(57)【要約】以下の一般式（１）で表される化合物、及び、被験試料中のダイオキシン類を定量するための免疫測定法であって、以下の一般式（１）で表される化合物を標準品として使用する方法。2004020397.tif 000011（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｚはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
2004020397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（１）で表される化合物。
2004020397.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｚはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
【請求項２】
以下の一般式（１）で表されるダイオキシン類の免疫測定用標準品。
2004020397.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｚはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
【請求項３】
請求項１に記載の化合物を含むダイオキシン類の免疫測定用キット。
【請求項４】
さらに、抗ダイオキシン抗体を含む請求項３に記載のキット。
【請求項５】
さらに、競合用抗原を含む請求項３又は４に記載のキット。
【請求項６】
ダイオキシン類を定量するための免疫測定法であって、請求項１に記載の化合物を標準品として用いる方法。
【請求項７】
免疫測定法が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法から選ばれる方法である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被験試料中のダイオキシン類の濃度又はさらに毒性等量を算出するための免疫測定法であって、請求項１に記載の化合物を標準品として用いる方法。
【請求項９】
免疫測定法が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法から選ばれる方法である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被験試料と抗ダイオキシン抗体とを反応させることにより、抗原抗体反応量を測定する工程（１）と、
工程（１）における抗原抗体反応量を、濃度既知の請求項１に記載の化合物と抗ダイオキシン抗体とを反応させることにより得られた抗原抗体反応量と比較することにより被験試料中に含まれるダイオキシン類濃度を算出する工程（２）と
を含むダイオキシン類の免疫測定法。
【請求項１１】
抗原抗体反応量を、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法から選ばれる方法で測定する請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ダイオキシン類の免疫測定に供される標準品に関する。また本発明は、この標準品を用いたダイオキシン類の免疫測定法、さらに詳しくは、大気、排ガス、土壌、河川、燃焼灰などの中のダイオキシン類の濃度または毒性等量（ＴＥＱ）を、ダイオキシンアナログを標準品として用いることにより算出する方法に関する。
【背景技術】  ダイオキシン類とは、ポリ塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎｓ：ＰＣＤＤｓ）、ポリ塩素化ジベンゾフラン類（ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｄｉｂｅｎｚｏ  ｆｕｒａｎｓ：ＰＣＤＦｓ）、及びコプラナーＰＣＢ（ｃｏｐｌａｎａｒ  ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｂｉｐｈｅｎｙｌ：Ｃｏ−ＰＣＢｓ）の総称である。これら３種類の骨格構造について、塩素置換位置の異なる多数の異性体群が存在する。このうち、ＰＣＤＤｓ及びＰＣＤＦｓでは、２、３、７及び８位に塩素置換がある異性体は強い毒性を有しており、塩素による皮膚炎、多発性神経症、眼球振とう症、肝機能不全などの症状を引き起こすことが知られている。
また、低濃度のダイオキシンであっても長期間曝露することにより、晩発性皮膚ポルフィリン症などの慢性的な症状を引き起こす他、催奇形性、発ガン性、助ガン性といった多種多様な毒性を示すことも知られている。
更に、近年、人や野生動物の内分泌機能を撹乱する作用を持つ、いわゆる「内分泌撹乱物質」が世界的な環境問題としてクローズアップされている。ダイオキシン類もエストロゲン活性を有する内分泌撹乱物質の一つである疑いがあることも判明している。
このように様々な毒性を持つダイオキシン類が、除草剤や殺虫剤などの化学製品、ゴミ焼却場から出る排ガスやフライアッシュ、製紙工場から排出される廃水の中などに含まれていることが明らかとされている。このため、大都市周辺の河川や港湾の水質や底質、大気、土壌といった環境試料のみならず、食品、血液、母乳、尿といった生体試料からもダイオキシン類が検出されている。このように、汚染が環境中に広範囲に広がっていることが大きな社会問題になっていることから、環境中のダイオキシン類暴露量を把握することが急務である。
ダイオキシン類の測定は精度の高い分析値が要求される。このため、各種のクロマトグラフィーにより、ダイオキシン類を抽出、濃縮、精製した後、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計などの高価な分析装置等の機器を用いる公定分析法が採用されている。これらの分析法は高感度であるとともに、複数の化合物を一度に同定、定量できる多成分分析が可能である。その反面、高価で特殊な機器やクリーンルーム等の設備投資が必要であること、分析にも熟練した技術者が求めらること、前処理の煩雑さのために結果を得るまでに時間がかかること等の難点があるのが現状である。
このため、精度が高くかつ簡便なダイオキシン類の測定方法の開発が望まれている。このような問題を解決すべく、抗体を用いた免疫測定法による環境汚染物質の検出技術が注目されている。
