(57)【要約】インターロイキン−６（ＩＬ−６）が関与する免疫異常性疾患の治療に有効な物質を提供する。ファージ抗体法を用いて、ヒトＩＬ−６に対して高い親和性を有するヒト抗ヒトＩＬ−６抗体及びヒト抗ヒトＩＬ−６抗体フラグメントを得た。当該抗体及び抗体フラグメントは、ＩＬ−６が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−６抗体または該抗体フラグメント。
【請求項２】
少なくとも１．０×１０−８Ｍ以下の解離定数を有する請求項１記截のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体または該抗体フラグメント。
【請求項３】
ヒトＩＬ−６に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−６抗体のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片。
【請求項４】
当該ＶＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列を有する請求項３に記載の遺伝子断片。
ＣＤＲ１：Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ａｌａ＜配列番号５＞
ＣＤＲ２：Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  ＶａｌＡｒｇ  Ｇｌｙ＜配列番号６＞
ＣＤＲ３：Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ＜配列番号７＞
【請求項５】
当該ＶＨ鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する請求項３または４に記載の遺伝子断片。
【請求項６】
当該ＶＨ鎖のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されている請求項４または５に記載の遺伝子断片。
【請求項７】
ヒトＩＬ−６に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−６抗体のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片。
【請求項８】
当該ＶＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列を有する請求項７に記載の遺伝子断片。
ＣＤＲ１：Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｌａ＜配列番号８＞
ＣＤＲ２：Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ＜配列番号９＞
ＣＤＲ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ＜配列番号１０＞
【請求項９】
当該ＶＬ鎖が配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する請求項７または８に記載の遺伝子断片。
【請求項１０】
当該ＶＬ鎖のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されている請求項８または９に記載の遺伝子断片。
【請求項１１】
請求項３から６のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項７から１０のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を結合してなる、ヒトＩＬ−６に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−６抗体の一本鎖Ｆｖ（以下、ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子断片。
【請求項１２】
請求項３から６のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項７から１０のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子と結合してなる、ヒトＩＬ−６に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ＩＬ−６抗体をコードする遺伝子断片。
【請求項１３】
請求項３から６のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項６から１０のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子の一部及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子の一部と結合してなる、ヒトＩＬ−６に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ＩＬ−６抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１４】
当該抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２から選ばれる請求項１３に記載の遺伝子断片。
【請求項１５】
請求項１１に記載のｓｃＦｖ遺伝子断片を、ヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子の一部、またはヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子の一部と結合してなる、ヒトＩＬ−６に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ＩＬ−６抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１６】
請求項３から１５のいずれかに記載の遺伝子断片を発現ベクターに組込み、遺伝子組換え法により発現される、ヒトＩＬ−６に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−６抗体または該抗体フラグメント。
【請求項１７】
