(57)【要約】軸部材に巻装可能な形状を有し、表面に共有結合を介してアミノ基含有物質を固定化し得るアミノ基含有物質固定用担体を提供することを目的とし、この目的を達成するために、本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、軸部材に巻装可能な形状を有するアミノ基含有物質固定用担体であって、ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基を表面に有することを特徴とする。
2003079019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軸部材に巻装可能な形状を有するアミノ基含有物質固定用担体であって、
ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基を表面に有することを特徴とする前記アミノ基含有物質固定用担体。
【請求項２】
軸部材に巻装可能な形状を有し、表面にポリアミドが露出した原料部材に加水分解処理を施して、前記ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合を開裂させたことを特徴とする請求項１記載のアミノ基含有物質固定用担体。
【請求項３】
前記原料部材が、ポリアミド繊維又はその集合体であることを特徴とする請求項２記載のアミノ基含有物質固定用担体。
【請求項４】
前記形状が、糸状、紐状又はテープ状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ基含有物質固定用担体。
【請求項５】
ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じたアミノ基に環状酸無水物を反応させて、前記アミノ基をカルボキシル基又はその誘導基に変換させたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ基含有物質固定用担体。
【請求項６】
アミノ基含有物質が表面に固定化されたアミノ基含有物質固定化担体であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ基含有物質固定用担体がその表面に有するカルボキシル基又はその誘導基と、前記アミノ基含有物質が有するアミノ基とを反応させて、前記アミノ基含有物質を前記アミノ基含有物質固定用担体の表面にアミド結合を介して固定化したことを特徴とする前記アミノ基含有物質固定化担体。
【請求項７】
軸部材に巻装可能な形状を有し、表面にポリアミドが露出した担体へのアミノ基含有物質の固定化方法であって、
（ａ）前記担体に加水分解処理を施して前記ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合を開裂させ、前記担体の表面にカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基を生じさせる工程、並びに
（ｂ）前記担体の表面のカルボキシル基又はその誘導基と、前記アミノ基含有物質が有するアミノ基とを反応させて、前記アミノ基含有物質を前記担体の表面にアミド結合を介して固定化する工程
を含むことを特徴とする前記固定化方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）の前に、前記担体の表面のアミノ基に環状酸無水物を反応させて、前記アミノ基をカルボキシル基又はその誘導基に変換させておくことを特徴とする請求項７記載の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アミノ基含有物質を表面に固定化し得るアミノ基含有物質固定用担体、アミノ基含有物質を表面に固定化したアミノ基含有物質固定化担体、並びに担体へのアミノ基含有物質の固定化方法に関する。
背景技術
標的核酸の検出、分離等の際には、一般に、標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを固定化した固体担体（固体支持体）が用いられ、固体担体に固定化されたプローブと標的核酸とをハイブリダイズさせた後、洗浄等によって標的核酸以外の物質を除去することによって、標的核酸の検出、分離等が行われる。
プローブを固定化した固体担体の一つに、スライドガラス等の固体担体の表面上に多数のプローブを配列して固定化したＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）がある。ＤＮＡアレイは、遺伝子の発現、変異、多型性等の解析を並列して行う際に非常に有用である。
ＤＮＡアレイの作製方法としては、例えば、プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドを固体担体表面で直接合成する方法と、予め調製しておいたオリゴヌクレオチド（場合によってポリヌクレオチド）を固体担体表面に固定化する方法とが知られている。
前者の方法の代表例としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術とを組み合わせて、マトリックスの所定の領域でプローブを選択的に合成する方法がある。
また、後者の方法の代表例としては、（１）ｃＤＮＡやＰＣＲ産物をポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固体担体表面に点着し、ＤＮＡの荷電を利用して固体担体に静電結合させる方法、（２）反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固体担体表面に該オリゴヌクレオチドを点着し、固体担体表面に共有結合させる方法がある。
