(57)【要約】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤。（ａ）各配列番号２〜４で表されるアミノ酸配列からなる３つのサブユニットで構成される、キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）が生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）（ｂ）（ａ）のタンパク質において、３つのサブユニットの少なくとも一つが配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるサブユニットであり、かつクリュイベロミセス・ラクティスのキラータンパク質（ＫＬＫＰ）活性を有するタンパク質【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）キラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤。
【請求項２】
以下のタンパク質を有効成分とする、請求項１記載の真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるサブユニット、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるサブユニットおよび配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるサブユニットの３つのサブユニットからなるクリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）キラータンパク質（ＫＬＫＰ）、または
（ｂ）（ａ）のタンパク質において３つのサブユニットの少なくとも一つが配列番号２、３または４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるサブユニットであり、かつクリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）キラータンパク質（ＫＬＫＰ）活性を有するタンパク質
【請求項３】
カルシウムイオンと請求項１または２記載のカルシニューリン活性化剤を含む真核細胞の増殖阻害剤。
【請求項４】
カルシウムイオンと請求項１または２記載のカルシニューリン活性化剤を含む真核細胞周期阻害剤。
【請求項５】
チーズホエーもしくはチーズホエー由来のカルシウムを高濃度で含む調製物と請求項１または２記載のカルシニューリン活性化剤を含む真核細胞周期阻害剤。
【請求項６】
カルシウムイオンおよび請求項１または２記載のカルシニューリン活性化剤を同時にまたは別々にサイレージに添加する工程を含む、サイレージの好気的変敗を防止する方法。
【請求項７】
カルシウムイオンの添加がチーズホエーもしくはチーズホエー由来のカルシウムを高濃度で含む調製物の添加により行われる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１または２記載のカルシニューリン活性化剤を含む医薬組成物であって、抗がん剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤、記憶に関する障害の治療剤、循環器の疾患の治療剤からなる群から選択される医薬組成物。
【請求項９】
ＫＬＫＰ感受性酵母株にクリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）キラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤と被験物質を作用させ、被験物質のＫＬＫＰ感受性酵母の感受性を解除させる能力を指標にカルシニューリン阻害に関与する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
ＫＬＫＰ感受性酵母株にクリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）キラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤と被験物質を作用させ、被験物質のＫＬＫＰ感受性細胞の感受性を解除させる能力を指標にカルシニューリンが関与する疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
カルシニューリンが関与する疾患の治療薬が、抗がん剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤、記憶に関する障害の治療剤、循環器の疾患の治療剤からなる群から選択される請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）が生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）の利用に関する。具体的には、キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤に関する。さらに、該カルシニューリン活性化剤を含有する真核細胞の増殖阻害剤および真核細胞周期阻害剤に関する。
背景技術