免疫測定法とは、抗体が抗原を特異的に認識する能力を用いて微量の抗原を検出又は定量する方法であり、抗体の抗原に対する高い親和性と高い特異性により抗原を高感度に測定することができる。このため、試料の前処理も簡便であり、多検体の測定を簡易かつ迅速に行なうことができ、測定に要するコストが低いといった種々のメリットを持ち、医学、生化学、薬学、農学など広い分野で利用されている。免疫測定法において測定対象物質を検出又は定量するには、抗体または抗原を標識する必要があり種々の標識法が開発されてい。中でも酵素を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は、その簡便性から臨床検査や生化学分野での生体試料中の目的成分の定量に広く応用されている。ＥＩＡは、抗原抗体反応の形式により、競合法と非競合法に大別できるが、ダイオキシン類のような低分子化合物は通常競合法によって測定される。
ＥＩＡにおいては、測定対象と同じ化合物を標準品に用いて検体と同様に測定し、得られた標準曲線から試料中の化合物濃度を算出する。しかしながら、ダイオキシン類は３種の基本骨格を有する化合物群についての塩素置換数の異なった異性体類の総称であるため、どの化合物を標準品にするかが問題となる。
ダイオキシン類の毒性は各同族体及び異性体により異なるため、毒性の異なる同族体及び異性体の混合物であるダイオキシン類の毒性の強さは、個々の異性体の存在比率に依存することになり、単純に各異性体量を合計しても、ダイオキシン類の毒性を正しく表現したことにはならない。
これまでに開発されたダイオキシンＥＩＡ測定系の多くは、最も毒性が高い２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ＴｅＣＤＤ）を標準試料として用いている（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０，１０９２−１０９９）。各異性体の毒性は、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤの毒性を１としこれに対する相対値である毒性等価係数（ＴＥＦ：Ｔｏｘｉｃ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｙ  Ｆａｃｔｏｒ）で表される。さらに、個々の異性体ごとにその存在量にＴＥＦを乗じて得られる毒性量を算出する。これが、測定対象に含まれる全ての異性体の全毒性量である毒性等量（ＴＥＱ：Ｔｏｘｉｃ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）である。
したがって、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤを主に測定するＥＩＡ測定系では、ダイオキシン類の毒性を正確に測定できる系とは言い難い。特にダイオキシン類の主要な発生源である廃棄物焼却炉から排出されるガス中のダイオキシン類毒性等量（ＴＥＱ）は、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤよりも、五塩素化ジベンゾフラン濃度又は六塩素化ジベンゾフラン濃度と相関が高いことが知られている。また、排ガス試料を分析対象とした場合、これまでのＥＩＡ測定系では、機器分析値と大きくかけ離れる場合がある。このように、ＥＩＡ測定系は、使用に制限が生じる可能性がある。
また、ＥＩＡにおいて、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤやその他のダイオキシン類異性体を標準品に用いる場合は、標準品調製時に毒性の高い化合物を取り扱うことになるため、測定者側の安全性確保及び作業時の精神的な負担等の問題が生じる。
従って、被験試料中のダイオキシンの定量のための標準品として毒性を有さない化合物が求められていることろ、例えば特開２００２−１２８７３１、特開２００２−１３１３１６及び特開２００２−１５５０２３には標準品としてクロロフェノール誘導体を使用することが記載されている。
【発明の開示】
本発明の目的は、ダイオキシン類の免疫測定用標準品であって毒性等価係数（ＴＥＦ）を有さない標準品、及び、この標準品を用いて環境試料中のダイオキシン類濃度または毒性等量を簡便かつ高感度に測定できる免疫測定法を提供することである。
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意検討した結果、以下の知見を得た。
（ｉ）下記一般式（１）で表されるクロロフェノール誘導体
2004020397.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｚはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）をダイオキシン類の標準品として使用して、免疫測定法により被験試料中のダイオキシン濃度を測定し算出した毒性等量は、試料中に含まれる各ダイオキシン化合物の濃度を測定する公定法により求めた毒性等量と高い相関性が認められる。
（ｉｉ）このクロロフェノール誘導体は毒性等価係数（ＴＥＦ）を有さないため、この化合物をダイオキシン類測定用標準品として用いることにより、安全に環境試料中のダイオキシン類濃度及び毒性等量を算出できる。
本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、以下の化合物などを提供する。
１．  以下の一般式（１）で表される化合物。
2004020397.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｚはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
２．  以下の一般式（１）で表されるダイオキシン類の免疫測定用標準品。
2004020397.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｚはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
３．  項１に記載の化合物を含むダイオキシン類の免疫測定用キット。
４．  さらに、抗ダイオキシン抗体を含む項３に記載のキット。
５．  さらに、競合用抗原を含む項３又は４に記載のキット。
