(57)【要約】鼻腔内投与（経鼻投与）に際し、医薬組成物中に含有される有効成分である生理活性ポリペプチドの生体内吸収性に優れた、経鼻吸収用医薬組成物の提供であり、具体的には、等電点が７以下である酸性生理活性ポリペプチドを、それを担体表面に分散、包埋ならしめ得る添加剤を用いて、水に不溶または難溶の担体である多価金属化合物担体、例えばアルミニウム化合物、カルシウム化合物、マグネシウム化合物、ケイ素化合物、鉄化合物、亜鉛化合物の２価以上の金属化合物に、均一に分散、包埋させた経鼻吸収用医薬組成物である。
2003045418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点が７以下である酸性生理活性ポリペプチドと、それを担体表面に分散、包埋ならしめうる添加剤と、水に不溶または難溶の担体とからなる経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項２】
等電点が７以下である酸性生理活性ポリペプチドと、それを担体表面に分散、包埋ならしめうる平均粒子径が１μｍ以上２０μｍ未満である添加剤と、水に不溶または難溶の担体とからなる請求の範囲第１項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項３】
等電点が７以下である酸性生理活性ポリペプチドと、それを担体表面に分散、包埋ならしめうる平均粒子径が１μｍ以上２０μｍ未満であって、水に不溶または難溶の添加剤と、水に不溶または難溶の担体とからなる請求の範囲第１項または第２項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項４】
水に不溶または難溶の担体が多価金属化合物である請求の範囲第１ないし３項のいずれかに記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項５】
多価金属化合物がアルミニウム化合物、カルシウム化合物、マグネシウム化合物、ケイ素化合物、鉄化合物または亜鉛化合物である請求の範囲第４項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項６】
アルミニウム化合物が、乾燥水酸化アルミニウム・ゲル、クロルヒドロキシアルミニウム、合成ケイ酸アルミニウム、軽質酸化アルミニウム、コロイド性含水ケイ酸アルミニウム、水酸化アルミニウムマグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム・ゲル、硫酸アルミニウム、ジヒドロキシアルミニウムアセテート、ステアリン酸アルミニウム、天然ケイ酸アルミニウム、モノステアリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムから選択される一種である請求の範囲第５項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項７】
カルシウム化合物が、アパタイト、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、ステアリン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、パントテン酸カルシウム、オレイン酸カルシウム、パルミチン酸カルシウム、Ｄ−パントテン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、無水リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム、酢酸カルシウム、糖酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸一水素カルシウム、パラアミノサリチル酸カルシウム、生体内石灰化合物から選択される一種である請求の範囲第５項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項８】
マグネシウム化合物が、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム、塩化マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、ケイ酸ナトリウム・マグネシウム、合成ケイ酸ナトリウム・マグネシウムから選択される一種である請求の範囲第５項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項９】
ケイ素化合物が、含水二酸化ケイ素、形質無水ケイ酸、合成ヒドロタルサイト、ケイソウ土、二酸化ケイ素から選択される一種である請求の範囲第５項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１０】
鉄化合物が、硫酸鉄である請求の範囲第５項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１１】
亜鉛化合物が、塩化亜鉛、ステアリン酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸亜鉛から選択される一種である請求の範囲第５項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１２】
多価金属化合物の平均粒子径が１００μｍ以下である請求の範囲第４項ないし第１１項のいずれか１項記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１３】
多価金属化合物の平均粒子径が２０以上６０μｍ以下である請求の範囲第１２項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１４】
酸性生理活性ポリペプチドが、以下のポリペプチドから選択される一種である請求の範囲第１項ないし第１３項に記載の経鼻吸収用医薬組成物：カルシトニン、カタカルシン、コレシストキニン１２、コレシストキニン８、コルチコトロピン−リポトロピン前駆体、コルチコトロピン様中間ペプチド、リポトロピンβ、リポトロピンγ、メラノトロピンβ、コルチコリベリン、エンドセリン−１、エンドセリン−２、エンドセリン−３、ガラニンメッセージペプチド、ガストリン−７１、ガストリン−３４、ガストリン−１７、ガストリックインヒビトリーポリペプチド、グリセンチンリレーティッドポリペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−１アミド、グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、グルカゴン様ペプチド−１（９−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド−１（９−３７）、グルカゴン様ペプチド−２、エクセンジン−３、エクセンジン−４、インスリンβ鎖、インスリンα鎖、インスリン、プロゴナドリベリンＩ、ゴナドリベリンＩＩ、ゴナドリベリン関連ペプチドＩ、ニューロメジンＣ、インスリン様蛋白質（ＩＮＳＬ）Ａ鎖、モチリン関連ペプチドＥ、ロイシン−エンケファリン、メチオニン−エンケファリン、ロイモルフィン、オキシトシン、ニューロフィジン１、ニューロフィジン２、コペプチン、ニューロメジンＢ、ニューロメジンＮ、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＡＦ、ＰＡＣＡＰ−関連ペプチド、パンクレアティックホルモン、パンクレアティックアイコサペプチド、ペプチドＹＹ、チロリベリン、ニューロキニンＡ、ウロコルチン、ウロテンシンＩＩ、インテスティナルペプチド（ＰＨＭ−２７）、インテスティナルペプチド−４２。
【請求項１５】
酸性生理活性ポリペプチドがグルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−１アミド、グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、グルカゴン様ペプチド−１（９−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド−１（９−３７）、グルカゴン様ペプチド−２、エクセンジン−３、エクセンジン−４、グルカゴン、ガストリックインヒビトリーポリペプチド、インスリンおよびこれらの誘導体である請求の範囲第１４項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１６】
ペプチド性インクレチンと、それを担体表面に分散、包埋ならしめうる添加剤と、水に不溶または難溶の担体とからなる請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれか１項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１７】
ペプチド性インクレチンが、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−１アミド、グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、グルカゴン様ペプチド−１（９−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド−１（９−３７）、グルカゴン様ペプチド−２、エクセンジン−３、エクセンジン−４、グルカゴン、ガストリックインヒビトリーポリペプチドおよびこれらの誘導体である請求の範囲第１６項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１８】
添加剤がアミロペクチンとアミロースをそれぞれ単独、あるいは任意の割合で含むデンプンである請求の範囲第１項ないし第１７項のいずれか１項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項１９】
添加剤が米粉、コメデンプン、コメ由来ベータ型デンプン（うるち型）、コメ由来ベータ型デンプン（もち型）、コメ由来アルファー化デンプン（うるち型）、コメ由来アルファー化デンプン（もち型）、トウモロコシデンプン、トウモロコシ由来ベータ型デンプン（うるち型）、トウモロコシ由来ベータ型デンプン（もち型）、トウモロコシ由来アルファー化デンプン（うるち型）、トウモロコシ由来アルファー化デンプン（もち型）、バレイショデンプン、バレイショ由来ベータ型デンプン（うるち型）、バレイショ由来アルファー化デンプン（うるち型）、コムギ由来アルファー化デンプン（うるち型）またはこれらのデンプンを部分的にα化したデンプンである請求の範囲第１項ないし第１８項のいずれか１項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項２０】
添加剤が、オリゴ糖、カルボキシビニルポリマー、ポビドン、ヒドロキシプロピルセルロース、キサンタンガム、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム末、またはゼラチンである請求の範囲第１項ないし第１９項のいずれか１項に記載の経鼻吸収用医薬組成物。
【請求項２１】
請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれか１項に記載の経鼻吸収用医薬組成物とＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を含有する医薬組成物。
【請求項２２】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、ジプロチニンＡ、バシトラシン、またはイソロイシンチアジリジドである請求の範囲第２２項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は経鼻吸収用医薬組成物に係り、詳細には、鼻腔内投与（経鼻投与）に際して、当該組成物中に含有される有効成分である等電点が７以下である酸性生理活性ポリペプチドの生体内吸収性に優れた、経鼻吸収用医薬組成物に関する。
背景技術
生理活性ポリペプチドは、様々な特異的薬理活性を示す高分子化合物であり、これまでに医療の現場で、種々の目的に応じ利用されてきた極めて有用な化合物である。例えば、グルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉ；以下、ＧＬＰ−１）は、グルカゴン前駆体（プログルカゴン）に含まれるペプチドホルモンである（Ｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３０４，３６８，１９８３）。哺乳類においてこれまでに知られているプログルカゴンは、アミノ酸１６０残基からなる前駆体蛋白質で、プログルカゴンは膵島（ランゲルハンス島）Ａ細胞と腸管Ｌ細胞で形成され、膵臓ではプロセッシング酵素によりグルカゴンと、ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔを生成する。一方、腸ではプロセッシングの違いにより、グリセンチン、ＧＬＰ−１、およびグルカゴン様ペプチド−２（以下、ＧＬＰ−２）が生成されることが分かっている（Ｍｏｊｓｏｖｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２６１，１１８８０，１９８６）。
プログルカゴンのアミノ酸番号７２−１０８からなるペプチド（ＧＬＰ−１に相当）は、インスリン分泌促進作用を有しており、ＧＬＰ−１のＮ末部の１−６位を欠如したＧＬＰ−１（７−３７）と、更に３６位がアミド化されたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、今まで知られていたインスリン分泌増強物質のなかで、最も強力なインスリン分泌促進作用（Ｍｏｊｓｏｖら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７９，６１６，１９８７）と、グルカゴン分泌抑制作用を有する。また、腸管Ｌ細胞から分泌され、血流中を循環している分子形はＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２であることが分かっている（Ｇｕｔｎｉａｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２６，１３１６，１９９３）。
ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、摂餌刺激により迅速に腸管Ｌ細胞から分泌され、膵臓に作用してインスリンの分泌を促進し、同時にグルカゴン分泌抑制、インスリン分泌細胞のｍＲＮＡ増加作用、肝臓における糖新生の抑制作用、更には消化管運動の抑制作用を示す。このことから、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２などのＧＬＰ−１はエネルギー代謝に関して合目的なインクレチン（インスリン分泌刺激物質）として生体内で重要な役割を果たしていると考えられている。
以上の生理的作用を基にして、本ペプチドを糖尿病治療薬として適用する場合には、例えば、食前にＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を投与することにより、２型糖尿病患者の治療に有効な食後高血糖を抑えることが可能である。同様のインスリン分泌促進作用を有するスルフォニル尿素薬が、血糖値に関係なく薬効を発現するために、過血糖低下を引き起こす懸念があること、また長期投与によってインスリン産生細胞を疲弊させるのに対して、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２のインスリン分泌促進作用は血中グルコース濃度によってフィードバックがかかるため、過血糖低下を引き起こす懸念が少なく、またインスリン産生細胞に対してむしろ賦活的に作用する。このことは糖尿病治療薬として現在臨床的に使用されているスルフォニル尿素薬と比べ、著しい対比を成すものである。
またＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が示す肝臓における糖新生の抑制作用、インスリン産生細胞に対する賦活的な作用、筋肉における糖取り込みの促進作用、消化管運動抑制作用、ならびに中枢性の食欲抑制作用等は、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が食後高血糖是正のみならず、本ペプチドを長期投与することによって、全身の糖代謝系を健全・賦活化、また糖尿病の原因の一つとなる肥満に対しても抑制的に作用することを充分に期待させるものである。
上記したＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２と同様のインクレチン作用（インスリン分泌刺激作用）を有するペプチドには、他にもＧｉｌａ  ｍｏｎｓｔｅｒ（爬虫類）から単離・構造決定されたエクセンジン−４がある。本ペプチドはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２よりも血漿中での分解を受け難く、その結果インスリン分泌促進作用が持続する。またＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２と同様にβ細胞の分化・新生を誘導することも知られている。
ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２等の８位は生体内に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）により切断を受けるため、８位Ａｌａを切断され難いＶａｌ等のアミノ酸に置換した誘導体、［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）や、溶解律速により見かけの血漿中半減期を延長させる目的で、脂肪酸をＧＬＰ−１に導入した誘導体、例えば、［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）なども同様の作用を有することが期待されている。
また、最近になって８位で切断を受けたＧＬＰ−１（９−３７）も血糖低下作用を有することが報告されているが（Ｄｅａｃｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍａｔｂ，２８２，８７３−８７９，２００２）、８位アミノ酸変換によるＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２からＧＬＰ−１（９−３６）ＮＨ２への分解抑制や、脂肪酸修飾による見かけの血漿中半減期の延長については、さらに検討が必要である。
また、グルコース依存性インシュリン分泌刺激ペプチドであるガストリックインヒビトリーポリペプチド（以下、ＧＩＰ）は、インスリン分泌促進作用を有するが、同時にグルカゴン分泌も促進する点においてＧＬＰ−１、エクセンジン−４と異なっている。
これらのペプチド性インクレチンのなかでも、特に哺乳類間でこれまでに知られているなかで共通のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、糖尿病治療薬として理想的な側面をもつ。しかしながらペプチドであるがために、消化管からの吸収を期待することはできず、本ペプチドを糖尿病治療薬として開発する際の大きな障害となっている。
もちろんペプチドの投与経路としては、経口投与以外の方法として、皮下注射による投与の可能性がある。しかしながら皮下投与は、長期にわたり医師の管理下において投与されることが必要であり、通院の負担、注射による投与部位での疼痛などを考慮すると、注射薬は長期にわたる投与が必要な糖尿病治療薬として好ましいものではない。特に、本ペプチドの特長を生かせる食後高血糖是正において、１日３回毎の食後における皮下投与は現実性を欠くことは明らかである。また、１型以外に、２型糖尿病治療薬患者にも使用されるインスリンの自己注射剤と、ＧＬＰ−１自己注射剤を併用することは現実性を欠く。
このような点を改善するものとして、口腔内粘膜貼付製剤の形態により、口腔内粘膜からＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を吸収させる試みが報告されている（Ｇｕｔｎｉａｋら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｃａｒｅ，２０，１８７４，１９９７）。しかしながら、この投与形態にあっては、吸収促進剤を使用する必要があり、本例においては胆汁酸のひとつである刺激性の強いタウロコール酸ナトリウムを使用しており、粘膜剥離等の刺激性は避けられず、長期投与には不適当である。
したがって現在、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２に代表されるペプチド性インクレチンについて、安全であり、かつ高い生体内吸収率を示し、頻回にわたる投与に耐えることができる簡便な手段としての非注射的投与方法は皆無であり、その開発が切に望まれているのが現状である。
一般に、生理活性ポリペプチドは、低分子化合物と異なり注射剤以外の投与法が困難である。これは生理活性ポリペプチドが胃内、小腸内、大腸内あるいはこれらの臓器や、鼻腔、肺の吸収上皮粘膜に存在する消化酵素によって分解を受けること、分子量的に一般的な輸送経路で運ばれないことが大きな理由である。そこで最近、ペプチドの非注射的投与方法として、経鼻吸収による投与方法である経鼻ペプチド製剤が提案されてきている。一般に、この経鼻ペプチド製剤は、吸収促進剤の存在下、ペプチド含有溶液を、噴霧器を用いて鼻腔内に噴霧する形態が通常であるが、多数見出されているいわゆる生理活性ポリペプチドのなかでも、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２のように、その等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ；以下、ｐＩ）が酸性から中性を示すペプチドは、酸性ないし中性領域での溶液中では、その安定性が悪いものである。
例えば、本発明者らの検討によれば、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２含有溶液をラットなどの動物に経鼻投与すると、一定の経鼻吸収が認められるものの、数十時間の保存によってペプチドが不溶化することが判明した（後記する参考例を参照）。したがって、溶液製剤は用時溶解型であっても、医薬用組成物として好ましくないものである。
同様にグルカゴンやインスリンも、その等電点は酸性から中性を示すものであり、酸性ないし中性溶液中で不溶化あるいは結晶化することが知られている。このような等電点が酸性から中性を示し、酸性ないし中性溶液中で不溶化あるいは結晶化する恐れのあるペプチドは数多く知られており、これらペプチドについては、酸性ないし中性溶液製剤として経鼻投与することは、ほとんど不可能といえる。
一方、酸性生理活性ポリペプチドは、アルカリ性（塩基性）溶媒に対しては溶解性の向上を期待できる。しかしながら、酸性生理活性ポリペプチドを塩基性に晒すことで、酸性条件下でもみられる加水分解等の分解に加え、ラセミ化が起こりやすく、化学的安定性が悪くなる。この副反応は酸性生理活性ポリペプチド、塩基性生理活性ポリペプチドのいずれであっても起こり得るが、例えば、酸性生理活性ポリペプチドであるカゼイン（ｐＩ＝約４．６付近）は、塩基性水溶液中でアスパラギン酸、フェニルアラニン、グルタミン酸、アラニン残基がラセミ化し、安定性が悪くなることが知られている（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，４７，７６０−７６４，１９８２）。また、有機酸は生体内成分である酢酸や酪酸、栄養成分となるオクタン酸、デカン酸のような長鎖カルボン酸など種類が豊富であるため、医薬用組成物の添加成分として使用できるものが多いが、有機塩基は一般にセロトニン、ドパミンのように薬理活性を有するものが多く、またナトリウムなどの金属アルカリは、ｐＨ調整が難しく、酸性ペプチド類と塩を形成しペプチドの性質が変化する可能性があるため、医薬用組成物の添加成分としては適さない場合が多い。したがって、酸性生理活性ポリペプチドをアルカリ性の溶液として供することは、化学的安定性および添加剤成分の選択等の観点から適さず、酸性生理活性ポリペプチドをアルカリ性の溶液製剤とすることは好ましくない。
このように、酸性生理活性ポリペプチドは、酸性ないし中性溶液製剤とすることも、アルカリ性溶液製剤とすることも好ましくなく、酸性生理活性ポリペプチドは経鼻投与用溶液製剤には適していない。
また、インスリン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、視床下部ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）等の生理活性ポリペプチドについて、溶液型経鼻投与製剤に代わる微粉末経鼻吸収製剤が提案され、かかる微粉末経鼻投与用製剤の担体（キャリヤ）について種々の検討により、これまでいくつかのキャリヤに担持させた、生理活性ポリペプチドの経鼻投与用微粉末組成物が提案されている。
その検討の中で、水に不溶性または難溶性の物質であり、また、酸性条件下で溶解する物質が、生理活性ポリペプチドの微粉末経鼻吸収用製剤の担体として、極めて良好なものであることが見出され、例えば、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウムのような多価金属化合物（特開平８−２７０３１）、粘膜組織修復・保護作用物質、特に胃粘膜組織修復・保護作用物質（特開平９−２５５５８６）あるいは穀物の微細粉体物（特開２０００−２３９１８７）を経鼻吸収用医薬組成物の担体とする組成物が提案されている。
しかしながら、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を、このような多価金属化合物の担体に分散、付着させて微粉末製剤として経鼻投与したとしても、イヌにおいて生物学的利用率は約４％、サルにおいても１％以下と、満足できる経鼻吸収率は得られなかった。
すなわち、等電点が中性ないし酸性領域にあるペプチドであって、酸性ないし中性領域での溶解度が低く、一旦溶解しても、凝集しやすいＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２のような生理活性ポリペプチドは、溶液型経鼻投与製剤はもとより、微粉末製剤として経鼻投与しても、生体内吸収性は不充分なものであり、このようなペプチドについて、経口投与に代わる良好な非注射投与経路は、今まだ確立されていないのが現状である。
また、環状ペプチドと多価金属化合物担体とからなる経鼻投与用組成物が開示されており（ＷＯ  ０１／５２８９４  Ａ２）、さらに、吸収促進剤として、米粉、スターチ等を添加することができ、吸収促進剤の好ましい平均粒子径は、好ましくは２５０μｍ以下、より好ましくは２０μｍから１８０μｍまでと記載されている。
しかしながら、本発明の経鼻吸収用医薬組成物の有効成分である等電点が７以下である酸性生理活性ポリペプチドについて吸収性を改善する手段、すなわち、本有効成分を添加剤を用いて担体に分散、包埋ならしめて本有効成分の吸収性を改善させること、およびこれらの成分の具体的物性については、全く開示されていない。
したがって、本発明はこれまで経口投与のみならず、他の非注射投与経路による生体吸収性が困難であった等電点が中性ないし酸性領域にあり、酸性ないし中性領域での溶解度が低く、一旦溶解しても、凝集しやすい生理活性ポリペプチドについて、生体内吸収性が良く、また刺激性が無く、安全である経鼻吸収用医薬組成物を提供することを課題とする。
かかる課題を解決するために本発明者らは、これらペプチドの経鼻投与組成物を構成する成分としての添加物について検討を加えた。そして第一に、ペプチドの安定化に寄与し得る添加物として、デンプンの効果について検討を加えた。
デンプンは穀物に多く含まれる栄養素であり、経鼻吸収用組成物の添加物として安全性の点では問題のない素材であり、グルコースがα−１，４結合した直鎖状に結合しているアミロースと、α−１，６結合の枝分かれ部分を含み樹枝状をなすアミロペクチンで構成されるものである。
そこで担体としての多価金属化合物と、添加剤としてのアミロースとアミロペクチンを種々の割合で含む数種類のデンプンを組み合わせて経鼻吸収用医薬組成物を得、その経鼻吸収性を検討した。また、平均粒子径の異なるデンプン粒子の吸収促進効果に関しても検討した。
その結果、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２等の酸性生理活性ポリペプチドを、米粉（道明寺粉）、アミロペクチンとアミロースを任意の割合で含むトウモロコシデンプン、バレイショデンプンおよびこれらのα化デンプンまたは部分的にα化したデンプン等を添加剤として、平均粒子径１００μｍ以下である粉末ないし結晶状の水に不溶または難溶の担体である多価金属化合物、例えばカルシウム化合物等の２価以上の金属化合物に、均一に分散、包埋し経鼻吸収用の微粉末として鼻腔内に投与すれば、良好な経鼻吸収性が得られ、有効な臨床的治療が可能であることを見いだした。
また、水に不溶または難溶性のデンプン等を添加剤として使用するとき、担体として用いる多価金属化合物、例えば平均粒子径１００μｍ以下の炭酸カルシウムなどを用いる場合、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２のような酸性ペプチドに関しては、水に不溶または難溶性のデンプン等の添加剤は、担体の平均粒子径より小さいものが、特に優れた吸収促進効果がみられることを見出した。本発明はかかる新たな知見に基づき完成されたものである。
発明の開示
しかして本発明は、等電点が７以下である酸性生理活性ポリペプチドと、それを担体表面に分散、包埋ならしめうる添加剤と、水に不溶または難溶の担体とからなる経鼻吸収用医薬組成物を提供するものである。
すなわち本発明は、等電点が７以下、すなわち中性ないし酸性領域にある生理活性ポリペプチドと、それを担体表面に分散、包埋ならしめうる添加剤と、多価金属化合物担体からなる経鼻吸収用医薬組成物である。
より具体的な本発明は、等電点が中性ないし酸性領域にある生理活性ポリペプチドの有効投与量を、その不溶性成分の平均粒子径が１μｍ以上２０μｍ未満である添加剤とともに平均粒子径１００μｍ以下を有する粉末状ないし結晶状の多価金属化合物担体に均一に分散、包埋した経鼻吸収用医薬組成物である。
また、さらに具体的な本発明は、ペプチド性インクレチンと、それを担体表面に分散、包埋ならしめうる添加剤と、水に不溶または難溶の担体とからなる経鼻吸収用医薬組成物であり、より具体的な本発明は、ペプチド性インクレチンの有効投与量を、不溶性成分の平均粒子径が１μｍ以上２０μｍ未満であって、水に不溶または難溶の添加剤とともに、平均粒子径１００μｍ以下を有する粉末状ないし結晶状の多価金属化合物担体に均一に分散、包埋した経鼻吸収用医薬組成物である。
添加剤の平均粒子径は、添加剤がα化デンプンで構成されるデンプンまたはα化デンプン成分を含むものであるときは、本出願に示す製造方法にて製剤を作成するときに、担体表面に付着する水に不溶または難溶であるデンプンで構成されるデンプン成分の平均粒子径を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明は上記したように、これまで経口投与のみならず、他の非注射投与経路による生体吸収性が困難であった等電点が７以下であり、酸性ないし中性領域での溶解度が低く、一旦溶解しても、凝集しやすい生理活性ポリベプチドについて、生体内吸収性が良く生物学的利用率に優れた経鼻吸収用医薬組成物を提供するものであり、より具体的な好ましい態様の一つとして、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ＮＨ２、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（９−３６）ＮＨ２、ＧＬＰ−１（９−３７）、のようなＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−２、エクセンジン−３、エクセンジン−４、グルカゴン、ガストリックインヒビトリーペプチド（ＧＩＰ）、インスリンについての経鼻吸収用医薬組成物を提供するものでもある。
本発明の経鼻吸収用医薬組成物が高い生体内吸収性を有しているのは、生理活性ポリペプチドが、添加剤により担体表面に安定かつ均一に分散、包埋されていることによる。
また、β型あるいは部分α型の不溶または難溶性のデンプン等の添加剤を用いる場合、平均粒子径が小さいコメデンプンやトウモロコシデンプン等を用いることにより、表面積を拡大し、溶出性を向上させ、吸収性を改善することができる。従って、本発明においては、吸収性を改善するために、平均粒子径１μｍ以上２０μｍ未満の添加剤を用いることが好ましい。
したがって、本発明において使用される添加剤は、生理活性ポリペプチドを担体表面に安定かつ均一に分散、包埋ならしめ得るものであればいずれであっても良い。例えば、アミロペクチンとアミロースをそれぞれ単独、あるいは任意の割合で含むデンプンを添加剤として使用することができる。米、トウモロコシなどから得られるデンプンには、アミロペクチンとアミロースの比が約７：３〜約８：２の比率であるうるち型デンプンと、ほとんどアミロペクチンのみで構成されるもち型デンプンがあり、本発明において使用できる添加剤としては、具体的には、米粉、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コメ由来ベータ型デンプン（うるち型）、コメ由来ベータ型デンプン（もち型）、トウモロコシ由来ベータ型デンプン（うるち型）、トウモロコシ由来ベータ型デンプン（もち型）、バレイショ由来ベータ型デンプン（うるち型）等のベーター型デンプン、コメ由来アルファー化デンプン（うるち型）、コメ由来アルファー化デンプン（もち型）、トウモロコシ由来アルファー化デンプン（うるち型）、トウモロコシ由来アルファー化デンプン（もち型）、バレイショ由来アルファー化デンプン（うるち型）、コムギ由来アルファー化デンプン（うるち型）、またはこれらのデンプンを部分的にα化したデンプン等が挙げられる。
