(57)【要約】本発明は、血管新生作用を有し、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの塩基性アミノ酸クラスター領域を含むペプチド又はタンパク質、前記ペプチド又はタンパク質を含む血管新生促進剤、前記ペプチド又はタンパク質の阻害物質のスクリーニング方法、及び前記阻害物質を含む血管新生阻害剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生作用を有し、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの塩基性アミノ酸クラスター領域を含むペプチド又はタンパク質。
【請求項２】
β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、下記性質；
（１）作用：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質としてＮ−アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転移させ；
（２）基質特異性：ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性を１００％とした場合、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約７８％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約１２５％、ＧｎＭ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約６６％であり；
（３）至適ｐＨ：６．２−６．３；
（４）活性：活性の発現にＭｎ２＋を必要とせず、また、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されず；
（５）分子量：約７３，０００（還元剤非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）並びに約７３，０００及び約６０，０００（還元剤存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；
（６）Ｋｍ値：受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ及び供与体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々１３３μＭ及び３．５ｍＭであり；
（７）以下のペプチドフラグメントを有する：
（ａ）Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、
（ｂ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ、
（ｃ）Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、
（ｄ）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及び
（ｅ）Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のペプチド又はタンパク質。
【請求項３】
β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、少なくとも配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のペプチド又はタンパク質。
【請求項４】
塩基性アミノ酸クラスター領域において、塩基性アミノ酸の数が前記領域の全アミノ酸数のうちの３０％以上を占めることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のペプチド又はタンパク質。
【請求項５】
塩基性アミノ酸クラスター領域が、少なくとも配列番号：７で示されるアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のペプチド又はタンパク質。
【請求項６】
請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質を含有することを特徴とする血管新生促進剤。
【請求項７】
創傷治癒剤、又は動脈硬化の予防及び／もしくは治療剤である請求の範囲第６項に記載の血管新生促進剤。
【請求項８】
請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質を用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞内で発現した請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質を細胞外に分泌することができる細胞を用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
細胞が、請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質を細胞内で高発現できる細胞であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ゴルジ体膜にアンカーリングされている成熟型β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを切断して分泌型β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに変換するプロテアーゼを用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
プロテアーゼが、β−セクレターゼであることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
プロテアーゼが、γ−セクレターゼであることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求の範囲第８〜１３項に記載のスクリーニング方法において血管新生阻害作用を示す化合物。
【請求項１５】
請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質の発現を抑制することを特徴とする血管新生阻害作用を示す化合物。
【請求項１６】
請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質がヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するのを抑制することを特徴とする血管新生阻害作用を示す化合物。
【請求項１７】
請求の範囲第１４〜１６項に記載の化合物を含有することを特徴とする血管新生阻害剤。
【請求項１８】
γ−セクレターゼ阻害作用を有する化合物を含有することを特徴とする血管新生阻害剤。
【請求項１９】
γ−セクレターゼ阻害作用を有する化合物が、下記式（１）；
2003060131.tif 000012
（式中、ＢｏｃはＢｏｃ基を、ＯＭｅはメトキシ基を、Ｖａｌはバリンを、Ｉｌｅはイソロイシンを表す。）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の血管新生阻害剤。
【請求項２０】
請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質に対する抗体。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項に記載の抗体を用いることを特徴とする請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質のアッセイ方法。
【請求項２２】
請求の範囲第２０項に記載の抗体を含むことを特徴とする請求の範囲第１〜５項に記載のペプチド又はタンパク質の検出キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、分泌型の糖転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ（以下、ＧｎＴ−Ｖと略称する）の血管新生作用、当該血管新生作用に関わるＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスター、ＧｎＴ−Ｖの血管新生促進剤としての利用、ＧｎＴ−Ｖ及びＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスターの阻害剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られた物質、分泌型ＧｎＴ−Ｖの産生を阻害する物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法によって得られた物質、及び該物質の血管新生阻害剤としての利用に関する。
背景技術
癌の増殖には、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＦＧＦ）及びインターロイキン−８（ＩＬ−８）などの因子が関与している。これらの因子及びサイトカインの産生は、遺伝子発現の増大、遺伝子産物の翻訳後の修飾及び細胞外マトリックスとの相互作用などの複雑なメカニズムによって制御されている。
多くの増殖因子とそのレセプターは糖タンパク質であり、そのうちの幾つかは腫瘍組織での血管新生に関与している。糖転移酵素遺伝子を用いた最近の研究において、増殖因子レセプターのオリゴ糖構造の変化が細胞内シグナル伝達の変化をもたらし、このことが細胞の癌化につながることが明らかにされている（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，３９６３−３９６９（１９８５）．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ  ＆  Ａｒａｎｇｏ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１０７７２−１０７７７（１９８６）．Ｚｈｕ，Ｔ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２３，２９６−２９９（１９９７）．Ｐｅｔｒｅｔｔｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ４６，３５９−３６６（２０００））。アスパラギン糖鎖のβ（１，６）分岐の形成を触媒するβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ  Ｖ（ＧｎＴ−Ｖ；β１，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｖ）は、癌の転移に関与する最も重要な糖転移酵素であることが提唱されている（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０，３８３−３９２（１９９５）．Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６，５８２−５８５（１９８７））。
血管新生は、癌の転移や増殖などの癌の進行において必須の段階である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６（１９７１）．Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１７５，４０９−４１６（１９７２））。ＧｎＴ−Ｖが欠損したトランスジェニックマウスを用いた最近の研究によれば、ＧｎＴ−Ｖは癌の増殖と癌の転移に必須であることが直接示された（Ｇｒａｎｏｖｓｋｙ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６，３０６−３１２（２０００））。臨床研究によれば、肺及び肝臓の悪性腫瘍においてＧｎＴ−Ｖ活性の上昇が示されている。ヒト肺癌細胞においては、ＧｎＴ−Ｖ活性と腫瘍のサイズに正の相関関係があることが示され（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｗ．＆  Ｌａｆｅｒｔｅ，Ｓ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，９４５−９５０（１９８９））、ヒト大腸癌組織におけるＧｎＴ−Ｖの発現が、予後の悪化と転移に関係していること（Ｍｕｒａｔａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６，１７７２−１７７７（２０００））が明らかにされている。しかしながら、ＧｎＴ−Ｖを介する癌の増殖・転移の詳細なメカニズムについては、まだ明らかにされていない。