少なくとも１．０×１０−８Ｍ以下の解離定数を有する請求項１６記載のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体または該抗体フラグメント。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体または該抗体フラグメントを有効成分として含有するＩＬ−６及びＩＬ−６受容体の結合活性阻害剤。
【請求項１９】
請求項１８に記載の結合活性阻害剤を用いるヒトＩＬ−６及びヒトＩＬ−６受容体の結合により惹起される炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトインターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）に結合し、ＩＬ−６とその受容体との結合を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−６抗体及び該抗体フラグメント、及びそれをコードする遺伝子断片に関する。本発明の抗体及び抗体フラグメントは、ＩＬ−６が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【背景技術】  ＩＬ−６はＴ細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、筋肉細胞などから、マイトジェン刺激、ウイルス感染、ＩＬ−１などの刺激により産生される分子量２１，０００の糖タンパク質である。ヒトでは１８４アミノ酸からなり、第７染色体上に遺伝子が存在する。その生物活性は多様で、１）細胞増殖誘導（ハイブリドーマ、Ｔ細胞、角質細胞、腎メサンジウム細胞）、２）細胞増殖抑制（骨髄性白血病細胞株、悪性黒色種細胞株）、３）細胞分化誘導及び細胞の特異的タンパク質の産生誘導（褐色細胞腫株の神経分化、キラーＴ細胞分化、巨核球成熟、骨髄性白血病細胞株のマクロファージ分化、Ｂ細胞の抗体産生、肝細胞の急性期タンパク質産生）などの機能を有する。このような多様な生物活性により、疾患との関連性も指摘されていたが、近年、１）慢性関節リウマチ、心房内粘液腫、キャッスルマン氏病、ＡＩＤＳなどでの高γグロブリン血症や自己免疫症状、２）メサンジウム増殖性腎炎、３）乾癬、４）ＡＩＤＳカポジ肉腫などの発症に関与することが知られている。また最近では、運動直後に骨格筋から多量のＩＬ−６が産生され、その視床下部を刺激して色々な神経ホルモンの分泌を促し、免疫系に影響を与えることが知られている（免疫学辞典第１版、４９頁、１９９３）。
とりわけ、ＩＬ−６が関与する疾患の中で慢性関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）は日本全国で約７０万人が罹患し、近年漸増の傾向にあり、患者の高齢化も進み社会問題となりつつある（Ｏｇａｔａ  Ａ．ら、臨床病理１９９９  Ａｐｒ；４７（４）：３２１−３２６［Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｔｈｅｒａｐｙ］）。
慢性関節リウマチの原因は不明であるが、関節腔内で起こった自己免疫反応が持続し慢性化した自己免疫疾患であり、難治性特定疾患に指定されている。これまでＩＬ−６との関連性について調べられ、患者の関節液中に多量に存在し、炎症惹起だけでなく、滑膜繊維芽細胞の増殖にも関わっていることが明らかにされている。また自己抗体の産生を促している可能性も考えられる（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｎ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．，日本免疫学会誌１９９７；２０：８７−９４）。
したがって、ＩＬ−６の生物活性を阻害するような抗ＩＬ−６抗体を作れば、ＲＡを含めた幾つかの免疫異常性疾患の対症療法的治療薬になる可能性があり、実際に検討が進められている（Ｍｉｈａｒａ  Ｍ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９５  Ａｐｒ；３４（４）：３２１−３２５；Ｍｉｈａｒａ  Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，９８：３１９−３２６）。
【発明の開示】
（発明が解決しようとする技術的課題）
ＲＡでは患者の症状の進行状況に応じて、非ステロイド系消炎鎮痛剤、ステロイド剤、免疫抑制剤、代謝阻害剤等の薬剤療法や人工関節などの外科的療法など多種多様な治療法が疾患のステージに応じて施される。しかしながらこれらはいずれもＲＡを根治するような治療法ではなく、長期使用や大量使用による副作用の問題も存在している。ＩＬ−６は炎症拡大という役割を果たしているため、患者が感じる苦痛の大きな原因となっており、ＩＬ−６の活性を阻害することにより苦痛が軽減出来る可能性が指摘されていた。そのための候補としてヒト型化抗ＩＬ−６抗体が検討の対象として使われてきた（Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｊｕｌｉａｎ  Ｆ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １９９５  Ｆｅｂ  １５；８５（４）：９１７−２４；Ｍｏｎｉｅｒ  Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９４  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１２（６）：５９５−６０２；Ｗｅｎｄｌｉｎｇ  Ｄ．ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９３  Ｆｅｂ；２０（２）：２５９−６２）。一方で、ＩＬ−６はミエローマ細胞の増殖因子としての活性を有しており（前述：免疫学辞典第１版、４９頁、１９９３）、このためＩＬ−６と高親和力で結合する抗体を産生するハイブリドーマが得られても、産生された抗体によって培地中のＩＬ−６が中和されてしまい増殖できなくなるので、結果的に高親和性の抗ＩＬ−６抗体は得られにくいという問題もあった。佐藤らが報告しているマウス由来抗ヒトＩＬ−６抗体は１１ｎＭの高親和性を示したが、解離速度が３×１０−２ｓｅｃと速いものしか得られていない（Ｓａｔｏ  Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １９９６；７（４）：１７５−８３）。この様な従来の方法で得られた解離速度の速い抗体を用いてＩＬ−６の活性を阻害するためには高濃度を維持する必要があった。ましてや完全ヒト抗体でそのような活性を持つ抗体は知られていない。
