(57)【要約】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの３４９番目から３７７番目の残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ阻害定数（Ｋｓｉ）が２００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素が提供される。本発明の改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨは、グルコースによる基質阻害が小さいため、高濃度のグルコースの存在下におけるグルコースの測定に有用である。
2003106668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの３４９番目から３７７番目の残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ阻害定数（Ｋｓｉ）が２００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６５番目のメチオニンが他のアミノ酸残基で置換されており、かつＫｓｉが２００ｍＭ以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６５番目のメチオニンがトリプトファンまたはフェニルアラニンで置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６６番目のトレオニンが他のアミノ酸残基で置換されており、かつＫｓｉが２００ｍＭ以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６６番目のトレオニンがアスパラギン酸、リジン、イソロイシンまたはアスパラギンで置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６７番目のチロシンが他のアミノ酸残基で置換されており、かつＫｓｉが２００ｍＭ以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６７番目のチロシンがアスパラギン酸で置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６８番目のイソロイシンが他のアミノ酸残基で置換されており、かつＫｓｉが２００ｍＭ以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項９】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６８番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６９番目のシステインが他のアミノ酸残基で置換されており、かつＫｓｉが２００ｍＭ以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６９番目のシステインがアルギニンで置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３７４番目のアラニンが他のアミノ酸残基で置換されており、かつＫｓｉが２００ｍＭ以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３７４番目のアラニンがプロリンで置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４９番目から３７７番目のいずれかのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ１６７番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、３６５番目のメチオニン、３６６番目のトレオニン、３６７番目のチロシン、３６８番目のイソロイシン、３６９番目のシステインおよび３７４番目のアラニンからなる群より選択されるアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ１６７番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、３６５番目のメチオニン、３６６番目のトレオニン、３６７番目のチロシン、３６８番目のイソロイシン、３６９番目のシステインおよび３７４番目のアラニンからなる群より選択されるアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３６６番目のトレオニンがアスパラギン酸、リジン、イソロイシンまたはアスパラギンで置換されており、かつ１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１８】
配列：
2003106668.tif 000019
（式中、ＸａａはＭｅｔまたはＴｒｐである）を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１９】
配列：
2003106668.tif 000020
（式中、ＸａａはＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｓｎである）を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項２０】
配列：
2003106668.tif 000021
を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項２１】
配列：
2003106668.tif 000022
を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項２２】
配列：
2003106668.tif 000023
を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項２３】
配列：
2003106668.tif 000024
を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項２４】
請求項１−２３のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項２７】
請求項２４に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれている、請求項２２記載の形質転換体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の形質転換体を培養し、菌体から水溶性画分を調製することを含む、水溶性ＰＱＱＧＤＨの製造方法。
【請求項２９】
請求項１−２３のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【請求項３０】
請求項１−２３のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素に関する。本発明の改変型酵素は、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
背景技術
