(57)【要約】本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＰｅｐＴに結合する抗体が細胞傷害活性を有すること、さらに、細胞増殖を抑制することを見出した。この結果から、ＰｅｐＴに結合する抗体、特に細胞傷害活性を有する抗体は細胞増殖抑制剤として、例えば癌の治療や予防への利用が可能である。
2003047621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｅｐＴに結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
ＰｅｐＴに結合する抗体が細胞障害活性を有する抗体である、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
細胞傷害活性が抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）である、請求項２に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）である、請求項２に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
ＰｅｐＴがＰｅｐＴ１である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
癌細胞の増殖を抑制する、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
癌細胞が膵臓癌である、請求項６に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
ＰｅｐＴに結合する抗体を投与することを特徴とする、細胞に障害を引き起こす方法。
【請求項９】
ＰｅｐＴに結合し、かつ細胞障害活性を有する抗体。
【請求項１０】
細胞傷害活性が抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
ＰｅｐＴの細胞外領域に特異的に結合する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
ＰｅｐＴがヒト由来である。請求項９に記載の抗体。
【請求項１４】
ＰｅｐＴがＰｅｐＴ１である、請求項９〜１３のいずれかに記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＰｅｐＴに結合する抗体および該抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤に関する。
背景技術
哺乳動物は、生体外から栄養源を取り込む必要性があり、細胞には多くの輸送タンパク質が存在することが知られている。ペプチドの輸送を行っているのはペプチドトランスポーター（ペプチド輸送タンパク質；ＰｅｐＴ）であり、現在までに多数のＰｅｐＴが見出されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０（１２），６４５６−６４６３．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９９５，１２３５，４６１−４６６．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９５，１６，８２５．、特開平６−２６１７６１、特開平１１−１７２、ＵＳ５８４９５２５など）。ＰｅｐＴはペプチドの細胞内への流入を行うタンパク質と細胞外への流出を行うタンパク質に分けられる。又、輸送の際に利用するエネルギー源の違いによっても分類することができ、細胞内外のプロトンの濃度差を利用して輸送を行うプロトン駆動型ＰｅｐＴは、ＰＴＲファミリーに属する（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９５，１６，８２５．）。一方生体内のＡＴＰを使用して輸送を行うＰｅｐＴはＡＢＣファミリーに属する（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，１８，６７．）。
ＰｅｐＴはジペプチド、トリペプチドなどの小分子ペプチドだけでなく、β−ラクタム抗生物質、ＡＣＥ阻害剤などの薬剤の輸送にも関与していることが報告されている（Ｇａｎａｐａｔｈｙ，Ｌｅｉｂａｃｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，３，６９５−７０１．、Ｎａｋａｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．，１９８４，３３，３３４５−３３５２．、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍｉｄｏｎ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９８９，６，１０４３−１０４７．、Ｏｋａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８６，２６１，１４１３０−１４１３４．、Ｍｕｒａｎｕｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９８９，６，３０８−３１２．、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍｉｄｏｎ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．，１９９０，１３，１４１−１４６．）。
ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２は小分子ペプチドを細胞内に取り込むことによりタンパク質の吸収やペプチド性窒素源の維持に寄与しているプロトン駆動型ＰｅｐＴであり、ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２はそれぞれアミノ酸７０８個、７２９個からなる１２回膜貫通型タンパク質である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０（１２），６４５６−６４６３．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９９５，１２３５，４６１−４６６．、Ｔｅｒａｄａ，Ｉｎｕｉ，Ｔａｎｐａｋｕｓｉｔｓｕ  Ｋａｋｕｓａｎ  Ｋｏｕｓｏ．，２００１，４６，５）。
ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２もβ−ラクタム抗生物質やベスタチンなどの薬物を輸送することが報告されている（Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９５，２７５，１６３１−１６３７．、Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ａｃｔａ，１９９６，１２８０，１７３−１７７．、Ｔｅｒａｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９７，２８１，１４１５−１４２１．）。
ＰｅｐＴ１は主に小腸で発現し、腎臓、膵臓での発現も確認されている。ＰｅｐＴ２は腎臓、脳、肺、脾臓での発現が確認されている。ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２は小腸や腎尿細管上皮細胞の刷子縁膜に局在していることが報告されている（Ｏｇｉｈａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９６，２２０，８４８−８５２．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９８，２８６，１０３７−１０４２．、Ｈｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９９，２７６，Ｆ６５８−Ｆ６６５．、Ｔｅｒａｄａ，Ｉｎｕｉ，Ｔａｎｐａｋｕｓｉｔｓｕ  Ｋａｋｕｓａｎ  Ｋｏｕｓｏ．，２００１，４６，５，）。
また、ヒト膵管癌株でＰｅｐＴ１が細胞膜に高発現していること（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９８，５８，５１９−５２５．）、およびＰｅｐＴ２のｍＲＮＡがヒト膵管癌株で発現していること（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２０００））が報告されている。しかしながら、ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２の癌細胞増殖への関与は不明であり、ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２を抗体の標的抗原とすることにより癌細胞の増殖に影響を与えるか否かの議論は行われていなかった。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞増殖の抑制に有効なＰｅｐＴに結合する抗体を提供することにある。さらに、本発明は、該抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤を提供することをも目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＰｅｐＴに結合する抗体が細胞傷害活性を有すること、さらに、細胞増殖を抑制することを見出した。この結果から、ＰｅｐＴに結合する抗体、特に細胞傷害活性を有する抗体は組胞増殖抑制剤としての利用が可能である。
即ち、本発明は、
〔１〕ＰｅｐＴに結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、
〔２〕ＰｅｐＴに結合する抗体が細胞障害活性を有する抗体である、〔１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔３〕細胞傷害活性が抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）である、〔２〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔４〕細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）である、〔２〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔５〕ＰｅｐＴがＰｅｐＴ１である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤、
〔６〕癌細胞の増殖を抑制する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤、
〔７〕癌細胞が膵臓癌である、〔６〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔８〕ＰｅｐＴに結合する抗体を投与することを特徴とする、細胞に障害を引き起こす方法、
〔９〕ＰｅｐＴに結合し、かつ細胞障害活性を有する抗体、
〔１０〕細胞傷害活性が抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）である、〔９〕に記載の抗体、
〔１１〕細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）である、〔９〕に記載の抗体、
〔１２〕ＰｅｐＴの細胞外領域に特異的に結合する、〔９〕に記載の抗体。
〔１３〕ＰｅｐＴがヒト由来である。〔９〕に記載の抗体。
〔１４〕ＰｅｐＴがＰｅｐＴ１である、〔９〕〜〔１３〕のいずれかに記載の抗体、を提供するものである。
