(57)【要約】消化管ホルモンの関わる特定の疾患、特には過敏性腸症候群治療薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を開示する。前記ポリペプチドは消化管で産生されるホルモンの調節に関わる新規なＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ又はその前駆体である。また、前記ポリペプチドを用いた消化管疾患治療薬のスクリーニング方法並びに該スクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする消化管疾患治療用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素であるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
請求の範囲１乃至請求の範囲５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求の範囲７に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項９】
ｉ）請求の範囲１または請求の範囲２に記載のポリペプチドと、ｉｉ）前記ポリペプチドにより切断可能な基質と、ｉｉｉ）試験化合物とを接触させる工程、
前記基質の切断を分析する工程、及び
前記基質を切断する活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、消化管疾患治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求の範囲９に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、消化管疾患治療用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、消化管ホルモンの制御に関わる新規なセリンプロテアーゼの前駆体または成熟体であるポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び該ベクターを含有する形質転換細胞に関するものである。
【背景技術】  これまでに数百種類のプロテアーゼが報告され、全ゲノムの約１％がプロテアーゼをコードすると予測されている。これらのプロテアーゼの中には、単に蛋白やペプチドの消化を行う分子の他に、ペプチド鎖の切断を介して蛋白質の成熟や生理活性の発現、代謝の調節、情報の発現や伝達など生命現象に直結した重要な役割に関与している分子が多数あることが知られている。そのため、古くより、プロテアーゼ阻害剤の医薬品応用が進められてきており、実際、現在世界で販売されているトップ５０の薬剤のうち、プロテアーゼ阻害剤は３２％を占めている。
ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼはセリンプロテアーゼのうち、Ｎ末端側に膜貫通領域、細胞外のＣ末端側にプロテアーゼドメインを有する分子種であり（非特許文献１参照）、心房性ナトリウム利尿因子前駆体（ｐｒｏＡＮＰ）から成熟体への変換を制御するコリン（Ｃｏｒｉｎ）（非特許文献２参照）、トリプシノーゲンをトリプシンに変換するエンテロペプチダーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（非特許文献３参照）など、重要な生理作用を調節する役割を担う分子が同ファミリーに分類される。また、これらのＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼの多くは比較的限局した特徴ある組織分布を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。また、これらのセリンプロテアーゼは膜付近の細胞外マトリクスに作用し、細胞の分化、細胞同士の接着の緩和、上皮細胞での恒常性の維持、等に関与することが示唆されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６参照）。
小腸は栄養分の消化及び吸収を主とする消化管であるが、一方で、種々の生理活性ペプチドや、種々のホルモンの生産、分泌を担う内分泌器官でもあることが分かってきている（非特許文献７参照）。１９０２年にＢａｙｌｉｓｓ，Ｓｔａｒｌｉｎｇらが小腸より膵外分泌を血行性に刺激する物質として抽出したセクレチンの発見以来、消化管ホルモンは、候補も含め４０以上のものが報告されてきているが、それらの大部分が脳でも発現していることから別名を神経ペプチド、または脳−腸ホルモンと呼ばれている。これら生理活性ペプチドは、その前駆体のプロセシングにより生成することが知られている。これら生理活性ペプチドは自律神経と共に腸管の機能を制御し、過敏性腸症候群の発症にこれらのペプチドの異常が関与しているとされている（非特許文献８参照、非特許文献９参照、非特許文献１０参照）。
このうち血管作用性小腸ペプチド（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＶＩＰ）は２８アミノ酸から成り、中枢神経系、泌尿生殖器、呼吸器、唾液腺などの神経線維にも分布し、血管拡張や血流増加作用とともに、消化管の平滑筋を弛緩する作用を有している（非特許文献１１参照）。また、最近になり、ＶＩＰには、抗炎症作用もあることが報告された（非特許文献１２参照）。
健康成人に外因性のＶＩＰを経静脈的に投与すると激しい下痢が引き起こされることが示されている（非特許文献１３参照）。また、実験的にラットに下痢をおこさせると、門脈中のＶＩＰ濃度が上昇することが報告されている（非特許文献１４参照）。一方、恒常的な強い便秘をきたすヒルシュプルング病（Ｈｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ病）において、ＶＩＰ陽性神経の減少、消失がみられている（非特許文献１５参照）。また、突発性慢性便秘症においては、健常人に比べ、組織中のＶＩＰ濃度が低下していることも報告されている（非特許文献１６参照）。このように、ＶＩＰは下痢、便秘の発生と密接に関連している。
炎症性腸疾患においては、潰瘍性大腸炎患者の急性炎症反応が強い部位で、ＶＩＰ陽性神経の減少、消失がみられ、血管系の増生が顕著な部位ではＶＩＰ神経が網状に絡み合っている像を観察している（非特許文献１７参照）。潰瘍性大腸炎の一種、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）のモデルであるＴＮＢＳ（ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）誘発大腸炎モデルにおいて、皮下投与によりＶＩＰの抗炎症作用が発揮され、治療効果が認められている（非特許文献１８参照）。
これらのことから、ＶＩＰは便秘症、特に女性患者数の多い便秘型の過敏性腸症候群の治療及び炎症性の消化管疾患の治療に有用であろうと考えられていた。ところが、ＶＩＰ自体の医薬応用は、ＶＩＰが体内で速やかに分解を受けるために血中半減期が短く（非特許文献１９参照、非特許文献２０参照）、加えて非経口投与性のために困難な状況にあった。
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性のある配列に関しては種々の報告がある（特許文献１−５参照）が、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと１００％同一の配列は知られていなかった。特許文献１には、本発明のポリペプチドと相同性を有する配列が関与するとして、実験的裏付けもなく消化管疾患を含む多数の疾患が列挙され、それらの疾患の予防、処置、又は診断に使用できるとの記載がされている。特許文献２には、本発明のポリペプチドが関与するとして多数の疾患名が列挙されている。特許文献３には本発明のポリペプチドの相同配列の制御は悪性細胞の転移、癌血管形成、炎症、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、ＣＯＰＤ、又は病原性感染の治療に特に有用であること、特許文献４には、本発明のポリペプチドの制御は癌、ＣＯＰＤ、末梢又は中枢神経系や循環器病の治療に特に有用であることが記載されている。しかしながら本発明のポリペプチドが上記疾患に関与するとの実験的裏付けはなく、本発明のポリペプチドの生理機能に関する具体的な情報はなかった。特許文献５には具体的な用途の記載はなかった。
【特許文献１】国際公開第０２／３８７４４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／００８６０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／９６３７８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０８３９２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／０４０３９３号パンフレット
【非特許文献１】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、２００１年、第２７６巻、ｐ．８５７−８６０
【非特許文献２】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッドステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」（米国）、２００１年、第９７巻、ｐ．８５２５−８５２９
【非特許文献３】「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（米国）、１９９５年、第３４巻、ｐ．４５６２−４５６８
【非特許文献４】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、２００１年、第２７７巻、ｐ．３０３−３０９
【非特許文献５】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９７年、第２７２巻、ｐ．３１３１５−３１３２０