近年酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のキラーシステムに関する種々の研究がされている。Ｋｌキラータンパク質はＴＯＫｌ過剰活性化し細胞膜機能を破壊する（Ａｈｍｅｄ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９９，２８３−２９１（１９９９））。また、キチンシンターゼＩＩＩの破壊および非局在化は酵母にＫ．ｌａｃｔｉｓキラータンパク質（ＫＬＫＰ）に対する耐性を付与する（Ｊａｂｌｏｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １８  ｐ．１２８５（２００１））。ＫＬＫＰはプラスミドｐＧＫＬ１上の遺伝子でコードされ、αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットの３つのサブユニットからなることが報告されている（Ｓｔａｒｋ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ａｕｇ，５（８），ｐ．１９９５−（１９８６））。
また、本発明者らは、先にＫＬＫＰの作用がＣａ２＋で活性化されることを報告した。しかし、そのキラー活性のメカニズムの解明はなされておらず、また、酵母キラータンパク質は、酵母のみに対してキラー活性を有するとされており、その産業への応用も醸造分野等に限られていた。
カルシニューリン（ＣａＮ）はＣａ２＋／カルモジュリン複合体で制御される真核生物唯一の脱リン酸化酵素で、細胞増殖・分化や転写制御の調節機構などＣａ２＋が介する情報伝達系の中心的役割を果たしている。酵母で明らかにされたＣａＮの作用機構は、高等真核生物におけるＣａＮの機能を解析する上で重要な情報となっている。ＣａＮ阻害剤は免疫抑制剤として実用化されているが、ＣａＮは様々な機能を持っており、さらに医療や農業への応用が期待されている。既に明らかにされたＣａＮの機能と、産業に応用されているものを表１に示した。
2003080841.tif 000002
出芽酵母を用いてＣａ２＋で活性化されたＣａＮが細胞周期エンジンの負の調節因子を活性化し、細胞周期を遅らせることが報告されている（ＮＡＴＵＲＥ，３９２，ｐ．３０３（１９９８））。
このように、カルシニューリンの活性化、阻害作用を有する物質は、真核細胞の増殖阻害剤、医薬等広く産業への応用が期待されているが、従来容易に入手可能なカルシニューリン活性化剤は多くなかった。
発明の開示
本発明は、キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤の提供を目的とする。さらに、本発明は、該カルシニューリン活性化剤を含有する真核細胞の増殖阻害剤および真核細胞周期阻害剤の提供を目的とする。カルシニューリン活性化剤を含む組成物は、真核細胞の増殖阻害剤、抗がん剤等に広く応用が可能であり、本発明はこのような真核細胞の増殖阻害剤、抗がん剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤、記憶に関する疾患の治療剤、循環器の疾患の治療剤の提供をも目的とする。
本発明者らは、キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）が出芽酵母細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）の細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ、カルシニューリン（ＣａＮ）を活性化させて細胞周期Ｇ２期遅延を引き起こすことを見い出した。さらに、ＫＬＫＰは植物培養細胞の増殖抑制も引き起こすことを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、クリュイベロミセス・ラクティスキラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤である。
本発明は、また以下のタンパク質を有効成分とする、上記真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤である。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるサブユニット、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるサブユニットおよび配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるサブユニットの３つのサブユニットからなるクリュイベロミセス・ラクティス  キラータンパク質（ＫＬＫＰ）、または
（ｂ）（ａ）のタンパク質において３つのサブユニットの少なくとも一つが配列番号２、３または４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるサブユニットであり、かつクリュイベロミセス・ラクティス  キラータンパク質（ＫＬＫＰ）活性を有するタンパク質。
本発明は、さらにカルシウムイオンと上記カルシニューリン活性化剤を含む真核細胞の増殖阻害剤である。
本発明は、さらにカルシウムイオンと上記カルシニューリン活性化剤を含む真核細胞周期阻害剤である。
本発明は、さらにチーズホエーもしくはチーズホエー由来のカルシウムを高濃度で含む調製物と上記カルシニューリン活性化剤を含む真核細胞周期阻害剤である。
本発明は、さらにカルシウムイオンおよび上記カルシニューリン活性化剤を同時にまたは別々にサイレージに添加する工程を含む、サイレージの好気的変敗を防止する方法である。
本発明は、さらにカルシウムイオンの添加がチーズホエーもしくはチーズホエー由来のカルシウムを高濃度で含む調製物の添加により行われる、上記方法である。
