(57)【要約】本発明は、新規な超好熱菌、特に、有機廃棄物を８５℃以上の温度で発酵させて得られたたい肥に由来する、８０℃以上で増殖することのできる新属に属する超好熱菌（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）に関する。本発明の超好熱菌は、５０℃以下では増殖せず、７０〜８５℃で活発に生育・増殖する。胞子を形成せず、グラム陰性で絶対好気性桿菌である。有機廃棄物を高温で発酵させ、たい肥を製造するときの発酵微生物として有用である。また、耐熱性酵素の生産に利用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
８０℃以上で増殖することができるカルドトリックス（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ）属に属する超好熱菌。
【請求項２】
カルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）に属する請求項１に記載の超好熱菌。
【請求項３】
カルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３３）である請求項１に記載の超好熱菌。
【請求項４】
１６Ｓｒ  ＤＮＡの塩基配列に基づく全塩基配列が配列表配列番号１である請求項１に記載の超好熱菌。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、８０℃以上で増殖することのできる、たい肥由来の新規超好熱菌に関する。
背景技術
従来、家畜糞、し尿、汚泥、都市ごみなどの有機廃棄物に、好熱性微生物を作用させてこれらを好気的に発酵させ、無臭化乾燥させて、たい肥を製造することが行われている。そして、このような好熱性微生物としてサーモアクチノミセス属またはサーモモノスポラ属に属する好熱性放射菌（特開昭５５−１２１９９２号公報）、バチルス菌、ゲオバチルス属、乳酸生成菌等の好熱好気性芽胞形成菌混合物（特開昭５１−１２９７５９号公報）、好気性枯草菌（特開平６−５１９７号公報）、リグニン可溶化能を有するサーマスアクティクス属細菌（特開平６−１０５６７９号公報）、好気性繊維分解菌クロストリジュウム  サーモセルム  サーマスアクティクス（特開平６−１９１９７７号公報）等が知られている。しかし、これらの微生物を利用しても、発酵時には発酵熱によって発酵温度は７０℃以上に上昇するものの、その温度はせいぜい８０℃にとどまり、雑菌、特に芽胞形成性雑菌を死滅させることができなかった。また、得られる肥料中の有用な菌体もせいぜい１ｇ当り（肥料乾物）１億前後であって、肥料として使用したときに肥効作用を充分発揮させることができなかった。
本発明者らは、汚泥処理におけるこのような問題を解決するために、汚泥を８５℃以上、好ましくは９５℃以上の高温で発酵処理して雑菌、草種子等を死滅させ、汚泥を清浄化し、しかも有用な菌体を多数含む発酵物を得るべく検討を行った。その結果、生汚泥に、日本国鹿児島県の霧島火山地帯の土壌から得られた８５℃以上の温度で生育する細菌培養物を加えて混合し、通気発酵させて８５℃以上の発酵温度で汚泥中に含有される雑菌、種子を死滅させ、汚泥を清浄化し、有用な菌体のみを多数含有する汚泥発酵物を得る方法を見出し、特許を取得した（日本特許第３０６４２２１号公報）。そして、この汚泥発酵物は、たい肥として利用され、このなかにはバチルス属、ゲオバチルス属に属する中温性好気性芽胞菌、高温性好気性芽胞菌、好熱菌等が多数見出された。
すなわち、この汚泥発酵物１ｇには、表１に示すとおり好気性細菌はじめ、高温性細菌、耐熱性芽胞を中心として汚泥発酵物グラム当り約１０億の細菌を含んでいた。
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また、この培養において培養平板上に優勢に生育した集落を鈎菌して分離菌とし、その分離菌について形態観察などを行って、発酵に関与するような微生物を検索したところ次のような微生物が介在していることが判明した。
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このように多形性、無芽胞グラム陽性桿菌、好気性芽胞菌（中温性及び高温性）が主に介在していることが判明した。
また、一方、Ｒ＆Ｄプランニング発行  山里一英他３名編「微生物の分離法」の記載を参考にして好熱菌の測定を行った。好熱菌の優勢菌は好気性芽胞菌（高温性）であった。
さらに、上記微生物の検索において優勢に分離された中温性好気性芽胞菌（分離菌ａ）、高温性好気性芽胞菌（分離菌ｂ）及び好熱菌（分離菌ｃ）について形態観察、生理学的性状試験及び菌体内のＤＮＡのＧＣ含量の測定を行った。その結果を表３に示した。
