(57)【要約】本発明は、一般式（Ｉ）：Ｒ−Ｙ−（−Ｘ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ２ＣＯＣｎＦ２ｎ＋１）ｍ  （Ｉ）（式中、Ｒは水素、アルキル基、フェニル基、又はタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基に結合可能な基であり、ＹはＣＨ２、炭素環又は複素環であり、ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＯＣＨ２、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯであり、Ｐｈｅはフェニレン基であり、ｎは１から５までの整数であり、ｍは１、２又は３である。）で表される化合物；前記化合物と希土類イオンからなる発光性錯体；前記化合物又は前記発光性錯体からなる標識試薬；及び前記標識試薬を用いるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸又は塩基の標識方法に関する。
2003033447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｙ−（−Ｘ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ２ＣＯＣｎＦ２ｎ＋１）ｍ  （Ｉ）
（式中、Ｒは水素、アルキル基、フェニル基、又はタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基に結合可能な基であり、ＹはＣＨ２、炭素環又は複素環であり、ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＯＣＨ２、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯであり、Ｐｈｅはフェニレン基であり、ｎは１から５までの整数であり、ｍは１、２又は３である。）
で表される化合物。
【請求項２】
一般式（１）：
2003033447.tif 000027
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項３】
一般式（２）：
2003033447.tif 000028
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項４】
一般式（３）：
2003033447.tif 000029
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項５】
一般式（４）：
2003033447.tif 000030
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項６】
一般式（５）：
2003033447.tif 000031
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項７】
一般式（６）：
2003033447.tif 000032
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項８】
一般式（７）：
2003033447.tif 000033
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項９】
一般式（８）：
2003033447.tif 000034
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項１０】
一般式（９）：
2003033447.tif 000035
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項１１】
一般式（１０）：
2003033447.tif 000036
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項１２】
一般式（１１）：
2003033447.tif 000037
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項１３】
一般式（１２）：
2003033447.tif 000038
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項１４】
一般式（１３）：
2003033447.tif 000039
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項１５】
一般式（１４）：
2003033447.tif 000040
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは請求の範囲第１項と同義である。）
で表される請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒが、酸素、窒素及びイオウから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を鎖員原子に含んでいてもよい炭素鎖からなるスペーサーの末端にタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸又は塩基に結合可能な官能基が結合した基である請求の範囲第１項〜第１５項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒが、下式：
2003033447.tif 000041
（ただし、Ｘはハライド原子、−ＯＳＯ３ＣＨ３、−ＯＳＯ２Ｆ、−ＯＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２Ｃ４Ｆ９、
2003033447.tif 000042
基、アラルキル基から選択され、ＲＢはアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基から選択され、ｐは０〜５、ｑは２〜１０である。
ｎは１から２０である。）
で表される少なくとも１つの官能基を有する請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
請求の範囲第１項〜第１７項のいずれか１項に記載の化合物と希土類イオンからなる蛍光性錯体。
【請求項１９】
請求の範囲第１項〜第１７項のいずれか１項に記載の化合物又は請求の範囲第１８項記載の蛍光性錯体からなる標識試薬。
【請求項２０】
免疫測定又は核酸検出に用いるための請求の範囲第１９項記載の標識試薬。
【請求項２１】
請求の範囲第１９項又は請求の範囲第２０項記載の標識試薬を用いるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸又は塩基の標識方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、核酸検出法、イムノアッセイ法、化学発光分析法において用いられる時間分解蛍光測定法、遅延燐光測定法あるいはエネルギートランスファー蛍光検出法の標識試薬に好適な化合物に係り、特に金属イオンに配位して錯体となるとき、蛍光、遅延蛍光あるいは燐光を発することのできる化合物に関する。
