(57)【要約】配列番号９で示されるＡＣＴ１遺伝子プロモーター、配列番号１０で示されるＧＡＰ３遺伝子プロモーター、配列番号１１で示されるＰＭＡ１遺伝子プロモーター、及び、配列番号１２で示されるＴＥＦ１遺伝子プロモーター；当該プロモーターを含む遺伝子発現ユニットを含んでなるプラスミド；当該プラスミドを導入した形質転換細胞；並びに、当該形質転換細胞を培養することからなる、共重合ポリエステルの生産方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＡＣＴ１遺伝子プロモーター。
（ａ）配列番号９で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号９で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号９で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号９で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
【請求項２】
請求の範囲第１項記載のＡＣＴ１遺伝子プロモーターと、そのプロモーター配列の下流に連結された構造遺伝子からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求の範囲第２項記載のＤＮＡとターミネーターからなる遺伝子発現ユニット。
【請求項４】
請求の範囲第３項記載の遺伝子発現ユニットを含んでなるプラスミド。
【請求項５】
プラスミドがｐＵＴＡ−ＡＣＴ１−ＯＲＦ２Ｓである請求の範囲第４項記載のプラスミド。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＧＡＰ３遺伝子プロモーター。
（ａ）配列番号１０で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１０で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１０で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１０で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
【請求項７】
請求の範囲第６項記載のＧＡＰ３遺伝子プロモーターと、そのプロモーター配列の下流に連結された構造遺伝子からなるＤＮＡ。
【請求項８】
請求の範囲第７項記載のＤＮＡとターミネーターからなる遺伝子発現ユニット。
【請求項９】
請求の範囲第８項記載の遺伝子発現ユニットを含んでなるプラスミド。
【請求項１０】
プラスミドがｐＵＴＡ−ＧＡＰ３−ＯＲＦ２Ｓである請求の範囲第９項記載のプラスミド。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＰＭＡ１遺伝子プロモーター。
（ａ）配列番号１１で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１１で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１１で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１１で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求の範囲第１１項記載のＰＭＡ１遺伝子プロモーターと、そのプロモーター配列の下流に連結された構造遺伝子からなるＤＮＡ。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項記載のＤＮＡとターミネーターからなる遺伝子発現ユニット。
【請求項１４】
請求の範囲第１３項記載の遺伝子発現ユニットを含んでなるプラスミド。
【請求項１５】
プラスミドがｐＵＴＡ−ＰＭＡ１−ＯＲＦ２Ｓである請求の範囲第１４項記載のプラスミド。
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＴＥＦ１遺伝子プロモーター。
（ａ）配列番号１２で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１２で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１２で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１２で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
【請求項１７】
請求の範囲第１６項記載のＴＥＦ１遺伝子プロモーターと、そのプロモーター配列の下流に連結された構造遺伝子からなるＤＮＡ。
【請求項１８】
請求の範囲第１７項記載のＤＮＡとターミネーターからなる遺伝子発現ユニット。
【請求項１９】
請求の範囲第１８項記載の遺伝子発現ユニットを含んでなるプラスミド。
【請求項２０】
プラスミドがｐＵＴＡ−ＴＥＦ１−ＯＲＦ２Ｓである請求の範囲第１９項記載のプラスミド。
【請求項２１】
宿主細胞に、請求の範囲第２、７、１２または１７項記載のＤＮＡを導入した形質転換細胞。
【請求項２２】
宿主細胞に、請求の範囲第４、５、９、１０、１４、１５、１９または２０項記載のプラスミドを導入した形質転換細胞。
【請求項２３】
宿主細胞がキャンディダ・マルトーサである請求の範囲第２１または２２項記載の形質転換細胞。
【請求項２４】
構造遺伝子が、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来の遺伝子である請求の範囲第２１〜２３項いずれか１項に記載の形質転換細胞。
【請求項２５】
請求の範囲第２４項に記載の形質転換細胞を培養することを特徴とする、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルの生産方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、キャンディダ属酵母において遺伝子発現を可能にするプロモーターに関する。詳しくは、キャンディダ属酵母において、培養条件や培地条件等の誘導条件に依存することなく構成的且つ高効率に有用遺伝子を発現できるプロモーターに関する。
背景技術
遺伝子組換え技術の発展に伴い、微生物を用いて有用蛋白質並びに有用化学品等の生産が行われてきた。原核生物である大腸菌や枯草菌を用いた遺伝子組換え系の開発が積極的に進められ、その中でも、特に大腸菌の宿主・ベクター系を用いて様々な有用物質の生産が行われている。しかし、大腸菌において生産される蛋白質は菌体内で不溶性顆粒を形成することがあり、また、真核生物において特徴的な糖鎖付加を行うことができないなどの問題もあった。
これに対して真核生物である酵母を宿主とした系の開発も進められた。酵母は古くから醸造や製パンに利用されており、またかつて飼料用として生産された経験もあり、高い安全性が保証されている。また、生産される蛋白質に糖鎖付加を行うことも原核生物とは区別される特徴である。
遺伝学的知見が豊富なサッカロマイセス・セレビジェの他、シワニオマイセス属、クルイベロマイセス属、ピキア属、ハンセヌラ属、ヤロウィア属、キャンディダ属において、宿主・ベクター系が開発されている（Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ著，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版）。
