(57)【要約】ＳＧＲＦ遺伝子のエクソン部分を適当な薬剤マーカー遺伝子に置換することによりターゲッティングベクターを構築し、該ベクターをマウスのＥＳ細胞株に導入することによりキメラマウスを得た。該キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞からなるマウスを得た。これらのマウス同士を交配することにより、ＳＧＲＦ遺伝子対の双方が不活性化されたマウスを作製することに成功した。該遺伝子改変動物は、例えばＳＧＲＦアンタゴニスト等についての副作用を推測するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＧＲＦ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２】
ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３】
非ヒト動物がげっ歯類である請求項１または２に記載の遺伝子改変動物。
【請求項４】
げっ歯類がマウスである請求項３に記載の遺伝子改変動物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子改変動物から樹立された細胞株。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子改変動物を使用することを特徴とする抗ＳＧＲＦ抗体の作製方法。
【請求項７】
ＳＧＲＦ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８】
ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする非ヒトＥＳ細胞。
【請求項９】
非ヒトＥＳ細胞がげっ歯類ＥＳ細胞である請求項７または８に記載のＥＳ細胞。
【請求項１０】
げっ歯類ＥＳ細胞がマウスＥＳ細胞である請求項９に記載のＥＳ細胞。
【請求項１１】
ＳＧＲＦあるいはそのシグナルを代替する化合物を有効成分として含有する感染防御剤。
【請求項１２】
ＳＧＲＦに対するアンタゴニストを有効成分として含有する自己免疫疾患治療薬。
【請求項１３】
ＳＧＲＦに対するアンタゴニストを有効成分として含有する炎症疾患治療薬。
【請求項１４】
アンタゴニストが抗ＳＧＲＦ抗体である請求項１２または１３に記載の治療薬。
【請求項１５】
下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、自己免疫疾患治療薬または炎症疾患治療薬のための候補化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）ＳＧＲＦと被験化合物を接触させる工程
（ｂ）ＳＧＲＦと被験化合物との結合活性を測定する工程
（ｃ）ＳＧＲＦと結合する化合物を選択する工程
【請求項１６】
下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むＳＧＲＦタンパク質の機能を代替する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子改変動物に被験化合物を投与する工程
（ｂ）被験化合物がＳＧＲＦの機能を代替しているか否かを判定する工程
（ｃ）ＳＧＲＦの機能を代替する化合物を選択する工程
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＳＧＲＦ遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物および細胞、並びにそれらの利用に関する。
背景技術
ＳＧＲＦ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−Ｓｉｘ，Ｇ−ＣＳＦ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ）／ＩＬ−２３（以下「ＳＧＲＦ」と記載する）は、ＥＳＴをベースに本発明者らがクローニングした新規サイトカインである（特許番号ＥＰ１０７２６１０、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０３００００）。Ｏｐｐｍａｎｎらも同様の手法で同一の遺伝子を単離し、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットと結合することで生理機能を発揮する新規サイトカイン（ｐ１９／ＩＬ−２３）として報告しているが（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌ．１３，ｐ７１５，２０００）、その活性については、（１）マウスのＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗのＴ細胞の増殖を誘起する、（２）ヒトのメモリーＴ細胞からＩＦＮ−γ産生を誘導すること以外、その生理機能は明らかになっていない。また、従来ＩＬ−１２  ｐ４０欠損マウス（ノックアウトマウス）を用いた解析や、ＩＬ−１２  ｐ４０に対する抗体を用いた研究によって、ＩＬ−１２の機能とみなされてきたものが、実際はＳＧＲＦの機能であった可能性が考えられるようになってきた。
しかしながら、その機能に関しては未だ解明されておらず、その機能の解明に有用な実験系が求められていた。ＳＧＲＦ遺伝子対が不活性化され、ＳＧＲＦの活性を全く持たない遺伝子改変動物、遺伝子改変動物から樹立された細胞株（遺伝子改変マウス由来細胞株）、あるいはＥＳ細胞株があれば、個体レベルおよび細胞レベルでの生理機能の解明が可能となり、該遺伝子に関連した疾患の治療薬などの研究に利用することが可能となる。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＳＧＲＦ遺伝子対が不活性化され、ＳＧＲＦの活性を持たない遺伝子改変動物を作製することにある。また、本発明は、該動物から樹立された細胞株、およびＳＧＲＦ遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞、並びに、該動物を用いたＳＧＲＦの機能を代替する化合物のスクリーニング方法の提供を目的とする。さらに、該遺伝子改変マウスを利用して得たＳＧＲＦの機能に関する知見を基に、ＳＧＲＦが関与する疾患に対する治療薬の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべくＳＧＲＦ遺伝子改変動物の作製を試みた。まず、ＳＧＲＦ遺伝子のエクソン部分を適当な薬剤マーカー遺伝子に置換することにより、ターゲッティングベクターを構築した。このターゲッティングベクターをマウスのＥＳ細胞株に導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜した。次いで、ＳＧＲＦ遺伝子対の一方が不活性化されたＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の胚盤胞にインジェクションし、キメラマウスを得た。こうして作製されたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、ＳＧＲＦ遺伝子遺伝子対の一方が不活性化された細胞からなるマウス（ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３＋／−マウス）を得た。これらのＳＧＲＦ／ＩＬ−２３＋／−マウス同士を交配することにより、ＳＧＲＦ遺伝子対の双方が不活性化されたマウス（ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウス）を作製することに成功した。
この遺伝子改変動物およびＥＳ細胞は、ＳＧＲＦ阻害剤、例えば抗ＳＧＲＦ抗体またはＳＧＲＦアンタゴニスト等についての副作用を推測するために使用することができる。また、被検タンパク質や低分子がＳＧＲＦの機能を代替する機能を有するか否かの判定、並びにＳＧＲＦの機能を代替する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡのスクリーニングに利用することも可能である。
さらに本発明者らは上記の遺伝子改変動物を利用して、ＳＧＲＦの生理機能および病態との関連を明らかにした。まず、遺伝子改変マウスは、病原微生物であるリステリアの感染に弱いことが判明した。従って、ＳＧＲＦは、病原微生物に対する治療薬となりうることが考えられる。また、遺伝子改変マウスは、実験的脳脊髄炎（ＥＡＥ）が誘導されにくいこと、および遅延型過敏反応が低下していることが分かった。従って、ＳＧＲＦはヒトの自己免疫疾患または炎症疾患発症への関与が示唆され、ＳＧＲＦの機能を阻害する化合物は、自己免疫疾患または炎症疾患の治療のための薬剤となることが期待される。
