(57)【要約】本発明はアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＮＳＳＣ１０４からニトリラーゼを抽出精製し、そのＮ末端及び内部アミノ酸配列を決定し、センスプライマーとアンチセンスプライマーを設計し、かかるプライマーを用いて染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡをジゴキシゲニン標識してプローブを作製し、このプローブを用いて、染色体ＤＮＡを制限酵素で消化したニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが組み込まれたプラスミドベクターを導入した大腸菌から、コロニーハイブリダイゼーションにより、目的の組換え体ＤＮＡを持つ形質転換体を選別することにより、ニトリラーゼ遺伝子を同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求の範囲２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子等に関する。
背景技術
ニトリラーゼはニトリルを加水分解して対応するカルボン酸に変換する酵素として知られている。当該酵素を産生する微生物としては、例えば、カゼオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテリジウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属等に属する微生物を挙げることができる（特公昭６３−２５９６号公報、特開平３−２５１１９２号公報、特開平４−４０８９８号公報、特開平８−１７３１５２号公報、特開平８−１７３１７５号公報、国際公開ＷＯ９６−０９４０３号公報、国際公開ＷＯ９７−３２０３０号公報参照）。
また、ニトリラーゼ遺伝子として、特開２００１−１３６９７７号公報にはロドコッカス属細菌由来のニトリラーゼ遺伝子が、特開平９−３７７８８号公報には、ゴルドナ・テラエ（Ｇｏｒｄｏｎａ  ｔｅｒｒａｅ）由来のニトリラーゼ遺伝子が、特開平７−９９９８０号公報にはロドコッカス・ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来のニトリラーゼ遺伝子が、特開平７−５１０７０号公報にはコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来のニトリラーゼ遺伝子が、特開平６−１５３９６８号公報にはアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のニトリラーゼ遺伝子が記載されている。
発明の開示
遺伝子組換えにより高活性のニトリラーゼ遺伝子をクローニングすることにより、細胞内での同遺伝子の発現を人為的に改良することが容易になり、微生物の触媒能力を増大させることができると期待される。本発明の課題は、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）由来の高活性ニトリラーゼの遺伝子を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するために、まず、アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４の培養条件、特に培地組成と培養温度を検討することによって、誘導酵素であるニトリラーゼを高発現した菌体を選択し、また、ＰＣＲに適切なプライマーを選択・使用し、さらに、染色体ＤＮＡの制限酵素消化に適切な酵素を選択することにより、アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４のニトリラーゼ遺伝子のクローニングを行い、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質（請求の範囲１）や、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ（請求の範囲２）や、請求の範囲２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求の範囲３）に関する。
また本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質（請求の範囲４）に関する。
本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるニトリラーゼをコードするＤＮＡや、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであればどのようなものでもよく、例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡを具体的に挙げることができる。ここで、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質とは、ニトリルを加水分解して対応するカルボン酸に変換する活性を定性的に有するタンパク質をいう。これら本発明のＤＮＡは、本発明に開示されたＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＮＳＳＣ１０４等のゲノムＤＮＡから公知の方法により調製することができる。
また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、新規のニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度及び塩濃度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明のタンパク質としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の他に、配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質など、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ活性を有するタンパク質等の新規ニトリラーゼ活性を有するタンパク質を挙げることができる。なお、本件タンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
本発明のニトリラーゼ遺伝子の供給源としては、ニトリラーゼ活性を有するアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９）が使用される。本菌株の菌学的性質は、国際公開ＷＯ９７−３２０３０号公報に記載されている。かかるニトリラーゼ活性を有するアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９）から、本発明のニトリラーゼ遺伝子を新たに調製するには、例えば下記の工程により実施することができる。
