(57)【要約】バイオアッセイにおいて標的物質を標識して高感度に検出するための発光検出プローブとして有用な発光性高分子化合物を提供する。また、当該発光性高分子化合物のバイオアッセイへの応用を提供する。本発明の発光性高分子化合物は、発光物質が共有結合してなる単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物に、さらにビオチンが共有結合してなるものである。好ましくは２以上のビオチンが結合してなる。上記発光物質としては、シアノイソインドール類、ルミノール類またはアクリジニウムエステル類が、また高分子化合物としては多糖類、ポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質を挙げることができる。
2003031974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光物質が共有結合してなる単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物に、さらにビオチンが共有結合してなる発光性高分子化合物。
【請求項２】
発光物質が化学発光物質または蛍光物質である、請求項１に記載の発光性高分子化合物。
【請求項３】
発光物質がシアノイソインドール類、ルミノール類及びアクリジニウムエステル類よりなる群から選択される少なくとも１種の化合物である請求項１に記載の発光性高分子化合物。
【請求項４】
高分子化合物が多糖類である請求項１に記載の発光性高分子化合物。
【請求項５】
高分子化合物がデキストランまたはプルランのいずれかである請求項１に記載の発光性高分子化合物。
【請求項６】
水溶性である請求項１に記載の発光性高分子化合物。
【請求項７】
高分子化合物が単糖を単体として含むものであって、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、１級アミノ基を各々有するシアノイソインドール類、ルミノール類及びアクリジニウムエステル類よりなる群から選択される少なくとも１種の発光物質が、当該アミノ基との脱水縮合反応によって結合してなり、さらに他の単糖の開環アルデヒド基に、ビオチンのヒドラジド誘導体のヒドラジノ基が結合してなるものである、請求項１に記載の発光性高分子化合物。
【請求項８】
下記の（ａ）及び（ｂ）の工程を有する、請求項１に記載の発光性高分子化合物を製造する方法：
（ａ）単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物に発光物質を反応させて該単体に発光物質を導入する工程、及び
（ｂ）単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物にビオチンを結合させる工程。
【請求項９】
下記の（ｃ）及び（ｄ）の工程を有する請求項８に記載する発光性高分子化合物の製造方法：
（ｃ）単糖を単体として含む高分子化合物の、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、１級アミノ基を各々有するシアノイソインドール類、ルミノール類及びアクリジニウムエステル類よりなる群から選択される少なくとも１種の発光物質を、当該アミノ基との脱水縮合反応によって結合する工程、及び
（ｄ）単糖を単体として含む高分子化合物の、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、ビオチンのヒドラジド誘導体のヒドラジノ基を結合させる工程。
【請求項１０】
請求項１に記載する発光性高分子化合物からなる発光検出プローブ。
【請求項１１】
発光性高分子化合物が、化学発光性高分子化合物または蛍光高分子化合物である請求項１０に記載の発光検出プローブ。
【請求項１２】
請求項１に記載する発光性高分子化合物を含む発光試薬。
【請求項１３】
請求項１に記載する発光性高分子化合物を、アビジンまたはストレプトアビジンと結合した状態で含む請求項１２に記載の発光試薬。
【請求項１４】
少なくとも、請求項１２に記載する発光試薬および標的物質に特異的に結合することが可能なビオチン標識された物質、または請求項１２に記載する発光試薬、標的物質に特異的に結合することが可能なビオチン標識された物質、及びアビジンあるいはストレプトアビジンを含む発光試薬キット。
【請求項１５】
更に標的物質を特異的に捕捉することが可能な物質を結合させた不溶性担体を含む請求項１４に記載する発光試薬キット。
【請求項１６】
バイオアッセイ法に使用される試薬キットである請求項１４に記載の発光試薬キット。
【請求項１７】
測定する対象の標的物質と請求項１に記載する発光性高分子化合物とをアビジンまたはストレプトアビジンを介して複合体形成させ、該形成された複合体を発光検出により測定する工程を有する、標的物質のバイオアッセイ法。
【請求項１８】
発光性高分子化合物として、化学発光性高分子化合物または蛍光高分子化合物を用いる、請求項１７に記載するバイオアッセイ法。
【請求項１９】
下記の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含む請求項１７に記載するバイオアッセイ法：
（ｉ）標的物質にビオチンを結合させる工程、
（ｉｉ）上記（ｉ）の工程で得られたビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及び請求項１に記載する発光性高分子化合物を反応させる工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の工程で得られるビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及び請求項１に記載する発光性高分子化合物から構成される複合体を化学発光または蛍光検出によって測定する工程。
【請求項２０】
工程（ｉ）の前に、標的物質を不溶性担体に固定する工程を含む請求項１９に記載するバイオアッセイ法。
【請求項２１】
下記の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含む請求項１７に記載するバイオアッセイ法：
（ｉ）標的物質にビオチンを結合させる工程、
（ｉｉ）上記（ｉ）の工程で得られたビオチン標識−標的物質、及び請求項１３に記載する発光試薬を反応させる工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の工程で得られるビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及び請求項１に記載する発光性高分子化合物から構成される複合体を化学発光または蛍光検出によって測定する工程。
【請求項２２】
工程（ｉ）の前に、標的物質を不溶性担体に固定する工程を含む請求項２１に記載するバイオアッセイ法。
【請求項２３】
工程（ｉｉ）で得られる複合体が、請求項１に記載する発光性高分子化合物がアビジンまたはストレプトアビジンを介して複数個結合してなり、さらに当該結合物がアビジンまたはストレプトアビジンを介してビオチン標識−標的物質と結合してなる形態を有する複合体である、請求項１９または２１に記載するバイオアッセイ法。
【請求項２４】
発光増幅法として用いられる、請求項２３に記載するバイオアッセイ法。
【請求項２５】
請求項１に記載する発光性高分子化合物の、バイオアッセイ法における発光検出プローブとしての使用。
【請求項２６】
請求項１４に記載する発光試薬キットの、バイオアッセイ法における発光増幅試薬キットとしての使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、検出対象とする標的物質を高感度に検出するために有用な発光性高分子化合物、及びその製造方法に関する。さらに本発明は当該発光性高分子化合物の発光検出プローブ及び発光試薬としての用途、並びに当該発光性高分子化合物を標的物質の検出プローブとして用いるバイオアッセイ法に関する。
背景技術
近年、核酸の検出や定量、シークエンス解析、ハイブリダイゼーションアッセイ及び免疫学的測定等において、従来の放射性検出プローブに代えて、蛍光性あるいは化学発光性の検出プローブが広く使用されるようになっている。これは、光学的検出法が放射線を利用した検出法に比して簡便でかつ安全であり、さらに近年の優れた分光検出器の開発に伴って高い選択性と放射化学的検出法に匹敵する感度が得られるようになったことによる。
しかしながら、当業界においては依然として検出感度の向上に対する要求は根強い。例えば、究極的にＤＮＡやＲＮＡなどの各ヌクレオチド一分子が検出できれば、一つの細胞内のゲノムＤＮＡやＲＮＡを分子レベルで解析することが容易になるであろう。また、近年のポストゲノム時代においては、組織や器官の異なる細胞間、正常細胞と異常細胞間における核酸の分子レベルの変化を容易に且つ迅速に検出する手法や技術の開発が求められている。
そこで、このような検出感度の向上を目指して、従来から検出試薬、検出プローブ、検出器などの種々の面からさらなる研究が進められているのが現状である。
今の技術レベルにおいて、一細胞内でのゲノムＤＮＡなどは、キロ単位でヌクレオチドが重合した高分子であれば、通常の蛍光標識や色素染色で検出することができる。しかしながら、高感度の蛍光色素として知られているレーザー蛍光色素を用いた場合であっても１０ｆｍｏｌレベル以上の検体量（ＤＮＡなど）が必要とされる。よって、今の蛍光標識技術でもって例えば塩基鎖中の一塩基の違い（ＳＮＰｓ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）や数塩基の違いを調べることは極めて困難である。
また、検出に蛍光色素を利用する場合、感度を上げる目的で蛍光色素を重合的に使用した場合であっても、蛍光色素同士によるクエンチング（消光）現象が発生して、所期の検出感度が得られない場合がある。このため、従来の蛍光色素を利用してＤＮＡ配列内の極めて微小な点突然変異部を検出することは容易でない。
一方、酵素反応時間で感度を増幅する原理を有する酵素プローブを用いた蛍光及び化学発光検出法も提案されているが［Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｂｅｃｋ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒｔ  Ｋｏｓｔｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６０，２２５８−２２７０（１９９０）、感度増幅の度合いが酵素反応時間に依存しているため、標的物質が微量の場合、感度を高めるために長時間の露光（酵素反応）を必要とし、迅速なデータが得られにくく、またノイズも同時に増幅することがあり解像度も劣る場合があるという問題がある。
また、検出の高感度化を目指して、蛍光または化学発光性の化合物を複数個結合させた高分子化合物を標識剤として用いた発光検出法も種々提案されている。具体的には、アクリジニウム環を複数有するアクリジニウム化合物またはその複合体を化学発光標識剤として用いる方法（特開平６−１５８０３９号、特開平９−１００４１５号公報）、アクリダン基結合部の繰り返し構造を有するアクリダン基含有ポリマー〔（メタ）アクリル酸（共）重合体、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート共重合体〕を化学発光標識剤として用いる方法（特開平７−３３０８３８号、特開平８−１１３６１１号、特開平９−３０２０３３号公報）、ルミノールやルシゲニンなどのルミネセントを複数個結合させた有機高分子化合物（合成ペプチドやポリビニルフェノールなど）を免疫測定における発光標識剤として用いる方法（特開昭５８−６１４６８号、特開昭５８−１３７７５９号、特開昭５８−１３７７６０号公報）を挙げることができる。また特開平２−１０２２０３号公報には、高感度検出を目的としたものではないが、ルミノールなどの発光物質をポリビニルアルコールに結合させることで該発光物質の水溶性を上げ、これを生体膜の物質透過性を評価するための試薬として用いることが記載されている。しかしながら、これらの公知文献を始めとして、従来、蛍光または化学発光性の化合物を１個もしくは複数個結合させた化合物（高分子化合物を含む）であって、当該化合物同士が互いに連鎖的に複合化することによって発光強度が増幅できるように構成された化合物ならびにその技術は一切提案されていない。
発明の開示
本発明は、安全で且つ簡便な光学的手法を利用して標的物質を高い検出感度で検出することを可能とする発光性高分子化合物及びその製造方法を提供することを目的とする。また本発明は、当該発光性高分子化合物について発光検出プローブ及び発光試薬（標識／検出用試薬）としての用途を提供することを目的とする。さらに、本発明はかかる発光性高分子化合物を発光検出プローブとして利用して、標的物質を高感度に検出するバイオアッセイ法を提供することを目的とする。
本発明者は、光学的手法によって標的物質の高感度検出を可能とする発光検出プローブの開発を目指して鋭意研究を重ねていたところ、（１）ポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質または多糖類といった高分子化合物の構成成分（アミノ酸または単糖）に発光物質を結合させることにより、当該結合した発光物質の数に応じて強い発光が得られること、（２）当該発光性高分子化合物にビオチンを結合させることによって（いわゆるビオチン標識−発光性高分子化合物の調製）、アビジンまたはストレプトアビジンとの結合を介して、測定標的物質を特異的に標識することが可能であること、さらに（３）上記ビオチン標識−発光性高分子化合物として、一分子中に２以上の複数のビオチンが結合した化合物を用いることにより、ビオチン標識−発光性高分子化合物同士をアビジン若しくはストレプトアビジンとの結合を介して連鎖的にまた多岐的に結合させることができることを見いだした。
かかる知見に基づいて、本発明者は当該ビオチン標識−発光性高分子化合物によれば、高分子化合物に結合させた発光物質の数に比例して発光強度を増大させることができ、さらにビオチンを複数有する発光性高分子化合物の場合は、当該ビオチン標識−発光性高分子化合物同士を多数結合して複合化することによって発光強度をさらに増幅することができ、高感度な発光検出プローブとして有効に利用できることを確認した。
加えて、高分子化合物として、ポリアミノ酸、ペプチドや多糖類などといった生体内成分と相溶性のある高分子化合物を用いることによって、上記のビオチン標識−発光性高分子化合物が、生体成分の測定、すなわちバイオアッセイにおける発光検出プローブとして幅広く応用可能であることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて開発されたものである。
すなわち、本発明は下記に掲げるビオチン標識−発光性高分子化合物にかかるものである：