背景技術
イムノアッセイあるいは核酸検出法は、可視的及び放射活性計測を含む数多くの手法によってその計測がなされている。蛍光体あるいは蛍光色素で標識したものの蛍光強度測定はその簡易さのため多く用いられている。この手法の有用性は、励起光波長とは異なる波長域にある蛍光あるいは発光が発生し、これを的確に検出することにあるが、蛍光あるいは発光が比較的短時間で消失することにより、励起光の発生と蛍光あるいは発光の測定がほぼ同時になされ、励起光に由来するノイズが計測され、バックグラウンドが高くなることがある問題がある。
蛍光あるいは発光波長のピークは励起光波長ピークに比較して長い波長域にあることが多く、これを波長選択フィルター等を使用し蛍光あるいは発光を励起光から分離して計測する。励起光波長と発光あるいは蛍光波長との波長差を一般的にストークスシフトと呼ぶが、蛍光計測においてはストークスシフトが小さく、励起光と蛍光発光とを波長差を持って明確に分離することが難しいことがある。
ローダミンあるいはフルオレセイン等の蛍光色素においては、蛍光の波長分布域が広く、ブロードな蛍光波形が得られる。複数の蛍光体あるいは蛍光色素を用いて複数物質の同時計測を行おうとする場合、蛍光波長域がオーバーラップし個々の物質の計測が難しいか、個々の物質の量を知るために換算式を適用しアルゴリズム解析する必要が生ずる。
発光に励起光が干渉しない方法として、電気化学発光法、酵素化学発光法を含む化学発光法の手法が用いられることがある。これにおいては標識体あるいは標識色素への励起光の照射はなく、したがって発光のみを計測すればよい。イソルミノールあるいはアクリジウムエステルを標識して対象物質の計測をする方法や、標識物質は酵素であるが基質に発光反応を起こすものを用いるペルオキシダーゼとルミノールとの反応、あるいはＡｄａｍａｎｔｙｌ  １，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ  ａｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＭＰＰＤ）とアルカリホスファターゼとの反応を利用した高感度計測系が構築されている。
近年、ユーロピウムあるいはサマリウム等の希土類元素とそれらのリガンドとのコンプレックスの蛍光あるいは燐光消光時間が長いことを利用した、時間分解蛍光あるいは燐光測定法が優れた手法として開発されている。蛍光あるいは燐光の消光時間が長いこと、ストークスシフトが大きいこと、蛍光あるいは燐光ピーク波形がシャープであることにより、励起光によるノイズを含むことなく蛍光あるいは燐光のシグナルが検出され、高感度の分析手法を提供するとされる。キセノンフラッシュランプあるいはレーザー等により励起光をパルスで照射し、励起光による装置あるいは他の物質の蛍光が消失する時間が経過してから、目的の蛍光あるいは燐光を計測する手法であり、このリガンドの改良が進展しており、４，７−ｂｉｓ（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ−２，９−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＰＤＡ）あるいは４，４’−ｂｉｓ（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４”，６”−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６”−ｙｌ）ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏ−ｏ−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ（ＢＨＨＣＴ）といった化合物が報告されている。ＢＨＨＣＴは、例えば特開平９−２４１２３３号公報に開示されている。これらは優れたキレートであるが、イムノアッセイあるいは核酸検出法に十分な最小検出感度を与えるには至っていない。
発明の開示
本発明の目的は、核酸検出法、イムノアッセイ法、化学発光分析法において用いられる時間分解蛍光測定法、遅延燐光測定法あるいはエネルギートランスファー蛍光検出法の標識試薬に関し、試料中の目的物質を高感度計測可能で有用な標識試薬、及びその標識試薬に用いられる化合物を提供することにある。
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｙ−（−Ｘ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ２ＣＯＣｎＦ２ｎ＋１）ｍ  （Ｉ）
（式中、Ｒは水素、アルキル基、フェニル基、又はタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基に結合可能な基であり、ＹはＣＨ２、炭素環又は複素環であり、ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＯＣＨ２、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯであり、Ｐｈｅはフェニレン基であり、ｎは１から５までの整数であり、ｍは１、２又は３である。）
で表される化合物。
（２）一般式（１）：
2003033447.tif 000003
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（３）一般式（２）：
2003033447.tif 000004
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（４）一般式（３）：
2003033447.tif 000005
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（５）一般式（４）：
2003033447.tif 000006
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（６）一般式（５）：
2003033447.tif 000007
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（７）一般式（６）：
2003033447.tif 000008
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（８）一般式（７）：
2003033447.tif 000009
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（９）一般式（８）：
2003033447.tif 000010
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（１０）一般式（９）：
