(57)【要約】エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質を連結してなる、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質との間にエネルギー移動が起こり得る分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質。
2004022600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質を連結してなる、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質との間にエネルギー移動が起こり得る分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質。
【請求項２】
以下の（１）〜（６）のいずれかの構造を有する請求項１に記載の分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質：
（１）（分泌型エネルギー発生蛋白質）−（エネルギー受容蛋白質）；
（２）（分泌型エネルギー受容蛋白質）−（エネルギー発生蛋白質）；
（３）（膜結合型エネルギー発生蛋白質）−（エネルギー受容蛋白質）；
（４）（膜結合型エネルギー受容蛋白質）−（エネルギー発生蛋白質）；
（５）（シグナルペプチド）−（エネルギー発生蛋白質）−（エネルギー受容蛋白質）；
（６）（シグナルペプチド）−（エネルギー受容蛋白質）−（エネルギー発生蛋白質）。
【請求項３】
モニターペプチドを、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質の間、エネルギー発生蛋白質の内部あるいはエネルギー受容蛋白質の内部に、エネルギー発生特性ないしエネルギー受容特性を維持できるように導入し、かつ、モニターペプチドの切断によりエネルギー移動が抑制される請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項４】
エネルギー発生蛋白質が発光蛋白質である請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項５】
発光蛋白質がルシフェラーゼである請求項４に記載のキメラ蛋白質。
【請求項６】
エネルギー受容蛋白質が蛍光蛋白質又は着色蛋白質である請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項７】
蛍光蛋白質がＧＦＰ，ＹＦＰ，ＢＦＰ，ＣＦＰ、ＤｓＲＥＤまたはＲＦＰである請求項６に記載のキメラ蛋白質。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養液中で培養する工程；該培養液から分泌型または膜結合型キメラ蛋白質を回収する工程を包含する分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
宿主細胞中の遺伝子転写活性の測定方法であって、請求項１１に記載の形質転換体を培養し、培養液中に分泌されるか、あるいは細胞膜に結合される分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質のエネルギー移動を定量することを特徴とする方法。
【請求項１４】
細胞内における遺伝子発現を調節する薬物のスクリーニング方法であって、培養液中に薬物候補化合物を存在させて請求項１１に記載の形質転換体を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下での培養液中に分泌されるか、あるいは、細胞膜に結合する分泌型または膜結合型キメラ蛋白質のエネルギー移動を定量的に比較する工程を包含する方法。
【請求項１５】
細胞内における遺伝子発現を調節する薬物が、蛋白質の修飾を調節する酵素の遺伝子転写発現調節ないし酵素活性を調節する薬物である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
形質転換体が、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は，分泌型または膜結合型キメラ蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、細胞の遺伝子転写活性の測定または評価方法並びに遺伝子発現を調節する薬物のスクリーニング方法に関する。本発明は、蛋白質の修飾を調節する酵素の遺伝子転写発現調節や酵素活性を調節する薬剤のスクリーニング方法も包含する。
本発明のキメラ蛋白質は、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質との間のエネルギー移動特性を利用することができる。
【背景技術】  発光酵素と蛍光蛋白質の間に起こるエネルギー移動の現象は、発光クラゲや発光シイタケの中で起こる自然現象であり、そのメカニズムは分子レベルで解明され（Ｏｈｍｉｙａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．：Ｓｈｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｇｈｔ：ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．（１９９６）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，３３７−３４７など）、さらにこの自然現象を模倣したＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びグリーン蛍光蛋白質融合遺伝子が構築され、ルシフェラーゼ活性及び蛍光活性を用いて遺伝子発現を定量的且つ定性的にモニターする方法が知られている（米国特許第５９７６７９６号およびＷＯ９８／１４６０５）。
ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼはＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓから精製された酵素である。この酵素は、酵素の存在下で発光基質セレンテラジンの酸化的脱炭酸を触媒して、４７８ｎｍの極大発光波長を伴う青色光を生成する。しかし自然界ではＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ中に存在するグリーン蛍光蛋白質へのエネルギー転移に起因した５１０ｎｍの極大波長を有する緑色へとシフトする。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの遺伝子は既にクローン化され、そしてｃＤＮＡは遺伝子の転写活性を測定するレポータ遺伝子として有用であることが示されている。
蛍光蛋白質は発光クラゲ、発光ウミシイタケ等の発光酵素の共在する場合と、サボテンのように単独に存在する場合がある。発光クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから精製されたグリーン蛍光蛋白質は発光蛋白質より青色の光を受け、これを緑色の光に変換する。この遺伝子はクローン化され、そのｃＤＮＡは細胞内で発現すると補因子を必要とせず青色励起光によって緑色の蛍光を発するので、種々の生物系（細菌、真菌、および哺乳類動物組織等）で強力なレポータ遺伝子である。野生型グリーン蛍光蛋白質改変体では、明るい発光を伴う赤方シフトの改変体や、哺乳類細胞の安定性を特化したものがある。また、天然サンゴより赤色蛍光蛋白質ｃＤＮＡがクローン化され、これは同じくレポータ遺伝子として有用である。
従来発明されたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びグリーン蛍光蛋白質融合遺伝子構築物の細胞内での局在はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの特性に依存して細胞質内全般に存在し、局在することはない。また、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発光基質は細胞透過性がなく、細胞を一度、溶解させなければ、細胞内の遺伝子発現を検出できない。
発光性甲殻類ウミボタルＶａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉやその近縁種Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａは分泌性の発光酵素を持ち、既にウミボタル発光酵素のｃＤＮＡはクローン化されている。ウミボタル発光基質Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリンと反応して最大発光波長４６０ｎｍの青色の光を発する。クローン化されたｃＤＮＡはレポータ遺伝子として、発光酵素が細胞外に分泌されることから細胞を破壊することなく遺伝子転写活性が測定できる。また、この分泌型発光酵素を画像解析することで細胞からの蛋白質の分泌を可視化することができる。一方、青色発光するが、エネルギー移動のドナー蛋白質として実用化された例はない。
本発明は，分泌型または膜結合型のエネルギー移動特性を有する蛋白質融合物を構築し、細胞外または細胞表面で測定可能なエネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質の２機能をもつ構築物の作成及び利用を目的とする。細胞外で遺伝子転写活性をエネルギー移動特性として測定、併せて細胞内から細胞外への分泌経路等をエネルギー移動特性によって評価できる。また、分泌型または膜結合型キメラ蛋白質のエネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質の間、或いはエネルギー発生蛋白質またはエネルギー受容蛋白質の内部にモニターペプチドを挿入し、モニターペプチドの切断によるエネルギー移動の変化を指標としてペプチド３次元構造情報を得ることができる。特に、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質として、発光酵素と蛍光蛋白質を使用した場合、発光酵素の放つ発光が蛍光蛋白質を励起し、エネルギー移動により発光色が変化することで、励起光を用いずに蛍光測定可能な融合構築物を作成することができる。
【図面の簡単な説明】  図１ａは、ＰＣＲ法により増幅したウミボタル発光酵素遺伝子（Ｖｌｕｃ）と変異型黄色蛍光蛋白質遺伝子（ＥＹＦＰ）を哺乳類細胞発現用ベクターｐＥＦ−ＢＯＳに挿入した発光蛍光融合蛋白質ベクターの構築。
図１ｂは、哺乳類細胞発現用ベクターｐＥＦ−ＢＯＳに挿入したウミボタル発光酵素遺伝子（Ｖｌｕｃ）と変異型黄色蛍光蛋白質遺伝子（ＥＹＦＰ）の発光蛍光融合蛋白質。