Ｉ．  発光物質が共有結合してなる単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物に、さらにビオチンが共有結合してなる発光性高分子化合物。
なお、本明細書において、上記ビオチンが共有結合してなる発光性高分子化合物を「ビオチン標識−発光性高分子化合物」とも称する。
当該ビオチン標識−発光性高分子化合物には、下記の具体的態様が含まれる：
Ｉ−１．  発光物質が共有結合してなる単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物に、さらに２以上のビオチンが共有結合してなる発光性高分子化合物。
Ｉ−２．  発光物質が化学発光物質または蛍光物質である、ＩまたはＩ−１に記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−３．  発光物質がシアノイソインドール類、ルミノール類及びアクリジニウムエステル類よりなる群から選択される少なくとも１種の化合物であるＩ、Ｉ−１またはＩ−２のいずれかに記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−４．  シアノイソインドール類が、下式
2003031974.tif 000003
（式中、Ｒ１は任意の基である。）
で示される化合物であるＩ−３に記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−５．  ルミノール類が、下式
2003031974.tif 000004
（式中、Ｒ２は任意の基である。）
で示される化合物であるＩ−３に記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−６．  アクリジニウムエステル類が、下式
2003031974.tif 000005
（式中、Ｒ３は任意の基である。）
で示される化合物であるＩ−３に記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−７．  高分子化合物がポリアミノ酸または多糖類である上記ＩからＩ−６のいずれかに記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−８．  高分子化合物が多糖類である上記ＩからＩ−６のいずれかに記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−９．  高分子化合物がデキストランまたはプルランのいずれかである、上記ＩからＩ−８のいずれかに記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−１０．  水溶性である、上記ＩからＩ−９のいずれかに記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−１１．  高分子化合物が単糖を単体として含むものであって、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、アミノ基を各々有するシアノイソインドール類、ルミノール類及びアクリジニウムエステル類よりなる群から選択される少なくとも１種の発光物質が、当該アミノ基との脱水縮合反応によって結合してなり、さらに他の単糖の開環アルデヒド基に、ビオチンのヒドラジド誘導体のヒドラジノ基（−ＮＨ−ＮＨ２）が結合してなるものである、上記ＩからＩ−１０のいずれかに記載の発光性高分子化合物。
Ｉ−１２．  １級アミノ基を有するシアノイソインドール類が、下式（７）
2003031974.tif 000006
（式中、Ｒ４はスペーサーである。）で示される化合物、１級アミノ基を有するルミノール類が、下式（８）
2003031974.tif 000007
（式中、Ｒ５はシングルボンドまたはスペーサーである。）で示される化合物、１級アミノ基を有するアクリジニウムエステル類が、下式（９）
2003031974.tif 000008
（式中、Ｒ６はシングルボンドまたはスペーサーである。）で示される化合物であって、
ビオチンのヒドラジド誘導体が、下式
2003031974.tif 000009
（式中、Ａはスペーサーである。）で示される化合物である、上記Ｉ−１１に記載の発光性高分子化合物。
さらに、本発明は下記に掲げる、上記ビオチン標識−発光性高分子化合物の製造方法にかかるものである：
ＩＩ．  下記の（ａ）及び（ｂ）の工程を有する、Ｉ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載のビオチン標識−発光性高分子化合物を製造する方法：
（ａ）単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物に発光物質を反応させて該単体に発光物質を導入する工程、及び
（ｂ）単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物にビオチンを結合させる工程。
当該製造方法には下記の態様が含まれる：
ＩＩ−１．  下記の（ｃ）及び（ｄ）の工程を有する、上記Ｉ−１１またはＩ−１２に記載するビオチン標識−発光性高分子化合物の製造方法：
（ｃ）単糖を単体として含む高分子化合物の、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、１級アミノ基を各々有するシアノイソインドール類、ルミノール類及びアクリジニウムエステル類よりなる群から選択される少なくとも１種の発光物質を、当該アミノ基との脱水縮合反応によって結合する工程、及び
（ｄ）単糖を単体として含む高分子化合物の、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、ビオチンのヒドラジド誘導体のヒドラジノ基（−ＮＨ−ＮＨ２）を結合させる工程。
なお、上記（ａ）と（ｂ）並びに（ｃ）と（ｄ）の工程は順不同であり、（ａ）工程後に（ｂ）工程を実施する方法（または（ｃ）工程後に（ｄ）工程を実施する方法）、また（ｂ）工程後に（ａ）工程を実施する方法（または（ｄ）工程後に（ｃ）工程を実施する方法）のいずれであってもよい。
また、本発明は下記に掲げるビオチン標識−発光性高分子化合物を利用した発光検出プローブにかかるものである：
ＩＩＩ．  上記Ｉ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物からなる発光検出プローブ。
当該発光検出プローブは、ビオチン標識−発光性高分子化合物の調製に用いる発光物質が化学発光物質である場合（発光性高分子化合物が化学発光性高分子化合物である場合）には化学発光検出プローブとして、また発光物質が蛍光物質である場合（発光性高分子化合物が蛍光高分子化合物である場合）には蛍光検出プローブとして提供することができる。
なお、当該発光検出プローブには、下記の態様が含まれる：
ＩＩＩ−１．  バイオアッセイにおいて、測定すべき標的物質の標識および検出に用いられるＩＩＩ記載の発光検出プローブ。
ＩＩＩ−２．  バイオアッセイにおいて、発光強度の増幅に用いられるＩＩＩ記載の発光検出プローブ。
また、本発明は下記に掲げるビオチン標識−発光性高分子化合物を利用した発光試薬にかかるものである：
ＩＶ．  上記Ｉ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物を含む発光試薬。
当該発光試薬は、ビオチン標識−発光性高分子化合物の調製に用いる発光物質が化学発光物質である場合（発光性高分子化合物が化学発光性高分子化合物である場合）には化学発光試薬として、また発光物質が蛍光物質である場合（発光性高分子化合物が蛍光高分子化合物である場合）には蛍光試薬として提供することができる。
なお、当該発光試薬には、下記の態様が含まれる：
ＩＶ−１．  上記Ｉ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物を、アビジンまたはストレプトアビジンと結合した状態で含むＩＶ記載の発光試薬。
ＩＶ−２．  バイオアッセイにおいて、測定すべき標的物質の標識および検出に用いられるＩＶまたはＩＶ−１に記載の発光試薬。
ＩＶ−３．  バイオアッセイにおいて、発光強度の増幅に用いられるＩＶまたはＩＶ−１に記載の発光試薬。
さらにまた、本発明は下記に掲げる、ビオチン標識−発光性高分子化合物を利用した発光試薬を構成成分として含む試薬キットにかかるものである：
Ｖ．  少なくともＩＶ、ＩＶ−１からＩＶ−３のいずれかに記載する発光試薬および標的物質に特異的に結合することが可能なビオチン標識された物質、または少なくともＩＶ、ＩＶ−１からＩＶ−３のいずれかに記載する発光試薬、標的物質に特異的に結合することが可能なビオチン標識された物質、及びアビジンあるいはストレプトアビジンを含む発光試薬キット。
Ｖ−１．  更に標的物質を特異的に捕捉することが可能な物質を結合させた不溶性担体を含むＶに記載する発光試薬キット。
Ｖ−２．  バイオアッセイ法に使用される試薬キットであるＶまたはＶ−１に記載の発光試薬キット。
また、本発明は下記に掲げる、ビオチン標識−発光性高分子化合物を利用したバイオアッセイ法にかかるものである：
ＶＩ．  測定する対象の標的物質とＩ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物とをアビジンまたはストレプトアビジンを介して複合体形成させ、該形成された複合体を発光検出により測定する工程を有する、標的物質のバイオアッセイ法。
当該バイオアッセイ法には下記の態様が含まれる：
ＶＩ−１．  ビオチン標識−発光性高分子化合物としてＩ−２に記載の化学発光性高分子化合物または蛍光高分子化合物を用いて、発光検出手段としてそれぞれ化学発光検出手段または蛍光検出手段を用いる、ＶＩに記載のバイオアッセイ法。
ＶＩ−２．  下記の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含むＶＩまたはＶＩ−１に記載するバイオアッセイ法：
（ｉ）標的物質にビオチンを結合させる工程、
（ｉｉ）上記（ｉ）の工程で得られたビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及びＩ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物を反応させる工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の工程で得られるビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及びビオチン標識−発光性高分子化合物から構成される複合体を化学発光または蛍光検出によって測定する工程。
ＶＩ−３．  工程（ｉ）の前に、標的物質を不溶性担体に固定する工程を含むＶＩ−２に記載するバイオアッセイ法。
ＶＩ−４．  ビオチン標識−発光性高分子化合物に代えて、ＩＶ−１に記載の発光試薬を用いる、ＶＩまたはＶＩ−１に記載のバイオアッセイ法。
ＶＩ−５．  下記の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含むＶＩ−４に記載するバイオアッセイ法：
（ｉ）標的物質にビオチンを結合させる工程、
（ｉｉ）上記（ｉ）の工程で得られたビオチン標識−標的物質、及びＩＶ−１に記載の発光試薬を反応させる工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の工程で得られるビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及びビオチン標識−発光性高分子化合物から構成される複合体を化学発光または蛍光検出によって測定する工程。
ＶＩ−６．  工程（ｉ）の前に、標的物質を不溶性担体に固定する工程を含むＶＩ−５に記載するバイオアッセイ法。
ＶＩ−７．  上記ＶＩ−２またはＶＩ−５において、工程（ｉｉ）で得られる複合体が、Ｉ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物がアビジンまたはストレプトアビジンを介して複数個結合してなり、さらに当該結合物がアビジンまたはストレプトアビジンを介してビオチン標識−標的物質と結合してなる形態を有する複合体である、ＶＩ、ＶＩ−１からＶＩ−６のいずれかに記載するバイオアッセイ法。
ＶＩ−８．  発光増幅法として用いられる、ＶＩ−７に記載するバイオアッセイ法。
さらに本発明は下記の発明にかかるものである。
ＶＩＩ．  上記Ｉ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物の、バイオアッセイ法における発光検出プローブとしての使用。
ＶＩＩＩ．  上記Ｉ、Ｉ−１からＩ−１２のいずれかに記載するビオチン標識−発光性高分子化合物の、バイオアッセイ法における発光試薬の調製のための使用。
ＩＸ．  Ｖ、Ｖ−１またはＶ−２のいずれかに記載する発光試薬キットの、バイオアッセイ法における発光増幅試薬キットとしての使用。
発明を実施するための最良の形態
（１）ビオチン標識−発光性高分子化合物
本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、発光物質が共有結合してなる単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物に、さらにビオチンが共有結合してなることを特徴とする発光性高分子化合物である。
（１−１）発光性高分子化合物
発光性高分子化合物の調製に用いられる高分子化合物は、１種または複数種の単糖またはアミノ酸を、同一または異なって、単体として含む高分子化合物である。具体的には１種または複数種からなる単糖の繰り返し構造を有する多糖類（糖の重合物）、並びに１種または複数種からなるアミノ酸の繰り返し構造を有するポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質（アミノ酸の重合物）を例示することができる。好ましくは、生体高分子、または生体成分と相溶性のある水可溶性の高分子化合物である。
ここで単糖としては、多糖類の構成成分（単体）となるものであって、環状構造となり得るものであれば特に制限されないが、通常炭素数５または６のピラノースまたはフラノースを挙げることができる。なお、α形、β形の別は特に問わない。具体的には、グルコースやフルクトース、並びに酸化物（例えばガラクツロン酸（ガラクトピラヌロン酸）等）を挙げることができるが、特にこれらに制限されない。
これらの単糖を単体として有する好適な多糖類としてはデキストラン、プルラン、グリコーゲン、イヌリン及びペクチン等を例示することができる。より好ましくはデキストラン及びプルランである。
