(57)【要約】本発明は、マレート：キノン  オキシドレダクターゼ活性が低下または欠損した微生物を用いるＬ−アミノ酸の製造法、該製造法に用いられるＤＮＡ、組換え体ＤＮＡ、形質転換体、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつマレート：キノン  オキシドレダクターゼ（以下、ＭＱＯと略す）活性が低下または欠損した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物が、ＭＱＯをコードするＤＮＡまたはその転写・翻訳調節領域の変異によるＭＱＯ活性の低下または欠損した微生物である、請求の範囲第１項記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項３】
変異が、ＭＱＯをコードするＤＮＡまたはその転写・翻訳調節領域中の１以上の塩基の置換、欠失、または付加による変異である、請求の範囲第２項記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項４】
変異が、ＭＱＯをコードするＤＮＡへのナンセンス変異の導入による変異である、請求の範囲第２項または第３項記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項５】
ＭＱＯをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、請求の範囲第２〜第４項いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項６】
変異が、配列番号２記載の塩基配列の第６７１番目および／または第６７２番目の塩基をアデニンへ置換することによる変異である、請求の範囲第２〜５項いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項７】
微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属および、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、請求の範囲第１〜６項いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項８】
微生物が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、請求の範囲第１〜７項いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項９】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、または微生物の代謝経路上Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸もしくはピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸である、請求の範囲第１〜８項いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項１０】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−イソロイシンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸である、請求の範囲第１〜９項いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項１１】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−イソロイシンである、請求の範囲第１〜１０項いずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項１２】
配列番号２記載の塩基配列のアミノ酸をコードするコドンのいずれかのコドンがナンセンスコドンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号２記載の塩基配列の第６７１番目および／または６７２番目の塩基がアデニンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１４】
請求の範囲第１２項または第１３項記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項１５】
請求の範囲第１４項記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項１６】
形質転換体が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、およびエシェリヒア属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、請求の範囲第１５項記載の形質転換体。
【請求項１７】
形質転換体が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、請求の範囲第１５項記載の形質転換体。
【請求項１８】
染色体上に請求の範囲第１２項または第１３項記載のＤＮＡを有する微生物。
【請求項１９】
微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、およびエシェリヒア属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、請求の範囲第１８項記載の微生物。
【請求項２０】
微生物が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、請求の範囲第１８項記載の微生物。
【請求項２１】
微生物が、請求の範囲第１５〜２０項いずれか１項に記載の形質転換体または微生物である、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項２２】
Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性を有する微生物に変異を導入し、得られた微生物のＭＱＯ活性を測定し、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を選択することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、マレート：キノン  オキシドレダクターゼ活性が低下または欠損した微生物を用いるＬ−アミノ酸の製造法、該製造法に用いられるＤＮＡ、組換え体ＤＮＡ、形質転換体、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法に関する。
背景技術
リンゴ酸からオキザロ酢酸への反応を司るマレート：キノン  オキシドレダクターゼ（以下、ＭＱＯと略す）は、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ回路）を構成する酵素の一つとして知られている。
コリネバクテリウム・グルタミカムのＭＱＯに関しては、生化学的性質やＭＱＯ遺伝子の塩基配列が報告されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４、３９５（１９９８）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］。
コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、ＭＱＯをコードする遺伝子（以下、ＭＱＯ遺伝子と略すこともある）を欠損させた変異株はニコチンアミドまたはニコチン酸要求性となり、最少培地で生育することができなくなることより、ＭＱＯ遺伝子は生育に重要な遺伝子であることが報告されている［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］。さらに、ＭＱＯをコードするＤＮＡを増幅して過剰発現させることにより、コリネ型細菌において、Ｌ−アミノ酸の生産性を改善できることが知られている（特開平２０００−２７０８８８）。