また、デンプンは水に難溶であるが、水と加熱することにより、結晶構造がほぐれてα化される。デンプンが完全にα化されたデンプン（α化デンプン）や、完全にα化されず部分的にα化されたデンプン（部分α化デンプン）も、本発明の添加剤として使用できる。
米粉は、イネの種子の種皮および胚を除いた胚乳部分を粉末としたものであり、デンプンを大量に含み、食品、医薬品添加物として使用されているが、本発明においては、熱処理をせず、β型のデンプンで構成される米粉が好ましいが、熱処理によりα化したデンプンあるいは部分α化デンプンを含む米粉を使用することも可能である。例えば、コメ由来アルファー化デンプンを含む道明寺粉等を挙げることができる。同様に、トウモロコシデンプンもβ型のみならず、部分α化、あるいはα化したデンプンも使用することができる。
さらに、これらのデンプンを適宜組合せて、本発明の経鼻吸収用医薬組成物の添加剤として使用することもできる。
また、本発明においては、オリゴ糖、カルボキシビニルポリマー、ポビドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、キサンタンガム、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム末、ゼラチン等も添加剤として使用することができる。
本発明の組成物とすることにより経鼻吸収される生理活性ポリペプチドは、等電点（ｐＩ）が７以下であり、酸性ないし中性領域での溶解度が低く、一旦溶解しても、凝集しやすい生理活性ポリベプチドである。
そのような生理活性ポリペプチドとしては、例えばその等電点と共に列記すれば、好ましくは、以下のものを挙げることができる。
ＧＬＰ−１；ｐＩ＝５．０５、ＧＬＰ−１ＮＨ２；ｐＩ＝５．４７、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２；ｐＩ＝６．７６、ＧＬＰ−１（７−３７）；ｐＩ＝５．５３、［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２；ｐＩ＝６．７６、［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）；ｐＩ＝５．５３、［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）；ｐＩ＝４．５７、ＧＬＰ−１（９−３６）ＮＨ２；ｐＩ＝４．６８、ＧＬＰ−１（９−３７）；ｐＩ＝４．８７、ＧＬＰ−２；ｐＩ＝４．４５、エクセンジン−３；ｐＩ＝４．９６、エクセンジン−４；ｐＩ＝４．９６、グルカゴン；ｐＩ＝６．７５、ガストリックインヒビトリーペプチド（ＧＩＰ）；ｐＩ＝６．９２、インスリン；ｐＩ＝５．３９。
またこのような生理活性ポリペプチドとしては、例えば、以下のような、経鼻投与可能な生理活性ペプチドを例示することもできる（なお、カッコ内の数字は、ｐＩは等電点を、ＭＷは分子量を示し、エクセンジン−３、エクセンジン−４以外はヒト由来のものである）。
カルシトニン（ｐＩ：６．７２，ＭＷ：３４２０．８８）、カタカルシン（ｐＩ：５．２６，ＭＷ：２４３６．６２）、コレシストキニン１２（ｐＩ：３．９３，ＭＷ：１５３５．７１）、コレシストキニン８（ｐＩ：３．５６，ＭＷ：１０６４．２０）、コルチコトロピン−リポトロピン前駆体（ｐＩ：５．２２，ＭＷ：８４６９．３２）、コルチコトロピン様中間ペプチド（ｐＩ：３．９１，ＭＷ：２３０９．５１）、リポトロピンβ（ｐＩ：６．１７，ＭＷ：９８０５．９４）、リポトロピンγ（ｐＩ：４．６６，ＭＷ：６０７４．５７）、メラノトロピンβ（ｐＩ：５．５７，ＭＷ：２２０４．４０）、コルチコリベリン（ｐＩ：５．０９，ＭＷ：４７５８．４９）、エンドセリン−１（ｐＩ：４．５４，ＭＷ：２４９５．９４）、エンドセリン−２（ｐＩ：４．５４，ＭＷ：２５５０．９）、エンドセリン−３（ｐＩ：５．３８，ＭＷ：２６４７．０９）、ガラニンメッセージアソシエーティッドペプチド（ｐＩ：４．４９，ＭＷ：６６７１．５２）、ガストリン−７１（ｐＩ：５．１７，ＭＷ：８０６６．８８）、ガストリン−３４（ｐＩ：４．２５，ＭＷ：３８６７．２６）、ガストリン−１７（ｐＩ：３．４０，ＭＷ：２１１６．２４）、ガストリックインヒビトリーポリペプチド（ｐＩ：６．９２，ＭＷ：４９８３．５９）、グリセンチンリレーティッドポリペプチド（ｐＩ：４．１３，ＭＷ：３３８４．５０）、グルカゴン（ｐＩ：６．７５，ＭＷ：３４８２．７９）、グルカゴン様ペプチド−１（ｐＩ：５．０５，ＭＷ：４１６７．０２）、グルカゴン様ペプチド−１アミド（ｐＩ：５．４７，ＭＷ：４１１１．５０）、グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド（ｐＩ：６．７６，ＭＷ：３２９７．６８）、グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ｐＩ：５．５３，ＭＷ：３３５５．７１）、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド（ｐＩ：６．７６，ＭＷ：３３２６．７４）、［Ｖａｌ８］−グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ｐＩ＝５．５３，ＭＷ：３３８３．８７）、［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）（ｐＩ：４．５７，ＭＷ：３７５１．２）、ＧＬＰ−１（９−３６）ＮＨ２（ｐＩ＝４．６８，ＭＷ：２９３３．２）、ＧＬＰ−１（９−３７）（ｐＩ：４．８７，ＭＷ：３０９０．４）、グルカゴン様ペプチド−２（ｐＩ：４．２１，ＭＷ：３９２２．３５）、エクセンジン−３（ｐＩ：４．９６，ＭＷ：４２０２．６３）、エクセンジン−４（ｐＩ：４．９６，ＭＷ：４１８６．６０）、インスリンβ鎖（ｐＩ：６．９０，ＭＷ：３４２９．９６）、インスリンα鎖（ｐＩ：３．７９，ＭＷ：２３８３）、インスリン（ｐＩ：５．３９，ＭＷ：５８０７．６）、プロゴナドリベリンＩ（ｐＩ：５．６３，ＭＷ：７８９３．８３）、ゴナドリベリンＩＩ（ｐＩ：６．９２，ＭＷ：１２５４．３３）、ゴナドリベリン関連ペプチドＩ（ｐＩ：４．６７，ＭＷ：６３７０．１１）、ニューロメジンＣ（ｐＩ：６．９２，ＭＷ：１１２１．２８）、インスリン様蛋白質（ＩＮＳＬ）Ａ鎖（ｐＩ：６．３６，ＭＷ：３５４２．１６）、モチリン関連ペプチドＥ（ｐＩ：４．７２，ＭＷ：７４３３．４７）、ロ��シン−エンケファリン（ｐＩ：５．５２，ＭＷ：５５５．６３）、メチオニン−エンケファリン（ｐＩ：５．５２，ＭＷ：５７３．６６）、ロイモルフィン（ｐＩ：６．２１，ＭＷ：３３５１．６８）、オキシトシン（ｐＩ：５．５１，ＭＷ：１０１０．１９）、ニューロフィジン１（ｐＩ：４．９４，ＭＷ：９６００．８８）、ニューロフィジン２（ｐＩ：５．０５，ＭＷ：９７８７．０７）、コペプチン（ｐＩ：４．１１，ＭＷ：４０２１．４６）、ニューロメジンＢ（ｐＩ：６．７４，ＭＷ：１１３３．２９）、ニューロメジンＮ（ｐＩ：５．５２，ＭＷ：６１７．７９）、ニューロペプチドＹ（ｐＩ：６．７６，ＭＷ：４２７２．７２）、ニューロペプチドＡＦ（ｐＩ：６．０５，ＭＷ：１９７９．１８）、ＰＡＣＡＰ−関連ペプチド（ｐＩ：５．３８，ＭＷ：４８００．３２）、パンクレアティックホルモン（ｐＩ：６．２６，ＭＷ：４１８２．７４）、パンクレアティックアイコサペプチド（ｐＩ：６．０１，ＭＷ：２２３５．４４）、ペプチドＹＹ（ｐＩ：６．７７，ＭＷ：４３１０．８０）、チロリベリン（ｐＩ：６．７４，ＭＷ：３８０．４０）、ニューロキニンＡ（ｐＩ：６．７４，ＭＷ：１１３４．３２）、ウロコルチン（ｐＩ：５．５８，ＭＷ：４６９７．２９）、ウロテンシンＩＩ（ｐＩ：４．３７，ＭＷ：１３９０．５９）、インテスティナルペプチド（ＰＨＭ−２７）（ｐＩ：６．７５，ＭＷ：２９８６．４３）、インテスティナルペプチド−４２（ｐＩ：６．７６，ＭＷ：４５５２．１８）。
これらの生理活性ペプチドは、上記のものに限定されず、経鼻投与可能なものであれば、本発明の組成物とすることができる。
一方、本発明において添加剤と共に生理活性ポリペプチドを担持する担体（キャリヤ）としては、水に不溶または難溶の担体、例えばアルミニウム化合物、カルシウム化合物、マグネシウム化合物、ケイ素化合物、鉄化合物または亜鉛化合物から選択される２価以上の多価金属化合物を挙げることができる。
より具体的なこれらの多価金属化合物としては、例えば、以下の多価金属化合物を例示することができる。アルミニウム化合物としては、乾燥水酸化アルミニウム・ゲル、クロルヒドロキシアルミニウム、合成ケイ酸アルミニウム、軽質酸化アルミニウム、コロイド性含水ケイ酸アルミニウム、水酸化アルミニウムマグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム・ゲル、硫酸アルミニウム、ジヒドロキシアルミニウムアセテート、ステアリン酸アルミニウム、天然ケイ酸アルミニウム、モノステアリン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウムカリウム等を挙げることができる。
カルシウム化合物としては、アパタイト、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、ステアリン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、パントテン酸カルシウム、オレイン酸カルシウム、パルミチン酸カルシウム、Ｄ−パントテン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、無水リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム、酢酸カルシウム、糖酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸一水素カルシウム、パラアミノサリチル酸カルシウムおよび生体内石灰化合物等を挙げることができる。
マグネシウム化合物としては、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム、塩化マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、ケイ酸ナトリウム・マグネシウムおよび合成ケイ酸ナトリウム・マグネシウム等を挙げることができる。
ケイ素化合物としては、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ヒドロタルサイト、ケイソウ土および二酸化ケイ素等を、また鉄化合物としては硫酸鉄を、さらに亜鉛化合物としては塩化亜鉛、ステアリン酸亜鉛、酸化亜鉛および硫酸亜鉛等を挙げることができる。
これらの多価金属化合物は、単独でもまた複数混合して用いてもよく、そのなかでも、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウムまたは乳酸カルシウムであるカルシウム化合物が好結果を与えた。
また、これらの多価金属化合物は、その平均粒子径が大きいと、噴霧特性が悪くなりすぐに沈降する。また平均粒子径が小さいと、粒子が鼻腔に留まらず気管、肺に及ぶ。鼻腔内に効率よく滞在させるためには、これらの多価金属化合物は、その平均粒子径が１００μｍ以下、１０μｍ以上が好ましく、２０μｍから６０μｍが特に好ましい。
一方、本発明の組成物に含有される生理活性ポリペプチドの有効投与量としての使用量は、選択すべき個々の活性物質、処置すべき対象疾患、所望の投与回数、患者の年齢、体重、症状の程度、投与経路、必要とする個々の治療効果等によって異なるが、本発明の組成物を鼻腔内投与により使用する場合には、例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２では、１回あたりＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２として５０〜５，０００μｇの範囲で投与することが好ましい。
具体的には、生理活性ポリペプチドの有効投与量を、平均粒子径２５０μｍ以下、好ましくは１００μｍ以下、さらに好ましくは２０〜６０μｍである粉末ないし結晶状の水に不溶または難溶の担体（例えばカルシウム化合物、アルミニウム化合物、マグネシウム化合物、ケイ素化合物、鉄化合物、亜鉛化合物等の多価金属化合物）と添加剤とともに、乾式混合、水あるいはエタノール等の有機溶媒により湿式混合・乾燥して、担体表面に生理活性ポリペプチドを均一に分散、包埋して本発明の経鼻吸収用医薬組成物を作製することができる。
本発明の経鼻吸収用医薬組成物は、製剤化に際し通常用いられる担体、例えば滑沢剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、賦形剤、増粘剤、保剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、界面活性剤、無痛化剤等の種々の機能性成分を適宜配合することができる。
滑沢剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸、タルク等が挙げられる。
安定化剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第四級アンモニウム塩や、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ソルビタンモノオレート（Ｓｐａｎ８０）等のソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
ＧＬＰ−１のような、ジペプチジルペプターゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）により分解を受ける酸性生理活性ポリペプチドの場合は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を配合することが好ましい。
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤としては、ジプロチニンＡ、バシトラシン、イソロイシンチアジリジド等が挙げられる。その添加量は阻害活性によって異なるが、有効成分である生理活性ポリペプチドの含有重量の１〜１０，０００倍程度添加することができる。
本発明の組成物を製造する場合において、生理活性ポリペプチドの含有量は、たとえば製剤重量１００％あたり０．００５〜５０％、好ましくは０．０１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０．０％配合するのが良い。また、本発明の組成物を構成する担体の配合量は、これら物質の臨床的に使用されている量の範囲内で、たとえば製剤重量１００％あたり７０〜９９．９９５％、好ましくは８０〜９９．９９％、より好ましくは９０〜９９．９％配合することにより、良好な経鼻吸収が得られる。また本発明の組成物を構成する添加剤の含有量は、たとえば製剤重量１００％あたり０．００５〜５０％、好ましくは０．０１〜２０％、より好ましくは０．０５％〜１０．０％配合するのが良い。
本発明の経鼻吸収用医薬組成物は、水に不溶または難溶の担体である多価金属化合物担体と、生理活性ポリペプチドおよび添加剤とを混合することにより得ることができる。例えば製造の一例として、ペプチド成分としてＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末と、トウモロコシデンプンとをよく混合した後、容器に入れ、少量の精製水を加えながら、徐々に炭酸カルシウムを添加しスラリーとする。このものをデシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を篩過後、要すれば適量のステアリン酸カルシウム等の滑沢剤を加えて混合して得られる。
あるいは、他の例として、トウモロコシデンプンと炭酸カルシウムを少量の水でスラリーとし、これを一旦乾燥させた後、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２粉末を加え塩化ベンザルコニウム等の安定化剤を含む水で練合、乾燥させ、得られた乾燥品を篩過後、要すれば適量のステアリン酸カルシウム等の滑沢剤を加えて混合して得られる。
かくして得られた経鼻吸収用医薬組成物は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、スターチあるいはゼラチンのカプセルに、適量を充填した後、適当な包装、好ましくは密閉包装とする。かかる密閉包装としては、ブリスター包装−アルミニウム包装を組み合わせるのが良い。必要であれば、アルミニウム袋のなかに乾燥剤をいれることが可能である。この場合の全行程の湿度は、６０％以下が望ましい。
実施例
本発明を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本実施例において用いた試験法と機器は、特に記載しない限り以下に記載のものを使用した。
また以下の例において使用した略号は、それぞれ以下の意味を有する。
主な略号
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキキシカルボニル（ｔｅｒｔ．−Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）
