(57)【要約】ヒト精神分裂病に対応する適切な動物モデルや、かかる動物モデルを用いる抗精神薬のスクリーニング方法等を提供するものである。一方の対立遺伝子座のみにおいてＰａｘ６遺伝子を欠損させ、ヒト精神分裂病の症状と類似の行動異常を示すＰａｘ６変異ヘテロラットを、精神分裂症のモデル動物として用い、該モデル動物に被検物質を投与し、ヒト精神分裂病の症状と類似の行動異常の変化を測定・評価して抗精神薬をスクリーニングする。上記モデル動物が呈する行動異常としては、野性型に比して、感覚ゲート機構が劣る行動異常や、恐怖による記憶付けが不十分な行動異常や、社会性が欠如した行動異常や、恐怖心が低下する行動異常や、好奇心が低下する行動異常を挙げることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐａｘ６遺伝子に変異を有し、且つヒト精神疾患の指標となる行動異常を示す非ヒト動物に被検物質を投与し、該行動異常の変化を指標として物質を選択することを特徴とする抗精神病薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
行動異常が、感覚ゲート機構の低下であることを特徴とする請求項１に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
抗精神病薬が、統合失調症の治療薬である請求項２に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
行動異常が、恐怖条件付け能力の低下、社会性欠如、恐怖心の低下、あるいは好奇心の低下である請求項１に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
Ｐａｘ６遺伝子に変異を有し、且つ感覚ゲート機構の低下を示す非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物の感覚ゲート機構を指標として物質を選択することを特徴とする統合失調症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
動物が、マウス、またはラットである請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のスクリーニング方法に用いるための動物。
【請求項８】
請求項１〜６に記載のスクリーニング方法により選抜された物質を製剤化することを特徴とする抗精神病薬の製剤化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｐａｘ６遺伝子に変異を有し、且つヒト精神疾患の指標となる行動異常を示す非ヒト動物を用いた抗精神病薬のスクリーニング方法、あるいはかかるスクリーニング方法に用いるための動物等に関する。
背景技術
Ｐａｘ遺伝子はホメオボックスとペアードボックスを有し、１〜９のサブファミリーに分類される、転写因子をコードするホメオボックス遺伝子のメンバーであり、サブファミリーのうち、Ｐａｘ６遺伝子は昆虫から哺乳類にいたるまで広い生物種にわたって眼の形態形成や神経系の発生に関与していることが知られている。本発明者らはこのＰａｘ６（例えば、非特許文献１〜５参照。）というホメオボックス型転写因子の脳神経発生における機能を解明するために、一方の対立遺伝子座のみにおいてＰａｘ６をコードする遺伝子に塩基が挿入される突然変異を有するラット（Ｓｍａｌｌ  ｅｙｅ  ｒａｔ：ｒＳｅｙ２、以下これを「Ｐａｘ６変異ヘテロラット」と称することがある）を用いた解析を進め、Ｐａｘ６が胎生期の脳、眼、膵臓などに発現し、Ｐａｘ６変異ヘテロラットのホモ接合個体では、これらの器官に重篤な発生異常を示すことを明らかにしている。すなわち、大脳新皮質層形成、嗅球形成、視床皮質路形成、小脳形成、菱脳及び脊髄のニューロン及びグリア分化などの異常についてすでに報告している（例えば、非特許文献６〜１１参照。）。
Ｐａｘ６遺伝子は生後の脳でも記憶や情動の機能に重要な海馬や扁桃体で発現し、Ｐａｘ６変異ラットホモ接合個体は出生直後に死亡するが、ヘテロ接合個体は小眼症などの他には目立った発生異常を示さず、交配可能であるため系統維持することができる。
