(57)【要約】本発明は、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターをグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を用いて製造する方法を提供する。この方法は、グラム陽性菌由来ＮＡの存在下で該ウイルスベクター産生細胞を培養し、産生されたウイルスを回収する工程を含む。本発明の方法により、高いコストパフォーマンスで高力価のウイルスを製造することができる。製造されるウイルスベクターは、造血幹細胞を含む血球系・造血系細胞、および粘膜上皮細胞を含む粘液を有する細胞などの、従来では遺伝子導入が困難であった細胞に対して高率で遺伝子を導入する能力を持つことから、遺伝子治療用ベクターとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアル酸結合活性を有する膜蛋白質を含むウイルスベクターの製造方法であって、グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼの存在下で該ウイルスベクター産生細胞を培養し、産生されたウイルスを回収する工程を含む方法。
【請求項２】
グラム陽性菌が放線菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
放線菌が、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）に属する放線菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ミクロモノスポラ科に属する放線菌が、ミクロモノスポラ・ビリディファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープ蛋白質である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）またはオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法により製造されたウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターを製造する方法に関する。
【背景技術】  ほとんどの細胞表面には、シアル酸を含む糖蛋白質が存在している。ある種のウイルスは、このシアル酸と結合する蛋白質をウイルスのエンベロープに有しており、ウイルス粒子の細胞への吸着に機能している。例えば、インフルエンザウイルスは、エンベロープ蛋白質の１つであるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＨＡ）を介して細胞の表面に存在するシアル酸に結合する。しかしながら、ウイルス複製過程において出芽の際には宿主細胞表面のシアル酸との結合を切断する必要があり、そのためにインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＮＡ）が大きな役割を果たしている。また、ＮＡは自己凝集の阻止にも働いていることが報告されている（Ｃｏｍｐａｎｓ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４：５２８−５３４；Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：３９７−４１０；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２５：３２４−３３４；Ｌｉｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１０９９−１１０６）。
ＨＡ蛋白質の性質を利用して、遺伝子導入能を改良したＨＡシュードタイプ化ウイルスの作製も試みられている。この場合、ノイラミニダーゼが存在しないと、低い力価のウイルスしか産生させることができない（Ｈａｔｚｉｉｏａｎｎｏｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５３１３−５３１７）。ベクターの生産系に外来的にＮＡを供給することにより、ＨＡ蛋白質のビリオンへの取り込みを促進し、力価も上昇させることができる（Ｄｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：７３７４−７３８２；Ｎｅｇｒｅ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１６１３−１６２３；Ｍｏｒｓｅ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，，２００２，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ’ｓ  ５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ；国際公開番号第ＷＯ０１／９２５０８号）。しかしながら、これまでに用いられている精製ＮＡで産生されるＨＡシュードタイプ化ウイルスの力価は満足できるものではない。
【発明の開示】
本発明は、グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターを製造する方法を提供することを課題とする。
これまでＨＡシュードタイプ化ウイルスの産生などにおいては、グラム陰性菌に属するビブリオコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のＮＡがしばしば用いられてきた。しかしながら、ビブリオコレラ菌由来ＮＡを用いて産生されるベクターの力価は低く、また、コストの面においてベクターを工業的に大量生産することは困難であった。本発明者らは、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターを高力価で、しかもより安価に製造する技術を開発するため、ウイルス生産に用いることができる新しいＮＡの探索を行った。その結果、グラム陽性菌由来のＮＡを用いることにより、ビブリオコレラ菌由来ＮＡに比べ有意に高い力価のウイルスを産生させることに成功した。グラム陽性菌由来のＮＡを用いることにより、シュードタイプ化ベクターの工業的な大量生産が効率的かつ経済的に実施可能となる。
すなわち本発明は、グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターを製造する方法に関し、より具体的には、
（１）シアル酸結合活性を有する膜蛋白質を含むウイルスベクターの製造方法であって、グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼの存在下で該ウイルスベクター産生細胞を培養し、産生されたウイルスを回収する工程を含む方法、
（２）グラム陽性菌が放線菌である、（１）に記載の方法、
（３）放線菌が、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）に属する放線菌である、（２）に記載の方法、
（４）ミクロモノスポラ科に属する放線菌が、ミクロモノスポラ・ビリディファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）である、（３）に記載の方法、
（５）ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（６）レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、（５）に記載の方法、
（７）シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープ蛋白質である、（１）から（６）のいずれかに記載の方法、
（８）一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）またはオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスである、（７）に記載の方法、
（９）シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質である、（１）から（６）のいずれかに記載の方法、
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の方法により製造されたウイルス、
に関する。
本発明は、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターを製造する方法を提供する。本発明において「ウイルスベクター」とは、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子またはそれと同等の感染性微粒子を指す。本発明の方法は、ウイルスベクター産生細胞をグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼの存在下で培養し、産生されたウイルスを回収する工程を含む方法である。グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いることにより、ウイルス産生細胞から回収されるウイルス量を有意に増大させることが可能となる。グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼは、好ましくは放線菌由来である。本発明の方法は、細胞膜由来のエンベロープを有する所望のウイルスベクターの製造において適用することができる。本発明の方法は、好ましくは、例えばネガティブ鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスなどの製造において適用されるが、特にレンチウイルスを含むレトロウイルスの生産に本発明の方法を好適に適用することができる。
製造されるウイルスは、複製能を持つウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ）であっても、複製欠損型ウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ）であってもよい。例えば複製欠損型のウイルスベクターは、ウイルスゲノムから、感染性ウイルス粒子の形成または放出に役割を持つウイルス遺伝子の一部または全部を欠損させることにより作製される。すなわち、ウイルスゲノムのウイルス粒子内への取り込み、および標的細胞への核酸の導入に必要な核酸配列を残し、エンベロープ遺伝子などを欠損させるようにウイルスゲノムを改変することにより、所望の遺伝子を細胞に導入するために適した複製欠損型の組み換えウイルスベクターを製造することができる。例えば複製欠損型のレトロウイルスベクターであれば、ウイルスゲノムＲＮＡ中のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどのウイルス蛋白質遺伝子の一部または全部を取り除き、ウイルスのパッケージングおよび標的細胞への遺伝子導入に必要な配列（ＬＴＲの一部など）のみを残すようにウイルスベクターのゲノムを改変することができる。ウイルス粒子の産生に際しては、欠損させた遺伝子のうち、ウイルス粒子形成に必要な遺伝子をウイルス産生細胞内で発現させる。このように野生型ウイルスが持つウイルス遺伝子の少なくとも一部を失っている核酸をウイルスゲノムとして含むウイルス粒子も、本発明においてウイルスベクターに含まれる。
本発明は、特に組み換えウイルスの製造において好適に用いられる。「組み換えウイルス」とは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、片方または両方の末端が自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換え蛋白質とは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成した蛋白質または人工的に合成された蛋白質を言う。例えば、蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより、組み換え蛋白質を生産することができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。
本発明の方法において製造されるウイルスベクターは、ウイルスエンベロープにシアル酸結合活性を有する蛋白質を有している。製造されるウイルスベクターとしては、天然においてシアル酸結合活性を有する蛋白質を持つウイルスであってもよく、天然においてはそのような蛋白質を持たないウイルスであって、人為的に該蛋白質をエンベロープに持たせたウイルスであってもよい。このように、天然型ウイルスのエンベロープには全くまたはほとんど含まれないある蛋白質をエンベロープに持たせたウイルスを、その蛋白質によりシュードタイプ化したウイルスという。異種エンベロープ蛋白質を持つシュードタイプウイルスは、例えばウイルス産生細胞において、その蛋白質を発現させることにより製造することができる。本発明の方法においては、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質でシュードタイプ化されたウイルスの製造において特に好適に適用することができる。
シアル酸結合活性を有する膜蛋白質としては、該蛋白質の細胞外領域にシアル酸結合領域を持つものが使用される。このような蛋白質としては、天然の蛋白質であるか人工的な蛋白質であるかは特に制限されない。天然においてシアル酸結合活性を有する膜蛋白質は、例えばウイルスのエンベロープ蛋白質などに多く見いだされている。このような蛋白質は、例えばヘマグルチネーション（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ，ＨＡ；赤血球凝集反応）を起す活性により同定することができる。ＨＡ活性を持つウイルス蛋白質は、ヘマグルチニン（ｈａｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；赤血球凝集素）と呼ばれることもある。このＨＡ活性を持つウイルス蛋白は、本発明のウイルスの製造において特に好適に用いられる。
これまでに様々なウイルスにおいてＨＡ活性が検出されている。これらのウイルスが持つＨＡ活性を持つ蛋白質をそのまま、あるいは他の蛋白質とのキメラ蛋白質を作製することなどにより改変して、本発明のウイルス製造に用いることができる。ＨＡ活性は、種々の生物の赤血球を利用して検出することができる。ＨＡ活性の検出によく用いられる赤血球の種類および反応の至適温度は、各ウイルスによって適宜調節される。風疹ウイルスなどにおいては、反応にカルシウムイオンが必要であると言われている。アルボウイルスにおいては、反応の至適ｐＨは厳密である。ウイルスのＨＡ活性を持つ蛋白質としては、エンテロウイルス、風疹ウイルスなどではビリオンそのもの、アルボウイルス、アデノウイルスなどではビリオン以外にもビリオンより小さい粒子としても存在する。ポックスウイルスのヘマグルチニンはビリオンとは別の脂質を含む粒子として存在する。このようなＨＡ活性を持つ蛋白質を用いて、ＨＡ活性を持つウイルスを製造することができる。アデノウイルスＩＩＩ亜群のウイルスなどは、ラットの赤血球を部分凝集させる不完全凝集を起すが、このような蛋白質もＨＡ活性を持つ膜蛋白質として用いることができる。
ＨＡ活性（ＨＡ価）は公知の方法により試験することができる（国立予防衛生研究所学友会編，改訂二版  ウイルス実験学  総論，ｐｐ．２１４−２２５，丸善株式会社）。赤血球としては、例えばニワトリ（ヒヨコおよび成鶏を含む）、ガチョウ、ラット、モルモット、アカゲザル、ミドリザル、またはヒトなどの赤血球が用いられ得る。反応温度は、０℃、４℃、室温、または３７℃など、蛋白質により適した条件で行う。各ウイルスの赤血球凝集反応の反応条件の例を以下に示す。
例えばアデノウイルスのＨＡ反応は、通常、ｐＨに非依存的であり、温度は例えば３７℃で行う。アデノウイルスのＩ亜群、例えば３，７，１１，１４，１６，２０，２１，２５，および２８型などにおいては、例えばアカゲザル赤血球を用いるとよい。ＩＩ亜群、例えば８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２２，２３，２４，２６，および２７型などにおいては、例えばラット赤血球を用いるとよい。ＩＩＩ亜群、例えば１，２，４，５，および６型などにおいては、例えばラット赤血球を用いるとよく、不完全凝集が起こる。
エンテロウイルスのＨＡ反応は、通常、ｐＨに非依存的である。その中でも、例えばＡ７型などのコクサッキーウイルスの場合は、例えばニワトリ赤血球が用いられ、室温で凝集を起こす。Ａ２０，Ａ２１，Ａ２４型などのコクサッキーウイルスの場合は、例えばヒトＯ型赤血球が用いられ、４℃で凝集反応を起こす。コクサッキーウイルスＢ１，Ｂ３，Ｂ５型などの場合は、例えばヒトＯ型赤血球が用いられ、３７℃で凝集反応を起こす。エコーウイルス、例えば３，６，７，１１，１２，１３，１９，２０，２１，２４，２９型などにおいては、例えばヒトＯ型赤血球が用いられ、４℃で凝集反応を起こす。
レオウイルスのＨＡ反応は、通常、ｐＨに非依存的であり、室温で反応が起きる。例えば１型および２型はヒトＯ型赤血球が、３型はウシ赤血球が用いられる。
マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ反応は、例えばインフルエンザウイルスにおいては、ｐＨは約７．２で行う。Ａ型およびＢ型の場合はニワトリ、ヒト、またはモルモットなどの赤血球が用いられ、室温で反応が起きる。Ｃ型の場合は例えばニワトリ赤血球が用いられ、反応は４℃がよい。おたふくかぜウイルスおよびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の場合は、例えばニワトリ赤血球が用いられ、室温、ｐＨ約７．２で行うとよい。パラインフルエンザウイルスのＨＡ反応は通常ｐＨ非依存的であり、１型などではニワトリまたはヒト赤血球が、２型の場合は例えばニワトリ赤血球が用いられ、反応は例えば４℃で行う。パラインフルエンザウイルス３型の場合は、ヒトまたはモルモット赤血球が用いられ、４℃〜室温で反応させる。はしかウイルスの場合は、例えばミドリザル赤血球を用いて、３７℃で反応させる。