これまで、Ｌ−アミノ酸の発酵生産において、ＭＱＯ活性を低下または欠損させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産効率を向上させることができることを記載および示唆した報告はない。
発明の開示
本発明の目的は、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を用いることを特徴とする、工業的に有利なＬ−アミノ酸の製造法、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法を提供することにある。
本発明は以下（１）〜（２２）に関する。
（１）  Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）  ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物が、ＭＱＯをコードするＤＮＡまたはその転写・翻訳調節領域の変異によりＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物である、上記（１）のＬ−アミノ酸の製造法。
（３）  変異が、ＭＱＯをコードするＤＮＡまたはその転写・翻訳調節領域中の１以上の塩基の置換、欠失、または付加による変異である、上記（２）のＬ−アミノ酸の製造法。
（４）  変異が、ＭＱＯをコードするＤＮＡへのナンセンス変異の導入による変異である、上記（２）または（３）のＬ−アミノ酸の製造法。
（５）  ＭＱＯをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（２）〜（４）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（６）  変異が、配列番号２記載の塩基配列の第６７１番目および／または第６７２番目の塩基をアデニンへ置換することによる変異である、上記（２）〜（５）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（７）  微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、およびエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１）〜（６）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（８）  微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物である上記（１）〜（７）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（９）  Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、または微生物の代謝経路上Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸もしくはピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸を経由して合成されるＬ−アミノ酸である上記（１）〜（８）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（１０）  Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−イソロイシンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸である、上記（１）〜（９）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（１１）  Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−イソロイシンである上記（１）〜（１０）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（１２）  配列番号２記載の塩基配列のアミノ酸をコードするコドンのいずれかのコドンがナンセンスコドンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ。
（１３）  配列番号２記載の塩基配列の第６７１番目および／または６７２番目の塩基がアデニンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ。
（１４）  上記（１２）または（１３）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（１５）  上記（１４）の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（１６）  形質転換体が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、およびエシェリヒア属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１５）の形質転換体。
（１７）  形質転換体が、コリネバクテリウム属に属する微生物である上記（１６）の形質転換体。
（１８）  染色体上に上記（１２）または（１３）のＤＮＡを有する微生物。
（１９）  微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、およびエシェリヒア属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１８）の微生物。
（２０）  微生物が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１８）の微生物。
（２１）  微生物が、上記（１５）〜（２０）いずれか１つの形質転換体または微生物である、上記（１）の製造法。
（２２）  Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性を有する微生物に変異を導入し、得られた微生物のＭＱＯ活性を測定し、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を選択することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の製造法に用いられる微生物（以下、本発明の微生物ともいう）は、Ｌ−アミノ酸を生産することのできる微生物であって、該微生物のＭＱＯ活性が、該微生物の野生株のＭＱＯ活性に比べて低下した微生物、またはＭＱＯ活性が欠損した微生物であればいずれの微生物であってもよいが、ニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を示す微生物であることが好ましい。
該微生物のＭＱＯ活性は、該微生物の野生株のＭＱＯ活性に比べて低下していればよいが、低いほど好ましく、実質的に欠損または完全に欠損していることがさらに好ましい。
本発明において、野生株とは、本発明の微生物と分類学上同じ種に属する微生物であって、かつ自然界で最も高頻度に出現する表現型を有する微生物をいう。
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性を有する微生物（以下、親株と称することもある）のＭＱＯ活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等の、微生物に変異を導入することのできる方法、またはアンチセンス法等のＭＱＯの発現を抑制できる方法等を用いて、低下または欠損させることにより得ることができる。
親株は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性を有する微生物であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された育種株であってもよい。