アミノ酸としては、ポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質の構成成分（単体）となるものであれば特に制限されず、各種の蛋白質構成アミノ酸、及び蛋白質構成アミノ酸以外の公知のアミノ酸を挙げることができる。なお、Ｄ−及びＬ−アミノ酸の別、及びα−、β−及びδ−アミノ酸の別も特に問うものではない。なお、蛋白質構成アミノ酸以外のアミノ酸としては、具体的には、例えば株式会社東京化学同人発行の「生化学データブックＩ」（社団法人日本生化学会、編集）（１９８２年１０月１日発行）の第３３〜５９頁に記載されているアミノ酸を例示することができる。これらのアミノ酸を単体として有する好適なポリアミノ酸としては、制限されないが、アスパラギン酸，グルタミン酸，及びホモグルタミン酸などのモノアミノジカルボン酸の重合体、並びにリシンやδ−ヒドロキシリシン等のジアミノモノカルボン酸の重合体を例示することができる。
なお、本発明で用いる高分子化合物は、上記単糖若しくはアミノ酸だけからなる重合体であってもよいし、単糖とアミノ酸の両方を構成成分として含むものであっても、また単糖若しくはアミノ酸以外に他の成分を構成成分として含有するものであってもよい。
かかる高分子化合物を構成する単糖またはアミノ酸の重合度並びに高分子化合物の分子量は特に制限されないが、好ましくは、当該高分子化合物に発光物質を結合させた発光性高分子化合物、より好適にはさらに前記高分子化合物にさらにビオチンを結合させたビオチン標識−発光性高分子化合物が、最終的に水可溶性を備えるような重合度並びに分子量を備えていることが望ましい。なお、ここで「水可溶性」とは、対象物を水または中性緩衝液に溶解した場合に、溶解度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上である場合をいう。実用面から定義すると、上記発光性高分子化合物またはビオチン標識−発光性高分子化合物が「水可溶性」であるとは、これらの高分子化合物が、発光検出プローブなど本発明における利用に際して、不溶化して沈澱や不溶物を生じることのない程度の溶解性を有することをいう。
かかる高分子化合物を構成する単糖またはアミノ酸を標識するために用いられる発光物質は、当該物質そのものが発光性を有するか、もしくは何らかの処理により発光するような性質を有するものであって、該発光が光学的検出手段によって検出できるようなものであれば特に制限されない。好ましくはその物質自体が蛍光性を有するもの（蛍光物質）、または該物質を化学的に酸化することによって発光する性質を有するもの（化学発光物質）である。また当該発光物質は単糖またはアミノ酸と直接もしくは間接的に共有結合可能な化合物であることが求められる。より好ましくは、本発明の発光性高分子化合物に好適に求められる所望の水可溶性を、発光物質の標識によって、さらには発光物質の標識数の増大に伴って、著しく損なわないような化合物である。また、上記の限りにおいて、発光物質それ自体の分子量などは特に制限されない。
本発明では発光物質として、上記の限りにおいて従来公知の、または将来開発され得る発光物質が広く使用できる。好ましくは下記に掲げるシアノイソインドール類、ルミノール類、及びアクリジニウムエステル類である。
（Ｉ）シアノイソインドール類
本発明でシアノイソインドール類とは、下式（１）：
2003031974.tif 000010
（式中、Ｒ１は任意の基である。）
で示されるシアノイソインドリル（１−ｃｙａｎｏｉｓｏｉｎｄｏｌ−２−ｙｌ）骨格を有する化合物を挙げることができる。
このシアノイソインドリル骨格を有する化合物は、それ自体蛍光を発する化合物（蛍光物質）であるとともに、またアルカリ性のホウ酸ナトリウム緩衝液中で過酸化水素及びアセトニトリルを存在させると室温において発光する性質も備えた化学発光性の化合物（化学発光物質）でもある。
なお、上記式（１）において、置換基Ｒ１はシアノイソインドール類が上記性質を有することを限度として特に制限されないが、後述する高分子化合物との結合反応に使用する場合には、その単体成分である単糖またはアミノ酸と結合できる官能基、特に単糖の開環アルデヒド基、またはアミノ酸のカルボキシル基若しくはアミノ基と結合できる官能基、例えば  アミノ基（−ＮＨ２）、ハロゲン基、イソチオシアナト基（−ＮＣＳ）、ヒドラジノカルボニル基（−ＣＯ−ＮＨＮＨ２）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、及び下式で示されるスクシンイミジルオキシカルボニル基を有する官能基を挙げることができる。
2003031974.tif 000011
（ＩＩ）ルミノール類
本発明においてルミノール類は、下式（２）：
2003031974.tif 000012
（式中、Ｒ２は任意の基である。）
で示されるフタルヒドラジド（１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅ）骨格を有する化合物を意味する。具体的には、５，６，７または８位の少なくとも１つの水素原子、好ましくは５位または６位の少なくとも１つの水素原子が他の官能基で置換されてなるフタルヒドラジド（別名：フタラジンジオン、１，４−ジヒドロキシフタラジン）化合物を挙げることができる。
このフタルヒドラジド骨格を有する化合物は、それ自体蛍光を発する化合物（蛍光物質）であるとともに、また中性又はアルカリ性の緩衝液中で過酸化水素及び適当な酸化触媒（ペルオキシダーゼ、重金属、シアン化物など）を加えると室温で発光する性質を備えた化学発光性の化合物（化学発光物質）でもある。なお、上記式（２）中、置換基Ｒ２はルミノール類が上記性質を有することを限度として特に制限されないが、後述する高分子化合物との結合反応に使用する場合には、その単体成分である単糖またはアミノ酸と結合できる官能基、特に糖の開環アルデヒド基、またはアミノ酸のカルボキシル基若しくはアミノ基と結合できる官能基、例えばアミノ基、ハロゲン基、イソチオシアナト基、ヒドラジノカルボニル基、ヒドラジノ基、及びスクシンイミジルオキシカルボニル基を有する官能基を挙げることができる。
なお、商業的に入手可能なルミノール類（２）として、ルミノール（Ｒ２＝ＮＨ２：５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）、イソルミノール（Ｒ２＝ＮＨ２：６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）、及び下式で示されるＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールなどがある。
2003031974.tif 000013
（ＩＩＩ）アクリジニウムエステル類
本発明においてアクリジニウムエステル類は、下式（３）：
2003031974.tif 000014
（式中、Ｒ３は任意の基である。）
で示される構造を有する化合物（１０−ｍｅｔｈｙｌ−９−ａｌｋｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｃｒｉｄｉｎｅ）である。
当該アクリジニウムエステル類（３）はそれ自体蛍光を発する化合物（蛍光物質）であるとともに、またアクリジンに結合しているエステルが加水分解することによって、過酸化水素及びアルカリ性の水溶液中で化学発光する性質を備えた化学発光性の化合物（化学発光物質）でもある。なお、上記式（３）中、Ｒ３はアクリジニウムエステル類が上記性質を有することを限度として特に制限されないが、後述する高分子化合物との結合反応に使用する場合には、その単体成分である単糖またはアミノ酸と結合できる官能基、特に単糖の開環アルデヒド基、またはアミノ酸のカルボキシル基若しくはアミノ基と結合できる官能基、例えばアミノ基、ハロゲン基、イソチオシアナト基、ヒドラジノカルボニル基、ヒドラジノ基、及びスクシンイミジルオキシカルボニル基を有する官能基を例示することができる。また、これまでＲ３位に種々の官能基を導入してなるアクリジニウムエステル類が報告され［Ｒ．Ｒｅｎｏｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，１５  ３１１−３２０（２０００）］、公知になっている。
本発明が対象とする発光性高分子化合物は、前述する単糖またはアミノ酸に上記の発光物質が共有結合してなるものを単体として含む発光性の高分子化合物である。好ましくは上記の発光物質が共有結合してなる単糖またはアミノ酸を有する、糖の重合物（多糖類）またはアミノ酸の重合物（ポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド若しくは蛋白質）である。
なお、当該発光性高分子化合物は、それを構成する単体成分の全てが上記の発光物質で標識された単糖またはアミノ酸であってもよいが、必ずしもその必要はなく、標識された単体成分（単糖またはアミノ酸）と非標識の単体成分（例えば、単糖またはアミノ酸）とが混在した状態で重合してなるものであってもよい。発光性高分子化合物に含まれる発光物質で標識された単体成分の割合は、用いる高分子化合物の水溶性を著しく損なわずに、発光性高分子化合物が水可溶性を有する範囲であれば特に制限されない。用いる高分子化合物の種類によっても異なるが、発光物質で標識された単体成分の割合として、通常高分子化合物を構成する単体成分の総数の半分以下、好ましくは３〜５割を例示することができる。
本発明で用いる発光性高分子化合物の製造方法としては、特に制限されないが、例えば高分子化合物を構成する単体成分（単糖またはアミノ酸）を予め上記発光物質で標識し、次いでこれを重合する方法、または単糖またはアミノ酸を単体として含む高分子化合物（好ましくは単糖の重合物またはアミノ酸の重合物）と発光物質を反応させることによって、高分子化合物中の複数の単糖またはアミノ酸に各々発光物質を導入する方法を例示することができる。好ましくは後者の方法である。以下、製造方法について例示する。
▲１▼例えば、高分子化合物として多糖類を用い、発光物質としてシアノイソインドール類（１）、ルミノール類（２）またはアクリジニウムエステル類（３）を用いる場合は、発光性高分子化合物は下式に記載するスキームＡに従って製造することができる。
2003031974.tif 000015
〔式中、ｎは５以上の任意の自然数である。ａとｂはｎ＝ａ＋ｂ（ａ≧１、ｂ≧０）、及びａ＝ａ１＋ａ２（ａ１≧１，ａ２≧０）の関係をそれぞれ満たす整数である。また、式中、Ｘ−ＮＨ２は発光物質、具体的には糖に結合するための官能基（−ＮＨ２）を有する発光物質である。Ｘ−ＮＨ２は、より具体的には下式に示されるシアノイソインドール類（７）：
2003031974.tif 000016
（式中、Ｒ４はスペーサーである。）、または下式に示されるルミノール類（８）：
2003031974.tif 000017
（式中、Ｒ５はシングルボンドまたはスペーサーである。）、または下式に示されるアクリジニウムエステル類（９）：
2003031974.tif 000018
（式中、Ｒ６はシングルボンドまたはスペーサーである。）
を意味する。〕
なお、上記式（７）で示すシアノイソインドール類においてＲ４−ＮＨ２は、前述の式（１）で示すシアノイソインドール類のＲ１がアミノ基を有する官能基である場合、上記式（８）で示すルミノール類においてＲ５−ＮＨ２は、前述の式（２）で示すルミノール類のＲ２がアミノ基を有する官能基である場合、並びに、上記式（９）で示すアクリジニウムエステル類においてＲ６−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２は、前述の式（３）で示すアクリジニウムエステル類のＲ３がアミノ基、ヒドラジノ基またはヒドラジノカルボニル基を有する官能基である場合にそれぞれ相当する。
ここでｎは、高分子化合物として用いる多糖類の単糖の重合度である。単糖の重合度が多ければ多いほど発光物質が結合可能な単糖の数も増すことから、ｎは大きいほど好適である。その数は特に制限されることはないが、水可溶性を保持する重合度であることが好ましい。通常、５以上の自然数であればよいが、好適な一例として１０〜１００００の自然数を挙げることができる。
また、式（７）、（８）及び（９）中、それぞれＲ４、Ｒ５及びＲ６で示されるスペーサーは、特に制限されないが、それぞれシアノイソインドール類（１）、ルミノール類（２）及びアクリジニウムエステル類（３）が有する本来の発光性を著しく損なわず、さらに好適には、それを高分子化合物と結合させた場合に該高分子化合物の水可溶性を著しく損なわずに、調製される発光性高分子化合物が所望の水可溶性を有するような範囲で適宜選択することができる。前記スペーサーの例として、異種原子を介してもよい炭化水素鎖を例示することができる。この炭化水素鎖は、一部または全部が環状であってもよい。好適には、鎖式炭化水素鎖としてアルキレン基、アルケニレン基、アルカジエニレン基またはアルキニレン基を、また環式炭化水素鎖としてシクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルカジエニレン基、フェニレン基などを例示することができる。特に好ましくは鎖式炭化水素鎖としてはアルキレン基、及び環式炭化水素鎖としてはフェニレン基である。なお、これらは任意に側鎖を有していてもよい。スペーサーは、これらの鎖式炭化水素鎖及び環式炭化水素鎖の単独からなるものであっても、または両者を組み合わせて含むものであってもよい。
シアノイソインドール類（７）において、Ｒ４で示されるスペーサーとしては好適にはアルキレン基、またはフェニレン基を例示することができる。Ｒ４としてアルキレン基を有するシアノイソインドール類（７）としては、下式：
2003031974.tif 000019
で示されるＮ−（アミノアルキル）−１−シアノインドール、またＲ４としてフェニレン基を有するシアノイソインドール類（７）として下式：
2003031974.tif 000020
で示されるＮ−（アミノフェニル）−１−シアノインドールを挙げることができる。
ここでアルキレン基としては炭素数１〜６の直鎖状炭化水素鎖を有する直鎖状または分岐状のアルキレン基を挙げることができる。好ましくは、炭素数１〜６の低級アルキレン基である。具体的にはメチレン基、エチレン基、ブチレン基、イソブチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、及びシクロヘキサンジイル基などが例示できる。
また、ルミノール類（８）において、Ｒ５はシングルボンドまたはスペーサーを意味する。ここでスペーサーとしては、具体的には−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ−基（ここで、−Ｐｈ−はフェニレン基を意味する。以下、本明細書において同じ。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−基、またはＮ−（４−アルキレン）−Ｎ−アルキル基（例えばＮ−（４−ブチレン）−Ｎ−エチル基）を例示することができる。なお、ここで−（ＣＨ２）ｎ−で示すアルキレン基としては前述と同様に炭素数１〜６（ｎ＝１〜６）の直鎖状炭化水素鎖を有する直鎖状または分岐状のアルキレン基、好ましくは低級アルキレン基を挙げることができる。Ｒ５がシングルボンドであるルミノール類（８）としてルミノール、及びイソルミノールを、またＲ５がスペーサーであるルミノール類（８）として下式：
