(57)【要約】本発明は、ＣＸＣＲ３作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬、および生活習慣病治療薬、特に抗糖尿病薬；ＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする低血糖改善薬、インスリノーマ治療薬、抗肥満薬；ＣＸＣＲ３と既知ＣＸＣＲ３リガンドとを用いた新規ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法；ＣＸＣＲ３と共役Ｇタンパク質の共発現系を用いたＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法；および生体試料中のＣＸＣＲ３リガンド発現量を検出することによる２型糖尿病の診断方法を提供する。
2003082335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ３リガンドを有効成分とする血糖及び／又はインスリン分泌調節薬。
【請求項２】
ＣＸＣＲ３作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬。
【請求項３】
ＣＸＣＲ３作動薬が、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１、それらの改変体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される少なくとも１種である、請求の範囲２の耐糖能異常改善薬。
【請求項４】
ＣＸＣＲ３作動薬が、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、それらの改変体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される少なくとも１種である、請求の範囲２の耐糖能異常改善薬。
【請求項５】
生活習慣病治療薬である請求の範囲２〜４のいずれかの耐糖能異常改善薬。
【請求項６】
糖尿病治療薬である請求の範囲２〜４のいずれかの耐糖能異常改善薬。
【請求項７】
ＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする低血糖改善薬。
【請求項８】
ＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする、インスリン分泌抑制により改善され得る疾患の治療薬。
【請求項９】
ＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする抗肥満薬。
【請求項１０】
ＣＸＣＲ３又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験試料を接触させ、該レセプター又はそのフラグメントに結合する化合物を選択することを含む、ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法。
【請求項１１】
被験物質の存在下及び非存在下で、ＣＸＣＲ３又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに既知リガンドを接触させ、該レセプター又はそのフラグメントと既知リガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む、ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法。
【請求項１２】
ＣＸＣＲ３又はリガンドが結合し得るそのフラグメントが、それらが包埋された脂質二重層の形態で提供される、請求の範囲１０または１１のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ＣＸＣＲ３を含む脂質二重層及びＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系において、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法。
【請求項１４】
上記反応系が、
（ｉ）ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、ＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、（ｉｉ）ＣＸＣＲ３のＣ末端側にＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、
（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、ＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質を内因的に発現する宿主動物細胞、
（ｉｖ）ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、請求の範囲１３のスクリーニング方法。
【請求項１５】
上記反応系に、被験物質の存在下及び非存在下でＧＴＰアナログを添加し、ＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットとＧＴＰアナログとの結合を両条件下で比較することを含む、請求の範囲１４のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットが、アデニル酸シクラーゼと相互作用する領域を含むものである、請求の範囲１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
上記反応系に、被験物質の存在下及び非存在下でＡＴＰを添加し、アデニル酸シクラーゼ活性を両条件下で比較することを含む、請求の範囲１６の方法。
【請求項１８】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞におけるｃＡＭＰ量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、請求の範囲１６記載の方法。
【請求項１９】
ＣＸＣＲ３に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットが、ホスホリパーゼＣβと相互作用する領域を含むものである、請求の範囲１４のスクリーニング方法。
【請求項２０】
上記反応系に、被験物質の存在下及び非存在下でホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸を添加し、ホスホリパーゼＣβ活性を両条件下で比較することを含む、請求の範囲１９のスクリーニング方法。
【請求項２１】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞における細胞内カルシウムイオンの量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、請求の範囲１９のスクリーニング方法。
【請求項２２】
ｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリポーター遺伝子を含む発現ベクターをさらに含む上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞における該リポーター遺伝子の発現量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、請求の範囲１６のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ＴＰＡ応答エレメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリポーター遺伝子を含む発現ベクターをさらに含む上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞における該リポーター遺伝子の発現量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、請求の範囲１９のスクリーニング方法。
【請求項２４】
既知リガンドの共存下で実施される、請求の範囲１３〜２３のいずれかのスクリーニング方法。
【請求項２５】
請求の範囲１０〜２４のいずれかの方法により選択されるＣＸＣＲ３リガンドを有効成分とする血糖及び／又はインスリン分泌調節薬。
【請求項２６】
請求の範囲１０〜２４のいずれかの方法により選択されるＣＸＣＲ３作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬。
【請求項２７】
生活習慣病治療薬である請求の範囲２６の耐糖能異常改善薬。
【請求項２８】
糖尿病治療薬である請求の範囲２６の耐糖能異常改善薬。
【請求項２９】
請求の範囲１０〜２４のいずれかの方法により選択されるＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする低血糖改善薬。
【請求項３０】
請求の範囲１０〜２４のいずれかの方法により選択されるＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする、インスリン分泌抑制により改善され得る疾患の治療薬。
【請求項３１】
請求の範囲１０〜２４のいずれかに記載の方法により選択されるＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする抗肥満薬。
【請求項３２】
ＣＸＣＲ３の生理的リガンドに特異的親和性を有する抗体又は該リガンドをコードする核酸もしくは該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸を用いて、生体試料中のＣＸＣＲ３リガンド又は該リガンド遺伝子の転写産物を測定することを含む、２型糖尿病の診断方法。
【請求項３３】
ＣＸＣＲ３の生理的リガンドに特異的親和性を有する抗体又は該リガンドをコードする核酸もしくは該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸を含んでなる２型糖尿病診断薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＣＸＣＲ３リガンドの新規医薬用途に関する。より詳細には、本発明はインスリン分泌調節のためのＣＸＣＲ３リガンドの使用、例えば、耐糖能異常改善及び糖尿病などの生活習慣病の治療のためのＣＸＣＲ３作動薬の使用、並びに低血糖改善及び肥満症などのインスリン過剰分泌が関与する疾患の治療のためのＣＸＣＲ３拮抗薬の使用に関する。本発明はまた、上記疾患の治療薬となり得る新規なＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法に関する。さらにまた、本発明は、生体試料中のＣＸＣＲ３の生理的リガンドの発現を調べることによる２型糖尿病の診断方法及びそのための臨床検査薬に関する。
背景技術
糖尿病はその病態から１型と２型に分類される。すなわち、１型は膵臓におけるインスリン分泌機能不全に基づく病態であり、２型はインスリン感受性組織におけるインスリン抵抗性と膵臓におけるインスリン分泌異常が主たる病態である。近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満とそれに付随する生活習慣病、特に２型糖尿病患者の増加が著しい。
血糖調節において膵臓は中心的役割をはたすと考えられている。主要な血糖調節ホルモンであるインスリンは膵臓のランゲルハンス島のβ細胞から分泌される。β細胞は食後などに一過的に上昇する血糖に応答して迅速に必要量のインスリンを分泌する。筋肉、脂肪等の末梢組織では膵臓から分泌されたインスリンに応答して糖を取り込むことにより、上昇した血糖の調節を行っている。さらに、肝臓ではインスリンに応答して糖新生が抑制され、血糖の調節が行われている。このようなサイクルに破綻が生じることにより糖尿病が発症すると考えられている。事実、１型糖尿病の多くは、膵臓が自己免疫的に破壊されインスリン分泌不全になることにより血糖コントロールが不能になるものであり、２型糖尿病ではインスリン分泌における第一相の分泌不良が高血糖を招来することが知られている。
上述のような観点から、膵臓におけるインスリン分泌の促進は糖尿病病態の改善効果に大きく貢献すると考えられる。このような作用機序を持つ薬剤としては、現在のところスルホニルウレア剤などが上市されているが、血糖値に応じたインスリン分泌調節作用がないため、血糖が低下してもなおインスリン分泌促進効果が持続して低血糖に陥り、昏睡、さらには死亡を招く危険性がある。現在、血糖値に応じたインスリン分泌促進効果が得られるというような特徴をもつ安全な薬剤は上市されておらず、このような薬剤の開発が望まれている。
したがって、本発明の目的は、糖代謝調節作用を有する化合物およびそのスクリーニング方法を提供することであり、それらを用いた耐糖能異常の改善方法、糖尿病を初めとする生活習慣病の治療薬を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、膵臓におけるインスリン分泌の調節に関与する因子を同定すべく、正常人の膵臓で発現する遺伝子と正常人のその他の諸組織で発現する遺伝子とを比較した結果、正常人の膵臓において発現局在する遺伝子として、ケモカインレセプターの一種であるＣＸＣケモカインレセプタータイプ３（ＣＸＣＲ３；またはＧＰＲ９ともいう）の遺伝子を同定した。このレセプターの膵臓内におけるさらに詳細な局在性を調べた結果、このタンパク質はランゲルハンス氏島で特異的に発現していることが明らかとなり、インスリン分泌調節に関与している可能性が強く示唆された。
ケモカインは特定の白血球サブセットの遊走作用、活性化を支配する一連のサイトカインとして発見されたものの総称である。ケモカインは分子内に保存されたシステイン残基を持ち、その分子構造上の位置によりＣＸＣ、ＣＣ、ＣおよびＣＸＸＸＣの４つのサブファミリーに分類されている。ケモカインの機能としては、免疫、炎症時の特異的白血球の浸潤のメディエーターとしての働きが知られているが、糖代謝制御に関する作用についてはこれまで全く知られていなかった。
本発明者らは、次に、ＣＸＣＲ３を介したシグナル伝達が膵臓におけるインスリン分泌に関与しているか否か、ＣＸＣＲ３のリガンドが膵臓を介した抗糖尿病作用を発揮するか否かを検討した。すなわち、ＣＸＣＲ３をレセプターとするケモカインであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ及びＩ−ＴＡＣの糖尿病モデルマウスにおける耐糖能異常に及ぼす効果を評価したところ、これらのケモカインは糖負荷による血糖値の上昇に応じて一過的にインスリン分泌を促進し、顕著な耐糖能異常改善作用を示すことを見出した。ＩＰ−１０投与による血糖値の変動はインクレチン作用を有するグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のそれと同様であったが、ＧＬＰ−１は摂食調節に関与することが報告されていることから、ＩＰ−１０も同様に血糖値をコントロールしながら摂食量を調節する効果が期待され、過食による肥満及びそれに伴う種々の生活習慣病の治療にも有効であることが示唆された。
これらの結果は、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ及びＩ−ＴＡＣ、並びに最近報告されたＢＣＡ−１（ＣＸＣＬ１３）といったケモカインのみならず、ＣＸＣＲ３に対するアゴニスト活性を有するあらゆる化合物が耐糖能異常改善作用及び糖尿病を含む生活習慣病の治療活性を有することを示している。一方、ＣＸＣＲ３に対するアンタゴニスト活性を有する化合物は、ＣＸＣＲ３を介したシグナル伝達の異常亢進を抑制することによりインスリン分泌を調節し得るので、低血糖や、他のインスリン分泌抑制により改善が期待される種々の病態の改善作用、抗肥満作用などを有すると考えられる。従って、ＣＸＣＲ３の新規リガンドの探索手段の提供は、上記疾患の治療薬の開発において極めて重要である。
