(57)【要約】本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された複製能を有する細胞融合型ベクターを提供する。パラミクソウイルスのＦ蛋白質の開裂部位が他のプロテアーゼにより開裂される配列に改変された改変Ｆ蛋白質をコードする、Ｍ遺伝子欠損型ウイルスベクターを製造した。このベクターは導入された細胞内でベクターに含まれるゲノムＲＮＡを複製し、該他のプロテアーゼの存在に依存して隣接する細胞に細胞融合型の感染を広げるが、ウイルス粒子は放出しない。癌で活性が亢進するプロテアーゼで開裂されるＦ蛋白質をコードする本発明のベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで癌増殖抑制作用を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含む複合体であり、以下の性質を有する複合体。
（１）該複合体が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有する。
（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失している。
（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該ＲＮＡを導入する能力を有する。
【請求項２】
ウイルス粒子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
野生型Ｆ蛋白質をさらに含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
該パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１から３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
該プロテアーゼが、癌で活性が亢進するプロテアーゼである、請求項１から４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
該プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１から５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
該プロテアーゼによって開裂される配列が、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、またはＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む、請求項１から６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
該改変Ｆ蛋白質において、野生型Ｆ蛋白質が持つ細胞質ドメインの一部が欠失している、請求項１から７のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
該改変Ｆ蛋白質がＨＮ蛋白質と融合している、請求項１から８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムＲＮＡを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（ｉ）パラミクソウイルスの野生型Ｍ蛋白質を発現する細胞において、該パラミクソウイルスのＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質、および該ゲノムＲＮＡを含むＲＮＰを増幅させる工程、
（ｉｉ）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法。
【請求項１１】
パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）条件的変異を有するＭ蛋白質をコードし、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムＲＮＡを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（ｉ）該Ｍ変異蛋白質の許容条件下、細胞内で該パラミクソウイルスのＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質、および該ゲノムＲＮＡを含むＲＮＰを増幅させる工程
（ｉｉ）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法。
【請求項１２】
工程（ｉ）を３５℃以下で行う、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）〜（ｉｉ）の少なくともいずれかの時期において該改変Ｆ蛋白質を開裂させるプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ｉｉ）において回収されたウイルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）において該細胞内でパラミクソウイルスの野生型Ｆ蛋白質を発現させ、工程（ｉ）〜（ｉｉ）の少なくともいずれかの時期に該野生型Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ｉｉ）において回収されたウイルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項５に記載の複合体および薬学的に許容される担体を含む癌の治療組成物。
【請求項１６】
パラミクソウイルスＦ蛋白質の改変蛋白質であって、開裂部位にＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、またはＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含み、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターの存在下で細胞融合能を示す組み換え蛋白質。
【請求項１７】
請求項１６に記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１６に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウイルス粒子。
【請求項１９】
パラミクソウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質の膜貫通領域を持ち、細胞質側において互いの蛋白質が結合している融合蛋白質であって、細胞融合活性を持つ蛋白質。
【請求項２０】
請求項１９に記載の融合蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質。
【請求項２１】
請求項１９に記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
請求項１９に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウイルス粒子。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された細胞融合型ベクターおよびその製造方法に関する。本発明のベクターは、癌特異的に感染する遺伝子治療ベクターとして有用である。
背景技術
近年、癌に対する遺伝子治療の開発が進展している。これまで本発明者らはセンダイウイルス（ＳｅＶ）を用いて遺伝子治療ベクターの開発を行ってきた。ＳｅＶはパラミクソウイルス科ウイルスの一種で、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスのグループに属す。パラミクソウイルスベクターは、外来遺伝子の高導入率および高発現を可能とするベクターであり、癌の遺伝子治療用ベクターとしても期待されている。パラミスソウイルスによる癌治療の試みは多数なされている。例えば、ＢＨＫ２１細胞にＭｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓを感染させると、担癌ヌードマウスで抗癌効果を示すことが報告された（Ｍｉｎａｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４９，１１１７−１１３３）。また、その他のパラミクソウイルスでも同様に抗腫瘍効果が報告されている。最近、Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎの抗癌効果が注目されている。Ｇａｌａｎｉｓらは、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓのＦ，ＨＮ蛋白質を搭載したａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒが、感染した癌細胞がシンシチウムを形成し、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗癌効果を報告している（Ｇａｌａｎｉｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２，８１１−８２１）。
言うまでもなく、転移しない癌はその部分を外科的に取り除けばよく、転移することと悪性の癌とは同義であるとされている。その浸潤転移する癌は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）および／またはプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ，ｔＰＡ）を高発現することが知られている（Ｃｏｘ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｏ’Ｂｙｒｎｅ，Ｋ．Ｊ．（２００１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１，４２０７−４２１９；Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．５７，２５−４０）。その理由として、癌細胞が転移浸潤する際、そのまわりにある細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が障壁となり細胞の移動ができないので、癌はそのＥＣＭを分解する酵素（ＭＭＰ，ｕＰＡ，ｔＰＡ）を発現し、ＥＣＭ分解することによってはじめて、浸潤、転移が可能になるためであると考えられている。
一方、癌遺伝子治療の問題点として３つのことがあげられている。第一に癌細胞への導入効率が低かったり、固形癌深部への導入ができないため、癌全体への導入ができず、残った癌が再び増殖を始め再発することである。第二に癌への導入と同時に正常細胞へも導入され、正常細胞にも傷害を与え、副作用が大きくなっていることである。第三にこれは癌治療全体の問題でもあるが、癌の悪性化にともなう浸潤転移である。これらの問題を解決するベクターは未だ開発されていない。
発明の開示
本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変され、特定のプロテアーゼ存在下でのみ周囲の細胞に浸潤する新たな細胞融合型ベクターおよびその製造方法を提供する。
センダイウイルスを含むパラミクソウイルス科ウイルスは、そのエンベロープに２つの蛋白を有している。Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）蛋白質はウイルスとその宿主である細胞とを膜融合をさせ、ヌクレオカプシドを細胞質へ放出させる。ＨＮ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）蛋白質は赤血球凝集能とのノイラミナーゼ活性をもち、宿主レセプターへ結合する役割を果たす。Ｆ蛋白質およびＨＮ蛋白質はスパイク蛋白質とも呼ばれ、ウイルスのエンベロープ表面に露出している。またＭ（ｍａｔｒｉｘ）蛋白質はエンベロープを裏打ちし、ウイルス粒子に強固さを付与している。このベクターの特徴は広範な細胞と動物組織に高効率で遺伝子導入可能で、かつ既存のベクターと比較し、高い発現量を実現していることである。
Ｆ蛋白質（Ｆ０）はそのままでは細胞融合活性を示さず、宿主由来のプロテアーゼにより開裂してＦ１とＦ２に分解されることによってはじめてその融合活性を示すようになる。従って、野生型のＦ蛋白質を持つウイルスの増殖は、この蛋白質を開裂できるｔｒｙｐｓｉｎ様のプロテアーゼを発現する気道粘膜上皮などの組織に制限されてしまう。パラミクソウイルスではＦの改変による感染のトロピズムもしくは融合能の改変についての様々な研究がなされている。ＳｅＶでは、α−キモトリプシンでのみ開裂するＦを持つ変異体がトリプシン感受性を失い、そのトロピズムがＦの開裂配列特異的に変わることが示されている（Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３（Ｐｔ  ６），１５７５−１５７９）。Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓでは、Ｆの開裂配列を改変し、そのシンシチウム形成能がトリプシン依存的に変わることを示している（Ｌｉ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，３７８９−３７９５；Ｍａｉｓｎｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，４４１−４４９）。
このように、Ｆの開裂配列を改変することにより、あるプロテアーゼを発現する特定の組織等にベクターを感染および増殖させることが可能となると考えられる。しかし、パラミクソウイルスベクターが持つ問題点の１つに、標的細胞へのベクター導入後に起こる細胞からのウィルスの２次放出がある。複製型ウィルスを感染させた細胞ではビリオンが形成され娘ウィルスが放出されるため、標的組織以外にもウイルス粒子が拡散する。上述のように野生型Ｆ蛋白質を持つウイルス粒子はトリプシン様酵素の非存在下では感染性を示さないものの、ウイルス粒子自身は細胞から放出される。生体内投与においては、血中に拡散したウイルスが全身に到達することも懸念される。さらに、複製能を持たないＦ遺伝子欠損ＳｅＶ（Ｌｉ，Ｈ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，６５６４−６５６９；ＷＯ００／７００５５；ＷＯ００／７００７０）を導入した細胞等からもウィルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）の放出が観察されている。このような２次放出粒子は、標的とする組織以外への感染や免疫反応を誘発することが懸念される。
本発明者らは、ウイルスエンベロープ遺伝子の中で、Ｍ遺伝子を欠損するパラミクソウイルスは、粒子形成が起こらないが感染細胞とそれに接した細胞が融合することによってシンシチウムを形成し、細胞融合型の感染をすることを見出している（ＷＯ００／０９７００）。これらのＭ欠損型ウイルスは、導入細胞において複製され、トリプシン存在下で隣接する細胞に伝達される。しかしながら、この現象はＦが開裂して活性化する条件においてのみ起こる現象であり、野生型Ｆ蛋白質を持つウイルスではｔｒｙｐｓｉｎ様のプロテアーゼがない状態ではウイルスの伝達は起きない。本発明者らは、このＭ欠損型ウイルスにおいてＦ蛋白質のトロピズムを改変すれば、２次放出粒子を産生せず、特定の組織でのみ感染を広げられる新規なベクターを開発できるのではないかと考えた。特に浸潤転移癌においては、ＥＣＭを分解するＭＭＰ，ｕＰＡ，ｔＰＡなどのプロテアーゼ活性が亢進しているものが多く知られている。そこで本発明者らは、このＭ欠失型ＳｅＶのプロテアーゼ依存的細胞融合型感染と癌におけるＭＭＰ，ｕＰＡ，ｔＰＡ高発現の現象を組み合わせて利用し、浸潤転移癌特異的に感染し広がってゆくＳｅＶベクターを作製した。
Ｍ欠損型ウイルスは粒子形成に必要なＭ遺伝子を欠損しているため、通常ウイルス粒子は放出しないか極度に抑制されている。複製能を持つ組み換えウイルスの産生に用いる通常の再構成法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）を用いた場合、Ｍ欠損型ウイルスのＲＮＰを調製することはできるが感染性ウイルス粒子は製造できない（ＷＯ００／０９７００）。実際の癌治療薬としてＭ欠失型ベクターを利用するためには、Ｍ欠失型ウイルスを感染性ウイルス粒子として調製できれば極めて有用である。そこで本発明者らは、Ｍ欠失型ウイルスをウイルス粒子として調製するための新たな製造方法の開発を行った。
本発明者らはまず、ＶＬＰ放出が抑制されたベクターを構築するための一つの解決法として、ウィルス遺伝子の温度感受性変異の利用を考えた。低温で生育するが高温では増殖できない幾つかの変異型ウィルスが報告されている。本発明者らは、特に高温でのビリオン形成が抑制されるような変異蛋白質、特にＭ蛋白に変異を有するものを利用すれば、低温で（例えば３２℃）ウィルス生産を行い、遺伝子治療等の実応用時はそれよりは高温（例えば３７℃）で行うことにより、ＶＬＰ形成を抑制できる可能性があると考えた。この目的のために、本発明者らはＭ蛋白質およびＨＮ蛋白質で報告されている、それぞれ３つ、計６つの温度感受性変異を持つ変異ＭおよびＨＮ蛋白質をコードするＦ遺伝子欠損型の組み換えセンダイウィルスベクターを構築した。このウィルスのＶＬＰ放出を調べたところ、野生型ウィルスに比べ約１／１０またはそれ以下であることが判明した。さらに、ＶＬＰ放出が抑制されたセンダイウィルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を、抗Ｍ抗体を利用した免疫染色により解析した結果、野生型ウィルスを導入した細胞では見られる細胞表面のＭ蛋白質の凝集が、ＶＬＰ放出抑制型ウィルスの場合は有意に減少しており、特に高温（３８℃）においてＭ蛋白の濃縮像が極端に減少していた。温度感受性変異Ｍ遺伝子を含むこのＳｅＶを感染させた細胞におけるＭ蛋白質およびＨＮ蛋白質の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡により詳しく調べたところ、低温（３２℃）においても細胞表面でのＭ蛋白の局在は有意に低下しており、微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の形態に近い形で観察された。さらに、高温（３７℃）ではＭ蛋白は微小管の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）に局在して存在していた。微小管脱重合剤を添加すると、温度感受性Ｍ遺伝子を持つＳｅＶのみならず、野生型Ｍ遺伝子を持つＳｅＶにおいても、Ｍ蛋白質の局在構造が破壊されたことから、Ｍ蛋白質は実際に微小管に沿って局在して機能している可能性が高いと判断された。以上の知見から、温度感受性変異導入ウィルスで二次放出粒子が減少しているのは、粒子形成の中心的な役割を担っていると考えられているＭ蛋白の細胞内局在の不全であると断定された。従って、Ｍ蛋白質の正常な細胞内局在を妨げることにより、ＶＬＰの形成を効果的に抑制することができると考えられる。また、Ｍ蛋白質の機能には微小管との相互作用が重要であり、例えばＭ蛋白質がゴルジ体から微小管に沿って細胞内移動することを阻害するような遺伝子変異や薬剤を開発することにより、Ｍ蛋白の細胞内局在の不具合を生じさせ、結果的に二次放出粒子の減少を達成することが可能と判断される。すなわち本発明者らは、Ｍ蛋白質の局在に欠陥を生じさせるような変異を有するウィルスベクターを調製することによって、粒子形成能が低下または消失した組み換えウィルスベクターを得ることができることを見出した。
また本発明者らは、Ｍ遺伝子をウィルスから欠失させることによって、ウィルスを導入した細胞におけるＭ蛋白質の細胞表面の凝集が完全に欠如したウィルスの構築を試みた。この目的のために、本発明者らはＭ遺伝子欠失型ウィルスの生産に利用可能な野生型Ｍ蛋白質を誘導的に発現させることができるヘルパー細胞を構築した。この細胞を利用することにより、野生型Ｍ蛋白質を含むエンベロープに、Ｆ改変型のＭ遺伝子欠損ウイルスのＲＮＰが包まれたウイルス粒子を回収することに初めて成功した。本発明の方法により１×１０８ＰＦＵ／ｍｌ以上の濃度でウイルス粒子を製造することが可能となり、臨床を含む実用に耐える組み換えウイルスを初めて提供することが可能となった。また本発明のウイルス製造系は、他のウィルスの混入を否定できる安全性の高い高タイターの遺伝子治療用ベクターの生産を可能にする。Ｍ発現細胞を利用してＭ蛋白質をトランスに供給する、本発明のＭ欠失型ＳｅＶ生産システムにおいて初めて、実用に適したＦ改変型Ｍ欠失型のパラミクソウィルスが提供された。
本発明者らは、上記のように構築した感染性ウイルス粒子を用いて、実際の抗腫瘍効果をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて検証した。癌細胞を移植したマウスに対して、この癌で活性が亢進するマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で活性化されるＭ欠失型ウイルスを投与したところ、細胞融合型の感染を通して癌組織内にウイルスが広がることが確認された。野生型ウイルスを投与した癌では、数日後でもウイルスは注入部位に限定されていたのに対し、本発明のベクターでは癌組織に対して強い浸透力を示し、癌全体にベクターの広がりが認められた。ウイルス未投与または野生型ウイルスを投与した対照に比べ、癌の増殖に対する抑制効果は明白であった。これまでにもレトロウイルスにおいてＭＭＰ発現細胞を標的とするベクターが作製されているが（Ｐｅｎｇ，Ｋ．−Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７２９−７３８；Ｐｅｎｇ，Ｋ．−Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１５５２−１５５７；Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６９２３−６９２９）、本発明とは認識配列のデザインが全く異なっている。また、これらの報告は癌組織への特異的な感染、則ちターゲッティングのみを目的としたものであり、癌組織で特異的に（細胞間で）感染が広がり治療効果を発揮するベクターは本発明において初めて提供された。
さらに本発明者らは、ウイルス粒子産生時にプロテアーゼの添加を制御することにより、ウイルス表面のＦ蛋白質が開裂されていないウイルス粒子（Ｆ非開裂型ウイルス）を調製することに成功した。このウイルスは、そのままでは感染性を持たないが、ウイルス表面のＦ蛋白質を開裂するプロテアーゼで処理するか、あるいは該プロテアーゼ存在条件下で細胞に添加することにより、特異的に感染能を示すことができた。このような潜在感染型ウイルスベクターにより、特定のプロテアーゼを産生する癌細胞に特異的にベクターを感染させることが可能となった。
また本発明者らは、改変Ｆ遺伝子を持つベクターを、野生型Ｆ蛋白質を用いて作製することにより、ベクター作製時に野生型Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼを用いてウイルス粒子を製造する方法を開発した。この方法によれば、野生型Ｆ蛋白質を発現するヘルパー細胞を用いて、トリプシン等の野生型Ｆ蛋白質を開裂する酵素によりウイルス増幅を行うことができる。得られたウイルス粒子は、開裂した野生型Ｆ蛋白質をエンベロープに含み感染性を有するが、ウイルスゲノムはＦ蛋白質の開裂部位が改変された改変Ｆ遺伝子をコードするため、特定のプロテアーゼの存在下でしか感染を広げられない。野生型Ｆ蛋白質を用いてウイルスを調製する方法は、ベクターゲノムに組み込む改変Ｆ遺伝子に依存せずにウイルス粒子を製造することが可能であるため有利である。
このように本発明は、癌などの特定の組織で発現するプロテアーゼ存在下でのみ感染を広げるベクターを提供する。本発明のベクターはウイルス様粒子を有意に産生せず、細胞融合により隣接する周囲の細胞にベクターを伝達する。特に癌で活性が亢進するプロテアーゼで感染性を獲得する本発明のベクターは、腫瘍増殖に対する強い抑制作用を持っており、このベクターを用いた癌の遺伝子治療は極めて有効と考えられる。
すなわち本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された細胞融合型ベクターおよびその製造方法等に関し、より具体的には
〔１〕パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含む複合体であり、以下の性質を有する複合体、
（１）該複合体が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有する、
（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失している、
（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該ＲＮＡを導入する能力を有する、
〔２〕ウイルス粒子である、〔１〕に記載の複合体、
〔３〕野生型Ｆ蛋白質をさらに含む、〔２〕に記載の複合体、
〔４〕該パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の複合体、
〔５〕該プロテアーゼが、癌で活性が亢進するプロテアーゼである、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の複合体、
〔６〕該プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の複合体、
〔７〕該プロテアーゼによって開裂される配列が、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、またはＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の複合体、
〔８〕該改変Ｆ蛋白質において、野生型Ｆ蛋白質が持つ細胞質ドメインの一部が欠失している、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の複合体、
〔９〕該改変Ｆ蛋白質がＨＮ蛋白質と融合している、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の複合体、
〔１０〕パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムＲＮＡを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（ｉ）パラミクソウイルスの野生型Ｍ蛋白質を発現する細胞において、該パラミクソウイルスのＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質、および該ゲノムＲＮＡを含むＲＮＰを増幅させる工程、
（ｉｉ）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法、
〔１１〕パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）条件的変異を有するＭ蛋白質をコードし、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムＲＮＡを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（ｉ）該Ｍ変異蛋白質の許容条件下、細胞内で該パラミクソウイルスのＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質、および該ゲノムＲＮＡを含むＲＮＰを増幅させる工程
（ｉｉ）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法、
〔１２〕工程（ｉ）を３５℃以下で行う、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕工程（ｉ）〜（ｉｉ）の少なくともいずれかの時期において該改変Ｆ蛋白質を開裂させるプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ｉｉ）において回収されたウイルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、〔１０〕または〔１１〕に記載の製造方法、
〔１４〕工程（ｉ）において該細胞内でパラミクソウイルスの野生型Ｆ蛋白質を発現させ、工程（ｉ）〜（ｉｉ）の少なくともいずれかの時期に該野生型Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ｉｉ）において回収されたウイルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、〔１０〕または〔１１〕に記載の製造方法、
〔１５〕〔５〕に記載の複合体および薬学的に許容される担体を含む癌の治療組成物、
〔１６〕パラミクソウイルスＦ蛋白質の改変蛋白質であって、開裂部位にＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、またはＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含み、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターの存在下で細胞融合能を示す組み換え蛋白質、
〔１７〕〔１６〕に記載の蛋白質をコードする核酸、
〔１８〕〔１６〕に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウイルス粒子、
〔１９〕パラミクソウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質の膜貫通領域を持ち、細胞質側において互いの蛋白質が結合している融合蛋白質であって、細胞融合活性を持つ蛋白質、
〔２０〕〔１９〕に記載の融合蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質、
〔２１〕〔１９〕に記載の蛋白質をコードする核酸、
〔２２〕〔２１〕に記載の核酸を含むベクター、
〔２３〕〔１９〕に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウイルス粒子、に関する。
本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウィルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウィルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（パラミクソウイルス属（レスピロウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、具体的にはセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウィルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウィルス１，２，３型等が挙げられる。より具体的には、例えばＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）、ｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）、およびＮｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）などが含まれる。より好ましくは、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）からなる群より選択されるウイルスが例示できる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウィルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
組み換え蛋白質および組み換えウイルスとは、それぞれ組み換えポリヌクレオチドを介して生成した蛋白質およびウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖がつなぎ替えられたり、あるいは合成されたポリヌクレオチドなどが含まれる。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換え蛋白質は、蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された複製能を有する細胞融合型ベクターを提供する。このベクターは、宿主内環境において細胞への導入後にウイルス様粒子を有意に放出せず、特定のプロテアーゼ存在下でのみ周囲の細胞に浸潤するベクターである。本発明のベクターは、具体的には以下の複合体を言う。
パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含む複合体であり、以下の性質を有する複合体。
（１）該複合体が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有する。
（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失している。
（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該ＲＮＡを導入する能力を有する。この複合体は、ゲノムＲＮＡを複製しそれを隣接細胞に導入する働きを有することから、本発明においてベクターとも呼ぶ。ベクターとは、核酸を細胞に導入する担体を言う。
上記複合体は、具体的には該パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとこれに結合するウイルス蛋白質を含む複合体である。本発明の複合体は、例えばパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であってよい。ＲＮＰは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このようなＲＮＰは、具体的にはパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡ、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質を含む複合体である。ＲＮＰは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムＲＮＡからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘ＲＮＰが形成される。ゲノムＲＮＡの複製は、該ＲＮＡのコピー数の増加をＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。
また上記複合体は、より好ましくはパラミクソウイルスのウイルス粒子である。ウイルス粒子とは、ウイルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。ウイルス粒子の形状はウイルスの種類により球状、棍棒状など様々であってよいが、細胞より十分に小さく、その大きさは通常１０ｎｍ〜８００ｎｍ程度である。パラミクソウイルスのウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質を含む上記ＲＮＰが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。ウイルス粒子は、感染性を示すものでも示さないものでもよい（後述）。例えば、そのままでは感染性を示さないが、特定の処理により感染性を獲得するような潜在的に感染性を有するウイルス粒子であってもよい。
またパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にＲＮＰを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、該核酸が複製して娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡを言う。パラミクソウイルスは一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスであるので、このようなＲＮＡは搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般にパラミクソウィルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）−介在配列（Ｉ配列）−転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子のＯＲＦをコードするＲＮＡが別々のシストロンとして転写される。本発明のベクターに含まれるゲノムＲＮＡは、該ＲＮＡにコードされる遺伝子群の発現およびＲＮＡ自身の自律的な複製に必要なウイルス蛋白質であるＮ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、およびＬ（ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該ＲＮＡは、隣接細胞への該ＲＮＡの伝播に必要な細胞膜融合を起こす蛋白質であるＦ（フュージョン）蛋白質をアンチセンスにコードしている。好ましくは、ゲノムＲＮＡはさらにＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）（またはＨ）蛋白質をアンチセンスにコードしている。但し、ある種の細胞では感染にＨＮ蛋白質は必要なく（Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２（４）：９７８−９８２（１９８５））、Ｆ蛋白質のみで感染が成立する。また、細胞に結合し得るＨＮ以外の蛋白質をＦ蛋白質と組み合わせてベクターを感染させることができる。従って、ＨＮ遺伝子をコードしないゲノムＲＮＡを用いても、本発明のベクターを構築することは可能である。
例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、Ｎ遺伝子は″ＮＰ″と表記されることもある。
レスピロウィルス属    ＮＰ  Ｐ／Ｃ／Ｖ  Ｍ    Ｆ    ＨＮ    −      Ｌ
ルブラウィルス属      ＮＰ  Ｐ／Ｖ      Ｍ    Ｆ    ＨＮ  （ＳＨ）  Ｌ
モービリウィルス属    ＮＰ  Ｐ／Ｃ／Ｖ  Ｍ    Ｆ    Ｈ      −      Ｌ
例えばパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のレスピロウィルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、Ｎ遺伝子については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ−１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ−２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ−３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢ０１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ  Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ−１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ−３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ−１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ−３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６���６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ，Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ−１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ−２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ−３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ−４Ａ，Ｍ３４０３３；ＨＰＩＶ−４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；およびＳＶ−５，Ｓ７６８７６が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
これらのウイルス蛋白質のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ−Ｉ−Ｓ配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ−Ｉ−Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、（Ｍ、）Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子は６つではないが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とするか、あるいは適宜変更することができる。Ｍ蛋白質のＯＲＦについては後述するが、本発明のベクターの１つの態様においては、このＯＲＦは存在しないか、あるいは変異Ｍ蛋白質をコードしている。また本発明のベクターの１つの態様においては、ゲノムにコードされるＦ蛋白質の開裂部位は、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に改変されている（後述）。本発明のゲノムＲＮＡは、１つまたはそれ以上の外来遺伝子をコードすることができる。外来遺伝子としては、標的とする細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子の導入位置は、例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位に挿入することができ、例えば３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。Ｍ遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，４８２２−４８３０，１９９３）。挿入した外来遺伝子とウイルスＯＲＦとの間には、Ｅ−Ｉ−Ｓ配列が構成されるようにする。あるいは、ＩＲＥＳを介して外来遺伝子を挿入してもよい。