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。また、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっている。従来、グルコースはグルコーｂスオキシダーゼ（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。最近、新たな酵素としてピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約５０ｋＤａのサブユニット２つからなるホモダイマーを形成する水溶性酵素であり、活性を示すためにＰＱＱとＣａ２＋を必要とし、２２００Ｕ／ｍｇ〜７４００Ｕ／ｍｇという高い酵素活性を示す。等電点が、ＰＱＱと結合していないアポ酵素で約９．２、ホロ酵素で約１０．２である塩基性蛋白質であることなどが知られている（Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１５４８−１５５５）。また、水溶性ＰＱＱＧＤＨのＸ線構造解析の結果が発表されており（Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２８９，３１９−３３３、Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＴｈｅＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９），５１８７−５１９４およびＡ．Ｏｕｂｒｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），ＰＮＡＳ  ９６（２１），１１７８７−１１７９１）、水溶性ＰＱＱＧＤＨの立体構造やＰＱＱおよびＣａ２＋の推定存在位置などが明らかにされている。
野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨでは、グルコース濃度が１００ｍＭ以上のとき基質阻害による活性の低下が顕著に見られる。このため、高濃度の基質の存在下では、定量的な基質濃度の測定を行うことが困難である。現在のところ、この基質阻害のメカニズムは明らかにされていない。
したがって、本発明は、基質阻害による酵素活性の低下が少ない改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者は従来の水溶性ＰＱＱＧＤＨを改良して高濃度のグルコースの存在下においてもグルコースの定量を可能とする改変型ＰＱＱＧＤＨを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶性ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸変異を導入することにより、グルコースによる基質阻害の少ない酵素を得ることに成功した。
すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの３４９番目から３７７番目の残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ阻害定数（Ｋｓｉ）が２００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素を提供する。
本明細書において用いる場合、阻害定数（Ｋｓｉ）とは、観察される最大酵素活性の二分の一の活性を与える基質濃度のうち、高濃度側の基質濃度を意味する。阻害定数とは、酵素活性において基質阻害が観察されるときにおいて、次式で定義される酵素固有の定数を意味する：
ｖ＝Ｖｍａｘ／［１＋（Ｋｍ／Ｓ）＋（Ｓ／Ｋ’ｓｉ）］
［ただし、ｖは反応速度、Ｖｍａｘは最大反応速度、Ｋｍはミハエリス・メンテン定数、Ｓは基質濃度、Ｋ’ｓｉは阻害定数の理論値を表す］。Ｋ’ｓｉが大きいほど、基質阻害が見られる基質濃度が大きくなり、基質阻害が緩和される。夾雑物を含む系でＫ’ｓｉを正確に測定することは困難であるため、本明細書においては、実測可能な値として上述したＫｓｉを用いる。
特定の理論に拘束されるものではないが、Ａ．Ｏｕｂｒｉｅらが明らかにしたＰＱＱＧＤＨの立体構造に基づくトポロジーの予測にしたがえば、３４９番目から３７７番目のアミノ酸の領域は４Ｄ５Ａループを形成する領域に該当するため、この領域が基質であるグルコースとの相互作用に関与していると考えられる。
本明細書においてアミノ酸残基または領域に関して用いる場合、「相当する」との用語は、構造上類似するが同一ではない２以上の蛋白質において、あるアミノ酸残基または領域が等価の機能を有することを表す。例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ以外の生物に由来する水溶性ＰＱＱＧＤＨにおいて、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの３４９番目から３７７番目の残基の領域とアミノ酸配列類似性の高い領域が存在し、かつ蛋白質の二次構造から見て該領域がその蛋白質において同じ役割を果たしていると合理的に考えられる場合、該領域は「Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの３４９番目から３７７番目の残基の領域に相当する」と言われる。さらに、該領域の第１７番目のアミノ酸残基は「Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの３６５番目の残基に相当する」と言われる。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号付けする。
好ましくは、本発明のグルコース脱水素酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、３６５番目のメチオニン、３６６番目のトレオニン、３６７番目のチロシン、３６８番目のイソロイシン、３６９番目のシステインおよび３７４番目のアラニンからなる群より選択されるアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする。
より好ましくは、本発明のグルコース脱水素酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｍｅｔ３６５Ｔｒｐ、Ｍｅｔ３６５Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３６６Ａｓｎ、Ｔｈｒ３６６Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３６６Ａｓｐ、Ｔｈｒ３６６Ｌｙｓ、Ｔｙｒ３６７Ａｓｐ、Ｉｌｅ３６８Ａｓｎ、Ｃｙｓ３６９ＡｒｇおよびＡｌａ３７４Ｐｒｏからなる群より選択される変異を有する。
また別の態様においては、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、上述の置換に加えて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基が同時に他のアミノ酸残基で、特に好ましくはグルタミン酸残基で置換されている。１６７番目のアスパラギン酸残基がＰＱＱＧＤＨによる基質の認識および結合に関与することは、特開２００１−３４６５８７に記載されている。しかし、一般的には、４Ｄ５Ａループに存在するアミノ酸残基と、これらとは異なるドメインに存在するアミノ酸残基とに同時に変異を導入することにより、基質の選択性や酵素活性がどのように変化するかについては、全く予測することができない。したがって、本発明において、これらの変異を同時に導入することによりグルコースの選択性の向上と高い酵素活性の両方が得られたことは、驚くべき発見であった。
また別の観点においては、本発明は、
2003106668.tif 000003
（式中、ＸａａはＭｅｔまたはＴｒｐである）；
2003106668.tif 000004
（式中、ＸａａはＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｓｎである）；
2003106668.tif 000005
