(57)【要約】新規な腎疾患の治療又は予防剤並びに腎疾患の診断方法（検出方法）が開示されている。本発明の腎疾患の治療又は予防剤は、カゼインキナーゼ２を阻害する物質を有効成分として含有する。また、本発明の腎疾患の診断方法は、生体から分離した試料中のカゼインキナーゼ２の活性若しくは含有量又はカゼインキナーゼ２遺伝子の発現量を測定する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼインキナーゼ２を阻害する物質を有効成分として含有する腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項２】
前記カゼインキナーゼ２が、腎臓の構成細胞に由来する請求項１記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記物質が、カゼインキナーゼ２のαサブユニット及び／又はα’サブユニットを阻害する物質である請求項１又は２記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項４】
前記カゼインキナーゼ２を阻害する物質が、（１）カゼインキナーゼ２の発現を阻害する物質又は（２）カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項５】
前記カゼインキナーゼ２を阻害する物質が、カゼインキナーゼ２の発現を阻害する核酸分子である請求項４記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項６】
前記カゼインキナーゼ２の発現を阻害する核酸分子が、カゼインキナーゼ２をコードするｍＲＮＡを標的とし、かつカゼインキナーゼ２の発現を阻害し得るカゼインキナーゼ２に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドである請求項５に記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項７】
前記カゼインキナーゼ２に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドが、カゼインキナーゼ２をコードするｍＲＮＡのコーディング領域、３’−非翻訳領域、５’−非翻訳領域、５’キャップ及びイントロン／エキソン結合部位に対して相補的な配列からなる群より選ばれる配列を有する１２〜５０塩基である請求項６記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項８】
前記カゼインキナーゼ２に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの核酸分子が、Ｓ−オリゴヌクレオチドである請求項７記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項９】
前記のカゼインキナーゼ２に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの核酸分子が、配列番号１〜１０に示すいずれかの配列を有する請求項７又は８記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１０】
前記のカゼインキナーゼ２に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドｃが、配列番号１に示す配列を有する請求項９記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１１】
カゼインキナーゼ２を阻害する物質が、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する化合物である請求項４記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１２】
前記のカゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する化合物が、１ｐＭから１００μＭまでの濃度範囲で、カゼインキナーゼ２の酵素活性を３０％以上阻害する化合物である請求項１１記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１３】
前記のカゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する化合物が、
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（但し式１中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、または式２に表される置換基から選ばれる１種乃至は２種以上を有していても良いフェニル基を表し、且つ、Ｒ１、Ｒ２の少なくとも一方は該置換基を有していても良いフェニル基であり、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子又は式２に表される置換基を表し、Ｒ５は水素原子、糖残基、Ｃ１〜４アルキル基又はアシル基を表す。）
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（但し、式中Ｒ５は式２のＲ５と同じ意味を表す）、
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（但し式３中、Ｒ６、Ｒ７はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子又はＣ１〜４アルキル基である。）
４，５，６，７−テトラブロモベンズイミダゾールであるＴＢＢ、５，６−ジブロモ−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ベンズイミダゾールであるＤＲＢ、
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（但し、式４中、Ｒ８は、１〜３個のハロゲン、メチル基、トリフルオロメチル基若しくは水酸基で置換されても良いフェニル基、またはキノリル基、エチルメチルスルヒド基、ｔ−ブチルフェニルチオ基、Ｎ−エチルフェニルアミノ基であり、Ｒ９は、水酸基、またはアミノ基を表す）
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（但し、式５中、ｎは、１〜３、Ｘは、−ＮＨ−又は−ＣＯＮＨ−であり、Ｙは、水酸基、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、ピラゾール又はトリアゾールを表す）
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（但し、式６中、Ｒ１０は、ハロゲン、メチル基、エチル基若しくはｔ−ブチル基で置換されてもよい２−チエニル基若しくはフェニル基であり、Ｒ１１は、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＭｅ又は−ＳＯ２−ＮＨ［（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２］を表す）、又はその薬剤上許容できる塩である請求項１２記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１４】
前記カゼインキナーゼ２を阻害する物質が、上記式１（各置換基の定義は上記と同じ）で表される化合物又はその薬剤上許容できる塩である請求項１３記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１５】
前記式１中、Ｒ１は水素原子または式２に表される置換基から選ばれる１種乃至は２種以上を有していても良いフェニル基を表し、Ｒ２は水素、または水酸基を表し、Ｒ５は水素原子である請求項１４記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１６】
前記カゼインキナーゼ２を阻害する物質が、アピゲニンである請求項１５記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１７】
腎疾患が、糸球体腎炎、間質性腎炎、腎硬化症、糖尿病性腎症、慢性又は急性腎不全である請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１８】
腎疾患が、糖尿病に起因しない腎炎である、またはカゼインキナーゼ２の発現亢進もしくは酵素活性亢進により特徴づけられる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の腎疾患の治療又は予防剤。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載のカゼインキナーゼ２を阻害する物質の、腎疾患の治療又は予防剤製造のための使用。
【請求項２０】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載のカゼインキナーゼ２を阻害する物質の有効量を、腎疾患患者若しくは動物又は腎疾患の予防が望まれるヒト若しくは動物に投与することを含む腎疾患の治療又は予防方法。
【請求項２１】
生体から分離した試料中のカゼインキナーゼ２の活性若しくは含有量又はカゼインキナーゼ２遺伝子の発現量を測定することを含む、腎疾患の診断方法。
【請求項２２】
前記試料は、腎臓の構成細胞である２１記載の方法。
【請求項２３】
前記カゼインキナーゼ２が、αサブユニット及び／又はα’サブユニットである請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
腎疾患が、糸球体腎炎、間質性腎炎、腎硬化症、糖尿病性腎症、慢性又は急性腎不全である請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
腎疾患が、糖尿病に起因しない腎炎である、またはカゼインキナーゼ２の発現亢進もしくは酵素活性亢進により特徴づけられる、請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
カゼインキナーゼ２遺伝子の発現量を測定することを含む請求項２１ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
カゼインキナーゼ２遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖中の領域と相補的な塩基配列を有し、請求項２６記載の方法に用いられるオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
遺伝子増幅用プライマー又は遺伝子検出用プローブである請求項２７記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、腎疾患治療又は予防剤及び腎疾患の診断方法に関する。
【背景技術】  腎臓は、体腔背側に左右対をなす泌尿器系器官であり、尿の生成により、１）水分排泄、２）代謝産物、特に窒素成分排泄、３）電解質排泄、４）異種物質排泄、５）血液浸透圧・体液量および酸・塩基平衡調節など、生体恒常性を維持する。腎臓はさらに、レニンやプロスタグランジンの産生と分泌を介して血圧の調節を、また、エリスロポエチンの産生を介して骨髄における赤血球の分化・成熟の調節を、さらにビタミンＤの前駆体である２５−ヒドロキシビタミンＤを活性化する機能など、重要な生理機能を担っている臓器である（Ｂｌｏｏｄ，６８（Ｓｕｐｐｌ），１７０ａ、１９８６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２８，１１９９，１９８１）。腎臓は約１００万個のネフロンと呼ばれる機能単位の集合体であり、ネフロンは、糸球体、ボーマン嚢、近位尿細管、ヘレン係蹄、遠位尿細管よりなる。ネフロンは集合管に合流し、集合管は腎孟に開口する。糸球体は、球状の毛細血管塊で血液をろ過して原尿を生成する。原尿は尿細管で再吸収と分泌を受け、最終尿が生成される。通常、糸球体は濾過過程において血液中の必要な物質、特に血清蛋白が尿中に漏出しないように制御しているが、糸球体に障害が生じると構成細胞の１つであるメサンギウム細胞の増殖と周辺基質の増加が起こり、尿中への蛋白の排泄量が増加する。尿中蛋白排泄量が増加すると、この蛋白自体が尿細管を障害し、それがさらに糸球体障害を増悪するという悪循環に陥って以後急速に腎機能が低下する。
代表的な腎疾患として、糸球体および尿細管間質性腎炎あるいは糖尿病性腎症がある。急性腎炎症候群、急速進行性腎炎症候群、反復性あるいは持続性血尿症候群、慢性腎炎症候群、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、慢性腎孟炎、腎硬化症、腎性高血圧、痛風腎、急性腎不全または慢性腎不全などが知られている。腎疾患は複雑で多様な病態を呈するが、いずれも慢性化すると腎不全にいたる重篤な経過をたどることがある。腎疾患の治療方法としては、現在、その重度に応じて、腎臓機能保持のための療法、例えば安静療法、食事療法もしくは薬物療法、血液透析療法または腎臓移値が知られている。特に腎不全に陥ると、血液透析や腹膜透析などの透析療法や腎移植が必要となる。血液透析療法は、腎疾患の最終療法とされているが、腎臓機能障害により体内に貯留される老廃物を血中から除去するのみで、重度の障害を受けた腎臓の機能は回復せず、患者は苦痛と煩雑さを伴い施設と経費のかかる透析療法を一生涯続けなければならない。しかも最終的には、多くの場合、心不全、感染症等を併発し死に至る。近年、新規に透析の導入に移行する患者数は年々増加し、経済的、社会的な面から問題となっている。腎不全の唯一の根治療法は腎移植であるが、提供者の不足、組織適合の難しさや拒絶反応の回避など問題が多く、実施例は少なく、根本的な治療法もしくは治療薬の開発が望まれている。腎不全の原因となる疾患や病態は数多くあるが、腎炎および糖尿病性腎症は原因疾患として最大の頻度を占めており、これらの腎疾患の治療および予防は腎疾患領域における最大の課題の一つである。腎炎は糸球体の障害から始まる糸球体腎炎と尿細管から始まる尿細管腎炎とがあり、前者の場合は糸球体の損傷に続いて尿細管の荒廃が起こるが、後者の場合は尿細管の荒廃に限られる。臨床的には重要なループス腎炎、ＩｇＡ腎症などは糸球体腎炎に含まれるが、その発症機序として免疫学的な機序と非免疫学的な機序とが考えられる。前者の例としてブドウ球菌、溶連菌などの細菌やＢ型肝炎、麻疹などのウィルスに由来する抗原と、これらに対する抗体とからなる免疫複合体の糸球体への沈着が知られているが、現在ではこの他にも多様な原因があると考えられており未解決の部分が多い。持続的な慢性腎炎により体液中の老廃物の排泄が滞ることによって腎臓への負担が増加し、さらに腎炎の進行を助長し荒廃が進む。糸球体および尿細管が完全に荒廃し腎不全に陥った腎臓は自力で再生することはなく、また再生させ得る治療法もしくは治療薬は現在までに完成されていない。急性腎炎や軽度な慢性腎炎にはステロイド性抗炎症剤が用いられるが、慢性腎炎が悪化しいわゆる腎不全に陥った場合の根本的な治療法はなく、透析治療を続けるほかはない。しかしながら、腎臓においてはホルモン等の分泌もまた機能として非常に重要であり、特に近位尿細管の荒廃によりここで産生されるエリスロポイエチンが減少すると深刻な貧血に陥る。このため早い段階での的確な診断および治療が望まれている。
現時点での薬物治療は腎炎ではステロイド性抗炎症剤を中心に、病因や病態に応じて免疫抑制剤、抗血小板剤、降圧剤、利尿剤などが用いられる。また糖尿病性腎症においては厳格な血糖コントロールとともに、アンジオテンシン変換酵素阻害剤や、ＡＴｌｌレセプターブロッカー、カルシウムブロッカーなどの降圧剤が用いられている。しかしながら、これらの従来の腎疾患治療剤では腎不全への進展を十分に阻止することは困難であり、根本的な治療にはほど遠いのが現状である（岡博・和田攻責任編集、「医科学大辞典」、追補５、最新の治療情報、第２１８ページ、講談社、１９８８年）。このように腎疾患の治療用薬剤として未だ十分に満足し得るような薬剤が存在するとはいえないのが現状である。また、長期連用による副作用も問題とされており、基本的には患者の安静や食事療法を主体とした予防・治療が行われている現状にある。腎疾患における薬物治療は未だ試行錯誤の状態であり、有効な薬剤の開発が望まれている。
【発明の開示】
