(57)【要約】目的タンパク質とドックリンとを遺伝子工学的技術によって融合させた組換え融合タンパク質を、コヘシンドメインを固定化した担体で処理することを特徴とする組換え融合タンパク質の精製方法および、目的タンパク質およびドックリンをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて目的タンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質を取得し、次いで、この組換え融合タンパク質をコヘシンドメインを固定化した担体に結合させて精製し、更に、組換え融合タンパク質からドックリンを除去することを特徴とする目的タンパク質の製造方法が開示されている。これらの方法により、特異結合を利用するアフィニティー精製技術において、不溶化や不活性化を引き起こさず、親和性が高く、しかも結合の解離が容易な技術を提供することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質を、コヘシンドメインを固定化した担体で処理することを特徴とする組換え融合タンパク質の精製方法。
【請求項２】
組換え融合タンパク質をカルシウムイオンと共にコヘシンドメインを固定化した担体に吸着処理し、その後、金属キレーターで処理してカルシウムを除去する請求項第１項記載の精製方法。
【請求項３】
組換え融合タンパク質が、目的タンパク質とドックリンとの間に、化学的もしくは酵素学的な開裂部位を有するものである請求項第１項または第２項記載の精製方法。
【請求項４】
酵素学的な開裂部位が、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）である請求項第３項記載の精製方法。
【請求項５】
固定化方法が、水素結合ないし共有結合を利用する請求項第１項記載の精製方法。
【請求項６】
請求項第１項記載の方法で用いられる組換え融合タンパク質を生産するための、目的タンパク質をコードする遺伝子とドックリン遺伝子とを組み込んだ発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターが、目的タンパク質をコードする遺伝子とドックリン遺伝子との間に、化学的もしくは酵素学的な開裂部位をコードする遺伝子を組み込んだ請求項第６項記載の発現ベクター。
【請求項８】
バキュロウイルス由来である請求項第６項または第７項記載の発現ベクター。
【請求項９】
目的タンパク質およびドックリンをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて目的のタンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質を取得し、次いで、この組換え融合タンパク質をコヘシンドメインを固定化した担体に結合させて精製し、更に組換え融合タンパク質からドックリンを除去することを特徴とする目的タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
目的タンパク質をコードする遺伝子とドックリンをコードする遺伝子との間に、化学的もしくは酵素学的な開裂部位をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いる請求項第９項記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
目的タンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質と、標識化されたコヘシンドメインとを結合させ、非結合の標識化されたコヘシンドメインを測定系中から除去した後、その標識量を測定することを特徴とする組換え融合タンパク質の検出・定量方法。
【請求項１２】
標識化が、ビオチニル化である請求項第１１項記載の検出・定量方法。
【請求項１３】
コヘシンドメインと、標識化されたドックリンとを結合させ、非結合の標識化されたドックリンを除去した後、その標識量を測定することを特徴とするコヘシンドメインの検出・定量方法。
【請求項１４】
コヘシンドメインを含有する溶液を、陰イオン交換担体で吸着処理してコヘシンドメインを陰イオン交換担体に吸着させ、次いで、塩濃度を上昇させることによりコヘシンドメインを溶離させることを特徴とするコヘシンドメインの精製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は組換え融合タンパク質の精製方法およびこれを利用する目的タンパク質の製造方法に関し、更に詳細にはコヘシン−ドックリン間の特異的結合を利用した組換え融合タンパク質の精製方法およびこれを利用する目的タンパク質の製造方法に関する。
背景技術
タンパク質を精製する方法としては、架橋したポリマーであるゲルの分子篩の性質を利用し、分子サイズの異なるタンパク質を分けるゲル濾過、タンパク質と解離基との静電気的な結合を利用するイオン交換クロマトグラフィー、そしてタンパク質の疎水基への結合性を利用し吸着させる疎水性クロマトグラフィー等が使用されてきた。これらの手法はタンパク質分子の物理的あるいは化学的差異に基づいているため、タンパク質の機能が有する特異的な親和力（アフィニティー）とは無関係に分離、精製されるものである。このため、これらの手法を用いてタンパク質の精製を行う場合には、いくつかの手法を組み合わせることが必要である。
そこで近年、ホルモンとホルモン受容体間や、抗原と抗体間等での特異的結合を利用したタンパク質の分離、精製を行う方法が開発されている。最近の遺伝子工学的技術の発達により、このような特異的結合を利用する分離、精製法の技術も向上している。例えば、任意のタンパク質をコードする遺伝子配列と、あるリガンドに対して高い親和性をもつタンパク質フラグメント（以下、「アフィニティーペプチド」という）をコードする遺伝子配列とを結合させた発現ベクターを作製し、任意の宿主に導入、組換えタンパク質を発現させ、アフィニティーペプチドを付加した組換えタンパク質を得て、付加したアフィニティーペプチドと相対するリガンドを固定化させた担体を使用することにより、任意のタンパク質を簡便に精製する方法が行われている。現在、この手法は組換えタンパク質を簡便に単離するのに非常に有用であることが知られている。
具体的に、アフィニティーペプチドとしてポリヒスチジンを用いた手法は、日本国特許番号第２６８６０９０号で知られており、またグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という）を用いた手法は、特開平７−１８４６６３号で知られている。さらに、アフィニティーペプチドと任意の組換えタンパク質の結合部位に特定の化学的または酵素学的な開裂部位を挿入しさえすれば、リガンドを結合させた担体で精製する過程において、特定の試薬または酵素を作用させることにより、アフィニティーペプチドは担体のリガンドに結合したまま、特異的に任意のタンパク質のみを溶出することができると考えられていた。実際に、この考え方に基づく方法はイタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１９８，ｐｐ１０５６−１０６３，（１９７７））により実施され、この手法もまた非常に有用な手段であることが知られている。
近年、ゲノム情報から何万種というこれまで発見されていなかった遺伝子配列が、明らかとなった。しかし、遺伝子配列のデータのみでは、その遺伝子が生体内でどういった機能をもったタンパク質であるかわからないため、遺伝子組換え技術により遺伝子からタンパク質へと変換し、その性状を調査する必要がある。その発現させた組換えタンパク質の性状を調査する際には、非常に大量の単離した組換えタンパク質が必要となる。しかし、未知の遺伝子は何万種もあり、それから生産した組換えタンパク質もまた何万種もあるため、これらの一つ一つについて精製方法を検討するにはたくさんの時間を必要とし、何万種の大量に単離した未知の組換えタンパク質を迅速に得ることは非常に困難である。
従って、上記のように、組換えタンパク質にアフィニティーペプチドを遺伝子工学的に付加させ、それを融合した組換えタンパク質の形熊で発現させる技術とそのアフィニティーペプチドと相対するリガンドを固定化させた担体を作製しアフィニティー精製として利用する手法の開発は、非常に有用である。
アフィニティーペプチドを遺伝子工学的技法により融合した組換えタンパク質のなかには、本来は可溶型として発現すべき組換えタンパク質が、付加したアフィニティーペプチドの影響により、不溶化してしまう場合がある。特に、これまでアフィニティーペプチドとして使用されているポリヒスチジンを融合させた組換えタンパク質のうちには、宿主によって不溶化してしまったり、本来の活性を有さない組換えタンパク質として発現することがしばしばある。また、ＧＳＴにおいてもその分子質量が約２６ｋＤａと大きいため、ＧＳＴを融合させた組換えタンパク質にも同様の問題がある。
また、上記のようなアフィニティー精製技術においては、付加したアフィニティーペプチドとそれに相応するリガンドとの親和性の高さと温和な条件下での解離のし易さが、非常に重要な要因として挙げられる。
さらに、アフィニティー精製技術に利用できるアフィニティーペプチドの候補として、タンパク質の機能ドメインとそのリガンド分子についても検討がなされてきている。そのうちの一つにカルシウムイオン結合モチーフがあるが、これまでカルシウムイオン結合モチーフとそのリガンド分子との結合力の強さ、温和な条件下での解離のし易さについて、アフィニティー精製用として利用可能なものがなく、このモチーフはこれまで組換えタンパク質の発現確認、つまり標識用のタンパク質としてしか使用されていなかった。また、カルシウム結合モチーフに相補的に結合するリガンド用のタンパク質を大量に取得する技術も完成させることは困難であったため、このモチーフを利用した組換えタンパク質の精製方法の確立がなされていなかった。
一方、上記の様にアフィニティー精製された組換えタンパク質の検出や定量を行う方法としては、目的とするタンパク質にアフィニティーペプチドを結合させた組換えタンパク質と特異的に結合する抗体を用いる方法や、アフィニティーペプチドと高い親和性を持つリガンドを用いる方法が知られている。具体的に、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体を用いる場合には、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いる方法が知られている。また、アフィニティーペプチドとリガンドを用いる場合には、ポリヒスチジンとニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）とを用いる方法や、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）とカルモジュリンとを用いる方法が知られている（Ｓｔｏｆｃｏ−Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．３０２，ｐｐ２７４−２７８（１９９２）；Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６６，ｐｐ１４１８８−１４１９２（１９９１）；Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１８５，ｐｐ６０−８９（１９９０）；Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７０，４３１−４４２（１９９２））。
しかしながら、組換えタンパク質の検出や定量に組換えタンパク質に対する抗体を用いる場合には次のような問題点が生じていた。例えば、抗体としてポリクローナル抗体を用いる場合には、これを作製するために抗原としてのアフィニティーペプチドが大量に必要であるという問題がある。また、抗体の作製に動物を使用するため、抗体の産生量や性質に個体差が生じ、常に均一な品質を持った抗アフィニティーペプチドポリクローナル抗体を作成することは困難であると言う問題がある。他方、抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、均一な品質のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜し維持しなければならず、これには数ヶ月の期間と技術と経験が必要であり、長時間にわたってモノクローナル抗体を安定的に供給することは困難であるという問題があった。
また、組換えタンパク質の検出や定量にアフィニティーペプチドと高い親和性を持つリガンドを用いる場合には、目的とするタンパク質を目的タンパク質とアフィニティーペプチドとを結合した組換えタンパク質の形態で発現させることにより不溶化等の問題が生じることがあり、実際に目的タンパク質の検出や定量が行えないこともある。
