(57)【要約】各遺伝子から転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡがそれぞれ配列番号１−８９の塩基配列を有する全８９遺伝子の集合であるマウス精子形成遺伝子群、このマウス遺伝子群に属する遺伝子のヒトホモログであり、ヒト男性不妊に関連するＳｃｏｔ−ｔ遺伝子変異およびプロタミン−２遺伝子変異を提供する。またマウス精子形成遺伝子群とこれに係わる各種分子生物学的材料、または男性不妊関連遺伝子変異に係わる各種の分子生物学的材料、並びにこれらを用いた各種の試験方法および診断方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各遺伝子から転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡがそれぞれ配列番号１−８９の塩基配列を有する全８９遺伝子の集合であるマウス精子形成遺伝子群。
【請求項２】
請求項１のマウス精子形成遺伝子群に属する各遺伝子由来のｃＤＮＡによって構成されるｃＤＮＡライブラリー。
【請求項３】
請求項２のｃＤＮＡライブラリーに属する各ｃＤＮＡの連続１０〜９９塩基の塩基配列からなるＤＮＡ断片群。
【請求項４】
請求項１のマウス精子形成遺伝子群に属する各遺伝子ＤＮＡまたは請求項３のｃＤＮＡ群に属する各ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセット群。
【請求項５】
請求項２のｃＤＮＡ群に属する１以上のｃＤＮＡ、または請求項３のＤＮＡ断片群に属する１以上のＤＮＡ断片を備えたマイクロアレイ。
【請求項６】
配列番号９０−１６７の各アミノ酸配列からなる全７８のポリペプチドの集合であるマウス精子形成ポリペプチド群。
【請求項７】
請求項６のマウス精子形成ポリペプチド群に属する各ポリペプチドに対する抗体群。
【請求項８】
請求項１のマウス精子形成遺伝子群に属する１以上の遺伝子の発現変調または変異を検出することによって、被験物質の毒性または変異原性を試験する方法。
【請求項９】
請求項１のマウス精子形成遺伝子群に属する１以上の遺伝子の発現変調または変異を検出することによって、被験個体の生殖能力を診断する方法。
【請求項１０】
ヒト男性不妊関連遺伝子Ｓｃｏｔ−ｔから転写されるｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１６８のＤＮＡ配列において、以下の群：
第１２９位ｔがｃに置換；
第８７０位ｔがｇに置換；
第１０７１位ｃがｔに置換；および
第１６６７位ｔがｃに置換
より選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチドまたはその相補配列。
【請求項１１】
請求項１０のポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む１０〜９９の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列。
【請求項１２】
請求項１０のポリヌクレオチドまたは請求項１１のオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１０のポリヌクレオチド、請求項１２のポリヌクレオチド、または請求項１２のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む１５〜４５の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
【請求項１４】
ヒト男性不妊関連遺伝子プロタミン−２から転写されるｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１７３のＤＮＡ配列において第２４８位ｃがｔに置換されているポリヌクレオチドまたはその相補配列。
【請求項１５】
請求項１４のポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む１０〜９９の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列。
【請求項１６】
請求項１４のポリヌクレオチドまたは請求項１５のオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１４のポリヌクレオチド、請求項１６のポリヌクレオチド、または請求項１６のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む１５〜４５の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
【請求項１８】
請求項１０または１２のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号１６９のアミノ酸配列において、以下の群：
第３８位ＬｅｕがＰｒｏに置換；
第２８５位ＬｅｕがＡｒｇに置換；および
第３５２位ＴｈｒがＭｅｔに置換；
より選択される１以上の変位を有するポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１４または１６のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号１７４のアミノ酸配列の第１−４９位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１８のポリペプチドの一部であって、変異箇所を含む５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項２１】
請求項１９のポリペプチドの一部であって、５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項２２】
請求項２０のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
【請求項２３】
請求項２１のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
【請求項２４】
配列番号１７４の第５０−９１位、または配列番号１７５の第１−１１位のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
【請求項２５】
ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した染色体ＤＮＡ中に請求項１２または請求項１６のポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項２６】
被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、請求項１０または１４のポリヌクレオチド、または請求項１１または１５のオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する請求項２５の方法。
【請求項２７】
被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、請求項１３または１７のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する請求項２５の方法。
【請求項２８】
ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項１８または１６のポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項２９】
被験者から単離した生体試料中に、請求項２２の抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出する請求項２８の方法。
【請求項３０】
被験者から単離した生体試料中に、請求項２３の抗体には反応し、請求項２４の抗体には反応しないポリペプチドが存在するか否かを検出する請求項２８の方法。
【請求項３１】
請求項１１または１５のオリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするＤＮＡプローブ。
【請求項３２】
請求項１１および／または請求項１５のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項３３】
請求項２２、２３または２４の抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、マウスの精子形成に関与する遺伝子（ｍｏｕｓｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｇｅｎｅ：以下「ＭＳＧ」と記載することがある）の集合（遺伝子群：ＭＳＧｓ）と、このＭＳＧｓを用いた診断システムに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＭＳＧｓに属する各遺伝子および遺伝子材料（精製ポリヌクレオチド、遺伝子発現産物であるポリペプチド、抗体等）を用いて、ＭＳＧの発現変調、変異、アミノ酸置換等を検出することを特徴とする毒性試験、変異原性試験、および遺伝子診断等の各方法に関するものである。この発明の方法は、医薬品や化学品の変異原性試験および毒性試験（生殖に及ぼす影響に係る試験を含む）、あるいは環境ホルモンまたは内分泌攪乱物質の検出・環境測定および環境アセスメントとして使用しうる。さらに、この発明の遺伝子および遺伝子材料、並びに各方法発明は、男性不妊症の診断・治療・予防の方法に関する医療技術の開発、また、その診断剤・治療薬・予防薬あるいは避妊薬の開発に寄与するものである。
またこの出願の発明は、前記ＭＳＧｓに含まれるマウス遺伝子のヒトホモログであるヒト男性不妊関連遺伝子の変異や発現変化と、これら遺伝子多型を検査対象とする男性不妊の診断方法に関するものでる。さらに詳しくは、点突然変異あるいは遺伝子多型によって特徴付けられる男性不妊関連遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドと、その遺伝子産物である変異ポリペプチド、並びにこれらの変異ポリヌクレオチドまたは変異ポリペプチドを対象とする男性不妊の診断方法に関するものである。また上記マウスＭＳＧと同様にヒトホモログから得られる情報ともとにした遺伝子材料を用いて、男性不妊の診断・治療・予防に関する医療技術の開発またその診断剤・治療薬・予防薬あるいは避妊薬の開発に寄与するものである。
背景技術
マウス精子形成遺伝子
内分泌攪乱物質（ｅｎｄｏｃｒｉｏｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ：以下「ＥＤ」と記載することがある）という概念の提唱（１９９７年）以来、このＥＤによる精子数減少や生殖機能障害等の誘発の危険性が広く周知となり、人類存亡の危機意識を高めると共に、ＭＳＤＳ（ｍａｔｅｒｉａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｄａｔａ  ｓｈｅｅｔ）やＰＲＴＲ（ｐｏｌｌｕｔａｎｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｅｇｉｓｔｅｒｓ）等の展開によるグローバルな環境保全対策に拍車をかけ、ＥＤの検出あるいは測定の方法、ＥＤの生体に及ぼす影響の確認は、今や急務の課題になっている。さらに、医薬品、化学薬品、化学品、化学物質等に関する従来の「生殖に及ぼす影響」の試験は、催奇性を指標とする試験に過ぎなかった。しかしながら、ＥＤによる生殖機能障害誘発の逼迫した危険性を回避・払拭するには、従来の催奇性試験だけでは不備かつ不足であり、「生殖に及ぼす影響」に係る試験を含む毒性試験には、「哺乳動物の精子形成遺伝子またはそのヒト相同遺伝子に対する変異原性」の検出、あるいは精細胞とその分化・精子形成過程に及ぼす影響の試験（例えば、マウス精巣やｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＳＧの発現変調、変異、アミノ酸置換等を指標として用いる毒性試験や検定）を追加する必要があり、これは切実な必須課題であると考えられる。
しかしながら、現在のところ、精子形成遺伝子の発現変調や変異を指標とした毒性試験（生殖に及ぼす影響に係る試験）、変異原性試験、ＥＤ検出等に関する技術は知られていない。その原因は、試験の対象として使用しうる精子形成遺伝子が特定されていなかったことによる。
また、日本をはじめとした欧米先進諸国では全夫婦の約１０％が何らかの形態の不妊問題を経験していることが知られており、これらの約半数が男性側の因子に起因している可能性がある。男性不妊の原因の一部として示唆されているのは、内分泌障害、染色体異常を含む遺伝的因子、環境因子、潜伏精巣や精索静脈瘤を含む奇形などである（Ｒｕｂｉｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１；１０：２０８４−２０９２；Ｌｅｅ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｕｒｏｌ．，１６４（５），１６９７−１７０１）。しかしながら男性不妊の原因の大半は不十分な精子形成や精子欠失であり、この問題の原因は現時点では未解明である（Ｃｒａｍ  ＤＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ  ２２（５），７３８−７４６）。また男性不妊の中には様々な遺伝的因子に関係すると考えられる事例が存在するが（Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ  ＢＦＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔ  Ｇｙｎｅｃ  １９９８；８１：２１７−２２５）、それらの全てについて原因遺伝子が特定されている訳ではない。従って、男性不妊症の診断・治療・予防の方法の確立（例えば、遺伝子診断とその結果に基づく遺伝子治療・薬剤療法・予防の達成）は、人類に多大の福音をもたらす待望の課題である。さたに、発展途上国での多出生に伴う貧困・飢餓や栄養失調、エイズ等感染症の蔓延等を想起するとき、避妊薬の開発もまた重要課題であると思惟される。
前記のとおり、毒性試験や変異原性試験によるＥＤ等の効果的な検出、あるいは男性不妊症の確実な診断のためには、精子形成遺伝子を対象とした分子生物学的なアプローチが不可欠である。しかしながら、現時点では、そのような試験に使用しうる精子形成遺伝子（群）は特定されておらず、また当然のことながら、そのような遺伝子（群）を各種の試験に適用するための手段も何ら提案されていない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＥＤ検出等に係る毒性試験、変異原性試験または遺伝子診断に使用しうるマウス精子形成遺伝子群（ＭＳＧｓ）と、そのような試験を実施するための材料としての精製ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体等を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、ＭＳＧｓを用いた毒性試験、変異原性試験および遺伝子診断の各方法を提供することを課題としている。
ヒト男性不妊関連遺伝子変異
この出願の発明者らは、前記のＭＳＧｓに属するマウス遺伝子のヒトホモログについて男性不妊との関係を広範に調査した結果、ヒトＳｃｏｔ−ｔ遺伝子およびプロタミン遺伝子における特定の変異と男性不妊との関係を見出した。なお、Ｓｃｏｔ−ｔ遺伝子およびプロタミン遺伝子と男性不妊との関係については以下が知られている。
