(57)【要約】甘味剤等の成分として期待されるモナティン等、グルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を効率的に製造する方法である。下記一般式（１）2003056026.tif 000069の置換α−ケト酸から、下記一般式（２）2003056026.tif 000070に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施する。
2003056026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
2003056026.tif 000064
（一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は相互に独立して、それぞれ水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水素原子を表す場合には、他方は水素原子、メチル基又はエチル基を表さない。また、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水酸基を表す場合には、他方は水素原子又はメチル基を表さない。Ｒ１が芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。）
の置換α−ケト酸から、下記一般式（２）
2003056026.tif 000065
（一般式（２）におけるＲ１及びＲ２は、一般式（１）におけるＲ１、Ｒ２と同義である。）
に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（２）のグルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を生成することを特徴とするグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
前記Ｒ１は、フェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であり、前記Ｒ２は、水酸基であることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
前記酵素は、デヒドロゲナーゼ又はトランスアミナーゼであることを特徴とする、請求の範囲第１項または第２項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記酵素は、トランスアミナーゼであり、かつ、反応系にアミノ供与体として、アミノ酸の１種又は複数種を含有することを特徴とする、請求の範囲第３項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、システイン、ヒスチジン及びリジンから選択されることを特徴とする、請求の範囲第４項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記酵素は、Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼであることを特徴とする、請求の範囲第３項〜第５項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼであることを特徴とする、請求の範囲第３項〜第５項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項８】
反応系にＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素を含有することを特徴とする、請求の範囲第７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ属からなる群から選ばれる微生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求の範囲第６項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉからなる群から選ばれることを特徴とする、請求の範囲第９項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求の範囲第７項又は第８項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１２】
前記微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓからなる群から選ばれることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１３】
前記酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子を導入した微生物の産生する酵素であることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１４】
前記微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求の範囲第１３項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１５】
前記Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来であることを特徴とする、請求の範囲第１３項又は第１４項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１６】
少なくとも、下記〔Ｉ〕および〔ＩＩ〕の工程を含むことを特徴とするグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔Ｉ〕下記一般式（３）
2003056026.tif 000066
（一般式（３）において、Ｒは、炭素数２〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。Ｒが芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。）
で表される置換α−ケト酸と、
オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、
下記一般式（４）
2003056026.tif 000067
（一般式（４）におけるＲは、一般式（３）におけるＲと同義である。）
に表す置換α−ケト酸を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（４）の置換α−ケト酸を生成する工程
〔ＩＩ〕前記一般式（４）の置換α−ケト酸から下記一般式（５）
2003056026.tif 000068
（一般式（５）におけるＲは、一般式（３）におけるＲと同義である。）
に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（５）のグルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を生成する工程
【請求項１７】
前記Ｒは、フェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であることを特徴とする、請求の範囲第１６項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１８】
前記〔Ｉ〕の工程の反応を触媒する酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、請求の範囲第１６項または第１７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１９】
前記微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉであることを特徴とする、請求の範囲第１８項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項２０】
前記微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１であることを特徴とする、請求の範囲第１９項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項２１】
前記〔１〕の工程の反応を触媒する酵素は、下記のいずれかのタンパク質であることを特徴とする、請求の範囲第１６項または第１７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２２】
前記〔Ｉ〕の工程の反応を触媒する酵素は、下記のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が増幅発現された組換え体から得られる酵素であることを特徴とする、請求の範囲第１６項または第１７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２３】
少なくとも、下記〔Ａ〕〜〔Ｃ〕の工程を含むことを特徴とするモナティンの製造方法。
〔Ａ〕トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成する工程
〔Ｂ〕インドール−３−ピルビン酸とオキサロ酢酸またはピルビン酸とから４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する工程
〔Ｃ〕４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸からモナティンを生成する反応を触媒する酵素の存在下で、前記４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を反応させることにより、モナティンを生成する工程
【請求項２４】
前記〔Ａ〕の工程は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成させて反応液とし、該反応液に脱気処理、脱酸素処理及び高くともｐＨ値２のｐＨ調整の何れかを施してインドール−３−ピルビン酸を採取する工程であることを特徴とする請求の範囲第２３項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２５】
前記脱気処理又は脱酸素処理は、前記反応液中に含まれる気体の全部又は一部を不活性ガスで置換する方法であることを特徴とする、請求の範囲第２４項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２６】
前記不活性ガスは、窒素、アルゴン及びヘリウムの何れかであることを特徴とする、請求の範囲第２５項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２７】
前記ｐＨ調整は、前記反応液への酸添加によるものであり、該ｐＨ調整の結果生成したインドール−３−ピルビン酸を晶析させ、これを採取する工程を含むことを特徴とする、請求の範囲第２４項〜第２６項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２８】
前記酸は、硫酸、塩酸、硝酸及び燐酸の何れかであることを特徴とする、請求の範囲第２７項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２９】
前記〔Ａ〕の工程の反応を触媒する酵素は、アミノ酸オキシダーゼ活性及びカタラーゼ活性を有する微生物に由来することを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第２８項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３０】
前記〔Ａ〕の工程の反応を触媒する酵素は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ属の何れかに由来することを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第２９項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３１】
前記酵素は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＪ２４２５、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＩＦＯ１３５０１、及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８の何れかに由来することを特徴とする、請求の範囲第３０項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３２】
前記〔Ａ〕の工程は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ属から選択されるトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する能力を有する微生物の培養物を、トリプトファンに作用させてインドール−３−ピルビン酸を生成せしめインドール−３−ピルビン酸を採取する工程であることを特徴とする、請求の範囲第２３項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３３】
前記〔Ｂ〕の工程を、当該反応を触媒する酵素の存在下で行うことを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第３２項記載のモナティンの製造方法
【請求項３４】
前記〔Ｂ〕の工程を、化学合成法により行うことを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第３２項記載のモナティンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酵素反応を利用したグルタミン酸誘導体の製造方法に関する。さらに本発明は、出発原料としてアミノ酸の一種であるトリプトファンを用いて甘味剤として有用なモナティンを製造する方法に関する。
背景技術
下記構造式（６）で示される４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）−インドール）（以下、「モナティン」と称する。）は、南アフリカの潅木シュレロチトン  イリシホリアス（Ｓｃｈｌｅｒｏｃｈｉｔｏｍ  ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ）の根に含有されるアミノ酸の一種であり、ショ糖の数百倍の甘味を有していることから、特に低カロリー甘味料として期待される化合物である（特開昭６４−２５７５７号公報参照）。
2003056026.tif 000003
上記モナティンは、２位と４位に不斉炭素を有しており、モナティンの天然型の立体異性体は（２Ｓ，４Ｓ）体である。その他、非天然型の立体異性体の存在についても、合成的に調製され３種の立体異性体の存在が確認されている。そして、天然型の前記モナティンのみならず、その他の立体異性体の何れもがそれぞれ高倍率の甘味強度を有し、その１種或いはその複数混合物の何れも、甘味剤或いは甘味剤成分（甘味料）としての利用が期待される。
モナティンの製造方法については、過去に５例の報告が為されている。詳細は下記（１）〜（５）の先行技術文献に記載の通りである。
（１）米国特許第５９９４５５９号明細書
（２）テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００１年、４２巻、３９号、６７９３〜６７９６頁
（３）オーガニック  レターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２０００年、２巻、１９号、２９６７〜２９７０頁
（４）シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、１９９４年、２４巻、２２号、３１９７〜３２１１頁
（５）シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、１９９３年、２３巻、１８号、２５１１〜２５２６頁
しかしながら、何れの方法も多段階の工程を必要とするものであり、工業的生産レベルでのモナティンの合成方法はいまだ確立されていない。従って、そのようなモナティン及びその類縁体を含むグルタミン酸誘導体を工業的に製造する上でより簡便かつ高収率な製造方法の開発が求められる。
従って、本発明は、甘味料等の成分として期待されるモナティン及びその類縁体等、グルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）の効率的な製造方法を提供することを目的とする。
発明の開示
上記問題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、下記一般式（１）
2003056026.tif 000004
（一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は相互に独立して、それぞれ水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水素原子を表す場合には、他方は水素原子、メチル基又はエチル基を表さない。また、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水酸基を表す場合には、他方は水素原子又はメチル基を表さない。Ｒ１が芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。）
の置換α−ケト酸から、下記一般式（２）
2003056026.tif 000005
（一般式（２）におけるＲ１及びＲ２は、一般式（１）におけるＲ１、Ｒ２と同義である。）
に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（２）のグルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を生成することに成功し、この知見に基づいて本発明を完成するに到った。
本発明のグルタミン酸誘導体の製造方法により、下記式（７）に示す４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、ＩＨＯＧ）から、酵素反応を利用して、下記式（６）に示すモナティンを効率的に製造することが可能となる。
2003056026.tif 000006
2003056026.tif 000007
また、本発明者らは、本発明のグルタミン酸誘導体の製造方法を利用して、アミノ酸の一種であるトリプトファンを出発原料とする下記の反応▲１▼〜▲３▼からなる新たなモナティンの製造方法を開発した。下記の反応▲１▼〜▲３▼からなるモナティンの製造方法において、本発明のグルタミン酸誘導体の製造方法は反応▲３▼に相当する。反応▲１▼〜▲３▼からなるモナティンの製造ルートを反応式（８）に示す。
反応▲１▼：酵素の存在下、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を合成
反応▲２▼：インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合により前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成
反応▲３▼：酵素の存在下、ＩＨＯＧの２位をアミノ化してモナティンを合成
2003056026.tif 000008
即ち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  下記一般式（１）
2003056026.tif 000009
（一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は相互に独立して、それぞれ水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水素原子を表す場合には、他方は水素原子、メチル基又はエチル基を表さない。また、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水酸基を表す場合には、他方は水素原子又はメチル基を表さない。Ｒ１が芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。）
の置換α−ケト酸から、下記一般式（２）
2003056026.tif 000010
（一般式（２）におけるＲ１及びＲ２は、一般式（１）におけるＲ１、Ｒ２と同義である。）
に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（２）のグルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を生成することを特徴とするグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔２〕  前記Ｒ１は、フェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であり、前記Ｒ２は、水酸基であることを特徴とする、〔１〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔３〕  前記酵素は、デヒドロゲナーゼ又はトランスアミナーゼであることを特徴とする、〔１〕または〔２〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔４〕  前記酵素は、トランスアミナーゼであり、かつ、反応系にアミノ供与体として、アミノ酸の１種又は複数種を含有することを特徴とする、〔３〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔５〕  前記アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、システイン、ヒスチジン及びリジンから選択されることを特徴とする、〔４〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔６〕  前記酵素は、Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼであることを特徴とする、〔３〕〜〔５〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔７〕  前記酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼであることを特徴とする、〔３〕〜〔５〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔８〕  反応系にＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素を含有することを特徴とする、〔７〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔９〕  前記Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ属からなる群から選ばれる微生物に由来する酵素であることを特徴とする、〔６〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１０〕  前記微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉからなる群から選ばれることを特徴とする、〔９〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１１〕  前記Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に由来する酵素であることを特徴とする、〔７〕又は〔８〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１２〕  前記微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ及び  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓからなる群から選ばれることを特徴とする、〔１１〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１３〕  前記酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子を導入した微生物の産生する酵素であることを特徴とする、〔１〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１４〕  前記微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであることを特徴とする、〔１３〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１５〕  前記Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来であることを特徴とする、〔１３〕又は〔１４〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１６〕  少なくとも、下記〔Ｉ〕および〔ＩＩ〕の工程を含むことを特徴とするグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔Ｉ〕下記一般式（３）
