(57)【要約】逆方向反復配列を有するＤＮＡを調製する工程、ここで当該逆方向反復配列を有するＤＮＡの塩基配列は標的核酸に相同的で、かつ標的核酸に導入しようとする変異を含む塩基配列を有している、及び前記逆方向反復配列を有するＤＮＡを細胞内に導入する工程、を包含することを特徴とする標的核酸の塩基配列に変異を導入する方法、ならびに該方法のためのキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の塩基配列に変異を導入する方法であって、
（１）逆方向反復配列を有するＤＮＡを調製する工程；ここで、当該逆方向反復配列を有するＤＮＡの塩基配列は標的核酸に相同的で、かつ標的核酸に導入しようとする変異を含む塩基配列を有している、及び
（２）前記逆方向反復配列を有するＤＮＡを細胞内に導入する工程、
を包含することを特徴とする標的核酸への変異の導入方法。
【請求項２】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが核移行シグナルを有するタンパクに対する結合モチーフ配列を有するものである請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項３】
核移行シグナルを有するタンパクに対する結合モチーフ配列が転写因子に対する結合モチーフ配列である請求項２記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項４】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが修飾された核酸塩基を有するものである請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項５】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項６】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項７】
標的核酸が、細胞質に存在する核酸である請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項８】
標的核酸が、核に存在する核酸である請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項９】
同時に複数の変異を標的核酸に導入することを特徴とする請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項１０】
標的核酸に導入される変異が、塩基の置換、欠失及び／又は挿入である請求項１記載の標的核酸への変異の導入方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法により標的核酸に変異を導入するためのキットであって、標的核酸に相同的で、かつ標的核酸に導入しようとする変異を含む塩基配列を有している逆方向反復配列を有するＤＮＡを含有することを特徴とするキット。
【請求項１２】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが核移行シグナルを有するタンパクに対する結合モチーフ配列を有するものである請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
核移行シグナルを有するタンパクに対する結合モチーフ配列が転写因子に対する結合モチーフ配列である請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが修飾された核酸塩基を有するものである請求項１１記載のキット。
【請求項１５】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである請求項１１記載のキット。
【請求項１６】
逆方向反復配列を有するＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである請求項１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は遺伝子への変異導入、遺伝子上の変異修復に有用な、標的核酸への変異の導入方法に関する。
【背景技術】  現在行われている遺伝子治療は、細胞中の遺伝子の欠損、変異によって機能に異常をきたした細胞に対して、ウイルスベクター等を用いてその遺伝子を細胞に導入する方法である。これによって、細胞が正常な機能を回復し本来の役割を果たすことができる。いわば遺伝子の補充療法である。
しかしウイルスベクターによる遺伝子の導入は問題点を有している。染色体上には変異遺伝子がそのまま残存しており、この変異遺伝子由来の変異タンパクが正常な遺伝子由来の正常タンパクと類似した構造をもつ場合、変異タンパクが正常タンパクの機能を妨げる可能性もある。
近年、ウイルスベクターによるＤＮＡの導入とは違って、細胞中の目的遺伝子の塩基を変換させる遺伝子ターゲティング法が注目されている。具体的な例を挙げれば、トーマス・ジェファーソン大学のＥｒｉｃ  Ｂ．Ｋｍｉｅｃが開発したキメラ形成法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９３、ｐ２０７１〜２０７６（１９９６）］では、変化させたい塩基部分をＤＮＡとし、その両端に位置決めのためのＲＮＡを配したキメラオリゴヌクレオチドを用いている。ＤＮＡ同士よりもＲＮＡとＤＮＡの方が強く結合するので、キメラオリゴヌクレオチドを細胞に導入すると両端のＲＮＡの塩基配列が細胞内のＤＮＡの中から対応する塩基配列をみつけて二本鎖を形成し、次いでミスマッチ修復によって目的部位に変異が導入される。しかし、キメラオリゴヌクレオチドの環状構造が複雑で、それを維持するため余計な８つのチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が使われているので、標的ＤＮＡへの結合力に対してかなりのマイナス面がある。
Ｏ．Ｉｇｏｕｃｈｅｖａらが一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、以下ｓｓオリゴと称す場合もある）形成法［Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌ．８、ｐ３９１〜３９９（２００１）］を開発した。ここでは標的核酸中の変異させようとする塩基に対応する塩基を中央に配し、両側に細胞中のヌクレアーゼに分解されにくい数個のメチル化したウラシル（ｕｒａｃｉｌ）をつけた数十個塩基のオリゴヌクレオチドが使用されている。
しかしながら、上記の二種類の変異導入方法はともに修復効率がまだ低い。二つの中では修復効率がよい一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）形成法でも明確な欠点がある。それは標的核酸に結合した後のミスマッチ修復の過程で、二本鎖ＤＮＡのセンス、アンチセンス両鎖の変異塩基を一度に修復することができず、どちらか一方の変異塩基を修復するだけで、残りの相補鎖中の変異塩基を細胞のミスマッチ修復機構によってもう一回修復する必要がある。
