(57)【要約】ナマコ由来硫酸化フカンを分解する硫酸化フカン分解酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フカンに該酵素を作用させて得られる低分子化物及びその製造方法、ならびに硫酸化フカン分解酵素の活性化因子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ：
（Ｉ）作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、α−Ｌ−フコシル結合を加水分解し、硫酸化フカンを低分子化させる；
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜９付近である；および
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２５〜４５℃である。
【請求項２】
請求項１記載のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有するフコイダノバクター属細菌を培養する工程、およびその培養物から該酵素を採取する工程を包含することを特徴とする請求項１記載のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼの製造方法。
【請求項３】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フカンスルファターゼ：
（Ｉ）作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、硫酸エステル結合を加水分解し、硫酸を遊離させ、そして請求項１記載のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼと共存して、ナマコ由来硫酸化フカンの低分子化を、請求項１記載のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを単独で作用させた場合よりも進行させる；
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは６〜８付近である；および
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２０〜４５℃である。
【請求項４】
請求項３記載の硫酸化フカンスルファターゼ生産能を有するフコイダノバクター属細菌を培養する工程、およびその培養物から該酵素を採取する工程を包含することを特徴とする請求項３記載の硫酸化フカンスルファターゼの製造方法。
【請求項５】
硫酸化フカンに請求項１記載のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを作用させる工程、および反応物から硫酸化フカンオリゴ糖を取得する工程を包含することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
塩化ナトリウムの共存下でエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを作用させることを特徴とする請求項５記載の硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
請求項５記載の方法で得られる硫酸化フカンオリゴ糖。
【請求項８】
硫酸化フカンに請求項１記載のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び請求項３記載の硫酸化フカンスルファターゼを作用させる工程、および反応物から硫酸化フカンオリゴ糖を取得する工程を包含することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。
【請求項９】
塩化ナトリウム及び／又はカルシウムイオンの共存下でエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを作用させることを特徴とする請求項８記載の硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
請求項８記載の方法で得られる硫酸化フカンオリゴ糖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は糖鎖工学分野において有用な硫酸化フカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、該酵素を活性化させる様々な因子、並びに糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フカンオリゴ糖、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】  ナマコには数種の硫酸化多糖が含まれている。これらの中には、硫酸化フコースを主要構成成分とする多糖、すなわち、硫酸化フカンが存在する。ナマコ由来硫酸化フカンのエイズウイルス感染抑制作用や抗凝血作用等が報告されているが、ナマコ由来硫酸化フカンを医薬品として開発する場合、その構造を決定する必要が生じる。ナマコ由来硫酸化フカンの構造は研究されているが、現時点ではその平均的構造が判明しているに過ぎない。硫酸化フカンの構造決定の際、硫酸化フカンを分解する酵素を用いれば非常に有利であるが、ナマコ由来硫酸化フカンを分解する酵素は市販されていない。一方、硫酸化フカンは種々の褐藻類にも含まれており、その構造は由来となる海藻により異なることが多い。例えば、ヒバマタ、マコンブ、モズクそれぞれから抽出される硫酸化フカンは異なる構造を持つ。そして、これまで褐藻類由来の硫酸化フカンを分解する酵素がいくつか報告されているが（国際公開第９６／３４００４号パンフレット、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット、国際公開第９９／１１７９７号パンフレット、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、欧州特許出願公開第１３０６３８９号明細書）、いずれも、ナマコ由来硫酸化フカンを分解することはできない。すなわち、ナマコ由来硫酸化フカンと褐藻類由来硫酸化フカンの構造は異なると考えられる。
以上のことから、ナマコ由来硫酸化フカンを分解する酵素、及び酵素的に製造した構造が均一な硫酸化フカンオリゴ糖が求められていた。
発明の目的
すなわち、本発明の目的は、ナマコ由来硫酸化フカンを分解する硫酸化フカン分解酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フカンに該酵素を作用させて得られる低分子化物及びその製造方法を提供することにある。また、本発明の目的は、硫酸化フカン分解酵素の活性化因子を提供することにもある。
発明の概要
本発明者らは、フコイダノバクター属に属する細菌の１菌株、フコイダノバクター  マリナス（Ｆｕｃｏｉｄａｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ）ＳＩ−００９８が新規な硫酸化フカン分解酵素を生産することを見出し、該酵素の製造方法を見出した。また、該酵素を利用してナマコ由来硫酸化フカンから、新規な硫酸化フカンオリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の発明は、フコイダノバクター属細菌の培養物から得られたエンド型α−Ｌ−フコシダーゼに関する。
本発明の第１の発明において、該酵素は、エンド型α−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有するフコイダノバクター属細菌を培養し、その培養物から採取することができる。
本発明の第２の発明は、フコイダノバクター属細菌の培養物から得られた硫酸化フカンスルファターゼに関する。
本発明の第２の発明において、該酵素は硫酸化フカンスルファターゼ生産能を有するフコイダノバクター属細菌を培養し、その培養物から採取することができる。
本発明の第３の発明は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に、本発明の第１の発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖に関する。