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分離菌ａは、いずれの種とも性状が一致せず、種の確定には至らなかった。分離菌ｂは、ややアルカリ性（ｐＨ８．０〜８．５）の培地で良好な生育を示し、ｐＨ７．０では生育しないが、その他の性状試験結果からＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓやＢ．ｂｒｅｖｉｓに近い種と思われた。しかし、どちらとも非典型となる性状があり種の確定には至らなかった。また、分離菌ｃは、バチルス  ステロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と菌学的性状が一致し同種であると同定されるものの、ＧＣ含量が大きく異なるので、近縁の種と思われる。
これらの分離菌は、工業技術院生命工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所微生物寄託センター）に寄託されており、分離菌ａは、ＹＭ−０１受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０８５、分離菌ｂは、ＹＭ−０２受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０８６、分離菌ｃは、ＹＭ−０３受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０８７としてそれぞれ受託番号が付されている。
本発明者らは、これらのたい肥中の高温で生育する微生物の存在について、さらに検討したところ、驚くべきことに７５℃以上の高温で活発に増殖し、８５℃においても増殖が認められるが５０℃以下では増殖が認められない新規な属に属する超好熱菌を見出した。
発明の開示
本発明の目的は、汚泥を８５℃以上で発酵させて得られたたい肥中から新規な好熱菌、特に超好熱菌を得ることにある。
本発明は、上記課題を解決するために、前記汚泥を８５℃以上で発酵させて得られるたい肥（商品名  サツマソイル；製造元鹿児島市水道局）中に存在する好熱性微生物の検索を試みたところ、通常の細菌の培養温度（３０〜４０℃）では増殖せず、７０〜８５℃、特に８０℃以上で活発に生育・増殖する絶対好気性菌を見出した。そして、この菌について１６Ｓｒ  ＤＮＡの塩基配列に基づく系統分類解析を行った。その結果、この絶対好気性菌は、グラム陰性で胞子形成能がないにもかかわらず、図１に示されるように胞子形成能を持つグラム陽性土壌細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属と近縁であるがこれらとは少なくとも属レベルにおいて独立の細菌であることを見出した。本発明者らは、これをカルドトリックス  サツマエ  Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ，ＹＭ０８１菌と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９８が付与された。そして、その後国際寄託に移管し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３３が付与された。
すなわち、本発明は、８０℃以上で増殖することのできるカルドトリックス  Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ属に属する新規な超好熱菌に関する。
本発明は、カルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）に属する新規な超好熱菌に関する。
特に、新規な超好熱菌であるカルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３３）株に関する。
また、この菌の１６Ｓｒ  ＤＮＡの全塩基配列は配列表配列番号１のとおりの塩基配列を示す。
発明を実施する最良の形態
本発明の超好熱菌は、前記した日本国、鹿児島県鹿児島市のし尿等の有機廃棄物を特許第３０６４２２１号公報に記載される方法に従って高温で発酵させて得られるたい肥（商品名  サツマソイル）から分離された。この分離方法としては、次の方法が用いられた。
下記表４記載の組成の培地５ｍｌに、前記たい肥約０．１ｇを加えて、８０℃に保温し、継代を繰り返して濃縮した後、同一の培地にゲランガムを加えたプレート上に単離、精製を反復した。
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このようにして得られた菌体の微生物学的性質及び分類学的位置は次のとおりであった。
１）形態は、幅０．５μｍ、長さ３μｍの長桿菌である。グラム染色の結果は陰性を示し、菌体の超薄切片の電子顕微鏡観察も細胞表層構造がグラム陰性型であること、すなわち、細胞膜（形質膜）、細胞壁に加えて、外膜の存在を示した。胞子形成能はない。
２）７０〜８５℃で活発に生育し、５０℃以下では増殖の認められない。７５℃以上の高温で活発に増殖し、８５℃においても増殖が認められる。絶対好気性である。
３）増殖の至適ｐＨは中性である。増殖可能なｐＨ範囲は６〜９である。また、弱好塩性を示す。
４）アルブミン、カゼインなど各種たんぱく質、およびでん粉の資化性がある。
５）ウレアーゼ生産性がある。硝酸還元能はない。硫化水素生産性、インドール生産性はない。