従って、本発明の目的は、有効な腎疾患治療又は予防剤、および腎疾患の診断方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために、抗糸球体基底膜抗体誘発によるラット動物モデルの腎炎を研究対象として鋭意研究を重ねた。すなわち、本モデルの腎疾患状態の腎臓での遺伝子発現と、非腎疾患状態の腎臓での遺伝子発現を比較することにより、腎疾患状態の腎臓で発現する遺伝子の探索を進めたところ、腎疾患状態の腎臓において、カゼインキナーゼ２が顕著に増加していることを見いだした。さらに、カゼインキナーゼ２の発現を指標とすることで腎疾患を診断できるうえ、カゼインキナーゼ２の阻害物質の投与により腎疾患の治療又は予防することができることを実証し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、カゼインキナーゼ２を阻害する物質を有効成分として含有する腎疾患の治療又は予防剤を提供する。また、本発明は、生体から分離した試料中のカゼインキナーゼ２の活性若しくは含有量又はカゼインキナーゼ２遺伝子の発現量を測定することを含む、腎疾患の診断方法を提供する。また、本発明は、カゼインキナーゼ２を阻害する物質の、腎疾患の治療又は予防剤製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、カゼインキナーゼ２を阻害する物質の有効量を、腎疾患患者又は腎疾患の予防が望まれるヒトに投与することを含む腎疾患の治療又は予防方法を提供する。
本発明による腎疾患治療又は予防剤は、従来の薬剤で十分な効果が期待できなかった腎疾患の優れた治療又は予防剤となる。さらに本発明の腎疾患の診断方法（腎疾患の検出方法）によって腎疾患の病態を的確に効率よく診断ないしは検出することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、腎臓組織すなわち腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２遺伝子の発現量と、尿中蛋白排泄量すなわち腎疾患の状態との関係を示す図である。
図２は、腎炎のラットモデルにおける尿中蛋白排泄量に対するカゼインキナーゼ２αサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチド投与の効果を示す図である。＊：ｐ＜０．０５
図３は、カゼインキナーゼ２の酵素活性に対するアピゲニンの阻害作用を示す図である。
図４は、腎炎のラットモデルにおける尿中蛋白排泄量に対するカゼインキナーゼ２阻害剤のアピゲニン投与の効果を示す図である。＊：ｐ＜０．０５
図５は、腎炎のラットモデルにおける尿中蛋白排泄量に対するカゼインキナーゼ２阻害剤投与の効果を示す図である。＊：ｐ＜０．０１
図６は、腎炎のラットモデルにおける血中クレアチニン濃度に対するカゼインキナーゼ２阻害剤投与の効果を示す図である。＊：ｐ＜０．０１
図７は、腎炎のラットモデルにおける内因性クレアチニンクリアランスに対するカゼインキナーゼ２阻害剤投与の効果を示す図である。＊：ｐ＜０．０１
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の腎疾患治療又は予防剤の治療又は予防対象となる腎疾患は、腎疾患であれば特に限定されるものではなく、例としては、糸球体腎炎、間質性腎炎、腎硬化症、糖尿病性腎症、慢性および急性腎不全があげられる。さらに、急性糸球体腎炎症候群、急速進行性糸球体腎炎症候群、反復性あるいは持続性血尿症候群、ＩｇＡ腎症、慢性腎孟炎、ネフローゼ症候群、ループス腎炎、腎性高血圧、痛風腎、急性尿細管間質性腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、腎梗塞、薬剤性腎障害、移植腎の機能不全、腎結石や尿管閉塞に伴う腎機能障害などが挙げられる。なかでも、非糖尿病性の腎疾患は好対象である。とりわけ、腎炎は好対象である。とくにカゼインキナーゼ２の発現亢進もしくは酵素活性亢進により特徴づけられる上記の疾患は好対象である。本発明は、ヒトの疾患に適用されるほか、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物にも適用され、ヒトのみならず動物用医薬品とすることができる。なお、本発明の腎疾患の治療又は予防剤は、腎疾患の治療、腎疾患の予防、並びに腎疾患の治療と症状の悪化の予防に並行して行うのに有用である。
上記の通り、本発明の腎疾患治療又は予防剤は、カゼインキナーゼ２を阻害する物質を有効成分として含有する。カゼインキナーゼ２は蛋白質であり、基質特異性の広い多機能性のプロテインキナーゼの一種である。真核細胞に広く分布し、細胞質、核に存在する。分子量４１〜４４ｋＤのαサブユニット、α’サブユニットと２４〜２８ｋＤのβサブユニットからなり、分子量１３０〜１４０ｋＤのααββあるいはαα’ββの四量体からなる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８、４０７２−４０７６（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、８４３６−８４４７（１９９０）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８、９０５３−９０５８（１９８９））。αサブユニットおよびα’サブユニットに活性中心があり、酵素として蛋白質のセリン、トレオニン残基をリン酸化し、ＡＴＰ、ＧＴＰをリン酸供与源として利用すると考えられている。しかしながら現在に至るまで、カゼインキナーゼ２の生体内における意義や、病態時における意義の解明は十分にはなされていない。さらにカゼインキナーゼ２が腎疾患の腎臓で発現することや、カゼインキナーゼ２の阻害物質の投与により腎疾患が治療又は予防できることは知られていなかった。カゼインキナーゼ２を阻害することにより、腎疾患が予防または治療できるという事実は、従来技術からは全く予期し得ないことであり、本発明者らによって初めて見出されたことである。
下記実施例において具体的に記載されるように、本願発明者らは、腎疾患状態にある腎臓細胞中におけるカゼインキナーゼ２遺伝子の発現量が、正常な腎細胞中における発現量よりも有意に多くなっていることを見出し、かつ、カゼインキナーゼ２を阻害する物質を投与することにより、腎疾患状態が有意に改善されることを見出した。従って、本発明の腎疾患治療又は予防剤に有効成分として含有される、カゼインキナーゼ２を阻害する物質は、カゼインキナーゼ２を阻害することができる、薬剤上許容できるいずれのものであってもよい。これらは、従来有効な治療法のなかった腎疾患に対する治療又は予防剤として有用である。腎疾患状態にある腎臓を構成する細胞では、実施例にも示されるように正常な腎臓を構成する細胞に比べて、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現量が有意に多い。腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２の遺伝子の発現量が多いほど腎疾患の状態は悪く、発現量が適正に近いほど腎疾患の状態は正常に近い。このことは遺伝子の発現に限らず蛋白質の発現においても同じであり、実施例にも示されるように腎疾患状態にある腎臓の構成細胞では、正常な腎臓の構成細胞に比べてカゼインキナーゼ２の蛋白質の発現量すなわち含有量もまた有意に多い。腎臓の構成細胞におけるカゼインキナーゼ２の蛋白質の発現量すなわち含有量が多いほど腎疾患の状態は悪く、発現量すなわち含有量が適正に近いほど腎疾患の状態は正常に近い。また、カゼインキナーゼ２の蛋白質の発現量すなわち含有量は、カゼインキナーゼ２の酵素活性すなわち機能と極めて密接な関係にある。すなわち実施例にも示されるように、カゼインキナーゼ２の蛋白質量が多いほど、カゼインキナーゼ２の酵素活性すなわち機能は高い。これらのことは、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現、蛋白質の発現量すなわち含有量、および酵素活性すなわち機能が高いほど腎疾患の状態は悪く、これらが抑制され適正に近いほど腎疾患の状態は正常に近いこと示している。さらに、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現、蛋白質の発現量すなわち含有量、および酵素活性すなわち機能を低下あるいは阻害する手段、およびそれらを低下あるいは阻害する機能を有する物質は、いずれの手段および物質による場合においても、腎疾患の状態を正常に近い状態にさせる作用あるいは効果を有し、腎疾患を治療および予防する作用あるいは効果を有することが一般的に認識できる理論的な説明がなされる。この例として、腎疾患状態にある腎臓に対して種々の手段（たとえば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いてカゼインキナーゼ２の発現を阻害する手段、または化合物を用いてカゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する手段）によりカゼインキナーゼ２を阻害すれば、いずれの手段においても腎疾患の状態を正常に近い状態にさせる作用あるいは効果を有し、腎疾患を治療および予防する作用あるいは効果を有することは実施例にも示されている。言い換えれば、腎疾患状態にある腎臓に対して、カゼインキナーゼ２を阻害する機能を有する種々の物質（たとえば、カゼインキナーゼ２の発現を阻害する物質のアンチセンス・オリゴヌクレオチド、またはカゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質の化合物）は、いずれの物質においても腎疾患の状態を正常に近い状態にさせる作用あるいは効果を有し、腎疾患を治療および予防する作用あるいは効果を有することは実施例にも示されている。すなわち、一般にカゼインキナーゼ２を阻害する作用を有する手段および物質は腎疾患を治療および予防する作用を有することが明らかにされる。従って、本発明の腎疾患治療又は予防剤に有効成分として含有される、カゼインキナーゼ２を阻害する物質は、カゼインキナーゼ２を阻害することができる、薬剤上許容できるいずれのものであってもよく、これは従来有効な治療法のなかった腎疾患に対する治療剤および予防剤として有用である。さらに、そのようなカゼインキナーゼ２の遺伝子の発現、発現量すなわち含有量、および酵素活性すなわち機能を指標とすることで腎疾患を診断することもできる。なお、カゼインキナーゼ２は既知なものであり、当業者はカゼインキナーゼ２を阻害する手段および物質を想定することができ、またこれらは本発明においても詳細に説明されている。したがって当然のことであるが、これらはいずれにおいても当業者であれば通常の技術の範囲内で十分に行われるものである。
本発明において、腎疾患の治療又は予防に有用なカゼインキナーゼ２の阻害物質としては、結果的にカゼインキナーゼ２の効果を減少させるものであればよく、好ましいものとして、（１）カゼインキナーゼ２遣伝子の発現を阻害する物質（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、リボザイム等の転写、翻訳、修飾阻害物質）及び（２）カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質（酵素活性の競合的もしくは非競合的な阻害物質、抗カゼインキナーゼ２抗体及びその抗原結合性断片等）を挙げることができる。また、カゼインキナーゼ２を分解する物質やカゼインキナーゼ２の分解を促進する物質も使用可能である。また、カゼインキナーゼ２に関連するシグナル伝達系を生体内又は試験管内で本質的に阻害又は排除する物質であってもよい。これらの阻害物質は、下記実施例に具体的に記載される酵素活性測定法によって決定されるカゼインキナーゼ２の機能的活性を少なくとも約３０％、好ましくは約５０％、より好ましくは８０％以上阻害又は減少させるものである。酵素活性測定法は、通常の酵素活性測定に慣用されている方法により、困難なく実施することができる。具体的な測定方法は後述する。
以下、これらのカゼインキナーゼ２阻害物質についてさらに詳細に説明する。
上記の（１）カゼインキナーゼ２遺伝子の発現を阻害する物質としては、カゼインキナーゼ２の各サブユニットの遺伝子もしくは蛋白質の発現（転写、翻訳）または翻訳後の修飾を阻害する核酸、化合物、ペプチド等を挙げることができる。好ましくは核酸であり、核酸の好ましいものとしては、カゼインキナーゼ２遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉやリボザイムが例として挙げられる。さらに、カゼインキナーゼ２アンチセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりカゼインキナーゼ２アンチセンス遺伝子を導入した細胞、並びに該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりカゼインキナーゼ２アンチセンス遺伝子を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤などもこの例に含まれる。
正常の細胞内では、遺伝子ＤＮＡ−ｍＲＮＡ−蛋白質という流れで遺伝子情報が伝達されていく。蛋白質をコードするｍＲＮＡの塩基配列をセンス配列と呼び、この配列に対して相補的な塩基配列をアンチセンス配列と呼ぶ。なお、アンチセンス配列は、原核生物（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８１巻、第１９６６−１９７０頁（１９８４年）に掲載のＴ．Ｍｉｚｕｎｏ、Ｍ−Ｙ  ＣｈｏｕおよびＭ．Ｉｎｏｕｅの論文）と真核生物（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１４巻、第６７７１−６７７２頁（１９８６年）に掲載のＳ．Ｍ．Ｈｅｙｗｏｏｄの論文）との双方において遺伝子発現の自然発生的な生物学的抑制因子として説明されており、これらの配列は、相補的なｍＲＮＡ配列に対してハイブリダイズさせることにより、翻訳の阻害を行なうように機能するものと考えられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第７４巻、第４３７０−４３７４頁（１９７７年）に掲載のＢ．Ｍ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｅ．ＲｏｂｅｒｔｓおよびＥ．Ｌ．Ｋｕｆｆの論文）。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含めオリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリックの塩基対形成により定義されるように、前駆体ｍＲＮＡもしくは成熟ｍＲＮＡのいずれかの相補的な塩基配列に特異的にハイブリダイズする。この用語には、天然に存在する塩基、糖、および糖間（主鎖）結合からなるオリゴマー、ならびに類似する様式で機能する天然非存在性部分を有するオリゴマーがある。アンチセンス法とは簡単に言えば、ある遺伝子ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、細胞や個体に投与してｍＲＮＡの相補的な一本鎖配列または二本鎖配列に特異的に結合させ、二重鎖構造を形成させ、その発現、ｍＲＮＡもしくは遺伝子ＤＮＡの機能、蛋白質への翻訳、もしくは細胞質内への輸送、もしくはその総体的生物学的機能に必要な任意の活性のうちのいずれかを塩基配列特異的に阻害する方法である。これにより、ｍＲＮＡもしくは遺伝子ＤＮＡがその機能の全てもしくは一部分を実行できないために、蛋白質が正しく発現されるように調節するゲノムの一部分の欠損がもたらされ、このことにより遺伝子ＤＮＡから蛋白質への遺伝子情報の流れが遮断され、発現が負の方向へ調節され阻害される。アンチセンス法は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドと同じ配列を有する遺伝子の発現を塩基配列特異的に阻害する。多大な数にのぼる最近の研究により、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの有用性は、遺伝子の機能解析に優れた方法としても実証されている（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９８９、８１、１５３９−１５４４、Ｚｏｎ、Ｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１９８８、５、５３９−５４９）。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは４つの塩基単位からなる長い鎖であるため、どのような標的遺伝子の塩基配列についても容易に合成することができる。オリゴヌクレオチド化学における最近の進歩により、また、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドやＳ−オリゴヌクレオチドなどの合成における最近の進歩により、現在では新規の形態の治療法としてのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの利用を考案することが可能となっている。細胞は核酸を分解し得る種々のエキソ−およびエンド−ヌクレアーゼを含む。多数のヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾が、これらを取り込んだオリゴヌクレオチドを天然のオリゴヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対してより耐性とすることが示されている。