(57)【要約】臍帯血由来の造血幹細胞を大人の患者へ造血幹細胞移植等臨床応用に十分な程度までに安全に増殖させる方法を開発し、更には、従来非常に少数しか得られなかった間葉系幹細胞又は間葉系細胞を多数調製するために、テロメラーゼ等の不死化遺伝子のみを間葉系幹細胞、間葉系細胞等に導入し、増殖した間葉系幹細胞を分化誘導した。
2003038076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞、間葉系細胞前駆細胞、間葉系細胞、又は間葉系細胞から派生する細胞から選択される間葉系に関連する細胞を、不死化遺伝子を高発現又は活性化させることにより不死化させた、不死化間葉系関連細胞。
【請求項２】
不死化遺伝子がテロメラーゼ遺伝子、テロメラーゼから派生する遺伝子、テロメラーゼの発現又は活性を調節する遺伝子のいずれかである請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
不死化遺伝子が遺伝子除去処理により特異的に除去されうるまたは除去された請求項１または２項に記載の細胞。
【請求項４】
不死化遺伝子の遺伝子除去処理が、不死化遺伝子をｌｏｘＰ配列またはｌｏｘＰ様配列にはさんだ後、Ｃｒｅリコンビナーゼなどのリコンビナーゼ処理することによりなされる請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
不死化遺伝子を遺伝子導入により細胞内に導入することにより、不死化遺伝子を高発現させたものである請求項１記載の細胞。
【請求項６】
間葉系幹細胞、間葉系細胞前駆細胞、間葉系細胞、又は間葉系細胞から派生する細胞から選択される間葉系に関連する細胞が骨髄、末梢血、臍帯血、皮膚、毛根、筋組織のいずれかに由来する、請求項１から５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
間葉系幹細胞、間葉系細胞前駆細胞、間葉系細胞、又は間葉系細胞から派生する細胞から選択される間葉系に関連する細胞がヒトＥＳ細胞（胎性幹細胞）またはＥＳ細胞（胎性幹細胞）から派生する細胞のいずれかに由来する、請求項１から６項のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
間葉系に関連する細胞が、間葉系細胞である請求項１−７項いずれかに記載の細胞。
【請求項９】
間葉系細胞が造血系細胞の増殖を支持することができる骨髄ストローマ細胞である請求項８項に記載の細胞。
【請求項１０】
間葉系に関連する細胞が、間葉系細胞から派生する細胞である請求項１−７項いずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
間葉系細胞から派生する細胞が、内皮細胞ないし心筋細胞などの心血管系の細胞ないし心血管系の細胞の前駆細胞である請求項１０項に記載の細胞。
【請求項１２】
間葉系細胞から派生する細胞が、骨、軟骨、腱、骨格筋、又は脂肪組織のいずれかの細胞又は前駆細胞である請求項１０項に記載の細胞。
【請求項１３】
間葉系細胞から派生する細胞が、神経系の細胞又は神経系細胞の前駆細胞である請求項１０項に記載の細胞。
【請求項１４】
間葉系細胞から派生する細胞が、内分泌細胞又は内分泌細胞の前駆細胞である請求項１０項に記載の細胞。
【請求項１５】
間葉系細胞から派生する細胞が、造血細胞又は造血細胞の前駆細胞である請求項１０項のいずれかに記載の細胞。
【請求項１６】
間葉系細胞から派生する細胞が、肝細胞又は肝細胞の前駆細胞である請求項１０項のいずれかに記載の細胞。
【請求項１７】
請求項９項に記載された細胞を造血系幹細胞と培養することにより得られる分化能及び増殖能を有する人工骨髄。
【請求項１８】
不死化ストローマ細胞又は不死化ストローマ細胞に由来する物質を更に存在させることにより得られる請求項１７項記載の人工骨髄。
【請求項１９】
不死化ストローマ細胞に由来する物質が調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる可溶性のサイトカイン、細胞との接触で供給される接着分子、非可溶性のサイトカインリガンドから選択される物質である請求項１８項記載の人工骨髄。
【請求項２０】
赤血球又は赤血球前駆細胞を含む請求項１７−１９項記載の人工骨髄
【請求項２１】
血小板または巨核球などの血小板の前駆細胞を含む請求項４７−１９項に記載された人工骨髄。
【請求項２２】
請求項１から７項、または第１１項のいずれかに記載された細胞とともに、心血管細胞前駆細胞を培養することによって得られる、増殖能を有し分化を制御することができる人工心血管系細胞構造物。
【請求項２３】
請求項１から７項、または第１２項のいずれかに記載された細胞とともに骨、軟骨、腱、骨格筋、又は脂肪組織のいずれかの細胞の前駆細胞としての性質を持つ細胞を培養することによって得られる、増殖能を有し分化を制御できる人工骨、人工軟骨、人工腱、人工骨格筋、又は人工脂肪組織。
【請求項２４】
請求項１から７項、または第１３項のいずれかに記載された細胞とともに、あるいはそれらの細胞に由来する物質とともに、神経系の前駆細胞を培養することによって得られる、増殖又は分化を制御できる神経系を構成する細胞群又は神経系に共存する細胞群。
【請求項２５】
請求項１から７項、または第１４項のいずれかに記載された細胞とともに、あるいはそれらの細胞に由来する物質とともに、内分泌系の前駆細胞を培養することによって得られる、増殖又は分化を制御できる内分泌組織を構成する細胞群又は内分泌組織に共存する細胞群。
【請求項２６】
請求項８記載の細胞から分化誘導処理により誘導された神経幹細胞。
【請求項２７】
請求項８記載の細胞を用いた神経作動性薬剤の薬効評価検査法。
【請求項２８】
請求項８記載の細胞から分化誘導処理により分化させられた骨髄ストローマ細胞。
【請求項２９】
請求項２８記載の細胞を用いた薬剤の薬効評価検査方法。
【請求項３０】
請求項１７記載の人工骨髄を分化させて誘導された赤血球。
【請求項３１】
間葉系細胞前駆細胞、間葉系幹細胞、間葉系細胞、又は間葉系細胞から派生する細胞から選ばれる間葉系に関連する細胞中で、不死化遺伝子を高発現或いは活性化することによる、間葉系に関連する細胞の不死化増殖方法。
【請求項３２】
不死化遺伝子が、テロメラーゼである請求項３１項記載の方法。
【請求項３３】
レトロウイルスベクターを用いてテロメラーゼを間葉系幹細胞に由来する細胞中に導入することにより高発現させる請求項３１項記載の方法。
【請求項３４】
レトロウイルスベクターがｐＢａｂｅである請求項３３項記載の方法。
【請求項３５】
間葉系幹細胞由来細胞にオンコジーンを導入しない請求項３１項記載の方法。
【請求項３６】
間葉系に関連する細胞が骨髄ストローマ細胞である請求項３１−３５いずれかに記載の方法。
【請求項３７】
不死化増殖された骨髄ストローマ細胞と造血幹細胞とを培養することによる人工骨髄製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本件発明は、細胞の増殖法、特に従来、十分な数の細胞を入手することが困難であった幹細胞の増殖方法に関する。
更に本件発明は、このように増殖した細胞の利用法にも関する。そして、本件発明は、このように増殖した細胞を用いる再生医療に関する。
背景技術
白血病などの難治性血液疾患に対して行われている造血幹細胞移植には、大量の血液幹細胞を必要とする。造血幹細胞は、血液の成分である、白血球、赤血球、血小板へと分化する、未分化の細胞である。造血幹細胞は、骨髄穿刺あるいは末梢血幹細胞採取等により，骨髄、末梢血や、臍帯血から採取することができる。
造血幹細胞は、現在までに、腫瘍の治療や、血液性疾患の治療に利用されている。血液幹細胞の供給源としては、臍帯血は、骨髄からの幹細胞に代え利用されているが、臍帯血の血液幹細胞は、治療に用いるのに充分なほどの数を得るのがむずかしいことが問題であった。
そのため、造血幹細胞のインビトロでの増殖が試みられており、例えば、ディック等は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）の存在下で、ストローマ細胞不存在でも、４日間で、２−４倍に増殖させることに成功している。しかしながら、長期の培養では、幹細胞活性の低減が見られている（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：６１９）。他方、イーブ等は、齧歯類の幹細胞をインターロイキン１１，ＦＬ、ＳＣＦ、を添加したストローマ細胞不存在下で、培養することで、３倍に増殖でき、更に、人の幹細胞をＳＣＦ、ＦＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３，及びＩＬ−６で刺激することで、２倍に増加することが出来た旨報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９４，１３６４８）。
他方、最近では、幹細胞の全能性の維持には、ストローマ細胞と経代された細胞との間の接触が重要だと言うことが理解されてきている。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて支持細胞（ストローマ細胞；ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ：ｓｔｒｏｍａ  ｃｅｌｌ）や各種サイトカインとの共培養によって，造血幹細胞の増幅をはかる試みがされており，ある程度の増幅がみられているが，臨床への応用に対しては不十分である（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２９，１７４−１８２）。
また、細胞の癌化にテロメラーゼが関与していることが示唆されており、ｒａｓのようなオンコジーン（癌化遺伝子）と組み合わせて、テロメラーゼを遺伝子導入することで、細胞を不死化させる試みはなされてきている。しかしながら，テロメレースを導入して不死化する試みはいくつかの細胞でなされているものの、癌化することなく正常な細胞の機能を持ったまま不死化することには成功していない。（Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４００  ｐ．４６５）。
発明の開示
発明が解決しようとする課題
本件発明の第一の課題は、臍帯血由来の造血幹細胞を、大人の患者へ造血幹細胞移植等臨床応用に十分な程度までに安全に増殖させる方法を開発することにある。
現在、貧血患者に対する赤血球輸血のソースとして、献血で得られた同種赤血球が主として用いられている。しかしながら、稀な血液型に対する血球のドナー不足および未知の感染源の播種の可能性が問題とされている。本件発明の第２の課題は、不死化ストローマ細胞で造血幹細胞を増幅し、その後に高率に赤血球前駆細胞の産生を誘導する系を作成することで、大量でかつ安全な赤血球供給系を確立することを目的とする。
本件発明の第３の課題は、造血幹細胞をその支持細胞とともに長期的に安定して増殖できるような人工的培養物、言い換えれば、人工骨髄を開発することにある。
更に、種々の再生組織、再生臓器の作製に、胎児細胞以外からの組織から人工的に心血管組織や神経組織など治療に有効な組織を再生することにある。