さらに、ＳＧＲＦが脳で発現していること、及びＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスではＥＡＥが発症しにくいことから、ＳＧＲＦは脳疾患に関与していると考えられ、ＳＧＲＦの機能を阻害する化合物は脳疾患治療のための薬剤になることも期待される。
即ち、本発明は、ＳＧＲＦ遺伝子対が不活性化され、ＳＧＲＦの活性を持たない遺伝子改変動物、該動物から樹立された細胞株、ＳＧＲＦ遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞、並びに、該動物を用いたＳＧＲＦの機能を代替する化合物のスクリーニングのための用途、さらにはＳＧＲＦ関連疾患に対する治療薬に関し、より具体的には、
〔１〕  ＳＧＲＦ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト動物、
〔２〕  ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト動物、
〔３〕  非ヒト動物がげっ歯類である〔１〕または〔２〕に記載の遺伝子改変動物、
〔４〕  げっ歯類がマウスである〔３〕に記載の遺伝子改変動物、
〔５〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の遺伝子改変動物から樹立された細胞株、
〔６〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の遺伝子改変動物を使用することを特徴とする抗ＳＧＲＦ抗体の作製方法、
〔７〕  ＳＧＲＦ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする非ヒトＥＳ細胞、
〔８〕  ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする非ヒトＥＳ細胞、
〔９〕  非ヒトＥＳ細胞がげっ歯類ＥＳ細胞である〔７〕または〔８〕に記載のＥＳ細胞、
〔１０〕  げっ歯類ＥＳ細胞がマウスＥＳ細胞である〔９〕に記載のＥＳ細胞、
〔１１〕  ＳＧＲＦあるいはそのシグナルを代替する化合物を有効成分として含有する感染防御剤、
〔１２〕  ＳＧＲＦに対するアンタゴニストを有効成分として含有する自己免疫疾患治療薬、
〔１３〕  ＳＧＲＦに対するアンタゴニストを有効成分として含有する炎症疾患治療薬、
〔１４〕  アンタゴニストが抗ＳＧＲＦ抗体である〔１２〕または〔１３〕に記載の治療薬、
〔１５〕  下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、自己免疫疾患治療薬または炎症疾患治療薬のための候補化合物をスクリーニングする方法、
（ａ）ＳＧＲＦと被験化合物を接触させる工程
（ｂ）ＳＧＲＦと被験化合物との結合活性を測定する工程
（ｃ）ＳＧＲＦと結合する化合物を選択する工程
〔１６〕  下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むＳＧＲＦタンパク質の機能を代替する化合物のスクリーニング方法、
（ａ）〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の遺伝子改変動物に被験化合物を投与する工程
（ｂ）被験化合物がＳＧＲＦの機能を代替しているか否かを判定する工程
（ｃ）ＳＧＲＦの機能を代替する化合物を選択する工程、を提供するものである。
本発明は、ＳＧＲＦ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物およびＥＳ細胞を提供する。
本発明のＳＧＲＦ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−Ｓｉｘ，Ｇ−ＣＳＦ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ）遺伝子（該遺伝子によってコードされるタンパク質を「ＳＧＲＦ」と記載）は、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０３００００）およびマウス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３０１６１９）等において知られており、４つのエクソンから構成される（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０３０００１）。本発明において「ＳＧＲＦ遺伝子の発現が人為的に抑制されている」とは、通常、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態を指す。正常なＳＧＲＦタンパク質としての機能が減少または喪失している変異ＳＧＲＦタンパク質が発現している場合も、この「ＳＧＲＦ遺伝子の発現の抑制」に含まれる。上記「抑制」には、ＳＧＲＦ遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほか、該遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明においては、ＳＧＲＦ遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが好ましい。また、遺伝子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。
本発明においてＳＧＲＦ遺伝子の改変の対象となる動物は、通常、ヒト以外の動物であり、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等のげっ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。本発明においてＳＧＲＦ遺伝子の改変の対象となるＥＳ細胞もまた、げっ歯類に由来するものが好ましく、特にマウス由来が好ましい。なお、一般的に称される「ノックアウト動物」も本発明の遺伝子改変動物に含まれる。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物（単に、「遺伝子改変動物」と記載する場合あり）および遺伝子改変ＥＳ細胞において、ＳＧＲＦ遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、ＳＧＲＦ遺伝子全体またはその一部を欠損させる方法やＳＧＲＦ遺伝子の発現制御領域の全部またはその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することによりＳＧＲＦ遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好ましい態様において、遺伝子改変動物および遺伝子改変ＥＳ細胞は、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする。
本発明の遺伝子改変動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製することができる。まず、マウスからＳＧＲＦ遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡを単離し、このＤＮＡ断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスのＥＳ細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、ＰＣＲおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法に従って、本発明の遺伝子改変マウスを作製することが可能である。マウス以外のＥＳ細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。
また、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株は、以下の方法により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性化された細胞株、即ち、ＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。
また本発明は、本発明の遺伝子改変非ヒト動物から樹立された細胞株を提供する。本発明の遺伝子改変動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法を用いることが可能である。（新生化学実験講座、１８巻、１２５頁〜１２９頁、東京化学同人、およびマウス胚の操作マニュアル、２６２頁〜２６４頁、近代出版）。
