(57)【要約】本来アルカン及びアルコールを資化しない微生物であって、メタンオキシゲナーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたことによってアルカンをアルコールに変換する能力を獲得した微生物の形質転換体を培養し、得られた培養物又はこの培養物より分離した菌体もしくはその菌体の処理物をアルカンと共存させ、アルコールを生成させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本来アルカン及びその酸化によって生成するアルコールを資化しない微生物であって、メタンオキシゲナーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたことによってアルカンをアルコールに変換する能力を獲得した微生物の形質転換体を培養し、得られた培養物又はこの培養物より分離した菌体もしくはその菌体の処理物をアルカンと共存させ、アルコールを生成させる、アルコールの製造方法。
【請求項２】
前記メタンオキシゲナーゼが可溶型メタンオキシゲナーゼである請求項１記載のアルコールの製造法。
【請求項３】
前記メタンオキシゲナーゼが、メタンヒドロキシラーゼ、Ｂコンポーネント、及びリダクターゼからなる請求項２記載のアルコールの製造法。
【請求項４】
前記メタンオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが、メチロコッカス・カプスラタスの可溶型メタンオキシゲナーゼ遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載のアルコールの製造法。
【請求項５】
前記微生物が、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌又はバチルス属細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載のアルコールの製造法。
【請求項６】
前記微生物が、エシェリヒア属細菌である請求項５記載のアルコールの製造法。
【請求項７】
前記培養を、２０〜３０℃で行う請求項６記載のアルコールの製造法。
【請求項８】
前記アルカンが炭素数１〜８のアルカンであり、アルコールが各々のアルカンの酸化によって生成するアルコールである請求項１〜７のいずれか一項に記載のアルコールの製造法。
【請求項９】
前記アルカンがメタンであり、アルコールがメタノールである請求項８記載のアルコールの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、微生物を用いたメタノール等のアルコールの製造法に関し、詳しくは、アルカンを微生物を用いた生化学的な酸化により、極めて緩和な条件下でアルコールに変換する方法に関するものである。
背景技術
現在のメタノールの製造工程は、原料のメタンを一酸化炭素と水素の混合ガスに改質する「合成ガス製造工程」と、その合成ガスを触媒の存在下で反応させてメタノールに転換する「メタノール合成工程」からなる。この合成ガス製造工程は８５０〜８８０℃、メタノール合成工程は５０〜１００気圧という高温高圧下で行われており、より緩和な条件下でのメタノール合成法が研究されている。近年、比較的熱安定性の高い金属錯体系触媒を用い、メタンからメタノールを高収率で合成する方法が報告されているが（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２８０，２４  Ａｐｒｉｌ（１９９８）５６０−５６３）、この方法においても１００℃以上の温度を必要としている。
一方、メタン資化性菌が有するメタンモノオキシゲナーゼ酵素（以下、「ＭＭＯ」と略記する）を用いると、常温・常圧でメタンからメタノールを直接合成できる。ＭＭＯは、可溶型と膜結合型が存在することが知られており、可溶型ＭＭＯ酵素は、ヒドロキシラーゼ、Ｂコンポーネント、リダクターゼ（Ｃコンポーネント）の３つのコンポーネントから形成される複合体蛋白である。この内、酸化反応はヒドロキシラーゼにより行われており、リダクターゼの代わりに化学的にヒドロキシラーゼを還元すれば、単独で酸化反応を触媒出来ることが報告されている。（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（１７）１００２３−１００３３，１９８９）なお、ヒドロキシラーゼはＡコンポーネントとも呼ばれ、これは更に３種類の蛋白質サブユニットα、β、γから構成される。
米国特許第５，１９０，８７０号には、メタン資化性菌から精製したヒドロキシラーゼを利用したアルカノールの酵素学的製造方法が示されているが、このヒドロキシラーゼの精製方法は複雑であり、単離後の活性低下が大きく不安定である。また、米国特許第５，１９２，６７２号には、ヒドロキシラーゼの精製後の活性を安定化させる方法が示されているが、精製方法が煩雑であるという根本的な問題を解決できていない。
