(57)【要約】（課題）  大腸菌内でＥＢウイルスの環状ＤＮＡを改変及び増殖させることを可能とし、これを細胞内でＥＢウイルス粒子として大量に産生することができるシステムを確立する。（解決手段）  相同組換え法を用いて大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）のＤＮＡ配列をＡｋａｔａ細胞内の環状ＥＢウイルスＤＮＡに挿入することにより、Ａｋａｔａ細胞由来の環状ＥＢウイルスゲノムを大腸菌で改変、増殖させることを可能とし、このゲノムＤＮＡをＡｋａｔａ細胞へ導入すると大量のＥＢウイルス産生を起こさせることができる。
2003056023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状エプスタインバーウイルスゲノムに大腸菌Ｆプラスミド由来の大腸菌人工染色体ベクター断片が挿入されてなる二本鎖環状ＤＮＡ。
【請求項２】
前記環状エプスタインバーウイルスゲノムがＡｋａｔａ細胞由来である請求の範囲第１項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ。
【請求項３】
更に細胞内で機能する少なくとも一種のマーカー遺伝子が挿入された請求の範囲第１項または第２項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ。
【請求項４】
前記エプスタインバーウイルスゲノムに任意の遺伝子が組み込まれた請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡ。
【請求項５】
請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡを大腸菌人工染色体として有する大腸菌。
【請求項６】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項に記載の二本鎖環状ＤＮＡをベクターとして使用する方法。
【請求項７】
エプスタインバーウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞にウイルス遺伝子ＥＢＮＡ１を導入して作製した、ウイルス蛋白質ＥＢＮＡ１を恒常発現するＥＢＮＡ１陽性Ａｋａｔａ細胞。
【請求項８】
エプスタインバーウイルス陽性ないし陰性Ａｋａｔａ細胞に、請求の範囲第４項に記載の二本鎖環状ＤＮＡがトランスフェクションにより導入されたＡｋａｔａ細胞。
【請求項９】
請求の範囲第７項に記載のＥＢＮＡ１陽性Ａｋａｔａ細胞に、請求の範囲第４項に記載の二本鎖環状ＤＮＡがトランスフェクションにより導入されたＡｋａｔａ細胞。
【請求項１０】
請求の範囲第８項または第９項に記載のＡｋａｔａ細胞を抗イムノグロブリン処理することからなるエプスタインバーウイルスを産生する方法。
【請求項１１】
請求の範囲第８項または第９項に記載のＡｋａｔａ細胞から産生されたエプスタインバーウイルス。
【請求項１２】
以下のステップ、
（ａ）トランスフェクションにより請求の範囲第４項に記載の二本鎖環状ＤＮＡをエプスタインバーウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入するステップ、
（ｂ）（ａ）のＡｋａｔａ細胞を抗イムノグロブリン処理することによりエプスタインバーウイルスを産生させるステップ、
（ｃ）（ｂ）で産生したエプスタインバーウイルスをエプスタインバーウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に導入するステップ、
（ｄ）（ｃ）の導入後のＡｋａｔａ細胞から、請求の範囲第４項に記載の二本鎖環状ＤＮＡを有するＡｋａｔａ細胞を選択するステップ、
（ｅ）（ｄ）で選択されたＡｋａｔａ細胞を抗イムノグロブリン処理するステップ、
を含むエプスタインバーウイルスを産生する方法。
【請求項１３】
以下のステップ、
（ａ）トランスフェクションにより請求の範囲第４項に記載の二本鎖環状ＤＮＡをエプスタインバーウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入するステップ、
（ｂ）（ａ）のＡｋａｔａ細胞から野生型エプスタインバーウイルスが脱落した細胞クローンを分離するステップ、
（ｃ）（ｂ）で分離された細胞クローンを抗イムノグロブリン処理するステップ、
を含むエプスタインバーウイルスを産生する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、エプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂｅｒｒ）ウイルス（以下「ＥＢウイルス」又は「ＥＢＶ」という。）環状ＤＮＡ、特にＡｋａｔａ細胞由来のＥＢウイルス環状ＤＮＡおよびその組換え体を、大腸菌を用いて増殖可能とする技術、及びこれを用いた感染性ＥＢウイルスの大量生産法に関する。
背景技術
ＥＢウイルス産生細胞としては、Ａｋａｔａ細胞、Ｂ９５−８細胞、Ｐ３ＨＲ−１細胞などが知られている。このうちＡｋａｔａ細胞は、抗ヒトイムノグロブリン抗体を液体培地中に加えるだけで感染性ＥＢウイルス産生を誘導できるため、ＥＢウイルスの大量生産に適した細胞株である（Ｔａｋａｄａ  Ｋ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３，２７−３２（１９８４）；Ｔａｋａｄａ  Ｋ．ａｎｄ  Ｏｎｏ  Ｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６３，４４５−４４９（１９８９））。
