(57)【要約】本発明は、摂食量のコントロールが良好な新規生活習慣病治療薬又は拒食症治療薬、並びにそのスクリーニング方法を提供する。詳細には、視床下部で発現するＧＰＣＲ、クローン９０１の発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬、該クローンの発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする拒食症治療薬、クローン９０１と各種Ｇ蛋白質の共発現系のシリーズからなるスクリーニング系、及び該スクリーニング系を用いることによる、生活習慣病又は拒食症に対して治療活性を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
2003030936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸：
（ａ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列からなる核酸もしくは転写後プロセッシングにより該塩基配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の視床下部の生理的条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で配列番号１記載の塩基配列にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸
を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項３】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的親和性を示し、該ポリペプチドの機能的発現を阻害する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項４】
該物質が核酸である請求項３記載の生活習慣病治療薬。
【請求項５】
該物質が抗体である請求項３記載の生活習慣病治療薬。
【請求項６】
請求項２又は４記載の核酸をコードする発現ベクターを有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項８】
摂食抑制剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤又は抗高脂血症剤である請求項１〜７のいずれかに記載の生活習慣病治療薬。
【請求項９】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする拒食症治療剤。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
を有効成分とする拒食症治療剤。
【請求項１１】
請求項１０記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを有効成分とする拒食症治療剤。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を有効成分とする拒食症治療剤。
【請求項１３】
生活習慣病又は拒食症に対する治療活性を有する物質のスクリーニング系であって、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
を含む脂質二重層膜、並びにあるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドを構成要素として含む系を１構成単位とし、該構成単位をＧ蛋白質αサブユニットの各ファミリーの受容体結合領域について有することを特徴とするスクリーニング系。
【請求項１４】
該構成単位が、該（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、あるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項１３記載のスクリーニング系。
【請求項１５】
該構成単位が、該（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのＣ末端側に、あるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項１３記載のスクリーニング系。
【請求項１６】
各構成単位の、Ｇ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドが、同一の効果器相互作用領域をさらに含み、且つ該脂質二重層膜が該領域と相互作用する効果器をさらに含むものである、請求項１３〜１５のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項１７】
生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項１３〜１６のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項１８】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のスクリーニング系の各構成単位において、被験物質の存在下及び非存在下で、標識したＧＴＰアナログを添加し、グアニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を両条件下で比較することを特徴とする、生活習慣病又は拒食症に対する治療活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１６記載のスクリーニング系の各構成単位における効果器の活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、生活習慣病又は拒食症に対する治療活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のスクリーニング系の各構成単位において、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対するリガンドの存在下又は非存在下で、標識したＧＴＰアナログを添加し、グアニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を各構成単位間で比較することを特徴とする、該ポリペプチドと共役し得るＧ蛋白質αサブユニットの同定方法。
【請求項２１】
請求項１６記載のスクリーニング系の各構成単位における効果器の活性を、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対するリガンドの存在下又は非存在下で比較することを特徴とする、該ポリペプチドと共役し得るＧ蛋白質αサブユニットの同定方法。
【請求項２２】
請求項１８又は１９記載の方法を、請求項２０または２１記載の方法により同定されたＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域を含むポリペプチドを構成要素として含む系についてのみ実施することを特徴とする、生活習慣病又は拒食症に対する治療活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
該Ｇ蛋白質αサブユニットがＧｓファミリーに属するものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
に対するリガンドのスクリーニング系であって、該ポリペプチドを含む脂質二重層膜、並びにＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドを構成要素として含むことを特徴とするスクリーニング系。
【請求項２５】
該（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、Ｇｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項２４記載のスクリーニング系。
【請求項２６】
該（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのＣ末端側に、Ｇｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項２４記載のスクリーニング系。
【請求項２７】
Ｇｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドが、任意の効果器相互作用領域をさらに含み、且つ該脂質二重層膜が該領域と相互作用する効果器をさらに含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項２８】
該効果器がアデニル酸シクラーゼである請求項２７記載のスクリーニング系。
【請求項２９】
生活習慣病又は拒食症に対する治療活性を有する物質を探索するための系である請求項２４〜２８のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項３０】
生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項２９記載のスクリーニング系。
【請求項３１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
に対するリガンドのスクリーニング方法であって、請求項２４〜２６のいずれかに記載のスクリーニング系において、被験物質の存在下及び非存在下で、標識したＧＴＰアナログを添加し、グアニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を両条件下で比較することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
に対するリガンドのスクリーニング方法であって、請求項２７記載のスクリーニング系における効果器の活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３３】
宿主真核細胞内のｃＡＭＰ量を被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、請求項３２記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
生活習慣病又は拒食症に対する治療活性を有する物質を探索するための系である請求項３１〜３３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項３５】
生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項１８、１９、２２、２３及び３４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
請求項１３〜１６、１８、１９、２２、２３、２９及び３４のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、生活習慣病に対する治療活性を有する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項３７】
請求項１３〜１６、１８、１９、２２、２３、２９及び３４のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、拒食症に対する治療活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、視床下部で発現するオーファンＧＰＣＲの発現又は機能を抑制する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬に関する。詳細には、本発明は、該ＧＰＣＲ  ｍＲＮＡのアンチセンス核酸、該核酸を含む発現ベクターもしくは該発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を有効成分とする生活習慣病治療薬、あるいは該ＧＰＣＲに対してアンタゴニスト活性を有する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬に関する。さらに、本発明は、該ＧＰＣＲ及びＧ蛋白質の共発現系及びそれを用いた生活習慣病治療活性化合物のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、該ＧＰＣＲの発現又は機能を増強する物質を有効成分とする拒食症治療剤に関する。詳細には、本発明は、該ＧＰＣＲに対してアゴニスト活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療剤に関する。さらに、本発明は、該ＧＰＣＲ及びＧ蛋白質の共発現系及びそれを用いた拒食症治療活性化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満とそれに付随する生活習慣病、特にＩＩ型糖尿病患者の増加が著しい。本症例の治療には、はじめに運動療法や食事療法が行われるが、本療法によっても体重コントロールが不十分な場合には薬物療法が行われる。この際、摂食量と体重、血糖コントロールが良好で、かつ安全な治療薬が望まれている。
一方、現代のストレス社会は、安易なダイエットの流行とも相まって、思春期の女性を中心に拒食症のような心因性の摂食障害の急増をもたらしている。これらの病気を根本的に治療するには、心理的な問題を解決することが不可欠であるが、サポート的な治療として摂食行動を強制的にコントロールするための薬物療法が施されることもある。この場合の治療薬も、体重や血糖値をコントロールしながら摂食を促進し得るものであることが要求される。
摂食のコントロールは主に中枢神経系で行われており、特に視床下部には、食欲等の人間の本能的な行動を支配する神経系が多く存在している。実際に、ラットの視床下部腹内側核を破壊すると過食と肥満をもたらし、一方、視床下部外側核を破壊すると摂食行動を行わなくなる。また、これまでに、摂食調節にかかわるレプチン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）等の神経ペプチドの受容体が視床下部に局在することが示されており、このことからも視床下部が摂食行動に重要な器官であることは明白である。