従って、特異的結合を利用するアフィニティー精製技術において、不溶化や不活性化を引き起こさず、親和性が高く、しかも結合の解離が容易な技術や、アフィニティー精製後の目的タンパク質の検出・定量が容易な技術の開発が求められていた。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく、種々検討を行ない、オオミヤら（Ｏｈｍｉｙａら、三重大学生物資源紀要第１９号、ｐｐ７１−９６、（１９９７））によって報告されたクロストリジウム．ジョスイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．ｊｏｓｕｉ（以下、「Ｃ．ｊｏｓｕｉ」という））由来の、ＣｉｐＡと呼ばれるセルロース結合タンパク質の構造体の一部でカルシウム結合モチーフをもつコヘシンというタンパク質と、このコヘシンにカルシウムイオンを介し相補的に結合するドックリンというタンパク質に着目した。
そして、目的のタンパク質をドックリンと融合した組換え融合タンパク質の形態で発現させ、さらにその特異的なリガンドとしてコヘシンドメインを利用することにより、目的タンパク質の単離や検出を容易にできることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、目的タンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質を、コヘシンドメインを固定化した担体で処理することを特徴とする組換え融合タンパク質の精製方法を提供するものである。
また本発明は、目的タンパク質およびドックリンをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて目的のタンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質を取得し、次いで、この組換え融合タンパク質をコヘシンドメインを固定化した担体に結合させて精製し、更に組換え融合タンパク質からドックリンを除去することを特徴とする目的タンパク質の製造方法を提供するものである。
更に本発明は、目的タンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質と、標識化されたコヘシンドメインとを結合させ、非結合の標識化されたコヘシンドメインを測定系中から除去した後、その標識量を測定することを特徴とする組換え融合タンパク質の検出・定量方法を提供するものである。
また更に本発明は、コヘシンドメインと、標識化されたドックリンとを結合させ、非結合の標識化されたドックリンを除去した後、その標識量を測定することを特徴とするコヘシンドメインの検出・定量方法を提供するものである。
更にまた本発明は、コヘシンドメインを含有する溶液を、陰イオン交換担体で吸着処理してコヘシンドメインを陰イオン交換担体に吸着させ、次いで、塩濃度を上昇させることによりコヘシンドメインを溶離させることを特徴とするコヘシンドメインの精製方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用する、目的タンパク質とドックリンとを融合させた組換え融合タンパク質は、目的タンパク質をコードする遺伝子（以下、「目的タンパク質遺伝子」という）と、ドックリンをコードする遺伝子（以下、「ドックリン遺伝子」という）とを発現ベクターに組み込み、その発現ベクターを任意の宿主に導入し、発現させることにより得ることができる。
より具体的には、上記組換え融合タンパク質は、任意の発現ベクターのプロモーターの下流に、目的タンパク質遺伝子の５´領域の上流もしくは、３´領域の下流にアフィニティーペプチドとしてドックリン遺伝子を組み込み、ドックリンと任意のタンパク質の組換え融合タンパク質を生産する発現ベクターを構築し、次いで、その発現ベクターを導入した宿主において生産させることにより得られる。
上記発現ベクターの構築において用いられるドックリン遺伝子としては、例えば、オオミヤら（Ｏｈｍｉｙａら、三重大学生物資源紀要第１９号、ｐｐ７１−９６、（１９９７））によって報告されたＣ．ｊｏｓｕｉ由来のセルラーゼ複合体から、常法によりクローニングした遺伝子を挙げることができる。また、これのみに限られず、オオミヤら（Ｏｈｍｉｙａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８０；ｐｐ４３０３−４３０８（１９９８））およびフィエロブら（Ｆｉｅｒｏｂｅ，Ｈ．Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３８；ｐｐ１２８２２−１２８３２（１９９９））等に記載したドックリン遺伝子を利用することもできる。一方、目的タンパク質遺伝子としても、特に制約はなく、種々の公知のタンパク質をコードする遺伝子を使用することができる。
上記の発現ベクターの構築に当たっては、組換え融合タンパク質の、目的タンパク質部分と、ドックリン部分との間に、ドックリンの除去が容易に行えるようにするため、化学的もしくは酵素学的な開裂部位をコードする遺伝子（以下、「切断遺伝子」という）を組み込んでも良い。この開裂部位のペプチド配列として酵素学的な開裂を利用する場合は、適当な酵素、例えば、エンドプロテアーゼ、プロホルモンコンバーターゼ等が認識、切断するペプチド配列でよい（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．ＸＩＸ，Ｐｅｒｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｏｒａｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７０）；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．ＸＬＶ，Ｌｏｒａｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）より具体的な開裂部位のペプチド配列の例としては、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）をコードする遺伝子配列などを挙げることができる。また、開裂部位のペプチド配列として、化学的な開裂を利用する場合は、化学的試薬、例えば、有機酸および無機酸、ヒドロキシルアミン、Ｎ−ブロモスクシンイミド、シアノゲンブロミドが認識、切断するペプチド配列でよい（Ｗｉｔｃｏｐ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｆｉｎｓｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ２３１−３２１，Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９６１））。より具体的な開裂部位のペプチド配列の例としては、シアノゲンブロミド切断部位（ＭＸ；Ｘは任意のアミノ酸）をコードする遺伝子配列などを挙げることができる。
また、上記目的タンパク質遺伝子およびドックリン遺伝子、および必要な場合は切断遺伝子を組み込む発現ベクターとしては特に制約はないが、使用する宿主に応じて選択することができる。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合は、ｐＴＲＣ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）等が使用され、宿主が昆虫培養細胞または虫体の場合は、ＡＢｖ（片倉工業製）等を使用することが好ましい。
上記発現ベクターを発現させる宿主としては、使用する発現ベクターに応じて選択することができ、当該ベクター中での組換え融合タンパク質の発現も、常法によって行なうことができる。
上記のようにして得られた組換え融合タンパク質は、コヘシンドメインを固定化した担体（以下、「固定化コヘシン担体」という）で処理し、精製される。
この工程において使用されるコヘシンドメインとしては、前記ドックリンと特異的に結合するものであれば良い。コヘシンドメインの調製は、組換え融合タンパク質の調製に準じて行うことができ、例えば、Ｃ．ｊｏｓｕｉ由来のＣｉｐＡから、コヘシンドメインの遺伝子をクローニングし、この遺伝子を任意の発現ベクターに組み込んでコヘシンドメインを発現するベクターを構築し、その発現ベクターを宿主に導入し、コヘシンドメインを産生させることができる。このコヘシンドメインの調製に当たり、ベクターには必要によりコヘシンドメインと担体とを結合させるための結合部位をコードする遺伝子（以下、「結合遺伝子」という）を組み込んでも良い。この結合遺伝子としては、コヘシンドメインと担体とを結合させるものであれば特に限定されないが、例えば、コヘシンドメインとして上記したＣｉｐＡのコヘシンドメインを用いる場合には、ＣｉｐＡのセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を結合遺伝子として利用することができる。
かくして得られるコヘシンドメインは、陰イオン交換担体を利用したクロマトグラフィーにより精製、単離することができる。具体的にはコヘシンドメインを含有する画分を陰イオン交換担体で吸着処理してコヘシンドメインを陰イオン交換担体に吸着させ、次いで、塩濃度を上昇させることによりコヘシンドメインを溶離させることにより精製、単離できる。クロマトグラフィーに用いられる陰イオン交換担体としては、ＤＥＡＥ陰イオン交換体、ＱＡＥ陰イオン交換体およびＱイオン交換体等が挙げられ、具体的な商品名としてはＱセファロース陰イオン交換体（アマシャムバイオサイエンス製）等が挙げられる。
この精製されたコヘシンドメインは、後述する標識化したドックリンを用いて検出することができる。ドックリンの標識化には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用い、これとドックリンを組換え融合タンパク質を常法により作製し、このＧＦＰを抗ＧＦＰ抗体で検出あるいはＧＦＰの蛍光を蛍光検出器で検出・定量することができる。
また、このコヘシンドメインの固定化は、常法に従い、担体に結合させることにより行われる。なお、コヘシンドメインは直接担体に結合させることもできるが、コヘシンドメインに、例えば、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）等を連結させた融合タンパク質を常法により作製し、これらを利用して担体に結合させても良い。また、固定化に使用される担体は、コヘシンドメインと担体との結合様式として水素結合を利用する場合には、上記したコヘシンドメインにセルロース結合ドメインを連結した融合タンパク質を利用すれば、コヘシンドメインに連結したセルロース結合ドメインを介しセルロースに吸着することができるため、ＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン製）等のセルロース担体が利用できる。さらに、コヘシンドメインと担体との結合様式として共有結合を利用する場合には、架橋剤等を利用すれば、コヘシンドメインを活性化担体に結合させることができるため、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、ＥＡＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、ＥＣＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ等（アマシャムバイオサイエンス製）の活性化担体が利用できる。
組換え融合タンパク質を、固定化コヘシン担体に結合させる具体的方法の例としては、例えば、組換え融合タンパク質を含む試料にカルシウムイオンを添加した後、これを固定化コヘシン担体にアプライする方法が挙げられる。このようにして組換え融合タンパク質を結合させた担体は、適当な緩衝液で洗浄後、ＥＤＴＡ等の金属キレーターを含む適当な緩衝液で洗浄することにより、組換え融合タンパク質が溶出される。
この理由は、ドックリンは６０アミノ酸残基（分子質量；約７ｋＤａ）と非常に小さく、またドックリンとコヘシンドメインの解離定数は４．７×１０−７と非常に小さい。また、このドックリンとコヘシンドメインは、カルシウムの存在により結合し、この複合体は金属キレーターによりカルシウムイオンを除くことにより、容易に解離する特性を有するためである。
従って、組換え融合タンパク質は、そのドックリン部分において固定化コヘシン担体と強く結合し、他の爽雑物と分離できるのである。すなわち、上記の強い結合により、担体上でドックリン−コヘシン複合体を形成させ、その担体を適当な緩衝液で十分洗浄して夾雑物を除去した後、金属キレーターを含む適当な緩衝液を添加することにより、組換え融合タンパク質のドックリン部分と、固相のコヘシンドメイン部分の結合に必要なカルシウムが除去されるため、組換え融合タンパク質のみが溶離し、精製することができるのである。
上記精製工程において使用される緩衝液としては、グッドバッファー（Ｇｏｏｄ，Ｎ．Ｅ．ａｎｄ  Ｉｚａｗａ，Ｓ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ２４，Ｐａｒｔ  Ｂ，ｐｐ５３−６８（１９７２）：以下、「Ｇｏｏｄバッファー」という）、リン酸バッファー等が挙げられ、また、金属キレーターとしては、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；以下、「ＥＤＴＡ」という）もくしくは、エチレンジアミンジオキシビス（エチルアミン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｂｉｓ（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：以下、「ＥＧＴＡ」という）等を例示することができる。
