(57)【要約】大腸菌を用いた絹又は絹様タンパク質の生産方法。家蚕絹フィブロイン、野蚕絹フィブロイン、エラスチン及びフィブロネクチンの中から選択され、前記家蚕絹フィブロイン又は野蚕絹フィブロインの何れかを必須とする少なくとも１個のタンパク質からなる絹又は絹様高分子を設計し、該絹又は設計された高分子の最小単位を合成する。合成された該最小単位の高分子を、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターの中から選択された少なくとも１つの発現ベクターに組み込み、次いで該発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの何れかの大腸菌に組み込む。次いでその大腸菌を複合培地から選択された培地を用いて育成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
家蚕絹フィブロイン、野蚕絹フィブロイン、エラスチン及びフィブロネクチンの中から選択され、前記家蚕絹フィブロイン又は野蚕絹フィブロインの何れかを必須とする少なくとも１個のタンパク質からなる絹又は絹様高分子を設計し、該絹又は設計された高分子の最小単位を合成し、合成された該最小単位の高分子を、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターの中から選択された少なくとも１つの発現ベクターに組み込み、次いで該発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの何れかの大腸菌に組み込み、該大腸菌を、複合培地から選択された培地を用いて育成することを特徴とする、絹又は絹様タンパク質の生産方法。
【請求項２】
前記大腸菌の育成に際し、大腸菌の増殖最適温度より２〜７℃下げた温度条件で培養する請求項１に記載された、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【請求項３】
発現ベクターがＴ７１ａｃプロモーターを含む発現ベクターの中から選択された発現ベクターである、請求項１又は２に記載された、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【請求項４】
発現ベクターがｐＥＴ３０ａである請求項３に記載された、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【請求項５】
前記培地がＴＢ培地である請求項１に記載された、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、絹タンパク質、及び機能性を付与した遺伝子組み換え絹様タンパク質の大量生産方法に関し、特に細胞接着性又は弾性若しくは強度を付与させた遺伝子組み換え絹様タンパク質の大量生産方法に関する。
背景技術
絹は高強度・高弾性な繊維であり、生体に含まれるアミノ酸を構成単位としているため生体適合性があることから、衣料品のみではなく、食品や化粧品等様々な分野で利用されている。
この優れた物性の起源を探るべく、絹の詳細な構造解析が行われてきた。絹の一次構造は、数種類の、ある決まったアミノ酸配列（モチーフ）が十数回繰り返すブロック共重合体であることが特徴である。近年、そのモチーフ単位での二次構造が明らかになるにつれて、絹繊維の構造と物性との相関についての成果が蓄積されつつある。
近年では絹タンパク質をコードする合成ＤＮＡから人工的な絹様タンパク質を合成する研究が為されてきた。絹タンパク質は同じアミノ酸配列の繰り返し構造を有するため、特定のアミノ酸の出現回数が多くなる事が特徴である。そのため数種のアミノアシルｔＲＮＡの枯渇が原因となり、タンパク質合成の終結にエラーが生じることがある。また、ＤＮＡ配列の繰り返しは大腸菌内で配列の組み換えを起こりやすくする原因となるため、繰り返し配列を持つ絹様タンパク質を大腸菌を用いて大量に得る事は未だ困難であった。
そこで発現効率を上げるために、発現ベクターに強力なＴ７プロモーターを融合させたベクターが広く利用されるようになったが、強力であるが故に、目的とするタンパク質が大腸菌にとって強いストレスになる場合には、該タンパク質が菌体の増殖に影響を与えて発現効率が上がらないという欠点があった。
そこで本発明者等は、家蚕絹フィブロイン、野蚕絹フィブロイン、エラスチン及びフィブロネクチンの機能部位モチーフを任意に選択して、４種類の機能性絹様タンパク質を設計し、これら４種類の繰り返し配列を有する機能性絹様タンパク質に関して、発現ベクターの選択、宿主大腸菌の選択及び発現条件の最適化を行ったところ、前記設計した機能性絹様タンパク質を大腸菌を用いて大量生産することが可能となること、及びこの方法を一般の絹タンパク質に対しても応用することが可能であることを見出し、本発明に到達した。
従って、本発明の目的は、絹タンパク質及び機能性を付与した絹様タンパク質の大量生産方法を提供することにある。
発明の開示
本発明の目的は、家蚕絹フィブロイン、野蚕絹フィブロイン、エラスチン及びフィブロネクチンの中から選択され、前記家蚕絹フィブロイン又は野蚕絹フィブロインの何れかを必須とする２以上の蛋白質の組み合わせからなる絹様高分子を設計し、該絹又は設計された高分子の最小単位を合成し、合成された該最小単位の高分子を、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターの中から選択された少なくとも１つの発現ベクターに組み込み、次いで該発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの何れかの大腸菌に組み込み、該大腸菌を、複合培地から選択された培地を用いて育成することを特徴とする絹様蛋白質の生産方法によって達成された。
また、本発明は、大腸菌の育成温度を、大腸菌の増殖最適温度より２〜７℃下げることが好ましく、特に、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターとしてＴ７１ａｃプロモーターを含む発現ベクターを使用することが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、家蚕絹フィブロインとは、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺から分泌されるタンパク質を意味し、野蚕絹フィブロインは、野蚕の後部絹糸腺から分泌されるタンパク質を意味する。
これらについては、蚕糸学用語辞典  日本蚕糸学会編（１９７９）に記載されている。
また、エラスチンとは、様々な生物の組織に存在する弾性を担うタンパク質であり、このエラスチンの一次構造の中には、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列表１）という５残基のアミノ酸配列が数回連なった領域が、頻度高く存在する（例えば、ヒヨコのエラスチンについてはＢｒｅｓｓａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ａｒｇｏｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋ  ｔｒｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６，１４９７−１５０３（１９８７）、ウシのエラスチンについてはＲａｊｕ，Ｋ．ａｎｄ  Ａｎｗａｒ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｅｌａｓｔｉｎ  ａ，ｂ  ａｎｄ  ｃ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，５７５５−５７６２（１９８７）に詳しい）。従って、本発明におけるエラスチンの機能性部位モチーフとは、上記５残基のアミノ酸配列を意味する。
また、フィブロネクチンとは、様々な生物の細胞外マトリックスに存在する細胞接着性のタンパク質であり、この細胞接着性は、そこに含まれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列表２）という４残基のアミノ酸配列が関連して発現している（参考文献：Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ  Ｍ  Ｄ，Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ  Ｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９  ３０〜３３（１９８４））。従ってフィブロネクチンに含まれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒという４残基のアミノ酸配列はフィブロネクチンの機能性部位モチーフである。そこで本発明ではＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒが細胞接着性を発現するために必要な二次構造を保持できるようにするために、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列表３）を機能性部位モチーフとした。従って必ずこの８残基の配列でなければならないというわけではないが、上記の余分な配列部分は、人工皮膚などとして利用する場合の生体適合性を考慮し、ヒトのフィブロネクチンに含まれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ配列の周辺のアミノ酸配列をそのまま採用したものである。
本発明においては、Ｌｅｗｉｓらによって提案された、絹タンパク質に含まれるモチーフの種類とその組み合わせ方を様々に変えることによって、絹の物性、機能性が変化するという考え方に基いてタンパク質を設計する。本発明では、天然絹繊維に含まれるモチーフやエラスチン、フィブロネクチンに特有の機能（それらはそれぞれ熱応答性（温度を上げると凝集して水に溶けなくなる性質）、細胞接着性）を発現すると考えられているモチーフ配列を様々に組み合わせる。
具体的には、天然絹繊維に含まれるモチーフを新たに様々に組み換えることによって、天然絹繊維にはない新しい物性、機能性を持つタンパク質を設計するために、ＳＬＰ（絹様タンパク質）、ＳＬＰＡ（ポリアラニンを有する絹様タンパク質）、ＳＥＬＰ（絹及びエラスチン様タンパク質）、ＳＬＰＦ（フィブロネクチンを有する絹様タンパク質）を下記のように設計した。