視床下部をはじめとする中枢神経系における生理活性物質の受容体、特にＧ蛋白質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）が、摂食行動と相関することが明らかとなっている。例えば、セロトニン５−ＴＨＴ２Ｃレセプターのノックアウト（ＫＯ）マウスは慢性的な過食をきたすことが知られている。また、メラノコルチン４レセプターのアンタゴニストは摂食を増加させ、逆に、ＮＰＹ  Ｙ５レセプターのアンタゴニストは摂食を抑制する。
従って、視床下部の神経系を刺激することは摂食行動等に影響を及ぼすものと考えられ、視床下部で発現するＧＰＣＲを介したシグナル伝達を、低分子化合物を用いて代替的に操作することは、摂食量と体重、血糖値等をコントロールするという上記の目的にかなうものである。しかし、このような作用機序を持つ薬剤は現在のところ上市されておらず、このような薬剤の開発が大いに望まれるところである。
従って、本発明の目的は、外的因子、特に摂食行動に関わるＧＰＣＲの発現もしくは機能を抑制あるいは促進する因子を作用させることによって、摂食行動を調節し、もって過食、肥満症を主因とする生活習慣病、あるいは拒食症を治療する手段を提供することである。また、本発明の別の目的は、過食もしくは拒食といった摂食障害、肥満症等の調節作用を有する化合物、並びにそのような化合物のスクリーニング方法を提供することである。
発明の開示
上記の目的を達成するために、本発明者らはまず、視床下部に発現する受容体をコードする遺伝子をデータベースより検索し、その結果、あるオーファンＧＰＣＲ（以下、クローン９０１という）を見出した。次に、本発明者らは、当該受容体をコードするｍＲＮＡのアンチセンスオリゴＤＮＡを実験動物に投与してその発現を阻害したところ、実際に摂食量が抑制された。このことから、クローン９０１は摂食行動を正に調節するシグナル伝達に関与する受容体であること、従って、この受容体の発現もしくは機能を阻害する物質は、過食、肥満等に由来するＩＩ型糖尿病をはじめとする生活習慣病に治療効果を発揮することが明らかとなった。また反対に、この受容体の発現もしくは機能を増強する物質は、拒食症のような摂食障害に対して治療効果を発揮するはずである。そこで、本発明者らは、クローン９０１と各種Ｇ蛋白質の共発現系のシリーズを構築し、それを用いてクローン９０１のアゴニスト又はアンタゴニストを探索することにより、生活習慣病又は拒食症に対して治療活性を有する化合物をスクリーニングする方法を開発して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、視床下部で発現するＧＰＣＲ、クローン９０１の発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。クローン９０１の発現を特異的に抑制し得る物質としては、好ましくはクローン９０１をコードするｍＲＮＡのアンチセンス核酸が挙げられる。この場合、アンチセンス核酸はそれ自体としてだけでなく、該核酸をコードする発現ベクターや、該発現ベクターを導入された宿主細胞の形態でも提供され得る。一方、クローン９０１の機能を特異的に抑制し得る物質としては、当該受容体のアンタゴニストが挙げられる。
本発明はまた、クローン９０１の発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする拒食症治療剤を提供する。クローン９０１の機能を特異的に増強し得る物質としては、当該受容体の生理的リガンドやアゴニストが挙げられる。
従って、別の本発明は、クローン９０１のアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングすることによる、生活習慣病又は拒食症に対して治療活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。当該方法は、クローン９０１又はその均等物を含む脂質二重層膜と、あるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニット（以下、Ｇαともいう）の受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドとを、必須の構成要素として少なくとも包含する系を１構成単位とし、該構成単位をＧαの各ファミリーの受容体結合領域について構築して得られる、一連の受容体−Ｇ蛋白質共発現系において、Ｇ蛋白質のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質が作用する効果器の活性を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする。
従って、本発明はまた、上記のような一連の受容体−Ｇ蛋白質共発現系からなる、生活習慣病又は拒食症に対して治療活性を有する物質のスクリーニング系を提供する。
本発明はさらに、上記スクリーニング系及びスクリーニング方法により得られる、生活習慣病又は拒食症に対して治療活性を有する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬又は拒食症治療剤を提供する。
本発明のさらなる特徴及び本発明の利点は、以下の「発明を実施するための最良の形態」の記載から明らかとあるであろう。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、視床下部で発現するＧＰＣＲ、クローン９０１の発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。一般に、「生活習慣病」は、食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症・進行に関与する疾患群として規定されるが、本発明においては、特に「摂食量を抑制方向に調節することにより治療効果がもたらされ得る疾患群」をいい、例えば、糖尿病、肥満症、高脂血症、高尿酸血症等が代表的なものとして含まれる。患者はこれらの疾患の２つ以上を併発している場合が多い。
「クローン９０１」は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるヒトＧＰＣＲ蛋白質の１つである。これまでに、胎児肝臓−脾臓（ＷＯ  ００／００５１５）や胎児小腸（ＷＯ  ００／１５７９３）由来のｃＤＮＡライブラリーからこの受容体をコードするｃＤＮＡが単離されているが、その生理的リガンドや共役するＧ蛋白質のファミリー等については不明のままであった。本発明者らは、この受容体遺伝子がヒト視床下部で高発現していることを独自に見出し、これに着目して研究を進めた結果、上述のように、この蛋白質が摂食中枢の刺激に関与する膜受容体であることを見出した。
ヒトクローン９０１に対応するＧＰＣＲが他の哺乳動物にも存在することは周知である［例えば、マウス由来の本受容体（ＧｅｎＢａｎｋに受託番号：ＮＭ＿０３０２５８として登録されている）はヒトクローン９０１とアミノ酸レベルで７４％の同一性を有する］。従って、本発明の生活習慣病治療薬は、ヒトのみならず他の哺乳動物における糖尿病、肥満症、高脂血症、高尿酸血症等の治療への使用をも意図している。近年のペットブームにより、過剰な給餌と運動不足の結果、肥満症等の生活習慣病様の疾患を発症する動物が増加していることから、本発明の治療薬は獣医学の分野においても極めて有用である。
本発明の生活習慣病治療薬は、クローン９０１の発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分として含有する。ここで「発現」とは、受容体蛋白質が産生され且つ機能的な状態で細胞膜上に配置されることをいう。従って、「発現を抑制する物質」は、遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル、膜への輸送レベル及び蛋白質フォールディングのレベル等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。一方、「機能を抑制する物質」とは、いったん機能的な状態で細胞膜上に配置された受容体に作用して、その活性型と不活性型との平衡状態を、少なくともより活性側にシフトさせない物質をいう。
クローン９０１の発現を抑制する物質としては、転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡ分解酵素、蛋白質合成阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤等が例示されるが、細胞内で発現する他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。従って、クローン９０１の発現を抑制する物質の好ましい一態様は、クローン９０１のｍＲＮＡ（配列番号１記載の塩基配列からなる）もしくは初期転写産物のアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
本発明のアンチセンス核酸の長さは、クローン９０１のｍＲＮＡもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。アンチセンス核酸が約２５ｍｅｒのオリゴＤＮＡの場合、生理条件下でクローン９０１のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、通常、約８０％以上の同一性を有するものであればよい。
本発明のアンチセンス核酸の標的配列は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、クローン９０１蛋白質もしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、クローン９０１のｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はクローン９０１のｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端まで（配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号１〜１１５２で示される領域）に位置することが望ましい。好ましくは５’末端からコード領域のＮ末端側の領域であり、最も好ましくは開始コドン（塩基番号１５４）近傍の塩基配列である。また、標的配列は、それに相補的なアンチセンス核酸がヘアピン構造等の二次構造を形成しないようなものを選択することが好ましい。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、クローン９０１のｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるクローン９０１遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
クローン９０１の発現を抑制する物質の別の好ましい一態様は、クローン９０１のｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域（配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号１５４〜１１５２で示される塩基配列）の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムである。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。クローン９０１のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
クローン９０１の発現を抑制する物質のさらに別の一態様は、クローン９０１のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡである。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として注目されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、クローン９０１のｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有する二本鎖オリゴＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
クローン９０１の機能的な発現を翻訳後レベルで抑制する物質の好ましい一態様は、クローン９０１に対する抗体もしくはそのフラグメントである。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。抗クローン９０１抗体のフラグメントは、クローン９０１に対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるものであってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。
例えば、ポリクローナル抗体は、クローン９０１蛋白質あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第２−１４頁、サンエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１（２）：２２３−２２８（１９８５）］でも電圧パルス法［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７（６）：６２７−６３３（１９８８）］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗クローン９０１抗体は、ヒトと他の動物（例えば、マウス等）のキメラ抗体であることが好ましく、ヒト化抗体であることがさらに好ましい。ここで「キメラ抗体」とは免疫動物由来の可変部（Ｖ領域）とヒト由来の定常部（Ｃ領域）を有する抗体をいい、「ヒト化抗体」とはＣＤＲを除いて他の領域をすべてヒト抗体に置き換えた抗体をいう。キメラ抗体やヒト化抗体は、例えば、上記と同様の方法により作製したマウスモノクローナル抗体の遺伝子からＶ領域もしくはＣＤＲをコードする配列を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体のＣ領域をコードするＤＮＡと融合したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、これを適当な宿主細胞に導入して該キメラ遺伝子を発現させることにより取得することができる。
クローン９０１の機能的な発現を翻訳後レベルで抑制する物質の別の好ましい態様は、クローン９０１に特異的に結合してその機能的発現を阻害するオリゴヌクレオチド、即ちアプタマーである。クローン９０１に対するアプタマーは、例えば、以下の手順により取得することができる。即ち、まず、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いてランダムにオリゴヌクレオチド（例えば、約６０塩基）を合成し、オリゴヌクレオチドのプールを作製する。次に、目的の蛋白質、即ちクローン９０１と結合するオリゴヌクレオチドをアフィニティーカラムで分離する。分離したオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅し、前述の選抜プロセスで再度選抜する。この過程を約５回以上繰り返すことによって、クローン９０１に親和性の強いアプタマーを選抜することができる。
クローン９０１の発現を抑制する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬は、標的組織（即ち、視床下部）の細胞内に取り込まれて初めてその治療活性を発揮し得るが、有効成分である核酸や蛋白質分子は細胞内に吸収されにくく、しかも体内で速やかに分解されやすい。また、通常これらの分子の取り込みはエンドサイトーシスにより行われるので、リソソーム酵素による分解を受けやすい。従って、クローン９０１の発現を抑制する物質を、視床下部の細胞に安定な状態で送達し、細胞膜の透過性を向上させ、リソソーム／エンドソームからの薬剤の遊離を促進するようなドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の設計が重要である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のオリゴ核酸分子の場合、上述のようにリン酸結合や糖部分（２’位、３’位等）を修飾した核酸の他、リン酸と糖部分をペプチド結合に置き換えたＰＮＡ、リン酸骨格の代わりにモルフィン骨格を有するオリゴヌクレオチド等、化学修飾により、ヌクレアーゼに対する安定性、細胞内移行、リソソーム／エンドソームからの遊離を改善させることが可能であり、これらの修飾オリゴ核酸はＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて容易に調製することができる。
一方、ポリＬ−リジン、アビジン、コレステロール又はリン脂質成分等の付属基をオリゴヌクレオチドや抗体分子に結合させることによって、細胞膜透過性を向上させることもできる。
さらに、オリゴヌクレオチドや抗体分子をカチオン性リポソームに被包して製剤化することもできる。リポソーム中に被包することにより、有効成分はヌクレアーゼやプロテアーゼによる分解から保護され、且つリポソーム膜のカチオン性表面は細胞表面の陰性荷電分子と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。カチオン性リポソームは、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ等のカチオン性脂質と、膜融合能を持つ中性脂質ＤＯＰＥを混合して調製することができる。核酸や蛋白質はポリアニオン性であるので、カチオン性リポソームと混合することにより容易に複合体を形成する。また、リポソーム膜に視床下部の細胞で特異的に発現する細胞表面分子に対する抗体もしくはリガンドを組み込むことにより、細胞特異的なターゲッティングを行うこともできる。例えば抗クローン９０１抗体自体をリポソーム膜に組み込むこともできる。
また、エンドサイトーシスにより取り込まれたリポソームをリソソーム酵素による分解から保護するために、ｐＨ感受性リポソーム（酸性ｐＨで膜が不安定化し、リソソームと融合する前にエンドソーム小胞から細胞質に内容物が遊離される）や、紫外線照射等によりウイルスＲＮＡを完全に断片化したセンダイウイルスとの融合リポソーム（センダイウイルスの膜融合能を用いてエンドサイトーシス経路を回避する）を使用することも好ましい。
上記のような剤形に設計された本発明の生活習慣病治療薬は、適当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、経口的又は非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは視床下部付近への局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、側脳室内への局所投与が挙げられる。
本発明の生活習慣病治療薬の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００８〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約０．０２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを１回もしくは数回に分けて投与することができる。
クローン９０１の発現を抑制する物質が、アンチセンス核酸、リボザイム又はアプタマーのような核酸分子（以下、有効核酸分子ともいう）である場合、本発明の生活習慣病治療薬は、該有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の有効核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の視床下部細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されているか、あるいは投与された動物の視床下部細胞内で、一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の視床下部細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。「一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置される」とは、例えば、以下でさらに詳述するように、プロモーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドが、該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有し、該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼの存在下に該スペーサー配列が切り出されて、有効核酸分子をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されるように配置されることをいう。
本発明の発現ベクターは、好ましくは有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。発現ベクターが上述のようにリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスペーサー配列を有する場合、該選択マーカー遺伝子は当該スペーサー配列内に配置することもできる。
本発明の発現ベクターに使用されるベクターは特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
アンチセンス核酸やリボザイム等の有効核酸分子は本来異物であり、これらの構成的且つ過剰な発現は、当該遺伝子を導入された宿主動物にとって毒性が強く、副作用を引き起こす場合も考えられる。従って、本発明の好ましい態様においては、発現ベクターは、不要な時期及び／又は不要な部位での有効核酸分子の過剰発現による悪影響を防ぐために、有効核酸分子を時期特異的及び／又は視床下部細胞特異的に発現させることができる。このようなベクターの第一の実施態様としては、投与対象となる動物の視床下部細胞において特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。例えば、クローン９０１遺伝子のネイティヴなプロモーター等が挙げられる。
本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターの第二の実施態様として、外因性の物質によってトランスに発現が制御される誘導プロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。誘導プロモーターとして、例えば、メタロチオネイン−１遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に視床下部に局所投与することにより、任意の時期に視床下部特異的に有効核酸分子の発現を誘導することができる。
本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターの別の好ましい態様は、プロモーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドとが、該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有するベクターである。該ベクターが視床下部の細胞内に導入されただけではプロモーターは有効核酸分子の転写を指示することができない。しかしながら、所望の時期に視床下部に該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼを局所投与するか、あるいは該リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを局所投与して該リコンビナーゼを視床下部の細胞内で発現させると、該認識配列間で該リコンビナーゼを介した相同組換えが起こり、その結果、該スペーサー配列が切り出され、有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されて、所望の時期に視床下部特異的に有効核酸分子が発現される。
上記ベクターに使用されるリコンビナーゼ認識配列は、投与対象に内在のリコンビナーゼによる組換えを防ぐために、内在のリコンビナーゼによっては認識されない異種リコンビナーゼ認識配列であることが望ましい。したがって、該ベクターにトランスに作用するリコンビナーゼもまた異種リコンビナーゼであることが望ましい。このような異種リコンビナーゼと該リコンビナーゼ認識配列の組み合わせとしては、大腸菌のバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘ  Ｐ配列、あるいは酵母由来のＦｌｐリコンビナーゼとｆｒｔ配列が好ましく例示されるが、それらに限定されるものではない。
Ｃｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージで発見されたが、特異的なＤＮＡ組換え反応は、原核細胞だけでなく真核細胞である動物細胞や動物ウイルスでも機能することが知られている。同一ＤＮＡ分子上に同方向の２つのｌｏｘ  Ｐ配列が存在する場合は、Ｃｒｅリコンビナーゼはその間に挟まれたＤＮＡ配列を切り出して環状分子を形成させる（切り出し反応）。一方、異なるＤＮＡ分子上に２つのｌｏｘ  Ｐ配列が存在し、その一方が環状ＤＮＡである場合は、ｌｏｘ  Ｐ配列を介して環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ分子上に挿入される（挿入反応）［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６（１９８１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：１５０９−１５１４（１９８４）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１０２６−１０２９（１９８４）］。切り出し反応の例は、動物培養細胞［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：１４７−１６１（１９８９）；Ｇｅｎｅ，１８１：２０７−２１２（１９９６）］、動物ウイルス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５１６６−５１７０（１９８８）；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：４６００−４６０６（１９９５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：３８１６−３８２１（１９９５）］、トランスジェニックマウス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６２３２−６２３６（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６８６１−６８６５（１９９２）；Ｃｅｌｌ，７３：１１５５−１１６４（１９９３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１０３−１０６（１９９４）］等で報告されている。
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用した本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターのプロモーターとしては、所望の時期及び部位での発現を確実にするために、好ましくはウイルス由来プロモーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターが使用される。
有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とする本発明の生活習慣病治療薬の投与は、治療対象動物自身の神経細胞を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うｉｎ  ｖｉｖｏ法のいずれかで行われる。ｅｘ  ｖｉｖｏ法の場合、標的細胞へのベクターの導入は、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等により行うことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法の場合、ウイルスベクターは、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等に投与される。あるいは、静脈内注射などによりベクターを投与すると、ウイルスベクターに対する中和抗体の産生が問題となるが、標的細胞の存在する視床下部付近、例えば側脳室内に局所的にベクターを注入すれば（ｉｎ  ｓｉｔｕ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。
