(57)【要約】遺伝子工学の技術を必要としないＨＤＬにターゲットを合わせた低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤並びに該病気・症状の予防・治療法の提供。システインプロテアーゼインヒビターを有効成分とすることで、遺伝子工学の技術を用いることなくＡＢＣＡ１の発現量を増加させ、血中ＨＤＬを増加させることが可能な臨床上有用な低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
システインプロテアーゼインヒビターを有効成分とする低ＨＤＬ血症改善剤。
【請求項２】
システインプロテアーゼインヒビターが、天然物由来または非天然物由来である請求項１に記載の低ＨＤＬ血症改善剤。
【請求項３】
天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターが、微生物、植物もしくは動物起源である請求項２に記載の低ＨＤＬ血症改善剤。
【請求項４】
微生物、植物もしくは動物起源のシステインプロテアーゼインヒビターが、ロイペプチン、アンチパインおよびＥ−６４からなる群から選択される請求項３に記載の低ＨＤＬ血症改善剤。
【請求項５】
非天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターが、微生物、植物および動物のいずれの起源でもなく、合成された物質である請求項２に記載の低ＨＤＬ血症改善剤。
【請求項６】
非天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターが、ＡＬＬＮまたはＮ−ａｃｅｔｙｌ  ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｌである請求項５に記載の低ＨＤＬ血症改善剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の低ＨＤＬ血症改善剤からなる動脈硬化症予防・治療剤。
【請求項８】
ＴＨＰ−１細胞を使用し、ＡＢＣＡ１の発現を指標とするＨＤＬ新生反応促進作用を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、システインプロテアーゼインヒビターを有効成分とする低ＨＤＬ血症改善剤および同低ＨＤＬ血症改善剤からなる動脈硬化症予防・治療剤に関する。
背景技術
ＨＤＬ（ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；高密度リポタンパク質）は、主に肝臓と小腸上皮細胞で合成、分泌される。分泌直後のＨＤＬは、アポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ  Ｉともいう）とリン脂質を主成分とする円盤状粒子で、原始ＨＤＬとも呼ばれる。このＨＤＬは、血中で末梢細胞の細胞膜から、もしくは他のリポタンパク質の水解過程で生じる遊離コレステロールを受け取り、ＬＣＡＴ（ｌｅｃｉｔｈｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の作用でコレステロールエステルとして疎水性の中心部に保持しつつ、球状ＨＤＬへと成熟する。
ＨＤＬは、血中で末梢組織から余剰となったコレステロールを引き抜き、これを肝臓に転送する「コレステロール逆転送系」と呼ばれる脂質代謝の中でも極めて重要な生理機能において主要な役割を果たしており、このようなコレステロール逆転送系は、動脈硬化に対して予防的に作用するものとされている。
上記生化学的な知見に加え、血中ＨＤＬコレステロール濃度と動脈硬化の関係については、これまで多数実施された疫学的調査から、ＨＤＬコレステロール濃度が低いほど動脈硬化の発症頻度が高いことが認められており、低ＨＤＬ血症を改善することは、動脈硬化の予防・治療の面から極めて重要であると言える。
現在、血中のＨＤＬ量は、臨床上容易に測定可能なＨＤＬ分画のコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロール）の濃度を指標として測定される。日本人では、一般に血中ＨＤＬコレステロールの値が４０ｍｇ／ｄｌ未満である場合、「低ＨＤＬ血症」と診断される。
低ＨＤＬ血症は、動脈硬化症を始め、高脂血症、脳梗塞、肥満、糖尿病等の種々の疾患において高頻度で見られるほか、Ｔａｎｇｉｅｒ病を始めとする様々な遺伝的疾患においても見られる。
