(57)【要約】この発明は、イネの非自立的トランスポゾン遺伝子、自立的トランスポゾン遺伝子及びトランスポゼース遺伝子、並びにトランスポゾン遺伝子を転移させる方法及びこの転移により形質転換した植物に関する。発明者は、イネゲノム塩基配列を調べた結果、イネの非自立的トランスポゾン遺伝子、自立的トランスポゾン遺伝子及びトランスポゼース遺伝子を見出し、これらの遺伝子を導入したイネ品種においてトランスポゾンの転移を確認した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列に少なくとも９５％相同のＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子。
【請求項２】
エンハンサー又はプロモーターがその内部に挿入された請求項１に記載のトランスポゾン遺伝子。
【請求項３】
配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列に少なくとも９０％相同のＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子。
【請求項４】
配列番号２の３１９０位〜４５５７位の塩基配列又は配列番号３の２９５９位〜４４０７位の塩基配列に少なくとも７５％相同のＤＮＡから成るイネのトランスポゼース遺伝子。
【請求項５】
配列番号４若しくは配列番号５で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするトランスポゼース遺伝子。
【請求項６】
配列番号４若しくは配列番号５で表されるアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質から成るトランスポゼース。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスポゾン遺伝子を含有するプラスミド。
【請求項８】
プロモーター及び請求項４又は５に記載のトランスポゼース遺伝子を含有するプラスミド。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスポゾン遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１０】
宿主が植物である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記植物がイネ、オオムギ、コムギ又はトウモロコシである請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
プロモーター及び請求項４又は５に記載のトランスポゼース遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１３】
宿主が植物である請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
前記植物がオオムギ、コムギ又はトウモロコシである請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか一項に記載の形質転換体を葯培養又は薬剤で処理することにより請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスポゾン遺伝子を転移させる方法。
【請求項１６】
前記薬剤が５−アザシチジン又は５−アザデオキシシチジンである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
イネを葯培養、又はイネの種子、葉、根、茎若しくは腋芽、又はそれに由来のカルスを５−アザシチジン若しくは５−アザデオキシシチジンで処理して培養することにより請求項１に記載のトランスポゾン遺伝子を転移させる方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法により、前記トランスポゾン遺伝子が転移して形質転換した植物又はその種。
【請求項１９】
前記植物がイネ、オオムギ、コムギ又はトウモロコシである請求項１８に記載の植物又はその種。
【請求項２０】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法により請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスポゾン遺伝子を移転させる段階、前段階で得た植物からＤＮＡを抽出する段階、該ＤＮＡをトランスポゾン遺伝子内にカッティングサイトのない制限酵素で消化する段階、前段階で得たＤＮＡ断片をライゲーションする段階、前段階で得たＤＮＡ断片をＰＣＲを行う段階、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定する段階から成る方法であって、該ＰＣＲを行うために用いるプライマーとして、配列番号１で表される塩基配列の５’末端から少なくとも１０塩基基のオリゴヌクレオチド及び配列番号１で表される塩基配列の３’末端から少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド又はこれらに相補的なオリゴヌクレオチドを用いるトランスポゾン遺伝子の挿入領域を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、イネの非自立的トランスポゾン遺伝子、自立的トランスポゾン遺伝子及びトランスポゼース遺伝子、並びにトランスポゾン遺伝子を転移させる方法及びこの転移により形質転換した植物に関する。
従来技術
イネ（ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のゲノムの機能解析の一手段として遺伝子破壊法が用いられている。イネの遺伝子破壊には、アクチベーター因子のトランスポゼース（転移酵素）遺伝子を導入した固体と分離因子を導入した固体とを交配させて、分離因子を活性化させる方法、Ｔ−ＤＮＡを用いる方法、レドロトランスポゾンによる方法等が知られているが、イネの自然突然変異体を解析しても、活性のあるトランスポゾンの存在は知られていなかった（細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１４「植物のゲノム研究プロトコール」２０００年２月（秀潤社））。
