(57)【要約】慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニングツールとして有用な、ＴＧＦ−βにより誘導され、細胞外マトリクスの代謝に関与し、腎不全モデル動物においてその遺伝子発現量が増加しているプロテアーゼＭＤＴＳ９のプロモーター、本プロモーターの阻害剤を選択することによる、慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニング方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列を含み、配列番号２記載のポリペプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１７で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７記載の塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、又は、配列番号１７で表される塩基配列を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項６】
請求項１記載のポリヌクレオチド、又は、請求項５記載の細胞からなる慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングツール。
【請求項７】
請求項１記載のポリヌクレオチド、又は、請求項５記載の細胞の慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングのための使用。
【請求項８】
（１）請求項５記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び（２）プロモーター活性を検出する工程を含む、試験化合物が請求項１乃至請求項３記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法による分析工程、及びプロモーター活性を阻害する物質を選択する工程を含む、配列番号２記載のポリペプチドの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法により、慢性腎不全治療及び／又は予防用物質をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
請求項８記載の方法による分析工程、及び製剤化工程を含む、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規なプロモーターに関する。
【背景技術】  ＡＤＡＭＴＳ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆ）は、ディスインテグリン様ドメイン、金属プロテアーゼ様ドメイン、及びトロンボスポンジンＩ型繰り返し配列（以下、ＴＳＰ−１繰り返し配列と称する）を含む分子群である。
前記ヒトＡＤＡＭＴＳ分子の中で、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）及びＡＤＡＭＴＳ１１（アグリカナーゼ−２）では、細胞外基質アグリカンを選択的に切断する活性が示され、関節炎や変形性関節症における軟骨細胞外基質アグリカンの分解の本体の酵素である可能性が示唆されていた（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ  Ｍ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１６６４−１６６６，１９９９；及びＡｂｂａｓｚａｄｅ  Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３４４３−２３４５０，１９９９）。また、ＡＤＡＭＴＳ２（プロコラーゲンＩ  Ｎ−プロテイナーゼ）は、Ｉ型コラーゲンプロ体のＮ末部の切断除去酵素として、Ｉ型コラーゲンのプロ体から成熟型への転換に関与し、コラーゲン線維の形成に重要な役割を果たしており、その遺伝子の異常とＶＩＩＣ型エーラース・ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ）症候群との関連性が示されている（Ｃｏｌｉｇｅ  Ａ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６５，３０８−３１７，１９９９）。
すなわち、ＡＤＡＭＴＳ分子は、アグリカンやコラーゲン等の細胞外マトリクスの分解及び成熟といった代謝に関与することが示されている。
一方、慢性腎不全は、糸球体硬化及び腎間質線維化を特徴とする疾患であり、細胞外マトリクス成分の質的変化及び／又は量的増加が主要な発病及び進行機序とされている。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、多種多様の生理機能を示す分化及び成長因子であることが知られており、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる作用を持つことも知られている（Ｂｏｒｄｅｒ，Ｗ．Ａら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３１，１２８６−１２９２，１９９６；Ｒｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３，４１６７−４１７１，１９８６；Ｆｕｋａｂｏｒｉ，Ｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．，４，５９７−６０２，１９９７；Ｌｏｈｒ，Ｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，５５０−５５５，２００１）。腎不全疾患モデルを用いた実験において、ＴＧＦ−βの特異的な作用抑制タンパク質であるデコリンの遺伝子導入（Ｉｓａｋａ  Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２，４１８−４２３，１９９６）や抗ＴＧＦ−β投与（Ｚｉｙａｄｅｈ  Ｆ．Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，８０１５−８０２０，２０００；Ｓｈａｒｍａ  Ｋ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，５２２−５３０，１９９６；及びＢｏｒｄｅｒ  Ｗ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，３７１−３７４，１９９０）が有効性を示したことより、ＴＧＦ−βの生理機能を抑制又は阻害することが慢性腎不全の治療に繋がると考えられている。
しかし、満足のいく慢性腎不全治療薬がない現状のもと、期待されているにもかかわらず、現在までにＴＧＦ−β阻害剤は上市されていない。
また、間質の炎症、ひいては繊維化を生じる機序に関しては様々な検討がなされている。腎臓では糸球体で産生・放出されたＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインにより尿細管上皮細胞が活性化され、ＭＣＰ−１などのケモカイン、インテグリン、オステオポンチンなどの細胞接着分子や細胞外基質を生産して細胞浸潤を促進し、浸潤してきた単球やＴリンパ球は更に新たなサイトカインを分泌することで尿管上皮細胞や浸潤細胞に作用して炎症巣が生じ、細胞外マトリクス成分の分解を伴う組織破壊が起こる。破壊された組織の修復の過程での過修復、繊維芽細胞や筋繊維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の関与により、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加が起こることも繊維化の機序として考えられている（岡田浩一，別冊・医学のあゆみ  糸球体腎炎の発症と治療，１２０−１２３，２００１）。
ＮＣＢＩデータベースにおいてＡＣ０１０２６９として、１８７０８４ｂｐのヒト染色体５クローンＣＴＣ−４８５１２１の配列が開示されている（非特許文献１参照）。公知配列との相同性分析に基づきＡＤＡＭＴＳファミリーに属すると推定される、卵巣での高発現、性周期による発現変動、及び腫瘍細胞における存在低下が知られているタンパク質をコードするｃＤＮＡ及びその推定アミノ酸配列が知られている（特許文献１参照）。また、ＡＤＡＭファミリーと推定される配列を含む、ゲノムデータベースを利用し、プロテアーゼをコードすると推定される多数の塩基配列、及び、それがコードする推定アミノ酸配列が知られている（特許文献２参照）。
非特許文献１
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１５２８１１９３＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ０１０２６９
特許文献１  国際公開第ＷＯ０２／３１１６３号パンフレット
特許文献２  国際公開第ＷＯ０１／８３７８２号パンフレット
【発明の開示】
ＴＧＦ−βは、多種多様の生理機能を示す分化及び成長因子であるため、ＴＧＦ−βの生理機能全てを阻害することは、長期投与が想定される慢性腎不全の治療においては問題が生じるおそれがある。ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害することが望ましい。