Ｔｒｔ：トリチル（ｔｒｙｔｙｌ）
Ｐｍｃ：ペンタメチルクロマンスルフォニル（ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ）
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄ）
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）
ＴＦＥ：トリフルオロエタノール（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｏｌ）
使用機器等
１．ペプチドのＨＰＬＣによる分析
製剤中のペプチド含量と、安定性試験でのペプチド分析を以下の機器と条件で逆相ＨＰＬＣを行なった。
機器：島津ＬＣ−９Ａシステム
カラム：ＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル濃度を１０分間で直線
的に変化させた。
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ（２１４ｎｍ）
注入量：５０μＬ
２．質量分析
ペプチドの質量を下記の機器および条件で求めた。
機器：フィニガンＭＡＴ  ＴＳＱＭＳ
イオン源：ＥＳＩ
検出イオンモード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
スプレー電圧：４．５ｋＶ
キャピラリー温度：２５０℃
移動相：０．２％酢酸／メタノール混液（１：１）
流速：０．２ｍＬ／分
スキャン範囲：ｍ／ｚ  ５５０〜８５０
３．アミノ酸配列分析
ペプチドのアミノ酸配列分析に下記の機器を用いた。
機器：パーキンエルマー社  ４７７Ａ型シークエンサー
４．アミノ酸組成分析
ペプチドのアミノ酸組成分析に下記の機器を用いた。
機器：日立製作所製  Ｌ−８５００型アミノ酸分析機計
５．試料の保存（安定性試験）
以下の保存庫に各温度条件で保存した。
機器：ナガノ科学  ＬＨ−３０−１４
設定温度：４０±２℃、２５±１℃
６．凍結乾燥
機器：ＬＡＢＣＯＮＣＯ  Ｃｏｒｐ．製  ＦＺ−６を使用した。
７．血漿中濃度測定
投与後の血漿中ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２濃度をラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）あるいはエンザイムイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）で測定した。
７−１．ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）：
ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２とウシサイログロブリンとの複合体アジュバンドをウサギに感作させて、抗血清（ＩｇＧ画分）を作成した。試験管に血漿および抗血清から得られた抗ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２ウサギ抗体を添加し、４℃で一晩静置した。本試料に１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を加え、４℃で一晩静置した。次に、抗ウサギＩｇＧヤギ血清を加え、４℃で１時間静置した。本試料を遠心分離し、沈殿物中の放射線量（γ線）をγ−カウンターで測定した。
７−２．エンザイムイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）：
抗ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２抗体（ウサギポリクローナル抗体）を固相化した９６穴プレートに血漿を添加し、室温で２時間反応した。プレートを洗浄した後、西洋わさび由来のペルオキシダーゼで標識した抗ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２抗体（マウスポリクローナル抗体）を加え、室温で１時間反応した。プレートを洗浄した後、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを加えて反応し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
８．生理活性ポリペプチドの等電点（ｐＩ）の計算：
ＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｒｅｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）Ｍｏｌｅｃｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｅｒ，Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを使用した。Ｃ末アミド体の計算は、シークエンス中のＡｓｐあるいはＧｌｕを１残基だけＡｓｎあるいはＧｌｎに変換して算出した。
９．ペプチド化学合成（インクレチンペプチドの合成）：
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製：４３３Ａ合成機を用い、ＡＢＩ社標準のＦａｓｔＦｍｏｃ（０．２５ｍｍｏｌ）プロトコルに従い、保護ペプチド樹脂を構築した。
１０．粒度分布（炭酸カルシウムとデンプン粒子の粒度測定）：
機器：ＳＹＭＰＡＴＥＣ  ＨＥＬＯＳ  ＆  ＲＯＤＯＳ社製、Ｌａｓｅｒ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＯＤＯＳ  ＳＲ）を使用した。
参考例１：ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の調製
大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼの誘導体（β−ｇａｌ９７）と２５アミノ酸のリンカーおよびＧＬＰ−１（７−３７）からなる融合タンパク質の発現プラスミドｐＧ９７ｏｍｐＰＲ（ＷＯ９９／３８９８４号公報）を作製した。これにより発現する融合タンパク質のリンカー領域には、ｏｍｐＴプロテアーゼの切断モチーフ（Ａｒｇ−Ａｒｇ）、およびＫｅｘ２プロテアーゼの切断モチーフ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）が配され、それぞれのプロテアーゼにより切断を受ける構造をもつ。
本融合タンパク質を得るため、大腸菌Ｗ３１１０株を親株とする株にｐＧ９７ｏｍｐＰＲを導入し、得られた形質転換株を酵母エキス、無機塩類およびグルコースを含む培地中で３００Ｌ培養槽にて培養した。菌体濃度がＯＤ６６０＝１８０になるまで培養し、得られた培養液を、高圧ホモジナイザーで処理し菌体を破砕し、遠心分離で封入体を回収した。封入体を含む沈澱を脱イオン水で再度懸濁後、再度遠心分離して封入体を洗浄後、脱イオン水で懸濁しＯＤ６６０値が１，０００の封入体濃縮液（約３０Ｌ）とした。
この封入体濃縮液３．９Ｌを採取し、ｐＨ未調整の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを１Ｌ、８Ｍ尿素１０Ｌを添加した後、脱イオン水を加え最終容量を２０Ｌとした。次に、５Ｎ塩酸でｐＨを６．５に調整し、３７℃で２時間加温することで封入体中に存在している大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼを融合タンパク質に作用させ、Ｎ末端に１３個のアミノ酸が付加されたＧＬＰ−１（７−３７）［以下、ＲＨＨＧＰ［Ｇ］と記載］を遊離させた。反応終了後、反応液に粉末尿素を７Ｍとなるように添加し、５Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを８．０とした。その後フィルタープレス処理して得られた３０Ｌの清澄液を、５Ｍ尿素／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢｉｇＢｅａｄｓカラム（１４０ｍｍ  ＩＤ×１６０ｍｍ、アマシャム・ファルマシアバイオテクノロジー）に添加し、０．２Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液にて洗浄後、０．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を用いてＲＨＨＧＰ［Ｇ］を溶出させ、約１００ｇのＲＨＨＧＰ［Ｇ］を含む画分（約２０Ｌ）を得た。
得られたＲＨＨＧＰ［Ｇ］画分を精製水（ＵＦ水）で５．０ｍｇ／ｍＬに調製後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、５．０μＭ硫酸銅、０．５ｇ／Ｌ−アスコルビン酸、１ｍｇ／Ｌカタラーゼ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、１，５００ｕｎｉｔ／ｍＬアミド化酵素を添加し、酸素を吹き込み１００％飽和の溶存酸素濃度を維持しながら温度３２℃で８０分間反応を行い、ＲＨＨＧＰ［Ｇ］のＣ末端をアミド体（ＲＨＨＧＰ−１）に変換した。さらに、本反応液にＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、Ｔｗｅｅｎ８０、塩化カルシウムおよびＫｅｘ２プロテアーゼを、それぞれ最終濃度が２０ｍＭ，０．１％，１ｍＭおよび８，０００Ｕ／ｍＬになるよう添加し、３２℃で２時間３０分反応させた。
ＲＨＨＧＰ−１のＮ末端１３アミノ酸を除去し、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を遊離させた。上記反応液から約１０Ｌ（３．４ｇ／Ｌ）を採取し、０．３％Ｔｗｅｅｎ８０／２０ｍＭ  Ｂｒｉｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ［以下ＢＲと記載］緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し（２６Ｌ）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．３％Ｔｗｅｅｎ８０／２０ｍＭ  ＢＲ緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した、陽イオン交換クロマトカラム（９０ｍｍ  ＩＤ×４００ｍｍ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｓ、バイオラッド社）に添加し、同溶液で洗浄後、Ａ液（２０ｍＭ  ＢＲ緩衝液（ｐＨ６．０）／２０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．３％Ｔｗｅｅｎ８０）、Ｂ液（２０ｍＭ  ＢＲ緩衝液（ｐＨ７．５）／２０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．３％Ｔｗｅｅｎ８０）を用い、５０％Ｂ液から１００％Ｂ液への直線濃度勾配によりＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を溶出させた。
得られた純度９８％以上の画分を、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２濃度６ｍｇ／ｍＬとなるようにＵＦ水で希釈後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化したＰｒｅｐ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）カラム（９０ｍｍ  ＩＤ×２４０ｍｍ）にかけ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および０．２％酢酸を含む１０％アセトニトリル溶液で洗浄した後、２％酢酸を含む３０％アセトニトリル溶液で溶出させ、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を２７ｇ含む溶液（２．５Ｌ）を得た。得られた溶出液のアセトニトリルを留去し、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２濃度を注射用水で１０ｍｇ／ｍＬに調整し、ＲＬ−９０３ＢＳ凍結乾燥機（共和真空技術（株）製）で凍結乾燥を行いＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の凍結乾燥品を２２ｇ得た。
本製造品の分子量、アミノ酸組成比は以下の通りであり、本品がＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２であることが確認された。ＥＳＩ−ＭＳ；３２９７．４（理論価：３２９７．６８）、６Ｎ塩酸加水分解後のＬｅｕ基準アミノ酸組成比：Ａｓｐ；１．０（１），Ｔｈｒ；２．０（２），Ｓｅｒ；２．７（３），Ｇｌｕ；４．０（４），Ｇｌｙ；３．０（３），Ａｌａ；４．１（４），Ｖａｌ；２．０（２），Ｉｌｅ；１．０（１），Ｌｅｕ；２．０，Ｔｙｒ；１．０（１），Ｐｈｅ；２．１（２），Ｌｙｓ；２．０（２），Ｈｉｓ；１．０（１），Ａｒｇ；１．０（１）
参考例２：ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２溶液医薬組成物の経鼻吸収性試験（ラ
ット）
参考例１で得られたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を約１０ｍｇ量り取り、１８０ｍｇシュークロース、８ｍｇ無水クエン酸、および０．２ｍｇの塩化ベンザルコニウムを２ｍＬの水溶液に溶かし、逆相ＨＰＬＣ上５ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。体重２５０ｇ前後の７〜９週齢のＳＤ系雄性ラット（Ｃｒｊ：ＣＤ、日本チャールズリバー）を金属ケージにて、温度２２±５℃、湿度３０〜７０％、明暗サイクル１２時間で飼育し、固形飼料と水道水を自由に摂取させた。試験２４時間前から絶食させ試験に供した（１群３匹）。
経鼻投与の場合、ペントバルビタール麻酔下で大腿動脈カニューレを施した後、試料溶液５μＬを精密分注器で左鼻腔内に投与し（約１００μｇ／ｋｇ）、投与後０、５、１０、１５、２０、３０、６０、９０分後にカニューレより、凝固防止剤と酵素阻害剤を添加した採血チューブに採血し、遠心して血漿を得た。血漿中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２濃度は、抗ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２抗体を用いたＲＩＡ法で測定した。皮下投与の場合、ラット背部皮下にシリンジにて１ｍＬ／ｋｇの容量で皮下投与用試料溶液（約１５μｇ／ｍＬ）を投与し、経鼻投与と同様の手順で血漿中ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２濃度を求めた。結果を表１に示す。
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表中の結果からも明らかなように、生物学的利用率は、１１．２±６．５％（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）であり、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の鼻粘膜からの吸収性が認められた。
参考例３：ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２溶液医薬組成物の安定性
参考例２で調製したＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の試料溶液を、２５℃、および４０℃で保存した。
その結果を表２に示す。表中の結果からも判明するように、いずれの温度条件においても、保存後１週間で微粒子の生成が認められた。
2003045418.tif 000004
参考例２の結果から、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の溶液型医薬組成物がラットにおいて経鼻吸収能を有することが判明したが、その溶液のｐＨとしてｐＨ２．７付近の溶液の物理化学的安定性が悪いものであり、かかるｐＨ値を有する溶液型の医薬組成物は好ましくない。
参考例４：ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の溶液安定性
リン酸３．９２ｇ、酢酸２．４０ｇ、塩化カリウム１４．９１ｇ、およびホウ酸２．４７ｇに蒸留水を加え１，０００ｍＬとした調製Ａ液に、水酸化ナトリウム８．０ｇに水を加えて１，０００ｍＬにした溶液Ｂを滴下して、ｐＨ２．０、ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ９．０の緩衝液（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ＢＲ）緩衝液）を各々１００ｍＬずつ調製した。