そこで、本発明者らは、ＣＸＣＲ３又はその発現細胞、および公知のＣＸＣＲ３リガンドを用いて新規ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング系を構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＣＸＣＲ３リガンドを有効成分とする血糖及び／又はインスリン分泌調節薬、詳細には、ＣＸＣＲ３作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬、生活習慣病、特に糖尿病治療薬、並びにＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする低血糖改善薬、インスリン分泌抑制により改善され得る疾患の治療薬、抗肥満薬を提供する。
別の本発明は、ＣＸＣＲ３又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験試料を接触させ、該レセプター又はそのフラグメントに結合する化合物を選択することを含む、ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法を提供する。
また別の本発明は、被験物質の存在下及び非存在下で、ＣＸＣＲ３又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに既知リガンドを接触させ、該レセプター又はそのフラグメントと既知リガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む、ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法を提供する。
ＣＸＣＲ３は三量体ＧＴＰ結合タンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）であり、共役するＧタンパク質αサブユニット（Ｇα）についても幾つかの知見が得られている。従って、本発明は、ＣＸＣＲ３を含む脂質二重層及び共役するＧαを含んでなる反応系において、該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は共役Ｇタンパク質の細胞刺激活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法を提供する。
さらに別の本発明は、上記のいずれかのスクリーニング方法により選択されるＣＸＣＲ３リガンドを有効成分とする血糖及び／又はインスリン分泌調節薬、詳細には、ＣＸＣＲ３作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬、生活習慣病、特に糖尿病治療薬、並びにＣＸＣＲ３拮抗薬を有効成分とする低血糖改善薬、インスリン分泌抑制により改善され得る疾患の治療薬、抗肥満薬を提供する。
本発明の知見に基づけば、ＣＸＣＲ３作動薬以外にも、ＣＸＣＲ３の発現もしくは活性を増強させる物質は、該レセプターを介したシグナル伝達を亢進することができるので、耐糖能異常の改善や生活習慣病、特に糖尿病の治療に有効である。従って、本発明はまた、ＣＸＣＲ３作動薬以外の、ＣＸＣＲ３の発現もしくは活性を増強する物質を有効成分とする耐糖能異常改善薬、生活習慣病、特に糖尿病治療薬を提供する。
一方、ＣＸＣＲ３拮抗薬以外にも、ＣＸＣＲ３の発現もしくは活性を阻害する物質は、該レセプターを介したシグナル伝達を遮断することができるので、低血糖や、他のインスリン分泌抑制により改善が期待される種々の病態の改善作用、抗肥満作用などを有する。従って、本発明はまた、ＣＸＣＲ３拮抗薬以外の、ＣＸＣＲ３の発現もしくは活性を阻害する物質を有効成分とする低血糖改善薬、インスリン分泌抑制により改善され得る疾患の治療薬、抗肥満薬を提供する。
また、２型糖尿病患者においては、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドの血中濃度が健常者と比較して有意に増加している。従って、本発明はまた、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドに特異的親和性を有する抗体又は該リガンドをコードする核酸もしくは該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸を用いて、生体試料中のＣＸＣＲ３リガンド又は該リガンド遺伝子の転写産物を測定することを含む、２型糖尿病の診断方法、並びに該抗体又は該核酸を含んでなる２型糖尿病診断薬を提供する。
本発明のさらなる特徴及び本発明の利点について、以下の「発明の実施の形態」においてより詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
「ＣＸＣＲ３」は、ＣＸＣケモカインであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ並びにＢＣＡ−１の共有レセプターであり、単球もしくはＴｈ１細胞表面に特異的に発現することの知られたＧＰＣＲである。ＣＸＣＲ３遺伝子の塩基配列及びＣＸＣＲ３のアミノ酸配列は公知であり、例えばヒトＣＸＣＲ３  ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）はＧｅｎＢａｎｋに受託番号：ＮＭ＿００１５０４として登録されている。本発明において「ＣＸＣＲ３」とは、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１等のリガンドと相互作用し得るものであれば特に制限されず、ヒト及び他の哺乳動物由来のＣＸＣＲ３の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードするＤＮＡを含む組換え細胞から製造される組換えＣＸＣＲ３、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。
より具体的には、本発明のＣＸＣＲ３は、配列番号２に示されるアミノ酸配列もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質をいう。ここで「実質的に同一」とは、当該技術分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を用いた場合に、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上のアミノ酸同一性を有することをいう。また、「同質の活性」とは活性が定性的に同等であることを意味し、定量的にも同等であることが好ましいが、許容し得る範囲（例えば、約０．５〜約２倍）で異なっていてもよい。ここでＣＸＣＲ３の活性としては、リガンド結合活性及び細胞刺激活性（例えば、細胞内カルシウム濃度増大活性、細胞内ｃＡＭＰ濃度低減活性等）が挙げられる。
「ＣＸＣＲ３リガンド」とは、特にことわらない限り、生理的リガンド（ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１）だけでなく、アゴニスト（即ち、レセプターの生理的リガンド結合部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やアンタゴニスト（レセプターの生理的リガンド結合部位に結合するが、リガンド様の活性を示さない物質）及びインバースアゴニスト（レセプターのいずれかの部位に結合してそのコンフォメーションを変化させ、レセプターを不活性化する物質）をも包含するものとする。例えば、ＣＣケモカインであるｅｏｔａｘｉｎ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−３α、６Ｃｋｉｎｅは、ＣＸＣＲ３と弱く結合することが知られている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（２９）：１８２８８−１８２９１（１９９８）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：３８０４−３８１２（１９９９）］。
「ＣＸＣＲ３作動薬」とは、ＣＸＣＲ３に結合して該レセプターの活性を促進する物質の総称として用いられ、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１やそれらの改変体の他、ＣＸＣＲ３に対するアゴニスト活性を有する公知及び新規のあらゆる化合物を包含する。好ましくは該作動薬はＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１、それらの改変体およびそれらのプロドラッグ（プロドラッグについては後述）からなる群より選択されるものであり、特に好ましくはＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、それらの改変体およびそれらのプロドラッグ（プロドラッグについては後述）からなる群より選択されるものである。
ＣＸＣＲ３の生理的リガンドであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１のアミノ酸配列及びそれらの遺伝子の塩基配列はいずれも公知であり、例えばヒト由来のこれらリガンドのｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号：ＮＭ＿００１５６５（配列番号３），ＮＭ＿００２４１６（配列番号５），ＮＭ＿００５４０９（配列番号７），ＮＭ＿００６４１９（配列番号９）としてそれぞれ登録されている。本発明において「ＩＰ−１０」、「Ｍｉｇ」、「Ｉ−ＴＡＣ」、「ＢＣＡ−１」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のこれら各ケモカインタンパク質の他、それらをコードするＤＮＡを含む組換え細胞から製造される組換えタンパク質を包含する。
ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ及びＢＣＡ−１の「改変体」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のこれらケモカインの成熟タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号４、６、８及び１０に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１以降のアミノ酸配列）において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、且つＣＸＣＲ３に対するアゴニスト活性を保持するあらゆるペプチド性物質を包含する。「複数のアミノ酸」とは、好ましくは１〜３０アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸、さらに好ましくは１〜５アミノ酸であり、これらは連続していても不連続であってもよい。例えば、任意の哺乳動物由来のＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ及びＢＣＡ−１の自然もしくは人工突然変異体、任意の哺乳動物由来のＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ及びＢＣＡ−１の機能的フラグメント等も、本発明における「改変体」に含まれる。
ＣＸＣＲ３の生理的リガンドは、インスリン分泌促進作用を有するＧＬＰ−１と同様、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）による分解を受けやすく、その分解産物はＣＸＣＲ３との結合活性を保持するが、ケモカイン活性を喪失することが知られている。すなわち、該分解産物はＣＸＣＲ３のアンタゴニストとして作用し、インタクトなリガンドの耐糖能改善作用を減殺してしまうので、これらのリガンドにＤＰＰＩＶ耐性を付与することがより望ましい。従って、好ましい改変体としては、これらのリガンドを環状化したり、レシチン化したもの、あるいはＮ末端から２番目のプロリンを他のアミノ酸に置換したもの等が挙げられる。このようなペプチドの改変は、自体公知の手法を用いて容易に行うことができる。
ＣＸＣＲ３作動薬は、投与された動物において、血糖値の上昇に応答して一過的にインスリン分泌を促進して血糖値を低下させるが、血糖値の低下後にはインスリン分泌作用が低下するので、低血糖を引き起こすことがなく、安全な耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬として有効である。
また、ＣＸＣＲ３作動薬は、摂食制御に関与することが知られているＧＬＰ−１と類似の効果を示すことから、糖尿病に限らず、過食等の摂食異常に起因する肥満症及びそれに付随する種々の生活習慣病の治療薬としても有効である。
「ＣＸＣＲ３拮抗薬」とは、ＣＸＣＲ３に結合するが該レセプターの活性を促進しない物質の総称として用いられ、生理的リガンドのＣＸＣＲ３への結合を阻害することによりＣＸＣＲ３の活性を遮断するニュートラルアンタゴニストと、ＣＸＣＲ３の活性型・不活性型の平衡をより不活性な方向に移動させるインバースアゴニストとに分けられる。ＣＸＣＲ３拮抗薬は、上記のいずれかの性質を有する公知及び新規のあらゆる化合物を包含するが、例えば、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１の上記ＤＰＰＩＶによる分解産物や、ＣＸＣＲ３に対して親和性を有することが知られているある種のＣＣケモカイン（例えば、ｅｏｔａｘｉｎはＣＸＣＲ３に対するアンタゴニストであることが示唆されている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（２９）：１８２８８−１８２９１（１９９８）］）等が挙げられる。
ＣＸＣＲ３拮抗薬は、投与された動物において、血糖値の低下に応答して一過的にインスリン分泌を抑制して血糖値を上昇させるので、低血糖改善薬、他のインスリン分泌抑制により改善され得る疾患（例えば、インスリノーマ等）の治療薬、抗肥満薬として有効である。
ＣＸＣＲ３リガンドは、投与対象動物の体内で代謝されてＣＸＣＲ３に対するリガンド活性（アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性）を発揮するプロドラッグの形態で用いることもできる。ＣＸＣＲ３リガンドがＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１等のペプチド性物質の場合、それらの「プロドラッグ」には、当該ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクター、及び該発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞も包含される。
当該発現ベクターは、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１等のＣＸＣＲ３に対するアゴニスト活性を有する生理的リガンド又はそれらの改変体、あるいはそれらのＤＤＰＩＶ分解産物等のＣＸＣＲ３に対するアンタゴニスト活性を有するペプチドをコードするＤＮＡが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されているか、あるいは投与された動物の細胞内で、一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置されていなければならない。
ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１等のＣＸＣＲ３に対するアゴニスト活性を有する生理的リガンドをコードするＤＮＡとしては、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、好ましくは配列番号３、５、７又は９に示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また該生理的リガンドの改変体をコードするＤＮＡとしては、上記アミノ酸配列において１または複数のアミノ酸（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸）が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、且つＣＸＣＲ３に対するアゴニスト活性を保持するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞、好ましくは肝臓、膵臓、小腸で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。「一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置される」とは、例えば、以下でさらに詳述するように、プロモーターとＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡが、該プロモーターからの該ＣＸＣＲ３リガンドの発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有し、該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼの存在下に該スペーサー配列が切り出されて、該ＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡがプロモーターに機能的に連結されるように配置されることをいう。
本発明の発現ベクターは、好ましくはＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。発現ベクターが上述のようにリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスペーサー配列を有する場合、該選択マーカー遺伝子は当該スペーサー配列内に配置することもできる。また、ＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡがシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を有する場合（例えば、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−１以下のアミノ酸配列をコードする塩基配列）、当該配列を他のシグナルコドンに置換することもできる。
本発明の発現ベクターに使用されるベクターは特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
本発明の一実施態様においては、発現ベクターは、不要な時期及び／又は不要な部位でのＣＸＣＲ３リガンドの過剰発現による悪影響を防ぐために、ＣＸＣＲ３リガンドを時期特異的及び／又は組織特異的に発現させることができる。このようなベクターの第一の実施態様としては、投与対象となる動物のＣＸＣＲ３リガンド産生細胞において特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターに機能的に連結したＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡを含むベクターが挙げられる。例えば、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１等のＣＸＣＲ３に対するアゴニスト活性を有する生理的リガンドの遺伝子のネイティブなプロモーター等が挙げられる。
本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターの第二の実施態様として、外因性の物質によってトランスに発現が制御される誘導プロモーターに機能的に連結したＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡを含むベクターが挙げられる。誘導プロモーターとして、例えば、メタロチオネイン−１遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に所望の組織（例えば、肝臓、膵臓、小腸等）に局所投与することにより、任意の時期に組織特異的にＣＸＣＲ３リガンドの発現を誘導することができる。
本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターの別の好ましい態様は、プロモーターとＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡとが、該プロモーターからの該リガンドの発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有するベクターである。該ベクターが標的細胞内に導入されただけではプロモーターはＣＸＣＲ３リガンドの転写を指示することができない。しかしながら、所望の時期に標的組織に該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼを局所投与するか、あるいは該リコンビナーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを局所投与して該リコンビナーゼを標的細胞内で発現させると、該認識配列間で該リコンビナーゼを介した相同組換えが起こり、その結果、該スペーサー配列が切り出され、ＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡがプロモーターに機能的に連結されて、所望の時期に組織特異的にＣＸＣＲ３リガンドが発現される。
上記ベクターに使用されるリコンビナーゼ認識配列は、投与対象に内在のリコンビナーゼによる組換えを防ぐために、内在のリコンビナーゼによっては認識されない異種リコンビナーゼ認識配列であることが望ましい。したがって、該ベクターにトランスに作用するリコンビナーゼもまた異種リコンビナーゼであることが望ましい。このような異種リコンビナーゼと該リコンビナーゼ認識配列の組み合わせとしては、大腸菌のバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘＰ配列、あるいは酵母由来のＦｌｐリコンビナーゼとｆｒｔ配列が好ましく例示されるが、それらに限定されるものではない。
Ｃｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージで発見されたが、特異的なＤＮＡ組換え反応は、原核細胞だけでなく真核細胞である動物細胞や動物ウイルスでも機能することが知られている。同一ＤＮＡ分子上に同方向の２つのｌｏｘＰ配列が存在する場合は、Ｃｒｅリコンビナーゼはその間に挟まれたＤＮＡ配列を切り出して環状分子を形成させる（切り出し反応）。一方、異なるＤＮＡ分子上に２つのｌｏｘＰ配列が存在し、その一方が環状ＤＮＡである場合は、ｌｏｘＰ配列を介して環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ分子上に挿入される（挿入反応）［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６（１９８１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：１５０９−１５１４（１９８４）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１０２６−１０２９（１９８４）］。切り出し反応の例は、動物培養細胞［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：１４７−１６１（１９８９）；Ｇｅｎｅ，１８１：２０７−２１２（１９９６）］、動物ウイルス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５１６６−５１７０（１９８８）；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：４６００−４６０６（１９９５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：３８１６−３８２１（１９９５）］、トランスジェニックマウス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６２３２−６２３６（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６８６１−６８６５（１９９２）；Ｃｅｌｌ，７３：１１５５−１１６４（１９９３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１０３−１０６（１９９４）］等で報告されている。
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用した本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターのプロモーターとしては、所望の時期及び組織での発現を確実にするために、好ましくはウイルス由来プロモーターや哺乳動物の構成タンパク質遺伝子のプロモーターが使用される。
ＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの投与は、治療対象動物自身のＣＸＣＲ３の生理的リガンドを産生する細胞を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うｉｎ  ｖｉｖｏ法のいずれかで行われる。ｅｘ  ｖｉｖｏ法の場合、標的細胞へのベクターの導入は、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等により行うことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法の場合、ウイルスベクターは、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等に投与される。あるいは、静脈内注射などによりベクターを投与すると、ウイルスベクターに対する中和抗体の産生が問題となるが、標的細胞の存在する部位に局所的にベクターを注入すれば（ｉｎ  ｓｉｔｕ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。
また、ＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとして非ウイルスベクターを使用する場合、該発現ベクターの導入は、ポリＬ−リジン−核酸複合体などの高分子キャリアーを用いるか、リポソームに被包して行うことができる。あるいは、パーティクルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用したベクターの使用において、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ自体を局所投与する場合、例えば、リコンビナーゼを適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁して局所注入すればよい。一方、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ発現ベクターを局所投与する場合、該リコンビナーゼ発現ベクターは、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドが、投与対象動物のＣＸＣＲ３の生理的リガンドを産生する細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結した発現カセットを有するものであれば特に制限されない。使用されるプロモーターが構成プロモーターである場合、不要な時期におけるリコンビナーゼの発現を防ぐために、標的細胞に投与されるベクターは、例えばアデノウイルスのように、宿主細胞の染色体への組込みが稀なものであることが望ましい。しかしながら、アデノウイルスベクターを使用した場合、リコンビナーゼの一過的発現はせいぜい４週間程度しか持続しないので、治療が長期に及ぶ場合には第二、第三の投与が必要になる。リコンビナーゼを所望の時期に発現させる別のアプローチとして、メタロチオネイン遺伝子プロモーターのような誘導プロモーターの使用が挙げられる。この場合、レトロウイルス等のインテグレーション効率の高いウイルスベクターの使用が可能となる。
本発明の製剤が、ＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含む宿主細胞を有効成分とする場合、使用される宿主細胞としては、上記のような発現ベクターのｅｘ  ｖｉｖｏ導入法において、投与対象から標的細胞として取り出される自己細胞、または同種異系（例えば、ヒトの場合、死産の胎児や脳死患者等）もしくは異種（ヒトの場合、ブタやサル等の他の哺乳動物）の個体から取り出した細胞、あるいはそれらの幹細胞やＥＳ細胞を培養・分化させて得られる細胞などが例示される。
また、別の態様においては、投与対象となる動物の鼻腔、咽頭、口腔、腸管等に常在する細菌等を宿主細胞として、常法によりこれをＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換し、得られる形質転換体を宿主細胞が通常存在する投与対象内の部位に送達することもできる。
ＣＸＣＲ３リガンドは、医薬上許容される担体とともに経口的もしくは非経口的投与に適した剤形に製剤化される。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のＣＸＣＲ３リガンドを溶解させた液剤、有効量のＣＸＣＲ３リガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のＣＸＣＲ３リガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のＣＸＣＲ３リガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。ここで「有効量」とは、ＣＸＣＲ３作動薬を耐糖能異常患者、糖尿病患者または他の生活習慣病患者の治療のために使用する場合にそれぞれの疾患を改善させるのに十分な量、あるいはＣＸＣＲ３拮抗薬を低血糖患者、他のインスリン分泌抑制により改善され得る疾患に罹病した患者または肥満症患者の治療のために使用する場合にそれぞれの疾患を改善させるのに十分な量をいう。
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
当該ＣＸＣＲ３リガンド製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、ＣＸＣＲ３リガンドおよび医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