これらの酵母の中には、直鎖炭化水素鎖（ｎ−アルカン）が唯一の炭素源であっても生育できるものがある。キャンディダ属のキャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などや、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などである。これらの酵母はｎ−アルカンの末端を酸化する酵素系をもち、酸化によって生じた長鎖カルボン酸を、ペルオキシソームのβ酸化系によってＴＣＡサイクルの基質となるアセチル−ＣｏＡにまで分解し、エネルギー源として利用することができる。
ｎ−アルカン資化性酵母は直鎖炭化水素を炭素源として生育するばかりでなく、通常の酵母の生育を阻害する疎水性物質に耐性であり、疎水性化学物質の変換による有用物質の生産・反応の場を提供する宿主としても有望である。したがって、このような酵母における遺伝子発現系を構築することによって、有害な副産物を生み出さず、エネルギーを浪費しない、新たな有用化学物質生産系を構築することができる。
ｎ−アルカン資化性酵母のうちキャンディダ・マルトーサにおいて、遺伝子発現系の構築が積極的に行われてきた。Ｍ．Ｋａｗａｍｕｒａらはキャンディダ・マルトーサより高効率形質転換の原因領域（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ：以下ＴＲＡと略す）を見出した（Ｍ．Ｋａｗａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２４，１５７，（１９８３））。この領域にはキャンディダ・マルトーサにおいて自律的複製に関わる配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：以下ＡＲＳと略す）およびセントロメア配列（以下ＣＥＮと略す）が含まれていることが判った。現在までにＴＲＡ全領域を有する低コピー数ベクターと、導入遺伝子高発現が期待できるＣＥＮ領域を除いた高コピー数ベクターが開発されている（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．２４９，４４７，（１９９５））。
キャンディダ・マルトーサにおける遺伝子発現のためには同酵母内で機能するプロモーターが必要であり、複数のプロモーターが利用可能になっている。キャンディダ・マルトーサはｎ−アルカン酸化系の酵素をアルカンの存在下に高生産する。特にアルカンの初発酸化を行うチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の転写（以下ＡＬＫと略す）は強く誘導され（Ｍ．Ｏｈｏｋｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４，１６３，（１９９５））、またβ酸化系の酵素をコードする遺伝子の転写も誘導される（Ｙ．Ｍａｓｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ，１６７，１５７，（１９９５））。ＡＬＫ遺伝子群のうちＡＬＫ１遺伝子のプロモーターは、ｎ−アルカンによって遺伝子発現を最も強く誘導し、遺伝子発現に利用することができる。また、脂肪酸存在下ではＡＬＫ２やＡＬＫ５遺伝子のプロモーターが適している。
解糖系の酵素として知られているホスホグリセリン酸キナーゼ（以下ＰＧＫと略す）のプロモーターは、グルコースの存在下で強力な遺伝子発現を誘導することが知られている。キャンディダ・マルトーサのＰＧＫプロモーターがＹ．Ｍａｓｕｄａ等によってクローニングされた（Ｙ．Ｍａｓｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．２５，４１２，（１９９４））。更に、ガラクトース存在下において強力な遺伝子発現誘導活性を有するＧＡＬプロモーターもクローニングされた（Ｓ．Ｍ．Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．１３，２１（１９９７））。このようにしてクローニングされたＡＬＫプロモーター、ＰＧＫプロモーターやＧＡＬプロモーターはキャンディダ・マルトーサにおける遺伝子発現に利用することができる。
しかしながら、ＡＬＫプロモーターはブドウ糖等の炭素源を利用する場合にはほとんど機能せず、またＰＧＫプロモーターは脂肪酸やｎ−アルカンを炭素源とした場合にほとんど機能しない。このためキャンディダ・マルトーサにおける有用物質の生産において、当該物質の生産に適した炭素源が必ずしも強力な遺伝子発現に適しているとはいえない。更にＧＡＬプロモーターはガラクトースを炭素源としたときにのみ誘導されることから、高価なガラクトースを利用しなければならない点で工業生産には適さないといえる。
そこで、キャンディダ・マルトーサにおいて高効率な有用物質の生産のためには、炭素源の種類による制限を受けず、強力に遺伝子発現できる新規プロモーターが望まれていた。
一方、サッカロマイセス・セレビジェではアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ３遺伝子（以下ＧＡＰ３と略す）、ＰＧＫ、ＧＡＬのプロモーターなどが既にクローニングされ、異種遺伝子発現用のプロモーターとして広く利用されており、同酵母を宿主とした場合にこれらのプロモーター活性が強力であることが判っている。そこで、キャンディダ・マルトーサを宿主とした場合でも高発現が期待できるが、キャンディダ・マルトーサのこれらのプロモーター領域遺伝子は未だクローニングされておらず、クローニングが待たれていた。
しかしながら、キャンディダ属酵母は、サッカロマイセス・セレビジェとは異なり有性世代が知られておらず、多くは２倍体ゲノムを有している。また、その遺伝暗号読みとりに異常があることも報告されている。キャンディダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａｅ）（Ｙ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３４１，１６４（１９８９））やキャンディダ・マルトーサ（Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．１１，４３（１９９５））は通常ロイシンをコードするＣＵＧコドンをセリンとして読むことが報告されている。このように、キャンディダ属酵母はサッカロマイセス・セレビジェとは大きく異なる性質を有しているといえるため、サッカロマイセス・セレビジェ由来のプロモーター領域がそのままキャンディダ属酵母内で同等のプロモーター活性を有するかどうかは不明であった。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、キャンディダ属酵母、特にキャンディダ・マルトーサにおいて炭素源の種類によって影響を受けることなく、構成的且つ高効率に有用物質の生産を行うことができる新規プロモーターを提供するものである。
本発明者等は鋭意研究を行った結果、キャンディダ・マルトーサのアクチン合成酵素１遺伝子（以下ＡＣＴ１と略す）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ３遺伝子（以下ＧＡＰ３と略す）プロモーター、原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ１遺伝子（以下ＰＭＡ１と略す）プロモーター、翻訳伸長因子１遺伝子（以下ＴＥＦ１と略す）プロモーターの配列を初めて同定し、それらプロモーターが、従来のＡＬＫプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＬプロモーターと、同等或いはそれ以上のプロモーター活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＡＣＴ１遺伝子プロモーターである。
