(57)【要約】本発明は成長ホルモン放出促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アンタゴニストを有効成分として含有する糖尿病予防剤又は治療剤、及びＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを特徴とする血糖値低下方法に関する。本発明はさらに、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤、及びＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する食欲抑制剤にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン放出促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アンタゴニストを有効成分として含有する糖尿病予防剤又は治療剤。
【請求項２】
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストがグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストである、請求項１記載の予防剤又は治療剤。
【請求項３】
末梢投与用である請求項１又は２記載の予防剤又は治療剤。
【請求項４】
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを特徴とする血糖値低下方法。
【請求項５】
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤。
【請求項６】
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する食欲抑制剤。
【請求項７】
有効量のＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを含む糖尿病予防法又は治療法。
【請求項８】
有効量のＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを含む肥満予防法又は治療法。
【請求項９】
有効量のＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを含む食欲抑制法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は新規な糖尿病の予防剤又は治療剤に関する。さらに詳しくは、成長ホルモン放出促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アンタゴニストを有効成分として含有する糖尿病の予防剤又は治療剤に関する。また、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを特徴とする血糖値低下方法に関する。本発明はさらに、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤、及びＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する食欲抑制剤に関する。
【背景技術】  近年、わが国では食生活の欧米化に伴って”飽食の時代”をむかえ、また一方では自動車をはじめとする機械化文明の普及により、国民の間に広く慢性の運動不足状態が蔓延してきた。このような社会的背景の中で、最近の糖尿病人口の増加は驚異的で、今日その数は予備軍を含めると５００万人とも６００万人とも言われている。
糖尿病には２つのタイプがある。１型糖尿病（インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ））は小児や若い人に多く、ウイルスの感染などによりインスリンを作り分泌する膵臓のランゲルハンス島が破壊され、インスリンを全く分泌することができなくなり糖尿病になる病気である。一方、中高年に多い２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ））は日本人の糖尿病のほとんど（約９５％）をしめ、インスリンの分泌量が低下しやすく糖尿病になりやすい体質を持っている人に、食べ過ぎ、運動不足、肥満、ストレス、加齢などのインスリンの作用を妨害するような引き金が加わって発症する。
糖尿病は肥満と深く関わっており、調査によると、インスリン非依存型糖尿病患者の約２／３が現在肥満であるかあるいは過去に肥満を経験している。実際、肥満者ではインスリンの血糖低下作用が弱まっていることがわかっている。
肥満は世界中で、特に先進社会において益々一般化しつつある重要な健康問題である。合衆国においては、成人の半数以上が体重過剰である。Ａｌｌｉｓｏｎらの報告では、１９９１年の合衆国の死亡数の約２８００００が肥満に帰せられるという（Ａｌｌｉｓｏｎ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ，２８２：１５３０−１５３８，１９９１）。肥満の病態生理は消費を超える過剰の栄養摂取の継続として知られている。脂肪含有量の高い「西洋式の食事」が肥満に対する危険性の増加と関連していることが示されている。
体重調節は摂食量とエネルギー消費のバランスが鍵を握り、両者のバランスが肥満、やせを引き起こす。１９９４年に発見されたレプチンがａｄｉｐｏｓｉｔｙ（体脂肪量蓄積）シグナルとして体重調節の根幹に関わることが明らかにされて以来、レプチンの下流に位置する、多くの新しい食欲調節に関与するペプチドが見いだされた。特に、それまで個々独立した機能としてしか捉えられていなかった視床下部由来の神経ペプチド群が、レプチンの下流でそれぞれが機能し、さらにこれらの神経ペプチド群相互間でも密に情報交換が行われていることがわかってきた。