一方、参考例１で製造したＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２約３００ｍｇに蒸留水３０ｍＬを加え溶解した。この液２．０ｍＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）に上記ＢＲ緩衝液、または０．１Ｍ塩酸を加え２０ｍＬとし、試料溶液とした。本試料を４０℃保存庫に入れ、１，４，７日保存した後の外観と、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の残存率を調べた。その結果を表３に示した。
2003045418.tif 000005
表３に示すように、ｐＨ１．２、ｐＨ２．０、ｐＨ３．０、ｐＨ６．０およびｐＨ７．０では、保存１日目から沈澱が生じており、ｐＨ５．０は保存４日目から、ｐＨ４．０は保存７日目から沈澱が生じた。また、ｐＨ９．０では、沈澱は生じないが、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の残存率は、保存７日目で７５．６％であった。したがって、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は酸性溶液、中性溶液および塩基性溶液のいずれの溶液においても安定性が悪く、溶液型の医薬組成物としては好ましくないことが明らかになった。
そこで、溶液型の医薬組成物に替わる、微粉末経鼻投与型組成物製剤についての吸収性試験を以下に検討した。
実施例１：イヌにおける粉末経鼻剤の吸収性試験
参考例１で得られたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２と、担体として炭酸カルシウムの平均粒子径５１．９μｍを有する微細粉体物に、以下の調製例１〜９で示す種々の添加剤を加えた経鼻吸収用組成物を調製した。
コントロールとして添加剤を含まない経鼻吸収用組成物を併せて調製した。
体重１０ｋｇ前後のビーグル犬を３頭用い、調製例１から調製例９に示す経鼻吸収用医薬組成物を粉末噴霧器で経鼻投与し、投与後０、５、１０、２０、３０、４５、６０、９０、１２０分後における血漿中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃度を測定した。対照として、添加剤を含まない炭酸カルシウムを担体としたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の微細粉体物を投与した。血漿中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃度は、抗ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２抗体を用いたＲＩＡ法で測定した。生物学的利用率は、経鼻投与後の血漿中濃度時間−曲線下面積（ＡＵＣ）を、生理食塩水に溶かしたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の皮下投与後のＡＵＣと比較して算出した。その結果を表４にまとめた。
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表中に示した結果からも明らかなように、添加剤を含まない医薬組成物の生物学的利用率が約４％であるのに対して、本発明の医薬組成物を投与することによりＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の吸収が促進され、生物学的利用率が約６％から１４％に上昇することが判明した。
調製例１：道明寺粉（１．０％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、道明寺粉３１ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９２ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。デシケーター中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．８３ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、６９０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２２６ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２：トウモロコシデンプン（０．１％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、トウモロコシデンプン（日局、平均粒子径１３．３μｍ）３．５ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９６ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。デシケーター中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２８ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．７５ｇ得た。約１，０００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２９７ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３：トウモロコシデンプン（１．０％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、トウモロコシデンプン（日局、平均粒子径１３．３μｍ）３２ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．８９ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、６７８μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２１３ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例４：うるち型バレイショ由来α化デンプン（０．１％）を含む医薬組成物
の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、うるち型バレイショ由来α化デンプン（アミコールＨＦ、日澱化学工業）３．２ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９６ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。デシケーター中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２８ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．７５ｇ得た。約１，０００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２９７ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例５：うるち型バレイショ由来α化デンプン（１．０％）を含む医薬組成物
の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、うるち型バレイショ由来α化デンプン（アミコールＨＦ、日澱化学工業）３０ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９２ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。デシケーター中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２７ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．７７ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、６６１μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２１７ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例６：ポビドン（１．０％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、ポビドンＫ３０（薬添規）３２ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。デシケーター中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．８４ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、６４２μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２１１ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例７：ペクチン（１．０％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、ペクチン（ＵＳＰ）３１ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。デシケーター中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．８８ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、６４４μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２１０ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例８：うるち型トウモロコシ由来部分α化デンプン（１．０％）を含む医薬
組成物の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、うるち型トウモロコシ由来部分α化デンプン（ＰＣＳ、旭化成工業）３１ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に２．９２ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。デシケーター中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２８ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を２．８８ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、６４６μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約２１１ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例９：添加剤を含まない医薬組成物の調製
ペプチド成分として３０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、本粉末をビーカーに入れ、徐々に８．８８ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（８７ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を８．７６ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、９３７μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約３００ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
実施例２：カニクイザルにおける粉末経鼻剤の吸収性試験
生理活性ポリペプチドとして、参考例１で得られたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を使用し、担体として平均粒子径５１．９μｍの炭酸カルシウムの微細粉体物、あるいはショ糖硫酸エステルアルミニウム塩（スクラルファート）の微細粉体物を用いた。本担体に調製例１０〜１８記載した方法に従い、種々の添加剤を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の投与量を、一回の投与量が約１００μｇ／頭になるように調製し、添加剤の配合量は製剤重量の０．５％、１．０％、１０％または５０％とした。添加剤を含まない２つの処方、すなわち炭酸カルシウムとＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、およびスクラルファートとＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の組み合わせをコントロールにおいた。
体重３ｋｇ前後のカニクイザルを用い、調製例１０〜１８の組成物をユニシアジェクス社製の鼻腔内噴霧器で経鼻投与し、投与後０、５、１０、２０、３０、４５、６０、９０、１２０分後における血漿中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃度をＲＩＡ法、一部をＥＬＩＳＡ法で測定した。生物学的利用率は、経鼻投与後のＡＵＣを皮下投与後のＡＵＣと比較して算出した。
生理食塩水に溶かしたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の皮下投与、添加剤を含まない経鼻２処方を経鼻投与したときの血中濃度推移を第１〜第３図に、１％導明寺粉、０．５％トウモロコシデンプン、あるいは０．５％うるち型バレイショ由来α化デンプンを添加した経鼻処方を経鼻投与したときの血中濃度推移を第４図に示す。
また、ＲＩＡ法および一部ＥＬＩＳＡ法で測定した血漿中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の評価を、表５および表６に示した。
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表５および表６からも明らかなように、添加剤を含まない２つの処方は、０．３〜３．１％程度の低い経鼻吸収しか示さなかったのに対し、本発明の医薬組成物を投与することにより、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が鼻粘膜から極めて高い効率で生体内に吸収されることが判明した。
調製例１０：添加剤を含まない医薬組成物の調製
ペプチド成分として３０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量った。本粉末をビーカーに入れ、徐々に８．８７ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（８４ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を８．２０ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約３０ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１１：添加剤を含まない医薬組成物の調製