また、有効核酸分子をコードする発現ベクターとして非ウイルスベクターを使用する場合、該発現ベクターの導入は、有効核酸分子自体を有効成分とする治療薬の剤形について上記したように、ポリＬ−リジン−核酸複合体などの高分子キャリアーを用いるか、リポソームに被包して行うことができる。あるいは、パーティクルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用したベクターの使用において、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ自体を局所投与する場合、例えば、リコンビナーゼを適当な無菌のビヒクル（例えば、人工の脳髄液等）に溶解または懸濁して視床下部に注入すればよい。一方、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ発現ベクターを視床下部に局所投与する場合、該リコンビナーゼ発現ベクターは、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドが、投与対象の視床下部細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結した発現カセットを有するものであれば特に制限されない。使用されるプロモーターが構成プロモーターである場合、不要な時期におけるリコンビナーゼの発現を防ぐために、視床下部に投与されるベクターは、例えばアデノウイルスのように、宿主細胞の染色体への組込みが稀なものであることが望ましい。しかしながら、アデノウイルスベクターを使用した場合、リコンビナーゼの一過的発現はせいぜい４週間程度しか持続しないので、治療が長期に及ぶ場合には第二、第三の投与が必要になる。リコンビナーゼを所望の時期に発現させる別のアプローチとして、メタロチオネイン遺伝子プロモーターのような誘導プロモーターの使用が挙げられる。この場合、レトロウイルス等のインテグレーション効率の高いウイルスベクターの使用が可能となる。
クローン９０１の発現を抑制する物質が、アンチセンス核酸、リボザイム又はアプタマーのような核酸分子である場合、本発明の生活習慣病治療薬は、上記のような有効核酸分子をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を有効成分とすることもできる。使用される宿主細胞としては、上記のような発現ベクターのｅｘ  ｖｉｖｏ導入法において、投与対象から標的細胞として取り出される自己細胞、または同種異系（例えば、ヒトの場合、死産の胎児や脳死患者等）もしくは異種（ヒトの場合、ブタやサル等の他の哺乳動物）の個体から取り出した神経細胞、あるいはそれらの神経幹細胞やＥＳ細胞を培養・分化させて得られる神経細胞などが例示される。中枢神経系は拒絶反応の最も起こりにくい器官・組織であるので、少量の免疫抑制剤の併用により異種細胞であっても生着させることが可能である。
また、別の態様においては、投与対象となる動物の鼻腔、咽頭、口腔、腸管等に常在する細菌等を宿主細胞として、常法によりこれを有効核酸分子をコードする発現ベクターで形質転換し、得られる形質転換体を宿主細胞が通常存在する投与対象内の部位に送達することもできる。最近、薬物を脳に移行させる際、血液脳関門以外の経路として鼻から脳脊髄液に直接移行させる経路が検討されており、鼻腔常在菌の使用はこの目的に適うものである。
有効核酸分子をコードする発現ベクター又は該発現ベクターを担持する宿主細胞を有効成分とする本発明の生活習慣病治療薬の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、プロモーター活性、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、有効核酸分子自体を有効成分とする治療薬を投与する場合の適切な投与量に相当する量の有効核酸分子を、ベクターもしくは宿主細胞を投与された動物の体内で発現させる程度であることが好ましく、例えば、成人１日あたりベクター量として約２〜約２０μｇ／ｋｇ、好ましくは約５〜約１０μｇ／ｋｇである。
クローン９０１は、摂食量を正に調節するシグナル伝達を仲介する膜受容体蛋白質であることから、この受容体の発現を増強することにより、摂食行動を惹起することができる。従って、本発明はまた、クローン９０１の発現を増強する物質を有効成分とする拒食症治療剤を提供する。
クローン９０１の発現を増強する物質としては、例えば、クローン９０１遺伝子からのＲＮＡ転写を促進し得るトランス活性化因子、スプライシングやｍＲＮＡの細胞質移行を促進し得る因子、ｍＲＮＡの分解を抑制する因子、リボソームのｍＲＮＡへの結合を促進し得る因子、クローン９０１蛋白質の分解を抑制する因子、クローン９０１蛋白質の膜への輸送を促進する因子等が挙げられるが、より直接的且つ特異的な物質として、クローン９０１蛋白質もしくはその均等物、クローン９０１をコードする核酸を含む発現ベクター又は該発現ベクターを担持する宿主細胞が好ましく例示される。
ここで「クローン９０１蛋白質」は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなる蛋白質であり、「その均等物」とは、配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは２以上（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、いっそう好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、配列番号２記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧαと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをいう。
クローン９０１蛋白質又はその均等物は、例えばヒト、あるいはウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の他の哺乳動物の視床下部組織由来の膜含有画分から、抗クローン９０１抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該組織由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、クローン９０１のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗クローン９０１抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、当該均等物は、クローン９０１のｃＤＮＡ配列（配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号１５４〜１１５２で示される塩基配列）を基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はクローン９０１の受容体特性を変化させない範囲で、クローン９０１蛋白質に適宜変異を導入することができる。しかしながら、リガンド結合ドメイン、好ましくはさらにインバースアゴニストが結合し得る細胞外ループ及びＮ末端鎖は高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。また、ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を保持するため、細胞内第３ループ上に存在するＧα活性化ドメインも高度に保存されることが好ましい。
クローン９０１蛋白質又はその均等物を有効成分とする拒食症治療剤は、抗クローン９０１抗体を有効成分とする生活習慣病治療薬に関して上記したように、ポリＬ−リジン、アビジン、コレステロール又はリン脂質成分等の付属基を結合させることによって、細胞膜透過性を向上させることができる。あるいは、本治療剤は、クローン９０１蛋白質又はその均等物をカチオン性リポソームに被包して製剤化することもできる。蛋白質はポリアニオン性であるので、カチオン性リポソームと混合することにより容易に複合体を形成する。また、リポソーム膜に視床下部の細胞で特異的に発現する細胞表面分子に対する抗体もしくはリガンドを組み込むことにより、細胞特異的なターゲッティングを行うこともできる。例えば、抗クローン９０１抗体（好ましくは、アンタゴニスト活性又はインバースアゴニスト活性を有しない抗体）をリポソーム膜に組み込むこともできる。
クローン９０１蛋白質又はその均等物を有効成分とする拒食症治療剤は、適当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、経口的又は非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは視床下部付近への局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、側脳室内への局所投与が挙げられる。
本拒食症治療剤の投与量は、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００８〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約０．０２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを１回もしくは数回に分けて投与することができる。
クローン９０１の発現を増強する物質が、クローン９０１蛋白質又はその均等物である場合、本発明の拒食症治療剤は、それらのポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターであってもよいし、また、該発現ベクターを担持する宿主細胞であってもよい。ここで使用される発現ベクターや宿主細胞は、上記の生活習慣病治療薬の場合と同様のものであってよい。さらに、これらの拒食症治療剤の投与経路及び投与量についても、上記の生活習慣病治療薬のそれぞれに関して例示したものを、同様に好ましく使用することができる。
本発明はまた、視床下部細胞の細胞膜上に発現したクローン９０１の機能を抑制する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬、あるいは該機能を促進する物質を有効成分とする拒食症治療剤を提供する。これらの治療薬は、クローン９０１に対してアゴニスト活性、アンタゴニスト活性又はインバースアゴニスト活性を有する物質をスクリーニングすることによって得ることができる。従って、本発明はまた、クローン９０１の機能を抑制もしくは促進する物質のスクリーニング方法と、そのためのスクリーニング系を同時に提供する。
ここで「アゴニスト活性」とは、クローン９０１受容体に特異的に結合し、クローン９０１の活性型と不活性型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいう。従って、アゴニスト活性を有する物質には、いわゆるフルアゴニストや部分アゴニストの他、クローン９０１の生理的リガンドも包含される。「アンタゴニスト活性」とは、クローン９０１のリガンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない性質をいう。従って、アンタゴニスト活性を有する物質とは、いわゆるニュートラルアンタゴニストをいい、インバースアゴニストは含まないものとする。「インバースアゴニスト活性」とは、クローン９０１の任意の部位に結合して、クローン９０１の活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。尚、本明細書において、以下、単に「リガンド」という場合は、生理的リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストをすべて包含するものとする。
本発明のスクリーニング系は、クローン９０１蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜、並びにあるファミリーに属するＧαの受容体結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドを、必須の構成要素として含む系を１構成単位とし、該構成単位をＧαの各ファミリー（即ち、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ）の受容体結合領域について構築して得られる、一連の受容体−Ｇ蛋白質共発現系である。クローン９０１蛋白質又はその均等物は、上記の拒食症治療剤の有効成分として上記した通りのものである。クローン９０１蛋白質又はその均等物を保持する脂質二重層膜の由来は、該受容体蛋白質が該膜上で本来の立体構造をとることができる限り特に制限されないが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞膜画分が挙げられる。しかしながら、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞の細胞膜における存在比に近い比率で混合した溶液から常法により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実施態様において好ましく使用され得る。
