(57)【要約】本発明者は、ヒトＤＲ５遺伝子のプロモーター塩基配列及びヒトＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター塩基配列並びにそのコアプロモーターと考えられる領域を初めて見出した。本発明は、さらに、これらのＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターを保持する細胞に被験物質を接触させる工程と、被験物質の接触によるレポーター遺伝子の発現量の変化を検出する工程とを含む、プロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、抗ガン剤などを極めて効率よく選択できる方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１における塩基番号１０２９〜１０３４の塩基配列若しくは塩基番号１０７５〜１０８０の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｂ）配列表の配列番号１における塩基番号１０２９〜１０３４の塩基配列若しくは塩基番号１０７５〜１０８０の塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ｃ）若しくは（ｄ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｄ）配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ：
塩基番号１０２〜１０８、１３３〜１４３、１４９〜１６２、１７４〜１８３、１９６〜２１０、２０８〜２２１、２１１〜２２０、２１２〜２２６、２２２〜２３１、２６３〜２６９、２６５〜２７８、２９６〜３０２、３７７〜３８３、３７０〜３７６、４０９〜４２０、４３０〜４４０、４３１〜４３６、４５７〜４７０、４５８〜４７０、４８２〜４９２、４９８〜５０７、４９９〜５０３、５００〜５０５、５２８〜５３４、５３６〜５４１、５３７〜５４２、５４２〜５４７、５４９〜５６１、５５５〜５６７、５５３〜５６０、５５９〜５６６、５７５〜５８７、５９３〜５９８、５９８〜６１０、６０１〜６１０、６１４〜６１９、６１８〜６２３、６４２〜６４８、６５０〜６５６、６５７〜６６２、６８３〜６９７、７００〜７０７、７４２〜７４７、７７４〜７７９、７８５〜７９８、７８８〜７９２、７９２〜７９９、７９５〜８０１、８０９〜８１３、８１４〜８２５、８１５〜８２５、８６１〜８６７、８６７〜８７２、８６７〜８７３、９０１〜９１３、９０１〜９０４、９０２〜９１１、９１５〜９２３、９１９〜９２４、９２４〜９３９、９２１〜９２８、９２６〜９３３、９３０〜９３６、９４８〜９５７、９７１〜９７７、９７２〜９７８、９８９〜９９４、１０２６〜１０３５、１０２９〜１０３４、１０４８〜１０５７、１０７５〜１０８０、１０９７〜１１０３、１１０６〜１１１３、１１２５〜１１３３、１１６９〜１１７５、１２００〜１２０９、１１５３〜１１６２、１１６０〜１１６９、１１６０〜１１６８、１２０６〜１３０５、１２０９〜１２２０、１２３０〜１２３８、１２９７〜１３０４、１３２４〜１３３１、１３６６〜１３７７、１３７３〜１３８０、１３７３〜１３８２、１３９１〜１３９８、１４２１〜１４３０、１４３０〜１３４２、１３３４〜１３４１、１５２１〜１５３０、１５８３〜１５８９、１５９１〜１６００、１５９０〜１５９６、１５９１〜１６００、１５９３〜１６０４、１６０７〜１６１４、１６０８〜１６１５、１６２６〜１６３６、１６２６〜１６３８、１６２８〜１６３７、１６２９〜１６３８、１６２９〜１６４１、１６３０〜１６４１の塩基配列
【請求項３】
配列表の配列番号１における塩基番号６１９〜７７６の塩基配列、塩基番号７７７〜１０２５の塩基配列および塩基番号１０２６〜１１０８の塩基配列のうち少なくとも１の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号１における塩基番号１〜１１０８の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ｅ）若しくは（ｆ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｅ）配列表の配列番号２における塩基番号２２１９〜２２２４の塩基配列（ＣＣＣＧＣＣ）を含むＤＮＡ、又は、
（ｆ）配列表の配列番号２における塩基番号２２１９〜２２２４の塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ
【請求項７】
以下の（ｇ）若しくは（ｈ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｇ）配列表の配列番号２における以下のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｈ）配列表の配列番号２における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ：
塩基番号９５〜１０４、１５８〜１７０、２７２〜２７８、３２０〜３２６、３６２〜３６８、４３８〜４４４、５６８〜５７５、７５３〜７６２、１３８３〜１３９１、１４３８〜１４４７、１５０９〜１５１５、１６１３〜１６１９、１６４９〜１６６０、１７１５〜１７２４、１７２８〜１７３７、１７８９〜１７９７、１８２６〜１８３２、１８８９〜１８９５、２０５８〜２０６９、２０７４〜２０７８、２１０３〜２１０７、２２０９〜２２１６、２２１９〜２２２４、２３０２〜２３０７、２３１７〜２３２４の塩基配列
【請求項８】
配列表の配列番号２における塩基番号２０３５〜２３８２の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
【請求項９】
配列表の配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターを保持する細胞に被験物質を接触させる工程と、被験物質の接触によるレポーター遺伝子の発現量の変化を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターを保持する細胞に被験物質を導入する工程と、被験物質の導入によるレポーター遺伝子の発現量の変化を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡに被験物質を接触させる工程と、このＤＮＡと結合した物質を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡに、被験物質の存在下および非存在下で、ＤＮＡ結合蛋白質を接触させる工程と、被験物質の存在による前記ＤＮＡへのＤＮＡ結合蛋白質の結合量の変化を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載のスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質。
【請求項１５】
請求項１１に記載のスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質。
【請求項１６】
請求項１２に記載のスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質。
【請求項１７】
請求項１３に記載のスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８のベクターを保持する細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、がん細胞にアポトーシスを誘導する遺伝子（癌抑制関連遺伝子）であるＤＲ５遺伝子およびＳｉａｈ−１遺伝子の各プロモーター、これらのプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法、及び、このスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質に関する。
背景技術
ｐ５３遺伝子は、ヒトがんにおいて高頻度に変異が報告されている代表的ながん抑制遺伝子である。ｐ５３蛋白は、転写因子として標的遺伝子を転写レベルで活性化することによりがんの発症および進行を抑制できることが知られている。詳述すれば、ｐ５３タンパク質は、正常細胞の遺伝子に突然変異が生じてがん化に進み出すときに、Ｇ１後期で細胞周期を停止させて、その間にＤＮＡ修復を行い、さらに修復できない場合にはアポトーシスにより初期のがん細胞を死滅させると考えられている（交通医学５３（５／６），１７８−１８０，１９９９）。
ここで、ｐ５３タンパク質により転写誘導され、ｐ５３依存性のアポトーシスに関わる蛋白の一つとしてＤＲ５（デスレセプター；Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）が知られている。ＤＲ５は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）が結合することによりアポトーシスを引き起こす。ＴＲＡＩＬのレセプターとしては、この他にＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２が知られている。ＤｃＲ１およびＤｃＲ２は、ＴＲＡＩＬ結合領域は有するが活性を持つ細胞内デス領域を有さないためにアポトーシスを誘導しない。一方、ＤＲ４およびＤＲ５は、ＴＲＡＩＬ結合領域と細胞内デス領域とを含み、細胞内デス領域を介してアポトーシスを誘導する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，８１５−８１８（１９９７））。
ＴＲＡＩＬは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで、正常細胞に比してがん細胞に選択毒性を示す（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２６８７−１２６９０）。これは、正常細胞においてはがん細胞に比して、ＴＲＡＩＬレセプター遺伝子のうちＤｃＲが優性に発現していることによると考えられる。
また、ｐ５３により転写誘導される他のタンパク質として、Ｓｉａｈ−１（ｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１）が知られている（ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，２７３６−２７４７（１９９８）．）。Ｓｉａｈ−１は、ｐ５３タンパク質により活性化されてアポトーシスおよび細胞周期停止を引き起こす。
詳述すれば、Ｓｉａｈ−１によるアポトーシスおよび細胞周期停止には、蛋白分解酵素複合体であるプロテアソームが関与している。プロテアソームはユビキチン化された標的蛋白を、そのユビキチンを認識して標的蛋白を分解する酵素である。Ｓｉａｈ−１は、その一部で標的タンパク質にユビキチンを結合させる酵素と結合することによりユビキチン結合酵素を活性化し、その結果プロテアソームによる標的タンパク質の分解を促進する。プロテアソームの標的タンパク質の１つにβ−カテニンタンパク質があるが、β−カテニンタンパク質が分解されることにより、ＣｙｃｌｉｎＤ１、Ｍｙｃ等の遺伝子の発現が抑制され、アポトーシス、細胞周期停止が起こる。（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１，２７０１−２７１４（１９９７）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，１７７５−１７８０（１９９８）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７，９１５−９２６（２００１））
以上のように、ＤＲ５遺伝子及びＳｉａｈ−１遺伝子は、転写レベルで活性化されることにより、アポトーシスや細胞周期停止を誘導し、その結果、がん抑制に重要な役割を果たしていることから、これらの遺伝子の転写を活性化できる物質を見出すことができれば、がん治療に非常に有用である。
発明の開示
本発明は、ヒトＤＲ５遺伝子及びＳｉａｈ−１遺伝子の各プロモーター、これらのプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法、並びに、これらのスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、ＤＲ５遺伝子の部分断片及びＳｉａｈ−１遺伝子の部分断片を調製し、これらをプローブとしてヒト白血球ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＤＲ５遺伝子のプロモーター領域及びヒトＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター領域を単離することに成功した。また、これらのプロモーター領域の一連の欠失変異体を作製することにより、プロモーター活性に主に寄与する領域を見出した。
