(57)【要約】ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応の治療剤及び／又は予防剤として有用な物質をスクリーニングする方法を提供する。また、新規タンパク質及びそれをコードする新規遺伝子を提供する。前記スクリーニング方法は、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を発現している細胞に、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程と、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化の阻害を分析する工程とを含む。前記の新規タンパク質はラット及びマウスＬＴＲＰＣ２タンパク質であり、前記の新規遺伝子はラット及びマウスＬＴＲＰＣ２遺伝子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞に、前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程、及び
前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体の活性化の阻害を分析する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
請求の範囲１に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法。
【請求項３】
（１）配列番号４又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド、あるいは、（２）配列番号４又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド（但し、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）。
【請求項４】
配列番号４又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲３又は４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求の範囲５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求の範囲６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求の範囲７に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、請求の範囲３又は４に記載のポリペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞死抑制剤スクリーニング法に関する。また、本発明は、新規ラットＬＴＲＰＣ２及びマウスＬＴＲＰＣ２に関する。
背景技術
核内に存在するポリ・ＡＤＰリボース・ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ；ｐｏｌｙ−ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、誘導型一酸化窒素（ＮＯ）、活性酸素などによるＤＮＡ分解によって活性化し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）からＡＤＰリボース部分を核タンパク質、およびＤＮＡに付加する酵素である。すなわち、ＤＮＡ障害はＰＡＲＰを活性化し、ＡＴＰを消費しながら大量のＡＤＰリボースをヒストンやＰＡＲＰ自身に付加する。その結果、細胞内のＮＡＤ量及びＡＴＰ量が減少し、細胞内エネルギー枯渇による細胞死を来すものと考えられている（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＳｎｙｄｅｒ，Ｓ．Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，６８７−６８９，１９９５）。ＰＡＲＰタンパク質を構成する遺伝子は、これまでに５つ報告されており、これらの遺伝子が機能することでＰＡＲＰ活性を示すことが推測されている。それらの遺伝子の中で、ＰＡＲＰ−１遺伝子が最も解析が進められている遺伝子であり、ＰＡＲＰタンパク質の活性化に伴う細胞死に最も貢献度が高い遺伝子であると推測されている。（Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２６１７４−１７９，２００１）
ＰＡＲＰ遺伝子を欠損させたミュータントマウスにおいて、膵臓ランゲルハンス島細胞でＤＮＡ損傷によるＮＡＤ枯渇が生じないことが報告されている（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１１１７６−１１１８０，１９９５）。また別文献によると、前記ミュータントマウスで大脳皮質ニューロンでも同様にＤＮＡ損傷によるＮＡＤ枯渇が生じないことが明らかになっており、さらにこのマウスでは一過性脳虚血に伴う脳梗塞範囲が著明に減少することが報告されている（Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３，１０８９−１０９５，１９９７）。このようにＰＡＲＰの活性化によって引き起こされた細胞死は、生体組織において重篤な疾患を引き起こすことが知られている。ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患として、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、１型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、免疫細胞死による炎症反応、免疫機能に異常が起きることで発病する自己免疫疾患である慢性関節リウマチ（Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３，１０８９−１０９５，１９９７；Ｚｉｎｇａｒｅｌｌｉ，Ｂ．，Ｓａｌｚｍａｎ，Ａ．Ｌ．及びＳｚａｂｏ，Ｃ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８３，８５−９４，１９９８；Ｂｕｒｋａｒｔ，Ｖ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５，３１４−３１９，１９９９；Ｐｉｅｐｅｒ，Ａ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６，３０５９−３０６４，１９９７；Ｓｚａｂｏ，Ｃ．，Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ，Ｓ．，Ｚｉｎｇａｒｅｌｌｉ，Ｂ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．及びＳａｌｔｚｍａｎ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００，７２３−７３５，１９９７；Ｏｌｉｖｅｒ，Ｆ．Ｊ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，４４４６−４４５４，１９９９、Ｓｚａｂｏ，Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５，３８６７−７２，１９９８）も知られている。
一方、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ；ＭＮＮＧ）又はＨ２Ｏ２は、ＰＡＲＰを活性化することによって細胞死を引き起こすことが知られており（Ｈａｌａｐｐａｎａｖａｒ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３７０９７−３７１０４，１９９９；Ｗａｔｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｓｋｅｗ，Ｊ．Ｎ．及びＢｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０９，４７２−４８２，１９９５）、３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン［３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−［４−（１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｂｕｔｏｘ］−１（２Ｈ）−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｏｎｅ；ＤＰＱ］、３−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドは、ＰＡＲＰの活性化を阻害することによって、ＰＡＲＰによる細胞死を抑制することが知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８２９，４６−５４，１９９９；Ｗａｔｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｓｋｅｗ，Ｊ．Ｎ．及びＢｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０９，４７２−４８２，１９９５）。
しかしながら、ＰＡＲＰの下流に存在している因子の存在は明確にはされておらず、どのような機序でＰＡＲＰの活性化が細胞死を引き起こすかについては現在のところ不明である。
一方、ヒトＬＴＲＰＣ２（ｌｏｎｇ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｈａｎｎｅｌ  ２）遺伝子は１９９８年に取得された（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５４，１，１２４−１３１，１９９８）。マウスＬＴＲＰＣ２遺伝子は取得したとの報告（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８０，Ｓｕｐｐｌ．１，８３，２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９，１６３−１７３，２００２）はあるもののその具体的な塩基配列については開示されていない。また、ラットＬＴＲＰＣ２に関する情報は開示されていない。ヒトＬＴＲＰＣ２遺伝子は細胞内のＡＤＰリボース又はＮＡＤによって活性化し、カルシウム透過型非選択的陽イオンチャネルとして機能することが明らかになっている（Ｓａｎｏ，Ｙ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１３２７−１３３０，２００１）。ＡＤＰＲによるＬＴＲＰＣ２の制御機構は細胞機能において大きな役割を持つかもしれないことが示唆されてはいるものの（Ｎａｔｕｒｅ，４１１，６８３７，５９５−５９９，２００１）、どのような機序によって細胞内でＬＴＲＰＣ２が機能して、その結果、細胞にどのような影響を示すかは不明である。
また、これまでに免疫細胞をクローン化した細胞でのＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現は明らかになっているが、実際のヒトの血液、特に免疫細胞が含まれているリンパ球での発現は不明である。
以上述べたように、ＰＡＲＰの活性化が細胞死を引き起こすこと自体は知られていたが、ＰＡＲＰの下流に存在している因子の存在は明確にはされておらず、その機序は不明であった。従って、ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患（例えば、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応）の治療剤及び／又は予防剤として有用な物質をスクリーニングする方法が待望されている。