課題を解決するための手段
まず、本件発明者等は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてストローマ細胞に発ガン遺伝子やテロメラーゼのような不死化遺伝子を組み込んだウイルスベクターを導入したところ、テロメラーゼのみを導入した場合に、細胞分裂を繰り返しても細胞の増殖が継続するという、細胞の寿命が飛躍的に延びるにもかかわらず、細胞形状が正常細胞と同じであり、正常細胞と同様に血液前駆細胞の増殖支持細胞として用いることができることを見いだした。
この寿命が飛躍的に伸びた不死化ストローマ細胞を臍帯血などから得られる造血前駆細胞の支持細胞として用いることにより、造血前駆細胞の増殖を飛躍的に増大させることができた。さらには、このように増大した、造血前駆細胞系を用いることにより、赤血球前駆細胞の産生を誘導することで、大量に、かつ未知の感染の心配なく、貧血患者などに対する赤血球供給系を開発することができるものである。
更に、本発明者等は、ストローマ細胞のみならず、間葉系幹細胞においても、テロメラーゼ等の不死化遺伝子のみを導入することで、間葉系幹細胞をも不死化でき、しかも、幹細胞としての特性を失わず、適当な分化誘導条件を用いれば、細胞分化を誘導できることをも見いだしたものである。そして、幹細胞のみならず間葉系細胞へと分化することができる間葉系細胞の前駆細胞、間葉系細胞から由来する細胞についても同様に不死化することが可能であることを見いだし、本発明を完成させたものである。
更に、このように不死化した間葉系幹細胞、間葉系細胞前駆細胞、間葉系細胞などの細胞と種々の組織の細胞を共存させることで、これら組織の増殖させ、人工的な組織構造物を構築できることを見いだしたものである。
発明の実施の最良の形態
本件発明は、（１）間葉系幹細胞、間葉系細胞前駆細胞、間葉系細胞、又は間葉系細胞から派生する細胞（以下間葉系細胞に関連する細胞と呼ぶ）に不死化遺伝子を導入して不死化させる方法、及び不死化させられた細胞、（２）不死化させられた間葉系幹細胞から分化させられた細胞及びその分化方法、（３）造血幹細胞（前駆細胞）をストローマ細胞と共培養する場合に、不死化遺伝子をストローマ細胞に導入し、長期間増殖させる方法。（４）心血管系細胞を間葉系細胞と共培養する場合に、不死化遺伝子を間葉系細胞に導入し、長期間増殖させる方法、及び分化制御させる方法、（５）骨、軟骨、腱、骨格筋、脂肪組織、などを間葉系細胞と共培養する場合に、不死化遺伝子を間葉系細胞に導入し、長期間増殖させる方法、及び分化制御させる方法、（６）神経系細胞を間葉系細胞と共培養する場合に、不死化遺伝子を間葉系細胞に導入し、長期間増殖させる方法、及び分化制御させる方法、（７）内分泌系細胞を間葉系細胞と共培養する場合に、不死化遺伝子を間葉系細胞に導入し、長期間増殖させる方法、及び分化制御させる方法、（８）不死化された細胞、又は不死化細胞を利用して増殖や分化などの修飾を施した細胞を用いた、検査方法、治療法を包含する。
また、本発明には、更に、不死化した間葉系に関連する細胞を用いた、試験管内測定法、好適には、薬剤の効果判定法である試験管内測定方法、そのための試験管内測定法のキット、更には、疾患の病態解析法、診断法、治療法、輸血治療法、心血管系の治療法、骨、軟骨、腱、骨格筋、脂肪組織の治療法、神経疾患の治療法、内分泌疾患の治療法、虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症の治療法、変形性関節症、リューマチ性関節疾患、外傷、難治性の骨・軟骨欠損の治療法、神経変性疾患、痴呆、脳血管障害、神経外傷の治療法も包含するものである。
本件発明における細胞の不死化とは、通常の細胞が一定回数の分裂を繰り返すと、増殖が停止するが、本件発明の不死化細胞は、このような回数の分裂を繰り返した後もなお、増殖する細胞のことを意味している。
本件発明においては、不死化遺伝子としては、テロメラーゼ又はテロメラーゼの発現又は活性を調節する遺伝子を意味するが、好適には、ヒトテロメラーゼを用いることができる。さらに、たとえば、ｍｙｃ遺伝子がテロメラーゼ活性を高めると言われている。
不死化遺伝子を、ストローマ細胞、間葉系幹細胞等の間葉系に関連する細胞への導入方法としては、公知の種々の方法を用いることができるが、例えば、不死化遺伝子をプラスミドベクターに組み込み、当該ベクターをカルシウムーリン酸の存在下でストローマ細胞のような間葉系細胞、間葉系幹細胞等に導入して、形質転換する方法、或いは不死化遺伝子をリポソームの様なベシクルとともに、間葉系細胞又は間葉系幹細胞に接触させ導入する方法、更に、不死化遺伝子の存在下でエレクトロポレーションにより導入する方法、あるいは不死化遺伝子を各種ウイルスベクターに組み込み、間葉系細胞、間葉系幹細胞等に感染させて導入する方法などを用いることができる。
ウイルスベクターを用いる導入方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスを用いる方法があり、レトロウイルスベクターとしては、ＭｏＭＬＶウイルスを用いる方法などがある。好適には、ｐＢａｂｅベクターを用いることができる。
更に、不死化した細胞を患者に戻す場合、不死化遺伝子などの外来遺伝子はなるだけ除去しておいた方が安全性が高いと考えられ、既に確立した技術により、細胞に導入した不死化遺伝子を除去することができる。例えば、好適には、不死化遺伝子がｌｏｘＰ配列またはｌｏｘＰ様配列にはさまれて、Ｃｒｅリコンビナーゼなどのリコンビナーゼ処理により特異的に除去する手法を用いることができる。
間葉系に関連する細胞とは、間葉系幹細胞、間葉系細胞、間葉系細胞の前駆細胞、間葉系細胞から由来する細胞のことを意味している。
間葉系幹細胞とは、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、血液、臍帯血、更には、種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細胞のことである。また、間葉系幹細胞は、ＥＳ細胞やテラトーマ細胞からも間葉系幹細胞が分離できることが知られている。幹細胞とは、全能性を有する全ての細胞に分化できる全能性幹細胞や、胎児性幹細胞のように三胚葉の系統には分化できるが胚外栄養膜細胞への分化は限定的であるｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙである幹細胞、更には、ある組織の多くの細胞に分化することができる多能性幹細胞などがある。間葉系幹細胞は、移植部位特異的に分化することが知られており、羊胎仔の腹腔内に移植すると、軟骨組織では軟骨に、骨格筋組織では骨格筋に、心臓では心筋に、脂肪組織では脂肪細胞に、胸腺・骨髄では間質細胞に分化することが知られているので、間葉系幹細胞は、ｐｌｕｉｒｉｐｏｔｅｎｔであると考えられる。このような性質から、十分な間葉系幹細胞を培養できれば、このような間葉系幹細胞を移植し、局所的に分化させることで、損傷を受けた組織、臓器を再生させることができるのではないかと考えられている。間葉系幹細胞として、好適には、骨髄の初期培養を行い、カルチャーディッシュの底面に付着した間質細胞から取得する幹細胞がある。
間葉系細胞の前駆細胞とは、間葉系幹細胞から分化し、間葉系細胞への分化の途上にある細胞のことを意味する。
間葉系細胞は、間葉系幹細胞の分化により生じ、幹細胞のように多方面に分化する能力はないが、ある方向への分化能力と増殖能力を有している細胞である。正常の状態ではＧ０期に止まっているが、刺激によりＧ１期（分裂開始）に移行できる細胞である。間葉系細胞は、例えば、ストローマ細胞、ストローマ細胞の性質を有する細胞も包含している。間葉系細胞は、皮下組織、肺、肝等あらゆる臓器に存在しており、骨、軟骨、脂肪、腱、骨格筋、骨随間質と言った間葉系組織に存在している。
間葉系細胞から派生する細胞とは、（１）内皮細胞又は心筋細胞等の心血管系の細胞又は心血管系の細胞の前駆細胞、並びにこれら細胞としての性質を持つ細胞、（２）骨、軟骨、腱、又は骨格筋のいずれかの細胞、並びに骨、軟骨、腱、骨格筋、又は脂肪組織のいずれかの細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（３）神経系の細胞又は神経系細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（４）内分泌細胞又は内分泌細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（５）造血細胞又は造血細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞、（６）肝細胞又は肝細胞の前駆細胞、更にはこれら細胞としての性質を持つ細胞を包含している。
不死化した細胞から由来する物質とは、調製培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる可溶性のサイトカイン等や、細胞との接触で供給される接着分子や非可溶性のサイトカインリガンドのような物質を意味する。これらの物質と共培養することによって、相手の細胞の増殖分化を制御できるものである。
例えば、可溶性のサイトカインとしては、可溶性のＳＣＦ（ｋｉｔリガンド）、ｆｌｔ３リガンド，トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、そのほかにも、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、各種インターロイキン（インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８、など）、各種インターフェロン、各種増殖分化制御因子（ＦＧＦ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ，ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ，ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ，ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；Ｇ−ＣＳＦ，ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ，ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｍ−ＣＳＦ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ，ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＴ−３，Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３；ＮＴ−４，Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−４；ＯＳＭ，Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ；ＰＤＧＦ，ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＧＦａｌｐｈａ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ；ＴＧＦｂｅｔａ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ；分泌型のＣＤ４０リガンドなどを含む分泌型のＴＮＦファミリー分子群、ＶＥＧＦ，ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１；Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２；ＰＧＦ，ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｐｌａｃｅｎｔａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；等）、各種のケモカイン（インターロイキン−８；ＲＡＮＴＥＳ；ＭＩＦ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ；ＭＩＰ−ｌａｌｐｈａ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ａｌｐｈａ；）等を挙げることができる。
