(57)【要約】本発明は、Ｄ型セリン及びＬ型セリンの生体試料中の濃度を測定することを特徴とする統合失調症の検査、診断方法に関する。本発明の方法によれば、高速液体クロマトグラフィーなどの分析技術を用いて生体試料中のＤ型セリン及びＬ型セリンの濃度を測定することによって、統合失調症の検査、診断ができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の（ａ）Ｄ型セリン、（ｂ）Ｌ型セリン又は（ｃ）Ｄ型セリン及びＬ型セリンの濃度を測定することを特徴とする統合失調症の検査方法。
【請求項２】
生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より低いことを指標とする請求の範囲１記載の統合失調症の検査方法。
【請求項３】
生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値−標準偏差より低いことを指標とする請求の範囲１記載の統合失調症の検査方法。
【請求項４】
生体試料中のＤ型セリン濃度が統合失調症個体又は個体群における該濃度の平均値＋標準偏差より低いことを指標とする請求の範囲１記載の統合失調症の検査方法。
【請求項５】
生体試料中のＬ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より高いことを指標とする請求の範囲１記載の統合失調症の検査方法。
【請求項６】
生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合を指標とする請求の範囲１記載の統合失調症の検査方法。
【請求項７】
生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値より低いことを指標とする請求の範囲６記載の統合失調症の検査方法。
【請求項８】
生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値−標準偏差より低いことを指標とする請求の範囲６記載の統合失調症の検査方法。
【請求項９】
生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が統合失調症個体又は個体群における該割合の平均値＋標準偏差より低いことを指標とする請求の範囲６記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１０】
Ｄ型セリン療法が有効な統合失調症患者を選別する請求の範囲１乃至９のいずれかに記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１１】
アミノ酸標識試薬を用いる請求の範囲１乃至１０のいずれかに記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１２】
生体試料にアミノ酸標識試薬を接触させ、セリンを標識する工程及び標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程を含む請求の範囲１１記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１３】
標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程の前に標識セリンを分離・定量する工程を更に含む請求の範囲１２記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１４】
標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程にカラム又はキャピラリーを用いる請求の範囲１２記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１５】
標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程にカラム又はキャピラリーを用いる請求の範囲１３記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１６】
標識セリンを分離・定量する工程にクロマトグラフィーを用いる請求の範囲１３記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１７】
標識セリンを分離・定量する工程にクロマトグラフィーを用いる請求の範囲１５記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１８】
カラム又はキャピラリーが光学分割用カラム又はキャピラリーである請求の範囲１４、１５又は１７記載の統合失調症の検査方法。
【請求項１９】
クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである請求の範囲１６又は１７記載の統合失調症の検査方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーであり、カラム又はキャピラリーが光学分割用カラム又はキャピラリーである請求の範囲１７記載の統合失調症の検査方法。
【請求項２１】
アミノ酸標識試薬がアミノ酸蛍光標識試薬である請求の範囲１１乃至２０のいずれかに記載の統合失調症の検査方法。
【請求項２２】
アミノ酸蛍光標識試薬が４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾールである請求の範囲２１記載の統合失調症の検査方法。
【請求項２３】
アミノ酸標識試薬を含有する統合失調症の検査用試薬。
【請求項２４】
アミノ酸標識試薬がアミノ酸蛍光標識試薬である請求の範囲２３記載の統合失調症の検査用試薬。
【請求項２５】
アミノ酸蛍光標識試薬が４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾールである請求の範囲２４記載の統合失調症の検査用試薬。
【請求項２６】
血清中のＤ型セリン及びＬ型セリンの濃度を測定し、濃度の増減を指標とすることを特徴とする統合失調症の検査、診断方法。
【請求項２７】
血清中のＤ型セリン濃度を測定し、濃度の減少を指標とすることを特徴とする統合失調症の検査、診断方法。
【請求項２８】
血清中のＬ型セリン濃度を測定し、濃度の増加を指標とすることを特徴とする統合失調症の検査、診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、統合失調症の検査、診断方法に関する。さらに詳しくは生体試料中のＤ型セリン、Ｌ型セリン又はＤ型セリン及びＬ型セリンの濃度を測定することを特徴とする統合失調症の検査、診断方法に関する。
【背景技術】  統合失調症（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）は、人口の約１％の割合で起こり、思春期から２０代の若い時期に発症する。症状としては、幻覚、妄想などの陽性症状、感情鈍麻、意欲減退、社会的引きこもりなどの陰性症状、及び認知機能障害などがある。病態の特殊性から早期診断、治療、社会復帰活動、再発予防といった包括的な治療体系の確立が望まれている。統合失調症の治療には、薬物治療が不可欠であり、フェノチアジン系化合物、ブチロフェノン系化合物、ベンズアミド系化合物、イミノジベンジル系化合物、チエピン系化合物、インドール系化合物及びセロトニン・ドーパミン受容体遮断薬などが投与されている。
統合失調症の病態には、遺伝的要因及び環境要因が関与していることが知られている。フェンサイクリジン、ケタミンなどのＮＭＤＡ受容体遮断薬によって統合失調症と酷似した症状が引き起こされることが知られており、いわゆる「統合失調症のグルタミン酸機能低下仮説」が提唱されている。現在のところ、統合失調症を検査、診断する生物学的マーカーが無い。血液や尿などの患者のサンプルを用いた研究が数多く行なわれてきたが、未だに確立されたものは無い。
ところで、Ｄ型アミノ酸は、哺乳類には存在しないと思われていたが、近年、Ｄ型セリンを含むＤ型アミノ酸がヒトを含む哺乳類にも低濃度で存在することが明らかになってきた。一方、Ｄ型セリンは、興奮性の神経伝達を司るグルタミン酸受容体のサブタイプＮＭＤＡ受容体のグリシン部位のアゴニストとして作用することが知られている。統合失調症のグルタミン酸機能低下仮説に基づくと、Ｄ型セリンが統合失調症の病態に関与している可能性がある。
したがって、統合失調症患者の治療のためにＤ型セリンを投与する方法（米国特許第６１６２８２７号明細書）や、統合失調症、アルツハイマー病、自閉症、鬱病などの神経精神疾患の治療に、ＮＭＤＡ受容体のグリシン部位のアゴニストであるＤ型セリン、Ｄ型アラニン等を投与する方法が知られている（国際公開ＷＯ９９／５２５１９号パンフレット）。
統合失調症による入院患者は日本における病院の総ベッド数の約１５％を占め、医療経済という点からも問題は大きい。医療の現場から統合失調症を早期に検査、診断するような検査、診断薬及び検査、診断方法の開発が望まれている。
尚、統合失調症は従来「精神分裂病」と呼ばれていたが、２００２年８月に開催された日本精神神経学会総会で「統合失調症」と病名が変更になった。「精神分裂病」、「統合失調症」はともに「Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ」を意味する。
【発明の開示】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、統合失調症患者の生体試料（例えば血清等）中のＤ型セリン及びＬ型セリンのレベルが、健常者のそれと比較して有意に変化していることを見出した。
