(57)【要約】本願発明者らは、分子シャペロンの一つＧＲＰ７８の発現を指標として、このＧＲＰ７８の発現を調節し得る物質を天然材料中から探索することを試みた。その結果、ストレプトマイセス・バーシペリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｓｉｐｅｌｌｉｓ）４０８３−ＳＶＳ６株の代謝産物より、ＧＲＰ７８の発現抑制活性を有する式（Ｉ）で示される新規テトロン酸誘導体ｖｅｒｓｉｐｅｌｏｓｔａｔｉｎ（別名ＪＬ６８）化合物を単離した。このｖｅｒｓｉｐｅｌｏｓｔａｔｉｎは、上記ストレプトマイセス・バーシペリス４０８３−ＳＶＳ６株を培養し、この培養上清より採取することができる。
2003044209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
2003044209.tif 000010
で示されるｖｅｒｓｉｐｅｌｏｓｔａｔｉｎ化合物。
【請求項２】
ストレプトマイセス属に属する請求項１記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物から該化合物を採取する、請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の化合物の生産菌がストレプトマイセス  バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１７９）である、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
ストレプトマイセス属に属し、請求項１記載の化合物を生産する微生物。
【請求項５】
ストレプトマイセス  バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１７９）である、請求項４記載の微生物。
【請求項６】
請求項１記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む、組成物。
【請求項７】
請求項１記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む、抗癌剤。
【請求項８】
生理的ストレス状態にある癌細胞に対して細胞死を誘導することを特徴とする、請求項７記載の抗癌剤。
【請求項９】
生理的ストレス状態が低栄養状態または低酸素状態である、請求項８記載の抗癌剤。
【請求項１０】
固形癌に対して抗癌作用を示すことを特徴とする、請求項７〜９のいずれか記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なテトロン酸誘導体に関し、特に、放線菌由来テトロン酸誘導体に関する。
背景技術
小胞体は、タンパク合成が行われる器官であり、さらに産生されたタンパク質の折り畳みや糖鎖修飾さらにはタンパク質の輸送を行うオルガネラである。近年、この小胞体におけるストレスが、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）の発症などの関連から着目されている。小胞体ストレスは、通常小胞体内で行われるタンパク質の折り畳み、糖鎖修飾あるいはタンパク質輸送などが生理学的バランスの崩れや外的因子などにより阻害されることにより誘発されると考えられている。例えば、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）やブレフェルディンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）などの薬剤は小胞体ストレスを誘発する。ツニカマイシンは、小胞体内におけるタンパク質の糖鎖付加を阻害し、フォールディングされないタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を小胞体に蓄積させる。このようなフォールディングされないタンパク質の蓄積は、小胞体ストレスを誘発させる原因となる。ブレフェルディンＡは、小胞体とゴルジ装置の間のタンパク質輸送を阻害することにより、タンパク質を蓄積させて小胞体ストレスを誘発させる。
これら小胞体ストレスに対し、小胞体にはストレス応答機構が備わっている。例えば、ストレスセンサーであるＩｒｅはフォールディングされないタンパク質を認識し、ＧＲＰ７８などの分子シャペロンの発現を誘導し、タンパク質のフォールディングを促進することが知られている。しかしながら、こうしたストレス応答機構によっても小胞体ストレスが解消できない場合には、細胞はアポトーシスにより死滅することが示唆されている。
小胞体ストレスにおける臨床的な知見もまた報告されている。家族性アルツハイマー病の遺伝的素因の解析では、主に小胞体（ＥＲ）に存在する膜タンパク質であるプレセレニン−１（ＰＳ１）の変異が検出されている。このＰＳ１変異によりアルツハイマー病に特徴的な老人斑の形成などの原因となるベータアミロイド産生を促進することが報告されている以外に、この変異ＰＳ１を発現する細胞では各種のアポトーシス刺激に対して感受性が増大し、アポトーシスが誘導され易くなることが報告されている（Ｇｕｏ，Ｑ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：４２１２−４２２２（１９９７）、Ｇｕｏ，Ｑ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１０１−１０６（１９９９））。こうしたＰＳ１変異による細胞死は、小胞体ストレスを低減させ得るような処理、例えば、小胞体からのカルシウム放出を阻害する薬剤や抗酸化剤の処理により抑制されることが示されている。
また一方では、ヒト癌細胞にストレスを負荷すると、ＤＮＡ  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩが分解されることが判明している。この際、癌細胞は、ＤＮＡ  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩをターゲットとする抗癌剤ＶＰ−１６に耐性を示すことが知られている。さらに、このとき分子シャペロンであるＧＲＰ７８の発現が上昇していることが判明している（Ｙｕｎ，Ｊ．ら，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．，７：５８３−５９０，１９９５）。また、Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ阻害剤を用いたときの、ヒト固形癌におけるストレス応答と癌細胞の薬剤耐性を検討した結果、ストレス応答によるＴｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩの分解が抑制され、抗癌剤に対する感受性が向上することが判明している（Ｏｇｉｓｏ，Ｙ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：２４２９−２４３４，２０００）。
