(57)【要約】ヒト変形性関節症（ＯＡ）患者滑膜組織に比較して、ヒト慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者滑膜組織において発現量が亢進している新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞、及び前記ポリペプチドに対する抗体を開示する。更に、前記ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド、ＲＡ診断に有用な検査方法、及びＲＡ診断に有用な検査用キットを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求の範囲１または請求の範囲２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求の範囲３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求の範囲４に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みしかも慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みしかも慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。
【請求項７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９で表されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
（１）被験者の滑膜生検サンプルにおける、ｉ）請求の範囲３に記載の塩基配列あるいはｉｉ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、若しくは配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する工程、及び（２）健常者または非慢性関節リウマチ患者の滑膜生検サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする、関節リウマチの検査方法。
【請求項９】
（１）請求の範囲３に記載のポリヌクレオチド、あるいは（２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、若しくは配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで表される遺伝子を特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向プライマーを含む慢性関節リウマチ検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）に関連する新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞及びＲＡ診断に有用な検査方法に関する。
【背景技術】  ＲＡは滑膜組織に病変の主座を持ち、関節の発赤、腫脹、熱感、疼痛、運動制限、および破壊をもたらす原因不明の慢性炎症性疾患である。ＲＡの滑膜組織では、インターロイキン−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１、ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカイン、一酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ、ＮＯ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ、ＰＧｓ）などの過剰産生が知られている（非特許文献１参照）。また、滑膜組織を構成する免疫担当細胞はＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド系、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）／ＬＦＡ−１（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）系などの細胞表面分子を介して相互に活性化しあい、炎症反応の遷延に関与すると考えられている（非特許文献２参照）。近年、モノクローナル抗体、可溶性受容体などを用い、ＩＬ−１、ＩＬ−６やＴＮＦ−αを標的とした治療法が開発されその有効性が注目を集めている（非特許文献３参照）。しかし、従来の治療標的分子を機序とする治療法では完全寛解導入には至らない患者群が存在する（非特許文献４参照）。従って、既存の報告とは異なる新しい治療標的分子の同定が望まれている。
また、ＲＡ病態解析が進むにつれて、滑膜の炎症、免疫異常を標的に、滑膜過増殖を抑制し、関節の骨破壊を抑制、あるいは遅延する療法の挑戦とともに、ＲＡの早期診断、早期治療の意義が注目されている。一方、米国の大学からＲＡの分類に関する基準が定義されているが（非特許文献５参照）、これらの基準は単なるランドマークであり、その病状パターンが多様であるため、ＲＡの診断、特に定量的かつ簡便な診断は困難であるとされてきた。従って、定量的かつ簡便なＲＡの診断方法が待望されている。
本発明のポリペプチドの一つであるＲＡ２の配列に関連する配列が、データベースｇｅｎｐｅｐｔにＡＫ０９４４６１（２００２．７．１５）として収載され、特許文献１、特許文献２、及び特許文献３に記載されている。特許文献１には、当該ポリペプチドのアンタゴニストは炎症反応を緩和するために処理することができ、例えば、動脈硬化の心臓病、炎症性腸疾病、クローン病、慢性関節リウマチおよび膵臓炎を治療するために処置することができるとの記載がある。特許文献２には、ＲＡ２と相同性のある配列を含む多数の蛋白質が記載され、癌、消化剤障害、免疫障害、内分泌腺疾患（例えば糖尿病）、神経疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン、クロイツフェルトヤーコプ病、脳脊髄炎、脳膜炎、精神分裂病）および結合性疾患（例えば骨粗鬆症、関節炎）等の治療に有用であることが記載されている。特許文献３には、ＲＡ２遺伝子配列に相同性のある配列を含む多数の遺伝子が挙げられ、各々は組織発現分布に基づき、増殖性疾患、癌、腫瘍、造血性疾患、免疫系の疾病、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患（例えば慢性関節リウマチ）、炎症、アレルギー、神経性疾患（例えばアルツハイマー病）、認識障害、精神分裂病、喘息、皮膚病（例えば乾癬）、敗血症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心血管障害、腎臓障害、胃腸病、妊娠に関連する障害、内分泌腺障害および伝染病等の処置に有用であると述べられている。