スクシニルＣｏＡ：３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＯＸＣＴ／ＳＣＯＴ）はケトン体のエネルギー代謝における重要な酵素の一つであり、このケトン体は肝臓で生産され、末梢組織に輸送されてエネルギー源として用いられる（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＧＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．１９９５；１８：１９３−２１６）。スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）はいくつかの組織のミトコンドリア内に局在しており、ＣｏＡ部分をスクシニルＣｏＡからアセト酢酸に転移させてアセトアセチルＣｏＡの形成を触媒するが、これはさらに分解され、トリカルボン酸サイクルに入ることが可能な２個のアセチルＣｏＡ分子になる（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１２１，４１−４７；Ｔｉｌｄｏｎ  ＪＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９７２；５１：４９３−４９８）。ＳｃｏｔのｃＤＮＡはブタおよびヒト心臓よりクローンされているが（Ｌｉｎ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｂｒｉｄｇｅｒ，Ｗ．Ａ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，９７５−９７８；Ｋａｓｓｏｖｓｋａ−Ｂｒａｔｉｎｏｖａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９６；５９：５１９−５２８）、この出願の発明者等はこれまでに、半数体の生殖細胞特異的なＳＣＯＴをコードするｓｃｏｔ−ｔと名付けられた新規遺伝子を、マウス精巣の差分化ｃＤＮＡライブラリよりクローニングしている（Ｋｏｇａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２０００；６３：１６０１−１６０９）。ＳＣＯＴ−ｔは生殖細胞に特異的なＳＣＯＴのイソ型であり、半数体精子と精子のミトコンドリア中に存在しており、精子形成や精子のエネルギー代謝にも特有の役割を果たしていると考えられている。ノーザンブロット、ウェスタンブロットおよび免疫組織科学的分析によれば、マウスｓｃｏｔ−ｔの発現は精巣（特に後期精子細胞中）において検出されたが、他の体細胞中では検出されなかった。マウスｓｃｏｔ−ｔのヌクレオチド配列は、ブタおよびヒト心臓のＳｃｏｔに対してそれぞれ６３．４％および６２．７％の同一性があり、推定されたアミノ酸配列はそれぞれ６８．０％および６７．４％の同一性があった。ＳＣＯＴ−ｔのＮＨ２末端の１−３９残基はミトコンドリアを標的とするシグナル配列を形成している。免疫蛍光染色では実際に、精巣上体尾部から得た固定精子中におけるＳＣＯＴ−ｔタンパク質のミトコンドリアへの局在が示されている（Ｋｏｇａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２０００；６３：１６０１−１６０９）。ＳＣＯＴ−ｔのアミノ酸配列にはグルタミン酸残基が１箇所存在しているが（アミノ酸残基：３４１）、これはＳＣＯＴを含む全てのＣｏＡトランスフェラーゼ中で保存されていることが知られているグルタミン酸３４４に対応するものである（Ｒｏｃｈｅｔ  ＪＣ，Ｂｒｉｄｇｅｒ  ＷＡ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，３，９７５−８１）。この出願の発明者らはまた、マウスｓｃｏｔ−ｔのヒトオーソログのクローニングおよび特徴付けを行った。ヒトＳｃｏｔ−ｔのｍＲＮＡのコーディング領域全体と推定アミノ酸配列は、マウスｓｃｏｔ−ｔに対してそれぞれ��５．４％および７５．８％の同一性を示した。同様に発明者らは、ｈ−Ｓｃｏｔ−ｔがイントロンを持たない単一遺伝子であり、精巣内で特異的に発現することを示している（Ｔａｎａｋａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１；８：１６−２３）。
精子の運動性と機能におけるエネルギー代謝においてミトコンドリア酵素の重要性が幾つか報告されている（Ｐａｓｃｕａｌ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ，Ｒｅｐ．，１６，３５−４０；Ｙｅｕｎｇ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２，５９１−５９６；Ｒｕｉｚ−Ｐｅｓｉｎｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４４，１６１６−１６２０）。Ｓｃｏｔ−ｔが特異的に存在する事実は、ケトン体を精子運動のためのエネルギー源として利用する新しい代謝系の存在を示すと考えられる。さらに、Ｓｃｏｔ−ｔは半数体の精子細胞で特異的に発現していることから、精子形成においてこれが何らかの特異的な役割を持つことも示唆される。
また、精子形成段階では精子核に著しい再編成が生じるが、この過程ではヒストンが除去されて特定の核タンパク質による置換を受け、最終的に高い陽電荷を帯びたプロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）により置換されて、高度に圧縮される（Ｗｏｕｔｅｒｓ−Ｔｙｒｏｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８０，１１７−１２８；Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ  Ｐ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，２１７６−２１７８）。ヒト精子のＤＮＡはプロタミン−１および−２の２種類のプロタミンによって、高度に凝縮した状態で精子頭部にまとめられている。プロタミン−１は５０個のアミノ酸を有する単一のポリペプチド分子であるが、プロタミン−２は５７個および５４個のアミノ酸を有する少なくとも２個の異なる形態の複合体である（ＭｃＫａｙ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８，３６１−３６６）。プロタミン−２ファミリータンパク質は第１６染色体に存在する単一のコピー遺伝子を元に、６６個から１０１個の間の残基を有する前駆体として合成される（Ｋｒａｗｅｔｚ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．５，６３９−６４５；Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｈｅｒｅｄ，８０，４４２−４４６）。
核濃縮障害の結果として男性不妊が生じる可能性があることが示唆されている。マウスにおいて、プロタミン−１のｍＲＮＡの早期翻訳の結果、未成熟な核濃縮が生じて精子の分化が停止する（Ｌｅｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１２４５１−１２４５５）。不妊患者を対象とした様々な研究ではプロタミン−２含有量の減少が報告されており（Ｂａｌｈｏｒｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ．，４４，５２−５５；Ｂｅｌｏｋｏｐｙｔｏｖａ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３４，５３−５７）、一部の男性不妊患者の精子核に完全に選択的なプロタミン−２欠損が見られるという報告もなされている（ｄｅ  Ｙｅｂａ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１０５５３−１０５５７）。しかしながら、その後これらの患者より得たプロタミン−２遺伝子の配列解析の結果では、検出されたプロタミン−２減少の原因となる変異の存在は見られなかった（ｄｅ  Ｙｅｂａ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１０５５３−１０５５７；Ｓｃｈｌｉｃｋｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．，９，２３１３−２３１７）。また一部の不妊症患者ではプロタミン−２前駆体分子のプロセッシングが不完全であるため、プロタミン−２減少が生じることが示唆されている（ｄｅ  Ｙｅｂｒａ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．，６９，７５５−７５９）。
以上のとおり、Ｓｃｏｔ−ｔ遺伝子やプロタミン遺伝子の何らかの変異が男性不妊に関連づけられることが指摘されているが、その実体は全く解明されていない。この出願の発明は、ヒト男性不妊の原因遺伝子としてＳｃｏｔ−ｔ遺伝子変異と、プロタミン−２遺伝子変異を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、前記の遺伝子変異に伴って発現する変異ポリペプチド、この変異ポリペプチドに対する抗体、並びに、これらの変異遺伝子や変異ポリペプチドを検査対象とする男性不妊診断方法を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、以下のマウス精子形成遺伝子群と、これを利用した発明を提供する。
すなわちこの発明は、各遺伝子から転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡがそれぞれ配列番号１−８９の塩基配列を有する全８９遺伝子の集合であるマウス精子形成遺伝子群を提供する。
この発明は、前記のマウス精子形成遺伝子群に属する各遺伝子由来のｃＤＮＡによって構成されるｃＤＮＡライブラリーを提供する。
この発明は、前記のｃＤＮＡライブラリーに属する各ｃＤＮＡの連続１０〜９９塩基の塩基配列からなるＤＮＡ断片群を提供する。
この発明は、前記遺伝子群に属する各遺伝子ＤＮＡまたは前記ｃＤＮＡ群に属する各ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセット群を提供する。
この発明は、前記ｃＤＮＡ群に属する１以上のｃＤＮＡ、または前記ＤＮＡ断片群に属する１以上のＤＮＡ断片を備えたマイクロアレイを提供する。
この発明は、また、配列番号９０−１６７の各アミノ酸配列からなる全７８のポリペプチドの集合であるマウス精子形成ポリペプチド群を提供する。
この発明は、前記の精子形成ポリペプチド群に属する各ポリペプチドに対する抗体群を提供する。
この発明は、さらに、前記のマウス精子形成遺伝子群に属する１以上の遺伝子の発現変調または変異を検出することによって、被験物質の毒性または変異原性を試験する方法を提供する。
この発明は、またさらに、前記のマウス精子形成遺伝子群に属する１以上の遺伝子の発現変調または変異を検出することによって、被験個体の生殖能力を診断する方法を提供する。
この出願は、前記のマウス精子形成遺伝子群に属する１以上の遺伝子の発現変調または変異を検出することによって、被験個体の生殖能力を診断する方法を提供する。
すなわち、前記発明のＭＳＧｓは、「精子形成遺伝子の発現変調と変異の検出は、毒性試験（特に生殖毒性試験）および変異原性試験に利用できる」という着想に基づき、主として以下の３種類の方法によってクローニングされたものである。
（ａ）モノクローナル抗体を用いたクローニング
精子形成の各過程を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、目的遺伝子（群）を特定した。すなわち、マウスの精巣から細胞抽出画分を得、ラットに免疫し、充分に免疫したのち得られた脾臓細胞をミエローマ細胞と細胞融合させハイブリドーマを作成した。得られた各々のハイブリドーマから、精細胞を特異的に認識する抗体を作成するハイブリドーマを探し出すため、各々のハイブリドーマの培養上清がどのような抗原を認識する抗体を産生しているかを、精巣の切片を用い反応させてスクリーニングを行い、精細胞特異的抗体を産生するハイブリドーマを得た。得られたモノクローナル抗体を用い、抗体が認識する抗原蛋白質をコードする遺伝子を大腸菌発現マウス精巣ライブラリーからクローニングした。
（ｂ）ポリクローナル抗体を用いたクローニング
精細胞（全ての分化段階の細胞を含む）を特異的に認識するポリクローナル抗体を作製し、目的遺伝子（群）を特定した。すなわち、マウスの精巣から精細胞抽出画分を得、ウサギに充分免疫し、得られた血清を去勢雄のマウスの腹腔に打ち、精細胞以外を認識する抗体を吸収させた。、そのマウスの血清成分を集め、さらにマウスの肝臓抽出画分と反応させ、得られた血清に含まれるウサギ抗体が認識する抗原遺伝子を大腸菌発現マウス精巣ライブラリーからクローニングした。
（ｃ）サブトラクテッドライブラリーを用いたクローニング
精細胞特異的遺伝子群を濃縮したサブトラクテッドライブラリーを作成し、各分化段階において特異的に発現する遺伝子群のクローニングを行い、得られた各クローンの機能を解析した。特に、精子細胞は動物個体に長期間多数存在する唯一の半数体細胞であり、そのような精子細胞において特異的に発現する遺伝子群は、精子形成のために特化した機能をそれぞれ発揮するので、これ等の遺伝子群を包括的にクローニングし、精子形成に特異的な現象の解析を行った。具体的には、すべての分化段階の精細胞を有する３５日齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）精巣ｃＤＮＡライブラリーから、精子細胞を持たない１７日齢マウス精巣で発現しているｍＲＮＡを差し引いたサブトラクテッドライブラリーを作成し、このライブラリーから精子細胞の形態形成期において特異的に発現している遺伝子群を得た。
以上（ａ）〜（ｃ）の方法により、最終的に、合計８９クローンの精細胞特異的遺伝子ｃＤＮＡ（ＭＳＧｓ  ｃＤＮＡ）を得た。そして、公知の方法によって各ｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、それらのｃＤＮＡが、配列番号１−８９の奇数配列番号に示した塩基配列からなることを確認した。また、既報の種々の塩基配列との間のホモロジー検索を行い、８９個のＭＳＧクローンのうち、既知遺伝子は約２６％、相同遺伝子は３２％、そして特に、未知遺伝子が４２％にも達することを見いだした。
表１は、配列番号１−８９に塩基配列を示した全８９遺伝子の、左から、「配列番号」、「遺伝子名」（公知なもの）、「データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号」、その遺伝子がコードする「ポリペプチドの配列番号」、およびその「コード領域」を示した。
2003068969.tif 000002
2003068969.tif 000003
さらにまた、上記ＭＳＧクローン群において次の知見（１）〜（３）を得た。
（１）遺伝子構造に関し、ＭＧＳの８９クローンの多数においてイントロンがなく、また、イントロンが存在しても非常に少ないものが多数をしめる。
（２）ＴＡＴＡ、ＣＡＡＴ、ＧＣモチーフ等の既知転写関連因子結合配列を持たないものが多い。
（３）発現時期は、精子形成の段階に特異的である。例えば、始原生殖細胞→精原細胞→精母細胞→精子細胞（半数体）→精子→雌性生殖管内での受精能獲得までの過程において、精子細胞→精子の段階においてのみ特異的に発現する遺伝子が多数存在する。
（４）発現産物の作用と機能に関し、体細胞に対する生殖細胞に特有のアイソフォームが存在し、精子形成の各段階においてだけ、かなり特異的に活性を呈するものが見られる。例えば、受精過程においてだけ、その作用を発揮するものが存在する。
これらの知見のうち、イントロンに係る上記（１）と（３）は特に重要である。すなわち、「精子形成に関与する遺伝子の構造と転写は（１）比較的単純であり、変異の検出が困難ではなく、しかも遺伝子に変異が起こったとしても、その（３）発現は生殖細胞だけに止どまり、変異形質は体細胞には現れず、生殖にのみ障害が現れ不妊となる」ことを示唆するものであり、その発現変調や変異を検出することによって、生殖毒性試験や変異原性試験として利用可能であることと判断されるからである。