外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、ネガティブ鎖の３’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、５’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子は高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。具体的には、３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に挿入される。あるいは、３’に一番近いウイルス遺伝子と２番目の遺伝子のＯＲＦの間に挿入してもよい。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばベクターにおける挿入遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖ゲノムのなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
また本発明のベクターは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウィルスベクターにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質も、開裂部位以外のドメインも改変することにより、膜融合能および／または粒子形成能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスベクターを作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける毒性のない遺伝子導入用ウィルスベクターとして有用である。
また好ましい態様において、本発明の複合体は実質的に均一な複合体である。実質的に均一な複合体とは、該複合体が、本発明の複合体ではないパラミクソウイルスのＲＮＰまたはウイルス粒子から分離されていることを言う。すなわち実質的に均一な本発明の複合体は、粒子形成能を有する他のパラミクソウイルスＲＮＰも該ウイルスのウイルス粒子も含んでいない。ここで粒子形成能とは、ウイルスベクターを感染させた細胞において、感染性ウイルス粒子および／または非感染性ウイルス粒子（これをウイルス様粒子という）を放出（これを２次放出という）するベクターの能力を言う。また、Ｆ蛋白質の開裂部位が改変された本発明の複合体においては、野生型Ｆ蛋白質またはこれと同等の融合活性を有するＦ蛋白質をコードする遺伝子をゲノムに含むウイルスＲＮＰも該ゲノムを含むウイルス粒子も含んでいない。
本発明の一態様においては、上記ゲノムＲＮＡにコードされるＦ蛋白質は、該蛋白質の開裂部位の配列が、他のプロテアーゼによって開裂される配列に置換されている。パラミクソウイルスのＦ蛋白質（Ｆ０）は、そのままでは細胞膜融合活性を示さないが、Ｆ０断片の細胞外ドメイン（またはウイルス粒子外ドメイン）が開裂することによってその融合活性を示すようになる。開裂により生じた２つのＦ蛋白質断片はＮ末側がＦ２、およびＣ末側がＦ１と呼ばれ両者はジスルフィド結合により結合している。Ｆ蛋白質を開裂するとは、このように膜上のＦ蛋白質を膜の外側のドメインにおいて切断し、細胞融合能を獲得させるような断片を生じさせることを言う。開裂部位の配列とは、プロテアーゼによる開裂のために必要なアミノ酸配列またはその中の本質的な残基を言う。パラミクソウイルスのＦ蛋白質の開裂部位は知られており、それらは細胞内のｆｕｒｉｎ等のトリプシン様プロテアーゼにより切断される。
ｆｕｒｉｎは、ほとんどの細胞のゴルジ体に普遍的に存在する。ｆｕｒｉｎの認識モチーフは、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＲＸＫ／ＲＲ）（″／″で区切られた２つのアミノ酸はどちらかであることを表す）である。病原性の高い、Ｈｕｍａｎ  ＰＩＶ３（ＲＴＫＲ）、ＳＶ５（ＲＲＲＲ）、Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（ＲＨＫＲ）、ＮＤＶ（ｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎ）強毒株（ＲＱＲ／ＫＲ）、Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＲＨＫＲ）、ＲＳ  ｖｉｒｕｓ（ＲＫＲＲ）などは開裂部位にこれらのモチーフの配列を持っている。強毒株のＦは、すべての細胞に存在するプロテアーゼに感受性をもち、どの臓器でもＦの開裂を伴って多段階増殖するため、感染が致命的になってしまう。一方、病原性の低い、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＰＱＳＲ）、Ｈｕｍａｎ  ＰＩＶ１（ＰＱＳＲ）、ＮＤＶ（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎ）弱毒株（Ｋ／ＲＱＧ／ＳＲ）ではこのモチーフに当てはまらず、セリンプロテアーゼ認識配列であるＡｒｇのみ持っている。パラミクソウイルスのＦ蛋白質開裂部位の配列はよく解析されており、当業者であれば適宜文献を参照して知ることができる（例えばウイルス学，畑中正一編集，東京，朝倉書店，１９９７，ｐｐ．２４７−２４８を参照）。
また開裂部位は、当該パラミクソウイルスが増殖可能な細胞、組織、または個体等で増殖させたウイルスのＦ蛋白質、あるいは該細胞または個体等でＦ蛋白質を発現させ回収したＦ蛋白質の開裂部位を同定することにより確認することができる。また、細胞表面に発現するＦ蛋白質を、この蛋白質の開裂部位を開裂するトリプシン等のプロテアーゼで処理することにより、人為的にＦ蛋白質を開裂させ同定することもできる。本発明の一態様においてＦ蛋白質は、Ｆ蛋白質開裂部位のアミノ酸配列が改変され、他のプロテアーゼにより開裂されるような配列となっている。このためには、Ｆ蛋白質の生来の開裂配列を、１またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入により改変し、他のプロテアーゼにより開裂されるような配列に再構築する。アミノ酸配列の改変は、公知の部位特異的変異導入法により行うことができる。なお、改変Ｆ蛋白質は、野生型Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼ（トリプシン等）により開裂される性質が維持されていてもよい（実施例参照）。このような改変Ｆ蛋白質をコードするベクターは、プロテアーゼ依存性トロピズムが野生型Ｆ蛋白質に比べて拡大される。
他のプロテアーゼにより開裂される配列としては、所望のプロテアーゼにより開裂される配列であってよく、例えばベクター導入の標的としたい所望の組織または細胞で発現されるプロテアーゼにより開裂される配列を用いることができる（ＷＯ０１／２０９８９）。このように標的組織で活性があるプロテアーゼで開裂される配列を持つＦ蛋白質遺伝子を用いてベクターを設計することにより、このプロテアーゼ活性が存在する環境下で特異的に周囲の細胞にベクターを増幅し伝達するという優れた性質を実現させることができる。例えば、ある組織で特異的に発現または活性化されるプロテアーゼの切断配列を利用すれば、該組織内でのみ特異的に浸潤するベクターを構築することができる。また、ある状態、例えばある疾患で特異的に発現または活性化するプロテアーゼの切断配列を利用すれば、その状態でのみ（例えば特定の疾患領域内でのみ）特異的に浸潤するベクターを構築することができる。プロテアーゼは細胞内または細胞外に存在するものであってよく、例えば細胞外に分泌されるプロテアーゼや、膜表面に発現する膜型プロテアーゼなどが好適である。また、Ｆ蛋白質が細胞内において翻訳され、細胞表面に分泌されるまでの輸送経路上に存在する所望のプロテアーゼであってよい。
プロテアーゼ遺伝子の発現異常によって生じる疾患の数は膨大で、代謝性疾患、循環障害、炎症・免疫疾患、感染症、悪性腫瘍など、病理学総論で扱われている全ての範疇に属する疾患を含んでいる。例えば、筋ジストロフィー症におけるカルパイン、自己免疫疾患や神経疾患におけるユビキチン・プロテアソームシステムの破錠、アルツハイマー病のネプリライシンの発現低下、癌の浸潤・転移におけＭＭＰの発現亢進、病原微生物による病原体由来プロテアーゼ、止血機構におけるセリンプロテアーゼ、胎盤におけるアミノペプチターゼなどがあげられる。
カルシウム依存性システインプロテアーゼであるカルパインは筋ジストロフィ症の筋蛋白質分解に関わる酵素として研究されてきた。カルパインはカルシウムとの結合によって活性化される特異的な活性化機構を有し、骨格筋の構造維持に重要なα−アクチニン、トロポニン、コネクチンなどの蛋白質を細胞内で限定分解し、筋蛋白質分解の引き金を引くと考えられている。カルパインの切断配列（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．２４，２３５−２４３）としては、例えばＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒが分解基質として用いられている。
ユビキチン・プロテアソームシステムは、細胞内における選択的かつ能動的な蛋白質分解機構であり、シグナル伝達や細胞周期などの重要な細胞機能制御システムである。７６個のアミノ酸からなるユビキチンは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１），ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）による連続的な触媒作用で蛋白質と共有結合し、ユビキチン化蛋白質は２６Ｓプロテアソームにより分解される。数百種類存在するＥ３酵素はＨＥＣＴ型とＲＩＮＧフィンガー型に大別され、これらの酵素活性の異常はきわめて多くの疾患に関与する。２６Ｓプロテアソームに対する分解基質としては例えばＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒが用いられている（Ｒｅｉｎｈｅｃｋｅｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７７，６５−６８）。
慢性関節リュウマチをはじめとする関節疾患は、関節軟骨の組織破壊により運動障害をきたす疾患である。関節軟骨の再生能はきわめて弱く、細胞外マトリックス分解による軟骨高次構造の崩壊は進行性の関節破壊へと導く。このような軟骨細胞外マトリックス分解には、ＭＭＰとその近縁遺伝子ファミリーのＡＤＡＭ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）分子の関わりが最近注目されている。特にＡＤＡＭＴＳ（ＡＤＡＭ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆ）分子は軟骨プロテオグリカン（アグリカン）の分解に必須の酵素と考えられている（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１６６４−１６６６）。ＡＤＡＭＴＳによってａｇｒｉｃａｎが分解された配列が特定されている（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１８５６６−１８５７３）。
これらのプロテアーゼの認識配列を用いることにより、該プロテアーゼが発現する組織に特異的なベクターを調製することができる。
本発明において特に好ましいプロテアーゼ開裂配列は、癌で活性が亢進するプロテアーゼの切断配列である。このような配列を利用してベクターを構築することにより、癌特異的に感染を広げるベクターを構築することが可能となり、癌治療用の遺伝子送達ベクターとして極めて有用となる。癌で活性が亢進するプロテアーゼとは、ある癌組織または癌細胞において、その癌に対応する正常組織または正常細胞と比べ活性が亢進しているプロテアーゼを言う。ここで活性の亢進は、プロテアーゼの発現レベルの亢進および／または活性自体の亢進であってよい。プロテアーゼの発現レベルは、該プロテアーゼの遺伝子断片をプローブにしたノーザンハイブリダイゼーション、該プロテアーゼ遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ、あるいは該プロテアーゼに対する抗体を用いたウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降などにより測定することができる。またプロテアーゼの活性は、該プロテアーゼの基質を用いた分解アッセイにより知ることができる。生体内プロテアーゼは、種々の阻害因子により活性が調節されているものが数多く知られている。プロテアーゼの活性レベルは、これらの阻害因子の発現レベルを測定することによっても測定することができる。
例えば細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）分解酵素の活性は、特に転移性の癌において活性が亢進している（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｃｈｏｐ，Ａ．Ｍ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２：１１５−１２７，１９９１；Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １０：１４５−１５５，１９９２；中島元夫「細胞外マトリクス分解酵素」，清木元治編集「癌の悪性化と転移」，中外医学社，ｐｐ．１２４−１３６，１９９３年）。動物においては、細胞間の隙間に、コラーゲンやプロテオグリカンなどの蛋白からなるマトリックスが形成されている。細胞外マトリックスの成分としては、具体的には、コラーゲン・フィブロネクチン・ラミニン・テネイシン・エラスチン・プロテオグリカンなどが知られている。これらのＥＣＭは、細胞の接着、進展、または移動等の機能を調節したり、可溶性因子を結合してその分布や活性を調節する機能等を有している。癌転移にはＥＣＭ分解酵素によるＥＣＭの浸潤が深く関わっており、実際ＥＣＭ分解酵素の阻害剤による転移または基底膜浸潤の阻害が多数報告されている。ＥＣＭ分解酵素による切断の認識配列を開裂部位に持つ改変Ｆ蛋白質をコードするベクターを設計することにより、癌特異的に感染および浸潤するベクターを構築することができる。
ＥＣＭ分解酵素は、活性中心にある触媒残基の種類によってアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼに分類される。中でも生体内でのＥＣＭ分解には中性プロテアーゼのセリンプロテアーゼとメタロプロテアーゼが中心的な役割を果たしている。セリンプロテアーゼは、微生物、動物、植物等に広く分布し、高等動物においては、食物の消化、血液の凝固、線溶、免疫補体反応、細胞増殖、発生、分化、老化、癌転移などきわめて多くの生体反応に関与している。また、セリンプロテアーゼの活性は、一般に血漿や組織内に存在するセリンプロテアーゼインヒビター（ｓｅｒｐｉｎ）によって調節されており、この量的あるいは質的異常は炎症などの原因となる。
ＥＣＭ分解性セリンプロテアーゼとしては、カテプシンＧ、エラスターゼ、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍トリプシン、キモトリプシン様中性プロテイナーゼ、トロンビンなどが挙げられる。プラスミンは、生体内で不活性な状態で存在するプラスミノーゲンが限定分解されて生じる。この限定分解をプラスミノーゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ＰＡ）とそのインヒビターであるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＡＩ）が制御している。ＰＡには、血液凝固に関係する組織型ＰＡ（ｔＰＡ）と、ＥＣＭ分解に関係するウロキナーゼ型ＰＡ（ｕＰＡ）とがある（Ｂｌａｓｉ，Ｆ．ａｎｄ  Ｖｅｒｄｅ，Ｐ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏ．１：１１７−１２６，１９９０）。これらの２つのＰＡは、ＰＡＩと結合するとその作用が阻害される（Ｃａｊｏｔ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６９３９−６９４３，１９９０；Ｂａｋｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：４６７６−４６８４，１９９０）。ｕＰＡは細胞表面のｕＰＡレセプター（ｕＰＡＲ）と結合した状態で作用することができる。プラスミンはフィブロネクチン、テネイシン、ラミニンなどを分解するが、コラーゲンは直接分解することができない。しかし、コラーゲン分解酵素の前駆体の一部を切断して活性化することにより、間接的にコラーゲンを分解する。これらが癌細胞においてしばしば活性が亢進しており、転移能ともよく相関している（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：４８１−４８４，１９９１；Ｂｏｙｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：３１１２−３１１６，１９８８；Ｈｏｌｌａｓ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３６９０−３６９５，１９９１；Ｃｏｒｒｅｃ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５０：７６７−７７１，１９９２；Ｏｈｋｏｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７１：１０５３−１０５７，１９８３；Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，現代医療１７：１８１５−１８２１，１９８５）。
ｕＰＡ，ｔＰＡの切断配列についての研究も多くなされている（Ｒｉｊｋｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２９２０−２９２５；Ｗａｌｌｅｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７１９，３１８−３２８；Ｔａｔｅ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６，３３８−３４３）。一般に用いられているｓｕｂｓｔｒａｔｅ配列はＶＧＲ（Ｄｏｏｉｊｅｗａａｒｄ，Ｇ．，ａｎｄ  ＫＬＵＦＴ，Ｃ．（１９８３）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５６，１１５−１２０）と、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓ−２２８８（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）（Ｍａｔｓｕｏ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３３，１０３１−１０３７）である。Ｂｕｔｅｎａｓは５４種類の蛍光基質を用いて、ｔＰＡに対する特異性の高い配列を提示し（Ｂｕｔｅｎａｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，２１２３−２１３１）、ＦＰＲ，ＶＰＲが高いｔＰＡに対する分解活性を示した。従って、これらの配列は特に好適に用いられる。
また、システインプロテアーゼまたはアスパルティックプロテアーゼに分類されるＥＣＭ分解酵素も知られており、これらも癌の転移およに浸潤に関与している。具体的には、ラミニン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、コラーゲン、プロコラゲナーゼ（分解により活性化する）等を基質とするカテプシンＢ（Ｓｌｏａｎｅ，Ｂ．Ｆ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：１３７−１５２，１９９０）、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスターゼ（活性化）等を基質とするカテプシンＬ（Ｋａｎｅ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：１２７−１３６，１９９０）、並びに、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、カテプシンＢおよびＬ（活性化）を基質とするカテプシンＤ（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔ，Ｈ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：１５３−１６０，１９９０）などが挙げられる。カテプシンＢおよびＬは特に乳癌組織（Ｓｐｙｒａｔｏｓ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ：１１１５−１１１８，１９８９；Ｌａｈ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５０：３６−４４，１９９２）、大腸癌カルシノーマ（Ｓｈｕｊａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４９：３４１−３４６，１９９１）に強く発現しており、阻害因子との均衡の破綻と癌の悪性化との関与も示唆されている（Ｓｌｏａｎｅ，Ｂ．Ｆ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：１３７−１５２，１９９０；Ｋａｎｅ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：１２７−１３６，１９９０）。
メタロプロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）はＺｎなどの金属元素を含む金属酵素であり、カスパーゼ、アミノペプチダーゼ、アンギオテンシンＩ変換酵素、コラゲナーゼなどが報告されている。ＥＣＭを分解するメタロプロテアーゼとしては、１６種類以上のマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｔｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）が報告されている。代表的なＭＭＰとしては、コラゲナーゼ−１、２、３（ＭＭＰ−１、８、１３）、ゼラチナーゼＡ、Ｂ（ＭＭＰ−２、９）、ストロメライシン１、２、３（ＭＭＰ−３、１０、１１）、マトリライシン（ＭＭＰ−７）、膜型メタロプロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ）などが挙げられる。一般にＭＭＰは、活性中心にＺｎ２＋を有し、酵素活性にＣａ２＋を必要とする。また潜在型酵素（ｌａｔｅｎｔ  ＭＭＰまたはＰｒｏＭＭＰという）として分泌され、細胞外で活性化を受け生体内に存在する種々のＥＣＭを分解する。またＭＭＰは、共通のインヒビターであるｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔｔａｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（ＴＩＭＰ）によって活性が阻害される。他に、ＥＣＭ分解性のメタロプロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼが挙げられ、例えばＥＣＭ構成蛋白質などを分解するアミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３およびアミノペプチダーゼＢなどが含まれる。阻害剤を用いた実験から、これらのプロテアーゼはいずれも癌と深く関与していることが報告されている。
その中でコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）（ＭＭＰ−１，８，１３）は、線維性コラーゲンであるＩ，ＩＩ，ＩＩＩ型コラーゲン分子を特異的部位で切断する。ゼラチナーゼ（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）は、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）およびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）の２つのタイプが知られている。ゼラチナーゼはＩＶ型コラゲナーゼともよばれ、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンを分解するが、Ｖ型コラーゲンおよびエラスチンも分解する。また、ＭＭＰ−２はＩ型コラーゲンをＭＭＰ−１と同じ部位で切断することが知られている。ＭＭＰ−９はラミニンおよびフィブロネクチンを分解しないが、ＭＭＰ−２はこれらを分解する。ストロメライシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）（ＭＭＰ−３，１０）は広い基質性を有し、プロテオグリカン、ＩＩＩ、ＩＶ、ＩＸ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどを分解する。マトリライシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）（ＭＭＰ−７）は、ヘモペキシンドメインをもたない分子であり、基質特異性はＭＭＰ−３と共通し、特にプロテオグリカンおよびエラスチンに対する分解活性が高い。膜型メタロプロテアーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ  ＭＭＰ；ＭＴ−ＭＭＰ）（ＭＴ１，２，３，４，５，６−ＭＭＰ）は膜貫通構造をもつＭＭＰである。ＭＴ−ＭＭＰは、プロペプチドドメインと活性部位の間に挿入配列（約１０アミノ酸）を有する。この挿入配列はＡｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（Ｘａａは任意のアミノ酸）を含み、細胞膜上に輸送される過程で、細胞内プロセシング酵素であるｆｕｒｉｎにより開裂され活性化される。ＭＴ−ＭＭＰとしては、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）、ＭＴ２−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１５）、ＭＴ３−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１６）、ＭＴ４−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１７）、ＭＴ５−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２３）、およびＭＴ−６−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２５）などが知られ、例えばＭＴ１−ＭＭＰはＩ，ＩＩ，ＩＩＩ型コラーゲンを、ＭＴ３−ＭＭＰはＩＩＩ型コラーゲンを分解する。
ＭＭＰの過剰発現は癌細胞で広範囲に起こっていることがわかっている。それらは癌自身と癌間質細胞による発現に分けられる。例えば間質コラーゲンを分解するコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）は癌細胞の浸潤に関与しており、大腸癌等でもその活性レベルは転移性と相関している（Ｗｏｏｌｅｙ，Ｄ．Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．３：３６１−３７２，１９８４；Ｔａｒｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：２６６−２７８，１９８２）。また、タイプＩＶコラゲナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）は様々な上皮性癌において活性と転移能との間に高い相関関係がある（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：９９−１０６，１９９０；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．実験医学１０：２４６−２５５，１９９２）。また、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）も皮膚の上皮性腫瘍の悪性化に相関していることが知られている（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｏｗｄｅｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｓｅｍｉ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：１０７−１１５，１９９０）。ストロメライシン−３（ＭＭＰ−１１）は乳癌および大腸癌などにおいて高発現が観察されている（Ｂａｓｓｅｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：６９９−７０４，１９９０；Ｐｏｒｔｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １０（Ｓｕｐｐｌ．１）：１１４，１９９２）。
ＭＭＰの切断基質は、多数知られている。ＭＭＰ全般を分解する基質配列としてＰＬＧＬＷＡＲ（Ｂｉｃｋｅｔｔ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２，５８−６４）、ＧＰＬＧＭＲＧＬ（Ｄｅｎｇ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３１４２２−３１４２７）、ＰＱＧＬＥＡＫ（Ｂｅｅｋｍａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９０，２２１−２２５）、ＲＰＫＰＶＥＷＲＥＡＫ（Ｂｅｅｋｍａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１８，３０５−３０９）、ＰＬＡＬＷＡＲ（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，１５２５−１５３６）がある。ＭＭＰ−２，９の分解基質としてＰＬＧＭＷＳ（Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５，８６−９２）とＰＬＧＬＧ（Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４，６７３０−６７３４）がある。
最近、ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇによって、ＭＭＰ９（Ｋｒｉｄｅｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２０５７２−２０５７８），ＭＭＰ２（Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４４８５−４４９１），ＭＴ１−ＭＭＰ（Ｋｒｉｄｅｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎ．ＪＢＣ  Ｐａｐｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｐｒｉｌ  １６，２００２，Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１１１５７４２００）に対する分解基質配列が明らかにされている。これらの論文で、特定されたアミノ酸配列を３つのＭＭＰに対する分解能の有無によって４つのグループに分類されている。Ｇｒｏｕｐ  ＩＶがＭＴ１−ＭＭＰに特異的に分解される配列で、Ａｒｇのない配列としてＶＦＳＩＰＬ，ＩＫＹＨＳの配列がＭＭＰ９，ＭＭＰ２で分解できずＭＴ−ＭＭＰでのみ分解できる基質としてしめされている。
例えば、ＭＭＰ９の切断配列としては、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ（Ｘは任意の残基，Ｈｙは疎水性残基を表す）が挙げられ、特にＰｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が好ましい。より具体的には、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が例示できる（Ｘ−Ｈｙ間で切断が起きる）。Ｈｙ（疎水性残基）としては、これらに限定されないが、例えばＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔが挙げられる。あるいは、これ以外の切断配列も同定されており（例えば以下の文献のＧｒｏｕｐ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩＡ，ＩＩＩＢを参照；Ｋｒｉｄｅｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２０５７２−２０５７８）、これらの所望の配列を用いることができる。またＭＭＰ２に関しても上記のＰｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙであってよく、他にも、（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ、Ｈｙ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙなどが例示できる（例えば以下の文献のＧｒｏｕｐ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶを参照；Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４４８５−４４９１）。ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）を含むＭＭＰファミリーの切断配列は、例えば天然の基質蛋白質の配列を参考にしたり、あるいはペプチドライブラリーのスクリーニング等によって適宜選択することができる（Ｔｕｒｋ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，６６１−６６７（２００１）；Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ＴＩＭＰｓ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，２０００）；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｔｒｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８５：９０６−９１１，１９９９；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８８８５−３８８９０，２０００；Ｍｃ  Ｑｕｉｂｂａｎ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１２０２−１２０６，２０００；Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９２３７−９２４３，１９９７）。例えば切断部位の８アミノ酸Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’（Ｐ１−Ｐ１’間で切断される）を例示すれば、ＭＭＰ−１はＶＰＭＳ−ＭＲＧＧ、ＭＭＰ−３はＲＰＦＳ−ＭＩＭＧ、ＭＭＰ−７はＶＰＬＳ−ＬＴＭＧ、ＭＴ１−ＭＭＰはＩＰＥＳ−ＬＲＡＧなどが挙げられるがこれらに制限されない。ＭＭＰ−８には例えばＰＬＡＹＷＡＲ（Ｎｅｚｅｌ−Ａｍｅｔｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５：８６，１９９１）が挙げられる。ＭＭＰの合成基質は様々なものが入手可能であり、これらの配列を比較することもできる（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ登録商標カタログ，Ｍｅｒｋ，の各ＭＭＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ参照）。
通常、組織内のＭＭＰ活性は、潜在型酵素の産生、その潜在型酵素の活性化、および活性型酵素のインヒビターによる阻害の過程で調節されており、発生排卵、受精、子宮内膜への着床、および創傷治癒などの様々な生理現象に関与している。ＭＭＰ活性の調節の障害は、癌細胞の浸潤・転移、関節炎、歯肉炎、動脈硬化、腫瘍、線維症などの様々な病態に寄与する。例えば、癌の転移には基底膜成分を分解するゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２、−９）が重要であることが知られている。ＭＭＰ−２は、ＭＴ１−ＭＭＰによるｐｒｏ−ＭＭＰ−２の切断により活性化される。またＭＭＰ−９の活性化には、ｕＰＡによりまずプラスミノーゲンからプラスミンがつくられ、ｐｒｏＭＭＰ−３を活性化し、ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ−３がｐｒｏＭＭＰ−９を活性化する経路が存在し、この経路は癌の転移に関与している。本発明のベクターを癌標的ベクターとして開発するためには、Ｆ蛋白質の開裂部位にこれらの癌転移に関与するプロテアーゼで切断される配列を導入することが特に有用である。このようなプロテアーゼとしては、例えばＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ、ＭＭＰ−３、およびＭＴ１−ＭＭＰが挙げられ、特にＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびｕＰＡが挙げられる。
プロテアーゼ切断配列をＦ蛋白質に組み込む場合は、Ｆ蛋白質の開裂部位に目的のプロテアーゼ切断配列を挿入し、もともとあるＴｒｙｐｓｉｎ様プロテアーゼによる切断部位をデジェネレートさせることが好ましい。このためにはもともとのＴｒｙｐｓｉｎ様プロテアーゼによる切断部位周辺のアミノ酸配列を、目的のプロテアーゼ切断配列（認識配列）に置換すればよい。改変Ｆ蛋白質は、細胞で発現したときに目的のプロテアーゼで切断され、かつＦ蛋白質の細胞膜融合作用を維持されている蛋白質である。Ｆ蛋白質が開裂して生じるＦ１断片のＮ末端付近のアミノ酸は、細胞膜融合に重要な機能を有していると考えられる。従って、切断が阻害されない限り、切断後のＦ１断片のＮ末端が、野生型Ｆ蛋白質のＦ１断片のＮ末端と同一となるように切断配列を設計することが好ましい。また効率的な切断反応を起こすために切断部位にリンカーを挿入する場合には、切断後のＦ１断片のＮ末端に、野生型Ｆ１と比べ最小限のアミノ酸が付加されるように設計することが望ましい。例えば、切断後のＮ末端には、野生型Ｆ１に比べ５アミノ酸以内、好ましくは４アミノ酸以内、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば１、２、または３アミノ酸）が付加されるようにする。例えば本発明において、改変Ｆ蛋白質のＦ１断片のＮ末端にＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号：１）を付加しても、ＭＭＰによる切断反応および切断後の細胞膜融合反応が障害されないことが判明した。従って、切断後のＦ１のＮ末端にＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒまたはその保存的置換配列、あるいはそれらの部分配列からなるアミノ酸が付加されるように開裂配列を設計することは好ましい。保存的置換とは、アミノ酸の側鎖の化学的性質が類似したアミノ酸間での置換を言う。具体的には、Ｍｅｔに関してはＩｌｅまたはＶａｌへの置換、Ｔｈｒに関してはＳｅｒまたはＡｌａへの置換、Ｓｅｒに関してはＡｌａ、Ａｓｎ、またはＴｈｒへの置換が挙げられる。各位置のアミノ酸の置換は独立に行ってよい。
具体的には、好ましい切断配列として、例えばＭＭＰ−２および−９の切断配列としてはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号：２）を含む配列を挙げることができる。この配列は、基質として利用されている合成基質（Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５，８６−９２（１９９１））に共通の配列であり、この配列が、改変したＦ蛋白質を切断後のＦ２断片のＣ末端に来るようにＦ蛋白質を設計する。このためには、野生型Ｆ蛋白質の切断後のＦ２断片のＣ末端のアミノ酸を含む配列を、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙを含む配列に置換すればよい。もともとのＦ蛋白質のＦ２断片のＣ末端の１または数アミノ酸に相当する配列を適宜欠失させ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙを挿入する（すなわち置換する）。欠失させるアミノ酸は、例えば挿入するアミノ酸数を同じ（例えば３アミノ酸）とするか、０〜１０アミノ酸程度の範囲で選択することができる。プロテアーゼによる開裂および膜融合の過程が障害されない限り、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙの下流にＦ１のＮ末端が直接連結するようにＦ蛋白質を調製することができるが、センダイウイルスのＦ蛋白質などにおいては、開裂配列とＦ１断片は適当なスペーサーを介して連結されることが好ましい。このようなスペーサーを含む開裂配列としては、特に好ましくは、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号：３）、またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（配列番号：４）を含む配列が挙げられる。Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒは、他のアミノ酸に保存的置換してもよい。より好ましくは、開裂後のＦ２においてＣ末端となるアミノ酸からＮ末方向に連続する１〜１０残基、例えば１、２、３、４、５、または６残基が、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒからなる配列に置換された改変Ｆ蛋白質を好ましい蛋白質として挙げることができる。例えば、センダイウイルスＦ蛋白質を例に挙げれば、野生型Ｆ蛋白質においてＦ２断片のＣ末４アミノ酸に相当する配列（株によるが典型的には１１３Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ１１６↓）（配列番号：５）をＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒなどに置換したＦ蛋白質を例示することができる。