細胞との接触に働くいわゆる接着分子や細胞外マトリックスとしては、たとえば、インテグリンファミリー、カドヘリンファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー、セレクチンファミリー、コラーゲン（タイプＩからＸＶＩ）、ファイブロネクチン、エラスチン、ラミニン群、オステオカルチン、オステオネクチン、オステオポンチン、テナシン、トロンボスポンディン、ビトロネクチン、軟骨マトリックスタンパク、等を挙がることができる。
非可溶性のサイトカインリガンドとしては、たとえば、膜結合型のＳＣＦ（ｋｉｔリガンド）、膜結合型のＣＤ４０リガンドやＴＮＦなどを含む膜結合型のＴＮＦファミリー分子群、などを挙げることができる。
更に本発明では、間葉系幹細胞を、不死化した後に適切な分化誘導条件を採用することにより、骨、軟骨、脂肪組織に分化できるものである。難治性の骨折や関節症に役立つものである。幹細胞を不死化により増殖して、治療に十分なだけの細胞数を確保できるようになったため、実用化が可能になったものである。
又、本発明には、例えば、心血管細胞前駆細胞、骨の前駆細胞、軟骨の前駆細胞、骨格筋の前駆細胞、又は脂肪組織の前駆細胞を、不死化した間葉系に関連する細胞である間葉系幹細胞、間葉系細胞前駆細胞、間葉系細胞、又は間葉系細胞から派生する細胞と共培養することにより、人工心血管系細胞構造物、人工骨、人工軟骨、人工腱、人工骨格筋、又は人工脂肪組織を構築することも含まれる。
さらに、神経系の前駆細胞、又は内分泌系の前駆細胞を不死化した間葉系に関連する細胞である間葉系幹細胞、間葉系細胞前駆細胞、間葉系細胞、又は間葉系細胞から派生する細胞と共培養することにより、増殖又は分化を制御できる神経系を構成する細胞群又は神経系に共存する細胞群、増殖又は分化を制御できる内分泌組織を構成する細胞群又は内分泌組織に共存する細胞群を構築することも含まれる。
なお、心血管細胞前駆細胞としては、心臓組織由来の心筋前駆細胞、骨格筋由来の筋芽細胞（ミオブラスト）、末梢血ないし骨髄中の血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、及び血管芽細胞（アンジオブラスト）等が挙げられる。
造血系幹細胞としては、末梢血ないし骨髄中の造血系幹細胞を含む細胞群若しくは特にＣＤ３４＋細胞、臍帯血の造血系幹細胞を含む細胞群若しくは特にＣＤ３４＋細胞、又はＥＳ細胞から由来する造血系幹細胞若しくはＣＤ３４＋細胞を挙げることができる。
「骨、軟骨、腱、骨格筋、脂肪組織のいずれかの細胞の前駆細胞としての性質を持つ細胞」としては、骨芽細胞、破骨細胞関連細胞、軟骨芽細胞、骨格筋由来の筋芽細胞（ミオブラスト）、及び脂肪組織関連細胞等を挙げることができる。
「神経系を構成する細胞群又は神経系に共存する細胞群」としては、神経幹細胞、神経細胞、グリア細胞前駆細胞、グリア細胞、並びに網膜を構成する神経細胞及び神経前駆細胞等が挙げられる。
「内分泌組織を構成する細胞群又は内分泌組織に共存する細胞群」としては、膵ラ氏島細胞若しくはその前駆細胞、又は副腎細胞若しくはその前駆細胞、等を挙がることができる。
また、不死化したストローマを臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞の様な造血細胞と共に培養することで、人工骨髄を構築できることも含まれる。
実施例
［実施例１］ストローマ細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）の不死化
１．初代ストローマ細胞の採取
健康成人男性の腸骨より得られた骨髄液１０ｍｌから単核球分離し，１晩培養後にフラスコに付着した細胞をストローマ細胞として利用した。
２．ストローマ細胞に導入する遺伝子として、ヒトテロメラーゼの触媒活性サブユニット（ｈＴＥＲＴ）をコードする遺伝子を用いた。ｈＴＥＲＴの配列は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，ｐ．９５５−９５９に記載されている。更に、細胞の癌化に関連する遺伝子として知られている、公知のｒａｓ遺伝子，ＳＶ４０Ｔ遺伝子についてもストローマ細胞に導入した。
３．ストローマ細胞への遺伝子導入に用いるベクター（図１）
ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴ（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇより供与）は、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴはＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ９５，ｐ１４７２３−１４７２８中に記載されているとおり、ｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ−ＨＡよりＰＣＲにて得たｈＴＥＲＴ  ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔをｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏにｃｌｏｎｉｎｇしたものである。ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ｒａｓＶ１２（Ｄｒ．Ｓｃｏｔｔ  Ｗ  Ｌｏｗｅから供与）は、Ｃｅｌｌ，８８，５９３−６０２，１９９７に記載の方法で調製された。ｐＭＦＧ−ｔｓＴ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏはＭＦＧ−ｔｓＴ（ｐＺＩＰｔｓＵ１９｛Ｄｒ．Ｒ．ＭｃＫａｙから頂いたもの｝よりｃｌｏｎｉｎｇしてＭＦＧベクターに組み込んだもの｛Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８，１４６７−１４６８，１９９８｝）にＩＲＥＳ−ｎｅｏ（ｐＲｘ−ｈＣＤ２５−ｉｒｅｓ−ｎｅｏ｛Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ９，１９８３−１９９３，１９９８｝から切り出した）のＢａｍＨＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔをｃｌｏｎｉｎｇして作成した。
４．レトロウイルス産生細胞の作製とそれによるウイルスの感染は「別冊実験医学  ザ・プロトコールシリーズ  遺伝子導入＆発現解析実験法（斎藤  泉  菅野  純夫  編  羊土社）」に準じておこなった（Ｐ５８−６２）。
具体的には、ＢＯＳＣ２３パッケージング細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８３９２−８３９６，１９９３）を用いて、次のように、ΨＣＲＩＰパッケージング細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：３５３９−３５４３，１９９３）を作成した。
４−１．組み換えレトロウイルスベクター産生細胞の作製
（ｉ）ＢＯＳＣ２３細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈにトランスフェクションの１８〜２４時間前に５．５ｘ１０６個播いた。
（ｉｉ）１５μｇのＤＮＡ（レトロウイルスベクター）にＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を８００μｌ静かに加え、攪拌しＡ液を調製した。
（ｉｉｉ）滅菌されたチューブにＯＰＴＩ−ＭＥＭを７５０μｌ採り，ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（２ｍｇ／ｍｌ  Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を５０μｌ加えてゆっくり混ぜＢ液を調製した。
（ｉｖ）Ａ液を静かにＢ液に混ぜＣ液を調製し，室温で３０〜４５分放置した。
（ｖ）ＢＯＳＣ２３細胞を抗生剤，ＦＢＳを除いた３７℃の培地で１度洗った。
（ｖｉ）Ｃ液（１．６ｍｌ）を静かにＢＯＳＣ２３細胞に加えた。
（ｖｉｉ）更に、２．４ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを加えた。
（ｖｉｉｉ）５時間，５％ＣＯ２下でインキュベートした。
（ｉｘ）４ｍｌの２０％胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭを加え，１晩インキュベートした。
（ｘ）１０％胎児ウシ血清を含む３７℃の培地に換え、同時にパッケージング細胞であるΨＣＲＩＰを１０ｃｍ  ｄｉｓｈに１〜２ｘ１０６個播いた。
（ｘｉ）２４時間後，ＢＯＳＣ２３細胞の培地を０．４５または０．２０μｍのシリンジフィルターで濾過し，ΨＣＲＩＰの培地を５ｍｌの濾過した培地に交換した。同時にポリブレン（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ  Ｈ−９２６８）を８μｇ／ｍｌになるように加えた。
（ｘｉｉ）４〜２４時間培養後，５ｍｌの培地を加え，さらに一晩培養した。
（ｘｉｉｉ）薬剤選択を行い，レトロウイルスを産生するΨＣＲＩＰ細胞が作成される。
次に、上記３種のベクターを別々に、レトロウイルス産生細胞（ψＣＲＩＰ／Ｐ１３１）で増殖させ、ストローマ細胞には次のように遺伝子導入（感染）された（図２）。