本発明の課題は、慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニングツールとして有用な、ＴＧＦ−βにより誘導され、細胞外マトリクスの代謝に関与する新規プロテアーゼのプロモーターを提供することにある。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、配列番号２で表される配列における第１番〜第１２２４番の配列からなる新規プロテアーゼＭＤＴＳ９をコードするポリヌクレオチドを取得し、続いてヒトゲノムＤＮＡよりＭＤＴＳ９のプロモーターを取得した。また、前記プロテアーゼは、（１）ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼに分類されることより、細胞外マトリックスの代謝に関与するプロテアーゼであると考えられること、（２）実際に、ヒトの腎臓での発現が認められること、（３）腎不全モデル動物において、その遺伝子発現量が増加していることを見出し、更に（４）ＴＧＦ−βによりプロモーター活性が亢進（すなわちプロテアーゼ発現誘導）されることを確認した。これらにより、ＭＤＴＳ９は、腎不全の原因となるポリペプチドであり、本ポリペプチドのプロモーターを用いて、ＭＤＴＳ９の発現を抑制する物質をスクリーニングすることにより、ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に関わる部分だけを抑制又は阻害する慢性腎不全治療及び／又は予防剤として有用な物質をスクリーニングできることを明らかにした。また、マトリクス・メタロ・プロテアーゼ（ＭＭＰ）などの細胞外マトリクス分解酵素の発現を誘導する炎症性サイトカインの一つであるＩＬ−１では本発明のプロモーターの活性が減弱する（すなわちプロテアーゼ発現が抑制される）こと、すなわち、本プロテアーゼの発現誘導が炎症時ではなく、組織の修復や細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加を特徴とする腎繊維化の過程に特異的であることを見出し、本発明のプロモーター阻害剤が慢性腎不全治療及び／又は予防剤として有用であることをさらに明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列を含み、配列番号２記載のポリペプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（２）配列番号１７で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７記載の塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列を含む、（１）記載のポリヌクレオチド、
（３）配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、又は、配列番号１７で表される塩基配列を含む、（１）記載のポリヌクレオチド、
（４）（１）乃至（３）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（５）（４）記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞、
（６）（１）記載のポリヌクレオチド、又は、（５）記載の細胞からなる慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングツール、
（７）（１）記載のポリヌクレオチド、又は、（５）記載の細胞の慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングのための使用、
（８）▲１▼（５）記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び、▲２▼プロモーター活性を検出する工程を含む、試験化合物が（１）乃至（３）記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法、
（９）（８）記載の方法による分析工程、及びプロモーター活性を阻害する物質を選択する工程を含む、配列番号２記載のポリペプチドの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、
（１０）（９）記載の方法により、慢性腎不全治療及び／又は予防用物質をスクリーニングする方法、及び
（１１）（８）記載の方法による分析工程、及び製剤化工程を含む、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法、
に関する。
なお、ＡＣ０１０２６９には、１８７０８４ｂｐの一部分として配列番号１７記載の塩基配列を含む配列を開示しているが、１８７０８４ｂｐからなる配列をＭＤＴＳ９コーディング配列の上流につなげても、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を示すとは考えがたく、ＭＤＴＳ９のプロモーター活性があることや、慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニングに関しては何ら開示されていない。ＷＯ０２／３１１６３には、配列番号２記載のアミノ酸配列と１アミノ酸違う配列が記載され、該配列を有するポリペプチドは、卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与することを示唆している。また、ＷＯ０１／８３７８２には、配列番号２記載のアミノ酸配列と２アミノ酸違う配列が記載されているが、該配列を有するポリペプチドを取得したこと、及び活性や機能を確認したことは記載されていない。そして、前記２件の公報に記載された配列を有するポリペプチドが慢性腎不全の原因であること、ＭＤＴＳ９のプロモーター、及び、ＭＤＴＳ９のプロモーターを用いた慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニングに関しては開示も示唆もない。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ５ｋを導入した細胞において、ＴＧＦ−β添加によりルシフェラーゼ活性が上昇することを示す図である。
図中、縦軸は、ルシフェラーゼ活性測定値を同時導入したβ−ｇａｌ発現プラスミドより発現したβ−ｇａｌの活性値で補正し、ＴＧＦ−β非処理のｐＧＶ−Ｂ２（空ベクター）導入細胞の補正値を１として示した相対値、横軸は、ＴＧＦ−βの濃度である。
図２は、ｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ５ｋを導入した細胞において、ＩＬ−１添加によりルシフェラーゼ活性が減弱することを示す図である。
図中、縦軸は、ルシフェラーゼ活性測定値を同時導入したβ−ｇａｌ発現プラスミドより発現したβ−ｇａｌの活性値で補正し、ＩＬ−１非処理のｐＧＶ−Ｂ２（空ベクター）導入細胞の補正値を１として示した相対値、横軸は、ＩＬ−１の濃度である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のプロモーターであるポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞
本発明者らは、細胞外マトリックスの代謝に関与するプロテアーゼであり、ヒトの腎臓での発現が認められ、腎不全モデル動物において、その遺伝子発現量が増加しているＭＤＴＳ９（Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ−１  ｒｅｐｅａｔｓ  ９）をコードするポリヌクレオチド及びそのプロモーターを得、塩基配列を決定した（配列番号１７）。取得したプロモーターの全長及び部分断片（配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目）を適当なプラスミド、具体的には、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＧＶ−Ｂ２内にサブクローニングした。この融合プラスミドのレポーター遺伝子の発現、すなわち、活性によりルシフェラーゼの発現を検出することにより、得られたポリヌクレオチドがプロモーター活性を有していることを確認した。また、本発明者らは、配列番号１７記載のポリヌクレオチドが、ＴＧＦ−βによりプロモーター活性が上昇し、ＩＬ−１によりプロモーター活性が減弱することを見出した。