特に、本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体アゴニスト活性を有するＤ型セリンが統合失調症患者末梢血で有意に減少していることを初めて発見した。これまでセリン（トータルセリン：Ｄ型セリンとＬ型セリンの総和，約９９％がＬ型セリン）が統合失調症患者末梢血中で増加しているという報告はあったが、今回トータルセリン、Ｌ型セリン、Ｄ型セリンそれぞれを測定したところ、トータルセリンはやはり統合失調症患者で増加（Ｐ＝０．０１７）、Ｌ型セリンも同様に増加（Ｐ＝０．０１２）していたのに対し、Ｄ型セリンは統合失調症患者で減少（Ｐ＝０．００１）しており、Ｄ型セリン／トータルセリンの比も患者で明らかに減少（Ｐ＝０．０００１）していることが判明した。Ｄ型セリンの減少と、患者の病態（陰性、陽性など）、薬物治療の有無、薬剤投与背景などとの明確な相関は見られなかったが、ただ薬物治療群でのみ解析した際に、Ｄ型セリンとＢＰＲＳスコア（Ｂｒｉｅｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ、このスコアが低いほど改善度が高い）に関してむしろ正の相関がみられた。Ｄ型セリンの減少に関してはＤ型セリンの合成酵素セリンラセマーゼ、分解酵素Ｄ型アミノ酸酸化酵素、Ｄ型セリントランスポーター等の関与が考えられる。
本発明は、上記の知見等に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の（１）から（２８）に関する。
（１）  生体試料中の（ａ）Ｄ型セリン、（ｂ）Ｌ型セリン又は（ｃ）Ｄ型セリン及びＬ型セリンの濃度を測定することを特徴とする統合失調症の検査方法。
（２）  生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より低いことを指標とする前記（１）記載の統合失調症の検査方法。
（３）  生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値−標準偏差より低いことを指標とする前記（１）記載の統合失調症の検査方法。
（４）  生体試料中のＤ型セリン濃度が統合失調症個体又は個体群における該濃度の平均値＋標準偏差より低いことを指標とする前記（１）記載の統合失調症の検査方法。
（５）  生体試料中のＬ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より高いことを指標とする前記（１）記載の統合失調症の検査方法。
（６）  生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合を指標とする前記（１）記載の統合失調症の検査方法。
（７）  生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値より低いことを指標とする前記（６）記載の統合失調症の検査方法。
（８）  生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値−標準偏差より低いことを指標とする前記（６）記載の統合失調症の検査方法。
（９）  生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が統合失調症個体又は個体群における該割合の平均値＋標準偏差より低いことを指標とする前記（６）記載の統合失調症の検査方法。
（１０）  Ｄ型セリン療法が有効な統合失調症患者を選別する前記（１）乃至（９）のいずれかに記載の統合失調症の検査方法。
（１１）  アミノ酸標識試薬を用いる前記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の統合失調症の検査方法。
（１２）  生体試料にアミノ酸標識試薬を接触させ、セリンを標識する工程及び標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程を含む前記（１１）記載の統合失調症の検査方法。
（１３）  標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程の前に標識セリンを分離・定量する工程を更に含む前記（１２）記載の統合失調症の検査方法。
（１４）  標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程にカラム又はキャピラリーを用いる前記（１２）記載の統合失調症の検査方法。
（１５）  標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程にカラム又はキャピラリーを用いる前記（１３）記載の統合失調症の検査方法。
（１６）  標識セリンを分離・定量する工程にクロマトグラフィーを用いる前記（１３）記載の統合失調症の検査方法。
（１７）  標識セリンを分離・定量する工程にクロマトグラフィーを用いる前記（１５）記載の統合失調症の検査方法。
