(57)【要約】本発明は、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）等の神経疾患の治療のためのＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する神経疾患治療剤を提供する。即ち、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、神経変性疾患治療剤である。
2003045439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、神経変性疾患治療剤。
【請求項２】
神経変性部位へ投与するための請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
神経変性疾患が、、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輪閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎・多発性筋炎、クロイツフェルド・ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマドーデス、サルコイドーシス、結節性動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱管狭窄症、混合性結合組織病、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎および虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）からなる群から選択される請求項１または２記載の治療剤。
【請求項４】
神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、虚血性脳血管障害、糖尿病性末梢神経炎および脊髄損傷からなる群から選択される、請求項３記載の治療剤。
【請求項５】
神経変性疾患がパーキンソン病である請求項４記載の治療剤。
【請求項６】
神経変性部位が大脳、中脳、小脳、脊髄、延髄、末梢神経からなる群から選択される、請求項２記載の治療剤。
【請求項７】
神経変性部位が大脳皮質、線条体、海馬、黒質からなる群から選択される請求項２記載の治療剤。
【請求項８】
変性した神経がドーパミンニューロンである、請求項６または７記載の治療剤。
【請求項９】
ＨＧＦ遺伝子がプラスミドベクターまたはウイルスベクターに組込まれている、請求項１〜８のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項１０】
ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームまたはセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−Ｅ（エンベロープ）の形態にある、請求項１〜８のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項１１】
少なくとも１回投与するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項１２】
医薬的に有効量の遺伝子を用いる、請求項１〜１１のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項１３】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を神経変性疾患治療剤を製造することに用いる用途。
【請求項１４】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子の薬理学的に有効な量を患者に投与することによる神経変性疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野：
本発明は、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輪閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）等の神経疾患の治療のためのＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する神経疾患治療剤に関する。
従来の技術：
パーキンソン病等の神経変性疾患の予防および治療に、神経保護作用が認められるＧＤＮＦ神経栄養因子ＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）が試みられていた。しかし、これまでの検討ではその作用効果は十分ではなく、神経変性疾患の予防および治療には、より神経保護作用の強い物質が望まれていた。
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、肝細胞増殖因子）は、成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子として発見され、様々な薬理作用について報告されている（実験医学Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３（増刊）３３０−３３９（１９９２））。また、これらの薬理作用を応用して、種々の疾患の治療剤として検討・開発されている。一方、ＨＧＦ遺伝子の遺伝子治療への応用についても報告されている（特開平３−７２８８３号公報、ＷＯ９７／０７８２４、ＷＯ０１／２６６９４）。
ＨＧＦの神経に対する作用として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により海馬ニューロンに対する生存維持、神経細胞死の抑制、運動ニューロンに対する成長促進、生存促進、ドーパミン作動性ニューロンに対する成熟、生存維持などが報告されており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経に対する作用はＧＤＮＦより強いことが推測された。
しかし、ＨＧＦの作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で確認されているに過ぎず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経に対する作用があったとしても、生体中で神経保護作用を示すとはいえず、パーキンソン病等の神経変性疾患に対して予防および治療効果があるかは検討されていなかった。