本発明の第３の発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に本発明の第１の発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法によって製造することができ、塩化ナトリウムの共存下で行っても良い。
本発明の第４の発明は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に、本発明の第１の発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び本発明の第２の発明の硫酸化フカンスルファターゼを作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖に関する。
本発明の第４の発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に本発明の第１の発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び本発明の第２の発明の硫酸化フカンスルファターゼを作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法によって製造することができ、塩化ナトリウム及び／又は塩化カルシウムの共存下で行っても良い。
【図面の簡単な説明】  図１  本発明により得られるエンド型α−Ｌ−フコシダーゼのｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図２  本発明により得られるエンド型α−Ｌ−フコシダーゼの温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図３  本発明により得られるエンド型α−Ｌ−フコシダーゼの塩濃度（ｍＭ）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図４  本発明により得られる硫酸化フカンスルファターゼのｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図５  本発明により得られる硫酸化フカンスルファターゼの温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図６  本発明により得られる硫酸化フカンスルファターゼの塩濃度（ｍＭ）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図７  本発明により得られるエンド型α−Ｌ−フコシダーゼにより硫酸化フカンを分解して得られる硫酸化フカンオリゴ糖をゲルろ過した際の溶出パターンを表す図である。
図８  本発明により得られるエンド型α−Ｌ−フコシダーゼと硫酸化フカンスルファターゼにより硫酸化フカンを分解して得られる硫酸化フカンオリゴ糖のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
発明の詳細な説明
以下本発明に関して具体的に説明する。
本発明において、ナマコ由来硫酸化フカンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、マナマコ（Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来硫酸化フカンを使用できる。マナマコは、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖の生産効率が高く、原料として好適である。
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼとは、ナマコ由来硫酸化フカンに作用して還元性末端にフコースを持つオリゴ糖を生成させる酵素である。
本発明の硫酸化フカンスルファターゼとは、ナマコ由来硫酸化フカン及びナマコ由来硫酸化フカンに本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを作用させて生成されるオリゴ糖に作用して硫酸を遊離させる酵素である。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、ナマコ由来硫酸化フカンに本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ単独、又は本発明の硫酸化フカンスルファターゼと一緒に作用させて得られるオリゴ糖で、還元性末端糖がフコースである。
本発明で使用するナマコ由来硫酸化フカンを製造する際にはまず、ナマコを水性溶媒中に浸し、硫酸化多糖画分を抽出する。その際硫酸化フカンの低分子化を防ぐためには、ｐＨは４〜９、温度は１００℃以下が好ましい。また、上記硫酸化多糖画分中のアミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過等により効率良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も有効である。
このようにしてナマコの硫酸化多糖画分を得ることができる。該画分を硫酸化フカン画分として、例えば本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼや硫酸化フカンスルファターゼの活性測定用基質及び本発明の硫酸化フカンオリゴ糖製造用の基質として使用できる。該画分を陰イオン交換カラムで分離すればより純度の高い硫酸化フカンを得られる。上記の硫酸化多糖画分も陰イオン交換カラムで精製した硫酸化フカンもともに本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼや硫酸化フカンスルファターゼの活性測定用基質及び本発明の硫酸化フカンオリゴ糖製造用の基質として使用できる。
本発明の、エンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼの製造に使用される細菌としては、該酵素を生産する細菌であれば特に限定はないが例えば、フコイダノバクター  マリナス（Ｆｕｃｏｉｄａｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ）ＳＩ−００９８株が挙げられる。当該細菌株は本発明者らが単離した細菌である。なお、上記菌株はＦｕｃｏｉｄａｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＳＩ−００９８と表示され、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１４８７３として平成７年３月２９日（原寄託日）より寄託され、ブダペスト条約に基づき上記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０３として平成８年２月１５日（移管日）より寄託されている。
本発明者らは、本菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、既知の細菌との相同性を調べ、本菌株がＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａに最も近い新属の細菌であると確認した。
本菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの配列を配列表の配列番号１に記載する。従って、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの配列より、フコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８と同属と判断される細菌から得られたエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼも、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼに含まれる。