本発明は、さらに上記カルシニューリン活性化剤を含む医薬組成物であって、抗がん剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤、記憶に関する障害の治療剤、循環器の疾患の治療剤からなる群から選択される医薬組成物である。
本発明は、さらにＫＬＫＰ感受性酵母株にクリュイベロミセス・ラクティス  キラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤と被験物質を作用させ、被験物質のＫＬＫＰ感受性細胞の感受性を解除させる能力を指標にカルシニューリン阻害に関与する化合物をスクリーニングする方法である。
本発明は、さらにＫＬＫＰ感受性酵母株にクリュイベロミセス・ラクティス  キラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤と被験物質を作用させ、被験物質のＫＬＫＰ感受性酵母の感受性を解除させる能力を指標にカルシニューリンが関与する疾患の治療薬をスクリーニングする方法である。
本発明は、さらにカルシニューリンが関与する疾患の治療薬が、抗がん剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤、記憶に関する障害の治療剤、循環器の疾患の治療剤からなる群から選択される上記方法である。
以下、本発明について詳細に説明する。
１．キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）の取得
キラー酵母とは、他の酵母の生育を選択的に抑制するタンパク性のキラートキシンを生産する酵母をいう。本発明に用いるキラー酵母が生産するキラータンパク質ＫＬＫＰは、クリュイベロミセス・ラクティスから得ることができる（Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）７ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｂｏｏｋ，６２）。クリュイベロミセス・ラクティスの生産するキラータンパク質ＫＬＫＰは、３つのサブユニットα、βおよびγからなり、これらをコードするＤＮＡは線状プラスミドｐＧＫＬ１上に存在する。クリュイベロミセス・ラクティスとしては例えば、ＩＦ０１２６７株が挙げられる。クリュイベロミセス・ラクティスＩＦ０１２６７株は、財団法人  発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）から入手することができる。前記キラー酵母を培養し、培養物からＫＬＫＰを単離・精製することができる。ここで、培養物とは培養上清および培養菌体をいう。酵母の培養は、公知の方法により行うことができる。また、培養物からのＫＬＫＰの単離・精製も公知の生化学的手法を用いて行うことができ、例えばハイドロキシアパタイトカラムを用いて行うことができる。精製タンパク質がＫＬＫＰであることは、酵母キラー活性を有するかどうかを測定することにより決定することができる。
また、クリュイベロミセス・ラクティスからＫＬＫＰをコードする遺伝子を単離して、遺伝子工学的手法により組換えＫＬＫＰを得ることができる。
組換えＫＬＫＰの取得に必要なｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法、ＤＮＡの塩基配列の決定、ノーザンブロットによる発現の検討などの実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの編集したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２００１，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
配列番号１にＫＬＫＰが存在する線状プラスミドｐＧＫＬ１のＤＮＡ配列を示した。該ＤＮＡはアクセッション番号Ｘ００７６２でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。このうち、第３２２９位から６６６９位がキラータンパク質のラージサブユニットをコードしている。ラージサブユニットのアミノ酸配列のうち、第３０位から８９２位のアミノ酸配列がαサブユニットであり、第８９５位から第１１４６位がβサブユニットである。配列番号１の第７９３９位から第８６８８位がＫＬＫＰのスモールサブユニットすなわちγサブユニットをコードしている。配列番号２、３および４にそれぞれＫＬＫＰのαサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットのアミノ酸配列を示した。
配列番号２、３および４で表されるαサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットからなるタンパク質であって、３つのサブユニットのうちの少なくとも１つのサブユニットのアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してアミノ酸配列を有し、かつキラー酵母活性またはカルシニューリン活性化作用を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
このような配列番号２、３または４で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２、３または４のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、デフォルトすなわち初期設定の条件で計算した場合）、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するものが挙げられ、このような相同性を有する３つのサブユニットからなるタンパク質であって、キラー酵母活性またはカルシニューリン活性化作用を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