このように修飾されたもしくは置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば天然形態のものよりも好ましい。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽出物または単離ヌクレアーゼ溶液とともにインキュベートし、通常はゲル電気泳動により、時間に関して残存する無傷のオリゴヌクレオチドの程度を測定することによりルーチン的に測定される。ヌクレアーゼ耐性を増強するように修飾されているオリゴヌクレオチドは非修飾オリゴヌクレオチドより長く無傷のままで残る。ヌクレアーゼ耐性を増強または与えるための種々のオリゴヌクレオチド修飾が知られている。例えば、意図される幾つかの好ましいオリゴヌクレオチドの態様には、Ｓ−オリゴヌクレオチドなどのホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル、もしくはシクロアルキル糖間結合、あるいは短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含むことができる。Ｓ−オリゴヌクレオチド（ヌクレオチドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）のリン酸基の非橋酸素原子がイオウ原子により置換された等電アナログである。Ｓ−オリゴヌクレオチドは、対応するＯ−オリゴを、イオウ転移試薬である３Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドで処理することにより得ることができる。Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第５５巻、第４６９３−４６９８頁（１９９０年）に掲載のＲ．Ｐ．Ｉｙｅｒ等の論文およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１２巻、第１２５３−１２５４頁（１９９０年）に掲載のＲ．Ｐ．Ｉｙｅｒ等の論文を参照されたい。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチド（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、Ｊ．Ｅ．およびＷｅｌｌｅｒ、Ｄ．Ｄ，、米国特許第５，０３４，５０６号）の態様も好ましい。他の好ましい態様においては、蛋白質−核酸（ＰＮＡ）主鎖のような、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖をポリアミド主鎖で置換することができる（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ、Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｆ、Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１、２５４、１４９７）。この場合、塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合している。オリゴヌクレオチドはペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖擬態物をも有することができる。さらに、オリゴヌクレオチドは典型的には、一つまたはそれ以上の有利な性質（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞内への取り込みの増加、ＲＮＡ標的に対する結���親和性の増加）を与える少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド領域およびＲＮａｓｅＨ切断のための基質である領域を含む。一つの好適な態様において、オリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾された少なくとも一つの領域および通常はＲＮａｓｅＨのための基質として働く領域を含む。その標的（この場合、カゼインキナーゼ２をコードしている核酸）に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度であるオリゴヌクレオチド／標的対の熱融解温度（Ｔｍ）を測定することによりルーチン的に決定される．また、解離は分光学的に検出される。熱融解温度（Ｔｍ）が高いほど標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は強い。より好適な態様では、カゼインキナーゼ２のｍＲＮＡ結合親和性を増加させるために修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位が修飾された少なくとも一つのヌクレオチド（最も好適であるのは２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾ヌクレオチド）を含む。そのような修飾はオリゴヌクレオチド内へルーチン的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは与えられた標的に対し、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高い熱融解温度（Ｔｍ）（即ちより強い標的結合親和性）を有していることが示される。そのような増加した親和性の効果は、カゼインキナーゼ２に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効果を非常に増強する。ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである．従って、この酵素の活性化はＲＮＡ標的の切断を生じ、アンチセンス阻害の効率を非常に促進しうる。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動によりルーチン的に示すことができる。
オリゴヌクレオチドまたは類似体は、約１２から約５０個、好ましくは１２〜２５個、さらに好ましくは１６〜２２個の塩基を含むことが好ましい。さらに、このようなオリゴヌクレオチドまたは類似体は、生理学的条件下（熱融解温度（Ｔｍ）では、実質上３７℃より高く、好ましくは少なくとも５０℃で、代表的には６０℃〜８０℃またはそれ以上）で標的ｍＲＮＡ塩基配列に特異的に結合しハイブリダイズする。そのようなハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応し、この条件はイオン強度およびｐＨでの標的ｍＲＮＡ塩基配列の熱融解温度（Ｔｍ）より約１０℃、そして好ましくは約５℃低く選択される。さらに、相補性（１つのポリペプチドが、別のポリペプチドに対して相補的である度合い）は、一般的に受け入れられる塩基対形成規則によって、お互いに水素結合を形成することが予測される相対する鎖の塩基の比率によって定量化できる。特異的にハイブリダイズ可能および相補的とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間で安定かつ特異的な結合が起こるように十分な程度の相補性を示すのに使用される術語である。特異的にハイブリダイズ可能であるには、オリゴヌクレオチドはその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことを理解されたい。もっとも、１００％相補的であることが特異性及び良好な翻訳阻害のために最も好ましい。１００％相補的でない場合でも、相補性は９０％以上（すなわち、ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド中の塩基のうち、対になるｍＲＮＡの塩基とミスマッチしている塩基の数が全アンチセンスオリゴヌクレオチド中の１０％以下）であることが好ましい。標的へのオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能を妨害して有用性の消失を起こす場合、および特異的結合が望まれる条件下、たとえば治療的処置の場合には生理的条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このようなオリゴヌクレオチドまたは類似体は、よく知られる技術である固相合成により簡便かつルーチンに作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成の検討については、バイオコンジュゲイト・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第１巻、第１６５−１６７頁（１９９０年）に掲載のグッドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）の論文を参照されたい。たとえば、オリゴヌクレオチドは、ヨウ素による酸化を行う標準ホスホロアミダイト化学を用いて自動化ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズモデル３８０Ｂ）で合成され、このような合成のための装置はアプライドバイオシステムズを含む数々の販売元により販売されている。このようなオリゴヌクレオチドまたは類似体の合成は、日常作業者の技術の範囲内で十分に行われる。あるいは、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成を専門的に行なっている数多くの企業から得ることができる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様な技術の使用もよく知られている。また、���光標識、ビオチニル化またはコレステロール修飾オリゴヌクレオチドのような他の修飾オリゴヌクレオチドを合成するために、同様の技術およびビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラーレン修飾アミダイトおよび／または制御細孔ガラス（ＣＰＧ）（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ）のような市販品として入手可能な修飾アミダイトおよびＣＰＧ産物の使用もよく知られている。
アンチセンス法は、疾患原因遺伝子あるいは疾患関連遺伝子自体を標的にしているので原因療法に近い方法であり、アンチセンス・オリゴヌクレオチドには多くの疾患の治療のための治療剤としての偉大な可能性が存在している。例えば、米国特許第５１３５９１７号はヒトインターロイキン−１レセプター発現を阻害するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５０９８８９０号はｃ−ｍｙｂ癌遺伝子と相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびある種の癌状態のアンチセンス・オリゴヌクレオチド治療に関している。米国特許第５０８７６１７号はアンチセンス・オリゴヌクレオチドによる癌患者の処置法を提供している。米国特許第５１６６１９５号はＨＩＶのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供している。米国特許第５００４８１０号は単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５ｍＲＮＡにハイブリダイズして複製を阻害しうるオリゴマーを提供している。米国特許第５１９４４２８号はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第４８０６４６３号はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製の阻害にそれらを用いる方法を提供している。米国特許第５２８６７１７号は癌遺伝子に相補的な混合結合オリゴヌクレオチドホスホロチオエートに関している。米国特許第５２７６０１９号および第５２６４４２３号は細胞における外来性核酸の複製阻害に使用されるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体に関している。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドはＡＩＤＳ患者のサイトメガロウイルス網膜炎に対して有効であることが示されている（ＢｉｏＷｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ、１９９４年）。従って、オリゴヌクレオチドは有用な治療手段であり、細胞および動物（特にヒト）の処置のための処置養生法で有用であろうことは確立されている。カゼインキナーゼ２の発現の阻害もまた、腎疾患の治療に極めて有用である。
カゼインキナーゼ２のｃＤＮＡ配列は公知である（例えば、ヒトカゼインキナーゼ２αサブユニットのｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＪＯ２８５３、ヒトカゼインキナーゼ２α’サブユニットのｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ５５２６８、ヒトカゼインキナーゼ２βサブユニットのｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ１１３１８６、ラットカゼインキナーゼ２βサブユニットのｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０３１０２１、ラットカゼインキナーゼ２αサブユニットのｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ１５６１８，マウスカゼインキナーゼ２αサブユニットのｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ００１４２０、マウスカゼインキナーゼ２βサブユニットのｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００９９７５に記載されている。これらのうち、ヒトカゼインキナーゼ２αサブユニット、同α’サブユニット、同βサブユニット、ラットカゼインキナーゼ２αサブユニット及びβサブユニットのｃＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号１５ないし１９に示す）ので、カゼインキナーゼ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは容易に合成することができる。