これらの神経ペプチドのうち、食欲を亢進する物質としては、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、オレキシン類（ｏｒｅｘｉｎｓ）、モチリン（ｍｏｔｉｌｉｎ）、メラニン濃縮ホルモン（ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＭＣＨ）やアグウチ関連タンパク質（ａｇｏｕｔｉ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＧＲＰ）が知られている。また、食欲を抑制する物質としては、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：α−ＭＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＣＲＦ）、コカイン−及びアンフェタミン−制御転写物（ｃｏｃａｉｎ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ：ＣＡＲＴ）やコレシストキニン（ｃｈｏｌｅｓｙｓｔｏｋｉｎｉｎ：ＣＣＫ）などが知られている。これらのペプチドは食欲を制御する生理学的メカニズムに関与しており、エネルギー恒常性に影響すると考えられている。
一方、成長ホルモン（ＧＨ）は、下垂体前葉から分泌されるホルモンであり、その分泌は巧妙に制御されており、視床下部の成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）によって刺激を受け、ソマトスタチンによって抑制される。近年、ＧＨＲＨやソマトスタチンとは別の経路によるＧＨ分泌調節機構が明らかになってきた。この別経路のＧＨ分泌調節機構は、ＧＨの分泌促進活性をもつ合成化合物である成長ホルモン放出促進因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ：ＧＨＳ）の研究により展開されてきた。ＧＨＳはＧＨＲＨとは異なる経路で作用する。すなわち、ＧＨＲＨはＧＨＲＨ受容体を活性化して、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させるのに対して、ＧＨＳはＧＨＲＨ受容体とは異なる受容体を活性化して、細胞内ＩＰ３系を介して細胞内Ｃａ＋＋イオン濃度を上昇させる。このＧＨＳが作用する受容体であるＧＨＳ−Ｒは、１９９６年に発現クローニング法により構造が解明された（Ｈｏｗａｒｄ  Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：９７４−９７７，１９９６）。ＧＨＳ−Ｒは細胞膜を７回貫通する典型的なＧタンパク質共役型受容体であり、主として視床下部、下垂体に存在する。
さらに、生体内に存在しない合成化合物であるＧＨＳを結合する受容体が存在することから、このＧＨＳ−Ｒに結合して、活性化する内因性のリガンドが探索された。その結果、ＧＨＳ−Ｒに特異的なリガンドとして、グレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）がラットの胃から精製、同定された（Ｋｏｊｉｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０２：６５６−６６０，１９９９）。
グレリンは、アミノ酸２８残基からなるペプチドで、３番目のセリン残基がｎ−オクタノイル化されている。また、ヒトのグレリンはラットグレリンとアミノ酸２残基が異なる。以下にラット及びヒトのグレリンの構造式を示す。
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化学合成したグレリンはナノモルオーダーで、ＧＨＳ−Ｒを発現させたＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａ＋＋上昇活性や、初代培養下垂体細胞で成長ホルモンの放出活性をもつ。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでもラットにおいて血中成長ホルモンを上昇させる。グレリンのｍＲＮＡは胃で顕著に発現しており、またグレリンは血中にも存在する。さらに、ＧＨＳ−Ｒは視床下部、心臓、肺、膵臓、小腸や脂肪組織にも存在している（前記Ｋｏｊｉｍａら）。また、グレリンには摂食促進作用のあることが報告されている（Ｗｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１（１１）：４３２５−４３２８，２０００）。本発明者らはグレリンがＮＰＹとＹ１受容体を介して顕著な食欲促進作用を示すことを発見し、グレリンが低栄養症状を示す疾患の治療剤として有用であることを提案した（ＰＣＴ／ＪＰ０２／００７６５）。
【発明の開示】
本発明の目的は、新規な糖尿病の予防剤又は治療剤、及び肥満の予防剤又は治療剤を開発することである。本発明のさらなる目的は、新規な血糖値低下方法、肥満予防剤又は治療剤、ならびに食欲抑制剤を提供することである。
本発明者らは、成長ホルモン放出促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アンタゴニストが血糖値を有意に低下させること、及び食欲を顕著に抑制することを発見して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、成長ホルモン放出促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アンタゴニストを有効成分として含有する糖尿病の予防剤又は治療剤を提供する。
本発明はさらに、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを特徴とする血糖値低下方法を提供する。