2003056026.tif 000011
（一般式（３）において、Ｒは、炭素数２〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。Ｒが芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。）
で表される置換α−ケト酸と、
オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、
下記一般式（４）
2003056026.tif 000012
（一般式（４）におけるＲは、一般式（３）におけるＲと同義である。）
に表す置換α−ケト酸を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（４）の置換α−ケト酸を生成する工程
〔ＩＩ〕前記一般式（４）の置換α−ケト酸から下記一般式（５）
2003056026.tif 000013
（一般式（５）におけるＲは、一般式（３）におけるＲと同義である。）
に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（５）のグルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を生成する工程
〔１７〕  前記Ｒは、フェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であることを特徴とする、〔１６〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１８〕  前記〔Ｉ〕の工程の反応を触媒する酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、〔１６〕または〔１７〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔１９〕  前記微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉであることを特徴とする、〔１８〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔２０〕  前記微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１であることを特徴とする、〔１９〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔２１〕  前記〔Ｉ〕の工程の反応を触媒する酵素は、下記のいずれかのタンパク質であることを特徴とする、〔１６〕または〔１７〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔２２〕  前記〔Ｉ〕の工程の反応を触媒する酵素は、下記のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が増幅発現された組換え体から得られる酵素であることを特徴とする、〔１６〕または〔１７〕記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔２３〕  少なくとも、下記〔Ａ〕〜〔Ｃ〕の工程を含むことを特徴とするモナティンの製造方法。
〔Ａ〕トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成する工程
〔Ｂ〕インドール−３−ピルビン酸とオキサロ酢酸またはピルビン酸とから４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する工程
〔Ｃ〕４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸からモナティンを生成する反応を触媒する酵素の存在下で、前記４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を反応させることにより、モナティンを生成する工程
〔２４〕  前記〔Ａ〕の工程は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成させて反応液とし、該反応液に脱気処理、脱酸素処理及び高くともｐＨ値２のｐＨ調整の何れかを施してインドール−３−ピルビン酸を採取する工程であることを特徴とする〔２３〕記載のモナティンの製造方法。
〔２５〕  前記脱気処理又は脱酸素処理は、前記反応液中に含まれる気体の全部又は一部を不活性ガスで置換する方法であることを特徴とする、〔２４〕記載のモナティンの製造方法。
〔２６〕  前記不活性ガスは、窒素、アルゴン及びヘリウムの何れかであることを特徴とする、〔２５〕記載のモナティンの製造方法。
〔２７〕  前記ｐＨ調整は、前記反応液への酸添加によるものであり、該ｐＨ調整の結果生成したインドール−３−ピルビン酸を晶析させ、これを採取する工程を含むことを特徴とする、〔２４〕〜〔２６〕記載のモナティンの製造方法。
〔２８〕  前記酸は、硫酸、塩酸、硝酸及び燐酸の何れかであることを特徴とする、〔２７〕記載のモナティンの製造方法。
〔２９〕  前記〔Ａ〕の工程の反応を触媒する酵素は、アミノ酸オキシダーゼ活性及びカタラーゼ活性を有する微生物に由来することを特徴とする、〔２３〕〜〔２８〕記載のモナティンの製造方法。
〔３０〕  前記〔Ａ〕の工程の反応を触媒する酵素は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ属の何れかに由来することを特徴とする、〔２３〕〜〔２９〕記載のモナティンの製造方法。
〔３１〕  前記酵素は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＪ２４２５、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＩＦＯ１３５０１、及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８の何れかに由来することを特徴とする、〔３０〕記載のモナティンの製造方法。
〔３２〕  前記〔Ａ〕の工程は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ属から選択されるトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する能力を有する微生物の培養物を、トリプトファンに作用させてインドール−３−ピルビン酸を生成せしめインドール−３−ピルビン酸を採取する工程であることを特徴とする、〔２３〕記載のモナティンの製造方法。
〔３３〕  前記〔Ｂ〕の工程を、当該反応を触媒する酵素の存在下で行うことを特徴とする、〔２３〕〜〔３２〕記載のモナティンの製造方法
〔３４〕  前記〔Ｂ〕の工程を、化学合成法により行うことを特徴とする、〔２３〕〜〔３２〕記載のモナティンの製造方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らが開発したグルタミン酸誘導体の製造方法は、酵素反応を利用して、下記一般式（１）の置換α−ケト酸から下記一般式（２）のグルタミン酸誘導体を生成するものであり、例えばアミノ基転移反応を触媒する酵素或いは該酵素を生産する微生物を作用させることによるグルタミン酸誘導体の製造方法に関する。
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また、本発明者らが開発した、トリプトファンを出発原料とするモナティンの製造方法は、下記の反応▲１▼〜▲３▼からなる。下記の反応▲１▼〜▲３▼からなるモナティンの製造方法は、反応▲３▼として本発明のグルタミン酸誘導体の製造方法を利用したものである。
反応▲１▼：酵素の存在下、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を合成
反応▲２▼：インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合により前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成
反応▲３▼：酵素の存在下、ＩＨＯＧの２位をアミノ化してモナティンを合成
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反応▲１▼〜▲３▼のうち、反応▲１▼および反応▲３▼は酵素を用いた反応であるが、反応▲２▼の実施方法については特に限定はなく、化学合成系および酵素系のいずれを用いて実施しても良い。
本発明のモナティンの製造方法は、トリプトファンを出発物質としてモナティンを製造する方法に限定されるものではなく、上記反応▲１▼〜▲３▼のうち、反応▲３▼を必須工程として含めばよい。すなわち、市販のインドール−３−ピルビン酸を出発物質として反応▲２▼＋反応▲３▼によりモナティンを製造する方法、および、前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を出発物質として反応▲３▼によりモナティンを製造する方法等も本発明に含まれる。したがって、下記の（イ）〜（ハ）の方法の全てが本発明のモナティンの製造方法に該当する。
（イ）反応▲１▼＋反応▲２▼＋反応▲３▼
（ロ）反応▲２▼＋反応▲３▼
（ハ）反応▲３▼のみ
また、上記モナティンの製造方法における反応▲２▼は、モナティンの前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）の合成に利用できるのみならず、本発明のグルタミン酸誘導体の製造方法に基質として用いる置換α−ケト酸の製造にも利用できる。すなわち、下記式（１０）に示すように、反応▲２▼を用いて得られた一般式（４）の置換α−ケト酸を用いて、反応▲３▼により一般式（５）のグルタミン酸誘導体を製造する方法（反応▲２▼＋反応▲３▼）も本発明のグルタミン酸誘導体の製造方法に含まれる。
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以下、本発明について、
〔Ａ〕反応▲１▼
〔Ｂ〕反応▲２▼
〔Ｃ〕反応▲３▼
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
〔Ａ〕反応▲１▼
下記反応式（１１）に示す反応▲１▼は、インドール−３−ピルビン酸の製造に関する反応である。本発明における反応▲１▼は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成させて反応液とし、該反応液に脱気処理、脱酸素処理及び高くともｐＨ値２のｐＨ調整の何れかを施してインドール−３−ピルビン酸を採取することを特徴とする。
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従来、インドール−３−ピルビン酸の化学的製造方法としては、Ｇｉｏｖａｎｎａ  Ｄｅ  Ｌｕｃａ等により、トリプトファンを出発原料とし、プロトン受容体脱水用塩基の存在下、ピリジンアルデヒドと反応させることにより、インドール−３−ピルビン酸を収率５０〜６２％で得る方法が知られている（特表昭６２−５０１９１２号公報、国際公開第８７／００１６９号パンフレット参照）。この方法においては、必要となる塩基とピリジンアルデヒドが高価であり、収率が低く、その結果、製造コストが非常に高いという問題があった。また、Ｐｏｌｉｔｉ  Ｖｉｎｃｅｎｚｏ等により、インドールとｅｔｈｙｌ−３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｅｓｔｅｒｏｘｉｍｅとを原料に用いた縮合反応の後、酸加水分解に付すことによって、インドール−３−ピルビン酸を収率６４％で得る方法が知られている（欧州特許４２１９４６号公報参照）。この方法においては、シリカゲルを用いた精製工程が必要であり、収率が低く、原料も高価であり、工業的製造では非常にコストが高いという問題点があった。
一方、酵素的製造方法としては、トランスアミナーゼを用いる方法が知られている（下記式（１２）参照）。
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Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）に  Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ由来Ｌ−トリプトファン  トランスアミナーゼを作用させ、４０ｍＭ  Ｌ−Ｔｒｐと８０ｍＭ  ２−ケトグルタル酸からインドール−３−ピルビン酸を生成させ、イオン交換樹脂等で精製し、収率７２％で得る方法（Ｂｏｂｅ  Ｒｕｅｄｉｇｅｒ等、東ドイツ特許ＤＤ  ２９７１９０参照）やアスパラギン酸トランスアミナーゼをＬ−Ｔｒｐと２−ケトグルタル酸に作用させてインドール−３−ピルビン酸を生成せしめ、該反応液を石油エーテル抽出後、カラムクロマトグラフィーによる分取によってインドール−３−ピルビン酸を精製し、これを採取する方法（マリオ・マテラツツイ等、特開昭５９−９５８９４号公報参照）について報告がある。これ等のトランスアミナーゼを用いる方法は、収率が低く、Ｌ−Ｔｒｐの他にアミノ基受容体として２−ケトグルタル酸等のケト酸を原料として必要とする上に、生成するインドール−３−ピルビン酸と等モルのアミノ基受容体に対応するアミノ酸が副生する。更に、収率を向上せしめるためにＬ−Ｔｒｐに対して過剰量のケト酸を反応系に投入するために、反応後に未反応のケト酸が残存する。これ等の理由により、反応液から目的とするインドール−３−ピルビン酸を採取するためには、イオン交換樹脂等を用いた精製工程が必要であり、操作が煩雑でコスト高となっている。
また、Ｌ−Ｔｒｐからインドール−３−ピルビン酸への製法としては、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いる方法が知られている。但し、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼによるトリプトファンの酸化反応（下記反応式（１３）参照）の際に副生する過酸化水素によってインドール−３−ピルビン酸がインドール酢酸へと分解される（下記反応式（１４）参照）ために、カタラーゼを反応系に添加して過酸化水素を分解する（下記反応式１５参照）方法が提案されている（米国特許第５００２９６３号明細書；テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９８７年、２８巻、１２号  １２７７〜１２８０頁参照）。
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即ち、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼと牛肝臓由来カタラーゼを担体に固定化した固定化酵素カラムを使用し、Ｌ−Ｔｒｐを含む溶液を通過させて反応せしめ、生成したインドール−３−ピルビン酸をイオン交換カラムに吸着させ、メタノールで溶出後、乾固・採取せしめる方法である。しかしながら、本法では初発０．５ｇのＬ−Ｔｒｐから０．２ｇのインドール−３−ピルビン酸しか取得できず収率が４０％と低い上に、酵素の固定化やイオン交換樹脂精製等の工程が煩雑であり、更に未反応のＬ−Ｔｒｐの回収・再利用工程も必要であるためコスト高であるという問題点を有していた。
一方、微生物由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼについて、Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｄｕｅｒｒｅ等により、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを粗精製し、Ｌ−Ｔｒｐの酸化活性が、酸素消費量を検出する活性測定法によって検出されている（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１９７５年、１２１巻、２号、６５６〜６６３頁参照）。また、古山等により、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｐ−５０１由来Ｌ−フェニルアラニンオキシダーゼがＬ−Ｔｒｐにも作用することが、酸素消費量を検出する活性測定法によって確認されている（野田産研、Ｋｉｙｏｆｕｍｉ  Ｍａｒｕｙａｍａ、ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９０年、１０８、３２７〜３３３頁参照）。
しかし、これ等の報告では何れも酵素反応中のＬ−トリプトファン消費量、酸素消費量乃至生成過酸化水素量を測定することによってオキシダーゼ活性を検出しており、インドール−３−ピルビン酸を直接定量していない。これはアミノ酸オキシダーゼによる反応で生成する過酸化水素によってインドール−３−ピルビン酸がインドール酢酸へと分解されるためであると考えられる。一方で、微生物菌体乃至菌体処理物を用いてインドール−３−ピルビン酸を生成せしめた例は無く、微生物によってトリプトファンがどのように代謝され、どのような分解産物が生成されるかは未知であった。
また、生成したインドール−３−ピルビン酸の採取法について、前述の関連技術の中で、トランスアミナーゼを用いる方法乃至蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いる方法においては、反応収率が低く、副生ケト酸乃至未反応Ｌ−トリプトファンが反応液中に混在するために、インドール−３−ピルビン酸の採取にクロマト分離工程を必要としており、操作が煩雑でコスト高であるという問題を有していた。
本発明者等は上記の事情に鑑み、安価かつ簡便にインドール−３−ピルビン酸を製造する方法を提供すべく検討を重ねた結果、アミノ酸オキシダーゼ及びカタラーゼ活性を有する微生物をトリプトファンに作用させると、インドール−３−ピルビン酸が生成し、これを採取できること、好ましくは、インドール−３−ピルビン酸が生成した反応液に対し不活性ガス置換等、或いはｐＨ調整により目的物の分解を抑制しつつインドール−３−ピルビン酸を生成し、採取できること等を見出した。更には、本発明者等は検討を重ねる中で、インドール−３−ピルビン酸が過酸化水素によるインドール酢酸への分解の他にも、溶液中で酸素等の攻撃を受け、構造未知の分解物を生成し、インドール−３−ピルビン酸を含む溶液が着色してしまうという問題点やその解決法を見出した。
すなわち、本発明においては、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成させて反応液とし、該反応液に脱気処理、脱酸素処理及び高くともｐＨ値２のｐＨ調整の何れかを施してインドール−３−ピルビン酸を採取する。
インドール−３−ピルビン酸は溶液状態では分解或いは着色が進行してしまうが、上記酸添加法によれば生成インドール−３−ピルビン酸の採取工程の初期段階でインドール−３−ピルビン酸が結晶化するため、その他の精製・処理法に比べて分解・着色が抑制されるという有利な点を有する。
また、インドール−３−ピルビン酸の分解物であるインドール酢酸は酸性条件下での直接晶析での淘汰が必ずしも容易ではないが、上記不活性ガス置換によれば、インドール酢酸の副生を抑制せしめる効果があることから、上記酸性下での晶析は不活性ガス置換と組み合わせることによって、高純度のインドール−３−ピルビン酸の採取により高い効果を有する。
また、本発明における反応▲１▼は、別の形態として、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する能力を有する微生物の培養物を、トリプトファンに作用させてインドール−３−ピルビン酸を生成せしめインドール−３−ピルビン酸を採取することを特徴とする。
これまで、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する能力を有する微生物の培養物について、これを、トリプトファンに作用させてインドール−３−ピルビン酸を生成せしめインドール−３−ピルビン酸を採取したとの報告は無く、故に上記方法は新規で有用なインドール−３−ピルビン酸の酵素法による製造方法を提供するものである。
以下、本発明の反応▲１▼の実施の形態について、
（Ａ−１）反応▲１▼に使用する酵素
（Ａ−２）反応▲１▼の反応条件
の順に説明する。
（Ａ−１）反応▲１▼に使用する酵素
反応▲１▼に使用する酵素としては、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する活性を有する酵素であれば特に限定なく使用できる。反応▲１▼に使用する酵素としては、アミノ酸オキシダーゼ活性とカタラーゼ活性を有する酵素が好ましい。
反応▲１▼において、「アミノ酸オキシダーゼ活性」とは、下記反応式（１３）に示される反応を触媒する活性である。一般的に、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼはＬ−アミノ酸から対応するケト酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼはＤ−アミノ酸から対応するケト酸を生成する。即ち、本発明において、Ｌ−トリプトファンを原料とした場合には、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物を、Ｄ−トリプトファンを原料とした場合は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物をそれぞれ使用することもできる。ＤＬ−トリプトファンから調製することもできる。これにＤ−及びＬ−アミノ酸オキシダーゼを作用させると定量的に、またＤ−又はＬ−アミノ酸オキシダーゼを作用させると５０％の収率で目的とするインドール−３−ピルビン酸を生成することができる。
また、「カタラーゼ活性」とは、下記反応式（１５）に示される反応を触媒する活性である。
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反応▲１▼におけるアミノ酸オキシダーゼ活性を有する酵素については、アミノ酸の酸化活性に伴う酸素消費量を検出する測定法（一例として、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１９７５年、１２１巻、２号、６５６〜６６３頁参照）、反応により生成する過酸化水素を定量する方法（一例として、Ｍ．Ｇａｂｌｅｒ等、エンザイム  アンド  ミクロバイアル  テクノロジー（Ｅｍｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０００年、２７、６０５〜６１１頁参照）等、各種公知の方法や、本発明において後述するトリプトファンから生成するインドール−３−ピルビン酸を直接定量する方法等の何れを用いても選択することができる。
反応▲１▼におけるカタラーゼ活性を有する酵素については、カタラーゼ反応による過酸化水素の減少を２３０ｎｍ〜２５０ｎｍの吸光度の変化で測定する方法、反応液の残存過酸化水素量をＫＭｎＯ４で定量する方法、反応で生じる酸素をマノメーターで測定する方法等、各種公知の方法で選択することができる。一例を挙げると、Ｍ．Ｇａｂｌｅｒ等、エンザイムアンド  ミクロバイアル  テクノロジー（Ｅｍｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０００年、２７、６０５〜６１１頁記載の残存過酸化水素をペルオキシダーゼの作用によりｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ等の電子供与体を酸化せしめて分光学的に定量する方法が挙げられる。これ等何れの方法を用いても、カタラーゼ活性を有する酵素を選択することができる。
