(57)【要約】妊娠成立においては胚と母体とのコミュニケーションそして胚が母体の子宮壁に着床することが許容されることが重要である。この胚と母体とのコミュニケーションを仲介する因子を解明し、それを制御することが可能になれば、不妊症などの障害の治療や予防手段の開発が可能であり、一方では避妊を安全に行う途も開かれる。インターフェロン・ガンマで通常誘起される１０ＫＤａのタンパク質（ＩＰ−１０）として知られていたタンパク質因子が胚の母体への着床時期に免疫過程や胚遊走活性化、胚の子宮壁への着床促進あるいはケモタキシス活性発揮などに関与し、胚が子宮壁に着床するのをコントロールしている因子であることが同定された。これを利用して不妊治療剤、妊娠効率促進剤、着床期に胚を子宮に誘因する剤、胚仔と母体との間の相互作用調整剤などが開発提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたものを有効成分として含有し、
（１）胚遊走活性化剤、（２）胚の子宮壁への着床促進剤、（３）不妊治療剤、（４）妊娠促進剤、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整剤、（６）免疫細胞遊走活性化剤、及び（７）子宮内免疫機能調整剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする医薬及び／又は動物医薬。
【請求項２】
ＩＰ−１０が、ヒト、ウシ、スイギユウ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ブタ、シカ、トナカイ、ヤク、イヌ、ネコ、サルを包含する哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項１記載の医薬及び／又は動物医薬。
【請求項３】
ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたもので、試料を処理し、
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性を得ることを特徴とする方法。
【請求項４】
ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたものを含有し、請求項３記載の方法に使用することを特徴とする試薬。
【請求項５】
ＩＰ−１０活性を測定し、
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性をアッセイすることを特徴とするアッセイ。
【請求項６】
請求項５のアッセイに使用することを特徴とする試薬。
【請求項７】
ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたものをコードする塩基配列を含有する核酸を有効成分として含有し、
（１）胚遊走活性化剤、（２）胚の子宮壁への着床促進剤、（３）不妊治療剤、（４）妊娠促進剤、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整剤、（６）免疫細胞遊走活性化剤、及び（７）子宮内免疫機能調整剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする医薬及び／又は動物医薬。
【請求項８】
（ｉ）配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、少なくともオープンリーディングフレーム部分を有するもの、
（ｉｉ）少なくとも該（ｉ）の配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることのできる塩基配列、
（ｉｉｉ）図２あるいは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち、且つ
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性を有するかあるいは同等の抗原性を包含した、該ＩＰ−１０（例えば、ヒツジＩＰ−１０）と実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードする塩基配列、
から成る群から選ばれた核酸を有効成分として含有し、
（１）胚遊走活性化剤、（２）胚の子宮壁への着床促進剤、（３）不妊治療剤、（４）妊娠促進剤、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整剤、（６）免疫細胞遊走活性化剤、及び（７）子宮内免疫機能調整剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする医薬及び／又は動物医薬。
【請求項９】
（Ａ）タンパク質ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたもの若しくはその塩又は
（Ｂ）（ｉ）配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、少なくともオープンリーディングフレーム部分を有するもの、
（ｉｉ）少なくとも該（ｉ）の配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることのできる塩基配列、
（ｉｉｉ）図２あるいは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち、且つ
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性を有するかあるいは同等の抗原性を包含した、該ＩＰ−１０（例えば、ヒツジＩＰ−１０）と実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードする塩基配列、
から成る群から選ばれた核酸
の生物学的活性、例えば（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物学的活性を促進又は阻害する化合物又はその塩を含有していることを特徴とする医薬。
【請求項１０】
（Ａ）ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたもの若しくはその塩、（Ｂ）前記（Ａ）をコードする核酸及び該核酸を含有するベクターあるいは該核酸又は該ベクターで形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものを使用し、前記ＩＰ−１０又はＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体若しくはその塩又は前記核酸の生物学的活性、例えば（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物学的活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法又はそのためのスクリーニングキット。
【請求項１１】
ＩＰ−１０の産生を亢進し、不妊症の発症及び／又は進展を防ぐ化合物のスクリーニング方法又はスクリーニングキットである請求項１０記載のスクリーニング方法又はスクリーニングキット。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載のスクリーニング方法又はスクリーニングキットを使用してスクリーニングすることにより得られる、ＩＰ−１０産生制御化合物。
【請求項１３】
ＩＰ−１０、該遺伝子又は該ＲＮＡに存在し、ＩＰ−１０の活性又は発現を変化させうる変異部位の存在を検知するためのものであることを特徴とするＩＰ−１０関連疾患用遺伝子診断薬。
【請求項１４】
ＩＰ−１０遺伝子、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡから選ばれたものに存在しうる変異部位を特異的に認識できる制限酵素及びそのアイソシゾマー並びにＩＰ−１０遺伝子、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡから選ばれたものに存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅するために利用されるオリゴヌクレオチドプライマーから成る群から選ばれたものを使用することを特徴とする請求項１３記載の診断薬。
【請求項１５】
工程（ａ）：核酸試料を得る工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅して、ＩＰ−１０遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び
工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について、変異の存在を調べる工程を含むことを特徴とするＩＰ−１０遺伝子関連疾患の遺伝子診断法。
【請求項１６】
被検試料におけるＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量を試験し、ＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量を指標に使用して、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断することを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断方法。
【請求項１７】
被検試料におけるＩＰ−１０タンパク質の存在量を試験し、ＩＰ−１０タンパク質の存在量を指標に使用して、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断することを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断方法。
【請求項１８】
ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含有する組成物であって、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断組成物。
【請求項１９】
（ｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドを備え、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする核酸アレイ。
【請求項２０】
ＩＰ−１０ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅し、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２１】
少なくとも以下の要素：
ＩＰ−１０を認識する抗体
からなるキットであって、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断キット。
【請求項２２】
少なくとも以下の要素：
（ａ）  固相化したＩＰ−１０を認識する抗体；および
（ｂ）  標識化した且つ上記抗体とは異なるエピトープと結合する抗体
からなるキットであって、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断キット。
【請求項２３】
すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料をＩＰ−１０を認識する抗体を固定化した担体と接触する工程；
（ｂ）  該生体試料と接触せしめた固相担体を洗滌する工程；
（ｃ）  該生体試料と接触せしめた固相担体を標識化した且つ上記抗体とは異なるエピトープと結合する抗体と接触する工程；
（ｄ）  固相化された標識あるいは遊離である標識を測定する工程；
（ｅ）  工程（ｄ）で測定された標識量をＩＰ−１０量の指標とし、正常な生体試料の結果と比較する工程；および
（ｆ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０タンパク質存在量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法。
【請求項２４】
すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）  工程（ａ）で調製されたＲＮＡを電気泳動分離する工程；
（ｃ）  工程（ｂ）で分離されたＲＮＡをＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で標識ヌクレオチドプローブとハイブリダイズする工程；
（ｄ）  工程（ｃ）でハイブリダイズしている標識量をＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常な生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特微とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法。
【請求項２５】
すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）  工程（ａ）で調製されたＲＮＡを鋳型にｄＴプライマーを使用して第１鎖ｃＤＮＡを調製する工程；
（ｃ）  工程（ｂ）で調製されたｃＤＮＡを鋳型にＩＰ−１０ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅する工程；
（ｄ）  工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物を電気泳動分離する工程；
（ｅ）  工程（ｄ）で分離されたＰＣＲ産物をＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする標識ヌクレオチドプローブとハイブリダイズする工程；
（ｆ）  工程（ｅ）でハイブリダイズしている標識量をＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常な生体試料の結果と比較する工程；および
（ｇ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法。
【請求項２６】
すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料を組織固定化処理に付す工程；
（ｂ）  工程（ａ）で調製された組織固定化標本を切片とする工程；
（ｃ）  切片化した組織をＩＰ−１０を認識する抗体による免疫組織染色に付す工程；
（ｄ）  被検体の生体試料における免疫組織染色の程度を、健常のもののそれらと比較する工程；および
（ｅ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０タンパク質存在量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法。
【請求項２７】
以下の工程：
（ａ）  ＩＰ−１０ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットを使用して被検体の生体試料をＰＣＲ増幅する工程；
（ｂ）  （ｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドを備えた核酸アレイを使用した分析に被検体の生体試料から分離した核酸分画をかける工程；
（ｃ）  ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと被検体の生体試料から分離した核酸分画とをハイブリダイズする工程
から成る群から選ばれた工程のすくなくとも一つを含み、且つ
被検体の生体試料におけるＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量を試験し、ＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量が健常のもののそれらと比較することを含むことを特徴とする、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を測定する方法。
【請求項２８】
定量的にＩＰ−１０タンパク質存在量又はＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を測定することを特徴とする請求項２３〜２７のいずれか一に記載の、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクを測定する方法。
【請求項２９】
請求項２３〜２７のいずれか一に記載の、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクを測定する方法において使用する、（ｉ）ＩＰ−１０を認識する抗体、（ｉｉ）該抗体（ｉ）とは異なるエピトープと結合する抗体、（ｉｉｉ）固相化した抗体（ｉ）又は（ｉｉ）及び（ｉｖ）標識した抗体（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれか一に記載の抗体を含有することを特徴とする試薬。
【請求項３０】
ＩＰ−１０を認識する抗体を使用し、検体試料中のＩＰ−１０タンパク質量又はＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を測定することを特徴とする以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を測定又は診断する方法。
【請求項３１】
ＩＰ−１０を認識する抗体を含有し、検体試料中のＩＰ−１０タンパク質量又はＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を測定し、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を測定又は診断するためのものであることを特徴とする測定又は診断試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、妊娠現象の着床において胚と母体との間のコミュニケーションを調整制御する因子の利用技術に関する。より具体的には、本発明は、ＩＰ−１０が胚の着床並びにその過程において重要な機能を有することに基礎をおいた技術に関する。
【背景技術】  着床とは胚仔と母体システムとの間で細胞増殖や分化が協調的に進行し、初期胎盤の形成までも含んだプロセスである。反芻動物では、着床期に高い頻度で胚が失われる事態が起こり（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｘｆ．Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．，１２：１４７−１８０（１９９０））、これは胚仔と母体組織との間のコミュニケーションが不成功に終わったためだと考えられている。一旦該コミュニケーションの確立が成功すると、母体システムは生理的にも免疫学的にも胚仔の受容をすることができるようになり、胚仔が付着、浸潤し、その後に胎盤が形成されることとなる。
インターフェロン・タウ（ＩＦＮ−τ；反芻動物における着床前の栄養膜（トロホブラスト）細胞により産生される抗黄体退行活性を持つタンパク質）は、他のインターフェロンと同様に抗ウイルス活性、細胞増殖抑制活性を有し、さらに免疫調整作用を有するのではないかと考えられている。
反芻動物では、成長する胚仔によって産生される主要な胚仔タンパク質であるインターフェロン・タウ（ＩＦＮ−τ）が、母体の妊娠の認識過程に関与している（Ｍａｒｔａｌ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，５６：６３−７２（１９７９）；Ｇｏｄｋｉｎ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，６５：１４１−１５０（１９８２）；Ｉｍａｋａｗａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：３７７−３７９（１９８７）；Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１１５：Ｒ１３−Ｒ１５（１９８７）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１３：４３２−４５２（１９９２））。ヒツジでは胚仔は妊娠の８〜９日目からＩＦＮ−τを産生し始める。１６日目に最高に産生され、その後ＩＦＮ−τの産生は胚仔が母親の子宮内膜に付着し始めるにしたがい低下し始め、２２〜２３日目までには胚仔はＩＦＮ−τを産生しなくなる（Ｇｕｉｌｌｏｍｏｔ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｃｅｌｌ．，６８：２０５−２１１（１９９０）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．，２００：７−１８（１９９２）；Ｆｌｉｎｔ  Ａ．Ｐ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１００：９３−９５（１９９４））。ＩＦＮ−τは黄体の退行を妨げ（エストロゲンレセプターの発現を阻害することにより少なくとも一部を妨げ）、オキシトシンレセプターのエストロゲンによる刺激を防止し、子宮内膜のＰＧＦ２ａｌｐｈａの間歇的な放出を抑制する（Ｆｌｉｎｔ  Ａ．Ｐ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．（Ｓｕｐｐｌ．），４３：１３−２５（１９９１）；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｔ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６：４９３２−４９４４（１９９５）；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｔ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：１１４４−１１４７（１９９６））。さらに、ＩＦＮ−τはリンパ球の分化及びサイトカイン産生を制御しており（リンパ球の分化：Ｎｅｗｔｏｎ  Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：９９−１０７（１９８９）；Ｐｏｎｔｚｅｒ  Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：５３０４−５３０７（１９９１）；Ｓｋｏｐｅｔｓ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，３４：８１−９６（１９９２）；Ａｓｓａｌ−Ｍｅｌｉａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：１４９−６５（１９９３）、サイトカイン産生：Ｔｕｏ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１９：７９−８７（１９９９）；Ｅｍｏｎｄ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６２：１７２８−１７３７（２０００））、ＩＦＮ−τが反芻有蹄動物の着床期の間局所的に免疫調整の過程において重要な役割を果たしていることを示している。
ＩＰ−１０（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０  ｋＤａ）は、主に白血球のサブセットに対するケモタクティック活性を介して炎症応答並びに免疫応答の多くの局面を制御しているケモカインファミリーの一員である。マウス及びヒトにおける研究からＩＰ−１０はＣ−Ｘ−Ｃケモカイン類の一員であり、例えばマクロファージ、線維芽細胞、星状（アストロサイト）細胞、ケラチノサイト細胞、上皮細胞、内皮細胞などを含めた様々なタイプの細胞において誘導されている（Ｌｕｓｔｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：６７２−６７６（１９８５）；Ｏｈｍｏｒｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６８：１２６１−１２６７（１９９０）；Ｓａｕｔｙ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：３５４９−３５５８（１９９９）；Ａｌｂａｎｅｓｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：１３９５−１４０２（２０００）；Ｈｕａｎｇ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１７７：５２−６７（２０００））ことが示されている。ＩＰ−１０はＣ−Ｘ−Ｃ型ケモカインのレセプター３（ＣＸＣＲ３）を介して優先的にＮＫ細胞並びにＴｈ１表現型の活性化されたＴ細胞を標的としている。
【発明の開示】
胚仔（コンセプタス又は受胎産物：胚並びに胚膜を指す）と母体との間の生化学的な情報伝達は着床の成功並びにその後に起こる胎盤形成にとって重要である。特に、反芻動物では、着床期に高い頻度で胚が失われる事態が起こることから、妊娠の成立を制御している因子の解明は、強く求められている。特に、妊娠成立過程において、胚仔側のシグナルに対する母体側の応答因子についての解明が待たれている。
上記妊娠成立過程を制御する因子を解明するため、鋭意研究を進め、特にはヒツジの妊娠と相関しているという特徴を有する分子を決定するための研究の過程で、本発明者等は妊娠１７日目の子宮内膜及び発情周期１５日目の子宮内膜からそれぞれＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡからｃＤＮＡを作出後、ｃＤＮＡサブトラクション解析からインターフェロン・ガンマで誘起される１０  ＫＤａのタンパク質（ＩＰ−１０）を同定するのに成功した。すなわち、妊娠１７日目の雌ヒツジと発情周期１５日目の雌ヒツジの子宮内膜組織の間でのｃＤＮＡサブトラクション解析の結果、インターフェロン・ガンマで誘起される１０ＫＤａのヒツジのタンパク質（ヒツジＩＰ〜１０）（Ｃ−Ｘ−Ｃ型ケモカインファミリーに属し、グルタミン−ロイシン−アルギニン（ＥＬＲ）モチーフを欠いている）が同定された。
さらに、ノーザンブロット分析の結果、妊娠初期の子宮内膜にＩＰ−１０  ｍＲＮＡが相当量見出され、そしてその量は発情周期の子宮内膜におけるよりもかなり多いものであることも見出すことに成功した。そして、ＣＸＣＲ３（ＩＰ−１０のレセプター）ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で検出してみると、妊娠している子宮の内膜では発情周期の状態にある子宮内膜におけるよりも僅かながらその発現が大きいことも見出すことに成功した。
本発明者等は、ＩＦＮ−τ及びＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡ（これらはＩＰ−１０の発現を誘導している可能性がある）の変動についてもノーザンブロット分析及びＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。その結果、ＩＦＮ−τ及びＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡは胚仔や妊娠している子宮の内膜では量的に高レベルであったことも見出した。また、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡは発情周期の状態にある子宮内膜においても検出された。免疫組織化学的解析の結果、ＩＰ−１０とＩＦＮ−γの双方のタンパク質は、子宮の管腔上皮、腺上皮、上皮下間質に局在していた。ＩＰ−１０とＩＦＮ−γの双方のタンパク質は、発情周期の状態にある雌ヒツジにおいてその偏在が認められたが、ＩＰ−１０染色の強度は周期性の状態にある子宮内膜では最小限のものであった。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の結果、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡは妊娠している子宮の上皮下間質に偏在していた。一方、発情周期の状態にある雌ヒツジにおいてはＩＰ−１０  ｍＲＮＡは検出されなかった。単球によるＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現は、用量依存的にＩＦＮ−α，ＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−τによって刺激されたが、ＩＦＮ−τがＩＰ−１０  ｍＲＮＡを増加するのに最も効果が高かった。子宮内膜の細胞片培養実験における解析の結果、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡは低量のＩＦＮ−τによっても刺激された。これらの結果から、妊娠初期の子宮において観察されるヒツジＩＰ−１０の発現はＩＦＮ−τによって誘導されていると考えられる。こうしてＩＦＮ−τとＩＰ−１０との間の相互作用が胚仔と母体組織との間での免疫学的情報伝達の確立に重要なものであるとの認識に至った。同様なことは、ヤギＩＰ−１０に関してもそれを観察することに成功した。本発明者等は、ＩＰ−１０は各種の動物に広くその存在が認められ、その相同性も、例えばヒツジとヒトとの間では、かなりの程度認められることから、ＩＰ−１０を利用した着床制御技術を提供することができるとの認識を有するに至り、本発明を完成せしめた。