また、ＭＭＰの切断配列としては他にも、例えば本明細書に記載した所望の配列を用いることができる。各種ＭＭＰの基質特異性に関してはペプチドライブラリーを利用して解析が行われている（Ｔｕｒｋ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，６６１−６６７（２００１））。また、着目しているＭＭＰ−２（Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（６）４４８５−４４９１（２００２））及びＭＭＰ−９（Ｋｒｉｄｅｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（８）２０５７２−２０５７８（２００１））についても詳細な解析が行われ、特にＭＭＰ−９について、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）のＰ３からＰ２’（Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’；切断はＰ１−Ｐ１’間で起こる）までのコンセンサス配列（Ｘ＝全ての残基，Ｈｙ＝疎水性残基）が提唱されている。このコンセンサス配列は、ＭＭＰ−２について提唱されているものの一つ（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ）にも合致するので、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９について特異性を出すためには良いデザインの一つであると考えられる。この点からも、上記例示した配列（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ）は好ましい例として支持される。すなわち、Ｆ蛋白質開裂部位はＰｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、さらに好ましくはＰｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒを含む配列が好ましい（“Ｔｈｒ／Ｓｅｒ”はＴｈｒまたはＳｅｒのどちらかを表す）。例えば、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒに当てはまらないＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−ＡｌａおよびＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａは好ましくない（図４４）。Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列に合致するペプチドをＦ蛋白質開裂部位に組み込めば、ＭＭＰ存在下で高い浸潤力を示すベクターを製造することができる。
また、好ましい切断配列としては他に、プラスミノーゲンアクチベーターにより切断される配列が挙げられる。具体的には、ｕＰＡおよびｔＰＡの切断配列としてＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む配列が挙げられる。この配列が、改変したＦ蛋白質を切断後のＦ２断片のＣ末端に来るようにＦ蛋白質を設計する。このためには、野生型Ｆ蛋白質の切断後のＦ２断片のＣ末端のアミノ酸を含む配列を、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号：６）を含む配列に置換すればよい。より好ましくは、開裂後のＦ２のＣ末端となるアミノ酸からＮ末方向に連続する１〜１０残基、例えば１、２、３、４、５、または６残基をＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇまたはこれを含む配列に置換された改変Ｆ蛋白質を好ましい蛋白質として挙げることができる。例えば、センダイウイルスＦ蛋白質を例に挙げれば、野生型Ｆ蛋白質においてＦ２断片のＣ末３アミノ酸に相当する配列（株によるが典型的には１１４Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ１１６↓）（配列番号：７）をＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇに置換したＦ蛋白質を例示することができる。
特定のプロテアーゼ存在下で融合能を発揮する改変Ｆ蛋白質を効率良く同定するために、プラスミドベクターを用いたアッセイ系を利用することができる（実施例３１）。すなわち、改変Ｆ蛋白質を発現するプラスミドベクターを細胞のトランスフェクションし、プロテアーゼ存在下で培養してシンシチウム形成を検出する。シンシチウムを形成させるプラスミドにコードされる改変Ｆ蛋白質は、プロテアーゼにより開裂し融合能を示すを判断される。例えばＭＭＰにより開裂するＦ蛋白質をアッセイするには、ＭＭＰを発現するＨＴ１０８０細胞を用いることができる。あるいは、培養系にＭＭＰを添加してもよい。本発明において開発されたこのアッセイ系を用いれば、融合能を持った改変Ｆ蛋白質を容易に取得することが可能である。
改変Ｆ蛋白質をコードするベクターは、該改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼの存在に依存して、該ベクターが導入された細胞と接触する細胞に、ベクターに含まれるゲノムＲＮＡを導入することができる。開裂したＦ蛋白質の働きにより、接触する細胞同士が細胞融合を起こし、融合した細胞にＲＮＰが拡散する。すなわち、本発明のベクターは、ウイルス粒子は形成しないが、このように接触する細胞にベクターが浸潤するために、限局した領域にベクターを伝達することができる。プロテアーゼは、細胞内または細胞外に発現するものであってもよく、あるいは外来的に添加されたものであってもよい。
本発明により提供される改変Ｆ蛋白質は、特定のプロテアーゼに依存的に細胞融合能を示す能力を有する。この蛋白質を利用して、そのプロテアーゼ存在下でのみ細胞融合を生じさせる或いは特異的に感染するウィルスベクター、あるいはリポソームなどの薬剤・遺伝子送達ベクターを作り出すことができる。例えば、Ｆ，ＨＮ遺伝子を搭載したａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｇａｌａｎｉｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２，８１１−８２１（２００１））のＦ遺伝子に癌で発現するプロテアーゼで開裂する改変Ｆ蛋白質の遺伝子を搭載することにより、特定のプロテアーゼ存在下で細胞融合を生じさせるベクターを開発することが可能である。更には、例えばレトロウィルスをＦ，ＨＮ蛋白でシュードタイプ化する場合に（Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（６）５２９６−５３０２（１９９８））、その製造過程において、癌で発現するプロテアーゼで開裂する改変Ｆ蛋白質を利用すれば、癌で特異的に感染する癌細胞標的化ベクターを開発することが可能かも知れない。このように、本発明により提供される改変Ｆ蛋白質およびこれをコードする核酸は、本発明のベクター以外にも、プロテアーゼに依存する種々のベクターの開発に利用することができる。
また本発明は、細胞質ドメインの欠失により細胞融合能が高められた改変Ｆ蛋白質を含むパラミクソウイルスベクターを提供する。この改変Ｆ蛋白質は、細胞質ドメインに０個〜２８個、より好ましくは１〜２７個、より好ましくは４〜２７個のアミノ酸を有するように、細胞質ドメインの一部のアミノ酸を欠失させたＦ蛋白質である。細胞質ドメインとは、膜蛋白質の細胞質側のドメインであり、Ｆ蛋白質においては膜貫通（ＴＭ）領域のＣ末側領域である（図４２参照）。例えば、細胞質ドメインとして６〜２０個、より好ましくは１０〜１６個、より好ましくは１３〜１５個のアミノ酸を有するＦ蛋白質は、野生型Ｆ蛋白質に比べ有意に高い細胞融合能を示す。従って、約１４アミノ酸の細胞質ドメインを有するように改変されたＦ蛋白質を含むパラミクソウイルスベクターを調製すれば、野生型Ｆ蛋白質を用いるよりも高い細胞融合能を持つベクターを得ることができる。好ましくは、この欠失Ｆ蛋白質は、野生型Ｆ蛋白質のＣ末端の１０アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは１５アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは２０アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは２５アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは２８アミノ酸またはそれ以上を欠失している。最も好ましい態様では、細胞質ドメイン欠失型のＦ蛋白質は野生型Ｆ蛋白質のＣ末端の約２８アミノ酸を欠失している。これらの細胞質ドメイン欠失型のＦ蛋白質をコードする遺伝子をゲノムに含むパラミクソウイルスベクターは、通常のベクターに比べ細胞融合能が高いことから、周囲の細胞へより強く浸潤することができる。このＦ蛋白質の開裂部位を本明細書に記載したように改変すれば、特定のプロテアーゼの存在下でのみ、高い浸潤力を発揮するベクターを得ることができる。
さらに本発明は、パラミクソウイルスが持つ２種のスパイク蛋白質の融合蛋白質に関する。パラミクソウイルスには細胞融合を機能すると考えられる蛋白質（これをＦ蛋白質と呼ばれる）と、細胞への接着に機能すると考えられる蛋白質（ＨＮまたはＨなどと呼ばれる）を有している。本明細書において、前者をＦ蛋白質、後者をＨＮ蛋白質を総称する。この２つの蛋白質を融合蛋白質として発現させると、別々に発現させる場合に比べ非常に強い融合能を発揮することができる。この融合蛋白質は、互いの細胞質ドメインの部分で両者の蛋白質が結合されている。具体的には、融合蛋白質のＮ末端側にＦ蛋白質を、Ｃ末端側にＨＮ（またはＨ）蛋白質を含んでいる。両者の蛋白質を融合させる場合、全長蛋白質同士を融合させてもよいが、Ｆ蛋白質の細胞質ドメインの一部または全部を欠失させた蛋白質をＨＮ（またはＨ）蛋白質に融合させてもよい。この場合、Ｆ蛋白質のＴＭ領域の下流からＨＮ（またはＨ）蛋白質までの長さを５残基以上、より好ましくは１０残基以上、より好ましくは１４残基以上、より好ましくは２０残基以上とする。例えば、Ｆ蛋白質の細胞質ドメインを欠失させた蛋白質をＨＮ（またはＨ）蛋白質に融合させる場合、Ｆ蛋白質部分のＣ末に適当な長さのリンカーペプチドを付加して長さを調節することは好ましい。具体的には、１４残基のＦ蛋白質の細胞質ドメインを持つ細胞質ドメイン欠失型のＦ蛋白質に、任意のリンカーペプチドを介してＨＮまたはＨ）蛋白質に融合させた蛋白質を好適に用いることができる。リンカーペプチドの長さは、例えば約５０残基とすることができる。リンカーペプチドのアミノ酸配列に特に制限はないが、有意な生理活性を持たないポリペプチドが好ましく、例えば図４３（配列番号：８０）に例示したようなポリペプチドを用いることができる。
また本発明は、これらの融合蛋白質をコードする核酸、および該核酸を搭載する発現ベクターに関する。この発現ベクターを導入した細胞は、強い融合能を示し周囲の細胞と融合してシンシチウムを形成する。発現ベクターとしては特に制限はなく、プラスミドベクターおよびウイルスベクターなどが例示できる。ＤＮＡベクターの場合は、例えばＣＡＧプロモーター（ニワトリβアクチンプロモーターとＣＭＶエンハンサーとのキメラプロモーター）（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ．１０８：１９３−１９９）などの強力なプロモーターを組み合わせることが好ましい。また、この蛋白質を発現するウイルスベクターは、導入細胞で強い融合を引き起こす。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベラター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、フォウルポックスウイルスベクター、その他の所望のウイルスベクターが例示できる。特にこの蛋白質を発現するパラミクソウイルスベクターは、様々な組織に対して高い浸潤力を発揮することができる。特に、本明細書に記載したＦ開裂部位を改変した融合蛋白質をコードする、Ｍ遺伝子欠失型のパラミクソウイルスベクターを用いれば、特定の組織で強い細胞融合を引き起こすベクターを製造することが可能である。
これらの組み換えウイルスベクターは当業者に周知の方法に従って調製することができる。例えば、遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウイルスベクターの作製は、斎藤らの方法および他（Ｍｉｙａｋｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、１３２０−２４頁；Ｋａｎｅｇａｅら、１９９６、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ、３８巻、１８２−１８８頁；鐘ヶ江ら、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、１９９４、４３−５８頁、羊土社；鐘ヶ江ら、１９９４、細胞工学、１３巻、８号、７５７−７６３頁）に従って製造することができる。また、例えばレトロウイルスベクター（脇本ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５０８−２５１３頁）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（玉寄ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５３２−２５３８頁）なども、公知の方法により調製することができる。哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のウイルスベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０２０６９、特公平６−９５９３７、特公平６−７１４２９が知られている。組換えパピローマウイルスを製造する方法としては特公平６−３４７２７、特表平６−５０５６２６が知られている。組換えアデノ随伴ウイルスを製造する方法としては、特開平５−３０８９７５が知られている。組換えアデノウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０８０３９が知られている。
本発明の一態様において提供されるベクターに含まれるＲＮＡゲノムにおいては、Ｍ（マトリックス）蛋白質をコードする遺伝子（Ｍ遺伝子）が変異または欠損している。本発明において、Ｆ蛋白質の開裂部位を他のプロテアーゼで切断される配列に改変し、さらにＭ遺伝子を変異または欠失させて粒子形成能を抑制することによって、ウイルス粒子を放出せず、特定のプロテアーゼを発現する細胞集団内でのみベクターを浸潤させる全く新しい性質を持ったベクターが開発された。Ｍ遺伝子の変異は、宿主内環境における粒子形成活性を消失または有意に低下させる変異である。このような変異は、このＭ蛋白質を発現する細胞において、該蛋白質の細胞表面の凝集が低下することにより同定することができる（実施例参照）。
本発明により、２次放出粒子、即ちＶＬＰ放出の抑制を目的とした改変を行う場合、Ｍ蛋白を欠失させることが最も効果的であることが実証された。このことは、ビリオン形成におけるＭ蛋白の役割に関するセンダイウィルス（ＳｅＶ）や他のマイナス鎖にＲＮＡウィルスにおける報告によっても支持される。例えば、ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＶＳＶ）ではＭ蛋白の強発現のみでウィルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）の発芽が観察されており（Ｊｕｓｔｉｃｅ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９；３１５６−３１６０（１９９５））、またＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓの場合もＭ蛋白のみの強発現でＶＬＰが生じることが報告されている（Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３；７０３５−７０３８（１９９９））。このようなＭ蛋白単独でのＶＬＰ形成に関しては、全てのマイナス鎖ＲＮＡウィルスで観察されているわけではないが、Ｍ蛋白がビリオン形成のｃｏｒｅになっていることは、マイナス鎖ＲＮＡウィルスで共通していると認識することができる（Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２；１１７１−１１９０（１９９８））。
ビリオン形成に対するＭ蛋白の具体的な役割に関して主に以下のようにまとめることができる。ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）と呼ばれている場（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｋ．ａｎｄ  Ｉｋｏｎｅｎ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８７；５６９−５７２（１９９７））であり、元々はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤に不溶性の脂質画分として同定された（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ｋ．Ｃｅｌｌ  ６８；５３３−５４４（１９９２））。インフルエンザウィルス（Ａｌｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４；８７０９−８７１９（２０００））、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ；ＭｅＶ：Ｍａｎｉｅ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４；３０５−３１１（２００６））及びＳｅＶ（Ａｌｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｎａｙａｋ，Ｄ．Ｐ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６；２８９−３０３（２０００））等でリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）でのビリオン形成が証明されており、そこでＭ蛋白はエンベロープ蛋白（ｓｐｉｋｅ蛋白とも表記される）やｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）を濃縮しビリオン形成を促進する、即ちウィルスアセンブリと出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）の駆動力となっていると考えられる（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７；３８９９−３９０８（１９９８），Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３；２４２−２５０（１９９９））。実際に、Ｍ蛋白はｓｐｉｋｅ蛋白のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌと結合することが、インフルエンザウィルス（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４；４６３４−４６４４（２０００））及びＳｅＶ（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７；６５１−６６３（１９９３））等で示されており、またＲＮＰとの結合もインフルエンザウィルス（Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７３；３１１−３１６（１９８９））や、パラインフルエンザウィルス及びＳｅＶ（Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５；１１１７−１１２３（２００１））等で示されている。更に、Ｍ蛋白自身のオリゴマー形成への関与がＳｅＶ（Ｈｅｇｇｅｎｅｓｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９；６２３２−６２３６（１９８２）及び水疱性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ：Ｇａｕｄｉｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６；２８−３７（１９９５），Ｇａｕｄｉｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７４；８１６−８２５（１９９７））等で報告され、これら多くのウィルスコンポーネント及び脂質との結合能がウィルスアセンブリと出芽の駆動力としての役割を担わせていると考えることができる。
また、エンベロープ蛋白（ｓｐｉｋｅ蛋白）に関しても改変によりＶＬＰ放出抑制に繋がる可能性も既に幾つか示唆されている。ビリオン形成が実際に減少した具体的な報告として以下の実験例がある。狂犬病ウィルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ；ＲＶ）の場合、Ｇ蛋白欠失型においてＶＬＰ形成が１／３０に減少し（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８４；９４１−９５１（１９９６））、Ｍ蛋白欠失型においては１／５００，０００以下に減少したと報告されている（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３；２４２−２５０（１９９９））。また、麻疹ウィルス（ＭｅＶ）の場合、Ｍ蛋白欠失型においてｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌの融合が亢進し（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７；３８９９−３９０８（１９９８））、これはビリオン形成が抑制された為であると考えることができる（Ｌｉ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（５），３７８９−３７９５（１９９８））。また、同様の融合亢進がＦ或いはＨ蛋白のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ（細胞質側のテール）の変異によっても生じている（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２；１２２４−１２３４（１９９８））。従って、Ｆおよび／またはＨＮ蛋白のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌのみを欠失させる変異を導入することにより、粒子形成を抑制することも考えられる。但し、特にＳｅＶにおいてはＦ欠失型（ＷＯ００／７００７０）或いはＨＮ欠失型（Ｓｔｒｉｃｋｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２；１７０３−１７０７（１９９１））において多くのＶＬＰが存在することが報告されており、これらのスパイク蛋白質の改変による効果は限定されることが予想される。さらにＳｅＶにおいては以下の点も明らかになっている。ＳｅＶのＦ及びＨＮが分泌経路に載っている間（即ちゴルジ体等に存在している間）、それぞれ（Ｆ及びＨＮ）のＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌがＭ蛋白と結合していることが示されている（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７；６５１−６６３（１９９３），Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８；６９−７６（１９９４））。即ち、ビリオン形成の場である細胞膜上のリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  Ｒａｆｔｓ）へＭ蛋白が効率的に運搬されるためには、Ｆ及びＨＮのＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌとの結合が重要であり、Ｍ蛋白は細胞質に存在しながらＦ及びＨＮと結合することで、Ｆ及びＨＮの分泌経路に乗った形で細胞膜へ運搬されていると予想される。このように、Ｍ蛋白質はウイルス粒子の形成に本質的な役割を果たしており、Ｍ蛋白質の細胞膜上の凝集を失わせるような変異Ｍ蛋白質遺伝子を用いることにより、粒子形成能を持たないベクターを作り出すことが可能となる。
細胞におけるＭ蛋白質の局在の検出は、細胞分画による方法、および免疫染色によりＭ蛋白質の局在を直接検出する方法などで実施することができる。免疫染色では、例えば蛍光標識された抗体を用いてＭ蛋白質を染色し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察することができる。また、細胞を溶解後、公知の細胞分画法により細胞画分を得て、Ｍ蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降またはウェスタンブロッティング等によりＭ蛋白質が含まれる画分を同定することにより局在を調べることができる。ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）と呼ばれている場であり、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤に不溶性の脂質画分である。Ｍ蛋白質はｓｐｉｋｅ蛋白、ＲＮＰ及びＭ蛋白自身更には脂質との結合能により、このリピッドラフトでウィルスコンポーネントを凝集すると考えられていることから、リピッドラフト分画後、電気泳動等で検出されるＭ蛋白は凝集したＭ蛋白質を反映していると捉えることができる。すなわち、検出されるＭ蛋白質量が低下していれば、細胞表面のＭ蛋白質の凝集が低下していると判断される。一方、本発明者らが利用した細胞免疫染色により細胞内局在を検出する方法では、細胞膜上のＭ蛋白の凝集を直接観察することが可能である。この場合、細胞免疫染色に利用可能な抗Ｍ抗体を利用する。この方法で検出した場合、Ｍ蛋白質が凝集していれば、細胞膜近傍に強い濃縮像が観察され、Ｍ蛋白の凝集がなければ濃縮像はなく細胞膜の輪郭が明確でなくなり、細胞質全体が薄く染色される。このように濃縮像が少ない或いは濃縮像がなく、細胞膜の輪郭がぼやけて観察され、細胞質全体が薄く染色された場合に、細胞表面のＭ蛋白質の凝集が低下していると判断される。
野生型Ｍ蛋白質に比べ、細胞表面における凝集が有意に低下する変異Ｍ蛋白質は、粒子形成能が有意に低下していると判断される。ウイルスの粒子形成能の低下は、例えば統計学的に有意（例えば有意水準５％またはそれ以下の％値）に低下している。統計学的な検定は、例えばスチューデントのｔ検定またはマンホイットニーＵ検定などにより行うことができる。変異Ｍ遺伝子を持つウイルスベクターは、宿主内環境における粒子形成能が好ましくは１／５以下、より好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／３０以下、より好ましくは１／５０以下、より好ましくは１／１００以下、より好ましくは１／３００以下、より好ましくは１／５００以下に低下している。本発明のベクターは、最も好ましくは宿主内環境におけるウイルス粒子の産生能が実質的に喪失している。実質的に喪失するとは、宿主内環境におけるウイルス粒子の産生が検出されないことを言う。このような場合、ウイルス粒子は１０３／ｍｌ以下、好ましくは１０２／ｍｌ以下、より好ましくは１０１／ｍｌ以下である。
ウイルス粒子の存在は、電子顕微鏡等で直接確認することができる。あるいは、ウイルスに含まれる核酸または蛋白質を指標に検出および定量することが可能である。例えば、ウイルス粒子中に含まれるゲノム核酸をＰＣＲ等の一般的な核酸検出法で検出および定量してもよい。あるいは、外来遺伝子を持つウイルス粒子は、これを細胞に感染させ該遺伝子の発現を検出することにより定量することができる。感染性を持たないウイルス粒子は、トランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入し、遺伝子発現を検出することにより定量することができる。本発明においてウイルス粒子は、感染能を持たない粒子も含まれ、例えばＶＬＰを含む。
また、ウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。また、実施例に記載したように、ＧＦＰなどのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーの指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。例えばウイルス粒子が含まれる可能性のある試料を細胞にトランスフェクションしても検出可能な感染価を示さないことにより、ウイルス粒子の生産能の喪失を確認することができる。感染能を持たないウイルス粒子（ＶＬＰ等）の検出は、例えばリポフェクション試薬を用いたトランスフェクションにより行うことができる。具体的には、例えばＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）を用いて行うことができる。ウイルス粒子を含むあるいは含まない溶液１００μｌにＤＯＳＰＥＲ  １２．５μｌを混合し、室温で１０分放置後、６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントに培養した細胞に１５分毎に振盪しながらトランスフェクションする。２日後に感染細胞の有無を検出することでＶＬＰの検出が可能である。
宿主内環境とは、対象とするベクターが由来するパラミクソウイルスの野生型が自然界において通常増殖する宿主内の環境またはそれと同等のウイルス増殖をもたらす環境を言う。宿主内環境は例えば該ウイルスの至適増殖条件であってよい。哺乳動物を宿主とするパラミクソウイルスであれば、哺乳動物生体内あるいはそれと同等の環境を言う。その温度は、哺乳動物体内に相当する約３７〜３８℃（例えば３７℃）である。インビトロであれば、通常の細胞培養条件、具体的には血清含有または非含有培地中（ｐＨ６．５〜７．５）、３７℃、５％ＣＯ２、湿環境下の培養環境が挙げられる。
環境条件による変異Ｍ蛋白質の活性の違いは、Ｍ蛋白質の温度感受性変異などの条件的変異において意味を持っている。条件的変異とは、宿主内環境では機能欠失型（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の変異形質を示すが、ある環境において活性を示す変異を言う。例えば３７℃では機能がほとんどまたは全く失われるが、低温条件においては機能が回復する温度感受性変異Ｍ蛋白質をコードする遺伝子を好適に用いることができる。温度感受性変異とは、低温（例えば３２℃）に比べ、高温（例えば３７℃）において有意に活性が低下する変異を言う。本発明者らは、Ｍ蛋白質の温度感受性変異体を用いて、宿主内環境に相当する３７℃において粒子形成能が劇的に低下したウイルス粒子を製造することに成功した。この変異Ｍ蛋白質は、低温条件下（例えば３２℃）では細胞表面への凝集を示し、ウイルス粒子を形成させるが、通常の宿主体内の温度（３７℃）では凝集性が失われウイルス粒子を形成することができない。このような温度感受性変異Ｍ蛋白質をコードする核酸をゲノムに持つベクターは、本発明のベクターとして好適である。条件的変異Ｍ蛋白質をコードするウイルスベクターは、Ｍ蛋白質が機能できる条件、すなわち許容条件でベクターを複製させることによりＭ蛋白質が機能してウイルス粒子が形成される。このようにして製造したウイルス粒子は、通常環境下で感染させるとＭ蛋白質が機能できずに粒子を形成しない。
Ｍ遺伝子の温度感受性変異としては特に限定されるものではないが、例えばセンダイウィルスのＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは任意に選択される２つ、さらに好ましくは３つすべてのアミノ酸部位、あるいは他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質のそれらと相同な部位に変異を含むものを好適に用いることができる。ここでＧ６９とはＭ蛋白質の６９番目のアミノ酸Ｇｌｙ、Ｔ１１６とはＭ蛋白質の１１６番目のアミノ酸Ｔｈｒ、Ａ１８３とはＭ蛋白質の１８３番目のアミノ酸Ａｌａを指す。
Ｍ蛋白質をコードする遺伝子（Ｍ遺伝子）は、（−）鎖ＲＮＡウイルスで広く保存されており、ウイルスのヌクレオカプシッドとエンベロープの両者に相互作用する機能を有することが知られている（Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１７−１９０（１９９８））。また、ＳｅＶ  Ｍ蛋白質においてａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  α−ｈｅｌｉｘと予想されている１０４−１１９（１０４−ＫＡＣＴＤＬＲＩＴＶＲＲＴＶＲＡ−１１９／配列番号：４５）は粒子形成に重要な領域として同定されている（Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ  Ｍｏｔｔｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：２９７７−２９８６（１９９９））が、当該領域は（−）鎖ＲＮＡウイルス間で良く保存されている。Ｍ蛋白質のアミノ酸配列は（−）鎖ＲＮＡウイルスで類似しており、特にパラミクソウイルス亜科においては既知のＭ蛋白質は共通して全長約３３０〜３８０アミノ酸からなる塩基性蛋白質であり、全領域にわたって類似性があるが、特にＣ端側半分での類似性が高い（Ｇｏｕｌｄ，Ａ．Ｒ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４３：１７−３１（１９９６）、Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｂ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１：３３４−３４９（２０００））。従って、例えばＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、及びＡ１８３と相同なアミノ酸は容易に同定することが可能である。
ＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、及びＡ１８３と対応する他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質の相同な部位のアミノ酸は、当業者であれば、例えばＢＬＡＳＴなどのアミノ酸配列のホモロジー検索プログラム（アライメント作成機能を持つもの）またはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗなどのアライメント作成プログラムを用いてＳｅＶ  Ｍ蛋白質のアミノ酸と整列化することにより同定することができる。例えばＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＧ６９に相当する各Ｍ蛋白質の相同部位としては、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）（括弧は略称）であればＧ６９、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）であればＧ７３、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）およびｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）であればＧ７０、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）であればＧ７１、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、およびｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）であればＧ７０、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）であればＧ８１、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）であればＧ７０、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）およびｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）であればＥ４７、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）であればＥ７２が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表す）。また、ＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＴ１１６に相当する各Ｍ蛋白質の相同部位としては、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）であればＴ１１６、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）でればＴ１２０、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）およびｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）であればＴ１０４、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）であれはＴ１０５、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）およびｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）であればＴ１０４、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）であればＴ１２０、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）およびｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）であればＴ１１７、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）およびｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）であればＴ１２１、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）であればＴ１１９、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）であればＳ１２０が挙げられる。ＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＡ１８３に相当する各Ｍ蛋白質の相同部位としては、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒ���ｓ−１（ＨＰＩＶ−１）であればＡ１８３、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）であれなＦ１８７、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）およびｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）であればＹ１７１、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）であればＹ１７２、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）およびｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）であれはＹ１７１、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）であればＹ１８７、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）であれはＹ１８４、ｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）であればＦ１８４、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）およびｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）であれはＦ１８８、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）であればＦ１８６、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）であればＹ１８７が挙げられる。ここに挙げたウイルスにおいて、それぞれのＭ蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異Ｍ蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適である。
アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、２０種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。例えばセンダイウィルスＭ蛋白質におけるＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、およびＡ１８３Ｓからなる群より選択される変異あるいはそれらと相同な位置に変異を含む他のパラミクソウイルスのＭ蛋白質を用いることができる。ここでＧ６９Ｅとは、Ｍ蛋白質の６９番目のアミノ酸ＧｌｙがＧｌｕに置換された変異、Ｔ１１６Ａとは、Ｍ蛋白質の１１６番目のアミノ酸ＴｈｒがＡｌａに置換された変異、Ａ１８３Ｓとは、Ｍ蛋白質の１８３番目のアミノ酸ＡｌａがＳｅｒに置換された変異を言う。すなわち、センダイウィルスＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３あるいは他のウイルスＭ蛋白質の相同部位を、それぞれＧｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）、およびＳｅｒ（Ｓ）へ置換することができる。これらの変異は組み合わせて有していることが好ましく、特に上記３変異の全てを保持していることがより好ましい。Ｍ遺伝子への変異の導入は、公知の変異導入方法に従って実施することができる。例えば実施例に記載のように目的の変異を入れたオリゴヌクレオチドを用いて導入することが可能である。
また、例えば麻疹ウィルスにおいては、Ｍ蛋白のモノクローナル抗体に対するエピトープが変化している温度感受性株のＰ２５３−５０５（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｔａｓａｔｏ  Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，６４；１５−３０（１９９１））のＭ遺伝子配列を用いてもよい。また、ＳｅＶ  Ｍ蛋白質の１１６番目のＴｈｒに対応する麻疹ウィルスＭ蛋白質の１０４番目のＴｈｒ、またはムンプスウィルスのＭ蛋白質の１１９番目のＴｈｒを他のアミノ酸（例えばＡｌａ）に置換してもよい。
本発明のベクターは、さらに好ましい態様においてはＭ遺伝子を欠損している。Ｍ遺伝子の欠損とは、Ｍ遺伝子の機能が失われていることを言い、機能欠失型の変異を有するＭ遺伝子を持つ場合およびＭ遺伝子を欠失する場合を含む。Ｍ遺伝子の機能欠失型変異は、例えばＭ遺伝子の蛋白質コード配列を欠失させたり、他の配列を挿入することにより作製することができる。例えば、Ｍ蛋白質コード配列の途中に停止コドンを設計することができる（ＷＯ００／０９７００）。本発明のベクターは、最も好ましくはＭ蛋白質のコード配列を完全に欠失している。Ｍ蛋白質のＯＲＦを欠失したベクターは、条件的変異Ｍ蛋白質をコードするベクターとは違い、任意の条件においてウイルス粒子を形成する能力を失っている。
本発明のベクターを製造するには、パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＰの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウイルスＲＮＰを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウイルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の３’端を制御するには、例えば転写産物の３’端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に３’が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡ中に外来遺伝子を挿入するためのクローニングサイトを設計することができる。その部位は、例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の位置であってよく、具体的には３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。Ｍ遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。複数の外来遺伝子をゲノム中の別々の位置に挿入できるように、クローニングサイトは、ゲノム中の複数箇所に存在してもよい。
例えば粒子形成能を持たない組み換えウィルスＲＮＰは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
外来遺伝子を組み込む場合は、まず目的の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、ＮｏｔＩ部位を利用してウィルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅し回収する。２つのプライマーの５’部分にＮｏｔＩ部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のＯＲＦとその両側のウイルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列が配置されるように、プライマー中にＥ−Ｉ−Ｓ配列またはその部分を含めるようにする。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を含む最終的なＰＣＲ増幅産物のＮｏｔＩ断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ  ｏｆ  ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９６８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。このプライマーにＥ−Ｉ−Ｓ配列を付加する場合には、挿入断片ののオリゴＤＮＡの３’側にセンダイウィルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：８）、Ｉ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：９）、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成ＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼまたはその他のＤＮＡポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウィルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、ＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：１０）を、クローニングされたセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ蛋白質のＯＲＦとの間に挿入し、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）。
さらに、例えばＭ遺伝子を欠損させたり、あるいは温度感受性変異を導入する場合、ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを制限酵素で消化して、Ｍ遺伝子を含むフラグメントを回収し、適当なプラスミドにクローニングする。Ｍ遺伝子の変異またはＭ遺伝子欠損部位の構築はこのプラスミド上で行う。変異導入には、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）などを利用してＫｉｔに記載の方法に従って実施することができる。Ｍ遺伝子の欠損または欠失のためには、例えばＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、Ｍ遺伝子のＯＲＦ全部または一部を欠失させ、適宜適当なスペーサー配列で連結することができる。Ｍ遺伝子の変異体または欠失体が得られたら、これを含むフラグメントを回収し、もとの全長ゲノムｃＤＮＡのＭ遺伝子と置換することにより、Ｍ遺伝子に変異を持つウィルスゲノムｃＤＮＡを調製することができる。同様の方法で、例えばＦおよび／またはＨＮ遺伝子等に変異を導入することができる。
ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記のウイルス蛋白質存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの使用に関する。マイナス鎖ＲＮＡウィルスのゲノムｃＤＮＡからのウィルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダーペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウィルスまたはウイルス成分となるＲＮＰをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。
具体的な手順は、（ａ）上記パラミクソウィルスゲノムＲＮＡ（ネガティブ鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞またはその培養上清から該ゲノムＲＮＡを含む複合体を回収する工程、により製造することができる。転写されたゲノムＲＮＡはＮ、Ｌ、およびＰ蛋白質の存在下で複製されＲＮＰ複合体を形成する。工程（ａ）を、該ゲノムがコードする改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼの存在下で実施することにより、形成されたＲＮＰが該細胞に接触する細胞へ伝達され、感染が広がりベクターが増幅する。この方法により、機能的なＭ蛋白質が存在しなくても、ＲＮＰの形態で本発明のベクターを製造することができる。
ＤＮＡからの最初のゲノムＲＮＡの転写に必要なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドやウイルスベクターの導入によって実施することができるし、または、例えば細胞の染色体にこの遺伝子の発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムＲＮＡ、およびベクター再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを用いることもできるが、これらのウイルスの混入を招くため好ましくない。
ゲノムＲＮＡを発現するＤＮＡを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ−９８８５  Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ  Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからのウイルスベクターの再構成は具体的には例えば次のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２をほぼ１００％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ  ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）を２ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの組換えセンダイウィルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウィルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．２５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は２：１：２とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。
トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物をＬＬＣ−ＭＫ２細胞に再度トランスフェクションして培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。ＲＮＰが導入された細胞では、ＲＮＴからのウイルス遺伝子の発現およびＲＮＰの複製の過程が遂行しベクターが増幅する。得られた細胞溶解物を希釈して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウィルスｖＴＦ７−３は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回上繰り返す。得られたＲＮＰは−８０℃で保存することができる。
ウィルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウィルスベクター等の再構成においては、サル腎由来ＬＬＣＭＫ２細胞およびＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウィルス粒子を得ることもできる。
ウイルスゲノム中のＭ遺伝子が欠損または欠失していると、このウイルスが感染した細胞からはウイルス粒子が形成されないため、上記のような方法ではＲＮＰまたはＲＮＰを含む細胞として本発明のベクターを調製することはできても、ウイルス粒子としてベクターを調製することはできない。また、ＲＮＰのトランスフェクションを行った後は、細胞内で増殖したＲＮＰは接触している細胞へのみ伝達されるため感染の拡大が遅く、高タイターのウイルスベクターを大量に調製するのは難しい。本発明は、本発明のベクターをウイルス粒子として産生するための方法を提供する。ウイルス粒子はＲＮＰに比べ溶液中で安定であり、さらに感染性を持たせることによりトランスフェクション試薬などを必要とせず細胞に接触させるだけでベクターを標的細胞に導入することができるため、産業上の利用に特に優れている。本発明のベクターをウイルス粒子として産生する方法の１つは、条件的変異を有するＭ遺伝子を持つウイルスゲノムを用いて、許容条件下でウイルスを再構成させる方法である。すなわち、上記の工程（ａ）、あるいは上記工程（ａ）および（ｂ）により得られた複合体を導入した細胞を培養する際に、許容条件下で行うことにより、Ｍ蛋白質を機能させ粒子を形成させることができる。条件的変異を有するＭ変異蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含むウイルス粒子を製造する方法は、（ｉ）該Ｍ変異蛋白質の許容条件下、細胞内でパラミクソウイルスのＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質、および該ゲノムＲＮＡを含むＲＮＰを増幅させる工程、および（ｉｉ）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法である。例えば温度感受性Ｍ変異蛋白質であれば、許容温度で培養する。
また、本発明のベクターをウイルス粒子として製造するもう１つの方法は、Ｍ蛋白質を発現するヘルパー細胞を用いる方法である。本発明者らは、Ｍヘルパー細胞を用いることによって、Ｆ蛋白質の開裂部位が他のプロテアーゼで切断される配列に改変されており、さらにＭ遺伝子を変異または欠失するベクターをウイルス粒子として産生させた。本発明の方法は野生型パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを必要としないため、Ｍ遺伝子を含んだ粒子形成能を持つウイルスが混入することがなく、本発明のベクターを純粋に調製することが可能である。本発明は、（ｉ）パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡであって、（ａ）Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変Ｆ蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムＲＮＡを導入する能力を有するウイルス粒子を提供する。好ましい態様では、このウイルス粒子はウイルス粒子を産生しない。
機能的Ｍ蛋白質を発現する細胞中で本発明のウイルス粒子を製造する方法は、（ｉ）パラミクソウイルスの野生型Ｍ蛋白質またはそれと同等の蛋白質を発現する細胞において、該パラミクソウイルスのＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質、および該ゲノムＲＮＡを含むＲＮＰを増幅させる工程、
（ｉｉ）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、
を含む方法である。野生型Ｍ蛋白質はウイルス粒子を形成させる活性を有する限り、ゲノムＲＮＡと違うパラミクソウイルスに由来していてもよい。また、タグペプチド等が付加されていてもよいし、適当な発現ベクターから発現される際に、ベクター由来のリンカーペプチドが付加されていてもよい。このように野生型Ｍ蛋白質そのものでなくても、それと同等のウイルス粒子形成能を有する蛋白質を用いることができる。Ｍ発現細胞から産生されたウイルス粒子は、この細胞で発現させたＭ蛋白質をエンベロープに含んでいるが、この蛋白質をコードする遺伝子は含んでいない。従って、このウイルスが感染した細胞では、もはや野生型Ｍ蛋白質は発現せず、ウイルス粒子を形成できない。
Ｍ蛋白を発現するヘルパー細胞の作製は、以下のように行うことができる。例えばＭ遺伝子の誘導的な発現が可能なベクターを構築するため、誘導性プロモーターまたはＣｒｅ／ｌｏｘＰなどの組み換えによる発現制御系などを利用する。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築には、例えば、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）等を利用することができる。Ｍ蛋白質を発現できる細胞として、Ｍ遺伝子が染色体に組み込まれ、誘導によりＭ蛋白質を持続的に高発現可能なヘルパー細胞株を樹立することが好ましい。細胞は、例えばサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞等を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ２で培養する。Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼによりＭ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
例えば、１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのＭ発現プラスミドを導入後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ  １枚、２ｍｌ  ２枚、０．２ｍｌ  ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
ヘルパー細胞においてＭ蛋白質が高発現することが、高力価のウイルスを回収するために重要である。そのためには、例えば上記のＭ発現細胞の選択を２回またはそれ以上行うことが好ましい。例えばある薬剤耐性マーカー遺伝子を持つＭ発現プラスミドをトランスフェクションし、その薬剤を用いてＭ遺伝子を保持する細胞を選択した後、別の薬剤耐性マーカー遺伝子を持つＭ発現プラスミドを再度、この細胞にトランスフェクションしこの別の薬剤耐性マーカーで細胞を選択することにより、１回目のトランスフェクションで選択された細胞よりも、さらにＭ蛋白質を高発現できる細胞を選択することが可能である。このように、２回のトランスフェクションを経て構築されたＭヘルパー細胞を好適に用いることができる。Ｍヘルパー細胞は、同時にＦ遺伝子も発現することにより、ＦおよびＭ遺伝子の両方を欠損する感染性ウイルス粒子を産生させることができる（ＷＯ０３／０２５５７０）。この場合、Ｆ遺伝子の発現プラスミドも２回以上トランスフェクションし、Ｆ蛋白質の発現誘導レベルをより高めることが好ましい。Ｆ遺伝子としては、本明細書に記載したような改変Ｆ蛋白質の遺伝子の用いることができる。
Ｍ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、例えば、アデノウィルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））により、好ましくはｍｏｉ＝３程度で感染させて行う。
野生型Ｍ蛋白質またはそれと同等の蛋白質を発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）を用いて本発明のウイルス粒子を産生させるには、この細胞に上述した本発明のＲＮＰを導入して培養すればよい。ＲＮＰの導入は、例えばＲＮＰを含む細胞溶解物などをＭヘルパー細胞にトランスフェクションしてもよいし、あるいはＲＮＰを産生する細胞とＭヘルパー細胞とを共培養することによっても、細胞融合によりＭヘルパー細胞にＲＮＰを導入することができる。あるいは、Ｍヘルパー細胞内で、ゲノムＲＮＡを転写させ、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下でＲＮＰを新規に形成させてもよい。
本発明においては、上記の工程（ｉ）（Ｍヘルパー細胞でＲＮＰを増幅させる工程）を低温で行うことが好ましい。温度感受性変異Ｍ蛋白質を用いたベクター産生では、ウイルス粒子産生過程を許容温度以下で行うことが必要であるが、驚くべきことに、野生型Ｍ蛋白質を用いた本方法においても、ウイルス粒子を形成させる過程を低温で行うことで効率的な粒子形成を行わせることが可能であることが判明した。低温とは、具体的には３５℃以下、より好ましくは３４℃以下、さらに好ましくは３３℃以下、最も好ましくは３２℃またはそれ以下である。
本発明の方法によれば、本発明のウイルス粒子は、例えば１×１０５ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７（１），６５−７４（１９９０）；ＷＯ００／７００７０）。
Ｍ欠失型のウィルスゲノムｃＤＮＡから組み換えウィルスベクターを再構成させるためのより好ましい一態様としては、以下のような方法が挙げられる。すなわち、（ａ）ゲノムＲＮＡ（ポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよい）をコードするＤＮＡを、感染性ウィルス粒子の形成に必要なウィルス蛋白質群（すなわちＮＰ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞と、染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）を共培養する工程、（ｃ）該培養から細胞抽出物を調製する工程、（ｄ）該抽出物を染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）にトランスフェクションして培養する工程、および（ｅ）該培養上清からウィルス粒子を回収する工程、を含む方法である。工程（ｄ）は上記の低温条件にて行うことが好ましい。得られたウイルス粒子は、再度Ｍヘルパー細胞に感染させて（好ましくは低温で）増幅することができる。具体的には、実施例の記載に従ってウィルスを再構成させることができる。回収したウイルス粒子は、希釈後、再度Ｍヘルパー細胞に感染させて増幅することができる。この増幅過程は例えば２または３回またはそれ以上行うことができる。得られたウィルスストックは−８０℃で保存することができる。ウィルス力価は赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる。ＨＡは「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」により決定することができる。
具体的には、まずＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播く。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、細胞培養２４時間後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））をＭＯＩ  ２程度で室温で１時間感染させる。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびパラミクソウイルスのそれぞれＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド適当なリポフェクション試薬と用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、例えば順に６：２：１：２：２：２とすることができるがこれに限定されない。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養する。２４時間培養後、約８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＭ蛋白を持続発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）を重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養する（Ｐ０）。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁する。凍結融解を３回繰り換えした後、ライゼートをそのままＭヘルパー細胞にトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ、およびＦ蛋白質を開裂できるプロテアーゼを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養する（Ｐ１）。３〜１４日後培養上清の一部をとり、新たに調製したＭヘルパー細胞に感染させ、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣおよび該プロテアーゼを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養する（Ｐ２）。３〜１４日後に新たに調製したＭヘルパー細胞に再度感染させ、該プロテアーゼの存在下（Ｆ開裂型ウイルスを調製する場合）または非存在下（Ｆ非開裂型ウイルス粒子を調製する場合）、血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で３〜７日間培養する（Ｐ３）。このように再増幅を３回以上繰り返すことにより、最初に用いたワクシニアウィルスは完全に除去することができる。回収した培養上清に終濃度１％になるようにＢＳＡを添加し−８０℃にて保存する。
本発明のウイルス粒子は、ウイルス粒子が持つ改変Ｆ蛋白質が開裂された感染性を有する粒子、あるいは、そのままでは感染性を有さないが、該改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼの処理により感染性を示す潜在的感染能を有するウイルス粒子であってよい。ウイルス粒子のエンベロープには、ゲノムがコードする改変Ｆ蛋白質が存在しているが、該蛋白質が開裂されていない場合は、そのままでは感染性を有さない。このようなウイルスは、この改変Ｆ蛋白質の開裂配列を切断できるプロテアーゼで処理するか、あるいは該プロテアーゼの存在下で細胞または組織に接触させることにより、該Ｆ蛋白質が開裂し感染性を獲得する。改変Ｆ蛋白質が開裂していないウイルス粒子を得るには、上記のウイルス産生細胞においてウイルスを製造する際に、その最終段階におけるウイルス増幅を改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼの非存在下で行うことにより実施することができる。逆に該プロテアーゼの存在下でウイルスを調製することによりＦ蛋白質が開裂した感染性ウイルス粒子を調製することができる。
またウイルス粒子の製造過程において、細胞においてウイルスゲノムがコードしていないエンベロープ蛋白質を発現させ、この蛋白質をエンベロープに含むウイルス粒子を産生させることができる。このようなエンベロープ蛋白質としては例えば野生型Ｆ蛋白質が挙げられる。このようにして産生したウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡには改変Ｆ蛋白質をコードしているが、エンベロープにはこの蛋白質に加え野生型Ｆ蛋白質も有する。ウイルス粒子の製造段階において野生型Ｆ蛋白質をトランスに供給し、これを開裂するトリプシン存在下で増幅させることにより、ウイルス粒子の野生型Ｆ蛋白質を開裂して感染性を獲得させることができる。この方法によれば、改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼを用いなくても感染性ウイルス粒子を高タイターで調製することが可能となる。このように本発明のウイルス粒子としては、パラミクソウイルスの野生型Ｆ蛋白質を含むウイルス粒子であってよい。野生型Ｆ蛋白質は、ウイルスゲノムと同一種に由来しなくても、他のパラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質であってよい。
また野生型Ｆ蛋白質でなくても、所望のウイルスエンベロープ蛋白質をエンベロープに有するウイルス粒子を作製してよい。すわなちウィルス再構成の際に、所望のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、このエンベロープ蛋白質を有するウィルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）などは好適である。本発明のウイルス粒子には、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムＲＮＡが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウィルスベクターが含まれる。この場合も上記野生型Ｆ蛋白質の場合と同様、ウイルスのゲノムＲＮＡにはこのエンベロープ蛋白質はコードされないため、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。
また、本発明のウィルス粒子は、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的として感染するベクターを作り出すこともできる。これらはウィルスベクターの再構成時に、細胞内で発現させることによりトランスに供給することができる。具体的には、例えばサイトカインなどの可溶性因子の受容体結合ドメインを含む断片、または細胞表面蛋白質に対する抗体断片などが挙げられる（ＷＯ０１／２０９８９）。
なお、ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウィルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウィルス遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
また、大量にウィルスベクターを得るために、上記の方法で得られたウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる可能性もある。例えばニワトリを使ってＭ遺伝子のトランスジェニック体を作製し、この鶏卵にベクターを接種して増幅させればよい。鶏卵を使ったウィルスベクターの製造の基本的な方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウィルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、増幅する組み換えウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのウィルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３（１９９５））。
回収したウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウィルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
Ｆ開裂部位が改変されたＭ遺伝子欠失型のベクターは、特定のプロテアーゼが存在する環境下でのみ、細胞融合型の感染によりベクターを細胞間に伝達する。従って、本発明のベクターは、あるプロテアーゼを発現する組織を標的にした遺伝子治療に有用である。通常のベクターでは、標的組織の表層に遺伝子導入することはできても、組織内部にまでベクターを浸透させることは難しい。しかし本発明のベクターは、標的とするプロテアーゼ活性が亢進している組織内にベクターを深く浸潤させる能力を持っている。例えば正常組織の深部まで浸潤した癌細胞に対しても、本発明のベクターを用いることにより、癌細胞の一部のベクター感染可能な表層部分にそのベクターを感染させることによって、標的細胞の内部までベクターを伝達する事が可能である。
疾患への適用としては、癌、動脈硬化、および慢性関節リウマチ（ＲＡ）をはじめとする関節疾患などが挙げられる。例えばＲＡ等の関節疾患では、上記のように細胞外マトリックス分解による軟骨高次構造の崩壊が進行し関節が破壊される。本発明のベクターによりＥＣＭ分解酵素活性が亢進した細胞を取り除くことにより、関節破壊を低下させることが期待される。また、動脈硬化においては、マクロファージ由来泡沫細胞の集簇が進行する。泡沫細胞はメタロプロテアーゼを大量に分泌し、その結果線維性肥厚を破壊しプラーク破綻を引き起こす。本発明のベクターを用いてＭＭＰを発現するマクロファージを殺すことにより、このような動脈硬化の治療を行うことが可能と考えられる。また後述のように、癌においては種々のプロテアーゼが活性化している。本発明のベクターは、癌特異的に感染・浸潤する治療ベクターとして有用である。
ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与されるベクター量は好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。癌組織等に投与する場合、ベクターの投与は標的部位に均等に行きわたるよう複数箇所に投与することができる。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０５ＣＩＵ〜２×１０１０ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
特に本発明のベクターは癌の治療に有用である。本発明のベクターが感染した細胞では、プロテアーゼ存在下で細胞融合によりシンシチウムを形成させる。この性質を利用して、本発明のベクターを特定のプロテアーゼの活性が亢進している癌の治療に用いることが可能である。本発明は、癌で活性が亢進するプロテアーゼにより開裂するＦ蛋白質をコードする本発明のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む癌の治療組成物を提供する。また本発明は、該ベクターの癌治療組成物の製造における使用に関する。また本発明は、該ベクターを癌に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。浸潤転移する悪性の癌ではＥＣＭ分解酵素の活性が亢進していることから、ＥＣＭ分解酵素により開裂するＦ蛋白質遺伝子を有するベクターを用いれば、悪性の癌に特異的にベクターを感染させ癌組織を死滅させることができる。
ベクターには、外来遺伝子を搭載させることができる。外来遺伝子は、ベクターの感染をモニターするためのマーカー遺伝子であってもよく、あるいは癌の治療用遺伝子を用いてもよい。治療用遺伝子としては、例えばアポトーシス等の細胞誘導性遺伝子、細胞毒性を持つ蛋白質をコードする遺伝子、サイトカイン、ホルモン、その他が挙げられる。本発明のベクターは、癌への直接（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与、および患者由来細胞またはそれ以外の細胞に本発明のベクターを導入し、その細胞を癌に注入する間接（ｅｘ  ｖｉｖｏ）投与により癌に投与することができる。
対象となる癌は特定のプロテアーゼ活性が亢進する所望の癌であってよく、癌種としてはほとんどの浸潤転移する悪性の腫瘍（肺癌、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌など）が挙げられる。しかし、悪性癌においてもＭＭＰ，ｕＰＡ，ｔＰＡなどのプロテアーゼの発現の低いものもあるため、プロテアーゼ活性の亢進の有無によって適用を判断する。食道癌における粘膜下層への浸潤癌、大腸癌における固有筋層へのＩＩＩ，ＩＶ期の進行癌や、浸潤性のメラノーマの深部に進入した外科的にとりきれない癌への適用に、本発明のベクターは特に優れている。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は全て本明細書の一部として組み込まれる。
１．粒子形成能を低下または欠損させたＳｅＶベクターの構築
［実施例１］  温度感受性変異導入ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
Ｍ遺伝子に温度感受性変異を導入したＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築を行った。下記記載のｃＤＮＡ構築のスキームを図１に表した。Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）をＮａｅＩで消化し、Ｍ遺伝子を含む断片（４９２２ｂｐ）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした（ｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰの構築）。Ｍ遺伝子への温度感受性変異導入はこのｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰ上で、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。Ｍ遺伝子上への変異導入の種類はＫｏｎｄｏらが報告しているＣｌ．１５１  ｓｔｒａｉｎ（Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１９２４−２１９３０（１９９３））の配列を利用し、Ｇ６９Ｅ，Ｔ１１６Ａ及びＡ１８３Ｓの３箇所の変異導入を行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、Ｇ６９Ｅ（５’−ｇａａａｃａａａｃａａｃｃａａｔｃｔａｇａｇａｇｃｇｔａｔｃｔｇａｃｔｔｇａｃ−３’／配列番号：１１，５’−ｇｔｃａａｇｔｃａｇａｔａｃｇｃｔｃｔｃｔａｇａｔｔｇｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｔｃ−３’／配列番号：１２）、Ｔ１１６Ａ（５’−ａｔｔａｃｇｇｔｇａｇｇａｇｇｇｃｔｇｔｔｃｇａｇｃａｇｇａｇ−３’／配列番号：１３，５’−ｃｔｃｃｔｇｃｔｃｇａａｃａｇｃｃｃｔｃｃｔｃａｃｃｇｔａａｔ−３’／配列番号：１４）及びＡ１８３Ｓ（５’−ｇｇｇｇｃａａｔｃａｃｃａｔａｔｃｃａａｇａｔｃｃｃａａａｇａｃｃ−３’／配列番号：１５，５’−ｇｇｔｃｔｔｔｇｇｇａｔｃｔｔｇｇａｔａｔｇｇｔｇａｔｔｇｃｃｃｃ−３’／配列番号：１６）である。
Ｍ遺伝子上に３箇所の変異を有するｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰをＳａｌＩで消化後ＡｐａＬＩで部分消化を行い、全Ｍ遺伝子を含むフラグメント（２６４４ｂｐ）を回収した。一方でｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＡｐａＬＩ／ＮｈｅＩで消化してＨＮ遺伝子を含む断片（６２８７ｂｐ）を回収し、この２種の断片をＬｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｌＩ／ＮｈｅＩサイトにサブクローニングした（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓΔＦＧＦＰの構築）。ＨＮ遺伝子への温度感受性変異導入はこのＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓΔＦＧＦＰ上で、Ｍ遺伝子への変異導入時と同様にＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。ＨＮ遺伝子上への変異導入の種類はＴｈｏｍｐｓｏｎらが報告しているｔｓ２７１  ｓｔｒａｉｎ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：１−８（１９８７））の配列を利用し、Ａ２６２Ｔ，Ｇ２６４Ｒ及びＫ４６１Ｇの３箇所の変異導入を行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、Ａ２６２Ｔ／Ｇ２６４Ｒ（５’−ｃａｔｇｃｔｃｔｇｔｇｇｔｇａｃａａｃｃｃｇｇａｃｔａｇｇｇｇｔｔａｔｃａ−３’／配列番号：１７，５’−ｔｇａｔａａｃｃｃｃｔａｇｔｃｃｇｇｇｔｔｇｔｃａｃｃａｃａｇａｇｃａｔｇ−３’／配列番号：１８）、及びＫ４６１Ｇ（５’−ｃｔｔｇｔｃｔａｇａｃｃａｇｇａａａｔｇａａｇａｇｔｇｃａａｔｔｇｇｔａｃａａｔａ−３’／配列番号：１９，５’−ｔａｔｔｇｔａｃｃａａｔｔｇｃａｃｔｃｔｔｃａｔｔｔｃｃｔｇｇｔｃｔａｇａｃａａｇ−３’／配列番号：２０）である。今回はＭ或いはＨＮ遺伝子への変異導入を別々のベクター上で行ったが、ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化し得られるＭ及びＨＮ遺伝子を含むフラグメント（８９３１ｂｐ）をＬｉｔｍｕｓ３８のＳａｌＩ／ＮｈｅＩサイトにサブクローニングして得られるプラスミド（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰ）を利用して、Ｍ及びＨＮ遺伝子への全変異を導入することは可能である。このようにして順次変異導入を行い、Ｍ遺伝子上に３箇所、ＨＮ遺伝子上に３箇所の計６箇所の温度感受性変異を導入した（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓＨＮｔｓΔＦＧＦＰの構築）。
ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓＨＮｔｓΔＦＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したフラグメント（８９３１ｂｐ）と、またｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したＭ及びＨＮ等遺伝子を含まないフラグメント（８２９４ｂｐ）をライゲーションして、Ｍ及びＨＮ遺伝子に６箇所の温度感受性変異を有し、Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ）を構築した（図２）。