ＳＬＰ（Ｓｉｌｋ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（絹様タンパク質）の略号）：家蚕絹に含まれるアミノ酸配列（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ）３（配列表４）と野蚕絹に含まれるグリシンリッチ領域のアミノ酸配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列表５）の組み合わせ
ＳＬＰＡ（Ｓｉｌｋ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ−ａｌａｎｉｎｅ（ポリアラニンを有する絹様タンパク質）の略号）：家蚕絹に含まれるアミノ酸配列Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ（配列表６）、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ（配列表７）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ及びＧｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ（配列表８）と野蚕絹に含まれるポリアラニン領域に類似したアミノ酸配列（Ａ）１８（配列表９）の組み合わせ
ＳＥＬＰ（Ｓｉｌｋ  ａｎｄ  Ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（絹及びエラスチン様タンパク質）の略号）：家蚕絹に含まれるアミノ酸配列（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ）３（配列表４）とエラスチンに含まれるアミノ酸配列（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）２（配列表１０）の組み合わせ
ＳＬＰＦ（Ｓｉｌｋ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（フィブロネクチンを有する絹様タンパク質）の略号）：家蚕絹に含まれるアミノ酸配列（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ）３（配列表４）とフィブロネクチンに含まれるアミノ酸配列Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ（配列表１１）の組み合わせ
繊維には、結晶領域と非晶領域が存在することが必要であり、新しい絹様タンパク質を設計する際には、これらの領域を同時に形成するようにモチーフを組み合わせることが必要である。例えば、ＳＬＰとＳＬＰＡの場合には、家蚕絹、野蚕絹の１種であるエリ蚕絹中で、結晶領域又は非晶領域を形成するようなモチーフをそれぞれ組み合わせる。また、ＳＥＬＰとＳＬＰＦの場合には、繊維としてだけではなく、バイオマテリアルとして利用するためにエラスチン、フィブロネクチンの機能性部位モチーフを絹タンパク質と組み合わせることによって、絹が持つ熱安定性や生分解性などの機能性に加えて、さらに新たな機能性を付与することが出来る。
本発明においては、発現ベクターとしてＴ７プロモーターを含むｐＥＴ３０ａ、発現の際の宿主大腸菌として発現誘導型のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを選択する。これらの組み合わせにより、発現誘導物質としてＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を添加するまでは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが発現しない為にＴ７プロモーターの下流にある目的タンパク質が発現されず、従って大過剰発現による大腸菌へのストレスが軽減される。また、プラスミドｐＬｙｓＳはさらにＴ７リゾチームを発現してＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを不活性化するため、２段階での抑制が期待できる。本発明においては、発現ベクターを、Ｔ７ｌａｃプロモーターを含む発現ベクターの中から選択することが好ましく、特にｐＥＴ３０ａを使用することが好ましい。
発現誘導後は、複合培地から選択された培地を用い、培養温度及びＩＰＴＧ添加濃度並びにｐＨ等の培養条件を最適化することにより、大腸菌へのストレスを軽減させる。本発明においては、故意に大腸菌の増殖にとって最適な培養条件からはずすことによって、目的タンパク質の発現を穏やかに進行させることが出来、これによって長時間の培養が可能となり、目的タンパク質の収量を上げることが出来る。従って、本発明においては、培養温度を、大腸菌の増殖最適温度より２〜７℃低温に設定することが好ましい。
また、本発明で使用する培地はＴＢ培地であることが特に好ましい。ＩＰＴＧ添加濃度は０．２〜１．０ｍＭであることが好ましい。更にｐＨは６．７〜７．０であることが好ましい。
実施例
以下、本発明を実施例によって更に詳述するが、本発明はこれによって限定されるものではない。尚、以下において、特にことわりのない限り、「％」は「重量％」を表し、比は重量比を意味する。又、文章中の各記号の意味は下記の通りである。
実施例１．
＜ＳＬＰ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）の合成による、配列表１２〜１５に示された４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、Ｔｒｉｓ（トリス）ＥＤＴＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：以下ＴＥとする）を用いて、濃度が１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補鎖を等モル混合し、９９℃で３０秒間熱処理した後、１時間かけて３７℃に冷まし、３０分間静置することによって、配列表１６及び１７で表されるアミノ酸をコードする２本の二本鎖ＤＮＡを構築した。それぞれの二本鎖ＤＮＡを等量混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（タカラライゲーションキットバージョン２溶液Ｉ（宝酒造（株）製の商品名））を用い、１６℃で１時間結合させ、ＳＬＰモノマーをコードする二本鎖ＤＮＡを調整した（ＳＬＰのアミノ酸配列；Ｔｈｒ  Ｓｅｒ［Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）３  Ａｌａ  Ｓｅｒ］ｎ（ｎ＝２，４，６）、配列表１８（ｎ＝２の場合）参照）。
クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）製）を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間３０分消化し、ＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（仔ウシ小腸由来アルカリ性フォスファターゼ）（宝酒造（株）製））を加え、３７℃で３０分間処理を行った（以降「アルカリフォスファターゼ処理」と記す）。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールが２５：２４：１（重量比）の混合溶液を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解し、ベクター試料とした。
ＳＬＰのモノマーＤＮＡとｐＵＣ１１８ベクター試料を１０：１（重量比）で混合し、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間結合させた。反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを用いて形質転換した。Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を用いたカラーセレクションによって挿入遺伝子の有無を確認し、挿入遺伝子を含むものについてＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってＳＬＰのモノマーＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣ−ＳＬＰ（１）を得た。
＜ＰＵＣ−Ｌｉｎｋの構築＞
本研究に用いるクローニングベクターｐＵＣ１１８は、制限酵素Ｎｈｅ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉによって消化される領域を含まない。そこで、ｐＵＣ１１８に制限酵素Ｎｈｅ  Ｉ及びＳｐｅ  Ｉの認識領域を付け加える事を目的とし、アダプターを設計して（配列表１９）、ｐＵＣ１１８−Ｌｉｎｋ（設計したアダプターを含むプラスミド）を構築した。またアダプターには制限酵素Ｎｈｅ  Ｉ及びＳｐｅ  Ｉの認識領域の他に、メチオニン残基をコードするコドンを両側に配置させた。これにより、発現して得られたタンパク質の挿入遺伝子の両側にメチオニン残基が付加され、臭化シアンを用いてメチオニン残基を特異的に切断することにより、プラスミド由来の配列を含まない試料が得られた。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補鎖を等モル混合し、９９℃で３０秒間熱処理した後、１時間かけて３７℃に冷まし、３０分間静置することによって二本鎖ＤＮＡを構築した。それぞれの二本鎖ＤＮＡを等量混合した後、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）製）を、制限酵素Ｘｂａ  Ｉを用い、３７℃で１時間３０分消化し、ＣＩＡＰを加え、３７℃で３０分間処理を行った。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールが２５：２４：１（重量比）の混合溶液を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解し、ベクター試料とした。