一方、ゲノムプロジェクトによりイネをはじめとして多くの植物の遺伝子の塩基配列が明らかにされつつあり、それらの結果は逐次データベース化されている。さらに動植物における動く遺伝子としてトランスポゾン遺伝子はある程度特有の塩基配列を有しているため、その情報を基にトランスポゾンの可能性を有する遺伝子の研究がなされているが、未だに十分な解明がなされていない。
なお、イネをγ線照射することにより誘発された突然変異体からトランスポゾンと考えられる配列が見出されている（中崎鉄也ら「易変性細粒遺伝子ｓｌｇ座領域におけるトランスポゾン様配列の挿入多型性」、日本育種学会第１００回秋季大会、２００１年１０月）。
発明が解決しようとする課題
発明者は、イネゲノム塩基配列を調べていたところ、トランスポゾンに特徴的な逆向き反復配列を発見し、トランスポゾンと目される配列に関し幾多の試験を行ったところ、これがトランスポゾン（非自立的トランスポゾン）であることの確証を得た。
更に、本発明者は、この非自立的トランスポゾン遺伝子を基に、自立的トランスポゾン遺伝子を見出し、更に、その遺伝子を転移させるトランスポゼース遺伝子を特定した。
課題を解決するための手段
発明者は、順次データベースに登録されるイネゲノム塩基配列をもとに、１番染色体より、反復配列（ＬＴＲ）を調べていた。表１に示すアクセッションナンバーＡＰ００２８４３のクローンにおいて、ＬＴＲに注目し、この領域について、詳細に解析していたところ、ＬＴＲの直後の１４４４５９−１４４４７３及び１４４８７４−１４４８８８の場所に、トランスポゾンに特徴的な逆向き反復配列を発見した（第１図、配列番号６）。後述の実施例にて明らかにされるが、この反復配列に挟まれた配列（配列番号１）は、葯培養等の人為的操作により顕著に可動性を示す非自立的トランスポゾンであることがわかった。
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次に、この非自立的トランスポゾン（配列番号１）をＱｕｅｒｙ（ホモロジー探索用ＤＮＡ）として用いてＢＬＡＳＴ法によりホモロジー検索を行った。検索結果の多くは、この非自立的トランスポゾン（配列番号１）そのものであったが、その他にトランスポゾンと期待されるアクセッションナンバーＡＰ００４２３６とＡＰ００３９６８が見出された。これらＡＰ００４２３６とＡＰ００３９６８とを比較したところ、共に第６染色体上のクローンであり、重複した同じ領域の配列であった。
そのため、非自立的トランスポゾン（配列番号１）の１−２５３とＡＰ００４２３６の８９３６０−８９６１２の間では、相同性は２５２／２５３（９９％）であり、非自立的トランスポゾン（配列番号１）の２５４−４３０とＡＰ００４２３６の９４５２４−９４７００の間では、相同性は１７７／１７７（１００％）と保存されていた。
この非自立的トランスポゾン（配列番号１、４３０ｂｐ）とこのトランスポゾン（配列番号２、５３４１ｂｐ）は、共に、１５ｂｐの逆向き反復配列を有し、ＴＴＡ又はＴＡＡを認識して挿入されている。
配列番号２（５３４１ｂｐ）の配列をもとにＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）を探したところ、２種類の推測されるＯＲＦＩとＯＲＦＩＩが検索された。
配列番号２で表される塩基配列を有するトランスポゾン遺伝子の構造を第９図上に示す。非自立的トランスポゾン（配列番号１、４３０ｂｐ）は、１−２５３及び５１６５−５３４１、ＯＲＦＩは１５２６−１９１４及び１９３９−２６６３、ＯＲＦＩＩは３１９０−４５５７にそれぞれ位置していた。
更に、配列番号２で表される塩基配列と類似した遺伝子を単離するために配列番号２をＱｕｅｒｙ（ホモロジー検索用ＤＮＡ）としてＢＬＡＳＴ法によりホモロジー検索をしたところ、配列番号２で表される塩基配列以外にアクセッションナンバーＡＰ００４７５３（第２染色体）とＡＰ００３７１４（第６染色体）が見い出された。この２種類のクローンは同じ配列（配列番号３）であり、異なる染色体に座上していた（数コピー存在）。インディカ型にも存在することから、日本型からインディカ型まで、多くの品種に保持されている遺伝子である。この配列番号３（５１６６ｂｐ）で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列と同じように、逆向き反復を有し、ＴＡＡ（３ｂｐ）を認識して挿入されていた。
配列番号３の配列をもとにＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）を探したところ、ＯＲＦＩとＯＲＦＩＩが検索され２種類のタンパク質をコードしていると考えられた。
配列番号３で表される塩基配列を有するトランスポゾン遺伝子の構造を第９図下に示す。非自立的トランスポゾン（配列番号１、４３０ｂｐ）は、１−１７０及び５０９２−５１６６に位置しているが、非自立的トランスポゾン（配列番号１、４３０ｂｐ）との一致が途中からなくなっている。またＯＲＦＩは１６３０−２６５２、ＯＲＦＩＩは２９５９−４４０７にそれぞれ位置していた。
配列番号３で表される塩基配列をジャポニカ（ＡＰ００４７５３及びＡＰ００３７１４）とインディカ（Ｓｃａｆｆｏｌｄ６９６２）で比較してみると、第１０図で示すように、９０％以上の相同性が確認された。なお、非自立的トランスポゾン（配列番号１、４３０ｂｐ）のインディカにおける変異頻度を調べてみると、第１１図で示すように、９５％以上の相同性が確認された。
配列番号２及び３のＯＲＦＩは、いまのところ機能の類推には至っていない。
次に、ＯＲＦＩＩがトランスポゼース（転移酵素）をコードしているか否かを明らかにするため、ＯＲＦＩＩのアミノ酸配列について、既知のトランスポゼースの保存領域の有無を調べた。配列番号２のＯＲＦＩＩと配列番号３のＯＲＦＩＩのアミノ酸配列を配列番号４と配列番号５に示す。これら２つのＯＲＦＩＩのアミノ酸配列の比較を第１２図に示すが、それらの間の相同性は７５％以上（７７％）と非常に高かった。これら２種のアミノ酸配列は、共にＤＸＧ／ＡＦ／Ｆ  ｍｏｔｉｆとＹＲＥＫ  ｍｏｔｉｆを有するため（Ｑ．Ｈ．Ｌｅ，Ｋ．Ｔｕｒｃｏｔｔｅ  ａｎｄ  Ｔ．Ｂｕｒｅａｕ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５８：１０８１−１０８８（２００１））、ＩＳ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｆａｍｉｌｙに属すると結論される。