かくして、目的タンパク質とドックリンとが結合した組換え融合タンパク質が精製される。この精製された組換え融合タンパク質は、目的タンパク質に対する抗体や、ドックリンとコヘシンドメインとの結合性を利用して、標識化されたコヘシンドメインを用いて検出・定量することができる。この検出・定量に抗体を用いる場合は、常法に従い、目的タンパク質あるいはドックリンに対する抗体を作製し、これを標識化して使用すればよい。また、標識化されたコヘシンドメインを用いる場合には、前記のようにして調製されたコヘシンドメインを、常法に従って標識化すれば良い。コヘシンドメインの標識化に用いられる標識は、酵素、蛍光タンパク質、放射性活性標識分子、蛍光剤、染料、粒子、化学発光物質、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、磁気粒子等を含む、直接的にまたは間接的に検出可能な信号を与えるものが好ましく、特にビオチンが好ましい。これらの標識は常法によりコヘシンドメインに標識化すればよい。具体的に、標識としてビオチンを用いてビオチニル化したコヘシンドメインは、アルカリホスファターゼあるいは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識化されたストレプトアビジンをビオチニル化したコヘシンドメインで検出・定量することができる。
標識化されたコヘシンドメインを使用する方法は、目的タンパク質の如何に関わらず利用することができるという点で、目的タンパクに対する抗体を利用する方法と比べ好ましい。
上記のようにして精製された組換え融合タンパク質からドックリン部分を除去することにより、目的タンパク質が得られる。
組換え融合タンパク質からドックリン部分を除去する方法としては、組換え融合タンパク質の目的タンパク質部分とドックリン部分の間に設けられた、化学的もしくは酵素学的な開裂部位を開裂させる方法が挙げられる。すなわち、予め目的タンパク質遺伝子とドックリン遺伝子の間に、化学的または酵素学的な開裂部位をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを用いれば容易にドックリン部分のみを除去できる組換え融合タンパク質が得られる。
従って、例えば組換えタンパク質では、固定化コヘシン担体に組換え融合タンパク質を結合させた後、適当な緩衝液、例えば、Ｇｏｏｄバッファー、リン酸バッファーで洗浄し、特定の試薬または酵素、例えば、開裂部位がエンテロキナーゼ開裂部位の場合にはエンテロキナーゼを作用させる等の処理により、ドックリンは固定化コヘシン担体のコヘシンドメインに結合したまま担体に残存させ、目的タンパク質のみを単離、取得することができる。
本発明は、ドックリンが６０アミノ酸残基と（分子質量；約７ｋＤａ）と非常に小さく、またドックリンとコヘシンドメインとの解離定数が４．７×１０−７と非常に小さいこと、およびこのドックリンとコヘシンドメイン複合体は金属キレーターによりカルシウムイオンを除くことにより、容易に解離する特性を有することに基づくものである。
すなわち、ドックリンはその分子質量が小さく、目的タンパク質と組換え融合タンパク質としても不溶化もしにくい。しかもこのドックリンとコヘシンドメインとの結合性は、アフィニティー精製を行うに十分な強さである。しかも、このドックリンとコヘシンドメインの結合は、金属キレーターによりカルシウムイオンを除去することにより、容易に分離させることができる。このような性質が、目的タンパク質を不溶化させずに、温和な精製条件で簡便に組換え融合タンパク質を単離できる手法の提供を可能とするのである。
また、上記手法に用いられる、ドックリンおよびコヘシンドメインは、組換えタンパク質として容易に得られるため、均一な品質のアフィニティーペプチドおよびリガンドとして長期間にわたって安定的に供給することが可能である。
更に、組換え融合タンパク質の目的タンパク質とドックリンの間に化学的または酵素学的な開裂部位を設けた場合は、簡単な手段で目的タンパク質のみを得ることができるのである。
また更に、従来は目的タンパク質を検出・定量するには、目的タンパク質に対する抗体を各タンパク質ごとに作製する必要があったが、ドックリンと目的タンパク質とを含む組換え融合タンパク質を利用すれば、標識化したコヘシンドメインで簡単に検出・定量できるようになる。
更にまた、上記した方法により目的タンパク質とドックリンとを結合させた組換え融合タンパク質を、標識化したコヘシンドメインを用いて検出・定量することにより、目的タンパク質の発現量、細胞および組織内における局在性、動態を測定あるいは検出できるようになる。
実施例
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例  １
コヘシン遺伝子の取得：
ｐＭＫベクターにＣ．ｊｏｓｕｉ  ＣｉｐＡ遺伝子（Ｏｈｍｉｙａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８０；ｐｐ４３０３−４３０８（１９９８））をクローニングしたｐＭＫ−２  Ｃｊ  ＣｉｐＡベクター（三重大学生物資源学部微生物研究室  粟冠助教授より分与）を鋳型とし、以下の条件でＰＣＲによりコヘシン遺伝子の増幅を行った。
（１）ＰＣＲプライマーの設計
コヘシン遺伝子増幅に用いたプライマーの配列および組み合わせは下記の通り行った。
2003033695.tif 000002
（２）ＰＣＲサンプルの調整
ｐＭＫ／Ｃ．ｊｏｓｕｉ  ＣｉｐＡ            １００ｐｇ
１０ｘＥｘ−Ｔａｑバッファー（宝酒造製）        ５μｌ
プライマー１                                    １ｎｇ
プライマー２またはプライマー３                  １ｎｇ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（宝酒造製）                    ４μｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造製）                      ０．５μｌ
蒸留水                        総量５０μｌとなるように加えた。
（３）ＰＣＲ条件
手順１：９４．０℃      ２分
手順２：９４．０℃    ３０秒
手順３：５５．０℃    ４５秒
手順４：７２．０℃    ６０秒
手順５：手順２〜４を３０回繰り返し
手順６：７２．０℃      ３分
実施例  ２
コヘシン発現用トランスファーベクターの構築：
（１）コヘシン遺伝子の調製
Ｃ．ｊｏｓｕｉ  ＣｉｐＡ遺伝子の５’端に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列、コヘシンドメインを１つ（Ｃｊ１）または２つ（Ｃｊ２）含み、３’端に制限酵素ＸｂａＩ認識配列が付加されたコヘシン遺伝子ＰＣＲ産物２０μｌに制限酵素ＢａｍＨＩ（８〜２４Ｕ）、ＸｂａＩ（８〜２４Ｕ）（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出した。次に、キアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理コヘシン遺伝子断片を精製した。
（２）トランスファーベクターへの挿入
組換えバキュロウイルス作製用トランスファーベクターｐＹＮＧ（片倉工業製）のマルチクローニングサイトの制限酵素認識サイトをＢｇｌｌＩ、ＸｂａＩ（共に宝酒造製）で開いた後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン酸化した。線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（２μｌ）と制限酵素処理済みコヘシン遺伝子断片（コヘシンドメイン１つまたは２つ含むもの）０．１μｇ（３μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液を５μｌ加え１６℃で１時間反応させた後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンの塩基配列確認のため下記プライマーを用いた。
2003033695.tif 000003
上記プライマーをＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて解析した。コヘシン遺伝子断片の挿入と変異のないクローンを選抜しｐＹＮＧ／Ｃｊ１（コヘシンドメインを１つ含む）、ｐＹＮＧ／Ｃｊ２（コヘシンドメインを２つ含む）とした（図１）。
実施例  ３
コヘシン発現組換えウイルスの作製（１）：
（１）コトランスフェクション
まず、細胞培養用の３５ｍｍディッシュを用いてＢｍ−Ｎ細胞を約１×１０６個の単層コンフルエントに静置培養で準備した。線状化したＡＢｖ  ＤＮＡ（片倉工業製）の０．１μｇと、上記で得られたトランスファーベクターｐＹＮＧ／Ｃｊ１、ｐＹＮＧ／Ｃｊ２の０．５μｇをそれぞれ１．５ｍｌチューブ中で１００μｌのＴＣ−１００（日本農産工業製）に混合し、室温で１５分間静置した。１００μｌのＴＣ−１００にカチオン性脂質試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）を５μｌ混合し、室温で１５分間静置した。次に２つの溶液を混合し、さらに室温で１５分間静置した後に８００μｌのＴＣ−１００を加えた。この混合液を３５ｍｍの細胞培養用ディッシュで単層コンフルエントに準備したＢｍ−Ｎ細胞に加え、２５℃で２０時間培養後にＤＮＡ溶液を除去し、１０％ＦＢＳ（シグマ製）を含むＴＣ−１００培地を２ｍｌ添加して、２５℃で７日間静置培養した。その培養上清を組換えウイルス原液とした。
（２）スクリーニング
上記で得たウイルス液よりＡＢｖの単離をキングら（Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｒ．Ｄ．，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ（１９９２））の方法で行った。まず、Ｂｍ−Ｎ細胞を１穴当たり１×１０３個／５０μｌにして、１０％ＦＢＳ（シグマ製）を含むＴＣ−１００培地（日本農産工業製）で培養した９６穴プレートを準備した。組換えウイルス原液を１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１００培地を用いて１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０と５段階に希釈したウイルス希釈液を各プレートの１穴当たり５０μｌずつ混合し感染させた。これらのプレートは乾燥防止のためシールして２５℃で静置培養した。組換えウイルスの選抜は、感染７日目に、光学顕微鏡下で多角体の形成がないことを確認し、さらに培地中に分泌された組換えコヘシンのセルロースバインディング活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で解析し、活性の認められたクローンを組換えコヘシン発現組換えウイルスクローン（Ｃｊ１−３、Ｃｊ２−３）として選抜した（図２）。
（３）組換えコヘシンタンパクの調製
上記の組換えウイルスをＥＸＣＥＬＬ４２０培地（ＪＲＨバイオサイエンス製）で培養したＳｆ９細胞（インビトロジェン製）にＭ．Ｏ．Ｉ．５で接種、接種後４日目の培養上清を組換えコヘシンサンプルとして用いた。
（４）セルロースバインディングアッセイ
セルロースバインディングアッセイは、以下の方法で行った。コヘシンが発現した培地の１ｍｌにセルロースＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン製）を１００ｍｇ加え、室温で６０分間撹拌した。撹拌後、６，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、ＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎの回収を行った。上清を捨て去りウォッシングバッファー（Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：ノバジェン製）１ｍｌを加え沈殿を懸濁した。さらに、室温で１０分間撹拌した後に、６，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、ＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎを回収した。同様の作業を２回繰り返しＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎを洗浄した。遠心により回収したＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎに１００μｌの１００％エチレングリコールを加え、懸濁後、室温で１０分間静置した。６，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した上清８０μｌを回収し溶出分画とした。これに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２２７，ｐｐ６８０−６８５（１９７０））４０μｌを加え、５分間煮沸し電気泳動用のサンプルを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