さらに、本発明者は、これらのプロモーター領域を挿入したレポータープラスミドを用いることにより、ＤＲ５遺伝子またはＳｉａｈ−１遺伝子の発現を調節できる物質を迅速かつ確実にスクリーニングできることを見出した。
本発明は、前記知見に基づき完成されたものであり、以下のＤＲ５遺伝子及びＳｉａｈ−１遺伝子の各プロモーター領域、これらのプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法、並びに、このスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質を提供する。
項１．  以下の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１における塩基番号１０２９〜１０３４の塩基配列若しくは塩基番号１０７５〜１０８０の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｂ）配列表の配列番号１における塩基番号１０２９〜１０３４の塩基配列若しくは塩基番号１０７５〜１０８０の塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ
項２．  以下の（ｃ）若しくは（ｄ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｄ）配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ：
塩基番号１０２〜１０８、１３３〜１４３、１４９〜１６２、１７４〜１８３、１９６〜２１０、２０８〜２２１、２１１〜２２０、２１２〜２２６、２２２〜２３１、２６３〜２６９、２６５〜２７８、２９６〜３０２、３７７〜３８３、３７０〜３７６、４０９〜４２０、４３０〜４４０、４３１〜４３６、４５７〜４７０、４５８〜４７０、４８２〜４９２、４９８〜５０７、４９９〜５０３、５００〜５０５、５２８〜５３４、５３６〜５４１、５３７〜５４２、５４２〜５４７、５４９〜５６１、５５５〜５６７、５５３〜５６０、５５９〜５６６、５７５〜５８７、５９３〜５９８、５９８〜６１０、６０１〜６１０、６１４〜６１９、６１８〜６２３、６４２〜６４８、６５０〜６５６、６５７〜６６２、６８３〜６９７、７００〜７０７、７４２〜７４７、７７４〜７７９、７８５〜７９８、７８８〜７９２、７９２〜７９９、７９５〜８０１、８０９〜８１３、８１４〜８２５、８１５〜８２５、８６１〜８６７、８６７〜８７２、８６７〜８７３、９０１〜９１３、９０１〜９０４、９０２〜９１１、９１５〜９２３、９１９〜９２４、９２４〜９３９、９２１〜９２８、９２６〜９３３、９３０〜９３６、９４８〜９５７、９７１〜９７７、９７２〜９７８、９８９〜９９４、１０２６〜１０３５、１０２９〜１０３４、１０４８〜１０５７、１０７５〜１０８０、１０９７〜１１０３、１１０６〜１１１３、１１２５〜１１３３、１１６９〜１１７５、１２００〜１２０９、１１５３〜１１６２、１１６０〜１１６９、１１６０〜１１６８、１２０６〜１３０５、１２０９〜１２２０、１２３０〜１２３８、１２９７〜１３０４、１３２４〜１３３１、１３６６〜１３７７、１３７３〜１３８０、１３７３〜１３８２、１３９１〜１３９８、１４２１〜１４３０、１４３０〜１３４２、１３３４〜１３４１、１５２１〜１５３０、１５８３〜１５８９、１５９１〜１６００、１５９０〜１５９６、１５９１〜１６００、１５９３〜１６０４、１６０７〜１６１４、１６０８〜１６１５、１６２６〜１６３６、１６２６〜１６３８、１６２８〜１６３７、１６２９〜１６３８、１６２９〜１６４１、１６３０〜１６４１の塩基配列
項３．  配列表の配列番号１における塩基番号６１９〜７７６の塩基配列、塩基番号７７７〜１０２５の塩基配列および塩基番号１０２６〜１１０８の塩基配列のうち少なくとも１の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
項４．  配列表の配列番号１における塩基番号１〜１１０８の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
項５．  配列表の配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
項６．  以下の（ｅ）若しくは（ｆ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｅ）配列表の配列番号２における塩基番号２２１９〜２２２４の塩基配列（ＣＣＣＧＣＣ）を含むＤＮＡ、又は、
（ｆ）配列表の配列番号２における塩基番号２２１９〜２２２４の塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ
項７．  以下の（ｇ）若しくは（ｈ）のＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
（ｇ）配列表の配列番号２における以下のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ、又は、
（ｈ）配列表の配列番号２における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接した上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接した下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡ：
塩基番号９５〜１０４、１５８〜１７０、２７２〜２７８、３２０〜３２６、３６２〜３６８、４３８〜４４４、５６８〜５７５、７５３〜７６２、１３８３〜１３９１、１４３８〜１４４７、１５０９〜１５１５、１６１３〜１６１９、１６４９〜１６６０、１７１５〜１７２４、１７２８〜１７３７、１７８９〜１７９７、１８２６〜１８３２、１８８９〜１８９５、２０５８〜２０６９、２０７４〜２０７８、２１０３〜２１０７、２２０９〜２２１６、２２１９〜２２２４、２３０２〜２３０７、２３１７〜２３２４の塩基配列
項８．  配列表の配列番号２における塩基番号２０３５〜２３８２の塩基配列を含むＤＮＡ、または、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーターとして機能するＤＮＡ。
項９．  配列表の配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡ。
項１０．  項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターを保持する細胞に被験物質を接触させる工程と、被験物質の接触によるレポーター遺伝子の発現量の変化を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
項１１．  項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターを保持する細胞に被験物質を導入する工程と、被験物質の導入によるレポーター遺伝子の発現量の変化を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
項１２．  項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡに被験物質を接触させる工程と、このＤＮＡと結合した物質を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
項１３．  項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡに、被験物質の存在下および非存在下で、ＤＮＡ結合蛋白質を接触させる工程と、被験物質の存在による前記ＤＮＡへのＤＮＡ結合蛋白質の結合量の変化を検出する工程とを含むプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法。
項１４．  項１０〜１３のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるプロモーター活性を調節する物質。
項１５．  項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター。
項１６．  項１５のベクターを保持する細胞。
発明の詳細な記述
ヒトＤＲ５遺伝子のプロモーター
＜プロモーター領域の単離＞
本発明者は、ヒトＤＲ５遺伝子のプロモーターＤＮＡを得るために、ヒトＤＲ５塩基配列（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，８１５−８１８（１９９７））に基づき、二つのオリゴヌクレオチド５’ＣＣＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＣＧ３’（配列番号３）および５’ＧＴＴＴＣＡＧＣＣＣＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＴＣＧＧＧＣＡＴＣＧ３’（配列番号４）を合成し、これらのオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−３２Ｐ］で標識した。さらに、標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒト白血球ゲノムλＰＳライブラリー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｔｅｃ．，Ｇｏｔｔｉｎｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をスクリーニングし、ＤＲ５プロモーターＤＮＡと考えられる約１０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。さらに、このＤＮＡ断片から約２．５ｋｂｐのＳａｃＩ−ＮｃｏＩ断片をｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０６−０４８３１）にサブクローニングし、その塩基配列を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ，ＰＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで決定した。
このＳａｃＩ−ＮｃｏＩ断片のうちＮｃｏＩサイトを含む３’末端側の一部分の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。この断片には、ヒトＤＲ５遺伝子のエクソン１のコーディング領域（配列番号１において塩基番号１２２５〜１３６８）およびイントロン１の一部（配列番号１において塩基番号１３６９〜１６５４）が含まれており、これらの配列は、報告されているヒトＤＲ５遺伝子の塩基配列（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，８１５−８１８（１９９７））と一致していた。
さらに、単離したＤＮＡがＤＲ５プロモーターとしての活性を示すことを確認するために、得られたＤＮＡの約２．５ｋｂのＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片をルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０６−０４８３１）にサブクローニングし、ＤＲ５遺伝子が恒常的に発現しているＭＣＦ−７細胞（国立医薬品食品衛生研究所、細胞バンク、ＪＣＲＢ０１３４）に遺伝子導入し、所定時間培養後のＭＣＦ−７細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、前記プラスミドが導入されたＭＣＦ−７細胞の溶解物はルシフェラーゼ活性を示し、前記ＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片は、プロモーター活性を有することが確認された。
すなわち、本発明のＤＲ５遺伝子のプロモーターとして最も好ましいのは、配列表の配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡである。
配列表の配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡが特に好ましい。
なお、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡにおいて、１または２以上の塩基が置換、欠失、もしくは付加したＤＮＡは、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの公知の方法により作製できる。