親株としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物等をあげることができるが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属する微生物が好ましく、コリネバクテリウム属に属する微生物がさらに好ましい。
具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等をあげることができる。
より具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ  ＡＴＣＣ  １５９９１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０６０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８２６（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０２０（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８６９（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １３８６８、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ  ＡＴＣＣ  １５９９０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  １７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ９２４４、ＡＴＣＣ  ９２４５、ＡＴＣＣ  ９２４６およびＡＴＣＣ  ９２７７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８２５、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １９２４０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １５３５４等をあげることができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、ＭＱＯをコードするＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、相同組換え等により該ＤＮＡを親株の染色体に組み込み、さらに相同組換え等により染色体上に元来存在していたＭＱＯをコードするＤＮＡを置換する方法をあげることができる。
ＭＱＯをコードするＤＮＡとしてはリンゴ酸からオキザロ酢酸への反応を司るＭＱＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであればいずれでもよく、例えば、配列番号２〔国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／アクセッション・ナンバーＡＪ２２４９４６〕記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
ＭＱＯをコードするＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法の例としては、以下の方法をあげることができる。
モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に従って、ＭＱＯをコードするＤＮＡに変異を導入する。
ＭＱＯをコードするＤＮＡは、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＭＱＯをコードするＤＮＡの塩基配列情報〔例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）アクセッション・ナンバーＡＪ２２４９４６〕に基づいて、ＰＣＲ法等により取得することができる。
該変異を導入されたＭＱＯをコードするＤＮＡ（以下、変異体ＤＮＡと略す）を適当なプラスミドベクター等に挿入することにより、組換え体プラスミドを作製する。
プラスミドベクターとしては、例えば、親株中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢ［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を有するプラスミドを用いることができる。
変異体ＤＮＡを有する組換え体プラスミドを親株に導入する。
変異体ＤＮＡを有する組換え体プラスミドを親株へ導入する方法としては、微生物へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）］やプロトプラスト法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６（１９８４）］等をあげることができる。
該組換え体プラスミドは親株中で自律複製できないので、該組換え体プラスミドの有する抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
さらに、変異体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９２）］によって、親株の染色体上のＭＱＯをコードするＤＮＡが変異体ＤＮＡに置換された株を取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
親株の染色体上のＭＱＯをコードするＤＮＡに置換、欠失、または付加を導入する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができ、例えば、相田  浩ら編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法等をあげることができる。
変異を導入する塩基の数は、置換、欠失、または付加によって、該ＤＮＡがコードするＭＱＯの活性を低下または欠損させることができる数であれば限定されない。
変異を導入する部位は、該変異によってＭＱＯ活性を低下または欠損させることができる部位であれば必ずしもＭＱＯをコードするＤＮＡの有する塩基配列中に限られないが、ＭＱＯをコードするＤＮＡの転写・翻訳調節領域（以下、ＭＱＯ遺伝子という）中であることが好ましく、ＭＱＯをコードするＤＮＡの有する塩基配列中であることがさらに好ましい。
塩基置換を導入してＭＱＯ活性を低下または欠損させる方法としては、例えばナンセンス変異の導入による方法があげられる。
ナンセンス変異を導入する方法としては、例えば、終止コドンを含むプライマーおよびＭＱＯをコードするＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られたナンセンス変異が導入されたＭＱＯをコードするＤＮＡを用いて親株の染色体上のＭＱＯを置換する方法があげられる。
ナンセンス変異が導入されたＤＮＡとしては、例えば、配列番号２記載の塩基配列において、第６７１番目および／または６７２番目の塩基がアデニンに置換されたＤＮＡ等をあげることができる。
塩基配列の欠失を導入することによってＭＱＯ活性を低下または欠損させる方法としては、例えば、ＭＱＯ遺伝子を制限酵素等で切断し、適当な数の塩基配列を削除した後に再結合させて得られるＭＱＯ遺伝子を染色体に組み込む方法等をあげることができる。
塩基配列を欠失させたＭＱＯ遺伝子の例としては、例えば、ＭＱＯ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる、配列番号２記載の塩基配列の第４２２〜１４３８番目の塩基が欠失したＭＱＯ遺伝子等をあげることができる。
