(57)【要約】スフィンゴシンキナーゼ活性を有する分泌型ポリペプチドおよびそれをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子、特に、ヒト由来のスフィンゴシンキナーゼ３（ＳＰＨＫ３）およびそれをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシンキナーゼ活性を有する分泌型ポリペプチド。
【請求項２】
ヒト由来であることを特徴とする、請求項１に記載の分泌型ポリペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは２以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、スフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）の核酸分子：
（ａ）配列番号２の塩基配列からなる核酸分子
（ｂ）遺伝暗号の縮重により、コドン配列が配列番号２の塩基配列と異なるが、コードするアミノ酸配列が（ａ）と同じである塩基配列からなる核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含むスフィンゴシンキナーゼ遺伝子。
【請求項７】
プロモーターと作動可能に連結した請求項４または６に記載のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた、スフィンゴシンキナーゼを発現する宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、スフィンゴシンキナーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子および／または該核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子および／または該核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフィンゴシン関連疾患の診断方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬。
【請求項１３】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬。
【請求項１４】
請求項８に記載の宿主細胞および薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドのスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用。
【請求項１６】
請求項５に記載の核酸分子のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用。
【請求項１７】
請求項８に記載の宿主細胞のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用。
【請求項１８】
スフィンゴシンキナーゼ関連疾患を治療するための医薬のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ３を発現する宿主細胞の培地に標識化スフィンゴシンおよび医薬の候補となる化合物を添加し、標識化スフィンゴシン１−リン酸を定量し、該化合物のスフィンゴシンキナーゼ活性への影響を評価することを特徴とする、前記方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載のスクリーニング方法によって得られたスフィンゴシン関連疾患を治療する医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、スフィンゴシンキナーゼ活性（ＳＰＨＫ活性）を有する分泌型ポリペプチドおよびそれをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関し、特に、ヒト由来の分泌型スフィンゴシンキナーゼ３（ＳＰＨＫ３）およびそれをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関する。
背景技術
スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）は、スフィンゴシンをリン酸化し、スフィンゴシン１−リン酸の生成を触媒する酵素であって、主に血小板に存在している。
スフィンゴシンのリン酸化によって生成するスフィンゴシン１−リン酸は、血液中の血小板に蓄積されており、血小板の活性化に伴って放出される。このスフィンゴシン１−リン酸は、血小板凝集の促進、血管壁の傷口治癒、抗がん転移、動脈硬化の防止などの種々の生理的、病理的役割を有することが知られている。
これまで、スフィンゴシンキナーゼとしては、スフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＨＫ１）（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１２５７６−１２５８３．（１９９８）、Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２３７２２−２３７２８．（１９９８））およびスフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）（Ｈｏｎｇ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１９５１３−１９５２０．（２０００））が知られていた。
ＳＰＨＫ１は、分子量４３ｋＤａの蛋白質であり、従来知られているＳＰＨＫの中で最も強いＳＰＨＫ活性を示す。細胞質中に多く存在し、カルモジュリンとの高い親和性を有する。スプライシング変異体として、ＳＰＨＫ  １ａ（分子量：４２．３ｋＤａ）およびＳＰＨＫ  １ｂ（分子量：４３．３ｋＤａ）が存在するが、これらはシグナルペプチドおよび膜貫通領域を有していない。また、ｍＲＮＡ発現は、脾臓と肺で強く発現している。
またＳＰＨＫ２は、分子量６５ｋＤａの蛋白質で、ＳＰＨＫ活性はＳＰＨＫ１の約５０分の１程度である。界面活性剤、ＮａＣｌ、ＫＣｌ濃度依存的に活性の上昇および阻害が観察されており、この点において、ＳＰＨＫ１と性質が逆である。スフィンゴシンよりデヒドロスフィンゴシンを、むしろ良い基質としている。また、ｍＲＮＡ発現は、腎臓、肝臓、脳において強く発現している。
ＳＰＨＫ１およびＳＰＨＫ２はいずれも、スフィンゴシンのリン酸化を触媒する酵素であるが、これらは細胞内での作用は確認されているものの、細胞外のスフィンゴシン−１−リン酸の生成は認められていない。即ち、これら酵素は、血中でのスフィンゴシン−１−リン酸の生成を司る酵素ではなく、血液中におけるＳＰＨＫを標的とする医薬品開発には適しているものではなかった。
