(57)【要約】ササエキスを含有する抗破傷風菌剤、ササエキス及び有機酸を含有する抗カビ剤、ササエキスを含有する抗ウイルス剤、ササタンニンを含有する抗菌剤、ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ササエキスを含有する抗破傷風菌剤。
【請求項２】
ササエキスを含有する抗カビ剤。
【請求項３】
さらに有機酸を含有する請求項２記載の抗カビ剤。
【請求項４】
カビがカンジダである請求項３記載の抗カビ剤。
【請求項５】
ササエキスを含有する抗ウイルス剤。
【請求項６】
ササタンニンを含有する抗菌剤。
【請求項７】
黄色ブドウ球菌、プロピオニバクテリウム、大腸菌に対する抗菌剤である請求項６記載の抗菌剤。
【請求項８】
ＭＲＳＡに対する抗菌剤である請求項６記載の抗菌剤。
【請求項９】
プロピオニバクテリウムアクネスに対する抗菌剤である請求項６記載の抗菌剤。
【請求項１０】
ササタンニンを含有するニキビ治療剤。
【請求項１１】
ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物。
【請求項１２】
インキ、塗料、食品添加物、飲料、調味料、ペットフード、プラスチック成形品、又は接着剤である請求項１１記載の抗菌性組成物。
【請求項１３】
ササエキスを含有するガス壊疽菌に対する抗菌剤。
【請求項１４】
ガス壊疽菌がクロストリジウム属菌である請求項１３記載の抗菌剤。
【請求項１５】
ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陽性球菌に対する抗菌剤。
【請求項１６】
無芽胞嫌気性グラム陽性球菌がＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏ  ｃｃｕｓ，Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ，又はＧｅｍｅｌｌａである請求項１５記載の抗菌剤。
【請求項１７】
ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌に対する抗菌剤。
【請求項１８】
無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌がＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ，Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｖｒｉｏ、又はＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである請求項１７記載の抗菌剤。
【請求項１９】
ササエキスを含有する膣炎および細菌性膣症関連微生物に対する抗菌剤。
【請求項２０】
さらに有機酸を含有する請求項１３〜１９のいずれか１項記載の抗菌剤。
【請求項２１】
ササエキスを含有する調味料。
【請求項２２】
ササエキスを含有する食塩である請求項２１記載の調味料。
【請求項２３】
さらに有機酸を含有する請求項２１又は２２記載の調味料。
【請求項２４】
ササエキスを含有する農薬。
【請求項２５】
さらに有機酸を含有する請求項２４記載の農薬。
【請求項２６】
ササエキスを含有する農業用殺菌剤。
【請求項２７】
さらに有機酸を含有する請求項２６記載の農業用殺菌剤。
【請求項２８】
ササエキスを含有する防腐剤。
【請求項２９】
さらに有機酸を含有する請求項２８記載の防腐剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ササエキスを含有する抗菌剤に関し、さらに詳細には、ササエキスを含有する抗破傷風菌剤、抗カビ剤、抗ウイルス剤及び抗菌性組成物に関する。
背景技術
ササエキスは古くから抗菌性を有することが知られている。例えば、創傷感染症の原因菌となる細菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に対する抗菌効果や、胃潰瘍の原因菌とされるピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に対する抗菌効果が報告されている。
しかし、創傷感染症の原因菌として、破傷風、ガス壊疽、各種化膿性感染症の原因となる有芽胞および無芽胞嫌気性菌も重要な存在であるが、これら嫌気性菌に対する抗菌作用についての検討はいまだみられない。
抗菌力を有する物質を評価する際には、その物質の人の病原菌に対する作用とともに皮膚、粘膜に常在する有用あるいは日和見細菌に対する作用を知っておくことは、極めて重要である。
ところで、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．は、口腔内、消化管内、膣内の常在細菌として知られている。常在細菌の生体に対する作用には二面性があることは周知のところである。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．も、血液を含む臨床材料から分離されることがあり、病原的意義も決して過少評価すべきではないが、その分離頻度は極めて低率であることから、それぞれの解剖学的部位で有用性が高い細菌種と考えられている。人に対して有用性の高い菌群と評価されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．に対して、ササエキスがどの程度の抗菌作用を有するかはきわめて興味ある点であるが、これまでその詳細な検討成績はみられない。
ところで、皮膚の皮脂腺内に常在するＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓは、嫌気性無芽胞嫌気性菌で、中等症から重症のＡｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ざそう）において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓやＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどとともにＡｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増悪因子として知られている。現在、Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓの治療には、これまで抗菌薬（エリスロマイシン、テトラサイクリン、ナジフロキサシン）のクリーム、ローションが使用されているが、それらの長期の使用によるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ｓｐｐ．やＰ．ａｃｎｅｓの耐性化が臨床上問題になっており、世界的にその対策について議論されているところである。ササエキスのＰ．ａｃｎｅｓについての検討成績は見あたらない。
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａやＰｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、健常な女性の膣では検出限界以下の菌数でしか存在しないが、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ｈｏｍｍｎｉｓ）、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓを中心とする嫌気性グラム陽性球菌、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．などとともに、膣内乳酸菌の減少、膣内ｐＨの低下、およびミルク様で悪臭（アミン臭）のある帯下を特徴とする細菌性膣症（ＢＶ）の状態で異常に増加する細菌性膣症（ＢＶ）関連微生物の範疇に入る偏性嫌気性グラム陰性桿菌で、子宮内、骨盤内感染症の原因菌としても極めて重要な細菌である。
ササエキスには抗菌作用があることが知られているが、これまでこれらのＢＶ関連細菌群菌種に対する抗菌作用の検討は全くみられない。
このように、ササエキスが全ての細菌に対して有効な抗菌活性を有するかどうかは知られていないし、細菌に対して抗菌活性を有する天然抽出物がカンジダ等のカビに対しても抗菌活性を有するかどうかは一般に知られていない。
一方、破傷風は、破傷風菌が創傷部位に感染し、そこで産生された神経毒素がおもに筋のけいれん、硬直、腱反射亢進を起す致命率の高い毒素性疾患である。破傷風菌は土、ヒト、動物の便に検出される嫌気性桿菌であり、破傷風の予防治療にはトキソイドによる自動免疫、抗毒素血清による受動免疫が有効であるとされている。しかし、ササエキスが破傷風菌に対して抗菌活性を有することは知られていない。
また、ウイルスは自己増殖不能で動植物や微生物に寄生増殖する極微小な病原体であり、動物ウイルス、植物ウイルス、微生物ウイルスに分けられる。ウイルス性疾患の予防治療用の種々の抗ウイルス剤が開発されているが、なお、副作用のない有効な抗ウイルス活性を有する薬剤が求められている。
また、各種の植物に含まれるタンニンが抗菌作用を有することも知られている。例えば、ササ以外の植物由来のタンニンがＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）に対する抗菌作用を有することも知られているが、副作用が大きいために抗菌剤として使用することができないという問題がある。
発明の開示
従って本発明の目的は、抗菌剤を提供することであり、さらに具体的には、抗破傷風菌剤、抗カビ剤及び抗ウイルス剤を提供することである。
本発明の他の目的は、抗菌性組成物を提供することである。
本発明はササエキスを含有する以下の抗菌剤、抗菌性組成物を提供するものである。
１．ササエキスを含有する抗破傷風菌剤。
２．ササエキスを含有する抗カビ剤。
３．さらに有機酸を含有する上記２記載の抗カビ剤。
４．カビがカンジダである上記３記載の抗カビ剤。
５．ササエキスを含有する抗ウイルス剤。
６．ササタンニンを含有する抗菌剤。
７．黄色ブドウ球菌、プロピオニバクテリウム、大腸菌に対する抗菌剤である上記６記載の抗菌剤。
８．ＭＲＳＡに対する抗菌剤である上記６記載の抗菌剤。
９．プロピオニバクテリウムアクネスに対する抗菌剤である上記６記載の抗菌剤。
１０．ササタンニンを含有するニキビ治療剤。
１１．ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物。
１２．インキ、塗料、食品添加物、飲料、調味料、ペットフード、プラスチック成形品、又は接着剤である上記１１記載の抗菌性組成物。
１３．ササエキスを含有するガス壊疽菌に対する抗菌剤。
１４．ガス壊疽菌がクロストリジウム属菌である上記１３記載の抗菌剤。
１５．ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陽性球菌に対する抗菌剤。
１６．無芽胞嫌気性グラム陽性球菌がＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ，又はＧｅｍｅｌｌａである上記１５記載の抗菌剤。
１７．ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌に対する抗菌剤。
１８．無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌がＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ，Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｖｒｉｏ、又はＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである上記１７記載の抗菌剤。
１９．ササエキスを含有する膣炎および細菌性膣症関連微生物に対する抗菌剤。
２０．さらに有機酸を含有する上記１３〜１９のいずれか１項記載の抗菌剤。
２１．ササエキスを含有する調味料。
２２．ササエキスを含有する食塩である上記２１記載の調味料。
２３．さらに有機酸を含有する上記２１又は２２記載の調味料。
２４．ササエキスを含有する農薬。
２５．さらに有機酸を含有する上記２４記載の農薬。
２６．ササエキスを含有する農業用殺菌剤。
２７．さらに有機酸を含有する上記２６記載の農業用殺菌剤。
２８．ササエキスを含有する防腐剤。
２９．さらに有機酸を含有する上記２８記載の防腐剤。
以下、この明細書において抗破傷風菌剤、抗カビ剤、抗ウイルス剤、ニキビ治療剤等を総称して単に「抗菌剤」と称することもある。
また、この明細書において「抗菌剤」とは、ヒト以外に使用される抗菌剤、防腐剤も包含するものとする。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、有効成分としてササエキスを含有する抗菌剤である。本発明の抗菌剤は、ササエキスを固形分で１〜５０質量％、好ましくは２〜２５質量％、さらに好ましくは４〜１５質量％含有する。ササエキスの固形分濃度が１質量％未満では目的とする抗菌性の発現が不充分であり、一方、５０質量％を超えると、刺激が強くなり過ぎて好ましくない。
従来、ササエキスは、通常０．５〜１０質量％の固形分を含有するエキスとして製造され、種々の用途に利用されてきた。この固形分濃度のものを通常は最終製品に対して１〜１０質量％程度添加して使用しているため、最終製品中のササエキスの固形分濃度は通常０．０５〜０．８質量％程度であり、最も高濃度のものでも１質量％未満程度であった。その理由としては、ササエキスが比較的高価であること、このような低濃度でも、ある程度の消炎効果や抗菌効果が発現していたこと、有効成分の添加量を１０質量％以上とすることは常識的ではないこと等が挙げられる。しかし、このような低濃度では、抗菌効果が充分なものではない場合が多かった。
本発明者は、ササエキスを固形分濃度で１〜１０質量％、好ましくは２〜８質量％、さらに好ましくは３〜７質量％含有させることにより、従来の低濃度の場合にはほとんど認められなかったアトピー等に対する改善効果、止痒効果が顕著に発現し、また創傷治癒効果も著しく向上することを見出した（ＷＯ  ０２／０７７４５）。本発明者は、さらにササエキスの各種菌類に対する抗菌効果を探索し、ササエキスを固形分で１〜５０質量％、好ましくは２〜２５質量％、さらに好ましくは４〜１５質量％含有するものが、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌等以外の菌、すなわち破傷風菌等の嫌気性菌、プロピオニバクテリウムアクネスを含むプロピオニバクテリウム、カンジダ等のカビ類、あるいはヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス等のウイルス等にも顕著な抗菌効果を有すること、ササエキスにリンゴ酸等の有機酸を含有させることにより、抗菌性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至ったものである。ササエキス自体は古くから知られているにも関わらず、これを高濃度で使用するという試みがこれまでになされなかった理由は定かではないが、従来の濃度より高濃度（１０倍以上）にすることにより、破傷風菌等の嫌気性菌、カンジダ等のカビ類、あるいはウイルス等にも顕著な抗菌効果を有することは全く驚くべきことである。
本発明は皮膚軟部組織感染症にも有効である。皮膚、骨、軟部組織が外傷、虚血、手術により損傷を受けると、嫌気性菌感染症に適した環境ができる。皮膚軟部組織感染症は糞便や上気道分泌物で汚染されやすい場所におこる。例えば、腸管手術と関係する創部、褥創、人による噛傷と関連する創傷がある。嫌気性菌は、ガス産生の見られる蜂窩織炎（ｃｒｅｐｉｔａｎｔ  ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ），相乗的蜂窩織炎（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ），壊疽（ｇａｎｇｒｅｎｅ）および壊死性筋膜炎の症例で分離される。さらに、嫌気性菌は皮膚の膿瘍、直腸膿瘍、そして、腋下汗腺感染症（化膿性汗腺炎）から分離される。嫌気性菌は糖尿病患者の足潰瘍からも頻繁に分離される。
皮膚軟部組織感染症は通常複数菌感染症である。平均すると症例あたり４．８菌種が分離されており、嫌気性菌と好気性菌の比率は３：２となる。分離頻度の高い細菌種は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．である。嫌気性菌がこれらの感染症に関係すると、発熱の頻度が高まり、患部に悪臭がみられるようになり、組織内にガスが、また、足には潰瘍がみられるようになる。
嫌気性菌と通性菌の相乗作用によっておこる壊疽（Ｍｅｌｅｎｅｙの壊疽）は、強烈な痛み、発赤、腫脹とそれに続いておこるｉｎｄｕｒａｔｉｏｎ（硬結）を特徴とする。紅斑が壊死帯を中心にして拡がる。肉芽性の潰瘍が、壊死と紅斑が外側に拡大するにつれて、中心部に形成されていく。症状は疼痛のみで、発熱は典型的な症状ではない。この感染症は、よく、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｓｐｐ．の組み合わせによっておこる。好発部位は腹部の手術創、下肢の潰瘍の周辺部である。治療は壊死組織の外科的除去と抗菌化学療法である。
壊死性筋膜炎という急速に広がる筋膜の破壊的な疾病はＡ群連鎖球菌によることが多いが、ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓやＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓのような嫌気性菌によっておこることもある。組織内にガスをみることもある。これと同様に、筋壊死も嫌気性菌と通性菌の混合感染症と関係している。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ壊疽は、陰嚢、会陰部、腹壁前部をおかす、複数の嫌気性菌が深部の筋膜面ｄｅｅｐ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｆａｃｉａｌ  ｐｌａｎｅｓにそって拡がっていき、広範な皮膚欠損をきたす蜂窩織炎である。
本発明は、ササエキスを含有する皮膚軟部組織感染症に対する治療及び／又は予防剤を提供するものである。
本発明はまた、ササエキスを含有するプロピオニバクテリウムアクネスを含むプロピオニバクテリウムに対する抗菌剤を提供するものである。
本発明者はササエキスの有効成分について、さらに検討した結果、ササエキス中に比較的多量に含まれるタンニンが優れた抗菌作用を有することを見出し本発明を完成するに至ったものである。従来、タンニンが抗菌作用を有することは報告されているが、これらのタンニンはいずれも副作用が大きいため実用化されたものは知られていない。ササエキス自体は古くから経口摂取され、人体に対する副作用を有していないことは知られている。このようなササエキス中にタンニンが比較的多量に含まれ、それが優れた抗菌作用を有することは全く予想されなかったことである。