アルボウイルスの場合は、反応は酸性側に厳密であり、例えばガチョウまたはヒヨコ赤血球を用いて３７℃で反応させる。ラブドウイルスの場合は、例えばガチョウ赤血球を用いて反応を行う。狂犬病ウイルスの場合はｐＨは６．４が好ましく、温度は例えば０℃で、水庖性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の場合は、ｐＨは５．８が好ましく、温度は例えば０℃で反応させる。ワクチニアウイルスおよび痘そうウイルスなどを含むポックスウイルスの場合は、通常、反応はｐＨに非依存的であり、例えばニワトリ赤血球を用いて室温〜３７℃において反応が見られる。風疹ウイルスの場合は、例えばヒヨコまたはガチョウ赤血球を用い、４℃、ｐＨ約６．２または７．２などで反応させる。ポリオーマウイルスの場合は、例えばモルモット赤血球を用い、４℃、ｐＨ７．２の条件を用いることができる。ラットウイルス（ＲＶ）の場合は、例えばモルモット赤血球で室温、ｐＨ７．２の条件が挙げられる。以上に挙げたようなＨＡ性を持つウイルス蛋白質またはその改変蛋白質を用いて、本発明の方法に従いウイルスを製造することが可能である。ここで改変蛋白質とは、天然の蛋白質の１つまたは複数のアミノ酸を欠失、置換、および／または挿入した蛋白質である。このような蛋白質であっても、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質であれば使用することができる。改変蛋白質は、もとの蛋白質の部分アミノ酸配列を含むことが好ましく、より好ましくはもとの蛋白質の８アミノ酸以上、より好ましくは９アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは１５アミノ酸以上を含む。あるいは、改変蛋白質は、もとの蛋白質と好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有する。改変蛋白質は、もとの蛋白質またはその部分蛋白質に、他の蛋白質が付加された蛋白質であってもよい。
ウイルスベクターのエンベロープに含まれるシアル酸結合活性を有する膜蛋白質の中でも、本発明の適用に特に好ましい蛋白質としては、具体的には、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質、オルソミクソウイルスのＨＡ蛋白質、トガウイルスのＥ１蛋白質、ワクシニアウイルスのＡ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ蛋白質、フラビウイルスのＭ、Ｅ蛋白質、コロナウイルスのＥ１、Ｅ２蛋白質、ブンヤウイルスのＧ１蛋白質などが挙げられる。特に、一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスが有するエンベロープ蛋白質が好ましく、特にオルソミクソウイルスのＨＡ蛋白質が好ましい。
「一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわち（−）鎖］ＲＮＡをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしは、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＴｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，およびＰｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。特に好ましくは、オルトミクソウイルス科ウイルスのＨＡ蛋白質が挙げられ、最も好ましくは、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質が挙げられる。また、例えばセンダイウイルス、狂犬病ウイルス、あるいは麻疹ウイルスのＨＮ（またはＨ）蛋白質なども好適である。これらの蛋白質は、複数を組み合わせて使用してもよい。これらの蛋白質は、ウイルスの天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。これらの蛋白質は、天然の蛋白質から改変された蛋白質であってもよい。
シアル酸結合活性を有する膜蛋白質は、シアル酸に結合する以外の活性を持つものであってもよい。例えば、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質には、シアル酸結合活性（ＨＡ活性）以外にノイラニミダーゼ（ＮＡ）活性も有している。ＨＮ蛋白質が持つノイラミニダーゼ活性は、それ自体がウイルス産生を促進する働きを持ちうるが、本発明の方法に従ってグラム陽性菌由来ＮＡを併用することにより、より効率的にウイルス産生を行うことが可能となる。また、本発明においてシアル酸結合活性を有する膜蛋白質を２種またはそれ以上用いてもよい。例えば、オルトミクソウイルスのＨＡ蛋白質とパラミクソウイルスＨＮ蛋白質の２種の蛋白質でシュードタイプ化したウイルスの製造において、本発明の方法を用いることができる。ＨＮ蛋白質がもつＮＡ活性とグラム陽性菌由来のＮＡにより、さらに高い効率でウイルスを細胞から放出させることが可能となる。
本発明におけるウイルスベクターの製造は、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質を持つウイルスベクターの製造工程において、該ウイルスベクター産生細胞をグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼの存在下で培養することにより行われる。すなわち、グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを含む培養液中でウイルス産生細胞を培養する。その後、産生されたウイルスを回収する工程により、細胞から産生されたウイルスを得ることができる。ウイルスの回収は、例えばウイルス産生細胞の培養上清を回収する工程であってよい。また、培養上清からさらにウイルスを回収する工程を含んでもよい。培養上清から、遠心、吸着、濾過等により、さらにウイルスを精製または濃縮することができる。
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）（ＥＣ  ３．２．１．１８）とはシアル酸のグリコシド結合を切断する活性（これをＮＡ活性という）を有する蛋白質を言い、具体的には細胞膜上の糖蛋白質または糖脂質中のシアル酸のグリコシド結合を切断する活性を有する蛋白質である（Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０（１９８２）１３１−２３４；Ｃａｂｅｚａｓ，Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７８（１９９１）３１１−３１２）。ノイラミニダーゼの活性は、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｙｌｌａｃｔｏｓｅ（ＮＡＮＡ−ｌａｃｔｏｓｅ）または牛顎下腺ムチン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎ）を基質として、ｐＨ５．０、３７℃において１分間に１μｍｏｌのＮ−Ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＮＡＮＡ）を生成するに要する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）として定義される（Ｃａｓｓｉｄｙ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０：３５０１（１９６５））。ＮＡは、シアリダーゼ（ｓｉａｌｉｄａｓｅ）と呼ばれることもある。
グラム陽性菌由来ＮＡとは、グラム陽性菌が持つＮＡまたはその構造的同等物、あるいはそれらの改変体を言う。例えばグラム陽性菌由来ＮＡには、グラム陽性菌から得ることができるＮＡが含まれる。例えば、グラム陽性菌培養物から精製されたＮＡ、およびその組み換え体が含まれる。グラム陽性菌由来ＮＡの組み換え体は、グラム陽性菌由来ＮＡをコードする遺伝子を同種あるいは異種の生物中で発現させることにより製造することができる。グラム陽性菌から得ることができるＮＡは、他の原料から得たものであっても、グラム陽性菌から得られたＮＡと同等の蛋白質であれば、グラム陽性菌由来ＮＡに含まれる。またグラム陽性菌由来ＮＡには、野生型グラム陽性菌ＮＡの１つまたは複数のアミノ酸を欠失、置換、および／または挿入することにより改変した蛋白質であって活性を持つ蛋白質が含まれる。改変されるアミノ酸数はＮＡ活性を持つ限り制限されないが、好ましくは７０アミノ酸以内であり、より好ましくは５０アミノ酸以内であり、より好ましくは３０アミノ酸以内であり、より好ましくは２０アミノ酸以内であり、より好ましくは１０アミノ酸以内であり、より好ましくは５アミノ酸以内であり、より好ましくは３アミノ酸以内である。改変されたＮＡは、グラム陽性菌野生型ＮＡのアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ，ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、デフォルトパラメーターを用いるとよい。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）のウェブサイトを参照）。例えば２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば野生型グラム陽性菌ＮＡのアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算すればよい。アミノ酸の改変に当たっては、ＮＡ活性に重要なＢＮＲ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｒｅｐｅａｔ；Ｐｆａｍ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＰＦ０２０１２（Ａｓｐボックスとも呼ばれる））を破壊しないよう、他の領域のアミノ酸を改変することが好ましい（Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．６：３４９−３５３，１９８９；Ｃｏｐｌｅｙ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１０：２８５−２９２，２００１）。ＢＮＲは複数コピーが互いに４０アミノ酸残基以上離れて繰り返すことが好ましい。野生型ＮＡのＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸は、改変しても活性に最小限の影響しか及ぼさないと考えられる。
グラム陽性菌由来ＮＡには、例えば、野生型グラム陽性菌ＮＡの部分蛋白質であって、ＮＡ活性を有する蛋白質が含まれる。部分蛋白質は、好ましくは野生型グラム陽性菌ＮＡの全アミノ酸配列の連続した６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上を含む。またグラム陽性菌由来ＮＡには、野生型グラム陽性菌ＮＡまたはその部分蛋白質に、他の蛋白質が付加された蛋白質であって、ＮＡ活性を有する蛋白質が含まれる。活性を維持したまま、部分長の蛋白質あるいは他の蛋白質との融合蛋白質を作製することは、当業者が通常行っている。
グラム陽性菌とは、グラム染色（Ｇｒａｍ  ｓｔａｉｎ）に陽性の細菌およびその他の菌類を言う。グラム染色とは、一般に、塩基性染色液（例えばクリスタルバイオレットなど）で染色し、ついでルゴール液（Ｉ２−ＫＩ液）で処理してから極性溶媒（アルコールまたはアセトンなど）で短時間洗浄した時に脱色抵抗性を示す菌を言う。洗浄後の対比染色（例えばサフラニン液または希釈カルボールフクシン液）により、グラム陰性菌は赤色に染まるがグラム陽性菌は紫色を呈する。グラム陽性菌は、一般に比較的厚い（１５〜８０ｎｍ）細胞壁を持ち、多くは外層にリポ多糖を欠く。またリソチームに感受性が高いものが多い。具体的には、グラム陽性菌にはブドウ球菌、連鎖球菌、枯草菌、巨大菌、および放線菌などが含まれる。本発明においてグラム陽性菌由来ＮＡは、好ましくは放線菌由来ＮＡである。
放線菌とは、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｓｅｔａｌｅｓ）細菌およびその他の放線細菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）を言う。放線菌はグラム陽性細菌のグループに属する。放線菌目には、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、プロピオニバクトリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シウドノカルジア科（Ｐｓｅｕｏｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、テルモモノスポラ科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａｃｅａｅ）、ノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、アクチノミセス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｔａｃｅａｅ科、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓａｃｅａｅ科、およびＧｌｙｃｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科などが含まれる。例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属ＮＡは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ０６８９８（ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＡＡ２１９３２、Ａ４９２２７）、Ｘ６２２７６（ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＡＡ４４１６６）（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓのＮＡ）を参照のこと。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＮＡは、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＣ＿００３４５０（ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿６００７７１）、ＡＰ００５２７８（ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＡＢ９８９４９）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＮＡ）を参照のこと。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属ＮＡは、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＣ＿００３１５５（ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿８２３０１８）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ＮＣ＿００３８８８（ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿６３０６３８）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）を参照のこと。
本発明において用いられるノイラミニダーゼは、好ましくは放線菌目細菌由来、より好ましくはミクロモノスポラ科細菌由来、より好ましくは、ミクロモノスポラ属細菌由来のＮＡである。ミクロモノスポラ属細菌としては、Ｍ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｍ．ｂｒｕｎｎｅａ、Ｍ．ｂｒｕｎｎｅｓｃｅｎｓ、Ｍ．ｃａｒｂｏｎａｃｅａ、Ｍ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｃｈａｌｃｅａ、Ｍ．ｃｈｅｒｓｉｎｉａ、Ｍ．ｃｉｔｒｅａ、Ｍ．ｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｍ．ｅｃｈｉｎｏａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｍ．ｅｃｈｉｎｏｂｒｕｎｎｅａ、Ｍ．ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｉｖｉｒｉｄｉｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｏｐｕｒｐｕｒｅｕｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｍ．ｇｌｏｂｏｓａ、Ｍ．ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａ、Ｍ．ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ、Ｍ．ｉｎｏｓｉｔｏｌａ、Ｍ．ｉｎｙｏｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓ、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｍ．ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒａ、Ｍ．ｎａｒａｓｈｉｎｏ、Ｍ．ｏｌｉｖａｓｔｅｒｏｓｐｏｒａ、Ｍ．ｐｅｕｃｅｔｉｃａ、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｍ．ｒｈｏｄｏｒａｎｇｅａ、Ｍ．ｒｏｓａｒｉａ、Ｍ．ｒｏｓｅａ、Ｍ．ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｍ．ｙｕｌｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｚｉｏｎｅｎｓｉｓなどが挙げられるが、これらに制限されない。特に好ましいＮＡとしては、Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ３１１４６）由来のＮＡが挙げられる。Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓのＮＡ遺伝子（ｎｅｄＡ）の塩基配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄ０１０４５（配列番号：１）に、コードされる蛋白質のアミノ酸配列はＱ０２８３４（配列番号：２）に記載されている（Ｓａｋｕｒａｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（２１）：６８９６−９０３，１９９２）。