また、小胞体ストレスに対する応答は、固形癌において上昇し、このストレス応答上昇が抗癌剤に対する耐性となり得ることが示唆されている。この癌細胞に上述したＧＲＰ７８などの分子シャペロンの誘導を阻害することにより、抗癌剤に対する感受性が向上することも報告されている（Ｋｏｏｍａｇｉ，Ｒ．ら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：４３３３−６（１９９９）、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｐ．Ｍ．ら，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．５９：１５−２６（２０００）、Ｋａｔｓｃｈｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２７：４２５−３２（２００１））。また、ＧＲＰ７８は抗癌剤の優れたターゲットであることが判明している（Ｊａｍｏｒａ，Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：７６９０−７６９４，１９９６；Ｔｏｍｉｄａ，Ａ．ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ，Ｔ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，１４：１６９−１７７，１９９９；Ｍｉｙａｋｅ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７７：３９６−４０８，２０００；Ｌｅｅ，ＡＳ．，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２６：５０４−５１０，２００１）。
このようにＧＲＰ７８発現などの分子シャペロンによる小胞体ストレス応答機構を調節することは、アルツハイマー病などの疾患の治療や抗癌剤に対する感受性の向上に重要となる。さらに、このような小胞体ストレス応答機構を調節し得る物質は、アルツハイマー病の疾患の治療薬や制癌剤の開発に有用となる。
発明の開示
そこで、本願発明は、小胞体ストレス応答機構を調節し得る物質ならびにその製造方法を提供することを目的とする。
上記課題に鑑み、本願発明者らは、分子シャペロンの一つＧＲＰ７８の発現を指標として、このＧＲＰ７８の発現を調節し得る物質を天然材料中から探索することを試みた。この探索では、ＧＲＰ７８プロモータの下流にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を連結させたカセットを保持した発現ベクターを細胞に導入し、この細胞を該化合物のスクリーニングに用いた。スクリーニングでは、この細胞に種々の生薬、かび、放線菌などの代謝産物を接触させ、さらにツニカマイシンを投与し小胞体ストレスを誘発させた。一般にツニカマイシン投与による小胞体ストレス誘発に起因したＧＲＰ７８の発現上昇が見られたが、ある放線菌ストレプトマイセス属の菌株由来の代謝産物を添加した群ではその発現上昇が抑制された。このように小胞体ストレス誘発時にもかかわらずＧＲＰ７８の発現を抑制し得る活性を指標として、この代謝産物から活性物質を精製した結果、新規テトロン酸誘導体ｖｅｒｓｉｐｅｌｏｓｔａｔｉｎ（別名ＪＬ６８）化合物を単離、同定することに成功した。また、この活性物質を産生する菌株も同定することができた。
上記知見より、本発明は、この新規テトロン酸誘導体ｖｅｒｓｉｐｅｌｏｓｔａｔｉｎおよびその製造方法、さらには該化合物を生産する微生物を提供する。
具体的には、本発明は、
（１）下記式（Ｉ）
2003044209.tif 000003
で示されるｖｅｒｓｉｐｅｌｏｓｔａｔｉｎ化合物、
（２）ストレプトマイセス属に属する上記（１）記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物から該化合物を採取する、上記（１）化合物の製造方法、
（３）上記（１）記載の化合物の生産菌がストレプトマイセス  バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１７９）である上記（２）記載の製造方法、
（４）ストレプトマイセス属に属し、上記（１）記載の化合物を生産する微生物、
（５）ストレプトマイセス  バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１７９）である上記（４）記載の微生物、
（６）上記（１）記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む組成物、
（７）上記（１）記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む抗癌剤、
（８）生理的ストレス状態にある癌細胞に対して細胞死を誘導することを特徴とする、上記（７）記載の抗癌剤、
（９）生理的ストレス状態が低栄養状態または低酸素状態である、上記（８）記載の抗癌剤、
（１０）固形癌に対して抗癌作用を示すことを特徴とする、上記（７）〜（９）のいずれか記載の抗癌剤、である。
本発明の新規テトロン酸誘導体ｖｅｒｓｉｐｅｌｏｓｔａｔｉｎ（以下ＶＳＴと略称する）は、上記式（Ｉ）で表される構造を有し、後述する実施例に示された物理化学的性状を有する。また、本発明のＶＳＴ化合物には、その塩、溶媒和物なども含まれる。ＶＳＴの塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、金属塩（アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩など）、無機塩（酢酸塩、アンモニウム塩）、有機アミン塩（ジベンジルアミン塩、グルコサミン塩、エチレンジアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、テトラメチルアンモニア塩など）、およびアミノ酸塩（グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩など）を挙げることができる。また、ＶＳＴは、上記式（Ｉ）に示されている通り、分子内に水酸基を有するので、それらの官能基において、各種のエーテル、エステル等の誘導体に変換することができる。これら誘導体はＶＳＴ生物活性を保持する限り、本発明に包含される。