（１）ニトリラーゼのＮ末端及び内部アミノ酸配列の決定とＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーの合成
アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４から誘導酵素であるニトリラーゼ高発現菌体を得て、ニトリラーゼを抽出精製し、そのＮ末端及び内部アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列を基に、ＰＣＲに用いるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを設計し、合成する。
（２）染色体ＤＮＡの調製
アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４から染色体ＤＮＡを調製する。
（３）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
工程（２）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型にして、工程（１）で合成したセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、ＤＮＡを増幅する。
（４）ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列決定
工程（３）においてＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、塩基配列を決定する。
（５）ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのジゴキシゲニン標識
工程（３）においてＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをジゴキシゲニンによって標識し、プローブを作製する。
（６）ニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの調製
工程（２）で調製した染色体ＤＮＡを制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、ＤＮＡを抽出する。ニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、工程（５）で調製したジゴキシゲニン標識ＤＮＡをプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによって検出する。
（７）組換え体ＤＮＡの作製と選別
工程（６）で調製したニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをプラスミドベクターｐＵＣ１８に組み込み、大腸菌に導入する。次に、工程（５）で調製したジゴキシゲニン標識ＤＮＡをプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションにより、目的の組換え体ＤＮＡを持つ形質転換体を選別する。
（８）ニトリラーゼ遺伝子領域の特定と塩基配列の決定
工程（７）で得られた組換え体ＤＮＡの制限酵素地図を作成し、工程（４）で決定したニトリラーゼ遺伝子の部分塩基配列に基づき、同遺伝子領域を特定し、周辺の塩基配列を決定する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
（１）ニトリラーゼのＮ末端及び内部アミノ酸配列の決定とＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーの合成
４００ｇのＣＳＬ（コーンスチープリカー）に水を加えて８００ｍＬにし、１０Ｎ  ＮａＯＨを滴下し、ｐＨ７．０に調整した。これに水を加えて１，０００ｍＬにし、遠心（１２，０００×ｇ、１０分間、２５℃）によって不溶物を除き、上清（ＣＳＬ抽出液）を得た。１０Ｌ容のジャーファーメンターに、５，０１０ｍＬの水、６００ｍＬのＣＳＬ抽出液、２４０ｍＬの５０％スクロース、及び１５０ｍＬの２０％ε−カプロラクタム（酵素誘導剤）を仕込み、これにアースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４を植菌し、３３℃で通気攪拌しながら４日間培養した。遠心（１２，０００×ｇ、１０分間、４℃）によって培養液から菌体を回収し、このうちの３６ｇの湿菌体を生理食塩水で洗浄し、これに３０％１，３−プロパンジオール、１ｍＭジチオスレイトール、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１５０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加え懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕装置で処理することによって細胞を破砕し、遠心（３１，０００×ｇ、３０分間、４℃）によって不溶物を除き、細胞抽出液を得た。細胞抽出液の１０−５５％硫安画分を調製し、これに０．５Ｍ硫安、１ｍＭジチオスレイトール、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む６０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加え懸濁し、遠心（３１，０００×ｇ、３０分間、４℃）によって上清（酵素抽出液）を得た。
酵素抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後、ブロッティング装置（ミリブロット−ＳＤＥ；ミリポア）を用いて、ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）メンブレン（イモビロン−ＰＳＱ；ミリポア）にタンパク質バンドを電気的にトランスファーした。トランスファー後、ＰＶＤＦメンブレンを水で十分洗浄し、染色液（０．２％クマジーブリリアントブルーＲ−２５０、４０％メタノール、及び１０％酢酸）によって染色し、脱色液（６０％メタノール、１０％酢酸）によって脱色した。その後、ＰＶＤＦメンブレンを風乾し、培地に酵素誘導剤を添加したとき現れる約４２ｋＤａのバンドの部分を切り取った。これをアミノ酸シークエンサーにかけ、ニトリラーゼのＮ末端アミノ酸配列を分析した。その結果、配列番号３のアミノ酸配列が決定された。