本発明はさらに、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する肥満予防剤又は治療剤を提供する。
本発明はさらに、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを有効成分として含有する食欲抑制剤を提供する。
本発明はさらに、有効量のＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを含む糖尿病予防法又は治療法を提供する。
本発明はさらに、有効量のＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを含む肥満予防法又は治療法を提供する。
本発明はさらに、有効量のＧＨＳ−Ｒアンタゴニストを投与することを含む食欲抑制法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ａは、ヒトグレリンとヒトモチリンのアミノ酸配列を示したものである。Ｂは、ヒトグレリン受容体とヒトモチリン受容体のアミノ酸配列を示したものである。同じアミノ酸を星印で示す。
図２は、グレリンＩＰ投与の高脂肪食餌下における体重に及ぼす効果を示す。
図３は、グレリンＩＰ投与の高脂肪食餌下における脂肪体塊に及ぼす効果を示す。
図４は、グレリンＩＰ投与後のＷＡＴにおけるレプチン、アジポネクチン及びレジスチンｍＲＮＡの発現（ノーザンブロットにて評価）を示す。
図５は、高脂肪食餌下でのグレリンｍＲＮＡの発現（ノーザンブロットにて評価）を示す。
図６は、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６をＩＰ投与したときの餌摂取量に及ぼす効果を示す。
図７は、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６をＩＣＶ投与したときの餌摂取量に及ぼす効果を示す。
図８は、ＩＰ投与されたグレリンとＩＣＶ投与された［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６の同時投与の餌摂取に及ぼす効果を示す。
図９は、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６をＩＰ投与したときの胃排出速度に及ぼす効果を示す。
図１０は、［Ｄ−Ａｒｇ−１，Ｄ−Ｐｈｅ−５，Ｄ−Ｔｒｐ−７，９，Ｌｅｕ−１１］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ＰをＩＰ投与したときの餌摂取量に及ぼす効果を示す。
図１１は、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６をＩＰ投与したときの餌摂取量に及ぼす効果を示す。
図１２は、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６をＩＰ投与したときのｏｂ／ｏｂマウスにおける餌摂取に及ぼす効果を示す。
図１３は、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６の繰り返し投与がｏｂ／ｏｂマウスにおける体重増加に及ぼす効果を示す。
図１４は、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６のＩＰ投与がｏｂ／ｏｂマウスにおける遊離脂肪酸に及ぼす効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明で有効成分として用いるＧＨＳ−Ｒアンタゴニストとは、ＧＨＳ−Ｒと結合してアゴニストの効果を阻害することのできる物質をいう。ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストとしては、グレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストを用いることができる。
グレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストは、例えば以下に記載のスクリーニング方法によって同定することができる（ＰＣＴ／ＪＰ０２／００７６５参照）。
すなわち、グレリン又はグレリン類似体の存在下又は非存在下に、候補物質を動物に投与し、摂食量、ＮＰＹ  ｍＲＮＡ発現量、ＮＰＹとＮＰＹのＹ１受容体との結合量、酸素消費量、胃内容排出速度、又は迷走神経の活性を測定することにより、グレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストをスクリーニングすることができるが、これに限定されない。
上記スクリーニング方法で得られたグレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストを本発明の糖尿病予防剤又は治療剤、肥満予防剤又は治療剤、及び食欲抑制剤の有効成分として用いることができる。
本発明では、グレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体のアンタゴニストを用いることもできる。