まず、感染を行う前日に、ストローマ細胞を５ｘ１０４ｃｅｌｌ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈとなるように播きなおし、レトロウイルスを産生するψＣＲＩＰ／Ｐ１３１の培地を１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭから１２．５％非働化ウマ血清１２．５％非働化胎児ウシ血清／２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ／ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ含有α−ＭＥＭの培地に代えて培養する。当日に培養上清を０．２０μｍフィルターで濾過してポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を最終濃度８μｇ／ｍｌになるように加えた。次に上清に産生された組み換えレトロウイルスベクターをストローマ細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）に惑染させた。４時間後培養上清を新しい培地に換えてさらに２日間培養した。その後、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴはハイグロマイシン１００μｇ／ｍｌで５日間、ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ｒａｓＶ１２はピューロマイシン１μｇ／ｍｌで５日間，ｐＭＦＧ−ｔｓＴ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏはＧ４１８  １ｍｇ／ｍｌで５日間それぞれ薬剤選択を行った。
感染には、３種類のレトロウイルスベクターを、（１）コントロール、（２）ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴベクターのみ、（３）ｐＭＦＧ−ｔｓＴ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏベクターのみ、（４）ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ｒａｓ−Ｖ１２ベクターのみ、（５）ｐＭＦＧ−ｔｓＴ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ／ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴ２種のベクター、（６）ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ｒａｓ−Ｖ１２／ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴ２種のベクター、（７）ｐＭＦＧ−ｔｓＴ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ／ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ｒａｓ−Ｖ１２の２種のベクター、（８）ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ｒａｓ−Ｖ１２／ｐＭＦＧ−ｔｓＴ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ／ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴの３種のベクター、で感染させた。
なおこれらのウイルスおよび細胞は、発明者らが保管しており、特許後いつでも分譲できる状態にある。
ｐＭＦＧ−ｌａｃＺを感染させたものでＸ−ｇａｌ染色を行うと，染色が確認できたストローマ細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）は約３％であった。
薬剤選択したものの細胞増殖を検討した。初代ストローマ細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ）は４３日間増殖して、世代数が１１（ＰＤ（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）＝１１）で分裂停止した。ＳＶ４０Ｔ、ｒａｓを導入した細胞はそれぞれ初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ）に比べ分裂速度は早いが、それぞれ１０２日、世代数６７（ＰＤ＝６７）、６１日、世代数４１（ＰＤ＝４１）で分裂停止した。  これらに対しｈＴＥＲＴを導入した細胞は，５５０日、世代数８０（ＰＤ＝８０）を経た現在でも、分裂速度が変わることなく、継代可能である（図３）。
次にＳＶ４０Ｔ、ｒａｓの混合感染での検討を行った。まずＳＶ４０Ｔ／ｒａｓであるが，この場合は１０９日、世代数（ＰＤ＝６８）で分裂停止をし、ＳＶ４０Ｔ単独の場合とほぼ同じ挙動を示した（図４）。
さらにＳＶ４０，ｒａｓ，ＳＶ４０Ｔ／ｒａｓそれぞれにｈＴＥＲＴを遺伝子導入したものを検討した（図５）。それぞれ（ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０Ｔ）は、２３５日で世代数２５８（ＰＤ＝２５８）、（ｈＴＥＲＴ／ｒａｓ）は２３６日で世代数２４２（ＰＤ＝２４２），（ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０Ｔ／ｒａｓ）は、２３２日で世代数３０６（ＰＤ＝３０６）であった。これらはＳＶ４０Ｔやｒａｓ単独とほぼ同じ分裂速度で停止することなく継代可能であった。これらの細胞は一時冷凍保存されており、細胞を融解して再度培養すると同じ様に継代可能である。以上の結果より，ｈＴＥＲＴ単独あるいはそれを含むｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０Ｔ，ｈＴＥＲＴ／ｒａｓ，ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０Ｔ／ｒａｓはｒａｓ，ＳＶ４０Ｔ単独やＳＶ４０Ｔ／ｒａｓで分裂停止する１００日で世代数７０（ＰＤ＝７０）以上をはるかに超えて継代可能であったことから，我々はこれらの細胞を不死化したと定義した。
ｈＴＥＲＴ遺伝子単独を導入した場合以外はコンタクトインヒビションがかかっておらず、特にｒａｓの入ったｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌは垂直方向へも増殖を示していた。
これらのストローマ細胞の形態学的観察として、メイ−ギムザ染色（Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った（図６）。その結果，ｈＴＥＲＴ遺伝子のみを導入したストローマ細胞の形態が１番コントロールと近かった（図７）。ＳＶ４０Ｔ遺伝子，ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴを導入したのものはコントロールと比べ、若干細胞の大きさが小さくなっていた。ｒａｓ遺伝子を導入したストローマ細胞は細胞質に空ほうを形成していた。
［実施例２］テロメラーゼの活性の検討
標的細胞に導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子が発現して、ｈＴＥＲＴ活性を生じさせていることを確認する目的で、テロメラーゼ活性をＴＯＹＯＢＯのＴｅｌｏ  Ｃｈａｓｅｒにて、調査した。
テロメラーゼ活性は、ＴＯＹＯＢＯのＴｅｌｏ  Ｃｈａｓｅｒのプロトコールに準じ、キットの添付のＨｅｌａのサンプルをポジティブコントロールとして用いて、測定した。実施例１と同様に分離されたストローマ細胞及びｈＴＥＲＴ遺伝子導入されたストローマ細胞、並びにＨｅｌａ細胞から、それぞれ、テロメラーゼを抽出した。各細胞から抽出したテロメラーゼ、及びｈＴＥＲＴ遺伝子導入されたストローマ細胞から抽出後７０℃１０分で熱処理されたテロメラーゼを用いて、基質プライマーに対してテロメア繰り返し配列の付加反応を起こし、その後リバースプライマーでＰＣＲを行いポリアクリルアミドゲルにて電気泳動して可視化した。その結果を図８に示す。図８では、１；分子量のマーカー、２；細胞溶解液のみ（ネガテイブコントロール）、３；ｈＴＥＲＴ遺伝子導入ストローマ細胞のサンプルを７０℃１０分で熱処理したもの、４；初代培養ストローマ細胞、５；ｈＴＥＲＴ遺伝子導入ストローマ細胞、６；腫瘍細胞であるヒーラ細胞（Ｈｅｌａ  ｃｅｌｌポジテイブコントロール）を示している。図８より、ｈＴＥＲＴ遺伝子を導入されたストローマ細胞が、ｈＴＥＲＴ活性を有していることが、５が６と同じ程度のバンドであることから、導入した遺伝子がｈＴＥＲＴを発現しｈＴＥＲＴ活性があることが確認できた。
更に、テロメアの長さは、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧテロメア長アッセイ（ロシュ  モラキュラー  バイオケミカルズ  ザンドホファー  ドイツ）を用いて測定した。要約すると、ゲノムＤＮＡはＲｓａ  Ｉ及びＨｉｎｆ  Ｉ制限酵素で分解され０．８％アガロースゲルで分離された。ＤＮＡはナイロンメンブレンにキャピラリーで移された。ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）でラベルされたテロメア特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションがされた。
次にテロメラーゼ活性を計測し、長期間にわたり、ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞のテロメア長を計測した（図３３）。デロメア活性は、ＰＤ＝１０，６０，及び１００で検出された。テロメア長は、平均６から２０ｋｂで、この期間保持されており、増加したテロメラーゼ活性はテロメア長の保持に貢献していることを示唆している。
［実施例３］ストローマ細胞株の特徴付け
（１）表面抗原の検討
健康な人ＮＫ及びＫＹの腸骨より骨髄穿刺にて骨髄液を採取し、比重遠心による単核球分離を行って得た細胞を１晩培養し、翌日フラスコに付着した細胞を初代ストローマ細胞として用いた。
実施例１と同様にして、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴを用いて、ｈＴＥＲＴ遺伝子をストローマ細胞に導入した。
初代ストローマ細胞とｈＴＥＲＴ遺伝子導入したストローマ細胞で、ＦＡＣＳを用いた細胞表面抗原の発現解析を行った。用いた抗体は、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１０５（ＳＨ２）、ＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ１５７（ＢＳＴ−１）で，Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔを用いてデータ収集，解析を行った。ＣＤ４５及びＣＤ９は、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅから、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）は、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡから、ＣＤ１０５は、Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＵＳＡから、ＣＤ７３（ＳＨ−２）は、Ａｌｅｘｉｓ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから、ＣＤ１５７（ＢＳＴ−１）は、ＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎより入手した。