更に、搭載遺伝子発現量の定量を行う為に、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を搭載したｃＤＮＡの構築も行った。即ち、ＳＥＡＰ遺伝子の下流に終止シグナル−介在配列−開始シグナルを有するＳＥＡＰ断片（ＷＯ００／７００７０）をＮｏｔＩで切り出し（１６３８ｂｐ）、電気泳動後回収・精製し、ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰのＮｏｔＩサイトに組み込んだ。それぞれ、ｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰとした（図２）。
［実施例２］  温度感受性変異導入ウィルスの再構成と増幅
ウィルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。Ｆ欠失型ウイルスを再構成させるため、Ｆ蛋白のヘルパー細胞を利用した。当該ヘルパー細胞作製にはＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用している。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））で感染させて挿入遺伝子を発現させる。ＳｅＶ−Ｆ蛋白の場合、Ｆ遺伝子を有する同トランスフォーマント細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７と記載し、ＡｘＣＡＮＣｒｅで誘導後Ｆ蛋白を持続発現している細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａと記載することにする。
温度感受性変異導入ウィルスの再構成は以下のように行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））を室温で１時間感染させた（ｍ．ｏ．ｉ．２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））をそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に懸濁し、１μｇＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＦ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）を重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した（Ｐ０）。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁した。凍結融解を３回繰り返した後、ライゼートをそのままＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａにトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ１）。５〜７日後培養上清の一部をとり、新たに調製したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａに感染させ、同４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ２）。３〜５日後に新たに調製したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａに再度感染させ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎのみを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で３〜５日間培養した（Ｐ３）。回収した培養上清に終濃度１％になるようにＢＳＡを添加し−８０℃にて保存した。保存ウィルス液を解凍し、その後の実験に供した。
この方法で調製した各ウィルス溶液のタイターはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰでそれぞれ、３×１０８，７×１０７，１．８×１０８及び８．９×１０７  ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ（ＧＦＰ−ＣＩＵの定義はＷＯ００／７００７０に記載）であった。なお、ＧＦＰを搭載したベクターについては、ＧＦＰの蛍光で直接的にカウントして定量したＣＩＵがＧＦＰ−ＣＩＵと定義される。ＧＦＰ−ＣＩＵは、ＣＩＵと実質的に同じ値を示すことが確認されている（ＷＯ００／７００７０）。これらのタイターを測定する際、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰについて、Ｆ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）に感染後のプラークの広がりを３２℃及び３７℃で観察した。感染６日後の写真を図３に示したが、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰは３２℃ではある程度プラークの広がりがあるものの３７℃では激減しており、ビリオン形成の減少が示唆された。
［実施例３］  ウィルス再構成における培養温度（３２℃）の効果
実施例２で示した温度感受性導入ウィルスの再構成実験において、Ｐ１以降の温度を３２℃で行った。これは温度感受性変異を導入するにあたって変異の参考にしたウィルスが３２℃での生育が良い（Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１９２４−２１９３０（１９９３），Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：１−８（１９８７））ことから試みたものであるが、当該実験条件を詳細に観察することで、ＳｅＶ再構成にあたっては（温度感受性変異導入ウィルス以外でも）、Ｐ１以降で３２℃で行うことで再構成効率が上昇し、従来取れ難かったものでも回収できるようになる可能性が高いことが明らかになった。
３２℃でウィルス再構成効率が上昇する理由として２点考えられる。まず、ワクシニアウィルスの増幅を抑制する為に添加しているＡｒａＣによる細胞毒性が、３２℃での培養の方が抑制されていると考えられる点である。再構成時の条件である、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用いてＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを培養した場合、３７℃では３−４日後で既に細胞障害が惹起され剥がれた細胞が増えてくるのに対し、３２℃で培養した場合は７−１０日は十分に培養継続が可能であり細胞が維持されている。転写複製効率の良くない或いは感染性ビリオン形成効率の良くないＳｅＶを再構成する場合、培養継続期間は再構成の可否に直接反映されると考えられる。２点目は３２℃で培養した場合にはＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／ＡにおけるＦ蛋白の発現が維持されている点である。Ｆ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）を６ｗｅｌｌプレートに１０％ＦＢＳを含むＭＥＭでコンフルエントになるまで３７℃で培養後、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭに置換し３２℃或いは３７℃で培養し、経時的にセルスクレーパーで細胞を回収した後、抗Ｆ抗体（マウスモノクローナル）を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行うことで、細胞内のＦ蛋白質を半定量的に解析した。３７℃では２日間は発現が維持されているもののそれ以降は減少していたが、３２℃では少なくとも８日間はＦ蛋白の発現が維持されていた（図４）。この点からも３２℃での再構成（Ｐ１以降）の有効性が確認された。
上記Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇは以下の方法で行った。６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌから回収した細胞を−８０℃で凍結保存後、１ｘに希釈したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（Ｒｅｄ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐａｃｋ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１００μＬで溶解し、９８℃で１０分間加熱した。遠心後、上清１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（マルチゲル１０／２０；Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にロードした。１５ｍＭで２．５時間泳動後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にセミドライ法にて１００ｍＡで１時間転写した。転写膜をブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ；Ｓｎｏｗ  Ｂｒａｎｄ  Ｍｉｌｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）で４℃１時間以上放置した後、１０％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含み抗Ｆ抗体を１／１０００容量添加した一次抗体溶液に浸し、４℃で一晩放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３回、更にＴＢＳで３回洗浄した後、１０％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含みＨＲＰを結合した抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｇｏａｔ  Ｆ（ａｂ’）２  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋ＩｇＭ，ＨＲＰ；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）  を１／５０００容量添加した二次抗体溶液に浸し、室温で１時間振盪した。ＴＢＳＴで３回、ＴＢＳで３回洗浄した後、化学発光法（ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により検出した。
［実施例４］  温度感受性変異導入ウィルスの２次放出粒子定量（ＨＡ  ａｓｓａｙ，Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰと共に、全てのウィルス蛋白を有する自律複製型でＮｏｔＩ部位にＧＦＰ遺伝子とその下流に終止シグナル−介在配列−開始シグナルを有するＧＦＰ断片（７８０ｂｐ）を搭載したＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ：図２）を用いて比較を行った。
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにおいてコンフルエントに増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞に、３×１０７ＣＩＵ／ｍＬの各ウィルス溶液を１ｗｅｌｌあたり１００μＬを添加して（ｍ．ｏ．ｉ．３）１時間感染し、ＭＥＭで洗浄後、１ｗｅｌｌあたり１ｍＬの血清を含まないＭＥＭを添加して３２℃，３７℃及び３８℃の各温度で培養した。１日毎にサンプリングし、サンプリング後直ぐに血清を含まない新しいＭＥＭ１ｍＬを添加して経時的に培養・サンプリングを行った。感染３日後に蛍光顕微鏡下でＧＦＰ発現の観察を行った所３種のウィルス共に、また３２℃，３７℃及び３８℃の全ての条件において、ほぼ同程度に感染し、また類似したＧＦＰの発現があると予想された（図５）。
２次放出粒子は赤血球凝集活性（ＨＡ活性）で定量し、Ｋａｔｏらの方法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  １，５６９−５７９（１９９６））に倣って行った。即ち、丸底の９６穴プレートを使用し、ウィルス液を段階的にＰＢＳで希釈し各ｗｅｌｌ  ５０μＬの２倍希釈系列を作製した。その５０μＬに１％濃度にＰＢＳで希釈したニワトリ保存血（コスモバイオ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）５０μＬを混合し、４℃で１時間放置し赤血球の凝集を観察し、凝集したもののうち最もウィルス希釈率の高いものの希釈率をＨＡ活性として判定した。また、１ＨＡＵを１×１０６ウィルスと換算して、ウィルス数で表した（図６）。ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰで２次放出粒子がかなり減少し、３７℃でＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰの約１／１０に減少していると判断された。また、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰは、３２℃でもウィルス粒子形成は減少しているが、少ないながらもある程度は粒子がでるので、生産が可能になっていると考えられた。
別の観点からの２次放出粒子の定量として、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇによる定量を行った。上記と同じようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞にｍ．ｏ．ｉ．３で感染後、感染２日後に培養上清と細胞を回収し、培養上清は４８，０００ｇで４５分間遠心しウィルス蛋白を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、抗Ｍ抗体で検出した。抗Ｍ抗体は新たに調製したポリクローナル抗体であり、ＳｅＶ−Ｍ蛋白質の１−１３（ＭＡＤＩＹＲＦＰＫＦＳＹＥ＋Ｃｙｓ／配列番号：２１），２３−３５（ＬＲＴＧＰＤＫＫＡＩＰＨ＋Ｃｙｓ／配列番号：２２）及び３３６−３４８（Ｃｙｓ＋ＮＶＶＡＫＮＩＧＲＩＲＫＬ／配列番号：２３）の合成ペプチドを３種混合して免疫したウサギ血清から調製したものである。Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇは実施例３に記載の方法で行い、一次抗体の抗Ｍ抗体は１／４０００希釈、二次抗体のＨＲＰを結合した抗ラビットＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｇｏａｔ）Ｈ＋Ｌ  ｃｏｎｊ．；ＩＣＮ  Ｐ．，Ａｕｒｏｌａ，ＯＨ）は１／５０００容量に希釈したものを使用した。ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰでは、細胞中にはＭ蛋白が同程度に多く発現しているのに対しｖｉｒｕｓの蛋白量が減少しており（図７）、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇの手法によっても、当該ウィルスに於いて２次放出粒子が減少していることが確認された。
［実施例５］  温度感受性変異導入ウィルスの搭載遺伝子発現量（ＳＥＡＰ  ａｓｓａｙ）
ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰにおいて２次放出粒子が減少しているが、それと同時に搭載遺伝子の発現量が減少していては遺伝子発現ベクターとしては意味のない改変になってしまうので、その発現量について検証を行った。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にｍ．ｏ．ｉ．３で感染後、経時的に（感染１２，１８，２４，５０，１２０時間後）培養上清を回収し、上清中のＳＥＡＰ活性をＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＳＥＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。ＳＥＡＰ活性は両者間での差が殆どなかった（図８）。また同サンプルについて赤血球凝集活性（ＨＡ活性）を測定したが、ＨＡ活性はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰでやはり約１／１０に減少していた（図９）。また、同サンプルのウィルスを４８，０００ｇで４５分間遠心しウィルス蛋白を回収した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇで抗Ｍ抗体を利用して半定量的に解析した。この場合も、上清中のウィルス蛋白の減少が確認された（図１０）。温度感受性変異の導入によって、搭載遺伝子の発現量を殆ど減少することなく、２次放出粒子を約１／１０に減少できたと判断された。
［実施例６］  温度感受性変異導入ウィルスの細胞障害性（ＬＤＨ  ａｓｓａｙ）
Ｓｅｖ感染によって細胞が障害を受ける場合も多い。この点に関して、変異導入による影響を調べた。ＬＬＣ−ＭＫ２，ＢＥＡＳ−２Ｂ及びＣＶ−１細胞をそれぞれ２．５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き培養した。培養にはＬＬＣ−ＭＫ２及びＣＶ−１には１０％ＦＢＳを含むＭＥＭを、ＢＥＡＳ−２Ｂには１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ及びＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の１：１混合液を使用した。２４時間培養後、１％ＢＳＡを含ＭＥＭで希釈したＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ溶液を５μＬ／ｗｅｌｌで添加し感染させ、６時間後ウィルス液を含む培地を除き、１０％ＦＢＳを含む或いは含まない各培地に置き換えた。ＦＢＳを含まない培地の場合は感染３日後に、ＦＢＳを含む培地の場合は感染６日後に培養上清をサンプリングし、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って細胞障害性の定量を行った。ＬＬＣ−ＭＫ２では両者ともに細胞障害は観察されなかった。またＣＶ−１及びＢＥＡＳ−２Ｂにおいては、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰの細胞障害性はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰと同等以下であると判断された（図１１）。即ち、温度感受性変異導入での２次放出粒子の抑制による細胞障害性の惹起はないと結論した。
［実施例７］  ２次放出粒子抑制メカニズムの検討
温度感受性変異導入によって２次粒子抑制が可能となったメカニズムの一端を調べる為に、Ｍ蛋白の細胞内局在について調べた。各ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ）をＬＬＣ−ＭＫ２細胞にそれぞれ感染し、３２℃、３７℃或いは３８℃で培養し２日後に抗Ｍ抗体を利用して免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法で行った。培養細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、−２０℃に冷却したメタノールを添加し４℃で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ溶液で室温１時間Ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。再度ＰＢＳで３回洗浄後、２％Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含む一次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ抗Ｍ抗体）で３７℃３０分間反応した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含む二次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で３７℃１５分間反応した。最後にＰＢＳで３回洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察した。自律複製型でＦ，ＨＮ両蛋白を有するＳｅＶ１８＋ＧＦＰでは、検討した何れの温度においても細胞表面でのＭ蛋白の濃縮像が観察された（図１２）。このようなＭ蛋白の濃縮像に関しては既に報告されており（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：１４３−１６１（１９７６））、ビリオン形成の場所を反映していると考えられている。即ちＳｅＶ１８＋ＧＦＰにおいては、何れの温度においてもＭ蛋白の細胞表面への局在が正常であり、十分量のビリオンが形成していることを示していると考えられる。一方ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰでは、３８℃においてＭ蛋白の濃縮像が極端に減少した。Ｍ蛋白はＦ及びＨＮ蛋白のそれぞれのＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌに結合して、細胞表面へ局在すると考えられており（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：６９−７６（１９９４）、Ａｌｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６：２８９−３０３（２０００））、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰではその一方のＦ蛋白を欠失している為、Ｍ蛋白の局在に影響していると考えられる。また、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰではその影響が強く出て、３７℃でさえＭ蛋白の局在に支障が出て、結果的に２次放出粒子減少に繋がったものと予想された。
［実施例８］  ２次放出粒子抑制メカニズムの検討（２）
細胞内におけるＳｅＶ蛋白の細胞内局在をより詳細に調べるために、共焦点レーザー顕微鏡（ＭＲＣ１０２４；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）による解析を実施した。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＡ−１０細胞（ｒａｔｍｙｏｂｌａｓｔ）にそれぞれ感染し（ｍ．ｏ．ｉ．１）、３２℃或いは３７℃で１０％血清を含むＭＥＭで培養し、１日後及び２日後に抗Ｍ抗体及び抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法で行った。培養感染細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、−２０℃に冷却したメタノールを添加し４℃で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ，１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ溶液で室温１時間ブロッキングを行った。２％Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含むＭの一次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ抗Ｍ抗体）で３７℃３０分間反応し、更にＨＮの一次抗体溶液（１μｇ／ｍＬ抗ＨＮ抗体（ＩＬ４−１））で３７℃３０分間反応した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含む二次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ及び１０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で３７℃１５分間反応した。ＰＢＳで３回洗浄後、核を染色するために１／４０００に希釈したＴＯ＿ＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を添加後室温で１５分間放置し、最後に消光を抑えるために、Ｓｌｏｗ  Ｆａｄｅ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の溶液に置換し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。感染１日後の結果を図１３に示したが、赤色がＭ蛋白、緑色がＨＮ蛋白の局在を示し、共存している場合には黄色に表される。また遠赤色を色変換しているので青色が核である。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰの場合は、３２℃，３７℃何れの温度においても各蛋白の局在に大きな違いはなく、細胞表面へのＭ蛋白及びＨＮ蛋白の局在が観察されている。一方ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰの場合は、両温度ともに各蛋白質の局在にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰの場合と比べ違いがあり、細胞表面でのＭ蛋白の局在がほとんどない。特に３７℃の場合は、Ｍ蛋白とＨＮ蛋白がほぼ完全に分離し、Ｍ蛋白は微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）とも予想される部分に局在して存在している。感染後２日間培養した場合も同様の結果が得られており、特にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染細胞においては、Ｍ蛋白の細胞内局在に感染１日後と変化がなく（図１４）、それぞれの位置で移動が止まっているように見える。この結果によっても、温度感受性変異導入ウィルスで二次放出粒子が減少しているのは、粒子形成の中心的な役割を担っていると考えられているＭ蛋白の局在不全であると断定された。
また、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染後３２℃で培養した場合、Ｍ蛋白が微小管の形態に近い形で染色されている（図１３）。実際に微小管の関与を証明するために、微小管の脱重合を促進する薬剤を添加し、Ｍ蛋白（及びＨＮ蛋白）の局在の変化を調べた。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＡ−１０にｍ．ｏ．ｉ．１で感染後、直後に脱重合試薬であるｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ（Ｎａｋａｒａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）或いはｃｏｌｃｅｍｉｄｅ（Ｎａｋａｒａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を終濃度１μＭ添加し、３２℃で培養した。感染２日後に上述と同じ方法で、Ｍ蛋白、ＨＮ蛋白の細胞内局在を観察した。脱重合試薬を添加しない場合は、Ｍ蛋白は微小管様形態に似た分布を示した（図１３）のに対し、脱重合試薬を添加することで、その構造が壊れ、大きな繊維状構造体として検出された（図１５）。この構造は、Ｍ蛋白そのもが凝集したものか或いは脱重合した微小管の残骸にＭ蛋白が結合している可能性があるが、何れにしても図１３に見られる、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染後３２℃で培養した場合のＭ蛋白は、微小管に沿って局在している可能性が高いと判断された。
上記の微小管へのＭ蛋白の局在が温度感受性ウィルスの特有のものか否かを調べるために、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰの両ウィルスについて、感染後のＭ蛋白（及びＨＮ蛋白）の局在変化に対する微小管脱重合試薬（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）の影響を調べた。ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＡ−１０にｍ．ｏ．ｉ．１で感染後、直後に脱重合試薬であるｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅを終濃度１μＭ添加し、３２℃或いは３７℃で培養した。感染２日後に上述と同じ方法で、Ｍ蛋白（及びＨＮ蛋白）の細胞内局在を観察した。結果を図１６に示すが、両ウィルス感染細胞共に類似の現象を示した。即ち、感染後３２℃で培養した場合は図１５と同様に大きな繊維状構造体として観察された。ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰの場合もＭ蛋白は微小管と共存している可能性が示唆された。更に、３７℃においては特にＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染細胞において、ゴルジ体付近と予想される部位に局在して観察された。
以上の結果から、以下のことが推察される。Ｍ蛋白はゴルジ体付近で合成され、主にＦ及びＨＮ蛋白のそれぞれのＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌに結合した状態（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：６９−７６（１９９４）、Ａｌｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６：２８９−３０３（２０００））で微小管に沿って（例えばキネシンのようなモーター蛋白に結合して）細胞内を移動し、細胞表面へ局在し粒子形成が達成される。温度感受性変異を導入したウィルスにおいては、３２℃においては微小管に沿った細胞内移動までは正常であるが、微小管から細胞表面へ局在する段階で不具合が生じ、微小管に沿っての局在が観察されていると考えることができる。３７℃においては微小管に沿った細胞内移動さえ不具合が生じ、ゴルジ体付近で局在が観察されていると捉えることができる。Ｍ蛋白質の合成の場としては、ゴルジ体付近と予想されるが、凝集が観察されるのがその付近ということであって、合成の場そのものは別である可能性がある。但し、過去の報告例によると、微小管のコンポーネントであるｔｕｂｕｌｉｎはＳｅＶの転写・複製活性に関与し、転写・複製を促進することが報告されており（Ｍｏｙｅｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，５４０５−５４０９（１９８６）；Ｏｇｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３５９９９−３６００８（１９９９））、またゴルジ体は、そのｔｕｂｕｌｉｎが多く存在すると予想される中心体付近に局在することから微小管の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）で合成されると予想できる。更に、ＳｅＶの変異株であるＦ１−Ｒ  ｓｔｒａｉｎはＭ遺伝子に変異を有しているが、感染後微小管を変化させて、Ｆ１−Ｒ  ｓｔｒａｉｎの細胞の極性に依存しない粒子形成を可能にしていると考えられている（Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５９０２−５９１０（１９９３））。即ち、ｔｕｂｕｌｉｎに沿ったＭ蛋白の細胞内移動を想定することで、本実施例の結果も説明できる。このように予想されるメカニズムにおいて、Ｍ及びＨＮ遺伝子へ当該温度感受性変異を導入することで、Ｍ蛋白の細胞内局在の不具合を生じ、結果的に二次放出粒子の減少が達成されていると判断された。
［実施例９］  ＥＧＦＰ遺伝子を有するＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
ｃＤＮＡの構築にはＭ遺伝子を欠失したＭ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭ：ＷＯ００／０９７００）を利用した。構築のスキームを図１７に表した。ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭのＭ欠失部位を含むＢｓｔＥＩＩ断片（２０９８ｂｐ）を、予めＳａｌＩ／ＸｈｏＩで消化後ライゲーションしてＥｃｏＲＶ認識部位を欠失させたｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔ  ｈｅｒｌａｎｄｓ）のＢｓｔＥＩＩサイトにサブクローニングした（ｐＳＥ−ＢｓｔＥＩＩｆｒｇの構築）。ＧＦＰ遺伝子を有するｐＥＧＦＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）をＡｃｃ６５Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化しＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）での５’末端のｆｉｌｌ  ｉｎにより末端の平滑化を行い、ＥｃｏＲＶで消化後ＢＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）処理を行ったｐＳＥ−ＢｓｔＥＩＩｆｒｇにサブクローニングした。このＥＧＦＰ遺伝子を含むＢｓｔＥＩＩフラグメントをもとのｐＳｅＶ１８＋／ΔＭに戻し、Ｍ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）を構築した。
［実施例１０］  Ｍ欠失複製能欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
ＭおよびＦ遺伝子の両方を欠失するＳｅＶゲノムｃＤＮＡを構築した。下記記載の構築のスキームを図１８に表した。Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）のＮａｅＩ断片（４９２２ｂｐ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングして構築したｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰを用いてＭ遺伝子の欠失を行った。Ｍ遺伝子直後のＡｐａＬＩサイトを利用してＭ遺伝子を切り出すようにデザインした。即ち、切り出すｆｒａｇｍｅｎｔが６ｎとなるようにＰ遺伝子直後にＡｐａＬＩ認識配列を導入した。変異導入はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は５’−ａｇａｇｔｃａｃｔｇａｃｃａａｃｔａｇａｔｃｇｔｇｃａｃｇａｇｇｃａｔｃｃｔａｃｃａｔｃｃｔｃａ−３’／配列番号：２４，５’−ｔｇａｇｇａｔｇｇｔａｇｇａｔｇｃｃｔｃｇｔｇｃａｃｇａｔｃｔａｇｔｔｇｇｔｃａｇｔｇａｃｔｃｔ−３’／配列番号：２５）である。変異導入後、ＡｐａＬＩで部分消化し（３７℃，５分）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で回収した後そのままライゲーションを行った。再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔでＤＮＡを回収し、ＢｓｍＩ及びＳｔｕＩで消化後ＤＨ５αへ形質転換してＭ遺伝子（及びＦ遺伝子）を欠失したＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰ）を調製した。
Ｍ（及びＦ遺伝子）を欠失したｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰをＳａｌＩ及びＡｐａＬＩで消化を行い、Ｍ欠失部位を含むフラグメント（１４８０ｂｐ）を回収した。一方でｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＡｐａＬＩ／ＮｈｅＩで消化してＨＮ遺伝子を含む断片（６２８７ｂｐ）を回収し、この２種の断片をＬｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｌＩ／ＮｈｅＩサイトにサブクローニングした（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰの構築）。ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したフラグメント（７７６７ｂｐ）と、またｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したＭ及びＨＮ等遺伝子を含まないフラグメント（８２９４ｂｐ）をライゲーションして、Ｍ及びＦ遺伝子を欠失しその欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＭ及びＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）を構築した。構築したＭ欠失型（及びＭ及びＦ欠失型）ウィルスの構造を図１９に表した。このゲノムｃＤＮＡは、所望の改変Ｆ蛋白質を含むＭ及びＦ欠失型ＳｅＶの作製に有用である。
［実施例１１］  ＳｅＶ−Ｍ蛋白を発現するヘルパー細胞の作製
Ｍ蛋白を発現するヘルパー細胞作製の為にＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用した。当該システム構築のため、Ｆ蛋白のヘルパー細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞）作製（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）において採用したＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用した。
〈１〉Ｍ発現プラスミドの構築
Ｍ蛋白を発現誘導するヘルパー細胞の作出の為に、既に作製している上記ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞を利用し、この細胞に同システムでのＭ遺伝子導入を行うこととした。但し、Ｆ遺伝子導入時に使用したｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆはｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有している為、同細胞を利用する為には別の耐性遺伝子の導入が必須であり、まず図２０に記載のスキームでＭ遺伝子搭載プラスミド（ｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｍ：ｐＣＡＬＮｄＬｗのＳｗａＩサイトにＭ遺伝子導入）のｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子に置き換えた。即ち、ｐＣＡＬＮｄＬｗ／ＭをＨｉｎｃＩＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化しＭ遺伝子を含む断片（４７３７ｂｐ）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで回収した。同時に、同ｐＣＡＬＮｄＬｗ／ＭをＸｈｏＩで切断、ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含まない断片（５９４１ｂｐ）を回収後、更にＨｉｎｃＩＩで切断し１７７９ｂｐの断片を回収した。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をテンプレートにｈｙｇｒｏ−５’（５’−ｔｃｔｃｇａｇｔｃｇｃｔｃｇｇｔａｃｇａｔｇａａａａａｇｃｃｔｇａａｃｔｃａｃｃｇｃｇａｃｇｔｃｔｇｔｃｇａｇ−３’／配列番号：２６）及びｈｙｇｒｏ−３’（５’−ａａｔｇｃａｔｇａｔｃａｇｔａａａｔｔａｃａａｔｇａａｃａｔｃｇａａｃｃｃｃａｇａｇｔｃｃｃｇｃｃｔａｔｔｃｃｔｔｔｇｃｃｃｔｃｇｇａｃｇａｇｔｇｃｔｇｇｇｇｃｇｔｃ−３’／配列番号：２７）の２種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで回収した後ＸｈｏＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化して調製した。これら３種の断片をライゲーションしｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｈｙｇｒｏＭを作製した。
〈２〉ＳｅＶ−Ｍ及びＦ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞のクローニング
トランスフェクションにはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いプロトコールに記載の方法で行った。即ち以下の方法をとった。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６０ｍｍシャーレに播き、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭで２４時間培養した。ｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｈｙｇｒｏＭの５μｇをＦＢＳ及び抗生物質を含まないＤ−ＭＥＭに希釈し（総量で１５０μＬ）、撹拌後Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ３０μＬを添加、再度撹拌し室温で１０分間放置した。放置後、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭを１ｍＬ添加し撹拌後、ＰＢＳで１回洗浄したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞へこのトランスフェクション混合液を添加した。３７℃，５％ＣＯ２インキュベーターで３時間培養後、トランスフェクション混合液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭを５ｍＬ添加し２４時間培養した。培養後、トリプシンで細胞を剥がし、９６ｗｅｌｌプレートに約５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割り合いで希釈し、１５０μｇ／ｍＬのｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含む１０％ＦＢＳ入りのＤ−ＭＥＭで約２週間培養した。単一の細胞から広がったクローンを６ｗｅｌｌプレートまで拡大培養した。このようにして調製した合計１３０クローンについて以下解析を行った。