図２は、分泌型発光・蛍光融合蛋白質（Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰ）を導入した細胞内及び細胞外でのウェスタンブロット解析。
図３は、分泌型（Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰ）、非分泌型（Ｒｌｕｃ−ＥＹＦＰ）の発光蛍光融合蛋白質分子プローブを導入したＣｏｓ７細胞の蛍光画像。
図４は、単独ウミボタル発光酵素（Ｖｌｕｃ）と発光蛍光融合蛋白質（Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰ）の発光活性の比較。
図５は、発光酵素単独及び発光酵素−蛍光蛋白質融合体の発光スペクトル。エネルギー移動したピークは蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと一致した。１）Ｖｌｕｃ単独の発光、２）Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰの発光、３）ＥＹＦＰの発光
図６は、発光酵素−蛍光蛋白質融合体に異なるモニターペプチドを挿入したときのエネルギー移動効率の変化（発光スペクトルの変化）を示す。
図７は、挿入ペプチド１，２の予想される２次構造及び疎水性を示す。
図８は、本発明のシステムの模式図を示す。エネルギー発生タンパク質には分泌型、膜結合型が存在する。本発明のキメラ蛋白質では、エネルギー発生蛋白質からエネルギー受容蛋白質にエネルギーが移動し（黒矢印）、エネルギー受容蛋白質からの光等のエネルギー（白矢印）を検出することが可能になる。一方、モニターペプチドへの外部因子の結合やモニターペプチドの切断によりキメラ蛋白質の立体構造が変化すると、エネルギー発生蛋白質からのエネルギーがエネルギー受容蛋白質に届かなくなる。
図９は、分泌型キメラ蛋白質のシステム例を示す。図９では、分泌型蛋白質はエネルギー発生蛋白質である。
図１０は、膜結合型キメラ蛋白質のシステム例を示す。図１０では、膜結合領域は、エネルギー発生蛋白質内に存在する。膜結合領域は、モニターペプチドにあってもよく、エネルギー受容蛋白質にあってもよい。
【発明の開示】
本発明者は，上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果，エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質を融合化した遺伝子を構築し、本発明を完成するに至った。
本遺伝子では既に遺伝子データベース上に記載されるタンパクを融合化することで得られたが、この組合せは未知であり、後述するように，融合構築物を発現解析し，分泌ないし膜結合特性、エネルギー発生（例えば発光）特性、及びエネルギー受容（例えば蛍光）特性の３つの特性が備わっていることは本発明者が初めて明らかにした。また，本来生物界に存在しない分泌型発光酵素（ウミボタルルシフェラーゼ）と蛍光蛋白質（ＹＦＰ）の組合せでも、エネルギー移動が起きることを明らかにしたのは、本発明者が初めてである。
項１．エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質を連結してなる、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質との間にエネルギー移動が起こり得る分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質。
項２．以下の（１）〜（６）のいずれかの構造を有する項１に記載の分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質：
（１）（分泌型エネルギー発生蛋白質）−（エネルギー受容蛋白質）；
（２）（分泌型エネルギー受容蛋白質）−（エネルギー発生蛋白質）；
（３）（膜結合型エネルギー発生蛋白質）−（エネルギー受容蛋白質）；
（４）（膜結合型エネルギー受容蛋白質）−（エネルギー発生蛋白質）；
（５）（シグナルペプチド）−（エネルギー発生蛋白質）−（エネルギー受容蛋白質）；
（６）（シグナルペプチド）−（エネルギー受容蛋白質）−（エネルギー発生蛋白質）。
項３．モニターペプチドを、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質の間、エネルギー発生蛋白質の内部あるいはエネルギー受容蛋白質の内部に、エネルギー発生特性ないしエネルギー受容特性を維持できるように導入し、かつ、モニターペプチドの切断によりエネルギー移動が抑制される項１に記載のキメラ蛋白質。
項４．エネルギー発生蛋白質が発光蛋白質である項１〜３のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
項５．発光蛋白質がルシフェラーゼである項４に記載のキメラ蛋白質。
項６．エネルギー受容蛋白質が蛍光蛋白質又は着色蛋白質である項１〜３のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
項７．蛍光蛋白質がＧＦＰ，ＹＦＰ，ＢＦＰ，ＣＦＰ、ＤｓＲＥＤまたはＲＦＰである項６に記載のキメラ蛋白質。
項８．配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、項１に記載のキメラ蛋白質。