ＭＱＯ遺伝子に変異を導入せずにＭＱＯ活性を低下させることもできる。このような方法として、例えば、ＭＱＯをコードするｍＲＮＡの有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡを該微生物に導入し、ＭＱＯ遺伝子の発現を抑制する、いわゆるアンチセンス法をあげることができる。
上記の操作を行って得られた微生物の中から、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を得ることができる。
例えば、ＭＱＯ活性が欠損した株はニコチンアミド、またはニコチンアミドから生合成されるニコチン酸の要求性になる［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］ことを利用し、変異の導入された微生物の中から、ニコチンアミドまたはニコチン酸を含有しない培地では生育しないか、親株に比べて生育が悪くなった株を、ニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性株として取得し、該ニコチンアミドまたはニコチン酸要求性株のＭＱＯ活性を測定して、該ニコチンアミドまたはニコチン酸要求性株の中から目的とするＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を選択し、取得することができる。
ＭＱＯ活性の測定は、例えば、実施例３に示すように、モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に準じて、２，６−ジクロロインドフェノールの還元を測定することにより行うことができる。
ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物の作製および取得方法は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力が親株より向上した微生物の育種方法として用いることができる。
本発明におけるＬ−アミノ酸の製造は、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積したＬ−アミノ酸を採取することにより行う。
微生物の培養は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有する微生物の通常の培養法によって行うことができる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを適量含有する培地であれば合成培地または天然培地いずれも使用できる。
炭素源としては、本発明の微生物が資化できるものであればよく、例えばグルコース、糖蜜、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０〜４２℃が好適であり、さらに好ましくは３０℃〜４０℃である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。
培養期間は通常１〜６日間であり、培養液中にＬ−アミノ酸が生成蓄積する。
培養終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することによりＬ−アミノ酸を回収することができる。
本発明により製造することができるＬ−アミノ酸は特に限定されないが、例えば、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、微生物の代謝経路上Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸またはピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸等をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン等があげられる。Ｌ−グルタミン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン等があげられる。ピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン等があげられる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ＭＱＯ遺伝子内部を欠失したＬ−リジン生産菌株の造成
（１）ＭＱＯ遺伝子への欠失変異の導入
モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に従って、Ｌ−リジン生産菌のＭＱＯ遺伝子への欠失変異の導入を試みた。
Ｌ−リジン生産菌としては、遺伝形質が明らかなコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＨＰ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３８２）を用いた。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＨＰ−３株は、コリネバクテリウム  グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ  １３０３２の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｏｍ）にアミノ酸置換変異Ｖａｌ５９Ａｌａ、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）にアミノ酸置換変異Ｔｈｒ３３１Ｉｌｅ、およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）にアミノ酸置換変異Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒを有する菌株である。
まず、ＭＱＯ遺伝子の内部に欠失を有する変異型遺伝子を、ＴＡクローニング法（モレキュラー・クローニング第３版）により、プラスミドｐＥＳＢ３０（宝酒造社製）に挿入した。ｐＥＳＢ３０は、カナマイシン耐性遺伝子を有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のベクターｐＨＳＧ２９９［Ｇｅｎｅ，６１，６３（１９８７）］のＰｓｔＩ切断部位に、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６ｋｂのＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を連結したプラスミドである。
具体的には、プラスミドｐＥＳＢ３０をＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１社製）を用いてｐＥＳＢ３０断片を抽出し精製した。
得られたｐＥＳＢ３０断片の両末端をＤＮＡブランティングキット（ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従って、平滑化した。平滑化したｐＥＳＢ３０断片をフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｄＴＴＰ存在下で７０℃、２時間反応させ、３’末端にチミンを１塩基を付加して、ｐＥＳＢ３０−Ｔを調製した。
一方、コリネバクテリウム  グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ  １３０３２の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製した。
公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＭＱＯ遺伝子およびその近傍領域の塩基配列情報［例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）アクセッション・ナンバーＡＪ２２４９４６］に基づいて、常法により、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を合成した。