更には、反応▲１▼に使用する酵素は、後述の実施例１に記載の方法に従って、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成せしめる活性を検出することによっても選択することができる。
反応▲１▼に使用する酵素を産生する微生物は、例えばＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ属から選択することができる。当該微生物としては、アミノ酸オキシダーゼ活性とカタラーゼ活性を有する微生物であることが好ましく、具体的にはＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属等を例示することができ、中でもＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＪ２４２５、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＩＦＯ１３５０１、及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８を好ましい微生物として挙げることができる。
尚、アクロモバクター  エスピーＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＪ２４２５については下記の通り寄託されている。
Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＪ２４２５株
（イ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７８６より、２００２年１１月２２日に国際寄託へ移管）
（ロ）受託日    ２００２年３月２０日
（ハ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））
また、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）受託微生物については、日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所から分譲、入手することができる。
これ等の微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
反応▲１▼に使用する酵素を産生する微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。例えば、炭素源としては、上記微生物が利用可能であれば何れも使用でき、具体的には、グルコース、シュークロース、デキストリン等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びこれ等の塩類、パラフィン等の炭化水素或いはこれ等の混合物を使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこの混合物を使用することができる。具体的な培地組成として、例えばグルコース１．０％、硫安０．３％、粉末酵母エキス１．０％、ペプトン  １．０％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．００１％（ｐＨ７．０）を含む培地等が挙げられる。
また、培地にはＬ−アミノ酸或いはＤ−アミノ酸等を酵素誘導剤として添加することによって、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する能力の高い菌体を得られる場合がある。
更に、基質の菌体内への透過性を高めるために、トライトン  Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）やトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）等の界面活性剤やトルエン、キシレン等の有機溶媒を利用することもできる。
培養温度については、通常、利用する微生物が生育する範囲、例えば２０〜４５℃程度の温度、好ましくは２５〜３７℃程度の温度範囲で反応が行われる。培地のｐＨ値については、好ましくは３〜１０程度、より好ましくは４〜８程度の範囲に調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常１２〜１２０時間程度、好ましくは１６〜９６時間程度反応が行われる。
（Ａ−２）反応▲１▼の反応条件
反応▲１▼は、酵素の存在下で、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成させて反応液とし、該反応液に脱気処理、脱酸素処理及び高くともｐＨ値２のｐＨ調整の何れかを施してインドール−３−ピルビン酸を採取することを特徴とする。
反応▲１▼において、「酵素の存在下で」とは、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換できる状態で、酵素を反応系に存在させることを意味する。即ち、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換できる限りはいかなる形態で酵素を反応系に存在させてもよく、例えば、酵素を単体で反応系に添加してもよいし、当該酵素活性を有する微生物（酵素産生菌、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞）、該微生物の培養物（液体培養、固体培養等）、培地（培養物から菌体を除去したもの）、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時に反応▲１▼を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いて反応▲１▼を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法（液体クロマトグラフィーや硫安分画等）によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
菌体又は菌体処理物の使用量については、所与の反応の場合において目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量については当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば、洗浄湿潤菌体の場合、反応液１００ｍｌ当たり１〜４０ｇである。
基質となるトリプトファンは、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体何れも使用可能であるが、入手の容易さと価格の点からＬ−体が採用される。トリプトファンは、目的の反応が抑制されない濃度の範囲で、一括して、間欠的に、又は連続的に添加される。添加方法については、菌株の培養中に直接添加してもよいし、培養後一旦菌体を分離し、この分離して得られた菌体若しくはその処理物と混合して用いることもできる。添加の際、基質は水溶液或いはスラリー状の状態で添加されるが、溶解度の増加や分散の促進を目的として、反応に影響を与えない有機溶媒や界面活性剤と混合して添加してもよい。
本発明において使用する反応については、好ましくはｐＨ３−１０程度、より好ましくはｐＨ５−９程度のｐＨ値範囲で、好ましくは１０−６０℃程度、より好ましくは２０−４０℃程度の温度範囲で、好ましくは０．５−１２０時間程度、より好ましくは０．５−２４時間程度の反応時間で、攪拌下或いは静置下で行うことができる。基質の使用濃度については、特に制限されないが、０．１％−１０％程度の濃度が好ましく採用される。
尚、培養液或いは反応液中の残存するトリプトファン、生成したインドール−３−ピルビン酸、若しくは副生したインドール酢酸の定量については、高速液体クロマトグラフィーによる周知の方法を用いて速やかにこれ等を容易に測定することができる。
かくして得られたインドール−３−ピルビン酸を蓄積した培養液（反応液）を、脱気或いは脱酸素処理することによりインドール−３−ピルビン酸の分解を抑制することができる。脱気処理及び脱酸素処理の方法としては、当該反応液中に含まれる気体（全部又は一部）を不活性ガス、例えば窒素及びアルゴン等で置換する方法を挙げることができる。
ここで、「脱気処理」とは、該反応液を不活性ガスで置換する、又は該反応液をアスピレーターや真空ポンプ等を用いて減圧条件下にする、等の操作によって、反応液中に存在する酸素、過酸化水素等のインドール−３−ピルビン酸と反応する成分の除去或いはその濃度を低下させる操作のことを意味する。また、「脱酸素処理」とは、反応液中の溶存酸素を除去し、又はその濃度を低下させるような操作のことである。具体的に溶液中の酸素を除去する方法としては、不活性ガスにより酸素を除去する方法、脱酸素剤を溶液中に添加する方法が例として挙げられる。
該反応液を不活性ガスで置換することにより、反応液中に残存する酸素を除去し、反応を停止させると共に、生成したインドール−３−ピルビン酸や残存したトリプトファンの分解を防ぐこともできる。ここで、「不活性ガス」とは、インドール−３−ピルビン酸と直接又は間接的に反応せずに、酸素或いは微量残存した過酸化水素等のインドール−３−ピルビン酸やトリプトファンと反応する成分を減少させる効果のある気体を意味する。本発明において使用し得る不活性ガスの例として、窒素、アルゴン、ヘリウム等を例示することができる。不活性ガス置換は、反応が終了した直後に実施してもよいし、洗浄菌体を用いた反応である場合には、菌体分離後に実施してもよい。
不活性ガスの投入方法としては、気相部を不活性ガスで置換し、気相部中の酸素濃度を下げる方法や、溶液中に不活性ガスを導入し溶存酸素を除去する方法等を挙げることができ、特にその投入方法には限定されない。気相部の酸素濃度については、５％以下、好ましくは３％以下、更に好ましくは１％以下が採用される。溶液中の酸素濃度については、１ｐｐｍ以下、好ましくは０．１ｐｐｍ以下、更に好ましくは０．０１ｐｐｍ以下であることが望ましい。
更には、亜硫酸ソーダ等、溶存酸素濃度を低下させる効果が知られている公知の物質を反応液に適宜添加することによっても、反応停止及びインドール−３−ピルビン酸の分解抑制を行うことが可能である。
本発明において脱酸素剤としては、亜硫酸イオンを用いることができる。亜硫酸イオン源としては、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸アンモニウム等の塩又は亜硫酸、或いはハイドロサルファイトを用いることができる。亜硫酸イオン、又はハイドロサルファイトとして、好ましくは２０ｐｐｍ以上１％以下、より好ましくは１００ｐｐｍ以上０．５％以下の濃度でこれ等を使用することが好ましい。
上記の不活性ガス置換処理と脱酸素剤を溶液中に添加する方法とは、これ等を組み合わせて実施することもできるし、何れか一方のみを実施することもできる。
反応によって生成したインドール−３−ピルビン酸は、常法により培養液或いは反応液中より採取して用いることができる。培養液或いは反応液中からの採取は、かかる場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作が必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。
本発明における望ましい一つの様態として、該反応液を酸性条件に調製することによって、インドール−３−ピルビン酸を晶析又は沈殿せしめ、インドール−３−ピルビン酸を反応終了混合物より直接分離し、採取することもできる。反応液のｐＨ調整に関しては、そのｐＨ値を、好ましくは２以下、より好ましくは１以下にすればよい。本発明においてはインドール−３−ピルビン酸の生成収率が高く、尚かつ副生ケト酸や未反応Ｌ−トリプトファンの溶液中濃度を低く調製できるため、酸性条件下でインドール−３−ピルビン酸を直接晶析せしめることにより、精製工程を簡略化することもできる。本発明において、更に望ましい一つの様態として、該反応液に硫酸、塩酸等の酸を適宜添加することによって、インドール−３−ピルビン酸を直接晶析せしめることもできる。この方法においては、インドール−３−ピルビン酸の生成収率が高く、尚かつ副生ケト酸や未反応トリプトファンの溶液中濃度を低く調製することができるため、酸性条件下でインドール−３−ピルビン酸を直接晶析せしめることにより、精製工程を簡略化することもできる。
酸性条件に調整するにあたり、使用する酸の種類としては、当該反応液が酸性になる効果をもつ方法であれば特に制限は無い。使用する酸の例としては塩酸、硫酸、硝酸、燐酸等を挙げることができる。当業者であれば、本発明の実施を妨げない範囲で晶析温度、酸の使用量、晶析時間、酸の添加方法等を適宜選択することができる。
晶析温度として好ましくは−２０℃〜１００℃程度、より好ましくは０℃〜６０℃程度を選択することができる。酸の使用量として好ましくは反応液のｐＨ値が２以下、より好ましくは１以下に調整できる量を選択することができる。酸添加後の溶液中の水素イオン濃度が好ましくは０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１ｍｏｌ／Ｌ程度になるよう酸を添加、使用することができる。
晶析時間として好ましくは１〜１００時間程度、より好ましくは１〜２４時間程度を選択することができる。
〔Ｂ〕反応▲２▼
本発明の反応▲２▼は、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）とから、モナティンの前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応である。しかし、反応▲２▼は、ＩＨＯＧの合成だけでなく、後述する反応▲３▼に基質として用いる置換α−ケト酸の合成にも利用することができる。
すなわち、反応▲２▼は、下記一般式（３）
2003056026.tif 000022
で表される置換α−ケト酸と、
オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、
下記一般式（４）
2003056026.tif 000023
に表す置換α−ケト酸を生成する反応にも広く利用することができる。
反応▲２▼によって得られた一般式（４）の置換α−ケト酸は、後述の反応▲３▼に基質として用いることができる。
一般式（３）、（４）において、Ｒは、炭素数２〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。Ｒが芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子（ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、フッ素原子等）、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。
Ｒは、フェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であることが好ましく、特に３−インドリルメチル基であることが好ましい。すなわち、一般式（３）の置換α−ケト酸としては、フェニルピルビン酸またはインドール−３−ピルビン酸が好ましく、特にインドール−３−ピルビン酸が好ましい。インドール−３−ピルビン酸としては、〔Ａ〕反応▲１▼の項で説明した方法により調製したインドール−３−ピルビン酸が好ましいが、インドール−３−ピルビン酸の調製方法は当然この方法に限定されるものではない。
一般式（３）の置換α−ケト酸としてインドール−３−ピルビン酸を用いた場合には、モナティン製造の重要中間体であるＩＨＯＧを製造することができる（反応式（１６））。
また、一般式（３）の置換α−ケト酸としてフェニルピルビン酸を用いた場合には、モナティンの類縁体である４−フェニルメチル−４−ヒドロキシグルタミン酸（ＰＨＧ）の中間体ケト酸であるＰＨＯＧ（４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸）を製造することができる（反応式（１７））。
2003056026.tif 000024
反応▲２▼の実施の形態は特に限定されず、化学反応系および酵素系のどちらを用いてもよい。以下、反応▲２▼の実施の形態について、化学反応系および酵素系に分けて、
（Ｂ−１）化学反応系
（Ｂ−２）酵素系
（Ｉ）反応▲２▼に使用する酵素
（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ
（２）アルドラーゼの性質
（３）アルドラーゼの製造方法
（ＩＩ）反応▲２▼の反応条件
の順に説明する。
（Ｂ−１）化学反応系
化学反応系を用いた反応▲２▼は、以下に示す方法や後述の実施例２を利用して容易に実施することができるが、当然この方法に限定されるものではない。
例えば、前記一般式（３）の置換α−ケト酸とオキサロ酢酸とを、交差アルドール反応及び脱炭酸反応に付して、前記一般式（４）で示される置換α−ケト酸を製造することができる。前記アルドール反応に付して得られる化合物が、反応系内で形成され重要な中間体となるが、敢えてこの化合物を単離することなく次の工程である脱炭酸反応に進むことができる。
当該アルドール反応の条件には特に困難は無く、無機塩基又は有機塩基存在下において適当な溶媒中にて置換ピルビン酸及びオキサロ酢酸を作用させるだけで容易に進行する。
用いる溶媒の種類としては、反応に不活性なものであれば特に制限は無い。
当業者であれば、本発明の実施を妨げない範囲で反応温度、塩基の使用量、反応時間、出発物質の添加方法を適宜選択することができる。
溶媒として好ましくは、水、メタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等を挙げることができる。
使用する場合の塩基として好ましくは、無機塩基、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム等のアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属に対応する水酸化物、若しくは炭酸化物や、有機塩基、例えばトリエチルアミン等を挙げることができる。
反応温度としては、好ましくは−２０〜１００℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度を採用することができる。
アルドール反応縮合物を脱炭酸させる反応においては、自発的な脱炭酸反応によっても達成されるが、反応液に酸又は金属イオン又はその両方を添加することで脱炭酸反応をより効果的に行うことができる。その場合に使用する酸としては、塩酸、硫酸、燐酸、酢酸、パラトルエンスルホン酸、イオン交換樹脂等の固体酸等を、金属イオンとしては、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオン等の遷移金属イオン等を、それぞれ挙げることができる。反応温度として好ましくは−１０〜１００℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度を選択することができる。
（Ｂ−２）酵素系
（１）反応▲２▼に使用する酵素
反応▲２▼に使用する酵素としては、一般式（３）で表される置換α−ケト酸と、オキサロ酢酸またはピルビン酸とのアルドール縮合により、前記一般式（４）で示される置換α−ケト酸を合成する反応を触媒できる酵素であれば、特に限定なく使用できる。すなわち、当該反応を触媒する酵素であれば、微生物由来の酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術により得られた酵素であってもよい。
本発明者らの研究により、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）の分解活性を有するアルドラーゼを生成する菌株が存在することが確認された。
これらの微生物が産生するアルドラーゼは、ＰＨＯＧ１分子を分解して、フェニルピルビン酸１分子およびピルビン酸１分子を生成する反応を触媒することから、本発明者らは、当該アルドラーゼが、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒しうると考えた。この考えに基づき、本発明者らは、新規アルドラーゼの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からアルドラーゼを精製単離するとともに、この酵素がインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合によりＩＨＯＧを合成することを発見した。
従来、２分子のα−ケト酸（ないしは置換α−ケト酸）を基質としたアルドール縮合を触媒する微生物酵素としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ、および、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどに存在する４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅの２例が報告されていた。前者の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅは、ピルビン酸２分子から４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ：４−ＨＭＧ）を生成する反応、および、４−ｏｘａｌｏｃｉｔｒａｍａｌａｔｅからオキサロ酢酸１分子とピルビン酸１分子を生成する反応を触媒することが報告されている（Ｋｉｙｏｆｕｍｉ  Ｍａｒｕｙａｍａ、ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９０年、１０８、３２７〜３３３頁参照）。また、後者の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅは、グリオキシル酸１分子とピルビン酸１分子から４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ：４ＨＧ）を生成する反応を触媒することが知られている。
しかし、これらのいずれの菌株からも、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、ＰＨＯＧ）分解活性や、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からモナティンの前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する活性についての報告・知見は全く無く、これらの菌株が産生するアルドラーゼを上述のモナティンの合成ルートに使用できるかについては不明であった。
すなわち、本発明者の発見以前に、微生物酵素系を用いてインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成させた例は、これまでに報告されていない。
また、本発明者らは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３由来のアルドラーゼを精製し、アルドラーゼのアミノ酸配列を決定した。さらに、アルドラーゼのアミノ酸配列から演繹した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、これを用いてＰＣＲ法により当該アルドラーゼをコードするＤＮＡの一部を単離・取得し、さらに該ＤＮＡ断片をプローブとして利用し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ由来アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ染色体遺伝子ライブラリーから単離することに成功した。
