(57)【要約】本発明は、医薬品等の中間体として有用な、Ｌ体又はＤ体の光学活性α−メチルシステイン誘導体又はその塩を、安価で入手容易な原料から、簡便かつ工業的に製造する方法を提供する。本発明は、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩をヒダントイナーゼによってＤ体選択的に環化させて、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩及びＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩とし、次いで、それぞれのアミノ基、硫黄原子の脱保護及び加水分解を行うことによる、Ｌ体又はＤ体の光学活性α−メチルシステイン誘導体又はその塩の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
2003106689.tif 000018
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩に、ヒダントイナーゼを作用させＤ体選択的に環化させることを特徴とする、一般式（２）：
2003106689.tif 000019
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩及び一般式（３）：
2003106689.tif 000020
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩の製造方法。
【請求項２】
ヒダントイナーゼが、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する微生物由来である請求の範囲第１項に記載の製造方法。
【請求項３】
ヒダントイナーゼが、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６由来である請求の範囲第１項記載の製造方法。
【請求項４】
ヒダントイナーゼを固定化酵素として使用することを特徴とする請求の範囲第１から３項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
Ｒ１が置換基を有していても良い炭素数４〜１５の３級アルキル基である請求の範囲第１から４項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
３級アルキル基がｔ−ブチル基である請求の範囲第５項記載の製造方法。
【請求項７】
一般式（３）：
2003106689.tif 000021
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を脱カルバモイル化し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（４）：
2003106689.tif 000022
（式中、Ｒ２は前記Ｒ１若しくは水素原子を表す）で表されるα−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩の製造方法。
【請求項８】
脱カルバモイル化を、亜硝酸、又は、亜硝酸の塩及び酸で処理することにより行い、前記式（４）においてＲ２が前記式（３）におけるＲ１と同じである化合物を製造することを特徴とする請求の範囲第７項記載の製造方法。
【請求項９】
脱カルバモイル化をアルカリで処理することにより行い、前記式（４）においてＲ２が前記式（３）におけるＲ１と同じである化合物を製造することを特徴とする請求の範囲第７項記載の製造方法。
【請求項１０】
脱カルバモイル化に用いるアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、又は水酸化カルシウムであることを特徴とする請求の範囲第９項記載の製造方法。
【請求項１１】
脱カルバモイル化に用いるアルカリが水酸化リチウムであることを特徴とする請求の範囲第９項記載の製造方法。
【請求項１２】
脱カルバモイル化反応後に、反応溶液に酸を加えてｐＨを下げることにより、前記式（４）においてＲ２が前記式（３）におけるＲ１と同じである化合物を晶析し、結晶を取得する請求の範囲第９から１１項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
用いる酸が、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の製造方法。
【請求項１４】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の製造方法。
【請求項１５】
反応溶液のｐＨを９．５以下に下げることを特徴とする請求の範囲第１２から１４項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
前記式（３）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩が、請求の範囲第１項記載の方法で製造されたものである、請求の範囲第７から１５項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
請求の範囲第７から１５項のいずれかに記載の方法により得られた、前記式（４）においてＲ２が前記式（３）におけるＲ１と同じである化合物を、酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（５）：
2003106689.tif 000023
で表されるα−メチル−Ｌ−システイン又はその塩の製造方法。
【請求項１８】
用いる酸が、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の製造方法。
【請求項１９】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の製造方法。
【請求項２０】
一般式（３）：
2003106689.tif 000024
においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基であるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、脱カルバモイル化と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（５）：
2003106689.tif 000025
で表されるα−メチル−Ｌ−システイン又はその塩の製造方法。
【請求項２１】
用いる酸が、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の製造方法。
【請求項２２】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の製造方法。
【請求項２３】
前記式（３）においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基であるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩が、請求の範囲第１項記載の方法で製造されたものである請求の範囲第２０から２２項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２４】
一般式（３）：
2003106689.tif 000026
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩の、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（６）：
2003106689.tif 000027
で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法。
【請求項２５】
前記式（３）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を環化して、一般式（７）：
2003106689.tif 000028
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩とし、次いで酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする請求の範囲第２４項記載の製造方法。
【請求項２６】
環化反応を、アルカリを用いて行うことを特徴とする請求の範囲第２５項記載の製造方法。
【請求項２７】
用いるアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、又は、水酸化カルシウムであることを特徴とする請求の範囲第２６項記載の製造方法。
【請求項２８】
前記式（３）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、硫黄原子の脱保護と環化を同時に行うことを特徴とする請求の範囲第２４項記載の製造方法。
【請求項２９】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第２５から２８項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３０】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第２５から２８項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３１】
前記式（３）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩が、請求の範囲第１項記載の方法により得られたものである請求の範囲第２４から２９項記載の製造方法。
【請求項３２】
請求の範囲第２４項記載の方法により得られた前記式（６）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩を加水分解することを特徴とする、一般式（５）：
2003106689.tif 000029
で表されるα−メチル−Ｌ−システイン又はその塩の製造方法。
【請求項３３】
加水分解を酸で行うことを特徴とする請求の範囲第３２項記載の製造方法。
【請求項３４】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第３３項記載の製造方法。
【請求項３５】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第３３項記載の製造方法。
【請求項３６】
一般式（２）：
2003106689.tif 000030
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩を加水分解し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（８）：
2003106689.tif 000031
（式中、Ｒ２は前記Ｒ１若しくは水素原子を表す）で表されるα−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩の製造方法。
【請求項３７】
加水分解を、アルカリを用いて行い、前記式（８）においてＲ２が前記式（２）におけるＲ１と同じである化合物を製造することを特徴とする請求の範囲第３６項記載の製造方法。
【請求項３８】
加水分解に用いるアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、又は、水酸化カルシウムであることを特徴とする請求の範囲第３７項記載の製造方法。
【請求項３９】
加水分解反応後に、反応溶液に酸を加えてｐＨを下げることにより、前記式（８）においてＲ２が前記式（２）におけるＲ１と同じである化合物を晶析し、結晶を取得する請求の範囲第３６から３８項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４０】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第３９項記載の製造方法。
【請求項４１】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第３９項記載の製造方法。
【請求項４２】
反応溶液のｐＨを９．５以下に下げることを特徴とする請求の範囲第３９から４１項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４３】
請求の範囲第３６項記載の方法により得られた前記式（８）で表される化合物においてＲ２が前記式（２）におけるＲ１と同じである化合物を、酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（９）：
2003106689.tif 000032
で表されるα−メチル−Ｄ−システイン又はその塩の製造方法。
【請求項４４】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第４３項記載の製造方法。
【請求項４５】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第４３項記載の製造方法。
【請求項４６】
一般式（２）：
2003106689.tif 000033
においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基である化合物を、酸で処理することにより加水分解反応と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（９）：
2003106689.tif 000034
で表されるα−メチル−Ｄ−システイン又はその塩の製造方法。
【請求項４７】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第４６項記載の製造方法。
【請求項４８】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第４６項記載の製造方法。
【請求項４９】
前記式（２）においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基である化合物が、請求の範囲第１項記載の方法で製造されたものである、請求の範囲第４６から４８項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５０】
一般式（８）：
2003106689.tif 000035
においてＲ２が下記式（１０）におけるＲ１と同じである化合物をカルバモイル化し、一般式（１０）：
2003106689.tif 000036
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩とし、次いで環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（１１）：
2003106689.tif 000037
で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法。
【請求項５１】
カルバモイル化を、シアン酸のアルカリ金属塩及び酸を用いて行うことを特徴とする請求の範囲第５０項記載の製造方法。
【請求項５２】
硫黄原子の脱保護と環化反応を酸で行うことを特徴とする請求の範囲第５０又は５１項記載の製造方法。
【請求項５３】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第５２項記載の製造方法。
【請求項５４】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第５２項記載の製造方法。
【請求項５５】
前記式（８）においてＲ２が前記式（１０）におけるＲ１と同じである化合物が、請求の範囲第３６項記載の方法により得られたものであることを特徴とする請求の範囲第５０から５４項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５６】
一般式（２）：
2003106689.tif 000038
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（１１）：
2003106689.tif 000039
で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法。
【請求項５７】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第５６項記載の製造方法。
【請求項５８】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第５６項記載の製造方法。
【請求項５９】
前記式（２）で表される化合物が、請求の範囲第１項記載の方法により得られたものであることを特徴とする、請求の範囲第５６から５８項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６０】
請求の範囲第５６項記載の方法で得られた、前記式（１１）で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩を加水分解することを特徴とする、一般式（９）：
2003106689.tif 000040
で表されるα−メチル−Ｄ−システイン又はその塩の製造方法。
【請求項６１】
加水分解を酸で行うことを特徴とする請求の範囲第６０項記載の製造方法。
【請求項６２】
用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸から選ばれる任意の１種あるいは２種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第６１項記載の製造方法。
【請求項６３】
用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第６１項記載の製造方法。
【請求項６４】
光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、該化合物の晶出を行うことを特徴とする光学活性α−メチルシステイン又はその塩の晶析方法。
【請求項６５】
光学活性α−メチルシステインの酸との塩を取得する請求の範囲第６４項記載の晶析方法。
【請求項６６】
光学活性α−メチルシステインのハロゲン化水素酸との塩を取得する請求の範囲第６５項記載の晶析方法。
【請求項６７】
光学活性α−メチルシステイン塩酸塩を取得する請求の範囲第６５項記載の晶析方法。
【請求項６８】