マウスにおいても自然発症的にＰａｘ６遺伝子に変異を有する個体（例えば、非特許文献１２〜１４参照。）が存在している。この個体が有するＰａｘ６遺伝子の変異はその３′下流に塩基が挿入されるものであり、この変異により発現されるＰａｘ６遺伝子の変異はそのＣ末端に数個のアミノ酸が添加されたものとなっている。また、この変異体はＰａｘ６ヘテロラットと同様の表現型を示す。さらに、ヒトにおいても、Ｐａｘ６に変異を有する例が報告されている。このうち、アミノ酸番号で１００番目、１３６番目、あるいは２４０番目のいずれかに変異を有する個体については無虹彩症という遺伝的疾患を引き起こすことが報告されている（例えば、非特許文献１５参照。）。
一方、ヒトのＰａｘ６変異を有する個体としてＰａｘ６の５′転写制御領域に存在するＡＣ／ＡＧリピートの数が２９以上のＰａｘ６のプロモーター活性化の程度が高い個体群で妄想性統合失調症との穏やかな関連が示唆されている（例えば、非特許文献１６参照。）。
これらのＰａｘ６変異体とその表現型の関連性を考え合わせると、Ｐａｘ６遺伝子に変異を有すると何らかの表現型の変化を示すことは明らかであり、いずれも神経発生制御にＰａｘ６が機能していることを示唆している。しかし、上記の如くそれぞれの変異体が有するＰａｘ６の変異の位置や種類が異なることから、これらの知見からＰａｘ６遺伝子の変異とその表現型を普遍的に予測することが困難である。
Ｐａｘ６変異ヘテロラットをはじめとするＰａｘ６遺伝子に変異を有する動物においては、その神経発生等については解析が行なわれているものの、その行動異常については解析が行なわれていなかった。該動物の行動においては特にヒト神経疾患と関連性のある異常があれば、該動物を該疾患のモデル動物として使用することができるようになるが、上記の如く、Ｐａｘ６遺伝子の変異からその行動の異常等を予測することは困難であることから、その行動解析が望まれていた。
非特許文献１：Ｃｅｌｌ，６９，７１９−７２２，１９９２
非特許文献２：Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４，９６７−９７２，１９９２
非特許文献３：実験医学増刊１４（８），１８６−１９２，１９９６
非特許文献４：細胞工学１８，１８３８−１８４５，１９９９
非特許文献５：Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３，１６３−１８０，２００１
非特許文献６：Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３，２９９−３０４，１９９３
非特許文献７：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５７，３１−３８，１９９４
非特許文献８：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２４，２９６１−２９６７，１９９７
非特許文献９：Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４０８，１４７−６０，１９９９
非特許文献１０：Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１２０，６５−７５，２０００
非特許文献１１：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８，３１３３−３１４４，２００１
非特許文献１２：Ｎａｔｕｒｅ，３５４，５２２−５２５，１９９１
非特許文献１３：Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，９７，９５−１１０，１９８６
非特許文献１４：Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，８６，１２６−１３５，１９９３
非特許文献１５：Ｔｒｅｎｄｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，２６８−２７２，１９９５
非特許文献１６：Ｇｅｒａｌｄ，Ｓ，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，４５，１５８５−１５９１，１９９９
統合失調症（精神分裂病）は素質的要因を主因とする機能性精神病であり、遺伝的素因が関係することが多いとされている。統合失調症の発症基盤としては、ストレスに対する脆弱性が問題となっており、高ストレスの現代社会において統合失調症の患者は増加傾向にある。統合失調症発症の基盤解明については、これまで手法的な限界もあり、未だ原因遺伝子の特定や、病態や経過の類似したモデル動物の作製には至っていない。有効な抗精神病薬の開発のためには、まずヒト統合失調症に対応する適切な動物モデルを用いた効果の判定が必要である。しかし、現在までに提供されているモデル動物は覚醒剤や麻薬を投与したもの等であり、このような適切な動物モデルは提供されていない。本発明の課題は、ヒト精神疾患に対応する適切な動物モデルや、かかる動物モデルを用いる抗精神病薬のスクリーニング方法等を提供することにある。
