(57)【要約】イン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するＷＴ１由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらペプチドやポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用した癌ワクチンなどを提供する。本発明の癌ワクチンは多くの癌患者を処置することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
2003106682.tif 000047
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号：２、３、４、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号：２、３、４、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み、かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性を有するペプチド（ただし、配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドは除く）。
【請求項４】
配列番号：２、３、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列の第９位のロイシンをフェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシンまたはメチオニンに置換した改変アミノ酸配列を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号：４のアミノ酸配列の第９位のフェニルアラニンをトリプトファン、ロイシン、イソロイシンまたはメチオニンに置換した改変アミノ酸配列を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号：４のアミノ酸配列の第５位のシステインをアラニン、セリンまたはα−アミノ酪酸に置換した改変アミノ酸配列（配列番号：６６、６７または６８）を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号：２、３、４、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列からなる、請求項３〜６のいずれか記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号：２〜６および６６〜６８のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列をコードする、請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか記載のペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞。
【請求項１５】
配列番号：２〜６および６６〜６８のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、請求項１４記載の抗原提示細胞。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ。
【請求項１７】
配列番号：２〜６および６６〜６８のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、請求項１６記載のＣＴＬ。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか記載のペプチド、請求項８または９記載のポリヌクレオチド、請求項１０記載の発現ベクター、請求項１１記載の細胞、請求項１４または１５記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１６または１７記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか記載のペプチド、請求項８または９記載のポリヌクレオチド、請求項１０記載の発現ベクター、請求項１１記載の細胞、請求項１４または１５記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１６または１７記載のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか記載のペプチド、請求項８または９記載のポリヌクレオチド、請求項１０記載の発現ベクター、請求項１１記載の細胞、請求項１４または１５記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１６または１７記載のＣＴＬにおける、癌ワクチンを製造するための使用。
【請求項２１】
癌を治療または予防するための方法であって、請求項１〜７のいずれか記載のペプチド、請求項８または９記載のポリヌクレオチド、請求項１０記載の発現ベクター、請求項１１記載の細胞、請求項１４または１５記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１６または１７記載のＣＴＬの治療または予防に有効な量を、それを必要としているＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の癌患者に投与する方法。
【請求項２２】
以下のａ）〜ｆ）
ａ）Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ（配列番号：７）を含むペプチド、
ｂ）上記ａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）上記ｂ）のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
ｄ）上記ｃ）の発現ベクターを含有する細胞、
ｅ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、および
ｆ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
のなかから選ばれるいずれかと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２３】
以下のａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むペプチド、
ｂ）上記ａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）上記ｂ）のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
ｄ）上記ｃ）の発現ベクターを含有する細胞、
ｅ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、および
ｆ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
のなかから選ばれるいずれかを有効成分とする癌ワクチン。
【請求項２４】
以下のａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むペプチド、
ｂ）上記ａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）上記ｂ）のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
ｄ）上記ｃ）の発現ベクターを含有する細胞、
ｅ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、および
ｆ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
のなかから選ばれるいずれかにおける、癌ワクチンを製造するための使用。
【請求項２５】
癌を治療または予防するための方法であって、以下のａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むペプチド、
ｂ）上記ａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）上記ｂ）のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
ｄ）上記ｃ）の発現ベクターを含有する細胞、
ｅ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、および
ｆ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
のなかから選ばれるいずれかの治療または予防に有効な量を、それを必要としているＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の癌患者に投与する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は癌ワクチン療法の分野に属し、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドに関する。詳細には、本発明は、イン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するＷＴ１由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを含有する癌ワクチン、癌ワクチンとしての使用およびそれを利用する癌の治療・予防方法に関する。
背景技術
生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌細胞上の癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）とＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡ抗原と称する）により形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃・破壊する。
癌抗原タンパク質は、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．１０：２８１，１９９９のｔａｂｌｅ１に記載のものが代表例として挙げられる。具体的にはメラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４）、ＭＡＲＴ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４）、およびチロシナーゼ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３）などのメラノソーム抗原、メラノーマ以外の癌抗原タンパク質としてはＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５）、ＣＥＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８７：９８２，１９９５）、およびＰＳＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）などの癌マーカーが挙げられる。癌抗原ペプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成される約８から１１個のアミノ酸から成るペプチドであり（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：７０９，１９９３；Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：７１９，１９９３；Ｃｅｌｌ，８２：１３，１９９５；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４６：１６７，１９９５）、前記のように、この生成された癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）との複合体が細胞表面に提示され、ＣＴＬにより認識される。従って、ＣＴＬによる癌細胞破壊を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、ＣＴＬを効率良く誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質より同定することが、非常に重要となる。
ＭＨＣクラスＩ分子は、多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２の結合モチーフは、２番目のアミノ酸がロイシン、メチオニンまたはイソロイシン、９番目のアミノ酸がバリン、ロイシンまたはイソロイシンである。またＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフは、２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファン、９番目のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。また最近では、前記モチーフを含むＨＬＡ抗原への推定結合配列をデータベース上で検索することも可能である（例えばＢＩＭＡＳソフト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／））。従って、ＣＴＬを誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質より同定するには、第一に、癌抗原タンパク質のアミノ酸配列より目的のＨＬＡタイプの結合モチーフまたは推定結合配列に一致する約８から１１個のアミノ酸より構成されるペプチド領域を同定する。
しかしながら、結合モチーフや推定結合配列より同定されたペプチドが必ず免疫原性を有するとは限らない。癌抗原ペプチドは癌抗原タンパク質が細胞内でプロセシングされることにより生成されるため、プロセシングにより生成されないペプチドは抗原ペプチドとはなり得ない。さらに、結合モチーフや推定結合配列を有するペプチドが実際に癌抗原ペプチドとして細胞内で生成されても、多くの癌抗原タンパク質は本来生体に存在する正常な物質であるため、ＣＴＬはこれら癌抗原に対してトレランスとなっている場合がある。以上のことから、ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを同定するためには、目的のＨＬＡタイプの結合モチーフ・推定結合配列による予測のみでは不充分であり、イン・ビボでの免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）の評価が重要となる。