アダプターＤＮＡとｐＵＣ１１８ベクター試料を１０：１（重量比）で混合し、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間結合させた。反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを用いて形質転換した。Ｘ−ｇａｌを用いたカラーセレクションによって挿入遺伝子の有無を確認し、挿入遺伝子を含むものについてＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによって、アダプターを含むプラスミドｐＵＣ−Ｌｉｎｋを得た。
＜ＳＬＰ（ｎ）の構築＞
ＳＬＰモノマーの両端には、Ｓｐｅ  ＩとＮｈｅ  Ｉの制限酵素認識領域が含まれている。制限酵素Ｓｐｅ  ＩとＮｈｅ  Ｉによって消化された断片の突出末端は、いずれも相補的であり互いに結合することができる。さらに、結合して新たに出来た配列は、Ｓｐｅ  ＩとＮｈｅ  Ｉの制限酵素認識領域のいずれとも異なっており、Ｓｐｅ  ＩとＮｈｅ  Ｉによっては消化されない。この性質を利用して、一方向にＳＬＰモノマーを重合してＳＬＰをｎ回繰り返しコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（ｎ）を構築した。
ｐＵＣ−ＳＬＰ（１）で、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、２ｘＹＴ培地で、３７℃で１８時間培養した。培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解した。試料を、３７℃で１時間３０分、Ｎｈｅ  Ｉ及びＳｐｅ  Ｉ（共に宝酒造（株）製）によって同時に消化し、プラスミドからＳＬＰ（１）を単離した。反応液をマイクロコン（ＭｉｃｒｏＣｏｎ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動させ、インサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡ（ウルトラフリーＤＡ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用い、抽出液を再びマイクロコンを用いて５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
ｐＵＣ−ＬｉｎｋをＮｈｅ  Ｉで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解し、ベクター試料とした。
１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換した。アンピシリンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップして２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。培地から、アルカリ−ＳＤＳミニプレップ法によってプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉを用いて同時に消化した後、電気泳動法によって、挿入遺伝子の有無とサイズを確認した。その後、ＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってプラスミドｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（１）を得た。
ｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（１）を、Ｎｈｅ  Ｉで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ溶液処理をした。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解し、ベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が重量比で１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換した。アンピシリンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップして２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。培地から、アルカリ−ＳＤＳミニプレップ法によってプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉを用いて同時に消化した後、電気泳動によって挿入遺伝子の有無とサイズを確認した。その後、ＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってプラスミドｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（２）（２量体）を得た。
ｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（２）にＳＬＰ（２）を挿入してｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（４）（４量体）を構築し、次いでｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（４）にＳＬＰ（２）を挿入してｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（６）（６量体）を構築した。
＜発現ベクターｐＥＴ−ＳＬＰ（ｎ）の構築＞
上記のようにして得られたｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰ（２、４、６）を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ（共に宝酒造（株）製）を用いて消化した。反応液をマイクロコンを用いてを５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用い、電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡを用い、抽出液を再びマイクロコンを用いてを５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解し、ベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
ライゲーション反応液をコンピテントセルＤＨ５αで形質転換し、カナマイシンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２  ｘ  ＹＴ培地に接種して培養した。培地から、アルカリ−ＳＤＳ法によってベクターを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉを用いて同時に消化した後、電気泳動法によってインサートＤＮＡの有無とサイズを確認した後ＤＮＡシークエンシングによって配列の確認を行い、発現ベクターｐＥＴ−ＳＬＰ（２，４、６）を構築した。
＜ｐＥＴ−ＳＬＰ（２、４、６）の発現＞
上記のようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＬＰ（２、４、６）それぞれを持つ宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、１ｍｌの２  ｘ  ＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次に、その培養液１００μｌを５ｍｌの前記２ｘＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入ったＬ字管に加え、３７℃で１時間（ＯＤ６００＝０．５〜０．７（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−１６０））培養した。この場合、ＳＬＰの発現を誘導するためにＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間おきに１００μｌの培地をエッペンドルフチューブに採取して３時間まで培養した。採取した培地は、遠心分離（１４５００ｒｐｍ、５分、４℃）した後上清を捨て、ペレットを２  ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（試料溶解用緩衝液）に溶解した後１００℃で５分間熱処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料とした。第１図に示したように、ＳＬＰ  ２では１９ｋＤａ、ＳＬＰ  ４では２９ｋＤａ、ＳＬＰ  ６では４０ｋＤａに、それぞれＩＰＴＧに依存したユニークなバンドが観測された。このことから、ＩＰＴＧ添加によりＳＬＰ遺伝子が誘導され、大量発現する株を得ることの出来ることが実証された。
次に、プラスミドｐＥＴ−ＳＬＰ（２、４、６）それぞれを持つ宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、２．５ｍｌの２  ｘ  ＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次に、その培養液を２５０ｍｌの２ｘＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った５００ｍｌのコルベンに加え、３７℃で１時間（ＯＤ６００＝０．５〜０．７（島津ＵＶ−１６０））培養した。この際に、タンパク質の発現を誘導するためにＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、さらに２時間培養して集菌（５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）することにより菌体を得た。得られた菌体を−３０℃で保存した。