代表的には、本発明は、
〔１〕  タンパク質ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたものを有効成分として含有し、
（１）胚遊走活性化剤、（２）胚の子宮壁への着床促進剤、（３）不妊治療剤、（４）妊娠促進剤、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整剤、（６）免疫細胞遊走活性化剤、及び（７）子宮内免疫機能調整剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする医薬及び／又は動物医薬；
〔２〕  ＩＰ−１０が、ヒト、ウシ、スイギユウ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、、ラクダ、ブタ、シカ、トナカイ、ヤク、イヌ、ネコ、サルを包含する哺乳動物由来のものであることを特徴とする上記〔１〕記載の医薬及び／又は動物医薬；
〔３〕  ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたもので、試料を処理し、
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性を得ることを特徴とする方法；
〔４〕  ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたものを含有し、上記〔３〕記載の方法に使用することを特徴とする試薬；
〔５〕  ＩＰ−１０活性を測定し、
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性をアッセイすることを特徴とするアッセイ；
〔６〕  上記〔５〕記載のアッセイに使用することを特徴とする試薬；
〔７〕  ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたものをコードする塩基配列を含有する核酸を有効成分として含有し、
（１）胚遊走活性化剤、（２）胚の子宮壁への着床促進剤、（３）不妊治療剤、（４）妊娠促進剤、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整剤、（６）免疫細胞遊走活性化剤、及び（７）子宮内免疫機能調整剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする医薬及び／又は動物医薬；
〔８〕  （ｉ）配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、少なくともオープンリーディングフレーム部分を有するもの、
（ｉｉ）少なくとも該（ｉ）の配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることのできる塩基配列、
（ｉｉｉ）図２あるいは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち、且つ
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性を有するかあるいは同等の抗原性を包含した、該ＩＰ−１０（例えば、ヒツジＩＰ−１０）と実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードする塩基配列、
から成る群から選ばれた核酸を有効成分として含有し、
（１）胚遊走活性化剤、（２）胚の子宮壁への着床促進剤、（３）不妊治療剤、（４）妊娠促進剤、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整剤、（６）免疫細胞遊走活性化剤、及び（７）子宮内免疫機能調整剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする医薬及び／又は動物医薬；
〔９〕  （Ａ）タンパク質ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたもの若しくはその塩又は
（Ｂ）（ｉ）配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、少なくともオープンリーディングフレーム部分を有するもの、
（ｉｉ）少なくとも該（ｉ）の配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることのできる塩基配列、
（ｉｉｉ）図２あるいは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち、且つ
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性を有するかあるいは同等の抗原性を包含した、該ＩＰ−１０（例えば、ヒツジＩＰ−１０）と実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードする塩基配列、
から成る群から選ばれた核酸
の生物学的活性、例えば（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物学的活性を促進又は阻害する化合物又はその塩を含有していることを特徴とする医薬；
〔１０〕  （Ａ）ＩＰ−１０及びＩＰ−１０において少なくとも１以上のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されているＩＰ−１０類縁体であって全長のＩＰ−１０と実質的に同等又は同一の生物活性を有するＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体から成る群から選ばれたもの若しくはその塩、（Ｂ）前記（Ａ）をコードする核酸及び該核酸を含有するベクターあるいは該核酸又は該ベクターで形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものを使用し、前記ＩＰ−１０又はＩＰ−１０類縁体あるいはＩＰ−１０誘導体若しくはその塩又は前記核酸の生物学的活性、例えば（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物学的活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法又はそのためのスクリーニングキット；
〔１１〕  ＩＰ−１０の産生を亢進し、不妊症の発症及び／又は進展を防ぐ化合物のスクリーニング方法又はスクリーニングキットである上記〔１０〕記載のスクリーニング方法又はスクリーニングキット；
〔１２〕  上記〔１０〕又は〔１１〕記載のスクリーニング方法又はスクリーニングキットを使用してスクリーニングすることにより得られる、ＩＰ−１０産生制御化合物；
〔１３〕  ＩＰ−１０、該遺伝子又は該ＲＮＡに存在し、ＩＰ−１０の活性又は発現を変化させうる変異部位の存在を検知するためのものであることを特徴とするＩＰ−１０関連疾患用遺伝子診断薬；
〔１４〕  ＩＰ−１０遺伝子、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡから選ばれたものに存在しうる変異部位を特異的に認識できる制限酵素及びそのアイソシゾマー並びにＩＰ−１０遺伝子、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡから選ばれたものに存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅するために利用されるオリゴヌクレオチドプライマーから成る群から選ばれたものを使用することを特徴とする上記〔１３〕記載の診断薬；及び
〔１５〕  工程（ａ）：核酸試料を得る工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅して、ＩＰ−１０遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び
工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について、変異の存在を調べる工程を含むことを特徴とするＩＰ−１０遺伝子関連疾患の遺伝子診断法を提供する。
さらなる態様では、本発明は
〔１６〕  被検試料におけるＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量を試験し、ＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量を指標に使用して、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断することを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断方法；
〔１７〕  被検試料におけるＩＰ−１０タンパク質の存在量を試験し、ＩＰ−１０タンパク質の存在量を指標に使用して、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断することを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断方法；
〔１８〕  ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含有する組成物であって、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断組成物；
〔１９〕  （ｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドを備え、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする核酸アレイ；
〔２０〕  ＩＰ−１０ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅し、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とするプライマーセット；
〔２１〕  少なくとも以下の要素：
ＩＰ−１０を認識する抗体
からなるキットであって、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断キット；
〔２２〕  少なくとも以下の要素：
（ａ）  固相化したＩＰ−１０を認識する抗体；および
（ｂ）  標識化した且つ上記抗体とは異なるエピトープと結合する抗体
からなるキットであって、被検体における以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検体における生物活性の判定又は診断キット；
〔２３〕  すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料をＩＰ−１０を認識する抗体を固定化した担体と接触する工程；
（ｂ）  該生体試料と接触せしめた固相担体を洗滌する工程；
（ｃ）  該生体試料と接触せしめた固相担体を標識化した且つ上記抗体とは異なるエピトープと結合する抗体と接触する工程；
（ｄ）  固相化された標識あるいは遊離である標識を測定する工程；
（ｅ）  工程（ｄ）で測定された標識量をＩＰ−１０量の指標とし、正常な生体試料の結果と比較する工程；および
（ｆ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０タンパク質存在量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法；
〔２４〕  すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）  工程（ａ）で調製されたＲＮＡを電気泳動分離する工程；
（ｃ）  工程（ｂ）で分離されたＲＮＡをＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で標識ヌクレオチドプローブとハイブリダイズする工程；
（ｄ）  工程（ｃ）でハイブリダイズしている標識量をＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常な生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法；
〔２５〕  すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料よりＲＮＡを調製する工程；
（ｂ）  工程（ａ）で調製されたＲＮＡを鋳型にｄＴプライマーを使用して第１鎖ｃＤＮＡを調製する工程；
（ｃ）  工程（ｂ）で調製されたｃＤＮＡを鋳型にＩＰ−１０ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅する工程；
（ｄ）  工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物を電気泳動分離する工程；
（ｅ）  工程（ｄ）で分離されたＰＣＲ産物をＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする標識ヌクレオチドプローブとハイブリダイズする工程；
（ｆ）  工程（ｅ）でハイブリダイズしている標識量をＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量の指標とし、正常な生体試料の結果と比較する工程；および
（ｇ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法；
〔２６〕  すくなくとも以下の工程：
（ａ）  被検体の生体試料を組織固定化処理に付す工程；
（ｂ）  工程（ａ）で調製された組織固定化標本を切片とする工程；
（ｃ）  切片化した組織をＩＰ−１０を認識する抗体による免疫組織染色に付す工程；
（ｄ）  被検体の生体試料における免疫組織染色の程度を、健常のもののそれらと比較する工程；および
（ｅ）  正常な生体試料と比較して有意に相違するＩＰ−１０タンパク質存在量を、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定する方法；
〔２７〕  以下の工程：
（ａ）  ＩＰ−１０ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットを使用して被検体の生体試料をＰＣＲ増幅する工程；
（ｂ）  （ｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）ＩＰ−１０ポリヌクレオチドを備えた核酸アレイを使用した分析に被検体の生体試料から分離した核酸分画をかける工程；
（ｃ）  ＩＰ−１０ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと被検体の生体試料から分離した核酸分画とをハイブリダイズする工程
から成る群から選ばれた工程のすくなくとも一つを含み、且つ
被検体の生体試料におけるＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量を試験し、ＩＰ−１０ポリヌクレオチドの存在量が健常のもののそれらと比較することを含むことを特徴とする、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を測定する方法；
〔２８〕  定量的にＩＰ−１０タンパク質存在量又はＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を測定することを特徴とする上記〔２３〕〜〔２７〕のいずれか一に記載の、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクを測定する方法；
〔２９〕  上記〔２３〕〜〔２７〕のいずれか一に記載の、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクを測定する方法において使用する、（ｉ）ＩＰ−１０を認識する抗体、（ｉｉ）該抗体（ｉ）とは異なるエピトープと結合する抗体、（ｉｉｉ）固相化した抗体（ｉ）又は（ｉｉ）及び（ｉｖ）標識した抗体（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれか一に記載の抗体を含有することを特徴とする試薬；
〔３０〕  ＩＰ−１０を認識する抗体を使用し、検体試料中のＩＰ−１０タンパク質量又はＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を測定することを特徴とする以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を測定又は診断する方法；及び
〔３１〕  ＩＰ−１０を認識する抗体を含有し、検体試料中のＩＰ−１０タンパク質量又はＩＰ−１０ポリヌクレオチド発現量を測定し、以下：
（１）胚遊走活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療、（４）妊娠促進、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性化、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又はそのリスクの程度を測定又は診断するためのものであることを特徴とする測定又は診断試薬を提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒツジＩＰ−１０の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を示す。
図２は、ヒツジ、ヤギ、ヒト及びマウスのＩＰ−１０のアミノ酸配列を比較して示した図である。これらの動物の間では、４個のシステイン残基が保存されているが、Ｎ末端側の２個のシステイン残基の前に位置するグルタミン−ロイシン−アルギニン（ＥＬＲ）モチーフはそこには存在していないことがわかる。ヒツジＩＰ−１０は、マウスＩＰ−１０よりヒトＩＰ−１０に対しより高い同一性を示している（表１）。
図３は、着床期のヒツジ子宮におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロット解析して調べた結果を示す電気泳動写真を左側に示す。右側は、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡについてのノーザンブロット解析を濃度解析した結果をグラフで示すものである。
図４は、ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ、Ｇ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡを妊娠ヒツジ子宮につき半定量的ＰＣＲで調べた結果を示す電気泳動写真を左側に示す。右側は、ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡとＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲ産物についての濃度解析した結果をグラフで示すものである。
図５は、着床期の間のヒツジの胚仔と子宮におけるＩＦＮ−τとＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの量を示す。左側（Ａ）は、妊娠ヒツジの胚仔におけるＩＦＮ−τ  ｍＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示す。右側（Ｂ）には、ヒツジ子宮及び胚仔におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡとＧ３ＤＰＨ  ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真が示され、右下側は、濃度解析した結果をグラフで示すものである。
図６は、ヒツジ子宮及び胚仔組織切片におけるＩＰ−１０及びＩＦＮ−γについての免疫組織化学解析の結果を示す生物組織の写真である。図中、ｌｅは管腔上皮、ｇｅは腺上皮、ｓｔは上皮下間質、ｔｒは栄養膜（トロホブラスト）細胞を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
図７は、ヒツジ子宮におけるＩＰ−１０についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析の結果を示す生物組織の写真である。図中、ｌｅは管腔上皮、ｇｅは腺上皮、ｓｔは上皮下間質、ｔｒは栄養膜（トロホブラスト）細胞を示す。スケールバーは写真ａ，ｃ及びｄについては４０μｍ、写真ｂについては１０μｍを示す。
図８は、ＡはＩＦＮ類がＩＰ−１０  ｍＲＮＡの量に及ぼす効果を調べた結果を示す電気泳動の写真である。Ｂは、発情周期中の雌ヒツジからの子宮内膜移植片についてＩＦＮ類がＩＰ−１０  ｍＲＮＡの量に及ぼす効果を調べた結果の電気泳動の写真である。Ｂの左側は、特定の量のＩＦＮ類で刺激した時の子宮内膜移植片でのＩＰ−１０  ｍＲＮＡについてのノーザンブロット解析の結果を示す電気泳動写真である。Ｂの右側は、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡ及びＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡについてのノーザンブロットを濃度解析した結果をグラフで示すものである。Ｃは、ＩＦＮ類により刺激された子宮内膜移植片の培養培地中のＩＰ−１０につきウェスタンブロット解析した結果の電気泳動の写真である。
図９は、ＩＦＮ−τで刺激された子宮内膜培養培地及び組換えＩＰ−１０のＰＢＭＣの移動活性への影響を調べた結果を示す。Ａは組換えヤギＩＰ−１０（ｒｃＩＰ−１０）についてのウェスタンブロットの結果、ＢはＰＢＭＣにおけるＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡのノーザンブロットの結果、ＣはＩＦＮ−τ処理及び非処理子宮内膜培養培地、及びｒｃＩＰ−１０のＰＢＭＣの移動、Ｄは抗ＩＰ−１０抗体の存在下におけるＩＦＮ−τまたはｒｃＩＰ−１０刺激子宮内膜培養培地のＰＢＭＣ移動を示す。
図１０は、組換えヤギＩＰ−１０タンパク質及びそれに対する抗体の作製について調査した結果を示す。Ａは、組換えヤギＩＰ−１０（ｒｃＩＰ−１０）を大腸菌ＢＬ２１−ＳＩで発現し、その細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を示すものである。レーン１は、ニッケルキレートカラムによる精製前のものを、レーン２は、精製後のものを示す。Ｂは、精製ｒｃＩＰ−１０タンパク質のウエスターンブロット分析の結果を示す。レーン１は、抗−Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体の結果、レーン２は、抗−ヤギＩＰ−１０抗体の結果を示す。Ｃの左側は、ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡについてのノーザンブロット分析の結果を示す。ＲＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１−ヤギＣＸＣＲ３により一過性にトランスフェクトされたＫＵ−１細胞から抽出されたもの（ＣＸＣＲ３）或いは親のベクターｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトされたＫＵ−１細胞から抽出された（Ｍｏｃｋ）。Ｃの右側は、ＣＸＣＲ３をトランスフェクトしたＫＵ−１細胞に対するｒｃＩＰ−１０の生物学的活性をケモタキシスアッセイにより調べた結果を示す。○は、ＣＸＣＲ３を発現しているもので、□は、ＣＸＣＲ３を発現していないものである。Ｄは、ｒｃＩＰ−１０を添加したＫＵ−１細胞におけるケモタキシスアッセイの結果を示す。ａｎｔｉ  ＩＰ−１０は、抗−ヤギＩＰ−１０抗体で前処理してある場合を、−は、抗体による処理の一切ない場合を、そしてｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧは、コントロールのウサギＩｇＧで前処理した場合を示している。
図１１は、妊娠初期におけるヤギ子宮内ＩＰ−１０の発現について調査した結果を示す。Ａは、ヤギ胚仔由来の培養培地中のＩＦＮ−τの存在をウエスターンブロット分析した結果を示す。Ｄ１４は、妊娠１４日目ヤギ胚仔由来の培養培地、Ｄ１７は、妊娠１７日目のもの、そしてＤ２０は、妊娠２０日目のものである。Ｂは、子宮内膜ＩＰ−１０  ｍＲＮＡのノーザンブロットの結果を示す。パネル左は、妊娠ヤギからのＲＮＡで、パネル右は、ｒｃＩＦＮ−τで刺激された発情周期ヤギからのＲＮＡである。Ｃの左側は、発情周期及び妊娠のヤギ子宮フラッシング培地中のＩＰ−１０のウエスターンブロット分析の結果を示す。Ｃの右側は、ＩＰ−１０のウエスターンブロットの濃度解析結果を示す。Ｄは、ヤギ子宮におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す。
図１２は、ヤギ胚仔におけるＣＸＣＲ３の発現と細胞内局在について調査した結果を示す。Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによりＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現レベルを調べた結果を示す。Ｂは、ノーザンブロット分析によりＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現を調べた結果を示す。Ｃは、抗−ＣＸＣＲ３抗体を用いてのＣＸＣＲ３発現について、免疫蛍光検査分析した結果を示す。
図１３は、ヤギトロホブラスト細胞へのｒｃＩＰ−１０の結合について調査した結果を示す。Ａは、組換えタンパク質のビオチン化効率を調べた結果を示す。Ｂは、ＩＰ−１０レセプターＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ及びリンフォタクチンレセプターＸＣＲ１  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す。Ｃは、ビオチン化したタンパク質を妊娠１７日目のヤギ胚仔と反応させ、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで可視化した結果を示す。
図１４は、ＣＸＣＲ３を発現している胚仔細胞に対する組換えｃＩＰ−１０の遊走活性刺激について調査した結果を示す。Ａの左側は、ＨＴＳ−１から抽出したＲＮＡのノーザンブロットの結果を示している。Ａの右側は、ＨＴＳ−１のケモタキシスアッセイの結果を示している。Ｂは、ＣＸＣＲ３発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＴＳ−１の遊走活性に対するｒｃＩＰ−１０の作用について調査した結果を示す。Ｃは、妊娠１７日目のＣＸＣＲ３を発現している初代トロホブラスト細胞についてケモタキシスアッセイを行った結果を示す。
図１５は、フィブロネクチン及び子宮内膜上皮細胞へのトロホブラスト細胞の接着性に及ぼすｒｃＩＰ−１０の影響について調査した結果を示す。Ａは、ヤギトロホブラスト細胞（妊娠１７日目）の接着性につき、ｒｃＩＰ−１０で活性化した場合の効果を試験した結果を示す。Ｂは、トロホブラスト細胞のフィブロネクチンへの接着性に及ぼすｒｃＩＰ−１０の作用を調べた結果を示す。Ｃは、ヤギＣＸＣＲ３発現ベクターを導入したＨＴＳ−１細胞について、フィブロネクチンへの接着性に及ぼすｒｃＩＰ−１０の作用を調べた結果を示す。Ｄは、ヤギＣＸＣＲ３発現ベクターを導入したＨＴＳ−１細胞について、子宮内膜上皮細胞に及ぼすｒｃＩＰ−１０の作用を調べた結果を示す。
図１６は、組換えｃＩＰ−１０により活性化されたヤギトロホブラスト細胞におけるインテグリンサブユニットの発現について調査した結果を示す。上側は、ヤギＣＸＣＲ３発現ベクターを導入したＨＴＳ−１細胞について、インテグリンサブユニット：α５、αＶ、β１、β３及びβ５  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す。ＩＰ１０＋Ａｂｓ：組換えｃＩＰ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）＋抗−ＩＰ−１０抗体（３０μｇ／ｍｌ）による前処理、ＩＰ１０：組換えｃＩＰ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）。下側は、ＰＣＲ産物をデンシオメトリック分析した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書において「ＩＰ−１０」とは、インターフェロン・ガンマで誘起される１０  ＫＤａのタンパク質（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０  ｋＤａ，ＩＰ−１０）を指している。本タンパク質因子は、主に白血球のサブセットに対するケモタクティック活性を介して炎症応答並びに免疫応答の多くの局面を制御しているケモカインファミリーの一員であるものを指してよい。ＩＰ−１０は、マウス及びヒトにおける研究からＣ−Ｘ−Ｃケモカイン類の一員であり、例えばマクロファージ、線維芽細胞、星状（アストロサイト）細胞、ケラチノサイト細胞、上皮細胞、内皮細胞などを含めた様々なタイプの細胞において誘導されていることの知られたものであってよい。該ＩＰ−１０はＣ−Ｘ−Ｃ型ケモカインのレセプター３（ＣＸＣＲ３）を介して優先的にＮＫ細胞並びにＴｈ１表現型の活性化されたＴ細胞を標的としているものであってよい。
