(57)【要約】試料をドットブロット法に供した後、タンパク質染色のための蛍光染色法に付して試料中に含まれる微量のタンパク質を分析することによりタンパク質の分析を行う。この方法により、飲食品、食品添加物、医薬品、飼料等の中に含まれるアレルギー性物質等の微量タンパク質を簡便かつ高感度に分析することができる。上記目的とする分析方法を提供し、試料中に含まれるタンパク質の定量分析及び限度分析を可能とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をドットブロット法に供した後、タンパク質染色のための蛍光染色法に付することを特徴とする試料中に含まれるタンパク質の分析方法。
【請求項２】
試料中に含まれるタンパク質の定量分析法又は限度分析法である請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
当該試料を溶液状態で当該ドットブロット法に供し、試料中に含まれるタンパク質固定用膜上にタンパク質を固定化するための工程と、当該蛍光染色法による当該膜上に固定化したタンパク質用の染色工程とを含む請求の範囲１又は２記載の方法。
【請求項４】
当該試料が、飲食品、食品添加物、医薬品及び飼料の何れかである請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】
少なくとも０．１ｐｐｍのタンパク質が分析可能な請求の範囲１記載の方法。
【請求項６】
当該膜がニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜である請求の範囲３記載の方法。
【請求項７】
当該試料がアミノ酸である請求の範囲１記載の方法。
【請求項８】
請求の範囲１〜７何れか記載の方法でタンパク質が分析されたことを特徴とする製品、又はこれを含有又は使用した製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、飲食品、食品添加物、医薬品、飼料等に含まれるタンパク質の新規分析方法に関する。
【背景技術】  食品や、食品添加物中に含まれる不純物の一つにアレルギー性物質があり、近年問題となっている。このアレルギー性物質を含む食品に起因する健康危機を防止するために、２００１年４月、衛生法の関連法令が改定され、特定原材料５品目（卵、乳、小麦、そば、落花生）中のアレルギー物質の表示が義務化された。また、アレルギー性物質はタンパク質であることから、厚生労働省は、総タンパク質が数μｇ／ｇ以上含有する食品は表示が必要との方針を出している（平成１３年１０月２９日付け厚生労働省医薬局食品保険部企画課「食品表示研究班アレルギー表示検討会中間報告」参照。）。
このような背景の下、食品、或いは食品添加物中に微量に含まれるアレルギー性物質の検出には、一般的にはエンザイムイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）が用いられている。省令施行直前の平成１４年３月に、日本ハム（株）から主要５品目に対するＥＬＩＳＡキットが発売されている。同じく、平成１４年３月２７日に、雪印乳業（株）が大豆タンパク質のＥＬＩＳＡ法について、日本農芸化学会で発表している（平成１４年日本農芸化学会年会）。この方法では、原料から生理食塩水でタンパク質を抽出し、これをウサギに免疫し、プロテインＡカラムで粗精製したＩｇＧを用いて、ＥＬＩＳＡの系を確立している。その感度は、大豆で１ｎｇ／ｍｌと、高感度であるが、原料と抗体の精製度が低いことから、大豆タンパク質に対する選択性は低い。また、抗原に関する情報が全く無い。このようにＥＬＩＳＡ法は、先ずアレルゲン（抗原）に対する抗体を作成する必要があり、分析法確立までに時間を要することに加えて、また全てのアレルゲンを検出できる保証も無い。更には、使用する抗体の性質により、感度や、特異性にばらつきがあるといった問題点がある。また、ＥＬＩＳＡ法は抗原−抗体反応を用いているために、抗原と抗体が結合する中性溶液を試料溶液に採用しなくてはならない。しかしながら、固形試料の場合には必ずしも中性付近の溶解度が高くないものもある。例えば、アミノ酸にも中性付近で溶け難いものがある。チロシンの場合、中性付近での溶解度が非常に低いため、重量あたりのタンパク質検出感度は、ＥＬＩＳＡでも数十〜数百ｐｐｍとなってしまう。