（ａ）配列番号９で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号９で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号９で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号９で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＧＡＰ３遺伝子プロモーターでもある。
（ａ）配列番号１０で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１０で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１０で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１０で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＰＭＡ１遺伝子プロモーターでもある。
（ａ）配列番号１１で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１１で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１１で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１１で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡからなるＴＥＦ１遺伝子プロモーターでもある。
（ａ）配列番号１２で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１２で示される塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１２で示される塩基配列において、少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１２で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡ。
また本発明は、上記いずれかのプロモーターと、そのプロモーター配列の下流に連結された構造遺伝子からなるＤＮＡでもある。
また本発明は、上記ＤＮＡとターミネーターからなる遺伝子発現ユニットでもある。
また本発明は、上記遺伝子発現ユニットを含んでなるプラスミドでもある。
また本発明は、宿主細胞に、上記ＤＮＡ又は上記プラスミドを導入した形質転換細胞でもある。
また本発明は、構造遺伝子が、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来の遺伝子である上記形質転換細胞を培養することからなる、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルの生産方法でもある。
発明の詳細な開示
キャンディダ・マルトーサ由来のＡＣＴ１遺伝子プロモーター、ＧＡＰ３遺伝子プロモーター、ＰＭＡ１遺伝子プロモーター、そしてＴＥＦ１遺伝子プロモーターは、本発明において初めてその配列が同定された、新規なプロモーターである。以下、その詳細について説明する。
（１）新規プロモーターのクローニング
ＡＣＴ１遺伝子は細胞骨格を構成するアクチンの合成に関与する酵素の一種、ＧＡＰ３遺伝子は解糖系酵素の一種、ＰＭＡ１遺伝子はサッカロマイセス属の酵母においては原形質膜蛋白の約１０％を占めると言われる原形質膜蛋白の一種、ＴＥＦ１遺伝子は蛋白質合成における翻訳伸長因子の１種であり、いずれのプロモーターもサッカロマイセス・セレビジェでは強力なプロモーターとして知られている。
本発明においてキャンディダ・マルトーサのＡＣＴ１遺伝子、ＧＡＰ３遺伝子、ＰＭＡ１遺伝子およびＴＥＦ１遺伝子のプロモーター領域をハイブリダイゼーション法によりクローニングするため、まず比較的近縁の属であるサッカロマイセス・セレビジェよりそれぞれ対応する構造遺伝子の部分ＤＮＡ配列をＰＣＲ法で増幅し、プローブ断片として用いた。例えばサッカロマイセス・セレビジェのＡＣＴ１遺伝子配列は既に報告されている（Ｄａｎｉｅｌ．Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．５１，１５９３（２００１））。その配列からサッカロマイセス・セレビジェのＡＣＴ１遺伝子増幅用ＰＣＲプライマーが合成できる。サッカロマイセス・セレビジェのＧＡＰ３構造遺伝子配列は、既に報告されている（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２５４，５４６６（１９７９））。その配列からサッカロマイセス・セレビジェのＧＡＰ３遺伝子増幅用ＰＣＲプライマーが合成できる。またサッカロマイセス・セレビジェのＰＭＡ１遺伝子配列はＣａｐｉｅａｕｘ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６４，７４３７（１９８９）により既に報告されている。その配列からサッカロマイセス・セレビジェのＰＭＡ１構造遺伝子増幅用ＰＣＲプライマーが合成できる。サッカロマイセス・セレビジェのＴＥＦ１構造遺伝子配列はＣｏｔｔｒｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６０，３０９０（１９８５）により既に報告されている。その配列からサッカロマイセス・セレビジェのＴＥＦ１構造遺伝子増幅用ＰＣＲプライマーが合成できる。
サッカロマイセス・セレビジェ及びキャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡは市販の試薬等を用いて分離できる。分離したサッカロマイセス・セレビジェの染色体ＤＮＡをＰＣＲの鋳型とし、上記の合成したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、それぞれのプライマーに対応してサッカロマイセス・セレビジェのＡＣＴ１、ＧＡＰ３、ＰＭＡ１又はＴＥＦ１構造遺伝子の一部分を増幅することが可能である。増幅したＤＮＡ断片を放射性化合物或いはアルカリフォスファターゼなどで標識する事により、ハイブリダイゼーションの検出プローブとする事ができる。
キャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡを分離し、適当な制限酵素で断片化し、アガロースゲル電気泳動後、上記検出プローブとサザン・ハイブリダイゼーションを行って、それぞれ目的とするプロモーター配列を含むと考えられる断片の長さを推定できる。各プロモーター毎に前記サザン・ハイブリダイゼーションに使用した制限酵素でキャンディダ・マルトーサの染色体を切断処理し、クローニングベクターを用いて遺伝子ライブラリーを作製できる。このライブラリーを抗生物質を含む寒天培地上に適当数コロニーが出現するように形質転換した後、ニトロセルロース膜上で培養し、この膜をアルカリ変性、次に中和、続いて洗浄、乾燥した後、ハイブリダイゼーションを行うことによりキャンディダ・マルトーサのそれぞれのプロモーターを含む染色体ＤＮＡ断片をクローニングする事が可能である。ここで得られるＤＮＡ断片はプロモーター領域だけでなく構造遺伝子も含んでいる。そこで、サッカロマイセス・セレビジェなどの塩基配列が既知の対応するプロモーターや構造遺伝子との塩基配列の類似性（相同性）から判断し、一般的な手法を用いて、プロモーター領域の同定や構造遺伝子との分離を行い、プロモーターの塩基配列を決定することができる。
