(57)【要約】Ｔｈ２サイトカイン遺伝子クラスター内に存在する低親和性ＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３の結合を阻害して、Ｔｈ２サイトカインの安定かつ十分な発現に必要なクロマチンリモデリングを抑制することにより、Ｔｈ２サイトカインの産生を特異的に抑制し得るＧＡＴＡ３デコイ、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質、およびこれらを含む医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するためのＧＡＴＡ３デコイ。
【請求項２】
Ｔ細胞においてＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害することによりＴｈ２サイトカイン遺伝子クラスターを含有する部分におけるクロマチンリモデリングを抑制して１種以上のＴｈ２サイトカインの産生を抑制することを特徴とする、請求項１記載のＧＡＴＡ３デコイ。
【請求項３】
ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合は阻害しないことを特徴とする、請求項２記載のＧＡＴＡ３デコイ。
【請求項４】
ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合を、ＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないことを特徴とする、請求項２記載のＧＡＴＡ３デコイ。
【請求項５】
ＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を特異的に阻害する、請求項１記載のＧＡＴＡ３デコイ。
【請求項６】
配列番号３、４、５もしくは６に示す配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３デコイ。
【請求項７】
Ｔ細胞においてＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害するのに有効であり、かつＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合を、ＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないような濃度で投与し得ることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３デコイ。
【請求項８】
以下の：
ａ）野生型のＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列におけるＣフィンガー領域内のアミノ酸配列は保存されている、または、
ｂ）野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるＣフィンガー領域内のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＨＳＳ２配列への結合能を保持している、
という特徴のいずれかを有している、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項９】
野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内に１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換または挿入を有しており、ＧＡＴＡ３蛋白質のクロマチンリモデリング誘導能を消失している、請求項８記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１０】
野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少なくとも１０残基以上のアミノ酸を欠失している、請求項９記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１１】
野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるＮフィンガー領域内に１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換または挿入をさらに有し、ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むＤＮＡへの結合能を消失している、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１２】
野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるＮフィンガー領域内の少なくとも１残基以上のアミノ酸を欠失している、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１３】
野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少なくとも１０残基以上のアミノ酸とＮフィンガー領域内の少なくとも１残基以上のアミノ酸とを欠失している、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１４】
配列番号１に示すマウス野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列において第２９位〜第１６８位までのアミノ酸を欠失している、マウスＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１５】
配列番号２に示すヒト野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列において第２９位〜第１６９位までのアミノ酸を欠失している、ヒトＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１６】
配列番号１に示すマウス野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列においてＮフィンガー領域内の少なくとも第２８０位〜第２８７位アミノ酸をさらに欠失している、請求項１４記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１７】
配列番号２に示すヒト野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列においてＮフィンガー領域内の少なくとも第２８１位〜第２８８位までのアミノ酸をさらに欠失している、請求項１５記載のヒトＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１８】
ＨＳＳ２配列への結合能を有するが、Ｔ細胞においてＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得る、請求項８〜１７のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項１９】
ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むＤＮＡへの結合能を消失していることを特徴とする、請求項１８記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体。
【請求項２０】
請求項８〜１９のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質をコードする核酸。
【請求項２１】
請求項２０記載の核酸を含有するベクター。
【請求項２２】
発現ベクターである、請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
請求項２１または２２記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２４】
Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための医薬組成物であって、哺乳動物に該薬剤を投与することにより、該薬剤がＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害することによりＴｈ２サイトカイン遺伝子クラスターを含有する部分におけるクロマチンリモデリングを抑制して１種以上のＴｈ２サイトカインの産生を抑制することを特徴とする、上記医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３デコイのうち１種以上を含有する、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項８〜１９のいずれか１項に記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質のうち１種以上を含有する、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２０記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質をコードする核酸のうち１種以上を含有する、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２１または２２に記載のベクターのうち１種以上を含有する、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２９】
Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための薬剤をスクリーニングするための方法であって、
ａ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質またはＨＳＳ２配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とが結合する条件下で、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質またはＨＳＳ２配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とを、試験化合物存在下または非存在下でインキュベートし、
ｂ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質またはＨＳＳ２配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体との結合を検出し、そして、
ｃ）上記結合を阻害し得る試験化合物を特定すること、
を含む、上記方法。
【請求項３０】
以下のステップ；
ｄ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質または遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質と遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とが結合する条件下で、遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体と、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質または遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とを、試験化合物存在下または非存在下でインキュベートし、