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを生産する細菌を培養するにあたり、培地に加える栄養源は使用する微生物が利用し、該酵素を生産するものであればよく、炭素源としては、例えば、硫酸化フカン、ナマコ、干しナマコ、海藻、アルギン酸、ラミナラン、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム、尿素、尿酸等が適当である。その他にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等を加えてもよい。なお、一般に海水から採取した微生物は、海水あるいは市販の人工海水を用いれば極めて生育しやすい。
また、培養条件は使用する微生物、培地組成等に応じ、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼの生産量が最大になるように設定するが、一般に培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは５〜９がよく、５〜７２時間の通気攪拌培養で本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼの生産量は最高に達する。培養終了後、遠心分離により菌体と培養上清に分画し、それぞれから本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを得ることができる。
上記のフコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常の細胞破砕手段、例えば超音波処理で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出液から通常の精製手段により本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを精製することもできる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水カラムクロマト、ゲルろ過等により精製した本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを得ることができる。また、上述の培養上清中にも本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼが存在するので、菌体内酵素と同様の手段で精製できる。
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、α−Ｌ−フコシル結合を加水分解する。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜９付近にある（図１）。
すなわち図１は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２５〜４５℃付近にある（図２）。
すなわち、図２は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼは、硫酸化フカン分解活性を測定して確認でき、生産菌の培養液を遠心分離した上清、無細胞抽出液、各種カラムクロマトによる精製後の酵素液でも確認できる。
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼは塩化ナトリウムの存在下で活性化される。
塩化ナトリウムは、試薬の塩化ナトリウム、食塩、海水、人工海水等、塩化ナトリウムを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本発明の、エンド型α−Ｌ−フコシダーゼの反応液に添加する塩化ナトリウム濃度は１ｍＭから１Ｍ程度がよく、好ましくは５ｍＭから９００ｍＭ程度がよい。
本発明の硫酸化フカンスルファターゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、硫酸を遊離させる。また、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼと共存して、ナマコ由来硫酸化フカンの低分子化を、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを単独で作用させた場合よりも進行させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは６〜８付近にある（図４）。
すなわち図４は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２０〜４５℃付近にある（図５）。
すなわち、図５は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
本発明の硫酸化フカンスルファターゼは、遊離した硫酸を測定して確認でき、生産菌の培養液を遠心分離した上清、無細胞抽出液、各種カラムクロマトによる精製後の酵素液でも確認できる。
本発明の硫酸化フカンスルファターゼは塩化ナトリウム及び／又はカルシウムイオンの存在下で活性化される。
塩化ナトリウムは、試薬の塩化ナトリウム、食塩、海水、人工海水等、塩化ナトリウムを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本発明の、硫酸化フカンスルファターゼの反応液に添加する塩化ナトリウム濃度は１ｍＭから２Ｍ程度がよく、好ましくは５ｍＭから１Ｍ程度がよい。
カルシウムイオンは、試薬の塩化カルシウム、酢酸カルシウム等、カルシウムイオンを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本発明の、硫酸化フカンスルファターゼの反応液に添加するカルシウムイオン濃度は０．１ｍＭから１Ｍ程度がよく、好ましくは１ｍＭから５００ｍＭ程度がよい。
フコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８株は硫酸化フカンを資化する微生物であり、硫酸化フカンを分解するために菌体内及び菌体外に本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを生産する。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖とは、ナマコ由来硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物に本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを単独で、または本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを一緒に作用させて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖がフコースである。硫酸化フカン含有物としては、例えば硫酸化フカンの部分精製品、ナマコ由来硫酸化多糖画分、ナマコの水性溶媒抽出物、干しナマコ、若しくは生ナマコが好適に使用できる。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製する際、硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物の溶解は定法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼの量を考慮して選定すればよい。硫酸化フカンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。反応の条件は、使用する酵素が活性を示す範囲であれば特に限定はないが、溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は通常３０℃付近で行う。反応に使用する本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼの配合比率や使用量、反応液の組成、反応時間等の調整により、硫酸化フカンオリゴ糖の分子量を調整できる。この様にして得られた本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムにより分画すれば、更に均一な分子量あるいは均一な荷電密度分布の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製できる。分子量分画は定法、例えばゲルろ過法や限外ろ過法を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と塩を形成する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニウム等の塩とすることができる。