また、Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓのＮＡ遺伝子をプローブに、他のミクロモノスポラのＮＡ遺伝子を単離することができる。例えば、配列番号：１に記載の配列および／またはその相補配列の３０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは１５０塩基以上、より好ましくは全長と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を選択すればよい。ハイブリダイゼーションにおいては、配列番号：１の配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）、７％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５ｘデンハルト液（１ｘデンハルト溶液は０．２％ポリビニールピロリドン、０．２％牛血清アルブミン、および０．２％フィコールを含む）を含む溶液中、４８℃、好ましくは５０℃、より好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で２ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、振蘯しながら２時間洗浄する条件である。より好ましくは、洗浄は１ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で、より好ましくは０．５ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で、より好ましくは０．１ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で、振蘯しながら２時間行う。
本発明のウイルスの製造方法においては、上記のようなグラム陽性菌由来ＮＡの存在下でウイルスの産生細胞を培養し、産生されたウイルスを回収する。ウイルスは細胞から培養液中に放出されるので、培養上清を回収することによりウイルスを回収することができる。シアル酸結合蛋白質によりシュードタイプ化したウイルスの製造であれば、該蛋白質を発現する細胞においてウイルスの産生させる際に、該細胞をグラム陽性菌由来ＮＡの存在下で培養し、産生されたウイルスを回収する。グラム陽性菌由来ＮＡは、ＮＡを培養液中に添加して供給してもよいし、ＮＡを発現するベクターを用いてウイルス産生細胞またはウイルス産生細胞と共培養する細胞などから該ＮＡを分泌させてもよい。ＮＡは、ウイルス産生細胞の培養期間の少なくとも一部の期間存在している。ＮＡの存在下でウイルス産生細胞を培養する時間は、例えば１時間以上、好ましくは３時間以上、より好ましくは５時間以上、より好ましくは１０時間以上、より好ましくは２０時間以上である。好ましくは、ウイルス産生細胞の培養物から産生されたウイルスを回収する前に１時間以上、好ましくは３時間以上、より好ましくは５時間以上、より好ましくは１０時間以上、より好ましくは２０時間以上、グラム陽性菌由来ＮＡの存在下でウイルス産生細胞を培養する。この間に培養上清中にウイルスが蓄積する。
グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼの存在量は、ウイルス産生量を最大化させるように適宜調整することができる。培養液中のグラム陽性菌由来ＮＡの濃度は、例えば、０．１ｍＵ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌであり、好ましくは０．２ｍＵ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは０．５ｍＵ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは１ｍＵ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌである。特に、グラム陽性菌由来ＮＡは１０Ｕ／ｍｌ以下でも十分な力価のウイルスを製造することが可能であり、例えば１Ｕ／ｍｌ以下、０．１Ｕ／ｍｌ以下、０．０５Ｕ／ｍｌ以下、あるいは０．０１Ｕ／ｍｌ以下といった低用量でも高い力価のウイルスをウイルス産生細胞から放出させることができる点で優れている。
本発明の方法を用いて製造されるウイルスベクターは、例えば上記のシアル酸結合膜蛋白質以外にさらに別の蛋白質をエンベロープに含んでいてもよい。例えば、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）蛋白質などのヘマグルチニン活性を有するエンベロープ蛋白質に加えて、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＦ蛋白質などの膜融合に関わるエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。また、所望のウイルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。例えばヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適に用いられる。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質などが挙げられる。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇｐ８５蛋白質、ＥＢウイルスのｇｐ３５０、ｇｐ２２０蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ蛋白質などが挙げられる。
例えば、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ（アンフォトロピックｅｎｖ）の蛋白質、およびネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）蛋白質を含むベクターを、本発明の方法に従って製造することができる。また、本発明の方法により製造されるウイルスは、例えば水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）の表面糖蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質を含むことができる。ＶＳＶ−Ｇはほとんどの動物細胞に存在するリン脂質をレセプターとしていると考えられており、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質およびシアル酸結合蛋白質を含むベクターを用いることにより、遺伝子導入できる細胞種が飛躍的に増え、導入効率も上昇する（ＷＯ０１／９２５０８）。例えば、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質およびネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）蛋白質を含むベクターが例示できる。これらのベクターは、さらにネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＦ蛋白質を含むことができる。すなわち、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＨＡ（またはＨＮ）蛋白質を含むベクター、並びにＶＳＶ−Ｇ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＨＡ（またはＨＮ）蛋白質を含むベクターの製造において本発明は有用である。さらに、これらのベクターは、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＭ蛋白質を含むことができる。本発明は、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質、Ｆ蛋白質、ＨＡ（またはＨＮ）蛋白質、およびＭ蛋白質を含むベクター、並びにＶＳＶ−Ｇ蛋白質、Ｆ蛋白質、ＨＡ（またはＨＮ）蛋白質、およびＭ蛋白質を含むベクターの製造において好適に適用することができる。上記のようなベクターは、粘液を有する細胞や造血幹細胞を含む細胞分画など、従来では遺伝子の導入が困難であった細胞に対しても高い遺伝子導入能を示す点でも優れている。また、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質は１種類の糖蛋白が安定な３量体を形成して膜上に存在するため、精製過程でのベクター粒子の破壊が起こりにくく、遠心による高濃度の濃縮が可能となる（Ｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：Ｓｅｐ，６（９），１２０３−１３．１９９５）。
ベクターのシュードタイプ化のために用いるネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）、Ｆ、およびＭ蛋白質としては特に制限はない。特に、オルトミクソウイルス科、およびパラミクソウイルス科ウイルスの蛋白質は好適である。具体的には、例えば、インフルエンザウイルスおよびセンダイウイルスのエンベロープ蛋白質は好適に用いられ得る。例えば、ウイルス産生細胞においてインフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質を発現させて製造されたＨＡシュードタイプウイルスは、ヒト細胞を含めた広い哺乳動物細胞に感染可能である。ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）、Ｆ、およびＭ蛋白質等は、所望の株由来の蛋白質を用いることができ、例えば病原性ウイルスの蛋白質においては、強毒株または弱毒株由来の蛋白質であってよい。例えばセンダイウイルスのＨＮ、Ｆ、およびＭ蛋白質としては、例えばＺ株由来の蛋白質を用いることができる。インフルエンザウイルスエンベロープ蛋白質としても、所望の単離株由来のものが用いられ得る。
また、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）４０７０Ａ株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、ＭｕＬＶ  １０Ａ１由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばｐＣＬ−１０Ａ１（Ｉｍｇｅｎｅｘ）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））。エコトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）由来のエンベロープ蛋白質を用いることができる。水疱性口内炎ウイルスＧ蛋白（ＶＳＶ−Ｇ）としては、例えばＩｎｄｉａｎａ血清型株（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：５１９−５２８（１９８１））由来の蛋白を用いることができる。これら以外にも、所望の株由来の蛋白質を用いることができる。
ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）、Ｆ、Ｇ、Ｍ、あるいはレトロウイルスエンベロープ蛋白質など、上記のエンベロープ蛋白質は、野生型ウイルスが持つインタクトな蛋白質であってもよいし、天然または人為的に変異が導入されていてもよい。例えば、細胞表面の抗原分子となりうるエンベロープ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用して抗原提示能を弱めた蛋白質を用いてウイルスを作成することも可能である。
例えば、ＨＡ蛋白質またはＨＮ蛋白質などのシアル酸結合活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質や、他のエンベロープ蛋白質の細胞質側領域を欠失、置換、および／または付加により改変した蛋白質を用いてウイルスベクターをシュードタイプ化することにより、より高い遺伝子導入能を有するベクターを製造することが可能である。本発明は、天然に存在するシアル酸結合活性を有する膜蛋白質の細胞質側領域の一部または全部が、置換、欠失、および／または付加により改変された蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターの製造方法に関する。具体的には、例えばネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）蛋白質および／またはＦ蛋白質の細胞質側領域を欠失させたり、他の膜蛋白質（例えばレンチウイルスを含むレトロウイルスのエンベロープ蛋白質）の細胞質側領域で置換または付加した改変蛋白質は、感染効率の高いウイルスベクターを製造するために好適に用いられる。特にシアル酸結合活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質の細胞質側領域が、置換、欠失、および／または付加により野生型から改変されている蛋白質を用いて、より感染効率の高いシュードタイプウイルスベクターを製造することができる。例えばレトロウイルスの製造であれば、細胞質側領域をレトロウイルスのエンベロープ蛋白質のそれに置換したり、あるいはレトロウイルスのエンベロープ蛋白質の細胞質側領域を付加することが好適である。
具体的には、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）蛋白質の細胞質側領域を、ＳＩＶ等のレンチウイルスまたはレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領域に置換した蛋白質、およびネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）蛋白質にレンチウイルス等のレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領域を付加した蛋白質などでレトロウイルスをシュードタイプ化することにより、ヒト細胞を含む広い細胞に高率で外来遺伝子を導入することが可能となる。欠失させる細胞質側領域の範囲、および付加されるレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領域の範囲は特に制限はなく、細胞質側領域の一部または全部を欠失、置換、および／または付加させることができる。
このようなウイルスベクターは、さらにネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの改変されたＦ蛋白質を含むことができる。例えば、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＦ蛋白質の細胞質側領域を欠失させた蛋白質、および、このような欠失蛋白質にＳＩＶ等のレンチウイルスまたはレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領域を付加した蛋白質などが用いられ得る。具体的には、例えばＦ蛋白細胞質側領域のアミノ酸を欠失させた蛋白質を発現するプラスミドを構築する。欠失させる範囲は特に制限はなく、細胞質側領域の一部または全部を欠失させることができる。例えば０〜数個のアミノ酸を残して細胞質側領域を欠失させたＦ蛋白質は、シュードタイプ化レトロウイルスの製造に好適と考えられる。これらの欠失型Ｆ蛋白質に、他のウイルスエンベロープ蛋白質（例えばレンチウイルスエンベロープ蛋白質）の細胞質側領域の一部または全部を付加することにより、Ｆ蛋白質の細胞質側領域を他のペプチドに置換した蛋白質をウイルスの製造に用いることができる。例えば、ＳＩＶのエンベロープ蛋白質の細胞質側領域の５’側より１１アミノ酸を付加した蛋白質などを例示することができる。このように本発明は、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＦ蛋白質であって、該蛋白質の天然型の細胞質側領域の一部または全部が、置換、欠失、および／または付加により改変されている蛋白質をさらに用いてシュードタイプ化ウイルスを製造する方法にも関する。特に本発明は、Ｆ蛋白質の細胞質側領域が、レンチウイルスを含むレトロウイルスのエンベロープ蛋白質の細胞質側領域の一部または全部と置換されている蛋白質をさらに有しているシュードタイプ化ウイルスを製造する方法にも関する。