Ｗｉｌｍｓ癌の癌抑制遺伝子ＷＴ１（ＷＴ１遺伝子）は、Ｗｉｌｍｓ癌、無紅彩、泌尿生殖異常、精神発達遅延などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ癌の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離され（Ｎａｔｕｒｅ，３４３：７７４，１９９０）、そのゲノムＤＮＡは約５０ｋｂで１０のエキソンから成り、そのｃＤＮＡは約３ｋｂである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０）。ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平９−１０４６２７号公報）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特開平９−１０４６２７号公報、特開平１１−３５４８４号公報）、白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質であることが判明した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１８７３−８０，２０００、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，１９５−２０２，２０００）。癌免疫療法剤（癌ワクチン）は多くの癌患者に対して適用可能であることが好ましいことから、多くの癌種で高発現しているＷＴ１における癌抗原ペプチドの同定、および当該癌抗原ペプチドを利用した癌ワクチンの開発は重要である。これに関してＷＯ００／０６６０２号公報およびＷＯ００／１８７９５号公報には、ＷＴ１タンパクの部分から成る幾つかの天然型の癌抗原ペプチドが記載されている。
前記癌ワクチンの開発においてイン・ビボにおける有用性を評価するには、実験動物として一般に使用されている純系マウスは使用できず、ＨＬＡを発現するヒトモデル動物を用いる必要がある。すなわち、癌ワクチンとして用いられるヒト抗原ペプチドは、ＨＬＡに提示されることにより特異的免疫応答を誘導することが可能となるものであるが、当該ＨＬＡはヒトに特異的なＭＨＣクラスＩ分子であるため、ＨＬＡを有さない非ヒト動物をヒト治療用癌ワクチンのイン・ビボ評価に使用することは出来ない。従って、前記のように癌ワクチンの有用性の評価には、ＨＬＡを発現するヒトモデル動物が必要である。
発明の開示
本発明の目的は、イン・ビボにおいて免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有するＷＴ１由来の癌抗原ペプチド、およびそれを含有する癌ワクチン、その癌ワクチンとしての使用およびそれを利用する癌の治療・予防方法を提供することにある。
最近、ＨＬＡ−Ａ２４抗原を発現しイン・ビボでの評価に使用できるヒトモデル動物が作製され、特許出願されている（ＷＯ  ０２／４７４７４、国際公開日：２００２年６月２０日、出願人：住友製薬株式会社）。
これにより、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原タンパク、癌抗原ペプチドおよびそれらの遺伝子をイン・ビボで評価することができるようになった。
本発明者らは、前記ヒトモデルマウスを用いて、ＷＴ１に由来するＨＬＡ−Ａ２４拘束性の天然型ペプチドおよび改変型ペプチドの評価を行った。すなわち、ＢＩＭＡＳソフト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）により推定したＷＴ１中のＨＬＡ−Ａ２４抗原への推定結合配列（結合モチーフ）を有するペプチドについて評価した結果、以下の天然型ペプチド：
2003106682.tif 000002
において、唯一ペプチドＢ（配列番号：７）のみが、イン・ビボにて免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有することを見出した。
さらに前記ペプチドＡ〜Ｃの第２位のアミノ酸をチロシン（Ｔｙｒ）に改変した以下の改変型ペプチド：
2003106682.tif 000003
を作製し同様の評価を行った。その結果、改変型ペプチドＧは、もとの天然型ペプチドＢよりも、より高い免疫原性を有することを見出した。また、天然型ペプチドＡおよびＣが免疫原性を有していなかったにもかかわらず、その改変型ペプチドＦおよびＨは、高い免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有することを見出した。
さらに、前記と同様、ＢＩＭＡＳソフトにより検索されたＷＴ１中のＨＬＡ−Ａ２４抗原への推定結合配列を有するヒトＷＴ１由来の以下の天然型ペプチド（ペプチドＫ、Ｌ）、およびその第２位のアミノ酸をチロシンに改変した以下の改変型ペプチド（ペプチドＩ、Ｊ）：
2003106682.tif 000004
についても同様の評価を行った。その結果、天然型ペプチドＫおよびＬは免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有していなかったにもかかわらず、その改変型ペプチドＩおよびＪはイン・ビボで高い免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有することを見出した。
これらの知見から、本発明者らは、前記配列番号：２〜６で示された改変型ペプチド、および配列番号：７で示された天然型ペプチドは、癌ワクチンとして種々の形態で利用可能であるとの確信を得た。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は：
（Ｉ）  以下のアミノ酸配列：
2003106682.tif 000005
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド；または配列番号：２、３、４、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド；あるいは
配列番号：２、３、４、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み、かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性を有するペプチド（ただし、配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドは除く）、好ましくは配列番号：２、３、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列の第９位のロイシンをフェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシンまたはメチオニンに置換した改変アミノ酸配列を含む、本発明のペプチド；配列番号：４のアミノ酸配列の第９位のフェニルアラニンをトリプトファン、ロイシン、イソロイシンまたはメチオニンに置換した改変アミノ酸配列を含む、本発明のペプチド；または配列番号：４のアミノ酸配列の第５位のシステインをアラニン、セリンまたはα−アミノ酪酸に置換した改変アミノ酸配列（配列番号：６６、６７または６８）を含む、本発明のペプチド；または配列番号：２、３、４、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列からなる、本発明のペプチド；
（ＩＩ）  本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：２〜６および６６〜６８のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列をコードする、本発明のポリヌクレオチド；あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；あるいは、本発明の発現ベクターを含有する形質転換細胞；あるいは、本発明の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、本発明のペプチドの製造方法；
（ＩＩＩ）本発明のペプチドに特異的に結合する抗体；
（ＩＶ）本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、好ましくは配列番号：２〜６および６６〜６８のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、本発明の抗原提示細胞；
（Ｖ）本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、好ましくは配列番号：２〜６および６６〜６８のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、本発明のＣＴＬ；および
（ＶＩ）本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、本発明の形質転換細胞、本発明の抗原提示細胞、あるいは本発明のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、具体的には癌ワクチン、ならびに本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換細胞、抗原提示細胞あるいはＣＴＬにおける癌ワクチンを製造するための使用、およびそれら発明の治療または予防に有効な量をそれを必要としている癌患者に投与する癌を治療または予防するための方法に関する。
さらに、本発明は、
（ＶＩＩ）以下のａ）〜ｆ）
ａ）Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ（配列番号：７）を含むペプチド、
ｂ）上記ａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）上記ｂ）のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
ｄ）上記ｃ）の発現ベクターを含有する細胞、
ｅ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、および
ｆ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
のなかから選ばれるいずれかと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、具体的には癌ワクチン、ならびに上記ペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換細胞、抗原提示細胞あるいはＣＴＬにおける癌ワクチンを製造するための使用、およびそれら発明の治療または予防に有効な量をそれを必要としている癌患者に投与する癌を治療または予防するための方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
（Ｉ）本発明のペプチド
本発明のペプチドは、ヒトＷＴ１（Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０、ＮＣＢＩデータベース  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＰ＿０３４４１８、配列番号：１）に由来し、イン・ビボでＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性（免疫原性）を有する。
本発明のペプチドは、抗原提示細胞に提示されて、イン・ビボにてＨＬＡ−Ａ２４抗原拘束性にＣＴＬを誘導するという特性を有する。当該特性は、後述の参考例に詳細に記述されるＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることにより調べることができる。
配列番号：２、３、４、５および６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含む本発明ペプチドは、本発明ペプチド由来の癌抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬを誘導するという特性を有する限り、何ら制限されないが、その長さは通常９〜１００個、好ましくは９〜５０個、より好ましくは９〜３０個、さらに好ましくは９〜２０個、そしてさらに好ましくは９〜１１個のアミノ酸残基である。ここに、癌抗原ペプチドとは、抗原提示細胞に提示される、ＣＴＬ誘導活性を導くペプチドとして定義される。
本発明ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），ｖｏｌ  ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
また本発明のペプチドは、本発明ペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。当該ＤＮＡ合成や各種プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収などの操作は、当業者に周知の方法、文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））、あるいは後述の（ＩＩ）項に記載の方法などに準じて行うことができる。
以下、本発明のペプチドについてより具体的に説明する。
（１）配列番号：２〜６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
本発明は前述のように、配列番号：２〜６に示されるＷＴ１由来の改変型ペプチドが、イン・ビボにてＣＴＬ誘導活性を有するという新たな知見を得たことに基づく。配列番号：２〜６に示される新規なペプチドがイン・ビボにおいてＣＴＬ誘導活性を確かに示すという知見は、従来知られていなかった。これら改変型ペプチドのいずれかを含む本発明のペプチドは、癌免疫療法におけるＣＴＬ誘導剤の有効成分として、また癌ワクチンの有効成分として有用である。
本発明のペプチドは、具体的には以下のアミノ酸配列：
2003106682.tif 000006
2003106682.tif 000007
このうちＡｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：４）を含むペプチドおよびＡｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ（配列番号：５）を含むペプチドが、好ましい。
本発明のペプチドとして、より具体的には以下の（１−１）〜（１−４）に挙げるペプチドを例示することができる。
（１−１）配列番号：２〜６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド
配列番号：２〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの具体例として、以下に示す癌抗原ペプチドを例示することができる：
2003106682.tif 000008
このうちＡｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：４）からなる癌抗原ペプチドおよびＡｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ（配列番号：５）からなる癌抗原ペプチドが、好ましい。これらのペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。また、本発明の参考例に記述のヒトモデル動物に供することによりイン・ビボでのＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
（１−２）配列番号：２〜６のいずれかのアミノ酸配列を含み、モチーフ構造を保持するペプチド
ＨＬＡ分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。ＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフとしては、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）であり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはメチオニン（Ｍｅｔ）となることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，ｐ３９１３，１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１，ｐ１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，ｐ４３０７，１９９４）。
従ってこの規則性に基づいて、以下に示される９アミノ酸からなる本発明の癌抗原ペプチド：
2003106682.tif 000009
のＣ末端に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１０アミノ酸からなるペプチド、あるいは当該１０アミノ酸からなるペプチドのＣ末端にさらにＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１１アミノ酸からなるペプチドであって、イン・ビボにてＣＴＬ誘導活性を有する当該ペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示できる。これらのペプチドも、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。また、本発明の参考例に記述のヒトモデル動物に供することにより、イン・ビボでのＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
（１−３）配列番号：２〜６のいずれかのアミノ酸配列を含むエピトープペプチド
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、イン・ビボで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ１１、Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープを連結した約３０ｍｅｒのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。
またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，１：７５１，１９９４）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、ＣＴＬエピトープ（メラノーマ抗原ｇｐ１００の第２８０位〜２８８位からなる癌抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Ｔヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）。
従って、前記（１−１）や（１−２）に記述したような本発明の癌抗原ペプチドやペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（エピトープペプチド）であってイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがＣＴＬエピトープの場合、用いるＣＴＬエピトープとしては、ＷＴ１由来のＨＬＡ−Ａ１，−Ａ０２０１，−Ａ０２０４，−Ａ０２０５，−Ａ０２０６，−Ａ０２０７，−Ａ１１，−Ａ２４，−Ａ３１，−Ａ６８０１，−Ｂ７，−Ｂ８，−Ｂ２７０５，−Ｂ３７，−Ｃｗ０４０１，−Ｃｗ０６０２などに拘束性のＣＴＬエピトープが挙げられる。これらＣＴＬエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのＣＴＬエピトープの長さとしては、各種ＨＬＡ分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９５）、８〜１４アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
本発明のエピトープペプチドとして、より具体的には、例えば配列番号：２〜６のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上とヘルパーエピトープとを連結させたペプチドを挙げることができる。より具体的には、例えば配列番号：２〜６のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：３２）とを連結させたペプチドや、配列番号：２〜６のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上とＡｌａ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ（配列番号：５０、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたペプチドなどが挙げられる。
このような複数のエピトープを連結させたペプチド（エピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））や後述の（ＩＩ）項に記載の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを本発明の参考例に記述のヒトモデル動物に供することにより、イン・ビボでのＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
（１−４）配列番号：２〜６のいずれかのアミノ酸配列を含み、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチド
前記（１−１）〜（１−３）に例示した本発明のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能である。
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられる。アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
（２）配列番号：２〜６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含むペプチド（多重改変ペプチド）
前述のように本発明は、配列番号：２〜６に示されるＷＴ１由来の改変型ペプチドが、イン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するという新たな知見を基礎とする。このようなイン・ビボでのＣＴＬ誘導活性を有するペプチドのアミノ酸配列をさらに改変することにより、同等またはそれ以上のＣＴＬ誘導活性を有するさらなる多重改変ペプチドを得ることができる。従って本発明においては、このような配列番号：２〜６のいずれかに示されるペプチドの改変アミノ酸配列を含むペプチド（以下、多重改変ペプチドと称することもある）を提供する。
すなわち本発明は、配列番号：２、３、４、５および６のいずれかに記載のアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み、かつＣＴＬ誘導活性を有するペプチドを提供するものである。ただし、配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドは本発明のペプチドの範囲から除外される。
本発明におけるアミノ酸残基の「改変」とは、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加を意味し、好ましくは置換である。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の位置および種類は、イン・ビボでのＣＴＬ誘導活性を保持する限り特に限定されない。このような改変アミノ酸配列を含むペプチドの具体例として、以下に挙げるペプチドが例示される。
前述のように、ＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフとして、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）であり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはメチオニン（Ｍｅｔ）となることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，ｐ３９１３，１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１，ｐ１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，ｐ４３０７，１９９４）。よって、本発明における多重改変ペプチドでは、配列番号：２〜６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列の第２位および／または第９位のアミノ酸残基を、前記モチーフ上とり得るアミノ酸残基に置換することが可能である。
具体的に第２位のアミノ酸の多重改変ペプチドとしては、以下に列挙するアミノ酸配列を含みかつイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するペプチドを挙げることができる：
2003106682.tif 000010
2003106682.tif 000011
ここには、前記配列番号：５３〜６５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなりかつイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドが包含される。
本発明の配列番号：２〜６に示されるペプチドは、いずれも、ヒトＷＴ１由来の天然型ペプチドの第２位のアミノ酸をチロシンに改変することにより良好なＣＴＬ誘導活性を有するに至った改変型ペプチドである。よって、本発明の多重改変ペプチドは、当該第２位のアミノ酸がチロシンであることが望ましい。一方Ｃ末端のアミノ酸については、前記のモチーフ上とり得るアミノ酸に改変することが可能である。
この態様における本発明の多重改変ペプチドとして、以下に列挙するアミノ酸配列を含みかつイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するペプチドを挙げることができる：
2003106682.tif 000012
2003106682.tif 000013
これには、前記配列番号：１２〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなりかつイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドが包含される。
さらに、上記第２位のアミノ酸の多重改変ペプチドにおける第２位のアミノ酸の改変と、ここに記載のＣ末端のアミノ酸の改変とを併せ持つ癌抗原ペプチドも例示することができる。
また、配列番号：４に記載のアミノ酸配列中にはシステイン残基が存在し、それは溶液中にて酸化されてジスルフィド結合を生じる可能性がある。これを避けるには、当該システイン残基を他のアミノ酸残基、例えばアラニン残基やセリン残基などに置換したり、システイン残基と化学構造の類似するα−アミノ酪酸に置換し、多重改変ペプチドとすることが考えられる。
この態様における本発明の多重改変ペプチドとして、以下に列挙するアミノ酸配列を含みかつイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するペプチドを挙げることができる：
2003106682.tif 000014
これには、前記配列番号：６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなりかつイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドが包含される。
これらのペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。また、本発明の参考例に記述のヒトモデル動物に供することによりイン・ビボでのＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
以上述べた本発明の多重改変ペプチドに関しても、前記（１−２）と同様のモチーフ構造を保持するペプチド、前記（１−３）と同様の複数のエピトープを連結させたペプチド、あるいは前記（１−４）と同様のアミノ基もしくはカルボキシル基を修飾したペプチドとすることができる。
以上のような本発明のペプチドは、例えば、後述するＣＴＬの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、また後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
（ＩＩ）本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、および形質転換細胞
本発明はまた、前記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
このような本発明のポリヌクレオチドとしては、以下に示すポリヌクレオチドが例示される：
2003106682.tif 000015
2003106682.tif 000016
具体的には、例えば前記（１−３）に記述したような配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかのアミノ酸配列を含むエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上とヘルパーペプチドとを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：３２）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上とＡｌａ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ（配列番号：５０、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパク質を発現するベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