すなわち、これらのｃＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、基本的にアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。もっとも、選択した塩基配列が標的遺伝子に対して特異的である（すなわち、該標的遺伝子以外の遺伝子中には、該塩基配列又はそれと相同性が高い塩基配列が存在しない）ことをＢＬＡＳＴ検索等により確認することが好ましい。具体例としては、ラットのカゼインキナーゼ２αサブユニット（α’サブユニットを含め）のアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして５’−ｇｔａａｔｃａｔｃｔｔｇａｔｔａｃｃｃｃａ−３’（配列番号１）、ラットのカゼインキナーゼ２βサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして５’−ｇｇｔｔｇｇｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｃｃ−３’（配列番号２）を用いることができる。その他、配列番号３〜１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドも例示することができる。さらに、カゼインキナーゼ２のｍＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは種々公知であり（例えば、ＷＯ出願０２０／６２９５１号およびＷＯ出願０２０／６２９５４号）、これらの公知のオリゴヌクレオチドを用いることもできる。動物種を越えて対応する塩基配列、またはその部分から成るオリゴヌクレオチドまたは類似体もまた本発明において有用である。ｍＲＮＡのコーディング領域だけでなく、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップおよびイントロン／エクソン結合部位のような領域もアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的領域として利用することが可能である。すなわち、本発明により調製されるオリゴヌクレオチドおよび類似体は、コーディング領域と同様にこれらの領域の全部または部分を標的とすることができる。好適な態様によれば、オリゴヌクレオチドまたは類似体は転写開始部位、翻訳開始部位、３’−非翻訳領域中のイントロン／エクソン結合部位または塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。妨害されるべきｍＲＮＡの機能には、蛋白質翻訳の部位へのｍＲＮＡのトランスロケーション、ｍＲＮＡからの実際の蛋白質の翻訳、ｍＲＮＡのスプライシングまたは成熟およびおそらくはｍＲＮＡにより行われているであろう独立した酵素活性のような生存のためのすべての機能が含まれる。ｍＲＮＡ機能のそのような妨害の全体的な効果はカゼインキナーゼ２の蛋白質の発現の妨害を起こすことである。このようにアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたは類似体は、少なくともカゼインキナーゼ２の蛋白質をコードするｍＲＮＡと塩基配列特異的にハイブリダイズでき、カゼインキナーゼ２の発現を選択的に変調し得るオリゴヌクレオチドまたは類似体である。またカゼインキナーゼ２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたは類似体を細胞や個体に投与すれば、塩基配列特異的にカゼインキナーゼ２の発現だけを選択的に阻害することができ、それゆえに腎疾患を治療することができる。本発明に用いられるカゼインキナーゼ２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、カゼインキナーゼ２をコードするｍＲＮＡのコーディング領域、３’−非翻訳領域、５’−非翻訳領域、５’キャップおよびまたはイントロン／エキソン結合部位に対して相補性を有するとともにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。この領域に対して相補性を有するオリゴヌクレオチドを使用すると、カゼインキナーゼ２に対して選択的にハイブリダイズする。好ましくは、ヌクレオチド中の少なくとも一つの結合基がイオウ含有基あるいはホスホロチオエート部分を含む、Ｓ−オリゴヌクレオチドである。本発明に更に包含されるものとして、有効量の本発明のカゼインキナーゼ２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを、薬学的に許容することができるキャリヤと組み合わせてなる薬剤組成物がある。カゼインキナーゼ２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与することにより、カゼインキナーゼ２の発現を抑制することができるので、腎疾患を治療することができる。特に、カゼインキナーゼ２の発現が亢進していることを特徴とする腎疾患、たとえば腎炎に対しては実に好適である。下記実施例にも一例が詳細に記載されている。
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）法とは、細胞や個体に投与された２本鎖ＲＮＡが、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現（蛋白質の合成）を阻害する現象による方法のことである。ＲＮＡｉ法は、標的遺伝子またはｍＲＮＡを破壊することで標的遺伝子の発現を選択的に抑制するため、その遺伝子の機能解析に有効な方法として、また、疾患原因遺伝子あるいは疾患関連遺伝子自体を標的にしているので原因療法に近い方法としても注目されている。ＲＮＡｉで使用する２１〜２３核酸塩基単位の二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとも呼ばれる。ｓｉＲＮＡは、容易に設計できる。たとえば、転写因子の結合部位を避けるため、翻訳領域でスタートコドンから５０塩基以上下流の最初のＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、ＴＡを見つけ、それに続く１９〜２１塩基を含めた２１〜２３塩基を選択する。なお、選択した塩基配列は、ＧＣコンテンツが３０〜７０％、望ましくは５０％、ＧＧＧまたはＣＣＣのパターンを含まないものが望ましい。ついで、選択した塩基配列が目的遺伝子に対して特異的であることをＢＬＡＳＴ検索等により確認すればよい。ｓｉＲＮＡもまた４つの塩基単位からなる長い鎖であるため、どのような標的遺伝子の塩基配列についても簡便かつ日常的に合成することができる。最近の進歩により、現在では新規の形態の治療法としてのｓｉＲＮＡの利用を考案することが可能となってきている。具体的には、ヒトのカゼインキナーゼ２βサブユニットのｓｉＲＮＡとして、例えば、５’−ｃｕａｃｃｇａｃａａｇｃｕｃｕａｇａｃｔｔ−３’および５’−ｇｕｃｕａｇａｇｃｕｕｇｕｃｇｇｕａｇｔｔ−３’を用いることができる。あるいは、例えば５’−ｃｕａｃｃｇａｃａａｇｃｕｃｕａｇａｃａｔ−３’および５’−ｇｕｃｕａｇａｇｃｕｕｇｕｃｇｇｕａｇｔｇ−３’を用いることができる。ラットは、例えば５’−ａｕｃｕｕａｃｕｇｇａｃｕｃａａｕｇａｔｔ−３’および５’−ｇａｕｇｇｃｕｇｕｕｃｇａｇａｕｃｕｇｔｔ−３’を用いることができる。あるいは当業者がカゼインキナーゼ２の発現の阻害のための好ましいｓｉＲＮＡ知識から調製することができる任意の同様なオリゴヌクレオチドまたは類似体を利用することが好ましい。これらのｓｉＲＮＡを細胞や個体に投与すれば、塩基配列特異的にカゼインキナーゼ２の発現だけを選択的に阻害することができ、それゆえに腎疾患を治療することができる。とくに、カゼインキナーゼ２の発現が亢進していることを特徴とする腎疾患、たとえば腎炎に対しては実に好適である．
カゼインキナーゼ２を阻害するこれらの核酸は、薬剤学的組成物中に調剤することができ、この薬剤学的組成物はこれらの核酸の他に、担体、増粘剤、賦形剤、緩衝液、保存料、界面活性剤、リポソーム、もしくは脂質製剤などを含むことができ、抗生物質および麻酔剤などのような一つもしくは複数の活性成分をも含むことができる。そのような医薬担体に加えて、オリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするためにカチオン性液体や、リポソームの形態をなすことができる親油性陽イオン性化合物が処方に含まれていてもよい。取り込みを容易にするそのような組成物の一つはリポフェクチン（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）である。オリゴヌクレオチドを細胞内に導入するのにリポソームを使用することは、例えば、米国特許第４，８９７，３５５号および同第４，３９４，４４８号に教示されている。更に、生物学的物質からなるリポソームをつくる一般的な方法に関しては、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，２３１，８７７号、同第４，２２４，１７９号、同第４，７５３，７８８号、同第４，６７３，５６７号、同第４，２４７，４１１号および同第４，８１４，２７０号を参照されたい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、コレステロール、コール酸およびデオキシコール酸をはじめとする数多くのステロールのうちのいずれか１つのような親油性キャリヤと組み合わせることができる。好ましいステロールは、コレステロールである。更に、オリゴヌクレオチドは、細胞によって摂取されるペプチドに結合させることができる。有効なペプチドには、例えば、ペプチドホルモン、抗原または抗体およびペプチドトキシンがある。腎臓を構成する細胞により選択的に取り込まれるペプチドを選択することにより、オリゴヌクレオチドの特定の給送を効果的に行なうことができる。オリゴヌクレオチドは、活性化されたアミノアルキル誘導体の形成により、５’ＯＨ基を介して共有結合させることができる。選択されたペプチドは、次に、アミノおよびスルフヒドリル反応性ヘテロ二官能価試薬を用いて活性化されたオリゴヌクレオチドに共有結合させることができる。後者は、ペプチドに存在するシステイン残基に結合する。細胞をペプチドに結合したオリゴヌクレオチドに曝すと、ペプチジルアンチセンス剤がエンドサイトシス化され、オリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡに結合して翻訳を抑制する。ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２３６３号ＰＣＴ出願公報を参照されたい。投与用量は処置されるべき状態の重度および応答度に依存し、処置進行は治療が達成されるかまたは疾患状態の軽減が達成されるまで数日から数カ月続く。至適投与計画は体内の薬剤蓄積の測定から計算しうる。当業者は容易に至適投与量、投与法および繰り返し頻度を決定しうる。至適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性に依存して変化するであろうが、一般的には動物実験からのＥＣ５０に基づいて計算しうる。例えば、化合物の分子量（オリゴヌクレオチド配列および化学構造から導かれる）およびＩＣ５０のような有効量（実験的に求められる）が与えられると、ｍｇ／ｋｇでの投与量がルーチン的に計算される。多数の刊行物が哺乳動物への遺伝子の投与に関連している。リポソームを介した遺伝子の注入お���び組織への直接的な遺伝子の注入の例にはブリガムら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８−２８１，ナーベルら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８，ハジンスキら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６−２０９；ワンとホアン（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８４：７８１５−７８５５がある。ヒト遺伝子治療手法の総説記事の例には、アンダーソン、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３がある。
オリゴヌクレオチドの投与量は、上記のように適宜設定されるが、通常、オリゴヌクレオチドの重量換算で１日当り０．００５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ程度が適当な場合が多い。また、投与経路は、好ましくは非経口投与であり、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等を例示することができる。
カゼインキナーゼ２を阻害する物質のうち、その酵素活性を阻害する物質としては、カゼインキナーゼ２の活性を少なくとも部分的に中和する抗カゼインキナーゼ２抗体又はその抗原結合性断片も用いることができる。抗カゼインキナーゼ２抗体は、カゼインキナーゼ２の各サブユニットの蛋白質またはカゼインキナーゼ２蛋白質の部分ペプチドを抗原とするモノクローナル抗体および／若しくはポリクローナル抗体又は抗体の抗原結合性断片であり、カゼインキナーゼ２の活性を少なくとも部分的に中和できる限り、特に制限はなく、カゼインキナーゼ２やそのサブユニットを抗原とし常法に従って作製できる。中和活性を有するポリクローナル抗体は、カゼインキナーゼ２を免疫原として得られた抗血清から常法により回収することができる。また、中和活性を有するモノクローナル抗体は、カゼインキナーゼ２やそのサブユニットを抗原として用いる常法によりモノクローナル抗体を作製し、カゼインキナーゼ２の中和活性を有するものをスクリーニングすることにより得ることができる。抗カゼインキナーゼ２抗体は、細胞によって摂取されるペプチドに結合させることができる。上述のように有効なペプチドには、例えば、ペプチドホルモン、抗原または抗体およびペプチドトキシンがある。腎臓を構成する細胞により選択的に取り込まれるペプチドを選択することにより、抗カゼインキナーゼ２抗体の特定の給送を効果的に行なうことができる。これらの抗カゼインキナーゼ２抗体もまた細胞や個体に投与すれば、抗体、抗原特異的にカゼインキナーゼ２の活性だけを選択的に阻害することができ、それゆえに腎疾患を治療することができる。とくに、カゼインキナーゼ２の活性が亢進していることを特徴とする腎疾患、たとえば腎炎に対しては実に好適である．
カゼインキナーゼ２を阻害する物質のうち、その酵素活性を阻害する物質の好ましい例としては、さらに、下記式１で示される構造を有する化合物を挙げることができる。
2004017997.tif 000003
（但し式１中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、または式２に表される置換基から選ばれる１種乃至は２種以上を有していても良いフェニル基を表し、且つ、Ｒ１、Ｒ２の少なくとも一方は該置換基を有していても良いフェニル基であり、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子又は式２に表される置換基を表し、Ｒ５は水素原子、糖残基、Ｃ１〜４アルキル基又はアシル基を表す。）
2004017997.tif 000004
（但し、式中Ｒ５は式２のＲ５と同じ意味を表す）。
式１について糖残基として好ましくはグルコース、ガラクトース、リボースが挙げられ、Ｃ１〜４アルキルとして好ましくはメチル、エチルが挙げられ、アシルとして好ましくはアセチルのようなＣ１〜Ｃ４アシル及びベンゾイルが挙げられる。
カゼインキナーゼ２を阻害する物質のうち、その酵素活性を阻害する物質の好ましい例としては、さらに、以下の化合物を挙げることができる。
2004017997.tif 000005
（但し式３中、Ｒ６、Ｒ７はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子又はＣ１〜４アルキル基である。）
４，５，６，７−テトラブロモベンズイミダゾールであるＴＢＢ（Ｓａｒｎｏ  Ｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００１  ４６９：４４−４８）、５，６−ジブロモ−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）ベンズイミダゾールであるＤＲＢ（Ｍｅｇｇｉｏ  Ｆ，Ｅｕｒ．Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９０１８７：８９−９４）、
2004017997.tif 000006
（但し、式４中、Ｒ８は、１〜３個のハロゲン、メチル基、トリフルオロメチル基若しくは水酸基で置換されても良いフェニル基、またはキノリル基、エチルメチルスルヒド基、ｔ−ブチルフェニルチオ基、Ｎ−エチルフェニルアミノ基であり、Ｒ９は、水酸基、またはアミノ基を表す）
2004017997.tif 000007
（但し、式５中、ｎは、１〜３、Ｘは、−ＮＨ−又は−ＣＯＮＨ−であり、Ｙは、水酸基、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、ピラゾール又はトリアゾールを表す）
2004017997.tif 000008
2004017997.tif 000009
（但し、式６中、Ｒ１０は、ハロゲン、メチル基、エチル基若しくはｔ−ブチル基で置換されてもよい２−チエニル基若しくはフェニル基であり、Ｒ１１は、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＭｅ又は−ＳＯ２−ＮＨ［（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２］を表す）。
上記一般式に含まれる化合物の好ましい例として、下記式７で表されるアピゲニンを挙げることができる。アピゲニンは、上記の酵素活性測定法によって決定されるカゼインキナーゼ２の機能的活性を１０μＭの濃度で約２５％阻害し、１００μＭの濃度で約７５％阻害、減少させるものであり好ましい。
2004017997.tif 000010
さらに、上記した各一般式に含まれる化合物のうち、特に好ましい化合物として下記の化合物を具体的に例示することができる。
2004017997.tif 000011
2004017997.tif 000012
これらの化合物自体、その製造方法及びそれらがカゼインキナーゼ２の酵素活性の阻害効果を有することは公知であり、例えば米国特許第６３，３５８，９７８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／４２２３１，ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０２／２４６８１，ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０２／０５７２４０等に記載されている。従って、これらの化合物は公知に方法に従って容易に製造することができる。
なお、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質は上記した化合物に限定されるものではなく、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害することが知られている他の化合物も用いることが可能である。