前記Ｋｍｉｅｃらのキメラオリゴヌクレオチド（キメラオリゴ）は環状構造の維持のため、標的ＤＮＡと関係のない配列が導入されている。その数はオリゴ全体の一割強を占めている。このため、キメラオリゴの標的ＤＮＡへのターゲッティング活性が低い。
もう一つ大事なポイントは、キメラオリゴとｓｓオリゴにおける修復のメカニズム、使用されるオリゴヌクレオチドの構造から見たとき、離れている二つ以上の塩基の同時修復が不可能ということである。もし、二つ以上の離れている変異塩基の修復あるいは変異の導入を行う場合は、数回のオリゴヌクレオチド導入とクローニングを行なわなければならない。手間がかかることは勿論、現在の細胞へのＤＮＡ導入技術では細胞へのダメージが大きく、生存し、かつ所望の機能を保持した細胞を得ることは困難である。
また、細胞の染色体の変異塩基を修復したい場合には、修復用ＤＮＡを細胞質に導入するだけである。この修復用ＤＮＡが濃度勾配にそって自由拡散する形で核へ移動する。この場合は細胞に高いモル数の修復用ＤＮＡを導入しなければならないが、結局、核に入る量が少なく変異の修復効率もよくない。
遺伝子治療の発展と共に、上記のようにメカニズムが複雑で、かつ効果の悪い修復方法にかわる、複数の塩基を同時に修復することが可能で、能動的に修復用ＤＮＡを核へ輸送でき、かつ効果の高い方法が求められている。
発明の概要
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、逆方向反復を有するＤＮＡを使用することにより、標的核酸中の塩基に効率よく変異を導入することができることを見出し、本発明を完成させた。
本発明の第１の発明は、標的核酸の塩基配列に変異を導入する方法に関し、
（１）逆方向反復配列を有するＤＮＡを調製する工程；ここで、当該逆方向反復配列を有するＤＮＡの塩基配列は標的核酸に相同的で、かつ標的核酸に導入しようとする変異を含む塩基配列を有している、及び
（２）前記逆方向反復配列を有するＤＮＡを細胞内に導入する工程、
を包含することを特徴とする。
第１の発明において、逆方向反復配列を有するＤＮＡは核移行シグナルを有するタンパクに対する結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）配列、たとえば転写因子に対する結合モチーフ配列を有することができる。また、前記ＤＮＡは適当な修飾塩基を含有するものであってもよい。
第１の発明において、標的核酸は細胞質、または核に存在する核酸であることができる。また、逆方向反復配列を有するＤＮＡは二本鎖、一本鎖いずれのＤＮＡでもよい。
第１の発明の方法によれば、同時に複数の変異を標的核酸に導入することも可能である。標的核酸に導入される変異としては塩基の置換、欠失及び／又は挿入が例示される。
本発明の第２の発明は、第１の方法により標的核酸に変異を導入するためのキットであって、標的核酸に相同的で、かつ標的核酸に導入しようとする変異を含む塩基配列を有している逆方向反復配列を有するＤＮＡを含有することを特徴とする。
第２の発明のキットに含有される逆方向反復配列を有するＤＮＡは転写因子の結合モチーフ配列や適当な修飾塩基を含有するものであってもよい。さらに、逆方向反復配列を有するＤＮＡは二本鎖、一本鎖ＤＮＡのいずれでもよい。
【図面の簡単な説明】  図１：本発明において作製した、逆方向反復配列を有するプラスミドの模式図である。
発明の詳細な説明
本明細書に記載の「標的核酸」には特に限定はなく、変異の導入が望まれる核酸のいずれもが包含される。例えば、本発明は細胞内に存在するＤＮＡへの変異の導入に使用することができ、細胞質に存在するＤＮＡ（エピゾームＤＮＡ；プラスミド、ミトコンドリアＤＮＡ等）、核内に存在するＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）を標的核酸とすることができる。
また、本発明で標的核酸に導入される変異にも特に限定はなく、塩基置換の他、欠失、挿入等の変異を導入することも可能であり、この場合には、使用する逆方向反復配列を有するＤＮＡに上記の変異を有する塩基配列を包含させればよい。
さらに、本発明における変異の導入が、正常な塩基配列への変異の導入のみならず、天然において生じた塩基配列の変異を正常な配列に修復する態様を包含することは当然である。
本発明に使用される逆方向反復配列を有するＤＮＡ（以下、逆方向反復ＤＮＡと記載することがある）は、標的核酸に相同的で、かつ標的核酸に導入しようとする変異を含む塩基配列を有しているＤＮＡである。ここで「相同的」とは、標的核酸もしくはその相補鎖との間で二本鎖を形成しうる塩基配列を有することを指し、完全に一致した塩基配列を有することを意味するものではない。すなわち、塩基対の形成によって標的核酸との間に二本鎖を形成するに十分な塩基配列を有していることを意味する。
逆方向反復配列を有するＤＮＡの作製方法には特に限定はなく、化学的な合成、酵素的な合成（核酸増幅反応等）、生物学的な合成（プラスミド等の自己複製能を有する核酸を利用する方法）のいずれもが使用できる。逆方向反復を有するＤＮＡは標的核酸のセンス鎖、アンチセンス鎖の配列がタンデムに並んだものであるが、両者の間には標的核酸への変異導入が可能な範囲で、任意の配列（スペーサー）が挿入されていてもよい。
本発明には、逆方向反復を有する二本鎖ＤＮＡを使用することができるが、このような二本鎖ＤＮＡを変性して得られる一本鎖ＤＮＡを使用することもできる。当該一本鎖ＤＮＡはセンス鎖部分とアンチセンス鎖部分が互いに相補的な塩基配列を有しているために、両部分が塩基対結合を形成したヘアピン構造をとることもあるが、本発明ではこのような形態の一本鎖ＤＮＡも使用することができる。
上記のヘアピン構造を形成した逆方向反復配列を有するＤＮＡは、例えば米国特許第５，６４３，７６２号、第５，７１４，３２３号、第６，０４３，０２８号にｓｌＤＮＡとして記載された一本鎖ＤＮＡと同じ方法により調製することができる。
本発明の方法では標的核酸上の２箇所以上に同時に変異を導入することも可能である。このような目的に使用される逆方向反復配列を有するＤＮＡはできるだけ長い方がいいと考えられる。細胞の増殖周期の中のＤＮＡ合成期（Ｓ  ｐｈａｓｅ）において、ＤＮＡ相同組換え修復が行われる。親ＤＮＡから娘ＤＮＡへの複製の際、親ＤＮＡらせんが解けて複製フォークが形成される。この時期にフォーク部分のＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に同時に結合できるＤＮＡが、ターゲッティング活性が高いはずである。以上のことから、本発明者らは、一本鎖のＤＮＡで、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の配列を持つ、つまり、標的ＤＮＡのセンス、アンチセンス両鎖に結合できる一本鎖の逆方向反復ＤＮＡを作製した。