以上のような本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターを本発明の参考例に記述のヒトモデル動物に供することにより、イン・ビボでのＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターは、例えば、後述する本発明のペプチドの製造において、後述する遺伝子治療において、また後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養することにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたポリペプチドは一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
（ＩＩＩ）本発明の抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。
これらの抗体の製造方法はすでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２〜１１．１３、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｌａｎｅ，Ｈ，Ｄ．ら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  出版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）。
具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、ＷＴ１遺伝子が発現している癌、すなわち胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の診断において有効である。
（ＩＶ）本発明の抗原提示細胞
本発明は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド投与によりＣＴＬ誘導活性が認められたが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された癌細胞を特異的に傷害するＣＴＬが誘導されたことを示している。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示された抗原提示細胞であれば良いが、好ましくは、例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスするか、または本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターを細胞内に導入して、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のペプチドであっても良いし、また本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターであっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を体外でパルスし、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を作製することにより得られる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載の配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド）あるいはそれを含有する発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができ、この場合は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６などを参考にして行うことができる。
以上のようにして作製された本発明の抗原提示細胞は、後述するＣＴＬの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、あるいは細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
（Ｖ）本発明のＣＴＬ
本発明は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬを提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド投与によりＣＴＬ誘導活性が認められたが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された癌細胞を特異的に傷害するＣＴＬが誘導されたことを示している。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬは、後述する養子免疫療法において有効に用いられる。
本発明のＣＴＬは、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するものであれば良いが、具体的には、例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬを挙げることができる。
養子免疫療法において用いられるＣＴＬは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載の配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド）やそれを含有する発現ベクターでイン・ビトロで刺激する等により作製される（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９９，１９０：１６６９）。
以上のようにして作製された本発明のＣＴＬは、癌ワクチンの有効成分として、あるいは養子免疫療法において有効に用いられる。
（ＶＩ）癌ワクチンとしての医薬組成物、使用および方法
以上に記載した本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、本発明の抗原提示細胞、および本発明のＣＴＬは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、ＣＴＬの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。
（６−１）本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン
本発明のペプチドは、ＣＴＬの誘導活性を有しており、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、癌の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンをＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原にペプチド（例えば配列番号：２〜６および６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）が提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の治療または予防のために使用することができる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチン製造のための使用、および本発明の癌ワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一のＣＴＬエピトープを有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，−Ａ３，−Ａ１１，Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。このようにして癌の治療または予防が達成される。
また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、水酸化アルミニウム如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
（６−２）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン
前記本発明のペプチドのみならず、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれを含有する発現ベクターもまた、癌の治療または予防のためのＤＮＡワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または当該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。また、本発明は別の態様として、本発明のＤＮＡワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。
本発明のポリヌクレオチドを癌ワクチン（ＤＮＡワクチン）の有効成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ  ｖｉｖｏ法がより好ましい。
ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
以上のような本発明のポリヌクレオチドの癌患者への投与により、抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の癌抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。以上のようにして、癌の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とする癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の治療または予防のために使用することができる。
（６−３）本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から樹状細胞を誘導し、イン・ビトロでペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に戻す細胞療法（ＤＣ療法）が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６）。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、癌を治療または予防することができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の治療または予防のために使用することができる。
（６−４）本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：１１５９，１９９４）。またマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン・ビトロで癌抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：４５３，１９９７）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドや発現ベクターを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明のＣＴＬを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者の体内でＣＴＬによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、癌を治療することができる。本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の治療または予防のために使用することができる。
（ＶＩＩ）配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに基づく癌ワクチン
本発明において、アミノ酸配列：Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ（配列番号：７）を有するペプチドが、イン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有することが見出された。当該配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドは、ＷＯ００／１８７９５号公報においてＨＬＡ−Ａ２４抗原への推定結合配列を有するペプチドとして開示されている。しかしながらイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有し、癌ワクチンとして利用可能であることは本発明において初めて見出された知見である。
従って本発明は、以下のａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、
ｂ）上記ａ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）上記ｂ）のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
ｄ）上記ｃ）の発現ベクターを含有する細胞、
ｅ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞、および
ｆ）上記ａ）のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
のなかから選ばれるいずれかを有効成分とする医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換細胞、抗原提示細胞あるいはＣＴＬにおける癌ワクチンを製造するための使用、およびそれら発明の治療または予防に有効な量をそれを必要としている癌患者に投与する癌を治療または予防するための方法に関する。
当該ａ）〜ｆ）に記載の各物質の作製法、およびこれらの物質の癌ワクチンとしての用途については、全て、前記本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、抗原提示細胞およびＣＴＬの項に記述のとおりである。
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
以下の参考例は、ＨＬＡ−Ａ２４抗原を発現するトランスジェニックマウスの作製に関するものであり、その詳細はＷＯ  ０２／４７４７４（国際公開日：２００２年６月２０日、ＰＣＴ／ＪＰ０１／１０８８５（国際出願日：２００１年１２月１２日（優先日：２０００年１２月１３日）））に記載されている。
参考例１
ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ断片のクローニング
（１）ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ断片のクローニング
ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡをＰＣＲクローニングするため、ヒト腫瘍細胞株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞（理研細胞バンクＲＣＢ０４４４）を培養し、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、ヒトゲノムＤＮＡを精製した。次に、キメラＨＬＡ遺伝子の構築に必要なＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ配列についてＧｅｎＢａｎｋデータベースにより調べたところ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．Ｚ７２４２２が該当するものであったが、プロモーター領域（２７０ｂｐ）が登録されていないことが判明した。当該トランスジェニックマウスの作製には、プロモーター、エキソン１〜３、およびイントロン１〜３を必要とする。そこで、プロモーターを含むＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡのＰＣＲクローニングにあたり、日本人に多いＨＬＡ−Ａ２６０１のプロモーターの塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．ＡＢ００５０４８）を参考にＨＬＡ２６−１Ｆ（５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ−３’，３６ｍｅｒ、配列番号：３６）を上流プライマーとし、またイントロン３に含まれる塩基配列の一部を改変したもの、すなわちＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．Ｚ７２４２２の５’末より１２８２番目をＧからＡに改変したＡ２４−Ｂｇｌ  ＩＩ  ３０（５’−ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＣＧＡ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＡＧＧ  ＣＧＣ−３’，３０ｍｅｒ、配列番号：３７）を下流プライマーとして用いた。
ここで、当該塩基改変の理由は以下の通りである。すなわち、トランスジェニックマウスにおいて発現するキメラＨＬＡが、エキソン１から３までをＨＬＡ−Ａ２４０２、エキソン４から８までをＨ−２Ｋｂによって構成されることを目的としており、このようなキメラＨＬＡを作製するために、ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ上流よりイントロン３にコードされる制限酵素Ｂａｍ  ＨＩ部位までとＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡのイントロン３より下流とを連結するため、ＨＬＡ−Ａ２４０２のイントロン３に人為的に制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ部位を構築する必要があったからである。
次に、３’→５’のエキソヌクレアーゼ活性の高いＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、上記プライマーペアを用いてＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ断片のＰＣＲクローニングを行った。ＰＣＲは９５℃４５秒で熱処理した後、９５℃４５秒、６６℃１分、および７２℃４分を３５サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩ切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％ＮａＣｌ、２％寒天）で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。
（２）ＨＬＡ−Ａ２４０２プロモーター領域の塩基配列の決定
上記で得られた形質転換体の４個について、３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）により精製した。次に、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡシークエンシングシステム（ＰＥバイオチステムズ社製）により塩基配列を解析した。シーケンス解析用サンプルは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、添付プロトコールに従い、各クローンのシーケンスを解析した。その結果、すべてのクローンについてプロモーター領域を比較すると完全に一致していたことより、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されていないＨＬＡ−Ａ２４０２のプロモーター領域の塩基配列が決定された。また、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．Ｚ７２４２２の塩基配列と各クローンを比較したところ、ＰＣＲ変異はみられない正常な１個のクローンが存在していた。
参考例２
Ｈ−２ＫｂゲノムＤＮＡ断片のクローニング
（１）Ｈ−２ＫｂゲノムＤＮＡ断片のクローニング
マウス腫瘍細胞株ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ  Ｔ１Ｂ−３９）を培養してマウスゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲクローニングに用いた。ＤＮＡの精製方法は、長鎖ＤＮＡの増幅に適するＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ（宝酒造社株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従い実施した。次に、キメラＨＬＡ遺伝子の構築に必要なＨ−２Ｋｂ遺伝子配列についてＧｅｎＢａｎｋデータベースにより調べたところ、２つに分断されて登録されていた。すなわち、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．ｖ００７４６およびｖ００７４７である。ｖ００７４６ではイントロン３の一部迄のＨ−２Ｋｂ上流をコードする１５９４ｂｐ領域が、一方、ｖ００７４７ではイントロン７の一部迄のＨ−２Ｋｂ下流をコードする１８３７ｂｐ領域が登録されていた。ｖ００７４６およびｖ００７４７により２つに分断されて登録されているイントロン３には制限酵素Ｂａｍ  ＨＩ部位が存在していなかったことにより、データベースに登録されているＨ−２Ｋｂ遺伝子は不完全長と推測された。
Ｈ−２Ｋｂ遺伝子には相同な偽遺伝子や相同性の高い遺伝子が存在している（Ｃｅｌｌ．，２５：６８３，１９８１）。そこで、当該相同遺伝子と相同性が低く且つｖ００７４６のエキソン３にコードされるＨ−２ＫＢ  Ｆ３（５’−ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ−３’，３０ｍｅｒ、配列番号：３８）を上流プライマーとし、またｖ００７４７の末端に制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ部位を付加したＨ−２ＫＢ  ３Ｒ（５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＴＣ−３’，３８ｍｅｒ、配列番号：３９）を下流プライマーとして、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ（宝酒造社株式会社製）を用いて添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を実施した。当該ＰＣＲは、９８℃１０秒および６６℃４分２５サイクル繰り返したのち、６８℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。
増幅遺伝子断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの制限酵素Ｋｐｎ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩ切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体３個を３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含する組み換えプラスミドクローンを精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。３つの当該クローンの塩基配列とｖ００７４７の塩基配列を比較したところ、２クローンでそれぞれ別々に１ヶ所のＰＣＲ変異が、他方１クローンで３ヶ所のＰＣＲ変異がみられた。また、３クローン間では共通しているがｖ００７４７と異なる塩基が５ヶ所みられた。これら塩基はイントロン６と３’非翻訳領域に相当する領域にあった。更に、未登録のイントロン３領域においては、３クローン間で異なるＰＣＲ変異した塩基が１ヶ所みられた。これより、未登録領域の塩基配列部分を決定することができなかったため、３’→５’のエキソヌクレアーゼ活性の高いポリメラーゼを用いて未登録のイントロン３領域について再度クローニングを行い、塩基配列の決定を行った。
（２）Ｈ−２Ｋｂイントロン３の塩基配列の決定
未登録領域の塩基配列を決定するため、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムＤＮＡを鋳型に未登録のイントロン３を含む領域についてＰＣＲクローニングした。ここでは、ｖ００７４６に登録されているＨ−２ｋｂ  Ｆ５（５’−ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴ−３’，２９ｍｅｒ、配列番号：４０）を上流プライマーとして用い、またｖ００７４７に登録されているＨ−２ｋｂ  ５Ｒ（５’−ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＧＡＡ−３’，３０ｍｅｒ、配列番号：４１）を下流プライマーとして用いた。ＰＣＲは９５℃４５秒で熱処理した後、９５℃４５秒、６８℃１分、および７２℃４分を２５サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの制限酵素Ｂａｍ  ＨＩおよびＢｇｌ  ＩＩ切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体の５個について３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製し、塩基配列を解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、解析したクローン間のイントロン３領域について比較すると、すべてのクローンで完全に一致していた。これよりイントロン３領域の塩基配列を決定することができた。未登録領域の制限酵素Ｂａｍ  ＨＩ部位よりｖ００７４７までは、４６３ｂｐであることも判明した。
（３）Ｈ−２ＫｂゲノムＤＮＡの構築
前記（２）で未登録領域の塩基配列が決定されたことにより、目的とするキメラＨＬＡ遺伝子の構築に必要なＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡの全塩基配列が決定された。その結果、前記（１）で得られた２種類のクローン、すなわち５’末端側にＰＣＲ変異の無い１つのクローン（Ｈ−２Ｋｂ＃２６）、および３’末端側にＰＣＲ変異の無い１つクローン（Ｈ−２Ｋｂ＃２０）を組み合わせることにより、目的とするＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡが構築できることが明らかとなった。そこで、これらクローンを制限酵素消化で切断したのち、ＰＣＲ変異の無いそれぞれの領域を互いに組み合わせることにより、ＰＣＲ変異の無いＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡを構築した。構築方法の模式図を図１に示す。
両クローンを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ部位およびＥｃｏ  ＲＩ部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。３個の形質転換体を３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法により精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、すべての形質転換体がＰＣＲ変異の無いＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡをコードするプラスミドを含有することが明らかとなった。
なお、ここで得られたＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡの塩基配列は、後述する配列番号：３３に記載の塩基配列の第１５５１位以降の配列に相当するものである。
参考例３
キメラゲノムＤＮＡ（ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂＤＮＡ）の構築
上記実施例１で得られたＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（ＨＬＡ−Ａ２４０２＃１）を制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ部位で切断し、また上記実施例２で得られたＨ−２ＫｂのゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（Ｈ−２Ｋｂ＃２０／２６）を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩ部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。構築方法の模式図を図２に示す。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。１０個の形質転換体を３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製してシーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、３個の形質転換体が目的のキメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂＤＮＡ、単にＡ２４０２／ＫｂＤＮＡと略することもある）を有するプラスミドを含有することが明らかとなった。構築されたＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂのゲノム配列を配列番号：３３に記載する。