実施例  ４
ドックリン遺伝子の取得：
ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにＣ．ｊｏｓｕｉ  ＣｅｌＢのドックリン遺伝子（ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースアクセッション番号Ｄ１６６７０．１）をクローニングしたベクター（三重大学生物資源学部微生物研究室  粟冠助教授より分与）を用い、これを鋳型にし、下記条件でＰＣＲによりドックリン遺伝子（配列Ｄｏｃｋｅｒｉｎ）の増幅を行った。
（１）ＰＣＲプライマーの設計
ドックリン遺伝子増幅に用いたプライマーの配列および組み合わせは下記の通り行った。
2003033695.tif 000004
2003033695.tif 000005
（２）ＰＣＲ反応条件
手順１：９４．０℃    ２分
手順２：９４．０℃    ６０秒
手順３：４２．０℃    ９０秒
手順４：７２．０℃    ６０秒
手順５：手順２〜手順４を３０回繰り返し
手順６：７２．０℃    ３分
ＰＣＲによる増幅の結果、Ｃ．ｊｏｓｕｉ  ＣｅｌＢの両端に制限酵素認識配列が付加されたドックリン遺伝子約２００ｂｐ断片を得ることが出来た。
実施例  ５
Ｃ末端ドックリン付加用トランスファーベクターの構築：
（１）ドックリン遺伝子の調製
Ｃ．ｊｏｓｕｉ  ＣｅｌＢの５’端に制限酵素ＮｃｏＩ、Ｅｃｏ８１Ｉ認識配列、３’端に制限酵素ＮｈｅＩ認識配列が付加されたドックリン遺伝子ＰＣＲ産物２０μｌに、制限酵素ＮｃｏＩ（８〜２４Ｕ）、ＮｈｅＩ（８〜２４Ｕ）（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出した。次に、キアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理ドックリン遺伝子断片を精製した。
（２）トランスファーベクターへの挿入
組換えバキュロウイルス作製用トランスファーベクターｐＹＮＧ（片倉工業製）のマルチクローニングサイトの制限酵素認識サイトをＮｃｏＩ、ＸｂａＩ（共に宝酒造製）で開いた後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン酸化した。線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（２μｌ）と制限酵素処理済みドックリン遺伝子断片０．１μｇ（３μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液を５μｌ加え１６℃で１時間反応させた後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンを選抜し、プライマーに前述のｙｎｇ．ｆｏｒを用い、ＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて塩基配列を解析した。ドックリン遺伝子断片が挿入され、変異のないクローンをｐＹＮＧ／ＣＴ−ＤＯＣＫベクターとした。
（３）エンテロキナーゼ認識サイトおよびマルチクローニングサイトの導入
エンテロキナーゼ認識サイトおよびマルチクローニングサイトを含んだオリゴヌクレオチドを合成した。
2003033695.tif 000006
それぞれのオリゴヌクレオチドを１μＭ、塩化ナトリウムを５０ｍＭ含む溶液を調製し、９４℃で５分間、５５℃で１５分間、３７℃で１５分間の処理を行い２本のオリゴヌクレオチドを重合した（以下、「ＥＫ−ＤＯＣＫ」という）。次に、ｐＹＮＧ／ＣＴ−ＤＯＣＫを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏ８１Ｉで処理し線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（３μｌ）とＥＫ−ＤＯＣＫ断片１μｌにライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液を４μｌ加え１６℃で１時間反応させた。さらに、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドの精製を行った。いくつかのクローンを選抜し、プライマーに前述のｙｎｇ．ｆｏｒを用い、ＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて塩基配列を解析した。エンテロキナーゼ認識配列およびマルチクローニングサイト（ＢｇｌｌＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｈｅＩ）の塩基配列が確認できたものをドックリン付加ベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣＫとした（図３）。
実施例  ６
Ｎ末端ドックリン付加用トランスファーベクターの構築：
（１）ドックリン遺伝子の調製
Ｃ．ｊｏｓｕｉ  ＣｅｌＢの５’端に制限酵素ＳａｃＩ認識配列、３’端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列が付加されたドックリン遺伝子のＰＣＲ産物２０μｌに、制限酵素ＳａｃＩ（８〜２４Ｕ）、ＥｃｏＲＩ（８〜２４Ｕ）（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出した。次に、キアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理ドックリン遺伝子断片を精製した。
（２）トランスファーベクターへの挿入
組換えバキュロウイルス作製用トランスファーベクターｐＹＮＧ３０Ｋｓｉｇ（片倉工業製）のマルチクローニングサイトの制限酵素認識サイトをＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ（共に宝酒造製）で処理し線状化した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン酸化した。線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（２μｌ）と制限酵素処理済みドックリン遺伝子断片０．１μｇ（３μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液５μｌを加え、１６℃で１時間反応させた後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンを選抜し、プライマーに前述のｙｎｇ．ｆｏｒを用い、ＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応した後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて解析した。ドックリン遺伝子断片が挿入され、変異のないクローンをｐＹＮＧ／ＮＴ−ＤＯＣＫベクターとした。
（３）エンテロキナーゼ認識サイトおよびマルチクローニングサイトの導入
エンテロキナーゼ認識サイトおよびマルチクローニングサイトを含んだオリゴヌクレオチドを合成した。
2003033695.tif 000007
それぞれのオリゴヌクレオチドを１μＭ、塩化ナトリウムを５０ｍＭ含む溶液を調製し、９４℃で５分間、５５℃で１５分間、３７℃で１５分間の処理を行い２本のオリゴヌクレオチドを重合した（ＥＫ−ＤＯＮＴ）。次に、ｐＹＮＧ／ＮＴ−ＤＯＣＫを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで処理し線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（３μｌ）とＥＫ−ＤＯＮＴ断片１μｌにライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液４μｌを加え、１６℃で１時間反応させた。さらに、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンを選抜し、プライマーに前述のｙｎｇ．ｆｏｒを用い、ＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応した後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて塩基配列を解析した。エンテロキナーゼ認識配列およびマルチクローニングサイト（ＢｇｌｌＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ）の塩基配列が確認できたものをドックリン付加ベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＮＴ−ＤＯＣＫとした（図４）。
実施例  ７
Ｃ末端ドックリン付加緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）の発現：
（１）ＰＣＲプライマーの設計
ＧＦＰ遺伝子を含むベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック製）を鋳型にＰＣＲにより制限酵素認識配列の導入、終止コドンの欠失を行った。ｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣＫへ挿入するＧＦＰ遺伝子調製のために下記のプライマーを合成した。
2003033695.tif 000008
（２）ＰＣＲサンプルの調整
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１                          １００ｐｇ
１０ｘＥｘ−Ｔａｑバッファー（宝酒造製）      ５μｌ
ｙｎｇ．ｆｏｒ                                １ｎｇ
プライマー５                                  １ｎｇ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（宝酒造製）                  ４μｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造製）                      ０．５μｌ
蒸留水                      総量５０μｌとなるように加えた。
（３）ＰＣＲ条件
実施例１のコヘシン遺伝子の取得と同様の操作を行った。
（４）ＧＦＰ遺伝子の調製
ＧＦＰ遺伝子の５’端に制限酵素ＢｇｌｌＩ認識配列、３’端に制限酵素ＥｃｏＲＶ認識配列が付加されたＰＣＲ産物２０μｌに制限酵素ＢｇｌｌＩ（８〜２４Ｕ）、ＥｃｏＲＶ（８〜２４Ｕ）（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出した。次に、キアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理ＧＦＰ遺伝子断片を精製した。
（５）トランスファーベクターへの挿入
Ｃ末端ドックリン付加用トランスファーベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣＫのマルチクローニングサイトの制限酵素認識サイトをＢｇｌｌＩ、ＥｃｏＲＶ（共に宝酒造製）で処理し線状化した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン酸化した。線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（２μｌ）と制限酵素処理済みＧＦＰ遺伝子断片０．１μｇ（２μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液３μｌを加え、１６℃で１時間反応した後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。次にアンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンを選抜し、ＧＦＰ遺伝子断片の挿入および読み枠が合っていること、またＧＦＰ遺伝子に変異のないことを確認した。塩基配列確認のためのプライマーは、前述のｙｎｇ．ｆｏｒおよびｙｎｇ．ｒｅｖを用いた。このプライマーをＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて解析した。