上記方法によって特定された本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡを配列表の配列番号１に示す。また、配列表の配列番号２および３に、配列表の配列番号１の塩基配列がコードするアルドラーゼのアミノ酸配列を示す。配列表の配列番号２は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列がコードするアルドラーゼのアミノ酸配列である。また、配列表の配列番号３は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号４４４〜１１１８の塩基配列がコードするアルドラーゼのアミノ酸配列である。配列表の配列番号２および３記載のいずれのアルドラーゼも、アルドラーゼ活性を有し、インドール−３−ピルビン酸１分子とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）１分子から、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒する。
（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有するアルドラーゼ遺伝子は、前述したようにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。配列表の配列番号１の塩基配列は、既知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｃｈｒａｃｅａｅ細菌由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（遺伝子名ｐｒｏＡ）（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．、バイオサイエンス  バイオテクノロジー  バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２００１年、６５（１２）、２７０１〜２７０９頁参照）とアミノ酸配列において、２９％の相同性を示す。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「ｇｅｎｅｔｙｘｖｅｒ．６」（ＧＥＮＥＴＹＸ社）を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。
アルドラーゼ産生菌からアルドラーゼをコードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
はじめに、精製されたアルドラーゼのアミノ酸配列を決定する。この際、エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．、アクタ  ケミストリー  スカンド（Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．）、１９５０年、４、２２７頁）を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼについて、プロテアーゼで限定分解した後に逆相ＨＰＬＣにてペプチド断片を分取し、それら断片のうち２つについて内部アミノ酸配列を決定したところ、配列表配列番号４および５に示される配列が明らかとなった。
明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はテトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９８１年、２２、１８５９頁に開示されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を、アルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはアルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長をアルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
ＰＣＲ法の操作については、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，トレンズ  イン  ジェネティックス  ５（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５），１９８９年、１８５頁に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、モレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ、１９８９年等に記載されている。
単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、ア  プラクティカル  ガイド  トゥ  モレキュラー  クローニング（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８５年に記載されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼをコードするＤＮＡを配列表配列番号１に示す。
なお、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する反応を触媒するアルドラーゼをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡだけではない。すなわち、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のうち、種および株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
また、当然ながら、アルドラーゼ産生菌の染色体ＤＮＡから単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、アルドラーゼをコードする場合には、反応▲２▼に利用することができる。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、メソッド  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１９８７年、１５４頁に記載されている部位特異的変異導入法がある。
また、配列表配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも反応▲２▼に利用することができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件（ここでいう相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、比較する配列間において一致する塩基の数が最大となるような並べ方にして演算された値であることが望ましい）、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、「アルドラーゼ活性」とは、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡがコードするアルドラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも反応▲２▼に利用できる。すなわち、
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡである。ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、アルドラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個である。また、「アルドラーゼ活性」とは、前述のとおり、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する活性を意味する。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３３℃、ｐＨ９の条件下で３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
（２）アルドラーゼの性質
つぎに、精製されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼの性質について説明する。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼは、前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、配列表配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、当然ながら、配列表の配列番号２および３に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質も反応▲２▼に利用することができる。
すなわち、下記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質を反応▲２▼を触媒する酵素として利用することができる。
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
ここで、「数個」および「アルドラーゼ活性」の定義は（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
これらのアルドラーゼは、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からアルドール縮合により４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒する。
上記のアルドラーゼのアルドラーゼ活性の測定は、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から生成するＩＨＯＧ量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することにより行うことが可能である。
具体的には、１００ｍＭバッファー、５０ｍＭインドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液にアルドラーゼを添加し、３３℃で４時間振とう反応させ、ＨＰＬＣにて生成したＩＨＯＧ量を定量することにより、アルドラーゼ活性を見積もることができる。
ＩＨＯＧの定量は、例えば、ジーエルサイエンス社製「ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量できる。分析条件の一例を以下に示す。
移動相：４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５ｍＭリン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
次に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ由来のアルドラーゼについて、上記分析方法にて測定した酵素化学的性質を以下に述べる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ由来アルドラーゼは、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合によりＩＨＯＧを合成する反応を触媒できる。２分子のα−ケト酸（ないしは置換α−ケト酸）を基質としたアルドール縮合を触媒する微生物酵素としては、これまでに、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ、および、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどに存在する４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅの２例が報告されているが、前者についてはＰＨＯＧあるいはＩＨＯＧに作用するといった知見・報告は全く無く、この酵素をもちいてＰＨＯＧ（およびＩＨＯＧ）を合成することが可能であるかについては全く不明であった。また、後者についてはＰＨＯＧ分解活性が認められず、この酵素を用いてもＰＨＯＧ（およびＩＨＯＧ）の合成は不可能であった。すなわち、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ由来のアルドラーゼは、今まで報告されていたアルドラーゼと異なり、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合によりＩＨＯＧを合成する反応を触媒できる点に特徴を有するものである。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ由来アルドラーゼの至適ｐＨは、３３℃において、約９付近にある。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ由来アルドラーゼの分子量をゲル濾過法により測定したところ約１４６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したところ約２５ｋＤａであったことから、本発明のアルドラーゼは、分子量約２５ｋＤａのサブユニット６量体構造をとると推察される。
（３）アルドラーゼの製造方法
次にアルドラーゼの製造方法について説明する。本発明の反応▲２▼に用いるアルドラーゼの製造方法としては、（ｉ）アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法と、（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法の２つがある。
（ｉ）微生物培養により生成蓄積する方法
アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法において、アルドラーゼの取得源となる微生物としてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物があげられる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のうち、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成する微生物であれば、いかなるものも本発明に使用可能であるが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ  ＡＪ１５８２、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ２９１７、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ  ＡＪ２７９７、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ  ＡＪ２４６８がより好ましい。このうち、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１が好ましい。これらの微生物の寄託先を下記に示す。
（１）  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株
（イ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４６（２００２年１１月２２日にＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８１より国際寄託へ移管）
（ロ）受託日    ２００２年６月１０日
（ハ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（２）  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ  ＡＪ１５８２株
（イ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４７（２００２年１１月２２日にＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８２より国際寄託へ移管）
（ロ）受託日    ２００２年６月１０日
（ハ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（３）  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ２９１７株
（イ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４５（２００２年１１月２２日にＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８０より国際寄託へ移管）
（ロ）受託日    ２００２年６月１０日
（ハ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（４）Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ  ＡＪ２４６８株
（イ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２
（ロ）受託日    １９８５年９月３０日
（ハ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（５）Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ  ＡＪ２７９７株
（イ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２５０（２００２年１１月２７日にＦＥＲＭ  Ｐ−４３４７より国際寄託へ移管）
（ロ）受託日    １９８５年９月３０日
（ハ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
アルドラーゼの取得源となる微生物の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。
通気条件としては、好気条件を採用する。培養温度としては、菌が発育し、アルドラーゼが生産される範囲であれば良い。従って、厳密な条件は無いが、通常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、アルドラーゼが最も生産される時間まで培養すれば良く、通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度である。
培養後、菌体を遠心分離（たとえば、１０，０００ｘｇ、１０分）により集菌する。アルドラーゼの大部分は菌体中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させることにより、アルドラーゼの可溶化を行う。菌体破砕には、超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
アルドラーゼ産生菌由来のアルドラーゼを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残査を除いた方が、精製に有利である。
アルドラーゼの精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を採用することができる。その結果、より比活性が高いアルドラーゼ含有画分を得ることができる。
（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術による製法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってアルドラーゼを製造する方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡは、アルドラーゼが発現可能であればよい。
ここで、ベクターＤＮＡに接続されるアルドラーゼ遺伝子の一例としては、（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡの項で説明したＤＮＡなどを使用できる。
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパクを生産する形質転換体内で該タンパクが会合し、タンパクの封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させることが好ましい。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク封入体は、タンパク変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパクに変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク封入体から活性型タンパクを得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパクを生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパクを菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパクを封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパクとの融合タンパクとして発現させる方法がある。
さらに、融合タンパクとして発現させた後に、目的のタンパクを切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。宿主−ベクター系が開発されている細菌細胞としてはエシェリヒア属細菌、シュードモナス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌などが挙げられるが、好ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。エシェリヒア・コリを用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてアルドラーゼを製造する方法を説明する。
アルドラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
アルドラーゼを融合タンパク封入体として生産させるためには、アルドラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク遺伝子とする。このような他のタンパクをコードする遺伝子としては、融合タンパクの蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパクの溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とアルドラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ  Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
プロモータ、アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、特にエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ＤＥ３）株、ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はモレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ、１９８９年等に記載されている。
融合タンパクとして発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、アルドラーゼ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてアルドラーゼを切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクを回収するには、以下の方法などがある。アルドラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりアルドラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、アルドラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパクとともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパクとして再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したアルドラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