項９．項１〜８のいずれかに記載の分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
項１０．項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
項１１．項１０に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
項１２．項１１に記載の形質転換体を培養液中で培養する工程；該培養液から分泌型または膜結合型キメラ蛋白質を回収する工程を包含する分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質の製造方法。
項１３．宿主細胞中の遺伝子転写活性の測定（評価）方法であって、項１１に記載の形質転換体を培養し、培養液中に分泌されるか、あるいは細胞膜に結合される分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質のエネルギー移動を定量することを特徴とする方法。
項１４．細胞内における遺伝子発現を調節する薬物のスクリーニング方法であって、培養液中に薬物候補化合物を存在させて項１１に記載の形質転換体を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下での培養液中に分泌されるか、あるいは、細胞膜に結合する分泌型または膜結合型キメラ蛋白質のエネルギー移動を定量的に比較する工程を包含する方法。
項１５．細胞内における遺伝子発現を調節する薬物が、蛋白質の修飾を調節する酵素の遺伝子転写発現調節ないし酵素活性を調節する薬物である項１４に記載の方法。
項１６．形質転換体が、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列を含む、項１４に記載の方法。
以下、本発明を説明する。
本発明のキメラ蛋白質は、分子内のエネルギー移動が可能である特徴を有する。分子内のエネルギー移動とは、エネルギー発生蛋白質（例えば生物発光蛋白質）から放出されるエネルギー（例えば光エネルギーなど）とエネルギー受容蛋白質（蛍光蛋白質、着色蛋白質）との間にエネルギー移動が起こることを意味し、エネルギー移動の結果、例えば蛍光蛋白質では外部から光を与えなくても蛍光を発する点に特徴を有し、これによりエネルギー移動の程度を定量することができる。
エネルギー発生蛋白質としては、生物発光蛋白質（ルシフェラーゼなどの発光酵素）が好ましく例示される。
エネルギー受容蛋白質としては、蛍光蛋白質、着色蛋白質などが例示できる。エネルギー受容蛋白質は、エネルギーの受容を確認可能な蛋白質であり、例えば蛍光蛋白質では、蛍光を測定することにより、エネルギー移動の程度を定量することができる。
以下、エネルギー発生蛋白質として分泌型生物発光蛋白質、エネルギー受容蛋白質として蛍光蛋白質を用いた場合を例に取り、さらに具体的に説明する。
該キメラ蛋白質は分泌性であり、細胞外にルシフェリンを与えることによりその存在を蛍光により容易に検出可能である。なお、キメラ蛋白質が膜結合性の蛋白質であっても、ルシフェリンを与えることにより同様に検出可能である。
ＧＦＰのような蛍光蛋白質のみでは、蛍光による定性分析は可能であるが、外部からの励起光により蛍光を発するため定量することはできない。一方、本発明のキメラ蛋白質では生物発光蛋白質からの励起光により蛍光蛋白質から蛍光を発するので、キメラ蛋白質の各修飾体（モニターペプチドにおける切断、糖鎖による修飾等）をその蛍光波長のシフトに基づき各々定量することが可能である。
本発明において、モニター蛋白質は、生物発光蛋白質から蛍光蛋白質への光エネルギーの移動を妨げないものであれば特に限定されない。モニターペプチドのアミノ酸の数は、通常５〜１００個、好ましくは６〜５０個、より好ましくは６〜２０個、特に６〜１５個である。モニターペプチドは、その切断によりエネルギー移動が起こらなくなる位置に導入されるのが好ましい。モニターペプチドの導入位置としては、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質の間、エネルギー発生蛋白質の内部、エネルギー受容蛋白質の内部が例示され、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質の間に導入するのがより好ましい。モニターペプチドがエネルギー発生蛋白質の内部に導入された場合、その導入後もエネルギー発生特性は残存し、かつ、モニターペプチドが切断されることによりその発光特性が喪失する。同様に、モニターペプチドがエネルギー受容蛋白質の内部に導入された場合、その導入後もエネルギー受容特性は残存し、かつ、モニターペプチドが切断されることによりそのエネルギー受容特性（例えば蛍光特性）が喪失する。
該モニターペプチドに制限酵素部位を導入すれば、キメラ蛋白質の製造がより容易になる。該モニターペプチドに特定のプロテアーゼに対する蛋白質加水分解部位を導入すると、分泌過程における蛋白質加水分解酵素の働きを定量することができ、各種分泌蛋白質のプロセッシング酵素の機能に影響する物質を定量的にスクリーニングすることが可能になる。好ましいモニターペプチド配列の１つは、配列番号４に示される４０個のアミノ酸からなる配列（スペーサーペプチド配列１）である。