また、ウイルスエンベロープ蛋白質の細胞外領域を、細胞に接着する活性を持つ他の膜蛋白質、接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片に置換したキメラ蛋白質などを用いて、広範な組織または特定の組織を標的として感染するベクターを作り出すこともできる。
本発明のウイルスの製造方法は、特にレトロウイルスベクターの製造に好適である。レトロウイルスとは、（＋）センス鎖ＲＮＡをゲノムに持ち、逆転写酵素を有することを特徴とするウイルスで、標的細胞に感染すると、逆転写酵素により自身のＲＮＡゲノムをＤＮＡに変換して標的細胞の染色体にこのＤＮＡを組み込むウイルスの総称である。レトロウイルスは野生型レトロウイルスの改変体であってもよく、ウイルス粒子中に含まれているＲＮＡがレトロウイルスのゲノムＲＮＡの少なくとも一部の配列を含んでおり、そのＲＮＡが、ウイルス粒子形成の際に、レトロウイルスのウイルス蛋白質の働きにより、その配列に依存してウイルス粒子中に取り込まれてできる感染性ウイルス粒子であればよい。より具体的には、レトロウイルスのゲノムＲＮＡには、ウイルス粒子への取り込みに必要なパッケージングシグナル配列が含まれている。両端にＬＴＲを持ち、このシグナル配列を含むようなＲＮＡを転写させることにより、レトロウイルスのウイルス蛋白質の存在下、このＲＮＡを持つウイルス粒子が形成される。
本発明においてレトロウイルスベクターは、オンコウイルスに由来するものが含まれる。「オンコウイルス」とは、オンコウイルス亜科（Ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）に属するレトロウイルスを指す。オンコウイルスには、肉腫ウイルス、白血病ウイルス、および乳癌ウイルスなど、発癌に関連するレトロウイルスが含まれる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ；ＭｏＭＬＶ）は、もっとも初期に開発されたレトロウイルスベクターの１つであり、これまでに多くの改良がなされ広く用いられている。ＭｏＭＬＶをネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）蛋白質などのシアル酸結合蛋白質でシュードタイプ化したウイルスベクターは本発明により好適に製造することができる。また、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ；ＭＳＣＶ）も、特に血球系・造血系細胞および胎児性幹細胞などに対する遺伝子導入のためのベクターとして好適に用いられる。例えばネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を持つエンベロープ蛋白質等を用いてシュードタイプ化したＭＳＣＶを用いることにより、造血幹細胞を含む骨髄ＣＤ３４陽性細胞に効率的に遺伝子を導入することができる。
また、本発明においてレトロウイルスベクターは、レンチウイルスに由来するものが含まれる。レンチウイルスとは、レンチウイルス亜科（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）に属するレトロウイルスを指す。レンチウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）（例えばＨＩＶ１またはＨＩＶ２）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディ・ビスナウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などが含まれる。レトロウイルスベクターは、所望の株およびサブタイプに由来するものであってよい。例えばＨＩＶ−１としては、全てのメジャー（Ｍ）サブタイプ（ＡからＪを含む）、Ｎおよびｏｕｔｌｉｅｒ（Ｏ）が含まれる（Ｈｕ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  １９９６；２７５：２１０−２１６；Ｚｈｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，５；３９１（６６６７）：５９４−７；Ｓｉｍｏｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９８，４（９）：１０３２−７）。ＳＩＶ単離株としては、ＳＩＶａｇｍ、ＳＩＶｃｐｚ、ＳＩＶｍａｃ、ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｎｍ、ＳＩＶｓｙｋ等が例示できる。
レンチウイルスの利点の１つは、非分裂細胞に対しても感染し、宿主細胞の染色体へウイルスゲノムを組み込む性質を持つことである。これにはｇａｇおよびｖｐｒにコードされている核移行シグナルやインテグラーゼが重要な働きをしているものと考えられている。この性質を利用し、レンチウイルスをベースとしたウイルスベクターを本発明に従って製造すれば、生体内組織の非分裂細胞、種々の組織の幹細胞のようにほとんど分裂しない細胞へも遺伝子を導入し、長期間の遺伝子発現が可能となるベクターを効率良く製造することができる。
レンチウイルスの中でもっとも早くベクター化の試みが行われたのはヒト免疫不全ウイルスＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）であり、本発明の方法においても好適に適用することができる。また、他にも、ＳＩＶ、ネコ免疫不全ウイルスＦｅｌｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ（ＦＩＶ）（Ｐｏｅｓｃｈｌａ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（３），３５４−７，１９９８）やヤギ関節炎脳炎ウイルスＣａｐｒｉｎｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（ＣＡＥＶ）（Ｍｓｅｌｌｉ−Ｌａｋｈａｌ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４３（４），６８１−９５，１９９８）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）をベースとしたベクターの開発が行われている。これらのベクターの製造に、本発明の方法を適用することも可能である。
サル免疫不全ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）はサルにおけるＨＩＶ類似ウイルスとして発見され、ＨＩＶとともにＰｒｉｍａｔｅｓ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓグループを形成している（井戸栄治，速水正憲，サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染・病原性，蛋白質  核酸  酵素：Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．８，１９９４）。このグループはさらに大きく４つのグループに分類され、１）ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）の原因となるＨＩＶ−１とチンパンジーより分離されたＳＩＶｃｐｚを含むＨＩＶ−１グループ、２）スーティーマンガベイＣｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓより分離されたＳＩＶｓｍｍとアカゲザルＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａより分離されたＳＩＶｍａｃ、およびヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示すＨＩＶ−２（Ｊａｆｆａｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１６（５），３２７−３２，１９９７）よりなるＨＩＶ−２グループ、３）アフリカミドリザルＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓから分離されたＳＩＶａｇｍに代表されるＳＩＶａｇｍグループ、４）マンドリルＰａｐｉｏ  ｓｐｈｉｎｘから分離されたＳＩＶｍｎｄに代表されるＳＩＶｍｎｄグループからなっている。
このうち、ＳＩＶａｇｍおよびＳＩＶｍｎｄでは自然宿主における病原性の報告はなく（Ｏｈｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１５，４１（１），１１５−２２，１９８８；Ｍｉｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．，１８（３−４），２５５−９，１９８９；速水正憲，日本臨床，４７，１，１９８９）、特に本実施例で用いたＳＩＶａｇｍの一種であるＴＹＯ−１株は自然宿主でも、カニクイザルＭａｃａｃａ  ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓ、アカゲザルＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａに対する実験感染でも病原性を示さないことが報告されている（Ａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１（６），：３６７−８４，１９９４；Ｈｏｎｊｏ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．，１９（１），９−２０，１９９０）。ＳＩＶａｇｍのヒトに対する感染、発症については報告がなく、ヒトに対する病原性は知られていないが、一般に霊長類におけるレンチウイルスは種特異性が高く、自然宿主から他種に感染、発症した例は少なく、その発症も低頻度あるいは進行が遅いという傾向がある（Ｎｏｖｅｍｂｒｅ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（５），４０８６−９１，１９９７）。従って、ＳＩＶａｇｍ、特にＳＩＶａｇｍ  ＴＹＯ−１をベースとして作製したウイルスベクターは、ＨＩＶ−１や他のレンチウイルスをベースとしたベクターと比べて安全性が高いと考えられ、本発明において製造されるウイルスとして好適である。
また、本発明においてレトロウイルスベクターは、スプーマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）に由来するものが含まれる。スプーマウイルスには、例えばフォーミーウイルス（Ｆｏａｍｙｖｉｒｕｓ）が含まれる（ＤＥ４３１８３８７；ＷＯ９６０７７４；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９５）２１０，１，１６７−１７８；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０，１，２１７−２２）。フォーミーウイルスに由来するベクターは、ヒト細胞への外来遺伝子導入、特に遺伝子治療および組換えワクチンの投与などに利用され得る。
本発明においてレトロウイルスベクターは、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）に改変を加えることもできる。ＬＴＲはレトロウイルスに特徴的な配列であり、ウイルスゲノムの両端に存在している。５’ＬＴＲはプロモーターとして働き、プロウイルスからのｍＲＮＡの転写を促す。したがって、ウイルスベクターに取り込ませるＲＮＡを発現するベクター（本発明においてこれをジーントランスファーベクターと呼ぶ）の５’ＬＴＲのプロモーター活性をもつ部分を別の強力なプロモーターと置換すれば、ジーントランスファーベクターからのｍＲＮＡ転写量が増大し、パッケージング効率が上昇、ベクター力価を上昇させることが期待できる。さらに、例えばレンチウイルスの場合、５’ＬＴＲはウイルス蛋白質ｔａｔによる転写活性の増強を受けることが知られており、５’ＬＴＲをｔａｔ蛋白質に依存しないプロモーターに置換することで、ウイルスのパッケージングに必要なウイルス遺伝子を発現するベクター（本発明においてこれをパッケージングベクターと呼ぶ）からｔａｔを削除することが可能となる。また、細胞に感染し細胞内に侵入したウイルスＲＮＡは逆転写された後、両端のＬＴＲを結合させた環状構造となり、結合部位とウイルスのインテグラーゼが共役して細胞の染色体内にインテグレートされる。プロウイルスから転写されるｍＲＮＡは５’ＬＴＲ内の転写開始点より下流から３’ＬＴＲのｐｏｌｙＡ配列までであり、５’ＬＴＲのプロモーター部分はウイルス内にパッケージングされない。したがって、プロモーターを置換したとしても標的細胞の染色体に挿入される部分には変化が無い。以上のことから、５’ＬＴＲのプロモーターの置換は、より高力価で安全性の高いベクターを作成することにつながると考えられる。従って、ジーントランスファーベクターの５’側プロモーターの置換を行い、パッケージングされるベクターの力価を上昇させることができる。
また、３’ＬＴＲの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターｍＲＮＡが転写されることを防止するＳｅｌｆ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＳＩＮベクター）（自己不活性化型ベクター）の作成により、安全性を上昇させることも可能である。標的細胞の染色体に侵入したレンチウイルスのプロウイルスは、３’ＬＴＲのＵ３部分を５’端に結合した形となる。したがってジーントランスファーベクターは、標的細胞の染色体では５’端にＵ３が配置され、そこからジーントランスファーベクター全体のＲＮＡが転写されることになる。仮に、標的細胞内にレンチウイルスあるいはその類似の蛋白質が存在した場合、ジーントランスファーベクターが再びパッケージングされ、他の細胞に再感染する可能性がある。また３’ＬＴＲのプロモーターにより、ウイルスゲノムの３’側に位置する宿主由来の遺伝子が発現されてしまう可能性がある（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｐ．，Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｌｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，４７５−５８５，１９９７）。この現象はレトロウイルスベクターにおいてすでに問題とされ、回避の方法としてＳＩＮベクターが開発された（Ｙｕ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３（１０），３１９４−８，１９８６）。ジーントランスファーベクター上の３’ＬＴＲのＵ３部分を欠失させることにより、標的細胞内では５’ＬＴＲや３’ＬＴＲのプロモーターが無くなるため、全長のＲＮＡや宿主遺伝子の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行われることになり、安全性が高く、高発現のベクターとなることが期待される。このようなベクターも、本発明の方法に従って製造することが可能である。ＳＩＮベクター製造のためのジーントランスファーベクターの構築は公知の方法に従えばよい（ＷＯ０１／９２５０８）。
レトロウイルスの産生には、宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターＤＮＡを転写させ、ｇａｇ，ｐｏｌ蛋白質およびエンベロープ蛋白質の存在下でウイルス粒子を形成させる。ジーントランスファーベクターＤＮＡは、プラスミドのようなＤＮＡベクターであってもよく、あるいはパッケージング細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれていてもよい。ジーントランスファーベクターＤＮＡにコードされるパッケージングシグナル配列は、この配列により形成される構造を保持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい一方で、該ベクターＤＮＡ上のパッケージングシグナルと、ｇａｇ，ｐｏｌ蛋白質を供給するパッケージングベクターとの間で起こる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度を抑制するためにはこれらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。従って、ジーントランスファーベクターＤＮＡの構築においては、パッケージング効率および安全性の両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。
パッケージングシグナルとしては、パッケージングベクターが導入された細胞によりパッケージングされる限り制限はなく、パッケージングベクターの種類に合わせて、レトロウイルス由来、レンチウイルス由来、免疫不全ウイルス由来のシグナル配列などが用いられる。
例えば、ＳＩＶａｇｍ由来のパッケージングベクターの場合は、ＨＩＶベクターはパッケージングされないため、用いられるシグナル配列の由来としてはＳＩＶのみに制限されると考えられる。但し、ＨＩＶ由来のパッケージングベクターを用いた場合、ＳＩＶ由来のジーントランスファーベクターもパッケージングされるので、組換えウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成させることが可能であると考えられる。この場合、霊長類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、ＨＩＶとＳＩＶ）であることが好ましい。
