(57)【要約】標的核酸の検出方法は、蛍光エネルギー移動が起こるように配置されたドナー蛍光物質とアクセプタ物質とで標識され、標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸プローブを準備するステップと、試料液と核酸プローブとを混合し、標的核酸と核酸プローブとをハイブリダイズさせるステップと、ステップ（ｂ）の後に、試料液に配列非依存的ヌクレアーゼを作用させて、上記試料液の蛍光強度の変化から標的核酸の検出を行うステップとを含んでいる。これにより、核酸プローブの設計の自由度の向上と、操作の簡便化とを両立させることができる。
2003035864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液中の標的核酸を検出する方法であって、
ドナー蛍光物質と、上記ドナー蛍光物質の蛍光を吸収し、蛍光エネルギー移動が起こるように配置されたアクセプタ物質とで標識され、上記標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸プローブを準備するステップ（ａ）と、
上記試料液と上記核酸プローブとを混合し、上記標的核酸と上記核酸プローブとがハイブリダイズして核酸プローブ−標的核酸複合体を形成可能な条件下で上記試料液を保持するステップ（ｂ）と、
上記ステップ（ｂ）の後に、上記試料液に配列非依存的ヌクレアーゼを作用させて、上記試料液の蛍光強度の変化から上記標的核酸の検出を行うステップ（ｃ）と
を含んでいる標的核酸の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の標的核酸の検出方法において、
上記配列非依存的ヌクレアーゼが二本鎖特異的エキソヌクレアーゼであることを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載の標的核酸の検出方法において、
上記二本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはλエキソヌクレアーゼのいずれかであることを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項４】
請求項２に記載の標的核酸の検出方法において、
上記核酸プローブを構成する塩基のうち複数の塩基が上記ドナー蛍光物質で標識されていることを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載の標的核酸の検出方法において、
上記配列非依存的ヌクレアーゼは一本鎖特異的ヌクレアーゼであることを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の標的核酸の検出方法において、
上記一本鎖特異的ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ及びアカパンカビヌクレアーゼのうちから選ばれた１つであることを特徴とする標的核酸の検出方法
【請求項７】
請求項１に記載の標的核酸の検出方法において、
上記ステップ（ｃ）では、上記ドナー蛍光物質が発する蛍光強度の変化から標的核酸の検出を行うことを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項８】
請求項１に記載の標的核酸の検出方法において、
上記ステップ（ｃ）では、上記アクセプタ物質が発する蛍光強度の変化から標的核酸の検出を行うことを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項９】
請求項１に記載の標的核酸の検出方法において、
上記ステップ（ａ）の後、上記ステップ（ｂ）の前に、上記核酸プローブをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、上記試料液に標的核酸が含まれる場合には上記標的核酸を増幅するステップをさらに含むことを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
配列非依存的なヌクレアーゼを用いる標的核酸の検出方法に用いられ、且つ単独で存在する場合に蛍光を発するドナー蛍光物質及び上記蛍光を吸収するアクセプタ物質で標識された核酸プローブであって、
上記標的核酸と相補的な塩基配列を有し、複数の塩基が上記ドナー蛍光物質で修飾されている核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、蛍光エネルギー移動を利用した標的核酸の検出方法及び、これに用いられる核酸プローブに関する。
背景技術
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。これに伴い、遺伝子診断による患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も実現されつつある。また、製薬分野では、生体分子の機能解析や相互作用の予測、特定等に遺伝子情報が利用され、新しいタイプの薬剤が開発されてきている。
上述のテーラーメード医療には、疾患のマーカー遺伝子や、患者の体質の目印となる遺伝子の検出技術が必須となる。また、所望の遺伝子の検出技術は、新薬の研究、開発を迅速に行なうためにも欠かせない。さらに、農業や食品分野でも、例えば遺伝子組み換え食品の検査や食肉の産地の特定など、遺伝子の検出技術が用いられる例は多い。