【非特許文献６】「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、２００１年、第２８７巻、ｐ．９９５−１００２
【非特許文献７】大根田昭；「メディコピア▲１２▼消化とホルモン−病態と検査−」１９８５年、ｐ．９４−１０８
【非特許文献８】「過敏性腸症候群の診断と治療」、１９８９年、ｐ．８１−９１
【非特許文献９】「過敏性腸症候群の診断と治療」、１９８９年、ｐ．２１４−２１８
【非特許文献１０】実験医学５、１９８７年、ｐ．５３１−５３４
【非特許文献１１】「日本臨床」、１９９２年、第５０巻、ｐ．２６９７−２７０２
【非特許文献１２】Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７，５６３−５６９，２００１
【非特許文献１３】「ニューイングランド  ジャーナル  オブ  メディスン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、（米国）１９８３年、第３０９巻、ｐ．１４８２−１４８５
【非特許文献１４】Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ７ｔｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ｐ．２６（Ａｂｓｔ），Ｓｈｉｚｕｏｋａ，１９８８
【非特許文献１５】「ニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、（アイルランド）、１９８２年、第３４巻、ｐ．５７−６２
【非特許文献１６】「（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．）」、（米国）、１９８８年、第９４巻、ｐ．３００−３１０
【非特許文献１７】「バイオメディカル  リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９１年、第１２巻、ｐ．２８
【非特許文献１８】「（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００３年、第１２４巻、ｐ．９６１−９７１
【非特許文献１９】「ヌクレアー  メディスン  アンド  バイオロジー（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９４年、第２１巻、ｐ．８６５−８７２
【非特許文献２０】「ヌクレアー  メディスン  アンド  バイオロジー（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９９年、第２６巻、ｐ．９３１−９３６
【発明の開示】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、小腸で産生されるホルモンの切断やプロセシングに関わるヒトの新規なＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ遺伝子全長配列、全長ＯＲＦを決定し、全長遺伝子及び組換え体蛋白質を取得した。次いで、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記プロテアーゼの細胞外領域であることを明らかにした。更に、合成ペプチドを用いてプロテアーゼ活性を測定する系を確立し、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチドが十分なプロテアーゼ活性を有することを見出した。加えて、活性型酵素を得る為に前記プロテアーゼの全長領域及び細胞外領域を用いることができることを見出した。また、前記プロテアーゼは小腸において強発現しており、肺、大腸、及び脾臓ではほどんど発現していないことを確認した。前記プロテアーゼが選択的にＶＩＰを切断したことから、前記プロテアーゼによる切断が消化管疾患の原因であることを明らかにした。すなわち、小腸に発現し、ＶＩＰ切断活性を有する本発明のプロテアーゼ成熟体の活性を阻害することにより消化管疾患、特には便秘型の過敏性腸症候群の治療が可能であることを明らかにした。
これらの結果、本発明者らは消化管疾患治療薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、消化管疾患治療薬をスクリーニングする方法、並びに、消化管疾患治療用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素であるポリペプチド、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド、
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［６］［１］乃至［５］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［７］［６］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［８］［７］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞
［９］ｉ）［１］又は［２］に記載のポリペプチドと、ｉｉ）前記ポリペプチドにより切断可能な基質と、ｉｉｉ）試験化合物とを接触させる工程、
前記基質の切断を分析する工程、及び
前記基質を切断する活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、消化管疾患治療薬をスクリーニングする方法、
［１０］［９］に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、消化管疾患治療用医薬組成物の製造方法、
に関する。
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性のある配列に関しては種々の報告がある（特許文献１−５参照）。特許文献１には、本発明のポリペプチドの相同配列が関与するとして、消化管疾患を含む多数の疾患が列挙され、それらの疾患の予防、処置、又は診断に使用できるとの記載がされている。しかしながら、それらの疾患に当該配列が関与するとの実験的裏付けは全くない。特許文献２には、本発明のポリペプチドの相同配列を含む多数のプロテアーゼが開示され、それらのプロテアーゼが関与するとして多数の疾患名が列挙されている。それら多数の疾患の中には消化管疾患に関する記載はない。また、実際に当該配列を現実に取得したとの実施例はなく、まして用途に関する実験的裏付けは全くない。特許文献５に本発明のポリペプチドの相同配列が記載されているが、実際に当該配列を現実に取得したとの実施例はなく、特定の具体的用途も記載されていない。特許文献３には本発明のポリペプチドの相同配列の制御は悪性細胞の転移、癌血管形成、炎症、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、ＣＯＰＤ、又は病原性感染の治療に特に有用であること、特許文献４には、本発明のポリペプチドの制御は癌、ＣＯＰＤ、末梢又は中枢神経系や循環器病の治療に特に有用であることが記載されている。特許文献３には当該配列は脾臓、骨髄に高発現すること、肺での発現に注目していることが記載され、特許文献４には、当該配列は精巣及び大腸に高発現することが記載されている。特許文献３及び特許文献４における当該配列の小腸における発現は低かった。また、特許文献３及び特許文献４には当該配列が消化管疾患に関与するとの情報はなかった。これらの相同配列と本発明のポリペプチドとは発現部位が異なることから、異なる機能を有していると考えられた。即ち、小腸に高発現し、ＶＩＰ切断活性を有するプロテアーゼ及びその前駆体である本発明のポリペプチドは本発明者らが初めて見出したものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、組換え体蛋白質精製酵素活性を検出した図である。
図２は、緩衝液コントロールによるＶＩＰ切断のＨＰＬＣ分析を示す図である。
図３は、酵素試料によるＶＩＰ切断のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「前駆体」は「酵素前駆体」を示しており、これ自体では不活性型であるが、活性化（プロセシング）を受けて活性型酵素となる蛋白質を表す。「成熟体」は、活性化を受けて活性型となった酵素である蛋白質を表す。「プロテアーゼ活性」は、ペプチド結合の加水分解を触媒する活性であり、主として活性型酵素（成熟体）の示す酵素活性を表す。
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド２３７／５３１」と称することがある）；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド５１／５３１」と称することがある）（以下、（２）及び（３）をあわせて「本発明の前駆体」と称することがある）；
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド（以下、「ポリペプチド２３７／５３１の機能的等価改変体」と称することがある）；
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド（以下、「ポリペプチド５１／５３１の機能的等価改変体」と称することがある）
（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド。（以下、（５）及び（６）を「本発明の前駆体の機能的等価改変体」と称する）；及び
（７）ポリペプチド２３７／５３１を含み、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、ポリペプチド５１／５３１のアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド（以下、「本発明の相同ポリペプチド」と称する）
が含まれる。