本発明者らは、Ｐａｘ６変異ヘテロラットの系統維持をしている間に、このラットが恐怖心の低下を示すことに気付いていたため、Ｐａｘ６変異ヘテロラットの行動解析を行った。その結果、Ｐａｘ６変異ヘテロラットがヒト精神疾患の指標となる行動異常を示すことを見い出した。すなわち、Ｐａｘ６変異ヘテロラットは、一般活動性においては野性型と差が認められないにも関わらず、社会性テスト、明暗テスト、恐怖条件付けテスト、プレパルス抑制テストなどにおいて顕著な差が認められ、好奇心や恐怖心の低下、社会性の欠如、感覚ゲート機構の低下を示した。
Ｐａｘ６変異ヘテロラットの系統は、遺伝的バックグラウンドが均一であり、産仔数が多く繁殖力が強く、さらに薬物を投与しない状態でヒト統合失調症類似の症状を呈することから、ヒト統合失調症に対応する適切な動物モデルであると考えられ、抗精神病薬開発のための実験動物としてきわめて有用であることを見い出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
発明の開示
すなわち本発明は、Ｐａｘ６遺伝子に変異を有し、且つヒト精神疾患の指標となる行動異常を示す非ヒト動物に被検物質を投与し、該行動異常の変化を指標として物質を選択することを特徴とする抗精神病薬のスクリーニング方法（請求項１）や、行動異常が、感覚ゲート機構の低下であることを特徴とする請求項１に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法（請求項２）や、抗精神病薬が、統合失調症の治療薬である請求項２に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法（請求項３）や、行動異常が、恐怖条件付け能力の低下、社会性欠如、恐怖心の低下、あるいは好奇心の低下である請求項１に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法（請求項４）や、Ｐａｘ６遺伝子に変異を有し、且つ感覚ゲート機構の低下を示す非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物の感覚ゲート機構を指標として物質を選択することを特徴とする統合失調症治療薬のスクリーニング方法（請求項５）や、動物が、マウス、またはラットである請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法（請求項６）や、請求項１〜６に記載のスクリーニング方法に用いるための動物（請求項７）や、請求項１〜６に記載のスクリーニング方法により選抜された物質を製剤化することを特徴とする抗精神病薬の製剤化方法（請求項８）に関する。
発明を実施するための最良の形態
（１）精神疾患モデル動物
本発明に用いられる動物としては、その染色体中のＰａｘ６遺伝子に変異を有し、かつヒト精神疾患の指標となる行動異常を示す動物（以下、「精神疾患モデル動物」と称することがある）であれば特に制限されるものではない。動物種としては、Ｐａｘ６遺伝子を染色体中に有するものであれば如何なるものでもあってもよいが、例えば、マウス、ラット等の齧歯類動物や、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、サル等が挙げられる。
本発明で、Ｐａｘ６遺伝子とは、翻訳領域に限らずＰａｘ６タンパク質の発現に係る全ての領域を指す。具体的には、例えば、ラットＰａｘ遺伝子としてＧｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＮＭ＿０１３００１に示されるものが挙げられ、マウスＰａｘ６遺伝子としては、Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１（２），４２４−４３４（１９９１）に示されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、本発明に用いる動物の染色体中にあって、上記の塩基配列からなるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーション等によって取得される領域を意味する。ここで、Ｐａｘ６遺伝子の発現制御領域を取得する場合には、取得されたＤＮＡ断片がＰａｘ６発現制御活性を有するか否かをそれ自体既知の通常用いられる方法によって確認することがきる。具体的には、例えば該ＤＮＡ断片の３′下流に適当なマーカー遺伝子を結合し、さらに必要に応じてターミネーション領域等を結合させた後に、これを適当な細胞等に導入し、該細胞内でマーカー遺伝子の発現を確認する方法等が挙げられる。