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼは硫酸化フカンを低分子化するため硫酸化フカンの構造解析に使用できる。また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として使用できる。例えば、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、該オリゴ糖のＰＡ−化物を調製すれば、硫酸化フカンオリゴ糖の蛍光標識標準物質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供できる。また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は抗原として利用でき、公知の方法により、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を認識する抗体を作製することができる。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を認識する抗体は、硫酸化多糖の構造解析に利用でき、極めて有用である。
【実施例】  以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例１  ナマコ由来硫酸化多糖画分の調製
市販のマナマコ３５ｋｇの体壁部分を細断し、４倍量のアセトンとともにホモジナイザーで８０００回転、５分処理後、ろ紙でろ過し残さを得た。得られた残さを４倍量のアセトンとともにホモジナイザーで８０００回転、５分処理後、ろ紙でろ過し残さを得た。得られた残さを吸引乾燥させ、１１３２ｇのナマコ体壁アセトン処理物を得た。
４００ｇのナマコ体壁アセトン処理物を、１０リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭイミダゾールー塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、アクチナーゼＥを２ｇ添加し、４５℃で３時間処理後、さらに、９５℃で２時間処理した。処理液を穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過し、得られたろ液に２０ｇの活性炭を添加し、室温で３０分間攪拌後、遠心分離した。得られた上清に１０％となるようにエタノールを加え、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過器で２リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を限外ろ過器により１０％エタノールを含む１００ｍＭ塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐＨを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過器により２０ｍＭ塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、ナマコ由来硫酸化多糖画分の乾燥物３７ｇを得た。
参考例２  硫酸化フカン画分の調製
参考例１記載のナマコ由来硫酸化多糖画分の乾燥物７ｇを、５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０％エタノールを含む２０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）７００ｍｌに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を、同緩衝液で平衡化した５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから２．０５Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配により溶出させた。溶出液は５００ｍｌずつ分取した。各フラクションの総糖量をフェノール硫酸法により、ウロン酸量をカルバゾール硫酸法により測定した。塩化ナトリウム濃度０．８〜１．５Ｍで溶出された画分（フラクションナンバー４５〜５７）を硫酸化フカン画分とした。
参考例３    エンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法
１５μｌの１％の硫酸化フカン画分溶液と、７５μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）と、９μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと、４１μｌの水と、１０μｌの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ溶液とを混合し、３７℃で１時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ溶液の代わりに、その酵素溶液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様にＨＰＬＣで分析した。
１単位のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化フカンのフコシル結合を切断する酵素量とした。エンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性は下記式により求めた。
｛（１５×１０００×１／１００）／ＭＧ｝×｛（ＭＧ／Ｍ）−１｝×｛１／（６０×０．０１）｝＝Ｕ／ｍｌ
１５×１０００×１／１００：反応系中に添加した硫酸化フカン画分（μｇ）
ＭＧ：基質硫酸化フカンの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化フカンが酵素により切断された部位の数
６０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。また、タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
参考例４  硫酸化フカンスルファターゼ活性測定方法
１５μｌの１％の硫酸化フカン画分溶液と、７５μｌの５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）と、６μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと、３μｌの１Ｍ塩化カルシウムと、３１μｌの水と、２０μｌの本発明の硫酸化フカンスルファターゼ溶液とを混合し、３７℃で１時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、生成する硫酸量を測定した。対照として、本発明の硫酸化フカンスルファターゼ溶液の代わりに、その酵素溶液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様にＨＰＬＣで分析した。
１単位の硫酸化フカンスルファターゼ活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸を生成させる酵素量とした。硫酸化フカンスルファターゼ活性は下記式により求めた。
Ｓ／（６０×０．０２）＝Ｕ／ｍｌ
Ｓ：反応により生成した硫酸（μｍｏｌｅ）
６０：反応時間（分）
０．０２：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０４ＨＱ（８×３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出：示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