また、当該アルドラーゼ遺伝子がシュードモーナス属細菌に由来するものである場合、好ましい一つの様態として、シュードモーナス属細菌を宿主として該アルドラーゼを発現・生産せしめることもできる。この場合の宿主細胞としては、例えばＳｈｉ−Ｅｎ  ＬｕらはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅでの組み換え発現法を報告している（ＦＥＭＳ  マイクロバイオロジー  レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００２年、２１０、１１５〜１２１頁）。また、Ｏｌｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．らはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａでの組換え発現法について報告している（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１９８２年、１５０、６０〜６９頁）。またＧｒａｐｎｅｒ，Ｓ．らはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉでの組換え発現法について報告している（バイオモレキュラー  エンジニアリング（Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．）、２０００年、１７、１１〜１６頁）。ただし、アルドラーゼ発現のための宿主細胞としてのシュードモナス属細菌はこれらに限定されるわけでない。
次にアルドラーゼ遺伝子をシュードモナス属細菌に導入するためのベクターについてであるが、シュードモナス属細菌細胞内で機能する複製開始点を有するプラスミドを用いることが出来る。例を挙げるとＥｚａ  ＫａｌｙａｅｖａらはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで機能するレプリコンＴＦＫを有するプラスミドｐＫＬＨ４．０５を報告している。また、グラム陰性細菌の形質転換に用いられる、いわゆる広宿主域ベクターを用いることも出来る。これらのベクターとしてはＲＫ４０４（Ｄｉｔｔａ，Ｇ．ら、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、１９８５年、１３、１４９〜１５３頁）やＲＳＦ１０１０（Ｆｒｅｙ，Ｊ．ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９８２年、２４、２８９〜２９６頁）などがシュードモナス属細菌でも機能することが知られている。
アルドラーゼをコードするＤＮＡとして、配列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を有するアルドラーゼが生産される。
（ＩＩ）反応▲２▼の反応条件
次に、酵素系を用いた場合の反応▲２▼の反応条件について説明する。
反応▲２▼を触媒する酵素としては、一般式（３）で表される置換α−ケト酸と、オキサロ酢酸またはピルビン酸とのアルドール縮合により、前記一般式（４）で示される置換α−ケト酸を合成する反応を触媒できる酵素であれば、特に限定なく使用できる。すなわち、当該反応を触媒する酵素であれば、微生物由来の酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術によって得られた酵素であってもよい。
このような酵素としては、（Ｉ）反応▲２▼に使用する酵素の項で説明したアルドラーゼが好ましい。この場合、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のうち、反応▲２▼を触媒するアルドラーゼを生成する菌体を培養して得たアルドラーゼを用いても良いし、組み換えＤＮＡ技術により当該反応を触媒するアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養して得たアルドラーゼを用いても良い。
反応▲２▼において、「酵素の存在下で」とは、一般式（３）で表される置換α−ケト酸とオキサロ酢酸またはピルビン酸とから前記一般式（４）で示される置換α−ケト酸を合成する反応を触媒できる状態で、酵素を反応系に存在させることを意味する。例えば、酵素を単体で反応系に添加してもよいし、酵素活性を有する微生物（アルドラーゼ産生菌、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞）、該微生物の培養物（液体培養、固体培養等）、培地（培養物から菌体を除去したもの）、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時に反応▲２▼を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いて反応▲２▼を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法（液体クロマトグラフィーや硫安分画等）によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
例えば、アルドラーゼ産生菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、一般式（４）の置換α−ケト酸を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からアルドラーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
酵素の存在下、反応▲２▼を進行させるには、前記一般式（３）で表される置換α−ケト酸、オキサロ酢酸またはピルビン酸のうち少なくとも一種、及び、反応▲２▼を触媒する酵素を含む反応液を２０〜５０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ６〜１２に保ちつつ、３０分〜５日静置、振とう、または攪拌すればよい。
当該反応液にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋などの２価のカチオンを添加することによって反応速度を向上させることもできる。コスト等の面から、好ましくはＭｇ２＋を用いることがある。
これら２価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれの塩を用いてもよいが、好ましくはＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＳＯ４等を用いることがある。これら２価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定することができるが、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０．５ｍＭ〜２ｍＭの範囲で添加することができる。
以下、反応▲２▼を実施する際の好ましい反応条件の一例を挙げれば、１００ｍＭバッファー、５０ｍＭインドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に、酵素源としてアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３３℃で４時間振とう反応させることにより、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）が得られる。
生成した一般式（４）の置換α−ケト酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
反応▲２▼により、インドール−３−ピルビン酸と、ピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）とから、モナティン合成における中間体として有用な前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を生成できる。
〔Ｃ〕反応▲３▼
本発明の反応▲３▼は、モナティンの製造に関する反応であり、前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）からモナティンを合成するのに好ましく利用できる。しかし、反応▲３▼は、当該モナティンの合成のみだけではなく、下記一般式（１）の置換α−ケト酸から（２）のグルタミン酸誘導体を生成する反応にも広く利用することができる。
2003056026.tif 000025
2003056026.tif 000026
ここで、Ｒ１及びＲ２は相互に独立して、それぞれ水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水素原子を表す場合には、他方は水素原子、メチル基又はエチル基を表さない。また、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水酸基を表す場合には、他方は水素原子又はメチル基を表さない。
当該式中Ｒ１の置換基に含まれる芳香環又は複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基及びアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい。
中でも、Ｒ１が、炭素数２〜４のアルキル基、炭素数２〜４のカルボキシアルキル基、フェニルメチル基及び３−インドリルメチル基から選択され（ベンゼン環又はインドール環は、更にハロゲン原子（ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、フッ素原子等）、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基及びアミノ基の少なくとも１種を有していてもよい）、かつ、Ｒ２が水酸基であることが好ましい。より好ましくはＲ１がフェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であり、Ｒ２が水酸基であることが好ましい。
Ｒ１が３−インドリルメチル基、Ｒ２が水酸基である場合、すなわち、一般式（１）の置換α−ケト酸としてＩＨＯＧ（４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸）を用いた場合、一般式（２）のグルタミン酸誘導体としてモナティンが得られる。
また、Ｒ１がフェニルメチル基、Ｒ２が水酸基である場合、すなわち一般式（１）の置換α−ケト酸としてＰＨＯＧ（４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸）を用いた場合、一般式（２）のグルタミン酸誘導体としてモナティンの類縁体である４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（ＰＨＧ）が得られる。
基質となる一般式（１）で示される置換α−ケト酸としては、〔Ｂ〕反応▲２▼の項で説明した方法により得られた一般式（４）の置換α−ケト酸を用いることが好ましい。より好ましくは、〔Ａ〕反応▲１▼の項で説明した方法により調製したインドール−３−ピルビン酸を用いて〔Ｂ〕反応▲２▼の方法により調製したＩＨＯＧを用いることが好ましいが、一般式（１）で示される置換α−ケト酸の調製方法は当然これらの方法に限定されるものではない。
反応▲３▼は、置換α−ケト酸を基質として対応するアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素反応を利用するものであり、例えばアミノ基転移反応を触媒するタンパク質或いは該タンパク質を生産する微生物を作用させることによるグルタミン酸誘導体の製造方法に関する。ここで、「アミノ基転移反応」とは、ケトン化合物前駆体をその対応するアミノ化合物に転化し、アミノ供与体基質をケトン化合物に転化する反応である。
以下に、本発明の反応▲３▼の実施の形態について、
（Ｃ−１）  反応▲３▼に使用する酵素
（Ｃ−２）  反応▲３▼の反応条件
の順に詳細に説明する。
（Ｃ−１）  アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素
反応▲３▼において、置換α−ケト酸を基質として対応するアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素、例えばアミノ基転移反応を触媒する酵素としてはトランスアミナーゼが、また、ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素としては、デヒドロゲナーゼが、それぞれ挙げられる。反応▲３▼において利用されるトランスアミナーゼは出発原料である置換α−ケト酸とアミノ供与体から、対応するグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素であればよい。このような酵素の作用により、前記一般式（１）で示される置換α−ケト酸を対応するグルタミン酸誘導体（前記一般式（２）で示される。）に変換することができる。
この際、アミノ供与体には、アミノ基を含む化合物が用いられる。例えば、天然及び非天然のＬ−アミノ酸やＤ−アミノ酸等のアミノ化合物が挙げられる。即ち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、システイン、ヒスチジン、リジン等がアミノ酸の例として挙げられる。反応に添加するアミノ供与体は１種類でもよいし、複数の供与体の混合物でもよい。
一般的に、Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼはＬ−アミノ酸供与体のアミノ基を前駆体ケト酸に転移することによって目的とするＬ−アミノ酸を生成し、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼはＤ−アミノ酸供与体のアミノ基を前駆体ケト酸に転移することによって目的とするＤ−アミノ酸を生成する。このような酵素の選択により、生成すべきグルタミン酸誘導体の光学異性体を選択することもできる。例えば、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼをＤ−アラニン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸等のＤ−アミノ酸存在下で作用させることにより、前駆体ケト酸からＤ−グルタミン酸誘導体を選択的に生成せしめることができる。
前述の通り、本発明の課題とするグルタミン酸誘導体の一つであるモナティンは、天然型（２Ｓ，４Ｓ）体の他に３種の光学異性体が存在しており、何れも数百倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている。本発明における一つの好ましい態様として、モナティンの前駆体ケト酸に対してＤ−アミノ酸トランスアミナーゼを作用させることにより、モナティンの２Ｒ体を立体選択的に生成せしめることが可能であり、また、Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼを作用させることにより、モナティンの２Ｓ体を選択的に生成せしめることができる。更に好ましい一つの態様としては、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼを用いることにより、高甘味度異性体である２Ｒ体を選択的に生成せしめることもできる。
ここで、Ｄ−アミノ酸をアミノ供与体とするとき、対応するＬ−アミノ酸を反応液中に添加し、該アミノ酸をラセミ化する反応を触媒する酵素を共存させることにより、Ｄ−アミノ酸供与体として供与体を供給することもできる。このようなラセミ化酵素としてはアラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼ、フェニルアラニンラセマーゼ等を好ましい例として挙げることができる。この場合、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、或いは前記Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物をＤ−グルタミン酸誘導体の生成中に反応溶液に添加することができる。
前述のアミノ基転移反応を触媒する酵素は、当該酵素を生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばアエロモーナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属及びモルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を挙げることができる。
これらの微生物として、具体的には、次のものが例として挙げられる。即ち、前記一般式（１）に記載の置換α−ケト酸から前記一般式（２）に記載のグルタミン酸誘導体を生成する活性を有するＬ−アミノ酸トランスアミナーゼ生産菌としては下記の例を挙げることができる。
・アエロモーナス  ヒドロフィラ  Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＩＦＯ３８２０
・アグロバクテリウム  ツメファシエンス  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＩＦＯ３０５８
・アルカリゲネス  フェカリス  Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ８７５０
・ベイジェリンキア  インディカ  Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ  ＡＴＣＣ９０３７
・エシェリヒア  コリ    Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  １２８１４
・プロテウス  レットゲリ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＩＦＯ１３５０１
・モルガネラ  モルガニイ  Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３８４８
また、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ生産菌としては下記の例を挙げることができる。
・バチルス  スフェリカス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１０２０８
・バチルス  プルビファシエンス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ１３２７
・パエニバチルス  ラバエ  サブスピシーズ  プルビファシエンス  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  １３５３７
・バチルス  マセランス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７
・パエニバチルス  マセランス  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＴＣＣ  ８２４４
・バチルス  レンタス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＡＪ１２６９９
・バチルス  レンタス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＡＴＣＣ  １０８４０
尚、バチルス  マセランス  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７については下記の通り寄託されている。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株
（イ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５３より、２００２年１１月２２日に国際寄託へ移管）
（ロ）受託日    ２００１年１２月１３日
（ハ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
本発明の一つの好ましい様態において、目的とする置換α−ケト酸からグルタミン酸誘導体へのアミノ基転移反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を微生物細胞中に組み込むこともできる。尚、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。組み込まれる遺伝子としては、Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子やＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子が挙げられる。一例を挙げると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓやＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓからのＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子が微生物に導入され得る。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子については、欧州特許出願公開０７３６６０４、及び、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナルオブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１９９８年、１８０巻、１６号、４３１９頁に報告がある。
また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子としては、配列表配列番号１７に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子ＤＮＡを用いることができる。配列表配列番号１７に記載のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子ＤＮＡを用いた場合、配列表配列番号１８に記載のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼが得られる。なお、当該Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子及びアミノ酸配列は、本発明者らによりはじめて明らかにされたものである。
Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子の由来はこれに限定されるものではなく、目的とするＤ−グルタミン酸誘導体を生成するようなＤ−アミノ酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子であればよい。
組み換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。このうち、組換えＤＮＡ操作について知見のある微生物としてはＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等が挙げられる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはＥｓｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが用いられる。
これら微生物へは、目的とするアミノ基転移酵素遺伝子を塔載したプラスミド、ファージ等のベクターを用いて導入してもよいし、相同組換えによって該細胞の染色体上に目的遺伝子を組み込んでもよい。好ましくは、いわゆるマルチコピー型のプラスミドベクターが挙げられ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉへのベクターとしてはＣｏｌ  Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、或いはその誘導体が挙げられる。これらベクターには目的とするアミノ基転移酵素遺伝子を発現させるプロモーターとして、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）等のように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