これまで、遺伝的疾患の場合の低ＨＤＬ血症については治療が困難なことが多く、また、動脈硬化症、高脂血症、脳梗塞、肥満、糖尿病等の疾患において見られる低ＨＤＬ血症についても、ＨＤＬ自体にターゲットを合わせた有用な低ＨＤＬ血症改善剤は見当たらず、その出現が望まれていた。
さらに、上記の肝臓と小腸上皮細胞で合成、分泌されるＨＤＬとは異なるアポリポタンパク質を成分とするＨＤＬについても興味ある知見が得られている。
すなわち、脳の星状細胞で合成、分泌されるＨＤＬは、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥともいう）とリン脂質を主成分としているが、ａｐｏＥは、中枢神経系の損傷修復に関与しており、ａｐｏＥの存在下、脳の星状細胞損傷修復作用により、アルツハイマー病等、神経障害に係わる疾患の進行を遅延させることが認められている［Ｓｃｈｉｅｆｅｒｍｅｉｅｒら，Ｓｔｒｏｋｅ，３１（９），２０６８−２０７３（２０００）］。したがって、脳の星状細胞で合成、分泌されるａｐｏＥ−ＨＤＬを増加させることは、神経障害もしくは中枢神経系の損傷に係わる疾患を予防・治療する上で極めて重要である。
一方、最近になって、Ｂｏｄｚｉｏｃｈら［Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２２，３４７−３５１（１９９９）］、Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎら［Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２２，３３６−３４５（１９９９）］およびＲｕｓｔら［Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２２，３４７−３５１（１９９９）］によって、ＨＤＬの著しい低値を示すＴａｎｇｉｅｒ病の原因遺伝子として、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  １）が同定され、低ＨＤＬ血症とＡＢＣＡ１遺伝子の関係が注目されている。
ＡＢＣＡ１は、肝臓、小腸、胎盤、副腎を始めとする各種臓器の細胞の主に細胞膜に存在するタンパク質であり、これまでにアミノ酸、ビタミン、糖などの様々な物質の膜輸送に関与していると考えられてきた［Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，８，６７−１１３（１９９２）］。
上記の最近の知見によれば、Ｔａｎｇｉｅｒ病患者においては、ＡＢＣＡ１遺伝子に変異があるため、脂質代謝に必要なＡＢＣＡ１の発現が見られず、コレステロールの細胞外への排泄が障害されてＨＤＬが消失することが報告されている。
また、上記知見に加え、Ｒｉｃｈａｒｄら［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４，Ｒ２５−Ｒ３１（１９９９）］およびＶｏｎ  Ｅｃｋａｒｄｓｔｅｉｎら［Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１５，１５５５−１５６１（２００１）］によって、ＡＢＣＡ１遺伝子の導入がＨＤＬの新生反応を促進することが見出され、現在、遺伝子工学技術を用いて体内のＡＢＣＡ１の発現量を増加させ、ＨＤＬコレステロールの濃度を上昇もしくは調節しようとする試みが行われている。
例えば、ＷＯ００／７８９７１およびＷＯ００／７８９７２においては、直接ＡＢＣＡ１ポリペプチドを宿主細胞に導入することによりＡＢＣＡ１の発現量と活性を高め、コレステロールのｅｆｆｌｕｘとＨＤＬ濃度の上昇を図るための技術が開示されている。また、ＷＯ０１／１５６７６においては、特定の物質によりＡＢＣＡ１遺伝子の転写・翻訳を亢進させ、ＡＢＣＡ１の発現量と活性を高め、ＨＤＬコレステロールとトリグリセリドの濃度を調節するための技術が開示されている。
以上述べたように、低ＨＤＬ血症を改善することは、動脈硬化の予防・治療の面からも極めて重要であり、ＨＤＬにターゲットを合わせた有用な低ＨＤＬ血症改善剤の出現が望まれているところ、最近得られたＴａｎｇｉｅｒ病に関する知見に基づき、ＡＢＣＡ１の発現量を増加させ、ＨＤＬコレステロールの濃度を上昇〜調節しようとする試みが行われている。しかし、これらはいずれも遺伝子工学技術を用いたものであり、たとえ遺伝的疾患の治療に有効であったとしても、当該遺伝的疾患に比べて圧倒的に患者数の多い動脈硬化症、高脂血症、脳梗塞、肥満、糖尿病等において見られる低ＨＤＬ血症に対しては、到底有用な改善剤とはなり得ないものである。
