(57)【要約】新規ガレクチン、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び形質転換体、前記ガレクチンに対する抗体、並びに前記ガレクチンの活性を修飾する物質のスクリーニング方法を開示する。前記ガレクチン、ポリヌクレオチド、又はベクターによれば、例えば、ダニ駆除、又はダニ媒介性感染症（例えば、リケッチア症、フィラリア症、Ｑ熱、アフリカ回帰熱、又はウイルス性脳炎など）の治療又は予防が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を示すポリペプチド；又は
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを含む、医薬。
【請求項７】
ダニに対するワクチンである、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを、ダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、ダニ駆除方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを、ダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、ダニ媒介性感染症の治療又は予防方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体又はその断片。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのガレクチン活性を分析する工程
を含む、前記ポリペプチドのガレクチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ダニのガレクチンに関する。
背景技術
ダニ類によって動物又は人に直接又は間接的に甚大な被害がもたらされている。
前者の直接的被害には、咬着と吸血による掻痒や失血、あるいは、吸血時の分泌睡液や腸内容の嘔吐によるアレルギー疾患やダニ麻痺の招来が知られている。後者の間接的被害には、ウイルス、リケッチア、細菌、スピロヘータ、原虫、又は線虫などによる様々な家畜でのその関連疾病を挙げることができ、その損害は、国内はもとより海外でも莫大な金額にのぼる。また、最近は、ダニ類によるいわゆる新興又は再興の人獣共通感染症の脅威が大きな社会問題になりつつある。
そのため、各国でダニ駆除を目的とした各種制圧方法がとられており、その中心をなしているのが、有機リン、カーバメイト、ピレスロイド系、又はマクロライド系抗生物質などの薬剤の利用である。しかしながら、薬剤の連続的使用又は大量使用による、いわゆる薬剤耐性がいずれの薬剤に対しても確立され、殺ダニ効果の消失するものも少なくない。更に、薬剤の使用には常に動物への副作用を考えなくてはならず、同時に、食と環境の安全性を脅かす薬物残留問題があり、消費者から敬遠される傾向にある。その上、薬剤の使用には有効性や適用範囲に加えて、膨大な開発コストの面からも限界が生じつつあり、２１世紀における人畜のダニ寄生と媒介疾病の被害を薬剤使用によって防ぐことは非常に難しい状況にある。
ダニを含む吸血性節足動物でも、ウイルスや細菌感染症に見られるような宿主の再感染防御能の獲得が知られており、古くから実験室段階で実証されている［Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｎａｔ．Ｉｎｓｔ．Ａｎｉｍ．Ｈｌｔｈ．Ｑｕａｒｔ．（Ｔｏｋｙｏ），１８，２７−３８（１９７８）］。近年の遺伝子組換え技術の発達によって、その感染防御抗原、あるいは、吸血性節足動物に特有な変態関連酵素などをコードする遺伝子クローニングが各国で精力的に進められ、安全なワクチンタンパク質や化学療法剤の製造が試みられている。
しかしながら、実用化に至っているのは、Ｗｉｌｌａｄｅｓｅｎ［Ｗｉｌｌａｄｅｓｅｎ及びＪｏｇｅｊａｎ，Ｐｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ．１５，２５８−２６２（１９９９）］らによって開発された１宿主性のマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ）に対してのみであって、南欧やアフリカ大陸に広く分布し、リケッチア症、フィラリア症、Ｑ熱、アフリカ回帰熱、又はウイルス性脳炎などの人獣共通感染症の媒介者となっているオルニソドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａ）に対しては、ワクチン候補の探索段階であり、早急なワクチン開発とその実用化が強く望まれている。
また、ダニの種類を問わないワクチンの開発とその実用化が強く望まれているもののダニ全般に対する有効なワクチンはまだ開発されていない。その大きな原因として  ダニの飼育が困難なことや、寄生防御に関わる有効抗原の検索が遅れていることが挙げられる。このような背景から、オルニソドロス・モウバタの主要抗原の検索、並びに前記抗原又はその組換えタンパク質を抗原とした有効な組換えワクチンの開発が望まれている。
一方、人医療面において、ガレクチンが炎症組織や腫瘍組織で過発現することが分かっており、炎症や腫瘍のマーカーとして注目されている。また、Ｔ細胞やＢ細胞のアポトーシスに関わり、自己認識において重要な役割を担っていることも知られており、ガレクチンやガレクチン阻害薬が自己免疫疾患における免疫抑制剤として、抗炎症薬として、転移抑制剤として、治療薬開発が試みられており、医療薬としての期待は計り知れない。
発明の開示
本発明者は、ダニ、特にはオルニソドロス・モウバタのワクチン候補として有用な新規ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを取得することを目的として、鋭意探索したところ、新規のガレクチン及びそれをコードするポリヌクレオチドを見出した。更に、このガレクチンをマウスに接種したところ、抗体産生の誘導を確認することができ、前記ガレクチンがダニワクチンとしての有用性を有することを確認した。本発明は、このような知見に基づくものである。  従って、本発明の課題は、ダニワクチンとして有用な新規ガレクチン及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
