(57)【要約】本発明は、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を高濃度に蓄積し、かつ工業的に満足できる生産速度を長期間維持できる特定の微生物菌株を用いる、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造方法を提供する。具体的には、α−ヒドロキシニトリルを、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換するに際し、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、ｇ乾燥菌体重量当たり少なくとも１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができ、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができる微生物菌株に由来する微生物触媒を用いる。かかる微生物菌株として、アースロバクターｓｐＮＳＳＣ２０４株を挙げることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ
（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを、一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ−ＮＨ４＋（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換するに際し、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、ｇ乾燥菌体重量当たり少なくとも１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができる微生物菌株に由来する微生物触媒を用いることを特徴とする一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項２】
微生物菌株に由来する微生物触媒が、反応系中に一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができる微生物菌株に由来する微生物触媒であることを特徴とする請求項１記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項３】
微生物菌株に由来する微生物触媒が、アースロバクター属に属する微生物菌株に由来する微生物触媒であることを特徴とする請求項１又は２記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項４】
アースロバクター属に属する微生物菌株が、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４又は当該菌株より誘導された微生物菌株であることを特徴とする請求項３記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項５】
微生物菌株に由来する微生物触媒が、微生物菌体、該微生物の菌体処理物、該微生物の抽出物又は該微生物から単離された酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項６】
置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基が、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルチオアルキル基又はＣ１〜Ｃ６のヒドロキシアルキル基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項７】
置換基を有してもよいアリール基が、フェニル基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項８】
α−ヒドロキシニトリルが、ラクトニトリル、アセトンシアンヒドリン、マンデロニトリル又は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法。
【請求項９】
一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを、一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ−ＮＨ４＋（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換するに際し、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、菌体触媒乾燥重量当たり少なくとも１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができることを特徴とする微生物菌株。
【請求項１０】
微生物菌株が、反応系中に一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができる微生物菌株であることを特徴とする請求項９記載の微生物菌株。
【請求項１１】
微生物菌株が、アースロバクター属に属する微生物菌株であることを特徴とする請求項９又は１０記載の微生物菌株。
【請求項１２】
アースロバクター属に属する微生物菌株が、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６２）であることを特徴とする請求項１１記載の微生物菌株。
【請求項１３】
アースロバクター属に属する微生物菌株が、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４から誘導された微生物菌株であることを特徴とする請求項１１記載の微生物菌株。
【発明の詳細な説明】
技術分野：
本発明は特定の微生物菌株に由来する微生物触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルを加水分解し、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を製造する方法や、該方法に用いられる微生物菌株に関する。α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩は通常の方法により遊離のα−ヒドロキシ酸に導くことができる。α−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩のうち乳酸や乳酸アンモニウムは食品工業、醸造工業、製薬工業等に用いられ、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸や２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム塩は家畜の飼料添加物として、またα−ヒドロキシイソ酪酸は有機合成原料として有用である。