上記した種々のカゼインキナーゼ２を阻害する物質は、薬剤上許容できる塩の形態にあってもよい。これらはよく知られた塩基または酸付加塩のいずれかである。塩基性塩の例は水酸化アンモニウムおよびアルカリおよびアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩から誘導されるものならびに脂肪族および芳香族アミン、脂肪族ジアミンおよびヒドロキシアルキルアミンから誘導される塩である。このような塩の調製に特に有用な塩基には、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、メチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、シクロヘキシルアミンおよびエタノールアミンが含まれる。カリウム、ナトリウムおよびリチウム塩形が特に好ましい。酸付加塩は、適当な酸との薬剤上許容されうる非毒性の付加塩、たとえば無機酸たとえば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸もしくはリン酸または有機酸たとえば有機カルボン酸、たとえばグリコール酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、サリチル酸もしくはｏ−アセトキシ安息香酸、または有機スルホン酸、たとえばメタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくはナフタレン−２−スルホン酸との塩が好ましい。
これらのカゼインキナーゼ２の酵素活性阻害化合物はそれぞれ単独で用いられるほか、２種類以上の化合物を混合して用いても良い。
本発明において、カゼインキナーゼ２の酵素活性阻害化合物を有効成分とする腎疾患の治療もしくは予防剤を動物あるいはヒトに投与する場合には、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腎臓組織内などいずれの投与形態を用いてもよい。投与に際しては、それぞれの投与方法に適した剤型に調製することができる。本発明の腎疾患治療あるいは予防剤の剤型としては、注射剤、舌下剤、経皮パップ剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ錠、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、座薬、軟膏剤、点眼剤等が挙げられる。剤型に応じて、製剤上許容される賦形剤、例えば、乳糖、バレイショデンプン、炭酸カルシウム、又はアルギン酸ナトリウム等を配剤してもよい。さらに、通常製剤に用いるその他の材料、例えば血清アルブミン等の蛋白質、緩衝作用、浸透圧調整のための塩、担体、賦型剤、基剤、溶解補助剤、分散剤、安定化剤、酸化防止剤、保存剤、崩壊剤、結合剤、矯味剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤等等の成分を配合しても良い。
投与量は、投与方法や対象とする人間をはじめとする温血動物の種類、個体の年齢、体重、症状の軽重、医師の診断などにより広範に変えることができるが、通常、体重１ｋｇ当たり１日に０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で設定される。しかし、患者の症状の軽重、医師の診断に応じて投薬範囲を変えることも可能である。上記投与量は１日１回又は数回に分けて投与することができる。上記の遺伝子治療の場合には、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４、３６５−３８９（１９９３））。本発明の腎疾患治療剤または予防剤は、文字通り腎疾患の治療又は予防を目的として使用できることは勿論であるが、腎疾患の、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的として投与することもできる。さらに本発明は、カゼインキナーゼ２を阻害する物質を用いた腎疾患の治療方法を含む。
また本発明の腎疾患の治療又は予防剤は、従来の腎疾患治療に用いられるステロイド、免疫抑制剤、降圧剤（例：カルシウムブロッカー、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＴＩＩレセプターブロッカー、α受容体遮断薬）、抗血小板薬（例：ジピリダモール、ジラゼップ）、抗凝固薬、などの薬剤と併用して用いることができる。またＨＧＦなどを導入することによる遺伝子治療と組み合わせて用いることができる。これらの薬剤を組み合わせて用いる場合、各薬物を別々にあるいは同時に、薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合して製剤化し、医薬組成物として経口的にまたは非経口的に投与することができる。薬物を別々に製剤化した場合、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して投与することができるが、別々に製剤化した個々の製剤を、同時に、あるいは時間差をおいて別々に、同一対象に投与してもよい。
上記の通り、本願発明者らは、腎疾患状態にある腎細胞中でのカゼインキナーゼ２遺伝子の発現量が、正常な腎細胞中における発現量よりも有意に多くなっていることを見出した。従って、本発明は、生体から分離した試料中のカゼインキナーゼ２の活性若しくは含有量又はカゼインキナーゼ２遺伝子の発現量を測定することを含む、腎疾患の診断方法をも提供する。ここで、「生体から分離した試料」は、腎臓を構成する細胞が好ましい。
カゼインキナーゼ２の発現を指標とする腎疾患の診断方法は、カゼインキナーゼ２のαサブユニット、α’サブユニットおよびβサブユニットの発現、特に遺伝子の発現、蛋白質の発現および酵素活性の発現を対象に実施することができる。例えば、遺伝子あるいは蛋白質の発現を対象に実施する場合では、まず、診断対象とする腎臓およびその対照とする非腎疾患状態の腎臓からＲＮＡもしくは蛋白質をそれぞれ抽出する。抽出した各ＲＮＡもしくは蛋白質の一定量ずつを検体として、カゼインキナーゼ２の発現をそれぞれ検出する。診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２の発現と、その対照（健常人）とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２の発現を比較することにより、診断対象とする腎臓における腎疾患状態を診断できる。診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２の発現が、その対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２の発現よりも高い場合には、診断対象とする腎臓は腎疾患状態にあり、特にカゼインキナーゼ２が関与する腎疾患状態と診断される。このような検出系を用いて、腎臓の組織あるいは細胞中のカゼインキナーゼ２の発現を測定することによって腎疾患程度を正確に測定することが可能である。
カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｉｎｎｉｓ  ＭＡ，Ｇｅｌｆａｄ  ＤＨ，Ｓｎｉｎｓｋｙ  ＪＪ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ＴＪ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ（１９９０））、ノーザンブロット法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．（１９８９））、アレイ法、ＤＮＡチップ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３１５９−３１６６（１９９３））などを利用して測定することができる。これらの方法自体は、いずれも周知のものであり、上記の通り、カゼインキナーゼ２のｃＤＮＡ配列も公知であるから、当業者であれば、細胞中のカゼインキナーゼ２の遺伝子の発現の測定は容易に行うことができるし、下記実施例にも一例が詳細に記載されている。ＲＴ−ＰＣＲ法による測定はより好ましく用いられる。すなわち、抽出した各ＲＮＡの一定量ずつより、逆転写反応を用いてｃＤＮＡをそれぞれ合成する。合成した各ｃＤＮＡの一定量ずつを鋳型にして、カゼインキナーゼ２のプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、これらをそれぞれ増幅する。増幅した各ＰＣＲ産物の一定量ずつをアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行い、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現をそれぞれ検出する。なお、カゼインキナーゼ２の遺伝子に関してＰＣＲを行う際には、恒常的に発現している遺伝子（例えばＧ３ＰＤＨやβアクチンなどのハウスキーピング遺伝子）を内部標準として同様にＰＣＲ法を行い、そのＰＣＲ産物の一定量をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行って遺伝子の発現を検出し、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現の検出結果を補正するとよい。これらはいずれも常法である。上記で得られる各ＰＣＲ産物は、常法、例えばジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３（１９７７））やマキサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列情報を確認するとよい。カゼインキナーゼ２の遺伝子のＰＣＲに用いるプライマーは、カゼインキナーゼ２の各サブユニットの遺伝子のみを特異的に増幅できる特有のものである限り、特に制限はなく、これら遺伝子の完全長ｃＤＮＡの公知（上述）の塩基配列情報をもとに適宜設定できる。すなわち、センスプライマーとしては、カゼインキナーゼ２のｃＤＮＡのセンス鎖と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができ、また、アンチセンスプライマーとしては、カゼインキナーゼ２のｃＤＮＡのアンチセンス鎖と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。センスプライマーとアンチセンスプライマーとで挟まれる領域がＰＣＲにより増幅される。また、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、市販の化学合成機を用いて、常法に従って合成できる。プライマーのサイズは、特に限定されないが、通常、１５��３０塩基程度である。例えば、ラットのカゼインキナーゼ２βサブユニットのプライマーの場合では、センス・プライマー；５’−ｃｃｇｃｇｇａｃａｔａａａｇａｔｇａｇｔ−３（配列番号１１）、アンチセンス・プライマー；５’−ａａａｃｃａｇｔｇｃｃｇａａｇｔａｔｇｃ−３’（配列番号１２）を用いることができる。ラットのカゼインキナーゼ２αサブユニットのプライマーの場合では、センス・プライマー；５’−ａｇａａａｇｃｔｔｃｇｇｃｔａａｔａｇａ−３’（配列番号１３）、アンチセンス・プライマー；５’−ａｃｔｇａａｇａａａｔｃｃｃｔｇａｃａｔ−３’（配列番号１４）を用いることができる。このようにして、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現を特異的にかつ簡便に検出することができる。あるいは、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲのような定量的ＰＣＲも探用することができる。リアルタイム検出ＰＣＲも周知であり、そのためのキットも市販されているので、容易に実施することができる。
また，本発明のオリゴヌクレオチドはまた、プローブとして用いることもでき、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現の検出および診断に有用である。例えば、上記したノーザンブロット法、アレイ法、ＤＮＡチップ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等におけるプローブとして利用できる。これらの手法自体は周知であり、当業者が容易に実施可能である。上記オリゴヌクレオチドに蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。なお、核酸プローブを用いた被検核酸の測定方法もこの分野において周知であり、緩衝液中、核酸プローブを被検核酸とＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）で接触させることによりハイブリダイズさせ、洗浄後、ハイブリダイズした標識プローブ又は固相プローブに結合された鋳型核酸を測定することにより行うことができる。このような方法には、上記したノーザンブロットやインサイチューハイブリダイゼーション、さらにはサザンブロット法等の周知の方法が包含される。
例えば、ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端の３２Ｐ標識により放射性標識オリゴヌクレオチドを製造しうる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，第２巻，ｐ１０．５９。次に、放射性標識オリゴヌクレオチドを組織または細胞試料と接触させ、試料を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去する。試料に残存している放射活性は結合されたオリゴヌクレオチドを示しており（それはカゼインキナーゼ２の発現を示している）、シンチレーションカウンターまたは他の通常の手段により定量しうる。放射性標識オリゴを用いて組織のオートラジオグラフィーを実施し、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現の局在化、分布または量を決定することができる。また，組織切片を放射性標識オリゴヌクレオチドで処理し、上記のように洗浄し、次にルーチンオートラジオグラフィー法に従って写真乳化剤へ暴露する。現像すると乳化剤はカゼインキナーゼ２の遺伝子を発現している範囲に銀粒子のイメージを与える。銀粒子の定量によりカゼインキナーゼ２の発現を検出することができる。カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、放射性標識の代わりにフルオレセインまたは他の蛍光性標識とコンジュゲートさせた本発明のオリゴヌクレオチドを用いて開発することができる。各々のこれらの様式は本分野では既知である。当業者は本発明の技術に従って容易にこれらの既知の様式をカゼインキナーゼ２の遺伝子の発現の検出に適用でき、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現を検出する新規かつ有用な手段が提供される。
また、カゼインキナーゼ２の蛋白質の発現を指標とする場合では、例えば上記カゼインキナーゼ２の各サブユニットの蛋白質またはカゼインキナーゼ２蛋白質の部分ペプチドを抗原とするモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体もしくはその抗体の抗原結合性断片を用いて、酵素結合イムノソルベントアッセイ（エライザ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）、および酵素免疫法（エンザイムイムノアッセイ、ＥＩＡ）、ウエスタンブロット解析法、ドットブロット解析法、プロテインチップ解析法、免疫染色解析法などを利用して、カゼインキナーゼ２の蛋白質またはカゼインキナーゼ２蛋白質の部分ペプチドを検出する。カゼインキナーゼ２の蛋白質の検出に用いる抗体もしくは抗体の部分は、カゼインキナーゼ２の各サブユニットの蛋白質またはカゼインキナーゼ２蛋白質の部分のみを特異的に検出できる特有のものである限り、特に制限はない。ポリクローナル抗体はウサギ、ラット、マウス、ヤギなどにカゼインキナーゼ２蛋白質のそれら抗原を静脈、皮下、筋肉中など非経口的に投与することによって得られる。モノクローナル抗体は例えば、カゼインキナーゼ２蛋白質のそれら抗原を非経口的に投与したマウスの脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ（骨肉腫）細胞と細胞融合した後培養して得られる培養上清を精製する、など通常の方法で得ることができる。また、カゼインキナーゼ２自体も公知の方法により容易に調製できる。例えば、ラット、ウシなどの哺乳動物の腎臓、肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、胎盤などの臓器及び血液細胞などから抽出、精製して得ることができる。また、カゼインキナーゼ２を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、細胞から分離精製してカゼインキナーゼ２を得ることもできる。あるいは公知の遺伝子工学的手法によりカゼインキナーゼ２をコードする遺伝子を大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物または動物細胞等適切な宿主細胞に組み込み、この形質転換体の培養物から目的とする組換えカゼインキナーゼ２を得ることができるので、容易に実施することができる。また、上記した各種免疫測定方法やその他の解析法自体は周知であり、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイでは、ポリスチレン製のマイクロプレートに抗カゼインキナーゼ２抗体を結合させたものに被検検体を注入し、一定時間反応後洗浄し、パーオキシターゼなどで酵素標識した抗カゼインキナーゼ２抗体を添加し再洗浄した後、過酸化水素などの基質およびＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）などの発色剤を加えて発色させる方法がある。また、免疫染色解析法により組織中のカゼインキナーゼ２を検出する方法は、摘出した組織切片にＦＩＴＣ（フルオレッセンス−イソチアネート）などの蛍光物質で標識した抗カゼインキナーゼ２抗体、もしくはパーオキシダーゼなどで酵素標識した抗カゼインキナーゼ２抗体で染色することができる。本発明はこれらの検出系を用いてカゼインキナーゼ２を検出することによって、腎疾患の程度を測定することができ、容易に実施することができる。