一方、酵素抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後、ポリアクリルアミドゲルを染色液（０．０５％クマジーブリリアントブルーＲ−２５０、２５％イソプロパノール、１０％酢酸）によって染色し、脱色液（１０％メタノール、１０％酢酸）によって脱色した。その後、培地に酵素誘導剤を添加したとき現れる約４２ｋＤａのバンドの部分を切り取り、リジルエンドペプチダーゼによるゲル内消化を行い、生成したペプチドをＨＰＬＣによって分離した。これらのペプチドのうち、比較的大きなものについて、アミノ酸シークエンサーにより、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した。その結果、配列番号４と配列番号５のアミノ酸配列が得られた。
すでに知られている、他の微生物のニトリラーゼのアミノ酸配列とのホモロジーから、配列番号４のアミノ酸配列はＮ末端に近い位置（最後のアミノ酸残基はＮ末端から約２４番目）に、配列番号５のアミノ酸配列は比較的Ｃ末端側（最後のアミノ酸残基はＮ末端から約２７６番目）にあると推定された。配列番号３のアミノ酸配列のうち、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａに対応する塩基配列（配列番号６に示される１２８通りの塩基配列）を有するＤＮＡをＰＣＲのセンスプライマーとして合成した。また、配列番号５のアミノ酸配列のうち、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌに対応する塩基配列（配列番号７に示される１，５３６通りの塩基配列）を有するＤＮＡをＰＣＲのアンチセンスプライマーとして合成した。ＤＮＡ合成は自動ＤＮＡ合成機によって行った。
（２）染色体ＤＮＡの調製
３００ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）に、アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４を植菌し、３３℃で２４時間振盪培養した。遠心（２２，０００×ｇ、１０分間、４℃）によって、培養液から菌体を回収し、１５０ｍＬのＴＥＮバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。これに２０ｍＬのＴＥＮバッファーを加え懸濁し、４０ｍｇのリゾチームを含む２００μＬのＴＥＮバッファーを加え、３７℃で２時間ゆっくり振盪した。さらに、２ｍＬの１０％ＳＤＳと１００μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間半ゆっくり振盪した後、４４０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び１％ＳＤＳと０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む１２ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加え、遠心チューブに移した。これに同容量のバッファー平衡化フェノール（フェノール結晶に約０．１％の８−ヒドロキシキノリンを加え、これに同容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］を加え攪拌し、フェノール結晶を溶解して静置した後、上の水層をデカンテーションによって除き、フェノール層を０．２％β−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］で平衡化する。このフェノール層を「バッファー平衡化フェノール」と呼ぶことにする）を加え攪拌し、遠心（１，５００×ｇ、１０分間、室温）によって二層に分離した。上の水層を新しい遠心チューブに移し、１／２容量のバッファー平衡化フェノール、及び同じく１／２容量のイソアミルアルコール含有クロロホルム（４％のイソアミルアルコールを含むクロロホルム）を加え攪拌し、遠心（１，５００×ｇ、１０分間、室温）によって二層に分離した。上の水層を新しい遠心チューブに移し、同容量のイソアミルアルコール含有クロロホルムを加え攪拌し、遠心（１，５００×ｇ、１０分間、室温）によって二層に分離した。以後、この操作をフェノール／クロロホルム抽出と呼ぶことにする。上の水層を新しい遠心チューブに移し、２倍容量のエタノールを加え、ガラス棒で攪拌することによって、不溶化するＤＮＡを巻き取った。このＤＮＡを５ｍＬのＴＥＮバッファーに溶解し、１ＬのＴＥＮバッファーに対して２回透析した。透析後、２５μＬの１０ｍｇ／ｍＬリボヌクレアーゼＡを加え、３７℃で２時間インキュベートした。これに２５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間インキュベートした後、１００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った。水層に２倍容量のエタノールを加え、ガラス棒で攪拌することによって、不溶化するＤＮＡを巻き取った。このＤＮＡを５ｍＬのＴＥＮバッファーに溶解し、１ＬのＴＥＮバッファーに対して３回透析し、得られた染色体ＤＮＡ溶液を４℃で保存した。
（３）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
氷冷した０．２ｍＬ容のＰＣＲ用チューブに、０．５μＬ（２．５Ｕ）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０μＬの１０倍濃度反応バッファー、８μＬのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、工程（２）で得られた２μＬ（０．８６μｇ）の染色体ＤＮＡ、工程（１）で合成した１０μＬの１００μＭセンスプライマー、工程（１）で合成した１０μＬの１００μＭアンチセンスプライマー、及び５９．５μＬのＨ２Ｏを加えた。これをＰＣＲ装置にセットし、９４℃で５分間の処理によってＤＮＡを変性させた後、３０回の温度サイクル（９４℃で２０秒間の変性ステップ、５７℃で３０秒間のアニーリングステップ、及び７２℃で３０秒間の伸長反応ステップ）によってＤＮＡを増幅し、最後に７２℃で１０分間の処理によって反応を完結させた。反応終了後、反応液を２．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約８５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
（４）ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列決定