所望の遺伝子の検出あるいは探索には、従来サザンブロッティング法やノーザンブロッティング法、ディファレンシャルディスプレイ法などが用いられてきたが、最近になりＤＮＡマイクロアレイと総称される微小な核酸検出用センサが使われるようになってきている。これらＤＮＡマイクロアレイは、核酸同士のハイブリダイゼーションを利用し、標的核酸の検出を行なうという点においては上記従来技術と同様である。しかし、例えばスライドガラスのような微小な基板上において数千から数十万種類といった大量の核酸断片を一度に処理することが可能であるので、多数の遺伝子の存在または発現を調べたい場合には有効である。
現在種々のタイプのＤＮＡマイクロアレイが市販されているが、それらを用いた遺伝子解析方法の概要は次の通りである。
まず、検出したい核酸あるいは核酸断片と相補的な配列からなる核酸プローブをスライドガラス等の基板上に固定化する。次に、蛍光物質などで標識した標的核酸をハイブリダイズさせ、その後ハイブリダイズした標的核酸のシグナルを検出する。これにより、所望の遺伝子の検出や発現パターンの解析などが可能となる。
解決課題
しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法では、上述のように、まず核酸プローブを基板上に高密度に固定するという高度な技術が必要である。また、現在の固定化技術では、基板上に固定される核酸プローブ量のばらつきが大きいため、遺伝子の発現を調べる場合に、定量的な解析を行なうことが困難であった。
加えて、標的核酸を含む試料は予め使用者によって標識されなければならず、そのための操作には専用の試薬を必要とする。例えば、現在最も利用されている標識方法は、標的核酸中のチミン塩基の一部を標識物質Ｃｙ３またはＣｙ５で標識する方法である。この方法では、標識物質の取り込まれる割合が核酸の配列や長さによって異なるため、定量的な解析がさらに困難となる。
以上のような課題を解決する方法として、二種類の物質間の蛍光エネルギー移動を利用する方法が提案されている。蛍光エネルギー移動は、一方の物質が蛍光物質（ドナー蛍光物質）であり、この蛍光物質から発せられる波長が他方の物質（アクセプタ物質）の吸収波長と重なる場合に起こる。すなわち、両者が十分近くに存在すると、ドナー蛍光物質に対する励起光を照射してもドナー蛍光物質から照射される蛍光はアクセプタ物質により吸収されるため、結果としてドナー蛍光物質から発せられる蛍光はほとんど検出されない。ここで、アクセプタ物質は、ドナー蛍光物質が発する蛍光を吸収する物質であればよいが、特に、ドナー蛍光物質の蛍光を励起光とする蛍光物質であってもよい。この場合には、ドナー蛍光物質の励起光を照射してもドナー蛍光物質から発せられる蛍光はアクセプタ物質の励起光となるため、結果としてドナー蛍光物質から発せられる蛍光はほとんど検出されず、アクセプタ物質の蛍光のみが検出される。
このような二種類の物質間の蛍光エネルギー移動を利用した核酸の検出方法として、以下のような方法が提案されている。
特公平０５−１５４３９号公報には、標的核酸に相補的な配列からなり、且つ蛍光エネルギー移動対を形成する二種類の物質で標識された核酸プローブを用いる方法が開示されている。
この方法では、標的核酸の塩基配列のうち、特定の制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を含む配列に相補的な配列を有する核酸プローブを準備する。この核酸プローブは、上述のドナー蛍光物質とアクセプタ物質とで標識され、該ドナー蛍光物質と該アクセプタ物質とは、上述の制限酵素の切断位置を挟んで配置されている。そして、試料と核酸プローブとを混合後、核酸の熱変性及び再結合を行なう。
これにより、試料中に標的核酸が含まれる場合、標的核酸−核酸プローブ対は制限酵素により切断され、ドナー蛍光物質とアクセプタ物質とが切り離される。その結果、ドナー蛍光物質の蛍光を検出することで、試料中に含まれる標的核酸を検出することができる。
この方法では、マイクロアレイと比べて核酸検出に用いる核酸プローブの量を制御できるので、測定される蛍光強度から標的核酸の濃度を求めることが可能となる。
しかしながら、この方法において核酸プローブの配列は、標的核酸と二本鎖を形成する際に必ず何らかの制限酵素の認識部位が形成されるように設計されなければならない。このため、核酸プローブの設計は非常に制限されたものとなり、標的核酸の配列によってはこの方法を適用できない場合もあった。
そこで、特開平１１−１２３０８３号公報に記載の方法では、この不具合の解決が図られている。この方法でもまた、蛍光エネルギー対を形成する二種類の物質で標識された核酸プローブが用いられる。
この方法で用いられる核酸プローブは、標的核酸の３’末端付近の配列に相補的な配列を有し、標的核酸とハイブリダイズする際に５’側が突出するように設計される。この５’側の一本鎖配列は、ポリメラーゼ伸長反応により相補鎖が形成された場合に、任意の制限酵素の認識部位が形成されるように設計されている。加えて、その制限酵素の認識部位を形成し得る部分は、ドナー蛍光物質で修飾された塩基とアクセプタ物質で修飾された塩基の間に配置される。
これにより、ポリメラーゼ伸長反応の後、制限酵素で試料を処理すれば、標的核酸が存在する場合には、ドナー蛍光物質の蛍光が観測される。
一方、試料中に標的核酸が含まれていなければ、核酸プローブは一本鎖状態のままとなり、ドナー蛍光物質とアクセプタ物質とは近接したままであるので、蛍光は検出されない。
この方法によれば、制限酵素の認識部位となる配列を核酸プローブに自由に組み込むことができるので、特公平０５−１５４３９号公報に記載の方法に比べて核酸プローブの設計の自由度を大きくすることができる。
しかしながら、特開平１１−１２３０８３号公報に記載の方法では、特公平０５−１５４３９号公報に記載の方法に比べてポリメラーゼ伸長反応を行なう操作が加わるため、検出手順が煩雑となり、検出時間が長くなってしまう。その上、ポリメラーゼ等の試薬は高価であるので、検査コストも上昇してしまう。