2003031974.tif 000021
に示すＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、下式：
2003031974.tif 000022
に示すＮ−（ｐ−ヒドラジノメチレン）ベンジルイソルミノール、及び下式
2003031974.tif 000023
に示すＮ−（５’−ヒドラジノペンタメチレン）イソルミノールを例示することができる。これらはいずれも商業的に入手可能かもしくは製造可能なルミノール類である。
ここでＲ５をスペーサーとして有する−Ｒ５−ＮＨ２基は、フタルヒドラジド骨格の５位または６位のいずれに位置していてもよい。なお、上記具体的に掲げた特定のＲ５基に限定されることなく、−Ｒ５−ＮＨ２基が単糖またはアミノ酸等の高分子化合物を構成する単体成分と結合し得るアミノ基を有する官能基であるルミノール類も使用することができる。
また、アクリジニウムエステル類（９）において、Ｒ６はシングルボンドまたはスペーサーを意味する。ここでスペーサーとしては具体的には−Ｐｈ−（ＣＨ２）ｎ−基を例示することができる。これに対応するアクリジニウムエステル類（９）として、下式：
2003031974.tif 000024
で示されるヒドラジド誘導体を挙げることができる。
ここで−Ｐｈ−（ＣＨ２）ｎ−基中のアルキレン基−（ＣＨ２）ｎ−としては炭素数１〜６（ｎ＝１〜６）の直鎖状炭化水素鎖を有する直鎖状または分岐状のアルキレン基を挙げることができる。好ましくは、炭素数１〜６の低級アルキレン基である。具体的にはメチレン基、エチレン基、ブチレン基、イソブチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、ペンタメチレン基、及びヘキサメチレン基などが例示できる。
当該ヒドラジド誘導体であるアクリジニウムエステル類（９）は、例えば下式：
2003031974.tif 000025
（式中、Ｒ６はスペーサーであり、ここでは一例として−Ｐｈ−（ＣＨ２）ｎ−を例示する。）
で示されるように、商業的に入手可能な１０−メチル−９−４−［２−（スクシンイミジルオキシカルボニル）アルキル］フェニルオキシカルボニルアクリジニウム（１０）をアセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン溶媒中でヒドラジン（ＮＨ２−ＮＨ２）と例えば４℃で１０分〜２時間程度反応させることによって調製することができる。
上記スキームＡで示す発光性高分子化合物（６）の製造方法は、具体的には、まず多糖類（４）を酸化することによって単体成分である環状型糖の全部または一部を開環し（５）、次いで開環によって形成されたアルデヒド基（開環アルデヒド基）にＸ−ＮＨ２で示される、糖への結合基（アミノ基）を有する発光物質（例えば、前述する、シアノイソインドール類（７）、ルミノール類（８）またはアクリジニウムエステル類（９））の該結合基（アミノ基）を脱水縮合反応によって結合させることにより実施できる。
上記単糖の開環のための酸化反応は、糖の炭素−炭素結合を酸化分解する方法であればよく、具体的には水または適当な水系溶媒中で多糖類（４）を過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させることによって実施することができる。かかる反応は制限はされないが、４〜３７℃、好ましくは２５℃程度の温度条件下で行うことができ、通常０．５〜５時間の反応で完了することができる。発光物質による多糖類の修飾反応は、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドまたは適当な水溶性溶媒中、酢酸等の酸の存在下で、上記反応で得られた開環多糖類（５）と発光物質とを反応させることによって実施することができる。かかる反応は制限はされないが、２５〜８０℃、好ましくは６０℃程度の温度条件下で行うことができ、通常６〜４８時間の反応で完了することができる。
なお、発光性高分子化合物（６）には、発光物質が共有結合した単体成分（単糖またはアミノ酸）及び発光物質が共有結合していない単体成分（単糖またはアミノ酸）のランダム重合物、及びブロック重合物のいずれもが包含される（以下において同じ。）。
▲２▼また、高分子化合物としてモノアミノジカルボン酸が重合してなるポリアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸またはホモグルタミン酸の重合物）を用い、発光物質としてシアノイソインドール類（１）、ルミノール類（２）またはアクリジニウムエステル類（３）を用いる場合は、下式に記載するスキームＢに従って製造することができる。
2003031974.tif 000026
（式中、ｍは１〜３の自然数であり、ｎは５以上の任意の自然数である。ａとｂはｎ＝ａ＋ｂ（ａ≧１、ｂ≧０）の関係を満たす整数である。また、Ｘ−ＮＨ２は上記と同じ。）
ここでｎは、高分子化合物として用いるポリアミノ酸のアミノ酸重合度である。高分子化合物が多糖類である場合に関して説明する上記と同様に、アミノ酸の重合度が多ければ多いほど発光物質が結合可能なアミノ酸の数も増すことから、ｎは大きいほど好適であるが、水可溶性を保持する重合度であることが好ましい。通常、５以上の自然数であればよいが、好適な一例として１０〜１００００の自然数を挙げることができる。
上記スキームＢにおいて、アミノ酸への結合基（アミノ基）を有する発光物質（Ｘ−ＮＨ２）によるポリアミノ酸（１１）の修飾反応は、具体的にはポリアミノ酸（１１）のカルボキシル基に、当該発光物質、例えば前述するシアノイソインドール類（７）、ルミノール類（８）、又はアクリジニウムエステル類（９）のアミノ基を酸アミド結合させることによって実施することができる。
ここで、酸アミド結合は、ジメチルホルムアミドまたは適当な溶媒中でポリアミノ酸（１１）をＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの縮合化剤の存在下で発光物質（Ｘ−ＮＨ２）と反応させることによって実施することができる。かかる反応は制限はされないが、４〜６０℃、好ましくは３７℃程度の温度条件下で行うことができ、通常１〜２４時間の反応で完了することができる。
▲３▼高分子化合物としてジアミノモノカルボン酸が重合してなるポリアミノ酸（例えば、ポリリシン、ポリδ−ヒドロキシリシンの重合物）を用い、発光物質としてシアノイソインドール類（１）またはルミノール類（２）を用いる場合は、下式に記載するスキームＣに従って製造することができる。なお、下式はポリアミノ酸としてリシンの重合物（ポリリシン）を使用する場合を例示するが、その他のジアミノモノカルボン酸の重合物も同様にして実施できる。
2003031974.tif 000027
〔式中、ｎは５以上の自然数であり、ａとｂはｎ＝ａ＋ｂ（ａ≧１、ｂ≧０）の関係を満たす整数である。また、式中Ｘ−ＮＣＳはアミノ酸への結合基（イソシアナト基）を有する発光物質であって、具体的には下式：
2003031974.tif 000028
（式中、Ｒ４は上記と同じ。）
に示されるシアノイソインドール類のイソチオシアン酸誘導体（１５）、または下式：
2003031974.tif 000029
2003031974.tif 000030
（式中、Ｒ５は上記と同じ。）
で示されるルミノール類のイソチオシアン酸誘導体（１６）である。〕
なお、上記シアノイソインドール類のイソチオシアン酸誘導体（１５）は、式（１）で示されるシアノイソインドール類のＲ１基が、イソチオシアナト基を有する官能基である場合に、またルミノール類のイソチオシアン酸誘導体（１６）は式（２）で示されるルミノール類のＲ２基が、イソチオシアナト基を有する官能基である場合に相当する。
イソチオシアン酸誘導体（１５）又は（１６）は、それぞれ式（７）で示されるシアノイソインドール類又は式（８）で示されるルミノール類のアミノ基をテトラヒドロフラン又はベンゼン等の非プロトン溶媒中でチオホスゲンと反応させることによって調製できる。かかる反応は制限はされないが、２５〜６０℃、好ましくは６０℃程度の温度条件下で行うことができ、通常０．１〜１０時間の反応で完了する。
上記スキームＣにおいて、上記発光物質（Ｘ−ＮＣＳ）によるポリアミノ酸（１３）の修飾反応は、具体的には、上記方法で調製したイソチオシアン酸誘導体（１５）又は（１６）のイソチオシアナト基をポリアミノ酸（１３）のアミノ基と結合させることによって実施できる。当該反応は、制限はされないが、ピリジンなどの有機塩基の存在下で、２５〜６０℃、好ましくは６０℃程度の温度条件下で行うことができ、通常０．１〜１０時間の反応で完了することができる。
▲４▼また発光物質として、上記シアノイソインドール類（７）又はルミノール類（８）に代えてアクリジニウムエステル類（３）を用いる場合は、下式に記載するスキームＤに従って製造することができる。なお、下式はポリアミノ酸としてリシンの重合物（ポリリシン）を使用する場合を例示するが、その他のジアミノモノカルボン酸の重合物も同様にして実施できる。
2003031974.tif 000031
〔式中、ｎは５以上の自然数であり、ａとｂはｎ＝ａ＋ｂ（ａ≧１、ｂ≧０）の関係を満たす整数である。また、式中、（１０）で示される化合物は、下式：
2003031974.tif 000032
（式中、Ｒ６はスペーサーであるが、ここでは一例として−Ｐｈ−（ＣＨ２）ｎ−を例示する。）
で示されるアクリジニウムエステル類（１０−メチル−９−４−［２−（スクシンイミジルオキシカルボニル）アルキル］フェニルオキシカルボニルアクリジニウム）である。〕
上記スキームＤにおいて、発光物質によるポリアミノ酸（１３）の修飾反応は、具体的には、アミノ酸との結合基（式（１０）中、Ｙ以外の基）を有する発光物質（ここでは１０−メチル−９−４−［２−（スクシンイミジルオキシカルボニル）アルキル］フェニルオキシカルボニルアクリジニウム（１０）を使用する）の活性エステル基（式（１０）中、Ｙで示される基）をポリアミノ酸（１３）のアミノ基に結合させることによって実施できる。当該反応は、該アクリジニウムエステル類（１０）を非プロトン溶媒または弱アルカリ性の水溶液中でポリアミノ酸（１３）と反応させることによって行うことができる。ここで非プロトン溶媒としては、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなどを用いることができる。
かかる反応は制限はされないが、４〜６０℃、好ましくは２５℃程度の温度条件下で行うことができ、通常０．１〜１０時間の反応で完了することができる。
なお、スキームＡ〜Ｄで示す上記各製造方法において、前述するように高分子化合物を構成する各単体成分（単糖またはアミノ酸）の全てに発光物質が結合しても（スキームＡの場合はｂ＝０、ａ２＝０、ｎ＝ａ１；スキームＢ〜Ｄの場合はｂ＝０、ｎ＝ａ）、その一部に発光物質が結合してもよい（スキームＡの場合はｂ≧１またはａ２≧１、ｎ＝ａ１＋ａ２＋ｂ；スキームＢ〜Ｄの場合はｂ≧１、ｎ＝ａ＋ｂ）。高分子化合物に対する発光物質の結合数は、好適には発光物質が結合することによって高分子化合物の水可溶性が損なわれない範囲であればよく、その範囲で適宜調製することができる。好ましくは発光物質が結合した単体数（スキームＡの場合はａ１、スキームＢ〜Ｄの場合はａ）が単体総数（ｎ）の半分以下、より好ましくは３〜５割となるような範囲である。なお、高分子化合物に対する発光物質の結合数は、発光物質と高分子化合物との結合反応条件を適宜調整することによって、所望数に調節することができる。
上記の方法によって得られる発光性高分子化合物は、必要に応じて従来公知の慣用手段によって反応系内より分離され、更に精製することができる。かかる精製方法としては、再結晶法、カラムクロマトグラフィー、溶媒抽出法、再沈殿法などを挙げることができる。
（１−２）ビオチン標識−発光性高分子化合物
上記の発光性高分子化合物は、例えばバイオアッセイなどの測定系において発光検出プローブとして有効に利用することができる。上記の発光性高分子化合物を発光検出プローブとして利用するためには、対象とする標的物質を特異的に検出できるように、発光性高分子化合物と標的物質とが、直接的或いは間接的に、特異的な結合を形成できるような手段を設けることが好ましい。特異的な結合を形成する方法として、標的物質と特異的に結合するためのいわゆるバインダーを上記発光性高分子化合物に結合させる方法を挙げることができる。ここで発光性高分子化合物に結合させるバインダーとしては、検出対象となる標的物質と直接的もしくは間接的に特異的な結合を形成する性質を有するものであればよく、例えば、従来公知のバイオアッセイ法で利用される、抗原と抗体、ビオチンとアビジン若しくはストレプトアビジン、第１抗体と第２抗体、ハプテンと抗ハプテン抗体、オリゴ（ポリ）ヌクレオチドにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖、レセプターとリガンド、糖鎖とレクチン、酵素と基質等の関係のように両者間の特異的結合性を利用したものを任意に使用することができる。具体的なバインダーの例としては、検出する対象の標的物質が、核酸である場合は該核酸の塩基配列と相補の関係にある塩基配列を有するオリゴ（ポリ）ヌクレオチド、標的物質が抗原（または抗体）である場合は該抗原（または抗体）を特異的に認識する抗体（または抗原）、また検出する対象の標的物質がアビジンもしくはストレプトアビジンで標識されている場合はビオチン、第１抗体で標識されている場合には第２抗体などを例示することができる。
本発明は、特に上記に掲げるバインダーとしてビオチンを用い、発光性高分子化合物にビオチンが共有結合してなる、ビオチン標識−発光性高分子化合物を提供する。
ここで発光性高分子化合物一分子に結合させるビオチンの数は、特に制限されることはないが１個よりは複数個が好ましく、具体的には例えば２〜５０個、２〜３０個または２〜１０個を例示することができる。発光性高分子化合物にビオチンを複数個結合させることによって、アビジン若しくはストレプトアビジンを介して発光性高分子化合物同士を多数結合させることができ、これによって発光強度を増幅することが可能となる。なお、発光性高分子化合物一分子に対するビオチンの結合数は、上記特定の数に限定されることなく、発光物質、高分子化合物、アビジン若しくはストレプトアビジンなど、測定系を構成する成分との関係を考慮して実験的に選択調整することができる。
発光性高分子化合物にビオチンを結合させる方法は、特に制限されず、ビオチンの結合方法に関する常法に従って行うことができる。
例えば、発光性高分子化合物が多糖類（６）の場合は、下式：
2003031974.tif 000033