（１８）  カラム又はキャピラリーが光学分割用カラム又はキャピラリーである前記（１４）、（１５）又は（１７）記載の統合失調症の検査方法。
（１９）  クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである前記（１６）又は（１７）記載の統合失調症の検査方法。
（２０）  クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーであり、カラム又はキャピラリーが光学分割用カラム又はキャピラリーである前記（１７）記載の統合失調症の検査方法。
（２１）  アミノ酸標識試薬がアミノ酸蛍光標識試薬である前記（１１）乃至（２０）のいずれかに記載の統合失調症の検査方法。
（２２）  アミノ酸蛍光標識試薬が４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾールである前記（２１）記載の統合失調症の検査方法。
（２３）  アミノ酸標識試薬を含有する統合失調症の検査用試薬。
（２４）  アミノ酸標識試薬がアミノ酸蛍光標識試薬である前記（２３）記載の統合失調症の検査用試薬。
（２５）  アミノ酸蛍光標識試薬が４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾールである前記（２４）記載の統合失調症の検査用試薬。
（２６）  血清中のＤ型セリン及びＬ型セリンの濃度を測定し、濃度の増減を指標とすることを特徴とする統合失調症の検査、診断方法。
（２７）  血清中のＤ型セリン濃度を測定し、濃度の減少を指標とすることを特徴とする統合失調症の検査、診断方法。
（２８）  血清中のＬ型セリン濃度を測定し、濃度の増加を指標とすることを特徴とする統合失調症の検査、診断方法。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明による統合失調症の検査、診断は、例えば次のようにして行なうことができる。生体試料（例えばヒトの血清）を調製し、生体試料中のトータルセリン、Ｄ型セリン及び／又はＬ型セリンの濃度を種々の方法により定量する。統合失調症患者の生体試料（例えば血清）中のＤ型セリン濃度及び／又はトータルセリンに対するＤ型セリンの濃度比が、健常者の値より有意に低いこと等を利用し、統合失調症を検査、診断する。
即ち、統合失調症の指標としては、例えば、
ｉ）生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より低いこと。
ｉｉ）生体試料中のＬ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より高いこと。
ｉｉｉ）生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値より低いこと。
等の指標が挙げられる。
さらに、統合失調症の好ましい指標としては、例えば、
ｉｖ）生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値−標準偏差より低いこと。
ｖ）生体試料中のＤ型セリン濃度が統合失調症個体又は個体群における該濃度の平均値＋標準偏差より低いこと。
ｖｉ）生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値−標準偏差より低いこと。
ｖｉｉ）生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が統合失調症個体又は個体群における該割合の平均値＋標準偏差より低いこと。
等が挙げられる。
ここで、「Ｄ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値（−標準偏差）より低い」とは、「一個体のＤ型セリン濃度が、その個体が健常であるときの該濃度を複数回測定した値の平均値（−標準偏差）より低い」こと、又は「一個体のＤ型セリン濃度が、健常個体の集団の該濃度の平均値（−標準偏差）より低い」ことを意味する。また、「Ｄ型セリン濃度が統合失調症個体又は個体群における該濃度の平均値＋標準偏差より低い」とは、「一個体のＤ型セリン濃度が、その個体が統合失調症であるときの該濃度を複数回測定した値の平均値＋標準偏差より低い」こと、又は「一個体のＤ型セリン濃度が、統合失調症個体の集団の該濃度の平均値＋標準偏差より低い」ことを意味する。本明細書中、「健常個体または個体群における該割合の平均値（−標準偏差）」、「統合失調症個体又は個体群における該割合の平均値＋標準偏差」等の意味も、同様に解することとする。
本発明において、生体試料中のＤ型セリン濃度のみを測定し、Ｄ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度より低いことを指標として統合失調症の検査、診断をすることもできる。このとき、好ましい指標としては、例えば生体試料が血清である場合、Ｄ型セリン濃度が２．００μｍｏｌ／Ｌ以下であることである。