一方、メタン資化性菌の菌体そのものを利用して、微生物学的にメタノールを得る方法も知られている。しかし、ＭＭＯを保持する菌体はメタノールデヒドロゲナーゼ等を同時に保持しており、メタンの酸化により生ずるメタノールは、直ちに酸化され、ホルムアルデヒドに変化し、菌体内で代謝されてしまうという問題点がある。特開平３−４３０９０号公報には、シクロプロパンによりメタノールデヒドロゲナーゼを選択的に阻害する方法が開示されているが、ＭＭＯを保持する菌体の懸濁液の空気相をシクロプロパンに置換し、更にその後、ヘリウムによりシクロプロパンを除去したりと大変煩雑であり、またシクロプロパンによるメタノール脱水素酵素の失活が十分にできない可能性もあるという問題が残されている。
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌｏｇｙ（１９９２），１３８，１３０１−１３０７には、メチロコッカス・カプスラタス  バス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｌｕｌａｔｕｓ（Ｂａｔｈ））由来の可溶型ＭＭＯのＢコンポーネントとリダクターゼをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現させ、それらを天然のヒドロキシラーゼと混合することによって、ＭＭＯ活性の発現に成功したことが示されている。また、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９９）１７１：３６４−３７０には、膜結合型ＭＭＯのみを有するメタン資化性菌に可溶型ＭＭＯの遺伝子を導入して、ＭＭＯ活性発現に成功したことが報告されている。しかし、ＭＭＯの全コンポーネントを、メタンやメタノールを資化しない微生物中で活性発現させた例は無く、この複雑な酵素複合体を異種生物で発現させることが期待されていた。
発明の開示
本発明は、可溶型ＭＭＯ（以下、「ｓＭＭＯ」ともいう）の全コンポーネントを、メタン及びメタノールを資化しない微生物中で発現させ、活性のあるｓＭＭＯを産生させること、及び、同微生物を用いてアルカンからアルコールを製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者は、そもそもメタノールデヒドロゲナーゼ等のメタノールを酸化する酵素を持たない微生物、即ち、メタンやメタノールを資化しない微生物に可溶型ＭＭＯをコードする遺伝子クラスターを導入し、これを活性ある形で発現する微生物を構築し、同微生物を用いてメタンからメタノールを生成させる方法を考えた。しかし、ｓＭＭＯは５つのサブユニットからなる複合体蛋白であり、活性型のｓＭＭＯを、特に異種の微生物内で活性ある形で発現させることは容易ではない。そこで、可溶型ＭＭＯ発現プラスミドに用いるプラスミドやプロモーターの種類、また培養条件を鋭意検討した結果、異種の菌体内で活性を保持した状態でｓＭＭＯを発現させることに成功した。さらに、得られた微生物を用いて、メタンからメタノールを生成させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）本来アルカン及びその酸化によって生成するアルコールを資化しない微生物であって、メタンオキシゲナーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたことによってアルカンをアルコールに変換する能力を獲得した微生物の形質転換体を培養し、得られた培養物又はこの培養物より分離した菌体もしくはその菌体の処理物をアルカンと共存させ、アルコールを生成させる、アルコールの製造方法。
（２）前記メタンオキシゲナーゼが可溶型メタンオキシゲナーゼである（１）のアルコールの製造法。
（３）前記メタンオキシゲナーゼが、メタンヒドロキシラーゼ、Ｂコンポーネント、及びリダクターゼからなる（２）のアルコールの製造法。
（４）前記メタンオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが、メチロコッカス・カプスラタスの可溶型メタンオキシゲナーゼ遺伝子である（１）〜（３）のいずれかに記載のアルコールの製造法。
（５）前記微生物が、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌又はバチルス属細菌である（１）〜（４）のいずれかに記載のアルコールの製造法。
（６）前記微生物が、エシェリヒア属細菌である（５）のアルコールの製造法。
（７）前記培養を、２０〜３０℃で行う（６）のアルコールの製造法。
（８）前記アルカンが炭素数１〜８のアルカンであり、アルコールが各々のアルカンの酸化によって生成するアルコールである（１）〜（７）のいずれかのアルコールの製造法。
（９）前記アルカンがメタンであり、アルコールがメタノールである（８）のアルコールの製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる微生物は、本来アルカン及びその酸化によって生成するアルコールを資化しない微生物であるが、ｓＭＭＯをコードするＤＮＡで形質転換されたことによってアルカンをアルコールに変換する能力を獲得した微生物である。尚、本発明に用いる微生物が前記アルコールを資化しないことは、アルカンをアルコールに変換することについては本質的ではないが、生成したアルコールを蓄積するためには、アルコールを資化しないことが好ましい。