本発明のポリペプチドの一つであるＤＧＰＰ１Ｌ及びＤＧＰＰ１Ｓの配列と相同性のある配列が、データベースｇｅｎｐｅｐｔにＢＣ０３３０２５（２００２．６．２４）として収載されている。
本発明のポリペプチドの一つであるＤＧＰＰ２Ｌと相同性のある配列が、特許文献４、特許文献５、及び特許文献６に記載されている。このうち特許文献４要約中には、ＤＧＰＰ２Ｌと相同性のある配列は悪性腫瘍、血液疾患、ＨＩＶ感染、免疫性疾患および種々の炎症の診断、処置に有用と記載されている。特許文献５にはＤＧＰＰ２Ｌと相同性のある配列は過増殖性疾患のような腫瘍性疾患を含む疾患の診断、治療、予防／予後に有用であること、神経性疾患、免疫系疾患、筋疾患、生殖性疾患、消化関係の疾患、肺疾患、循環器疾患、又は腎疾患のような疾患の治療にも有用であること、また、当該ポリペプチドの異常な発現や活性と関わる疾患の検査薬として有用であり、癌や慢性関節リウマチの処置に有用であることが記載されている。特許文献６にはＤＧＰＰ２Ｌと相同性の高い配列が開示され、過増殖性疾患（例えば癌）、免疫不全性疾患（例えばＡＩＤＳ）、自己免疫疾患（例えば関節炎）、神経性疾患（例えばアルツハイマー病）、代謝異常（例えばフェニルケトン尿症）、炎症性疾患（例えば喘息）、循環器病（例えばアテローム性動脈硬化症）、血液疾患（血友病）、生殖性疾患（例えば不妊症）及び感染症（例えばインフルエンザ）等の検査、処置、予防または予後に有用であると記載されている。
本発明のポリペプチドの一つであるＤＧＰＰ２Ｓと同一の配列が前記特許文献４に記載され、相同性のある配列が前記特許文献５及び特許文献６に記載されている。
【特許文献１】国際公開第００／４２０７０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／７７１３７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／３２９１０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／２６７９８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／５５１６３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０１／５５３０１号パンフレット
【非特許文献１】「ザ・ジャーナル・オブ・エクスメンタル・メディシン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、（米国）、１９９１年、第１７３巻、ｐ．５６９−５７４
【非特許文献２】「ザ・ジャーナル・オブ・リューマトロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、（カナダ）、２００２年、第２９巻、ｐ．８７５−８８２
【非特許文献３】「カレント・ファーマシューティカル・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２０００年、第１巻、ｐ．２１７−２３３
【非特許文献４】「ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、（英国）、２００２年、第２巻、ｐ．３６４−３７１
【非特許文献５】ジェー・アックスフォード（Ｊ．Ａｘｆｏｒｄ）編、「メディシン（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、（米国）、ブラックウエルサイセンス（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９６年、ｐ３．１８−３．２２
【発明の開示】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡを鋳型として６つの遺伝子全長配列を取得することに成功した（実施例１）。このうち、５つは新規な遺伝子であった。また、前記６つの遺伝子がコードする蛋白質を動物細胞株で発現することに成功した（実施例２）。更に、前記６つの遺伝子は、ヒトＲＡ患者滑膜組織において発現量が亢進していることを見出した。加えて、ＲＡの病理所見スコアーに連動して前記各遺伝子の発現量が亢進していること、すなわちＲＡの炎症症状の重篤性と前記各遺伝子の発現量の亢進が相関することを見出した（実施例４）。これらの知見から、ＲＡの進行度を検出することができるＲＡ診断法として有用な検査方法を可能にした。
これらの結果、新規遺伝子、前記遺伝子がコードする蛋白質、前記遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された細胞及び抗体、並びにＲＡの診断に有用な検査方法及び該検査用キットを提供し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］（１）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、
［２］配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］［１］または、［２］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［４］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［５］［４］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みしかも慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みしかも慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、
［７］配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９で表されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド、
［８］（１）被験者の滑膜生検サンプルにおける、ｉ）［３］に記載の塩基配列あるいはｉｉ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、若しくは配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する工程、及び（２）健常者または非慢性関節リウマチ患者の滑膜生検サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする、関節リウマチの検査方法、
［９］（１）［３］に記載のポリヌクレオチド、あるいは（２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者において発現が増強するポリペプチド、若しくは配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで表される遺伝子を特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向プライマーを含む慢性関節リウマチ検査用キット