本発明では、特にヒツジＩＰ−１０を同定して、その特徴的な着床期における活性が認識されることになっていることから、こうした特性という点では有蹄動物のＩＰ−１０のいかなるものを包含しているものであってよい。また、その着床期における活性を利用する観点からは、ヒトＩＰ−１０及びその誘導体、類縁体、等価物などを包含していてよい。
ヒツジＩＰ−１０は、１０２個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、その中には４個のシステイン残基が存在する。当該４個のシステイン残基は、ケモカインファミリーにおいて保存され、その最初の２個のシステイン残基は一個のアミノ酸残基により分けられてＣ−Ｘ−Ｃ型のモチーフを形成していることが認められるが、他の動物のものと同様にヒツジＩＰ−１０は、該最初の２個のシステイン残基よりも前に位置するグルタミン−ロイシン−アルギニン（ＥＬＲ）モチーフを欠いており、ヒトＩＰ−１０と高い類似性、すなわちそれぞれヌクレオチド配列では８２．７％及びアミノ酸配列では７５．５％の相同性を示していることを特徴としている。本発明のヒツジＩＰ−１０を含めたＩＰ−１０は、（１）胚遊走活性、（２）胚の子宮壁への着床促進活性、（３）不妊治療作用、（４）妊娠促進活性、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性を有することが挙げられる。
典型的には、本発明のヒツジＩＰ−１０やヤギＩＰ−１０を含めたＩＰ−１０は、生体内に存在する天然型ペプチド（内在性ペプチドあるいは内因性ペプチド）であってよい。本発明の代表的なＩＰ−１０としては、配列表の配列番号：１のＤＮＡでコードされて産生されるポリペプチド、例えば配列表の配列番号：２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。また、本発明の代表的なＩＰ−１０は、配列表の配列番号：２のアミノ酸配列のうちの少なくとも１〜１０２個の連続したアミノ酸残基を有し且つ（１）胚遊走活性、（２）胚の子宮壁への着床促進活性、（３）不妊治療作用、（４）妊娠促進活性、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性を有するもの、あるいはそれらの特徴を有し且つ配列表の配列番号：２のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％の相同性、より好ましくは７５．５％より大きい相同性、またある場合には８２．７％より大きい相同性、さらに好適には９０％以上の相同性、または９５％以上の相同性を有するものなどが挙げられる。特に好ましくは、新規なものが挙げられる。
本発明の「ポリペプチド」としては、特にはＩＰ−１０及びその関連ポリペプチド、特にはヒツジＩＰ−１０やヤギＩＰ−１０を含めた有蹄動物由来のＩＰ−１０を包含する。該ＩＰ−１０及びその関連ポリペプチドとしては、妊娠に関連して着床期における活性を利用する観点からは、ヒト由来のものが挙げられてよい。例えばヒツジＩＰ−１０が挙げられ、代表的には、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、少なくとも６０％より高い相同性、好ましくは７０％以上の相同性、さらに好ましくは８０％以上の相同性、また好ましくは８５％以上の相同性、もっと好ましくは９０％以上の相同性、より好ましくは９５％以上の相同性、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し且つ（１）胚遊走活性、（２）胚の子宮壁への着床促進活性、（３）不妊治療作用、（４）妊娠促進活性、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた活性あるいは同等の抗原性などといった実質的に同等の生物学的活性を有するアミノ酸配列を有するものがすべて挙げられる。
本発明のＩＰ−１０としては、妊娠に関連して着床期における活性を利用する観点からは、ヒト由来ＩＰ−１０、ヒツジやヤギなどの有蹄動物由来のＩＰ−１０あるいはそこに存在する特徴あるドメインやモチーフあるいはその一部を有し且つ新規なアミノ酸配列を有するものも含まれてよい。より好ましくは、本発明のペプチドとしては、妊娠に関連して着床期における上記したような活性を持つもので、各ＩＰ−１０ファミリーと少なくとも６０％より高い相同性を持つアミノ酸配列を有するものが挙げられる。代表的には、本発明のペプチドは、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたものである。さらに本発明のペプチドとしては、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよい。こうした配列を有するものはすべて包含されてよい。
本明細書中、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同士又は各塩基同士の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である（例えば、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．（Ｅｄ．），Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｉｎ，Ａ．Ｍ．＆  Ｇｒｉｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ：Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．＆  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．（Ｅｄ．），Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ−Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）等）。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ（Ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，（１９９４）；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３（１９９０））等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
本発明で対象とするポリペプチドあるいはタンパク質をコードする核酸は、妊娠に関連して着床期における上記したような活性を利用する観点からは、ＩＰ−１０及びその関連ポリペプチド及びその一部の連続したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するもの、ヒツジやヤギなどの有蹄動物由来のＩＰ−１０及びその関連ポリペプチド及びヒト由来のＩＰ−１０及びその関連ポリペプチド並びにその一部の連続したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するもの、ある代表的な場合には、配列表の配列番号：２で表されるペプチド及びその一部の連続したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するもの、例えば、配列表の配列番号：１で表される塩基配列の少なくとも６３−３６５位により構成される塩基配列を含有するもの、及び配列表の配列番号：１で表される塩基配列の６０−６２位のＡＴＧから３６６−３６８位のＴＡＡより構成される塩基配列を含有するもの（終止コドンＴＡＡは、ＴＧＡまたはＴＡＧであってもよい）であることができるし、塩基配列に開始コドン（Ｍｅｔをコードするコドン）及び終止コドンを付加したもの、また、該塩基配列がコードするタンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち且つ配列表の配列番号：２のアミノ酸配列のうちの少なくとも１〜１６個の連続したアミノ酸残基を有し、尚且つ（１）胚遊走活性、（２）胚の子宮壁への着床促進活性、（３）不妊治療作用、（４）妊娠促進活性、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた活性を有するかあるいは同等の抗原性などのそれと実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードするといったそれと同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該ＩＰ−１０をコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、合成ＤＮＡなどの核酸であり、またヒツジ、ヤギあるいはヒトゲノムＤＮＡ、ヒツジ、ヤギあるいはヒトゲノミックＤＮＡライブラリー、ヒツジあるいはヒト組織・細胞由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれであってもよい。該ＩＰ−１０をコードする核酸の塩基配列は、修飾（例えば、付加、欠失、置換など）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。さらには、以下説明するように、本発明の核酸は、本発明のペプチドあるいはその一部をコードするものであってよく、好ましいものとしてはＤＮＡが挙げられる。また上記「同効の塩基配列」とは、例えばストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件下で配列表の配列番号：１の塩基配列のうちの連続した５個以上の塩基配列、好ましくは１０個以上の塩基配列、より好ましくは１５個以上の塩基配列、さらに好ましくは２０個以上の塩基配列とハイブリダイズし、該ＩＰ−１０と実質的に同等のアミノ酸配列をコードするものなどが挙げられる。ストリンジェントな条件とは、所定のポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミドなど）、温度、およびその他の公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳなどの界面活性剤など）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。一つの好ましい態様としては、例えばナトリウム濃度が約１９〜２０ｍＭで、かつ温度が約６０〜６５℃である条件が好ましく、ナトリウム濃度が約１９ｍＭの濃度で、かつ温度が約６５℃の温度である条件が更に好ましい。
所定の遺伝子産物の確認を、当該遺伝子をトランスフェクションした、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ−１細胞などのそれに適した動物細胞などを用いて行うことができる。この外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例えば、Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，１９７３など）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（例えば、Ｄ．Ｗａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３：３７１，１９６８など）、エレクトロポレーション法（例えば、Ｅ．Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１：８４１，１９８２など）、マイクロインジェクション法、リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法などが挙げられる。こうして所定の遺伝子、例えばＩＰ−１０遺伝子をトランスフェクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物は、それを解析することもできる。
本発明で得られたＤＮＡなど（例えば、ＩＰ−１０遺伝子など）を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等の真核細胞宿主、Ｓｆ２１等の昆虫細胞宿主）中で該ＤＮＡが発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適に修飾されたコドンが含まれていることができるし、制限酵素部位が設けられていることもできるし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに有用な配列（ハイブリドタンパク質や融合タンパク質をコードするものも含む）等を含んでいることができる。好ましくは、適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主とするプラスミドでは、トリプトファンプロモーター（ｔｒｐ）、ラクトースプロモーター（ｌａｃ）、トリプトファン・ラクトースプロモーター（ｔａｃ）、リポプロテインプロモーター（ｌｐｐ）、λファージＰＬプロモーター等を、動物細胞を宿主とするプラスミドでは、ＳＶ４０レートプロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等を、酵母を宿主とするプラスミドでは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０プロモーター等を使用し得る。
大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴＺ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、ｐＡＳ、ｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＭＣ１４０３、ｐＭＣ９３１、ｐＫＣ３０、ｐＲＳＥＴ−Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）なども挙げられる。動物細胞を宿主とするプラスミドとしては、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマ・ウイルスベクター、ワクシニア・ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられ、例えばｐｃＤ、ｐｃＤ−ＳＲα、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＢＣ１２ＢＩ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとしては、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＣｐ型ベクターなどが挙げられ、例えばｐＧＰＤ−２などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌Ｋ１２株に由来するものが挙げられ、例えばＮＭ５３３、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ１１Ｓ、ＤＨ１２Ｓ、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＪＭ１０９、ＳＴＢＬ２、Ｂ８３４株由来としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどが挙げられる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミドリザル線維芽細胞由来のＣＯＳ−７細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＶ−１細胞、マウス線維芽細胞由来のＣＯＰ細胞、ＭＯＰ細胞、ＷＯＰ細胞、チャイニーズ・ハムスター細胞由来のＣＨＯ細胞、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、マウス細胞由来Ｃ１２７細胞、マウス細胞由来ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、カイコ核多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）あるいはそれに由来するものをベクターとし、カイコ幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えばＢＭ−Ｎ細胞などを用いることが挙げられる。植物細胞を宿主細胞として使用することも可能であり、それに適するベクターと共に、それらは当該分野で広く知られている。本発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、ＤＮＡ断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素であるＤＮＡ修飾・分解酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを用いることが出来る。ＤＮＡ遺伝子をクローニングしてＤＮＡライブラリーを構築するのに適したベクターとしては、プラスミド、λファージ、コスミド、Ｐ１ファージ、Ｆ因子、ＹＡＣなどが挙げられ、好ましくはλファージ由来のベクターが挙げられ、例えばＣｈａｒｏｎ  ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ  ２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＤＡＳＨＩＩ、λＦＩＸＩＩ、λＥＭＢＬ３、λＺＡＰＩＩＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。
本発明のタンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクローニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する細胞株を得ることができる。例えば、宿主細胞として動物細胞を用いた形質転換体において、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして利用した場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを増幅させ、より高い発現を得られる細胞株を得ることができる。本発明の形質転換体は、本発明のタンパク質をコードする核酸が発現可能な条件下で培養し、目的物を生成、蓄積せしめることができる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培養することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母などを宿主としている形質転換体は、液体培地を好適に使用することができる。培地中には、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては，例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加してもよい。また、必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル  アクリル酸のような薬剤を加えることができる。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
培養は、例えば大腸菌では通常約１５〜約４５℃で約３〜約７５時間行い、必要により、通気や攪拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜約２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＰＲＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地などが用いられる。ｐＨは約６〜約８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜約４０℃で約１５〜約７２時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。上記培養細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中には尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、Ｔｗｅｅｎ−８０（商品名）などの界面活性剤を加えてあってもよい。培養液中に目的生成物が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンドなどを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
さらに、本発明に係わる所定の遺伝子塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、ＩＰ−１０（例えばヒトＩＰ−１０、ヒツジＩＰ−１０、ヤギＩＰ−１０など）のアミノ酸配列中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するタンパク質を製造することができる。こうした変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０  ＆  ｐ．３６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．４５７  ＆  ｐ．４６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ａ．Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５，１９８５；Ｔ．Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：３３０５，１９８５；Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：８７６５，１９８５；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５５，ｐ．５６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ａ．Ｒ．Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４４：１７７，１９８６などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７，１９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１，１９８６），カセット変異導入法（ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５，１９８５），制限部位選択変異導入法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ，Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  Ｓｅｒ  Ａ，３１７：４１５，１９８６），アラニン・スキャンニング法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５，１９８９），ＰＣＲ変異導入法，Ｋｕｎｋｅｌ法，ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ），亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
さらに得られた本発明のタンパク質（あるいはペプチド）は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ１−５アルキル−カルボニル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。また遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然のＩＰ−１０と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティ・クロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合タンパク質としては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）又はＣｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅのアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによる精製をなし得るようにすることもできる。より適した実施態様においては、該エピトープタグとしては、例えばＡＵ５，ｃ−Ｍｙｃ，ＣｒｕｚＴａｇ  ０９，ＣｒｕｚＴａｇ  ２２，ＣｒｕｚＴａｇ  ４１，Ｇｌｕ−Ｇｌｕ，ＨＡ，Ｈａ．１１，ＫＴ３，ＦＬＡＧ（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｒａｄｅｍａｒｋ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），Ｏｍｎｉ−ｐｒｏｂｅ，Ｓ−ｐｒｏｂｅ，Ｔ７，Ｌｅｘ  Ａ，Ｖ５，ＶＰ１６，ＧＡＬ４，ＶＳＶ−Ｇなどが挙げられる。（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：ｐｐ．２１５９−２１６５（１９８８）；Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：ｐｐ．３６１０−３６１６（１９８５）；Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：ｐｐ．５４７−５５３（１９９０）；Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：ｐｐ．１２０４−１２１０（１９８８）；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：ｐｐ．１９２−１９４（１９９２）；Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：ｐｐ．１５１６３−１５１６６（１９９１）；Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：ｐｐ．６３９３−６３９７（１９９０）など）。
さらに融合タンパク質としては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付されたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン系のＢｉｏｔｉｎ  Ａｖｉ  Ｔａｇ、螢光を発する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｅａ）などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）、それを改変した変異体（ＧＦＰバリアント）、例えば、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＧＦＰ），ｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ  ＧＦＰ），黄色螢光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ），緑色螢光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ），藍色螢光タンパク質（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＦＰ），青色螢光タンパク質（ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ），ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＧＦＰなどが挙げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３−ＧＦＰとバイオイメージング、羊土社（２０００年））。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検出を行うこともできる。酵母を利用したｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法も利用できる。