本発明の遺伝子改変動物、該動物から樹立した細胞株、およびＥＳ細胞株は、ＳＧＲＦ遺伝子の詳細な機能の解析に利用することができる。例えば抗ＳＧＲＦ抗体またはＳＧＲＦアンタゴニスト低分子等のＳＧＲＦ阻害剤の副作用を推測するために使用することができる。本発明で取得される遺伝子改変マウスは正常に生育し、少なくとも胎生期に死亡することはなかったことから、ＳＧＲＦ阻害剤（アンタゴニスト）は致死性の副作用はないものと考えられる。本発明の遺伝子改変動物を詳細に検討することにより、ＳＧＲＦ阻害剤の副作用を推測することができる。また、遺伝子改変動物の組織から樹立した細胞株を用いることで、各組織でのＳＧＲＦ阻害剤の副作用を詳細に検討することが可能である。さらに、本発明の遺伝子改変動物は、後述のＳＧＲＦタンパク質の機能を代替する化合物のスクリーニング方法に利用することができる。
本発明の遺伝子改変動物は、生まれながらにしてＳＧＲＦ遺伝子が不活性化されているため、ＳＧＲＦあるいはＩＬ−１２  ｐ４０等のようにＳＧＲＦと結合するタンパク質に対する抗体を効率よく作製することができる。例えば、完全フロインドアジュバンドとともに、ＳＧＲＦを本発明の遺伝子改変マウスに免疫することによって、ＳＧＲＦに対するモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗体を効率よく作製することができる。この際、免疫するＳＧＲＦはマウス由来のもの以外に、ラットやヒト由来であってもよい。
また、本発明の遺伝子改変動物の症状を観察し、これまで原因の明らかでなかった疾患の症状と比較することで、疾患の原因がＳＧＲＦの機能不全であることを明らかにすることも可能である。例えば、遺伝子改変マウスあるいは当該マウス由来細胞に特徴的に現れる表現系を観察し、ヒトの疾患の諸症状と比較する。当該ヒト疾患の諸症状のうち半分以上が本発明の遺伝子改変マウスで観察されれば、当該疾患の原因がＳＧＲＦの機能不全であると推定することができる。
本発明者らは後述の実施例で示すように、ＳＧＲＦ遺伝子を不活性化したマウス（ＳＧＲＦ  ＫＯマウス）を作製し、これを解析することによりＳＧＲＦ自体の生理機能や病態との関連を明らかにした。このＳＧＲＦ  ＫＯマウスは病原微生物であるリステリアの感染に弱い。このことから、ＳＧＲＦ並びにそのシグナルに関与する代価物質は、病原微生物に対する薬となりうることが期待される。よって本発明は、ＳＧＲＦを有効成分として含有する感染防御剤を提供する。
また、ＳＧＲＦ  ＫＯマウスは実験的脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）が誘導されにくい。即ち、ＳＧＲＦはヒトの多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）を始めとする自己免疫疾患発症の重要な因子であることが考えられ、ＳＧＲＦは自己免疫疾患のための治療のターゲットになり得るものと考えられる。つまり、ＳＧＲＦに対するアンタゴニストは、自己免疫疾患の治療のための薬剤となることが期待される。従って本発明は、ＳＧＲＦに対するアンタゴニストを有効成分として含有する自己免疫疾患治療薬を提供する。
さらに、後述の実施例で示すようにＳＧＲＦ  ＫＯマウスは、遅延型過敏反応が低下していることが分かった。このことからＳＧＲＦの機能の抑制は、喘息やアレルギー等の様々な炎症疾患の治療の目的になりうるものと考えられる。よって本発明は、ＳＧＲＦに対するアンタゴニストを有効成分として含有する炎症疾患治療薬を提供する。
さらに本発明は、ＳＧＲＦに対するアンタゴニストを有効成分として含有する脳疾患治療剤を提供する。
本発明のＳＧＲＦに対するアンタゴニストとしては、例えば、抗ＳＧＲＦ抗体、および抗ＩＬ−１２  ｐ４０抗体等を挙げることができる。このＳＧＲＦに対するアンタゴニストは、例えば以下のような方法によりスクリーニングすることが可能である。
Ｂａ／Ｆ３細胞にＩＬ−１２Ｒβ１とＩＬ−２３Ｒを導入すると、Ｂａ／Ｆ３細胞がＩＬ−２３に反応して増殖することが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６８，ｐ．５６９９−５７０８，（２００２））。従って、こうした細胞株のＩＬ−２３に依存した増殖を特異的に阻害する被検化合物をアンタゴニストとして同定することが可能である。
ＰＨＡで活性化させたヒト幼若化Ｔ細胞にＳＧＲＦを加えると、ＳＴＡＴ４のリン酸化が起きることが知られており、この系においてＳＧＲＦとの共存下でＳＴＡＴ４のリン酸化を抑える化合物は、アンタゴニスト候補となるものと考えられる。即ち、ＰＨＡで活性化させた幼若化Ｔ細胞と、ＳＧＲＦおよび被験化合物を接触させ、ＳＴＡＴ４のリン酸化を抑制する化合物を選択することにより、ＳＧＲＦアンタゴニストのスクリーニングが可能である。
上記自己免疫疾患としては例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、自己免疫性大腸疾患、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳脊髄炎、多発性筋炎・皮膚筋炎、慢性炎症性脱髄性多発性神経根炎、インスリン依存性糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、川崎病、習慣性流産等が挙げられる。また、炎症疾患としては、例えば、喘息、アレルギー、肝炎、関節炎（脊椎関節症、慢性関節リウマチ等）、痛風性関節炎、変形性関節症、気管支炎、月経性痙攣、腱炎、滑液包症、皮膚炎、湿疹、乾癬、火傷、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性大腸症候群、潰瘍性大腸炎、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症、リウマチ熱、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、結膜炎、心筋虚血等が挙げられる。
本発明の薬剤における「ＳＧＲＦ」は、天然のタンパク質の他、公知の遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。本発明の薬剤における「ＳＧＲＦ」は、その由来する生物に特に制限はない。ヒトの疾患の治療や予防に用いる場合には、好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。天然のタンパク質は、例えばＳＧＲＦが発現していると考えられる精巣、リンパ節、胸腺等の組織の抽出液に対し、ＳＧＲＦに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。
一方、組換えタンパク質は、当業者においては公知の方法により、例えば組換えポリペプチドとして調製することができる。組み換えポリペプチドは、例えば、ＳＧＲＦ遺伝子をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいはＳＧＲＦに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、ＳＧＲＦをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
上記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等が挙げられる。ＳＧＲＦを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ等が挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、ＳＧＲＦを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ）（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。この動物または植物にＳＧＲＦをコードするＤＮＡを導入し、動物または植物の体内でＳＧＲＦを産生させ、回収する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、ＳＧＲＦをコードするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、ＳＧＲＦを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、ＳＧＲＦをコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液や糸からＳＧＲＦを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、ＳＧＲＦをコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉よりＳＧＲＦを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られたＳＧＲＦは、宿主細胞内または細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