ここで、キラー酵母活性とは、野生酵母類の増殖を抑制する活性をいい、酵母に本発明のタンパク質を添加して培養した場合の酵母の増殖の抑制を指標に測定することができる。例えば、酵母を本発明のタンパク質を含むペーパーディスクを乗せた培地で培養し、阻止円の面積を測定する方法により、キラー酵母活性を測定することができる。
また、カルシニューリン活性化作用とは、細胞内のカルシウムイオンを増加させ、カルシウム情報伝達経路であるカルシニューリンを活性化する作用をいい、該活性化作用は、後述の方法により測定することができる。
該遺伝子を適当なベクターに組込み、該ベクターで適当な宿主を形質転換し、組換えＫＬＫＰを発現させ取得することができる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、イントロンの５’末端側に存在するスプライス供与部位およびイントロンの３’末端側に存在するスプライス受容部位からなるスプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌が挙げられ、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳ１２１等の昆虫細胞が挙げられる。
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより本発明のタンパク質を得ることができる。「形質転換体の培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりＫＬＫＰを抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスからの精製と同様に、ハイドロキシアパタイトゲルを用いたクロマトグラフィーにより精製するのが望ましい。
２．キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）のカルシニューリン活性化剤としての使用
上述のキラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスの培養物から精製したＫＬＫＰまたは遺伝子工学的手法により得られたＫＬＫＰを本発明のカルシニューリン（ＣａＮ）活性化剤として用いることができる。
キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスの生産するキラータンパク質は、カルシウムイオンの細胞内への流入による真核細胞内カルシウム濃度を上昇させ、カルシニューリンを活性化させて細胞周期Ｇ２期遅延を引き起こす。
ここで、細胞内へのカルシウムイオンの流入とは、細胞外に存在するカルシウムイオンの細胞内部への流入だけでなく、細胞内のオルガネラ中に存在するカルシウムイオンの細胞質内への流入をも含む。従って、細胞内カルシウムイオン濃度の増加とは、細胞質中のカルシウムイオン濃度を増加をいう。
本発明のＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤は、真核生物の細胞増殖・分化や転写制御の調節機構などのＣａ２＋が介する情報伝達系の研究用試薬として用いることができる。また、カルシニューリンの活性化は細胞周期Ｇ２期遅延を引き起こすので、本発明のカルシニューリン活性化剤は、酵母、植物、動物細胞等の真核細胞の細胞周期阻害剤として用いることができ、さらに細胞周期を阻害することから細胞増殖阻害剤としても使用することができる。さらに、カルシニューリンの活性化は、Ｔ細胞の増殖、がん細胞の分化誘導、アポトーシス、筋原繊維の再構築をもたらすので、免疫系の活性化、抗がん剤等としても使用することが可能である。
ＫＬＫＰのカルシニューリン活性化作用は、以下のようにして確認することができる。
カルシウム情報伝達経路がＳｗｅ１を活性化することにもとづき、カルシウム情報伝達経路を遮断した場合のキラー感受性の変化により確認できる。
また、Δｚｄｓ１（Ｚｄｓ１破壊株）においてカルシウム存在下、ＫＬＫＰを共存させた場合に細胞の細胞周期がＧ２期で遅れることを指標にしてもカルシウム情報伝達経路であるカルシニューリンが活性化していることを確認することができる。Ｇ２期での遅延はＦＡＣＳ解析により確認することができる。
３．キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）の細胞増殖阻害剤としての使用
本発明のキラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）は、細胞の増殖阻害剤として用いることができる。
ＫＬＫＰを細胞と接触させること、または細胞内で発現させることにより細胞増殖阻害剤として用いることができる。
例えば、ＫＬＫＰを抗かび剤等として真菌類の増殖抑制に使用し得るし、また細胞増殖を阻害することから植物体等の生物体そのものの増殖阻害剤としても用い得る。細胞または生物体と接触させるＫＬＫＰは増殖を阻害させようとする生物種、量により適宜決定することができる。例えば、培養タバコ細胞の場合、生重量で１／４０量の細胞を添加した培養液に、ＫＬＫＰを最終濃度１／１００〜１／１０００となるように添加すればよい。
４．キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）を用いたサイレージ（牛の飼料）の変敗防止