2003033447.tif 000011
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（１１）一般式（１０）：
2003033447.tif 000012
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（１２）一般式（１１）：
2003033447.tif 000013
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（１３）一般式（１２）：
2003033447.tif 000014
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（１４）一般式（１３）：
2003033447.tif 000015
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）記載の化合物。
（１５）一般式（１４）：
2003033447.tif 000016
（式中、＊はＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）であり、Ｒは前記（１）と同義である。）
で表される前記（１）に記載の化合物。
（１６）Ｒが、酸素、窒素及びイオウから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を鎖員原子に含んでいてもよい炭素鎖からなるスペーサーの末端にタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸又は塩基に結合可能な官能基が結合した基である前記（１）〜（１５）のいずれかに記載の化合物。
（１７）Ｒが、下式：
2003033447.tif 000017
（ただし、Ｘはハライド原子、−ＯＳＯ３ＣＨ３、−ＯＳＯ２Ｆ、−ＯＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２Ｃ４Ｆ９、
2003033447.tif 000018
基、アラルキル基から選択され、ＲＢはアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基から選択され、ｐは０〜５、ｑは２〜１０である。
ｎは１から２０である。）
で表される少なくとも１つの官能基を有する基が挙げられる。
で表される少なくとも１つの官能基を有する前記（１）〜（１６）のいずれかに記載の化合物。
（１８）前記（１）〜（１７）のいずれかに記載の化合物と希土類イオンからなる蛍光性錯体。
（１９）前記（１）〜（１７）のいずれかに記載の化合物又は前記（１８）に記載の蛍光性錯体からなる標識試薬。
（２０）免疫測定又は核酸検出に用いるための前記（１９）に記載の標識試薬。（２１）前記（１９）又は（２０）に記載の標識試薬を用いるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸又は塩基の標識方法。
前記式（Ｉ）において、Ｒは水素、アルキル基、フェニル基、又はタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基に結合可能な基である。ここで、「タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基に結合可能な基」とは、対象となるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、水酸基のいずれかに結合可能な基であれば特に制限はないが、例えば、下式：
2003033447.tif 000019
（ただし、Ｘはハライド原子、−ＯＳＯ３ＣＨ３、−ＯＳＯ２Ｆ、−ＯＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２Ｃ４Ｆ９、
2003033447.tif 000020
基、アラルキル基から選択され、ＲＢはアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基から選択され、ｐは０〜５、ｑは２〜１０である。
ｎは１から２０である。）
で表される少なくとも１つの官能基を有する基が挙げられる。
前記式において、Ｘで表されるハライド原子（ハロゲン原子）としては、フルオリド（フッ素）、クロリド（塩素）、ブロミド（臭素）、ヨージド（ヨウ素）が挙げられる。ＲＡで表されるアルキル基としては、例えば炭素数１〜６のアルキル基（例えばメチル基、エチル基）が挙げられ、アルケニル基としては、例えば炭素数２〜６のアルケニル基（例えばビニル基、プロペニル基）が挙げられ、アリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基が挙げられ、アラルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基が挙げられる。ＲＢで表されるアルキレン基としては、例えば炭素数１〜６のアルキレン基（例えば−（ＣＨ２）ｎ−、ここでｎは１〜６の整数）が挙げられ、アリーレン基としては、例えばフェニレン基、ナフチレン基が挙げられ、アラルキレン基としては、例えば−Ａｒ−（ＣＨ２）ｎ−（ここでＡｒはフェニレン基、ナフチレン基、ｎは１〜６の整数）が挙げられる。
Ｒが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基に結合可能な基である場合、Ｒの結合相手となるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸もしくは塩基としては、特に制限はないが、例えば抗体類、標識抗体類、抗原類、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ウシ血清アルブミン、ハプテン、ホルモン、ポリペプチド、ポリヌクレオチドが挙げられる。
Ｙで表される炭素環としては、例えば、置換されていてもよい芳香族単環炭化水素環（例えば、ベンゼン環）、置換されていてもよい飽和単環炭化水素からなる３〜８員環（例えば、シクロヘキサン環）、置換されていてもよい不飽和単環炭化水素からなる４〜８員環（例えば、シクロヘキセン環、シクロペンタジエン環）、置換されていてもよい縮合多環炭化水素環（例えば、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環）、炭化水素環集合（例えば、ビフェニル、テルフェニル、フェナントレン環、フルオレン環）が挙げられる。
Ｙで表される複素環としては、例えば、置換されていてもよい芳香族複素単環（例えば、チオフェン環）、置換されていてもよい３〜８員の飽和複素単環（例えば、テトラヒドロフラン環）、置換されていてもよい不飽和複素単環（例えば、ピロリン環）、置換されていてもよい縮合複素環（例えば、ベンゾチオフェン環、ジベンゾチオフェン環、ベンゾフラン環、ジベンゾフラン環）が挙げられる。
Ｐｈｅで表されるフェニレン基としては、１，４−フェニレンが好ましい。
