(57)【要約】消化器収縮作用や精子形成作用には働かず、中枢作用、特に、神経細胞死抑制作用に働くヒトプロキネティシン１、２に対する内在性受容体を同定した。前記受容体および／又は前記受容体で形質転換した細胞を用いることによる中枢作用をコントロールできる有用な物質、例えば、神経細胞死を伴うことが知られている痴呆症、脳卒中、及び／又は痛覚過敏症の治療剤として有用な物質を簡便にスクリーニングする方法を開示する。また、神経細胞死抑制剤、及び／又は痛覚過敏治療剤を得るためのプロキネティシン受容体ＧＰＲｇ２、機能的等価改変体、又は相同ポリペプチドである神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、及び前記の各種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である神経細胞死抑制剤スクリーニングツールを開示する。さらに、前記スクリーニングツール又はスクリーニング方法により得ることができる、前記受容体の活性を修飾する物質を有効成分とする神経細胞死抑制用、及び／又は痛覚過敏治療用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、
かつ、
プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチドである、神経細胞死抑制剤スクリーニングツール。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、
かつ、
プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチドである、神経細胞死抑制剤スクリーニングツール。
【請求項３】
請求の範囲１又は２に記載のポリペプチドであり、神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、脳卒中治療剤、及び／又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール。
【請求項４】
請求の範囲１又は２に記載のポリペプチドを発現している細胞である、神経細胞死抑制剤スクリーニングツール。
【請求項５】
請求の範囲４に記載の細胞であり、神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、脳卒中治療剤、及び／又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール。
【請求項６】
請求の範囲４又は５に記載の細胞、又は、その細胞膜と、試験化合物とをプロキネティシン存在下で接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、試験化合物がプロキネティシン受容体アンタゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法。
【請求項７】
請求の範囲４又は５に記載の細胞、又は、その細胞膜と、試験化合物とをプロキネティシン存在下で接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、神経細胞死抑制剤をスクリーニングする方法。
【請求項８】
請求の範囲４又は５に記載の細胞、又は、その細胞膜と、試験化合物とをプロキネティシン存在下で接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、脳卒中治療剤及び／又は痛覚過敏症治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求の範囲７又は請求の範囲８に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、神経細胞死抑制用あるいは痴呆症治療用、脳卒中治療用及び／又は痛覚過敏症治療用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、プロキネティシン受容体を使用した神経細胞死及び／又は痛覚過敏を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
プロキネティシン（Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）は、ヒトでプロキネティシン１とプロキネティシン２の２種類のサブタイプが存在する生理活性ペプチドである（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１  ５９：６９２−８）。もともとプロキネティシンは、１９９０年にフランスのグループにより、マンバ（南アフリカ産のコブラ科の大型毒ヘビ）の蛇毒成分として同定され、「ＭＩＴ１」と命名されたが（Ｔｏｘｉｃｏｎ．１９９０  ２８：８４７−５６）、後にオーストリアのグループにより、カエル皮膚より該当分子が精製され、「Ｂｖ８」と命名された（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  ３７４：１８９−９６）。哺乳類のプロキネティシンは、１９９９年にマウスプロキネティシン２遺伝子配列が報告され（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９  ２６：１７７−８１）、さらに同遺伝子がマウスでは第６染色体、ヒトでは第３染色体ｐ２１に存在している事が確認された（Ｇｅｎｅ．２０００  ３：１８９−９５）。２００１年には、ヒトゲノム配列データベース検索により、初めてヒトプロキネティシン１の存在が確認された（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１  ５９：６９２−８）。
プロキネティシン１、２は、それぞれアミノ酸１０５個、１０８個で構成される前駆体として細胞内で合成され、成熟分子ではシグナルペプチドの除去により、プロキネティシン１が８６個、プロキネティシン２が８１個になると考えられている。プロキネティシン１、２は、互いに約５５％の相同性を有しており、マンバ、カエルの該当分子に対しても５０％以上の相同性がある。分子内には５本のＳ−Ｓ結合が存在しており、これらＣｙｓの位置はＭＩＴ１、Ｂｖ８でも保存されている。プロキネティシンは立体構造が非常に安定でプロテアーゼ処理に対しても耐性を示す。
プロキネティシン１は、組織発現解析から脳、卵巣、腎臓、子宮、心臓、精巣等、中枢および抹消組織で広範な発現パターンを示している。一方、プロキネティシン２も同様に広い組織発現が観察されるが、ｍＲＮＡ転写量はプロキネティシン１に比べ低い（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９  ４６２：１７７−８１、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１  ５９：６９２−８）。
プロキネティシンの生理機能に関しては、▲１▼中枢作用として神経細胞死抑制活性（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１  １３：１６９４−７０２）や痛覚過敏惹起活性（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  ３７４：１８９−９６）、▲２▼消化器収縮作用（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１  ５９：６９２−８、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９  ４６１：１８３−８）そして▲３▼精子形成作用（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９  ４６２：１７７−８１）が報告されている。プロキネティシンの神経細胞死抑制活性は、ラット小脳性顆粒初代培養細胞を用いて、増殖培地中のカリウム濃度を上昇させる事によるアポトーシス誘導実験系により、確認された。また同活性がマップキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ、ＭＡＰＫ）やホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ｋｉｎａｓｅ、ＰＩ−３−Ｋ）阻害剤であるＰＤ９８０５９やＬＹ２９４００２により消失した事から、プロキネティシンはＭＡＰＫ／ＰＩ−３−Ｋを介して細胞内情報伝達を行う、と考察されている。痛覚過敏惹起活性については、プロキネティシンがオピオイド系を介する痛覚過敏や、オピオイド・リガンドの脳内受容体結合には影響しない事から、オピオイド系とは、独立のシステムにより痛覚過敏が惹起されると考えられている。