方法としては、先ず、プラスミドに二つの同じ遺伝子或いはその断片が向きを逆にして並んだ逆方向反復ＤＮＡインサートが入っているプラスミドを構築する。例えば、実施例２のようなプラスミドの構築方法である。このプラスミドでトランスフォームした大腸菌を培養して大量のプラスミドを得ることができる。プラスミド中の逆方向反復ＤＮＡインサートの両端にある制限酵素を使いインサートをベクターから切断すると逆方向反復ＤＮＡを得ることできる。また、上記のプラスミドを鋳型としたＰＣＲ法で逆方向反復ＤＮＡを増幅する方法もある。
ただ、上記のプラスミドの構築において、逆方向反復ＤＮＡに挿入される遺伝子あるいはその断片は、特に限定するものではないが、一般的に５００ｂｐから１５００ｂｐまでが好ましい。５００ｂｐ以下の場合には、全く同じ二つのＤＮＡ断片を互いに逆方向でベクタープラスミドに挿入することは難しいことがある。このような場合には他の方法、例えば化学的、もしくは酵素的に目的のＤＮＡを合成することもできる。
また、相同組換えを起こしやすいように、変異を導入しようとする標的核酸上の部位の上、下流の十塩基以上、好ましくは百塩基以上を含む塩基配列を有する逆方向反復ＤＮＡが本発明に使用できる。
本発明により、逆方向反復配列を有するＤＮＡを使用して標的核酸中に変異を導入する場合、例えば、遺伝子上に存在する変異塩基を是正する場合は、変異塩基に対応する部位に正常な塩基を含むワイルドタイプ（野生型）遺伝子の配列を持つ逆方向反復ＤＮＡを作製し、公知のＤＮＡ導入法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、脂質を媒体としたトランスフェクション法などを用いて細胞に導入すると変異塩基の修復ができる。
逆に、ワイルドタイプ遺伝子に変異を導入する場合はその遺伝子に導入したい塩基（塩基配列）を含ませた逆方向反復ＤＮＡを調製し、上記のＤＮＡ導入法を用いて細胞に導入すれば、標的遺伝子に変異導入ができる。
本発明中の逆方向反復配列を有するＤＮＡがヌクレアーゼにより分解されるのを防ぐため、前記ＤＮＡの５’末端と３’末端をヌクレアーゼの作用から保護してもよい。末端の保護は、特に限定するものではないが、たとえばＤＮＡを物理的、化学的に環化させて実施することができる。また、修飾した塩基、たとえば修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ＬＮＡ（ＷＯ  ９９／１４２２６号国際公開パンフレット）等を前記ＤＮＡに含有させてもよく、特に好ましくはメチル化されたリボヌクレオチドや硫黄化デオキシリボヌクレオチド等を導入して末端の保護が行われる。前記の各種塩基の逆方向反復配列を有するＤＮＡの末端部分への導入は、化学的手段、もしくは後述の実施例に示すように酵素的手段によって実施することができる。
本発明に使用される逆方向反復配列を有するＤＮＡには核移行シグナルを有するタンパクに対する結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）配列、すなわち当該タンパクに結合しうるＤＮＡ配列を含有させることができる。
本発明に使用できる核移行シグナルを有するタンパクには特に限定はなく、天然、もしくは人工のものを使用することができ、例えば転写因子、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヒストン、ヌクレオプラスミン、二本鎖ＲＮＡ結合タンパクであるＮＦ９０等が例示される。また、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．１０７１、ｐ８３〜１０１（１９９１）にも多種の核移行シグナルを有するタンパクが記載されており、これらを本発明に使用することができる。
上記の核移行シグナルを有するタンパクが特定のＤＮＡ配列に結合できる能力を有するものである場合、本発明の逆方向反復配列を有するＤＮＡに前記タンパクに対する結合モチーフ配列を含有させることができる。
本発明に使用できる結合モチーフ配列には特に限定はなく、例えば変異を導入しようとする細胞において発現されている核移行シグナルを有するタンパクに結合しうる配列を本発明に使用することができる。ＤＮＡとの結合部位を有しない、もしくは結合部位の存在が知られていない核移行シグナルを有するタンパクについても、これらの核移行シグナルと適切なＤＮＡ結合配列とを有するキメラタンパク質を作製することによって本発明に使用することができる。
前記の核移行シグナルを有するタンパクが変異を導入しようとする細胞において発現されているものであった場合、前記タンパクに対する結合モチーフ配列を有する逆方向反復配列を有するＤＮＡを細胞に導入することにより、導入されたＤＮＡが前記タンパク質に結合して核に輸送され、染色体ＤＮＡに目的の変異を導入することができる。核移行シグナルを有するタンパクが変異を導入しようとする細胞において発現されていない場合、あるいは人工的に作製したものであった場合には、変異を導入しようとする細胞に前記タンパクもしくはこれをコードする遺伝子を導入し、本発明の方法を実施すればよい。前記タンパクもしくはこれをコードする遺伝子の細胞への導入方法には特に限定はなく、公知の方法、例えばリポソーム等を使用する方法やプラスミドベクター、ウイルスベクター等を使用する方法が利用できる。さらに、前記タンパクもしくはこれをコードする遺伝子と該タンパクに対する結合モチーフ配列を有する逆方向反復配列を有するＤＮＡとを同時に細胞に導入してもよい。
本発明に好適に使用される核移行シグナルを有するタンパクに結合しうる配列としては、例えば転写因子に結合することができるＤＮＡ配列が例示される。本明細書に記載の転写因子とはＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡからのＲＮＡの転写の効率に影響を与える因子を意味する。本発明に使用することのできる転写因子に対する結合モチーフ配列としては、特に本発明を限定するものではないが、たとえば、ＮＦ−κＢ、Ｓｐ１、ＡＰ１、ＮＦ−ＩＬ６（Ｃ／ＥＢＰβ）、ＡＰ２、Ｏｃｔ−１、ＳＲＦ、Ｅｔｓ−１等の転写因子に結合しうる配列が例示される。前記転写因子の結合モチーフ配列は、例えば以下の文献に記載されている：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．２６８、ｐ１８２８〜１８３６（２００１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２６３、ｐ３３７２〜３３７９（１９９８）；Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．４９、ｐ７４１〜７５２（１９８７）；ＥＭＢＯ  Ｊ．、Ｖｏｌ．９、ｐ１８９７〜１９０６（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．８８、ｐ７９４８〜７９５２（１９９１）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、Ｖｏｌ．２、ｐ１５８２〜１５９９（１９８８）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、Ｖｏｌ．２０、ｐ３２９７〜３３０３（１９９２）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１４５１〜１４５３（１９９０）。