発明の開示
本発明の目的は、標的核酸の配列によらず適用でき、簡便に行なうことができる標的核酸の検出方法と、この方法を実現するための材料とを提供することにある。
本発明の標的核酸の検出方法は、試料液中の標的核酸を検出する方法であって、ドナー蛍光物質と、上記ドナー蛍光物質の蛍光を吸収し、蛍光エネルギー移動が起こるように配置されたアクセプタ物質とで標識され、上記標的核酸の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸プローブを準備するステップ（ａ）と、上記試料液と上記核酸プローブとを混合し、上記標的核酸と上記核酸プローブとがハイブリダイズして核酸プローブ−標的核酸複合体を形成可能な条件下で上記試料液を保持するステップ（ｂ）と、上記ステップ（ｂ）の後に、上記試料液に配列非依存的ヌクレアーゼを作用させて、上記試料液の蛍光強度の変化から上記標的核酸の検出を行うステップ（ｃ）とを含んでいる。
この方法により、上記ステップ（ｃ）では配列非依存的ヌクレアーゼを作用させるので、核酸プローブの設計の自由度を大きくすることができる。また、ポリメラーゼ反応を用いる必要もないので、従来の方法ではできなかった核酸プローブの設計の自由度の向上と操作の簡便性の向上とを両立することができる。
上記配列非依存的ヌクレアーゼが二本鎖特異的エキソヌクレアーゼであることにより、ステップ（ｂ）で標的核酸が試料液中に存在する場合に形成される核酸プローブ−標的核酸複合体が二本鎖の末端部から選択的に消化される。その結果、ドナー蛍光物質によって修飾された塩基が遊離するので、試料液の蛍光強度が変化する。この方法によれば、一本鎖の核酸プローブは切断されないので、標的核酸の検出を定量的に行える上、核酸プローブの修飾方法を工夫することで検出感度の向上などを図ることもできる。
上記二本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはλエキソヌクレアーゼのいずれかであることが好ましい。
上記核酸プローブを構成する塩基のうち複数の塩基が上記ドナー蛍光物質で標識されていることにより、核酸プローブ−標的核酸複合体が消化される際により多量のドナー蛍光物質が試料溶液中に遊離するので、標的核酸の検出感度を向上させることができる。
上記配列非依存的ヌクレアーゼは一本鎖特異的ヌクレアーゼであることにより、ハイブリダイゼーション後に一本鎖状態で残存する核酸プローブを含めた一本鎖核酸を消化することができる。この方法によれば、標的核酸を定量的に検出することができる上、核酸プローブの設計の自由度をさらに大きくできる。
上記一本鎖特異的ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｓ１ヌクレアーセ及びマングビーンヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ及びアカパンカビヌクレアーゼのうちから選ばれた１つであることが好ましい。
上記ステップ（ｃ）では、上記ドナー蛍光物質が発する蛍光強度の変化から標的核酸の検出を行うことができる。
また、上記ステップ（ｃ）では、上記アクセプタ物質が発する蛍光強度の変化から標的核酸の検出を行うこともできる。
上記ステップ（ａ）の後、上記ステップ（ｂ）の前に、上記核酸プローブをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、上記試料液に標的核酸が含まれる場合には上記標的核酸を増幅するステップをさらに含むことにより、検出感度の向上を図ることができる。
本発明の核酸プローブは、配列非依存的なヌクレアーゼを用いる標的核酸の検出方法に用いられ、且つ単独で存在する場合に蛍光を発するドナー蛍光物質及び上記蛍光を吸収するアクセプタ物質で標識された核酸プローブであって、上記標的核酸と相補的な塩基配列を有し、複数の塩基が上記ドナー蛍光物質で修飾されていることにより、検出感度を向上させることができる。
最良の実施形態
−検出方法についての検討−
本願発明者らは、標的核酸の配列によらず適用でき、簡便に行なうことができる標的核酸の検出方法について、核酸プローブを固定化する方法や、核酸検出に蛍光以外の標識を行なう方法などを検討した。その結果、市販の試薬を使用できることや、操作の簡便性などから、ドナー蛍光物質とアクセプタ物質を用いた検出方法を採用することとした。
−第１の実施形態−
本発明の第１の実施形態に係る標的核酸の検出方法について、図を用いて説明する。
図１（ａ）−（ｃ）は、本発明の第１の実施形態に係る標的核酸の検出方法を示す図である。
まず、本発明で用いられる核酸プローブについて説明する。
同図に示すように、本方法で用いられる核酸プローブは、通常一本鎖のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）であって、蛍光エネルギー移動対を形成するドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３とで標識されている。このような核酸プローブ１は、通常の化学合成法または遺伝子工学的な手法によって得られる。また、市販の配列を核酸プローブとして用いる場合もある。
この核酸プローブ１は、標的核酸配列のうち任意の部分に相補的な配列を有する。