反応▲３▼に使用する酵素を産生する微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。また、微生物の種類或いは培養条件によっては、培地中に０．１〜１．０ｇ／ｄｌ程度のアミノ酸等のアミノ化合物を添加することによって、アミノ基転移反応活性を促進することもできる。
遺伝子組換え細胞を培養する場合は、ベクターの選択マーカーに対応してアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤を適宜添加することもできる。また、ベクターに塔載されているプロモーターに合わせて、誘導剤を適量添加することによって該組換え遺伝子の発現量を上げることもできる。一例を挙げると、ｌａｃプロモーターの下流に目的とする遺伝子を連結してベクターを構築した場合は、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で適宜添加することも可能であり、また、この代りとしてガラクトースを終濃度０．１〜５ｇ／ｄｌ望ましくは０．５ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌ適宜添加することもできる。
上記培地成分として用いる具体的物質として、例えば、炭素源としては、利用する微生物が利用可能であれば制限は無く、例えばグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセロール、酢酸等、又はこれらの混合物を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこれらの混合物を使用することができる。具体的な培地組成として、例えばフマル酸０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス  １ｇ／ｄｌ、ペプトン  １ｇ／ｄｌ、硫安  ０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ、及びＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）を含む培地等が挙げられる。
培養温度は、通常、利用する微生物が生育する範囲内、即ち１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０℃〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲である。また、培地のｐＨ値については、好ましくは２〜１２、より好ましくは３〜１０、更に好ましくは４〜８の範囲で調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常１２〜１２０時間、好ましくは２４〜９６時間程度である。
（Ｃ−２）  反応▲３▼の反応条件
反応▲３▼は、酵素の存在下で、一般式（１）で示される置換α−ケト酸から一般式（２）のグルタミン酸誘導体を生成することを特徴とする。
反応▲３▼において、「酵素の存在下で」とは、一般式（１）で示される置換α−ケト酸から一般式（２）のグルタミン酸誘導体を生成できる状態で、酵素を反応系に存在させることを意味する。即ち、一般式（１）で示される置換α−ケト酸を一般式（２）のグルタミン酸誘導体に変換できる限りはいかなる形態で酵素を反応系に存在させてもよく、例えば、酵素を単体で反応系に添加してもよいし、当該酵素活性を有する微生物（酵素産生菌、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞）、該微生物の培養物（液体培養、固体培養等）、培地（培養物から菌体を除去したもの）、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時に反応▲３▼を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いて反応▲３▼を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法（液体クロマトグラフィーや硫安分画等）によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
反応▲３▼において、基質となる置換α−ケト酸としては、前記一般式（１）で示される置換α−ケト酸を挙げることができる。
反応系に、反応促進物質として、補酵素、界面活性剤、有機溶剤等を含有させてもよい。例えば、基質となる置換α−ケト酸の菌体内への透過性を高めるために、トライトン  Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）やトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）等の界面活性剤やトルエン、キシレン等の有機溶媒を利用することもできる。また、ピリドキサール−５−リン酸等の補酵素類を上記培地に添加してもよい。
また、酵素を生産させるための培養と反応▲３▼を分割して順次行わせる場合は、後者の反応▲３▼の工程では必ずしも好気的雰囲気下で反応を行う必要はなく、むしろ嫌気的雰囲気下で、更には窒素ガス置換、アルゴンガス置換、亜硫酸ソーダ添加等によって反応液中の溶存酸素を除いた系で反応を行わせることも可能である。反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内、即ち好ましくは１０〜５０℃で行われるが、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲で行われる。反応溶液のｐＨ値については、通常、２〜１２、好ましくは６〜１１、更に好ましくは７〜９の範囲で調節される。反応時間については、通常１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、更に好ましくは１〜２４時間程度が選択される。
尚、培養液或いは反応液中のグルタミン酸誘導体又は置換α−ケト酸を定量する場合、周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはＭｅｒｃｋ社製「Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４」等を利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−８０Ａ」やダイセル化学工業（株）製「ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）」等の光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。このようにして、培養液或いは反応液中に蓄積されたグルタミン酸誘導体は、常法により培養液或いは反応液中より採取して用いることができる。培養液或いは反応液中からの採取は、このような場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作が必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。
尚、目的とするグルタミン酸誘導体は遊離体の形で取得することができるが、必要により塩の形態で取得することもできる。塩の形態としては、塩基との塩を挙げることができる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機塩基、アンモニア、各種アミン等の有機塩基を挙げることができる。
実施例
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
実施例１は本発明の反応▲１▼に関するものである。なお、実施例１におけるＬ−トリプトファン、インドール−３−ピルビン酸及びインドール酢酸の定量は高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（４．６×２５０ｍｍ）、カラム温度：４０℃、溶出液：０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ＝２．８０）／ＣＨ３ＣＮ＝１／９〜５／５、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ）により行った。
（１−１）アミノ酸オキシダーゼ活性菌の菌体反応によるＬ−Ｔｒｐからのインドール−３−ピルビン酸の生成
酵母エキス１ｇ／ｄｌ、ポリペプトン１ｇ／ｄｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌを含む５０ｍｌの培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、１１０℃で１０分間殺菌した。
これ等の培地に予めブイヨン寒天培地で３０℃にて２４時間培養したＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＪ２４２５、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＩＦＯ１３５０１又はＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８の菌体をそれぞれ一白金耳量接種し、３０℃にて２４時間振とう培養した。培養後、培養物より菌体を遠心分離により集め、それぞれ５０ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）にて洗浄し、再び遠心分離により洗浄菌体を調製した。
これ等の湿菌体をＬ−トリプトファン  １ｇ／ｄｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）からなる反応液に湿菌体重量で１％（ｗ／ｖ）となるように添加した。これ等反応液１ｍｌを５ｍｌ容試験管に移し、３０℃で１時間振とうさせて反応させた。反応終了後、インドール−３−ピルビン酸（ＩＰＡ）の生成量、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）の残存量及びインドール酢酸（ＩＡＡ）の副生量を測定した（表１参照）。
2003056026.tif 000027
その結果、洗浄菌体反応を実施した区何れの実験区においても、０．９７〜０．９９ｇ／ｄｌのインドール−３−ピルビン酸が蓄積しており、１ｇ／ｄｌのＬ−トリプトファンからほぼ定量的にインドール−３−ピルビン酸が生成した。
（１−２）Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８の洗浄菌体反応液の窒素置換処理及び塩酸晶析によるインドール−３−ピルビン酸の採取
（ａ）Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８の洗浄菌体反応液の調製
（１−１）と同様の方法でＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８の洗浄菌体を調製した。Ｌ−トリプトファン  １ｇ／ｄｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）からなる反応液５０ｍｌを含む坂口フラスコを６本調製し、それぞれ調製した湿菌体を湿菌体重量で１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３０℃で１時間振とう反応させた。反応終了後、遠心分離によって菌体を除き、反応液を約２９０ｍｌ得た。
（ｂ）反応液の窒素置換及び酸晶析によるインドール−３−ピルビン酸の採取
（ａ）で得られた反応液のうち７４ｍｌをナス型フラスコに移し、窒素置換を行った。該反応液のｐＨ値を２以下に調整するために塩酸を添加した。該反応液７４ｍｌに６Ｎ塩酸１５ｍｌを添加し（塩酸の終濃度として約１Ｎ）、２０℃にて攪拌した。この操作によって結晶が析出した。２４時間後、この混合物を濾過し、１５ｍｌの水で結晶を洗浄した。このようにして得られた湿結晶を４０℃にて減圧乾燥し、インドール−３−ピルビン酸を６８４ｍｇ取得した（初発トリプトファンに対する収率は７９．５％）。このインドール−３−ピルビン酸は黄白色結晶であり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により含量は９７．２ｗｔ％であった。
（ｃ）反応液の酸晶析によるインドール−３−ピルビン酸の採取
（ａ）で得られた反応液のうち６６ｍｌをナス型フラスコに移し、該反応液のｐＨ値を２以下に調整するために６Ｎ塩酸１３ｍｌを添加し、２０℃にて攪拌した。この操作により、結晶が析出した。２４時間後、この混合物を濾過し、１３ｍｌの水で結晶を洗浄した。このようにして得られた湿結晶を４０℃にて減圧乾燥し、インドール−３−ピルビン酸を５３８ｍｇ取得した（初発トリプトファンに対する収率５８．２％）。このインドール−３−ピルビン酸は褐色結晶であり、ＨＰＬＣ分析により含量は８０．５ｗｔ％であった。
（ｄ）得られたインドール−３−ピルビン酸の比較
（ｂ）及び（ｃ）で得られたインドール−３−ピルビン酸（ＩＰＡ）の結晶品質を比較した（表２参照。）
この結果から明らかな如く、窒素置換を実施した区（ｂ）の方が明らかに結晶中のＩＰＡの含量が多く、不純物である副生したインドール酢酸（ＩＡＡ）の含量が減少していた。更に、結晶の着色も窒素置換を実施した区では抑制されており、それぞれの実験区の結晶を１０ｍｇ／ｄｌに希釈して４５０ｎｍ及び４００ｎｍでの透過率を測定したところ、窒素置換区での透過率の減少、即ち分解による着色が抑えられていることが確認された。
2003056026.tif 000028
以上の結果から明らかな如く、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を効率良く簡便に製造することができる。
実施例２
実施例２は、反応▲２▼を化学合成系を用いて実施したものである。
（２−１）４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成
水酸化カリウム１８．９１ｇ（２８６．５ｍｍｏｌ、含量８５重量％）を溶解した水６４．４５ｍｌに、インドール−３−ピルビン酸７．５０ｇ（３５．８ｍｍｏｌ、含量９７．０重量％）とオキサロ酸１４．１８ｇ（１０７．４ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた。この混合溶液を３５℃にて２４時間攪拌した。
更に、３Ｎ−塩酸４０．０ｍｌを加えて中和（ｐＨ＝７．０）し、１５３．５ｇの反応中和液を得た。この反応中和液には、ＩＨＯＧが５．５５ｇ含まれており、収率５３．３％（対インドール−３−ピルビン酸）であった。
この反応中和液に水を加え、１６８ｍｌとし、合成吸着剤（三菱化学製ＤＩＡＩＯＮ−ＳＰ２０７）８４０ｍｌにて充填された樹脂塔（直径４．８ｃｍ）に通液した。更に、流速２３．５ｍｌ毎分にて純水を通液し、１．７３〜２．５５（Ｌ／Ｌ−Ｒ）を収集することにより、高純度のＩＨＯＧを３．０４ｇ含む水溶液を、収率５４．７％（樹脂への投入量に対して）にて得た。
（ＮＭＲ測定）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：３．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），３．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），７．０６−７．１５（ｍ，３Ｈ），７．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：３５．４３，４７．９１，７７．２８，１０９．４９，１１２．０５，１１９．４４，１１９．６７，１２１．９１，１２５．４２，１２８．４１，１３６．２１，１６９．７８，１８１．４３，２０３．５８
（２−２）  ４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）の合成
水酸化カリウム（純度８５％）１３．８ｇを溶解した水２５ｍｌに対し、フェニルピルビン酸５．０ｇ（３０．５ｍｍｏｌ）、オキサロ酢酸１２．１ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）を加えて室温にて７２時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２．２に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、ＰＨＯＧ２．８ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）を結晶として得た。
（ＮＭＲ測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：２．４８（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．６０（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．８５−３．３０（ｍ，３．６４Ｈ），７．１７−７．３６（ｍ，５Ｈ）
（分子量測定）
ＥＳＩ−ＭＳ計算値Ｃ１２Ｈ１２Ｏ６＝２５２．２３，分析値２５１．２２（ＭＨ−）
実施例３
実施例３は、反応▲２▼を酵素系を用いて実施したものである。なお、実施例３において、基質として用いたＩＨＯＧおよびＰＨＯＧは、実施例２に記載の方法により合成したものである。
（３−１）ＰＨＯＧアルドラーゼ活性菌の採取
４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）を基質としたアルドラーゼ活性菌株の採取を実施した。
ブイヨン平板培地（栄研化学）に供試微生物（細菌・酵母）を接種し、３０℃で２４時間培養した。これをグリセロール０．５ｇ／ｄｌ、フマル酸０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．３ｇ／ｄｌ、ペプトン０．２ｇ／ｄｌ、硫安０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．１ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ／ｄｌ、フタル酸ナトリウム０．２５ｇ／ｄｌ、寒天末２ｇ／ｄｌ（ｐＨ６．５）を含むプレートに接種し、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体を湿菌体重量で約１％（ｗ／ｖ）となるように、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭリン酸カリウム溶液（ＫＰｉ）、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に接種し、３０℃で２４時間反応させた。該反応液中の遊離ピルビン酸濃度はｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｅ（ＬＤＨ）を用いた酵素法にて定量した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５Ｕ／ｍｌ  ＬＤＨからなる反応液２００μＬにサンプル１０μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。反応後の３４０ｍＭの吸光度を測定し、ＮＡＤＨの減少量からサンプル中のピルビン酸量を定量した。
また生成フェニルピルビン酸量はジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
本条件により、ＰＨＯＧは約９．８分に、フェニルピルビン酸は約１２分の保持時間に溶出され、それぞれ分別、定量できた。
供試菌体添加区においてＰＨＯＧより生成したピルビン酸ないしフェニルピルビン酸量より対照区（菌体無添加区）の生成量を差し引いた値をアルドラーゼによる生成量とした。その結果、表３に掲げる菌株においてＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性を見出した。
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Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３を選抜し、フェニルピルビン酸とオキサロ酢酸ないしピルビン酸からのＰＨＯＧの合成反応を検討した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭフェニルピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＰｉ、１００ｍＭオキサロ酢酸ないしピルビン酸、１％（ｗ／ｗ）トルエンからなる反応液に、Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３（ＡＪ２２１２）菌体を終濃度で約１％（ｗ／ｖ）となるように接種し、３０℃で１６時間反応させた。反応終了後、生成ＰＨＯＧ量をＨＰＬＣにて定量した。フェニルピルビン酸とオキザロ酢酸ないしピルビン酸からのＰＨＯＧの生成量を表４に示す。
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表４より、菌体添加区においてＰＨＯＧの生成量の増加が認められ、フェニルピルビン酸＋オキサロ酢酸およびフェニルピルビン酸＋ピルビン酸のいずれの組み合わせにおいても、該アルドラーゼの作用によりＰＨＯＧを生成せしめることが明らかとなった。
（３−２）  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来ＩＨＯＧアルドラーゼの精製
Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株の可溶性画分からＩＨＯＧアルドラーゼの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．２ｍＭＫＰｉ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μＬ酵素／６００μＬ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
１．可溶性画分の調製：
ブイヨン平板培地で３０℃、２４時間培養したＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３菌体を一白金耳かきとり、５０ｍｌの酵素生産培地（０．５ｇ／ｄｌグリセロール、０．５ｇ／ｄｌフマル酸、０．５ｇ／ｄｌ硫酸アンモニウム、０．３ｇ／ｄｌ  Ｋ２ＨＰＯ４０．１ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．０５ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ／ｄｌ、酵母エキス、０．２ｇ／ｄｌペプトン、０．２５ｇ／ｄｌフタル酸ナトリウム、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）、ｐＨ６．５にＫＯＨで調整）を含む５００ｍｌ容フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。該培養液０．５ｍｌを酵素生産培地５０ｍｌを含む５００ｍｌ容フラスコ４０本に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を２００ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、さらに超遠心分離（ｘ５００００ｒｐｍ、３０分間）し、得られた上清を可溶性画分とした。
２．陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ
上記の可溶性画分８０ｍｌをバッファーＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて（ｔｏｔａｌ  １４０ｍｌ）吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてＰＨＯＧアルドラーゼ活性を検出したところ、約０．５Ｍ相当の画分にＰＨＯＧアルドラーゼ活性のピークを検出した。同様のクロマト操作を２度繰り返して実施した。