−３０℃で保存した上記菌体を氷上でゆっくり解凍し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（タンパク質溶解用緩衝液）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に懸濁し、氷上で超音波破砕（Ｏｕｔ  ｐｕｔ  ３．５、Ｄｕｔｙ  ６０％（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１））を、１分間の冷却時間を設けながら１分間ずつ、４回行った。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を回収した。
得られた上清を添加試料とし、あらかじめ同緩衝液を用いて平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズを充填したカラムを用い、アフィニティークロマトグラフィー（流速１５〜２０ｍｌ／時間）による精製を行った。各溶出液を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって目的タンパク質の存在する分画を確認し回収した。
得られた分画を、蒸留水に対して２４〜４８時間適宜外液を交換しながら透析した後、凍結乾燥することによって白色粉末が得られた。分子量１９ｋＤａ、２９ｋＤａ、４０ｋＤａの各タンパク質についてそれぞれの収量を表１に示す。
2003100065.tif 000002
＜ＳＬＰの同定＞
各タンパク質について、Ｎ−末端アミノ酸シーケンスによりＮ−末端の数残基のアミノ酸配列を決定した。各タンパク質を、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法によって挟雑タンパク質から分離し、ザルトブロット２−Ｓ（ザルトリウス社製）を用いてＰＶＤＦ（ポリビニリデンフロライド）膜に転写した。転写後、染色液で５分間染色した後、メタノールで脱色し洗浄したハサミを用いて目的タンパク質のバンドを切りだした。この試料を用い、ＡＢＩ  ４７３気相式エドマンシーケンサーによってＮ−末端アミノ酸配列を決定した。この結果は予想されるアミノ酸配列と一致し、発現したタンパク質がプラスミド由来のタンパク質であることが確認された。
＜臭化シアンによるタグ配列の切断＞
設計したＳＬＰ  ２、４、６には、アダプターによって挿入遺伝子の両側にメチオニン残基が配置されている。ＳＬＰ  ２、４、６自身にはメチオニン残基を含まないため、メチオニン残基を化学的に切断することによって、タグなどプラスミド由来のアミノ酸配列を含まないタンパク質を得ることができる。タンパク質のメチオニン残基を切断し、Ｎ−末端アミノ酸シーケンスによりＮ−末端の数残基のアミノ酸配列を決定した。
ＳＬＰ  ６を１０ｍｇエッペンドルフチューブに取り、９０％のギ酸に溶解した。完全に溶解したことを確認した後、ｍｉｌｌｉ  Ｑ水（超純水）を加えギ酸の最終濃度が７０％となるまで希釈した。臭化シアン１０ｍｇを試料溶液に加えて溶解した後、アルミホイルで完全に遮光し、室温で１２〜４８時間放置した。反応溶液に対して１０倍量のｍｉｌｌｉ  Ｑ水を加え、反応を止めた後、蒸留水を外液にして透析を行い、次いで凍結乾燥を行う事によって白色粉末を得た。得られた白色粉末を２  ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量を比較したところ、臭化シアン処理前の試料に比べて分子量の減少が確認された。
この様にして精製されたＳＬＰ  ６を、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法によって不純タンパク質から分離し、ザルトブロット２−Ｓ（ザルトリウス）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、染色液を用いて５分間染色した後メタノールで脱色し、洗浄したハサミを用いて目的とするタンパク質のバンドを切りだした。この試料を用い、ＡＢＩ  ４７３気相式エドマンシーケンサーを用いてＮ−末端アミノ酸配列を決定した。決定したＮ−末端アミノ酸配列は予想されるアミノ酸配列と一致し、目的としたタンパク質ＳＬＰ  ６であることが確認された。
実施例２．
＜ＳＬＰＡ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）で合成した配列表２０〜２３に示される４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて、濃度が１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補鎖を等モル混合し、９９℃で３０秒間熱処理した後１時間かけて３７℃に冷まし、３０分間静置して配列表２４及び２５で表されるアミノ酸配列をコードする２本の二本鎖ＤＮＡを構築した。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間３０分消化し、ＣＩＡＰを加え、３７℃で３０分間処理を行った。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
それぞれの二本鎖ＤＮＡとｐＵＣ１１８ベクター試料を１０：１で混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間結合させ、配列表２４及び２５で表されるアミノ酸配列をコードする二本鎖ＤＮＡを調製した。反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを用いて形質転換した。Ｘ−ｇａｌを用いたカラーセレクションによって挿入遺伝子の有無を確認し、挿入遺伝子を含むものについてＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによって、ポリアラニン（配列表２４）をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＵＣ−ＡＬＡと、グリシンの交互共重合体ＧＸ（Ｘ＝Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）（配列表２５）をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＵＣ−ＧＸを得た。
ｐＵＣ−ＡＬＡをコンピテントセルＤＨ５αで形質転換し、２ｘＹＴ培地で、３７℃で１８時間培養した。培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解した。試料を３７℃で１時間３０分、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉを用いて同時に消化し、プラスミドからＡＬＡを単離した。反応液をマイクロコンを用いて５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用い、電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出した液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
ＰＵＣ−ＧＸをＳｐｅ  Ｉを用いて消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換した。アンピシリンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップして２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。培地からアルカリ−ＳＤＳミニプレップ法でプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によって挿入遺伝子の有無とサイズを確認した。次いで、ＤＮＡシークエンシングを行って配列を確認することにより、プラスミドｐＵＣ−ＳＬＰＡ（１）を得た（ＳＬＰＡのアミノ酸配列；［Ａｌａ  Ｓｅｒ（Ａｌａ）１８  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ］ｎ、配列表２６（ｎ＝４の場合）参照）。
＜ＳＬＰＡ（ｎ）の構築＞
ｐＵＣ−ＳＬＰＡ（１）を用いてコンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、２ｘＹＴ培地で、３７℃で１８時間培養した。アルカリ−ＳＤＳ法によって培養液からプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解した。試料を３７℃で１時間３０分、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化し、プラスミドからＳＬＰＡ（１）を単離した。マイクロコンを用いて反応液を５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出した液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
ｐＵＣ−ＳＬＰＡ（１）をＮｈｅ  Ｉで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合溶液（重量比２５：２４：１）を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解し、ベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換した。アンピシリンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。アルカリ−ＳＤＳミニプレップ法によって培地からプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によって挿入遺伝子の有無とサイズを確認した。次いで、ＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってプラスミドｐＵＣ−ＳＬＰＡ（２）（２量体）を得た。
ｐＵＣ−ＳＬＰＡ（２）にＳＬＰＡ（２）を挿入してｐＵＣ−ＳＬＰＡ（４）（４量体）を構築した。
＜発現ベクターｐＥＴ−ＳＬＰＡ（４）の構築＞
ｐＵＣ−ＳＬＰＡ（４）をＢａｍＨＩを用いて消化した。マイクロコンを用いて反応液を５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅ  ＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出した液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
