(57)【要約】本発明は、肺癌を治療するための医薬組成物並びに肺癌の診断薬を提供する。具体的には、本発明は、インターロイキン−２０受容体β鎖に結合し得る抗体を含有する、肺癌を治療するための医薬組成物及び肺癌の診断薬、及び肺癌のおそれがある哺乳動物から得た試料におけるインターロイキン−２０受容体β鎖の発現を検出することを含む、肺癌の検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２０受容体β鎖に結合する抗体を有効成分として含有する、肺癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗体が、ヒト抗体、ヒト型化抗体又はキメラ化抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
インターロイキン−２０受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、該遺伝子の発現を抑制し得るアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有する、肺癌を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
インターロイキン−２０受容体β鎖に結合し得る抗体を含有する肺癌の診断薬。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項５に記載の診断薬。
【請求項７】
抗体がヒト抗体、ヒト型化抗体又はキメラ化抗体である、請求項５又は６に記載の診断薬。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の診断薬を用いて、哺乳動物の肺癌を検出する方法。
【請求項９】
肺癌のおそれがある哺乳動物から得た試料におけるインターロイキン−２０受容体β鎖の発現を検出することを含む、肺癌の検出方法。
【請求項１０】
発現の検出にインターロイキン−２０受容体β鎖に結合し得る抗体を用いる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
発現の検出にＰＣＲ法を用いる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肺癌を治療するための医薬組成物、肺癌の診断薬及び検出方法に関する。
背景技術
わが国の男性における癌死亡原因の第一位は肺癌であり、その患者数は増加の一途をたどっている。女性においては依然胃癌が最多ではあるが、肺癌は癌死亡原因の第二位であり、その差は年々縮小し、男性同様の増加傾向を示している。病理学的には、肺癌は、小細胞肺癌（Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＳＣＬＣ）、腺癌（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮肺癌（Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞肺癌（Ｌａｒｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に分類されている。また、治療の観点からは、後の三者をまとめて非小細胞肺癌（Ｎｏｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＮＳＣＬＣ）として取り扱うことも多く、これが全肺癌の約８５％を占めると言われている（表１）。
2003090779.tif 000002
非小細胞肺癌は、比較的化学療法等の治療による効果が高い小細胞肺癌に比較して、化学療法に対する反応性は極めて悪く、ＣＤＤＰを中心とする多剤併用化学療法や放射線療法の近年の進歩にもかかわらず、その延命効果は依然非常に小さく、満足できるものであるとは言えない。すなわち、非小細胞肺癌は極めて予後の悪い癌の一つであり、その画期的な治療薬の開発が切望されている。
癌関連遺伝子探索の試みは、従来、遺伝子発現量の違いに基づいて多くなされているが、それらの多くは、単純に癌組織とそれに対応する正常組織間の遺伝子発現を比較するというアプローチである。そのような方法においては、細胞の一般的、基本的な増殖機構に起因する遺伝子が同時に多く見出されてきてしまうことが想像される。そのような遺伝子は、癌細胞だけではなく正常細胞の増殖にとっても必要な遺伝子である可能性が高く、従って、それら遺伝子を標的とした薬剤は、造血細胞や小腸の上皮細胞といった増殖性が高い正常細胞に対しても同様に影響を与えてしまうことが予想される。そのような薬剤は既存の代謝拮抗剤等の化学療法剤に比較して、基本的には何らアドバンテージを持たない。
従って、増殖性が高い正常細胞に比較して、肺癌細胞の増殖や悪性化により特異的に関与する遺伝子を特定することが求められている。また、そのようにして特定された遺伝子を用いた、肺癌、特に、非小細胞肺癌の進展は阻害するが、正常細胞の増殖には何ら影響を及ぼさない肺癌の治療に有効な薬剤の開発が必要となっている。また、その特異性を利用して、肺癌を初期に検出し得る診断薬の開発も要望されている。
一方、細胞増殖に関係する因子としては、皮膚のケラチノサイト細胞の増殖においてインターロイキン−２０（以下、ＩＬ−２０と称する）が重要な因子であること、また、ヒトの乾癬患者においてＩＬ−２０受容体が過剰発現していること、ＩＬ−２０受容体を介したシグナルを遮断する物質は乾癬治療薬となり得ることが開示されている（Ｃｅｌｌ．２００１  Ｊａｎ  １２；１０４（１）：９−１９．）。しかしながら、前記報告においては、ＩＬ−２０やＩＬ−２０受容体と肺癌細胞の増殖とを結び付ける知見、あるいは、癌細胞の増殖に対するＩＬ−２０受容体を介したシグナルの作用については全く記載されていない。
発明の開示
本発明は、肺癌を治療するための医薬組成物、肺癌の診断薬及び検出方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、サブトラクション法による肺癌標的遺伝子の探索によって、肺癌細胞においてインターロイキン−２０受容体β鎖の遺伝子が高度かつ高頻度に発現上昇していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）  インターロイキン−２０受容体β鎖に結合する抗体を有効成分として含有する、肺癌を治療するための医薬組成物。
（２）  抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）  抗体が、ヒト抗体、ヒト型化抗体又はキメラ化抗体である、（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）  インターロイキン−２０受容体β鎖のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、該遺伝子の発現を抑制し得るアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有する、肺癌を治療するための医薬組成物。
（５）  インターロイキン−２０受容体β鎖に結合し得る抗体を含有する肺癌の診断薬。
（６）  抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、（５）に記載の診断薬。
（７）  抗体がヒト抗体、ヒト型化抗体又はキメラ化抗体である、（５）又は（６）に記載の診断薬。
（８）  （５）〜（７）のいずれかに記載の診断薬を用いて、哺乳動物の肺癌を検出する方法。
（９）  肺癌のおそれがある哺乳動物から得た試料におけるインターロイキン−２０受容体β鎖の発現を検出することを含む、肺癌の検出方法。
（１０）  発現の検出にインターロイキン−２０受容体β鎖に結合し得る抗体を用いる、（９）に記載の方法。
（１１）  発現の検出にＰＣＲ法を用いる、（１０）に記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−１２４７４３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための形態
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本明細書で用いられる治療という用語には、本発明の医薬組成物を被験者に投与することによって、肺癌を消滅させること、さらなる肺癌の広がりを抑制すること、肺癌による症状を軽減することが含まれる。
本発明の肺癌を治療するための医薬組成物及び肺癌の診断薬に用いる抗体は、ＩＬ−２０受容体β鎖に結合する抗体であればいかなるものでもよく、特に限定するものではないが、好ましくはモノクローナル抗体である。さらに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性等の細胞傷害活性を有するモノクローナル抗体或いはインターロイキン−２０受容体β鎖を介して細胞内に伝達されうるシグナルを遮断することができるモノクローナル抗体を用いることもできる。
また、既知の方法により放射性同位体（ＲＩ）或いはトキシンを結合させることにより、ＩＬ−２０受容体β鎖を発現している細胞の増殖を抑制できる抗体も本発明の抗体に含まれる。
さらに、上記抗体を基に作成した、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等の抗体断片、一本鎖Ｆｖ等のペプチドも本発明の抗体に含まれる。
１．サブトラクション法による肺癌細胞標的遺伝子の探索
従来、癌関連遺伝子の探索において、遺伝子の発現量の違いに基づいた探索が多く試みられているが、それらの多くは単純に癌組織とそれに対応する正常組織間の遺伝子発現を比較するというアプローチである。そのような方法においては、細胞の一般的、基本的な増殖機構に起因する遺伝子が多く見出されてきてしまうことが想像される。また、そのような遺伝子は癌細胞だけではなく正常細胞の増殖にとっても同様に必要な遺伝子である可能性が高い。従って、従来のサブトラクション法によって探索された遺伝子を標的とした薬剤は、造血細胞や小腸の上皮細胞といった増殖性が高い正常細胞に対しても同様に影響を与えてしまうことが予想され、そのような薬剤は既存の代謝拮抗剤等の化学療法剤に比較して、基本的には何らアドバンテージを持たない。