なお、表１および前記のＭＳＧｓに関する知見の一部は、この出願の発明者らによって発表された以下の文献に詳細が記載されている：Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．２０：３６１−３６６，１９９７；Ｇｅｎｅ  ２０４：１５９−１６３，１９９７；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６：１３８−１４２，１９９７；Ｍａｍｍａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  ８：８７３−８７４，１９９７；Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｔ．７８：１０３−１０４，１９９７；Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：６０７−６１１，１９９７；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９７：６７−７６，１９９８；Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ  ５８：２６１−２６５，１９９８；Ｇｅｎｅ  ２３７：１９３−１９９，１９９９；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７０４９−１７０５７，１９９９；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５６：３１５−３２１，１９９９；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５７：９４−１０１，１９９９；Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６２：１６９４−１７０１，２０００；Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６３：９９３−９９９，２０００；Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ５：２６５−２７６，２０００；Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６３：１６０１−１６０９，２０００；Ｇｅｎｅ  ２６７：４９−５４，２００１；Ｍｏｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．７：２１１−２１８，２００１。
さらにこの出願は、前記のマウス精子形成遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、ヒト男性不妊に関連した遺伝子変異の発明と、この遺伝子変異の利用発明を提供する。
すなわちこの発明は、ヒト男性不妊関連遺伝子Ｓｃｏｔ−ｔから転写されるｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１６８のＤＮＡ配列において、以下の群：
第１２９位ｔがｃに置換；
第８７０位ｔがｇに置換；
第１０７１位ｃがｔに置換；および
第１６６７位ｔがｃに置換
より選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチド（Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチド）またはその相補配列を提供する。
この発明は、前記のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む１０〜９９の連続したＤＮＡ配列からなるＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドまたはその相補配列を提供する。
この発明は、前記Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドまたはＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド（Ｓｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチド）を提供する。
この発明は、前記Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチド、Ｓｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチド、またはＳｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む１５〜４５の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットを提供する。
この発明は、ヒト男性不妊関連遺伝子プロタミン−２から転写されるｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１７３のＤＮＡ配列において第２４８位ｃがｔに置換されているポリヌクレオチド（プロタミン−２変異ポリヌクレオチド）またはその相補配列を提供する。
この発明は、プロタミン−２変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む１０〜９９の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチド（プロタミン−２変異オリゴヌクレオチド）またはその相補配列を提供する。
この発明は、前記のプロタミン−２変異ポリヌクレオチドまたはプロタミン−２変異オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド（プロタミン−２変異ゲノムポリヌクレオチド）を提供する。
この発明は、前記のプロタミン−２変異ポリヌクレオチド、プロタミン−２変異ゲノムポリヌクレオチド、またはプロタミン−２変異ゲノムポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む１５〜４５の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットを提供する。
この発明は、前記のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドまたはＳｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号１６９のアミノ酸配列において、以下の群：
第３８位ＬｅｕがＰｒｏに置換；
第２８５位ＬｅｕがＡｒｇに置換；および
第３５２位ＴｈｒがＭｅｔに置換；
より選択される１以上の変位を有するポリペプチド（Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチド）を提供する。
この発明は、前記のプロタミン−２変異ポリヌクレオチドまたはプロタミン−２変異ゲノムポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号１７４のアミノ酸配列の第１−４９位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド（プロタミン−２変異ポリペプチド）を提供する。
この発明は、前記のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドの一部であって、変異箇所を含む５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（Ｓｃｏｔ−ｔ変異オリゴペプチド）を提供する。
この発明は、前記のプロタミン−２変異ポリペプチドの一部であって、５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（プロタミン−２変異ポリペプチド）を提供する。
この発明は、前記のＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴペプチドを抗原として作製された抗体（抗変異Ｓｃｏｔ−ｔ抗体）、および前記のプロタミン−２変異オリゴペプチドを抗原として作製された抗体（抗変異プロタミン−２抗体）をそれぞれ提供する。
この発明は、配列番号１７４の第５０−９１位、または配列番号１７５の第１−１１位のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを抗原として作製された抗体（抗プロタミン−２抗体）を提供する。
この発明はまた、ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した染色体ＤＮＡ中にＳｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドまたはプロタミン−２変異ゲノムポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法を提供する。
上記の診断方法においては、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドまたプロタミン−２変異ポリヌクレオチド、またはＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドまたはプロタミン−２変異オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出することを好ましい態様としている。またこの診断方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記のそれぞれのプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出することを好ましい態様としてもいる。
この発明は、ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中にＳｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドまたはプロタミン−２変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法を提供する。
上記の診断方法においては、被験者から単離した生体試料中に、抗変異Ｓｃｏｔ−ｔ抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出することを好ましい態様としている。またこの診断方法では、被験者から単離した生体試料中に、抗変異プロタミン−２抗体には反応し、抗プロタミン−２抗体には反応しないポリペプチドが存在するか否かを検出することを好ましい態様としてもいる。
この発明は、前記のＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドまたはプロタミン−２変異オリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするＤＮＡプローブを提供する。
この発明は、前記のＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドおよび／またはプロタミン−２変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＤＮＡチップを提供する。
この発明は、前記の抗変異Ｓｃｏｔ−ｔ抗体、抗変異プロタミン−２抗体または抗プロタミン−２抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体を提供する。
すなわち、この出願の発明者らは、Ｓｃｏｔ−ｔ遺伝子について５１６名の男性（不妊症２５５例、健常者２６１例）およびプロタミン遺伝子について４９６名の男性（不妊症２２６例、健常者２７０例）のＤＮＡ資料について分析した結果、それぞれのｃＤＮＡ（Ｓｃｏｔ−ｔ：配列番号１６８、プロタミン−１：配列番号１７０、プロタミン−２：配列番号１７３）には、表２に示したようなヌクレオチド変異と、それに伴うアミノ酸変異が存在することを見出した。特にＳｃｏｔ−ｔの一塩基置換およびアミノ酸変異、並びにプロタミン−２における一つの塩基置換によるタンパク質の短縮化が、男性不妊の原因として重要であることを見出した。なお、配列番号１６８は、公知のヒトＳｃｏｔ−ｔ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＢ０５０１９３）の第４−１７６０塩基配列に相当する。配列番号１７０は、公知のヒトプロタミン−１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｍ６０３３１）の第５３２−１０８９塩基配列に相当する。また配列番号１７３は公知のヒトプロタミン−２  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｍ６０３３２）の第８０４−１６２９塩基配列に相当する。表２におけるヌクレオチド変異およびアミノ酸変異の位置（数字）は、配列表の塩基位置およびアミノ酸位置に対応する。また「−」は非コード領域であることを示し、「Ｓｉｌｅｎｔ」はヌクレオチド変異にともなってアミノ酸が変異しないことを示す。「＊＊＊」は停止コドンに変異したことを示す。また「ｄｅｌｅｔｉｏｎ」はヌクレオチドの欠失を、「ａｄｄｉｔｉｏｎ」はヌクレオチドの付加を示す。
2003068969.tif 000004
この出願の各発明において、「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡに存在し、特定のポリペプチド（タンパク質）をコードする２本鎖ＤＮＡであり、そのコード領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｇ  ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）、およびＯＲＦに対する発現制御領域（プロモーター／エンハンサー配列、リプレッサー配列）を含む。
この出願の発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のヌクレオチド鎖であり、ポリヌクレオチドが１００ｂｐ以上、オリゴヌクレオチドが１００ｂｐ未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
この出願の発明において、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のペプチド鎖であり、ポリペプチドが３０アミノ酸残基以上、オリゴペプチドが３０アミノ酸残基未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
また、以下の説明において、「生殖に及ぼす影響」とは、催奇性ではなく、精子形成および妊よう性に及ぼす影響を意味する。
さらに、この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術や分子生物学的技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等）に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
発明を実施するための最良の形態
この発明のマウス精子形成遺伝子群（ＭＳＧｓ）は、各遺伝子から転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが、それぞれ配列番号１−８９の塩基配列を有する全８９遺伝子の集合である。