また、本発明において、生体試料中のＬ型セリン濃度のみを測定し、Ｌ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度より高いことを指標として統合失調症の検査、診断をすることもできる。このとき、好ましい指標としては、例えば生体試料が血清である場合、Ｌ型セリン濃度が１９０μｍｏｌ／Ｌであることである。
さらに、本発明において、生体試料中のトータルセリン濃度を測定し、トータルセリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度より高いことを指標として統合失調症の検査、診断をすることもできる。このとき、好ましい指標としては、例えば生体試料が血清である場合、トータルセリン濃度が１９０μｍｏｌ／Ｌ以上であることである。
本発明の検査、診断に供することのできる生体試料としては、例えば血清、血漿、血液、尿、髄液、唾液、涙液、汗等の生体由来の液体成分、毛髪、血球、バイオプシー等で切除された組織の一部等の生体由来の固形成分等が挙げられ、生体由来の全ての成分が含まれる。好ましい生体試料としては血清が挙げられる。また、生体から直接採取された試料に、種々の処理を加えて得られた産物も本発明における生体試料である。この場合、処理の種類、回数は限定されず、複数種類の処理を組み合わせたものであってもよい。処理の種類としては、例えば除蛋白、脱塩、透析、酸／塩基／緩衝液等の添加、加熱、カラムによるアミノ酸含有画分の分離・精製等が挙げられるが、これらのものに限定されない。
本発明の検査、診断に供せられる試料の由来する生体としては、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット等）が挙げられる。
本発明の統合失調症の検査、診断方法において、生体試料中のＤ型及びＬ型セリンの濃度を測定する方法は自体公知の全ての方法を用いることができる。また、今後新たに開発されるであろう、生体試料中のＤ型及びＬ型セリンの濃度を測定する方法も用いることが可能である。好ましくはアミノ酸標識試薬により生体試料中のセリンを含むアミノ酸を標識して、検出感度を上昇させる。ここで、アミノ酸標識試薬とは、アミノ酸の分離・定量等に際して、その検出感度を上昇させる目的で、アミノ酸を標識する試薬であり、アミノ酸標識試薬とアミノ酸／セリンとを反応させることにより、それぞれ標識アミノ酸／セリンを得る。アミノ酸標識試薬としてはアミノ酸吸光標識試薬、アミノ酸蛍光標識試薬及びアミノ酸発光標識試薬とがあり、アミノ酸／セリンと反応することにより各々吸光標識アミノ酸／セリン、蛍光標識アミノ酸／セリン又は発光標識アミノ酸／セリンを得る。これらの吸光度、蛍光強度又は発光強度を指標に生体試料中のアミノ酸、セリンを分離・定量する。好ましくはアミノ酸蛍光標識試薬を用いる。アミノ酸吸光標識試薬としては例えばニンヒドリン等が挙げられる。アミノ酸蛍光標識試薬としては例えば、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）、フルオレッサミン（ＦＬＡ）、ナフタレン−２，３−ジカルボキシアルデヒド（ＮＤＡ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ）、９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ−Ｃｌ）、３，４−ジヒドロ−６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソキノキサリン−２−カルボニルクロリド（ＤＭＥＱ−ＣＯＣｌ）、７−メチルクマリン−３−カルボニルフルオリド、４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）、４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）、ＤＢＤ試薬、蛍光性エドマン試薬、フルオレッセインイソチオシアネート、ＤＢＤ−ＮＣＳ、ＤＢＤ−Ｐｒｏ−ＣＯＣｌ、ＮＢＤ−Ｐｒｏ−ＣＯＣｌ、（＋）−１−（１−イソシアネートエチル）ナフタレン、（＋）−１−（９−フルオレニル）エチルクロロホルメート、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等が挙げられ、いずれも本発明に用いることが出来るが、好ましくは４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）を用い、これとアミノ酸／セリンを反応させてＮＢＤ標識アミノ酸／セリンを得る。