しかしながら、上記のようにプロキネティシンの生理機能については報告があるものの、その受容体については最近になるまで同定されておらず、プロキネティシンの中枢作用を制御する化合物の簡便なスクリーニング系の構築はなされていなかった。ＷＯ０１／１６３６０９にプロキネティシン受容体の開示はあるが、該受容体は主に精巣に発現すると記載されている。従って、消化器収縮作用や精子形成作用には働かず、中枢作用、特に、神経細胞死抑制作用及び／又は痛覚過敏を制御する物質に働くヒトプロキネティシン１、２に対する内在性受容体分子を同定し、さらに該受容体を使用した神経細胞死抑制剤及び／又は痛覚過敏治療剤のスクリーニング方法が待望されている。
発明の開示
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒトプロキネティシン１、２に対する内在性受容体ＧＰＲｇ２をコードする遺伝子を同定することに成功した。ＧＰＲｇ２遺伝子はヒト扁桃核、海馬、脳梁、黒質、視床、前頭葉、及び胎児脳で発現しており、胃、小腸、精巣では発現していないこと、及びＧＰＲｇ２遺伝子が一次知覚神経の投射を受けており侵害受容器により感受された痛みの刺激を脳に伝達する役割を担っている神経組織である脊髄後根神経節で発現していることより、ＧＰＲｇ２が消化器収縮作用や精子形成作用には働かず、中枢作用に働くヒトプロキネティシン１、２に対する内在性受容体分子であることを見出した。また、ＧＰＲｇ２の発現及び精製、並びにＧＰＲｇ２を発現する形質転換細胞の生産を可能にした。加えて、ＧＰＲｇ２を発現させた細胞がプロキネティシンにより細胞内カルシウム濃度変化すること、プロキネティシンがＧＰＲｇ２を安定発現するＣＨＯ細胞の膜画分に特異的に結合することを見出し、ＧＰＲｇ２及びＧＰＲｇ２を発現する細胞が神経細胞死抑制を制御する物質、及び／又は痛覚過敏を制御する物質をスクリーニングするためのスクリーニングツールとなることを見出した。これらにより、プロキネティシン受容体の活性を修飾する物質を選択することによってプロキネティシンの神経細胞死抑制作用及び／又は痛覚過敏を制御することができる物質を同定することができ、引いては神経細胞死によって引き起こされる疾患治療薬、例えば、痴呆症治療剤、脳卒中治療剤、及び／又は痛覚過敏症治療剤として有用な物質を見出すことができる。本発明はこのような知見に基づくスクリーニングツール及びスクリーニング方法を提供するものである。
すなわち本発明は、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、
かつ、
プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチドである、神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、
かつ、
プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチドである、神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、
（３）（１）又は（２）に記載のポリペプチドであり、神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、脳卒中治療剤、及び／又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール（以下、（１）〜（３）記載の神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、痴呆症治療剤、脳卒中治療剤、及び痛覚過敏症治療剤スクリーニングツールを総称してポリペプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールと称する）、
（４）（１）又は（２）に記載のポリペプチドを発現している細胞である、神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、
（５）（４）に記載の細胞であり、神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、脳卒中治療剤、及び／又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール（以下、（４）〜（５）記載の神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、痴呆症治療剤、脳卒中治療剤、及び痛覚過敏症治療剤スクリーニングツールを総称して形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールと称する）、
（６）（４）又は（５）に記載の細胞、又は、その細胞膜と、試験化合物とをプロキネティシン存在下で接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、試験化合物がプロキネティシン受容体アンタゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法、
（７）（４）又は（５）に記載の細胞、又は、その細胞膜と、試験化合物とをプロキネティシン存在下で接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、神経細胞死抑制剤をスクリーニングする方法、
（８）（４）又は（５）に記載の細胞、又は、その細胞膜と、試験化合物とをプロキネティシン存在下で接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、脳卒中治療剤及び／又は痛覚過敏症治療剤をスクリーニングする方法、
（９）（７）又は（８）に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、神経細胞死抑制用である痴呆症治療用、脳卒中治療用及び／又は痛覚過敏症治療用医薬組成物の製造方法
に関する。
本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングの為に用いる物（具体的には、スクリーニングの為に用いるポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞）をいう。「神経細胞死抑制剤スクリーニングツール」とは、神経細胞死抑制剤、及び／又は痛覚過敏治療剤をスクリーニングするために、本発明の神経細胞死抑制剤、及び／又は痛覚過敏治療剤をスクリーニングする方法において、試験化合物を接触させる対象となる細胞又はポリペプチドである。（１）〜（５）に記載のポリペプチド又は細胞の、神経細胞死抑制剤、及び／又は痛覚過敏治療剤スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
前記ＷＯ０１／１６３６０９に主に精巣に発現するプロキネティシン受容体として開示された受容体は、本発明で用いることのできるプロキネティシン受容体ＧＰＲｇ２と８７％のホモロジーを有している。一方、本発明で用いることのできるプロキネティシン受容体ＧＰＲｇ２と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドがコードする推定アミノ酸配列については、種々の報告（ＷＯ９８／４６６２０、ＷＯ０１／３６４７１、ＷＯ０１／５３３０８、ＷＯ０１／６８６９９、ＷＯ０１／６８７００）があるが、いずれもリガンド及び用途が解明されていない。なお、本願優先日後に出版された論文（ＪＢＣ  ２７７，２２，ｐｐ１９２７６−１９２８０，２００２）において、本発明で用いることのできるプロキネティシン受容体と同一の配列の蛋白質がプロキネティシンの受容体であることが開示されているが、同論文中では前記受容体は小腸の収縮や血管形成に関与すると記載されている。また本願優先日後に公開されたＷＯ０２／６４８３において、Ｉ５Ｅと称されるプロキネティシン受容体ＧＰＲｇ２と同一の受容体と、ヒトＺＡＱリガンドと称されるプロキネティシン１との結合が示されているが、これらの結合が中枢作用に関与するとの記載はなく、前記受容体とプロキネティシン２とが結合するとの記載もない。