〈３〉ＳｅＶ−Ｍ及びＦ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞クローンの解析
得られた１３０種のクローンについて、Ｍ蛋白の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで半定量的に解析した。各クローンを６ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの状態で、５％ＦＢＳを含むＭＥＭで希釈したＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））でｍ．ｏ．ｉ．５で感染させた。３２℃で２日間培養後、培養上清を除去しＰＢＳで１回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がして細胞を回収した。１ｌａｎｅあたりこの１／１０量をアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、抗Ｍ抗体を利用して実施例３及び４に記載の方法でＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。１３０クローンの中で比較的Ｍ蛋白の発現量の多かったものに関して、抗Ｆ抗体（ｆ２３６：Ｓｅｇａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，１０６４−１０７２（１９９８））を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果と併せて図２１に記載した。
［実施例１２］  ＳｅＶ−Ｍ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の評価
実施例１１でクローニングしたＳｅＶ−Ｍ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞を用いてＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）のウィルス再構成を実施し、これらの細胞クローンのウイルス産生能を評価した。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各クローンに添加し、ＧＦＰ蛋白の広がりが観測されるか（Ｍ蛋白のトランス供給が達成されるか）否かについて検証した。Ｐ０  ｌｙｓａｔｅの調製は以下のように行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７を室温で１時間感染させた（ｍ．ｏ．ｉ．２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ，ｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ及びｐＧＥＭ／Ｍをそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した（Ｐ０）。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、凍結融解を３回繰り返えしてＰ０  ｌｙｓａｔｅを調製した。一方で１０種のクローンを２４ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの時にＡｘＣＡＮＣｒｅをｍ．ｏ．ｉ．５で感染し、感染後３２℃で２日間培養した細胞を準備した。この細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各２００μＬ／ｗｅｌｌでトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した。＃１８及び＃６２のクローンでＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰによるＧＦＰ蛋白の広がりが観察された（図２２）。特に、＃６２の方で広がりが早く、以下の実験にはこの＃６２を使用した。当該細胞についてＡｘＣＡＮＣｒｅ誘導前のものをＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２と記載し、誘導後のものでＦ及びＭ蛋白を持続発現しているものをＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａと記載することにする。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａを利用してＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの調製を継続し、Ｐ２の感染６日後に９．５×１０７，Ｐ４の感染５日後に３．７×１０７ＧＦＰ−ＣＩＵのウィルスを調製した。
本実験において、実施例３に示すように、Ｐ１以降を３２℃などの低温で培養することがＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス回収にとって非常に重要と考えられた。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰにおいてＭ蛋白を発現細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａ）からトランスに供給していることが原因と考えられるが、感染の広がりが非常に遅くＰ１の感染７日後でようやく広がりが見られた（図２２）。即ち、当該ウィルスの再構成実験においても、「Ｐ１以降を３２℃で培養する」ことが転写複製効率の良くない或いは感染性ビリオン形成効率の良くないＳｅＶを再構成する場合に非常に有効であることを支持している。
［実施例１３］  ＳｅＶ−Ｍ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞を用いたウイルス生産条件の検討
上記のウィルスの生産性の面での検討も行った。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａを６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き３７℃で培養した。ほぼコンフルエントの状態で３２℃に移行させ、１日後にＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．０．５で感染し、経時的に培養上清を回収し新たな培地を添加した。回収した上清についてＣＩＵとＨＡＵを求めた。感染４〜６日後で最も多くのウィルスが回収された（図２３）。ＨＡＵは感染６日後以降も維持されているが、この時点では細胞障害性が強く出ており、ウィルスパーティクル由来では無く、細胞断片に結合している或いは遊離しているＨＡ蛋白による活性が出ているものと予想された。即ち、ウィルスを回収するには感染５日後までの培養上清を回収することが好ましいと考えられる。
［実施例１４］  Ｍ欠失型ＳｅＶのウィルスの構造確認
ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで、ウィルス蛋白をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した。ＲＴ−ＰＣＲはＰ２の感染６日後のウィルスを利用した。ウィルス溶液からのＲＮＡの回収はＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を利用し、またｃＤＮＡ調製はＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を利用して、両システムともに添付のプロトコールに記載の方法で行った。ｃＤＮＡ調製時のプライマーにはキットに添付のｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒを使用した。また、ＲＮＡからの産物であることの確認として、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅの有無で同反応を行った。調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰ遺伝子上のＦ３５９３（５’−ｃｃａａｔｃｔａｃｃａｔｃａｇｃａｔｃａｇｃ−３’／配列番号：２８）とＦ遺伝子上のＲ４９９３（５’−ｔｔｃｃｃｔｔｃａｔｃｇａｃｔａｔｇａｃｃ−３’／配列番号：２９）の組み合わせと、同じくＰ遺伝子上のＦ３２０８（５’−ａｇａｇａａｃａａｇａｃｔａａｇｇｃｔａｃｃ−３’／配列番号：３０）とＲ４９９３の組み合わせの２種でＰＣＲを行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの遺伝子構造から予想されたように、前者及び後者からそれぞれ１０７３ｂｐ及び１４５８ｂｐの増幅が観察された（図２４）。ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ無し（ＲＴ−）の場合は当該遺伝子の増幅はなく、またＧＦＰ遺伝子ではなくＭ遺伝子が挿入している場合（ｐＳｅＶ１８＋ＧＦＰ）はそれぞれ１４００ｂｐ及び１７８５ｂｐなので明らかに大きさが異なり、本ウィルスはＭ欠失型の遺伝子構造であることを支持した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより蛋白側からの確認を行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ（図中ΔＭ），ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ（図中ΔＦ）及びＳｅＶ１８＋ＧＦＰ（図中１８＋）をｍ．ｏ．ｉ．３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、感染３日後に培養上清と細胞を回収し、培養上清は４８，０００ｇで４５分間遠心しウィルス蛋白を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、抗Ｍ抗体、抗Ｆ抗体及び主にＮＰ蛋白を認識するＤＮ−１抗体（ラビットポリクローナル）で検出した。実施例３及び実施例４に記載の方法で行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞ではＭ蛋白が観測されずＦ或いはＮＰは観測されたことから、蛋白側からもＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの構造であることが確認された（図２５）。この時、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞ではＦ蛋白が観測されず、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰでは調べた全てのウィルス蛋白質が観測された。また、培養上清のウィルス蛋白に関しては、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰにおいてはＮＰの観測量が非常に少なく、二次放出粒子が無いか或いは非常に少ないと予想された。
［実施例１５］  Ｍ欠失型ＳｅＶの２次放出粒子の有無に関する定量的解析
実施例１４記載のようにＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、感染３日後に培養上清を回収し、０．４５μｍ径のフィルターを通した後４８，０００ｇで４５分間遠心し、回収したウィルス蛋白を用いてＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、半定量的に培養上清中のウィルス蛋白を検出した。対照としてＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを同様に感染して調製したサンプルを使用した。それぞれの希釈系列を作製しＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行いＤＮ−１抗体（主にＮＰ蛋白認識）で検出した。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞上清中のウィルス蛋白はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞のものの約１／１００であると判断された（図２６）。また、同サンプルのＨＡ活性はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ（６４ＨＡＵ）なのに対しＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ（＜２ＨＡＵ）であった。
同実験を再度経時的に行った。即ち、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、経時的に（一日毎に）培養上清を回収し、ＨＡ活性を測定した（図２７）。感染４日後以降に少ないながらもＨＡ活性が観測された。但し、同サンプルについて細胞障害性の指標となるＬＤＨ活性を測定した所、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞では感染４日後以降明らかな細胞障害性が惹起しており（図２８）、ＨＡ活性の上昇はウィルス様パーティクルに起因するのでは無く、細胞断片に結合している或いは遊離しているＨＡ蛋白による活性が出ている可能性が高いと予想された。更に、感染５日後の培養上清について、カチオニックリポソームであるＤｏｓｐｅｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて検証した。即ち、培養上清１００μＬとＤｏｓｐｅｒ  １２．５μＬを混合し室温で１０分放置後、６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントに培養したＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションした。２日後に蛍光顕微鏡下で観察した所、二次放出粒子の存在するＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞の培養上清では、多くのＧＦＰ陽性細胞が観察されるのに対し、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞の培養上清ではＧＦＰ陽性細胞は僅かには存在したが殆ど観察されなかった（図２９）。以上の結果より、Ｍ蛋白を欠失することで、二次放出粒子はほとんど抑制可能であると結論できた。
２．プロテアーゼ依存性トロピズムを変換した、粒子形成能を低下または欠損させたＳｅＶベクターの構築
上記で構築したＭ欠損ＳｅＶの再構成系を利用して、以下のようにＦ蛋白質の開裂部位を改変したＳｅＶの構築を行った。
［実施例１６］  Ｆ蛋白質の活性化部位を変換したＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
ＦのＦ１／Ｆ２の開裂部位（Ｆの活性化部位）に癌細胞で高発現しているプロテアーゼの認識配列を導入したＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡを構築した。ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の合成基質として利用されている配列を元にした様々な配列、及びｕＰＡの基質を元にした配列をデザインした。図３０には、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の基質として利用されている合成基質の配列（Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５，８６−９２（１９９１））を元にし、または新たに修正を加えてデザインした２種の配列［ＰＬＧ↓ＭＴＳ（配列番号：３）およびＰＬＧ↓ＬＧＬ（配列番号：３１）；以下、これらの配列を有するＦ蛋白をそれぞれＦ（ＭＭＰ＃２）及びＦ（ＭＭＰ＃３）と表す］、ＭＭＰの合成基質に共通の３アミノ酸配列ＰＬＧのみを導入した配列（以下、同配列を有するＦ蛋白をＦ（ＭＭＰ＃４）と表す）及びｕＰＡの基質ＶＧＲ（配列番号：６）を元にした配列（以下、同配列を有するＦ蛋白をＦ（ｕＰＡ）と表す）の４種の配列のデザインが示されている。
着目しているＭＭＰ（ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９）に、より選択的に作用するように実際のデザインを行う場合、市販されている合成基質の配列とともに基質特異性を詳細に検討した報告（Ｔｕｒｋ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９（７）６６１−６６７（２００１）；Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（６）４４８５−４４９１（２００２））を参考にすることが出来る。特にＭＭＰ−９に関しては、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）のＰ３からＰ２’までのコンセンサス配列（Ｘ＝全ての残基，Ｈｙ＝疎水性残基）が提唱されている（Ｋｒｉｄｅｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２３）２０５７２−２０５７８（２００１））。そこで、Ｆ（ＭＭＰ＃２）については、このコンセンサス配列に合致するように、元の合成基質の配列ＰＬＧ↓ＭＷＳから本デザインのＰＬＧ↓ＭＴＳに新たにデザインを行っている。
遺伝子構築のスキームを図３１に示した。Ｍ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＭ欠失型センダイウイルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）をＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化し、Ｆ遺伝子を含む断片（９６３４ｂｐ）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で回収し、ＬＩＴＭＵＳ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｌＩ／ＮｈｅＩサイトにサブクローニングした（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇΔＭ−ＧＦＰの構築）。Ｆ遺伝子への変異導入はこのＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇΔＭ−ＧＦＰ上で、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、Ｆ（ＭＭＰ＃２）への変換のためには５’−ＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣｃｃＴｃｔＴｇｇＣａｔＧａＣＧＡＧｔＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＴＣ−３’（配列番号：３２）および５’−ＧＡＴＡＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡａＣＴＣＧｔＣａｔＧｃｃＡａｇＡｇｇＧＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＴＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：３３）、Ｆ（ＭＭＰ＃３）への変換には５’−ＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣｃｃＴｃｔＴｇｇＣＣｔＧｇｇＧｔｔＡＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＴＣＧ−３’（配列番号：３４）および５’−ＣＧＡＴＡＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＴａａＣｃｃＣａＧＧｃｃＡａｇＡｇｇＧＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＴＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：３５）、Ｆ（ＭＭＰ＃４）への変換には５’−ＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＣｃＧＴｔＧｇＧＡＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴ−３’（配列番号：３６）および５’−ＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＴＣｃＣａＡＣｇＧＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：３７）、及びＦ（ｕＰＡ）への変換には５’−ＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣｇｔＧｇｇＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧ−３’（配列番号：３８）および５’−ＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＴＣＴＣｃｃＣａｃＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：３９）である。小文字表記が変異導入塩基を示している。
Ｆ遺伝子上に目的の変異を有するＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇΔＭ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して、Ｆ遺伝子を含むフラグメント（９６３４ｂｐ）を回収した。一方で、Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウイルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）をＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化しＮＰ遺伝子を含む断片（８２９４ｂｐ）に、合成オリゴＤＮＡを利用してマルチクローニングサイトを導入したプラスミド（ｐＳｅＶ／ΔＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ−ＭＣＳ：ＰＣＴ／ＪＰ００／０６０５１）を、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化してフラグメント（８２９４ｂｐ）を回収した。この両フラグメントをライゲーションし、Ｆ（ＭＭＰ＃２）、Ｆ（ＭＭＰ＃３）或いはＦ（ＭＭＰ＃４）の遺伝子（ＭＭＰで活性化されるようにデザインしたＦ遺伝子）を有するＭ欠失型ＳｅＶ  ｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ、ｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃３）ΔＭ−ＧＦＰ或いはｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃４）ΔＭ−ＧＦＰ）、及びＦ（ｕＰＡ）の遺伝子（ｕＰＡで活性化されるようにデザインしたＦ遺伝子）を有するＭ欠失型ＳｅＶ  ｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰ）を構築した。
［実施例１７］  Ｆの活性化部位を変換したＭ欠失型ＳｅＶベクターの再構成と増幅
ウイルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。Ｍ欠失型であるので、Ｍ蛋白をトランスに供給することが可能な上記のヘルパー細胞（実施例１１）を利用した。当該ヘルパー細胞作製にはＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用している。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））で感染させて挿入遺伝子を発現させた（実施例１１および１２参照）。
Ｆの活性化部位を変換したＭ欠失型ＳｅＶの再構成は以下のように行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））を室温で１時間感染させた（ＭＯＩ２）。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ（或いはｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃３）ΔＭ−ＧＦＰ、ｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃４）ΔＭ−ＧＦＰ、またはｐＳｅＶ１８＋／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰ），ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）をそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＭ蛋白質を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａ）を重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した（Ｐ０）。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁した。凍結融解を３回繰り換えした後、ライゼートをそのままＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａにトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ及び５０Ｕ／ｍＬのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶ（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｌａ，ＯＨ）を含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ１）。３〜１４日後培養上清の一部をとり、新たに調製したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａに感染させ、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ及び５０Ｕ／ｍＬのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ２）。３〜１４日後に新たに調製したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａに再度感染させ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ及び５０Ｕ／ｍＬのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で３〜７日間培養��た（Ｐ３）。回収した培養上清に終濃度１％になるようにＢＳＡを添加し−８０℃にて保存した。保存ウイルス液を解凍し、その後の生産及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験に供した。
また、Ｍ蛋白をトランスに供給するヘルパー細胞として、ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２に、更に同システム（ｐＣＡＬＮｄＬｗ：Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））のＳｅＶ−Ｍ遺伝子（及びＳｅＶ−Ｆ遺伝子）を導入し、細胞のクローニングを継続することで、より高いタイターでのＭ欠失型ＳｅＶベクターを調製可能なヘルパー細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２−＃３３）の作出に成功した。この細胞を用いて調製した場合、Ｆ遺伝子に変異を導入していないＭ欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）を１×１０８ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ（ＧＦＰ−ＣＩＵの定義はＷＯ００／７００７０に記載）以上のタイターで調製することが可能となった。尚、同細胞を利用した場合、ＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰの場合もともに１×１０８ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ以上のタイターでの調製が可能であった。
同様の方法で再構成を行った場合、ＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃３）ΔＭ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃４）ΔＭ−ＧＦＰについてはウィルス粒子を回収することが出来なかった。これらのものについてもウィルス粒子を回収するには、更に再構成の条件を検討しなければならないが、同じ条件で回収出来なかったことから、Ｆ（ＭＭＰ＃３）及びＦ（ＭＭＰ＃４）においては、Ｆ１／Ｆ２開裂部位（Ｆ蛋白の活性化部位）のデザイン上に問題があり、例えば開裂効率が悪い、或いは開裂後のＦ蛋白の活性が弱い等の影響が出ている可能性がある。逆に、Ｆ（ＭＭＰ＃２）のデザインで高タイターのウィルス粒子が回収できたことから、このデザインであれば、開裂効率が良く、開裂後のＦ蛋白の活性にも影響しない良いデザインであると考えられた。
［実施例１８］  Ｆの活性化部位を変換したＭ欠失型ＳｅＶベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ用サンプル調製
ｉｎ  ｖｉｖｏ検討用各種Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの調製は、超遠心でウイルス粒子をｐｅｌｌｅｔ  ｄｏｗｎする簡易精製法で行った。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２−＃３３を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでほぼコンフルエントに増殖した後、ＡｘＣＡＮＣｒｅをＭＯＩ  ５で感染し、感染後３２℃で２日間培養した。この細胞にＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをＭＯＩ  ０．５で感染し、ＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰの場合は７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ及び５０Ｕ／ｍＬのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶを含み血清を含まないＭＥＭ（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）で、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの場合は７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎのみを含み血清を含まないＭＥＭ（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）中で、３日間３２℃で培養した。各６ｗｅｌｌ分をまとめて上清を回収後、２，１９０ｇで１５分間遠心し、回収した上清を内径０．４５μｍフィルターでろ過し、更に４０，０００ｇで３０分間遠心した。ｐｅｌｌｅｔをＰＢＳ  ５００μＬで懸濁し精製ウイルス溶液とした。このようにして調製したＭ欠失型ＳｅＶベクターのタイターは、ＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰでそれぞれ、１．３×１０９及び４．５×１０９ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬであった。実施例１７および１８で作製したウイルスはＦ蛋白質が開裂されており感染性を有する。このようなＳｅＶをＦ開裂型ＳｅＶまたは感染型ＳｅＶと呼ぶ。また、以下ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ、ＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ、及びＳｅＶ１８＋／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰを、それぞれＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰとも略記する。
［実施例１９］  Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターのプロテアーゼ依存的感染および細胞融合型感染の評価方法
Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
細胞系に外からプロテアーゼを添加する感染手順をＥｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔと呼ぶ。以下の実施例において行ったｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔの基本的な手順を示す。これと異なる条件で行った場合はそれぞれの実施例において記載した。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＬＬＣ−ＭＫ２をｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）になるように培養した。ＭＥＭで２回洗浄後、ＳｅＶ［Ｆ開裂型：１×１０５ＣＩＵ／ｍｌもしくはＦ非開裂型：１×１０７ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ（ＨＡ換算；実施例２５参照）］含有ＭＥＭを５０μｌ加え、感染させた。同時に同量５０μｌのプロテアーゼ含有ＭＥＭを加えた。３７℃で培養した。４日後、蛍光顕微鏡にて感染のひろがりを観察した。また、１ｍｍ２の細胞あたりのＧＦＰの発現している細胞をカウントした。プロテアーゼは、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶ）はＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ社、ＭＭＰ２（ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ２），ＭＭＰ３，ＭＭＰ７，ＭＭＰ９（ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ９）、およびプラスミンは、コスモバイオ社より購入して使用した。
Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
細胞系に外からプロテアーゼを添加せず、細胞が発現するプロテアーゼにより感染を成立させる感染手順をＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔと呼ぶ。以下の実施例において行ったｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔの基本的な手順を示す。これと異なる条件で行った場合はそれぞれの実施例において記載した。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに各癌細胞をｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）になるように培養した。ＭＥＭで２回洗浄後、ＳｅＶ［Ｆ開裂型：１×１０５ＣＩＵ／ｍｌもしくはＦ非開裂型：１×１０７ＨＡＵ／ｍｌ（実施例２５参照）］含有ＭＥＭを５０μｌ加え、感染させた。この時、培地には終濃度１％となるようにＦＢＳを添加した。４日後、蛍光顕微鏡にて感染のひろがりを観察した。また、１ｍｍ２の細胞あたりのＧＦＰの発現している細胞をカウントした。
［実施例２０］  Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターによるプロテアーゼ依存的細胞融合型感染（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）
プロテアーゼをほとんど発現していないＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いて、Ｆの改変によってそのプロテアーゼ依存的に細胞融合型感染が成立しているかを上記のＥｘｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔにより確かめた（図３２）。ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰの３種類のＭ欠失型のＳｅＶ（実施例１７）を細胞に感染させ、同時にそれぞれ０．１μｇ／ｍｌのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ），ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ２，ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ９，またはｕＰＡ，あるいは７．５μｇ／ｍｌ  Ｔｒｙｐｓｉｎを加えた。４日後、蛍光顕微鏡で観察した。Ｆを改変していないＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰは、ｔｒｙｐｓｉｎを加えたＬＬＣ−ＭＫ２でのみ、感染した細胞の周りの細胞と細胞融合をおこし、細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるｓｙｎｔｈｉｔｉｕｍを形成した（図３２Ｌ）。ＭＭＰ分解配列をＦ蛋白質に組み込んだＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰは、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ２，ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ９を加えたＬＬＣ−ＭＫ２で細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるｓｙｎｔｈｉｔｉｕｍを形成した（図３２Ｅ，Ｆ，Ｍ）。一方、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｕＰＡ），ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ＰＡ（ｔＰＡ）分解配列をＦ蛋白質に組み込んだＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰでは、ｔｒｙｐｓｉｎ存在下で細胞融合型感染がみられ、さらにＦ蛋白質を改変したことによってｕＰＡで多核細胞であるｓｙｎｔｈｉｔｉｕｍを形成した（図３２Ｑ，Ｒ）。これは、それぞれのプロテアーゼ分解基質配列をＦ蛋白質に組み込むことによって、Ｍ欠失型ＳｅＶは、その分解基質配列依存的に細胞融合型感染をして、接している細胞に感染が広がっていくことを示している。
［実施例２１］  癌細胞株のＭＭＰ発現特異的な細胞融合型感染（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）
ＭＭＰ発現癌細胞株であるＨＴ１０８０（ヒト線維芽肉腫）（Ｍｏｒｏｄｏｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５（Ｐｔ２），６０３−６１１），ｔＰＡ発現株であるＭＫＮ２８（ヒト胃癌細胞株）（Ｋｏｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，５０４６−５０５３），どちらのプロテアーゼも発現していない細胞株ＳＷ６２０（ヒト大腸癌株）を用いて、内在性のプロテアーゼ選択的に細胞融合型感染がみられるかどうか、実施例１７で作製したＳｅＶを用いてＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔにより実験を行った。これらの癌細胞のうち、ＭＫＮ２８は理化学研究所（Ｃｅｌｌ  Ｎｏ．ＲＣＢ１０００）より、またＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１２１），およびＳＷ６２０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２２７），並びに以下の実施例で使用するＳＷ４８０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２２８），ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２１８），Ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１４６９）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より分与されたものを用いた。培地はそれぞれ分与先で用いられている培地を用いた。この時、全ての培地に終濃度１％となるようにＦＢＳを添加した。図３３で示すように、ＭＭＰ発現株ＨＴ１０８０ではＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰのみ１０倍以上その感染がひろがっていて、ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８ではＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰのみが細胞融合型感染のひろがりがみられる。どちらのプロテアーゼの発現もないＳＷ６２０では全く感染のひろがりはみられない。