その長期継代により得られたＥＢウイルスゲノムが脱落したクローン（以下「ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞」という。）は、ＥＢウイルスを再感染することによって、抗ヒトイムノグロブリン抗体処理によるウイルス産生能を再獲得することができる（特開平７−１１５９６６号公報）。従って、野生型のＥＢウイルスを持つＡｋａｔａ細胞内で相同組換えにより改変した薬剤マーカー遺伝子をもつ組換えＥＢウイルスを、野生型ウイルスとの混合物の状態でＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に再感染させて薬剤で選択することで、組換えＥＢウイルスのみを持つＡｋａｔａ細胞を作製することができる。この細胞は、抗ヒトイムノグロブリン抗体処理により、組換えウイルスのみを大量に産生する。しかしＡｋａｔａ細胞由来のＥＢウイルスＤＮＡは、現状ではＡｋａｔａ細胞内のみで増殖可能であり、遺伝子の改変はすべてＡｋａｔａ細胞内で行うため、時間のかかるのが難点であった。
これに対して、別のＥＢウイルス産生細胞であるＢ９５−８細胞由来の環状ＥＢウイルスＤＮＡは既に大腸菌人工染色体に組み込まれて、大腸菌内で増殖することが可能となっている（米国特許第６，２９１，２４６号）。このシステムの利点は、大腸菌内での高効率の相同組換えを利用してウイルスゲノムに効率良く変異を導入できることである。しかし、現状では大腸菌内で増殖、改変したＢ９５−８株のＥＢウイルスＤＮＡから、感染性ウイルスを大量生産するのに適した細胞株は存在しない。
現存する唯一のシステムは、大腸菌で増やしたＢ９５−８株ＥＢウイルスＤＮＡをヒト２９３細胞へ導入した後、ウイルス初期遺伝子ＢＺＬＦ１をトランスフェクションにより外来性に発現させ、ウイルス産生を誘導するものである（Ｈ−Ｊ  Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅ，Ｗ．Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ：Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０００；５３：２７０−２７９）。しかし、このシステムはウイルス産生誘導のための手段が煩雑で、しかもウイルス力価が低いため、感染性ウイルスの大量生産には向いていない。また、Ｂ９５−８細胞由来のＥＢウイルスＤＮＡをＡｋａｔａ細胞に導入することでウイルス産生が可能か否かについては、未だ検討されていない。
発明の開示
本発明の目的は、大腸菌内でＥＢウイルスの環状ＤＮＡを改変及び増殖させることを可能とし、これを細胞内でＥＢウイルス粒子として大量に産生することができるシステムを確立することである。
我々は相同組換え法を用いて大腸菌人工染色体（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，以下「ＢＡＣ」という。）のＤＮＡ配列をＡｋａｔａ細胞内の環状ＥＢウイルスＤＮＡに挿入することにより、Ａｋａｔａ細胞由来の環状ＥＢウイルスゲノムを大腸菌で改変、増殖させることを可能とした。さらに、このゲノムＤＮＡをＡｋａｔａ細胞へ導入すると大量のＥＢウイルス産生が起こることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち本発明は、環状エプスタインバーウイルスゲノムに大腸菌Ｆプラスミド由来の大腸菌人工染色体ベクター断片が挿入されてなる二本鎖環状ＤＮＡである。この環状エプスタインバーウイルスゲノムは、Ａｋａｔａ細胞由来であることが好ましい。この二本鎖環状ＤＮＡは、更に細胞内で機能する少なくとも一種のマーカー遺伝子が挿入されていてもよい。更に、この二本鎖環状ＤＮＡは、前記ＥＢウイルスゲノムに任意の遺伝子が、好ましくは相同組換えにより、組み込まれていてもよい。
また本発明は、上記いずれかの二本鎖環状ＤＮＡを大腸菌人工染色体として有する大腸菌である。
更に本発明は、上記いずれかの二本鎖環状ＤＮＡをベクターとして使用する方法である。
また、本発明は、ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞にウイルス遺伝子ＥＢＮＡ１を導入して作製した、ウイルス蛋白質ＥＢＮＡ１を恒常発現するＥＢＮＡ１陽性Ａｋａｔａ細胞である。
また、本発明は、ＥＢウイルス陽性ないし陰性Ａｋａｔａ細胞、もしくはウイルス蛋白質ＥＢＮＡ１を恒常発現するＥＢＮＡ１陽性Ａｋａｔａ細胞に、上記相同組換えにより前記ＥＢウイルスゲノムに任意の遺伝子が組み込まれた二本鎖環状ＤＮＡがトランスフェクションにより導入されたＡｋａｔａ細胞である。
更に、本発明は、これらのＡｋａｔａ細胞を抗イムノグロブリン処理することから成るＥＢウイルスを産生する方法であり、また、こられのＡｋａｔａ細胞から産生されたＥＢウイルスである。
また、本発明は、以下のステップ、