さらに、ＨＧＦは、血中での半減期が約１０分と短く、血中濃度を維持することが困難であり、またＨＧＦ有効量の患部への移行性も問題となっていた。本発明者らは既にＨＧＦ遺伝子を種々の疾患の治療に用いることによりＨＧＦの半減期の問題、患部への移行性の問題を解決できることを明らかにしている（特開平３−７２８８３号公報、ＷＯ９７／０７８２４、ＷＯ０１／２６６９４）。
従って、ＨＧＦによる神経変性疾患の予防および治療に対してもＨＧＦ遺伝子の利用が期待される。
発明の開示：
本発明は、これまで有効な治療法が見出されていなかったパーキンソン病の神経変性疾患の治療法、それに用いる治療剤を提供することを目的とする。具体的には、ＨＧＦ遺伝子を有効成分として含むパーキンソン病等の神経変性疾患の治療剤の提供、ＨＧＦ遺伝子を投与することを含むパーキンソン病等の神経変性疾患の治療法の提供およびパーキンソン病等の神経変性疾患の治療剤の作製へのＨＧＦ遺伝子の使用を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討の結果、ＨＧＦ遺伝子が実際にパーキンソン病等の神経変性疾患の予防および治療に有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、神経変性疾患治療剤。
（２）  神経変性部位へ投与するための、（１）の治療剤。
（３）  神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害からなる群から選択される、（１）または（２）の治療剤。
（４）  神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、虚血性脳血管障害、糖尿病性末梢神経炎および脊髄損傷からなる群から選択される、（３）の治療剤。
（５）  神経変性疾患がパーキンソン病である、（４）の治療剤。
（６）  神経変性部位が大脳、中脳、小脳、脊髄、延髄、末梢神経からなる群から選択される、（２）の治療剤。
（７）  神経変性部位が大脳皮質、線条体、海馬、黒質からなる群から選択される、（２）の治療剤。
（８）  変性した神経が、ドーパミンニューロンである、（６）または（７）の治療剤。
（９）  ＨＧＦ遺伝子がプラスミドベクターまたはウイルスベクターに組込まれている、（１）〜（８）のいずれかの治療剤。
（１０）  ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームまたはセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−Ｅ（エンベロープ）の形態にある、（１）〜（８）のいずれかの治療剤。
（１１）  必要に応じて複数回投与するための、（１）〜（１０）のいずれかの治療剤。
（１２）  医薬的に有効量の遺伝子を用いる、（１）〜（１１）のいずれの治療剤。
（１３）  ＨＧＦ遺伝子をヒトに導入することを含む、神経変性疾患の治療法。
（１４）  ＨＧＦ遺伝子を神経変性部位へ投与する、（１３）の治療法。
（１５）  神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害よりなる群から選択される、（１３）または（１４）の治療法。
（１６）  神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、虚血性脳血管障害、糖尿病性末梢神経炎および脊髄損傷よりなる群から選択される、（１５）の治療法。
（１７）  神経変性疾患がパーキンソン病である、（１６）の治療法。
（１８）  神経変性部位が大脳、中脳、小脳、脊髄、延髄、末梢神経からなる群から選択される、（１３）の治療法。
（１９）  神経変性部位が大脳皮質、線条体、海馬、黒質からなる群から選択される、（１３）の治療法。
（２０）  変性した神経が、ドーパミンニューロンである、（１８）または（１９）の治療法。
（２１）  ＨＧＦ遺伝子がプラスミドベクターまたはウイルスベクターに組込まれている、（１３）〜（２０）のいずれかの治療法。
（２２）  ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームまたはセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−Ｅ（エンベロープ）の形態にある、（１３）〜（２０）のいずれかの治療法。
（２３）  ＨＧＦ遺伝子を必要に応じて複数回投与する、（１３）〜（２２）のいずれかの治療法。
（２４）  医薬的に有効量の遺伝子を投与する、（１３）〜（２３）のいずれかの治療法。
（２５）  神経変性疾患治療剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子の使用。
（２６）  神経変性疾患治療剤が神経変性部位へ投与される、（２５）の使用。
（２７）  神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害よりなる群から選択される、（２５）または（２６）の使用。
（２８）  神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、虚血性脳血管障害、糖尿病性末梢神経炎および脊髄損傷よりなる群から選択される、（２７）の使用。
（２９）  神経変性疾患がパーキンソン病である、（２８）の使用。
（３０）  神経変性部位が大脳、中脳、小脳、脊髄、延髄、末梢神経からなる群から選択される、（２６）の使用。
（３１）  神経変性部位が大脳皮質、線条体、海馬、黒質からなる群から選択される、（２６）の使用。
（３２）  変性した神経が、ドーパミンニューロンである、（３０）または（３１）の治療法。
（３３）  ＨＧＦ遺伝子がプラスミドベクターまたはウイルスベクターに組込まれている、（２５）〜（３２）のいずれかの使用。
（３４）  ＨＧＦ遺伝子がセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームまたはセンダイ・ウイルス（ＨＶＪ）−Ｅ（エンベロープ）の形態にある、（２５）〜（３３）のいずれかの使用。
（３５）  医薬的に有効量のＨＧＦ遺伝子を用いる、（２５）〜（３４）のいずれかの使用。