６）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は７０．０％である。
７）１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統分類解析を行った。その結果を図１及び表６に示す。また１６Ｓｒ  ＤＮＡの全塩基配列は配列表配列番号１に記載のとおりの塩基配列となった。
このように、本発明の菌体は、グラム陰性で胞子形成能がないにも拘わらず、胞子形成能を持つグラム陽性土壌細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属と近縁であるが、これらとは少なくとも属レベルにおいて独立の細菌である。
これらのことより、本発明の微生物は、眞正細菌に属し、超好熱菌であることが判明した。また１６Ｓｒ  ＤＮＡの塩基配列からはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに近縁であるが、これとは独立の属を形成していることが判明した。
実施例
次に本発明の参考例及び実施例について説明する。しかし、本発明はこれらの参考例及び実施例に限定して解釈されるべきではない。
参考例１
１．菌体培養物の調製
日本国、鹿児島県姶良郡牧園町の霧島火山帯の硫黄地帯の３７〜４０℃の土壌とその付近の水田の青苔の生育している土壌とを混合し、これに蔗糖を５００〜１０００倍量の水に溶解した蔗糖水溶液を土壌混合物１ｍ３当り３〜４Ｌ加え、４０〜５０℃で３０〜５０日間放置して培養する。この培養物をいくつかのロットに生汚泥と混合し、空気を吹き込みながら好気的条件下で発酵させ、８５℃以上の発酵温度が得られるロットを菌体培養物とした。
２．生汚泥の処理
動物糞、下水の汚泥、でん粉カス及び生ゴミの混合物に消石灰を加えて消臭処理し、その８０重量部に前記１で得られた菌体培養物２０重量部を混合し、発酵槽内で通気条件下で発酵を行う。このようにすると発酵物が約１日のうちに常温から８５〜９５℃に上昇する。この温度で発酵を３日間維持し、発酵開始後５日目に切り返し（撹拌）を行う。切り返しにより発酵物の温度は６０℃前後に低下するが約１日のうちに温度８５〜９５℃に上昇する。この温度に５日間維持して発酵を行う。この発酵及び切り返しの操作を数回繰り返すと切り返しのさいの温度及び発酵温度が次第に低下する。４回この操作を繰り返し、切り返しのさいの発酵物の温度が３５℃程度に低下したときを最終発酵日とする。得られた発酵物は乾燥されて茶色の顆粒状となっており、これはそのまま有機肥料として用いられる。
３．原料たい肥の調製
日本国、鹿児島県鹿児島市の公共下水道汚泥を圧縮脱水し、水分６８％となった生汚泥８０重量部に対し、前記２で得られた菌体培養物２０重量部を混合し、発酵ヤードに入れ、下から空気を吹き込みながら発酵を行った。発酵開始後７日で温度９８℃に達した。１０日間発酵を行って、発酵温度が９８℃から低下しはじめた時点で、切り返しを行って再度発酵させた。最初９９℃の温度に達した後、すなわち切り返し後１０日目に温度が急速に６０〜７０℃に低下した。この時点で、発酵ヤードに発酵生成物を拡げ急速に温度を常温まで低下させ、茶色の汚泥発酵粉末を得た。この汚泥発酵粉末はたい肥として、または前記発酵を行うための菌体培養物あるいは培地として用いられる。
実施例１
超好熱菌の単離
参考例で得られた、たい肥を試料としてその約０．１ｇを、表４の培地５ｍｌに接種し、８０℃に保温し、継代を繰り返して濃縮したのち、同一組成の培地にゲランガムを加えたプレート上で単離精製を繰り返して本発明の超好熱菌を得た。
なお、たい肥試料を、ペプトン・イーストエキス培地（各０．５％、０．３％、ｐＨ７．２）に加えて７０℃で培養し、増殖した細菌を寒天プレート（ｐＨ７．２、７０℃）上で単離したところ、温度７０℃以上で従来からたい肥の発酵をになうとされているＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓほか、その他の多数の新規な好熱性細菌が見出された。
実施例２
超好熱菌の微生物学的性質
実施例１で得られた、本発明の超好熱菌を、カゼイン０．３％、酵母エキス０．２％、でん粉０．１％、ＮａＣｌ５％よりなる、ｐＨ７〜８の寒天培地に接種し、８０℃で２４時間培養し、その微生物学的性質を検討した。その結果を表５に示した。
また、この超好熱菌の顕微鏡写真を図２〜５に示す。
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この結果、本発明の細菌は眞正細菌に属し、グラム陰性で胞子形成能がないにもかかわらず、胞子形成能をもつグラム陰性土壌細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属とは近縁であるので、新属に属することは明らかとなった。また、ＤＮＡのＧＣ含量については、表１にみられるように９０％に達する相同性を示す菌はなく、また２つの属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属のそれぞれから等距離（各８５％）離れているので新属と判定される（表６及び図１参照）。そしてこの属をカルドトリックスと命名した。至適増殖温度が８０℃であるので、この菌は超好熱菌であることも明らかとなった。