上記ＶＳＴはその生産微生物を培養し、その培養物から採取することにより該化合物を得ることができる。ＶＳＴの生産微生物としては、好適には放線菌ストレプトマイセス  バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株を用いることができる。ストレプトマイセス  バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株は、本願発明者らにより広島県三次市で採取された土壌試料から分離された。この菌株は、インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（ＩＳＰ）の方法に従い同定され、菌体学的性状は次の通りである。
本菌株は基生菌糸を分断しない。この気菌糸は長い主軸を形成し、そこより不規則に分枝した先端に、１０〜５０個またはそれ以上からなる螺旋状の胞子鎖を形成する。胞子は、幅０．３〜０．５μｍおよび長さ０．７〜１．０μｍのサイズであり、非運動性で円柱形あるいは楕円形を呈し、胞子表面は平滑である。胞子表面の黒湿化が、グリセリン・アスパラギン寒天培地や無機塩スターチ寒天培地、イースト麦芽寒天培地、オートミール寒天培地などで観察される。菌核、胞子嚢、その他の特殊形態は観察されない。また、細胞壁化学型はＬＬ−ジアミノジメリン酸を有する（Ｉ）型であり、ＤＮＡのＧＣ含量は７１．３ｍｏｌ％であった。
本菌株を種々の培養基上で２８℃、１４日間培養した際の培養性状は表１に示す。集落表面の菌叢色灰色系列であるが、２週間過ぎると胞子の表面は黒質化（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｍａｓｓ）が観察された。裏面色は淡黄色から暗茶味灰色などの不鮮明色を呈し、ｐＨによって変化しない。拡散性色素はメラニン様色素の産生以外は認められなかった。なお、色調名は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカ（Ｃｏｎｔａｉｎｎｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）の「ザ・カラー・ハーモニー・マニュアル」（Ｔｈｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｈａｒｍｏｎｙ  Ｍａｎｕａｌ）（１９５８年版）に基づいて示した。
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本菌株を２８℃、２〜２１日間で培養した際の生理学的性質は表２に示す。
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表２において「＋」は要求性を、「−」は非要求性を示す。
本菌株は中温性であり、メラニン様色素を産生する。本菌株は胞子が螺旋状に連鎖する形態と細胞壁化学型が（Ｉ）型であることからストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に位置する菌種である。上記諸性状を基に「細菌名承認リスト，１９８０」およびそれ以降の有効名リストに記載されたストレプトマイセス属の種について検索し、近縁種としてストレプトマイセス  バーシペリスを選出した。本菌株とこの近縁種との比較を表３に示す。
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表３に示すように、本菌株はストレプトマイセス・バーシペリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｓｉｐｅｌｌｉｓ）の性状とよく一致している。従って、本菌株は、ストレプトマイセス・バーシペリスに最も近似しているため、本菌株はストレプトマイセス・バーシペリスに含まれる一菌株と同定し、ストレプトマイセス・バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株として下記の通り国際寄託した。
（イ）国際寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（旧  通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：  平成１３年１１月１６日
（ハ）受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１７９
上記において、ＶＳＴ生産微生物として、ストレプトマイセス・バーシペリス  ４０８３−ＳＶＳ６株を説明したが、本発明のＶＳＴ産生微生物は、これに限定されるものではない。上述した菌体の諸性状は一般に変異し易く、一定したものではない。菌体の性質は自然的に変化し、またはＸ線照射などの物理的な変異誘導手段、エチルメタンスルホネートなどによる科学的な変異誘導手段、もしくは遺伝子操作などの細胞工学的な変異導入手段によって人工的にも改変し得ることは周知の事実である。したがって、本発明のＶＳＴ生産微生物には、ＶＳＴの産生するストレプトマイセス属に属する上記菌株の自然変異株、人工的変異株であっても、ＶＳＴを産生し得る限り、本発明に包含される。
ＶＳＴ生産菌の培養は、通常の放線菌の培養方法（Ｓｈｉｎ−ｙａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４８：５７４−５７８（１９９５））を用いることができる。具体的には、培地としては、微生物が同化し得る炭素源、窒素源、必要に応じて無機塩，有機栄養源等を適宜含有する栄養培地を用いることができる。上記炭素源としては、グルコース、アラビノース、キシロース、フラクトース、シュクロース、ラムノース、ラフィノース、イノシトール、マンニット、ガラクトース、セルビオース、メルビオース、糖蜜、澱粉、デキストリン、セルロース、グリセリン、有機酸などを挙げることができる。
