(57)【要約】緑内障関連遺伝子と緑内障発症の関係から、緑内障の発症リスクを事前に予知するための遺伝子の検査方法を提供するために、緑内障関連遺伝子のコード領域および／または上流領域を含む遺伝子領域における塩基の変異を指標として将来の緑内障の発症を予測する。変異の位置が配列番号１で示される塩基配列における１９４位；１９９位；３２４位；１０５１位；１０８４位；１６２７位；１６８５位；１７５６位；１８５３位；２８３０位；３３７１位；４０３７位または４３４６位のいずれか少なくとも１以上の位置の変異を検出することによる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障関連遺伝子のコード領域および／または上流領域を含む遺伝子領域における少なくとも２箇所以上の塩基の変異を検出し、該変異を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査方法。
【請求項２】
緑内障関連遺伝子がミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子である請求の範囲第１項に記載の検査方法。
【請求項３】
遺伝子領域が配列番号１で示される塩基配列である請求の範囲第１項または第２項に記載の検査方法。
【請求項４】
塩基の変異が、置換、欠失および／または挿入である請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項５】
配列番号１で示される塩基配列における１９４位のＣからＡへの置換；１９９位のＡからＣへの置換；３２４位のＧからＡへの置換；１０５１位のＣからＴへの置換；１０８４位のＣからＴへの置換；１６２７位のＴからＣへの置換；１６８５位のＴからＣへの置換；１７５６位のＣからＴへの置換；１８５３位のＧからＣへの置換；２８３０位のＧからＡへの置換；３３７１位のＡからＧへの置換；４０３７位のＧからＡへの置換；４３４６位のＧからＡへの置換からなる群のいずれかを検出する請求の範囲第３項に記載の検査方法。
【請求項６】
配列番号１で示される塩基配列における１９４位のＣからＡへの置換；１０８４位のＣからＴへの置換；１６２７位のＴからＣへの置換；４０３７位のＧからＡへの置換；４３４６位のＧからＡへの置換からなる群の少なくとも２以上の同時置換を検出する請求の範囲第３項に記載の検査方法。
【請求項７】
配列番号１で示される塩基配列における１０５１位のＣからＴへの置換；１６８５位のＴからＣへの置換；１７５６位のＣからＴへの置換；１８５３位のＧからＣへの置換からなる群の少なくとも２以上の同時置換を検出する請求の範囲第３項に記載の検査方法。
【請求項８】
配列番号１で示される塩基配列における１９９位のＡからＣへの置換；３２４位のＧからＡへの置換；１０５１位のＣからＴへの置換；１０８４位のＣからＴへの置換；１６２７位のＴからＣへの置換；１６８５位のＴからＣへの置換；１７５６位のＣからＴへの置換；１８５３位のＧからＣへの置換；２８３０位のＧからＡへの置換；３３７１位のＡからＧへの置換からなる群の少なくとも１の置換を検出し、該変異を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査方法。
【請求項９】
緑内障が原発性開放隅角緑内障および／または正常眼圧緑内障である請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項１０】
緑内障関連遺伝子のコード領域および／または上流領域を含む遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドを用いて変異を検出することを特徴とする請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項１１】
緑内障関連遺伝子のコード領域および／または上流領域を含む遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドが、以下に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より少なくとも１以上選択され、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）配列番号２から２７のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求の範囲第１１項に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅処理方法を行うことを含む請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項〜第１０項または第１２項のいずれか１に記載の検査方法に使用する試薬を含んでなる検査用試薬または検査用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、臨床検査の分野における緑内障関連遺伝子の検査方法および該遺伝子の変異を指標として緑内障発症リスクを予測するための検査方法に関する。例えば緑内障遺伝子として知られているミオシリン（以下「ＭＹＯＣ」という。）遺伝子の異常を検出し、該検出された異常、すなわち遺伝子の特定位置における塩基の変異を指標として緑内障を診断する遺伝子の検査方法、特に個体について将来発症する可能性を予知するための検査方法に関する。