糖タンパク質中に見いだされるアスパラギン型糖鎖（Ａｓｎ型糖鎖）は、その構成糖及び分岐の型から高マンノース型、複合型及び混合型の３タイプに分類される。これらＡｓｎ型糖鎖の生合成は、先ず、粗面小胞体の内腔側で脂質中間体からその糖鎖部分が、翻訳中のポリペプチド鎖のアスパラギンにひとまとめに転移されることから始まる。その後、粗面小胞体でグルコースと一部のマンノースが除去されるが、一部の粗面小胞体局在性のＡｓｎ型糖鎖をもつ糖タンパク質はこのままとどまるため、高マンノース型糖鎖のままとなる。その他のオルガネラ糖タンパク質、細胞表層糖タンパク質あるいは分泌糖タンパク質は、ベシクル輸送によりゴルジ体に移り、さらにマンノースが除去される。このゴルジ体では、ゴルジ体酵素であるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ群の作用によりＮ−アセチルグルコサミンが導入され、分枝構造をとるようになる。この分枝構造の形成により、高マンノース型糖鎖から混成型糖鎖及び複合型糖鎖への変換が始まり、フコースの導入、また、トランスゴルジ領域でのガラクトースの導入を経て、最後に、シアル酸が導入されてＡｓｎ型糖鎖の生合成が完成する。
これら一連のＡｓｎ型糖鎖合成のそれぞれのステップで、種々の酵素が触媒として働いていることがわかっている。そのうち、Ａｓｎ型糖鎖の種々の分枝構造の形成における、Ｎ−アセチルグルコサミンの転移導入反応を触媒している酵素として、６種のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが知られている。Ｓｃｈａｃｈｔｅｒら（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６６，１１３４（１９８８））は、Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃのトリマンノシル構造のコア構造に、Ｎ−アセチルグルコサミンを転移するこの６種の酵素をＧｎＴ−ＩないしＧｎＴ−ＶＩと命名した。このうち、ＧｎＴ−Ｖは、β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造（−［ＧｌｃＮＡｃβ（１，６）Ｍａｎα（１，６）Ｍａｎ］−）の形成に関わる酵素である。β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造は、細胞の形質転換株や腫瘍形成性細胞に、顕著に増加している事が知られている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４６，６７９−６８４（１９８７）及びＡｒａｎｇｏ，Ｊ．，＆  Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ．，Ｊ．，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，１３４２１−１３４２７（１９８２））。また、腫瘍形成性細胞の癌転移能とβ（１，６）ｂｒａｎｃｈの出現との間に関連があることが示されている（Ｈｉｒａｉｚｕｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８０，９−１９（１９９０））。ヒトでも、乳癌の生検例において、５０％の例でβ（１，６）ｂｒａｎｃｈの発現が亢進していると報告されている（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｗ．，＆  Ｌａｆｅｒｔｅ，Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，９４５−９５０（１９８９））。いずれの場合でも、β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造の出現は、ＧｎＴ−Ｖ活性の上昇をともなっていることがわかっている。このように、ＧｎＴ−Ｖは、糖鎖生合成経路においてβ（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造の形成を触媒する点で重要であるばかりでなく、癌細胞の易転移能及び悪性度と関連するという点においても、重要な鍵となる酵素である。
発明の開示
本発明は、上記の実情を鑑みてなされたものであり、その目的は糖転移酵素ＧｎＴ−Ｖの癌転移・増殖において果たす役割を解明することにより、癌治療における最も重要な課題である癌転移・増殖に係る新たな治療ターゲット、治療剤、治療剤を見出すスクリーニング方法、評価方法、診断方法を提供することである。本発明はまた、ＧｎＴ−Ｖが癌転移並びに血管新生を促進するという新たな生化学的概念を提供することにより、ＧｎＴ−Ｖの分泌或いは発現の阻害は、癌転移の抑制だけではなく転移部位の癌増大に係る要因である血管新生を抑制することをも含めた新たな治療概念を提供するものでもある。また更に、血管新生を肯定的因子として捉えれば、血管損傷などに起因する血流障害による各種の虚血性疾患の新たな創薬ターゲットを提供するものである。
発明者らは、糖転移酵素の一つであるＧｎＴ−Ｖが、本来の糖転移酵素としての機能とは全く異なる新たな機能として、癌の転位及びその後の癌の増殖において、最初の規制段階である血管新生を促進する作用を有することを見出した。即ち、分泌型ＧｎＴ−Ｖ並びに精製された組換えＧｎＴ−Ｖは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生理的濃度で血管新生を促進する。さらに、ＧｎＴ−Ｖのアミノ酸配列中に、細胞表面及び細胞外マトリックスにおいてヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）から繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）を遊離する作用を示す、塩基性アミノ酸を高度に含む塩基性アミノ酸クラスター領域が存在することを確認した。本発明の一つは、ＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスター領域のアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質、及び当該ペプチド又はタンパク質を含有する血管新生促進剤である。
本発明は、糖転移酵素ＧｎＴ−Ｖ及び当該糖転移酵素の塩基性アミノ酸クラスター領域のアミノ酸配列を有するペプチド（塩基性ペプチド）が癌細胞表層のＨＳＰＧからＦＧＦ−２を遊離することによって血管新生を促進し、癌転移・増殖を促進することを知見した。本発明は、かかる知見に基づいて想到した、ＧｎＴ−Ｖ及び上記塩基性ペプチドによる血管新生を阻害する化合物のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法で得られた化合物、及び該化合物を含有する血管新生阻害剤である。より具体的には、下記物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られた化合物、及び該化合物を含有する血管新生阻害剤である。
（ａ）ＧｎＴ−Ｖ及び塩基性ペプチドによる血管新生作用を阻害する物質
（ｂ）ゴルジ体にある成熟型ＧｎＴ−Ｖを切断して分泌型ＧｎＴ−Ｖに変換するプロテアーゼを阻害する物質
（ｃ）ＧｎＴ−Ｖの遺伝子発現を阻害する物質
（ｄ）ＧｎＴ−Ｖ及び塩基性ペプチドによるヘパラン硫酸プロテオグリカンからのＦＧＦ−２の遊離を阻害する物質
（ｅ）分泌型ＧｎＴ−Ｖが細胞外に分泌されるのを阻害する物質
すなわち、本発明は、
（１）  血管新生作用を有し、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの塩基性アミノ酸クラスター領域を含むペプチド又はタンパク質、
（２）  β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、下記性質；
（ｉ）作用：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質としてＮ−アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転移させ；
（ｉｉ）基質特異性：ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性を１００％とした場合、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約７８％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約１２５％、ＧｎＭ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約６６％であり；
（ｉｉｉ）至適ｐＨ：６．２−６．３；
（ｉｖ）活性：活性の発現にＭｎ２＋を必要とせず、また、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されず；
（ｖ）分子量：約７３，０００（還元剤非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）並びに約７３，０００及び約６０，０００（還元剤存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；
（ｖｉ）Ｋｍ値：受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ及び供与体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々１３３μＭ及び３．５ｍＭであり；
（ｖｉｉ）以下のペプチドフラグメントを有する：
（ａ）Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、
（ｂ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ、
（ｃ）Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、
（ｄ）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及び
（ｅ）Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
を有することを特徴とする前記（１）に記載のペプチド又はタンパク質、
（３）  β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、少なくとも配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を有することを特徴とする前記（１）に記載のペプチド又はタンパク質、
（４）  塩基性アミノ酸クラスター領域において、塩基性アミノ酸の数が前記領域の全アミノ酸数のうちの３０％以上を占めることを特徴とする前記（１）に記載のペプチド又はタンパク質、
（５）  塩基性アミノ酸クラスター領域が、少なくとも配列番号：７で示されるアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする前記（１）に記載のペプチド又はタンパク質、
（６）  前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質を含有することを特徴とする血管新生促進剤、
（７）  創傷治癒剤、又は動脈硬化の予防及び／もしくは治療剤である前記（６）に記載の血管新生促進剤、
（８）  前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質を用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
（９）  細胞内で発現した前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質を細胞外に分泌することができる細胞を用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
（１０）  細胞が、前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質を細胞内で高発現できる細胞であることを特徴とする前記（９）に記載のスクリーニング方法、
（１１）  ゴルジ体膜にアンカーリングされている成熟型β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを切断して分泌型β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに変換するプロテアーゼを用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
（１２）  プロテアーゼが、β−セクレターゼであることを特徴とする前記（１１）に記載のスクリーニング方法、
（１３）  プロテアーゼが、γ−セクレターゼであることを特徴とする前記（１１）に記載のスクリーニング方法、
（１４）  前記（８）〜（１３）に記載のスクリーニング方法において血管新生阻害作用を示す化合物、