サイレージとは、草を乳酸発酵させ保存性を高めた反芻家畜の飼料である。サイレージが好気的条件に曝されると、酵母の乳酸代謝により好気的変敗が進む。このような好気的変敗を防止するためには、変敗の原因となる乳酸資化性の野生酵母類の増殖を抑制することが必要である。
キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）はカルシウムイオン存在下に酵母等の真菌細胞の増殖を抑制することから、ＫＬＫＰをサイレージの変敗防止に使用することができる。サイレージ１ｋｇ当たり、カルシウムイオン０．１〜０．５ｇ、ＫＬＫＰを０．１〜０．５ｇ添加すればよい。また、カルシウムイオンの供給源として、例えばチーズホエーを用いることができる。カルシウムイオンとＫＬＫＰは同時にサイレージに添加してもよいし、別々に添加してもよい。
カルシウムイオンもしくはカルシウムイオン供給源とＫＬＫＰを含むサイレージ変敗防止用の組成物も本発明の範囲に含まれる。
５．キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）の医薬としての使用
ＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤を医薬として用いることもできる。カルシニューリンは、種々の機能を有することからカルシニューリンを活性化させることにより種々の疾患の予防・治療に用いることが可能である。
本発明のＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤は、例えば抗がん剤として利用することができる。さらに、本発明のＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤は、免疫抑制剤、免疫活性化剤、記憶に関する障害の治療剤、循環器の疾患の治療剤としても利用することができる。ＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤を含む医薬組成物も本発明の範囲に包含される。ここで、記憶に関する障害として、例えば記憶減退（ｈｙｐｏｍｎｅｓｉａ）、記憶消失（ａｍｎｅｓｉａ）、前向健忘症、情動健忘症が挙げられる。循環器の疾患として、例えば虚血性神経細胞障害が挙げられる。
本発明のＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤を患者に投与してがん、記憶に関する障害を治療する方法、循環器の疾患を治療する方法、免疫を抑制または活性化する方法も本発明の範囲に包含される。また、本発明のＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤の抗がん剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤、記憶に関する障害の治療剤、循環器の疾患の治療剤の製造への使用も本発明の範囲に包含される。
本発明の医薬は、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、ＫＬＫＰまたはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常経口投与では、１日約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇであり、１回または数回に分けて投与される。また、非経口投与では、１回あたり、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇを皮下注射、筋肉注射、または静脈注射によって投与される。
さらに、本発明のクリュイベロミセス・ラクティスキラータンパク質（ＫＬＫＰ）を有効成分とする、真核細胞のカルシウムイオンの細胞内への流入による細胞内カルシウムイオン濃度増加作用を有するカルシニューリン活性化剤をカルシニューリンが関与する疾患の治療薬のスクリーニングに用いることができる。例えば、以下のようにして行うことができる。
Δｚｄｓ１（Ｚｄｓ１破壊株）等のＫＬＫＰ感受性株をマイクロプレートに培地およびカルシウムとともに入れ、ＫＬＫＰを添加、または組換えＫＬＫＰを発現させると通常は増殖阻害が起こる。各種の薬剤を添加したときに、増殖阻害がおきなかった場合、その薬剤はカルシニューリン阻害剤と判断できる。
このスクリーニングは酵母だけではなく、動物細胞を用いても行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１  キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）の精製
酵母クリュイベロミセス・ラクティスＩＦＯ１２６７株を植菌した１００ｍｌのＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）を５００ｍｌ容フラスコにいれ、２８℃、２２０回転で一夜回転振とう培養した。１．３Ｌの培養液を遠心した上清を０．２μｍフィルター濾過後、限外濾過装置（旭化成ＡＣＰ−１０１０およびＳＬＰ−００５３）で１０ｍｌまで濃縮した。１０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６．８で置換後、同バッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（ナカライテクス１８７−３７、１００−２００ｍｅｓｈ）に吸着させた。１０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６．８で洗浄後、４００ｍＭのリン酸カリウムバッファー６．８でキラータンパク質を遊離させた。キラー活性を持つフラクションを集め、５０ｍＭクエン酸リン酸バッファーｐＨ６．０で透析後、０．２μｍフィルターを用いて濾過滅菌し、最終濃度が１０％になるようにグリセロールを加えて１０ｍｌとし、−８０℃で保存した。