発明の開示
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化がＰＡＲＰの活性化によって制御されており、細胞死を引き起こす機能を有していることを、初めて見い出した。さらに、ＬＴＲＰＣ２遺伝子がヒトリンパ球で発現しており、さらに、慢性関節リウマチ疾患において発現量が増加していることを、初めて見い出した。
より具体的には後述の実施例６に示すように、ＰＡＲＰを活性化することが知られている物質、すなわち、ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２を、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を発現させた細胞に添加すると、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が観察された。更に、実施例７に示すように、ＰＡＲＰの活性化阻害剤であるＤＰＱ、３−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドを、ＰＡＲＰ活性化剤（例えば、ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２）と共に添加すると、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化は有意に阻害された。
さらに、実施例１０に示すように、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を発現させた細胞で、ＰＡＲＰ活性化剤であるＨ２Ｏ２による細胞死が促進された。
また、実施例２に示すように、ＬＴＲＰＣ２遺伝子は免疫の機能を担うリンパ球で多く発現しており、さらに、実施例１２に示すように免疫疾患の１つである慢性関節リウマチのモデル動物において、ＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現量が増加していた。
加えて、実施例１７に示すように、ＬＴＲＰＣ２タンパク質は１型糖尿病モデルであるストレプトゾトシン刺激による細胞死を促進することを見出した。
従って、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質を選択することにより、ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制することができる物質を同定することができ、引いては、細胞死によって引き起こされる疾患治療薬、例えば、免疫疾患である慢性関節リウマチ、脳虚血後の神経細胞死、又は１型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊の治療薬として有用な物質を見出すことができる。本発明は、このような知見に基づくスクリーニング系を提供するものである。
すなわち本発明は、
（１）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞に、前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程、及び
前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体の活性化の阻害を分析する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法、
（２）（１）に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法、
（３）（ｉ）配列番号４又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド、あるいは、（ｉｉ）配列番号４又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド（但し、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）、
（４）配列番号４又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５）（３）又は（４）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（６）（５）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
（７）（６）に記載のベクターを含む細胞、
（８）（７）に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、（３）又は（４）に記載のポリペプチドを製造する方法
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書における「細胞死」には、アポトーシス及びネクローシスの両方が含まれる。アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死である。一方、ネクローシスは生体の一部が死ぬことを示し、非生理的条件下で強制的に引き起こされる細胞死である。
［１］本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
配列番号４及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれラット、及びマウス由来の天然型ＬＴＲＰＣ２タンパク質である。「配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」又はその機能的等価改変体（但し、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）は、それら自体、新規のポリペプチドであり、本発明のポリペプチドに包含される。
「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列の１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、更に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド；
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示す部分断片；又は
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８４％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができる。
また、「配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
（１）配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド；
（２）配列番号１４で表されるアミノ酸配列の１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、更に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド；
（３）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示す部分断片；又は
（４）配列番号１４で表されるアミノ酸配列との相同性が８４％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができる。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用いて得られた値を意味する。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
本明細書において、或るポリペプチドが「ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性」を示すとは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる公知のヒト由来の天然型ＬＴＲＰＣ２タンパク質と同様の活性を示すことを意味し、具体的には、例えば、ＰＡＲＰ共発現下で、ＰＡＲＰ活性化剤を作用させることにより、膜に存在する前記ポリペプチドそれ自体がイオンの通り道を生じ、その結果、イオンの透過を生じさせる活性を意味する。
本明細書において、或るポリペプチドが「ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは実施例６に記載の方法）により確認することができる。すなわち、ＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードするポリペプチドを含む発現ベクターで、ＰＡＲＰを発現している細胞をトランスフェクションする。得られた細胞に予め８６Ｒｂ＋を取り込ませ、ＰＡＲＰ活性化剤を添加する。その結果生じるＬＴＲＰＣ２タンパク質を介した細胞からの８６Ｒｂ＋の放出を、細胞外液又は細胞内の８６Ｒｂ＋の放射活性の変化を指標に確認することができる。
「配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体の１つである「配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド」には、例えば、配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（但し、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すことが必要）を挙げることができる。前記マーカー配列としては、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
「配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体の起源は、ヒト、ラット又はマウスに限定されない。例えば、前記機能的等価改変体には、例えば、配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒト、ラット又はマウスにおける天然のアレル変異体（但し、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示す）、あるいは、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）などのアミノ酸置換で生じたポリペプチド（但し、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示す）が含まれるだけでなく、ヒト、ラット又はマウス以外の生物［例えば、ヒト又はラット以外の哺乳動物（例えば、ハムスター、又はイヌ）］由来の天然に存在する機能的等価改変体が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。
本発明の新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それら自体、新規物であり、本発明のポリヌクレオチドに包含される。本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号４若しくは配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号３で表される塩基配列における第８４番〜第４６１０番の塩基からなる配列若しくは配列番号１３で表される塩基配列における第３６番〜第４５５９番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドがより好ましい。更に好ましくは、配列番号３で表される塩基配列における第８４番〜第４６１０番の塩基からなる配列である。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドは、細胞死抑制用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