本発明の抗菌剤の有効成分であるササエキスの原料として使用するササは、特に限定されず、ササ属（Ｓａｓａ）に属するすべてのササが例示される。例えば、クマイザサ、クマザサ、チシマザサ、オクヤマザサ、エゾミヤマザサ、チマキザサ、ヤヒコザサ、オオバザサ、ミヤマザサ、センダイザサ、ユカワザサ、アボイザサ、オヌカザサ等が挙げられる。これらのうち、市販品の具体例としてはクマイザサ、クマザサ（チュウゴクザサ、ヒダザサ）等が挙げられる。例えば、北海道天塩山系で７〜１０月に採取されたクマイザサ、クマザサの水抽出物等が好ましい。
本発明に使用するササエキスは、ササの生葉又は乾燥葉、好ましくは乾燥葉を、１００〜１８０℃の水で、常圧又は加圧抽出して得られるものが好ましい。
抽出方法は特に限定されないが、例えば、特許第３２１２２７８号（特開平１１−１９６８１８号公報）に記載された方法を使用することができる。さらに具体的には、加圧熱水抽出機により１００〜１８０℃、５〜３０分処理してエキスを抽出し、該エキスを水分分離器により含水固形分（含水率４０〜７０％）と分離し、次に飽和水蒸気加熱処理機により該含水固形分を１００℃〜２００℃で５分〜６０分処理した後、再度加圧熱水抽出機により１００℃〜１８０℃で５〜３０分処理してエキスを抽出させ、第１回目と第２回目のエキスを合わせて使用する。また、ササ乾燥葉を例えば、６０〜１００℃の水で３０分〜１２時間程度抽出して得られるエキスも使用できる。
ササエキスを固形分で５０質量％含有する市販品としては、株式会社クロロランド・モシリ製「ＡＨＳＳ」、株式会社鳳凰堂の「ＴＷＥＢＳ」がある。
こうして得られるササエキスは硫黄成分を含有しており、その含有量は硫黄に換算して、ササエキスの固形分１ｇあたり約４〜１０ｍｇ、通常は約６〜９ｍｇである。硫黄成分のうち主たる成分は含硫アミノ酸と考えられる。
本発明の抗菌剤は、ササエキス由来の硫黄成分を、硫黄に換算して１００ｇ当り、好ましくは４〜５００ｍｇ、さらに好ましくは８〜２５０ｍｇ、最も好ましくは１６〜１５０ｍｇ含有する。
また、ササエキスはタンニンを含んでおりその含有量はササエキスの固形分に対して５〜１５質量％程度である。
本発明の抗菌剤は、ササタンニンを固形分濃度で好ましくは０．０５〜７．５質量％、さらに好ましくは０．１〜６質量％含有することが望ましい。
本発明の抗菌剤は、ササエキスのみを有効成分とするものであっても良いし、これに適量の有機酸を併用することにより、その抗菌効果をさらに向上させることができる。このような有機酸としては、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酢酸、安息香酸、フェニル酢酸、サリチル酸、フェノール類等が挙げられる。
有機酸の使用量は、本発明の抗菌剤中、好ましくは０．０１〜５質量％、さらに好ましくは０．０２〜３質量％、最も好ましくは０．０５〜１．５質量％である。
本発明の抗菌剤は、ササエキスそのものでも良いし、これを他の成分、担体と混合しても良い。
本発明はササエキス又はササエキスと有機酸の混合物を含有する食塩、砂糖、醤油、味噌、ソース、マヨネーズ、酒、味醂、ドレッシング等の調味料等を提供するものである。例えば、ササエキス又はササエキスと有機酸の混合物を食塩に添加すると、食塩による魚類、肉類等の保存期間が各段に長くなるという効果がある。食塩に対するササエキスの添加量は、固形分で好ましくは１〜１０質量％、さらに好ましくは２〜８質量％、最も好ましくは３〜６質量％である。
本発明の抗菌剤の剤型は、液体状、固体状、気体状いずれでも良い。本発明の抗菌剤は、経口、非経口投与いずれの投与形態で投与してもよい。経口投与形態としては錠剤、丸剤、粉剤、液剤、チューインガム、飴、チョコレート、パン、クッキー、そば、うどん、各種ドリンク剤等の食品形態が、非経口投与形態としては、注射剤、局所投与剤（クリーム、軟膏等）、座薬等が挙げられる。局所投与剤の剤型の例としては、本発明の抗菌剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの、口紅等の化粧品に含有させたもの等が挙げられる。
本発明の抗菌剤は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類等用の抗菌剤としても有効である。従って本発明の抗菌剤は、これらの動物の用の抗菌剤（例えば、ペット用医薬、ペットフード等）として使用することができる。さらに本発明の抗菌剤は、動物以外に、各種植物に対する抗菌剤としても有用であり、また、防腐剤としても有用である。
本発明の種々の剤型の抗菌剤の製造には、所定量の上記ササエキスのほか、通常の医薬組成物、化粧品、皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、保湿剤、防腐剤等を使用することができる。
抗菌剤に使用する水は、水道水、天然水、精製水等、特に限定されないが、一般にイオン交換水等の高純度の水が好ましい。
油性成分としては、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋等の動物性油、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油（例えば、米胚芽油）等の植物性油、流動パラフィン、高級脂肪酸エステル（例えば、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル）、シリコーン油等の合成油、半合成油が挙げられる。
油性成分は、皮膚の保護、エモリエント性付与効果（皮膚表面を薄膜で覆い、乾燥を防ぐと共に、柔軟性、弾力性を与える効果）、さっぱり感等の要求性能に合わせて適宜組み合わせて用いられる。スクワラン、オリーブ油及びミリスチン酸オクチルドデシルの組合せは好ましい例の一つである。
抗菌剤の硬さ、流動性を調節するために、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、ワセリン等の固体油が用いられ、好ましくはステアリン酸とセタノールが組み合わせて用いられる。
本発明の抗菌剤をクリーム組成物として製造するためには、ササエキス、水、油性成分をクリーム状にするためのクリーム化剤が用いられる。クリーム化剤は、特に限定されないが、モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン酸グリセリン（モノステアリン酸グリセリンに乳化剤を添加したもの）とを組み合わせて使用するのが一般的である。
本発明の抗菌剤には、さらに必要に応じて安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤、界面活性剤等を含有させることができる。
安定化剤としては、カルボキシビニルポリマーと水酸化カリウムの組合せ、ジステアリン酸ポリエチレングリコール等が挙げられる。特に、セスキステアリン酸ポリエチレングリコール（ジステアリン酸ポリエチレングリコールとモノステアリン酸ポリエチレングリコールの１：１混合物）（ポリエチレングリコールの分子量は１０００〜２万）は、安定性が高く、水と油に分離することがなく、また、クリーム組成物として皮膚に塗布する際の硬さを効果的に調節することができるので好ましい。
保湿剤としては、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、アロエエキス（特に、木立アロエ由来のアロエエキス（２）が好ましい）、尿素、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、トレハロース、ソルビトール、アミノ酸、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等が挙げられる。
創傷治癒剤としては、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、カンゾウエキス、ヨモギエキス等が挙げられる。
防腐剤は、ササエキス自体に抗菌作用があるため補助的に用いられるものである。例えば、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル（例えば、メチル、エチル、プロピル又はブチルエステル等のパラベンと称されるもの）、プロピオン酸ナトリウム、混合脂肪酸エステル（カプリン酸グリセリル、ラウリン酸ポリグリセリル−２、ラウリン酸ポリグリセリル−１０の混合物）、フェノキシエタノール、感光素２０１号（黄色色素）、１，２−ペンタンジオール等が挙げられるが、パラベン、混合脂肪酸エステル、１，２−ペンタンジオールが好ましい。
界面活性剤としては、例えば、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等が挙げられる。
さらに必要により、香り成分、例えば、オレンジオイル、レモンオイル、トウヒ油、香料等を含有させてもよい。
以上の各成分に、水、及び必要により有機酸を加えて全体で１００質量％とする。
本発明の抗菌剤をクリーム組成物として製造する場合の各成分の好ましい配合量（質量％）を、以下の表１に示す。水分以外の各成分の配合量は水分を除いたものの質量％である。
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以上の各成分を、攪拌翼と好ましくは乳化器を備えた加熱混合釜に投入し、７０〜９０℃で１〜２時間攪拌混合し、本発明の抗菌剤を得る。
本発明の抗菌剤は、クリーム組成物の他、軟膏、液状、ジェル状、ゲル状、エアゾール、その他の形態で使用することができるが、クリーム組成物の形態が簡便で効果も大きい。また、シャンプー、ボディーソープ、洗顔フォーム等の半固体又は液体の形態としてもよい。
本発明の抗菌剤は、患部を清潔にした後、適量、例えば、クリーム組成物として適用する場合、皮膚１００ｃｍ２当たり０．１〜１ｇ程度を、１日１〜５回、通常は１〜３回程度塗布すればよい。塗布量、塗布回数は症状や創傷の程度に合わせ適宜増減すればよい。
本発明の抗菌剤は、経口摂取する場合、ササエキス固形分として体重１ｋｇ当たり０．０１〜０．１ｇ程度を１日１〜５回、通常は１〜３回程度摂取するのが適当である。摂取量、摂取回数は症状に合わせ適宜増減すればよい。
本発明の抗菌剤は、注射剤等として非経口摂取する場合、ササエキス固形分として体重１ｋｇ当たり０．０１〜０．１ｇ程度を１日１〜５回、通常は１〜３回程度摂取するのが適当である。摂取量、摂取回数は症状に合わせ適宜増減すればよい。
本発明の抗菌剤は、コンドーム等に塗布しておくことにより、性病やＨＩＶ感染等を予防し得る。
本発明の抗菌剤の有効成分であるササエキスは笹属の抽出物であり、その１．２５質量％水溶液はヒトの胎児腎臓由来の２９３細胞に対して毒性を示さない。
本発明の抗菌剤は、ササエキスを固形分で１〜５０質量％含有しており、破傷風菌、ガス壊疽を起すクロストリジウム属ガス壊疽菌群、カンジダ菌、白癬菌、ケカビ、クモノスカビ、アスペルギルス属菌、クリプトコッカス属菌、コクシジオイデス属菌、ヒトプラズマ属菌、ＭＲＳＡ等の抗生物質耐性菌、プロピオニバクテリウムアクネスを含むプロピオニバクテリウム属菌、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス等のウイルス等に対する顕著な抗菌効果を示す。
本発明の抗菌剤の好ましい実施態様は以下のとおりである。
１．ササエキス（固形分で１〜５０質量％）、水、油性成分及びクリーム化剤を含む抗菌剤。
２．油性成分が、動物性油、植物性油、合成油、及び半合成油からなる群から選ばれた少なくとも１種である上記１記載の抗菌剤。
３．油性成分が、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油、流動パラフィン、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、シリコーン油、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、及びワセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種である上記１記載の抗菌剤。
４．クリーム化剤が、モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン酸グリセリンとの組み合わせである上記１〜３のいずれか１項記載の抗菌剤。
５．さらに有機酸、安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤及び界面活性剤からなる群から選ばれた少なくとも１種の成分を含有する上記１〜４のいずれか１項記載の抗菌剤。
６．安定化剤が、カルボキシビニルポリマーと水酸化カリウムの組合せ、及びジステアリン酸ポリエチレングリコールからなる群から選ばれた少なくとも１種である上記５記載の抗菌剤。
７．保湿剤が、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、アロエエキス、尿素、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、トレハロース、ソルビトール、アミノ酸、及びピロリドンカルボン酸ナトリウムからなる群から選ばれた少なくとも１種である上記５記載の抗菌剤。
８．創傷治癒剤が、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、カンゾウエキス、及びヨモギエキスからなる群から選ばれた少なくとも１種である上記５記載の抗菌剤。
９．防腐剤が、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル、プロピオン酸ナトリウム、混合脂肪酸エステル、フェノキシエタノール、１，２−ペンタンジオール及び黄色色素からなる群から選ばれた少なくとも１種である上記５記載の抗菌剤。
１０．さらに、オレンジオイル、レモンオイル、トウヒ油、及び香料からなる群から選ばれた少なくとも１種の成分を含有する上記５記載の抗菌剤。
１１．ササエキス、水、油性成分、クリーム化剤、安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤及び界面活性剤を含有する抗菌剤において、油性成分が、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油、流動パラフィン、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、シリコーン油、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、及びワセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であり、クリーム化剤が、モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン酸グリセリンとの組み合わせであり、安定化剤が、カルボキシビニルポリマーと水酸化カリウムの組合せ、及びジステアリン酸ポリエチレングリコールからなる群から選ばれた少なくとも１種であり、保湿剤が、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、アロエエキス、尿素、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、トレハロース、ソルビトール、アミノ酸、及びピロリドンカルボン酸ナトリウムからなる群から選ばれた少なくとも１種であり、創傷治癒剤が、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、カンゾウエキス、及びヨモギエキスからなる群から選ばれた少なくとも１種であり、防腐剤が、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル、プロピオン酸ナトリウム、混合脂肪酸エステル、フェノキシタール、及び黄色色素からなる群から選ばれた少なくとも１種であり、界面活性剤がＮ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウムである上記抗菌剤。
１２．さらに、オレンジオイル、レモンオイル、トウヒ油、及び香料からなる群から選ばれた少なくとも１種の成分を含有する上記１１記載の抗菌剤。
１３．ササエキス、水、スクワラン、オリーブ油、モノステアリン酸グリセリン、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、カルボキシビニルポリマー、水酸化カリウム、尿素、１，３−ブチレングリコール、アラントイン、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル、ステアリン酸、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、レモンオイルを含有する上記１記載の抗菌剤。
１４．ササエキス、水、スクワラン、オリーブ油、ミリスチン酸オクチルドデシル、セタノール、モノステアリン酸グリセリン、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、カルボキシビニルポリマー、水酸化カリウム、尿素、１，３−ブチレングリコール、アラントイン、混合脂肪酸エステル、ステアリン酸、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、オレンジオイルを含有する上記１記載の抗菌剤。
１５．セスキステアリン酸ポリエチレングリコールを含有する上記１〜１４のいずれか１項記載の抗菌剤。
１６．有機酸が、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酢酸、安息香酸、フェニル酢酸、サリチル酸、及びフェノール類からなる群から選ばれたる少なくとも１種である上記１〜１５のいずれか１項記載の抗菌剤。
本発明はまた、ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物を提供するものである。本発明の抗菌性組成物として好ましい形態は、インキ、塗料、食品添加物、飲料、ペットフード、プラスチック成形品、及び接着剤が挙げられる。
これらの抗菌性組成物の素材として、食品添加物、飲料（清涼飲料水、果物ジュース、野菜ジュース、酒類（日本酒、ビール、発泡酒、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ワイン、ブランデー等））等の水性素材を使用する場合は、これらの素材に、ササエキス及び有機酸を添加、混合すれば良い。添加時期は、素材の製造前、製造中、製造後のいずれの段階であっても良い。ササエキス及び有機酸を添加した後、７０〜９０℃で１〜２時間攪拌混合処理することにより、抗菌性をさらに向上することができる。食品添加物、飲料等の抗菌性組成物中のササエキスの含有量は、好ましくは０．１〜２０質量％、さらに好ましくは０．２５〜７質量％である。