６．  ダイオキシン類を定量するための免疫測定法であって、項１に記載の化合物を標準品として用いる方法。
７．  免疫測定法が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法から選ばれる方法である項６に記載の方法。
８．  被験試料中のダイオキシン類の濃度又はさらに毒性等量を算出するための免疫測定法であって、項１に記載の化合物を標準品として用いる方法。
９．  免疫測定法が、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法から選ばれる方法である項８に記載の方法。
１０．  被験試料と抗ダイオキシン抗体とを反応させることにより、抗原抗体反応量を測定する工程（１）と、
工程（１）における抗原抗体反応量を、濃度既知の請求項１に記載の化合物と抗ダイオキシン抗体とを反応させることにより得られた抗原抗体反応量と比較することにより被験試料中に含まれるダイオキシン類濃度を算出する工程（２）と
を含むダイオキシン類の免疫測定法。
１１．  抗原抗体反応量を、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法及び蛍光免疫測定法から選ばれる方法で測定する項１０に記載の方法。
本発明により、ダイオキシン類の免疫測定用標準品であって毒性等価係数（ＴＥＦ）を有さない標準品、及び、この標準品を用いて環境試料中のダイオキシン類濃度または毒性等量を簡便かつ高感度に測定できる免疫測定法が提供された。
詳述すれば、本発明の一般式（１）で表される免疫測定用標準品を用いて定量した試料中ダイオキシン類濃度及びこれから算出した毒性等量は、機器分析により毒性等価係数を有するダイオキシン類化合物濃度を測定する公定法により得られる毒性当量と良好な相関性を示す。このように、ダイオキシン類定量用の標準品として本発明化合物を用いれば、被験試料の毒性等量を正確かつ高感度に測定できる。このことから、従来のＥＩＡに較べて、被験試料中のダイオキシン類の毒性量を正確に評価することができる。
また従来の公定法では、毒性等量を有する２９種類のダイオキシン類濃度を測定しＴＥＱ値を算出する必要があり毒性等量の評価に長時間を要する。これに対して本願化合物を用いた免疫測定法では比較的短時間で毒性等量を評価できる。
また、本発明の標準品はＷＨＯがその毒性等価係数を定めていないため、毒性のない化合物であると考えられる。また、本願の化合物は市販化合物であるクロロフェノール（例えば２，４，５−トリクロロフェノール）にメチレン鎖及びペプチドを付加した誘導体であり、この点からも毒性がないことは明らかである。このことから、本願化合物を用いることによりダイオキシン類の免疫測定作業時の安全性を大幅に向上させることができる。
以上のことから本発明の化合物及び方法は環境分析等に広く応用することができ、食品、母乳、血液、尿のような生体試料の分析においても有用である。
発明の詳細な記述
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）本発明の化合物
基本的構成
以下の一般式（１）で表される化合物は、文献未記載の新規化合物である。
2004020397.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｚはアミノ酸残基又はペプチドを表す。）
好ましい化合物
上記一般式（１）で表される化合物について、塩素置換数及び置換位置は特に限定されないが、抗ダイオキシン抗体との反応性から、全置換塩素数が３以上である化合物が好ましく、全置換塩素数が３である化合物がより好ましい。
全置換塩素数が３である化合物の中でも、Ｒ１、Ｒ２が塩素原子を表しＲ３及びＲ４が水素原子を表す化合物；Ｒ１、Ｒ３が塩素原子を表しＲ２及びＲ４が水素原子を表す化合物；Ｒ２、Ｒ３が塩素原子を表しＲ１及びＲ４が水素原子を表す化合物；Ｒ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ３が水素原子を表す化合物；Ｒ３、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ２が水素原子を表す化合物が好ましく、Ｒ２、Ｒ３が塩素原子を表しＲ１及びＲ４が水素原子を表す化合物；Ｒ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ３が水素原子を表す化合物がより好ましく、Ｒ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ３が水素原子を表す化合物が最も好ましい。
ｎは０〜２０程度の整数、特に２〜６程度の整数であることが好ましい。最も好ましいのはｎ＝２である。ポリメチレン鎖の長さ即ちｎが上記範囲であれば合成を容易に行える。
Ｚのアミノ酸残基又はペプチドは、通常のペプチドの定義に従い構成アミノ酸残基数が１００残基以内のものであれば特に限定されないが、通常１〜５０残基程度、特に１〜１０残基程度、さらに特に１〜４残基程度、さらに特に１〜３残基程度のアミノ酸又はペプチドが好ましい。ペプチドが余りに長いと水溶性が増大するため測定時に有機溶媒に溶解させることが困難になり反応液中で沈殿が生じる場合があるが、上記範囲であればこのような問題は生じない。
具体的には、Ｒ１、Ｒ２が塩素原子を表しＲ３及びＲ４が水素原子を表し、ｎが２〜６であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜４程度のペプチドである化合物；Ｒ１、Ｒ３が塩素原子を表しＲ２及びＲ４が水素原子を表し、ｎが２〜６であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜４程度のペプチドである化合物；Ｒ２、Ｒ３が塩素原子を表しＲ１及びＲ４が水素原子を表し、ｎが２〜６であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜４程度のペプチドである化合物；Ｒ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ３が水素原子を表し、ｎが２〜６であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜４程度のペプチドである化合物；Ｒ３、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ２が水素原子を表し、ｎが２〜６であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜４程度のペプチドである化合物が好ましい化合物として例示できる。