前記課題は、本発明による、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド；又は（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドによって解決することができる。
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体に関する。
また、本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記ポリペプチドを製造する方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド若しくはその断片、前記ポリヌクレオチド、又は前記ベクターを含む、医薬に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド若しくはその断片、前記ポリヌクレオチド、又は前記ベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド若しくはその断片、前記ポリヌクレオチド、又は前記ベクターを、ダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、ダニ駆除方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド若しくはその断片、前記ポリヌクレオチド、又は前記ベクターを、ダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、ダニ媒介性感染症の治療又は予防方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドに対する抗体又はその断片に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのガレクチン活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのガレクチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
本明細書において「ガレクチン活性」とは、β−ガラクトシドと結合する活性を意味する。ポリペプチドがガレクチン活性を有するか否かは、例えば、試験ポリペプチドとガラクトース又はその誘導体とを接触させ、前記ガラクトース又はその誘導体との結合の有無及び／又は程度を分析する公知のガレクチン活性測定法により容易に判定することができ、特に限定されるものではないが、後述の実施例１２に記載の方法により判定することが好ましい。
具体的には、例えば、ガラクトース又はその誘導体を結合させたアフィニティーカラム（例えば、ラクトシルセファロースカラム）に、試験ポリペプチドを通過させ、前記カラムに試験ポリペプチドが吸着するか否かを分析する。吸着した場合には、前記試験ポリペプチドがガレクチン活性を有すると判定することができ、吸着しない場合には、前記試験ポリペプチドがガレクチン活性を有しないと判定することができる。
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド」としては、例えば、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、ガレクチン活性を有する融合ポリペプチド；あるいは、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、融合用パートナーとの融合ポリペプチドであって、しかも、ガレクチン活性を有する融合ポリペプチド
を挙げることができる。
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
また、前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ  α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを用いることができる。
更に、前記融合ポリペプチドにおいては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと前記マーカー配列又は融合用パートナーとの間に、限定分解するタンパク質分解酵素（例えば、トロンビン又はファクターＸａ）で切断することができるアミノ酸配列を適宜導入することもできる。
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、全体として１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もオルニソドロス・モウバタに限定されない。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのオルニソドロス・モウバタにおける変異体が含まれるだけでなく、オルニソドロス・モウバタ以外の生物（例えば、その他のヒメダニ類、又はマダニ類）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、オルニソドロス・モウバタ由来の変異体、あるいは、オルニソドロス・モウバタ以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを元にして、遺伝子工学的に、コードするアミノ酸配列を人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのオルニソドロス・モウバタにおける変異体、あるいは、オルニソドロス・モウバタ以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における第２４番〜第１０２５番の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従って実施することが可能である。