（ａ）トランスフェクションにより上記いずれかの二本鎖環状ＤＮＡをエプスタインバーウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入するステップ、
（ｂ）（ａ）のＡｋａｔａ細胞を抗イムノグロブリン処理することによりエプスタインバーウイルスを産生させるステップ、
（ｃ）（ｂ）で産生したエプスタインバーウイルスをエプスタインバーウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に導入するステップ、
（ｄ）（ｃ）の導入後のＡｋａｔａ細胞から、上記いずれかの二本鎖環状ＤＮＡを有するＡｋａｔａ細胞を選択するステップ、
（ｅ）（ｄ）で選択されたＡｋａｔａ細胞を抗イムノグロブリン処理するステップ、
を含むエプスタインバーウイルスを産生する方法である。
さらに、本発明は、以下のステップ、
（ａ）トランスフェクションにより上記いずれかに記載の二本鎖環状ＤＮＡをエプスタインバーウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入するステップ、
（ｂ）（ａ）のＡｋａｔａ細胞から野生型エプスタインバーウイルスが脱落した細胞クローンを分離するステップ、
（ｃ）（ｂ）で分離された細胞クローンを抗イムノグロブリン処理するステップ、
を含むエプスタインバーウイルスを産生する方法である。
本発明で用いる環状ＥＢウイルスゲノムは、既知の二本鎖ＤＮＡを有するヘルペスウイルスの一種であり、既述のように本発明と同様な目的の下に様々な研究が行われている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ：Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０００；５３：２７０−２７９等）。
ＥＢウイルスには、Ａｋａｔａ細胞、Ｂ９５−８細胞、Ｐ３ＨＲ−１細胞中に含まれるものの他、無数のＥＢウイルス株が存在する。Ａｋａｔａ  ＥＢウイルスゲノムは、その制限酵素地図から、欠失の無いプロトタイプＥＢウイルスである。本発明における環状ＥＢウイルスゲノムは、いずれのＥＢウイルス株のゲノムを用いてもよく、本発明においては特にＡｋａｔａ細胞由来のものが好ましい。
Ａｋａｔａ細胞は、既知のヒトリンパ球癌細胞であり、抗ヒトイムノグロブリン抗体を加えることで感染性ＥＢウイルス産生を誘導できる（Ｔａｋａｄａ  Ｋ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３，２７−３２（１９８４）：Ｔａｋａｄａ  Ｋ．ａｎｄ  Ｏｎｏ  Ｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６３，４４５−４４９（１９８９））。
本発明の二本鎖環状ＤＮＡは、下記でＡＫ−ＢＡＣと呼ばれる１７６ｋｂの二本鎖の環状プラスミドであり、その地図を図１及び図２に示す。図２は、ＢａｍＨＩによる切断地図を示し、ＢａｍＨＩ  Ｘ断片内に挿入された大腸菌Ｆプラスミドの由来の配列（図中「Ｆ」で示す。）を有し、更にクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）により大腸菌内で単コピープラスミドとして増殖可能である。更に、図２では、ヒト細胞内で働くネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）を有している。
ＥＢウイルスＤＮＡに組み込むべきベクター断片としては、大腸菌内で単一コピープラスミドとして複製及び分配を可能とする遺伝子を含む断片であればよく、例えば、バクテリオファージＰ１由来のものや大腸菌Ｆプラスミド由来のものが知られているが、本発明においては特に大腸菌Ｆプラスミド由来のベクターであるｐＢｅｌｏＢＡＣ１１が好ましく機能することがわかっている。このＢＡＣベクター断片が組み込まれた二本鎖環状ＥＢウイルスＤＮＡ（ＡＫ−ＢＡＣ）の例を、図３（下）に示す。図３下のＡＫ−ＢＡＣにおいては、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ  Ｘ断片内のＳｍａＩサイト（Ｓ）に、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、大腸菌Ｆプラスミド由来の配列（ＯｒｉＳ、ｒｅｐＥ、ＰａｒＡ、ＰａｒＢ、ＰａｒＣ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）が挿入されている。
マーカー遺伝子としては、目的に応じて適宜公知のものを用いることができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、ハイグロマシン耐性遺伝子、ＸＧＰＲＴ遺伝子等が挙げられる。
本発明の二本鎖環状ＤＮＡは、大腸菌に導入されることにより、任意の遺伝子を導入すること等の改変を容易に行うことや大腸菌人工染色体として増殖を行うことが可能である。このように組み込むことのできる遺伝子には特に制限はないが、１０〜１７０ｋｂ程度のものが好ましい。このようにして、任意の遺伝子が挿入され増殖された大腸菌人工染色体ＤＮＡを、Ａｋａｔａ細胞へ導入することができる。このため、本発明の二本鎖環状ＤＮＡは、ベクターとして用いることができる。更に、このＡｋａｔａ細胞を抗イムノグロブリン処理すれば、この遺伝子を有する組換えＥＢウイルスを大量に生産することが可能になる。