従って、本発明の課題は、ＳＰＨＫ１およびＳＰＨＫ２とは異なる血中に存在するスフィンゴシン−１−リン酸の生成を司る新規なスフィンゴシンキナーゼを提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ＥＳＴデータベースによるＳＰＨＫ１のホモロジー解析により、ＳＰＨＫ１およびＳＰＨＫ２とは異なる新規な分泌型スフィンゴシンキナーゼ３（ＳＰＨＫ３）を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、スフィンゴシンキナーゼ活性を有する分泌型ポリペプチドに関する。
また本発明は、ヒト由来であることを特徴とする、前記の分泌型ポリペプチドに関する。
さらに本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに関する。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは２以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、スフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチド。
また本発明は、前記のポリペプチドをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関する。
さらに本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の核酸分子に関する。
（ａ）配列番号２の塩基配列からなる核酸分子
（ｂ）遺伝暗号の縮重により、コドン配列が配列番号２の塩基配列と異なるが、コードするアミノ酸配列が（ａ）と同じである塩基配列からなる核酸分子。
また本発明は、前記の核酸分子を含むスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関する。
さらに本発明は、プロモーターと作動可能に連結した前記のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を含む発現ベクターに関する。
また本発明は、前記の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた、スフィンゴシンキナーゼを発現する宿主細胞に関する。
さらに本発明は、前記の宿主細胞を培養することを特徴とする、スフィンゴシンキナーゼの製造方法に関する。
また本発明は、前記の核酸分子および／または該核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の検出方法に関する。
さらに本発明は、前記の核酸分子および／または該核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフィンゴシン関連疾患の診断方法に関する。
また本発明は、前記のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬に関する。
さらに本発明は、前記の核酸分子および薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬に関する。
また本発明は、前記の宿主細胞および薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬に関する。
さらに本発明は、前記のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドのスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用に関する。
また本発明は、前記の核酸分子のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用に関する。
さらに本発明は、前記の宿主細胞のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用。
また本発明は、スフィンゴシンキナーゼ関連疾患を治療するための医薬のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ３を発現する宿主細胞の培地に標識化スフィンゴシンおよび医薬の候補となる化合物を添加し、標識化スフィンゴシン１−リン酸を定量し、該化合物のスフィンゴシンキナーゼ活性への影響を評価することを特徴とする、前記方法に関する。
さらに本発明は、前記のスクリーニング方法によって得られたスフィンゴシン関連疾患を治療する医薬に関する。
本発明のスフィンゴシンキナーゼ活性を有する分泌型ポリペプチドは、典型的には、図１に示すアミノ酸配列で示されるポリペプチドであり、図１の下線部で示す分泌型特有のシグナル配列を有し、細胞外に分泌される。
発明を実施するための形態
本発明において、スフィンゴシンキナーゼ活性（ＳＰＨＫ活性）とは、スフィンゴシンをリン酸化し、スフィンゴシン１−リン酸の生成を触媒する酵素活性のことをいう。ＳＰＨＫ活性を有するポリペプチドとして、スフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＨＫ１）やスフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）などが知られているが、本発明のＳＰＨＫ活性を有するポリペプチドとは、典型的には、スフィンゴシンキナーゼ３（ＳＰＨＫ３；配列番号１）である。
アミノ酸の欠失とは、任意のアミノ酸配列から、１または２以上のアミノ酸が部分的に欠失することをいう。またアミノ酸の置換とは、任意のアミノ酸配列において、１または２以上のアミノ酸が他のアミノ酸と置き換わることをいう。さらにアミノ酸の付加とは、任意のアミノ酸配列に、１または２以上のアミノ酸が付加されることをいう。
本発明のＳＰＨＫ活性を有するポリペプチドには、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、アミノ酸が欠失、置換または付加したポリペプチドについても、ＳＰＨＫ活性を有する限りにおいて含まれる。
本発明のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子とは、ＳＰＨＫ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列からなるスフィンゴシンキナーゼ３をコードする遺伝子である。このスフィンゴシンキナーゼ３をコードする遺伝子は、典型的には、配列番号２の塩基配列からなる核酸分子からなる遺伝子である。
