(57)【要約】組織培養に際し、培養装置内の雰囲気を加湿するに際し、細菌透過制御を容易に確保するための簡便な手段とエアーの循環に際し細菌透過制御を容易に確保するための簡便な手段を提供することを課題とし、その解決手段は、組織培養装置であって、以下の少なくとも１の要素を備えた装置；１）組織培養装置への湿度供給手段であって、組織培養装置内の湿度を過飽和状態に保つために約３７℃の温度条件下で水の自然蒸発が可能であり、組織培養のための雰囲気と本湿度供給手段内の水とが細菌透過制御性の膜で隔てられ、本湿度供給手段内に水の補充が可能である組織培養用加湿装置の設置。２）クロスコンタミネーションの防止対策として、装置のエアー吸引口と排気口に、溶菌酵素を固定化した細菌透過制御性の膜の設置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織培養装置であって、以下の少なくとも１の要素を備えた装置；
１）組織培養装置への湿度供給手段であって、組織培養装置内の湿度を過飽和状態に保つために約３７℃の温度条件下で水の自然蒸発が可能であり、組織培養のための雰囲気と本湿度供給手段内の水とが細菌透過制御性の膜で隔てられ、本湿度供給手段内に水の補充が可能である組織培養用加湿装置の設置。
２）クロスコンタミネーションの防止対策として、装置のエアー吸引口と排気口に、溶菌酵素を固定化した細菌透過制御性の膜の設置。
【請求項２】
細菌透過制御性の膜が、口径０．４５ミクロン以下である請求の範囲第１項記載の組織培養用装置。
【請求項３】
溶菌酵素が、空気中に通常存在する微生物を対象として溶菌スペクトルが設計される請求の範囲第１項〜第２項の何れか一に記載の装置。
【請求項４】
組織培養用加湿装置と組織培養装置が、分離可能である請求の範囲第１項〜第３項の何れか一に記載の組織培養用装置。
【請求項５】
組織培養用加湿装置と組織培養装置が、一体化されている請求の範囲第１項〜第３項の何れか一に記載の組織培養用装置。
【請求項６】
請求の範囲第４項の組織培養用加湿装置を、組織培養装置内にセットする組織培養方法。
【請求項７】
請求の範囲第５項の組織培養用加湿装置と組織培養装置が一体化した装置による組織培養方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号２００２−１６５２２５号からの優先権を請求する。
技術分野
本発明は、より一層の微生物汚染が制御された組織培養のための装置に関し、より詳細には、加湿手段及び空気流通手段の改良に関する。さらに詳しくは、組織培養装置内の湿度を過飽和に保つための手段と流入空気の細菌透過制御を可能にする手段を導入した組織培養用装置（（ＣＯ２インキュベーター）に関する。
背景技術
組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）を使用して、ヒト細胞を始め哺乳動物細胞等の組織培養がさかんに行われている。組織培養とは、ヒトや動物の組織、臓器、リンパ細胞を分離して、フラスコやシャーレ等の培養容器にて、細胞を増殖させる方法である。通常培養フラスコ、シャーレにはヒト由来細胞のほか、メディウム液（培地）と牛由来血清などを入れて細胞の増殖を行う。培養の条件としては、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度過飽和が一般的である。
組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）は、培養条件環境を維持するため開発された装置であり、例えば温度は、哺乳動物細胞が生理的に必要な増殖条件である。
ＣＯ２濃度は、細胞が増殖に必要な培養液のｐＨを安定に維持することを目的にしている。培養液中の水素イオン濃度を調整するため、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を添加することで、２ＮａＨＣＯ３⇔Ｎａ２ＣＯ３＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２となる。ＣＯ２が放出されると、Ｎａ２ＣＯ３濃度が増し培養液中のｐＨは７．４以上となり、細胞の培養にとって障害となる。これを防止するために組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）にＣＯ２ガスを供給することでＮａ２ＣＯ３はＮａＨＣＯ３に戻り、培養液中のｐＨは７．１から７．４にて平衡化することが可能となる。