請求の範囲第７、１７、２０、３２、３６、４３、４６又は６０項に記載の方法により製造された光学活性α−メチルシステイン又はその塩を晶析する、請求の範囲第６４から６７項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項６９】
光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、濃縮を行い、水を系外に除去すると共に、有機溶剤に置換し、該化合物を晶出させる請求の範囲第６４から６８項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項７０】
有機溶剤として、水と相溶性の低い又はない有機溶剤を用いる請求の範囲第６９項記載の晶析方法。
【請求項７１】
有機溶剤として、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、又はエーテル系溶剤を用いる請求の範囲第６９又は７０項記載の晶析方法。
【請求項７２】
有機溶剤として、炭化水素系溶剤を用いる請求の範囲第６９又は７０項記載の晶析方法。
【請求項７３】
炭化水素系溶剤として、トルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンから選ばれる一種又は二種以上の混合溶剤を用いる、請求の範囲第７２項記載の晶析方法。
【請求項７４】
光学活性α−メチルシステイン又はその塩の濃度が１〜７０重量％で晶出を行う、請求の範囲第６９から７３項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項７５】
残存する水の量として、光学活性α−メチルシステイン又はその塩に対して１００重量％以下まで濃縮、溶剤置換し、晶出する光学活性α−メチルシステイン又はその塩を取得する、請求の範囲第６９から７４項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項７６】
濃縮時の蒸発速度を、１０００Ｌ／ｈ・ｍ２以下に制御して行う請求の範囲第６９から７５項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項７７】
濃縮時の蒸発速度を、６００Ｌ／ｈ・ｍ２以下に制御して行う請求の範囲第６９から７５項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項７８】
濃縮時の蒸発速度を、３００Ｌ／ｈ・ｍ２以下に制御して行う請求の範囲第６９から７５項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項７９】
濃縮時の減圧度を、５００ｍｍＨｇ以下に制御する請求の範囲第６９から７８項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項８０】
光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、濃縮を行い、水を系外に除去すると共に有機溶剤に置換し、析出する難溶性無機塩をろ別した後、該化合物の溶液から、貧溶媒添加、冷却、又は濃縮の操作により、該化合物を晶出させる請求の範囲第６４から６８項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項８１】
残存する水の量として、光学活性α−メチルシステイン又はその塩に対して１００重量％以下まで水分を系外に除去する請求の範囲第８０項記載の晶析方法。
【請求項８２】
置換する有機溶剤として、アルコール系溶剤単独、エーテル系溶剤単独、又は、各々を任意に混合した溶剤を用いる請求の範囲第８０又は８１項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項８３】
アルコール系溶剤が、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコールのいずれか１種あるいは２種以上の混合溶媒である請求の範囲第８２項記載の晶析方法。
【請求項８４】
エーテル系溶剤が、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチル−ｔ−ブチルエーテルのいずれか１種あるいは２種以上の混合溶媒である請求の範囲第８２項記載の晶析方法。
【請求項８５】
α−メチルシステイン又はその塩を晶出させる為に、貧溶媒を加えることを特徴とする請求の範囲第８０から８４項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項８６】
貧溶媒が、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、エーテル系溶剤のいずれか一種又は二種以上の混合溶媒である請求の範囲第８５項記載の晶析方法。
【請求項８７】
貧溶媒が、炭化水素系溶剤である請求の範囲第８５項記載の晶析方法。
【請求項８８】
炭化水素系溶剤が、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタンのいずれか一種又は二種以上の混合溶媒である請求の範囲第８７項記載の晶析方法。
【請求項８９】
光学活性α−メチルシステイン又はその塩の晶析時の濃度が、１〜７０重量％である請求の範囲第８０から８８項のいずれかに記載の晶析方法。
【請求項９０】
一般式（１２）：
2003106689.tif 000041
（式中、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立して置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩を、有機塩基又はアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解を行うことを特徴とする、一般式（１３）：
2003106689.tif 000042
（式中、Ｒ３、Ｒ４は前記と同じ）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体又はその塩の製造方法。
【請求項９１】
用いるアルカリ金属水酸化物が、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムであることを特徴とする請求の範囲第９０項記載の製造方法。
【請求項９２】
前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、０．１倍から１０倍重量の水を用いることを特徴とする、請求の範囲第９０又は９１項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９３】
前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、０．２倍から３倍重量の水を用いることを特徴とする、請求の範囲第９０から９２項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９４】
前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、１モル当量から１０モル当量の塩基を用いることを特徴とする、請求の範囲第９０から９３項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９５】
前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、２モル当量から５モル当量の塩基を用いることを特徴とする、請求の範囲第９０から９４項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９６】
前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、０．２倍から３倍重量の水と、２モル当量から５モル当量の塩基を用いることを特徴とする、請求の範囲第９０から９５項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９７】
溶媒として、水単独、又は、水と有機溶剤の混合溶媒を使用する請求の範囲第９０から９６項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９８】
水と組み合わせる有機溶剤として、炭化水素系有機溶媒を用いる請求の範囲第９７項記載の製造方法。
【請求項９９】
反応温度が８０℃から１１０℃であることを特徴とする請求の範囲第９０から９８項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１００】
前記式（１２）において、Ｒ３が置換基を有していても良い炭素数１〜６の１級アルキル基であることを特徴とする請求の範囲第９０から９９項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０１】
前記式（１２）において、Ｒ３がメチル基であることを特徴とする請求の範囲第１００項に記載の製造方法。
【請求項１０２】
前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体として、一般式（１４）：
2003106689.tif 000043
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表される化合物を用い、前記式（１３）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体として、一般式（１）：
2003106689.tif 000044
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表される化合物を製造する請求の範囲第９０から１０１項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０３】
前記式（１４）においてＲ１がｔ−ブチル基であることを特徴とする請求の範囲第１０２項に記載の製造方法。
【請求項１０４】
請求の範囲第１０２又は１０３項のいずれかの方法により製造された前記式（１）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩を用いることを特徴とする、請求の範囲第１から５項のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０５】
一般式（１）：
2003106689.tif 000045
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩。
【請求項１０６】
一般式（３）：
2003106689.tif 000046
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）、又は、一般式（１０）：
2003106689.tif 000047
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表される、Ｌ体又はＤ体の光学活性Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩。
【請求項１０７】
Ｒ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基である請求の範囲第１０５又は１０６項記載の化合物。
【請求項１０８】
３級アルキル基がｔ−ブチル基である請求の範囲第１０７項記載の化合物。
【請求項１０９】
一般式（２）：
2003106689.tif 000048
又は一般式（７）：
2003106689.tif 000049
においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基である、Ｄ体又はＬ体の光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩。
【請求項１１０】
３級アルキル基がｔ−ブチル基である請求の範囲第１０９項記載の化合物。
【請求項１１１】
一般式（４）：
2003106689.tif 000050
又は一般式（８）：
2003106689.tif 000051
において、Ｒ２が置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基である、Ｌ体又はＤ体の光学活性α−メチルシステイン誘導体又はその塩。
【請求項１１２】
Ｒ２が炭素数４〜１５の３級アルキル基である請求の範囲第１１１項記載の化合物。
【請求項１１３】
３級アルキル基がｔ−ブチル基である請求の範囲第１１２項記載の化合物。
【請求項１１４】
一般式（６）：
2003106689.tif 000052
又は一般式（１１）：
2003106689.tif 000053
で表される、Ｌ体又はＤ体の光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬品等の中間体として有用な、光学活性なＬ体又はＤ体のα−メチルシステイン誘導体又はその塩の製造方法に関する。
背景技術
光学活性なＬ体又はＤ体のα−メチルシステイン誘導体又はその塩の製造方法としては、以下の様な方法が知られている。
１）光学活性システインとピバルアルデヒドより得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉メチル化による方法（ＷＯ０１／７２７０２）。
２）光学活性アラニンとベンズアルデヒドより得られる光学活性オキサゾロン化合物への不斉チオメチル化による方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，３３５０〜３３５７）。
３）システインとシアノベンゼンより得られるチアゾリン化合物のメチル化を行い、得られたラセミ体のチアゾリン化合物をキラルＨＰＬＣにて分離精製する方法（Ｓｙｎｌｅｔｔ．，１９９４，９，７０２−７０４）。
４）光学活性バリンとアラニンより合成される光学活性ジケトピペラジン化合物を不斉ブロモメチル化し、得られた化合物の臭素原子をアルカリ金属アルキルチオラートで置換する方法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８３，３７〜３８）。
５）２−メチル−２−プロペン−１−オールのシャープレス不斉酸化により得られる光学活性な２−メチルグリシドールから光学活性アジリジンを合成し、これにチオールを反応させる方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６０，７９０〜７９１）。
６）アミノマロン酸誘導体をメチル化した後に、豚肝臓エステラーゼ（以下ＰＬＥと略す）による非対称化を行い、得られた非対称エステルをチオ酢酸アルカリ金属塩と反応させる方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３，１１５，８４４９〜８４５０）。
しかしながら、上記１）〜４）の方法はいずれも、ブチルリチウム等の高価な塩基を用いた低温反応が必要である。５）の方法では、工程数が長くて煩雑であり高価な試薬を多く使う必要がある。６）の方法ではエステラーゼとしてＰＬＥを用いたジエステルの非対称化をキーとしているが、ＰＬＥは大量生産が困難であるため工業的規模での安定確保は難しく、実用的とは言い難い。このように、いずれの方法においても光学活性メチルシステイン誘導体又はその塩の工業的製造方法としては解決すべき課題を有している。
また、上記のような方法を経て得られる、光学活性メチルシステイン誘導体は必要に応じて、適切に脱保護を行い、光学活性α−メチルシステイン又はその塩とすることができる。そこで得られた光学活性α−メチルシステイン又はその塩の単離精製法としては、晶析による方法が好ましいと考えられる。しかし、光学活性α−メチルシステイン又はその塩を結晶として晶析単離取得した例は知られていない。わずかに、単離された例としては、前記ＷＯ０１／７２７０２等に記載があるにすぎない。これらは、光学活性α−メチルシステイン誘導体であるチアゾリジン化合物を塩酸により脱保護し、得られた光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液を濃縮して固化させ、場合によっては、有機溶媒にて洗浄して単離する方法である。しかしながら、我々が、この方法に従い該化合物の単離を行ったところ、水溶液を濃縮するにつれ、固体が析出すると共に含水した大きな塊状となり、攪拌が不良となることが判明した。また、引き続き濃縮操作を行っても、固体が壁面に強固に付着し流動性の全くない状態となった。したがって、水溶液を濃縮して乾固させ固体を析出させることですら、工業的操作としては不具合があるうえに、濃縮するにつれ塊状化する傾向があることから、晶析液の攪拌や固体の取り出しが困難であると考えられる。以上のことから、前記ＷＯ０１／７２７０２等に記載の単離方法も、工業的生産に適した方法とは言い難い。
さらに、光学活性メチルシステイン誘導体を脱保護し、得られる光学活性α−メチルシステイン又はその塩に、例えば反応若しくは中和等の後処理工程上、難溶性無機塩等が副生、混入する場合には、上述の従来法ではそれら無機塩を除去することは全くできない。
また、α−メチルシステイン及びその塩は、酸化に対して不安定で２量化しジスルフィドになりやすい。例えば、類似構造を有するシステインの場合、シスチンへの２量化は速やかに進行する（「タンパク質化学１、アミノ酸・ペプチド」共立出版、３２６ページ）。本化合物においても２量化が進行し、しかもジスルフィド体が一旦生成するとその除去は容易ではなく、製品中への混入を避けることは難しい。故に、ジスルフィド体の生成及び混入を高度に抑制したプロセスの構築も重要である。
このように、工業的に実施可能な、高品質の光学活性α−メチルシステイン及びその塩を好適に結晶として晶析取得する方法の確立が強く望まれていた。
ところで、光学活性α−メチルシステイン誘導体を簡便に製造するための従来技術とは異なる方法論の１つとして、ラセミ体のα−メチルシステイン誘導体を酵素的に分割して光学活性なα−メチルシステイン誘導体へと導く方法が考えられる。本方法論を実現するためには、光学分割に供するラセミ体α−メチルシステイン誘導体の製造方法、並びに、高い光学分割能力を有する酵素反応の確立が重要である。さらには、酵素的光学分割に供するラセミ体α−メチルシステイン誘導体の選定も大きなポイントとなる。
酵素的光学分割を用いる方法を実現するうえで、基質となるラセミ体α−メチルシステイン誘導体は、簡便かつ効率的に製造できること、酵素の基質特異性に適合し、かつ高い立体選択性を得るための適切な保護基あるいは補助基を有すること、更には、酵素反応後に前記保護基あるいは補助基が簡単に除去できること、が要求される。このような観点からは、好適なラセミ体α−メチルシステイン誘導体として、Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体を挙げることができる。