ＤＮＡアレイの作製に当たっては、プローブとして用いられる核酸の種類や固体担体の種類に応じて適当な作製方法が選択され、固体担体への確実かつ効率的なプローブの固定化が図られる。
発明の開示
ＤＮＡアレイの一般的な形態は、平坦な固体担体の表面に複数種類のＤＮＡを高密度に配列させたものである。
しかしながら、平面上において複数種類のＤＮＡを高密度に配列させる場合、異なる種類のＤＮＡのクロスコンタミネーションが生じやすくなる。各部位におけるＤＮＡ量を少量化することによってクロスコンタミネーションを防止することも考えられるが、ＤＮＡ量を少量化すれば反応性が低下してしまう。また、平面上において複数種類のＤＮＡを高密度に配列させるには、多大な手間と時間を要するため、ＤＮＡアレイの製造に多大なコストがかかる。
そこで、本発明者は、これらの問題を解決するために、所定の化学構造をもつ各種検出用物質が、長手方向に沿って並ぶように固定され、各化学構造とその固定位置とが対応付けられた糸状、紐状又はテープ状等の細長形状の基礎部材と、前記基礎部材が巻装される支持体とを有する集積支持体を開発し、先に特許出願している（ＷＯ  ０１／６９２４９Ａ１，ＷＯ  ０１／５３８３１Ａ１，ＷＯ  ０２／６３３００Ａ１）。
本発明者が開発した集積技術を利用すれば、糸状、紐状又はテープ状等の細長形状の固体担体を展開した状態においてＤＮＡを固定化した後（第１次集積化）、それを軸部材に巻装することにより（第２次集積化）、クロスコンタミネーションを防止しつつ、容易かつ低コストで、ＤＮＡが高密度に配列したＤＮＡアレイを作製することが可能となる。このようなＤＮＡアレイの作製を実現化するためには、糸状、紐状又はテープ状等の細長形状の固体担体へ確実かつ効率的にＤＮＡを固定化することが必要となる。
一方、ＤＮＡを構成するヌクレオチドの中に、アミノ基を有するヌクレオチド（例えば、デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸、デオキシグアニル酸）が含まれていれば、当該ＤＮＡはアミノ基を含有することとなる。また、ＤＮＡをはじめとする種々の化学物質には、化学修飾により人為的にアミノ基を導入することも可能である。
そこで、本発明は、第一に、軸部材に巻装可能な形状を有し、表面に共有結合を介してアミノ基含有物質を固定化し得るアミノ基含有物質固定用担体を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、軸部材に巻装可能な形状を有し、表面に共有結合を介してアミノ基含有物質を固定化したアミノ基含有物質固定化担体を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、軸部材に巻装可能な形状を有する担体表面へのアミノ基含有物質の固定化方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下のアミノ基含有物質固定用担体、アミノ基含有物質固定化担体、及びアミノ基含有物質の固定化方法を提供する。
（１）軸部材に巻装可能な形状を有するアミノ基含有物質固定用担体であって、
ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基を表面に有することを特徴とする前記アミノ基含有物質固定用担体。
（２）軸部材に巻装可能な形状を有し、表面にポリアミドが露出した原料部材に加水分解処理を施して、前記ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合を開裂させたことを特徴とする前記（１）記載のアミノ基含有物質固定用担体。
（３）前記原料部材が、ポリアミド繊維又はその集合体であることを特徴とする前記（２）記載のアミノ基含有物質固定用担体。
（４）前記形状が、糸状、紐状又はテープ状であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載のアミノ基含有物質固定用担体。
（５）ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じたアミノ基に環状酸無水物を反応させて、前記アミノ基をカルボキシル基又はその誘導基に変換させたことを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載のアミノ基含有物質固定用担体。
（６）アミノ基含有物質が表面に固定化されたアミノ基含有物質固定化担体であって、
前記（１）〜（５）のいずれかに記載のアミノ基含有物質固定用担体がその表面に有するカルボキシル基又はその誘導基と、前記アミノ基含有物質が有するアミノ基とを反応させて、前記アミノ基含有物質を前記アミノ基含有物質固定用担体の表面にアミド結合を介して固定化したことを特徴とする前記アミノ基含有物質固定化担体。
（７）軸部材に巻装可能な形状を有し、表面にポリアミドが露出した担体へのアミノ基含有物質の固定化方法であって、
（ａ）前記担体に加水分解処理を施して前記ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合を開裂させ、前記担体の表面にカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基を生じさせる工程、並びに
（ｂ）前記担体の表面のカルボキシル基又はその誘導基と、前記アミノ基含有物質が有するアミノ基とを反応させて、前記アミノ基含有物質を前記担体の表面にアミド結合を介して固定化する工程