中でも、Ｒ２、Ｒ３が塩素原子を表しＲ１及びＲ４が水素原子を表し、ｎが２〜６であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜４程度のペプチドである化合物；Ｒ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ３が水素原子を表し、ｎが２〜６であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜４程度のペプチドである化合物が好ましい。
特に、Ｒ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１及びＲ３が水素原子を表し、ｎが５であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜３程度のアミノ酸又はペプチドである化合物；Ｒ２、Ｒ３が塩素原子を表しＲ１及びＲ４が水素原子を表し、ｎが２であり、Ｚがアミノ酸残基数１〜３程度のアミノ酸又はペプチドである化合物が好ましい。
用途
上記一般式（１）で表される化合物は、抗ダイオキシン抗体と反応することから、ダイオキシン類の免疫測定用標準品として使用できる。さらに、この化合物は毒性等価係数（ＴＥＦ）を有さないため、この化合物を標準品として用いることにより、測定者が安全に測定できるダイオキシン類免疫測定系を構築することができる。
製造方法
本発明のダイオキシン類測定用標準品は、それには限定されないが、例えば以下の方法で合成できる。
以下の一般式（２）で表される化合物
2004020397.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させる活性化エステル法により活性化することにより、以下の一般式（３）で表される活性化エステル化合物
2004020397.tif 000008
（式中、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は互いに異なって、塩素原子又は水素原子を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
を得る。
次いで、一般式（３）で表される化合物をアミノ酸またはペプチド等のアミノ基を含有する化合物と常法に従い反応させることにより、上記の一般式（１）で表される化合物が得られる。
出発原料である上記一般式（２）のクロロフェノール誘導体は、例えば以下の方法により合成することができる。クロロフェノール、炭酸カリウム及び６−ブロモヘキサン酸エチルエステルを６０℃で１６時間加熱攪拌し、反応終了後、酢酸エチルで抽出し減圧下で溶媒を濃縮する。残渣をエタノールで溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加え、室温で３時間攪拌する。反応終了後、濃塩酸で中和し、反応液を減圧濃縮後、濃塩酸を加えて酸性にし、酢酸エチルで抽出した後、再結晶を行うことにより、上記一般式（２）で表されるクロロフェノール誘導体が得られる。
（ＩＩ）ダイオキシン類の免疫測定用キット
本発明のダイオキシン類の免疫測定用キットは本発明の一般式（１）で表される化合物をダイオキシン類定量用の標準品として含む。また、抗ダイオキシン抗体は使用者が作成してもよくこのキットに含まれていてもよいが、このキットに含まれていると便利である。抗ダイオキシン抗体については後述する。さらに、競合型測定法に供するものである場合は、競合用抗原を含んでいればよい。競合用抗原についても後述する。
その他、反応容器、容器の余剰表面を覆うためのブロッキング剤、バッファー、間接競合法に供するキットの場合は２次抗体などを含んでいてもよい。
（ＩＩＩ）ダイオキシン類の免疫測定法
基本的構成
本発明方法は、ダイオキシン類を定量するための免疫測定法であって、上記一般式（１）で表される化合物を標準品として用いる方法である。より詳しくは、本発明方法は、被験試料中のダイオキシン類の濃度又はさらに毒性等量を算出するための免疫測定法であって、上記一般式（１）で表される化合物を標準品として用いる方法である。
具体的には、本発明のダイオキシン類の免疫測定法は、被験試料と抗ダイオキシン抗体とを反応させることにより抗原抗体反応量を測定する工程（１）と；工程（１）における抗原抗体反応量を、濃度既知の一般式（１）で表される化合物と抗ダイオキシン抗体とを反応させることにより得られた抗原抗体反応量と比較することにより被験試料中に含まれるダイオキシン類濃度を算出する工程（２）とを含む方法である。
すなわち、本発明のダイオキシン類免疫測定法は、上記一般式（１）で表されるクロロフェノール誘導体をダイオキシン類測定の標準品として用いることを特徴とし、それ以外は、通常の免疫測定法に従って実施することができる。
本発明の化合物は公知のいずれの免疫測定法にも適用できる。このような公知の免疫測定法としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）等が挙げられる。測定の簡便さからＥＩＡが好ましい。
ＥＩＡには競合型測定法、非競合型測定法、均質法等があるが、ダイオキシン類は低分子化合物であるため、通常競合法により行なえばよい。競合法には主にマイクロプレートのウェル、チューブ等に抗原を固定化する間接競合法と、ウェルやチューブ等に抗体を固定化する直接競合法がある。
間接競合法
（ｉ）競合用抗原
間接競合法においては、ウェルに固定化する競合用抗原として、ダイオキシン類又はこれらとキャリアータンパク質との複合体を用いる。樹脂製又はガラス製などの未処理の反応容器を用いる場合は、ダイオキシン類単独では容器に固定化するのが困難であるためキャリアタンパク質との複合体を用いることが好ましい。また、アミノ基又はカルボキシル基のような反応性の高い官能基で表面が活性化された反応容器を使用する場合は、ダイオキシン類単独でもこれらの官能基を介して容器に固定化することができる。キャリアタンパク質の有無にかかわらず、ダイオキシン類にはリンカーを結合させることが好ましい。これにより、立体障害が緩和されて競合用抗原と抗ダイオキシン抗体との反応性が良好になり、ひいては被験試料中のダイオキシン類の測定感度が向上する。