本来アルカン及びその酸化によって生成するアルコールを資化しない微生物としては、ｓＭＭＯをコードするＤＮＡの導入によって、アルカンをアルコールに変換する能力を獲得し得るものであれば特に制限されないが、具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）等のコリネ型細菌、及びバチルス・ズブチリス等のバチルス属細菌等が挙げられる。
本発明に用いるメタンオキシゲナーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは可溶型ＭＭＯ（ｓＭＭＯ）をコードするＤＮＡである。ｓＭＭＯは、Ａコンポーネント（メタンヒドロキシラーゼ）、Ｂコンポーネント、及びＣコンポーネント（リダクターゼ）の各コンポーネントからなる。また、Ａコンポーネントは、α、β及びγの各サブユニットからなる。これらのコンポーネントは、それぞれ独立して、微生物に導入されてもよいが、全コンポーネントをコードするＤＮＡを含む単一のベクターによって導入されることが好ましい。以下、このようなｓＭＭＯの全コンポーネントをコードする遺伝子クラスターは、便宜上ｓＭＭＯ遺伝子と呼ばれる。
ｓＭＭＯ遺伝子は、メタン資化性菌、例えばメチロコッカス・カプスラタス  バスＮＣＩＭＢ１１１３２株の染色体ＤＮＡから得られる。この株は、例えばＮＣＩＭＢ（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｔｄ．，２３  Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２  １ＲＹ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）より入手できる。
以下に、メタン資化性菌として、メチロコッカス・カプスラタスからｓＭＭＯ遺伝子を含む断片を調製する方法の一例を述べるが、他のメタン資化性菌からも、同様にして取得することができる。
まず、メチロコッカス・カプラタスを培養するために用いる培地としては該細菌が十分に増殖しうるものであればよいが、好適な培地としてホイッテンベリー等の培地（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，２０５−２０８，１９７０）がある。培地を入れた培養容器の空間にはメタンと酸素含有ガス（空気など）との混合ガスにて置換し、該ガスと接触している培地にメチロコッカス・カプスラタスを接種する。メチロコッカス・カプスラタスは好気性細菌であり、その培養は２０〜５０℃にて好気的条件に回分培養もしくは連続培養を行えばよい。
ｓＭＭＯ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、同遺伝子の公知の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ９００５０  Ｍ３２３１４  Ｍ５８４９８  Ｍ５８４９９、Ｓｔａｉｎｔｈｏｒｐｅ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９１（１），２７−３４，１９９０、配列番号５）に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、メチロコッカス・カプスラタスの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ポリメラーゼチェインリアクション）により、ｓＭＭＯ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を取得し、同ＤＮＡ断片をプローブとして、以下に述べる方法でメチロコッカス・カプスラス株染色体由来のＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により、分離取得することができる。前記ｓＭＭＯ遺伝子に含まれるオープンリーディングフレームは、５’末端側から順に、ｍｍｏＸ、ｍｍｏＹ、ｍｍｏＢ、ｍｍｏＺ、ＯｒｆＹ、ｍｍｏＣと名付けられている。
メチロコッカス・カプスラタスＮＣＩＭＢ１１１３２株の培養液から染色体ＤＮＡは、それ自体既知の通常用いられる方法（例えば、［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３）］）等で抽出することができる。
ＤＮＡライブラリーは、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩを用いて分解し、得られる様々な大きさのＤＮＡ断片をプラスミドベクター、例えばｐＵＣ１８（宝酒造製）に連結し、連結反応液を用いて適当な宿主、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換することにより、調製することができる。
ハイブリダイゼーションによりｓＭＭＯ遺伝子を含むＤＮＡ断片を持つクローンを選択するためのプローブは、ｓＭＭＯ遺伝子の公知の塩基配列から適宜設定した塩基配列、例えば配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、メチロコッカス・カプスラタスの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、得ることができる。