なお、本発明のＳＧＲＦを精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ等が用いられる。
本発明の上記抗ＳＧＲＦ抗体としては特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物にＳＧＲＦを免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらに遺伝子組み換えによるヒト化抗体、ヒト抗体も含まれる。上記抗体は、以下の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、ＳＧＲＦをウサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これをＳＧＲＦをカップリングさせたアフィニティーカラムにより、ＳＧＲＦのみを認識する画分を得て、さらにこの画分から免疫グロブリンＧあるいはＭを、プロテインＡ、あるいはプロテインＧカラムにより精製することにより調製することができる。また、モノクローナル抗体であれば、ＳＧＲＦをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＳＧＲＦに対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをヌードマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＳＧＲＦをカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。上記抗体は、ＳＧＲＦの精製や検出に用いられる他、ＳＧＲＦの機能を制御するための薬剤として用いることが可能である。抗体をヒトのための薬剤として用いる場合には、免疫原性の点で、ヒト抗体またはヒト化抗体が有効である。ヒト抗体またはヒト化抗体は当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ヒト抗体は、例えば、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＳＧＲＦを免疫することにより調製することが可能である。あるいは、ヒト抗体のファージライブラリーから、パニングすることにより調製することが可能である。また、ヒト化抗体は、例えば、モノクローナル抗体産生細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するＣＤＲグラフト法により調製することが可能である。
また本発明は、自己免疫疾患治療薬または炎症疾患治療薬のための候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）ＳＧＲＦと被験化合物を接触させる工程、（ｂ）ＳＧＲＦと被験化合物との結合活性を測定する工程、および（ｃ）ＳＧＲＦと結合する化合物を選択する工程を含む。
さらに、本発明のスクリーニングは、脳疾患治療剤のスクリーニングに用いることも可能である。
スクリーニングに用いる被検化合物としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清等が挙げられる。ＳＧＲＦと被験化合物との結合活性は、当業者に公知の方法によって測定することができる。
ＳＧＲＦと結合するタンパク質のスクリーニングは、例えば、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現してることが予想される組織若しくは細胞（例えば、精巣、リンパ節、胸腺等）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰＩＩなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、本発明のタンパク質をビオチンラベル、あるいはＧＳＴタンパク質との融合タンパク質として精製し、これを上記フィルターと反応させ、結合するタンパク質を発現しているプラークを、ストレプトアビジンや抗ＧＳＴ抗体などにより検出する「ウエストウエスタンブロッテイング法」（Ｓｋｏｌｎｉｋ  ＥＹ，Ｍａｒｇｏｌｉｓ  Ｂ，Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｍ，Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ  Ｅ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｒ，Ｄｒｅｐｐｓ  Ａ，Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  Ｊ（１９９１）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＰＩ３  ｋｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐ８５  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  ６５，８３−９０）により実施することが可能である。
また、ＳＧＲＦに結合するタンパク質またはその遺伝子のスクリーニングは、「ｔｗｏハイブリッドシステム」（「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、文献「Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２」）に従い実施することも可能である。即ち、ＳＧＲＦをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＳＧＲＦと結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製する。これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＳＧＲＦと結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させて、該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を得ることができる。
さらに、ＳＧＲＦを固定したアフィニティーカラムにＳＧＲＦと結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞の培養上清もしくは細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより、ＳＧＲＦに結合するタンパク質のスクリーニングを実施することも可能である。
また、固定したＳＧＲＦに、合成化合物、または天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）によりＳＧＲＦに結合する、低分子化合物、タンパク質（またはその遺伝子）、ペプチド等を単離する方法も当業者に周知の技術である。
さらに本発明は、本発明の遺伝子改変動物を利用した、ＳＧＲＦタンパク質の機能を代替する化合物のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法は、（ａ）本発明の遺伝子改変動物に被験化合物を投与する工程、（ｂ）被験化合物がＳＧＲＦの機能を代替しているか否かを判定する工程、および（ｃ）ＳＧＲＦの機能を代替する化合物を選択する工程を含む。
上記工程（ａ）における遺伝子改変動物への被験化合物の投与は、経口的または非経口的に行うことができる。また、被験化合物がＳＧＲＦの機能を代替しているか否かの判定は、例えば以下のような場合に、被験化合物はＳＧＲＦの機能を代替しているものと判定される。
（１）本発明の遺伝子改変動物は、リステリア等の病原微生物の感染に弱いことから、被験化合物の投与により、該動物がリステリア等の病原微生物感染に対して耐性を示す場合。
（２）本発明の遺伝子改変動物は、実験的脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の自己免疫疾患の症状が誘導されにくいことから、被験化合物の投与により、該動物がＥＡＥ等の自己免疫疾患の症状を誘導するようになる場合。
（３）本発明の遺伝子改変動物は、遅延型過敏反応等の炎症性疾患の症状が軽いことから、被験化合物の投与により、該動物の炎症性疾患が発症する、もしくは症状が悪化する場合。
（４）本発明の遺伝子改変動物（あるいは正常動物）からＳＧＲＦ受容体を発現している細胞（例えば、ヒト幼若化Ｔ細胞）を初代培養、あるいは継代培養し、その培養細胞に被験化合物を加えたときに、ＪａｋやＳＴＡＴがリン酸化される場合。
（５）Ｂａ／Ｆ３細胞にＩＬ−１２Ｒβ１とＩＬ−２３Ｒを導入すると、Ｂａ／Ｆ３細胞がＩＬ−２３に反応して増殖することが知られている。こうした細胞株のＩＬ−２３に依存した増殖を特異的に阻害する場合。