さらに、カゼインキナーゼ２の酵素活性の発現を指標とする場合では、蛋白リン酸化解析法、細胞内局在変化解析法などを利用して、または酵素活性解析法を利用して、カゼインキナーゼ２の蛋白質またはカゼインキナーゼ２蛋白質の部分ペプチドに酵素基質を接触させた場合における、カゼインキナーゼ２の蛋白質またはカゼインキナーゼ２蛋白質の部分ペプチドの酵素活性を検出する。上記において、酵素基質としてはカゼインキナーゼ２の蛋白質またはペプチドなどの酵素基質となり得るものであれば何れのものでもよく、通常、カゼインの蛋白質やカゼインキナーゼ２蛋白質の部分ペプチドが用いられる。また、上述のようにカゼインキナーゼ２は種々の方法により得ることができる。例えば、哺乳動物の臓器などから抽出精製して得ること、細胞を培養し分離精製して得ること、あるいは公知の遺伝子工学的手法によりカゼインキナーゼ２をコードする遺伝子を適切な宿主細胞に組み込み、この形質転換体の培養物から組換えカゼインキナーゼ２を得ることができる。こうして得られたカゼインキナーゼ２は、そのアミノ酸配列の一部が欠失、もしくは置換したり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていても、酵素活性を有する限り、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質の阻害活性の確認に使用できる。酵素活性解析法としては、例えば，検体（１０ｎｇ〜０．１ｍｇ蛋白量）に，酵素基質としてペプチドのＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＧｌｕあるいはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（０．２ｍＭ）を緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．２，２５ｍＭ  β−グリセロールホスフェート，５ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭオルソバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰあるいは［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ，０．００２ｍＣｉ）中で３７℃，１０分間インキュベートすればよい．インキュベート後、４０％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた後、反応液の一部をホスホセルロースペーパー（１〜１．５ｃｍ角，Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１など）に分取する。酵素基質であるペプチドのリン酸化は，ホスホセルロースペーパーを０．７５％リン酸で５分間ずつ３回洗浄し、さらにアセトンで５分間洗浄した後、ホスホセルロースペーパー上の３２Ｐの放射活性をシンチレーション（Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ−２，ＮＥＮなど）で測定すればよい（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第９９巻、第３−６頁（１９８３年）に掲載のＲ．Ｒｏｓｋｏｓｋｉの論文など）．この時、３２Ｐの放射活性が高いことは、検体にカゼインキナーゼ２の蛋白質またはカゼインキナーゼ２蛋白質の部分ペプチドの酵素活性の発現が高いことを示している。なお、これらに類似した酵素活性解析法は市販の酵素活性測定キット（カゼインキナーゼ２  キナーゼアッセイ、Ｕｐｓｔａｔｅ）を利用することもできるため、容易に実施することができる。
上記のプライマーや抗体などの産生技術および精製する技術は当該分野においてよく知られており、本発明のカゼインキナーゼ２の発現を特徴とする腎疾患の診断方法には、上記の通りカゼインキナーゼ２の遺伝子の発現、蛋白質の発現、酵素活性の発現を検出する方法がある。カゼインキナーゼ２の遺伝子発現を検出するためには、カゼインキナーゼ２遺伝子、それに対するプライマーおよび／またはプローブが利用できる。カゼインキナーゼ２を検出するためには、カゼインキナーゼ２またはその部分ペプチドに対する抗体もしくは抗体の部分、またはカゼインキナーゼ２を特異的に認識する核酸（アプタマー）が利用できる。さらに、カゼインキナーゼ２酵素基質を腎疾患の診断に使用することも包含される。これらの技術を適宜選択することができ、カゼインキナーゼ２の発現の検出のための試薬キットを利用することによって、腎疾患の診断を簡便に実施することができる。故に本発明の腎疾患の診断方法は、上記のカゼインキナーゼ２の発現を指標とする、腎疾患の診断用試薬キット、試薬が提供される。
本発明の腎疾患の診断方法は、上記の各種のヒト腎疾患の診断に広く用いることができるばかりでなく、各種の腎疾患モデル動物に用いることができる。特に糸球体腎炎では多数の症例で免疫機序の関与を示唆する所見が認められており、これに基づきヒト慢性腎炎モデルとしての動物実験モデルの作製が種々研究されて来た。例えば抗糸球体基底膜抗体により誘発する腎疾患動物モデルに好ましく用いることができる。すなわち、本発明の方法により、腎疾患動物モデルが本当に腎疾患に罹患しているか否かのチェックを容易に行うことができる。抗糸球体基底膜抗体誘発による腎疾患動物モデルは、ラットやマウスにウサギより得た抗糸球体基底膜抗血清を投与することにより作製できる。抗糸球体基底膜抗血清は、ラットやマウスの腎皮質から糸球体基底膜を調製し、これをフロインドの完全アジュバントと共にウサギに与え、血清を得ることで調製できる（「新薬開発のための薬効スクリーニング法−最新の動向と実際−Ｖｏｌ．１」、小澤光監修、清至書院、１９８４，Ｐ．１４３）。最も一般的な原発性糸球体腎炎の病態モデルとして広範に利用される。形態上および臨床症候上の分類から原発性糸球体腎炎の中でも、半月体形成性糸球体腎炎および急性進行性糸球体腎炎に最も類似した病態モデルである。病態は、腎機能マーカーの尿中蛋白排泄量や、血中のクレアチニンの濃度、内因性クレアチニン・クリアランスを測定することにより把握できる。クレアチニンは腎臓から全く吸収されないため、腎疾患により糸球体瀘過機能の低下すると、血中のクレアチニンの濃度が増加するので、血中のクレアチニンの濃度やクレアチニン・クリアランスは腎機能のよいマーカーとなる。腎炎誘発後２週目では、血中クレアチニン濃度が正常値の約２倍に上昇し、一般的な糸球体濾過能の低下を伴う腎炎・腎不全の病態を呈する。このような抗糸球体基底膜抗体誘発による腎疾患動物モデルは、ヒト慢性腎炎モデルとして世界的に広く用いられており、鈴木良雄らの方法（日本腎臓学会誌２３巻３２３〜３３１頁  １９８１年）および（日本薬理学会誌７７巻４０７〜４１７頁  １９８１年）により用いることができる。また、本発明薬剤の有用性を確認することもできる。他の腎疾患動物モデルとしては、１）Ｔｈｙ−１モノクローナル抗体や抗胸腺抗体を用いる方法、２）遺伝性ネフローゼラットおよびマウスを用いる方法、３）マウス、ラットでの自然発症糖尿病モデルを用いる方法、４）マウス、ラットにストレプトゾトシンあるいはアロキサンを投与して惹起した糖尿病モデル動物を用いる方法、５）５／６腎臓摘出モデルを用いる方法などが有用である。
以下、実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】  腎臓組織すなわち腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２の発現と、腎疾患の状態との関係を解析した。すなわち、ラットを対象として、腎機能マーカーとして広く用いられている尿中蛋白排泄量を指標として腎疾患の状態を診断するとともに、腎臓組織中でのカゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検出し、腎疾患の状態とカゼインキナーゼ２の発現の関係を解析した。
まず、ラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系、雄性、体重１９０〜２１０ｇ、日本チャールス・リバー株式会社）にウサギの抗糸球体基底膜抗血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内より注射し、腎炎を誘発した。正常群のラットには、正常ウサギ血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内投与した。腎炎誘発後７〜１４日目に、すべてのラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、尿量を測定した後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して、その上清について尿蛋白をＴＰテストワコー（和光純薬）を使用して測定した。さらに、採尿終了後、腎臓を摘出し、腎臓から常法によりＲＮＡを抽出し、ＲＮＡの１μｇより市販の逆転写反応用キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの１μｌずつを鋳型にして、カゼインキナーゼ２αサブユニットのプライマーを用いて市販のＰＣＲ用キット（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲ法を行い増幅した。プライマーは、ラットのカゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の完全長ｃＤＮＡの塩基配列をもとにセンス・プライマー；５’−ａｇａａａｇｃｔｔｃｇｇｃｔａａｔａｇａ−３’、アンチセンス・プライマー；５’−ａｃｔｇａａｇａａａｔｃｃｃｔｇａｃａｔ−３’を作製して用いた。また、ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で４０秒間からなる行程を１サイクルとし、３０サイクル行い、最後に４℃にて終了するようにして行った。増幅したＰＣＲ産物の１０μｌずつをアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行い、カゼインキナーゼ２αサブユニットの遺伝子の発現をそれぞれ測定した。この測定は、カゼンインキナーゼ２の遺伝子の発現を、検出したカゼインキナーゼ２を写真撮影して画像ファイル化し、マッキントッシュ上のソフトウェアＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて数値化することにより行った。なお、カゼインキナーゼ２αサブユニットの遺伝子に関してＰＣＲを行う際には、恒常的に発現している遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）のＧ３ＰＤＨを内部標準として検出し、カゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現の検出結果を補正した。
その結果、図１に示すように、腎疾患状態にある腎臓組織すなわち腎臓を構成する細胞は，正常な腎臓に比べて，カゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現量が顕著に多い。また、腎臓組織すなわち腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２の遺伝子の発現量が多いほど腎疾患の状態は悪く，発現量が適正に近いほど腎疾患の状態は正常に近いことは容易に理解できる。
【実施例２】  カゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現を指標として、腎疾患を診断した。すなわち、ラットを対象として、腎臓組織すなわち腎臓を構成する細胞でのカゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検出し、これを指標として腎疾患を診断した。
まず、ラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系、雄性、体重１９０〜２１０ｇ、日本チャールス・リバー株式会社）にウサギの抗糸球体基底膜抗血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内より注射し、腎炎を誘発した。正常群のラットには、正常ウサギ血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内投与した。腎炎誘発後に、ラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、採尿終了後、腎臓を摘出し、診断対象とする腎臓、および、その対照とする非腎疾患状態の腎臓から常法によりＲＮＡをそれぞれ抽出し、各ＲＮＡの１μｇずつより市販の逆転写反応用キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成した各ｃＤＮＡの１μｌずつを鋳型にして、カゼインキナーゼ２αサブユニットのプライマーを用いて、市販のＰＣＲ用キット（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲ法を行い、これらをそれぞれ増幅した。プライマーは、ラットのカゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の完全長ｃＤＮＡの塩基配列をもとにセンス・プライマー；５’−ａｇａａａｇｃｔｔｃｇｇｃｔａａｔａｇａ−３’、アンチセンス・プライマー；５’−ａｃｔｇａａｇａａａｔｃｃｃｔｇａｃａｔ−３’を作製して用いた。また、ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で４０秒間からなる行程を１サイクルとし、３０サイクル行い、最後に４℃にて終了するようにして行った。増幅した各ＰＣＲ産物の１０μｌずつをアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行い、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現をそれぞれ測定した。この測定は、カゼンインキナーゼ２の遺伝子の発現を、検出したカゼインキナーゼ２を写真撮影して画像ファイル化し、マッキントッシュ上のソフトウェアＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて数値化することにより行った。なお、カゼインキナーゼ２の遺伝子に関してＰＣＲを行う際には、恒常的に発現している遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）のＧ３ＰＤＨを内部標準として検出し、カゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現の検出結果を補正した。
診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現と、その対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現を比較したところ、診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２サブユニット遺伝子の発現は、その陰性対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２αサブユニット遺伝子の発現よりも高かった（表１）。したがって、診断対象とする腎臓は腎疾患状態にあり、特にカゼインキナーゼ２が関与する腎疾患状態と診断された。そこで、これらの診断結果を検証するために、腎疾患状態にあると診断されたラット個体の腎機能マーカーとして広く用いられている尿中蛋白排泄量を測定した。また、その対照とする非腎疾患状態の個体についても同様に測定した。その結果、腎疾患状態にあると診断された個体の尿蛋白は、非腎疾患状態の個体のものよりも明らかに高かった（表２）。よって、本診断法によって腎疾患状態にあると診断された個体は、確かに腎疾患状態にあることが確かめられ、本発明の診断方法が、腎疾患の病態を的確に判定できることが実証された。