工程（３）で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて、次のようにしてクローニングした。５μＬの２倍濃度ラピッドライゲーションバッファー（Ｒａｐｉｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）、１μＬ（５０ｎｇ）のｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ、工程（３）で得られた１μＬ（４０ｎｇ）のＰＣＲ増幅ＤＮＡ、１μＬ（３Ｕ）のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、及び２μＬのＨ２Ｏを混合し、室温で１時間反応させた。この反応液の５μＬを１００μＬの大腸菌ＪＭ１０３コンピテントセルに加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷中で冷却し、９００μＬのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間振盪した。このうちの１００μＬを、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌ、及び１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。
上記ＬＢプレート上に現れた白色コロニーを、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。遠心（３１，０００×ｇ、１０分間、４℃）によって培養液から菌体を回収し、０．１Ｍ  ＮａＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で洗浄した。これに２．５ｍＬの溶液Ｉ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５０ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え懸濁し、新しく調製した０．２５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬリゾチームを加え、室温に１０分間置いた。次に、新しく調製した５ｍＬの溶液ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）を加え、良く攪拌し、室温に１０分間置いた。これに氷冷した３．７５ｍＬの溶液ＩＩＩ（６０ｍＬの５Ｍ酢酸カリウム、１１．５ｍＬの酢酸、及び２８．５ｍＬのＨ２Ｏを混合したもの）を加え、良く攪拌し、氷中に１０分間置いた。遠心（３１，０００×ｇ、１０分間、４℃）によって不溶物を除き、上清を新しい遠心チューブに移し、０．６倍容量のイソプロパノールを加え、室温に１０分間置き、遠心（３１，０００×ｇ、１０分間、室温）にかけた。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、７５０μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶かした。この溶液に氷冷した７５０μＬの５Ｍ  ＬｉＣｌを加え、氷中に１０分間置いた。遠心（１７，０００×ｇ、５分間、４℃）によって不溶物を除き、上清に等容量のイソプロパノールを加え、遠心（１７，０００×ｇ、５分間、室温）によって沈殿を得た。この沈殿を７０％エタノールでリンスし、１２５μＬのＴＥバッファーに溶かし、０．２５μＬの１０ｍｇ／ｍＬリボヌクレアーゼＡを加え、室温に３０分間置いた。これに１３％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ８０００を含む１２５μＬの１．６Ｍ  ＮａＣｌを加えて良く攪拌し、遠心（１７，０００×ｇ、５分間、４℃）によって沈殿を得た。この沈殿を２００μＬのＴＥバッファーに溶かし、フェノール／クロロホルム抽出を行い、５０μＬの１０Ｍ酢酸アンモニウムと５００μＬのエタノールを加え、室温に１０分間置き、遠心（１７，０００×ｇ、５分間、４℃）によって沈殿を得た。この沈殿を７０％エタノールでリンスし、２００μＬのＴＥバッファーに溶かし、プラスミド溶液を調製した。このプラスミドの挿入ＤＮＡ部分の塩基配列を、オートシークエンサーを用いて、ジデオキシ法によって分析した。その結果、配列番号８の塩基配列が得られた。この塩基配列中には、ＰｓｔＩ部位（４９９番目塩基）とＢａｍＨＩ部位（６４６番目塩基）が見出された。
（５）ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのジゴキシゲニン標識
工程（３）で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡを、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、次のようにしてジゴキシゲニン標識した。１５μＬのＰＣＲ増幅ＤＮＡ（６００ｎｇ）をエッペンドルフチューブに取り、沸騰水中で１０分間処理し熱変性させた後、氷中で急冷した。これに２μＬのヘキサヌクレオチド混合液、２μＬのｄＮＴＰ標識混合液、及び１μＬのクレノウ酵素を加え、３７℃で一晩反応させた。これに２μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え反応を停止させ、２８μＬのＴＥバッファーを加え、−２０℃で保存した。
（６）ニトリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの調製
工程（２）で得られた２μｇの染色体ＤＮＡ、５μＬの１０倍濃度Ｍバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ）、５０ＵのＨｉｎｄＩＩＩをエッペンドルフチューブに取り、Ｈ２Ｏを加えて５０μＬにした。３７℃で２時間反応させた後、１μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った。エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した後、２０μＬのＴＥバッファーに溶かした。このうちの１０μＬを０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡのサイズマーカーとして、λファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物をジゴキシゲニンで標識したもの（ジゴキシゲニン標識ＤＮＡ分子量マーカーＩＩ；ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた。