参考例４
キメラゲノムＤＮＡのスプライシング解析
マウス腫瘍細胞株ＥＬ４細胞へ、遺伝子導入装置（島津製作所製）を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）をトランスフェクトした。２日後、トランスフェクトしたＥＬ４細胞およびコントロールとして遺伝子導入していないＥＬ４細胞より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて添付のプロトコールに従って、トータルＲＮＡを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、添付プロトコールに従い、当該ＲＮＡの一部を鋳型にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８により逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。更に、当該ｃＤＮＡの一部を鋳型にＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、キメラ遺伝子を特異的にＰＣＲ増幅した。
このとき、上流プライマーとしてＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子のエキソン１にコードされ且つＨ−２Ｋｂ遺伝子と相同性の低いＣｈｉｍｅｒａ−Ｆ２（５’−ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＴＣ−３’，２３ｍｅｒ、配列番号：４２）を、一方の下流プライマーとしてＨ−２Ｋｂ遺伝子のエキソン８にコードされ且つＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子と相同性が低いＣｈｉｍｅｒａ−Ｒ２（５’−ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＣ−３’，２３ｍｅｒ、配列番号：４３）を用い、ＰＣＲは９５℃４５秒を熱処理した後、９５℃４５秒、５３℃１分、および７２℃２分を４０サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。
その結果、トランスフェクトしたＥＬ４細胞においてのみ特異的に約１．１ｋｂｐ遺伝子断片が増幅したことより、導入したキメラゲノムＤＮＡはマウス細胞内で転写されたこと、すなわちＨＬＡプロモーターが機能し、予想した部位でスプライシングされたｍＲＮＡが発現していることが予想された。次に、前記ＰＣＲの増幅断片をシークエンス解析した結果、予想通りのＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂをコードするｃＤＮＡの塩基配列が決定された。当該ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３４に、またそのアミノ酸配列を配列番号：３５に記載する。さらに、配列番号：３３に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂのゲノム配列と配列番号：３４に記載のｃＤＮＡ配列との位置関係を示したものを、図３〜図５に示す。
参考例５
マイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液の製造
構築したキメラＨＬＡ遺伝子をコードするプラスミド１１μｇを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＥｃｏ  ＲＩ、更にベクターのみを切断する制限酵素Ｄｒａ  Ｉで消化した。１％ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ（ニッポンジーン社製）ゲルで電気泳動したのち、キメラゲノムＤＮＡを含有するゲル片を回収した。その後、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（バイオ・ラッド社製）を用い、添付プロトコールに従い、導入遺伝子を精製し、１／１０ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８）に溶解することにより、マイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液を製造した。
参考例６
マウス受精卵への導入とトランスジェニックマウスの同定
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス由来の受精卵を対象に構築したキメラ遺伝子のインジェクションを施行した。
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス由来の受精卵を用いた理由は、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスはクラスＩ分子としてＨ−２ｂ系統を発現しており、ＨＬＡ−Ａ２４０２と同様な結合モチーフを有するＨ−２Ｋｄを発現していないことによるものである。すなわち、当該Ｃ５７ＢＬ／６系統のトランスジェニックマウスにＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドを投与しても、内因性のマウスクラスＩによって当該ペプチドが細胞表面に提示されず、交差反応が起こらないという利点を有する。
第１回目のインジェクションでは、８１個の受精卵を対象に施行し、４匹のレシピエントマウスに移植したが産出されなかった。第２回目のインジェクションでは、５０個の受精卵を対象に施行し、２匹のレシピエントマウスに移植することにより４匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。第３回目のインジェクションでは１０１個の受精卵を対象に施行し、４匹のレシピエントマウスに移植することにより１１匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。
第４回目のインジェクションでは、１６８個の受精卵を対象に施行し、６匹のレシピエントマウスに移植することにより２２匹が産出され、１９匹が離乳した。その中の４匹、すなわち０１−４、０４−２、０５−１、および０５−６がトランスジェニックマウスとして同定されたが、０１−４は奇形のため交配不可能で、０５−６は離乳後まもなく死亡した。第５回目のインジェクションでは、２２１個の受精卵を対象に施行し、８匹のレシピエントマウスに移植することにより１４匹が産出され、６匹が離乳した。その中の３匹、すなわち０４−１、０４−５、および０４−６がトランスジェニックマウスとして同定された。第６回目のインジェクションでは、２２５個の受精卵を対象に施行し、８匹のレシピエントマウスに移植することにより１３匹が産出され、９匹が離乳した。その中の３匹、すなわち１０−５、１４−１、および１５−２がトランスジェニックマウスとして同定された。
ここでトランスジェニックマウスの同定は、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子のクローニングで使用したプライマー、すなわちＨＬＡ２６−１Ｆ（配列番号：３６）およびＡ２４−Ｂｇｌ  ＩＩ３０（配列番号：３７）を用いて尾ＤＮＡ調整物を鋳型にＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ（宝酒造社株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従ってＰＣＲを行い、１％アガロースゲル電気泳動を行い、１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡバンドがみられるマウスを選別することにより行った。
参考例７
トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子産物の発現
実施例６で作出された８ライン、すなわち０４−２、０５−１、０４−１、０４−５、０４−６、１０−５、１４−１、および１５−２由来のトランスジェニックマウスより、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の記載に従い脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。トランスジェニックマウス脾細胞における導入遺伝子由来のタンパク質であるＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂの細胞表面発現は、フローサイトメトリー法により解析した。このとき、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスより調整した脾細胞をコントロールとして用いた。具体的には、５×１０６個の脾細胞をモノクローナルなＦＩＴＣ標識抗ＨＬＡ抗体Ｂ９．１２．１（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）で染色した。また、モノクローナルなＦＩＴＣ標識抗Ｈ−２Ｋｂ抗体ＡＦ６−８８．５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で内因性のマウスクラスＩを染色した。
その結果、５ライン、すなわち０４−１、０４−５、１０−５、１４−１、および１５−２でＨＬＡクラスＩ特異的な発現がみられ、このうち０４−１ラインのみが、繁殖能を有するラインであることが明らかとなった。一方、他の３ライン、すなわち０４−６、０４−２、および０５−１ラインではＨＬＡクラスＩ特異的な発現はみられなかった。以上により、８ラインのトランスジェニックマウスが作出されたが、クラスＩの発現様式であり且つホモ化を達成したのは０４−１ラインのみであった。
参考例８
ＨＬＡ−Ａ２４０２を発現する形質転換細胞の樹立
前記で作製されたトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導活性の評価のために、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂを安定に発現する形質転換細胞、Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を樹立した。
（１）発現ベクターの構築
Ｔｇマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用い、添付のプロトコールに従って、トータルＲＮＡを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、添付プロトコールに従い、当該ＲＮＡの一部を鋳型にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８により逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。更に、当該ｃＤＮＡの一部を鋳型にＬＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従った。このとき、上流プライマーとしてｃｈｉ．ＰＦ１（５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＧＡＡ−３’、配列番号：４４）を、一方の下流プライマーとしてｃｈｉ．ＰＲ１（５’−ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＡＣ−３’、配列番号：４５）を用いた。ＰＣＲは９５℃４５秒で熱処理した後、９５℃４５秒、６０℃１分、および６８℃２分を２５サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。ＰＣＲ増幅遺伝子を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入することにより、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂをコードする発現ベクターを構築した。
（２）Ｊｕｒｋａｔ細胞への導入
１０ｕｇの上記ベクターを制限酵素Ｐｖｕ  Ｉで消化することにより、直線化した。次に、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｔ１Ｂ−１５２）５×１０６個について、遺伝子導入装置（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラＨＬＡ遺伝子をトランスフェクトした。９６穴プレートに０．５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、０．６ｍｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ含有培地で培養した。その結果、６穴中（６クローン）にて細胞の増殖が確認された（Ａ−２、Ａ−４、Ａ−６、Ａ−９、Ａ−１０、Ａ−１１）。これらの中で、Ａ−１０において導入遺伝子の発現が最も高かったことより、当クローンをＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞として樹立した。
参考例９
トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導活性試験
ヒト癌抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕは乳癌、卵巣癌、および肺癌で過剰発現していることで知られ、当該抗原由来ペプチドによってＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人末梢血から特異的ＣＴＬを誘導できることが、イン・ビトロ試験により明らかにされている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，８７：５５３，２０００）。