背景技術：
α−ヒドロキシニトリルから微生物によってα−ヒドロキシ酸を製造する方法としては、例えばバチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属及びブレビバクテリウム属の微生物による乳酸、グリコール酸等の製造方法（特公昭５８−１５１２０号公報）、コリネバクテリウム属に属する微生物による乳酸、グリコール酸及び２−ヒドロキシイソ酪酸の製造法（特開昭６１−５６０８６号公報）、シュードモナス属、アースロバクター属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、コクリオボラス属、及びフザリウム属の微生物による乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−ヒドロキシフェニルプロピオン酸及びマンデル酸の製造方法（特開昭６３−２２２６９６号公報）、アースロバクター属、アスペルギルス属、バチルス属、バクテリジウム属、ブレビバクテリウム属、コクリオバラス属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、ノカルディア属、ペニシリウム属、シュードモナス属及びフザリウム属の微生物による、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−４−ブチロラクトンの製造法（特開昭６４−１０９９６号公報）、ロドコッカス属、シュードモナス属、アースロバクター属及びブレビバクテリウム属の微生物による２−ヒドロキシイソ酪酸の製造法（特開平４−４０８９７号公報）、カセオバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ノカルディア属、ロドコッカス属及びアースロバクター属の微生物による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造法（特開平４−４０８９８号公報）、パントエア属、ミクロコッカス属、バクテリジウム属、バチラス属等の微生物によるα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造法（特開平８−１７３１７５号公報）、アルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０、ロドコッカス・エスピーＨＴ２９−７、ゴルドナ・テラエＭＡ−１によるα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造法（ＷＯ９６−０９４０３号公報）等が知られている。これら先行文献に開示されたα−ヒドロキシ酸の製造においては、α−ヒドロキシニトリルを微生物触媒で加水分解し、先ずα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を得て、これを通常の方法、例えば酸による中和、イオン交換樹脂カラム、電気透析、熱分解等の方法により、遊離のα−ヒドロキシ酸を製造している。
これらα−ヒドロキシ酸の製造方法は、いずれも目的とする物質を高濃度で生成蓄積させることにおいて満足しうるものではなく、また、目的物質の微生物触媒あたりの生産速度も工業的見地から十分とは言えない。例えば、前記特開昭６１−５６０８６号公報にはコリネバクテリウム属に属する微生物による乳酸蓄積濃度が９．８重量％、生産速度が２５７ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−乾燥細胞重量（３０℃／４時間）であることが、特開昭６３−２２２６９６号公報にはシュードモナス属に属する微生物による乳酸蓄積濃度が１０重量％、アースロバクター属に属する微生物による乳酸蓄積濃度が０．１５重量％、シュードモナス属に属する微生物による２−ヒドロキシイソ酪酸蓄積濃度が０．８重量％であることが、特開平４−４０８９８号公報にはカセオバクターｓｐ．ＢＣ２３株による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸蓄積濃度が１８８ｍＭ（２．８重量％）、生産速度が４．７ｍｍｏｌ／ｈ／４５ＯＤ−６３０ｎｍ（２５℃）であることが、特開平８−１７３１７５号公報にはバクテリディウム・エスピーＲ３４１（ＦＥＲＭ−Ｐ２７１９）による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸蓄積濃度が０．７９重量％であることが、ＷＯ９６−０９４０３号公報にはアルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０株による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸蓄積濃度が９４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４．１重量％）、生産速度が８．７ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−乾燥細胞重量（２５℃／１８０時間）、ゴルドナ・テラエＭＡ−１株による２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸蓄積濃度が１．５ｍｏｌ／Ｌ（２２．５重量％）、生産速度が２５０ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−乾燥細胞重量（３５℃初速度）であることがそれぞれ記載されている。
このように生成物の蓄積濃度が低い理由として、α−ヒドロキシニトリルが水溶液中で対応するアルデヒドもしくはケトンと青酸に部分的に解離し（ケミカルレビューズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）第４２巻、１８９ページ、１９４８年）、青酸によって酵素活性が阻害されることが挙げられる（アグリカルチュラル  バイオロジカル  ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第４６巻、１１６５ページ、１９８２年）。また解離したアルデヒドの作用で酵素が短時間で失活する可能性も指摘されており、これを解決するための方法として、酸性亜硫酸イオン又は亜ジチオン酸イオンを添加する方法（特開平５−１９２１８９号公報）、亜リン酸イオン又は次亜リン酸イオンを添加する方法（特開平７−２１３２９６号公報）が提案されている。しかしながらこれらの添加物を使用してもα−ヒドロキシ酸の生成蓄積濃度は高いものではない。アルカリゲネス・エスピーＢＣ３５−２株によるマンデル酸の蓄積濃度１６．６重量％（特開平５−１９２１８９号公報）、ゴルドナ・テラエＭＡ−１株によるマンデル酸の蓄積濃度１２重量％（特開平７−２１３２９６号公報）がそれぞれの特許で最も高い生成物蓄積濃度として、実施例に示されている。