以上の手法により、本発明の新規なＡＣＴ１遺伝子プロモーター、ＧＡＰ３遺伝子プロモーター、ＰＭＡ１遺伝子プロモーターおよびＴＥＦ１遺伝子プロモーターを得ることができる。これらプロモーターの塩基配列を、それぞれ、配列番号９、１０、１１、１２に示す。
本発明の上記プロモーターは、上述した手法を用いて得ても良いし、塩基配列が同定されたことから、化学的に合成して得ることも可能である。
本発明のプロモーターは、上記配列番号９、１０、１１または１２で示されるＤＮＡだけでなく、プロモーター活性を有する限り、上記配列番号で示される塩基配列を含むＤＮＡであってもよいし、上記配列番号で示される塩基配列において少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡであってもよいし、上記配列番号で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、キャンディダ属酵母由来のＤＮＡであってもよい。
上記配列番号で示される塩基配列を含むＤＮＡ、及び、上記配列番号で示される塩基配列において少なくとも１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡとは、蛋白核酸酵素  増刊  遺伝子増幅ＰＣＲ法  ＴＡＫＫＡＪ  ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編  加藤郁之進監訳  ＰＣＲテクノロジー（１９９０）などに記載の当業者に周知の方法により欠失、追加、挿入及び／又は置換できる程度の数の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されてなる塩基配列からなるＤＮＡのことをいう。
上記配列番号で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、上記配列番号に示す塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、又はサザン・ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡのことをいう。
本発明のＤＮＡは、上記配列番号で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなるものが好ましい。相同性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましい。
「相同性」は、対比する２つの塩基配列を最適に整列させた後、塩基（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ又はＩ）が両方の配列で適合した位置の数を適合位置数とし、これを比較塩基総数で除して、そして、この結果に１００を乗ずることにより算出する。具体的には、日立ソフトエンジニアリング製のＤＮＡＳＩＳ、ソフトウェア開発のＧＥＮＥＴＹＸ、又は、Ｆｉｎｌａｎｄ  ＣＳＣのＣｌｕｓｔａｌ  Ｘといった解析ソフトを用いて算出することができる。
これらＤＮＡは、上述した当業者に周知の方法により上記配列番号で示されるＤＮＡに対して少なくとも１つの塩基の欠失、追加、挿入及び／又は置換を行うことにより、また、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に準じてハイブリダイゼーションを実施したりすることで容易に取得することができる。
本発明において「プロモーター活性を有する」プロモーターとは、後述するプロモーターの機能解析によって測定した酵素活性が、上記配列番号で示されるＤＮＡについて同条件下で測定された酵素活性に対して、５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を示すプロモーターのことをいう。
（２）プロモーター機能の解析
新規プロモーターの機能解析は、同プロモーターによって転写されるｍＲＮＡや同ｍＲＮＡから翻訳される遺伝子産物を定量することによって行うことができる。
本発明のプロモーターは、その下流に構造遺伝子を連結させることで、該構造遺伝子の機能を発現させることができる。本発明で用いられる構造遺伝子としては特に限定されないが、例えば、ポリヒドロキシアルカノエート（特に、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ））の合成に関与する酵素をコードする遺伝子、抗体遺伝子、リンホカイン等の有用蛋白質をコードする遺伝子等が挙げられる。
さらに、必要であれば、本発明のプロモーター、およびその下流に連結された構造遺伝子に、ターミネーターを加えた遺伝子発現ユニットとして用いることができる。ここで、用いられるターミネーターとしては、目的とする発現系で使用しうるものであれば、適宜公知のターミネーターを使用することができる。上記ターミネーターとしては特に限定されないが、ＡＬＫ１、ＧＣＮ４等が挙げられる。
また、前記遺伝子発現ユニットをプラスミドに組み込んで利用することもできる。本発明において用いられるプラスミドとしては特に限定されないが、ｐＵＴＵ１，ｐＢＴＨ１０Ｂ（Ｎａｋａｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７９，５０３０（１９９７））等が挙げられる。
本発明において、上記プラスミドを、発現系となる宿主細胞に導入して形質転換細胞を作製し、これら形質転換細胞を培養して、導入した構造遺伝子を発現させることができる。また、プラスミドを導入するのではなく、本発明のプロモーターとその下流に連結された構造遺伝子からなるＤＮＡを、直接宿主の染色体に組み込んでもかまわない。ここで用いられる宿主としては、本発明のプロモーターが機能するものであれば特に限定されないが、キャンディダ属酵母が好ましく、特にキャンディダ・マルトーサが好ましい。
本発明のプラスミドの宿主細胞への形質転換は、公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウム法（Ｅ．Ｍ．Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１１９，１０７２（１９７４））や、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４項、１９９４年）等を用いることができる。また、Ｆａｓｔ  ＴｒａｃｋＴＭ−Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＫｉｔＳＭ（Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような市販の形質転換キットを利用することもできる。