本発明のプロモーターは、ヒトＤＲ５遺伝子の塩基配列に基づき公知の方法で作製することができる。例えば、前述したように、ヒトＤＲ５遺伝子の塩基配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ヒトゲノムライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法の他、ヒトゲノムライブラリーをＰＣＲの鋳型として用いて、ベクターＤＮＡに対応するセンスプライマーとＤＲ５ＤＮＡの一部に対応するアンチセンスプライマーのオリゴヌクレオチドを合成し、これらを組み合わせてＰＣＲを行うことによっても得ることができる。
＜プロモーター活性に主に寄与する領域＞
本発明のヒトＤＲ５遺伝子のプロモーターは、少なくとも以下の▲１▼又は▲２▼の塩基配列を含むか、又は、この塩基配列のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーター活性を有する塩基配列を含むものであってもよい。特に、少なくとも以下の▲１▼又は▲２▼の塩基配列からなるか、又は、この塩基配列のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともにプロモーター活性を有する塩基配列が好ましい。
▲１▼  配列表の配列番号１において、塩基番号６１９〜７７６の塩基配列、塩基番号７７７〜１０２５の塩基配列、又は、塩基番号１０２６〜１１０８の塩基配列
これらの領域は、以下のようにして、プロモーター活性に寄与する領域であると結論付けられた。すなわち、ＤＲ５遺伝子のプロモーター領域であるＳａｃＩ−ＮｃｏＩ断片が連結されたルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２について、市販のキットを用いて、プロモーター領域の一連の５’末端変異体を作製した。これらの変異体をＭＣＦ−７細胞に一時的に遺伝子導入し、所定時間培養後のＭＣＦ−７細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、配列番号１における塩基番号６１９〜７７６の領域、塩基番号７７７〜１０２５の領域および塩基番号１０２６〜１１０８の領域の欠失によりルシフェラーゼ活性が有意に減少した。このことから、これらの領域に、プロモーター活性に必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が存在すると考えられる。
▲２▼配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列、又は、配列表の配列番号１における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列とからなる塩基配列：
塩基番号１０２〜１０８、１３３〜１４３、１４９〜１６２、１７４〜１８３、１９６〜２１０、２０８〜２２１、２１１〜２２０、２１２〜２２６、２２２〜２３１、２６３〜２６９、２６５〜２７８、２９６〜３０２、３７７〜３８３、３７０〜３７６、４０９〜４２０、４３０〜４４０、４３１〜４３６、４５７〜４７０、４５８〜４７０、４８２〜４９２、４９８〜５０７、４９９〜５０３、５００〜５０５、５２８〜５３４、５３６〜５４１、５３７〜５４２、５４２〜５４７、５４９〜５６１、５５５〜５６７、５５３〜５６０、５５９〜５６６、５７５〜５８７、５９３〜５９８、５９８〜６１０、６０１〜６１０、６１４〜６１９、６１８〜６２３、６４２〜６４８、６５０〜６５６、６５７〜６６２、６８３〜６９７、７００〜７０７、７４２〜７４７、７７４〜７７９、７８５〜７９８、７８８〜７９２、７９２〜７９９、７９５〜８０１、８０９〜８１３、８１４〜８２５、８１５〜８２５、８６１〜８６７、８６７〜８７２、８６７〜８７３、９０１〜９１３、９０１〜９０４、９０２〜９１１、９１５〜９２３、９１９〜９２４、９２４〜９３９、９２１〜９２８、９２６〜９３３、９３０〜９３６、９４８〜９５７、９７１〜９７７、９７２〜９７８、９８９〜９９４、１０２６〜１０３５、１０２９〜１０３４、１０４８〜１０５７、１０７５〜１０８０、１０９７〜１１０３、１１０６〜１１１３、１１２５〜１１３３、１１６９〜１１７５、１２００〜１２０９、１１５３〜１１６２、１１６０〜１１６９、１１６０〜１１６８、１２０６〜１３０５、１２０９〜１２２０、１２３０〜１２３８、１２９７〜１３０４、１３２４〜１３３１、１３６６〜１３７７、１３７３〜１３８０、１３７３〜１３８２、１３９１〜１３９８、１４２１〜１４３０、１４３０〜１３４２、１３３４〜１３４１、１５２１〜１５３０、１５８３〜１５８９、１５９１〜１６００、１５９０〜１５９６、１５９１〜１６００、１５９３〜１６０４、１６０７〜１６１４、１６０８〜１６１５、１６２６〜１６３６、１６２６〜１６３８、１６２８〜１６３７、１６２９〜１６３８、１６２９〜１６４１、１６３０〜１６４１の各塩基配列
これらの領域は、以下のようにして、プロモーター活性に必須な転写因子結合部位を含むと結論付けられた。すなわち、配列番号１の塩基配列について、ＴＦＳＥＡＲＣＨを用いて、公知の転写因子との結合可能性をコンピューター検索により調べた。使用した公知の転写因子は、ＧＡＴＡ−１、ＡＭＬ−１ａ、ｃ−Ｅｔｓ２、ＡＤＲ１、ｃ−Ｍｙｂ、ＳＲＹ、Ｓｐ１、ＭＺＦ１、ＣｄｘＡ、ＮＦｋＢ、ｐ３００、ＨＳＦ２、Ｔｓｔ−１、Ｓｏｘ−５、Ｏｃｔ−１、ＧＡＴＡ−１、Ｔｓｔ−１、Ｎｋｘ−２、Ｃ／ＥＢＰ  β、ｄｅｌｔａＥ、Ｉｋ−２、Ｅｌｋ−１、ＩＲＦ−２、Ｅ４７、ＳＰＹ、ＳＴＡＴ、ＵＳＦ、ＧＡＴＡ−３、ＴＡＴＡ、ｃ−Ｒｅｌなどである。検索の結果、上記の各ＤＮＡ領域がこれらのいずれかの転写因子と結合し得る領域であることが判明した。
また、これらのＤＮＡ領域に隣接する前後６塩基程度までのＤＮＡ領域も、転写因子との結合性に関与すると考えられる。すなわち、これらの塩基配列とこれに隣接する上流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ（特にこれらの塩基配列とこれに隣接する上流側の最大６塩基までの塩基配列からなるＤＮＡ）、これらの塩基配列とこれに隣接する下流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ（特にこれらの塩基配列とこれに隣接する下流側の最大６塩基までの塩基配列からなるＤＮＡ）、又は、これらの塩基配列とこれに隣接する上流側および下流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ（特にこれらの塩基配列とこれに隣接する上流側および下流側の最大６塩基までの塩基配列からなるＤＮＡ）も、転写因子との結合性可能性がある。「最大６塩基」には、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基または１塩基のいずれの場合も含まれる。
前記の転写因子との結合可能領域のうち、塩基番号１０２９〜１０３４で示されるＤＮＡ領域及び塩基番号１０７５〜１０８０で示されるＤＮＡ領域は、コアプロモーター領域と考えられる。これは、この二つの転写因子結合可能部位がＤＲ５遺伝子の開始コドンに最も近い転写因子結合可能部位であること、及び、この二つの転写因子結合可能部位を含むプロモーターＤＮＡを連結したルシフェラーゼレポータープラスミドにおいて、この二つの部位に位置指定突然変異を導入した場合には、ルシフェラーゼの発現量が有意に減少することから導かれる。
従って、本発明のＤＲ５遺伝子のプロモーターとして前記▲２▼に列記したＤＮＡのうちでは、塩基番号１０２９〜１０３４の塩基配列若しくは塩基番号１０７５〜１０８０の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、これらの塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡが、特に好ましい。塩基番号１０２９〜１０３４の塩基配列若しくは塩基番号１０７５〜１０８０の塩基配列からなるＤＮＡ、又は、これらの塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列からなるＤＮＡが、さらに特に好ましい。
ヒトＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター
＜Ｓｉａｈ−１プロモーター領域の単離＞
本発明者は、ヒトＳｉａｈ−遺伝子のプロモーターＤＮＡを得るために、ヒトＳｉａｈ−１遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６，１０３−１１１（１９９７））に基づき、ヒトＳｉａｈ−１遺伝子のエクソン１のＤＮＡ配列を含む二つのオリゴヌクレオチド５’ＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴ３’（配列番号５）および５’ＴＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＡＣＧＧＧＡＣＡＣＣＣＴ３’（配列番号６）を合成し、これらのオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−３２Ｐ］で標識した。さらに、標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒト白血球ゲノムλＰＳライブラリー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｔｅｃ．，Ｇｏｔｔｉｎｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をスクリーニングし、ヒトＳｉａｈ−１遺伝子のエクソン１およびその５’末端隣接領域を含む約１６．５ｋｂのＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片を得た。さらに、このＳａｃＩ断片から２５１５ｂｐのＫｐｎ−１−ＮｃｏＩ断片（ＮｃｏＩ  ｓｉｔｅはＰＣＲにより導入した）をｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０６−０４８３１）にサブクローニングし、その塩基配列を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ，ＰＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで決定した。
このＫｐｎ−１−ＮｃｏＩ断片の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。この断片には、ヒトＳｉａｈ−１遺伝子の５’隣接領域（エクソン１の一部）（配列番号２において塩基番号２３８８〜２５１５）が含まれており、これらの配列は、報告されているヒトＳｉａｈ−１遺伝子の５’隣接領域の塩基配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６，１０３−１１１（１９９７））と一致していた。
さらに、単離したＤＮＡがＳｉａｈ−１プロモーターとしての活性を示すことを確認するために、前記の２５１５ｂｐのＫｐｎ−１−ＮｃｏＩ断片を含むルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０６−０４８３１）を、Ｓｉａｈ−１遺伝子が恒常的に発現しているＭＣＦ−７細胞（国立医薬品食品衛生研究所、細胞バンク、ＪＣＲＢ０１３４）に遺伝子導入し、所定時間培養後のＭＣＦ−７細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、前記プラスミドが導入されたＭＣＦ−７細胞の溶解物はルシフェラーゼ活性を示し、前記Ｋｐｎ−１−ＮｃｏＩ断片は、プロモーター活性を有することが確認された。
すなわち、本発明のＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーターとしては、配列表の配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡが最も好ましい。配列表の配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、又は、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーターとして機能するＤＮＡが特に好ましい。
＜プロモーター活性に主に寄与する領域＞