発明の開示：
一般的に生成物の蓄積濃度が低い場合、あるいは生成物の微生物触媒あたりの生産速度が低い場合や生成速度がある程度速くても長期間維持できない場合、これを製造するための設備が複雑かつ大規模になることは当業者によく知られている。このため上述のような公知の方法によって工業的にα−ヒドロキシ酸を製造することは製造効率の点で問題があった。本発明の課題は、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を高濃度に蓄積し、かつ工業的に満足できる生産速度を長期間維持できる特定の微生物菌株を用いる、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造方法を提供することにある。
本発明者らはα−ヒドロキシニトリルから、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を生成する微生物について、高濃度のα−ヒドロキシニトリル又はα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩によって活性の抑制を受けにくく、長期間活性が持続する耐久性を有し、なおかつ高濃度のα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を高速度で蓄積する能力を有する工業的に有利な微生物の探索を鋭意行った結果、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の生産能力が今まで知られた微生物で最も高いアースロバクター・エスピーＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９）の変異処理により新たに分離されたアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６２））が目的とする活性を有することを見い出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを、一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ−ＮＨ４＋（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換するに際し、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、ｇ乾燥菌体重量当たり少なくとも１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができる微生物菌株に由来する微生物触媒を用いることを特徴とする一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項１）、微生物菌株に由来する微生物触媒が、反応系中に一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができる微生物菌株に由来する微生物触媒であることを特徴とする請求項１記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項２）、微生物菌株に由来する微生物触媒が、アースロバクター属に属する微生物菌株に由来する微生物触媒であることを特徴とする請求項１又は２記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項３）、アースロバクター属に属する微生物菌株が、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４又は当該菌株より誘導された微生物菌株であることを特徴とする請求項３記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項４）、微生物菌株に由来する微生物触媒が、微生物菌体、該微生物の菌体処理物、該微生物の抽出物又は該微生物から単離された酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項５）、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基が、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルチオアルキル基又はＣ１〜Ｃ６のヒドロキシアルキル基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項６）、置換基を有してもよいアリール基が、フェニル基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項７）α−ヒドロキシニトリルが、ラクトニトリル、アセトンシアンヒドリン、マンデロニトリル又は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法（請求項８）に関する。
また本発明は、一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを、一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ−ＮＨ４＋（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換するに際し、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、ｇ乾燥菌体重量当たり少なくとも１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができることを特徴とする微生物菌株（請求項９）、微生物菌株が、反応系中に一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができる微生物菌株であることを特徴とする請求項９記載の微生物菌株（請求項１０）、微生物菌株が、アースロバクター属に属する微生物菌株であることを特徴とする請求項９又は１０記載の微生物菌株（請求項１１）、アースロバクター属に属する微生物菌株が、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６２）であることを特徴とする請求項１１記載の微生物菌株（請求項１２）、アースロバクター属に属する微生物菌株が、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４から誘導された微生物菌株であることを特徴とする請求項１１記載の微生物菌株（請求項１３）に関する。