背景技術
緑内障は、目の中にある房水が排出されない状態となり、目圧が上がって目の機能が落ちる疾患である。放置しておくと、見える範囲が狭まったり、視力が落ちたりして失明する。ただし、眼圧が正常にも関わらず、視神経に障害をきたす場合がある。
緑内障は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）、原発性閉鎖隅角緑内障（ＰＡＣＧ）、先天性緑内障および続発性緑内障の５つの病態に分類され、緑内障の２０％が遺伝性のものと言われている。これらのうち、最も多いのがＰＯＡＧである。１９８８年から１９８９年にかけて社団法人日本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、４０歳以上の人口のうち３．５６％が緑内障患者であると報告されている。
緑内障の主な危険因子は家族歴であり、その発症には遺伝子が関与していることが強く示唆される。１９９６年５月１７日に出願されたＮｇｕｙｅｎらの米国特許第５，７８９，１６９号において、緑内障関連遺伝子としてＴＩＧＲ（小柱網誘導グルココルチコイド応答）タンパク質をコードする遺伝子が開示された。ＴＩＧＲ遺伝子は、別名ＭＹＯＣ遺伝子としても知られている。Ｎｇｕｙｅｎらの米国特許第５，７８９，１６９号はまた、そのタンパク質のｃＤＮＡ配列、タンパク質自身、それに結合する分子、および結合分子をコードする核酸分子を開示しており、また緑内障および関連疾患の診断、ならびに心血管疾患、免疫疾患または該タンパク質の発現や活性に影響する他の疾患や状態といった他の疾患または状態の診断のための改善された方法および試薬を提供した。また、緑内障関連遺伝子のうちＣＹＰ１Ｂ１遺伝子における突然変異を検出し、該突然変異の存在を緑内障の指標として個体における緑内障の診断を行う方法も開示されている（特表２００１−５１２９６９号公表公報）。しかしながら、これらは緑内障関連遺伝子と緑内障の関係に着目しているものの、将来における緑内障の発症リスクを効果的に予知する手段を開示するものではない。
一方、ＷＯ０１／８８１２０Ａ１国際公開公報では、該公報の配列表に示すＭＹＯＣ遺伝子のプロモーター領域である−１５３位の遺伝子の変異を検出する方法が開示され、遺伝性が心配される家系や未発症キャリアーであることが心配される患者においては、緑内障のスクリーニングとして使用することができることが示されている。しかしながら、ここでは−１５３位の１箇所の変異に着目し、これを指標としているのみである。
緑内障は潜行性であるため、視神経に対し重大な損傷が起こる前に予防また軽減する方法をとることができるように、緑内障が発生する可能性を早期に診断または効果的に予測する一層優れた方法が要望されている。
発明の開示
（発明が解決しようとする課題）
遺伝的に緑内障の危険因子を保有し、将来における発症リスクが高い個体を特定し、その個体に関して重点的に緑内障の検査を実施することができれば、効率的に緑内障の早期発見、早期治療をなしうると考えられる。係る状況に鑑みて、本発明は緑内障関連遺伝子と緑内障発症の関係から、緑内障の発症リスクを効果的に予知するための遺伝子の検査方法を提供する事を課題とする。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、緑内障の発症が遺伝子の変異に関与することに着目し、緑内障患者および非患者の緑内障原因遺伝子の上流領域およびコード領域の遺伝子配列の分析を行い、鋭意研究を重ねた結果、該遺伝子に患者群と非患者群で頻度に差が観察される遺伝的多型が存在することを見出した。さらに、この遺伝的多型の有無により緑内障の有病率が一般集団の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
１．緑内障関連遺伝子のコード領域および／または上流領域を含む遺伝子領域における少なくとも２箇所以上の塩基の変異を検出し、該変異を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査方法、
２．緑内障関連遺伝子がミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子である前項１に記載の検査方法、
３．連遺伝子領域が配列番号１で示される塩基配列である前項１または２に記載の検査方法、
４．塩基の変異が、置換、欠失および／または挿入である前項１〜３のいずれか１に記載の検査方法。
５．配列番号１で示される塩基配列における１９４位のＣからＡへの置換；１９９位のＡからＣへの置換；３２４位のＧからＡへの置換；１０５１位のＣからＴへの置換；１０８４位のＣからＴへの置換；１６２７位のＴからＣへの置換；１６８５位のＴからＣへの置換；１７５６位のＣからＴへの置換；１８５３位のＧからＣへの置換；２８３０位のＧからＡへの置換；３３７１位のＡからＧへの置換；４０３７位のＧからＡへの置換；４３４６位のＧからＡへの置換からなる群のいずれかを検出する前項３に記載の検査方法、