本発明のプロモーターは、少なくとも以下の▲３▼又は▲４▼の塩基配列を含むか、又は、この塩基配列のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーター活性を有する塩基配列を含むものであってよい。少なくとも以下の▲３▼又は▲４▼の塩基配列からなるか、又は、この塩基配列のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、プロモーター活性を有する塩基配列からなるものが好ましい。
▲３▼  配列表の配列番号２において、塩基番号２０３５〜２３８２の塩基配列
この領域は、以下のようにして、プロモーター活性に寄与する領域であると結論付けられた。すなわち、Ｓｉａｈ−１遺伝子のプロモーター領域であるＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ断片が連結されたルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２について、プロモーター領域の一連の５’末端変異体を作製した。これらの変異体をＭＣＦ−７細胞に一時的に遺伝子導入し、所定時間培養後のＭＣＦ−７細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、配列番号２において、塩基番号２０３５〜２３８２の領域の欠失によりルシフェラーゼ活性が有意に減少した。このことから、この領域に、プロモーター活性に必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が存在すると考えられる。
▲４▼  配列表の配列番号２における以下のいずれかの塩基配列、又は、配列表の配列番号２における以下のいずれかの塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列とからなる塩基配列：
塩基番号９５〜１０４、１５８〜１７０、２７２〜２７８、３２０〜３２６、３６２〜３６８、４３８〜４４４、５６８〜５７５、７５３〜７６２、１３８３〜１３９１、１４３８〜１４４７、１５０９〜１５１５、１６１３〜１６１９、１６４９〜１６６０、１７１５〜１７２４、１７２８〜１７３７、１７８９〜１７９７、１８２６〜１８３２、１８８９〜１８９５、２０５８〜２０６９、２０７４〜２０７８、２１０３〜２１０７、２２０９〜２２１６、２２１９〜２２２４、２３０２〜２３０７、２３１７〜２３２４の各塩基配列
これらの領域は、以下のようにして、プロモーター活性に必須な転写因子結合部位を含むと結論付けられた。すなわち、配列番号２の塩基配列について、ＴＦＳＥＡＲＣＨを用いて、公知の転写因子との結合可能性をコンピューター検索により調べた。使用した公知の転写因子は、ＧＡＴＡ−１、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＲＹ、ｃｄｘＡ、ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＮＦκＢ、Ｓｐｌ、Ｎ−ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｂ、Ｅ２Ｆなどである。検索の結果、これらの転写因子との結合可能性が見出されたのは、上記の各ＤＮＡ領域である。
また、これらのＤＮＡ領域に隣接する前後６塩基程度までのＤＮＡ領域も、転写因子との結合性に関与すると考えられる。すなわち、これらの塩基配列とこれに隣接する上流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ（特にこれらの塩基配列とこれに隣接する上流側の最大６塩基までの塩基配列からなるＤＮＡ）、これらの塩基配列とこれに隣接する下流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ（特にこれらの塩基配列とこれに隣接する下流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ）、又は、これらの塩基配列とこれに隣接する上流側および下流側の最大６塩基までの塩基配列とを含むＤＮＡ（特にこれらの塩基配列とこれに隣接する上流側および下流側の最大６塩基までの塩基配列からなるＤＮＡ）も、転写因子との結合性可能性がある。
前記の転写因子との結合可能領域のうち、塩基番号２２１９〜２２２４で示されるＤＮＡ領域は、コアプロモーター領域と考えられる。これは、このＤＮＡ領域を含むプロモーターＤＮＡを連結したルシフェラーゼレポータープラスミドにおいて、塩基番号２２１９〜２２２４で示されるＤＮＡ領域に位置指定突然変異を導入した場合には、ルシフェラーゼの発現量が有意に減少することから導かれる。
従って、本発明のＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーターとして前記▲４▼に列記したＤＮＡのうちでは、配列番号１における塩基番号２２１９〜２２２４の塩基配列を含むＤＮＡ、又は、この塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列とを含むＤＮＡが、特に好ましい。配列番号１における塩基番号２２１９〜２２２４の塩基配列からなるＤＮＡ、又は、この塩基配列と、これに隣接する上流側の最大６塩基若しくは／及びこれに隣接する下流側の最大６塩基の塩基配列からなるＤＮＡがさらに特に好ましい。
ヒトＤＲ５遺伝子のプロモーター及びヒトＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーターの有用性
本発明のプロモーターＤＮＡは、例えば、その生体内における変異によるＤＲ５又はＳｉａｈ−１タンパク質の欠損あるいは発現異常症などの治療や予防に利用することができる。即ち、本発明のＤＲ５プロモーターＤＮＡを有するＤＲ５遺伝子または本発明のＳｉａｈ−１プロモーターを有するＳｉａｈ−１遺伝子を、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのベクターに挿入し、あるいはリポソームなどに封入して体細胞に導入することにより、正常な制御の下にＤＲ５タンパク質又はＳｉａｈ−１タンパク質を発現させることができ、これによりＤＲ５タンパク質又はＳｉａｈ−１タンパク質の欠損あるいは発現異常症などの改善を図ることができる。
また、本発明のプロモーターＤＮＡがある特異的な刺激により活性化または抑制されることが判明した場合、所望の遺伝子の上流に本発明のＤＮＡを挿入したベクターなどを作製して体細胞に導入し、その刺激を付加することにより、その所望の遺伝子を誘導的に発現誘導または発現抑制させることができる。例えば、所望の遺伝子として殺細胞遺伝子を用いれば、その該特異的な刺激により、本発明のプロモーターＤＮＡが導入された細胞を選択的に死滅させることが可能である。このような本発明のプロモーターＤＮＡの利用は、殺傷したい細胞が存在する幅広い疾患（例えば、がん等）に適用可能である。
また、本発明のプロモーターＤＮＡと同じ塩基配列を有するＤＮＡは、細胞に存在するＤＲ５プロモーターＤＮＡ又はＳｉａｈ−１プロモーターＤＮＡとこれらに結合しうる蛍白質（例えば、転写因子）との結合を拮抗阻害しうる。このためそのＤＮＡが、ＤＲ５又はＳｉａｈ−１プロモーターＤＮＡのプロモーター活性を阻害するタンパク質とＤＲ５又はＳｉａｈ−１プロモーターとの結合を拮抗阻害する場合には、この方法によりＤＲ５又はＳｉａｈ−１プロモーター活性を促進することができ、逆にプロモーター活性を促進するタンパク質とＤＲ５又はＳｉａｈ−１プロモーターとの結合を拮抗阻害する場合には、この方法によりＤＲ５又はＳｉａｈ−１プロモーター活性を阻害することができる。
前述したように、ＤＲ５又はＳｉａｈ−１蛋白質はアポトーシス又は細胞周期停止を引き起こす作用を有することから、ＤＲ５又はＳｉａｈ−１プロモーターの活性の促進は、悪性腫瘍、動脈硬化またはバルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄のような細胞増殖性疾患の治療等に有用である。一方、ＤＲ５又はＳｉａｈ−１プロモーターＤＮＡの活性の阻害は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療等に有効である。
また、本発明プロモーターＤＮＡは、後述するように、このＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子を用いることにより、このプロモーターの活性を調節する物質のスクリーニングに利用できる。すなわち、本発明のプロモーターＤＮＡは、このプロモーターＤＮＡに直接結合することにより、または細胞膜受容体や細胞内蛋白質に結合し間接的にこのプロモーターＤＮＡに作用することにより、ＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子を転写レベルで調節できる物質をスクリーニングすることに使用できる。
ＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子を転写レベルで活性化できる化合物は、悪性腫瘍、動脈硬化、あるいはバルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄などの細胞増殖性疾患の治療等に有用である。一方、ＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子を転写レベルで抑制できる物質は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療などに有効である。
ヒトＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーターの活性を調節する物質のスクリーニング方法
＜被験物質＞
本発明のスクリーニング方法において、被験物質は特に制限されず、蛋白質、オリゴペプチド、これらをコードするＤＮＡ、多糖類、低分子化合物等が広く含まれる。これらは自然界から単離されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。これらの物質の種類および分子量は特に制限されないが、細胞内への移行性を考慮すれば、低分子化合物であるのが最も好ましい。
オリゴペプチドないしはタンパク質が、細胞内に移行して本発明のプロモーターに作用するものである場合には、治療薬として使用する際は、例えば、膜透過蛋白質との融合蛋白質として用い、この膜透過タンパク質の細胞膜透過機構を利用することにより細胞内に移行させることができる。
＜レポーター遺伝子＞
以下に述べるスクリーニング方法において使用するレポーター遺伝子としては、公知のレポーター遺伝子を広く使用できる。このような公知のレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）等が挙げられる。これらのうち、ルシフェラーゼ遺伝子は、高感度であること、活性の測定が容易であること等により好ましい。
これらは、内在性のプロモーター領域が欠損したレポータープラスミドまたは内在性のエンハンサーが欠損したレポータープラスミドとして市販されている。ルシフェラーゼプラスミドとしては、ｐＴ８１１ｕｃ、ｐＳｌｕｃ２、ｐＸＰ１／ｐＸＰ２（いずれも、Ｎｏｒｄｅｅｎ，１９８８）等が市販されている。
レポーター遺伝子は、市販のレポータープラスミドを使用してもよいが、公知のベクターに挿入して用いることもできる。ベクターは、プラスミドベクター、ウィルスベクター等のいずれも用いることができる。また、ベクターは、動物細胞用のものであることが好ましい。
動物細胞用ベクターとしては、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｍ１３ｍｐ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２等を使用できる。
レポーター遺伝子の発現量を測定するにあたっては、前記のレポータータンパク質のうち、ＳＥＡＰおよびｈＧＨは分泌型タンパク質であるため細胞の培養上清のタンパク質発現量を定量すればよく、その他のレポータータンパク質は界面活性剤等を用いて溶解した細胞溶解物中のタンパク質発現量をこれらのタンパク質に応じた方法で測定すればよい。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、細胞溶解物について、ルシフェラーゼにより触媒されるルシフェリンの分解による蛍光をルミノメーターを用いて検出することにより定量することができる。また、細胞が発する蛍光をルミノメーターを用いて検出することもできる。
これらのレポーターアッセイは、マニュアル作業でも行えるが、機械を用いて自動で行ういわゆるハイスループットスクリーニング（組織培養工学、Ｖｏｌ２３，Ｎｏ．１３，５２１−５２４，米国特許第５，６７０，１１３号）を用いることにより迅速かつ簡便に行うことができる。
＜本発明の第１のスクリーニング方法＞