ダイオキシン類としては、例えばポリ塩化ジベンゾ−パラ−ジオキシン（ＰＣＤＤ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、コプラナーポリ塩化ビフェニル（コプラナーＰＣＢ）等を使用できる。毒性のあるダイオキシン類との共通性の低いダイオキシン類又はダイオキシン様化合物を用いることにより、競合用抗原の抗ダイオキシン抗体との反応性が被験試料中のダイオキシン類との反応性より低くなり、被験試料中のダイオキシン濃度の検出感度が向上する。
キャリアタンパク質は特に限定されず公知のキャリアタンパク質を制限なく使用できる。このようなキャリアタンパク質として、ＫＬＭ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）などを例示できる。
リンカーは、抗体との結合に立体障害を及ぼさないもの、反応過程において溶解性に支障をきたさないものが好ましく、例えばポリメチレン鎖等を使用できる。リンカーはダイオキシン類若しくはダイオキシン様化合物又はこれらとキャリアタンパク質と容器との間に配置される。
さらに、競合反応用抗原として本発明の一般式（１）で表されるクロロフェノール誘導体を用いることにより高感度にダイオキシン類を定量できる。特に検量線作成用の標準品と同一の化合物を競合用抗原として使用することが好ましい。この場合は、本発明の一般式（１）で表される標準品代替化合物の末端に結合しているアミノ酸またはペプチド部分をＢＳＡ等のキャリアータンパク質に変えることにより固相化用抗原を作製することができる。
（ｉｉ）抗ダイオキシン抗体
ＥＩＡで使用する抗体は、公知の方法に従ってポリ塩化ジベンゾ−パラ−ジオキシン（ＰＣＤＤ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、コプラナーポリ塩化ビフェニル（コプラナーＰＣＢ）などのダイオキシン類をハプテン化し、ＢＳＡ等のキャリアータンパク質に結合させたコンジュゲートを免疫用抗原として哺乳動物に免疫することにより作製することができる（Ｋｕｎ  Ｃｈａｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．，２５，１２０７〜１２０９（１９７７）；Ｓｉｍｏｎａ  Ｇ．Ｍｅｒｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，７３，８２６〜８３４（１９９５））。
抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく特に限定されない。抗体自身の均一性及び抗体製造時のロット差が生じ難い等の点で、モノクローナル抗体であることが望ましい。モノクローナル抗体は、ハプテン化したダイオキシン類で免疫したマウスの脾臓細胞と腫瘍細胞とを細胞融合させたハイブリドーマをクローン化した単一抗体産生細胞より得られる抗体であるが、ダイオキシン類を認識するものであればよい。
間接競合法は例えば次のようにして行えばよい。まず競合用抗原をマイクロプレートのような反応容器のウェル内に固相化する。次いでウェル表面の抗原が結合していない部分を牛血清アルブミン、カゼイン等の市販のブロッキング剤でブロックする。このウェルに検体と一次抗体である抗ダイオキシン類抗体を加えて、被験試料と固相化抗原を抗体に対して競合反応させる。固相化抗原と結合しなかった抗体を洗浄除去後、同ウェルに二次抗体として例えばヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体をペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素で標識した酵素標識抗体を加えて、固相化抗原と結合した一次抗体と結合させる。緩衝液で数回洗浄した後、標識酵素の基質を加えて発色した酵素反応生成物の吸光度を測定する。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合は、基質として過酸化水素、発色剤としてｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジン等を使用すればよい。酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合は、通常基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を用いればよい。
上述の競合法において、被験試料を添加しない反応溶液の吸光度に対する、被験試料を添加することによる反応溶液の吸光度の減少量の比率を検体による阻害率として測定する。その際、本発明の一般式（１）で表される化合物をダイオキシン類標準品として用い、被験試料に代えてこの標準品の複数の既知濃度の溶液を用いた他は同様の操作で競合反応を行う。標準品の濃度と阻害率との関係を示す検量線を作成し、得られた検量線と被験試料による阻害率とを比較することにより、被験試料中のダイオキシン類濃度を標準品換算濃度として算出することができる。
直接競合法
直接競合法においては、容器のウェル内に抗ダイオキシン抗体を固相化し、ウェルの抗体が結合していない部分を上記と同様にしてブロッキングする。次いで、このウェルに競合用の酵素標識抗原及び検体を加えることにより、被験試料及び酵素標識抗原を固相抗体に対して競合反応させる。次いで、抗体と結合しなかった酵素標識抗原を洗浄除去し、標識に使用した酵素の基質を加えて反応生成物の吸光度を測定する。
酵素標識抗原は、間接競合法で使用する競合用抗原と同様のダイオキシン類若しくはダイオキシン様化合物に、ペルオキダーゼ若しくはアルカリフォスファターゼのような酵素を結合することにより調製できる。また、本発明の一般式（１）で表される化合物の末端に存在しているアミノ酸またはペプチド部分をペルオキダーゼ若しくはアルカリフォスファターゼのような酵素に変えたものを使用する場合は感度が向上する。
なお、ＥＩＡではなくＲＩＡを行う場合はこれらの化合物をアイソトープで標識することにより標識抗原が得られる。またＦＩＡを行う場合はこれらの化合物にローダミンのような蛍光物質若しくは化学発光物質を結合させることにより標識抗原を得ることができる。