実施例  ８
Ｃ末端ドックリン付加マウスインターフェロン（ｍＩＦＮ）の発現：
（１）ＰＣＲプライマーの設計
ｍＩＦＮ遺伝子（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５８，ｐｐ９５２２−９５２９（１９８３）；京都工芸繊維大学  宗川教授より分与）を鋳型にＰＣＲにより制限酵素認識配列の導入、終止コドンの欠失を行った。ｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣＫへ挿入するｍＩＦＮ遺伝子調製のためのプライマーを合成した。
2003033695.tif 000009
（２）ＰＣＲサンプルの調整：
ｍＩＦＮ遺伝子                            １００ｐｇ
１０ｘＥｘ−Ｔａｑバッファー（宝酒造製）      ５μｌ
プライマー６                                  １ｎｇ
プライマー７                                  １ｎｇ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（宝酒造製）                  ４μｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造製）                      ０．５μｌ
蒸留水                      総量５０μｌとなるように加えた。
（３）ＰＣＲ条件
コヘシン遺伝子の取得方法と同様の操作を行った。
（４）ｍＩＦＮ遺伝子の調製
ｍＩＦＮ遺伝子の５’端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列、３’端に制限酵素ＥｃｏＲＶ認識配列が付加されたＰＣＲ産物２０μｌに、制限酵素ＥｃｏＲＩ（８〜２４Ｕ）、ＥｃｏＲＶ（８〜２４Ｕ）（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出した。次に、キアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理ｍＩＦＮ遺伝子断片を精製した。
（５）トランスファーベクターへの挿入
Ｃ末端ドックリン付加用トランスファーベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣＫのマルチクローニングサイトの制限酵素認識サイトをＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ（共に宝酒造製）で処理し線状化した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン酸化した。線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（２μｌ）と制限酵素処理済みｍＩＦＮ遺伝子断片０．１μｇ（２μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩ液を３μｌ加え、１６℃で１時間反応した後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。次にアンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンを選抜し、ｍＩＦＮ遺伝子断片の挿入および読み枠が合っていること、またｍＩＦＮ遺伝子に変異のないことを確認した。塩基配列確認のためのプライマーは、前述のｙｎｇ．ｆｏｒおよびｙｎｇ．ｒｅｖを用いた。ＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて解析した。
実施例  ９
Ｎ末端ドックリン付加マウスインターフェロン（ｍＩＦＮ）の発現：
（１）ＰＣＲプライマーの設計
ｍＩＦＮ遺伝子（京都工芸繊維大学  宗川教授より分与）を鋳型にＰＣＲにより制限酵素認識配列の導入を行った。ｐＹＮＧ／ＥＫ−ＮＴ−ＤＯＣＫへ挿入するｍＩＦＮ遺伝子調製のためのプライマーを合成した。
2003033695.tif 000010
（２）ＰＣＲサンプルの調整
ｍＩＦＮ遺伝子                            １００ｐｇ
１０ｘＥｘ−Ｔａｑバッファー（宝酒造製）      ５μｌ
プライマー８                                  １ｎｇ
プライマー９                                  １ｎｇ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（宝酒造製）                  ４μｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造製）                      ０．５μｌ
蒸留水                        総量５０μｌとなるように加えた。
（３）ＰＣＲ条件
コヘシン遺伝子の取得方法と同様の操作を行った。
（４）ｍＩＦＮ遺伝子の調製
ｍＩＦＮ遺伝子の５’端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列、３’端に制限酵素ＸｂａＩ認識配列が付加されたＰＣＲ産物２０μｌに制限酵素ＥｃｏＲＩ（８〜２４Ｕ）、ＸｂａＩ（８〜２４Ｕ）（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出した。次に、キアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理ｍＩＦＮ遺伝子断片を精製した。
（５）トランスファーベクターへの挿入
Ｎ末端ドックリン付加用トランスファーベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＮＴ−ＤＯＣＫのマルチクローニングサイトの制限酵素認識サイトをＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ（共に宝酒造製）で処理し線状化した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン酸化した。線状化したトランスファーベクター０．１μｇ（２μｌ）と制限酵素処理済みｍＩＦＮ遺伝子断片０．１μｇ（２μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液３μｌを加え、１６℃で１時間反応した後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。次にアンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンを選抜し、ｍＩＦＮ遺伝子断片の挿入および読み枠が合っていること、またｍＩＦＮ遺伝子に変異のないことを確認した。塩基配列確認のためのプライマーは、前述のｙｎｇ．ｆｏｒ、ｙｎｇ．ｒｅｖを用いた。ＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させ後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて解析した。
実施例  １０
Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰおよびｍＩＦＮ発現組換えウイルスの作製：
（１）コトランスフェクション
まず、３５ｍｍ細胞培養用ディッシュを用いてＢｍ−Ｎ細胞を約１×１０６個の単層コンフルエントに静置培養で準備した。線状化したＡＢｖ  ＤＮＡ（片倉工業）の０．１μｇと、上記で得られたＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ遺伝子トランスファベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣ／ＧＦＰ、Ｃ末端ドックリン付加ｍＩＦＮ遺伝子トランスファベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣ／ｍＩＦＮあるいはＮ末端ドックリン付加ｍＩＦＮ遺伝子トランスファーベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＮＴ−ＤＯＣ／ｍＩＦＮの０．５μｇを１．５ｍｌチューブ中で１００μｌのＴＣ−１００（日本農産工業製）に混合し、室温で１５分間静置した。ＴＣ−１００の１００μｌにカチオン性脂質試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）を５μｌ混合し、室温で１５分間静置した。次に２つの溶液を混合し、さらに室温で１５分間静置した後に８００μｌのＴＣ−１００を加えた。この混合液を３５ｍｍの細胞培養用ディッシュで単層コンフルエントに準備したＢｍ−Ｎ細胞に加え、２５℃で２０時間培養後にＤＮＡ溶液を除去し、１０％のＦＢＳ（シグマ製）を含むＴＣ−１００培地を２ｍｌ添加して、２５℃で７日間静置培養した。その培養上清を組換えウイルス原液とした。
（２）スクリーニング
上記で得たウイルス液よりＡＢｖの単離を、キングら（Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｒ．Ｄ．，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ（１９９２））の方法で行った。まず、Ｂｍ−Ｎ細胞を１穴当たり１×１０３個／５０μｌにして１０％のＦＢＳ（シグマ製）を含むＴＣ−１００培地（日本農産工業製）で培養した９６穴プレートを準備した。組換えウイルス原液を１０％のＦＢＳを含むＴＣ−１００培地を用いて１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０と５段階に希釈したウイルス希釈液を各プレートの１穴当たり５０μｌずつ混合し感染させた。これらのプレートは乾燥防止のためシールして２５℃で静置培養した。組換えウイルスの選抜は、感染７日目に、光学顕微鏡下で多角体の形成がないことを確認することによって行った。
（３）組換えドックリン付加タンパク質サンプルの調製
上記で作製した組換えウイルスをＥＸＣＥＬＬ４２０培地（ＪＲＨバイオサイエンス製）で培養したＳｆ９細胞にＭ．Ｏ．Ｉ．５で接種した。、接種後４日目の培養上清を組換えドックリン付加タンパク質サンプルとして用いた。
実施例  １１
組換えドックリン付加タンパク質サンプルの検出（１）：
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗体によるＧＦＰの検出
ＧＦＰの検出は、上記サンプルを常法に基づいてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、抗ＧＦＰ抗体（ベーリンガーマンハイム製）を用いてウエスタンブロットすることによって行った。
（２）結果
図５に示すように、Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰ遺伝子組換えウイルスを接種したＳｆ９細胞（インビトロジェン製）では、上清にＧＦＰが観察され、しかもこのＧＦＰは可溶化状態で発現していることが確認できた。
実施例  １２
組換えドックリン付加タンパク質サンプルの検出（２）：
（１）抗ウイルス活性によるｍＩＦＮの検出
ｍＩＦＮの活性検出は、マウスＬ９２９細胞を用いて次のように行った。まず、対数増殖期にある継代細胞を血球計算盤でカウントした後に、５％のＦＢＳ（シグマ製）を含有するＭＥＭ培地で４〜６×１０６細胞／ｍｌに調製し、これを９６穴プレートに１００μｌ／ウエルずつ入れた。２４時間後、サンプルを１０−４〜１０−５になるように培地で希釈し、更にトランスファープレートを用いて２倍希釈を行ない、培養プレートにトランスファープレートを重ねて試料を移した。これを５％のＣＯ２濃度に調整したインキュベーター内において、３７℃で１２〜２４時間培養した。培養後、マウス脳心筋炎ウイルスを１０００〜３０００ＰＦＵ／ｍｌとなるように培地で希釈し、さらに培養プレート中の培地を捨て、ウイルス液を１００μｌ／ウエルずつ１〜１０列目まで添加した。プレートの１１〜１２列はウイルスを含まない培地を１００μｌ／ウエルずつ入れた。２４〜３６時間培養後、細胞変性状況を検鏡し、ウイルス感染対照群の細胞変性がほぼ１００％となったところで、培地を捨て５分間ＵＶ照射をしてウイルスを不活性にした。その後１０％ホルマリン溶液に１０分間程度浸し細胞を固定した。
固定後、ホルマリン溶液を捨て、ナフトールブルーブラック染色液を５０μｌ／ウエルずつ添加し、３０分間程度染色した。その後、染色液を捨て、水道水でよく染色液を洗い流し、プレートを風乾した後に１００ｍＭの水酸化ナトリウムで染色された細胞を溶出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用い、溶出プレートを６００ｎｍの吸光度で測定し、レファレンスと比較してサンプルの力価を求めた。レファレンスには米国ＮＩＨの国際標準品ｍＩＦＮを使用した。