上記のようにして得られるプローブを用いて、メチロコッカス・カプスラタスＮＣＩＭＢ１１１３２株の染色体ＤＮＡライブラリーについて、コロニーハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションによりプローブであるｓＭＭＯ遺伝子部分ＤＮＡ断片とハイブリダイズするクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを適当な制限酵素により切断し、挿入断片を得ることにより、ｓＭＭＯ遺伝子又はその一部を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
上記にようにして得られたクローン断片が、ｓＭＭＯ遺伝子の一部を含む場合は、残りの領域は、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等によって、取得することができる。例えば、クローン化断片がｓＭＭＯ遺伝子の５’側を欠いている場合には、クロン化断片の上流は、５’−ＲＡＣＥ法によって取得することができる。また、配列番号３及び配列番号４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ＮＣＩＭＢ１１１３２株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによっても、ｓＭＭＯ遺伝子の上流側を取得することができる。得られたＤＮＡ断片を、先に得られたｓＭＭＯ遺伝子断片と連結することによって、ｓＭＭＯ遺伝子全長を取得することができる。
ｓＭＭＯの各々のコンポーネント又はサブユニットは、野生型の他に、各々のコンポーネント又はサブユニットの機能を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から１０個、好ましくは、２から５個、より好ましくは２から３個である。
上記のようなｓＭＭＯと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号４に示す塩基配列中のオープンリーディングフレーム又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性のあるｓＭＭＯを構成し得るタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
ｓＭＭＯ遺伝子を宿主微生物に導入するのに使用されるベクターとしては、宿主微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、エシェリヒア属細菌用のベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等のプラスミドベクターが挙げられる。また、コリネ型細菌用のベクターとしては、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報参照）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４（以上、特開昭５８−１９２９００号公報参照）、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報参照）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報参照）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（以上、特開昭５７−１８３７９９号公報参照）、ｐＨＫ４（特開平５−７４９１号公報参照）等が挙げられる。また、バチルス属細菌用のベクターとしては、ｐＵＢ１１０、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１２４８、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４、ｐＢＣ１６、ｐＳＡ０５０１、ｐＳＡ２１００、ｐＡＭ７７、ｐＴ１８１、ｐＢＤ６、ｐＢＤ８及びｐＢＤ６４、ｐＨＶ１４等が挙げられる。
ｓＭＭＯ遺伝子のプロモーターは、導入する微生物に応じて、適当なプロモーターに置換してもよい。そのようなプロモーターとしては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター等が挙げられる。ベクターとして、プロモーターを含む発現ベクターを用いると、ｓＭＭＯ遺伝子と、ベクター及びプロモーターとの連結を一度に行うことができる。このようなベクターとしては、ｔａｃプロモーターを含むｐＫＫ２３３−３（ファルマシア社製）等が挙げられる。