本発明の統合失調症の検査、診断方法における、生体試料中のセリンの測定方法としては、例えば、生体試料にアミノ酸標識試薬を接触させ、セリンを標識する工程及び標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程を含む測定方法が挙げられる。
ここで、標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程の前に、標識セリンを分離・定量する工程を更に含むことが好ましい。
即ち、本発明の統合失調症の検査、診断方法における、生体試料中のセリンの好ましい測定方法としては、例えば、以下の工程、
工程１：生体試料にアミノ酸標識試薬を接触させ、セリンを標識する工程；
工程２：標識セリンを分離・定量する工程；
工程３：標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとを分離・定量する工程；
を含む測定方法が挙げられる。
該測定方法は、通常工程１→工程２→工程３の順で行われる。ここで、工程１の前、工程１と工程２の間、工程２と工程３の間に他の工程を行うことを妨げるものではない。
上記工程２において、標識セリンを分離・定量する方法は、特に限定されないが、好ましくはクロマトグラフィーを用いる。標識セリンの分離・定量に使用することの出来るクロマトグラフィーとしては、例えば移動相が液体であるクロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中高圧液体クロマトグラフィー等）、移動相が気体であるクロマトグラフィー（例えばガスクロマトグラフィー）、移動相が超臨界液体であるクロマトグラフィー（例えば超臨界液体クロマトグラフィー）が挙げられるが、好ましくは高速液体クロマトグラフィーを用いる。移動相又は試料の移動手段としては、ポンプ等による物理的手段の他、電気的手段（例えば電気泳動等）を用いることも出来る。
標識セリンは、上記のクロマトグラフィーの装置に設置された適当な分離媒体を介して分離される。好ましい分離媒体としては、カラム、キャピラリー、ゲル、薄層等が挙げられ、より好ましくはカラムが挙げられる。標識セリンの分離に用いることの出来るカラムとしては、例えば逆相カラム、順相カラム、イオン交換カラム、配位子交換カラム、イオン排除カラム、サイズ排除カラム（ＧＰＣ及びＧＦＣ）、光学分割用カラム、アフィニティカラム等が挙げられるが、好ましくは逆相カラム、イオン交換カラムを用いる。
分離された標識セリンは、適当な検出手段を用いて定量される。吸光標識セリンは吸光光度計によって、蛍光標識セリンは蛍光光度計によって定量することが望ましい。本工程により生体試料中のトータルセリン濃度を測定することができる。
なお、工程２において、複数種のクロマトグラフィーを組み合わせて用いたり、複数種の分離媒体を組み合わせて用いたりしてもよい。
上記工程３において、標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとの分離・定量の方法は、特に限定されないが、好ましくはクロマトグラフィーを用いる。該クロマトグラフィーとしては、上記工程２の標識セリンの分離・定量に使用することの出来るクロマトグラフィーと同様のクロマトグラフィーが例示され、好ましくは高速液体クロマトグラフィーを用いる。移動相又は試料の移動手段としては、ポンプ等による物理的手段の他、電気的手段（例えば電気泳動等）を用いることも出来る。
標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとは、上記のクロマトグラフィーに設置された適当な分離媒体を介して分離される。該分離媒体の態様としては、本目的を達成できるものは全て用いることができるが、好ましくはカラム、キャピラリー、ゲル、薄層が挙げられ、より好ましくはカラム又はキャピラリーを用いる。標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとの分離に用いることの出来るカラム又はキャピラリーとしては、例えば逆相カラム又はキャピラリー、順相カラム又はキャピラリー、イオン交換カラム又はキャピラリー、配位子交換カラム又はキャピラリー、イオン排除カラム又はキャピラリー、サイズ排除カラム（ＧＰＣ及びＧＦＣ）又はキャピラリー、光学分割用カラム又はキャピラリー、アフィニティカラム又はキャピラリー等が挙げられるが、好ましくは光学分割用カラム又はキャピラリーを用いる。
分離された標識Ｄ型セリン及び標識Ｌ型セリンは、上述の適当な検出手段を用いて定量される。本工程により生体試料中のＤ型セリン濃度及びＬ型セリン濃度を測定することができる。工程３においては、複数種のクロマトグラフィーを組み合わせて用いたり、複数種の分離媒体を組み合わせて用いたりしてもよい。