培養フラスコの蓋は、培養装置内のＣＯ２ガスを培養フラスコに供給するために閉めずに空気の出入りがあるよう、緩めておく必要がある。この時培養フラスコよりメディウムの水分が蒸発することで、培地の塩濃度が変わり細胞培養環境に著しい影響をおよぼす。この乾燥を防ぐ目的で、組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）の内部を加湿する必要がある。
通常の加湿方法は、組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）内のバットに水を入れ自然蒸発にて培養装置内を過飽和状態にするのが一般的である。しかし組織培養温度条件が３７℃であるため、バットに入っている水は通常カビや細菌に汚染されている。組織培養フラスコ中には、細胞の増殖に必要な栄養成分を多く含んでおり、これら雑菌が培養フラスコに混入することで重大な汚染を発生させ、動物細胞を死滅させる危険がある。
組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）の中は、雑菌が繁殖している蒸発バットと無菌性を要求されている培養フラスコとが同居している状態である。
また、組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）へは、エアーの循環も必要であり、これを格別の装置によって供給することは費用面で大きな負担となる。そのため、空気の流入において細菌透過制御を施した手段を用いれば安価に目的を達成できる。
発明の開示
（解決しようとする課題）
本発明の課題は、組織培養に際し、培養装置内の雰囲気を加湿するに際し、加湿にともなう微生物汚染を容易に防止するための簡便な手段及び／又は培養装置への空気の流入に細菌透過制御を施した簡便な手段を提供しようとするものである。
（解決する手段）
本発明は、
１．組織培養装置であって、以下の少なくとも１の要素を備えた装置；
１）組織培養装置への湿度供給手段であって、組織培養装置内の湿度を過飽和状態に保つために約３７℃の温度条件下で水の自然蒸発が可能であり、組織培養のための雰囲気と本湿度供給手段内の水とが細菌透過制御性の膜で隔てられ、本湿度供給手段内に水の補充が可能である組織培養用加湿装置の設置。
２）クロスコンタミネーションの防止対策として、装置のエアー吸引口と排気口に、溶菌酵素を固定化した細菌透過制御性の膜の設置。
２．細菌透過制御性の膜が、口径０．４５ミクロン以下である前項１に記載の組織培養用装置。
３．溶菌酵素が、空気中に通常存在する微生物を対象として溶菌スペクトルが設計される前項１〜２の何れか一に記載の装置。
４．組織培養用加湿装置と組織培養装置が、分離可能である前項１〜３の何れか一に記載の組織培養用装置。
５．組職培養用加湿装置と組織培養装置が一体化されている前項１〜３の何れか一に記載の組織培養用装置。
６．前項４の組織培養用加湿装置を、組織培養装置内にセットする組織培養方法。
７．前項５の組織培養用加湿装置と組織培養装置が一体化した装置による組織培養方法。
からなる。
発明を実施するための最良の形態
本発明の一の手段は、組織培養装置（ＣＯ２インキュベーター）内の湿度を蒸発バットを使用せず加湿する方法として、蒸発用の水の入った容器の蓋に細菌透過制御性の膜（メンブラン）を張ることで容器内への加湿に際しての汚染防止が達成され、同時に培養フラスコへの細菌、カビの感染を予防することを可能としたものである。
本発明の一は、組織培養装置であって、湿度供給手段を担持するものである。組織培養は、広くヒト細胞、哺乳動物細胞等が対象となり格別限定されるものではない。組織培養装置とは、所謂ＣＯ２インキュベーターを意味し、ＣＯ２の雰囲気下で組織・細胞を培養するための装置である。一般的に、組織・細胞の培養は、培養フラスコを使い培地上で行われる。この培地の乾燥をふせぐために、培養装置内の湿度は過飽和状態に保たれる。培養容器内の温度は、一般的に約３７℃の恒温状態が保持されるため、この温度条件下で水が自然蒸発し、組織培養装置内を過飽和状態することが必要である。そして、組織培養のための雰囲気（培養フラスコ及び培養装置内の雰囲気）と本発明の湿度供給手段内の水は、細菌透過制御性の膜で隔てられいる。さらに、本湿度供給手段内には、水の補充が可能であり、蒸発に応じて漸次追加されることが可能である。
本発明において、細菌透過制御性の膜とは、細菌、カビ等の微生物が、例え水に、湿度供給手段に、又は加湿装置内に夾雑していても、これらを通過させない口径であるが、蒸発水分の通過は可能とする膜を意味する。その膜の口径は一般的な除菌膜の口径である０．４５好ましくは０．２ミクロン以下が好適である。この口径は、水分供給効果と除菌の完全性の効率を判断して随時変更可能である。