一方、ドットブロット法に染色法を組み合わせた方法も知られている。例えば、ドットブロット法で、一般に、膜上に濃縮、保持されたタンパク質は、クーマシーブリリアントブルー法等で染色することにより、視覚化される。他に高感度の染色法としては、金コロイド染色法が知られているが、バックグラウンドが高くなること、染色ムラが起こること、操作が煩雑である等、欠点が多い。
以上のような情況下に、微量のタンパク質を簡便かつ再現性良く高感度に分析する方法が求められている。
【発明の開示】
１．発明が解決しようとする課題
本発明が解決しようとする課題は、飲食品、食品添加物、医薬品、飼料等の中に含まれるアレルギー性物質等の微量タンパク質の簡便かつ再現性良い高感度の分析方法を提供することにある。
２．課題を解決するための手段
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、従来生化学分野で用いられてきたドットブロット法と蛍光染色法を組み合わせることにより、検査対象（試料）中に含まれる微量タンパク質の簡便かつ高感度の分析が可能であることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は、一つの形態として、試料をドットブロット法に供した後、タンパク質染色のための蛍光染色法に付することに特徴を有する試料中に含まれるタンパク質の分析方法に存する。
この発明の分析方法においては、試料中に含まれるタンパク質の定量分析及び限度分析（限度試験）が可能である。
上記方法においては、当該試料を溶液状態で当該ドットブロット法に供し、試料中に含まれるタンパク質固定用膜上にタンパク質を固定化するための工程と、当該蛍光染色法による当該膜上に固定化したタンパク質用の染色工程とを含めることができる。
当該試料としては、飲食品、食品添加物、医薬品及び飼料、並びにこれ等の中間品を使用することができる。好ましい例としてアミノ酸を挙げることができる。このような製品中に含まれる微量タンパク質の検出には十分な感度を、この方法は有している。
この方法においては、好ましい場合少なくとも０．１ｐｐｍのタンパク質を分析することができる。
上記タンパク質固定用膜の好ましい例として、ニトロセルロース膜及びＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜を挙げることができる。
本発明は、別の形態として、上記本発明の方法でタンパク質が分析された製品、例えば飲食品、食品添加物、医薬品及び飼料、並びにこれ等の中間品、並びにアミノ酸等も本発明に含まれる。更に、このように分析された製品を含み、又は使用したもの（製品）も、当然本発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】    ［図１］
図１は、実施例１で使用したドットブロット装置の概略図である。
１．試料テンプレート；２．ガスケット；３．ガスケットサポートプレート；４．バキュームマニフォールド；５．膜；及び６．濾紙。
［図２］
図２は、実施例１においてＢＳＡ（牛血清アルブミン）標品とアミノ酸＋ＢＳＡ試料の画像データの１例を図示したものである。
レーン１，２：アミノ酸＋ＢＳＡ試料；レーン３，４：ＢＳＡ標品。
［図３］
図３は、実施例１において標準添加法によるアミノ酸中のタンパク質濃度算出法を示したものである。
●：アミノ酸；■：ＢＳＡ．；矢印：アミノ酸溶液中のタンパク質濃度。
横軸：ＢＳＡ添加量；縦軸：蛍光強度。
［図４］