［実施例２２］  Ｐｈｏｒｂｏｌ  ＥｓｔｅｒでのＭＭＰ誘導による細胞融合型感染
癌細胞はその周りに存在する増殖因子などによって生体内ではＭＭＰが誘導されていることが報告されている。その現象はＰｈｏｒｂｏｌ  Ｅｓｔｅｒであるｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現することが可能である。このＭＭＰ発現の誘導が再現された条件における感染を調べるために、ＰＭＡによってＭＭＰ２の活性化とＭＭＰ９の誘導が知られているＰａｎｃ  Ｉ（膵臓癌株）を用いて、Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの細胞融合型感染の有無を調べた（Ｚｅｒｖｏｓ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８４，１６２−１６７）。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＰａｎｃＩおよび他の癌細胞株をｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）になるように培養した。実施例１７で作製したＳｅＶを用いてＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔにより実験を行った。ＭＥＭで２回洗浄後、Ｍｏｉ＝０．０１になるように１×１０５ＣＩＵ／ｍｌのＳｅＶ含有ＭＥＭを５０μｌ加え、感染させた。同量５０μｌの４０ｎＭ  ｐｈｏｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭを加えた。この時、培地に終濃度１％となるようにＦＢＳを添加した。
ＭＭＰ２，９の誘導発現はｇｅｌａｔｉｎ分解活性がある部分が白くぬけるｇｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ法（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｍｅｄｓｒｏｄ，Ｂ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，４３６３−４３６６）によって確認した。具体的には、それぞれの培養の上澄みをとり、Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒで溶解した。最終濃度が１ｍｇ／ｍｌ  ｇｅｌａｔｉｎとなるようアクリルアミドに混合し、８％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌを作製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄した。Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ活性化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０−６Ｍ  ＺｎＣｌ２）で３７℃１日培養後、１％クマジプルーＲ−２５０、５％酢酸、１０％メタノールで染色した（図３４上パネル）。Ｃが対照（ｃｏｎｔｒｏｌ），Ｔが２０ｎＭ  ＰＭＡによって誘導された上澄みを用いたもので、ＨＴ１０８０とＰａｎｃ  ＩでＭＭＰ９が誘導されていることがわかる。Ｐａｎｃ  Ｉで誘導前に潜在型のＭＭＰ２が検出されているがそれは潜在型でｇｅｌａｔｉｎ分解活性はほとんどないことが知られている。図３４（下パネル）が示すように、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰに感染したＰａｎｃ  Ｉは、ＭＭＰ誘導によって細胞融合型感染がみられるようになることが示された。
［実施例２３］  Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＴ１０８０細胞株感染ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰのひろがり
ＨＴ１０８０の担癌ヌードマウスを作製した。ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕｄｅ  ｍｏｕｓｅ（ｃｈａｒｌｅｓ  ｒｉｖｅｒ）の右背部の皮下にヒト線維芽腫ＨＴ１０８０を５×１０６ｃｅｌｌ（１×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌを５０μｌ）注入した。７〜９日後に長径が３ｍｍを越えた個体を用いた。癌を楕円形とみなした体積は３０〜１００ｍｍ３となり、そこに以下のＦ開裂型ＳｅＶを５０μｌ癌部位に１度だけ注入した：ＭＥＭ（対照）（Ｎ＝５），ＳｅＶ−ＧＦＰ（１×１０８ＣＩＵ／ｍｌ）を含むＭＥＭ（Ｎ＝５），ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰ（１×１０８ＣＩＵ／ｍｌ）を含むＭＥＭ（Ｎ＝７），ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ（１×１０８ＣＩＵ／ｍｌ）を含むＭＥＭ（Ｎ＝７）。２日後、蛍光顕微鏡にて観察した（図３５）。ＳｅＶ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰは注入したまわりのみ蛍光がみられることが確認できる（図３５Ｅ，Ｈ）。それに対してＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰでは癌全体に広がることが観察された（図３５Ｋ）。拡大したものでは、ＳｅＶ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰが細胞１つ１つの蛍光が確認されるのに対して、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰでは細胞の形がはっきりせず細胞融合していることを示唆している。また、上部から写真の像における癌全体およびＧＦＰの発現の面積をＮＩＨ  ｉｍａｇｅによってもとめた。癌全体に対するＧＦＰ発現領域の割合は、ＳｅＶ−ＧＦＰが１０％、ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰが２０％であるのに対してＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ投与では９０％の感染がみられ、明らかな感染の広がりが確認された（図３６）。癌以外の組織に関しては、癌細胞との境界に存在する筋膜及び皮下の結合組織に対して細胞融合型感染はほとんど観察されず、この条件では癌以外の正常組織には感染は広がらないと判断された。
［実施例２４］  担癌ヌードマウスによるＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの抗腫瘍効果
図３５と同様にＨＴ１０８０担癌マウスを作製した。８または９日後、腫瘍径が３ｍｍ以上の個体を選択し、以下の４群のＦ開裂型ＳｅＶを５０μｌ癌部位に注入した：ＭＥＭ（Ｎ＝５），ＳｅＶ−ＧＦＰ（１×１０８ＣＩＵ／ｍｌ）を含むＭＥＭ（Ｎ＝５），ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰ（１×１０８ＣＩＵ／ｍｌを含むＭＥＭ（Ｎ＝７），ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ（１×１０８ＣＩＵ／ｍｌ）を含むＭＥＭ（Ｎ＝７）。２日後、もう一度同量のＳｅＶを癌部位に注入した。癌部位の大きさの長径（ａ）、短径（ｂ）、厚み（ｃ）を１日おきに計測した。腫瘍体積は、楕円形とみなし、腫瘍体積Ｖ＝π／６×ａｂｃで計算した。ＰＢＳ，ＳｅＶ−ＧＦＰ，ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰは急速に癌が大きくなるのに対して、図３７で示したようにベクターが癌全体に広がっていたＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ投与癌は明らかに増殖せず小さいままであった。ｔ検定による有意差検定でもＰ＜０．０５で有意に他の３群と比較して小さいことが判明した。これは治療遺伝子を搭載していないにもかかわらず、その抗癌効果があることが示している。
［実施例２５］  Ｆ非開裂／Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの作製と選択的感染
上記で用いた通常のＳｅＶベクターの作製にはＦの開裂を起こさせるために７．５μｇ／ｍｌの高い濃度のトリプシンおよび５０Ｕ／ｍｌのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅがはいった培地で培養、回収し、Ｆ開裂型ＳｅＶベクターとした（実施例１７および１８参照）。ここでは、感染時のプロテアーゼ依存的な選択を実現するため、作製時にプロテアーゼを加えずにＳｅＶを回収し、Ｆ非開裂型ＳｅＶを作製した。
具体的には、１０ｃｍ  ｄｉｓｈにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａ細胞をｃｏｎｆｌｕｅｎｔに培養した。実施例１７で調製した各Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶをＭｏｉ＝５になるように感染させた。１時間後、上澄みを取り２回ＭＥＭ培地で洗浄した。４ｍｌ  ＭＥＭを加え３２℃で培養した。５日後、上澄みを回収し、最終濃度が１％になるようにＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を加えた。ＨＡＵ  ｔｉｔｅｒを測定後、使用まで−７０℃で保存した。それぞれのＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶは２７〜２１０ＨＡＵ／ｍｌ（１ＨＡＵ＝１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのウイルス粒子に換算されるので１×１０８〜１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌに相当する）の間で回収され、希釈により１×１０８ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌにあわせた。
Ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔの結果、ＬＬＣ−ＭＫ２への感染が、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰは、ＭＭＰ依存的に、ＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰは、ｕＰＡまたはｔＰＡ依存的に感染するベクターが作製できたことが確認された（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅのデータは示さない）。ＭＭＰ発現株ＨＴ１０８０，ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８，プロテアーゼをほとんど発現していないＳＷ６２０で、プロテアーゼ発現による選択的感染が可能かどうかをｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔにより試みた（図３８）。ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰはＭＭＰ発現株ＨＴ１０８０で感染がみられるが、ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８では、感染がみられない。ＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰは、ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８では感染がみられるが、ＭＭＰ発現株ＨＴ１０８０では感染がみられない。このようにプロテアーゼ発現依存的にそれぞれのＳｅＶが感染の選択性が示された。
［実施例２６］  Ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔによるＭＭＰ３，ＭＭＰ７誘導によるＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの感染
ＳＷ４８０およびＷｉＤｒはｆｉｂｒｏｂｌａｓｔと共培養、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの培養によってそれぞれＭＭＰ３，ＭＭＰ７が誘導されることが示されている（Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．９，１０１−１０９；Ｍｃ  Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．１７，３４１−３４９）。これらの細胞を使ってｉｎ  ｖｉｖｏでＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの感染が変化するかどうか調べた。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにそれぞれの癌細胞株をｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）になるように培養した。ＭＥＭで２回洗浄後、１ＨＡＵ／ｍｌ（１ＨＡＵ＝１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのウイルス粒子に換算して１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ）のＦ非開裂型ＳｅＶ含有ＭＥＭを５０μｌ加え、感染させた。５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるようにＮｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を加え、４日間３７℃で培養した（図３９）。ＳＷ４８０およびＷｉＤｒは、ともにｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔをｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅすることによって、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰが感染するようになった。誘導のかからないＳＷ６２０ではその現象はみられない。
［実施例２７］  ヒト大動脈平滑筋細胞へのＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターのＭＭＰ選択的感染
ＭＭＰの発現異常の疾病は癌以外にも動脈硬化、リュウマチ、創傷治癒などで報告されている（Ｇａｌｉｓ，Ｚ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｈａｔｒｉ，Ｊ．Ｊ．（２００２）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０，２５１−２６２；Ｍａｒｔｅｌ−Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１５，８０５−８２９）。
これらの疾患への応用の可能性を示すため、ヒト大動脈平滑筋細胞へのＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターのＭＭＰ選択的感染を試みた。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにｈｕｍａｎ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ（ＴＡＫＡＲＡ）をｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）になるように培養した。ＭＥＭで２回洗浄後、ＳｅＶ（Ｆ非開裂型：１ＨＡＵ／ｍｌ（１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍｌ）含有ＭＥＭを５０μｌ加え、感染させた。同量５０μｌのプロテアーゼ含有ＭＥＭを加え、４日間３７℃で培養した。１ｍｍ２の細胞あたりのＧＦＰの発現している細胞をカウントした（図４０）。ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰではｔｒｙｐｓｉｎを加えることによってのみ感染が亢進したのに対して、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰではｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ＭＭＰ２，ＭＭＰ３，ＭＭＰ９でその感染が亢進した。
［実施例２８］  Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターのプロテアーゼ依存的Ｆの開裂
実施例２０でＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターは、それぞれのプロテアーゼ分解配列をＦタンパク質に組み込むことによって、Ｍ欠失型ＳｅＶは、その分解配列依存的に細胞融合型感染をすることを示した。さらに改変後にプロテアーゼ依存的にＦ０の開裂が起こっているかどうかウエスターンブロッティングによって確かめた。ウイルスのサンプリングは以下の方法で行った。ＳｅＶ／ΔＭ，ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ，ＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭの３種類のウイルス粒子をＭＯＩ＝３でＭタンパク誘導したヘルパー細胞に感染させた。感染２日後、上澄みを回収し、ｘ１８５００ｇで３時間遠心し、その沈殿物をＰＢＳで再けん濁した。それぞれのウイルス懸濁液に７．５μｇ／ｍｌトリプシン、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＭＭＰ９，０．１ｎｇ／ｍｌ  ｕＰＡの最終濃度になるようにプロテアーゼを添加し、３７℃、３０ｍｉｎ処理後、サンプルバッファーを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンブロッティングは定法に従って行った（Ｋｉｄｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｌａｒａ  ｃｅｌｌｓ．Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７，１３５７３−９（１９９２））。抗Ｆ１ウサギ抗体は３つの混合合成ペプチド（ＦＦＧＡＶＩＧＴ＋Ｃｙｓ：１１７−１２４，ＥＡＲＥＡＫＲＤＩＡＬＩＫ：１４３−１５５，ＣＧＴＧＲＲＰＩＳＱＤＲＳ：４０１−４１３；それぞれ配列番号：４６、４７、４８）を免疫し抗血清を得た。２次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｌａ，ＯＨ）を用い、発色の検出には化学蛍光法（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。図４１には、Ｆを改変していないＭ欠失型ＳｅＶベクター（１，４，７，１０），ＦにＭＭＰ＃２配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクター（２，５，８，１１）、ＦにｕＰＡ配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクター（３，６，９，１２）を上記のプロテアーゼで３７℃、３０分間処理したときの結果が示されている。
図４１から分かるように、トリプシン存在下ではＦを改変していないＭ欠失型ＳｅＶベクターで、ＭＭＰ存在下ではＦにＭＭＰ＃２配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクターで、ｕＰＡ存在下ではＦにｕＰＡ配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクターで、それぞれ挿入したプロテアーゼ基質に従って、Ｆ１への開裂が起こっていた。ここには示さないがｕＰＡ配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクターにおいてはトリプシン存在下で、その分解時間を４時間にするとＦ１への開列が見られた。これは実施例２０の結果と合致し、Ｆの開裂依存的にシンシチウムの形成がおきていることが示された。
［実施例２９］  Ｆの細胞質ドメイン欠失による融合能の上昇
パラミクソウイルスによる宿主への侵入はウイルスの膜と宿主側の細胞膜の融合によって成立する。その侵入機構はセンダイウイルスのＨＮタンパクが宿主側のシアル酸に結合し、Ｆタンパクが細胞膜の融合を起こす。その際、ＨＮの結合によってＦのコンフォメーションが変わることが重要であるとされている（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．，Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ，Ｔ．Ｓ．＆  Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｃｈｉｎｅｓ  ｏｆ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ：ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０，４０２４−３４（２００１））。そのため、ほとんどのパラミクソウイルスのＦタンパクは単独で細胞に発現させても細胞同士の融合能がなく、ＨＮを同時に発現した細胞のみ融合能を持つ。パラミクソウイルスにおいてＦおよびＨＮの細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）を削るとその融合能が上昇する事が知られている（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．，Ｎａｉｍ，Ｈ．Ｙ．＆  Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ｒ．Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌｓ  ｇａｉｎ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，１２２４−３４（１９９８））。センダイウイルスにおいて、どのＦの細胞質ドメインの欠失変異体が融合能を最もよく上昇させるかを、欠失変異体を作製し、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクター（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ．１０８：１９３−１９９）に搭載した後、ｐＣＡＧＧＳ搭載ＨＮを同時にトランスフェクションし、その融合能をシンシチウムの数によって確認した。
Ｆのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎを削った変異体遺伝子は、以下のプライマーによって、それぞれＰＣＲを行い、断片をＸｈｏ  Ｉ，Ｎｏｔ  Ｉ処理後、ｐＣＡＧＧＳベクターにライゲーションした。Ｆｃｔ２７  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡ−３’／配列番号：４９，５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣＴＡＡＴＧＴ−３’／配列番号：５０），Ｆｃｔ１４  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡ−３’／配列番号：５１，５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＡＡＡＧＣＡＣ−３’／配列番号：５２），Ｆｃｔ４  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡ−３’／配列番号：５３，５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＡＡＡＧＣＡＣ−３’／配列番号：５４）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｏｌ．，ｖｏｌ７７：２６０７，２００３）。
細胞融合能の測定のため、ＬＬＣＭＫ２もしくはＨＴ１０８０細胞を２４ウェルプレートへｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるようにまいた。５０μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに対して３μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ６を混合した。各ｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドを２μｇと等量のｐＣＡＧＧＳ／ＥＧＦＰを混合後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭとＦｕｇｅｎ６の混合液に加えた。室温で１５分間放置後、５００μｌ  ＭＥＭ培地に培地交換した２４ウェルプレートへ添加した。３７℃，５％ＣＯ２で３時間培養後、ＨＴ１０８０の場合１％ＦＢＳ添加ＭＥＭ，ＬＬＣＭＫ２の場合７．５μｇ／ｍｌ  Ｔｒｙｐｓｉｎもしくは指定された濃度のｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を添加したＭＥＭ培地へ置換した。４８時間培養後、倒立顕微鏡の１００倍視野あたり（０．３ｃｍ２）の融合したシンシチウムの数をカウントした。もしくは４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ固定を２時間後、７０％エタノール，蒸留水置換後、５分間ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染色を行った後、水洗し、シンシチウムを形成している０．３ｃｍ２当たりの核の数をカウントした。
３種類のＦの細胞質ドメインの欠失させたアミノ酸配列を図４２（Ａ）に，その融合活性を図４２（Ｂ）に示す。図４２（Ｂ）で示すように、Ｆ単独では融合した細胞はないが、ＨＮを共トランスフェクションすることによって融合能を示した。また、細胞質ドメインが１４アミノ酸になるように２８アミノ酸を削った配列のＦタンパク質（Ｆｃｔ１４）が最もその融合能が高いことが明らかになった。
［実施例３０］  Ｆ／ＨＮキメラタンパクは融合能を飛躍的に上昇させる
パラミクソウイルスのエンベロープタンパクは、細胞膜上でＦは３量体で、ＨＮは４量体を形成しており、お互いの外部ドメイン（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）およびＭタンパク質を介して相互作用していることが明らかになっている（Ｐｌｅｍｐｅｒ，Ｒ．Ｋ．，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ａ．Ｌ．＆  Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ｒ．Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，４４２３９−４６（２００１））。図４２で示したようにＦは単独では融合能をもたず、ＨＮが必須である。このことよりＦとＨＮのキメラタンパクを作製し、同じ細胞膜上に同時に融合タンパクとしてＦとＨＮを発現させることによって、より融合能の高いベクターの作製を試みた。ＦはＩＩ型の膜タンパクであり、ＨＮはＩ型の膜タンパクであることより、図４３（Ａ）で示すように、２つの膜貫通ドメインを持つ細胞膜上でＵ字型を形成するようなキメラタンパクを作製した（Ｆｃｔ１４／ＨＮ）。Ｆタンパクは融合能の高かったＦｃｔ１４を用いた。同時にその２つのタンパクの間に５０アミノ酸からなるリンカー配列を挿入した（Ｆｃｔ１４／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ）。このリンカー配列は現在の検索ではどのタンパクにもホモロジーを持たない配列である。（Ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ（ＳＩＶａｇｍ）のｅｎｖのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎのアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端を逆にして合成したｎｏｎ−ｓｅｎｓｅな配列を用いた。）
Ｆ／ＨＮキメラタンパク遺伝子の発現プラスミドの調製方法の詳細を以下に示す。Ｆ／ＨＮキメラタンパク遺伝子をｐＣＡＧＧＳベクターに搭載した。Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子についてそれぞれＰＣＲを行い、２つの断片をｐＣＡＧＧＳにライゲーションした。この時、Ｆ／ＨＮ遺伝子間に１５０ｂｐのリンカー遺伝子（５０ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を挿入したもの、しないものを作製した。以下にプライマーの配列を示す。Ｆ遺伝子プライマー（Ｆ−Ｆ：５’−ＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧ−３’／配列番号：５５；Ｆｃｔ１４−Ｒ：５’−ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＴＡＧＣ−３’／配列番号：５６）、Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ遺伝子プライマー（Ｌｉｎｋｅｒ−ＨＮ−Ｆ：５’−ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＴＴＴＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧ−３’／配列番号：５７，ＨＮ−Ｒ：５’−ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＡ−３’／配列番号：５８），ＨＮ遺伝子プライマ（５’−ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＧＧＧＣＡ−３’／配列番号：５９，５’−ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣＡ−３’／配列番号：６０）。
図４３（Ｂ）で示すようにリンカー配列のないキメラタンパクでは低い融合能を示すのに対してリンカーを挿入することによってＦとＨＮを同時にトランスフェクションすることに比べて約５倍その融合活性が飛躍的に上昇することが判明した。
［実施例３１］  融合能の機能維持と基質特異性
Ｆタンパク質が融合能を獲得するためには、ＨＮが同時に発現するだけではなく、プロテアーゼによってＦタンパク質が２つのサブユニット（Ｆ１，Ｆ２）に開裂することが不可欠である。図４２および４３ではトリプシン存在下での融合能を測定しており、トリプシンがない状態では全く融合能がない。図４３で示したＦｃｔ１４／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮキメラタンパクがＭＭＰ依存的に融合能を獲得するように、Ｆの開裂配列の改変を試みた。ＭＭＰの分解基質の配列については多くの報告があり、その中から８種類の配列に対して改変を試みた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって図４４（Ａ）のように開裂部位のアミノ酸配列を改変した。この改変で考慮したことは、プロテアーゼによる切断後のＦｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅの配列である。パラミクソウイルスのＦタンパク質のＦ１のＮ末端領域はＦｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅと呼ばれ、その融合活性に重要であり、その領域のアミノ酸の変異が、Ｆタンパク質の融合能を消失する場合があることが報告されている（Ｂａｇａｉ，Ｓ．＆  Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．Ａ  ｇｌｙｃｉｎｅ  ｔｏ  ａｌａｎｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８，２８３−９０（１９９７））。そのため重要性が指摘されているＦ１のＮ末端領域配列はそのまま残存させることにした。その場合も、ＭＭＰの分解基質として一般的な６残基配列を導入する場合には、ＭＭＰによる分解後にＦ１のＮ末端に３残基が付加されるデザインとなり、ＭＭＰによる分解は起こったとしても、Ｆ蛋白の融合能に影響を与える可能性があると推測された。則ち、ＭＭＰ依存的に開裂し活性化するＦ蛋白のデザインを行うには、ＭＭＰによる基質特異性と共に、開裂後のＦ蛋白の融合能の保持という２点を考慮してデザインを行うことが必須である。
ＭＭＰ＃１は最もＭＭＰの合成基質としてよく知られている配列である。この配列はその他のＭＭＰによるターゲッティングにも用いられている配列である。ＭＭＰ＃３および＃８も合成基質として市販されている配列である。ＭＭＰ＃２，６は、ＭＭＰ２，９の分解基質ＰＬＧＭＷＳの配列をファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）で明らかになったＭＭＰ９に対するコンセンサス配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）にしたがってＰＬＧＭＴＳ，ＰＱＧＭＴＳと改変した（それぞれ配列番号：６１および６２）。ＭＭＰ＃５はＳｈｎｅｉｄｅｒらの報告（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｎｏ．１１６３  ２００２，Ｂｏｓｔｏｎ）よりＰＱＧＬＹＡ（配列番号：６３）とした。ＭＭＰ＃４は分解後のＦｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅの配列が改変されない。ＭＭＰ＃７はＭＭＰ２に対するｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙで明らかになった配列である。
以下に、Ｆ／ＨＮ融合遺伝子のＦの活性化部位を改変した発現プラスミドの調製の詳細を示した。Ｆ／ＨＮ融合遺伝子を構築後、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  Ｆ／ＨＮ上で、Ｆの活性化部位の変異を導入した。変異の導入には、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、
2003093476.tif 000002
2003093476.tif 000003
小文字表記が変異導入塩基を示している。改変後、ＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＣＡＧＧＳへライゲーションを行った。
それぞれの配列を有するベクターとＥＧＦＰ遺伝子を有するベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＥＧＦＰ）を等量混合し、ＭＭＰを高発現しているＨＴ１０８０にトランスフェクションした。その結果、ＭＭＰ＃２及び＃６の配列の遺伝子を導入した時のみ細胞融合が生じ、シンシチウムを形成した（図４（Ｂ））。これらの配列に共通であるのは、プロテアーゼによる切断後、Ｆ１タンパクのＮ末端にＨｙ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ配列（ＭＴＳ）が付加されることである。このことよりＨｙ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ配列（特にＭＴＳ配列）の付加であれば、ＨＴ１０８０由来のＭＭＰによるＦ蛋白の切断と共に、開裂後のＦ蛋白の融合能が保持されており、これら両者の必要条件を満たしている可能性が高いと考えられる。一方、ＭＭＰ＃１，＃３，＃４，＃５，，＃７，および＃８の場合、細胞融合が全く見られなかった。ＭＭＰ＃４を除くすべての配列はＭＭＰの合成基質由来の配列なのでｐｒｏｔｅａｓｅによる切断は生じていると予想されることから、Ｆ１に付加された３アミノ酸のペプチドが切断後のＦタンパクの活性を限定している可能性が示唆された。また、ＭＭＰ＃４についてはこの条件ではプロテアーゼによる切断そのものが生じていない可能性が高い。その根拠として、データは示さないが、ＨＴ１０８０のＰｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒによるＭＭＰの誘導によってＭＭＰ＃４がシンシチウムの形成がみられるようになることでも明らかである。
さらにこのＭＭＰ＃２，＃６の配列の融合能の比較とともに＃６のＦｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ配列のＮ末端側から７番目と１２番目の配列をＧからＡへ改変した配列についてＭＭＰ濃度依存的な細胞融合能を測定した（図４５）。このＦ／ＨＮ融合遺伝子の変異導入に使用した合成オリゴの配列は、５’−ＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧｃＴＡＣＴＡＴＣＧＣＡＣＴＴＧｃＡＧＴＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号：７４）および５’−ＧＴＧＣＴＧＡＴＧＴＣＧＣＣＡＣＴｇＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴＡＧＴＡｇＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＧ−３’（配列番号：７５）である。小文字表記が変異導入塩基を示している。発現プラスミドの調製は上記と同様に、変異を導入後にＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＣＡＧＧＳへライゲーションすることにより行なった。
その結果、ＭＭＰ＃６の方がＭＭＰ＃２に比較して、２−３倍融合能が高いことがわかった。重要な点はＭＭＰ＃６の場合、低濃度のプロテアーゼ濃度条件下でも細胞融合が生じ、低濃度でのＦタンパクの活性化が実現していることである。しかしながら、Ｆタンパクの融合能の上昇する変異として報告されているＧからＡへの変異（Ｐｅｉｓａｊｏｖｉｃｈ，Ｓ．Ｇ．，Ｅｐａｎｄ，Ｒ．Ｆ．，Ｅｐａｎｄ，Ｒ．Ｍ．＆  Ｓｈａｉ，Ｙ．Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｒｅｐｅａｔｓ，ｂｏｔｈ  ｏｆ  ｗｈｉｃｈ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９，４３４２−５０（２００２））をさらに導入した場合（＃６Ｇ１２Ａ）、融合能が１０分の１以下に減少してしまった。これらの結果より、プロテアーゼによるトロピズムの改変のためプロテアーゼ分解配列を単に挿入するだけではＦタンパクの活性を維持することができずＦｕｓｉｏｎ能を失う場合が多いことが明らかになった。目的とする分解配列を導入する場合、この系を用いて融合能の確認を行いウイルスを構築することが可能である。また、このｐＣＡＧＧＳに搭載したＦｃｔ１４／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮのキメラ遺伝子のみで顕著な融合活性を示すことより、このプラスミド導入による抗癌効果があること推測される。さらに、このキメラタンパクをＭ欠失型センダイウイルスへ搭載することによってさらなる抗癌効果の上昇が期待される。
［実施例３２］  融合能を上昇させた改良型Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
