(57)【要約】式2003104265.tif 000009［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ水素原子またはメチル基を示し、Ｒ４は水素原子または水酸基を示し、Ｒ５は水素原子またはメチル基を示す。］で表される化合物は、グリア細胞のグリシントランスポーターに対する阻害活性を有する新規な生理活性物質であり、統合失調症治療剤として有用である。
2003104265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
2003104265.tif 000007
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ水素原子またはメチル基を示し、Ｒ４は水素原子または水酸基を示し、Ｒ５は水素原子またはメチル基を示す。］で表される化合物。
【請求項２】
式
2003104265.tif 000008
で表される化合物。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項に示された化合物からなる医薬。
【請求項４】
請求の範囲第１項または第２項に示された化合物を有効成分とするグリシントランスポーター阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、哺乳動物のグリア細胞に発現しているグリシントランスポーター阻害活性を有する新規化合物に関する。
背景技術
近年、統合失調症の原因としてグルタミン酸神経の伝達機能低下がいわれており、統合失調症患者の脳ではグルタミン酸受容体数の増加が認められることがわかっている。グリシンはグルタミン酸受容体に結合し、受容体の活性化を行うことが知られている。シナプス間隙に存在するグリシン量はグリア細胞に発現しているグリシントランスポーターによる取り込みにより調節を受けているため、グリシントランスポーターの阻害剤はシナプス間隙のグリシン量を増大させ、グルタミン酸受容体を活性化できる統合失調症治療薬として有用である。
本発明の化合物に構造類似でグリシントランスポーターに対する取り込み阻害活性を有する化合物は知られていない。
本発明の目的は、グリア細胞のグリシントランスポーターに対する阻害活性を有する新規な生理活性物質を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは種々検討した結果ある種の化合物がグリア細胞のグリシントランスポーターに対する優れた阻害活性を有することを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は式１
2003104265.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ水素原子またはメチル基、Ｒ４は水素原子または水酸基、Ｒ５は水素原子またはメチル基を示す］で示される化合物、及び、式２
2003104265.tif 000004
で示される化合物である。
以下、式１で示され、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水酸基、Ｒ５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２１７、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３がメチル基、Ｒ４およびＲ５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２１８、Ｒ１，Ｒ２がメチル基，Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水酸基、Ｒ５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２１９、Ｒ１が水素原子，Ｒ２がメチル基，Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水酸基、Ｒ５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２２１、Ｒ１がメチル基，Ｒ２，Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水酸基である化合物をＷＳＳ２２２２、Ｒ１，Ｒ２がメチル基，Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水酸基、Ｒ５がメチル基である化合物をＷＳＳ８０２７と称する。また、式２で示される化合物をＷＳＳ２２２０と称する。
本発明者らは、前記目的達成のために多数の菌株を土壌および植物より分離し、その菌株の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株の産生する化合物がラットグリア細胞のグリシン取り込みに対して強い阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
この菌株の菌学的性状を以下に示す。
ＷＳＳ２２１７、ＷＳＳ２２１８、ＷＳＳ２２１９、ＷＳＳ２２２０、ＷＳＳ２２２１、及びＷＳＳ２２２２を産生する菌株は、本発明者らが自然界より分離した放線菌であり、以下に菌学的性状を示す。
Ａ．形態的性質
よく分岐した基生菌糸より気菌糸を形成する。気菌糸上にはフック状、カール状、あるいは緩い螺旋状（１〜３巻き）の４〜１５胞子から成る短い胞子鎖を単生する。胞子は、大きさが１．０〜１．３×１．４〜２．０μｍで、形が卵形で、表面がしわ状である。なお、菌束糸、胞子嚢や疑似胞子嚢の形成、及び胞子の運動性は認められない。
Ｂ．培養的性質
各種培地上で、３０℃、３週間培養した場合の肉眼的観察結果を次の表１に示した。
2003104265.tif 000005
Ｃ．生理学的性質
１）生育温度範囲
ａ．生育温度      ：１６〜３９℃
ｂ．最適生育温度  ：３２〜３４℃
２）各種性質
ａ．ゼラチンの液化（３０℃、２週間）：陰性
ｂ．脱脂乳の凝固（３７℃、２週間）：陰性
ｃ．脱脂乳のペプトン化（３７℃、２週間）：陰性
ｄ．メラニン様色素の生産（３０℃、２週間）：陰性
ｅ．でんぷんの加水分解（３０℃、２週間）：陰性
３）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上、３０℃、２週間）
Ｌ−アラビノース  ：  ｗ        Ｌ−ラムロース    ：  ｗ
Ｄ−キシロース    ：  ＋        ラフィノース      ：  ＋
Ｄ−グルコース    ：  ＋        イノシトール      ：  ＋
Ｄ−フラクトース  ：  ＋        Ｄ−マンニトール  ：  ＋
シュクロース      ：  ＋
（＋：生育する    ｗ：弱く生育する）
Ｄ．化学分類学的性質
１）ジアミノピメリン酸の有無と光学異性型：メソ型のジアミノピメリン酸が検出された。
２）メナキノン組成：ＭＫ−９（Ｈ２）、ＭＫ−９（Ｈ４）が主成分として検出された。
３）全菌体の還元糖の種類：リボース、マジュロース、マンノース、及びグルコースが検出された。
４）リン脂質：未知のグルコサミン含有リン脂質が検出された。フォスファチジルグリセロールは検出されなかった。