「ポリペプチド２３７／５３１の機能的等価改変体」および「本発明の前駆体の機能的等価改変体」を総称して「本発明の機能的等価改変体」と称するが、「本発明の機能的等価改変体」としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド」、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド」、あるいは「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第５０番のアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入された配列を含むアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド」が含まれるが、各本発明の機能的等価改変体のうち、小腸に高発現されるポリペプチドが好ましい。また、本発明の機能的等価改変体には、本発明のポリペプチド、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ポリペプチド５１／５３１、又はポリペプチド２３７／４６５のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、プロテアーゼ活性を示すか、あるいは、プロセシングを受けた後にプロテアーゼ活性を示す限り含まれる。
前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明の機能的等価改変体の起源はヒトに限定されない。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）又は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３７番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５１番〜第５３１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
「本発明の相同ポリペプチド」は、「ポリペプチド２３７／５３１を含み、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、ポリペプチド５１／５３１のアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示す酵素の前駆体であるポリペプチド」である限り、特に限定されるものではないが、該相同性が、好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むことができ、また、各相同ポリペプチドのうち、小腸に高発現されるポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓを意味する。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
以上、本発明のポリペプチドについて説明したが、本発明のポリペプチドのうち、配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＡＲＳ蛋白質」と称する。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはＡＲＳ蛋白質全長ＯＲＦであり、ポリペプチド５１／５３１は細胞外領域であり、いずれも酵素の前駆体に関するものである。また、ポリペプチド２３７／５３１はセリンプロテアーゼ領域およびＣ末端配列であると推定される。後述の実施例に示すように配列番号２に記載の酵素前駆体は、酵素分解的にＮ末端領域をプロセシングし、成熟体（活性型酵素）となった結果、酵素活性が増強することが明らかとなっている。また同様に、細胞外領域（ポリペプチド５１／５３１）も活性型酵素を得る為に用いることができる。セリンプロテアーゼ領域およびＣ末端配列であると推定されるポリペプチド２３７／５３１は、酵素活性が観察されたことから、該領域を有すれば酵素活性を示すことが確認された。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列における第１５１番〜第１５９３番の塩基配列、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における第７０９番〜第１５９３番の塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号１で表される塩基配列からなる前記ポリヌクレオチドは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。また、配列番号１で表される塩基配列における第１５１番〜第１５９３番の塩基からなる前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド５１／５３１を、配列番号１で表される塩基配列における第７０９番〜第１５９３番の塩基からなる前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド２３７／５３１をコードする。
本発明のポリヌクレオチドは、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ポリペプチド５１／５３１、またはポリペプチド２３７／５３１をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列における第１５１番〜第１５９３番の塩基からなる配列または配列番号１で表される塩基配列における第７０９番〜第１５９３番の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に従って実施することが可能である。
例えば、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列における第１５１番〜第１５９３番の塩基からなる配列、または配列番号１で表される塩基配列における第７０９番〜第１５９６番の塩基からなる配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリヌクレオチドを取得できる。そのポリヌクレオチドを適当な発現系（例えば、実施例７に記載の方法）を用いて発現させることにより本発明のポリペプチドが得られる。例えば、実施例８又は実施例１１に記載の方法により、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドがプロセシングを受けて生成した成熟体がプロテアーゼ活性を示すことを確認できる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドまたは該ポリペプチドがプロセシングを受けて生成した成熟体が、例えば、実施例８又は実施例１１に記載の方法により、プロテアーゼ活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
本発明のポリペプチドには、本発明の前駆体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させることにより得られる、活性化に伴う切断を受けたポリペプチドもプロテアーゼ活性を示す限り含まれる。好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるセリンプロテアーゼの活性化配列の間、即ち、第２３６番目と第２３７番目のアミノ酸の間が切断されて生成した、セリンプロテアーゼ活性を有する、Ｎ末端が第２３７番目のアミノ酸であるポリペプチド（すなわち、ポリペプチド２３７／５３１であると推定される）である。
また、本発明のポリペプチドには、本発明の前駆体蛋白貿をコードするポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させることにより得られた蛋白質を好ましくは実施例９に記載の方法によりトリプシン処理して得られる、活性化に伴う切断を受けたポリペプチドもプロテアーゼ活性を示す限り含まれる。
本明細書において、あるポリペプチドが「プロテアーゼ活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、蛍光標識された合成ペプチド、例えばＭＣＡ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）でＣ末端を標識された合成ペプチドを用いて酵素切断活性を検出することにより確認することができ（Ｙａｓｕｏｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１６，３００−３０８，１９９７）、より好ましくは、実施例８又は実施例１１に記載の方法により確認することができる。更に好ましくは、生理活性物質であるＶＩＰを用いて例えば実施例１２に記載の方法により酵素切断活性を検出し確認することができる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されていると同様に実施できる。ただし、上記特許出願明細書における「本発明の新規蛋白」を本発明のポリペプチド、「本発明の遺伝子」を本発明のポリヌクレオチドと読み替える。
以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。変性温度又は変性剤添加条件などを適宜選択し、作成した各々のプライマーセットに適した逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
あるいは、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織から調製したｍＲＮＡから逆転写酵素により作製したｃＤＮＡ、あるいは、市販のヒト細胞又は組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。より具体的には、化学合成法によって製造したヌクレオチド断片を結合することによっても製造できる。また、各ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡ合成機（例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ベックマン社）、あるいは、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）など）を用いて合成することができる。