また、配列番号２のＯＲＦＩＩの塩基配列と、配列番号３のＯＲＦＩＩの塩基配列との相同性は７５％以上（７９．３％）であった。
即ち、本発明は、配列番号１で表される塩基配列に少なくとも９５％相同のＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子である。配列番号１で表される塩基配列に少なくとも９５％相同のＤＮＡは、葯培養又は薬剤で処理することにより転移する非自立的トランスポゾンとしての機能を有する遺伝子であると考えられる。
また、本発明は、エンハンサー又はプロモーターがその内部に挿入された請求項１に記載のトランスポゾン遺伝子である。
更に、本発明は、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列に少なくとも９０％相同のＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子である。配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列に少なくとも９０％相同のＤＮＡは、葯培養又は薬剤で処理することにより転移する自立的トランスポゾンとしての機能を有する遺伝子であると考えられる。
また、本発明は、配列番号２の３１９０位〜４５５７位の塩基配列又は配列番号３の２９５９位〜４４０７位の塩基配列に少なくとも７５％相同のＤＮＡから成るイネのトランスポゼース遺伝子である。これらの塩基配列に少なくとも７５％相同のＤＮＡは、上記のトランスポゾン遺伝子を転移させる機能を有する遺伝子であると考えられる。
また、本発明は、配列番号４若しくは配列番号５で表されるアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質から成るトランスポゼースである。また、このトランスポゼースは、配列番号４又は配列番号５で表されるアミノ酸配列に少なくとも７５％相同のアミノ酸配列を有するイネのトランスポゾン遺伝子であるといえる。
更に、本発明は、このタンパク質をコードするトランスポゼース遺伝子である。
本発明は、また、上記に記載のいずれかのトランスポゾン遺伝子を含有するプラスミドである。更に、本発明は、プロモーター及び上記に記載のいずれかのトランスポゼース遺伝子を含有するプラスミドである。ここで用いることのできるプラスミドとして、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターが挙げられる。ここで用いることのできるプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター・熱ショックプロモーター・化学物質誘導性プロモーター等が挙げられる。またプロモータ及び上記遺伝子の結合方法に特に制限は無く、通常の遺伝子工学的手法に従って適宜行えばよい。
また、本発明は、上記のいずれかのトランスポゾン遺伝子が導入された形質転換体である。この宿主は植物であることが好ましく、宿主としては、イネ、オオムギ、コムギ又はトウモロコシが好ましい。このような植物を形質転換するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、この遺伝子を上記プラスミドに挿入し、この植物を形質転換すればよい。
更に、本発明は、プロモーター及び上記トランスポゼース遺伝子が導入された形質転換体である。これらの他に必要に応じてトランスポゾン遺伝子を導入してもよい。プロモーターとしては上記のものを用いることができる。この宿主は植物であることが好ましく、宿主としては、オオムギ、コムギ又はトウモロコシが好ましい。このような植物を形質転換するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、この遺伝子を上記プラスミドに挿入し、この植物を形質転換すればよい。
本発明はまた、上記のいずれかの形質転換体を葯培養又は薬剤で処理することにより、上記のいずれかのトランスポゾン遺伝子を転移させる方法である。
更に、本発明は、上記のいずれかの方法により、前記トランスポゾン遺伝子が転移して形質転換した植物又はその種である。この植物としてイネ、又はイネの近隣種であるオオムギ、コムギ若しくはトウモロコシが好ましい。
また本発明は、上記のいずれかのトランスポゾン遺伝子を転移させる方法により上記のいずれかのトランスポゾン遺伝子を移転させる段階、前段階で得た植物からＤＮＡを抽出する段階、該ＤＮＡをトランスポゾン遺伝子内にカッティングサイトのない制限酵素で消化する段階、前段階で得たＤＮＡ断片をライゲーションする段階、前段階で得たＤＮＡ断片をＰＣＲを行う段階、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定する段階から成る、トランスポゾン遺伝子の挿入領域を特定する方法であって、このＰＣＲを行うために用いるプライマーとして、配列番号１で表される塩基配列の５’末端から少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜２０塩基、より好ましくは１０〜１５塩基のオリゴヌクレオチド及び配列番号１で表される塩基配列の３’末端から少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜２０塩基、より好ましくは１０〜１５塩基のオリゴヌクレオチド又はこれらに相補的なオリゴヌクレオチドを用いる方法である。このプライマーは、このオリゴヌクレオチドの塩基数が１５塩基以下の場合には、塩基配列の５’末端から１０〜１５塩基のオリゴヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列の３’末端から１０〜１５塩基を兼ねることができるので、一種類とすることができる。即ち、この場合には、ＰＣＲを行うために用いるプライマーとして、配列番号１で表される塩基配列の５’末端から１０〜１５塩基のオリゴヌクレオチド又はこれに相補的なオリゴヌクレオチドを用いればよい。このようにしてトランスポゾン遺伝子の挿入領域を特定することができれば、トランスポゾン遺伝子の挿入により破壊された遺伝子を知ることができる。