［２］スクリーニング用細胞、並びに、本発明の発現ベクター及び細胞
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来の天然型ＬＴＲＰＣ２タンパク質である。配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、その機能的等価改変体とを総称して、「ＬＴＲＰＣ２タンパク質」と称する。
「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、更に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示す部分断片；又は
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８４％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができ、配列番号４又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能改変体と同様、その起源は限定されず、また、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも含まれる。
本発明のスクリーニング方法で用いる細胞（スクリーニング用細胞と称する）は、上記のＬＴＲＰＣ２タンパク質を発現している細胞である限り特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により製造した細胞及び天然に存在する細胞の何れを用いることも出来るが、遺伝子組換え技術により製造した細胞を用いることが好ましい。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞が好ましく、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現している細胞が更に好ましい。スクリーニング用細胞は、細胞死抑制用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのベクターを含む細胞は、それぞれ、新規であり、本発明のベクター及び本発明の細胞に包含される。本発明の細胞は上記スクリーニング用細胞に包含され、本発明のスクリーニングに用いることが出来る。
［３］スクリーニング用細胞の製造方法
スクリーニング用細胞の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに組込み、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくはＣＨＯ細胞）を形質転換させることにより取得することができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
スクリーニング用細胞の製造に用いることのできる、ＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチドを含む）の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。なお、以下の説明は、本発明のポリヌクレオチドを例にとって説明するが、本発明のポリヌクレオチド以外の、ＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドについても、同様にして製造することができる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。また、ゲノムＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、ＷＯ０１／３４７８５の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。より具体的には、化学合成法によって製造したヌクレオチド断片を結合することによっても製造できる。また、各ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡ合成機（例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）、あるいは、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）など）を用いて合成することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物）を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
スクリーニング用細胞の製造に用いることのできる、宿主細胞及び発現ベクターとしては、例えば、遺伝子工学において一般的に使用可能な公知の宿主細胞及び発現ベクターを用いることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株であるＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）等を挙げることができる。
宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、ＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（インビトロジェン社）又はｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、細胞に取り込ませることができる。
ＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞表面にＬＴＲＰＣ２タンパク質が生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＨＯ細胞の場合には、例えば、ダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３細胞の場合には、牛胎仔血清（ＥＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
［４］細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法
本発明の細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法は、（１）ＬＴＲＰＣ２タンパク質を発現している細胞に、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程と、（２）ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化の阻害を分析する工程とを含む。
本発明のスクリーニング方法では、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下において、スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる。ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下としては、例えば、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤の存在下を挙げることができる。前記ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤としては、例えば、ＡＤＰリボース若しくはＮＡＤ、又はＰＡＲＰ活性化剤（例えば、ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２）を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法では、特に限定されるものでないが、例えば、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化の後に、試験物質と接触させることもでき、あるいは、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化と同時に、試験物質と接触させることもできる。前者の場合には、試験物質がＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質であれば、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が阻害され、逆に、試験物質がＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質でなければ、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が維持される。一方、後者の場合には、試験物質がＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質であれば、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が起こらないか、あるいは、減弱される。逆に、試験物質がＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質でなければ、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が起こる。
本発明のスクリーニング方法を用いると、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質（すなわち、アンタゴニスト）をスクリーニングすることができる。本発明者が今回初めて見出したように、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化は、ＰＡＲＰの活性化によって制御されている。また、ＰＡＲＰの活性化により細胞死が引き起こされることが、既に公知である。従って、ＰＡＲＰの活性化により、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が引き起こされ、その結果、更に、細胞死が引き起こされることが、本発明者により今回初めて明らかになった。従って、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質は、ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制することができ、ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用である。
より具体的には、本発明のスクリーニング方法は、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を分析するのに用いる方法の違いに基づいて、例えば、
（ａ）パッチクランプ（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）法を利用したスクリーニング方法、
（ｂ）放射性同位元素イオンの流入又は放出を利用したスクリーニング方法、
（ｃ）Ｒｂ＋イオンの放出を利用したスクリーニング方法、又は
（ｄ）細胞内Ｃａ２＋検出色素を利用したスクリーニング方法
などを挙げることができる。