ジーントランスファーベクターＤＮＡでは、ｇａｇタンパク質が発現しないように改変されていることが好ましい。ウイルスｇａｇタンパク質は、生体にとって異物として認識され、抗原性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。ｇａｇタンパク質を発現しないようにするためには、ｇａｇの開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレームシフトするように改変することができる。また、ｇａｇタンパク質のコード領域の一部を欠失させることが好ましい。一般にウイルスのパッケージングには、ｇａｇタンパク質のコード領域の５’側が必要であるとされている。従って、ジーントランスファーベクターにおいては、ｇａｇタンパク質コード領域のＣ末側を欠失していることが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与えない範囲でできるだけ広いｇａｇコード領域を欠失させることが好ましい。また、ｇａｇタンパク質の開始コドン（ＡＴＧ）をＡＴＧ以外のコドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パッケージング効率に対する影響が少ないものを適宜選択する。これにより構築されたパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターＤＮＡを、適当なパッケージング細胞に導入することにより、ジーントランスファーベクターＤＮＡの転写産物が取りこまれたウイルスベクターを生産させることができる。生産させたウイルスベクターは、パッケージング細胞の培養上清等から回収することができる。
パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的にウイルスの産生に使用される細胞株であれば制限はない。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株としては、例えば２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３ＥＢＮＡ細胞、ＳＷ４８０細胞、ｕ８７ＭＧ細胞、ＨＯＳ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＴ−４細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＴＥ６７１細胞などが挙げられる。サル由来細胞株としては、例えば、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＭＴ１０細胞などが挙げられる。また、既存のパッケージング細胞を用いることも可能である。パッケージング細胞としては、例えばＢｏｓｃ２３細胞、ＰＥ５０１細胞などが挙げられる。
ベクターが保持する外来遺伝子としては特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸であってもよく、また、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。
近年、遺伝子治療の標的として造血幹細胞をはじめとする各種の幹細胞が注目されている（花園豊，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．７，１９９９）。ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を持つエンベロープ蛋白質を持つシュードタイプレトロウイルスベクターは、ヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性細胞に対し高い効率で遺伝子を導入することができる（ＷＯ０１／９２５０８）が、このＣＤ３４陽性細胞は造血幹細胞を含む分画として近年注目されている。ＣＤ３４陽性細胞は、メチルセルロースを含む培地を用いたコロニーアッセイにおいて多分化能を持つこと（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（３），７７２−７，１９９２）や、複合免疫不全系統であるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＣＤ３４陽性細胞を移植するとマウス骨髄に生着し造血系の再建が認められること（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２（１２），１３２９−３７，１９９６）が報告されており、少なくともＣＤ３４陽性細胞分画中に非常に未熟で幹細胞に近い状態の細胞が存在すると考えられている。また、ＣＤ３４陽性細胞中の造血幹細胞は非分裂状態であり、一般にレトロウイルスベクターでは遺伝子導入効率が低いが（Ｋｉｅｍ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，７（２），１０７−１４，１９９５）、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を持つエンベロープ蛋白質を持つシュードタイプ化ベクターにより感染効率を大幅に改善することが可能であると考えられる。特に、ＨＩＶやＳＩＶベクターなどのレンチウイルスベクターを用いれば、非分裂細胞に対する遺伝子導入効率はさらに上昇することが期待される。本発明のシアル酸結合活性を持つ蛋白質でシュードタイプ化されたレトロウイルスベクターの製造方法は、血球系または造血系細胞への遺伝子導入のためのベクターの製造において有用である。本発明は、本発明のウイルスの製造方法により、血球系または造血系細胞への遺伝子導入用ベクターを製造する方法に関する。また本発明は、本発明の方法で製造されたベクターを血球系または造血系細胞に接触させる工程を含む、血球系または造血系細胞へ遺伝子を導入する方法、および血球系または造血系細胞への遺伝子導入のための、本発明の方法で製造されたベクターの使用に関する。血球系および造血系細胞に対する外来遺伝子導入の評価は、例えば既知の様々な表面抗原に対する抗体を用いたフローサイトメーターによる解析やコロニーアッセイ、造血系を破壊したマウスなどに造血細胞を移植して行う造血系再構築などにより検証することが可能である。
シアル酸結合活性を持つ蛋白質によりシュードタイプ化されたレトロウイルスベクターは、血球系細胞および造血系細胞に対する高率な遺伝子導入が可能であるので、ＡＤＡ欠損症（Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．，３３（１  Ｓｕｐｐｌ），Ｓ４９−５３，１９９３）、血友病（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（１８），９９７３−５，１９９９）、およびＦａｎｃｏｎｉ貧血症などの血液細胞を対象とした遺伝子治療において有用である。投与は例えばエクスビボ法により行うことができる。
具体的には、本発明の方法で製造されるベクターが適用可能な造血細胞系を対象とした遺伝子治療としては、例えは、腫瘍を化学抗癌剤治療するときの幹細胞の保護を目的とした薬剤耐性遺伝子ＭＤＲ１の利用（Ｌｉｃｈｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２０００）７，４，３４８−５８）、ファンコーニ貧血症のための正常ＦＡＮＣＣ遺伝子の導入（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０，１４，２３３７−４６）、エクスビボ幹細胞増殖を補助するためのサイトカインの組み合わせ（トロンボポエチン、インターロイキン６および１１、並びにＦｌｔ−３リガンド）の導入（ＷＯ９９／０７８３１）、血球減少症を治療するためのＦｌｔ−３アゴニストなどのキメラ蛋白質の発現（ＷＯ９８／４６７５０）、βセラミアを治療するためのヒトβグロビン遺伝子の導入（ＷＯ９７４１１４１）、ＩＬ−６依存的な多発性骨髄腫治療のためのＩＬ−６アンタゴニストと自殺遺伝子の発現の組み合わせ治療（独国特許ＤＥ１９７０４９７９）、造血因子の組み合わせによる受容体アゴニスト［インターロイキン（ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ−Ｓｅｒ１７，Ｍ−ＣＳＦ，エリスロポエチン，ＩＬ−１，ＩＬ−１４，ＩＬ−２，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１５）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒトソマトトロピン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、赤血球分化因子（ＥＤＦ）、または幹細胞因子（ＳＣＦ）］（ＷＯ９７／１２９８５）、幹細胞培養および造血疾患の遺伝子治療に用いられるｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト（ＷＯ９７／１２９７８）、ヒト造血始原細胞の増殖に用いられるＩＬ−６およびＩＬ−６可溶型受容体の融合蛋白質（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）１５，２，１４２−４５）、造血始原細胞の増殖に用いられるＩＬ−６スーパーアゴニストおよびスーパーアンタゴニスト（ＷＯ９６／１８６４８）、血液疾患の治療に用いられるＦａｃｔｏｒ−Ｘ（Ｊ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅ．（１９９５）Ｓｕｐｐｌ．２１Ａ，４１０）、ヒト造血始原細胞の増殖に用いられる幹細胞因子、ＩＬ−６、および可溶型ＩＬ−６受容体複合体（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９５）２，９，６９４）、ＲＮＡウイルスを標的とするリボザイムおよびＨＩＶ感染防御および細胞内免疫に有用なアンチセンスおよび／またはＲＮＡデコイ（ＷＯ９６／２２３６８）などの遺伝子導入が挙げられる。本発明は、これらのいずれかまたはその組み合わせをコードするウイルスベクターであって、シアル酸結合膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターの製造方法に関する。
また本発明の方法で製造されるベクターは、鼻腔の粘膜上皮細胞および肺の気管支粘膜上皮細胞など、粘液を持つ細胞に対する感染能力が高い。気管上皮などの粘膜細胞は、従来のウイルスベクターでは遺伝子導入が困難であり、導入に際して物理的障害を取り除く処理がされており、例えばＶＳＶ−ＧシュードタイプＨＩＶベクターを用いた遺伝子導入では二酸化硫黄などにより傷害しないと十分な導入効果が認められていない（Ｌ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，５６８−５７４，２０００）。本発明の方法で製造されるベクターは、従来では遺伝子導入が困難であった粘液を持つ細胞に対して、細胞や組織を傷害することなく高い効率で遺伝子を導入することが可能である（ＷＯ０１／９２５０８）。本発明は、本発明のウイルスの製造方法により、粘液を有する細胞への遺伝子導入ベクターを製造する方法に関する。また本発明は、本発明の方法で製造されたベクターを粘液を有する細胞に接触させる工程を含む、粘液を有する細胞へ遺伝子を導入する方法、および粘液を有する細胞への遺伝子導入のための、本発明の方法で製造されたベクターの使用に関する。粘液を有する細胞としては、特に粘膜上皮細胞、具体的には、例えば鼻腔または肺の気管支の粘膜上皮細胞などが挙げられる。
具体的な適用例としては、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の濃度が高いことを利点として応用した皮膚・粘膜への遺伝子（ＩＬ−２，ＩＦＮ−γ，ＴＧＦ−β等）導入による免疫誘導（ＷＯ９５／０５８５３）、遺伝子の経口的粘膜投与によるロタウイルスワクチン（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２，７，５７５７−６１）、自己免疫疾患を治療するための粘膜投与（ＷＯ９７４６２５３）、感染予防のための粘膜投与（ＷＯ９６／２１３５６）、性病またはパピローマウイルス感染による子宮頚癌を予防するための、女性性器粘膜への遺伝子投与（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６，１，３２２−２９）、粘膜投与による投与の容易性と安全性の向上（Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９５）３６，８６  Ｍｅｅｔ．，４１８）などが挙げられる。
本発明における組み換えレトロウイルスベクターの製造方法は、具体的には、例えば、（ａ）レトロウイルスのゲノムＲＮＡを転写し、かつｇａｇ蛋白質、ｐｏｌ蛋白質、およびシアル酸結合活性を有する膜蛋白質を発現する細胞（ウイルス産生細胞）を提供する工程、および（ｂ）グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼの存在下で該細胞を培養し、産生されたウイルスを回収する工程を含む方法である。レトロウイルスのゲノムＲＮＡは、ウイルス粒子中にパッケージングされ、標的細胞の染色体に組み込まれる機能を有する限り、野生型ウイルスのゲノムから改変されていてよく、例えば両端にＬＴＲを持ち、内部にパッケージングシグナル配列を含むＲＮＡであってよい。ゲノムＲＮＡには、所望の遺伝子を組み込むことができる。組み込まれた外来遺伝子は、ＬＴＲのプロモーター活性により発現させることもできるし、ゲノムの内部に他のプロモーターを組み込んでそのプロモーターから発現させてもよい。
ウイルス産生細胞で発現させるｇａｇおよびｐｏｌ蛋白質、およびゲノムＲＮＡは、これらがアセンブルされてウイルスが形成される限り、異なるウイルスに由来するものであってもよい。例えば、ＨＩＶ由来のウイルス蛋白質を発現するパッケージング細胞を用いて、ＳＩＶのゲノムＲＮＡをパッケージングすることができる。このとき、パッケージング細胞にシアル酸結合活性を持つ膜蛋白質を一時的あるいは持続的に発現させる。グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼの存在下で上記のウイルス産生細胞を培養することにより、シアル酸結合活性を持つ膜蛋白質をエンベロープに持つレトロウイルスが培養液中に放出される。この培養物あるいは培養上清を回収することにより、産生されたウイルスを得ることができる。
例えば本発明におけるレトロウイルスベクターの製造は、次のように行うことができる。但し、以下に示すウイルスベクターの製造方法の具体例は一例であり、当業者であれば適宜変更することが可能である。
組み換えウイルスのシュードタイプ化に用いるウイルスエンベロープ蛋白質をプラスミドベクターを用いて発現させる場合には、例えば該蛋白質をコードする遺伝子をｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ：１０８，１９３−２００，１９９１）等に組み込んで発現ベクターを構築する。このベクターに、例えばネガティブ鎖ＲＮＡウイルス（インフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスなど）のＨＡ（またはＨＮ）蛋白質、Ｆ蛋白質、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子を組み込む。例えば、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）由来ヘマグルチニン蛋白（ＨＡ）発現プラスミドの構築であれば、プラスミドｐＤＲＥＦ  ＨｉｓＤ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４（８），６７７−６８５，２０００）をテンプレートとし、適当なプライマー対を用いたＰＣＲによりＨＡ蛋白質のＯＲＦを増幅する。増幅断片をＮｏｔＩにより切断後、ｐＣＡＧＧＳにＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位を付加したベクターのＮｏｔＩ部位に組み込む。これにより、ＨＡ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ（ＷＯ０１／９２５０８）が得られる。また、センダイウイルスのエンベロープ蛋白質発現プラスミド等であれば、例えばセンダイウイルスＺ株の全長ゲノムＤＮＡ  ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）から切り出したＦ、ＨＮ、およびＭ蛋白遺伝子をｐＣＡＧＧＳのＸｈｏＩサイトに導入することにより、センダイウイルス由来Ｆ、ＨＮおよびＭ蛋白発現ベクター（それぞれｐＣＡＧＧＳ  Ｆ、ｐＣＡＧＧＳ  ＨＮ、およびｐＣＡＧＧＳ  Ｍと称す）（ＷＯ０１／９２５０８）を作製することができる。
レトロウイルス産生であれば、ウイルス産生細胞としては、例えばヒト胎児腎細胞由来細胞株２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．８３９２−８３９６，１９９３）を用いることができる。２９３Ｔ細胞は、例えば１０％非動化ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で培養する。ＤＮＡベクターのトランスフェクションは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）などを用いて添付説明書に従って行うことができる。一例を挙げれば、２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックプレートへ１ウェルあたり１×１０６個の細胞密度でまき、炭酸ガスインキュベーター中（３７℃、１０％炭酸ガス存在下）で４８時間培養する。トランスフェクションの３０分前に培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含むＤ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に培地交換し培養を続ける。