古くから、ヒダントインの開環加水分解酵素として知られているヒダントイナーゼは、Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を対応する５−置換ヒダントインに変換する逆反応も触媒することが知られており、当該酵素を用いてラセミ体のＮ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体のうち、一方の光学異性体のみを選択的にヒダントインに変換し、光学分割することが期待される。光学分割で得られた光学活性Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体は、脱カルバモイル化して容易に光学活性α−メチルシステイン誘導体に変換できる。一方、光学分割のもう一方の生成物である光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体は、光学活性α−メチルシステイン誘導体の等価体であり、開環加水分解および脱カルバモイル化を経て光学活性α−メチルシステイン誘導体（光学分割で直接得られるものとは逆の立体を有する）に導くことができる。
ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体は、一般的なアミノ酸の化学的合成法とＮ−カルバモイル化反応とを組み合わせて製造することができるが、ラセミ体のＮ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体を短工程かつ高収率で製造する方法は、未だ確立されていない。
一般的なラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−二置換アミノ酸の製造方法としては、Ｂｕｃｈｅｒｅｒ法により、アセトン誘導体をラセミ体５，５−二置換ヒダントインに変換した後、これを加水分解することによりラセミ体α−二置換アミノ酸誘導体とし（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１，３５，５３−５８）、次いでシアン酸カリウムで処理してＮ−カルバモイル化する方法が知られている。しかしながら、この方法では、ラセミ体５，５−二置換ヒダントインのウレイレン基（−ＮＨＣＯＮＨ−）をラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−二置換アミノ酸誘導体のウレイド基（カルバモイルアミノ基：−ＮＨＣＯＮＨ２）として有効に利用することができず、また、３工程を要するなど、効率的な方法とは言い難い。
一方、ヒダントイン類を加水分解し、アミノ酸を経由せずカルバモイル体を製造する方法としては、塩基として水酸化カルシウムを用いて加水分解する方法が知られている（ＵＳ５３３８８５９）。しかしながら、我々が、本特許記載の方法により、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体の製造を試みたところ、わずか２５％の収率でしか目的の化合物が得られないことがわかった。即ち、少ない工程で効率的に、かつ、高収率でラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−二置換アミノ酸誘導体、特にはラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体を製造する方法は確立されていない。
一方、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体の酵素的光学分割に関しては、特開平１−１２４３９８号公報には、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−アミノ酸誘導体にヒダントイナーゼを作用させ立体選択的に環化することにより分割を行う方法が記されているが、Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体の反応の可能性については、記載も示唆もない。
発明の要約
上記に鑑み、本発明の目的は、医薬品等の中間体として有用な、光学活性なＬ体又はＤ体のα−メチルシステイン誘導体又はその塩を、安価で入手容易な原料から簡便に製造でき、工業的生産に対して実用的な方法を提供することにある。
本発明者等は上記に鑑み鋭意検討を行った結果、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩にヒダントイナーゼを作用させることによりＤ体選択的に環化させ、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩及びＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩とし、次いでＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩の脱カルバモイル化と硫黄原子の脱保護を行うことによりα−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を得る方法を見出した。
また、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩の加水分解及び硫黄原子の脱保護を行うことにより、α−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩を得る方法を見出した。さらには、上記方法の原料となるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体を簡便かつ高収率で製造する方法も確立し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、一般式（１）：
2003106689.tif 000002
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩に、ヒダントイナーゼを作用させＤ体選択的に環化させることを特徴とする、一般式（２）：
2003106689.tif 000003
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩、及び、一般式（３）：
2003106689.tif 000004
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩の製造方法に関する。
また、本発明は、前記Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩を脱カルバモイル化し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（４）：
2003106689.tif 000005
（式中、Ｒ２は前記Ｒ１若しくは水素原子を表す）で表されるα−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩の製造方法に関する。
また、本発明は、前記式（３）においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基であるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、脱カルバモイル化と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（５）：
2003106689.tif 000006
で表されるα−メチル−Ｌ−システイン又はその塩の製造方法に関する。
また、本発明は、前記Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩の、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（６）：
2003106689.tif 000007
で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法、また、Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩を環化して、一般式（７）：
2003106689.tif 000008
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩とし、次いで酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とするＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（６）又はその塩の製造方法に関する。
また、本発明は、前記Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩を加水分解し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（８）：
2003106689.tif 000009
（式中、Ｒ２は前記と同じ）で表されるα−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩の製造方法に関する。
また、本発明は、前記式（２）においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基である化合物を、酸で処理することにより加水分解反応と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（９）：
2003106689.tif 000010
で表されるα−メチル−Ｄ−システイン又はその塩の製造方法に関する。
また、本発明は、前記式（８）においてＲ２がＲ１と同じであるα−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩をカルバモイル化し、一般式（１０）：
2003106689.tif 000011
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩とし、次いで、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、下記式（１１）：
2003106689.tif 000012
で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法に関する。
また、本発明は、前記式（２）で表される化合物を酸で処理することにより、硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、前記式（１１）で表されるＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法に関する。これら光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩は、加水分解することにより容易に光学活性α−メチルシステインに変換することができ、光学活性α−メチルシステインと同様に、医薬等の合成中間体として好適に使用できる。
さらに、本発明は、光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下にこれらの晶出を行うことを特徴とする、光学活性α−メチルシステイン又はその塩の晶析方法にも関する。
さらに、本発明は、下記式（１２）：
2003106689.tif 000013
（式中、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立して置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩、とりわけ下記式（１４）：
2003106689.tif 000014
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるラセミ体５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩を、有機塩基又はアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解を行うことを特徴とする、下記式（１３）：
2003106689.tif 000015
（式中、Ｒ３、Ｒ４は前記と同じ）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体又はその塩、とりわけ、前記式（１）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩の製造方法にも関する。
さらに、本発明は、前記式（１）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩；前記式（３）又は（１０）で表されるＬ体又はＤ体の光学活性Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩；前記式（２）又は（７）においてＲ１が炭素数４〜１５の３級アルキル基である、Ｄ体又はＬ体の光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩；前記式（４）又は（８）において、Ｒ２が置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基である、Ｌ体又はＤ体の光学活性α−メチルシステイン誘導体又はその塩；前記式（６）又は（１１）で表されるＬ体又はＤ体の光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントイン又はその塩に関する。
発明の詳細な開示
以下、本発明を詳細に説明する。まず、本発明の化合物について説明する。
本発明に用いるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体（１）において、Ｒ１は、置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す。
炭素数１〜２０のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基等の直鎖アルキル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｔ−ヘキシル基等の分枝アルキル基等が挙げられ、好ましくは炭素数１〜１０のアルキル基である。
炭素数７〜２０のアラルキル基としては、例えばベンジル基，ｐ−メトキシベンジル基、フェネチル基，ナフチルメチル基等が挙げられ、好ましくは炭素数７〜１５のアラルキル基である。
炭素数６〜２０のアリール基としては、例えばフェニル基，ナフチル基等が挙げられ、好ましくは炭素数６〜１５のアリール基である。
上記アルキル基、アラルキル基、アリール基は、それぞれ無置換であってもよく、また置換基を有していてもよい。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子等が挙げられる。
当該置換基としてのアリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基、ｐ−メチルフェニル基、ｍ−メチルフェニル基、ｏ−メチルフェニル基等の炭素数６〜１５のアリール基が挙げられる。アルカノイル基としては、例えばアセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基等の炭素数２〜１０のアルカノイル基が挙げられる。アルケニル基としては、例えばエテニル基、プロペニル基等の炭素数２〜１０のアルケニル基が挙げられる。アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基等の炭素数２〜１０のアルキニル基が挙げられる。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基等の炭素数１〜１０のアルコキシ基が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
上記Ｒ１の中でも、脱保護の容易さ及びヒダントイナーゼによる立体選択的環化反応の反応性の点からは、置換基を有していても良い炭素数４〜１５の３級アルキル基が好ましい。具体的には、ｔ−ブチル基、ｔ−ペンチル基、ｔ−ヘキシル基等が挙げられ、より好ましくはｔ−ブチル基である。
ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体（１３）において、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表す。炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数７〜２０のアラルキル基、炭素数６〜２０のアリール基としては、上記Ｒ１の説明で挙げた基と同様の基を挙げることができる。
上記アルキル基、アラルキル基、アリール基は無置換であってもよく、置換基を有していても良い。置換基としては、前記Ｒ１の説明で挙げた置換基に加え、下記式（１５）：
2003106689.tif 000016
で表される置換チオ基を挙げることができる。ここで、Ｒ１は上記と同じであり、その好ましい具体例も上記と同じである。
後述するように、対応するヒダントインを加水分解して前記化合物（１３）を調製するうえでは、加水分解反応の反応性の観点から、Ｒ３、Ｒ４としては置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられ、Ｒ３、Ｒ４の少なくとも一方がメチル基であるのがより好ましい。言うまでもなく、化合物（１３）において、Ｒ３、Ｒ４の一方がメチル基、他方が、前記置換チオ基（１５）で置換されたメチル基の場合、化合物（１）を表す。
ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体（１）及びラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体（１３）は塩であってもよく、塩は、塩基との塩を表す。塩基との塩は、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等）との塩；アルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等）との塩等が挙げられる。好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムとの塩である。