上記（１）の病原体の感染に抵抗性を付与するか否かを検討は、例えば、本発明のＳＧＲＦ遺伝子の遺伝子対の双方が不活性化されているマウスに病原体を感染させ、不活性化されていない正常個体（ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３＋／＋）と比較すればよい。こうしたマウスの感染実験にはリステリアなどが良く使用されているが、リステリアに限らず病原性の大腸菌、サルモネラ菌、プドウ状球菌などの病原菌、あるいは水庖性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）やインフルエンザ等のウイルス、さらにはリューシュマニアや日本住血吸虫などの寄生虫を感染させて比較することもできる。また、ＳＧＲＦの生体防御に関わる作用の検討において、上記病原微生物はマウスに感染するものに限らず、その他の動物に感染するもの、例えばＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、あるいはＨＩＶに対してであってもよい。
上記（２）は、具体的には、本発明の遺伝子改変マウスに公知の免疫学的方法で病態モデルを誘導し、正常個体と比較することにより検討することができる。例えば、ヒトの多発性硬化症のモデルとして、実験的脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）が知られている。また、ヒト慢性関節リウマチのモデルとしてはコラーゲン誘導関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、大腸炎のモデルとして硫酸デキストランナトリウム誘導大腸炎などが知られている。さらに、公知の自然に自己免疫疾患を発病するｌｐｒ／ｌｐｒマウス、あるいはＮＯＤマウス等と交配することによって、ヒトの全身性エリテマトーデスのモデルや糖尿病モデルで検討することもできる。
上記（３）は、具体的には、本発明の遺伝子改変動物に公知の免疫学的方法で病態モデルを誘導し、正常個体と比較することにより検討することができる。例えば、ＯＶＡを免疫後に再び気道からＯＶＡを感作させれば、喘息のモデルができる。あるいは、コンカナバリンＡをマウスの尾静脈から投与すると肝炎を誘導することができる。遅延型過敏反応（Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｔｙｐｅ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ；ＤＴＨ）は一般的な炎症のモデルである。
本発明のＳＧＲＦ、ＳＧＲＦに対するアンタゴニスト、抗ＳＧＲＦ抗体、またはスクリーニングにより単離しうる化合物をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ＳＧＲＦ  ｍＲＮＡの発現解析
マウス組織におけるＳＧＲＦ  ｍＲＮＡの発現解析を、ＳＧＲＦ  ｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロットにより行った。マウスＳＧＲＦ  ｍＲＮＡは胸腺において高発現しており、脳と精巣においても発現が確認された（図３ａ）。又、ＲＴ−ＰＣＲによる解析では、脾臓とリンパ節においても発現が確認された（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
［実施例２］マウスの作製
ＳＧＲＦ遺伝子のクローニングは、特許ＥＰ１０７２６１０に記載の方法に従って行った。マウスＳＧＲＦゲノムのスクリーニングは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（現Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）に依頼し、２つのＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンが得られた。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．が示したクローンアドレス（Ｃｌｏｎｅ  Ａｄｄｒｅｓｓ）とＧＳコントロールナンバー（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎｕｍｂｅｒ）は以下の通りである。
クローンアドレス      ＧＳコントロールナンバー
２２５（Ｌ１２）                ２４０５７
１９８（Ａ０３）                ２４０５８
これらのＢＡＣクローンを公知の方法によって大量調製し、ＱＩＡＧＥＮ社のＬａｒｇｅ−Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔによってＢＡＣ  ＤＮＡを調製した。
これらのＢＡＣは制限酵素マッピングの結果、同一のものと考えられたが、ＧＳコントロールナンバーが２４０５７のクローンをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、あるいは２４０５８のクローンをＢｇｌ  ＩＩによって切断し、それぞれから切り出されてくる約１３ｋｂ、９ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＨｉｎｄ  ＩＩＩサイト、あるいはｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＥｃｏＲ  Ｖサイト（ただし、Ｂｇｌ  ＩＩに変換済み）にサブクローニングした。それぞれのＤＮＡ断片を有するベクターをｐＢＳＫ−ｍＳＧＲＦ（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）、ｐＧＥＭ−ｍＳＧＲＦ（Ｂｇｌ  ＩＩ）と称する。シーケンスの結果、マウスＳＧＲＦ（ｍＳＧＲＦ）遺伝子をコードするゲノムの配列は図１、２、および配列番号：１〜７で示すように決定された（ただし、これは１２９／ＳＶ  ＪＩＩマウスの配列である）。
以上のシーケンス結果から、マウスＳＧＲＦ（ｍＳＧＲＦ）遺伝子もヒトＳＧＲＦ（ｈＳＧＲＦ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０３０００１）と同様に、４つのＥｘｏｎからなることが明らかになった。従って、本発明の遺伝子改変マウスは、以下のようにして作製することができる。すなわち、このＳＧＲＦのＥｘｏｎ部分を適当な薬剤マーカー遺伝子に置換してターゲッティングベクターを構築し、次いで、このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスのＥＳ細胞株に導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜すればよい。具体的には以下のようにして行った。
ｐＧＥＭ−ｍＳＧＲＦ（Ｂｇｌ  ＩＩ）に挿入されているｍＳＧＲＦ  ＤＮＡ断片は、開始コドンの１８塩基上流のＢｇｌ  ＩＩサイト、およびそのさらに上流のＢｇｌ  ＩＩまで約９ｋｂのプロモーター領域を含んでいる。また、ｐＢＳＫ−ｍＳＧＲＦ（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）は開始コドンの約１．７ｋｂから下流の約１３ｋｂまでを含むＤＮＡ断片である。また、Ｉｎｔｒｏｎ２からＥｘｏｎ４まで（シーケンスデータの配列５’−ＣＴＡＡＧＣＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：８）から５’−ＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号：９）まで）の約１．１ｋｂの領域は、ｐＢＳＫ−ｍＳＧＲＦ（Ｈｉｎｄ  ＩＩ）を鋳型に、制限酵素サイト（Ｓａｌ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ）を付加するような以下のプライマー（ＦｍＳＧＲＥＸ２、ＲＳＧＲ−Ａ）を用いてＰＣＲで増幅したものを、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＥａｓｙベクターにＴＡクローニングし、これをＳａｌ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで切断した。
フォワードプライマー；
2003034818.tif 000002
リバースプライマー；
2003034818.tif 000003
この場合にプライマーのＦｍＳＧＲＦＥＸ２内と、ＳＧＲＦ遺伝子のＥｘｏｎ４内にあるＳａｌ  Ｉサイト、およびＸｈｏ  Ｉサイトで切り出される約０．９ｋｂのフラグメントと、前述のｐＧＥＭ−ｍＳＧＲＦ（Ｂｇｌ  ＩＩ）に挿入されているｍＳＧＲＦプロモーター領域の約９ｋｂのフラグメントをノックアウトベクターに用いた。すなわち、これらのフラグメントの間に薬剤耐性遺伝子（ｎｅｏ）を配し、さらにジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）を結合させることにより、相同組換えを起こさなかった細胞株を排除することができる。