（式中、Ｘ、ａ１、ａ２及びｂは上記と同じ。ａ３とａ４はａ２＝ａ３＋ａ４の関係をそれぞれ満たす整数であり、且つａ１≧１、ａ２≧０、ｂ≧０、ａ３≧０、５０≧ａ４≧２である。式（１８）で示されるビオチンのヒドラジド誘導体中、Ｚは下式：
2003031974.tif 000034
で示されるビオチン残基であり、Ａはスペーサーである。）
に示すスキームＥに従って、発光性高分子化合物（６）にビオチンを結合することができる。
具体的には、まず、前述するスキームＡで示す製造方法▲１▼で得られた発光性多糖類（６）を、ビオチン残基ＺにスペーサーＡを介してヒドラジノカルボニル基が結合してなるビオチンのヒドラジド誘導体（１８）とエチレングリコール、ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中で反応させて、ビオチンのヒドラジド誘導体（１８）のヒドラジノ基（−ＮＨ−ＮＨ２）を、多糖類（６）を酸化することによって生じた単糖の開環アルデヒド基に結合させることによって製造することができる。上記反応で生成したビオチン標識−発光性高分子化合物（１９）は、さらにアルコール溶媒（例えばエチレングリコール等）に溶解して水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を用いて還元することによって、安定化させることもできる（化合物（２０））。
なお、ここで用いられるビオチンのヒドラジド誘導体（１８）は、商業的に入手可能なものを任意に使用することができ、例えば式（１８）中、Ａで示されるスペーサーとして−（ＣＨ２）５−を有するＢｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ  ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社）、及びスペーサーとして−ＮＨ（ＣＨ２）５−を有するＢｉｏｔｉｎｈｙｄｒａｚｉｄｅ  ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅを例示することができる。
また発光性高分子化合物が、モノアミノジカルボン酸の重合構造を有するポリアミノ酸（１２）の場合は、下式：
2003031974.tif 000035
（式中、Ｘ、ｍ、ａ、ｂ、Ｚ及びＡは、それぞれ上記と同じ。ｂ１とｂ２はｂ＝ｂ１＋ｂ２、且つ５０≧ｂ１≧２、ｂ２≧０の関係をそれぞれ満たす整数である。）
に示すスキームＦに従って発光性高分子化合物（１２）にビオチンを結合することができる。
具体的には、まず、前述するスキームＢで示す製造方法▲２▼で得られたポリアミノ酸（１２）を、ビオチン残基ＺにスペーサーＡを介してアミノ基を結合したビオチンのアミン誘導体（２１）とジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中で反応させて、ビオチンのアミン誘導体（２１）のアミノ基とポリアミノ酸（１２）を構成するモノアミノジカルボン酸の未反応のカルボキシル基とを結合させることによってビオチン標識−発光性高分子化合物（２２）を製造することができる。
なお、ここで用いられるビオチンのアミン誘導体（２１）は、商業的に入手可能なものを任意に使用することができ、例えばスペーサーＡとして−（ＣＨ２）５−を有するビオチンアミドペンチルアミン、及びスペーサーＡとして−ＮＨ（ＣＨ２）５−を有するビオチンヒドラジドペンチルアミン等を例示することができる。
さらに発光性高分子化合物が、ジアミノモノカルボン酸の重合構造を有するポリアミノ酸（１４）の場合は、下式：
2003031974.tif 000036
（式中、Ｘ、ａ、ｂ、ｂ１、ｂ２、Ｚ及びＡは、それぞれ上記と同じ。）
に示すスキームＧに従って発光性高分子化合物（１４）にビオチンを結合することができる。
具体的には、まず、前述するスキームＣで示す製造方法▲３▼で得られたポリアミノ酸（１４）を、ビオチン残基ＺにスペーサーＡを介してスクシンイミジルオキシカルボニル基を結合したビオチンのスクシンイミド誘導体（２３）とテトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中で反応させて、ビオチンのスクシンイミド誘導体（２３）のカルボニル基と水溶性ポリアミノ酸（１４）の未反応のアミノ基とを結合させることによってビオチン標識−発光性高分子化合物（２４）を製造することができる。
なお、ここで用いられるビオチンのスクシンイミド誘導体（２３）は、商業的に入手可能なものを任意に使用することができ、例えばスペーサーＡとして−（ＣＨ２）５−を有するＢｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ  ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（ＳＩＧＭＡ社）、またはスペーサーＡとして−ＮＨ（ＣＨ２）５−を有するＢｉｏｔｉｎｈｙｄｒａｚｉｄｅ  ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ等を例示することができる。
また発光性高分子化合物が、ジアミノモノカルボン酸が重合してなるポリアミノ酸（１７）の場合には、下式：
2003031974.tif 000037
（式中、Ｙ、ａ、ｂ、ｂ１、ｂ２、Ｚ及びＡは、それぞれ上記と同じ。）
に示すスキームＨに従って発光性高分子化合物（１７）にビオチンを結合することができる。この場合、発光性高分子化合物として前述するスキームＤで示す製造方法▲４▼で得られた化合物（１７）を使用する以外は、上記のスキームＧの方法と同様にして実施することができる。
上記の方法によって得られるビオチン標識−発光性高分子化合物は、必要に応じて従来公知の慣用手段によって反応系内より分離され、更に精製することができる。かかる精製方法としては、発光性高分子化合物に関連して前述する各種の方法を挙げることができる。また、この際、ビオチンと特異的に結合するアビジンまたはストレプトアビジンを利用することもできる。
なお、好適なビオチン標識−発光性高分子化合物としては、高分子化合物が単糖を単体として含むものであって、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、各々アミノ基を有するシアノイソインドール類（７）、ルミノール類（８）及びアクリジニウムエステル類（９）よりなる群から選択される少なくとも１種の発光物質が、当該アミノ基との脱水縮合反応によって結合してなり、さらに他の単糖の開環アルデヒド基にビオチンのヒドラジド誘導体（１８）のヒドラジノ基が反応して結合してなる化合物（１９）及びその還元反応物（２０）を挙げることができる。当該ビオチン標識−発光性高分子化合物（１９、２０）は、下記の工程（ｃ）及び（ｄ）を有する製造方法によって製造することができる。
（ｃ）  単糖を単体として含む高分子化合物（多糖類）の、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、各々１級アミノ基を有するシアノイソインドール類（７）、ルミノール類（８）及びアクリジニウムエステル類（９）よりなる群から選択される少なくとも１種の発光物質を、当該アミノ基との脱水縮合反応によって結合する工程、及び
（ｄ）  単糖を単体として含む高分子化合物（多糖類）の、酸化によって生じる当該単糖の開環アルデヒド基に、ビオチンのヒドラジド誘導体（１８）のヒドラジノ基を結合させる工程。
上記（ｃ）は前述するスキームＡに相当する工程であり、（ｄ）は前述するスキームＥに相当する工程である。工程（ｃ）と（ｄ）の実施順番は特に制限されず、工程（ｃ）の実施後に工程（ｄ）を実施しても、またその逆であってもよい。
（２）ビオチン標識−発光性高分子化合物のバイオアッセイにおける利用
（２−１）発光検出プローブ
斯くして得られる本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、測定対象とする標的物質とアビジンまたはストレプトアビジンとの反応を介して、直接的または間接的に結合することができる。なお、ここで直接的な結合とは、例えば、標的物質である抗原を特異的に認識する抗体自体にアビジンあるいはストレプトアビジンが標識されており、これにビオチン標識−発光性高分子化合物が結合して複合体を形成する場合などをいい、間接的な結合とは、標的物質である抗原を特異的に認識する抗体をさらに特異的に認識する抗体（いわゆる第二抗体）にアビジンあるいはストレプトアビジンが標識されており、これとビオチン標識−発光性高分子化合物が結合する場合などをいう。しかしながら、抗体へのアビジンあるいはストレプアビジンの標識もビオチンを介して行うことが可能であるなど、さらに細かい態様があるため、上記の説明に限定されるものではなく、要は標的物質とビオチン標識−発光性高分子化合物の複合体を、特異性のある手段により形成させることができれば、いかなる手段を採用しても良いのである。
このようにして得られた複合体は、ビオチン標識−発光性高分子化合物中の発光性高分子化合物の発光特性（蛍光性、化学発光性）に応じた光学的手段を利用して簡便に且つ高感度に検出することができる。すなわち、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、その発光性高分子化合物が備える高い発光性に基づいて、発光検出プローブとして利用することができる。特に本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、微生物、植物、及びヒトを含む動物などの各種生物の生体成分〔例えば酵素、抗原、抗体、レセプター、核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）など〕の測定において、発光検出プローブとして好適に利用することができる。また、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、発光検出プローブとして、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）などの固相ハイブリダイゼーションによる特定遺伝子の検出、細胞内ＤＮＡまたはＲＮＡの顕微鏡画像検出などによる検出、ＤＮＡシークエンシングにおけるバンドの検出など多岐にわたり有効に利用することができる。ゆえに本発明は、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物について、発光検出プローブとしての用途を提供するものである。
なお、本明細書において「検出」あるいは「測定」という用語は、定量的及び定性的のいずれの意味をも含むものであり、さらに画像解析、診断のための測定及び検査など、具体的な手段や目的の別にかかわらず、最も広義に解釈されるべきものである。また、上記各種生物の生体成分の測定等を広義に意味するものとして、本明細書では「バイオアッセイ」という用語を用いる。
本発明の発光検出プローブは、それに用いる発光性高分子化合物の種類に応じて、それ自体が蛍光性を有するか、または何らかの処理（酸化など）によって発光を生じるものである（化学発光性）。よって、本発明の発光検出プローブは、用いる発光性高分子化合物が蛍光性高分子化合物である場合には蛍光検出プローブであり、また化学発光性高分子化合物である場合には化学発光検出プローブであることができる。
かかる発光検出プローブの検出手段としては、具体的には発光検出プローブが蛍光検出プローブである場合には、測定対象とする標的物質と蛍光検出プローブとの複合体に適切な蛍光励起波長を照射し、それにより発光する蛍光強度を専用のフルオロメーターなどの光度計で検出し測定する方法を例示することができる。また発光検出プローブが化学発光検出プローブである場合には、測定対象とする標的物質と化学発光検出プローブとの複合体についてそれぞれ発光母体に適した酸化反応条件で化学発光反応を行い、これによって生じた化学発光強度を専用のルミノメーターなどの光度計で測定する方法を例示することができる。
図１に、標的物質がＤＮＡである場合を例として、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物を発光検出プローブとして用いた該標的物質（以下、ターゲットＤＮＡともいう。）の検出方法の原理を模式的に示す。
図１に示すように、ターゲットＤＮＡを予め直接的または間接的にアビジンまたはストレプトアビジンで標識しておくことによって、本発明の発光検出プローブ（ビオチン標識−発光性高分子化合物）中のビオチンを介して発光性高分子化合物とターゲットＤＮＡの複合体を形成させて、発光性高分子化合物の発光を指標としてターゲットＤＮＡを検出し測定することができる。
このとき、ターゲットＤＮＡへのアビジンまたはストレプトアビジンの標識方法としては、図１に示すようにターゲットＤＮＡを予めビオチンで標識しておいてこれに更にアビジンまたはストレプトアビジンを結合させる方法のほか、ターゲットＤＮＡに直接アビジンまたはストレプトアビジンを結合させる方法、またはターゲットＤＮＡに対してハイブリダイズ可能なＤＮＡ断片を予めビオチン標識しておき、該ビオチン標識−ＤＮＡ断片をターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせて、これにアビジンまたはストレプトアビジンを結合させる方法などを例示することができる。
また、種々のＤＮＡが混在する生体成分などからターゲットＤＮＡを特異的に検出し測定する場合には、ターゲットＤＮＡに対してハイブリダイズ可能なＤＮＡ断片など、ターゲットＤＮＡに対して親和性を有する物質を固相上（支持体上）に固定化しておき、これにターゲットＤＮＡを捕捉した後に、上記方法を用いて発光性高分子化合物とターゲットＤＮＡの複合体を形成させることができる。
さらに、図１に示すように、発光検出プローブ（ビオチン標識−発光性高分子化合物）が、複数個のビオチンで標識されている場合には、アビジンまたはストレプトアビジンを介して、一分子のターゲットＤＮＡに多数の発光検出プローブ（ビオチン標識−発光性高分子化合物）を連鎖的また多岐的に結合させることができる。このように、複数個のビオチンで標識された発光検出プローブ（ビオチン標識−発光性高分子化合物）によれば、一分子のターゲットＤＮＡに与える発光強度を増幅することができるため、該ＤＮＡをより高感度に検出することが可能となる。こうした意味で、本発明の発光検出プローブは、互いに連鎖的また多岐的に結合することによって自らが発光を増幅することができることから発光増幅プローブとして、またその結果、高感度発光検出プローブとして位置づけることが可能である。従って、複数のビオチンで標識された本発明の発光検出プローブを用いたバイオアッセイ（後述）は、発光増幅法としても位置づけることができる。
（２−２）発光試薬、及び発光試薬キット