ＣＸＣＲ３リガンド製剤の投与量及び投与回数は、症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、通常は、成人に対して１日あたり約０．０００１〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約０．００１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。
ＣＸＣＲ３リガンドをコードする発現ベクター又は該発現ベクターを担持する宿主細胞を有効成分とする本発明の製剤の投与量は、有効成分の種類、プロモーター活性、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、ＣＸＣＲ３リガンド分子自体を有効成分とする治療薬を投与する場合の適切な投与量に相当する量のＣＸＣＲ３リガンド分子を、ベクターもしくは宿主細胞を投与された動物の体内で発現させる程度であることが好ましく、例えば、成人１日あたりベクター量として約２〜約２０μｇ／ｋｇ、好ましくは約５〜約１０μｇ／ｋｇである。
本発明はまた、ＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング系及びそれを用いた当該リガンドのスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の第一の態様は、ＣＸＣＲ３又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験試料を接触させる工程、及び該レセプター又はそのフラグメントに結合する化合物を選択する工程を含む。被験試料としては、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。被験物質との結合活性は、例えば、ＣＸＣＲ３又はそのフラグメントを発現する細胞膜画分をチップ上に固定し、該チップ上に被験試料溶液をロードして、表面プラズモン共鳴法により被験物質の膜への結合及び解離を測定し、結合及び解離の速度あるいは結合量から、被験物質とＣＸＣＲ３との親和性を算出することにより導かれる。
本発明のスクリーニング方法の第二の態様は、被験物質の存在下及び非存在下で、ＣＸＣＲ３又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに既知リガンドを接触させ、該レセプター又はそのフラグメントと既知リガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む。既知リガンドとしては、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１等を用いることができる。
上記のいずれの態様においても、ＣＸＣＲ３又はそのフラグメントは、それらの発現細胞、該細胞の細胞膜画分、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態で提供され得る。ＣＸＣＲ３の発現細胞としては、ＣＸＣＲ３又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞や、ＣＸＣＲ３を内因的に発現する単球もしくはＴｈ１細胞等が挙げられる。また、アフィニティーカラムとしては、抗ＣＸＣＲ３抗体カラム、既知リガンドを用いたカラム、また、ＣＸＣＲ３が組換えタンパク質として提供される場合、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、（ストレプト）アビジン等とそれぞれ特異的親和性を有する金属キレートカラム、グルタチオンカラム、ビオチンコーティングカラム等を用いることができる。
ＣＸＣＲ３またはそのフラグメントと既知リガンドとの結合活性の検出は、例えば、既知リガンドを標識して、ＣＸＣＲ３またはそのフラグメントに結合した標識量を測定することにより行うことができる。
ＣＸＣＲ３はＧＰＣＲの１つであり、ある種の三量体Ｇタンパク質と共役して細胞内にシグナルを伝達する。従って、本発明はまた、ＣＸＣＲ３を含む脂質二重層と、ＣＸＣＲ３と共役するＧタンパク質（特にＧαサブユニット）とを用いたＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ＧαにおけるＧＴＰ・ＧＤＰ交換反応または共役するＧタンパク質の細胞刺激活性を指標として行われる。Ｇタンパク質の細胞刺激活性を指標とする場合、共役させるＧαの態様に応じて、エフェクターの選択や活性測定方法等の具体的な手順が決定されるが、通常、アデニル酸シクラーゼと相互作用する領域を含むＧα（具体的にはＧｉもしくはＧｓファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えばｃＡＭＰ量を測定することにより、ホスホリパーゼＣβと相互作用する領域を含むＧα（具体的にはＧｑファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えば細胞内カルシウムイオンの量を測定することにより、ＣＸＣＲ３リガンドをスクリーニングすることができる。
また、Ｇαの供給源として該Ｇαを含む三量体Ｇタンパク質（Ｇαβγ）を内因的に発現する動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９細胞、Ｌ１．２細胞等）を用いる場合、ＣＸＣＲ３によって活性化されたＧαβγはＧαとＧβγに解離するが、遊離のＧβγはホスホリパーゼＣβに相互作用して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ得るので、共役するＧαのファミリーに関係なく細胞内カルシウムイオンを指標にしてリガンドスクリーニングを行うことも可能である。
ここで、「ＣＸＣＲ３」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のＣＸＣＲ３、及びそれらのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然ＣＸＣＲ３と同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するタンパク質をいう。
ＣＸＣＲ３は、哺乳動物の単球もしくはＴｈ１細胞の膜含有画分から、抗ＣＸＣＲ３抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ＣＸＣＲ３のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗ＣＸＣＲ３抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、ＣＸＣＲ３のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はＣＸＣＲ３の特性を変化させない範囲で、ＣＸＣＲ３に適宜変異を導入することができる。
ＣＸＣＲ３を保持する脂質二重層膜の由来は、当該レセプターが本来の立体構造をとることができる限り特に制限されないが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞膜画分が挙げられる。しかしながら、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞の細胞膜におけるそれに近い比率で混合した溶液から常法により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実施態様において好ましく使用され得る。
ＣＸＣＲ３と共役するＧαは、少なくとも該ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を有することが必要である。例えば、ＣＸＣＲ３と共役するＧαがＧｉファミリーに属する場合（Ｇｉα）には、用いるＧαはＧｉαのＧＰＣＲ結合領域を少なくとも有し、Ｇｉαのグアニンヌクレオチド結合領域もしくは他のファミリーに属するＧα由来のグアニンヌクレオチド結合領域を有するものである。ＧαのＸ線結晶構造解析の結果等から、ＧＰＣＲとの結合にはＣ末端の約５アミノ酸程度の配列が重要であり、一方、グアニンヌクレオチド結合領域は、ｒａｓタンパク質のヌクレオチド結合部位と相同な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ’ボックス、Ｇボックス、Ｇ″ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内のαＥヘリックスの先頭及びαＦヘリックスなど）であることが明らかになっている。
ＣＸＣＲ３に対する生理的リガンド又はアゴニストが該レセプターに結合すると、該レセプターのＧα活性化ドメインとＧαのＧＰＣＲ結合領域とが相互作用してＧαのコンフォメーション変化を生じ、グアニンヌクレオチド結合領域からＧＤＰが解離して速やかにＧＴＰを結合する。一方、インバースアゴニストが結合すると、レセプターのコンフォメーション変化によりＧα活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型のＧα−ＧＴＰレベルが減少する。ここで、ＧＴＰの代わりに３５Ｓ標識したＧＴＰγＳなどのＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加しておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、ＣＸＣＲ３のアゴニスト又はインバースアゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質はアゴニストであり、放射活性が減少すればインバースアゴニストである。
あるいは、ＧαへのＧＴＰアナログの結合を表面プラズモン共鳴法等を用いてモニタリングすることによってもスクリーニングが可能である。
ＣＸＣＲ３のリガンドの活性は、共役するＧαのエフェクターへの作用を指標として測定することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、ＣＸＣＲ３に加えて、さらにエフェクターを含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要がある。また、共役するＧαは該エフェクターと相互作用するための領域をさらに含む必要がある。当該領域はそのＧα本来のエフェクター相互作用領域であってもよいし、異なるファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域であってもよい。例えばＧｉαに対しては異なるファミリーに属するＧαとしてＧｑα、Ｇｓα、Ｇ１２α等が挙げられ、Ｇｑαに対しては異なるファミリーに属するＧαとしてＧｉα、Ｇｓα、Ｇ１２α等が挙げられる。異なるファミリーに属するＧα（例えばＧｑα）のエフェクター相互作用領域を含むＧα（例えばＧｉα）キメラの最も簡便な例としては、ＧｑαのＣ末端の約５アミノ酸程度を、ＧｉαのＣ末端配列で置換したもの（Ｇｑｉα）が挙げられる。
ＣＸＣＲ３と共役するＧαがＧｉαのエフェクター相互作用領域を含む場合、エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられる。一方、共役ＧαがＧｑαのエフェクター相互作用領域を含む場合は、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβを含む脂質二重層膜を用いる必要がある。尚、共役ＧαがＧｓαのエフェクター相互作用領域を含む場合は、エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられ、Ｇｉαの場合とは逆に、アデニル酸シクラーゼ活性の促進作用を指標としてリガンド活性が評価される。
エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼ（以下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系においては、Ｇαのエフェクターへの作用は、ＡＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、ＡＣを含む膜画分にＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（１２５Ｉ）、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ＡＣを含む膜画分に［α−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成する［３２Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法が挙げられるが、これに限定されない。従って、例えば、ＣＸＣＲ３と共役するＧαがＧｉαのエフェクター相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はＣＸＣＲ３のインバースアゴニストであり、活性が減少すればアゴニストである。
スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、ＧαのＡＣへの作用は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定するか、あるいは細胞を［３Ｈ］アデニンで標識し、生成した［３Ｈ］ｃＡＭＰの放射活性を測定することによっても評価することができる。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。
別の態様として、ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＣＲＥを含むプロモーターの下流にリポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された動物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内ｃＡＭＰ量を評価するというものである。
従って、例えばＣＸＣＲ３と共役するＧαがＧｉαのエフェクター相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はＣＸＣＲ３のインバースアゴニストであり、減少すればアゴニストである。
一方、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβ（以下、ＰＬＣβともいう）を含むスクリーニング系（即ち、ＧαがＧｑαであるか又はＧｑαのエフェクター相互作用領域を含むキメラタンパク質（キメラＧｑα）の場合）においては、該Ｇｑα又はキメラＧｑαのエフェクターへの作用は、ＰＬＣβ活性を直接測定することにより評価することができる。ＰＬＣβ活性は、例えば、３Ｈ標識したホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸をＰＬＣβ含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下でＰＬＣβ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＰＬＣβ活性が増加すれば該被験物質はＣＸＣＲ３のアゴニストであり、活性が減少すればインバースアゴニストである。
スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、Ｇｑα又はキメラＧｑαのＰＬＣβへの作用は、細胞に［３Ｈ］イノシトールを添加し、生成した［３Ｈ］イノシトールリン酸の放射活性を測定したり、細胞内のＣａ２＋量を測定することによっても評価することができる。細胞内Ｃａ２＋量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏ−３、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光タンパク質であるエクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、ＦＬＩＰＲ登録商標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）システムが挙げられる。
別の態様として、Ｃａ２＋によりアップレギュレートされるＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、Ｃａ２＋量を評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＴＲＥを含むプロモーターの下流にリポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核生物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ２＋量を評価するというものである。
従って、被験物質の存在下で細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はＣＸＣＲ３のアゴニストであり、減少すればインバースアゴニストである。
上記のＣＸＣＲ３と共役Ｇαとを用いたＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング方法を、ＣＸＣＲ３に対する既知リガンド、例えば、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＣＡ−１等の共存下で行えば、さらにＣＸＣＲ３に対するニュートラルアンタゴニストを容易に選抜することができる。
本発明のスクリーニング法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
本発明のスクリーニング法のために提供される、ＣＸＣＲ３を含む脂質二重層膜、及びＣＸＣＲ３と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系の好ましい一実施態様は、ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、共役ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
「ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡ」は、ヒト及び他の哺乳動物由来のＣＸＣＲ３、あるいは該レセプターのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然ＣＸＣＲ３と同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限はない。ヒトＣＸＣＲ３  ｃＤＮＡのコーディング領域の他、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来のＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡ等が例示され、これらは、哺乳動物の単球もしくはＴｈ１細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ヒトＣＸＣＲ３のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離され得る。また、ＣＸＣＲ３は、ヒトＣＸＣＲ３のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。
Ｇαとしては、ＣＸＣＲ３と共役するものであれば特に制限はない。Ｇαの各遺伝子は公知であり、容易に入手可能である。ＣＸＣＲ３と共役するＧαを含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、少なくとも共役ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域をコードする配列と、任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域をコードする配列を有することが必要である。上述の通り、ＧαのＸ線結晶構造解析の結果から、ＧＰＣＲ結合領域及びグアニンヌクレオチド結合領域はよく知られており、当業者は、所望によりＧαのコーディング配列の一部を欠失したフラグメントを容易に構築することができる。
Ｇαのエフェクターへの作用を指標とするスクリーニング系においては、ＣＸＣＲ３と共役するＧαをコードするＤＮＡは、所望のエフェクターと相互作用するための領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む必要がある。エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを用いる場合は、該ＤＮＡはＧｉαもしくはＧｓαのエフェクター相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一方、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβを用いる場合には、該ＤＮＡはＧｑαのエフェクター相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。各Ｇα遺伝子は公知であり、それらのエフェクター相互作用領域もよく知られている。従って、当業者は、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、容易にキメラＧαタンパク質をコードするＤＮＡを構築することもできる。当該キメラタンパク質（例えば、Ｇｑｉα）をコードするＤＮＡの最も簡便な例としては、ＧｑαのｃＤＮＡのＣ末端の約５アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲ等の公知の手法を用いてＧｉαのＣ末端配列をコードするＤＮＡ配列に置換したものが挙げられる。
ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡ、及びＣＸＣＲ３と共役するＧαをコードするＤＮＡは、宿主真核生物細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、宿主真核生物細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター、バキュロウイルス由来ポリヘドリンプロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の真核生物由来細胞の構成タンパク質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ましい。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有していてもよい。
本発明のスクリーニング系に使用されるベクターとしてはプラスミドベクターの他、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等、あるいは昆虫細胞での使用に好適なバキュロウイルスベクター等も挙げられる。
ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡと、ＣＸＣＲ３と共役するＧαをコードするＤＮＡは、２つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主細胞に共トランスフェクトされてもよいし、あるいは、１つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されてもよい。
宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物細胞、あるいは昆虫細胞であれば特に制限はない。具体的には、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＴ２等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｒｏ等のサル由来細胞、ＨｅＬａ、２９３等のヒト由来細胞、およびＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ等の昆虫由来細胞などが例示される。
宿主細胞への遺伝子導入は、真核生物細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｇｒａｃｅ’ｓ昆虫細胞培養用培地等を用いて培養することができる。培地のｐＨは約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、通常約２７〜約４０℃である。
上記のようにして得られる、ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡ及びＣＸＣＲ３と共役するＧαをコードするＤＮＡを導入された真核生物細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例えば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収する）単離される膜画分の形態であってもよい。
例えば、ＧＴＰγＳ結合アッセイや、エフェクターの活性を直接測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはｃＡＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＣａ２＋応答性リポーターの発現量）を測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核生物細胞である。
尚、リガンド活性の評価を、ｃＡＭＰ応答性リポーター（エフェクターがアデニル酸シクラーゼの場合）もしくはＣａ２＋応答性リポーター（エフェクターがホスホリパーゼＣβの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿主真核生物細胞は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）またはＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター領域の下流にリポータータンパク質をコードするＤＮＡが機能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入されたものである必要がある。ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＧＴＣＡを含む配列が挙げられるが、ｃＡＭＰ応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。一方、ＴＲＥはＣａ２＋の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＴＣＡを含む配列が挙げられるが、Ｃａ２＋応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。ＣＲＥ又はＴＲＥを含むプロモーター配列としては、上記のようなウイルスプロモーターや哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターが同様に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列の下流にＣＲＥまたはＴＲＥ配列を挿入することができる。ＣＲＥ又はＴＲＥの制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポータータンパク質をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列が配置されることがより好ましい。このようなＣＲＥ（又はＴＲＥ）−リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用することができる。
本発明のスクリーニング法のために提供される、ＣＸＣＲ３を含む脂質二重層膜、及びＣＸＣＲ３と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系の別の好ましい実施態様は、ＣＸＣＲ３のＣ末端側に、共役ＧαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡ、及びＣＸＣＲ３と共役するＧαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、上述のようにして取得することができる。当業者は、これらのＤＮＡ配列をもとにして、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、ＣＸＣＲ３とＧαとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを構築することができる。簡潔にいえば、ＰＣＲ等を用いてＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡの終始コドンを除去したものに、ＧαをコードするＤＮＡを読み枠が合うように、即ちインフレームに、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする。この際、ＣＸＣＲ３のＣ末の一部を欠失させたり、ＣＸＣＲ３とＧαとの間にＨｉｓタグ等のリンカー配列を挿入してもよい。
得られた融合タンパク質をコードするＤＮＡは、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主真核生物細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。得られた真核生物細胞の膜上に当該融合タンパク質が発現すると、レセプターの細胞内第３ループ上のＧα活性化ドメインと共役Ｇαのレセプター結合領域とは、ＣＸＣＲ３に対する生理的リガンドの非存在下に相互作用して、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進し得る。従って、Ｇαは恒常的に活性化された状態となる。
レセプター−Ｇα融合タンパク質発現細胞を、Ｇαのエフェクターへの作用を指標にしたスクリーニングに使用する場合において、Ｇαがレセプターと連結していることがエフェクターとの相互作用の妨げとなる場合には、レセプターとＧαとのジャンクション部位に、特異的なプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列（例えば、トロンビン感受性配列等）を導入し、融合タンパク質を膜上に発現させた後に当該プロテアーゼを作用させてレセプターとＧαとを切り離すことができる。
レセプター−Ｇα融合タンパク質発現細胞についても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択して用いることができる。
本発明のスクリーニング法のために提供される、ＣＸＣＲ３を含む脂質二重層膜、及びＣＸＣＲ３と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系のさらに別の実施態様は、共役Ｇタンパク質を内因的に発現する宿主動物細胞を、ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトすることにより調製される細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを挿入する発現ベクター、該発現ベクターの宿主細胞への導入法は、上述の通りのものを使用することができる。
