(57)【要約】動物にリジン欠乏食を摂取させることにより作成した慢性ストレス性疾患モデル動物及び該モデル動物の作成方法を提供する。このモデル動物を用いて慢性ストレス性疾患に対する薬物の効果を判定、又、上記モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物をスクリーニングすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物にリジン欠乏食を摂取させることにより作成した慢性ストレス性疾患モデル動物。
【請求項２】
動物がげっ歯類である請求項１記載のモデル動物。
【請求項３】
げっ歯類がラットである請求項２記載のモデル動物。
【請求項４】
慢性ストレス性疾患が機能性消化管疾患である請求項１〜３のいずれか１項記載のモデル動物。
【請求項５】
消化管器質的無変化、内臓痛過敏及び消化管運動異常からなる群から選ばれる少なくとも１つを有する請求項１〜４のいずれか１項記載のモデル動物。
【請求項６】
動物にリジン欠乏食を摂取させることを特徴とする慢性ストレス性疾患モデル動物の作製方法。
【請求項７】
リジン欠乏食がリジン含有量１ｇ／ｋｇ  ｄｉｅｔ以下のものである請求項６記載の作製方法。
【請求項８】
リジン欠乏食がリジン含有量０．３ｇ／ｋｇ  ｄｉｅｔ以下のものである請求項６記載の作製方法。
【請求項９】
動物のリジン要求量の１／４以下の量でリジン欠乏食を摂取させる請求項６記載の作製方法。
【請求項１０】
リジン欠乏食がグルテンを主原料とするものである請求項８記載の作製方法。
【請求項１１】
リジン欠乏食を少なくとも３日間連続摂取させる請求項６〜１０のいずれか１項記載の作製方法。
【請求項１２】
リジン欠乏食を３〜１０日間連続摂取させる請求項１１記載の作製方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項記載のモデル動物を用いて慢性ストレス性疾患に対する薬物の効果を判定することを特徴とする薬物の効果判定方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項記載のモデル動物を用いることを特徴とする慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法を用いて得られる、慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、リジン欠乏食を動物に摂取させた結果得られる慢性ストレス性疾患モデル動物、該モデル動物の作製方法、該モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患に対する薬物の効果を判定する方法、または慢性ストレス性疾患を予防および／または治療するための医薬品を開発することを目的とするスクリーニング方法、および該スクリーニングにより見出される化合物に関する。
近年、生活の質の改善（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ；ＱＯＬ）が医療現場で求められてきている。過度な精神ストレスは、個々人の病後、日常生活のＱＯＬのみならず、社会的生産性も低下させている。
ストレス性疾患を治療する医薬としては、心理的ストレッサーの緩和を目的とした、抗不安薬（ベンゾジアゼピン誘導体など）、抗うつ薬（モノアミン取り込み阻害薬、三環系薬剤など）や、消化管蠕動運動異常、内臓痛に対する薬剤の開発が多くなされている。
これらＱＯＬの改善を目的とした生活改善薬、予防薬は近年待望され、多くの企業がその開発を試みているが、安全かつ有効な治療薬の開発には至っていない。これまで、ストレス性疾患を模倣したモデル動物のうち、機能性消化管疾患ではＲｅｓｔｒａｉｎｔ  Ｓｔｒｅｓｓモデル（Ｋ．Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６１，２９７−３０３，１９９２，Ｇ．Ｊ．Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３０，７０６−７１２，２０００）、Ｗｒａｐ  Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ  Ｓｔｒｅｓｓモデル（Ｃ．Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９４，６１１−６２１，１９８８，Ｃ．Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８０，６７−７２，１９９７）等が存在するが、これらのモデルは急性のストレスを身体的に付加することにより発症させるため、慢性的、心因的であるはずのストレス性疾患に対する治療薬を探索するモデルとしては満足なものではない。従って、機能性消化管疾患の一つである過敏性腸症候群を対象とした既存の治療薬（Ａｌｏｓｅｔｒｏｎ，Ｐｉｎａｖｅｒｉｕｍなど）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による評価が中心であり、動物モデルでの試験報告が少ないのが現状である。