また本発明は、前述する本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物について発光試薬としての用途を提供する。本発明の発光試薬は、少なくとも前述する本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物を含むものであり、バイオアッセイに好適に利用することができる。当該発光試薬においてビオチン標識−発光性高分子化合物は、発光検出プローブであり、また発光増幅プローブでありえる。本発明の発光試薬は、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物（発光検出プローブ、発光増幅プローブ）とアビジン若しくはストレプトアビジンが予め結合して複合体（以下、「ビオチン標識−発光性高分子化合物＋（ストレプト）アビジン複合体」という）を形成してなるものであってもよい。なお、本発明の発光試薬は、溶液状、または粉末などに固体形状など、所望の形状で提供することができる。
バイオアッセイなど標的物質の測定には、ビオチン標識−発光性高分子化合物を必須成分として含む上記発光試薬〔例えば、（ａ）ビオチン標識−発光性高分子化合物、（ｂ）ビオチン標識−発光性高分子化合物＋（ストレプト）アビジン複合体など〕（下記でいう▲４▼）に加えて、下記▲１▼〜▲３▼を目的に応じて適宜組み合わせて構成成分として含む、発光試薬キットを用いることができる。
▲１▼標的物質を特異的に捕捉することが可能な物質を結合させた不溶性担体、
▲２▼標的物質に特異的に結合することが可能な、ビオチン標識された物質、
▲３▼アビジンあるいはストレプトアビジン、
▲４▼発光試薬〔（ａ）ビオチン標識−発光性高分子化合物（発光検出プローブ）、または（ｂ）ビオチン標識−発光性高分子化合物＋（ストレプト）アビジン複合体〕。
本発明の好適な発光試薬キットは、発光試薬が（ａ）ビオチン標識−発光性高分子化合物（発光検出プローブ）からなる場合は、少なくとも上記▲２▼〜▲４▼を構成成分として含むものであり、より好適には上記▲１▼〜▲４▼の全てを構成成分として含むものである。また、発光試薬が（ｂ）ビオチン標識−発光性高分子化合物＋（ストレプト）アビジン複合体からなる場合は、少なくとも上記▲２▼及び▲４▼を構成成分として含むものであり、より好適には上記▲１▼、▲２▼及び▲４▼を構成成分として含むものである。
発光試薬キットの構成成分として、上記▲２▼〜▲４▼の成分に加えて▲１▼の成分を含むことによって、標的物質を不溶性担体に捕捉させることによって固定化した標的物質に、上記▲２▼のビオチン標識物質を結合させることができる。
なお、上記▲１▼でいう「標的物質を特異的に捕捉することが可能な物質」としては、標的物質に対して特異的親和性を有する物質、例えば標的物質が抗体（抗原）である場合は該抗体（抗原）に対する抗原（抗体）、核酸である場合は該核酸とハイブリダイズする相補的な核酸断片などを挙げることができる。また、▲１▼でいう「不溶性担体」とは標的物質を固定化する支持体（固相）として用いられるものであって、当該分野において慣用の各種の支持体（固相）を用いることができる。例えばガラス、セルロース、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン共重合体などの種々の素材からなるスティック、ビーズ、プレート（マイクロプレートを含む）、試験管などを広く例示することができる。
さらに上記▲２▼でいう「標的物質を特異的に結合することが可能な、・・・物質」には標的物質に直接結合する物質と間接的に結合する物質とが含まれる。標的物質に直接結合する物質としては、具体的には上記と同様に、標的物質に対して特異的親和性を有する物質、例えば標的物質が抗原（抗体）である場合は該抗原（抗体）に対する抗体（抗原）、核酸である場合は該核酸とハイブリダイズする相補的な核酸断片などを挙げることができる。標的物質に間接的に結合する物質としては、いわゆる第二抗体や二本鎖ＤＮＡに対する抗体などを挙げることができる。
上記の各構成成分（▲１▼〜▲４▼）には、りん酸、トリス、グッドの緩衝剤などｐＨを調整する物質、塩化ナトリウムなどの塩、蛋白成分（例えば、アルブミンなど）や糖成分（例えば、スクロースなど）検出プローブほかを安定化させる効果が知られている物質、界面活性剤などの溶解補助物質、カゼインやゼラチンあるいは界面活性剤などの非特異的反応を抑制する効果が知られている物質、アジ化ナトリウムやプロクリン（製品名、スペルコ社）などの防腐剤、その他、一般に検出や測定にその有用性が知られている公知の物質を適宜選択して使用することができる。
なお、発光試薬に必須成分として配合するビオチン標識−発光性高分子化合物（発光検出プローブ）は、それ自体が水可溶性であってもよいが、少なくともバイオアッセイに用いる測定反応系の中で不溶化（析出、沈澱）しないものであればよく、具体的には当該測定系の反応液に対して０．５ｍｇ／ｍＬ以上の溶解度を示すものであれば足りる。
（２−３）バイオアッセイ法
さらに本発明は、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物を用いたバイオアッセイ法を提供する。当該バイオアッセイ法において、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、発光検出プローブとして、また発光増幅プローブとして有効に用いることができる。
本発明のバイオアッセイ法は、測定対象物たる標的物質を、当該標的物質とビオチン標識−発光性高分子化合物で形成される複合体の発光を検出することによって測定する、バイオアッセイ法である。本発明のバイオアッセイ法は、具体的には、標的物質とビオチン標識−発光性高分子化合物とを、アビジンまたはストレプトアビジンを直接または間接的に介して複合体形成させ、該形成された複合体を発光検出により測定する工程を有するものである。
なお、ここで測定の対象とする標的物質としては、前述するように、酵素、抗体、抗原、レセプターなどの蛋白質、及び核酸（ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの各種生物の生体由来成分を広く挙げることができる。
本発明のバイオアッセイ法は、具体的には下記の（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の工程を含む方法によって行うことができる：
（ｉ）標的物質にビオチンを結合させる工程、
（ｉｉ）上記（ｉ）の工程で得られたビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及び前述するビオチン標識−発光性高分子化合物を反応させる工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の工程で得られるビオチン標識−標的物質、アビジンまたはストレプトアビジン、及び前述するビオチン標識−発光性高分子化合物から構成される複合体を化学発光または蛍光検出によって測定する工程。
なお、上記工程（ｉ）の前に、測定対象の標的物質を不溶性担体（支持体）上に固定しておいてもよい。
本発明のバイオアッセイ法は、高い発光強度を有するビオチン標識−発光性高分子化合物を発光検出プローブとして用いることに基づいて、測定対象の標的物質を高い感度で測定することができる。また、当該発光検出プローブに用いるビオチン標識−発光性高分子化合物は、好適には生体成分に高い相溶性のある水溶性の化合物（多糖類、ポリアミノ酸やポリペプチドなどの修飾体）である。このため、本発明のバイオアッセイ法は、試薬の溶解性に制限されにくく、生体成分の測定に広く利用することができる。
さらに、複数のビオチンで標識されてなるビオチン標識−発光性高分子化合物を用いたバイオアッセイ法の場合、上記工程（ｉｉ）の反応により、ビオチン標識−標的物質と結合するビオチン標識−発光性高分子化合物（発光検出プローブ）は、ビオチン標識−発光性高分子化合物同士が互いにアビジンまたはストレプトアビジンを介して連鎖的にまた多岐的に複数個結合してなる結合物を形成することができる。このため、当該バイオアッセイ法は、上記結合物を形成することによって発光強度が増幅されたビオチン標識−発光性高分子化合物（結合物）を発光検出プローブとしてビオチン標識−標的物質を標識し、測定することができるため、標的物質をさらに高い感度で測定することが可能である。この点で本発明のバイオアッセイ法は、発光増幅法として位置づけることもできる。斯くして、本発明のバイオアッセイは、特に核酸や抗原、抗体などの微量な生体成分の測定に有効に利用することができる。
＜実施例＞
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されるものではない。
参考例１  シアノイソインドール類の合成
（１）４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネート〔Ｎ−（４−イソチオシアナトフェニル）−１−シアノイソインドール〕
（ｉ）４−（２’−シアノイソインドリル）アニリン〔Ｎ−（４−アミノフェニル）−１−シアノイソインドール〕
ｏ−フタルアルデヒド（５３６ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、ｐ−アミノアセトアニリド（６００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、及びシアン化カリウム（２６０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）の混合物を水１ｍｌ及びメタノール１５ｍｌの混合溶媒中で９０分間、室温（２５〜２８℃）で撹拌した。生成した不溶性産物（化合物Ｉ）を濾取して、５ｍｌの冷メタノールで洗浄した。該化合物Ｉをエタノール６０ｍｌに懸濁して１Ｍの塩酸３０ｍｌの存在下で１０時間還流した。反応混合液を真空下で濃縮して、無色の明るい結晶性粉末（化合物ＩＩ、約１００ｍｇ）として、下式：
2003031974.tif 000038
に示す標記の４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンを得た。
（ｉｉ）４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネート〔Ｎ−（４−イソチオシアナトフェニル）−１−シアノイソインドール〕
４−（２’−シアノイソインドリル）アニリン（８４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を、ベンゼン−テトラヒドロフラン（１：１，ｖ／ｖ）混合液４０ｍｌ中に懸濁して、トリエチルアミン（６５ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）とチオホスゲン（４０ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）の存在下で１時間還流した。真空下で濃縮した後、生じた残渣をアセトニトリルで再結晶することによって、無色針状物として下式：
2003031974.tif 000039
に示す標記の４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネート（３７ｍｇ）を得た。
ｍ．ｐ．（未修正）１７２℃、
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７５（Ｍ＋）
元素分析：計算値Ｃ６９．８２、Ｈ３．２７、Ｎ１５．２７％；実測値Ｃ６９．６７、Ｈ３．２９、Ｎ１５．２２％
１Ｈ−ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ）：７．１４−７．７５（９Ｈ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ，ａｒｏｍａｔｉｃ  ｐｒｏｔｏｎｓ）。
（２）（２’−シアノイソインドリル）エチルイソチオシアネート〔Ｎ−（２−イソチオシアナトエチル）−１−シアノイソインドール〕
（ｉ）（２’−シアノイソインドリル）エチルアミン〔Ｎ−（２−アミノエチル）−１−シアノイソインドール〕
上記（１）（ｉ）において、ｐ−アミノアセトアニリドに代えて、Ｎ−アセチルエチレンジアミンを用いる以外は、上記の方法と同様にして、下式：
2003031974.tif 000040
に示す標記の（２’−シアノイソインドリル）エチルアミンを取得する。
（ｉｉ）（２’−シアノイソインドリル）エチルイソチオシアネート〔Ｎ−（２−イソチオシアナトエチル）−１−シアノイソインドール〕
上記（１）（ｉｉ）において、４−（２−シアノイソインドリル）アニリンに代えて上記で得られる（２’−シアノイソインドリル）エチルアミンを用いる以外は、上記の方法と同様にして、下式：
2003031974.tif 000041
に示す標記の（２’−シアノイソインドリル）エチルイソチオシアネートを取得する。
ｍ．ｐ．（未修正）１１３℃、
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２７（Ｍ＋）
元素分析：計算値Ｃ６２．６２、Ｈ４．０８、Ｎ１８．２６％；実測値Ｃ６２．７６、Ｈ４．０８、Ｎ１７．７５％。
実施例１  水溶性の発光性高分子化合物（ポリアミノ酸）
（１−１）１．６個の４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネートが結合したポリリシン（発光性高分子化合物（１））
リシンの５オリゴマーであるポリリシン［ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓ）５・５ＨＢｒ；平均分子量１０４５］５６ｍｇ（５４μｍｏｌ）を水２ｍｌに溶かし，３０ｍｌのピリジン及び４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネート７９ｍｇ（２８７μｍｏｌ）を加えて，５０℃で３０分間加温したのち，反応液の溶媒を減圧下留去した。残渣をアセトニトリルと水（４５：５５，％ｖ／ｖ）の混液５０ｍｌに溶かして，分取用ゲルカラム（セファデックスＬＨ２０）に注入して，アセトニトリルと水（４５：５５，％ｖ／ｖ）の溶離液で分離した。下式：
2003031974.tif 000042
で示す４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基〔４−［２−（１’−シアノイソインドリル）］フェニル基〕に由来する蛍光ピークを追跡し、４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合した高分子量の画分を分取した。
分画液中のアセトニトリルを減圧留去して，凍結乾燥によって，４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合したポリリシン（発光性高分子化合物）５３ｍｇを得た。