本発明の発現ベクター、宿主細胞、蛋白質の製造方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例３、実施例４、実施例５、及び実施例６に記載のように本発明のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧ（ＷＯ  ０１／３４７８５  実施例３）に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターを市販のトランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥＴＭ６を用いてヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により本発明の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
上記により、形質転換細胞に生産される本発明の蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。
本発明の蛋白質はマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、該蛋白質の発現の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ・ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃエピトープなどがある。また、マーカー配列と該新規蛋白の間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。
＜本発明のスクリーニング方法＞
本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドとしては、後述の実施例２に示すように小腸において高発現している蛋白質であり、かつ実施例８、実施例１１、又は実施例１２に示すようにプロテアーゼ活性を有するものが望ましい。実施例１２に示すように本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドの１つである、ポリペプチド５１／５３１をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより得られる活性化に伴う切断を受けたポリペプチドはＶＩＰを切断することがわかった。背景技術の欄で述べたように、ＶＩＰは便秘症、特に女性患者数の多い便秘型の過敏性腸症候群の治療及び炎症性の消化管疾患の治療に有用であることが知られている生理活性ペプチドである。本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドがＶＩＰを切断したことから、本発明のスクリーニングに用いるポリペプチドを用いてその阻害剤をスクリーニングすることにより、内在性のＶＩＰ量を増加させることで消化管疾患、特には過敏性腸症候群を改善する物質が得られる。
本発明のスクリーニング法は、特に限定されるものではないが、蛍光標識された合成ペプチド、例えばＭＣＡ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）でＣ末端を標識された合成ペプチドを用いて酵素切断活性を検出することにより実施することができ（Ｙａｓｕｏｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１６，３００−３０８，１９９７）、より好ましくは、実施例８又は実施例１１に記載の方法により実施することが出来る。また、実施例１２に示すように生理活性ペプチド（例えばＶＩＰ）を基質として酵素反応を行った後、ＨＰＬＣによる分析により酵素活性を判断し、酵素の阻害剤をスクリーニングすることができる。
例えば実施例８に記載の条件で、ＩＣ５０＝１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０＝１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０＝０．１μＭ以下の物質をプロテアーゼ阻害活性を有する物質として選択することができる。また、このようにプロテアーゼ阻害活性を有する物質を選択することによって消化管疾患治療薬、特には過敏性腸症候群の治療薬を得ることができる。
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５））によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
＜本発明の消化管疾患治療用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、消化管疾患治療用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】  以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等）の実験マニュアルに従った。
また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）ＡＲＳの全長ＯＲＦ配列の決定
ヒト小腸由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型とし、ｃＤＮＡ末端増幅ＰＣＲ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、ＲＡＣＥ）を繰り返すことにより、５’側および３’側の塩基配列を解読し、新規遺伝子配列の全長のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）配列を決定した。以下に、詳細を記した。５’ＲＡＣＥにはプライマーとしてＧＳＰＲ１〜１０を用いた。ＧＳＰＲ１（配列番号５）とＡＰ−１（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ添付品；クロンテック社）（配列番号３）を１ｓｔＰＣＲプライマー、ヒト小腸由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９７℃（２分間）で熱変性を行なった後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４０回、７２℃７分の条件でＰＣＲをおこなった。続いて、反応液のアガロースゲル電気泳動をおこなった。ＤＮＡの増幅を確認した、先のＰＣＲ反応液を滅菌水で５０倍に希釈したものを、２ｎｄ  ＰＣＲのテンプレートとし、ＧＳＰＲ−２（配列番号６）とＡＰ−２（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ添付品；クロンテック社）（配列番号４）をプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９６℃２分半の後、９７℃２０秒、６８℃３０秒、７２℃６０秒のサイクルを４０回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲをおこなった。こうして増幅された遺伝子を直接、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析した。［ＧＳＰＲ３（配列番号７）とＧＳＰＲ４（配列番号８）］、［ＧＳＰＲ５（配列番号９）とＧＳＰＲ６（配列番号１０）］、［ＧＳＰＲ７（配列番号１１）とＧＳＰＲ８（配列番号１２）］、及び［ＧＳＰＲ９（配列番号１３）とＧＳＰＲ１０（配列番号１４）］のそれぞれ２本ずつの組み合わせについても同様にＡＰ−１とセットで１ｓｔＰＣＲ、ＡＰ−２とセットで２ｎｄＰＣＲをおこない、５’側の配列を決定していった。また、３’側の遺伝子配列についても５’側同様に１ｓｔ３’ＲＡＣＥのプライマーとしてＧＳＰＦ１（配列番号１５）とＡＰ−１、を用い、前記ｃＤＮＡをテンプレートとし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社）を用い９７℃（２分間）で熱変性を行なった後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４０回、７２℃７分の条件でＰＣＲをおこなった。反応液のアガロースゲル電気泳動をおこない、ＤＮＡの増幅を確認した後、先のＰＣＲ反応液を滅菌水で５０倍に希釈したものを、２ｎｄ  ＰＣＲのテンプレートとし、ＧＳＰＲ−２（配列番号１６）とＡＰ−２をプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９６℃２分半の後、９７℃２０秒、６８℃３０秒、７２℃６０秒のサイクルを４０回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲをおこなった。こうして増幅された遺伝子を直接、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析することで３’側のＯＲＦを決定し、全ＯＲＦを決定した。そしてこの遺伝子をＡＲＳと名付けた。該遺伝子の全長塩基配列を配列番号１に、推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。ＡＲＳのＯＲＦは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番から第５３１番までの５３１アミノ酸からなる新規蛋白質をコードしており、ホモロジー検索の結果、そのドメイン構造はＮ末から、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、プロ領域、プロテアーゼ活性化配列、セリンプロテアーゼドメイン、Ｃ末端配列であり、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼファミリーに属する分子であった。
（実施例２）ＡＲＳ遺伝子の組織発現分布
市販のｃＤＮＡパネル（Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ、Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩ、Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ、及びＨｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ；クロンテック社）を用いて、ＡＲＳ遺伝子の組織発現分布を以下の手順で解析した。