以上のように、本実施例ではＳＧＲＦ遺伝子のＥｘｏｎ１とＥｘｏｎ２を薬剤耐性遺伝子（ｎｅｏ）に置換することによって、ＳＧＲＦ遺伝子を不活化した（図３（Ａ））。また、薬剤耐性遺伝子（ｎｅｏ）は近傍の遺伝子の発現に影響する可能性が高いことから、ｎｅｏの両側にはｌｏｘＰ配列（５’−ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  Ｔ−３’（配列番号：１２））を配置し、ＳＧＲＦ遺伝子の近傍に既知もしくは未知の遺伝子が存在する場合には、ｎｅｏをＣｒｅ蛋白で除去することができるようになっている。ターゲッティングベクターは制限酵素（Ｎｏｔ  Ｉ）で１ヶ所切断し、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。
相同組み換え体作製にあたっては、ＴＡＫＡＲＡから販売されているＴｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｉｔ（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、添付のマニュアルに従ってＡＢ２．２細胞（１２９ＳｖＥｖマウス由来のＥＳ細胞）に導入し、Ｇ４１８による選抜を行った。組み換え体のスクリーニングには、ＰＣＲ法を採用した。スクリーニングに用いるＥＳ細胞は９６穴プレートで培養し、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳで２回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液（１０×ＬＡ緩衝液（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ用）５μｌ；５％  ＮＰ−４０  ５μｌ；プロティナーゼＫ（ＴＡＫＡＲＡ，２０ｍｇ／ｌ）４μｌ；蒸留水３６μｌ）を加えて５５℃、２時間処理し、続いて９５℃にて１５分処理することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲサンプルとした。ＰＣＲ反応混合物は上記のＰＣＲサンプル１μｌ、１０×ＬＡ緩衝液５μｌ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）８μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．４μｌ、ＬＡ  ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．５μｌ、および蒸留水２９．７μｌ（全５０μｌ）とした。また、ＰＣＲの条件は、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、６４℃にて３０秒間および７２℃にて１分２０秒間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて７分の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組換えを起こしたＥＳ細胞のサンプルでは、約１．３ｋｂのバンドが増幅された。プライマーはＦｎｅｏ−１がノックアウトベクターの薬剤耐性遺伝子内で、ＲＳＦＲ−ＡはＳＧＲＦ遺伝子のＥｘｏｎ４内に配置したが、これはノックアウトベクターの外側の領域である。
リバースプライマー；
2003034818.tif 000004
フォワードプライマー；
2003034818.tif 000005
２回の実験で解析したＥＳ細胞のクローン数は、それぞれ４２０個、７６０個であり、そのうち相同組み換え体は、それぞれ２個、および６個であった。すなわち、組換え効率は２／４２０（０．４６７％）、６／７６０（０．７９％）で、両実験あわせての組換え効率は０．６８％であった。
ＳＧＲＦ遺伝子対の一方が不活性化されたＥＳ細胞の７株を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の胚盤胞にインジェクションし、キメラマウスを得た。こうして作製されたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、ＳＧＲＦ遺伝子遺伝子対の一方が不活性化された細胞からなるマウス（以下、「ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３＋／−マウス」と記載する）を得た。実験に用いた７株のうち、クローンナンバー１１、２３、７５、８６の４株で、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３＋／−マウスが得られた。このうちのクローン１１、およびクローン８６由来のマウスを実験に用いた。これらのＳＧＲＦ／ＩＬ−２３＋／−マウス同士を交配することにより、ＳＧＲＦ遺伝子対の双方が不活性化されたマウス（以下、「ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウス」と記載する）を得た。これらのマウスにおいてＳＧＲＦ遺伝子対の片方、あるいは双方に変異遺伝子が挿入されていることをサザンブロット解析により確認した（図３（ｃ））。
なお、遺伝子発現の喪失は、胸腺由来のｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡを対象とした逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認した（図３（ｄ））。ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３のヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスは外見および成長とも正常であり、生殖能力が認められた。
［実施例３］ＳＧＲＦ遺伝子欠損マウスの解析
（１）ＫＬＨで免疫したＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスのサイトカイン産生
抗原誘導によるサイトカイン産生能及びＴ細胞増殖能とＳＧＲＦ／ＩＬ−２３との関連を検討するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）で免疫した野生型マウス（正常個体、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３＋／＋）とＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスから採取したリンパ節細胞のサイトカイン産生能および増殖能について調べた。
具体的には、Ｔｈ１応答を誘導する為に、２．５ｍｇ／ｍｌの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ株（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むフロインド完全アジュバンド（ＣＦＡ）に２００μｇのＫＬＨ（溶媒はＰＢＳ）を１：１の割合で溶解した乳濁液を、マウス（オス、１０週齢）の尾基部に経皮的に注入することで免疫した。５日後に鼡径リンパ節を切除し、１０％ＦＣＳと０．３ｍｇ／ｍｌのＫＬＨを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養した。サイトカインの産生を測定するために、リンパ節細胞を２４ウェルのプレート上で６×１０６細胞／ｍｌとなるように、１ｍｌの培養液中で培養した。培養開始から４８時間後に培養上清を回収し、サイトカイン濃度（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ）を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより入手）を用いて業者指定の方法で決定した。又、４８時間インキュベートした後に、０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加し、９６ウェルの平底マイクロプレート上で総容量２００μｌ中で６×１０６細胞／ｍｌになるように４時間静置し増殖の程度を測定し、ＤＮＡへの放射標識の取り込み率をＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
その結果、野生型マウスに由来するリンパ球と比較して、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−由来のリンパ球のＩＦＮ−γ産生は有意に低下した（図４ａ）。一方、ＫＬＨによって誘導されたＩＬ−４およびＩＬ−５の産生は著しく上昇した（図４ｂ，ｃ）。これとは対照的に、ＩＬ−１０産生およびＫＬＨ誘導性のＳＧＲＦ／ＩＬ−２３欠損リンパ球の増殖は野生型と同等であった（図４ｄ、ｅ）。