６．配列番号１で示される塩基配列における１９４位のＣからＡへの置換；１０８４位のＣからＴへの置換；１６２７位のＴからＣへの置換；４０３７位のＧからＡへの置換；４３４６位のＧからＡへの置換からなる群の少なくとも２以上の同時置換を検出する前項３に記載の検査方法、
７．配列番号１で示される塩基配列における１０５１位のＣからＴへの置換；１６８５位のＴからＣへの置換；１７５６位のＣからＴへの置換；１８５３位のＧからＣへの置換からなる群の少なくとも２以上の同時置換を検出する前項３に記載の検査方法、
８．配列番号１で示される塩基配列における１９９位のＡからＣへの置換；３２４位のＧからＡへの置換；１０５１位のＣからＴへの置換；１０８４位のＣからＴへの置換；１６２７位のＴからＣへの置換；１６８５位のＴからＣへの置換；１７５６位のＣからＴへの置換；１８５３位のＧからＣへの置換；２８３０位のＧからＡへの置換；３３７１位のＡからＧへの置換からなる群の少なくとも１の置換を検出し、該変異を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査方法、
９．緑内障が原発性開放隅角緑内障および／または正常眼圧緑内障である前項１〜８のいずれか１に記載の検査方法、
１０．緑内障関連遺伝子のコード領域および／または上流領域を含む遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドを用いて変異を検出することを特徴とする前項１〜９のいずれか１に記載の検査方法、
１１．緑内障関連遺伝子のコード領域および／または上流領域を含む遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドが、以下に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より少なくとも１以上選択され、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）配列番号２から２７のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
１２．前項１１に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅処理方法を行うことを含む前項１〜９のいずれか１に記載の検査方法、
１３．前項１〜１０または１２のいずれか１に記載の検査方法に使用する試薬を含んでなる検査用試薬または検査用試薬キット、からなる。
発明を実施するための最良の形態
発明者らは、緑内障患者および非患者において、配列番号１に示される塩基配列からなる緑内障原因遺伝子の翻訳開始点から４１２０塩基にわたる上流領域および翻訳開始点以降のコード領域の遺伝子配列の決定を行った。その過程において、該遺伝子の上流領域およびコード領域に患者群と非患者群で頻度に差が観察される遺伝的多型が存在することを確認した。さらに、この遺伝的多型の有無の検討によって、緑内障の有病率が一般集団の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化する事実を見出した。本発明は、上記新知見に基づいて構成される。
（緑内障関連遺伝子）
本発明における、緑内障関連遺伝子の例としてＴＩＧＲ（小柱網誘導グルココルチコイド応答）遺伝子が挙げられる。このＴＩＧＲ遺伝子は、別名ＭＹＯＣ遺伝子としても知られている。ＭＹＯＣ遺伝子の上流およびコード領域の構造および配列は、第１図および配列番号１に表されているとおりであって、例えばプロモーター要素を有する上流領域およびタンパク質をコードするコード領域ならびに他の要素がある。該ＭＹＯＣ遺伝子の塩基の位置は、配列番号１において定めた塩基番号に従う（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＴ＿０２９８７４）。このＭＹＯＣタンパク質をコードする領域は、三個のエキソンから構成される。配列番号１の１〜４１２０位は上流領域であり、４１２０〜４７２２位はエキソン１を表す。
（遺伝子の変異）
本発明の緑内障関連遺伝子の変異とは、ＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列中の特定位置の塩基の、異なる塩基への置換、欠失および／または挿入があることをいう。該特定位置は、たとえば、異なる塩基に置換されることをいう。該特定位置は、配列番号１に示される塩基配列の１９４位、１９９位、３２４位、１０５１位、１０８４位、１６２７位、１６８５位、１７５６位、１８５３位、２８３０位、３３７１位、４０３７位および／または４３４６位から選択される位置をいう。