前述のとおり、ＭＤＴＳ９の発現を抑制（プロモーター阻害）する物質が慢性腎不全治療及び／又は予防剤として有用であるので、本発明のプロモーターは、阻害剤をスクリーニングするためには、有用である。ＭＤＴＳ９プロモーター阻害剤をスクリーニングするためには、配列番号１７中のＴＧＦ−β応答領域を含む配列を必ずしも用いる必要はなく、例えば、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目を用いて、実施例７記載の方法でスクリーニングすることも可能である。したがって、本発明のプロモーターは、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目の塩基配列を含み、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を有していれば、５’領域のいかなる塩基配列をさらに含んでいても良い。より好ましくは、配列番号１７の塩基配列を含み、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を有しているポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。また、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目の塩基配列の中のいずれかの１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個）の部位において、１乃至複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列を含み、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を有するポリヌクレオチドも、より好ましくは、配列番号１７記載の塩基配列の中のいずれかの１〜１０個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個）の部位において、１乃至複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列を含み、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を有するポリヌクレオチドも、本発明のプロモーターに含まれる。「プロモーター活性」とはＤＮＡ鎖の情報をＲＮＡ鎖に転写するための開始部位として働く活性を意味し、「ＭＤＴＳ９プロモーター活性を有する」とは、実施例２記載の方法でプロモーター活性を確認できることであり、より好ましくは、実施例３記載の方法でＴＧＦ−βによりプロモーター活性が亢進することを意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、実施例記載の方法で製造する以外に、下記の方法で製造することもできる。
▲１▼ＰＣＲ法を用いた製造
実施例１記載のように、プライマーとヒトゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列番号１７の塩基配列を含むＤＮＡを製造することができる。一般に、アレル変異体の存在は良く知られている。本方法でＤＮＡを製造した場合に、配列番号１７の塩基配列の中のいずれかの部位において、塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列を含み、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を有するＤＮＡが得られる場合もあるが、これも本発明のプロモーターに含まれる。
▲２▼ＤＮＡ合成を用いた製造
配列番号１７記載の配列及びその相補鎖を、何本かに分割して化学合成法によって製造し、これらのＤＮＡ断片を結合することによっても製造できる。各ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ合成機（例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）、あるいは、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）など）を用いて合成することができる。
製造したポリヌクレオチドがＭＤＴＳ９プロモーター活性を有するか否かは、例えば、実施例２又は実施例３記載の方法で確認することができる。
当業者であれば、天然型に存在するプロモーター配列の塩基配列の一部を他の塩基への置換や塩基の欠失、及び／又は付加などの改変により、天然型のプロモーターポリヌクレオチドと同等のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを調製することが可能である。このように天然型の塩基配列において塩基が置換、欠失、及び／又は付加した塩基配列を有し、天然型のプロモーターポリヌクレオチドと同等のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。塩基の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２））、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）。
本発明のＭＤＴＳ９プロモーターであるポリヌクレオチドは、生体内における変異に由来したＭＤＴＳ９蛋白質の欠損又は発現異常症の治療や予防に利用することも可能である。例えば、本発明のＭＤＴＳ９プロモーターとＭＤＴＳ９コーディング領域を含むＭＤＴＳ９遺伝子を、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のベクターに挿入し、又はリポソームなどに封入して体細胞に導入することにより、正常な転写制御下にＭＤＴＳ９蛋白質を発現させることができ、これによりＭＤＴＳ９蛋白質の欠損又は発現異常症などに対する改善を図ることが可能となる。
配列番号１７記載のＤＮＡの少なくとも一部分を含むＤＮＡは、プロモーター活性を有するか否かを問わず、本発明のＭＤＴＳ９プロモーターとこれに結合しうる蛋白質（例えば、転写因子）との結合を拮抗阻害しうる。このため該ＤＮＡが、本発明のプロモーターの活性を阻害する蛋白質の結合部位に相当する場合には、このＤＮＡを投与することによりプロモーター活性を促進することができ、逆にプロモーター活性を促進する蛋白質の結合部位に相当する場合には、このＤＮＡを投与することによりプロモーター活性を阻害することができる。拮抗阻害に用いるＤＮＡは、通常少なくとも６塩基以上、好ましくは１０塩基以上の鎖長を有する。
本発明の組換えベクターは、目的に応じ適宜選択したベクターに、本発明のポリヌクレオチドを組み込むことにより製造できる。例えば、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を調節する物質のスクリーニング系構築を目的とする場合は、実施例に記載したように、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を組み込んだベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込んで製造することが好ましい。また、ＭＤＴＳ９蛋白質の欠損又は発現異常症の遺伝子治療を目的とする場合は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のベクターに、本発明のプロモーターとＭＤＴＳ９コーディング領域のＤＮＡを組み込むことにより製造できる。
本発明の形質転換体は、目的に応じ適宜選択した宿主細胞に、本発明のポリヌクレオチドを組み込むことにより製造できる。例えば、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を調節する物質のスクリーニング系構築を目的とする場合は、ヒトあるいはマウス、ラットなどの哺乳動物由来で、腎臓組織由来の細胞を用いることが好ましい。
（２）本発明の分析方法及びスクリーニング方法
本発明のプロモーターを用いることにより、試験化合物が、ＭＤＴＳ９のプロモーター活性を阻害するか否かを分析することができる。また、この本発明の分析方法を用いると、ＭＤＴＳ９プロモーター活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。ＭＤＴＳ９はその配列よりＡＤＡＭＴＳプロテアーゼであると考えられることから、細胞外マトリクスの代謝に関与するプロテアーゼであると考えられ、後述の参考例５及び参考例７に示すように、ヒトの腎臓で発現しているタンパク質であり、参考例６で示すように腎不全モデル動物において、その遺伝子発現量が増加しているおり、しかも、後述の実施例３に示すように、ＴＧＦ−βにより誘導され、ＩＬ−１により発現が抑制されるＡＤＡＭＴＳプロテアーゼである。従って、本発明のプロモーターの活性を阻害する物質は、ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害する可能性が高く、長期投与が想定される慢性腎不全治療剤の有効成分として有用であり、本発明のプロモーターを発現する細胞を、本発明のプロモーターの活性を阻害する物質、あるいは、慢性腎不全治療及び／又は予防用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
本発明の分析方法又はスクリーニング方法にかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。前記公知化合物には、例えば、プロモーター阻害活性を有することが知られているが、本発明のプロモーターの活性を阻害するか否かが不明な化合物（ペプチドを含む）が含まれる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明の分析方法は、
▲１▼本発明のプロモーターを含む発現ベクターでトランスフェクションされた細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び、▲２▼プロモーター活性を検出する工程を含む、試験化合物が本発明のプロモーターの活性を阻害するか否かを分析する方法を含む。