以上のデータは、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスではＴｈ１型サイトカインの産生が低下し、Ｔｈ２型サイトカインの産生が上昇することを示している。
（２）病原微生物に対する生体防御及びＤＴＨ
Ｔｈ１型応答はリステリア菌を始めとする細胞内病原体に対する防御に重要であり、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−αのようなＴｈ１型サイトカインは生体防御に不可欠である（Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｓ  Ｈ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１，１２９−１６３（１９９３））。
ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３と病原微生物感染に対する防御との関連を調べるため、リステリア菌感染後のＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスの生存率と、感染から４日後の肝臓中のリステリア菌体数を検討した。
具体的には、リステリア菌（血清型４ｂ）（２．３×１０６  ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ）を各ＳＧＲＦ遺伝子型のマウス（オス、１０週齢）及び野生型マウス（オス、１０週齢）の静脈に注入し（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，２９２−２９６（１９９７））、感染後のマウスの生存率を１５日間にわたって毎日調べた。その結果、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスの生存率は野生型マウスの生存率より低いことが判明した（図５ａ）。
又、感染後のリステリア菌の増殖を調べるために、３．１×１０６  ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅのリステリア菌をマウスに注入し、感染から４日後のマウスの肝臓を無菌的に除去し、滅菌済みのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジナイズした組織をＰＢＳで段階的に希釈して、ｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天（Ｄｉｆｃｏ）にプレーティングして３７℃で１６時間インキュベートした後にＣＦＵをカウントした。その結果、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスの肝臓におけるリステリア菌の増殖は、野生型マウスと比べて注射から４日後に有意に上昇した（図５ｂ）。
これらの結果は、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスは野生型マウスよりも、リステリアに感受性（非抵抗性）であり、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３がＩＬ−１２と同様にリステリア菌の排除に関与することを示唆している。
Ｔｈ１型免疫反応におけるＳＧＲＦ／ＩＬ−２３の役割をさらに調べるため、典型的な細胞媒介性免疫症状である遅延型過敏反応（ＤＴＨ）について検討した。
遅延型過敏反応は公知の方法で誘導した（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ４７１，１９９６）。すなわち、２．５ｍｇ／ｍｌのメチルＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）とＣＦＡ（ベクトンディッキンソン社）のエマルジョンをマウスの腹の皮内に２ヶ所、それぞれ５０μｌずつ免疫し、免疫から５日後に足裏の皮下に５．０ｍｇ／ｍｌのメチルＢＳＡ  ３０μｌを免疫して遅延型過敏反応を誘導した。なお、もう片足の裏の皮下にはコントロールとしてＰＢＳを投与した。２４時間後、４８時間後、７２時間後に足の腫れをマイクロメーター（尾崎製作所）で測定した。足の腫れは、ＰＢＳを投与した側の足の腫れを基準にして、メチルＢＳＡを投与した側の足の腫れを数値化し、各群の平均を求めた（ｎ＝６）。
その結果、特異的な足蹠の膨張反応はＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスで投与後３日間にわたって抑制された（図５ｃ）。
これらの結果からＳＧＲＦ／ＩＬ−２３がＴｈ１型応答に重要な役割を果たすことが示唆された。従って、ＳＧＲＦが病原微生物に対する感染防御に必要な因子であると考えられる。
（３）自己免疫疾患の発症への関与
多発性硬化症、慢性関節リウマチ、自己免疫性大腸疾患のなどの自己免疫疾患とＳＧＲＦ／ＩＬ−２３との関連は、本発明の遺伝子改変マウスに公知の免疫学的方法で病態モデルを誘導し、正常個体と比較することにより検討することができる。
実験的脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）はＴｈ１媒介性の中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患であり、ヒトの多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとして知られている。自己免疫疾患におけるＳＧＲＦ／ＩＬ−２３の役割を検討するため、以下の実験を行った。
ＥＡＥをＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスと野生型マウスに公知の方法で誘導した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．１８６  ｐ１２３３，１９９７）。すなわち、０日目と７日目に、３００μｇのＭＯＧペプチド（ＭＥＶ  ＧＷＹ  ＲＳＰ  ＦＳＲ  ＶＶＨ  ＬＹＲ  ＮＧＫ／配列番号：１５；サワデーテクノロジー社）を、０．２ｍｌのＣＦＡ（５００μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ株（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む）とともに、マウスの片側の腹の皮下に注射した。２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０日目にマウスの静脈内に投与し、最初の免疫から２日後に腹腔内に投与した。
マウスにＥＡＥを誘導した後、病態のスコアリングを行った。病態のスコアリングは、公知の方法にのっとって行った。すなわち、スコア１：正常、スコア２：足がふらつく、スコア３：後ろ脚に麻痺がある、スコア４：四肢に麻痺がある、スコア５：死亡する。個々のマウスでスコアリングし、各群の平均値をまとめた。その結果、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスは野生型マウスと比較してＭＯＧ誘導性ＥＡＥに対して著しい耐性を示した。図６の実験では６匹のＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスと６匹の野生型マウスを用いた。６匹中２匹のＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスがＥＡＥを発症したが、いずれもスコアは低いものであった。一方、野生型マウスは全てのマウスが重度のＥＡＥを発症し、６匹中４匹は死亡した。
さらに、ＥＡＥを誘導したＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスと野生型マウスについて組織学的分析を行った。組織学的分析を行うために、ＥＡＥを誘導したマウスの脊髄を切除して２０％中性緩衝ホルマリン液（Ｗａｋｏ）で固定化した。パラフィン切片を調整し、ヘマトキシリン／エオジン染色およびＫｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ（「Ｋｌｕｖｅｒ」の「ｕ」はｕにウムラウト）染色の実施を札幌総合病理研究所に依頼して行った。
ＭＯＧペプチドを注入した野生型マウスの脊髄を対象に組織学的分析を行ったところ、典型的なリンパ球浸潤（図６ｂ）と脱髄（図６ｄ）が認められた。これとは対照的に、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスの脊髄に組織学的変化は認められなかった（図６ｃ、ｅ）。
