販品を用いることも随意である。
癌又はウイルス感染細胞のインターフェロン感受性を調べる方法としては、まず、腸癌、肺癌、膵癌、乳癌、胃癌、肝癌、腎癌、神経癌、皮膚癌、咽喉癌、肉腫、子宮癌などの癌、又は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス病患者から採取した癌又はウイルス感染細胞、又はこれらに由来する培養株化細胞を、１００乃至１０，０００ＩＵ／ｍｌのインターフェロンを含む適宜の培養培地中で、適宜の時間培養した後、ヨウ化プロピジウムなどの色素で染色処理し、分光光度計又はフローサイトメトリーなどの測定装置により、死滅若しくはアポトーシスを起こした細胞の割合を測定する。各細胞におけるインターフェロン感受性は、上記のインターフェロンを含む培地で培養した細胞の死滅若しくはアポトーシスを起こした細胞の割合から、対照として、インターフェロンを含まない培地で培養した細胞の死滅若しくはアポトーシスを起こした細胞の割合を減じて算出することができる。また、ヌードマウスなどの実験動物に癌又はウイルス病患者から採取した癌又はウイルス感染細胞を移植し、当該動物にインターフェロンを適宜の用量で投与し、適宜の期間飼育した後、当該動物体内の腫瘍の大きさを測定して、インターフェロンを投与しなかった動物体内の腫瘍の大きさと比較することによって、移植に供した癌又はウイルス感染細胞のインターフェロンに対する感受性を測定することもできる。
インターフェロン関連遺伝子の発現量を評価する方法として、例えば、細胞、組織間で発現量の差の少ない遺伝子、例えば、グリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素などの解糖系の酵素又はβアクチンなどの細胞骨格系の構成タンパク質などのｍＲＮＡ又はタンパク質レベルでの発現量を内部標準にしてインターフェロン関連遺伝子の相対発現量を算出する方法、癌又はウイルス感染細胞とそれらの由来細胞におけるｍＲＮＡ又はタンパク質レベルでの発現量を比較して、癌又はウイルス感染細胞におけるインターフェロン関連遺伝子の発現量の増減を調べる方法、又は、経時的に患者から癌又はウイルス感染細胞を摘出し、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルでの発現量の推移を調べる方法などが挙げられる。
インターフェロン感受性の程度と、インターフェロン関連遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質レベルでの発現量との相関性は、適宜の統計的手法により、所望の有意差水準において有意差が存在するか否かにより判定される。統計的手法としては、例えば、マン・ホイットニーのＵ検定、スチューデントのｔ検定、クラスター分析などが例示できる。
本発明のインターフェロンの効果を予測する方法の一例を述べる。癌又はウイルス病患者由来の癌又はウイルス感染細胞からｍＲＮＡを調製し、これを鋳型にして逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製する。得られたｃＤＮＡを鋳型にして、インターフェロン関連遺伝子の一種であるＣｏｘ−２遺伝子の任意の一部分を特異的に増幅可能にデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ反応を行い、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量を測定する。このとき、どの細胞においてもほぼ同じ発現量を示すことが知られるβアクチン遺伝子の発現量を同時に測定し、βアクチンに対するＣｏｘ−２遺伝子の相対発現量を算出する。
Ｃｏｘ−２遺伝子の相対発現量が少ない細胞ほどインターフェロンに対する感受性が高いため、このような癌又はウイルス感染細胞を有する患者に対してのインターフェロンによる治療は効果的である。この場合、Ｃｏｘ−２遺伝子の相対発現量は低ければ低いほど好ましく、望ましくは０．１以下である。
上記のＰＣＲ法による定量操作を簡便化するために、鋳型ＤＮＡ以外の成分、例えば、Ｃｏｘ−２遺伝子を複製増幅可能なプライマー、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ、基質のデオキシヌクレオチド三リン酸などを混合したプレミックスは、本発明の実施を容易にするうえで有利である。
また、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量が多い癌又はウイルス感染細胞を有する患者の場合、インターフェロン感受性を高めるためにＣｏｘ−２遺伝子発現を抑制することは、インターフェロンによる癌又はウイルス病の治療をより効果的にすることができる。Ｃｏｘ−２遺伝子発現を抑制する方法としては、例えば、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又は２本鎖ＲＮＡを癌又はウイルス感染細胞に導入する方法、インドメタシンなどのＣｏｘ−２タンパク質の阻害剤を癌又はウイルス感染細胞に導入するか患者に投与する方法が挙げられる。インドメタシンなどのＣｏｘ−２タンパク質阻害剤とインターフェロンとの併用は、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量に関係なくインターフェロンによる治療効果を高めることが可能になるので、Ｃｏｘ−２阻害剤とインターフェロンを含んでなる癌又はウイルス病治療剤は、より多くの癌又はウイルス病患者にとって、有効な治療方法となる。
以下、実験に基づいてより詳細に本発明を説明する。
実験１：各種臓器由来の細胞株のインターフェロン感受性