を含むことを特徴とする前記固定化方法。
（８）前記工程（ｂ）の前に、前記担体の表面のアミノ基に環状酸無水物を反応させて、前記アミノ基をカルボキシル基又はその誘導基に変換させておくことを特徴とする前記（７）記載の固定化方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、軸部材に巻装可能な形状を有するアミノ基含有物質固定用担体であって、ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基を表面に有することを特徴とする。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、軸部材に巻装可能な形状を有する。軸部材は、巻く物の中心となり得る限り、その形状や構造は特に限定されるものではなく、例えば、棒状、円柱状、円筒状、角柱状、角筒状等のものが挙げられる。軸部材に巻装可能な形状としては、糸状、紐状、テープ状等の細長形状が挙げられるが、これらの形状に限定されるものではない。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、ポリアミドを必須の構成成分とする。ここで、ポリアミドの種類は、その主鎖中にアミド結合を有するポリマーである限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、ラクタムの開環重合により得られるポリマー（例えば、ナイロン６、ナイロン１２等）、アミノカルボン酸の重縮合により得られるポリマー（例えば、ナイロン１１等）、ジアミンとジカルボン酸との重縮合により得られるポリマー（例えば、ナイロン６６、ナイロン６，１０等）等が挙げられる。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、ポリアミドのみから構成されていてもよいし、その他の構成成分を含有していてもよい。本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、主として水性媒体中で用いられるので、水に対して不溶性であって非膨潤性であることが好ましい。また、本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、軸部材に巻装可能であるように、可撓性を有することが好ましい。本発明のアミノ基含有物質固定用担体を構成し得るポリアミド以外の構成成分としては、例えば、水不溶性ポリマーが挙げられる。水不溶性ポリマーの具体例としては、スチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、トリブロモプロピルアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類又はアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、低級脂肪酸ビニルエステル等のビニル系単量体の１種以上を重合して得られるポリマー；アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体；メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体等が挙げられる。また、その他の構成成分として、ガラス、セラミックス、シリコン等が挙げられる。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体を構成するポリアミドのうち、アミノ基含有物質固定用担体の表面に存在するポリアミドの一部又は全部は、加水分解処理（加水分解処理後、必要に応じて適当な誘導化処理）が施されたものである。すなわち、本発明のアミノ基含有物質固定用担体の表面には、ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基が形成されている。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体は、例えば、軸部材に巻装可能な形状を有し、表面にポリアミドが露出した原料部材に加水分解処理を施して、原料部材の表面のポリアミドが主鎖中に有するアミド結合を開裂させることにより得ることができる。
軸部材に巻装可能な形状を有し、その表面にポリアミドが露出した原料部材としては、ポリアミド繊維又はその集合体（例えばポリアミド繊維を撚ったもの）や、上記水不溶性ポリマーを主成分とする繊維又はその集合体の表面にポリアミドをコーティングしたもの等を用いることができる。
原料部材に施す加水分解処理は、酸又は塩基の存在下で常法に従って行うことができる。
加水分解処理に用いる酸は特に限定されるものではなく、その具体例としては、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、硫酸等の無機酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸等が挙げられ、好ましい酸としては塩酸が挙げられる。酸の使用量は、通常０．５〜６Ｎ、好ましくは２〜４Ｎである。