発明の実施の形態
本発明は、まず、全長４３０ｂｐのイネの非自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号１）である。このトランスポゾン遺伝子は、１５ｂｐのターミナルインバーテッドリピートを有し、２１５ｂｐ（ＣＴ）より対称構造をしている。
次に、２種類のトランスポゾン遺伝子（配列番号２及び３）は、共にトランスポゼース（配列番号４及び５）をコードしており、自立的トランスポゾンである。
自立的トランスポゾンとは、トランスポゼースをコードしているのが特徴であり、自ら可動でき、非自立的トランスポゾンの転移を誘発するものである。一方、非自立的トランスポゾンとは、このトランスポゼースが欠失したものであり、自ら可動できず、可動には自立的トランスポゾンの助けが必要である。構造上、自立的トランスポゾンと非自立的トランスポゾンを比較すると、欠失した以外の領域では相同性が保存されているのが特徴である。
本発明のトランスポゾンを有する植物、本発明のトランスポゾンで形質転換された植物、また本発明のトランスポゼース遺伝子を有する植物、又は本発明のトランスポゼース遺伝子で形質転換された植物は、放射線照射、薬剤による処理、又は葯培養等によって活性化させることにより、本発明のトランスポゾンを移転させることができる。このような手段によってトランスポゾンが顕著に活性化するため、容易に人工的なトランスポゾンの転移が起こる。
薬剤による処理は、イネ等の植物の種子、葉、根、茎若しくは腋芽、又はそれに由来のカルスを薬剤で処理して行う。薬剤、例えば、５−アザシチジン又は５−アザデオキシシチジン、による処理を行うためには、これら薬剤を０．０１〜５ｍＭ、好ましくは０．０５〜２ｍＭ含んだ固体又は液体培地に、これら植物のカルスを移植して行うのが一般である。このカルスとは、根、葉、茎などの植物器官をオーキシンやサイトカイニンを適当量添加した培地で、組織培養することにより、分化している植物器官より脱分化して形成された細胞塊をいう。この細胞塊は未分化で、分化全能性を持つ。分化全能性とは、芽、根などの新たな器官に再分化する能力であり、例えば、カルスを介することで１枚の葉から、数百のクローン植物体を得ることが可能である。
また、葯培養は、半数体育種法の一種であり、イネのおしべの先端にある葯を取り出して、オーキシン等のホルモンを主体とし、コルシチン等の倍数処理剤等を添加した培地で培養する。病は遺伝子を一組しか有さない半数体であるが、半数体は倍化しやすいため、容易に純系を得ることができる。イネの葯由来カルスは、培養期間が長くなると、自然に倍化し半数体倍化系統になる。このカルスを再分化培養すれば、変異植物体であるホモ型の種子が得られる。この再分化培地としては、サイトカイニン等のホルモンを主体とした培地を用いる。
また、トランスポゾンの配列中の適当な２つの配列をプライマーとして用いてＰＣＲ法により作製したプローブを用いれば、転移したトランスポゾンが挿入されることにより破壊された遺伝子を特定することができる。このように形質転換されたイネの変異体とその遺伝子との相関を解明することにより、その遺伝子の機能を知ることができる。
トランスポゾンタグ系統より破壊された遺伝子を簡便に同定することは、もっとも重要な課題である。トランスポゾン挿入位置の調べるには、トランスポゾディスプレーなどさまざまな手法があるがそれぞれ煩雑な操作が必要である。そこで本発明者は、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を用いた簡便な方法を確立した。この際、トランスポゾン内に設計したＰＣＲプライマーが成功の鍵を握る。植物体などよりゲノムＤＮＡを抽出後、トランスポゾン内にカッティングサイトのない制限酵素（本実験ではＡｌｕＩを使用）で消化し、ライゲースで（セルフ）ライゲーションを行う。これをテンプレートとし、配列番号１で表される塩基配列の５’末端から少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド及び配列番号１で表される塩基配列の３’末端から少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド又はこれらに相補的なオリゴヌクレオチド、特にターミナルインバーテットリピート領域（配列番号１で表される塩基配列の５’末端から１５塩基、及び３’末端から１５塩基の領域）に作成したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、トランスポゾンの挿入位置を知ることができる。
非自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号１）の利用法の一つとして、この非自立的トランスポゾン遺伝子の内部にエンハンサー又はプロモーターを挿入し、これらを非自立的トランスポゾンと共に転移させることができる。即ち、エンハンサーやプロモーター等が挿入された遺伝子をイネその他の植物に導入して、葯培養や薬剤処理することにより、この遺伝子の転移を誘発すれば、この遺伝子の転移先の近傍にある別の遺伝子を積極的に発現させることが可能になり、その結果、効率よくｇａｉｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎの変異体を作出することができる。このプロモーターとして、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどを用いることができ、またエンハンサーとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター中のエンハンサー領域（−９０〜−４４０）を４つタンデムにつないだものなど、を挙げることができる。エンハンサーの挿入箇所は、配列番号１の遺伝子内のインバーテットリピート領域を除いた場所であれば、特に制限はない。またプロモーターの挿入箇所は、配列番号１の遺伝子内のインバーテットリピート領域を除いた場所でメチオニンが下流になければ、特に制限はない。これらは、共にトランスポゾンの転移に支障がなければ、配列番号１の２５０ｂｐ付近に挿入することが好ましい。エンハンサーやプロモーター等の挿入方法は、配列番号１の塩基配列を二分するような制限酵素サイトもしくは、ＰＣＲ法を用いてその中にクローニングサイトを作成して、挿入することができる。