本発明の第１のスクリーニング方法は、本発明のヒトＤＲ５またはＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター領域（プロモーター活性に必須の最小限の領域を含むものであってもよい。以下、同じ。）を含むＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターを保持する細胞に被験物質を接触させる工程と、被験物質の接触によるレポーター遺伝子の発現量の変化を検出する工程とを含む方法である。
細胞としては、ＤＲ５プロモーターを活性化する物質をスクリーニングする場合には、ＤＲ５遺伝子自体は正常であるが、ＤＲ５タンパク質の活性が低下している細胞を用いることができる。また、Ｓｉａｈ−１プロモーターを活性化する物質をスクリーニングする場合には、Ｓｉａｈ−１タンパク質の活性が低下している細胞を用いることができる。具体的には、ｐ５３の変異が認められる、ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ８５）、大腸癌細胞株のＤＬＤ−１、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（国立医薬品食品衛生研究所  細胞バンク、ＪＣＲＢ０１３４）、ヒト腎上皮細胞株２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５７３）、赤白血球病細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３）等のがん細胞を使用することができる。
また、これらのプロモーターの活性を抑制する物質をスクリーニングする場合には、例えばベロ細胞、ヒーラ細胞、ＣＶ１細胞、ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＨＯ細胞等の公知の細胞を広い範囲から選択して用いることができる。
また、本発明のプロモーター領域とこのプロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターについては、前記説明した通りである。このベクターは、細胞に恒常的に導入することが好ましい。
細胞と被験物質との接触は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち、ベクターを保持する細胞は、その細胞に適した培地を用いて継代し、対数増殖期の状態になるように培養しておく。被験物質を接触させる際には、細胞を２０〜３０％程度コンフルエントになるように播き、２４時間程度培養する。次いで、被験物質を５ｎＭ〜５０μＭ程度の濃度になるように細胞培養に添加する。次いで、３７℃程度で、１２〜４８時間程度、より好ましくは２４時間程度インキュベートする。なお、被験物質によりプロモーターが活性化され、アポトーシスが誘導されてしまうのを防ぐために、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤を添加してもよい。
この後、レポーター遺伝子の発現量をレポーター遺伝子の種類に応じた方法で測定すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、細胞を界面活性剤入り溶解剤で溶解し、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェリンの分解による発光をルミノメーターを用いて検出すればよい。
被験物質を用いることにより、ルシフェラーゼ活性が対照の５０％程度以下になる場合には、プロモーターが抑制されたと判定する。また、ルシフェラーゼ活性が対照の２００％程度以上になる場合には、プロモーターが活性化されたと判定する。
この方法の被験物質は特に制限されず、タンパク質、オリゴペプチド、多糖類、低分子化合物等を広く対象にすることができる。
この方法によると、細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のプロモーターＤＮＡの活性に影響を与える物質の他、細胞内に取り込まれて直接本発明のプロモーターに結合する低分子化合物、細胞内に取り込まれて他の細胞内タンパク質に作用することにより間接的に本発明のプロモーターに作用する低分子化合物が選択される。
＜本発明の第２のスクリーニング方法＞
本発明の第２のスクリーニング方法は、本発明のヒトＤＲ５またはＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとこのＤＮＡに発現可能に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターを保持する細胞に被験物質を導入する工程と、被験物質の接触によるレポーター遺伝子の発現量の変化を検出する工程とを含む方法である。
第２のスクリーニング方法において、使用できる細胞、ベクターおよびレポーター遺伝子の発現量の測定方法は、第１のスクリーニング方法の場合と同様である。
この方法の１例として、遺伝子導入に通常用いられるリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法などにより、前記の細胞に被験物質を一時的に導入した後、レポーター遺伝子の発現量の変化を検出する方法を例示できる。
また、被験物質がタンパク質である場合には、膜透過タンパク質との融合タンパク質とすることにより細胞内に導入することができる。
この方法により、直接本発明のプロモーターＤＮＡと結合する物質の他に、細胞内の内在性タンパク質等に作用して間接的に本発明のプロモーターＤＮＡの活性を調節する物質を得ることができる。この方法の対照となる被験物質は、ＤＮＡの他、タンパク質ないしはオリゴペプチド、多糖類、低分子化合物等のいずれであってもよい。
また、この方法の他の例としては、ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法を例示できる。具体的には、本発明のプロモーターＤＮＡを挿入したレポータープラスミドを細胞に安定に導入し、次いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択することにより、本発明のプロモーターＤＮＡに結合するタンパク質等を選択する。この方法により、直接本発明のプロモーターＤＮＡと結合するタンパク質等の他に、細胞内の内在性タンパク質等に作用して間接的に本発明のプロモーターＤＮＡの活性を調節するタンパク質等を得ることができる。ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｌｉ  Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  Ｉ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１８７０−１８７３、Ｗａｎｇ  Ｍ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  Ｒ．Ｒ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：１２１−１２６）は、例えば「Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）等の市販のキットを用いて行うことができる。
＜本発明の第３のスクリーニング方法＞
本発明の第３のスクリーニング方法は、本発明のヒトＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片に被検物質を接触させる工程と、このＤＮＡと結合した物質を検出する工程とを含む方法である。
第３のスクリーニング方法では、通常６ｂｐ以上、より好ましくは１８ｂｐ以上のプロモーターＤＮＡ断片を用いることができる。
この方法の１例としては、アフィニティー精製を例示できる。具体的には、本発明のプロモーターＤＮＡをビオチン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに結合させてＤＮＡアフィニティービーズを作製する。次いで、これを被験物質とインキュベートして本発明のプロモーターＤＮＡと特異的に結合する被験物質を精製し、この構造を決定する。
この方法において被験物質は特に制限されず、タンパク質ないしはオリゴペプチド、多糖類、低分子化合物等を広く対象にできる。天然のタンパク質ないしはオリゴペプチド（以下、「タンパク質等」という。）の混合物としては、例えば、細胞の核抽出液や微生物の培養上清等を用いることができる。核抽出液は、通常、転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質が含まれていることから好ましい。タンパク質等の混合物を用いる場合には、直接本発明のプロモーターＤＮＡと結合する被験物質の他、ＤＮＡ結合活性は持たないがＤＮＡ結合タンパク質等と複合体を形成することにより本発明のプロモーターＤＮＡに間接的に結合するタンパク質等を得ることができる
また、この方法の他の例としては、被験物質がタンパク質等である場合には、サウスウェスタンブロットを例示できる。具体的には、タンパク質等の混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したものをフィルター膜に転写した後、本発明のプロモーターＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、このＤＮＡプローブと結合するタンパク質等を選択する。
サウスウェスタンブロットの他の具体例としては、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌でタンパク質等を発現させ、これらをフィルター膜に転写した後、本発明のプロモーターＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、該ＤＮＡプローブと結合するタンパク質等を発現するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単離する方法を例示できる。この方法によると、本発明のＤＮＡに結合する活性を有するタンパク質等とともに、これをコードする遺伝子を得ることができる。
この方法のさらに他の例としては、被験物質がタンパク質等である場合には、ゲルシフト法を例示できる。具体的には、タンパク質等の混合物を、アイソトープなどにより標識した本発明のプロモーターＤＮＡプローブと混合し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質等と本発明のプロモーターＤＮＡとの複合体のバンドをゲルシフト法により検出する。この方法によると、本発明のプロモーターＤＮＡに直接結合するタンパク質等およびこのタンパク質等に結合することにより間接的に本発明のプロモーターＤＮＡに結合するタンパク質等の双方が得られる。
＜本発明の第４のスクリーニング方法＞
本発明の第４のスクリーニング方法は、本発明のヒトＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片に、被験物質の存在下および非存在下で、ＤＮＡ結合タンパク質を接触させる工程と、被験物質の存在による前記ＤＮＡへのＤＮＡ結合蛋白質の結合量の変化を検出する工程とを含む方法である。
この方法の対象となる被験物質は、特に制限されず、タンパク質ないしはオリゴペプチド、多糖類、低分子化合物等を広く用いることができる。
ＤＮＡ結合タンパク質としては、コンピューターを用いた検索によりスクリーニングに使用するプロモーターＤＮＡ断片に結合することが予想されている転写因子等のタンパク質を用いることができる。
この方法の具体例としては、前記説明したゲルシフト法を例示できる。具体的には、被検物質の存在下または非存在下で、ＤＮＡ結合タンパク質と標識されたプロモーターＤＮＡプローブとを結合させ、ＤＮＡ結合タンパク質と本発明のプロモーターＤＮＡとの複合体のバンドの形成を促進または阻害する物質を選択する。これにより、本発明のプロモーターに直接結合はしないが、ＤＮＡ結合タンパク質のプロモーターＤＮＡへの結合を促進または抑制する物質を選択することができる。例えば、本発明のプロモーターＤＮＡに結合するタンパク質等が生体内で本発明のプロモーターＤＮＡの活性を阻害するような場合、このタンパク質等と本発明のプロモーターＤＮＡとの結合を阻害するような物質は、本発明のプロモーターＤＮＡの活性を促進できると考えられる。
また、この方法の他の例としては、以下の方法を例示できる。すなわち、本発明のプロモーターＤＮＡに結合することが予想されているＤＮＡ結合タンパク質にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを融合したタンパク質を精製して、この融合タンパク質を抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビチオン化した本発明のプロモーターＤＮＡを融合タンパク質と接触させ、融合タンパク質と本発明プロモーターＤＮＡとの結合をストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼで検出する。本発明のプロモーターＤＮＡ添加の際、被験物質も添加し、融合タンパク質と本発明のプロモーターＤＮＡとの結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。