また、加水分解処理に用いる塩基も特に限定されるものではなく、その具体例としては、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）又はアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）の水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩等の無機塩基、トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン等）等の有機塩基が挙げられ、これらのうち好ましい塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられる。塩基の使用量は、通常０．１〜４Ｎ、好ましくは１〜２Ｎである。
加水分解処理を行う溶媒には、水以外に、加水分解反応を阻害しない溶媒、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等を含有させてもよい。
２〜４Ｎの塩酸を用いて加水分解処理を行う場合、反応温度は通常５〜６０℃、好ましくは常温〜４０℃であり、反応時間は通常０．０５〜２４時間、好ましくは０．１〜２時間である。最も好ましくは、２．５Ｎの塩酸を用いて、４０℃、１時間程度加水分解処理を行う。加水分解処理を過剰であると本発明のアミノ基含有物質固定用担体の強度が低下する一方、加水分解処理が不十分であるとアミド結合の開裂によって生じるカルボキシル基及びアミノ基の量が不十分となるが、上記反応条件によれば、アミノ基含有物質固定用担体の強度を保持したまま十分量のカルボキシル基及びアミノ基をアミノ基含有物質固定用担体表面に形成させることができる。
糸状、紐状又はテープ状等の細長形状に代表される、軸部材に巻装可能な形状を有する原料部材を用いれば、酸又は塩基を含有する溶液中に、原料部材を連続的に通過させることにより（すなわち原料部材を上記溶液に連続的に浸漬させることにより）、原料部材に効率よく加水分解処理を施すことができる。例えば、図７に示すように、糸状、紐状又はテープ状等の細長形状を有する原料部材４を、容器１に収容された酸又は塩基を含有する溶液２中に、４つのローラー３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄを利用して連続的に浸漬させることにより、原料部材４に連続的に加水分解処理を施すことができる。容器１中に収容された溶液２中を通過した原料部材４には溶液２が付着しており、そのままの状態では加水分解が必要以上に進行するおそれがある。そこで、図７に示すように、溶液２中を通過した原料部材４を、容器５に収容された洗浄水６中に、４つのローラー７ａ，７ｂ，７ｃ，７ｄを利用して連続的に浸漬させることにより、原料部材４に付着した溶液２を洗い落とし、原料部材４の加水分解を停止させる。
上記のようにして原料部材に加水分解処理を施すことにより、原料部材表面のポリアミドが主鎖中に有するアミド結合は、カルボキシル基とアミノ基とに開裂する。加水分解処理後、アミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基又はアミノ基に適当な誘導化処理を施すことにより、カルボキシル基又はアミノ基を適当な誘導基に変換してもよい。
アミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基に施す誘導化処理及びこれによって生じる誘導基の種類は、誘導基がアミノ基との反応性を有する限り特に限定されるものではない。すなわち、本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面のカルボキシル基は、固定化されるべきアミノ基含有物質が有するアミノ基と反応し、アミド結合を介してアミノ基含有物質を本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面に固定化する役割を果たすので、カルボキシル基の誘導基は、アミノ基と反応してアミド結合を形成し得るものであれば特に限定されるものではない。誘導化処理及び誘導基の具体例としては、カルボキシル基のハロゲン化によって生じる誘導基−ＣＯＸ（Ｘはハロゲンを表す。）、カルボキシル基とアミノカルボン酸ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは任意の自然数であり、通常は２〜１２の自然数である。）との反応によって生じる誘導基−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ等が挙げられる。
また、アミド結合の開裂によって生じたアミノ基に施す誘導化処理及びこれによって生じる誘導基の種類は、誘導基がカルボキシル基との反応性を有しない限り特に限定されるものではない。すなわち、本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面へのアミノ基含有物質の固定化は、本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面のカルボキシル基を活性化し、活性化されたカルボキシル基と固定化されるべきアミノ基含有物質が有するアミノ基とを反応させることにより行われるが、このとき、本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面にアミド結合の開裂によって生じたアミノ基が存在していると、このアミノ基が活性化されたカルボキシル基と反応し、本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面へのアミノ基含有物質の固定化が阻害されるおそれがある。したがって、アミノ基の誘導基は、カルボキシル基との反応性を有しないものであれば特に限定されるものではない。誘導化処理の具体例としては、例えば、アミノ基の不活性化、アミノ基のカルボキシル基又はその誘導基への変換等が挙げられる。アミノ基の不活性化の具体例としては、アミノ基のアセチル化が挙げられ、これによって誘導基−ＮＨＣＯＣＨ３が生じる。また、アミノ基のカルボキシル基への変換は、アミノ基に環状酸無水物を反応させることによって行うことができ、こうして生じたカルボキシル基に上記に例示した誘導化処理を施すことによってカルボキシル基の誘導基に変換することができる。アミノ基をカルボキシル基又はその誘導基へ変換することによって、より多くのアミノ基含有物質を本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面に固定化することが可能となる。