Ｇｓファミリーに属するＧα（Ｇαｓ）は、アデニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、Ｇαｓ−１〜Ｇαｓ−４、あるいはＧｏｌｆ等が挙げられる。Ｇｉファミリーに属するＧα（Ｇαｉ）は、アデニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を抑制するものであり、例えば、Ｇαｉ−１〜Ｇαｉ−３、あるいはＧｚ等が挙げられる。Ｇｑファミリーに属するＧα（Ｇαｑ）は、ホスホリパーゼＣを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、ＧαｑあるいはＧ１６等が挙げられる。本スクリーニング系のＧαｓポリペプチド、Ｇαｉポリペプチド及びＧαｑポリペプチドはそれぞれ、自身のＧＰＣＲとの結合に関与する領域（ＲＢ領域）と任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域（ＧＢ領域）を有する限り、それらの一部を欠いていてもよい。ＧαのＸ線結晶構造解析の結果から、ＲＢ領域はＣ末端近傍にあり、一方、ＧＢ領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ’ボックス、Ｇボックス、Ｇ”ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内のαＥヘリックスの先頭及びαＦヘリックスなど）であることが明らかになっている。クローン９０１に対する生理的リガンド又はアゴニストが該受容体に結合すると、該受容体のＧα活性化ドメインと該受容体に共役するＧαのＲＢ領域とが相互作用してＧαのコンフォメーション変化を生じ、ＧＢ領域からＧＤＰが解離して速やかにＧＴＰを結合する。Ｇα−ＧＴＰは効果器に作用してその活性を促進又は抑制する。一方、インバースアゴニストが結合すると、受容体のコンフォメーション変化によりＧα活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型のＧα−ＧＴＰレベルが減少し、効果器への作用が阻害される。ここで、ＧＴＰの代わりに、例えば、３５Ｓ標識したＧＴＰγＳ等のＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加しておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価することができ、クローン９０１に対するリガンド活性を有する物質をスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。一方、放射活性が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。
いったんクローン９０１に対するリガンドがスクリーニングされれば、該受容体と共役するＧαのファミリーが明らかになるので、以後のスクリーニングは、当該ファミリーに属するＧαポリプチペプチドを構成要素として含む系のみを用いて行うことができる。後述の受容体−Ｇα融合蛋白質発現系によるクローン９０１の恒常的活性化の結果から、クローン９０１と共役し得るＧ蛋白質αサブユニットはＧαｓであることが強く示唆される。したがって、本発明はまた、クローン９０１と共役し得るＧ蛋白質αサブユニット（好ましくは、Ｇαｓ）と該受容体との共発現系において、該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇαと相互作用する効果器の活性を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする、該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
クローン９０１に対するリガンドの活性は、Ｇαポリペプチドの効果器への作用を指標として測定することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、クローン９０１蛋白質又はその均等物に加えて、さらに効果器を含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要がある。また、Ｇαポリペプチドは該効果器と相互作用するための領域をさらに含む必要がある。各ファミリーに属するＧαは効果器の種類又は作用の方向が異なるので、それぞれが自身の効果器相互作用領域を有するよりも、共通の効果器相互作用領域をすべてのＧαポリペプチドが有することがより好ましい。従って、本スクリーニング系において、少なくとも２種のＧαポリペプチドは他のファミリーに属するＧαの効果器相互作用領域を含むキメラポリペプチドである。例えば、効果器としてホスホリパーゼＣを用いる場合、Ｇαｑポリペプチドはネイティブなものであってよいが、Ｇαｓポリペプチド及びＧαｉポリペプチドは効果器相互作用領域がＧαｑのもので置換されたキメラポリペプチドであることが必要である。別のファミリーに属するＧαの効果器相互作用領域を含むキメラポリペプチドの最も簡便な例としては、別のファミリーに属するＧαのＣ末端の約５アミノ酸程度（即ち、ＲＢ領域）を、自身のＣ末端配列で置換したものが挙げられる。
本スクリーニング系において、３種のＧαポリペプチドがＧαｓ又はＧαｉの効果器相互作用領域を含む場合、効果器としてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられる。一方、Ｇαポリペプチドが、Ｇαｑの効果器相互作用領域を含む場合は、効果器としてホスホリパーゼＣを含む脂質二重層膜を用いる必要がある。
効果器としてアデニル酸シクラーゼ（以下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系においては、Ｇαポリペプチドの効果器への作用は、ＡＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、ＡＣを含む膜画分にＧＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（例えば、３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ＡＣを含む膜に［α−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成する［３２Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法が挙げられるが、これに限定されない。ＧαポリペプチドがＧαｓの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。反対にＡＣ活性が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。一方、ＧαポリペプチドがＧαｉの効果器相互作用領域を含む場合は、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対にＡＣ活性が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、ＧαポリペプチドのＡＣへの作用は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定することによっても評価することができる。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッセイ等を実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。
別の態様として、ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＣＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内ｃＡＭＰ量を評価するというものである。
従って、ＧαポリペプチドがＧαｓの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。反対にｃＡＭＰ量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。一方、ＧαポリペプチドがＧαｉの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対にｃＡＭＰ量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。
一方、効果器としてホスホリパーゼＣ（以下、ＰＬＣともいう）を含むスクリーニング系（即ち、ＧαポリペプチドがＧαｑの効果器相互作用領域を含む場合）においては、Ｇαポリペプチドの効果器への作用は、ＰＬＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＰＬＣ活性は、例えば、３Ｈ標識したホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸をＰＬＣ含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下でＰＬＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＰＬＣ活性が増加すれば、該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。反対にＰＬＣ活性が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、ＧαポリペプチドのＰＬＣへの作用は、細胞に［３Ｈ］イノシトールを添加し、生成した［３Ｈ］イノシトールリン酸の放射活性を測定したり、細胞内のＣａ２＋量を測定することによっても評価することができる。細胞内Ｃａ２＋量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏｒ−３、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）システムが挙げられる。
別の態様として、Ｃａ２＋によりアップレギュレートされるＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、Ｃａ２＋量を評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＴＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ２＋量を評価するというものである。
従って、被験物質の存在下で細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。反対に細胞内Ｃａ２＋量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。
本発明のスクリーニング法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
本発明のスクリーニング系の１構成単位である、クローン９０１蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜及びＧαポリペプチドを必須構成要素として含有する系の好ましい一実施態様は、クローン９０１蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、あるファミリーに属するＧαのＲＢ領域及び任意のＧαのＧＢ領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
「クローン９０１蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ」は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは該アミノ酸配列において、１もしくは２以上（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、いっそう好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、クローン９０１と同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧαと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限はない。クローン９０１ｃＤＮＡのコード領域（配列番号１に記載される塩基配列中、塩基番号１５４〜１１５２で示される塩基配列）の他、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来のクローン９０１に対応するＧＰＣＲをコードするＤＮＡ等が例示され、これらは、哺乳動物の視床下部を含む脳神経組織由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、クローン９０１のｃＤＮＡをプローブとして単離され得る。また、当該均等物は、クローン９０１のｃＤＮＡを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。
３種のＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、少なくとも各ファミリーのＧαのＲＢ領域をコードする配列と、任意のＧαのＧＢ領域をコードする配列とを有する限り、Ｇαの全コード配列の一部を欠いていてもよい。各種Ｇα遺伝子の配列は公知であり、また、上述の通り、ＧαのＸ線結晶構造解析の結果から、ＲＢ領域及びＧＢ領域はよく知られている。従って、当業者は、所望によりＧαのコード配列の一部を欠失したフラグメントを容易に構築することができる。
Ｇαポリペプチドの効果器への作用を指標とするスクリーニング系においては、ＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、効果器相互作用領域をコードする核酸配列をさらに含む必要がある。上述のように、３種のＧαポリペプチドは共通の効果器相互作用領域を有するので、少なくとも２種のＧαポリペプチドは別のファミリーの効果器相互作用領域を有するキメラである。当該キメラポリペプチドをコードするＤＮＡの最も簡便な例としては、目的の効果器相互作用領域を有するＧαのｃＤＮＡのＣ末端の約５アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲ等の公知の手法を用いて、他のファミリーのＧαのＣ末端配列をコードするＤＮＡ配列に置換したものが挙げられる。
クローン９０１蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ、及びＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、宿主真核細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、真核細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター、バキュロウイルス由来ポリヘドリンプロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の真核生物由来の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ましい。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有していてもよい。