一方、リジンは必須アミノ酸の一つで、その欠乏および低い摂取が精神的および身体的障害を引き起こす可能性が報告されている（Ｄ．Ａ．Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  ａｎｄ  Ｂ．Ｊ．Ｓｔｒｕｐｐ，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５，２２１２Ｓ−２２２０Ｓ，１９９５，Ｄ．Ａ．Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｂａｒｎｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２５，４６８−４６９，１９７０，Ｈ．Ｐ．Ｃｈａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２２１，５５４−５５５，１９６９，Ｐ．Ｈ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６４，１７，１９６９）。また、リジン自体がけいれんモデルにおいて抗不安薬であるジアゼパムの作用を増強すること（Ｃ．Ｙｕｎｇ−Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｘｕｅ−Ｍｉｎ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０，９３１−９３７，１９９５）、虚血脳を保護すること（Ｇ．Ｈｏｎｇ−Ｐｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋ．Ｂａｏ−Ｓｈａｎ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６５，１９−２５，１９９９）、更に、脳に非常に高い濃度で存在（Ｑ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０，１０１６Ｓ−１０２２Ｓ，２０００）している。これらのことより、リジン欠乏および低い摂取が精神的な負担、即ち、ストレス状態を生じさせる可能性が考えられる。また、リジンを含む必須アミノ酸の欠乏による症状（例えば、体重減少など）はその欠乏の開始後数日で認められることより、その欠乏状態による症状の変化は急激に生じるものではない。しかしながら、このリジン欠乏によるストレス状態の時間的変化およびその成立後の内臓痛および消化管に対する作用を検討した報告がない。またリジン欠乏食を摂取することにより、慢性ストレス性疾患が発症することも知られていない。
発明の開示
本発明は、慢性ストレス性疾患に対する薬物の治療効果を判定する目的、または慢性ストレス性疾患を予防および／または治療するための医薬品を開発する目的で薬剤のスクリーニングを行う際に必要なモデル動物を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患に対する薬物の効果を判定する方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記スクリーニング方法を用いて得られた慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ってきた結果、食餌中のリジンを欠乏させることにより、慢性ストレス性疾患と同様の病態が発現することを見出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、動物にリジン欠乏食を摂取させることにより作成した慢性ストレス性疾患モデル動物を提供する。
本発明は、又、動物にリジン欠乏食を摂取させることを特徴とする慢性ストレス性疾患モデル動物の作製方法を提供する。
本発明は、又、上記モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患に対する薬物の効果を判定することを特徴とする薬物の効果判定方法を提供する。