本発明の逆方向反復配列を有するＤＮＡに含有させる結合モチーフ配列のコピー数には限定はなく、１コピーでも、複数コピーでもよい。また、その位置にも特に限定はなく、前記ＤＮＡの５’あるいは３’末端部分でもよい。たとえば、２コピー以上の結合モチーフ配列を５’末端部分、３’末端部分の両方に含有させてもよい。好ましくは、逆方向反復配列部分の中央、すなわち反復する配列の間に結合モチーフ配列が導入される。
前記の、核移行シグナルを有するタンパクに対する結合モチーフを含有する逆方向反復配列を有するＤＮＡは、核内に能動的に輸送されることができるため、染色体ＤＮＡへの変異の導入、もしくは変異の修復に高い効果を示す。
本発明の方法により遺伝子のノックアウトを行うこともでき、この場合には、例えば、開始コドンであるＡＴＧ中の一つまたは二つの塩基を置換してタンパクへの翻訳を妨害すればよい。また、標的遺伝子中の適当な位置に終止コドンを導入して完全長の翻訳産物の生成を阻害してもよい。さらに、標的遺伝子の塩基配列に一つまたは二つの塩基を挿入した（もしくは欠失させた）逆方向反復ＤＮＡを調製し、これを利用して標的遺伝子のタンパクをコードする領域の塩基配列にフレームシフトを生じさせて遺伝子のノックアウトを達成することができる。例えば、遺伝子の開始コドン塩基、開始コドンから２〜３０塩基以内、酵素タンパクの場合はその酵素活性部位に当たるアミノ酸残基をコードする塩基、蛍光を出すタンパクの場合はその蛍光を決めるアミノ酸残基をコードする塩基を変異させることが望ましい。
二つまたは二つ以上の離れた変異塩基を同時に修復することが可能であることが本発明の最も重要な特徴である。数百から千数百塩基の間に、標的核酸中の複数の変異塩基を修復できるような塩基を含有させた、数百から千数百塩基の逆方向反復ＤＮＡを使用すれば、単一の変異塩基の修復と同様に複数の変異を修復することができる。例えば、実施例５のように遺伝子中の約２００塩基離れた二つの変異塩基を一度で修復することが可能である。
上記の態様により、２以上の部位に変異を導入する場合の、前記部位間の距離には特に限定はなく、数百塩基離れていてもよい。変異導入効率の観点からは、好ましくは２００塩基以内の部位であり、より好ましくは１００塩基以内であり、特に好ましくは３０塩基以内である。
本発明は、上記の本発明の変異の導入に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは標的核酸に変異を導入するための逆方向反復配列を有するＤＮＡを含有する。さらに、前記ＤＮＡを細胞に導入するための試薬を含有するものであってもよい。
さらに、本発明の方法によって遺伝子に変異を導入された細胞は生体に移植することが可能である。こうして生体内で変異遺伝子、もしくは変異が修復された遺伝子を発現させる遺伝子治療を行うことができる。
上記の細胞には特に限定はなく、血液細胞（造血細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、臍帯血液細胞、末梢血幹細胞、単核球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、癌細胞、白血病細胞等が例示される。
たとえば、造血幹細胞を標的細胞とした遺伝子治療は以下のような操作によって実施することができる。まず、ドナーより造血幹細胞を含有する材料、たとえば骨髄組織、末梢血液、臍帯血液等を採取する。これらの材料はそのまま遺伝子導入操作に用いることも可能だが、通常は密度勾配遠心分離等の方法により造血幹細胞が含まれる単核細胞画分を調製するか、さらに適切な細胞表面のマーカー分子を利用した造血幹細胞の精製を行う。これらの造血幹細胞を含有する材料について、本発明の方法を用いた変異の導入もしくは変異の修復を実施する。こうして得られた細胞は、例えば静脈内投与やその他の方法によってレシピエントに移植することができる。レシピエントは好ましくはドナー自身であるが、同種異系移植を行うことも可能であり、たとえば臍帯血液を材料とした場合には同種異系移植が行われる。
本発明による遺伝子治療としては、患者において発現が亢進している、あるいは変異のために機能が低下もしくは失われている遺伝子を対象とするものが例示される。例えば、鎌形赤血球貧血症のような単一の塩基置換に起因する遺伝病は本発明の方法による治療に好適な疾患である。
上記の遺伝子治療はヒト、ならびにヒト以外の脊椎動物、非脊椎動物についても適用可能である。
さらに、本発明の適用の一例として、たとえば標的細胞として生殖系の細胞（胚性幹細胞、プライモディアル  ジャーム  セル、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子等）を使用した非ヒトトランスジェニック動物（例えばマウス、ラット、イヌ、ブタ、ウシ、ニワトリ、カエル、メダカ等）の簡便な作製を挙げることができる。本発明の方法によれば、例えば目的の遺伝子の発現のみを特異的に抑制した遺伝子ノックアウト動物を作製することができる。前記ノックアウト動物は遺伝子機能の解析、当該遺伝子の機能に関連した薬剤のスクリーニング等に非常に有用である。
【実施例】  以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。
【実施例１】Ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子への変異塩基の導入
プラスミドｐＱＢＩ２５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ＧＦＰと略称する）をコードする遺伝子（配列表の配列番号１）について、該遺伝子が発現されることがないように、その塩基配列中の一つの塩基を置換した。ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧＦＰの蛍光に重要な６６〜６８番目アミノ酸残基のうち、６７番目のチロシンをコードするコドンＴＡＴを終止コドンであるＴＡＧに変えた。このようにして作製した変異ＧＦＰ（ｍＧＦＰ）遺伝子と変異を導入しないＧＦＰをコードする遺伝子をそれぞれプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）に挿入し、ｐＤＯＮ−ｍＧＦＰとｐＤＯＮ−ＧＦＰを構築した。これらのプラスミド１μｇを含むＴＥ緩衝液５０μｌずつを、１μｇのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＬＦ２０００，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を含む５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）と混ぜて２９３細胞にトランスフェクトし、４日後に蛍光顕微鏡で観察した。ｐＤＯＮ−ＧＦＰを加えた細胞では強い緑蛍光が観察されたが、ｐＤＯＮ−ｍＧＦＰが入った細胞には蛍光がみられなかった。この結果、細胞内で蛍光を発することのない、変異遺伝子が構築された。このｍＧＦＰ遺伝子を以降の実験に用いた。