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物（例えば、その他のヒメダニ類、又はマダニ類）由来の試料（例えば、全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例６に記載の方法により、ガレクチン活性を有することを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例６に記載の方法により、ガレクチン活性を有することを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではない。本発明の相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができる。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３，２３７−２４４，１９８８；並びにＴｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０，１９９４）により、デフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値を意味する。
これらの本発明の新規ポリペプチドは、種々の公知の方法によって製造することができ、例えば、本発明の前記ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する本発明の形質転換体（すなわち、本発明のポリヌクレオチドを含む形質転換体）を、本発明による新規ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、ポリペプチドの分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的ポリペプチドを分離及び精製することにより調製することができる。前記の分離及び精製方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
また、本発明には、本発明によるポリペプチドの断片も含まれる。本発明による前記断片は、本発明による医薬の有効成分として、あるいは、本発明の抗体を調製するための抗原として有用である。
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列における第２４番〜第１０２５番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
また、本発明には、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な塩基配列としては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列又はその部分配列に、相捕的な塩基配列であることが好ましく、配列番号１で表される塩基配列における第２４番〜第１０２５番の塩基からなる配列又はその部分配列に、相捕的な塩基配列であることがより好ましい。
［３］本発明のベクター及び形質転換体
本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
また、本発明の形質転換体も、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明による前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、本発明によるポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明によるポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明による前記ベクターにより、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
前記宿主細胞としては、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、又はｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹ又はｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３又はｐＭＡＭｎｅｏを；ＨＥＫ−２９３細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＣＯＳ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば、ｐＢＫ２８３）を挙げることができる。更に、公知の発現ベクターとしては、遺伝子治療用のベクターとして使用することのできるウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセンダイウイルス等を挙げることができる。
［４］本発明の医薬
本発明の医薬（好ましくはダニに対するワクチン）は、有効成分として、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む。すなわち、本発明においては、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ダニ駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。
本発明の医薬における前記有効成分である、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターをダニワクチンとして投与すると、抗体産生を誘導することができ、宿主の再感染防御能を介してダニを駆除することができる。また、その結果として、ダニ媒介性感染症（例えば、リケッチア症、フィラリア症、Ｑ熱、アフリカ回帰熱、又はウイルス性脳炎など）の治療又は予防が可能である。
すなわち、本発明の医薬組成物（好ましくは、ダニ駆除用医薬組成物、あるいは、ダニ媒介性感染症の治療又は予防用医薬組成物）は、有効成分としての本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む。本発明における有効成分である、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターは、前記医薬（好ましくは、ダニ駆除用医薬、あるいは、ダニ媒介性感染症の治療又は予防用医薬）を製造するために使用することができる。