ドナー蛍光物質とアクセプタ物質との組み合わせとしては、フルオレセインイソシアナート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／テキサスレッド、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンブチレート（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／イオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンスルフォネート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）／ＴＡＭＲＡ、ＢＰＴＡ−テルビウム／Ｃｙ３などが挙げられるが、これらの例に限定されるわけではない。すなわち、励起されたドナー蛍光物質の蛍光波長がアクセプタ物質の吸収波長あるいは励起光波長と重なるという条件を満たせば、任意の物質の組み合わせを用いることができる。また、ドナー蛍光物質の励起光や蛍光、あるいはアクセプタ物質が蛍光物質である場合の蛍光などは、可視光の他、赤外線や紫外線などであってもよい。例えば、Ｃｙ５（Ｎ，Ｎ修飾テトラメチルインドジカルボシアニン）の様な近赤外の蛍光を発する物質でも、例えばＢＨＨＣＴ−ユウロピウムやＲＯＸと対にして使用することができる。
本発明の実施例では、一例としてＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣの組み合わせを用いる例を示す。なお、ＦＩＴＣの励起光及び蛍光の波長はそれぞれ４９０ｎｍ及び５２０ｎｍであり、ＴＲＩＴＣの励起光及び蛍光の波長はそれぞれ５４１ｎｍ及び５７２ｎｍである。これらの標識用物質は、当業者に公知の方法によって核酸プローブに導入される。
また、核酸プローブにおいて、標識位置は任意でよいが、蛍光エネルギー移動を生じさせるためにはドナー蛍光物質とアクセプタ物質との間隔を２４−２６塩基以内とすることが好ましい。なお、核酸プローブにおける標識用物質のペア数は後述のように、標的核酸の検出感度や検出時間に影響する。
上述のように設計された核酸プローブは、反応液中に溶解される。これらの核酸プローブは、必要とされる濃度に溶解されていればよく、マイクロアレイのように、基板などの固層に固定化されている必要はない。
次に、上述の核酸プローブを用いた本実施形態の標的核酸の検出手順を説明する。
まず、図１（ａ）に示すように、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３とで標識された核酸プローブ１を含む溶液（以下「プローブ溶液」と称する）を準備する。図示しないが、これと同時に試料溶液も準備しておく。本検出方法では、生体材料から抽出したＤＮＡやｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡなどを試料とすることができる。ＲＮＡは比較的不安定であるので、実際にはＤＮＡまたはｃＤＮＡが好ましく用いられる。例えば、患者の遺伝子型を特定する場合などはＤＮＡを試料とすればよいし、細胞内で発現しているＤＮＡを調べたい場合にはｃＤＮＡを試料として用いればよい。
次に、図１（ｂ）に示すように、反応槽４内でプローブ溶液と試料溶液を混合し、適当な条件下において十分なハイブリダイゼーション反応を行なう。なお、同図では、理解を容易にするため、試料溶液中に標的核酸５を含む例を示している。
この操作で、試料溶液に含まれる核酸が二本鎖である場合には、熱または強アルカリにより一本鎖状態に変性してからハイブリダイゼーションを行なう。試料中の核酸の変性条件は、当業者に公知の方法で行なう。核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの実験書に記載される公知の方法によって行われる。一例として、ハイブリダイゼーションは、いわゆる「ストリンジェント」な条件下で行われる。例えば、反応液のｐＨを７．０以上ｐＨ８．３以下とし、ナトリウムイオンの塩濃度を約０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下とする。そして、核酸プローブ１が１０−５０ヌクレオチドと短い場合には少なくとも３０℃で、５０ヌクレオチドを超える核酸プローブ１については少なくとも６０℃でハイブリダイゼーションを行なう。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成でき、この場合にはより低い温度が採用され得る。
本操作によって、試料中に標的核酸５が存在する場合、核酸プローブ１と標的核酸５の相補部分とがハイブリダイズし、一部または全長が二本鎖の核酸プローブ−標的核酸複合体６が形成される。後にエキソヌクレアーゼで処理する場合、核酸プローブ１は、その３’末端がハイブリダイズする際に３塩基以上突出しなければ、標的核酸５のうちどの部分にハイブリダイズするように設計してもよい
次に、図１（ｃ）に示すように、二本鎖の核酸に特異的なエキソヌクレアーゼ７を反応液に加え、核酸プローブ−標的核酸複合体６を切断する。これが、本実施形態の最大の特徴である。
エキソヌクレアーゼ７は、核酸のうち二本鎖を形成する部分を末端部から順次切断していくので、ドナー蛍光物質２で標識された核酸断片９とアクセプタ物質３で標識された核酸断片が生じる。すると、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３との距離が広がるので、ドナー蛍光物質２からアクセプタ物質３への蛍光エネルギー移動は起こらなくなる。従って、試料溶液に標的核酸５が含まれていた場合には、ドナー蛍光物質２の励起光を照射すればドナー蛍光物質２の蛍光強度が増大する。
一方、試料溶液に標的核酸５が含まれていない場合には、核酸プローブ１が一本鎖のまま遊離した状態なので、二本鎖特異的なエキソヌクレアーゼによって切断されない。このため、ドナー蛍光物質２の蛍光強度の変化も見られない。