得られた発光性高分子化合物について１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ  溶媒；５００ＭＨｚ）を測定したところ、δ１．３７−４．２６にリシンのアルキレン基の４０Ｈ，δ７．２−７．８に４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基の芳香環の１３Ｈが観察され、生成された化合物はポリリシン−分子に４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基がチオカルバモイル結合によって計算上、平均して約１．６個結合したものと分かった。
（１−２）ビオチン標識化（ビオチン標識−発光性高分子化合物（６））
上記で得られた４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合したポリリシン（１）について、ＥＺ−Ｌｉｎｋ？  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を使用し、その取り扱い説明書に従って、上記化合物のアミノ基にビオチンを結合した。具体的には、上記で得られた発光性高分子化合物（１）１０ｍｇを１ｍＬのＰＢＳに溶解し、これにＳｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｂｉｏｔｉｎ  ４０ｍｇを添加、溶解し、室温で３０分間放置した。付属の脱塩カラムにて蛍光ピークを追跡し、フラクションを得た。
（２−１）８個の４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネートが結合したポリリシン（発光性高分子化合物（２））
リシンの４２オリゴマーであるポリリシン［ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓ）４２−４２ＨＢｒ；平均分子量８８００］４９ｍｇ（９μｍｏｌ）を水０．８ｍｌに溶かし，６ｍｌのピリジン及び４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネート２０ｍｇ（７３μｍｏｌ）を加えて，５０℃で３０分間加温したのち，反応液の溶媒を減圧留去した。残渣をアセトニトリルと水（４５：５５，％ｖ／ｖ）の混液３５ｍｌに溶かして，分取用カラム（セファデックスＬＨ２０）に注入して，アセトニトリルと水（４５：５５，％ｖ／ｖ）の溶離液で分離した。４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基由来の蛍光ピークを追跡し，４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合した高分子量の分画を分取した。分画液中のアセトニトリルを減圧留去して，凍結乾燥によって，４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合したポリリシン（発光性高分子化合物）４９ｍｇを得た。
得られた発光性高分子化合物について１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ  溶媒；５００ＭＨｚ）測定を行ったところ、δ１．３８−４．２にリシンのアルキレン基３３６Ｈ，δ７．２−７．８に４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基の芳香環の６４Ｈが観察され、生成された化合物がポリリシン一分子に４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基がチオカルバモイル結合によって計算上、平均して約８個結合したものであることが判明した。
（２−２）ビオチン標識化（ビオチン標識−発光性高分子化合物（７））
上記で得られた４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合したポリリシン（２）について、ＥＺ−Ｌｉｎｋ？  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を使用し、その取り扱い説明書に従って、上記化合物のアミノ基にビオチンを結合した。具体的には、上記で得られた発光性高分子化合物（２）１０ｍｇを１ｍＬのＰＢＳに溶解し、これにＳｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｂｉｏｔｉｎ  ４０ｍｇを添加、溶解し、室温で３０分間放置した。付属の脱塩カラムにて蛍光ピークを追跡しフラクションを得た。
実施例２  水溶性の発光性高分子化合物（多糖、その１）
◆３０個の４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンが結合したデキストラン（発光性高分子化合物（３））
デキストラン（平均分子量１６８００；平均１０４個のグルコースが重合したもの）４７０ｍｇ（２８μｍｏｌ）を水１０ｍｌに溶解し、３８１ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（１．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４０分間攪拌した。この反応により、デキストラン中のグルコースは約３０％酸化された。この反応液に水１５ｍｌを加えて、２５０ｍｌのメタノールに滴下した。酸化したデキストランの沈澱物をろ取して、減圧下乾燥した（収量４１０ｍｇ）。その５０ｍｇをエチレングリコール６ｍｌに溶かし、これを４−（２’−シアノイソインドリル）アニリン９８ｍｇ（４２０μｍｏｌ）を３ｍｌのテトラヒドロフランに溶かした溶液と混合して、室温で２４時間攪拌した。この反応液を１００ｍｌのメタノールに滴下した。生じた沈澱物を採取して再度４００ｍｌのメタノール中に懸濁して室温で１５時間攪拌して、４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合したデキストラン（発光性高分子化合物）５４ｍｇを得た。この発光性高分子化合物の一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷのゲルカラム及び１５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の水溶液を溶離液として使用）によって分離して、遊離の４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンが高分子物質に吸着していないことを確認した。
得られた上記発光性高分子化合物について元素分析（実測値Ｃ：５１．１７％，Ｈ：５．６７％，Ｎ：５．１２％；計算値  Ｃ：５１．１７％，Ｈ：５．４１％，Ｎ：５．１２％）を行ったところ、この化合物は平均１０４個のグルコースが重合したデキストラン１分子に対して計算上、平均して約３０個の４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基がアミノ基の脱水縮合反応によって結合していることが分かった。
実施例３  水溶性の発光性高分子化合物（多糖、その２）
◆３００個のルミノールが結合したデキストラン（発光性高分子化合物（４））
デキストラン（平均分子量１７４０００；平均１０７４個のグルコースが重合したもの）３２４ｍｇ（１．９μｍｏｌ）を水１０ｍｌに溶解し、２８３ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（１．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間反応させた。この反応により、デキストラン中のグルコースは約３３％酸化された。この反応液を５００ｍｌのメタノールに滴下して、酸化したデキストランの沈澱物をろ取して、減圧下乾燥した（収量２６０ｍｇ）。このデキストランの酸化体１００ｍｇを６０℃のジメチルスルホキシド１０ｍｌに溶解後、ルミノール９５ｍｇ（５４０μｍｏｌ）及び５ｍｌの酢酸と混合して、６０℃で２４時間攪拌した。この反応液を５００ｍｌのメタノールに滴下した。生じた沈澱物をろ取して減圧下乾燥した（収量５６ｍｇ）。この沈澱物３０ｍｇを６０℃のエチレングリコール２０ｍｌに溶解後、室温下、水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇ（２６４μｍｏｌ）を徐々に加えて２．５時間静置した。反応液を３００ｍｌのアセトンに滴下して、還元した生成物を再沈澱した。ろ取した沈澱物を５００ｍｌのメタノールに懸濁させ、室温で１５時間攪拌して、ルミノールが結合したデキストラン（発光性高分子化合物）２８ｍｇを得た。この発光性高分子化合物の一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷのゲルカラム及び０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の水溶液を溶離液として使用）によって分離して、遊離のルミノールが該発光性高分子化合物に吸着していないことを確認した。
上記で得られた発光性高分子化合物について元素分析（実測値Ｃ：４３．９３％，Ｈ：５．１２％，Ｎ：５．４７％；計算値  Ｃ：４４．３３％，Ｈ：４．９６％，Ｎ：５．４７％）を行ったところ、この化合物は平均１０７４個のグルコースが重合したデキストラン一分子に対して計算上、平均して約３００個のルミノールがアミノ基とアルデヒド基との脱水縮合と還元反応によって結合していることが分かった。
実施例４  ビオチン標識−発光性高分子化合物
◆３００個のルミノールと１５個のビオチンが結合した水溶性発光性高分子化合物（ビオチン標識−発光性高分子化合物（５））
上記実施例３において、合成されたデキストランの酸化体１００ｍｇを６０℃のジメチルスルホキシド１０ｍｌに溶解後、ルミノール９５ｍｇ（５４０μｍｏｌ）及び５ｍｌの酢酸を加えて６０℃で２４時間攪拌し、次いでさらにビオチンアミドペンタメチレンヒドラジド１０ｍｇ（２７μｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間攪拌した。
この反応液を５００ｍｌのメタノールに滴下した。生じた沈澱物を減圧下乾燥した（収量５９ｍｇ）。その乾燥沈殿物３０ｍｇを６０℃のエチレングリコール２０ｍｌに溶解後、室温で、水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇを徐々に加えて２．５時間静置した。この溶液を３００ｍｌのアセトンに滴下した。生じた沈澱物をろ取し、得られた沈澱物を５００ｍｌのメタノールに懸濁させ、室温で２時間攪拌後、ろ過して、ルミノールとビオチンが結合したデキストラン（ビオチン標識−発光性高分子化合物）２１ｍｇを得た。この高分子化合物の一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷのゲルカラム及び０．１％トリフルオロ酢酸の水溶液を溶離液として使用）によって分離して、遊離のルミノールが当該高分子化合物に吸着していないことを確認した。
上記で得られたビオチン標識−発光性高分子化合物について元素分析（実測値Ｃ：４４．１２％，Ｈ：６．１８％，Ｎ：５．７６％；計算値  Ｃ：４４．３０％，Ｈ：６．２４％，Ｎ：５．７６％）を行ったところ、この化合物平均１０７４個のグルコースが重合したデキストラン一分子に対して、計算上、平均して約３００個のルミノールが、そのアミノ基と酸化によって開環したグルコースのアルデヒド基との脱水縮合反応と還元反応によって結合しており、且つ約１５個のビオチンが同様に酸化によって開環したグルコースのアルデヒド基と結合した水溶性のビオチン標識−発光性高分子化合物であることが分かった。
実施例５  ビオチン標識−発光性高分子化合物（８）
◆３０個の４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンとビオチンが結合した水溶性発光性高分子化合物（ビオチン標識−発光性高分子化合物（８））
実施例２において、調製されたデキストランの酸化体５０ｍｇをエチレングリコール６ｍｌに溶かし、これを４−（２’−シアノイソインドリル）アニリン９８ｍｇ（４２０μｍｏｌ）を３ｍｌのテトラヒドロフランに溶かした溶液と混合して、室温で２４時間攪拌し、次いでさらにビオチンアミドペンタメチレンヒドラジド（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ  ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）（ＳＩＧＭＡ社）８ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間攪拌した。この反応液を５００ｍｌのメタノールに滴下した。生じた沈澱物を減圧下乾燥した。その乾燥沈殿物３０ｍｇを６０℃のエチレングリコール２０ｍｌに溶解後、室温で、水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇを徐々に加えて２．５時間静置した。この溶液を３００ｍｌのアセトンに滴下した。生じた沈澱物をろ取し、得られた沈澱物を５００ｍｌのメタノールに懸濁させ、室温で２時間攪拌後、ろ過して、４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基とビオチンが結合したデキストランの高分子化合物（ビオチン標識−発光性高分子化合物（８））を得た。
実施例６  ビオチン標識−発光性高分子化合物
◆１９００個のルミノールと４００個のビオチンが結合した水溶性発光性高分子化合物（ビオチン標識−発光性高分子化合物（９））
デキストラン（平均分子量２００００００；平均１２０００個のグルコースが重合したもの）６０ｍｇを水３０ｍｌに溶解し、４７ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを加え、室温で２時間反応させた。この反応液を３００ｍｌのメタノールに滴下して、酸化したデキストランの沈澱物をろ取し、もう一度３０ｍｌの水に溶かし、３００ｍｌのメタノールで再沈澱させた。ろ取したデキストランの酸化体すべてをジメチルスルホキシド１２ｍｌに溶解後、４ｍｌの氷酢酸を加えたのち、イソルミノール７９ｍｇ及びビオチンアミドペンタメチレンヒドラジド（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ  ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）（ＳＩＧＭＡ社）３．２ｍｇを加えて室温で６０時間攪拌した。この反応液を１６０ｍｌのメタノールに滴下した。生じた沈澱物を減圧下乾燥した（収量５２ｍｇ）。その乾燥沈殿物５２ｍｇを６０℃のエチレングリコール２０ｍｌとジメチルスルホキシド１５ｍｌに溶解後、４℃で、水素化ホウ素ナトリウム４４２ｍｇを徐々に加えて９時間静置した。この溶液を３５０ｍｌのアセトンに滴下した。生じた沈澱物をろ取して、イソルミノールとビオチンが結合したデキストラン（ビオチン標識−発光性高分子化合物）７５ｍｇを得た。