本発明の大腸菌人工染色体ＤＮＡを組み込んだＥＢウイルスＤＮＡは、これを大腸菌内に導入し、その大腸菌を大量培養することにより、環状のままの形で大量に調整することが可能である。さらに、大腸菌内で相同組換えを利用してＤＮＡを改変し、この環状ウイルスＤＮＡをＡｋａｔａ細胞へトランスフェクションにより導入することで容易に組換えＥＢウイルスを産生することが可能である。
本発明は、組換えＥＢウイルスを簡便かつ大量に作製することを可能にする。外来遺伝子をＥＢウイルスへ組み込むことにより、感染細胞内で外来遺伝子産物を発現させることができる。従って、本発明を用いることにより、ＥＢウイルスを遺伝子治療のためのベクターとして利用することが可能となる。また、感染細胞を遺伝子産物生産に利用できる。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は、全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００１−３９１３００号の明細書に記載の内容は、全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。なお、本実施例の操作の概略を図４に示す。本実施例においては、任意の遺伝子ＸとしてＧＦＰ遺伝子を用いている。
実施例１
本実施例では、Ａｋａｔａ細胞内の環状ＥＢウイルスＤＮＡへＢＡＣベクター配列の組み込みを行った。
まず、汎用されているクローニングベクターＰＵＣ１１９へ環状ＥＢウイルスＤＮＡの制限酵素ＢａｍＨＩ酵素で消化して得られる断片であるＴ、Ｘ、Ｖ断片領域を含むＤＮＡを、サブクローニングした。この中のＸ断片部分に、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）及びｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  社）由来のＢＡＣベクター断片を挿入した。このＢＡＣベクターは、図３に示すように、ＯｒｉＳ、ｒｅｐＥ、ＰａｒＡ、ＰａｒＢ、ｐａｒＣといった人工染色体（ＢＡＣ）として機能しうる遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）を備えている。
このようにして得られたプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで直鎖化した後、２０マイクログラム分を野生型の環状ＥＢウイルスＤＮＡを持つＡｋａｔａ細胞（５×１０６個）に電気穿孔法により導入し、５％炭酸ガス、３７℃、飽和湿度下培養を２日間行った。２日後、細胞を１ウェルあたり１万個含まれるようにネオマイシン３７５μｇ／ｍｌを含む培地に懸濁し９６穴プレートに播種し、培養液を５日ごとに半量をネオマイシン入りの新しい培養液と交換しつつ培養を行った。３週間後、細胞増殖が認められた１７ウェルについて抗イムノグロブリン抗体処理によりウイルス産生を誘導した。
これら産生されたウイルスについて、ＢａｍＨＩ  Ｘ断片をプローブとしたサザンブロッティング解析を行い、相同組換えを起こしたＥＢＶゲノムを含む細胞クローンの探索を行った。その結果を図５に示す。ＢａｍＨＩ消化後の解析により（図５左）、クローン６及び８において、野生型のＥＢＶ由来のバンド（約２．１ｋｂ）に加えて、相同組換えを起こしたときに生じると予想されるバンド（約１１．３ｋｂ）を有していることが観察された。
更に、クローン６及び８について、Ｘｂａｌ消化後の解析を行ったところ（図５右）、クローン６のみが、野生型ＥＢＶ由来バンド（１２．２ｋｂ）に加えて、正しい相同組換えにより生じると予想されるバンド（１１．３ｋｂ及び５．１ｋｂ）を有していることが観察された。なお、クローン８については、野生型ＥＢＶ由来バンド（約１２．２ｋｂ）に加えて１０．５ｋｂのバンドが観察され、非相同組換えを起こしたと推察された。即ち、このクローン６が、野生型ＥＢウイルスと共にＢＡＣベクターＤＮＡが挿入されたＥＢウイルスゲノムを含むことが確認された。
このクローン６細胞より抽出した全ゲノムＤＮＡ１００ｎｇを用いてＤＨ１０Ｂコンピテント細胞をトランスフォームしたところ、多数のクロラムフェニコール耐性コロニー（すなわち、ＢＡＣの持つ薬剤マーカーを発現しているコロニー）を得た。得られたコロニー６個を増殖し、プラスミドＤＮＡを抽出した。
これらのＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化してアガロースゲル電気泳動により解析した結果、全て同じ泳動パターンであった。この内の１クローンの結果を図６に示す。各電気泳動パターンの右にＡｋａｔａ細胞内のＥＢＶ制限酵素地図から予想される切断パターン（図１）を併記する。これらから明らかなように、これらのアガロースゲル電気泳動パターンは、Ａｋａｔａ細胞内のＥＢウイルスＤＮＡの制限酵素地図より予想されるパターンと一致した。
以下、このＢＡＣクローンを「ＡＫ−ＢＡＣ」という。大腸菌１リットルの培養から４０μｇのＡＫ−ＢＡＣの環状ＤＮＡが回収された。
実施例２