分析したところ、図９−１０に示されるように、４種類の細胞はいずれも、ＣＤ４５（−），ＣＤ９（＋），ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）（＋），ＣＤ１０５（ＳＨ２）（＋），ＣＤ７３（ＳＨ３）（＋）であった。ＣＤ１５７（ＢＳＴ−１）はストローマ（ｓｔｒｏｍａ）ＮＫではＣＤ１５７（ＢＳＴ−１）は（＋），ストローマ（ｓｔｒｏｍａ）ＫＹではＣＤ１５７（ＢＳＴ−１）は（−）であったが，初代ストローマ細胞とｈＴＥＲＴ遺伝子導入ストローマ細胞とのあいだにＣＤ１５７（ＢＳＴ−１）の発現には変化はみられなかった。
（２）染色体型
また上記（１）で用いた、ｈＴＥＲＴ遺伝子導入ストローマ細胞について核型を調べたところ，染色体数は４６本で正常で、染色体の欠失、転座も認められなかった。
（３）サイトカインの発現
ストローマ細胞から産生されるサイトカインの発現をｍＲＮＡレベルで検討した。細胞からＲＮＡを抽出し，逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型にして，サイトカインとして、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬ、Ｍ−ＳＣＦについて、対応するプライマーを用いてＰＣＲを行い，バンドの増幅をアガロースゲル電気泳動にて確認した。上記４種のサイトカインについては，両者ともに発現を認めた（図１１）。
［実施例４］ＣＤ３４（＋）臍帯血細胞とストローマ細胞株との共培養
実施例１と同様に遺伝子導入されたストローマ細胞の血液幹細胞の支持能をまずコロニーアッセイによって検証した。遺伝子導入には、実施例１と同じベクターを用いて、実施例１におけるレトロウイルスベクター感染における（２）（３）（５）（６）（７）（８）の条件及び骨髄採取時に保存しておいた細胞（初代ストローマ細胞）をコントロールとして使用して、レトロウイルスを感染させ、薬剤で選択した。こうして１−３種の遺伝子導入したストローマ細胞を３ヶ月間培養した。
レトロウイルス感染させたストローマ細胞を２５ｃｍ２  ｆｌａｓｋに播きなおし、サブコンフルエントになった時点で２１〜２２Ｇｙ放射線照射をして、細胞の成長を停止させストローマ細胞の培地を除いた。次に、Ｘ−ＶＩＶＯ１０を添加した後除去を繰り返すことにより、ストローマ培地に含まれていた血清を取り除いた。そして、Ｘ−ＶＩＶＯ１０ｗｉｔｈ  ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、あらかじめＸ−ＶＩＶＯ１０（ｗｉｔｈＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ））にいれてある５ｘ１０３  ＣＤ３４＋臍帯血細胞を加えた。こうして、ＣＤ３４＋臍帯血の存在下ベクターにより遺伝子導入したストローマ細胞と２週間共培養した。培養上清を回収し、２ｘ１０３細胞をコロニーアッセイに用いた。２週間後にコロニーをカウントした。その結果を下記表１に示す。
共培養したストローマ細胞の中でコントロール（初代ストローマ細胞）とｈＴＥＲＴ遺伝子のみを導入したもののみがコロニーアッセイすることができた。残りのものは、共培養する間にストローマ細胞が培養プレートからはがれてしまい培養を継続できなかった。これは放射線照射によるアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）もしくは成長が抑えられずに死滅した可能性がある。ＣｉｃｕｔｔｉｎｉらはＳＶ４０  Ｔを遺伝子導入したストローマ細胞では放射線照射によっては増殖を制御できなかったと報告している（Ｂｌｏｏｄ，８０：１９９２，１０２−１１２）。
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2003038076.tif 000004
コントロールとｈＴＥＲＴ遺伝子のみの導入でのコロニー数の増幅率はそれぞれ２２．３倍、１４．８倍であった。このことからｈＴＥＲＴでは３ヶ月培養していても血液幹細胞のサポート能をある程度有しており、株化したストローマ細胞でも共培養できることが確認された。
次に再現性確認のため、５ｘ１０３  ＣＤ３４＋臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）を添加後Ｘ−ＶＩＶＯ  １０  ｗｉｔｈ  ５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ，１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦの無血清培地で培養、７日目に再度同じ培地を添加し、再度共培養を行った。２週間後より浮遊細胞のみを回収し（ストローマ細胞にもぐりこんでいる細胞は回収せず）、以後１週間ごとに細胞を回収し、上記したように、総細胞数、ＣＤ３４＋細胞、コロニー形成数（ＣＦＵ−Ｃ）、未熟なコロニー数（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）、顆粒球系細胞コロニー、赤芽球系細胞コロニーの検討を８週まで行い、結果を図１２−１４に示した。
さらにストローマ細胞の不存在下、あるいは別の健常人から採取したストローマ細胞へｈＴＥＲＴ遺伝子導入して樹立したストローマ細胞ｈＴＥＲＴ２及び３との比較も行った。結果を図１５に示す。ストローマ細胞が存在しない場合については、１４日目に既に血液細胞が死滅しており、アッセイが不能であった。初代ストローマ細胞との比較では２８日目までは同等の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示すが、それ以降はｈＴＥＲＴ遺伝子導入ストローマ細胞のみが増殖能を維持していた。
ｈＴＥＲＴを導入した各ストローマ細胞は試料間に若干の差を認めるも、３５日目までは総細胞数，ＣＤ３４＋細胞，ＣＦＵ−Ｃに於て、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖を示した。
［実施例５］間葉系幹細胞の分化能
つぎに、骨、軟骨、筋肉等へ分化する能力と、自己複製能を合せもつ間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の分化や血液幹細胞の支持能を検討した。
健康成人の腸骨より骨髄穿刺を行い、比重遠心法により単核球を採取、１０％非働化胎児ウシ血清含有ＤＭＥＭにて一晩培養。翌日より付着細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を培養する。２週後にＴ−Ｅ（トリプシン−ＥＤＴＡ）にて細胞を回収したものを初代間葉系幹細胞とし凍結保存した。その後ｈＴＥＲＴ遺伝子を実施例１と同様に導入した。次に、初代間葉系幹細胞とｈＴＥＲＴ遺伝子の導入された不死化間葉系幹細胞との増殖曲線を比較した。結果を図１６に示す。図１６より明らかなように、初代間葉系幹細胞は４２日世代数１７（ＰＤ＝１７）で細胞分裂の停止（ｃｒｉｓｉｓ）が起こったが、不死化間葉系幹細胞は２７０日世代数５４（ＰＤ＝５４）経過した現在でも、分裂速度が遅くなることなく継代培養が可能であったことから、安定したセルライン（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を樹立したしたものと考えられる。
次に作製した間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）が多分化能を保持しているかを検討した。
（１）まず、１μＭデキサメサゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）、６０μＭインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｅ）、０．５μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、５μｇ／ｍｌインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）を用いて、脂肪細胞への分化を誘導した。約１週間の培養後Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色で染色された（赤いのが脂肪滴）。
（２）次に、１μＭデキサメサゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、６．２５μｇ／ｍｌインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、５．３５μｇ／ｍｌセレン酸（ｓｅｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１．２５ｍｇ／ｍｌリノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βを用いて、軟骨分化を誘導した。２−３週間の培養で、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅで染色された。染色（凍結切片）軟骨基質内のコンドロイチンが青く染まる。
（３）更に、１μＭデキサメサゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）、５０μＭアスコルビン酸−２−リン酸（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、１０ｍＭ  β−グリセロフォスフェイト（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）で、骨分化を誘導した。２−３ｗｅｅｋｓの培養で、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で染色された（ミネラルの沈着）。
結果を図１７に示す。
［実施例６］不死化間葉系幹細胞から血液細胞を支持する不死化支持細胞への分化
実施例５と同様の方法で採取・不死化した間葉系幹細胞の培地から支持細胞への培地に替えることによる血液細胞に対する支持能を検討した。