以上の性状をもとに放線菌の分離と同定（日本放線菌学会編、２００１年）に従って検索を行った結果、本菌株はノノムラエア属に属する放線菌に分類することができるので、ノノムラエア・エスピー・ＴＡ−０４２６（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ  ｓｐ．ＴＡ−０４２６）と命名した。
なお、本菌株は受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７１」として独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００１年１２月４日付けで受託（寄託の移管請求２００３年４月３０日）されている。
ＷＳＳ２２１７〜ＷＳＳ２２２２の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でＴＦ−株を好気的条件下で培養することにより行う。
培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物質および消泡剤を加えることができ、ｐＨは７前後に調製する。炭素源としては、例えばグルコース、シュウクロース、アキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまたは混合して用いる。窒素源としては、例えば肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コーン・スティープ・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独または混合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを、単独または混合して用いる。消泡剤としてはアデカノール、シリコン化合物などを用いることができる。
培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、ｐＨ４〜１０、２５〜３５℃で２〜５日間、望ましくはｐＨ６〜７、２５〜２８℃で４日間培養する。
本発明の化合物は、発酵生産物について一般的な方法で精製を行うことにより得られる。すなわち、培養終了後、遠心分離または濾過により培養濾液を得、ダイヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化学社製）などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。菌体は低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。次いでこの菌体抽出液および吸着樹脂からの溶出液を合わせて減圧濃縮し、有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ブタノールなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび逆層分配用ＯＤＳを充填したカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに伏すことにより本発明化合物を精製単離することができる。
ＷＳＳ８０２７は以下に示すような方法で合成することができる。すなわち、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９７巻、第３８０２頁（１９７５年）］に記載の方法に準じて、ＷＳＳ２２１９をヨウ化メチルで処理することによって合成することができる。
以上の方法によって得られたＷＳＳ２２１７〜ＷＳＳ２２２２およびＷＳＳ８０２７は、その分子量、紫外線吸収スペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル等の解析により、その化学構造が決定された。
ＷＳＳ２２１７の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４７４
（ｃ）．分子式：Ｃ２５Ｈ３８Ｎ４Ｏ５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：４９７．２７３６
理論値：４９７．２７４０（Ｃ２５Ｈ３８Ｎ４Ｏ５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］Ｄ２５：−１６９．４（ｃ０．０６２，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：λＭＡＸｎｍ（ｌｏｇ  ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．５（４．２７），２２３．５（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図１に示す。
（ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２１８の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４８６
（ｃ）．分子式：Ｃ２７Ｈ４２Ｎ４Ｏ４
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５０９．３０９９
理論値：５０９．３１０４（Ｃ２７Ｈ４２Ｎ４Ｏ４Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］Ｄ２５：−１４６．２（ｃ０．０８１，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ  ｎｍ（ｌｏｇ  ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．０（４．２６），２２３．５（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重メタノール中、５００ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。
（ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重メタノール中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図４に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルム、メタノールに難溶
水、ヘキサン、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２１９の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：５０２
（ｃ）．分子式：Ｃ２７Ｈ４２Ｎ４Ｏ５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５２５．３０４４
理論値：５２５．３０５３（Ｃ２７Ｈ４２Ｎ４Ｏ５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］Ｄ２５：−１８２．６（ｃ０．０６８，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ  ｎｍ（ｌｏｇ  ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．５（４．２６），２２３．０（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図５に示す。
（ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図６に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２２０の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：５７９
（ｃ）．分子式：Ｃ２７Ｈ３９Ｎ４Ｏ８Ｓ
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：６２５．２０２３
理論値：６２５．２２８４（Ｃ２７Ｈ３９Ｎ４Ｏ８Ｓ  Ｎａ２）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］Ｄ２５：−１９０．８（ｃ０．１０４，ｍｅｔｈａｎｏｌ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ  ｎｍ（ｌｏｇ  ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０７．５（４．２５），２２３．５（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図７に示す。
（ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図８に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、水、メタノールに可溶
ジオキサン、クロロホルム、アセトンに難溶
ヘキサン、エーテル、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：酸性
ＷＳＳ２２２１の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４８８
（ｃ）．分子式：Ｃ２６Ｈ４０Ｎ４Ｏ５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５１１．６０３４
理論値：５１１．６１５５（Ｃ２５Ｈ３８Ｎ４Ｏ５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］Ｄ２５：−２２８．１（ｃ０．０６５，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ  ｎｍ（ｌｏｇ  ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０７．０（４．２６），２２３．５（ｓｈ，３．５７）
（ｇ）．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図９に示す。
（ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図１０に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２２２の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４８８
（ｃ）．分子式：Ｃ２６Ｈ４０Ｎ４Ｏ５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５１１．６０４８
理論値：５１１．６１５５（Ｃ２５Ｈ３８Ｎ４Ｏ５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］Ｄ２５：−２２８．１（ｃ０．０６５，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ  ｎｍ（ｌｏｇ  ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０７．０（４．２６），２２３．５（ｓｈ，３．５７）
（ｇ）．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図１１に示す。
（ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図１２に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ８０２７の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：５５８
（ｃ）．分子式：Ｃ３１Ｈ５０Ｎ４Ｏ５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５８１．７４３３
理論値：５８１．７４９６（Ｃ３１Ｈ５０Ｎ４Ｏ５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］Ｄ２５：−１６０．４（ｃ０．０４，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ  ｎｍ（ｌｏｇ  ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．５（４．２６），２２３．０（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ピリジン中、５００ＭＨｚで測定した結果を図１３に示す。
（ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ピリジン中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図１４に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例および試験例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１
ＷＳＳ２２１７、ＷＳＳ２２１８、ＷＳＳ２２１９、ＷＳＳ２２２０の製造
（１）可溶性澱粉２．５％、グルコース１％、フィッシュミール０．５％、ファーマメディア０．３％、ＮＺケース０．３％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％を含む液体培地６０ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２気圧で２０分滅菌した。次いで、この無菌培地にＮｏｎｏｍｕｒａｅａ  ｓｐ．ＴＡ−０４２６株を接種し、２８℃、２００ｒｐｍで３日間回転振とう培養し、種培養とした。
次に、コーンスターチ２％、グリセリン１．０％、グルコース０．５％、ファーマメディア０．５％、麦芽エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．３％からなる無菌液体培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れ、これに前記種培養液４ｍｌを加えたものを１００本用意し、２８℃、１８０ｒｐｍで１４日間回転振とう培養した。
培養終了後、得られた培養液１０Ｌに５Ｌのｎ−ブタノールを加えて撹拌し、遠心分離により菌体とｎ−ブタノール抽出画分に分けた。ｎ−ブタノール画分を減圧濃縮して、褐色の油状物質６．０３ｇを得た。