Ｐａｘ６遺伝子に変異を有するとは、用いる動物の野生型Ｐａｘ６遺伝子の塩基配列が１塩基以上変化していることを意味する。変異の具体例としては、ＤＮＡの置換、欠失、挿入等が挙げられる。これらの変異は、自然発症的なものでもよいし、人為的に導入したものでもよい。Ｐａｘ６遺伝子に変異を有することは、それ自体既知の通常用いられる方法により確認することができる。具体的には、例えば、該動物の適当な細胞からｃＤＮＡ、またはゲノムライブラリーを作製し、該ライブラリーからポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）等を用いてＰａｘ６遺伝子を含むＤＮＡを単離し、その塩基配列を野生型と比較することによって行う方法等が挙げられる。
また、人為的に遺伝子変異を導入する方法としては、それ自体公知の通常用いられる方法によることができるが、例えば、ノックアウト法（ジーンターゲティングの最新技術、八木健、羊土社、２０００）、ノックイン法（ジーンターゲティングの最新技術、八木健、羊土社、２０００）、トランスジェニック法（トランスジェニック動物、山村研一他編集、共立出版、１９９７年）等が挙げられる。Ｐａｘ６遺伝子の変異は、用いる動物が有する相同染色体上の２つの遺伝子座のうち、どちらか一方のＰａｘ６遺伝子における変異でも、両方の変異でもよい。ここで、対立遺伝子座のどちらか一方のＰａｘ６遺伝子の変異（以下、この変異を「ヘテロ型」と称することがある）を有する動物から、両方の変異（以下、この変異を「ホモ型」と称することがある）を有する動物を取得する方法としては、該ヘテロ型変異を有する動物の雄雌を交配し、得られた産仔の遺伝子型を解析して、ホモ型の変異を有するものを選択することによる方法が挙げられる。
また、Ｐａｘ６遺伝子以外の遺伝子に変異を有しているものでも、下述の行動異常を示すものであれば、本発明に用いることができる。
本発明に用いられる動物は、上記のようなＰａｘ６遺伝子に変異を有し、さらに、ヒト精神疾患の指標となる行動異常を示す。ヒト精神疾患の指標となる行動異常としては、例えば、感覚ゲート機構が低下する行動異常、恐怖による記憶付けが不十分な行動異常、社会性が欠如する行動異常、恐怖心が低下する行動異常、あるいは好奇心が低下する行動異常等が挙げられる。これらのうち、特に感覚ゲート機構が低下する行動異常は、統合失調症との関連が明らかになっているので好ましい（Ｂｒａｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１５６，２３４−２５８（２００１）、本明細書の実施例５）。
これらの行動異常を解析、同定する方法としては、それ自体既知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、感覚ゲート機構を解析する方法としては、音刺激によるプレパルス抑制テスト（Ｂｒａｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１５６，２３４−２５８（２００１））が挙げられる。感覚ゲート機構とは、大きな刺激の直前にそれより少し小さな刺激（プレパルス）を与えると、与えられないものに比べて刺激に対する反射の程度が小さくなることを言う。このテストの方法としては、具体的には、例えば、対象動物を測定装置の中に入れ、まずプレパルス音（６８，７１あるいは７７ｄｂ）を２０ｍ秒間聞かせた後、その１００ｍ秒後に本刺激音（１０５ｄｂ）を４０ｍ秒間聞かせる。この時該動物が音に反応して動く加速度を測定する。この値が野生型のものより大きければ感覚ゲート機構が低下していると判断でき、本発明の神経疾患モデル動物、好ましくは統合失調症モデル動物として用いることができる。
上記恐怖による条件付けが不十分な行動異常は、例えば、音による恐怖条件付けテストによって観察・識別することができる。音条件付け用観察箱に１匹の雄ラットを入れ、２分おいてから音を２０秒間聞かせた直後に０．３ｍＡの強さの電流を１秒間流して電気ショックを与えた。５分後に飼育用ケージに移し、条件付けから所定時間後に、音条件付け恐怖テスト箱に１匹の雄ラットを入れ、２分後から５分間、条件付けに用いたものと同じ音を聞かせ、条件付けられた恐怖によってすくみ反射をしていた時間を測定し、すくみ反射をしていた時間が野性型に比して減少した場合、恐怖による条件付けが不十分な行動異常と判断することができる。