本発明の対象タンパク質（例えば、ヒト由来のＩＰ−１０、ヒツジ由来のＩＰ−１０など）は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよいし、特徴的な着床期における活性、例えば妊娠に関連しての着床期における活性、より具体的には、（１）胚遊走活性、（２）胚の子宮壁への着床促進活性、（３）不妊治療作用、（４）妊娠促進活性、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性を有するものが挙げられる。本発明の対象タンパク質は、上記したようなヒト由来のＩＰ−１０、ヒツジ由来のＩＰ−１０などの、特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。天然のＩＰ−１０の特徴であるドメイン構造あるいはレセプター結合能が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含されてもよい。また本発明の所定タンパク質は天然のＩＰ−１０と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のＩＰ−１０と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。本発明の対象タンパク質は、例えば、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、（１）第２位〜第１０２位のアミノ酸配列を有するもの、（２）同第１位〜第１０２位のアミノ酸配列を有するもの、及び（３）少なくとも同第２０位〜第８０位のアミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミノ酸配列に対し、６０％、場合によっては７０％より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好ましくはそれに対し、８０％あるいは９０％以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。本発明の対象タンパク質の一部のものとは、該タンパク質の一部のペプチド（すなわち、該タンパク質の部分ペプチド）であって、本発明のヒツジＩＰ−１０と実質的に同等な活性を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、本発明のヒツジＩＰ−１０の構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは２０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは８０個以上、もっと好ましくは９０個以上、ある場合には９５個以上のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられ、好ましくはそれらは連続したアミノ酸残基に対応するものであるか、あるいは、例えば、配列表の配列番号：２で示されるアミノ酸配列のうち対応する領域に対する相同性に関して、上記と同様の相同性を有するものが挙げられる。
本明細書において、「実質的に同等」や「実質的に同一」とは蛋白質の活性、例えば、着床期の活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、（１）胚遊走の活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療作用、（４）妊娠促進作用、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、（１）胚遊走の活性化、（２）胚の子宮壁への着床促進、（３）不妊治療作用、（４）妊娠促進作用、（５）胚仔と母体との間の相互作用調整活性、（６）免疫細胞遊走活性、及び（７）子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた活性などの活性が、同等（例えば、約０．００１〜約１０００倍、好ましくは約０．０１〜約１００倍、より好ましくは約０．１〜約２０倍、さらに好ましくは約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。次に、アミノ酸の置換、欠失、あるいは付加は、しばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないし、あるいはプラスの変化を生ぜしめるが、こうした場合、その置換、欠失、あるいは付加を施されたポリペプチドは、所定の目的からはそうした置換、欠失、あるいは付加のされていないものと実質的に同一であるとされてよい。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドの合成には、当該ペプチド合成分野で知られた方法、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。こうした方法では、例えばタンパク質あるいはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドは、それが遊離型のものとして得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換することができ、またそれらは塩として得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で遊離型のものあるいは他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドの塩としては、生理的に許容されるものあるいは医薬として許容されるものが好ましいが、これらに限定されない。こうした塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ駿、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。さらに該塩としては、アンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
こうした本発明のＩＰ−１０及びその変異体、修飾体、誘導体などは、上記で説明したような分離・精製処理を施すことができる。本発明では、「断片」、「誘導体」及び「類縁体」なる用語は、例えば、配列番号：２のポリペプチド、配列番号：１の配列から転写され且つスプライシングされていないか又は特異的にスプライシングされたｈｎＲＮＡ又はｍＲＮＡによりコードされるポリペプチド、又はゲノミックＤＮＡによりコードされるポリペプチドに関連して、その「断片」、「誘導体」又は「類縁体」と称した場合、このようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能又は活性を有しているポリペプチドを意味する。
本発明ではこれまで知られていなかった哺乳動物のタンパク質ＩＰ−１０の機能に関する情報を提供しているから、こうした情報を利用することも本発明に包含される。こうした利用としては、例えばＩＰ−１０及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特に好ましくはヒトの、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離及び検知などをして、該ＩＰ−１０の解明された機能、例えば胚遊走活性化、胚の子宮壁への着床促進、不妊治療、妊娠効率促進、着床期に胚を子宮に誘因する活性、胚仔と母体との間の相互作用調整活性などを調べる手法や試薬の開発が挙げられる。
例えば、ヒツジＩＰ−１０ＤＮＡ配列などのＩＰ−１０ＤＮＡ配列をプローブとして利用して、例えばＩＰ−１０及び関連タンパク質の機能解析、例えば胚遊走活性化、胚の子宮壁への着床促進、不妊治療、妊娠効率促進、着床期に胚を子宮に誘因する活性、胚仔と母体との間の相互作用調整活性などが可能である。プローブは、必要に応じて、当該分野で知られた標識を付与しておくことができる。標識は、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法または非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ  ＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することができる。例えば、遺伝子の単離にあたっては、ＰＣＲ法、さらには逆転写酵素（ＲＴ）を用いたＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用することが出来る。ＩＰ−１０  ｃＤＮＡ及びその関連ＤＮＡは、クローニングされ、配列決定されたＩＰ−１０  ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ＤＮＡプライマーをデザインして化学合成し、得られたＤＮＡプライマー（プライマーセットを含む）を用いて、ＰＣＲ法、競合ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２５，１６９−１９３（２０００）、その他の方法を用いてＩＰ−１０関連遺伝子の単離、検出などに利用することが出来る。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発（株）（日本）製）等を用いることもできる。プライマーには、ユニバーサルプライマーとして知られたもの、例えばｄＴプライマーなどの公知のプライマーを使用することもできる。例えば、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡのヒト組織中での発現を各種の組織由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに対するノーザンブロット分析により検討することができる。本発明にしたがって、ｃＤＮＡをプローブとして用いれば、例えばノーザン・ブロティング、サザン・ブロティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ドット・ブロット、ＲＮａｓｅプロテクション・アッセイなどによりヒト組織中でのＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現やＩＰ−１０遺伝子自体などを検出・測定でき、ヒト組織における細胞内タンパク質代謝、ホルモン前駆体の活性化、さらには上記妊娠に関連した活性を含む、多くの正常な細胞のプロセスに関与する、胚仔と母体との間の相互作用における役割、不妊症、流産の様な多くの疾患等を含めた生理作用の研究の発展に貢献できる。ＩＰ−１０に関連した疾患の遺伝子診断にも利用できる。そうした診断は、当該ＩＰ−１０及び関連タンパク質をコードする核酸の異常、例えば損傷、突然変異、発現低下、発現過多などを診断するものであることができる。
該ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには、例えばノンＲＩ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれてよく、そこには、例えば直接法及び間接法が含まれてよい。該直接法は、例えば核酸プローブに検出可能な分子（レーポーター）が直接結合しているものを使用し、該間接法は、例えばレーポーター分子に対する抗体などを使用してシグナルを増幅せしめているものである。核酸プローブ中のオリゴヌクレオタイドには、官能基（例えば、第一級脂肪族アミノ基、ＳＨ基など）が導入されており、こうした官能基にハプテン、螢光色素、酵素などが結合せしめられていてもよい。核酸プローブの標識としては、代表的にはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、フルオレッセインなどが挙げられるが、下記抗体のところで説明する標識から適宜選択して使用することができるし、また多重ラベリングも利用でき、さらに標識抗体も利用できる。核酸プローブの標識法としては、当該分野で知られた方法から適宜選択して使用できるが、例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅、ラベリング／テイリング法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法などが挙げられる。処理された試料の観察には、当該分野で知られた方法から適宜選択して使用できるが、例えば暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、反射コントラスト顕微鏡、螢光顕微鏡、デジタルイメージング顕微鏡、電子顕微鏡なども使用できるし、さらにフローサイトメトリーなどによることもできる。
本発明に従えば、本発明のＩＰ−１０に関連して着床期の生理現象の遺伝子診断法（検出方法）が提供できる。該遺伝子診断法では、（ａ）核酸試料を得る工程、（ｂ）工程（ａ）にて得られた核酸試料を、例えばＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法、鎖置換増幅法などで遺伝子増幅し、例えば該ＩＰ−１０遺伝子に存在しうる変異部位などを含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び（ｃ）工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程を含む態様が挙げられる。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法を含む）、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法が含まれる。増幅の対象となるのは、目的に応じて適宜選択でき、例えば、増幅の対象となる変異部位を含む領域としては、本発明のＩＰ−１０の遺伝子の塩基配列のうち、機能活性低下の原因となる変異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の中の任意の位置の塩基を含む領域が挙げられる。上記工程（ｃ）においては、当該分野で当業者に知られている変異の存在に検出方法の中から適切な方法を選んでそれを適用でき、特には限定されないが、例えばＡＳＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）法により得られたＤＮＡ断片長を調べることにより検出することができる。ＤＮＡ断片長を調べる方法は、特に限定されるものではないが、例えば螢光ＤＮＡシークエンサーなどを使用して行うことができる。本工程で使用される変異検出法としては、例えば制限酵素断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＲＦＬＰ）を検出して調べる方法などが挙げられる。また、変異の検出には、例えば変異部位を含む適当なＤＮＡ片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法や、ＳＳＣＰ法（単鎖高次構造多型）のような公知の変異検出法を使用してよい。本発明の遺伝子診断に従い、本発明のＩＰ−１０に関係した遺伝子診断が可能であり、例えば不妊症、着床障害など、胚仔と母体との間の相互作用に関連した抵抗性・感受性決定の一素因と考えられる本発明のＩＰ−１０の発現や多型を遺伝子診断し、さらに、当該診断結果に基づき関連した障害や問題のリスクを下げるような遺伝子治療を行うことが可能となる。
本明細書中で対象とするＩＰ−１０及びそれに関連したタンパク質、そのフラグメント、さらにはＤＮＡを含めた核酸（ｍＲＮＡやオリゴヌクレオチドを含む）は、それらを単独あるいは有機的に使用し、更には当該分野で広く知られた遺伝子操作技術・抗体操作技術（例えば、アンチセンス法、モノクローナル抗体を含めた抗体、トランスジェニク動物など）とも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプロテオミックス技術に応用できる。例えば、ＩＰ−１０変異体は、ドミナントネガティブ効果を利用した機能解析にも利用可能である。また、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してのＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技術への応用の途もある。かくして、一塩基多型（ＳＮＰ；ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を中心とした遺伝子多型解析、核酸アレイ（ＤＮＡマイクロアレイを含む；Ｍａｒｋ  Ｓｈｅｎａ（Ｅｄ．），“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ２０００）、タンパク質アレイを使用した遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、関連遺伝子解析、タンパク質間相互作用解析、関連疾患解析、疾患治療薬解析をすることが可能となる。
ＲＮＡｉ技術を利用する場合、例えばｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）をデザインしてそれを導入して行うことをしてもよい。ｓｉＲＮＡをデザインする場合、代表的な場合、対象遺伝子のスタートコドンから約５０〜１００塩基下流、例えば７５塩基以上下流の領域に存在するＡＡで開始する１９塩基の領域を選択する。好ましくは５’−や３’−ＵＴＲやスタートコドン近傍はそれを避けるが、場合によってはＵＴＲ領域を対象とすることもできよう。該選択領域のＧＣ含量が約３０〜７０％程度、例えば約４５〜５５％程度の領域を選択することが好ましい。２塩基（ＡＡ）＋１９塩基＝２１塩基の配列、例えばＡＡ（Ｎ１９）（Ｎは任意のヌクレオチド）をＤＮＡデータベース、例えばＮＣＢＩなどで検索（例えば、ＢＬＡＳＴサーチなど）してその特異性を確認する。選択した配列をもつ合成ＲＮＡにはその３’端にｄＴｄＴ（あるいはＵＵ）が付加されていてよい。センス配列の合成ＲＮＡとそれに対応するアンチセンス配列の合成ＲＮＡを用意し、該合成ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡとされて、細胞などに導入される。ｄｓＲＮＡ作製で使用される典型的なアニーリングバッファとしては、例えば１００ｍＭ  ＫＯＡｃと２ｍＭ  ＭｇＯＡｃを含有する３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ  ７．４液、５０ｍＭ  ＮａＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５〜８．０液などが挙げられるが、これに限定されるものではない。アニーリングの代表的な条件は、９５℃２〜３分間とした後４５〜６０分間かけて３７〜２５℃にまで徐々に冷却するという処理条件が挙げられるが、これに限定されるものではない。形成されたｄｓＲＮＡは、例えばフェノール／クロロホルム抽出−エタノール沈殿で回収できる。ｓｉＲＮＡを哺乳動物などの細胞に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例えば、Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，１９７３など）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（例えば、Ｄ．Ｗａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３：３７１，１９６８など）、カチオン性脂質複合体形成法などのリボソーム法、エレクトロポレーション法（例えば、Ｅ．Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１：８４１，１９８２など）、マイクロインジェクション法、ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ粒子導入法などが挙げられる。核酸導入法は、トランスフェクションにより効率的に行い得るような技術的改良が図られており、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＱＩＡＧＥＮ社などのキット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。ｓｉＲＮＡ技術については、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８−２００（２００１）；多比良和誠編、「実験医学別冊プロトコールシリーズ・遺伝子の機能阻害実験法」、羊土社、２００１年などを参照することができる。
また、核酸アレイ技術では、ＤＮＡマイクロアレイなどが利用される。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明で使用するマイクロアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７，１９９１）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４９１３，１９９６）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１１９−１１２３，１９９７）。このように核酸アレイ技術では、ｃＤＮＡライブラリーを使用したり、ＰＣＲ技術で得たＤＮＡを基板上にスポッティング装置で高密度に配置して、ハイブリダイゼーションを利用して試料の解析が行われる。該アレイ化は、針あるいはピンを使用して、あるいはインクジェトプリンティング技術などでもって、スライドガラス、シリコン板、プラスチックプレートなどの基板のそれぞれ固有の位置にＤＮＡが付着せしめられることによりそれを実施することができる。該核酸アレイ上でのハイブリダイゼーションの結果得られるシグナルを観察してデータを取得する。該シグナルは、螢光色素などの標識（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５，ＢＯＤＩＰＹ，ＦＩＴＣ，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ｄｙｅｓ（商品名），Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（商品名）など）より得られるものであってよい。検知にはレーザースキャナーなどを利用することもでき、得られたデータは適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコンピューターシステムで処理されてよ��。典型的なマイクロアレイを使用しての遺伝子などの解析では、例えば細胞などの試料から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとする。この標識ｃＤＮＡをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）にハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出する。ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注して標識ｃＤＮＡ水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、１〜１００ｎｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ｃＤＮＡを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
また、タンパク質アレイ技術では、タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよく、二次元電気泳動（２−ＤＥ）、酵素消化フラグメントを含めての質量分析（ＭＳ）（これにはエレクトロスプレーイオン化法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ），マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）などの技術が含まれ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析計、ＥＳＩ−３連四重極分析計、ＥＳＩ−イオントラップ分析計などを使用してよい）、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術などが利用されることができる。したがって、本発明には上記で得られるあるいは利用できるＩＰ−１０及びそれに対する抗体などと相関した胚仔と母体との間の相互作用に関連した機能解析に関連したソフトウエア、データベースなども含まれてよい。
本発明に従えば、ＩＰ−１０遺伝子の発現を阻害することのできるアンチセンス・オリゴヌクレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定されたＩＰ−１０をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成して、解明されたＩＰ−１０機能を探査したり、調節するのに使用しうる。そうしたオリゴヌクレオチド（核酸）は、ＩＰ−１０遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ｍＲＮＡの機能を阻害することができるか、あるいはＩＰ−１０関連ｍＲＮＡとの相互作用などを介してＩＰ−１０遺伝子の発現を調節・制御することができる。またある場合には、ＩＰ−１０発現制御領域をコントロールして、ＩＰ−１０遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＩＰ−１０関連遺伝子の選択された配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及びＩＰ−１０関連遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、生体内及び生体外でＩＰ−１０遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、またそれに関連した病気などの治療又は診断に有用である。
以上述べた、本発明者らの研究成果によりＩＰ−１０の遺伝子及び組換えＤＮＡ分子を宿主に移入し、ＩＰ−１０を発現させ、目的とするＩＰ−１０を得て、それらを利用して胚仔と母体との間の相互作用に関連した機能を研究・探査する方法が提供される。こうして本発明によれば、該解明された機能に関連しての、ＩＰ−１０の遺伝子を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフェクタント及びその製造法、さらにはその用途も提供される。
また、本発明では、胚仔と母体との間の相互作用に関連した現象や機能を研究・探査するため、ＩＰ−１０遺伝子、それから誘導されたプローブを用い、あるいはさらに必要に応じ、ＩＰ−１０に対する阻害物質を用い、被検試料中のＩＰ−１０あるいはその遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量する優れた方法及びその為の試薬キットを提供することにある。本発明はこうしたＩＰ−１０あるいはその遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量することのできる試薬キットのうちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと理解される。さらに本発明の目的は、上記方法を用いてＩＰ−１０あるいはその遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量することにより、細胞内タンパク質代謝、ホルモン前駆体の活性化、胚遊走活性化作用、胚の子宮壁への着床促進作用、不妊治療活性、妊娠効率促進作用、着床期に胚を子宮に誘因する活性、胚仔と母体との間の相互作用調整活性など、さらにはそれらのプロセスに関与する因子や生理現象などをモニターし得る方法並びに試薬あるいは診断剤を提供することができる。
したがって、医学的・生理学的分野における上記試薬の各種利用、胚仔とＩＰ−１０との相互作用、胚遊走活性化作用、胚の子宮壁への着床促進作用、不妊治療活性、妊娠効率促進作用、着床期に胚を子宮に誘因する活性、胚仔と母体との間の相互作用調整活性などに起因する応答・症状・疾患の研究・解析・測定、診断、予防、治療などの目的で上記試薬を使用することは、すべて本発明のその実施態様のうちに含まれると理解される。
本発明で対象とするＩＰ−１０及びその関連物質は、着床期における胚と母体との間において重要な働きを有する因子であると考えられる。胚のシグナルに対して母体がＩＰ−１０を適切な時期に適量を分泌させ、それによって母体側の生理的、免疫的な応答経路が確立し、その結果として妊娠（着床）が進行し、このシグナルに対する応答が不十分な場合には妊娠は成立しない。したがって、該タンパク質は胚と母体との間のコミュニケーションに有用であると考えられる。すなわち、ＩＰ−１０、変異体、修飾体、誘導体を含有する医薬を用いれば、ＩＰ−１０による活性が不充分であることに起因する不妊症患者を健常な状態にすることが可能である。本発明のポリペプチドは、こうした問題の治療及び／又は予防剤などの医薬として有用である。