この方法によると、直接本発明のプロモーターＤＮＡに作用する物質およびＤＮＡ結合タンパク質に作用する物質の双方が得られる。例えば、本発明のプロモーターＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のプロモーターＤＮＡの活性を阻害する場合、このタンパク質と本発明のプロモーターＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は本発明のプロモーターＤＮＡの活性を促進できると考えられる。
スクリーニング方法により得られた物質
上記本発明のスクリーニング方法により得られた物質は、以下の形態で医薬として使用できる。
すなわち、そのまま又は薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、潤沢剤等が含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製できる。この医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤）等に応じて経口投与又は非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、当業者であれば容易に決定できる。
また、得られた物質がオリゴペプチド又はタンパク質である場合には、膜透過性タンパク質との融合タンパク質として投与することができる。これにより当該オリゴペプチド又はタンパク質を、膜透過性タンパク質の細胞膜透過機構を利用することにより細胞内に移行させることができる。また、当該オリゴペプチド又はタンパク質ををコードするＤＮＡを、遺伝子治療用のウィルスベクターに組み込んで、目的細胞に導入することもできる。これらの場合も、投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、当業者であれば適宜選択することができる。
また、得られた物質がポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである場合には、前述した医薬組成物の形態で医薬として投与できる他、例えばリポソーム内に封入して送達するリポソームデリバリーシステム、マイクロインジェクション、直接注射法、遺伝子銃等を利用して細胞内に導入することもできる。これらの場合も、投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、当業者であれば適宜選択することができる。さらに、遺伝子治療用のウィルスベクター等に組み込んで、目的細胞に導入することもできる。
得られた物質がＤＲ５遺伝子又はＳｉａｈ−１遺伝子の発現量を増大させるものである場合には、当該物質を有効成分とする医薬は、悪性腫瘍、動脈硬化またはバルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄のような細胞増殖性疾患の治療又は予防薬として有用である。一方、得られた物質がＤＲ５遺伝子又はＳｉａｈ−１遺伝子の発現量を低下させるものである場合には、当該物質を有効成分とする医薬は、再生不良性貧血、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷治癒等の細胞増殖を必要とする疾患の治療又は予防薬として有用である。
本発明の効果
本発明によりがん抑制遺伝子であるヒトＤＲ５遺伝子及びヒトＳｉａｈ−１遺伝子の各プロモーターが提供された。これにより、これらのプロモーターの活性を調節し、ＤＲ５遺伝子またはＳｉａｈ−１遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングが可能となった。
前述したように、ＤＲ５遺伝子およびＳｉａｈ−１遺伝子は、ｐ５３タンパク質により転写誘導され、アポトーシスや細胞周期停止を引き起こすことによりがん抑制に関与している。がん細胞において、ＤＲ５およびＳｉａｈ−１は、タンパク質自体が失活している場合より、発現量が低下している場合が多いと考えられるため、本発明のプロモーターに直接または間接的に作用することによりＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子を転写レベルで活性化できる物質は、がん等の治療に非常に有効である。
また、ＤＲ５およびＳｉａｈ−１遺伝子の各プロモーターに作用する物質は、がん細胞に選択毒性を示す可能性が高い。すなわち、正常細胞ではＤＲ５およびＳｉａｈ−１のようながん抑制関連遺伝子のプロモーター活性が正常であるために、該プロモーターを活性化させるような物質を投与しても、それ以上にプロモーター活性は向上し難いが、がん細胞では、これらのがん抑制遺伝子のプロモーター活性が抑制されているために、物質投与によりプロモーター活性を正常レベルにまで向上させることができる。その結果、ＤＲ５プロモーターおよびＳｉａｈ−１プロモーターを活性化させる物質は、がん細胞に選択毒性を示す可能性が高い。
また、従来の遺伝子導入によるがん治療等では、細胞への遺伝子導入効率が悪い、局所投与しなければならない、ウィルスベクターによる副作用が生じる可能性がある、生殖細胞に導入された場合には遺伝病を生む可能性がある等の難点があったが、プロモーター活性を調節することにより、目的遺伝子を転写レベルで調節できる物質を用いれば、これらの難点を解消することができる。特に、遠隔投与できること及び細胞への導入効率がよいことが大きなメリットである。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
先ず、本発明のＤＲ５遺伝子のプロモーターおよびそのプロモーター活性に必須な領域について詳細に説明し、次いで、Ｓｉａｈ−１遺伝子のプロモーターの塩基配列およびそのプロモーターの活性に必須な領域について詳細に説明する。
実施例１（使用細胞）
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（国立医薬品食品衛生研究所細胞バンク、ＪＣＲＢ０１３４）、ヒト腎上皮細胞株２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５７３）、ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ８５）を１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、日本、東京、ニッスイ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．０５９１９）に維持し、５％のＣＯ２を含む湿潤大気中で３７℃でインキュベートした。また、赤白血球病細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３）を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日本、東京、ニッスイ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．０５９１８）に維持し、同様にしてインキュベートした。
実施例２（ヒトＤＲ５遺伝子プロモーターＤＮＡのクローニング）
ヒトＤＲ５塩基配列（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，８１５−８１８（１９９７））に基づき、二つのオリゴヌクレオチド（ＣＣＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＣＧおよびＧＴＴＴＣＡＧＣＣＣＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＴＣＧＧＧＣＡＴＣＧ）を合成し、ヒト白血球ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。このプローブは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ，Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ  Ｎｏ．９４５７８４）及びＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（日本、大阪、東洋紡、ＰＮＫ−１０３）を用いて標識した。標識条件は、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅの添付マニュアルに従った。ヒトＤＲ５遺伝子の５’末端側領域を含むゲノミックＤＮＡ断片を得るために、このプローブを用いて、ヒト白血球ゲノム由来のλＰＳライブラリー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ、商品番号：０Ｂ−４９０１−００、フナコシカタログ）中のおよそ３．８×１０６ファージプラークをスクリーニングした。なお、スクリーニングはλＰＳライブラリーの添付マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションは５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハールト溶液と熱変性した魚の精子ＤＮＡ  ０．１μｇ／μｌを含む緩衝溶液中で５０℃で１６時間以上行った。一つの陽性ファージプラークをλＰＳゲノムライブラリー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ、商品番号：０Ｂ−４９１０−１０、フナコシカタログ）の添付マニュアルに従って、プラスミドに転換後、ＤＮＡを増殖、精製した。具体的には、単一のコロニーをＬＢブロスの中で一晩増殖後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮのキット（ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（２５），Ｃａｔ．Ｎｏ．１２１６３，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って抽出、精製した。
ゲノミックＤＮＡ断片はＳａｃＩ、ＮｃｏＩ（日本、東洋紡）などの制限酵素で処理し、サザンブロッティングにより分析した（ラボマニュアル遺伝子工学、第３版、松村正實編、ｐ７３−７６）。
実施例３（ヒトＤＲ５プロモーターＤＮＡの塩基配列）
実施例２で取得した陽性ファージＤＮＡ由来のほぼ２．５ｋｂのＳａｃＩ−ＮｃｏＩ断片をｐＧＶＢ２にサブクーロニングし、その配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ，ＰＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．９８０５０１０，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４３０３１５２）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで塩基配列を決定した。
この２．５ｋｂのＳａｃＩ−ＮｃｏＩ断片の３’末端側を含む１６５４塩基の配列を配列表の配列番号１に示す。この配列にはエクソン１の一部及びＤＲ５遺伝子の５’末端側の隣接領域が含まれており、エクソン１の一部の塩基配列は報告されているヒトＤＲ５遺伝子の配列（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，８１５−８１８（１９９７））と同一であった。
実施例４（ヒトＤＲ５プロモーターの転写開始部位）
転写開始部位を決定するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングしたＤＲ５ゲノムＤＮＡのエクソン１を含む断片（ＳｍａＩ−ＡｐａＩ断片）を鋳型として用いて、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＡＸＩ  ｓｃｒｉｐｔ，Ａｍｂｉｏｎ）により、ＲＮＡプローブを作製した。また、培養細胞ＭＣＦ−７からセパゾールＲＮＡ  Ｉ（日本、京都、ナカライテスクＣｏｄｅ  Ｎｏ．３０６５５−３６）を用いて全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ保護アッセイは、ＲＰＡ  ＩＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、このキットの添付マニュアルに従って行った。得られた産物の塩基配列は、Ｔ７シークエンシングキット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて決定した。