本発明に用いる希土類イオンとしては、好ましくはランタノイドイオン、例えば、ユウロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）等のイオンが挙げられる。
金属元素を含むキレートの分子サイズは比較的小さいものであるが、ペプチド、アミノ酸、特に、タンパク質あるいは塩基鎖の標識においては、Ｃ（炭素）を主とした鎖（スペーサー）を介して標識した方が有利であることがある。タンパク質あるいは塩基鎖には複雑な３次構造をとることが多く、標識体の有する官能基に対する結合サイトが構造の内部にあることがある。これらに標識させようとする場合、スペーサーの使用は有効である。
前記スペーサーとしては、例えば酸素、窒素及びイオウから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を鎖員原子に含んでいてもよい炭素鎖からなるスペーサーが用いられる。
前記スペーサーを有するＲの具体例としては、
−（ＣＨ２）ａ−ＦＧ、又は
−「（ＣＨ２）ｂ−Ａ］ｃ−（ＣＨ２）ｄ−ＦＧ
（式中、ａは１から４０までの整数であり、ｂは１から２０までの整数であり、ｃは１から１０までの整数であり、ｄは０から２０までの整数であり、Ａは酸素（Ｏ）、窒素（ＮＨ）又はイオウ（Ｓ）であり、ＦＧは官能基である。）
で表されるものが挙げられる。
蛍光は第一励起状態から基底状態への遷移に際して起こる発光であり、スピン多重度の異なる状態間の遷移により燐光が発せられる。従来、重金属イオンと配位する錯体試薬は、β−ジケトン構造を有する標識試薬、芳香族基を有する標識試薬があった。フェノールフタレインは蛍光も燐光も観測されないのに、−Ｏ−（酸素）の橋渡しをつけたフルオレセインは強い蛍光や燐光を示す。またピリジンは蛍光も燐光も観測されないが、ベンゼン環を１つつけたキノリンになると蛍光や燐光も見られるようになる。
蛍光あるいは燐光の強度を強くしようとする場合、芳香族基とＯ（酸素）の両者を有し、かつ、安定であり更には合成収率の高いものが有利である。
イムノアッセイあるいは核酸検出手法においては、固相をその反応プラットホームとし、固相上で、抗原抗体反応物、あるいはＤＮＡあるいはＲＮＡハイブリダイゼーション反応産物を形成させ、これを計測する。標識体あるいは標識色素はあらかじめ抗原、抗体、ＤＮＡあるいはＲＮＡに結合され反応生成物が構成されるか、あるいは、例えばアビジンとビオチンとの反応を利用して、最後に反応物に結合させ、計測が開始される。
本発明の化合物及び標識試薬は、β−ジケトン構造と芳香族基の両方を有し、かつ、Ｐｈｅで表されるフェニレン基と、Ｙで表されるＣＨ２、炭素環又は複素環との間に、Ｘで表されるＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＯＣＨ２、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯが存在し、これによりユーロピウムを例とする希土類元素を橋渡しするβ−ジケトン部位での可動域が大きくなり、より効果的に希土類イオンを保持することができる。これにより、希土類イオンはより確実にβ−ジケトン部位に配位し、結果として、適切な励起光が照射された場合、確実に蛍光あるいは燐光を発することができる。
また、本発明の化合物及び標識試薬は、前記のように、Ｐｈｅで表されるフェニレン基と、Ｙで表される炭素環又は複素環との間に、Ｘで表されるＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＯＣＨ２、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯを置くことにより芳香族基（フェニレン基）と炭素環又は複素環とが連続しないので、親水性を大きく阻害せずに有効なキレートを得ることができる。
また、本発明の化合物及び標識試薬は、Ｐｈｅで表されるフェニレン基と、Ｙで表される炭素環又は複素環との間に、Ｘで表されるＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＯＣＨ２、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯを置くことにより、ＣｎＦ２ｎ＋１（ここで、ｎは１から５までの整数である。）及びβ−ジケトン部と対峙する位置においてそれらの電子吸引効果に影響され難くなり、リアクティブグループの導入がなされやすくなる。結果として、より効率的にアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸との結合体が得られることになる。
同様に、本発明の化合物及び標識試薬は、Ｐｈｅで表されるフェニレン基と、Ｙで表される炭素環又は複素環との間に、Ｘで表されるＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＯＣＨ２、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯを置くことにより、リアクティブグループを介したアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸あるいはプラスチック粒子等の固相担体との結合を行う場合、それらの影響をβ−ジケトン部においては受け難くなり、効果的に希土類イオンを保持することができる。これにより、希土類イオンはより確実にβ−ジケトン部位に配位し、結果として、適切な励起光が照射された場合、確実に蛍光あるいは燐光を発することができる。
更には、本発明の化合物及び標識試薬は、Ｒ中にスペーサーを用いると、Ｒの官能基がよりタンパク質あるいは塩基鎖等に結合しやすくなり、結果として被標識体１分子あたりの標識体ラベル数を増やすことができる。
本発明の化合物は、例えば、次のようにして製造することができる。
（製造法１）
第１工程
Ｒ−Ｙ−（−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｈ）ｍ＋ＣＨ３ＣＯＸ→
Ｒ−Ｙ−（−Ｘ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３）ｍ
（式中、Ｘはハロゲン原子、例えば塩素であり、Ｒ、Ｙ、Ｘ及びＰｈｅは前記式（Ｉ）と同義である。）
この反応は、いわゆるフリーデル−クラフツアシル化（Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ  ａｃｙｌａｔｉｏｎ）であり、常法により行うことができる。溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム等が用いられ、塩化アルミニウム等のルイス酸の存在下に反応を行う。
第２工程
Ｒ−Ｙ−（−Ｘ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３）ｍ＋ＣｎＦ２ｎ＋１ＣＯＯＲ１→
Ｒ−Ｙ−（−Ｘ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ２ＣＯＣｎＦ２ｎ＋１）ｍ