（１５）  前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質の発現を抑制することを特徴とする血管新生阻害作用を示す化合物、
（１６）  前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質がヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するのを抑制することを特徴とする血管新生阻害作用を示す化合物、
（１７）  前記（１４）〜（１６）に記載の化合物を含有することを特徴とする血管新生阻害剤、
（１８）  γ−セクレターゼ阻害作用を有する化合物を含有することを特徴とする血管新生阻害剤、
（１９）  γ−セクレターゼ阻害作用を有する化合物が、下記式（１）；
2003060131.tif 000002
（式中、ＢｏｃはＢｏｃ基を、ＯＭｅはメトキシ基を、Ｖａｌはバリンを、Ｉｌｅはイソロイシンを表す。）
で示される化合物であることを特徴とする前記（１８）に記載の血管新生阻害剤、
（２０）  前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質に対する抗体、
（２１）  前記（２０）に記載の抗体を用いることを特徴とする前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質のアッセイ方法、
（２２）  前記（２０）に記載の抗体を含むことを特徴とする前記（１）〜（５）に記載のペプチド又はタンパク質の検出キット、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの塩基性アミノ酸クラスター領域を含むペプチド又はタンパク質を含有する血管新生促進剤を提供する。
上記β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、公知のものであってよいが、下記の酵素学的性質を有することが好ましい。すなわち、
（ａ）作用：Ｎ−アセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからα−６−Ｄ−マンノシドに転移させ；
（ｂ）基質特異性：ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性を１００％とした場合、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約７８％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約１２５％、ＧｎＭ−ＰＡを受容体とした時の基質特異性が約６６％であり；
（ｃ）至適ｐＨ：６．２−６．３；
（ｄ）活性：活性の発現にＭｎ２＋を必要とせず、また、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されず；
（ｅ）分子量：約７３，０００（還元剤非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）並びに約７３，０００及び約６０，０００（還元剤存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；
（ｆ）Ｋｍ値：受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ及び供与体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々１３３μＭ及び３．５ｍＭであり；
（ｇ）以下のペプチドフラグメントを有する：（ｉ）Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１），（ｉｉ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ（配列番号２），（ｉｉｉ）Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（配列番号３），（ｉｖ）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号４）及び（ｖ）Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号５）という性質である。
本発明において、上記β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴ−Ｖを用いることが好ましい。ＧｎＴ−Ｖは、β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造（−［ＧｌｃＮＡｃ−β（１，６）Ｍａｎ−α（１，６）Ｍａｎ］−）の形成に関わる酵素である。なかでも、上記β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、少なくとも配列番号：６で示されるアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を有することがより好ましい。特に、上記酵素は、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８，３１８−３２７（１９９４）に記載のアミノ酸配列を有することがさらに好ましい。
上記酵素は、公知の方法により容易に入手することができる。例えば、ヒト由来のＧｎＴ−Ｖは、Ｓｈｏｒｅｉｂａｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２９２０−２９２７（１９９２）に記載の方法で、ラット腎よりＧｎＴ−Ｖを単離、精製することにより得ることができる。特開平６−１９７７５６号公報に記載の方法で、ヒト肺癌（小細胞癌）由来ＱＧ細胞の無タンパク質培養上清の濃縮液から単離、精製することができる。なお、当該ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞は、Ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＳＢＭ３３１と命名され、１９９２年８月１８日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号微工研条寄第３９６７号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３９６７）としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
本発明に係る血管新生促進剤に含まれるペプチド又はタンパク質は、上記β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、好ましくはＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスター領域を含む。前記塩基性アミノ酸クラスター領域は、アミノ酸の総数が５〜５０程度、好ましくは８〜４０程度、より好ましくは１０〜３０程度の塩基性アミノ酸を多く含む部分をいう。前記塩基性アミノ酸クラスター領域においては、塩基性アミノ酸の数が前記領域の全アミノ酸数のうちの約３０％以上、好ましくは約３５〜９５％程度、より好ましくは約４０〜９０％程度を占めていることが好ましい。
より好ましくは、前記塩基性アミノ酸クラスター領域は、少なくとも配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含んでなる。また、前記塩基性アミノ酸クラスター領域は、少なくとも配列番号：７で示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を含んでなるものであってよい。具体的には、（ａ）この配列番号：７で示されるアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸が付加されており、なお血管新生作用を維持しているペプチド；（ｂ）前記アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸が除去されており、なお血管新生作用を維持しているペプチド；又は、（ｃ）前記アミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられており、なお血管新生作用を維持しているペプチド；さらには、（ｄ）上記のアミノ酸付加修飾、アミノ酸除去修飾及びアミノ酸置換修飾が組合わされた修飾を有し、なお血管新生作用を維持しているペプチドなど、種々の修飾型塩基性アミノ酸クラスター領域が挙げられる。上記アミノ酸の付加、除去及び置換等の修飾をうけるアミノ酸の数は、特に限定されず、当該修飾の目的に依存して決定されるが、具体的には、塩基性アミノ酸クラスター領域のアミノ酸数の３０％程度以下、好ましくは約２０％程度以下、より好ましくは約１０％程度以下である。また、上記アミノ酸の付加、除去及び置換等の修飾は、塩基性のアミノ酸以外において行われていることが好ましい。
本発明に係る血管新生促進剤においては、活性成分である上記ペプチド又はタンパク質そのものであってもよいが、通常、該活性成分と薬理学的に許容される担体とを自体公知の方法［製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方（例えば第１３改正）に記載の方法等］にしたがって混合することによって製造される。本発明に係る血管新生促進剤の剤形としては、例えば錠剤（糖衣錠もしくは腸溶錠などのコーティング錠および多層錠を含む。）、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤；及び注射剤（例、皮下注射剤，静脈内注射剤，筋肉内注射剤，腹腔内注射剤等）、外用剤（例、経鼻投与製剤，軟膏剤などの経皮製剤等）、坐剤（例、直腸坐剤，膣坐剤等）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例、徐放性マイクロカプセル等）等の非経口剤が挙げられる。本発明に係る血管新生促進剤は、非経口剤とすることが好ましい。
薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
本発明に係る血管新生促進剤は、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対して用いることができる。
本発明に係る血管新生促進剤の用途は特に限定されないが、創傷治癒剤として用いられることが好ましい。この場合の本剤の投与量は、治療すべき病態の種類、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度などにより異なるので一概には言えないが、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ程度である。特に、本発明に係る血管新生促進剤を、創傷部位に、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、パップ剤等の方法により局所適用し、経皮吸収により創傷を治癒させることが好ましい。外用液剤の場合は、例えば、上記ペプチド又はタンパク質を約０．００１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で適用することができる。液剤以外の外用剤の場合は、上記ペプチド又はタンパク質を約０．０１〜１０重量％の濃度で含有していることが好ましい。
また、本発明に係る血管新生促進剤は、動脈瘤；冠動脈硬化症、脳動脈硬化症もしくは末梢動脈硬化症などの動脈硬化症；末梢動脈閉塞、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、深部静脈血栓、肺塞栓、解離性動脈瘤、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、脳卒中及び他の閉塞関連障害；不安定狭心症、汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）、敗血症、外科又は感染性ショック、術後及び分娩後外傷、心肺バイパス外科手術、不適合輸血、胎盤早期剥離、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、蛇毒及び免疫病のごとき過剰凝集による急性又は慢性の腎疾患、炎症、溶血性尿毒症性症候群、対象性末梢性壊死、褥創の治療又は予防に用いることができる。さらに本発明にかかる血管新生促進剤は、血栓溶解剤の作用増強と再閉塞防止、ＰＴＣＡ後の再閉塞防止、透析による血小板減少症の防止、人工血管及び臓器による血栓防止に用いることができる。
本発明に係る血管新生促進剤を上記用途に用いる場合、その投与量は、血管新生促進剤の用途、治療すべき病態の種類、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度などにより異なるので、一概には言えないが、１日約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇである。特に、静脈投与する場合は、その投与量は、１日約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約０．０４〜１．５ｍｇ／ｋｇである。この量を１日１〜３回程度投与するのが望ましい。