ジーントランスファーベクターとしては特に制限されないが、例えばマウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ；ＭＳＣＶ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）（Ｒ．Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０２９７−１０３０２（１９９６）；Ｒ．Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｒａｐｙ  １：１３６−１３８（１９９４））を用いることができる。ここに、発現させたい所望の遺伝子を組み込んで使用する。トランスフェクションに使用するＤＮＡ量は、例えば１ウェルあたり７００ｎｇのジーントランスファーベクターと、３００ｎｇのパッケージングベクター（ｐＣＬ−Ｅｃｏ，ｐＣＬ−Ａｍｐｈｏ（ＭｕＬＶ  ４０７０Ａ）、共にＩＭＧＥＮＥＸ社）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））とを使用し、それらに加えて２００ｎｇの上記ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープ蛋白発現ベクターを単独あるいは任意に組み合わせて使用することができる。ＤＮＡを１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭに溶解後に６μｌのＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を加えて撹拌後１５分室温で静置する。ＤＮＡとＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）との混合液に、１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥを添加して撹拌後さらに１５分室温で静置する。以上の方法により調製したＤＮＡとＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥとの複合体を含む溶液を６ウェルプレートで培養している２９３Ｔ細胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭酸ガスインキュベーター中（３７℃，１０％炭酸ガス存在下）で３時間培養する。培養後１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と１５μｇ／ｍｌの濃度のトリプシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加し、炭酸ガスインキュベーター中（３７℃，１０％炭酸ガス存在下）で２４時間培養する。その後１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．０１ｕｎｉｔのグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを含むＤＭＥＭに培地交換し、２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのポアサイズのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ  フィルター、ＡＤＶＡＮＴＥＣなど）で濾過してベクター溶液を得ることができる。グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼは、例えば放線菌由来ＮＡ、具体的にはＭ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ由来ＮＡを用いることができる。ＮＡの用量は適宜調整することができる。ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのヘマグルチニン活性を持つエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化したレトロウイルスは、肺の気管支粘膜上皮細胞など粘液を持つ細胞に対して高い感染能力を持つことから。このようにして製造されるベクターは、粘液を持つ細胞への遺伝子導入に有用である。また、このウイルスベクターは、ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４−細胞の両方に遺伝子導入能を持っていることから、造血系細胞に対する遺伝子導入に有用である。
モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）をベースにしたシュードタイプレトロウイルスベクターも、本発明において好適に製造される。また、エンベロープ蛋白質としてＶＳＶ−Ｇをさらに含むベクターを作製することもできる。例えば、ジーントランスファーベクターとして、上記のｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ、またはモロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）由来のＬＴＲの制御下にｌａｃＺを発現するｐＬＺＲＮＬ（Ｙｅｅ，Ｊ．−Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４３，ｐｐ．９９−１１２（１９９４）；Ｘｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１，３３１−３４１（１９８９））を用いて、以下に示すように様々なエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化したレトロウイルスベクターを作製することが可能である。
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養する。この２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーする。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いる。１ウェルあたリジーントランスファーベクター（ｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰまたはｐＬＺＲＮＬ）７００ｎｇに加えて、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｉｎｄｉａｎａ血清型株由来）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１００ｎｇ、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）、Ｆ、およびＭ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ中）をそれぞれ２００ｎｇ、並びにマウスレトロウイルス外殻蛋白発現プラスミドｐＣＬ−Ｅｃｏ、およびｐＣＬ−Ａｍｐｈｏ（Ｉｍｇｅｎｅｘ）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））３００ｎｇを任意に組み合わせて、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後、６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置する。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２下で３時間カルチャーする。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルプミンおよび１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で、２４時間培養、その後１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．０１ｕｎｉｔのグラム陽性菌（例えば放線菌）由来ノイラミニダーゼを含むＤＭＥＭに培地交換し、２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過してベクター溶液を得る。
また、本発明は特にレンチウイルスベクターの製造に好適に適用される。以下に、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターの製造方法の一例を示す。
ベクター系の構築には、例えば非病原性のアフリカミドリザル免疫不全ウイルスのクローンであるＳＩＶａｇｍ  ＴＹＯ−１株を用いることができる。ＳＩＶａｇｍ  ＴＹＯ−１を組み込んだプラスミドとしては、例えばｐＳＡ２１２（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，ｖｏｌ．６４，ｐｐ．３０７−３１２，１９９０）を材料にして構築することができる。ジーントランスファーベクターおよびパッケージングベクターの構築は、公知の文献を参照することができる（ＷＯ０１／９２５０８）。具体的には、ベクター粒子形成に必要な蛋白質を供給するため、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ／ｘの各配列をプロモーター下流に配置した発現プラスミド（パッケージングベクター）を構築する。野生型ウイルスの産生を回避するためパッケージングシグナルΨおよびｅｎｖの大部分を除去することが好ましい。ｇａｇ上流にＳＤ配列、ｔａｔ／ｒｅｖの第一エクソンの下流にＲＲＥ配列を挿入し、パッケージングベクター上のすべての遺伝子が発現しうるようにすることができる。さらに、ベクターのパッケージングに必須ではないと考えらるｎｅｆの全配列を除外することができる。
ベクター内にパッケージングされるＲＮＡを供給するジーントランスファーベクターには、ゲノム両端のＬＴＲ配列、ＳＤ、Ψ、ＲＲＥが組み込まれたものを構築する。さらに、ジーントランスファーベクターの５’ＬＴＲプロモーター領域を外来のプロモーターと置換してもよい。また、３’ＬＴＲの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターｍＲＮＡが転写されることを防止するＳｅｌｆ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＳＩＮベクター）を作製し、プロモーターとして例えばＣＭＶプロモーターを挿入し、その下流に所望の外来遺伝子を組み込む。
シュードタイプベクター粒子を形成するための外殻蛋白質供給ベクターとしてＶＳＶ−Ｇ発現ベクターを用いることができる。例えば、ＶＳＶ−Ｇ供給ベクターとして、これまでにレトロウイルスベクター、ＨＩＶベクターのシュードタイプ化において実績のあるｐＶＳＶ−Ｇを使用してもよい（Ｂｕｒｎｓ，Ｊ，Ｃ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７）。
以下にその詳細を記載する。
＜パッケージングベクターの構築＞
ｖｉｆとｔａｔ／ｒｅｖの第１エクソンを含む領域（５３３７−５７７０）に相当するＤＮＡ断片を適当なプライマー対を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより得る。ＰＣＲプライマーに制限酵素部位であるＥｃｏＲＩ部位を付加することでＤＮＡ断片の３’端にＥｃｏＲＩ部位を持つ断片を調節する。ＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動とＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製する。以上のようにして得たＤＮＡ断片と、ｇａｇ／ｐｏｌ領域をコードするＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ（３５６）部位からＢｇｌＩＩ（５３３８）部位まで）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位へライゲーションする。次に、Ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＲＲＥ）とｔａｔ／ｒｅｖの第２エクソンを含む領域（６９６４−７９９３）に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する。テンプレートとしては、例えばｐＳＡ２１２を用い、ＰＣＲにより３’端にＮｏｔＩ部位を付加し、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断後に精製し、ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖを組み込んだｐＢｌｕｅ  ｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位へ組み込む。
スプライシングドナー（ＳＤ）部位は、この配列を含むＤＮＡ断片を合成し、合成時に５’端にＸｈｏＩ部位、３’端にＳａｌＩ部位を付加し、上記のｇａｇ−ＲＲＥ−ｔａｔ／ｒｅｖを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＸｈｏＩ部位に組み込む。得られたプラスミドをＸｈｏＩとＮｏｔＩにより切断し、ＳＤ−ｇａｇ−ＲＲＥ−ｔａｔ／ｒｅｖを含む断片を精製する。ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．１９３−２００，１９９１）のＥｃｏＲＩ部位にＸｈｏＩ／ＮｏｔＩリンカーを組み込んだプラスミドを作製し、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位に上記のＳＤ−ｇａｇ−ＲＲＥ−ｔａｔ／ｒｅｖ断片を組み込む。以上の方法により得られたプラスミドをパッケージングベクターｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖとして使用する（ＷＯ０１／９２５０８）。
＜ジーントランスファーベクターの構築＞
ＳＩＶａｇｍＴＹＯ１由来の５’ＬＴＲ領域（８５４７−９０５３＋１−９８２、５’端にＫｐｎＩ部位、３’端にＥｃｏＲＩ部位を付加）、３’ＬＴＲを含む領域（８５２１−９１７０、５’端にＮｏｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位、３’端にＳａｃＩ部位を付加）、およびＲＲＥ配列（７３８０−７９９３、５’端にＥｃｏＲＩ部位、３’端にＳａｃＩＩ部位を付加）を適当なプライマー対を用いて、ｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲでそれぞれ増幅する。ｐＥＧＦＰＮ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＣＭＶプロモーター領域（１−６００、５’端にＳａｃＩＩ部位、３’端にＮｏｔＩ部位を付加）を適当なプライマー対で増幅する。これらのＤＮＡ断片の末端を切断、精製後にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位に５’ＬＴＲ→ＲＲＥ→ＣＭＶプロモーター→３’ＬＴＲの順でライゲーションし組み込む。レポーター遺伝子としで例えばｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片をＮｏｔＩ部位へ組み込み、ＫｐｎＩ−ＳａｃＩで切断して５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでを含むＤＮＡ断片を切り出し、ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位へ組み込み、ジーントランスファーベクターｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶ  Ｆ  β−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲとする。
また、ｐＥＧＦＰＣ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＣＭＶプロモーター領域とＥＧＦＰをコードする領域（１−１３３０、５’端にＳａｃＩＩ部位、３’端にＮｏｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位と翻訳ストップコドンを付加）を適当なプライマー対を用いてｐＥＧＦＰＣ２をテンプレートとしたＰＣＲにより増幅する。４種のＰＣＲ断片をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩ、ＢａｍＨＩとＳａｃＩ、ＳａｃＩＩとＢａｍＨ切断した後に精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ−ＳａｃＩの間に５’ＬＴＲ→ＲＲＥ→ＣＭＶプロモーターＥＧＦＰ→３’ＬＴＲの順にライゲーションして組み込む（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。プラスミドｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲをＫｐｎＩ−ＳａｃＩで切断して５’ＬＴＲ−３’ＬＴＲを含むＤＮＡ断片を調製し、ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位へ組み込み、ベクター（ｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）を構築する。
＜５’ＬＴＲの改変＞