得られた形質転換体を用いての新規プロモーターの機能解析は、同形質転換体が資化できる炭素源を用いて培養して行うことができる。培養には、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％）やＹＮＢ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ０．６７％）等に炭素源を加えた、一般的に形質転換体の培養に用いられる培地が利用できる。また、完全合成培地なども利用可能である。本発明で用いられる炭素源としては特に限定されないが、例えば、グルコース、マルトース等の糖類；ｎ−アルカン、脂肪酸、油脂等が利用できる。培養温度、培養時間は形質転換体が好適に増殖可能であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１０℃〜４０℃で２時間〜７２時間培養を行うことができる。培養の終了した菌体は、培養液又は菌体内蛋白質を解析することによりプロモーターの機能解析を行うことができる。プロモーターの下流に接続した遺伝子から発現する酵素などが菌体外に発現する場合は菌体を破砕する必要はないが、菌体内に留まる場合は菌体処理が必要となる。菌体処理を行う方法は特に限定されるものではないが、菌体をＺｙｍｏｌｙａｓｅ等の細胞壁溶解酵素により消化した後に超音波処理や凍結融解法等を用いることができる。また、ガラスビーズを用いて直接物理的破砕を行うこともできる。
プロモーターの機能解析は、プロモーターの下流に接続する遺伝子から発現する酵素等の活性や量を特異的に検出できる方法を用いて行うことができる。特に限定されることはないが、例えば、（１）でクローニングしたそれぞれのプロモーター領域を用いて、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の合成に関与する酵素をコードする、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来の遺伝子（以下ＯＲＦ２Ｓと略す）発現ベクターを構築し、その酵素活性を以下の文献の方法により測定して行うことができる（Ｖａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ．４０，６９９，（１９９４））。具体的には、ＯＲＦ２Ｓを用いてプロモーターの活性を測定する場合は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡがＯＲＦ２Ｓにより取り込まれる際に遊離するＣｏＡ−ＳＨを、ＣｏＡ−ＳＨと等モルで反応するＤＴＮＢ（５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））と反応させ、この時遊離ＣｏＡ−ＳＨと等モルで生ずるイオン化ＴＮＢ（２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸）に由来する４１２ｎｍ付近の吸光度の単位時間当たりの増加を測定することで、簡便に酵素活性を測定することができる。
得られた酵素活性の値は、酵素活性測定に用いた菌体破砕溶液の蛋白質量を用いて標準化することで、本発明によるプロモーターにより発現する酵素比活性として表記することができ、プロモーター活性として相互に比較することができる。
本発明のプロモーターのうち、ＡＣＴ１遺伝子プロモーター、ＰＭＡ１遺伝子プロモーターおよびＴＥＦ１遺伝子プロモーターは、いずれも生育に不可欠な遺伝子のプロモーターであり、従って、炭素源の種類に制限されず、キャンディダ・マルトーサが生育しうる条件であれば、機能しうるプロモーターである。またＧＡＰ３遺伝子プロモーターは解糖系の酵素のプロモーターであり、特に炭素源としてグルコースを用いた場合に非常に強力な発現が期待できるという点で従来のプロモーターにない性質を有している。
本発明の生産方法においては、構造遺伝子が、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来の遺伝子である上記形質転換細胞を培養することにより、上記共重合ポリエステルを生産することができる。
この際の培養に用いる炭素源としては、形質転換体が資化できるものであればどのようなものでもよい。炭素源以外の栄養源としては窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地が使用できる。培養温度はその菌の生育可能な温度であればよいが、２０℃〜４０℃が好ましい。培養時間には特に制限はないが、１〜７日程度で良い。その後、得られた該培養菌体又は培養物からポリエステルを回収すればよい。
炭素源としては、グルコース、グリセリン、シュークロース等の炭水化物、油脂類、脂肪酸類、さらにはｎ−パラフィン等を用いることができる。油脂としては、例えば、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油などが挙げられる。脂肪酸としては、例えば、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいは、これら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。一例として、キャンディダ・マルトーサの培養において、炭素源として油脂を用いて培養することもできる。また、油脂を資化ができないかまたは効率よく資化できない形質転換体では、培地中にリパーゼを添加することによって改善することもできる。さらに、リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資化能を付与することもできる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えば、アミノ酸類（例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等）、ビタミン類（例えばビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等）等が挙げられる。
本発明において、ポリエステルの菌体からの回収は、例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液を遠心分離器などで菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体をクロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液を濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。沈殿したポリエステルを濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
（実施例１）酵母染色体ＤＮＡの調製
サッカロマイセス・セレビジェ及びキャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡはＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔｓ（ＯＭＥＧＡ  ＢＩＯＴＥＫ社製）を用いて調製した。調製方法は、同Ｋｉｔに付属する説明書に従った。
（実施例２）サッカロマイセス・セレビジェのＡＣＴ１、ＧＡＰ３、ＰＭＡ１及びＴＥＦ１遺伝子断片の増幅