アミノ基のカルボキシル基への変換の際に用いる環状酸無水物としては、例えば、無水マロン酸、無水シュウ酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水アジピン酸等が挙げられ、これらのうち好ましい環状酸無水物としては無水コハク酸が挙げられる。アミノ基と無水マロン酸、無水シュウ酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水アジピン酸との反応によって、それぞれ、誘導基−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯ−ＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨが生じる。
アミノ基のカルボキシル基への変換は、例えば、表面にアミノ基を有するアミノ基含有物質固定用担体を、０．８Ｍ無水コハク酸を含有する緩衝液（例えばリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ６．０））を用いて、室温で一晩処理することにより行うことができる。アミノ基のカルボキシル基への変換は、ニンヒドリン試薬で確認することができる（未反応のアミノ基が存在すると青色を呈する）。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体表面のカルボキシル基又はその誘導基と、固定化されるべきアミノ基含有物質のアミノ基とを反応させることによって、当該アミノ基含有物質を、本発明のアミノ基含有物質固定用担体の表面にアミド結合を介して固定化することができる。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体に固定化されるアミノ基含有物質の種類は、アミノ基を含有する限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、アミノ基を含有する核酸タンパク質等が挙げられる。
核酸を構成するヌクレオチドに、アミノ基を有するヌクレオチド（アデニル酸、シチジル酸、グアニル酸、デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸、デオキシグアニル酸）が含まれていれば、当該核酸はアミノ基を含有するので、アミノ基の人為的な導入は特に必要ではないが（もちろんアミノ基を人為的に導入してもよい）、このようなヌクレオチドを含んでいない場合には、アミノ基を人為的に導入することができる。アミノ基の人為的な導入は、例えば、化学的修飾によるアミノ化（例えばアミノアルキル基の導入）、ＤＮＡリガーゼを用いたアミノ化リンカーの付加反応等によって行うことができる。標的核酸とのハイブリダイズ効率を向上させる点から、本発明の担体に固定化される核酸が５’末端若しくは３’末端又はこれらの近傍にアミノ基を有しており、それらのアミノ基を介して本発明の担体表面に固定化されていることが好ましい。なお、核酸は、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのいずれであってもよく、核酸を構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであってもよいしリボヌクレオチドであってもよい。すなわち、核酸はＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよい。また、その塩基配列や塩基長は特に限定されるものではなく、標的核酸とハイブリダイズし得るように塩基配列や塩基長が選択される。核酸は二本鎖の状態で固定化されていても一本鎖の状態で固定化されていてもよい。
タンパク質のＮ末端が遊離のアミノ基となっていれば、当該タンパク質はアミノ基を含有するので、アミノ基の人為的な導入は特に必要ではないが（もちろんアミノ基を人為的に導入してもよい）、Ｎ末端が遊離のアミノ基となっていない場合には、化学的修飾によるアミノ化等によってアミノ基を人為的に導入することができる。
固定化すべきアミノ基含有物質が有するアミノ基と反応するアミノ基含有物質固定用担体表面のカルボキシル基又はその誘導基には、アミド結合の開裂によって生じたカルボキシル基又はその誘導基と、アミド結合の開裂によって生じたアミノ基の変換によって生じたカルボキシル基又はその誘導基の両者が含まれる。アミノ基含有物質固定用担体表面にアミド結合の開裂によって生じたアミノ基が存在していると、このアミノ基が活性化されたカルボキシル基と反応し、アミノ基含有物質固定用担体表面へのアミノ基含有物質の固定化が阻害されるので、アミノ基含有物質固定用担体表面へのアミノ基含有物質の固定化にあたり、アミノ基含有物質固定用担体表面のアミノ基をカルボキシル基又はその誘導基へ変換しておくことが好ましい。これによって、アミノ基含有物質固定用担体表面へのアミノ基含有物質の固定化が阻害されないばかりでなく、アミノ基含有物質固定用担体表面へのより多くのアミノ基含有物質の固定化が可能となる。