ｃＤＮＡは、前記のとおりの（ａ）〜（ｃ）のクローニング方法、またはそれらを組み合わせることによって特定することができる。これらの方法はいずれも公知の方法であり、当業者であれば過度の実験等を必要とすることなく、行うことができる。例えば、方法（ｃ）のサブトラクション法の操作の基本手順は、一般的なテキスト（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：５．８．９−５．９．２０，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７〜）に例示されている。すなわち、（ｉ）すべての分化段階の精細胞を有する成熟マウス、例えば３５日齢マウスの精巣からトータルＲＮＡおよびｍＲＮＡを抽出・精製の後、そのｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、別途に、（ｉｉ）精細胞が未だ分化していない未成熟マウス、例えば１７日齢マウスの精巣からトータルＲＮＡとｍＲＮＡとを抽出・精製し、そのｍＲＮＡを、例えば、ビオチンで標識する。次いで、（ｉｉｉ）上記ｃＤＮＡライブラリーと過剰濃度のビオチン標識ｍＲＮＡとの間でハイブリダイゼーションを行い、これ等両者が形成するハイブリッドおよび残存する過剰のビオチン標識ｍＲＮＡを共にアビジンとの凝集反応により除去し、サブトラクテッドｃＤＮＡライブラリーを作成する。そして、（ｉｖ）上記サブトラクテッドｃＤＮＡライブラリーから、例えば１７日齢および３５日齢両マウスのトータルＲＮＡを用いるノーザンブロツティングにより、３５日齢マウスのトータルＲＮＡとだけ特異的に反応するｃＤＮＡを選別・採取（クローニング）することにより、ＭＳＧクローンを得ることができる。なお、上記のｃＤＮＡライブラリーおよびサブトラクテッドｃＤＮＡライブラリーは、いずれも、ｃＤＮＡをベクターに挿入連結した後、これを宿主大腸菌に移入し、得られる形質転換体のかたちで作成すると、その後のｃＤＮＡの増幅・調製・スクリーニングが共に容易になる。
この発明のＭＳＧｓは、上記の方法によって特定されたｃＤＮＡクローンの塩基配列情報（配列番号１−８９）に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片としても定義することができる。ハイブリダイゼーションは、塩濃度、有機溶媒濃度および温度等を一定の範囲として行う「ストリンジェントな条件」のもとで行う。
このようにして特定されるＭＳＧｓの遺伝子ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）は、前記のプローブを用いて、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、コスミドベクターやファージベクター等にクローニングされているマウスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。そして、単離したゲノムＤＮＡ断片は、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による染色体異常を診断するためのプローブとしても用いることができる。
また、得られたＭＳＧｓのクローンｃＤＮＡｓの塩基配列の決定は、公知の方法によって行うことができるが、通常、ダイデオキシ法（サンガー法）を基本として用いるサイクルシークエンス法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１：７．４Ａ．１２−７．４Ａ．１３）によって行う。このサイクルシークエンス法の利点は、ＰＣＲ増幅したポリヌクレオチドを直接シークエンスできることであり、例えば市販のＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ［Ａｍａｓｈａｍ社（米国）製］およびＬＣ４０００オートシークエンサー［ＬＩ−ＣＯＲ製］を用いて行うことができる。
なお、ＭＳＧｓに属する各遺伝子のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡからポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）を公知の方法によって精製することもできる。このような精製ポリヌクレオチドは、例えば、毒性試験等における被験対象として有用である。
さらに、これらのポリヌクレオチドや前記のｃＤＮＡは、相同遺伝子の検出とクローニングにも使用することができる。すなわち、例えば、配列番号１−８９の塩基配列を用いるホモロジー検索により、ＭＳＧｓ相同のマウス以外の動植物遺伝子、例えばヒトゲノムＤＮＡにおける相同塩基配列を検出することができる。ホモロジー検索には、例えば、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｊｂ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等が提供する遺伝子データベースを用いることができる。相同遺伝子は、完全長塩基配列、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ）、ＳＴＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｓｉｔｅｓ）、ＧＳＳ（ｇｅｎｏｍｅ  ｓｕｒｖｅｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等のかたちで知ることができる。また、これ等の相同遺伝子は、例えば、ヒト染色体ＤＮＡから直接（ヒトの精子や白血球等の染色体から抽出・調製したＤＮＡを用いることにより）、あるいは、この発明が提供するプローブとして用いるハイブリダイゼーション、ＰＣＲプライマーによるＲＴ−ＰＣＲ等により、スクリーニングし、クローニングすることができる。
この発明のＤＮＡ断片群は、前記のＭＳＧｓ群に属する各遺伝子ＤＮＡ、または前記のｃＤＮＡ群に属する各ｃＤＮＡの連続１０〜９９塩基断片（センス鎖またはアンチセンス鎖）の集合である。これらのＤＮＡ断片は、例えば、遺伝子ＭＳＧｓの変異を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして有用である。また、生殖毒性試験や不妊症の遺伝子診断用マイクロアレイ作製のためのプローブとしても使用できる。
これらのＤＮＡ断片は、常法により合成して調製することもでき、あるいは場合によっては前記のポリヌクレオチドやｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断することによってもできる。
この発明のプライマーセット群は、前記の遺伝子ＭＳＧｓやｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するための合成オリゴヌクレオチドの集合であり、これらのプライマーセットを用いたＰＣＲによって、ＭＳＧｓの各遺伝子の発現変調や変異を検出することができる。
これらのプライマーセットは、配列番号１−８９の塩基配列に基づき、設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、ＰＣＲの成否はプライマー設計とこれに係る諸条件の設定に大きく依存するので、最適プライマーの調製には種々の創意工夫と試行を要する。プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。なお、この発明では、配列番号１−８９にそれぞれのｃＤＮＡ塩基配列内に、各ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するための２つのオリゴヌクレオチドのセットを１セット以上提供する。
この発明のマイクロアレー（ＤＮＡチップ）は前記のｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡの連続１０〜９９塩基断片の１以上をプローブとして基盤上に備えていることを特徴とする。なお、ｃＤＮＡは、２以上、もしくは５以上を備えていることが好ましい。このようなマイクロアレーは、ＤＮＡ断片を基板上に直接合成したものであっても、あるいはＤＮＡが結合するような素材でコーティングした基盤上にＤＮＡ断片をスポットしたものであってもよい。
この発明の精子形成ポリペプチド群は、マウス細胞から単離する方法、配列番号９０−１６７のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができ、またｃＤＮＡ等のポリヌクレオチドを用いた遺伝子組換え法によって大量に得ることもできる。すなわち、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターに挿入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写や発現ベクターによる形質転換体細胞から、ＭＳＧｓがコードするポリペプチドを大量に得ることができる。形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。また、形質転換細胞の培養物からポリペプチドを単離・精製するには、公知の方法（例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等）を用いることができる。なお、この発明のポリペプチドには、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
このようにして得られるポリペプチドは、例えば抗体作製のための免疫原として、あるいは不妊症の治療薬を開発するための標的分子等として有用である。
この発明の抗体群は、前記のＭＳＧｓポリペプチドを認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の集合である。この抗体群は、精細胞でのＭＳＧｓポリペプチドまたはその変異体の発現を調べることによって、毒性試験や遺伝子診断を行うための材料等として有用である。この抗体には、ＭＳＧｓポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のＭＳＧｓポリペプチドやその部分ペプチドを抗原として用いて動物を免疫した後、血清から得ることが出きる。あるいは、上記の発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエローマと融合させてハイブリドーマを作製すれば、モノクローナル抗体を産生することができる。
次に、この発明の毒性試験、変異原性試験および遺伝子診断の方法は、例えば以下の（Ａ）〜（Ｉ）によって実施することができる。
（Ａ）ＥＤ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）検出：
例えば、ＥＤ被疑物質の経口投与下で飼育したマウス、モルモット、サル等の実験動物を用い、その白血球や組織細胞等から染色体ＤＮＡを抽出・精製（前記のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：２．２．１−２．２．３）の後、これを用いて、例えば、前記プライマーセットを用いるＰＣＲによってＭＳＧｓに相同の実験動物ＤＮＡを増幅することにより検体ＤＮＡを調製し、塩基配列を決定し、この検体と、正常遺伝子ＤＮＡとの間のホモロジー検索を行う。この検索の結果、得られる両者間の塩基配列およびアミノ酸配列の相違に基づき、実験動物ＤＮＡにおける変異、その変異がもたらす発現変調及びアミノ酸置換を解析する遺伝子診断を行うことができる。これには、例えば、市販のホモロジー検索用ソフトウェア（前述したＤＤＢＪやＮＣＢＩが提供するホモロジー検索プログラム、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等）を用いることができる。なお、ホモロジー検索の留意点は、例えば、文献（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１：７．７．１２−７．７．１５）に記載されている。さらに上記動物の各臓器（特に精巣や精子）から抽出したＲＮＡを用いてＭＳＧｓについてノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレー法等でｍＲＮＡの発現量の変化を検出する事により、被疑物質がＥＤであるか否かを判定することができる。
（Ｂ）ＥＤ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）検出：
例えば、培地にＥＤ被疑物質を添加混合し培養した細胞培養、テトラヒメナ、ウニ受精卵、微生物等を用い、培養下における形態学的異常（例えば、細胞分裂の異常、細胞変性等）を検鏡により検出すると共に、前記（Ａ）と同様にして、上記培養物からＭＳＧｓに相同の遺伝子ＤＮＡ（検体ＤＮＡ）を調製し、そのホモロジー検索を行い、変異の発生とノーザンブロッテング、ＲＴ−ＰＣＲ法等により発現量の変化を調べる事により、被疑物質がＥＤであるか否かを判定することができる。なお、培養細胞等として、この発明のＭＳＧｓの各ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）をクローニングした発現ベクターによる形質転換体を用いることもできる。
（Ｃ）変異原性試験・毒性試験：
開発途上の新薬や環境汚染の被疑化学品を検体に用い、前記（Ａ）、（Ｂ）と同様にして行うことができる。
（Ｄ）生殖に及ぼす影響（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験：
開発途上の新薬や環境汚染の被疑化学品を検体に用い、前記（Ａ）および（Ｂ）と同様にして行うことができる。。
（Ｅ）生殖に及ぼす影響（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験：
ＭＳＧ遺伝子（ｃＤＮＡ等のポリヌクレオチド）を挿入連結した発現ベクターを構築し、これを宿主に移入して形質転換体を作出する。この形質転換体を、開発途上の新薬や環境汚染の被疑化学品の存在下で培養し、その発現産物の量や、あるいは機能が正常か異常であるかを判定することにより、この試験を行うことができる。例えば、Ｃａｌｍｅｇｉｎ遺伝子を発現させ、得られたＣａｌｍｅｇｉｎのシャペロンとしての機能の異常を検出する。また、そのような発現ベクターを用いることにより、その発現能や発現物活性を阻害あるいは促進する物質の検出・検索を行うことができる。
（Ｆ）実験動物の作出：
ＭＳＧｓとその相同遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ機能解析を行うため、これ等の遺伝子のノックアウト動物を作出することができる。また、これ等の遺伝子の調節遺伝子座およびその活性、さらに遺伝子産物の個体での機能を解析するため、トランスジェニック動物を作出することができる。このような実験動物はまた、男性不妊症の遺伝子治療・予防のための医薬品・医療技術の開発や、避妊薬の開発における前臨床試験を可能にする
（Ｇ）ＭＳＧ導入による形質転換体を用いた試験：
前記（Ｆ）と同様にして、検体遺伝子ＤＮＡの発現ベクターを構築し、その形質転換体を作出する。次いで、その発現産物の機能の異常を検出すると共に、ホモロジー検索により検体ＤＮＡの変異とその変異によるアミノ酸置換について解析する。これより得られる両結果を対比分析することにより、発現産物の機能と変異との間の相関を意味付けることができる。
（Ｈ）ＰＣＲによる増幅ＤＮＡ：
この発明のプライマーを用いるＰＣＲにより、様々な実験条件下におかれた動物または培養細胞のＤＮＡを鋳型とし、これ等のＤＮＡを増幅することができる。なお、ＰＣＲの基本手順は、例えば、前述の文献（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１：１５．０．１−１５．３．８）に記載されている。また、ＰＣＲで増幅された実験群ＤＮＡおよびその断片または制限酵素断片は、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、ＳＮＰ等の解析、また、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に用いることができる。例えば，ポリアクリルアミド電気泳動の検体として、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップのプローブとして、また、標識することによりハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることもできる。
次に、この発明のヒト男性不妊遺伝子変異について説明する。
この発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドは、配列番号１６８のＤＮＡ配列において、