本発明の一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ−ＮＨ４＋（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法としては、一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換するに際し、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、ｇ乾燥菌体重量当たり１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができる微生物菌株に由来する微生物触媒を用いる一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の製造法であれば、特に制限されるものではないが、上記微生物触媒として、上記平均生産速度２００μｍｏｌ／ｍｉｎ以上の微生物触媒が好ましく、３００μｍｏｌ／ｍｉｎ以上の微生物触媒がより好ましい。
また、上記微生物菌株に由来する微生物触媒としては、反応系中に一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができる微生物菌株に由来する微生物触媒が好ましい。そして、反応系中に一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができ、かつ、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、ｇ乾燥菌体重量当たり１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができる微生物菌株としては、アースロバクター属に属する微生物菌株を例示することができ、具体的にはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４又は当該菌株より誘導された微生物菌株を挙げることができる。
上記アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４は、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の生産能力が今まで知られた微生物で最も高いアースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９）の変異処理により新たに分離されたものである。親株であるアースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４は本発明者等によって見出されたものである。
アースロバクターＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９）は独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９９６年２月６日付で寄託されており、その菌学的性質についてはＷＯ９７／３２０３０に記載されている。
アースロバクターＮＳＳＣ２０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６２）も同様に、独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２０００年６月２２日付で寄託されている。その菌学的性質は以下の通りである。
形態                                        多形桿菌
グラム染色性                                陽性
ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓサイクル                有
芽胞                                        無
運動性                                      無
細胞壁のジアミノ酸                          リジン
酸素に対する態度                            好気的
カタラーゼ                                  ＋
ＤＮＡの分解                                ＋
ゼラチンの液化                              ＋
デンプンの分解                              ＋
カゼインの分解                              ＋
栄養要求性                                  無
グリコリル試験                              −
キノン系                                    ＭＫ−９（Ｈ２）
以上の菌学的性質を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８６）に基づいて検索した結果、ＮＳＳＣ２０４株はアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新菌株と同定された。また、このＮＳＳＣ２０４株はα−ヒドロキシニトリル〔Ｉ〕及び／又はα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩〔ＩＩ〕の５０重量％〜６０重量％でも濃度耐性を示す。
本発明に係る微生物菌株としては、一般式〔Ｉ〕で表されるα−ヒドロキシニトリルを、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換するに際し、一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の平均生産速度として、新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、ｇ乾燥菌体重量当たり少なくとも１００μｍｏｌ／ｍｉｎを１４日間以上維持することができる微生物菌株であれば、特に制限されるものではないが、上記微生物菌株として、上記平均生産速度２００μｍｏｌ／ｍｉｎ以上、特に３００μｍｏｌ／ｍｉｎ以上の活性を有する微生物菌株が好ましく、反応系中に一般式〔ＩＩ〕で表されるα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩を２０〜６０重量％蓄積することができる微生物菌株がより好ましい。