本発明は、又、上記モデル動物を用いることを特徴とする慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明は、又、上記スクリーニング方法を用いて得られる、慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられる動物としては、食餌によるストレスを受ける動物であればいかなる動物でも良いが、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、サルなどの哺乳動物（ただしヒトを除く）が好ましく、さらに好ましくはげっ歯類、さらに好ましくは週令が約７週のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットが用いられる。
本発明における慢性ストレス性疾患とは、ストレスを慢性的に受けることによって発症する疾患の総称であり、その中には機能性消化管疾患および類似の病態を伴う疾患（不安性障害（パニック障害および全般性不安障害）、身体表現性障害、解離性障害、気分障害などの神経症、過食症、神経性拒食症、睡眠障害、糖尿病性胃腸症など）、腹部外科手術後の消化器症状などがあり、特に機能性消化管疾患が好ましい。機能性消化管疾患としては、例えば、過敏性腸症候群、反芻症候群、球症候群、機能性胸焼症、食道起因性胸痛症、機能性胃腸障害、機能性嚥下困難症、機能性嘔吐、嚥下症、呑気症、機能性便秘、機能性腹部膨満、機能性腹痛症候群、機能性下痢、オッジ括約筋機能異常、胆嚢機能異常症、肛門挙筋症候群、機能性便失禁、骨盤底協調運動障害、消散性肛門痛、小児消化管機能障害（小児逆流症、小児反芻症候群、周期性嘔吐症候群、機能性胃腸障害、過敏性腸症候群、機能性腹痛、発作性腹痛、空気嚥下症、機能性下痢、小児排便困難症、機能性便秘、機能性便貯留、機能性非貯留型便失禁など）などが知られており、それらのうちで特に過敏性腸症候群が好ましい。
本発明のモデル動物が、慢性ストレス性疾患モデル動物であることを確認することに、特に困難はない。例えばＰ．Ｂ．Ｃｈａｐｐｅｌｌらの文献（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，６（１０）：２９０８−２９１４，１９８６）中に記載されているように、急性ストレス動物モデルでは血中ＡＣＴＨ量、コルチコステロン量の増加が認められるが、副腎肥大は認められない。一方で、慢性ストレスモデルでは血中コルチコステロン量の増加および副腎肥大が認められるが、血中ＡＣＴＨ量の増加は認められないということを確認すればよい。
本発明に用いられるリジン欠乏食としては、通常の食餌におけるリジン含量よりも少ないリジン含量である食餌、具体的には、通常食のリジン含有量が１３．４ｇ／ｋｇ  ｄｉｅｔである。これに対して、本発明で用いるリジン欠乏食としては、リジン含有量が１ｇ／ｋｇ  ｄｉｅｔ以下であるのが好ましく、０．３ｇ／ｋｇ  ｄｉｅｔ以下であるのがより好ましい。リジン含有量の少ない小麦グルテンを主原料とすることで調整した低リジン食を使用することが好ましい。これはリジンの理想要求量の１／４を含み、なおラットの体重増加を維持できるものである。つまり、理想要求量の１／４以下の量の餌を与えるのが好ましい。
本発明のモデル動物は、慢性ストレス性疾患の病態、特に機能性消化管疾患の病態を有するが、その病態としては、例えば消化管器質的無変化、内臓痛過敏（Ｊ．Ｅ．Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，３１：１３１−１３８，１９８６、Ｗ．Ｅ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９８：１１８７−１１９２，１９９０）、消化管運動異常（Ｊ．Ｅ．Ｋｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９８：１２０８−１２１８，１９９０）などがあり、これらの１つ、２つ又は全部を有するのがよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明の慢性ストレス性疾患モデル動物の作製において、用いるリジン欠乏食は上記記載のリジン欠乏食であり、リジン欠乏食を摂取させる期間は、特に制限は無いが、連続摂取させることが好ましく、少なくとも３日間連続摂取させることがより好ましく、３〜１０日間連続摂取させることが更に好ましい。