に関する。
本発明のポリペプチドの一つであるＲＡ２と同一の配列は知られていないが、相同性のある配列がデータベースｇｅｎｐｅｐｔにＡＫ０９４４６１（２００２．７．１５）として収載され、特許文献１、特許文献２、及び特許文献３に記載されている。特許文献１、特許文献２、及び特許文献３には、当該ポリペプチド等が関与するとして多数の疾患を列挙しておりその中に慢性関節リウマチや関節炎が含まれている。しかしながら、特許文献１は当該分子がリンパ節、脾臓、胸腺、精巣、小腸、ヒト大動脈内皮細胞、平滑筋、腎臓、マスト細胞、好酸球、扁桃腺、膵臓、大腸、末梢血リンパ細胞、胃、気管、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋を含むＴ細胞および骨髄などで発現することのみから当該分子がサイトカインであって、当該分子のアンタゴニストはＲＡを含む炎症性疾患に有用であると記載している。特許文献２には当該分子に関する実施例は全く記載されていない。特許文献３には複数の分子が記載され実施例の記載を見ると現在形で記載されているにすぎない。しかも、特許文献１〜３には、当該分子の滑膜での発現の有無やＲＡ患者での発現量については全く記載されていない。従ってＲＡ２がＲＡの診断に有用であることは本発明者らが初めて見出した知見であり、更には、この知見を利用したＲＡの検査方法は本発明者らによって初めてなされた発明である。
本発明のポリペプチドの一つであるＲＡ３と同一又は相同性の高い配列は知られていない。従って、ＲＡ３は本発明者らが初めて見出し、取得したポリペプチドであり、ＲＡ３の発現量がＲＡの炎症症状の重篤性と相関して亢進することは本発明者らが初めて見出した知見である。
本発明のポリペプチドの一つであるＤＧＰＰ１Ｌ及びＤＧＰＰ１Ｓと同一の配列は知られていない。これらと相同性のある配列が、データベースｇｅｎｐｅｐｔにＢＣ０３３０２５（２００２．６．２４）として収載されているがその機能については不明である。しかも、ＤＧＰＰ１Ｌ及びＤＧＰＰ１ＳがＲＡの検査に有用であることは本発明者らが初めて見出した知見である。
本発明のポリペプチドの一つであるＤＧＰＰ２Ｌと同一の配列は知られていないが、相同性のある配列が特許文献４、特許文献５、及び特許文献６に記載されている。このうち特許文献４の要約中には、ＤＧＰＰ２Ｌと相同性のある配列は悪性腫瘍、血液疾患、ＨＩＶ感染、免疫性疾患および種々の炎症の診断、処置に有用であると記載されている。特許文献５にはＤＧＰＰ２Ｌと相同性のある配列を含む多数の配列が開示され、これらのポリペプチドは過増殖性疾患のような腫瘍性疾患を含む疾患の診断、治療、予防／予後に有用であること、神経性疾患、免疫系疾患、筋疾患、生殖性疾患、消化関係の疾患、肺疾患、循環器疾患、又は腎疾患のような疾患の治療にも有用であること、当該ポリペプチドの異常な発現や活性と関わる疾患の検査薬として有用であり、癌や慢性関節リウマチの処置に有用であることが記載されている。しかしながら、これら多数の配列のうち、どの配列のものがどの用途に用いることができるかの具体的開示はなく、また、実際に行った実施例もない。
特許文献６にはＤＧＰＰ２Ｌと相同性のある配列を含む多数の配列が開示され、過増殖性疾患（例えば癌）、免疫不全性疾患（例えばＡＩＤＳ）、自己免疫疾患（例えば関節炎）、神経性疾患（例えばアルツハイマー病）、代謝異常（例えばフェニルケトン尿症）、炎症性疾患（例えば喘息）、循環器病（例えばアテローム性動脈硬化症）、血液疾患（血友病）、生殖性疾患（例えば不妊症）及び感染症（例えばインフルエンザ）等の検査、処置、予防または予後に有用であると記載されている。しかしながら、特許文献６には具体的な実施例の記載はおろか、これらの用途の具体的な裏付けは全くない。更に特許文献５及び特許文献６にはＤＧＰＰ２Ｌ類似分子の滑膜での発現の有無やＲＡ患者での発現量については全く記載されていない。従ってＤＧＰＰ２ＬがＲＡの診断に有用であることは本発明者らが初めて見出した知見であり、更には、この知見を利用したＲＡの検査方法は本発明者らが初めて行った発明である。
本発明のポリペプチドの一つであるＤＧＰＰ２Ｓと同一の配列が前記特許文献４に記載され、相同性のある配列が前記特許文献５及び特許文献６に記載されている。上述したように特許文献５及び特許文献６には滑膜での発現の有無やＲＡ患者での発現量については全く記載されていない。従ってＤＧＰＰ２ＳがＲＡの診断に有用であることは本発明者らが初めて見出した知見であり、更には、この知見を利用したＲＡの検査方法は本発明者らが初めて行った発明である。
【図面の簡単な説明】図１は、各新規蛋白質の発現を示した図である。
図２は、ＲＡ滑膜線維芽様細胞、ＯＡ線維芽様細胞における各遺伝子の発現量を比較した図である。図の縦軸は相対的発現度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】以下に本発明について詳細に説明する。
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド；（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０配列番号１２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。
「本発明の機能的等価改変体」としては、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド」、あるいは、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド」が含まれる。
「本発明の相同ポリペプチド」は、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド」である限り、特に限定されるものではないが、該相同性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓを意味する。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、
「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、
「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」を、
それぞれ使用する。
「ＲＡ患者特異的に発現が増強する」とは、非ＲＡ患者に比してＲＡ患者の滑膜組織または滑膜線維芽様細胞において発現が２倍以上増強することを意味する。