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【実施例３】  カゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現を指標として、腎疾患を診断した。すなわち、ラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系、雄性、体重１９０〜２１０ｇ、日本チャールス・リバー株式会社）を対象として、腎臓でのカゼインキナーゼ２のβサブユニット遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検出し、これを指標として腎疾患を診断した。
まず、ラットにウサギの抗糸球体基底膜抗血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内より注射し、腎炎を誘発した。正常群のラットには、正常ウサギ血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内投与した。腎炎誘発後にラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、採尿終了後、腎臓を摘出し、診断対象とする腎臓、および、その対照とする非腎疾患状態の腎臓から常法によりＲＮＡをそれぞれ抽出し、各ＲＮＡの１μｇずつより市販の逆転写反応用キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成した各ｃＤＮＡの１μｌずつを鋳型にして、カゼインキナーゼ２のβサブユニットのプライマーを用いて、市販のＰＣＲ用キット（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲ法を行い、これらをそれぞれ増幅した。プライマーは、ラットのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の完全長ｃＤＮＡの塩基配列をもとにセンス・プライマー；５’−ｃｃｇｃｇｇａｃａｔａａａｇａｔｇａｇｔ−３’、アンチセンス・プライマー；５’−ａａａｃｃａｇｔｇｃｃｇａａｇｔａｔｇｃ−３’を作製して用いた。また、ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で４０秒間からなる行程を１サイクルとし、３０サイクル行い、最後に４℃にて終了するようにして行った。増幅した各ＰＣＲ産物の１０μｌずつをアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行い、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現をそれぞれ測定した。この測定は、カゼンインキナーゼ２の遺伝子の発現を、検出したカゼインキナーゼ２を写真撮影して画像ファイル化し、マッキントッシュ上のソフトウェアＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて数値化することにより行った。なお、カゼインキナーゼ２の遺伝子に関してＰＣＲを行う際には、恒常的に発現している遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）のＧ３ＰＤＨを内部標準として検出し、カゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現の検出結果を補正した。
診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現と、その対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現を比較したところ、診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現は、その陰性対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現よりも高かった（表３）。したがって、診断対象とする腎臓は腎疾患状態にあり、特にカゼインキナーゼ２が関与する腎疾患状態と診断された。そこで、これらの診断結果を検証するために、腎疾患状態にあると診断されたラット個体の腎機能マーカーとして広く用いられている尿中蛋白排泄量を測定した。また、その対照とする非腎疾患状態の個体についても同様に測定した。その結果、腎疾患状態にあると診断された個体の尿蛋白は、非腎疾患状態の個体のものよりも明らかに高かった（表４）。よって、本診断法によって腎疾患状態にあると診断された個体は、確かに腎疾患状態にあることが確かめられ、本発明の診断方法が、腎疾患の病態を的確に判定できることが実証された。
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【実施例４】  カゼインキナーゼ２の発現を指標として，腎疾患を診断した。すなわち，糖尿病性腎症を自然発症する糖尿病ラット（Ｚｕｃｋｅｒ系）を対象として，腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニットの遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検出し，これを指標として糖尿病性腎症を診断した。糖尿病性腎症を自然発症する糖尿病ラット（Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａ系，６ヶ月齢、日本チャールス・リバー株式会社）および、その対照とする糖尿病性腎症を自然発症しないラット（Ｚｕｃｋｅｒ  Ｌｅａｎ系，６ヶ月齢、日本チャールス・リバー株式会社）から血液を採取し、採血終了後に腎臓を摘出した。診断対象とする腎臓、およびその対照とする非腎疾患状態の腎臓から常法によりＲＮＡをそれぞれ抽出し、各ＲＮＡの１μｇずつより市販の逆転写反応用キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成した各ｃＤＮＡの１μｌずつを鋳型にして、カゼインキナーゼ２αサブユニットのプライマーを用いて、市販のＰＣＲ用キット（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲ法を行いこれらをそれぞれ増幅した。プライマーは、ラットのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の完全長ｃＤＮＡの塩基配列をもとにセンス・プライマー；５’−ｃｃｇｃｇｇａｃａｔａａａｇａｔｇａｇｔ−３’、アンチセンス・プライマー；５’−ａａａｃｃａｇｔｇｃｃｇａａｇｔａｔｇｃ−３’を作製して用いた。また、ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で４０秒間からなる行程を１サイクルとし、３０サイクル行い、最後に４℃にて終了するようにして行った。増幅した各ＰＣＲ産物の１０μｌずつをアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行い、カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現をそれぞれ測定した。この測定は、カゼンインキナーゼ２の遺伝子の発現を、検出したカゼインキナーゼ２を写真撮影して画像ファイル化し、マッキントッシュ上のソフトウェアＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて数値化することにより行った。なお、カゼインキナーゼ２の遺伝子に関してＰＣＲを行う際には、恒常的に発現している遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）のＧ３ＰＤＨを内部標準として検出し、カゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現の検出結果を補正した。
診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現と、その対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現を比較したところ，診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現は，その陰性対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニット遺伝子の発現よりも高かった（表５）。したがって，診断対象とする腎臓は腎疾患状態にあり，特にカゼインキナーゼ２が関与する腎疾患状態と診断された。そこで，これらの診断結果を検証するために，腎疾患状態にあると診断されたラット個体の腎機能マーカーとして広く用いられている血中クレアチニン濃度および血中尿素窒素濃度を測定した。また，その対照とする非腎疾患状態の個体についても同様に測定した．その結果，腎疾患状態にあると診断された個体の血中クレアチニン濃度は，非腎疾患状態の個体のものよりも明らかに高かった（表６）。また、腎疾患状態にあると診断された個体の血中尿素窒素濃度は，非腎疾患状態の個体のものよりも明らかに高かった（表６）。よって，本診断法によって腎疾患状態にあると診断された個体は，確かに腎疾患状態にあることが確かめられ，本発明の診断方法が、腎疾患の病態を的確に判定できることが実証された。
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【実施例５】  カゼインキナーゼ２の含有量を指標として，腎疾患を診断した。すなわち，ラットを対象として，腎臓でのカゼインキナーゼ２のαサブユニットおよびβサブユニットの蛋白量をウエスタンブロット法を用いて検出し，これを指標として腎疾患を診断した。
まず、ラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系、雄性、体重１９０〜２１０ｇ、日本チャールス・リバー株式会社）にウサギの抗糸球体基底膜抗血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内より注射し、腎炎を誘発した。正常群のラットには、正常ウサギ血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内投与した。腎炎誘発後にラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、採尿終了後に腎臓を摘出し、診断対象とする腎臓、および、その対照とする非腎疾患状態の腎臓から常法により蛋白質をそれぞれ抽出し、各蛋白質（１ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）を１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ，ＡＴＴＯ）を用いて電気泳動（ＰＡＧＥＲＵＮ，ＡＴＴＯ，４０ｍＡ，８４ｍｉｎ）した。泳動した各蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）にブロット（１００Ｖ、９０ｍｉｎ）した。メンブレンをブロッキング（ブロッキングエース、大日本製薬、４℃、１時間）し、Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄（１０ｍｉｎ）した後、一次抗体としてカゼインキナーゼ２αサブユニットに対する抗体（ヤギ由来、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ，１００倍希釈）あるいはカゼインキナーゼ２βサブユニットに対する抗体（ヤギ由来、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ、１００倍希釈）を用いてインキュベート（室温、１時間）した。インキュベート後、Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄（１０ｍｉｎ）した後、二次抗体としでヤギＩｇＧに対するＨＲＰ標識抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ，１０００倍希釈）を用いてインキュベート（室温、１時間）した。インキュベート後、ＥＣＬ試薬（アマシャム）を用いてカゼインキナーゼ２αサブユニットあるいはカゼインキナーゼ２βサブユニットの蛋白量をそれぞれ測定した。この測定は、カゼンインキナーゼ２の蛋白量を、検出したカゼインキナーゼ２を写真撮影して画像ファイル化し、マッキントッシュ上のソフトウェアＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて数値化することにより行った。
診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２αサブユニットの蛋白量と，その対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２αサブユニットの蛋白量を比較したところ，診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２αサブユニットの蛋白量は，その陰性対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２αサブユニットの蛋白量よりも高かった（表７）。また、診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニットの蛋白量と，その対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニットの蛋白量を比較したところ，診断対象とする腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニットの蛋白量は，その陰性対照とする非腎疾患状態の腎臓でのカゼインキナーゼ２βサブユニットの蛋白量よりも高かった（表８）。したがって，診断対象とする腎臓は腎疾患状態にあり，特にカゼインキナーゼ２が関与する腎疾患状態と診断された。そこで，これらの診断結果を検証するために，腎疾患状態にあると診断されたラット個体の腎機能マーカーとして広く用いられている尿中蛋白排泄量を測定した。また，その対照とする非腎疾患状態の個体についても同様に測定した。その結果，腎疾患状態にあると診断された個体の尿蛋白は，非腎疾患状態の個体のものよりも明らかに高かった（表９）。よって，本診断法によって腎疾患状態にあると診断された個体は，確かに腎疾患状態にあることが確かめられ，本発明の診断方法が、腎疾患の病態を的確に判定できることが実証された。また、腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２の発現量すなわち含有量が多いほど腎疾患の状態は悪く，発現量すなわち含有量が適正に近いほど腎疾患の状態は正常に近いことも容易に理解できる．
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【実施例６】  カゼインキナーゼ２の蛋白量と酵素活性の関係を解析した。すなわち、種々の蛋白量（０、１０あるいは２０ｎｇ蛋白量）のカゼインキナーゼ２（Ｕｐｓｔａｔｅ）を，酵素基質のＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（１０ｎｍｏｌ，０．２ｍＭ，Ｕｐｓｔａｔｅ）を含む緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．２，２５ｍＭ  β−グリセロールホスフェート，５ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭオルソバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ，０．００２ｍＣｉ、アマシャム）０．０５ｍｌ中で３７℃，１０分間インキュベートした。インキュベート後、４０％トリクロロ酢酸０．０２５ｍｌを加えて反応を停止させた後、反応液の一部０．０２５ｍｌをホスホセルロースペーパー（１ｃｍ角）に分取した。ホスホセルロースペーパーを０．７５％リン酸２５ｍｌで５分間ずつ３回洗浄し、さらにアセトン２５ｍｌで５分間洗浄した後、ホスホセルロースペーパー上の３２Ｐの放射活性をシンチレーションで測定した。
その結果、表１０に示すように、カゼインキナーゼ２の蛋白質量が多いほど，カゼインキナーゼ２の酵素活性すなわち機能は高く、カゼインキナーゼ２の蛋白質の発現量すなわち含有量は，カゼインキナーゼ２の酵素活性すなわち機能と極めて密接な関係にあることが容易に理解できる。これらは，カゼインキナーゼ２の遺伝子の発現，蛋白質の発現量すなわち含有量，および酵素活性すなわち機能が高いほど腎疾患の状態は悪く、これらが抑制され適正に近いほど腎疾患の状態は正常に近いこと示している．