前記のとおり、本願記載の神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、神経細胞死抑制剤、及び／又は痛覚過敏治療剤スクリーニング方法、神経細胞死抑制用である痴呆症治療用、脳卒中治療用及び／又は痛覚過敏症治療用医薬組成物の製造方法は本願発明者らが初めて行った発明である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書中で使用される「プロキネティシン受容体」は「プロキネティシン受容体蛋白質」を表す。「プロキネティシン」は「プロキネティシン１」、「プロキネティシン２」を含む。「アゴニスト」はプロキネティシン存在下、非存在下でプロキネティシン受容体の活性を促進する物質を表す。
［１］神経細胞死抑制剤スクリーニングツール
本発明の神経細胞死抑制剤スクリーニングツールには、ポリペプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールと形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとが含まれる。また、神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして、痴呆症治療剤、脳卒中治療剤又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツールが含まれる。
１）ポリペプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。以下、本発明のポリペプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いることができるこれらの各種ポリペプチドを総称して、スクリーニング用ポリペプチドと称する。
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができる。なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｎｇｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られた値を意味する。ＢＬＡＳＴ検索は、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用いて行うことができる。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
以上、スクリーニング用ポリペプチドについて説明したが、該ポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」、あるいは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド」が好ましく、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」がより好ましい。スクリーニング用ポリペプチドは前記ポリペプチドである限り特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列を、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することが可能である。
本発明のポリペプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用ポリペプチドは、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述するスクリーニングツール用形質転換細胞（すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞）を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、受容体タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、機能的改変体をコードするポリヌクレオチド、及び相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（Ａ）ＰＣＲを用いた方法、（Ｂ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（Ｃ）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
（Ａ）ＰＣＲを用いた方法
本発明のプロキネティシン受容体を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織からｍＲＮＡを抽出する。次いでこのｍＲＮＡを鋳型として該受容体ｍＲＮＡ又は一部のｍＲＮＡ領域をはさんだ２種類のプライマーを作製する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲという）を行うことにより、該プロキネティシン受容体ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。さらに、得られたヒトのプロキネティシン受容体ｃＤＮＡ又はその一部を適当な発現ベクターに組み込むことにより、宿主細胞で発現させ、該受容体の蛋白質を製造することができる。
まず、本発明のプロキネティシン受容体の産生能力を有する細胞あるいは組織、例えばヒト脳から該蛋白質をコードするものを包含するｍＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。該蛋白質の産生能力を有する細胞あるいは組織は、該蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング法、該蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えばｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製することができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出せずとも、市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いても良い。
次に、精製されたｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うことができる。また、ｃＤＮＡは合成せずとも、実施例１、実施例２で用いているように、市販されているｃＤＮＡを用いても良い。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７−４９１；以下、ＰＣＲという）に供し、目的とするプロキネティシン受容体ＤＮＡを増幅する。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、上記ＤＮＡを制限酸素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
（Ｂ）常法の遺伝子工学的手法
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ  Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング方法、（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング方法、（３）他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株を培養し、ポリヌクレオチドを増幅させ、そのポリヌクレオチドを動物細胞にトランスフェクトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを細胞表面に産生させる。なお、この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド、あるいは、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれを用いることもできる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することにより、元の形質転換株の中から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