プロモーター活性を検出する方法としては、特に限定されないが、実施例２又は実施例３に記載したような配列番号１７記載の配列を含むレポーター遺伝子プラスミドを用いる方法が簡便である。レポーター遺伝子とは通常の手段（例えば、酵素活性の測定等、当業者に既知の定量法）によって定量することができる蛋白をコードする遺伝子を指し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ遺伝子がよく用いられているがこれらに限定されない。レポーター遺伝子プラスミドを構築する基となるベクターに関しては制限はなく、市販のプラスミドベクター、例えば、ｐＧＶ−Ｂ２（東洋インキ社製）やｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いることができる。これらのベクターのレポーター遺伝子の上流に当該配列を順方向に挿入したレポーター遺伝子プラスミドを構築し、このプラスミドで形質転換した細胞において発現されるレポーター蛋白の量をそれぞれに適した方法で測定することにより当該配列のプロモーター活性の有無、強度を知ることができ、また、上記形質転換細胞の培養液に試験化合物を添加することにより、試験化合物の当該プロモーター活性に及ぼす作用を分析することができる。
また、本発明には、▲１▼上記分析工程、及び、▲２▼プロモーター活性を阻害する物質を選択する工程を含む、配列番号２記載のポリペプチド（ＭＤＴＳ９）の発現を抑制する物質をスクリーニングする方法、又は慢性腎不全治療及び／又は予防用物質をスクリーニングする方法も含まれる。
上記スクリーニング法で選択するプロモーター活性を阻害する物質としては、後述の実施例３に記載の方法で、ＴＧＦ−β処理のみの場合のプロモーター活性の９０％以下になる物が好ましく、ＴＧＦ−β未処理と同等かそれ以下になる物がさらに好ましい。
（３）本発明の慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法
本発明には、（２）記載の本発明の分析方法による分析工程、及び、製剤化工程を含む、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法も含まれる。本発明の慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法には、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の品質規格の確認試験において、本発明の分析方法により、本発明のプロテアーゼの活性を阻害するか否かを分析する工程、及び製剤化工程を含む、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法も含まれる。
また、本発明には、本発明のスクリーニング方法により選択される、本発明のプロテアーゼの活性を阻害する物質を有効成分とする慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物、並びに、本発明のプロテアーゼの活性を阻害する物質を投与することからなる慢性腎不全治療及び／又は予防方法が包含される。そして、（２）記載の本発明の分析工程を含む本発明のスクリーニング方法で得られた物質を製剤化することからなる、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法も本発明の慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法に含まれる。
本発明のプロテアーゼの活性を阻害する物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与又は消化を受けない製剤化手段、例えば、ＷＯ９５／２８９６３号パンフレットに記載の製剤化手段を適用するのが好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施した。
参考例１：Ｃ末ＦＬＡＧ付加型発現ベクターの作製
プラスミドｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）を、制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化した後、自己連結反応を行なうことにより、エプスタイン・バーウイルス由来のＥＢＮＡ１発現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製した。得られた発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを、制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル抽出することにより得られた約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせて得られた二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入することにより、発現ベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを作成した。なお、得られた発現ベクターが目的の配列を有することは、塩基配列により確認した。
得られた発現ベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを鋳型とし、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとして、パイロベスト（ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７２℃（３０秒間）とからなるサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃（７分間）の伸長反応を行なった。前記ＰＣＲにより生じた約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで切断した後、このＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧ（約７．７ｋｂｐ）に挿入することにより、発現ベクターｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧを作成した。得られた発現ベクターｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧにおいては、プロモーターから下流に向かって、クローニングサイトであるＸｂａＩ認識配列、ＮｈｅＩ認識配列、ＮｏｔＩ認識配列、及びＢａｍＨＩ認識配列、並びにＦＬＡＧタグがこの順に配列されている。
参考例２：新規プロテアーゼ遺伝子ＭＤＴＳ９の全長ＯＲＦ遺伝子のクローニング
配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加してある）と配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＮｏｔＩ認識配列が付加してある）との組み合わせをプライマーとし、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社製）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（２分３０秒間）とからなるサイクルを４０回繰り返し、最後に６８℃（７分間）の伸長反応を行なった。前記ＰＣＲにより生成した約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加され、３’側にＮｏｔＩ認識配列が付加されている）を、プラスミドＰＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローンすることにより、クローンｐＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１を得た。
得られたプラスミドｐＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１を制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、前記参考例１で構築したｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧのＸｂａＩ部位及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１−ＦＬＡＧを構築した。
配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びｋｏｚａｋ配列が付加してある）と配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社製）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｇＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（３０秒間）とからなるサイクルを４５回繰り返し、最後に６８℃（７分間）の伸長反応を行なった。前記ＰＣＲにより生成した約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加されている）を、プラスミドＰＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローンすることにより、クローンｐＭＤＴＳ９（５Ｓ２−１２）を得た。挿入断片は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡであり、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列をコードする。