（２）前項の油状物質６．０３ｇをクロロホルム約１０ｍｌに溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（Ｍｅｒｃｋ社製）２００ｍｌ：カラム管  ｆ＝４０ｍｍ］に吸着させた。クロロホルム４００ｍｌで洗浄した後、クロロホルム−メタノール（９８：２〜５０：５０）の混合溶媒で順に溶出した。このうち混合溶媒比（９５：５）で溶出した画分を合わせ減圧濃縮乾固し、２７２．８ｍｇのＦｒ．１を得た。また混合溶媒比（９０：１０）で溶出した画分を合わせ減圧濃縮乾固し、１７２．５ｍｇのＦｒ．２を得た。さらに混合溶媒比（８０：２０）で溶出した画分を合わせ減圧濃縮乾固し、３９８．０ｍｇのＦｒ．３を得た。
（３）前項のＦｒ．１を少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−０．０２％トリフルオロ酢酸水溶液（６５：３５）を移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製  ＯＤＳ−ＡＭ（１０・×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速２．５ｍｌ／ｍｉｎで保持時間１３〜１６分の画分を分取した。この画分を減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した後、半量の酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル抽出画分を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し１５．２ｍｇのＷＳＳ２２１８を得た。
（４）前項のＦｒ．２を少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液（４５：６５）を移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製  ＯＤＳ−ＡＭ（１０ｆ×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収  ２１０ｎｍでモニターしながら流速２．５ｍｌ／ｍｉｎで保持時間９．５〜１０分、１５〜１６分の画分を分取した。分取した２画分を各々合わせ減圧濃縮し、アセトニトリルを除去した後、半量の酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル抽出画分を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し３．５ｍｇのＷＳＳ２２１７、１３．４ｍｇのＷＳＳ２２１９を得た。
（５）前項のＦｒ．３を少量のメタノールに溶解し、３０％アセトニトリルを移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製  ＯＤＳ−ＡＭ（２０ｆ×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速１０ｍｌ／ｍｉｎで保持時間８．０〜９．０分の画分を分取した。分取した画分を減圧濃縮乾固し、８．８ｍｇのＷＳＳ２２２０を得た。
実施例２
ＷＳＳ２２２１、ＷＳＳ２２２２の製造
（１）可溶性澱粉２．５％、グルコース１％、フィッシュミール０．５％、ファーマメディア０．３％、ＮＺケース０．３％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％を含む液体培地６０ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２気圧で２０分滅菌した。次いで、この無菌培地にＮｏｎｏｍｕｒａｅａ  ｓｐ．ＴＡ−０４２６株を接種し、２８℃、２００ｒｐｍで３日間回転振とう培養し、種培養とした。
次に、コーンスターチ２％、グリセリン１．０％、グルコース０．５％、ファーマメディア０．５％、麦芽エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．３％からなる無菌液体培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れ、これに前記種培養液４ｍｌを加えたものを１５０本用意し、２８℃、１８０ｒｐｍで１４日間回転振とう培養した。
培養終了後、得られた培養液１５Ｌに５Ｌのｎ−ブタノールを加えて撹拌し、遠心分離により菌体とｎ−ブタノール抽出画分に分けた。
ｎ−ブタノール画分を減圧濃縮後、酢酸でｐＨ３．０に調製した水５００ｍｌを加えて撹拌し、５００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル抽出画分を合わせて減圧濃縮し、褐色の油状物質２．８３ｇを得た。
（２）前項の油状物質２．８３ｇをクロロホルム約１０ｍｌに溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（Ｍｅｒｃｋ社製）２５０ｍｌ：カラム管  ｆ＝４０ｍｍ］に吸着させた。クロロホルム４００ｍｌで洗浄した後、クロロホルム−メタノール（９９：１〜５０：５０）の混合溶媒で順に溶出した。このうち混合溶媒比（９０：１０）で溶出した画分と混合溶媒比（８０：２０）で溶出した画分を合わせて減圧濃縮乾固し、褐色油状物質８６４ｍｇを得た。
（３）前項の褐色物質８６４ｍｇを少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液（４５：５５）を移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：日本分光社製、カラム：ワイエムシー社製ＯＤＳ−ＡＭ（２０・×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速１０ｍｌ／ｍｉｎで保持時間１２〜１２．５分、１３〜１４分の画分を分取した。分取した２画分を各々合わせ減圧濃縮乾固し、５．３ｍｇのＷＳＳ２２２１、３．７ｍｇのＷＳＳ２２２２を得た。
実施例３
ＷＳＳ８０２７の製造
窒素気流下、水素化ナトリウム（１００．６ｍｇ）にジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて氷冷下、撹拌した。これにＷＳＳ２２１９（１２．９ｍｇ）を溶解したジメチルホルムアミド１ｍｌを加えた後、ヨウ化メチル（３００ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、氷冷下にて水及び酢酸エチルを加え、酢酸エチル抽出画分を減圧留去した。残渣を分取高速液体クロマトグラフィー［移動相：アセトニトリル−０．０２％トリフルオロ酢酸水溶液（８０：２０）、使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製  ＯＤＳ−ＡＭ（１０ｆ×１５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速２．５ｍｌ／ｍｉｎで分取した。分取した画分を減圧濃縮乾固し、４．４ｍｇのＷＳＳ８０２７を得た。
試験例１  ラットグリア細胞に対するグリシン取り込み抑制試験
（検体）
ＷＳＳ２２１７、ＷＳＳ２２１８、ＷＳＳ２２１９、ＷＳＳ２２２０、ＷＳＳ２２２１、ＷＳＳ２２２２及びＷＳＳ８０２７をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解し、滅菌水で目的濃度となるように希釈したものを用いた。
