(57)【要約】本発明は、免疫細胞中の抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを著しく促進させ、その結果、抗体の多様性を獲得するための新規方法を提供する。抗体遺伝子座においてＤＮＡ相同組換えが起きている免疫細胞（例えば、ＤＴ４０細胞等）をヒストンアセチル化酵素阻害剤等（例えば、トリコスタチンＡなど）と接触等させることにより、当該抗体遺伝子座におけるクロマチン構造を弛緩させることで、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを促進し、多様な抗体分子の作製を可能にする。体細胞相同組換えの促進により抗体分子が多様化された細胞集団から、適切な選別方法（例えば、抗原でコートしたビーズ等）を用いて抗原に対して特異的に結合する抗体の作製を可能にする。
2004011644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子座においてＤＮＡ相同組換えが起きている体細胞の相同組換えを、該体細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって促進することを特徴とする、体細胞相同組換えの促進方法。
【請求項２】
抗体遺伝子座においてＤＮＡ相同組換えが起きている免疫細胞から抗体を作製するに当たり、該免疫細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって、抗体遺伝子座におけるＤＮＡ相同組換えを促進させ、それによって多様な抗体を獲得することを特徴とする抗体作製方法。
【請求項３】
染色体のクロマチン構造の弛緩を、細胞をヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤と接触させて処理することにより誘導することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤がトリコスタチンＡであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
トリコスタチンＡの処理濃度が約０．５ｎｇ／ｍｌから約５．０ｎｇ／ｍｌであり、接触処理時間が約２週間から約６週間であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞がＤＴ４０培養細胞であることを特徴とする請求項１ないし５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１、３、４、５又は６のいずれか１項に記載の方法により遺伝子座における体細胞相同組換えが促進された免疫細胞。
【請求項８】
請求項２ないし６のいずれか１項に記載の方法により作製された多様な抗体。
【請求項９】
作製された抗体がＩｇＭである請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
遺伝子座における体細胞相同組換えを促進するための薬剤であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤からなる薬剤。
【請求項１１】
阻害剤がトリコスタチンＡである請求項１０に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、一般には体細胞相同組換えを促進する技術に係り、より詳細には体細胞中の遺伝子座における体細胞相同組換えを促進する方法及びかかる方法によって体細胞相同組換えが促進された免疫細胞に関する。
また、本発明は、前記の体細胞相同組換えの促進方法を利用して多様な抗体分子を作製する方法並びにかかる方法によって作成された多様な抗体にも関する。
さらに、本発明は体細胞相同組換えを促進するために使用して好適な薬剤にも関する。
【背景技術】  従来、体細胞相同組換えは、遺伝子の多様性を産み出す要因の一つであると考えられている。例えば、ニワトリ由来のＢ細胞培養株では、抗体遺伝子座においてＤＮＡ組換えが起きていることが知られている（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９０）９：９２１−９２７）。
このようなＤＮＡ組換えを利用して種々のタンパク質因子を人工的に創り出すことが考えられるが、実際にはその組換え頻度は非常に低く、そのままではタンパク質因子の創製に利用することは困難であった。
また、抗体を作製する場合、通常ウサギやマウスなどの動物を利用するのが一般的であり、さらに多様な抗体を獲得することが望まれる場合には、多数の動物個体に対して抗原を免疫しなければならなかった。また、得られる抗体の力価も動物の個体差、抗原の性質に依存していたため、多様で高力価の抗体を安定して得ることは困難であった。
そこで、前記ニワトリ由来のＢ細胞株等において生じているＤＮＡ相同組換えを利用して抗体を獲得することが考えられ、原理的にはこの手法により多様な抗体の合成が可能となると考えられる。しかし、上述の様に、ＤＮＡ相同組換え頻度が極めて低いため、特定の抗原に対する抗体を培養細胞により人工的に作製することは現実的には極めて困難であると考えられていた。
一方、近年、ＸＲＣＣ２及びＸＲＣＣ３のノックアウトＤＴ４０細胞株（ニワトリ由来のＢ細胞株）において、体細胞突然変異の頻度が増加するという報告がなされている（Ｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１２：９２１−９２６）。このような体細胞突然変異を利用することも想定され、実際、Ｒａｍｏｓ細胞やＸＲＣＣ２やＸＲＣＣ３のノックアウトＤＴ４０細胞を用いることで抗体の抗原に対する結合を上昇させる試みがなされている。しかしながら、このような方法で得られた抗体に特異性はなく、様々なタンパク質に対して結合してしまう（Ｃｕｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２０（１１）：１１２９−１１３４）。体細胞突然変異は生体内においては親和性の成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の為に二次的に利用されるものであることから、抗体の特異性を大規模に変えることは困難であると思われる。
【発明の開示】
本発明者らは、上記事情に鑑みて、所望の体細胞相同組換えを制御された状況下で誘起促進させる方法がないかについて鋭意研究した結果、意外にも、免疫細胞の染色体のクロマチン構造を弛緩させることで、体細胞相同組換えの頻度を大幅に高めることが可能になることを見出した。
よって、本発明は、一般には、体細胞中の遺伝子座における体細胞相同組換えを促進する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は上記方法によって体細胞相同組換えが促進された免疫細胞を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、免疫細胞において生じている体細胞相同組換えを利用して多様な抗体を獲得することを可能にする抗体作製方法を提供することを目的とする。