本発明の医薬をダニワクチンとして使用する場合、本発明のポリペプチドの断片としては、投与対象に投与した場合に、前記断片に対して免疫を誘導するのに充分な断片である限り、特に限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択することができる。
本発明の医薬（特にはダニワクチン）では、例えば、本発明のポリペプチドをアジュバント等と混合して、ダニに対するワクチンとして、適当な間隔で動物（例えば、家畜等）に接種することができる。あるいは、本発明のポリペプチドを直接、適当な溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできるし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用することもできる。また、必要に応じて、本発明のポリペプチドに薬学的に許容し得る担体を添加し、例えば、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、坐剤、噴霧剤、又はパップ剤等の適当な剤型にして使用することができる。
薬学的に許容し得る担体には、当業者には周知の溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、及び緩衝剤等が含まれる。本発明の医薬に含有される本発明のポリペプチドは、このような剤型とした場合、例えば、投与対象の年齢、性別、疾患の種類、又は程度等に応じて、その投与方法及び投与量を適宜設定して使用することができる。
経口投与には舌下投与を含む。非経口投与としては、例えば、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、動脈内投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与することができる。
また、ガレクチンは、炎症組織や腫瘍組織で過発現すること、そして、Ｔ細胞やＢ細胞のアポトーシスに関わり、自己認識において重要な役割を担っていることが知られている［Ｈ．Ｌｅｆｆｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９−１９（１９９７）］。従って、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の抗体又はその断片、あるいは、後述の本発明のスクリーニング方法により選択されるガレクチン活性の修飾（例えば、抑制又は促進）物質は、自己免疫疾患における免疫抑制剤、抗炎症薬、若しくは転移抑制剤、又はアポトーシスの誘導剤若しくは抑制剤の有効成分として有用である。
本発明には、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の抗体又はその断片、あるいは、後述の本発明のスクリーニング方法により選択されるガレクチン活性の修飾（例えば、抑制又は促進）物質を有効成分として含有する、自己免疫疾患における免疫抑制剤、抗炎症薬、若しくは転移抑制剤、又はアポトーシスの誘導剤若しくは抑制剤が含まれる。
［５］本発明の抗体又はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
［６］本発明のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドを用いると、試験物質が、本発明のポリペプチドのガレクチン活性を修飾（例えば、抑制又は促進）するか否かをスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法においては、試験ポリペプチドとガラクトース又はその誘導体とを接触させる代わりに、本発明のポリペプチドとガラクトース又はその誘導体と試験物質とを接触させること以外は、先述のガレクチン活性の判定方法と同様にして実施することができる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法では、本発明のポリペプチドとガラクトース又はその誘導体と試験物質とを接触させ、前記試験物質の存在下において、本発明のポリペプチドと前記ガラクトース又はその誘導体とが結合するか否か（あるいは、その結合の程度）を分析することにより、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのガレクチン活性を修飾するか否かを判断する。本発明のポリペプチドと前記ガラクトース又はその誘導体とが結合しないか、あるいは、前記結合の程度が減少する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのガレクチン活性を抑制すると判断することができる。一方、本発明のポリペプチドと前記ガラクトース又はその誘導体との結合の程度が上昇する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのガレクチン活性を促進すると判断することができる。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例においては、各種分子生物学、ダニ学、節足動物学、免疫学、及び生化学的な技術を用いた。これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９やその関連書を参考にした。また、ＤＮＡ解析ソフトとしては、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社）を使用した。
実施例１：抗ダニヘモリンフモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得
飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａ）第四若ダニよりヘモリンフを回収し、そのホモジネートをソニケーションすることにより、ヘモリンフ溶液を得た。ヘモリンフ溶液２００μＬ（タンパク質量として１００μｇ）と、フロイント完全アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ；Ｄｉｆｃｏ社）２００μＬとを混合した後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌）に腹腔内接種した。腹腔内接種から１４、２１、２８、４２、及び５６日経過後に、それぞれ、ヘモリンフ溶液２００μＬ（タンパク質量として１００μｇ）をフロイント不完全アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ；Ｄｉｆｃｏ社）と混合し、追加接種を行なった。腹腔内接種から７４日目に、ヘモリンフ溶液２００μＬ（タンパク質量として１００μｇ）を尾静脈から最終接種した後、その３日目にマウスより脾臓を摘出した。