また本発明のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子には、遺伝暗号の縮重により、コドン配列が配列番号２の塩基配列と異なるが、コードするアミノ酸配列が配列番号２の塩基配列からなる核酸分子と同じである核酸分子からなる遺伝子も含まれる。ここでいう遺伝暗号とは、ポリペプチドのアミノ酸配列を規定するための情報をもつ塩基配列のことである。なお本発明の塩基配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を含む。
ここで遺伝暗号の縮重について説明する。例えば、ロイシン残基は、コドンＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧによりコードされることが可能であり、これら６つのコドンの各々は、ロイシン残基をコードするという目的に関して等価である。このようなアミノ酸残基と塩基配列の関係は、当業者にはよく知られている。このようなアミノ酸について複数のコドンが存在する状況では、１つのアミノ酸配列をコードする遺伝子について、複数の塩基配列からなることができるが、本発明はこれらの遺伝暗号の縮重によって生じる塩基配列からなる核酸分子についても包含する。
本発明に用いることができるプロモーターは、作動可能に連結する核酸分子を転写することができるものであれば特に限定されない。具体的なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＥＦ３２１、ＭＣ１、ＴＫ、Ｐｌａｃ、Ｐｔａｃなどが挙げられる。特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌で発現させるためにはＰｔａｃ、Ｐｌａｃが好ましい。また、発現量の観点からは、ＣＭＶ、ＥＦ３２１が好ましい。
本明細書において、「作動可能に連結する」とは、プロモーターなどの調節配列とＳＰＨＫ３遺伝子などのコード配列が直接または間接的に連結され、コード配列の遺伝子の発現・転写などが、調節配列の影響下または制御下にあるように機能的に連結していることをいう。
コード配列がポリペプチドに翻訳されることが望ましい場合、例えば、プロモーターの誘導によって、コード配列の転写をもたらす。そして双方のＤＮＡ配列間の連結が、（１）フレームシフト突然変異の導入を生じない、（２）コード配列の転写を指図するプロモーター領域の能力を妨げず、あるいは（３）蛋白質に翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しないならば、２つのＤＮＡ配列は作動可能に連結されているといえる。
本明細書において、「ベクター」とは、異なる遺伝子環境間での運搬のために、または宿主細胞中での発現のために、制限酵素処理およびライゲーションなどにより所望の配列が挿入され得るものである。ベクターは、典型的にはＤＮＡで構成されるが、しかし、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、プラスミド、ファージミドおよびウイルスゲノムなどが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内において、自律的に、あるいは宿主細胞中のゲノムに組込み後に、複製し得るものである。発現ベクターは、コード配列が調節配列に作動可能に連結されており、コード配列の遺伝子がＲＮＡ転写物として発現され得るものである。
ベクターには、細胞が該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされているか否かを同定するのに用いるのに適した１つまたはそれ以上のマーカー配列を含含むことができる。マーカーとしては、例えば、抗体またはその他の化合物に対する耐性または感受性を増大または低減する蛋白質をコードする遺伝子（例えば、カナマイシン抵抗性遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子など）、活性が標準的な方法により検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなど）をコードする遺伝子、および形質転換組胞またはトランスフェクションされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型（例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）など）を視覚的に検出できる遺伝子などが挙げられる。
このようなベクターの例としては、クローニングベクターとして、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ１、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐｃＤＮＡなどが挙げられる。また、発現ベクターとして、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＭＡＬ−Ｃ２が挙げられる。これらのうち、発現効率、発現後の回収率、検出効率、発現蛋白質の可溶化などの観点から、それぞれｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ１、ｐＭＡＬ−Ｃ２が好ましい。
また、マーカーとしては、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ５抗体、ＧＦＰなどが好ましい。
「ストリンジェントな条件」とは、通常知られた核酸ハイブリダイゼーションが行われ得る条件のことをいい、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどに記載されている。
特に本明細書におけるストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５ｘＳＳＣ、１０ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド）中での６８℃でのハイブリダイゼーションを指す。
本発明のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子の検出方法は、例えば、配列番号２で示される塩基配列より、適当なマーカーで標識化したプローブを作製し、該プローブを試料から得られた核酸とハイブリダイズすることによって行なうことができる。このようなハイブリダイズはスフィンゴシン関連疾患の診断方法においても利用可能である。
本発明に用いられる宿主細胞は、スフィンゴシンキナーゼ３が発現可能であれば、原核細胞および真核細胞のいずれでもよく、特に限定されない。また動物細胞、植物細胞、糸状菌、細菌などのいずれの細胞であってもよい。さらに具体的には、ＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、Ｈ．ｅｎｄ  ＦＢ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＥＧ−０１、ＣＭＫなどが挙げられる。特に好ましい細胞は、トランスフェクションした場合に発現量が多く、また内生的な（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＳＰＨＫ３を産生するという観点から、ＣＯＳ７、ＨｅＬａである。