そこで、本発明者等は、より特異的に肺癌細胞の増殖や悪性化に関与する遺伝子を探索するために、肺癌組織に発現する遺伝子から正常肺組織に発現する遺伝子をサブトラクト（差し引き）する際、同時に造血細胞に発現する遺伝子をサブトラクトした。具体的には、扁平上皮肺癌由来ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡをテスター（引かれる側）とし、正常肺由来ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ、及び造血細胞を多く含む組織である正常骨髄、正常胸腺由来ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを混合したものをドライバー（引く側）として、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９６  Ｊｕｎ  １１；９３（１２）：６０２５−３０．）によるサブトラクションを行った（図１参照）。
このようなサブトラクション法により得られた遺伝子は、肺癌細胞において選択的に発現しているが、増殖性の正常造血細胞においては発現していない遺伝子であり、従って、細胞の一般的な増殖機構に関与する遺伝子ではないと考えられた。実際、この手法により得られたサブトラクトされたクローンを解析した結果、非小細胞癌細胞において顕著に発現上昇している遺伝子ＣＲＡ２６２が見出された（実施例１〜３及び図２参照）。
この遺伝子は、正常の肺組織においては極めて少量しか発現していないが、５人の異なる肺癌患者から得られた非小細胞肺癌サンプルでは、いずれにおいても同様な発現の上昇が確認された。さらに、増殖性の造血細胞を含む骨髄や胸腺、また増殖性の上皮細胞を多く含む小腸では、この遺伝子は極めて少量しか発現していなかった。以上の結果から、この遺伝子は、肺癌細胞の増殖や悪性度に特異的な何らかの重要な役割を有する遺伝子であり、肺癌の進展は阻害するが正常細胞の増殖には何ら影響を及ぼさない理想的な肺癌治療薬の標的となり得るものであると考えられ、これを以後の検討材料とした。
この遺伝子について、特許文献の核酸・アミノ酸に関するデータベース（ＧｅｎＳｅｑ）等を検索した結果、この遺伝子がＩＬ−２０受容体のβ鎖（以下、ＩＬ−２０Ｒβと称する）遺伝子であることが確認された。このＩＬ−２０Ｒβ遺伝子はすでに複数のグループにより発見されている（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９９／４６３７９，ＷＯ  ００／５３７５８，ＷＯ  ００／３９１６１，ＷＯ  ９９／６２９３４等）。なお、ヒトＩＬ−２０Ｒβ  ｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列について、配列番号１５及び配列番号１６に示した。
以上のように、ＩＬ−２０Ｒβ遺伝子が肺癌細胞、特に、非小細胞肺癌細胞において、高度に、また高頻度に発現上昇しており、ＩＬ−２０Ｒβが肺癌細胞の増殖と深く関係していることが明らかとなった。従って、本知見より、以下に説明するＩＬ−２０Ｒβに結合する抗体、或いはＩＬ−２０Ｒβをコードする遺伝子の配列（ポリヌクレオチド）に対するアンチセンスポリヌクレオチド等を用いて肺癌を治療するための医薬組成物及び肺癌の診断薬を提供することができる。
２．ＩＬ−２０Ｒβに結合し得る抗体
（１）抗体
本発明で用いられる抗体は、ＩＬ−２０Ｒβに結合し得る抗体（以下、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体と称する）であれば、その由来、種類（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）及び形状は問わない。
例えば、抗原のＩＬ−２０Ｒβと結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができるが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、及び、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものをも含む。
（２）抗体産生ハイブリドーマ
本発明で使用される抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、例えば、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ−２０Ｒβタンパク質やＩＬ−２０Ｒβを発現する細胞を感作抗原として使用して、哺乳動物を通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
具体的には、まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＩＬ−２０Ｒβを、すでに開示されているＷＯ  ９９／４６３７９，ＷＯ  ００／５３７５８，ＷＯ  ００／３９１６１，ＷＯ  ９９／６２９３４等に記載のＩＬ−２０Ｒβをコードする遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。ＩＬ−２０Ｒβをコードする遺伝子配列を有するポリヌクレオチドを公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＩＬ−２０Ｒβタンパク質を公知の方法で精製する。次に、この精製したＩＬ−２０Ｒβタンパク質、あるいは、該タンパク質の部分ペプチドを感作抗原として使用することができる。また、部分ペプチドは、ＩＬ−２０Ｒβのアミノ酸配列により化学合成により得ることもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル等を使用することができる。
感作抗原の動物への免疫は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、一般的な方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ，（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ：（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１，０００〜６，０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−２０ＲβまたはＩＬ−２０Ｒβを発現する細胞に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＩＬ−２０Ｒβへの結合活性を有するヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に、抗原となるＩＬ−２０Ｒβを投与して抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＩＬ−２０Ｒβに対するヒト抗体を取得してもよい（ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などを採用することができる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
（３）組換え型抗体
抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることもできる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。
具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。例えば、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体のＶ領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９），ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてＩＬ−２０Ｒβ抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２．Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
目的とするＩＬ−２０Ｒβ抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
さらに、マウス、ヒト等の哺乳類の抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。
（４）改変抗体
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領城とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
（５）抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＩＬ−２０Ｒβに結合し、ＩＬ−２０Ｒβの活性を阻害する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理して抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６，Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３，Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９，Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１−３０残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はＩＬ−２０Ｒβ分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＲβを認識し、他方の抗原結合部位がＩＬ−２０受容体α鎖（以下、ＩＬ−２０Ｒαと称する）、インターロイキン−２２受容体（以下、ＩＬ−２２Ｒと称する）等のその他の細胞表面分子を認識してもよい。さらに他方の抗原結合部位がＴ細胞、ナチュラルキラー細胞等の免疫系細胞の表面分子であってもよい。この場合、ＩＬ−２０Ｒβを発現している細胞に直接免疫系細胞を作用させて癌細胞に特異的に傷害を与え、癌細胞の増殖を抑えることが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
（６）組換え型抗体または改変抗体の発現及び産生