（２）結果
Ｃ末端ドックリン付加ｍＩＦＮ遺伝子組換えウイルスを接種した培養上清では、９．２２×１０６単位／ｍｌ、Ｎ末端ドックリン付加ｍＩＦＮ遺伝子組換えウイルスを接種した培養上清では、３．５１×１０７単位／ｍｌの活性を検出した。従ってｍＩＦＮが活性を保持した状態で発現していることが確認できた。
実施例  １３
組換えＣ末端ドックリン付加ＧＦＰの精製：
（１）カラムの調製およびＣ末端ドックリン付加ＧＦＰの溶出
まず、組換えコヘシンを吸着させたカラムの調製は、以下のとおり行った。すなわち、セルロース結合担体樹脂（ＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎ：ノバジェン製）５０ｍｇに対し、上記実施例３で作製した組換えコヘシンサンプル１ｍｌを加え、回転震とう器を用い、１時間、室温の条件で混合した。その後、ＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎと組換えコヘシンサンプルとの混合物をエコノカラム（φ１．０×５ｃｍ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に移し、組換えコヘシンを吸着させたＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎを沈殿させた。組換えコヘシンを吸着させたＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎと培養上清とが二層に分離後、エコノカラム下部のコックを開き、培養上清を流出させた。エコノカラム内の上清が組換えコヘシンを吸着させたＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎの上端に達したら、カラムの上部より５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．２）（以下、「洗浄緩衝液」という）を２０ｍｌ添加し、組換えコヘシンを吸着させたＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎを洗浄した。
また、上記カラムへのアプライ用サンプルの調製は、上記実施例１０で作製したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰサンプルに、１Ｍの塩化カルシウム水溶液を終濃度１０ｍＭとなるように加え、混合することにより行った。次に、上記カラムへのアプライ用サンプル５ｍｌを組換えコヘシンを吸着させたＣＢｉｎＤ  １００Ｒｅｓｉｎを詰めたカラムに添加した。サンプルをアプライ後、洗浄緩衝液を２０ｍｌ添加することによりカラムを洗浄した。カラム洗浄後、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．２）（以下、「溶出緩衝液」という）を３０ｍｌ添加することにより、Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを溶出した。
さらに溶出後、カラムへエチレングリコールを２ｍｌ添加し、組換えコヘシンを吸着させたＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎを懸濁後、それをマイクロチューブに回収し、回転震とう器を用い、１時間、室温の条件で混合した後に遠心分離を行い、その上清をサンプリングした。上記実施例の各工程をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる銀染色と抗ＧＦＰ抗体（ベーリンガーマンハイム製）によるウエスタンブロッティングにより分析を行った（図６）。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色および抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロッティングによるＣ末端ドックリン付加ＧＦＰの検出：
上記実施例１３の（１）の各精製工程において分画したサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２２７，ｐｐ６８０−６８５（１９７０））により分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは１２．５％のものを使用し、分子量マーカーとともに、定電流（２０ｍＡ）で電気泳動した。泳動終了後、銀染色キット（銀染キットワコー；和光純薬）によるタンパク質の確認を行い、各精製段階における精製度を確認した。また、ウエスタンブロッティングによる分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ブロッティング装置（アトー製）によりタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜（アドバンテック製）に転写した。転写後、タンパク質の吸着したＰＶＤＦ膜を３％ＢＳＡ（和光純薬工業製）を含むＴ−ＴＢＳによりブロックキング処理後、一次抗体として抗ＧＦＰマウス抗体（ベーリンガーマンハイム製）、二次抗体として抗マウスＩｇＧウサギ抗体（和光純薬工業製）を用いたウェスタンブロッティングを行った。シグナルの検出は、ＥＣＬ試薬（アマシャムバイオサイエンス製）を使用し、Ｘ線感光フィルム（フジフィルム製）へ露光することにより行った。これにより得られたＸ線感光フィルム上のシグナル強度の測定は、画像データとしてコンピュータに入力しＮＩＨ  ｉｍａｇｅ  ｖｅｒ．１．５５ソフトで解析定量することにより、組換えＧＦＰの発現量を求めた。
（３）結果
Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰは図６のレーン１１において、Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰサンプル中に確認することができた。すなわち、ウエスタンブロッティングの結果から、Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰサンプルを組換えコヘシンを吸着させたＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎに添加した際には、図６のレーン４および５（洗浄緩衝液で溶出した分画）では検出されず、溶出緩衝液を加えた分画（レーン６）でバンドが認められた。また、銀染色の結果からも同位置に相当するバンドが認められた。さらに、銀染色したゲルの結果を画像データとしてコンピュータに入力し、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ  ｖｅｒ１．５５ソフトで解析したところ、１回のカラム操作により、Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰの精製純度は９０％に達することが明らかになった。
実施例  １４
コヘシンドメインを６つ含むコヘシン（Ｃｊ６）発現用トランスファーベクターの構築：
実施例２において構築したｐＹＮＧ／Ｃｊ１をＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ（共に宝酒造製）で開いた後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン化した。次に、実施例１で用いたのと同様のｐＭＫ−２Ｃ  Ｃｊ  ＣｉｐＡベクターから、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ（共に宝酒造製）にてコヘシンドメインを６つ含む遺伝子断片を切り出した。この遺伝子断片０．１μｇ（３μｌ）と線状化したｐＹＮＧ／Ｃｊ１  ０．１μｇ（２μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液を５μｌ加え１６℃で１時間反応させた後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。最後にアンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンの塩基配列確認のため実施例２と同様にｙｎｇ．ｆｏｒおよびｙｎｇ．ｒｅｖのプライマーを用いた。このプライマーをＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて解析した。６つのコヘシンドメインの挿入を確認し、これをｐＹＮＧ／Ｃｊ６とした（図７）。
実施例  １５
コヘシン発現組換えウイルスの作製（２）：
コトランスフェクションおよびスクリーニングは、実施例３の方法に従って行った。ただし、トランスファーベクターには上記で作製したｐＹＮＧ／Ｃｊ６を用い、セルロースバインディング活性の認められたクローンを組換えコヘシン発現組換えウイルスクローン（Ｃｊ６−１）として選抜した。
実施例  １６
組換えコヘシンタンパクの調製：
（１）組換えコヘシンタンパクのカイコ幼虫での生産
実施例３および１５で作製した組換えウイルス（Ｃｊ１−３、Ｃｊ２−３およびＣｊ６−１）を、５齢１日目のカイコ幼虫に皮下接種後、２５℃、湿度４５％の条件で人工飼料（モーラス；片倉工業製）を与えて飼育し、６日後に体液を回収した。回収した体液を１２，５００ｇで６０分間、遠心分離して上清を回収し、混入した組織片などを除去した。こうして得られた上清を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０；以下、「緩衝液Ａ」という）にて１０倍希釈して、組換えコヘシンタンパクを含む体液を調整した。
（２）カイコ体液中に発現させた組換えコヘシンタンパクの精製
Ｑセファロース陰イオン交換体（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；アマシャムバイオサイエンス製）を、緩衝液Ａに対して平衡化した後、エコノカラム（φ２．５×５ｃｍ：Ｂｌｏ−Ｒａｄ製）に移し、上記の組換えコヘシンタンパクを含む体液を添加して吸着させた。次に、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗浄した後、塩濃度を０．５Ｍまで上昇させることによって、組換えコヘシンタンパクを溶出した。このようにして得られた組換えコヘシンタンパクを含む画分を、精製組換えコヘシンタンパク画分とした。
（３）コヘシンタンパク（コヘシンドメイン）の検出
精製組換えコヘシンタンパクを含むサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ブロッティング装置（アトー製）により分離したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜（アドバンテック製）に転写した。転写後、タンパク質の吸着したＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下、「ブロッキング緩衝液１」という）によりブロックキング処理した。実施例１０で調製した組換えドックリン付加タンパク質サンプル（Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを含むＳｆ９細胞の培養上清）をブロッキング緩衝液１で１００倍希釈したものに、ブロッキング処理したＰＶＤＦ膜を室温で２時間処理した。処理後のＰＶＤＦ膜を用いて、一次抗体を抗ＧＦＰマウス抗体（ベーリンガーマンハイム製）、二次抗体を抗マウスＩｇＧウサギ抗体（和光純薬工業製）としてウェスタンブロッティングによる分析を行った。シグナルの検出は、ＥＣＬ試薬（アマシャムバイオサイエンス製）を使用し、Ｘ線感光フィルム（フジフィルム製）へ露光することにより行った。
（４）結果
Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを用いた検出によって、ほとんど非特異的反応が無く、コヘシンドメインを１つ、２つおよび６つ有する組換えコヘシンタンパクを全て検出することができた（図８）。
実施例  １７
Ｎ末端ドックリンタグ付加緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）の発現：
（１）ＰＣＲプライマーの設計
ＧＦＰ遺伝子を含むベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック製）を鋳型にＰＣＲにより制限酵素認識配列の導入、終止コドンの欠失を行った。ｐＹＮＧ／ＥＫ−ＮＴ−ＤＯＣＫへ挿入するＧＦＰ遺伝子調製のために下記のプライマーを合成した。
2003033695.tif 000011
（２）ＰＣＲサンプルの調整
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１                          １００ｐｇ
１０ｘＥｘ−Ｔａｑバッファー（宝酒造製）      ５μｌ
プライマー４                                  １ｎｇ