他のモニターペプチドとしては、プロセッシング酵素ＰＣ１によりＲのＣ末端側が切断され得る天然蛋白質の部分配列であるＳＥＱＫＱＬＱＫＲＦＧＧＦＴＧＧ（配列番号１０）で表される配列が例示される。このモニターペプチド配列を有するキメラ蛋白質は、エネルギー移動特性を有し、プロセッシング酵素ＰＣ１により該配列のＲのＣ末端側が切断されることによりエネルギー移動特性を失うことを本発明者は確認している。
一方、非天然のポリペプチドであるスペーサーペプチド配列２を有するキメラ蛋白質は、エネルギー移動を生じない。
このように、エネルギー発生蛋白質とエネルギー受容蛋白質の間のエネルギー移動を可能にするために、モニターペプチドは天然のポリペプチドの部分アミノ酸配列であるか、或いは天然のポリペプチドのアミノ酸配列に類似する配列であるのが好ましい。天然のポリペプチドまたはその部分配列をモニターペプチドとすることで、当該天然配列の特性（例えばプロセッシング酵素（ＰＣ１、ＰＣ２、フリン、プロテアソーム、カプテシン、トロンビンなど）を含む種々のプロテアーゼによる切断特性、酵素の基質、受容体のアゴニスト／アンタゴニスト、あるいは蛋白質、糖類、低分子物質などの結合因子の結合特性など）をエネルギー移動の変化に基づき測定または評価することができる。
本明細書において、生物発光蛋白質としては、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫（ホタル、ヒカリコメツキなど）、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケ、オワンクラゲ（エクオリン）などの各種発光生物由来のルシフェラーゼが例示される。例えば、ウミボタル・ルシフェラーゼは分泌型であるのでそのまま分泌型生物発光蛋白質として利用でき、ウミシイタケ由来のルシフェラーゼのように非分泌型ルシフェラーゼの場合には、Ｎ末端側にシグナルペプチドを導入し、分泌型生物発光蛋白質として利用することもできる。
蛍光蛋白質としては、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ），黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ），青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ），シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、ＤｓＲＥＤ、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）などが例示される。
着色蛋白質としては、フィコシアニン、フィコエリトリンが挙げられる。
本発明の蛍光蛋白質または着色蛋白質は、生物発光蛋白質から放出される光が蛍光蛋白質の励起波長または着色蛋白質の吸収波長になるように選択される。このような組み合わせとしては、例えば以下のものが挙げられる。
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分泌型生物発光蛋白質と蛍光蛋白質は、直接連結させてもよく、両者の間にモニターペプチド配列を介在させて連結してもよい。
本発明のキメラタンパクには，以下の１）−３）に示す蛋白質が包含される。
１）分泌型生物発光蛋白質のＣ末端側に蛍光蛋白質を連結した分泌型キメラ蛋白質。該蛋白質の好ましい実施形態の１つが、配列番号１記載のアミノ酸配列によって表わされる蛋白質である。
２）配列番号１記載のアミノ酸配列において，１若しくは複数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列より表わされ，且つ分泌性、発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有する融合構築物。
３）上記１）の蛋白質に分泌性、発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を失わない程度の変異が導入された蛋白質。このような変異は，自然界において生じる（例えば対立遺伝子）ほかに，人為的な変異も含む。人為的変異を生じさせる手段としては，部位特異的変異誘導法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００，１９８２）などを挙げることができるが，これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は，分泌、発光、蛍光活性及びエネルギー移動特性が失われない限り，その個数は制限されないが，好ましくは発光酵素及び蛍光蛋白質部分において２０アミノ酸以内であり，より好ましくは１５アミノ酸以内であり，更に好ましくは１０アミノ酸以内であり，最も好ましくは５アミノ酸以内である。また、発光酵素及び蛍光蛋白質を連結するモニターペプチドは、１〜１００個のアミノ酸について、任意に置換、欠失、付加、挿入することができる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入により変異を導入する場合には、変異を導入したタンパクが発光・蛍光活性を維持しているかは，そのタンパクの発光・蛍光活性を調べることによって判定できる。