またさらに、本発明は上記抗体作製方法により作製された多様な抗体を提供することを目的とする。
加えて、本発明は体細胞相同組換えを促進するために使用して好適な薬剤を提供することを目的とする。
しかして、本発明においては、遺伝子座においてＤＮＡ相同組換えが起きている体細胞の相同組換えを、該体細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって促進することを特徴とする体細胞相同組換えの促進方法が提供される。また、かかる方法によって体細胞相同組換えが促進された免疫細胞も提供される。
また、本発明においては、抗体遺伝子座においてＤＮＡ相同組換えが起きている免疫細胞から抗体を作製するに当たり、該免疫細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって、抗体遺伝子座におけるＤＮＡ相同組換えを促進させ、それによって多様な抗体を獲得することを特徴とする抗体作製方法が提供される。また、かかる方法によって作成された多様な抗体も提供される。
抗体遺伝子の多様性の獲得という観点では、相同組換えは、突然変異よりも高効率であることが知られており、ＸＲＣＣ２／ＸＲＣＣ３の変異株（Ｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１２：９２１−９２６）と比べると、より容易に抗体の高い多様性を獲得し得ると考えられる。抗体遺伝子座における体細胞相同組換えが促進された細胞であって、目的の抗体を産生する細胞が得られれば、当該細胞を培養し、維持していくことで、目的の抗体をいつでも簡便に調製することが可能となる。従って、将来的には実験動物を使わずに、あらゆる抗原に対して高力価な抗体を作製する技術の確立が期待でき、病気等の治療に役立つ抗体等を高力価で継続的に提供することが可能となる。また、動物愛護の観点からも利用価値があると思われる。
本発明は、従来技術の動物を使った抗体作製に比べ、はるかに少ない量（１μｇ以下。動物には通常ｍｇレベルを免疫する）の抗原で抗体を作製することができ、作製時間の大幅な短縮も可能である（最短で１週間。動物ではポリクローン抗体で数週間、モノクローン抗体で数ヶ月を要する）。さらに、作製期間の短縮による人件費の圧縮から、モノクローナル抗体におけるハイブリドーマ作製に要するコストを大幅に下げることも可能である。また、培養細胞を用いた系であるため、個体レベルで有害な因子であっても、細胞レベルで無害であるならば、抗原として使用し得る点に利点を有する。
また、試験管内で抗体を作製する手法として、従来はファージディスプレイ法などが知られているが、これらの手法は、抗体軽鎖、重鎖の可変領域遺伝子をリンカーでつなぎ、一本鎖にしたものをファージミドに組み込んだライブラリーを用いる。本来の抗体とは、可変領域以外、極めて異なる構造を有するものであるため、実際に抗体にするためには、選別したファージから遺伝子を再クローニングし、抗体の定常領域とつなげる必要がある。一方、本発明に係る方法によると、すでにＩｇＭの形になっていることから、すぐに抗体分子の形態で使用可能な状態にある。その後の操作は周知の方法に従うことが可能であり、例えば、既存の二次抗体などを利用することで単離、精製等を行うことができる。
さらに、通常のｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ファージディスプレイ法など）の手法は初期の段階で作製したライブラリーの質（例えば、クローン数など）が重要であり、ライブラリー作製に多大な手間がかかる。このことに加えライブラリーは一般に、繰り返し使用すると性能が低下することから、その維持も容易ではない。
本発明に係る方法によれば、単純な培養操作でライブラリーの作製が可能であり、作製されたライブラリー自体が自ら多様化していくことから、通常の培養細胞として維持管理する事ができる。また、ファージディスプレイ法では数回のスクリーニングが必要となる場合も多いが、本発明に係る方法によれば、１回のスクリーニングで特異的抗体を得ることができ、容易かつ迅速に、特異的抗体を得ることができる。
本発明において使用できる免疫細胞としては、抗体遺伝子座において体細胞相同組換えが生じる細胞であれば如何なるものでも使用可能であると思われるが、好適にはニワトリ由来のＢ細胞株であるＤＴ４０細胞が使用される。
クロマチン構造を弛緩させるための手段は、当業者において周知である如何なる手段でも可能であると思われるが、好ましくはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を対象の細胞に接触させる処理を用いることができる。かかる阻害剤はヒストン脱アセチル化酵素を阻害すれば如何なるものでもよいが、好ましくはトリコスタチンＡが利用される。
また、クロマチン構造を弛緩させる方法としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に免疫細胞を接触させる場合、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤での処理濃度及び処理時間は、接触させる細胞が死に至らない範囲内であれば、使用可能である。具体的には、トリコスタチンＡの場合には、処理濃度は約０．５ｎｇ／ｍｌから約５．０ｎｇ／ｍｌが好ましく、処理時間としては約２週間から約２年間が好ましい。
またさらに、本発明においては、遺伝子座における体細胞相同組換えを促進するための薬剤であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤からなる薬剤が提供される。
本発明における薬剤としては、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であれば如何なるものでも使用可能であるが、トリコスタチンＡが最も一般的でかつ好適である。
【図面の簡単な説明】  図１は、定常領域及びサザンハイブリダイゼーションのプローブ領域欠失変異株作製のための模式図を示す。ブラストサイシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミド（コンストラクトＵＲ１）を用いて、非再編成軽鎖遺伝子座の定常領域付近（プローブ領域を含む）をブラストサイシン耐性遺伝子で置換させている。
図２は、抗体軽鎖遺伝子クロマチン構造のＴＳＡ依存的なアクセシビリティーの増加を示す。ｎａｋｅｄ  ＤＮＡとは、除タンパクした同じ領域のＤＮＡのことである。
図３は、トリコスタチンＡの相同組換えへの影響を示す。
（ａ）トリコスタチンＡ１．２５ｎｇ／ｍｌ存在下で３週間培養したクローンの抗体軽鎖遺伝子可変領域の多様性を示す。
（ｂ）トリコスタチンＡ非存在下で３週間培養したクローン（Ｎｏ．１−Ｎｏ．６）の抗体軽鎖遺伝子可変領域の多様性を示す。
図４は、トリコスタチンＡのＩｇＭ（＋）細胞出現頻度への影響を示す。
（ａ）トリコスタチンＡ１．２５ｎｇ／ｍｌ存在下で培養した５クローン（Ｎｏ．１−Ｎｏ．５）の結果を示す。
（ｂ）トリコスタチンＡ非存在下で培養した６クローン（Ｎｏ．１−Ｎｏ．６）の結果を示す。