発明の効果
本発明は、従来イネにおいて可動性を示すトランスポゾン遺伝子は知られていなかったが、可動性を示すイネのトランスポゾン遺伝子を始めて明らかにした。更に、発明者は、葯培養等の簡単な手段によって、非自立的トランスポゾン遺伝子が転移することを確認した。即ち、人為的に非自立的トランスポゾン遺伝子を転移させる手段を提供することに成功した。
また実施例において、葯培養等の人為的操作により、非自立的トランスポゾン遺伝子が欠失することを明らかにし、更に、非自立的トランスポゾン遺伝子が挿入された遺伝子座を直接確認した。このように人為的に転移させることのできるトランスポゾン遺伝子を見出すことができたため、人為的にトランスポゾンタギング系統をイネで初めて作出することに成功した。
更に、本発明は、イネの自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２及び３）を明らかにし、更に、これらに含まれるトランスポゼース遺伝子を明らかにした。発明者は、このような自立的トランスポゾン遺伝子を導入したイネにおいて、葯培養や薬物投与という簡単な手段によって、このトランスポゾン遺伝子が転移することを確認した。即ち、本発明は、この自立的トランスポゾン遺伝子やトランスポゼース遺伝子を、イネその他の植物に導入して、これら人為的操作を施すことにより、これら植物を容易に人為的に形質転換する手段を提供する。
本発明の自立的トランスポゾンの利用法として、これを変異源として利用し、イネやその他の植物において、トランスポゾンタグ系統を作出することができる。
本発明を利用して、ランダムに本トランスポゾンを転移させた系統を数万系統をつくり出すことができる。自然界で生育した植物での転移は非常に稀であるため、植物組織培養により誘導した葯由来カルスや５−アザシチジン処理した種子由来カルスなどにより高頻度に転移を誘発する。イネ以外の植物においても形質転換法により本発明の自立的トランスポゾンを導入すれば、同様に転移を誘発することが可能である。このようにして得た変異体は、遺伝学的解析法や逆遺伝学的解析法により解析することができる。
この遺伝学的解析法とは、変異体の表現型からその原因遺伝子を単離する方法であり、本トランスポゾンと変異体の表現型がリンクしていれば、このタグ（トランスポゾン）を利用して、容易に原因遺伝子の単離を行える。たとえば、塩に強いイネを探したければ、トランスポゾンタグ系統の種子から培養したイネの耐塩性を調べて、所望のイネを選べばよい。
また、逆遺伝学的解析法とは、遺伝子からその遺伝子の機能が失われた変異体を単離する方法である。多数の変異体よりＤＮＡを抽出し、プールを作る。トランスポゾンタグ系統のＤＮＡを購入し、その中から、目的の遺伝子にトランスポゾンが挿入した変異体をＰＣＲ法により釣りあげることができる。
さらに、近年のゲノムプロジェクトにより、網羅的な解析として、イネの全遺伝子に対応した、変異体を作出し、トランスポゾンの挿入位置をデーターベース化することもできる。利用者は、目的にあわせてデーターベースを検索してヒットした変異体の種子をオーダーすることができる。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらは本発明を制限することを意図したものではない。
実施例１
イネ品種、日本晴の成葉からＤＮＡを抽出した（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４５−４８）。トランスポゾンＤＮＡの両端にある逆向き反復配列間の領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号７のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲには、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム（ＡＢＩ社）を使用して行った。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）、１０μｌ  １０×Ｅｘ  Ｔａｑバッファー、８μｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）、２００ｐｍｏｌプライマーが含まれる。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で１２分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、１％ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ社）で分画した。増幅された約４５０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を３１０ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて決定した。決定された塩基配列は４３０ｂｐから成る配列番号１に示すものであった。
実施例２
４種のイネ品種（日本晴、コシヒカリ、ひとめぼれ、及びヤマホウシ）の成葉からＤＮＡを抽出した。トランスポゾンＤＮＡを含む領域（アクセッションナンバーＡＰ００２８４３）をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号８と配列番号９のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社）、１０μｌ  ＧｅｎｅＡｍｐ  １０×ＰＣＲバッファー（ｃｏｎｔａｉｎｓ  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０μｌ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、２００ｐｍｏｌプライマーが含まれる。ＰＣＲの条件は、９６℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、２％ＬＯ３アガロース（ＴａＫａＲａ社）で分画した。第２図にこのアガロースゲル電気泳動を示す。日本晴においてのみ、約８５０ｂｐのバンドが得られた。約８５０ｂｐのバンドは実施例１で示した配列番号１のトランスポゾン遺伝子（４３０ｂｐ）が挿入されている断片である。一方、コシヒカリ、ひとめぼれ、及びヤマホウシでは、約４２０ｂｐのバンドが得られ、トランスポゾン遺伝子が挿入されていない断片であった。こうような品種間で日本晴にのみ特異的であるということは、この遺伝子がトランスポゾンとしての機能を有する可能性を示唆している。