前記のようにして得られる抗体遺伝子を適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
例えば、哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合は、Ｗａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合は、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウイルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
形質転換された宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生させる蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。該抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２参照）。
（７）抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し、均一になるまで精製することができる。本発明において使用される抗体の分離、精製は、アフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。
（８）抗体の活性の確認
本発明において使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を用いることができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法も用いることができる。
ＥＬＩＳＡを用いる場合、ＩＬ−２０Ｒβをコーティングしたプレートに、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を含む試料、例えば、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
（９）細胞傷害活性
さらに、本発明において使用することができる、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性等の細胞傷害活性を有する抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体は、上記の方法で得られた抗体のＡＤＣＣ活性、或いはＣＤＣ活性を、一例として、以下の測定方法により測定することができる。
ＡＤＣＣ活性は、エフェクター細胞と標的細胞と抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体とを混合し、ＡＤＣＣの程度を調べることにより測定することができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト抹消血、骨髄から分離した単核球等を利用することができ、標的細胞としてはヒト肺癌細胞株、例えばＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２などを用いることができる。標的細胞を予め５１Ｃｒにより標識し、これに抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を加えインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加え、インキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の放射活性をカウントすることによりＡＤＣＣ活性を測定することができる。
またＣＤＣ活性は、上記の標識標的細胞と抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体とを混合し、その後補体を添加してインキュベーションを行い、培養後に上清中の放射活性をカウントすることにより測定することができる。
（１０）ＩＬ−２０Ｒβに対する中和活性
さらに、本発明において使用することができる、ＩＬ−２０Ｒβを介して細胞内に伝達されうるシグナルを遮断する活性（ＩＬ−２０Ｒβに対する中和活性）を有する抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体は、上記の方法で得られた抗体について、ＩＬ−２０Ｒβに対する中和活性を、一例として、以下の測定方法により測定することができる。
ＩＬ−３に依存して増殖するマウスＢａ／Ｆ３などの細胞に、ＩＬ−２０Ｒ遺伝子を単独で、あるいはＩＬ−２０Ｒα遺伝子やＩＬ−２２Ｒ遺伝子といった適当な遺伝子と共に導入することにより、ＩＬ−３によるシグナルの代わりに、ＩＬ−２０あるいはＩＬ−１９やＩＬ−２４などによるＩＬ−２０Ｒβを介したシグナルに依存して増殖し得る細胞株を構築する。
この際、それぞれの受容体の細胞内領域を、例えばＧ−ＣＳＦ受容体の細胞内領域などに変換したキメラ受容体を用いることにより、より効果的なシグナルを伝達させるようにすることもできる。
このような細胞株をＩＬ−２０あるいはＩＬ−１９やＩＬ−２４などの存在下で培養し、ここに本発明において使用される抗体を添加してその細胞増殖に対する抑制能を調べることにより、当該抗体の「ＩＬ−２０Ｒβを介したシグナルを遮断する活性」を測定することができる。
あるいは、ＩＬ−２０又はＩＬ−１９やＩＬ−２４などによるＩＬ−２０Ｒβを介したシグナルに依存して増殖し得るヒト癌細胞株、好ましくはヒト肺癌細胞株を用い、同様な方法によって当該抗体の「ＩＬ−２０Ｒβを介したシグナルを遮断する活性」を測定することができる。
また、ＳＴＡＴ３の活性化といったＩＬ−２０Ｒβを介して伝えられる細胞内のシグナルを検出することによっても、当該抗体の「ＩＬ−２０Ｒβを介したシグナルを遮断する活性」を測定することができる。細胞内のシグナルの検出には、たとえばレポーター遺伝子を用いた検出系を用いることができる。レポーター遺伝子は、例えば活性化ＳＴＡＴ３によって転写活性が促進される配列（ＳＴＡＴ３反応性の配列）と、適当なレポーターを連結することによって作製することができる。ＳＴＡＴ３反応性の配列としては、ＳＴＡＴ３が結合することが知られているコンセンサス配列や、ＳＴＡＴによって発現制御されることが知られているｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーターなどを用いることができる。レポーターとしては、通常よく用いられるホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いることができ、発現されたルシフェラーゼの活性は例えばＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを用いた一般的な方法により測定することができる。Ａ５４９細胞やＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞などの適当な細胞にレポーター遺伝子を導入し、ＩＬ−２０あるいはＩＬ−１９やＩＬ−２４などといったリガンドによって刺激を入れてレポーターの発現を測定する系において、当該抗体を同時に添加することにより、当該抗体の「ＩＬ−２０Ｒβを介したシグナルを遮断する活性」を測定することが可能である。なおこの際、レポーター遺伝子と共に、ＩＬ−２０Ｒβ遺伝子、ＩＬ−２０Ｒα遺伝子、ＩＬ−２２Ｒ遺伝子などのレセプターを構成する遺伝子を同時に導入してもよい。
さらには、ＩＬ−２０あるいはＩＬ−１９やＩＬ−２４などといったリガンドの、ＩＬ−２０Ｒβを含む受容体複合体への物理的な結合に対する阻害活性を測定することによっても、当該抗体の「ＩＬ−２０Ｒβを介したシグナルを遮断する活性」を測定することができる。
ここで、「ＩＬ−２０あるいはＩＬ−１９やＩＬ−２４などといったリガンドのＩＬ−２０Ｒβを含む受容体複合体への物理的な結合」の測定は、受容体タンパク質あるいはリガンドタンパク質を固相化したセンサーチップを用い、ＢＩＡＣｏｒｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）などの装置により表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出することにより実施することができる。
または、放射性同位元素、酵素、ビオチンなどにより標識されたリガンドを用い、固相化された受容体タンパク質に対するそれら標識リガンドの結合を、上記ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法などにより検出することによっても測定することができる。
３．  抗体を含有する医薬組成物
上記の方法により得ることができる、ＩＬ−２０受容体β鎖に結合し得る抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を有効成分として含有する医薬組成物は、肺癌を治療することを目的として使用することができる。
さらに抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質を結合させた抗体を有効成分として含有する医薬組成物も肺癌を治療することを目的として使用することができる。
また、ＩＬ−２０Ｒβは、ＩＬ−２０Ｒα、あるいはＩＬ−２２Ｒとヘテロダイマーを形成することにより、細胞内にシグナルを伝達することが知られている（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１Ｏｃｔ  １；１６７（７）：３５４５−９．）。このため、これらのいずれかを標的としたとしても、ＩＬ−２０Ｒβを介するシグナルを遮断することが可能である。従って、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体の他に、ＩＬ−２０Ｒα又はＩＬ−２２Ｒに特異的に結合し得る抗体を単独で、又は互いに組み合わせて有効成分として含有させることもできる。しかしながら、正常組織においてより限局した発現パターンを示すＩＬ−２０Ｒβを標的とする方が、より正常細胞に対する影響が少なく、また、副作用の軽減という観点から有利であると考えられ、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を有効成分として含有するのが好ましい。