図５は、ヤギＩｇＧ磁気ビーズにセレクションを行った細胞の抗原特異性を示す。
（ａ）ヤギＩｇＧ磁気ビーズでセレクションを行った後の細胞のヤギＩｇＧへの結合性を示す。左：セレクションを行わなかった細胞集団の、ヤギＩｇＧ  ＦＩＴＣに対する結合性の結果を示す（ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ）。中央：ヤギＩｇＧと強い結合を示すクローンの結果を示す（ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．３）。右：ヤギＩｇＧと極めて弱い結合性しか示さないクローンの結果を示す（代表例のみ、ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．１７）。
（ｂ）ヤギＩｇＧに対して強い結合を示すクローン（Ｎｏ．３）の他の抗原への結合性の結果を示す。上段：ストレプトアビジンに対する結合性の結果を示す（ＳＡ）。左がセレクションを行わなかった細胞集団（ＳＡ、ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ）、右がヤギＩｇＧに対して結合するクローン（ＳＡ、ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．３）の結果を示す。下段：オボアルブミン−ＦＩＴＣに対する結合性の結果を示す（ＯＡ）。左がセレクションを行わなかった細胞集団（ＯＡ、ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ）、右がヤギＩｇＧに対して結合するクローン（ＳＡ、ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．３）の結果を示す。
図６は、ヒトＩｇＧ磁気ビーズによりセレクションを行った細胞の解析結果を示す。
（ａ）エライザ法において強いシグナルの見られた細胞の、ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣに対する結合性の結果。代表的な３クローン（ｃｌｏｎｅ７、ｃｌｏｎｅ８、ｃｌｏｎｅ２０）の結果を示す。
（ｂ）（ａ）で示した３クローンに関し、結合の特異性を検討した結果を示す。ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ｈＩｇＧ）、ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ｒＩｇＧ）、ヤギＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ｇＩｇＧ）、ストレプトアビジンＦＩＴＣ（ＳＡ）、オボアルブミン  ＦＩＴＣ（ＯＡ）で染色し、ＦＡＣＳで解析した結果を示す。ｕｎｓｔａｉｎｅｄは、染色していないもののことである。
（ｃ）細胞培養上清でエライザ法を行った結果である。ｃｌｏｎｅ７、ｃｌｏｎｅ２０、セレクションを行っていない細胞（ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ）について、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）、ウサギＩｇＧ（ｒＩｇＧ）、ヤギＩｇＧ（ｇＩｇＧ）、ストレプトアビジン（ＳＡ）、オボアルブミン（ＯＡ）でコートしたイムノプレートを用い、エライザ法を行った。培養上清は、１倍希釈から５０万倍希釈までの希釈系列（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）をとった。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の抗体作製方法は体細胞相同組換えの促進方法を一部に利用するものであるので、以下では抗体の作製方法について詳細に説明する。
前述のように、本発明の抗体作製方法においては、抗体遺伝子座において  ＤＮＡ相同組換えが起きている免疫細胞を選択して培養し、抗体を作製するにあたり、該免疫細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させる操作を行うことによって、抗体遺伝子座において起きているＤＮＡ相同組換えの頻度を大幅に向上させ、それによって多様な抗体を獲得する。
よって、以下では、細胞培養、クロマチン構造の弛緩の誘導、クロマチン構造の弛緩の確認、相同組換えの確認、抗体の発現の確認について順に説明する。
細胞培養：
本発明における「免疫細胞」とは、抗体産生能を有するＢ細胞を指し、宿主動物の種類としては、マウス、ヒツジ、ラット、ニワトリなどが含まれる（Ｈｏｎｊｏ，Ｔ．，Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．（１９９５）．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））。好ましくは、株化された細胞が使用され、特に好ましくは免疫細胞としてはＤＴ４０細胞が使用される。
「ＤＴ４０細胞」とは、ニワトリ由来Ｂ細胞の株化培養細胞であり、当該細胞の保有する染色体に何らかの修飾（例えば、特定の遺伝子の組換え、挿入、削除等）を加えられた、誘導体株、サブライン（Ｓｕｂｌｉｎｅ）も含む。
本発明で用いる細胞の培養条件は当該技術分野において周知の方法によって行われるが、選択される免疫細胞に適した培地、培養条件（培養温度、ＣＯ２濃度）下で行われることは言うまでもない。しかして、選択される免疫細胞がＤＴ４０細胞である場合、例えば、培地はＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、培養温度は例えば３９．５℃、５％のＣＯ２濃度条件下で行う。培養は、細胞濃度を一定に保ちながら行い、適当な期間毎（例えば、日毎、週毎）に目的の細胞の抗体遺伝子座における体細胞相同組換えの有無を確認する。
免疫細胞の抗体遺伝子座におけるクロマチン構造の弛緩の誘導：
ここで用いられる「クロマチン構造の弛緩」とは、標的の遺伝子座（ここでは、抗体遺伝子座）に、相同組換えに関与する各種因子が直接或いは間接的に作用し得るように、当該遺伝子座全体のクロマチン構造を緩めることをいう。「弛緩」を引き起こす因子には、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、クロマチン構造変換因子（例えば、Ｓｗｉ／Ｓｎｆタンパク質、Ｉｓｗｉタンパク質、及びこれらのホモログ、及びこれらの機能複合体）などが含まれる。好ましい「弛緩」を引き起こす因子は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である。
「ヒストン脱アセチル化阻害剤」には、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性を抑制する活性を持つ抗体などのタンパク質因子、トリコスタチンＡ、ブチル酸及びバルプロ酸など小分子化合物など、当業者に知られているものであれば如何なるものも使用可能であると思われるが、最も好適にはトリコスタチンＡが使用される。