被験試料
被験試料の種類は特に限定されず、環境から採枢した環境試料、生物試料、食品などの各種製品、実験用に調製したダイオキシン類溶液であってもよい。本発明方法は、特に被験試料として環境試料を用いる場合に好適な方法である。環境試料としては、例えば大気；自動車、機器、工場などからの排気ガス；土壌；河川、湖、港湾の水；燃焼灰、飛灰などが挙げられる。生物試料としては、母乳、血液、尿などが挙げられる。
毒性等量の算出方法
被験試料はそのまま免疫測定に供してもよく、前処理により被験試料からダイオキシンを多く含む画分を抽出してもよいが、前処理を行うことが好ましい。前処理方法を以下に例示するが、前処理方法はこれらに限定されるものではない。
（ｉ）排気ガス試料の場合
Ａ（Ｎｍ３）の被験ガスを採取し、トルエンによりガス中物質を抽出し２０ｍｌに定量して粗抽出液とする。この粗抽出液１０ｍｌを分取し、硫酸層の着色がなくなるまで硫酸で処理する。この溶液をヘキサンに転溶後、硫酸ナトリウム１ｇ、１０％硝酸銀シリカゲル１ｇおよびシリカゲル３ｇを積層した多層シリカゲルカラムにヘキサン２００ｍｌで流通させてクリーンアップを行い、最終的に１ｍｌのＤＭＳＯに定量した溶液を免疫測定に供する。
得られた標準品換算ダイオキシン類濃度を下式に代入して毒性等量（ＴＥＱ）を算出する。
ＴＥＱ（ｎｇ−ＴＥＱ／Ｎｍ３）＝０．０９２２×標準品換算ダイオキシン類濃度（μｇ／Ｎｍ３）０．８４７４
上記式において、０．０９２２及び０．８４７４の値は、実施例において排気ガスについて本発明方法で得られたダイオキシン類濃度と公定法で得られたダイオキシン類毒性等量との間の相関式における係数であり、被験試料毎に定められる値である。なお、標準品換算ダイオキシン類濃度の単位の変換は以下の式に従い行えばよい。
標準品換算ダイオキシン類濃度（μｇ／Ｎｍ３）
＝標準品換算ダイオキシン類濃度（ｎｇ／ｍｌ）×１／１０×２０×１／Ａ×１／１０００
（ｉｉ）飛灰の場合
Ｂ（ｇ）の飛灰を採取し、トルエンで含有化合物を抽出し、２０ｍｌに定量して粗抽出液とする。この粗抽出液１ｍｌを分取してクリーンアップを行い、最終的に２ｍｌのＤＭＳＯに定量した溶液を免疫測定に供する。得られた標準品換算ダイオキシン類濃度を下式に代入して毒性等量（ＴＥＱ）を算出する。
ＴＥＱ（ｎｇ−ＴＥＱ／ｇ）＝０．００３８×〔標準品換算ダイオキシン類濃度（μｇ／ｇ）〕０．９７９６
上記式において、０．００３８及び０．９７９６の値は、実施例において飛灰について本発明方法で得られたダイオキシン類濃度と公定法で得られたダイオキシン類毒性等量との間の相関式における係数であり、被験試料毎に定められる値である。
なお、標準品換算ダイオキシン類濃度の単位の変換は以下の式に従い行えばよい。
標準品換算ダイオキシン類濃度（μｇ／ｇ）
＝標準品換算ダイオキシン類濃度（ｎｇ／ｍｌ）×２／１×２０×１／Ｂ×１／１０００
（ｉｉｉ）土壌の場合
Ｂ（ｇ）の土壌を採取し、トルエンで含有化合物を抽出し、２０ｍｌに定量して粗抽出液とする。この粗抽出液１ｍｌを分取してクリーンアップを行い、最終的に２ｍｌのＤＭＳＯに定量した溶液を免疫測定に供する。得られた標準品換算ダイオキシン類濃度を下式に代入して毒性等量（ＴＥＱ）を算出する。
ＴＥＱ（ｎｇ−ＴＥＱ／ｇ）＝９．４５５３×〔標準品換算ダイオキシン類濃度（μｇ／ｇ）〕０．９３５２
上記式において、９．４５５３及び０．９３５２の値は実施例において飛灰について本発明方法で得られたダイオキシン類濃度と公定法で得られたダイオキシン類毒性等量との間の相関式における係数であり、被験試料毎に定められる値である。なお、標準品換算ダイオキシン類濃度の単位の変換は飛灰の場合と同様にして行えばよい。
【実施例】  以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】ダイオキシン類免疫反応測定用標準品の作製
上記一般式（１）で示される本発明の化合物のうち、Ｒ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１、Ｒ３が水素原子を表す化合物を以下の方法により合成した。合成手順を図１を参照して説明する。
アルゴン気流下で、２，４，５−トリクロロフェノール（１）（市販品）  １５．０ｇ（７６．０ｍｍｏｌ）、６−ブロモヘキサン酸エチルエステル  １８．６ｇ（８３．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム  １２．６０ｇ（９１．２ｍｍｏｌ）、無水ジメチルホルムアミド  １５０ｍｌを混合し、６０℃で一晩加熱攪拌した。反応終了後、室温まで冷却し、反応液を水４５０ｍｌに加え、酢酸エチル２２５ｍｌで２回抽出した。硫酸マグネシウムを加え乾燥させた後、乾燥剤をろ別、有機層を濃縮し、粗生成物３０．７ｇの淡黄色オイルを得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル４５０ｇ、展開溶媒  酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１５）で精製し、６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸エチル（２）を２６．５ｇの透明オイルとして得た（収率１００％）。
６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸エチル（２）をエタノール２００ｍｌに溶解し、続いて２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍｌを氷冷下で滴下し、室温で３時間攪拌した。反応終了後、濃塩酸７０ｍｌで中和し、反応液を半分になるまで濃縮した。濃縮した反応液に濃塩酸５ｍｌを加えて酸性にし、酢酸エチル１００ｍｌで１回、１５０ｍｌで２回抽出した。次に水２００ｍｌ、飽和塩化ナトリウム水溶液２００ｍｌの順で有機層を洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ別し、有機層を濃縮して粗生成物２３．３ｇの白色固体を得た。粗生成物にイソプロピルエーテル２５ｍｌ、ｎ−ヘキサン５０ｍｌを加えて再結晶し、析出結晶をろ取し、イソプロピルエーテル／ｎ−ヘキサン＝１／３で洗浄後、６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸（３）を２１．４ｇの白色結晶として得た（収率８８．０％）。