本発明の医薬組成物の投与は、非経口的全身投与又は局所的投与で行うことができる。例えば、具体的な投与方法としては、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、経肺投与等が挙げられ、患者の年齢、症状等により適宜選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１Ｋｇあたり０．００１ｍｇから１，０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１００，０００ｍｇの投与量を選ぶことができる。しかしながら、これらの投与量に制限されるものではない。
また、本発明の医薬組成物の投与時期は、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容され得る担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。
実際に使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を溶剤、例えば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤型とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
４．アンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物
本発明においては、ＩＬ−２０Ｒβの発現を阻害し得る、ＩＬ−２０Ｒβをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物を肺癌を治療することを目的として使用することができる。
また、ここで「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成する各ヌクレオチドに対応するそれぞれのヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよく、その合成法や由来はいずれでもよい。
本発明の医薬組成物に用いられるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＩＬ−２０Ｒβをコードする５’領域を含む１５〜３０個の連続する塩基配列に対するアンチセンスポリヌクレオチドが好ましい。
これらのアンチセンスポリヌクレオチドは常法によって得ることができる。例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成される。合成は、ホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などを用いることによって達成することができる。精製および純度確認は、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて行うことができる。分子量の確認は、ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ又はＦａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｎｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙで行うことができる。本発明の医薬組成物に用いられるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＩＬ−２０ＲβをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡの塩基配列にハイブリダイズする配列を有するものであれば、その合成法や由来はいずれでもよい。
上記のようにして得られるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＩＬ−２０Ｒβの産生細胞に作用して、ＩＬ−２０ＲβをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合するこによりその転写又は翻訳を阻害し、ＩＬ−２０Ｒβの発現を抑制し、結果的にＩＬ−２０Ｒβの作用を抑制する効果を有する。従って、ＩＬ−２０Ｒβに対するアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物は、肺癌を治療するために有用である。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物は、アンチセンスポリヌクレオチドに適当な基剤を混和し、塗布剤等の外用剤とすることができる。また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法に従って調製することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、患者の患部に直接適用するか、または血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適応させる。さらに持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポゾーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチル又はこれらの誘導体が挙げられる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
５．抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を含有する肺癌の診断薬及び検出方法
本発明において用いられる抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を含む診断薬は、哺乳動物（ヒト等）の肺癌を診断するのに用いることができる。具体的には、抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を用いて、免疫学的測定法により、被検試料中の抗原（ＩＬ−２０Ｒβ）を検出することによって肺癌を診断する診断薬及び肺癌の検出方法を提供する。抗体は、ＩＬ−２０Ｒβに結合しうるものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良く、またヒト抗体、ヒト型化抗体又はキメラ抗体等を適宜使用することができる。免疫学的測定法としては、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法等が挙げられるがこれに限定されるものではない。本発明の診断において利用可能な被検試料としては、リンパ液、血液、関節液等の体液、生検により採取した肺組織等を用いることができる。
本発明の方法は、肺癌のおそれがある哺乳動物、特にヒトから得た試料におけるＩＬ−２０Ｒβの発現を検出することを含む。例えば、肺癌を潜在的に患っている被験者から得た被検試料と抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体とを結合させ、この抗体と被検試料中のＩＬ−２０Ｒβの複合体の量（発現レベル）を検出し、標準値と比較することによって肺癌の存在を確認することができる。ここで「標準値」としては、多数の正常試料における発現レベルを測定して得られた統計的な値を用いても良く、あるいは、同一被験者の正常組織における発現レベルであっても良い。肺癌細胞におけるＩＬ−２０Ｒβ遺伝子の発現上昇は、個人間の差異ではなく、同一の患者の肺組織内において癌化に伴い起こる現象であり、肺以外の組織から得られたサンプルを対照サンプルとして用いることができる。当業者であれば、本明細書の記載及び当分野における知識に基いて、診断の際に用いるべき標準値（対照試料）を適宜決定することができ、特に限定するものではない。
あるいはまた、ＰＣＲ法等の核酸増幅法を用いて、被検試料中のＩＬ−２０Ｒβの発現を検出することができる。具体的には、肺癌のおそれがある哺乳動物、特にヒトの肺組織由来のｃＤＮＡを鋳型にして、ＩＬ−２０Ｒβ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによる発現解析を行うことによって、臨床的には症状が見られないような初期においても肺癌を検出することが可能である。対照としては、同一または異なる被験者由来の正常組織を用いることができるが、予め決定された標準的な正常レベルを比較対照として用いることもできる。
また、ラジオアイソトープ（１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ等）で標識した抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体を被験者に静脈内投与することにより、初発肺癌のみならず転移肺癌の局在を検出することもできる。
実施例
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］  サブトラクション
サブトラクションは、ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用い、Ｌｕｄａ  Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏらの方法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６  Ｊｕｎ  １１；９３（１２）：６０２５−３０．）に基本的に従って行った。
ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いた標準的な方法を用いて、ヒト扁平上皮肺癌サンプル由来ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ヒト正常肺由来ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ヒト正常骨髄由来ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）及びヒト正常胸腺由来ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）より二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡ末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化し、さらにＲｓａＩを用いて切断した。