本操作に使用できるエキソヌクレアーゼの例としては、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、λエキソヌクレアーゼなどが挙げられる。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、ＤＮＡの二本鎖部分を認識して３’末端から５’方向へＤＮＡを切断し、モノヌクレオチドを生じる。この際に、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＤＮＡの平滑末端では一方の鎖の３’側から、３塩基以下の３’突出末端では突出している鎖の３’末端から、あるいは５’突出末端では突出した鎖の相補鎖の３’末端からそれぞれＤＮＡを切断していく。従って、本操作でエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いる場合、核酸プローブ−標的核酸複合体６において、核酸プローブ１の３’末端が４塩基以上突出しないようにさえすれば、核酸プローブ１は標的核酸５のどの部分とハイブリダイズするように設計してもよいことになる。
また、λエキソヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを認識し、５’末端から３’方向にＤＮＡを切断する。なお、これ以外にも、二本鎖特異的なエキソヌクレアーゼであれば本実施形態の検出方法に使用できる。
次に、図１（ｃ）に示すエキソヌクレアーゼ処理の完了後、ドナー蛍光物質２の蛍光強度を測定することで、試料について標的核酸５の有無を検出できる。ここで、反応液中の核酸プローブ１の濃度を標的核酸５の濃度以上にしておけば、標的核酸５の濃度と蛍光強度とを相関させられるので、検量線を作成して標的核酸５を定量的に検出することが可能となる。
また、アクセプタ物質３も蛍光物質である場合には、図１（ｃ）に示すエキソヌクレアーゼ処理後にアクセプタ物質３の蛍光強度が減少する。従って、その変化を解析することによっても試料中の標的核酸５を定量的に検出することが可能である。この方法によれば、反応条件によっては、ドナー蛍光物質２の蛍光を観測する方法よりも精度良く定量を行えることがある。
以上のように、本実施形態の標的核酸の検出方法によれば、試料中の標的核酸を定量的に検出できるので、例えば、組織中での標的遺伝子の発現量を調べたり、感染症についての検査における状態の判定など、定量性が求められる種々の検査が可能になる。
また、本実施形態の方法は、特開平１１−１２３０８３号公報に記載の従来例に比べてポリメラーゼ伸長反応を行なう手順が不要であり、しかも核酸プローブの設計の自由度が大きいので、いかなる配列を有する標的核酸であっても短時間に検出することができる。
なお、本実施形態の方法において、同時に複数の標的核酸を検出したい場合は、検出に用いられる蛍光の波長が異なるドナー蛍光物質−アクセプタ物質のペアを用いればよい。すなわち、相異なる標的核酸を相異なる波長の蛍光を発するドナー蛍光物質−アクセプタ物質のペアで標識することにより、同時に複数の標的核酸を定量的に検出することが可能となる。ただし、ドナー蛍光物質−アクセプタ物質のペアは限られるので、この方法は、標的核酸の数が数種類に絞られている時に好ましく用いられる。
また、本実施形態の方法によれば、核酸プローブをプライマーとするＰＣＲを行って標的核酸を前もって増幅しておくことができるので、必要に応じて検出感度を向上させることもできる。このＰＣＲは、例えば標識した核酸プローブをコーディング鎖側のプライマーとし、これより標的核酸の非コーディング鎖に相補的な配列のＤＮＡ断片を下流側のプライマーとして公知の方法で行なえばよい。
また、本実施形態の標的核酸の検出方法によれば、次に説明するように核酸プローブの標識方法を工夫することにより検出感度を向上させたり、反応時間を短縮したりすることも可能であり、状況に応じて柔軟な対応が可能となる。従って、特開平１１−１２３０８３号公報に記載の方法や特公平０５−１５４３９号公報に記載の方法に比べて検出感度の向上や反応時間の短縮を図ることが可能となる。
−核酸プローブの標識部位についての検討−
本願発明者らは、本実施形態の標的核酸の検出方法において、核酸プローブの標識位置及び標識状態が検出時間及び検出感度に影響を与える可能性について考え、検討を行った。
図２（ａ）−（ｃ）は、標識に用いるドナー蛍光物質及びアクセプタ物質の位置またはペア数が異なる核酸プローブを示す図である。
二本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、二本鎖状態のＤＮＡを末端部から消化していくため、核酸プローブの末端部付近の塩基を標識する方がそれ以外の塩基を標識する場合に比べて検出時間を短くできると考えられる。
これを確認するため、図２（ａ）に示すような、５’末端付近の塩基をアクセプタ物質３またはドナー蛍光物質２で標識した核酸プローブと、３’末端付近の塩基をドナー蛍光物質２及びアクセプタ物質３で標識した核酸プローブとを準備し、本実施形態の検査方法を行った。ヌクレアーゼとしては、λエキソヌクレアーゼを用い、酵素反応は、５’→３’方向にのみＤＮＡの切断が起こる条件で行った。その結果、５’末端付近にアクセプタ物質３またはドナー蛍光物質２を配置した核酸プローブを用いる方が、エキソヌクレアーゼによる反応時間を短くすることができることが分かった。
また、エキソヌクレアーゼとして、３’→５’方向にＤＮＡを切断するエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた場合には、３’末端付近にドナー蛍光物質２及びアクセプタ物質３を配置した核酸プローブを用いる場合にエキソヌクレアーゼの反応時間を最も短縮することができた。