免疫細胞の抗体遺伝子座におけるクロマチン構造を弛緩させるために、弛緩を誘導する因子を、目的の免疫細胞中で発現させ又は該細胞と直接接触させる。弛緩を誘導する因子がタンパク質性の因子であって、細胞内で該因子を発現させてクロマチン構造の弛緩を誘起する場合、目的の細胞における該因子の発現にとって適切なプロモータ、ターミネータ、エンハンサー等を保持するベクターを目的の細胞に形質移入することにより達成される。該因子の免疫細胞内での発現は当業者にとって周知の方法によって容易に実施することが可能である（Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｃｅｌｌｓ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと）。弛緩を誘導する因子を目的の免疫細胞に直接接触させる場合は、該因子の濃度を一定に保ちながら培養する。弛緩を誘導する因子を発現させ又は接触させた細胞は、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを引き起こすために適切な時間、培養する。例えば、該因子がヒストンアセチル化酵素阻害剤のトリコスタチンＡである場合、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを引き起こすために適切な時間は、好ましくは、約２週間から約２年間、より好ましくは約２週間から約６週間であり、最も好ましくは約５週間であり、適切な濃度は、好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍｌから約５．０ｎｇ／ｍｌであり、最も好ましくは、１．２５ｎｇ／ｍｌである。
抗体遺伝子座におけるクロマチン構造変化の検出：
特定の遺伝子座領域におけるクロマチン構造の変化は、当該領域に対するＤＮａｓｅ感受性を指標として検出するのが一般的である。上述した方法による処理を行った細胞において、目的の遺伝子座領域のクロマチン構造が弛緩すると、その部分におけるＤＮＡ及びクロマチン構成タンパク質（ヒストン等）間の結合に緩みが生じると考えられる。その結果、クロマチン構成タンパク質と結合していたためにＤＮａｓｅにより切断されなかったＤＮＡ部分が、クロマチン構造の弛緩により緩むことで、ＤＮａｓｅに対して感受性を示すようになる。クロマチン構造の変化の前後における、ＤＮａｓｅに対する感受性の変化は、当該領域のＤＮＡ切断パターンを変化させることとなり、新たに生じたＤＮＡ断片をサザンブロット法等で検出することで、クロマチン構造が弛緩した遺伝子座領域を確認することができる。ここで、ＤＮａｓｅとしては、ＤＮａｓｅＩ、ＭＮａｓｅ（球菌ヌクレアーゼ）などが一般的に用いられる。
抗体遺伝子座における体細胞相同組換えの確認：
体細胞相同組換えの確認は、上述した方法による処理を行った細胞の抗体遺伝子座領域のゲノム配列を決定し、上述の処理を行っていないコントロールの細胞の抗体遺伝子座領域のゲノム配列と比較することで行う。抗体遺伝子座領域のゲノム配列の決定方法として、一般的には、該遺伝子領域を特異的なＤＮＡプライマーにより増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を適当な配列決定用のベクターに組込んで配列決定を行う。簡単には、目的の免疫細胞から調製したゲノムＤＮＡの抗体遺伝子座領域を増幅するのに必要なＤＮＡプライマー（例えば、目的の抗体遺伝子領域全体を含むように、該遺伝子の５’側近傍に正方向のプライマーを設計し、該遺伝子の３’側に逆方向のプライマーを設計する）を用意し、抗体遺伝子座領域をＰＣＲ法により増幅させる。増幅させる抗体遺伝子座領域は、抗体軽鎖遺伝子又は／及び抗体重鎖遺伝子のどちらかであり、好ましくは、何れかの遺伝子の可変領域がよい。増幅に使用されるＤＮＡポリメラーゼは市販のものを用いることができるが、長いＤＮＡ鎖の伸長が可能で、かつ正確性の高いものを使用することが望ましい。抗体遺伝子座領域の増幅を行うための条件は、使用するＤＮＡプライマーのアニール温度、使用するＤＮＡポリメラーゼの性質等に依存するが、例えば、９８℃２分間の反応後、９８℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃１分を２７サイクル、さらに７２℃で１５分間反応させる。反応後の増幅産物は、アガロースゲル電気泳動で分離し、目的抗体遺伝子座領域を含むＤＮＡのバンドを切り出し、ＤＮＡを回収後、配列決定用のベクターへ組込む。配列決定用のベクターは当該技術分野で用いられる如何なるベクターであってもよいが、例えば、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが用いられる。上記調製された配列決定用のベクター中の、抗体遺伝子座領域のＤＮＡ配列を解析し、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを誘導していない細胞由来の対応配列と比較して、体細胞組換えの程度を測定する。
抗体の発現の確認：
上述の記載に従い抗体遺伝子座における体細胞相同組換えが確認された細胞について、実際に抗体の発現が誘導されていることを確認する。
「多様な抗体」には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＹ及びＩｇＭが含まれる。
（ｉ）分泌された抗体の確認
体細胞相同組換えが行われた遺伝子座に由来する抗体が分泌型の場合、産生された抗体分子を含む培養上清について目的の抗体分子の存在を確認する。確認の方法としては、当業者にとって周知の如何なる方法によっても実施することが可能であるが、例えば、産生された抗体分子を特異的に認識する抗体による検出法（例えば、標識化した二次抗体を用いる、ウェスタンブロット法、エライザ法など）が一般的である。簡単には、培養上清をそのまま、ウェスタンブロット法、又はエライザ法等に用いることができる。産生された抗体の濃度が低い場合には、該培養上清から目的の抗体を濃縮した後、産生された抗体の確認を行うことができる。簡単には、該培養上清から硫安沈殿法（５０％硫安）等により抗体分子を濃縮沈殿させ後、抗体分子のペレットを適当なバッファー（例えば、ＰＢＳなど）に懸濁後、同バッファーに対して透析する。透析は透析外液を数時間毎に代えながら、硫安が除かれるまで行う。得られた抗体分子に対して、当該抗体分子を特異的に認識する抗体を用い、ウェスタンブロット法により直接又は間接的に産生抗体分子の検出を行う。あるいは、産生される抗体がＩｇＧである場合には、プロテインＡ又はプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより直接精製することで確認してもよい。
（ｉｉ）細胞膜上に発現されたＩｇＭの確認
体細胞相同組換えの促進により産生された抗体が、細胞膜上に提示されるＩｇＭの場合、抗ＩｇＭ抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析によって確認することができる。