ヒト扁平上皮肺癌サンプル由来のｃＤＮＡ（テスター）の一部を二分割し、それぞれ配列番号１と配列番号２に示すヌクレオチド配列を有する２種のポリヌクレオチドからなるアダプター１と、それぞれ配列番号３と配列番号４に示すヌクレオチド配列を有する２種のポリヌクレオチドからなるアダプター２に、それぞれを別々にライゲートした。各アダプターにライゲートされたヒト扁平上皮肺癌サンプル由来のｃＤＮＡ（テスター）の一部を含むサンプルに対して、それぞれ過剰量のヒト正常肺由来ｃＤＮＡ、ヒト正常骨髄由来ｃＤＮＡ及びヒト正常胸腺由来ｃＤＮＡの混合物（ドライバー）を加え、熱変性を行い、次いで、６８℃で８時間の一次ハイブリダイゼーションを行った。
次に、これらのハイブリダイゼーション後の溶液を熱変性せずに互いに混合し、さらに熱変性した過剰量のドライバーを加え６８℃で約１６時間の二次ハイブリダイゼーションを行った。その後、希釈用バッファーにて希釈し、７５℃で７分間インキュベートし、配列番号２及び配列番号４に示す前記各アダプターの短い方の鎖を取り除いたものをＰＣＲの鋳型として用いた。各アダプターに対応するプライマーである、配列番号５、６でそれぞれ表されるＰＣＲプライマー１、２を用いたＰＣＲ（サプレッションＰＣＲ）を行うことにより、両端に異なるアダプターを持ったｃＤＮＡ（サブトラクトされたｃＤＮＡ）のみを選択的に増幅した。これの一部を鋳型とし、ＰＣＲプライマー１、２のさらに内側に位置するプライマーである、配列番号７、８でそれぞれ表されるＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマー１、２を用いたＰＣＲを行うことにより、さらに選択性を増した生成物を得た。
得られた生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＴＡクローニング法によりクローニングした。
2003090779.tif 000003
2003090779.tif 000004
［実施例２］シークエンスの解読
シークエンシングは、アルカリＳＤＳ法によって調製したプラスミドＤＮＡ、またはコロニーＰＣＲなどのＰＣＲ産物を鋳型とし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｙＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いたサイクルシークエンシング法により行い、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより解読した。
コロニーＰＣＲは、ベクタープライマーであるＭ１３  Ｐ４−２２プライマー（配列番号９：５’ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ  ３’）及びＭ１３  Ｐ５−２２プライマー（配列番号１０：５’ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ  ３’）を含むＰＣＲ反応溶液の中に、組み換え体を持つコロニーを直接懸濁することにより行った。ＰＣＲ反応後、増幅されたインサートＤＮＡからゲル濾過法などにより未反応のプライマー、ヌクレオチド等を除き、シークエンシングの鋳型として用いた。
［実施例３］ＲＴ−ＰＣＲ解析
ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いた標準的な方法を用いて、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡより１本鎖ｃＤＮＡを合成し、その一部をＲＴ−ＰＣＲ解析の鋳型として用いた。ＰＣＲは基本的に以下の条件で行った。
１．反応液組成
2003090779.tif 000005
2003090779.tif 000006
２．反応条件
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→５０℃〜６０℃、１分→７２℃、１分）×２８〜３５サイクル→７２℃、３分
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→６８℃、２分）×２８〜３５サイクル→７２℃、３分
３．プライマー
（１）ＣＲＡ２６２に関するプライマー
2003090779.tif 000007
（２）ＲＰ  Ｓ９に関するプライマー
2003090779.tif 000008
得られた結果を図２に示す。図中、上段はＣＲＡ２６２（ＩＬ−２０Ｒβ）遺伝子の発現を表し、下段は対照としてのリボゾームタンパクＳ９遺伝子（ＲＰ  Ｓ９）の発現を表している。図２から明らかなように、正常細胞においてはＣＲＡ２６２（ＩＬ−２０Ｒβ）遺伝子の発現は極めて弱いが、癌細胞においては、顕著な発現上昇が認められた。従って、ＣＲＡ２６２（ＩＬ−２０Ｒβ）遺伝子は肺癌細胞の増殖に深く関与していることが明らかとなった。
［実施例４］Ｌ−２０Ｒβを介するシグナル伝達に関与する各種分子（ＩＬ−２０Ｒβ関連分子）の非小細胞肺癌臨床サンプルにおける発現プロファイルの解析
４種類の互いに異なる非小細胞肺癌患者由来の癌組織、および正常の肺、肝臓、胸腺、骨髄、小腸の各組織から調製したｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡより、実施例１に記載の条件に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成した。この一部を鋳型とし、次に示す各遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによる発現解析を行った。ＰＣＲの条件は実施例３に記載の条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。
（１）ＩＬ−２０Ｒαに対するプライマー
2003090779.tif 000009
（２）ＩＬ−２０Ｒβに対するプライマー
2003090779.tif 000010
（３）ＩＬ−２２Ｒに対するプライマー
2003090779.tif 000011
（４）ＩＬ−１９に対するプライマー
2003090779.tif 000012
（５）ＩＬ−２０に対するプライマー
2003090779.tif 000013
（６）ＩＬ−２４に対するプライマー
2003090779.tif 000014
2003090779.tif 000015
（７）ＲＰ  Ｓ９に対するプライマー
2003090779.tif 000016
その結果、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４の受容体を形成するサブユニットである、ＩＬ−２０Ｒα、ＩＬ−２０Ｒβ、ＩＬ−２２Ｒの中で、ＩＬ−２０Ｒβのみが肺の癌化に伴って顕著に発現上昇していることが明らかになった（図３）。このことから、これらの受容体サブユニットの中でも特にＩＬ−２０Ｒβが肺の癌化に深い関与があることがわかった。
また、３種類のリガンドの中では、特にＩＬ−２４の遺伝子発現が肺癌細胞において高度に上昇していることが明らかとなった（図４）。このことから、ＩＬ−２４により伝えられるシグナルが肺癌細胞の増殖において非常に重要な役割を果たしているものと考えられる（図５）。
一方、ＩＬ−２４以外にも、ＩＬ−１９およびＩＬ−２０の遺伝子発現が肺癌細胞に認められることが明らかとなった（図４）。これらの遺伝子の場合は癌化に伴う顕著な発現上昇は認められないものの、肺癌細胞に発現が存在することから、その増殖に深く関与しているものと考えられた。特にＩＬ−２０は皮膚ケラチノサイト細胞の増殖に重要な働きをしていることが明らかにされていることから、ＩＬ−２０によるシグナルが肺癌細胞の増殖においてもまた同様に重要な働きを持つことが推測される。ＩＬ−２０Ｒβは、これらのいずれのリガンドのシグナル伝達にも共通に関わる受容体であり（図５）、さらに、肺の癌化において顕著に発現が上昇していることが本発明により初めて明らかになったことから、ＩＬ−２０Ｒβを標的としそのシグナルを遮断する薬剤は、効果的に肺癌細胞の増殖を抑制できるものと考えられる。
次に、５人の肺癌患者の癌部（Ｔ）、および非癌部（Ｎ）由来のｃＤＮＡ（Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型に、次に示す各遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによる発現解析を行った。ＰＣＲの条件は実施例３に記載の条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。
（１）ＩＬ−２０Ｒβに対するプライマー
2003090779.tif 000017
（２）ＲＰ  Ｓ９に対するプライマー
2003090779.tif 000018
その結果、４人の肺癌患者の癌部においてＩＬ−２０Ｒβ遺伝子の顕著な発現上昇がみられることが明らかとなった（図６）。このことから、これまでのＲＴ−ＰＣＲ解析でみられた肺癌細胞におけるＩＬ−２０Ｒβ遺伝子の発現上昇は、個人間の差異ではなく、同一の患者の肺組織内において癌化に伴い起こる現象であることが確認された。
［実施例５］ＩＬ−２０Ｒβ関連分子のヒト非小細胞肺癌細胞株における遺伝子発現プロファイルの解析
次の１０種類のヒト非小細胞肺癌細胞株より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて、メーカー推奨の標準的な方法に従いｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
＜ヒト非小細胞肺癌細胞株＞
ＬＣ−１／ｓｑ、ＥＢＣ−１、ＬＫ−２、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＣ−２／ａｄ、ＡＢＣ−１、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２
こうして得たｔｏｔａｌ  ＲＮＡより、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、メーカー推奨の標準的な方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーとしてはオリゴｄＴ（１２〜１８ｍｅｒ）を用いた。このｃＤＮＡの一部を鋳型とし、次に示す各遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの条件は実施例３に記載の条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。