また、これらの抗菌性組成物の素材として、インキ、塗料、プラスチック成形品、接着剤等を使用する場合、これらの素材が親水性である場合には上述のとおり、素材にササエキス及び有機酸を添加、混合すれば良い。添加時期は、素材の製造前、製造中、製造後のいずれの段階であっても良い。一方、これらの素材が疎水性（親油性）である場合には、ササエキス及び有機酸が混和しにくいことが多い。そこで、ササエキス、又はササエキスと有機酸の混合物を、界面活性剤（乳化剤）又は親水性有機溶剤（例えば、メチルアルコール、エチルアルコール等のアルコール、アセトン等のケトン、酢酸エチル等のエステル、ピリジン、ジメチルホルムアミド等）を併用して素材との混和性を改善する、あるいは、ササエキス、又はササエキスと有機酸の混合物を、予め親油性材料を用いてマイクロカプセル化しておく等の手段を講じて、素材との混和性を改善することが望ましい。いずれの場合にもササエキス及び有機酸を添加した後、７０〜９０℃で１〜２時間攪拌混合処理することにより、抗菌性をさらに向上することができる。
素材として、インキ、塗料、プラスチック成形品、接着剤等を使用した、本発明の抗菌性組成物中のササエキスの含有量は、好ましくは１〜２０質量％、さらに好ましくは３〜７質量％であり、有機酸の含有量は、好ましくは０．１〜１０質量％、さらに好ましくは３〜７質量％である。
特に好ましい有機酸はリンゴ酸、コハク酸、クエン酸等である。
本発明の抗菌性組成物は、本発明の抗菌剤を含有しないものと比較して顕著な抗菌性を示し、インキや塗料は抗菌性建材として、一般家庭はもとより、院内感染のおそれのある病院や公共建築物用の建材として極めて有用である。
次に、参考例、実施例及び試験例を示し本発明をさらに詳細に説明する。
参考例１  ササエキスの製造
北海道天塩山系で９月に採集されたササの乾燥葉を、加圧熱水抽出タンクに入れ、１２５℃で１０分処理し、冷却水で熱水を８０℃程度まで冷却し、エキスと含水固形分をスクリュープレスで分離して、含水率を約５０質量％とした。次に、約５０質量％含水固形分をオートクレーブに入れ、１８０℃で１０分、飽和水蒸気による加圧熱処理を行った。処理した含水固形分を、再度加圧熱水抽出タンクに入れて１１０℃で５分処理してエキスを抽出させた。第１回目と第２回目のエキスを合わせ、珪藻土濾過し、固形分５０質量％となるまで減圧濃縮し、１１０〜１３０℃の流動殺菌処理をしてササエキスを得た。
このササエキス中の硫黄含有量は３８５０μｇ／ｍｌ（７．７ｍｇ／固形分１ｇ）であった。
参考例２
ササエキス（Ｂａｍｂｕｓｅａｅ  Ｓａｓａ）（株式会社鳳凰堂より入手）の成分を分析したところ下記の結果が得られた。
水                          ５９．５質量％
蛋白質                        ８．６
脂質                          ０．６
ミネラル                      ９．０
炭水化物                    １９．８
タンニン                      ２．５
実施例１〜４
下記の表２に示す成分を表２に示す質量比で混合し、攪拌翼と乳化器を備えた加熱混合釜に投入し、８０℃で２時間攪拌混合し、本発明の抗菌剤を得た。固形分濃度８質量％のササエキス（参考例１で製造した固形分５０質量％のササエキスを水で希釈したもの）の添加量は実施例１〜４においてそれぞれ、１２．５、２５、３７．５、及び７５質量％（従って、ササエキス固形分の含有量は、１、２、３、及び６質量％、硫黄含有量は、抗菌剤１００ｇ中、７．７ｍｇ、１５．４ｍｇ、２３．１ｍｇ及び４６．２ｍｇである）。
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比較例１
実施例１において、固形分濃度８質量％のササエキス（参考例１で製造した固形分５０質量％のササエキスを水で希釈したもの）の添加量を６．２質量％（従って、ササエキス固形分の含有量は０．５質量％、硫黄含有量は、抗菌剤１００ｇ中、３．８ｍｇである）とした他は同様にして、比較例１の抗菌剤を得た。
実施例５
下記の表３に示す成分を表３に示す質量比で混合し、実施例１〜４と同様にして、本発明の抗菌剤を得た。
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この抗菌剤１００ｇ中の硫黄含有量は、４６．２ｍｇである。
実施例６
下記の表４に示す成分を表４に示す質量比で混合し、攪拌翼と乳化器を備えた加熱混合釜に投入し、８０℃で２時間攪拌混合し、本発明の抗菌剤を得た。
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このクリームのｐＨは６．００であった。
実施例７
下記の表５に示す成分を表５に示す質量比で混合し、攪拌翼と乳化器を備えた加熱混合釜に投入し、８０℃で２時間攪拌混合し、本発明の抗菌剤クリームを得た。
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このクリームのｐＨは４．６８であった。
実施例８〜１０
実施例７において、ｄｌ−リンゴ酸を添加せず、ササエキス（固形分含有量５０質量％）の量を１６質量％、２０質量％及び３０質量％とし、精製水の量を調整した他は同様にしてササエキス固形分含有量が８質量％、１０質量％及び１５質量％の本発明の抗菌剤クリームを得た。
実施例１１〜１３
実施例７においてササエキス（固形分含有量５０質量％）の量を１６質量％、２０質量％及び３０質量％とし、精製水の量を調整した他は同様にしてササエキス固形分含有量が８質量％、１０質量％及び１５質量％の本発明の抗菌剤クリームを得た。
試験例１（破傷風菌に対する抗菌活性）
破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）の２６株を使用した。これらの菌株は日本の土壌から分離されたものである。対照として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２５９２２とブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。
参考例１で製造したササエキス（ササエキス固形分含有量５０質量％）を滅菌蒸留水で希釈してササエキス水溶液とした。
種々の濃度のササエキス水溶液について、寒天平板希釈法により最少発育阻止濃度を測定した。最終濃度が１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、０．１０質量％となるように変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。ササエキス水溶液と２倍寒天培地を１：１で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。破傷風菌の迷走防止のため寒天濃度は３％に補正した。寒天を３％に調整した変法ＧＡＭ寒天培地で２４時間培養して得た被験菌株の集落を白金耳でかきとり、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．１の濁度に調整した。その１μｌ（接種量：１０５ｃｆｕ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株は、血液寒天培地上の集落を用い、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に，ＭＣ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．０．５の濁度に調整し、その１μｌ（接種量：１０５ｃｆｕ）を画線塗抹法により接種した。なお、嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃１８時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
この方法により測定したササエキスの大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２とブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３に対する最少発育阻止濃度はいずれも３．１３質量％であった。
破傷風菌２６株の最少発育阻止濃度は０．７８質量％から０．１９質量％に分布した。結果を表６に示す。破傷風菌使用菌株の８０％又は５０％の株の発育を阻止するササエキス濃度（ＭＩＣ８０％及びＭＩＣ５０％）はそれぞれ０．７８％及び０．３９％であった。
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破傷風は、土壌中に存在する破傷風菌の芽胞が土壌とともに創傷部位に侵入することが契機となって発症する疾患である。発症には、芽胞が局所で発芽し、増殖して、毒素（テタノスパスミン）を産生することが必要不可欠である。汚染された創傷部位は芽胞の発芽に嫌気的環境となり易いため、破傷風の発症予防の基本は、デブリドマンと呼ばれる侵入した異物や壊死組織の除去などの適切な外科的処置を行い、創傷部位が嫌気性環境となることを阻止し、破傷風菌の増殖を防ぐことである。
表６に記載したように、ササエキスは破傷風菌２６株のすべての増殖を０．７８％の低濃度で完全に抑制した。ササエキスの抗菌活性は、大腸菌やブドウ球菌に対する抗菌活性の４倍以上であることが明らかとなった。
菌の発育がササエキスを含まない培地での発育と差のない濃度（０．１９％）で得た破傷風菌の単染色の顕微鏡観察で、菌体のフィラメント化と菌体が膨れて溶菌している像が観察された。また、菌の発育がササエキスを含まない培地での発育より顕著に抑制された濃度（０．３８％）では、発色性の悪い菌体が認められ、また芽胞を有する菌体を容易に認めることができた。ぶどう球菌で隔壁形成が阻害されていることを示唆する所見が電子顕微鏡レベルですでに観察されている。最少発育阻止濃度以下の濃度で見られたフィラメント化は、分裂時の毛句へ気形成が阻害される場合に見られる所見であることが抗生物質の研究から知られている。
破傷風と類似の発症機序を有する外傷と関連する疾患であるガス壊疽を起す幾つかの嫌気性菌、すなわち、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ等のガス壊疽菌群に対するササエキスの抗菌活性や、化膿性感染症を起す無芽同胞嫌気性菌に対する抗菌活性も期待される。
試験例２（カンジダ菌に対する抗菌活性）
実施例８〜１３で調製したササエキス及びササエキス並びにリンゴ酸を含むクリーム組成物について、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ臨床分離株）に対する抗菌活性を調べた。
使用培地
・ＮＢ培地：肉エキス０．２％を添加した普通ブイヨン（栄研化学）
・１／５０ＮＢ培地：ＮＢ培地をリン酸緩衝液で５０倍に希釈し、ｐＨ７．２±０．２に調整したもの。
・ＳＣＤＬＰブイヨン（栄研化学）
・ＳＡ培地：標準寒天培地（日水製薬）
菌液の調整
試験実施１日前純培養した新鮮培養菌を１／５０ＮＢ培地にＭｃ  Ｆａｒｌａｎｄ（マッファーランド）０．５、約１０８個／ｍｌに懸濁する。更に、１／５０ＮＢ培地で菌液を１００倍（約１０６個／ｍｌ）に希釈する。
クリーム組成物を６０℃で１０分間加熱してクリーム組成物を融解する。融解したクリーム組成物１ｍｌをアクリル板（５０ｍｍ×５０ｍｍ）上に滴下し、１０分間室温で放置して固める。菌液０．５ｍｌをクリーム組成物塗布面に滴下し、この上にアクリル板（４５ｍｍ×４５ｍｍ）を密着させる。これを高湿度下で、３６℃２４時間培養する。
滅菌シャーレに１０ｍｌのＳＣＤＬＰブイヨンを入れ、この中に２４時間培養後のアクリル板を移動し、アクリル板をブイヨンで洗い流す。この１００μｌをとり、ＳＡ培地上に滴下し、均一に塗り拡げ、４８時間培養後、菌数を測定し、アクリル板１枚当たりの菌数に換算する。結果を表７に示す。
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ササエキスを含有するがリンゴ酸を含有しないクリーム組成物（試験Ｎｏ．３〜５）は、カンジダ菌に対して抗菌活性を殆ど示さないのに対して、ササエキス及びリンゴ酸を含有するクリーム組成物（試験Ｎｏ．６〜８）は、特にササエキス濃度１０質量％以上において高い抗菌活性を示す。
試験例３（ヘルペスウイルスに対する治癒効果）
実施例７で製造したクリーム組成物（ササエキス固形分含有量６質量％）をヘルペスウイルス感染患者（６０歳、女）の患部（口角）に１日２回適量を塗布したところ、２日間で症状が著しく緩和し、３日間で完治した。
試験例４（ニキビ患者の病巣由来株の分析）
ニキビ患者の病巣から下記の黄色ブドウ球菌４４株とプロピオニバクテリウムアクネス属菌２６株を分離した。
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上記４４株の黄色ブドウ球菌の抗生物質感受性は以下のとおりであった。（μｇ／ｍｌ）
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上記２６株のプロピオニバクテリウムアクネス属菌の抗生物質感受性は以下のとおりであった。（μｇ／ｍｌ）
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試験例５（参考例２のササエキスの抗菌性）
参考例２のササエキス（ササタンニン）と市販タンニン（Ｌｏｔ．０２０６０６１８，Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ，Ｇｅｎｅｙ，Ｆｒａｎｃｅ）の抗菌性（ＭＩＣ（ｍｇ／ｍｌ）：最小生育阻止濃度）を寒天培地上、２倍希釈法により調べた。結果を以下に示す。
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試験例６（参考例２のササエキスの抗菌性）
試験例４のニキビ患者の病巣由来株のブドウ球菌属細菌４４株（混合物）とプロピオニバクテリウムアクネス菌２６株（混合物）を用いて、参考例２のササエキス（ササタンニン）と市販タンニン（Ｌｏｔ．０２０６０６１８，Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ，Ｇｅｎｅｙ，Ｆｒａｎｃｅ）の抗菌性（ＭＩＣ（ｍｇ／ｍｌ）：最小生育阻止濃度）を寒天培地上、２倍希釈法により調べた。結果を以下に示す。ブドウ球菌属の菌はＭＨ寒天（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ａｇａｒ（ＢＢＬ））培地、ｐＨ７．０、空気中、３７℃２４時間、プロピオニバクテリウムアクネス菌はＧＡＭ培地、ｐＨ７．０、嫌気中、３５℃４８時間、培養した。なお、市販タンニンのＭＩＣ８０はブドウ球菌属群に対して０．０４ｍｇ／ｍｌであり、プロピオニバクテリウムアクネス菌に対して０．０８ｍｇ／ｍｌであった。
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実施例１４
水性インキ１００質量部に参考例１で製造したササエキス６質量部及びｄｌ−リンゴ酸１０質量部を加え、８０℃で２時間混合加熱処理し、抗菌性インキを得た。
実施例１５
水性塗料１００質量部に参考例１で製造したササエキス６質量部及びｄｌ−リンゴ酸１０質量部を加え、８０℃で２時間混合加熱処理し、抗菌性塗料を得た。
実施例１６
日本酒１００質量部に参考例１で製造したササエキス３質量部及びｄｌ−リンゴ酸０．２５質量部を加え、８０℃で３時間混合加熱処理し、抗菌性日本酒を得た。
実施例１７
水性接着剤１００質量部に参考例１で製造したササエキス６質量部及びｄｌ−リンゴ酸１０質量部を加え、８０℃で２時間混合加熱処理し、抗菌性接着剤を得た。
試験例７（ガス壊疽菌群Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  １０株に対する抗菌作用）
使用菌株：Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ１３１２４の１株と臨床分離のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ９株（ＧＡＩ−９２０９９，ＧＡＩ−９２１００，ＧＡＩ−９２１０１，ＧＡＩ−９２１０２，ＧＡＩ−９２１０３，ＧＡＩ−９２１０４，ＧＡＩ−９２１０５，ＧＡＩ−９２１０６，ＧＡＩ−９２１０７）の合計１０株を使用した。これらの臨床分離株は感染症患者由来の臨床材料から分離され、岐阜大学医学部附属嫌気性菌実験施設（以下「当施設」という）に保存されていた株である。なお、抗菌力評価の精度管理用菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２を使用した。
ササエキス溶液の固形分濃度は５０％で、水溶性タンパク・アミノ酸、ミネラル、タンニン、糖質、水溶性多糖体、カルボン酸、総クロロフィル、ケイ酸、ビタミン、脂質、精油、水分からなる。原液のｐＨは約５．０である。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法に準じて最小発育阻止濃度を％で測定した。最終濃度が２５％から０．２％になるようにササエキスの２倍希釈水溶液の系列を作製した。ササエキス希釈液と変法ＧＡＭ寒天培地（２倍）を１：１で混合して、最終的に１２．５〜０．１％の濃度のササエキス含有変法ＧＡＭ寒天培地を作製した。変法ＧＡＭ寒天培地で２４時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ  １の濁度の菌液を調整した。その１０μｌ（接種量：１０６ｃｆｕ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株Ｅ．ｃｏｌｉについては、ＴＳＡ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）上の集落を用い、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ中にＭｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．０．５の濁度に調整し、その１０μｌ（接種量：１０５ｃｆｕ）を画線塗抹法により接種した。なお、嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃１８時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。本方法により測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２に対する最小発育阻止濃度は３．１３％であった。
結果
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ１０株の発育を阻止するに必要なササエキスの最小濃度（ＭＩＣ）は、３．１３〜６．２５％に分布した。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ使用菌株の８０％、あるいは５０％の株の発育を阻止するササエキスの濃度は６．２５％であった。