（Ｃ）化学合成法
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドは、下記の方法によって得ることができる。単離されたスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくはＣＨＯ細胞又は２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることができる。
前記形質転換細胞を培養することにより、前記細胞の細胞表面に生産されるスクリーニングツール用ポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。該方法としては、具体的には例えば受容体蛋白質を含む膜分画を可溶化した後、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。なお、膜分画は常法に従って得ることができる。例えば本発明のプロキネティシン受容体を表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁後、ホモジナイズし遠心分離することにより得られる。また、できるだけ緩和な可溶化剤（ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ジキトニン等）でプロキネティシン受容体を可溶化することにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドはマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧ  ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｔａｇ、ｍｙｃ  ｅｐｉｔｏｐｅなどがある。また、マーカー配列とプロキネティシン受容体の間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とＨｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｇａ，Ｔ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８）
２）形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツール
本発明の形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いることのできる形質転換細胞（以下、スクリーニングツール用形質転換細胞と称する）としては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞；
（２）機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞；及び
（３）相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞
を挙げることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、例えば、先に述べた方法により単離されたスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくはＣＨＯ細胞又は２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることにより取得することができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
前記発現ベクターは、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。また、本発明の形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用形質転換細胞は、前記発現ベクターで形質転換され、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いる際に前記ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。スクリーニングツール用形質転換細胞は、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞および同細胞にＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ＶｉｒｕｓのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４）、ヒトのｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒプロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２）、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を例示できるが、これに限定されない。
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ、（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．（１９９０）Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２）、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２）等が挙げられる。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７）、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することによりスクリーニング用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの発現ベクターを用いて所望の形質転換細胞を得ることができる。
上記で得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内又は細胞表面に本発明のスクリーニング用ポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であればＲＰＭＩ−１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に必要に応じ牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したものを使用できる。また、上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
［２］神経細胞死抑制剤及び／又は痛覚過敏治療剤スクリーニング方法
スクリーニングツール用ポリペプチド又はスクリーニングツール用形質転換細胞を用いると、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を修飾可能な物質（化合物、ペプチド及び抗体）を検出及びスクリーニングすることができる。