また、アミノ基含有物質固定用担体表面へのアミノ基含有物質の固定化にあたり、アミノ基含有物質固定用担体表面のアミノ基を不活性化させておいてもよい。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体がその表面に有するカルボキシル基又はその誘導基と、アミノ基含有物質が有するアミノ基とを反応させる際には、カルボキシル基又はその誘導基を活性化させる。このような活性化は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）等のカルボジイミド類；ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシフタルイミド等のヒドロキシイミド類；塩化チオニル、オキサリルクロリド等の塩化物；ウッドワード試薬Ｋ，Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）等の水溶性の脱水縮合剤を用いて行うことができる。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体が表面に有するカルボキシル基又はその誘導基と、固定化すべきアミノ基含有物質が有するアミノ基との反応は、具体的には次のようにして行うことができる。表面にカルボキシル基又はその誘導基を有するアミノ基含有物質固定用担体を、２０％１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド水溶液で５分間程度処理し、カルボキシル基又はその誘導基を活性化させた後、水又は緩衝液で洗浄して過剰の試薬を除去する。次いで、固定化すべきアミノ基含有物質を含有する緩衝液（例えば重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４））を加えて１５分間程度処理し、活性化カルボキシル基と、固定化すべきアミノ基含有物質が有するアミノ基とを反応させる。次いで、１％カゼイン含有ＰＢＳ緩衝液（又は５％ＳＤＳ−１×ＳＳＣ、若しくは１×Ｄｅｎｈａｒｄ溶液−２×ＳＳＣ）を加え、残存する活性化カルボキシル基をブロックする。
上記のようにして、固定化すべきアミノ基含有物質がアミド結合を介して表面に固定化されたアミノ基含有物質固定用担体が得られる。このようなアミノ基含有物質固定用担体においては、アミノ基含有物質がアミド結合（共有結合）を介してアミノ基含有物質固定用担体表面に固定化されているので、アミノ基含有物質がアミノ基含有物質固定用担体表面から脱落するおそれがない。したがって、アミノ基含有物質固定用担体表面に核酸やタンパク質等のアミノ基含有物質を固定し、これを軸部材に巻装して作製したＤＮＡアレイやプロテインアレイを利用することにより、標的核酸や標的タンパク質の検出、分離、スクリーニング等を容易かつ効率よく行うことができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
〔実施例１〕
ナイロン６で構成されるナイロン糸（平均径１００μｍ）を４０℃で所定時間、２Ｎの塩酸の存在下で加水分解処理し、ナイロン糸表面のアミド結合をカルボキシル基とアミノ基とに開裂させた。加水分解時間は０分、３０分、６０分、９０分、１２０分とし、それぞれＩ〜Ｖ群とした。
Ｉ〜Ｖ群の各ナイロン糸を水で３回洗浄した後、室温で５分間、２０％ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）によって処理し、ナイロン糸表面のカルボキシル基を活性化した。このナイロン糸を直接、２００ｍＭのプローブ（５’末端にアミノリンカーを導入したアミノ化ＤＮＡ）を含有する０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５）に加え、１５分間反応させた。なお、プローブの塩基配列は５’−ａｇｔｇｇａｇｇｔｃａａｃｇａ−３’である。
プローブと反応させたＩ〜Ｖ群の各ナイロン糸を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、残存する活性化カルボキシル基をブロックし、使用するまで４℃で保存しておいた。
プローブと反応させたＩ〜Ｖ群の各ナイロン糸を、５００ｎＭの標的核酸（ビオチン化ＤＮＡ）溶液２０μＬと１５分間反応させた。なお、標的核酸の塩基配列は、５’−ｔｃｇｔｔｇａｃｃｔｃｃａｃｔ−３’である。
次いで、Ｉ〜Ｖ群の各ナイロン糸を、１００倍希釈のアビジン化アルカリホスファターゼ溶液と１５分間反応させた後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで５回洗浄し、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）溶液１００μＬを加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、０．６ｍＬの水を加え、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果を図１に示す。
図１に示すように、標的核酸の存在下では、加水分解処理時間の延長に伴って吸光度が増加し、加水分解処理時間が６０分を越えた辺りからプラトーに達した。この結果から、アミド結合の開裂によって生じたナイロン糸表面のカルボキシル基と、プローブのアミノ基とが反応し、プローブがアミド結合を介してナイロン糸表面に固定化されたことが確認された。また、ナイロン糸の加水分解処理時間は、２Ｎの塩酸、４０℃の条件下では６０分程度が適当であることが判明した。