例えば、生体内においてＩＰ−１０が減少あるいは欠損しているために、細胞における当該生物学的活性が十分に得られていないか、あるいは正常でない症状の患者の場合には、（Ａ）本発明のタンパク質等を該患者に投与することによるか、（Ｂ）本発明のＤＮＡなどの核酸を該患者に投与して、生体内で本発明のタンパク質等を発現させることによるか、（Ｃ）本発明のＤＮＡなどの核酸を発現可能に導入した細胞を該患者に移植することによって、生体内に本発明のタンパク質等を補充する等して、該患者における当該症状を改善したりする。つまり、ＩＰ−１０産生を誘起させることによって、またはＩＰ−１０を投与することによって妊娠率の向上をはかる。
本発明のＩＰ−１０の生物学的活性などの機能の解明に基づいて、該ＩＰ−１０の機能を促進する化合物（アゴニスト、あるいは促進剤）又はその塩は、ＩＰ−１０機能不全による妊娠障害などの上記で指摘した生物活性に関連した症状などの各種の疾病の治療及び／又は予防剤として有用な医薬（獣医薬を含む）として使用できる。一方、本発明のＩＰ−１０の生物学的活性などの機能を阻害する化合物（アンタゴニスト、あるいは阻害剤）又はその塩は、過ＩＰ−１０機能症、妊娠制御などにおいて治療及び／又は予防剤などの医薬として使用できる。
かくして、本発明で明らかにされたＩＰ−１０の機能に着目して、ＩＰ−１０などのポリペプチド等は、それの胚仔と母体との間の相互作用などに関連した生理現象を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩をスクリーニングするための試薬として有用である。本発明は、こうした生理作用あるいは生物活性をを促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニングでは、例えば（ｉ）本発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩（該タンパク質を発現する形質転換体を含んでいてもよい、以下同様）などに胚を接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩などに胚及び試験試料を接触させた場合との比較を行う。具体的には、上記スクリーニングでは、当該生物学的活性（例えば、胚と子宮膜との相互作用に関連した活性など）を測定して、比較する。スクリーニングでは、胚に代えて、適切な基質を使用することもでき、該基質は、そのまま使用してもよいが、好ましくはフルオレッセインなどの蛍光、酵素や放射性物質で標識したものを使用できる。
試験試料としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、植物抽出物、動物などの組織抽出物、細胞抽出物などが挙げられる。試験試料に使用される試験化合物の例には、好ましくは抗ＩＰ−１０抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＦＮ−τ抗体、ＣＸＣＲ３とＩＰ−１０の結合阻害剤、胚の着床に対するインヒビター活性を有する化合物、胚の着床に対する促進活性を有する化合物、特には合成化合物などを含んでいてよい。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。該スクリーニングは、通常の結合活性の測定法に準じて実施することができ、例えば当該分野で公知の方法などを参考にして行うことができる。また、各種標識、緩衝液系その他適当な試薬等を使用したり、そこで説明した操作等に準じて行うことができる。使用ペプチドなどは、活性化剤で処理したり、その前駆体あるいは潜在型のものを活性型のものに予め変換しておくこともできる。測定は通常トリス塩酸緩衝液、リン酸塩緩衝液などの反応に悪影響を与えないような緩衝液等の中で、例えば、ｐＨ約４〜約１０（好ましくは、ｐＨ約６〜約８）において行うことができる。これら個々のスクリーニングにあたっては、それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明のＩＰ−１０あるいはそれと実質的に同等な活性を有するポリペプチドあるいはペプチドに関連した測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社（ＵＳＡ）発行）など参照〕。
本発明のスクリーニング方法又はスクリーニングキットを用いて得られる化合物又はその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の機能を促進あるいは阻害する化合物である。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容される塩などが挙げられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のＩＰ−１０ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’及びＦａｂといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ），トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、ＤＮＡ組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい本発明の抗体は、天然型のＩＰ−１０ポリペプチドを特異的に識別できるものである。
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ）に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり（例えば、ヒト化抗体）、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７など）。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５））；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４，ｐｐ．７２−７９（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，ｐｐ．３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ｌｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；トリオーマ法；ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８号（単鎖抗体の産生のための技術）が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる：Ｓ．Ｂｉｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，９，ｐｐ．１０１−１０８（１９９０）；Ｒ．Ｅ．Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．４２３−４２６（１９８８）；Ｍ．Ａ．Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，ｐｐ．３７９１−３８０６（１９８４）；Ｊ．Ｂｕｋｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，ｐｐ．２１９−２２８（１９８７）；Ｍ．ＤＡＩＮＯ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，ｐｐ．２２３−２２９（１９８７）；Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐｐ．５８７９−５８８３（１９８８）；Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｓ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）；Ｖ．Ｔ．Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，ｐｐ．２１４−２２１（１９８６）；Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３−３２７（１９８８）；Ａ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐｐ．６７３６−６７４０（１９８６）；Ｃ．Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４４６−４４９（１９８５）；Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４５２−４５４（１９８５）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
本発明に係るモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスである、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に包含する（米国特許第４８１６５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４））。
抗体は、それをトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体フラグメントであってもよい。
抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３巻，１０１４−１０２１頁（１９７４）；Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：ｐｐ．２１９−２３１（１９８１）；及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４，ｐｐ．１３８−１６３（１９９０）により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。
本発明で検知・測定は、イムノ染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡解析、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、ルミネッセントイムノアッセイ（ＬＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）などを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはＲＩＡ，ＥＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどが包含されてよい。
標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。
酵素標識は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。
例えば、本発明でＩＰ−１０などの測定系としては、例えば組織に対しては免疫染色、免疫電子顕微鏡などの蛋白測定系、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎなどの発現遺伝子測定系が、組織抽出物に対してはＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡ，ウエスタンブロッティングなどの蛋白測定系、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、競合ＰＣＲなどの発現遺伝子測定系が、そして血中、体液などに対してはＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡ，ウエスタンブロッティングといった蛋白測定系が有利に利用できる。ＥＩＡの測定系において、例えば競合法では、抗ＩＰ−１０抗体を固相化抗体として使用し、標識抗原及び非標識抗原（抗原としては、ＩＰ−１０あるいはそのフラグメントペプチドなどが挙げられる）を使用するし、また非競合法で、例えばサンドイッチ法では、固相化抗ＩＰ−１０抗体や標識抗ＩＰ−１０抗体を利用できる他、抗ＩＰ−１０抗体を直接標識したり、固相化せずに、抗ＩＰ−１０抗体に対する抗体を標識したり、固相化して行うこともできる。感度増幅法としては、例えば、非酵素標識一次抗体との組み合わせでは、高分子ポリマーと酵素と一次抗体を利用するもの（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ試薬を応用したもの；Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｓｔａｉｎｉｎｇ（ＥＰＯＳ））が挙げられ、非酵素標識二次抗体との組合せでは、例えばＰＡＰ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）法などの酵素と抗酵素抗体複合体の組合せ、ＡＢＣ（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−アビジン複合体の組合せ、ＳＡＢＣ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）法、ＬＳＡＢ（ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−ストレプトアビジン複合体の組合せ、ＣＳＡ（ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などのＳＡＢＣとビオチン標識タイラマイドと酵素標識ストレプトアビジンの組合せ、高分子ポリマーで二次抗体と酵素を標識してあるものなどが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析・定量法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編，「ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和４９年発行；入江  寛編，「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和５３年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２版），医学書院，昭和５７年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和６２年発行；Ｈ．Ｖ．Ｖｕｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ａ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ，Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１７８（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｍｉｃｒｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｎｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）などあるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）〕。
本発明の活性成分〔例えば、（ａ）ＩＰ−１０ポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩、それに関連するペプチド等、（ｂ）該ＩＰ−１０あるいはＩＰ−１０ポリペプチドをコードするＤＮＡなどの核酸等、（ｃ）本発明で対象とする抗体、その一部断片（モノクローナル抗体を包含する）またはその誘導体、（ｄ）ＩＰ−１０による胚と母体との間の着床などの相互作用を促進及び／又は活性化するなどの現象あるいはそれに関連した組織あるいはタンパク質の変質・過剰生産あるいは分解現象といった生物学的活性を促進及び／又は活性化する化合物またはその塩、ＩＰ−１０産生を制御する化合物またはその塩、あるいはＩＰ−１０による胚と母体との間の着床などの相互作用を抑制及び／又は阻害するなどの現象あるいはそれに関連した組織あるいはタンパク質の変質・過剰生産あるいは分解現象といった生物学的活性を抑制及び／又は阻害する化合物またはその塩、（ｅ）本発明で対象とするＤＮＡなどの核酸に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドなど、（ｆ）本発明を使用して見出された活性物質など〕を医薬として用いる場合、例えば胚と母体との間の相互作用促進剤またはそれらの塩等は、通常単独或いは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与することができる。好ましくは、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていずれの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含される）によってもよい。
また、本発明の活性成分は、ホルモン作用剤、ビタミン剤、サイトカイン類、インターフェロン類、その他の生理活性物質及び／又は免疫調整剤と配合して使用することもでき、それらは、有利な働きを持つものであれば制限なく使用でき、例えば当該分野で知られたものの中から選択することができる。
そして、非経口的な投与形態としては、局所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内投与を包含し得るが、患部への直接投与も可能であり、またある場合には好適でもある。好ましくはヒトを含む哺乳動物に経口的に、あるいは非経口的（例、細胞内、組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することができる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製剤などが挙げられ、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（例えば、直腸坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、凍結乾燥製剤、ゲル調製品等が挙げられる。
医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理学的に認められる担体、医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、無痛化剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本発明のタンパク質等を混和することによって、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造することができる。
非経口的使用に適した製剤としては、活性成分と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る媒体との無菌性溶液、または懸濁液剤など、例えば注射剤等が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキストロース水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類が好ましい注射剤用液体担体として挙げられる。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル液、生理食塩液のような担体、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、溶液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる形に調製する。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、哺乳動物中で極めて毒性が低いことから、それを結合させることは特に有用である。また、ＰＥＧを結合せしめると、異種性化合物の免疫原性及び抗原性を効果的に減少せしめることができる場合がある。該化合物は、マイクロカプセル装置の中に入れて与えてもよい。ＰＥＧのようなポリマーは、アミノ末端のアミノ酸のα−アミノ基、リジン側鎖のε−アミノ基、アスパラギン酸又はグルタミン酸側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端のアミノ酸のα−カルボキシル基、又はある種のアスパラギン、セリン又はトレオニン残基に付着したグリコシル鎖の活性化された誘導体に、簡便に付着させることができる。
タンパク質との直接的な反応に適した多くの活性化された形態のＰＥＧが知られている。タンパク質のアミノ基と反応させるのに有用なＰＥＧ試薬としては、カルボン酸、カルボネート誘導体の活性エステル、特に、脱離基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾール、又は１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルフォネートであるものが挙げられる。同様に、アミノヒドラジン又はヒドラジド基を含有するＰＥＧ試薬は、タンパク質中の過ヨウ素酸酸化によって生成したアルデヒドとの反応に有用である。
さらに、本発明のＤＮＡなどの核酸を上記したような治療及び／又は予防剤として用いる場合、該核酸はそれを単独で用いることもできるし、あるいは上記したような遺伝子組換え技術で使用される適当なベクター、例えばレトロウイルス由来ベクターなどウイルス由来のベクターなどに結合させるなどして用いることができる。本発明のＤＮＡなどの核酸は通常の知られた方法で投与でき、そのままで、あるいは、例えば細胞内への摂取が促進されるように、適当な補助剤あるいは生理的に許容される担体などと共に、製剤化されて用いることができ、上記したような、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与することができる。また遺伝子治療として知られた方法を適用することもできる。
本発明の活性成分は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
医薬品製造にあたっては、その添加剤等や調製法などは、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十四改正  日本薬局方解説書、平成１３年６月２７日発行、株式会社廣川書店；一番ヶ瀬  尚  他編  医薬品の開発１２巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２年１０月１５日発行、株式会社廣川書店；同、医薬品の開発１２巻（製剤素材〔ＩＩ〕）平成２年１０月２８日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して適用することができる。
本発明の活性成分は、典型的には、胚と母体との相互作用を促進あるいは活性化するといった生物学的活性をもつものであれば特に限定されないが、好ましくは有利な作用を持つものが挙げられる。本発明の活性成分は、例えば、（ａ）ＩＰ−１０、その変異体ポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩等、（ｂ）該ＩＰ−１０をコードするＤＮＡ、ＩＰ−１０変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡなどの核酸等、（ｃ）本発明の抗体、その一部断片（モノクローナル抗体を包含する）またはその誘導体、（ｄ）ＩＰ−１０による、胚遊走活性化、胚の子宮壁への着床促進、不妊治療、妊娠効率促進、着床期に胚を子宮に誘因する活性、胚仔と母体との間の相互作用調整活性などの活性のうちの少なくとも一つあるいはそれ以上を有するといった有利な作用をもつ化合物またはその塩などが包含される。
本発明の活性成分は、例えば胚遊走活性化、胚の子宮壁への着床促進、不妊治療、妊娠効率促進、着床期に胚を子宮に誘因する活性、胚仔と母体との間の相互作用調整活性などの生物活性を利用した薬物並びにそれを用いた予防あるいは治療法に有用と期待される。
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸を単離・配列決定したり、組換え体を作製したり、所定のペプチドを得ることができる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９  ＆  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”シリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、例えばＲ．Ｗｕ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ），（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｂ）＆  １０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｃ），（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｅ）＆  １５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｆ），（１９８７）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．２０４，（１９９１）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．２１６（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｇ），（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．２１７（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｈ）＆  ２１８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｉ），（１９９３）；Ｊ．Ｌ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．２６２（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ），（１９９５）；Ｐ．Ｍ．Ｃｏｎｎ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．３０２（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ），（１９９９）；Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．３０３（ｃＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ），（１９９９）；Ｊ．Ｃ．Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．３０６（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ），（１９９９）；Ｍ．ｌａｎ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．３１３（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ  Ａ：Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）＆  ３１４（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），（１９９９）；Ｊ．Ｔｈｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，ｉｂｉｄ．，Ｖｏｌ．３２６（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ��ｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｒｔ  Ａ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ），３２７（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）＆  ３２８（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｒｔ  Ｃ：Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），（２０００）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法が挙げられる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。本発明の診断方法等に使用可能な薬剤の調製は、例えばＡ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．，“Ｒｅｍｉｎｇｔｏ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０等に、分子生物学的技術は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【実施例】  以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、ＤＮＡクローニングではＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９  ＆  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；特にＰＣＲ法では、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）及びＭ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）や添付の薬品等を使用している。