本発明の検出方法において、スクリーニング用ポリペプチドの活性の変化は、スクリーニングに用いる受容体蛋白質の生理学的な特性に応じた活性の指標を測定することにより行われる。指標とする活性とは、たとえばリガンドとの結合活性であり、あるいはリガンドの結合によってもたらされる刺激に対する応答である。具体的には、以下に述べるような検出方法を示すことができる。スクリーニング用ポリペプチドとしては、該ポリペプチドを発現させた細胞、該細胞の膜分画、又は該ポリペプチドからなる蛋白質の精製標品などを用いることもできる。また本発明によるスクリーニング方法のための被験化合物としては、市販の化合物、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物やペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７）によって得られた化合物群やファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などもスクリーニングの対象となる。あるいは本発明のスクリーニング方法により選択された化合物又はペプチドを化学的又は生物学的に修飾した化合物又はペプチドを用いうるが、それらに限らない。
ａ）リガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドに結合する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）はリガンド結合アッセイ法によりスクリーニングする事ができる。該スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜、あるいは該スクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質精製標品を調製する。緩衝液、イオン、ｐＨのようなアッセイ条件を最適化し、最適化したバッファー中で同スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜、あるいは該スクリーニング用ポリペプチドからなる蛋百質精製標品を、標識リガンド、例えば１２５Ｉ標識プロキネティシン（好ましくは１２５Ｉ標識プロキネティシン２）を被験薬と共に一定時間インキュベーションする。反応後、ガラスフィルター等で濾過し適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性をγカウンター等で測定する。得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）、あるいはアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によって選択される、該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質は、例えば、痛覚過敏症の治療や予防に有用である。また、本発明のスクリーニング方法によって選択される、該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質は、神経細胞死抑制、例えば、痴呆症や脳卒中の治療や予防に有用である。
本発明のスクリーニング方法は、ＷＯ  ０１／１９９８６に記載のリガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法により実施できる。ただし、リガンドはＬＴＣ４をプロキネティシンに、受容体はＬＴＣ４受容体をプロキネティシン受容体（すなわちスクリーニング用ポリペプチド）に置き換える。より具体的には実施例７に記載の方法により実施できる。
ｂ）ＧＴＰγＳ結合法を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を修飾する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）はＧＴＰγＳ結合法によりスクリーニングすることが可能である（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．ａｎｄ  Ｂｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０９，１１２０−１１２７）。スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＧＤＰ溶液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ  ４００ｐＭと混合する。被験薬存在下と非存在下でインキュベーション後、ガラスフィルター等で濾過し、結合したＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。被験薬存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標に、該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、被験薬存在下における、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
ｃ）細胞内Ｃａ２＋濃度の変動を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を修飾する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）は、スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の変動を利用してスクリーニングすることが可能である。細胞内のＣａ２＋濃度の測定はｆｕｒａ２やｆｌｕｏ３等を用いて測定することができる。
あるいは、Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を検出することにより、間接的にＣａ２＋濃度を測定することが可能である。具体的には以下の方法で、Ｃａ２＋濃度を測定することができる。まず、セラムレスポンシブエレメントをつないだレポーター遺伝子をスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞に導入し、被験薬を該細胞の培養液中に加える。レポーター遺伝子には、検出可能なシグナルを生成することができる任意の遺伝子を用いることができる。例えばルシフェラーゼ遺伝子は、レポーター遺伝子として望ましい。３７℃で４時間インキュベート後、培地を除去し、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定する。そして被験薬添加時のルシフェラーゼ活性誘導を指標にスクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、被験薬を該細胞の培養液中に添加後、最終濃度５−５００ｎＭのプロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）を添加し同様にルシフェラーゼ活性を測定する。そして、被験薬添加時のプロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）によるルシフェラーゼ活性誘導の阻害を指標に、スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法においては、該蛋白質を発現させた細胞と発現させていない宿主細胞（コントロール細胞）に物質（化合物、ペプチド、及び抗体）等を一定時間作用させ、Ｃａ２＋濃度を直接あるいは間接的に測定する。コントロール細胞と比較して、該蛋白質を発現させた細胞特異的なＣａ２＋濃度の上昇又は低下を指標にアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、被験薬存在下における、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）によるＣａ２＋濃度の上昇又は低下の阻害作用を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法は、実施例４記載の条件で行うことが好ましい。
たとえば実施例４に記載の条件で、ＥＣ５０＝１００μＭ以下の物質を、好ましくはＥＣ５０＝１０μＭ以下の物質を、更に好ましくはＥＣ５０＝１μＭ以下の物質をアゴニスト活性を有する物質として、選択することができる。また、実施例４に記載のアッセイ条件に被験薬を追加することにより、即ち、実施例４の条件でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質をアンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