前記式（２）、（７）又は（１４）で表されるラセミ及び光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体において、Ｒ１は、前記式（１）で表される化合物において定義したものと同じである。
前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体において、Ｒ３、Ｒ４は、前記式（１３）で表される化合物において定義したものと同様である。言うまでもなく、化合物（１２）において、Ｒ３、Ｒ４の一方がメチル基、他方が前記置換チオ基（１５）で置換されたメチル基の場合が、化合物（１４）である。
これら５，５−二置換ヒダントイン誘導体は塩であってもよく、塩は、塩基との塩を表し、ヒダントイン環のイミド基上での塩を表す。塩基との塩は、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等）との塩；アルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等）との塩等が挙げられる。好ましくは、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムとの塩である。
前記式（３）又は（１０）で表される光学活性Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体において、Ｒ１は前記と同じである。これら光学活性Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体は塩であってもよく、塩の種類は、前記式（１）で表される化合物の場合と同様である。
前記式（４）及び（８）で表される光学活性α−メチルシステイン誘導体において、Ｒ２は、Ｒ１若しくは水素原子を表す。当該Ｒ１は、置換基を有していても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数６〜２０のアリール基を表し、前記式（１）で表される化合物で定義したものと同じである。これら光学活性α−メチルシステイン誘導体は塩であってもよく、塩としては、酸との塩、塩基との塩が挙げられる。酸としては、ハロゲン化水素酸（塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸等）、スルホン酸（メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等）、硫酸、硝酸、カルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸等）等が挙げられる。塩基としては、有機塩基（アンモニア、トリエチルアミン、アニリン、ピリジン等）、アルカリ金属水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等）、アルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等）等が挙げられる。
前記式（６）又は（１１）で表される光学活性５−メチル−５−チオメチルヒダントインは、塩であってもよく、塩の種類は、前記式（１）で表される化合物の場合と同様である。
次に、前記式（１）及び（１３）で表される化合物の製造法について詳細に記載する。ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体（１３）又はその塩は、前記式（１２）で表されるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体又はその塩を、有機塩基又はアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解することにより製造することができる。
原料となるラセミ体５，５−二置換ヒダントイン誘導体（１２）又はその塩は、対応するケトンから当業者周知のＢｕｃｈｅｒｅｒ法により合成することができる。
本製法においては、塩基として有機塩基又はアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解する。当該有機塩基としては、特には限定されないが、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、アニリン等が挙げられる。これら有機塩基は、それぞれ単独で用いても良いし、２種類以上混合して用いても良い。
上記アルカリ金属水酸化物としては、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等が挙げられる。これらアルカリ金属水酸化物は、それぞれ単独で用いても良いし、２種類以上混合して用いても良い。
上記加水分解に用いる塩基は、収率、経済性の点から、好ましくはアルカリ金属水酸化物であり、より好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムである。
塩基の使用量としては、特には限定されないが、基質に対して、好ましくは１〜１０モル当量、より好ましくは２〜５モル当量である。
反応溶媒は、水単独でも良いし、水と有機溶媒を混合して用いても良い。
上記溶媒として水と混合する有機溶媒は、特には限定されないが、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、エーテル系溶剤、アルコール系溶剤、ニトリル系溶剤、アミド系溶剤等が挙げられる。好ましくは炭化水素系溶剤である。
上記炭化水素系溶剤としては、特には限定されないが、例えばトルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等が挙げられ、これらのいずれか一種を単独で用いても良いし、又は二種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくはトルエンである。
エステル系溶剤としては、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、プロピオン酸メチル等が挙げられる。
エーテル系溶剤としては、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルｔ−ブチルエーテル等が挙げられる。
アルコール系溶剤としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等が挙げられる。
ニトリル系溶剤としては、アセトニトリル、プロピオニトリル等が挙げられる。
アミド系溶剤としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等が挙げられる。
反応に用いる水は、基質に対して、好ましくは０．１倍〜１００倍重量であり、収率、容積効率の点から、より好ましくは０．１倍〜１０倍重量、さらに好ましくは０．２〜３倍重量である。
また、基質に対して、水を０．２倍〜３倍重量、塩基を２〜５モル当量使用する場合に、最も反応は収率良く進行する。
反応温度は、基質の種類、試材量に依存するので一概に言えないが、５０℃〜１５０℃の条件から選択でき、好ましくは８０℃〜１１０℃、より好ましくは８５℃〜１００℃である。
反応時間は、基質の種類、試材量、反応温度に依存するので一概に言えないが、１〜５０時間反応させるのが好ましく、収率良く生成物を得るには、より好ましくは２〜２４時間である。
反応後の後処理としては、このまま、次の反応に用いても良いし、酸を加えて中和した後に、抽出、精製により単離してもよい。また、反応混合物をろ過して該化合物を単離してもよい。
前記式（１）で表される化合物は上記と同様にして、チオアセトン誘導体からＢｕｃｈｅｒｅｒ法にて前記式（１４）で表されるラセミ体５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体を製造し、これを加水分解することにより製造することができる。
次に、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体（１）又はその塩を、ヒダントイナーゼによってＤ体選択的に環化反応させ、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩及びＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩を合成する方法について説明する。
ここでヒダントイナーゼとは、５−置換ヒダントイン誘導体又はその塩を加水分解してＮ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素である。また、本酵素は、一般に、加水分解反応の逆反応として、Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体を環化して５−置換ヒダントイン誘導体を生成することが知られている（特開平１−１２４３９８９号公報）。
本発明で用いるＤ体選択的な環化反応を触媒するヒダントイナーゼとしては、動物、植物、又は、微生物由来のいずれでも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。酵素源となる微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物を挙げることができる。
例えば、細菌に属するものとしてはアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルチナ属（Ｓａｒｔｉｎａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）等；放線菌に属するものとしてはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルデイア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）等；かびに属するものとしてはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、パエシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）等；酵母に属するものとしてはキャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｈｉｃｈｉａ）、ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）等が挙げられる。
好ましくは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。
より好ましくは、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）又はリゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ１４１５由来の酵素が挙げられる。
なお、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００の受託番号で、１９８８年５月３１日付で；バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２４５は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３の受託番号で、１９９４年１１月２日付で；シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１の受託番号で、１９９０年１２月１日付で；それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。
上記微生物は野生株であってもよく、また、変異処理によってヒダントイナーゼ活性が高められた変異株であってもよい。さらに、遺伝子組換え等の方法を用いて、上記微生物由来のヒダントイナーゼを高生産するように作成された形質転換微生物であってもよい。
ヒダントイナーゼを効率良く高生産する形質転換微生物の作成方法としては、例えばＷＯ９６／２０２７５記載のように、ヒダントイナーゼ活性を示す菌株からヒダントイナーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されている。
このようにして得られた、ヒダントイナーゼを高生産する形質転換微生物としては、ＷＯ９６／２０２７５記載の、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＴＨ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６５）、又はシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６６）を挙げることができる。
なお、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＴＨ１０４は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４の受託番号で、１９９４年１１月２日付で；エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＡＨ１０４３は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６５の受託番号で、１９９４年１１月２日付で；エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＰＨＤ３０１は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６６の受託番号で、１９９４年１１月２日付で；それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。
前述のヒダントイナーゼ活性を示す微生物、或いは、上記形質転換微生物によるヒダントイナーゼの生産は、例えば、ＷＯ９６／２０２７５に記載されているように、通常の栄養培地を用いて培養を行えば良く、必要に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。酵素誘導は、例えば、培地にウラシルを添加して培養することにより行うことができる。
本発明において、上記微生物によって生産されたヒダントイナーゼは、酵素自体として用いることができるほか、本酵素活性を有する微生物若しくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、又はそれらの菌体の破砕物を意味する。
さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。なお、酵素を固定化して安定化することで、酵素反応を、より過酷な温度域で行うこと等が可能となり、反応をより効率的に進行させることができる。さらに、酵素の反復使用が可能となること、製造プロセスが簡略化できる等による製造コストの低減等のメリットも期待できる。
固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法等で行い得る。酵素の固定化に使用される支持体としては、例えば、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８又はＤＳ１７１８６（ローム・アンド・ハース社：登録商標）等のフェノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９３５、ＩＲＡ９４５、ＩＲＡ９０１（ローム・アンド・ハース社：登録商標）、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＯＣ１０３７（バイエル社：登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＥＸ−０５（三菱化学：登録商標）等のポリスチレン樹脂のような各種アミンやアンモニウム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他、ＤＥＡＥ−セルロース等の支持体も使用することができる。
固定化酵素の好適な製造方法としては、例えば、ＷＯ９６／２０２７５に示す方法で行い得る。すなわち、ヒダントイナーゼ活性を有する菌株の培養液を集菌し、超音波等により菌体を破砕後、得られた酵素液に例えば陰イオン交換樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８を加えて攪拌して酵素を吸着させることができる。この酵素を吸着した樹脂に、例えばグルタルアルデヒド等の架橋試薬を加えて攪拌することで架橋処理を行い、さらに安定性を向上させることもできる。これらの処理を行った後に、樹脂を濾集、洗浄して、固定化ヒダントイナーゼを得ることができる。
本発明の酵素反応は、以下の方法で行うことができる。基質として前記一般式（１）で表されるラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩を用い、前述のヒダントイナーゼ存在下、水性媒体中で反応を行う。基質の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上５０％（ｗ／ｖ）以下で、溶解又は懸濁した状態で反応を行い、反応温度は１０℃以上８０℃以下、好ましくは２０℃以上６０℃以下の適当な温度で調節し、ｐＨ４以上９以下、好ましくはｐＨ５以上８以下に保ちつつ、暫時静置又は攪拌すればよい。また、基質を連続的に添加しうる。反応は、バッチ法又は連続方式で行い得る。さらに、本発明の当該反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
水性媒体としては、水、緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液等）、これらに水溶性有機溶媒（例えばエタノール、メタノール、アセトニトリル等）を含む溶媒等を用いることができる。なお、上記水性媒体は、水に溶解しにくい有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等）との２相系として用いることもできる。さらに必要に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属等を添加することもできる。
かくして、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体（１）又はその塩は、Ｄ体のみが環化され、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩と、Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩に変換される。