第１２９位ｔがｃに置換；
第８７０位ｔがｇに置換；
第１０７１位ｃがｔに置換；および
第１６６７位ｔがｃに置換
のいずれか１以上を有するポリヌクレオチドまたはその相補配列である。
このＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドは、例えば、後記のＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドをプローブとして、男性不妊者の全ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。また後記発明のプライマーセットを用い、男性不妊者のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲによって単離することもできる。あるいは、野性型Ｓｃｏｔ−ｔ  ｃＤＮＡに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ    Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
この発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドは、この発明の男性不妊診断方法に使用することができる。また、後記発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドを遺伝子工学的に作製するための材料としても使用することができる。
この発明のＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドは、前記のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドの一部であって、各々の変異箇所を含む１０〜９９の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列である。
このＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成して作製することができる。また、Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
このＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドもまた、この発明の男性不妊診断方法に使用することができる。あるいは、Ｓｃｏｔ−ｔ変異オリゴペプチドを遺伝子工学的に作成するための材料として使用することもできる。
この発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドは、Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドまたはＳｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチド若しくはそれらの相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）である。ここで、ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好ましい態様としては、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳの条件で、３０℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、３７℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはＮａＣｌ約３０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約３ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約１５ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約１．５ｍＭ以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、最も好ましくは約６８℃以上である。１つの好ましい態様としては、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、２５℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、４２℃の温���により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行うことである。
このＳｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドは、例えば、Ｓｃｏｔ−ｔ変異オリゴヌクレオチドをプローブとして、以上のとおりのストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄処理により、男性不妊者の染色体ＤＮＡから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。
このＳｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドは、例えばこの発明の診断方法において検出対象となる。
この発明のＳｃｏｔ−ｔプライマーセットは、前記発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチド、Ｓｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、またはＳｃｏｔ−ｔ変異ゲノムポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１６８（Ｓｃｏｔ−ｔ  ｃＤＮＤ）の少なくとも１箇所のヌクレオチド変異箇所を含む１５〜４５ｎｔ、好ましくは１５〜３０ｎｔの連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなっている。他方のプライマーは、配列番号１６８の各変異箇所の５’側または３’側の任意の連続ＤＮＡ配列またはその相補配列とすることができる。
これらのプライマーセットは、それぞれの変異箇所を含む配列番号１６８に基づいて公知のＤＮＡ合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。さらに、配列の設計には、市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
この発明のＳｃｏｔ−ｔプライマーセットは、この発明の男性不妊診断方法等に使用することができる。
この発明のプロタミン−２変異ポリヌクレオチドは、配列番号１７３（プロタミン−２  ｃＤＮＡ）において第２４８位のｃがｔに置換している。
この発明のプロタミン−２変異オリゴヌクレオチド、変異ゲノムポリヌクレオチド、プロタミン−２プライマーセットは、Ｓｃｏｔ−ｔに関する前記発明と同一にして取得し、また使用することができる。
この発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドは、前記発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドまては変異ゲノムポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号１６９のアミノ酸配列において、
第３８位ＬｅｕがＰｒｏに置換；
第２８５位ＬｅｕがＡｒｇに置換；および
第３５２位ＴｈｒがＭｅｔに置換；
のいずれか１以上を有するポリペプチドである。
すなわち、これらのＳｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドは、前記発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドにおけるミスセンス変異によって、正常（野性型）ポリペプチド（配列番号１６９）のアミノ酸が前記のとおりに変異している。
この発明のプロタミン−２変異ポリペプチドは、前記発明のプロタミン−２変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号１７４のアミノ酸配列の第１−４９位までのアミノ酸配列からなる短鎖のポリペプチドである。すなわちこのポリペプチドは、プロタミン−２変異ポリヌクレオチドの第２４８位の一塩基置換（ｃがｔ）によって第５０番目グルタミン酸コドンが停止コドンに変異し、それ以降のタンパク質コード領域が発現しないことによる短鎖のポリペプチドである。
これらの変異ポリペプチドは、男性不妊者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、それぞれの変異アミノ酸残基を含む配列番号１６９または１７４のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは前記発明の変異ポリヌクレオチド（変異ｃＤＮＡ）を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。これらの変異ポリペプチドは、例えば、この発明の男性不妊診断方法の検査対象とすることができる。
この出願の変異オリゴペプチドは、前記発明のそれぞれの変異ポリペプチドの一部であって、各々のアミノ酸変異を含む５−３０の連続したアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。これらの変異オリゴペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、あるいは前記の変異ポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化する方法等によって作製することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、この発明の抗体作製のための抗原として使用することができる。
この発明の抗変異Ｓｃｏｔ−ｔ抗体、抗変異プロタミン−２抗体、抗プロタミン−２抗体は、前記発明のオリゴペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、この発明の変異ポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、ＭＳＧｓ発明について説明した抗体と同様にして作成することができる。またこれらの抗体は、前記の変異ポリペプチドを特異的に認識することができ、この発明の診断方法等に使用することができる。
この発明の診断方法は、被験者が男性不妊であるか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体ＤＮＡを単離し、このＤＮＡ中に、前記発明の変異ゲノムポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者を男性不妊のハイリスク者と判定する。被験者は、不妊男性、あるいは母方の親族に男性不妊者を有する男児等とすることができるが、それらの者に限定されるものではない。変異ポリヌクレオチドの検出は、それを直接シークエンシングする方法によっても行うことができるが、以下の方法が好ましい。
第１には、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリヌクレオチドおよび／またはプロタミン−２変異ポリヌクレオチド、もしくはそれぞれの変異オリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者が男性不妊に関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと変異ポリヌクレオチドまたは変異オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは公知の方法によって検出することができ、例えば、この発明のＤＮＡプローブやＤＮＡチップを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばＡｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等の公知の方法を採用することができる。また、ＤＮＡチップは、変異ポリヌクレオチドおよび／または変異オリゴヌクレオチドを基盤上に直接合成したものであってもよく、あるいはヌクレオチドが結合するような素材でコーティングした基盤上にオリゴヌクレオチドをスポットしたものであってもよい。そして、標識化した被験サンプルＤＮＡと基盤上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの有無を指標として、被験サンプルＤＮＡにおけるヌクレオチド変異を同定することができる。
第２の好ましい方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する。被験者が男性不妊に関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは公知の方法により行うことができる。ヌクレオチド変異の検出は、ＰＣＲ産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法等を行ってもよい。また、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法の公知の方法を採用することもできる。
この発明の別の男性不妊診断方法出願は、被験者から単離した生体試料中に、前記発明のＳｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドおよび／またはプロタミン−２変異ポリペプチドが存在する場合に、その被験者を男性不妊のハイリスク者と判定する。ポリペプチドの検出は様々な公知方法によって行うことができるが、抗変異Ｓｃｏｔ−ｔ抗体を用い、Ｓｃｏｔ−ｔ変異ポリペプチドを検出する方法が好ましい方法の一つである。また抗変異プロタミン−２抗体と、抗プロタミン−２抗体（配列番号７の第５０−９１位、または配列番号８の相１−１１位のアミン酸配列からなるオリゴペプチドを抗原として作製された抗体）を組み合わせて用いる方法である。すなわち、短鎖のプロタミン−２変異ポリペプチドの場合には、抗変異プロタミン−２抗体は反応するが、長鎖のプロタミン−２ポリペプチドを抗原として作成された抗プロタミン−２抗体は反応しないからである。
以上の抗体を用いる診断方法の場合には、特にこの発明に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ＥＬＩＳＡ法」）も好ましく用いることができる。
実施例
以下、この発明の様態並びに構成と効果を、実施例および利用例を示して具体的に説明するが、この出願の発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
マウス全（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡの調製
次の２群のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、１７日齢マウス１９匹、および３５日齢５匹からそれぞれ精巣を摘出し、群別にカプセルに採取し、これに５０ｍｌの５．５Ｍ  ＧＴＣ溶液（ｐｈ７．５；５．５Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、２５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ２Ｈ２Ｏ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓａｒｃｏｎａｔｅ、および０．２Ｍ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）を添加した後、１８Ｇ注射針付きシリンジに通し細胞を破砕した。次いで、低速遠心し、その上清を採取し、沈渣の細胞破片を除去した。採取した５０ｍｌの上清は、１４ｍｌのＣｓＴＦＡ（トリフルオロ酢酸セシウム）液を入れたチューブ２本に２５ｍｌずつ移注の後、超遠心（２５，０００ｒｐｍ、１５℃、２４時間）した。この超遠心により沈殿したＲＮＡを、６００μｌの４．４Ｍ  ＧＴＣ溶液／チューブにて溶解の後、エタノール沈殿した。沈殿ＲＮＡはＴＥ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に溶解の後、再度のエタノール沈殿により回収し、前記１７日齢および３５日齢両群マウスの各全ＲＮＡを得た。