本発明の血管新生促進剤において、本発明に係るペプチド及びタンパク質の血管新生作用に悪影響を及ぼさない併用薬剤を用いることができる。併用薬剤としては、特に限定されないが、本発明の血管新生促進剤を動脈硬化などの治療又は／及び予防剤として用いる場合は、例えば、高血圧治療薬、高脂血症治療薬、利尿剤、血栓溶解剤などが挙げられる。
本発明に係る血管新生阻害剤及び併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与対象の年齢及び体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、組み合わせ等により適宜選択することができる。併用薬剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に本発明に係る血管新生促進剤と併用薬剤とが組み合わされていればよい。
本発明は、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの塩基性アミノ酸クラスター領域を含むペプチド又はタンパク質に対する抗体を提供する。前記ペプチド又はタンパク質を抗原とする抗体は、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれでもよい。それらの抗体は、例えば、「タンパク質・酵素の基礎実験法  改訂第２版（堀尾武一編集  南江堂発行  １９９４年）」又は「Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８２  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．１９９０」などに記載の公知方法に従って作製することができる。
また、本発明は、これらの抗体を用いた前記血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質のアッセイ方法及び当該アッセイ方法を利用する前記血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の検出キットを提供する。かかるアッセイ方法及び検出キットは、種々の用途に利用可能である。例えば、癌の転移において血管新生は必須工程であることから、本発明に係るアッセイ方法及び検出キットを用いて、癌患者の血中又は癌組織における上記血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の有無又は量を測定することにより、癌転移の可能性を知ることができる。
本発明に係るアッセイ方法及び検出キットにおいては、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明に係るアッセイ方法及び検出キットにおいては、ＧｎＴ−Ｖの抗体またはその画分を用いることが好ましい。
前記アッセイ方法又は検査キットの作製は、公知の方法が利用できる。例えば、上記抗体を用いる上記血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の定量法としては、被検液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定方法などが挙げられる。より具体的には、例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法またはサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度及び特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
本発明に係るアッセイ方法の具体的態様を以下に述べるが、本発明は以下の態様に限られない。すなわち、前記アッセイ方法としては、例えば（ｉ）上述した血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質に対する抗体と、被検液と、標識化されている上記血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質（以下、この欄において単に「標識ペプチド」という）とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識ペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の上記血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の定量法が挙げられる。また、（ｉｉ）上述した血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質に対する抗体を担体に保持させ不溶化する。また、前記不溶化した抗体とは異なる部位を認識する血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質に対する抗体を標識する。ついで、被検液と、担体上に不溶化した抗体と、標識した抗体とを同時あるいは連続的に反応させる。次いで、担体上に抗原（血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質）を介して捕捉されている標識剤の活性又は／及び担体上に捕捉されなかった標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の定量法も挙げられる。また、本発明の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質のアッセイ方法として、かかるペプチド又はタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の定量を行えるほか、組織染色等による検出を行うこともできる。
本発明にかかるアッセイ方法において用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。前記放射性同位元素としては、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ又は１４Ｃなどが用いられる。前記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。前記発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
本発明は、血管新生阻害剤を提供する。本発明にかかる血管新生阻害剤は（ａ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質を用いるスクリーニング方法において血管新生阻害作用を示す化合物、（ｂ）ゴルジ体膜にアンカーリングされている成熟型β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを切断して分泌型β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに変換するプロテアーゼの活性を阻害する化合物、（ｃ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現を抑制する化合物、及び（ｄ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質がヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するのを抑制する化合物からなる群から選ばれる１以上の化合物を含むことを特徴とする。本発明にかかる血管新生阻害剤は、（ｅ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質が細胞外に分泌されるのを阻害する化合物を含んでいてもよい。前記（ｅ）の化合物は、上記（ａ）〜（ｄ）の化合物のうち１種以上と組み合わせて用いることもできる。以下に、上記（ａ）〜（ｅ）の化合物について詳述する。
上記（ａ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質を用いるスクリーニング方法において血管新生阻害作用を示す化合物は、下記のようなスクリーニング方法により得ることができる。すなわち、該スクリーニング方法としては、実施例に詳細に記載した血管新生を観察する系において、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質と被検物質とを存在させた場合の血管新生を観察し、被検物質が存在しない場合の血管新生と比較するという方法が挙げられる。かかるスクリーニング方法において、被検物質を存在させた場合の血管新生が、被検物質が存在しない場合の血管新生に比して少ない場合は、かかる被検物質は血管新生阻害作用を示す物質であるといえる。本スクリーニング方法においては、血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質としてＧｎＴ−Ｖを用いることが好ましい。より具体的には、被検物質を存在させた場合の顕微鏡写真から測定できる新生された血管の長さの合計が、被検物質が存在しない場合のそれに対して、約９０％以下、好ましくは約８０％以下、より好ましくは約７０％以下となっていれば良い。また、実施例に詳細に記載した血管新生の評価方法において、被検物質を存在させた場合の値が、被検物質が存在しない場合の値に対して、約９０％以下、好ましくは約８０％以下、より好ましくは約７０％以下となっていれば良い。
ここで、上記スクリーニング方法に用いる被検物質としては特に限定されず、タンパク質であってもよいし、低分子化合物であってもよいし、高分子化合物でもよい。また、精製された物質であってもよいし、複数の物質が共存している混合物であってもよい。さらに、微生物の培養液などの自然界由来のものであってもよいし、化学合成によって合成されたものでもよい。また、被検物質は、新規化合物であっても、公知化合物であってもよい。以下のスクリーニング方法においても同様である。
（ｂ）ゴルジ体膜にアンカーリングされている成熟型ＧｎＴ−Ｖを切断して、ゴルジ体膜から遊離させ、分泌型ＧｎＴ−Ｖに変換するプロテアーゼの活性を阻害する化合物は、前記プロテアーゼを用いるスクリーニング方法により容易に得ることができる。前記プロテアーゼを用いるスクリーニング方法としては、特に限定されず、被検物質の存在下に、前記プロテアーゼをゴルジ体膜にアンカーリングされている成熟型ＧｎＴ−Ｖに作用させることにより生じる分泌型ＧｎＴ−Ｖが、被検物質の非存在下におけるそれと比べて少ない場合は、かかる被検物質は、プロテアーゼの活性を阻害する化合物であるといえる。また、試験管内で前記プロテアーゼの活性を阻害する被検物質をスクリーニングしてもよい。
前記プロテアーゼとしては、例えばβ−セクレターゼ（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）などが挙げられる。該β−セクレターゼは、そのアミノ酸配列がＶａｓｓａｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，７３５−７４１（１９９９）などに記載されており、またＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ１９０７２５などの情報から、容易に入手することができる。前記プロテアーゼとしては、γ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）も挙げられる。γ−セクレターゼは、アミロイド−β−前駆体のアミノ末端がβ−セクレターゼによって切断されて生成する１２ＫＤのアミロイドタンパク質のゴルジ体膜に結合したカルボキシル末端側ペプチド断片を、膜貫通部位で切断する（Ｔｓａｉ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，１０８７−１１０６（２００２））。γ−セクレターゼの実体はまだ明らかにされていないが、ゴルジ体膜に結合したプレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）と複合体を形成して、アミロイドタンパク質の切断を行うと考えられている（Ｗｏｌｆｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２，３７１−３８３（２００２））。該γ−セクレターゼを発現している細胞は前記文献に記載されている公知の方法により得ることができる。例えばプレセニリンを高発現させてγ−セクレターゼ活性を高めた細胞（例、ＰＳ−１ΔＥ９）などを用いることができる。
化合物（ｂ）としては、例えばγ−セクレターゼ阻害作用を有する化合物が挙げられ、かかる化合物はγ−セクレターゼ活性を抑制または阻害する作用を有すれば、いかなる構造をとっていてもよい。γ−セクレターゼ阻害作用を有する化合物としては、下記式（１）；