本発明における特定位置での具体的な塩基の置換は、配列番号１で示される塩基配列の１９４位のＣからＡへ；１９９位のＡからＣへ；３２４位のＧからＡへ；１０５１位のＣからＴへ；１０８４位のＣからＴへ；１６２７位のＴからＣへ；１６８５位のＴからＣへ；１７５６位のＣからＴへ；１８５３位のＧからＣへ；２８３０位のＧからＡへ；３３７１位のＡからＧへ；４０３７位のＧからＡへ；４３４６位のＧからＡへの置換が挙げられる。
好ましくは、配列番号１で示される塩基配列の１９９位；３２４位；１０５１位；１０８４位；１６２７位；１６８５位；１７５６位；１８５３位；２８３０位の；３３７１位の塩基について少なくとも１の置換を検出し、遺伝子の検査を行う。さらに、１９４位；１９９位；３２４位；１０５１位；１０８４位；１６２７位；１６８５位；１７５６位；１８５３位；２８３０位；３３７１位；４０３７位；４３４６位の塩基から少なくとも２以上の置換を検出することがより好ましい。
（検査方法）
当該遺伝子の変異の検査方法は、本発明によって開示するＭＹＯＣ遺伝子の特定の変異を検出しうる限りにおいて、その手法は何ら限定されるものではなく、公知もしくは将来得られうる各種の方法を広く用いることができる。
被験者のＭＹＯＣ遺伝子について本発明で開示される変異を検査するために、当該変異位置を含む塩基配列を解析する各種の方法を用いることができる。これらの方法としては、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３−５１７（１９７５）等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法（サンガー法）、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：２７６６−２７７０（１９８９）等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（ＳＳＯ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６３−１６６（１９８６）等参照）］等を例示することができる。本発明によって検出すべき遺伝子変異の位置が開示され特定されている以上、当業者にとっては公知の方法を用いてその変異を検出することができる。
（検査用試料の調製）
被験者のＭＹＯＣ遺伝子を解析するために、本発明の検査方法に供される検査用試料は、被験者のＭＹＯＣ遺伝子を含む生物学的試料であれば良く、特に限定されない。このような生物学的試料としては、生体材料組織、手術切除組織、口腔粘膜組織等の生体から採取した組織の他、血液、血清、糞便、射出精液、喀痰、唾液、脳脊髄液、毛髪等が挙げられる。例えばブレンダーを用いて組織等の生物学的試料を破砕し、フェノール・クロロホルム法などの公知の遺伝子抽出方法で抽出したＭＹＯＣ遺伝子を被検用試料とすることができる。さらに抽出したＭＹＯＣ遺伝子を増幅し、濃縮したものを被検用試料とすることができる。
ここで、被検用試料は、ＭＹＯＣ遺伝子の全長ＤＮＡでもよく、ＤＮＡ断片（部分ＤＮＡ）であってもよい。ＤＮＡ断片が検査に供される場合には、ＭＹＯＣ遺伝子の上流領域および／またはコード領域を含み、少なくとも１箇所以上、好ましくは２箇所以上、より好ましくは３箇所以上の変異にかかる特定位置を含むことが必要である。当該ＤＮＡ断片は、本発明の遺伝子変異の検出に利用できるもの、即ち、塩基置換の測定のために供される被験ＤＮＡとしての測定可能な塩基長を有するものであれば、特にその塩基長について制限はない。そのようなＤＮＡの塩基長として、通常１０塩基長程度以上、好ましくは２０塩基長程度以上のものを選択することができ、一般的には１００〜１０００程度の、好ましくは２００〜３００程度の塩基長からなるものが選択される。
また、被検用試料は、ＤＮＡ、ＤＮＡ転写産物のいずれであってもよい。具体的には、ＤＮＡより転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でもよいし、さらにそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、あるいは相補ＤＮＡであってもよい。本発明の遺伝子変異の検出法において採用され得る各種の操作、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡ断片の合成、ＤＮＡの切断、削除、付加または結合を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単離、精製、複製、選択、ＤＮＡ断片の増幅などはいずれも常法に従うことができる（分子遺伝学実験法、共立出版（株）１９８３年発行等参照）。またこれらは必要に応じて、適宜常法に従い修飾して用いることもできる。
被検用試料を調製するための核酸の増幅は、例えばＰＣＲ法またはその変法に従って実施することができる（ＰＣＲテクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行等参照）。この場合、緑内障関連遺伝子の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチド、具体的には変異にかかる上記特定位置を少なくとも１以上有する所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように適宜選択したプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドを利用するができる。
（プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド）
プライマー機能を有するオリゴヌクレオチドとして、例えば１）配列番号２〜２７のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により設計することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９  ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができ、その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
（ＤＮＡの変異の検出）
ＤＮＡの変異は、例えば、被検用試料に含まれるＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列をサンガー法により決定し、検出することができる。
１本鎖の目的ＭＹＯＣ遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、これをプライマーとして５′から３′方向に相補鎖をＤＮＡポリメラーゼによって合成させる。このときに使用するオリゴヌクレオチドは、例えば上記（プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド）で説明したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。
反応の基質として４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のほかに少量のジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を塩基ごとに別々に加え、相補鎖を合成させる。ｄｄＮＴＰはデオキシリボースの３′位の−ＯＨ基が−Ｈ基になっているｄＮＴＰのアナログ（類似物質）で、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰが取り込まれると、それ以上相補鎖が合成されなくなり、様々な長さのＤＮＡが合成される。反応系に、例えば化学発光物質や放射性同位元素（ＲＩ）で標識したプライマーやｄＮＴＰを加えることにより、合成されるＤＮＡを標識し、反応物を変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することにより塩基配列を決定することができる。
サンガー法に用いるＤＮＡポリメラーゼとして、例えばクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素、Ｔ７ファージや好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼなとが挙げられる。これらは共通してエキソヌクレアーゼ活性を遺伝子工学的に除いてある。当初、サンガー法では目的の遺伝子を１本鎖ＤＮＡにして用いていたが、現在では２本鎖プラスミドをそのままアルカリ変性させて用いる方法も多用されている。
シークエンス反応はサンガー法またはサイクルシークエンス法により行うことができる。サイクルシークエンス法はサンガー法とＰＣＲを組み合わせた方法で、鋳型ＤＮＡを１本鎖にする必要はなく、反応系にＤＮＡとプライマー１種類、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ、そして耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを加えて行う。ＰＣＲ反応中にｄｄＮＴＰｓが取り込まれ、伸長が止まり、結果として３′末端が同一の塩基のＤＮＡが合成される点はサンガー法と同じである。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したＤｙｅ  ｐｒｉｍｅｒ法と、ｄｄＮＴＰを蛍光標識したＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法、さらに基質のｄＮＴＰに標識したＩｎｔｅｒｎａｌ−ｌａｂｅｌ法等がある。
（検査用試薬および検査用試薬キット）
本発明はまた、緑内障の遺伝子検査方法に使用する検査試薬および検査試薬キットも含むものである。検査試薬としては、例えば被検試料増幅用プライマー、被検用試料の塩基配列決定用プライマー、各種ポリメラーゼ、塩基基質、標識物質など本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであっても良い。また、検査用試薬キットは本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであれば良い。