ｅ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質または遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質と、遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体との結合を検出し、そして、
ｆ）ステップｅ）で検出される結合を、上記ステップｂ）で検出される結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しない、試験化合物を特定すること、をさらに含む、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患の治療および／または予防薬ならびにＴｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための方法に関する。
背景技術
Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患は、先進国における保健費の支出の大きな部分を占める疾患の１つである。全世界においては、１億５千万人以上の人々が喘息を患っており、喘息治療薬は日本では１年当たり２，３００億円、米国においては７，６００億円の市場を形成している。アレルギー性喘息は、気道の過敏性、気道炎症による気道閉塞を主とする、慢性炎症性肺疾患であり、患者は小児から成人まで幅広く分布し、重積発作は致死を引き起こす病である。この疾患の形態には環境因子に加え、遺伝的素因も関与すると考えられているが、未だにその詳細な発症機序は不明である。
現在の喘息治療薬は、大別すると、１）発作の治療薬として気管支拡張を主目的とするキサンチン誘導体や、β２刺激剤（ステロイド剤を含む）と、２）長期管理薬としての、抗炎症作用を含む抗アレルギー薬である、クロモグリク酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）をはじめとする、化学伝達物質遊離抑制薬、ヒスタミン拮抗薬、トロンボキサン阻害剤、ロイコトリエン拮抗薬などの、二種類が存在する。真の意味での喘息治療薬は、対症療法でなく、疾患の主体となる気道の炎症反応を制御する、アレルギー制御薬であるべきであり、アレルギー発症を予防しうる新しいカテゴリーの治療薬の開発が必要である。現在用いられている薬剤の中で最も有効かつ強力なのは、吸入、内服を主体としたステロイド剤であり、速効性の気道炎症の沈静化と、免疫細胞の活性抑制による強力な抗喘息作用を有するが、その強い副作用から長期間の使用には適さない。現在まで新たに開発されてきた抗アレルギー薬は、発作の引き金となる炎症細胞が産生する化学伝達物質を種々のレベルで阻害するものがほとんどであったが、近年、Ｔｈ２細胞とその産生するサイトカインが、アレルギーの発症の鍵であることが発見（Ｏ’Ｇａｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：２７５、Ｇｌｉｍｃｈｅｒ，Ｌ．Ｈ．，およびＫ．Ｍ．Ｍｕｒｐｈｙ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１６９３、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４５１など参照のこと）されて以来、かかるＩＬ−４，５，１３といったＴｈ２サイトカインの作用を阻害する抗体等が、治療薬として開発され臨床試験が進行中である。しかし、アレルギー疾患の多くは、アレルゲンに繰り返し暴露された結果である場合が多いことからＴｈ２サイトカインそのものを標的としたアレルギー反応の抑制は有効な治療法にはならない可能性がある。
様々な研究グループによるＴｈ２細胞への分化のメカニズム及びそれに関与するファクターについての研究の結果、ＧＡＴＡ３蛋白質がいわゆる転写因子としての機能のみならず、Ｔｈ２細胞への分化およびコミットメントに重要な役割を果たしている事が明らかになった。このプロセスの阻害剤は、ステロイドの離脱が困難な重度の喘息を含むすべてのアレルギー疾患に対する全く新しいタイプの治療薬になりうると考えられる。
ヘルパーＴ細胞は、そのサイトカイン産生のパターンから、少なくとも二つのサブセット、Ｔｈ１およびＴｈ２に分けられる。この現象は当初ｉｎ  ｖｉｖｏでクローン化Ｔ細胞にのみ認められる特徴とも考えられていた。しかしマウスではパラサイトに対する感受性がどちらのサブセットが活性化するかによって決まること、更にヒトではライ病など実際の疾患の予後を左右しうることが示され、これらのサブセットが感染症の予後を決める重要な細胞群であることが認識された。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγやリンホトキシン（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）を産生し、細胞性免疫に関与するといわれ、細菌やウイルスなど細胞内病原体の除去に重要であり、その不適切な活性化は、自己免疫疾患を誘発する。これに対し、Ｔｈ２細胞は、インターロイキン（ＩＬ）−４，５，１３等を産生し、液性免疫に関与し、寄生虫等の駆除の役割になっていると考えられているが、これらの過剰な活性化は、喘息、アトピー性皮膚炎といったアレルギー疾患を引き起こすことが知られている。
近年増加の一途をたどるアレルギー疾患の治療には、新しいメカニズムに基づくＴｈ２細胞の制御が必須である。Ｔｈ２細胞は、抗原刺激によって、ナイーブＴ細胞から分化し、サイトカインＩＬ−４はＴｈ２細胞の分化誘導の主要なサイトカインである。ＩＬ−４のレセプターへの結合は、その下流のシグナル伝達経路ＪＡＫ／ＳＴＡＴを活性化し、最終的にＴｈ２細胞特異的転写因子であるＧＡＴＡ３蛋白質の発現を誘導する。Ｔｈ２サイトカイン遺伝子はヒト第５染色体（マウス第１１染色体）にクラスターを成し、ｑ２３−３１領域の１６０Ｋｂの中にＩＬ−４，ＩＬ−１３，ＩＬ−５をコードする遺伝子が存在する。Ｔｈ２細胞への分化に伴い、Ｔｈ２サイトカイン遺伝子群の転写が一斉に”ＯＮ”になることは、長い間観察されていたが、メカニズムについては、最近になるまで明らかにされなかった。本発明者らは、最近この遺伝子クラスターの中にＴｈ２サイトカイン遺伝子の発現を支配する領域を見出した（Ｔａｋｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，１９８１−１９８５（１９９８），Ｔａｋｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６６８７−６６９１（２０００））。
この領域（ＨＳＳ１，２，３）は、種々の哺乳動物間での塩基配列がよく保存されている１５領域（ＣＮ−１〜１５）の一つであるＣＮＳ−１とよい一致を示し、この部位を欠損させた動物実験では、ＩＬ−４，５，１３の発現が損なわれた。従ってこの領域がグロビン遺伝子でよく研究されているＬｏｃｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＣＲ）様の機能を持つことが明らかになった。本発明者らは、この領域（ＣＮＳ−１／ＨＳＳ１，２）にＧＡＴＡ３蛋白質の認識配列が存在し、実際にＧＡＴＡ３蛋白質が結合することを示した（Ｔａｋｅｍｏｎｏ  ｅｔ．ａｌ．（２０００）前掲）。
発明の開示
本発明は、Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための医薬組成物、特にＧＡＴＡ３デコイ、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質に関する。さらに、本発明は、染色体上のＴｈ２サイトカインの産生に必要なＴｈ２サイトカイン遺伝子クラスターの存在する部位のクロマチンリモデリングを特異的に抑制することを特徴とするＧＡＴＡ３デコイおよびＧＡＴＡ３変異体蛋白質を提供する。また、上記クロマチンリモデリングの抑制をターゲットとする治療および／または予防薬の有用なスクリーニング方法も提供する。
Ｔｈ２細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系で、誘導するためにはナイーブＴ細胞をＩＬ−４の存在下で数回の抗原刺激を繰り返す必要がある。この繰り返し刺激の結果Ｔｈ２細胞は分化の最終段階まで辿り着き、以後、その表現型を変えることはない。これら細胞のコミットメントと呼ばれる現象は、同じ血液系幹細胞から発生した白血球が、分化を終えた後、決して赤血球にかわることはないことに類似している。喘息を初めとするアレルギー疾患で活性化されているＴｈ２細胞は、この最終段階の分化に行き着いているものと考えられ、それら細胞のサイトカイン産生を含む表現型を変えることは不可能であると考えられていた。しかし、前述した、転写因子ＧＡＴＡ３蛋白質は、細胞のクロマチン構造を変えることによって、不可能とされていた細胞の形質を変え、異なるサイトカインを産生させ、Ｔｈ１への再分化誘導が可能であることを本発明者らは発見し報告した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０５，Ｔａｋｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００前掲）。従って、転写因子ＧＡＴＡ３蛋白質のかかる機能を特異的に阻害する低分子化合物や、デコイヌクレオチドは、アレルギーの主体を担う、Ｔｈ２細胞の形質転換を可能にする。これによって、従来の既にある炎症に対する対症療法や、ステロイドなどの免疫細胞を全般的に抑制する薬剤とは異なる新たな治療薬となる可能性が考えられる。
本発明者らは、ナイーブＴ細胞のＴｈ２細胞へのコミットメントに伴う、クロマチンの構造変化には、ＧＡＴＡ３蛋白質のマスターレギュレーターとしての機能が関与しており、これはＧＡＴＡ３蛋白質の特定のドメインが通常のＧＡＴＡ３蛋白質の機能に必要なＤＮＡ配列とは異なる塩基配列を認識することにより生じることを明らかにし、ＧＡＴＡ３蛋白質が新規喘息治療薬のターゲットとなりうる事を見出した。
上記知見に基づき、本発明において、ＧＡＴＡ３蛋白質のマスターレギュレーターとしての機能を発揮する際に結合するＤＮＡ配列（配列番号３にマウスのセンス鎖側の配列を、配列番号６にヒトのセンス鎖側の配列を示している、さらにマウスの配列については図１上段ＨＳＳ２の配列を参照のこと）を特定し、該配列とＧＡＴＡ３蛋白質との結合は、ＩＬ−５遺伝子およびＴＣＲα遺伝子の転写制御領域内にある他のＧＡＴＡ３結合配列とＧＡＴＡ３蛋白質との結合とは異なる結合様式を有していることを明らかにした。即ち、該配列との結合に必要なＧＡＴＡ３蛋白質内の領域と、ＩＬ−５遺伝子およびＴＣＲα遺伝子等のＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内にある他のＧＡＴＡ３結合配列とＧＡＴＡ３蛋白質との結合に必要なＧＡＴＡ３蛋白質内の領域とは異なっており、またこれらの結合親和性も異なっていることがわかった。
以上のことから、本発明は、喘息の治療および／または予防のために有用である以下の第１〜第３０までの態様；
［１］Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するためのＧＡＴＡ３デコイ、
［２］Ｔ細胞においてＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害することによりＴｈ２サイトカイン遺伝子クラスターを含有する部分におけるクロマチンリモデリングを抑制して１種以上のＴｈ２サイトカインの産生を抑制することを特徴とする、上記［１］記載のＧＡＴＡ３デコイ、
［３］ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合は阻害しないことを特徴とする、上記［２］記載のＧＡＴＡ３デコイ、