2003060131.tif 000003
（式中、ＢｏｃはＢｏｃ基を、ＯＭｅはメトキシ基を、Ｖａｌはバリンを、Ｉｌｅはイソロイシンを表す。）
で示される化合物が挙げられる。また、かかる化合物の誘導体であっても、γ−セクレターゼ阻害作用を有していれば、本発明の血管新生阻害剤として用いることができる。前記式（１）で示される化合物の誘導体としては、例えば、（ａ）メチル基をＣ２−６の低級アルキル基に変換した化合物、（ｂ）バリンのアミノ末端の保護基であるＢｏｃ基を他のアミノ基の保護基に変換した化合物、（ｃ）イソロイシンのカルボキシル末端の保護基であるメトキシ基を他のカルボキシル基の保護基に変換した化合物、（ｄ）前記式（１）で示される化合物を還元し、一または二のカルボニル基を−ＣＨＯＨ−基に変換した化合物、（ｅ）一または二のバリンを他のアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンなどの脂肪族アミノ酸に変換した化合物、（ｆ）一または二のイソロイシンを他のアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、ロイシンまたはバリンなどの脂肪族アミノ酸に変換した化合物、（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の変換を２つ以上組み合わせた化合物などが挙げられる。
（ｃ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現を抑制する化合物は、公知の方法により得ることができる。例えば、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現のためのプロモーターと、レポーター遺伝子を用いる方法（横田崇、新井賢一著、バイオマニュアルシリーズ４、羊土社（１９９３））が挙げられる。すなわち、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現のためのプロモーター、好ましくはＧｎＴ−Ｖ遺伝子のプロモーターと、レポーター遺伝子とが導入されている形質転換細胞を用いるスクリーニング方法により化合物（ｃ）を得ることができる。より具体的には、上記プロモーターをレポーター遺伝子の翻訳領域に連結して発現ベクターを作製し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を作製し、該形質転換細胞を一定時間培養し、その後、被験物質の任意の量を添加し、一定時間後の該細胞が発現するレポーターの量を酵素活性として、又は発現タンパク質の量として測定することによって行うことができる。より具体的には、被検物質の存在下でのレポーター遺伝子の発現量が、被検物質の非存在下でのレポーター遺伝子の発現量に比して少ない場合、かかる被検物質は、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現を抑制する物質であるといえる。
上記方法において、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現のためのプロモーターとしては、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の上流のプロモーター領域を用いることが好ましい。かかるプロモーターは、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の５’−上流領域をＨｕＣＣ−Ｔ１細胞のゲノムからクローニングする（Ｓａｉｔｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３，１８−２６（１９９５））ことにより得ることができる。ＨｕＣＣ−Ｔ１細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋから得ることができる。
また、上記方法において、レポーター遺伝子としては、その発現産物の活性又は生産量（ｍＲＮＡの生産量も含まれる）を当業者が測定可能なものであれば、いかなるペプチド、タンパク質をコードする遺伝子を用いてもよい。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ルシフェラーゼ等を酵素活性を測定することで利用できる。また、分泌型成長ホルモンなどは、免疫抗体反応法などでその生産量を測定することで利用することができる。
上記発現ベクターは、上記プロモーター及びレポーター遺伝子の翻訳領域を、複製可能なベクター中に挿入することによって得ることができる。該複製可能なベクターとしては特に限定されないが、例えば大腸菌内で複製可能なものとして、ｐＵＣ１８又はｐＧＥＭ−３Ｚなどが挙げられる。前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を作製する。宿主細胞は、特に限定されず、発現ベクターの種類により適宜選択することができる。また、かかる形質転換は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明に用いられる形質転換細胞としては、発現ベクターが安定的（ｓｔａｂｌｅ）に宿主染色体に組み込まれるものの他、発現ベクターが一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）に宿主に導入されるものも用いられる。発現ベクターが安定的に宿主染色体に組み込まれた形質転換細胞の選択は、導入したいベクター内に選択マーカー遺伝子を組み込んだベクター、又は、導入したいベクターと同時に選択マーカーを含むベクターで宿主細胞を形質転換し、該選択マーカーを有しているものだけが生存できる培地で該形質転換された細胞を培養することによって行うことができる。
より好ましくは、下記方法により上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現を抑制する化合物を得ることができる。すなわち、（ａ）下記の塩基配列：５’−ＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号：８）および５’−ＡＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＡＣＧＴＴＡＴ−３’（配列番号：９）の少なくとも一方を含有するＤＮＡと；（ｂ）Ｅｔｓ−１タンパク質又はその断片と；（ｃ）被検物質とを一緒にインキュベートし、そして前記ＤＮＡ（ａ）とＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との結合を測定するという方法である。
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の転写は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の上流のプロモーター領域のうち上記配列で示した特定の部位にＥｔｓ−１タンパク質が結合することにより促進する。ペプチド又はタンパク質は、少なくともＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスター領域を含む。したがって、前記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との結合を阻害する被検物質は、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の発現を抑制することができる。
上記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との結合を測定する方法としては、公知の方法を用いてよい。かかる測定方法の好ましい態様としては、ゲルシフトアッセイ及びスーパーシフトアッセイが挙げられ、これらの方法について下記に詳述する。
ゲルシフトアッセイは、例えば、下記のように行う。〔γ−３２Ｐ〕ｄＡＴＰ（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ社より入手可能）を用いて、上記配列のＤＮＡの５’−延長端をラベルする。得られた３２ＰラベルされたＤＮＡ（１０，０００ｃｐｍ）と、ＭＯＬＴ４細胞のインビトロで転写され／翻訳された切断Ｅｔｓ−１タンパク質又は核抽出物を、６５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０％グリセロールを含む緩衝液と共に２０ｍｌの合計体積となるように混合する。ついで、２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）（例えばＳｉｇｍａ社より入手可能）を反応混合物に添加する。ついで、反応混合物を室温で１時間培養する。得られた培養液を、６％の非変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２９：１）、０．５×ＴＢＥ（１×ＴＢＥ＝８９ｍＭ  トリス、８９ｍＭ  ホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）上に付加し、そして次に電気泳動を４℃、１５０Ｖで１時間行う。電気泳動の後、ゲルをゲルドライヤーにより乾燥せしめ、そして次にＸ線フィルム（例えばコダック社より入手可能）に暴露する。
ゲルシフトアッセイにおいては、上記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との複合体が示す非変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動における移動度が、Ｅｔｓ−１タンパク質又はその断片と結合していない上記配列のＤＮＡが示すそれに比して小さくなる。そこで、上記反応混合物に被検物質を所望量添加したときに、上記のような操作によって得られる電気泳動の結果において、上記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との複合体が示すバンドが観察されないか、そのバンドの量が少なくなっていれば、被検化合物は、上記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との結合を阻害する物質であると判断できる。
スーパーシフトアッセイは、反応混合物に、さらに他のＥｔｓファミリーのタンパク質と交差反応しない抗−Ｅｔｓ−１  ＩｇＧ（例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手可能）を添加する以外は、ゲルシフトアッセイと全く同様に行う。スーパーシフトアッセイにおいては、上記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との複合体が示す非変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動における移動度が、Ｅｔｓ−１タンパク質又はその断片と結合していない上記配列のＤＮＡが示すそれに比して、ゲルシフトアッセイのときよりもさらに小さくなる。そこで、上記反応混合物に被検物質を所望量添加したときに、上記のような操作によって得られる電気泳動の結果において、上記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との複合体が示すバンドが観察されないか、そのバンドの量が少なくなっていれば、被検化合物は、上記配列のＤＮＡとＥｔｓ−１タンパク質又はその断片との結合を阻害する物質であると判断できる。
（ｄ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質がヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）に結合するのを抑制する化合物は、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質がヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合しないようにする化合物はもちろん、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質と、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの親和性を小さくする化合物であってもよい。上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質は、ＦＧＦ−２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２）と競合して、細胞表面又は及び細胞外マトリクス上のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する。さらに、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質のほうが、ＦＧＦ−２よりもヘパラン硫酸プロテオグリカンとの親和性が高いため、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合しているＦＧＦ−２をヘパラン硫酸プロテオグリカンから解離させる。そのようにして生じた遊離ＦＧＦ−２が内皮細胞などを刺激して血管新生が起こる。そのため、上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質がヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合しないようにするか、又はヘパラン硫酸プロテオグリカンとの親和性を小さくする化合物が存在すれば、ＦＧＦ−２は優位にヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合することができ、上述のような血管新生の過程が進行しない。