６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸（３）１８．２ｇ（５８．４ｍｍｏｌ）を１８０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、１−エチル−３−（３‘−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１２．７ｇ（７０．１ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド８．０７ｇ（７０．１ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で一晩攪拌した。反応終了後、ＴＨＦ  １２５０ｍｌに反応液を加え、水３６０ｍｌ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５４０ｍｌ、水５４０ｍｌの順に有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別し、有機層を濃縮して粗生成物２１．９ｇの白色固体を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１回目：シリカゲル４００ｇ、展開溶媒  塩化メチレン、２回目：シリカゲル３３０ｇ、展開溶媒  塩化メチレン）で精製し、スクシンイミジル−６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸ヘキサノエート（４）を９．７３ｇの白色固体として得た（収率４０．７％）。
スクシンイミジル−６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸ヘキサノエート（４）２０ｍｇを１００ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解した。その後、５０ｍＭのグリシルグリシン水溶液１００ｍｌを徐々に添加し、室温で３時間攪拌してダイオキシン類測定用標準品溶液を得た。
また、上記操作において、出発原料として２，４，５−トリクロロフェノールに代えて２，４，６−トリクロロフェノール（市販品）を使用する他は同様にして、一般式（１）においてＲ２、Ｒ３が塩素原子を表しＲ１、Ｒ４が水素原子を表す化合物を合成した。
また、上記操作において、出発原料として２，４，５−トリクロロフェノールに代えて３，４，５−トリクロロフェノール（市販品）を使用する他は同様にして、一般式（１）においてＲ１、Ｒ４が塩素原子を表しＲ２、Ｒ３が水素原子を表す化合物を合成した。
【実施例２】競合測定用抗原の作製実施例２
実施例１で作製したスクシンイミジル−６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸ヘキサノエート（４）と牛血清アルブミンを用いて競合測定用抗原を作製した。まず５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液１ｍｌ（ＢＳＡ１５ｍｇ（２．２７×１０−７ｍｏｌ）相当分）を氷冷攪拌下、ジメチルスルホキシド  ５４５．５μｌを加え、その後スクシンイミジル−６（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサノエート（ＢＢ２−４）の２０ｍＭジメチルスルホキシド溶液  ４５４．５μｌ（４０等量（９．０９×１０−６ｍｏｌ））を滴下し、室温１時間反応させた。反応後、４ＬのＰＢＳに対して透析を行い、競合測定用抗原を得た。
【実施例３】排ガス試料の調製及び公定法によるダイオキシン類ＴＥＱ値測定
公定法（ＪＩＳ  Ｋ０３１１）に準じてごみ焼却場の排ガスを採取し、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）により試料中のダイオキシン類濃度を測定した。また、都市ごみ焼却場の煙道から、排ガス約３Ｎｍ３をガス採取装置に吸引して採取し、採取した試料を、ろ紙、樹脂、吸収液などの形態ごとにトルエン、ジクロロメタン等の有機溶媒を用いて抽出した。これらの抽出液を合わせて２０ｍｌまで濃縮し、粗抽出液を得た。
粗抽出液から１ｍｌ分取し、それを硫酸処理、多層シリカゲルクロマトグラフ処理および活性炭カラムクロマトグラフ処理を行って精製した後に、ガスクロマトグラフ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製）によって各ダイオキシン類異性体濃度を求めた。
次に各ダイオキシン類異性体濃度にその毒性等価係数（ＴＥＦ）を乗じて、排ガス試料中のダイオキシン類毒性等量（ＴＥＱ）を算出した。
一方、別に分取した粗抽出液１ｍｌを硫酸処理および多層シリカゲルクロマトグラフ処理を行って精製した後、有機溶剤を乾固してジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２ｍｌに転溶し、ＥＩＡ評価用試料とした。
【実施例４】間接競合法による抗ダイオキシンモノクローナル抗体を用いた排ガス試料の毒性等量の測定
実施例２で作製した競合測定用抗原をＰＢＳで１μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６穴アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製，Ｃａｔ  Ｎｏ．３５９０）の各ウェルに、この溶液を１００μｌずつ分注し、プレートをシールで密閉して、４℃で１８時間静置して固相化を行なった。抗原溶液を除去後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、５倍希釈したブロッキング溶液（ナカライテスク製）を３００μｌずつ分注し、プレートをシールで密閉し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、ダイオキシン類測定用プレートを作製した。このプレートを用い次のようにしてダイオキシン類の免疫測定を行なった。