そこで、当該ヒト癌抗原由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８（配列番号：４６）を、破傷風毒素由来のマウスＭＨＣクラスＩＩのＩ−Ａｂ拘束性ヘルパーペプチド（Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：３２）と共に当該トランスジェニックマウスに免疫し、ヒトの場合と同様に特異的ＣＴＬを誘導し得るか調べた。すなわち、ＤＭＳＯによりＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８を４０ｍｇ／ｍｌに、またヘルパーペプチドを２０ｍｇ／ｍｌに調整し、生理食塩水で２ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌに希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬株式会社製）と混合することによりｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルションを作製した。２００μｌの当該薬剤をトランスジェニックマウス（０４−１ライン）の尾の皮下に免疫した。実験開始７日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）にて溶血処理した脾細胞の一部をＸ線照射（２，０００ｒａｄ）した後、前記ペプチドを１００μｇ／ｍｌで１時間パルスして０．７×１０６個／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。このとき、非照射・非ペプチドパルスの７×１０６個／ｗｅｌｌの脾細胞を同時に加えて３７℃下で再刺激を施行した（ペプチド終濃度１μｇ／ｍｌ）。培養液には、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを含む培養液（ＣＴＭ培養液）を１０ｍｌ用い、６日間イン・ビトロ刺激した。
他方、実施例８で作製したＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を３．７ＭＢｑ／１０６個で５１Ｃｒラベル後、前記ペプチドを１００μｇ／ｍｌで１時間パルスした。（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを終濃度１００μｇ／ｍｌ添加）。また、ペプチド非パルスの細胞をコントロール標的細胞として調製した。
当該Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂを標的細胞とし、先に調製されたトランスジェニックマウス脾細胞調製物を添加して、ＣＴＬの誘導活性を５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：４７５３，１９９７）により測定した。結果を図６に示す。結果として、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８で刺激することにより、特異的なＣＴＬの誘導が認められた。
さらに、前記ＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８と同様にＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドであることが知られているＭＡＧＥ−３１９５−２０３（配列番号：４７）、ＣＥＡ６５２−６６０（配列番号：４８）、およびＣＥＡ２６８−２７７（配列番号：４９）を用いて、前記と同様のＣＴＬ誘導活性試験を行った。結果を図７〜図９に示す。結果として、これら既知のＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドで刺激することにより、特異的なＣＴＬの誘導が認められた。
以上の結果から、本発明のＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウスは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の癌抗原タンパクや癌抗原ペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで評価することのできるヒトモデル動物であることが明らかとなった。
実施例１
ヒトＷＴ１由来の天然型および改変型ペプチドによるＣＴＬ誘導活性
ＨＬＡ抗原に結合可能な配列を検索するためのＢＩＭＡＳソフト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）を用いて、ヒトＷＴ１アミノ酸配列中のＨＬＡ−Ａ２４抗原への推定結合配列を検索した。検索により同定されたペプチドの例を以下に示す。
2003106682.tif 000017
ここでペプチドＡはヒトＷＴ１のアミノ酸配列の第１２６−１３４位に、ペプチドＢは第３０２−３１０位に、ペプチドＣは４１７−４２５位に、ペプチドＤは第２８５−２９４位に、またペプチドＥは第３２６位−３３５位に、それぞれ該当する配列である。これらのペプチドをＦｍｏｃ法により合成した。
また、前記天然型ペプチドＡ〜Ｃの第２位のアミノ酸をチロシンに改変した改変型ペプチドについてもＦｍｏｃ法により合成した。
2003106682.tif 000018
各抗原ペプチドの免疫原性について、先の参考例にて作製したＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスを利用することにより評価した。１ペプチドにつき３匹のトランスジェニックマウスに免疫することにより、それぞれのペプチドの免疫原性を評価した。
マウスＭＨＣクラスＩＩのＩ−Ａｂ拘束性ヘルパーペプチドである破傷風毒素由来ペプチド（Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：３２）と共に各合成ペプチドをトランスジェニックマウスに免疫した。すなわち、ＤＭＳＯに各抗原ペプチドをそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌ、ヘルパーペプチドを２０ｍｇ／ｍｌに調整し、さらに生理食塩水で２ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、等量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合することによりｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルジョンを作製し、２００μｌの当該エマルジョンをＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスの尾底部の皮下に免疫した。実験開始７日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）にて溶血処理した脾細胞の一部をＸ線照射（２，０００ｒａｄ）した後、前記抗原ペプチドを１００μｇ／ｍｌで１時間パルスして７×１０６個／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。このとき、非照射・非ペプチドパルスの７×１０５個／ｗｅｌｌの脾細胞を同時に加えて３７℃下で６日間イン・ビトロ刺激培養した。この際の培地として、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを用いた。
次に、常法に従って細胞傷害性試験を行った。標的細胞（Ｔ）として、Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞（参考例８）、およびペプチドパルスしたＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を用いた。これらの細胞は３．７ＭＢｑ／１０６個で５１Ｃｒラベルし、ペプチドパルスは１００μｇ／ｍｌで１時間実施された（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを添加）。イン・ビトロ刺激培養した脾細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｅ／Ｔ比８０において作用させ、傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：４７５３，１９９７）により測定した。結果を図１０〜図１７に示す。Ｙ軸は傷害活性を示し、Ｘ軸の１、２、および３は、３匹のマウスの個体番号を示す。
これらの図から明らかな通り、試験したＷＴ１天然型ペプチド５種類の中では、ペプチドＢのみが免疫原性を有していた。また、天然型ペプチドＢの第２位のアミノ酸をチロシンに改変した改変型ペプチドＧは、ペプチドＢより高い免疫原性を示した。さらに、天然型ペプチドＡおよびＣの第２位のアミノ酸をチロシンに改変した改変型ペプチドＦおよびＨは、もとのペプチドＡおよびＣが免疫原性を有していなかったにもかかわらず、高い免疫原性を有していた。
以上の結果から、ＷＴ１天然型ペプチドＢ、改変型ペプチドＦ、Ｇ、およびＨは、イン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有する抗原ペプチドとして機能を有することが明らかとなった。
実施例２
ヒトＷＴ１由来の改変型ペプチドによるＣＴＬ誘導活性（ＩＩ）
実施例１と同様、ＢＩＭＡＳソフトにより検索された、ＨＬＡ−Ａ２４抗原への推定結合配列を有するヒトＷＴ１由来の以下の天然型ペプチド（ペプチドＫ、Ｌ）、およびその第２位のアミノ酸をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＩ、Ｊ）を、Ｆｍｏｃ法により合成した。
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ここでペプチドＫはヒトＷＴ１のアミノ酸配列の第１０−１８位に、またペプチドＬは第２３９位−２４７位にそれぞれ該当するペプチドであり、さらにペプチドＩおよびＪはそれぞれペプチドＫおよびＬの配列中第２位のアミノ酸残基をチロシンに改変した改変型ペプチドである。これらの天然型および改変型ペプチドについて、実施例１と同様にして免疫原性を評価した。結果を図１８、１９、２１および２２に示す。Ｙ軸は傷害活性を示し、Ｘ軸の１、２、および３は、３匹のマウスの個体番号を示す。
これらの図から明らかな通り、天然型ペプチドＫおよびＬが免疫原性を有していないにもかかわらず、改変型ペプチドＩおよびＪは、いずれも高い免疫原性を有することが示された。
以上の結果から、ＷＴ１改変型ペプチドＩおよびＪは、イン・ビボで細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する抗原ペプチドとして機能を有することが明らかとなった。
実施例３
ヒトＷＴ１由来の改変型ペプチドによる細胞傷害活性
改変型ペプチドによって誘導されたエフェクター細胞の天然型ペプチドに対する交差反応性を試験した。前記改変型ペプチドＨをマウスに免疫することにより誘導されたエフェクター細胞（Ｅ）と、標的細胞（Ｔ）として天然型ペプチドＣをパルスしたＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞とを、Ｅ／Ｔ比８０において作用させ、傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。結果を図２０に示す。この図から明らかな通り、ＷＴ１改変型ペプチドで誘導したエフェクター細胞は変異型および天然型をパルスしたいずれの細胞に対しても細胞傷害活性を示した。
実施例４
ヒトＷＴ１由来の改変型ペプチドによるヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導
ＨＬＡ−Ａ２４０２陽性の健常人から末梢血単核球を分離し、２４ウェルプレートに４×１０６細胞／ウェルの量で分配し、これに配列番号７の天然型ペプチドまたは配列番号３の改変型ペプチドを１０μＭの濃度になるように添加し、１週間培養した。この際の培地として、４５％ＲＰＭＩ１６４０、４５％ＡＩＶ、１０％非働化ヒトＡＢ血清、１×非必須アミノ酸、２５ｎｇ／ｍｌ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンを用いた。上記の培養の後、細胞を２×１０６細胞／ウェルに調製し、レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）細胞とした。他方、上記と同じ健常人から分離した末梢血単核球に、前記いずれかのペプチド１０μＭと共に４時間培養してペプチドパルスし、次に３０Ｇｙの放射線照射した後、細胞を４×１０６細胞／ウェルに調製し、スティミュレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）細胞とした。
上記のようにして調製したレスポンダー細胞とスティミュレーター細胞を混合し、更にＩＬ−２を３０Ｕ／ｍｌの濃度で加えて培養した。同様なレスポンダー細胞に対するスティミュレーター細胞による刺激を１週間ごとに３回実施した。このようにして得られた細胞の細胞傷害性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。標的細胞（Ｔ）として５１Ｃｒで標識したＨＬＡ−Ａ２４陽性のＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８１，ｐ３８７，１９９９）に配列番号７の天然型ペプチドをパルスした細胞を用い、上記の通りに配列番号７の天然型ペプチドまたは配列番号３の改変型ペプチドにより刺激した細胞（エフェクター細胞）（Ｅ）をＥ：Ｔ比１０、２０または４０において作用させ、細胞傷害活性を測定した。結果を図２３に示す。この図から明らかな通り、改変型ペプチドは天然型ペプチドを認識するＣＴＬを誘導することができ、そして天然型よりも優れたＣＴＬ誘導活性を示した。また、標的細胞をＷＴ１陽性でＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌細胞株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞、ＷＴ陽性でＨＬＡ−Ａ２４０２陰性の肺癌細胞株１１−１８細胞、またはＷＴ１陰性でＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌細胞株１１−１８細胞を用いて、同様に上記のエフェクター細胞の細胞傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。結果を図２４に示す。改変型ペプチドおよび天然型ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞は、ＷＴ１とＨＬＡ−Ａ２４０２が共に陽性のＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞のみを特異的に傷害することから、ペプチド刺激によりＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性のＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導されていることが示された。また、改変型ペプチドの方が天然型ペプチドよりも優れたＣＴＬ誘導活性を示した。
実施例５
システイン残基置換型ペプチドによるＣＴＬ誘導活性
ペプチドＨ（Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ；配列番号：４）は第５位にシステイン残基を有する。当該システイン残基は溶液中で酸化されジスルフィド結合を生じる可能性がある。そこで、第５位のシステイン残基をセリン残基、アラニン残基、またはα−アミノ酪酸に置換した置換型ペプチド（ペプチドＭ、Ｎ、Ｏ）を合成し、それぞれのイン・ビボでの免疫原性を検討した。