本発明のさらに別の態様においては、本発明のスクリーニング系は、ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ３と共役するＧタンパク質を内因的に発現する動物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。このような細胞としては、哺乳動物の単球もしくはＴｈ１細胞が好ましく例示される。
本発明のさらに別の態様においては、ＣＸＣＲ３を含む脂質二重層膜、及びＣＸＣＲ３と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系として、精製したＣＸＣＲ３と共役Ｇα、あるいは精製した該レセプターと共役Ｇαとの融合タンパク質を、人工脂質二重層膜中に再構成させたものを使用することができる。ＣＸＣＲ３は、ヒト又は他の哺乳動物の単球もしくはＴｈ１細胞から得られる膜画分から、抗ＣＸＣＲ３抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。あるいは、該レセプターは、ＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗ＣＸＣＲ３抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することもできる。同様に、該レセプターと共役Ｇαとの融合タンパク質も、該融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗ＣＸＣＲ３抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
人工脂質二重層膜を構成する脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。
例えば、レセプターとＧα、又はレセプター−Ｇα融合タンパク質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオリポソーム）は、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝１２：１２：１の混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製したレセプターとＧα、又はレセプター−Ｇα融合タンパク質を、適量添加し、氷中で時々攪拌しながら２０〜３０分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液に対して透析する。約１００，０００×ｇで３０〜６０分間遠心して沈渣を回収することにより、プロテオリポソームを調製することができる。
上記の本発明のスクリーニング法により選択されるＣＸＣＲ３アゴニストは、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドと同様に、耐糖能異常改善作用を示すことは明白であり、従って、これらを適当な添加剤と組み合わせることにより、耐糖能異常改善薬とすることができる。従って、本発明はまた、本発明のスクリーニング法により選抜されたＣＸＣＲ３作動薬を有効成分とし、必要に応じて医薬上許容される担体とを配合させてなる耐糖能異常改善薬、又は生活習慣病治療薬、特に糖尿病治療薬を提供する。
また、上記の本発明のスクリーニング方法により選択されるＣＸＣＲ３アンタゴニストまたはインバースアゴニストは、投与することにより、インスリン分泌が低下することが想定されるため、インスリン分泌が低下することによって効果がもたらされると考えられる各種の疾患に適用可能である。また、ＣＸＣＲ３拮抗薬が従来より動物が安全に摂取している食用物質である場合には、それらの物質はダイエット食品等の用途にも適用可能である。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のＣＸＣＲ３リガンドを溶解させた液剤、有効量のＣＸＣＲ３リガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のＣＸＣＲ３リガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のＣＸＣＲ３リガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。当該ＣＸＣＲ３リガンド製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、ＣＸＣＲ３リガンドおよび医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
ＣＸＣＲ３リガンド製剤の投与量及び投与回数は、症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、通常は、成人に対して１日あたり約０．０００１〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約０．００１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明によれば、２型糖尿病患者の血中には、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドであるＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ又はＢＣＡ−１等が健常者のそれよりも高濃度に存在することが見出された。従って、本発明はまた、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドに特異的親和性を有する抗体又は該リガンドをコードするＤＮＡもしくは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを用いて、生体試料中のＣＸＣＲ３リガンド又は該リガンド遺伝子の転写産物を測定することを含む、２型糖尿病の診断方法を提供する。
抗ＣＸＣＲ３リガンド抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。抗ＣＸＣＲ３リガンド抗体のフラグメントは、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ及びＢＣＡ−１等のＣＸＣＲ３の生理的リガンドに対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるものであってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。
例えば、ポリクローナル抗体は、ＣＸＣＲ３の生理的リガンドあるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリアータンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１（２）：２２３−２２８（１９８５）］でも電圧パルス法［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７（６）：６２７−６３３（１９８８）］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
ＣＸＣＲ３の生理的リガンドをコードするＤＮＡもしくは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡは、公知のヒトＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ及びＢＣＡ−１のｃＤＮＡ配列を基にして、容易に取得することができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、標的ＤＮＡと約８０％以上の同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件であり、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件が選択される。このようなストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションバッファーや洗浄液の塩濃度やハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度等を適宜選択することにより、容易に調節することができる。
本発明の診断方法に用いられる生体試料としては、血液、血漿、血清、尿、血球細胞ホモジネートやバイオプシーにより採取した組織（例えば筋肉組織や脂肪組織）等が例示されるが、それらに限定されない。
本発明はまた、ＣＸＣＲ３作動薬以外の、ＣＸＣＲ３の発現もしくは活性を増強する物質を有効成分として含有する耐糖能異常改善薬、生活習慣病、特に糖尿病治療薬を提供する。このような物質としては、ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその改変体、あるいはそれらをコードするＤＮＡを含む発現ベクター等が挙げられる。ＣＸＣＲ３タンパク質としては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質、改変体としては、該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列を有し、且つＣＸＣＲ３の生理活性を保持するタンパク質が挙げられる。ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその改変体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、上記ＣＸＣＲ３リガンドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと同様の手法により構築することができる。
本発明はまた、ＣＸＣＲ３拮抗薬以外の、ＣＸＣＲ３の発現もしくは活性を阻害する物質を有効成分として含有する低血糖改善薬、インスリン分泌抑制により改善され得る疾患の治療薬、抗肥満薬を提供する。
ＣＸＣＲ３の発現を阻害する物質の好ましい一態様は、ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。
本発明のアンチセンス核酸の長さは、ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。アンチセンス核酸が約２５ｍｅｒのオリゴＤＮＡの場合、生理条件下でＣＸＣＲ３のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、通常、約８０％以上の同一性を有するものであればよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＸＣＲ３のｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。
ＣＸＣＲ３の機能的な発現を翻訳後レベルで阻害する物質の好ましい一態様は、ＣＸＣＲ３に対する抗体もしくはそのフラグメントである。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。抗ＣＸＣＲ３抗体のフラグメントは、ＣＸＣＲ３に対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるものであってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。
ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗ＣＸＣＲ３抗体は、ヒトと他の動物（例えば、マウス等）のキメラ抗体であることが好ましく、ヒト化抗体であることがさらに好ましい。ここで「キメラ抗体」とは免疫動物由来の可変部（Ｖ領域）とヒト由来の定常部（Ｃ領域）を有する抗体をいい、「ヒト化抗体」とはＣＤＲを除いて他の領域をすべてヒト抗体に置き換えた抗体をいう。キメラ抗体やヒト化抗体は、例えば、上記と同様の方法により作製したマウスモノクローナル抗体の遺伝子からＶ領域もしくはＣＤＲをコードする配列を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体のＣ領域をコードするＤＮＡと融合したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、これを適当な宿主細胞に導入して該キメラ遺伝子を発現させることにより取得することができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
参考例１：正常人の膵臓におけるＣＸＣＲ３の発現局在
正常人各組織（脂肪、小脳、心臓、海馬、腎臓、肝臓、肺、筋肉、膵臓、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、白血球）からそれぞれ調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行った。ＤＮＡチップ解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを用いて行った。具体的には、解析は、（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製、（２）該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５）プローブアレイの染色、（６）プローブアレイのスキャンおよび（７）遺伝子発現解析の手順で行った。
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
正常人各組織から調製した各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０μｇおよびＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃で１０分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）２μＬおよび該キットに含まれる１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ  ２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）９１μＬ、該キットに含まれる５×Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３０μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３μＬ、該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ４μＬ（４０Ｕ）および該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  １μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加して混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μＬの本層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬおよびエタノール３６２．５μＬを加えて混合した後、４℃、１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むＤＮＡペレットを得た。その後、該ペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水１２μＬに溶解した。以上の操作によってｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを取得した。