また、本発明は肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を神経変性疾患治療剤を製造することに用いる用途、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子の薬理学的に有効な量を患者に投与することによる神経変性疾患を治療する方法も提供する。
また、神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輪閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎・多発性筋炎、クロイツフェルド・ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマドーデス、サルコイドーシス、結節性動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱管狭窄症、混合性結合組織病、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎および虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）からなる群から選択される疾患の治療剤、治療方法または治療剤製造への用途である。
神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎および虚血性脳血管障害からなる群から選択される疾患でもよい。
発明の実施の形態：
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用される「ＨＧＦ遺伝子」とは、ＨＧＦ（ＨＧＦタンパク）を発現可能な遺伝子を指す。具体的には、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）；特許第２７７７６７８号公報；Ｂｉｏ  ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３，９６７（１９８９）；Ｂｉ  ｃｃ  ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７２，３２１（１９９０）などに記載のＨＧＦのｃＤＮＡを後述の如き適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだものが挙げられる。ここでＨＧＦをコードするＤＮＡの塩基配列は、前記文献に記載されている他Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ等のデータベースにも登録されている。従ってこれらの配列情報に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、例えば肝臓や白血球由来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなどにより、ＨＧＦのｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。さらに、本発明のＨＧＦ遺伝子は前述のものに限定されず、発現されるタンパク質がＨＧＦと実質的に同じ作用を有する遺伝子である限り、本発明のＨＧＦ遺伝子として使用できる。すなわち、１）前記ｃＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、２）前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡなどのうち、ＨＧＦとしての作用を有するタンパクをコードするものであれば、本発明のＨＧＦ遺伝子の範疇に含まれる。また、ＨＧＦ様の活性を有するＨＧＦのサブタイプやＨＧＦのバリアントをコードするものも本発明のＨＧＦ遺伝子に含まれる。ＨＧＦバリアントとして、例えばｄｅｌｔａ５ＨＧＦと表される５アミノ酸を欠失した天然で生じる変異体の他ＮＫ２およびＮＫ１なども含まれる。ここでいうＨＧＦの作用とは、海馬ニューロンに対する生存維持、神経細胞死の抑制、運動ニューロンに対する成長促進、生存促進、ドーパミン作動性ニューロンに対する成熟、生存維持等の作用をいう。ここで前記１）及び２）のＤＮＡは、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、又は通常のバイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして行うことができる。
次に、本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、導入形態および導入量等について詳述する。
ＨＧＦ遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いた場合と、ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別され、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
以下、具体的に説明する。
Ａ．非ウイルスベクターを用いる場合
慣用の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。
細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。
また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｏｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、ＨＶＪ−Ｅ（エンベロープ）ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に供することにより、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。
このうちＨＶＪ−リポソームは、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＨＶＪ）とを融合させたものである。