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシス（ＪＣＲＢ）、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）、ジャーマン・コレクション・オブ・ミクロオルガニズムズ・アンド・セル・カルチャーズ（ＤＳＭＺ）、国立医薬品食品研究所（ＮＩＨＮ）、理研細胞バンク（ＲＣＢ）又は東北大学加齢医学研究所（ＩＤＡＣ）から入手した９３種類の株化細胞又は癌又はウイルス病患者から摘出した２７種類の癌又はウイルス感染細胞を、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に１×１０４乃至３×１０４個／ｍｌの濃度で培養した後、１，０００ＩＵ／ｍｌのインターフェロン−αを添加し、３７℃、５％ＣＯ２中で４８時間培養した。陰性対象としては、インターフェロン−αを含有しない培地で同様に培養した細胞を用いた。培養後、培養液から細胞を採取し、７０％（ｖ／ｖ）冷エタノール水溶液中に２時間放置し固定化した。固定化された細胞を４０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有するリン酸−食塩緩衝液（ｐＨ７．２）中で２０分染色した。染色された細胞は、フローサイトメトリー（ベックマンコールター社販売、商品名『ＥＰＩＣＳ  ＸＬ』）によって、各細胞のＤＮＡ含量を測定し、専用のソフトウエア（ベックマンコールター社販売、商品名『ＷＩＮＣＹＣＬＥ』）によって、アポトーシスの割合を計測した。さらに、陰性対照として、インターフェロン−α非添加で培養した各細胞のアポトーシスの割合を減じた後、インターフェロン−α感受性の評価し、感受性の程度により４グループ（Ａ乃至Ｄ）にランク分けした。すなわち、アポトーシスの割合が、５％未満をＡグループ、５以上１０％未満をＢグループ、１０以上２０％未満をＣグループ、２０％以上をＤグループとした。結果を表１乃至３に示す。
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表１乃至３に示すように、実験に用いた１２０種類の細胞は、インターフェロン−αの感受性のランク分けにより、Ａグループが９５、Ｂグループが１１、Ｃグループが１３、Ｄグループが１に分類された。
実験２：各種細胞による各種因子の発現
表１乃至３に示す１２０種類の細胞から、市販のＲＮＡ調製キット（商品名『ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ』、キアゲン社販売）を使用して、常法にしたがってそれぞれＲＮＡを調製した。１μｇの上記ＲＮＡ、１００ｎｇのランダムヘキサマー及び１００単位のマウス乳癌ウイルス逆転写酵素を含む１００μｌの反応溶液を調製し、２５℃１０分間、４２℃３０分間反応させた後、７０℃で１０分間処理して、反応を停止させ、ｃＤＮＡを得た。
次に、ＤＮＡデータベースのユニジーン（Ｕｎｉｇｅｎｅ）に登録されている５１種類のインターフェロン関連遺伝子と、内部標準遺伝子としてβアクチン遺伝子に対応するＰＣＲ用のプライマー（配列表における配列番号１乃至１０４）を作製した。常法にしたがって、リアルタイムＰＣＲ法を市販の装置（商品名『ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ７７００  シークエンス・ディテクション・システム』、アプライドバイオシステムズ社販売）を用いて行った。すなわち、２０ｎｇのｃＤＮＡ、１００ｎＭのセンスプライマー及び１００ｎＭのアンチセンスプライマーを水に溶解し１２．５μｌの水溶液とし、それに１２．５μｌの『ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス』（アプライドバイオシステムズ社販売）を添加して反応溶液を調製した。これを、９０℃１５秒、６０℃１分で４５サイクルのＰＣＲを行い、各遺伝子の発現量を、内部対照のβアクチン遺伝子の発現量と比較し、相対発現量として数値化した。次に、実験１での感受性のランク分けにしたがい、各遺伝子において、Ａグループに対するＢ、Ｃ又はＤグループについてマン・ホイットニーのＵ検定を行い、有意水準ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５で有意差があるかどうか調べた。結果を表４に示す。
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表４の結果から、インターフェロン関連遺伝子のうちＣｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現量は、インターフェロン−αの感受性の高い癌又はウイルス感染細胞において、統計的に有意に低い発現量を示すことが明らかとなった。図１にｍＲＮＡレベルにおけるＣｏｘ−２遺伝子の発現量を統計処理した結果を示す。また、表５に、ｍＲＮＡレベルにおける各細胞株のＣｏｘ−２遺伝子の相対発現量と感受性のランク分け結果を示す。Ｃｏｘ−２遺伝子の相対発現量と感受性のランク分け結果とを比較すると、肝、腎、肉腫、皮膚、腸、肺、神経、乳及び胃由来の細胞株においても、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量が低い場合に、インターフェロン−αの感受性が高くなり、特に、肝、腸、肉腫由来の癌細胞において顕著に感受性が高くなった。また、インターフェロン−α高感受性とランク分けされた細胞であるグループＣおよびＤの細胞株においては、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡの相対発現量が０．１を越えるものは皆無であった。したがって、この結果は、Ｃｏｘ−２遺伝子発現はインターフェロン−αの抗腫瘍活性の阻害要因となり、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現を測定することにより、インターフェロン−αの治療効果の予測が可能であることを示している。とりわけ、肝臓癌、大腸癌において、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量は、インターフェロン−α感受性と負の相関関係を示した。