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考察
ガス壊疽は、土壌中に存在するガス壊疽菌群と称される１群のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．の芽胞が土壌とともに創部に侵入することが契機となって発症する疾患である。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓなどが原因菌として知られるが、ガス壊疽の症例の８０％は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによるものである。ガス壊疽は、救急外科における適切な治療により十分予防できる疾患であるが、外科的処置が遅れるような状況になった場合、また、外科的処置が十分適切でなかった場合には、受傷後６時間以降に発症、急激な経過をとり、致死的となることが知られている。また、救命のために四肢など患部の切断を余儀なくされることがあり、医療上軽視できない疾患のひとつである。
今回の試験管内で検討した成績によると、ササエキスのＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに対する抗菌作用は、試験例１で検討したＣ．ｔｅｔａｎｉに対する作用には及ばなかったものの、Ｃ．ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ１０株の増殖を３．１３％以上〜６．２５％以下の濃度で完全に抑制することが明らかとなった。従って、この程度の濃度のササエキスを含浸させた患部保護布等はＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの最小発育阻止濃度を上回っており、受傷後の外科医の適切な治療を受けるまでの応急処置として人体へ使用した場合、受傷部位でのＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの発芽あるいは発芽後の増殖を抑制する効果があるといえる。
試験例８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ以外のガス壊疽菌群に対する抗菌作用）
使用菌株：感染症患者由来の臨床材料から分離された、または当施設保存の参考菌株を使用した。なお、抗菌力評価の精度管理用菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。試験液は試験例７と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法に準じて最小発育阻止濃度を％で測定した。最終濃度が８％から０．１２５％になるようにササエキスを含む変法ＧＡＭ寒天培地を作製した。培地ｐＨを７．０に調整した。変法ＧＡＭ寒天培地で２４時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ  １の濁度の菌液を調整した。その１０μｌ（接種量：１０６ｃｆｕ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓについては、ＴＳＡ天培地（Ｄｉｆｃｏ）上の集落を用い、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ中にＭｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．０．５の濁度に調整し、その１０μｌ（接種量：１０５ｃｆｕ）を画線塗抹法により接種した。なお、嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃１８時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。結果を表１４に示す。
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考察
ササエキスはＣ．ｎｏｖｙｉとＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓの発育を３％の濃度で、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍの発育を３〜５％の濃度で、また、Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉの発育を５〜７％の濃度で抑制することが明らかとなった。すなわち、ガス壊疽に関係するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．に対するササエキスの抗菌作用は、菌種により差が認められたが、７％の濃度であれば使用した全株の増殖を抑制できることが明らかとなった。創傷部位に本エキスをガス壊疽の予防を意図して使用する場合には、ｐＨ７の条件下で、７％の濃度に設定することが望ましい。
試験例９（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ１６株に対する抗菌作用）
使用菌株：Ｐ．ａｃｎｅｓ  ＡＴＣＣ１１８２７とＰ．ａｃｎｅｓ臨床分離株の１５株（ＧＡＩ−１０３４１，ＧＡＩ−１０３４２，ＧＡＩ−１０３４３，ＧＡＩ−１０３４４，ＧＡＩ−１０３４５，ＧＡＩ−１０３４６，ＧＡＩ−１０３４７，ＧＡＩ−１０３４８，ＧＡＩ−１０３４９，ＧＡＩ−１０３５０，ＧＡＩ−１０３５１，ＧＡＩ−１０３５２，ＧＡＩ−１０３５３，ＧＡＩ−１０３５４，ＧＡＩ−１０３５５）の合計１６株を使用した。これらの臨床分離株は皮膚科感染症患者から分離され、当施設に保存されていた株である。試験液は、試験例７と同じである。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が１２．５，６．２５，３．１３，１．５６，０．７８％になるようにササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。ササエキス液と２倍寒天培地を１：１で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、ｐＨの調整は、実施しなかった。
ブルセラＨＫ半流動培地（極東製薬）で４８時間培養して得た被験菌株の濃厚発育部位からの１白金耳をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、１白金耳には、１０８／ｍｌの細菌数を含む。嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃２日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
結果
Ｐ．ａｃｎｅｓ１６株の発育を完全に阻止するに必要なササエキスの最小濃度（ＭＩＣ）は６．２５％であった（表１５）。ササエキスはＰ．ａｃｎｅｓの１６株中１２株に対して、３．１３％でササエキス不含の対照培地と比し顕著な発育の抑制を呈したが、完全な阻止には６．２５％が必要であった。
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考察
Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓに関与するＳ．ａｕｒｅｕｓの阻止に必要なササエキスの濃度は３．１３％であるが、この試験例の検討で、Ｐ．ａｃｎｅｓの全株を完全に阻止するのに必要なササエキス濃度は、３．１３％以上から６．２５％以下の範囲の濃度であった。Ｐ．ａｃｎｅｓはＳ．ａｕｒｅｕｓとともに重要なＡｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増悪因子であることから、Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ治療を目的とする場合には、Ｐ．ａｃｎｅｓの発育を完全に阻止できる６．２５％程度が適当と考えられる。
ササエキスのこのような抗菌作用の機作については現時点では不明であるが、その由来が植物であるササエキスは、これまでの放線菌由来や真菌由来の各種抗菌薬とは異なる作用機作をもっている可能性があり、耐性発現の点からも興味深い。
試験例１０（にきび由来のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ  ２６株に対する抗菌作用）
使用菌株：Ｐ．ａｃｎｅｓ臨床分離株の合計２６株を使用した。これらの臨床分離株は、にきび患者から分離され、当施設に保存されていた株である。試験液は試験例７と同じであり、濃度は５０％の酸性（ｐＨ５．０前後）の溶液である。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が８，７，６，５，４，３，２，１，０．５％になるようにササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。ｐＨは７．０付近に調整した。ＧＡＭ寒天培地で４８時間培養して得た被験菌株の集落をＡｎａｅｒｏｂｅ  Ｂｒｏｔｈに懸濁し、所定の菌数を含む菌液を調整した。嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃２日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。
結果と考察
同時に行った成績ではないが、各種抗菌薬に対する感受性の分布を参考に示した。今回は、ｐＨ無調整で実施した前回の実験の場合と異なり、終末点の判定が困難であった。
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試験例１１（ササエキスのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．に対する抗菌作用）
使用菌株：表１７に示した施設保存の参考菌株を使用した。これらの菌株はＡＴＣＣ，ＪＣＭから購入し、当施設に保存されていた株である。なお、対照として、細菌性膣症の婦人の膣内や婦人科領域感染症から比較的高頻度に分離される代表的な菌種の中からＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ  ＡＴＣＣ２９３０３，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＣＣ２５２６０，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  Ｎ−１，Ｎ−２を選んだ。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も、同様の目的と感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例７と同じである。
なお、ササエキス原液を滅菌蒸留水で希釈し、しばらく放置すると、茶褐色の沈殿物が生じる場合があるが、培地との混釈時にそれをよく撹拌混合して使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が１０，９，８，７，６，５，４，３，２，１，０．５％になるようにササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。１０％〜６％までの高濃度領域については、それぞれ２０％〜１２％のササエキス液と２倍寒天培地を１：１で混合して作製し（最終ｐＨ５．３〜５．５）、５％〜０．５％までの低濃度の領域については，５０％〜５％のササエキス液と１倍寒天培地を１：９で混合して（最終ｐＨ５．５〜６．０）、ササエキス含有寒天培地を作製した。
また、今回の抗菌力の検討は、酸性（ｐＨ５．３〜６．０）条件下に加え、より弱酸性〜環境下でも実施した。ササエキス添加後のｐＨを２ＮのＮａＯＨ水で、ｐＨ６．５〜７．０に、調整した培地を作製した。
接種菌液の調整：
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地で４８時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ  １の濁度に調整した。その１０μｌ（接種量：１０６ｃｆｕ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株についても、ＴＳＡ寒天培地上の集落を用い、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ中にＭｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ＃１の濁度に調整し、その１０μｌ（接種量：１０６ｃｆｕ）を画線塗抹法により接種した。今回、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３については、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ＃１／２，１／２の１０倍希釈液、１／２の１００倍希釈液についても同時にＭＩＣを測定し、接種菌量のＭＩＣに与える影響を検討した。
なお、嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃１８時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
結果
ｐＨ無調整の酸性（ｐＨ５．３〜６．０）の実験条件下で測定したササエキスの最小発育阻止濃度は、表１７に示した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｓ．ｃａｓｅｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｂｒｅｖｉｓ  ｓｓ．ｂｒｅｖｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓの４菌種４株に対して７〜８％，その４菌種４株を除く５菌種５株に対して、１０％以上であった。なお、同時に測定したＰ．ｂｉｖｉａ  ＡＴＣＣ２９３０３，Ｐ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＣＣ２５２６０に対する最小発育阻止濃度は、いずれも０．５％で、本方法により測定したササエキスの精度管理用菌株２株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対する最小発育阻止濃度はともに４％であった。
ｐＨ調整（ｐＨ６．８〜７．１）の実験条件下で測定したササエキスの最小発育阻止濃度も表１に示した。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ  ｓｓ．ｂｒｅｖｉｓ，Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、の２菌種２株に対して７％，その２菌種２株を除く７菌種７株に対して、＞＝９％であった。Ｐ．ｂｉｖｉａでは１％、Ｐ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａでは０．５％であった。また、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３のＭＩＣは、６％であった。
なお、ｐＨ調整下（ｐＨ６．４〜７．０）でのＭＩＣを求めるにあたり、接種菌量のＭＩＣに与える影響をＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３を用いて検討した。その結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ＃１〜１／２（＞１０８／ｍｌ）の濁度の菌液の１白金耳量を使用した場合、ＭＩＣは６％，Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ＃１／２の１０倍（１０７／ｍｌ）、１００倍希釈液（１０６／ｍｌ）のそれを使用した場合には、ＭＩＣは３％と読み取られた。Ｅ．ｃｏｌｉは、接種菌量の変化により、ｓｕｂＭＩＣの領域での菌の発育程度が段階的に悪化していたものの、読み取ったＭＩＣ値の変動はなく、いづれも６％と読み取られた。
考察
ササエキスが６．２５％〜３．１３％以下の濃度で、いくつかの病原性細菌の発育を阻止することが明らかとなってきた。ササエキスのこれら病原性細菌に対する抗菌力の他に、非病原性細菌に対する抗菌力についての情報を集積することも極めて重要と考え、この試験例を実施した。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．の多くは、人の粘膜で生体防御の観点から、極めて重要な役割を演じていることがわかっている。本発明者らは、すでに２９名の健康な妊婦の膣からＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．９１株を分離し、それらを詳細に同定した結果、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓが４８株（５２．７％）と最も多く、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉが１９株（２０．８５）とそれに次ぐことを、そして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓなどが分離されることを見出した。中でも、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓはその１００％が過酸化水素を産生し、その産生量も多いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．の代表的な菌種であり、１００％ではないが過酸化水素産生株が存在することが報告されているＬ．ｇａｓｓｅｒｉやＬ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの２菌種とともに、女性の膣および子宮粘膜内の感染防御機構においてとりわけ重要な役割を果たしていると考えられている。今回の検討で、ササエキスの過酸化水素産生Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．であるＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓとＬ．ｇａｓｓｅｒｉに対する抗菌作用は、ＭＩＣが１０％以上と、同時に実施したＥ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどの代表的な病原性通性菌に対するＭＩＣ  ４％やＰ．ｂｉｖｉａ，Ｐ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓなどの代表的化膿性嫌気性菌に対するＭＩＣ  ０．５〜４％に比し、極めて弱いことが明らかとなった。