実施例２
マウスｍＲＮＡ［Ｐｏｌｙ（Ａ）＋］の調製
実施例１で得たエタノール沈殿状態の２本のチューブ（２群）の全ＲＮＡを各々７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールでリンスした後、５００μｌの前記ＴＥ／チューブを添加して溶解し、６５℃で５分間加熱し、氷上で急冷した。次いで、５００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ／チューブを加えた後、予めＴＥ／ＮａＣｌ（ＴＥ：１Ｍ  ＮａＣｌ＝１：１）で平衡化しておいたオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム［Ｔｙｐｅ３；Ｃｏｌｌａｂｏｔｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米国）製］にかけ、各カラムを８ｍｌの上記ＴＥ／ＮａＣｌで洗浄の後、それぞれ０．５ｍｌのＴＥで溶出し分画した。この分画を合計５回行ない、各分画の一部を取り、ＥｔＢｒ（臭化エチジウム）と混合の後、ＵＶ照射下で蛍光放射が認められた第２分画をｍＲＮＡ分画として採用した。この第２分画につき、再度、６５℃、５分間の加熱からカラム分画に至る上記操作を繰り返した。得られた分画をエタノール沈殿した後、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールでリンスし、１０μｌのＴＥに溶解した。その一部を取り、吸光光度計で定量した。
実施例３
３５日齢マウス精巣のｃＤＮＡライブラリーの作成
以下（１）〜（６）に記載の手順で作成した。
（１）第１ストランドの合成（一本鎖、ｓｓ−ｃＤＮＡの調製）：
実施例２で得た３５日齢マウスｍＲＮＡを７μｇを秤取し、これに蒸留水を添加して全量７．５μｌとし、６５℃で５分間、加熱の後、氷冷した。次いで、以下の試薬を添加混合した：２．５μｌの１０×１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２］、２．５μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１．５μｌの１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；および５ｍＭ  ５−ｍｅｔｈｙｌ−ｄＣＴＰ）、１μｌ（１．６μｇ）のｌｉｎｋｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ［（ＧＡ）１０ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＧ（Ｔ）１８］、０．５ＭｌのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、および７．５μｌのＨ２Ｏ。これを室温にて１０分間放置し、アニーリングを行った後、２μｌの逆転写酵素［（株）生化学工業（日本）製］を添加し、３７℃で４０分間反応させた。次いで、２μｌのＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ［ＢＲＬ社（米国）製］を添加混合の後、５０℃で４０分間反応させることにより、一本鎖の第１ストランド（ｓｓ−ｃＤＮＡ）を得た。
（２）第２ストランドの合成（二本鎖、ｄｓ−ｃＤＮＡの調製）：
上記（１）で得た第１ストランド液に、以下の試薬を氷上で添加混合した：２０μｌの１０×２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ［１８８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、９０６ｍＭ  ＫＣｌ、４６ｍＭ  ＭｇＣｌ２］、７．５μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、３μｌの２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；および２５ｍＭ  ５−ｍｅｔｈｙｌ−ｄＣＴＰ）、および１３５μｌのＨ２Ｏ。これを５分間、氷冷の後、１．５μｌ（２ｕｎｉｔ）のＲＮａｓｅ  Ｈと、６μｌ（５０ｕｎｉｔ）の大腸菌ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉをそれぞれ添加混合し、１６℃で１８０分間反応させた。反応終了後、２００μｌのフェノール／クロロホルム（水飽和フェノール：クロロホルム＝１：１混合）、およびクロロホルムで順次ｃＤＮＡを抽出し、これを３０μｌの１／１０  ＴＥに溶解し、第２ストランド（ｄｓ−ｃＤＮＡ）を得た。
（３）平滑末端化（平滑末端ｄｓ−ｃＤＮＡの調製）：
３０μｌの上記（２）のｄｓ−ｃＤＮＡ溶液に、以下の試薬を添加混合した：１０×Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ］、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、１μｌ（１０ｕｎｉｔ）のＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、および５４μｌのＨ２Ｏ；全量は１００μｌ。次いで、３７℃で３０分間（時間厳守にて）反応させた後、１００μｌの前述のフェノール／クロロホルム、およびクロロホルムで順次ｃＤＮＡを抽出しこれを２０μｌの１／１０ＴＥに溶解し、平滑末端化したｄｓ−ｃＤＮＡを得た。
（４）アダプターの連結：
４μｌの上記（３）の平滑末端化ｄｓ−ｃＤＮＡ溶液に、以下の試薬を添加混合し５分間氷冷した：２μｌの１０×ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ］、２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌ（０．３５μｇ）のアダプター、および９．５μｌのＨ２Ｏ；全量は１８．５μｌ。なお、上記のアダプターは、ＢａｍＨ  Ｉ（Ｂｇｌ  ＩＩ）−Ｓｍａ  Ｉ［ｄ（ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ）］［（株）宝酒造（日本）製］とｐＳｍａ  Ｉ  ｌｉｎｋｅｒ［ｄ（ｐＣＣＣＧＧＧ）］［（株）宝酒造（日本）製］との１：１（Ｗ／Ｗ）の混合物であり、濃度が０．３５μｇ／μｌになるよう、緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２］で溶解し調製した。次いで、１．５μｌ（４ｕｎｉｔ）のＴ４  ｌｉｇａｓｅを添加混合し、８℃で一晩反応させた後、７０℃で３０分間加熱処理し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５秒間遠心し、その上清をアダプター連結ｄｓ−ｃＤＮＡとした。
（５）ｄｓ−ｃＤＮＡの制限酵素断片の調製とスピンカラムによる分画：
上記（４）のアダプター連結ｄｓ−ｃＤＮＡ溶液に、２７μｌのＮｏｔ  Ｉ  ｂｕｆｆｅｒ［２７８ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、０．０１８％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］、および３μｌのＮｏｔ  Ｉ（１０ｕｎｉｔ）をそれぞれ添加混合し、３７℃で、１５０分間、反応させた。反応終了の後、５μｌの１０×ＳＴＥ［１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］、および１０μｇのｔＲＮＡを添加混合し、これを１０μｌ／カラム、Ｃｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎカラム［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（米国）製］に入れ、４℃で５分間、１，８００ｒｐｍで遠心し、遠心チューブ底の制限酵素断片の分画を採取した。次に、等量のフェノール／クロロホルム、およびクロロホルムで順次抽出の後、１０μｇのｔＲＮＡを補充し、蒸留水を加え全量を２５０μｌにした。更に、エタノール沈殿を行いない、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールでリンスした後、軽く乾燥させることによりアダプター連結ｄｓ−ｃＤＮＡの制限酵素（Ｎｏｔ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ）断片を得た。
（６）ベクターへのｄｓ−ｃＤＮＡ制限酵素断片の挿入連結：
上記（５）のｄｓ−ｃＤＮＡ制限酵素（Ｎｏｔ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ）断片の軽度乾燥物に、次の試薬を添加混合の後、氷上で５分間冷却した：３μｌの前記１０×ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ、３μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌ（１μｇ）のプラスミドベクターｐＡＰ３ｎｅｏ（制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ開裂）、および２２μｌのＨ２Ｏ。次に、１μｌ（４ｕｎｉｔ）のＴ４  ＤＮＡライゲースを添加混合し、１２℃で一晩反応させた後、７０℃で３０分間加熱した。これよりフェノール／クロロホルム、およびクロロホルムで順次抽出の後、２０μｌのＴＥで溶解し、ｄｓ−ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドベクター溶液を得た。次いで、この溶液全量を用い、ｄｓ−ｃＤＮＡ挿入プラスミドベクターをエレクトロポレーションによりコンピテント細胞である大腸菌に移入し形質転換させた。得られた形質転換体は、３５日齢マウス精巣のｃＤＮＡライブラリーとして、後述する実験４でのサブトラクテッドライブラリーの作成に供した。
実施例４
マウスのサブトラクテッドライブラリーの作成
以下に記載の（１）〜（５）の手順により、実験例３で得た３５日齢マウス精巣のｃＤＮＡライブラリー（Ａ）から、１７日齢マウス精巣での発現遺伝子（ｍＲＮＡ：Ｂ）をハイブリダイゼーションにより差し引くことにより、サブトラクテッドライブラリーを作成した。半数体細胞出現前から過剰発現している遺伝子も差し引き除去されるよう、ハイブリダイゼーションにおけるＡとＢとの反応量比、Ａ：Ｂ＝１：４０を採用した。
（１）３５日齢マウス精巣ｃＤＮＡライブラリーの一本鎖化：
実験３の（６）で得たｃＤＮＡライブラリーの形質転換体（大腸菌）を、４ｍｌのＳＯＣ［２％（Ｗ／Ｖ）Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％（ｗ／Ｖ）ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、および２０ｍＭグルコース］培地で３７℃で１時間培養の後、これを１００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ［１％（Ｗ／Ｖ）Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／μｌ  ａｍｐｃｉｌｌｉｎ］培地に移し、更に、３７℃で４時間３０分培養し、ｃＤＮＡを増幅した。得られた１００ｍｌの培養液のうち、５０ｍｌを別の容器に移注し、１ｍｌのヘルパーファージ（Ｒ４０８；２×１０１２ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）／ｍｌ）を添加し、３７℃で１０時間培養した。なお、残り５０ｍｌの培養液は、そのまま３７℃で培養の後、最終濃度７％（Ｖ／Ｖ）のＤＭＳＯ添加混合下で凍結保存した。培養終了後、遠心により除菌し、採取した上清をポアサイズ０．２μｍのフィルターでろ過し、大腸菌デブリスを完全に除去した、次いで、この培養ろ液５０ｍｌに以下の試薬を添加混合した：５ｍｌのＤｎａｓｅ  Ｉ溶液［０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、および０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２］、および５μｌのＤｎａｅ  Ｉ。これを３７℃で３０分間反応させた後、その全量の１／４量に２０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；溶媒は２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を添加混合し、室温で、更に２０分間反応させた。次に、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の超遠心によりファージを集め、上清を捨てＰＥＧを完全に除去した後、４００μｌのＴＥでファージを浮遊させた。これに２５μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液（２ｍｇのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ、８００μｌのＴＥ、および２００μｌのグリセロールからなる溶液）、および４μｌの１０％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を添加混合し、４２℃で１時間反応させた。反応終了後、フェノール、フェノール／クロロホルム、およびクロロホルムにより順次抽出を行い、更に、エタノール沈殿し、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールでリンスの後、これを１００μｌのＴＥで溶解し、その一部を紫外分光器を用いて定量した。
（２）１７日齢マウス精巣ｍＲＮＡのビオチン化：
実験例２で得た４０μｇの１７日齢マウス精巣ｍＲＮＡを入れたチューブに蒸留水を加え、全量を２０μｌとし、これに暗室で３０μｌのビオチン（ｐｈｏｔｏｐｒｏｂｅ  ｂｉｏｔｉｎ  １μｇ／μｌ水溶液）［Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製］を添加混合して、十分にピペッティングを行った後、チューブの蓋を開けて氷上に置き、水銀ランプ（ＢＨＲＦ１００／１１０ｖ／６０Ｗ）をチューブの上方１０ｃｍから２０分間照射することによりラベルを行った。ラベル完了後、これに５０μｌの０．１Ｍ  ＴＥ（ｐＨ９．５）を添加し、十分にピペッティングを行った後、これに１００μｌの水飽和ブタノールを加え、過剰のビオチンを除去した。更に、１００μｌのクロロホルムを添加してブタノールを除去し、次いでエタノール沈殿、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールによるリンスを順次行った後、２０μｌの蒸留水に溶解した。上記のラベル操作を再度繰り返し、最終的には１０μｌの蒸留水に溶解しビオチン化ｍＲＮＡ水溶液とした。
（３）ハイブリダイゼーション：