〔実施例２〕
実施例１において反応時間を６０分に特定し、プローブの濃度とともに標的核酸の濃度を変化させて、実施例１と同様に吸光度測定を行った。
その結果を図２に示す。
図２に示すように、プローブの濃度の増加に伴って、プローブと反応し得る標的核酸の濃度も増加した。この結果から、標的核酸はナイロン糸表面に非特異的に吸着しているのではなくナイロン糸に固定化されたプローブと反応（ハイブリダイズ）していること、すなわち、ナイロン糸表面に固定化されたプローブを用いて標的核酸を分離、検出等できることが確認された。
〔実施例３〕
実施例１において反応時間を６０分に特定し、塩酸の濃度を０Ｎ、１Ｎ、２Ｎ、２．５Ｎ、３Ｎと変化させるとともに、アルカリホスファターゼの基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）を用いて３７℃で３０分間インキュベートした後、各ナイロン糸の所定箇所で生じた色の濃淡を検出イメージソフト（ソフト名：Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ，販売元：Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってスコア化した。
その結果を図３に示す。なお、図３中のカッコ内の数値が上記ソフト処理により得られたスコアであり、スコアが大きいほど色が濃いこと（すなわち、より多くの標的核酸がナイロン糸に結合していること）を示す。
図３に示すように、塩酸の濃度が２Ｎ以上であると十分な濃さが得られた。この結果から、ナイロン糸の加水分解処理に用いる塩酸の濃度は２Ｎ以上が適当であることが判明した。但し、塩酸の濃度が２．５Ｎを越えると、ナイロン糸の強度が低下するので、塩酸の濃度は２．５Ｎが適当であると考えられる。実施例１の結果と併せると、ナイロン糸の加水分解処理は、２．５Ｎの塩酸を用いて４０℃、１時間程度行うことが適当であると考えられる。
〔実施例４〕
実施例１と同様のナイロン糸を、２．５Ｎの塩酸を用いて、３７℃、１時間加水分解処理した。加水分解処理を施したナイロン糸を、０．８３Ｍ無水コハク酸を含有する０．５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）中に浸漬して一晩放置し、ナイロン糸表面のアミノ基をカルボキシル基に変換させた。
その後、ナイロン糸を水で３回洗浄し、室温で６分間、２０％ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）によって処理し、ナイロン糸表面のカルボキシル基を活性化した。このナイロン糸に、１６６μＭのプローブ（５’末端にアミノリンカーを導入したアミノ化ＤＮＡ）を含有する炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）約０．０５μＬをスポッティングし、５分間乾燥させた。なお、プローブの塩基配列は５’−ａｇｔｇｇａｇｇｔｃａａｃｇａ−３’である。
プローブと反応させたナイロン糸を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、残存する活性化カルボキシル基をブロックし、使用するまで４℃で保存しておいた。
プローブと反応させたナイロン糸を、５００ｎＭの標的核酸（ビオチン化ＤＮＡ）溶液２０μＬと１５分間反応させた後、１００倍希釈のアビジン化アルカリホスファターゼ溶液と１５分間反応させた。なお、標的核酸の塩基配列は、５’−ｔｃｇｔｔｇａｃｃｔｃｃａｃｔ−３’である。
次いで、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで５回洗浄し、アルカリホスファターゼの基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）を用いて３７℃で３０分間インキュベートした後、各ナイロン糸の所定箇所で生じた色の濃淡を検出イメージソフト（ソフト名：Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ，販売元：Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってスコア化した。
無水コハク酸による処理を除いて上記と同様の操作及び測定を行い、無水コハク酸処理を施した場合と施さなかった場合とで、上記ソフト処理で得られたスコアを比較した。
その結果を図４に示す。図４中、（ａ）は無水コハク酸処理を施したナイロン糸の発色状態を示し、（ｂ）はナイロン糸の１つのスポット（（ａ）において左から２番目のスポット）を左から右にスキャンしたときのスコアを示す。また、（ｃ）は無水コハク酸処理を施さなかったナイロン糸の発色状態を示し、（ｄ）はナイロン糸の１つのスポット（（ｃ）において左から２番目のスポット）を左から右にスキャンしたときのスコアを示す。
図４に示すように、無水コハク酸処理を施した場合の方が無水コハク酸処理を施さなかった場合よりもスコアが大きかった（すなわち色が濃かった）。この結果から、アミド結合の開裂によって生じたナイロン糸表面のアミノ基を、無水コハク酸処理によってカルボキシル基に変換することにより、ナイロン糸表面により多量のプローブ（アミノ化ＤＮＡ）を固定できることが判明した。
〔実施例５〕