本発明は、まず、ＰｅｐＴに結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤を提供する。
本発明において、「ＰｅｐＴに結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗ＰｅｐＴ抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗ＰｅｐＴ抗体の含有率を制限するものではない。
本発明の細胞増殖抑制剤に含有される抗体はＰｅｐＴと結合する限り特に制限はない。一つの好ましい態様は、ＰｅｐＴと特異的に結合する抗体である。他の好ましい態様は、細胞障害活性を有する抗体である。
本発明における細胞障害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
抗ＰｅｐＴ抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１）エフェクター細胞の調製
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調製する。
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
（３）標的細胞の調製
膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−２等）を０．２ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍｌに調製して、標的細胞を調製する。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗ＰｅｐＴ抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗ＰｅｐＴ抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
本発明の細胞増殖抑制剤に含有される抗体は、抗原と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
感作抗原としては特に限定されないが、例えば、ＰｅｐＴがヒトＰｅｐＴ１の場合、ヒトＰｅｐＴ１蛋白質やヒトＰｅｐＴ１を発現する細胞、ヒトＰｅｐＴ１の部分ペプチド（例えば、ｎｄｌｔｄｈｎｈｄｇｔｐｄｓ、ｓｓｐｇｓｐｖｔａｖｔｄｄｆｋｑ、ｔｄｄｆｋｑｇｑｒｈｔ、ａｐｎｈｙｑｖｖｋｄｇｌｎｑｋｐｅ、ｋｄｇｌｎｑｋｐｅｋｇｅｎｇ、ｓｃｐｅｖｋｖｆｅｄｉｓａｎｔ、ｋｓｎｐｙｆｍｓｇａｎｓｑｋｑ等）などを用いることができる。
抗原の調製は、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。
ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，７３，３−４６．）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明の抗ＰｅｐＴ抗体の認識するＰｅｐＴ分子上のエピトープは特定のものに限定されず、ＰｅｐＴ分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよいが、ＰｅｐＴは１２回膜貫通型タンパク質なので、細胞外領域に存在するエピトープを認識するのが好ましい。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、抗体はＰｅｐＴに結合することができれば、抗体の断片又はその修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）などが挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンなどで処理し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５２，２９６８−２９７６．、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１２１，６６３−６６９．、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９１，９，１３２−１３７．参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはベプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８８，８５，５８７９−５８８３．）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、特に放射性標識抗体は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体は、例えば、ＰｅｐＴ分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＰｅｐＴを認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。この場合、ＰｅｐＴを発現している細胞に直接細胞障害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に障害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
また、本発明の細胞増殖抑制剤に含有されるＰｅｐＴに結合する抗体としては特に限定されないが、好ましいのはプロトン駆動によりペプチドを細胞内に取り込む（トランスポート活性を有する）ＰｅｐＴに結合する抗体であり、さらに好ましいのはＰｅｐＴ１またはＰｅｐＴ２に結合する抗体であり、特に好ましいのはＰｅｐＴ１に結合する抗体である。
ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２の塩基配列、アミノ酸配列は既に知られている（ヒトＰｅｐＴ１：ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＭ＿００７０６３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０（１２），６４５６−６４６３．、ヒトＰｅｐＴ２：ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＭ＿００２９２２、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９９５，１２３５；４６１−４６６．、マウスＰｅｐＴ１：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２０５５４０、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，２０００，１４９２，１４５−１５４．、マウスＰｅｐＴ２：ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０２１３０１、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０００，２７６，７３４−７４１．）。
また、本発明のｐｅｐＴに結合する抗体は、ｐｅｐＴの細胞外領域に特異的に結合する抗体であることが好ましい。本発明において、細胞外領域に対する特異的な結合とは、ＰｅｐＴの細胞外領域とそれ以外の領域を免疫学的に識別しうることを言う。より具体的には、細胞外領域には結合するが、細胞内領域等や膜貫通ドメインとは結合しない抗体を、ＰｅｐＴの細胞外領域に特異的に結合する抗体と言うことができる。本発明において、好ましいＰｅｐＴは、ヒトＰｅｐＴである。ヒトＰｅｐＴは、ヒトに由来のみならず、ヒトＰｅｐＴをバキュロウイルス発現系で発現させて得ることができる組み換え体であることもできる。細胞外領域に特異的に結合する抗体を取得する際に用いられる免疫原としては、例えば、細胞膜やウイルス膜などの膜上に発現させたＰｅｐＴや、ＰｅｐＴの細胞外領域を含む断片などを挙げることができる。又、免疫原として用いられるＰｅｐＴは、トランスポーター活性の有無に限定されず、トランスポート活性を有するＰｅｐＴ、トランスポート活性のないＰｅｐＴのどちらでも用いることが可能である。トランスポート活性を有するＰｅｐＴを免疫原として用いる場合には、例えば、細胞膜やウイルス膜などの膜上に発現させたＰｅｐＴを用いることができる（例えば、Ｂａ／Ｆ３細胞膜上やバキュロウイルス膜上に発現させたＰｅｐＴ）。ＰｅｐＴはグリシルザルコシン等を基質として取り込むことが知られているので、例えば、［１４Ｃ］グリシルザルコシンなどを、膜上に発現したＰｅｐＴに接触させ、［１４Ｃ］グリシルザルコシンの取り込みを観察することによって、トランスポート活性の有無を判断することが可能である。
増殖抑制の標的とする細胞は特に限定はされないが、好ましいのは膵臓癌、肝臓癌、肺癌、食道癌、乳癌、大腸癌などの癌細胞であり、特に好ましいのは膵臓癌細胞である。よって、本発明の細胞増殖阻害剤は、細胞増殖に起因する疾患、特に膵臓癌などの癌の治療、予防を目的として使用できる。
本発明の細胞増殖阻害剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の細胞増殖阻害剤は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体や添加物を供に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
また、本発明は、ＰｅｐＴに結合する抗体を投与することを特徴とする、細胞に障害を引き起こす方法を提供する。該ＰｅｐＴに結合する抗体は、本発明の細胞増殖抑制剤に含有されるＰｅｐＴに結合する抗体として上述している。本発明の方法は、細胞増殖に起因する疾患、特に膵臓癌などの癌の治療、予防を目的として使用できる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
１．ＰｅｐＴ１抗体の作成
１−１．ＤＥＦ２Ａ抗体の作成
ヒトＰｅｐＴ１を発現するＢａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３−ＰｅｐＴ１）をＰＢＳで洗浄し、４ｘ１０７細胞／ｍＬになるようにＰＢＳで懸濁した。この細胞液０．２５ｍＬをＢａｌｂ／ｃマウス（メス）に腹腔内投与することにより免疫を行った。１週間から２週間おきに計１９回の免疫を同様に行い、さらに細胞液を尾静脈内投与することにより２０回目の免疫を行った。
このマウスから脾臓細胞を調製し、通常のポリエチレングリコールを使用する方法によってマウスＰ３Ｕ１細胞との細胞融合を行った。細胞を９６ウェルプレートに蒔きこみ、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）中で細胞を培養することにより、ハイブリドーマの選択を行った。細胞融合から９日目に培養上清を回収し、ヒトＰｅｐＴ１を発現する発芽バキュロウイルス（ＰｅｐＴ１−ＢＶを抗原としたＥＬＩＳＡ（ＢＶ−ＥＬＩＳＡ）によるスクリーニングを行い陽性ウェルを選択した。
ＢＶ−ＥＬＩＳＡは次のように実施した。すなわち、４０μｇタンパク／ｍＬの濃度になるようにＰｅｐＴ１−ＢＶをＰＢＳで希釈し、それを１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社）に分注した。このプレートを４℃で一晩以上放置することによってＰｅｐＴ１−ＢＶをプレートに吸着させた。このプレートを用い、通常の方法に従ってＥＬＩＳＡを行った。
陽性ウェルであると判定されたウェルから限界希釈法によりハイブリドーマのクローン化を行った。クローン化された細胞の培養上清につき再度ＰｅｐＴ１−ＢＶを用いたＢＶ−ＥＬＩＳＡを行うことにより、陽性クローンＤＥＦ２Ａを同定した。