からなる群より選択される配列を含む、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素を提供する。
本発明はまた、上述のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、および本発明のＰＱＱＧＤＨの製造方法、ならびに本発明のＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。
本発明のＰＱＱＧＤＨの酵素蛋白質はグルコースによる基質阻害が小さいため、高濃度のグルコースの存在下におけるグルコースの測定に有用である。
発明の詳細な説明
改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は配列番号２で規定される。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が、当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨにおいては、所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
さらに、当業者は、他の細菌に由来する水溶性ＰＱＱＧＤＨについても、蛋白質の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該酵素の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨの３４９番目から３７７番目の領域に相当する領域を容易に認識することができ、本発明にしたがって、この領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、基質阻害の減少した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。これらの改変型ＰＱＱＧＤＨも本発明の範囲内である。
上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させることもできる。
次に、得られた水溶性画分を、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。精製は、蛋白質のクロマトグラフィー精製についての当該技術分野において一般に知られる教科書の記載にしたがって行うことができる。蛋白質の精製に用いることができる種々の陽イオン交換クロマトグラフィー用カラムが当該技術分野において知られており、これらのいずれを用いてもよい。例えば、ＣＭ−５ＰＷ、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ、ＳＰ−５ＰＷ（以上、東ソー株式会社）、Ｓ−セファロース、Ｍｏｎｏ−Ｓ、Ｓ−Ｒｅｓｏｒｃｅ（以上ファルマシア社）を用いることができる。カラムを適当なバッファーで平衡化し、試料をカラムに負荷し、未吸着成分を洗い流す。バッファーとしては、例えばリン酸バッファー、ＭＯＰＳバッファー等を用いることができる。
次に、塩濃度のより高いバッファーを用いて、カラムに吸着された成分を溶出する。塩濃度は、塩濃度の異なる複数のバッファーを用いて、段階的に、直線勾配により、またはこれらの組み合わせにより変化させることができる。試料の溶出は吸光度測定などによりモニターし、適当な量ずつ分取する。各画分について酵素活性を測定して、所望の画分を回収することにより、本発明の改変型酵素を精製標品として得ることができる。
さらに、陽イオンクロマトグラフィーの前または後に、必要に応じて、濾過、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の、蛋白質の精製に関して当該技術分野において知られる他の手法による精製を行ってもよい。
酵素活性の測定方法
本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。
基質阻害の評価方法
本発明のＰＱＱＧＤＨの基質阻害の程度は、阻害定数（Ｋｓｉ）を用いて評価することができる。Ｋｓｉは、種々の濃度のグルコースを基質として用いて、上述のように酵素活性を測定したとき、観察される最大酵素活性の二分の一の活性を与える基質濃度のうち、高濃度側の基質濃度として表される。
基質特異性の評価方法
本発明のＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノース、アロース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドの遊離官能基をブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−７１７４４ならびに２００２−１７２９５５号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１
改変型酵素ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の構築
配列番号２に示されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、変異の導入を行った。プラスミドｐＧＢ２は、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構造遺伝子を挿入したものである（図１）。常法に従って部位特異的変異法により、天然のＰＱＱＧＤＨをコードする塩基配列をそれぞれ目的とする変異を有するＰＱＱＧＤＨをコードする塩基配列に置換した。部位特異的変異はプラスミドｐＧＢ２を用いて、図２に示す方法により行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲットプライマーの配列を以下に示す。２カ所の変異を有する変異体を作成するためには、２種類のオリゴヌクレオチドターゲットプライマーを同時に用いて上記と同様に変異を導入した。
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ベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ（宝酒造（株））にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の一部を含むＫｐｎ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプレート５０ｆｍｏｌと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキットに付属のセレクションプライマー５ｐｍｏｌ、リン酸化したターゲットプライマー５０ｐｍｏｌを全体（２０μｌ）の１／１０量の同キットのアニーリングバッファーとともに混合し、１００℃、３分間の熱処理でプラスミドを変性させ、１本鎖にした。セレクションプライマーはｐＫＦ１８ｋのカナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのものである。これを５分間氷上に置き、プライマーをアニーリングさせた。これに３μｌの同キットエクステンションバッファー、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌの滅菌水を加えて相補鎖を合成した。これをＤＮＡのミスマッチ修復能欠損株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳに形質転換し、一晩振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。