以下の試薬をＰＣＲチューブに、泡が入らないよう留意し、添加混合した：１．５μｌ（０．５μｇ）の前記（１）で調製したｓｓ−ｃＤＮＡ、５μｌ（２０μｇ）の（２）で得たビオチン化ｍＲＮＡ、１２．５μｌの２×ＨＢ［８０％（Ｗ／Ｖ）ｆｏｒｍａｍｉｄｏ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ；使用時に調製］、２．５μｌの２Ｍ  ＮａＣｌ、および１μｌのＰｏｌｙ  Ａ（１μｇ／μｌ水溶液）［Ｐｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデン）製］、２．５μｌの蒸留水；全量は２５μｌ。これを、６５℃で１０分間反応させた後、更に、４２℃で４３時間反応させることにより、ハイブリダイゼーションを行った。
（４）アビジンとの反応によるｓｓ−ｃＤＮＡの回収：
上記（３）の２５μｌの反応液を別のチューブに移し、これに４００μｌのＳＢ［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５００ｍＭ  ＮａＣｌ］、および１０μｇのストレプトアビジン［Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（米国）製］を添加混合し、室温で５分間反応させた後、４００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１等量混合）によりハイブリダイゼーションしないｓｓ−ｃＤＮＡの抽出を行った。再度、上記のアビジン添加からフェノール／クロロホルム抽出までの操作を繰り返した後、更に、クロロホルム抽出を行い、ミリポアフィルターにて精製ｓｓ−ｃＤＮＡを回収した。次いで、これを３０μｌの１／１０  ＴＥに溶解の後、その１５μｌを別のチューブに採取し（残りは−２０℃で保存）、１０分間の真空乾燥により（完全に乾燥させず）濃縮した。
更に、上記のハイブリダイゼーションから真空乾燥までの操作を２回繰り返し行った。２回目および３回目のハイブリダイゼーション時の組成は次の通りであった：上記の真空乾燥により濃縮したｓｓ−ｃＤＮＡ、５μｌ（１０μｇ）のビオチン化ｍＲＮＡ、１２．５μｌの２×ＨＢ、２．５μｌの２Ｍ  ＮａＣｌ、および１μｌのｐｏｌｙ  Ａ、これに蒸留水を加え全量２５μｌにした。また、第２回ハイブリダイゼーションにより得た３０μｌのｓｓ−ｃＤＮＡのうち、１５μｌを第３回ハイブリダイゼーションに供し、残りは−２０℃で保存した。
（５）ｓｓ−ｃＤＮの二本鎖化：
上記（４）で得た１５μｌのｓｓ−ｃＤＮＡ溶液に、１５μｌのＰＮＫ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを添加混合し、６５℃で１０分間反応させた。なお、ＰＮＫ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅは、以下の組成物を３７℃で３０分間反応させることにより調製した：１μｌの二本鎖形成用ｐｒｉｍｅｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、３μｌの１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＤＴＴ］、３μｌの１０ｍＭ  ｒＡＴＰ、２μｌのＰＮＫ（Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ；１０ｕｎｉｔ／μｌ）［（株）Ｔｏｙｏｂｏ（日本）製］、および蒸留水を２１μｌ加え全量を３０μｌにした。反応終了後、室温まで冷やした後、この３０μｌの反応液に次の試薬を添加混合し、更に６５℃で１時間反応を行った：５μｌの１０×ＢｃａＢＥＳＴ  Ｂｕｆｆｅｒ［（株）Ｔａｋａｒａ（日本）製］、１０μｌの１ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌのｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（２．１μｇ／μｌ）［ＵＳＢ社（米国）製］、２μｌのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ［（株）Ｔａｋａｒａ（日本）製］、および３μｌの蒸留水を加えて全量を５０μｌにした。反応終了の後、１００μｌのフェノール／クロロホルム、およびクロロホルムによる抽出を順次行い、ミリポアフィルターろ過により精製ｄｓ−ｃＤＮＡを回収し、これを２０μｌのＴＥで溶解した。その一部をエレクトロポレーションにより大腸菌（ＸＬ−１  Ｂｌｅｕ）に移入し形質転換を行なった。これにより得られた形質転換体はサブトラクテッドライブリー、即ち、ＭＳＧ候補ｃＤＮＡライブラリーとして、ＭＳＧのクローニングに供した。
実施例５
ＭＳＧのクローニング
実験例４で作成したサブトラクテッドライブラリーのＭＳＧ候補ｃＤＮＡを保有する形質転換体の培養液から、実験例４の（１）の記載と同様にして調製したｓｓ−ｃＤＮＡと実験例１で得た１７日齢および３５日齢の両マウス精巣の全ＲＮＡとの間でノーザンブロッティングを行い、３５日齢マウスにおいてのみシグナルが検出されるｃＤＮＡをスクリーニングし採取した。その結果、合計７９のＭＳＧクローンを得た。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体でクローニングしたクローンをあわせ、全８９のＭＳＧクローンを得た。
実施例６
ＭＳＧクローンＤＮＡの塩基配列の決定
実施例５で得たＭＳＧライブラリーの各形質転換体をそれぞれ培養することにより、ＭＳＧクローン／ベクターを増幅の後、各ベクター（プラスミド）をアルカリ法で抽出精製した。次いで、ダイデオキシ法（サンガー法）に基づき、ベクター内に設定したプライマーを用いるサイクルシークエンス法により、実施例１で得た合計８９のＭＳＧクローンの各ｃＤＮＡのシークエンスを決定した。その結果を配列番号１−８９に示す。
実施例７
ＭＧＳに対するＥＤ作用の検討
環境中に放出されるＥＤのモデルの一つとしてエストロゲン作用を持つＤＥＳ投与によるＭＳＧ遺伝子の発現の変化をマウスを用いて調べた。
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに一日おきに二度、ＤＥＳを腹腔内注射し、その二日後に両精巣を取り出し、片方を組織観察行い、他方からＲＮＡを抽出して、遺伝子発現レベルを比較した。
材料：マウス：８週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス
投与ＤＥＳ濃度と匹数：
１：無処理（２匹）
２：０μｇ    ＤＥＳ  ｉｎ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌ（２匹）
３：１μｇ    ＤＥＳ  ｉｎ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌ（２匹）
４：１０μｇ  ＤＥＳ  ｉｎ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌ（２匹）
５：５０μｇ  ＤＥＳ  ｉｎ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌ（３匹）
実験スケジュール：
１日目に無処理あるいは２０μｌ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌに溶かした各量のＤＥＳを腹腔内注射。３日目に１日目と同じ処理。４日目に精巣を取り出す。片側をブアン固定、パラフィン包埋後、ＨＥ染色して、組識観察。他方をＴｒｉｚｏｌにてＲＮＡ抽出して、ノーザンハイブリダイゼイションにより遺伝子発現レベルを比較。
解析した遺伝子：ＯＡＺｔ（Ｏｒｎｉｔｈｉｎ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｔｉｚｙｍｅ−ｔ）：配列番号５０
結果：
形態的に明瞭な変化は検出できなかった。しかし、精子細胞特異的に発現する遺伝子ＯＡＺｔにつてノーザンハイブリダイゼイションを行った結果、個体差が非常に大きかったが、全体的に処理群の方がレベルが低かった。
ＯＡＺ−ｔは半数体精子細胞特異的発現を示す遺伝子であり、その発現開始がＤＥＳにより抑制されることが示唆された。形態的に異常が見られないほどの、低濃度短期間ＤＥＳ処理にもかかわらず、遺伝子発現レベルでは差異が検出されたことは、この発明方法がエストロジェンの雄性生殖細胞に及ぼす影響の個体レベルでの高感度検出系として充分利用可能であることを示す。
実施例８
マウスｈａｓｐｉｎの機能解析
ｈａｓｐｉｎ（配列番号８１）は、精子細胞特異的に発現するタンパク質キナーゼで、キナーゼドメインを初めとした様々な機能ドメイン（核移行シグナル、ロイシンジッパー、転写因子様構造）を有しており、多様な精子細胞機能に関係し、精子形成に重要な役割を果たしていると考えられる。さらにｈａｓｐｉｎ遺伝子を培養細胞に発現させるとこのタンパク質は核に移行し、細胞の増殖がＧ１期で停止することも知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｍ．２７４，１７０４９−１７０５７，１９９９）。
このｈａｓｐｉｎについて以下を明らかにした。
ｈａｐｓｉｎノックアウトマウスの解析：
サイミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子とネオマイシン（ｎｅｏ）耐性を選択に用いてＥＳ細胞のｈａｐｓｉｎ遺伝子を破壊し、このＥＳ細胞からマウス胚を作成することによってｈａｓｐｉｎ遺伝子欠損（ｈａｓｐｉｎ  ＫＯ）マウスを作成した。このＫＯマウス個体は正常に発生し成長したが、雄は不妊を示し、雌は妊よう性がみられた。また精子形成に明らかな障害はなく、形態的に異常の見られない精子が作られるものの、機能不全のため雄性不妊を示すことが確認された。
ｈａｐｓｉｎ遺伝子の発現制御領域の解析：
ｈａｓｐｉｎ遺伝子上流の１９２塩基にＧＦＰ遺伝子を結合したレポーター遺伝子を用いてトランスジェニック（ＴＧ）マウスを作成した。このＴＧマウスの解析の結果、ＧＦＰは半数体精子細胞特異的に発現したことから、この１９２塩基からなる領域がｈａｓｐｉｎ遺伝子の特異的発現の制御するプロモーターであることが確認された。
ｈａｐｓｉｎ分子との相互作用タンパク質の解析
酵母２ハイブリッド系の実験結果からＨａｓｐｉｎ分子と相互作用をする精巣内タンパク質が少なくとも８種類存在することが明らかになった。これらのタンパク質は、ヒト（Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．７，２１１−２１８．２００１）、マウスｈａｓｐｉｎと相互作用することによって精子形成に重要な役割を果たしている。
これらの結果から次の応用が考えられる。すなわち、ｈａｓｐｉｎの遺伝子欠損により雄性不妊が引き起こされることが確認されたことから、
１）ｈａｓｐｉｎ自身の機能障害や、相互作用をするタンパク質の機能障害により雄性不妊を引き起こすことが出来る。
２）ｈａｓｐｉｎと他の分子との間に起こる相互作用を阻害することによって不妊を引き起こすことが出来る。
３）ｈａｓｐｉｎの核移行を阻害することによって不妊を引き起こすことが出来る。
すなわち、発明者らはｈａｓｐｉｎと相互作用をする分子の中に、その特異的核移行を司るタンパク質（インポーチンアルファ）を見出しており、このインポーチンアルファの機能障害によってｈａｓｐｉｎの核移行を阻害し、ｈａｐｓｉｎを機能欠損させることができる。
４）ｈａｓｐｉｎのキナーゼ活性に対する阻害剤により不妊を引き起こすことが出来る。
すなわち、これまで様々なキナーゼに対する特異的な阻害剤が種々開発されており、ｈａｓｐｉｎのように特異性の高いキナーゼに対する特異的阻害剤の開発の可能性は高い。
また、前記のとおりに特定されたｈａｐｓｉｎプロモーターは半数体精子細胞にのみ特異的に発現するが、このプロモーターを体細胞で活性化することによって、異常増殖する細胞の増殖を制御することもできる。プロモーターの活性化は、それに働く特異的転写因子やその遺伝子の導入によって行うことが出来る。あるいはその転写因子の遺伝子発現を活性化することなどの方法によっても行うことができる。
実施例９
マウスによるＥＤ検出
１０日齢マウス（雄）に、ＥＤ（Ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ  Ａなど）被疑検体を２００日間、継続して経口投与・飼育し、その生殖機能、行動、または外観に異常が観察されるか否かに拘らず、この飼育マウスの精巣から、ＲＮＡ抽出キット（各々、例えばＴＯＬＩｚｏｌ：ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）およびＤＮＡ抽出キット（例えば、ＤＮＡｚｏｌ  ＢＤ  Ｒｅａｇｅｎｔ：オリエンタル酵母（日本））を用いて細胞ＲＮＡおよび染色体ＤＮＡを抽出の後、ＲＮＡはノーザンブロッイィングによりその発現レベルの変化を調べ、ＤＮＡは実施例５で得たＰＣＲプライマーにより精子形成遺伝子の増幅を行う。これにより、増幅不能の場合は、その遺伝子に大きな変異があると判定される。増幅可能の場合は、その増幅ＤＮＡ断片を直接、シークエンスを行うか、または特異的なＤＮＡ塩基配列を認識し切断するエンドヌクレアーゼで断片化した後、これをアガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、およびＳＮＰの解析を行うことにより変異を検出する。変異が検出されたＤＮＡ断片は、更にその塩基配列を決定の後、コンピューター解析によりその変異がポリモルフィズムであるのか、遺伝子の調節・複製・転写の過程での変調を生じるのか、翻訳物（タンパク質）の機能に大きな障害をもたらすかを判定する。これらＲＮＡおよびＤＮＡの変化によりＥＤ検出を行う。
実施例１０
ヒトＳｃｏｔ−ｔ遺伝子とプロタミン遺伝子の解析
１．方法
１−１．被験者とゲノムＤＮＡの抽出
Ｓｃｏｔ−ｔ遺伝子の分析には、合計２５５例の男性不妊患者を精液学に従って複数の下位群に分けた。１５２例（６０％）は非閉塞性の無精子症であり、７２例（２８％）には重度の精子減少症（０．１から３×１０６細胞／ｍｌ）、２７例（１１％）は精子運動性が低く、４例（２％）が精子の数、形態および運動に異常がない特発性不妊症であった。対照群は、生殖可能な男性２６１例（産科医院を訪れた妊娠した妻の夫）を対象とした。
プロタミン遺伝子の分析には、合計２５８例の不妊患者を精液学に従って複数の下位群に分けた。１５３例（５９％）は非閉塞性の無精子症であり、７３例（２８％）には重度の精子減少症（精子数は５×１０６細胞／ｍｌ未満）、２８例（１１％）は精子運動性が低い無力精子症であり、４例（２％）が精子の数、形態および運動に異常がない特発性不妊症であった。対照群としては、前記と同様の健常者２７０例を対象とした。
前記の各不妊患者および健常者のゲノムＤＮＡを、プロテアーゼおよびフェノールを用いる公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）により抽出して使用した。
１−２．ヒトＳｃｏｔ−ｔゲノムＤＮＡ中の変異同定
ヒトＳｃｏｔ−ｔにはコーディング領域の中央部に１９ｂｐの欠失（７４５番から７６２番までの１８個のヌクレオチドと、１５個のヌクレオチドをはさんで７７８番の１個のヌクレオチド）を持つ偽遺伝子があるため（Ｔａｎａｋａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１；８：１６−２３）、この欠失領域を含むＰＣＲプライマーを２種類作成し、偽遺伝子が増幅されないようにした。すなわち、５’半分の増幅には推定転写開始部位の上流にある２５個のオリゴヌクレオチド（ｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｃｇｃｇｃｇｇｃｃｃｇａｇｇｃ：配列番号１７６）と７７０番から７４５番までの２６個のオリゴヌクレオチド（ｃｃｔｃｃａｃｇａｔｃｔｃｔｔｃｃａｃｃｔｃｃａｃｃ：配列番号１７７）、７４１番から７６４番までの２４子のオリゴヌクレオチド（ｃｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇａａｇａｇａｔｃｇｔｇｇ：配列番号１８３）、そしてｈ−Ｓｃｏｔ−ｔ遺伝子の推定転写ユニットの下流にある２５個のオリゴヌクレオチド（ｔｃｃａｔｔｃｃｔｃａｃｃａｃｔｇｃａｃａｃｃｔｇ：配列番号１７８）（図１参照）を用いた。