以上の結果から、ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−が、ＥＡＥの発症の重要な要因であり、ＳＧＲＦがヒトの多発性硬化症（ＭＳ）治療の新しい標的となりうることが分かった。
（４）骨代謝への関与
ＳＧＲＦが骨代謝に関与するか否かは、公知の雌マウスの卵巣を取り除くＯＶＸモデルで明らかにすることができる。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＳＧＲＦ遺伝子対が不活性化されＳＧＲＦの活性を持たない遺伝子改変動物が提供された。本発明の遺伝子改変動物およびＥＳ細胞は、ＳＧＲＦ阻害剤、例えば抗ＳＧＲＦ抗体またはＳＧＲＦアンタゴニスト等についての副作用を推測するために使用することができる。また、被検タンパク質や低分子がＳＧＲＦの機能を代替する機能を有するか否かの判定、並びにＳＧＲＦの機能を代替する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡのスクリーニングに利用することも可能である。
また、遺伝子改変マウス（ＳＧＲＦ  ＫＯマウス）は、病原微生物であるリステリアの感染に弱いことから、ＳＧＲＦ、あるいはそのシグナルに関与する代価物質は、病原微生物に対する薬となりうることが考えられる。
さらに、ＳＧＲＦ  ＫＯマウスは実験的脳脊髄炎が誘導されにくく、遅延型過敏反応が低下している。従って、ＳＧＲＦの機能を阻害するアンタゴニストは、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療薬となるものと大いに期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図中のＷｔは野性型マウス、ＫＯはＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスを表わす。
図１は、マウスＳＧＲＦ遺伝子をコードするゲノム塩基配列を示す図である。
図２は、マウスＳＧＲＦ遺伝子をコードするゲノム塩基配列を示す、図１の続きの図である。
図３は、マウス組織におけるＳＧＲＦ  ｍＲＮＡの発現解析とＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスの作製の写真及び図である。
ａ．マウスＳＧＲＦ転写物のノーザンブロット解析を示す写真である。ノーザンブロットハイブリダイゼーションに使用されたｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（５μｇ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス、４週齢）の組織（脳、心臓、胸腺、肺、肝臓、脾臓、リンパ節、腎臓、精巣）から調整した。リファレンスとしてβ−アクチンを用いた。
ｂ．マウスＳＧＲＦ遺伝子及びジーンターゲッティングベクターの構造を示す。ＳＧＲＦ遺伝子の２つのエクソンを、ｌｏｘＰ配列ではさまれたネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）で置換することにより、ターゲティングベクターを構築した。ジフテリアトキシンＡ（ＤＴＡ）フラグメント遺伝子は、ゲノムＤＮＡフラグメントの外側（３’側）に配置した。図中の■はエクソンを、矢印黒三角はｌｏｘＰ配列を表す。
ｃ．ＥｃｏＲ−Ｉで切断したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す写真である。相同組換え後、変異アリルをｎｅｏ遺伝子上に導入したＥｃｏＲＩ切断部位を利用して検出した。
ｄ．胸腺から単離したｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である。それぞれのＳＧＲＦ遺伝子型を有するマウスから得られたＰＣＲ産物、及びコントロールとして用いたＧＡＰＤＨのＰＣＲ産物を表す。
図４は、野生型マウス及びＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスから採取したリンパ節細胞の抗原誘導サイトカイン産生能と増殖能を示す図である。マウス（オス、１０週齢）５匹ずつをＣＦＡで溶解したＫＬＨ（２００μｇ）で免疫した。リンパ節は５日後に採取し、３００μｇ／ｍｌのＫＬＨ存在下で４８時間培養した後に、ＩＦＮ−γ（ａ）、ＩＬ−４（ｂ）、ＩＬ−５（ｃ）、ＩＬ−１０（ｄ）の産生能力、又は増殖能力（ｅ）を分析した。Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｃｏｎ  Ａ，２μｇ／ｍｌ）は非特異的な増殖のコントロールとして用いた。データは各群５匹のマウスから得た平均±標準偏差で表される。†はＰ＜０．００３，‡はＰ＜０．０５，§はＰ＜０．０３を表す（対応のないｔ検定によりＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスを野生型マウスと比較）。
図５は、野生型マウスとＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスにおけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染に対する感受性とＤＴＨ反応を示す図である。
ａ．Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．感染後の野生型マウスとＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスの生存率を示す。６匹のマウス（メス、１０週齢）の静脈内にＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（２．３×１０６ＣＦＵ）を注入した。
ｂ．野生型マウス及びＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウス体内でのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を示す。感染（３．１×１０６ＣＦＵ）から４日後、肝臓を回収し、菌体数を測定した。統計的解析として、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｒａｎｋ−ｔｅｓｔを用いた（ｐ＜０．００４）。
ｃ．野生型マウス及びＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスにおけるＤＴＨ反応を示す。６匹のマウス（オス、１０週齢）に、ＣＦＡに溶解したｍＢＳＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを皮内に免疫した。５日後、３０μｌのｍＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）を一方の後ろ足に注射した。Ｐ＜０．００７、それぞれの時点においてＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスを野生型マウスと比較（対応のないｔ検定）。
図６は、野生型マウス及びＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスにＥＡＥを誘導した結果を示す図及び写真である。マウス（メス、８週齢）をＣＦＡに溶解したＭＯＧペプチド３５−５５で免疫し、百日咳毒素をＥＡＥ誘導プロトコールにしたがって皮下注射した。
ａ．６匹の野生型マウスと６匹のＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスの平均疾患スコアの臨床経過を示す。グラフには、実験中に死亡した４匹の野生型マウスのスコアが含まれている。その他のマウスはいずれも生存した。
ｂ−ｅ．実験的にＥＡＥを誘導した野生型マウス及びＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウスから得たＣＮＳの組織学的切片を示す写真である（ｂ，ｄ：野生型マウス、ｃ，ｅ：ＳＧＲＦ／ＩＬ−２３−／−マウス）。切片はマウスを感作処理してから１ヶ月後に回収した。図ｂ及びｃは組織切片（厚さ４−６μｍ）をヘマトキシリン及びエオジンで染色したものを表す（×２００）。図ｄ及びｅは組織切片（厚さ４−６μｍ）をＫｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ（「Ｋｌｕｖｅｒ」の「ｕ」はｕにウムラウト）染色したものを表す（×２００）。矢印はリンパ球浸潤を示し、くさび形は脱髄を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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