既に塩基配列が明らかにされているサッカロマイセス・セレビジェのＡＣＴ１、ＧＡＰ３、ＰＭＡ１及びＴＥＦ１遺伝子断片の増幅は以下のように行った。実施例１で調製したサッカロマイセス・セレビジェ染色体ＤＮＡを鋳型として、ＡＣＴ１用には配列番号１及び２、ＧＡＰ３用には配列番号３及び４、ＰＭＡ１用には配列番号５及び６、ＴＥＦ１用には配列番号７及び８に示した合成ＤＮＡをプライマーとして、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いてＰＣＲにより増幅させた。その条件は、同Ｋｉｔに付属する説明書に従ったが、詳しくは、鋳型ＤＮＡ１μｇ、それぞれ終濃度１μＭの２種類のプライマー、２．５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ、付属するＢｕｆｆｅｒを０．０１ｍｌ、付属するｄＮＴＰ混合液を０．００８ｍｌに水を加えて０．１ｍｌとした。これを、９８℃１５秒、５５℃１分、７２℃１分を１サイクルとして２５サイクルのＰＣＲを行って、サッカロマイセス・セレビジェの約４００ｂｐのＡＣＴ１遺伝子断片、或いは約１ｋｂのＧＡＰ３遺伝子断片、或いは約２．８ｋｂのＰＭＡ１遺伝子断片、或いは約１．５ｋｂのＴＥＦ１遺伝子断片を増幅させた。
（実施例３）標識プローブ断片の調製、ハイブリダイゼーション、洗浄、陽性クローンの検出
増幅させたそれぞれのプローブ断片は、アマーシャムファルマシア社製Ｇｅｎｅ  ｉｍａｇｅｓ  ＡｌｋＰｈｏｓキットを用い、付属する説明書に従ってアルカリフォスファターゼにより標識した。
ハイブリダイゼーションはアマーシャムファルマシア社製Ｇｅｎｅ  ｉｍａｇｅｓ  ＡｌｋＰｈｏｓキットを用い、付属する説明書に従って５５℃で一晩行った。
洗浄は、アマーシャムファルマシア社製Ｇｅｎｅ  ｉｍａｇｅｓ  ＡｌｋＰｈｏｓキットを用い、付属する説明書に従って５５℃及び室温で行った。
陽性クローンの検出は、アマーシャムファルマシア社製ＣＤＰ−Ｓｔａｒキットを用い、付属する説明書に従って行った。
（実施例４）キャンディダ・マルトーサＡＣＴ１遺伝子プロモーター領域のクローニング
実施例１で調製したキャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動にて約１ｋｂ〜３ｋｂの断片をゲルから抽出した。この断片をｐＵＣ１９を制限酵素ＢａｍＨＩで処理したものと連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に形質転換した。同形質転換株約３０００個をアルカリフォスファターゼで標識したサッカロマイセス・セレビジェＡＣＴ１遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、６株の陽性クローンが得られ、挿入されていた断片の部分塩基配列を決定したところ、キャンディダ・マルトーサのＡＣＴ１プロモーター領域を含む遺伝子であった。クローニングした断片の一部配列を配列番号９に示した。
（実施例５）キャンディダ・マルトーサＧＡＰ３遺伝子プロモーター領域のクローニング
実施例１で調製したキャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動にて約７ｋｂ〜９ｋｂの断片をゲルから抽出した。この断片をｐＵＣ１９を同制限酵素で処理したものと連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に形質転換した。同形質転換株約２０００個をアルカリフォスファターゼで標識したサッカロマイセス・セレビジェＧＡＰ３遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、２株の陽性クローンが得られ、挿入されていた断片の部分塩基配列を決定したところ、キャンディダ・マルトーサのＧＡＰ３プロモーター領域を含む遺伝子であった。クローニングした断片の一部配列を配列番号１０に示した。
（実施例６）キャンディダ・マルトーサＰＭＡ１遺伝子プロモーター領域のクローニング
実施例１で調製したキャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動にて約２ｋｂ〜４ｋｂの断片をゲルから抽出した。この断片をｐＵＣ１９を同制限酵素で処理したものと連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に形質転換した。同形質転換株約５０００個をアルカリフォスファターゼで標識したサッカロマイセス・セレビジェＰＭＡ１遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、５株の陽性クローンが得られ、挿入されていた断片の塩基配列を決定したところ、配列番号１１に示すようにキャンディダ・マルトーサのＰＭＡ１プロモーター領域を含む遺伝子であった。
（実施例７）キャンディダ・マルトーサＴＥＦ１遺伝子プロモーター領域のクローニング
実施例１で調製したキャンディダ・マルトーサの染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動にて約２ｋｂ〜４ｋｂの断片をゲルから抽出した。この断片をｐＵＣ１９を同制限酵素で処理したものと連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に形質転換した。同形質転換株約４００個をアルカリフォスファターゼで標識したサッカロマイセス・セレビジェＴＥＦ１遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、７株の陽性クローンが得られ、挿入されていた断片の塩基配列を決定したところ、配列番号１２に示すようにキャンディダ・マルトーサのＴＥＦ１プロモーター領域を含む遺伝子であった。
（実施例８）ポリエステル合成に関与する遺伝子の合成
ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子として、アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，ｅｔ  ａｌ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７０，６９（１９９９））のアミノ酸配列をもとに、当該酵素遺伝子を合成した。キャンディダ・マルトーサはＣＴＧコドンをロイシンではなくセリンに翻訳する酵母であるため、ロイシンコドンにはＣＴＧを割り当てなかった。各アミノ酸に対応するコドンはキャンディダ・マルトーサにおいて使用頻度の高いコドンを優先的に選択した。コドンの使用頻度はＫｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ著のＮｏｎｃｏｎｖｅｎｄｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版）を参考にした。このようにしてＰＨＡ合成酵素遺伝子（以下ＯＲＦ２Ｓと略す；配列番号１３）を設計し、ＯＲＦ２Ｓ遺伝子部分を全合成した。
（実施例９）キャンディダ・マルトーサＡＬＫ１プロモーターによるＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築