実施例２９および３０においてｐＣＡＧＧＳベクターに搭載したＦを改変することによって融合能が上昇することを示したが、同様の改変をＭ欠失型センダイウイルスベクターに行うことによって、融合能を上昇させた改良型Ｆ改変ΔＭ  ＳｅＶの作製を試みた。改良型Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの遺伝子構築を以下の方法で行った。ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰに関しては、実施例１６と同様の方法で行った。Ｆ遺伝子への変異導入は配列番号：６９のオリゴヌクレオチドを用い、ＬＩＴＭＵＳＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇΔＭ−ＧＦＰ上でＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。変異を導入したＬＩＴＭＵＳＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇΔＭ−ＧＦＰのＳａｌ  Ｉ，Ｎｈｅ  Ｉ消化後のフラグメントとＦ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウイルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ＋１８／Ｆ−ＧＦＰ：Ｌｉ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｖｉｏｌ．７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ０００／７００７０）のＳａｌ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉで消化したＮＰ遺伝子を含むフラグメントをライゲーションし、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰのｃＤＮＡを構築した（図４６）。Ｆタンパク質の細胞質ドメインの２８アミノ酸を欠失させたＭ欠失型センダイウイルス（ＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰ）およびＦ／ＨＮキメラタンパクを搭載したＭ欠失型センダイウイルス（ＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰ）の構築はマルチクローニングサイトセンダイウイルスｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）と称す）（特開２００２−２７２４６５）を基本骨格とした。Ｆタンパク質の細胞質ドメインをｔｒａｎｃａｔｅしたＭ欠失型センダイウイルスＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰは以下のように構築した。ＴＤＫを骨格にするため、まずｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／ΔＭ−ＧＦＰを作製した。ＬＩＴＭＵＳＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇΔＭ−ＧＦＰを鋳型にして合成プライマー（Ｎｈｅ−ＧＦＰ−Ｆ：ＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号：９４）とＧＦＰ−ＥＩＳ−ＢｓｓＨＩＩ：ＡＴＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＡＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣ（配列番号：９５））を使ってＰＣＲによって増幅したＧＦＰ／ＥＩＳ（転写開始終結シグナルをコードするＥＩＳ配列を付加したＧＦＰ）とマルチクローニングサイトセンダイウイルスｃＤＮＡをＮｈｅＩ，ＢｓｓＨＩＩ処理をし、フラグメントをライゲーションすることによってＭタンパクをＧＦＰに置換し、ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／ΔＭ−ＧＦＰを作製した。
さらに実施例３１で作製したｐＣＡＧＧＳ／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮを鋳型にして合成プライマーＭｌｖ−Ｆ：ＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧ（配列番号：９６）、及びＦｃｔ１４−ＥＩＳ−Ｓａｌ  Ｉ：ＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＧＴＣＡＴＣＴ  ＧＧＡＴＴＡＣＣ（配列番号：９７）を使ってＰＣＲによって増幅したＦｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）をＦ遺伝子のかわりにＦの位置に挿入、置換し、ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰを構築した（図４６）。次に、Ｆ／ＨＮキメラタンパクを搭載したＭ欠失型センダイウイルス（ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰ）の構築を行った。ＧＦＰを鋳型にして合成プライマー（Ｎｈｅ−ＧＦＰ−Ｆ：ＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号：９８）とＧＦＰ−ＥＩＳ−Ｓａｌ  Ｉ：ＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＡＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣ（配列番号：９９））を使ってＰＣＲによって増幅したＧＦＰ／ＥＩＳとマルチクローニングサイトセンダイウイルスｃＤＮＡをＮｈｅ  Ｉ，Ｓａｌ  Ｉ処理をし、フラグメントをライゲーションすることによってＭ遺伝子およびＦ遺伝子を欠失させ、ＧＦＰに置換した、ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／ΔＭΔＦ−ＧＦＰを作製した。さらに実施例３１で作製したＦｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮを鋳型にして、合成プライマー（Ｆ／ＨＮ５’Ｎｈｅ−Ｆ：ＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧ（配列番号：１００），Ｆ／ＨＮ３’Ｎｈｅ−ＥＩＳ−Ｒ：ＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＴＴＴＴＡＡＧＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＡ（配列番号：１０１））を使ってＰＣＲによって増幅したＦｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮを上記のｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／ΔＭΔＦ−ＧＦＰのＮｈｅＩ部位にライゲーションすることによってｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰを構築した。
［実施例３３］  改良型Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスの再構成と増幅
実施例３２で構築したｃＤＮＡからのウィルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。しかし、実施例１７と同様にＭ欠失型であるので、Ｍ蛋白をトランスに供給することが可能なヘルパー細胞（実施例１１）を利用した。ヘルパー細胞作製にはＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用している。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））で感染させて挿入遺伝子を発現させる。Ｆの活性化部位を変換したＭ欠失型ＳｅＶの再構成は以下のように行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））を室温で１時間感染させた（ＭＯＩ２）。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰ（或いはｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰ，ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰ），ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））ｐＧＥＭ／Ｍ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）をそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に懸濁し、１μｇＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＦ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａ：実施例１２）を重層し、���０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した（Ｐ０）。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁した。凍結融解を３回繰り換えした後、ライゼートをそのままＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａにトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ及び５０Ｕ／ｍＬのｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｌａ，ＯＨ）を含み（ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰの場合ｔｒｙｐｓｉｎのみ）血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ１）。３〜１４日後培養上清の一部をとり、新たに調整したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａに感染させ、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ及び５０Ｕ／ｍＬのｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを含み（ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰの場合ｔｒｙｐｓｉｎのみ）血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ２）。３〜１４日後に新たに調整したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａに再度感染させ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ及び５０Ｕ／ｍＬのｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを含み（ｐＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰの場合ｔｒｙｐｓｉｎのみ）血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で３〜７日間培養した（Ｐ３）。回収した培養上清に終濃度１％になるようにＢＳＡを添加し−８０℃にて保存した。保存ウィルス液を解凍し、その後の生産及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験に供した。
以上のように、Ｆ蛋白質開裂部位をＰＬＧＭＴＳ（配列番号：６１）からＰＱＧＭＴＳ（配列番号：６２）にしたＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰ、ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎを２８アミノ酸削ったＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰ、およびＦ／ＨＮのキメラタンパクを搭載したＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ）＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮ  ΔＭ−ＧＦＰの作製に成功した。
［実施例３４］  改良型Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターの融合活性の上昇
実施例３３で製造したウィルスの性能を調べるため、以下のようにＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現量の違う様々な癌細胞株とＭＭＰの発現が検出されないＬＬＣＭＫ２へ感染させ細胞融合能を測定した（図４７）。各種癌細胞（ＨＴ１０８０，Ｕ８７ＭＧ，Ａ１７２，Ｕ２５１，ＳＷ４８０，ＬＬＣＭＫ２）を供与先より指示された培地で２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅへｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるようにまいた。Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＮＯ．ＨＴＢ−１４），Ａ１７２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６２０）はＡＴＣＣより購入した。Ｕ２５１（ＩＦＯ５０２８８）はＪＣＲＢ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋより購入した。ＭＥＭ培地で２回洗浄後、それぞれのＭ欠失型センダイウイルスベクター（ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰ）をＭＯＩ＝０．１で感染させた。室温で１時間放置後、ＭＥＭ培地で洗浄し、０．５ｍｌの１％ＦＢＳ添加ＭＥＭを２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加えた。４８時間培養後、倒立顕微鏡の１００倍視野あたり（０．３ｃｍ２）の融合したシンシチウムの数をカウントした。もしくは４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅを使用して２時間固定処理を行なった後、７０％エタノール、蒸留水置換後、５分間ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染色を行い、水洗後、シンシチウムを形成している０．３ｃｍ２当たりの核の数をカウントした。結果を図４９に示した。
ＭＭＰ２，９の発現は実施例２２で行ったｇｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙによって確かめた（図４８）。その結果、ＨＴ１０８０，Ｕ８７ＭＧ，Ａ１７２でＭＭＰ２の発現が確認された。またＵ２５１とＳＷ４８０で低いＭＭＰ９の発現が確認された。ＬＬＣＭＫ２でＭＭＰ２の発現があるようにみえるのは１％血清を含んでいるため、血清中のＭＭＰ２の活性が見えている。それぞれの癌細胞株に感染後２日後、ＧＦＰの広がりを観察した。その結果、従来型のＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰでは広がらなかったＵ２５１，ＳＷ４８０において改良型Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターにおいて、特にＦ／ＨＮキメラタンパクを搭載したＭ欠失型センダイウイルスベクター（ＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮΔＭ−ＧＦＰ）で融合活性がみられるようになった。データでは示さないが、マウス肺癌Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，およびマウス大腸癌ｃｏｌｏｎ  ２６においても、同様に改良型にすることによって、Ｍ欠失型センダイウイルスベクター感染後、融合活性が見られるようになり、改良型にすることによってさらなる効果の増大と低い濃度のＭＭＰ量の癌にも効果が期待される。
産業上の利用の可能性
本発明により、所望のプロテアーゼ存在下で特異的に感染を広げるベクターが提供された。本発明のベクターはウイルス様粒子を有意に産生せず、細胞融合により隣接する周囲の細胞にベクターを伝達する。従って、本発明のベクターは、目的とする組織の局所に限局してベクターを感染させるために有用である。特に本発明により癌特異的に感染を広げるベクターが提供された。このベクターは、腫瘍増殖に対する強い抑制作用を持っている。本発明のベクターを用いた癌の遺伝子治療は、副作用の少ない新たな癌治療として高い可能性を持っている。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｍ遺伝子に温度感受性変異を導入したＦ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図２は、Ｍ遺伝子への温度感受性変異導入による２次放出粒子抑制を目的として構築したウィルス遺伝子及びその変異導入の効果を比較検討する為に構築した或いは使用したウィルス遺伝子の構造を示す図である。
図３は、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰを、Ｆ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）に感染し、それぞれ３２℃及び３７℃で６日間培養後のＧＦＰ発現を示す顕微鏡像を示す写真である。
図４は、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）について、３２℃或いは３７℃でｔｒｙｐｓｉｎ及び血清を含まないＭＥＭで培養し経時的にＦ蛋白の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで半定量的に観測した結果を示す写真である。
図５は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し３２℃，３７℃或いは３８℃で培養し３日後のＧＦＰ発現を示す顕微鏡像を示す写真である。
図６は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し３２℃，３７℃或いは３８℃で培養し経時的にサンプリング（同時に新しい培地に交換）した培養上清の赤血球凝集活性（ＨＡ活性）を示す図である。
図７は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、３７℃で培養２日後の培養上清及び細胞を回収して、１ｌａｎｅ当り６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ培養１ｗｅｌｌ分の１／１０相当量を用いて、抗Ｍ抗体を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより求めた、細胞内とウィルス様パーティクル（ＶＬＰ）間のＭ蛋白の存在比率を示す写真である。
図８は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、培養１２，１８，２４，５０，１２０時間後にサンプリングした培養上清を用いて測定したＳＥＡＰ活性を示す図である。
図９は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、培養２４，５０，１２０時間後にサンプリングした培養上清のＨＡ活性を示す図である。
図１０は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、培養５日後にサンプリングした培養上清について遠心後ウィルスを回収し、１ｌａｎｅ当り６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ培養１ｗｅｌｌ分の１／１０相当量を用いて、抗Ｍ抗体を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより求めたウィルス様パーティクル量を示す写真である。
図１１は、ＬＬＣ−ＭＫ２，ＢＥＡＳ−２Ｂ或いはＣＶ−１細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０で感染し、血清を含まない或いは１０％ＦＢＳを含む培地で培養し、血清を含まない培地の場合は感染３日後に、１０％ＦＢＳを含む培地の場合は感染６日後に、培地中に放出されたＬＤＨ量から見積った細胞障害性を示す図である。同じ細胞数の細胞を細胞変性剤（Ｔｒｉｔｏｎ）を用いて１００％ｌｙｓｉｓした時の値を１００％とした相対値で表した。
図１２は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、３２℃，３７℃或いは３８℃で培養し、培養２日後に抗Ｍ抗体を利用して免疫染色を行うことにより求めたＭ蛋白の細胞内局在を示す写真である。
図１３は、Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、３２℃或いは３７℃で培養し、１０％血清を含む培地で培養１日後に抗Ｍ抗体および抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を示す写真である。ステレオ立体画像で示した。
図１４は、Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、３２℃或いは３７℃で培養し、１０％血清を含む培地で培養２日後に抗Ｍ抗体および抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を示す写真である。ステレオ立体画像で示した。
図１５は、Ｍ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示す写真である。Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、直後に微小管の脱重合試薬であるコルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）或いはコルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄｅ）を終濃度１μＭになるように添加し、３２℃で培養した。１０％血清を含む培地で培養２日後に抗Ｍ抗体及び抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を観察した。ステレオ立体画像で示した。
図１６は、Ｍ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示す写真である。Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、直後に微小管の脱重合試薬であるｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅを終濃度１μＭになるように添加し、３２℃或いは３７℃で培養した。１０％血清を含む培地で培養２日後に抗Ｍ抗体及び抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を観察した。ステレオ立体画像で示した。
図１７は、ＥＧＦＰ遺伝子を有するＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図１８は、Ｆ及びＭ両欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図１９は、構築したＦおよび／またはＭ欠失型ＳｅＶ遺伝子の構造を示す図である。
図２０は、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有するＭ遺伝子発現プラスミドの構築スキームを示す図である。
図２１は、クローニングしたＭ（及びＦ）蛋白を誘導発現する細胞について、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｃＣＡＮＣｒｅ）を感染後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇによるＭ及びＦ蛋白の半定量的な発現比較を示す写真である。
図２２は、ヘルパー細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ）クローン＃１８及び＃６２を用いたＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）のウィルス再構成を示す写真である。
図２３は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス生産性（ＣＩＵとＨＡＵの経時変化）を示す図である。
図２４は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのビリオン中の遺伝子構造確認の為のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真および図である。
図２５は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス構造を蛋白の視点から確認する為に、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に感染後の細胞及び培養上清中のウィルス蛋白についてＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰとの比較結果を示す写真である。
図２６は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞培養上清中のウィルス由来蛋白の定量比較（希釈系列を作製してＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を示す写真である。抗ＳｅＶ抗体（ＤＮ−１）を用いた。
図２７は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２にｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、経時的に回収した培養上清中のＨＡ活性を示す図である。
図２８は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２にｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染５日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
図２９は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２にｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染５日後に回収した培養上清について、カチオニックリポソーム（Ｄｏｓｐｅｒ）を用いてＬＬＣ−ＭＫ２にトランスフェクションした２日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
図３０は、Ｆ１／Ｆ２の開裂部位（Ｆ蛋白質の活性化部位）のアミノ酸配列のデザインを示す図である。癌細胞で高発現しているプロテアーゼ（ＭＭＰ或いはｕＰＡ）の認識配列を合成基質の配列を元にデザインした。上から順に配列番号：４０〜４４。
図３１は、Ｆの活性化部位を変換したＭ欠失型ＳｅＶベクターのｃＤＮＡ構築スキームを示す図である。
図３２は、Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターによるプロテアーゼ依存的細胞融合型感染を示す写真である。
ＬＬＣ−ＭＫ２を用いて、Ｆの改変によってそのプロテアーゼ依存的に細胞融合型感染が成立しているかを確かめた。ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰ（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｊ，Ｋ，Ｌ）、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ（Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｍ，Ｎ，Ｏ）、ＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰ（Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｏ，Ｒ）の各Ｍ欠失型のＳｅＶを細胞に感染させ、同時に０．１μｇ／ｍｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（Ｂ，Ｅ，Ｈ），ＭＭＰ２（Ｃ，Ｆ，Ｉ），ＭＭＰ９（Ｊ，Ｍ，Ｐ），ｕＰＡ（Ｋ，Ｎ，Ｑ），７．５μｇ／ｍｌ  Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｌ，Ｑ，Ｒ）を加えた。４日後、蛍光顕微鏡で観察した。Ｆを改変していないＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰは、ｔｒｙｐｓｉｎを加えたＬＬＣ−ＭＫ２でのみ、感染した細胞の周りの細胞と細胞融合をおこし、細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるｓｙｎｔｈｉｔｉｕｍを形成した（Ｌ）。ＭＭＰ分解配列をＦに組み込んだＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰは、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ＭＭＰ２，ＭＭＰ９を加えたＬＬＣ−ＭＫ２で、細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるｓｙｎｔｈｉｔｉｕｍを形成した（Ｅ，Ｆ，Ｍ）。一方、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｕＰＡ），ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ＰＡ（ｔＰＡ）分解配列をＦに組み込んだＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰでは、ｔｒｙｐｓｉｎで細胞融合型感染がみられ、さらに改変したことによってｕＰＡで多核細胞であるｓｙｎｔｈｉｔｉｕｍを形成した（Ｑ，Ｒ）。
図３３は、Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターによる癌細胞のプロテアーゼ依存的細胞融合型感染を示す写真である。
ＭＭＰ発現癌細胞株であるＨＴ１０８０（Ａ，Ｄ，Ｇ），ｔＰＡ発現株であるＭＫＮ２８（Ｂ，Ｅ，Ｈ），どちらのプロテアーゼも発現していない細胞株ＳＷ６２０（Ｃ，Ｆ，Ｉ）を用いて、内在性のプロテアーゼ選択的に細胞融合型感染がみられるかどうか実験をおこなった。ＨＴ１０８０ではＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰのみ１０倍以上その感染がひろがっていて（Ｄ）、ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８ではＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰのみが細胞融合型感染のひろがりがみられる（Ｈ）。どちらのプロテアーゼの発現もないＳＷ６２０では全く感染のひろがりはみられない。
図３４は、Ｐｈｏｒｂｏｌ  ＥｓｔｅｒによるＭＭＰ誘導とＦ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターの細胞融合型感染の誘導を示す写真である。
ＭＭＰ２，９の発現をｇｅｌａｔｉｎ分解活性がある部分が白くぬけるｇｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ法によって確認した（Ａ）。レーンＣが対照（ｃｏｎｔｒｏｌ），Ｔが２０ｎＭ  ＰＭＡによって誘導された上澄みを用いたもので、ＨＴ１０８０とＰａｎｃ  ＩでＭＭＰ９のバンドが確認され、ＭＭＰ９が誘導されていることがわかる。ＭＭＰ２は、Ｐａｎｃ  Ｉで誘導前に潜在型（ｌａｔｅｎｔ）のＭＭＰ２が検出されているがそれは潜在型であるため活性がほとんどない。Ｂが示すように、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰは、ＭＭＰ９誘導によって細胞融合型感染がみられることが示された。
図３５は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターの細胞融合型感染を示す写真である。
ＨＴ１０８０の担癌ヌードマウスを作製した。皮下に注射後、７〜９日後に長径が３ｍｍを越えた個体を用いた。５０μｌのＳｅＶを１度だけ注入した。２日後、蛍光顕微鏡にて観察した。Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｊが明視野、Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｋがそれに対応するＧＦＰの蛍光像、Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌはその拡大像である。ＳｅＶ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰは注入したまわりのみ蛍光がみられることが確認できる（パネルＥ，Ｈ）。それに対してＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰでは癌全体に広がることが観察された（パネルＫ）。拡大したものでは、ＳｅＶ−ＧＦＰ、ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰが細胞１つ１つの蛍光が確認されるのに対して、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰでは細胞の形がはっきりせず細胞融合していることが示唆された。
図３６は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦ改変Ｍ欠失型センダイウイルスベクターの細胞融合型感染を示す図である。図３５の写真像におけるＧＦＰの癌全体に対する割合をＮＩＨ  ｉｍａｇｅによって面積から測定した。その結果、図に示すようにＳｅＶ−ＧＦＰが１０％、ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰが２０％であるのに対してＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰでは９０％の感染がみられ、明らかな感染の広がりが確認された。
図３７は、担癌ヌードマウスによるＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの抗腫瘍効果を示す図である。図３５の腫瘍体積の大きさを計測した。３ｍｍ以上に発達した癌に４群のＳｅＶを注入した。２日後、再度注入し、癌の大きさを計測した。ＰＢＳ，ＳｅＶ−ＧＦＰ，ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰは急速に癌が大きくなるのに対して、図３６で示したように癌全体に広がっていたＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰを注入した癌は明らかに増殖せず小さいままであった。ｔ検定によりＰ＜０．０５で有意に他の３群と比較して抗癌効果がみられた。
図３８は、Ｆ非開裂型Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの癌細胞へのプロテアーゼ発現選択的感染を示す写真である。
ＭＭＰ発現株ＨＴ１０８０，ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８，プロテアーゼをほとんど発現していないＳＷ６２０で、プロテアーゼ発現による選択的感染が可能かどうか調べた。ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰはＭＭＰ発現株ＨＴ１０８０で感染がみられるが、ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８では、感染がみられない。ＳｅＶ／Ｆ（ｕＰＡ）ΔＭ−ＧＦＰは、ｔＰＡ発現株ＭＫＮ２８では感染がみられるが、ＭＭＰ発現株ＨＴ１０８０では感染がみられない。
図３９は、Ｆ非開裂Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターのｆｉｂｒｏｂｌａｓｔによるＭＭＰ３，７の誘導による感染能の獲得を示す写真である。
ＳＷ４８０およびＷｉＤｒを使ってｉｎ  ｖｉｔｒｏでｆｉｂｒｏｂｌａｓｔによるＭＭＰの誘導でＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターの感染が変化するかどうか調べた。ＳＷ４８０，ＷｉＤｒともにｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏ  ｂｌａｓｔ（ｈＦＢ）をｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅすることによって、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰが感染するようになった（Ｂ，Ｄ）。誘導のかからないＳＷ６２０ではその現象はみられない（Ｆ）。
図４０は、ヒト大動脈平滑筋細胞へのＦ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターのＭＭＰ選択的感染を示す写真である。ＳｅＶ／ΔＭ−ＧＦＰではｔｒｙｐｓｉｎを加えることによってのみ感染が亢進するのに対して、ＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰではｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ＭＭＰ２，ＭＭＰ３，およびＭＭＰ９でその感染が亢進する。
図４１は、Ｆ改変Ｍ欠失型ＳｅＶベクターのプロテアーゼ依存的Ｆの開裂を示す写真である。
プロテアーゼ依存的なセンダイウイルスのＦ０からＦ１への開裂をウェスターンブロッティングによって確認した。レーン１，４，７，１０がＦを改変していないＭ欠失型ＳｅＶベクター、レーン２，５，８，１１がＦにＭＭＰ＃２配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクター、レーン３，６，９，１２がＦにｕＰＡ配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクターを上記のプロテアーゼ（未処理，レーン１，２，３；０．１ｎｇ／ｍｌ  ＭＭＰ９，レーン４，５，６；０．１ｎｇ／ｍｌ  ｕＰＡ，レーン７，８，９；７．５μｇ／ｍｌ  ｔｒｙｐｓｉｎ，レーン１０，１１，１２）で３７℃、３０分間処理した。その結果、ｔｒｙｐｓｉｎがＦを改変していないＭ欠失型ＳｅＶベクターを、ＭＭＰ９がＦにＭＭＰ＃２配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクターを、ｕＰＡがＦにｕＰＡ配列を挿入したＭ欠失型ＳｅＶベクターをそれぞれ挿入したプロテアーゼ基質に従って、Ｆ１へ開裂させた。
図４２は、Ｆの細胞質ドメイン欠失変異体（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）の作製とＨＮとの同時発現による融合能の比較を示す図である。
Ａ；センダイウイルスＦタンパク質の細胞質ドメイン欠失変異体構築図。上から順に配列番号：７６〜７９。
Ｂ；Ｆの細胞質ドメイン欠失変異体の作製とＨＮとの同時発現による融合能の比較。７．５μｇ／ｍｌ  ｔｒｙｐｓｉｎ添加ＬＬＣＭＫ２細胞へセンダイウイルスＦタンパク質のそれぞれのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔとＨＮを同時発現した後、４日後、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎによって核染色し、シンシチウム形成した核の数をカウントした。
図４３は、Ｆ／ＨＮキメラタンパクは融合能を飛躍的に上昇させることを示す図である。
Ａ：Ｆ／ＨＮキメラタンパク構造図。図中のリンカー配列は配列番号：８０とした。
Ｂ：Ｆ／ＨＮキメラタンパクはＬｉｎｋｅｒの挿入によって融合能が上昇する。７．５μｇ／ｍｌ  ｔｒｙｐｓｉｎ添加したＬＬＣＭＫ２細胞へそれぞれのセンダイウイルスＦ／ＨＮキメラタンパクとＨＮを同時発現させた。
図４４は、Ｆ／ＨＮキメラタンパクのＦ開裂部位へのＭＭＰ基質配列の挿入の概略を示す図および写真である。
Ａ：ＭＭＰ基質配列を挿入したＦ改変Ｆ／ＨＮキメラタンパクの構築図。上から順に配列番号：８１〜８９。
図４５は、Ｆペプチド（Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）改変と濃度依存的シンシチウム形成への影響を示す図である。
Ａ：Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ改変構築図。上から順に配列番号：９０〜９３。
Ｂ：ＭＭＰ＃２，＃６，＃６Ｇ１２Ａのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｃｌａｓｔｒｉｄｉｕｍ）添加濃度による融合能。
図４６は、改良型Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスのゲノム構造を示す図である。
図４７は、ＭＭＰ発現量の低い癌においての改良型Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスの広がりを示す写真である。改良型Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルス感染２日後の細胞融合のひろがりを示す。
図４８は、癌細胞株におけるＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現を示す写真である。癌細胞株の上清のＧｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙを示す。
図４９は、ＭＭＰ発現量の低い癌においての改良型Ｆ改変Ｍ欠失型センダイウイルスの広がりを示す図である。感染２日後の０．３ｃｍ２あたりのシンシチウム数の比較を示す。「ΔＭ」はＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ、「＃２」はＳｅＶ１８＋／Ｆ（ＭＭＰ＃２）ΔＭ−ＧＦＰ、「＃６」はＳｅＶ／Ｆ（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰ、「＃６ｃｔ１４」はＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）ΔＭ−ＧＦＰ、「Ｆ／ＨＮキメラ」はＳｅＶ（ＴＤＫ）／Ｆｃｔ１４（ＭＭＰ＃６）／Ｌｉｎｋｅｒ／ＨＮΔＭ−ＧＦＰを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2003093476.tif 000069
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【国際調査報告】
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