実施例２  キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）による細胞内Ｃａ２＋の上昇およびカルシニューリン活性化
９種のキラー酵母培養濾液をＣａ２＋存在下出芽酵母に作用させ、生育阻害を調べた。９種のキラー酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＣＹＣ２３５株（キラータイプの名称はＫ１、以下同様）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＣＹＣ７３８株（Ｋ２）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＣＹＣ７６１株（Ｋ３）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＮＣＹＣ３８８株（Ｋ４）、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ  ＮＣＹＣ４３４株（Ｋ５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ＮＣＹＣ５８７株（Ｋ６）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ  ＮＣＹＣ３２７株（Ｋ７）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＹＣ５７５株（Ｋ１０）およびＷｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ  ＩＦＯ０１１７株であった。さらに、キラー酵母培養濾液からハイドロキシアパタイトカラムを用いて精製したＫＬＫＰを用いて各種金属塩存在下での細胞周期関連遺伝子変異株の増殖を９６穴マイクロプレート上で調べた。同様に５０ｍＭ  Ｃａ２＋，１／１００  ＫＬＫＰ存在下フラスコ内で振とう培養後、経時的に生菌数を調べた。さらに固定した細胞の細胞周期をフローサイトメトリー装置（ＦＡＣＳ）で調べ、形態、核、アクチンとキチンを蛍光顕微鏡観察で解析した。その結果以下のことが判明した。
供試したキラー酵母の内４株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＣＹＣ７３８株（Ｋ２）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＣＹＣ７６１株（Ｋ３）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ  ＮＣＹＣ３２７株（Ｋ７）およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＹＣ５７５株（Ｋ１０））がＣａ２＋共存下出芽酵母の増殖を阻害したが、本研究で用いたクリュイベロミセス・ラクティス培養液は他のキラー酵母が活性を示さない１０倍希釈でも強い増殖阻害活性を示した（図１）。図１中、白いバーはカルシウムありの場合であり、黒いバーがカルシウムなしの場合である。横軸は、増殖の程度を示す。
また、出芽酵母Ｗ３０３株は高いＣａ２＋濃度でＫＬＫＰによって増殖阻害されたが、Ｚｎ２＋，Ｍｎ２＋，Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋の影響は受けなかった（図２（ａ），（ｂ））。Ｗ３０３株から分離された高濃度Ｃａ２＋に感受性を示すΔｚｄｓ１株（Ｚｄｓ１破壊株）は、Ｗ３０３株より低濃度のＫＬＫＰに感受性を示しただけでなく、Ｃａ２＋キレート剤ＥＧＴＡ添加によりＫＬＫＰによる生育阻害が抑えられた（図３（ｂ））。Ｚｄｓ１は細胞周期エンジンの負の調節因子であるＳｗｅ１の転写抑制を行う。Δｚｄｓ１ではＳｗｅ１が転写され、Ｃｄｃ２８−Ｃ１ｂ細胞周期エンジンがリン酸化されるために細胞周期Ｇ２期で遅れる。また、Ｃａ２＋情報伝達系カルシニューリンとＭｐｋ１  ＭＡＰキナーゼは各々Ｃａ２＋存在下Ｓｗｅ１の転写と活性化をして、細胞周期エンジンを負に制御する（図４）。図４のメカニズムはＭｉｚｕｎｕｍａらにより報告された（ＮＡＴＵＲＥ，３９２，ｐ．３０３（１９９８））。そこでΔｚｄｓ１ではＣａ２＋の細胞周期への影響を見ることができる。Δｚｄｓ１とＣａ２＋情報伝達系の２重遺伝子破壊株Δｚｄｓ１Δｓｗｅ１，Δｚｄｓ１Δｃｎｂ１（カルシニューリンサブユニット），Δｚｄｓ１Δｍｐｋ１は、０．１〜３００ｍＭ  Ｃａ２＋においてΔｚｄｓ１に比べてＫＬＫＰ感受性が低くなった（図３（ｃ），（ｄ），（ｅ））。
ＦＡＣＳ解析の結果、ＫＬＫＰ添加によりΔｚｄｓ１株ではＧ２期の細胞が多くなった（図５）。一方、Δｚｄｓ１Δｃｎｂ１，Δｚｄｓ１Δｓｗｅ１はＫＬＫＰ添加でＧ１期の細胞が増え、Δｚｄｓ１Δｍｐｋ１ではＫＬＫＰ無添加と変わらず、いずれもＧ２期の細胞は増えない（図６）。図５および図６中のＦＡＣＳ解析図中２本のピークのうち第１番目のピークがＧ１期の細胞の増加を、第２番目のピークがＧ２期の細胞の増加を示す。