本発明の微生物菌株の創製方法としては特に制限されるものではなく、土壌等からのスクリーニング手段、放射線・紫外線や変異薬剤による突然変異手段、遺伝子組換え手段、細胞融合手段などを用いる方法を挙げることができるが、操作の簡便性からして突然変異手段が好ましい。かかる突然変異手段としては、例えば、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換する能力を有する公知の微生物菌株に、放射線・紫外線や変異薬剤を用いた常法による変異処理を施した後、α−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の生産量（蓄積濃度や生産速度）に優れた菌株や、α−ヒドロキシニトリルやα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩の高濃度溶液中で耐性を示す菌株をスクリーニングすることにより得ることができる。また、一次スクリーニングで選抜された菌株をより厳しい条件で二次スクリーニングすることにより、あるいは、一次スクリーニングで選抜された菌株に再度突然変異処理を施した後、より厳しい条件で二次スクリーニングすることにより、所望の菌株を得ることができる。
本発明にかかる微生物の培養は、酵素誘導物質、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機栄養源を含む通常の培地で行われる。酵素誘導物質としては、イソブチロニトリル等のニトリル化合物、ε−カプロラクタムなどの環状アミド化合物等が使用される。炭素源としてはグルコース等の炭水化物、エタノール等のアルコール類、有機酸その他が適宜用いられる。窒素源としては、アミノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩その他が用いられる。無機イオンとしては、リン酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、硫酸イオン、鉄イオン、その他が必要に応じて使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸など及びこれらを含有するコーンスチープリカー、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、その他が適宜用いられる。培養は好気的条件下に、ｐＨ６〜９、温度２５〜３７℃の適当な範囲に制御しつつ行えばよい。
本発明の微生物によるα−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩への加水分解反応に用いられる微生物菌株に由来する微生物触媒としては、微生物菌体、該微生物の菌体処理物、該微生物の抽出物又は該微生物から単離された酵素等を挙げることができるが、かかる微生物触媒は上記のように培養した菌体を採取し、必要に応じて固定化菌体、粗酵素、固定化酵素等の菌体処理物として調製することができる。菌体又は酵素を固定化する場合は担体結合法、包括法等の通常行われる固定化技術を適用できる。粗酵素を調製する場合は、菌体を超音波、高圧ホモジナイザー等によって破砕した後に、硫安塩析、クロマトグラフィー等の通常行われる酵素精製技術が適用できる。
α−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩への加水分解は、微生物触媒を水性溶媒中でα−ヒドロキシニトリルと接触させることによって行われるが、微生物菌体は乾燥重量に換算して０．０１〜１０重量％の濃度で通常使用され、反応終了後は濾過、遠心分離又は限外濾過膜濃縮法によって回収されて繰り返し加水分解反応に使用できる。上記水性溶媒としては、水、緩衝剤等の塩類又は有機溶媒を含む水溶液が挙げられるが、これらは二相に分離していてもよい。
本発明で用いられる一般式〔Ｉ〕（Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルにおける、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基としては、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルチオアルキル基又はＣ１〜Ｃ６のヒドロキシアルキル基を、置換基を有してもよいアリール基としてはフェニル基を好適に例示することができ、一般式〔Ｉ〕で表されるα−ヒドロキシニトリルの具体例としては、ラクトニトリル、アセトンシアンヒドリン、マンデロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル等を挙げることができる。これらのα−ヒドロキシニトリル〔Ｉ〕は通常０．１〜５０重量％の濃度で反応に使用され、必要ならば反応の間、逐次添加されてもよい。反応のｐＨは適当な緩衝剤もしくは酸とアルカリによって５〜１０の間に保てばよい。反応の温度は４〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃に保てばよい。反応温度は必要に応じて変化させても良く、徐々に昇温ないし降温させる反応方式も採用することができる。
α−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩への加水分解の反応所要時間は特に制限されないが、通常６時間ないし１２０時間で反応液中に用いたα−ヒドロキシニトリル〔Ｉ〕に対応するα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩〔ＩＩ〕、例えば乳酸アンモニウム、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム、マンデル酸アンモニウム、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウムなどが高濃度、例えば２０重量％以上の高濃度で蓄積される。反応に用いた菌体は、実質的な活性低下なしに、繰り返し加水分解反応に使用することができる。生成物は、濃縮、抽出などの定法によって分離精製することができ、必要ならば酸性条件下での有機溶媒抽出、熱分解等によってアンモニアと分離することができる。
発明を実施する為の最良の形態：
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１