図４は、実施例１においてドットブロット−蛍光染色法を用いたＧｌｕ−Ｎａ（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物）及びＴｈｅ（Ｌ−テアニン）中のタンパク質の測定結果（標準添加法）を示したものである。
●：ＢＳＡ；■：Ｇｌｕ−Ｎａ；▲：Ｔｈｅ。
横軸：ＢＳＡ濃度（ｐｐｍ）；縦軸：蛍光強度。
［図５］
図５は、実施例２においてドットブロット−蛍光染色法を用いたＢＳＡ、リゾチーム、ユビキチン、インスリン及び酸化型インスリンＢ鎖のタンパク質測定結果を示したものである。
●：ＢＳＡ；■：インスリン；▲：ユビキチン；×：インスリン酸化型Ｂ；＋：リゾチーム。
横軸：タンパク質濃度（ｐｐｍ）；縦軸：蛍光強度。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、本発明の実施の形態について説明する。
本発明においては、分析すべき試料をドットブロット法によりタンパク質固定用の膜上に、試料中に含まれるタンパク質を固定化する。この場合通常は溶液状態で固定化される。
ドットブロット法とは、その代表例を示すと、多数の穴の空いたアクリル板の間に、例えばニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＰＶＤＦ膜）等を挟んで、膜上の穴にタンパク質溶液を注入し、水流ポンプによって吸引濾過することにより、タンパク質を膜上に固定する方法である。これにより、多種類のタンパク質試料を同時に濃縮及び脱塩しながら、膜上に固定保持することができる（遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析、ブロッティングとシークエンシング、平野久著、東京化学同人発行、ｐ．６２参照。）。
次に、前記膜上に固定されたタンパク質を蛍光染色法により染色後、これを測定する。
近年、プロテオーム解析用として開発された蛍光染色試薬ＳｙｐｒｏＲｕｂｙは、ＳＤＳ電気泳動法でタンパク質を分離したゲルの蛍光染色試薬である。この試薬を使用することにより、従来法に比較して染色が迅速かつ簡単で、高感度かつ定量性が高い等の利点が得られる。これを、例えばＰＶＤＦ膜に固定化したタンパク質の検出或いは定量に用いることができる。高感度のタンパク質定量であればあるほど、通常の操作では、容器への吸着等によるロスが大きく、検出することは困難である。そこで、微量タンパク質の取り扱いを更に検討した結果、希釈操作は可能な限り減らすこと、容器、チップ等はシリコナイズ処理をしたものを使用することにより、０．１ｐｐｍのタンパク質を検出できる高感度タンパク質定量分析法を確立するに到った。
本発明方法によれば、ドットブロット法−蛍光染色法の組み合わせで、比較的短時間（サンプル調製から画像解析までおよそ４−５時間）、高感度でかつ定量性の高い微量タンパク質の分析方法を提供することができる。本発明方法を、ＥＬＩＳＡ法と比べると、感度の面で若干劣るところもあるが、膜に保持され得るタンパク質全てを測定対象とすることができる点で優れている。更に、これよりも小さなタンパク質についても疎水性が高ければ検出可能であるし、好ましいタンパク質固定用の膜を選択又は開発したりすることでもそれが検出可能となる。また、固形試料の場合は、溶解度が高いほど、重量あたりの検出感度が高くなる。本発明では、溶媒のｐＨ値を選ばないため酸性、中性及びアルカリ性何れの溶媒でも使用することができるので、試料の溶解度に最適なｐＨ値の溶媒に試料を溶解して使用することが可能であり、この結果検出感度を向上させることができる。
ＥＬＩＳＡ法の定量性及び特異性は、用いる抗体の性質に大きく左右されるし、また抗原となり得るタンパク質或いはペプチドを完全に漏らさずに測定することは非常に困難である。その上、抗体が用意されていない抗原を検出することはできない。これに対し、本発明によるドットブロット法−蛍光染色法は、総タンパク質を検出することから、タンパク質の抗原性の有無を問わず評価することが可能であり、より信頼性の高い測定法であると言うことができる。