（実施例）
以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
（実施例１  ＭＹＯＣ遺伝子のＤＮＡ解析）
（１）ＤＮＡの抽出
被験者から提供を受けた血液を常法に従って処理し、有核細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出キットとして製品名「ＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）」（宝酒造社製）を用い、同製品規定のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
（２）鋳型ＤＮＡの増幅
得られたＤＮＡ抽出液を鋳型とし、ＰＣＲ増幅用キット、製品名「ＬＡＴａｑ（アプライドバイオシステムズ社製）」を用いてＰＣＲにより、ＭＹＯＣ遺伝子の増幅を行った。増幅用プライマーはＭ−Ｆ１（配列番号：２）をセンスプライマー、Ｍ−Ｒ３（配列番号：３）をアンチセンスプライマーとして使用した。Ｍ−Ｆ１は配列番号１に表された塩基配列に基づく２２−４６位の領域に表された塩基配列、Ｍ−Ｒ３は５９９２−５９６８位の領域に表された塩基配列の相補的な配列からなる。反応は、９４℃１分の加熱の後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃５分３０秒のサイクルを３０回実施した。ＭＹＯＣ遺伝子のエキソン、翻訳開始点および上流領域の構造と、プライマーによって増幅される領域の位置関係は第１図のとおりである。
（３）ＤＮＡ断片の配列決定
上記ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片について、自動ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３１００（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、同製品規定のプロトコールに従ってＤＮＡの塩基配列を決定した。このとき、次に示すプライマーを用いてサイクルシーケンス反応を行った。
配列番号１に表された塩基配列に基づく領域に含まれる塩基配列またはその相補的な配列からなる次の各配列番号に表されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
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上記プライマーのうち、Ｍ−Ｆ１からＭ−ＳＦ１１までは順鎖、Ｍ−ＳＲ４からＭ−ＳＲ１６までは逆鎖の配列を決定するために用いる。
（４）ＤＮＡ断片の連結およびＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列
さらに、各血液提供者毎のＤＮＡ断片の配列を、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐソフトウェア（米国ワシントン大学製）を用いて連結し、各血液サンプル提供者毎に１個の塩基配列を得た。
対照となる非患者ボランティア群６７名から得られた血液を上記手法に従って処理し、非患者群で多数を占めるＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列（配列番号：１）を決定した。
（実施例２）
（１）ＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列の多型の解析１
医療機関によって開放隅角緑内障と診断された患者８８名から得られた血液を上記実施例の手法に従って処理し、各提供者についてのＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列を調べ、非患者群の塩基配列と比較した。
その結果を表１に示す。表１の第１行は、配列番号１で表されるＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列の位置、第２行は各位置における非患者群で多数を占める塩基、第３行は非患者群における各塩基位置での変異の頻度、第４行は患者群における各塩基位置での変異の頻度、第５行が変異として検出された塩基の変化を示す。
その結果、塩基位置３２４位、４０３７位および４３４６位において、非患者群で約３％の頻度で変異を認め、患者群では６．８〜１０．２％の頻度で変異を認めた。その他の位置では、非患者群では全く変異を認めなかったのに対し、患者群では約１〜３．４％の頻度で変異を認めた。
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（２）ＭＹＯＣ遺伝子の塩基配列の多型の解析２
さらに、塩基位置４０３７位および４３４６位に変異を有していた患者１１名および非患者２名について、他の位置での変異を調べた。
その結果を表２に示す。表２の第１行は塩基位置、第２行以下は各被験者での変異の有無を示す。