電気泳動後、アガロースゲルを変性溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に浸し、１５分間ゆっくり振盪し、液を換えてこの操作をもう１回行った。次に、サザントランスファー用中和バッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、３Ｍ  ＮａＣｌ）に浸し、１５分間ゆっくり振盪し、液を換えてこの操作をもう１回行った。このようにして準備したアガロースゲルから、２０×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を用いて、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャム  ファルマシア  バイオテク）に、キャピラリー法によってＤＮＡをトランスファーした。トランスファー後、ナイロンメンブレンを風乾し、２枚の濾紙の間に挟んで８０℃で２時間ベーキングし、ＤＮＡを固定した。
ジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡとのハイブリダイゼーション及び検出は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、次のようにして行った。ベーキングしたナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグに入れ、５０μｇ／ｍＬサカナ精子ＤＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティクス）を含む６ｍＬの高ＳＤＳ濃度ハイブリダイゼーションバッファー（７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム［ｐＨ７．０］、及び０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）を加え、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後液を捨て、５μＬのジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（工程（５）で調製されたものを沸騰水中で５分間処理し熱変性した後、氷中で急冷したもの）を含む１ｍＬの高ＳＤＳ濃度ハイブリダイゼーションバッファーを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグから出し、０．１％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用いて、室温で５分間２回洗浄した。続いて、０．１％  ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣを用いて、６８℃で１５分間２回洗浄した。このナイロンメンブレンを０．３％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍマレイン酸；１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整したもの）で１分間リンスし、ブロッキング溶液（１％ブロッキング試薬を含むマレイン酸バッファー）中で３０分間ゆっくり振盪し、次に、０．０２％（Ｖ／Ｖ）アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体を含むブロッキング溶液中で３０分間ゆっくり振盪した。その後、０．３％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファーで、１５分間２回洗浄し、検出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．５］、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に２分間浸し平衡化した。このナイロンメンブレンを発色基質溶液（２００μＬのＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液を含む１０ｍＬの検出バッファー）に浸し、暗下に１時間置き、バンドの発色を確認した後、ＴＥバッファーで洗浄し、風乾した。染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物において、ジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡフラグメントは、５．５５ｋｂと４．２５ｋｂの大きさであった。
工程（２）で得られた４０μｇの染色体ＤＮＡ、４０μＬの１０倍濃度Ｍバッファー、４００ＵのＨｉｎｄＩＩＩをエッペンドルフチューブに取り、Ｈ２Ｏを加えて４００μＬにした。３７℃で２時間反応させた後、８μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った。エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した後、１００μＬのＴＥバッファーに溶かし、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。５．５５ｋｂと４．２５ｋｂのＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、それぞれのゲル切片から、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン）によってＤＮＡを抽出した。
（７）組換え体ＤＮＡの作製と選別
１．５μｇのｐＵＣ１８、２０μＬの１０倍濃度Ｍバッファー、及び５０ＵのＨｉｎｄＩＩＩをエッペンドルフチューブに取り、Ｈ２Ｏを加えて２００μＬにした。３７℃で１時間反応させた後、６５℃で１５分間熱処理し、酵素を失活させた。これに２７μＬの１０倍濃度脱リン酸化バッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、３０μＬ（３０Ｕ）のシュリンプアルカリホスファターゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、及び１３μＬのＨ２Ｏを加えて、３７℃で３０分間反応させた後、６５℃で１５分間熱処理し、酵素を失活させた。これに５．４μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った。エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した後、３０μＬのＴＥバッファーに溶かした。
上記調製したクローニングベクターの１μＬと工程（６）で調製した５．５５ｋｂ又は４．２５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントの１９μＬを混合し、１０μＬのライゲーションハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ；東洋紡）を加え、１６℃で１時間反応させた。この反応液の５μＬを１００μＬの大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造）に加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間熱処理した。これを氷中で１分間冷却した後、９００μＬのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２０ｍＭグルコース）を加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの１００μＬを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。