［３］神経細胞死抑制用及び／又は痛覚過敏治療用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、神経細胞死抑制用、及び／又は痛覚過敏治療用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち、ＬＴＲＰＣ２蛋白質の活性化を阻害する物質、あるいは、本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
実施例
以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ａｔ  ａｌ．（１９８２）：″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）動物細胞でのプロキネティシン発現系の構築
ヒトプロキネティシン１、２をコードする遺伝子の増幅には、プロキネティシン１はヒト小腸、プロキネティシン２はヒト精巣由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ｃＤＮＡに用いた。プロキネティシン１が、フォワードプライマーとして、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。プロキネティシン２がフォワードプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号４、配列番号６で表される塩基配列にはＦＬＡＧ配列が含まれる。従って、プロキネティシンは、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現される。これにより、プロキネティシンの精製が簡便化できる。なお、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＸｂａＩ認識配列、ＮｏｔＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９６°Ｃ（５秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／７０°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／６８°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、プロキネティシン１、２共に約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をｐＣＲ２．１ｐｌａｓｍｉｄ（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ直アプライドバイオシステムズ社）で解析し、既知プロキネティシン１、２配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ３３３０２４、ＡＦ３３３０２５）と合致したクローンをそれぞれ選択した。これらクローンをＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、動物細胞発現用ｐＣＥＰ４  ｐｌａｓｍｉｄ（インビトロジェン社）に挿入した。
構築されたプロキネティシン発現プラスミドは、６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ  ６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社製）にＨＥＫ２９３細胞を１ウェルあたり１ｘ１０５細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり１μｇのプロキネティシン１又はプロキネティシン２発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入７２時間後より、ハイグロマイシンＢ含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、得られた薬剤耐性細胞をプロキネティシン発現細胞として用いた。プロキネティシン発現細胞は、１０ｃｍシャーレ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ；アサヒテクノグラス社）にコンフルエントになるまで培養後、培地を廃棄し、０．５％牛胎児血清入りＤＭＥＭ培地にて４日間培養して、プロキネティシン含有培地を回収した。
（実施例２）Ｇ蛋白質共役型受容体、ＧＰＲｇ２の遺伝子クローニングとＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞の取得
ヒトＧＰＲｇ２をコードする遺伝子の増幅には、ヒト脾臓由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ｃＤＮＡに、フォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。なお、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＸｂａＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９６°Ｃ（５秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／７０°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／６８°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＸｂａＩで消化した後、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ  ｐｌａｓｍｉｄ（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７  １３５４：１５９−７０）に挿入した。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号１に示す。
同配列は１１５５塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号：１）を持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（３８４アミノ酸）を配列番号２に示す。
構築されたＧＰＲｇ２発現プラスミドは、６ウェルプレートにＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を１ウェルあたり１ｘ１０５細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり１μｇのＧＰＲｇ２発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入７２時間後より、メトトレキセート含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、得られた薬剤耐性細胞をＧＰＲｇ２発現細胞として用いた。
（実施例３）ヒト組織におけるＧＰＲｇ２の発現分布解析
ＧＰＲｇ２の組織発現分布を解析するために、ヒト各組織由来ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｅｘ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、実施例１と同じである。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が扁桃核、海馬、脳梁、黒質、視床、前頭葉、胎児脳に由来するｃＤＮＡで増幅された。胃、小腸、精巣由来のｃＤＮＡでは増幅が確認されなかった。
（実施例４）ＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞のプロキネティシンによる細胞内Ｃａ２＋濃度の変化