間葉系幹細胞の培地（１０％非働化胎児ウシ血清含有ＤＭＥＭ）を支持細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）の培地（組成：１２．５％非働化胎児ウシ血清１２．５％非働化ウマ血清１ｘ１０−６  Ｍ  ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，１０−４  Ｍ  ２−ＭＥ含有αＭＥＭ）に交換後、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞との共培養を行い、共培養７日後肉眼的観察を行った。図１８中、上段は不死化間葉系幹細胞での共培養、下段は不死化支持細胞での共培養で、左側は弱拡大、右側は強拡大によるものである。いずれの場合でも血液細胞の増幅を認めたが（７日目では数に両者の差は認めなかった）、不死化支持細胞での共培養において、未熟な血液細胞の集団と考えられている敷石状の細胞を認めた（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ；ＣＡＦＣ）。このことは、間葉系幹細胞から支持細胞への分化が間葉系幹細胞が不死化されていても、充分に働いたことが考えられる。
［実施例７］赤血球前駆細胞の生産
実施例１と同様にｈＴＥＲＴ遺伝子導入により不死化したストローマ細胞を２５ｃｍ２  ｆｌａｓｋに播き、ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達した時点で２１〜２２ＧｙのＸ線照射をして、細胞の増殖を停止させた。
５ｘ１０３  ＣＤ３４＋ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌをＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下でストローマ細胞と２週間あるいは４週間共培養することで造血前駆・幹細胞を増幅した（幹細胞増幅相）。ストローマ上に増幅された血球を回収し細胞数をカウントするとともにグリコフォリンＡ（Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ：ＧＰＡ）陽性細胞率をフローサイトメトリーで解析した。
幹細胞増幅相１４日後で回収された総細胞数は、２ｘ１０６個であり、増幅前の５０００個に比べ約４００倍に増幅し得た。そのうち赤芽球のマーカーであるＧＰＡ陽性細胞率および細胞数は、それぞれ２２．９％、２．９ｘ１０４であった。また幹細胞増幅相２８日後でも総細胞数は３．６ｘ１０６個と高収量が得られ、ＧＰＡ陽性細胞率および細胞数は、それぞれ２．０％および６．１ｘ１０３であった。
５ｘ１０３個の増幅された造血前駆・幹細胞を分化誘導倍地（１）エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）誘導培地（組成：Ｘ−ＶＩＶＯ  １０，５００μｇ／ｍｌ  ｄｉｆｅｒｒｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，１％  ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），２Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ）あるいは（２）幹細胞因子（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）併用エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）培地（組成：Ｘ−ＶＩＶＯ  １０，５００μｇ／ｍｌ  ｄｉｆｅｒｒｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，１％  ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），２Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ，ＳＣＦ  １０ｎｇ／ｍｌ）に入れ、８日間培養し赤芽球の産生を誘導した。（赤芽球誘導相）
得られた赤芽球はカルチャーディシュ内の光顕像、塗末標本、総細胞数およびＧＰＡ陽性細胞率をフローサイトメトリーで解析した。
図１９に赤芽球誘導相第８日目の赤芽球培養所見を示す。上段はエリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＥＰＯ）培地、下段は幹細胞因子（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）併用エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）培地により赤芽球を分化誘導した結果である。ＥＰＯ単独で赤芽球分化を誘導した際には、総細胞数およびクラスター形成はわずかであった。一方、ＳＣＦとＥＰＯ併用で分化誘導すると、総細胞数およびクラスター形成はきわめて豊富であることが示された。
図２０に幹細胞増幅相１４日後、２種類の分化誘導倍地で赤芽球産生を促した結果を示す。図左は総細胞数を、右はＧＰＡ陽性赤芽球細胞数を示す。図内ＥＰＯはＥＰＯ培地で、ＥＰＯ＋ＳＣＦはＳＣＦ併用ＥＰＯ培地で分化誘導した結果を示している。従来の方法であるＥＰＯ単独で分化誘導すると増幅前の３ｘ１０５から１．４ｘ１０５と総細胞数の減少を認めた。ＳＣＦを併用した際には、総細胞数で１．３ｘ１０６と増幅前に比し約４．２倍の増幅を認めた。さらにＧＰＡ陽性赤芽球細胞を見ると、ＥＰＯ単独ではＧＰＡ細胞数は増幅前の５．３ｘ１０４から２．９ｘ１０４と減少を認めたが、ＳＣＦを併用した際には、８．７ｘ１０５と増幅前に比し約１６．４倍の増幅を認めた。
図２１に幹細胞増幅相２８日後、赤芽球産生を誘導した結果を示す。図２０の結果と同様、ＥＰＯ単独の際は増幅前の３ｘ１０５から６．７ｘ１０４と総細胞数の減少を認めたが、ＳＣＦを併用した際には、総細胞数で５．３ｘ１０５と増幅前の３ｘ１０５に比べ役１．７倍の増幅を認めた。さらにＧＰＡ陽性赤芽球細胞を見ると、ＥＰＯ単独ではＧＰＡ細胞数の減少を認めたが、ＳＣＦを併用した際には、１．９ｘ１０５と増幅前の６．１ｘ１０３に比べ約３１倍の増幅を認めた。
Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｚａ染色による赤芽球所見
図２２にＳＣＦとＥＰＯ併用で赤芽球を分化誘導した８日目のＭａｙ−Ｇｉｅｍｚａ染色所見を示す。殆どの全ての血球で細胞質が好塩基性（ｂａｓｏｐｈｉｌｉｃ）で核が円形粗造な幼弱赤芽球であることが示された。すなわちＧＰＡ陽性細胞のみならず、ＧＰＡ陰性細胞も赤芽球であり、きわめて幼若であるためＧＰＡを発現するにはいたっていないものと考えられた。
なお、エリスロポイエチンおよびエリスロポイエチン並びにＳＣＦ併用による赤芽血球誘導については、参考文献
１．Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｎ，Ｎｉｉｔｓｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｌｏｏｄ，８３．１９９４：１２０９−１２１５液体培養下で赤芽球を分化させた際の、トランスフェリンレセプターの発現と細胞外遊離
２．Ｋａｐｕｒ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃ−Ｋｉｔ  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｔ５  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｂｙ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６  ２００１：１０９９−１１０６．ｃ−Ｋｉｔとｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ間の新たな協同機構；Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒはｓｔａｔ５とｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現を誘導し、その結果ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎによる高率な増殖と生存を引き起こす。
に説明されている。
［実施例８］
不死化ストローマ細胞を用いた臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞の成熟赤血球への分化／増殖
（１）方法：
臍帯血より、ＭＡＣＳ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＣＤ３４陽性細胞を分離した。赤血球への分化増殖は三段階によった。１ｓｔ  ｐｈａｓｅ（ｄａｙ０￣１４）では、２５ｃｍ２ｆｌａｓｋを用いて、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔとなった不死化ストローマ細胞と共に、Ｘ−ＶＩＶＯ１０にＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）１０ｎｇ／ｍｌ，Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２  Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ）５０ｎｇ／ｍｌを加えたｍｅｄｉｕｍに、５ｘ１０３／３ｍｌの濃度でＣＤ３４陽性細胞を浮遊し、１４日間培養した。Ｄａｙ７に上記と同組成のｍｅｄｉｕｍを３ｍｌ追加した。２ｎｄ  ｐｈａｓｅ（ｄａｙ１４￣２８）では、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用いて、Ｘ−ＶＩＶＯ１０に１％脱イオン化ウシ血清アルブミン，２価鉄トランスフェリン５００μｇ／ｍｌ，２％ヒトＡＢ型血清，ＳＣＦ１００ｍｇ／ｍｌ，ＩＬ−３  １０ｎｇ／ｍｌ，ＥＰＯ  ４Ｕ／ｍｌを加えたｍｅｄｉｕｍに、１ｘ１０５／３ｍｌの濃度で細胞を浮遊し、１４日間液体培養した。Ｄａｙ２１に上記と同組成のｍｅｄｉｕｍを３ｍｌ追加した。３ｒｄ  ｐｈａｓｅ（ｄａｙ２８￣３１）では、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用いて、Ｘ−ＶＩＶＯ１０に１％脱イオン化ウシ血清アルブミン，２価鉄トランスフェリン５００μｇ／ｍｌ，２％ヒトＡＢ型血清，ＥＰＯ  ４Ｕ／ｍｌを加えたｍｅｄｉｕｍに１ｘ１０６／３ｍｌの濃度で細胞を浮遊し、マクロファージと３日間共培養した。マクロファージは健常人末梢血単球由来のものを用いた。すなわち、ｄａｙ２１に健常人末梢血を採取し、Ｒｏｓｅｔｔｅ  ＳｅｐＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて単球を分離し、これを２％ヒトＡＢ型血清，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ）１００ｎｇ／ｍｌを加えたＩＭＤＭに３ｘ１０５／３ｍｌで浮遊し、７日間培養することで、単球をマクロファージへと分化させた。いずれも３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。解析は各ｐｈａｓｅ毎に細胞を回収し総細胞数をカウントし、フローサイトメトリーを用いて細胞の表面形質を解析した。またサイトスピン標本を作成し、メイ・ギムザ染色を行い細胞の形態を観察した。
（２）結果：