比較例１
日本晴の種子を、３％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５〜３０分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、９個の種子を２０〜３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロル−フェノキシ酢酸（ｓｉｇｕｍａ社）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇプロリン（ＷＡＫＯ）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。誘導培養１０日目に、誘導された種子由来カルスは、２０〜３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロル−フェノキシ酢酸（ｓｉｇｕｍａ社）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇプロリン（ＷＡＫＯ）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
増殖培養２週間目の種子由来カルスよりＤＮＡを抽出した。トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、実施例２と同様にＰＣＲプライマーとして配列番号８と配列番号９のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社）、１０μｌ  ＧｅｎｅＡｍｐ  １０×ＰＣＲバッファー（ｃｏｎｔａｉｎｓ  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０μｌ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、２００ｐｍｏｌプライマーが含まれる。ＰＣＲの条件は、９６℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、２％ＬＯ３アガロース（ＴａＫａＲａ社）で分画した。第３図にこのアガロースゲル電気泳動を示す。約８５０ｂｐの１本のバンドのみが得られた。約８５０ｂｐのバンドは、トランスポゾン遺伝子が挿入されたままのサイズである。期待されたトランスポゾン遺伝子が欠失したバンドのサイズである約４２０ｂｐのバンドは得られなかった。約４２０ｂｐのバンドの得られる確率は６４カルス中０カルス（０％）であった。これにより、種子（胚盤）由来カルスにおいてトランスポゾン遺伝子は動いていないことが認められた。
実施例３
日本晴の出穂前の穂を採取し、１０℃の温度で、１０日間の低温処理を行った後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、頴花から葯を摘出し、５０個の葯を３ｍｌ液体培地の入った３５×１０ｍｍのシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロル−フェノキシ酢酸（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）を含む液体培地を使用した。誘導培養３〜４週間目に、誘導された葯由来カルスは、２０〜３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ｋｉｎｅｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
増殖培養２週間目の葯由来カルスよりＤＮＡを抽出した。トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、実施例２と同様にＰＣＲプライマーとして配列番号８と配列番号９のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社）、１０μｌ  ＧｅｎｅＡｍｐ  １０×ＰＣＲバッファー（ｃｏｎｔａｉｎｓ  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０μｌ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、２００ｐｍｏｌプライマーが含まれる。ＰＣＲの条件は、９６℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、２％ＬＯ３アガロース（ＴａＫａＲａ社）で分画した。第４図にこのアガロースゲル電気泳動を示す。図中、約８５０ｂｐと約４２０ｂｐの２本のバンドが得られた。約８５０ｂｐのバンドは、トランスポゾン遺伝子が挿入されたままのサイズである。一方、約４２０ｂｐのバンドは、トランスポゾン遺伝子が欠失したことを示す。約４２０ｂｐのバンドの得られる確率は、６４カルス中、１１カルス（１７．２％）であった。
なお、本実施例においてトランスポゾン遺伝子が欠失したサイズの約４２０ｂｐのバンドが得られた葯由来カルスのうち、増幅された約４２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ＝５）をゲルから回収し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。得られたクローンついて、塩基配列を３１０  ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて決定した。これらの塩基配列を比較したところ、トランスポゾン遺伝子配列は見られなかった（その結果はここには示さない。）。これにより、トランスポゾン遺伝子の欠失が塩基配列からも確認された。
比較例１においては、胚盤（種子）由来の培養細胞ではトランスポゾン遺伝子の可動性は認められなかったのに対して、本実施例においては、葯由来の培養細胞においてトランスポゾン遺伝子の極めて高頻度の可動性が認められた。