モチリンは十二指腸、空腸上部の内分泌細胞から分泌される２２アミノ酸残基のペプチドであり（Ｉｔｏｈ，Ｚ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１８：５９３−６０８，１９９７）、消化管の空腹期（ｉｎｔｅｒｄｉｇｅｓｔｉｖｅ）運動、胆嚢収縮及び胃や膵臓からの酵素分泌に関与する。モチリンはＧＨ分泌を促進することが報告されており、非ペプチド性のモチリンアゴニストを用いて胃の運動を促進することが報告されている（前出、Ｉｔｏｈ）。図１のＡに示すように、ヒトグレリンとヒトモチリンは互いに３６％のアミノ酸同一性を示す（アクセス番号Ａ５９３１６及びＰ１２８７２）。さらに、図１のＢに示すように、ヒトグレリン受容体はヒトモチリン受容体と全体として５０％のアミノ酸同一性を示す（アクセス番号Ｑ９２８４７、Ｑ９２８４８及びＱ４３１９３）。また、最近になって、Ｔｏｍａｓｅｔｔｏたちもマウス胃から新規なペプチドを単離したが、これはグレリンと同一であり、モチリン関連ペプチドと命名した（Ｔｏｍａｓｅｔｔｏ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１９：３９５−４０５，２０００）。グレリンとモチリンとの配列相同性及びグレリン受容体とモチリン受容体との配列相同性に鑑み、グレリン又はグレリン類似体のアンタゴニストとしてモチリンもしくはモチリン類似体のアンタゴニストを用いることができる。
なお、グレリンは、式１で表されるラットグレリン又はヒトグレリン又はグレリン類似体である。
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本発明にいうグレリン類似体には、食欲促進作用を有する限り、２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているものも包含され、さらに、これらの各種誘導体〔例えば、ペプチド構成アミノ酸が置換された誘導体（アミノ酸間に基、例えば、アルキレンが挿入されたものも包含する）及びエステル誘導体〕も包含される。
グレリン又はグレリン類似体はいかなる方法で製造したものでもよく、例えば、ヒト、ラットの細胞より分離、精製したもの、合成品、半合成品、遺伝子工学により得られたものなどを含み、特に制限はない。
２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているもの例としては、グレリンの１４番目のＧｌｎ残基が欠除した、ｄｅｓ−Ｇｌｎ１４−グレリンなどが代表的である。ラットｄｅｓ−Ｇｌｎ１４−グレリンはグレリン遺伝子のスプライシングの違いにより生じるものであり、ラット胃においてはグレリンの４分の１程度存在し、成長ホルモン放出活性の強さは同じである。
さらに、グレリン類似体には、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３，４３７０−４３７６に記載された
さらに、グレリン類似体には、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３，４３７０−４３７６に記載された下記のようなものも包含される。例えば、グレリン２８個のアミノ酸のうち、Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸（好ましくは、Ｎ末端４個のアミノ酸）を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているペプチド及びその誘導体であって、成長ホルモン遊離促進作用を有するものがあげられる。
Ｎ末端から３番目のアミノ酸の側鎖の例としてはグレリンの側鎖であるオクタノイル以外のアシル基及びアルキル基（これらの炭素数は６〜１８が好ましい）があげられる。具体的な側鎖としては、下記のものがあげられる：
−ＣＨ２（ＣＨ２）９ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）６ＣＨ３、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＯ−（ＣＨ２）９ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）１４ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）６ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＣＯＰｈ、
下記式：
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Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているグレリン類似体の具体的な例としては、第３７回ペプチド討論会（２０００年１０月１８日〜２０日）で報告された化合物：ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯ−Ｓｅｒ（オクチル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２があげられる。
本発明では、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストとして、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６（Ｖｅｅｒａｒａｇａｖａｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５０：１１４９−５５，１９９２）及び［Ｄ−Ａｒｇ−１，Ｄ−Ｐｈｅ−５，Ｄ−Ｔｒｐ−７，９，Ｌｅｕ−１１］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（Ｃｈｅｎｇ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５２：１５５−１５８，１９９７）を用いて本発明の効果を確認した。
本発明の予防剤又は治療剤、及び抑制剤は中枢投与（例えば脳室内投与、脊髄腔注）とすることも、末梢投与とすることも可能である。好ましくは、末梢投与で使用する。食欲調節ペプチドの多くは末梢投与では中枢投与のような作用を示さないが、本発明の予防剤又は治療剤、及び抑制剤は末梢投与でも血糖濃度を有意に低下させた。従って、本発明の予防剤又は治療剤、及び抑制剤は投与に伴う患者の苦痛が少なく、かつ簡便に服用することができ、従来の食欲調節性ペプチドに比べてはるかに利点が大きい。