ペプチド成分として３０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量った。本粉末をビーカーに入れ、徐々に８．８７ｇのスクラルファートを添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（８４ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を８．０３ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約３０ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１２：道明寺粉（１．０％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として３０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、道明寺粉８９ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に８．７８ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（８４ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を８．１１ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約３０ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１３：トウモロコシデンプン（０．５％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として３０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、トウモロコシデンプン（日局、平均粒子径１３．３μｍ）４５ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に８．８３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（８８ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を８．４６ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、９８μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約３０ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１４：うるち型バレイショ由来α化デンプン（０．５％）を含む医薬組成
物の調製
ペプチド成分として３０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、うるち型バレイショ由来α化デンプン（アミコールＨＦ、日澱化学工業）４５ｍｇと混合した。本混合粉末をビーカーに入れ、徐々に８．８３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（８９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を８．４７ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、１０１μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約３０ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１５：ヒドロキシプロピルセルロース−Ｈ（ＨＰＣ−Ｈ、１０％）を含む
医薬組成物の調製（粉末混合）
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、３００ｍｇのＨＰＣ−Ｈ（日局）を倍散混合して粉末を得た。本混合粉末と、２．６９ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を同様に倍散混合し均一な粉末とした。この粉末を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２８ｍｇ）を加えて混合して試料粉末を２．７６ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末（約３０ｍｇ）を２号カプセルに充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１６：ＨＰＣ−Ｈ（１０％）を含む医薬組成物の調製（水練合）
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、３００ｍｇのＨＰＣ−Ｈ（日局）を倍散混合して粉末を得た。本混合粉末と、２．６９ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を同様に倍散混合し均一な粉末とした。精製水を混合物がペースト状になるまで加え、さらによく混ぜた後、デシケーター中で終夜減圧乾燥させた。乾燥した混合物を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２８ｍｇ）を加えて混合して試料粉末２．７０ｇを得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を測定し、２号カプセルに１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末約３０ｍｇを充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１７：ＨＰＣ−Ｈ（１０％）を含む医薬組成物の調製（エタノール練合）
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、３００ｍｇのＨＰＣ−Ｈ（日局）を倍散混合して粉末を得た。本混合粉末と、２．６９ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を同様に倍散混合し均一な粉末とした。エタノールを混合物がペースト状になるまで加え、さらによく練合したのち、デシケーター中で終夜減圧乾燥させた。乾燥した混合物を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウムを（２８ｍｇ）加え、よく混合して試料粉末２．７３ｇを得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を測定し、２号カプセルに１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末約３０ｍｇを充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例１８：ＨＰＣ−Ｈ（５０％）を含む医薬組成物の調製
ペプチド成分として１０ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１２ｍｇ）を量り、１．５ｇのＨＰＣ−Ｈ（日局）を倍散混合して粉末を得た。本混合粉末と、１．４９ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５１．９μｍ）を同様に倍散混合し均一な粉末とした。精製水を混合物がペースト状になるまで加え、さらによく練合したのち、デシケーター中で終夜減圧乾燥させた。得られた乾燥粉末を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２７ｍｇ）を加え、よく混合して試料粉末２．５４ｇを得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を測定し、２号カプセルに１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む量の試料粉末約３０ｍｇを充填し、経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
実施例３：カニクイザルにおける粉末経鼻剤の吸収性試験−２
本試験で、トウモロコシデンプン、ＨＰＣ−ＳＳＬ（ヒドロキシプロピルセルロース−ＳＳＬ）、およびこれらの併用、うるち型トウモロコシ由来部分α化デンプン（ＰＣＳ；旭化成工業）を添加したときの経鼻吸収効果について検討した。
体重２〜４ｋｇのカニクイザルを用い、調整例１９〜２７の組成物約３０ｍｇ［ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２として約３００μｇ］をユニシアジェック社製の鼻腔内噴霧器で経鼻投与し、投与前及び投与後５，１０，１５，３０，６０，９０，１２０分の血漿中ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２濃度をＲＩＡ法で測定した（５．０％トウモロコシデンプン：ｎ＝２；それ以外はｎ＝３）。生物学的利用率（ＢＡ）は、経鼻投与後のＡＵＣを皮下投与後のＡＵＣと比較して算出した。
結果を以下の表７にまとめた。トウモロコシデンプンは１〜１０％の広い範囲で、添加なしと比べ経鼻吸収促進効果がみられた。また、一部しかα化されず、水に対して不溶部分（平均粒子径：約１５μｍ）が残る部分α化デンプンも良好な経鼻吸収促進効果を示した。水に溶け難いグレードのＨＰＣ（ＳＳＬ）も一定の吸収促進効果を示し、さらに、ＨＰＣ−ＳＳＬはトウモロコシデンプンと併用して本発明の組成物に用いることができることが示された。
2003045418.tif 000009
調製例１９：コントロール製剤（０．０１％塩化ベンザルコニウム含有）の調製
ペプチド成分として３０．６ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２粉末（約３６ｍｇ）を量り、徐々に約２．９３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）を添加し、よく混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約３０ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．９５ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３１１μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２０：１．０％トウモロコシデンプン＋０．０１％塩化ベンザルコニウム
含有製剤の調製
約２．９１ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径１３．３μｍ）を約２９ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として２９．９ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．８８ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３１２μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２１：５．０％トウモロコシデンプン＋０．０１％塩化ベンザルコニウム
含有製剤の調製
約２．７８ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径１３．３μｍ）を約１５０ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として２９．６ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３５ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、さらに精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約３０ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．８９ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３０７μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２２：１０．０％トウモロコシデンプン＋０．０１％塩化ベンザルコニウ
ムＪ含有製剤の調製
約２．６３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径１３．３μｍ）を約３０１ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として３０．６ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約２７ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．６９ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３４１μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２３：０．１％ＨＰＣ−ＳＳＬ＋０．０１％塩化ベンザルコニウム含有製
剤の調製
約２．９３ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径１３．３μｍ）に約３ｍｇのＨＰＣ−ＳＳＬ（日局）を含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として３０．４ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約３０ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．９４ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３１０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２４：０．５％ＨＰＣ−ＳＳＬ＋０．０１％塩化ベンザルコニウム含有製
剤の調製
約２．９２ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）に約１５ｍｇのＨＰＣ−ＳＳＬ（日局）を含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として３０．５ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約３０ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．９３ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３１２μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２５：１．０％ＨＰＣ−ＳＳＬ＋０．０１％塩化ベンザルコニウム含有製
剤の調製
約２．９０ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）に約３０ｍｇのＨＰＣ−ＳＳＬ（日局）を含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として３０．６ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約２８ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．８５ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３２２μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２６：１．０％うるち型トウモロコシ由来部分α化デンプン＋０．０１％
塩化ベンザルコニウム含有製剤の調製
約２．９０ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）に約３０ｍｇのうるち型トウモロコシ由来部分α化デンプン（ＰＣＳ；旭化成工業）を含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として３０．８ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３７ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．９０ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３１９μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２７：５．０％トウモロコシデンプン＋０．１％ＨＰＣ−ＳＳＬ＋０．０
１％塩化ベンザルコニウム含有製剤の調製
約２．７８ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径１３．３μｍ）を約１５１ｍｇ添加し、よく混合したのち、約３ｍｇのＨＰＣ−ＳＳＬ（日局）を含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として３０．３ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約３６ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約３０ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．９３ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３０ｍｇ中に３１０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
実施例４：インクレチンペプチドのデンプン添加による経鼻吸収への効果
ラットの血糖降下作用を指標に、デンプンの添加がＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２以外のインスリン分泌刺激活性を有する酸性ペプチドに対しても経鼻吸収を促進するかどうか調べた。