実施例４
日本晴の出穂前の穂を採取し、１０℃の温度で、１０日間の低温処理を行った後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、頴花から、葯を摘出し、５０個の葯を３ｍｌ液体培地の入った３５×１０ｍｍのシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロル−フェノキシ酢酸（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）を含む液体培地を使用した。誘導培養３〜４週間目に、誘導された葯由来カルスは、２０〜３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ｋｉｎｅｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
増殖培養２週間目に増殖した葯由来カルスは、２０〜３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で再分化培養した。１Ｌの培地中に、４．３ｇのＭＳ  Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏｂｒｌ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、１０ｍｌ  ６−Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ−ｐｕｒｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇ  ｓｏｌｂｉｔｏｌ（ＷＡＫＯ）３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む個体培地を使用した。再分化培養３〜４週間目に再生していきた植物体は生育培地に内に移植され、大きくなったところで土に植えかえた。生育培地は、１Ｌの培地中に、４．３ｇのＭＳ  Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏｂｒｌ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
葯由来カルスから再分化した、９個体の幼苗より、ＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、０．８％ＬＯ３アガロース（ＴａＫａＲａ社）で分画し、アルカリブロッテイング法でナイロンメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＮ＋）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に転写した。サザンハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ発光検出キット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。プローブの作製には、ＰＣＲＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。トランスポゾンＤＮＡの内部領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０と配列番号１１のＤＮＡ配列（いずれも配列番号１（トランスポゾン遺伝子）中の配列である。）を有するオリゴヌクレオチドを用いプローブを作製した。第５図にこのアガロースゲル電気泳動を示す。第５図に示すように、Ｎｏ．２及びＮｏ．６においてコントロールの日本晴品種にはない新たな位置にバンド（矢印）が現れた。このバンドは、トランスポゾン遺伝子が挿入されて破壊された遺伝子座を示している。
本実施例により、新たな遺伝子座へのトランスポゾン遺伝子の挿入が明らかになった。なお、本実施例にて再分化した稲には第６図に示すような形質が変異したものが認められ（遺伝子は未確認）、このような形質に関連する遺伝子がこのようなトランスポゾンによって破壊されていることが示唆される。
実施例５
日本晴の種子を、３％次亜鉛素酸ナトリウム溶液で１５〜３０分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、９個の種子を２０−３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇ  ｐｒｏｒｉｎｅ（ＷＡＫＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体倍地を使用した。
数日後、イネの種子内の胚盤組織より、カルスが形成され始め、１０日目には、５ｍｍ程度のクリーム色のカルスとなった。この５ｍｍ程度のクリーム色のカルスを、５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ、ｓｉｇｕｍａ社）を０ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭの濃度で含む増殖培地に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇ  ｐｒｏｒｉｎｅ（ＷＡＫＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
増殖培養２週間目の種子由来カルスより、Ｄｎｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを抽出した。トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２と配列番号１３のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ反応液は、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。ＰＣＲの条件は、９６℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし、４５サイクル反応させた。反応後、２％  ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画した。