ＤＥＦ２Ａを拡大培養し、その培養上清を用いてヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ−１に対する反応性をＦＡＣＳ解析により調べたところ、ＤＥＦ２Ａが産生する抗体はＡｓＰＣ−１と特異的に反応することが明らかとなった（図１）。
１−２．ＢＰＴ０１−１３抗体の作成
ＰＢＳに懸濁した１ｍｇのタンパク量に相当するｐｅｐＴ１−ＢＶと２００ｎｇの百日咳毒素をｇｐ６４トランスジェニックマウス（特願２００２−１８０３５１）に皮下注射する事により初回免疫を行った。以後の免疫は同様に調製した５００μｇタンパク量相当のｐｅｐＴ１−ＢＶ（ただし百日咳毒素は含まない）を皮下注射することにより行った。最終免疫は２５０μｇタンパク量相当のｐｅｐＴ１−ＢＶ（ヒトＰｅｐＴ１を発現するバキュロウイルス：特願２００２−１８０３５１）を尾静注する事により行った。このマウスから脾臓細胞を調製し、通常のポリエチレングリコールを使用する方法によってマウスＰ３Ｕ１細胞との細胞融合を行った。
スクリーニングはＢａＦ／３−ｐｅｐＴ１細胞を用いたＦＡＣＳで行った。更にＢａＦ／３−ｐｅｐＴ２細胞を用いたＦＡＣＳによりｐｅｐＴ１特異的に結合するモノクローナル抗体「ＢＰＴ０１−１３」を樹立した。最終的にＡｓＰＣ−１とＢｘＰＣ−３のＦＡＣＳを行いガン細胞上のｐｅｐＴ１特異的な結合を確認した（図１）。
２．ＰｅｐＴ１抗体のＣＤＣ活性測定
ＰｅｐＴ１発現陽性の膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１細胞）および陰性の膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ−３細胞）を用いてＰｅｐＴ１抗体のＣＤＣ活性を測定した。
ＡｓＰＣ−１細胞は２０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地、ＢｘＰＣ−３細胞は１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地で培養した。細胞を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまいて（１Ｅ４個／ｗｅｌｌ）２日間培養後、５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＣＪＳ４）を５μＣｉ／ｗｅｌｌ添加し、１時間培養して細胞を標識した。細胞を３００μＬ／ｗｅｌｌのＨＡＶ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、０．２，２，２０μｇ／ｍＬのＰｅｐＴ抗体（ＢＰＴ０１−１３またはＤＥＦ２Ａ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、氷上で１５分間静置した。さらに１００％の幼齢ウサギ補体（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ，ＣＬ３４４１，Ｌｏｔ．６２１３）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で９０分間静置した。遠心（１，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃）後、上清を１００μＬ／ｗｅｌｌ回収してγカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＡＭＭＡ，ＭＯＤＥＬ５０５）で放射活性を測定した。下式により、ＣＤＣ活性（％）を求めた。
ＣＤＣ活性（％）＝（Ａ−Ｃ）ｘ１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ｗｅｌｌの放射活性、Ｂは補体の代わりに２％ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，ナカライテスク，２５２−２３，Ｌｏｔ．Ｍ７Ｍ７６９０）を１００μＬ加えたｗｅｌｌについて放射活性の平均値、Ｃは抗体および補体を添加せず、ＨＡＶ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加えたｗｅｌｌについて放射活性の平均値を示す。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行い、ＣＤＣ活性値および標準誤差を算出した（図２）。
産業上の利用の可能性
本発明者らによって、ＰｅｐＴに結合する抗体が細胞傷害活性を有し、細胞増殖を抑制することが見出された。これらの抗体は、細胞増殖抑制剤として、例えば癌の治療や予防への利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｐｅｐＴ１高発現膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ−１およびｐｅｐＴ２高発現膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３に対するＰｅｐＴ１抗体の反応性をＦＡＣＳ解析により調べた結果を示す図である。
図２は、ＡｓＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３細胞におけるＰｅｐＴ１抗体のＣＤＣ活性測定の結果を示す図である。上がＡｓＰＣ−１、下がＢｘＰＣ−３に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１】
2003047621.tif 000003
【図２】
2003047621.tif 000004
【国際調査報告】
2003047621.tif 000005
2003047621.tif 000006
2003047621.tif 000007
2003047621.tif 000008
2003047621.tif 000009
2003047621.tif 000010
2003047621.tif 000011