上記社会性が欠如した行動異常は、社会性テストによって観察・識別することができる。例えば、オープンフィールドボックスの中に別々に飼育した２匹の雄ラットを入れ、その行動をビデオテープに所定時間記録した後、活動していた総時間及びその内容（相手を嗅ぐ、相手の後をつける、毛繕いをする、乗りかかる、喧嘩をしかけるなど）を解析し、野性型に比して相手の後をつける行動（Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）が少なくなり、逆に喧嘩をしかける行動（Ａｇｇｒｅｓｓｉｏｎ）が増加していた場合、社会性が欠如した行動異常と判断することができる。
上記恐怖心が低下する行動異常は、例えば、明暗選択テストによって観察・識別することができる。通常、ラットは明るいところでは恐怖を感じ、暗室を好む傾向がある。明暗フィールドボックスの明室に１匹の雄ラットを置き、暗室との仕切を通過した回数及び明室にいた時間を、フォトセンサーを用いて所定時間記録し、野性型に比して明室と暗室の行き来の回数及び明室にいた時間がともに大きな値を示した場合、明室でもあまり恐怖を感じていないことから恐怖心が低下する行動異常と判断することができる。
上記好奇心が低下する行動異常は、例えば、一般活動性テストによって観察・識別することができる。オープンフィールドボックスの中に１匹の雄ラットを入れ、フォトセンサーを用いて一般活動性を所定時間記録した後、活動していた時間、移動距離、立ち上がり行動（好奇心を表す）を示した時間を算出し、活動していた時間、移動距離、移動速度に関しては野性型に比して差が無く、好奇心を表す立ち上がり行動時間が野性型に比して少なかった場合、好奇心が低下する行動異常と判断することができる。
このような神経疾患モデル動物としては、例えばＰａｘ６遺伝子の７７７番目にシトシン（Ｃ）が挿入されている変異を有するラット（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８，３１３３−３１４４，２００１）であり、かつ感覚ゲート機構の低下、恐怖条件付け能力の低下、社会性欠如、恐怖心の低下、あるいは好奇心の低下等の行動異常を示すもの等が挙げられる。上記のラットは、野生型に比べて特に感覚ゲート機構が劣っていることが明確であるので統合失調症のモデル動物として用いることが好ましい。
（２）精神疾患モデル動物を用いた抗精神病薬のスクリーニング方法
本発明の精神疾患モデル動物は、統合失調症をはじめとする精神疾患やその病態を分子レベルで解明するためのモデル動物として、あるいはこれら疾患や病態に対する治療薬を開発するためのモデル動物としてきわめて有用であり、かかる精神疾患モデル動物を利用して野生型ラットと比較することで、Ｐａｘ６及びその下流因子を標的とした抗精神病薬のスクリーニングが可能となる。ここで抗精神病薬とは、統合失調症をはじめとする精神疾患の幻覚妄想や躁病などの興奮の鎮静に効果のある薬物をいう。その特徴は意識水準を低下させずに情動を鎮静させ、周囲への関心を低下させる点にある。
本発明の抗精神病薬のスクリーニング方法としては、本発明の精神疾患モデル動物に被検物質を投与し、該モデル動物がヒト精神疾患の指標となる行動異常の変化を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではない。このうち、ヒト統合失調症の指標となる行動異常の変化としては、感覚ゲート機構が劣る行動異常の消失・改善の程度の変化が挙げられる。また、恐怖による記憶付けが不十分な行動異常の消失・改善の程度の変化、社会性が欠如した行動異常の消失・改善の程度の変化、恐怖心が低下する行動異常の消失・改善の程度の変化、好奇心が低下する行動異常の消失・改善の程度の変化などもヒト精神疾患の指標となる行動異常として具体的に例示することができる。また、上記スクリーニングに際して、前記本発明の精神疾患モデル動物におけるヒト精神疾患の指標となる行動異常の消失・改善の変化の程度と、野生型非ヒト動物、好ましくは同腹の野生型非ヒト動物における同様の行動異常の消失・改善の変化の程度とを比較・評価することが好ましい。