以上、本発明のポリペプチドについて説明したが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、本発明の機能的等価改変体、及び本発明の相同ポリペプチドを総称して、以下、「本発明のポリペプチド」と称する。更に、「本発明のポリペプチド」、及び、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、若しくは配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを総称して以下「本発明の検査方法用ポリペプチド」と称する。「本発明の検査方法用ポリペプチド」のうち、配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＲＡ２蛋白質」、配列番号４で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＲＡ３蛋白質」、配列番号６で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＤＧＰＰ１Ｌ蛋白質」、配列番号８で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＤＧＰＰ１Ｓ蛋白質」、配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＤＧＰＰ２Ｌ蛋白質」、配列番号１２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＤＧＰＰ２Ｓ蛋白質」と称する。
本発明のポリペプチドとしては、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド」あるいは、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上（好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上）であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＲＡ患者特異的に発現が増強するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」がより好ましい。
また、本発明のＲＡ２蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるＲＡ２蛋白質、その機能的等価改変体、又は、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。好ましくは、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１記載の塩基配列である。
本発明のＲＡ３蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号４記載のアミノ酸配列で示されるＲＡ３蛋白質、その機能的等価改変体、又は、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。好ましくは、配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号３記載の塩基配列である。
本発明のＤＧＰＰ１Ｌ蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号６記載のアミノ酸配列で示されるＤＧＰＰ１Ｌ蛋白質、その機能的等価改変体、又は、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。好ましくは、配列番号６記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号５記載の塩基配列である。
本発明のＤＧＰＰ１Ｓ蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号８記載のアミノ酸配列で示されるＤＧＰＰ１Ｓ蛋白質、その機能的等価改変体、又は、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。好ましくは、配列番号８記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号７記載の塩基配列である。
本発明のＤＧＰＰ２Ｌ蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１０記載のアミノ酸配列で示されるＤＧＰＰ２Ｌ蛋白質、その機能的等価改変体、又は、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。好ましくは、配列番号１０記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号９記載の塩基配列である。
本発明検査方法用のＤＧＰＰ２Ｓ蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１２記載のアミノ酸配列で示されるＤＧＰＰ２Ｓ蛋白質、その機能的等価改変体、又は、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。好ましくは、配列番号１２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１１記載の塩基配列である。
本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチドを含む）、本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されていると同様に実施できる。ただし、上記特許出願明細書における「本発明の新規蛋白」を本発明の検査方法用ポリペプチド（すなわち、ＲＡ２蛋白質、ＲＡ３蛋白質、ＤＧＰＰ１Ｌ蛋白質、ＤＧＰＰ１Ｓ蛋白質、ＤＧＰＰ２Ｌ蛋白質またはＤＧＰＰ２Ｓ蛋白質）、「本発明の遺伝子」を本発明の検査用ポリペプチドをコードする遺伝子（すなわち、ＲＡ２遺伝子、ＲＡ３遺伝子、ＤＧＰＰ１Ｌ遺伝子、ＤＧＰＰ１Ｓ遺伝子、ＤＧＰＰ２Ｌ遺伝子またはＤＧＰＰ２Ｓ遺伝子）と読み替える。以下、本発明のポリヌクレオチドを例に記載するが、本発明のポリヌクレオチドに含まれない本発明の検査方法用ポリペプチド（より具体的には、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、慢性関節リウマチ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、若しくは配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドも同様にして製造することができる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞あるいは組織、例えば、ヒトＲＡ患者由来滑膜からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方味では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。より具体的には、化学合成法によって製造したヌクレオチド断片を結合することによっても製造できる。また、各ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡ合成機（例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）、あるいは、３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）など）を用いて合成することができる。