３．疎水性クロマトグラフィー：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析し０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ１６／１０（ファルマシア社製）に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＢを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．２Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
４．ゲルろ過クロマトグラフィー：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ＨＰ１６／６０
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、バッファーＡに対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーＣ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１Ｍ  ＫＣｌ）で平衡化されたゲルろ過Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ＨＰ１６／６０（ファルマシア社製）に供し、１ｍｌ／ｍｉｍの流速で溶出した。この操作によりアルドラーゼは６６−７１ｍｌの画分に溶出された。活性のピークの溶出位置より、該アルドラーゼの分子量は約１４６ｋＤａと見積もられた。
５．陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５
得られた画分を０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＡで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＭｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ５／５（ファルマシア社製）に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着した。バッファーＡにより非吸着タンパク質を洗い流した後、ＫＣｌ濃度を直線的に０ｍＭから７００ｍＭへ変化させてタンパク質の溶出をおこなった（Ｔｏｔａｌ２４ｍｌ）。各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、ＫＣｌ濃度が約０．４Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
６．ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー：ＣＨＴ−ＩＩ
得られた画分をバッファーＤ（１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０））に４℃で一晩透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＤで平衡化されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムＣＨＴ−ＩＩ  ５ｍｌ（ＢｉｏＲａｄ社製）に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着せず、吸着タンパクと分離することができた。
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約２５ｋＤａに相当する位置にほぼ単一なバンドとして検出された。ゲルろ過クロマトグラフィーでの推定分子量が約１４６ｋＤａであることから、該アルドラーゼは６量体を形成していると推定された。精製表を表５に示す。
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（３−３）  ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅの内部アミノ酸配列の決定
精製したアルドラーゼ約２μｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の試料をトリプシン処理し（ｐＨ８．５、３５℃、２０時間）、逆相ＨＰＬＣに供して断片ペプチドを分離した。分取したフラクションのうち、２つのフラクションについてそれぞれ２０残基、１２残基分のアミノ酸配列（配列番号４、５）を下記の通り決定した。
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（３−４）  Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ遺伝子のクローニング
１．染色体ＤＮＡの調製
Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株を５０ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
２．ＰＣＲによる内部配列の取得
決定したＩＨＯＧアルドラーゼの内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマー（配列番号６、７）を合成した。
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作製したミックスプライマーを用いて、Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＰＥＲＳＯＮＥＬ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて行い、以下の条件で３０サイクル行った。
９４℃  ３０秒
５５℃  ３０秒
７２℃  １分
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約５００ｂｐの断片の増幅が認められた。該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、ＩＨＯＧアルドラーゼの内部アミノ酸配列と一致しており、目的のアルドラーゼ遺伝子が取得されたことが確認された。
３．コロニーハイブリダイゼーションによる全長遺伝子の取得
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。ＤＮＡプローブの作製はＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃でＯ／Ｎインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析は染色体ＤＮＡ１μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、Ｏ／Ｎでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。その結果、該ＰＣＲ断片をプローブとして強くハイブリダイゼーションする約４ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を検出した。次に、このＰｓｔＩ断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体ＤＮＡ２０μｇをＰｓｔＩで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約４ｋｂｐ大きさの断片を回収した。これをｐＵＣ１１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。その結果、プローブと強くハイブリダイゼーションするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号１に記載の塩基配列を有することが明らかになった。決定した内部アミノ酸配列に対応する塩基配列（配列番号１にて５０７〜５６６番目、および、１０４６〜１０８２番目）を含む６７８ｂｐのｏｒｆを見出し、目的とするアルドラーゼの全長を取得した。
４．Ｅ．ｃｏｌｉでのＩＨＯＧアルドラーゼの発現（その１）
表８に示すプライマー（配列番号８および９）を用いてＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡより増幅した断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐＵＣＡＬＤを構築した。構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪させた（前培養）。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
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該粗酵素液を用いてＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、ｐＵＣ１８を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはＰＨＯＧアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐＵＣＡＤＬ導入株においては０．８１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が検出された。このことより、該遺伝子が目的とするアルドラーゼをコードしていることが示された。
（３−５）  アルドラーゼ発現株を用いたインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成
（３−４）にて作製したアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を酵素源として用いて、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成を実施した。ＩＨＯＧの定量はジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５ｍＭリン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
１００ｍＭバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ８．０，９．０ないしＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ１０．０）、５０ｍＭインドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液にアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３３℃で４時間振とう反応させた。酵素反応液を適宜希釈し、生成したＩＨＯＧを定量した。
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その結果、アルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉ添加区において、ＩＨＯＧ生成量が増加しており、該アルドラーゼによりＩＨＯＧを生成せしめることができた。
（３−６）  Ｅ．ｃｏｌｉでのＩＨＯＧアルドラーゼの大量発現（その２）
１．ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドｐＴｒｐ４の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表１０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号１０および１１の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。次にｐＴｒｐ２を鋳型として表１０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号１０および１２の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
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２．アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドｐｔｒｐＡＬＤ１、ｐｔｒｐＡＬＤ２の構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
表１１に示すプライマー（配列番号９および１３）を用いてＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＡＬＤ１を構築した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち４４４番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして配列番号３記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。また、プライマー（配列番号９および１４）を用いてＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＡＬＤ２を構築した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち４５６番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。それぞれ構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンヲ含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪させた（前培養）。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるよにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
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該粗酵素液を用いてＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、ｐＴｒｐ４を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはＰＨＯＧアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐｔｒｐＡＤＬ１導入株においては１６．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が、ｐｔｒｐＡＤＬ２導入株においては３６．０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が検出された。このことより、配列番号２ないし３記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼのいずれも、アルドラーゼ活性を有していることが明らかとなった。
実施例４
実施例４は、本発明の反応▲３▼に関するものである。なお、実施例４において、モナティン及び４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（ＰＨＧ）の定量は、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−８０Ａ」（５μｍ，６Ｘ１５０ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：１２％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液；
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ；
カラム温度：３０℃；及び
検出：ＵＶ２１０ｎｍ。
本分析条件により、（２Ｓ，４Ｓ）−モナティン及び（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンは１２．１分に、（２Ｓ，４Ｒ）−モナティン及び（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンは９．７分に、（２Ｓ，４Ｓ）−ＰＨＧ及び（２Ｒ，４Ｒ）−ＰＨＧは７．２分に、（２Ｓ，４Ｒ）−ＰＨＧ及び（２Ｒ，４Ｓ）−ＰＨＧは６．０分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
また、必要に応じて、ダイセル化学工業製光学分割カラム「ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）」（４．６Ｘ１５０ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーによる分析も行った。分析条件は以下に示す通りである。
（モナティンの場合）
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／１０％（ｖ／ｖ）メタノール；
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；
カラム温度：３０℃；及び
検出：ＵＶ２１０ｎｍ。
本条件によりモナティン光学異性体は（２Ｒ，４Ｓ）、（２Ｒ，４Ｒ）、（２Ｓ，４Ｒ）、及び（２Ｓ，４Ｓ）の順に４２分、５７分、６４分、及び１２５分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
（ＰＨＧの場合）
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）；
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；
カラム温度：３０℃；及び
検出：ＵＶ２１０ｎｍ。
本条件によりＰＨＧの光学異性体は（２Ｒ，４Ｓ）、（２Ｒ，４Ｒ）、（２Ｓ，４Ｒ）、及び（２Ｓ，４Ｓ）の順に２０分、２８分、３１分、及び４６分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
（４−１）Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼによる（２Ｓ，４Ｓ）−モナティンの製造
ブイヨン平板培地（栄研化学）に下記表１２に示す微生物を接種し、３０℃で２４時間培養後、菌体をかきとり、これを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３０ｍＭ  ＩＨＯＧ、１００ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに５重量％湿菌体となるように接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。反応終了後に生成したモナティンを定量した。その結果は表１２の通りであり、ＩＨＯＧから（２Ｓ，４Ｓ）−モナティンを生成せしめることができた。
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（４−２）Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼによる（２Ｓ，４Ｓ）−ＰＨＧの製造
ブイヨン平板培地（栄研化学）に下記表１３に示す微生物を接種し、３０℃で２４時間培養後、菌体をかきとり、これを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１００ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム又はＬ−アスパラギン酸１ナトリウム、１ｍＭピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに５重量％湿菌体となるように接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。反応終了後に生成したＰＨＧを定量した。その結果は表１３の通りであり、ＰＨＯＧから（２Ｓ，４Ｓ）−ＰＨＧを生成せしめることができた。
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（４−３）Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼによる（２Ｓ，４Ｓ）−ＰＨＧの製造
ブイヨン平板培地（栄研化学）に下記表１４に示す微生物を接種し、３０℃で２４時間培養した。これをフマル酸０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス  １ｇ／ｄｌ、ペプトン  １ｇ／ｄｌ、硫安  ０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ、及びＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）を含む培地を５０ｍｌずつ５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１１０℃、１０分間殺菌した液体培地に１白金耳接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。培養液１ｍｌを遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄・集菌した後に、該菌体を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１００ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに懸濁した後に１０ｍｌ容試験管に移し、３０℃で１８時間振とう反応した。反応終了後に生成したＰＨＧを定量した。その結果は表１４の通りであり、ＰＨＯＧから（２Ｓ，４Ｓ）−ＰＨＧを生成せしめることができた。
2003056026.tif 000040
（４−４）Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼによる２Ｒ−ＰＨＧの製造
ブイヨン平板培地（栄研化学）に下記表１５に示す微生物を接種し、３０℃で２４時間培養した。ここから菌体をかきとり、これを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１００ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸、１００ｍＭ  Ｄ−アラニン、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに５重量％湿菌体となるように接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。反応終了後に、生成したＰＨＧを定量した。その結果は表１５に示す通りであり、ＰＨＯＧから（２Ｒ，４Ｓ）−ＰＨＧ及び（２Ｒ，４Ｒ）−ＰＨＧを生成せしめることができた
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（４−５）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来ＤＡＴ（以下、ＢＳＤＡＴ）発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製と洗浄菌体反応による２Ｒ−ＰＨＧの製造
１．発現プラスミドの構築
バチルス  スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）由来Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子（以下「ｂｓｄａｔ」と略記する）をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にｂｓｄａｔ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＢＳＤＡＴを以下のようにして構築した。先ず、バチルス  スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１０２０８株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表１６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより当該遺伝子を増幅した。これにより、欧州特許出願公開０７３６６０４本文中、配列番号２記載のｂｓｄａｔ塩基配列において、８番目から１２７８番目までに相当するＤＮＡ断片が増幅される。この断片をＢａｍＨ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉにて処理し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、発現プラスミドｐＵＣＢＳＤＡＴを構築した。