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１：トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）処理後のＤＴ４０細胞の抗体遺伝子座領域におけクロマチン構造の解析
ＴＳＡにより実際に抗体軽鎖遺伝子のクロマチン構造に変化が生じているかどうかは、球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）感受性を指標とし、間接末端標識法を用いて解析した。ニワトリ抗体遺伝子にはＶＪ組換えを起こしたものと起こしていないものが存在するが、実際に抗体産生において機能しているのはＶＪ組換えを起こした側のみである事が知られている。しかしながら両者の配列は、ほぼ同一であることから、間接末端標識法をそのまま適用するだけでは、野生型ＤＴ４０細胞の、ＶＪ組換えを起こした遺伝子座のみを解析することは困難である。この問題を解決するために、ＶＪ組換えを起こしていない側において、サザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いる領域の周辺配列を欠失した変異株を作製し、この変異株を用いてＭＮａｓｅ感受性の解析を行った。
欠失変異株の作製：
抗体軽鎖遺伝子をクローニングしたプラスミド＃１８−４（京都大学医学系研究科、武田俊一教授より譲渡されたもの）を  ＥｃｏＲＩで消化し、二つ生じる断片のうち、大きい方とブラストサイシン耐性遺伝子（武田教授より譲渡されたもの）断片をライゲートし、大腸菌にトランスフォームした。これにより、定常領域及びサザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いる領域を含む領域が欠失し、それに代わりブラストサイシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミド（ＵＲ１）が得られた（図１）。このプラスミド約２０．ｇをＸｂａＩで消化して直線化し、既知の手法（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．Ｃｅｌｌ．１９９１  ６７（１）：１７９−８８．）に従ってＤＴ４０細胞に感染させ、欠失変異をもつＤＴ４０細胞株（３Ｈ１２）を作製した。
核の単離：
ＴＳＡ（０ｎｇ／ｍｌ，０．６２５ｎｇ／ｍｌ，１．２５ｎｇ／ｍｌ，２．５ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地で８時間培養した１０７−１０８の３Ｈ１２細胞含む培養液を３００ｇ，１５分遠心し、細胞を回収したのち、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、再び３００ｇで１５分遠心してペレットに回収した。その後、細胞を４ｍｌのＮｕｃｌｅａｒ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．３２Ｍ  Ｓｕｃｒｏｓｅ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁後、氷上で１５分間放置して細胞膜を除去した。１０００ｇで５分間遠心することで核を回収した。
ＭＮａｓｅ消化：
核のペレットをＲＳＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）１０ｍｌに再懸濁した。再び１０００ｇで５分間遠心して核を回収し、４００．ｌのＲＳＢに懸濁した。この核懸濁液のＤＮＡ濃度をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８の結合で測定し、１００．ｇ相当の懸濁液をＲＳＢで５００．ｌにした。これを各細胞ごとに４本ずつ用意した。０．５．ｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２、さらにＭＮａｓｅ（０Ｕ，０．０４Ｕ，０．２Ｕ，１Ｕ）を加え、３７℃で５分間消化後、２０．ｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡと１２．５．ｌの２０％ＳＤＳ、２．ｌの１５ｍｇ／ｍｌプロテイネースＫを加え、５０℃で一晩反応させた。５００．ｌのフェノールクロロホルムを添加し、３０分間、穏やかに震盪させた後、１．５Ｋｒｐｍで５分間遠心し、上層を回収し、新しいチューブに移した。クロロホルム５００．ｌをさらに加えて再び３０分間、震盪させ、１．５Ｋｒｐｍで５分間遠心したのち、上層を新しいチューブに移した。５０．ｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、１ｍｌの冷エタノールを加え、穏やかに混ぜた。１．５Ｋｒｐｍで２０分間遠心し、上清を除去後、８０％エタノールを５００．ｌ加えて穏やかに混ぜ、再び１．５Ｋｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去し、沈澱を風乾させた。ここに１００．ｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、５５℃で１時間保温し、その後４℃で一晩放置して溶解させた。
サザンブロット解析：
サザンブロット解析は、Ｃｈｕｒｃｈ及びＧｉｌｂｅｒｔ（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９８４  ８１（７）：１９９１−５．）の方法で行った。２０．ｇ相当のＤＮＡをスピンカラム（ファルマシア社ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０）で精製した後、制限酵素ＢｓａＡＩ（ＮＥＢ社）で消化した。その後フェノールクロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱でＤＮＡを回収したのち、ＴＡＥ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）バッファー中、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行った。ＤＮＡはＶａｃｕ  Ｇｅｎｅ  ＸＬ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりメンブレンにトランスファーした。最初に変成バッファー（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で１５分間変成させ次にトランスファーバッファー（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２５Ｍ  ＮａＯＨ）で４時間かけてトランスファーした。メンブレンは２０ｘＳＳＣで中和した後、ハイブリダイゼーションバッファー（１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，０．５Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ７．