本発明の手段は、組織培養用加湿装置と組織培養装置が、分離可能であることが簡便で、取り扱いも容易であり、製造も安価に可能であり、好ましい。分離可能とは、従前と同様に、水分補給用バットの代わりに本発明からなる加湿装置を組織培養装置内にセットすることを意味する。このようにして、本発明の組織培養用加湿装置を、組織培養装置内にセットする組織培養方法が可能となる。
また、本発明の別の手段は、組織培養用加湿装置と組織培養装置が一体化されていてもよい。組織培養装置に予め加湿装置を備え付けておけばよく、追加の水の補給も組織培養装置外部から可能にする態様は極めて好ましい。かくして、組織培養用加湿装置と組織培養装置が一体化した装置による組織培養方法が可能となる。
本発明のその他の手段は、クロスコンタミネーションの防止対策として、装置のエアー吸引口と排気口に、溶菌酵素を固定化した細菌透過制御性の膜が設置される。細菌透過制御性の膜とは、細菌、カビ等の微生物が、これらを通過しない口径であるが、空気の通過は可能とする膜を意味する。その膜の口径は一般的な除菌膜の口径である０．４５好ましくは０．２ミクロン以下が好適である。本膜には、溶菌酵素が、空気中に通常存在する微生物を対象として溶菌スペクトルが設計され選択され、固定化される。固定化手段は、無機質と有機質を結びつける一般的なシランカップリング剤でおこなわれるが、これに限定されない。市販の溶菌酵素を固定化した殺菌・酵素フィルターとしては近藤化学工業株式会社のものがある。このような膜を使えば、微生物がフィルターに捕捉された後、捕捉された微生物を酵素の作用で溶菌をしてしまうので装置内の汚染がより確実に簡便に防止が可能となる。
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
（実施例１）加湿容器
図１は、本発明の加湿容器の一例を示す。加湿容器の上部に市販のメンブランフィルターを張る付け、追加用の水取込み口を備えた加湿容器である。使用にあたっては、事前にガンマ線やオートクレーブ処理にて無菌処置を行った加湿容器に加湿用の滅菌水を入れる。加湿容器内の滅菌水は、加湿容器に張られたメンブランフィルターにより外部よりの雑菌の混入がなく無菌を維持した状態である。又、加湿容器内の無菌水は、蒸気となってメンブランフィルターを通過してＣＯ２インキュベーター内に拡散し、培養装置内を加湿する。図３は、本装置を使っての湿度復帰実験を示す。約１０分で、３０％程度までさがった湿度が一定値に復帰し、十分実用に供せることを確認した。
（実施例２）落下菌のコロニー数によるＣＯ２インキュベーターの性能試験
口径０．２ミクロンのメンブランフィルター（モデルＮＨ５４２０  ＨＥＰＡ）を使い、加湿装置を準備し、無菌化処理後、滅菌水を充填し、ＣＯ２インキュベーター内にセットした。コントロールとして別のＣＯ２インキュベーターには、メンブランフィルター無しの加湿装置をセットした。インキュベータ内に棚を上段、中段、下段設置し、トリプトソーヤ寒天培地（ニッスイプレート、９ｃｍシャーレ）をそれぞれ前後２枚計４枚づつ配置した。シャーレの蓋を１時間解放後、蓋を閉じ、培養後のコローニー数を測定した。培養開始後、各２、３、５、７、１０週目すると、本発明のメンブランフィルーターを使用した群は１０週目でも無菌であったが、コントロール群は２週目でも雑菌が認められ、３週目目にはさらに菌の増殖が確認された。表１は、その結果をコロニー数で示したものである。
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（実施例３）
図２は、加湿容器と溶菌酵素を固定化した殺菌・酵素フィルター（Ｎ１−１ＥＵ−１１ＯＳ）を装着した、ＣＯ２インキュベーターを示し、図中ヘパフィルターと表示した。このフィルターを装着した装置を使い、実施例２の実験を同様におこなったところ、雑菌の増殖は有意に抑制されていた。
産業上の利用の可能性
本発明は、極めて効率的に微生物汚染制御状態で加湿処理・空気循環可能な手段を提供でき、組織培養の実用上に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、加湿装置概略を示す。
第２図は、溶菌酵素を固定化した殺菌・酵素フィルター（図中ヘパフィルターと表示）を装着した、ＣＯ２インキュベーターを示す。
第３図は、加湿容器による湿度復帰実験を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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