本発明のモデル動物を用いて、慢性ストレス性疾患、特に機能性消化管疾患に対する薬物の効果を判定する際には、その評価方法は、本発明のモデル動物が有する病態を指標にすれば良く、例えば内臓痛過敏または消化管運動異常に関して薬物の効果を評価すればよい。
内臓痛過敏の評価方法としては、動物におけるバルーンを用いた痛み反応の測定に用いられる種々の方法が利用できる。例えば、目視による腹筋収縮を指標とした閾値測定法があるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
消化管運動異常の評価方法としては、排便増加反応を評価する方法が好ましく、動物における腸管輸送能の測定に用いられる種々の方法が利用できる。例えば、カルミン色素を用いる方法があるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
これらの評価方法において用いられるモデル動物は、上記作製方法で作製されれば良いが、好ましくは評価前日は絶食処理されることが好ましい。
また、本発明に示すモデル動物を用いて慢性ストレス性疾患、特に機能性消化管疾患に対する化合物の効果の測定および慢性ストレス性疾患、特に機能性消化管疾患を予防および／または治療するための医薬品のスクリーニングを行いうる。具体的には、化合物を経口、皮下、静脈内、局所などに投与した後、本発明のモデル動物において内臓痛過敏および／または消化管運動異常に対する化合物の影響を判定することでスクリーニングを実施しうる。スクリーニングにおいて内臓痛過敏および消化管運動異常を軽減した化合物は慢性ストレス性疾患、特に機能性消化管疾患に伴う内臓痛過敏および消化管運動異常の予防および／または治療薬の候補となりうる。
スクリーニングにより得られた慢性ストレス性疾患の予防および／または治療に有効な化合物を薬剤として使用する場合、そのままもしくはそれ自体公知の薬学的に許容されうる担体、賦形剤などと混合した医薬組成物として使用に供される。投与は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤などの経口投与、注射剤、シロップ剤、軟膏剤、坐剤などの非経口投与のいずれであっても良い。投与量は、投与対象、投与ルート、症状などによって異なるが、１日０．００１ｍｇ〜５ｇ程度、好ましくは０．０１ｍｇ〜２ｇ程度であり、これを１日１〜数回に分けて投与することができる。
本発明の慢性ストレス性疾患モデル動物は、ヒトにおける慢性ストレス性疾患と同様の症状を発現する他にはない特徴を持つ画期的なモデルであり、ヒトにおける慢性ストレス性疾患に対する薬物の効果の判定に有用である。従って、本発明により、慢性ストレス性疾患の予防および／または治療のための医薬品の開発が飛躍的に進歩する。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。
実施例１
低リジン食、リジン含有食の調製
低リジン食及びリジン含有食として、表１の組成のものを調製し、以下の実施例で使用した。
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実施例２
リジン欠乏ラットにおけるストレス指標の測定
ラット（日本チャールズリバー、Ｗｉｓｔａｒ系雄性、５Ｗ）に、低リジン食（ｎ＝１８）又はリジン含有食（Ｎｏｒｍａｌ食；ｎ＝１８）を与え、７日経過した後、採血を行い、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）で血清および血漿を得た。血漿中のＡＣＴＨ量はＲＩＡ固相法にて、血清中のコルチコステロン量はＲＩＡ硫安塩析法にて測定した。同時に、ラットの副腎を摘出し、副腎重量／体重比を測定した。統計検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔを用いた。
結果を図１に示した。低リジン食を与えて７日経過したラットは、Ｎｏｒｍａｌ食を与え続けたラットと比べて、ストレス暴露に由来する指標としてよく用いられている血中コルチコステロン量が増加する傾向を示した。同様に、低リジン食を与えて７日経過したラットは、Ｎｏｒｍａｌ食を与え続けたラットと比べて副腎重量／体重比が増加した。一方、コルチコステロンの調節因子である血中ＡＣＴＨ量は、Ｎｏｒｍａｌ食を与え続けたラットと比べて減少していた。
実施例３
リジン欠乏ラットにおける消化管部位の器質的変化の有無