このことから、使用するエキソヌクレアーゼの特性に応じて、５’末端付近または３’末端付近の塩基をドナー蛍光物質２またはアクセプタ物質３で標識することにより、標的核酸の検出時間を短縮できることが明らかになった。なお、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３とがペアになっていれば、末端部の塩基はドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３のいずれで標識されていてもよい。
次に、本願発明者らは、複数の塩基をドナー蛍光物質２で標識することにより、本実施形態の検出感度を向上させることができるかどうかを検討した。
検討のため、図２（ｃ）に示すような、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３の複数対で標識した核酸プローブと、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３の一対のみで標識した核酸プローブとを用いて標的核酸の検出感度を比較した。
その結果、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３の複数対で標識した核酸プローブを用いた方が標的核酸の検出感度が向上することが確認された。これは、一分子の核酸プローブが分解された場合により多くのドナー蛍光物質が遊離するためである。なお、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３とは交互に配置することが好ましいが、分解されない状態で核酸プローブからのドナー蛍光物質の蛍光が抑えられていればこれ以外の配置であってもよい。
このように、本実施形態の標的核酸の検出方法においては、複数のドナー蛍光物質２−アクセプタ物質３対で標識した核酸プローブを用いることにより、検出感度の向上を図ることができる。これに対し、エンドヌクレアーゼを用いる従来の検出方法では、核酸プローブ−標的核酸複合体のうち一カ所しか切断されないので、先に示した核酸プローブを用いても検出感度を向上させることはできない。
なお、図２（ａ）−（ｃ）に示す核酸プローブは、本発明の標的核酸の検出方法に共通して用いることができる。
−第２の実施形態−
本発明の第２の実施形態に係る標的核酸の検出方法として、一本鎖の核酸に特異的で配列非依存的なヌクレアーゼを用いる方法を説明する。
本実施形態の標的核酸の検出方法では、第１の実施形態と同様に、蛍光エネルギー対を形成するドナー蛍光物質とアクセプタ物質で標識された核酸プローブを用いる。そして、核酸プローブは、標的核酸の配列の一部あるいは全部と相補的な配列を有する。以下、本実施形態の標的核酸の検出手順を説明する。
図３（ａ）−（ｃ）は、本発明の第２の実施形態に係る標的核酸の検出方法を示す図である。
まず、図３（ａ）に示すように、核酸プローブ１１を含む溶液（以下「プローブ溶液」と称する）を準備する。図示しないが、これと同時に試料溶液も準備しておく。この核酸プローブ１１は、基板等に固定されている必要はない。
次に、図３（ｂ）に示すように、反応槽４内でプローブ溶液と試料溶液を混合し、適当な条件下において十分なハイブリダイゼーション反応を行なう。本操作によって、試料中に標的核酸５が存在する場合、核酸プローブ１１と標的核酸５の相補部分とがハイブリダイズし、一部または全長が二本鎖の核酸プローブ−標的核酸複合体１２が形成される。本操作での条件は第１の実施形態と同じである。
次に、図３（ｃ）に示すように、反応液に一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ１３を加え、ハイブリダイズしていない一本鎖状態の核酸プローブ１１を含む一本鎖核酸を特異的に切断する。ここで用いられるヌクレアーゼ１３は、エンドヌクレアーゼであってもよいし、エキソヌクレアーゼであってもよい。例えば、一本鎖核酸に特異的なエンドヌクレアーゼであるＳ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、あるいは一本鎖核酸特異的エキソヌクレアーゼであって両方向から核酸を切断するエキソヌクレアーゼＶＩＩなどが用いられる。コスト面や酵素活性の問題等からこれらの酵素を用いるのが好ましいが、これら以外でも、一本鎖核酸に作用し、二本鎖核酸には作用しないヌクレアーゼであれば本方法に用いることができる。一本鎖特異的ヌクレアーゼの他の例としては、エキソヌクレアーゼである蛇毒ヌクレアーゼ（３’→５’）、脾臓ホスホジエステラーゼ（５’→３’）及びエキソヌクレアーゼＩ（３’→５’）や、エンドヌクレアーゼであるスタフィロコッカスヌクレアーゼ及びアカパンカビヌクレアーゼなどがある。ただし、３’から５’方向に核酸を切断するエキソヌクレアーゼは、核酸プローブ−標的核酸複合体６の３’側の突出末端も切断するため、これらの３’→５’エキソヌクレアーゼを用いる場合は、核酸プローブ５の標識部位が突出しないように設計する必要がある。
本操作では、ヌクレアーゼ１３で処理することによって、ハイブリダイズしていない核酸プローブ１１が切断され、ドナー蛍光物質２で標識された蛍光標識核酸断片１５、アクセプタ物質３で標識されたアクセプタ標識核酸断片１４、核酸断片１６が溶液中に遊離する。すると、ドナー蛍光物質２とアクセプタ物質３との距離が開くので、ドナー蛍光物質２の蛍光が観測されるようになる。
一方、核酸プローブ−標的核酸複合体１２のうち二本鎖の部分は切断されない。