本発明のポリヌクレオチドには、分泌型生物発光蛋白質のＣ末端側またはＮ末端側に蛍光蛋白質を連結した分泌型または膜結合型キメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドが包含される。該ポリヌクレオチドの好ましい実施形態の１つとして、配列番号１または２記載の塩基配列により表わされるＤＮＡ又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられ、該ＤＮＡがコードするタンパクは，分泌活性、発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有する融合構築物である。
上記のＤＮＡがコードするタンパクは，ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる分泌型発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有する蛋白質である。本明細書において「ストリンジェントな条件」とは，特異的なハイブリダイゼーションのみが起き，非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は，通常，「１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」程度であり，好ましくは「０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」程度であり，更に好ましくは「０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」程度である。配列番号１または２記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡは配列番号１または２記載の塩基配列により表わされるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは，６０％以上の相同性，好ましくは７５％以上の相同性，更に好ましくは９０％以上の相同性、特に９５％以上の相同性を指す。
本発明のタンパクは，後述する本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み，適当な宿主細胞内で発現させることにより得ることができる。発現ベクターとして，例えば，ｐＢＴ−ＶＬ−ｍｐ−ＹＦＰ（ＶＬはウミボタル・ルシフェラーゼ、ｍｐはモニターペプチド、ＹＦＰは黄色蛍光蛋白質をそれぞれ示す）などを用いることができ，宿主細胞としては哺乳動物細胞、酵母などの真核生物細胞、大腸菌、枯草菌、藻類、真菌類などの原核生物細胞が挙げられ、そのいずれを用いてもよい。好ましい宿主細胞としては、哺乳動物培養細胞ＣＯＳ７細胞株（この系では哺乳類系のタンパク合成、タンパク修飾過程を経ることが重要であり、つまり、この過程をモニタリングする）などを用いることができる。
本発明の好ましいキメラ蛋白質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）は，
１）配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子；および
２）配列番号１記載の塩基配列により表わされるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する遺伝子
である。
図８〜１０に本発明のシステムの模式図を示す。図８に示すように、本発明のキメラ蛋白質は、モニターペプチドの構造変化がない場合、黒矢印に示すようにエネルギー発生蛋白質からエネルギー受容蛋白質にエネルギーが移動し、エネルギー受容蛋白質からの光等のエネルギー（白矢印）を検出することが可能になる。一方、モニターペプチドへの外部因子の結合やモニターペプチドの切断によりキメラ蛋白質の立体構造が変化すると、エネルギー発生蛋白質からのエネルギーがエネルギー受容蛋白質に届かなくなる。キメラ蛋白質から発せられるエネルギーは、エネルギー受容蛋白質を介するもの（図８の白矢印）とエネルギー発生蛋白質から直接発せられるもの（図８の黒矢印）とで異なるので、キメラ蛋白質からのエネルギーを測定することにより、キメラ蛋白質に影響する因子の影響の程度を定量することが可能である。例えば、該因子が薬物の候補化合物である場合、以下に示すように、本発明のキメラ蛋白質は薬物のスクリーニング系に有用である。
図９に示すように、本発明のキメラ蛋白質のエネルギー発生蛋白質が分泌型蛋白質である場合、プロセッシング酵素活性などの分泌経路上の変化をモニターするのに有用である。また、図１０に示すように、本発明のキメラ蛋白質が膜結合型蛋白質である場合、膜周辺の細胞内変化ないし細胞外変化をモニターするのに有用である。
（スクリーニング方法）
本発明のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換体を培養することにより、宿主細胞中の遺伝子転写活性を定量的に測定（評価）することができ、また、細胞内における遺伝子発現を調節する薬物をスクリーニングすることができる。
本発明のキメラ蛋白質は、細胞内に導入し、蛍光強度及び波長のシフトを追跡することで、細胞内において、ｍＲＮＡからのタンパク合成の速度、合成された蛋白質のフォールディングやプロセッシング、蛋白質の膜結合ないし分泌の機構などが正常に働いているかどうかを検証することができる。
従って、本発明のキメラ蛋白質を発現可能な形質転換体を、薬物の候補化合物の存在下に培養した場合と、非存在下に培養した場合の結果を比較することにより、当該候補化合物がタンパク発現系にどのような作用を及ぼすかが分かり、タンパク発現系（遺伝子発現系）に作用する候補化合物を選択することが可能である。