【実施例２】  ＧＦＰ遺伝子の塩基配列を有する逆方向反復ＤＮＡ（以下ｉｒＤＮＡと称す）を作るために、先ず、プラスミドにｉｒＤＮＡ増幅の鋳型となる逆向きの二つのＧＦＰ遺伝子断片を組み込んだ。プラスミドｐＱＢＩ２５に挿入されているＧＦＰ遺伝子の全配列をプライマーＵｓ−ＥｃｏＲＩ、ＤＥＮＤ（配列表の配列番号２、３）で増幅した断片をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（ともにタカラバイオ社製）で消化して得られた７６０ｂｐのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩサイト間に組み込んだ。ついで、このプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩサイト間にＧＦＰ遺伝子の全配列をプライマーＵｓ−ｈｉｎｄＩＩＩ（配列表の配列番号４）およびＤＥＮＤを用いて増幅して得られたＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）およびＢａｍＨＩで消化して得られた７６０ｂｐのＤＮＡ断片を組み込んだ。こうして構築されたプラスミドをｐｕｃＧＦＰ０−０と命名した。
また、ＧＦＰ遺伝子の全配列をプライマーＵｓ−ＥｃｏＲＩおよびＤＥＮＤを用いて増幅した断片をＥｃｏＲＩ、ＰｖｕＩＩ（タカラバイオ社製）で消化して得られた７１４ｂｐのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩサイト間に組み込んだ。次いで、このプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩサイト間にＧＦＰ遺伝子の全配列をプライマーＵｓ−ｈｉｎｄＩＩＩおよびＤＥＮＤを用いて増幅して得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで消化して得られた７６０ｂｐのＤＮＡ断片を組み込んだ。こうして構築されたプラスミドをｐｕｃＧＦＰ０−２と命名した。
さらに、ＧＦＰ遺伝子をプライマーＵ１００ｈｉｎｄＩＩＩおよびＵ１００ｂａｍｈＩ（配列表の配列番号５、６）で増幅して得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで消化して１１０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。上記のプラスミドｐｕｃＧＦＰ０−０中の７６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をこの１１０ｂｐのＤＮＡ断片と置き換え、プラスミドｐｕｃＧＦＰ０−６を構築した。
ｐｕｃＧＦＰ０−０はＧＦＰをコードする遺伝子の全長について逆方向反復配列を有しており、インサートＤＮＡの長さは１５１８ｂｐである。ｐｕｃＧＦＰ０−２は反復配列の一方が終止コドンから３８塩基までを欠失しており、インサートＤＮＡの長さは１４７９ｂｐである。プラスミドｐｕｃＧＦＰ０−６はＧＦＰをコードする遺伝子の全長とＧＦＰ遺伝子中の１５０〜２５０番目の塩基から形成される逆方向反復配列を有しており、インサートＤＮＡの長さは８６８ｂｐである。図１ＡにｐｕｃＧＦＰ０−０、図１ＢにｐｕｃＧＦＰ０−２、図１ＣにｐｕｃＧＦＰ０−６を図示する。
ｐｕｃＧＦＰ０−０、ｐｕｃＧＦＰ０−２、ｐｕｃＧＦＰ０−６をそれぞれ鋳型としたＰＣＲにより、逆方向反復ＤＮＡである０−０  ｉｒＤＮＡ、０−２  ｉｒＤＮＡ、０−６  ｉｒＤＮＡを作製した。０−０  ｉｒＤＮＡ、０−２  ｉｒＤＮＡの作製にはプライマーＵｓ−ｅｃｏＲＩ−１、Ｕｓ−ｈｉｎｄＩＩＩ−１（配列表の配列番号７、８）、また０−６  ｉｒＤＮＡの作製にはプライマーＵｓ−ｅｃｏＲＩ−１、Ｕ１００ｈｉｎｄＩＩＩ−１（配列表の配列番号９）を使用した。ｍＧＦＰ遺伝子に導入された変異塩基であるＧとＣを、野生型ＧＦＰ遺伝子の塩基に取り戻すためのＴとＡは、０−０  ｉｒＤＮＡ、０−２  ｉｒＤＮＡ、０−６  ｉｒＤＮＡにおけるセンス鎖の５’側或いはアンチセンス鎖の３’側（ＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅ）からそれぞれ２３７と１２８２、２３７と１２４３、２３７と８１３番目の塩基に当たる。図１において、ｍＧＦＰ遺伝子のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖における、変異塩基の修復に関与する塩基の位置を＊および＃で示している。
【実施例３】エピゾーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）実験モデルでのｍＧＦＰ遺伝子の単一変異塩基の修復
逆方向反復ＤＮＡによる遺伝子修復実験を行い、標的核酸との結合、標的核酸の変異塩基の修復を調べた。数回のＤＮＡ導入による細胞への毒性の影響を避けて、標的核酸であるｍＧＦＰ遺伝子を組み込んだプラスミド（ｐｃｅｐ−ｍＧＦＰ）と、修復用の三種類の逆方向反復ＤＮＡ（ｉｒＤＮＡ）またはコントロールに用いたｓｓオリゴのいずれかを同時に細胞質に導入した。ｓｓオリゴの塩基配列を配列表の配列番号１０に示す。
（１）熱で変性したｉｒＤＮＡによるエピゾームｍＧＦＰ遺伝子の修復
実験モデルを作るために、実施例１で構築したｐＤＯＮ−ｍＧＦＰからｍＧＦＰ遺伝子を含む７６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離し、ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩサイトの間にサブクローニングし、プラスミドｐｃｅｐ−ｍＧＦＰを作った。４８ウェルプレートに２９３細胞（８万個）を播いて、１０％  ＦＢＳを含むＤＥＭＥ培地で一晩培養した。それぞれ２μｇの０−０  ｉｒＤＮＡ、０−２  ｉｒＤＮＡ、０−６  ｉｒＤＮＡをそれぞれ９４℃、５分間で熱変性し、氷水で急冷した。２μｇのｓｓオリゴ、０−０  ｉｒＤＮＡ、０−２  ｉｒＤＮＡ、０−６  ｉｒＤＮＡと１．５μｇのｐｃｅｐ−ｍＧＦＰ或いはｐＵＣ１９（ネガティブコントロール１）を３７．５μｌのＯｐｔｉｍｅｎ培地で希釈し、同量の２μｇのＬＦ２０００を含むＯｐｔｉｍｅｎ培地と混ぜた。３．５μｇのｐｃｅｐ−ｍＧＦＰだけを含む３７．５μｌのＯｐｔｉｍｅｎ培地と、同量の２μｇのＬＦ２０００を含むＯｐｔｉｍｅｎ培地と混ぜた混合物をネガティブコントロール２とした。