５’ＬＴＲのＴＡＴＡボックスの下流からｇａｇ領域（９０３９−９１７０＋１−９８２）を含む断片を適当なプライマー対を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲで増幅する。サイトメガロウイルス由来のＣＭＶ  Ｌプロモーター（ｐＣＩ（ｐｒｏｍｅｇａ）由来、１−７２１）をＰＣＲにより増幅する。５’ＬＴＲのＴＡＴＡボックス下流を含む断片と、プロモーターを含む断片とを混合し、これをテンプレートとして、プロモーターの５’側プライマーとＬＴＲの３’側プライマーを用いてＰＣＲを行い、プロモーターと５’ＬＴＲとのキメラプロモーターのＤＮＡ断片を得る。得られたＤＮＡ断片をジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ部位に組み込む（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。同様に、上記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を、ベクターｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ部位にも組み込む（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。
＜３’ＬＴＲの改変；ＳＩＮ（ｓｅｌｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）ベクターの作製＞
３’ＬＴＲのＵ３領域５’側２７ｂｐと３’側１５ｂｐおよびＲ領域を含むＤＮＡ断片を適当なプライマー対を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲで増幅する。この断片を、前節で得られたキメラプロモーター導入ジーントランスファーベクターｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲのＳａｌＩ−ＳａｃＩ部位に組み込む（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３’ＬＴＲΔＵ３）。同様に、この断片をｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲのＳａｌＩ−ＳａｃＩ位へも組み込む（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）（ＷＯ０１／９２５０８）。
構築したプラスミドは、定法に従いＤＨ５α（東洋紡）にトランスフォームし、寒天培地上で培養、出現したコロニーをテンプレートとして、ＰＣＲ等により構造が正しいことを確認する。確認されたクローンについて、１００ｍｌのＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製する。
＜ウイルスベクター回収＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーする。培養液を１ウェルあたり８００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（ＨＡを用いた場合は１％ＢＳＡを含む）に置換してトランスフェクションに用いる。１ウェルあたり上記のジーントランスファーベクター６００ｎｇおよび上記のパッケージングベクター３００ｎｇに加え、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）およびＦ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ中）１００−３００ｎｇ．ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１００ｎｇ等のエンベロープ蛋白質発現プラスミドを任意に組み合わせて、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置する。これに、４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えた１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭを添加し攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーする。１ウェルあたり１ｍｌの２０％非働化ウシ血清（ＨＡを用いた場合はウシ血清の代わりに１％ＢＳＡおよび５μｇ／ｍｌのトリプシン）を含むＤ−ＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１２時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１０％非働化ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭに培地交換し、（ＨＡを用いた場合はウシ血清の代わりに１％ＢＳＡおよび５μｇ／ｍｌのトリプシンを含むＤ−ＭＥＭにてＭ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ由来ＮＡの存在下で）２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものを使用する。
＜ＳＩＶａｇｍベクターによる遺伝子導入＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーする。カルチャーより培養液を除去し、ベクター液にポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度８μｇ／ｍｌで添加したものを１ｍｌ重層し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーし、ベクターを感染させる。３時間後に培養液を１ｍｌ加え、１日後に培養液を交換する。さらに１日後に、β−Ｇａｌ発現ベクターの場合は、β−Ｇａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＸ−ｇａｌを基質とした染色を行い、標的細胞でのβガラクトシダーゼの発現を光学顕微鏡による検鏡で確認する。ＥＧＦＰ発現ベクターの場合は、蛍光顕微鏡により解析する。
＜ベクターの力価測定＞
ベクターの力価測定は、ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって計算する。２９３Ｔ細胞を１×１０６／ｐｌａｔｅで６ウェルカルチャープレートにまき、４８−７２時間カルチャーする。ここに、上記と同様の方法で段階的に希釈したベクター液を感染、感染後４８時間後にＸ−ｇａｌ染色を行う。光学顕微鏡で２００倍の倍率で検鏡、例えば視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数８５４．８６５をかけることにより力価の算出を行う。これにより算出されるウイルスベクターの力価の単位はＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌと定義される。
このようにして作製されるＳＩＶａｇｍベクターは、培養細胞および生体内外の細胞に対して高い遺伝子導入能を持つ。上記のような、ジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、およびエンベロープ発現ベクターという複数種類の独立したプラスミドのコトランスフェクションによるベクターのパッケージングにおいては、野生型ウイルスの再構成の確率は極めて低いと考えられる。また、ベースであるＳＩＶａｇｍＴＹＯ−１は、自然感染および実験的な感染の両方において病原性を示さないことが確認されている（Ｏｈｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１，１１５−２２，１９８８；Ｍｉｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．１８（３−４），２５５−９．１９８９；Ｈｏｎｊｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．１９（１），９−２０，１９９０）。さらに、一般にレンチウイルスは種特異性が強く、他種の動物では病原性が低い傾向がある（Ｎｏｖｅｍｂｒｅ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（５），４０８６−９１，１９９７）ことからもベクターの安全性は高いものと考えられる。
このベクター産生系は、構築過程においてパッケージングベクター上からはパッケージングシグナル配列が削除されているため、ウイルス蛋白質をコードするＲＮＡは粒子内にパッケージングされない。また、ｒｅｖ蛋白質はＲＲＥに結合し、ＲＮＡの細胞質への輸送やスプライシングの抑制などを行うことでウイルス蛋白質の発現、全長ＲＮＡのウイルス内への取り込みが行われるため、パッケージングベクターおよびジーントランスファーベクターの双方にＲＲＥを組み込んだことにより、パッケージングベクターのｍＲＮＡスプライシングが制御され、すべての遺伝子の発現が可能となると考えられる。さらに、ジーントランスファーベクターのｍＲＮＡが細胞質に運搬され、ベクター粒子内にパッケージングされると考えられる。ｖｉｆ、ｖｐｒ／ｘについては、ＨＩＶ−１ベクターでは除去している場合もあり（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１），８４６３−７１，１９９８）、ベクター粒子のパッケージングおよび機能にとって必須ではない可能性がある。ｖｐｒは非分裂細胞に対する感染性の一因であるとも考えられており（Ｈｅｉｎｚｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１５），７３１１−５，１９９４）、ＨＩＶ−１ベクターではｖｐｒの有無により遺伝子導入できる細胞が異なるという報告がある（Ｋｉｍ，Ｖ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１），８１１−６．１９９８）。上記においてパッケージングベクターから完全に除去したｎｅｆは、ＳＩＶによる免疫不全症を引き起こす原因の一つであることがサルを用いた感染実験で報告されている（ｖｏｎ  Ｇｅｇｅｒｆｅｌｔ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，６１５９−６５，１９９９；Ｋｅｓｔｌｅｒ，Ｈ．Ｗ．３ｄ．，Ｎａｉｄｕ，Ｙ．Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．，Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｗ．，Ｄａｎｉｅｌ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｅｓ  ｏｆ  ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．１８（３−４）：３０５−９，１９８９）。上記で構築したＳＩＶａｇｍベクターではこの配列を完全に除去しているため、仮にパッケージングベクター由来のウイルス遺伝子を含む再構成ウイルス粒子ができたとしても、病原性を持つ危険性がさらに低下していると考えられる。
レンチウイルスをベースとしたベクターは、ベースのウイルスが非分裂状態の細胞に対し感染性を持つことから、細胞周期を停止した培養細胞や神経細胞に対して遺伝子導入能を持つことが期待される（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ：２７２２６３−２６７，１９９６；Ｓｕｔｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（５），３６４９−６０，１９９９）。さらに、ＶＳＶ−Ｇによるシュードタイプ化を行うことにより、感染指向性はベースであるＳＩＶのようにＣＤ４およびケモカインレセプター陽性細胞に限定されない。ＶＳＶ−Ｇのレセプターはリン脂質の一種であるホスファチジルセリンであることが知られており、この分子はさまざまな細胞上に存在する（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，，Ｃｅｌｌ，３２（２），６３９−４６，１９８３）。このためＶＳＶ−Ｇによってシュードタイプ化を行ったＳＩＶａｇｍベクターの感染指向性は非常に広い。このベクターを基にシアル酸結合活性を有する膜蛋白質によりシュードタイプ化されたウイルスを作製することにより、ほぼすべての動物細胞に高い効率で遺伝子導入が可能となると予想される。
ウイルスベクター作製の際のプラスミドベクターの細胞へのトランスフェクション量は、適宜調整することが可能である。例えば、これに制限されるものではないが、次のような方法も例示できる。
１．細胞培養
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養する。
２．ベクターの作製
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーする。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いる。１ウェルあたリジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３またはｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３ＬＴＲΔＵ３）１２００ｎｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）３６０ｎｇに加え、エンベロープ蛋白質を発現するＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１２０ｎｇ、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）、Ｆ、およびＭ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ中）のそれぞれ２４０ｎｇを任意に組み合わせて１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置する。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２下で３時間カルチャーする。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、および１５μｇ／ｍｌ（ＨＡの場合１０μｇ／ｍｌ）のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で、２４時間培養する。その後１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、７．５μｇ／ｍｌ（ＨＡの場合５μｇ／ｍｌ）のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．０１ｕｎｉｔのグラム陽性菌（例えば放線菌）由来ノイラミニダーゼを含むＤＭＥＭに培地交換し、２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過してベクター溶液を得る。
ベクターの大量調製および濃縮は、例えば以下のようにして行われる。例えば、２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのプラスチックシャーレへ１枚あたり５×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーする。培養液を１ウェルあたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いる。シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター８μｇ、パッケージングベクター２．４μｇ、それにＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）０．８μｇ、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＨＡ（またはＨＮ）およびＦ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ中）のそれぞれ１．６μｇを任意に組み合わせて、１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後、４０μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置する。これに、６０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加した１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭを加え攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２下で３時間カルチャーする。シャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で、２４時間培養する。シャーレ１枚あたり２０ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、７．５μｇ／ｍｌ（ＨＡの場合５μｇ／ｍｌ）のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．０５〜０．５Ｕ程度のグラム陽性菌（例えば放線菌）由来ＮＡを含むＤ−ＭＥＭに培地交換し、３７℃、１０％ＣＯ２で、２４時間培養した後培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過し、４２，４９０×ｇ（Ｆ／ＨＮの場合１６，０００×ｇ）（ＴＯＭＹ  ＳＲＸ−２０１，ＴＡ２１ＢＨ）、４℃、９０分遠心する。ペレットをＰＢＳ（５％ＦＣＳ，２μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）に溶解し、使用まで−８０℃に保存する。