４），７％ＳＤＳ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で６２℃、１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、［．３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルしたプローブ５０ｎｇをハイブリダイゼーションバッファーで６２℃、一晩、ハイブリダイズさせた。その後、メンブレンを６５℃に加温したＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ７．４），１％ＳＤＳ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０ｍｌで６２℃，１０分間洗浄し、これをさらに４回繰り返して洗浄した後、メンブレンの放射活性をＢＡＳ２０００で解析した。なお、プローブＤＮＡは、ＰＣＲ法（ロッシュ社、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて作製した。その際プライマーは、ＡＴＣＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣ（配列番号１）および、ＧＴＴＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号２）を使用し、鋳型はニワトリ抗体軽鎖遺伝子をクローニングしたプラスミド＃１８−４を鋳型とした。
結果：
各濃度のＴＳＡ存在下において（０ｎｇ／ｍｌ，０．６２５ｎｇ／ｍｌ，１．２５ｎｇ／ｍｌ，２．５ｎｇ／ｍｌ）、添加するＭＮａｓｅ（０Ｕ，０．０４Ｕ，０．２Ｕ，１Ｕ）量を増加させたところ、ＴＳＡ濃度及びＭＮａｓｅ量の増加に伴い、ＶＪ領域が切断されて生じるＤＮＡ断片が出現することが確認された（図２、「ＶＪ」で示した位置のバンド、例えば、左から第５レーン目と第１７レーン目を比較する）。これらのバンドは、ＴＳＡ非存在下（０ｎｇ／ｍｌ）においてＭＮａｓｅ量を増加させても検出されなかったため（図２、左から第５レーン目）、ＶＪ領域がＭＮａｓｅにより切断されるためには、ＴＳＡの存在が必要であることを示す。以上の結果から、ＴＳＡによりＤＴ４０細胞株のＶＪ領域（抗体軽鎖遺伝子座領域）のクロマチン構造が弛緩し、この領域へのＭＮａｓｅのアクセシビリティーが増加したことが確認された。
実施例２：トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）によるＤＴ４０細胞中の抗体遺伝子座における体細胞相同組換え促進の確認
細胞培養：
ＤＴ４０細胞は、ＣＯ２恒温槽にて５％のＣＯ２、３９．５℃で培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００．ｇ／ｍｌ，２−メルカプトエタノール５５．Ｍを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、メタノールに５ｍｇ／ｍｌに溶解したものをストックとし、最終濃度が１．２５ｎｇ／ｍｌとなるように適宜培地で希釈して用いた。
細胞表面にＩｇＭを発現していないＤＴ４０細胞（以下、ＩｇＭ（−）細胞）を、約２０細胞／ｍｌに希釈して９６穴プレートに１００．ｌずつ分注した。この際、培地にトリコスタチンＡを１．２５ｎｇ／ｍｌ加えたものと、加えないものを用意した。シングルコロニーが現れるまで培養し、５クローン（ＴＳＡなしは６クローン）を新鮮な培地２ｍｌを入れた６穴プレートに移した。なお、この際ＴＳＡ濃度は当初の濃度を維持し、細胞濃度は１０５〜１０６個／ｍｌに保ちながら培養を続けた。
ゲノムＤＮＡの抽出：
上述の方法により３週間培養したＤＴ４０細胞の生細胞を蛍光活性化セルソーターで回収した。ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰにより、生細胞１０万個を１．５ｍｌチューブに集めた。シース液に懸濁された細胞を遠心（１０００ｇ，１０ｍｉｎ）により回収し、ペレットに直接３００．ｌのゲノム抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１００．ｇ／ｍｌプロテイネースＫ）を加え、５０℃で一晩消化した。翌日、７５０．ｌのエタノールを加え、穏やかに上下に反転させて混ぜた。ゲノムＤＮＡを遠心（１０００ｇ，１０ｍｉｎ）により回収し、７０％エタノールで洗い、風乾した。ここに１００．ｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、５０℃で３０分放置した後、４℃にて一晩かけて溶解させた。
抗体軽鎖遺伝子可変領域の配列の解析：
抗体軽鎖遺伝子可変領域の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ９６００）を利用した。ゲノムＤＮＡ溶液５．ｌ（細胞５０００個相当）を鋳型とし、プライマーは、上流（ＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＧ（配列番号３））、下流（ＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧ（配列番号４））それぞれ１０ｐｍｏｌを使用した。Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いて、５０．ｌスケールで反応させた。反応条件は、９８℃  ２分の後、９８℃  ３０秒、５７℃  ３０秒、７２℃  １分を２７サイクル行い、最後に７２℃  ５分反応させた。その後、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を１．ｌ加え、７２℃  １５分反応させた後、全反応液の２０．ｌ分をアガロースゲル電気泳動で分離した。軽鎖遺伝子可変領域に相当するバンドを切り出し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）によりＤＮＡを回収後、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションした。プラスミドを抽出し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）により配列を解析した。
結果：
増幅された抗体軽鎖遺伝子可変領域を、プラスミドベクターにクローニングしたものの配列をしらべてみたところ、図３の結果が得られた。トリコスタチンＡを加えて培養した細胞では、４２サンプルが１６種類に分類された（図３（ａ））。この多様性は、相同組換え、遺伝子挿入、遺伝子欠失、点変異により生じたものであることが分かった。一方、トリコスタチンＡ非存在下で培養した細胞では、３０サンプル調べたかぎりでは、相同組換えは見い出されなかった（図３（ｂ））。以上の解析結果より、トリコスタチンＡの添加により、ＤＴ４０細胞株での抗体軽鎖遺伝子の多様性が著しく上昇したと結論付けられる。
実施例３：トリコスタチンＡにＩｇＭ（＋）ＤＴ４０細胞の出現頻度の促進