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実験３：Ｃｏｘ−２タンパク質阻害剤のインターフェロン感受性への効果
実験２の結果により、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現はインターフェロン−αの感受性に影響を与えることが明らかになった。そこで、Ｃｏｘ−２タンパク質の阻害剤で処理された癌又はウイルス感染細胞において、インターフェロン−αの感受性がどのように変化するかを調べた。癌又はウイルス感染細胞としては、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡの発現量が比較的高く、インターフェロン−αの感受性が低いものを実験１及び２の結果を参照して７種類選抜し、それぞれ、１，０００ＩＵ／ｍｌのインターフェロン−α及び５μＭのインドメタシンを添加して、実験１と同様にして、アポトーシスの割合を計測した。インドメタシンは非ステロイド性の抗炎症薬の一種であり、Ｃｏｘ−２タンパク質の活性を阻害する作用を有する。結果を表６に示す。
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表６の結果から、各細胞におけるアポトーシスの割合、即ちインターフェロン−αの感受性は、インドメタシンを併用することにより高くなることが明らかになった。この結果は、インドメタシンによってＣｏｘ−２タンパク質の作用が阻害されるため、インターフェロン−αの感受性が高まり、アポトーシスの割合が増加したことを示している。
以下、実施例により、本発明を詳細に説明する。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１：インターフェロンの効果予測
肺癌患者５名から摘出した癌細胞から、常法にしたがって、それぞれｍＲＮＡを採取し、得られたｍＲＮＡを鋳型にしてマウス乳癌ウイルス逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製し、２０ｎｇ／１２．５μｌのｃＤＮＡ溶液とした。一方、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡ検出用のプライマー（配列表における配列番号７１及び７２）あるいはβアクチンｍＲＮＡ検出用のプライマー（配列表における配列番号１０３及び１０４）各１００ｎＭを、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼなどを含有する『ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス』（アプライドバイオシステムズ社販売）を混合したプレミックス反応液１２．５μｌを、上記ｃＤＮＡ溶液に添加して合計２５μｌのＰＣＲ反応溶液を調製した。これらを、リアルタイムＰＣＲ装置（商品名『ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ７７００  シークエンス・ディテクション・システム』、アプライドバイオシステムズ社販売）により、９０℃１５秒、６０℃１分で４５サイクルのＰＣＲを行い、βアクチンｍＲＮＡの発現量を基準にしてＣｏｘ−２遺伝子の発現量を算出した。
一方、肺癌患者５名から摘出した上記癌細胞を、それぞれ、１匹当り１×１０４個ずつ１５匹のヌードマウスの腹腔に移植し、その２日後に、５匹に１匹当り１，０００ＩＵのインターフェロン−αを静脈投与した。３週間後に、ケー・ハラナカ等、『インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー』、第３４巻、第２号、２６３乃至２６７頁（１９８４年）に記載の方法にしたがって腫瘍体積を計測し、インターフェロン−αを投与しなかった対照と比較し抗腫瘍効果を評価した。その結果、ｍＲＮＡレベルでのＣｏｘ−２遺伝子の発現量が少ないほどインターフェロン−αによる抗腫瘍効果は高くなっていた。
実施例２：インターフェロン製剤
滅菌処理した生理食塩水に、１０００，０００ＩＵ／ｍｌのヒトインターフェロン−α及び５ｍＭのインドメタシンを溶解し、除菌濾過して、滅菌したガラス製バイアルに１ｍｌずつ充填し、本発明のインターフェロン製剤を製造した。
本品は、Ｃｏｘ−２タンパク質の阻害剤であるインドメタシンを含有しているので、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量が多い癌又はウイルス感染細胞を保有する患者に対しても、インターフェロン−αを効果的に投与することができる。
【産業上の利用可能性】  叙述のとおり、本発明によれば、癌又はウイルス感染細胞におけるインターフェロンの感受性は、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量と負の相関性を有していることから、この遺伝子の発現量を測定することにより、インターフェロンの効果を予測できる。したがって、本発明を癌又はウイルス病の治療に先立って用いれば、インターフェロンによる治療を安全にかつ無駄なく行うことができる。また、インターフェロンとＣｏｘ−２タンパク質の阻害剤を併用すれば、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量が高い癌又はウイルス感染細胞においても、インターフェロンの効果を増強することができる。したがって、Ｃｏｘ−２遺伝子の発現量を測定することは、インターフェロンの適用可能な癌又はウイルス病を調べることを可能とし、さらに、インターフェロンによる癌又はウイルス病治療におけるＣｏｘ−２タンパク質の阻害剤の併用の要否をも判定することも可能とする。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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