また、窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、スキムミルク、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、カゼイン加水分解物、大豆蛋白加水分解物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物等を挙げることができる。
上記炭素源、窒素源は単独でまたは組み合わせで培地に添加することができる。また、必要に応じて、培地には、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、リン酸塩、硫酸塩、炭酸塩等の無機塩や、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属、ＶＳＴ生産株の生育やＶＳＴの生産を促進し得る微量栄養素、発育促進物質、前駆物質など適宜添加してもよい。また、培地ｐＨは、中性付近、具体的にはｐＨ７．０〜７．６とすることが好ましい。また液体培地においては、培養時の発泡を抑制するために、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜添加してもよい。
ＶＳＴの産生菌の培養は、通常の放線菌の培養方法同様、振とうまたは通気攪拌培養などの好気的培養方法で行なうことが好ましい。培養温度は、２４〜３０℃、好適には２７℃とすることがよい。また、大量液体培養を行なう場合には、先ず、少量の培地を用いた前培養により保存状態であった菌体の増殖を活性化させ、その後、この前培養液を大量の培地に接種して本培養を行なうことが効率的である。培養時間は、前培養の場合、通常２〜３日、本培養の場合には、４〜６日とすることができる。なお、これらの培養温度、通気量、培養時間などの培養条件はＶＳＴの産生量を基に、適宜調節、選択することができる。また、ＶＳＴ産生菌の種類、培養環境に応じて、上記培養条件などを変更することもできる。
培養液からＶＳＴを採取するためには、培養液を遠心分離あるいはろ過などに供して菌体成分を分離し、その上清またはろ液を回収する。回収された上清またはろ液からのＶＳＴの精製は、ＶＳＴの生化学的な活性、例えば、実施例１等に示したＧＲＰ７８の発現抑制活性、またはＨＰＬＣ分析などの物理的な性質を利用して実行することができる。一例を示せば、ＶＳＴの精製は次の操作で行い得る。
培養上清またはろ液を酢酸エチルなどの非親水性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮あるいは脱水剤を用いて脱水して粗精製ＶＳＴを得る。該粗製物質はさらに脂溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカゲルなどの担体を用いる吸着カラムクロマトグラフィー、さらにＳｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ（センシュー科学）などを用いたＨＰＬＣにより純品まで精製することができる。
但し、上記精製方法は一例であり、この方法に限定されるものではない。従って、当業者において通常用いられているその他の精製手段、例えば、他の吸着担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過用樹脂を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換あるいは陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いることもできる。これら精製手段は単独または適宜組み合わせることにより、ＶＳＴを分離精製してもよい。
上記において精製されたＶＳＴは、医薬組成物として用いてもよく、また、さらなる化合物を製造するための中間体として用いることができる。ＶＳＴを含む医薬組成物の剤形には特に限定はなく、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤などに製剤化することができる。また、これら製剤化において、ＶＳＴの活性を阻害しない範囲で賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の補助剤を適宜添加することができる。
このような組成物は、癌、アルツハイマー病などの治療において有効な組成物であるが、好ましくは抗癌剤として使用される。本発明における抗癌剤としては、生理的ストレス状態にある癌細胞に対して細胞死を誘導する抗癌剤であることが好ましい。ここで、生理的ストレス状態としては、低栄養状態または低酸素状態などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
該低栄養状態としては、グルコース飢餓状態、低ミネラル、低脂質、低ビタミンなどが挙げられるが、グルコース飢餓状態が好ましい。
また、本発明における抗癌剤は、癌細胞に対し直接的に抗癌作用を示すが、例えば、他の化学療法剤や放射線療法との併用により、より強い抗癌作用を発揮することができる。また、本発明における抗癌剤は、固形癌に対しても有効な抗癌剤である。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］  スクリーニング
自然界中におけるＧＲＰ７８の発現を調節し得る物質のスクリーニングを行った。詳細には、被験試料には、生薬、かび、放線菌のそれぞれの代謝産物を準備した。また、スクリーニング系は、次の通り調製した。ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ部位にＥＲＳＥを３つ含むＧＲＰ７８プロモーター領域（−１３２〜＋７）を挿入して、ＧＲＰ７８プロモータの下流にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を連結させたベクターを構築した。さらに、このベクターに選択マーカーとして、ｐｇｋ−ｎｅｏカセット（１，８６７ｂｐ）（ＭｃＢｕｒｎｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５７５５−５７６１（１９９１））を上記ベクターのマルチクローニングサイトのＳａｌＩ部位に挿入した。ここで構築されたベクター（以下、「ＧＲＰルシフェラーゼベクター」という）をＨｅＬａ細胞に導入した。細胞への導入には、「Ｔｒａｎｓｆａｓｔ」（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたリポフェクチン法により実行した。上記ＧＲＰルシフェラーゼベクターを保持した細胞（以下、この細胞を「ＨｅＬａ７８Ｃ６細胞」という）をＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて選択した。選択された細胞は１０％ＦＣＳ及び４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８含有ＤＭＥＭ培地で培養され、ＨｅＬａ７８Ｃ６細胞懸濁液（１．５×１０５細胞／ｍｌ）を調製した。