０．３％肉汁、０．５％ペプトン及び０．５％食塩を含む培地２ｍｌを試験管に、下記の組成の培地２０ｍｌを１００ｍｌ容量のバッフル付き三角フラスコに入れ、各々１２１℃で１５分間滅菌した。アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ２０４株を２ｍｌの試験管に一白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養した後、０．２ｍｌをバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、さらに５日間３０℃で振盪培養した。この培養液を遠心分離して得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、乾燥重量に換算して４重量％の菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを終濃度２３７ｍＭになるように添加し、３０℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加後１時間毎に同量の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを７回繰り返し追加し、さらに１．５時間毎に８回追加して総計１９時間の反応を行った。
コーンスチープリカー                １．０％  （別滅菌）
スクロース                          １．０％  （別滅菌）
リン酸一カリウム                    ０．１％
リン酸二カリウム                    ０．１％
食塩                                ０．０２％
硫酸マグネシウム７水塩              ０．０２％
硫酸第一鉄                          ０．００１％（別滅菌）
ε−カプロラクタム                  ０．５％
ｐＨ                                ７．２（２Ｎ苛性ソーダで調整）
反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ、キャリア：アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝８０／２０／０．１）を用いて定量した結果、５８．９重量％の２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム塩の蓄積を確認した（収率９８％）。全く同様な条件でアースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４株を用いて反応を実施したときは、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの１回の添加量は最初の終濃度として２００ｍＭであり、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム塩の蓄積濃度は４８．８重量％で、収率９６％であった。
実施例２
流加培養法で得た菌体を用いて、昇温コントロールにより２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム塩を一定速度で生産する反応を実施した。前培養培地として、０．５重量％酵母エキス、０．５重量％グルコース、０．５重量％ε−カプロラクタム、０．１重量％Ｋ２ＨＰＯ４、０．１重量％ＫＨ２ＰＯ４、０．０２重量％硫酸マグネシウム・７水和物、０．１重量％塩化ナトリウム、０．００１重量％硫酸第一鉄・７水和物を含み、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整した液体培地２００ｍｌを３リットル容の三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄のみは別にろ過滅菌して加えた）ものを用い、この前培養培地にアースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ２０４株を接種して、３３℃で３日間振盪培養して前培養を行った。
次に、コーンスチープリカー２０重量％を含み、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した水溶液を調製し、生じた不溶物を遠心分離により除いた上清液をコーンスチープリカー抽出液とした。２０．５重量％コーンスチープリカー抽出液、０．５重量％グルコース、１重量％ε−カプロラクタムからなる液体培地２．９リットルを１０リットル容ジャーファメンター中に用意した。滅菌は、コーンスチープリカー抽出液はろ過滅菌、その他の培地成分は１２０℃、２０分間の加熱滅菌によった。この増殖培地に、前記の前培養で得た培養液を接種して、３３℃で通気攪拌培養した。培養開始後６時間から１２時間の間に、上記と同様の滅菌法で調製した９５．５重量％コーンスチープリカー抽出液、２．２重量％グルコースからなる液体培地２．５リットルを流加した。流加終了後約１時間で、溶存酸素濃度が回復して対数増殖期が終了した。対数増殖期終了後直ちに、予め１１０℃、２０分間滅菌した５０重量％グルコース溶液５６０ｍｌを約１０時間かけて流加した。グルコースの流加終了後、３３℃の通気攪拌条件下、熟成培養を更に３日間続けた。この培養液から遠心分離により集菌し、さらに生理食塩水で洗浄して、湿菌体６６０ｇ（乾燥重量として１３２ｇ）を得た。
限外ろ過（ＵＦ）膜分離機、自動希釈装置・オートインジェクター付きのオンライン高速液体クロマトグラフィー装置、ｐＨコントローラーを備えた３００ｍｌ容攪拌型反応槽に、上記培養法で得た菌体触媒アルスロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ２０４の湿菌体８６．０ｇ（乾燥重量として１７．２ｇ）を添加し、水で１８９．２ｍｌで希釈した。この反応槽に反応温度２１℃で、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを０．４０９ｇ／ｍｉｎの速度で連続的に添加し、合計で５１．８ｇ加え終わった時点で、水の１．７０１ｇ／ｍｉｎによる連続添加を開始し、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの０．４０９ｇ／ｍｉｎによる連続添加を継続しながら、膜分離機で菌体触媒を分離回収して反応槽に戻すと同時に、透過ろ液を２．１１１ｇ／ｍｉｎで排出した。また、反応を通してｐＨを７．０に保つように、２８％アンモニア水を添加した。