中央部周辺の内部プライマー配列（７３０−７６４）周辺に位置する３５個のヌクレオチドを除く、ｈ−Ｓｃｏｔ−ｔのＤＮＡの全配列決定を、ｈ−Ｓｃｏｔ−ｔ遺伝子の左半分および右半分をカバーする２種類のＰＣＲ増幅断片を用いて行うことが可能であった（図１）。
１−３．組換えｈ−Ｓｃｏｔ−ｔ  ｃＤＮＡの各種ＳＮＰタイプの遺伝子導入とスクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性分析
ＣａＰＯ４を用いて各ｃＤＮＡをトランスフェクションした７２時間後に、ＨＥＫ２９３細胞を溶解し、それぞれの細胞溶解液（５ｍｇタンパク質）をＨＰＬＣを用いたクロマトグラフ処理に供して外因性ＳＣＯＴ−ｔと内因性ＳＣＯＴ−ｓを分離し、酵素活性分析を行った。スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性の標準化は、抗ＳＣＯＴ−ｔ抗体を用いたウェスタンブロッティングシグナルから濃度計により評価したｈ−ＳＣＯＴ−ｔタンパク質の相対量を用いて行った。
ＳＣＯＴ酵素活性は、文献（Ｍａｒｃｏｎｄｅｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，７１４６−７１５１）の記載に若干の修正を加えた方法で行った。すなわち、分析混合液の内容を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．２ｍＭ  スクシニル  ＣｏＡ、５ｍＭ  アセト酢酸リチウム、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ヨードアセトアミド、およびｈ−ＳＣＯＴ−ｔ分画とした。ＳＣＯＴ活性の分光光度分析による測定は、アセトアセチル−ＣｏＡ吸収の形成を３１３ｎｍで測定することにより行った。タンパク質濃度の測定はＢｒａｄｆｏｒｄの方法により、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて行った。
１−４．プロタミン−１および−２ゲノムＤＮＡの変異同定
ゲノムＤＮＡはプロテアーゼおよびフェノールを用いた公知の方法によって血液から単離した。５’および３’の側面領域の両方におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーセットを２種類構築し、これらのプロタミンのゲノムＤＮＡを増幅した。プロタミン−１（Ｄｏｍｅｎｊｏｕｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８，１２７−１３３）では、５’プライマーには転写開始部位上流の−４２から−１９までの２４個のオリゴヌクレオチド（Ｐ１Ａ；ｃｃｃｃｔｇｇｃａｔｃｔａｔａａｃａｇｇｃｃｇｃ：配列番号１７９）、そして３’プライマーにはカノニカルポリＡ追加シグナルＡＡＴＡＡＡの下流４９２から５１５までの２４個のオリゴヌクレオチド（Ｐ１Ｂ；ｔｃａａｇａａｃａａｇｇａｇａｇａａｇａｇｔｇｇ：配列番号１８０）を用いた。プロタミン−２（Ｄｏｍｅｎｊｏｕｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８，１２７−１３３）では５’プライマーには＋４９から＋７２までの２４個のオリゴヌクレオチド（Ｐ２Ａ；ｃｔｃｃａｇｇｇｃｃｃａｃｔｇｃａｇｃｃｔｃａｇ：配列番号１８１）、３’プライマーには６２５から６４８までの２４個のオリゴヌクレオチド（Ｐ１Ｂ；ｇａａｔｔｇｃｔａｔｇｇｃｃｔｃａｃｔｔｇｇｔｇ：配列番号１８２）を用いてＰＣＲ増幅を行った。このプライマー設定により、ここではプロタミン−１および−２遺伝子の−４２から５１５までの５５７個のポリヌクレオチド（配列番号１７０）と、４９から６４８までの５９９個のポリヌクレオチド（配列番号１７３）をそれぞれ増幅することができた（図２）。なお、ＰＣＲ条件は次のとおりとした；プロタミン−１では９６℃で変性（４５秒）、６６℃でアニーリング（４５秒）、および７２℃で伸張（１分）を４０サイクルにわたり行い、プロタミン−２では９８℃で変性（１０秒）、６８℃でアニーリング（４５秒）、および７２℃で伸張（４５秒）を４０サイクルにわたり行った。ＰＣＲ増幅した断片の精製をＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲスピンカラム（Ｔａｋａｒａ，Ｓｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行い、熱サイクルシーケンス分析（ＡＢＩ，ＣＡ，ＵＳＡ）を行った。ＤＮＡシーケンスの決定は同じＰＣＲプライマーを用いて行った。
２．結果
２−１．ヒトＳｃｏｔ−ｔ  ＤＮＡの配列分析
前記１−２に記載したＰＣＲプライマーの設定により、偽遺伝子ＤＮＡを増幅せず、真のＳｃｏｔ−ｔゲノムＤＮＡのみを増幅することによって、不妊の危険性がある男性と生殖能力の証明された対照男性との比較を行った。
その結果、表２に示した４箇所の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）が見られたが、不妊患者２５５例と対照となる生殖能力の証明されたボランティア２６１例との合計５１６例の男性において、１箇所は３’非コーディング領域に存在し（ｔ１６６７ｃ）、他の箇所はコーディング領域に存在して第３８、２８５および３５２番のアミノ酸変化を誘導していた（図１）。コンセンサスミトコンドリア標的シーケンスドメイン内部の３８番アミノ酸（Ｌ３８Ｐ）に位置するｔ１２９ｃ  ＳＮＰは、生殖可能な対照群と不妊患者において、それぞれ９４％（２４６例）および９６％（２４６例）がメジャーのホモ接合ロイシンタイプであり（ｔ／ｔ）、５．４％（１４例）および２．７％（７例）がヘテロ接合（ｔ／ｃ）、そして０．４％（１例）および０．８％（２例）がマイナーのホモ接合でありプロリン（ｃ／ｃ）へのアミノ酸変化の原因となっていることが観察された。２８５番アミノ酸（Ｌ２８５Ｒ）に位置するｔ８７０ｇＳＮＰは、生殖可能な対照群と不妊患者において、それぞれ８０％（２０８例）および８０％（２０４例）がメジャーのホモ接合ロイシンタイプであり（ｔ／ｔ）、１９％（５０例）および１５％（３９例）がヘテロ接合（ｔ／ｇ）、そして１．１％（３例）および４．７％（１２例）がＳＮＰのマイナー型のホモ接合（ｇ／ｇ）、でありアルギニン（ｇ／ｇ）へのアミノ酸変化の原因となっていることが観察された。３５２番アミノ酸（Ｔ３５２Ｍ）に位置するｃ１０７１ｔ  ＳＮＰは、正常対照群と不妊男性において、それぞれ９６％（２５０例）および９３％（２３８例）がメジャーのホモ接合ロイシンタイプであり（ｃ／ｃ）、３．１％（８例）および４．３％（１１例）がヘテロ接合（ｃ／ｔ）、そして０．８％（２例）および２．４％（６例）がマイナー型のホモ接合（ｃ／ｃ）でありスレオニン（ｃ／ｃ）からメチオニン（ｔ／ｔ）へのアミノ酸変化の原因となっていることが観察された。３箇所の領域でアミノ酸変化を引き起こすホモ接合ＳＮＰｓの発現率は、生殖可能な対照群と比べて不妊患者母集団のほうが２から４倍有意な高値を示した。さらにここでは、３’非コーディング領域中に非常に興味深いＳＮＰ（ｔ１６６７ｃ）が見出された。正常対照群と不妊男性母集団において、それぞれ８０％（２０６例）および８０％（２００例）がメジャーのｔ型ホモ接合であり（ｔ／ｔ）、１９％（４９例）および１５％（３８例）がヘテロ接合（ｃ／ｔ）、そして１．２％（３例）および４．８％（１２例）がｃ型のマイナーホモ接合（ｔ／ｔ）であった。これらのマイナーのホモ接合の事例は全て二重ＳＮＰｓであり、正常な生殖可能対照群（３例の男性）と不妊患者（１２例の男性）の両方において、それぞれｔ８７０ｇにおける遺伝子型がマイナーｇ型ホモ接合であったが、不妊事例において１例の例外が見られた（以上、表３、表４）。
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２−２．ＳＮＰｓを有する組換えｈ−ＳＣＯＴ−ｔのスクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性
ｈ−ＳＣＯＴ−ｔ酵素活性に対するＳＮＰｓの影響を調べるため、アミノ酸置換を生じる３箇所のＳＮＰｓを保有する組換えタンパク質をＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性の分析をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行った。ｔ１２９ｃ（Ｌ３８Ｐ）とｃ１３９２ｔ（Ｔ３５２Ｍ）に位置するマイナー型のＳＮＰｓは、いずれもメジャー型ＳＮＰｓと同様なレベルの酵素活性を示した。対照的にＴ８７０Ｇ（Ｌ２８５Ｒ）に位置するマイナー型（ｇ／ｇ）のＳＮＰは、メジャー型と比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏで約半分ほど酵素活性を減少させた（表５）。この結果から、ｈ−ＳＣＯＴ−ｔのスクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ活性が男性不妊の前提条件であり、酵素活性を減少させるＳＮＰｓの中には男性不妊の原因となるものが存在することが示される。
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２−３．ヒトプロタミン−１  ＤＮＡの配列分析
ＰＣＲにより増幅された５５７ｂｐのＤＮＡ断片は２０４から２９４までの９１個のヌクレオチドから成るイントロンを含んでいた（（配列番号１７０、図２）。各プライマー内部の５０９ｂｐ中のＳＮＰｓの同定を、５５７ｂｐのＤＮＡ断片に対する配列分析により行った（図２）。全てのＤＮＡ試料がほぼ等量のＰＣＲ産物を増幅したことから、プライマー配列領域にはＳＮＰｓは一切含まれていないことが確認された。男性不妊患者を対象にＳＮＰの発現率を評価し、生殖能力が証明されたボランティアの場合と比較した。合計５２８例の男性被験者（不妊患者２５８例と対象の生殖能力を持つボランティア２７０例）において、ＳＮＰｓは５箇所で発見され、うち４箇所は１３３、１６０、３２０および３２１番目のコーディング領域に、１箇所は４３１番の３’未翻訳領域に存在していた（図２および表６）。観察されたＳＮＰｓは全てアミノ酸の変化を引き起こさなかった（サイレント変異）。ａ１３３ｇ、ｃ１６０ｇおよびｇ３２０ａに位置する３箇所のＳＮＰｓと、１４および４６番目のアミノ酸に位置するＳＮＰ（図２）は全てメジャーホモ接合とヘテロ接合であり、マイナーホモ接合ＳＮＰｓは見られなかった（表６）。４７番目アミノ酸に位置する他のｃ３２１ａ  ＳＮＰでは、不妊症および生殖能力を持つ対照母集団において、それぞれ５６．６％（１４６例）および４７．８％（１２９例）がホモ接合メジャーｃ／ｃタイプであり、３４．５％（８９例）および４３．３％（１１７例）がヘテロ接合（ｃ／ａ）、そして８．９％（２３例）および８．９％（２４例）がホモ接合マイナータイプ（ａ／ａ）ＳＮＰであった。３’非コーディング領域におけるａ４３１ｇ  ＳＮＰに加えて、これらのＳＮＰはいずれもアミノ酸変化を生じず、不妊症患者において生殖能力の証明されたボランティアより有意に発生率が高いことも示されなかった（表６：なお、表６におけるヌクレオチド位置は図２のヌクレオチド位置に対応している）。
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２−３．ヒトプロタミン−２  ＤＮＡの配列分析
各プライマー内部の５５１ｂｐにおけるＳＮＰｓを、５９９ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１７３）に対する配列分析により同定した（図３）。全てのＰＣＲは、アガロースゲル電気泳動上で調べてほぼ等量のＤＮＡを増幅したため、プライマー配列領域はＳＮＰｓを含んでいないことを確認した。ここでは、プロタミン−２遺伝子の５９９個のヌクレオチド中に３箇所のＳＮＰｓが観察されたが、１箇所はエクソン中に、２箇所はイントロン内に存在していた（図３）。２４８番ヌクレオチドにおける１箇所のヘテロ接合ＳＮＰはｃからｔへ変化しており、グルタミンをストップコドンに変えているものであるが、これは１５３例の無精子症患者のうち１例の不妊症患者にのみ観察され、２７０例の生殖可能な対照母集団中には見られなかった（表６）。この変化は、たとえヘミ接合状態であったとしても無精子症の原因に関連している可能性がある。さらにイントロン内部にはｇ３９８ｃとａ４７３ｃの２箇所のＳＮＰｓが見られた。ｇ３９８ｃでは、不妊症および生殖可能な対照母集団中において、それぞれ５７．４％（１４８例）および４７．０％（１２７例）がメジャー型のホモ接合、３４．１％（８８例）および４３．７％（１１８例）がヘテロ接合（ｇ／ｃ）、そして８．５％（２２例）および８．９％（２４例）がマイナーホモ接合（ｃ／ｃ）型であった。さらに、ｇ／ａ型である異なったヘテロ接合ＳＮＰの存在が１例の対照群において観察された。もう一つのａ４７３ｃのＳＮＰでは、不妊症および生殖可能な対照母集団中においてそれぞれ５６．６％（１４６例）および４７．０％（１２７例）がメジャー型のホモ接合、３４．９％（９０例）および４３．７％（１１８例）がヘテロ接合、そして８．５％（２２例）および９．３％（２５例）がｃ型のマイナーホモ接合型であった。これらのイントロンＳＮＰｓの不妊症の母集団における発現率は、生殖能力の証明されたボランティアでの場合に対して有意差がなかった（表６）。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、マウスの精子形成遺伝子（ＭＳＧ）８９クローン、およびこれらＭＳＧｓの完全長ｃＤＮＡ塩基配列が提供される。また、この発明によって、ＭＳＧｓの発現変調および変異を指標として用いる遺伝子診断および毒性試験、変異原性試験方法が提供される。これらの試験方法は、具体的には、男性不妊症の遺伝子ＤＮＡを直接使用する遺伝子診断、環境中に放出される微量な化学物質が性分化・生殖細胞分化に与える影響としての環境毒性、また、生殖毒性・変異原性を有する物質の生体に及ぼす影響、特に、生殖細胞特異的発現を示す遺伝子群に対する影響の分子レベルでの解析が可能となる。さらにまた、この発明は、精子数減少や生殖機能障害等を誘発する危険性のあるＥＤの検出・測定、およびＥＤに係るグローバルな環境アセスメントに貢献する。その上、催奇性の検出を目的とする従来の「生殖に及ぼす影響」試験において、新規な「ＭＳＧｓに対する変異原性」検定の追加をもたらし、医薬品や化学品等の安全性を保証するための国際基準の向上に多大に寄与する。
また、この出願の発明によって、遺伝的な男性不妊の原因となるＳｃｏｔ−ｔ遺伝子変異とプロタミン−２遺伝子変異が提供される。さらに、これらの遺伝子変異、および遺伝子変異に伴う変異ポリペプチド等を検査対象とする男性不妊診断方法が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＳｃｏｔ−ｔゲノムＤＮＡとタンパク質をＳＮＰｓ位置と共に示した模式図である。水平矢印は２対のプライマーを示す。
図２は、プロタミン−１のゲノムＤＮＡ配列と、ＰＣＲ増幅および配列分析のためのプライマーを示す。翻訳開始点、イントロンおよびカノニカルポリＡ付加シグナルは、それぞれ＋１、白ヌキ箱およびカゲ付きで示した。プライマー配列は下線部分である。各タンパク質のアミノ酸配列は、ヌクレオチドシーケンスの下に大文字で記入した。右余白の数字は、ヌクレオチドおよびアミノ酸（太字）配列の位置番号を示している（ヌクレオチド位置番号は翻訳開始点（＋１）からの番号であり、配列番号１７０とは異なることに注意）。ＳＮＰｓは太字で示した。星印はＧｅｎＢａｎｋ登録配列（ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／Ｙ００４４３、Ｍ２９７０６、Ｍ６０３３１、Ｍ６０３３２）に対して、不妊および生殖能力が証明された母集団の４９６例のヒト男性患者の持つヌクレオチドの違いを示す。
図３は、プロタミン−２のゲノムＤＮＡ配列と、ＰＣＲ増幅および配列分析のためのプライマーを、図２と同様に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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