発現ベクターｐＥＴ３０ａをＢａｍＨＩで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解し、ベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
ライゲーション反応液をＤＨ５αを用いて形質転換し、カナマイシンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２  ｘ  ＹＴ培地に接種して培養した。アルカリ−ＳＤＳ法を用いて培地からベクターを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によってインサートＤＮＡの有無とサイズを確認した。次いでＤＮＡシークエンシングによって配列の確認を行うことにより、発現ベクターｐＥＴ−ＳＬＰＡ（４）を構築した。
＜ｐＥＴ−ＳＬＰＡ（４）の発現＞
プラスミドｐＥＴ−ＳＬＰＡ（４）それぞれを持つ宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、１．５ｍｌの２  ｘ  ＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次にその培養液１００μｌを、５ｍｌの２  ｘ  ＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った試験管に加え、３７℃で１時間（ＯＤ６００＝０．５〜０．７（島津ＵＶ−１６０））培養した。この場合、ＳＬＰＡ  ４の発現を誘導するためにＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間おきに１００μｌの培地をエッペンドルフチューブに採取し、４時間まで培養した。採取した培地を遠心（１４５００ｒｐｍ、５分、４℃）分離した後上清を捨て、ペレットを２  ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した後、１００℃で５分間熱処理してＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料とした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとした後、Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロットを行うことにより、ＳＬＰＡ  ４を検出した（第２図）。
図から明らかなように、ＳＬＰＡ４では２９ｋＤａにバンドが観測された。この結果から、ＩＰＴＧ添加によってＳＬＰ遺伝子が誘導され大量発現する株を得られることが実証された。
プラスミドｐＥＴ−ＳＬＰＡ（４）を持つ宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、１．５ｍｌの２ｘＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次にその培養液を１２ｍｌの２ｘＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った試験管に加え、３７℃で１６時間培養した。次に、１．２１の２ｘＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った２１のファーメンターに加え、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．７（島津ＵＶ−１６０））となるまで培養した。この場合、タンパク質の発現を誘導するためにＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、さらに４時間培養して集菌（８５００ｒｐｍ、３０分、４℃）することにより菌体を得た。得られた菌体を−２０℃で保存した。
−２０℃で保存された菌体を氷上でゆっくり解凍し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に懸濁し、氷上で超音波破砕（Ｏｕｔ  ｐｕｔ  ３．５、Ｄｕｔｙ  ６０％（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１））を、１分間の冷却時間を設けながら、２分間ずつ２０回行った。得られた菌体破砕液について遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４０分、４℃）操作を行い、沈殿を回収した。
得られた沈殿にＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕を行った。ここで得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４０分、４℃）して、上清を回収した。
得られた上清を添加試料とし、あらかじめ同緩衝液を用いて平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズを充填したカラムを用い、アフィニティークロマトグラフィー（流速１５〜２０ｍｌ／ｈ）による精製を行った。各溶出液を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって目的とするタンパク質が存在する分画を確認し回収した。
蒸留水に対して２４〜４８時間適宜外液を交換しながら得られた分画を透析した後、凍結乾燥することによって白色粉末を得た。収量は３４．２ｍｇ／Ｌであった。
実施例３．
＜ＳＥＬＰ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）で合成し配列表２７〜３０で表される、４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補鎖を等モル混合し、９９℃で３０秒間熱処理した後１時間かけて３７℃に冷まし、３０分間静置して配列表３１及び３２で表されるアミノ酸配列をコードする２本の二本鎖ＤＮＡを構築した。それぞれの二本鎖ＤＮＡを等量混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用い、１６℃で１時間結合させ、ＳＥＬＰモノマーをコードするで表される二本鎖ＤＮＡを調整した（ＳＥＬＰのアミノ酸配列；Ｔｈｒ  Ｓｅｒ［（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）２  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）２  Ａｌａ  Ｓｅｒ］ｎ、配列表３３（ｎ＝８の場合）参照）。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間３０分消化し、ＣＩＡＰを加え、３７℃で３０分間処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合溶液（重量比２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
ＳＥＬＰモノマーＤＮＡとｐＵＣ１１８ベクター試料を１０：１で混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間結合させた。反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを用いて形質転換した。Ｘ−ｇａｌを用いたカラーセレクションによって挿入遺伝子の有無を確認し、挿入遺伝子を含むものについてＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってＳＥＬＰモノマーＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣ−ＳＥＬＰ（１）を得た。
＜ＳＥＬＰ（ｎ）の構築＞
ｐＵＣ−ＳＥＬＰ（１）を用いて、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、２ｘＹＴ培地で３７℃、１８時間培養した。培養液からアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドを抽出し、次いでＴＥに溶解した。試料を３７℃で１時間３０分、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉによって同時に消化し、プラスミドからＳＬＰ（１）を単離した。マイクロコンを用いて反応液を５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅ  ＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出した液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
ｐＵＣ−ＬｉｎｋをＮｈｅ  Ｉで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法よって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換した。アンピシリンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２ｘＹＴ培地に接種して３７℃で１８時間培養した。アルカリ−ＳＤＳミニプレップ法によって培地からプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によって挿入遺伝子の有無とサイズを確認した。次いで、ＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってプラスミドｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（１）を得た。
ｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（１）を用いて、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、２ｘＹＴ培地で、３７℃で１８時間培養した。培養液からアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解した。試料を３７℃で１時間３０分、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉによって同時に消化し、プラスミドからＳＥＬＰ（１）を単離した。マイクロコンを用いて反応液を５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
ｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（１）をＮｈｅ  Ｉによって消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換した。アンピシリンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。アルカリ−ＳＤＳミニプレップ法によって培地からプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によって挿入遺伝子の有無とサイズを確認した。次いで、ＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってプラスミドｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（２）を得た。
ｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（２）にＳＥＬＰ（２）を挿入してｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（４）を構築し、ｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（４）にＳＥＬＰ（４）を挿入してｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＥＬＰ（８）を構築した。
＜発現ベクターｐＥＴ−ＳＥＬＰ（ｎ）の構築＞
ｐＵＣ−ＳＥＬＰ  ８をＢａｍＨＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いて消化した。マイクロコンを用いて反応液を５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
発現ベクターｐＥＴ３０ａを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを使用した電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
ライゲーション反応液を用いてコンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、カナマイシンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２  ｘ  ＹＴ培地に接種して培養した。アルカリ−ＳＤＳ法によって培地からベクターを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によってインサートＤＮＡの有無とサイズを確認し、ＤＮＡシークエンシングによって配列の確認をおこなうことにより、発現ベクターｐＥＴ−ＳＥＬＰ  ８を構築した。
ｐＥＴ−ＳＥＬＰ（８）の発現
プラスミドｐＥＴ−ＳＥＬＰ（８）それぞれを持つ宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３〕ｐＬｙｓＳを、１．５ｍｌの２  ｘ  ＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次に、５ｍｌの２  ｘ  ＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った試験管にその培養液１００μｌを加え、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．７となるまで培養した。この場合、ＳＥＬＰ  ８の発現を誘導させるためにＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間おきに１００μｌの培地をエッペンドルフチューブに採取し、４時間まで培養した。採取した培地を遠心分離（１４，５００ｒｐｍ、５分、４℃）して上清を捨て、ペレットを２  ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した後、１００℃で５分間熱処理してＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料とした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとした後、Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロットを行うことによって、ＳＥＬＰ  ８を検出した（第３図）。
図に示したように、ＳＥＬＰ  ８では３５ｋＤａにバンドが観測された。この結果から、ＩＰＴＧ添加によりＳＬＰ遺伝子が誘導され、大量発現する株を得られることが実証された。
プラスミドｐＥＴ−ＳＥＬＰ  ８それぞれを持つ宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、１．５ｍｌの２  ｘ  ＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次に、その培養液を１２ｍｌの２  ｘ  ＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。さらにその培養液を１．２１の２ｘＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った２１のファーメンターに加え、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．７となるまで培養した。この場合、タンパク質の発現を誘導させるためにＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍＭ）を添加し、温度を３０℃まで下げてさらに４時間培養し、集菌（８５００ｒｐｍ、３０分、４℃）することにより菌体を得た。得られた菌体は−２０℃で保存した。
−２０℃で保存した菌体を氷上でゆっくり解凍し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に懸濁し、氷上で超音波破砕（Ｏｕｔ  ｐｕｔ  ３．５、Ｄｕｔｙ  ６０％（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１））を、１分間の冷却時間を設けながら、２分間ずつ２０回行った。得られた菌体破砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分、４℃）して上清を回収した。
得られた上清を添加試料とし、あらかじめ同緩衝液を用いて平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズを充填したカラムを用い、アフィニティークロマトグラフィー（流速１５〜２０ｍｌ／ｈ）による精製を行った。各溶出液を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって目的とするタンパク質の存在する分画を確認し回収した。
蒸留水に対して２４〜４８時間適宜外液を交換しながら、得られた分画を透析した後凍結乾燥することによって、白色粉末が得られた。３５ｋＤａのタンパク質についての収量は３８．８ｍｇであった。
実施例４．
＜ＳＬＰＦ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）によって合成され、配列表３４〜３７に示される４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補鎖を等モル混合し、９９℃で３０秒間熱処理した後、１時間かけて３７℃に冷まし、３０分間静置して配列表３８及び３９で表されるアミノ酸配列をコードする２本の二本鎖ＤＮＡを構築した。それぞれの二本鎖ＤＮＡを等量混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間結合させ、ＳＬＰＦモノマーをコードする二本鎖ＤＮＡを調整した（ＳＬＰＦのアミノ酸配列；［Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）３  Ａｌａ  Ｓｅｒ］ｎ、配列表４０（ｎ＝５の場合）参照）。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間３０分消化し、次いでＣＩＡＰを加え、３７℃で３０分間処理を行った。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
ＳＬＰＦモノマーＤＮＡとｐＵＣ１１８ベクター試料を１０：１で混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間結合させた。反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを用いて形質転換した。Ｘ−ｇａｌを用いたカラーセレクションによって挿入遺伝子の有無を確認し、挿入遺伝子を含むものについてＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってＳＬＰＦモノマーＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣ−ＳＬＰＦ（１）を得た。
＜ＳＬＰＦ（ｎ）の構築＞
ＳＬＰＦモノマーの両端にはＳｐｅ  Ｉと、Ｎｈｅ  Ｉの制限酵素認識領域を含んでいる。Ｓｐｅ  Ｉと、Ｎｈｅ  Ｉによって消化された断片の突出末端は、いずれも相補的であり互いに結合することができる。さらに、結合して新たに出来た配列は、Ｓｐｅ  Ｉと、Ｎｈｅ  Ｉ制限酵素認識領域のいずれとも異なっており、Ｓｐｅ  Ｉと、Ｎｈｅ  Ｉによっては消化されない。この性質を利用して、一方向にＳＬＰＦモノマーを重合してｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰＦ（ｎ）を構築した。