該合成ＤＮＡをプライマー、染色体ＤＮＡを鋳型として用い、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＭＱＯ遺伝子の全長を含む約２．２ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲ増幅産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（ともに宝酒造社製）で切断後、アガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１社製）を用いて約２．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を抽出、精製した。
このようにして得た完全長のＭＱＯ遺伝子を含む約２．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片と、あらかじめＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによって切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて結合させた。
得られた反応産物を用い、常法（モレキュラー・クローニング第３版）に従って大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地］で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）に記載の方法に従って、完全長のＭＱＯ遺伝子を含むプラスミドを調製した。
得られた完全長のＭＱＯ遺伝子を含むプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて結合反応を行い自己環状化させ、上記と同様に大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で形質転換株を選択した後、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。制限酵素切断法で解析したところ、該プラスミドは、ＭＱＯ遺伝子内部の約１．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片が欠失した構造を有していることが確認された。
このプラスミドを鋳型として、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）によりＰＣＲ反応を行い、欠失変異型ＭＱＯ遺伝子（約１．１ｋｂ）を増幅した。
得られた増幅産物を、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、上記のｐＥＳＢ３０−Ｔ断片と結合させた。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
該プラスミドを、制限酵素切断法で解析し、配列番号２記載の塩基配列の第４２２〜１４３８番目が欠失した欠失変異型ＭＱＯ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片がｐＥＳＢ３０に挿入された構造を有していることを確認した。このプラスミドをｐＣｍｑｏｄ１と命名した。
（２）遺伝子置換法によるＬ−リジン生産菌ＡＨＰ−３株へのＭＱＯ遺伝子欠失変異の導入
プラスミドｐＣｍｑｏｄ１が、コリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、以下の方法で、該プラスミドが相同組換えでコリネバクテリウム  グルタミクムＡＨＰ−３株の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた株を選択した。
ｐＣｍｑｏｄ１を用い、レストらの方法［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）］に従って電気穿孔法にてＡＨＰ−３株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの１株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、ｐＣｍｑｏｄ１がＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型と欠失を有する変異型のＭＱＯ遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。
該形質転換株（１回組換え体）をＳＵＣ寒天培地〔ショ糖１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して生育するコロニーを選択した。
ｓａｃＢ遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するので、この培地では生育できない［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９１）］。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型のＭＱＯ遺伝子間での２回目の相同組み換えがおこり、ｓａｃＢ遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この２回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、ｓａｃＢとともに欠失する。このとき野生型のＭＱＯ遺伝子がｓａｃＢとともに欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製し、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体のＭＱＯ遺伝子が野生型か変異型かを調べた。
その結果、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失を有する２回組換え体であるＭＱＤ−４朱を取得した。
実施例２  ＭＱＯ遺伝子内にナンセンス変異を有するＬ−リジン生産菌株の造成  ＭＱＯをコードする配列番号２記載の塩基配列の第６７０〜６７２番目のＴｒｐ残基（配列番号１記載のアミノ酸配列の２２４番目のアミノ酸残基）をコードする領域を終止コドンに置換したＤＮＡを、部位特異的変異法（モレキュラー・クローニング第３版）に準じて、以下のように作製した。
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの第６７０〜６７２番目のＴｒｐ残基をコードする領域（ｔｇｇ）を目的の終止コドン（ｔｇａ）をコードするように塩基を置換した配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡ断片（置換前の塩基配列は、配列番号２記載の塩基配列の第６６２〜６８４番目の塩基配列に相当する）、およびその相補配列から成る配列番号６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法により合成した。
また、配列番号７に示した、配列番号２記載の塩基配列の第１６５〜１８５番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および配列番号８に示した、配列番号２記載の塩基配列の第１１４５〜１１６４番目の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法により合成した。これら合成した４種類の一本鎖ＤＮＡ断片をプライマーとして用いた。