体重約３００ｇのＣＤ（ＳＤ）系ラットをペントバルビタールで麻酔した。ピペット用チップ（ＧＰＳ−２５０，ＲＡＩＮＩＮ）の先端に調製例２８〜３５に示す組成物３ｍｇ（ペプチドとして約１００μｇ）を充填した。本チップを注射筒に装填し、１ｍＬの空気とともに組成物を鼻腔内に噴霧した。経鼻投与後５分にグルコースを０．５ｇ／ｋｇの投与量で尾静脈内投与し、経鼻投与後１５分（グルコース投与後１０分）に腹部大動脈から採血した。血糖値を血糖測定器（フリースタイルキッセイ、キッセイ薬品工業株式会社）で測定した（各群ともｎ＝３）。なお、対照群のラットには、鼻腔内には何も投与せず、グルコース投与のみを行った。
その結果を、下記表８に示した。インクレチンホルモンを投与していない対照群の血糖値は１９６ｍｇ／ｄＬ（ラット３匹の平均値）であった。インクレチンホルモンを含む組成物は、対照群と比較して血糖値が低下した。また、いずれのインクレチンホルモンにおいても５％コーンスターチ添加の組成物のほうが、未添加の組成物より血糖値が低下した。
これらの結果から、本経鼻吸収用医薬組成物で種々のインクレチンホルモンを鼻粘膜から吸収させることが可能であり、デンプンの添加でこの吸収促進作用が改善することが明らかとなった。
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参考例５：［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ
）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）の合成
塩化メチレン（３０ｍＬ）で膨潤させたＣｌ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂（５ｇ，６．９ｍｍｏｌ）に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（５．８ｇ，１３．７ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１．５ｇ，１１．８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（２０ｍＬ）を加え、緩やかに３０分攪拌した後、樹脂をフィルター上でろ過し、塩化メチレン、イソプロパノール、塩化メチレンの順で洗浄した。このものに２０％ピペリジン／ＤＭＦ（３０ｍＬ）を加え、２０分間緩やかに攪拌し、樹脂をフィルター上で、濾取、次いでＤＭＦ、イソプロパノール、塩化メチレンの順で洗浄し乾燥した。得られたＨ−Ｇｌｕ（α−ＯｔＢｕ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂（６．１ｇ，６．９ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）／塩化メチレン混液（１：１，３０ｍＬ）に懸濁させ、３当量のパルミチン酸（５．３ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２．８ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）、および水溶性カルボジイミド（４．０ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）を加え、終夜緩やかに攪拌した。反応樹脂を塩化メチレン、ＮＭＰ、塩化メチレンの順で洗浄した後、乾燥して得られたｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｇｌｕ（α−ＯｔＢｕ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂（８ｇ，６．９ｍｍｏｌ）に、酢酸／ＴＦＥ／塩化メチレン混液（１：２：７，２０ｍＬ）を加え２０分間攪拌した。樹脂をフィルター上に濾去し、ＴＦＥ１０ｍＬで洗いこんだ後、濾液を濃縮して得られる残渣にヘキサンを加え沈殿とした。更に、塩化メチレン／ヘキサンから再結晶し、２６位Ｌｙｓ側鎖に導入するグルタミン酸誘導体；ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｇｌｕ（α−ＯｔＢｕ）を２．０ｇ得た（収率６６％）。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］４４２．３、［Ｍ＋Ｎａ］４６２．４、（Ｍ理論値４４１．３）。
次にＡＢＩ社製４３３Ａペプチド自動合成機を用い、Ｆｍｏｃ法（０．２５ｍｍｏｌプロトコル）にて、縮合と脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（４−ｍｅｔｈｙｌｔｒｉｔｙｌ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂（１．５ｇ，約０．２５ｍｍｏｌ）を構築した。本保護樹脂に、１％ＴＦＡ／５％ＴＩＰＳ／塩化メチレン（３０ｍＬ）を３０分作用させ、２６位Ｌｙｓの側鎖４−ｍｅｔｈｙｌｔｒｉｔｙｌ基を除去した。５％ＤＩＰＥＡ／塩化メチレンで中和し、塩化メチレンで洗浄、ＮＭＰ（３０ｍＬ）で膨潤させた後、ＨＯＢｔ（１３５ｍｇ，１ｍｍｏｌ）存在下、ＤＣＣ（２６０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）でｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｇｌｕ（α−ＯｔＢｕ）（４４１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を３時間反応させた。得られたペプチド樹脂を２０％ピペリジンで脱Ｆｍｏｃ後、８８％ＴＦＡ／２％ＴＩＰＳ／５％水／５％フェノール（２０ｍＬ）で１時間処理した。樹脂をフィルター上で除去後、ＴＦＡ１０ｍＬで洗い込み、濾液を濃縮してエーテルで沈殿とした（７２０ｍｇ）。得られた粗ペプチドのうち５００ｍｇを飽和尿素液（２００ｍＬ）に溶かし、Ｃ４（ＹＭＣ−ｐａｃｋ，ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ、２ｃｍ  ｘ  ２５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣで精製した。すなわち、５から１０ｍＬ／分の流速で、０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル濃度を１３％から６０％まで直線的に変化させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的ペプチド１４５ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：理論値；３７５１．２、測定値；３７５１。６Ｎ塩酸加水分解後のＬｅｕ基準アミノ酸組成比：Ａｓｘ  ０．９７（１）、Ｔｈｒ  １．８９（２）、Ｓｅｒ  ２．７５（３）、Ｇｌｘ  ５．０８（５）、Ｇｌｙ  ４．０５（４）、Ａｌａ  ４．０１（４）、Ｖａｌ  １．９３（２）、Ｉｌｅ  ０．９９（１）、Ｌｅｕ  ２、Ｔｙｒ  ０．９１（１）、Ｐｈｅ  １．９０（２）、Ｌｙｓ  １．１０（１）、Ｈｉｓ  ０．９０（１）、Ａｒｇ  １．９２（２）
参考例６：ＧＬＰ−１（７−３７）の合成
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂を出発物質として、ＡＢＩ社製４３３Ａペプチド自動合成機を用い、Ｆｍｏｃ法（０．２５ｍｍｏｌプロトコル）にて、Ｈ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（１．１ｇ）を構築した。得られたペプチド樹脂のうち６００ｍｇを８８％ＴＦＡ／２％ＴＩＰＳ／５％水／５％フェノール（２０ｍＬ）で１時間処理し、樹脂を除去後、濾液を濃縮、エーテルで沈殿とした（３８０ｍｇ）。得られた粗ペプチドを精製水（２０ｍＬ）に溶かし、Ｃ４（ＹＭＣ−ｐａｃｋ，ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ、２ｃｍ  ｘ  ２５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣで精製した。すなわち、１０ｍＬ／分の流速で、０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル濃度を９％から６８％まで直線的に変化させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的ペプチド５３ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：理論値；３３５５．７、測定値；３３５５。６Ｎ塩酸加水分解後のＬｅｕ基準アミノ酸組成比：Ａｓｘ  １．００（１）、Ｔｈｒ  １．９９（２）、Ｓｅｒ  ２．７９（３）、Ｇｌｘ  ４．１０（４）、Ｇｌｙ  ４．０１（４）、Ａｌａ  ４．０２（４）、Ｖａｌ  １．９２（２）、Ｉｌｅ  ０．９８（１）、Ｌｅｕ  ２、Ｔｙｒ  ０．９２（１）、Ｐｈｅ  １．９２（２）、Ｌｙｓ  ２．１８（２）、Ｈｉｓ  ０．９６（１）、Ａｒｇ  ０．９４（１）
参考例７：［Ｖａｌ８］ＧＬＰ−１（７−３７）の合成
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂を出発物質として、ＡＢＩ社製４３３Ａペプチド自動合成機を用い、Ｆｍｏｃ法（０．２５ｍｍｏｌプロトコル）にて、Ｈ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（１．４ｇ）を構築した。得られたペプチド樹脂０．７ｇを８８％ＴＦＡ／２％ＴＩＰＳ／５％水／５％フェノール（２０ｍＬ）で１時間処理し、樹脂を除去後、濾液を濃縮、エーテルで沈殿とした（３２７ｍｇ）。得られた粗ペプチドを精製水（５０ｍＬ）に溶かし、Ｃ４（ＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ、２．５ｃｍ  ｘ  ３０ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣで精製した。すなわち、１０ｍＬ／分の流速で、０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル濃度を５％から７２％まで直線的に変化させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的ペプチド７５ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：理論値；３３８３．８、測定値；３３８３。６Ｎ塩酸加水分解後のＬｅｕ基準アミノ酸組成比：Ａｓｘ  ０．９９（１），Ｔｈｒ  １．９８（２），Ｓｅｒ  ２．８０（３），Ｇｌｘ  ４．１０（４）、Ｇｌｙ  ４．０１（４）、Ａｌａ  ３．０３（３）、Ｖａｌ  ２．８６（３）、Ｉｌｅ  ０．９８（１）、Ｌｅｕ  ２、Ｔｙｒ  ０．９２（１）、Ｐｈｅ  １．９２（２）、Ｌｙｓ  ２．１８（２）、Ｈｉｓ  ０．９２（１）、Ａｒｇ  ０．９４（１）
参考例８：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４の合成
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂を出発物質として、Ｆｍｏｃ法（０．２５ｍｍｏｌプロトコル）にて、Ｈ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂（１．９ｇ）を構築した。得られたペプチド樹脂１．９ｇを８８％ＴＦＡ／２％ＴＩＰＳ／５％水／５％フェノール（２０ｍＬ）で１時間処理し、樹脂を除去後、濾液を濃縮、エーテルで沈殿とした（８７０ｍｇ）。得られた粗ペプチドを精製水（８０ｍＬ）に溶かし、Ｃ４（ＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ、２．５ｃｍ  ｘ  ３０ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣで精製した。すなわち、１０ｍＬ／分の流速で、０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル濃度を１８％から７２％まで６０分間直線的に変化させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的ペプチド２７０ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：理論値；４１８６．６、測定値；４１８６。６Ｎ塩酸加水分解後のＬｅｕ基準アミノ酸組成比：Ａｓｘ  １．９９（２），Ｔｈｒ  １．９７（２），Ｓｅｒ  ４．７７（５），Ｇｌｘ  ６．０６（６）、Ｇｌｙ  ４．９７（５）、Ａｌａ  ２．０２（２）、Ｖａｌ  ０．９４（１）、Ｍｅｔ  ０．６８（１）、Ｉｌｅ  ０．９８（１）、Ｌｅｕ  ３、Ｐｈｅ  １．９０（２）、Ｌｙｓ  ２．１７（２）、Ｈｉｓ  ０．９８（１）、Ａｒｇ  ０．９２（１）、Ｐｒｏ  ３．９６（４）
調製例２８：ＧＬＰ−１（７−３７）経鼻製剤（５％トウモロコシデンプン＋０
．０１％塩化ベンザルコニウム）の調製
約２６９ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径：１３．３μｍ）を約１５ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として９．０３ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３７）の粉末（約１０．８ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２．２ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２５２ｍｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３７）の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１０７μｇのＧＬＰ−１（７−３７）を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例２９：ＧＬＰ−１（７−３７）経鼻製剤（０．０１％塩化ベンザルコニウ
ム）の調製
ペプチド成分として８．７５ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３７）の粉末（約１０．５ｍｇ）を量り、徐々に約２８４ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）を添加し、よく混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２．９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２５８ｍｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３７）の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１０２μｇのＧＬＰ−１（７−３７）を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３０：［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）経鼻製剤（５％トウモロコ
シデンプン＋０．０１％塩化ベンザルコニウム）の調製
約２６９ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径：１３．３μｍ）を約１５ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として９．３８ｍｇ相当量の［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）の粉末（約１３ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（３．１ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２６１ｍｇ得た。この試料粉末中の［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１０８μｇの［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３１：［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）経鼻製剤（０．０１％塩化
ベンザルコニウム）の調製