本発明のスクリーニング系に使用されるベクターとしては、プラスミドベクターや、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、あるいは昆虫細胞での使用に好適なバキュロウイルスベクター等が挙げられる。
クローン９０１蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡと、ＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、２つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主細胞に共トランスフェクトされてもよいし、あるいは、１つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されてもよい。
宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞であれば特に制限はない。具体的には、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＴ２等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｒｏ等のサル由来細胞、ＨｅＬａ、２９３等のヒト由来細胞及びＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ等の昆虫由来細胞などが例示される。
宿主細胞への遺伝子導入は、真核細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、約５〜約２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｇｒａｃｅ’ｓ昆虫細胞培養用培地等を用いて培養することができる。培地のｐＨは約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、通常約２７〜約４０℃である。
上記のようにして得られる、クローン９０１蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ及びＧαポリペプチドをコードするＤＮＡを導入された真核細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例えば、約１０，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収する）単離される膜画分の形態であってもよい。
例えば、ＧＴＰγＳ結合アッセイや、効果器の活性を直接測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはｃＡＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＣａ２＋応答性リポーターの発現量）を測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核細胞である。
尚、リガンド活性の評価を、ｃＡＭＰ応答性リポーター（効果器がアデニル酸シクラーゼの場合）もしくはＣａ２＋応答性リポーター（効果器がホスホリパーゼＣの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿主真核細胞は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）またはＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター領域の下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが機能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入されたものである必要がある。ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＧＴＣＡを含む配列が挙げられるが、ｃＡＭＰ応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。一方、ＴＲＥはＣａ２＋の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＴＣＡを含む配列が挙げられるが、Ｃａ２＋応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。ＣＲＥ又はＴＲＥを含むプロモーター配列としては、上記のようなウイルスプロモーターや真核動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列の下流にＣＲＥまたはＴＲＥ配列を挿入することができる。ＣＲＥ又はＴＲＥの制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列が配置されることがより好ましい。このようなＣＲＥ（又はＴＲＥ）−リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用することができる。
本発明のスクリーニング系の１構成単位である、クローン９０１蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜及びＧαポリペプチドを必須構成要素として含有する系の別の好ましい実施態様は、クローン９０１蛋白質又はその均等物のＣ末端側に、あるファミリーに属するＧαのＲＢ領域及び任意のＧαのＧＢ領域を少なくとも含むポリペプチドが連結した融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
クローン９０１蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ、並びに各ファミリーのＧαのＲＢ結合領域及び任意のＧαのＧＢ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、上述のようにして取得することができる。当業者は、これらのＤＮＡ配列をもとにして、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、クローン９０１とＧαポリペプチドとの融合蛋白質をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。例えば、ＰＣＲ等を用いてクローン９０１をコードするＤＮＡの終止コドンを除去したものに、ＧαポリペプチドをコードするＤＮＡを読み枠が合うように、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする等の方法が挙げられる。
得られた融合蛋白質をコードするＤＮＡは、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主真核細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。得られた真核細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現すると、クローン９０１とＧαが相互作用し得る場合には、該受容体の細胞内第３ループ上のＧα活性化ドメインとＧαのＲＢ領域とは、該受容体に対する生理的リガンドの非存在下に相互作用して、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進し得る。即ち、Ｇαは恒常的に活性化された状態となる。一方、クローン９０１と相互作用しないＧαとの融合蛋白質ではクローン９０１は活性化されず、Ｇα−ＧＴＰレベルは増大しない。ここで、ＧＴＰの代わりに、例えば、３５Ｓ標識したＧＴＰγＳ等のＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加しておけば、３種の融合蛋白質をそれぞれ含む膜系において、膜に結合した放射活性を測定し、相互に比較することによって、クローン９０１の活性化の有無を評価することができ、該受容体と相互作用し得るＧαを同定することができる。
いったんクローン９０１と相互作用し得るＧαが同定されれば、以後のスクリーニングは、クローン９０１と当該Ｇαとを含む膜系、好ましくはクローン９０１と当該Ｇαとの融合蛋白質を含む膜系のみを用いて行うことができる。すなわち、上記の共役Ｇαの同定に用いたのと同様に、ＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加し、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価することができ、ＧＰＣＲに対するリガンド活性を有する物質をスクリーニングすることができる。被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質はクローン９０１に対するアゴニスト活性を有し、放射活性が減少すれば、該被験物質はクローン９０１に対するインバースアゴニスト活性を有する。融合蛋白質による受容体の活性化は部分的であるので、クローン９０１に対する生理的リガンド又はアゴニストが結合すると、該受容体の活性型−不活性型の平衡状態はさらに活性状態側にシフトし、Ｇα−ＧＴＰレベルはさらに増大するので、本スクリーニング系はアゴニストのスクリーニングも可能である。
後記実施例に示される通り、クローン９０１はＧαｓとの融合蛋白質として発現させた場合にのみ恒常的に活性化されることから、該受容体と共役するＧαはＧαｓであることが強く示唆される。したがって、本発明はまた、Ｇαｓと該受容体との融合蛋白質発現系において、ＧαｓのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする、該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
融合蛋白質におけるクローン９０１の活性化は、Ｇαの効果器への作用を指標として評価することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、各融合蛋白質に加えて、各Ｇαが相互作用する効果器をさらに含む脂質二重層を包含する膜系である必要がある。すなわち、Ｇαｑとの融合蛋白質を含む膜系はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）をさらに含有し、ＧαｉおよびＧαｓとの融合蛋白質を含む膜系はアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）をさらに含有する。この場合、クローン９０１の活性化の有無は、各Ｇαについて、クローン９０１とＧαとを別個に（即ち、融合蛋白質としてではなく）含有する膜系を調製し、それぞれについて効果器の活性を測定・比較することにより評価することもできる（即ち、クローン９０１と相互作用し得るＧαとの融合蛋白質を含む膜系では、両者を非融合蛋白質として含む膜系よりも効果器の活性が有意に高く（Ｇαｉの場合は低い）、相互作用しないものでは両系間で効果器の活性に有意差はない）。
いったんクローン９０１と相互作用し得るＧαが同定されれば、以後のスクリーニングは、該Ｇαとの融合蛋白質を含む膜系のみを用いて、該Ｇαが相互作用し得る効果器の活性を、被験物質の存在下および非存在下で直接的もしくは間接的に測定し、比較することにより行うことができる。したがって、本発明はまた、上記クローン９０１に対する共役Ｇαの同定方法により同定される該受容体と共役し得るＧαと該受容体との融合蛋白質及び該Ｇαが相互作用し得る効果器を含む膜系において、該効果器の活性を被験物質の存在下および非存在下で測定・比較することを特徴とする、クローン９０１に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
上述のように、クローン９０１はＧαｓとの融合蛋白質として発現させた場合にのみ恒常的に活性化されることから、該受容体と共役するＧαはＧαｓであることが強く示唆される。したがって、クローン９０１とＧαｓとの融合蛋白質およびＡＣを含有する膜系におけるＡＣ活性を、被験物質の存在下および非存在下で測定・比較する。ＡＣ活性の測定は上記と同様にして行うことができる。
あるいは、ＧαをコードするＤＮＡの特定の部分に公知の手法により変異を導入して、そのアミノ酸配列を改変することによっても、Ｇαが恒常的に活性化された状態となることが知られている。従って、この系もリガンドのスクリーニングに同様に用いることができる。このような技術は、例えば、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，８９０−８９８（２０００）やＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，８２５３−８２６１（１９９８）に記載される方法に準じた内容で実施することができる。
このような融合蛋白質（もしくは変異Ｇα）発現細胞についても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択して用いることができる。
本発明のさらに別の態様においては、クローン９０１蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜、及びＧαポリペプチドを構成要素として含有するスクリーニング系として、精製したクローン９０１蛋白質又はその均等物とＧαポリペプチド、あるいは精製した該受容体とＧαとの融合蛋白質を、人工脂質二重層膜中に再構成させたものを使用することができる。クローン９０１蛋白質又はその均等物は、ヒト又は他の哺乳動物の視床下部を含む脳神経組織等から得られる膜画分より、抗クローン９０１抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。あるいは、該受容体は、クローン９０１蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗クローン９０１抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することもできる。同様に、該受容体とＧαとの融合蛋白質も、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗クローン９０１抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