このような状況から、遺伝子工学技術を必要とせず、かつＨＤＬにターゲットを合わせた有用な低ＨＤＬ血症改善剤の出現が望まれていた。
発明の開示
そこで、本発明者らは、遺伝子工学の技術を必要としない、かつＨＤＬにターゲットを合わせた有用な低ＨＤＬ血症改善剤を見出すために、ＡＢＣＡ１の発現量の上昇を指標とする試験系を用い、種々の物質について検討を重ねた結果、システインプロテアーゼインヒビターがＡＢＣＡ１の発現量を大幅に、しかも持続的に上昇させることを見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成した。
本発明は、
１）  システインプロテアーゼインヒビターを有効成分とする低ＨＤＬ血症改善剤；
２）  システインプロテアーゼインヒビターが、天然物由来または非天然物由来である請求項１に記載の低ＨＤＬ血症改善剤；
３）  天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターが、微生物、植物もしくは動物起源である上記２）に記載の低ＨＤＬ血症改善剤；
４）  微生物、植物もしくは動物起源のシステインプロテアーゼインヒビターが、ロイペプチン、アンチパインおよびＥ−６４からなる群から選択される上記３）に記載の低ＨＤＬ血症改善剤；
５）  非天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターが、微生物、植物および動物のいずれの起源でもなく、合成された物質である上記２）に記載の低ＨＤＬ血症改善剤；
６）  非天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターが、ＡＬＬＮまたはＮ−ａｃｅｔｙｌ  ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｌである上記５）に記載の低ＨＤＬ血症改善剤；
７）  上記１）〜６）のいずれかに記載の低ＨＤＬ血症改善剤からなる動脈硬化症予防・治療剤；および
８）  ＴＨＰ−１細胞を使用し、ＡＢＣＡ１の発現を指標とするＨＤＬ新生反応促進作用を有する物質のスクリーニング方法を提供している。
さらなる態様では、本発明は、
９）  システインプロテアーゼインヒビターの有効量を、低ＨＤＬ血症あるいは動脈硬化症の危険因子を有する動物に投与せしめることを特徴とする当該病気あるいは疾患の予防及び／又は治療法；および
１０）  システインプロテアーゼインヒビターの有効量を、医薬として許容される担体と配合して、低ＨＤＬ血症改善剤あるいは低ＨＤＬ血症改善剤からなる動脈硬化症予防・治療剤を製造するためのシステインプロテアーゼインヒビターの用途が提供される。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容は本明細書の開示に含めて解釈されるべきものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明で、システインプロテアーゼインヒビターを有効成分とする低ＨＤＬ血症改善剤および同低ＨＤＬ血症改善剤からなる動脈硬化症予防・治療剤、さらには該病気・疾患の予防・治療法が提供される。
本明細書中、「システインプロテアーゼインヒビター」とは、ＳＨ基が活性中心に存在するプロテアーゼであるシステインプロテアーゼ［生化学辞典、第３版、（株）東京化学同人、６３７（１９９８）］に対して阻害作用を示す物質であり、天然物由来および非天然物由来のどちらの場合であってもよい。
上記天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターとは、微生物、植物もしくは動物起源のシステインプロテアーゼインヒビターであり、微生物、植物もしくは動物の組織において生成され、単離された物質をいう。上記微生物、植物もしくは動物起源のシステインプロテアーゼインヒビターには、ロイペプチン［生化学辞典、第３版、（株）東京化学同人、１５３１（１９９８）］、アンチパイン［生化学辞典、第３版、（株）東京化学同人、１１０（１９９８）］、Ｅ−６４［Ｌ−ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ−（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ｂｕｔａｎｅ；生化学辞典、第３版、（株）東京化学同人、１５０（１９９８）］等が含まれ、さらに特開平１０−７７２７６号に開示の微生物起源のシステインプロテアーゼインヒビターおよび特開平７−４８３４０号に引用されている微生物起源のシステインプロテアーゼインヒビター等も含まれる。これらの中で、ロイペプチン、アンチパインおよびＥ−６４が好ましい。