このため、試料中に含まれる標的核酸５の濃度が大きくなるにつれ遊離状態のドナー蛍光物質２濃度が減少するので、ドナー蛍光物質２の蛍光強度を測定することで標的核酸５を定量的に検出することができるようになる。例えば、試料液と試料を加えないコントロール液とを用意して両者の蛍光強度を比較することで、どれだけの核酸プローブが標的核酸とのハイブリダイズ反応に寄与したのかを知ることができる。それによって、間接的に試料中の標的核酸を検出することが可能になる。この際に、既知濃度の標準核酸溶液を測定することで標的核酸濃度と蛍光強度の検量線をあらかじめ作成しておけば試料に含まれる標的核酸の定量が可能となる。なお、本実施形態の方法では、標的核酸５の濃度に対して反応液中の核酸プローブ１１の濃度が大きすぎると蛍光強度のバックグラウンドが高くなり過ぎるので、核酸プローブ１１の濃度は適度に調節しておく必要がある。
また、アクセプタ物質もまた蛍光物質である場合は、ドナー蛍光物質の蛍光を測定する代わりにアクセプタ物質の蛍光を測定しても標的核酸の定量的な検出が可能である。
本実施形態の標的核酸の検出方法によれば、マイクロアレイに比べて標的核酸を定量的に検出することができる。また、標的核酸の任意の部分に相補的な配列を核酸プローブの配列として選択できる上、ポリメラーゼ伸長反応が不要であるので、本実施形態の標的核酸の検出方法は、蛍光エネルギー移動を利用した従来の方法に比べ簡便性が高く、且つ反応時間の短縮も図られている。
また、核酸プローブの標識方法によって検出感度の向上を図ることができる。
以上の特徴から、本実施形態の方法は各種の遺伝子診断、疾患の検査、動植物などの種類の特定など、種々の用途に好ましく用いることができる。
−第１の具体例−
第１の具体例として、第１の実施形態で示した検出方法の具体的な一例を示す。
本具体例では、標的核酸として、２０塩基からなる一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１（配列番号１）を用いた。また、核酸プローブとして、一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１と相補的な配列からなり、且つその５’末端がＦＩＴＣで、５’末端から数えて４塩基目のグアニンがＴＲＩＴＣによってそれぞれ修飾された修飾一本鎖オリゴヌクレオチドＰ１（配列番号２）を用いた。
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まず、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に修飾一本鎖オリゴヌクレオチドＰ１を、最終濃度が５００ｐｍｏｌ／１００μＬとなるように溶解し、４つのガラス製キュベットに１００μＬずつ分注した。
次に、上記溶液中に一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１を溶解した。この際に、分注された４つの溶液のそれぞれが、相異なる濃度の一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１を含むように溶解する。すなわち、各溶液中に含まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１の最終濃度を、それぞれ１、１０、５０、１００ｐｍｏｌ／１００μＬとなるように溶解し、それぞれの溶液を試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤとした。その後、室温で４時間放置し、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションの後、試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれに１００Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ液を１０μＬずつ滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
その後、試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含むガラス製キュベットに波長が４９０ｎｍの励起光をそれぞれ照射し、５２０ｎｍにおける蛍光強度を測定して比較した。この結果を図４に示す。
図４は、本発明の第１の具体例において、試料Ｄの蛍光強度に対する試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの蛍光強度の割合を示す図である。ここでは、各試料の５２０ｎｍにおける蛍光強度値を試料Ｄの蛍光強度値に対する割合で示した。
図４に示すように、各試料が発する蛍光強度は試料Ａ＜試料Ｂ＜試料Ｃ＜試料Ｄとなり、観察された蛍光強度は各試料中の一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１の濃度にほぼ比例していた。
この結果から、本発明の第１の実施形態に係る方法は、標的核酸あるいは所望の核酸断片の定量的検出において有効であることが確認された。
−第２の具体例−
本具体例においては、第１の具体例と同様に試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを調整し、ハイブリダイゼーションを行った後、試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれに１００Ｕ／μＬのλエキソヌクレアーゼ液を１０μＬずつ滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