［４］ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合を、ＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないことを特徴とする、上記［２］記載のＧＡＴＡ３デコイ、
［５］ＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を特異的に阻害する、上記［１］記載のＧＡＴＡ３デコイ、
［６］配列番号３、４、５もしくは６に示す配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を含有する、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３デコイ、
［７］Ｔ細胞においてＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害するのに有効であり、かつＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合を、ＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しないような濃度で投与し得ることを特徴とする、上記［１］〜［６］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３デコイ、
［８］以下の：
ａ）野生型のＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列におけるＣフィンガー領域内のアミノ酸配列は保存されている、または、
ｂ）野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるＣフィンガー領域内のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＨＳＳ２配列への結合能を保持している、
という特徴のいずれかを有している、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［９］野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内に１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換または挿入を有しており、ＧＡＴＡ３蛋白質のクロマチンリモデリング誘導能を消失している、上記［８］記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１０］野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少なくとも１０残基以上のアミノ酸を欠失している、上記［９］記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１１］野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるＮフィンガー領域内に１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換または挿入をさらに有し、ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むＤＮＡへの結合能を消失している、上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１２］野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるＮフィンガー領域内の少なくとも１残基以上のアミノ酸を欠失している、上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１３］野生型のＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列におけるトランス活性化領域内の少なくとも１０残基以上のアミノ酸とＮフィンガー領域内の少なくとも１残基以上のアミノ酸とを欠失している、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１４］配列番号１に示すマウス野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列において第２９位〜第１６８位までのアミノ酸を欠失している、マウスＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１５］配列番号２に示すヒト野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列において第２９位〜第１６９位までのアミノ酸を欠失している、ヒトＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１６］配列番号１に示すマウス野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列においてＮフィンガー領域内の少なくとも第２８０位〜第２８７位までのアミノ酸をさらに欠失している、上記［１４］記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１７］配列番号２に示すヒト野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列においてＮフィンガー領域内の少なくとも第２８１位〜第２８８位までのアミノ酸をさらに欠失している、上記［１５］記載のヒトＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１８］ＨＳＳ２配列への結合能を有するが、Ｔ細胞においてＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得る、上記［８］〜［１７］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［１９］ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むＤＮＡへの結合能を消失していることを特徴とする、上記［１８］記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体、
［２０］上記［８］〜［１９］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質をコードする核酸、
［２１］上記［２０］記載の核酸を含有するベクター、
［２２］発現ベクターである、上記［２１］記載のベクター、
［２３］上記［２１］または［２２］記載のベクターを含有する宿主細胞、
［２４］Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための医薬組成物であって、哺乳動物に該薬剤を投与することにより、該薬剤がＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合を阻害することによりＴｈ２サイトカイン遺伝子クラスターを含有する部分におけるクロマチンリモデリングを抑制して１種以上のＴｈ２サイトカインの産生を抑制することを特徴とする、上記医薬組成物、
［２５］上記［１］〜［７］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３デコイのうち１種以上を含有する、上記［２４］記載の医薬組成物、
［２６］上記［８］〜［１９］のいずれかに記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質のうち１種以上を含有する、上記［２４］記載の医薬組成物、
［２７］上記［２０］記載のＧＡＴＡ３変異体蛋白質をコードする核酸のうち１種以上を含有する、上記［２４］記載の医薬組成物、
［２８］上記［２１］または［２２］に記載のベクターのうち１種以上を含有する、上記［２４］記載の医薬組成物、
［２９］Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための薬剤をスクリーニングするための方法であって、
ａ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質またはＨＳＳ２配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とが結合する条件下で、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質またはＨＳＳ２配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とを、試験化合物存在下または非存在下でインキュベートし、
ｂ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質またはＨＳＳ２配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体との結合を検出し、そして、
ｃ）上記結合を阻害し得る試験化合物を特定すること、
を含む、上記方法、ならびに、
［３０］以下のステップ；
ｄ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質または遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とが結合する条件下で、遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体と、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質または遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質とを、試験化合物存在下または非存在下でインキュベートし、
ｅ）野生型ＧＡＴＡ３蛋白質または遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質と、ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体との結合を検出し、そして、
ｆ）ステップｅ）で検出される結合を、上記ステップｂ）で検出される結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しない、試験化合物を特定すること、をさらに含む、上記［２９］記載の方法、
を包含し得る。
本明細書中に用いる「Ｔｈ２サイトカイン」とは、Ｔｈ２細胞により産生されるインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−５を指す。これらのサイトカインの産生は、Ｔｈ２細胞に特徴的なものであり、Ｔｈ１細胞では認められない。
本明細書中に用いる「Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患」とは上記Ｔｈ２サイトカインの産生が発症メカニズムに関与するアレルギー性疾患を指す。即ち、喘息、アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息、花粉症などがこれに含まれる。