上記のようにしてｓＭＭＯ遺伝子が組み込まれたペクターを目的の微生物に導入するための形質転換法としては、例えば、エシェリヒア  コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））や、バチルスズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））を用いることができる。あるいは、バチルス  ズブチリス、放線菌類および酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．，Ｇｅｎｅｔ．，１６８．１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７５  １９２９（１９７８））も応用できる。これらの方法は、宿主として用いる細胞に応じて適宜選択すればよい。さらには、電気パルス法（杉本ら，特開平２−２０７７９１号公報）によっても、組換えＤＮＡをブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属細菌に属する受容菌へ導入できる（ＯＰ１９９）。
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１．２１（１９８９）に記載されている。
上記にようにして得られたｓＭＭＯ遺伝子を含む発現ベクターｐＲＳｓＭＭＯＴＢで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株は、ＡＪ１３８５２と命名され、平成１３年８月２日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４４６として寄託され、平成１４年８月１９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１５３の受託番号が付与されている。
上記にようにしてｓＭＭＯ遺伝子を含むＤＮＡで形質転換されたことによってアルカンをアルコールに変換する能力を獲得した微生物の形質転換体を培養し、得られた培養物又はこの培養物より分離した菌体もしくはその菌体の処理物をアルカンと共存させ、アルコールを生成させることにより、アルコールを製造することができる。
ｓＭＭＯ遺伝子を導入された微生物の培養に使用する培地は、用いる微生物に応じて適宜選択することができる。一例を示すと、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
尚、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌を用いる場合は、ｓＭＭＯを構成する各サブユニットを可溶性ペプチドとして産生させるために、２０〜３０℃で培養を行うことが好ましい。
アルカンをアルコールに変換するための触媒として用いるのは、菌体又は菌体を含む培養物の他、菌体の処理物であってもよい。菌体の処理物としては、アセトン処理または凍結乾燥等した菌体、該菌体または生菌体より調製した無細胞抽出物、該無細胞抽出液から分画した膜画分等の分画物等、又はこれらの菌体、無細胞抽出物もしくは分画物を固定化した固定化物であってもよい。これらの菌体又は菌体処理物をアルカンに接触反応させることにより、反応液中にアルコールを生成させることができる。用いる微生物は、一種でもよく、任意の二種以上の混合物として用いてもよい。また、微生物の生育を妨げないアルカンであれば、微生物の培養に用いる培地にアルカンを含有させることによって、微生物の培養とアルコールの製造を同時に行うこともできる。その場合、アルカンは、培地に接する気相に含ませるか、培地に吹き込むことによって、培地中に含有させることができる。また、本発明に用いる微生物としてエシェリヒア属細菌等の還元力の強い微生物を用いるか、反応液中にＮＡＤＨを添加することによって、ｓＭＭＯにより触媒する反応を効率よく進行させることができる。
本発明を適用するアルカンとしては、好ましくは炭素数１〜８、より好ましくは１〜６、特に好ましくは炭素数１〜５のアルカンである。なかでも、メタンが最も好適である。また、ｓＭＭＯによってアルカンが酸化される位置は特に制限されず、末端の炭素に結合している水素でもよく、複数の炭素が結合している炭素に結合している水素でもよい。また、アルカンは直鎖状でもよく、分岐鎖状でもよく、また、環状であってもよい。また、アルカンは、ハロゲン等の置換基を有していてもよい。
メチロコッカス・カプスラタス  バス株のｓＭＭＯの基質特異性については研究が行われており（Ｃｏｌｂｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９７７）１６５，３９５−４０２）、少なくともメタンからオクタンまでのアルカンを酸化し、アルコールを生成する能力を有していることが示されている。
発明を実施するための最良の形態
本発明を、実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞メタン資化性細菌メチロコッカス・カプスラタスの染色体ＤＮＡライブラリーの作製
ホイッテンベリー等の培地［Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，２０５−２０８，１９７０］を入れた培養容器の空間を、メタンと空気との混合ガスにて置換した。該ガスと接触している培地にメタン資化性細菌メチロコッカス・カプスラタスＮＣＩＭＢ１１１３２株を接種し、ガス置換を行いながら好気的条件で回分培養した。