コロニーが出現したプレートを、４℃に３０分間以上置き、冷却した。このプレート上に、ピンセットを用いてナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャム  ファルマシア  バイオテク）を乗せ、１分間経過後に剥がした。プレートは、３７℃でインキュベートし、コロニーを再生させ、４℃で保存した。ナイロンメンブレンは、コロニーの面を上にして、変性溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に浸した２枚の濾紙の上に置いた。１５分間静置した後、乾いた濾紙上に移し、余分な水分を吸い取った。次に、同様にコロニーの面を上にして、コロニーハイブリダイゼーション用中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に浸した２枚の濾紙の上に置いた。１５分間静置した後、乾いた濾紙上に移し、余分な水分を吸い取った。その後、２×ＳＳＣ（３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）に浸した２枚の濾紙の上に置き、１０分間静置した。乾いた濾紙上で、３０分間風乾させ、８０℃で２時間ベーキングを行い、ＤＮＡをナイロンメンブレンに固定した。このナイロンメンブレンを、２×ＳＳＣ中に５分間浸した後、プレ洗浄溶液（５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に浸し、５０℃で３０分間振盪した。ナイロンメンブレン上のセルデブリスを、プレ洗浄溶液に浸したキムワイプを用いて拭き取り、２×ＳＳＣで２回洗浄した。
上記ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグに入れ、５０μｇ／ｍＬサカナ精子ＤＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む１０ｍＬのホルムアミド含有標準ハイブリダイゼーションバッファー（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬、０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、０．０２％  ＳＤＳ）を加え、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、液を捨て、１０μＬのジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（工程（５）で調製されたものを沸騰水中で５分間処理し熱変性した後、氷中で急冷したもの）を含む２ｍＬのホルムアミド含有標準ハイブリダイゼーションバッファーを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグから出し、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用いて、室温で５分間２回洗浄した。続いて、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣを用いて、６８℃で１５分間２回洗浄した。このナイロンメンブレンを０．３％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  マレイン酸；１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整したもの）で１分間リンスし、ブロッキング溶液（１％ブロッキング試薬を含むマレイン酸バッファー）中で３０分間ゆっくり振盪し、次に、０．０２％（Ｖ／Ｖ）アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体を含むブロッキング溶液中で３０分間ゆっくり振盪した。その後、０．３％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファーで、１５分間２回洗浄し、検出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に２分間浸し平衡化した。このナイロンメンブレンを発色基質溶液（２００μＬのＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液を含む１０ｍＬの検出バッファー）に浸し、暗下に数時間置き、コロニーの発色を確認した後、ＴＥバッファーで洗浄し、風乾した。このコロニーハイブリダイゼーションによって陽性と判断されたコロニーを保存プレートから拾い上げ、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液から菌体を回収し、工程（４）で用いた方法によって、プラスミドを調製した。
（８）ニトリラーゼ遺伝子領域の特定と塩基配列の決定
上記調製したプラスミドをいくつかの制限酵素で消化し、制限酵素地図を作成した。その結果、５．５５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントを含むもの（ｐＡＮＨ５Ｒと命名）は図１に示される構造、４．２５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントを含むもの（ｐＡＮＨ４Ｒと命名）は図２に示される構造であることが明らかになった。約１５０ｂｐだけ離れて存在するＰｓｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位の位置から、ニトリラーゼ遺伝子の位置と方向が推定された。これらの遺伝子領域周辺の塩基配列を、オートシークエンサーを用いて、ジデオキシ法によって分析した。その結果、５．５５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントのＳｍａＩ部位（３．５３ｋｂ位置）からＨｉｎｄＩＩＩ部位（５．５５ｋｂ位置）までの塩基配列が配列番号９に示したように決定された。また、４．２５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントのＳａｃＩ部位（３．１５ｋｂ位置）からＨｉｎｄＩＩＩ部位（４．２５ｋｂ位置）までの塩基配列が配列番号１０に示したように決定された。