本実施例では、大腸菌内での高効率相同組換え法を用いることで、ＡＫ−ＢＡＣにクローン化されたＥＢウイルスゲノムを迅速に改変することが可能であることを示す。そのため、本実施例では、ＥＢウイルスゲノムのＢ９５−８株欠失領域（ウイルス産生には必須ではない領域）に、発光クラゲ由来の蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子を相同組換え法により挿入した。大腸菌内の相同組換え法は、Ｉｏａｎｎｏｕらの方法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６４４２−４４７，１９９６）を用いた。
ＧＦＰ遺伝子の発現ユニット（プロモーター＋ＧＦＰ遺伝子＋ポリＡシグナル）と大腸菌内で機能するカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）が連結されたテンプレートを、ＥＢウイルスゲノムのＢ９５−８欠失領域と相同な塩基配列を５’側に持つ合成プライマーを用いてＰＣＲで増殖することで、ターゲッティングコントラクト（ＰＣＲ産物）を作製した。
実施例１で得られたＡＫ−ＢＡＣでトランスフォームし、更にｐＧＥＴｒｅｃ（組換え酵素ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴの発現プラスミド）でトランスフォームしたＤＨ１０Ｂ細胞を用意し、これにＲｅｃＥ／ＲｅｃＴの発現を誘導した後に、コンピテント化した。
このコンピテント細胞を、上記ターゲッティングコンストラクトでトランスフォームした。
このようにトランスフォームした細胞を、クロラムフェニコール（ＣｍＲ）とカナマイシン（ＫｍＲ）で２重選択し、両者に耐性となるコロニーをスクリーニングした。
図７に、このコロニーから得たＤＮＡについてＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。比較のため、相同組換えを行っていない（改変前）ＡＫ−ＢＡＣのものを、図７左に示す。改変前のＡＫ−ＢＡＣのレーンで見られる２８．８ｋｂのバンド（Ｂ９５−８欠失領域が含まれる）が消失し、その代わりに１０．５ｋｂ前後に新たなバンドが出現していることが観察された。サザンブロッティングの結果、このバンドが近接した２本のバンドよりなることを確認した。これは、ＧＦＰ遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）の挿入により新たに出現すべきバンドのサイズ（１０５２３ｂｐ及び１０２９７ｂｐ）と合致する。
即ちＲｅｃＥ／ＲｅｃＴにより大腸菌内で相同組換えが起こったことによって、ＡＫ−ＢＡＣのＢ９５−８欠失領域（図２）が除去され、その代わりに同じ場所にＧＦＰ遺伝子が挿入されたことが分かる。以上より、解析した３クローンの全てにおいて、このような相同組換えによる遺伝子改変が正確に行われていることが確認された（図７）。
得られたＢＡＣクローンを、「ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰ」と命名した。大腸菌１リットルの培養から、４０μｇのＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰの環状ＤＮＡが回収された。
実施例３
本実施例では、Ａｋａｔａ細胞を１０％ウシ胎児血清を含む培養液中で長期継代を行うことにより、ＥＢウイルスの脱落した細胞を用いた（ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞）。
実施例２で得られたＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰのＤＮＡを、このＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞へ電気穿孔法により導入し、２日後にネオマイシン７００μｇ／ｍｌ入りの培地に懸濁し９６穴プレートに播種し、培養液を５日ごとに半量をネオマイシン入りの新しい培養液と交換しつつ培養を行った。
３週間後に得られた多数のネオマイシン耐性細胞をサザンブロッティング法により解析し、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰを環状ＤＮＡ（エピゾーム）として有する細胞クローンを選択した。
得られた細胞クローンについて、抗イムノグロブリン抗体処理によりウイルス産生を誘導した。２日後に培養上清を回収し、上清中のＥＢウイルスの存在を、ＥＢウイルスＤＮＡの定量および臍帯血リンパ球のトランスフォーム活性により検討した。
ＥＢウイルス産生量は、培養１００ｍｌ当り５μｇのＥＢウイルスＤＮＡであり、５０％トランスフォーム能は、１０７／ｍｌ以上であった。
この実施例から、実施例２で得られたＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰのＤＮＡを、ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクションにより導入し、ネオマイシン選択を行うことで、組換えウイルス産生細胞を作製し、こうして得られたウイルス産生細胞を抗イムノグロブリン抗体で処理することにより、ＧＦＰ蛋白質を発現する感染性組換えＥＢウイルスが産生されることが示された。
実施例４