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストは、公知の製剤技術により、単独であるいは薬理学的に受容しうる担体、添加剤などとともに、通常の経口投与用製剤及び非経口投与用製剤とすることができる。例えば、溶液製剤（動脈注、静脈注又は皮下注などの注射剤、点鼻剤、シロップ剤等）、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、座剤などに製剤化することができる。また、ドラッグデリバリーシステム（除放剤など）で使用することも可能である。
本発明の予防剤又は治療剤、及び抑制剤の投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路などに応じて異なり、医師の判断によって決定される。通常、静脈内投与のためには、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストとして、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。但し、投与量はこれに限定されるものではない。
本発明の糖尿病予防剤又は治療剤は、糖尿病の予防又は治療に用いることができ、特に２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ：インスリン非依存型糖尿病）の予防剤又は治療剤として有用である。本発明の肥満治療剤は、肥満に由来する虚血性心疾患、変形性関節症、腰椎症、脂質代謝異常、睡眠時無呼吸症候群、月経異常などの病態に有効である。本発明の食欲抑制剤は、過食症、ストレス過食、糖尿病性過食などの病態に有効である。
本発明者らは、後述する実施例に記載するように、体重、脂肪質量、グルコース、インシュリン、及び白色脂肪組織におけるレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、アジポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、レジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）遺伝子発現を、高脂肪食餌下でのグレリンの繰り返し投与の後に測定した。また、胃のグレリン遺伝子発現をノーザンブロット分析により測定した。さらに、エネルギー摂取及び胃排出（ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｍｐｔｙｉｎｇ）はＧＨＳ−Ｒアンタゴニスト投与の後に測定した。ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストの繰り返し投与をｏｂ／ｏｂ肥満マウスで６日間継続して行い、その効果を試験した。
その結果、グレリンは高脂肪食餌下で明らかな脂肪蓄積（ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）を引き起こし血糖制御を悪化させた。グレリンはレプチンｍＲＮＡ発現を上昇させ、かつレジスチンｍＲＮＡ発現を減少させた。胃グレリンｍＲＮＡ発現は高脂肪食餌により増加した。
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストは痩マウス（ｌｅａｎ  ｍｉｃｅ）において、食餌誘導性（ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ）肥満のマウスにおいて、そしてｏｂ／ｏｂ肥満マウスにおいてエネルギー摂取を減少させたが、その作用の機構は胃排出の減少に関連している。ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストの繰り返し投与はｏｂ／ｏｂマウスにおいて体重増加を減少させ血糖制御を向上させた。
従って、グレリンは特に高脂肪食餌下における過剰な体重増加、脂肪蓄積及びインシュリン抵抗性に密接に関連していることが確認された。さらに、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストは、肥満及び２型糖尿病のための有望な予防又は治療剤となることが期待できる。
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストの摂食に対する作用についての考察
ＧＨＲ−Ｒアンタゴニストがエネルギーの負平衡（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｌａｎｃｅ）状態を誘導するであろうという予測に基づいて、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストの摂食に対する作用を検討した。ＧＨＳ−Ｒの投与により痩マウス及び高脂肪食によって肥満となったマウスにおいて摂食が減少した。過去の報告によれば、ＧＨＳ−Ｒは視床下部、心臓、肺、すい臓、小腸及び脂肪組織に存在している。視床下部ではＧＨＳ−Ｒは弓状核（ＡＲＣ）に位置しており、ここでは２つの食欲増進ペプチド、ニューロペプチドＹ（ＮＲＹ）及びアゴウチ関連タンパク（ＡＧＲＰ）、がニューロンで合成されている。さらに、非ペプチドＧＨ分泌促進物質が視床下部に作用してＡＲＣニューロンの電気的活性を変化させ、ｃ−ｆｏｓの発現を活性化するように作用している（例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４３：１５５−１６２，２００２）。