９６ウェルプレートの各ウェルに上記細胞懸濁液（１００μｌ）を分注し、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。その後、上記被験試料（１μｌ相当分）を添加し、３７℃にて３０分インキュベーションを行った。その後、さらにツニカマイシン溶液を最終濃度２μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに添加した。ツニカマイシン添加後、３７℃にて１８時間インキュベーションを行った。その後、細胞におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ測定キット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃  Ｅ１５０１）を用い、添付のプロトコルに従って測定した。
ツニカマイシンの添加による小胞体ストレス誘発により、ＧＲＰ７８プロモータからの発現が誘導されルシフェラーゼ活性が上昇したが、放線菌４０８３−ＳＶＳ６株の代謝産物を添加した群ではツニカマイシンによるルシフェラーゼ活性の上昇が抑制された。
［実施例２］  放線菌４０８３−ＳＶＳ６株の培養上清によるＧＲＰ７８発現抑制
実施例１においてＧＲＰ７８発現抑制を示した放線菌４０８３−ＳＶＳ６株の前培養を行った。前培養用の培地（１リットル中  スターチ  １０ｇ、ポリペプトン  １０ｇ、糖蜜  １０ｇおよび肉エキス  １０ｇを含み、ｐＨ２に調整）を調製し、滅菌した。滅菌済みの培地（１５ｍＬ）を５０ｍｌ用試験管に分注し、ここに放線菌を無菌的に接種した。植菌後、試験管を振とう（２００ｒｐｍ）しながら、２７度にて３日間培養した。
次に、本培養を行った。すなわち、本培養用の培地（１リットル中  スターチ  ２５ｇ大豆ミール  １５ｇ、乾燥イースト２ｇおよびＣａＣＯ３  ４ｇ含有、ｐＨ７．０）を調製した。本培養液の培地（１００ｍｌ）を５００ｍｌ用コブ付三角フラスコに分注し、そこに前培養液（２ｍｌ）を無菌的に添加した。添加後、振とう（２００ｒｐｍ）を行いながら、２７度にて５日間培養を行った。
上記本培養液を遠心分離により培養上清と、菌体とに分離した。これら培養上清と、菌体を破砕した菌体産物とをそれぞれ用いて、実施例１と同様にＧＲＰ７８発現抑制活性をレポーター解析法によりそれぞれの画分の活性を測定した。９６ウェルプレートの各ウェルに上記細胞懸濁液（１００μＬ）を分注し、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。その後、培養上清（１μｌ）または菌体産物（１μｌ）を含む溶液（１０μｌ）を添加し、３７℃にて３０分インキュベーションを行った。その後、さらにツニカマイシン溶液を最終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。ツニカマイシン添加後、３７℃にて１８時間インキュベーションを行った。その後、細胞におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ測定キットを用いて測定した。測定の結果、放線菌培養上清を添加した群において、ルシフェラーゼ活性の抑制が観察された。
［実施例３］  放線菌４０８３−ＳＶＳ６株培養上清からの活性物質の精製
放線菌４０８３−ＳＶＳ６株を実施例１と同様の培養方法をスケールを上げて行い、本培養液（２リットル）を調製した。この培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）にかけ、培養上清を回収し、菌体を除去した。回収した培養上清を酢酸エタノールにより抽出し、その後、硫酸ナトリウムで脱水した。この脱水後の粗精製物の重量は２．５７ｇであった。
脱水後の酢酸エタノール抽出物を濃縮乾燥後、クロロホルム：メタノール（２０：１）溶液に溶解し、この溶解液をシリカゲルカラム（カラム容量：３．５φＸ３０ｃｍ）に供与し、同溶媒にてクロマトグラフィーを行った。溶出試料を、上記実施例１に示したレポーター解析で測定し、活性を有する溶出画分（２５０ｍｇ）を分離した。続いて、上記活性を有する画分を集め、濃縮乾固後、メタノールに溶解し、ＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  Ｃ１８、２０φＸ２５０ｍｍ、センシュー科学製）に供与し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で８０％ＭｅＯＨを用いてクロマトグラフィー行った。溶出液を紫外可視（２５４ｎｍ）にてモニターし、保持時間２８分のピークを回収した。回収した溶出液を乾燥させ、３５．７ｍｇのＶＳＴ（別名ＪＬ６８）化合物の純品が得られた。
以下に、ＶＳＴの物理化学的性状を示す。
（１）物質の性状：白色粉末状物質
（２）融点：１７２〜１７５℃
（３）分子式：Ｃ６１Ｈ９Ｏ１７、（３）ＦＡＢマルスペクトル法による測定した分子量：１０９８（Ｍ）−、１１２１（Ｍ＋Ｎａ）＋
（４）一般式（Ｉ）：
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（５）高分解能ＦＡＢマススペクトル法により測定した精密質量（ｍ／ｚ）：実測値１１２１．６３９８［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値１１２１．６３８９
（６）メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトル（図１）の極大吸収（λＭｅＯＨｎｍ（ε））：２４８（８，０００），２６７（７，７００）、メタノール−ＮａＯＨ中で測定した紫外部吸収スペクトル（図２）の極大吸収（λＭｅＯＨ−ＮａＯＨｎｍ（ε））：２４３（１１，４００），２６９（８，９００）、メタノール−ＨＣｌ中で測定した紫外部吸収スペクトル（図３）の極大吸収（λＭｅＯＨ−ＨＣｌｎｍ（ε））：２６３（８，５００）