ｐＵＣ−ＳＬＰＦ（１）を、コンピテントセルＤＨ５αを用いて形質転換し、２ｘＹＴ培地で、３７℃で１８時間培養した。培養液からアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解した。試料を、３７℃で１時間３０分Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉを用いて同時に消化し、プラスミドからＳＬＰＦ（１）を単離した。マイクロコンを用いて反応液を５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出した液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって挿入遺伝子試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加えて１６℃で１６時間結合させた。
ｐＵＣ−ＬｉｎｋをＮｈｅ  Ｉで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加えて生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを形質転換した。アンピシリンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２ｘＹＴ培地に接種して、３７℃で１８時間培養した。アルカリ−ＳＤＳミニプレップ法によって培地からプラスミドを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によって挿入遺伝子の有無とサイズを確認した。次いで、ＤＮＡシークエンシングを行い、配列を確認することによってプラスミドｐＵＣ−Ｌｉｎｋ  ＳＬＰＦ（５）を得た。
＜発現ベクターｐＥＴ−ＳＬＰＦ（５）の構築＞
ｐＵＣ−ＳＬＰＦ（５）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いて消化した。マイクロコンを用いて反応液を５μｌにまで濃縮した後、１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によってインサートＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出にはＵｌｔｒａｆｒｅｅＤＡを用い、再びマイクロコンを用いて抽出液を５μｌにまで濃縮し、挿入遺伝子試料とした。
発現ベクターｐＥＴ３０ａを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した後、ＣＩＡＰを加えてアルカリフォスファターゼ処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
１．５％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって、挿入遺伝子試料とベクター試料中のＤＮＡ濃度を確認し、挿入遺伝子試料とベクター試料が１０：１になるように混合し、混合液と等量のＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え、１６℃で１時間結合させた。
ライゲーション反応液を用いてコンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、カナマイシンを加えたＬＢプレートに植菌してスクリーニングした。発生したコロニーをピックアップし、２  ｘ  ＹＴ培地に接種して培養した。アルカリ−ＳＤＳ法によって培地からベクターを抽出し、ＴＥに溶解して試料とした。試料を、Ｎｈｅ  ＩとＳｐｅ  Ｉで同時に消化した後、電気泳動法によってインサートＤＮＡの有無とサイズを確認し、ＤＮＡシークエンシングによって配列の確認をおこない、発現ベクターｐＥＴ−ＳＬＰＦ  ５を構築した。
ｐＥＴ−ＳＬＰＦ（５）の発現
プラスミドｐＥＴ−ＳＬＰＦ（５）を持つ宿主大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を１．５ｍｌの２  ｘ  ＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次に、５ｍｌの２  ｘ  ＴＹ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った試験管にその培養液１００μｌを加え、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．７となるまで培養した。この場合、ＳＬＰＦ  ５の発現を誘導させるためにＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１時間おきに１００μｌの培地をエッペンドルフチューブに採取して４時間まで培養した。採取した培地を遠心分離（１４５００ｒｐｍ、５分、４℃）して上清を捨て、ペレットを２  ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した後、１００℃で５分間熱処理してＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料とした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとした後、Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロットを行うことにより、ＳＬＰＦ  ５を検出した（第４図）。
第４図に示したように、ＳＬＰＦ  ５では２３ｋＤａにバンドが観測された。この結果から、ＩＰＴＧ添加によりＳＬＰＦ遺伝子が誘導され大量発現する株を得られることが実証された。
プラスミドｐＥＴ−ＳＬＰＦ  ５それぞれを持つ宿主大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、１．５ｍｌの２  ｘ  ＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。次にその培養液を、５ｍｌの２  ｘ  ＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）液体培地で、３７℃で１６時間培養した。さらにその培養液を、２５０ｍｌの２ｘＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った１ｌの三角フラスコに加え、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．７となるまで培養した。この場合、タンパク質の発現を誘導させるためにＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍＭ）を添加し、さらに４時間培養して集菌（８，５００ｒｐｍ、３０分、４℃）することにより菌体を得た。得られた菌体を−２０℃で保存した。
−２０℃で保存した菌体を氷上でゆっくり解凍し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に懸濁し、氷上で超音波破砕（Ｏｕｔ  ｐｕｔ  ３．５、Ｄｕｔｙ  ６０％（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１））を、１分間の冷却時間を設けながら、２分間ずつ２０回行った。得られた菌体破砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分、４℃）して上清を回収した。
得られた上清を添加試料とし、あらかじめ同緩衝液を用いて平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズを充填したカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィー（流速１５〜２０ｍｌ／ｈ）による精製を行った。各溶出液を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって目的とするタンパク質の存在する分画を確認し、回収した。
蒸留水に対して２４〜４８時間適宜外液を交換しながら、得られた分画を透析した後凍結乾燥することによって、白色粉末が得られた。２３ｋＤａのタンパク質について収量は３８．８ｍｇ／Ｌであった。
【配列表】
2003100065.tif 000003
2003100065.tif 000004
2003100065.tif 000005
2003100065.tif 000006
2003100065.tif 000007
2003100065.tif 000008
2003100065.tif 000009
2003100065.tif 000010
2003100065.tif 000011
2003100065.tif 000012
2003100065.tif 000013
2003100065.tif 000014
2003100065.tif 000015
2003100065.tif 000016
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＳＬＰ２、４、６を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内で発現させたときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果である。
第２図は、ＳＬＰＡ４をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロットで検出した結果である。
第３図は、ＳＥＬＰ８をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロットで検出した結果である。
第４図は、ＳＬＰＦ５をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロットで検出した結果である。
【図１】
2003100065.tif 000017
【図２】
2003100065.tif 000018
【図３】
2003100065.tif 000019
【図４】