人工脂質二重層膜を構成する脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等が挙げられ、これらの１種または２種以上を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。
例えば、受容体とＧα、又は受容体−Ｇα融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオリポソーム）は、以下の方法により調製することができる。即ち、まず、ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈ＝１２：１２：１の混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製した受容体とＧα、又は受容体−Ｇα融合蛋白質を適量添加し、氷中で時々攪拌しながら２０〜３０分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液に対して透析する。約１００，０００×ｇで３０〜６０分間遠心して沈渣を回収することにより、所望のプロテオリポソームを得ることができる。
上記のようなスクリーニング系及びスクリーニング方法により選ばれた、生活習慣病又は拒食症に対する治療活性を有する物質は、任意の医薬上許容される担体を配合することにより生活習慣病又は拒食症の治療薬とすることができる。従って、本発明は、本発明のスクリーニング法により選抜されたクローン９０１に対するアンタゴニスト又はインバースアゴニストを有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。本発明はまた、本発明のスクリーニング法により選抜されたクローン９０１に対する生理的リガンド又はアゴニストを有効成分とする拒食症治療剤を提供する。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。投与方法が視床下部付近への局所注入の場合、有効成分であるリガンドを人工脳髄液に溶解もしくは懸濁させた注射液剤が好ましい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。プルロニックゲルは体温でゲル化し、それ以下の低温では液体であることから、リガンドをプルロニックゲルとともに局所注入して標的組織周辺でゲル化させることにより、長期持続性とすることができる。当該リガンド製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、リガンドおよび医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明のリガンド製剤の投与量は、リガンド活性（フルアゴニストか部分アゴニストか、あるいはアンタゴニストかインバースアゴニストか）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたりリガンド量として約０．０００８〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約０．０２５ｍｇ／ｋｇである。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、特に明記しない限り、以下の実施例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年発行、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．等に記載の方法で行なった。
実施例１：正常および肥満モデルマウスに対するクローン９０１アンチセンスＤＮＡの作用
（１）実験材料
試薬：クローン９０１アンチセンスＤＮＡは当該遺伝子開始コドン付近に対する２５ｍｅｒのアンチセンスＤＮＡを２種類混合したものであり、合成、チオール化、ＨＰＬＣ精製は（株）日本バイオサービスに依頼した。
以下にアンチセンスＤＮＡの塩基配列を示す。
2003030936.tif 000003
その他試薬は市販の特級試薬を用いた。
実験動物：雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（以下正常マウス）およびＣ５７ＢＬ  ｄｂ／ｄｂ（以下肥満マウス）（ＳＰＦ規格）をそれぞれ日本チャールズリバー社、日本クレア社より購入、予備飼育の後正常マウスは９週齢、肥満マウスは１１週齢で実験に使用した。
飼育環境：温度２０℃以上２６℃以下、相対湿度３０％以上７０％以下に制御され、照明は８：００〜２０：００点灯、２０：００〜８：００消灯のサイクルに設定された部屋で飼育した。飼育中は固形飼料（ＣＥ−２，日本クレア）および滅菌蒸留水を自由摂取させた。
（２）投与液の調製
アンチセンスＤＮＡ投与液として、７．５μｇ／μｌのアンチセンスＤＮＡを含む人工脳髄液（０．１６６ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、７．０１４ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２９８ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．２０３ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２．１０ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３）を調製した、またアンチセンスＤＮＡを含まない人工脳髄液を溶媒対照液とした。
（３）アンチセンスＤＮＡの脳室内投与
正常マウスおよび肥満マウスを各々２群に分け、一晩絶食のあと、午前８：００に照明点灯と同時に、１群にアンチセンスＤＮＡ投与液を４μｌ／マウス（アンチセンスＤＮＡとして３０μｇ／マウス）を、もう一群には溶媒対照液４μｌ／マウスを側脳室内に投与した。
（４）アンチセンスＤＮＡ投与によるマウスの摂餌量に対する影響
投与直後よりマウスへの給餌を再開し、投与１２時間後に摂餌量を算出した。正常マウスおよび肥満マウスの摂餌量に対するアンチセンスＤＮＡの作用を図１に示す。クローン９０１のアンチセンスＤＮＡ投与により、正常マウス、肥満マウスともに摂餌量を減少させる効果が見られた。また投与後１２時間から２４時間における摂餌量を算出した。正常マウスおよび肥満マウスの摂餌量に対するアンチセンスＤＮＡの作用を図２に示す。投与後１２時間から２４時間では摂餌量は投与の影響から回復し、溶媒対照液投与群では肥満マウスで正常マウスに比較して摂餌量の亢進が見られたが、クローン９０１のアンチセンスＤＮＡの投与により、摂餌量は正常マウスと同程度にまで抑制される。正常マウスではクローン９０１のアンチセンスＤＮＡの効果は見られなかった。
上記の結果から、クローン９０１は摂餌行動に関与する因子である可能性が示唆された。また肥満マウスではクローン９０１の活性もしくは発現量が亢進している可能性が考えられ、アンチセンスＤＮＡによる発現抑制効果がより強く、より長時間認められた。クローン９０１は正常動物および過食を伴なう肥満糖尿病動物の摂餌量の調節に関与しており、特に過食、肥満を伴う場合にクローン９０１の作用を遮断することにより、効果的な治療効果が得られることが明らかになった。
実施例２：クローン９０１安定発現株の樹立
（１）導入遺伝子ベクターの構築
クローン９０１のコード領域をＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）にてＰＣＲ法で増幅する。増幅した遺伝子断片と以下の３つのタイプのキメラＧα（Ｇα１６、Ｇαｑｉ５、ＧαｑＳ５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）との融合遺伝子を作成する。この断片をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入する。
（２）細胞株の樹立
ＣＨＯ細胞を１０ｃｍ２培養皿に播種し、１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。その後無血清培地に転換し、上記のとおり構築した導入遺伝子とＬｉｐｏｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ）と複合体を形成させ培地に添加する。５時間インキュベート後１０％  ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に転換後さらに８時間培養する。その後トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を培養皿から剥離させ、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８と１０％  ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、１０ｃｍ２培養皿に播種する。数日後に形成されたコロニーを単離し、クローン９０１安定発現株（￥１６、￥ｑｉ５、￥ｑｓ５）とする。
実施例３：レセプターアゴニストのスクリーニング
（１）細胞の調製  クローン９０１安定発現株（￥１６、￥ｑｉ５、￥ｑｓ５）を９６穴培養皿に播種し、１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。これを発現細胞として使用する。
（２）薬物添加
発現細胞の培地を使用前日に無血清のＤ−ＭＥＭ培地に交換する。評価日に各化合物（２．５ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液）をＤ−ＭＥＭ培地で目的の濃度になるように希釈する。培養皿の培地を除去し、希釈した被験化合物と４μＭのＦｌｕｏ３ＡＭ（Ｔｅｆｌａｂ．）及び２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを添加し、３７℃で６０分培養する。被験化合物を添加しない以外は同様に処理したサンプルを比較のために用意する。
（３）ＦＬＩＰＲ法による細胞内カルシウム濃度測定
上記の処理を施した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、Ｔｈｙｒｏｄｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、１％ゼラチンを含む）に懸濁する。培養皿の４８８ｎＭ、５４０ｎＭでの吸収をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて定量する。
実施例４  クローン９０１−Ｇα融合蛋白質発現用プラスミドの構築
ＧＰＣＲのシグナリングをほぼ網羅できると考えられる代表格３種のαサブユニットとして、ＧｑファミリーからＧα１６、ＧｉファミリーからＧαｉ２、ＧｓファミリーからＧαＳ２を選択した。これらの全コーディング領域を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にＰＣＲクローニングした。さらに、ＰＣＲにより各Ｇαコーディング領域の直前に制限酵素ＥｃｏＲＶ切断部位と、６×Ｈｉｓタグを含む配列を付加し、各Ｇα蛋白質の５’側にＧＰＣＲの遺伝子を容易に融合することが出来るようなプラスミドｐｃＨＩＳＧα１６、ｐｃＨＩＳＧαｉ２、ｐｃＨＩＳＧαＳ２を作製した。
即ち、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ）を２０倍希釈し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。酵素は、ＫＯＤｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。ただし、Ｍｇ２＋濃度は１ｍＭとした。増幅反応は、２０μｌの反応液でＫＯＤｐｌｕｓに添付の反応バッファーを使用した。Ｇα１６  ｃＤＮＡを増幅するためにはプライマーＧＮＡ１５Ｆ１（配列番号５）とＧＮＡ１５Ｒ１（配列番号６）を、Ｇαｉ２  ｃＤＮＡを増幅するためにはプライマーＧＮＡｉ２Ｆ１（配列番号７）とＧＮＡｉ２Ｒ１（配列番号８）を、またＧαＳ２  ｃＤＮＡを増幅するためにはプライマーＧＳ２Ｆ１（配列番号９）とＧＳ２Ｒ１（配列番号１０）をそれぞれ使用した。増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃、２分→（９４℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクルの条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。各ＰＣＲ産物の末端をリン酸化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分離精製後、制限酵素ＥｃｏＲＶで切断しＣＩＡＰ処理したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを確認し、得られた各Ｇ蛋白質発現プラスミドをそれぞれ、ｐｃＧα１６、ｐｃＧαｉ２およびｐｃＧαＳ２と命名した。
次に、各Ｇ蛋白質のＮ末側にＨＩＳタグを介してクローン９０１を融合することが出来るように、各Ｇ蛋白質の開始コドンＡＴＧの直前にＨＩＳタグ配列を連結し、さらに制限酵素ＥｃｏＲＶの認識部位を付加した。即ち、先ず、ｐｃＧα１６、ｐｃＧαｉ２およびｐｃＧαＳ２それぞれ１０ｎｇを鋳型として、プライマー（ＧＮＡ１５ＡＴＧ：配列番号１１、ＧＮＡｉ２ＡＴＧ：配列番号１２またはＧＳ２ＡＴＧ：配列番号１３）とベクター部分のプライマー（ｐｃＤＮＡＲＶ：配列番号１４）でＰＣＲを行った。増幅は、９４℃、２分→（９４℃、１５秒→５８℃、３０秒→６８℃、６０秒）×２０サイクルの条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。次に、ＨＩＳ２ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１５）とＨＩＳ２ｌｉｎｋｅｒ（Ｒ）（配列番号１６）をアニーリングし、末端をリン酸化後、各ＰＣＲ産物とライゲーションした。これらを制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＸｈｏＩで切断後、目的ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離、精製した。回収したＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで切断した発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを確認し、得られたプラスミドをそれぞれｐｃＨＩＳＧα１６、ｐｃＨＩＳＧαｉ２およびｐｃＨＩＳＧαＳ２と命名した。