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【実施例７】  本実施例は、カゼインキナーゼ２αサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチド投与の腎炎のラットモデルに対する効果を検討し、本発明の有用性を確認するために行なったものである。ラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系、雄性、体重１９０〜２１０ｇ）にウサギの抗糸球体基底膜抗血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内より注射し、腎炎を誘発した。カゼインキナーゼ２αサブユニットの発現を選択的に阻害するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの５’−ＧＴＡＡＴＣＡＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＣＣＣＡ−３’、およびカゼインキナーゼ２αサブユニットの発現を阻害しない陰性対照のセンス・オリゴヌクレオチドの５’−ＴＧＧＧＧＴＡＴＣＡＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’を、カゼインキナーゼ２の阻害のために適当とされる１２μｇ／日の投与量で、ポリエチレンチューブ（ＰＥ−１０）を接続したアルザポンプ（０．２５μｌ／時間、１００２、Ａｌｚｅｔ）を用いて、腎炎誘発前日から７日目まで持続的に腎炎ラットの腎臓組織内に投与した。なお、オリゴヌクレオチドの核酸分子はホスホロチオエート部分を含むＳ−オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするためにカチオン性液体（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いた。すなわち、実験群の構成は、正常群（カゼインキナーゼ２αサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与しない正常ラット、ｎ＝８）、腎炎対照群（カゼインキナーゼ２αサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与しない腎炎ラット、ｎ＝８）、腎炎＋カゼインキナーゼ２αサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチド投与群（本発明群、カゼインキナーゼ２αサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与する腎炎ラット、ｎ＝４）、腎炎＋カゼインキナーゼ２αサブユニットのセンス・オリゴヌクレオチド投与群（陰性対照群、カゼインキナーゼ２αサブユニットのセンス・オリゴヌクレオチドを投与する腎炎ラット）の４群である。誘発後７日目に、すべてのラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、尿量測定後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して、その上清について尿蛋白を定量した。また、採尿終了後に腎臓を摘出し、腎臓組織から常法により蛋白質をそれぞれ抽出し、各蛋白質（１ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）を１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ，ＡＴＴＯ）を用いて電気泳動（ＰＡＧＥＲＵＮ，ＡＴＴＯ，４０ｍＡ，８４ｍｉｎ）した。泳動した各蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）にブロット（１００Ｖ、９０ｍｉｎ）した。メンブレンをブロッキング（ブロッキングエース、大日本製薬、４℃、１時間）し、Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄（１０ｍｉｎ）した後、一次抗体としてカゼインキナーゼ２αサブユニットに対する抗体（ヤギ由来、ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ，１００倍希釈）を用いてインキュベート（室温、１時間）した。インキュベート後、Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄（１０ｍｉｎ）した後、二次抗体としてヤギＩｇＧに対するＨＲＰ標識抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ，１０００倍希釈）を用いてインキュベート（室��、１時間）した。インキュベート後、ＥＣＬ試薬（アマシャム）を用いてカゼインキナーゼ２αサブユニットの蛋白量をそれぞれ測定した。この測定は、カゼンインキナーゼ２の蛋白量を、検出したカゼインキナーゼ２を写真撮影して画像ファイル化し、マッキントッシュ上のソフトウェアＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて数値化することにより行った。
結果を表１１および図２に示した。本発明であるカゼインキナーゼ２αサブユニットのアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、腎臓組織すなわち腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２αサブユニット蛋白質の発現量すなわち含有量を顕著に低下させ（表１１）、腎疾患状態の重要な指標である蛋白尿を有意に低下させた（図２）。他方、陰性対照となるカゼインキナーゼ２αサブユニットのセンス・オリゴヌクレオチドは、腎臓組織中すなわち腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２αサブユニット蛋白質の発現量すなわち含有量を低下させることはなく（表１１）、腎炎ラットの蛋白尿も有意に低下させなかった（図２）。つまり、腎臓組織すなわち腎臓を構成する細胞におけるカゼインキナーゼ２を低下あるいは阻害する手段および物質は，腎疾患の状態を正常に近い状態にさせる作用あるいは効果を有し，腎疾患を治療および予防する作用あるいは効果を有することが一般的に認識できる理論的な説明がなされている。カゼインキナーゼ２のアンチセンス・オリゴヌクレオチド投与群と腎炎対照群間、およびカゼインキナーゼ２のアンチセンス・オリゴヌクレオチド投与群と陰性対照群間に体重の差はなく、また各臓器の障害は何ら認められなかったことから、本アンチセンス・オリゴヌクレオチドが腎疾患の治療剤として安全に用いられることが明らかになった。
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【実施例８】  カゼインキナーゼ２の酵素活性に対する、化合物であるアピゲニンの阻害作用を検討した。すなわち、カゼインキナーゼ２（１０ｎｇ蛋白量、Ｕｐｓｔａｔｅ）を，酵素基質であるＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（１０ｎｍｏｌ，０．２ｍＭ，Ｕｐｓｔａｔｅ）とともに、０．１から１００μＭまでの濃度範囲のアピゲニンを含む緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．２，２５ｍＭ  β−グリセロールホスフェート  ５ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭオルソバナジウム酸ナトリウム，１ｍＭジチオスレイトール，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ，０．００２ｍＣｉ、アマシャム）０．０５ｍｌ中で３７℃，１０分間インキュベートした．インキュベート後、４０％トリクロロ酢酸０．０２５ｍｌを加えて反応を停止させた後、反応液の一部０．０２５ｍｌをホスホセルロースペーパー（１ｃｍ角）に分取した。ホスホセルロースペーパーを０．７５％リン酸２５ｍｌで５分間ずつ３回洗浄し、さらにアセトン２５ｍｌで５分間洗浄した後、ホスホセルロースペーパー上の３２Ｐの放射活性をシンチレーションで測定した。アピゲニンを含まない緩衝液中で測定した３２Ｐの放射活性を１００％とした場合の、各濃度の阻害物質を含む緩衝液中で測定した３２Ｐの放射活性の割合をそれぞれ％で表し、これによりアピゲニンの、カゼインキナーゼ２の機能的活性又は効果に対する効果を決定した。
その結果、アピゲニンは１０μＭの濃度でカゼインキナーゼ２の酵素活性を２５％阻害し、１００μＭの濃度で７５％阻害した（図３）。したがって、アピゲニンは、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質として好ましいことがわかる。
【実施例９】  本実施例は、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質として好ましいアピゲニンを用いて、腎炎のラットモデルにおけるカゼインキナーゼ２阻害剤投与の効果を検討し、本発明の有用性を一層確認するために行なったものである。
ラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系、雄性、体重１９０〜２１０ｇ、日本チャールス・リバー株式会社）にウサギの抗糸球体基底膜抗血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内より注射し、腎炎を誘発した。正常群のラットには、正常ウサギ血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内投与した。カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する物質として好ましいカゼインキナーゼ２阻害剤のアピゲニンを、カゼインキナーゼ阻害のために適当とされる体重１ｋｇあたり２０ｍｇの投与量で，腎炎誘発後１日目から１４日目まで連日１日１回，腎炎ラットに腹腔内投与した。投与したアピゲニン溶液の組成は、アピゲニンを、ジメチルスルホキシドと０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース・ナトリウムの１：４の割合の混合液であった。カゼインキナーゼ２阻害剤を投与しないラットには、溶媒のみを腹腔内投与した。すなわち、実験群の構成は、正常群（カゼインキナーゼ２阻害剤を投与しない正常ラット、ｎ＝５）、腎炎対照群（カゼインキナーゼ２阻害剤を投与しない腎炎ラット、ｎ＝５）および、腎炎＋カゼインキナーゼ２阻害剤投与群（本発明群、カゼインキナーゼ２阻害剤を投与する腎炎ラット、ｎ＝５）の３群である。誘発後７日目にすべてのラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、尿量測定後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して、その上清について尿蛋白をＴＰテストワコー（和光純薬）を使用して定量した。
結果を図４に示した。本発明のカゼインキナーゼ２阻害剤は腎疾患の重要な指標である蛋白尿を有意に低下させ、腎疾患の状態をほぼ正常化させた。つまり、腎疾患状態にある腎臓に対して、化合物を用いてカゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害すれば，腎疾患の状態を正常に近い状態にさせる作用あるいは効果を有し，腎疾患を治療および予防する作用あるいは効果を有することが示されている。言い換えれば、腎疾患状態にある腎臓に対して、カゼインキナーゼ２を阻害する機能を有する物質は，腎疾患の状態を正常に近い状態にさせる作用あるいは効果を有し，腎疾患を治療および予防する作用あるいは効果を有することが示されている。すなわち、一般にカゼインキナーゼ２を阻害する作用を有する手段および物質は腎疾患を治療および予防する作用を有することが明らかである。カゼインキナーゼ２阻害剤を投与することにより、腎疾患が治療できることを示している。カゼインキナーゼ２の阻害剤投与群と腎炎対照群間に体重の差はなく、また各臓器の障害は何ら認められなかったことから、本化合物が腎疾患の治療剤として安全に用いられることが明らかになった。
【実施例１０】  本実施例は、本発明の有用性をさらに一層確認するために行なったものである。種々の薬理作用が知られているが、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する作用も有するとして知られている３−メチル−１，６，８−トリヒドロキシアントラキノン（Ｂａｔｔｉｓｔｕｔｔａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００，２７５（３８）：２９６１８−２２）を用いて、腎炎のラットモデルにおけるカゼインキナーゼ２阻害剤投与の効果を検討した。
ラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系、雄性、体重１９０〜２１０ｇ、日本チャールス・リバー株式会社）にウサギの抗糸球体基底膜抗血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内より注射し、腎炎を誘発した。正常群のラットには、正常ウサギ血清（０．３ｍｌ／ｋｇ）を静脈内投与した。３−メチル−１，６，８−トリヒドロキシアントラキノン（Ｂａｔｔｉｓｔｕｔｔａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００，２７５（３８）：２９６１８−２２）を、カゼインキナーゼ阻害のために適当とされる体重１ｋｇあたり２０ｍｇの投与量で、腎炎誘発後１日目から１４日目まで連日１日１回、腎炎ラットに腹腔内投与した。投与した３−メチル−１，６，８−トリヒドロキシアントラキノン溶液の組成は、３−メチル−１，６，８−トリヒドロキシアントラキノンを、ジメチルスルホキシドと０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース・ナトリウムの１：４の割合の混合液であった。カゼインキナーゼ２阻害剤を投与しないラットには、溶媒のみを腹腔内投与した。すなわち、実験群の構成は、正常群（カゼインキナーゼ２阻害剤を投与しない正常ラット、ｎ＝５）、腎炎対照群（カゼインキナーゼ２阻害剤を投与しない腎炎ラット、ｎ＝５）および、腎炎＋カゼインキナーゼ２阻害剤投与群（本発明群、カゼインキナーゼ２阻害剤を投与する腎炎ラット、ｎ＝５）の３群である。誘発後７日目にすべてのラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、尿量測定後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して、その上清について尿蛋白をＴＰテストワコー（和光純薬）を使用して定量した。誘発後１４日目に、ラットを代謝ケージに入れ２４時間分の尿を採取し、尿量測定後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して、その上清について尿中のクレアチニン濃度をクレアチニンテストワコー（和光純薬）を使用して測定した。さらに、採尿終了後、尾静脈より採血し、採血した血液は３０００ｒｐｍ，１５分間遠心後、血清について血中のクレアチニン濃度をクレアチニンテストワコー（和光純薬）を使用して定量した。尿中のクレアチニン濃度と血中のクレアチニン濃度からクレアチニン・クリアランスを算出した。また、腎を摘出し、１０％緩衝ホルマリンにて固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製して鏡検した。
結果を図５、６および７に示した。種々の薬理作用が知られているが、カゼインキナーゼ２の酵素活性を阻害する作用も有するとして知られている３−メチル−１，６，８−トリヒドロキシアントラキノンは腎疾患の重要な指標である蛋白尿を有意に低下させるとともに、血中のクレアチニン濃度、クレアチニン・クリアランスをほぼ正常化させた。腎組織病理所見においても、３−メチル−１，６，８−トリヒドロキシアントラキノン投与群では腎炎対照群に比して、糸球体および尿細管間質の改善が認められた。つまり、カゼインキナーゼ２阻害剤を投与することにより、腎疾患が治療できることを示している。
【産業上の利用可能性】  本発明の腎疾患治療又は予防剤は、腎疾患の治療又は予防に用いることができる。また、本発明の診断（検出）方法によれば、腎疾患を的確かつ簡便に診断（検出）することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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