【実施例１】〔動物及び組織調製〕
ＵＳ  Ｍｅａｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｌａｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＥ（米国）において維持されてきたホワイト・フェース雑種雌ヒツジを用い、羊についての実験プロトコルはＵＳＤＡの「実験動物（使用）委員会」により承認されている手法に従った。
Ｉｍａｋａｗａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．，４５：４４１−４５０（１９９８）に記載のようにして、動物の飼育及び発情の同期化を行った。発情周期の１５日目（ｎ＝９）のヒツジからの子宮、及び妊娠１４日目（ｎ＝３）、１７日目（ｎ＝９）、２０日目（ｎ＝３）、２５日目（ｎ＝３）、そして３０日目（ｎ＝３）のヒツジからの子宮を、屠殺後に直ちに取り出した。発情周期の１５日目のヒツジ及び妊娠１７日目のヒツジからのそれぞれの三つの子宮につき、Ｉｍａｋａｗａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．，４５：４４１−４５０（１９９８）に記載のようにして、全子宮を固定化処理に付し、そしてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用にさらに発情周期の１５日目のヒツジ及び妊娠１７日目のヒツジからの三つの子宮全体を直ちに凍結した。妊娠した残りのヒツジ（調査の各日あたりｎ＝３）から集められた子宮内膜組織及び胚仔（コンセプタス又は受胎産物：胚並びに胚膜を指す）組織について凍結し、−７０℃で保存した。これら凍結された組織はＲＮＡ抽出処理に付された。東京大学農場で三頭の発情周期雌ヒツジから全血を集め、それから末梢血多核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。これらの試料は、ＩＦＮ類量に対する応答性やケモタキシスアッセイに使用された。さらに３頭の発情周期の雌ヒツジから全子宮を摘出し、子宮内膜外植片をＩＰ−１０産生に対するＩＦＮの刺激効果を調べるために培養した。羊の使用法は、東京大学の「実験動物（使用）委員会」により承認されている。Ａｉｄａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，４５：２４９−２５７（１９９９）に従って動物の飼育及び発情の同期化を行った。
〔ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養〕
Ｄｏｍｅｎｅｃｈ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，８１：１０９−１１８（２０００）に記載の方法を幾分か改良した方法を使用して発情周期１５日目のヒツジから初代単球並びにリンパ球細胞を単離した。ＥＤＴＡ処理した血液（８０ｍｌ）より密度勾配遠心法（８００×ｇ，２０℃，３０分間，ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ，Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）でもってＰＢＭＣを分離し、１０％ＦＣＳ，４０ユニット／ｍｌのペニシリン，４０μ／ｍｌのストレプトマイシン及び抗胸膜肺炎様微生物（ＰＰＬＯ）剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、米国）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地の中に懸濁した。３×１０７個／ｍｌになるようにしてＰＢＭＣを６−ウェルのコースタープレート（３ｍｌ／ウェル）に播種し、３７℃で５％ＣＯ２−９５％空気雰囲気でもって２時間培養した。非接着性細胞（リンパ球細胞）から接着性細胞（単球細胞）を分離し、上記のように添加物を補ってある新鮮なＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＩＰ−１０発現に及ぼすＩＦＮ類の有効量を決定するため、１０２，１０３又は１０４  ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ−α（ｒｈＩＦＮ−α，シグマ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズリー州、米国），組換えヒトＩＦＮ−γ（ｒｈＩＦＮ−γ，Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ニューヨーク州、米国）又は組換えウシＩＦＮ−τ（ｒｂＩＦＮ−τ，Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）でもって単球を処理した。３７℃、５％ＣＯ２−９５％空気条件下でもって２０時間維持した後、培養液を集めて、−７０℃で保存した。一方、細胞は直ぐさま全ＲＮＡ抽出のため処理された。加えて、ヒツジの子宮の上皮細胞及び間質細胞（ｓｔｒｏｍａ  ｃｅｌｌ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６１：１３２４−１３３０（１９９９）を４０ユニット／ｍｌのペニシリン，４０μ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％ＦＣＳを添加したダルベッコズ改良イーグルズ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）中で培養した（前記細胞は、Ｄｒ．Ｂａｚｅｒ，Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍよりの贈与物である）。
発情周期１５日目のヒツジからの子宮内膜組織（おおよそ６００ｍｇ湿重量／培養皿）は、４０ユニット／ｍｌのペニシリン及び４０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭの２０ｍｌ中で培養し、１０２  ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α，ｒｈＩＦＮ−γ又はｒｂＩＦＮ−τの何れかにより処理した。これらのＩＦＮ類の濃度は、上記の単球についての有効量についての実験により決められたものである。３７℃、５％ＣＯ２含有空気条件下でもって２０時間維持した後、培養液及び子宮内膜組織はそれぞれぞれ別々に凍結し、その後のウェスターンブロット及びノーザンブロット分析のために−７０℃で保存した。
〔ヒツジＩＰ−１０のクローニング〕
妊娠１７日目のヒツジの子宮内膜ＲＮＡ及び発情周期１５日目のヒツジの子宮内膜ＲＮＡを使用し、Ａｋｏｐｙａｎｔｓ  Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９５：１３１０８−１３１１３（１９９８）に記載の方法に従って、ｃＤＮＡライブラリーの構築並びにサブトラクション実験を遂行した。数多くのｃＤＮＡサブトラクション試験から、ヒツジＩＰ−１０をコードしているｃＤＮＡ断片を同定し、次に５’−ＲＡＣＥ，３’−ＲＡＣＥ並びに完全長ＰＣＲ法（Ｋｕｒａｉｓｈｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３４７：５７９−５８３（２０００））を使用して完全長のＩＰ−１０  ｃＤＮＡを取得した。完全長のＩＰ−１０  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物は、ベクターｐＣＲＩＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒシークエンサー（ｍｏｄｅｌ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＸＬ，ロッシュ・モレキュラー・システムズ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ニュージャージー州、米国）を使用して自動配列解析にかけた。ヒツジＩＰ−１０  ｃＤＮＡの塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、東京、日本）により解析した。
〔プローブの作成及びＲＴ−ＰＣＲによる半定量解析〕
ヒツジのＩＦＮ−τ、ＩＰ−１０及びＧ３ＰＤＨに対して特異的なｃＲＮＡプローブを調製するため、子宮内膜組織ＲＮＡ又は胚仔組織ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを使用してそれぞれのｃＤＮＡを調製した。すなわち、先ず全ＲＮＡ試料をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ−ｄＴプライマー（２０μｌ反応液容量）でもって逆転写し、表１に示したプライマーを使用してＰＣＲにより増幅せしめた。
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表１は、ＰＣＲに使用されたプライマーセットを示すもので、表中ＮａｍｅはプライマーセットでＰＣＲ増幅の対象とされた遺伝子の名称、Ｓｅｑｕｅｎｃｅは、使用プライマーの塩基配列、Ｌｅｎｇｔｈは、増幅対象遺伝子の鎖長をそれぞれ示している。
ＲＴ−ＰＣＲにより得られた断片のそれぞれは、ベクターｐＣＲＩＩＴＭにサブクローニングし、次に自動配列解析に付した。ＢＬＡＳＴネットワークプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して配列を比較したところ、正しいヒツジのｃＤＮＡであることを示していた。ノーザンブロット解析のため、ＤＩＧ−標識ｃＲＮＡプローブを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用して上記ｃＤＮＡ構築物から作成した（Ｋｕｒａｉｓｈｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３４７：５７９−５８３（２０００））。
オリゴヌクレオチドプライマー（表１）を使用してＰＣＲ増幅して子宮のＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡ及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの量を測定した。ＩＦＮ−γ／Ｇ３ＰＤＨ又はＣＸＣＲ３／Ｇ３ＰＤＨに対するプライマー対を含有しているそれぞれの反応液にＲＴ用鋳型（１μｌ）及びＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（１．２５ユニット；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、最終の容量を２５μｌにして反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物を直線的に与えるようなプライマー対の比率を決定した。該比は、ＩＦＮ−γ：Ｇ３ＰＤＨでは６：１で、ＣＸＣＲ３：Ｇ３ＰＤＨでは５：２であった。ＰＣＲの条件は、次の通りであった：最初に９５℃で１１分間加熱し、次に９５℃で１分間、５７℃で１分間、そして７２℃で１分間のサイクルを４０サイクルを行った。そして最後に７２℃での延長反応を５分間行った。ＰＣＲ産物は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ  ｖ３．０ソフトウェアを備えたイメージ解析システム（ＴｏＹｏＢｏ、大阪、日本）を使用して定量した。
〔ノーザンブロット解析〕
幾つかの子宮内膜や胚仔の組織や細胞からの全ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ，東京）を使用して単離した。また、ＰＢＭＣから単離した全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを取得した（ＴａＫａＲａ、東京、日本）。これらのＲＮＡは１．０％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上の電気泳動により分離し、ナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ−Ｂ；Ｐａｌｌ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ニューヨーク州、米国）に転写した。該ナイロン膜を６５℃で１．５時間、５ｘＳＳＣ，５０％ホルムアミド，５０ｍＭ  ＰＢＳ，７％ＳＤＳ，０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン，５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及び２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を含有するハイブリダイゼーションバッファ中でプレハイブリダイゼーションを行い、次にｃＲＮＡブローブと一緒に新しいハイブリダイゼーションバッファ中で６３℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、該ナイロン膜を２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳでもって６５℃で３０分間洗浄処理を一回行い、０．１ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳでもって６５℃で３０分間洗浄処理を二回行って、次に３７℃で１時間ＲＮａｓｅ−Ａ（２０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションした。該ナイロン膜を室温で１時間ブロッキングバッファ（１％ブロッキング試薬）中でインキュベーションし、ついで抗ＤＩＧ抗体（１：１０，０００希釈、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を添加した。該ナイロン膜を１００ｍＭマレイン酸（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．３％Ｔｗｅｅｎ  ２０中で１０分間の洗浄処理を３回行い、最後に１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）及び１００ｍＭ  ＮａＣｌ液中でリンスした。ＣＳＰＤ試薬（１：１００希釈；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）及び１００ｍＭ  ＮａＣｌ液中でケミルミネッセンス反応を実施し、Ｘ線フィルムを露光せしめて該ナイロン膜を解析した。
〔ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション〕
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、公知の方法（Ｋａｎａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３３：６６７−６８１（１９９６））に少し改変を加えて行った。すなわち、切片（１０μｍ）化した凍結組織をシランコートされたスライド上にのせ、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定化した。スライド切片は順次０．２Ｎ  ＨＣｌ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中の２０μｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ、４％パラホルムアルデヒド、そして０．２％グリシンでもって前処理した。次に切片は５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌヘパリン，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１０％デキストランサルフェート，そして０．１ｍｇ／ｍｌの変成されたｔＲＮＡ及びｓｓＤＮＡを含有しているプレハイブリダイゼーション液で処理し、次にＤＩＧ標識されたアンチセンス及びセンスｃＲＮＡプローブとともに４５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、４２℃で２０分間４ｘＳＳＣでもって１回洗い、次に切片を３７℃で３０分間ＲＮａｓｅ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションし、６５℃で３０分間２ｘＳＳＣでもって２回洗い、次に６５℃で３０分間０．１ｘＳＳＣでもって２回洗った。該スライドをブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によりブロッキング処理し、次にアルカリホスファターゼ標識化抗ＤＩＧ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共にインキュベーションした。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、米国）でもってシグナルを検出した。
〔組換えヤギＩＰ−１０の発現及び精製〕
ヒツジＩＰ−１０と同様のプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ヤギＩＰ−１０（ｃａｐｒｉｎｅ  ＩＰ−１０；ｃＩＰ−１０）ｃＤＮＡをヤギの子宮内膜のＲＮＡから増幅した。該ｃＤＮＡは、プラスミドｐＳＴＢｌｕｅ（商品名、ＴａＫａＲａ）にクローニングせしめた。成熟ｃＩＰ−１０の領域をコードしている塩基配列をＰＣＲ増幅せしめ、発現ベクターｐＥＴ−１４ｂ（商品名、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、米国）にクローニングせしめた（ｃＩＰ−１０のＮ−末端側にヒスチジンタグを有しており、得られた発現ベクターは、ｐＥＴ−１４ｂ−ｃＩＰ−１０と呼称した）。該得られた発現ベクターでもって大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換せしめ、培養後菌体を収穫して、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）に懸濁し、氷上で超音波による破砕処理を行った。遠心して細胞破砕物及び不溶性タンパク質を除去した後、上澄液中のｃＩＰ−１０についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。組換えｃＩＰ−１０はニッケルキレート化カラム（Ｈｉ−ｔｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用したクロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により精製した。イミダゾールグラジエント（２０−５００ｍＭ）によりカラムからタンパク質を溶出せしめ、ＰＢＳに対して透析処理し、イミダゾールを除いた。
〔ウエスタンブロット解析〕
子宮内膜組織をインビトロ培養した後及び組換えＩＰ−１０を産生せしめた後、その培養液試料並びに透析されたタンパク試料をウエスタンブロットで分析して、ＩＰ−１０が存在するか否を調べた。該培養液試料（４０μｌ）あるいは組換えタンパク質試料（５０ｎｇ／４０μｌ又は２００ｎｇ／４０μｌ）をＳＤＳサンプルバッファ中で５分間煮沸処理し、還元条件下１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動にかけ、ニトロセルロースメンブレン（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，米国）に転写した。該ニトロセルロースメンブレンを室温で１時間Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（大日本製薬、大阪）でもってブロッキング処理し、次に４℃で１２時間ヒトＩＰ−１０に対するマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、米国）あるいはヒスチジンタグに対するウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベーションした。インキュベーション後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０液中で３回（それぞれ１０分間）洗浄処理し、室温で１時間ホースラディシュペルオキシダーゼで標識されたロバ抗マウスあるいは抗ウサギＩｇＧと共にインキュベーションし、次にＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０液中で３回（それぞれ１５分間）洗浄処理した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｐｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）によりバンドを検出処理した。
〔免疫組織化学的分析〕
子宮内膜組織及び胚仔組織の双方を含んでいるヒツジの子宮全体を４％パラホルムアルデヒド中で固定化し、パラフィンに包埋し、６μｍの切片とした。脱パラフィン化した後、切片は０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に浸し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。切片を室温で１時間４．５％Ｈ２Ｏ２のメタノール液中でインキュベーションし、湿度を高めたチャンバー内で１時間Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅと共にインキュベーションした。次に、一次抗体、すなわち、マウスの抗ヒトＩＰ−１０モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ）あるいはウサギポリクローナル抗ヒトＩＦＮ−γ（５００ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ、英国）と一緒に切片を４℃で一晩インキュベーションした。本インキュベーション後、切片を二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ、米国）でもって１時間処理し、ついで室温で３０分間ＰＢＳ中でアビジン−ビオチンコンプレックスと一緒にインキュベーションした。Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｐｉｅｒｃｅ）により切片に結合している抗体を可視化した。等しい濃度の正常マウスあるいはウサギＩｇＧを非特異的結合（ネガティブコントロール）を評価するために同じ組織のセミシリアル切片に使用した。組織切片は次にヘマトキシリンでカウンター染色せしめられた。
〔ｉｎ  ｖｉｔｒｏケモタキシスアッセイ〕
９６穴の修飾ボイデンチャンバー（９６ｗｅｌｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ；ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ，Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ，ＭＤ、米国）内でポリビニルピロリドンを含まないポリカルボネート製メンブレン（５μｍの孔径、ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ）（これは、使用前に２時間１０μｇ／ｍｌウシ血漿フィブロネクチンでコートせしめられた）を使用してＰＢＭＣの移動について調べた。アッセイは、Ｇａｓｐｅｒｉｎｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：４９２８−４９３７（１９９９）に記載の方法にすこし改変を加えた方法で実施した。すなわち、ケモタキシス用チャンバーのウェルの下部に、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ、組換えＩＰ−１０（０．２〜５００ｎｇ／ｍｌ）を含有する同じ培地、あるいはＩＦＮ−τで処理したあるいは処理していない子宮内膜の培養物の上清液を加えた。該チャンバーのウェルの上部に、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中のＰＢＭＣ（５×１０６個／ｍｌ）を添加した。チャンバーを３７℃で５％ＣＯ２含有空気雰囲気でもって２時間培養した後、メンブレンを取り除いて、ＰＢＳで洗い、固定化した後、Ｄｉｆ−Ｑｕｉｃｋで染色した。下側の層に移動した細胞の数をランダムに選ばれた六つのｈｉｇｈ  ｐｏｗｅｒ  ｆｉｅｌｄｓのもとで顕微鏡下にカウントした。
ブロック実験としては、ＩＦＮ−τあるいは５ｎｇ／ｍｌの組換えＩＰ−１０で刺激された子宮内膜から得られた上清液を３０μｇ／ｍｌの抗ＩＰ−１０  ＩｇＧあるいはコントロールのマウスＩｇＧとともにチャンバーの上層部に添加する前に３７℃で１時間プレインキュベーションした。それぞれ独立に３回アッセイを行った。
〔統計学的解析〕
それぞれのデータポイントは互いに独立な３つの試料を示し、平均±ＳＥＭとして表した。これらのデータはｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、そして次にＤｕｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅテストを使用して分析された。加えて、妊娠ヒツジが集められたノーザンブロットデータは最小二乗法を用いて回帰分析により分析された。Ｐ＜０．０５の値をもつ差異はすべて有意なものとした。
結果
〔ＩＰ−１０  ｃＤＮＡのクローニング〕
妊娠１７日目に集められた子宮内膜組織からヒツジＩＰ−１０のｃＤＮＡ断片を得て、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥにより完全長のヒツジＩＰ−１０  ｃＤＮＡをクローニングした。得られたヒツジＩＰ−１０  ｃＤＮＡは、１０２個のアミノ酸残基からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持っている１１７２ｂｐを有しているものであった。図１に、クローニングされて単離されたヒツジＩＰ−１０の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を示す。図１において、１０２個のアミノ酸に相当するオープンリーディングフレームを有する１１７２  ｂｐのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢＯ７０７１７）が示されており、該コードアミノ酸配列（ヒツジＩＰ−１０；ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ６３９５８）のうち、１〜９番目までのアミノ酸配列部分はシグナルペプチドと推定される。
また、ｃＩＰ−１０  ｃＤＮＡは、ヒツジＩＰ−１０  ｃＤＮＡからデザインされたプライマーセットを使用したＲＴ−ＰＣＲによりヤギ子宮内膜ＲＮＡからクローニングされた。ｃＩＰ−１０  ｃＤＮＡは、９９番目の残基がヒツジＩＰ−１０のグルタミンからヤギＩＰ−１０のアルギニンになっていることを除いては同じ１０２個のアミノ酸からなるものをコードするものであった。