図２３に培養により得られた総細胞数を示す。１ｓｔ  ｐｈａｓｅの共培養にて総細胞数は５ｘ１０３から２．５ｘ１０６まで５００倍に増幅された。さらに２ｎｄ  ｐｈａｓｅの液体培養で２．５ｘ１０８まで増幅され（５０，０００倍）、３ｒｄ  ｐｈａｓｅでさらに５．０ｘ１０８まで増幅された（１００，０００倍）。
図２４にフローサイトメトリーを用いた解析の結果を示す。Ｄａｙ１４の時点では、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ陽性細胞は１．４％に過ぎないが、Ｄａｙ２８では８０．１％、Ｄａｙ３１においては９０％がＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ陽性細胞となった。つまり、５ｘ１０３のＣＤ３４陽性細胞から、Ｄａｙ２８，Ｄａｙ３１において、それぞれ、２．０ｘ１０８，４．５ｘ１０８の赤芽球系細胞へと分化増殖させることができた（図２５）。
図２６にメイ・ギムザ染色の結果を示す。Ｄａｙ２８において成熟赤血球は０．７％のみであったが、Ｄａｙ３１まで３日間マクロファージと共培養することで赤芽球は脱核し、成熟赤血球は１６％まで増加した。したがって、５ｘ１０３のＣＤ３４陽性細胞から、Ｄａｙ２８，Ｄａｙ３１においてそれぞれ、１．８ｘ１０６，８．０ｘ１０７の成熟赤血球へと分化増殖させることができた（図２７）。
図２８にＤａｙ２８におけるメイ・ギムザ染色像を示す。ほとんどが赤芽球系細胞であり、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球が主体であった。
図２９、図３０にＤａｙ３１におけるメイ・ギムザ染色像を示す。多染性赤芽球が主体となり、脱核した成熟赤血球を多数認めた（図２９）。マクロファージを赤芽球系細胞が取り囲むように存在し、いわゆる赤血球小島（Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｉｓｌａｎｄ）を形成していた（図３０）。
以上の結果から、不死化ストローマ細胞（ｈＴＥＲＴ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）と１４日間共培養することで増殖させた臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を、さらに１４日間エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むサイトカイン存在下で液体培養することにより、効率的に赤芽球系細胞へと分化／増殖できること、得られた赤芽球系細胞は、さらに３日間マクロファージと共培養させることにより赤芽球を脱核させ、効率的に成熟赤血球を得ることが確認できた。
［実施例９］
（１）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ｎｏｎｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウスへの移植
移植対象として、Ｌ  Ｓｈｕｌｔｚ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｂａｙ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から得られた育種親から育てられた６−１０週齢のＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）が用いられた。全てのマウスは滅菌下で取り扱われ、マイクロアイソレータで保管された。ＴＰＯ，ＳＣＦ，ＦＬの存在下で、初代ストローマ細胞又はｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞の層とＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が２−４週間共培養された。当該ストローマ細胞層の上方又は下方で増殖した全ての造血細胞（ＨＰＣｓ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を回収した。造血細胞中のストローマ細胞の混入率は、顕微鏡下で０．０１％以下であった。ストローマ細胞は、顕微鏡下で、細胞の大きさ及び形態的特徴に基づいて造血細胞から簡単に見分けることができる。４００ｃＧｙで照射されたマウスに得られた造血細胞を外側尾静脈を通じて注射した。正常なボランティアからの末梢血単核球細胞で１５００ｃＧＹで照射された５Ｘ１０６細胞が、アクセサリー細胞として（造血細胞）と共培養された。
（２）移植細胞の定着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の検討
マウスは、移植後６週間で頸部脱臼により、屠殺し、骨髄と末梢血単核球を（前回報告されたとおり）回収した。ヒトの造血細胞の存在は、（ｉ）ＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ４５コンジュゲートにより染まる細胞を、フローサイトメトリーを用いて検出すること、（ｉｉ）及び以下に説明されるように、ヒトゲノムＡＬＵ反復遺伝子ＤＮＡを検出することにより定量した。
ヒトＡＬＵ反復配列遺伝子の検出
移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄及び末梢血単核球からゲノムＤＮＡが単離された。プライマー配列としては、５’−ＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴ−３’及び５’−ＣＧＣＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡ−３’を用いた。ＤＮＡ試料は９４度で４分間変性し、９４度で１分（変性）、５５度で４５秒（アニーリング）、更に７２度で１分（伸長）からなるサイクルを３５サイクルし増増幅した。
増幅産物は、２．５％アガロースゲル電気泳動上でエチジウムブロマイド染色で２２１ｂｐのバンドとして可視化された。
（３）結果
ＳＲＣ（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，ＳＣＩＤ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の増殖
ＨＳＣ（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ヒト造血幹細胞）の増殖を評価するためのインビボでのヒト幹細胞アッセイの代わりとして、ＳＲＣの移植を調べた。前共培養臍帯血ＣＤ３４＋、又は２又は４週間ストローマ細胞株と共培養から生じた全増殖ＨＰＣが、照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植された。同時に、移植された細胞の総数をおよそ調整するために、５Ｘ１０６細胞の照射された末梢血単核球が共移植された。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄及び末梢血中にあるヒト細胞は、移植後６週間後に、フローサイトメトリーとＡＬＵ  ＰＣＲで評価された（図３１）。ヒト細胞（ｈＣＤ４５＋）が０．１３％以上であるときには、ヒトＡＬＵ配列がＰＣＲ増幅で検出できるが（図３１Ｂ、レーン５−８）、０．０７％のｈＣＤ４５＋では検出できないことを見出した（図３１Ｂレーン４）。したがって、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中でのヒト細胞の検出限界は、ｈＣＤ４５＋が０．１％と決定された。初代ストローマ細胞又はｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞と２週間共培養された造血細胞が移植されたマウスの骨髄中には、ｈＣＤ４５＋細胞が検出された（図３１Ａ）。しかしながら、初代ストローマ細胞又はｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞で前共培養及び共培養された造血細胞間でｈＣＤ４５＋細胞の％に顕著な差はなかったので、２週間ではＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ（ＳＲＣ）は、クローン性細胞の顕著な増加にもかかわらず（表２）増殖しないことを示している。これは、おそらくヒト造血幹細胞の静的特性のためである。２週間だけサイトカイン類と培養された造血細胞を移植したマウスの骨髄にはｈＣＤ４５＋細胞は検出されなかったことから、ヒト造血細胞のＳＲＡ（ＳＣＩＤ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）の維持にはストローマ細胞が必要であり、ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞と共培養された造血幹細胞のＳＲＡは初代ストローマ細胞と共培養された造血幹細胞のＳＲＡと同じレベルで維持できるであろうことを示している。４週間ストローマ細胞と共培養された造血細胞を移植したマウスの骨髄及び末梢血中にも、ｈＣＤ４５＋細胞は検出された（図３１Ａ、３１Ｃ、３１Ｄ）。ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞と共培養した造血細胞を移植されたマウスの骨髄中のｈＣＤ４５＋細胞の比率はＣＤ３４＋細胞と前共培養された細胞を移植したマウスの骨髄中のｈＣＤ４５＋細胞の比率より有意に高いが、初代ストローマ細胞と前共培養された造血細胞を移植されたマウスの骨髄中のｈＣＤ４５＋細胞の比率は前共培養されたＣＤ３４＋細胞を移植されたマウスよりも、高くなる傾向が見られた（ｐ＝０．０７）（表３）。これらの結果は、ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞で共培養された臍帯血ＣＤ３４＋細胞におけるＳＲＣの増幅は初代ストローマ細胞で共培養した場合よりも同等か、優れているであろうことを示唆している。
次に、ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞上に増殖（ｅｘｐａｎｄ）したＳＲＣから分化した造血細胞の表面マーカーを検査した（図３２Ｂ）。大部分の細胞は、ＣＤ１９＋Ｂ−リンパ球系細胞、及びＣＤ１１ミエロイド系列細胞で、少数のＣＤ４１＋及びグリコフォリンＡ＋細胞があった。ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞と共培養された造血細胞の表面抗原の発現パターンは、初代ストローマ細胞と共培養された造血細胞（図３２Ａ）又は前培養されたＣＤ３４＋細胞（図３２Ｃ）の場合と同じである。この結果は、初代ストローマ細胞上又はｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞上に増殖（ｅｘｐａｎｄ）した造血前駆細胞はいずれも同等の多分化能と同じ能力を保持している。
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［参考例］
間葉系幹細胞から肝細胞への分化
（１）方法