また、ササエキス溶液は、膣内環境のｐＨに近いｐＨを示し、アルカリ性より中性、中性より酸性の条件下でより強い抗菌作用を発揮することが知られている。Ｅ．ｃｏｌｉやＳ．ａｕｒｅｕｓ参考菌株に対する抗菌力が２管程度低下するｐＨをやや中性付近にシフトさせた弱酸性の実験条件下でも、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．のＭＩＣは大きく変化しなかった。
さらに、本発明者らは、妊婦や新生児の腸管からＬ．ｇａｓｓｅｒｉ，Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ，Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ，Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ，Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓなどが比較的高率に分離されることも見出しているが、これらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．の中で、膣からの分離率が高いＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓとＬ．ｇａｓｓｅｒｉ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．に対しても、ＭＩＣは７％以上と高い値を示していた。
ササエキスは、膣内有用菌や消化管内有用菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．に対して，その抗菌力が、より病原性の強いと評価されている細菌種に対するより、本来弱いことを示唆している。このことは、同時に、婦人科膣、消化管で、ササエキスを使用するような場合、極めて本物質にとって優れた特徴となる可能性が示唆された。
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試験例１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対する抗菌作用）
本発明者らは、ササエキスが、各種化膿性感染症の原因菌として極めて重要なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、各種抗菌薬に多剤耐性を示すＭｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、ＭＲＳＡと同様に多くの抗菌薬に対して耐性傾向の強いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどに対して抗菌作用を示すことを見出している。本発明者らは、これまでササエキスの嫌気性菌に対する抗菌作用を嫌気性菌に対して推奨されている変法ＧＡＭ寒天培地を感受性測定培地とする寒天平板希釈法により測定してきた。
この試験例では、患者から分離されたＥ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの通性菌と好気性菌であるそれぞれ１０株以上を使用して、ササエキスのこれらの菌種に対する抗菌作用を通性菌で推奨されているＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ａｇａｒを測定培地とする寒天平板希釈法により検討した。
材料と方法
使用菌株：施設保存の臨床分離株であるＥ．ｃｏｌｉ１４株，Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ１４株およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ１３株を用いた。また、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例７と同じである。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。可能な限り、日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が，７，６，５，４，３，２，１，０．５，０．２５，０．１２５，０．０６３，０．０３２％になるようにササエキスを含有させたＭｕｅｌｌａｒ  Ｈｉｎｔｏｎ寒天平板（Ｄｉｆｃｏ）を作製した。７％〜６％の高濃度領域については、それぞれ１４％〜１２％のササエキス液と２倍濃度のＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地を１：１で混合して作製し、５％〜０．０３２％までの低濃度の領域については，５０％〜０．３２％のササエキス液と１倍濃度のＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地を１：９で混合して、ササエキス含有寒天培地を作製した。２ＮのＮａＯＨ水で、培地ｐＨ６．５〜７．３に調整した。
なお、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地の代わりに、変法ＧＡＭ寒天培地〔日水製薬〕を用いてササエキス含有寒天培地を作成し、同一の接種菌液を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉとＭＲＳＡを接種し、一夜嫌気性培養を実施し、ＭＩＣを求めた。なお、この場合もｐＨは２ＮＮａＯＨを用いて、６．７〜７．３に調整した。
接種菌液の調整と判定：
ＴＳＡ寒天培地で２４〜４８時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ  １の濁度の菌液を調整した。その１０μｌをＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ  １ｍｌに浮遊させ、その５μｌをササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。
３５℃２０時間好気環境下で培養後、発育の有無を肉眼で観察した。嫌気培養した平板については、一夜培養後の判定後、さらに大気環境下で一夜放置して、再増殖の有無の判定を行った。
結果
ｐＨ調整（ｐＨ６．５〜７．３）の実験条件下で測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉに対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、２〜３％に分布し、ＭＩＣ５０％は２％であった。また、ＭＲＳＡに対するＭＩＣは、０．２５〜０．５％に分布し、ＭＩＣ５０％は、０．５％であった。また、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＭＩＣは、全株１％であった。
また、精度管理用菌株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２に対するＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地での中性環境、好気性培養という今回の実験条件下でのＭＩＣは２％、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対するＭＩＣは、０．５％であった。
変法ＧＡＭ寒天培地を用いて、嫌気性環境下で測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉ臨床分離株１４株に対するＭＩＣ５０％は８％で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ臨床分離株１４株に対するＭＩＣ５０％は３％であった。精度管理用菌株に対する変法ＧＡＭ寒天培地での中性環境、嫌気性環境でのＭＩＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２に対して８％、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対して３％であった。
考察
この試験例において、日本化学療法学会ＭＩＣ測定標準法に可能な限り近づけたササエキスのＭＩＣ測定結果から、ササエキスはＭＲＳＡやＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して、ほぼ中性の環境で、いずれも１％以下のＭＩＣを示し、極めて強い抗菌作用があることを確認した。
ある薬物の細菌に対するＭＩＣは、測定に使用する培地の成分やｐＨ、血液など添加物の有無、接種菌量、培養環境など種々の実験条件で変動することは、よく知られている。本発明者らは、栄養学的に複雑な成分を必要とし、かつ遊離酸素の存在しない嫌気性環境でしか発育しない嫌気性菌である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓなどを対象として、ササエキスのＭＩＣを検討してきた。これらの測定の際には、精度管理用菌株として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３を使用してきたが、ササエキスのこれらの精度管理用菌株に対する嫌気性環境下でのＭＩＣと、通性菌に対して本来使用される測定環境でのＭＩＣを同時に比較したことはなかった。今回その点を検討し、その差を明確にした。変法ＧＡＭ寒天培地を感受性測定培地の基礎培地として、嫌気性環境で測定したササエキスのＭＩＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２に対して７％以上となり、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地で好気性培養した場合の２％に比較し、耐性側への大きなシフトが観察された。また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対しても嫌気性環境で測定したササエキスのＭＩＣは３％となり、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地で好気性培養した場合の０．５％から耐性側への大きなシフトが見られた。ＭＲＳＡ１４株対するササエキスの嫌気性菌と同様の測定環境でのＭＩＣ９０％は３％であった。嫌気培養でのＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖は、発育が抑制された露滴状の集落となることから、エンドポイントの判定が困難な場合があった。一度判定した平板をさらに一夜好気環境で放置し、露滴状の集落が再増殖するかどうかを確認する操作を行ったところ、発育陽性と判定したポイントで一夜培養しても再増殖が認められなかった例を３例経験したことから、ササエキスの嫌気性培養での抗菌力の測定の場合で，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２３を精度管理用として露滴状集落が見られた場合には、再増殖能の有無を確認しておくなど、ＭＩＣの決定の仕方についても、再考が必要であると考える。以上のことから、嫌気性菌と同様の条件で測定した通性菌のＭＩＣは６〜８倍耐性側にシフトすることが明らかとなった。この原因がＭｕｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ａｇａｒと変法ＧＡＭ寒天の培地成分の相違によるものか、抗菌薬であるアミノ配糖体でみられるような嫌気培養と好気培養の相違によるものかは興味ある点であるが、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ａｇａｒを用いた好気培養と嫌気培養のＭＩＣの比較検討から、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２では、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ａｇａｒを用いた嫌気培養でのＭＩＣは、好気培養でのＭＩＣと同一であったが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３では、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２と同一実験条件であるにもかかわらず、嫌気培養でのＭＩＣが好気培養でのＭＩＣより４倍高いなど、菌種により異なる現象を確認した。この現象には、種々の要素が複合して関係しているものと考えられる。
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試験例１３（細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
１．Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａおよびｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．株について
ＢＶ関連細菌に分類される細菌の中で、まずＰ．ｂｉｖｉａおよびＰｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．に対するササエキスの抗菌作用を検討した。
使用菌株：Ｐ．ｂｉｖｉａの合計１４株とＰｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）９株を使用した。Ｐ．ｂｉｖｉａは、１９９０年代前半に女性膣内から分離され、また、Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、２００２年に各種臨床材料から分離され、当施設に保存されていた株である。ＭＩＣ精度管理用菌株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。試験液は試験例７と同じである。濃度は５０（ｗ／ｖ）％の酸性（ｐＨ５．０前後）の溶液である。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が４，３，２，１，０．５，０．２５，０．１２５％になるようにササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。ササエキス液と寒天培地を１：９で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお２ＮＮａＯＨ水溶液を使用して、培地ｐＨの調整（ｐＨ７．０〜７．３）を実施した。
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地（極東製薬）で４８時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ（Ｄｉｆｃｏ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度の菌液を調整し、１０倍希釈の後、その１白金耳（１０μｌ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、１白金耳には、約１０４の細菌を含む。嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃で、２日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対するＭＩＣは、ともに＞５％であった。
結果
ササエキスは、０．５％でＰ．ｂｉｖｉａの発育を、１％でｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐの発育を完全に阻止した。ササエキスのＰ．ｂｉｖｉａ１４株に対するＭＩＣ５０％およびＰｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．に対するＭＩＣ５０％は、いずれも０．５％であった。
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考察
健常な女性の膣は嫌気性菌と好気性菌の宝庫である。女性産道の正常細菌叢には、膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．が最優勢に存在している。しかしながら、一方では日和見病原体として知られるＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓなどの嫌気性グラム陽性球菌やＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａなど）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．などの嫌気性グラム陰性桿菌も低菌量で存在し、細菌性膣症とよばれる状況で異常に増殖することがわかっていて、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖａｇｉｎｏｓｉｓ（細菌性膣症）関連微生物と称されている。細菌性膣症は、ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、ＳＴＤに対する易感染性、早産、前期破水など周産期に見られる各種異常との関係、骨盤内炎症性疾患ＰＩＤへの進展との関係で論じられている。
Ｐ．ｂｉｖｉａおよびｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、細菌性膣症関連微生物の中でも、重症度あるいは難治性と関連する極めて重要な細菌種であることが知られている。
今回の検討から、ササエキスは、これらのＰ．ｂｉｖｉａおよびｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．に対して、きわめて良好な抗菌作用を示すことが明らかになった。
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試験例１４（細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
２．Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ株について
Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓは健常な女性の膣からも検出されるが、その菌数は少ない。Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｍｉｎｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｎｏｎ−Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．などとともに、細菌性膣症の状態で異常に増殖するいわゆるＢＶ関連微生物の範疇に入る細菌の一つである。しかも、産道感染症の原因菌としても極めて重要である。この試験では、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓについて検討した。