実施例１で作製したダイオキシン類標準品は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を０．０１％含む５０％ＤＭＳＯで、０〜０．２μｇ／ｍｌの範囲の希釈系列を作製した。実施例３で調製した排ガス試料はＤＭＳＯに転溶後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を０．０１％含む５０％ＤＭＳＯで希釈を行い測定用試料とした。
一方、抗ダイオキシン類モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを無血清培地中で炭酸ガス培養容器内において３７℃で１週間以上培養し、培養上清を取得し、得られた培養上清をプロテインＡカラムを用いてアフィニティクロナトグラフィーにより精製した後、ＰＢＳ中で透析し、抗ダイオキシン類モノクローナル抗体を調製した。
ダイオキシン類標準品の希釈系列及び排ガス試料をダイオキシン測定用プレートにそれぞれ５０μｌずつ添加し、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで０．１μｇ／ｍｌになるように希釈した抗ダイオキシンモノクローナル溶液を５０μｌずつ添加し、４℃で１時間反応させた。反応後、ウェルに添加した溶液を除去し、プレートをＴｗｅｅｎ２０を０．００５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ標識抗体（アフィニティー精製したもの、ＤＡＫＯ社製）１００μｌを分注した。プレートを室温で１時間静置した後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄し、各ウエルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μｌずつ分注し、３０分間室温で静置した。各ウエルに１００μｌずつ０．５Ｍ硫酸溶液を添加し、マイクロタイター用分光光度計で波長４５５ｎｍ（対照６５５ｎｍ）の吸光度を測定した。
ダイオキシン類標準品を用いることにより得られた吸光度データより標準曲線（検量線）を作成し、排ガス試料を用いた場合の吸光度データを標準曲線に当てはめて、試料中のダイオキシン量を標準物質濃度に換算して算出した。
得られた標準曲線を図２に示す。図２において、Ｂは標準品存在下での吸光度であり、Ｂ０は標準品非存在下での吸光度である。
また実施例３においてＧＣ−ＭＳを用いた定量により得られたダイオキシン類毒性等量と、実施例４において本発明の標準品を用いて免疫測定を行なうことにより得られた試料中ダイオキシン類濃度との相関関係を図３に示す。図３から明らかなように、本発明の免疫測定用標準品を用いた排気ガス試料の免疫測定法による測定値と、公定法である機器分析法から算出されたダイオキシン類毒性等量との間に良好な相関性（Ｒ２＝０．９８５）が認められた。
【実施例５】飛灰試料の調製及び公定法によるダイオキシン類ＴＥＱ値測定
飛灰について、実施例３と同様にしてＧＣ−ＭＳの結果から毒性当量を算出した。
【実施例６】間接競合法による抗ダイオキシンモノクローナル抗体を用いた飛灰試料の毒性等量の測定
実施例４と同様にして、ＥＩＡにより飛灰試料中のダイオキシンの毒性等量を測定した。
実施例５においてＧＣ−ＭＳを用いた定量により得られたダイオキシン類毒性等量と、実施例６において本発明の標準品を用いて免疫測定を行なうことにより得られた試料中ダイオキシン類濃度との相関関係を図４に示す。図４から明らかなように、本発明の免疫測定用標準品を用いた飛灰試料の免疫測定法による測定値と、公定法である機器分析法から算出されたダイオキシン類毒性等量との間に良好な相関性（Ｒ２＝０．９９０）が認められた。
【実施例７】土壌試料の調製及び公定法によるダイオキシン類ＴＥＱ値測定
土壌について、実施例３と同様にしてＧＣ−ＭＳの結果から毒性当量を算出した。
【実施例８】間接競合法による抗ダイオキシンモノクローナル抗体を用いた土壌試料の毒性等量の測定
実施例４と同様にして、ＥＩＡにより土壌試料中のダイオキシンの毒性等量を測定した。
また実施例７においてＧＣ−ＭＳを用いた定量により得られたダイオキシン類毒性等量と、実施例８において本発明の標準品を用いて免疫測定を行なうことにより得られた試料中ダイオキシン類濃度との相関関係を図５に示す。図５から明らかなように、本発明の免疫測定用標準品を用いた土壌試料の免疫測定法による測定値と、公定法である機器分析法から算出されたダイオキシン類毒性等量との間に良好な相関性（Ｒ２＝０．９９２）が認められた。
なお、ここでは一般式（１）においてＲ２、Ｒ４が塩素原子を表しＲ１、Ｒ３が水素原子を表す化合物について公定法との相関性を検討したが、実施例１において合成した一般式（１）においてＲ２、Ｒ３が塩素原子を表しＲ１、Ｒ４が水素原子を表す化合物、及び、一般式（１）においてＲ１、Ｒ４が塩素原子を表しＲ２、Ｒ３が水素原子を表す化合物についても、実施例２〜８と同様の操作を行ったところ、ダイオキシン類の毒性等量について公定法との間に高い相関性が認められた。
【産業上の利用可能性】    本発明の化合物及び方法は、土壌、大気、排気ガス、湖水又は河川のような環境試料；母乳、血液、尿のような生物試料；食品のような製品などに含まれるダイオキシン量の定量に好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１によるダイオキシン類の免疫測定用標準品の合成スキームを示す図である。
図２は、本発明の１実施例であるダイオキシン類免疫測定用標準品を用いて得られた標準曲線を示す図である。
図３は、ガスクロマトグラフ質量分析による排ガス中のダイオキシン毒性等量の測定量と、本発明のダイオキシン類免疫測定用標準品を用いた免疫測定法による排ガス中のダイオキシン類濃度との相関を示す図である。
図４は、ガスクロマトグラフ質量分析による飛灰中のダイオキシン毒性等量の測定量と、本発明のダイオキシン類免疫測定用標準品を用いた免疫測定法による飛灰中のダイオキシン類濃度との相関を示す図である。
図５は、ガスクロマトグラフ質量分析による土壌中のダイオキシン毒性等量の測定量と、本発明のダイオキシン類免疫測定用標準品を用いた免疫測定法による土壌中のダイオキシン類濃度との相関を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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