前記（ａ）のパッチクランプ法を利用して、細胞死抑制剤として有用な、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、例えば、ホールセルパッチクランプ（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）法（Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，“Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，１９９２，Ｓｉｎａｕｅｒ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓＩｎｃ．，ＭＡ）を用いて、スクリーニング用細胞における全細胞電流を測定することにより、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が阻害されるか否かを分析することができる。すなわち、パッチクランプ法を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞をホールセルパッチクランプ法により膜電位固定し、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞における全細胞電流の変化を分析する工程を含む。
より具体的には、スクリーニング用細胞をホールセルパッチクランプ法により膜電位固定し、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化する化合物（例えば、ＡＤＰリボース、ＮＡＤ、Ｈ２Ｏ２、又はＭＮＮＧ）を添加して、スクリーニング用細胞の全細胞電流を測定する。この場合、細胞外液としては、１４５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．４）を含む溶液を使用し、細胞内液としては、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣｓＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｃｓ（ｐＨ７．２）を含む溶液などを用いることができる。続いて、細胞外液又は細胞内液に試験物質を添加した場合の電流変化を測定することで、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。例えば、試験物質を添加した場合に、スクリーニング用細胞にＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化刺激の際に生じる全細胞電流の変化がなくなるか、あるいは、減弱されれば、前記試験物質は、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。
前記（ｂ）の放射性同位元素イオンの放出を利用して、細胞死抑制剤として有用な、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、例えば、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、又はＫ＋イオンの各放射性同位元素を指標としてそのチャネル活性を測定することができる（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮａｔｈａｎ  Ｏ．Ｋａｐｌａｎ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ”，８８（１），１９８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，３４６−３４７）。この分析方法は、ＬＴＲＰＣ２タンパク質がＣａ２＋、Ｎａ＋、又はＫ＋イオンを透過させる（Ｓａｎｏ，Ｙ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１３２７−１３３０，２００１）との公知の知見に基づくものである。
放射性同位元素イオンの放出を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に、放射性同位元素を取り込ませた後、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞の細胞外へ放出される放射活性、あるいは、細胞内に残存する放射活性の量を分析する工程を含む。
具体的には、各イオンの放射性同位元素である４５Ｃａ２＋、２２Ｎａ＋、又は４２Ｋ＋を用いて測定することができる。Ｋ＋を用いる場合には、Ｋ＋を予め細胞に取り込ませた後、細胞外液に残ったＫ＋を取り除く。その後、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤を用いてＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させると、放射性同位体元素Ｋ＋が透過することから、細胞外液中の放射活性（すなわち、細胞外へ放出された放射活性）、あるいは、細胞内に残存した放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。４５Ｃａ２＋又は２２Ｎａ＋を用いる場合には、４５Ｃａ２＋又は２２Ｎａ＋を反応液中に入れておいた状態で、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤を用いてＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させると、放射性同位体元素が透過することから、細胞外液中の放射活性（すなわち、細胞外液に残存した放射活性）、あるいは、細胞内に流入した放射性同位元素の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる（黒木登志夫、許南浩、及び千田和広編、実験医学別冊「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、１９９５年、羊土社；以下、文献１と称する）。この際、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤の存在下において、試験物質を添加して、細胞外液中の放射活性（すなわち、細胞外へ放出された放射活性）、あるいは、細胞内に残存した放射活性を測定することで、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、次に説明する「（ｃ）Ｒｂ＋イオンの放出を利用したスクリーニング方法」に準じて実施することができる。
一般的に、Ｋ＋イオンを透過するイオンチャネルは、Ｋ＋イオンと同様に、Ｒｂ＋イオンを通すことができるので、放射性同位元素８６Ｒｂ＋の放出を指標としてそのチャネル活性を測定することができる（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮａｔｈａｎ  Ｏ．Ｋａｐｌａｎ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ”，８８（１），１９８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，３４６−３４７；以下、文献２と称する）。
前記（ｃ）のＲｂ＋イオンの放出を利用して、細胞死抑制剤として有用な、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に放射性同位元素８６Ｒｂ＋イオンを取り込ませた後、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞の細胞外へ放出される８６Ｒｂ＋の放射活性、あるいは、細胞内に残存する８６Ｒｂ＋の放射活性の量を分析する工程を含む。
Ｒｂ＋イオンの放出を利用する本発明のスクリーニング方法では、スクリーニング用細胞を、８６ＲｂＣｌとインキュベート（例えば、３７℃にて２４時間）することにより、８６Ｒｂ＋を前記細胞内に取り込ませることができる（文献１）。細胞を通常の生理食塩水で洗浄し、取り込まれなかった８６Ｒｂ＋を取り除く。ＬＴＲＰＣ２タンパク質が活性化すると、細胞外への８６Ｒｂ＋放出量が増加するので、細胞外液中の８６Ｒｂ＋の放射活性、あるいは、細胞内に残存した８６Ｒｂ＋の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。
より具体的には、例えば、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤の存在下で、試験物質を含有する溶液（例えば、生理食塩水）中で、予め８６Ｒｂ＋を取り込ませたスクリーニング用細胞をインキュベート（例えば、３７℃にて３０分間）した後、細胞外液中の８６Ｒｂ＋の放射活性、あるいは、細胞内に残存した８６Ｒｂ＋の放射活性を測定する。この際、ネガティブコントロールとして、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤の不在下で、試験物質不含溶液中で、同様の操作を実施し、ポジティブコントロールとして、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤の存在下で、試験物質不含溶液中で、同様の操作を実施することが好ましい。前記ネガティブコントロールでは、ＬＴＲＰＣ２タンパク質が活性化されないため、８６Ｒｂ＋が細胞外へ放出されないのに対して、前記ポジティブコントロールでは、ＬＴＲＰＣ２タンパク質が活性化されるため、８６Ｒｂ＋が細胞外へ放出される。ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤の存在下において試験物質を添加した場合に、（１）前記ネガティブコントロールの場合と同様に、８６Ｒｂ＋の細胞外への放出が観察されないか、あるいは、（２）前記ポジティブコントロールに比べて、８６Ｒｂ＋の細胞外への放出量が減少すれば、前記試験物質は、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。本発明による、Ｒｂ＋イオンの放出を利用したスクリーニング方法は、後述の実施例７に記載の条件で実施することが好ましい。
前記（ｄ）の細胞内Ｃａ２＋検出色素を利用して、細胞死抑制剤として有用な、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、細胞内Ｃａ２＋検出色素として、例えば、Ｆｌｕｏ３−ＡＭなどを用いることができる。細胞内Ｃａ２＋検出色素は、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の開口に伴う細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を光学的に検出することが可能である（工藤佳久編、実験医学別冊「細胞内カルシウム実験プロトコール」、１９９６年、羊土社）。これらの色素を用いることによってＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性を測定することができ、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化時の試験物質存在下と不在下とで変化量を比較することにより、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能である。細胞内Ｃａ２＋検出色素を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に細胞内Ｃａ２＋検出色素を取り込ませた後、ＬＴＲＰＣ２タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞における細胞内Ｃａ２＋検出色素の量変化を光学的に分析する工程を含む。