９６ウェルプレート（９６ｗｅｌｌ  Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ；ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）にＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞もしくは、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒを組み込んだＣＨＯ細胞（空ベクター処理細胞）を１ｘ１０４細胞でプレーティングして２４時間培養後、培地を廃棄し、４μＭ  Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、０．００４％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄおよび１％  ＦＢＳと２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨｕｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓｏｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｈａｎｋｓ  ＢＳＳ；ギブコ社）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ  ＢＳＳで４回洗浄して、１ウェルあたり１００μｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ  ＢＳＳを添加した。
細胞内Ｃａ２＋濃度の変化はＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）を用いて経時的に測定した。すなわち、測定開始１０秒後に、プロキネティシンを含むＨＥＫ２９３細胞培養上清を添加し、添加後、５０秒間は１秒毎に、さらに４分間は６秒毎に蛍光強度を測定した。得られた結果の蛍光値をＹ軸に、時間をＸ軸にプロットすると、ＧＰＲｇ２はプロキネティシンに反応して細胞内Ｃａ２＋濃度の変化が観察されたが、プロキネティシンを発現させないＨＥＫ２９３細胞培養上清では観察されなかった。さらに、同反応は、空ベクターを処理したＣＨＯ細胞では見られなかった。以上の事から、ＧＰＲｇ２はプロキネティシン１、２に対する生体内受容体である事が確認できた。
本プロキネティシン受容体で形質転換した細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測定する事でプロキネティシンアゴニスト、アンタゴニスト、すなわち神経細胞死抑制剤、及び／又は痛覚過敏治療剤のスクリーニングが可能となった。
（実施例５）動物細胞発現プロキネティシン１及び２の発現並びに精製
動物細胞で発現させたプロキネティシンの精製サンプルを用いて、放射性同位元素標識を行い、バインディングアッセイ等に用いることを考え、まず、以下の実験により精製プロキネティシンを得た。その際、プロキネティシン１は、精製時に用いたＦＬＡＧ配列を除去するために、インフレームでＦａｃｔｏｒＸａ配列を入れて、ｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍと同じものを作製した。また、プロキネティシン２は、分子内に放射性同位元素標識に用いるＴｙｒ残基を有していないため、Ｃ末端のＦＬＡＧ配列を残して、同配列中のＴｙｒ残基に対して放射性同位元素標識することを考えた。具体的には以下の手順で精製プロキネティシンを取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン１を取得するために、フォワードプライマーとして配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＳｐｅＩ認識配列が付加してある。なお、配列番号９で表される塩基配列には、インフルエンザＡウイルス・ヘマグルチニンのシグナルシーケンス配列、ＦＬＡＧ配列、そしてＦａｃｔｏｒ  Ｘａ認識配列が含まれる。従って、プロキネティシン１は、細胞外分泌後は、Ｎ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープとＦａｃｔｏｒ  Ｘａ認識配列をインフレームで融合して発現される。これにより、プロキネティシン１の精製が簡便化できる。ＰＣＲはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９４°Ｃ（３０秒）／５５°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＳｐｅＩで消化した後、ｐＣＥＰ４  ｐｌａｓｍｉｄに挿入した。得られたクローンの塩基配列は、ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解析した。構築されたプロキネティシン１発現プラスミドは、（実施例１）で用いた方法と同様に、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、プロキネティシン１安定発現細胞株を取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン２の取得のためには、実施例１で作製した、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現されるプロキネティシン２をコードするｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ  ｐｌａｓｍｉｄに挿入して用いた。従って、プロキネティシン２は、細胞外分泌後は、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現される。構築されたプロキネティシン２発現プラスミドは、実施例２で用いた方法と同様に、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に遺伝子導入し、プロキネティシン２安定発現細胞株を取得した。
実施例１と同じ方法で回収したプロキネティシン１もしくは、プロキネティシン２を含有する培地を、それぞれＭ２−アガロースカラム（シグマ社）にかけ、０．５％ＮａＣｌ含有ＰＢＳでカラムを洗浄後、プロキネティシン１は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ（アマシャム社）含有ＰＢＳで一晩反応して、プロキネティシン２は、ＦＬＡＧ−ｐｅｐｔｉｄｅ含有ＰＢＳにて、それぞれＭ２−アガロースカラムより溶出した。目的プロキネティシンを含む溶出産物は、最終的にＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＦＰＬＣカラム（アマシャム社）でゲルろ過を行い精製を行った。精製産物をＳＤＳ電気泳動後、銀染色（第一化学社）を行ったところ、プロキネティシン２の方がプロキネティシン１よりわずかに高分子側に、共に約１０ｋＤａの単一バンドとして確認された。プロキネティシン１と２の推定分子量は、それぞれ９６６６．８８Ｄａ、１００３９．３１Ｄａである事から、予測分子量に合致しており、プロキネティシン１及び２が精製されていることが確認できた。
（実施例６）ＧＰＲｇ２発現ＨＥＫ２９３細胞のプロキネティシンによるルシフェラーゼレポーターアッセイ系の構築
コラーゲンタイプＩをコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ  ２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）を１ウェル当たり７ｘ１０４細胞となるように播種し、２４時間培養した後、実施例１で構築したＧＰＲｇ２動物細胞発現プラスミド、又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロールとしての空ベクター）（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、プラスミドｐＳＲＥ−Ｉｕｃ（ストラタジーン社）（１ウェル当たり２０ｎｇ）とを、遺伝子導入試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて、２者同時に遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間経過した後、培地を廃棄し、１０ｎＭの精製プロキネティシン１もしくは精製プロキネティシン２を添加して、５時間３７℃で反応させ、ルシフェラーゼ・アッセイシステム（和光純薬社）の方法に従い、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ＧＰＲｇ２を遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞では、空ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞に比べて、細胞内ルシフェラーゼ活性が特異的に上昇していた。