本明細書中に用いる「ＧＡＴＡ３デコイ」という用語は、ＧＡＴＡ３蛋白質のＤＮＡ結合部位を特異的にアンタゴナイズする化合物のあらゆるものを指す。該化合物には核酸および核酸誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ＧＡＴＡ３デコイの好ましい例としては、ＩＬ−５遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば配列番号４に示すマウス由来のオリゴヌクレオチド、またはヒトにおいて該配列に対応するオリゴヌクレオチド）、またはＴＣＲα遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号５に示すマウス由来のオリゴヌクレオチド、またはヒトにおいて該配列に対応するオリゴヌクレオチド）、およびＨＳＳ２配列中にあるＧＡＴＡ３結合配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば配列番号３に示すマウス由来のオリゴヌクレオチド、またはヒトにおいて該配列に対応する配列番号６に示すオリゴヌクレオチド）が挙げられる。後述の実施例において示すように、これらの配列のうち、ＩＬ−５遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば配列番号４に示すオリゴヌクレオチド）、またはＴＣＲα遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば配列番号５に示すオリゴヌクレオチド）は、そのＧＡＴＡ３蛋白質との結合特異性がＨＳＳ２配列中にあるＧＡＴＡ３蛋白質配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合特異性より高いため、ＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合を阻害するためには、低濃度で有効であり得る。即ち、結合親和性の高いＧＡＴＡ３結合配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその誘導体もしくはその修飾物をデコイとして用いて患者に投与した場合、結合親和性の低いＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合の阻害は起こすが、他のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の高親和性結合は、その親和性の高さ故に低親和性のＨＳＳ２配列−ＧＡＴＡ３蛋白質間の結合に比べて阻害を受け難い。したがって、クロマチンリモデリングに必要なＨＳＳ２配列とＧＡＴＡ３蛋白質との結合は、他のＧＡＴＡ３結合配列とＧＡＴＡ３蛋白質との結合に比べて結合親和性が低いという特性により、ＨＳＳ２配列とＧＡＴＡ３蛋白質との結合を選択的に阻害することが可能となり得るデコイ濃度が存在し得る。このような濃度は、当業者であれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの、例えばゲルシフトアッセイなどの技法および培養細胞を用いる一般的な実験手法で容易に推定することができる。
デコイとして用いるオリゴヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、修飾されたヌクレオチドを含んでもよく、さらに他の化合物を含有していてもよい。また、ＧＡＴＡ３蛋白質に対する結合能が消失されない限り、上記オリゴヌクレオチドの配列内に１つ以上の位置に欠失、置換および／または付加などの変異を含んでいてもよい。さらに、一本鎖または二本鎖でもよく、線状でも環状でもよい。より好ましいデコイオリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、１つ以上のＧＡＴＡ３結合配列を含有するものである。なお、配列番号３、４、５および６は、それぞれの配列のセンス鎖を表しており、二本鎖で用いる場合には、それぞれのオリゴヌクレオチドとその相補鎖が結合したものを用いることとする。投与前または投与後の分解を抑制するために、オリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチオホスホジエステル結合を含有するように修飾したものでもよく、またはリン酸ジエステル部分を電荷を持たないメチルホスフェートで置換したものでもよく、アルキル化、アシル化またはその他の化学修飾を施したものでもよい。本発明のＧＡＴＡ３デコイは、常用の化学的または生化学的手法により合成することができる。該デコイが核酸である場合は、あらゆる遺伝子操作技法（制限酵素切断、遺伝子組換え法などを含む）、ＰＣＲ法または核酸合成機を利用して合成可能である。これらは、当業者には容易に実施することができる。
本明細書中に用いるＨＳＳ２配列とは、ゲノム上のＩＬ−４遺伝子とＩＬ−１３遺伝子との間に存在するＣＮＳ−１と呼ばれる領域内に存在するＤＮａｓｅ  Ｉにより切断を受け易いＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性部位（ＨＳＳ２部位）の近傍に存在するＧＡＴＡ３結合配列を含む配列である。例えば、図１上段のＨＳＳ２の欄に示す（そのセンス鎖を配列番号３に示す）配列はマウスのＨＳＳ２配列であり、ヒトのＨＳＳ２配列を配列番号６（センス鎖のみを示している）に示している。該ＨＳＳ２配列がＧＡＴＡ３蛋白質と結合し得、該結合がＴ細胞におけるＴｈ２サイトカインの産生に必要なクロマチンリモデリングに必要であることを見出している。
本明細書中に用いる「ＧＡＴＡ３結合配列」とは、ＧＡＴＡ３蛋白質が特異的に結合するＤＮＡ配列を意味しており、（Ａ／Ｔ）ＧＡＴＡ（Ａ／Ｇ）というＧＡＴＡ３蛋白質結合コンセンサス配列を含有するものである。ＧＡＴＡ３蛋白質は多くの遺伝子に対して作用する転写因子であり、ＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域にはＧＡＴＡ３結合配列が存在し、該配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合が該遺伝子の転写活性化に必要であることは公知である。このような遺伝子の例としては、例えばＩＬ−５遺伝子、ＴＣＲα遺伝子およびＣＤ８などが挙げられるが、これらには限定されない。前記クロマチンリモデリングに必要なＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合もまた、ＨＳＳ２配列中のＧＡＴＡ３結合配列へＧＡＴＡ３蛋白質が結合するものであるが、このＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合は、上述の遺伝子転写制御領域におけるＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合に比べてＧＡＴＡ３蛋白質結合親和性が低く、さらに特定の遺伝子に対する転写活性化を担うものではなく、クロマチンリモデリングによるクロマチン構造の変化のみを担っていると考えられている。したがって、本明細書中では「遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列」という場合には、ＨＳＳ２配列内のＧＡＴＡ３結合配列は含まないこととする。
本明細書中で用いる「クロマチンリモデリング」という用語は、Ｔ細胞において、染色体のＴｈ２サイトカイン遺伝子クラスターを含有する部分にＧＡＴＡ３蛋白質が結合することにより、クロマチンの構造が、Ｔｈ２サイトカインがそれらの遺伝子に特有な転写制御機構により遺伝子の転写が可能な構造へと変化することを指す。即ち、ＧＡＴＡ３蛋白質とゲノム内のＨＳＳ２配列との結合が阻害または抑制されるとクロマチンリモデリングが起こらず、Ｔｈ２サイトカインが安定かつ十分に産生されない。
様々な動物種についてＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列が公知となっている。例えばマウスの野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１、およびヒトの野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示している。これらは保存性が非常に高く、ヒトの第３８位のアミノ酸であるＡｌａがマウスでは欠損しており、第３８位よりＣ末端側のアミノ酸位が１つずつずれている。いずれの種におけるＧＡＴＡ３蛋白質においても、その基本的構造は保存されており、Ｎ末端側に２つのトランス活性化ドメイン、トランス活性化ドメインＩ（ヒトでは第３０〜７４アミノ酸位、マウスでは第３０〜７３アミノ酸位）およびトランス活性化ドメインＩＩ（ヒトでは第１３１〜２１４アミノ酸位、マウスでは第１３０〜２１３アミノ酸位）を含むトランス活性化領域を有し、それよりＣ末端側に２つのジンクフィンガー領域を有している。これらの２つのジンクフィンガー領域はそれぞれ、Ｎ末端に近い方のものをＮフィンガー領域（ヒトでは第２６４〜２８８アミノ酸位、マウスでは第２６３〜２８７アミノ酸位）、Ｃ末端に近い方のものをＣフィンガー領域（Ｃフィンガー：ヒトでは第３０５〜３２６アミノ酸位、マウスでは第３０４〜３２５アミノ酸位）と呼ばれている。これらのジンクフィンガー領域は、それぞれ４個のシステイン残基を含有しており、このシステイン残基のいずれかが欠失、置換されても、その機能を消失し得る。遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合には、Ｎフィンガー領域およびＣフィンガー領域の両方が必要であり、さらに結合後に転写活性化を誘導するためにはトランス活性化領域が必要である。一方、クロマチンリモデリングに必要なＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合には、Ｃフィンガー領域のみが必要であり、Ｎフィンガー領域は必要ではない。すなわち、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質であって、Ｃフィンガー領域内のアミノ酸配列が保存されているか、または１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含んでいてもＨＳＳ２への結合能を保持し得る程度の欠失、置換若しくは付加であるものは、クロマチンリモデリングを誘導し得るため、本発明の範囲に包含される。したがって、Ｎフィンガー領域内に１若しくは複数のアミノ酸残基の欠失、置換または挿入を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を消失し得るが、この欠失、置換または挿入によってはＨＳＳ２配列への結合能は影響されない。ＨＳＳ２配列への結合は可能であるが、遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を消失している好ましいＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、Ｎフィンガー領域内に少なくとも１残基以上、好ましくは５残基以上、より好ましくは８残基以上、さらに好ましくは１０残基以上のアミノ酸配列の欠失、置換または挿入を有しているものである。例えば、実施例において用いるマウスｄｅｌＮ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＩＬ−５およびＴＣＲα遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を消失しているが、ＨＳＳ２配列への結合能は保持しておりクロマチンリモデリングを誘導し得る。
また結合後のクロマチンリモデリングの誘導には、トランス活性化領域が必要であり、この領域に１若しくは複数、（好ましくは１０残基以上）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＧＡＴＡ３結合配列への結合は可能であるが、クロマチンリモデリングを誘導し得ないものが有り得る。ＧＡＴＡ３結合配列への結合は可能であるが、クロマチンリモデリングを誘導し得ない好ましいＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、トランス活性化領域内のアミノ酸配列の少なくとも１残基以上、好ましくは１０残基以上、さらに好ましくは５０残基以上、特に好ましくは１００残基以上に欠失、置換または挿入を有しているものである。例えば、実施例に用いているマウスｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＧＡＴＡ３結合配列への結合能は保持しているが、クロマチンリモデリング誘導能を消失している。