次に、菌体から抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４に形質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラスミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子のＫｐｎ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片と入れ替え、各変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨの遺伝子を構築した。
実施例２
改変型酵素の調製
野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿入し、構築されたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩振とう培養し、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００μＭＰＱＱを含む７ＬのＬ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加し、その後１．５時間培養した。菌体を遠心分離（５，０００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）で集菌した後、０．８５％  ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。この菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁し、フレンチ・プレスで破砕（１１０ＭＰａ）した後、遠心分離（１５，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）を２回行い、未破砕菌体を沈殿として除去した。この上清を超遠心分離（４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．，９０ｍｉｎ，４℃）し、その上清を水溶液画分として得た。これをＡバッファー（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０））で４℃にて一晩透析し、粗精製画分を得た。
実施例３
酵素活性の測定
酵素活性の測定は、室温で１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
実施例４
基質阻害の評価
実施例３で得られた野生型ＰＱＱＧＤＨおよび各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素標品を用いて、実施例５と同様にそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注し、３μｌの活性試薬（６ｍＭＤＣＩＰ４８μｌ，６００ｍＭＰＭＳ  ８μｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０  １６μｌ）および各濃度のＤ−グルコース溶液１０μｌを加え、実施例４に示す方法により室温で酵素活性を測定した。基質濃度対酵素活性のプロットから、Ｋｍ、ＶｍａｘおよびＫｓｉを求めた。結果を表１に示す。また、Ｔｙｒ３６７ＡｓｐのＳＶプロットおよびＣｙｓ３６９ＡｒｇのＳＶプロットをそれぞれ図３および図４に示す。これらの結果から明らかなように、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して高いＫｓｉ値を示し、基質阻害が有意に低下していた。
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実施例５
酵素の精製
実施例２で得られた粗精製酵素を１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ蛋白質を得た。得られた精製酵素標品について、０．６ｍＭのＰＭＳ存在下で、酵素活性および基質の阻害を測定した。結果を表２に示す。本発明の改変型酵素Ｔｈｒ３６６ＡｓｎおよびＴｈｒ３６６Ａｓｐは、高いＫｓｉ値を有するのみならず、野生型と匹敵するかまたはそれより高い酵素活性を示した。
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実施例６
二重変異酵素の作製
二重変異酵素Ａｓｐ１６７Ｇｌｕ／Ｔｈｒ３６６Ａｓｎを製造し、その性質を調べた。Ａｓｐ１６７Ｇｌｕ変異を有する改変型酵素は、グルコースに対する基質特異性が高いことが知られている。実施例５と同様にして基質阻害を調べたところ、Ｋｓｉ＝６００ｍＭ、Ｋｍ＝２６ｍＭであり、したがってＫｓｉ／Ｋｍ＝２３であった。この値は実施例５で測定した本発明の各改変型酵素と同等であり、野生型酵素より大きい。
次に、この二重変異酵素の基質特異性を調べた。実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注し、３μｌの電子受容体を含む活性試薬（６ｍＭ  ＤＣＩＰ，６００ｍＭ  ＰＭＳ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を含む）および基質を加えた（終濃度０．０６ｍＭ  ＤＣＩＰ、０．６ｍＭ  ＰＭＳ）。基質として、それぞれ終濃度１００ｍＭとなるように４００ｍＭのグルコース、ラクトースおよびマルトースを１０μｌ加え、室温で３０分間インキュベートして、実施例３と同様に酵素活性を測定した。値はグルコースを基質としたときの活性を１００とし、これに対する相対活性で表した。結果を表３に示す。Ｔｈｒ３６６ＡｓｎとＡｓｐ１６７Ｇｌｕとの二重変異を有する改変型酵素は、野生型およびＡｓｐ１６７Ｇｌｕ単独の変異を有する改変型酵素と比較してグルコースに対する高い基質特異性を示した。なお、Ｔｈｒ３６６Ａｓｎ単独の変異を有する改変型酵素は野生型と同等の基質特異性を有する（データ示さず）。
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さらに、この二重変異酵素について、電子受容体として終濃度０．０６ｍＭのＤＣＩＰの存在下で、基質濃度１０ｍＭのグルコースを用いて、実施例３と同様にして酵素活性を測定した。値は野生型の活性を１００とし、これに対する相対活性で表した。結果を表４に示す。Ｔｈｒ３６６ＡｓｎとＡｓｐ１６７Ｇｌｕとの二重変異を有する改変型酵素は、野生型酵素と比較して高い酵素活性を有していた。
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実施例７
酵素センサーの作製および評価
５Ｕの改変型酵素にカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、５ｍＭ−５０ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
産業上の利用性
本発明の改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨは、グルコースによる基質阻害が小さいため、高濃度のグルコースの存在下におけるグルコースの測定に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明において用いたプラスミドｐＧＢ２の構造を示す。
図２は、本発明の改変型酵素をコードする突然変異遺伝子を作成する方法を示す。
図３は、本発明の改変型酵素Ｔｙｒ３６７ＡｓｐのＳＶプロットを示す。
図４は、本発明の改変型酵素Ｃｙｓ３６９ＡｒｇのＳＶプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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