前記ＯＲＦ２Ｓをキャンディダ・マルトーサで発現させるため、５′上流にキャンディダ・マルトーサのＡｌｋ１遺伝子のプロモーターＡＬＫ１ｐ（配列番号１５）を、また３’下流にキャンディダ・マルトーサのＡｌｋ１遺伝子のターミネーターＡＬＫ１ｔ（配列番号１４）を連結した。プロモーターおよびターミネーターと構造遺伝子を連結するための制限酵素部位を作成するためにＰＣＲ法を利用した。プロモーター部分は配列番号１５を鋳型にして配列番号１６と配列番号１７を用いて行い、５’末端がＰｖｕＩＩ、３’末端がＥｃｏＲＩのＡＬＫ１ｐ断片を作製した。ターミネーター部分は配列番号１４を鋳型にして配列番号１８と配列番号１９を用いて行い、５’末端がＨｉｎｄＩＩＩ、３’末端がＥｃｏＲＶのＡＬＫ１ｔ断片を作製した。ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３に記載）のＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＩ部位にＡＬＫ１ｐ断片を連結し、またｐＵＣＮＴのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ部位にＡＬＫ１ｔ断片を結合してｐＵＡＬ１を構築した。次にｐＵＡＬ１のＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ部位にＯＲＦ２Ｓ断片を結合し、プラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ｓ（図１）を構築した。次にこのプラスミドをＳａｌＩで部分分解し、ＸｈｏＩリンカー（宝酒造社製）を用いてＳａｌＩ部位をＸｈｏＩ部位に変換した。一旦、ＰｖｕＩ及びＰｖｕＩＩで切断し、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）のＰｖｕＩ及びＳｍａＩ断片と連結し、図２に示したｐＳＴＶ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓを構築した。
更にｐＵＴＵ１（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７３，３９４８（１９９８））とキャンディダ・マルトーサのＡＤＥ１遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｄ００８５５）を用いてマーカー遺伝子をウラシルからアデニンに変更したベクターであるｐＵＴＡ１（図３）を使用した。その構築は、ｐＵＴＵ１からＸｈｏＩを用いてＵＲＡ３遺伝子を除去し、これにＳａｌＩを用いて切り出したＡＤＥ１遺伝子断片を接続して行った。
ｐＳＴＶ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２ＳからＥｃｏＴ２２Ｉを用いてプロモーター及びＯＲＦ２Ｓ及びターミネーターを含む断片を調製し、ｐＵＴＡ１のＰｓｔＩ部位に挿入して図４に示したｐＵＴＡ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓを構築した。
（実施例１０）キャンディダ・マルトーサＡＣＴ１プロモーターによるＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築
実施例４でクローニングしたキャンディダ・マルトーサＡＣＴ１プロモーター領域を用いたＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築は、以下のように行った。配列番号２０及び２１に示す合成ＤＮＡをプライマーとし、キャンディダ・マルトーサＡＣＴ１プロモーター領域を含む断片（配列番号９）を鋳型としてＰＣＲを行い、５‘側末端が制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ、３’側末端が制限酵素ＮｄｅＩとなる断片を得、この断片をＥｃｏＴ２２Ｉ及びＮｄｅＩで処理した。実施例９で得たｐＳＴＶ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓを同じくＥｃｏＴ２２Ｉ及びＮｄｅＩで処理し、ＡＬＫプロモーターを除く断片を調製した。これら２個の断片を連結して、ｐＳＴＶ−ＡＣＴ１−ＯＲＦ２Ｓを構築した。同プラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、ＡＣＴ１−ＯＲＦ２Ｓ断片を調製した。この断片を、実施例９で得たｐＵＴＡ１のＰｓｔＩ部位に挿入して図５に示したｐＵＴＡ−ＡＣＴ１−ＯＲＦ２Ｓ発現ベクターを構築した。
（実施例１１）キャンディダ・マルトーサＧＡＰ３プロモーターによるＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築
実施例５でクローニングしたキャンディダ・マルトーサＧＡＰ３プロモーター領域を用いたＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築は、以下のように行った。配列番号２２及び２３に示す合成ＤＮＡをプライマーとし、キャンディダ・マルトーサＧＡＰ３プロモーター領域を含む断片（配列番号１０）を鋳型としてＰＣＲを行い、５‘側末端が制限酵素ＸｈｏＩ、３’側末端が制限酵素ＮｄｅＩとなる断片を得、この断片をＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで処理した。実施例９で得たｐＳＴＶ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓプラスミドを同じくＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで処理し、ＡＬＫプロモーターを除く断片を調製した。これら２個の断片を連結して、ｐＳＴＶ−ＧＡＰ３−ＯＲＦ２Ｓを構築した。同プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｌＩで処理し、ＧＡＰ３−ＯＲＦ２Ｓ断片を調製した。実施例９で得たｐＵＴＡ１プラスミドをＳａｌＩで処理し、これらを連結することによって図６に示したｐＵＴＡ−ＧＡＰ３−ＯＲＦ２Ｓ発現ベクターを構築した。
（実施例１２）キャンディダ・マルトーサＰＭＡ１プロモーターによるＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築
実施例６でクローニングしたキャンディダ・マルトーサＰＭＡ１プロモーター領域を用いたＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築は、以下のように行った。配列番号２４及び２５に示す合成ＤＮＡをプライマーとし、キャンディダ・マルトーサＰＭＡ１プロモーター領域を含む断片（配列番号１１）を鋳型としてＰＣＲを行い、５‘側末端が制限酵素ＸｈｏＩ、３’側末端が制限酵素ＮｄｅＩとなる断片を得、この断片をＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで処理した。実施例９で得たｐＳＴＶ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓプラスミドを同じくＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで処理し、ＡＬＫプロモーターを除く断片を調製した。これら２個の断片を連結して、ｐＳＴＶ−ＰＭＡ１−ＯＲＦ２Ｓを構築した。同プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｌＩで処理し、ＰＭＡ１−ＯＲＦ２Ｓ断片を調製した。実施例９で得たｐＵＴＡ１プラスミドをＳａｌＩで処理し、これらを連結することによって図７に示したｐＵＴＡ−ＰＭＡ１−ＯＲＦ２Ｓ発現ベクターを構築した。
（実施例１３）キャンディダ・マルトーサＴＥＦ１プロモーターによるＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築