上記非天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターとは、微生物、植物および動物のいずれの起源でもなく、合成された物質をいう。上記非天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターには、例えば、ＡＬＬＮ［Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎａｌ；Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，３，１９５（１９９０）］およびＮ−ａｃｅｔｙｌ  ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｌ［Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，３，１９５（１９９０）］などに加え、次に示す文献および特許公報に開示のシステインプロテアーゼインヒビターが含まれ、さらに、当該文献および特許公報に引用されている非天然物由来のシステインプロテアーゼインヒビターも含まれる。これらの中で、ＡＬＬＮおよびＮ−ａｃｅｔｙｌ  ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｌが好ましい。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５７，１１１７（１９８８）、Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，３，１９５（１９９０）、特開平７−４８３４０号、特開平８−１５１３５５号、特開平８−３２５２８２号、特開平９−１６５３６０号、特開平９−１６９７５２号、特開平９−２９５９９６号、特開平１０−１４７５６４号、特開平１０−１４７５６６号、特開平１１−１４９１号、特開平１１−１７１８８１号、特開２００１−１３９５３４号、特開２００１−２３３８４７号、特表平１１−５０７９１２号、特表２０００−５１０４４７号、特表２００１−５０５８８９号、特表２００１−５０６５９６号、特表２００１−５０６６１４号、ＷＯ９６／２５４０８、ＷＯ９７／０３０６０、ＷＯ９８／４７８８７、ＷＯ９８／０１１３３、ＷＯ９８／０４５３９。
上記システインプロテアーゼインヒビターは、いずれも既知物質であり、上記文献および特許公報に開示の方法等に準じて単離、合成したものまたは市販品を使用することができるが、好ましくは、医薬品として耐えうる品質および安定性を有するグレードのものが使用される。
該システインプロテアーゼインヒビターとしては、ロイペプチン、アンチパイン、ＡＬＬＮおよびＮ−ａｃｅｔｙｌ  ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｌなどを含めた、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５７，１１１７（１９８８）、Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，３，１９５（１９９０）などで示された化学構造上の骨格を有していてよいペプチジルアルデヒド誘導体、例えば、特開平７−４８３４０号、特開平１０−１４７５６４号、特開平１０−１４７５６６号、特開２００１−２３３８４７号などで示された化学構造上の骨格を有していてよいスルホンアミド化ペプチジルアルデヒド誘導体、例えば、Ｅ−６４、特開平８−３２５２８２号、特開平１０−７７２７６号、特開平１０−１４７５６６号、ＷＯ９７／０３０６０、ＷＯ９８／４７８８７などで示された化学構造上の骨格を有していてよいエポキシコハク酸アミド誘導体、例えば、特開平９−１６９７５２号、特開平１１−１７１８８１号、ＷＯ９６／２５４０８、ＷＯ９８／０４５３９などで示された化学構造上の骨格を有していてよい少なくとの一つのペプチド結合を有する含酸素複素環誘導体、特開平９−１６５３６０号、特開平１１−１４９１号、特開平９−２９５９９６号などで示された化学構造上の骨格を有していてよいペプチド類、例えば、特開平８−１５１３５５号などで示された化学構造上の骨格を有していてよいアシルアミノアルデヒド誘導体、例えば、特開２００１−１３９５３４号などで示された化学構造上の骨格を有していてよいバリン誘導体、例えば、特表平１１−５０７９１２号などで示された化学構造上の骨格を有していてよいα−（１，３−ジカルボニルエノールエーテル）メチルケトン誘導体、例えば、特表２０００−５１０４４７号などで示された化学構造上の骨格を有していてよい４−オキサ−１−アザビシクロ［３，２，０］ヘプタン誘導体、例えば、特表２００１−５０５８８９号、特表２００１−５０６５９６号などで示された化学構造上の骨格を有していてよいベンズアミドアルデヒド誘導体、例えば、特表２００１−５０６６１４号などで示された化学構造上の骨格を有していてよいケトベンズアミド誘導体、例えば、ＷＯ９８／０１１３３などで示された化学構造上の骨格を有していてよいプロリン誘導体など、あるいはそれらの改変体や修飾体なども挙げることができる。
上記低ＨＤＬ血症改善剤とは、臨床上の診断基準に基づく低ＨＤＬ血症において、血中ＨＤＬコレステロール濃度を上昇させ、低ＨＤＬ血症を改善する薬剤である。通常、日本人の場合、血中ＨＤＬコレステロールの濃度が４０ｍｇ／ｄｌ未満を低ＨＤＬ血症というが、同診断基準が変更された場合、変更された診断基準に基づく低ＨＤＬ血症が含まれる。
低ＨＤＬ血症は、Ｔａｎｇｉｅｒ病等の遺伝的疾患および動脈硬化症、高脂血症、脳梗塞、肥満、糖尿病、甲状腺機能異常、肝硬変症、骨髄種、慢性腎不全、慢性炎症性腸疾患（例：クローン病、潰瘍性大腸炎）等の疾患において見られるが、本発明の低ＨＤＬ血症改善剤は、Ｔａｎｇｉｅｒ病等ＡＢＣＡ１が生体内で正常に合成されない遺伝的疾患を除き、上記疾患のいずれの場合の低ＨＤＬ血症にも使用することができる。
さらに、本発明の低ＨＤＬ血症改善剤は、後述の試験例からも明らかなように優れたＨＤＬ新生反応促進作用を示し、血中ＨＤＬを増加させることが可能である。血中ＨＤＬは、前述したように動脈硬化に対して予防的に作用するとされているコレステロール逆転送系において主要な役割を果たしており、血中ＨＤＬ増加作用のある本発明の低ＨＤＬ血症改善剤は、動脈硬化症の予防・治療剤としても有用である。
すなわち、低ＨＤＬ血症の場合、ＨＤＬの減少により、コレステロール逆転送系が充分に機能できず、血管壁に蓄積したコレステロールが血管外へ搬出されにくくなるため動脈硬化が促進される。本発明の低ＨＤＬ血症改善剤は、このような状態を改善することが可能であり、動脈硬化症に対して、予防的にも治療的にも使用される。
さらに、本発明の低ＨＤＬ血症改善剤は、脳内においても、ａｐｏＥ−ＨＤＬ濃度を上昇させ、中枢神経系損傷修復促進作用により、中枢神経系損傷に係わる疾患（例：アルツハイマー病）の予防・治療剤としても有用である。
本発明は、また、ＴＨＰ−１細胞（ヒト白血病細胞）を使用し、ＡＢＣＡ１の発現を指標とするＨＤＬ新生反応促進作用を有する物質のスクリーニング方法も提供する。
すなわち、ＴＨＰ−１細胞を培養・分化して得られたマクロファージに、スクリーニング対象物質を添加し、細胞内に発現するＡＢＣＡ１の量を測定することにより、ＨＤＬ新生反応促進作用を有する物質を見出すことができる。スクリーニング対象物質は特に限定はされず、天然物由来および非天然物由来のどちらの物質でもよい。さらに、ＡＢＣＡ１発現量の測定方法は、一般的な遺伝子工学手法であればよく、例えば、後述の試験例１または２に示された手法を採用することができる。
本発明の低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤は、単独で、好ましくは薬剤学的に許容される添加物を加えた製剤の形で投与される。その投与経路としては、経口および注射による経路が採用される。上記製剤においては、いずれの投与経路による場合も、公知の製剤添加物から選択された成分（以下「製剤成分」ということもある）を適宜使用することができる。具体的な公知の製剤添加物は、例えば、（１）医薬品添加物ハンドブック、丸善（株）、（１９８９）、（２）医薬品添加物事典、第１版、（株）薬事日報社（１９９４）、（３）医薬品添加物事典追補、第１版、（株）薬事日報社（１９９５）および（４）薬剤学、改訂第５版、（株）南江堂（１９９７）に記載されている成分の中から、投与経路および製剤用途に応じて適宜選択することができる。