当該ＨＶＪ−リポソーム法は従来のリポソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、好ましい導入形態である。ＨＶＪ−リポソームの調製法については文献（実験医学別冊、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））などに詳しく述べられているため、それらを参照されたい。またＨＶＪリポソーム法とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０，１４４０−１４４８（１９９３）；実験医学，１，１８２２−１８２６（１９９４）；蛋白質・核酸・酵素，４２，１８０６−１８１３（１９９７）等に記載の方法であり、好ましくはＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ），４７９−４８２（１９９５）に記載の方法が挙げられる。
なおＨＶＪとしてはＺ株（ＡＴＣＣより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７やＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５など）も用いることができる。
また、ＨＶＪ−Ｅ（エンベロープ）ベクターは、外来遺伝子を不活化したセンダイウイルスエンベロープに導入したものであり、ＷＯ０１／５７２０４号国際公開公報の記載に従い調製することが可能である。
さらに、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であり、この観点から好ましい導入法である。
ここで用いられる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）、ｐＶＡＸ１などの発現ベクターが挙げられる。
Ｂ．ウイルスベクターを用いる場合
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁；月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）；実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましい。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。ＨＶＪ−リポソームの調製は、ＷＯ０１／３２２２０、ＷＯ０１／２６６９４等の開示に従い行うことができる。
本発明でいう疾患は、神経の変性を伴う疾患をいい、進行性に神経細胞の障害が進む疾患、外傷や他の疾患を原因とするもの等種々の疾患が含まれる。この中には、非常にまれに起こるいわゆる神経難病等も含まれる。これらの神経疾患の原因ならびに変性する部位もしくは神経は様々であるが、本発明の治療剤が変性した神経自体を修復し、機能を改善することから、本発明の治療剤は種々の神経変性を伴う疾患の治療・改善に効果がある。本発明の疾患として、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輪閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎・多発性筋炎、クロイツフェルド・ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマドーデス、サルコイドーシス、結節性動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱管狭窄症、混合性結合組織病、脊髄損傷、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）等の神経疾患が挙げられる。これらの疾患はすべて神経変性を伴い、例えば、パーキンソン病は中脳ドーパミンニューロンの変性、アルツハイマー病は大脳皮質および海馬の変性、脊髄損傷は脊髄の運動神経および感覚神経の変性、糖尿病性末梢神経炎は感覚神経の変性、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）は大脳皮質および海馬の変性、脊髄小脳変性症は小脳、多発性硬化症は大脳、中脳、小脳、延髄等の神経髄症の変性、線条体黒質変性症は小脳、脊髄等の線条体、黒質、被殻、尾状核などの変性、脊髄性筋萎縮症は脊髄の運動神経の変性、ハンチントン舞踏病は大脳基底核の変性、筋ジストロフィーは大脳や脊髄の変性、ピック病は大脳の変性、シャイ・ドレーガー症候群は脊髄、自立神経節、小脳、錐体外路、錐体路などの変性を伴う。本発明の遺伝子治療剤は、重症の神経疾患の患者だけでなく、軽度の患者にも使用することができ、治療および症状の緩和に効果を奏し得る。
本発明の遺伝子治療剤は、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与方法・投与部位が選択される。例えば、大脳の変性を主に伴う疾患に対しては、大脳に投与すればよいし、線条体が局所的に変性する疾患に対しては線条体に投与すればよいし、全身の神経変性を伴う疾患に対しては全身投与してもよい。投与方法としては、注射等適切な方法により投与することが好ましい。また投与部位としては、脳内投与、脊髄内投与等、神経変性部位周辺および動・静脈内に投与することが好ましい。
神経変性部位として、例えばパーキンソン病では中脳ドーパミンニューロン、アルツハイマー病では大脳皮質および海馬、脊髄損傷では脊髄の運動神経および感覚神経、糖尿病性末梢神経炎では感覚神経、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）では大脳皮質および海馬、脊髄小脳変性症では小脳、多発性硬化症では大脳、中脳、小脳、延髄等の神経髄症、線条体黒質変性症では小脳、脊髄等の線条体、黒質、被殻、尾状核等、脊髄性筋萎縮症では脊髄の運動神経、ハンチントン舞踏病では大脳基底核、筋ジストロフィーでは大脳や脊髄、ピック病では大脳、シャイ・ドレーガー症候群では脊髄、自律神経節、小脳、錐体外路、錐体路等が挙げられる。これらの変性疾患に対し、これらの変性部位、変性部位周辺または変性部位を含む広い部位にＨＧＦ遺伝子を投与することにより、治療効果を発揮し得る。
例えば、パーキンソン病の治療においては、線条体に直接投与することもできる。