本発明の発現ベクター、宿主細胞、蛋白質の製造方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例１及び実施例２に記載のように本発明のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターを市販のトランスフェクション試薬リポフェクトアミンを用いてヒト胎児腎臓由来２９３Ｔ細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により本発明の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記２９３Ｔ細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
上記により、形質転換細胞に生産される本発明の蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。
本発明の蛋白質はマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、該蛋白質の発現の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧ  ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｔａｇ、ｍｙｃ  ｅｐｉｔｏｐｅなどがある。また、マーカー配列と該新規蛋白の間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、それ自体、またはその一部を後述のＲＡの検査方法においてハイブリダイズプローブとして用いることができ、ＲＡの検査に有用である。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の作製や、発現レベルを検出・定量する際のコントロールとして用いることができる。
＜本発明の抗体の製造方法＞
本発明の抗体の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」＜本発明のポリペプチドに結合する抗体＞に記載されていると同様に実施できる。本発明の抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、各種動物に配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みしかも慢性関節リウマチ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みしかも慢性関節リウマチ患者特異的に発現が増強するポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全部または断片を直接投与することで得ることができる。また、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を導入したプラスミドを用いてＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は前記ポリペプチドまたはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁し、腹腔、皮下また静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、ラット、ヤギ、またはニワトリ等の血清または卵から製造される。このように製造されたポリクローナル抗体は常法の蛋白質単離精製法により、分離精製することができ、常法の蛋白質単離精製法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により当業者が容易に製造することが可能である。
＜本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド＞
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９、で表されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドも本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドと「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは厳格な条件下で、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、他のポリヌクレオチドとはハイブリダイズしないことを意味する。厳格な条件とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、３７℃オーバーナイト」程度の条件であり、より厳しい条件としては「５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」程度の条件である。また洗浄のための条件として、緩い条件としては「５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、４２℃」、通常「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようなポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜４０ｂｐの鎖長を有する。プライマーとして好ましい塩基配列は、１）配列番号２５及び配列番号２６に記載の塩基配列で表されるプライマー、２）配列番号２７及び配列番号２８に記載の塩基配列で表されるプライマー、３）配列番号２９及び配列番号３０に記載の塩基配列で表されるプライマー、４）配列番号３１及び配列番号３２に記載の塩基配列で表されるプライマーが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。
本発明に基づくプローブやプライマーは、ＲＡ診断の検査のための本発明の遺伝子発現量の測定に利用することができる。
本発明に基づいて、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技法は公知で、遺伝子発現を解析するために用いられている（Ｃｈｅｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，．２７４，６１０−６１３）。
＜ＲＡの検査方法／ＲＡ検査用キット＞
ヒト変形性関節症（ＯＡ）患者滑膜組織に比較して、ヒトＲＡ患者滑膜組織において発現量が亢進している遺伝子を見出したことから、これらの発現量を利用してＲＡ疾患を検出することが出来る。ＲＡ特異的な現象を捉えるために、滑膜組織に病変を有するＯＡを対照とした。具体的には、次の工程を含む態様が例示される。すなわち、