宿主細胞の培養は、通常知られている方法を用いればよく、特に限定されない。ＣＯＳ７、ＨｅＬａを宿主細胞として用いる場合は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（市販のＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）に２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０％ウシ胎仔血清を添加）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養する。
本明細書において、スフィンゴシン関連疾患とは、スフィンゴシンのリン酸化が過剰、不足または欠損していることによって起きる疾患・障害のことをいう。また、スフィンゴシンのリン酸化が過剰、不足または欠損以外の原因によって起きる疾患であって、スフィンゴシンのリン酸化を調節することによって治癒可能な疾患・障害も含まれる。
このようなスフィンゴシン関連疾患は、具体的には、動脈硬化、癌、アレルギー、心筋梗塞が挙げられる。
したがって、本発明の医薬は、スフィンゴシン関連疾患治療薬として用いることができる。さらに、血管新生促進剤、抗癌転移剤、動脈硬化防止剤などとして用いることができる。本発明の医薬の有効成分として、ＳＰＨＫ３などの分泌型スフィンゴシンキナーゼ、それをコードする核酸分子、または分泌型スフィンゴシンキナーゼを発現する宿主細胞などが用いることができる。
本明細書の薬学的に許容し得る担体とは、本発明のポリペプチド、核酸分子および宿主細胞が安定に保たれ、薬学的に有効な投与を可能にし、実質的に非毒性である担体を意味する。具体的な担体としては、水、ワセリン、鉱油、植物油、動物油、有機または無機ワックス、キサンタン、ゼラチン、セルロースまたはアラビアゴムのような天然ポリマー、合成ポリマー、アルコールなどである。
本発明の医薬は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等の投与形態によって投与することができ、剤形は投与形態に適した剤形を適宜選択することができる。例えば、散剤、顆粒、ペレット若しくは錠剤、コーティング剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤等の経口投与に適した剤型、または注射剤、点滴剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤などの非経口投与に適した剤型にすることができる。これらの製剤は、医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて造ることができる。補助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等が挙げられる。
これら医薬製剤の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法及び剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１日あたり、上限が１０ｍｇ〜２０ｍｇ、下限が１ｍｇ〜２ｍｇであり、好適な投与量は５ｍｇである。
本発明のスフィンゴシンキナーゼ関連疾患を治療するための医薬のスクリーニング方法は、例えば、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸配列からＳＰＨＫに対する特異的な抗体を作製し、試料に対して、該抗体を用い、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法などをおこなうことにより可能である。
また配列番号２で示される塩基配列から、ＳＰＨＫに対する特異的な標識化プローブを作製し、試料に対してノーザンブロットなどを行なうことにより可能である。
これらの方法により得られた医薬を、インビトロの系において、所望の特性（例えば、ＳＰＨＫ活性を阻害する性質）を指標にさらに選抜し、その後に動物実験を通して各種疾患への検討を経ることによって、所望の特性を有する医薬をスクリーニングすることができる。
スクリーニング方法には、次に示す方法が例示される。
スフィンゴシンキナーゼ活性阻害剤のスクリーニングにおいては、ＳＰＨＫ３発現細胞の培地プレートに３Ｈ−スフィンゴシンを添加し、培地中に生成する３Ｈ−スフィンゴシン１−リン酸をＴＬＣまたはＨＰＬＣで定量する。この系において、培地に阻害剤の候補となる化合物を加え、前記活性の強弱を指標に抑制効果のある化合物をスクリーニングすることができる。スフィンゴシンの標識化は３Ｈによるものに限らず、標識となるものであれば、適宜選択でき、抗体を用いる場合には、イムノアッセイを利用して活性を定量化することも可能である。このようなスクリーニングによって得られた阻害剤は、血中の過剰なスフィンゴシン１−リン酸の生成を制御することが可能であり、例えば、血小板輸血毒性抑制剤、血小板安定化剤などに用いることができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）ＳＰＨＫ３のクローニング
ヒト由来のＥＳＴのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）提供））の中から、既知のｍＳＰＨＫ１遺伝子（マウス由来のスフィンゴシンキナーゼ１）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ０６８７４８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７３，Ｉｓｓｕｅ  ３７，２３７２２−２３７２８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １１，１９９８）について、ＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／（ＮＣＢＩ提供））を利用して相同性検索をおこなった。その結果、ｍＳＰＨＫ１遺伝子と相同性のあるクローン（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＡ０７５９７１、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ  ｃｌｏｎｅＩＤ  ５３１４５６）が存在することが判明した。