今までに、その作用メカニズムがＡＲＣ内（ここでは血液脳関門障壁の作用が弱い）の視床下部ＮＰＹ及びＡＧＲＰニューロンの直接的活性化に関与するような摂食行動をグレリンが刺激することが報告されている（例えば、Ｉｎｕｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２：５５１−５６０，２００１）。しかしながら、胃からのグレリンシグナルの別の経路は、迷走神経と脳幹核（ｂｒａｉｎｓｔｅｍ  ｎｕｃｌｅｉ）を通り最後に視床下部に到達する上行神経ネットワークを介する。本発明において、中枢に投与されたＧＨＳ−Ｒアンタゴニストは末梢投与されたグレリンにより誘導された摂食に対する刺激作用を停止した。これらの結果によりグレリンが脳内でＧＨＳ−Ｒを通じて作用しているらしいことが示唆された。さらに、末梢で投与されたＧＨＳ−Ｒアンタゴニストが胃排出速度を減少させることを明らかにしたが、このことはその食欲不振誘発作用（食欲抑制作用）に寄与する。かなりの証拠が蓄積して、胃の拡張が満腹シグナルとして作用して食物摂取を阻害し、速やかな胃排出が過食と肥満に関連し、遅滞した胃排出が食欲不振と悪液質に関連することが示されている（Ｉｎｕｉ，Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６：６２０−６２４，２００１）。過去の研究によりグレリンが迷走神経性経路を介して胃排出速度及び運動性を増加することが示されている（Ｉｎｕｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２：５５１−５６０，２００１）。
本発明により、摂食行動の制御においてＧＨＳ−Ｒがある役割を持ち、ＧＨＳ−Ｒの拮抗作用が肥満の治療のための有望なアプローチとなりうることが示された。
さらに、本発明により、末梢に投与されたＧＨＳ−Ｒアンタゴニストがｏｂ／ｏｂマウス（インシュリン抵抗性及び速やかな胃排出で肥満及び糖尿病の遺伝モデルとして知られる）において食欲不振作用を生起し、体重減少と血糖濃度を低下させることを明らかにした。この中程度の血清インシュリンレベルの減少を伴ったグルコースレベルの著しい減少により、インシュリン抵抗性の改善におけるＧＨＳ−Ｒアンタゴニストの役割が示された。他方、フォスファチジルイノシトール３キナーゼ活性の減少に関与する作用メカニズムのグルコース輸送活性の阻害を通じて、血清ＦＦＡの上昇によりインシュリン抵抗性が誘導されることが示された。最近、循環性ＦＦＡ濃度の上昇が中年男性の突然死の独立危険因子となることが、長期間のコホート調査において報告された（Ｊｏｕｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０４：７５６−７６１，２００１）。以下に示す実施例では、ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストはｏｂ／ｏｂ肥満マウスのＦＦＡレベルの顕著な減少を起こした。
結論として、末梢で投与されたＧＨＳ−Ｒアンタゴニスト、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６及び［Ｄ−Ａｒｇ−１，Ｄ−Ｐｈｅ−５，Ｄ−Ｔｒｐ−７，９，Ｌｅｕ−１１］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐにより、痩マウス、食餌誘導性肥満マウスおよびｏｂ／ｏｂ肥満マウスにおける食料摂取が減少することを見出した。また、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６の繰り返し投与により、マウスにおいて体重増加が減少し、血糖制御が向上することを示した。
本出願は特願２００２−１９７５８２に基づく優先権を主張するものであり、前記出願の内容の全てを参照として本出願に包含する。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】試験材料と方法
（１）動物実験
ｄｄｙ系のオスのマウス（３４−３７ｇ、ＪＡＰＡＮ  ＳＬＣ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）及びｏｂｅｓｅ（ｏｂ／ｏｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６８−７４ｇ、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を使用した。マウスは１匹ずつ制御された環境中で収容された（２２±２℃、５５±１０％湿度、１２：１２時間の明：暗サイクルで午前７：００にライトをつけた）。マウスは全エネルギーの１２％を脂肪として含む標準食餌又は全エネルギーの４５％を脂肪として含む高脂肪食餌（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ，ＩＮＣ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を与えられた。他に記載しない限り餌と水は自由に摂取できた。全実験は我々の大学の動物ケア委員会により承認された。
（２）試験薬剤