得られたプラスミドｐＭＤＴＳ９（５Ｓ２−１２）を制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｃｏＩで切断して生成した約０．２ｋｂｐのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ  ＤＮＡ断片Ａと、先に得られたプラスミドｐＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１を制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約２．０ｋｂｐのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ  ＤＮＡ断片Ｂとを、前記参考例１で構築したｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧのＸｂａＩ部位及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧを構築した。同様に、前記ＤＮＡ断片Ａと前記ＤＮＡ断片Ｂとを、プラスミドｐＺＥｒＯ−２（インビトロジェン社製）のＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２を構築した。
プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧは、新規プロテアーゼ遺伝子ＭＤＴＳ９の配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第２２５０番の塩基からなる遺伝子を含有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列のＣ末端に、配列番号１１で表されるアミノ酸配列が付加したポリペプチドを、動物細胞を宿主として、発現することができる。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼであると考えられる。
参考例３：ＭＤＴＳ９短長タンパク質（ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２）の発現
参考例２で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧ又は対照として、参考例１で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧを、市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｅｎｔ；ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて、添付指示書に従い、血清培地［ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１０％牛胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２５０μｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ナカライテスク社製）］で培養していたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ（インビトロジェン社製）に導入した。
プラスミド導入後、そのまま４８時間培養する（以下、血清培養と称する）か、あるいは、前記プラスミド導入後、そのまま１６時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後に、無血清培地［ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ナカライテスク社製）］にて３２時間培養した（以下、無血清培養と称する）。
前記血清培養又は無血清培養で得られた各培養液を、遠心分離器（８８００型；久保田製作所社製）により遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０分間）することにより、培養上清を得た。また、前記培養液を除去した後に残った各細胞を、抽出液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１％トリトンＸ−１００、１％グリセロール、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］にて１５分間処理した後、ピペッティングにより細胞を培養プレートより剥離し、得られた細胞懸濁液を遠心分離器（８８００型；久保田製作所社製）により遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０分間）することにより、細胞膜結合画分（上清）と細胞画分（沈澱）とに分画した。
得られた各画分（すなわち、培養上清、細胞膜結合画分、及び細胞画分）における目的タンパク質の発現は、Ｃ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；シグマ社製）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、前記の各画分を、２−ＭＥを用いた還元条件下、ＳＤＳ／１０％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、前記マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ザイメッド社製又はタゴ社製）とを、順次反応させた。あるいは、前記ブロッキングに続いて、ビオチン化Ｍ２抗体（シグマ社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）とを、順次反応させた。反応後、市販のウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、目的タンパク質の発現を確認した。
プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧを導入した細胞を無血清培養することにより得られた各画分において検出されたタンパク質（すなわち、ＭＤＴＳ９短長タンパク質）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における見かけ上の分子質量は、培養上清において約５５〜６５ＫＤａであり、細胞膜結合画分において約５５〜６５ＫＤａであり、細胞画分において８０〜９５ＫＤａであった。
参考例４：ＭＤＴＳ９短長タンパク質のプロテアーゼ活性の確認
（１）プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧの構築
クィックチェンジ・サイトダイレクテド・ミュータジェネシス・キット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；ストラタジーン社製）を用い、添付の指示書に従って、活性中心と考えられるＨｉｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（配列番号１２）のＧｌｕ（グルタミン酸）をＧｌｎ（グルタミン）に置換した遺伝子ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑを含有するプラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑを作製した。なお、鋳型としては、参考例２で作製したプラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２を用い、プライマーセットとしては、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
得られたプラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑを制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、前記参考例１で構築したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧのＸｂａＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧを得た。
（２）α２−マクログロブリンとの複合体形成を指標としたプロテアーゼ活性の確認
参考例２で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧ、参考例４（１）で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧ又は、対照として、参考例１で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧでトランスフェクションした各細胞の血清培養の培養上清を、参考例３で示した手順と同様にして、２−ＭＥを用いた還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、ヤギ抗α２−マクログロブリン抗体［セダーレーン（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ）社製］と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧポリクローナル抗体［ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製］とを、順次反応させた。反応後、市販のウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、目的タンパク質の発現を確認した。
プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧでトランスフェクションした細胞由来の血清培養の培養上清では、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧ又はプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧでトランスフェクションした細胞由来の各血清培養の培養上清で検出されない約２５０ＫＤａのバンドが検出された。この結果は、ＭＤＴＳ９短長タンパク質（ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２）がα２−マクログロブリンと複合体を形成したことを示しており、従って、ＭＤＴＳ９短長タンパク質（ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２）にプロテアーゼ活性があることが確認された。
参考例５：ＭＤＴＳ９遺伝子の組織発現分布の確認
市販のｃＤＮＡパネル［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ（ＭＴＣＴＭ）Ｐａｎｅｌの内、Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ（カタログ番号：Ｋ１４２０−１）、Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩ（カタログ番号：Ｋ１４２１−１）、Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ（カタログ番号：Ｋ１４２５−１）、及びＨｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ（カタログ番号：Ｋ１４２２−１）］を用いて、ＭＤＴＳ９遺伝子の組織発現分布を以下の手順で解析した。
すなわち、配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、前記ｃＤＮＡパネルを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（１分３０秒間）とからなるサイクルを４４回繰り返した。続いて、反応液のアガロースゲル電気泳動を行ない、ＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡに由来する約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出した。その結果、ＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡは、腎臓に発現していることが判明した。
参考例６：腎不全モデルにおけるＭＤＴＳ９遺伝子の発現変動
（１）鋳型ｃＤＮＡの調製
ｃＤＮＡの調製は、ラット５／６腎摘モデル（木村健二郎，「腎と透析」１９９１臨時増刊号，４３１−４３９）の腎臓より調製した。５／６腎摘終了後、１週、２週、３週、４週、６週、８週、及び１０週に、５／６腎摘ラット及び偽手術ラットを各々５匹ずつ解剖し、腎臓を摘出し、その後直ちに−８０℃にて凍結保存した。これら各群の腎臓を液体窒素凍結下、細胞破砕機（クライオプレスＣＰ−１００；マイクロテック・ニチオン社製）を用いて破砕後、総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；日本ジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。抽出した総ＲＮＡをＤＮアーゼ（ニッポンジーン社製）を用い、３７℃で９０分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．２５μｇをスーパースクリプトＩＩファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）にてｃＤＮＡに変換した。
（２）ラット腎不全モデルにおけるＭＤＴＳ９遺伝子の発現変動
ラット腎不全モデルにおける腎臓での発現変動解析は、参考例６（１）で調製したｃＤＮＡを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行なった。配列番号３０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号３１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして用いた。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬［サイバーグリーンＰＣＲコアリエージェント（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｃｏｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）；アプライドバイオシステムズ社製］を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。
また、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）の遺伝子発現量を算出するため、前記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号３３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして同条件のＰＣＲを行なった。更に、ｍＲＮＡ発現量算出に用いる標準曲線を得るために、ラットゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行なった。各群における一定量の総ＲＮＡ当たりのラットＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡの発現量を比較するため、各条件でのラットＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、各条件でのＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量に対する割合で示した。その結果、ラットＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡは、５／６腎摘モデルにおいて、偽手術ラットに比べ、術後１週で約５倍の遺伝子が発現しており、尿タンパク質量が顕著に増加する術後３週、正常腎重量と比べ著明に腎重量が増加し始める術後６週、更に病態が悪化する術後８週で、それぞれ、約２倍の遺伝子が発現していることが判明した。
（３）マウス５／６腎摘モデルにおけるＭＤＴＳ９遺伝子の発現変動
マウス５／６腎摘モデルにおいても、参考例６（１）と同様に鋳型ｃＤＮＡを作成し、参考例６（２）と同様にラットＭＤＴＳ９カウンターパートのｍＲＮＡの定量を行った。蛋白尿及び病理組織切片の観察から、重症例と判断されるマウスに関して約４倍の遺伝子発現（発現量の増加）が認められた。
本参考例により、腎不全モデルでは、ＭＤＴＳ９の遺伝子が発現誘導されることが明らかとなった。
参考例７：ヒト腎臓組織切片の免疫組織染色
（１）抗ヒトＭＤＴＳ９抗体の作製
まず、実験解説書（岡田雅人及び宮崎香編，「改訂タンパク質実験ノート」上，羊土社，ｐ．１６２−１７９）に準じて、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を発現ベクターとして用い、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２８０番〜第４１０番のアミノ酸からなるペプチドと、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質（ＧＳＩ−ＭＤＴＳ９Ａ）を、大腸菌を用いて封入体画分に生産した。続いて、封入体画分について、調製用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施し、ゲルから拡散法によって目的のＧＳＩ−ＭＤＴＳ９Ａタンパク質を抽出した（岡田雅人及び宮崎香編，「改訂タンパク質実験ノート」下，羊土社，ｐ．４８−５１）。
得られたＧＳＴ−ＭＤＴＳ９Ａタンパク質を、ウサギ（日本白色種）に１０〜１４日間隔で計５回免疫した後、抗血清を調製した。この抗血清より、まずＩｇＧ画分をプロテインＧセファロースＦＦカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でアフィニティー精製し、続いて、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２８０番〜第４１０番のアミノ酸からなるペプチドと、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質（ＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａ）を固定したカラム（ＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａカラム）でアフィニティー精製を行ない、抗ヒトＭＤＴＳ９抗体とした。プロテインＧセファロースＦＦカラムでのアフィニティー精製、並びにＣＮＢｒ活性化セファロースＦＦカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）へのＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａの固定及びＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａカラムでのアフィニティー精製は、添付説明書に従った。また、ＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａの大腸菌での生産及び精製は、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を発現ベクターとして用い、同社の「ｐＭＡＬ蛋白融合及び精製システム」の指示書に従った。