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によるＩｇＭの発現の確認：
実施例２に記述した方法でトリコスタチンＡ処理を行ったＩｇＭ（−）細胞の約１０６個を含む培養液を１．５ｍｌチューブにとり、遠心により該細胞を回収（１０００ｇ、５分）し、染色バッファー（ＰＢＳ、０．３％ＢＳＡ）２００．ｌに懸濁した。細胞を再び遠心により回収し、次にＦＩＴＣラベルした抗ニワトリＩｇＭ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）を染色バッファーで１／２５０倍希釈したものを２００．ｌで懸濁し、氷上で１時間反応させた。細胞を遠心により回収し再び染色バッファー２００．ｌに懸濁し、これを遠心することで細胞の洗いを行った。この洗いのステップをもう一度繰りかえしたのち、細胞を５．ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ナカライ社）を含む染色バッファー１  １００．ｌに懸濁した。ＩｇＭを発現している細胞の割合は、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により、１００００細胞を測定して算出した。その際、ヨウ化プロピジウムにより染色される細胞は死細胞としてゲートアウトした。
結果：
一週間おきにＦＡＣＳでＩｇＭを発現している細胞（以下、ＩｇＭ（＋）細胞）の割合を測定したところ、図４のように、時間依存的にＩｇＭ（＋）の割合が増加するものが見られた。ＩｇＭ（＋）細胞は、ＩｇＭ（−）細胞が相同組換えを起こした結果生じたと考えられる。
実施例４：抗原特異的抗体の選択
抗原磁気ビーズの作製：
磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｄｙｎａｌ社）を用い、抗原との共役は解説書に従った。この際、磁気スタンドはＤｙｎａｌ  ＭＰＣ（Ｄｙｎａｌ社）を用いた。ビーズ２００μｌを５００μｌのＢｕｆｆｅｒＡ（０．１Ｍ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．４）で３回洗った後、ＢｕｆｆｅｒＡ４００μｌ中で２４０μｇのヤギＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社）またはヒトＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社）と３７℃で２４時間、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズをＢｕｆｆｅｒＣ（１０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＢＳＡ）５００μｌで２回洗浄した。その後ＢｕｆｆｅｒＤ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５，０．１％  ＢＳＡ）５００μｌを加え、３７℃で４時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後５００μｌのＢｕｆｆｅｒＣで２回洗浄した後、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＢｕｆｆｅｒＣ４００μｌに懸濁した。
抗原磁気ビーズによるセレクション：
抗原磁気ビーズによるセレクションは、Ｃｕｍｂｅｒｓらの方法（Ｃｕｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２０（１１）：１１２９−１１３４）に準じた。トリコスタチンＡ１．２５ｎｇ／ｍｌを含むＩＭＤＭ培地で６週間以上植え継いだ野生型ＤＴ４０細胞約５×１０７個をセレクションバッファー（１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）５ｍｌにより２回洗浄し、さらに１ｍｌのセレクションバッファーで洗浄した。その後細胞を１ｍｌのセレクションバッファーに懸濁したのち、１μｌ相当の抗原磁気ビーズ（セレクションバッファー１ｍｌで２回洗浄したもの）に加えた。４℃で１０分間、回転により攪拌しながら反応させた。以後の処理は、用いた抗原の種類によって若干の変更を加えているため、分割して記述する。
（ｉ）ヤギＩｇＧ磁気ビーズによるセレクション
ヤギＩｇＧ磁気ビーズでセレクションを行った細胞に関しては、磁気スタンドを用いて１ｍｌのセレクションバッファーで３回洗浄した。その後回収した細胞を５００μｌのセレクションバッファーに懸濁したのち、ＩＭＤＭ培地１０ｍｌに加え、これを９６穴プレートに１００μｌずつ分注した。９６穴プレートはＣＯ２インキュベーター中で４０℃で保温した。
（ｉｉ）ヒトＩｇＧ磁気ビーズによるセレクション
ヒトＩｇＧ磁気ビーズによるセレクションを行った細胞に関しては、磁気スタンドを用い、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（ＳＩＧＭＡ社）を含む１ｍｌのセレクションバッファーで３回洗浄した。その後回収した細胞を５００μｌのセレクションバッファーに懸濁したのち、ＩＭＤＭ培地３０ｍｌに加え、これを９６穴プレートに３００μｌずつ分注した。９６穴プレートはＣＯ２インキュベーター中で４０℃で保温した。
蛍光標識抗原による染色：
９６穴プレートの１個のウエルに由来する細胞約１０６個を含む培養液を１．５ｍｌチューブにとり、遠心により細胞を回収し、セレクションバッファー２００μｌで２回洗浄した。次にＦＩＴＣラベルした抗原（ヤギＩｇＧ、ヒトＩｇＧ、ウサギＩｇＧ（いずれもＳＩＧＭＡ社）、ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ社），オボアルブミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をセレクションバッファーで１０μｇ／ｍｌにしたもの２００μｌで懸濁し、氷上で１時間反応させた。細胞を遠心により回収し再びセレクションバッファー２００μｌに懸濁し、これを遠心することで細胞の洗いを行った。染色した細胞の蛍光強度は、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により測定した。
エライザ：