各種の動物間でそのアミノ酸配列を比較解析した結果を図２に示す。４個のシステイン残基は、ケモカインファミリーにおいて保存され、その最初の２個のシステイン残基は一個のアミノ酸残基により分けられてＣ−Ｘ−Ｃとなっている。このシステインモチーフはヒツジＩＰ−１０  ｃＤＮＡ及びヤギＩＰ−１０  ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸残基の中に見いだすことができる。該Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン類は該最初の２個のシステイン残基よりも前に位置するグルタミン−ロイシン−アルギニン（ＥＬＲ）モチーフが存在するか否かにより二つのクラスに分けられている（Ｒｏｌｌｉｎｓ  Ｂ．Ｊ．，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ，９０：９０９−９２８（１９９７））。他の動物のものと同様にヒツジＩＰ−１０は、該ＥＬＲモチーフを欠いており、ヒトＩＰ−１０と高い類似性、すなわちそれぞれヌクレオチド配列では８２．７％及びアミノ酸配列では７５．５％の相同性を示している（表２）。
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表２中、Ｏｖｉｎｅはヒツジ、Ｃａｐｒｉｎｅはヤギ、Ｈｕｍａｎはヒト、Ｍｏｕｓｅはマウスを示し、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄは、アミノ酸配列について、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｎｅｃｅは、塩基配列について、それぞれその相同性（同一性）の程度を表す。
〔着床期におけるＩＰ−１０，ＣＸＣＲ３，ＩＦＮ−τ及びＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現の変動〕
妊娠１４日目、１７日目、２０日目、２５日目及び３０日目の子宮のＩＰ−１０  ｍＲＮＡ量をノーザンブロット解析により調べた（図３）。図３は、ヒツジ子宮におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現レベルを示すもので、そこの図３左側に妊娠している雌ヒツジ（３頭、１４，１７，２０，２５及び３０日目）の子宮、発情周期雌ヒツジ（１５日目，ｎ＝３）の子宮及び１７日目の胚仔（Ｃｏｎ）におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡについての結果が示されている。図３左側には、独立した３つのブロットのうち一つを示してある。図３右側に示されたシグナルの比率ＩＰ−１０／Ｇ３ＰＤＨはすべてのノーザンブロット実験の結果より求めたもので、各棒線は平均値±ＳＥＭを示している。図３右側における＊は、発情周期１５日目の子宮についての値と比較しての統計的な違い（ｐ＜０．０５）を表す。ＩＰ−１０  ｍＲＮＡと妊娠日についての回帰分析の結果は、ｙ＝−５１．５ｘ２＋２８８．２ｘ−１３１．２（Ｒ２＝０．８２３，ｐ＜０．０１）というものであった。
その結果はヒツジＩＰ−１０  ｃＤＮＡクローニングの結果と一致するもので、妊娠している雌ヒツジの子宮内膜でＩＰ−１０  ｍＲＮＡに対応する単一の転写産物（おおよそのサイズ１．１ｋｂ）を検出した。ＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現は、発情周期雌ヒツジと比べると妊娠１４日目、１７日目、２０日目及び２５日目ではかなり高いものであった。ＩＰ−１０のレセプターである子宮内膜ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現は、１７日目及び２０日目の妊娠している雌ヒツジにおいてより高いものであった（図４）。図４は、ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現レベルを示すもので、そこの図４左側に妊娠している雌ヒツジ（３頭、１４，１７，２０，２５及び３０日目）の子宮及び発情周期雌ヒツジ（１５日目，ｎ＝３）の子宮におけるＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡとＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲの結果を示す。そこでは独立した３つの解析のうち一つを示してある。図４右側は、ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡとＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲ産物についての濃度解析した結果が示され、Ｇ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡに対するＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの量（ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ／Ｇ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡ比）として示してある。各棒線は平均値±ＳＥＭを示している。該図４右側中の＊は、発情周期１５日目の子宮についての値と比較しての統計的な違い（ｐ＜０．０５）を表す。ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡと妊娠日についての回帰分析の結果は、ｙ＝−８．９ｘ２＋４５．８ｘ＋６１．４（Ｒ２＝０．４３１，ｐ＜０．０１）というものであった。
次に、図５に、着床期の間のヒツジの胚仔と子宮におけるＩＦＮ−τとＩＦＮ−γの量を調べた結果を示す。図５の左側（Ａ）には、妊娠している雌ヒツジ（３頭、１４，１７及び２０日目）の胚仔におけるＩＦＮ−τ  ｍＲＮＡについてのノーザンブロット解析の結果が示され、右側（Ｂ）には、妊娠している雌ヒツジ（３頭、１４，１７，２０，２５及び３０日目）の子宮、発情周期雌ヒツジ（１５日目，ｎ＝３）の子宮及び１７日目の胚仔（Ｃｏｎ）におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡとＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲの結果が示されており、そこには独立した３つの解析のうち一つが示してある。図５の右下側には、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡとＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの半定量的ＰＣＲ産物についての濃度解析した結果が示され、そこではＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡに対するＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの量（ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡ／Ｇ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡ比）として示してある。各棒線は平均値±ＳＥＭを示している。＊は、発情周期１５日目の子宮についての値と比較しての統計的な違い（ｐ＜０．０５）を表す。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡと妊娠日についての回帰分析の結果は、ｙ＝−１０．６ｘ２＋５６．６ｘ＋８１．３（Ｒ２＝０．７６２，ｐ＜０．０１）というものであった。
ＩＦＮ−τ  ｍＲＮＡの発現は、胚仔中で検出され、この発現のレベルは１．４日目の胚仔においてより高いものであった（図５Ａ）。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現は、妊娠している雌ヒツジ並びに発情周期の雌ヒツジの子宮内膜で検出され、この発現のレベルは１４日目、１７日目、２０日目及び２５日目の妊娠している雌ヒツジにおいてより高いものであった（図５Ｂ）。
〔ＩＰ−１０及びＩＦＮ−γタンパク質の分布〕
ＩＰ−１０及びＩＦＮ−γの細胞内の局在部位を調べるため、発情周期１５日目の雌ヒツジ及び妊娠１７日目の雌ヒツジから調製された子宮及び胚仔組織切片について免疫組織化学解析を実施した（図６）。図６において、発情周期１５日目の雌ヒツジ（左側Ａ−Ｃ）及び妊娠１７日目の雌ヒツジ（右側Ｄ−Ｆ）についてほぼ一連の切片として示してある。写真Ａ及びＤは、ＩＰ−１０について、写真Ｂ及びＥは、ＩＦＮ−γについて、そして写真Ｃ及びＦはコントロールである。
ＩＰ−１０及びＩＦＮ−γの双方のタンパク質は、胚仔及び妊娠している子宮の管腔上皮、腺上皮、上皮下間質に局在していた。発情周期中の雌ヒツジの子宮内膜においては検出されたＩＦＮ−γタンパク質の量は妊娠している雌ヒツジにおけると同様であった（図６）。ＩＰ−１０タンパク質は発情周期中の子宮内膜において見いだされたが、その染色の程度は最小のものであった。
〔ＩＰ−１０  ｍＲＮＡの分布〕
ヒツジ子宮内膜中のＩＰ−１０  ｍＲＮＡの細胞内の産生場所を決定するため、発情周期１５日目の雌ヒツジ及び妊娠１７日目の雌ヒツジから調製された子宮組織切片におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った（図７Ａ）。図７において、写真ａ及びｂは、妊娠１７日目の雌ヒツジ子宮内におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡの局在をＤＩＧ標識アンチセンスＩＰ−１０  ｃＲＮＡを用いて示し、写真ｃは、妊娠１７日目の雌ヒツジ子宮内におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡをＤＩＧ標識のセンスｃＲＮＡで解析し、写真ｄは、発情周期１５日目の雌ヒツジ子宮内におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡの局在をＤＩＧ標識アンチセンスＩＰ−１０  ｃＲＮＡで解析した。
妊娠している子宮の上皮下間質にはＩＰ−１０  ｍＲＮＡが検出されたが管腔上皮及び腺上皮には検出されなかった。より強度を高めて行った場合には、免疫細胞にもシグナルが存在するように見えた。発情周期の子宮ではＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現は検出されなかった。加えて、ノーザンブロット解析をＩＰ−１０を発現している組織及び／又は細胞のタイプを同定するために行った。ＩＰ−１０  ｍＲＮＡは単球細胞から抽出されたＲＮＡに見出されたが、リンパ球細胞、上皮細胞や間質細胞からのＲＮＡには見出されなかった（図７Ｂ）。
〔ＩＰ−１０発現に及ぼすＩＦＮ−τの作用効果〕
ＩＦＮ類につき、単球細胞におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡ発現の誘導刺激に対するその活性及び有効量を調べた。雌ヒツジから単離された単球細胞を１０２〜１０４ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−α，ＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−τの存在下又は非存在下にｉｎ  ｖｉｔｒｏで２０時間培養した。図８に幾つかのＩＦＮ類がＩＰ−１０  ｍＲＮＡの量に対して及ぼす効果を調べた結果を示す。図８Ａには、ＩＦＮ類により刺激された単球細胞におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡ発現につきそのＩＦＮ添加量を変えて見たときの結果が示されており、そこでは独立した３つのノーザンブロット解析結果のうちの一つが示してある。
ＩＦＮ類はすべてヒツジ単球細胞においてＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現を刺激できたが、その有効量はこれらＩＦＮ間で異なっていた（図８Ａ）。ＩＦＮ−τは、１０２ＩＵ／ｍｌの量でＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現を刺激し、それは他のＩＦＮ類よりも有効性の高いものであった。
発情周期の状態の雌ヒツジで、子宮内膜のＩＰ−１０  ｍＲＮＡの量がＩＦＮ類の影響を受けているか否かを調べた。発情周期１５日目の雌ヒツジから得られた子宮内膜の体外移植片を１０２ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−α，ＩＦＮ−γ、あるいはＩＦＮ−τの存在下又は非存在下にｉｎ  ｖｉｔｒｏで２０時間培養した。ＩＦＮ刺激された子宮内膜組織から抽出された全ＲＮＡにつきＩＰ−１０  ｍＲＮＡをノーザンブロット解析でもって調べた。コントロール並びにＩＦＮ−α刺激あるいはＩＦＮ−γ刺激された試料でわずかながらＩＰ−１０  ｍＲＮＡが検出されたが、ＩＦＮ−τで刺激された後においてのみ高いレベルのＩＰ−１０  ｍＲＮＡが検知された（図８Ｂ）。また、子宮内膜でのＩＰ−１０の産生はＩＦＮ−τにより刺激を受けていることがウエスタンブロット解析により示された（図８Ｃ）。
図８Ｂには、発情周期の状態の雌ヒツジからの子宮内膜移植片についてＩＦＮ類がＩＰ−１０  ｍＲＮＡの量に及ぼす効果が示してある。図８Ｂの左側は、１０２ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、あるいはＩＦＮ−τで刺激した時の子宮内膜移植片でのＩＰ−１０  ｍＲＮＡについてのノーザンブロット解析の結果を示し、そこでは独立した３つのノーザンブロット解析結果のうちの一つが示してある。図８Ｂの右側には、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡ及びＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡについてのノーザンブロットを濃度解析した結果が示してあり、シグナルの比率ＩＰ−１０／Ｇ３ＰＤＨはすべてのノーザンブロット実験の結果より求めた。各棒線は平均値±ＳＥＭを示している。＊は、ＩＦＮを添加しないで培養した移植片についての値と比較しての統計的な差異（Ｐ＜０．０５）を表す。また、図８Ｃには、ＩＦＮ類により刺激された子宮内膜移植片の培養培地中のタンパク質につきウェスタンブロット解析した結果が示されている。
〔ＰＢＭＣの移動に及ぼすＩＰ−１０の作用効果〕
組換えヤギＩＰ−１０（ｒｃＩＰ−１０）及び子宮内膜で誘導・分泌されたＩＰ−１０が生物学的に活性を持つものであるのか否かを確認するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏケモタキシスアッセイをしてＰＢＭＣに対する走化性、遊走性をｒｃＩＰ−１０やＩＦＮ−τで刺激された子宮内膜より分泌された分泌物が持っているか否かを調べた。組換えｃＩＰ−１０をニッケル  キーレティング  カラムを用いて精製し、ＩＰ−１０及びヒスチジンタグに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した（図９Ａ）。ＰＢＭＣにＩＰ−１０受容体ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡが存在することを確認した（図９Ｂ：レーンＴは全ＲＮＡ１０μｇ、レーンＭはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを示す）。ケモタキシスアッセイの結果、ＰＢＭＣは０．２〜５ｎｇ／ｍｌのｒｃＩＰ−１０に応答していたが、その反応はより高濃度のｒｃＩＰ−１０においては減少した。その結果、特徴的なベル形状の用量応答曲線（図９Ｃ）となった。ＩＦＮ−τで刺激された子宮内膜組織培養物からの培地はＰＢＭＣに対し顕著なケモタクティック活性を示したが、一方非処理の子宮内膜から得られた培養液では効果はなかった（図９Ｃ）。各棒線は平均±ＳＥＭ、＊はＩＦＮ−τ非処理子宮内膜培養培地でのＰＢＭＣ移動からの値（Ｐ＜０．０５）であり、＊＊はｒｃＩＰ−１０不存在におけるＰＢＭＣ移動からの値（Ｐ＜０．０５）を示す。免疫中和試験の結果、抗ＩＰ−１０抗体はｒｃＩＰ−１０及びＩＦＮ−τで刺激された子宮内膜からの培養液のケモタクティック活性を６０〜７０％を減少せしめ、これはＩＦＮ−τで刺激された子宮内膜からの培養液により示されるケモタクティック活性は主にＩＰ−１０によるものであることを示している（図９Ｄ）。各棒線は平均±ＳＥＭ、＊はＰ＜０．０５での抗ＩＰ−１０抗体非存在下におけるＩＦＮ−τ処理子宮内膜培養培地におけるＰＢＭＣの移動値であり、＊＊はＰ＜０．０５における抗ＩＦＮ−τ非存在下におけるＩＰ−１０によるＰＢＭＣの移動値を示す。
〔考察〕
本発明により、ヒツジＩＰ−１０は、妊娠子宮内に存在し、発情周期の子宮にはほとんど存在していないことが明らかにされた。ＩＰ−１０は、Ｃ−Ｘ−Ｃ型ケモカインの一員に属するものである。このケモカインファミリーは、ＩＰ−１０のレセプターであるＣＸＣＲ３及び／又は白血球のサブセットに対するケモタクティック活性を介して様々な炎症反応や免疫応答を制御している（Ｆａｒｂｅｒ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．，６１：２４６−２５７（１９９７））。さらに、本発明はＩＦＮ−τの存在下において子宮内膜培養培地はＩＰ−１０を含有していること、これら培地の上清はＰＢＭＣの移動を誘導すること、また抗ＩＰ−１０抗体によってその活性が７０％まで阻害されたという事実に基づいている。
本発明では、単球を使用した用量に対する応答試験により、ＩＦＮ−α，ＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−τが、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現を刺激することができることを示したが、また、該活性に及ぼす有効量はＩＦＮ類の間で異なっていることを示すことにも成功している。ＩＦＮ−τは、１０２ＩＵ／ｍｌの量で単球でＩＰ−１０の発現を効果的に刺激することができるが、一方、ｒｈＩＦＮ−γはそれと同じ用量では有効ではなかった。ｒｈＩＦＮ−γによるＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現刺激が低いのが、ＩＦＮ−γが他のＩＦＮ類と比較して高度に種特異性を持っている（Ｐｅｓｔｋａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：７２７−７７７（１９８７））ということによるか否かは明らかにされてはいない。しかしながら、高用量のｒｈＩＦＮ−γ（１０４ＩＵ／ｍｌ）は単球でＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現を刺激することができるとの結果に注意しなければならない。すなわち、ｒｈＩＦＮ−γによりＩＰ−１０を効果的に誘導することができなかったのは、その活性がなかったことによるものではない。子宮内膜のＩＰ−１０  ｍＲＮＡの発現パターンは着床期の胚仔、ＩＦＮ−τ  ｍＲＮＡのレベルに続いて発現しているようにみえるもので、ＩＰ−１０発現の変動は、例えば、ＭＣＰ−１やＭＣＰ−２といった他の子宮内膜のケモカイン類と類似している。
ｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、上皮下間質の領域にＩＰ−１０  ｍＲＮＡを観察した。そして免疫細胞においてそのシグナルがあるようであった。ヒト及びマウスにおけるこれまでの研究（Ｌｕｓｔｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：６７２−６７６（１９８５）；Ｏｈｍｏｒｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６８：１２６１−１２６７（１９９０））で単球によりＩＰ−１０が分泌されていることが、そして本発明でＩＰ−１０がヒツジ単球において発現されているが、リンパ球、上皮細胞、及び間質細胞では発現していないことが見出された。加えて、ＭＣＰ  ｍＲＮＡも上皮下間質に偏在しており、ＭＣＰ陽性細胞は好酸球である（Ａｓｓｅｌｉｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｐｅｐｒｏｄ．，６４：９９２−１０００（２００１））。これらの観察結果は、上皮下間質に偏在しているＩＰ−１０は常在性のマクロファージ及び／又は該領域に集められたマクロファージによって産生されていることが示唆された。上皮下間質の領域にＩＰ−１０タンパク質が局在していることに加えて、ＩＰ−１０は子宮の管腔上皮や腺上皮にも存在していた。胚仔においては、極くわずかなＩＰ−１０タンパク質が検出されたが、ＩＰ−１０  ｍＲＮＡは検出されなかった。上皮下領域のマクロファージにより産生されたＩＰ−１０は表面の上皮の中に拡散してゆき、それはＣＸＣＲ３発現免疫細胞を着床部位に移動させることを誘引することが示唆される。
結論として、本発明により、ヒツジの子宮において着床期の間にはＩＰ−１０及びＩＦＮ−τ  ｍＲＮＡの経時的、細胞特異的に意味のある発現があること、そして胚仔のＩＦＮ−τでは子宮内膜のＩＰ−１０の発現を制御する能力があることを示しており、ＩＦＮ−τにより制御されたＩＰ−１０が反芻動物における着床期には免疫細胞の補充及び／又は再分配に重要な役割を果たしているとの可能性を提供している。
本発明により、ＩＰ−１０とＩＦＮ−τとの間の関係並びに子宮におけるＩＰ−１０の機能を解明する途が開拓されているものである。
【実施例２】〔動物組織の調製〕
発情周期１４日目と１７日目、及び妊娠１４日目、１７日目及び２０日目のヤギの子宮をイソフルレン麻酔下に摘出した。発情周期１４日目、及び妊娠１４日目及び１７日目のヤギから摘出した全適子宮をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析用に凍結した。妊娠１４日目及び１７日目、及び発情周期１４日目及び１７日目のヤギの子宮を灌流処置し、胚仔の単離や灌流液の収集用とした。ＰＢＳ（１５ｍｌ）を該子宮に穏やかに注入させ、収集した子宮灌流液を濃縮（Ｍａｃｒｏｓｅｐ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）し、ＩＰ−１０検出のウエスターンブロット分析に使用した。胚仔組織は妊娠１４日目（全胚仔）、１７日目（胚仔の約半分）及び２０日目（トロホブラスト部分のみ）のヤギから採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した。妊娠１７日目及び２０日目の胚仔の残存部分はＲＮＡ抽出及び免疫染色用に凍結した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養培地はＩＦＮ−τの検出用ウエスターンブロット分析に使用した。上皮細胞は発情周期１４日目のヤギの子宮から単離した。ＩＦＮ−τのＩＰ−１０産生刺激効果の試験用に発情周期１４日目のヤギの子宮内膜外植片を培養した。胚仔を取り除いたヤギ子宮内膜組織は凍結しＲＮＡ抽出に使用した。
〔Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養〕
全胚仔（１４日目、ｎ＝３）及び細片化した胚仔（１７日目及び２０日目、約２００ｍｇ／培養皿、各ｎ＝３）をＩｍａｋａｗａらの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ（１９９５），３，５１１−５１７）に基づいた条件下に培養した。
子宮内膜上皮細胞の分離及びその特徴づけはＴａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．（２００１）４７，１８１−１８７）により行った。発情周期１４日目のヤギの子宮角を０．７６％のＥＤＴＡ−ＰＢＳで満たし、３７℃で１時間プレインキュベートした。子宮内膜上皮を外科用ナイフで擦り取り、０．１％のコラゲネース（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で３７℃、８分間インキュベートした。細胞懸濁液をナイロンメッシュ（７０μｍ）に通し、密度勾配遠心分離法にかけた。回収した上皮細胞を４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、４０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％ＦＣＳを加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。該細胞をブタ皮タイプＩコラーゲン（Ｎｉｔｔａ  ｇｅｌａｔｉｎ、大阪、日本）でコートした２４−穴プレートに添加し、細胞が増殖飽和した段階で接着試験（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。
１７日目のヤギ胚仔から細胞を分離した。該胚仔は細片化し、０．２％のコラゲネース（Ｓｉｇｍａ）で３７℃、３０分間インキュベートした。該細胞をナイロンメッシュ（７０μｍ）に通し、抗生物質を含有するＤＭＥＭに再懸濁し、直ちにケモタキシスアッセイあるいは接着試験に使用した。更に、ウシＢ−細胞（ＫＵ−１、３３）及びヤギトロホブラストクローン細胞（ＨＴＳ−１、３３）を１０−２０％のＦＣＳ及び抗生物質を含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートした。
発情周期１４日目のヤギ子宮内膜組織（約６００ｍｇ  ｗｅｔ  ｗｅｉｇｈｔ／培地皿）を抗生物質を含有する２０ｍｌのＤＭＥＭ中で培養し、５ｎＭの組換えウシＩＦＮ−τ（ｒｂＩＦＮ−τ、Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、東京、日本）で処理した。３７℃、５％ＣＯ２含有空気条件下に２４時間培養後、子宮内膜組織を凍結し、ＲＮＡ抽出及びノーザンブロット分析に用いるため−７０℃に保存した。
〔ヤギＩＰ−１０及びＣＸＣＲ３  ｃＤＮＡのクローニング〕
実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲを利用してヤギ子宮内膜のＲＮＡからヤギＩＰ−１０及びＣＸＣＲ３のｃＤＮＡを増幅し、ｐＳＴＢｌｕｅベクター（ＴａＫａＲａ、東京、日本）にサブクローニングしてパーキン−エルマーシークエンサー（モデルＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＸＬ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を使って自動塩基配列分析を行った。ヤギＩＰ−１０及びＣＸＣＲ３の塩基配列比較をＢＬＡＳＴネットワークプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて行った結果、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢＯ９９８９２及びＡＢＯ９９８９３を得た。
〔ＣＸＣＲ３発現プラスミドのトランスフェクション〕
ヤギＣＸＣＲ３のオープンリーディングフレームをコードしている塩基配列をＰＣＲ増幅し、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。得られたプラスミドをＴｒａｎｓｆａｓｔＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によりその使用説明書にしたがってＫＵ−１細胞及びＨＴＳ−１細胞に導入した。導入２日後の細胞をケモタキシス又は接着試験に使用した。
〔組換えヤギＩＰ−１０及びそれに対する抗体の作製〕
ヤギＩＰ−１０（ｃＩＰ−１０）の全配列をコードしているヌクレオチド配列ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ｃＩＰ−１０のＮ−端末にヒスチジン−タグを組み込んでいる発現プラスミドｐＥＴ−１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。得られた発現ベクター、ｐＥＴ−１４ｂ−ｃＩＰ−１０で大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞を形質転換し、一夜培養した。培養細胞を集め、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）に再懸濁し、氷冷下音波破砕した。遠心分離により細胞片及び不溶性タンパク質を除去した後、上清中の組換えｃＩＰ−１０（ｒｃＩＰ−１０）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。組換えｃＩＰ−１０をニッケル−キレートカラム（Ｈｉ−ｔｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用してクロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）により精製した。目的のタンパク質をカラムからイミダゾール（２０−５００ｍＭ）濃度勾配溶離した後ＰＢＳで透析しイミダゾールを除去した。