上記で得られた高分子化合物について元素分析（実測値Ｃ：３６．５６％，Ｈ：５．４８％，Ｎ：３．５５％，Ｓ：０．４０％；計算値  Ｃ：３６．０５％，Ｈ：７．３２％，Ｎ：３．５３％，Ｓ：０．４２％）を行ったところ、この化合物平均１２０００個のグルコースが重合したデキストラン一分子に対して、計算上、平均して約１９００個のイソルミノールが、そのアミノ基と酸化によって開環したグルコースのアルデヒド基との脱水縮合反応と還元反応によって結合しており、且つ約４００個のビオンが同様に酸化によって開環したグルコースのアルデヒド基と結合した水溶性のビオチン標識−発光性高分子化合物であることが分かった。
実施例７  化学発光性の評価
実施例１〜４で調製した各高分子化合物（１）〜（５）について、次の操作で化学発光強度を測定した。
＜測定操作＞
高分子化合物（１）〜（３）については、各化合物を水に溶解し、それを試験管に５μｌとり、０．３Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）を１００μｌ、アセトニトリル１００μｌ、及び４．９Ｍ  Ｈ２Ｏ２の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む水溶液１００μｌを順次加えて、ルミノメーター（アロカ社製ＢＬＲ−２０１形）で１０分間の発光強度（フォトンカウント）を測定した。また、高分子化合物（４）及び（５）については、同じく水に溶解し、それを試験管に３０μｌとり、０．１Ｍ炭酸ナトリウムの水溶液１００μｌ、０．１Ｍ  Ｈ２Ｏ２の水溶液２０μｌ、及びアセトニトリル５０μｌを順次加えて、上記と同様に１０分間の発光強度（フォトンカウント）を測定した。なお、比較対照のため、発光性高分子化合物の合成に用いた化学発光物質、４−（２’−シアノイソインドリル）アニリン及びルミノールそれ自体についても同様にして発光強度（フォトンカウント）を測定した。
＜結果＞
表１に各化合物から得られた化学発光強度示す。
2003031974.tif 000043
表からわかるように、４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基が結合している高分子化合物（１）〜（３）は、それに結合している４−（２’−シアノイソインドリル）フェニル基相当数の４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンよりも、顕著に高い発光強度を示し、またより多く重合するほど発光強度がより増強する傾向があることが認められた。
ルミノールを計算上約３００個結合した高分子化合物（４）及び（５）も、また増強の程度は予測されるものより少なかったものの、ルミノール単独よりも高い発光強度を示した（ルミノール単独の発光強度の約４倍）。
予測よりも発光強度の増強程度が少なかった理由は定かではないが、ルミノールのアミノ基をアルキル基やフェニル基で修飾することによって、その発光強度はルミノールの化学発光量子収率の１００分の１程度まで低くくなるという報告［Ｃ．Ｄｏｄｅｉｉｇｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｌａｎｔａ，５１  ４１５−４３９（２０００）］があることから、同様な現象が生じている可能性が考えられる。
なお、高分子化合物（４）及び（５）の発光強度を結合しているルミノール一つあたりの発光強度に換算すると約３００００と考えられる。これはルミノール単独の化学発光量子収率の約８５分の１に相当する。そうすると、高分子化合物（４）及び（５）は、各々それらに結合した発光性物質（ルミノール）の重合度にほぼ比例した化学発光強度を有していると考えられる。
また表１から分かるように、高分子化合物（４）よりもビオチンを結合させた高分子化合物（５）の発光強度の方が高かった。この結果は、より大きな高分子化合物に発光量子収率の高い発光性物質を重合させることにより、より強い発光性高分子化合物が得られることを示唆するものである。なお、高分子化合物（５）は、現在知られている化学発光性化合物の中で、一分子あたりの発光強度が最も強いものである。
実施例８  蛍光性の評価
実施例１〜２で調製した各高分子化合物（１）〜（３）について、次の操作で蛍光強度を測定した。
＜測定操作＞
高分子化合物（１）〜（３）を水に溶解し、その１．０ｍｌを蛍光測定用石英セルにいれて分光蛍光光度計でスペクトルを測定した。次に、それぞれの励起極大波長と蛍光極大波長（未補正）における相対蛍光強度を求めた。
＜結果＞
表２に各化合物から得られた蛍光強度を示す。
2003031974.tif 000044
表から分かるように、４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネート基が結合している高分子化合物（１）及び（２）は、その結合した数に応じて蛍光が強くなった。なお、４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオカルバモイル体の蛍光強度は、表２に示す４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンの約１００分の１程度である（相対蛍光強度：約２６）。このことから４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオシアネート基が結合している高分子化合物（１）及び（２）の蛍光強度は、４−（２’−シアノイソインドリル）フェニルイソチオカルバモイル体の蛍光強度より高く、またその結合した数に応じて強くなることが確認された。また、４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンを約３０個結合させている高分子化合物（３）の蛍光強度は、４−（２’−シアノイソインドリル）アニリンよりも約１０倍強い蛍光強度が得られた。
実施例９  発光検出プローブとしての利用
実施例４で調製したビオチン標識−発光性高分子化合物（５）を発光検出プローブとして用いて、ターゲットＤＮＡの化学発光検出を行った。
具体的には、ビオチンを５’末端に結合させたサンプルＤＮＡ（ビオチン標識−ＤＮＡ、０．１ｍｏｌ＝１ｘ１０−１６ｍｏｌ）をナイロン膜に吸着させ、それに、ストレプトアビジン（１０ｆｍｏｌ）と実施例４で調製したビオチン標識−発光性高分子化合物（５）（１００ｆｍｏｌ）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で３７℃、１時間反応させた。反応後、反応液からナイロン膜を取り出し、その膜を別のシャーレ中の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）及び水で洗浄して、結合しなかったストレプトアビジン及び実施例４のビオチン標識−発光性高分子化合物（５）を膜から除去した。次に、得られた膜を０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、０．０１ＭＨ２Ｏ２及び２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む溶液に２秒間浸して、直ちに化学発光用ＣＣＤカメラ（ルミノデンシドグラフＡＥ−６９３０形、アトー社製）で検出した。
＜結果＞
膜上のサンプルＤＮＡに対して、ストレプトアビジンを介して結合したビオチン標識−発光性高分子化合物（５）から得られる化学発光強度は、サンプルＤＮＡ（０．１ｆｍｏｌ）と同量（０．１ｆｍｏｌ）のビオチン標識−発光性高分子化合物（５）から得られる化学発光強度よりも約２０倍強かった。このことは、上記ビオチン標識−ＤＮＡ、ストレプトアビジン及びビオチン標識−発光性高分子化合物の反応系内では、ビオチン標識−ＤＮＡにストレプトアビジンを介して結合したビオチン標識−発光性高分子化合物（５）が、ストレプトアビジンを介して他のビオチン標識−発光性高分子化合物（５）と連鎖的に多数結合していることが伺われる。
ゆえに当該実施例においてストレプトアビジンとビオチン標識−発光性高分子化合物（５）との結合反応の最適条件を選択し、そのような反応条件に調整することにより、ストレプトアビジンを介してビオチン標識−発光性高分子化合物（５）同士をさらに多数連鎖的に結合させることが可能となり、より高い検出感度が得られるものと思われる。また、表１に示すようにビオチン標識−発光性高分子化合物（５）は、それ単品で極めて強い発光量を示すものであるが、この実施例の結果から、ビオチン標識−発光性高分子化合物（５）を利用することによって極めて感度の高い検出が可能になることが分かった。
また、かかるビオチン標識−発光性高分子化合物（５）を発光検出プローブとして用いたこの検出法は、極めて短い検出時間（５分以内）で最大の発光量を測定できる簡便性も有している。
実施例１０  発光検出プローブとしての利用、その２
実施例６で調製したビオチン標識−高分子化合物（９）を発光検出プローブとして用いて、免疫学的測定における化学発光検出を行った。
＜発光検出プローブを１回使用する場合＞
（ｉ）  常法により、抗Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）モノクローナル抗体を発光用マイクロタイタープレート（ダイナテック社、Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ  Ｉ）に固定した後、ブロックエース（大日本製薬社）によりブロッキングを行い、ＣＲＰ捕捉用抗ＣＲＰ抗体感作プレート（測定用プレート）を作製した。
（ｉｉ）  測定用プレートに０、１０、または１０００ｐｇ／ｍＬの濃度の遺伝子組換え型ＣＲＰ（ｒＣＲＰ、オリエンタル酵母社）を５０μＬ／ウエルの割合で加え、２時間反応させ、上記プレート上に固定した捕捉用抗ＣＲＰモノクローナル抗体にｒＣＲＰを捕捉させた。
（ｉｉｉ）  反応液を除去、洗浄後、ビオチン標識抗ＣＲＰポリクローナル抗体を加え、１時間反応させ、上記捕捉用抗ＣＲＰモノクローナル抗体に捕捉させたｒＣＲＰにビオチン標識抗ＣＲＰポリクローナル抗体を結合させた。
（ｉｖ）  反応液を除去、洗浄後、ストレプトアビジンを加え、１時間反応させ、上記ビオチン標識抗ＣＲＰポチクローナル抗体にストレプトアビジンを結合させた。
（ｖ）  反応液を除去、洗浄後、ビオチン標識−発光性高分子化合物（９）を加え、１時間反応させ、ストレプトアビジンにビオチン標識−発光性高分子化合物（９）を発光検出プローブとして結合させた。当該（ｉ）〜（ｖ）の工程により、捕捉用抗体−ｒＣＲＰ−ビオチン標識抗体−ストレプトアビジン−発光検出プローブ（ビオチン標識−発光性高分子化合物（９））、で構成される複合体が形成された。
（ｖｉ−ａ）  反応液を除去、洗浄後、０．１Ｍ  炭酸ナトリウム、０．０２５ＭＨ２Ｏ２含有５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液を各２５μＬ加え、ルミノメーターＭＬ１０００（ダイナテック社）、によりＬｏｗ  Ｇａｉｎ、３分間積算の条件で発光を測定した。
＜発光検出プローブを２回使用する場合＞
（ｉ）〜（ｖ）については、上記発光検出プローブを１回使用する場合と同様に行った。
（ｖｉ−ｂ）  反応液を除去、洗浄後、再度、ストレプトアビジンを加え、１時間反応させ、（ｉ）〜（ｖ）工程で形成された複合体に、ストレプトアビジンをさらに結合させた。
（ｖｉｉ）  反応液を除去、洗浄後、再度、高分子化合物（９）を加え、１時間反応させ、（ｖｉ−ｂ）工程で得られた反応産物に、高分子化合物（９）を発光検出プローブをさらに結合させた。これにより（ｉ）〜（ｖ）工程で形成された複合体にさらにストレプトアビジンを介して発光検出プローブが結合した複合体が形成された。
（ｖｉｉｉ）  反応液を除去、洗浄後、（ｖｉ−ａ）と同様の操作を行い、発光を測定した。
上記各発光の測定結果を表３に示す。なお、表の結果の数値は相対発光強度の３分間の積算量を表している。
2003031974.tif 000045
＜結果＞
本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物（９）を発光検出プローブとして１回使用した場合、ｐｇ／ｍＬオーダーのＣＲＰを測定することができた。さらに、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物（９）を発光検出プローブとして２回使用した場合、上記１回使用の場合に比べ発光の増加が確認された。これは、本発明の発光検出プローブ（ビオチン標識−発光性高分子化合物（９））がその分子中のビオチンと反応系のストレプトアビジンとの結合を介して連鎖的に多数結合し、その結果形成された複合体が、ビオチン標識抗体−ストレプトアビジンとの結合を介して測定対象のＣＲＰと結合したことによるものであり、このことから、本発明の発光検出プローブによればより高い検出感度が得られることを示している。
産業上の利用可能性
本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、高分子化合物に結合する発光物質の数に応じて１分子あたり高い発光強度を有しているため、各種の測定の検出用標識剤、発光検出プローブ、または光源として利用することができる。特に高分子化合物として単糖やアミノ酸の重合物を用いることで本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は生体成分に対する相溶性を備えることができ、各種成分の生体成分の測定、すなわちバイオアッセイ法における検出プローブ、検出試薬として好適に利用することができる。さらに１分子中に２以上のビオチンを結合させた態様の本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、アビジンまたはストレプトアビジンとの結合を介して、互いに連鎖的にまた分岐的に結合して複合体を形成することができ、それによって発光強度を増幅することが可能である。
このように、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物は、１分子あたり高い発光強度を有するとともに自ら複合体を形成することによってその発光強度を増幅することができるため、高感度な検出用標識剤、発光検出プローブ、または発光試薬として、特に微量な生体成分の測定に有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のビオチン標識−発光性高分子化合物をプローブとした標的物質の検出原理を、ＤＮＡを例として模式的に示した図である。
【図１】
2003031974.tif 000046
【国際調査報告】
2003031974.tif 000047
2003031974.tif 000048
2003031974.tif 000049