（１）被験者の滑膜生検サンプルにおける、本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する工程、及び（２）健常者または非ＲＡ患者の滑膜生検サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと比較する工程、である。
本発明のＲＡの検査方法における遺伝子の発現レベルとは、該遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。従って、本発明によるＲＡの検査方法は、本発明の遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベル、または、該遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
工程（１）における本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する方法は公知の遺伝子解析法に従って実施することが出来る。例えば、本発明の遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または、本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することが出来る。具体的には、被験者から得た滑膜細胞由来の核酸、例えばｍＲＮＡ等を用いて測定することが出来る。ｍＲＮＡ量の測定は、本発明の遺伝子配列を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定できる。遺伝子増幅反応方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法などを利用することが出来る。本発明のＲＡの検査方法に用いられるプライマー、または、ＲＡ検査用キットに含まれるプライマーは、本発明の検査方法用ポリペプチドをコードする遺伝子配列を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、本発明の遺伝子の塩基配列に基づいて設計できる。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを利用してできる。また、上記本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプライマーとして使用できる。
ハイブリダイゼーション技術を利用したＲＡの検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法などを使用して行うことが出来る。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６（１０），９８６，１９９６）を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置およびキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。より具体的には、実施例４に記載の方法により実施できる。
また、工程（１）において、本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する方法として、発現レベルを前記遺伝子により発現される蛋白質の検出によって測定する方法が可能である。このような検査方法としては、例えば、被験者から得た滑膜細胞由来の細胞抽出液を用いて、前記蛋白質に結合する抗体、好ましくは、前記蛋白質に特異的に結合する抗体を利用したウエスタンブロッティング、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することが出来る。
工程（２）においては、工程（１）で得られた発現レベルと健常者または非ＲＡ患者における発現レベルと比較するのであれば、比較方法は特に限定されず、例えば実施例４に記載の方法で比較できる。
本発明のＲＡ検査用キットには、少なくとも、本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向プライマーが含まれる。
順方向及び逆方向プライマー対の例としては、本発明の検査方法用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のＲＡ検査用キットに含めることが出来る他の試薬としては、ＰＣＲを行うのに必要な試薬（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、緩衝液など）などを挙げることができる。
【実施例】  以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｓｔ  ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等）の遺伝子操作実験マニュアルや試薬等に添付の指示書に従った。
（実施例１）全長オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）のクローニングと蛋白質発現プラスミドの構築
表１に示すプライマーセット（配列番号１３−配列番号１４、配列番号１５−配列番号１６、配列番号１７−配列番号１８、配列番号１９−配列番号１８、配列番号２０−配列番号２１、又は、配列番号２２−配列番号２１）、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  ｓｐｌｅｅｎ  ５’−ｓｔｒｅｔｃｈ  ｐｌｕｓ  ｃＤＮＡ；インビトロジェン社）、及びＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃１分３０秒のサイクルを２０回、続いて７２℃３分のＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物をフェノールクロロホルム処理し、エタノール沈殿処理し、精製水に溶解した。これらのＤＮＡのうち、プライマーセット配列番号１３−配列番号１４で増幅したＤＮＡをＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで二重切断し、その他のＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩで二重切断した。発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＣＦＬのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、各発現プラスミドをＣＦＬ−ＲＡ２、ＣＦＬ−ＲＡ３、ＣＦＬ−ＤＧＰＰ１Ｌ、ＣＦＬ−ＤＧＰＰ１Ｓ、ＣＦＬ−ＤＧＰＰ２Ｌ，ＣＦＬ−ＤＧＰＰ２Ｓと名付けた。ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＦＬは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位に配列番号２３及び配列番号２４からなる２重鎖オリゴＤＮＡを挿入したプラスミドであり、本プラスミドにより、目的蛋白質にＦＬＡＧタグが付加されて発現される。前記各プラスミドの配列をジデオキシターミネーター法により、ＡＢＩ３７００  ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解読したところ、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、又は配列番号１１で表される配列が得られた。それぞれの全長ＯＲＦ配列を決定した。該遺伝子をそれぞれＲＡ２，ＲＡ３，ＤＧＰＰ１Ｌ，ＤＧＰＰ１Ｓ，ＤＧＰＰ２Ｌ，及びＤＧＰＰ２Ｓと名付けた。推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１２に示した。配列番号２で表されるＲＡ２のＯＲＦは３５７アミノ酸からなる新規蛋白質を、配列番号４で表されるＲＡ３のＯＲＦは１０１アミノ酸からなる新規蛋白質を、配列番号６で表されるＤＧＰＰ１ＬのＯＲＦは３１３アミノ酸からなる新規蛋白質を、配列番号８で表されるＤＧＰＰ１ＳのＯＲＦは２６４アミノ酸からなる新規蛋白質を、配列番号１０で表されるＤＧＰＰ２ＬのＯＲＦは２９１アミノ酸からなる新規蛋白質を、そして配列番号１２で表されるＤＧＰＰ２ＳのＯＲＦ（は２７１アミノ酸からなる蛋白質をコードしていた。
【表１】
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（実施例２）動物細胞株での発現
実施例１において作製した６個の発現プラスミドを、トランスフェクション試薬（リポフェクトアミン；ギブコ社）を用いて、添付指示書に従い２９３Ｔ細胞（インビトロジェン社）にそれぞれ導入した。プラスミド導入後１２−１６時間で培地を無血清に置換した後、さらに４８−６０時間培養を継続し、細胞を回収した。回収した細胞に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，０．２５Ｍ  ＮａＣｌ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ（シグマ社）から成る溶液を加えて溶解し、エッペンドルフチューブ遠心機（トミー精工社）にて１５０００回転１５分遠心後の上清を回収した。この導入細胞ライゼート中に目的蛋白が存在することをＣ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；シグマ社）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、上記ライゼートをＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社）に電気泳動（還元条件）後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にブロックエース（大日本製薬社）を添加してブロッキングした後、ビオチン化マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシア社）を順次反応させた。反応後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマシャムファルマシア社）を用いて目的蛋白の発現を確認した。ＲＡ２、ＤＧＰＰ１Ｌ、ＤＧＰＰ１Ｓ、ＧＤＰＰ２Ｌ、ＤＧＰＰ２Ｓの各発現プラスミドを導入した細胞のライゼートにおいて、各予想分子量（ＲＡ２：４０．１ｋＤａ、ＤＧＰＰ１Ｌ：３４．３ｋＤａ、ＤＧＰＰ１Ｓ：２９．５ｋＤａ、ＤＧＰＰ２Ｌ：３２．３ｋＤａ，ＤＧＰＰ２Ｓ：３０．４ｋＤａ）付近に位置するバンドが検出され、各導入細胞で目的蛋白質が発現していることがわかった（図１）。ＲＡ３はプロリン残基の含有率が高いため、電気泳動上の移動度が低く予想分子量（１１．０ｋＤａ）よりも大きな分子量で観察された（図１）。
（実施例３）滑膜組織サンプル、滑膜線維芽様細胞サンプルの取得
ヒトＲＡ患者、ヒトＯＡ患者から滑膜生検により滑膜組織、滑膜線維芽様細胞を得た。滑膜組織の調製はＨａｒｉｇａｉ  Ｍらの文献（Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９９  Ｍａｙ；２６（５）：１０３５−４３）に、滑膜線維芽様細胞の調製はＺｈａｎｇ  ＨＧらの文献（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２０００  Ｍａｙ；４３（５）：１０９４−１０５）に従った。Ｇ１、Ｇ６はヒトＲＡ患者各２名の滑膜組織を混合したサンプルであり、各種病理所見スコアーは、表層細胞重層化についてはＧ１：１．５、Ｇ６：０、リンパ濾胞形成についてはＧ１：２．５、Ｇ６：０、血管新生についてはＧ１：２．０、Ｇ６：０．５であった。Ｇ７はヒトＯＡ患者２名の滑膜組織を混合したサンプルである。病理所見スコアーはＨａｒｉｇａｉ  Ｍら，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９９３  Ｏｃｔ；６９（１）：８３−９１．に基づくものであり、滑膜組織の炎症の程度を反映している。病理所見スコアーが高いＧ１は炎症の程度がＧ６よりも大きいサンプルである。
ＲＳ１、ＲＳ２はヒトＲＡ患者各１名の滑膜線維芽様細胞サンプルであり、各種病理所見スコアーは、表層細胞重層化についてはＲＳ１：２、ＲＳ２：０、リンパ濾胞形成についてはＲＳ１：２、ＲＳ２：０、血管新生についてはＲＳ１：３、ＲＳ２：２であった。すなわちＲＳ１とＲＳ２の比較において、ＲＳ１はＲＳ２よりも炎症の程度が大きいサンプルである。ＯＡ１、ＯＡ２はヒトＯＡ患者各１名の滑膜線維芽様細胞サンプルである。
（実施例４）滑膜組織、滑膜線維芽様細胞における各遺伝子の発現上昇
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥバイオシステムズ社）（以降Ｐｒｉｓｍ７９００とする）によるリアルタイムＰＣＲをＰＣＲ検出定量試薬キットＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いてキット添付の指示書に従って行い、滑膜組織、滑膜線維芽様細胞における各遺伝子の発現量を定量的に測定した。以下に詳細を述べる。ＡＢＩ７９００による測定に用いたプライマーは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、または配列番号１１に表した配列情報からＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ社）により設計した。各遺伝子のプライマーは表２に示した。
【表２】