（試験細胞）
ラットグリア細胞Ｃ６
（試験方法）
液体シンチレーションカクテル含有の平底９６穴プレート（Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ：アマシャムファルマシアバイオテク社製）にＣ６細胞を５Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、１０％仔牛血清（ギブコ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製）中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。その後、培地を１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭグルコースの組成のバッファーに交換した。さらに目的濃度の薬物溶液０．０１ｍｌ、および３７５ＫＢｑ／ｍｌの［１４Ｃ］−グリシンを０．０１ｍｌ添加して、３７℃で５０分間培養した。培養後、バッファーを吸引除去し、室温で５時間乾燥させた。その後プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ；パッカード社製）で放射活性を測定した。抑制率はコントロール群の放射活性を０％、過剰量（１０ｍＭ）グリシン添加群を１００％とし、薬物添加群の放射活性との比較から求めた。
抑制率（％）＝［（薬物添加群の値−過剰量グリシン添加群の値）／（薬物未添加群の値−過剰量グリシン添加群の値）］×１００
抑制率５０％を示す化合物濃度をＩＣ５０（μＭ）として表２に示した。また、ポジティブコントロールとしてＧｌｙｃｉｎｅの抑制率を同時に求めた。
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試験例２  脳内マイクロダイアリシス法を用いたグリシン遊離量の測定
グリシンは他の神経伝達物質およびアミノ酸と同様に脳内において特異的トランスポーターによって神経細胞およびグリア細胞に取り込まれ、その作用を消失させる。従って、グリシンの取り込みを阻害することによりシナプス間隙のグリシン濃度が高まり、ポストシナプスのＮＭＤＡ受容体を刺激することが可能となる。
グリシン取り込み機構を阻害し、前頭前野局所におけるグリシン量を増加させることから統合失調症治療薬になる可能性が期待できる。
そこで本発明化合物の前頭前野グリシン量に対する作用を検討した。
（検体）
ＷＳＳ２２２０
（測定方法）
被験動物としてＳＤ系雄性ラットを用いた。あらかじめ測定部位である前頭前野（ＡＰ＋３．２，Ｌ±０．９，Ｖ脳表面下０．８）に透析プローブ挿入用ガイドカニューレを植込み、術後約１週間の回復を待ってから実験を開始した。
測定当日、エーテル麻酔下でガイドカニューレを通して透析プローブ（透析膜３ｍｍ）挿入固定後、無麻酔下で透析液（リンゲル液）を２μｌ／ｍｌで環流しながら２０分間隔でサンプル（４０μｌ）を回収した。ダイアリシスサンプルと２０ｍＭ  ＯＰＡ−ＭＥを３：１で混合し、１０℃にて２．５分間反応させた後、ＨＰＬＣにて誘導体化されたアミノ酸を検出した。Ｂａｓａｌ  ｌｅｖｅｌは、投与前１時間（３サンプル）の平均遊離量とした。ＷＳＳ２２２０  １０μｍｏｌ／Ｌは１０ｍｍｏｌ／ＬＤＭＳＯ溶液をリンゲル液で希釈し、還流液として透析プローブを介して注入した。薬物還流液は３時間処置した後、通常のリンゲル液に戻した。
（結果及び考察）
結果を第１５図に示した。
ｖｅｈｉｃｌｅ（０．１％ＤＭＳＯ／リンゲル）の前頭前野内局所投与ではグリシン量の変化は認められなかった。
ＷＳＳ２２２０  １０μｍｏｌ／Ｌ含有還流液中を３時間処置したところ、最大１００．７％のグリシン量増加が認められた。本化合物は、グリシン取り込み阻害に起因すると思われるグリシン量増加が確認された。
本化合物は前頭前野局所においてグリシン取り込み機構を阻害し、前頭前野局所におけるグリシン量を増加させることから統合失調症治療薬になる可能性が示唆された。
産業上の利用可能性
本発明の化合物はグリア細胞に発現したグリシントランスポーターに対する取り込み阻害作用を有するので、統合失調症治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１７の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第２図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１７の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第３図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１８の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第４図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１８の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第５図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１９の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第６図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１９の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第７図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第８図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２０の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第９図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１０図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１１図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１２図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１３図は重ピリジン中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ８０２７の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１４図は重ピリジン中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ８０２７の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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