具体的には、配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、該染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた２種類の約０．５ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１６５〜６８４番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および第６６２〜１１６４番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１社製）を用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ増幅により、配列番号２記載の塩基配列の第２２４番目のＴｒｐ残基をコードする領域が終止コドン（ｔｇａ）に置換された約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該ＰＣＲ産物をＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニンを１塩基付加した。得られた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を、上記実施例１と同様にしてプラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＣｍｑｏ２２４と命名した。
ｐＣｍｑｏ２２４の塩基配列を調べ、ＭＱＯ遺伝子内部に目的のナンセンス変異が導入されていることを確認した。
次に、ｐＣｍｑｏ２２４を用い、実施例１と同様な遺伝子置換法により、Ｌ−リジン生産菌ＡＨＰ−３株の染色体上のＭＱＯ遺伝子へ該ナンセンス変異を導入した。得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定した結果、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有する２回組換え体であるＡＰＭ−４株を取得した。
実施例３  ＭＱＯ活性の測定
上記実施例１および２で得たＭＱＤ−４株、ＡＰＭ−４株、およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株のＭＱＯ活性の測定を、モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に準じて以下の方法で測定した。
なお、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＨＰ−３株は、コリネバクテリウム  グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ  １３０３２より誘導された菌株である。コリネバクテリウム  グルタミクムＡＨＰ−３株に、ＭＱＯ活性に関与する変異は一切導入されていない。
ＭＱＤ−４株、ＡＰＭ−４株、およびＡＨＰ−３株を、それぞれＭＭＹＥ培地〔グルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、尿素３ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．４ｇ、塩化ナトリウム５０ｍｇ、硫酸鉄７水和物２ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２ｍｇ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ、ビオチン０．０５ｍｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕２００ｍｌに植菌し、３０℃で培養した。
培養中、培養液の濁度を分光光度計等で測定し、培養液のＯＤ．６６０ｎｍが２〜３になった時点（本実験では３６時間）で培養を終了した。培養終了後、培養液を４，０００ｇ、４℃の条件下で５分間遠心分離した。該遠心分離で得られた菌体を氷冷した溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）［１０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸カリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、５ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム、５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５を含む］で２回洗浄した。洗浄後、溶解緩衝液２０ｍｌを添加し、菌体を該溶解緩衝液に懸濁した。この懸濁液をフレンチプレス装置を用いて１６５Ｍｐａで３回処理して菌体を破砕した。破砕した菌体を含む懸濁液を１０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、得られた上清を７５，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈澱を溶解緩衝液で１回洗浄し、最終タンパク質濃度が５〜１５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解緩衝液に懸濁し、粗膜懸濁液とした。
１ｍｌのキュベット内に２，６−ジクロロインドフェノール（Ｃｌ２Ｉｎｄ）を５０μｍｏｌ／ｌの濃度となるように溶解緩衝液に溶かした溶液および上記で得られた粗膜懸濁液を入れ、１ｍｍｏｌ／ｌのＬ−リンゴ酸ナトリウムを添加し、反応を行った。分光光度計で６００ｎｍの吸収を測定し、モル吸光係数を２２ｃｍ−１（ｍｍｏｌ／ｌ）−１として２，６−ジクロロインドフェノールの濃度を算出し、１分間で減少する２，６−ジクロロインドフェノール量を算出した。１分間にタンパク質１ｍｇ当たりの２，６−ジクロロインドフェノール量の減少量をＭＱＯ比活性とした。
同様に、野生株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ  １３０３２株のＭＱＯ比活性を測定した。
第１表に、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ  １３０３２株、ＡＨＰ−３株、ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株のＭＱＯ比活性を示す。
ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株ではＭＱＯ活性が検出されず、ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。
また、ＡＴＣＣ１３０３２株およびＡＨＰ３株のＭＱＯ比活性はほぼ同一であった。
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実施例４  ＭＱＯ変異株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性
第２表に示す成分を３００ｍｌの水に溶解し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整した。該水溶液に、４００ｍｌとなるように水を加え、濾過滅菌した。これに、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した１０％グルコース水溶液を１００ｍｌ加えた。得られた溶液に、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した３％バクトアガー水溶液（ディフコ社製）５００ｍｌを添加し、プレートに撒いて最少寒天培地を作製した。また、第２表に示す成分とニコチンアミドまたはニコチン酸０．９ｍｇを３００ｍｌの水に溶解する以外は上記と同様な方法により、ニコチンアミドまたはニコチン酸を１ｍｇ／ｌの濃度で含む最少寒天培地を作製した。
なお、バクトアガーは、オートクレーブで滅菌する前に、蒸留水により５回洗浄した。
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ＭＱＤ−４株、ＡＰＭ−４株およびＡＨＰ−３を、該最少寒天培地、およびニコチンアミドまたはニコチン酸を１ｍｇ／ｌの濃度で含む最少寒天培地に塗布し、３０℃で４日間培養した。