このｍＳＰＨＫ１遺伝子と相同性のあるクローン５３１４５６をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から購入した。ＥＳＴクローンが有する塩基配列は部分的にしか公開されていないことから、相同性のあるクローンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を決定するために、ＥＳＴクローンの全塩基配列を決定した。決定した塩基配列から、フレームシフト変異を考慮し、検討した結果、推定されるポリペプチドの分子量から、目的のポリペプチドをコードすると推定されるＯＲＦを見出した。
図１に前記ＯＲＦのコードするポリペプチドのアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｅｒｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢｉｏＣｅｎｔｒｕｍ−ＤＴＵ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ提供）の予想プログラムによってシグナル配列とその切断部位が予想された。
決定したＥＳＴクローンの全塩基配列から前記ＯＲＦをクローニングするために、それぞれＢａｍＨＩサイト、ＥｃｏＲＩサイトを含む下記プライマーをデザインした。
2003031628.tif 000002
2003031628.tif 000003
ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｄａｓｈ（東洋紡）を用いて製造者のプロトコールに従って、クローンＡＡ０７５９７１から調製したｃＤＮＡをテンペレートとし、プライマー１および２を用いてＰＣＲ反応を行なった。反応液は、２．５Ｕ／μｌ  ＫＯＤ  ｄａｓｈ（１μｌ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（５μｌ）、２５ｍＭ塩化マグネシウム（２μｌ）、１０×反応バッファー（５μｌ）を加え、全量が５０μｌとなるようにした。
ＰＣＲ反応は、９８℃１５秒間、６５℃２秒間および７４℃３０秒間を１サイクルとし、２５サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって確認したところ約１３００ｂｐの断片であった。また常法により塩基配列を決定した（配列番号２）。
得られたＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、転写産物がＮ末端にＦＬＡＧ  ＨＡ  ｔａｇを有するように、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ１（ｐｃＤＮＡ３をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入し、ＦＬＡＧ発現配列をＭＡＰの位置に挿入することによって作製、図２）に組み込んだ。
（実施例２）ヒト由来スフィンゴシンキナーゼ３（ｈＳＰＨＫ３）の発現
ＣＯＳ７細胞（理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター、細胞開発銀行（ＲＣＢ）より購入）を３５ｍｍ  ｄｉｓｈに２×１０５個播種し、播種２４時間後にｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ１単独とｈＳＰＨＫ３遺伝子（実施例１におけるＰＣＲ産物）が挿入されたｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ１とをそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）試薬を用いて一過的にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。なお、ＣＯＳ７細胞の培養は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｕｄｉｕｍ、ＳＩＧＭＡより購入）に１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加）で、３７℃、５％ＣＯ２条件下でおこなった。
播種２４時間後に１００μｌ  １×サンプルバッファー（０．０１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４％  ＳＤＳ、２％グリセロール、０．０００２％  ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）、１％  β−メルカプトエタノール）を用いてＣＯＳ７細胞を回収した。回収した細胞の１／１０量を試料としてＳＤＳ−ＰＡＧＥを常法により行ない蛋白質を分離した。分離した蛋白質を、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ）に転写したのち、抗−ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ）を用いたウェスタンブロッティングによってバンドを確認した（図３）。なお、発色はＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって行った。
図３に示すように、ｈＳＰＨＫ３遺伝子が挿入されたｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ１をトランスフェクションした細胞からは、ＳＰＨＫ３を示す２本のバンドが検出されたが、これらは、それぞれ未成熟型（図中、ｐＳＰＨＫ３という）、成熟型（図中、ｍＳＰＨＫ３という）である。ＳＰＨＫ３はＮ末端側にシグナル配列（図１下線部）が存在し、これが小胞体（ＥＲ）において、図１に示す切断部位で切断されることにより、未成熟型から成熟型に変換される。
（実施例３）スフィンゴシンキナーゼ活性の測定
ＣＯＳ７細胞を１００ｍｍ  ｄｉｓｈに２×１０６個播種し、播種２４時間後に＿ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ１単独とｈＳＰＨＫ３遺伝子が挿入されたｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ１とをそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）試薬を用いて一過的にトランスフェクションした。