例えば、経口投与による場合、上記添加物としては、経口剤を構成できる製剤成分であって本発明の目的を達成し得るものならばどのようなものでも良いが、通常は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤など公知の製剤成分が選択される。具体的な経口剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤などが挙げられる。なお、当該経口剤には、公知の製剤成分を用いて、有効成分であるシステインプロテアーゼインヒビターの体内での放出をコントロールした製剤（例：速放性製剤、徐放性製剤）も含まれる。
また、注射による場合、上記添加物としては、水性注射剤もしくは非水性注射剤を構成できる製剤成分が使用され、通常は溶解剤、溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、保存剤などの公知の製剤成分が使用されるが、さらに投与時に溶解あるいは懸濁して使用するための粉末注射剤を構成する公知の製剤成分であっても良い。水性注射剤の製剤成分としては、例えば、注射用蒸留水、等張の滅菌された塩溶液（リン酸１ナトリウムまたは２ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウム等、もしくはこのような塩の混合物を含む）等が挙げられる。
本発明の低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤の効果的な投与量は、投与される患者の年齢、体重、低ＨＤＬ血症もしくは動脈硬化症の症状、合併症の有無等によって異なり、適宜調整されるが、通常、経口投与の場合、１ｍｇ〜３，０００ｍｇ／日程度、または注射の場合、０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ／日程度投与される。
上記に鑑み、本発明では、システインプロテアーゼインヒビターの有効量を、低ＨＤＬ血症あるいは動脈硬化症の危険因子を有する動物に投与せしめることを特徴とする当該病気あるいは疾患の予防及び／又は治療法、さらに、システインプロテアーゼインヒビターの有効量を、医薬として許容される担体と配合して、低ＨＤＬ血症改善剤あるいは低ＨＤＬ血症改善剤からなる動脈硬化症予防・治療剤を製造するためのシステインプロテアーゼインヒビターの用途が提供されることも理解されよう。そして、それらは、上記記載にしたがってそれぞれの具体的な態様を実施できる。
実施例等
次に、試験例及び製剤例を記載して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。全ての例等は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
試験例１  ＡＬＬＮによるＡＢＣＡ１発現増加作用
＜試験法＞ＴＨＰ−１細胞（ヒト白血病細胞；アメリカンタイプカルチャーコレクション社製）をＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート；和光純薬工業（株）製）の存在下に１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地（岩城硝子（株）製）を用いて７２時間培養することによりマクロファージへと分化させた。培地を５０μＭのＡＬＬＮ（シグマ社製）を添加した０．２％ＢＳＡ−ＲＰＭＩ１６４０（岩城硝子（株）製）に交換し、下記の方法に従い、経時的に細胞内ＡＢＣＡ１の発現量を解析した。
ＡＬＬＮ処理細胞およびＡＬＬＮを添加しない培地で培養した対照細胞を５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中で低張破砕後、遠心（６５０ｇ、５分間）し核分画を沈殿させた。上清を１０５，０００ｇ、３０分間遠心し、ｔｏｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ分画を回収した。Ｔｏｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅを０．９Ｍウレア、０．２％トリトンＸ−１００（和光純薬工業（株）製）、０．１％ジチオスレイトール溶液（和光純薬工業（株）製）に溶解後、１／４量の１０％リチウムドデシルサルフェート溶液（和光純薬工業（株）製）を加え、１０％ＳＤＳ−７％ポリアクリルアミドゲル（和光純薬工業（株）製）にて電気泳動分離した。分離した蛋白をＰＶＤＦｍｅｍｂｒａｎｅ（バイオラッド社製）に固定・転写した後、抗ヒトＡＢＣＡ１ウサギ抗体（通常の手法を用いた自己精製）を用いたイムノブロッティングにてＡＢＣＡ１蛋白の発現量を解析し、さらに得られた当該発現量のバンドの濃さ・太さをＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（画像解析ソフト；Ｓｃｉｏｎ社製）で読み取って数値化した。