したがって、Ｎフィンガー領域内のアミノ酸配列の少なくとも１残基以上、好ましくは５残基以上、より好ましくは８残基以上、さらに好ましくは１０残基以上に欠失、置換または挿入を有しており、かつトランス活性化領域内のアミノ酸配列の少なくとも１残基以上、好ましくは１０残基以上、さらに好ましくは５０残基以上、特に好ましくは１００残基以上に欠失、置換または挿入を有しているＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を消失しており、さらにＨＳＳ２配列への結合能は保持しているが、クロマチンリモデリング誘導能を消失し得る。このようなＧＡＴＡ３変異体蛋白質を外因的に核内に導入する（遺伝子操作的手法でも蛋白質の注入法によるものでもよい）と、ＨＳＳ２配列に結合して、内因性のＧＡＴＡ３蛋白質のＨＳＳ２配列への結合を阻害するが、クロマチンリモデリングは誘導せず、かつＩＬ−５およびＴＣＲαを含む遺伝子制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列には結合しないため、これらへの内因性のＧＡＴＡ３蛋白質の結合を阻害することがない。即ち、ＧＡＴＡ３蛋白質の機能のうち、クロマチンリモデリングの誘導のみを選択的に阻害し、Ｔｈ２サイトカインの産生を抑制し得る。このようなＧＡＴＡ３変異体蛋白質の例としては、配列番号１に示すマウス野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列のうち、第２９位〜第１６８位までのアミノ酸残基とＮフィンガー領域内の少なくとも第２８０位〜第２８７位（例えば、第２６３位から２８７位）までのアミノ酸残基とを欠失したマウスＧＡＴＡ３変異体蛋白質、および該欠失アミノ酸残基のヒトに対応するアミノ酸残基（即ち、配列番号２に示すヒトＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列の第２９位〜第１６９位までのアミノ酸残基とＮフィンガー領域内の少なくとも第２８１位〜第２８８位（例えば、第２６４位から２８８位）までのアミノ酸残基を欠失したマウスＧＡＴＡ３変異体蛋白質が挙げられる。
上記のＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得るＧＡＴＡ３変異体蛋白質またはその誘導体は、Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患の治療および／または予防のための医薬組成物として利用することができる。したがって、該ＧＡＴＡ３変異体蛋白質を含有する医薬組成物もまた、本発明の範囲に包含される。この場合の「ＧＡＴＡ３変異体蛋白質の誘導体」とは、該ＧＡＴＡ３変異体蛋白質のＨＳＳ２配列への結合能、および遺伝子転写活性化能およびクロマチンリモデリング誘導能のいずれをも変化させることなく、該ＧＡＴＡ３変異体蛋白質に任意の修飾または改変を加えたものを指す。
本発明のＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、すでに報告されているＧＡＴＡ３蛋白質のアミノ酸配列（マウスＧＡＴＡ３蛋白質については配列番号１、およびヒトＧＡＴＡ３蛋白質については配列番号２を参照のこと）を参照すれば、その作製方法は当業者には容易に想到し得る。特定のアミノ酸配列をコードする核酸を作製する常用の技法で作製することができる。この技法には、ＰＣＲ法、種々の突然変異誘発法、制限酵素切断、ＤＮＡリガーゼによる連結などの多様な遺伝子操作技法を適宜利用するとよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）などを参照のこと。例えば、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質アミノ酸配列をコードする核酸は、該当する動物種に由来するｃＤＮＡライブラリーなどからＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法によりクローニングすることもでき、該核酸を上記手法により所望の変異体をコードするように改変するとよい。そうして得られた所望の変異体をコードする核酸を適切な発現ベクターにクローニングして適切な宿主（例えば、大腸菌または哺乳動物細胞など）に形質転換することにより、該変異体を発現させることができる。そして、当業者には、該形質転換細胞から変異体蛋白質を得ることは容易である。したがって、上記核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルスベクターなど）、および該ベクターを含有する宿主細胞もまた、本発明の範囲に包含される。上記変異体をコードする核酸が機能し得る形で連結されている発現ベクターを、Ｔ細胞に送達され得る形態で投与することにより、Ｔ細胞内で該変異体の発現が可能となる。
本発明の「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体を含み、必要に応じて増粘剤、安定剤および／または可溶化剤などの添加剤を含有することができる。そのような担体または添加剤の例としては、ラクトース、クエン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、スクロース、デンプン、タルク、ジェラチン、寒天、植物油、エチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、香料、防腐剤、着色剤、甘味剤なども投与方法に応じて適宜添加される。
「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されているか、または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることを指し、当業者は容易に理解できる。Ｔｈ２サイトカイン関連疾患の治療および／または予防に有効な量を、経口および鼻孔からの吸入もしくは吸引による投与、経口投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内および皮下注射ならびに連続輸液による非経口投与、局所への塗布を含む局所投与を含む（これらに限定はされない）、様々な適切な経路で投与することができる。また、特定の組織または細胞型（本発明の場合は胸腺またはＴ細胞が好ましい）に特異的に送達され得るように送達ビヒクルと共に投与することができる。本発明の医薬組成物を含む製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、リポソーム、錠剤、丸剤、粉末、顆粒、カプセル剤、エアロゾル剤、スプレー剤、軟膏、クリームなど、様々な用途に適した形態とすることができる。また該組成物は、１回または複数回の用量にて、凍結乾燥粉末またはペレットの形態で、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように混合するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水またはバッファーの入ったアンプルと共に提供されることも有り得る。本発明の医薬組成物の治療および／または予防に有効な量は、標準的な臨床技術により医療従事者により判断することができる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは疾患モデル動物などを用いたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを随意に利用して、最適用量範囲の特定に役立てることができる。用いる厳密な用量はまた、投与経路および疾患の重篤度にも依存し、実施者の判断および各患者の症状に応じて決定するべきである。本明細書中に用いる場合「患者」という用語は、あらゆる哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
核酸および／またはその誘導体もしくは修飾物であるＧＡＴＡ３デコイおよび／またはＧＡＴＡ３変異体蛋白質を有効成分として含有する医薬組成物の場合の好ましい剤形には、遺伝子治療に一般的に用いられるリポソームがあるが、これはＳｚｏｋａ，Ｆ．ら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．６０１  ５５９（１９８０））またはＢｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．ら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．４５５  ３２２（１９７６））などを含む多数の文献に記載されている方法で作製することができる。
さらに、本発明は、ＧＡＴＡ３蛋白質とＨＳＳ２配列との結合を阻害し得る化合物を標的として、Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための薬剤をスクリーニングするための方法も包含する。スクリーニングされる化合物は、核酸および蛋白質等の生体に存在する物質も含み、低分子量のもの高分子量のものを問わず、あらゆる物質が含まれる。即ち、本発明のデコイおよびＧＡＴＡ３変異体蛋白質およびこれらの誘導体をスクリーニングすることもできる。該方法において、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とが結合する条件（これは、一般的なゲルシフトアッセイ等に用いる条件でよい。例えばＬｅｅら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２３４３等の文献を参照してもよい）下で、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とを、試験化合物存在下または非存在下でインキュベートして野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体との結合を検出することにより、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とＨＳＳ２配列との結合を阻害し得る試験化合物を特定することができる。上記の方法では、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質の替わりに、ＨＳＳ２配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質（例えば、本明細書中のｄｅｌＴＡまたはｄｅｌＮ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質など、但しこれに限定されるわけではない）を使用してもよい。