エライザは、ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＧＵＩＤＥ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）に準じて行った。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｓｕｒｆａｃｅ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）の各ウエルに抗原溶液（ＰＢＳで５μｇ／ｍｌにしたもの）２００μｌを加え、室温で一晩反応させ、抗原によるプレートのコートを行った。翌日ウエル中の液を捨て、そこにブロッキング液（０．５％スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μｌを加え、１時間反応させた。その後ウエルをＥＬＩＳＡ洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。ここに細胞の培養上清等、抗体を含む溶液１００μｌをくわえ、１時間反応させた。次にＥＬＩＳＡ洗浄液２００μｌで５回洗浄した。二次抗体は、ＨＲＰ標識した抗ニワトリＩｇＭヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）をＰＢＳで２０００倍に希釈したものを１００  ２００μｌ加え、一時間反応させた。二次抗体後の洗浄はＥＬＩＳＡ洗浄液２００μｌで５回行った。発色反応は、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）１００μｌにより行い、反応の停止は１Ｍ硫酸１００μｌにより行った。定量は、μＱｕａｎｔＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）により、４５０ｎｍの吸光を測定した。
エライザ用培養上清の作製：
エライザにより力価を解析した培養上清は、血清由来のＩｇＭ等を除去するため、以下のようにして調製した培地を用いた。ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ社）から５０％飽和硫安によりイムノグロブリンを沈殿として除去し、上清をＰＢＳに透析した。透析により生じた体積増加をＣｅｎｔｒｉ  Ｐｒｅｐ（Ａｍｉｃｏｎ社）による濃縮で補正し、抗体除去ニワトリ血清とした。これをＡＩＭ−Ｖ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に３％の濃度で加えた。ここに約１０６／ｍｌの濃度で細胞を加え、２日培養し、培養上清をとりエライザを行った。
結果：
トリコスタチンＡ１．２５ｎｇ／ｍｌを含む培地で６週間植え継いだＤＴ４０細胞約５×１０７個から、ヤギＩｇＧを共有結合させた磁気ビーズによりセレクションを行い、ヤギＩｇＧに結合する細胞の選択を試みた。磁気ビーズに結合した細胞は９６穴プレートに分注して培養した。その後生じたコロニーに由来する細胞の抗原結合性を検討した。ＦＩＴＣラベルしたヤギＩｇＧとの結合を、９クローンに関して  ＦＡＣＳにより解析したところ、うち１クローンで、強い蛍光が認められ、この細胞とヤギＩｇＧとの結合が示唆された（図５（ａ））。次に、この結合が特異的であるかどうかを検討するために、ＦＩＴＣラベルしたストレプトアビジン、およびオボアルブミンで同様の実験を行った。するとストレプトアビジン  ＦＩＴＣ、オボアルブミン  ＦＩＴＣいずれにおいても、蛍光強度の増大は認められず、細胞とヤギＩｇＧの結合は特異的なものであることが示唆された（図５（ｂ））。以上の結果は、トリコスタチンＡ処理により多様化した細胞表面のＩｇＭの中で、ヤギＩｇＧに特異的結合するものが生じ、それが抗原磁気ビーズにより選択されたことを示唆していると考えられる。
次に、ヤギＩｇＧ以外の抗原に対する抗体を産生する細胞を選別することが可能かどうかを検討するため、ヒトＩｇＧ磁気ビーズを用いてセレクションを行った。ここでは、陽性クローンの候補を得るために、エライザを行った。９６穴プレート中の細胞培養上清１００μｌにより、ヒトＩｇＧでコートしたイムノプレートを用いて解析したところ、１４個のウエル由来の培養上清に関して、著しく強い吸光度がみられた。次にこれらのウエル中の細胞を培養し、ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣにより染色し、ＦＡＣＳで解析した。代表的な例の結果を図６（ａ）に示す。いずれにおいても、低いものでも数倍、高いものでは数百倍の蛍光強度の増加が認められた。また、ｃｌｏｎｅ２０のように単一のピークを示すものも見られたが、ｃｌｏｎｅ７やｃｌｏｎｅ８のように複数のピーク、あるいはブロードな分布を示すものもみられた。これらの複数のピークやブロードなピークをもつ細胞集団を限外希釈して再度クローン化してやると、明確な単一のピークを示すものが得られた（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。このことから、ｃｌｏｎｅ７やｃｌｏｎｅ８のようなパターンを示すものは、９６穴プレートにおいて複数の陽性クローンが同一のウエルに存在していたことを示唆していると考えられる。
次に、ｃｌｏｎｅ７、８、２０について、抗原特異性を検討した（図６，（ｂ））。ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣ、ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ、ヤギＩｇＧ  ＦＩＴＣ、ストレプトアビジン  ＦＩＴＣ、オボアルブミン  ＦＩＴＣで染色し、ＦＡＣＳで解析した。ｃｌｏｎｅ７とｃｌｏｎｅ８に関しては、明確なヒトＩｇＧに対する特異性が認められた。一方ｃｌｏｎｅ２０の場合、ヤギＩｇＧに対しても若干の結合がみられ、異種のホモログに対しても交差することが明らかになった。なお、いずのクローンもウサギＩｇＧ、ストレプトアビジン、オボアルブミンに対する結合は認められなかった。
さらに、ｃｌｏｎｅ７およびｃｌｏｎｅ２０について、培養上清を用いてエライザを行った（図６（ｃ））。ヒトＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ストレプトアビジン、オボアルブミンでコートしたイムノプレートを用いたところ、ｃｌｏｎｅ７、ｃｌｏｎｅ８いずれにおいてもヒトＩｇＧに対して反応性を示し、ｃｌｏｎｃ７では５０倍希釈、ｃｌｏｎｅ２０では５００倍希釈まで、有意なシグナルが検出された。また、ｃｌｏｎｅ２０はＦＡＣＳ解析でヤギＩｇＧとの若干の反応性が認められたが（図６（ｂ））、ＥＬＩＳＡにおいても、弱いながら、ヤギＩｇＧとの反応が見られ、ＦＡＣＳ解析と一致した結果となった。なお、セレクションをかけていない細胞の培養上清はどの抗原に対しても特に反応は示さなかった。
【産業上の利用可能性】  本発明に係る体細胞相同組換えの促進方法によれば、所望の体細胞相同組換えを制御された状況下で誘起促進させることができ、よって、例えばタンパク質因子の創製に利用することが可能になる。
また、本発明に係る抗体作製方法によれば、培養細胞を用いて人工的に多様な抗体を作製することができる。
さらにまた、特定の疾病の治療に有効な抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体等）を生産するために作成された免疫細胞株（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａ１  ２００２００２８４８８）を用いることで、より治療効果を発揮する多様な抗体を、培養細胞系の利用により簡便かつ継続的に確保することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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