２０分間のインキュベーション後、これらのＤＮＡ−ＬＦ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓを細胞に添加して、３０分間室温に置き、更に１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎ培地を加えた。６時間トランスフェクション後、１ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＤＥＭＥ培地を添加した。４８時間後、ネガティブコントロール１とネガティブコントロール２には緑蛍光を発する細胞（ＧＦＰ陽性細胞）が見られなかったのに対して、変異塩基修復用のｓｓオリゴまたは三種類のｉｒＤＮＡと標的ＤＮＡを含むｐｃｅｐ−ｍＧＦＰとがトランスフェクションされたウェルにはＧＦＰ陽性細胞が見られるようになり、４日目にＧＦＰ陽性細胞が一番多くなった。この細胞をトリプシンで処理してプレートから細胞を外し、ＦＡＣＳでＧＦＰ陽性細胞を測定した。この測定値よりバックグラウンドに相当するネガティブコントロール１の値を引いた結果を表１に示す。
ｍＧＦＰ遺伝子上の変異塩基の修復の指標である２３９細胞１万細胞あたりのＧＦＰ陽性細胞の数は０−０  ｉｒＤＮＡの場合が最も多く、その修復効果はｓｓオリゴによるものの約３倍であった。４回の独立した実験のＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定の結果、ｓｓオリゴの修復効率に対する０−０  ｉｒＤＮＡの修復効率は有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
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（２）熱変性しないｉｒＤＮＡによるエピゾームｍＧＦＰ遺伝子の修復
ＰＣＲ増幅により調製したｉｒＤＮＡを熱変性することなく使用した他は、上記実施例３−（１）と同じ操作でｍＧＦＰ遺伝子の修復を調べた。１万個の２９３細胞中に出現したＧＦＰ陽性細胞の数を表２に示す。熱変性しないｉｒＤＮＡを使用した場合の修復効率はいずれもｓｓオリゴより高かった。４回の独立した実験のＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定の結果、ｓｓオリゴの修復効率に対する０−０  ｉｒＤＮＡ、０−２  ｉｒＤＮＡの修復効率は有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
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一方、標的核酸であるｐｃｅｐ−ｍＧＦＰと変異修復用０−０  ｉｒＤＮＡを６時間の間隔をあけて順次トランスフェクションした場合も、ｓｓオリゴを使用した場合より高い修復効率が得られた。
上記（２）の実験において、標的核酸であるプラスミドは使用した細胞のすべてに導入されていないことが明らかとなったことから、ｐｃｅｐ−ＧＦＰと０−０  ｉｒＤＮＡとを上記と同一の条件で２９３細胞に導入し、ＧＦＰ陽性細胞数を調べた。この結果、２１．２２±４．６７％の細胞だけにプラスミドが入っていた。従って、表２に示された結果をプラスミドが入ってない細胞を除いて換算すると、ｐｃｅｐ−ｍＧＦＰが導入されている細胞１万個当たりの、変異塩基が修復されたＧＦＰ陽性細胞の数は表３のとおりとなった。４回の独立した実験のＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定の結果、ｓｓオリゴの修復効率に対する０−０  ｉｒＤＮＡの修復効率は有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
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上記の実験においてトランスフェクションには三種類のｉｒＤＮＡとｓｓオリゴをいずれも２μｇずつ使用したが、それぞれをモル数に換算すると、ｓｓオリゴのモル数が５２９ｎｍｏｌ、０−０  ｉｒＤＮＡ、０−２  ｉｒＤＮＡ、０−６  ｉｒＤＮＡのモル数がそれぞれ９．５、１０．１、１６．６ｎｍｏｌである。それでも、三つのｉｒＤＮＡがいずれもｓｓオリゴより変異塩基の修復率が高かった。ｉｒ  ＤＮＡを熱で変性してトランスフェクションした場合と同様に、変性しないでトランスフェクションした場合でも、修復効率が高いのは全ＧＦＰ遺伝子領域を含む０−０  ｉｒＤＮＡであり、ｓｓオリゴの５倍以上であった。０−０  ｉｒＤＮＡの数がｓｓオリゴより数十倍少ないにもかかわらず、修復効率がｓｓオリゴより数倍高いという実験結果からは、ｉｒＤＮＡの標的核酸へのターゲッティング活性がｓｓオリゴよりかなり高く、修復効率の向上を導いたと示唆された。
【実施例４】細胞の染色体へのｍＧＦＰ遺伝子の導入
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ  ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いて、細胞の染色体にｍＧＦＰ遺伝子を導入するレトロウイルス粒子の作製を行なった。実施例１に記載の組み換えレトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ｍＧＦＰと上記キットのパッケージングベクターを、ともにリン酸カルシウム法により同時に２９３細胞に導入した。４８時間培養後、培養液上清を採取してフィルター濾過した。さらに、この培養液上清（レトロウイルス溶液）を希釈して２９３細胞の培地に添加した。ここからクローニングした細胞（２９３−１０細胞）にｍＧＦＰ遺伝子が入っていることはＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片のシークエンスを解析して確認した。また、この２９３−１０細胞のゲノムＤＮＡを抽出して、レトロウイルスベクターのｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅと該ｓｉｔｅに隣接する細胞側の染色体ＤＮＡの配列を解析し、１コピーのＧＦＰ遺伝子を細胞に導入したことを確認した。以下の実験にはこのクローン化した細胞を使用した。
【実施例５】メチル化リボヌクレオチドで修飾した修復用０−０  ｉｒＤＮＡの作製とｍＧＦＰ変異塩基の修復