2003100065.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月11日(2003.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
家蚕絹フィブロイン、野蚕絹フィブロイン、エラスチン及びフィブロネクチンの中から選択され、前記家蚕絹フィブロイン又は野蚕絹フィブロインの何れかを必須とする少なくとも１個のタンパク質からなる絹又は絹様高分子を設計し、該絹又は設計された高分子の最小単位を合成し、合成された該最小単位の高分子を、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターの中から選択された少なくとも１つの発現ベクターに組み込み、次いで該発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの何れかの大腸菌に組み込み、該大腸菌を、複合培地から選択された培地を用いて大腸菌の増殖最適温度より２〜７℃下げた温度条件で培養することを特徴とする、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【請求項２】
削除
【請求項３】
発現ベクターがＴ７１ａｃプロモーターを含む発現ベクターの中から選択された発現ベクターである、請求項１に記載された、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【請求項４】
発現ベクターがｐＥＴ３０ａである請求項３に記載された、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【請求項５】
前記培地がＴＢ培地である請求項１に記載された、絹又は遺伝子組換え絹様タンパク質の生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
ることが好ましい。
発現誘導後は、複合培地から選択された培地を用い、培養温度及びＩＰＴＧ添加濃度並びにｐＨ等の培養条件を最適化することにより、大腸菌へのストレスを軽減させる。本発明においては、故意に大腸菌の増殖にとって最適な培養条件からはずすことによって、目的タンパク質の発現を穏やかに進行させることが出来、これによって長時間の培養が可能となり、目的タンパク質の収量を上げることが出来る。従って、本発明においては、培養温度を、大腸菌の増殖最適温度より２〜７℃低温に設定する。
また、本発明で使用する培地はＴＢ培地であることが特に好ましい。ＩＰＴＧ添加濃度は０．２〜１．０ｍＭであることが好ましい。更にｐＨは６．７〜７．０であることが好ましい。
実施例
以下、本発明を実施例によって更に詳述するが、本発明はこれによって限定されるものではない。尚、以下において、特にことわりのない限り、「％」は「重量％」を表し、比は重量比を意味する。文、文章中の各記号の意味は下記の通りである。
参考例１．
＜ＳＬＰ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）の合成による、配列表１２〜１５に示された４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、Ｔｒｉｓ（トリス）  ＥＤＴＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：以下ＴＥとする）を用いて、濃度が１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
この様にして精製されたＳＬＰ６を、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法によって不純タンパク質から分離し、ザルトブロット２−Ｓ（ザルトリウス）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、染色液を用いて５分間染色した後メタノールで脱色し、洗浄したハサミを用いて目的とするタンパク質のバンドを切りだした。この試料を用い、ＡＢＩ  ４７３気相式エドマンシーケンサーを用いてＮ−末端アミノ酸配列を決定した。決定したＮ−末端アミノ酸配列は予想されるアミノ酸配列と一致し、目的としたタンパク質ＳＬＰ６であることが確認された。
参考例２．
＜ＳＬＰＡ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）で合成した配列表２０〜２３に示される４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて、濃度が１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補鎖を等モル混合し、９９℃で３０秒間熱処理した後１時間かけて３７℃に冷まし、３０分間静置して配列表２４及び２５で表されるアミノ酸配列をコードする２本の二本鎖ＤＮＡを構築した。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間３０分消化し、ＣＩＡＰを加え、３７℃で３０分間処理を行った。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合溶液（重量比で２５：２４：１）を用いて抽出し、精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
それぞれの二本鎖ＤＮＡとｐＵＣ１１８ベクター試料を１０：１で混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
蒸留水に対して２４〜４８時間適宜外液を交換しながら得られた分画を透析した後、凍結乾燥することによって白色粉末を得た。収量は３４．２ｍｇ／Ｌであった。
実施例１．
＜ＳＥＬＰ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）で合成し配列表２７〜３０で表される、４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて１μｇ／μｌとなるように溶解した。それぞれの相補鎖を等モル混合し、９９℃で３０秒間熱処理した後１時間かけて３７℃に冷まし、３０分間静置して配列表３１及び３２で表されるアミノ酸配列をコードする２本の二本鎖ＤＮＡを構築した。それぞれの二本鎖ＤＮＡを等量混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用い、１６℃で１時間結合させ、ＳＥＬＰモノマーをコードするで表される二本鎖ＤＮＡを調整した（ＳＥＬＰのアミノ酸配列；Ｔｈｒ  Ｓｅｒ［（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）２  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）２  Ａｌａ  Ｓｅｒ］ｎ、配列表３３（ｎ＝８の場合）参照）。
クローニングベクターｐＵＣ１１８を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間３０分消化し、ＣＩＡＰを加え、３７℃で３０分間処理した。反応液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合溶液（重量比２５：２４：１）を用いて抽出し精製した。精製した反応液にエタノールを加え、生じた沈殿を滅菌水に溶解してベクター試料とした。
ＳＥＬＰモノマーＤＮＡとｐＵＣ１１８ベクター試料を１０：１で混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて１６℃で１時間結合させた。反応終了後、コンピテントセルＤＨ５αを用いて形質転換した。Ｘ−ｇａｌを用いたカラーセレクションによって挿入遺伝子の有無を確認


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
さらにその培養液を１．２ｌの２ｘＹＴ（２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の入った２ｌのファーメンターに加え、３７℃でＯＤ６００＝０．５〜０．７となるまで培養した。この場合、タンパク質の発現を誘導させるためにＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍＭ）を添加し、温度を３０℃まで下げてさらに４時間培養し、集菌（８５００ｒｐｍ、３０分、４℃）することにより菌体を得た。得られた菌体は−２０℃で保存した。
−２０℃で保存した菌体を氷上でゆっくり解凍し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に懸濁し、氷上で超音波破砕（Ｏｕｔ  ｐｕｔ  ３．５、Ｄｕｔｙ  ６０％（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１））を、１分間の冷却時間を設けながら、２分間ずつ２０回行った。得られた菌体破砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分、４℃）して上清を回収した。
得られた上清を添加試料とし、あらかじめ同緩衝液を用いて平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  アガロースビーズを充填したカラムを用い、アフィニティークロマトグラフィー（流速１５〜２０ｍｌ／ｈ）による精製を行った。各溶出液を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって目的とするタンパク質の存在する分画を確認し回収した。
蒸留水に対して２４〜４８時間適宜外液を交換しながら、得られた分画を透析した後凍結乾燥することによって、白色粉末が得られた。３５ｋＤａのタンパク質についての収量は３８．８ｍｇであった。
参考例３．
＜ＳＬＰＦ遺伝子の構築＞
旭テクノグラス（株）によって合成され、配列表３４〜３７に示される４本のオリゴヌクレオチドを設計した。
合成したフィルム状のオリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて１μｇ／μｌとなるように溶




【国際調査報告】
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