（７）メタノール中で測定した旋光度：［α］Ｄ：−５２°（ｃ  ０．８，ＭｅＯＨ）
（８）臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトル（図４）の極大吸収（ＩＲ（ＫＢｒ）λｍａｘ  ｃｍ−１）：３４４６，２９３４，１７５８，１７１１，１２６１，１０７５
（９）重クロロホルム：重メタノール＝１：１溶液中、２５℃で測定した１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（図５）および１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（図６）：表４に示す。
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（１０）ＨＰＬＣ分析：カラム  Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ（ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  Ｃ１８、４．６φＸ２５０ｍｍ、センシュー科学社製）、溶媒  ８０％メタノール、流速  １ｍｌ／分、検出  ２５４ｎｍ、保持時間  １４分
［実施例４］  ＶＳＴの活性の定量
実施例３において精製されたＶＳＴ純品を用いてＧＲＰ７８プロモータ発現抑制活性を定量化した。この定量も実施例１と同様のルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーター解析により測定した。詳細には、実施例１と同様に９６ウェルプレート中にＨｅＬａ７８Ｃ６細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１００μｌ）を分注した。一方、段階的にメタノールで希釈したＶＳＴ溶液（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５μｇ／ｍｌ）を調製し、この溶液をさらに、ＰＢＳ（−）で１０％に希釈した。これらＰＢＳで希釈後の溶液（１０μｌ）をウェル（１００μｌ細胞懸濁液／ウェル）に添加した。添加後、３７℃、５％ＣＯ２にて３０分インキュベーションを行った。その後、一部のウェルにはさらに一定量のツニカマイシン溶液を最終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。ツニカマイシン添加後、３７℃にて１８時間インキュベーションを行い、最終的な細胞におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ測定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した（図７）。なお、図７の横軸の数値は、ＶＳＴの最終濃度を示す。
ＶＳＴのみではＧＲＰ７８プロモータからのルシフェラーゼ発現には影響はなく、試料非添加の細胞における相対ルシフェラーゼ活性「１」と同程度であったが、ツニカマイシン添加による小胞体ストレスに応答してＧＲＰ７８からのルシフェラーゼ発現は上昇した。しかし、ツニカマイシン添加による発現上昇は、ＶＳＴの濃度増加にともなって抑制された。この結果より、ＶＳＴはツニカマイシンによる小胞体ストレスに応答したＧＲＰ７８からの発現上昇を抑制することが示された。
［実施例５］  種々細胞におけるＶＳＴの活性測定
本実施例ではＨｅＬａ細胞を含め、その他種々の培養細胞を用いて、上記レポーター解析およびＶＳＴ添加時の生存率を測定した。具体的には、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚癌細胞）の他、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）、ＰＣ１２ＮＨ（ラット黒褐色細胞腫）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌細胞）、ＴＩＧ−３（ヒト正常繊維芽細胞）、ＨｅＬａ７８６Ｃ細胞（ヒト子宮頚癌細胞）Ｓａｏｓ−２（テロメラーゼおよびｐ５３欠損ヒト癌細胞）、ＳＵＳＭ−１（テロメラーゼ欠損ヒト癌細胞）を用いた。
これら細胞に対するＶＳＴの直接の増殖抑制活性をＭＴＴ法を用いて測定した。上記各細胞の細胞懸濁液（５×１０４／ｍｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌ分注し、６時間３７℃にて培養した。培養後、上記実施例４と同様に段階希釈したＶＳＴ溶液を添加し、さらに２４時間培養を行った。２４時間培養後、各ウェルに０．０５ｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液（１０μｌ）を添加し、３７℃にて４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除き、ＤＭＳＯ（１００μｌ）を添加して５３０ｎｍ吸光度を測定した（図８）。これら測定値よりＩＣ５０を求めた結果を表５に示す。
ＶＳＴ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）では、生存率に低下は観察されず、１０μｇ／ｍｌ程度の高濃度で、２〜３細胞株で生存率の若干の低下が観察された。さらに高濃度１００μｇ／ｍｌにすることにより、多くの細胞株の生存率が低下したが、その低下程度は最大５０％程度であった。また１００μｇ／ｍｌの高濃度であっても依然として生存率に変化が見られない細胞株もあった。この結果より、ＶＳＴの細胞毒性は低く、特に１μｇ／ｍｌ濃度以下では、いずれの細胞に対しても直接の細胞毒性はないことが示された。
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［実施例６］  ＨｅＬａ７８Ｃ６細胞株に対するＶＳＴの生物活性
ＨｅＬａ７８Ｃ６細胞をＤＭＥＭ培地にて培養し、各濃度のＶＳＴをツニカマイシン添加３０分前に添加し、さらに２μｇ／ｍｌのツニカマイシンを添加し１８時間処理した。本細胞を集め、抗ＧＲＰ７８抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎｅ）を用いてＧＲＰ７８の誘導をＷｅｓｔｅｒｎブロッティングにて検出した。その結果、ＶＳＴはレポーターアッセイのみならず、内因性の分子シャペロンＧＲＰ７８の誘導を濃度依存的にタンパクレベルで阻害することが確認された（図９Ａ）。