このことから、ＫＬＫＰ添加で出芽酵母の細胞周期Ｇ２期で遅れ、この作用はＣａ２＋で活性化されることが明らかになった。この機構には、Ｃａ２＋情報伝達経路によるＳｗｅ１キナーゼの活性化が関わる。ＫＬＫＰは出芽酵母細胞周期Ｇ１期で停止させることが知られているが、高濃度では他の細胞周期で止まる場合もあると報告されている。そこで、ＫＬＫＰの細胞周期抑制はＧ１期とＧ２期２箇所あり、Ｃａ２＋により活性化される機構はＧ２期を遅延すると結論した。Ｃａ２＋情報伝達経路が遮断されると、図６で見られたようにもう一方のＧ１期での細胞周期抑制が観察される。
この培養条件で、Ｗ３０３株の生菌数にはほとんど影響が出ないが、Δｚｄｓ１株はＫＬＫＰ添加で急速に死滅し、ＫＬＫＰ超感受性を示した（図７（ａ），（ｂ））。図７中灰色線は総菌体数を示す。また、図７（ａ）は親株Ｗ３０３株の結果を、図７（ｂ）はΔｚｄｓ株の結果を示す。
この培養条件で、Ｗ３０３株の生菌数にはほとんど影響が出ないが、Δｚｄｓ１株はＫＬＫＰ添加で急速に死滅し、ＫＬＫＰ超感受性を示した（図７）。
ＫＬＫＰはキチンを認識することが知られている。通常キチンは出芽痕に局在するが、Ｗ３０３株、Δｚｄｓ１株ともにＣａ２＋，ＫＬＫＰ添加でキチンの塊が細胞表層に点在した（図８（ａ））。また、アクチンは通常出芽の方向にケーブルが走り、出芽位置にパッチが局在するが、Ｃａ２＋はアクチン局在に影響を与えることが知られている。Ｗ３０３株、Δｚｄｓ１株ともにＫＬＫＰ添加によってアクチン局在が欠損した。ＫＬＫＰによるキチン、アクチン局在欠損はＣａ２＋共存で強められ、Ｗ３０３株よりもΔｚｄｓ１株が深刻だった（図８（ｂ））。このようにＫＬＫＰは通常静菌的効果を示し、アクチンの局在欠損を引き起こす。さらに、ＫＬＫＰ超感受性株や、Ｃａ２＋によるＫＬＫＰ活性化によってキチン局在欠損も引き起こす。また、細胞を殺すことが観察された。
さらに、ＫＬＫＰによる細胞内カルシウム濃度上昇を測定した。
発光タンパク質エクオリン前駆体を発現させた酵母であってカルシウムイオンを含まない培地で培養した酵母に基質（セレンタジン）を吸収させた後Ｃａ２＋とＫＬＫＰを作用させ、フォトンカウンターで発光量を測定した。また、Ｃａ２＋流入のコントロールとしてカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を用いた。
また、Ｃａ２＋で誘導されるタンパク質のプロモーターの下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を接続したプラスミドを形質転換した酵母にＫＬＫＰを作用させ、５分後に細胞を水で洗浄した。その後液体培地を加えて４時間振とうして、細胞内Ｃａ２＋濃度に対応してβ−ガラクトシダーゼを発現させた。細胞をエーテル処理したのち、基質（ＯＮＰＧ）を加えて細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を調べた。結果を図９（ａ）ａ〜ｆに示し（エクエリオン測定法）、βガラクトシダーゼ活性を図９（ｂ）に示した（レポーターアッセイ法）。図９（ａ）中、（ａ）ａは野生型の結果を、（ａ）ｂから（ａ）ｆはエクオリン前駆体発現細胞での結果を示す。
その結果、エクオリン前駆体を発現させた細胞（図９（ａ）ｂ〜ｆ）はＣａ２＋添加でわずかに発光し（図９（ａ）ｃ）、Ｃａ２＋，カルシウムイオノフォア添加で発光量が２．４倍になった（図９（ａ）ｄ）。一方、カルシウムイオノフォア同様ＫＬＫＰ単独では発光を誘導しない（図９（ａ）ｅ）が、Ｃａ２＋、ＫＬＫＰ添加によりＣａ２＋添加の発光に比べて２．４倍の発光を生じ（図９（ａ）ｆ）、ＫＬＫＰ添加後ただちにカルシウムイオノフォアと同等のＣａ２＋が細胞内で増加したことが確認された。
続いて、レポーターアッセイを行った。ＫＬＫＰ処理をした細胞は、β−ガラクトシダーゼ活性が増えたため、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したと考えられる（図９（ｂ））。
以上の２つの方法により、ＫＬＫＰ処理により、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇することが確認された。
さらに、４５Ｃａを用いてＫＬＫＰの作用解析を行った。カルシウム欠乏培地で培養した酵母細胞に４５Ｃａを添加した。９分後にカルシウム吸収量が平坦域に達してから、ＫＬＫＰを添加した。４５Ｃａ添加後２分ごとに細胞を取り、細胞中の４５Ｃａの量を測定した。その結果、ＫＬＫＰ添加後の細胞中のカルシウムの量がＫＬＫＰ無添加の場合に比べて１．５倍から２倍に上昇した（図１１）。
図９および図１１に示すように、ＫＬＫＰによって細胞外からカルシウムイオンが流入することが確認された。
ＫＬＫＰによるカルシニューリンの活性化は以下の方法で確認した。
カルシウム情報伝達経路は、Ｓｗｅ１を活性化する（図４）ことに基づき、Ｃａ２＋情報伝達によるＳｗｅ１活性化が観察できるようにΔｚｄｓ１株を用いた。
カルシウム情報伝達経路を遮断した場合、キラー感受性が低下した。特に、Ｃｎｂ１との２重破壊では、親株に比べても耐性となっており、カルシニューリンがないと、キラー感受性にならない。
Δｚｄｓ１株は、カルシウムを添加するとＧ２期で遅れることが知られているが、ＦＡＣＳ解析の結果、カルシウム存在下にＫＬＫＰを共存させると、さらにＧ２期で遅れることから（図５）、図４のカルシウム情報伝達系が活性化していることが確認された。
以上の結果から、ＫＬＫＰによって細胞内カルシウム濃度が上昇し、カルシウム情報伝達経路カルシニューリンが活性化され、細胞周期Ｇ２期で遅れる機構があることがわかった。
実施例３  キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）による植物培養細胞増殖抑制