さらに２４時間後に細胞を回収して、超音波によって細胞を破砕させたのち、終濃度が１％となるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、４℃で１時間回転（ｒｏｔａｔｉｏｎ）させながら可溶化した。その後１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、得られた上清に抗−ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ）およびプロテイン  Ａ  セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えて抗体沈殿反応を行なったのち、沈殿を回収して、そこに０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０μＭスフィンゴシン、１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むアッセイバッファー（組成：１５ｍＭ  ＨＯＰＳ、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフッ化物、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ４−デオキシピリドキシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％アプロチニン、ｐＨ７．５）を加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。
その後、オリベラらの方法（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．，Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，Ｔｕ，Ｚ．，Ｍｉｌｓｔｉｅｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（２０），１２５７６−８３．）に準じ、脂質抽出して３２Ｐラベルされたスフィンゴシン１−リン酸をブタノール／酢酸／水（３：１：１）の展開溶媒を用いることによって、ＴＬＣによって展開・分離し、イメージアナライザー（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＢＡＳ２０００、富士フィルム）により解析した。解析結果を図４および図５に示す。
図４は、ＴＬＣのスポットを示しているが、ｈＳＰＨＫ３遺伝子が挿入されたｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ１をトランスフェクトした細胞からは、対照（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ１単独）にはほとんど見られないスフィンゴシン−１−リン酸のスポット（図中矢印の位置）が明確に現れており、挿入したｈＳＰＨＫ３遺伝子のコードするポリペプチドがＳＰＨＫ活性を有することを確認した。
図５は、図４のスポットを数値化したグラフであるが、ｈＳＰＨＫ３遺伝子が挿入されたｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ１をトランスフェクトした細胞は、対照に比べて６３倍のＳＰＨＫ活性を有することが判った。
（実施例４）ｈＳＰＨＫ３のｐＨ依存性
ＳＰＨＫ活性に対するｐＨの効果をみるために、各ｐＨにおけるＳＰＨＫ活性を測定した。測定方法は実施例３と同様に行ない、それぞれのｐＨでのアッセイバッファーとして、ｐＨ３〜６については５０ｍＭトリエチルアミンを用い、ｐＨ５．５〜８．５については５０ｍＭ  ＭＯＰＳを用いた。測定結果を図６に示す。
図６に示すように、ＳＰＨＫ３は中性付近、特にｐＨ６．５〜８あたりに至適ｐＨをもつ。
（実施例５）ｈＳＰＨＫ３の基質特異性
ｈＳＰＨＫ３の基質特異性について調べるために、スフィンゴシン以外の脂質を基質として用い、キナーゼ活性を測定した。測定方法は実施例３と同様である。
用いた脂質（各１０μｇ）は、Ｄ−エリスロスフィンゴシン（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（ＳＰＨ））、Ｄ−エリスロジヒドロスフィンゴシン（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（ＤＨＳ））、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｙｌ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（ＤＭＳ））、セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ（ＣＥＲ））、Ｃ２−セラミド（Ｃ２−Ｃｅｒａｍｉｄｅ（Ｃ２−ＣＥＲ））（以上Ｍａｔｒｅｙａ）、ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＧ））（Ａｖａｎｔｉ）、フォスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＰＩ））（ＳＩＧＭＡ）である。結果を図７に示す。
図７に示すように、ｈＳＰＨＫ３は、スフィンゴシンに対して最も強い活性を示すが、ＤＨＳ、ＤＭＳ、ＤＧ、ＰＩに対しても活性を有する。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、ＥＳＴデータベースより、ＳＰＨＫ１およびＳＰＨＫ２とは異なる新規なスフィンゴシンキナーゼ３（ＳＰＨＫ３）が得られた。このＳＰＨＫ３は、ＳＰＨＫ活性があり、スフィンゴシン関連疾患の治療のための医薬として用いることができる。
特に、既知のＳＰＨＫ１およびＳＰＨＫ２と比べて、細胞外分泌の点で優れており、血中での直接的な医薬品の作用に役立つ。具体的には、血小板輸血毒性抑制剤、血小板安定化剤などに用いるのに適している。
また、本発明のＳＰＨＫ３およびＳＰＨＫ３遺伝子を用いて、スフィンゴシン関連疾患の診断等にも応用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のヒト由来ＳＰＨＫ３（ｈＳＰＨＫ３）のアミノ酸配列を示す図である。
図２は、ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ１の概略およびその制限酵素地図を示す図である。
図３は、ＣＯＳ７細胞で一過的に発現したＳＰＨＫ３のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
図４は、ＣＯＳ７細胞で一過的に発現したＳＰＨＫ３のＳＰＨＫ活性を示すＴＬＣのスポットを示す図である。
図５は、ＣＯＳ７細胞で一過的に発現したＳＰＨＫ３のＳＰＨＫ活性を示すグラフである。
図６は、ＳＰＨＫ３のＳＰＨＫ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。
図７は、ＳＰＨＫ３の基質特異性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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