（１）ＩＬ−２０Ｒαに対するプライマー
2003090779.tif 000019
（２）ＩＬ−２０Ｒβに対するプライマー
2003090779.tif 000020
（３）ＩＬ−２２Ｒに対するプライマー
2003090779.tif 000021
（４）ＩＬ−１９に対するプライマー
2003090779.tif 000022
（５）ＩＬ−２０に対するプライマー
2003090779.tif 000023
（６）ＩＬ−２４に対するプライマー
2003090779.tif 000024
2003090779.tif 000025
その結果、調べた１０種類の非小細胞肺癌細胞株の全てにおいてＩＬ−２０Ｒβ遺伝子の発現がみられることが明らかとなった（図７）。また、ＩＬ−２０Ｒβとヘテロダイマーを形成することが知られているＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２２の遺伝子発現も高頻度で認められることがわかった。このことから、ＩＬ−２０Ｒβ／ＩＬ−２０Ｒα、あるいはＩＬ−２０Ｒβ／ＩＬ−２２Ｒからなる受容体は肺癌細胞において高頻度に発現しており、肺癌細胞の増殖に深く関与しているものと考えられた。次に、これらの受容体のリガンドであるＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４の遺伝子発現を調べたところ、これらもまた非小細胞肺癌細胞株において高頻度に発現していることが明らかとなった（図８）。特に、ＬＣ−１／ｓｑ、ＥＢＣ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＣ−２／ａｄ、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３においては、リガンドのいずれかと、ＩＬ−２０Ｒβ／ＩＬ−２０ＲαあるいはＩＬ−２０Ｒβ／ＩＬ−２２Ｒのいずれかがともに発現していることから、これらのリガンド・受容体によるオートクライン機構が働いている可能性があるものと考えられた。
［実施例６］ＩＬ−２０Ｒβ遺伝子の他癌種における発現プロファイルの解析
４人の胃癌患者（Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５）の癌部（Ｔ）、非癌部（Ｎ）由来ｃＤＮＡ（Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、および４人の子宮癌患者（Ｕ１、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６）の癌部（Ｔ）、非癌部（Ｎ）由来ｃＤＮＡ（Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）の一部を鋳型に、次に示す各遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの条件は実施例３に記載の条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。
（１）ＩＬ−２０Ｒβに対するプライマー
2003090779.tif 000026
（２）ＲＰ  Ｓ９に対するプライマー
2003090779.tif 000027
その結果、いずれの患者においても癌部におけるＩＬ−２０Ｒβの顕著な発現上昇は認められないことが明らかとなった（図９）。このことから、胃癌や子宮癌においては、ＩＬ−２０Ｒβを介するシグナルの癌化や癌細胞の増殖に対する関与は非常に小さいものと考えられた。すなわち、ＩＬ−２０Ｒβを介するシグナルは全ての癌種においてその癌化や癌細胞の増殖に関わっているのではなく、肺癌などの一部の癌においてのみ重要な役割を果たしていることが明らかとなった。従って、本発明により特に肺癌においてＩＬ−２０Ｒβを介するシグナルがその癌化や癌細胞の増殖において重要な役割を持つことが明らかにされたことによって初めてＩＬ−２０Ｒβを標的とする薬剤の有用性が見出された。
［実施例７］Ｌ−２０Ｒβ関連分子の発現プラスミドの作製
各種ＩＬ−２０Ｒβ関連分子を発現するプラスミドの作製を以下のようにして行った。まず、次に示す各遺伝子に特異的なプライマーを用い、ＰＣＲ法によりそれぞれの鋳型ＤＮＡから目的とするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの条件は次に示す条件、あるいは実施例３に記載の条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。増幅されたｃＤＮＡをプライマーに付加した制限酵素サイトによって切断し、哺乳動物細胞発現用ベクター（ｐＣＸＮＤ３）の適当なサイトに組み込んだ。複数のクローンをシークエンシングすることにより、ｃＤＮＡが正しい向きに組み込まれ、ＰＣＲエラーのないクローンを選択し、以降の実験に用いた。
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０Ｒβ
鋳型                ：ヒト肺癌由来ｃＤＮＡプール
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒβ、全ＯＲＦ、タグなし
プライマー：
2003090779.tif 000028
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈｓＩＬ−２０Ｒβ−ＦＬＡＧ
鋳型                ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０Ｒβ
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒβ、細胞外領域のみ、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ付加
プライマー：
2003090779.tif 000029
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈｓＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓ
鋳型                ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０Ｒβ
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒβ、細胞外領域のみ、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加
プライマー：
2003090779.tif 000030
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈｔＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓ
鋳型                ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０Ｒβ
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒβ、膜結合型、細胞内領域欠失、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加
プライマー：
2003090779.tif 000031
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０Ｒα
鋳型                ：ヒト正常肺由来ｃＤＮＡプール
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒα、全ＯＲＦ、タグなし
プライマー：
2003090779.tif 000032
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２２Ｒ
鋳型                ：ヒト正常小腸由来ｃＤＮＡプール
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２２Ｒ、全ＯＲＦ、タグなし
プライマー：
2003090779.tif 000033
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０
鋳型                ：ヒト正常肺由来ｃＤＮＡプール
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２０、全ＯＲＦ、タグなし
プライマー：
2003090779.tif 000034
プラスミド名        ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０−ＦＬＡＧ
鋳型                ：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０
コードするタンパク質：ヒトＩＬ−２０、全ＯＲＦ、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ付加
プライマー：
2003090779.tif 000035
＜ＰＣＲ反応液組成＞
2003090779.tif 000036
2003090779.tif 000037
あるいは
2003090779.tif 000038
＜ＰＣＲ反応条件＞
９４℃、２分→（９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２分）×２５〜４０サイクル→７２℃、１０分
あるいは
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、２分）×２５〜４０サイクル→７２℃、１０分
［実施例８］Ｌ−２０Ｒβ関連分子の発現細胞の作製
上記のようにして作製した発現プラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで消化することにより直線化し、ＧＥＮＥ−ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いたエレクトロポレーション法によりＣＨＯ細胞に導入した。エレクトロポレーションの条件は以下を用いた。
キュベット：０．４ｃｍ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ
パルス：１．５ｋＶ、２５μＦ
エレクトロポレーションを行った細胞をＧ４１８の存在下に培養することにより、遺伝子が導入された細胞を選択した。発現されたタンパク質の検出は、タグに対する抗体などを用いたウエスタン解析などにより行った。
このようにして次に示す細胞株を作製した。
・細胞株１
発現するタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒβ、細胞外領域のみ、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ付加
親細胞：ＣＨＯ細胞
導入したプラスミド：ｐＣＸＮＤ３／ｈｓＩＬ−２０Ｒβ−ＦＬＡＧ
・細胞株２
発現するタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒβ、細胞外領域のみ、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加
親細胞：ＣＨＯ細胞
導入したプラスミド：ｐＣＸＮＤ３／ｈｓＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓ
・細胞株３
発現するタンパク質：ヒトＩＬ−２０Ｒβ、膜結合型、細胞内領域欠失、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加
親細胞：ＣＨＯ細胞
導入したプラスミド：ｐＣＸＮＤ３／ｈｔＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓ
・細胞株４
発現するタンパク質：ヒトＩＬ−２０、全ＯＲＦ、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ付加
親細胞：ＣＨＯ細胞
導入したプラスミド：ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０−ＦＬＡＧ
また、ＩＬ−２０に依存的に増殖する細胞株（細胞株５）は次のようにして作製した。すなわち、ｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２０ＲβとｐＣＸＮＤ３／ｈＩＬ−２２ＲをＰｖｕＩで消化することにより直線化し、ＧＥＮＥ−ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いたエレクトロポレーション法によりＢａ／Ｆ３細胞導入した。エレクトロポレーションの条件は以下を用いた。
キュベット：０．４ｃｍ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ
パルス：０．３３ｋＶ、９５０μＦ
エレクトロポレーションを行った細胞を、Ｇ４１８、およびＩＬ−２０の存在下で培養することにより、ＩＬ−２０依存的に増殖するようになった細胞を選択した。このようにして細胞株５を樹立した。
［実施例９］Ｌ−２０Ｒβ関連組み換えタンパク質の調製
・可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−ＦＬＡＧタンパク質
細胞株１を大量に培養し、その培養上清を回収した。この培養上清を、陰イオン交換樹脂であるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）充填カラムにアプライし、洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．６）によりカラムを洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．２）を用いて可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−ＦＬＡＧタンパク質を含む粗精製画分を得た。続いて、本粗精製画分からＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｆｒｅｅｚｅｒ  ｓａｆｅ）−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いたアフィニティー精製を以下の様にして実施した。即ち、上記粗精製画分を上記アフィニティー樹脂充填カラムにアプライし、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴａＫａＲａ社）よりカラムを洗浄した後、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ３．５により溶出した。溶出された画分に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を適宜加えることにより中和し、ついでＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用い０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）にバッファー置換を行った。これをセントリプレップＹＭ−１０（ミリポア社）にて適当量まで濃縮したものを最終精製品とした。
最終精製品の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、タンパク質濃度はＤｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）により、ウシガンマグロブリン換算値として算出した。
・可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓタンパク質
細胞株２を大量に培養し、その培養上清を回収した。この培養上清に１／１０量の５００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０を添加したものを金属キレート・アフィニティークロマトグラフィー担体であるＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ社）充填カラムにアプライし、洗浄バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）によりカラムを洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２５０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）を用いて可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓタンパク質を含むアフィニティー精製画分を得た。続いて、本アフィニティー精製画分をセントリプレップＹＭ−１０（ミリポア社）にて、適当量まで濃縮し、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行った。このゲルろ過クロマトグラフィーによって不純物と分離された可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓ画分を分取し、再度セントリプレップＹＭ−１０にて、適当量まで濃縮したものを最終精製品とした。なお、ゲルろ過クロマトグラフィー用のバッファーはＤ−ＰＢＳ（−），０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。
最終精製品の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、タンパク質濃度はＤｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）により、ウシガンマグロブリン換算値として算出した。
・ヒトＩＬ−２０−ＦＬＡＧタンパク質
細胞株４を大量に培養し、その培養上清を回収した。この培養上清をＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｆｒｅｅｚｅｒ  ｓａｆｅ）−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）アフィニティー樹脂充填カラムにアプライし、Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴａＫａＲａ社）によりカラムを洗浄した後、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ３．５により溶出した。これに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を適宜加えることにより中和を行い、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＤ−ＰＢＳ（−）にバッファー置換した。これをセントリプレップＹＭ−１０（ミリポア社）にて適当量まで濃縮したものを最終精製品とした。
最終精製品の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、タンパク質濃度はＤｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）により、ウシガンマグロブリン換算値として算出した。
［実施例１０］抗ＩＬ−２０Ｒβ抗体の作製
抗ＩＬ−２０Ｒβウサギポリクローナル抗体の作製
ヒトＩＬ−２０Ｒβアミノ酸配列（配列番号１６）をもとに、次のペプチドを合成した（サワディー・テクノロジー社）。
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ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）を用いた方法により、アミノ末端のシステインを介して各ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。これをウサギ（日本白色種、メス）に数回免疫することにより抗血清を得た。ペプチドを固定化したカラムによるアフィニティ精製を行い、ペプチドに特異的に反応するモノスペシフィックな抗体を調製した。得られた抗体の力価は、免疫に用いたペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡ法、あるいは先述のヒトＩＬ−２０Ｒβ発現細胞（細胞株３）を用いたＦＡＣＳ解析などにより解析した（図１０）。
抗ＩＬ−２０Ｒβマウスモノクローナル抗体の作製