生成したＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩は、反応液のまま、脱カルバモイル化反応に供してもよいし、常套分離方法、例えば抽出、濃縮、晶析、又はカラムクロマトグラフィー等や、それらの組み合わせにより、分離、精製することができる。
例えば、前記式（１）においてＲ１がｔ−ブチル基であるＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインをヒダントイナーゼによるＤ体選択的環化反応の基質とした場合、反応後に不溶分として析出するＤ−５−メチル−５−ｔ−ブチルチオメチルヒダントインを、ろ過により容易に除去することができる。
この場合、得られたＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システインを含むろ液は、そのまま次工程に使用してもよいし、精製して次工程に使用してもよい。精製する場合、例えばｐＨを酸性にすることで結晶を析出させ、ろ過することにより該化合物を取得することができる。
また、不溶分として析出したＤ−５−メチル−５−ｔ−ブチルチオメチルヒダントインは、そのまま次工程に用いてもよいし、一旦アルカリ水溶液に溶解してアルカリ溶液として次の工程に用いることもできる。また、アルカリ水溶液を中和することにより、結晶として取得することもできるが、これらの方法に限られるものではない。
次に、Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩の脱カルバモイル化及び必要に応じた硫黄原子の脱保護による前記式（４）で表されるα−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩の製造方法について説明する。
硫黄原子の保護基は上記Ｒ１で示されるなかから選択される。脱保護としては、脱カルバモイル化（アミノ基の脱保護）と硫黄原子の脱保護を一緒に行ってもよいし、段階的にどちらか片方を行い、続いて残りの保護基を除去してもよい。脱保護の方法は、保護基と目的により適切な方法を選択すればよい。
まず、脱カルバモイル化と硫黄原子の脱保護を一緒に行う方法について説明する。本発明者らは検討を重ねる中で、硫黄原子の保護基（Ｒ１）として、ｔ−ブチル基等に代表される炭素数４〜１５の３級アルキルを用いた場合、Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩を酸で処理することにより、脱カルバモイル化（アミノ基の脱保護）と硫黄原子の脱保護を一段階で行えることを見出した。
本方法で用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。反応性、経済性から、好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは反応溶媒を兼ねるのが好適である。
反応条件としては、例えば、硫黄原子の保護基がｔ−ブチル基であるＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインを塩酸で処理することにより一段階でα−メチルシステイン塩酸塩を得る場合、反応温度は、好ましくは７０℃〜１８０℃、より好ましくは９０℃〜１５０℃である。反応時間は、例えば１００℃〜１１０℃、常圧で反応を行った場合、２〜４日間程度が好ましく、耐圧反応器を用いて、より高温で反応を行うことにより、反応時間を短くすることができる。
次に、まずＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩の脱カルバモイル化を行って、前記式（４）においてＲ２が前記式（１）におけるＲ１と同じであるα−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩とした後に、硫黄原子の脱保護を行い、前記式（５）で表されるα−メチル−Ｌ−システイン又はその塩を得る方法について説明する。
この場合、脱カルバモイル化はカルバモイル基を除去でき得る方法であれば特に制限されるものではないが、例えば、亜硝酸酸化法、アルカリ加水分解法及び酸加水分解法が挙げられる。硫黄原子上の保護基がｔ−ブチル基等の３級アルキル基の場合、塩酸等による酸加水分解法では、硫黄原子上の脱保護が進行する傾向にあるので、脱カルバモイル化のみを行いたい場合は、他の方法を用いることが好ましい。
亜硝酸酸化法は、通常の脱カルバモイル化に用いられる反応条件が利用できる。例えば、亜硝酸単独、又は、亜硝酸の塩と適当な酸の組み合わせを用いることができるが、亜硝酸塩と酸の組み合わせを用いることが好ましい。
亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸カルシウム、亜硝酸セシウム、亜硝酸マグネシウム、亜硝酸バリウム等が挙げられ、亜硝酸カリウム、亜硝酸ナトリウムが好ましい。また組み合わせる酸としては、酢酸、塩酸、硫酸、臭化水素酸等が好ましく、特に好ましくは塩酸である。溶媒としては特に制限されるものではないが、基質の溶解性から、水又はアルコール（例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等）を用いることが好ましい。
亜硝酸酸化法の反応温度は、−５℃〜１００℃の範囲で行うことが好ましく、生成物の安定性、収率向上の面から、より好ましくは０℃〜５０℃の範囲である。
アルカリ加水分解法で用いるアルカリとしては、特に限定されないが、例えば水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等が好ましく、より好ましくは水酸化リチウムである。
アルカリ加水分解の反応温度は、−５℃〜１５０℃の範囲で行うことが好ましく、生産性及び収率向上の面から、より好ましくは８０℃〜１２０℃の範囲である。
前記式（４）においてＲ２が前記式（１）におけるＲ１と同じである化合物は、そのまま次工程に用いてもよいし、精製して次工程に用いてもよい。精製する場合、例えばＲ２がｔ−ブチル基である場合、アルカリ加水分解後の反応溶液のｐＨを、酸を加えることにより下げることで、前記式（４）においてＲ２がｔ−ブチル基であるα−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を結晶として得ることができる。
この場合、アルカリ加水分解に用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のなかから任意に選ばれる。また、アルカリ加水分解後の反応溶液に加える酸としては、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良いが、中和時に生成する無機塩が水に対して良好な溶解度を有し、脱塩が容易であることから、アルカリとして水酸化リチウム、酸として塩酸の組み合わせを用いることが好ましい。
ここでいう「中和」とは、反応液のｐＨを結晶が析出する領域に調整することを表す。前記式（４）においてＲ２がｔ−ブチル基であるα−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩を結晶として収率良く得るためには、ｐＨの上限は９．５以下が好ましく、７．０以下がより好ましい。ｐＨの下限は通常、１．０以上であり、２．０以上が好ましく、３．０以上がより好ましい。
以上のようにして脱カルバモイル化した後、さらに硫黄原子の脱保護が必要な場合は、例えば反応液をそのまま、又は、一旦α−メチル−Ｌ−システイン誘導体を単離した後、保護基に応じた反応条件で硫黄原子の脱保護を行うことができる。
例えば、保護基がｔ−ブチル基等の３級アルキル基の場合、酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことができる。酸としては、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸の場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することもできる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。反応温度は、好ましくは５０℃〜１２０℃、より好ましくは８０℃〜１００℃である。
次に、前記式（３）で表されるＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩から、Ｌ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（６）又はその塩を経由することによる、α−メチル−Ｌ−システイン（５）又はその塩の製造方法について説明する。
まず、Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩の硫黄原子の脱保護と環化反応を一段階で行う方法について説明する。硫黄原子上の保護基がｔ−ブチル基に代表される３級アルキル基の場合、酸で処理することにより脱保護と環化を同時に行うことが可能である。
用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いてもよい。好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸の場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて用いることができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、反応溶媒を兼ねるのが好適である。
反応温度は特に限定されるものではないが、Ｌ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（６）又はその塩の加水分解を抑制するためには、温和な条件が良く、例えば０℃〜１００℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲で数時間反応を行い、目的物が主たる生成物となった時点で反応を停止すればよい。
次に、環化のみを先に行いＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（７）又はその塩を得た後に、硫黄原子の脱保護を行う方法を説明する。硫黄原子上の保護基がｔ−ブチル基に代表される３級アルキル基の場合、酸で環化を行うと先に硫黄原子の脱保護が進行するため、アルカリで処理することが好ましい。
用いるアルカリとしては、特に制限されるものではなく、例えば水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化リチウム，水酸化マグネシウム，水酸化バリウム，水酸化カルシウム等が挙げられるが、入手の容易さ、価格の面等から、水酸化ナトリウム，水酸化カリウムあるいは水酸化リチウムが好ましい。
環化の際の反応温度としては、好ましくは０℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜９０℃である。また、溶媒は、水単独でも良いし、有機溶媒との混合溶媒でも良い。好ましくは水単独である。
Ｌ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（７）又はその塩は、そのまま次工程に用いてもよいし、有機溶媒で抽出後に次工程に用いてもよいし、晶析等により単離してから次工程に用いてもよい。
得られた（７）又はその塩をさらに酸で処理することにより硫黄原子の脱保護が進行し、Ｌ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（６）又はその塩を得ることができる。
用いる酸としては、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等が挙げられ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。収率や価格の面から塩酸が好ましい。酸処理は、前述の脱保護と環化を一段階で行う場合と同様の条件にて、好適に実施できる。
以上のようにして得られたＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（６）又はその塩は、酸又はアルカリで加水分解することにより、α−メチル−Ｌ−システイン（５）又はその塩に変換できる。好ましくは酸による加水分解である。
酸としては、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。塩酸又は臭化水素酸が好ましく、塩酸がより好ましい。また、アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が好ましい。
次に、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩の加水分解反応を行い、得られた前記式（８）においてＲ２が前記式（１）におけるＲ１と同じであるα−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩の硫黄原子の脱保護を行うことによるα−メチル−Ｄ−システイン又はその塩の製造方法について説明する。
加水分解は、通常、アルカリを用いて行われる。加水分解に用いるアルカリは特に制限されるものではないが、例えば水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化リチウム，水酸化バリウム，水酸化マグネシウム，水酸化カルシウム等が挙げられ、好ましくは水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化リチウムである。反応後に生成物の晶析を行う際に、生じる無機塩不純物が水に対して良好な溶解度を有することから、水酸化リチウムを用いることが特に好ましい。
溶媒は、水単独でも良いし、有機溶媒との混合溶媒でも良い。好ましくは水単独である。
反応温度としては、好ましくは−５℃〜１５０℃、より好ましくは８０℃〜１２０℃である。
例えば、Ｒ２がｔ−ブチル基の場合、得られたα−メチル−Ｓ−ｔ−ブチル−Ｄ−システインは、加水分解反応後に反応液に酸を加えてｐＨを下げることにより、結晶として取得することができる。
ここで用いる酸は、反応液のｐＨを下げ得るものであれば特に限定されるものではないが、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等が挙げられ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良く、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。加水分解に水酸化リチウムを用いた場合、中和時に生成する無機塩不純物が水に対して良好な溶解度を有し、結晶中に混入しにくいことから塩酸を用いることが好ましい。
ここでいう「中和」とは、反応液のｐＨを結晶が析出する領域に調整することを表す。α−メチル−Ｓ−ｔ−ブチル−Ｄ−システインを結晶として収率良く得るためには、ｐＨの上限は９．５以下が好ましく、７．０以下がより好ましい。ｐＨの下限は通常、１．０以上であり、２．０以上が好ましく、３．０以上がより好ましい。
かくして、得られた前記式（８）においてＲ２がＲ１と同じである化合物は、硫黄原子の脱保護を行うことによりα−メチル−Ｄ−システイン（９）又はその塩に変換することが出来る。脱保護の方法は、硫黄原子上の保護基に応じて選択されるが、保護基としてｔ−ブチル基等の３級アルキル基を用いた場合、酸で処理することにより容易に脱保護することができる。
本方法で用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。反応性、経済性から、好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。
反応温度としては、好ましくは７０℃〜１８０℃、より好ましくは９０℃〜１５０℃である。
次に、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩の加水分解反応と硫黄原子の脱保護を酸により一段階で行う方法を説明する。例えば、前記式（２）におけるＲ１がｔ−ブチル基に代表される炭素数４〜１５の３級アルキル基の場合、酸で処理することにより一段階でα−メチル−Ｄ−システイン（９）又はその塩を得ることができる。
ここで用いる酸は、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することがでできる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。
反応温度としては、好ましくは７０℃〜１８０℃、より好ましくは９０℃〜１５０℃である。
次に、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩から、硫黄原子の脱保護を行ってＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（１１）又はその塩とし、さらに該化合物を加水分解することによりα−メチル−Ｄ−システイン（９）又はその塩を製造する方法について説明する。
まず、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩の硫黄原子の脱保護のみを選択的に行い、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（１１）又はその塩を得る方法について説明する。前述したように、硫黄原子の保護基がｔ−ブチル基等の３級アルキル基である場合、酸で処理することにより容易に脱保護が可能である。
用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。
反応条件は、加水分解を抑制し、選択性良くＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（１１）を得られる比較的温和な条件であれば特に限定されるものではないが、１００℃以下で数時間反応を行い、目的物が主たる生成物となった時点で反応を停止すればよい。
次いで、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（１１）又はその塩を加水分解して、α−メチル−Ｄ−システイン（９）又はその塩を製造する。