またヒト型化抗体では、完全ヒト抗体と異なり、投与された患者では抗ＩＬ−６抗体の活性を阻害するような抗体（阻止抗体）が作り出される可能性も否定できなかった。
（その解決方法）
そこで、本発明では、ファージ抗体法を用いて、スクリーニング系を工夫することにより完全ヒト抗ヒトＩＬ−６一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子を取得し、その抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を明らかにした。さらに、その性状を解析し、当該ｓｃＦｖが、ヒトＩＬ−６に対して従来得られていた各種動物由来の抗体よりも特に解離速度が遅く（１０−３ｓｅｃオーダー、従来より約４０倍解離速度が遅い）、かつ従来の抗体と同程度以上の高い親和性を有すること、またＩＬ−６依存性細胞株の増殖を濃度依存的に抑制することを明らかにした。
（従来技術より有効な効果）
このような完全にヒト由来でかつ高親和性の抗体を用いることにより、キメラ抗体やヒト型化抗体に比べて低い抗体濃度で治療効果を発揮でき、従ってこの抗体に対する抗イディオタイプ抗体の産生も極めて低く抑えることが可能になり、抗ＩＬ−６アンタゴニストとして、ＩＬ−６依存性の白血病や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療薬として優れた治療効果を有する抗ヒトＩＬ−６抗体薬を提供することができると期待される。また副作用が少なく活性が強い、急性の炎症の治療薬としての利用も期待できる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＩＬ−６ｇｋシリーズ由来のＩＬ６ｇｋ３−２ｓｃＦｖの組換えＩＬ−６、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＡＢ型血清、単球走化性タンパク質１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＭＣＰ−１）、ＭＩＰ−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α）との反応性をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。
図２は、ＢＩＡ  ＣＯＲＥにより測定したＩＬ６ｇｋ３−２ｓｃＦｖのＩＬ−６との結合親和力を測定した結果を示すグラフである。
図３は、ＩＬ−６依存性細胞株ＫＴ−３のＩＬ−６依存性の増殖応答をＩＬ６ｇｋ３−２ｓｃＦｖが抑制した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  健常者２０名分の末梢血Ｂリンパ球より、ＲＴ−ＰＣＲ法にて、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖ｃＤＮＡを増幅、更に両者をリンカーＤＮＡで結合し、健常者リンパ球由来のＶＨ鎖とＶＬ鎖のランダムな組み合わせによる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ＤＮＡを作製した。
このｓｃＦｖ  ＤＮＡをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組込み、１０９クローンからなる健常者由来ｓｃＦｖ提示ファージライブラリーを作製した。このライブラリーを、固相に固定化されたヒトＩＬ−６と結合させて回収、濃縮し、抗ヒトＩＬ−６Ｆｖ提示ファージクローンをスクリーニングした。その結果、スクリーニングされたｓｃＦｖクローン（ＩＬ６ｇｋ３−２）は、ヒトＩＬ−６と結合するｓｃＦｖ抗体を産生した。
クローンＩＬ６ｇｋ３−２が産生するｓｃＦｖ抗体は、一本鎖にも拘わらず通常の完全型抗体と同等の親和力でリガンド（ＩＬ−６）に特異的に結合した。
クローンＩＬ６ｇｋ３−２が産生するｓｃＦｖ抗体は、ヒトＩＬ−６に依存して増殖する細胞株ＫＴ−３に加えたときにＩＬ−６依存的増殖応答を濃度依存的に阻害した。
上記阻害活性を有するｓｃＦｖクローンのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を、配列番号１及び２（ＶＨ鎖）、及び配列番号３及び４（ＶＬ鎖）にそれぞれ示す。
さらに、上記配列中、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列を下記に示す。
［ＶＨ鎖］
ＣＤＲ１：Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ａｌａ＜配列番号５＞
ＣＤＲ２：Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ＜配列番号６＞
ＣＤＲ３：Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ＜配列番号７＞
［ＶＬ鎖］
ＣＤＲ１：Ａｌｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｌａ＜配列番号８＞
ＣＤＲ２：Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ＜配列番号９＞
ＣＤＲ３：Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ＜配列番号１０＞
上記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のいずれかまたは両方の可変領域を有する抗体フラグメントは、ヒト由来抗ヒトＩＬ−６抗体の可変領域を有し、ヒトＩＬ−６と強く反応して、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体間の結合に対して阻害作用を示す。
本発明で開示されるヒト抗ヒトＩＬ−６抗体のＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いてｓｃＦｖの形で得られたものであるが、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常部と連結した完全分子型ヒト抗ヒトＩＬ−６抗体、またヒト免疫グロブリンの定常部の一部と組み合わせたＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２などのヒト抗ヒトＩＬ−６抗体フラグメント、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンの定常部と結合させたヒト抗ヒトＩＬ−６一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）などの他のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体フラグメント、並びにこれら抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子断片をも本発明は包含する。また、これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も本発明に包含される。