上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質がヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するのを抑制する化合物としては、例えば、かかるペプチド又はタンパク質が有する塩基性アミノ酸クラスター領域をブロックする化合物などが挙げられる。かかる化合物としては、具体的には、例えば、酸性アミノ酸を多く含む酸性アミノ酸クラスター領域を含むペプチド又はタンパク質が挙げられる。前記酸性アミノ酸クラスター領域としては、アミノ酸の総数が５〜５０程度、好ましくは８〜４０程度、より好ましくは１０〜３０程度の酸性アミノ酸を多く含む部分が好ましい。前記酸性クラスター領域においては、酸性アミノ酸の数が前記領域の全アミノ酸数のうちの約３０％以上、好ましくは約３５〜９５％程度、より好ましくは約４０〜９０％程度を占めていることが好ましい。化合物（ｄ）としては、ＧｎＴ−Ｖがヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するのを抑制する化合物が好ましい。
（ｅ）上述の血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質が細胞外に分泌されるのを阻害する化合物は、細胞内で発現した血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質を細胞外に分泌することができる細胞を用いたスクリーニング方法により容易に得ることができる。具体的には、前記細胞を被検物質の存在下に培養し、培養液中に分泌された血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の量を測定するというスクリーニング方法が挙げられる。かかるスクリーニング法で、血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の量が減少していれば、被検物質は血管新生阻害剤となり得る。
「細胞内で発現した血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質を細胞外に分泌することができる細胞」としては、例えばヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒなどの血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質、好ましくは分泌型ＧｎＴ−Ｖを分泌する細胞であればよい。特に、血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質、好ましくはＧｎＴ−Ｖの一部又は全部をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞であって、野生型細胞に比べて血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質、好ましくは分泌型ＧｎＴ−Ｖを高発現することができる細胞が好ましい。かかる細胞として、例えば、膵癌細胞ＭＩＡ  ＰａＣａ−２にＧｎＴ−Ｖ遺伝子を導入してＧｎＴ−Ｖを高発現された細胞（ＰａＣａ−２／ＧｎＴ−Ｖ細胞）または口腔癌細胞ＫＢにＧｎＴ−Ｖ遺伝子を導入してＧｎＴ−Ｖを高発現させた細胞（ＫＢ／ＧｎＴ−Ｖ細胞）などが挙げられる。
培養液中に分泌された血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質は、例えばゲル電気泳動などを用いて直接その量を測定することができる。また、培養液中の当該ペプチド又はタンパク質の活性、例えばβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を測定することによっても、間接的に培養液中に分泌された血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質の量を測定することができる。
本発明に係る血管新生阻害剤は、活性成分である上記（ａ）〜（ｅ）の化合物のうちの少なくとも１種類の化合物そのものであってもよいが、通常、該活性成分と薬理学的に許容される担体を自体公知の方法［製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方（例えば第１３改正）に記載の方法等］にしたがって混合することによって製造される。ここで、薬学的に許容される担体としては、上述の血管新生促進剤と同一のものが挙げられる。本発明に係る血管新生阻害剤の剤形としては、上述の血管新生促進剤の剤形と同一の剤形を例示でき、なかでも、本発明に係る血管新生阻害剤は、非経口剤とするのが好ましい。
本発明に係る血管新生阻害剤は、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対して用いることができ、その投与量は、血管新生阻害剤の有効成分の種類、治療すべき病態の種類、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度などにより異なるので、一概には言えない。
本発明に係る血管新生阻害剤の用途は特に限定されないが、血管新生を伴う種々の疾患、例えば腫瘍（例、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器（例、胃、腸など）癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、骨肉腫、筋肉腫、血管線維腫など）、炎症性疾患（例、関節リウマチ、乾癬など）、糖尿病網膜症、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網形成における異常な脈管形成を含む）などの予防・治療剤として用いられる。また、本発明の血管新生阻害剤は、目の充血の治療剤としても用いることができる。
本発明の血管新生阻害剤において、上記（ａ）〜（ｅ）の化合物の血管新生阻害作用に悪影響を及ぼさない併用薬剤を用いることができる。このような併用薬剤としては、例えば抗腫瘍薬、悪液質改善薬、インスリン抵抗性改善薬以外の糖尿病治療薬、糖尿病合併症治療薬、抗肥満薬、高血圧治療薬、高脂血症治療薬、利尿剤などが挙げられ、２種類以上を組み合わせてもよい。また、本発明の血管新生阻害剤を用いる際に、外科療法（手術）あるいは放射線療法を行ってもよい。
本発明に係る血管新生阻害剤及び併用薬剤の投与時期、併用薬剤の投与量および併用薬剤の投与形態などについては、上述した血管新生促進剤の場合と同一である。
実施例
以下に、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１  ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞の転移によるヌードマウスの血管新生の促進〕
ＧｎＴ−Ｖの発現が大腸癌の転移と予後の悪化に高い相関性を示すことから、ヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを用いて、ＧｎＴ−Ｖの安定な形質転換細胞とともに、コントロールとしてβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ；β１，４−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ＩＩＩ）及びα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ；α１，６−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の形質転換細胞を作成し、ヌードマウスの皮下に注射して癌転移に及ぼす影響を調べた。ヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒを１０％の子ウシ血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ．社製）で培養した。形質転換は、ＣＥＬＬ  ＦＥＣＴＩＮ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ．社製）を用いて行い、形質転換の方法はＣＥＬＬ  ＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の説明書に従って行った。上記形質転換された癌細胞のヌードマウスへの移植は、上記それぞれの糖転移酵素で形質転換した５ｘ１０５の細胞をヌードマウスの背中に注射し、１ヶ月後に癌の形成と血管新生を肉眼的に観察した。ＷｉＤｒ細胞はもともと上記の糖転移酵素をわずかしか発現していないが、ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞を移植したヌードマウスには、他の糖転移酵素遺伝子で形質転換したＷｉＤｒ細胞を移植したヌードマウスに比較して、癌転移の促進が認められ、腫瘍組織において著しい血管新生が認められた。この結果は、ＧｎＴ−Ｖを過剰発現している癌細胞では、血管新生を促進する何らかの因子を分泌していることを示唆している。
〔実施例２  ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞による血管新生の誘導〕
ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞による血管新生促進を、ニワトリ受精卵の胚を用いたＣＡＭ（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）アッセイによって確認した。ＣＡＭアッセイは、Ｙｅｎらの方法（Ｙｅｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，３４６０−３４６９（２０００））及びＢｅｒｎａｒｄｉｎｉの方法（Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９６，４０３９−４０４５（２０００））を若干改良して行った。白色レグホンの受精後８日のＣＡＭを用い、１ｘ１０５の細胞をコラーゲンスポンジの上に植え、４時間保持した。コラーゲンスポンジ上のＣＡＭの上に５ｍｍのシリコンリングを置き、４８時間保持した。実施例１に記載の糖転移酵素遺伝子で形質転換したＷｉＤｒ細胞の中で、ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞にだけコラーゲンスポンジ中への血管の侵入が増加していることが認められた。また、ＷｉＤｒ細胞及びＣＯＳ−１細胞やＣＨＯ細胞のような非癌性細胞にＧｎＴ−Ｖ遺伝子を一過性に形質転換した細胞においても、上記ＧｎＴ−Ｖの安定な形質転換細胞と同様にＣＡＭアッセイによって血管新生の促進が認められた。これらの結果は、ＧｎＴ−Ｖの発現によって血管新生が促進されるのに共通の機構が存在することを強く示唆している。
〔実施例３  ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞の培養液による血管新生の誘導〕
ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞による血管新生の誘導を試験管内で評価するために、Ｓｏｋｅｒらの方法（Ｓｏｋｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３１５８２−３１５８８（１９９７））によってＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞の培養液で刺激した後のヒト臍帯静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ；ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）のＤＮＡ合成量を測定した。タイプＩコラーゲンでコーティングした９６穴プレートに、ＨＵＶＥＣをウェルあたり２ｘ１０３細胞になるように植え、２４時間後に、培地を０．１％子ウシ血清アルブミンを含むＭＣＤＢ１３１培地（ＦＢＳとＦＧＦ−２を含まない）に交換し、２４時間飢餓状態にした。培地を、実施例１に記載の糖転移酵素遺伝子で形質転換したＷｉＤｒ細胞の培養液と交換し、２４時間ＨＵＶＥＣを刺激した。ＨＵＶＥＣを［３Ｈ］−チミジン（［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（１μＣｉ／ｍｌ）とともに８時間保持し、［３Ｈ］−チミジンのＨＵＶＥＣへの取り込みを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ−Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ社製）で分析して、ＤＮＡ合成量を測定した。結果は６ウェルのアッセイの結果の平均値で示し、標準偏差を測定した。全ての実験は少なくとも３回繰り返し、同じ結果が得られた。第１図から明らかなように、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子で形質転換したＷｉＤｒ細胞の培養液で刺激されたＨＵＶＥＣのＤＮＡ合成は増加したが、他の糖転移酵素遺伝子で形質転換したＷｉＤｒ細胞の培養液では同様の効果は認められなかった。これらの結果は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子で形質転換したＷｉＤｒ細胞がＧｎＴ−Ｖの過剰発現に由来する血管新生因子を培養液中に分泌していることを示している。
〔実施例４  組換えＧｎＴ−ＶのＨＵＶＥＣの分化・増殖に及ぼす影響〕
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子で形質転換したＷｉＤｒ細胞の培養液中に存在する血管新生因子の精製を、各種カラムクロマトグラフィーを用いて行った。各画分の血管新生活性は、実施例３に記載したＨＵＶＥＣの分化・増殖で評価した。ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーにおいて、ＨＵＶＥＣの増殖活性が高い画分が０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。この性質は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、胎盤由来増殖因子（ＰｌＧＦ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの公知の増殖因子が０．８−１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出されるので（Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．＆  Ｗｅｉｃｈ  Ｈ．Ａ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ９，２５９−２６８（１９９３）．Ｇｏｈｄａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１，４１４−４１９（１９９８）．Ｍａｒｅｚ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６９，１２５−１２９（１９８７）．Ｒｉｓａｕ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．７，９５９−９６２（１９８８）．Ｒｏｔｈｅｎｔｈａｌ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ４，５３−５９（１９９０））、これら公知の増殖因子の性質と全く異なる。ＷｉＤｒ細胞自身はこのような血管新生因子を産生しない。ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーにおいて０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出される画分を、抗ＧｎＴ−Ｖ抗体用いたウェスターンブロット分析を行ったところ、抗ＧｎＴ−Ｖ抗体の反応とＨＵＶＥＣの分化・増殖活性が一致し、当該画分に存在するＨＵＶＥＣの分化・増殖活性を有する主要なタンパク質がＧｎＴ−Ｖそのものであることを確認した。
ＧｎＴ−Ｖは、他の糖転移酵素（Ｇｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｍ．１１３，６１４−６１９（１９９３）．ＭａＣａｆｆｅｒｙ，Ｇ．＆  Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ．１０４，９１−９４（１９９３）．Ｕｇａｒｔｅ，Ｍ．Ａ．＆  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３，７１９−７２６（１９９１））と同様、ＧｎＴ−Ｖは癌細胞から分泌されること（Ｃｈｅｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１２，８１３−８２３（１９９５））が知られているが、それらの糖転移酵素の分泌の生理学的意義については知られていない。分泌型ＧｎＴ−Ｖ自身がＨＵＶＥＣの分化・増殖を誘導するという仮説を実証するために、膜貫通部分を欠くが糖転移酵素活性は保持されているＧｎＴ−ＶΔ７３という組換えＧｎＴ−Ｖを作成した。組換えＧｎＴ−Ｖで可溶性のＧｎＴ−ＶΔ７３は、Ｓａｓａｉらの文献（ＳａＳａｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ））に開示された方法に従い、バキュロウィルスのシステムで調製した。第２図に示すように、ＧｎＴ−ＶΔ７３の組換えＧｎＴ−Ｖを添加することにより、ＨＵＶＥＣの分化・増殖が添加量依存的に増加した。用いたＧｎＴ−ＶΔ７３の濃度は生理的範囲にあり、ＧｎＴ−Ｖ形質転換細胞の培養液中に存在するＧｎＴ−Ｖは、ＧｎＴ−ＶΔ７３の比活性を基準にすると、１４０ｎｇ／ｍｌになった。さらに、Ｂ１６−Ｆ１０のマウスメラノーマ細胞は高い内在性のＧｎＴ−Ｖ活性があり、Ｂ１６−Ｆ１０細胞の培養液は７０ｎｇ／ｍｌのＧｎＴ−Ｖを含有しており、Ｂ１６−Ｆ１０細胞もＣＡＭアッセイで同様の血管新生活性を示した。また、組換えＦｕｃ−Ｔの添加は、いかなるＨＵＶＥＣ増殖促進活性も示さなかった。これらの結果は、生理的濃度範囲内の分泌型ＧｎＴ−ＶがＨＵＶＥＣの増殖促進活性を有していることを示している。
〔実施例５  ＨＵＶＥＣの分化・増殖に関与するＧｎＴ−Ｖのドメイン解析〕
ＧｎＴ−ＶのどのドメインがＨＵＶＥＣの増殖促進活性に関与するかを明らかにするために、第３図Ａに示したＧｎＴ−Ｖの欠失変異体を作成した。ＧｎＴ−ＶΔ１８８プラスミドの作成法はＳａｓａｉらの文献（Ｓａｓａｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ））に開示されている。ＧｎＴ−ＶΔ２３３遺伝子をもつトランスファープラスミドは、ＧｎＴ−ＶΔ１８８プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＥａｇＩで切断して得られる、ヒトＧｎＴ−ＶのＧｌｕ２３４からＬｅｕ７４１及びＣ末端のポリヒスチジンタグをコードする１５２１塩基対のＤＮＡ断片を、トランスファーベクターｐＡｃＧＰ６７−Ａ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）のＥｃｏＲＩ−ＥａｇＩサイトに結合して作成した。ＧｎＴ−ＶΔ４３６遺伝子をもつトランスファープラスミドは、ＧｎＴ−ＶΔ１８８プラスミドをＥｃｏＲＶ及びＥａｇＩで切断して得られる、ヒトＧｎＴ−ＶのＩｌｅ４３７からＬｅｕ７４１及びＣ末端のポリヒスチジンタグをコードする９１２塩基対のＤＮＡ断片を、トランスファーベクターｐＡｃＧＰ６７−ＡのＥｃｏＲＶ−ＥａｇＩサイトに結合して作成した。組換えバキュロウィルスを作成するために、文献公知の方法（Ｉｋｅｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２８，６０９−６１９（２０００））に従って、上記で得られたトランスファープラスミドで昆虫細胞Ｓｆ２１を形質転換した。形質転換したＳｆ２１細胞に由来する組換え糖転移酵素は、Ｓａｓａｉらの文献（Ｓａｓａｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ））に開示された方法に従い、Ｎｉ２＋−キレーティングアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
第３図Ｂに示すように、ＧｎＴ−ＶΔ７３、ＧｎＴ−ＶΔ１８８及びＧｎＴ−ＶΔ２３３の変異体はＨＵＶＥＣの増殖・分化亢進作用を有していたが、ＧｎＴ−ＶΔ４３６はＨＵＶＥＣの増殖・分化亢進作用がなかった。ＧｎＴ−ＶΔ７３及びＧｎＴ−ＶΔ１８８は糖転移酵素活性があるが、ＧｎＴ−ＶΔ２３３及びＧｎＴ−ＶΔ４３６には糖転移酵素活性はなかった。これらの結果は、ＨＵＶＥＣの増殖促進活性がＧｎＴ−Ｖの２３４番目から４３６番目までのアミノ酸配列に対応する領域に存在し、この領域は糖転移酵素活性に関わる領域を含まないことを示唆している。
〔実施例６  血管新生を誘導するＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスター領域の同定〕
ヒトＧｎＴ−Ｖの２５４番目から２６９番目までのアミノ酸配列は、塩基性アミノ酸がクラスターになった、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓの配列（配列番号７）であり、この配列に非常に似た配列がＶＥＧＦ１８９（Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．＆  Ｗｅｉｃｈ  Ｈ．Ａ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ９，２５９−２６８（１９９３））の１４２から１５７番目のアミノ酸配列に認められる（第４図参照）。このアミノ酸クラスター領域は、ＰＩＧＦ−２及びヘパリン結合型表皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＦＧＦ）にも保存されており（第４図参照）、ヘパリン結合モチーフとして働いている（Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．＆  Ｗｅｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ９，２５９−２６８（１９９３））。Ｂａｒｉｌｌａｒｉらは、ＰＩＧＦ−２由来のＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１０）の配列を持つ塩基性ペプチドが、細胞表層及び／又は細胞外マトリックス上のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）からＦＧＦ−２を遊離することにより、表皮細胞の増殖を誘導することを報告している（Ｂａｒｉｌｌａｒｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｐａｔｈｏ．１５２，１１６１−１１６６（１９９８））。
ＧｎＴ−Ｖの、２６４番目から２６９番目のアミノ酸配列であるＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１１）からなる塩基性ペプチド（ＫＲＫＲＫＫペプチド）、及び２９１番目から２９６番目のアミノ酸配列であるＰｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１２）からなる非塩基性のコントロールペプチド（ＦＳＧＧＰＬペプチド）を合成し、これらのペプチドのＨＵＶＥＣの増殖に及ぼす影響を調べた。ペプチドの合成はペプチド合成機Ａ４３２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で合成し、逆相ＨＰＬＣで精製した後、分子量と精製度をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（登録商標）ＲＰ；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で確認した。ＦＧＦ−２の濃度は公知の方法（Ｂａｒｉｌｌａｒｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｐａｔｈｏ．１５２，１１６１−１１６６（１９９８））で測定した。すなわち、ウェルあたり５ｘ１０４細胞のＨＵＶＥＣをコラーゲンでコートした１２穴プレートに植え、ＰＢＳで２回洗浄後、培地をＭＣＤＢ１３１／０．１％  ＢＳＡ（０．５ｍｌ／ｗｅｌｌ）に交換し、ヘパリンと共に、ＧｎＴ−ＶΔ７３、ＧｎＴ−ＶΔ４３６、ＫＲＫＲＫＫペプチドもしくはＦＳＧＧＰＬペプチドの存在又は非存在下、４℃で２時間プレート回転台で保持した。４℃、３０００ｒｐｍ、５分の遠心後、上清を回収し、上清中のＦＧＦ−２濃度をＦＧＦ−２ＥＬＩＳＡシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、当該システムの説明書に従って測定した。