これらの菌株の成育を観察したところ、ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株は、最少寒天培地では生育せず、ニコチンアミドまたはニコチン酸を１ｍｇ／ｌの濃度で含む最少寒天培地では生育した。
このことから、ＭＱＯ欠損株であるＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株は、明らかにニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性である。なお、ＡＨＰ−３株は、最少寒天培地でも良好に生育した。
実施例５  ＭＱＯ変異株によるＬ−リジン生産試験
実施例１および２で得たＭＱＯ変異株ＭＱＤ−４、ＡＰＭ−４およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株をＢＹＧ寒天培地〔グルコース１０ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕で３０℃で１５時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地〔スクロース５０ｇ、コーン・スティープ・リカー４０ｇ、硫酸アンモニウム８．３ｇ、尿素１ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８３ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸銅５水和物１ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、β−アラニン１０ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、ビオチン０．５ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２５０ｍｌの入った２リットルバッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃で１２〜１６時間培養した。
得られた種培養液全量を、それぞれ、本培養培地〔グルコース６０ｇ、コーン・スティープ・リカー２０ｇ、塩化アンモニウム２５ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．７５ｇ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１３ｍｇ、塩化カルシウム２水和物５０ｍｇ、硫酸銅５水和物６．３ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１．３ｍｇ、塩化ニッケル６水和物５ｍｇ、塩化コバルト６水和物１．３ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１．３ｍｇ、ニコチン酸１４ｍｇ、β−アラニン２３ｍｇ、チアミン塩酸塩７ｍｇ、ビオチン０．４２ｍｇを水１Ｌに含む培地〕１，４００ｍｌを含む５リットルジャーファーメンターに植菌し、３４℃、１ｖｖｍ、８００ｒｐｍ条件下で、アンモニア水でｐＨ７．０に調整しながら培養した。
培地中のグルコースが消費された時点でグルコース・フィード液（グルコース４００ｇ、塩化アンモニウム４５ｇを水１Ｌに含む培地）を連続的に添加した。
該フィード液の添加は、流加速度が３菌株間で同じになるように調整しながら行い、培養時間が２８時間に達したところで培養を終了した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を第５表に示す。
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ＭＱＯ活性を欠損させたＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株では、Ｌ−リジンの生産効率が親株ＡＨＰ−３に比べて明らかに向上していた。
実施例６  ＭＱＯ活性を欠損したＬ−スレオニン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−スレオニン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−スレオニン生産菌としては、コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ  ２１６６０を用いた。ＡＴＣＣ  ２１６６０は、コリネバクテリウム  グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ  １３０３２から、メチオニン要求性変異、ＡＨＶ耐性変異、およびＡＥＣ耐性変異を誘導することにより取得された変異株である［Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６１１（１９７２）］。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定した結果、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＴＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＴＭＮ−３株も取得した。
ＴＭＤ−１株およびＴＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＴＭＤ−１株およびＴＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例７  ＭＱＯ変異株によるＬ−スレオニン生産試験
ＴＭＤ−１株、ＴＭＮ−３株、およびこれらの親株であるＡＴＣＣ  ２１６６０株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃で２４時間培養し、種培地〔グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地〕１０ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液１ｍｌを本培養培地（グルコース１００ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、ビオチン０．１ｍｇ、Ｌ−メチオニン０．１ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整後、炭酸カルシウムを２０ｇ加えた培地）１０ｍｌの入った太型試験管に植菌し、３０℃で７２時間、培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−スレオニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第６表に示す。
2003029457.tif 000007
ＭＱＯ活性を欠損させたＴＭＤ−１株およびＴＭＮ−３株では、Ｌ−スレオニンの生産効率が親株ＡＴＣＣ  ２１６６０に比べて明らかに向上していた。
実施例８  ＭＱＯ活性を欠損したＬ−グルタミン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−グルタミン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−グルタミン生産菌としては、コリネバクテリウム  グルタミクムの野生株であるコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ  １４７５２を用いた。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＧＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＧＭＮ−３株も取得した。