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２．ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
ｐＵＣＢＳＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（バクトトリプトン１ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ  １ｇ／ｄｌ）で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に４時間培養を行った。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
３．ＢＳＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いた洗浄菌体反応
上記２で調製した菌体を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１００ｍＭ  アミノ酸ドナー（Ｄ−Ｇｌｕ，Ｄ−Ａｌａ，Ｌ−Ｇｌｕ，Ｌ−Ａｌａ）、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに、湿菌体重量で５％となるように懸濁した後に、１０ｍｌ容試験管に移し、３０℃で１８時間振とう反応した。反応終了後に生成したＰＨＧを定量した。その結果は表１７の通りであり、ＰＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）、（２Ｒ，４Ｓ）及び（２Ｓ，４Ｓ）−ＰＨＧを生成せしめることができた。
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2003056026.tif 000044
（４−６）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株由来ＤＡＴ（以下ＢＭＤＡＴ）発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製と洗浄菌体反応による２Ｒ−モナティンの製造
１．染色体ＤＮＡの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株を５０ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２０００ｘ  ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
２．遺伝子ライブラリからのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子（以下ｂｍｄａｔ）の単離
まず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＡＪ１６１７株の染色体ＤＮＡ３０μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩを１Ｕ添加し、３７℃にて３時間反応させて部分消化した。次にこのＤＮＡからアガロースゲル電気泳動にて３〜６ｋｂｐの断片を回収した。これをプラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断物（ＢＡＰ処理済み・宝酒造製）１μｇとライゲーションさせ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換して遺伝子ライブラリを作製した。これをアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天２％、ｐＨ７．０）にプレーティングして、コロニーを形成させた。出現したコロニーをアンピシリンとイソブチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭ含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養後、遠心・集菌して菌体を得た。得られた菌体を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に接種し、３０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応液を遠心分離した上清５μｌを２００μｌのピルビン酸定量反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６Ｕ／ｍｌ  Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（オリエンタル酵母製））を含む９６ウェルプレートに加え、３０℃で１０分間反応させた後に３４０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて測定した。同様の反応を終濃度０．２ｍＭ〜１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加して実施し、これをスタンダードとしてピルビン酸の減少量を定量し、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ活性を検出した。
上記のＤＡＴ活性クローンのスクリーニングにより、ＤＡＴ活性を示すクローンを採取した。これら形質転換体よりｂｍｄａｔを含むプラスミドを調製し、ｐＵＣＢＭＤＡＴと命名した。プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴをＥｃｏＲＩ処理してアガロースゲル電気泳動に供したところ、挿入断片の長さは約３．３ｋｂｐと見積もられた。
３．挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴの挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定したところ、配列表配列番号１７に示す配列のうち、６３０番から１４８１番に対応する約８５０ｂｐからなるＯＲＦを見出した。本ＯＲＦについて既知配列との相同性検索を行ったところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１０２０８株由来のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子とアミノ酸配列において９１％の相同性を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＹＭ−１株由来のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子とアミノ酸配列において６６％の相同性を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１０７１６株由来のＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子とアミノ酸配列において４２％の相同性を示した。この結果より、本ＯＲＦはＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子をコードしていることが明らかとなった。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．６」（ＧＥＮＥＴＹＸ社）を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。
４．ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
ｐＵＣＢＭＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（バクトトリプトン１ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ  １ｇ／ｄｌ）で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に４時間培養を行った。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
５．ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いた洗浄菌体反応
上記４で調製した菌体を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＩＨＯＧ、２００ｍＭ  Ｄ−アラニン、１ｍＭ  ピリドキサール−５’−リン酸、及び０．５％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液１ｍｌに、湿菌体重量で５％となるように懸濁した後に、１０ｍｌ容試験管に移し、３３℃で２０時間振とう反応した。反応終了後に生成した２Ｒ−モナチンを定量した。その結果、２２ｍＭの２Ｒ−モナティンを生成せしめることができた。
産業上の利用可能性
本発明により、本発明にかかるグルタミン酸誘導体の製造方法は、甘味料等として期待できるモナティンを含む前記特定のグルタミン酸誘導体を酵素反応を利用して効率良く製造することができるので、工業上極めて有用である。
また、本発明にかかるモナティンの製造方法は、本発明にかかるグルタミン酸誘導体の製造方法を利用した方法であり、アミノ酸の一種であるトリプトファンを出発原料として酵素反応を利用して効率良くモナティンを製造することができるので、工業上、特に食品の分野において極めて有用である。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月30日(2003.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（補正後）下記一般式（１）
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（一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は相互に独立して、それぞれ水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。但し、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水素原子を表す場合には、他方は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基又はメチレン基を表さない。また、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が水酸基を表す場合には、他方は水素原子又はメチル基を表さない。また、Ｒ１及びＲ２のうちの一方がメチル基の場合には、他方はメチル基を表さない。Ｒ１が芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。）
の置換α−ケト酸から、下記一般式（２）
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（一般式（２）におけるＲ１及びＲ２は、一般式（１）におけるＲ１、Ｒ２と同義である。）
に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（２）のグルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を生成することを特徴とするグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
前記Ｒ１は、フェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であり、前記Ｒ２は、水酸基であることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
前記酵素は、デヒドロゲナーゼ又はトランスアミナーゼであることを特徴とする、請求の範囲第１項または第２項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記酵素は、トランスアミナーゼであり、かつ、反応系にアミノ供与体として、アミノ酸の１種又は複数種を含有することを特徴とする、請求の範囲第３項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、システイン、ヒスチジン及びリジンから選択されることを特徴とする、請求の範囲第４項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記酵素は、Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼであることを特徴とする、請求の範囲第３項〜第５項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼであることを特徴とする、請求の範囲第３項〜第５項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項８】
反応系にＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素を含有することを特徴とする、請求の範囲第７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸トランスアミナーゼは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ属からなる群から選ばれる微生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求の範囲第６項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉからなる群から選ばれることを特徴とする、請求の範囲第９項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求の範囲第７項又は第８項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１２】
前記微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓからなる群から選ばれることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１３】
前記酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子を導入した微生物の産生する酵素であることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１４】
前記微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求の範囲第１３項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１５】
前記Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来であることを特徴とする、請求の範囲第１３項又は第１４項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１６】
少なくとも、下記〔Ｉ〕および〔ＩＩ〕の工程を含むことを特徴とするグルタミン酸誘導体の製造方法。
〔Ｉ〕下記一般式（３）
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（一般式（３）において、Ｒは、炭素数２〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基、炭素数２０までのアラルキル基、複素環含有炭化水素基、水酸基から選択される置換基を表す。Ｒが芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。）
で表される置換α−ケト酸と、
オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、
下記一般式（４）
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（一般式（４）におけるＲは、一般式（３）におけるＲと同義である。）
に表す置換α−ケト酸を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（４）の置換α−ケト酸を生成する工程
〔ＩＩ〕前記一般式（４）の置換α−ケト酸から下記一般式（５）
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（一般式（５）におけるＲは、一般式（３）におけるＲと同義である。）
に表すグルタミン酸誘導体を生成する反応を触媒する酵素の存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式（５）のグルタミン酸誘導体（その塩の形態にあるものを含む）を生成する工程
【請求項１７】
前記Ｒは、フェニルメチル基又は３−インドリルメチル基であることを特徴とする、請求の範囲第１６項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１８】
前記〔Ｉ〕の工程の反応を触媒する酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、請求の範囲第１６項または第１７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項１９】
前記微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉであることを特徴とする、請求の範囲第１８項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項２０】
前記微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１であることを特徴とする、請求の範囲第１９項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
【請求項２１】
前記〔１〕の工程の反応を触媒する酵素は、下記のいずれかのタンパク質であることを特徴とする、請求の範囲第１６項または第１７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２２】
前記〔Ｉ〕の工程の反応を触媒する酵素は、下記のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が増幅発現された組換え体から得られる酵素であることを特徴とする、請求の範囲第１６項または第１７項記載のグルタミン酸誘導体の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２３】
少なくとも、下記〔Ａ〕〜〔Ｃ〕の工程を含むことを特徴とするモナティンの製造方法。
〔Ａ〕トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成する工程
〔Ｂ〕インドール−３−ピルビン酸とオキサロ酢酸またはピルビン酸とから４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する工程
〔Ｃ〕４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸からモナティンを生成する反応を触媒する酵素の存在下で、前記４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を反応させることにより、モナティンを生成する工程
【請求項２４】
前記〔Ａ〕の工程は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する反応を触媒する酵素の存在下で、トリプトファンを反応させることによりインドール−３−ピルビン酸を生成させて反応液とし、該反応液に脱気処理、脱酸素処理及び高くともｐＨ値２のｐＨ調整の何れかを施してインドール−３−ピルビン酸を採取する工程であることを特徴とする請求の範囲第２３項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２５】
前記脱気処理又は脱酸素処理は、前記反応液中に含まれる気体の全部又は一部を不活性ガスで置換する方法であることを特徴とする、請求の範囲第２４項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２６】
前記不活性ガスは、窒素、アルゴン及びヘリウムの何れかであることを特徴とする、請求の範囲第２５項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２７】
前記ｐＨ調整は、前記反応液への酸添加によるものであり、該ｐＨ調整の結果生成したインドール−３−ピルビン酸を晶析させ、これを採取する工程を含むことを特徴とする、請求の範囲第２４項〜第２６項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２８】
前記酸は、硫酸、塩酸、硝酸及び燐酸の何れかであることを特徴とする、請求の範囲第２７項記載のモナティンの製造方法。
【請求項２９】
前記〔Ａ〕の工程の反応を触媒する酵素は、アミノ酸オキシダーゼ活性及びカタラーゼ活性を有する微生物に由来することを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第２８項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３０】
前記〔Ａ〕の工程の反応を触媒する酵素は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ属の何れかに由来することを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第２９項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３１】
前記酵素は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＪ２４２５、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＩＦＯ１３５０１、及びＭｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ３１６８の何れかに由来することを特徴とする、請求の範囲第３０項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３２】
前記〔Ａ〕の工程は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ属から選択されるトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換する能力を有する微生物の培養物を、トリプトファンに作用させてインドール−３−ピルビン酸を生成せしめインドール−３−ピルビン酸を採取する工程であることを特徴とする、請求の範囲第２３項記載のモナティンの製造方法。
【請求項３３】
前記〔Ｂ〕の工程を、当該反応を触媒する酵素の存在下で行うことを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第３２項記載のモナティンの製造方法
【請求項３４】
前記〔Ｂ〕の工程を、化学合成法により行うことを特徴とする、請求の範囲第２３項〜第３２項記載のモナティンの製造方法。
【国際調査報告】
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