上記のようにして培養したメチロコッカス・カプスラタスＮＣＩＭＢ１１１３２の菌体から、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３）に記載の方法で、染色体ＤＮＡを抽出した。この染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩを用いて完全分解した。得られた様々な大きさのＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造（株）製）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られた組換えプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
＜２＞コロニーハイブリダイゼーションによるｓＭＭＯ遺伝子のクローニング
上記染色体ＤＮＡライブラリーからｓＭＭＯ遺伝子断片を含むクローンを、コロニーハイブリゼーションにより選択した。ハイブリダイゼーション用のプローブは、ＰＣＲ法によりｓＭＭＯ遺伝子断片を増幅することによって調製した。メチロコッカス・カプスラタスのｓＭＭＯ遺伝子は、その塩基配列が既に報告されており［Ｇｅｎｅ，９１，２７−３４（１９９０）］、その配列に基づいて配列番号１及び配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを合成した。
前記と同様にして調製したメチロコッカス・カプスラタスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、デナチュレーション工程（９４℃、１０秒）、アニーリング工程（５５℃、３０秒）、及びエクステンション工程（７２℃、１分３０秒）からなるサイクルを３０サイクル行った。
上記のようにして増幅されたｓＭＭＯ遺伝子の部分断片をプローブとして、前記染色体ＤＮＡライブラリーについてコロニーハイブリダイゼーションを行った。プローブの標識及びハイブリダイゼーション反応は、ＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション  スターターキットＩ（ベーリンガー・マンハイム社より購入）を用い、添付のプロトコールに従って行った。
ハイブリダイゼーションの陽性クローンから組換えプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断し、挿入断片を確認した。その結果、プラスミドｐＵＣ１８の長さ約２．３ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさが約６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
この挿入ＤＮＡを種々の制限酵素により切断し、目的のｓＭＭＯ遺伝子の大部分を含む断片であることを確認した。その結果、前記断片は、ｓＭＭＯを構成するαサブユニットをコードする遺伝子の一部を欠落していることが判明した。この約６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを、ｐＵＣ６Ｋと命名した。
＜３＞ｓＭＭＯ遺伝子全長を含むプラスミドの構築
次に、欠落を含むｓＭＭＯ遺伝子の上流領域を、以下に示すように、ＰＣＲ法により取得した。合成したプライマーの塩基配列を、配列表の配列番号３及び配列番号４に示す。ＮＣＩＭＢ１１１３２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、デナチュレーション工程（９８℃、１０秒）、アニーリング工程（６０℃、３０秒）、及びエクステンション工程（７２℃、１８０秒）からなるサイクルを３０サイクル行った。得られた約１．５ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイトにライゲーションした。このプラスミドのＢａｍＨＩ部位に、ｐＵＣ６ＫからＢａｍＨＩで切り出される約６ｋｂｐの断片を組み込み、ｓＭＭＯ遺伝子の全長を含むプラスミドｐＵＣｓＭＭＯを得た。
＜４＞ｓＭＭＯ遺伝子発現プラスミドの構築
次に、上記のプラスミドｐＵＣｓＭＭＯから、制限酵素ＥｃＯＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用い、ｓＭＭＯ遺伝子領域を切り出し、発現ベクターｐＫＫ２３３−３（ファルマシア社製）のｔａｃプロモーターの下流に組み込み、ｔａｃプロモーターからの転写がｓＭＭＯ遺伝子に流れ込むように構築した発現プラスミドｐＫＫｓＭＭＯを得た。
ｐＫＫｓＭＭＯを制限酵素ＮｄｅＩとＤｒａＩにより消化し、ｐＫＫ２３３−３由来のｔａｃプロモーター領域を含むｓｍｍｏ遺伝子を切り出して末端を平滑化し、制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、末端を平滑化した広宿主域ベクターｐＲＳ（特表平３−５０１６８２に記載）にライゲーションして、ｓＭＭＯ発現プラスミドｐＲＳｓＭＭＯＴＢを取得した。
＜４＞ｓＭＭＯ発現の確認