ラット（日本チャールズリバー、Ｗｉｓｔａｒ系雄性、５Ｗ）に、低リジン食（ｎ＝３〜４）又はリジン含有食（Ｎｏｒｍａｌ食；ｎ＝３〜４）を与えた。実験食を与えて９日経過したラットを軽度のエーテル麻酔下にて、胃、回腸、および結腸部位を摘出し、実体顕微鏡下にて粘膜の器質的変化の有無を観察するとともに、即座に４％ホルムアルデヒド／１０％メタノールにて固定した。これらをパラフィン包埋し、スライドグラス上に作製した切片をＨＥ染色し、顕微鏡下にて観察した。
低リジン食を与えて９日経過したラットから摘出した胃、回腸、結腸標本の肉眼所見、ＨＥ染色組織所見において、Ｎｏｒｍａｌ食を与え続けたラットと同様に異変は認められず、炎症性細胞の浸潤および粘膜の損傷も観察されなかった。
実施例４
リジン欠乏ラットにおける絶食ストレス負荷後の内臓知覚過敏状態の形成
ラット（日本チャールズリバー、Ｗｉｓｔａｒ系雄性、５Ｗ）に、低リジン食（ｎ＝１０）又はリジン含有食（Ｎｏｒｍａｌ食；ｎ＝８）を与え、７日以上経過したラットを用いた。一日絶食させたラットを軽度のエーテル麻酔下に、肛門から非侵襲的にバルーンカテーテルを挿入した。Ｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎバルーンの内圧が１００ｍｍＨｇ（ｃｕｔ  ｏｆｆ値）に達するまで、水を流速０．９ｍｌ／ｍｉｎで注入し、目視による腹筋収縮が認められた時点のＤｉｓｔｅｎｓｉｏｎバルーンの内圧を内臓知覚閾値として測定した。腹腔内への刺激の間隔は５分とし、内臓知覚閾値を５〜８回測定し、連続して安定した３回分の閾値を平均した値を内臓知覚閾値として測定した。統計検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
結果を図２に示した。低リジン食を与え続けたラットの内臓知覚閾値は、１４．２３±２．１７ｍｍＨｇと求められ、Ｎｏｒｍａｌ食を与え続けたラットの内臓知覚閾値（２９．９±５．３７ｍｍＨｇ）と比べて有意に低下することが確認された。
実施例５
リジン欠乏ラットにおける便通異常に対する薬物の効果の検討
ラット（日本チャールズリバー、Ｗｉｓｔａｒ系雄性、５Ｗ）に、低リジン食（ｎ＝１０）又はリジン含有食（Ｎｏｒｍａｌ食；ｎ＝１０）を与え、７日経過したラットを用いた。実験開始前日（実験食開始６日目）から一日絶食させたラットに薬物およびカルミン色素を経口投与し、カルミン色素含有糞個数を経時的に累積測定した。統計検定は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定を用いた。
被験薬物としてＤｉａｚｅｐａｍ（抗不安薬）、Ａｔｒｏｐｉｎｅ（抗コリン薬）、Ａｌｏｓｅｔｒｏｎ（セロトニン３受容体拮抗薬：過敏性腸症候群治療薬）、Ｐｉｎａｖｅｒｉｕｍ（新しいタイプのカルシウム拮抗薬：過敏性腸症候群治療薬）を用い、その結果をそれぞれ図３に示した。抗不安薬は、心理的ストレスが腸機能を悪化させることから、過敏性腸症候群患者に処方される。また、抗コリン薬は、腸管運動と分泌を抑制し、鎮けい作用を有することから過敏性腸症候群治療に使用されることがある。本モデルでも、臨床で過敏性腸症候群治療に用いられている、機序の異なる４薬物の全てにおいて、低リジン食を与えて７日経過した活動期ラットの糞排泄の促進を有意に抑制して、Ｎｏｒｍａｌ食を与え続けたラットの糞排泄状態に回復させた。
従って、これらの薬物に対する本モデルでの結果とヒトにおける過敏性腸症候群に伴う消化管運動異常に対する薬物の作用が類似しており、本モデルがヒトにおける過敏性腸症候群を含む機能性消化管疾患に伴う消化管運動異常のモデルおよびその病態に対する薬物の効果を判定するモデルとして有用であることが判った。
本発明の慢性ストレス性疾患の動物モデルはヒトにおける慢性ストレス疾患と同様の症状を発現する他にはない特徴をもつ画期的なモデルである。本発明の動物モデルを用いることにより、慢性ストレス性疾患に対する薬剤の改善効果を効率良く判定することが可能になる。すなわち、本発明により、慢性ストレス性疾患の治療および／または予防のための医薬品の開発が飛躍的に進歩する。
【図面の簡単な説明】
図１は、リジン欠乏ラットの血中コルチコステロン量、副腎重量／体重比、及び血中ＡＣＴＨ量を測定したグラフである。
図２は、リジン欠乏ラットにおいて、結腸内バルーン拡張による内臓知覚閾値への影響を測定したグラフである。
図３は、リジン欠乏ラットの便通異常に対する、過敏性腸症候群治療に用いられる薬物の作用を評価したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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