本実施例では、環状ＥＢウイルスゲノムを有するＡｋａｔａ細胞（ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞）を用いた。
実施例２で得られたＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰのＤＮＡを、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に電気穿孔法により導入した。なお、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞は、実施例３のＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に比べて、ＧＦＰ陽性細胞の割合が約１０倍高いことを、遺伝子導入後２日目の蛍光顕微鏡によるＧＦＰ蛍光の観察により確認した。
遺伝子導入を行なったＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に対してネオマイシン選択を行い、得られた細胞クローンを増殖し、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰが環状ＤＮＡ（エピゾーム）として維持されているか否かを解析した。その結果、ＥＢウイルス陽性細胞に由来するネオマイシン耐性細胞クローンの多くが、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰをエピゾームとして維持していることを確認した。そして、エピゾームとして維持している頻度は、実施例３のＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞を用いた場合に比べて約２０倍高かった。
ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞にＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰが完全なエピゾームとして導入された細胞クローンを選択し、この細胞クローンについて抗イムノグロブリン処理抗体処理を行ってウイルス産生を誘導した。得られたウイルス液をＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に感染させ、再びネオマイシン選択を行なうことで、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰだけを持つＡｋａｔａ細胞を得た。この細胞クローンについて、抗イムノグロブリン抗体処理によりウイルス産生を誘導した。２日後に培養上清を回収し、上清中のＥＢウイルスの定量、および臍帯血リンパ球のトランスフォーム活性を測定した。
ＥＢウイルス産生量は、培養１００ｍｌ当り５μｇのＥＢウイルスＤＮＡであり、５０％トランスフォーム能は、１０７／ｍｌ以上であった。
この実施例から、実施例２で得られたＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰをＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクションにより導入し、ネオマイシン選択を行なうことで、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰがエピゾームとして維持される細胞クローンを効率良く樹立できることが示された。また、こうして得られる細胞クローンよりウイルス産生を行い、ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に感染導入し、再びネオマイシン選択を行なうことにより、ＧＦＰ蛋白質を発現する感染性組換えＥＢウイルスのみ（野生型ＥＢウイルスを含まない）を産生可能であることが示された。
なお、野生型ＥＢウイルスを含まないものを産生可能とする方法としては、上記のようにＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に感染導入するほかに、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞から野生型ＥＢウイルスが脱落した細胞クローンを分離する方法を用いることもできる。即ち、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞にＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰが完全なエピゾームとして導入された細胞クローンを選択し、ヒドロキシウレアで処理し、再び細胞クローンに分けることにより野生型ＥＢウイルスが脱落した細胞クローンを分離することができる。あるいは、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞にＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰが完全なエピゾームとして導入された細胞クローンを選択し、継代培養して限界希釈法によりクローニングすることにより、野生型ＥＢウイルスが脱落した細胞クローンを分離することができる。
実施例５