ＧＭＤ−１株およびＧＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＧＭＤ−１株およびＧＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例９  ＭＱＯ変異株によるＬ−グルタミン生産試験
ＧＭＤ−１株、ＧＭＮ−３株、および親株であるＡＴＣＣ  １４７５２株を、ＢＹＧ寒天培地上で２８℃で２４時間培養した。この培養菌体１白金を、生産培地（グルコース１５０ｇ、塩化アンモニウム５０ｇ、リン酸一水素カリウム０．７ｇ、リン酸二水素カリウム０．７ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２０ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、ビオチン６μｇ、チアミン塩酸塩１ｍｇ、肉エキス５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを５０ｇ加えた培地）２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、２８℃で９６時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第７表に示す。
2003029457.tif 000008
ＭＱＯ活性を欠損させたＧＭＤ−１株およびＧＭＮ−３株では、Ｌ−グルタミンの生産効率が親株ＡＴＣＣ１４７５２株に比べて明らかに向上していた。
実施例１０  ＭＱＯ活性を欠損したＬ−アルギニン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−アルギニン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカムＫＹ１０６７１（ＦＥＲＭ  Ｐ−３６１６）株を用いた。ＫＹ１０６７１株は、コリネバクテリウム  グルタミカムの野生株であるＫＹ９００４（ＦＥＲＭ  Ｐ−３２９５）株から、Ｄ−セリン感受性変異、Ｄ−アルギニン耐性変異、アルギニンハイドロキサメート耐性変異、および６−アザウラシル耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭５３−１２４９１、特開平１−２５７４８６）。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＡＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＡＭＮ−３株も取得した。
ＡＭＤ−１株およびＡＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＡＭＤ−１株およびＡＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例１１  ＭＱＯ変異株によるＬ−アルギニン生産試験
ＡＭＤ−１株、ＡＭＮ−３株、およびこれらの親株であるＫＹ１０６７１株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）６ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地〔廃糖蜜１５０ｇ（グルコース換算）、コーン・スティープ・リカー５ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、尿素３ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム２水和物０．２５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第８表に示す。
2003029457.tif 000009
ＭＱＯ活性を欠損させたＡＭＤ−１株およびＡＭＮ−３株では、Ｌ−アルギニンの生産効率が親株ＫＹ１０６７１に比べて明らかに向上していた。
実施例１２  ＭＱＯ活性を欠損したＬ−イソロイシン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−イソロイシン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−イソロイシン生産菌としては、コリネバクテリウム  グルタミクムＦＥＲＭ  ＢＰ−９８６を用いた。ＦＥＲＭ  ＢＰ−９８６は、コリネバクテリウム  グルタミカムの野生株から、アルギニン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン耐性、フルオロピルビン酸感受性、リファンピシリン耐性およびスレオニンハイドロキサメート耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭６２−１９５２９３）。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＩＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＩＭＮ−３株も取得した。
ＩＭＤ−１株およびＩＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＩＭＤ−１株およびＩＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例１３  ＭＱＯ変異株によるＬ−イソロイシン生産試験
ＩＭＤ−１株、ＩＭＮ−３株、およびこれらの親株であるＦＥＲＭ  ＢＰ−９８６を、ＢＹＧ寒天培地上で２８℃で２４時間培養し、種培地（グルコース５％、酵母エキス（ディフコ社製）１％、ペプトン１％、尿素０．３％、ＮａＣｌ０．２５％、コーン・スティープ・リカー０．５％、ビオチン
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養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地〔廃糖蜜（グルコース換算）７０ｇ、コーン・スティープ・リカー５ｇ、塩化アンモニウム２０ｇ、尿素２ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物０．０１ｇ、塩化マンガン４水和物０．０１ｇ、硫酸銅５水和物０．０１ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、硫酸亜鉛７水和物１ｍｇ、塩化ニッケル１ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１ｍｇ、塩化コバルト６水和物１ｍｇ、
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を水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地〕２０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種して７２時間、種培養と同様の方法で培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−イソロイシンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第９表に示す。
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ＭＱＯ活性を欠損させたＩＭＤ−１株およびＩＭＮ−３株では、Ｌ−イソロイシンの生産効率が親株ＦＥＲＭ  ＢＰ−９８６に比べて明らかに向上していた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、マレート：キノン  オキシドレダクターゼ活性が低下または欠損した微生物を用いるＬ−アミノ酸の製造法、該製造法に用いられるＤＮＡ、組換え体ＤＮＡ、形質転換体、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【国際調査報告】
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