（２）ヒト腎臓でのＭＤＴＳ９タンパク質の検出
スライドガラス上にホルマリン固定及びパラフィン包埋した組織切片に、参考例７（１）で調製した抗ヒトＭＤＴＳ９抗体を反応させた後、市販の染色キット（ベクタステインＡＢＣ−ＡＰキット，カタログ番号ＡＫ−５０００；ベクター社製）を用いて、添付説明書に従い、染色した。その際、二次抗体としてビオチン標識抗ウサギ抗体（カタログ番号ＢＡ−１０００；ベクター社製）、発色基質としてアルカリフォスファターゼ基質キットＩ（カタログ番号ＳＫ−５１００；ベクター社製）を用いた。その結果、健常人及び糖尿病性腎症（初期又は後期）患者の腎臓において、上皮細胞、中でも特に糸球体上皮細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅｓ）での染色が認められた。
本参考例から、ＭＤＴＳ９タンパク質がヒト腎臓で発現していることが明らかである。
実施例１：ＭＤＴＳ９遺伝子５’上流域遺伝子のクローニング
ヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型にし、配列番号１８と配列番号１９で示されるオリゴＤＮＡをプライマー、ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社）をＤＮＡポリメラーゼとして、９７℃３分の後、９６．５℃３０秒、７２℃２分のサイクルを５回、続いて９６．５℃３０秒、７０℃２分のサイクルを５回、続いて９６．５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを５回、続いて９６．５℃３０秒、６３℃２５秒、７２℃２分のサイクルを２５回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲを行い、生成した約２ｋｂｐ断片をｐＺＥｒＯＴＭ−２．１（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＶ認識部位にサブクローニングした。ここで得られたサブクローンの塩基配列を確認した結果、ＭＴＤＳ９遺伝子５’上流域の配列であることが確認でき、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で示される遺伝子であった。このサブクローンを鋳型、配列番号２０と配列番号２１で示されるオリゴＤＮＡをプライマーとし、ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社）を用いて、９５℃３分の後、９７℃２０秒、５９℃３０秒、７２℃２分のサイクルを３５回、続いて７２℃３分の条件でＰＣＲを行い、５’側に制限酵素ＳａｃＩ認識配列、３’側に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を導入した約１．８ｋｂｐ断片を生成した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ処理し、ルシフェラーゼアッセイシステム用ベクター（ＰｉｃａＧｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ２  ベーシックベクター；東洋インキ社）のＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ２ｋを得た。
また、５’側にＭｌｕＩ認識配列を付加した配列番号２２で示されるオリゴＤＮＡと配列番号２３で示されたオリゴＤＮＡのセットと、配列番号２４と２５で示されるオリゴＤＮＡのセットをプライマー、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型とし、ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社）を用い、９６℃２分の後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃１分のサイクルを４０回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲを行なった。こうして生成した約６００ｂｐ、１ｋｂｐの断片をｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にサブクローニングし、サブクローンｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−１、ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−３を得た。また、配列番号２６と２７で示されるオリゴＤＮＡのセット、配列番号２８と２９で示されるオリゴＤＮＡのセットをプライマーとし、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型、ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社）を用い、９６℃２分の後、９７℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４０回、続いて７２℃７分の条件でＰＣＲを行なった。こうして生成した約１．６ｋｂ、１．９ｋｂの断片をｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にサブクローニングし、サブクローンｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−２、ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−４を得た。ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−３をＫｐｎＩ、ＳｍａＩ処理して生成した約０．５ｋｂｐの断片とｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−４をＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ処理して生成した約１．５ｋｂｐの断片を連結し、ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）のＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−５を得た。ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−１をＭｌｕＩ、ＳｐｈＩ処理して得られる約０．４ｋｂｐの断片、ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−２をＳｐｈＩ、ＫｐｎＩ処理して得られる約１．５ｋｂｐの断片、ｐＣＲ４ＢＩｕｎｔ−ＴＯＰＯ５ｋ−５をＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ処理して得られる約２．１ｋｂｐの断片を連結し、ｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ２ｋのＭｌｕＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ５ｋを得た。ここで得られたサブクローンの塩基配列を確認した結果、配列番号１７で示される遺伝子であった。
実施例２：ＭＤＴＳ９プロモーター領域ＤＮＡ配列の解析
実施例１で得られたプラスミドｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ２ｋ又はｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ５ｋを参考例３に示す方法でＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に導入し、そのまま、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１０％牛胎児血清、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ナカライテスク社製）で、４８時間培養を継続した後、ＰｉｃａＧｅｎｅ発色キット（東洋インキ社）を用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。この際、測定値は同時導入したβ−ｇａｌ発現プラスミド（ｐＣＨ１１０；アマシャムファルマシアバイオテック社）より発現したβ−ｇａｌの活性値で補正した。β−ｇａｌ活性の測定はＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓキット（ＴＲＯＰＩＸ社）を用いた。その結果、ｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ２ｋでは約２７倍の、及びｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ５ｋでは約２７〜４０倍の、もとのプラスミドであるｐＧＶ−Ｂ２では認められないルシフェラーゼ活性の明らかな上昇が観察された。このことは上記ＤＮＡ断片中にプロモーター活性が存在することを示している。