また、該方法は、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とＩＬ−５および／またはＴＣＲαなど（これらに限定はされない）のＧＡＴＡ３蛋白質により転写活性化を受ける遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体とが結合する条件下で、該遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含有するｄｓＤＮＡまたはその誘導体と野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とを、試験化合物存在下または非存在下でインキュベートして、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質と該遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列との結合を、阻害しないか、または野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とＨＳＳ２配列との結合を阻害する程度に比べて低い程度でしか阻害しない試験化合物をさらに特定することができ、ＧＡＴＡ３結合配列のうちＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合のみを選択的に阻害する化合物を特定し得る。この段階では、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質の替わりに、遺伝子転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質（例えば、本明細書中のｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質など、但しこれに限定されるわけではない）を使用してもよい。
上記方法に用いるｄｓＤＮＡまたはその誘導体は、放射性、蛍光または化学発光をはじめとする様々な標識化合物で標識すると、検出および上記方法における結合阻害の程度の比較が容易となる。適切な標識化合物の選択および標識化、ならびに結合阻害の程度の比較のための方法は、当業者であれば容易に実施可能である。常用のゲルシフトアッセイ、または固相支持体に結合したＧＡＴＡ３蛋白質を用いる方法など様々な方法で可能である。さらに、ＨＳＳ２配列を含有するｄｓＤＮＡの誘導体としては、上記デコイについての記載で述べたような、誘導体および修飾物が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
本発明をより明確に実証するために下記の実施例を記載するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  野生型ＧＡＴＡ３蛋白質およびＧＡＴＡ３変異体蛋白質をコードする遺伝子の作製
野生型ＧＡＴＡ３蛋白質および種々のＧＡＴＡ３変異体蛋白質を作製した。マウスＧＡＴＡ３蛋白質ｃＤＮＡ、レトロウイルスベクターｐＭＸＩ、哺乳動物細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓは、それぞれ筑波大学の山本教授、東京大学医科学研究所の北村教授、東京医科歯科大学の丸山助教授より分与された。野生型および変異ＧＡＴＡ３ｃＤＮＡを、Ｔ細胞に導入するために、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をバイシストロニックに発現するｐＭＸＩのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位に挿入した。またＣＯＳ細胞で発現させるために、ｐＭＥ１８Ｓの同じくＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ部位に挿入した。
ｄｅｌＴＡ変異体は、転写活性化領域の欠損（第２９〜１６８位のアミノ酸を欠失している）である。この欠損を含むふたつのＰＣＲフラグメントをＧＡＴＡ３蛋白質ｃＤＮＡを鋳型として作成した。その際のプライマーとして、プライマー１：５’−ＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号７）／プライマー２：５’−ＡＣＣＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＧ−３’（配列番号８）およびプライマー３：５’−ＡＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＧＴＣＧＧＣＣＡＧＧ−３’（配列番号９）／プライマー４：５’−ＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＴ−３’（配列番号１０）の組み合わせを用いた。得られたふたつのＰＣＲフラグメントを、プライマー１とプライマー４を用いて増幅することにより結合させた。このＰＣＲフラグメントの塩基配列を決定して確認し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断しｐＭＸＩおよびｐＭＥ１８Ｓに挿入した。
ｄｅｌＮ変異体は、Ｎフィンガーの欠損（第２６３〜２８７位のアミノ酸を欠失している）を持つ。この欠損を含む２つのＰＣＲフラグメントをＧＡＴＡ３  ｃＤＮＡを鋳型として作成した。プライマーとして、プライマー１／プライマー５：５’−ＧＧＴＡＧＡＧＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１１）およびプライマー６：５’−ＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＣＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１２）／プライマー４の組み合わせを用いた。さらにこの２つのＰＣＲフラグメントを、プライマー１とプライマー４を用いて増幅することにより結合させた。このＰＣＲフラグメントの塩基配列を決定することにより確認し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断し、ｐＭＸＩおよびｐＭＥ１８Ｓに挿入した。
ｄｅｌＣ変異体は、Ｃフィンガーの欠損（第３０４〜３２５位のアミノ酸を欠失している）を持つ。この欠損を含むふたつのＰＣＲフラグメントをＧＡＴＡ３ｃＤＮＡを鋳型として作成した。プライマーとして、プライマー１／プライマー７：５’−ＴＴＣＡＴＡＧＴＣＡＧＧＧＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＧＣＴＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号１３）およびプライマー８：５’−ＡＡＧＣＧＡＡＧＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１４）／プライマー４の組み合わせを用いた。さらにこのふたつのＰＣＲフラグメントを、プライマー１とプライマー４を用いて増幅することにより結合させた。このＰＣＲフラグメントの塩基配列を決定することにより確認し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断し、ｐＭＸＩおよびｐＭＥ１８Ｓに挿入した。
以上のように作製したＧＡＴＡ３蛋白質およびＧＡＴＡ３変異体蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをＣＯＳ細胞にて発現させてその細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。それぞれのＧＡＴＡ３変異体蛋白質および野生型ＧＡＴＡ３蛋白質は、予測どおりの分子量の位置に検出された（データは示していない）。
［実施例２］  ＨＳＳ２配列と遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の特異性
ＨＳＳ２配列（ＨＳＳＧＡＴＡ配列）を含むプローブを用いて、ＧＡＴＡ３を発現しているＣＯＳ細胞の細胞抽出液でＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）を行った。その結果を図５に示す。ＨＳＳ２配列を含むプローブに結合する蛋白質複合体は、ラベルされていない同じ配列や遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列（ＴＣＲａＧＡＴＡ配列：Ｔ細胞受容体ａ鎖のエンハンサーのＧＡＴＡ配列）のＤＮＡを過剰に加えることにより、競合阻害がおこり消失した。変異のあるＨＳＳ２配列では阻害がおこらず、特異的な配列を認識していることが判明した。抗ＧＡＴＡ３抗体特異的なスーパーシフトが観察され、複合体の蛋白質はＧＡＴＡ３であることが判明した。
同様に遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列を含むプローブを用いたＥＭＳＡでも、ＧＡＴＡ３の複合体が認められ、ＧＡＴＡ配列を含むＨＳＳ２配列およびプローブと同じ遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列により、競合的に複合体が消失した。変異のあるＨＳＳ２配列では阻害がおこらず、ＧＡＴＡ３の複合体が特異的な配列を認識していることが判明した。
［実施例３］  ＧＡＴＡ３結合配列への結合に必要なＧＡＴＡ３蛋白質の領域の同定
上記実施例１で得られたＣＯＳ細胞で発現させたＧＡＴＡ３変異体蛋白質および野生型ＧＡＴＡ３蛋白質と、ＨＳＳ２配列（図１上段ＨＳＳ２、配列番号３にそのセンス鎖側を示す）、ＧＡＴＡ３結合配列を含むＩＬ−５プロモーター配列（図１上段ＩＬ−５プロモーター、配列番号４にそのセンス鎖側を示す）およびＧＡＴＡ３結合配列を含むＴＣＲαエンハンサー配列（図１上段ＴＣＲαエンハンサー、配列番号５にそのセンス鎖側を示す）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてゲルシフトアッセイを実施した。
ゲルシフトアッセイは、上記合成オリゴヌクレオチド３２Ｐで放射性標識し、定法に従って実施した。その結果を図１に示す。野生型（ＷＴ）ＧＡＴＡ３蛋白質およびｄｅｌＴＡ変異体蛋白質は上記３種のＧＡＴＡ３結合配列に結合したが、ｄｅｌＮ変異体はＨＳＳ２配列にしか結合しなかった。またｄｅｌＣ変異体は上記３種のＧＡＴＡ３結合配列のいずれにも結合しなかった。この結果から、ＨＳＳ２配列以外のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合は、ＧＡＴＡ３蛋白質のＣフィンガー領域とＮフィンガー領域の双方とも必要であることが示唆され、このことはすでに報告されている知見とも一致する。一方、ＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合には、ＧＡＴＡ３蛋白質のＣフィンガー領域が必要であることが示唆され、他のＧＡＴＡ３結合配列への結合とその結合様式が異なっていることが示唆される。
本発明者らのさらなる研究により、ＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合は、ゲルシフトアッセイを用いた親和性測定実験の実験結果から、他のＧＡＴＡ３結合配列への結合と比べて結合親和性が低いことが判った（図６）。この発明者らの知見の他に、ＧＡＴＡ３結合配列のうちで結合親和性が他のＧＡＴＡ３結合配列とは異なっているものは報告されていない。即ち、ＧＡＴＡ３結合配列のうち、クロマチンリモデリングの機序を担っているＨＳＳ２配列のみが低親和性結合配列であることが考えられる。
したがって、高結合親和性を示すＧＡＴＡ３結合配列（例えば、ＩＬ−５プロモーター配列内のもの；配列番号４、およびＴＣＲαエンハンサー配列内のもの；配列番号５など）は、クロマチンリモデリングを担っている、結合親和性の低いＨＳＳ２配列とのＧＡＴＡ３蛋白質の結合を特異的に阻害し、ＨＳＳ２配列以外のＧＡＴＡ３結合配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の高親和性結合は阻害しないＧＡＴＡ３デコイとして、低濃度で有効に用いることができる。
［実施例４］  上記で調製したＧＡＴＡ３蛋白質およびその変異体のクロマチンリモデリングに対する影響