（式中、Ｒ１は低級アルキル基、例えばメチル基、エチル基であり、Ｒ、Ｙ、Ｘ、Ｐｈｅ、ｎ及びｍは前記式（Ｉ）と同義である。）
この反応は、ケトン化合物とエステル化合物との縮合反応であり、常法により行うことができる。溶媒としては、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル等が用いられ、水素化ナトリウム、金属アルコキシド等の存在下に反応を行う。
（製造法２）
この製造法は、ＸがＣＨ２である場合の製造法である。
第１工程
Ｒ−Ｙ−（−ＣＨ２−Ｂｒ）ｍ＋（ＨＯ）２Ｂ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３→
Ｒ−Ｙ−（−ＣＨ２−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３）ｍ
（式中、Ｒ、Ｙ、Ｐｈｅ及びｍは前記式（Ｉ）と同義である。）
この反応は、テトラヒドロフラン−水混合溶媒等の溶媒中、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）・ＣＨ２Ｃｌ２（ｄｐｐｆ＝１，１’−Ｂｉｓ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ）ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ）の存在下に反応を行う。
第２工程
Ｒ−Ｙ−（−ＣＨ２−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３）ｍ＋ＣｎＦ２ｎ＋１ＣＯＯＲ１→
Ｒ−Ｙ−（−ＣＨ２−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ２ＣＯＣｎＦ２ｎ＋１）ｍ
（式中、Ｒ１は低級アルキル基、例えばメチル基、エチル基であり、Ｒ、Ｙ、Ｐｈｅ、ｎ及びｍは前記式（Ｉ）と同義である。）
この反応は、製造法１の第２工程と同様に行うことができる。
（製造法３）
この製造法は、ＸがＯである場合の製造法である。
第１工程
Ｒ−Ｙ−（−ＯＨ）ｍ＋Ｆ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３（又はＢｒ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３）→
Ｒ−Ｙ−（−Ｏ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３）ｍ
（式中、Ｒ、Ｙ、Ｐｈｅ及びｍは前記式（Ｉ）と同義である。）
この反応は、溶媒にＫ２ＣＯ３、ＮａＯＨ又はＮａＨ等を加え行う。
第２工程
Ｒ−Ｙ−（−Ｏ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ３）ｍ＋ＣｎＦ２ｎ＋１ＣＯＯＲ１→
Ｒ−Ｙ−（−Ｏ−Ｐｈｅ−ＣＯＣＨ２ＣＯＣｎＦ２ｎ＋１）ｍ
（式中、Ｒ１は低級アルキル基、例えばメチル基、エチル基であり、Ｒ、Ｙ、Ｐｈｅ、ｎ及びｍは前記式（Ｉ）と同義である。）
この反応は、製造法１の第２工程と同様に行うことができる。
以上のようにして得られる化合物は、標識試薬としてタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸又は塩基の標識に用いたり、あるいはプラスチック粒子等の担体表面に固相化、更にはリポソーム等の中空を有する封入体に内封し用いることができる。
本発明の化合物を用いた標識反応は、当該化合物中の官能基とタンパク質、核酸中の官能基の関係に応じて適当な反応を選択することにより行うことができる。例えば、本発明の化合物中のクロロスルホニル基、カルボキシル基と、タンパク質中のアミノ基とのアミド形成反応によって標識反応を行うことができる。このアミド形成反応は、室温で炭酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０〜９．５）中で反応が容易に進行する。
本発明の標識試薬を用いる免疫測定法としては、例えば、時間分解蛍光免疫測定法や抗原抗体反応を利用した特異的結合アッセイが挙げられる。ここで、時間分解蛍光免疫測定法とは、長寿命の蛍光標識体（Ｅｕ−キレート等）を用い、短い寿命のバックグラウンドの蛍光が消失した後に、標識体の蛍光シグナルのみを時間分解蛍光測定する高感度な蛍光免疫測定法をいう。特異的結合アッセイとは、抗原抗体反応を利用した免疫測定、レセプター・アクセプターの結合反応を利用したアッセイ、核酸のハイブリダイゼーションを利用したアッセイ等をいう。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００１−３１２５６２の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を、実施例を用いて説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではない。
（実施例１）
以下、一般式（６）で表される化合物の合成法の１例である。
第１工程
以下を第１工程とする。
2003033447.tif 000021
材料
（１）無水塩化アルミニウム：２．１８ｇ
（２）無水ジクロロメタン：３５ｍＬ
（３）塩化アセチル：１．２９ｇ
（４）ジフェニルメタン：２．５ｇ
合成方法
フラスコに材料（１）及び（２）を加え、０℃に冷却した。更に材料（３）を加え、冷却下材料（４）のジクロロメタン溶液１５ｍＬをゆっくり滴下し、室温にて２時間攪拌した。混合物に１５ｇ程度の氷を加え、更に１規定塩酸溶液２０ｍＬを加え、析出する酸化アルミニウムを溶解させ、有機層を分取した。水層をジクロロメタン２０ｍＬで３回抽出した。有機層を混合し、水洗し、無水硫酸マグネシウムを加え、減圧下にて溶媒を留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒  ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）にて精製し化合物（ａ）を得た。（収率９６％）
第２工程
以下を第２工程とする。
2003033447.tif 000022
材料
（１）水素化ナトリウム（６０％ｉｎ  ｏｉｌ）：６０ｍｇ
（２）無水シクロヘキサン：５ｍＬ
（３）Ｃ３Ｆ７ＣＯＯＣ２Ｈ５：４６０ｍｇ
（４）化合物（ａ）：２００ｍｇ
合成方法
フラスコに材料（１）及び（２）を加え、加熱攪拌しながら材料（３）及び（４）のシクロヘキサン溶液３ｍＬを加え、更に室温で３０分攪拌した。混合物に１５％酢酸水溶液を加え、氷水１０ｍＬに注ぎいれた。分液ロートにて有機層を分取し、水層をジエチルエーテル２０ｍＬで３回抽出した。有機層を混合し、更に水洗し、無水硫酸マグネシウムを加え乾燥し、減圧下で溶媒を留去させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒  ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）にて精製し淡黄色の化合物（ｂ）を得た。（収率９９％）