また、上記培養法にてＨｅＬａ７８Ｃ６を培養し、５０μＭのＶＳＴで３０分間前処理した後、ツニカマイシンを添加した各時間後の細胞を集め、ＧＲＰ７８のタンパクレベルをＷｅｓｔｅｒｎブロッティングにて検出した。その結果、ＧＲＰ７８は２μｇ／ｍｌのツニカマイシン処理後１２時間から１８時間で誘導されること、またＶＳＴによりその誘導が阻害されることを明らかになった（図９Ｂ）。
さらに、各記載の小胞体ストレス誘導剤で処理した１８時間後のＧＲＰ７８レベルを図９Ａと同様の方法で検出した。その結果、ＶＳＴは何れの小胞体ストレスに対してもＧＲＰ７８の誘導を阻害したが、その効果は生理的な小胞体ストレスに近い２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（２−ＤＧ）に対してより選択性が高かった（図９Ｃ）。
［実施例７］  様々なストレス状況下でのＨＴ−２９及びＨＴ１０８０細胞におけるＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４レベルに対するＶＳＴの影響
実施例６の結果、ＶＳＴは小胞体ストレスによる内因性の分子シャペロンＧＲＰ７８の誘導を阻害することが明らかになったので、次に癌細胞のうち小胞体ストレス応答が亢進している癌細胞であるＨＴ−２９細胞とＨＴ１０８０細胞を用いて、ＧＲＰ７８の誘導阻害、アポトーシス誘導および他の抗腫瘍剤との併用効果を検討した。
具体的には、肝臓癌細胞ＨＴ−２９細胞およびＨＴ１０８０細胞をＲＰＭＩ１６４０培地にて培養し、３μＭおよび３０μＭのＶＳＴで３０分間前処理をした。次いで、各小胞体ストレス処理した１８時間後のＧＲＰ７８レベルをＷｅｓｔｅｒｎブロッティングにて検出した（図１０）。その結果、ＶＳＴは小胞体ストレス応答が亢進している癌細胞ＨＴ−２９およびＨＴ１０８０細胞においても、生理的な小胞体ストレスである２−ＤＧによるＧＲＰ７８の誘導を３μＭの低濃度でも阻害した。これに対し、ＶＳＴは３０μＭの濃度でも化学的な小胞体ストレスであるツニカマイシン処理に対しては、ＧＲＰ７８誘導阻害効果を示さなかった。また、データは示さないが、熱ショックプロテインであるＨＳＰ７０の転写活性には影響を与えないことを確認しており、ＶＳＴは小胞体ストレス応答特異的に作用することが証明された。本結果により、ＶＳＴは実際の固形癌の体内での状態を反映するモデルであるグルコース飢餓試験において、特に特異性の高い小胞体ストレス応答抑制効果を示した。このことは、抗腫瘍剤の効果が現れにくい固形癌に対し、その耐性メカニズムを克服することを可能にすることを示唆するものである。また、ＶＳＴが全ての小胞体ストレスに対し、効果を示すのではないことが明らかにされたが、本結果は小胞体ストレス応答経路が単一のメカニズムを介して発現するのではないことを示しているが、本現象はＶＳＴを用いることにより世界で初めて明らかにされたものである。
［実施例８］  ストレス状況下でのアポトーシスの誘導
以上に示したよう、ＶＳＴは生理的な小胞体ストレスであるグルコース飢餓によるＧＲＰ７８の発現を特異的に阻害することが示されたが、次にこのＧＲＰ７８の誘導阻害が癌細胞に対し細胞増殖抑制あるいはアポトーシスを誘導するかを検討した。
ＨＴ−２９細胞を各濃度のＶＳＴで３０分間前処理し、ツニカマイシン、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、グルコース飢餓および２−ＤＧの各小胞体ストレス負荷処理を１８時間行った。その後、１週間プレート上で培養しフォルマリンで固定後、クリスタルバイオレット染色によりコロニーを染色計測した。その結果、ＶＳＴは、ＧＲＰ７８誘導阻害活性と比例して、グルコース飢餓および２−ＤＧ処理下で強い細胞増殖抑制効果を示した（図１１Ｃ及びＤ）。これに対し、ツニカマイシン処理に対しては、ＧＲＰ７８誘導阻害同様、細胞増殖抑制効果も示さなかった（図１１Ａ及びＢ）。
また、ＨＴ１０８０細胞を３μＭのＶＳＴで３０分間前処理し、細胞を固定後ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅで核を染色し、ＦＡＣＳ解析を行った。その結果、図１２Ａに示すよう、ＶＳＴはグルコース存在下ではコントロールと同様、何の効果も示さなかったが、グルコース飢餓状態では４８時間後に強いサブＧ１期誘導を示し、ＨＴ１０８０細胞に対してグルコース飢餓下でアポトーシスを誘導することが示唆された。これに対し、ＨＴ１０８０細胞はグルコース飢餓処理のみではアポトーシスする細胞は極めて限定されていた。また、図１２Ｂに示すようにＶＳＴは時間依存的にグルコース飢餓状態下でＨＴ１０８０細胞にアポトーシスを誘導することが示唆された。
以上の結果より、ＶＳＴはＧＲＰ７８の誘導を阻害することにより、グルコース飢餓状態にある癌細胞に対して特異的に細胞死を誘導することを明らかにした。
［実施例９］  ＶＳＴと抗癌剤との併用活性
小胞体ストレス応答の亢進は、低栄養条件下での生存を促進すると共に抗腫瘍剤への耐性を獲得している。そのため、既知の抗腫瘍剤に対する効果を検討することにした。しかしながら、細胞レベルでの実験ではグルコース飢餓条件下ではＶＳＴ単独でも強いアポトーシス誘導を示すため、他の薬剤との併用効果を十分に検討することができなかった。そこで、癌細胞に対し低グルコース下でも活性が維持されることから、固形癌治療に汎用されるシスプラチンを用いて併用効果を検討した。具体的には、ＨＴ−２９細胞を上記の方法により培養し、ＶＳＴで３０分間前処理した後、１８時間培養した。その後各濃度のシスプラチンで４時間処理し、１週間後コロニー形成能を検討した。
その結果、ＶＳＴ、シスプラチンともグルコース飢餓条件下で活性増強が確認されたが、ＶＳＴを低濃度添加することにより（３００ｎＭおよび５００ｎＭ）、シスプラチンの効果をさらに増強することが明らかになった（図１３）。
シスプラチンは、固形癌治療に汎用されるが、副作用が強いことが知られている。そのためＶＳＴにより、投与量を減らすことが可能となれば、患者のｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）に大きく貢献することが期待される。
［実施例１０］  動物試験
ＶＳＴの動物レベルでの抗腫瘍効果について検討した。具体的には、ＨＴ−２９細胞をヌードマウスに移植し、１００ｍｍ３になるまで腫瘍を増殖させた。その後、各濃度のＶＳＴを尾静脈投与し、経過観察し各経過日数時に腫瘍を摘出し大きさを比較検討した。その結果、ＶＳＴは図１４に示すよう、シスプラチンほど強い効果は認められなかったが抗腫瘍効果を示した。また、ｃＤＤＰ（シスプラチン）との併用効果を検討したが、シスプラチンの効果が十分であり、併用効果は認められなかった。