尚、前述の通り、工程２において標識セリンを分離し、これを工程３において更に標識Ｄ型セリンと標識Ｌ型セリンとに分離・定量するのが好ましい。この場合、工程２で分離された標識セリンを一度分取して、これを工程３に用いる。あるいは、一つのクロマトグラフィー装置に複数個のカラムをスイッチングバルブを介して連続して取り付ける等して、工程２と工程３とを連続的に行ってもよい。
生体試料中のＤ型セリン及びＬ型セリンを測定する更に具体的な方法としては、例えば、以下の工程、
工程（Ａ）：生体試料に４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）を接触させ、セリンを標識する工程；
工程（Ｂ）：ＮＢＤ標識セリンを高速液体クロマトグラフィーで分離・定量する工程；
工程（Ｃ）：ＮＢＤ標識Ｄ型セリンとＮＢＤ標識Ｌ型セリンとを光学分割用カラムを用いて分離・定量する工程；
を含む方法や、以下の工程、
工程（Ｉ）：  生体試料に４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾールなどのアミノ酸蛍光標識試薬を接触させて、蛍光標識アミノ酸（例えばＮＢＤ標識セリン等）を合成する工程；
工程（ＩＩ）：  ＮＢＤ標識セリンを高速液体クロマトグラフィーで分離・定量する工程；
工程（ＩＩＩ）：  分取したＮＢＤ標識セリンを光学分割用カラムを用いて分離・定量する工程；
からなる方法などが例示される。
本発明の統合失調症の検査、診断方法は、従来の主観的検査、診断方法（例えばＤＳＭ−ＩＶに従ったＢＰＲＳスコア判定等）や今後開発される全ての検査、診断方法と併用することもできる。また、何らかの方法によって、確定的に統合失調症であることが明らかな患者から、本発明の検査、診断方法において指標として使用し得るＤ型セリン、Ｌ型セリンの定量値についてのデータを収集することによって、本発明の検査、診断方法のみによって確定的な判定を下すことも可能となる。また、本発明の検査、診断方法は、法的責任能力の有無を調べる目的で、又はその他の目的で行われる精神鑑定に適用することも可能である。
本発明の検査、診断方法を用いることにより、患者の病態（陰性、陽性など）の判定、重症度の判定、病態の経過観察、治療効果の有無の判定、予後の予測、他の精神疾患との判別等が容易に出来る。特に、トータルセリンに対するＤ型セリンの濃度比が特に低い患者を選別できることから、Ｄ型セリン療法が有効な対照患者を、治療開始前に選別し、より効率的な治療を行うことが出来る。ここで、Ｄ型セリン療法とは、例えば、Ｄ型セリン自体、セリンラセマーゼの発現を上昇させる化合物、セリンラセマーゼを活性化させる化合物、Ｄ型セリンのトランスポータ阻害剤又はＤ型セリンの分解酵素阻害剤等を投与することによって、生体中のＤ型セリンを増加させるような、統合失調症の治療方法を意味する。
Ｄ型セリン療法が有効な統合失調症患者を選別する指標としては、上述の統合失調症の指標を用いることが出来る。
即ち、Ｄ型セリン療法が有効な統合失調症患者を選別する指標としては、例えば、
Ｉ）生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より低いこと。
ＩＩ）生体試料中のＬ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値より高いこと。
ＩＩＩ）生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値より低いこと。
等の指標が挙げられる。
さらに、Ｄ型セリン療法が有効な統合失調症患者を選別する好ましい指標としては、例えば、
ＩＶ）生体試料中のＤ型セリン濃度が健常個体又は個体群における該濃度の平均値−標準偏差より低いこと。
Ｖ）生体試料中のＤ型セリン濃度が統合失調症個体又は個体群における該濃度の平均値＋標準偏差より低いこと。
ＶＩ）生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が健常個体又は個体群における該割合の平均値−標準偏差より低いこと。
ＶＩＩ）生体試料中のトータルセリン濃度に対するＤ型セリン濃度の割合が統合失調症個体又は個体群における該割合の平均値＋標準偏差より低いこと。
等が挙げられる。
また、以上のことから、アミノ酸標識試薬、好ましくはアミノ酸蛍光標識試薬、より好ましくは４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾールは統合失調症の検査、診断用試薬として用いることが出来る。
本発明方法は、また「抗統合失調症薬の候補物質」の判定にも有用である。すなわち、Ｄ型セリンを増加させる作用あるいはＬ型セリンを減少させる作用を有する化合物は、抗統合失調症薬として有用である可能性がある。「抗統合失調症薬の候補物質」は、試験者が所望する任意の物質であり得る。
【実施例】  以下、試験例により、本発明をさらに詳細に説明するが、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
試験例１