次に、本発明の手順を簡単に説明する。代表的かつ好ましい例を中心に説明するが、これは代表例を示すものであり故にこの代表例の説明により本発明が何等制限を受けるものではない。
溶液試料の場合はそのまま、固体試料の場合は、溶解度の高い溶液の形態で試料を可能な限り高い濃度で溶解する。アミノ酸の場合は、酸性溶液での溶解度が高いことから、３．５％塩酸水溶液で溶解することが望ましい。標準添加法により、正確に試料中のタンパク質量を求めるために、標準タンパク質（例えば、牛血清アルブミン：ＢＳＡ）を適宜添加した試料を調製する。次に、ドットブロット法を用いて、例えば、ニトロセルロース膜或いはＰＶＤＦ膜に試料中のタンパク質を捕捉させると同時に、試料中の測定妨害物質の除去を行なう。９６穴のドットブロット用装置が市販されており、これを使用すると、同時に多検体を処理することができる。
試料を注入後、アスピレーターで吸引することにより、試料中のタンパク質を、タンパク質固定用膜に吸着させる。膜の材質には、吸着能の高いＰＶＤＦ膜が望ましい。液体が全て吸引された後、数回水を注入し、吸引することで、膜に残った分析妨害物質を除去することができる。アミノ酸試料の場合では、染色液に反応するアミノ酸と妨害する低分子や塩酸等を除去することができる。続いて、洗浄後の膜をブロッテリング装置（ドットブロット装置；図１参照。）より取り出し、十分に乾燥させる。
上記の如く乾燥した膜は、蛍光染色試薬を用いて染色する。プロテオーム解析用として開発された蛍光染色試薬ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ（モレキュラー・ダイナミクス社製）は、感度と定量性の高い試薬であり、この試薬を好ましく使用することができる。
このように乾燥して得られた膜に対して酢酸−メタノール溶液処理を施すことにより、タンパク質を固定化した後に、蛍光染色試薬でタンパク質を染色、その後膜を洗浄し、好ましくは蛍光画像検出装置を用いて解析する。
得られた画像データで、各試料及びそれにＢＳＡを添加した試料がスポットとして観測される。各スポットのエリア強度を求め、標準タンパク質添加量を横軸に、蛍光エリア強度を縦軸にとり、プロットするとよい。後述の実施例ではブランク試料のＹ軸切片がバックグラウンドとなることから、それを水平に引いた線に検体試料を外挿し、その切片を検体中のタンパク質濃度とした。標準タンパク質として、ＢＳＡを用いた場合、少なくとも０．１ｐｐｍのＢＳＡを検出することができた。溶液試料の場合においては、この検出感度がそのまま適用される。一方、固体試料の場合においては、試料の溶解度に検出感度が依存する。検体の最も高い溶媒で溶解することにより、最大の検出感度を得ることができる。
本発明方法においては、酸、アルカリでも、膜にタンパク質を吸着させた後に、除去することができるため、溶媒の種類により制限を受けない点でも優れている。
アミノ酸の場合、中性で溶解度の低いチロジンやシスチン等も、酸性にすることにより溶解度が向上する。
最近、米国を始めとして日本でも、遺伝子組み替え生物、植物を用いた食品及び食品添加物が市場に出回るようになったが、依然として消費者のＧＭＯ（遺伝子組換え作物）に対する不安が根強く存在している。ＧＭＯを利用して生産された食品添加物中の残存タンパク質を可能な限り高感度で定量或いは検出し、製品の品質を保証することは、今後益々必要になってくると考えられる。
更に、最近脚光を浴び始めた再生医療の分野においては、人の組織や臓器をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生し、移植する最先端の医療技術であり、今後更なる発展が期待されている分野である。これ等組織や臓器を再生する際に用いる培地は、異種・他人のタンパク質がアレルゲンとなり得るため、無タンパク質培地が一般的に用いられる。従って、再生医療の分野においても、培地中のタンパク質を可能な限り高感度で分析或いは定量する方法、手段が待ち望まれている。この他にも、医薬品、化粧品、サプリメント（栄養補助剤、栄養補助食品）や健康食品中のタンパク質の高感度測定も今後益々重要になってくると考えられる。