［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６、［Ｄ−Ａｒｇ−１，Ｄ−Ｐｈｅ−５，Ｄ−Ｔｒｐ−７，９，Ｌｅｕ−１１］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ及びラットグレリンはＢＡＣＨＥＭ  ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ  ＩＮＣ．（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＮＥＯＳＹＳＴＥＭ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）及びＰｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）からそれぞれ購入した。投与の直前に、各薬剤は第三脳質内（ＩＣＶ）投与のために４μｌの人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中あるいは腹膜内（ＩＰ）投与のために１００μｌ生理食塩水中に希釈された。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍで表した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔを用いてグループ間の差を評価した。Ｐ＜０．０５で統計的に有意とされた。
（３）ＩＣＶによる薬剤投与
ＩＣＶ投与のために、マウスをペントバルビタールナトリウム（８０−８５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）で麻酔し、実験前の７日間、定位固定装置（ＳＲ−６，Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）内においた。各頭蓋骨に、針を使って中央縫合の側方０．９ｍｍで前頂の０．９ｍｍ後方に穴をあけた。一端を長さ３ｍｍにわたって傾斜させた２４ゲージのカニューレ（Ｓａｆｅｌｅｔ−Ｃａｓ，Ｎｉｐｒｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を第三脳室に埋め込みＩＣＶ投与用とした。カニューレを歯科用セメントで頭蓋骨に固定し、シリコンでふたをした。２７ゲージの注入用インサートをＰＥ−２０チュービングでミクロシリンジに取り付けた。
（４）摂食試験
摂食試験の前に、マウスは水は自由に飲めたが１６時間絶食（ｆｏｏｄ  ｄｅｐｒｉｖｅｄ）した。ただし、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６及びグレリンの共投与の餌摂取に対する影響の実験においてはマウスは餌と水を自由に摂取した。餌摂取は投与後２０分間、１，２及び４時間で、初めに前もって測定しておいた餌から食べられていない餌を減算することにより測定した。
（５）ＲＮＡ分離及びノーザンブロット分析
ＲＮＡは胃及び精巣上体脂肪からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて分離した。全ＲＮＡをホルムアルデヒドで変性し、１％アガロースゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレン上にブロットした。メンブレンをフルオレセイン標識ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションシグナルのトータルの積分密度（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）はデンシトメトリー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により求めた。データはグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）ｍＲＮＡ存在度（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）に標準化されて対照に対するパーセンテージとして示した。
（６）グレリン遺伝子の発現
痩マウスは全エネルギーの１２％を脂肪として含む標準食餌あるいは全エネルギーの４５％を脂肪として含む高脂肪食餌を２週間摂取した。マウスは８時間絶食してから頸部脱臼により殺された。その直後に胃を取り除き、ドライアイス上で凍結し−８０℃でノーザンブロットの調製まで保存した。
（７）胃排出
胃排出における実験の前に、マウスは水分は自由に摂取しながら１６時間絶食した。絶食したマウスは予め秤量したペレットを１時間自由に摂取してから［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６を投与された。マウスには注入の後、再び１又は２時間餌を与えなかった。餌の摂取は食べられなかったペレットを秤量することにより測定した。マウスは実験開始から２又は３時間後に頸椎脱臼により殺された。直後に、開腹により胃が露出され、幽門と噴門の両方で素早く結紮され、それから取り除かれ、そして乾燥内容物の重量を測定した。胃排出は以下の式により算出した：
胃排出（％）＝｛１−（胃から取り出された餌の乾燥重量／摂取した餌の重量）｝Ｘ１００
（８）繰り返し投与
痩マウスにおいて高脂肪食餌又は標準食餌下で５日間、及びｏｂ／ｏｂ肥満マウスにおいて標準食餌下で６日間、繰り返しＩＰ投与をそれぞれ継続した。マウスは午前７：００と午後１９：００に投与を受けた。餌の摂取と体重を毎日測定した。実験の終わりに（餌の除去及び最終ＩＰ投与後８時間）、エーテル麻酔下で眼窩洞（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）から得られた血液から血清を分離した。マウスは頸椎脱臼により殺された。直後に、白色脂肪組織（ＷＡＴ）として査定された精巣上体脂肪体（ｆａｔ  ｐａｄ）塊（ｍａｓｓ）、及び腓腹筋を取り除き、重量を測定した。血中グルコースをグルコースオキシダーゼ法により測定した。血清インシュリンと遊離脂肪酸（ＦＦＡ）をそれぞれ酵素免疫法及び酵素法（ＥＩＫＥＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．，ＬＴＤ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により測定した。血清トリグリセリドと全コレステロールを酵素法（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により測定した。