化合物（ｂ）のゲルクロマトグラフィー分析データを図１に示す。また、ＴＯＦ／ＭＳスペクトルによる分析でｍ／ｚ  ４０６を確認した。
（実施例２）
以下、一般式（２）で表される化合物の合成法の１例である。
第１工程
以下を第１工程とする。
2003033447.tif 000023
材料
（１）１，２−Ｂｉｓ（ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ：５．０ｇ
（２）４−Ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：１３．６ｇ
（３）Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ（ＴＨＦ）５０ｍＬと蒸留水５ｍＬとの混合液
（４）炭酸セシウム：１８．５ｇ
（５）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）・ＣＨ２Ｃｌ２：１．５ｇ
ｄｐｐｆ＝１，１’−Ｂｉｓ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ）ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ
反応温度：７０℃（還流）
反応時間：１日
合成方法
反応容器に材料（１）、（２）、（３）及び（４）を混合し、７０℃で加熱攪拌した。３０分後、材料（５）を添加した。２４時間後、加熱を停止し、反応溶液を蒸留水６０ｍＬに投入して、クロロホルム８０ｍＬで抽出した。有機層を５％塩酸水溶液４０ｍＬ、蒸留水４０ｍＬで順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒を減圧留去して粗生成物６ｇを得た。シリカゲルクロマトグラフィーにて分離精製した後、ゲルクロマトグラフィーにて分取精製を行った。１．０ｇの化合物（ａ）を得た。（ＨＰＬＣ純度９９％、収率１５％）
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２．５６（６Ｈ，ｓ），３．９６（４Ｈ，ｓ），７．１０−７．１５（６Ｈ，ｍ），７．２３−７．２７（２Ｈ，ｍ），７．８１−７．８４（４Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ３４４（Ｍ＋Ｈ＋）
第２工程
以下を第２工程とする。
2003033447.tif 000024
材料
（１）化合物（ａ）：３００ｍｇ
（２）Ｃ３Ｆ７ＣＯＯＣ２Ｈ５：４４０ｍｇ
（３）脱水ジエチルエーテル：１２ｍＬ
（４）ナトリウムメトキシド：９９ｍｇ
反応時間：室温
反応温度：１日
合成方法
反応容器に材料（１）、（２）、（３）及び（４）を混合した。２４時間後、１０％硫酸水溶液１２ｍＬを加えた。１５分間の攪拌の後、有機層を減圧留去して析出した結晶をろ過した。よく水洗した後、結晶をエタノール１０ｍＬへ投入し、加熱攪拌した。エタノールを５ｍＬ程度まで減圧留去し、石油エーテル２０ｍＬを加えて加熱攪拌した。不溶分をろ過し、溶媒を留去し化合物（ｂ）３００ｍｇを得た。ゲルクロマトグラフィーにて分取精製し、化合物（ｂ）１００ｍｇを得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ７３５（Ｍ＋Ｈ＋）
化合物（ｂ）のＨＰＬＣ分析データを図２に、化合物（ｂ）のＮＭＲ分析データを図３に、化合物（ｂ）のＴＯＦ／ＭＳスペクトル分析データを図４に示す。
（実施例３）
以下、一般式（１）で表される化合物の合成法の１例である。
第１工程
以下を第１工程とする。
2003033447.tif 000025
材料
（１）１，２−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ
（２）４’−Ｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ
合成方法
材料（１）、材料（２）を溶媒Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅに溶解した炭酸カリウム存在下に反応させて、化合物（ａ）を得た。
第２工程
以下を第２工程とする。
2003033447.tif 000026
材料
（１）化合物（ａ）：１．７５ｇ
（２）無水ジエチルエーテル：４０ｍＬ
（３）ナトリウムメトキシド：１．３６ｇ
（４）Ｃ３Ｆ７ＣＯＯＣ２Ｈ５：３．６７ｇ
合成方法
材料（１）及び（２）を混合冷却し、材料（３）を加えた。更に材料（４）のジエチルエーテル溶液１０ｍＬを滴下した。冷却し１時間攪拌後、ジエチルエーテルを加え希塩酸でｐＨ４とし、水、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を除去して赤褐色ペースト３．８７ｇを得た。これをウェットカラム精製し（溶媒、ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）、赤褐色ペースト２．６９ｇを得た。
（実施例４）
本発明による化合物を含む発光性化合物を用意した。なお、ＴＴＡ（４，４，４−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ−１−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）−１，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ）及びＢＦＡ（４，４，４−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−１，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ）は（株）同人化学研究所より購入し、ＢＨＨＴ（４，４’−ｂｉｓ（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４”，６”−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６”−ｙｌ）−ｏ−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）の合成は特開平９−２４１２３３及びＹｕａｎ  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，７０，５９６−６０１）を参照した。
これらの化学構造式を図５に示す。
（実施例５）