以上のような多くの各種要請に対して本発明は極めて有用であり、期待が大きい。
好適な実施の形態
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこの実施例により何等限定されるものではない。
（実施例１）食品添加物用アミノ酸中のタンパク質定量
器具
使用した器具は下記の通りである。
微量９６検体同時濾過装置（アトー（株）ＡＥ−６１９０型）；
蛍光画像解析装置（アマシャム・バイオテク製Ｆｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ５９５又はＴｙｈｏｏｎ  ８６００）；
ＰＶＤＦ膜（ミリポア製ＰＶＤＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ）；
振とう機（東京理化（株）ＭＵＬＴＩ  ＳＨＡＫＥＲ  ＭＭＳ）；
クリーンドラフト（ヤマト科学製）；
アスピレーター；
ポリメスフラスコ（１００ｍｌ）；
シリコナイズエッペン（１．５ｍｌ）；
シリコナイズチップ（２５０，１０００μｌ）；及び
マイクロピペッター。
試薬
使用した試薬は下記の通りである。
蛍光染色液（モレキュラープローブ社Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｔ  ｓｔａｉｎ  ２００ｍｌ入り）；
ＢＳＡ標品（ＳＩＧＭＡ製ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  １０００ｐｐｍ）；
塩酸（関東化学（株）超高純度試薬２５０ｍｌ入り）；
酢酸（純正化学（株）特級５００ｍｌ入り）；及び
メタノール（純正化学（株）高速液体クロマトグラフィー用３Ｌ入り）。
実験操作手順
実験操作手順、即ち分析手順と実験操作を以下に示す。
分析手順
１．器具洗浄（ウェルの洗浄）
↓
２．試薬の調製（３．６％塩酸，固定液）
↓
３．試料調製
（アミノ酸溶解，ＢＳＡ標品の希釈，アミノ酸に標品添加）
↓
４．ＰＶＤＦ膜の切断と活性
↓
５．３．６％ＨＣｌに３０分間浸潤
↓
６．膜をブロッターにセットし、洗浄
↓
７．試料を膜に添加
↓
８．膜を洗浄
↓
９．膜を乾燥
↓
１０．タンパク質を膜に固定
↓
１１．膜を洗浄
↓
１２．膜を染色
↓
１３．膜を洗浄
↓
１４．蛍光画像装置での測定と解析
実験操作
１．サンプルウェル、シールガスケット、及びガスケット保持プレートを純水で器具を洗浄する。
２．試薬の調製
２−１．３．６％塩酸；３６％塩酸（関東化学（株）超高純度試薬２５０ｍｌ入り）から、マイクロピペッターで１０ｍｌ採取し、１００ｍｌポリメスフラスコに入れ純水でメスアップ（１００ｍｌ）する。
２−２．固定液
メタノール（純正化学（株）高速液体クロマトグラフィー用３Ｌ入り）１０ｍｌと酢酸（純正化学（株）特級５００ｍｌ入り）７ｍｌをマイクロピペットでとり、１００ｍｌポリメスフラスコに入れ、純水でメスアップ（１００ｍｌ）する。
３．試料調製
３−１．アミノの秤量と溶解
下記アミノ酸を１２０ｍｇ／ｍｌになるように、３．６％塩酸で溶解する。（１．５ｍｌシリコナイズエッペンを用いる。）
Ｌ−Ａｓｐ，（Ｌ−Ｃｙｓ）２，Ｌ−Ｇｌｕ，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｔｒｐ，Ｌ−Ｇｌｎ，Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ，Ｌ−Ｇｌｕ−Ｎａ。
Ｌ−Ｐｈｅについては、７０ｍｇ／ｍｌになるように、３．６％塩酸に溶解する。
３−２．スタンダード（標準試薬：ＢＳＡ）の調製
０，０．１，０．２，０．５μｇ／ｍｌになるように、３．６％塩酸で希釈する。尚、０μｇ／ｍｌは、３．６％塩酸とする。
３−３．測定試料アミノ酸溶液（ＳＡ）の調製
ＳＡ中のＢＳＡ濃度が、０，０．１，０．２，０．５μｇ／ｍｌになるように、アミノ酸溶液で希釈する。尚、０μｇ／ｍｌは、アミノ酸溶液とする。