タバコ培養細胞（ＢＹ細胞）２８℃７日間増殖させたもの１ｍｌを、３％しょ糖を含むムラシゲ・スクーグ培地２０ｍｌに添加した。ＫＬＫＰを最終濃度１／１００〜１／１０００００加え、２８℃１１５回転で５日間培養した。培養液ごと細胞をメモリ付き試験管に移し、静置後、沈殿した細胞の量を測定した。また、ＫＬＫＰ無添加と１／１００添加した細胞を蛍光試薬ＤＡＰＩで染色し、細胞と核の形態を観察した。
その結果、１／１００濃度のＫＬＫＰ存在下では培養細胞の増殖は無添加の半分程度であった、１／１０００濃度でも無添加の８割程度の細胞量となり、ＫＬＫＰによって細胞の増殖が阻害されることが示された。さらにＫＬＫＰ添加により細胞が通常よりも大きくなっており、このことからも分裂阻害が示された（図１１）。図１１中、図１１（ａ）は細胞の増加を、図１１（ｂ）は細胞の形態の変化を示す。また、ＫＬＫＰは酵母以外の真核生物にも作用することが明らかになった。
産業上の利用性
実施例２に示すように、キラー酵母クリュイベロミセス・ラクティスが生産するキラータンパク質（ＫＬＫＰ）は真核細胞において、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ、カルシニューリンを活性化させるので、真核細胞におけるカルシニューリン活性化剤として利用することができる。また、カルシウムイオンの存在下で真核細胞の細胞周期をＧ２期で止めることができ、細胞周期阻害剤として利用することができる。特に、実施例３に示すように酵母以外の真核細胞の細胞増殖を抑制することが可能であり、広く細胞増殖阻害剤として用いることができる。特に本発明のＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤をカルシウムイオン供給源とともにサイレージに添加することによりサイレージの変敗を防止することができる。
また、本発明のＫＬＫＰを有効成分とするカルシニューリン活性化剤を抗がん剤等の医薬として用いることが可能である。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
2003080841.tif 000003
2003080841.tif 000004
2003080841.tif 000005
2003080841.tif 000006
2003080841.tif 000007
2003080841.tif 000008
2003080841.tif 000009
2003080841.tif 000010
2003080841.tif 000011
2003080841.tif 000012
2003080841.tif 000013
2003080841.tif 000014
2003080841.tif 000015
2003080841.tif 000016
2003080841.tif 000017
2003080841.tif 000018
【図面の簡単な説明】
図１は、カルシウムで活性化されるキラータンパク質の検索の結果を示す図である。
図２は、Ｗ３０３株に対するＫＬＫＰのキラー効果を示す図である。（ａ）はＣａ２＋共存下の結果、（ｂ）はその他のイオン共存下の結果を示す。
図３は、Ｃａ２＋情報伝達系変異株に対するキラー効果を示す図である。図３Ａは（ａ）親株Ｗ３０３株および（ｂ）そのｚｄｓ１遺伝子破壊株（Δｚｄｓ１）の結果を示し、図３ＢはΔｚｄｓ１との二重遣伝子破壊株の結果を示す。（ｃ）がΔｚｄｓ１Δｓｗｅ１、（ｄ）がΔｚｄｓ１Δｃｎｂ１および（ｅ）がΔｚｄｓ１Δｍｐｋ１の結果を示す。
図４は、出芽酵母Ｃａ２＋情報伝達系に関わる細胞周期Ｇ２／Ｍ期モデルを示す図である。
図５は、ＫＬＫＰを作用させたΔｚｄｓ１株（Ｚｄｓ１破壊株）のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
図６は、ＫＬＫＰを作用させたΔｚｄｓ１とＣａ２＋情報伝達系の二重変異株のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。（ａ）がΔｚｄｓ１Δｃｎｂ１、（ｂ）がΔｚｄｓ１Δｓｗｅ１および（ｃ）がΔｚｄｓ１Δｍｐｋ１の結果を示す。
図７は、ＫＬＫＰの生菌数への影響を示す図である。（ａ）が親株Ｗ３０３株について、（ｂ）がΔｚｄｓ１についての結果を示す。
図８は、ＫＬＫＰを作用させた細胞の（ａ）キチン（９時間後）、（ｂ）アクチン（６時間後）の様子を示す写真である。
図９は、野生型およびエクオリンを発現させた細胞における発光量（図９（ａ））およびＫＬＫＰによる細胞内カルシウムの増加（レポーターアッセイ法）（図９（ｂ））を示す図である。
図１０は、４５Ｃａを用いたＫＬＫＰの作用解析の結果を示す図である。
図１１は、ＫＬＫＰを作用させたタバコ培養細胞の生育を示す写真である。
【図１】
2003080841.tif 000019
【図２】
2003080841.tif 000020
【図３Ａ】
2003080841.tif 000021
【図３Ｂ】
2003080841.tif 000022
【図４】
2003080841.tif 000023
【図５】
2003080841.tif 000024
【図６】
2003080841.tif 000025
【図７】
2003080841.tif 000026
【図８】
2003080841.tif 000027
【図９】
2003080841.tif 000028
【図１０】
2003080841.tif 000029
【図１１】
2003080841.tif 000030
【国際調査報告】
2003080841.tif 000031
2003080841.tif 000032
2003080841.tif 000033
2003080841.tif 000034