本発明の抗精神病薬のスクリーニング方法を利用すると、Ｐａｘ６及びその下流因子を標的とした精神疾患病の治療薬のスクリーニングが可能となる。本発明の抗精神病薬の製剤化方法としては、抗精神病薬のスクリーニング方法により選抜された物質を製剤化する方法であればどのような方法でもよく、例えば、かかる選抜された物質を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができ、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる。
本発明治療薬を、精神疾患の可能性のある個体（患者）に投与することにより、該疾患を治療することができる。当業者であれば、本発明治療薬の投与経路、剤形、投与対象の種類、年齢、体重等に応じて適切な投与時期や投与量を選択することは容易である。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（Ｐａｘ６変異ヘテロラット）
Ｐａｘ６というホメオボックス型転写因子をコードする遺伝子に突然変異を有するヘテロ接合ラット（Ｓｍａｌｌ  ｅｙｅ  ｒａｔ；ｒＳｅｙ２  Ｍａｔｓｕｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３，２９９−３０４，１９９３；Ｏｓｕｍｉ  Ｎ．，Ｈｉｒｏｔａ  Ａ．，Ｏｈｕｃｈｉ  Ｈ．，Ｎａｋａｆｕｋｕ  Ｍ．，Ｉｉｍｕｒａ  Ｔ．，Ｋｕｒａｔａｎｉ  Ｓ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｍ．，Ｎｏｊｉ  Ｓ．，＆  Ｅｔｏ  Ｋ．：Ｐａｘ−６  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２４，２９６１−２９６７，１９９７；以下「Ｐａｘ６変異ヘテロラット」と称することがある）の生後８〜１６週齢の雄、及びその同腹の野生型ＳＤラット（以下「野生型」と称することがある）を用いた。このＰａｘ６変異ヘテロラットが有する突然変異はＰａｘ６遺伝子の７７７番目にシトシン（Ｃ）が挿入されており、その結果、変異ヘテロラットが有するＰａｘ６遺伝子においては、翻訳開始点から４３２番目に終止コドンが出現している。
（行動解析用装置）
オープンフィールドボックス：８０×８０×４０ｃｍのアクリル製の箱で、下面から２ｃｍ及び１４ｃｍの高さのところに２４本×２４本の光ビームセンサーが取り付けてあり、一般活動性テスト及び社会性テストに用いた。測定は無音の部屋で行い、光ビームセンサーからの入力をコンピュータに記録するとともに、行動の様子をビデオテープに記録した。
明暗フィールドボックス：上記オープンフィールドボックスと同じ大きさの箱を２つに仕切り、片方は白熱電球で照射して明るくしてあり（２５０ルクス）、片方は暗く（１ルクス）なっている。２つの部屋を仕切る壁には１２×２５ｃｍの開放部が設けてあり、その間を光ビームセンサーが走るようになっている。明暗選択テストに用い、測定は無音の暗室で行った。
音条件付け用観察箱（室町機械、特注品）：Ｈ２８×Ｄ２４×Ｗ３０ｃｍの箱を透明及びグレーのプラスチックパネルで三角形に仕切ってある。箱の床部は１９本のステンレススチールの棒が渡されており、電気ショックを与えることができる。音条件付けは無音の部屋で行った。
音条件付け恐怖テスト箱（室町機械、特注品）：上記音条件付け用観察箱とは異なる形状の箱（Ｗ３２×Ｄ２２×Ｈ２２ｃｍ、四角）である。恐怖度はすくみ反射をもって測定し、恐怖度の測定は無音の部屋で行った。
プレパルス抑制テスト装置（ＳＲ−Ｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）：シリンダー状の容器にラットを入れて、驚愕度の測定を圧センサーによって行う装置である。音刺激によるプレパルス抑制テストの測定は無音の部屋で行った。
実施例１（一般活動性テスト）
野生型２４例及びＰａｘ６変異ヘテロラット３４例についてオープンフィールドボックスの中での３０分間の行動を解析した。オープンフィールドボックスの中に上記ラットを１匹ずつ入れ、フォトセンサーを用いて一般活動性を３０分間記録した。この結果を分析することにより、活動していた時間、移動距離、立ち上がり行動（好奇心を表す）を示した時間を算出した。その結果、活動していた時間（図１Ａ）、移動距離（図１Ｂ）、移動速度（図１Ｃ）に関しては、野生型と本発明のモデルラットの間で差は無かったが、好奇心を表す立ち上がり行動（Ｒｅａｒｉｎｇ；図１Ｄ）については、Ｐａｘ６変異ヘテロラットは野生型に比して少なかった。すなわち、Ｐａｘ６変異ヘテロラットは新しい環境に対して興味を示さない傾向が見られた。
実施例２（明暗選択テスト）