すなわち、配列番号１７と配列番号１９とで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、前記ｃＤＮＡパネルを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９６℃（２分間）で熱変性を行なった後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４０回、７２℃７分の条件でＰＣＲをおこなった。続いて、反応液のアガロースゲル電気泳動を行ない、ＡＲＳ遺伝子のｍＲＮＡに由来する約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出した。その結果、ＡＲＳ遺伝子のｍＲＮＡは、小腸において強発現しており、肺、大腸、及び脾臓ではほどんど発現していないことが判明した。
（実施例３）新規ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ遺伝子ＡＲＳ全長ＯＲＦ遺伝子のクローニング
配列番号１８と配列番号１９で示されるオリゴＤＮＡとをプライマーとし、ヒト小腸由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９６℃２分半の後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４５回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲを行った。こうして生成した約１．５ｋｂｐの断片をクローニングベクター（ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にアンピシリン耐性を指標にサブクローニングし、プラスミドクローンを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理した場合に、クローニングベクターのクローニング部位両側に存在するＥｃｏＲＩ認識配列により切断され、約１．５ｋｂのインサート配列が生成するプラスミドクローンｐＰＣＲ６１７−５’Ｆを選択した。ここで得られたプラスミドクローンｐＰＣＲ６１７−５’Ｆを鋳型にし、５’側にＸｂａＩ認識配列およびコザック（Ｋｏｚａｋ）配列が付加された配列番号２０と配列番号１９で示されるオリゴＤＮＡとをプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９５℃２分半の後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４０回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲを行った。こうして生成した約１．５ｋｂｐの断片をクローニングベクター（ＰＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）に、アンピシリン耐性を指標にサブクローニングし、プラスミドクローンを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理した場合にクローニングベクターのクローニング部位の両側に存在するＥｃｏＲＩ認識配列が切断され、約１．５ｋｂのインサート配列が生成するプラスミドクローンｐＣＲ６１７−ＸｂａＦ１を選択した。また、配列番号２１と３’側にＮｏｔＩ認識配列が付加された配列番号２２で示されるオリゴＤＮＡとをプライマー、ヒト小腸由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９６℃２分半の後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒のサイクルを４０回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲを行った。（１）こうして生成した約０．６ｋｂｐの断片をフェノール／クロロホルム処理後、増幅配列中に存在するＡｐａＩ認識配列とプライマー部位に挿入したＮｏｔＩ認識配列を利用し、制限酵素ＡｐａＩ、ＮｏｔＩで切断して得られた約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、（２）先に取得したｐＣＲ６１７−ＸｂａＦ１のインサート内に存在するＡｐａＩ認識配列とサブクローニングの際にプライマー部位に挿入したＸｂａＩ認識配列とを利用し、制限酵素ＸｂａＩ、ＡｐａＩで切断して得られた約１ｋｂｐのＤＮＡ断片とを連結させ、ｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧ（ＷＯ  ０１／３４７８５実施例３）のＸｂａＩ、ＮｏｔＩ部位に挿入して、全長蛋白質発現プラスミドｐＣＥＰ−ＡＲＳＦ−ＦＬＡＧを完成した。ｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧに挿入された配列をジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ��アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析したところ、配列番号１の１番から１５９３番で表される塩基配列であることが確認された。
この発現プラスミドｐＣＥＰ−ＡＲＳＦ−ＦＬＡＧは配列番号２の１番から５３１番にコードされるポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列が付加された蛋白質を発現させることができる。
（実施例４）ＡＲＳ細胞外領域蛋白質発現プラスミドの構築
配列番号２の５１番から５３１番にコードされるポリペプチドをＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧを付加した蛋白質として発現するためのプラスミドを以下のように構築した。
まず、配列番号１の１５１番から１５９６番の遺伝子をＰＣＲにより取得した。詳しくは、ＢｇｌＩＩ認識配列が付加された配列番号２３とＸｈｏＩ認識配列が付加された配列番号２４で示されるオリゴＤＮＡをプライマー、鋳型としてｐＣＥＰ−ＡＲＳ−ＦＬＡＧ、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９６℃２分の後、９８℃１５秒、６５℃３０秒、７２℃１分３０秒のサイクルを３６回、続いて７２℃７分の反応を行った。こうして生成したＤＮＡ断片をｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）にサブクローニングし、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列を確認した。ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ部位で目的のＤＮＡ断片を切り出し、ｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧベクターのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入しｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒを完成させた。
この発現プラスミドｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒは配列番号２の５１番から５３１番にコードされるポリペプチドのＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧ配列が付加された蛋白質を発現させることができる。
（実施例５）ＡＲＳのセリンプロテアーゼドメインおよびＣ末端配列発現プラスミドの構築
配列番号２の２３７番から５３１番にコードされるポリペプチドをＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧを付加した蛋白質として発現するためのプラスミドは以下のように構築した。
まず、配列番号１の７０９番から１５９６番の遺伝子をＰＣＲにより取得した。詳しくは、ＢｇｌＩＩ認識配列が付加された配列番号２５と配列番号２４で示されるオリゴＤＮＡプライマー、鋳型としてｐＣＥＰ−ＡＲＳ−ＦＬＡＧ、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９６℃２分の後、９８℃１５秒、６５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３５回、続いて７２℃７分の反応を行った。こうして生成したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ｐＣＥＰ４−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧベクターのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入しｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤを完成させた。ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析したところ、配列番号１で表される塩基配列の７０９番から１５９６番の塩基からなる配列であることが確認された。
この発現プラスミドｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤは配列番号２の２３７番から５３１番にコードされるポリペプチドのＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧ配列が付加された蛋白質を発現させることができる。
（実施例６）ＡＲＳのセリンプロテアーゼドメイン発現プラスミドの構築
配列番号２の２３７番から４６４番にコードされるポリペプチドをＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧを付加した蛋白質として発現するためのプラスミドは以下のように構築した。