【産業上の利用の可能性】
以上より、本発明のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体及び該抗体フラグメント分子は、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合によって引き起こされる種々の免疫応答を阻害することができ、消炎鎮痛剤としてあるいは自己免疫疾患の治療及び予防のための薬剤として使用することができる。
さらに、本発明のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体及び該抗体フラグメント分子は、その特性からヒト末梢血中または筋肉内のＩＬ−６発現細胞を検出或いは測定する免疫学的測定法を提供することが可能である。
また、本発明のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体及び該抗体フラグメント分子は、免疫学的に不活性な吸着物質からなる免疫吸着物質と吸着させた複合体とすることにより多くの応用が可能になる。たとえば、ヒト末梢血中のＩＬ−６をイムノアフィニティクロマトグラフィにより精製することができる。さらに、遺伝子組換え法により形質転換された培養細胞から産生される培養上清中のＩＬ−６の精製に用いることが可能である。
また、本発明のヒト抗ヒトＩＬ−６抗体の可変部位のペプチドまたはその誘導体は、それを認識するペプチドまたは抗イディオタイプ抗体を、ライブラリーより単離する新たな手段を提供する。得られるペプチドと抗イデオタイプ抗体、及びその誘導体は、ＩＬ−６の中和による急性炎症や自己免疫疾患の治療に有効であることが期待できる（Ｖｒｅｕｇｄｅｎｈｉｌ  Ｇ．ら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１９９０；１０（３）：１２７−３０；Ｈｉｒａｎｏ  Ｔ．ら、Ｒｉｃ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．１９８９  Ｊａｎ−Ｍａｒ；１９（１）：１−１０）。
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）により報告されている方法を参考に調製した。
健常者２０名由来末梢血よりＦｉｃｏｌを用いた比重遠心法にてリンパ球を分離し、ＰＢＳで充分に洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で処理して、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを４つに分割し、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、κ鎖、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを使用し、ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）にて、それぞれのｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートにして、Ｍａｒｋｓらが報告したのと同様にＶＨ（γまたはμ）とＪＨ及びＶκとＪκ、ＶλとＪλの組合せで各ジーンファミリーに特異的なプライマーを用いて、それぞれの抗体Ｖ領域遺伝子をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法にて増幅した。
更に、ＶＨ（γまたはμ）とＶκ、及びＶＨ（γまたはμ）とＶλをリンカーＤＮＡを用いて、アッセンブリーＰＣＲ法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ら：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６）により結合させ、一本鎖ｓｃＦｖ  ＤＮＡを作製した。ｓｃＦｖ  ＤＮＡは更にＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位を付加し、アガロースゲルで電気泳動後、精製した。精製したｓｃＦｖ  ＤＮＡは制限酵素ＳｆｉＩ（Ｔａｋａｒａ）とＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）で消化後、ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを結合させたｐＣＡＮＴＡＢ５ＥはＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ毎にエレクトロポレイションにより大腸菌ＴＧ１に導入した。形質転換したＴＧ１の数から、ＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλはそれぞれ１．１×１０８、２．１×１０８、８．４×１０７、５．３×１０７クローンの多様性を有すると評価された。この形質転換したＴＧ１から、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いてファージ抗体を発現し、健常人由来ｓｃＦｖ提示ファージライブラリーを調製した。
《実施例２：パンニング》
ヒトＩＬ−６は０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３１ｍＬに溶解し、３５ｍｍのディッシュ（岩城）に４℃で一晩反応させて固定化した。０．５％ゼラチン／ＰＢＳを用いて２０℃で２時間ブロッキングした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄した。これに健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）を０．９ｍＬ（１×１０１２ｔｕ／ｍＬ）加え、反応させた。