ペプチド成分として９．３１ｍｇ相当量の［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）の粉末（約１３ｍｇ）を量り、徐々に約２８４ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）を添加し、よく混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２．６ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２５２ｍｇ得た。この試料粉末中の［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１１１μｇの［Ｖａｌ８］−ＧＬＰ−１（７−３７）を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３２：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４経鼻製剤（５％トウモロコシデンプン＋０．０
１％塩化ベンザルコニウム）の調製
約２７０ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径：１３．３μｍ）を約１５ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として９．０８ｍｇ相当量のＥｘｅｎｄｉｎ−４の粉末（約１２ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（３．０ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２５５ｍｇ得た。この試料粉末中のＥｘｅｎｄｉｎ−４の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１０７μｇのＥｘｅｎｄｉｎ−４を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３３：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４経鼻製剤（０．０１％塩化ベンザルコニウム）
の調製
ペプチド成分として９．００ｍｇ相当量のＡｍｙｌｉｎ：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４の粉末（約１２ｍｇ）を量り、徐々に約２８５ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）を添加し、よく混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２．６ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２６０ｍｇ得た。この試料粉末中のＥｘｅｎｄｉｎ−４の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１０４μｇのＥｘｅｎｄｉｎ−４を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３４：［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙ
ｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）（５％トウモロコシデンプン＋
０．０１％塩化ベンザルコニウム）の調製
約２７０ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径：１３．３μｍ）を約１５ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として９．２３ｍｇ相当量の［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）の粉末（約１２ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２．７ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２４５ｍｇ得た。この試料粉末中の［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１１３μｇの［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３５：［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙ
ｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）（０．０１％塩化ベンザルコニ
ウム）の調製
ペプチド成分として９．０８ｍｇ相当量の［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）の粉末（約１２ｍｇ）を量り、徐々に約２８５ｍｇの炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）を添加し、よく混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．０３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。デシケータ中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（２．４ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２６５ｍｇ得た。この試料粉末中の［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に１０３μｇの［Ｌｙｓ２６，ε−ＮＨ｛γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）｝］−ＧＬＰ−１（７−３７）を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
実施例５：酸性ペプチドに対するデンプン添加の経鼻吸収促進効果
インクレチンホルモン以外の酸性ペプチドの例として、ヒトインスリンの経鼻吸収に対するデンプン添加の効果を、サルを用いて検討した。本試験では担体として平均粒子径５１．９μｍの炭酸カルシウム、あるいはショ糖硫酸エステルアルミニウム塩（スクラルファート）を使用した。調製例３８に記載した方法に従い、１．０％道明寺粉の添加剤を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。ヒトインスリンの投与量を、約２５ＩＵ（国際単位）／頭／４０ｍｇになるように調製し添加剤を含まない２つの処方、すなわち炭酸カルシウム、およびスクラルファートとヒトインスリンの組み合わせをコントロールにおいた。
体重３ｋｇ前後のカニクイザルを用い、調製例３６〜３８の組成物をユニシアジェクス社製の鼻腔内噴霧器で約４０ｍｇ経鼻投与し、投与後０、５、１５、６０、９０、１２０分後における血漿中インスリン濃度ならびに血漿中グルコース濃度を、それぞれインスリン・ＲＩＡビーズＩＩ（ダイナボット株式会社）、血糖測定器フリースタイルキッセイ（キッセイ薬品株式会社）で測定した（各群ともｎ＝２）。
結果を表９と表１０に示す。添加剤未添加の製剤でもヒトインスリン吸収とそれに伴う血糖低下がみられたが、１．０％道明寺粉の添加により、ヒトインスリンの吸収が増大し、血糖降下作用も強くかつ早く出現した。
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調製例３６：インスリン−スクラルファート製剤の調製
ヒトインスリン製剤（ヒューマリンＲ、１００ＩＵ／ｍＬ、塩野義製薬株式会社）１ｍＬをスクラルファート１２０ｍｇに加え練合した。このものを減圧乾燥し、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約１．２ｍｇ）を加えて混合した。２号カプセルに４０ｍｇを充填し、カプセル中に約２５ＩＵのヒトインスリンを含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３７：ヒトインスリン−炭酸カルシウム製剤の調製
ヒトインスリン製剤（ヒューマリンＲ、１００ＩＵ／ｍＬ、塩野義製薬株式会社）１ｍＬを炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）１２０ｍｇに加え、練合した。このものを減圧乾燥し、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約１．２ｍｇ）を加えて混合した。２号カプセルに４０ｍｇを充填し、カプセル中に約２５ＩＵのヒトインスリンを含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例３８：１％道明寺粉を含むヒトインスリン−炭酸カルシウム製剤の調製
１．２ｍｇの道明寺粉をヒトインスリン製剤（ヒューマリンＲ、１００ＩＵ／ｍＬ、塩野義製薬株式会社）１ｍＬに懸濁させた溶液を炭酸カルシウム（平均粒子径：５３．６μｍ）１２０ｍｇに加え練合した。このものを減圧乾燥し、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約１．２ｍｇ）を加えて混合した。２号カプセルに４０ｍｇを充填し、カプセル中に約２５ＩＵのヒトインスリンを含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
実施例６：添加剤として用いるデンプンの平均粒子径による経鼻吸収率の差
ＧＬＰ−１（７−２６）ＮＨ２を用いて、添加するデンプンの平均粒子径による経鼻吸収率の差をラットにおける血糖低下作用を指標に検討した。本試験では以下に示す粒子径の異なる２種類のデンプンを添加剤に使用した。
トウモロコシデンプン：平均粒子径；１３．３μｍ、中心分布；１４μｍ、分布領域；５．５〜３０μｍ
バレイショデンプン：平均粒子径；３７．７μｍ、中心分布；４５μｍ、分布領域；５．５〜１０５μｍ
体重約３００ｇのＣＤ（ＳＤ）系ラットをペントバルビタールで麻酔した。ピペット用チップ（ＧＰＳ−２５０，ＲＡＩＮＩＮ）の先端に調製例３９〜４１の組成物３ｍｇ（ペプチドとして９０μｇ）を充填した。本チップを注射筒に装填し、１ｍＬの空気とともに組成物を鼻腔内に噴霧した。経鼻投与後５分にグルコースを０．５ｇ／ｋｇの投与量で尾静脈内投与し、経鼻投与後１５分（グルコース投与後１０分）に腹部大動脈から採血した。血糖値を血糖測定器（フリースタイルキッセイ、キッセイ薬品工業株式会社）で測定した（各群ともｎ＝３）。結果を表１１にまとめた。
ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を投与していない対照群の血糖値は１９６ｍｇ／ｄＬ（ラット３匹の平均値）であった。ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む組成物については、添加剤を含まない組成物、５％トウモロコシデンプンを含む組成物および５％バレイショデンプンを含む組成物の血糖値は、それぞれ１７０ｍｇ／ｄＬ、１５７ｍｇ／ｄＬおよび１８２ｍｇ／ｄＬでありＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む組成物はいずれも対照群と比較して血糖値が低下した。しかしながら、デンプンの添加による吸収促進効果は、バレイショデンプンでは顕著ではなく、粒度の細かいトウモロコシデンプンを含む組成物の血糖低下作用が強かった。
表１１に示す結果から明らかなように、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の経鼻吸収は、添加剤として使用したデンプンの平均粒子径が細かい粒子径が良好であり、大きいデンプンでは吸収促進効果が殆どないことが判明した。
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調製例３９：デンプン未添加の製剤の調製
ペプチド成分として９０．２ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２粉末（約１０８ｍｇ）を量り、徐々に約２．８６ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）を添加し、よく混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約３０ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．９５ｇ得た。この試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に９２μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例４０：デンプン添加の製剤（５％トウモロコシデンプン）の調製
約２．７１ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）にトウモロコシデンプン（日局；平均粒子径１３．３μｍ）を約１５０ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として８９．２ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１０７ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．９０ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に９２μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
調製例４１：デンプン添加の製剤（５％バレイショデンプン）の調製
約２．７１ｇの炭酸カルシウム（平均粒子径５３．６μｍ）にバレイショデンプンＢ（日局；平均粒子径３７．７μｍ）を約１５０ｍｇ添加し、よく混合したのち、精製水を加え練合した。凍結乾燥機で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過した。ペプチド成分として８９．５ｍｇ相当量のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粉末（約１０７ｍｇ）を量り、乾燥品と混合した。本混合粉末に塩化ベンザルコニウムを０．３ｍｇ含む溶液を加え、更に精製水を加え練合した。凍結乾燥機中で終夜減圧乾燥させ、得られた乾燥品を１８０μｍの篩で篩過後、全重量の１．０％となる量のステアリン酸カルシウム（約２９ｍｇ）を加えて混合し、試料粉末を約２．８８ｇ得た。試料粉末中のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の含量を逆相ＨＰＬＣで測定し、３ｍｇ中に９３μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む経鼻吸収用医薬組成物を調製した。
産業上の利用の可能性
以上記載したように、本発明によれば、これまで経口投与を含む非注射投与が困難であった生理活性ポリペプチド、特に溶液安定性に問題があった等電点７以下の酸性生理活性ポリペプチドについて、生理活性ポリペプチドと、それを担体表面に分散、包埋ならしめ得る添加剤と、水に不溶または難溶の担体とからなる医薬組成物とすることによって初めて経鼻投与により吸収性が良い経鼻吸収用医薬組成物が提供される。
したがって、本発明の経鼻吸収用医薬組成物は、非注射投与経路が確立されていないインスリン分泌促進ポリペプチド等を粉末組成物として経鼻投与すること、すなわち鼻粘膜に適用することにより、その組成物中に含有されるポリペプチドの生体内吸収性に優れ、有効な臨床的治療が可能であることを示すものであり、その医療効果は多大である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例２における、皮下投与による投与をしたときのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の血中濃度推移を示す図である。
第２図は、実施例２における、担体として炭酸カルシウムを用い、添加剤を含まない組成物を経鼻投与したときのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の血中濃度推移を示す図である。
第３図は、実施例２における、担体としてスクラルファートを用い、添加剤を含まない組成物を経鼻投与したときのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の血中濃度推移を示す図である。
第４図は、実施例２における、添加剤を含有した組成物を経鼻投与したときのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の血中濃度推移を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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