まず、配列番号１の７０９番から１３９２番の遺伝子をＰＣＲにより取得した。詳しくは、ＢｇｌＩＩ認識配列が付加された配列番号２５と、ＸｈｏＩ認識配列及び終止コドン配列が付加された配列番号２６で示されるオリゴＤＮＡをプライマーとし、鋳型及びＰＣＲ条件は実施例５と同様にしてＰＣＲを行った。生成したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ｐＣＥＰ４−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧベクターのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入しｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤＯを完成させた。ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析したところ、配列番号１で表される塩基配列の７０９番から１３９２番の塩基からなる配列であることが確認された。
この発現プラスミドｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤＯは配列番号２の２３７番から４６４番にコードされるポリペプチドのＮ末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧ配列が付加された蛋白質を発現させることができる。
（実施例７）ＡＲＳ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤＯの動物細胞株での発現
実施例３〜５において作製した発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ロシュ社）を用いて添付指示書に従いＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）に導入した。プラスミド導入後１２−１６時間で培地を無血清に置換した後、さらに４８−６０時間培養を継続し、培養上清を回収し、得られた各培養液を、遠心分離器（８８００型；久保田製作所社）により遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０分間）することにより、培養上清を得た。また、前記培養上清を除去した後に残った細胞を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）にて洗浄後、リン酸緩衝液にてピペッティングにより細胞を培養プレートより剥離したものを遠心分離器（８８００型遠心分離器；久保田製作所社）にて３０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離した沈殿をリン酸緩衝液に懸濁させたものを細胞画分とした。ｐＣＥＰ−ＡＲＳＦ−ＦＬＡＧ、ｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｐＣＥＰ−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤを導入して得られてた遠心分離処理後の培養上清を以下、各々ＡＲＳＦ−ＦＬＡＧ培養上清、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ培養上清、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤ培養上清、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤＯ培養上清と称する。
培養上清中並びに細胞内に目的蛋白が存在することを末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；シグマ社）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、上記培養上清（１５ｃｍシャーレ１枚より回収した培養上清１２ｍｌ中２０μｌ）並びに細胞画分（１５ｃｍシャーレ１枚より回収した細胞を１０ｍｌのリン酸緩衝液に懸濁させた細胞画分５μｌ）をＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社）で電気泳動（還元条件）後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にブロックエース（大日本製薬社）を添加してブロッキングした後、ビオチン化マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２；シグマ社）、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシア社）を順次反応させた。反応後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマシャムファルマシア社）を用いて目的蛋白の発現を確認した。ＡＲＳ−ＦＬＡＧを発現させた場合、細胞画分に予想分子量約５５−６０ｋＤの全長タンパクと考えられるバンドが検出されたほか、約３５−４０ｋＤの蛋白が検出された。また培養上清中にも空ベクターを導入した場合には検出されない分子量約５５−６０ｋＤと３５−４０ｋＤのバンドが検出された。培養上清中と比べ、細胞画分中に少なくとも約１０倍以上の発現蛋白が検出され、大部分の発現蛋白は細胞内に留まっていることが確認されると共に、ＡＲＳ遺伝子産物はセリンプロテアーゼファミリーに保存されたプロ領域とセリンプロテアーゼドメインの間にある活性化配列で切断されて成熟体となるものがあり、切断された場合でも大部分はシステイン間のＳ−Ｓ結合等により細胞外に放出されないでいることが示唆された。一方、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒを発現させた細胞では細胞画分に約５０−６０ｋＤ、約２３−２５ｋＤ、約２０−２３ｋＤのバンドが検出され、同様のバンドは培養上清中でも確認された。またｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−６１７−ＳｅｒＰＤを発現させた細胞では細胞画分に分子量約３０−３５ｋＤ、約２７ｋＤ、約２４ｋＤのバンドが検出され、培養上清中には主として３５−３７ｋＤのバンドが検出された。ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤＯを発現させた細胞では細胞画分に分子量約２５−２８ｋＤ、約２４ｋＤ、約２３ｋＤのバンドが検出され、培養上清中には主として約２５−２８ｋＤのバンドが検出され、それぞれの蛋白の発現が確認された。
セリンプロテアーゼが活性化するときに切断されることが知られている活性化部位（小出武比古、医学の歩み、１９８，１１−１６、２００１）がＡＲＳにも存在する（配列２で示した２３６番アルギニンと２３７番イソロイシン）ことからこの間で切断され、さらにそのＮ端側で少なくとも１箇所切断されると考えられる。また、既知のＩＩ型セリンプロテアーゼＨＡＴ（Ｙａｍａｏｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１１８９５−１１９０１，１９９８），Ｄｅｓｃ１（Ｌａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４，２３７−２４３，２００１），ｈｅｐｓｉｎ（Ｌｅｙｔｕｓ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１０６７−１０７４，１９８８），Ｓｐｉｎｅｓｉｎ（ＴＭＰＲＳＳ５）（Ｎｏｚｏｍｉ  Ｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７６８０６−６８１２，２００２）とのアミノ酸配列の比較から、ジスルフィド結合を形成すると推定されているシステイン残基がＡＲＳでも保存されている（Ｃｙｓ２２５、３４６、２６２、２７８、３９２、４０６、４１７、４４６）ことから約２６ｋＤのセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドとＮ端側のポリペプチドがジスルフィド結合を形成していると推測される。（他のプロテアーゼとの比較からＣｙｓ２２５と３４６の間でジスルフィド結合が形成されていると予想される。）
（実施例８）合成ペプチドを用いた組換え体ＡＲＳ蛋白質の酵素活性の検出
ＭＣＡ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）でＣ末端を標識された合成ペプチドを用いて酵素的切断活性を検出する方法は特に断りの無い限り、論文報告された方法（Ｙａｓｕｏｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１６，３００−３０８，１９９７）に従った。すなわち、ＭＣＡでＣ末端を標識された合成ペプチド（ペプチド研究所）を基質として、９６穴プレートに終濃度１００μＭとなるようにＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に基質を希釈した。この基質溶液に実施例６に示したＡＲＳ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤＯ培養上清及びコントロールとして空ベクターを遺伝子導入した場合の培養上清を添加した後、３７℃でインキュベートした。その後合成ペプチドから酵素により切断されて遊離したＡＭＣ（７−Ａｍｉｎｏ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）の蛍光を蛍光測定プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ、ＳＬＴ社）で励起波長３９０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍにて測定した。この結果、ＡＲＳ−ＦＬＡＧ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤ、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ＳｅｒＰＤＯ培養上清はいずれも空ベクターを遺伝子導入した場合の培養上清では得られない合成ペプチドＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、及びＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡの切断活性を示した。