その後、試料液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを入れたガラス製キュベットのそれぞれに４９０ｎｍの励起光を照射し、５２０ｎｍにおける蛍光強度について比較した。その結果、第１の具体例と同様に、観測された蛍光強度は各試料中の一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１の濃度にほぼ比例していた。
−第３の具体例−
本具体例はとして、第２の実施形態で示した検出方法の具体的な一例を示す。
本具体例では、第１、第２の具体例と同じく、標的核酸として一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１を、また核酸プローブとして修飾一本鎖オリゴヌクレオチドＰ１を用いた。
まず、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に修飾一本鎖オリゴヌクレオチドＰ１を最終濃度５００ｐｍｏｌ／１００μＬとなるように溶解し、４つのガラス製キュベットに１００μＬずつ分注した。
次に、上記溶液中に一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１を溶解した。この際、４つのキュベットのそれぞれにおいて、一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１の最終濃度が互いに異なるようにした。すなわち、最終濃度が０、５０、１００、２００ｐｍｏｌ／１００μＬとなるように溶解し、それぞれの溶液を試料Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨとした。その後、室温で４時間放置することによりハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションの後、試料Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのそれぞれを、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理した。すなわち、１００Ｕ／μＬのＳ１ヌクレアーゼ液を１０μＬずつ各試料に加え、３７℃で３０分間反応させた。
その後、試料液Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのそれぞれに４９０ｎｍの励起光を照射し、５２０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。この結果を図５に示す。
図５は、本発明の第３の具体例において、試料Ｅの蛍光強度に対する試料Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨの蛍光強度の割合を示す図である。
同図に示すように、一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１を加えなかった試料Ｅの蛍光強度が最も大きく、試料に含まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１の濃度が高くなるにつれ、蛍光強度は小さくなった。
この結果から、本発明の第２の実施形態に係る方法は、標的核酸あるいは所望の核酸断片の定量的検出において有効であることが確認された。
−第４の具体例−
第３の具体例と同様に試料Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨを調整し、ハイブリダイゼーションを行った後、試料Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのそれぞれに１００Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼＶＩＩ液を１０μＬずつ加え、３７℃で３０分間反応させた。
その後、試料Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨを入れたガラス製キュベットのそれぞれに４９０ｎｍの励起光を照射し、５２０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。その結果、具体例３と同様に、試料に含まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＴ１の濃度が高くなるにつれ、蛍光強度が小さくなることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明の標的核酸の検出方法は、生物工学等の研究のための基礎技術として用いられる他、医学分野にあっては遺伝子診断や疾患の検査、農業分野にあっては動植物の品種の特定など、種々の用途に用いられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１（ａ）−（ｃ）は、本発明の第１の実施形態に係る標的核酸の検出方法を示す図である。
図２（ａ）−（ｃ）は、本発明の標的核酸の検出方法で用いられる核酸プローブを模式的に示す図である。
図３（ａ）−（ｃ）は、本発明の第２の実施形態に係る標的核酸の検出方法を示す図である。
図４は、第１の実施形態に係る標的核酸の検出方法において、試料Ｄの蛍光強度に対する試料Ａ−Ｄの蛍光強度の割合を示す図である。
図５は、第２の実施形態に係る標的核酸の検出方法において、試料Ｅの蛍光強度に対する試料Ｅ−Ｇの蛍光強度の割合を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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