４．ＰＶＤＦ膜の切断と活性化
ＰＶＤＦ膜を約１２ｃｍ×９ｃｍになるようにハサミで切り、裏表が分かるように右上と鉛筆で書く。容器に、メタールを入れ１分間浸ける。
５．３．６％ＨＣｌに３０分間浸潤
容器に塩酸を入れ、活性処理後のＰＶＤＦ膜を３．６％塩酸に３０分間浸ける。
６．膜をブロッターにセットし、洗浄
膜をブロッターにセットし、３．６％塩酸３５０μｌをアプライし、アスピレータで吸引しながら洗浄する。尚、ここで使用したブロッテリング装置（ドットブロット装置）の概略を図１に示している。
７．試料を膜にアプライ
ＳＡ３５０μｌをアプライし、アスピレータで吸引する。
８．膜の洗浄
３．６％塩酸３５０μｌをアプライし、アスピレータで吸引しながら洗浄する。次に、純水３５０μｌをアプライし、アスピレータで吸引しながら洗浄する。
９．膜の乾燥
膜をブロッターから外し、クリーンドラフト内で１時間乾燥する。
１０．タンパク質を膜に固定
固定液を専用用器に入れ、乾燥した膜の転写面を下にして固定液に浮かべる。振とう機を用いて１５分間固定を行なう。（振とう機のスピードは、５０ｒｐｍで行なう。）
１１．膜の洗浄
容器に純水を入れる。膜の転写面を下にして純水に浮かべる。振とう機を用いて５分間洗浄を行なう。（振とう機のスピードは、５０ｒｐｍで行なう。）膜を取り出し容器の純水を交換後洗浄する。純水よる洗浄操作を、４回行なう。
１２．膜の染色
容器に染色液を入れる。膜の転写面を下にして染色液に浮かべる。振とう機を用いて１５分間染色を行なう。（振とう機のスピードは、５０ｒｐｍで行なう。）
１３．膜の洗浄
１５分後、膜を取り出し容器に純水を入れる。膜の転写面を下にして純水に浮かべる。振とう機を用いて１分間洗浄を行なう。（振とう機のスピードは、５０ｒｐｍで行なう。）膜を取り出し容器の純水を交換後洗浄する。純水による洗浄操作を、２回行なう。
１４．蛍光画像装置による測定と解析
１４−１．蛍光画像処理装置の使用法
測定条件及び測定手順を下記に示す。
測定条件：
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  ：Ｒｏｘ６１０ＢＰ３０
ＰＭＴ                          ：４１５
Ｌａｓｅｒ                      ：Ｇｒｅｅｎ（５３２ｎｍ）
Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ          ：Ｎｏｒｍａｌ
測定手順：
（ア）本体のカバーを開け、ガラス板にＰＶＤＦ膜をのせる。このとき、染色面を下向き（ガラス側）にする。
（イ）上から無蛍光ガラス板をのせて膜をおさえる。
（ウ）本体カバーを閉じる。
（エ）スキャン（Ｓｃａｎ）範囲を設定し、測定を開始する。
（オ）スキャンが終了したら、データを保存する。
（カ）感度不足、蛍光が飽和した場合は、ＰＭＴ  ｖｏｌｔａｇｅの値を変えて、再度測定する。
１４−２．画像処理装置
市販のソフトウエアを用いて、画像処理を行なう。図２に示したように、スポットを丸く囲みその中の蛍光強度の積分値を求める。
（結果）
ドットブロット法で得られる画像の一例を図２に示した。図２に示したように、ＢＳＡ標品においては、添加量に従ってスポット濃度も高くなっている。ＢＳＡ添加量０．１μｇ／ｍｌ（０．１ｐｐｍ）が明らかに観測されていることから、本発明では、少なくとも０．１ｐｐｍのタンパク質を検出することができる。実際のアミノ酸試料の場合も同様にスポット濃度変化が観測されたが、更にサンプルスポットと同心円状にドーナツ型に蛍光が観測された。これは、アミノ酸を減圧除去する際に、ウエルの周りに浸潤したものが蛍光試薬と反応していると考えられる。従って、定量分析をする際は、スポット部分の蛍光強度の積（ボリューム）を採用することとした。その結果、ＢＳＡと各アミノ酸の添加回収実験では、傾きが異なるけれども、共に直線性が見られた。アミノ酸の種類によって傾きが異なる理由としては、▲１▼アミノ酸の存在により、ＢＳＡの器具等への吸着量に差が見られる、▲２▼ＢＳＡにアミノ酸が吸着して残存している、の２点が考えられる。そこで、同じ膜で測定したＢＳＡの線と、ブランク（ＢＳＡ無添加）のＹ軸を通る線を基準として、標準添加法による各アミノ酸の線との交点をタンパク質濃度とした（図３参照。）。実試料中のタンパク質濃度は、各アミノ酸の希釈倍率に従って、下記の式を用いて算出した。