本実施例の方法において、切断された基質を用い、試験物質を存在させて測定を行うことにより、本発明のプロテアーゼ活性の阻害剤をスクリーニングすることができる。
（実施例９）トリプシンビーズによるＡＲＳの活性化
Ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ培養上清をトリプシンビーズ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）で処理した場合に人工基質の分解活性の上昇がみられるかを調べた。トリプシンビーズを用いた酵素の処理方法については特に断りの無い限り、論文報告された方法（Ｓｈｉｇｅｋｉ  Ｓａｔｏｍｉら．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２８７，９９５−１００２，２００１）に従った。以下に詳細を示した。
酵素試料及びコントロール試料としては実施例７と同様にして得たｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ培養上清、空ベクターを遺伝子導入した場合の培養上清を用いた。０．１Ｍ炭酸アンモニウムバッファーで３回洗浄し、同バッファー中に懸濁したトリプシンビーズと、前述の各々の試料とを１：２〜１：４の比率で混合し、前記バッファー中、３７℃で２時間処理をおこなった。処理後、遠心分離器（Ｍ１５０−ＩＶ型；佐久間製作所）で４℃、毎分３０００回転で３分間遠心して上清を回収し、更に回収した上清を遠心分離器（Ｍ１５０−ＩＶ型；佐久間製作所）で４℃、毎分６０００回転で３分間遠心して上清を回収することでトリプシンビーズを除去した。このようにして得られたトリプシンビーズ処理した酵素試料及びコントロール試料の人工基質Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡの分解活性を実施例７で示した酵素活性検出法を用いて比較した。その結果、ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ培養上清をトリプシンビーズ処理した試料は、トリプシンビーズ未処理の場合と比べて１０倍以上の活性の上昇が確認された。一方、コントロール試料、及び、トリプシン処理後のコントロール試料では人工基質の分解活性は観察されなかった。このことにより、ＡＲＳは他のプロテアーゼによる活性化の制御を受けている可能性が考えられた。Ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒをトリプシン処理して得られる試料は、高活性であり、本発明のプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングするのに用いることが出来る。
（実施例１０）ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ蛋白質の精製
ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ蛋白質発現細胞を用い、細胞の培養液中に分泌された組換え蛋白質を抽出、精製した。具体的には実施例７と同様の方法により、作製した形質転換ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を８０％程度コンフルエントになるまで培養した後、培地を取り除き、代わりに４％の血清を含む培地を加え、３７℃、二酸化炭素濃度５％の条件で更に４日間培養を続けた。４日後にその培養上清を回収し、０．２２μｍフィルター（ザルトル社）でろ過したものをＴＢＳバッファーで平衡化させたＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−ＡＧＡＲＯＳＥ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＧＥＬ（シグマ社）カラムに定法に従い吸着させた。その後、およそ５０ｍｌのＴＢＳバァッファーでカラムを洗浄後、０．１ｍＭグリシン塩酸溶液（ｐＨ２．２）を６ｍｌ用い、１ｍｌずつ分取した。分取した画分に直ちに１００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を加えてｐＨを調整した。ここで得られた各画分をＮ末端側に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；シグマ社）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、上記溶出画分をＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社）で電気泳動（還元条件）後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にブロックエース（大日本製薬社）を添加してブロッキングした後、ビオチン化マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２；シグマ社）、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシア社）を順次反応させた。反応後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマシャムファルマシア社）を用いて該蛋白の溶出画分を確認したところ、ほとんどのタンパクは１番目の画分に溶出されてきていることが分かったため、この溶出画分を以って精製蛋白溶出液とした。
（実施例１１）合成ペプチドを用いた組換え体精製蛋白質酵素活性の検出
実施例８と同様の方法によりＭＣＡ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ）でＣ末端を標識された合成ペプチドを用いて実施例１０で精製した酵素の切断活性を検出した。手法に関しては特に断りの無い限り、論文報告された方法（Ｙａｓｕｏｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１６，３００−３０８，１９９７）に従った。具体的には、ＭＣＡでＣ末端を標識された合成ペプチド（ペプチド研究所）を基質として、９６穴プレートに終濃度２００μＭまたは４００μＭとなるように炭酸水素アンモニウム緩衝液中に基質を希釈した。この基質溶液に実施例１０で得られた精製タンパク溶出液又はコントロールとして炭酸水素アンモニウム緩衝液を添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。その後合成ペプチドから酵素により切断されて遊離したＡＭＣ（７−Ａｍｉｎｏ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）の蛍光を蛍光測定プレートリーダー（ＳＡＦＩＲＥ、ＴＥＣＡＮ社製）で励起波長３９０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍにて測定した。結果を図１に示す。図１における白バーは緩衝液コンロトール、黒バーは精製タンパク溶出液を用いた場合を示している。▲１▼はＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、▲２▼はＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、▲３▼はＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、▲４▼はＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、▲５▼はＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、▲６▼はＳｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＭＣＡ、▲７▼はＢｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、▲８▼はＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、▲９▼はＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、▲１０▼はＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質とした場合を示している。
精製タンパク溶出液は緩衝液コントロールでは検出されない合成ペプチドＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡの切断活性を示した。更に、今回新たに以下の基質、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡについて検討したところ、精製蛋白質はこれら全ての基質を切断することが明らかとなった。
また、精製蛋白溶出液を用い実施例９と同様の方法によりトリプシンビーズ処理した酵素溶液を得た。この酵素溶液の基質切断活性を実施例８と同様の手法で測定した。すなわち、９６穴プレートに終濃度４００μＭとなるように炭酸水素アンモニウム緩衝液中に合成ペプチド基質を希釈し、前述の酵素溶液を混合して３７℃で１時間インキュベートした。その後合成ペプチドから酵素により切断されて遊離したＡＭＣの蛍光を蛍光測定プレートリーダーで測定したところ、当該酵素溶液は合成ペプチドＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡを切断する事がわかった。また、トリプシンビーズ処理した酵素溶液は、精製蛋白溶出液より高い切断活性を示した。
本実施例により、精製酵素、精製酵素トリプシンビーズ処理標品を用いることによっても、上記切断された基質を用い、試験物質を存在させて測定を行うことにより、本発明のプロテアーゼ活性の阻害剤をスクリーニングすることができることがわかった。