２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅとＣＥ−ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅを用いて、ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ法で合成した５’プライマー  ＲＮＡ−ｅｃｏＲＩ、３’プライマー  ＲＮＡ−ｈｉｎｄＩＩＩの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１１、１２に示す。これら両プライマーの最初の６塩基がメチル化リボヌクレオチドである。この二つのプライマーを使用し、ｐｕｃＧＦＰ０−０を鋳型としてＰＣＲを行って得られた０−０ｉｒＤＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖の５’末端には６個のメチル化リボヌクレオチドがつく。この、細胞内でヌクレアーゼに分解され難い０−０  ｉｒＤＮＡをＲ０−０  ｉｒＤＮＡと命名した。
２４ウェルプレートの各ウェルに４０万個の２９３−１０細胞或いは２９３細胞（ネガティブコントロール用）を播いて、一晩、１０％  ＦＢＳを含むＤＥＭＥ培地で一晩培養した。４μｇのｓｓオリゴと０−０  ｉｒＤＮＡまたはＲ０−０  ｉｒＤＮＡをＯｐｔｉｍｅｎ培地で７５μｌになるように希釈し、４μｇ  ＬＦ２０００を含む同量のＯｐｔｉｍｅｎ培地と混ぜた。２０分間インキュベート後、このＤＮＡ−ＬＦ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓを細胞に直接にかけて、更に、９０μｌの１０％  ＦＢＳを含むＤＥＭＥ培地を添加してトランスフェクションを行った。培地中のｓｓオリゴのモル数は９９２．００ｎｍｏｌで、０−０  ｉｒＤＮＡは１７．８３ｎｍｏｌ、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡは１７．８２ｎｍｏｌであった。６時間後、１．５ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＤＥＭＥ培地を添加した。１６〜１８時間後に３％  ＦＢＳを含むＤＥＭＥに培地を交換し、３２℃で２日半培養した。
正確にＧＦＰ陽性細胞を数えるため、ＰＢＳで洗った細胞をトリプシンで剥がして、新しいウェルプレートの培地が入っているウェルに移し、蛍光顕微鏡で各ウェル（１６０〜１９０万細胞）における各々のＧＦＰ陽性細胞を数えた。修復用ＤＮＡをかけた２９３−１０細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の数からコントロールの２９３細胞におけるバックグラウンドを引き算した。その結果ｓｓオリゴ、０−０  ｉｒＤＮＡ、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡを用いた場合には、平均的に１ウェル中にそれぞれ約５４、２３００、３８００個のＧＦＰ陽性細胞が存在していた。２９３−１０細胞１万個あたりのＧＦＰ陽性細胞の数を表４に示す。
４回の独立した実験のＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定の結果、ｓｓオリゴの修復効率に対する２種類のｉｒＤＮＡの修復効率はいずれも有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
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以上の、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡによる２９３−１０細胞の染色体中の変異塩基修復率がｓｓオリゴと０−０  ｉｒＤＮＡのものよりも高いとの実験結果は、メチル化リボヌクレオチドがヌクレアーゼ等による分解作用に対して耐性であり、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡの細胞質成いは核にいる時間が０−０  ｉｒＤＮＡより長く保たれたことから変異修復効率が高められたことを示唆した。
【実施例６】転写因子と結合できる配列を含むｉｒＤＮＡによる変異塩基の修復
転写因子は核へのシグナルトランスダクションにかかわる重要な因子で、遺伝子の発現を制御する役割を果たしている。多くの転写因子は細胞質で合成され、常に細胞質に待機して出番を待っている。もし、活性化シグナルを受けた場合には、転写因子は核内に移行して機能する。
転写因子であるＮＦ−κＢとその活性を抑制するＩ−κＢとは結合した形で細胞質に多く存在し、ＴＮＦα等のサイトカインの刺激によってＩ−κＢがリン酸化されるとＮＦ−κＢが活性化され核へ移行する［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９１、ｐ１１８８４〜１１８８８（１９９４）］。ＮＦ−κＢが遺伝子の上流にあるＮＦ−κＢモチーフという短いＤＮＡ配列と結合して遺伝子の転写を促進する。
２９３細胞にＮＦ−κＢが存在し、それと結合できるＤＮＡ配列（５’−ｇａｔｔｇｃｔｔｔａｇｃｔｔｇｇａａａｔｔｃｃｇｇａｇｃｔｇ−３’、配列番号１３）が報告されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．２６８、ｐ１８２８〜１８３６（２００１）］。この配列をｉｒＤＮＡの中央の逆方向反復配列に導入するために、三つのプライマー、ＧＦＰ−ｋＢ１、ＧＦＰ−ｋＢ２、ＧＦＰ−ｋＢ３（各プライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１４、１５、１６に示す）を合成した。まずＧＦＰ−ｋＢ１と前記のプライマーＵｓ−ＥｃｏＲＩを用い、ｐｕｃＧＦＰ０−０から切り出したＧＦＰ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。ついでこの増幅断片を鋳型としてＧＦＰ−ｋＢ２とＵｓ−ＥｃｏＲＩを用いたＰＣＲを行い、増幅断片を得た。さらに、この増幅断片を鋳型としてＧＦＰ−ｋＢ３とＵｓ−ＥｃｏＲＩを用いたＰＣＲを行い、増幅断片を得た。得られた増幅断片をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで消化して、その断片をｐｕｃＧＦＲ０−０中のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と入れ替えた。こうして構築されたプラスミドをｐｕｃＧＦＰ０ｎｆ−０と命名した。
ｐｕｃＧＦＰ０ｎｆ−０にはＧＦＰ遺伝子の逆方向反復配列とＮＦ−κＢ結合モチーフ配列を含むインサートが含まれており、インサートの長さは１５４８ｂｐである。このプラスミドを鋳型ＤＮＡにしてＲＮＡ−ｅｃｏＲＩプライマーとＲＮＡ−ｈｉｎｄＩＩＩプライマー、或いはＳ−ｅｃｏＲＩとＳ−ｈｉｎｄＩＩＩプライマー（配列はＲＮＡ−ｅｃｏＲＩプライマー、ＲＮＡ−ｈｉｎｄＩＩＩプライマーとまったく同じであるが、５’から六つの塩基がデオキシリボヌクレオチドに変更されるとともに、その間のリン酸基が硫黄分子で修飾されたプライマーである）を用いてＰＣＲを行った。増幅したフラグメントはそれぞれＲ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡ、Ｓ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡと命名した。