本発明による化合物を含む図５の化合物をアセトニトリル（和光純薬製）に１０−４モル／ｍＬあるいは１０−５モル／ｍＬに溶解し、更に１０−１０モル／ｍＬまで１０倍段階希釈した。この１０−７モル／ｍＬの溶液を用い、分光光度計Ｕ−３３００（日立ハイテクノロジーズ製）にて吸収スペクトル分析を行った。更に、化合物の１０−１０モル／ｍＬ液と０．２ｍＭ塩化ユーロピウム６水和物（ＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、和光純薬製）、０．２ｍＭ  ＴＯＰＯ（Ｔｒｉ−ｎ−ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ，同仁化学研究所製）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（シグマ製）を含む水溶液を１：９に混合し、４２℃２時間インキュベーションした。その０．１ｍＬを９６穴平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ製）のウェルに分注し、時間分解測定装置（日立ハイテクノロジーズ製）にて３４０ｎｍ付近の励起光を照射、励起光照射より０．２ミリ秒後から０．８ミリ秒までの６１５ｎｍ付近の波長を有する蛍光を計測した。更に、同様の液を用い、蛍光分光計Ｆ−４０１０（日立ハイテクノロジーズ製）励起スペクトル分析を行った。
これらの結果を図６に示す。化合物４においては、時間分解測定装置において最も高いシグナル強度を示し、蛍光スペクトル分析及び吸収スペクトル分析においてピーク強度が最も大きく蛍光体として有用な化合物であることが確認された。化合物６においてはフェニレン基と、Ｙで表される炭素環との間に、Ｘで表されるＣＨ２を置くことにより炭素環３個をまたぐ共役系が形成され難くなり、結果として化合物１の構造の個数に応じたシグナルが観察されているものと思われた。
（実施例６）
実施例５の１０−１１モル／ｍＬ化合物溶液の０．１ｍＬをマイクロタイタープレートのウェルに分注し、時間分解測定装置にて３４０ｎｍ付近の励起光を照射、励起光照射より０．１、０．２、０．３．．．０．８、０．９、及び１．０ミリ秒後に計測を開始し、その後、０．１ミリ秒間に観察された発光シグナルをそれぞれ図に点を記入し、線で結んだ。
その結果を図７に示す。本発明の化合物は十分に長い蛍光の持続があることが確認された。特に化合物４において、最も長い半減時間を示した。
（実施例７）
αフェトプロテイン（ＡＦＰ）の測定
Ｙｕａｎ  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，７０，５９６−６０１）を参照した。
（１）ＡＦＰ抗体のビオチン標識（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ取扱説明書に従う）
抗ヒトＡＦＰ抗体（ＤＡＣＯ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ製）１ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）１ｍＬで溶解した。Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ  ０．０６２ｍｇを混合、氷浴中に２時間静置した。その後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア製）を用い、ＰＢＳにて抗体画分を溶出採取、未結合のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを除いた。ビオチン標識抗体液は０．１％にアジ化ナトリウムを加え、４℃に保存した。
（２）実施例４の化合物のクロロスルホニル基の導入
図５の化合物０．１ミリモルあたり０．２ｍＬのクロロ硫酸（和光純薬製）を加え、室温にて７時間攪拌した後、攪拌下の純水（氷浴中）４ｍＬに反応溶液を滴下した。生成する沈殿を遠心分離し、純水にて３回洗浄した。その後、沈殿を４５時間真空乾燥した。
（３）化合物のストレプトアビジン標識
ストレプトアビジン（ＳＡ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製））１０−５ミリモルを０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．１）４ｍＬに溶解した。前記（２）の化合物１０−３ミリモルをエタノール４０μＬに溶解し、ＳＡ液中に滴下した。混合液を室温にて１時間攪拌した後、０．０５％アジ化ナトリウム加０．１ＭＮａＨＣＯ３水溶液で十分に透析した。透析後、１Ｍ  ＨＣｌにてｐＨを６．８に調整し全量を６ｍＬとし、０．１％にＢＳＡを加えた。これを１０−７Ｍ  ＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）にて３００倍に希釈し、５６℃２時間加温の後、反応に使用した。
（４）抗ＡＦＰ抗体によるマイクロタイタープレートコーティング
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５μｇ／ｍＬに稀釈した抗ヒトＡＦＰ抗体（日本バイオテスト研究所製）をマイクロタイタープレートに１００μＬ分注し、４℃一夜静置コーティングを行った。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で洗浄した後、１％ＢＳＡ、２％シュクロース加炭酸緩衝液（ｐＨ９．１）１００μＬを加え、３７℃にて静置した。１時間後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ製）加生理食塩水で洗浄し，−２０℃で保管した。
（５）イムノアッセイの実施
１％ＢＳＡ加ＰＢＳにて、ヒトＡＦＰ標準品（ＤＡＣＯ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ製）を１０倍段階稀釈し、その５０μＬをマイクロタイタープレート各穴に加えた。３７℃、１時間振盪後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で洗浄した。その後、前記（１）で得られたビオチン標識抗ＡＦＰ抗体を１％ＢＳＡ加生理食塩水にて１μｇ／ｍＬに稀釈し、その５０μＬを各穴に分注した。３７℃、１時間振盪後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で洗浄した。その後、前記（３）のストレプトアビジン標識化合物の５０μＬを各穴に分注した。
室温にて３０分静置後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で洗浄した。マイクロタイタープレートを時間分解測定装置にて発光量を計測した。
結果を図８に示す。本発明の化合物は、性能良くイムノアッセイにて使用できることがわかる。特に化合物４においては、良好な検量線が描け、これによる最小検出感度は同時に検討した他の化合物に比較して最も良かった。化合物６においても比較的良好な検量線と最小検出感度が得られた。これは、実施例６においては、大きなシグナルを示さなかったものの、クロロスルホニル基であったリアクティブグループの結合の良好さ、及び、β−ジケトン部のユーロピウムイオンの捕捉とその安定性が高く、抗原抗体反応において相対的に良好な結果が得られたものと思われる。
炭素環あるいは複素環１個を有する化合物１、ＴＴＡ，ＢＦＡの場合、クロロスルホニル基であったリアクティブグループが結合しないか、β−ジケトン部にあるユーロピウムイオンが安定的に保持されず、結果として抗原抗体反応を示すシグナルは得られなかった。
（実施例８）