ウイルス蛋白質であるＥＢＮＡ１蛋白質は、ＥＢウイルスゲノムが細胞核内においてエピゾームとして複製・維持されるために必須の蛋白質であり、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞ではＥＢＮＡ１蛋白質が発現しているために、エピゾーム形成の効率がＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に比べて高いことが推察された。そこで、ウイルス蛋白質ＥＢＮＡ１を恒常発現するＡｋａｔａ細胞（ＥＢＮＡ１発現Ａｋａｔａ細胞）を作成した。この細胞は、ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に、ＥＢＮＡ１遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子を連結した直鎖状ＤＮＡをトランスフェクション後、ハイグロマイシン選択を行うことにより得られた細胞クローンである。
得られたＥＢＮＡ１発現Ａｋａｔａ細胞に、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰのＤＮＡを電気穿孔法により導入後、ネオマイシン選択を行い、得られた細胞クローンを増殖し、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰが環状ＤＮＡ（エピゾーム）として維持されているか否かを解析した。その結果、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞を用いた場合とほぼ同様の効率でＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰをエピゾームとして維持している細胞クローンが得られた。これらの細胞クローンよりウイルス産生を誘導し、２日後に培養上清を回収し、上清中のＥＢウイルスの定量、および臍帯血リンパ球のトランスフォーム活性を測定した。
ＥＢウイルス産生量は、培養１００ｍｌ当たり５μｇのＥＢウイルスＤＮＡであり、５０％トランスフォーム能は、１０７／ｍｌ以上であった。
この実施例から、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰを細胞に再導入する際に、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞の代わりに、ＥＢＮＡ１発現Ａｋａｔａ細胞を用いても、ＡＫ−ＢＡＣ−ＧＦＰがエピゾームとして維持される細胞株を効率よく樹立可能であることが示された。また、こうして得られる細胞株よりウイルス産生行うことで、野生型ＥＢウイルスを含まない、感染性組換えＥＢウイルスのみを産生可能であることが示された。
産業上の利用性
本発明によれば、大腸菌内でＥＢウイルスの環状ＤＮＡを改変及び増殖させることを可能とし、これを細胞内でＥＢウイルス粒子として大量に産生することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の二本鎖環状ＤＮＡ（ＡＫ−ＢＡＣ）の、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによる切断地図である。
図２は、本発明の二本鎖環状ＤＮＡ（ＡＫ−ＢＡＣ）の構造の模式図である。アルファベットは制限酵素ＢａｍＨＩによる切断断片を示す。
図３は、Ａｋａｔａ細胞内のＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ  Ｘ断片周辺の主な制限酵素切断部位（図３上）と相同組換え完了後のＡＫ−ＢＡＣのＢａｍＨＩ  Ｘ断片周辺の主な制限酵素切断部位（図３下）を示す図である。図中、ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄＩＩＩ、ＮはＮｏｔＩ、ＳはＳｍａＩ、ＸはＸｂａＩの各制限酵素の位置を示す。
図４は、本発明の二本鎖環状ＤＮＡの製法及びこれを用いた遺伝子組換えＥＢウイルスの産生法を示す概略図である。
図５は、ＢＡＣベクター断片が挿入された環状ＥＢウイルスＤＮＡを持つＡｋａｔａ細胞についての、ＢａｍＨＩ  Ｘ断片をプローブとしたサザンブロッティング解析を示す図である（実施例１）。
図６は、大腸菌で大量調整したＡＫ−ＢＡＣのＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化してアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す図である（実施例１）。矢印は不完全消化により生じたバンドを示す。
図７は、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴを用いて大腸菌内で相同組換えによりＧＦＰ遺伝子を挿入したＡＫ−ＢＡＣのＤＮＡについてのＥｃｏＲＩで消化後のアガロースゲル電気泳動を示す図である（実施例２）。左の１レーンは、相同組換えを行っていない（改変前）もの、右の３レーンは相同組換えを行った（ＧＦＰ挿入後）ものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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