実施例３：ＭＤＴＳ９プロモーター領域ＤＮＡ配列のＴＧＦ−β、ＩＬ−１応答性
実施例１で得られたプラスミドｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ５ｋを参考例３に示す方法でＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に導入し、そのまま１６時間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ナカライテスク社）に置換し、６時間培養した（以下、無血清培養）。続いて、ＴＧＦ−β（シグマ社製）又はＩＬ−１（シグマ社製）を添加し、２４時間培養後のルシフェラーゼ活性を測定した。測定値は、実施例２同様、β−ｇａｌの活性値で補正した。その結果、ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）添加により約１．７倍のルシフェラーゼ活性上昇が、ＩＬ−１（１ｎｇ／ｍｌ）添加により約０．７倍以下までルシフェラーゼ活性の減弱が観察された（図１、図２）。このことは上記ＤＮＡ断片中にＴＧＦ−β応答領域、ＩＬ−１応答領域が存在することを示している。一方、ｐＧＶ−Ｂ２−ＭＤＴＳ９ｐｒｏ２ｋを導入した細胞について、同様に、ＴＧＦ−βを添加してルシフェラーゼ活性を測定したところ、ルシフェラーゼ活性はコントロールと同等であった。
【産業上の利用可能性】  本発明のプロモーターは、腎不全モデル動物において遺伝子発現量が増加しており、ＴＧＦ−βにより誘導され、ＩＬ−１により阻害され、細胞外マトリクスの代謝に関与する、ヒトの腎臓に発現しているプロテアーゼＭＤＴＳ９のプロモーターであるので、本発明のプロモーターの活性を阻害する物質は、ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に関わる部分だけを抑制又は阻害し、長期投与が想定される慢性腎不全治療及び／又は予防剤として有用である。したがって、本発明のプロモーターであるポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞は、慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニングツールとして有用であり、本発明のプロモーターであるポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞を用い、慢性腎不全治療及び／又は予防剤のスクリーニングが可能である。また、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の品質規格の確認試験における本発明のプロテアーゼの活性を阻害するか否かを分析する工程、及び製剤化工程を含む、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造も可能とした。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３及び４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したリンカー配列である。また、配列表の配列番号５〜９、１３及び１４、及び２０〜２２の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。更に、配列表の配列番号１１の配列で表されるアミノ酸配列は、制限酵素ＮｏｔＩ認識ヌクレオチド配列及びＦＬＡＧタグアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡの発現により得られるアミノ酸配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
2004001047.tif 000002
【図２】
2004001047.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月24日(2004.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、又は、配列番号１７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】 下記（１）乃至（３）から選択されるいずれかの塩基配列を含み、配列番号２記載のポリペプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１）配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列、
（２）配列番号１７で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７記載の塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列、並びに、
（３）配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、又は、配列番号１７で表される塩基配列。
【請求項３】  請求項２記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項４】  請求項１記載のポリヌクレオチド、又は、請求項３記載の細胞からなる慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングツール。
【請求項５】  請求項１記載のポリヌクレオチド、又は、請求項３記載の細胞の慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングのための使用。
【請求項６】  （１）請求項３記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び（２）プロモーター活性を検出する工程を含む、試験化合物が請求項１乃至請求項２記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法。
【請求項７】  請求項６記載の方法による分析工程、及びプロモーター活性を阻害する物質を選択する工程を含む、配列番号２記載のポリペプチドの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】  請求項７記載の方法により、慢性腎不全治療及び／又は予防用物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】  請求項６記載の方法による分析工程、及び製剤化工程を含む、慢性腎不全治療及び／又は予防用医薬組成物の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月10日(2004.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、又は、配列番号１７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】  下記（１）乃至（３）から選択されるいずれかの塩基配列を含み、配列番号２記載のポリペプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１）配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列、
（２）配列番号１７で表される塩基配列、あるいは、配列番号１７記載の塩基配列の中において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されている塩基配列、並びに、
（３）配列番号１７の３２５３番目から５０２３番目で表される塩基配列、又は、配列番号１７で表される塩基配列。
【請求項３】  請求項２記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項４】  請求項１記載のポリヌクレオチド、又は、請求項３記載の細胞からなる慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングツール。
【請求項５】  請求項１記載のポリヌクレオチド、又は、請求項３記載の細胞の慢性腎不全治療及び／又は予防用物質スクリーニングのための使用。
【請求項６】  （１）請求項３記載の細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び（２）プロモーター活性を検出する工程を含む、試験化合物が請求項１乃至請求項２記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法。
【請求項７】  請求項６記載の方法による分析工程、及びプロモーター活性を阻害する物質を選択する工程を含む、配列番号２記載のポリペプチドの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】  請求項７記載の方法により、慢性腎不全治療及び／又は予防用物質をスクリーニングする方法。
【国際調査報告】
2004001047.tif 000004
2004001047.tif 000005