この結果、配列表の配列番号１における塩基番号１０７６のＣ残基および塩基番号１１０２のＡ残基が転写開始部位であることが判明した。
実施例４（転写因子結合部位の候補の検索）
ＤＲ５遺伝子の５’隣接領域（配列表に示す塩基配列）について、ＴＦＳＥＡＲＣＨを用いて、公知の転写因子との結合可能性をコンピューターを用いて検索した。検索に供した転写因子は、ＧＡＴＡ−１、ＡＭＬ−１ａ、ｃ−Ｅｔｓ２、ＡＤＲ１、ｃ−Ｍｙｂ、ＳＲＹ、Ｓｐ１、ＭＺＦ１、ＣｄｘＡ、ＮＦｋＢ、ｐ３００、ＨＳＦ２、Ｔｓｔ−１、Ｓｏｘ−５、Ｏｃｔ−１、ＧＡＴＡ−１、Ｔｓｔ−１、Ｎｋｘ−２、Ｃ／ＥＢＰ  β、ｄｅｌｔａＥ、Ｉｋ−２、Ｅｌｋ−１、ＩＲＦ−２、Ｅ４７、ＳＰＹ、ＳＴＡＴ、ＵＳＦ、ＧＡＴＡ−３、ＴＡＴＡ、ｃ−Ｒｅｌである。
この結果、公知の転写因子との結合可能性がある塩基配列が多数見出された。これらの塩基配列は、配列表の配列番号１における塩基番号１０２〜１０８、１３３〜１４３、１４９〜１６２、１７４〜１８３、１９６〜２１０、２０８〜２２１、２１１〜２２０、２１２〜２２６、２２２〜２３１、２６３〜２６９、２６５〜２７８、２９６〜３０２、３７７〜３８３、３７０〜３７６、４０９〜４２０、４３０〜４４０、４３１〜４３６、４５７〜４７０、４５８〜４７０、４８２〜４９２、４９８〜５０７、４９９〜５０３、５００〜５０５、５２８〜５３４、５３６〜５４１、５３７〜５４２、５４２〜５４７、５４９〜５６１、５５５〜５６７、５５３〜５６０、５５９〜５６６、５７５〜５８７、５９３〜５９８、５９８〜６１０、６０１〜６１０、６１４〜６１９、６１８〜６２３、６４２〜６４８、６５０〜６５６、６５７〜６６２、６８３〜６９７、７００〜７０７、７４２〜７４７、７７４〜７７９、７８５〜７９８、７８８〜７９２、７９２〜７９９、７９５〜８０１、８０９〜８１３、８１４〜８２５、８１５〜８２５、８６１〜８６７、８６７〜８７２、８６７〜８７３、９０１〜９１３、９０１〜９０４、９０２〜９１１、９１５〜９２３、９１９〜９２４、９２４〜９３９、９２１〜９２８、９２６〜９３３、９３０〜９３６、９４８〜９５７、９７１〜９７７、９７２〜９７８、９８９〜９９４、１０２６〜１０３５、１０２９〜１０３４、１０４８〜１０５７、１０７５〜１０８０、１０９７〜１１０３、１１０６〜１１１３、１１２５〜１１３３、１１６９〜１１７５、１２００〜１２０９、１１５３〜１１６２、１１６０〜１１６９、１１６０〜１１６８、１２０６〜１３０５、１２０９〜１２２０、１２３０〜１２３８、１２９７〜１３０４、１３２４〜１３３１、１３６６〜１３７７、１３７３〜１３８０、１３７３〜１３８２、１３９１〜１３９８、１４２１〜１４３０、１４３０〜１３４２、１３３４〜１３４１、１５２１〜１５３０、１５８３〜１５８９、１５９１〜１６００、１５９０〜１５９６、１５９１〜１６００、１５９３〜１６０４、１６０７〜１６１４、１６０８〜１６１５、１６２６〜１６３６、１６２６〜１６３８、１６２８〜１６３７、１６２９〜１６３８、１６２９〜１６４１、１６３０〜１６４１で示される塩基配列である。
これらの領域は、所定の物質が結合することにより、ＤＲ５の転写を活性化または阻害することが予想される領域である。
実施例５（プロモーター活性の確認およびプロモーター活性に主に寄与する領域の決定）
実施例５−１
実施例２で得られたヒトＤＲ５プロモーター領域を含む約２．５ｋｂのＳａｃＩ−ＮｃｏＩ断片をルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（日本，東京，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）内のＳａｃＩ−ＮｃｏＩサイトにサブクローニングした。このプラスミドをｐＤＲ５／ＳａｃＩと命名した。
また、ｐＤＲ５／ＳａｃＩについて、本発明のプロモーター領域の一連の５’末端欠失変異体を「Ｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（日本、東京、Ｔａｋａｒａ）を用いて作製した。これらの変異体は、配列表の塩基番号３７〜１２２３を含むｐＤＲ５／３７、塩基番号６１９〜１２２３を含むｐＤＲ５／６１９、塩基番号７７７〜１２２３を含むｐＤＲ５／７７７、塩基番号１０２６〜１２２３を含むｐＤＲ５／１０２６、塩基番号１１０９〜１２２３を含むｐＤＲ５／１１０９、塩基番号１１８６〜１２２３を含むｐＤＲ５／１１８６である。
これらのプラスミドをＭＣＦ−７細胞へと一時的に遺伝子導入した。
具体的には、ＭＣＦ−７細胞（３×１０４個）を１２穴組織培養プレートに播種し、２４時間後、０．５μｇの上記プラスミドおよびアクチンプロモーターによって調節されているβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む０．４μｇのｐＡｃｔβ−ｇａｌを遺伝子導入効率を標準化するために併用し、Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２７−９２６８−０１）を用いて細胞にともに遺伝子導入した。４８時間後の細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をＰｉｃａ  Ｇｅｎｅ発光ｋｉｔ（東洋インキ、東京、日本、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０９−０４３２１）のプロトコールに従って測定し、細胞溶解物中のβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １６．６６：Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ（１９８６））。各実験は、３回づつ行い、ルシフェラーゼアッセイは、３回ずつ行った。また、スチューデンツＴ検定で有意差検定を行い、ｐ＜０．０５未満の場合に有意差ありとした。
結果を図１に示す。図１に示すように、全長ＤＲ５プロモーターを有するプラスミドｐＤＲ５／ＳａｃＩを導入した細胞は、極めて強いルシフェラーゼ活性を示し、配列表の配列番号１に示すＤＮＡがＤＲ５遺伝子のプロモーター領域であることが確認された。
また、ルシフェラーゼ活性について、全長ＤＲ５プロモーターを有するプラスミドｐＤＲ５／ＳａｃＩとｐＤＲ５／３７との間、ｐＤＲ５／３７とｐＤＲ５／６１９との間には有意差が認められなかったが、ｐＤＲ５／６１９とｐＤＲ５／７７７との間、ｐＤＲ５／７７７とｐＤＲ５／１０２６との間、ｐＤＲ５／１０２６とｐＤＲ５／１１０９との間には有意差が認められた。また、ｐＤＲ５／１１０９およびｐＤＲ５／１１８６を保持した細胞のルシフェラーゼ活性は、プロモーター領域を挿入していないｐＧＶＢ２を保持した細胞のルシフェラーゼ活性とほぼ同様であった。
これらのことから、配列番号１の塩基番号６１９〜７７６の間、塩基番号番号７７７〜１０２５の間、塩基番号１０２６〜１１０８の間に、ＤＲ５遺伝子のプロモーター活性に必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が含まれていると考えられる。
実施例５−２
次いで、実施例４で転写因子結合部位になり得ることが判明した部位のうち、開始コドンの上流域にあって開始コドンに最も近い二つの部位（配列表の塩基番号１０２９〜１０３４および塩基番号１０７５〜１０８０の領域（Ｓｐ１サイト））に部位特異的突然変異導入を行った。
具体的には、配列番号１の塩基番号１０２６〜１２２３を挿入したルシフェラーゼレポータープラスミドｐＤＲ５／１０２６に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、このキットの添付マニュアルに従って、塩基番号１０２９〜１０３４の領域に置換変異が導入されたｐＤＲ５ｍＳｐ１−１および塩基番号１０７５〜１０８０の領域に置換変異が導入されたｐＤＲ５ｍＳｐ１−２を作製した。なお、同様にして、配列表の塩基番号１０９７〜１１０３のＴＡＴＡ様配列に置換変異が導入されたｐＤＲ５ｍＴＡＴＡも作製した。実施例５−２と同様にして、各変異レポータープラスミドをＭＣＦ−７細胞へと一時的に遺伝子導入し、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。
各変異体の塩基配列およびルシフェラーゼ活性を図２の（Ａ）および（Ｂ）に示す。図２（Ｂ）の結果、配列番号１の塩基配列において、プロモーター活性に寄与する領域である塩基番号１０２６〜１２２３（ｐＤＲ５／１０２７に含まれるプロモーター領域）の中でも両Ｓｐ１領域は、特にプロモーター活性に主に寄与する領域であり、転写因子結合部位またはエンハンサー部位が存在することが分かる。
なお、配列表の塩基番号１０９７〜１１０３のＴＡＴＡ様配列は、プロモーター活性に寄与していないことが分かる。
実施例６（ヒトＳｉａｈ−１遺伝子プロモーターＤＮＡのクローニング）
ヒトＳｉａｈ−１塩基配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６．１０３−１１１（１９９７））に基づき、二つのオリゴヌクレオチド（５’ＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴ３’および５’ＴＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＡＣＧＧＧＡＣＡＣＣＣＴ３’）を合成し、ヒト白血球ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。このプローブは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ，Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ  Ｎｏ．９４５７８４）及びＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（日本、大阪、東洋紡、ＰＮＫ−１０３）を用いて標識した。標識条件は、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅの添付マニュアルに従った。ヒトＳｉａｈ−１遺伝子の５’末端側領域を含むゲノミックＤＮＡ断片を得るために、このプローブを用いて、ヒト白血球ゲノム由来のλＰＳライブラリー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ、商品番号：（０Ｂ−４９０１−００）、フナコシカタログ）中のおよそ３．８×１０６ファージプラークをスクリーニングした。なお、スクリーニングはλＰＳファージゲノムライブラリーの添付マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションは５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハールト溶液と熱変性した魚の精子ＤＮＡ０．１μｇ／μｌを含む緩衝溶液中で５０℃で終夜行った。一つの陽性ファージプラークをλＰＳゲノムライブラリーの添付マニュアルに従って、プラスミドに転換後、ＤＮＡを増殖、精製した。具体的には、単一のコロニーをＬＢブロスの中で一晩増殖後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮのキット（ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（２５），Ｃａｔ．Ｎｏ．１２１６３，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って抽出、精製した。
ゲノミックＤＮＡ断片はＫｐｎＩやＳａｃＩ（日本、東洋紡）などの制限酵素で処理し、Ｓｉａｈ−ａ及びＳｉａｈ−ｂの各オリゴヌクレオチドを用いて、サザンブロッティングにより分析した（ラボマニュアル遺伝子工学、第３版、松村正實編、ｐ７３−７６）。
実施例７（ヒトＳｉａｈ−１プロモーターＤＮＡの塩基配列）
実施例６で取得した陽性ファージＤＮＡ由来のほぼ２５１５ｂのＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ断片をｐＧＶＢ２にサブクーロニングし、その配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ，ＰＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．９８０５０１０，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４３０３１５２）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで塩基配列を決定した。塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