実施例５  クローン９０１−Ｇα融合蛋白質発現プラスミドの構築
クローン９０１と各Ｇα蛋白質の融合蛋白質を発現させるプラスミドは以下の方法で構築した。即ち、クローン９０１をＧα１６、Ｇαｉ２あるいはＧαＳ２と融合蛋白質として発現できるように、実施例４で構築した各ＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現用プラスミドにクローン９０１遺伝子を挿入することとした。同時に、クローン９０１を単独発現させるプラスミドの作製も実施した。まず、クローン９０１遺伝子（配列番号１）含有プラスミド２ｎｇを鋳型として、クローン９０１遺伝子の５’側のプライマー（９０１ＦＡＴＧ：配列番号１７）と終始コドンの直前までを増幅するための３’側プライマー（９０１ＲＴ：配列番号１８）あるいは、終始コドンを含むように増幅するための３’側プライマー（９０１ＲＯ：配列番号１９）でＰＣＲをおこなった。増幅は、ＫＯＤｐｌｕｓを使用し、Ｍｇ２＋濃度を１．２ｍＭとし、９４℃、２分→（９４℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×２０サイクルの条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。各ＰＣＲ産物の末端をリン酸化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分離精製した。３種のＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現用プラスミドｐｃＨＩＳＧα１６、ｐｃＨＩＳＧαｉ２およびｐｃＨＩＳＧαＳ２と単独発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（＋）をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶで切断しＣＩＡＰ処理した。３種のＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現用プラスミドについては、これらとクローン９０１の終始コドン直前までをコードするよう増幅させたＰＣＲ産物をそれぞれライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。単独発現用プラスミドについては、クローン９０１の終始コドンを含むように増幅させたＰＣＲ産物をそれぞれライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを確認し、３種のクローン９０１−Ｇα融合蛋白質発現プラスミドをそれぞれｐｃ９０１ＨＩＳＧα１６、ｐｃ９０１ＨＩＳＧαｉ２およびｐｃ９０１ＨＩＳＧαＳ２と命名した。また、クローン９０１単独発現プラスミドをｐｃ９０１Ｚｅｏと命名した。ｐｃ９０１ＨＩＳＧα１６、ｐｃ９０１ＨＩＳＧαｉ２およびｐｃ９０１ＨＩＳＧαＳ２中に含まれる挿入ｃＤＮＡ配列を配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４にそれぞれ示す。
実施例６  クローン９０１−Ｇα融合蛋白質発現による恒常的活性化の確認
オーファンＧＰＣＲとＧαとの融合蛋白質を発現させることによる恒常的活性化は、オーファンＧＰＣＲが活性化されたとき共役するＧα蛋白質がＧｓであれば、ｃＡＭＰの上昇を観察することにより確認できる。また、Ｇｑであれば、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）の生成を観察することにより確認できる。Ｇｉであれば、例えばｆｏｒｓｋｏｌｉｎで活性化しておいたｃＡＭＰ産生量の減少を観察することにより、あるいはＩＰ３の生成を観察することにより確認できる。あるいは、オーファンＧＰＣＲの活性化を受けた共役Ｇα蛋白質のＧＴＰ結合活性の上昇は、すべてのＧα蛋白質で観察される。したがって、これらのパラメータについて、各オーファンＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現プラスミドを一過的に導入した細胞株で評価することにより、恒常的活性化が可能な、即ち、本来そのオーファンＧＰＣＲが共役するＧα蛋白質を予想することが出来ると同時に、そのオーファンＧＰＣＲをターゲットとするスクリーニング方法が確立される。
本実施例では、クローン９０１について恒常的に活性化するＧα蛋白質との組み合わせを検討する目的で、実施例５で作製したクローン９０１とＧα１６、Ｇαｉ２、ＧαＳ２の３種のＧ蛋白質との融合蛋白発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過的に導入し、細胞抽出液中のｃＡＭＰ濃度を定量した。即ち、ＨＥＫ２９３細胞を、２×１０４個／ｗｅｌｌ（１００μｌ）の細胞密度で９６−ｗｅｌｌ  ＰＤＬ  ｃｏａｔｅｄ  ｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にまきこみ、２４時間培養した（抗生物質マイナス）。各クローン９０１−Ｇα融合蛋白質発現プラスミド（ｐｃ９０１ＨＩＳＧα１６、ｐｃ９０１ＨＩＳＧαｉ２およびｐｃ９０１ＨＩＳＧαＳ２）、クローン９０１単独発現プラスミド（ｐｃ９０１Ｚｅｏ）あるいは発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（＋）のプラスミドＤＮＡ５０ｎｇを５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈、また０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに希釈した。両者を混合し室温で３０分間静置後、４０μｌの血清無添加のＤＭＥＭ培地を加え、血清無添加のＤＭＥＭ培地で１回洗浄したｗｅｌｌに添加した。ＣＯ２インキュベータで４時間培養後、１０％  ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で洗浄し、１０％  ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に置換し、ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。
２４時間培養後、ｃＡＭＰの定量実験をおこなった。ｃＡＭＰの定量にはＣＩＳ  ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のＣｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｋｉｔを用いた。細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、５０μｌの０．５ｍＭ  ＩＢＭＸを含有したＨａｎｋｓ  Ｈｅｐｅｓ液に置換した。１５分後に、Ｈａｎｋｓ  Ｈｅｐｅｓ液を吸引除去し、４０μｌの０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、細胞を溶解し細胞抽出液を得た。そのうち２４μｌを３８４−ｗｅｌｌの黒プレートに移し入れた。１２μｌのｃＡＭＰ−ＸＬ６６５を添加して攪拌し、さらに１２μｌのａｎｔｉ  ｃＡＭＰ−Ｃｒｙｐｔａｔｅを添加し、攪拌後４℃で１時間反応させた。マルチプレートリーダーＡＲＶＯ（Ｗａｌｌａｃ）により、ＴＲ−ＦＲＥＴ法によりｃＡＭＰの定量をおこなった。３４０ｎｍでＣｒｙｐｔａｔｅを励起し、５０μｓ後にＸＬ−６６５の蛍光を６６５ｎｍで、Ｃｒｙｐｔａｔｅの蛍光を６１５ｎｍで同時に測定した。ＣｒｙｐｔａｔｅとＸＬ−６６５が近接したときのみＦＲＥＴにより６６５ｎｍの蛍光が観察される。サンプル中のｃＡＭＰはｃＡＭＰ−ＸＬ６６５と競合してａｎｔｉ  ｃＡＭＰ−Ｃｒｙｐｔａｔｅと結合することにより、６６５ｎｍの蛍光を低減させる。
各細胞抽出液中のｃＡＭＰ濃度の定量結果を図３に示した。クローン９０１蛋白質（９０１：ｐｃ９０１Ｚｅｏ）、Ｇα１６との融合蛋白質（９０１−Ｇｑ：ｐｃ９０１ＨＩＳＧα１６）、Ｇαｉ２との融合蛋白質（９０１−Ｇｉ：ｐｃ９０１ＨＩＳＧαｉ２）を発現するプラスミドをそれぞれ導入した細胞抽出液は、発現ベクターのみ（ｍｏｃｋ：ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（＋））を導入した場合と同じく、ｃＡＭＰ濃度は約２ｎＭであったが、ＧαＳ２との融合蛋白質（９０１−ＧＳ：ｐｃ９０１ＨＩＳＧαＳ２）を発現するプラスミドを導入した細胞抽出液では、約１７ｎＭと約８．５倍にｃＡＭＰ濃度が上昇していた。即ち、ＧαＳ蛋白質と融合したときのみ恒常的活性化が観察された。クローン９０１は、ＧαＳと共役するＧＰＣＲであることが強く示唆された。
配列表フリーテキスト
配列番号３：クローン９０１の発現を阻害するアンチセンスＤＮＡとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：クローン９０１の発現を阻害するアンチセンスＤＮＡとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇα１６  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇα１６  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαｉ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαｉ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαＳ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαＳ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：ヒトＧ蛋白質Ｇα１６  ｃＤＮＡフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：ヒトＧ蛋白質Ｇαｉ２  ｃＤＮＡフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：ヒトＧ蛋白質ＧαＳ２  ｃＤＮＡフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニング部位を増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：６ｘＨｉｓタグペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインされたセンス鎖オリゴヌクレオチド。
配列番号１６：６ｘＨｉｓタグペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインされたアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド。
配列番号１７：全長ＯＲＦを含むヒトクローン９０１のｍＲＮＡを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１８：ヒトクローン９０１のｍＲＮＡを終始コドンの直前まで増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１９：全長ＯＲＦを含むヒトクローン９０１のｍＲＮＡを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２０：ｐｃ９０１ＨＩＳＧα１６に含まれるインサートｃＤＮＡ配列。
配列番号２２：ｐｃ９０１ＨＩＳＧαｉ２に含まれるインサートｃＤＮＡ配列。
配列番号２４：ｐｃ９０１ＨＩＳＧαＳ２に含まれるインサートｃＤＮＡ配列。
産業上の利用可能性
クローン９０１は摂食行動に関与するＧＰＣＲであることから、クローン９０１の発現もしくは機能を抑制もしくは増強する物質を有効成分とする本発明の医薬組成物は、摂食量を所望の値に調節することが可能であり、それによって糖尿病、肥満症、高脂血症等の過食に起因する生活習慣病、あるいは拒食症の治療に効果を発揮することが期待される。また、本発明のスクリーニング系及びスクリーニング方法によれば、クローン９０１のリガンドを容易に且つ迅速にスクリーニングすることができ、クローン９０１をターゲットとした新薬の開発、さらには疾患マーカーの探索や、当該疾患マーカーを用いた診断方法の確立に有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願２００１−３０６８７２を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、正常マウス及び肥満マウスの摂餌量に及ぼすクローン９０１のアンチセンスＤＮＡ投与の効果（投与直後〜１２時間後）を示す。黒色のカラムは溶媒対照液投与群、白色のカラムはアンチセンスＤＮＡ溶液投与群における、投与直後〜１２時間後までの摂餌量（平均±標準偏差、正常マウスｎ＝４、肥満マウスｎ＝３）をそれぞれ示している。図中の＊は両群間に有意な差があることを示している（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
図２は、正常マウス及び肥満マウスの摂餌量に及ぼすクローン９０１のアンチセンスＤＮＡ投与の効果（投与１２時間後〜２４時間後）を示す。黒色のカラムは溶媒対照液投与群、白色のカラムはアンチセンスＤＮＡ溶液投与群の、投与１２時間後〜２４時間後の摂餌量（平均±標準偏差、正常マウスｎ＝４、肥満マウスｎ＝３）をそれぞれ示している。
図３は、クローン９０１を単独で、あるいは各種Ｇα蛋白質と融合して一過的に発現させたＨＥＫ２９３細胞の抽出液中のｃＡＭＰ濃度を示す。ｍｏｃｋはｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（＋）で、９０１はｐｃ９０１Ｚｅｏで、９０１−Ｇｑはｐｃ９０１ＨＩＳＧα１６で、９０１−Ｇｉはｐｃ９０１ＨＩＳＧαｉ２で、９０１−ＧＳはｐｃ９０１ＨＩＳＧαＳ２でそれぞれトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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