プライマーｙｎｇ．ｒｅｖ                      １ｎｇ
ｄＮＴＰｍｉｘ（宝酒造製）                    ４μｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造製）                      ０．５μｌ
蒸留水                        総量５０μとなるように加えた。
（３）ＰＣＲの条件
実施例１のコヘシン遺伝子の取得と同様の操作を行った。
（４）ＧＦＰ遺伝子の調製
ＧＦＰ遺伝子の５’端に制限酵素ＢｇｌｌＩ認識配列、３’端に制限酵素ＥｃｏＲＶ認識配列が付加されたＰＣＲ産物２０μｌに制限酵素ＢｇｌｌＩ（８〜２４Ｕ）、ＥｃｏＲＶ（８〜２４Ｕ）（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出した。次に、キアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理ＧＦＰ遺伝子断片を精製した。
（５）トランスファーベクターへの挿入
Ｎ末端ドックリンタグ付加用トランスファーベクターｐＹＮＧ／ＥＫ−ＮＴ−ＤＯＣＫの有するマルチクローニングサイトの制限酵素認識サイトを、ＢｇｌｌＩ、ＥｃｏＲＶ（共に宝酒造製）で処理し、線状化した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により切断末端を脱リン化した。線状化したトランスファベクター０．１μｇ（２μｌ）と制限酵素処理済みＧＦＰ遺伝子断片０．１μｇ（２μｌ）にライゲーションキット（宝酒造製）のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ液を３μｌ加え、１６℃で１時間反応した後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。次にアンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。
次にいくつかのクローンを選抜し、ＧＦＰ遺伝子断片の挿入および読み枠が合っていること、またＧＦＰ遺伝子に変異のないことを確認した。塩基配列確認のためのプライマーは、前述のｙｎｇ．ｆｏｒおよびｙｎｇ．ｒｅｖを用いた。このプライマーをＤＮＡシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＡＢＩジェネティックアナライザー（ＡＢＩ製）を用いて解析した。
実施例  １８
Ｎ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰ発現組換えウイルスの作製：
コトランスフェクションおよびスクリーニングは、実施例３と同様の方法に従って行ない、Ｎ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰ発現組換えウイルスを作製した。ただし、トランスファーベクターには実施例１７で作製したトランスファーベクターを用いた。
実施例  １９
コヘシンタンパク（コヘシンドメイン）の担体への固定化：
（１）コヘシンタンパク（コヘシンドメイン）を固定化した担体の作製
リガンド固定化用カップリング担体（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；アマシャムバイオサイエンス製）６ｇを１ｍＭ塩酸２１で膨潤、洗浄した。これを三等分した各５．３ｇ（湿潤重量）のリガンド固定化用カップリング担体に、実施例１６により精製したコヘシンドメインを１つ、２つおよび６つ有する組換えコヘシンタンパクを含む画分をそれぞれタンパク質量で１４ｍｇ加え、室温で２時間カップリングした。カップリングが終了した担体は、１Ｍアミノエタノールで室温で２時間ブロッキングした後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭ酢酸で３回づつ交互に洗浄した。洗浄が終了したコヘシンドメインを共有結合により固定化した担体（以下、コヘシンドメインを１つ有する担体を「Ｃｊ１担体」、２つ有する担体を「Ｃｊ２担体」および６つ有する担体を「Ｃｊ６担体」という）は、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、「緩衝液Ｂ」という）で平衡化後、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む緩衝液Ｂ中に保存した。
（２）タンパク質濃度の測定
上記で作製したＣｊ１担体、Ｃｊ２担体およびＣｊ６担体に共有結合したタンパク質濃度は、マイクロビーシーエータンパク質測定キット（ピアース製）を用いて、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質溶液として常法に基づいて吸光度を測定した。吸光度の測定は、マイクロプレートリーダーモデル４５０（バイオラド製）を用いて５５０ｎｍで行った。
（３）結果
上記担体のタンパク質濃度はそれぞれ１４ｍｇ、１４ｍｇおよび１１ｍｇであった。従って、リガンド固定化用カップリング担体にコヘシンドメインが１つ、２つおよび６つ有するコヘシンタンパクが共有結合により固定化された担体が作製できた。
実施例  ２０
コヘシンタンパク（コヘシンドメイン）を共有結合により固定化した担体によるドックリン付加タンパク質の精製：
（１）ドックリン付加タンパク質の調製
実施例１０で作製した、Ｃ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰを発現する組換えウイルスを、５齢１日目のカイコ幼虫に皮下接種後、２５℃、湿度４５％の条件で人工飼料（モーラス；片倉工業製）を与えて飼育し、６日後に体液を回収した。回収した体液を１２，５００ｇで６０分間、遠心分離して上清を回収し、混入した組織片などを除去した。こうして得られた上清を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む緩衝液Ｂにて１０倍希釈して、組換えドックリン付加タンパク質を含む体液を調製した。
（２）ドックリン付加タンパク質の精製
実施例１９で作製したコヘシンタンパク（コヘシンドメイン）を共有結合により固定化した担体（Ｃｊ１担体、Ｃｊ２担体およびＣｊ６担体）を、それぞれ直径１．５ｃｍのエコノカラム（バイオラド製）に高さ４．０ｃｍに詰め、エコノカラムフローアダプターを装着し、上記（１）で調整した組換えドックリン付加タンパク質を含む体液を１７０ｍｌづつ通液した。更に、同量の緩衝液Ｂで担体を洗浄後、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液Ｂで溶出した。
（３）ドックリン付加タンパク質の検出
ＧＦＰの検出は、上記サンプルを常法に基づいてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、銀染色あるいは抗ＧＦＰ抗体（ベーリンガーマンハイム製）を用いてウエスタンブロッティングによる分析を行った。
（４）結果
Ｃｊ１担体、Ｃｊ２担体およびＣｊ６担体の全てにおいて、Ｃ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰの吸着と５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液Ｂによる溶出が確認できた。Ｃｊ１担体の場合には、幼虫体液中に３．１％であったＣ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰの純度が、精製操作後には、８５．７％まで上昇した（図９）。
実施例  ２１
ドックリン付加タンパク質のエンテロキナーゼによる切断：
（１）ドックリン付加タンパク質の調製
実施例１０あるいは実施例１８で作製したＣ末端あるいはＮ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰを発現する組換えウイルスを、蛹化１日後のカイコ蛹に皮下接種後、２５℃、湿度４５％の条件で保存し、７日後に回収した。これを、蛹２頭当たり、１０％グリセロールを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを加えてホモジェナイザー（ＨＧ３０：日立製作所製）で１分間、超音波破砕装置（ＵＳＰ−６００：島津製作所製）で２分間処理した。これを、３，０００ｒｐｍ×１０分間の低速遠心処理して得られた上清を濾過し、ドックリン付加タンパク質を含む蛹磨砕液とした。
（２）ドックリン付加タンパク質の精製
上記蛹磨砕液２５０μｌに、実施例１９で作製したコヘシンドメインを共有結合により固定化した担体（Ｃｊ２担体）１００μｌと、緩衝液Ｂ  １，１５０μｌを加え、リボリューションミキサーＲＶＭ−１００（イワキ製）を用いて、４℃で２時間回転吸着させた。得られたＣｊ２担体は緩衝液Ｂ  １ｍｌを加えて３回遠心洗浄し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡあるいは２ｍＭ  ＥＧＴＡを含む緩衝液Ｂ  ２００μｌにて４℃で溶出、更に残った担体に緩衝液Ｂを添加して得た溶出液を合わせて溶出液とした。
（３）エンテロキナーゼによるタグの切断
上記で得られた溶出液の内７００μｌに、エンテロキナーゼ（バイオザイム製）１００単位を加え、４℃で４８時間保温した。エンテロキナーゼによるタグの切断の確認は、これらのサンプルを常法に基づいてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、銀染色あるいは抗ＧＦＰ抗体（ベーリンガーマンハイム製）を用いてウエスタンブロットすることによって行った。
（４）結果
２ｍＭ  ＥＧＴＡでも５０ｍＭ  ＥＤＴＡと同程度の溶出効果が見られた。また、Ｎ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰおよびＣ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰは、共に、エンテロキナーゼによって切断されていた（図１０）。
実施例  ２２
ビオチニル化によるコヘシンタンパクの標識：
（１）コヘシンタンパクのビオチニル化
実施例１６で精製した、コヘシンドメインが１つのコヘシンタンパクを含む分画を、セントリプレップＹＭ−１０（ミリポア製）でタンパク質量１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。コヘシンタンパクのビオチニル化は、ＥＣＬタンパク質ビオチン化システム（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて行った。すなわち、濃縮したコヘシンタンパク溶液２．５ｍｌの溶媒を炭酸水素ナトリウム緩衝液に置換し、常法に従ってビオチニル化試薬を加え、室温下で１時間振盪した。その後、キットに付属のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムに添加し、ＰＢＳを通液してビオチニル化したコヘシンドメインが１つのコヘシンタンパクが含まれる分画を得た。
（２）ビオチニル化コヘシンによるドックリンと結合させた組換え融合タンパク質の検出
実施例２１で作製した、Ｃ末端あるいはＮ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰの蛹磨砕液および精製溶出液ならびに実施例１０で作製したＣ末端あるいはＮ末端ドックリンタグ付加ｍＩＦＮを発現する組換えウイルスを、実施例２１と同様の方法で接種、回収、調整し、蛹磨砕液を得た。これを常法に基づいてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、銀染色またはブロッティング装置（アトー製）によりタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜（アドバンテック製）に転写した。転写後、タンパク質の吸着したＰＶＤＦ膜を、１％スキムミルクを含む０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝液（以下、「ブロッキング緩衝液２」という）によりブロッキング処理した。ブロッキング処理したＰＶＤＦ膜を、上記のビオチニル化したコヘシンが含まれる分画をブロッキング緩衝液２で１，０００倍希釈した溶液中で、室温で１時間処理した。ビオチニル化コヘシンで処理したＰＶＤＦ膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識化されたストレプトアビジン（アンティジェニックスアメリカ社製）を用いてウエスタンブロッティングによる分析を行った。シグナルの検出は、ＤＡＢ（和光純薬工業製）と過酸化水素を用いて発色させることにより行った。
（３）結果
ビオチニル化コヘシンを用いることにより、Ｃ末端あるいはＮ末端ドックリンタグ付加ＧＦＰおよびＣ末端あるいはＮ末端ドックリンタグ付加ｍＩＦＮを、特異的にかつ高感度で検出することができた（図１１）。
産業上の利用可能性