採取した脾臓細胞と、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞とを、ポリエチレングリコールを用いて融合させた。融合細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）／５％ブライクローン（ＢｒｉＣｌｏｎｅ；Ａｒｃｈ  Ｐｏｒｔ  Ｌｔｄ．，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）／ＨＡＴ添加ＧＩＴ培地にて３７℃及び５％ＣＯ２条件下で培養した。培養上清を用いて、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフを抗原とした間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動［Ｌａｅｍｍｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０）］、及びイムノブロット法［Ｔｏｗｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４（１９７９）］を用いたウエスタンブロッティングにより抗体産生クローンのスクリーニングを行ない、シングルクローンになるまでスクリーニング及び限界希釈を繰り返し、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
実施例２：新規のダニ・ガレクチンをコードする遺伝子ｎ４Ｅ１２−２の単離
飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニより、酸グアニジニウム（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）−フェノール−クロロホルム法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９（１９８７）］により、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ単離キット［Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（Ｓｕｐｅｒ），ｃｏｄｅ  Ｗ９０２１Ｂ；Ｔａｋａｒａ社］を用いて、前記キットに添付のプロトコールに従い、ポリＡ＋ＲＮＡを精製した。
以下に述べるｃＤＮＡライブラリーの構築、イムノスクリーニング、及びｃＤＮＡクローンのプラスミド化（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、全て、市販の試薬キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を用い、キットに添付のプロトコールに従って実施した。
すなわち、オルニソドロス・モウバタｍＲＮＡ５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２００４０１−５；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをセファロースＣＬ−２Ｂゲルカラムにてサイズ分画した後、ベクター（Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲ  Ｖｅｃｔｏｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３７２１１；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）に挿入し、パッケージング試薬（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）にてパッケージングを行なった。パッケージング産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株）に感染させ、約５０万個のｃＤＮＡクローンを含むライブラリーを得た。
実施例１で得られた飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフに対するモノクローナル抗体を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをイムノスクリーニングし、３つのオーバラップする陽性クローンを得た。これらの陽性クローンをインビボ切り出し（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）法にてプラスミド化（すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへ変換）した。
ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドをプラスミド精製キット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２１２５；Ｑｉａｇｅｎ社）にて精製した後に、シークエンスキット（Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４３０３１５３；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用い、前記キットに添付のプロトコールに従ってＰＣＲを行なった。続いて、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いてＰＣＲ産物を解析し、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
その結果、３つのクローン全てが同一遺伝子由来であることが判明した。その中で最も長いクローンを以後の解析に供した。