野生型２４例及びＰａｘ６変異ヘテロラット３４例について、明暗フィールドボックスの中で３０分間測定した。明暗フィールドボックスの明室に上記ラットを１匹ずつ置き、暗室との仕切を通過した回数及び明室にいた時間を、フォトセンサーを用いて３０分間記録した。その結果、明室と暗室の行き来の回数（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；図２Ａ）及び明室にいた時間の割合（図２Ｂ）ともに、野生型に比べてＰａｘ６変異ヘテロラットでは大きな値を示した。すなわち野生型ラットが明室では恐怖を感じ暗室を好む傾向があるのに対し、Ｐａｘ６変異ヘテロラットは明室でもあまり恐怖を感じていないことが伺われた。
実施例３（社会性テスト）
野生型２４例及びＰａｘ６変異ヘテロラット３４例について、それぞれ２匹ずつをオープンフィールドボックスの中に入れ、ビデオテープに録画した行動を解析した。オープンフィールドボックスの中に別々に飼育した上記のうち同種の２匹の雄ラットを入れ、その行動をビデオテープに１５分間記録した。これを解析し、活動していた総時間及びその内容（相手の臭いを嗅ぐ、相手の後をつける、毛繕いをする、乗りかかる、けんかをしかけるなど）を解析した。その結果、相手の臭いを嗅ぐ行動（Ｓｎｉｆｆｉｎｇ）、毛繕いをする行動（Ｇｒｏｏｍｉｎｇ）、乗りかかる行動（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ）等において有意差は認められなかったが、Ｐａｘ６変異ヘテロラット同士では相手の後をつける行動（Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）が約４０％少なく、逆にけんかをしかける行動（Ａｇｇｒｅｓｓｉｏｎ）が３００％以上に増加していた（図３）。したがって、Ｐａｘ６変異ヘテロラットでは社会性が欠如している傾向があることが示唆された。
実施例４（音による恐怖条件付けテスト）
野生型２６例及びＰａｘ６変異ヘテロラット３６例について、音による恐怖条件付けを行った。音条件付け用観察箱に上記ラットを１匹ずつ入れ、２分おいてから音を２０秒間聞かせた（Ｔｏｎｅ）直後に０．３ｍＡの強さの電流を１秒間流して電気ショックを与えた。５分後に飼育用ケージに移し、条件付けから４８時間及び９６時間後に、再度音条件付け恐怖テスト箱に入れ、２分後から５分間、条件付けに用いたものと同じ音を聞かせ、条件付けられた恐怖によってすくみ反射をしていた時間を測定した。すくみ反射をしていた時間は、６０秒間中の何秒間動かずにいたかを測定し、これをパーセンテージで示した。４８時間後（図４Ａ）及び９６時間後（図４Ｂ）の結果から、Ｐａｘ６変異ヘテロラットでは恐怖による条件付けが不十分であることが分かった。なお、野生型２例及びＰａｘ６変異ヘテロラット２例について、音条件付けのみ（Ｔｏｎｅ）を行い、恐怖条件付けを行わなかった場合、音条件付けから４８時間後に、すくみ反射をしていた時間は両者ともほとんど認められなかった。
実施例５（音刺激によるプレパルス抑制テスト）
野生型２１例及びＰａｘ６変異ヘテロラット３６例について、音刺激によるプレパルス抑制テストを行った。上記のラットを１匹ずつ測定装置の中に入れ、まず本刺激音（１０５ｄＢ、４０ｍｓｅｃ）のみを聞かせたときの驚愕反応を測定した（図５Ａ）。驚愕反応は、ラットの後ずさり反応の加速度の大きさとして測定した。次に音によるプレパルス抑制を測定するために、本刺激音の１００ｍｓｅｃ前に、２０ｍｓｅｃのプレパルス音（６８、７１あるいは７７ｄＢ）を聞かせた時の本刺激音（１０５ｄＢ）に対する驚愕反応を測定した（図５Ａ）。プレパルス抑制は、１−Ｓｐｐ／Ｓで表した（Ｓｐｐ：プレパルスを聞かせたときの本刺激音に対する驚愕反応、Ｓ：本刺激音のみを聞かせたときの驚愕反応）。その結果、Ｐａｘ６ヘテロラットでは６８ｄＢのプレパルス音に対して、プレパルス抑制の割合が野生型に比べて有意に低い（ｐ検定、ｐ＜０．００１、ソフト名：Ｓｔａｒｖｉｅｗ）ことが示された（図５Ｂ）。従って、Ｐａｘ６ヘテロラットは感覚ゲート機構が野生型に比べて低下していることがわかった。
実施例６
（１）（クロザピンを投与したＰａｘ６変異ヘテロラットの音刺激に対するプレパルスの抑制テスト）