実施例４において無水コハク酸処理を施し、プローブを固定化したナイロン糸に、各種濃度（６９ｎＭ，１３８ｎＭ，２７５ｎＭ，５５０ｎＭ，１．１μＭ）の標的核酸を反応させ、各ナイロン糸の所定箇所で生じた色の濃淡を検出イメージソフト（ソフト名：Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ，販売元：Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってスコア化した。
その結果を図５に示す。なお、図５中、（ａ）は各種濃度の標的核酸を反応させた各ナイロン糸の発色状態を示し、（ｂ）は各ナイロン糸の１つのスポット（（ａ）において四角で囲まれているスポット）におけるスコアを示す。図５（ｂ）の各ピークは左から順に１．１μＭ，５５０ｎＭ，２７５ｎＭ，１３８ｎＭ，６９ｎＭの濃度の標的核酸と反応させたときのスコアである。図５（ａ）の最も下のナイロン糸は、６９ｎＭの標的核酸を反応させたナイロン糸のスポット間の部分（すなわち、プローブが固定化されていない部分）であり、図５（ｂ）の最も右側のピークは当該部分におけるスコアである。
図５に示すように、標的核酸の濃度の増加に伴ってスコアが増加した。この結果から、標的核酸はナイロン糸表面に非特異的に吸着しているのではなくナイロン糸に固定化されたプローブと反応（ハイブリダイズ）していること、すなわち、ナイロン糸表面に固定化されたプローブを用いて標的核酸を分離、検出等できることが確認された。
〔実施例６〕
４Ｎの塩酸で加水分解処理して得られた白濁半透明ナイロン糸と、２．５Ｎの塩酸で３７℃、１時間加水分解処理して得られた透明ナイロン糸に、それぞれ実施例４と同様にしてプローブを固定化し、各種濃度（１１ｎＭ，１１４ｎＭ，２２８ｎＭ）の標的核酸（Ｃｙ５で標識したＤＮＡ）を１０分間、２×ＳＳＣ，５％ＳＤＳの条件下でハイブリダイズさせた後、蛍光強度を検出した。
その結果を図６に示す。なお、図６中、（ａ）は白濁半透明ナイロン糸を用いたときの結果であり、（ｂ）は透明ナイロン糸を用いたときの結果である。
図６に示すように、白濁半透明ナイロン糸はバックグラウンドが大きいので、標的核酸の濃度が低いときにはバックグラウンドが小さい透明ナイロン糸を用いることが好ましく、標的核酸の濃度が大きいときには、白濁半透明ナイロン糸及び透明ナイロン糸のいずれも用いることができることが判明した。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、アミノ基含有物質をその表面に共有結合（アミド結合）を介して固定化し得るアミノ基含有物質固定用担体、アミノ基含有物質をその表面に共有結合（アミド結合）を介して固定化したアミノ基含有物質固定化担体、並びに担体表面へ共有結合（アミド結合）を介してアミノ基含有物質を固定化できる方法が提供される。
本発明のアミノ基含有物質固定用担体及び固定化方法によれば、ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じるカルボキシル基若しくはアミノ基又はこれらの誘導基を利用することによって、アミノ基含有物質固定用担体表面へアミノ基含有物質を簡便かつ効率よく固定化することができる。特に、ポリアミドがその主鎖中に有するアミド結合の開裂によって生じるアミノ基をカルボキシル基又はその誘導基に変換することによって、アミノ基含有物質固定用担体表面により多くのアミノ基含有物質を固定化することができる。本発明のアミノ基含有物質固定化担体は、本発明のアミノ基含有物質固定用担体の表面にアミノ基含有物質を固定化されたものであり、固定化されたアミノ基含有物質はアミド結合（共有結合）を介して担体表面に固定化されているので、アミノ基含有物質が担体表面から脱落するおそれがない。したがって、本発明のアミノ基含有物質固定化担体を用いることにより、核酸やタンパク質等のアミノ基含有物質の検出、分離等を容易かつ効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、４０℃で所定時間、２Ｎ塩酸を用いて加水分解処理したナイロン糸にプローブを固定化した後、これを標的核酸と反応させたときの吸光度の変化を示す図である。
図２は、４０℃で１時間、２Ｎ塩酸を用いて加水分解処理したナイロン糸に各種濃度のプローブを固定化した後、これを各種濃度の標的核酸と反応させたときの吸光度の変化を示す図である。
図３は、４０℃で１時間、各種濃度の塩酸を用いて加水分解処理したナイロン糸にプローブを固定化した後、これを標的核酸と反応させたときの発色の測定結果を示す図である。
図４（ａ）及び（ｂ）は、加水分解処理後に無水コハク酸処理を施したナイロン糸にプローブを固定化した後、これを標的核酸と反応させたときの発色の測定結果を示す図であり、図４（ｃ）及び（ｄ）は、加水分解処理後に無水コハク酸処理を施すことなくプローブを固定化した後、これを標的核酸と反応させたときの発色の測定結果を示す図である。
図５（ａ）及び（ｂ）は、加水分解処理後に無水コハク酸処理を施したナイロン糸にプローブを固定化した後、これを各種濃度の標的核酸と反応させたときの発色の測定結果を示す図である。
図６は、４Ｎの塩酸で加水分解処理して得られた白濁半透明ナイロン糸と、２．５Ｎの塩酸で３７℃、１時間加水分解処理して得られた透明ナイロン糸に、それぞれプローブを固定化した後、各種濃度の標的核酸を反応させたときの蛍光強度の測定結果を示す図である。
図７は、紐状又はテープ状等の細長形状を有する原料部材を加水分解処理する際に用いる装置の一実施形態を示した一部断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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