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これら置換型ペプチドＭ、ＮおよびＯをＦｍｏｃ法により合成し、実施例１と同様にして免疫原性を評価した。なお細胞傷害性試験は、イン・ビトロで刺激培養した脾細胞をエフェクター細胞（Ｅ）として標的細胞と各種の比率で混合することにより５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；１５９：４７５３）を実施し、エフェクター細胞の傷害活性を測定することにより行った。結果を図２５〜２８に示す。縦軸は傷害活性を示し、横軸の値はＥ／Ｔ比を示す。
これらの図から明らかな通り、ペプチドＨの第５位のシステイン残基を、セリン残基、アラニン残基、あるいはα−アミノ酪酸に置換したペプチドＭ、ＮおよびＯは、置換前のペプチド（ペプチドＨ）と同等の免疫原性を有していることが示された。
実施例６
システイン残基置換型ペプチドによる細胞傷害活性
置換型ペプチドによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドに対する交差反応性を試験した。ペプチドＭまたはＮをマウスに免疫することにより誘導されたエフェクター細胞（Ｅ）に対して、ペプチドＭまたはＮをパルス、ペプチドＨをパルス、あるいはペプチド非パルスのＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を標的細胞（Ｔ）として作用させ、エフェクター細胞の細胞傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。結果を図２９および３０に示す。
この図から明らかな通り、置換型ペプチドで誘導したエフェクター細胞は、置換型ペプチド（ペプチドＭ、ペプチドＮ；図中免疫ペプチド）および非置換型ペプチド（ペプチドＨ）をパルスしたいずれの細胞に対しても細胞傷害活性を示した。
産業上の利用の可能性
本発明により、イン・ビボにおいてＣＴＬ誘導活性を有するＷＴ１由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらペプチドやポリヌクレオチドを含む癌ワクチンなどが提供される。本発明の癌ワクチンは多くの癌患者を処置することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のキメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）の作製に用いたＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡの構築方法を示す模式図である。
図２は、本発明のキメラ遺伝子であるＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子の構築方法を示す模式図である。
図３は、配列番号：３３に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂゲノム配列の第１位〜第１３００位までと、配列番号：３４に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂｃＤＮＡ配列の第１位〜第４０７位までの位置関係を示したものである。
図４は、配列番号：３３に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂゲノム配列の第１３０１位〜第２６００位までと、配列番号：３４に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂｃＤＮＡ配列の第４０８位〜第１０１５位までの位置関係を示したものである。
図５は、配列番号：３３に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂゲノム配列の第２６０１位〜第３８５７位までと、配列番号：３４に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂｃＤＮＡ配列の第１０１６位〜第１１１９位までの位置関係を示したものである。
図６は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ由来抗原ペプチド（ＨＥＲ２／ｎｅｕ７８０−７８８）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、ｐｅｐ＋はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、ｐｅｐ−はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図７は、ＭＡＧＥ−３由来抗原ペプチド（ＭＡＧＥ−３１９５−２０３）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図８は、ＣＥＡ由来抗原ペプチド（ＣＥＡ６５２−６６０）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図９は、ＣＥＡ由来抗原ペプチド（ＣＥＡ２６８−２７７）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１０は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＡ（ＷＴ１１２６−１３４）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されないことを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１１は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＢ（ＷＴ１３０２−３１０）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１２は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＣ（ＷＴ１４１７−４２５）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されないことを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１３は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＤ（ＷＴ１２８５−２９４）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されないことを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１４は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＥ（ＷＴ１３２６−３３５）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されないことを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１５は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＡ（ＷＴ１１２６−１３４）の第２位をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＦ）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１６は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＢ（ＷＴ１３０２−３１０）の第２位をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＧ）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１７は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＣ（ＷＴ１４１７−４２５）の第２位をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＨ）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１８は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＫ（ＷＴ１１０−１８）の第２位をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＩ）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図１９は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＬ（ＷＴ１２３９−２４７）の第２位をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＪ）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図２０は、改変型ペプチドＨによって誘導されたエフェクター細胞の天然型ペプチドに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬ誘導活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒は改変型ペプチド（ペプチドＨ）をパルスした標的細胞を用いた結果を、点線棒は天然型ペプチド（ペプチドＣ）をパルスした標的細胞を用いた結果を、また黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図２１は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＫ（ＷＴ１１０−１８）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されないことを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図２２は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＬ（ＷＴ１２３９−２４７）でＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されないことを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、白棒および黒棒は、図６におけると同義である。
図２３は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＢ（ＷＴ１３０２−３１０）、またはそのペプチドの第２位をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＧ）でＨＬＡ−Ａ２４０２陽性の健常人末梢血単核球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激してＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性を、また横軸はエフェクター細胞（Ｅ）とターゲット細胞（Ｔ）の比率Ｅ／Ｔを示す。黒丸は多重改変ペプチド、黒三角は天然型ペプチドで刺激したエフェクター細胞による細胞傷害活性を示す。
図２４は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチドＢ（ＷＴ１３０２−３１０）、またはそのペプチドの第２位をチロシンに改変した改変型ペプチド（ペプチドＧ）でＨＬＡ−Ａ２４０２陽性の健常人末梢血単核球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激してＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性を、また横軸はエフェクター細胞（Ｅ）とターゲット細胞（Ｔ）の比率Ｅ／Ｔを示す。多重改変ペプチドで誘導されたエフェクター細胞のＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞に対する傷害性を黒丸、ＬＫ８７細胞に対する傷害性を黒三角、１１−１８細胞に対する傷害性を黒四角で示す。天然型ペプチドで誘導されたエフェクター細胞のＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞に対する傷害性を中空丸、ＬＫ８７細胞に対する傷害性を中空三角、１１−１８細胞に対する傷害性を中空四角で示す。
図２５は、ペプチドＨでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＨ（免疫ペプチド）をパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図２６は、ペプチドＭでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、黒丸および白丸は図２５におけると同義である。
図２７は、ペプチドＮでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、黒丸および白丸は図２５におけると同義である。
図２８は、ペプチドＯでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸、横軸、黒丸および白丸は図２５におけると同義である。
図２９は、置換型ペプチドＭによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドＨに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬ誘導活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸はＥ／Ｔ比を示す。また図中、黒丸はペプチドＭ（免疫ペプチド）をパルスした標的細胞を用いた結果を、黒四角はペプチドＨをパルスした標的細胞を用いた結果を、また白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図３０は、置換型ペプチドＮによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドＨに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸、横軸、黒丸、黒四角および白丸は図２９におけると同義である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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