より具体的には、ＬＴＲＰＣ２タンパク質活性化剤の存在下において、試験物質を添加した場合に、試験物質不在下の場合と比較して、細胞内に流入するＣａ２＋量が減少するか、あるいは、なくなれば、前記試験物質は、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法によって選択対象とする試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の天然成分（例えば、培養上清又は組織抽出物）などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
［５］細胞死抑制用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質、あるいは、本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、遺伝子工学的操作及びチャネル活性分析操作については、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ；Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，“Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，１９９２，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．，ＭＡ）に従って実施可能である。
本実施例のクローニングにおいては、逆転写反応用キットはインビトロジェン社のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲを、クローニングキットはインビトロジェン社のＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いた。
【実施例１】
《ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードする遺伝子の単離及び発現ベクターの構築》
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質（以下の各実施例において、単に「ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質」と称する）をコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト白血球由来のｍＲＮＡを鋳型とする逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により取得した。まず、ヒト白血球ｍＲＮＡ（１０ｎｇ）を、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、ホットスタート法によるＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／６５℃（３０秒間）／７２℃（６分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。その結果、約４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
このＤＮＡ断片を、クローニングキットを用いて、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングを行なった。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して、ＬＴＲＰＣ２−ｃＤＮＡのみを単離した後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドは、サイトメガロウイルス由来のプロモーター配列を持っており、動物細胞でＬＴＲＰＣ２タンパク質を発現させるために使用することができる。得られたクローンｐｃＤＮＡ３．１−ＬＴＲＰＣ２の塩基配列を、ジデオキシターミネーター（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析したところ、配列番号１で表される配列が得られた。
【実施例２】
《ヒトＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現分布》
ヒト組織及びヒト血液におけるヒトＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。ヒト組織については、ヒトの各組織由来のｍＲＮＡ（クロンテック社）５ｎｇをＤＮアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて逆転写させ、第一鎖ｃＤＮＡを得た。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、ホットスタート法によるＰＣＲを行なった。
ヒト血液は、１名の匿名社内ボランティア（健常人）より、血液凝固を防ぐためにヘパリン・ナトリウムを添加したシリンジを用いて、１００ｍｌ採取した。その血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ試薬（アマシャムファルマシア社）を用いて、好酸球、好中球、リンパ球、血小板に分画した後、それぞれからＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社）を用いて、総ＲＮＡを抽出した。なお、実際の操作は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ試薬、及びＩＳＯＧＥＮ試薬に添付のプロトコールに従って行った。それぞれの総ＲＮＡ２０ｎｇをＤＮアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖ｃＤＮＡを得た。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、ホットスタート法によるＰＣＲを行なった。
前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／７０℃（１分間）からなるサイクルを３０回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号１で表される塩基配列における第２２番目〜第４５３３番目の塩基からなる配列からなるヒトＬＴＲＰＣ２遺伝子に特異的な配列である。
ヒトの各組織（扁桃体、尾状核、海馬、脳梁、黒質、視床、小脳、前頭葉、視床下部、脊髄、下垂体、全脳、心臓、胎盤、肺、気管、肝臓、骨格筋、腎臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、及び前立腺）についてＲＴ−ＰＣＲ解析を行なったところ、約６６０ｂｐのＤＮＡ断片が、脳、脊髄、心臓、胎盤、肺、気管、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、及び白血球にて増幅された。このことから、ヒトＬＴＲＰＣ２のｍＲＮＡが、ＰＡＲＰ活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で発現していることが明らかになった。
また、ヒト血液についてのＲＴ−ＰＣＲ解析を行ったところ、約６６０ｂｐのＤＮＡ断片が主にリンパ球にて増幅された。このことから、ヒトＬＴＲＰＣ２は、ヒト血液において主にリンパ球にて発現していることが明らかになった。リンパ球は免疫機能を担っていることが明らかになっていることから、ＬＴＲＰＣ２遺伝子が免疫機能において重要な役割を担っている事が示唆された。
【実施例３】
《ラットＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードする遺伝子の単離》
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるラットＬＴＲＰＣ２タンパク質（以下の各実施例において、単に「ラットＬＴＲＰＣ２タンパク質」と称する）をコードする全長ｃＤＮＡは、ラット脳由来のｍＲＮＡ（クロンテック社）１０ｎｇを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより実施例１と同様の手法で取得した。ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／６０℃（３０秒間）／７２℃（５分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。その結果、約４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングして得られたクローンｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｒａｔＬＴＲＰＣ２の塩基配列を解析したところ、配列番号３で表される配列が得られた。配列番号３で表される塩基配列は、４５２７塩基対からなるオープンリーディングフレーム（配列番号３で表される塩基配列における第８４番〜第４６１０番の塩基からなる配列）を有する。前記オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、１５０８アミノ酸残基からなる配列番号４で表されるアミノ酸配列であった。
配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質）と８４％のホモロジーを有する。なお、前記ホモロジーの数値は、前記ＢＬＡＳＴ検索により得られた値である。
【実施例４】
《ラットＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現分布》
ラット組織におけるラットＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。ラットの各組織由来のｍＲＮＡ（クロンテック社）５ｎｇをＤＮアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖ｃＤＮＡを得た。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；インビトロジェン社）を用いて、ホットスタート法によるＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９５℃（１分間）で熱変性を行なった後、９５℃（１５秒間）／６２℃（３０秒間）／７２℃（１分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号３で表される塩基配列における第８４番目〜第４６１０番目の塩基からなる配列からなるラットＬＴＲＰＣ２遺伝子に特異的な配列である。
ラットの各組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、網膜、骨格筋、脾臓、及び精巣）についてＲＴ−ＰＣＲ解析を行なったところ、約３８０ｂｐのＤＮＡ断片が全ての組織にて増幅され、ラットＬＴＲＰＣ２のｍＲＮＡは、前記の各組織で発現していることが明らかになった。また、この結果から、ＰＡＲＰ活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で、ラットＬＴＲＰＣ２のｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
【実施例５】
《ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の動物細胞での発現》
ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のチャネル活性を検出するために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例１で得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＬＴＲＰＣ２と、形質転換用試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００；インビトロジェン社）とを用いて、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞の形質転換を行ない、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法（文献１）に従って実施した。
【実施例６】
《ＰＡＲＰ活性化剤によるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化検出》
以下で具体的に記載した操作以外は、公知の方法（文献１、文献２）に従って実施した。
実施例５で得られた形質転換細胞（１．６×１０５細胞）を、８６ＲｂＣｌ（１μＣｉ／ｍＬ）存在下、３７℃で２４時間インキュベートすることにより、８６Ｒｂ＋を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった８６Ｒｂ＋を取り除いた。得られた細胞を、ＰＡＲＰ活性化剤であるＭＮＮＧ（最終濃度＝１ｍｍｏｌ／Ｌ）又はＨ２Ｏ２（最終濃度＝０．０６％）を添加した生理食塩水中にて、室温で３０分間インキュベートした。なお、コントロールとして、通常の生理食塩水（すなわち、ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２のいずれも添加しない生理食塩水）中にて、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った８６Ｒｂ＋の放射活性を測定した。その結果、８６Ｒｂ＋の残存活性は、コントロールの細胞（ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２を添加していない細胞）と比較して、ＭＮＮＧを添加した細胞では３５．６％に、Ｈ２Ｏ２を添加した細胞では８．９％に、それぞれ減少していた。これは、ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２によりヒトＬＴＲＴＰＣ２タンパク質が活性化し、細胞内の８６Ｒｂ＋が細胞外へ排出されたことを示している。この結果から、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質は、ＰＡＲＰ活性化剤であるＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２で活性化することが明らかになった。
【実施例７】
《ＰＡＲＰ活性阻害剤によるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化阻害》
以下で具体的に記載した操作以外は、公知の方法（文献１、文献２）に従って実施した。
実施例５で得られた形質転換細胞（１．６×１０５細胞）を、８６ＲｂＣｌ（１μＣｉ／ｍＬ）存在下、３７℃で２４時間インキュベートすることにより、８６Ｒｂ＋を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった８６Ｒｂ＋を取り除いた。得られた細胞に対して、ＭＮＮＧ（最終濃度＝１ｍｍｏｌ／Ｌ）又はＨ２Ｏ２（最終濃度＝０．０６％）存在下で、ＰＡＲＰ活性化阻害剤であるＤＰＱ（最終濃度＝１００μｍｏｌ／Ｌ）、３−アミノベンズアミド（最終濃度＝１ｍｍｏｌ／Ｌ）、又はニコチンアミド（最終濃度＝１ｍｍｏｌ／Ｌ）をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で３０分間インキュベートした。なお、コントロールとして、ＭＮＮＧ及びＨ２Ｏ２不在下で、生理食塩水（すなわち、ＤＰＱ、３−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドのいずれも添加しない生理食塩水）中にて、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った８６Ｒｂ＋の放射活性を測定した。その結果、ＰＡＲＰ活性化阻害剤を添加した各細胞における８６Ｒｂ＋の残存活性は、コントロールの細胞（ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２を添加していない細胞）、すなわち、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性を誘導していない細胞と同等であった。より具体的には、ＤＰＱを添加した細胞では、コントロール細胞に対して、９３．４％（Ｈ２Ｏ２存在下の場合）又は９５．５％（ＭＮＮＧ存在下の場合）の８６Ｒｂ＋残存活性を示した。同様に、３−アミノベンズアミドを添加した細胞では、９１．９％（Ｈ２Ｏ２存在下の場合）又は９６．２％（ＭＮＮＧ存在下の場合）の８６Ｒｂ＋残存活性を示し、ニコチンアミドを添加した細胞では、５７．８％（Ｈ２Ｏ２存在下の場合）又は９５．９％（ＭＮＮＧ存在下の場合）の８６Ｒｂ＋残存活性を示した。
これは、ＤＰＱ、３−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドによってヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の８６Ｒｂ＋が細胞外へ排出されなかったか、あるいは、排出が減少したことを示している。この結果から、ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２によるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化は、ＰＡＲＰ活性化阻害剤であるＤＰＱ、３−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドによって阻害されることが明らかになった。
【実施例８】
《ＰＡＲＰ活性阻害剤によるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化阻害とＰＡＲＰ活性化阻害との比較》
実施例７で示したＰＡＲＰ阻害剤によるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化阻害がＰＡＲＰを介していることを確認するために、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化阻害のＩＣ５０値とＰＡＲＰ活性化阻害のＩＣ５０値を比較、検討した。
前述のＰＡＲＰ活性化阻害剤であるＤＰＱ、３−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのＬＴＲＰＣ２の活性化阻害のＩＣ５０値を各濃度の阻害剤を添加することにより実施例７の方法で検討した。その結果、ＤＰＱ、３−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化阻害のＩＣ５０値はそれぞれ、０．２０μＭ、１１７μＭ、５４１μＭであった。
ＰＡＲＰ活性化阻害のＩＣ５０値は次の方法で検討した。実施例５で得られた形質転換細胞を、ＰＡＲＰ活性化剤であるＭＮＮＧ（最終濃度＝１ｍｍｏｌ／Ｌ）又はＨ２Ｏ２（最終濃度＝０．０６％）、及び前述で用いた各濃度のＰＡＲＰ阻害剤をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で３０分間インキュベートした。なお、コントロールとして、通常の生理食塩水（すなわち、ＭＮＮＧ又はＨ２Ｏ２のいずれも添加しない生理食塩水）中にて、同様の操作を実施した。その後、活性剤、及び阻害剤を添加した生理食塩水を除いた細胞に３Ｈ−ＮＡＤを最終濃度０．２ｎＣｉ／μＬになるように加え、３７度で４０分間インキュベートした。その後、この細胞にＴＣＡを最終濃度１０％になるように加えて４度で３０分間インキュベートすることで反応を停止させた。その後、細胞を５％ＴＣＡで２回洗浄することで、取り込まれなかった３Ｈ−ＮＡＤを除いた。洗浄した細胞を、２％ＳＤＳ、０．１Ｍ−ＮａＯＨを含む溶液で溶解した後、細胞に含まれる３Ｈの放射活性を測定した。その結果、ＤＰＱ、３−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのＰＡＲＰ活性化阻害のＩＣ５０値は、それぞれ０．２６μＭ、７１．７μＭ、３３５μＭであった。
それぞれのＩＣ５０値は、ＬＴＲＰＣ２活性化阻害、及びＰＡＲＰ活性化阻害で近似していることから、ＬＴＲＰＣ２活性化阻害はＰＡＲＰ活性化阻害によるものであることが確認された。
【実施例９】
《ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の動物細胞での発現》
ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の細胞での機能を明らかにするために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例１で得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＬＴＲＰＣ２と、形質転換用試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００；インビトロジェン社）とを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞の形質転換を行ない、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法（文献１）に従って、実施した。
【実施例１０】
《ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質による細胞死誘導》
実施例８で得られた形質転換細胞を９６穴プレート（旭テクノグラス社）に４×１０４細胞／ウェルになるように蒔き一晩培養した後、、最終濃度０．００１％Ｈ２Ｏ２を含む細胞培地で室温、２時間インキュベートした。生理食塩水で洗浄した後、細胞培地を添加し４時間培養した。培地を除いた後、細胞の生死を判定するためにアラマブルーアッセイ（ａｌａｍａＢｌｕｅ  Ａｓｓａｙ；バイオサイエンス社）を行った。本操作は、細胞における酸化還元反応によって蛍光を発する試薬を加え、その結果生じる蛍光強度を測定することによって、細胞の生死を判断することができる。なお、実験操作は、前記アラマブルーアッセイ用試薬に添付のプロトコールに従って実施した。刺激を加えた細胞にアラマブルーアッセイ用試薬を加え、さらに１時間インキュベーションした後、蛍光強度を測定した。なお、コントロールとして、ＬＴＲＰＣ２を含まないｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみを形質転換した細胞を用いて、同様の操作を実施した。その結果、ＬＴＲＰＣ２を発現させた細胞はベクターのみを発現させた細胞に比較して、有意に蛍光強度が減少していた（４７．５％の減少）。これは、Ｈ２Ｏ２刺激によってＬＴＲＰＣ２を介して細胞死が起き、その結果、生きている細胞が減少したことを示している。この結果から、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質は、Ｈ２Ｏ２刺激による細胞死を促進することが確認できた。また、前記の結果よりＬＴＲＰＣ２はＨ２Ｏ２刺激によって活性化することが明らかになっているので、本実施例の結果からもＬＴＲＰＣ２タンパク質は細胞死を引き起こす機能を有していることが明らかである。
【実施例１１】
《マウスＬＴＲＰＣ２タンパク質をコードする遺伝子の単離》