その結果、非患者群では塩基位置４０３７位および４３４６位の他の位置では変異を認めなかったのに対し、患者群では１９４位、１０８４位および１６２７位に変異を認める群、１０５１位、１６８５位、１７５６位および１８５３位に変異を認める群および変異を認めない群が確認された。
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（３）リスク判定
ベイズの定理にしたがって、ＭＹＯＣ遺伝子の配列に変異を有する場合の緑内障発症のリスクを予測する。
ある被験者が緑内障を将来発症する確率は、事前に何の情報も無い場合には、疫学的に得られた一般集団における有病率で判断される。この有病率をＰ（Ｇ）とし、緑内障を発症しない確率をＰ（Ｎ）とすると、Ｐ（Ｎ）＝１−Ｐ（Ｇ）とと表される。
一方、ＭＹＯＣ遺伝子の配列に単一もしくは複数の変異を有する場合をＭとして、Ｍを保有する被験者が緑内障を将来発症する確率を条件付確率Ｐ（Ｇ｜Ｍ）とする。ここで、もしＰ（Ｇ｜Ｍ）＞Ｐ（Ｇ）であるならば、その変異Ｍを保有している被験者は将来緑内障を発症する確率が一般集団よりも高いことになり、高リスク者と判定される。
条件付確率Ｐ（Ｇ｜Ｍ）は、以下のように算出される。
緑内障患者群においてＭを保有する確率をＰ（Ｍ｜Ｇ）、非患者においてＭを保有する確率をＰ（Ｍ｜Ｎ）とする。ベイズの定理（第２図）より、Ｐ（Ｍ｜Ｎ）は式１で示される。Ｐ（Ｇ）値には、１９８８年から１９８９年にかけて社団法人日本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、４０歳以上の人口のうち３．５６％が緑内障患者であると報告されている数値を引用することができる。さらに、緑内障患者および非患者の各位置におけるＭＹＯＣ遺伝子の塩基の変異の確率を、各々式１、Ｐ（Ｍ｜Ｇ）値、Ｐ（Ｍ｜Ｎ）値にあてはめることができる。
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以上の数式を用いて各変異についてＰ（Ｇ｜Ｍ）を算出したところ、１９４位＝２８．１、１９９位＝２８．１、３２４位＝２．１８４、１０５１位＝２８．１、１０８４位＝２８．１、１６２７位＝２８．１、１６８５位＝２８．１、１７５６位＝２８．１、１８５３位＝２８．１、２８３０位＝２８．１、３３７１位＝２８１、４０３７位＝３．２、４３４６位＝３．２の割合で、Ｐ（Ｇ）よりもＰ（Ｇ｜Ｍ）の数値が高く算出され、これらの位置で変異を有することが緑内障の高リスク群であることを示すことが判明した。このことより、上記遺伝子の位置における変異を検出することが、開放隅角緑内障の発症リスクの予知に有効であることが確認された。
（４）リスク判定のために有効な検査
さらに、リスク判定を有効に行うためのＭＹＯＣ遺伝子の変異の位置について解析し、その結果を表２に示した。
４０３７位または、４３４６位に変異を有する患者の確率は約１０％であるから、当該位置に変異を有する者の緑内障発症のリスクがまず判断できる。また、この位置に変異を有する患者はいずれもその双方に変異を有している。したがって、４０３７位または４３４６位のいずれか一方の変異を検出し、指標とすることにより緑内障発症リスク判定することができる。
しかし、非患者群でも４０３７位、４３４６位に変異を有する患者の確率は各々約３％である。一方、４０３７位、４３４６位に変異を有する者のうち、１９４位、１０８４位および１６２７位の全てに変異を有する者は全て患者（患者１、患者２、患者３）であった。したがって、４０３７位または４３４６位のいずれか一方の変異に加えて、さらに１９４位、１０８４位および１６２７位のいずれか少なくとも１箇所の変異を検出し指標とすることで、偽陽性の判定を回避し緑内障発症の予測を行うことができる。
また、同様に１０８４位、１６８５位、１７５６位、１８５３位の全てに変異を有する者も全て患者（患者１０、患者１１）であった。したがって、１０８４位、１６８５位、１７５６位および１８５３位のいずれか少なくとも１箇所の変異を検出し指標とすることで、偽陽性の判定を回避し緑内障発症の予測を行うことができる。
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明にかかる遺伝子の変異に関する情報は、緑内障の将来における発症予測に有効である。本発明の遺伝子検査方法によりＭＹＯＣ遺伝子の変異を検出することで、特に開放隅角緑内障の発症を予測することができれば、発症前の段階で発症予防または早期に治療することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＭＹＯＣ遺伝子の構造およびプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
第２図は、ベイズの定理の説明を示す図である。（実施例２）
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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