ＡＪ１３８５２株を、ストレプトマイシンを２０ｍｇ／ｍｌ含むＬＢ液体培地に植菌し、２５℃で一晩前培養したものを、同様に調製した液体培地に１％（ｖ／ｖ）植菌して、２５℃で本培養した。本培養では、ＯＤ６６０が０．６に到達した時点でＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに２．５時間培養した。この培養条件で得られた菌体を超音波破砕した後、遠心分離を行い、可溶性画分と不溶性画分に分画した。各々の画分について、ｓＭＭＯを構成する各成分ペプチドに対する抗体用いて分析した。その結果、ｓＭＭＯのα、β、γの全サブユニットと、Ｂ、Ｃの両コンポーネントが可溶性画分に存在することを確認した。
上記の培養を全て３７℃で行うと、αサブユニットは完全に封入体を形成し、可溶性画分には存在しなかった。さらに、β、γ両サブユニットも大半が不溶性であった。また、培養を３０℃で行うと、２５℃の場合と比較して可溶性画分に存在するαサブユニットの量が少なかった。
＜５＞メタンからのメタノールの製造
ＡＪ１３８５２株を上記と同様にして（温度は２５℃）、１００ｍｌの培地を用いて培養し、集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を洗浄した。その後、菌体を同緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液の総蛋白濃度を、１５ｍｇ／ｍｌに調整した。５ｍｌ容量のアルミシールバイアルに上記無細胞抽出液を１ｍｌ入れ、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を終濃度１ｍＭになるように添加し、密閉してからメタンガスを５ｍｌ（１ａｔｍ換算）封入し、反応を行った。反応は、３７℃で振とうしながら６０分間行った。また、ＡＪ１３８５２株、及びベクターｐＲＳのみを導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＲＳを、メタンガスを封入しない以外は上記と同様にして培養した。
メタノール濃度の定量は、３段階の酵素反応を用いる定量系により行った。反応液組成を表１に示す。まず、上記メタノール生成反応後の反応液を６００μｌ取り、５０μｌの５Ｎ水酸化カリウムを添加し、よく攪拌してから５分間放置した。次に、５Ｍ塩化ナトリウムを５０μｌ添加し、さらに１Ｍリン酸カリウム緩衝液でｐＨ７．５に調整した。その後、遠心分離により変性蛋白を除いてから、以下の酵素反応に供した。
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酵素反応は、以下の手順で行った。アルコールオキシダーゼによりメタノールをホルムアルデヒドに変換し、ホルムアルデヒド脱水素酵素によりホルムアルデヒドからギ酸を生成させる。その際、生成するＮＡＤＨをジアホラーゼの呈色反応により、５５０ｎｍの吸光度として定量した。なお、アルコールオキシダーゼ、ホルムアルデヒド脱水素酵素はシグマ社より、ジアホラーゼは東洋紡社より、そしてヨードニトロ  テトラゾリウムはナカライテスク社より、各々購入した。
ＡＪ１３８５２株と、ベクターｐＲＳのみを導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＲＳを用いて、メタンガスを封入しないで得た反応液に対し、上記３段階酵素反応を適用し、測定された吸光度を、それぞれメタノール濃度０Ｍとした。その値を基準にして、各種濃度のメタノールを、前記定量系に添加して、吸光度に対するメタノール量をプロットして、検量線を作成した（図１）。その結果、この測定系では、メタノール濃度が２００μＭから１０００μＭの範囲において、メタノール濃度値と吸光度値が直線的に対応することがわかった。
上記検量線を用いて、各菌体によるメタノール生成量を定量した結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＲＳを用いた場合は、メタノールの生成が検出されなかったのに対して、ＡＪ１３８５２株を用いた場合は、メタノールの生成が確認され、その濃度は２４０μＭであった。この反応の比活性は、酵素液中の蛋白質１ｍｇ当たり、０．３３ｎｍｏｌ／分であった。
産業上の利用の可能性
本発明により、本来アルカン及びその酸化によって生成するアルコールを資化しない微生物に、アルカンをアルコールに変換する能力を付与することができ、得られた微生物を用いてアルカンからアルコールを製造することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、吸光度に対するメタノール量をプロットした検量線を示す図である。横軸はメタノール濃度（ｍＭ）、縦軸は吸光度である。◆はＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＲＳ、■はＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＲＳｓＭＭＯＴＢ（ＡＪ１３８５２）の結果を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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