この連続反応の間、オンライン高速液体クロマトグラフィーにより２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの反応液中濃度を検知し、約０．２重量％になるように、反応温度を徐々に上昇させた。かくして、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩を２２．９重量％（平均値）含有する膜透過ろ液が、上記一定速度で排出された。この反応を２７日間継続したところ、反応温度は３５℃まで上昇した。膜透過ろ液は全量で８５．１ｋｇであった。更に、この２７日間の連続反応終了後、反応槽及び反応配管系に存在する滞留液を膜濃縮洗浄し、５３４．５ｇの洗浄膜透過ろ液を別に得た。ここに得られた膜透過ろ液及び洗浄膜透過ろ液を、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、生成物である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸が２０．０重量％及び９．３５重量％存在し、用いた基質２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの純度が９５．０％であったことから、生成物のモル収率を計算すると、９５．０％となった。以上の反応結果から２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩の菌体触媒あたりの平均生産速度を計算すると１７４．５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−乾燥菌体重量（２１→３５℃／２７日間）となる。
比較例１
実施例２と全く同条件で培養して得た菌体アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４株を菌体触媒として用い、実施例２と全く同条件で反応を行ったところ、下記の結果が得られた。
使用菌体触媒量：８６．０ｇ（乾燥重量として１７．２ｇ）／実施例２と同様反応温度：２１℃→３５℃（２７日間）／実施例２と同様
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル添加速度：０．２２７ｇ／ｍｉｎ
水添加速度：０．９４５ｇ／ｍｉｎ
ろ液排出速度：１．１７３ｇ／ｍｉｎ
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩平均蓄積濃度：２２．８重量％
ろ液排出量：４７．３ｋｇ／２７日間
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩の菌体触媒あたりの平均生産速度：９６．６μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−乾燥菌体重量
実施例３
流加培養法で得た菌体を用いて、定温で２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム塩を連続的に生産する反応を実施した。
限外ろ過（ＵＦ）膜分離機、自動希釈装置・オートインジェクター付きのオンライン高速液体クロマトグラフィー装置、ｐＨコントローラーを備えた３００ｍｌ容攪拌型反応槽に、上記培養法で得た菌体触媒アルスロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ２０４の湿菌体８６．０ｇ（乾燥重量として１７．２ｇ）を添加し、水で１８９．２ｍｌで希釈した。この反応槽に反応温度３５℃で、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを０．９７４ｇ／ｍｉｎの速度で連続的に添加し、合計で５１．８ｇ加え終わった時点で、水の連続添加を４．０５２ｇ／ｍｉｎで開始し、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの０．９７４ｇ／ｍｉｎによる連続添加を継続しながら、膜分離機で菌体触媒を分離回収して反応槽に戻すと同時に、透過ろ液を５．０２８ｇ／ｍｉｎで排出した。反応を通して、ｐＨを７．０に保つように、２８％アンモニア水を添加した。
この連続反応の間、オンライン高速液体クロマトグラフィーにより２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの反応液中濃度を検知し、約０．２重量％になるように、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルおよび水の添加速度を徐々に低下させ、これに伴い膜透過ろ液の排出速度も低下させた。この条件で１８時間の反応を継続し、反応終了時には、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの添加速度は０．９０２ｇ／ｍｉｎ、膜透過ろ液の排出速度は４．６５８ｇ／ｍｉｎとなった。２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの連続反応開始後の添加量合計は１．０１ｋｇであり、膜透過ろ液は全量で５．２３ｋｇであった。ここに得られた膜透過ろ液を、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、生成物である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸が２０．７重量％存在し、用いた基質２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの純度が９５．０％であったことから、生成物のモル収率を計算すると、９８．５％となった。以上の反応結果から２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩の菌体触媒あたりの平均生産速度を計算すると３８８．５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−乾燥菌体重量（３５℃／１８時間）となる。
産業上の利用可能性：
本発明によれば、α−ヒドロキシニトリル〔Ｉ〕及び／又はα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩〔ＩＩ〕に対する濃度耐性並びに活性が長時間持続する耐久性を有する微生物を用いることにより、α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩〔ＩＩ〕が高濃度に蓄積され、なおかつ微生物菌体触媒が繰り返し使用できるので、効率的にα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩〔ＩＩ〕を製造することが可能である。
【国際調査報告】
2003062437.tif 000002
2003062437.tif 000003
2003062437.tif 000004
2003062437.tif 000005