本発明の化合物の１例である図５の化合物４をとり、考察を試みる。
フェニレン基と、Ｙで表される炭素環との間に、Ｘで表されるＯを置くことにより、Ｃ３Ｆ７及びβ−ジケトン部とＲの部位間の距離が大きくなり、Ｃ３Ｆ７及びβ−ジケトン部の電子吸引効果に影響され難くリアクティブグループの導入がなされやすくなる。結果として、より効率的にアミノ酸、ペプチド、タンパク質、あるいは核酸との結合体が得られることになる。
同様に、Ｘで表されるＯを置くことにより、リアクティブグループを介したアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸あるいはプラスチック粒子等の固相担体との結合を行う場合、それらの影響をβ−ジケトン部においては受け難くなり、効果的かつより安定に希土類イオンを保持することができる。これにより、希土類イオンはより確実にβ−ジケトン部位に配位し、結果として、適切な励起光が照射された場合、確実に蛍光あるいは燐光を発することができる。
更に、Ｘで表されるＯを置くことにより、Ｃ３Ｆ７、β−ジケトン部及びそれに続く炭素環はよりフレキシブルに配位子を配置し希土類イオンとともにより安定した錯体を形成しているものと思われる。
（実施例９）
図５の化合物４のＢＳＡ標識を行った。実施例７の（２）に従いクロロスルホニル基を導入した。また、標識にあたっては、Ｙｕａｎ  ＆  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，７０，５９６−６０１）を参照した。
クロロスルホニル基を導入した化合物４の１．５ｍｇを含む０．０８ｍＬ  ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）液を、ＢＳＡ２ｍｇを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）０．４ｍＬに攪拌しながら加えた。室温にて攪拌の後、ＰＤ−１０カラムを用い、化合物により標識されたＢＳＡ画分を採取する。このとき、０．０５ＭＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）水溶液を溶出液とした。
これを１０−７Ｍ  ＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）にて希釈し、５６℃、２時間加温した。
ユーロピウム標識ＢＳＡを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．１）で１０倍段階稀釈し、時間分解測定装置にて発光量を計測した。結果を図１０に示す。本発明の化合物は、性能がよい標識体として使用できることがわかる。
（実施例１０）
以下、本発明の化合物（図５の化合物４）を用いたイムノアッセイを例示する。
（１）抗ヒトＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク）抗体のビオチン標識
抗ヒトＣＲＰ抗体を実施例７の（１）に従い、ビオチン標識を行った。
（２）ＳＡ標識体の作製
実施例７の（３）に従い、図５の化合物４のＳＡ標識体を作製し、更に、ユーロピウムを混合した。
（３）抗ヒトＣＲＰ抗体によるマイクロタイタープレートコーティング
実施例７の（４）に従い、抗ヒトＣＲＰ抗体の固相化されたマイクロタイタープレートを用意した。
（４）イムノアッセイの実施
１％ＢＳＡ加生理食塩水にて、ヒトＣＲＰ標準品を１０倍段階稀釈し、その５０μＬをマイクロタイタープレート各穴に加えた。３７℃、１時間振盪後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で洗浄した。その後、１μｇ／Ｌに（１）のビオチン標識抗ヒトＣＲＰ抗体を１％ＢＳＡ加生理食塩水にて稀釈し、その５０μＬを各穴に分注した。３７℃、１時間振盪後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で洗浄した。その後、（２）のユーロピウム標識ＳＡを１％ＢＳＡ加生理食塩水にて稀釈し、その５０μＬを各穴に分注した。
室温にて３０分静置後、０．０５％Ｔｗｃｅｎ２０加生理食塩水で洗浄した。マイクロタイタープレートを時間分解測定装置にて発光量を計測した。
結果を図１１に示す。図５の化合物４は標識体として、性能よくイムノアッセイにて使用できることがわかる。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、（１）錯体を形成しやすい新規化合物、及び（２）タンパク質等との反応が容易な新規化合物が得られる。更に、イムノアッセイ法あるいは核酸検出法等において有用な標識体の使用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の化合物（ｂ）のゲルクロマトグラフィー分析データを示す。
図２は、実施例２の化合物（ｂ）のＨＰＬＣ分析データを示す。
図３は、実施例２の化合物（ｂ）のＮＭＲスペクトル分析データを示す。
図４は、実施例２の化合物（ｂ）のＴＯＦ／ＭＳスペクトル分析データを示す。
図５は、実施例５〜７に用いられた本発明による化合物及びその他のβ−ジケトン（１，３−ジオン）化合物を示す。
図６は、時間分解測定装置での本発明化合物を使用した蛍光シグナル、蛍光分光計励起スペクトルの最大励起波長、及び、分光光度計吸収スペクトルの最大吸収波長を示した一覧表とグラフである。
図７は、本発明による化合物の蛍光減衰曲線を示す。
図８は、本発明による化合物を標識体として用いた、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）の検量線を示す。
図９は、本発明による化合物の１例を用い、本発明の特徴を示すものである。
図１０は、本発明によるユーロピウム標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の検量線を示す。
図１１は、本発明によるヒトＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）の計測結果を示す。
【図１】
2003033447.tif 000043
【図２】
2003033447.tif 000044
【図３】
2003033447.tif 000045
【図４】
2003033447.tif 000046
【図５】
2003033447.tif 000047
【図６】
2003033447.tif 000048
【図７】
2003033447.tif 000049
【図８】
2003033447.tif 000050
【図９】
2003033447.tif 000051
【図１０】
2003033447.tif 000052
【図１１】
2003033447.tif 000053
【国際調査報告】
2003033447.tif 000054
2003033447.tif 000055
2003033447.tif 000056
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