この断片には、ヒトＳｉａｈ−１遺伝子の５’隣接領域（エクソン１の一部）（配列番号２において塩基番号２３８８〜２５１５）が含まれており、これらの配列は、報告されているヒトＳｉａｈ−１遺伝子の５’隣接領域の塩基配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６．１０３−１１１（１９９７））と一致していた。
実施例８（転写因子結合部位の候補の検索）
Ｓｉａｈ−１遺伝子の５’隣接領域（配列表に示す塩基配列）について、ＴＦＳＥＡＲＣＨを用いて、公知の転写因子との結合可能性をコンピューターを用いて検索した。検索に供した転写因子は、ＧＡＴＡ−１、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＲＹ、ｃｄｘＡ、ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＮＦκＢ、Ｓｐ１、Ｎ−ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｂ、Ｅ２Ｆである。
この結果、公知の転写因子との結合可能性がある塩基配列が多数検出された。これらの塩基配列は、配列表の配列番号２における塩基番号９５〜１０４、１５８〜１７０、２７２〜２７８、３２０〜３２６、３６２〜３６８、４３８〜４４４、５６８〜５７５、７５３〜７６２、１３８３〜１３９１、１４３８〜１４４７、１５０９〜１５１５、１６１３〜１６１９、１６４９〜１６６０、１７１５〜１７２４、１７２８〜１７３７、１７８９〜１７９７、１８２６〜１８３２、１８８９〜１８９５、２０５８〜２０６９、２０７４〜２０７８、２１０３〜２１０７、２２０９〜２２１６、２２１９〜２２２４、２３０２〜２３０７、２３１７〜２３２４で示される塩基配列である。
これらの領域は、所定の物質が結合することにより、Ｓｉａｈ−１の転写を活性化または阻害できる領域である。
実施例９（プロモーター活性の確認およびプロモーター活性に主に寄与する領域の決定）
実施例９−１
実施例６で得られたヒトＳｉａｈ−１プロモーター領域を含む２５１５ｂｐのＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ断片（配列番号２における塩基番号１〜２５１５）をルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２（日本，東京，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）内のＫｐｎＩ−ＮｃｏＩサイトにサブクローニングした。このプラスミドをｄｅｌＫｐｎＩと命名した。
また、ｄｅｌＫｐｎＩについて、本発明のプロモーター領域の一連の５’末端欠失変異体を「Ｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（日本、東京、Ｔａｋａｒａ）を用いて作製した。これらの変異体は、配列表の塩基番号６４３〜２５１５を含むｄｅｌＰｓｔＩ、塩基番号１２９０〜２５１５を含むｄｅｌＳｍａＩ、塩基番号１４１０〜２５１５を含むｄｅｌＢａｌＩ塩基番号１６８３〜２５１５を含むｄｅｌＭｕｌＩ、塩基番号２０３５〜２５１５を含むｄｅｌＮｈｅＩ、塩基番号２３８３〜２５１５を含むｄｅｌＸｈｏＩである。
これらのプラスミドをＭＣＦ−７細胞へと一時的に遺伝子導入した。
具体的には、ＭＣＦ−７細胞（１×１０５個）を直径３．５ｃｍの組織培養皿に播種し、１日間培養後、２μｇの上記プラスミドを、ＤＥＡＥ／デキストラン法で細胞に遺伝子導入した。（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２７−９２６８−０１）４８時間後の細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をＰｉｃａ  Ｇｅｎｅ発光ｋｉｔ（東洋インキ、東京、日本、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３０９−０４３２１）のプロトコールに従って測定し、細胞溶解物のタンパク質濃度によって標準化した。各実験は、３回づつ行い、ルシフェラーゼアッセイは、３回ずつ行った。また、スチューデンツＴ検定で有意差検定を行い、ｐ＜０．０５未満の場合に有意差ありとした。
結果を図３に示す。図３に示すように、全長Ｓｉａｈ−１プロモーター（配列番号２における塩基番号１〜２５１７）を有するプラスミドｄｅｌＫｐｎＩを導入した細胞は、極めて強いルシフェラーゼ活性を示し、配列表の配列番号２に示すＤＮＡがＳｉａｈ−１遺伝子のプロモーター領域であることが確認された。
また、ルシフェラーゼ活性について、全長Ｓｉａｈ−１プロモーターを有するｄｅｌＫｐｎＩ、ｄｅｌＰｓｔＩ、、ｄｅｌＳｍａＩ、、ｄｅｌＢａｌＩ、ｄｅｌＭｕｌＩ、ｄｅｌＮｈｅＩの間には有意差が認められなかったが、ｄｅｌＮｈｅＩとｄｅｌＸｈｏＩの間には有意差が認められた。また、ｄｅｌＸｈｏＩを保持した細胞のルシフェラーゼ活性は、プロモーター領域を挿入していないｐＧＶＢ２を保持した細胞のルシフェラーゼ活性とほぼ同様であった。
これらのことから、配列番号２の塩基番号２０３５〜２３８２の間に、Ｓｉａｈ−１遺伝子のプロモーター活性に必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が含まれていると考えられる。
実施例９−２
次いで、実施例９−２でプロモーター活性に寄与することが判明した塩基番号２０３５〜２３８４の領域にあって、実施例８で転写因子結合部位になり得ることが判明した二つのＳｐ１部位（配列番号２の塩基番号２２２１〜２２２４（ＣＣＣＧＣＣ）および塩基番号２３０２〜２３０７（ＧＧＣＧＧＧ）の領域）に部位特異的突然変異を導入した。
具体的には、配列番号２の塩基番号２０３５〜２５１５を挿入したルシフェラーゼレポータープラスミドｄｅｌＮｈｅＩから、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、このキットの添付マニュアルに従って、塩基番号２２１９〜２２２４の領域に置換変異が導入されたプラスミドｍＳｐ１、塩基番号２３０２〜２３０７の領域に置換変異が導入されたプラスミドｍＳｐ２、この両領域に置換変異が導入されたプラスミドｍＳｐ１２を作製した。また、ルシフェラーゼレポータープラスミドｄｅｌＮｈｅＩの５’末端側の欠失変異体ｄｅｌ−Ｓｐ１（塩基番号２２６９〜２５１５を有し、５’側のＳｐ１部位が欠失している。）及びｄｅｌ−Ｓｐ１２（塩基番号２３１１〜２５１５を有し、両方のＳｐ１部位が欠失している。）を、「Ｋｉｌｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｔａｋａｒａ）を用いて作製した。
実施例９−１と同様にして、各変異レポータープラスミドをＭＣＦ−７細胞へと一時的に遺伝子導入し、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した。
各変異体の塩基配列およびルシフェラーゼ活性を図４に示す。図４の結果、配列番号２の塩基配列において、塩基番号２２１９〜２２２４の領域の置換又は欠失によりルシフェラーゼ活性が有意に減少している。このことから、塩基番号２２１９〜２２２４の領域がＳｉａｈ−１プロモーター領域の中で基本プロモーター活性に関与する領域であると考えられる。
実施例１０（ｐ５３タンパク質によるＳｉａｈ−１遺伝子の制御）
ｐ５３タンパク質による内在性Ｓｉａｈ−１の発現誘導を以下の方法で調べた。
ｐ５３が全欠失（ｎｕｌｌ）変異しているヒト骨肉腫細胞Ｓａｏｓ２を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ニッスイＮｏ．０５９１９）に、１×１０６個播種し、３７℃で２４時間培養した。次いで、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ｎｅｏＢａｍ（Ｄｒ．Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎから分与された）にｐ５３ｃＤＮＡを挿入したｐ５３発現プラスミドｐ５３ｐＣＭＶ−ｎｅｏＢａｍ１０μｇを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（ＧＩＢＣＯ）（リポフェクトアミン試薬１５μｌ、プラス試薬１０μｌを含む。）を用いてＳａｏｓ２細胞にトランスフェクションした。
トランスフェクション後、１２、２４、３２時間後にＳａｏｓ２細胞をサンプリングし、トータルＲＮＡをセパゾール（ナカライ）試薬を用いて抽出した。抽出したトータルＲＮＡを１０μｇずつアガロースゲル電気泳動し、フィルターに移した後、アイソトープで標識したＳｉａｈ−１のｃＤＮＡをハイブリダイズさせた。
また、ｐ５３が変異している赤白血病細胞株Ｋ５６２、ｐ５３が不活化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）しているヒト腎上皮細胞株２９３でも同様の実験を行った。
この結果、ｐ５３ｃＤＮＡのトランスフェクション後、Ｓｉａｈ−１のｍＲＮＡ量が経時的に増加していた。このことから、ｐ５３タンパク質によりＳｉａｈ−１の発現が誘導されることが分かった。
実施例１１（ｐ５３タンパク質によるＳｉａｈ−１遺伝子の制御）
ｐ５３が全欠失（ｎｕｌｌ）変異しているヒト骨肉腫細胞Ｓａｏｓ２を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ニッスイＮｏ．０５９１９）に、１×１０５個播種し、３７℃で２４時間培養した。次いで、ｐ５３ｃＤＮＡを挿入したｐ５３発現プラスミドｐ５３ｐＣＭＶ−ｎｅｏＢａｍ（プラスミドｐＣＭＶ−ｎｅｏＢａｍは、Ｄｒ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎから分与された。）２０、２５、２５０ｎｇと、Ｓｉａｈ−１プロモーター領域（配列番号２の塩基番号１〜２５１５と、さらに約１ｋｂ上流を含み、２箇所のｐ５３結合配列を含む。）を挿入したルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＶＢ２の０．５μｇとを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（ＧＩＢＣＯ）（リポフェクタミン試薬１．５μｌ、プラス試薬２．２５μｌを含む。）を用いてＳａｏｓ２細胞にトランスフェクションした。
トランスフェクション後、２４時間後にＳａｏｓ２細胞をサンプリングし、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を実施例６と同様にして測定した。この結果、ｐ５３によりルシフェラーゼ活性は有意に増加しなかった。従って、ｐ５３は、本発明のＳｉａｈ−１プロモーター領域のうちｐ５３結合部位とは異なる部位を介してＳｉａｈ−１を発現誘導している可能性がある。
このことから、Ｓｉａｈ−１プロモーター領域に作用することによりＳｉａｈ−１の発現を誘導する物質は、がん等によりｐ５３タンパク質が失活している場合に、ｐ５３パスウェイを正常に進行させる有効な物質であると考えられる。
産業上の利用可能性
ＤＲ５遺伝子およびＳｉａｈ−１遺伝子は、ｐ５３タンパク質により転写誘導され、アポトーシスや細胞周期停止を引き起こすことによりがん抑制に関与している。従って、本発明のＤＲ５遺伝子プロモーターおよびＳｉａｈ−１遺伝子プロモーターは、それに直接または間接的に作用することによりＤＲ５又はＳｉａｈ−１遺伝子を転写レベルで活性化できる物質をスクリーニングするのに好適に使用できる。本発明のスクリーニング方法により選択される物質は、がん等の治療に非常に有効である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＤＲ５プロモーター領域の欠失変異によるルシフェラーゼの発現量の変化を示す図である。
図２は、ＤＲ５プロモーターのＳｐ１部位の変異によるルシフェラーゼの発現量の変化を示す図である。（Ａ）は、各変異体の塩基配列を示す図であり、（Ｂ）はルシフェラーゼ発現量を示すグラフである。
図３は、Ｓｉａｈ−１プロモーター領域の欠失変異によるルシフェラーゼの発現量の変化を示す図である。
図４は、Ｓｉａｈ−１プロモーターのＳｐ１部位の変異によるルシフェラーゼの発現量の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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