本発明の精製方法は、目的タンパク質をドックリンと遺伝子工学的技術によって融合させた組換え融合タンパク質として生産させることにより、目的タンパク質の性質と無関係にドックリンとコヘシンの特異的な結合を利用して組換え融合タンパク質の分離精製を行うことができる。
従って、本発明の精製方法は任意の目的タンパク質とドックリンの組換え融合タンパク質の分離・精製を可能にする。特に、組換え融合タンパク質として、目的タンパク質とドックリンとの間に化学的あるいは酵素学的開裂部位を導入したものを用いれば、目的タンパク質のみを簡単に精製、分離することができるので、遺伝子操作によるタンパク質の精製分離法として、極めて有利なものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図はｐＹＮＧ／Ｃｊの構築のフローを示す図面である。
第２図はＣｊ１組換えウイルスおよびＣｊ２組換えウイルスにより発現したコヘシンのセルロースバインディングアッセイによる検出を示す図面である。
（Ａ）Ｃｊ１組換えウイルスにより発現したコヘシン
符号の説明
Ｍ；マーカー
１；クローンＮＯ．１                    ５；クローンＮＯ．６
２；クローンＮＯ．２                    ６；クローンＮＯ．７
３；クローンＮＯ．３（選抜したクローン）７；空白
４；クローンＮＯ．４                    ８；ＣＪ２クローンＮＯ．１
（Ｂ）Ｃｊ２組換えウイルスにより発現したコヘシン
符号の説明
Ｍ；マーカー
１；クローンＮＯ．１                    ５；クローンＮＯ．５
２；クローンＮＯ．２                    ６；クローンＮＯ．６
３；クローンＮＯ．３（選抜したクローン）７；空白
４；クローンＮＯ．４                    ８；空白
第３図はＣ末端ドックリン付加用ベクター（ｐＹＮＧ／ＥＫ−ＣＴ−ＤＯＣＫ）の構成を示す図面である。
第４図はＮ末端ドックリン付加用ベクター（ｐＹＮＧ／ＥＫ−ＮＴ−ＤＯＣＫ）の構成を示す図面である。
第５図はＣ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現する組換えウイルスに感染した培養細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図面である。なお、（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体によるウェスタンブロッティングを示し、（Ｂ）はＣＢＢ染色を示す。
第６図はコヘシンを結合させたＣＢｉｎＤ  １００  ＲｅｓｉｎからのＣ末端ドックリン付加ＧＦＰの精製を示す図面である。なお、（Ａ）は銀染色を示し、（Ｂ）は抗ＧＦＰ抗体によるウェスタンブロッティングを示す。
符号の説明
１：コヘシン発現培養上清
２：上記１の物をＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎに結合させた後の残物分画１
３：上記１の物をＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎに結合させた後の残物分画２
４：コヘシン結合ＣＢｉｎＤ  １００  ＲｅｓｉｎにＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ発現培養上清をアプライした後の残物分画１
５：コヘシン結合ＣＢｉｎＤ  １００  ＲｅｓｉｎにＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ発現培養上清をアプライした後の残物分画２
６：ＥＤＴＡを含むバッファーでＣ末端ドックリン付加ＧＦＰを溶出した分画１
７：ＥＤＴＡを含むバッファーでＣ末端ドックリン付加ＧＦＰを溶出した分画２
８：ＥＤＴＡを含むバッファーでＣ末端ドックリン付加ＧＦＰを溶出した分画３
９：エチレングリコールでコヘシン結合ＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎよりコヘシンドメインを脱離させた分画
１０：上記９の処理後のＣＢｉｎＤ  １００  Ｒｅｓｉｎ
１１：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰ発現培養上清
第７図はｐＹＮＧ／Ｃｊ６の構築のフローを示す図面である。
第８図はＣ末端ドックリン付加ＧＦＰによる、コヘシンドメインの検出を示す図面である。
符号の説明
１：コヘシンドメインを１つ含むコヘシンのＣ末端ドックリン付加ＧＦＰによる検出
２：コヘシンドメインを２つ含むコヘシンのＣ末端ドックリン付加ＧＦＰによる検出
３：コヘシンドメインを６つ含むコヘシンのＣ末端ドックリン付加ＧＦＰによる検出
第９図の（Ａ）および（Ｂ）はコヘシンタンパク（コヘシンドメインを１つ、２つあるいは６つ有する）を共有結合させたＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗからのＣ末端ドックリン付加ＧＦＰの精製を示す図面である。
符号の説明
１：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現した幼虫体液
２：Ｃｊ１担体に結合させた後の残存分画
３：ＥＤＴＡでＣｊ１担体から溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画１
４：ＥＤＴＡでＣｊ１担体から溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画２
５：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現した幼虫体液
６：Ｃｊ２担体に結合させた後の残存分画
７：ＥＤＴＡでＣｊ２担体から溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画１
８：ＥＤＴＡでＣｊ２担体から溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画２
９：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現した幼虫体液
１０：Ｃｊ６担体に結合させた後の残存分画
１１：ＥＤＴＡでＣｊ６担体から溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画１
１２：ＥＤＴＡでＣｊ６担体から溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画２
Ｍ：マーカー
←：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰ
第１０図（Ａ）および（Ｂ）はコヘシンを共有結合させたＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗからのＮ末端あるいはＣ末端ドックリン付加ＧＦＰの精製と、エンテロキナーゼによるタグの切断を示す図面である。
符号の説明
１：ＥＤＴＡで溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画１−１
２：分画１−１をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
３：ＥＤＴＡで溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画１−２
４：分画１−２をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
５：分画１を溶出後の担体
６：ＥＧＴＡで溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画２−１
７：分画２−１をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
８：ＥＧＴＡで溶出したＣ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画２−２
９：分画２−２をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
１０：分画２を溶出後の担体
１１：ＥＤＴＡで溶出したＮ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画３−１
１２：分画３−１をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
１３：ＥＤＴＡで溶出したＮ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画３−２
１４：分画３−２をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
１５：分画３を溶出後の担体
１６：ＥＧＴＡで溶出したＮ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画４−１
１７：分画４−１をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
１８：ＥＧＴＡで溶出したＮ末端ドックリン付加ＧＦＰ分画４−２
１９：分画４−２をエンテロキナーゼで４℃で４８時間切断
２０：分画４を溶出後の担体
←：タグを切断したＧＦＰ
第１１図はビオチニル化をしたコヘシンタンパクによる、ドックリン付加タンパク質の検出を示す図面である。
符号の説明
１：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現した蛹磨砕液
２：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰ精製品
３：Ｎ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現した蛹磨砕液
４：Ｎ末端ドックリン付加ＧＦＰ精製品
５：Ｃ末端ドックリン付加マウスインターフェロンβを発現した蛹磨砕液
６：Ｎ末端ドックリン付加マウスインターフェロンβを発現した蛹磨砕液
７：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現した蛹磨砕液
８：Ｃ末端ドックリン付加ＧＦＰ精製品
９：Ｎ末端ドックリン付加ＧＦＰを発現した蛹磨砕液
１０：Ｎ末端ドックリン付加ＧＦＰ精製品
１１：Ｃ末端ドックリン付加マウスインターフェロンβを発現した蛹磨砕液
１２：Ｎ末端ドックリン付加マウスインターフェロンβを発現した蛹磨砕液
←：ドックリン付加ＧＦＰ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月20日(2003.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質を、カルシウムイオンと共に、コヘシンドメインを固定化した担体に吸着処理し、その後、金属キレーターで処理してカルシウムを除去し、組換え融合タンパク質を溶出することを特徴とする組換え融合タンパク質の精製方法。
【請求項２】
削除
【請求項３】
組換え融合タンパク質が、目的タンパク質とドックリンとの間に、化学的もしくは酵素学的な開裂部位を有するものである請求項第１項記載の精製方法。
【請求項４】
酵素学的な開裂部位が、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）である請求項第３項記載の精製方法。
【請求項５】
固定化方法が、水素結合ないし共有結合を利用する請求項第１項記載の精製方法。
【請求項６】
請求項第１項記載の方法で用いられる組換え融合タンパク質を生産するための、目的タンパク質をコードする遺伝子とドックリン遺伝子とを組み込んだ発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターが、目的タンパク質をコードする遺伝子とドックリン遺伝子との間に、化学的もしくは酵素学的な開裂部位をコードする遺伝子を組み込んだ請求項第６項記載の発現ベクター。
【請求項８】
バキュロウイルス由来である請求項第６項または第７項記載の発現ベクター。
【請求項９】
目的タンパク質およびドックリンをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて目的のタンパク質とドックリンとを結合した組換え融合タンパク質を取得し、次いで、この組換え融合タンパク質をカルシウムイオンと共に、コヘシンドメインを固定化した担体に結合させて精製し、更に組換え融合タンパク質からドックリンを除去することを特徴とする目的タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
目的タンパク質をコードする遺伝子とドックリンをコードする遺伝子との間に、化学的もしくは酵素学的な開裂部位をコードする遣伝子を組み込んだ発現ベクターを用いる請求項第９項記載の目的タンパク質の製造方法。
【国際調査報告】
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