なお、本発明のカルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１と枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）との生化学的性質を比較すると表７のとおりである。
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本発明では、前記新属に属する細菌をカルドトリッスク  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株と名付け独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９８を得た。そして、その後国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３３が付された。
実施例３
カルドトリッスク  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の温度と生育との関係
カルドトリッスク  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株をデンプン／カゼイン／イーストエキスよりなる培地に接種し、それぞれ所定の温度で１２０ｒｐｍで振盪培養を行い、倍加時間（細胞数が２倍に増加するまでの時間）を測定した。その結果を図６に示した。
図６からわかるように、この菌の増殖至適温度は７８℃であるが、７８℃のときの倍加時間が２６分位であるのに対し８２℃のときの倍加時間は５５分程度で、８２℃においても至適時の１／２の速さで増殖を続けている。
さらに、培地にたい肥からの水抽出液を加えると、表８に示すように８５℃でも増殖することがわかる。
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産業上の利用可能性
し尿等の有機廃棄物を原料として発酵培養物を接種し、発酵を行うと、多数のＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する中等度好熱菌等によって発酵温度が上昇する。その後、発酵温度が上昇するに従い、本発明の超好熱菌Ｃ．ｓａｔｓｕｍａｅが有機廃棄物の分解と発酵に関与するようになる。従って、本発明の超好熱菌は有機廃棄物を高温で分解し、発酵させたい肥を製造する種菌、培地等として有用に利用される。
さらに、この超好熱菌の産生するプロテアーゼおよびアミラーゼは高温で活性を有するので、この性質を利用して耐熱性酵素を製造することが期待される。
寄託された生物材料への言及
イ．生物材料を寄託した寄託機関の名称及びあて名
名称  ：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：〒３０５−８５６５  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６
ロ．イの機関に寄託した日付
平成１４年（２００２）１１月７日
（原寄託日：平成１３年（２００１）１１月１３日）
ハ．イの機関に寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３３
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のカルドトリックス（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ属の１６Ｓｒ  ＤＮＡに基づく分子系統樹を示す。なお、図中ＹＭ０８１が本発明の超好熱菌、カルドトリックス  サツマエＹＭ０８１株である。
図２は、本発明のカルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の光学電子顕微鏡写真を示す。
図３は、本発明のカルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の走査型電子顕微鏡写真を示す。
図４は、本発明のカルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の透過型電子顕微鏡写真を示す。
図５は、本発明のカルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の菌体の超薄切片の電子顕微鏡写真を示す（倍率５，０００倍）。
図６は、本発明のカルドトリックス  サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の温度別世代時間を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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