配列番号９の塩基配列においては、８３９番目塩基に始まり２，０２０番目塩基で終わるオープンリーディングフレームが見出され、９４１番目塩基以降の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が、ニトリラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸配列）と一致した。したがって、９４１番目塩基から２，０２０番目塩基まで、すなわち、配列番号１に示した塩基配列が、ニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＡと命名）の塩基配列であることが明らかになった。このアースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４のニトリラーゼ遺伝子の塩基配列は、既知の他の微生物のニトリラーゼ遺伝子の塩基配列と５０〜６０％のホモロジーを有していた。すなわち、ゴルドナ・テラエ（Ｇｏｒｄｏｎａ  ｔｅｒｒａｅ）ＭＡ−１とは、１，０１３塩基中６０．１％（特開平９−３７７８８号公報）、ロドコッカス・ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｋ２２とは、１，０６２塩基中５９．４％（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：９０００−９００７，１９９２）、ロドコッカス・ロドクロスＪ１とは、１，０４２塩基中６１．３％（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７４６−２０７５１，１９９２）、アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＪＭ３とは、１，０５４塩基中５７．８％（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２４７−２５１，１９９３）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＯｘＢ−１では、９６７塩基中５０．５％（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８００−８０９，２０００）、クレブシエラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅ）では、１，０４４塩基中５２．４％（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４，１９８８）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）では、１，０１６塩基中５０．２％（ＡＵ９４５３１６４）のホモロジーを有していた。
配列番号１の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列、すなわち、ニトリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２に示した通りであった。このアースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４のニトリラーゼのアミノ酸配列は、既知の他の微生物のニトリラーゼのアミノ酸配列と３９〜５３％のホモロジーを有していた。すなわち、ゴルドナ・テラエ（Ｇｏｒｄｏｎａ  ｔｅｒｒａｅ）ＭＡ−１とは、３３０アミノ酸残基中５２．７％（特開平９−３７７８８号公報）、ロドコッカス・ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｋ２２とは、３１２アミノ酸残基中５１．３％（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：９０００−９００７，１９９２）、ロドコッカス・ロドクロスＪ１とは、３４３アミノ酸残基中４７．５％（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７４６−２０７５１，１９９２）、アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＪＭ３とは、３５０アミノ酸残基中４６．９％（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２４７−２５１，１９９３）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＯｘＢ−１では、３２３アミノ酸残基中４０．６％（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８００−８０９，２０００）、クレブシエラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅ）では、３４７アミノ酸残基中３９．５％（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４，１９８８）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）では、３２０アミノ酸残基中３８．８％（ＡＵ９４５３１６４）のホモロジーを有していた。
配列番号１０の塩基配列においては、３１１番目塩基に始まり１，１０２番目塩基で終わるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１１）は、ニトリラーゼのＮ末端から９７番目のＭｅｔ残基以降のアミノ酸配列と完全に一致した。したがって、このオープンリーディングフレームは、Ｎ末端側が欠失したニトリラーゼの遺伝子（ｎｉｔＢと命名）であると考えられる。
産業上の利用可能性
遺伝子組換えによってニトリラーゼ遺伝子をクローニングすることにより、細胞内での同遺伝子の発現を人為的に改良することが容易になり、微生物の触媒能力を増大させることができると期待される。
【配列表】
2003014355.tif 000002
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2003014355.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＡ）を含むプラスミドｐＡＮＨ５Ｒの制限酵素地図を示す図である。
第２図は本発明のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＢ）を含むプラスミドｐＡＮＨ４Ｒの制限酵素地図を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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