２００μｇのｒｃＩＰ−１０タンパク質を含むＰＢＳをフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合しウサギ（ｎ＝２）に皮下注射した。ｒｃＩＰ−１０タンパク質を２週間毎に更に２回注射した。最後の注射の１週間後に抗体価を調べ、次の日に全血採取した。抗−ヤギＩＰ−１０抗体をＨｉｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いて抗血清から精製した。
〔ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターンブロット分析〕
プロテインアッセイキットＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  ＩＩ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してタンパク質濃度を測定した後、培養培地（３〜８μｌ、１０μｇタンパク質／レーン、ｎ＝３）、濃縮子宮フラッシング培地（１０μｇタンパク質／レーン、各日ｎ＝３）または組換えＩＰ−１０（５０または２００ｎｇ／レーン）をＮａｇａｏｋａらの方法（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２００３）６８，１４１３−１４２１）に従ってウエスターンブロット分析を行った。タンパク質検体はＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、還元条件下で１０％または１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動した後ゲルをクマシーブルーで染色した。ウエスターンブロット用にゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写した。該膜を室温で１時間、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ：大日本製薬、大阪、日本）でブロック処理した後、ヒツジＩＦＮ−τに対するウサギポリクローナル抗体（１：５０００、Ｄｒ．Ｂａｚｅｒからの贈呈）、ヒスチジン−タグ（Ｓｉｇｍａ）またはヤギＩＰ−１０（１：１０００）と共に４℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション後、該膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧロバ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）と室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。バンドはＥＣＬウエスターンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用して検出した。
〔ＲＴ−ＰＣＲ分析〕
Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン、東京、日本）を使って、子宮内膜組織、胚仔組織及び培養細胞（それぞれｎ＝３）から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ検体はまずＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマー（２０μｌ反応液容量）により逆転写した。ＣＸＣＲ３、ＸＣＲ１及びインテグリンレセプターのｍＲＮＡ量はオリゴヌクレオチドプライマー（表３）を使ってＰＣＲ増幅により測定した。
2004022082.tif 000004
プライマーペアによる各反応はＲＴテンプレート（１μｌ）及びＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（０．６２５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）により最終容量２５μｌで行った。全ＰＣＲ反応は、９５℃で１分間、６０℃で１分間、及び７２℃で１分間のサイクルを４０サイクル行い、最後に７２℃で１２分間反応させた。アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドによる可視化後、ＰＣＲ産物は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（ｖ３．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ；ＰＤＩ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＹ）を備えたイメージ解析システム（ＡＴＴＯ  Ｃｏｒｐ．，東京、日本）を使用して定量した。
〔ノーザンブロット分析〕
ノーザンブロット分析はＮａｇａｏｋａらの方法（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２００３）６８，１４１３−１４２１）に従って行った。ＤＩＧ標識ｃＲＮＡプローブはＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ってＩＰ−１０及びＣＸＣＲ３  ｃＤＮＡプラスミドから作製した。ＩＰ−１０  ｍＲＮＡの検出には全ＲＮＡを使用し、ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの試験にはポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（ＴａＫａＲａ）を使用してＰＢＭＣから単離した全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを取得した。全ＲＮＡ（２０μｇ／レーン、各ｎ＝３）あるいはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（２μｇ／レーン、各ｎ＝３）を電気泳動により分離し、ナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ−Ｂ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に転写した。該ナイロン膜にｃＲＮＡプローブを６３℃で１２時間ハイブリダイズさせた後、ＤＩＧ検出システムを用いてシグナルを検出した。
〔免疫蛍光検査法〕
凍結胚仔組織切片（１０μｍ、各試験日それぞれｎ＝３）をシラン−コートスライド上に載せ、アセトンで固定した。非特異的結合をブロックするためにＢｌｏｃｋ  Ａｃｅで室温、１時間処理した後、スライドをヒトＣＸＣＲ３に対するマウスモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）または正常マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と４℃、１２時間インキュベートした。一次抗体との反応後、スライドをＦＩＴＣ結合抗−マウスＩｇＧ  ヤギ抗体（１５μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で室温、１時間処理した。細胞核をヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で染色し、デジタル画像を共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ３００、ＯＬＹＭＰＵＳ、東京、日本）に記録した。
〔タンパク質のビオチン化及び検出〕
組換えｃＩＰ−１０タンパク質をＥＺ−連結ビオチン化試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してビオチン化した。コントロールとして組換えＧＳＴ及び組換えヤギリンホタクチン−ＧＳＴ（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ−ＧＳＴ）タンパク質をビオチンで標識した。ビオチン化はこれらのタンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌ  ＥＺ−連結ビオチン化試薬の１ｍｌと共にＰＢＳ中で氷冷下２時間インキュベートして行なった。インキュベーション後、透析して未反応のビオチンを除去した。タンパク質濃度を測定し、ビオチン化タンパク質（２μｇ／レーン）を還元条件下１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで展開しホースラディシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ａｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）により可視化し、標識効率を確認した。
凍結胚仔組織切片（１０μｍ、それぞれｎ＝３）をシラン−コートスライドに載せ、アセトンで固定化した。スライドをＢｌｏｃｋ  Ａｃｅで室温、１時間ブロック処理した。ビオチン化タンパク質（１００μｇ／ｍｌ）と室温で１時間インキュベートした後、スライドをホースラディシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（１：５０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）と室温で１時間、反応させた。ビオチン化タンパク質の組織への結合をＤＡＢ溶液（Ｓｉｇｍａ）を使って可視化した。組織切片をヘマトキシリンにより対比染色した。
〔ケモタキシスアッセイ〕
ＫＵ−１細胞、ＨＴＳ−１細胞及び初代トロホブラスト細胞の遊走活性を９６ウエル−修飾ボイデンチャンバー（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ；ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ、Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ、ＭＤ）内でポリビニルピロリドンを含まないポリカルボネート膜（５μｍ  ポアサイズ、ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ）を使って調べた。該ポリカルボネート膜は予め１０μｇ／ｍｌのウシ血漿フィブロネクチン（和光純薬、大阪、日本）によりコートして使用に供した。アッセイはＮａｇａｏｋａらの方法（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２００３）６８，１４１３−１４２１）にしたがって行った。すなわち、ケモタキシス用チャンバーのウエルの下部にｒｃＩＰ−１０の所定量を含有するＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ（フェノールレッド及びＦＣＳ不含）を添加し、チャンバーのウエルの上部に細胞（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ（フェノールレッド及びＦＣＳ不含）を添加した。チャンバーを３７℃、５％ＣＯ２含有空気雰囲気下で２時間インキュベーション後、膜を取り除き、ＰＢＳで洗浄、固定化後、Ｄｉｆ−Ｑｕｉｃｋ（国際試薬、神戸、日本）で染色した。下層へ移動した細胞の数を無作為に選んだ６つの領域において顕微鏡下でカウントした。阻止試験は、チャンバー下部への添加前にｒｃＩＰ−１０を抗−ＩＰ−１０抗体またはコントロールウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と３７℃、１時間プレインキュベーションして行った。これらの試験はそれぞれ３回ずつ行った。
〔接着性試験〕
２４−穴プレートにタイプＩコラーゲン（Ｎｉｔｔａ  ｇｅｌａｔｉｎ）またはフィブロネクチンを１０μｇ／ｍｌ濃度で室温、２時間コートするか、あるいはヤギ上皮細胞を貼り付ける。ＰＢＳで３回洗浄後、プレートを１％ＢＳＡで室温、３０分間ブロック処理した。ＨＴＳ−１細胞または初代トロホブラスト細胞を細胞内蛍光色素、カルセイン−ＡＭ（ｃａｌｓｅｉｎ−ＡＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）４μＭと３７℃、３０分間標識反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を所定量のｒｃＩＰ−１０と３７℃で１時間反応させ、各ウエルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳで３回洗浄し、ウエルに結合しなかった細胞を除去し、ウエルに結合した細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％エタノール含有ＰＢＳで処理した。細胞の蛍光を蛍光読取装置（励起フィルター４８５ｎｍ、発光フィルター５３５ｎｍ）（ＡＲＶＯＴＭ  ＳＸ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ．ＭＡ）を使って測定した。阻止試験は、ｒｃＩＰ−１０を３０μｇ／ｍｌの抗−ＩＰ−１０抗体またはコントロールウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と３７℃、１時間プレインキュベーションして行った。フィブロネクチンへの細胞の接着性に対するＩＰ−１０の関与について更に調べるために、５０ｍＭのＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＧＲＧＤＳＰＫ、Ｓｉｇｍａ）合成ペプチド、そのコントロール、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（ＲＧＥＳ、Ｓｉｇｍａ）、または５ｍＭのＥＤＴＡを細胞及びｒｃＩＰ−１０とプレインキュベーションした。これらの試験はそれぞれ３回ずつ行った。
〔統計学的解析〕
光学密度（ウエスターンブロット）及び光度（ＲＴ−ＰＣＲ）の測定は、統計学的解析システム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＹ）の一般線形モデルを採用した最小二乗法（ＬＳ）ＡＮＯＶＡで行った。Ｇ３ＰＤＨのＰＣＲ産物の光度はＲＴ−ＰＣＲ分析の共変量として使用した。ケモタキシスアッセイでは、遊走あるいは処理により付着した細胞の数は、未処理の細胞と比較した数として算出し、前述のように統計学的に解析して求めた。ＬＳ−ＡＮＯＶＡに用いられているモデルは変動値の母集団として処置及び複製を含んでいる。図中に描かれた最小二乗平均（ＬＳＭ）及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）は、この解析から得られた。
〔組換えヤギＩＰ−１０タンパク質及びそれに対する抗体の作製結果〕
ｐＥＴ−１４ｂ−ｃＩＰ−１０プラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１−ＳＩに組換えヤギＩＰ−１０（ｒｃＩＰ−１０）を発現させ、Ｈｉｓ−Ｔａｇを利用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ニッケルキレートカラムによる細胞溶解物の精製前（レーン１）と精製後（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１０Ａに示す。抗−Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体（レーン１）及び抗−ヤギＩＰ−１０抗体（レーン２）による精製ｒｃＩＰ−１０タンパク質（５０及び２００ｎｇ／レーン）のウエスターンブロット分析の結果を図１０Ｂに示す。特異的なバンドが約１４ｋＤａのところに見られた。
ｒｃＩＰ−１０の生物学的活性を調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏケモタキシスアッセイをヤギＣＸＣＲ３  ｃＤＮＡを導入したウシＢ−細胞株ＫＵ−１細胞を使用して行った。遺伝子の導入された細胞によるＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析により確認した。ＲＮＡはｐｃＤＮＡ３．１−ヤギＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３）或いは親のベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｍｏｃｋ）が導入されたＫＵ−１細胞から抽出した（図１０Ｃ、左）。ＣＸＣＲ３に対するｒｃＩＰ−１０の生物学的活性をＣＸＣＲ３を発現している（○）および発現していない（□）ＫＵ−１細胞を用いてケモタキシスアッセイにより調べた。各棒線はＬＳＭ±Ｓ．Ｅ．を示している。アッセイの結果は、ＣＸＣＲ３トランスフェクト細胞が１−２０ｎｇ／ｍｌのｒｃＩＰ−１０に対し常に応答したことを示していた。更に高濃度のｒｃＩＰ−１０に対しては応答の度合いが低下しており円錐形の用量反応曲線を示した（図１０Ｃ、右）。更に、免疫中和試験として２０ｎｇ／ｍｌのｒｃＩＰ−１０を添加したＫＵ−１細胞によるケモタキシスアッセイを行った（図１０Ｄ）。アッセイは抗体無添加（−）、３０μｇ／ｍｌの抗−ヤギＩＰ−１０抗体で前処理（ａｎｔｉ  ＩＰ−１０）及びコントロールとしてウサギＩｇＧで前処理（ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ）により行った。アスターリスク（＊）は有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。免疫中和試験では、抗−ｒｃＩＰ−１０抗体がｒｃＩＰ−１０のケモタキシス活性を低減することを示した。
〔妊娠初期におけるヤギ子宮内ＩＰ−１０の発現〕
妊娠１４日目、１７日目及び２０日目のヤギ胚仔由来の培養培地（１０μｇタンパク質／レーン）におけるＩＦＮ−τをウエスターンブロット分析により調べた。ＩＦＮ−τタンパク質産生は妊娠１７日目で最も高濃度を示した（図１１Ａ）。子宮内膜ＩＰ−１０  ｍＲＮＡのノーザンブロットの結果を図１１Ｂに示す。妊娠ヤギ（パネル左）の胚仔（１７日目：Ｃｏｎ）、子宮内膜（１４日目：Ｄ１４、１７日目：Ｄ１７、２０日目：Ｄ２０）及びｒｃＩＦＮ−τで２４時間刺激した発情周期ヤギ（１４日目、パネル右）からのＲＮＡ（２０μｇ／レーン）を１．２％アガロースゲルで電気泳動した。ノーザンブロット分析の結果は、ヤギ子宮内膜のＩＰ−１０  ｍＲＮＡのレベルが妊娠１７日目から上昇してくること、及び胚仔因子ＩＦＮ−τがｉｎ  ｖｉｔｒｏで発情周期１４日目の子宮内膜におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡレベルを刺激していることを示した（図１１Ｂ）。ＩＰ−１０タンパク質はウエスターンブロット分析により発情周期及び妊娠１４日目、１７日目のヤギ（それぞれｎ＝３）子宮灌流溶液中（１０μｇタンパク質／レーン）に検出された（図１１Ｃ、左）。ＩＰ−１０のウエスターンブロットの濃度解析結果（図１１Ｃ、右）の各棒線はＬＳＭ±Ｓ．Ｅ．を示し、アスターリスク（＊）は発情周期１４日目の子宮における値と比較した場合の有意差（Ｐ＜０．０５）を示している。妊娠１７日目の子宮灌流溶液は他の試験日の培地中よりも多量のＩＰ−１０を含有していた。ヤギ子宮におけるＩＰ−１０  ｍＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を図１１Ｄに示す。パネルａ、ｂ及びｃはそれぞれ発情周期１４日目、妊娠１４日目及び１７日目のヤギについてのＤＩＧ−標識アンチセンスヤギＩＰ−１０  ｃＲＮＡの結果である。パネルｄは妊娠１７日目のヤギについてのセンスＩＰ−１０の結果である。ここで、ｌｅは管腔上皮細胞、ｓｔは間質細胞、ｔｒはトロホブラストを示し、スケールバー（−）は５０μｍを示す。ＩＰ−１０  ｍＲＮＡが妊娠子宮内膜の上皮下間質領域に見られ、妊娠１７日目の子宮内膜では発情周期１４日目または妊娠１４日目の子宮内膜に比べて高いレベルのＩＰ−１０  ｍＲＮＡが検知された（図１１Ｄ）。
〔ヤギ胚仔におけるＣＸＣＲ３の発現と細胞内局在〕
妊娠１４、１７または２０日目のヤギ子宮内膜（Ｄ１４、Ｄ１７及びＤ２０、ｎ＝３）及び１７日目の胚仔組織（Ｃｏｎ、ｎ＝３）におけるＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した（図１２Ａ）。更に１７及び２０日目の胚仔（２μｇポリ（Ａ）＋ＲＮＡ／レーン、それぞれｎ＝３）におけるＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析により確認した（図１２Ｂ）。免疫蛍光検査分析を凍結胚仔及び抗−ＣＸＣＲ３抗体を用いて行った。抗−ヒトＣＸＣＲ３モノクローナル抗体（ａ）、正常マウスＩｇＧ（ネガティブコントロール、ｄ）、及び同一の領域の細胞核をヨウ化プロピジウムで染色（ｂ、ｅ）、及び抗−ＣＸＣＲ３抗体とヨウ化プロピジウムによる染色結果を重ねた画像（ｃ）を図１２Ｃに示した。スケールバーは１００μｍ。トロホブラスト層に斑点状の蛍光が観察され、核とははっきり異なる局在性を示している。
〔ヤギトロホブラスト細胞へのｒｃＩＰ−１０の結合〕
組換えｃＩＰ−１０タンパク質、組換えＧＳＴ及びヤギリンフォタクチン（リンフォタクチン−ＧＳＴ）をビオチン化し、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンによりビオチン化を確認した（図１３Ａ）。妊娠１７日目のヤギ胚仔（Ｃｏｎ）、子宮内膜（Ｅｎｄｏ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるＩＰ−１０レセプターＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ及びリンフォタクチンレセプターＸＣＲ１  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図１３Ｂ）。リンフォタクチンはＣケモカインファミリーに属し、ＩＰ−１０と同様に妊娠初期のヤギ子宮内膜に発現する。しかしながら、リンフォタクチンレセプターＸＣＲ１  ｍＲＮＡはＣＸＣＲ３とは異なり胚仔には検出されなかった。これらの理由により、リンフォタクチン／ＸＣＲをネガティブコントロールとして使用した。ビオチン化したタンパク質を妊娠１７日目のヤギ胚仔と反応させ、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで可視化した。ＣＸＣＲ３の存在はｒｃＩＰ−１０とインキュベートしたトロホブラスト細胞においてのみ観測された（図１３Ｃ）。スケールバーは２００μｍ。
〔ＣＸＣＲ３を発現している胚仔細胞に及ぼす組換えｃＩＰ−１０の遊走活性刺激〕
図１４Ａ、左は、ＨＴＳ−１細胞（−）、空プラスミドを導入したＨＴＳ−１（Ｍｏｃｋ）及びヤギＣＸＣＲ３  ｃＤＮＡを導入したＨＴＳ−１（ＣＸＣＲ３）から抽出したＲＮＡのノーザンブロットの結果を示している。ＨＴＳ−１細胞のケモタキシスアッセイを行った。ＣＸＣＲ３発現プラスミドでトランスフェクトされていないＨＴＳ−１（□）はｒｃＩＰ−１０に反応しなかったが、ＣＸＣＲ３発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＴＳ−１（○）は１−２０ｎｇ／ｍｌのｒｃＩＰ−１０に対し常に応答した。ｒｃＩＰ−１０の濃度が上昇するにしたがって反応性は低下し、円錐形の用量反応曲線を示した（図１４Ａ、右）。ＣＸＣＲ３発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＴＳ−１（黒棒）および空プラスミドでトランスフェクトしたＨＴＳ−１（白棒）の遊走活性に対するｒｃＩＰ−１０の作用を調べた（図１４Ｂ）。３０μｇ／ｍｌの抗−ｃＩＰ−１０抗体（Ａｂｓ：ＩＰ−１０）または３０μｇ／ｍｌの正常ウサギＩｇＧ（Ａｂｓ：ＩｇＧ）で前処理したｒｃＩＰ−１（２０ｎｇ／ｍｌ）をこれらＨＴＳ−１細胞と反応させた。ｒｃＩＰ−１０で処理された細胞の遊走細胞数を未処理細胞の遊走細胞数で割った数を遊走細胞率とした。アスターリスク（＊）は有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。抗−ｒｃＩＰ−１０抗体がｒｃＩＰ−１０のケモタキシス活性を低減することを示した。次いで、妊娠１７日目のＣＸＣＲ３を発現している初代トロホブラスト細胞についてケモタキシスアッセイを行った。該トロホブラスト細胞の遊走性はｒｃＩＰ−１０タンパク質によって促進され、ケモタキシス活性は抗−ＩＰ−１０抗体により中和された（図１４Ｃ）。
〔フィブロネクチン及び子宮内膜上皮細胞へのトロホブラスト細胞の接着性に及ぼすｒｃＩＰ−１０の影響〕
コラーゲンＩまたはフィブロネクチンでコートした或いは何もコートされていないプレートへのｒｃＩＰ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）で活性化した（＋）または活性化していない（−）ヤギトロホブラスト細胞（妊娠１７日目）の接着性試験の結果、フィブロネクチンをコートしたプレートへのｒｃＩＰ−１０活性化細胞の接着率が非常に高かった（図１５Ａ）。阻止試験として、抗−ｃＩＰ−１０抗体（ＩＰ−１０）または正常ウサギＩｇＧ（ＩｇＧ）でｒｃＩＰ−１０を前処理してトロホブラスト細胞のフィブロネクチンへの接着性試験を行った（図１５Ｂ）。更に、５０ｍＭのＲＧＤペプチド（フィブロネクチンのＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）サイトを介して起こる細胞接着を阻止する）、５０ｍＭのＲＧＥペプチド（不活性コントロール）または５ｍＭのＥＤＴＡ（インテグリンシグナルのインヒビター）をトロホブラスト細胞に添加してケモタキシスアッセイを行った（図１５Ｂ）。組換えｃＩＰ−１０で活性化されたトロホブラスト細胞のフィブロネクチンへの接着性をＲＧＥペプチドは阻止しなかったが、ＲＧＤペプチドは阻止した。ＥＤＴＡもまたトロホブラスト細胞のフィブロネクチンへの接着を阻止した。
ＣＸＣＲ３  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＴＳ−１細胞（黒棒）は、フィブロネクチンへの細胞の接着性がｒｃＩＰ−１０タンパク質により活性化され、抗−ＩＰ−１０抗体によりその活性化が抑制された（図１５Ｃ）。ＲＧＤペプチドまたはＥＤＴＡの添加によりＣＸＣＲ３トランスフェクト細胞のフィブロネクチンへの接着性は抑制された（図１５Ｃ）。空プラスミドでトランスフェクトした細胞（白棒）の遊走活性もまたＲＧＤペプチド及びＥＤＴＡで抑制された。
ＣＸＣＲ３プラスミドでトランスフェクトしたＨＴＳ−１細胞（黒棒）及び空プラスミドでトランスフェクトしたＨＴＳ−１細胞（白棒）の子宮内膜上皮細胞に対する接着性試験を行った（図１５Ｄ）。ＣＸＣＲ３を発現しているＨＴＳ−１の子宮内膜上皮細胞への接着性はｒｃＩＰ−１０タンパク質によって上昇し、ＩＰ−１０に対する抗体による中和試験により阻止された。ＥＤＴＡ処理トロホブラスト細胞では上皮細胞に対する接着活性は失われた。ＲＧＤペプチドは接着活性を抑制した。各棒線はＬＳＭ±Ｓ．Ｅ．を表し、アスターリスク（＊）は有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
〔組換えｃＩＰ−１０により活性化されたヤギトロホブラスト細胞におけるインテグリンサブユニットの発現〕
組換えｃＩＰ−１０により活性化されたＨＴＳ−１細胞によるインテグリンサブユニットの発現を調べた。インテグリンサブユニット、α５、αＶ、β１、β３及びβ５の転写をＲＴ−ＰＣＲにより検出した。トロホブラスト細胞におけるインテグリンα５、αＶ及びβ３サブユニットｍＲＮＡの発現がｒｃＩＰ−１０により促進され、この促進は抗−ＩＰ−１０抗体により中和された（図１６）。インテグリンβ１及びβ５サブユニットｍＲＮＡの発現はｒｃＩＰ−１０により影響されなかった。各棒線はＬＳＭ±Ｓ．Ｅ．を表す。
以上の結果より、ヒツジと同様、ヤギの子宮において着床期の間にはＩＰ−１０及びＩＦＮ−τ  ｍＲＮＡの経時的、細胞特異的に意味のある発現があること、そして胚仔のＩＦＮ−τが子宮内膜のＩＰ−１０の発現を制御する能力があることが示され、ＩＦＮ−τにより制御されたＩＰ−１０が着床期に免疫細胞の補充及び／又は再分配に重要な役割を果たしている可能性が示されている。
本発明により、ＩＰ−１０とＩＦＮ−τとの間の関係並びに子宮におけるＩＰ−１０の機能を解明する途が開拓される。
【産業上の利用可能性】  本発明により、ＩＰ−１０が、胚が子宮に着床する現象や過程を制御することを利用する技術が提供されたことにより、母親の妊娠認識過程を制御する医薬、動物薬、治療法、活性測定法、アッセイ法、それらに使用される試薬などを提供する途を開くものである。本発明に従い、妊娠現象の調整制御か可能となり、ヒト及び家畜を含めた動物について、妊娠を確実に成功せしめたり、妊娠を防いだりすることが可能となるし、そうした目的に重要な物質や薬物の開発が容易になる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【配列表フリーテキスト】
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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