比較対象としては、融合蛋白質の発現の総量、細胞内と細胞外における融合蛋白質の発現量の比較、融合蛋白質の蛍光蛋白質に対応する蛍光波長のシフトの程度、モニターペプチドの切断・糖鎖結合の程度などが挙げられる。
例えば、糖尿病患者の中には、プロインシュリンからインシュリンへのプロセッシングの異常、つまり切断部位のアミノ酸残基の変異や蛋白質限定分解酵素の活性低下に伴い活性型のインシュリンを合成出来ない場合がある。このようなプロセッシングの異常を正常にする薬物は、糖尿病治療薬として有用である。
また、プロオピオメラノコルチコトロピン（ＰＯＭＣ）は、共通の前駆物質とするペプチドホルモンとして，ＡＣＴＨ，βリポトロピン（βＬＰＨ），αおよびβメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ），エンケファリンとエンドルフィンがあり、ＰＯＭＣから活性ペプチドへの切断過程に影響を与えることで、ＡＣＴＨの切り出しを指標とした抗炎症剤やエンドルフィンの切り出しを指標とした鎮痛剤のスクリーニング系としても使用可能である。
本発明の分泌型キメラ蛋白質は細胞外に分泌されるため、培養液中に発光基質（ルシフェリン）を加えて生物発光蛋白質と蛍光蛋白質を各々独立して定量することができる。蛍光蛋白質の切断、モニターペプチドの切断や糖鎖修飾などにより生物発光蛋白質と蛍光蛋白質の発光の程度は大きく影響されるため、本発明のスクリーニング系により、薬物候補化合物がどの程度遺伝子発現系に影響を与えたのかを定量的に評価できる。
本発明のキメラ蛋白質は細胞外に分泌されるため、細胞を破壊することなく、培養液中に発光基質（ルシフェリン）を加えることで発光スペクトルや発光活性を測定することができ、生物発光蛋白質と蛍光蛋白質の間に起きているエネルギー移動を定量化できる。分泌された融合蛋白質は細胞内で生理的な分泌過程を経て、多くの修飾を受けている。モニターペプチドの切断や糖鎖修飾などにより生物発光蛋白質と蛍光蛋白質の間に起きるエネルギー移動は顕著に変化、発光スペクトルの形状が変化する。本発明のスクリーニング系により、例えばモニターペプチドの切断に伴って、エネルギー移動は消失、或いは糖鎖修飾によりエネルギー移動が増減するため、薬物候補化合物がどの程度、切断や糖鎖修飾を行う蛋白質修飾酵素の酵素活性やその遺伝子発現に影響を与えたのか、を定量的に評価できる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
【実施例１】  ウミボタル発光酵素（Ｖａｒｇｕｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；；以下、「ＶＬ」または「Ｖｌｕｃ」と略すことがある）遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．＆  Ｔｓｕｊｉ，Ｆ．Ｉ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｏｓｔｒａｃｏｄ  Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，６５６７−７１（１９８９））及び発光クラゲ由来変異型黄色蛍光蛋白質（ＥＹＦＰ）遺伝子のフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲ法）によって増幅し、哺乳類細胞発現用ベクターに挿入し、発光・蛍光融合蛋白質遺伝子を構築した。図１は、ベクターのマップと、遺伝子部分の配列を記したものである。ＶｌｕｃをＰＣＲ増幅する際、プライマー１（５’−（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＸＩ）：
ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＴＡＴＡＴＴＧＧＣ−３’；プライマー２（５’−（ＢａｍＨＩ）：ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＣＴＡＧ−３’）を用い、ＶｌｕｃのＮ末端に開始コドンを付与し、Ｃ末端には終止コドンを削除し、ＢａｍＨＩサイトを含むリンカー配列を導入した。一方、ＥＹＦＰのＰＣＲ増幅はプライマー３（５’−（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ）：
ＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣ−３’）、プライマー４（５’−（ＢｓｔＸｉ）ＴＡＣＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’）を用い、ＥＹＦＰのＮ末端の開始コドンを削除し、ＢａｍＨＩサイトを含むリンカー配列をＮ末端に連結し、Ｃ末端には終止コドンを導入した。哺乳類細胞発現用ベクターとして既に公知であるｐＥ−ＢＯＳ（Ｓ  Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ＆  Ｓ  Ｎａｇａｔａ  ｐＥＦ−ＢＯＳ，ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１７  Ｐ．５３２２）のＢｓｔＸＩに前記ＰＣＲ増幅産物を順次挿入して発現ベクターを作成し、ｐＥＦ−ＢＯＳ  Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰと命名した。また、本ベクターでは上流にウミボタル発光酵素遺伝子を下流に発光クラゲ由来変異型黄色蛍光蛋白質遺伝子を配しており、その中間のＢａｍＨＩ制限酵素部位にはペプチド配列が挿入可能である。