例えば、インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質でシュードタイプ化したレンチウイルスベクターは濃縮が可能である。濃縮は、例えば次のようにして実施できる。２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのプラスチックシャーレへ１枚あたり５×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーする。培養液をシャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。シャーレ１枚あたリジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＬａｃＺ／３ＬＴＲΔＵ３）８μｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）２．４μｇ、インフルエンザＨＡ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ１．６μｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後、４０μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置する。これに、１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した６０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーする。シャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１０μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、シャーレ１枚あたり２０ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）およびおよび０．０５〜０．５Ｕ程度のグラム陽性菌（例えば放線菌）由来ＮＡを含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過する。１６，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−２５Ｉ、ＪＡ−１８）、４℃、１時間遠心する。ペレットをＰＢＳ（５％ＦＣＳ、２μｇ／ｍｌポリブレンを含む）に溶解し、−８０℃で保存する。インフルエンザウイルスＨＡを用いることにより、ＶＳＶ−Ｇなど他のエンベロープ蛋白質を共発現させることなく遺伝子導入が認められる。ＨＡシュードタイプベクターは遠心により高度の濃縮が可能である。
シアル酸結合活性を持つ２種またはそれ以上の蛋白質を用いて、シュードタイプレンチウイルスベクターを作製することも可能である。例えば、インフルエンザウイルスおよびセンダイウイルスエンベロープシュードタイプレンチウイルスベクターの製造の例を示す。
＜細胞培養＞
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養する。
＜ベクターの作製＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーする。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いる。１ウェルあたりジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）１２００ｎｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）３６０ｎｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮおよびＨＡ蛋白発現プラスミドそれぞれ２４０ｎｇを１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置する。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーする。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１０μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後する。その後１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．０１ｕｎｉｔのグラム陽性菌（例えば放線菌）由来ノイラミニダーゼを含むＤＭＥＭに培地交換し、２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過してウイルス溶液を得る。
本発明の方法で製造されたベクターは、周知のウイルス精製方法により精製することができる。精製方法は、上記した遠心分離、あるいはフィルトレーション（濾過）、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。これにより、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質を含む実質的に純粋なウイルスベクターを得ることができる。実質的に純粋ウイルスベクターとは、該ウイルスベクターが、核酸を細胞に導入する能力を持つ他のウイルスベクターを実質的に有さないことを言う。実質的に純粋なウイルスベクターは、ウイルス産生細胞の細胞破砕物や他の不純物を含まないことが好ましい。
本発明の方法で製造されたウイルスベクターは、薬学的に許容される担体または媒体と適宜組み合わせて組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などと適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。本発明の方法で製造されたウイルスベクターを含む組成物は試薬または医薬として有用である。該組成物は、例えば、各種細胞に対するインビトロまたはインビボでの遺伝子導入試薬として、または、エクスビボまたはインビボでの遺伝子治療のための医薬として有用である。患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経腸投与、経口投与、鼻腔内投与、エクスビボ投与など当業者に公知の方法により行いうる。特に鼻腔または気管支粘膜への投与、および血球系・造血系細胞へのエクスビボ投与は好適である。ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。
本発明の方法で製造されたウイルスベクターは、各種遺伝性疾患の遺伝子治療にも応用が可能である。対象となる疾患は特に制限されない。例えば、対象となり得る疾患とその単一原因遺伝子としては、ゴーシェ病においてはβ−セレブロシダーゼ（第２０染色体）、血友病においては血液凝固第８因子（Ｘ染色体）および血液凝固第９因子（Ｘ染色体）、アデノシンデアミナーゼ欠損症においてはアデノシンデアミナーゼ、フェニルケトン尿症においてはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（第１２染色体）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーにおいてはジストロフィン（Ｘ染色体）、家族性高コレステロール血症においてはＬＤＬレセプター（第１９染色体）、嚢ほう性繊維症においてはＣＦＴＲ遺伝子の染色体への組み込み等が挙げられる。それら以外の複数の遺伝子が関与していると思われている対象疾患としては、アルツハイマー、パーキンソン病等の神経変性疾患、虚血性脳障害、痴呆、またエイズ等の難治性の感染症等が考えられる。エイズ患者の造血幹細胞を細胞外にとりだしｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＩＶベースの本発明の方法で製造されたベクターを導入し、ＨＩＶの感染が起こる前にＳＩＶに由来するゲノム転写を優勢にして、患者の体に戻し、ＨＩＶの転写因子を無効にする治療方法が考えられる。さらには、慢性疾患への応用として、虚血性心疾患においてはＶＥＧＦならびにＦＧＦ２遺伝子、動脈硬化の遺伝子治療に関しては、細胞増殖関連遺伝子、例えば細胞増殖因子（ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β等）、Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ等の発現抑制への応用が可能となる。また糖尿病においてはＢＤＮＦ遺伝子が候補となりうる。またこの方法により、遺伝子変異が癌化を引き起こす癌抑制遺伝子ｐ５３等の遺伝子を染色体に組み込む補充治療への応用、多剤耐性遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄由来造血幹細胞に導入した後、患者の血液に戻すことによって、癌の薬物治療の限界を超えた治療が可能となる。自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ、糸球体腎炎等の遺伝子治療に関しては、Ｔ細胞レセプター、各種接着因子（例えばＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＣＡＭ−１、ＬＦＡ−４等）、サイトカインおよびサイトカインレセプター（例えばＴＮＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１等）、細胞増殖因子（例えばＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β等）、作用因子（例えばＭＭＰ等）のアンチセンス発現による発現抑制への応用が可能となる。アレルギー性疾患の遺伝子治療に関しては、ＩＬ−４、ＦｃεＲ−Ｉ等のアンチセンス発現による発現抑制への応用が可能となる。臓器移植に関連する遺伝子治療に関しては、ヒト以外の動物ドナーの組織適合性抗原をヒト型に変えて異種移植の成功率を高める応用が可能となる。さらにはヒトＥＳ細胞の染色体に外来遺伝子を導入し、胚の段階で欠損する遺伝子を補って、体循環する酵素、成長因子等の不足を補充する治療が考えられる。
例えば、ＩＬ−４はヘルパーＴリンパ球のＴｈ２リンパ球への分化を促す。Ｔｈ２リンパ球はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３といった喘息の炎症を媒介するサイトカインを分泌する。ＩＬ−４は呼吸障害に関与する肺粘液膜からの粘液分泌を誘導する分子の１つである。ＩＬ−４は、好酸球表面に存在するＶＬＡ４分子と相互作用する細胞接着分子であるＶＣＡＭ−１の発現を制御している。この相互作用により、好酸球は血液中から肺組織の炎症部位へ移動することができる。ＩＬ−４はＢ細胞の増強と、アレルギー反応を引き起こすために必要な抗原特異的ＩｇＥの産生を誘導する。抗原特異的ＩｇＥはマスト細胞がヒスタミン、ロイコトリエンといった炎症の媒介となる物質の放出を引き起こし、これらが、気管支収縮を引き起こす。このようなＩＬ−４の役割から、喘息患者を対象とした可溶性インターロイキン４（ＩＬ−４）受容体などを発現するベクターも有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ由来ＮＡを用いて製造したウイルスによる遺伝子導入を示す写真である（右側のＮＡ）。対照としてＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＮＡを用いて同様にウイルスを製造し、同量のウイルス産生細胞の培養上清を用いて遺伝子を導入した（左側のｖｃＮＡ）。
図２は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ由来ＮＡを用量を変えて用いて製造した場合のウイルスの力価を示す写真である。ウイルス産生細胞の培養上清を同量用い、それぞれ同じ条件下で遺伝子導入を行なった。各パネルの上の数値はノイラミニダーゼ添加量（ｕｎｉｔ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  グラム陽性菌由来のＮＡを使用したインフルエンザウイルスエンベロープシュードタイプＳＩＶベクターの調製
細胞培養
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．８３９２−８３９６，１９９３）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。
ベクターの作製
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたりジーントランスファーベクターｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３  １２００ｎｇ、パッケージングベクターｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ３６０ｎｇ、ＨＡ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ２４０ｎｇを１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した（ＷＯ０１／９２５０８）。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１０μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．０１ｕｎｉｔのＭ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ精製ノイラミニダーゼを含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものを使用した。対照として、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの精製ノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）０．０５ｕｎｉｔを用いて同様にベクターを製造した。
ＳＩＶａｇｍベクターによる遺伝子導入
標的となる２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり１×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間培養した。カルチャープレートより培養液を除去し、ベクター液にポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度８μｇ／ｍｌで添加したものを１ｍｌ重層し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間培養し、ベクターを感染させた。３時間後に２０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含む培養液を１ｍｌ加え、３７℃、１０％ＣＯ２で４８〜７２時間培養した。
ベクターの力価測定
ベクターの力価測定は、ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって計算した。上記の方法で１ｍｌのベクター液を感染、感染後７２時間後に蛍光倒立型顕微鏡（ＤＭＩＲＢ（ＳＬＲ）、ライカ）にて２００倍の倍率で検鏡、視野内の遺伝子導入細胞（ＧＦＰ陽性細胞）数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数８５４．８６５をかけることにより力価の算出を行った。力価の単位はＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（ＴＵ）／ｍｌで表記することとした。その結果、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ由来ＮＡ（ＶｃＮＡ）を用いた場合の力価が２．８×１０４（ＴＵ／ｍｌ）であったのに対し、Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ由来ＮＡ（ＭｖＮＡ）を用いた場合の力価は１．１×１０５と有意に高かった（図１）。
［実施例２］  ＨＡシュードタイプＳＩＶベクターの製造におけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ由来ＮＡの添加量の効果
上記と同様のＨＡシュードタイプＳＩＶベクターの調製において、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＮＡを添加量を変えて用い、その効果を検証した。その結果、ＮＡの添加量が０．０１〜０．１Ｕ（０．００５〜０．０５Ｕ／ｍｌ）の間で力価にほとんど変化はなかった。この結果より、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＮＡを使用したベクターの力価が低いのは、使用したＮＡの量が少ないことによるものではないと考えられる（図２）。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターを製造する新規な方法が提供された。グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼは安価であり、低用量でも高い力価のウイルス産生が可能であることから、工業的なウイルスの大量生産において、本発明の方法はコストパフォーマンスに優れている。製造されるベクターは、遺伝子治療などの臨床場面において好適に用いられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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