配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるマウスＬＴＲＰＣ２タンパク質（以下の各実施例において、単に「マウスＬＴＲＰＣ２タンパク質」と称する）をコードする全長ｃＤＮＡは、マウス脳由来のｍＲＮＡ（クロンテック社）１０ｎｇを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより実施例１及び実施例２と同様の手法で取得した。ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、ＰＣＲサイクルは実施例２と同様の条件で行った。その結果、約４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片をｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングして得られたクローンｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｍｏｕｓｅＬＴＲＰＣ２の塩基配列を解析したところ、配列番号１３で表される配列が得られた。配列番号１３で表される塩基配列は、４５２４塩基対からなるオープンリーディングフレーム（配列番号１３で表される塩基配列における第３６番〜第４５５９番の塩基からなる配列）を有する。前記オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、１５０７アミノ酸残基からなる配列番号１４で表されるアミノ酸配列であった。配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質）、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列（ラットＬＴＲＰＣ２タンパク質）とそれぞれ８４％、９４％のホモロジーを有する。なお、前記ホモロジーの数値は、前記ＢＬＡＳＴ検索により得られた値である。
【実施例１２】
《マウスＬＴＲＰＣ２遺伝子の慢性関節リウマチモデル動物における発現解析》
慢性関節リウマチにおけるＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現解析を行うために、慢性関節リウマチのモデルであるマウスコラーゲン誘発関節炎モデルを作製し、このマウスでのマウスＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現変動を解析した。
マウスコラーゲン誘発関節炎モデルの作製は以下の方法で行った。マウス関節部分に１５０μｇのタイプ２コラーゲンを注射し３週間飼育した後、再度同量のコラーゲンの注射を行った。その後、５週間飼育を行った後、解剖して関節部分を取り出した。この時、取り出したマウス関節は慢性関節リウマチ患者と同様の損傷（軟骨、骨破壊）がおきていることを確認した。このマウス関節を凍結粉砕後、ＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社）を用いて、ｍＲＮＡを抽出した。なお、コントロールとして、処理を行っていない正常マウスの関節からも同様にｍＲＮＡを抽出した。
得られたマウスコラーゲン誘発関節炎モデルの関節におけるマウスＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現変動を解析するために、ＰＲＩＳＭ７９００（アプライドバイオシステムズ社）を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲを行うことで、ｍＲＮＡ中に含まれるマウスＬＴＲＰＣ２遺伝子を定量化して測定することができる。
得られたｍＲＮＡをＤＮアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖ｃＤＮＡを得た。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として、蛍光試薬ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９５℃（１０分間）で熱変性を行なった後、９５℃（１５秒間）／５９℃（１分間）からなるサイクルを４５回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号１３で表される塩基配列における第３７６３番目〜第３７８０番目、及び第３８１３番目〜第３８３０番目の塩基配列からなるマウスＬＴＲＰＣ２遺伝子に特異的な配列である。
その結果、マウスＬＴＲＰＣ２遺伝子はコラーゲン誘発関節炎モデルマウスにおいて、処理を行っていない正常マウスと比較して、発現量が約１５倍増加していた。このことから、マウスＬＴＲＰＣ２遺伝子は、慢性関節リウマチにおいて重要な働きを担っていることが明らかになった。
【実施例１３】
《マウスＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現分布》
マウス組織におけるマウスＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現分布を、実施例１２と同様の方法で、ＰＲＩＳＭ７９００（アプライドバイオシステムズ）を用いたリアルタイムＰＣＲにより解析した。マウスの各組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、平滑筋、脾臓、及び精巣）由来のｍＲＮＡ（クロンテック社）５ｎｇをＤＮアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖ｃＤＮＡを得た。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行なった。その結果、脳、脾臓を中心に全ての組織にて増幅が検出された。このことから、マウスＬＴＲＰＣ２のｍＲＮＡは、前記の各組織で発現していることが明らかになった。また、この結果から、ＰＡＲＰ活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で、マウスＬＴＲＰＣ２のｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
【実施例１４】
《ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体をコードする遺伝子の単離及び発現ベクターの構築》
ヒトＰＡＲＰ−１全長アミノ酸配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿０３７２７３）の第１番目〜第３７４番目はＤＮＡ結合部位であり、このＤＮＡ結合部分のみを野生型ＰＡＲＰ−１と共発現すると、ＤＮＡへの結合を競合することが知られている。その結果、野生型ＰＡＲＰ−１のＤＮＡへの結合の割合が減少することで、活性化したＰＡＲＰ−１のＤＮＡへのポリＡＤＰリボース化の阻害、および細胞死の誘導が阻害されることが知られている（ドミナントネガティブ効果）。従って、ＰＡＲＰ−１のＤＮＡ結合部位のみは、ＰＡＲＰ−１に対してドミナントネガティブ効果を示すドミナントネガティブ変異体タンパク質として機能することが明らかなっている。（Ｋｕｐｐｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ｄｅ，Ｍｕｒｃｉａ，Ｇ．及びＢｕｒｋｌｅ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８７２１−１８７２４，１９９０）。
上記部位、すなわち、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるヒトＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体タンパク質（以下の各実施例において、単に「ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体」と称する）をコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト脾臓由来のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより取得した。まず、ヒト脾臓ｍＲＮＡ（１０ｎｇ）を、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、ホットスタート法によるＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号２２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／６５℃（３０秒間）／７２℃（６分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片を、クローニングキットを用いて、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングを行なった。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して、インサート（ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体をコードするｃＤＮＡ）のみを単離した後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたクローンｐｃＤＮＡ３．１−ＰＡＲＰｔの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析したところ、配列番号１９で表される配列が得られた。配列番号１９で表される塩基配列は、ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体をコードしていた。
【実施例１５】
《ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体によるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化阻害》
ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のチャネル活性へのＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体の影響を検討するために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例１、及び実施例１４で得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＬＴＲＰＣ２及びｐｃＤＮＡ３．１−ＰＡＲＰｔと、形質転換用試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００；インビトロジェン社）とを用いて、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞の形質転換を行ない、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質及びＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法（文献１）に従って、実施した。
得られた形質転換細胞（１．６×１０５細胞）におけるＬＴＲＰＣ２活性化を、Ｒｂ＋イオンの放出を測定する方法を利用して測定した。方法は実施例６と同様に行った。ただし、ＰＡＲＰ活性化剤としてはＨ２Ｏ２（最終濃度＝０．０６％）を用い、コントロールとして、実施例５で得られたＬＴＲＰＣ２タンパク質のみを発現させた細胞を用いた。
測定の結果、ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞における８６Ｒｂ＋の残存活性は、コントロールの細胞（ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体を発現させていない細胞）と比較して有意に上昇していた。