反応により遊離した硫酸量の測定のために、１ｍＭ及び０．５ｍＭの硫酸ナトリウムを上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、硫酸ナトリウム濃度とそのピークの高さとの関係を曲線に表し、遊離硫酸量測定のための標準曲線とした。
実施例１  エンド型α−Ｌ−フコシダーゼの調製（１）
フコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８を参考例１の方法で調製したナマコ由来硫酸化多糖画分０．３％とペプトン１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地５ｍｌを１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に接種し、２５℃で２日培養した。得られた培養物のうち１５０μｌを、上記と同じ成分を含む１００ｍｌの培地に植え継ぎ、２５℃で３日培養した。上記と同じ成分及び０．０１％消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業社製）を含む培地６００ｍｌを２リットルの三角フラスコに入れたものを７本用意し、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理後、各培地に上記の培養物を１ｍｌずつ接種し、２５℃で３日培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。同じ培養を繰り返し、培養液１２．６リットルから約１５ｇの湿菌体を得た。
得られた菌体を２００ｍｌの１００ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭイミダゾールー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離して上清を得た。得られた上清を上記の緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。
得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した５００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから５００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を４５ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。
得られた活性画分を５０ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した１５０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから４００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を２０ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。
得られた活性画分を５０ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した８０ｍｌの硫酸化セルロファインのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから１５００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を５ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。
得られた活性画分を１００ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し溶媒置換した。次に、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した４０ｍｌのヒドロキシルアパタイト（和光純薬製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４０ｍＭから２５０ｍＭリン酸カリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を６ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。
得られた活性画分を１００ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した１５２０ｍｌのセファクリルＳ−２００（４．４×１００ｃｍ、ファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で溶出させ、溶出液を１３．５ｍｌずづに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定した。
こうして本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼの精製物を得た。なお、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼのセファクリルＳ−２００によるゲルろ過の際の溶出位置及び電気泳動の際の泳動距離から求めた該酵素の分子量はそれぞれ、およそ３万２０００（２万〜４万の分布）及び４万２０００（３万〜５万の分布）であった。
以上の精製工程を表１にまとめる。
2004001031.tif 000002
実施例２  エンド型α−Ｌ−フコシダーゼの調製（２）
フコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８を実施例１に記載の方法で培養し、培養液４．２リットルから約６ｇの湿菌体を得た。
得られた菌体を５０ｍｌの５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離して上清を得た。得られた上清を上記の緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。
得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した３００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから５００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を２５ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。
得られた活性画分を１００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した５０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから４００ｍＭ  塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を１０ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。
得られた活性画分を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した２０ｍｌのヒドロキシルアパタイトのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから２００ｍＭのリン酸カリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を１０ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。
得られた活性画分を、１００ｍＭ  塩化ナトリウム及び５ｍＭアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した１５２０ｍｌのセファクリルＳ−２００（４．４×１００ｃｍ、ファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で溶出させ、溶出液を１３．５ｍｌずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定した。