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１０回洗浄した後、１．０ｍＬのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ＩＬ−６と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ９．１を加えてｐＨを調整した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は３０００×ｇ，１０分で遠心分離して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレート（２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＳＯＢプレート）に播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイパー（Ｃｏａｓｔｏｒ）を使って懸濁、回収した。
このＴＧ１液５０μＬを、３０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。
健常人由来ファージライブラリーＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ、それぞれについて前述のＩＬ−６固定化プレートを用いてパンニングを計４回行った。４回目のパンニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認及びＩＬ−６  ＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った。
《実施例３：スクリーニングＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ》
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ヒトＩＬ−６及びコントロール蛋白をＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。１．２５μｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ−６、２．５μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１．２５μｇ／ｍＬのヒト単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ヒトＭＩＰ−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １−α）またはヒトＡＢ型血清を４０μＬ／ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、０．５％ＢＳＡ、０．５％ゼラチン及び５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液４００μＬ／ｗｅｌｌを入れて４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。
ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液４０μＬ／ｗｅｌｌを入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液（１ｇ／ｍＬ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ）、１０％ジエタノールアミン（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。マルチプレートオートリーダーＮＪ−２００１（Ｉｎｔｅｒ  Ｍｅｄ）で４０５ｎｍの吸光度を測定した結果、評価したクローン全てが、ＩＬ−６に特異的であることが確認できた（図１）。
《実施例４：クローンの配列分析》
単離したクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ塩基配列をＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。ＥＬＩＳＡ及び配列分析の結果、単離したクローンは４種に分類された。このうち、クローンＩＬ６ｇｋ３−２のＶＨ及びＶＬの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号３に示す。
《実施例５：ｓｃＦｖの発現と回収》
可溶性ｓｃＦｖを大腸菌ＨＢ２１５１を用いて発現させ、大腸菌ペリプラズム画分より回収、粗精製した。更に精製が必要な場合はＲＡＰＡＳ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）用いて、アフィニティ精製を行った。精製したｓｃＦｖ蛋白の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、ｓｃＦｖ蛋白のＣ末端のＥｔａｇエピトープを標的にしたウェスタンブロッティングにより確認した。ｓｃＦｖ蛋白精製品の蛋白濃度の決定には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。
《実施例６：ＳＰＲ法による精製ｓｃＦｖの親和性測定》
ＢＩＡｃｏｒｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ社）を用いて、ＳＰＲ法により精製ｓｃＦｖの親和性を測定した結果、単離されたクローンのうち最も高い親和性を示したクローンＩＬ６ｇｋ３−２は、ヒトＩＬ−６に対して１３×１０−９Ｍの解離定数を有すると評価された（図２）。
《実施例７：ＩＬ−６依存性細胞株の増殖応答に対する影響》
精製ｓｃＦｖを用いて、ＩＬ−６に依存的に増殖する細胞株ＫＴ−３のＩＬ−６依存的な増殖応答に対する阻害効果について検討した。２ｘ１０４個／２００μｌ／ウエルに調製したＫＴ−３をＩＬ−６（８０ｐｇ／ｍｌ）と１．２５〜２０μｇ／ｍｌのクローンＩＬ６ｇｋ３−２由来の精製ｓｃＦｖ存在下、４日間培養しチミジン取り込みによるＤＮＡ合成を評価した結果、クローンＩＬ６ｇｋ３−２由来ｓｃＦｖはＫＴ−３細胞の増殖応答を濃度依存的に抑制することがわかった（図３）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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