実施例７でクローニングしたキャンディダ・マルトーサＴＥＦ１プロモーター領域を用いたＯＲＦ２Ｓ発現ベクターの構築は、以下のように行った。配列番号２６及び２７に示す合成ＤＮＡをプライマーとし、キャンディダ・マルトーサＴＥＦ１プロモーター領域を含む断片（配列番号１２）を鋳型としてＰＣＲを行い、５‘側末端が制限酵素ＸｈｏＩ、３’側末端が制限酵素ＮｄｅＩとなる断片を得、この断片をＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで処理した。実施例９で得たｐＳＴＶ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓプラスミドを同じくＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで処理し、ＡＬＫプロモーターを除く断片を調製した。これら２個の断片を連結して、ｐＳＴＶ−ＴＥＦ１−ＯＲＦ２Ｓを構築した。同プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｌＩで処理し、ＴＥＦ１−ＯＲＦ２Ｓ断片を調製した。実施例９で得たｐＵＴＡ１プラスミドをＳａｌＩで処理し、これらを連結することによって図８に示したｐＵＴＡ−ＴＥＦ１−ＯＲＦ２Ｓ発現ベクターを構築した。
（実施例１４）キャンディダ・マルトーサの形質転換株の分離
キャンディダ・マルトーサ  ＡＣ１６株（ブダペスト条約に基づく寄託、国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）、寄託日２０００年１１月１５日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３６６）への形質転換はエレクトロポレーション法にて行った。ＹＰＤ培地にて３０℃で一晩前培養した培養液の１ｍｌを同培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容坂口フラスコに接種し、３０℃にて約７時間培養した。３０００ｒｐｍで室温、１０ｍｉｎ遠心した後、氷冷した１Ｍソルビトール溶液約５０ｍｌで３回洗浄した。３ｍｌの同溶液に細胞を懸濁し、０．１ｍｌずつ分注して−８０℃にて保存し、形質転換用細胞とした。遺伝子導入にはＥＣＭ６００Ｍ（ＢＴＸ社製）を用いた。詳しくは同形質転換用細胞０．１ｍｌに対し、実施例９〜１３で構築した発現ベクターＤＮＡのいずれか約１μｇをギャップが２ｍｍ幅のキュベットに入れ、モード２．５ｋｖ、電圧１．９ｋｖ、抵抗２４６Ωの条件で電気パルスをかけ直ちに氷冷後、０．５ｍｌの１Ｍソルビトールを添加し室温に１時間保温した後、ＹＮＢ選択プレート上で３０℃にて培養した。選択プレートとしては、０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いた。
以上によって、実施例９〜１３で構築した発現ベクターのいずれかを含む５種類の形質転換体を得た。
（実施例１５）プロモーター機能の解析
実施例１４で得られた形質転換株を０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２ｗ／ｖ％グルコースで一晩前培養した後、その２．５ｍｌを同培地５０ｍｌの入った５００ｍｌ容坂口フラスコに接種し、３０℃にて２４時間培養した。比較例としたＡＬＫ１プロモーターによる発現ベクターの培養のみ、炭素源として２ｗ／ｖ％のｎ−ドデカンを用いた。そのうち約１０ｍｌ相当の培養液を３０００ｒｐｍで室温、１０ｍｉｎ遠心した後、生理食塩水で洗浄、同条件にて再度遠心した。この菌体を１ｍｌの０．５Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．２）に懸濁し、同量の酵母破砕用ガラスビーズ（０．４５ｍｍ、Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）と混合し、Ｍｉｎｉ  ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）で１ｍｉｎずつ５回処理して細胞を破砕し、卓上遠心器にて３０００ｇで１０秒間遠心して上清を分取してＯＲＦ２Ｓ活性測定用サンプルとした。同サンプルを用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）による蛋白質濃度測定及びＶａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ．４０，６９９，（１９９４）に示される酵素活性の測定を行った。
具体的には、水０．３３８ｍｌに細胞破砕液０．０１ｍｌと７ｍｇ／ｍｌの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（シグマ社製）の水溶液０．０１２１３ｍｌ及び０．５Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．２）に溶解した３．８ｍｇ／ｍｌのＤＴＮＢ（シグマ社製）０．０４ｍｌを混合し、室温にて５分間４１２ｎｍの吸光度の変化を測定した。吸光度の測定には、島津製作所製の分光光度計を用いた。活性は、以下に示す式により算出した。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ΔＡ４１２／分×１０３×ＶＴ／ε４１２×ＶＥ
上記式において、ΔＡ４１２／分：１分間当たりの吸光度の増加量、ＶＴ：反応液量（ｍｌ）、ε４１２：１５．６×１０３（Ｍ−１・ｃｍ−１）、ＶＥ：酵素液量（ｍｌ）である。
同酵素活性は、上記文献及び以下の式に示されるように比活性（Ｕ／ｍｇ）で表示される。
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝活性（Ｕ／ｍｌ）／蛋白質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
その結果を表１に示した。この結果から本発明によりクローニングされたＡＣＴ１、ＧＡＰ３、ＰＭＡ１、ＴＥＦ１プロモーター領域がキャンディダ・マルトーサ細胞内でＡＬＫ１プロモーターと同等又はそれ以上の効率で機能するプロモーターであることが分かった。
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産業上の利用の可能性
本発明により、キャンディダ属酵母、特にキャンディダ・マルトーサにおいて有用遺伝子の発現を高効率に行うことが可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例９のプラスミド構築に用いたプラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２Ｓの制限酵素地図を示してある。
図２は、実施例９〜１３のプラスミド構築に用いたプラスミドｐＳＴＶ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓの制限酵素地図を示してある。
図３は、実施例９〜１３のプラスミド構築に用いたプラスミドｐＵＴＡ１の制限酵素地図を示してある。
図４は、実施例９で構築したプラスミドｐＵＴＡ−ＡＬＫ１−ＯＲＦ２Ｓの制限酵素地図を示してある。
図５は、実施例１０で構築した、本発明の一態様であるプラスミドｐＵＴＡ−ＡＣＴ１−ＯＲＦ２Ｓの制限酵素地図を示してある。
図６は、実施例１１で構築した、本発明の一態様であるプラスミドｐＵＴＡ−ＧＡＰ３−ＯＲＦ２Ｓの制限酵素地図を示してある。
図７は、実施例１２で構築した、本発明の一態様であるプラスミドｐＵＴＡ−ＰＭＡ１−ＯＲＦ２Ｓの制限酵素地図を示してある。
図８は、実施例１３で構築した、本発明の一態様であるプラスミドｐＵＴＡ−ＴＥＦ１−ＯＲＦ２Ｓの制限酵素地図を示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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