これは、ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体によってＰＡＲＰ活性が阻害されて、その結果、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の８６Ｒｂ＋の細胞外への排出が減少したことを示している。
また、この時のＰＡＲＰの活性化を実施例８の手法を用いて検討した。ただし、ＰＡＲＰ活性化剤としてはＨ２Ｏ２（最終濃度＝０．０６％）を用い、コントロールとして、実施例５で得られたＬＴＲＰＣ２タンパク質のみを発現させた細胞を用いた。測定の結果、ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞における３Ｈの放射活性は、コントロールの細胞と比較して、６７％に減少していた。
これらの結果から、Ｈ２Ｏ２によるヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化は、ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体によって阻害されることが明らかになった。ＰＡＲＰ阻害化合物を用いた結果（実施例７）に加え、ＰＡＲＰ−１ドミナントネガティブ変異体を用いた結果（本実施例）からも、ＰＡＲＰ活性が減少することによりＬＴＲＰＣ２活性化が阻害され、ＬＴＲＰＣ２はＰＡＲＰによって活性が制御されていることが確認された。
【実施例１６】
《ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質活性阻害剤のスクリーニング》
ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のイオンチャネル活性を阻害する化合物のスクリーニングを行なった。
実施例５で得られた形質転換細胞を（１．６×１０５細胞）を、８６ＲｂＣｌ（１μＣｉ／ｍＬ）存在下、３７℃で２４時間インキュベートすることにより、８６Ｒｂ＋を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった８６Ｒｂ＋を取り除いた。得られた細胞に対して、Ｈ２Ｏ２（最終濃度＝０．０６％）存在下で、さまざまな化合物（最終濃度＝１０μｍｏｌ／Ｌ）をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で３０分間インキュベートした。なお、コントロールとして、化合物を添加しないＨ２Ｏ２存在下で、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った８６Ｒｂ＋の放射活性を測定した。得られた放射活性がコントロールの細胞（Ｈ２Ｏ２のみを添加した細胞）の放射活性と比較して、有意に高い残存活性を示す化合物がヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のチャネル活性を阻害する化合物である。これは、添加した化合物によってヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の８６Ｒｂ＋が細胞外へ排出されなかったか、あるいは、排出が減少したことを示している。
上記で見出された化合物は、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化に伴う８６Ｒｂ＋の細胞外への排出を指標にしたものであり、直接のヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の阻害活性を検出していない。より具体的には、細胞内に含まれるＰＡＲＰの阻害活性を示す化合物もヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害し、その結果８６Ｒｂ＋の細胞外への排出を阻害する。そのため、上記工程で得られた化合物について、更にＰＡＲＰ阻害活性の検討を行なった。
実施例５で得られた形質転換細胞に対して、Ｈ２Ｏ２（最終濃度＝０．０６％）存在下で、さまざまな化合物（最終濃度＝１０μｍｏｌ／Ｌ）をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で３０分間インキュベートした。なお、コントロールとして、化合物を添加しないＨ２Ｏ２存在下で、同様の操作を実施した。その後、反応液を除去した細胞に３Ｈ−ＮＡＤを最終濃度０．２ｎＣｉ／ｍｉｃｒｏＬになるように加え、３７度で４０分間インキュベートとした。その後、この細胞にＴＣＡを最終濃度１０％になるように加えて４度で３０分間インキュベートすることで反応を停止させた。その後、細胞を５％ＴＣＡで２回洗浄することで、取り込まれなかった３Ｈ−ＮＡＤを除いた。洗浄した細胞を、２％ＳＤＳ、０．１％ＮａＯＨを含む溶液で溶解した後、細胞に含まれる３Ｈの放射活性を測定した。
その結果、コントロールの細胞（Ｈ２Ｏ２のみを添加した細胞）の残存放射活性と同程度の残存活性を示す化合物を選択した。これは、添加した化合物が、ＰＡＲＰ活性を阻害していないことを示している。
これらの検討の結果、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化に伴う８６Ｒｂ＋の細胞外への排出を阻害し、同時に細胞内のＰＡＲＰ活性を阻害しない化合物を選択した。この化合物はヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を直接阻害していることが考えれる。
次に、見出された化合物がヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質を直接阻害していることを確認するために、電気生理の手法を用いて、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のイオンチャネル活性への影響を検討した。具体的には、前記実施例５で得られた形質転換細胞を、ホールセル膜電位固定（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法により膜電位固定し、ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ（最終濃度５００μＭ）を細胞内へ投与したときに生じる全細胞電流を測定した。細胞外液として、１４５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）を含む溶液を使用し、細胞内液として、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣｓＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｃｓ（ｐＨ＝７．２）を含む溶液を用いた。
この時、上記工程で見出された化合物をＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ投与と同時に、あるいは前処理時から加え、ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅによって惹起される全電流変化を測定した。この時、全電流変化がＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ単独を加えた時と比較して、減少、あるいは完全に惹起されなくなる化合物を選択する。これは、添加した化合物が直接ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のチャネル活性を阻害したことを示している。
これらの検討を行なうことで、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質を直接阻害する化合物を見出すことが可能である。
【実施例１７】
《ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のすい臓細胞での発現とヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質による１型糖尿病の細胞死の促進》
ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質のすい臓での機能、及び１型糖尿病モデルにおける細胞死へのヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の関与を検討した。すい臓細胞の１型糖尿病の細胞死は、ストレプトゾトシン刺激による細胞死をモデルとすることができる。さらに、この細胞死の過程には、ＰＡＲＰが関与していることも明らかになっている（Ｐｉｅｐｅｒ，Ａ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６，３０５９−３０６４，１９９９）。
実施例１で得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＬＴＲＰＣ２と、形質転換用試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００；インビトロジェン社）とを用いて、マウスすい臓ランゲルハンス島ベータ細胞由来のＭＩＮ６Ｂ細胞の形質転換を行ない、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法（文献１）に従って、実施した。
得られた形質転換細胞を９６穴プレート（旭テクノグラス社）に４×１０４細胞／ウェルになるように蒔き一晩培養した後、最終濃度１ｍＭストレプトゾトシン（シグマ・アルドリッチ社）を含む細胞培地で室温、越夜でインキュベートした。細胞培地を除いた後、細胞の生死を判定するためにＭＴＴアッセイを行った。本操作は、細胞内のミトコンドリアの呼吸酵素系によってＭＴＴがホルマザンに還元されて青色を呈する反応を利用することによって、細胞の生死を判断することができる。刺激を加えた細胞にＭＴＴ試薬（和光純薬）を加え２時間培養した後、培養上清を抜き取った細胞にＤＭＳＯを加えてホルマザンを溶解した後、吸光光度計で吸光度を測定した。なお、コントロールとして、ＬＴＲＰＣ２を含まないｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみを形質転換した細胞を用いて、同様の操作を実施した。その結果、ＬＴＲＰＣ２を発現させた細胞はベクターのみを発現させた細胞に比較して、有意に吸光度が減少していた（９３％に減少）。これは、ストレプトゾトシン刺激によってＬＴＲＰＣ２を介して細胞死が起き、その結果、生きている細胞が減少したことを示している。この結果から、ヒトＬＴＲＰＣ２タンパク質は、ストレプトゾトシン刺激による細胞死を促進することが確認できた。さらに、ストレプトゾトシン刺激による細胞死は１型糖尿病のモデルであることから、ヒトＬＴＲＰＣ２は１型糖尿病による細胞死を誘導する機能を有していることが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法によれば、ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、ＰＡＲＰの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患（例えば、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、１型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応）の治療剤及び／又は予防剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。本発明のＬＴＲＰＣ２、本発明の細胞を用いて、本発明のスクリーニング系を構築することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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