ＧＡＴＡ３蛋白質およびその変異体のクロマチンリモデリングに対する影響をＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性アッセイにて検討した。ＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性アッセイでは、クロマチンリモデリングを起こすことによって、ＤＮａｓｅ  Ｉにゲノム中のその作用部位が露出されるために特定の断片が検出され得るということを利用したアッセイである。
ＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性アッセイは、Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｎ．ら（（１９９８）前掲）に記載の方法にしたがって実施した。フェニックスＥｃｏパッケージング細胞株は東京大学医科学研究所、北村博士より分与された。フェニックスＥｃｏパッケージング細胞株には、リポフェクタミンプラス（ギブコＢＲＬ）を用いてプラスミドを導入した。
ＤＯ１１．１０ＴＣＲαβ−トランスジェニックマウス（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１７２０（１９９０））由来のナイーブＴ細胞をＣＤ４の発現を指標にしてセルソーターにて回収した（Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｎ．らＩｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９８１（１９９８）参照のこと）。得られたナイーブＴ細胞を、ニワトリ卵白アルブミンに由来するペプチド抗原および抗原提示細胞（放射線照射したマウス脾臓細胞）により刺激した。１日後レトロウイルスを感染させるために、レトロウイルスを含む培養上清にポリブレン（０．５μｇ／ｍｌ）を加えたもので、活性化したＴ細胞を培養した。その際、培養プレートを１８００ｒｐｍ、３２℃で１時間遠心した。次の日に、もう一度繰り返した。Ｔｈ１への分化を誘導するＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体存在下に、引き続き培養した。抗原刺激後７日において、ＧＦＰを発現している細胞を、セルソーターを用いて分離した。１週間おきに抗原刺激を加えながら、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体存在下でさらに２週間培養した。
得られた感染ナイーブＴ細胞を０．５％ＮＰ−４０含有ＲＳＢバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に懸濁し、ホモジナイザーで細胞を破壊して細胞溶解液を得て、そこから核を抽出した。得られた核を１×１０７個ずつ１００μｌのＲＳＢバッファーに含有されるように調製し、これに０、５、１０、１５、２０μｇ／ｍｌとなるようにＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を添加して、３７℃で１２分間インキュベートしてＤＮａｓｅ  Ｉを作用させた。２×反応停止バッファー（１％ＳＤＳ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ｐＨ７．４、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を１００μｌ添加して反応を停止させ、反応液を一晩３７℃にて激しく浸透して該液に含まれる蛋白質を分解させた。該溶液より、酢酸アンモニウム沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。該ＤＮＡをＳｃａＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、膜にブロッティングし、さらにα３２ＰＡＴＰ標識化プローブ（ＩＬ−４遺伝子転写開始点の約７．０ｋｂ〜約６．７ｋｂに相当する、ＢａｍＨＩおよびＮｓｐＶとで消化したゲノムＤＮＡ断片）で、一般的なサザンブロット法に用いる条件下でハイブリダイズさせた。結果を図２に示す。ＨＳＳ３切断断片は感染させていない細胞、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質発現細胞、およびいずれのＧＡＴＡ３変異体蛋白質発現細胞のいずれのゲノムＤＮＡからも検出されたが、クロマチンリモデリングを起こしたＴｈ２細胞に特異的なＴｈ２特異的ＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性配列であるＨＳＳ２切断断片およびＨＳＳ１切断断片は、非感染細胞のゲノムＤＮＡでは検出されず、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質を感染発現させた野生型ＧＡＴＡ３蛋白質発現細胞では検出された。さらに、ＧＡＴＡ３変異体蛋白質を感染発現させた細胞については、ｄｅｌＮ変異体発現細胞では野生型ＧＡＴＡ３蛋白質発現細胞と同様、ＨＳＳ２切断断片およびＨＳＳ１切断断片が検出されたのに対して、ｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質およびｄｅｌＣ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質発現細胞ではこれらの断片は共に検出されなかった。この結果は上記実施例２のゲルシフトアッセイの結果から推察された、クロマチンリモデリングを担うＨＳＳ２配列への結合に必要なＧＡＴＡ３蛋白質の部位は、Ｃフィンガー部位であるとの結果と一致する。しかし、ｄｅｌＴＡ変異体発現細胞でＨＳＳ２切断断片およびＨＳＳ１切断断片が検出されなかったということから、ｄｅｌＴＡ変異体は、ＨＳＳ２配列に結合はするものの、クロマチンリモデリングに必要な部位を欠失していることが示唆された。即ち、ｄｅｌＴＡ変異体は、ＧＡＴＡ３蛋白質のＨＳＳ２配列への結合によるクロマチンリモデリングに対して、ドミナントネガティブ変異体として機能し得ることがわかった。
さらに、同様の実験を、ＩＬ−４コード領域に対する３２Ｐ標識化プローブを用いて、それぞれＩＬ−４コード領域内のＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性領域を検出したところ、やはり、ｄｅｌＮ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は野生型ＧＡＴＡ３蛋白質と同様の結果をもたらしたが、ｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質およびｄｅｌＣ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質に認められる作用をしめさなかった（図３）。このことからも、ｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＨＳＳ２配列に結合はするものの、クロマチンリモデリングに必要な部位を欠失していることが示唆された。即ち、ｄｅｌＴＡ変異体は、ＧＡＴＡ３蛋白質のＨＳＳ２配列への結合によるクロマチンリモデリングに対して、ドミナントネガティブ変異体として機能し得ること、およびｄｅｌＣ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＨＳＳ２配列に結合できないためクロマチンリモデリングを誘導し得ないという上記推察が支持される。
［実施例５］  上記で調製したＧＡＴＡ３蛋白質およびその変異体のＴｈ２細胞への分化に対する影響
上記実施例３と同様にして得たナイーブＴ細胞をＩＬ−１１刺激によりＴｈ１細胞へと分化させた（Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｎ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９８１（１９９８）参照のこと）。分化したＴｈ１細胞を、上記実施例３と同様に各ＧＡＴＡ３変異体蛋白質および野生型ＧＡＴＡ３蛋白質のいずれかをコードする上記ウイルスで感染させ、それぞれの感染細胞におけるＩＦＮγ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の細胞内発現量をフローサイトメトリー法にて検出した。上記感染細胞を回収後、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）とイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）で６時間活性化する。細胞を回収する２時間前にモネンシン（２μＭ）を加え培養した。３７℃にて５分間４％パラホルムアルデヒドにて固定化して洗浄した後、０．５％トリトンＸ−１００含有溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０２％  ＮａＮ３、ｐＨ７．５）中に懸濁して氷上にて１０分間静置することにより、細胞膜を透過性にした。抗体の非特異的吸着を阻止するために３％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳでブロッキング（氷上、３０分静置）し、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮγ抗体（ＸＭＧ１．２）、フィコエリチン標識抗ＩＬ−４抗体（１１Ｂ１１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、またはＰＥ標識抗ＩＬ−５抗体（ＴＲＦＫ５；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６０分間染色し、結合していない抗体を洗浄除去した後、フローサイトメトリー解析に供した。その解析結果を図４に示す。図４の右端の列には、ＩＬ−４刺激によりＴｈ２細胞に分化させた細胞を、上記と同様に処理および解析した結果を示している。何も感染させていないＴｈ１に分化した細胞の解析結果（左端）と比較すると、Ｔｈ２細胞では、ＩＦＮγは発現せず、ＩＬ−４およびＩＬ−５が高レベルで発現が認められることがわかる。一方のＴｈ１細胞ではＩＦＮγが高レベルで発現しており、ＩＬ−４およびＩＬ−５はほとんど発現していないことがわかる。またＴｈ１細胞に野生型ＧＡＴＡ３蛋白質を発現させると、Ｔｈ１細胞と比較してＩＦＮγ発現が低減され、さらにＩＬ−４およびＩＬ−５の発現が誘導された。即ち、Ｔｈ１細胞では、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質の発現によりＴｈ２サイトカインの発現が誘導され、その表現型がＴｈ２細胞の表現型へと変化することが見て取れる。
本実験に用いた３４種のＧＡＴＡ３変異体蛋白質のうち、ｄｅｌＮ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＩＦＮγおよびＩＬ−４については野生型ＧＡＴＡ３蛋白質と同様の作用を呈し、Ｔｈ２細胞の表現型へと変化させた。該変異体蛋白質が野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とは異なり、ＩＬ−５を誘導し得ないのは、上述したようにＩＬ−５の十分な発現にはプロモーター配列内のＧＡＴＡ３結合配列にＧＡＴＡ３蛋白質が結合する必要があるので、該変異体蛋白質がプロモーター配列内のＧＡＴＡ３結合配列への結合能を喪失しているせいであると考えられる。一方、ｄｅｌＣ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質およびｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質を発現させても、このような表現型の変化すなわちＩＦＮγ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の発現パターンの変化は認められなかった。上記ゲルシフトアッセイおよび上記ＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性アッセイで得られた結果から、ｄｅｌＣ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質はＨＳＳ２配列に結合し得ないためにクロマチンリモデリングを誘発できないこと、およびｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質はＨＳＳ２配列に結合はするもののクロマチンリモデリングを誘発できないことが判っており、上記フローサイトメトリー解析結果は、クロマチンリモデリングがＴｈ２細胞への分化に必須であることをあらためて実証するものであった。