（実施例１２）生理活性ペプチドを用いた酵素活性の検出
実施例９の方法と同様にトリプシンビーズ処理したｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ−ＡＲＳ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ精製酵素を酵素試料として用い、以下の生理活性ペプチドと混合して３７℃、１６時間反応させた後に酵素活性を検出した。酵素未添加のコントロールとして炭酸水素アンモニウム緩衝液を用いた。ペプチドは１００ｍＭ炭酸水素アンモニム緩衝液（ｐＨ８）中でそれぞれ０．１ｍＭに調整しておいた。用いたペプチドは、アドレノコルチコトロピックホルモン（Ａｄｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ＡＣＴＨ）、アンジオテンシン１−１３（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  １−１３）、アンジオテンシン１−１４（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  １−１４）、アンジオテンシン１−７（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  １−７）、アンジオテンシン１−９（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  １−９）、アンジオテンシン３−７（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ３−７）、アンジオテンシン３−８（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ３−８）、アンジオテンシンＩ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ）、アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ）、アンジオテンシンＩＩＩ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩＩ）、Ａ型ナトリウム利尿ペプチド（Ａ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＡＮＰ）、アペリン１３（Ａｐｅｌｉｎ  １３）、アペリン３６（Ａｐｅｌｉｎ  ３６）、ビッグガストリン（Ｂｉｇ  Ｇａｓｔｒｉｎ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド３２（Ｂ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ３２、ＢＮＰ  ３２）、ブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、ベンゾイルグリシルヒスチジルロイシン（Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）、キモスタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド２２（Ｃ−ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−２２、ＣＮＰ２２）、アルギニン欠失ブラジキニン（Ｄｅｓ−Ａｒｇ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、ロイシン末エンケファリン（Ｌｅｕ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、メチオニン末エンケファリン（Ｍｅｔ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ＧＨ）、ガストリックイン  ヒビタリーペプチド（Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １、ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、（ＧＬＰ−２）、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ、ＧＲＦ）、インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎ、ＬＨ−ＲＨ）、メラニン凝集ホルモン（Ｍｅｌａｎｉｎ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ＭＣＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン（α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎ、α−ＭＳＨ）、モチリン（Ｍｏｔｉｌｉｎ）、ニューロテンシン（Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ）、ニューロペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ、ＮＰＹ）、オキシトシン（ｏｘｙｔｏｓｉｎ）、脳下垂体アデ���ルシクラーゼ活性化ポリペプチド３８（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ３８、ＰＡＣＡＰ３８）、プロラクチン放出ペプチド（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰｒＲＰ３１）、ピログルタミックアペリン１３（Ｐｙｒ−Ａｐｅｌｉｎ１３）、セクレチン（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、サブスタンスＰ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）、１，２，７，９位Ｄ体アミノ酸置換型１１位ロイシン型サブスタンスＰ（［Ｄ−Ａｒｇ１，Ｄ−Ｐｒｏ２，Ｄ−Ｔｒｐ７，９，Ｌｅｕ１１］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）、２，７，９位Ｄ体アミノ酸置換型サブスタンスＰ（［Ｄ−Ｐｒｏ２，Ｄ−Ｔｒｐ７，９］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）、ウロテンシンＩＩ（Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ）、又は血管作用性消化管ペプチド（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＶＩＰ）（すべてペプチド研究所社）である。基質ペプチドの切断は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（島津製作所製ＬＣ−１０ＡＳ）により、酵素液を入れて反応させた試料と、酵素の代わりに炭酸水素アンモニウム緩衝液を加えた試料とを分析比較することで確認した。
ＨＰＬＣ条件
ＴＯＳＯＨ社製  ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム
カラム温度４０℃
測定波長２２０ｎｍ
溶媒液組成
Ａ液：１０ｍＭ燐酸２水素カリウム緩衝液（ｐＨ７．４−８．０）
Ｂ液：９０％アセトニトリル：１０％超純水混合液
流速１ｍｌ／１分
グラジエントプログラム
０分−５分  Ｂｃｏｎｃ．０％
５分−３０分  Ｂｃｏｎｃ．８０％（グラジエント）
３０分−３５分  Ｂｃｏｎｃ．８０％（一定）
３５分−３６分  Ｂｃｏｎｃ．０％（戻し）
３６分−４０分  Ｂｃｏｎｃ．０％
分析比較した結果、酵素試料はＶＩＰ、ＮＰＹ、ＡＮＰ、ＣＮＰ、α−ＭＳＨ、ＭＣＨを選択的に切断することがわかった。ＶＩＰ切断のＨＰＬＣ分析の結果を図２及び図３に示す。図２は緩衝液コントロールを添加した場合、図３は酵素試料を添加した場合の図である。図の横軸はリテンションタイムを、縦軸は吸光度を示している。一般に同一条件でＨＰＬＣをおこなった場合、同一の物質が同程度の量含まれていれば、その物質は同一の検出時間帯（リテンションタイム）に、同一のピーク面積という形のチャートという結果を得ることができる。本ＨＰＬＣは同一の条件下でおこない、もともと溶解させておいたＶＩＰの量を揃えておいたにも関わらず、緩衝液を反応系に加えた場合と、酵素試料を反応系に加えた場合とでは検出されるピークに違いが認められた。すなわち、特には、緩衝液では検出されなかったリテンションタイム１７．６１４及び１８．８００のピークが酵素試料添加の場合に検出された。これは酵素試料添加によりＶＩＰが切断され、違う物質を検出したことを示している。すなわち本酵素試料がＶＩＰを切断したことを示している。
ＶＩＰは便秘症、特に女性患者数の多い便秘型の過敏性腸症候群の治療及び炎症性の消化管疾患の治療に有用であることが知られていることから、ＶＩＰ切断活性を有する本発明のポリペプチドは消化管疾患治療薬のスクリーニングに有用であることがわかった。更に、本実施例の方法またはより簡便には実施例８又は実施例１１の方法を消化管疾患治療薬をスクリーニングする方法として用いることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明のポリペプチドは小腸に高発現するプロテアーゼまたはその前駆体である。本発明の前駆体は本発明のプロテアーゼを得るために有用である。本発明のプロテアーゼはＶＩＰ切断活性を有することから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び細胞は、消化管疾患治療薬のスクリーニングに有用である。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３、４、２０、２２〜２６の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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