加水分解は、酸加水分解、アルカリ加水分解のいずれも可能である。酸加水分解の場合、酸としては、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の１種を単独で用いても良いし、あるいは２種以上を任意の割合で混合して用いても良い。反応性、経済性から好ましくは塩酸または臭化水素酸であり、更に好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好ましい。反応温度は、好ましくは７０℃〜１８０℃、更に好ましくは、９０℃〜１５０℃である。反応時間は、例えば１００℃〜１１０℃、常圧で反応を行う場合、２〜４日間程度が好ましく、耐圧反応器を用いてより高温で反応を行うことにより、反応時間を短縮することができる。
次に、まずＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩の加水分解を先に行うことにより、前記式（８）で表されるα−メチル−Ｄ−システイン誘導体又はその塩を得た後に、カルバモイル化して、Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｄ−システイン誘導体（１０）又はその塩で表される化合物に変換し、次いで、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことによりＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（１１）又はその塩を得る方法について説明する。
この場合、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体（２）又はその塩からα−メチル−Ｄ−システイン誘導体（８）又はその塩への変換は、既に記載した方法で行うことができる。
α−メチル−Ｄ−システイン誘導体（８）又はその塩のカルバモイル化は、シアン酸のアルカリ金属塩及び酸を用いて行うことができる。シアン酸のアルカリ金属塩としては、例えばイソシアン酸カリウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム等が挙げられる。酸としては、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。これらを用いて、通常のカルバモイル化反応条件（例えば、水溶媒中、０〜１００℃）に付すことにより、カルバモイル化する。
Ｎ−カルバモイル−α−メチル−Ｄ−システイン誘導体（１０）又はその塩の環化及び硫黄原子の脱保護は、前述のＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体（３）又はその塩からＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（６）への変換で記載した方法と同様にして行うことができる。
次に、光学活性α−メチルシステイン又はその塩の晶析方法について詳細に説明する。光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、これらの晶出を行うことにより、光学活性α−メチルシステイン又はその塩を容易に取得することが可能である。
光学活性α−メチルシステイン又はその塩としては、特には限定されないが、光学活性α−メチルシステイン、光学活性α−メチルシステインの酸との塩、光学活性α−メチルシステインの塩基との塩が挙げられるが、好ましくは酸との塩である。また、光学活性α−メチルシステインは、Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよい。
前記の酸との塩の酸としては、ハロゲン化水素酸、スルホン酸、硫酸、硝酸、カルボン酸等が挙げられるが、好ましくはハロゲン化水素酸である。
前記ハロゲン化水素酸としては、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸等が挙げられるが、好ましくは塩酸である。
スルホン酸としては、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、カルボン酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。また、塩基との塩の塩基としては、アンモニア、トリエチルアミン、アニリン、ピリジン等が挙げられる。
光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液は、その調製法は特には限定されない。例えば、前記従来の技術１）〜６）の方法により得られるα−メチルシステイン誘導体又はその塩、若しくは保護体を、適切に変換、脱保護して得られる水溶液である。また、本明細書記載の方法に従い得られる該化合物の水溶液であってもよい。好ましくは、本明細書記載の方法により製造された光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液である。
本晶析方法においては、光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液を、有機溶剤との共存下に濃縮することにより、水を系外に除去すると共に、有機溶剤に置換する。これにより、当該化合物が塊状化することを抑制して、取り出し及びろ過が容易なスラリーを得ることができる。得られたスラリーをろ過後、洗浄、乾燥し、光学活性α−メチルシステイン又はその塩を結晶として取得することが可能である。
本晶析方法の実施にあたっては、有機溶剤の添加に先立ち、光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液を予備的に濃縮しておくこともできる。この場合、該化合物の重量濃度が１０重量％以上、より好ましくは３０重量％以上となる程度に水溶液を濃縮するのが好ましい。
置換する有機溶剤の種類は、特には限定されないが、好ましくは水と共沸することができ、共沸時の水の組成が５．０重量％以上の溶媒である。また、水と相溶性の低い又はない有機溶剤がさらに好ましい。
前記水と相溶性の低い又はない有機溶剤として、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、又はエーテル系溶剤等が挙げられる。水と相溶性が低く、光学活性α−メチルシステイン又はその塩の溶解性が低く、溶剤の回収再利用が容易である点から、好ましくは炭化水素系有機溶剤である。
炭化水素系有機溶剤としては、特には限定されないが、例えばトルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタンのいずれかの一種又は二種以上混合して用いても良い。好ましくは経済性の点からトルエンである。
エステル系溶剤としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル等が挙げられる。
エーテル系溶剤としては、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、１，４−ジオキサン、メチルｔ−ブチルエーテル等が挙げられる。
これら上記溶剤は、各々単独で用いても良いし、同種または異種の溶剤を任意の割合で混合して用いても良い。
有機溶剤への置換は、一度に行っても良いし、複数回に分けて行っても良い。また、置換する有機溶剤の使用量は、有機溶剤の種類、濃縮の減圧度、内温により異なるので一概には言えないが、例えばトルエンの場合、一回の投入量として、水溶液の全重量に対して、好ましくは０．１〜１００倍重量であり、より好ましくは０．２〜１０倍重量である。
有機溶剤添加後、水を系外に除去しつつ、光学活性α−メチルシステイン又はその塩を晶出させるときの濃度としては、溶質としての光学活性α−メチルシステイン又はその塩が０．１〜７０重量％、好ましくは１〜７０重量％である。
上記操作により、系外に水を除去した後に最終的に残存する水の量としては、光学活性α−メチルシステイン又はその塩に対して、１００重量％以下であることが好ましく、得られる結晶の性状、ろ過性、晶出率、スラリーの流動性の点からは、４０重量％以下まで水を系外に除去することがより好ましい。
濃縮を行う際の蒸発速度としては、装置の能力に依存するので一概には言えないが、蒸発速度を大きくすると、発泡が激しくなり得られるスラリーの流動性が極めて悪くなり、また塊状化する傾向にある。したがって、蒸発速度を、単位蒸発面積及び単位時間あたりの速度として１０００Ｌ／ｈ・ｍ２以下に制御するのが好ましい。６００Ｌ／ｈ・ｍ２以下がより好ましく、３００Ｌ／ｈ・ｍ２以下が更に好ましく、１００Ｌ／ｈ・ｍ２以下が特に好ましい。
有機溶剤投入後濃縮を行う際の減圧度としては、通常５００ｍｍＨｇ以下であり、好ましくは２００ｍｍＨｇ以下である。下限は特に制限されないが、通常０．１ｍｍＨｇ以上である。
濃縮時の温度は、減圧度、装置の能力に依存するが、取り扱いが容易な、高品質の結晶を取得する為には、０℃〜１５０℃であり、好ましくは１０℃〜１００℃、より好ましくは３０〜７０℃である。
次に、光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液から、無機塩を除去した後に、該化合物を晶析取得する方法について下記に詳細に記載する。光学活性α−メチルシステイン又はその塩の水溶液に有機溶剤を添加し、濃縮を行い、水を系外に除去すると共に有機溶剤に置換する。このとき、難溶性無機塩の大半は析出しており、ろ過等の方法により無機塩を除去することができる。そして、得られたろ液から、貧溶媒添加、冷却、又は濃縮等の操作により、該化合物を晶出させることにより、光学活性α−メチルシステイン又はその塩を結晶として取得することができる。
上記操作により、有機溶剤を添加し、系外に水を除去するとき最終的に残存する水の量としては、光学活性α−メチルシステイン又はその塩に対して、好ましくは１００重量％以下であり、除去すべき無機塩の析出量の点から、４０重量％以下まで水を系外に除去することがより好ましい。
置換する有機溶剤の種類は、特には限定されないが、無機塩が難溶又は不溶で、かつ、光学活性α−メチルシステイン塩酸塩が可溶な物性を有している点で、水と相溶性のある有機溶剤が好ましい。より好ましくは、アルコール系溶剤単独、水と相溶性のあるエーテル系溶剤単独、又は、各々を任意に混合した溶剤である。
アルコール系溶剤としては、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等が挙げられる。これらの中から任意に１種を単独で用いても良いし、２種以上を任意の割合で混合して用いても良いが、脱水効率、経済性、エステル化等の副反応を低減する観点から、好ましくはイソプロピルアルコールである。
上記水と相溶性のあるエーテル系溶剤としては、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチル−ｔ−ブチルエーテル等が挙げられる。これらの中から任意に１種を単独で用いても良いし、２種を任意の割合で混合して用いても良いが、脱水効率、経済性の点から、好ましくはテトラヒドロフランである。
難溶性無機塩を除去後、得られるろ液から、光学活性α−メチルシステイン又はその塩を晶出させる方法としては特には限定されず、例えば貧溶媒添加、冷却、又は濃縮等の一般的な晶析操作が実施可能であるが、好ましくは貧溶媒を添加する方法である。
上記貧溶媒としては、特には限定されず、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、水と相溶性のない又は低いエーテル系溶剤等が挙げられる。結晶の析出量、純度の点から、好ましくは炭化水素系溶剤及びエステル系溶剤である。より好ましくは炭化水素系溶剤である。
上記炭化水素系溶剤としては、特には限定されないが、例えばトルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等が挙げられ、好ましくはトルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタン、より好ましくはトルエンである。
上記エステル系溶剤としては、特には限定されないが、例えば酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル等が挙げられ、好ましくは酢酸エチルである。
水と相溶性のない又は低いエーテル系溶剤としては、特には限定されないが、例えばジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、１，４−ジオキサン、メチルｔ−ブチルエーテル等が挙げられる。
これら上記溶剤は、各々単独で用いても良いし、同種または異種の溶剤を任意の割合で混合して用いても良い。
光学活性α−メチルシステイン又はその塩を晶出させるときの当該化合物の濃度としては、温度、溶媒比等により異なるが、溶液全体に対して、通常０．１〜７０重量％、好ましくは１〜７０重量％、より好ましくは２〜７０重量％である。
本発明の晶析方法によれば、高純度の光学活性α−メチルシステイン又はその塩を工業的に実施可能な工程で良好に取得できる。また、本発明の晶析方法で取得した結晶中の対応するジスルフィド体含有量は、１．０モル％以下、好ましくは０．５モル％以下、より好ましくは０．１モル％以下である。ジスルフィド体の含有量の低い光学活性α−メチルシステイン又はその塩を得るために好ましい形態は、酸との塩であり、より好ましくはハロゲン化水素酸との塩、さらに好ましくは塩酸との塩である。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（参考例１）ラセミ体５−メチル−５−ｔ−ブチルチオメチルヒダントインの製造方法
窒素風船を備えた反応容器に、５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液（９．６ｇ，１２ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチルメルカプタン（１．１３ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）を０℃で混合し、１０分間攪拌した。クロロアセトン（０．７９ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）を加え、室温に昇温し２時間反応させた。このとき反応溶液は淡黄色で二相分離していた。反応容器にジムロート型冷却管を備え、ＮａＣＮ（５８８ｍｇ，１２ｍｍｏｌ）、（ＮＨ４）ＨＣＯ３（２．７７ｇ，３５ｍｍｏｌ）、２８％アンモニア水（３．１ｍＬ）を加え、均一な溶液とした後、５５−６０℃に昇温した。６時間加熱攪拌した後、０℃に冷却し、反応溶液に濃塩酸を加えｐＨ＝７．０−７．６に調整した。生成した白色結晶を濾別し、１Ｈ  ＮＭＲ分析を行ったところ目的物（１．８４ｇ、収率８４．８％）であった。
（参考例２）５−（２−メトキシフェニルメチル）−５−メチル−ヒダントインの製造方法
２−メトキシフェニルアセトン（１６．４ｇ、１００ｍｍｏｌ）と水１６４ｇを混合し、これにＮａＣＮ（５．８８ｇ、１２０ｍｍｏｌ）、（ＮＨ４）ＨＣＯ３（２７．７ｇ、３５０ｍｍｏｌ）、２８％アンモニア水２７．７ｇを加えた。５０℃で４時間、６０℃で１２時間攪拌した後に、２３℃まで放冷し、濃塩酸を加えｐＨ７．５に調整した。析出した固体をろ取し、トルエンで洗浄した後に、減圧乾燥し、標題化合物２２．１０ｇ（収率９４．５％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．１０−６．８８（ｍ，４Ｈ），５．４９（ｂｒｓ，１Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．２０（ｄ，１Ｈ），２．９７（ｄ，１Ｈ），１．４９（ｓ，３Ｈ）。
（参考例３）ラセミ体Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの製造方法
ラセミ体５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（４．７７ｇ，２２．１ｍｍｏｌ）を１０％水酸化ナトリウム水溶液（７５ｇ）に溶解し、７２時間還流させた。室温まで放冷後、反応液を一部抜き取り、ＨＰＬＣ（カラム：コスモシルＡＲ−ＩＩ（ナカライ社製）、移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９７／３、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃、保持時間２１．１５分）にてラセミ体Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの生成を確認した。濃塩酸にてｐＨを８に調整した後、溶液を７０℃に加熱、シアン酸カリウム（２．０７ｇ）を蒸留水（１０ｍＬ）に溶解した溶液を２０分かけて滴下した。滴下終了後、５時間攪拌した後、反応液の一部を抜き取りＨＰＬＣにて分析したところ未反応のアミノ酸が認められたので、さらにシアン酸カリウム（４．１４ｇ）を蒸留水（２０ｍＬ）に溶かした溶液を２０分かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間攪拌し室温まで放冷、濃塩酸にてｐＨを２とし、析出した固体をろ取した。得られた固体を水洗、乾燥させ１Ｈ  ＮＭＲで分析したところ目的物であることがわかった（３．３８ｇ、収率６６％）。
（実施例１）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システイン及びＤ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインの製造方法
ＷＯ９６／２０２７５記載の培養方法と固定化酵素の調製方法に従い、バチルス  ｓｐ．ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）を培養、集菌後、超音波破砕して得た酵素液に、固定化用担体である陰イオン交換樹脂、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８を添加して酵素を吸着させ、さらにグルタルアルデヒドで架橋処理することで固定化ヒダントイナーゼを得た。