ｃＤＮＡの全長は１０９４ｂｐであり、その塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列であった。また、塩基配列中に、１００２ｂｐのオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列における第２４番〜第１０２５番の塩基からなる配列）を有していることが確認された。前記オープンリーディングフレームから推測されるタンパク質のアミノ酸配列は、３３３残基のアミノ酸からなる配列番号２で表されるアミノ酸配列であり、その推定分子量は３６．６ｋＤａであった。
以下、この遺伝子をｎ４Ｅ１２−２遺伝子と称する。ｎ４Ｅ１２−２遺伝子より予想されるアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴ法（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｎｇｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｑｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎより入手）にて相同性検索を行なったところ、これまでに報告されているガレクチンタンパク質に高い相同性を有することが確認された。例えば、マウスの前立腺癌抗原ガレクチンとの相同性は約２７％であった。
以下、ｎ４Ｅ１２−２遺伝子によりコードされるタンパク質を「ガレクチン」と称する。なお、前記タンパク質がガレクチンであることは、後述の実施例１１及び実施例１２にて確認した。
実施例３：ダニ・ガレクチン融合タンパク質の発現用ベクターの構築
実施例２で取得したオルニソドロス・モウバタｎ４Ｅ１２−２遺伝子を含むｃＤＮＡ断片が挿入されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び制限酵素ＸｈｏＩで消化することにより、ｎ４Ｅ１２−２遺伝子を含むｃＤＮＡ断片を切り出した。このＤＮＡ断片を、大腸菌発現用ベクターｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＥｃｏＲＩサイト及びＸｈｏＩサイトに挿入し、ガレクチンＯＲＦ断片がベクターのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と同一方向に挿入された組換えクローンを選択した。プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）にて組換えプラスミドｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３／ｎ４Ｅ１２−２を精製した。
実施例４：ダニ・ガレクチン組換えタンパク質の大腸菌による発現
実施例３で得られた組換えプラスミドにて、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を形質転換させた後、３７℃でアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。培養液のＯＤ６００ｎｍが０．３〜０．５に達した時点で、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．０１ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、更に３７℃で４時間培養を続けた。
ダニガレクチン組換えタンパク質の発現は、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動［Ｌａｅｍｍｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０）］を実施し、イムノブロット法［Ｔｏｗｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４（１９７９）］にてブロッティングを行なった後、アミドブラック染色で確認した。
その結果、約６３ｋＤａの組換えタンパク質の発現が認められ、ＧＳＴリーダータンパク質（２６ｋＤａ）とダニガレクチンタンパク質（３６．６ｋＤａ）との融合タンパク質であることが確認された（後述の図１参照）。
実施例５：ダニ・ガレクチン組換えタンパク質の精製及び抗血清の調製
実施例４で述べた方法により、大腸菌で発現させた組換えガレクチン融合タンパク質を、市販のキット（Ｂｕｌｋ  ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に添付のプロトコールに従って精製した。より具体的には、ＩＰＴＧで誘導した大腸菌を遠心により集菌し、得られたペレットをリゾチーム含有のＴＮＥ緩衝液でソニケーションした後、５０００ｒｐｍで遠心し、ペレットを得た。得られたペレット（非可溶性画分）をトリトンＸ−１００により可溶化し、５０００ｒｐｍで遠心し、上清を得た。この上清をグルタチオン樹脂に混合した後、５０００ｒｐｍで遠心し、得られたペレットを１６ｍｍｏｌ／Ｌグルタチオン溶液で溶出し、「可溶性画分」を精製した。
精製後の組換えガレクチン融合タンパク質の電気泳動像を図１に示す。なお、電気泳動、ブロッティング、及び染色は、実施例４と同様にして実施した。図１において、左端のレーンは、分子量マーカーの泳動結果であり、レーン１は、非可溶性画分の泳動結果であり、レーン２は、可溶性画分の泳動結果である。レーン２の右側の数値「６３」は、組換えガレクチン融合タンパク質の分子量（６３ｋＤａ）を意味する。
精製した組換えガレクチン融合タンパク質１００μｇを含む溶液５０μＬと、フロイント完全アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ；Ｄｉｆｃｏ社）５０μＬとを混合し、乳化したものを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢，雌）に腹腔内接種した。腹腔内接種から２週目、４週目、６週目、及び８週目に、それぞれ、組換えガレクチン融合タンパク質１００μｇと、タイターマックス（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ，Ｇｏｌｄ；ＣｙｔＲｘ社）５０μＬとを混合し、乳化したものを追加接種した。最終接種後から２週目に採血し、得られた血清を−３０℃に保存した。