２９３−１０細胞とネガティブコントロールである２９３細胞の前培養の条件及び修復用ＤＮＡをトランスフェクションする方法は実施例５と同じであるが、ｓｓオリゴ、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡ、Ｒ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡ、Ｓ０ｎｆ−０ｉｒＤＮＡを導入してから６時間後、添加する培地中に８ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを加えた。
実施例５のように細胞を処理し、蛍光顕微鏡の下で各ウェルのＧＦＰ陽性細胞の数を数えて、修復用ＤＮＡをかけた細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の数からコントロールの２９３細胞におけるバックグラウンドを引き算した。ｓｓオリゴの場合の平均ＧＦＰ陽性細胞数８８個に対して、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡが約６０００個、Ｒ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡ、Ｓ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡはそれぞれ１万個を超えた。ｓｓオリゴ、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡ、Ｒ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡ、Ｓ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡを用いた場合の２９３−１０細胞１万個あたりのＧＦＰ陽性細胞の数を表５に示す。もっとも修復効率がよいＳ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡを用いた場合はｓｓオリゴの１３８倍高い修復効率を示した。
４回の独立した実験のＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定の結果、ｓｓオリゴの修復効率に対する３種類のｉｒＤＮＡの修復効率はすべて有意差（ｐ＜０．０５）を示した。また、転写因子の結合モチーフ配列を導入されたＲ０ｎｆ−０ｉｒＤＮＡ、Ｓ０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡの修復効率は、Ｒ０−０  ｉｒＤＮＡの効率に対しても有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
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ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて細胞質に導入したｓｓオリゴと０−０  ｉｒＤＮＡは、受動拡散の形で、濃度勾配に沿って核へ自由拡散する。０−０  ｉｒＤＮＡの濃度はｓｓオリゴの数十分の一であるため核に入るコピー数が少なく、０−０  ｉｒＤＮＡによる変異塩基の修復率はｓｓオリゴより低いと思われたが、実際の結果はｓｓオリゴより高い修復率を示した。この結果は、０−０  ｉｒＤＮＡが細胞核に入るコピー数が少なくても、高いターゲッティング活性を持つために変異塩基の修復率が高いことを示唆した。また、ｉｒＤＮＡの核内への輸送を促進するため、転写因子と結合できる短いＤＮＡ配列をｉｒＤＮＡに導入することによって修復の効果が高められる。このｉｒＤＮＡの５’側をヌクレアーゼによって分解され難いメチル化リボヌクレオチド或いは硫黄化デオキシリボヌクレオチドで修飾すれば、効果が更に高くなる。
ただ、逆方向反復の構造を持たない単なる標的ＤＮＡと同じ配列のＤＮＡにＮＦ−κＢの結合モチーフ配列を付け加えても、修復効果は逆方向反復ＤＮＡ（０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡ）の数分の一である。また、二分子の逆方向にしたＮＦ−κＢの結合モチーフ配列を０−０  ｉｒＤＮＡの中央に導入したＤＮＡは一分子を導入した０ｎｆ−０  ｉｒＤＮＡの効果の半分程度であった。
【実施例７】ダブルミューテーションを有するＧＦＰ遺伝子の修復
ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を適用し、ＧＦＰ遺伝子の開始コドンであるＡＴＧ中のＧをＴに変えた。このミューテーションＧＦＰ（ｍ１ＧＦＰ）遺伝子をｐＣＥＰ４にサブクローニングし、２９３細胞にトランスフェクトして、蛍光が見られないことを確認した。さらに、このｍ１ＧＦＰ遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ断片（−３６−１７４）を用い、既に実施例１で作製したｍＧＦＰ遺伝子の上流側のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ断片（−３６−１７４）と入れ替えて、ダブルミューテーションＧＦＰ（ｄｍＧＦＰ）遺伝子を構築した。
このｄｍＧＦＰ遺伝子には３番目のＴ、２０１番目のＧの二つの変異塩基があり、両者は１９８塩基離れている。このｄｍＧＦＰ遺伝子に入っている７６０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＣＥＰ４のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩの間にサブクローニングし、標的核酸として使用するプラスミドｐｃｅｐ−ｄｍＧＦＰを作った。
実験条件は実施例３と同じ条件で、０−０  ｉｒＤＮＡによるダブルミューテーションの同時修復の効率を調べた。その結果、二つ変異塩基が一度に修復できたことを示すＧＦＰ陽性細胞は、１万細胞当たりに１５．８５±２．００個が得られた。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、高い効率で遺伝子上の塩基配列に変異を導入できる方法が提供される。本発明によれば、細胞内のＤＮＡへの人工的な変異の導入、あるいは変異が起こって機能していない遺伝子の修復を行うことができる。本発明の方法は遺伝子治療、ノックアウト生物の作製、遺伝子機能の解析などに有用である。
【配列表フリーテキスト】
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【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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