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、実施例５で述べた方法で調製した。初代培養の間葉系幹細胞は、実施例５で述べた方法で調製して継代培養し、初代培養からＰＤ４（４回の世代分裂ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇを経た時期）で、以下の実験に使用した。
日本チャールズリバーより購入したＳｐｒａｇｎｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、約１５０グラムの５週齢の雄を使用した。
肝障害モデルの作成とＭＳＣの肝臓への移植
肝切除前日（ｄａｙ−１）より，サイクロスポリンＡ（ＣｙＡ、サンディミュンＳａｎｄｉｍｍｕｎ：ノバルティスファーマより購入）を１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙでラット腹腔内投与開始した。当日（ｄａｙ０），定法（Ｍ．Ｂｒｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６５：１５，１９３７）に従い２／３肝切除施行後、残存した肝臓の尾状葉に対し、２ｘ１０６／３００ｕｌでＭＳＣを２３Ｇ注射器を用いて局所注入した。
（２）肝細胞への分化の検討
肝切除後１０日目（ｄａｙ１０）に屠殺し，肝臓を３％パラホルムアルデヒドで灌流固定しＯＴＣ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋後、凍結切片（６μｍ）を作製し、抗ヒトアルブミン抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ａ６６８４）抗ヒトＡＦＰ抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ａ８４５２）、抗ヒトＣＫ１９抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ｃ６９３０）を用いて免疫染色した。
（３）結果
ＰＤ４のＭＳＣを２／３肝切除施行後の残存肝に局所注入後１０日目（ｄａｙ１０）に屠殺し，ＭＳＣ細胞を局所注射した肝臓を摘出固定し抗ヒトアルブミン抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ａ６６８４）を用いて染色した。正常のラット肝組織中にヒトアルブミンの発現を呈する細胞が確認できた（図３４）。
本実施例によって、肝部分切除を受けた動物の肝臓組織内など、肝臓への分化誘導に好適な条件が整った条件と環境下では、ヒト間葉系幹細胞を効率よく成熟肝細胞へと分化させることができることが示された。
産業上の利用性
本発明により、従来非常に少数しか得られなかった間葉系幹細胞又は間葉系細胞を多数調製でき、更に間葉系細胞から、種々の細胞に分化させることができるので、従来十分な細胞量が得られないために、実施できなかったような種々の検査や治療が実施可能になる。
例えば、上記実施例でＴＥＲＴ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌによる幹細胞増幅後にＳＣＦおよびＥＰＯで分化誘導をかけることで、赤芽球が大量に回収できることが示された。通常１つの臍帯から得られるＣＤ３４陽性細胞は、約１ｘ１０５と極めて少量であるが、本件発明によれば、５０００個のＣＤ３４陽性細胞から０．５−１ｘ１０６の赤芽球が産生可能である。したがって１ｘ１０５個のＣＤ３４陽性細胞からは、１−２ｘ１０７前後の赤芽球前駆細胞の収量が２週ごとに見込まれる。この量はこれまでの方法よりもはるかに高率であり、充分な臍帯血の供給が得られれば新たな輸血ソースとなりうる可能性を秘めており、きわめて有用な発明である。
なお、本件明細書及び図面には、優先権主張の基礎出願である２００１年１０月３１日に日本国特許庁に出願された特願２００１−３３５３７５号の明細書及び図面に記載された内容を引用により含めるものである。
【図面の簡単な説明】
図１    ストローマ細胞への遺伝子導入に用いるベクターの構成
図２    ストローマ細胞へのトランスフェクション
図３    ストローマ細胞分裂世代数（初代、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０Ｔ、ｒａｓ導入）
図４    ストローマ細胞細胞分裂世代数（初代、ＳＶ４０Ｔ、ｒａｓ、ＳＶ４０Ｔ／ｒａｓ導入）
図５    ストローマ細胞細胞分裂世代数（ｈＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＴ／ｒａｓ、ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０Ｔ、ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０Ｔ／ｒａｓ導入）
図６    初代ストローマ細胞とｈＴＥＲＴ導入ストローマ細胞のメイーギムザ染色
図７    初代ストローマ細胞と各種遺伝子導入ストローマ細胞のメイーギムザ染色
図８    テロメラーゼ活性
レーン１．分子量のマーカー
レーン２．ネガティブコントロール
レーン３．５の加熱処理
レーン４．初代ストローマ細胞
レーン５．ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞
レーン６．ヒーラ細胞（Ｈｅｌａ  ｃｅｌｌ）
図９    ＮＫ由来のストローマ細胞の細胞表面抗原の発現解析
図１０  ＫＹ由来のストローマ細胞の細胞表面抗原の発現解析
図１１  サイトカインのｍＲＮＡ発現
図１２  ＣＤ３４＋臍帯血細胞とストローマ細胞との共培養後の細胞増殖
図１３  ＣＤ３４＋臍帯血細胞とストローマ細胞との共培養後の細胞増殖
図１４  ＣＤ３４＋臍帯血細胞とストローマ細胞との共培養後の細胞増殖
図１５  ＣＤ３４＋臍帯血細胞とストローマ細胞との共培養後の細胞増殖
図１６  間葉幹細胞の細胞分裂世代数
図１７  間葉幹細胞の分化誘導
図１８  ＣＤ３４＋臍帯血細胞とｈＴＥＲＴ導入間葉幹細胞又はストローマ細胞
図１９  赤芽球培養
図２０  幹細胞増幅相で１４日共培養後の赤芽球への分化誘導
図２１  幹細胞増幅相で２８日共培養後の赤芽球への分化培養
図２２  分化誘導した赤芽球のメイ・ギムザ染色
図２３  不死化ストローマ細胞を用いたＣＤ３４＋細胞の成熟赤血球細胞への分化  総細胞数
図２４  ＦＡＣＳ解析結果  グリコフォリンＡ陽性細胞の比率
図２５  赤芽系細胞への分化増殖・グリコフォリンＡ陽性細胞数
図２６  メイ・ギムザ（ＭＧ）染色結果
図２７  成熟赤血球数
図２８  ２８日目のメイ・ギムザ染色像（赤芽球系細胞、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球が中心）
図２９  ３１日目のメイ・ギムザ染色像（他染性赤芽球が主体で、脱核した成熟赤血球も認められる）
図３０  ３１日目のメイ・ギムザ染色像（マクロファージが赤芽球形細胞を取り囲むように存在する赤血球小島を形成）
図３１  移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄及び末梢血中のｈＣＤ４５＋細胞の分析
図３１Ａ  フローサイトメトリーによる骨髄中のｈＣＤ４５＋細胞の分析
図３１Ｃ  フローサイトメトリーによる末梢血中のｈＣＤ４５＋細胞の分析図３１Ａ及びＣ共
Ｘ：アクセサリー細胞；□、ＣＤ３４＋細胞との前共培養；△、ストローマ細胞なしで２週間生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で増殖されたＣＤ３４＋細胞；○、初代ストローマ細胞上で２週間又は４週間増殖されたＣＤ３４＋細胞；●、ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞で２又は４週間増殖されたＣＤ３４＋細胞。
点線は、ヒト造血細胞の移植成功カットオフ値（０．１％）を示す。
前共培養されたＣＤ３４＋細胞に対してｐ＊＜０．０５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｅｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔによる）
図３１Ｂ  ヒトａｌｕ配列のＰＣＲ増幅及び移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄中のｈＣＤ４５細胞の比率
レーン１−３、アクセサリー細胞のみを移植したマウス（３匹）
レーン４−８、前共培養されたＣＤ３４＋細胞を移植したマウス（５匹）
レーン９、ＰＣ（ポジティブコントロール、ヒト末梢血単球）
レーン１０、ＮＣ（移植されていないネガティブコントロールマウス（１匹）
図３１Ｄ  抗ヒトＣＤ４５抗体を用いるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの末梢血のフローサイトメトリー分析
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＣＤ３４＋前共培養を移植（右上方）、初代ストローマ細胞上で４週間増殖した造血細胞を移植（左下方）、又はｈ−ＴＥＲＴストローマ細胞で４週間増殖した造血細胞を移植（右下方）した分析結果が示されている。移植されたマウスの末梢血単球に対するアイソタイプ適合抗体によるデータも示されている（左上方）。
Ｙ軸はＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）の染色を示している。
図３２  ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト造血細胞の系統マーカのフローサイトメトリー分析
ＣＤ３４＋細胞は（Ａ）初代ストローマ細胞上での４週間の増殖、（Ｂ）ｈＴＥＲＴ−ストローマ細胞上での４週間の増殖、又は（Ｃ）増殖することなく（前共培養）し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植された。ヒト起源を確認するため造血細胞はＦＩＴＣコンジュゲートｈＣＤ４５抗体で免疫ラベルされ更に、表示された系統マーカーに特異的なＰＥコンジュゲート抗体で免疫ラベルされた。
図３３  初代ストローマ細胞又はｈＴＥＲＴストローマ細胞のテロメラーゼ活性及びテロメア長
図３３（Ａ）テロメラーゼ活性
レーン１、初代ストローマ細胞；レーン２，ｈ−ＴＥＲＴストローマ細胞（ＰＤ＝１０）；レーン３ｈ−ＴＥＲＴストローマ細胞（ＰＤ＝６０）；レーン４、ｈ−ＴＥＲＴストローマ細胞（ＰＤ＝１００）９
図３３（Ｂ）テロメア長
レーン１、初代ストローマ細胞；レーン２，ｈ−ＴＥＲＴストローマ細胞（ＰＤ＝１０）；レーン３、ｈ−ＴＥＲＴストローマ細胞（ＰＤ＝６０）；レーン４、ｈ−ＴＥＲＴストローマ細胞（ＰＤ＝１００）
図３４  ＭＳＣを移植したラット肝細胞の抗ヒトアルブミン抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ａ６６８４）を用いた染色
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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