（２）ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
上記（１）で調製した各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＤＴＴ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ  ４μＬおよび該キットに含まれる２０×Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させた。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えた後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて添付プロトコールに従って、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
上記（２）で精製した各ラベル化ｃＲＮＡ  ２０μｇを含む溶液に、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  トリス−酢酸，ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、５００ｍＭ  酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）および１５０ｍＭ  酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加え、得られる反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによってラベル化ｃＲＮＡをフラグメント化した。
（４）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイゼーション
上記（３）で得た各フラグメント化ｃＲＮＡ  ４０μＬに、５ｎＭ  Ｃｏｎｔｏｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μＬ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ４μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ［Ｎａ＋］、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５−６．７）２００μＬおよびＤＥＰＣ処理水１４４μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
一方、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
（５）プローブアレイの染色
上記（４）で得たハイブリダイズ済みプローブアレイのそれぞれから、ハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０および０．００５％  Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０（Ｓｉｇｍａ社製））で満たした。次に、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置に、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後、染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って、一次染色液（１０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および０．００５％  Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）、および二次染色液（１００μｇ／ｍＬ  Ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｖｅｃｔｏｒ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および０．００５％  Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）でそれぞれ染色した。
（６）プローブアレイのスキャンおよび（７）遺伝子発現解析
上記（５）で染色した各プローブアレイをＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎおよび遺伝子発現の比較解析を行った。
その結果、ＣＸＣＲ３は他組織と比較して膵臓において特異的に発現していることが明らかとなった（他組織の発現相対値が−２３〜７２であるのに対して、膵臓では６６８；表１参照）。
2003082335.tif 000003
参考例２：ＣＸＣＲ３の膵臓ランゲルハンス氏島における発現局在
ウエスタンブロット法により、膵臓ランゲルハンス氏島におけるＣＸＣＲ３の発現の有無を検討した。
ＩＣＲマウス（日本クレア）より文献（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５２１（３），７１７−７２８（１９９９））記載の方法により膵臓ラ氏島を単離した。一昼夜培養後、遠心収集しＰＢＳで数回洗浄後、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．２５ｍｌ（１％  ＮＰ４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｓｉｎ、１０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）でピペッティングにより溶解した。また別途膵臓を摘出しＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍｌを加えホモジェナイザーで破砕した。これら抽出液の不溶物を遠心分離にて除いた上清を、等量の２×ＳＤＳサンプルＢｕｆｆｅｒを添加しボイルした後、上清をマルチゲル１０／２０（第一化学）にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）にトランスファーした後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１×ＴＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、５％  Ｓｋｉｍｍｉｌｋ）を用いて１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。抗ＣＸＣＲ３抗体（ＳＮＡＴＡ  ＣＲＵＺ社Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−１３９５１：ＰＢＳＴで２５０倍希釈）を用いて１次抗体反応を行い、２次抗体には、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗ｒａｂｂｉｔ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社：ＰＢＳＴで１０００倍希釈）を用いた。検出はＥＣＬ−Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて行った。
その結果、ＣＸＣＲ３は膵臓のラ氏島に発現局在していることが明らかになった（図１）。この結果より、ＣＸＣＲ３はインシュリンの分泌調節に関与していることが示唆された。
実施例１：経口糖負荷試験
試験には糖尿病モデルマウスＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウス（雄、ＳＰＦグレード、７週齢、日本クレア）を前日より一晩絶食させ、マウスＩＰ−１０（ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ社）、ＧＬＰ−１（７−３６Ａｍｉｄｅ）（ペプチド研）乾燥品を生理食塩水（大塚製薬）に溶解し静脈内投与を行なった（ＩＰ−１０は６μｇ／ｈｅａｄ；ｎ＝４、ＧＬＰ−１は５０μｇ／ｈｅａｄ；ｎ＝４）。溶媒対照群として生理食塩水（大塚製薬）を用いた（ｎ＝４）。静脈内投与後に３ｇ／ｋｇのＤ−ｇｌｕｃｏｓｅを経口投与した。糖負荷前（０分）、糖負荷後１５、４５、９０および１３５分後に尾部静脈より採血し、以下の方法に準じ、血糖値を測定した。
すなわち１０μｌの血液を採取し、０．４Ｎ過塩素酸水溶液１００μｌと混和し、更に０．３７Ｍ炭酸カリウム水溶液５０μｌを添加し、遠心後の上清についてグルコースＣＩＩ・テストワコー（グルコース定量キット、ムタロターゼ・ＧＯＤ法、和光純薬）を用いて血糖値を測定した。その結果ＩＰ−１０は膵臓に作用して、インスリン分泌を促進する作用を持つことが知られているインクレチンの一種であるＧＬＰ−１と用量換算でほぼ同等の耐糖能改善効果が見られた。また糖負荷後の一過的血糖上昇に応答してインスリンが分泌され、血糖が低下するとインスリン分泌作用が低下していることが血糖値の変動から示唆された（図２及び３）。
ＩＰ−１０以外のＣＸＣＲ３リガンドであるＭｉｇ、Ｉ−ＴＡＣについても、マウスＭｉｇ、ヒトＩ−ＴＡＣ（ともにＢＩＯＣＡＲＴＡ社）乾燥品を生理食塩水（大塚製薬）に溶解し静脈内投与を行ない、同様の手法で耐糖能改善作用を評価した。その結果溶媒対照群と比較してＭｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ投与群の糖負荷後９０分後血糖値が低下することを見出した（図４）。よってＣＸＣＲ３リガンドは耐糖能異常改善作用を有することが示された。
実施例２：ＣＸＣＲ３安定発現株の樹立
▲１▼導入遺伝子ベクターの構築
ＣＸＣＲ３のコード領域をＡｍｐｌｉＴａｑ（パーキンエルマー社）にてＰＣＲ法で増幅する。増幅した遺伝子断片を動物細胞で機能するプロモーター（ｐｃＤＡＮ４／ＨｉｓＭａｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））の下流に導入する。
▲２▼細胞株の樹立
Ｌ１．２細胞を１０ｃｍ２培養皿に播種し６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。その後無血清培地に転換し、上記▲１▼で構築したＣＸＣＲ３導入遺伝子をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ）と複合体を形成させたのちに培地に添加する。５時間インキュベート後１０％ＦＢＳを含む培地に転換後さらに８時間培養する。その後トリプシンＥＤＴＡで細胞を培養皿から剥離させ、Ｇ４１８と１０％ＦＢＳを含む培地に懸濁し、１０ｃｍ２培養皿に播種する。数日後形成されたコロニーを単離し、ＣＸＣＲ３リガンドスクリーニング用ＣＸＣＲ３安定発現株とする。
実施例３：ＦＬＩＰＲ登録商標を用いたＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング
▲１▼細胞の調製
ＣＸＣＲ３リガンドスクリーニング用ＣＸＣＲ３安定発現株を９６穴培養皿に播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を培地中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。
▲２▼蛍光測定による細胞内カルシウムの定量
上記の処理を施した細胞の培地を除去し、希釈した評価化合物（ＤＭＳＯ溶液）と４μＭのＦｌｕｏ−３−ＡＭ（Ｔｅｆｌａｂ．）および２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを添加し３７℃で６０分培養する。上記の処理を施した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、１％ゼラチンを含む）に懸濁する。ＦＬＩＰＲ登録商標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）にて培養皿の４８８ｎＭおよび５４０ｎＭにおける吸収を定量する。
実施例４：ＦＬＩＰＲ登録商標を用いたＣＸＣＲ３リガンドのスクリーニング系の構築
ＣＸＣＲ３を一過的に、あるいは安定に発現するＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞を作製し、リガンドであるＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣに対する応答性を確認した。
（１）材料
細胞はＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用し、Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）、１０％  ＦＢＳ（ＩＣＮ）、１００Ｕ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライ）、２５０μｇ／ｍｌ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）で培養した。
ヒトＣＸＣＲ３発現プラスミドとして、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＣＸＣＲ３［ヒトＣＸＣＲ３のコード領域をＡｍｐｌｉＴａｑ（パーキンエルマー社）にてＰＣＲ法で増幅し、これをｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入することにより作製］を使用した。
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬としてはＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）を、形質転換細胞を選択するための薬剤としてはＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）を使用した。
ＦＬＩＰＲ登録商標用試薬として、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）、Ｈ／Ｈ／Ｆ／ＰＢ液（ハンクス液（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％  ＦＢＳ、２．５ｍＭ  ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ）、及びＰｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を使用した。
ＣＸＣＲ３リガンドとしては、Ｈｕｍａｎ  ＩＰ−１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｈｕｍａｎ  Ｉ−ＴＡＣ（Ｇ／Ｔ）を使用した。
（２）方法
１．細胞への一過的遺伝子導入
ＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞を２ｘ１０４個／ｗｅｌｌで９６穴Ｂｌａｃｋ  ｂｏｔｔｏｍ  ｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にまき、抗生物質非存在下、ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＣＸＣＲ３あるいはｐｃＤＮＡ３．１を５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに希釈、また０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに希釈した。両者を混合し室温で３０分間静置後、４０μｌの血清無添加のＦ１２培地を加え、血清無添加のＦ１２培地で１回洗浄したｗｅｌｌに添加した。ＣＯ２インキュベータで４時間培養後、１０％ＦＢＳ添加Ｆ１２培地に置き換え（１回洗浄）、ＣＯ２インキュベータで２４時間培養し、ＦＬＩＰＲ登録商標での測定に供した。
２．薬剤耐性株の選択
細胞を１ｘ１０６個Ｔ２５フラスコにまき、ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＣＸＣＲ３を制限酵素ＳｓｐＩで切断し、ベクター部分で直鎖状とした。このプラスミドＤＮＡ２．５μｇを２５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに希釈、また、１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを２５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに希釈した。両者を混合し、室温で３０分間静置後、２ｍｌの血清無添加のＦ１２培地を加え、血清無添加のＦ１２培地で１回洗浄したフラスコに添加した。ＣＯ２インキュベータで４時間培養後、１０％ＦＢＳ添加Ｆ１２培地に置き換え（１回洗浄）、ＣＯ２インキュベータで４８時間培養した。細胞を回収し、１、５または２５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６穴プレートにまいた。この時、Ｚｅｏｃｉｎを２５０μｇ／ｍｌで添加した。各細胞濃度で３枚ずつ計９枚の９６穴プレートを培養した。約２０日後、増殖してきたｗｅｌｌから細胞を回収し、９６穴Ｂｌａｃｋ  ｂｏｔｔｏｍ  ｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にまいた。翌日ＦＬＩＰＲ登録商標での測定に供し、リガンド応答性のよい株の選択を実施した。リガンド応答性の良好な株について、リクローニングを実施した。それぞれ０．１ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６穴プレートで選択し、約２０日後に増殖してきたｗｅｌｌから細胞を回収し、上記と同様に株の選択を実施した。
３．ＦＬＩＰＲ登録商標によるカルシウムシグナリングの測定
各ｗｅｌｌから回収した細胞は、９６穴Ｂｌａｃｋ  ｂｏｔｔｏｍ  ｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にまいた。細胞数の測定が可能な場合は、２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでまいた。翌日、培地を除去し、２μＭ  Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ、０．０２％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄを含むＨ／Ｈ／Ｆ／ＰＢ液を５０μｌ添加、ＣＯ２インキュベータで１時間培養した。１００μｌのＨ／Ｈ／Ｆ／ＰＢ液に置換し、ＣＯ２インキュベータで１０分間加温した後、ＦＬＩＰＲ登録商標にプレートをセットし、さらに、１０分間３７℃で加温した後、同じく３７℃で加温したリガンドをインジェクターで２５μｌ添加し、カルシウムシグナリングの測定をおこなった。
（３）結果
１．一過的導入によるリガンド応答性の確認
前述の（２）−１．の方法によりＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞にｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＣＸＣＲ３あるいはｐｃＤＮＡ３．１を一過的に導入し、ＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣに対する応答性をＦＬＩＰＲ登録商標で確認した（図５）。その結果、ＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣのいずれのリガンドによってもレスポンスが観察された。一方、コントロールのｐｃＤＮＡ３．１を導入した場合は、いずれのリガンドによっても、レスポンスは検出されなかった。
２．安定発現株におけるリガンド応答性の確認
前述の（２）−２．の方法によりｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＣＸＣＲ３を制限酵素ＳｓｐＩで切断し、ベクター部分で直鎖状とした。これをＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞に導入し、２５０μｇ／ｍｌ  ｚｅｏｃｉｎを用い薬剤耐性株を選択し、１５６株の薬剤耐性株を取得した。次に、これら耐性株について、ＩＰ−１０に対する応答性をＦＬＩＰＲ登録商標で確認し、リガンド応答性の高い株（６クローン）を単離した。これらクローンについてリクローニングを実施し、得られたサブクローンについてそれぞれ１６クローンずつリガンド応答性を調べ、最終的に＃１２２−１７株をＣＸＣＲ３発現細胞株として樹立した。
＃１２２−１７株のＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣに対する応答の濃度依存性を調べた（図６）。その結果、いずれのリガンドに対しても濃度依存性は確認でき、ＩＰ−１０に対しては３００ｎｇ／ｍｌから、Ｉ−ＴＡＣに対しては１００ｎｇ／ｍｌから応答性が確認できた。以上のようにして作製された細胞株に対して被験化合物を供することにより、ＣＸＣＲ３リガンドをスクリーニングすることができる。
実施例５：バインディングアッセイによるスクリーニング
▲１▼細胞膜画分の調製
ＣＸＣＲ３リガンドスクリーニング用ＣＸＣＲ３安定発現株または正常ヒト単球、Ｔｈ１細胞をフラスコに播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を培地中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。細胞を回収し、ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ２−ＭＥ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．２５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁する。Ｐｏｔｔｅｒ型ホモジェナイザーでホモジナイズ（４００ｒｐｍ、２０ストローク）した後、１００，０００ｇで６０分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度ｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁する。この懸濁液を３５％（ｍａｓｓ／ｖｏｌ）ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａの上に重層し、４５，０００ｇで４５分遠心分離を行う。界面の画分を回収してｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し、１００，０００ｇで６０分遠心分離を行う。得られた沈殿を２０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎを含むｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し、以下のアッセイに用いる。
▲２▼レセプターバインディングアッセイ
ＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎＧＶＰｌａｔｅ（Ｍｉｒｉｐｏｒｅ）に反応バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３．１２５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）に懸濁した１２５ＩでラベルしたＩＰ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と希釈した評価化合物（ＤＭＳＯ溶液）とを添加する。３０℃でインキュベートした後、上記の手順で調製した膜画分を添加する。さらに３０℃でインキュベートした後、等量の２０％ＴＣＡを添加し、上清を吸引除去しタンパク質を沈殿させる。１０％ＴＣＡで数回洗浄した後、３７℃で乾燥させた膜をパンチアウトしγカウンターで測定する。
実施例６：ＢＩＡＣＯＲＥ登録商標を用いたスクリーニング
▲１▼細胞膜画分の調製
ＣＸＣＲ３リガンドスクリーニング用ＣＸＣＲ３安定発現株または正常ヒト単球、Ｔｈ１細胞をフラスコに播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を培地中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。細胞を回収し、ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ２−ＭＥ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．２５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁する。Ｐｏｔｔｅｒ型ホモジェナイザーでホモジナイズ（４００ｒｐｍ、２０ストローク）した後、１００，０００ｇで６０分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度ｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁する。この懸濁液を３５％（ｍａｓｓ／ｖｏｌ）ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａの上に重層し、４５，０００ｇで４５分遠心分離を行う。界面の画分を回収してｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し、１００，０００ｇで６０分遠心分離を行う。得られた沈殿を２０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎを含むｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し、以下のアッセイに用いる。
▲２▼ＢＩＡＣＯＲＥ登録商標の結合測定
文献［Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８  Ｄｅｃ  １５；２６５（２）：３４０−５０．Ｍａｒｋｇｒｅｎ  Ｐ０  ｅｔ  ａｌ．］に記載されている一般的な方法を用いる。上記手順で調製したＣＸＣＲ３（例えば１〜１０μｇ）を１０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４）に溶解し、ＢＩＡＣＯＲＥ登録商標のセンサーチップＣＭ５の表面のマトリックスにカルボキシル基を介して固定化する。ＨＢＳバッファー（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社製）をセンサーチップに２０μｌ／分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録する。途中からＨＢＳバッファーに１０ｎＭ〜１０μＭの濃度で溶解した被検化合物に切り替えて１分間流し、薬剤の結合に伴う値の変化を記録する。再び、薬剤を含まないＨＢＳバッファーに切り替え、結合した薬剤の解離に伴う値の変化を記録する。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から被検化合物とＣＸＣＲ３との親和性を計算する。
産業上の利用可能性
本発明のＣＸＣＲ３作動薬は、一過的な血糖値の上昇に対してインスリン分泌を促進し、血糖値の低下後は、インスリン分泌作用が低下するように働くので、低血糖を引き起こすことなく安全な耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬となり得る。また、本発明のＣＸＣＲ３拮抗薬は、インスリン分泌抑制効果を示すので、低血糖の他、インスリン分泌抑制により病態の改善が期待される各種疾患、抗肥満薬として有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願２００２−１０１７８１を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウス膵臓ランゲルハンス氏島におけるＣＸＣＲ３の発現局在を示す電気泳動像である。ＩＣＲマウス由来のラ氏島、全膵臓（各１２μｇ相当）の可溶性画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＣＸＣＲ３抗体をプローブとしてウエスタンブロットした。バンドの位置は約４０．３ＫＤａに相当する。
図２は、マウスの糖負荷後の血糖値の経時変化に及ぼすＩＰ−１０およびＧＬＰ−１投与の効果を示す。横軸は糖負荷後の時間、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す。◆は溶媒対照群、■はＩＰ−１０投与群、▲はＧＬＰ−１投与群をそれぞれ示す。
図３は、図２における各投与群の糖負荷後１３５分までの血糖値の曲線下面積（ＡＵＣ；ｍｇ＊１３５分／ｄｌ）を示す。
図４は、マウスの糖負荷９０分後の血糖値の変化に及ぼすＭｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ投与（静脈内投与）の効果を示す。縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す。
図５は、ＣＸＣＲ３を一過的に発現させたＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞株（上グラフ）の、ＩＰ−１０（図５Ｂ）およびＩ−ＴＡＣ（図５Ａ）に対する応答性を示す。下グラフは空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）を導入したＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞株での結果を示す。各グラフにおいて、横軸は時間（秒）、縦軸は蛍光強度変化を示し、−■−はリガンド濃度３００ｎｇ／ｍｌ、−＊−はバッファーのみでの結果をそれぞれ示す。
図６は、ＣＸＣＲ３を安定に発現するＣＨＯ／Ｇｑｉ５細胞株（＃１２２−１７）の、ＩＰ−１０（図６Ａ）およびＩ−ＴＡＣ（図６Ｂ）に対する応答性を示す。各グラフにおいて、横軸は時間（秒）、縦軸は蛍光強度変化を示し、◆は１，０００ｎｇ／ｍｌ、■は３００ｎｇ／ｍｌ、▲は１００ｎｇ／ｍｌの各リガンド濃度、＊はバッファーのみでの結果をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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