こうして本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼの精製物を得た。
以上の精製工程を表２にまとめる。
2004001031.tif 000003
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼの精製物の至適ｐＨ、温度、塩濃度を調べた。その結果をそれぞれ図１、図２および図３に示す。
実施例３  エンド型α−Ｌ−フコシダーゼを用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製
参考例２に記載の硫酸化フカン画分１．５ｇを１３５ｍｌの２５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解させ、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを１４４ｍＵ（１５ｍｌ）添加し３０℃で４日間攪拌後、１１００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−１０００（４×８７ｃｍ、生化学工業社製）で５０ｍｌずつ３回に分けてゲルろ過し分子量分画した。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。その結果、図７に示すような分布を示した。図７の縦軸はフェノール硫酸法により発色させた際の４８０ｎｍにおける吸光度、横軸はフラクション番号を示す。すなわち、フラクション番号５０〜７５の付近を中心に、分子量４万を中心に分布する本発明の硫酸化フカンオリゴ糖が溶出された。これらのオリゴ糖の糖組成、還元性末端糖分析を行ったところ、実質的に総てフコースであった。
すなわち、ナマコ由来硫酸化フカン画分に本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを作用させることにより種々の分子量の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖が調製できた。
実施例４  硫酸化フカンスルファターゼ
実施例１及び２の方法により精製した本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ単独では、ナマコ由来硫酸化フカンを実施例３に示した分子量分布より低分子化させることができなかった。そこで、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼと共存してナマコ由来硫酸化フカン画分を低分子化させる画分を探した。その結果実施例１に記載した硫酸化セルロファインの溶出画分のうち、６００ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分に、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼによる硫酸化フカンの低分子化を活性化させる活性が検出された。そこで、該画分をナマコ由来硫酸化フカンに作用させ、反応液中に生成した物質を調べた。まず、反応液を参考例４に記載の方法でＨＰＬＣにより分析したところ、硫酸の生成が確認できた。次に、糖を含む低分子成分が生成していないかどうかを調べるため、反応液をセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（４×９０ｃｍ）でゲルろ過し、溶出させた各フラクションの総糖量をフェノール−硫酸法により分析した。その結果、糖を含む低分子成分は生成していなかった。このようにして、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼによる硫酸化フカンの低分子化を活性化させる酵素は硫酸化フカンスルファターゼであることが強く示唆されたので、参考例４に記載の方法で活性が検出される硫酸化フカンスルファターゼの精製を行った。
すなわち、実施例１に記載した硫酸化セルロファインの溶出画分のうち、６００ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される本発明の硫酸化フカンスルファターゼの活性画分を集め、１００ｍＭ塩化ナトリウムと５ｍＭアジ化ナトリウムと５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液で平衡化させた１５２０ｍｌのセファクリルＳ−２００のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。分取は１本あたり１３．５ｍｌで行った。本発明の硫酸化フカンスルファターゼの分子量を溶出位置から計算すると約８万４０００（７万〜１０万の分布）であった。
本発明の硫酸化フカンスルファターゼの精製物の至適ｐＨ、温度、塩濃度を調べた。その結果をそれぞれ図４、図５および図６に示す。
実施例５  ナトリウム塩濃度の影響
本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び本発明の硫酸化フカンスルファターゼの反応系に含まれる塩化ナトリウムの濃度と相対活性の関係を調べた。その結果、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び本発明の硫酸化フカンスルファターゼは塩化ナトリウムにより賦活化されることが判明した。
実施例６  カルシウム塩濃度の影響
本発明の硫酸化フカンスルファターゼ反応系に含まれる塩化カルシウムの濃度と相対活性の関係を調べた。その結果、本発明の硫酸化フカンスルファターゼは塩化カルシウムにより賦活化されることが判明した。なお、酢酸カルシウムによっても同様の賦活化がみられた。
実施例７  エンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製
参考例２に記載のナマコ由来硫酸化フカン画分の１％水溶液３０μｌに、１５０μｌの５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１４μｌの４Ｍ塩化ナトリウム、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム、６４μｌの水を混合し、本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼを４２４μＵ（１６μｌ）及び本発明の硫酸化フカンスルファターゼを２２６μＵ（２０μｌ）添加し３０℃で２日間反応後、反応液１００μｌを参考例４に記載の方法でＨＰＬＣにより分析した。その結果を図８に示す。図８の縦軸は差示屈折率の相対強度、横軸は保持時間を示す。生成した本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、７分〜１０分の位置に分子量９千を中心値として分布しており、明らかに実施例３に記載のオリゴ糖よりも低分子のオリゴ糖を得ることができた。これらのオリゴ糖の糖組成、還元性末端糖分析を行ったところ、実質的に総てフコースであった。
すなわち、ナマコ由来硫酸化フカン画分に本発明のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び本発明の硫酸化フカンスルファターゼを作用させることにより種々の分子量の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖が調製できることがわかった。
【産業上の利用の可能性】
本発明によりナマコ由来硫酸化フカンの構造解析やナマコ由来硫酸化フカンの低分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規のエンド型α−Ｌ−フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼが提供される。また、該酵素の製造方法についても提供される。また、該酵素を使用することにより糖鎖工学用試薬として有用な様々な分子量の、ナマコ由来硫酸化フカンオリゴ糖が提供される。また、該酵素を効率良く使用するための添加物が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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