健常者４２名及び統合失調症患者４２名より血液を採取した後、通常の方法で血清を分離し、以下の試験に供した。すべての患者はＤＳＭ−ＩＶに従って診断され、専門医によるＢＰＲＳスコア判定が行われた。被験者の背景は表１に示した通りである。
（試験方法）
ヒト血清２０μＬにメタノール１８０μＬを加えて、除タンパク後、遠心し、この上清２０μＬに０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２０μＬ、５０ｍＭ  ＮＢＤ−Ｆのアセトニトリル溶液を６０μＬ加えた後、６０℃で１分間加温した。これに０．１％トリフルオロ酢酸含有の水／アセトニトリル混液（９０／１０）２００μＬを加えた。この溶液１０μＬをＨＰＬＣに注入した。
ＨＰＬＣとしては、ＯＤＳカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー社製））とキラルカラム（Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−２５００（Ｓ）（住化分析センター社製））を６方バルブで接続したカラムスイッチングＨＰＬＣを使用した。これにより、ＯＤＳカラムにてＮＢＤ標識セリン（ＮＢＤ標識Ｄ型セリンとＮＢＤ標識Ｌ型セリンの和）を分離・定量し、続いてキラルカラムでＮＢＤ標識Ｄ型セリンとＮＢＤ標識Ｌ型セリンを分離・定量した。ＮＢＤ標識セリンの検出・定量には蛍光検出器（日立社製）を用いた。励起波長は４７０ｎｍ、蛍光波長は５３０ｎｍである。
ＯＤＳカラムによるＮＢＤ標識セリンの分離・定量に際しては、移動相は０．８ｍＬ／ｍｉｎの定流速で流した。移動相としてはＡ液（０．１％トリフルオロ酢酸含有の水／アセトニトリル混液（９０／１０））、Ｂ液（０．１％トリフルオロ酢酸含有の水／アセトニトリル混液（１０／９０））およびＣ液（アセトニトリル）を用意した。溶出条件は以下の通りである。
０〜２５．０分  Ａ液：Ｂ液：Ｃ液＝９２：８：０
２５．１〜３５．０分  Ａ液：Ｂ液：Ｃ液＝０：１００：０
３５．１〜４５．０分  Ａ液：Ｂ液：Ｃ液＝０：０：１００
キラルカラムによるＮＢＤ標識Ｄ型セリンとＮＢＤ標識Ｌ型セリンの分離・定量に際しては、移動相は０．８ｍＬ／ｍｉｎの定流速で流した。移動相としては、１５ｍＭクエン酸のメタノール溶液を用いた。
ＮＢＤ標識Ｄ型セリンとＮＢＤ標識Ｌ型セリンの定量に際しては、Ｄ型セリンおよびＬ型セリンの標準品（シグマ社製）を上記と同様に処理し、検量線を作製した。各試料を処理した際に得られる蛍光ピーク面積を検量線にプロットし、Ｄ型セリン濃度およびＬ型セリン濃度を算出した。
以上の操作により、ヒト血清中のＤ型セリンならびにＬ型セリンを定量した。
（結果）
健常者群と統合失調症群において、ヒト血清中のＤ型セリン及びＬ型セリンの含量を高速液体クロマトグラフィーにて測定し、濃度を算出した。その結果を表１に示す。
2004005935.tif 000002
統合失調症群では、Ｄ型セリンのレベルは、平均１．８６μｍｏｌ／Ｌ、健常者では、Ｄ型セリンのレベルは、平均２．２８μｍｏｌ／Ｌであった。この２群間の値をノンパラメトリック・マンホイットニ・Ｕテストで解析した結果、統合失調症患者で有意（ｚ＝−４．７８，ｐ＝０．００１）に減少していることが判った。また、未治療の患者と治療中の患者においてＤ型セリン濃度の有意な変化は認められなかった。さらに、治療中の患者においてもクロルプロマジン換算で統計解析した結果、Ｄ型セリン濃度と相関していないこと、さらに罹病期間とも相関していないことが判った。統合失調症群では、Ｌ型セリンのレベルは、平均１９７．９μｍｏｌ／Ｌ、健常者では、Ｌ型セリンのレベルは、平均１７５．０μｍｏｌ／Ｌであった。この２群間の値をノンパラメトリック・マンホイットニ・Ｕテストで解析した結果、統合失調症患者で有意（ｚ＝−２．４９，ｐ＝０．０１３）に増加していることが判った。統合失調症群では、全セリンに対するＤ型セリンの割合は、平均０．９５％、健常者では、全セリンに対するＤ型セリンの割合は、平均１．３４％であった。この２群間の値をノンパラメトリック・マンホイットニ・Ｕテストで解析した結果、統合失調症患者で有意（ｚ＝−４．７８，ｐ＜０．０００１）に減少していることが判った。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法を用いれば、血清中のＤ型セリン、Ｌ型セリンの濃度を指標とすることにより、被験者が統合失調症に罹患しているか否かを客観的に検査、診断することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００２−１９５３１５を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【国際調査報告】
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