動物試験においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの強い効果が認められなかったため、ＶＳＴのＨＴ−２９細胞に対するアポトーシス誘導効果を再検討した結果、ＶＳＴはコロニー形成試験で増殖抑制効果を示すが、アポトーシス誘導効果は発現しないことが明らかになった。
［実施例１１］  メカニズム解明研究
ＶＳＴの活性発現メカニズム解明のため、小胞体ストレス応答経路で作用する幾つかの因子に対する効果を検討した。このうち、酵母からほ乳類細胞まで広く保存されている小胞体ストレス応答経路であるＩｒｅ１α−ＸＢＰ１経路について検討した。ＸＢＰ１は、ｍＲＮＡレベルで前駆体（ＸＢＰ１（Ｕ））から小胞体ストレスを受け活性化されたＩｒｅ１αによりスプライシングされ、活性化体となり（ＸＢＰ１（Ｓ））核へ移行しＧＲＰ７８プロモーターであるＥＲＳＥに結合し、ＧＲＰ７８の転写を誘導する。
クローニングしたＸＢＰ１にＦｌａｇタグを繋いだプラスミドをＨＴ１０８０へ導入し、３０分間ＶＳＴで前処理した。各ストレス負荷６時間後プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を添加し、さらに６時間培養した細胞から調製した試料を用いて、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて全長およびスプライシング型ＸＢＰ１を検出した。図１５Ａが２−ＤＧ、右側がツニカマイシン処理によるＸＢＰ１のスプライシング型の形成について検討したものである。ＳＢＰ１のスプライシング型はプロテアソームによる分解を極めて速く受けるため、その検出が困難である。この問題を解決するため、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を添加した。図１５Ａ及びＢとも右２つのレーンを比較すると、２−ＤＧ処理ではＶＳＴ添加によりスプライシング型ＸＢＰ１の形成が阻害されているのが観察された。これに対し、ツニカマイシンによるＸＢＰ１のスプライシングをＶＳＴは阻害しなかった。これは、ＸＢＰ１の活性化レベルで、ツニカマイシンとグルコース飢餓とでは小胞体ストレス応答メカニズムが異なることを示唆している。本結果により得られた新しい知見はＶＳＴの発見によって初めて見出されたものである。また、ＸＢＰ１のスプライシングを阻害する物質はＶＳＴ以外報告されていない。
産業上の利用の可能性
放線菌からＧＲＰ７８発現を低減させ得る新規な物質（ＶＳＴ）が同定された。また、この新規化合物を産生する微生物、ストレプトマイセス  バーシペリスが単離同定された。このＶＳＴは小胞体ストレス誘発剤によるＧＲＰ７８の発現上昇を抑制したことから、ＶＳＴ自身がストレス応答に起因したＧＲＰ７８の発現を阻害し得ることが示された。この結果より、ＶＳＴを利用し、化学療法や放射線療法による癌治療の際に癌細胞のストレス応答機構を抑制し、癌細胞にこれら化学療法剤や放射線療法に対する高い感受性を付与する薬剤の開発に有効となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、メタノール中で測定したＶＳＴの紫外部吸収スペクトルを示す図である。
図２は、メタノール−ＮａＯＨ中で測定したＶＳＴの紫外部吸収スペクトルを示す図である。
図３は、メタノール−ＨＣｌ中で測定したＶＳＴの紫外部吸収スペクトルを示す図である。
図４は、臭化カリウム錠剤法で測定したＶＳＴの赤外部吸収スペクトルを示す図である。図４において、波長番号１は３４５４ｃｍ−１、２は２９３４ｃｍ−１、３は２３６０ｃｍ−１、４は１７５８ｃｍ−１、５は１７１１ｃｍ−１、６は１６２３ｃｍ−１、７は１５７５ｃｍ−１、８は１４５７ｃｍ−１、９は１３８１ｃｍ−１、１０は１３０８ｃｍ−１、１１は１２０８ｃｍ−１、１２は１０６２ｃｍ−１、１３は９８９ｃｍ−１、１４は９３４ｃｍ−１、１５は８６７ｃｍ−１、１６は８３０ｃｍ−１、１７は７３０ｃｍ−１のシグナルを示す。
図５は、ＶＳＴの１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
図６は、ＶＳＴの１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
図７は、ＶＳＴのＧＲＰ７８発現抑制活性を測定した結果を示す図である。図において、黒塗りのシンボルは濃度を変えたＶＳＴを添加後、ツニカマイシンを添加して細胞内の小胞体ストレスを誘発し、ＧＲＰ７８の発現を誘導した群を示す。白抜きシンボルは濃度を変えたＶＳＴのみを添加し、ツニカマイシン非添加の群を示す。
図８は、種々の細胞に様々な濃度のＶＳＴを添加した際の細胞の生存率に基づいて、直接的な細胞毒性を測定した結果を示す図である。各シンボルは図右に示した細胞にそれぞれ対応している。
図９は、ＶＳＴによるＨｅＬａ７８Ｃ６細胞における小胞体ストレスによって誘導される内在性ＧＲＰ７８の発現抑制活性について示す写真である。Ａは用量依存性、Ｂはタイムコース、Ｃは各ストレス条件についての検討を示す。
図１０は、小胞体ストレス応答亢進癌細胞ＨＴ−２９およびＨＴ１０８０細胞において、各種小胞体ストレスによって誘導されるＧＲＰ７８の発現をＶＳＴが阻害するかについて示す写真である。ＡはＨＴ−２９細胞、ＢはＨＴ１０８０細胞を示す。
図１１は、ＨＴ−２９細胞において、各種小胞体ストレス条件下でのＶＳＴのコロニー形成阻害活性能について示す図である。
図１２は、ＨＴ１０８０細胞に対する、グルコース飢餓条件下でのＶＳＴによるアポトーシス誘導について示す図である。
図１３は、ＨＴ１０８０細胞に対するグルコース飢餓条件下ＶＳＴによるアポトーシス誘導の経時変化を示す図である。
図１４は、固形癌に対して有効な抗腫瘍剤シスプラチンとＶＳＴとの併用効果について示す図である。
図１５は、ヌードマウスにおけるＨＴ−２９癌細胞に対する、ＶＳＴの動物レベルでの抗腫瘍効果について示す図である。
図１６は、ＶＳＴのＧＲＰ７８の誘導に深く関与するＸＢＰ１の活性化抑制について示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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