実施例１：高脂肪食餌下における体重増加及び血糖制御に対するグレリン繰り返し投与の作用
一日２回５日間のグレリンのＩＰ投与（１回投与量：３ｎｍｏｌ／マウス）により、一日のエネルギー摂取の増加に伴い体重が有意に増加した（図２、図３、表１）。脂肪体塊は、標準食餌及び高脂肪食餌を与えられた生理食塩水処理のマウスと比較してそれぞれ４９％及び１２５％有意に増加した。骨格筋は重量の増加を示さなかった。血清コレステロール及びインシュリンレベルも増加し、血中グルコース濃度の中程度の増加を伴った。次にＷＡＴにおけるレプチン、アジポネクチン及びレジスチンのｍＲＮＡレベルを測定した。グレリンの繰り返し投与によりＷＡＴにおいてレプチンｍＲＮＡの発現が増加するとともにレジスチンｍＲＮＡのＡＴにおいてレプチンｍＲＮＡの発現が増加するとともにレジスチンｍＲＮＡの発現が減少した（図４）。
次に、全エネルギーの４５％を脂肪として含む高脂肪食餌下でのグレリンｍＲＮＡの発現を測定した。２週間の高脂肪食餌により、餌剥奪マウスの胃におけるグレリン遺伝子の発現は、標準食餌と比較して有意に増加した（図５）。
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実施例２：ＧＨＳ−Ｒアンタゴニストがエネルギーバランスに及ぼす影響
ＧＨＳ−Ｒアンタゴニスト、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６を餌剥奪マウスにＩＰ投与した。図６に示すように、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６により有意に用量依存的に餌摂取が減少した。
次いで、中枢投与の［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６が同様の効果を持つかどうかについても検討した。ＩＣＶ並びにＩＰ投与された［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６により、摂食行動の強力な減少が起こった（図７）。
グレリンが脳内のＧＨＳ−Ｒを介して作用する可能性を評価するために、グレリンと［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６の同時投与の餌摂取に対する効果を調べた。ＩＣＶ投与された［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６はグレリンのＩＰ投与により誘導された摂食に対する刺激効果を阻害した（図８）。
次に胃排出速度に対する［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６のＩＰ投与の効果を調べた。末梢投与された［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６により、胃排出速度の有意な減少が、投与の１時間後に起こった（図９）。
別のＧＨＳ−Ｒアンタゴニスト、［Ｄ−Ａｒｇ−１，Ｄ−Ｐｈｅ−５，Ｄ−Ｔｒｐ−７，９，Ｌｅｕ−１１］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（Ｌ−７５６，８６７）の摂食に対する効果についても餌剥奪マウスで調べた。末梢投与された［Ｄ−Ａｒｇ−１，Ｄ−Ｐｈｅ−５，Ｄ−Ｔｒｐ−７，９，Ｌｅｕ−１１］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐは［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６と同様に用量依存的に餌摂取を有意に減少させた（図１０）。
高脂肪食餌によって引き起こされた体重増加が賦形剤の繰り返し投与により大幅に損なわれたため（図２）、食餌により肥満となったマウスにおける［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６の急性作用を検討した。［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６のＩＰ投与により餌の摂取は大きく減少し、体重増加が減少した（図１１）。
治療効果についてさらに見通しを得るために、ＩＰ投与された［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６がｏｂ／ｏｂマウスにおいて食欲不振誘発性作用を産生するかどうか検討した。投与された［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６は、ｏｂ／ｏｂマウス並びに痩マウスにおいて餌摂取を有意に減少させた（図１２）。
最後に、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６の繰り返し投与がｏｂ／ｏｂマウスにおける体重増加と血糖制御に与える影響を検討した。［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６の繰り返し注射により、筋肉重量を減少することなく体重増加と血糖濃度が有意に低下した（図１３、表２）。さらに、［Ｄ−Ｌｙｓ−３］−ＧＨＲＰ−６処理によりｏｂ／ｏｂマウスのＦＦＡレベルは生理食塩水処理ｏｂ／ｏｂマウスに比較して２４％有意に減少した（図１４）。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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