実試料中のタンパク質濃度＝標準添加法で求めた溶液中のタンパク質濃度×希釈倍率。
希釈倍率：Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ  １４．３倍；及び上記以外  ８．３倍。
この結果、標品とした牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で０．１ｐｐｍ、アミノ酸では試料換算で１ｐｐｍを少なくとも検出することができた。
尚、図３は標準添加法によるアミノ酸中のタンパク質濃度算出法を示したもので、矢印をアミノ酸溶液中のタンパク質濃度とした。
本法を用いて食品添加物用アミノ酸２５品目について分析を実施した。その結果の一部を図４に、また２５品目の定量結果のうちその一部を表１に示しているが、２５品目の全てのアミノ酸について、試料中のタンパク質は１ｐｐｍ以下（１μｇ／ｇ以下）であった。
尚、図４にはドットブロット−蛍光染色法を用いて、食品添加物用アミノ酸、ＧｌｕＮａＨ２Ｏ（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物）及びＴｈｅ（Ｌ−テアニン）中のタンパク質測定結果（標準添加法）を示す。
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以上の結果、この方法によりアミノ酸中のタンパク質を高感度に分析できることが示された。特に、タンパク質固定用の膜としてのＰＶＤＦ膜及び蛍光染色試薬を用いたドットブロット法が有効であることも分かった。この方法を用いて食品添加物アミノ酸２５品目を測定した結果では、全ての品目について、試料中のタンパク質は１ｐｐｍ以下であることも明らかとなった。
本実施例では、アミノ酸濃度を一定としたが、溶解性が高いアミノ酸の場合においては、濃度を高くすることにより、更に検出感度を向上させることができる。
（実施例２）検出できるタンパク質の分子量範囲
分子量の大きなタンパク質が抗原となり易い為、ＥＬＩＳＡでは高分子量のタンパク質が検出され易い。一方、低分子量のタンパク質であってもアレルゲンとなりうる為、より低分子量タンパク質や、ペプチドを高感度で検出することが望ましい。本発明の手法で、分子量の異なるタンパク質ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、リゾチーム（１４ｋＤａ）、ユビキチン（８．６ｋＤａ）、インスリン（５．７ｋＤａ）、及び酸化型インスリンＢ鎖（３．５ｋＤａ）を用いて、検出下限と定量性の評価を行った。実施例１のＢＳＡに替わり、各タンパク質を適宜希釈し、ドットブロット−蛍光染色法により、検量線を作成した。その結果（図５参照。）、何れのタンパク質においても、直線性の高い検量線を引くことができ、０．１ｐｐｍ（酸化型インスリンＢ鎖のみ０．２ｐｐｍ）の検出下限であり、低分子量のタンパク質であっても高感度に検出することができた。
【発明の効果】
以上説明した通り、本発明によりタンパク質の分析方法が提供され、この方法により、飲食品、食品添加物、医薬品、化粧品、飼料等に含まれるアレルギー性物質等の微量タンパク質の分析を簡便かつ高感度に行なうことができる。従って、本発明は産業上、特に食品、医薬品、化粧品、飼料等の分野で広く実施することができ、故にその有用性は明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2004011948.tif 000009
2004011948.tif 000010