プロキネティシンの代わりに、又はプロキネティシンと同時に被験薬を添加してこの反応系を用いる事で、プロキネティシン１又は２と同様の活性を有するアゴニスト活性を有する物質（すなわち神経細胞死抑制剤）、並びにＧＰＲｇ２に対するプロキネティシン１又は２の反応を阻害するアンタゴニスト活性を有する物質（すなわち痛覚過敏治療剤）のスクリーニングが可能になった。
（実施例７）１２５Ｉ標識プロキネティシン２を用いたＧＰＲｇ２受容体結合アッセイ系の構築
１５０ｍｍ培養シャーレにＣＨＯ細胞及びＧＰＲｇ２を安定発現するＣＨＯ細胞をコンフルエントになるまでそれぞれ培養後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２にそれぞれ懸濁してホモジナイザー（ポリトロン；キネマティカ社）にてホモジェナイズした。超遠心後、各沈殿物を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に懸濁し、これをＣＨＯ膜画分、ＧＰＲｇ２膜画分とした。１２５Ｉ標識したプロキネティシン２（［１２５Ｉ］−ＰＫ２）は、実施例５で精製した５μｇのプロキネティシン２をＩｏｄａｉｎｅ−１２５（パーキンエルマー社）を用いて、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ  Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅ法（ピアス社）に従って作製した。
前記ＣＨＯ膜画分、ＧＰＲｇ２膜画分各３０μｇに［１２５Ｉ］−ＰＫ２を最終濃度５００ｐＭになるようにそれぞれ加え、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＢＳＡからなる溶液５０μｌ中で室温１時間インキュベーションし、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで膜画分への総結合量を測定した。さらに、前述の試験に最終濃度０．５μＭの非標識プロキネティシン１もしくは２（すなわち実施例５で精製したプロキネティシン）を加えることで、膜画分への非特異的結合量を測定した。その結果、［１２５Ｉ］−ＰＫ２はＧＰＲｇ２を安定発現するＣＨＯ細胞の膜画分に特異的に結合することが分かった。一方、空ベクターを遺伝子導入したＣＨＯ細胞の膜画分では、特異的結合は観察されなかった。
以上のように、本発明のＧＰＲｇ２受容体は、プロキネティシン２に結合親和性を持つ受容体であることが確認された。本ＧＰＲｇ２受容体を発現する細胞を用いて被験薬存在下で結合実験を行うことで、ＧＰＲｇ２受容体に対して親和性を有する物質のスクリーニングが可能となった。こうした物質は、プロキネティシン１又は２の活性を増強する活性を有する物質（すなわち神経細胞死抑制剤）、もしくはＧＰＲｇ２に対するプロキネティシン１又は２の反応を阻害するアンタゴニスト活性を有する物質（すなわち痛覚過敏治療剤）である。
（実施例８）ＧＰＲｇ２のヒト脊髄後根神経節での遺伝子発現の確認
脊髄後根神経節は、一次知覚神経の投射を受けており、侵害受容器により感受された痛みの刺激を脳に伝達する役割を担っている神経組織である。そのため、脊髄神経細胞の興奮性を低下させる薬剤は、侵害刺激の伝達を抑制することができる。このような薬剤は、慢性関節リウマチや変形性関節炎における痛みのような病的な痛みを抑える疼痛治療薬として有用である。疼痛には、神経因性疼痛のように侵害刺激を伴わないものも存在するが、神経因性疼痛は、痛みの伝達に関わる神経細胞自体の興奮性が高まっているために誘発される疼痛と考えられているため、神経因性疼痛に対しても脊髄神経細胞の興奮性を低下させる薬剤は有効である（Ｓｏｔｇｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓ．Ｍｏｔ．Ｒｅｓ．，９，２２７，１９９２；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８４，７９８，２０００；Ｍａ  ａｎｄ  Ｗｏｏｌｆ，Ｐａｉｎ，６１，３８３，１９９５；Ｓｏｔｇｉｕ  ａｎｄ  Ｂｉｅｌｌａ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔ．，２８３，１５３，２０００）。
ヒトＧＰＲｇ２遺伝子のヒト脊髄後根神経節での組織発現を解析するために、市販のヒト脊髄後根神経節由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（クロンテック社）から、ｍＲＮＡ精製キット（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０；宝酒造社）を用いてｍＲＮＡを精製後、逆転写反応用試薬（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ；ギブコ社）を用いて逆転写反応を行なうことにより、ヒト脊髄後根神経節ｃＤＮＡを調製した。合成されたｃＤＮＡを鋳型とし、実施例２に記載した条件を用いてＰＣＲを行なった。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅され、ＧＰＲｇ２がヒト脊髄後根神経節で発現している事が確認された。こうした結果より、ＧＰＲｇ２の活性化機構を調節するような化合物をスクリーニングにより取得することで、疼痛治療薬特には痛覚過敏治療剤を開発できる。
産業上の利用可能性
プロキネティシンの中枢作用として、神経細胞死抑制活性（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１  １３：１６９４−７０２）や痛覚過敏惹起活性（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  ３７４：１８９−９６）が知られており、従って、前記受容体および／又は前記受容体で形質転換した細胞を用いる本発明のスクリーニング方法によって、中枢作用をコントロールできる有用な物質、例えば、神経細胞死を伴うことが知られている痴呆症、脳卒中、及び／又は痛覚過敏症の治療剤として有用な物質を簡便にスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニングツールによれば、神経細胞死抑制剤、及び／又は痛覚過敏治療剤として有用な物質をスクリーニング及び評価することができる。
また、本発明のスクリーニングツール又は本発明のスクリーニング方法により得ることができる、前記受容体の活性を修飾する物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、神経細胞死抑制用、及び／又は痛覚過敏治療用医薬組成物を製造することができる。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し〈２２３〉には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３〜１０の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プロキネティシン受容体ＧＰＲｇ２を発現させたＣＨＯ細胞を用い、プロキネティシン１（ＰＫ１）又はプロキネティシン２（ＰＫ２）を含むＨＥＫ２９３培養上清を添加したときのカルシウム濃度の経時変化を示すグラフである。
図２は、空ベクターを発現させたＣＨＯ細胞を用い、プロキネティシン１（ＰＫ１）又はプロキネティシン２（ＰＫ２）を含むＨＥＫ２９３培養上清を添加したときのカルシウム濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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