材料と方法
使用菌株：Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの合計１１株を使用した。これらはＮＣＴＣまたはＡＴＣＣから購入した菌株２株と臨床分離株９株からなる。臨床分離株は、１９９０年代前半に、本発明者らが女性膣内から分離し、当施設に保存していた株である。また、ＭＩＣ精度管理用菌株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。試験液は、試験例７と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が８，７，６，５，４，３，２，１，０．５，０．２５，０．１２５％になるようにササエキスを含有させたＢｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地（極東製薬）を作製した。ササエキス液とＢｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地を１：１または、１：９の割合で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を使用して、培地ｐＨの調整（ｐＨ７．０〜７．３）を実施した。
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地（極東製薬）で４８時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ（Ｄｉｆｃｏ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度の菌液を調整し、その１白金耳（１０μｌ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照培地での発育が塗抹部位全体に一様に見られるように設定した。
嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃で、２日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対するＭＩＣは、それぞれ、＞８％、８％であった。
結果
ササエキスのＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ  １１株に対するＭＩＣの範囲は６％から４％に分布し、ＭＩＣ５０％は６％であった。
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考察
今回の検討から、ササエキスは、細菌性膣症関連微生物のひとつとして重要な通性嫌気性菌のＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓに対しては、６％の濃度で完全に発育を阻止することが明らかになった。ＢＶ関連微生物の嫌気性菌であるＮｏｎ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａであるＰ．ｂｉｖｉａやｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａであるＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａより抗菌力は弱いことが明らかとなった。本エキスは、８％の濃度でもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．の多くの菌株の発育を阻止しないことが知られており、生体での使用に際しての濃度の設定に重要な成績が得られたと考えられる。
なお、一連の検討において、参考菌株であるＥ．ｃｏｌｉやＳ．ａｕｒｅｕｓのＭＩＣに実験条件により変動があることが明らかになっている。ＭＩＣは、使用する感受性測定用培地の種類、接種菌量、培養条件などの因子により影響を受けるが、今回は初めて感受性測定培地としてＢｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地を使用した。本培地でのＭＩＣは、変法ＧＡＭ培地でのＭＩＣより酸性側にシフトする印象であった。
試験例１５（細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
３．Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓについて
嫌気性球菌であるＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒｏｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ、Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ｈｏｍｍｎｉｓ）、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓなどとともに、膣内乳酸菌の減少、膣内ｐＨの低下、およびミルク様かつ悪臭（アミン臭）のある帯下を特徴とする細菌性膣症（ＢＶ）の状態で異常に増加する細菌性膣症関連微生物の仲間である。この試験例では、細菌性膣症関連細菌に分類される細菌のひとつである嫌気性球菌に対するササエキスの抗菌作用を検討した。
材料と方法
使用菌株：Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ（５株）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ（３株）、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ（７株）、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒｏｓ（６株）の合計２１株を使用した。ＭＩＣ精度管理用菌株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。試験液は試験例７と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が５，４，３，２，１，０．５，０．２５，０．１２５％になるようにササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。ササエキス液と寒天培地を１：９で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を使用して、培地ｐＨの調整（ｐＨ７．０〜７．３）を実施した。
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地（極東製薬）で４８時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ（Ｄｉｆｃｏ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度の菌液を調整し、その１白金耳（１０μｌ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、１白金耳には、約１０６の細菌を含む。
嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃で、２４時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対するＭＩＣは、ともに＞＝５％であった。
結果
ササエキスは、３％の濃度でＭ．ｍｉｃｒｏｓ，Ｆ．ｍａｇｎａ，Ｐ．ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ，Ｐ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓの嫌気性球菌群２１株の発育を完全に阻止した。ササエキスの嫌気性球菌に対するＭＩＣ５０％は０．５％であった。
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考察
細菌性膣症は、ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、性感染症（ＳＴＤ）に対する易感染性、早産、前期破水など周産期に見られる各種異常との関係、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）への進展との関係で論じられている。細菌性膣症では、健康時には膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．が著しく減少し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．（Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａなど）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．などの嫌気性グラム陰性桿菌やＰ．ａｎａｅｒｏｂｉｕｓなどの嫌気性グラム陽性球菌、さらにはＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓやＭｙｃｏｐｌａｓｍａなどの微生物が異常に増殖することがわかっている。これらの細菌群は細菌性膣症関連微生物と称されている。
先に、ササエキスが細菌性膣症関連微生物であるＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．（Ｐ．ｂｉｖｉａ、Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａなど）の発育を２％という低い濃度で、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｇｒｏｕｐやＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの発育を、６％の濃度で阻止することを述べた。今回の検討から、ササエキスは嫌気性球菌群に対しても、２％の濃度で全株の発育を阻止することが明らかとなった。
試験例１６（細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．について
嫌気性グラム陽性桿菌であるＭｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．は、嫌気性無芽胞グラム陽性嫌気性桿菌で、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ、Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ｈｏｍｍｎｉｓ）、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓなどとともに、膣内乳酸菌の減少、膣内ｐＨの低下、およびミルク様で悪臭（アミン臭）のある帯下を特徴とする細菌性膣症の状態で異常に増加する細菌性膣症関連微生物の仲間である。この試験例では、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．対するササエキスの抗菌作用を検討した。
材料と方法
使用菌株：Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．の１２株を使用した。この中には、Ｍ．ｃｕｒｔｉｓｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃｕｒｔｉｓｉｉ  ＡＴＣＣ３５２４２、Ｍ．ｃｕｒｔｉｓｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｈｏｌｍｅｓｓｉｉ  ＡＴＣＣ２５２４１、Ｍ．ｍｕｌｌｉｅｌｉｓ  ＡＴＣＣ３５２４０、ＡＴＣＣ３５２４３を含む。また、ＭＩＣ精度管理用菌株として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。試験液は試験例７と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が８，７，６，５，４，３，２，１，０．５，０．２５，０．１２５％になるようにササエキスを含有させたＢｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天平板を作製した。血液は、凍結融解により溶血させた羊脱繊血（日生材）を使用し、培地に５％の割合で添加した。ササエキス液と寒天培地を１：１で混合し、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を使用して、培地ｐＨの調整（ｐＨ７．０±０．３）を実施した。
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地（極東製薬）で７２時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ（Ｄｉｆｃｏ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度の菌液を調整し、その１白金耳（１０μｌ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、１白金耳には、約１０６の細菌を含む。
嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃で、２日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
なお、ｐＨ７．０での本実験条件下で測定したササエキスのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対するＭＩＣは８％であった。（対照培地での発育と比較し、著しく発育が阻止される濃度を観察すると４％であった。）
結果
表２６に成績を示した。ササエキスは、４％でＭｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．の発育を完全に阻止した。ササエキスのＭｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．に対するＭＩＣ５０％は４％であった。
考察
細菌性膣症は、ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、ＳＴＤに対する易感染性、早産、前期破水など周産期に見られる各種異常との関係、骨盤内炎症性疾患ＰＩＤへの進展との関係で論じられている。細菌性膣症では、健康時には膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．が著しく減少し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．（Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａなど）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．などの嫌気性グラム陰性桿菌や嫌気性グラム陽性桿菌であるＭｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐ．ａｎａｅｒｏｂｉｕｓなどの嫌気性グラム陽性球菌、さらにはＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓやＭｙｃｏｐｌａｓｍａなどの微生物が異常に増殖することがわかっている。これらの細菌群は細菌性膣症関連微生物と称されている。細菌性膣症関連微生物の中で、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．は、ＢＶ  ｓｃｏｒｅが高い値をとる状態で検出率が高くなる菌種が、本発明者らの研究でも確認されている。
先に、ササエキスが細菌性膣症関連微生物であるＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．（Ｐ．ｂｉｖｉａ，Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａなど）の発育を２％という低い濃度で、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｇｒｏｕｐやＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの発育を、６％の濃度で、さらには嫌気性球菌群に対しても、全株を２％で発育を阻止することを述べた。この試験例では、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．について検討した。その結果、ササエキスは、４％の濃度で、これらの発育を阻止することが明らかとなった。
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試験例１７（ササエキスのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ株に対する抗菌作用）
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓは人糞便中から分離される無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌で、褥創や肛門周囲膿瘍などを含む各種皮膚や皮下軟部組織感染症において、黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、多薬剤耐性緑膿菌ととともに臨床上極めて重要な菌種である。この試験例では、ササエキスのＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓについての抗菌作用を検討した。
使用菌株：Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの合計１２株を使用した。これらの臨床分離は、２００２年１月から７月までに各種化膿性感染症患者から分離され、当施設に保存されていた株である。ＭＩＣ精度管理用菌株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。試験液は試験例７と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が１０，９，８，７，６，５，４，３，２，１％になるようにササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。１０〜６％までは、ササエキス液と２倍寒天培地を１：１で混合して、５〜１％までは、ササエキス液と寒天培地を１：９で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を使用して、培地ｐＨの調整（ｐＨ６．６〜７．１）を実施した。Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地（極東製薬）で４８時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ（Ｄｉｆｃｏ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度の菌液を調整し、その１白金耳（１０μｌ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、１白金耳には、１０６ｃｆｕ／ｍｌの細菌数を含む。
嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃で、１、２日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対するＭＩＣは、ともに６％であった。
結果：ササエキスのＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ１２株に対するＭＩＣは４〜６％に分布した。ＭＩＣ９０％は、５％であった。
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考察
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｇｒｏｕｐ（特に、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）は、嫌気性無芽胞グラム陰性嫌気性桿菌で、人の下部消化管粘膜に常在している。本菌群は、粘膜の破綻の際に、通常無菌の組織や臓器に侵入し、感染症を惹起する。各種化膿性感染症、特に横隔膜から下部の化膿性感染症から、最も高頻度に分離される嫌気性菌である。本菌は、感染部位で、大腸菌などの通性桿菌、ぶどう球菌、腸球菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｌｌｅｒｉ  ｇｒｏｕｐなどの通性、微好気性球菌やＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ以外の無芽胞嫌気性菌嫌気性菌などとともに存在している。すなわち複数菌感染症の構成菌として重要である。また、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓは、他の一部の通性菌と同様に、多くの抗菌薬に対し自然耐性であり、本菌種に抗菌力のある抗菌薬は、クリンダマイシン、セファマイシン、カルバペネムなどと比較的限られている。しかし、それらの数少ない抗菌薬に対しても獲得耐性化傾向にあり問題となっている。従って、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓが関与する感染症の治療には、より広域の抗菌薬が、または複数種の抗菌薬が長期にわたり使用される傾向がある。ところが、その使用方法によっては、本菌種はもとより、本菌種以外の細菌種の抗菌薬耐性化を増長する可能性があり、感染症治療上、極めて厄介な菌種ともいえる菌である。
今回の検討から、ササエキスには、化膿性複数菌感染症の原因菌としてＳ．ａｕｒｅｕｓ，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｅ．ｃｏｌｉとともに重要な無芽胞嫌気性菌嫌気性菌の代表的な菌群であるＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｇｒｏｕｐの細菌種に対しても、嫌気性条件下でのＳ．ａｕｒｅｕｓやＥ．ｃｏｌｉ参考菌株に対する作用と少なくとも同程度の抗菌作用があることが明らかになった。
試験例１８（骨盤内感染症）
健常な女性の膣は嫌気性菌と好気性菌の宝庫の一つである。女性産道の正常細菌叢には、嫌気性菌が好気性菌の１０倍以上多く存在している。嫌気性グラム陽性球菌とＢａｃｔｅｐｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．（現在の分類ではＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．とＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）である。嫌気性菌はＳＴＤ病原体が関係しない産道感染症のほとんどの患者から分離される。主要な嫌気性病原体は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ，嫌気性球菌、そしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．である。嫌気性菌は、卵管卵巣膿瘍、敗血症性流産、骨盤内膿瘍、子宮内膜炎、術後創部感染症、特に帝王切開術後創部感染症、などに関係している。これらの感染症は嫌気性菌と腸内細菌科の細菌との複数菌感染症であることが多いが、腸内細菌科の細菌やその他の通性菌が分離されない嫌気性菌だけによる感染症は腹腔内感染症の場合よりも多くみられる。また、子宮から悪臭ある膿汁や血液の排出があること、子宮のある下腹部全体のあるいは骨盤内の局所的な圧痛、持続する発熱や悪寒が特徴である。骨盤静脈の化膿性血栓性静脈炎が合併することがあり、反復性の敗血症性肺栓塞のエピソードを起こす原因となる。
嫌気性菌は細菌性膣症（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖａｇｉｎｏｓｉｓ）の病因に関係する因子であると考えられている。原因がいまだ明らかではない症候群は、あふれるような悪臭のある分泌物と膣内のＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．そしてｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓなどの細菌の異常な増加を特徴とする。嫌気性菌は骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）の病因において重要な役割を演じていると考えられており、何人かの専門家は細菌性膣症とＰＩＤへの進展との間の関係を示してきた。
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．が原因となる骨盤内感染症は、子宮内避妊道具の使用と関係がある感染症である。
試験例１９（ササエキスのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．に対する抗菌作用）
抗菌力を有する物質の評価の際には、人の病原菌に対する作用とともに皮膚、粘膜に常在する有用あるいは日和見細菌に対する作用を知っておくことが極めて重要である。
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．と同様に、消化管内、膣内の常在細菌として知られ、呼吸器病原性があることが知られているＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍを除き、病原的意義が指摘されている菌種がない有用菌として知られている細菌である。そこで、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．に対して、ササエキスがどの程度の抗菌作用を有するか、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．の参考菌株を用いて検討を行った。
材料と方法
使用菌株：表２８に示した施設保存の参考菌株を使用した。これらの菌株はＡＴＣＣ，ＪＣＭから購入し、当施設に保存されていた株である。なお、対照として、婦人科領域感染症および消化器感染症からもっとも高頻度に分離される嫌気性菌菌種の中からＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ  ＡＴＣＣ２９３０３，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＣＣ２５２６０，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  Ｎ−１を選んだ。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も、同様の目的と感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例７と同じである。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：
抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が９，８，７，６，５，４，３，２，１，０．５％になるようにササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。１０％〜６％までの高濃度領域については、それぞれ２０％〜１２％のササエキス液と２倍寒天培地を１：１で混合して作製し（最終ｐＨ５．３〜５．５）、５％〜０．５％までの低濃度の領域については，５０％〜５％のササエキス液と１倍寒天培地を１：９で混合して（最終ｐＨ５．５〜６．０）、ササエキス含有寒天培地を作製した。
接種菌液の調整：
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地で４８時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ  １の濁度に調整した。その１０μｌ（接種量：１０６ｃｆｕ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株についても、ＴＳＡ寒天培地上の集落を用い、Ａｎａｅｒｏｂｅ  ｂｒｏｔｈ中にＭｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ＃１の濁度に調整し、その１０μｌ（接種量：１０６ｃｆｕ）を画線塗抹法により接種した。なお、嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃１８時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
結果
ｐＨ無調整の酸性（ｐＨ５．３〜６．０）の実験条件下で測定したササエキスの最小発育阻止濃度は、表２８に示した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．の５菌種５株に対しても、ＭＩＣが４％であったＢ．ｂｉｆｉｄｕｍの１株を除き、すべて７％以上の最小発育阻止濃度であった。なお、同時に測定したＰ．ｂｉｖｉａ  ＡＴＣＣ２９３０３、Ｐ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＣＣ２５２６０に対する最小発育阻止濃度は、いずれも０．５％で、本方法により測定したＡＨＳＳの精度管理用菌株２株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対する最小発育阻止濃度ともに４％であった。
考察
ササエキスが６．２５％以下（多くは４％程度）の濃度で、いくつかの病原性細菌の発育を阻止することが明らかとなってきた。ササエキスのこれら病原性細菌に対する抗菌力の他に、非病原性細菌に対する抗菌力についての情報を集積することも極めて重要と考え、今回の検討を実施した。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．やＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐの多くは、人の粘膜で生体防御の観点から、極めて重要な役割を演じている。本発明者らはすでに、ササエキスの過酸化水素産生Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．であるＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓとＬ．ｇａｓｓｅｒｉに対する抗菌作用は、ＭＩＣが１０％以上と、同時に実施したＥ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどの代表的な病原性通性菌に対するＭＩＣ４％やＰ．ｂｉｖｉａ，Ｐ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓなどの代表的化膿性嫌気性菌に対するＭＩＣ０．５〜４％に比し、極めて弱いことを報告した。
今回、ササエキスは、消化管常在のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．の５菌種５株に対しても、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．に対すると同様に弱い抗菌力しか示さないことが明らかとなった。
ササエキスは、膣内有用菌や消化管内有用菌に対して抗菌力が、日和見病原細菌より相対的に弱いことを強く示唆している。
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試験例２０（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａに対する抗真菌作用）
この試験例では、“鵞口瘡”や女性の膣炎・外陰炎の原因となるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａに対する抗真菌作用を検討した。
使用菌株：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａの合計１３株を使用した。これらは、２００２年に各種臨床材料から分離され、当施設に保存されていた株である。ＭＩＣ精度管理用菌株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３を使用した。
試験液は試験例７と同じである。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が８，７，６，５，４，３，２，１％となるようにササエキスを含有させたＭＨ寒天平板（Ｄｉｆｃｏ）を使用した。ササエキス液と寒天培地を１：９で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液または１０％塩化水素水溶液を使用して、培地ｐＨの調整（ｐＨ７．０前後とｐＨ５．０前後の２種類）を実施した。
マイコセル寒天培地（ＢＤ）で４８時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、ＭＨ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度の菌液を調整し、その１白金耳（１０μｌ）をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、１白金耳には、約１０６の細菌を含む。
３５℃で、２４時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３に対する１日後でのＭＩＣは、ｐＨ７で、それぞれ２、＜＝１、２であり、ｐＨ５では、すべて＜＝１であった。また、さらに３日室温後でのＭＩＣは、ｐＨ７で、それぞれ３、＜＝１、３であり、ｐＨ５では、２、＜＝１、＜＝１であった。
結果
表にｐＨ５とｐＨ７の環境で、１日後、および３日後に判定したササエキスのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対するＭＩＣの分布を示した。ｐＨ５で、２４時間判定で、ササエキス５％の濃度で、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ８株とＣ．ｇｌａｂｒａｔａ４株のすべての発育を阻止した。３日後の判定では、全株の発育阻止には８％が必要であった。
ｐＨ７で、２４時間判定で、ササエキス５％の濃度で、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ全株の発育阻止を示した。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａに対するＭＩＣは判定不能であった。３日後の判定では、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａを含め全株の発育阻止には８％以上が必要であった。
考察
女性の膣炎には、原虫によるトリコモナス膣炎、真菌によるＣａｎｄｉｄａ性膣炎もの、および細菌による細菌性膣症（＝非特異性膣炎）が知られている。膣炎をおこすＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．は、外陰炎の原因ともなる。Ｃａｎｄｉｄａ性膣炎は、他の膣炎と異なり、チーズ状の帯下が特徴で、きわめて掻痒感の強い疾患である。治療には抗真菌薬が投与される。
今回の検討から、ササエキスは酵母状真菌に対して発育阻止効果があることが確認された。酸性下で１日後に測定したＭＩＣは、５％から３％に分布した。また、ｐＨ調整後中性下で測定したＭＩＣは、５％から４％に分布した。しかしながら、さらに３日間の室温放置後に再度ＭＩＣを判定したところ、ササエキスのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対するｐＨ５．０でのＭＩＣは、８％の１株を除き１２株が５〜３％の範囲から７〜４％の範囲と耐性側にシフトし、ｐＨ７．０でのＭＩＣは、１３株の全株が５〜４％の範囲から８％以上にシフトした。このことから、１日後に決定したＭＩＣあるいはそれ以上の濃度でのササエキス真菌に対する作用が静菌的であることを示しており、殺菌にはより高濃度が必要であることを示唆した。また、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａは、中性環境で３７℃で１日培養後には充分な発育が認められなかったが、その後３日室温に放置した時、充分な発育が認められ、ＭＩＣの判定が可能となった。酸性に調整したＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地では、３７℃１日でも充分な発育が見られ、ＭＩＣの判定が可能であった。
Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地を感受性測定用培地として用いた本実験では、ササエキスのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対するＭＩＣは７〜４％の濃度にあり、抗真菌作用を示すことが明らかとなった。そのＭＩＣは、中性環境で、酸性環境より１管程度低い値を示した。さらに、中性条件で１日後で発育を阻止していたかなり高い濃度でも、その後の室温放置によりＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の発育が観察され、その作用は静菌的であることが知られた。酸性条件下でも、１日後で発育を阻止していた濃度で、その後Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の発育が観察されたが、その程度は中性環境で観察されたより軽度であった。すなわち、本エキスは、酸性条件下で、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対して、中性環境下より、強い殺菌作用を示すことが明らかとなった。ササエキスを臨床応用する場合の濃度の設定には、本エキスの毒性に関する情報に加え、この点も充分考慮して、使用濃度と使用回数を設定する必要があると考えられた。
以上のことから、抗菌作用に加え、抗真菌作用を有するササエキスはＣａｎｄｉｄａ膣炎および外陰炎およびその他のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐが関与する病態の治療薬として、充分使用できることが強く示唆された。
また、本エキスがＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓなど細菌性膣症に関係する細菌に強いあるいは中等度の抗菌作用を示すことや、その他の細菌学的な特性があることを本発明者らが確認していることから、細菌性膣症の治療薬としての有用性が高いと考えられるが、その場合、抗真菌作用を合わせもつ本エキスは、当然ながら、現在細菌性膣症に使用されるクロラムフェニコールのように抗真菌作用を全く示さない抗菌薬の使用後に副現象として生じることが報告されているＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．による菌交代現象あるいは交代症の発生を防止できる特性を有していることが容易に予想される。
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試験例２１（Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ患者病巣由来のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に対する抗菌作用）
ササエキスは、にきび（Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の病因の一つとして重要なＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓを６．２５％の濃度で、完全に発育を抑制する。また、ササエキスは、化膿性球菌として重要なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）に対しても、１％以下の濃度で完全に発育を抑制をすることが明らかとなった。本発明者らは、にきびの患者の病巣から分離されたにきびの増悪因子として重要なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ１３株とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ１株のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．合計１４株を使用して、ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により検討した。
材料と方法
使用菌株：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ１３株とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ１株の合計１４株を用いた。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。表３０に使用した菌株の菌種と抗菌薬感受性パターンを示した。
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試験液は試験例７と同じである。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。可能な限り、日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が５，４，３，２，１，０．５，０．２５，０．１２５％になるようにササエキスを含有させたＭｕｅｌｌａｒ  Ｈｉｎｔｏｎ寒天平板（Ｄｉｆｃｏ）を作製した。５０％〜１．２５％のササエキス液と１倍濃度のＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地を１：９で混合して、ササエキス含有寒天培地を作製した。２ＮのＮａＯＨ水で培地ｐＨ６．１〜７．１に調整した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２２およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２に対するＭＩＣは２％であった。
接種菌液の調整と判定：
ＴＳＡ寒天培地で２４〜４８時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、ＭＣ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ  １の濁度の菌液を調整した。その１０μｌをＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ  １ｍｌに浮遊させ、その１０μｌをササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。３５℃２０時間好気環境下で培養後、発育の有無を肉眼で観察した。
結果
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ１３株とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ１株のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．合計１４株を使用して、ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により検討した。その結果、ササエキスは、１％の濃度で、これらの発育を完全に抑制した。１４株については、抗菌薬３薬剤（テトラサイクリン、クリンダマシシン、オフロキサシン）についての感受性が試験されており、テトラサイクリン１剤耐性の菌株が２株、クリンダマイシン１剤耐性株が１株、テトラサイクリンとクリンダマイシンの２剤耐性の菌株が２株、オフロキサシン１剤耐性株が１株含まれていたが、これらの耐性菌をササエキスは、一様に１％以下で発育を阻止した。
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考察
本発明者らは、にきびの患者から分離された、にきびの増悪因子として重要なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ１３株とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ１株のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．合計１４株のササエキスに対する感受性を寒天平板希釈法により検討した。その結果、ササエキスは、２％の濃度で、これらの発育を完全に抑制した。抗菌薬３薬剤（テトラサイクリン、クリンダマシシン、オフロキサシン）についての感受性が試験されたこれら１４株には、テトラサイクリン１剤耐性の菌株が２株、クリンダマイシン１剤耐性株が１株、テトラサイクリンとクリンダマイシンの２剤耐性の菌株が２株、オフロキサシン１剤耐性株が１株含まれていたが、ササエキスは、これらの耐性菌を一様に、２％以下の濃度で発育阻止した。
以上の事実は、ササエキスＰ．ａｃｎｅｓの発育を抑制できる６．２５％の濃度であれば、増悪因子のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に対しても充分な効果があり、にきびの治療薬として、極めて有用であることを示唆する。
試験例２２（Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ患者病巣由来のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に対する抗菌作用）
この試験例では、にきびの患者の病巣から分離されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｓｐｐ．合計４４株を使用して、ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により検討した。
使用菌株：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ合計４４株を用いた。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例７と同じである。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。可能な限り、日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が５，４，３，２，１，０．５，０．２５，０．１２５％になるようにササエキスを含有させたＭｕｅｌｌａｒ  Ｈｉｎｔｏｎ寒天平板（Ｄｉｆｃｏ）を作製した。２ＮのＮａＯＨ水で、培地ｐＨ６．１￣７．１に調整した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２２およびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２に対するＭＩＣは２％であった。
接種菌液の調整と判定：
ＴＳＡ寒天培地で２４￣４８時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中に浮遊させ、Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  Ｎｏ  １の濁度の菌液を調整した。その１０μｌをＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ  １ｍｌに浮遊させ、その１０μｌをササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。３５℃２０時間好気環境下で培養後、発育の有無を肉眼で観察した。
結果を表３２にまとめた。
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試験例２３（膣炎および細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
試験液は試験例７と同じである。５０（ｗ／ｖ）％の茶褐色で、芳香を有するやや粘性のある酸性の液体である。
抗菌力の試験法：嫌気性菌の抗菌薬の抗菌力測定法にならい、変法ＧＡＭ寒天培地またはＢｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ寒天培地を測定用基礎培地として、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を％で求めた。
供試菌株：Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．とＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ（１４株）、Ｐｉｇｍｅｎｅｄ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．（９株）、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの嫌気性球菌群（２１株）、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．（１２株）、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ（１１株）を用いた。
成績とまとめ
ＢＶ関連微生物の通性嫌気性菌と嫌気性菌およびＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対するササエキスの抗菌力の程度、が明らかとなった。Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を３〜５％で、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの発育を６％の濃度で、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ．を４％の濃度で、嫌気性球菌群を３％の濃度で、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．を１％の濃度で抑制した。
試験例２４（ササエキスの偏性嫌気性菌に対する抗菌スペクトル）
嫌気性菌参考菌株を用いたｐＨ６．０とｐＨ７．０での検討
この試験例では、ササエキスの抗菌スペクトルを明らかにする目的で、一部の気難しい微好気性菌、通性菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）を含む教室保存の偏性嫌気性菌の多数株を使用して、ササエキスの抗菌作用を中性（ｐＨ７．０）と弱酸性（ｐＨ６．０）付近で検討した。
使用菌株：当施設に保存されていた参考菌株を用いた〔表３３〜３６〕。ＭＩＣ精度管理用菌株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３も使用した。試験液は試験例７と同じである。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が６．４，３．２，１．６．０．８，０．４，０．２，０．１％ササエキスを含有させた変法ＧＡＭ寒天平板（日水製薬）を作製した。なお、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と１０％塩酸水を使用して、培地ｐＨの調整を実施し、その目標をｐＨ６．０とｐＨ７．０とした。
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ＨＫ血液寒天培地（極東製薬）で４８時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｂｒｏｔｈ  ＭＩＣ（Ｄｉｆｃｏ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度の菌液を調整し、１０倍希釈の後、その１白金耳をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、１白金耳には、約１０４の細菌を含む。
嫌気ワークステーション（グンゼ産業）中で、３５℃で、２日間培養後（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍでは、１日培養後）、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（＋）と判定した。結果を表３３〜３６に示す。
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まとめ
ササエキスの嫌気性菌群に対する抗菌スペクトルの概要が明らかになった。ササエキスに対するＭＩＣが３％以下の場合に強い抗菌力、４％〜６％の場合に、中等度の抗菌力、そして７％以上の場合に弱い抗菌力を示すと仮定した場合には、以下のように記述できる。
ササエキスは、無芽胞嫌気性グラム陽性球菌（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ，Ｇｅｍｅｌｌａ）に強い抗菌力を示した。しかしながら、微好気性菌のａｎｇｉｎｏｓｕｓ  ｇｒｏｕｐには弱い抗菌力しか示さなかった。
無芽胞グラム陽性嫌気性菌には、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍには中等度の、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓには弱い抗菌力を示した。無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌には、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ，Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｖｒｉｏ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍには強い抗菌作用を、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａには、中等度の抗菌作用を示した。嫌気性グラム陰性球菌（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）には強い抗菌作用を示した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍには、中等度の抗菌作用を示したＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉを除くすべてに強い抗菌作用を示した。
産業上の利用可能性
本発明の抗菌剤は、破傷風菌、カンジダ菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、プロピオニバクテリウムアクネス属菌、ガス壊疽菌、各種耐性菌（例えば、Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、膣炎および細菌性膣症関連微生物（例えば、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ）等には強い抗菌作用を、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ等には弱い抗菌作用を示し、また、ヘルペスウイルス等のウイルスに対する抗ウイルス作用を示し、抗菌性インキ、抗菌性塗料、抗菌性日本酒、抗菌性接着剤、抗菌性飲料、抗菌性食品、抗菌性調味料、動植物用抗菌剤、防腐剤、農業用殺菌剤、農薬等として有用である。特にササエキスに加え、有機酸（例えば、リンゴ酸）を含有する本発明の抗菌剤の抗菌作用は特に顕著である。
【国際調査報告】
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