本発明の治療剤の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、神経変性疾患を治療するのに適切なレベルのポリペプチド、タンパク質を生じるために十分なＨＧＦ遺伝子を患者に投与することをいい、その具体的な投与量としては、患者の症状等によって異なるが、成人患者１人当たりＨＧＦ遺伝子として約１μｇ〜約５０ｍｇの範囲、好ましくは約１０μｇ〜約５ｍｇ、より好ましくは約５０μｇ〜約５ｍｇの範囲から投与量が選択される。
本発明の治療剤は、数日ないし数週間に一回投与するのが好適であり、投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。本発明の治療剤は、非侵襲的な投与に供されるものであるため、病状に応じて何回でも投与できるという特徴を有する。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
本発明は、特に実施例が示すように、ＨＧＦを前投与することにより、ドーパミンニューロンの変性および死滅を防げる。パーキンソン病は慢性進行性の疾患であるが、ＨＧＦはドーパミンニューロンの保護作用があることにより、その進行を遅延させる、または抑制することができ、パーキンソン病の予防および治療剤として作用する。さらに、アルツハイマーなどの神経変性疾患、脊髄損傷、虚血性脳血管障害、末梢神経炎等の神経の損傷に起因する疾患の治療剤としても有用である。
実施例：
〔実施例１〕  ＨＧＦを用いたパーキンソン病の治療
パーキンソン病モデルラットを用いて、ＨＧＦのモデルラットへの作用効果を行動学的におよび組織学的に検討した。
用いた薬物惹起性パーキンソン病モデルラットは、４週齢のオスＷｉｓｔｅｒ  ｒａｔであり、体重は約１００ｇであった。Ｗｉｓｔｅｒ  ｒａｔの線条体２ヶ所へＨＧＦプラスミド１０μＬ（１００μｇ）を注入した（５μＬを２ヶ所）。コントロールとして、同量のβ−ｇａｌを注入したＷｉｓｔｅｒ  ｒａｔを用いた。
注入５日後に、中脳黒質緻密斑にドーパミンニューロンを特異的に破壊する神経毒である６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン）を３μＬ（９μｇ）注入した。
６−ＯＨＤＡ注入２、４、６、８、１０週間後に正常ラット群、モデルラット群、β−ｇａｌを注入したコントロールラット群およびＨＧＦ注入群のそれぞれ５匹について回転運動を観察した。ここで、正常ラット群は、無処置の正常ラット、モデルラット群は、黒質緻密斑に６−ＯＨＤＡを投与したパーキンソンモデルラット群であり、コントロール群はβ  ｇａｌ注入後６−ＯＨＤＡを注入した群であり、ＨＧＦ注入群は、ＨＧＦ注入後に６−ＯＨＤＡを注入した群である。
回転運動は、６−ＯＨＤＡ注入後２、４、６、８および１０週間後の各群のラットにアンフェタミン（ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）（又は、アポモルフィン（Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ））を５ｍｇ／ｋｇラットの量で腹腔内注射し誘発した。ここで、アンフェタミンは、ドーパミンニューロンからドーパミンを放出させるが、６−ＯＨＤＡ注入側では神経終末が破壊されているため線条体でドーパミンの放出が起こらず、正常側の線条体のみが刺激されるため障害側への回転運動が生じる。
８週間後、各群のラットより脳を取り出し抗ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）抗体により免疫染色を行った。ここで、ＴＨはカテコラミンの律速酵素でドーパミンニューロンの指標となる各々の群の５ヶ所の細胞をカウントし、正常黒質と比較してドーパミンニューロンの残存率を算出した。
回転運動の観察により以下の結果が得られた。
β−ｇａｌを注入したコントロール群はパーキシソン病モデル群と同様に異常回転運動を示した。ＨＧＦ投与群ではほとんど回転運動を示すことなく、正常なラットと同様な状態であった（図１）。アンフェタミンの刺激による興奮性（毛が逆立つ、音に敏感になる）はいずれのラット群でも観察された。この結果は、ＨＧＦを前投与することにより中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒６−ＯＨＤＡから保護し、パーキンソン病モデルラットの症状を抑えたことを示している。
パーキンソン病は黒質ドーパミン細胞が正常の２０％以下になると症状が現れるといわれている。モデル動物では１０％以下になると異常回転運動などの特異的行動が現れる。
組織学的検討の結果は以下のとおりであった。
正常は黒質と比較して、神経毒６−ＯＨＤＡを黒質に注入したモデルラットでは黒質細胞がほとんど変性、死滅している（図２〜図４、それぞれ異なる倍率での観察結果を示す）。いくつかの視野を観察して残存細胞数をカウントすると細胞の残存率は正常黒質の数％〜１０％程度であった。ＨＧＦ注入群では、残存細胞率が２０〜３０％であった。このことは異常回転運動と相関している。また、正常な黒質にＨＧＦを注入しても細胞正常には影響を及ぼさなかった。
〔実施例２〕  ＨＧＦの神経修復作用効果
ＨＧＦの中脳黒質のドーパミンニューロンの再生および修復作用の検討を行った。
Ｗｉｓｔｅｒ  ｒａｔの中脳黒質緻密班に３μＬ（９μｇ）の６−ＯＨＤＡを注入し、その後、線条体２ヶ所へＨＧＦプラスミド１０μＬ（１００μｇ）を注入した（５μＬを２ヶ所）。この際、β−ｇａｌを注入したＷｉｓｔｅｒ  ｒａｔをコントロールラットとして用いた。
【図面の簡単な説明】
図１は、アンフェタミンにより誘発される回転運動に対するＨＧＦの作用（回転運動の変化）を示す図である。
図２は、パーキンソン病モデルラットにおけるＨＧＦの神経保護作用を示す図である（倍率：３．３×１０（接眼レンズ倍率×対物レンズ倍率））。
図３は、パーキンソン病モデルラットにおけるＨＧＦの神経保護作用を示す図である（倍率：３．３×２０（接眼レンズ倍率×対物レンズ倍率））。
図４は、パーキンソン病モデルラットにおけるＨＧＦの神経保護作用を示す図である（倍率：３．３×４０（接眼レンズ倍率×対物レンズ倍率））。
図２、図３および図４はそれぞれ４ケの写真を含み、これらの写真はモデルラット群およびＨＧＦ投与群におけるそれぞれの正常側および６−ＯＨＤＡ注入側を示す。  図２、図３および図４は倍率が異なるのみである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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