次に、参考例２で得たラセミ体のＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン１５ｍｇに０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００３ｍｌを加え１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整した溶液に、上記の様にして得られた固定化ヒダントイナーゼ２００ｍｇ（湿重量）を加えて、４０℃、４８時間攪拌して反応させた。反応中は６Ｎ塩酸によりｐＨを６．５付近に保った。反応液をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ、移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３／７、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）した結果、Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの残存率は４１％であった。さらに、反応液中Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの光学純度をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール／トリクロロ酢酸＝７／３／０．０１、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）したところ９６．７％ｅｅであった。また、得られた光学活性Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインがＬ体であることを、実施例９及び１０に示す方法でメチルシステインに誘導して旋光度を測定することで確認した。
一方、上記酵素反応中に生成し析出した化合物を酢酸エチルで抽出した後、キラルＨＰＬＣで分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール＝１０／３、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）したところ、溶出時間が標品と一致したことから光学活性５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインであることを確認した（面積比から化学純度８８％、光学純度１００％ｅｅ）。また、得られた光学活性５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインがＤ体であることを、別途合成した標品とのＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール＝１０／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃、Ｄ体：１４．７分、Ｌ体：２５．３分）による保持時間の比較により確認した。
Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システイン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：３．２２（ｄ，１Ｈ），３．１６（ｄ，１Ｈ），１．５２（ｓ，３Ｈ），１．２９（ｓ，９Ｈ）
Ｄ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３  ｗｉｔｈ  ３  ｄｒｏｐｓ  ｏｆ  ＣＤ３ＯＤ）δ：２．９０（ｄ，１Ｈ），２．８０（ｄ，１Ｈ），１．４９（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ）。
（実施例２）形質転換微生物エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１  ｐＴＨ１０４を用いたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造方法
バチルス  ｓｐ．ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）のヒダントイナーゼ遺伝子を組み込んだ形質転換微生物エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１  ｐＴＨ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）を１０ｍｌ液体培地（１０ｇ／ｌ  トリプトン、１０ｇ／ｌ  イーストエキス、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７を１２０℃で１５分間殺菌後、１００ｍｇ／ｌ  アンピシリンをろ過滅菌にて添加）に植菌し、３７℃にて１８時間振とう培養した。この培養液１ｍｌを、５００ｍｌ容坂口フラスコ中、１２０℃で１５分間殺菌した５０ｍｌ液体培地（１０ｇ／ｌ  トリプトン、１０ｇ／ｌ  イーストエキス、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）に植菌し、３７℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１．５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン１５０ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００３ｍｌを添加後、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを６．５に調整した。そして、６Ｎ塩酸によりｐＨを６．５付近に保ちつつ、４０℃で２４時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ、移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３／７、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）した結果、Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの残存率は４９％であった。さらに、反応液中Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの光学純度をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール／トリクロロ酢酸＝７／３／０．０１、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）したところ９４．６％ｅｅであり、また、実施例１で得られたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインとの保持時間の比較からＬ体であることを確認した。
（実施例３）バチルス属細菌を用いたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造方法
バチルス  ｓｐ．ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）の乾燥保存菌体を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中、１２０℃で１５分間殺菌した１００ｍｌ液体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、１０ｇ／ｌ  肉エキス、５ｇ／ｌ  イーストエキス、ｐＨ７．５）に植菌し、４５℃にて１５時間振とう培養した。この培養液２ｍｌを、上記培地成分にさらに１ｇ／ｌ  ウラシル、２０ｍｇ／ｌ  塩化マンガンを加えた培地に植菌し、４５℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１５ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１．５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン１５０ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００３ｍｌを添加後、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを６．５に調整した。そして、６Ｎ塩酸によりｐＨを６．５付近に保ちつつ、４０℃で１９時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ、移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３／７、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）した結果、Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの残存率は４４％であった。さらに、反応液中Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの光学純度をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール／トリクロロ酢酸＝９／１／０．０１、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）したところ９９．０％ｅｅであり、また、実施例１で得られたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインとの保持時間の比較からＬ体であることを確認した。
（実施例４）シュードモナス属細菌を用いたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造方法
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６を固体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、２ｇ／ｌ  イーストエキス、１ｇ／ｌ  硫酸マグネシウム七水和物、１５ｇ／ｌ  寒天、ｐＨ７．０）で３０℃にて２４時間培養した。この菌体一白金耳を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中、１２０℃で１５分間殺菌した１００ｍｌ液体培地（２０ｇ／ｌ  肉エキス、６ｇ／ｌ  グリセロール、１ｇ／ｌ  ウラシル、２ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ  硫酸マグネシウム七水和物、４０ｍｇ／ｌ  塩化カルシウム二水和物、２０ｍｇ／ｌ  硫酸第一鉄七水和物、２０ｍｇ／ｌ  硫酸マンガン四〜六水和物、２０ｍｇ／ｌ  硫酸銅五水和物、ｐＨ５．５）に植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１０ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン１０ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００２ｍｌを添加した。そして、６Ｎ塩酸によりｐＨを６．５付近に保ちつつ、４０℃で５０時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ、移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３／７、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）した結果、Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの残存率は５２％であった。さらに、反応液中Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの光学純度をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール／トリクロロ酢酸＝９／１／０．０１、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）したところ９５．６％ｅｅであり、また、実施例１で得られたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインとの保持時間の比較からＬ体であることを確認した。
（実施例５）アグロバクテリウム属細菌を用いたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造方法
アグロバクテリウム・スピーシーズ  ＫＮＫ７１２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）を大型試験管中、１２０℃で１５分間殺菌した１０ｍｌ液体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、１０ｇ／ｌ  肉エキス、５ｇ／ｌ  イーストエキス、５ｇ／ｌ  グリセリン、５ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、５ｇ／ｌ  リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．５）に植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１ｍｌを、１００ｍｌ液体培地（２５ｇ／ｌ  グリセリン、５ｇ／ｌ  シュークロース、５ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、５ｇ／ｌ  リン酸水素二ナトリウム、１ｇ／ｌ  リン酸マグネシウム七水和物、１０ｍｇ／ｌ  塩化マンガン四水和物、４ｇ／ｌ  イーストエキス、ｐＨ６．５を１２０℃で１５分間殺菌後、２ｇ／ｌ  ウレア、１ｇ／ｌ  Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンをろ過滅菌にて添加）に植菌し、３３℃にて２３時間振とう培養した。この培養液５ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン１０ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００２ｍｌを添加した。そして、６Ｎ塩酸によりｐＨを６．５付近に保ちつつ、４０℃で５時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ、移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３／７、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）した結果、Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの残存率は２３％であった。さらに、反応液中Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの光学純度をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール／トリクロロ酢酸＝９／１／０．０１、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）したところ８５．８％ｅｅであり、また、実施例１で得られたＮ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインとの保持時間の比較からＬ体であることを確認した。
（実施例６）Ｄ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインの製造方法
実施例３の方法により得られた酵素とＤ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインの混合物（５０ｇ）に不純物として含まれるＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインを除去するために、水（４００ｇ）を加え攪拌した後に不溶分をろ取し、水（２００ｇ）でさらに洗浄した。これに５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液（１２０ｇ）を加え、攪拌した。酵素を不溶分としてろ別し、ろ液を濃塩酸にてｐＨ＝９に調整した。析出した結晶をろ取し、これを水洗した後に、減圧下にて乾燥を行い、粗生成物を結晶として得た（１９．７ｇ）。これをＨＰＬＣにて分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ、移動相：アセトニトリル／リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）＝２／８、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）し、標品との比較により純度及び収率を算出したところ、純度８７．５ｗｔ％，収率７９．６％であった。また光学純度は、ＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃，保持時間：Ｄ体＝１５．２分，Ｌ体＝３９．８分）により決定し、９７．６％ｅｅであった。
（実施例７）Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｄ−システインの製造方法
実施例１〜５のいずれかの方法で取得したＤ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインと酵素混合物（８０ｇ）に、１０ｗｔ％水酸化リチウム水溶液（１５０ｍＬ）を加えて溶解させた。酵素をろ別した後に、母液中に含まれるＤ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインをＨＰＬＣ（分析条件は実施例６と同じ）にて定量したところ４４．２ｇ含有していた。この溶液に水酸化リチウム（５４ｇ）、蒸留水（５１ｇ）を加え３８時間加熱還流した。室温まで放冷し、生じた固体をろ別した。母液を内温２０°Ｃ付近に保ち、濃塩酸（１１０ｇ）を加えｐＨ＝６．７に調整し、内温２°Ｃに冷却し２時間攪拌を続けた。次に生じた固体をろ取し、４０°Ｃで２４時間真空乾燥し、乾燥結晶（３４．９ｇ）を取得した。ＨＰＬＣ（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライ社製）、移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９０／１０、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）で分析して、上記目的物であることを確認し、標品との比較により純度及び収率を決定した（純度９６．７ｗｔ％，収率８５．７％）。
（実施例８）α−メチル−Ｄ−システイン塩酸塩の製造方法
Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｄ−システイン（２０ｇ）を濃塩酸（１８０ｇ）に溶解させ４５時間加熱還流した。室温まで放冷し、反応溶液を３５ｇまで濃縮した。これを４０°Ｃに加温し、トルエン（１１０ｍＬ）を加え、約４０ｇになるまで濃縮した。この操作をさらに４回行い、生じた固体をろ取し、６０°Ｃで４８時間真空乾燥し、標題化合物を白色固体として得た（１５．３ｇ）。ＨＰＬＣ（カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ（資生堂社製）、移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９５／５、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）で分析したところ、上記目的物であることを確認した（収率８４．６％）。また旋光度を測定したところ、［α］Ｄ２０＝−６．２８（ｃ１．２１，Ｈ２Ｏ）であり、符号が実施例１０で得られたα−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩と逆であることから、立体が目的とするＤ体であることを確認した。
（実施例９）α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の製造方法
Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システイン（１００ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）を濃塩酸（１ｍＬ）に溶解し、窒素下、６０時間還流させ、α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の水溶液を得た。
（実施例１０）α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の単離方法
実施例９で得られたα−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩反応溶液に、イソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）を加えて減圧下濃縮し、共沸脱水を行った。同様の操作を３回繰り返し、容量が約１／３となったところで濃縮を止め、６０℃に加熱、トルエン（１ｍＬ）を加え、攪拌しながら室温まで放冷した。そのまま約１時間攪拌した後、析出した結晶をろ別、トルエンで洗浄し、減圧下乾燥させ、標題化合物を白色固体として得た（４４．３ｍｇ）。ＨＰＬＣ（実施例８の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることを確認した（収率６０．０％）。また旋光度を測定したところ、［α］Ｄ２０＝８．７７（ｃ１．１５，Ｈ２Ｏ）であり、符号が文献値（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，２１３１〜２１３８，ＷＯ９８／３８１７７）と一致することから、立体が目的とするＬ体であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：３．１８（ｄ，１Ｈ），２．８９（ｄ，１Ｈ），１．６０（ｓ，３Ｈ）。
（実施例１１）Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造方法
Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システイン（８２．４ｇ，３５１．４ｍｍｏｌ）を１８％水酸化リチウム水溶液（６３０ｇ）に溶解し、窒素下、４１時間還流させた。室温まで放冷後、不溶分をろ別した後の溶液に濃塩酸（１８０．１ｇ）を加えてｐＨを６に調整し、そのまま約１時間攪拌した後に４〜５°Ｃに冷却し、さらに１時間攪拌した。得られた結晶をろ別し、水洗の後に減圧下乾燥を行い、標題化合物を白色固体として得た（５３．９ｇ）。ＨＰＬＣ（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライ社製）、移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９０／１０、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）で分析したところ、上記目的物であることを確認した（収率８５．７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：３．１８（ｄ，１Ｈ），２．９１（ｄ，１Ｈ），１．６０（ｓ，３Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）。
（実施例１２）α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の製造方法
実施例１１記載の方法で得られたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システイン（３８．４ｇ，２０１ｍｍｏｌ）に濃塩酸（３４５．３ｇ）を加え、２４時間還流し、α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の水溶液を得た。
（実施例１３）α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の単離方法
実施例１２により得られたα−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩反応溶液を６７．５ｇにまで濃縮（減圧度３０〜６０ｍｍＨｇ、温度４５℃）し、トルエン（２０６ｇ）を加え、減圧濃縮操作（減圧度４０〜６０ｍｍＨｇ、温度４０℃、留出速度１０７Ｌ／ｈ・ｍ２）を行い、全量１０９ｇとした。さらにトルエン（２０６ｇ）を加えて濃縮し、同様の操作を合計６回繰り返し、得られたα−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩トルエンスラリー（１０４ｇ）を得た。このものの水分含量は３０重量％（対α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩）であった。ろ過し、トルエンにて結晶を洗浄、減圧下乾燥（０〜１００ｍｍＨｇ、３０〜８０℃、５−１０時間）させ、標題化合物を白色固体として得た（３２．２ｇ、収率９３．４％）。
（実施例１４）α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の製造方法
実施例１１記載の方法で得られたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システイン（２５ｇ，１３１ｍｍｏｌ）に水（４７．６ｇ）及び濃塩酸（１７７．４ｇ）を加え、４１時間還流した。さらに濃塩酸（４７．６ｇ）を加え３時間還流させた後に、室温まで放冷した。イソプロピルアルコール（９０ｍＬ）を加え減圧下濃縮を行い、共沸脱水を３回、同量のイソプロピルアルコールを用いて行った。最後にイソプロピルアルコールを加え濃縮し、容量が約１／３となったところで濃縮を止め６０°Ｃに加熱、トルエン（９０ｍＬ）を加え、攪拌しながら室温まで放冷した。そのまま約１時間攪拌した後、析出した結晶をろ取し、トルエンで洗浄し、減圧下乾燥させ、標題化合物を白色固体として得た（１３．５ｇ、収率６０．０％）。
（実施例１５）Ｄ−５−メルカプトメチル−５−メチルヒダントインの製造方法
実施例６により得られたＤ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（４．３８ｇ）を濃塩酸（１００ｇ）に溶解し、８０℃で１８．５時間攪拌した。室温まで放冷後、約半量となるまで濃縮した後、３０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液を３０．５ｇ加えてｐＨを０とした。酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出後、有機相を全量の１０％となるまで濃縮した後、トルエン（３０ｍＬ）を加えて析出した結晶をろ取し、目的のＤ−５−メルカプトメチル−５−メチルヒダントイン（２．６５ｇ）を収率８０％で得た。このものの光学純度をＨＰＬＣ（ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３５℃、保持時間Ｄ体；３０．４分、Ｌ体；３３．８分）により測定したところ、Ｌ体は検出されなかった。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）δ：１．３２（ｓ、３Ｈ）、２．６０（ｄ、１．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．７２（ｄ、１．６Ｈｚ、１Ｈ）。
（実施例１６）α−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩の光学純度決定法
実施例１３記載の方法で得られたα−メチル−Ｌ−システイン塩酸塩（７４．９ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（１９７．７ｍｇ）を添加し、エタノール３ｍＬを加えた。窒素置換後、クロロ炭酸ベンジルエステル（０．１７ｍＬ，１．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間攪拌した。反応液に濃塩酸を添加してｐＨ＝１．９とし、酢酸エチルで抽出後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。これをＰＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１に少量の酢酸を添加）で精製し１Ｈ  ＮＭＲにて分析したところ、目的物（１０６ｍｇ、収率６０％）であることを確認した。これをＨＰＬＣにて分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−ＲＨ（ダイセル社製）、移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝６／４、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃、保持時間１９．１５分（Ｄ）、２２．９２分（Ｌ））した結果、光学純度は９８．６％ｅｅであった。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：７．３０−７．４０（ｍ，１０Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），３．６０（ｓ，２Ｈ），１．６３（ｓ，３Ｈ）。
（実施例１７−２１）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−システインの製造方法
５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントインに水酸化ナトリウムと水を加え、所定の温度まで加熱攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライ社製），移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３０／７０，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：４０℃）し、表題化合物の収率を求めた。結果を表１に示す。
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（実施例２２）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−システインの製造方法
５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（５ｇ、２３ｍｍｏｌ）と５８％水酸化カリウム水溶液（９．２ｇ）を混合した後、９５℃まで加熱し、２２時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、反応収率９２％で表題化合物が生成していた。
（実施例２３）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−システインの製造方法
５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（５ｇ、２３ｍｍｏｌ）、６５％水酸化カリウム水溶液（４．４ｇ）及び、トルエン５ｍｌを混合した後、９５°Ｃまで加熱し、２７時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、反応収率８８％で表題化合物が生成していた。
（実施例２４）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−システインの製造方法
５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（５ｇ、２３ｍｍｏｌ）、７３％水酸化カリウム水溶液（５．７ｇ）及び、トルエン１０ｍｌを混合した後、９５°Ｃまで加熱し、５１時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、反応収率９０％で表題化合物が生成していた。
（実施例２５）Ｎ−カルバモイル−２−アミノ−２−メチルプロピオン酸の製造方法
５，５−ジメチルヒダントイン４．０ｇ、水酸化ナトリウム４．０ｇ、水４．０ｇを混合し、８５〜９０℃で３．５時間攪拌した。反応混合物をＨＰＬＣ（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（ナカライ社製），移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝２０／８０，流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：４０℃）にて分析したところ、標題化合物が３．３８ｇ（収率７４．１％）生成していた。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：１．３９（ｓ，６Ｈ）。
（実施例２６）Ｎ−カルバモイル−２−アミノ−３−（２−メトキシフェニル）−２−メチルプロピオン酸の製造方法
５−（２−メトキシフェニルメチル）−５−メチル−ヒダントイン４．４０ｇ、水酸化ナトリウム２．６４ｇ、水３．５ｇを混合し、９４〜９６℃で３０時間反応させた。反応混合物をＨＰＬＣ（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（ナカライ社製），移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝２０／８０，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：４０℃）にて分析したところ、標題化合物と２−アミノ−３−（２−メトキシフェニル）−２−メチルプロピオン酸と原料が７８．８：５．５：１５．５の面積比で生成していた。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：７．３２−６．９０（ｍ，４Ｈ），４．８４（ｓ，３Ｈ），３．１９（ｄ，１Ｈ），３．１８（ｄ，１Ｈ），１．３７（ｓ，３Ｈ）。
（実施例２７）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ベンジル−α−メチル−システインの製造方法
５−ベンジルチオメチル−５−メチル−ヒダントイン５．０ｇ、水酸化カリウム３．６ｇ、水３ｇを混合し、９４〜９６℃で１２時間反応させた。反応混合物をＨＰＬＣ（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（ナカライ社製），移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３０／７０，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２５４ｎｍ，カラム温度：４０℃）にて分析したところ、標題化合物が３．５６ｇ（収率６６．４％）生成していた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：７．４０−７．３０（ｍ，５Ｈ），３．７８（ｓ，２Ｈ），３．１５（ｄ，１Ｈ），３．１４（ｄ，１Ｈ），１．４１（ｓ，３Ｈ）。
（比較例１）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−システインの製造方法
５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（５ｇ、２３ｍｍｏｌ）、水酸化バリウム（１１．７）、水（１０ｇ）を混合した後、９５°Ｃまで加熱し、２時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、反応収率３９％で表題化合物が生成していた。
（比較例２）Ｎ−カルバモイル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−システインの製造方法（ＵＳ５３３８８５９記載の方法により実施）
５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（純分１０．８２ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）、水酸化カルシウム（３．７０ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）、水（６０ｇ）を混合した後、１００°Ｃまで加熱し、３，５時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、反応収率２５％で表題化合物が生成していた。
産業上の利用可能性
以上述べたように、本発明によれば、安価で入手容易な原料から簡便かつ工業的に実施可能な方法によって、医薬品等の中間体として有用な光学活性α−メチルシステイン誘導体又はその塩のＤ体、Ｌ体両方を製造することができる。また、該化合物を工業的実施可能な形態で、晶析取得することができる。
【国際調査報告】
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