上記のようにして調製した可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−ＦＬＡＧタンパク質をマウスに免疫した。初回免疫は、タンパク質溶液をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）と混合することによりエマルジョン化し、１匹あたり１００μｇのタンパク質を腹部皮下に数箇所に分けて投与することにより行った。それ以降の免疫は、タンパク質溶液をフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）と混合することによりエマルジョン化し、１匹あたり５０μｇのタンパク質を腹部皮下に数箇所に分けて投与することにより行った。免疫した３匹のマウスより採血して血清を分離し、それを用いて抗体化の上昇をＥＬＩＳＡ法により検定した（図１１）。
ＥＬＩＳＡには可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓタンパク質を抗原として用い、一般的な操作法に基づいて行った。抗体価の上昇がみられたマウスについて脾臓細胞を調製し、一般的なポリエチレングリコールを用いる方法によってマウスミエローマ細胞株であるＰ３Ｕ１細胞との細胞融合を行い９６ウェルプレートに蒔きこんだ。これをＨＡＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ，Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を含む培地中で培養することにより、ハイブリドーマのみを選択した。ハイブリドーマの培養上清について可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓタンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡを行うことにより、ＩＬ−２０Ｒβに対する抗体を産生するハイブリドーマが存在するウェルを選択した。
またこのとき同時に、ＩＬ−２０依存性細胞株（細胞株５）を用いた増殖アッセイによってハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、中和活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマを選択することもできる。細胞株５を用いた増殖アッセイは例えば次のようにして実施することができる。すなわち、細胞株５をサイトカインを含まない培地で数回洗浄し、適当数（２０００細胞〜５００００細胞／ウェル、通常２００００細胞／ウェル）で９６ウェルプレートに蒔きこんだ後、抗体サンプル、サイトカイン（ヒトＩＬ−２０−ＦＬＡＧタンパク質）を適宜添加し、３７℃で適当な時間（１６時間〜９６時間、通常２４時間）培養する。培養後に細胞数をＭＴＴアッセイやＷＳＴ−８アッセイなどの一般的な方法により測定することにより増殖度を検定することができる。ＷＳＴ−８アッセイは、培養液中にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライテスク株式会社）を適当量（通常培養液の１／１０量）添加し、適当な時間（通常２時間）培養した後に、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより実施することができる。
結合活性がみられたウェルについて限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）法によりハイブリドーマのシングルクローン化を行い、再びＥＬＩＳＡ法により抗体の結合活性を検定することにより、ＩＬ−２０Ｒβに結合する抗体を産生するハイブリドーマクローン（ＭＫ８、ＭＫ１０、ＭＫ１４、ＭＫ２３、ＭＫ２４、ＭＫ２７、ＭＫ２８）を単離した（図１２）。
産業上の利用可能性
本発明の医薬組成物及び診断薬は、肺癌細胞において正常細胞に比較して顕著に発現が認められたＩＬ−２０Ｒβに対して特異的に結合作用するので、肺癌の治療並びに肺癌の診断に有用である。本発明は、既存の治療方法では治癒率が極めて低い非小細胞肺癌を含む肺癌について非常に効果的な治療方法及び診断方法を提供し得る。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明におけるサブトラクション法の流れを示す図である。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって得られた電気泳動の結果を示す図である。図中、ＬＧは正常肺、ＴＨは正常胸腺、ＢＭは正常骨髄、ＳＩは正常小腸、Ｃはコントロールを示す。
図３は、ＲＴ−ＰＣＲによるヒト正常組織（肺、肝臓、胸腺、骨髄、小腸）、および非小細胞肺癌臨床サンプル（Ｓｑ．３、Ｓｑ．９、Ｓｑ．１１、Ｓｑ．１２）における各ヒト遺伝子（ＩＬ−２０Ｒα、ＩＬ−２０Ｒβ、ＩＬ−２２Ｒ、ＲＰ  Ｓ９）の発現解析の結果を示す。「ｃＤＮＡなし」は鋳型ＤＮＡを入れなかった場合を表す。
図４は、ＲＴ−ＰＣＲによるヒト正常組織（肺、肝臓、胸腺、骨髄、小腸）、および非小細胞肺癌臨床サンプル（Ｓｑ．３、Ｓｑ．９、Ｓｑ．１１、Ｓｑ．１２）における各ヒト遺伝子（ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４、ＲＰ  Ｓ９）の発現解析の結果を示す。「ｃＤＮＡなし」は鋳型ＤＮＡを入れなかった場合を表す。
図５は、肺上皮細胞の癌化におけるＩＬ−２０Ｒβを介するシグナルの関与を模式的に示す。丸印は各サイトカインを、また円柱はサイトカインの受容体をそれぞれ表す。矢印は、それぞれのサイトカインが結合し得る受容体を示す。上部は正常の肺上皮細胞におけるＩＬ−２０Ｒβを介するシグナルの状態であり、下部は癌化した肺上皮細胞におけるＩＬ−２０Ｒβを介するシグナルの状態である。癌化することにより、ＩＬ−２０Ｒβ、およびＩＬ−２４の発現が上昇し、これらによるシグナルが効率的に細胞に伝えられるようになる。
図６は、ＲＴ−ＰＣＲによる肺癌患者由来サンプルにおけるヒトＩＬ−２０Ｒβ（矢印）、およびヒトＲＰ  Ｓ９遺伝子の発現解析の結果を示す。Ｎは非癌部由来サンプルであることを、またＴは癌部由来サンプルであることをそれぞれ表す。「ｃＤＮＡなし」は陰性コントロールとして鋳型ＤＮＡを入れない場合を、また「ＰＣ」は陽性コントロールとしてＩＬ−２０Ｒβが高発現している肺癌由来ｃＤＮＡを用いた場合をそれぞれ示す。
図７は、ＲＴ−ＰＣＲによる各種ヒト肺癌細胞株（ＬＣ−１／ｓｑ、ＥＢＣ−１、ＬＫ−２、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＣ−２／ａｄ、ＡＢＣ−１、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２）における各ヒト遺伝子（ＩＬ−２０Ｒα、ＩＬ−２０Ｒβ、ＩＬ−２２Ｒ）の発現解析の結果を示す。「ｃＤＮＡなし」は鋳型ＤＮＡを入れなかった場合、「ゲノムＤＮＡ」はヒト染色体ＤＮＡを鋳型として用いた場合をそれぞれ表す。
図８は、ＲＴ−ＰＣＲによる各種ヒト肺癌細胞株（ＬＣ−１／ｓｑ、ＥＢＣ−１、ＬＫ−２、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＣ−２／ａｄ、ＡＢＣ−１、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２）における各ヒト遺伝子（ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４）の発現解析の結果を示す。「ｃＤＮＡなし」は鋳型ＤＮＡを入れなかった場合、「ゲノムＤＮＡ」はヒト染色体ＤＮＡを鋳型として用いた場合をそれぞれ表す。
図９は、ＲＴ−ＰＣＲによる胃癌患者由来サンプル（Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５）、および子宮癌患者由来サンプル（Ｕ１、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６）における各ヒト遺伝子（ＩＬ−２０Ｒβ、ＲＰ  Ｓ９）の発現解析の結果を示す。各サンプルにおいて、Ｎは非癌部由来サンプルであることを、またＴは癌部由来サンプルであることをそれぞれ表す。「ｃＤＮＡなし」は鋳型ＤＮＡを入れなかった場合を表す。
図１０は、抗ＩＬ−２０Ｒβウサギポリクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ解析の結果を示す。「ｈＩＬ−２０ＲＢトランスフェクタント」はヒトＩＬ−２０Ｒβを強制発現させた細胞株（細胞株３）、「対照」はベクターのみを同じ親細胞に発現させた細胞をそれぞれ示す。抗ＮＰ２抗体、および抗ＮＰ３抗体により特異的に細胞株３が染色されており、これらの抗体がヒトＩＬ−２０Ｒβと特異的に反応していることがわかる。「正常ウサギＩｇＧ」は陰性コントロールとして正常ウサギから精製したＩｇＧを１次抗体として用いた場合を示す。
図１１は、可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−ＦＬＡＧタンパク質を免疫したマウス（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２，Ｎｏ．３）の血清についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示す。「Ｐｒｅ」は免疫前の血清であることを、また「３ｒｄ」は３回免疫後の血清であることをそれぞれ表す。ＥＬＩＳＡの抗原としては可溶型ヒトＩＬ−２０Ｒβ−Ｈｉｓタンパク質を用いた。横軸（「希釈」）は血清の希釈率を表す。
図１２は、抗ＩＬ−２０Ｒβモノクローナル抗体（ＭＫクローン）を用いたＦＡＣＳ解析の結果を示す。ヒトＩＬ−２０Ｒβを強制発現させた細胞株（細胞株３）が特異的に染色されており、これらの抗体がヒトＩＬ−２０Ｒβと特異的に反応していることがわかる。「培地のみ」は陰性コントロールとしてハイブリドーマの培地のみを１次抗体として用いた場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２】
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【図１２】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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