＜結果＞ＡＬＬＮを添加した培地で培養したＴＨＰ−１細胞では、対照細胞に比べて細胞内のＡＢＣＡ１の発現が顕著に増加することが認められた。すなわち、図１には、ＡＬＬＮ添加後４時間までのＡＢＣＡ１発現増加作用を示したが、同増加作用は、ＡＬＬＮ添加１５分後から認められ、その強度は、対照細胞（ＡＬＬＮ添加後の時間が０時間のもの）におけるＡＢＣＡ１発現量を１００とした場合、１６８〜１９１で推移した。なお、ＡＢＣＡ１発現増加作用は、ＡＬＬＮ添加２４時間後でも認められた。
試験例２  ロイペプチンによるＡＢＣＡ１の発現上昇作用
試験例１と同様な方法にて、ＴＨＰ−１細胞をＡＬＬＮの代わりにロイペプチンを添加した培地で培養し、ロイペプチン非処理の対照細胞と比較した。その結果、ロイペプチン処理細胞では、対照細胞に比べ、細胞内のＡＢＣＡ１の発現の顕著な増加が認められた。図２に対照細胞（ロイペプチン添加後の時間が０時間のもの）とロイペプチン添加７時間後のＡＢＣＡ１発現相対量を示した。なお、ロイペプチンのＡＢＣＡ１発現増加作用は、培地にロイペプチン添加後２４時間後でも認められた。
試験例３  ＡＬＬＮによるＨＤＬ新生反応促進作用
＜試験法＞Ａｒａｋａｗａらの方法［Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４１，１９５２−１９６２（２０００）］と同様の方法にて、ＴＨＰ−１細胞を用いて、ａｐｏＡＩ依存性のＨＤＬ新生反応に基づき培地中に搬出されたコレステロールおよびリン脂質量を解析し、ＡＬＬＮを添加した細胞と添加しない細胞を比較した。
＜結果＞ａｐｏＡＩとＡＬＬＮを添加した細胞では、ａｐｏＡＩおよびＡＬＬＮを添加しない細胞（コントロール群）およびａｐｏＡＩのみを添加した細胞（ａｐｏＡＩ添加群）に比べ、ａｐｏＡＩ依存性のコレステロールおよびリン脂質の搬出量の増加、すなわちＨＤＬの新生促進が認められた。図３にその結果を示した。
以上のように、本発明の低ＨＤＬ血症改善剤は、遺伝子工学技術を用いることなくＡＢＣＡ１発現増加作用を示し、ＨＤＬの新生反応を促進することが上記試験により確認された。
上記本発明のシステインプロテアーゼインヒビターによるＡＢＣＡ１発現増加作用は、システインプロテアーゼインヒビターを細胞培地に添加後、極めて速やかに認められており、このことは、上記従来技術における遺伝子工学技術を用いた場合のようなＡＢＣＡ１の細胞内合成の亢進によって得られたものではなく、ＡＢＣＡ１の代謝阻害という全く新しい機序によるものであることを示唆している。
製剤例１  本発明のシステインプロテアーゼインヒビター１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇ、トウモロコシデンプン２８ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
上記処方について日局ＸＩＩＩの製剤総則記載の公知方法に従ってカプセル剤を得た。
製剤例２  本発明のシステインプロテアーゼインヒビター５０ｍｇを、塩化ナトリウムの適量を含む注射用蒸留水１０ｍｌから製した等張化水溶液に溶解し、アンプルに充填・密封後、滅菌して注射剤を得た。
産業上の利用可能性
以上のように、システインプロテアーゼインヒビターを有効成分とする本発明の薬剤は、上記従来技術で見られる遺伝子工学技術を用いることなく、同従来技術とは全く異なる機序でＡＢＣＡ１の発現量を増加させ、血中ＨＤＬ量を増加させることが可能であり、動脈硬化症等の種々の疾患において高頻度で見られる低ＨＤＬ血症の改善剤として有用である。さらに、本発明の低ＨＤＬ血症改善剤は、その低ＨＤＬ血症改善作用により、動脈硬化症予防・治療剤としても有用である。また、システインプロテアーゼインヒビターを低ＨＤＬ血症や動脈硬化症に罹患する危険因子を有する動物などに投与することで、病気・疾患の予防・治療を行うことが可能である。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、試験例１の結果を示す図である。
図２は、試験例２の結果を示す図である。
図３は、試験例３の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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