【実施例２】  発光・蛍光融合蛋白質遺伝子ｐＥＦ−ＢＯＳ  Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰをＣｏｓ７細胞に導入したところ、発光・蛍光融合蛋白質Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰが作られたことを発光酵素Ｖｌｕｃ抗体、蛍光蛋白質ＥＹＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。図２はＶｌｕｃ、ＥＹＦＰ、Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰをそれぞれ導入した際の細胞内、細胞外培地での結果である。細胞外にはＶｌｕｃ（分子量６３ｋＤａ）、ＥＹＦＰ（分子量２７ｋＤａ）及びＶｌｕｃ−ＥＹＦＰ（分子量９５ｋＤａ）が分泌された。Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰの細胞内の発現では、より小さいサイズの蛋白質も作られていたが、分泌したものは完全長のものと考えられる。融合蛋白質が分泌されることから、Ｃｏｓ７細胞の蛍光画像を観察した。比較として分泌シグナルを持たないウミシイタケＲｌｕｃとＥＹＦＰを融合したものＲｌｕｃ−ＥＹＦＰ導入細胞も観察した。図３の蛍光画像によると、Ｒｌｕｃ−ＥＹＦＰの蛍光画像が細胞全体に満遍なく広がるのに対して、Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰでは蛍光は細胞内に局所、Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰ蛋白質はＶｌｕｃの持つ分泌シグナルに呼応して、局在、分泌されることが確認できた。分泌されたＶｌｕｃ−ＥＹＦＰの発光活性を測定した結果、図４のようにＶｌｕｃ単独と比較して、約８０％程度の発光活性が保持されていた。以上の結果から、Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰはＶｌｕｃの持つ発光活性能及び分泌能と、蛍光蛋白質の蛍光能を有する融合蛋白質であることが確認された。また、発光活性はプロモータ活性の強さ、分泌能は分泌過程・経路の可視化能を、蛍光は、融合蛋白質の局在を指している。
【実施例３】Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰの発光スペクトルを測定した。図５で示すように２つの発光スペクトルのピーク（図５−２））が観察され、うち一つは発光酵素単独のもの（図５−１））、つまり最大発光波長４６０ｎｍと一致した。また長波長側のピークは蛍光蛋白質単独の蛍光スペクトルのピーク（図５−３））と一致した。また、発光・蛍光融合蛋白質遺伝子の蛍光スペクトルとも一致した。この長波長側のピークは発光・蛍光蛋白質間のエネルギー移動による、つまり発光蛋白質の発する光が励起光となり蛍光蛋白質より長波長の光、蛍光を発したものである。このエネルギー移動は単独にＶｌｕｃとＥＹＦＰを加えてもおきないことは確認した。よって、Ｖｌｕｃ−ＥＹＦＰは分泌する特性を持ち、且つ発光、蛍光特性及び発光・蛍光蛋白質間のエネルギー移動特性が保持された構築物である。
【実施例４】  発光・蛍光融合蛋白質遺伝子のリンカー配列部分ＢａｍＨＩ制限酵素部位に２つのペプチド配列を挿入した。図６では挿入ペプチド１及び挿入ペプチド２に対する発光スペクトルを表わしたものである。挿入ペプチド１ではエネルギー移動が起き、長波長側に小さなピークがみられた。しかしながら、ペプチド配列２ではエネルギー移動が起きなかった。この結果よりエネルギー移動は挿入されたペプチド配列に依存することが明らかとなった。それぞれのペプチド配列の２次構造予測及び疎水性解析を行うとそれぞれのペプチド配列の立体的な構造が異なることが予想され（図７）、このエネルギー移動の違いを指標に挿入ペプチドの立体構造情報を得ることができることが明らかとなった。
本発明は，モニター蛋白質及びそれをコードする遺伝子，本酵素の発現を制御する遺伝子を提供する。この融合蛋白質はウミボタル発光酵素の分泌する特性及び生物発光活性を有し、同時に蛍光蛋白質の蛍光特性を有している。ウミボタル発光酵素−蛍光融合蛋白質は酵素活性に遺伝子の発現量及び細胞からの分泌を、また蛍光から細胞内での分泌部位の位置情報を定量的にモニターするためのマルチマーカーとして利用できる。さらに発光酵素と蛍光蛋白質の間にペプチドを配することでエネルギー移動効率が変化する特性から挿入ペプチドの３次元構造や切断や糖付加等の機能変化情報を得るセンサーとして利用できる。
【配列表】
2004022600.tif 000004
2004022600.tif 000005
2004022600.tif 000006
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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