実施例６：抗ダニヘモリンフモノクローナル抗体を用いるイムノブロット法によるネイティブ（天然型）ガレクチンの同定
本実施例では、実施例１で得られた飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフに対するモノクローナル抗体を用い、イムノブロット法［Ｔｏｗｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４（１９７９）］にて天然型ガレクチンタンパク質の同定を行なった。なお、試料としては、実施例１に記載の手順と同様にして調製した飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフ、及びダニ脂肪体ライセートを使用した。なお、ダニ脂肪体ライセートは、ダニをＰＢＳ（リン酸緩衝液）中で解剖して得られた脂肪体を含む気管を、ＰＢＳにてホモジナイズし、その後、氷冷しながらソニケーションを行なうことにより調製した。
結果を、図２のレーン５及び６に示す。なお、図２のレーン１〜４は、後述の実施例７の結果である。
図２において、レーン５は、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフの結果であり、レーン６は、脂肪体ライセートの結果である。レーン６の右側の数値「６３」及び「４３」は、それぞれ、組換えガレクチン融合タンパク質の分子量（６３ｋＤａ）及び天然型ガレクチンタンパク質の分子量（４３ｋＤａ）を意味する。
図２のレーン５及び６に示すように、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフ及び脂肪体ライセートにおいて、４３ｋＤａの特異的バンドが検出された。天然型ガレクチンタンパク質の分子量が推定理論値（３６．６ｋＤａ）より大きいのは、翻訳後の修飾の違いによるものと考えられる。
実施例７：組換えガレクチン融合タンパク質に対する抗ダニヘモリンフモノクローナル抗体の反応性の確認
本実施例では、イムノブロット法を用いて、実施例１で得られた飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフに対するモノクローナル抗体の、組換えガレクチン融合タンパク質に対する反応性を検討した。試料としては、プラスミドｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３／ｎ４Ｅ１２−２で形質転換した大腸菌（組換えガレクチン融合タンパク質を発現）由来の可溶性画分及び非可溶性画分（実施例５参照）、並びにベクターｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３で形質転換した大腸菌（ＧＳＴタンパク質を発現）由来の可溶性画分及び非可溶性画分を使用した。
結果を、図２のレーン１〜４に示す。
図２において、レーン１及び２は、それぞれ、ベクターｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３で形質転換した大腸菌（ＧＳＴタンパク質を発現）由来の可溶性画分及び非可溶性画分の泳動結果であり、レーン３及び４は、それぞれ、プラスミドｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３／ｎ４Ｅ１２−２で形質転換した大腸菌（組換えガレクチン融合タンパク質を発現）由来の可溶性画分及び非可溶性画分の泳動結果である。
図２のレーン４に示すように、組換えガレクチン融合タンパク質（約６３ｋＤａ）は、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフに対するモノクローナル抗体と反応することが確認された。この結果から、組換えガレクチン融合タンパク質は、ダニワクチン候補物質の一つであることが示された。なお、正常マウス血清と組換えガレクチン融合タンパク質との反応は認められなかった。
実施例８：抗組換えガレクチン融合タンパク質マウス血清を用いるイムノブロット法によるネイティブ（天然型）ガレクチンの同定
本実施例では、実施例５で得られた抗組換えガレクチン融合タンパク質マウス血清を用い、イムノブロット法［Ｔｏｗｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４（１９７９）］にて天然型ガレクチンタンパク質の同定を行なった。試料としては、実施例６で使用したのと同じ、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフ及び脂肪体ライセートを使用した。
結果を、図３のレーン２及び３に示す。なお、図３のレーン１及び４は、後述の実施例９の結果である。
図３において、レーン２は、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフの結果であり、レーン３は、脂肪体ライセートの結果である。また、レーン４の右側の数値「６３」及び「３７」は、それぞれ、組換えガレクチン融合タンパク質の分子量（６３ｋＤａ）及び天然型ガレクチンタンパク質の分子量（３７ｋＤａ）を意味する。
図３のレーン２及び３に示すように、飽血後６日目のオルニソドロス・モウバタ第四若ダニヘモリンフ及び脂肪体ライセートにおいて、３７ｋＤａ及び４３ｋＤａの特異的バンド２本が検出された。３７ｋＤａのバンドは、ガレクチンタンパク質の推定理論値（３６．６ｋＤａ）に一致した。なお、前記実施例６において、４３ｋＤａのバンドのみが検出され、３７ｋＤａのバンドが検出されなかったのは、電気泳動に用いたサンプル量が少なかったためと考えられる。
実施例９：組換えガレクチン融合タンパク質に対する抗組換えガレクチン融合タンパク質マウス血清の反応性の確認
本実施例では、イムノブロット法を用いて、実施例５で得られた抗組換えガレクチン融合タンパク質マウス血清の、組換えガレクチン融合タンパク質に対する反応性を検討した。試料としては、プラスミドｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３／ｎ４Ｅ１２−２で形質転換した大腸菌（組換えガレクチン融合タンパク質を発現）由来の精製した組換えガレクチン融合タンパク質（実施例５）、及びベクターｐＧＥＭＥＸ−４Ｔ−３で形質転換した大腸菌（ＧＳＴタンパク質を発現）由来の精製前「非可溶性分画」を使用した。