上述のように、ＨＵＶＥＣの培養液にＧｎＴ−Ｖの各種欠失変異体及び合成ペプチドを４℃で添加し、ＨＵＶＥＣ上のＨＳＰＧから遊離するＦＧＦ−２の量を測定した結果、第５図に示すように、ＧｎＴ−ＶΔ７３及びＫＲＫＲＫＫペプチドはＦＧＦ−２を遊離したが、ＧｎＴ−ＶΔ４３６及びＦＳＧＧＰＬペプチドはＦＧＦ−２の遊離に影響しなかった。ＧｎＴ−ＶΔ７３と同様、ＧｎＴ−ＶΔ１８８及びＧｎＴ−ＶΔ２３３もＦＧＦ−２を遊離した。同様に、ＨＳＰＧ結合分子のヘパリン結合サイトと競合することによって当該ＨＳＰＧ結合分子を遊離することが知られているヘパリン（Ｂｉａｒｄ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２３２４−２３２８（１９８８））は、ＦＧＦ−２の遊離を誘導した。遊離したＦＧＦ−２の刺激によるＨＵＶＥＣ上のＦＧＦレセプターのリン酸化も確認した。第６図に示すように、ＫＲＫＲＫＫペプチドは、ＧｎＴ−ＶΔ７３と同程度にＨＵＶＥＣの増殖を促進したが、この効果は同時に添加した抗ＦＧＦ−２中和抗体によって完全に抑制された。これらの結果は、ＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスター領域はＨＵＶＥＣ増殖促進活性に十分であり、ＧｎＴ−Ｖタンパク質は当該タンパク質の塩基性部分の作用によって、内皮細胞上のＨＳＰＧからＦＧＦ−２を遊離することにより血管新生を促進することを示唆している。
〔実施例７  ＧｎＴ−Ｖタンパク質によるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生〕
ＧｎＴ−Ｖによる血管新生の誘導は、ＨＵＶＥＣを用いた、キャピラリー様チューブ形成アッセイ（Ａｓｈｏｔｏｎ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３５５６２−３５５７０（１９９９））及びマイグレーションアッセイ（Ｚｅｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３２７１−３２７９（２００１））のような他のｉｎ  ｖｉｔｒｏの血管新生アッセイによっても確認された。ＧｎＴ−Ｖの血管新生活性を生体外（ｅｘ−ｖｉｖｏ）で確認するために、ＧｎＴ−ＶΔ７３タンパク質を用いたＣＡＭアッセイを行った。ＧｎＴ−ＶΔ７３は、ＦＧＦ−２と同様にニワトリのマイクロベッセルの血管新生を誘導し、さらにＫＲＫＲＫＫペプチドも同様に血管新生を誘導したが、ＧｎＴ−ＶΔ７３及びＫＲＫＲＫＫペプチドによる血管新生の誘導は抗ＦＧＦ−２中和抗体による処理によって阻害された。これに対して、ＧｎＴ−ＶΔ４３６及びＦＳＧＧＰＬペプチドは血管新生活性を持っていなかった。これらの結果は、分泌型ＧｎＴ−Ｖ及びＧｎＴ−Ｖ由来のＫＲＫＲＫＫペプチドはＦＧＦ−２の作用を介した血管新生を誘導するが、ＨＵＶＥＣの分化・増殖アッセイの結果を考慮すれば、ＧｎＴ−Ｖの塩基性領域は内皮細胞上のＨＳＰＧからのＦＧＦ−２の遊離をもたらす。
〔実施例８  成熟型ＧｎＴ−Ｖタンパク質の切断箇所の解析〕
第８図に示すように、成熟型ＧｎＴ−Ｖは、アミノ末端側に疎水性アミノ酸からなる膜貫入部位を有していることから、細胞内オルガネラであるゴルジ体の膜にアミノ末端側がアンカーリングし、ゴルジ体の内腔側に糖転移酵素活性に関与する触媒部位が存在していると考えられている。成熟型ＧｎＴ−Ｖはゴルジ体内腔側で切断を受けて分泌型ＧｎＴ−Ｖに変換され、分泌経路に乗って細胞外に分泌されるものと推定されるので、細胞外に分泌された分泌型ＧｎＴ−Ｖのアミノ末端のアミノ酸配列を決定して、切断箇所を解析した。
膵癌細胞ＭＩＡ  ＰａＣａ−２にＧｎＴ−Ｖ遺伝子を導入して、ＧｎＴ−Ｖを高発現させた細胞（ＰａＣａ−２／ＧｎＴ−Ｖ）を培養し、１５００ｍｌの無血清培養液を得た。細胞の形質転換及び形質転換細胞の培養は、実施例１に記載した方法に従った。この培養液を飽和硫安で沈澱させ、回収した硫安沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝サリン）に溶解して、ＰＤ−１０カラム（Ｃｏｄｅ  Ｎｕｍｂｅｒ：１７−０８５１−０１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩すると同時に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）へ緩衝液を置換した。続いて、「タンパク質・酵素の基礎実験法  改訂第２版（堀尾武一編集  南江堂発行  １９９４年）」および「Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８２  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．１９９０」に記載の公知方法に従って作製したＧｎＴ−Ｖのマウスモノクローナル抗体２４Ｄ１１をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを担体とするカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化して分泌型ＧｎＴ−Ｖをカラムに吸着させた後、０．０５％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で分泌型ＧｎＴ−Ｖを溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画したところ、およそ１００ｋＤの分泌型ＧｎＴ−Ｖの分子量に相当する部分にメインバンドが認められた。
ゲルから抽出した分泌型ＧｎＴ−Ｖのアミノ末端のアミノ酸配列を文献公知の方法で決定した。その結果、第８図に示すように、分泌型ＧｎＴ−Ｖのアミノ末端の配列はＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−（配列番号：１３）と決定されたが、このアミノ酸配列は配列番号６に記載したＧｎＴ−Ｖのアミノ酸配列中の３１〜３５番目までのアミノ酸配列と一致したので、分泌型ＧｎＴ−Ｖは成熟型ＧｎＴ−Ｖの３０番目のロイシンと３１番目のヒスチジンの間が切断されて生成することがわかった。
〔実施例９  分泌型ＧｎＴ−Ｖの生成に関与するプロテアーゼの同定と分泌型ＧｎＴ−Ｖの生成を阻害する物質のスクリーニング〕
実施例８で解析した分泌型ＧｎＴ−Ｖの切断箇所は、第８図に示したＧｎＴ−Ｖの膜貫入部位とゴルジ体内腔部位の境界にあることから、切断に関与するプロテアーゼとして、ゴルジ体膜に結合したγ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）が想定された。
変異プレセニリン−１を高発現させた、γ−セクレターゼ活性が高く内因性ＧｎＴ−Ｖの発現が強い神経細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨを用い、この細胞を実施例１に示した方法で培養し、分泌型ＧｎＴ−Ｖの産生に及ぼすγ−セクレターゼの影響を調べた。培養液中のＧｎＴ−Ｖの分泌量は、培養液を１０倍に濃縮し、特開平６−１９７７５６号公報に記載の方法に従いＨＰＬＣを用いて酵素活性を測定することにより定量した。
第９図Ａに示すように、変異プレセニリン−１を高発現させた細胞（ＰＳ−１ΔＥ９）での培養液中のＧｎＴ−Ｖ活性は変異プレセニリン−１を高発現させていない細胞（コントロール）の約４倍となり、γ−セクレターゼが成熟型ＧｎＴ−Ｖを切断して分泌型ＧｎＴ−Ｖを生成することが確認された。また、第９図Ｂに示すように、変異プレセニリン−１を高発現させた細胞（ＰＳ−１ΔＥ９）での培養液中（細胞外）と細胞内のＧｎＴ−Ｖ活性の比は約３．５であり、変異プレセニリン−１を高発現させていない細胞（コントロール）での同比約１．２よりも約３倍高くなり、γ−セクレターゼ活性の高発現により分泌型ＧｎＴ−Ｖの生成及び分泌が促進されることが確認できた。
γ−セクレターゼの阻害剤として知られているＤＦＫ１６７（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１，６−９（１９９８））の分泌型ＧｎＴ−Ｖ産生に及ぼす影響を調べた。なお、ＤＦＫ１６７は上記式（１）で示される化合物であり、ＩＣＮ社（米国オハイオ州）から入手可能である。膵癌細胞ＭＩＡ  ＰａＣａ−２及び口腔癌細胞ＫＢにＧｎＴ−Ｖ遺伝子を導入してＧｎＴ−Ｖを高発現させた細胞を実施例１に示した方法で培養して、培養液中のＧｎＴ−Ｖの活性を測定した。第１０図Ａに示したように、ＰＢＳを添加したコントロールに対して、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォオキサイド）を添加したＰａＣａ−２／ＧｎＴ−Ｖ細胞の培養液中のＧｎＴ−Ｖ活性は少し低下した。第１０図Ａ及びＢに示したように、ＤＭＳＯに溶解したＤＦＫ１６７を１００μＭになるように添加したＰａＣａ−２／ＧｎＴ−Ｖ細胞及びＫＢ／ＧｎＴ−Ｖ細胞培養液中のＧｎＴ−Ｖ活性は検出できなかった。このことは、γ−セクレターゼ阻害剤であるＤＦＫ１６７によって、ＧｎＴ−Ｖの切断及び分泌型ＧｎＴ−Ｖの分泌が完全に阻害されたことを示している。従って、ＤＦＫ１６７のようなγ−セクレターゼ阻害剤は本発明の１つである血管新生阻害剤であること、及び上記実施例で示したＧｎＴ−Ｖを高発現させた細胞を用いたスクリーニング方法も、本発明の１つである血管新生阻害剤のスクリーニング方法として実施可能であることを示している。
産業上の利用可能性
本発明は、血管新生作用を有するペプチド又はタンパク質、及びそれを含有する血管新生促進剤を提供する。かかる血管新生促進剤は、創傷治癒、又は動脈硬化もしくは血栓、血瘤、血管閉塞に関連する病気の予防及び／もしくは治療に有効である。
また、本発明は、膜に貫通している成熟型ＧｎＴ−Ｖが分泌型ＧｎＴ−Ｖに変換されるのを抑制することによって、血管新生作用を抑制することができる。また、ＧｎＴ−Ｖの発現を抑制したり、分泌型ＧｎＴ−Ｖがヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するのを抑制したりすることによっても、血管新生作用を抑制することができる。このような血管新生作用を抑制する物質は、癌の転移などをはじめとする血管新生が原因となる疾患の予防及び／又は治療に有効である。
さらに、前記ＧｎＴ−Ｖの塩基性アミノ酸クラスター領域を含むペプチド及びタンパク質に対する抗体を用いることにより、被検物質中の前記ペプチド及びタンパク質の有無又は量を測定することができ、例えば癌転移の可能性などを知ることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、各細胞の培養液で処理されたＨＵＶＥＣの分化・増殖を、［３Ｈ］−チミジンの取り込み量を指標に示した図である。なお、ＣＲＴは、ＨＵＶＥＣの培養に用いた通常の新鮮な培地である。
第２図は、ＧｎＴ−ＶΔ７３の添加量と、ＨＵＶＥＣの分化・増殖との関係を示す図である。
第３図Ａは、各ＧｎＴ−Ｖ欠失変異体のアミノ酸配列の概略を示す図である。第３図Ｂは、各ＧｎＴ−Ｖ欠失変異体によるＨＵＶＥＣの分化・増殖亢進作用を示す図である。
第４図は、ＧｎＴ−Ｖの塩基クラスター領域のアミノ醒配列と、ＶＥＧＦ１８９、Ｐ１ＧＦ−２及びＨＢ−ＥＧＦのアミノ酸配列との類似性を示す図である。
第５図は、ＧｎＴ−Ｖの各種欠失変異体及び合成ペプチドによるＦＧＦ−２の放出量を示す図である。
第６図は、ＧｎＴ−Ｖの各種欠失変異体及び合成ペプチドによるＨＵＶＥＣの分化・増殖亢進作用を示す図である。
第７図は、ＧｎＴ−Ｖによる癌血管新生の誘導を示す概略図である。塩基性アミノ酸クラスター領域を含む分泌型ＧｎＴ−Ｖは、ＦＧＦ−２と競合して細胞表面のＨＳＰＧに結合し、その結果、ＦＧＦ−２の遊離が起こり、標的細胞上のＦＧＦ−２レセプターが刺激される。
第８図は、成熟型ＧｎＴ−Ｖの構造の概要を示す図である。成熟型ＧｎＴ−Ｖがゴルジ体内腔側で切断を受けて分泌型ＧｎＴ−Ｖに変換される際の切断部分を拡大し、そのアミノ酸配列を示した。
第９図Ａは、変異プレセニリン−１を高発現させた細胞（ＰＳ−１ΔＥ９）と変異プレセニリン−１を高発現させていない細胞（コントロール）における培養液中のＧｎＴ−Ｖ活性を示す。第９図Ｂは、前記２種の細胞における培養液中（細胞外）と細胞内のＧｎＴ−Ｖ活性の比を示す。
第１０図Ａは、何も添加しない場合、ＤＭＳＯを添加した場合、ＤＭＳＯに溶解したＤＦＫ１６７を添加した場合、それぞれの場合におけるＰａＣａ−２／ＧｎＴ−Ｖ細胞の培養液中のＧｎＴ−Ｖ活性の値を示す。第１０図Ｂは、前記３つの場合、それぞれにおけるＫＢ／ＧｎＴ−Ｖ細胞の培養液中のＧｎＴ−Ｖ活性の値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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