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ＲＡ滑膜組織（Ｇ１及びＧ６サンプル）、ＯＡ滑膜組織（Ｇ７サンプル）、ＲＡ滑膜線維芽様細胞（ＲＳ１及びＲＳ２サンプル）およびＯＡ滑膜線維芽様細胞（ＯＡ１及びＯＡ２サンプル）からＲＮＡ抽出用試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）抽出を行った。抽出は、試薬添付のプロトコールに従った。抽出方法の詳細を以下に記載する。１００ｍｇの凍結組織に対し、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮを加え、ホモジナイズ゛後、５分静置した。０．２ｍｌのクロロホルム（関東化学社）を加え、攪拌後３分静置した。１２０００ｘｇで４℃にて１５分の遠心分離を行った。上清を回収し、０．５ｍｌの２−イソプロパノール（関東化学社）を加え、１０分静置した。１２０００ｘｇで４℃にて１０分の遠心分離を行った。上清を除いた後、７０％エタノールを１ｍｌ加えた。７５００ｘｇで４℃にて５分の遠心分離を行った。風乾後、５０μｌ水に溶解した。
抽出した全ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ処理キット（ＲＮａｓｅｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ；共にキアゲン社）を用い、カラム上でＤＮａｓｅ処理を行った。キット添付のプロトコールに従って処理を行った。詳細を以下に記載する。全ＲＮＡ溶液に水を加え、１００μｌとした。次に、３５０ｍｌのキットに含まれるバッファーＲＬＴを加え攪拌した。次に２５０μｌのエタノールを加え攪拌後、キットに含まれるカラム（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ）に加えた。８０００ｘｇにて１５秒遠心した。３５０μｌのキットに含まれるバッファーＲＷ１を加え、８０００ｘｇにて１５秒遠心した。さらに、１０μｌのＤＮａｓｅＩストック溶液および７０μｌのキットに含まれるバッファーＲＤＤを加え、室温で１５分静置した。３５０μｌのバッファーＲＷ１を加え、８０００ｘｇにて１５秒遠心した。３５０μｌのバッファーＲＷ１を加え、８０００ｘｇにて１５秒遠心した。５００μｌのキットに含まれるバッファーＲＰＥを加え、８０００ｘｇにて１５秒遠心した。５００μｌのバッファーＲＰＥを加え、１５０００ｘｇにて１分遠心した。３０μｌ水を加え、８０００ｘｇにて１分遠心し、全ＲＮＡ溶液を得た。
全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により、ｃＤＮＡを作成した。全ＲＮＡ（１μｇ）を１０μｌのランダムヘキサマー（１００ｎｇ／μｌ）（アマシャムファルマシアバイオテク社）と混合し、最終量が４８μｌとなるように水を加えた。７０℃で１０分処理後、氷上に置いた。次に３２μｌのＲＴ反応混合液を加えた。混合液の組成を以下に示す。５ｘＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３，３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２），１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−  ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（８００ｕｎｉｔｓ）（以上全てＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）。混合後、２５℃１５分、４２℃５０分、７０℃１５分の処理を行った。
作成したｃＤＮＡを鋳型として、以下の実験を進めた。目的遺伝子の各測定サンプル間での相対的発現量を算出するための標準曲線を作成する鋳型として、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（クロンテック社）の希釈系列、あるいは各測定サンプルの混合液の希釈系列を用いた。また、サンプル中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてＧ３ＰＤＨ遺伝子について同様の定量解析を行い、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量を基に補正して、目的遺伝子の発現量を算出した。Ｇ３ＰＤＨにより補正した各遺伝子の発現量のうち、ＯＡ滑膜組織Ｇ７サンプルあるいはＯＡ滑膜線維芽様ＯＡ１サンプルの各遺伝子の発現量を１００として、各サンプル、各遺伝子の相対的発現度を算出した。滑膜線維芽様細胞を用いた結果を図２及び表３に示した。ＲＡ滑膜組織サンプルＧ１は、ＯＡ滑膜組織サンプルＧ７に比して、ＲＡ２、ＲＡ３、ＲＡ４、ＤＧＰＰ１、及びＤＧＰＰ２の全ての遺伝子の発現量が有意に亢進していることが明らかとなった。また、ＲＡ滑膜組織のうち炎症程度の大きいＧ１サンプルに比して、前記各遺伝子の発現量が有意に亢進しており、ＲＡの病理所見スコアーに連動して前記各遺伝子の発現量が亢進していること、すなわちＲＡの炎症症状が悪化するほど前記各遺伝子の発現量が亢進していることを見出した。ＲＡ滑膜線維芽様サンプルＲＳ１は、ＯＡ滑膜線維芽様サンプルＯＡ１及びＯＡ２に比して、ＲＡ２、ＲＡ３、ＲＡ４、ＤＧＰＰ１、及びＤＧＰＰ２の全ての遺伝子の発現量が有意に亢進していることが明らかとなった。また、ＲＡ滑膜線維芽様サンプルのうちＲＳ１サンプル）は、ＲＳ２サンプルに比して、前記各遺伝子の発現量が有意に亢進しており、ＲＡの病理所見スコアーに連動して前記各遺伝子の発現量が亢進していること、すなわちＲＡの炎症症状の重篤性と前記各遺伝子の発現量の亢進が相関することを見出した。
これらのことより、本実施例記載の方法でＲＡの進行度を検出することができ、ＲＡ診断の検査が可能であることがわかった。
【表３】
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【産業上の利用可能性】  本発明のポリヌクレオチドは、その発現亢進がＲＡ病態の程度と結びついていることから、ＲＡ診断の指標となることが解かった。本発明のポリヌクレオチド、本発明の抗体、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドはＲＡ診断の検査に有用である。本発明のポリペプチドは前記検査に有用な本発明の抗体を製造するために有用である。また、本発明は、ＲＡ滑膜細胞で発現量が亢進する新規遺伝子を提供するものであり、その特異的なプライマー配列を用いたＰＣＲによりＲＡ診断の検査へ応用できる。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し〈２２３〉には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１３〜２４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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