結果を、図３のレーン１及び４に示す。
図３において、レーン１は、精製した組換えガレクチン融合タンパク質の結果であり、レーン４は、精製前（非可溶性）ＧＳＴタンパク質の結果である。
図３のレーン１に示すように、組換えガレクチン融合タンパク質（約６３ｋＤａ）は、抗組換えガレクチン融合タンパク質マウス血清と反応することが確認された。この結果から、組換えガレクチン融合タンパク質は、ダニワクチン候補物質の一つであることが示された。なお、正常マウス血清と組換えガレクチン融合タンパク質との反応は認められなかった。
実施例１０：組換えガレクチン融合タンパク質のマウスに対する抗原性の確認
本実施例では、実施例５で調製した組換えガレクチン融合タンパク質のマウスに対する抗体産生誘導について検討した。
実施例５において組換えガレクチン融合タンパク質を用いて免疫したマウス１１匹から、それぞれ得られたマウス抗血清１１種類を、精製組換えガレクチン融合タンパク質を転写したメンブレンと反応させ、前記抗原に結合した抗体をウェスタンブロッティング法により検出した。なお、コントロールとして、アジュバントのみで免疫したマウス２匹から得られたマウス抗血清２種類を使用した。
その結果、組換えガレクチン融合タンパク質を用いて免疫したマウス由来の抗血清では、組換えガレクチン融合タンパク質に対する抗体が全ての抗血清中において認められたが、コントロールのマウス抗血清中には抗体は認められなかった。
この結果から、組換えガレクチン融合タンパク質をマウスに接種することによって、前記タンパク質に対する抗体産生の誘導が確認され、組換えガレクチン融合タンパク質の抗ダニワクチンとしての有用性が示された。
実施例１１：組換えガレクチン融合タンパク質のマウス赤血球に対する凝集能の確認
本実施例では、組換えガレクチン融合タンパク質のマウス赤血球に対する凝集能について検討した。
具体的には、マウス赤血球をＰＢＳでよく洗浄した後、精製した組換えガレクチン融合タンパク質を希釈添加し、その有効濃度を測定した。決定した有効濃度をもとに、ガレクチンのインヒビターであるラクトースを最終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加した。また、実施例５で得られた抗ガレクチンマウス血清を用い、そのガレクチン凝集抑制効果を調べた。
結果を図４に示す。図４において、ウェル１〜４は、それぞれ、組換えガレクチン融合タンパク質を、５μｇ、０．２５μｇ、０．０２５μｇ、又は０．００２５μｇを添加した場合の結果であり、ウェル５は、組換えガレクチン融合タンパク質０．２５μｇ及び１０ｍｍｏ／Ｌラクトースを添加した場合の結果であり、ウェル６は、組換えガレクチン融合タンパク質０．２５μｇ及び抗ガレクチンマウス血清（実施例５で調製したもの）１０μＬを添加した場合の結果である。
図４に示すように、組換えガレクチン融合タンパク質は、用量依存性にマウス赤血球を凝集した。また、この反応は、１０ｍｍｏｌ／Ｌラクトース、あるいは、実施例５で得られた抗組換えガレクチン融合タンパク質マウス血清により阻害された。
この結果から、組換えガレクチン融合タンパク質にレクチン作用があることが確認された。
実施例１２：組換えガレクチン融合タンパク質のガラクトース結合能の確認
本実施例では、組換えガレクチン融合タンパク質のガラクトース結合能について、ラクトシルセファロースを用いるバッチ法により検討した。
具体的には、精製した組換えガレクチン融合タンパク質を、ラクトシルセファロースと共に、１．５ｍＬマイクロチューブ中で混合した後、５０００ｒｐｍで遠心し、得られたペレットをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１００ｍｍｏｌ／Ｌラクトースで溶出させた。
結果を図５に示す。図５において、レーン１は、ラクトシルセファロースと混合する前の組換えガレクチン融合タンパク質（以下、アプライ前サンプルと称する）を泳動した結果であり、レーン２は、組換えガレクチン融合タンパク質とラクトシルセファロースとの混合懸濁液を遠心して得られた上清を泳動した結果であり、レーン３からレーン５は、それぞれ、１回目から３回目の各洗浄液を泳動した結果であり、レーン６は、ラクトース溶出後の上清を泳動した結果である。また、レーン６の右側の数値「６３」は、組換えガレクチン融合タンパク質の分子量（６３ｋＤａ）を意味する。
図５に示すように、アプライ前サンプル中に含まれる組換えガレクチン融合タンパク質量とほぼ等量のガレクチン（レーン１）が、ラクトースにより溶出された（レーン６）。また、組換えガレクチン融合タンパク質は、ラクトシルセファロースに結合性を有し、１００ｍｍｏｌ／Ｌラクトースで溶出された。
この結果から、組換えガレクチン融合タンパク質にガラクトース結合能があることが示された。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、及び抗体によれば、本発明の医薬、特にはダニワクチンを提供することができる。
また、本発明の医薬、特にはダニワクチンによれば、例えば、ダニ駆除、又はダニ媒介性感染症（例えば、リケッチア症、フィラリア症、Ｑ熱、アフリカ回帰熱、又はウイルス性脳炎など）の治療又は予防が可能である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、組換えガレクチン融合タンパク質の電気泳動の結果を示す図面である。
図２は、第四若ダニヘモリンフに対するモノクローナル抗体を用いるイムノブロット法による電気泳動の結果を示す図面である。
図３は、抗組換えガレクチン融合タンパク質マウス血清を用いるイムノブロット法による電気泳動の結果を示す図面である。
図４は、組換えガレクチン融合タンパク質のマウス赤血球に対する凝集能試験の結果を示す図面である。
図５は、組換えガレクチン融合タンパク質のガラクトース結合試験における電気泳動の結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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