さらに、データは示していないが、Ｎフィンガー領域を部分的に欠損したＧＡＴＡ３変異体蛋白質（第２８０位から２８８位のアミノ酸残基の欠損した変異体蛋白質）についても、上記全ての実験において試験したところ、ｄｅｌＮ変異体蛋白質と同様の結果が得られた。また、Ｎフィンガー領域内の一つのアミノ酸残基（対応するＧＡＴＡ−１蛋白質の残基がＦＯＧ−１（Ｃｒｉｓｐｉｎｏ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．３：２１９（１９９９））との接触を仲介するために必須である）が置換された変異体（Ｖ２６４Ｇ）は、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質と同様の結果を示した。一方、Ｎフィンガー領域とＣフィンガー領域の間に存在する、第３０４から第３０６位の３つのアミノ酸残基をＡＡＡに置換した変異体は、ＩＬ−５の産生は減少させたが、ＩＦＮγおよびＩＬ−４については野生型ＧＡＴＡ３蛋白質とほぼ同様の結果を示した。さらに、Ｃフィンガー領域を含む第３０９位から３４５位が欠損した変異体も、上記のｄｅｌＣ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質と同様の結果を示した。
以上の結果をまとめると、ｄｅｌＣ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、クロマチンリモデリングに必要なＨＳＳ２配列への結合能を欠失しており、かつＨＳＳ２以外のＧＡＴＡ３結合配列への結合能も欠失している。すなわち、ＧＡＴＡ３蛋白質のＣフィンガー領域がＨＳＳ２配列のみならずあらゆるＧＡＴＡ３結合配列への結合には必須である。ｄｅｌＮ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＨＳＳ２配列への結合能を有しておりかつＴｈ２細胞の表現型への変化を誘導し得ることから、ＧＡＴＡ３蛋白質のＮフィンガー領域はＨＳＳ２配列への結合およびクロマチンリモデリングには関与していないが、ＨＳＳ２以外のＧＡＴＡ３結合配列への結合には必須である。つまり、ＧＡＴＡ３結合配列の中で、ＨＳＳ２配列のみがＧＡＴＡ３蛋白質との結合にＧＡＴＡ３蛋白質のＣフィンガー領域しか必要とせず、他のＧＡＴＡ３結合配列はＣフィンガー領域およびＮフィンガー領域の両方を必要とする。さらに、ｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＨＳＳ２を含む試験した全てのＧＡＴＡ３結合配列に結合はするものの、クロマチンリモデリングを誘導せず、Ｔｈ２細胞の表現型への変化を誘導しない。即ちｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質はクロマチンリモデリングにおけるＧＡＴＡ３蛋白質のドミナントネガティブ変異体となり得る。ｄｅｌＴＡ  ＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、トランス活性化領域の一部を欠失しており、この欠失した領域にＨＳＳ２配列に結合した後のクロマチンリモデリングに対して必要な領域が含まれている。この考察から、トランス活性化領域とＮフィンガー領域との両方に欠失を有するＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、ＨＳＳ２配列に結合は結合するがクロマチンリモデリングは誘導せず、ＨＳＳ２以外のＧＡＴＡ３結合配列には結合し得ないため、クロマチンリモデリング以外のＧＡＴＡ３蛋白質により誘導される細胞内の機構（ＩＬ−５、ＴＣＲαなどの転写活性化等）には影響を与えないＧＡＴＡ３変異体蛋白質となり得、Ｔｈ２細胞の分化のみを特異的かつ効果的に阻害するドミナントネガティブ変異体であることが、当業者には容易に考えられる。
また、他のＧＡＴＡ３結合配列への結合にはＣフィンガーとＮフィンガーの両方が必要であるのに対して、ＨＳＳ２配列へのＧＡＴＡ３蛋白質の結合には、ＧＡＴＡ３蛋白質内のＣフィンガー部位のみしか必要ではなく、この結合は相対的に低親和性であることから、クロマチンリモデリングに関与する低親和性のＧＡＴＡ３蛋白質とＨＳＳ２配列との結合を特異的に阻害し得るデコイとして、結合親和性の高いＧＡＴＡ３結合配列を含むオリゴヌクレオチドが非常に有用であることが示唆された。
［実施例６］  ゲルシフトアッセイを用いた、ＧＡＴＡ３蛋白質のＨＳＳ２配列（ＣＮＳ−１）と遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列（ＴＣＲαエンハンサー配列）への結合親和性の比較
上記実施例１で得られたＣＯＳ細胞で発現させたＧＡＴＡ３野生型ＧＡＴＡ３蛋白質と、ＨＳＳ２配列（図６上段右「ＨＳＳ２」、配列番号３にそのセンス鎖側を示す）、およびＧＡＴＡ３結合配列を含むＴＣＲαエンハンサー配列（図６上段左「ＴＣＲαエンハンサー」、配列番号５にそのセンス鎖側を示す）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてゲルシフトアッセイによる結合の競合阻害実験を実施した。ゲルシフトアッセイは、上記合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐで放射性標識したプローブを用いて、定法に従って実施した（図６）。野生型ＧＡＴＡ３蛋白質を３２Ｐで放射性標識したＧＡＴＡ３結合配列を含むＴＣＲαエンハンサー配列を用いて複合体を形成させ電気泳動により検出した（図６上段左レーン１）。プローブと同じＧＡＴＡ３結合配列を含むＴＣＲαエンハンサー配列を持つ非標識のＤＮＡを、プローブの量の５０倍、１００倍を結合反応液に加えた。またＨＳＳ２配列を持つ非標識のＤＮＡを５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍加えた（図６下段左）。逆にＨＳＳ２配列を３２Ｐで放射性標識したプローブを用いてゲルシフトアッセイをおこない、ＴＣＲαエンハンサー配列を持つ非標識のＤＮＡを５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍（図６上段右）、およびＨＳＳ２配列を持つ非標識のＤＮＡを同じく５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍（図６下段右）加えて結合の競合阻害をおこなった。
その結果、遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列をプローブとしたゲルシフトアッセイでは、同じＨＳＳ２配列以外の配列では５０倍の量で競合阻害されたが、ＨＳＳ２配列では２００倍の量でも完全には阻害されなかった。逆にＨＳＳ２配列をプローブとした場合では、遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列では５０倍の量でほぼ阻害されるのに対して、ＨＳＳ２配列では１００倍の量でも完全には阻害されない。この結果から、ＧＡＴＡ３蛋白質への結合親和性は、ＨＳＳ２配列よりも遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列の方が高いことが判明した。
産業上の利用の可能性
本発明により、Ｔｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための、ＧＡＴＡ３デコイおよびＧＡＴＡ３変異体蛋白質が提供される。本発明の該デコイおよびＧＡＴＡ３変異体蛋白質は、Ｔｈ２サイトカイン遺伝子クラスターにおけるクロマチンリモデリングを選択的に抑制することが可能であり、Ｔｈ２サイトカイン以外のＧＡＴＡ３蛋白質の細胞内機能に影響することなく、効果的にＴｈ２サイトカインの発現を抑制し得る。したがって、これらを有効成分として含有するＴｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患を治療および／または予防するための医薬組成物、ならびにこれを投与することを含むＴｈ２サイトカイン関連アレルギー疾患の治療および／または予防方法は、極めて有効である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す写真及び図である。それぞれのアッセイに用いたＤＮＡを上方に記している。ｄｅｌＮ変異体蛋白質は、ＩＬ−５プロモーターおよびＴＣＲαエンハンサー内のＧＡＴＡ３結合配列には結合するが、ＨＳＳ２内ＧＡＴＡ３結合配列には結合できない。さらに、ｄｅｌＣ変異体蛋白質はいずれのＧＡＴＡ３結合配列にも結合しない。ｄｅｌＴＡ変異体蛋白質は、いずれのＧＡＴＡ３結合配列にも結合する。
図２は、各ＧＡＴＡ３変異体蛋白質を発現させた形質転換Ｔ細胞におけるＩＬ−１３遺伝子とＩＬ−４遺伝子の間の領域についてのＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性アッセイの結果を示す写真及び図である。
図３は、各ＧＡＴＡ３変異体蛋白質を発現させた形質転換Ｔ細胞におけるＩＬ−４遺伝子のコード領域についてのＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性アッセイの結果を示す写真及び図である。
図４は、各ＧＡＴＡ３変異体蛋白質を発現させた形質転換Ｔｈ１細胞における、ＩＦＮγ、ＩＬ−４およびＩＬ−５についてその発現を免疫化学的フローサイトメトリー法により調べた結果を示す図である。ｄｅｌＴＡ変異体およびｄｅｌＣ変異体は、試験した全てのサイトカインについてＴｈ１細胞の同様の発現パターンを示した。しかし、ｄｅｌＮ発現形質転換細胞では、野生型ＧＡＴＡ３蛋白質を発現させた細胞と同様、非感染細胞に比べてＩＦＮγの発現が抑制され、ＩＬ−４の発現が向上し、Ｔｈ２と同様の傾向が見られた。
図５は、ＧＡＴＡ３蛋白質への結合におけるＨＳＳ２配列と遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列との競合実験の結果を示す写真である。図の左は、ＨＳＳ２配列（ＨＳＳＧＡＴＡ配列）を含むプローブを用いて、ＧＡＴＡ３を発現しているＣＯＳ細胞の細胞抽出液でＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）をおこなった結果である。図の右は、遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列（ＴＣＲａＧＡＴＡ配列）を含むプローブを用いて、ＧＡＴＡ３を発現しているＣＯＳ細胞の細胞抽出液でＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）をおこなった結果である。
図６は、ゲルシフトアッセイを用いた、ＧＡＴＡ３蛋白質のＨＳＳ２配列（ＣＮＳ−１）と遺伝子の転写制御領域内のＧＡＴＡ３結合配列（ＴＣＲαエンハンサー配列）への結合親和性の比較を行った結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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