野生型１１例及びＰａｘ６変異ヘテロラット１１例について、それぞれ抗精神病薬として統合失調症などの治療に用いられているクロザピン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔に注射して投与した。またコントロールとして、野生型１１例及びＰａｘ６変異ヘテロラット１１例について、同量の生理食塩水を腹腔に注射して投与した。投与後３０分〜２時間の上記ラットについて音刺激によるプレパルス抑制テストを行った。上記のラットを１匹ずつ測定装置の中に入れ、まず本刺激音（１２０ｄＢ、４０ｍｓｅｃ）の１００ｍｓｅｃ前に、２０ｍｓｅｃのプレパルス音（６８、７１あるいは７７ｄＢ）を聞かせたときの本刺激音（１２０ｄＢ）に対する驚愕反応を測定した。驚愕反応は、ラットの後ずさり反応の加速度の大きさとして測定した。プレパルス抑制は、１−Ｓｐｐ／Ｓで表した（Ｓｐｐ：プレパルスを聞かせたときの本刺激音に対する驚愕反応、Ｓ：本刺激音のみを聞かせたときの驚愕反応）。
この結果を図６に示す。図中、黒棒はクロザピン投与した動物の結果を示し、白棒はコントロールの動物の結果を示す。図から明らかなように、Ｐａｘ６ヘテロラットで見られた６８、７１ｄＢのプレパルスに対して、プレパルス抑制の割合が野生型に比べて有意に低い症状は、クロザピン投与によって明らかに改善された。また、このような変化は、野生型ラットにおいては見られなかった。
（２）（クロザピンを投与したＰａｘ６ヘテロラットの音による恐怖条件付けテスト）
野生型６例及びＰａｘ６変異ヘテロラット６例について、それぞれ抗精神病薬として統合失調症などの治療に用いられているクロザピン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔に注射して投与した。またコントロールとして、野生型６例及びＰａｘ６変異ヘテロラット６例について、同量の生理食塩水を腹腔に注射して投与した。投与後３０分〜２時間の上記ラットについて音による恐怖条件付けテストを行った。音条件付け用観察箱に上記ラットを１匹ずつ入れ、２分おいてから音を２０秒間聞かせた（Ｔｏｎｅ）直後に、０．３ｍＡの強さの電流を１秒間流して電気ショックを与えた。５分後に飼育用ケージに移し、条件付けから４８時間後に、再度音条件付け恐怖テスト箱に入れ、１分後から６分間、条件付けに用いたものと同じ音を聞かせ、条件付けられた恐怖によってすくみ反射をしていた時間を測定した。すくみ反射をしていた時間を、６０秒間中の何秒間動かずにいたかを測定し、これをパーセンテージで示した。
この結果を図７に示す。図中、●で示したグラフはクロザピンを投与した動物の結果を、また○で示したグラフはコントロールの動物の結果を示す。図から明らかなように、Ｐａｘ６変異ヘテロラットに見られた恐怖による条件付けが不十分である症状は、クロザピンの投与によっては改善されないことがわかった。
本発明のＰａｘ６変異ヘテロラットにクロザピンを投与することにより、その行動異常のうち、感覚ゲート機構の低下のみが改善された。このことは、統合失調症に選択性の高い物質を該動物の感覚ゲート機構の変化を指標とすることによって、選択し得ることを示している。
産業上の利用可能性
本発明の精神疾患モデル動物は、薬物投与をしない状態で統合失調症のような精神疾患の指標となる行動異常を呈することから、ヒト統合失調症等の精神疾患に対応する適切な動物モデルと考えられ、抗精神病薬を新規開発するためのモデル動物としてきわめて有用である。特に、Ｐａｘ６変異ヘテロラットの系統は、遺伝的バックグラウンドが均一であり、同じ遺伝子に突然変異を有するマウスの系統よりも産子数が多く繁殖力が強く、薬物を投与しない状態でヒト統合失調症等の精神疾患の指標となる行動異常を呈することから、ヒト統合失調症等の精神疾患に対応する適切な動物モデルである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｐａｘ６変異ヘテロラットと野生型ラットの一般活動性テストの結果を示す図である。
第２図は、Ｐａｘ６変異ヘテロラットと野生型ラットの明暗テストの結果を示す図である。
第３図は、Ｐａｘ６変異ヘテロラットと野生型ラットの社会性テストの結果を示す図である。
第４図は、Ｐａｘ６変異ヘテロラットと野生型ラットの恐怖条件付けテストの結果を示す図である。
第５図は、Ｐａｘ６変異ヘテロラットと野生型ラットのプレパルス抑制テストの結果を示す図である。
第６図は、クロザピンを投与したＰａｘ６変異ヘテロラットの音刺激に対するプレパルスの抑制テストの結果を示す図である。
第７図は、クロザピンを投与したＰａｘ６ヘテロラットの音による恐怖条件付けテストの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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