０．０３ｍＭ−０．３ｍＭの５−アザシチジン添加区において、約７３０ｂｐと約３００ｂｐの２本のバンドが得られた（第７図）。約７３０ｂｐのバンドは、トランスポゾン遺伝子が挿入されたままのサイズである。一方、約３００ｂｐのバンドは、トランスポゾン遺伝子（４３０ｂｐ）が欠失したバンドのサイズであった。
これらのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。得られた４種類のクローンについて、塩基配列を３１０  ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて決定した。４種類のクローンの塩基配列を比較した（第８図）。その結果、トランスポゾン遺伝子配列は全く見られなかった。
本実施例により、種子由来カルスにおいても、脱メチル化剤である５−アザシチジンを使用することで、本トランスポゾンの転移を誘発することが可能であることが分かった。これにより、１粒の種子より、本トランスポゾンが転移した数百のクローン植物体を得ることができると期待される。
実施例６
イネ品種、日本晴の出穂前の穂を採取し、１０℃の温度で、１０日間の低温処理を行った後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、頴花から、葯を摘出し、５０個の葯を３ｍｌ液体培地の入った３５×１０ｍｍのシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）を含む液体培地を使用した。誘導培養３〜４週間目に、誘導された葯由来カルスは、２０〜３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ｋｉｎｅｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。増殖培養２週間目の葯由来カルスよりＤＮＡを抽出した（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４５−４８）。トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１４（ＡＰ００４２３６の８８９３３−８８９６２）と配列番号１５（ＡＰ００４２３６の９５５４５−９５５７４）のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）、１０μｌ  １０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、６μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８μｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、１００ｐｍｏｌ  ｐｒｉｍｅｒが含まれる。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６８℃で１２分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、０．８％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画した。約６．６ｋｂｐのバンドは、本発明のトランスポゾン遺伝子（５３４１ｂｐ）が挿入されたままのサイズである。本発明のトランスポゾン遺伝子は約５．４ｋｂｐであるため、このトランスポゾン遺伝子が欠失すると約１．２ｋｂｐのバンドが現れるはずである。本実施例では約１．２ｋｂｐのバンドが得られた（第１３図）。これにより、葯由来カルスにおいては動いていることが明らかにされた。約１．２ｋｂのバンドの得られる確率は、６４カルス中、３カルス（４．７％）であった。本実施例にて、葯由来カルスにおいて配列番号２で表されるＤＮＡ配列から成るイネのＭＩＴＥが動くことを証明した。
比較例２
イネ品種、日本晴の種子を、３％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５〜３０分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、９個の種子を２０−３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇ  ｐｒｏｒｉｎｅ（ＷＡＫＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。誘導培養１０日目に、誘導された種子由来カルスは、２０−３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇ  ｐｒｏｒｉｎｅ（ＷＡＫＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。増殖培養２週間目の種子由来カルスよりＤＮＡを抽出した（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４５−４８）。トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１４と配列番号１５のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）、１０μｌ  １０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、６μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８μｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、１００ｐｍｏｌ  ｐｒｉｍｅｒが含まれる。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６８℃で１２分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、０．８％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画した。その結果、約６．６ｋｂｐの１本のバンドのみが得られ、約１．２ｋｂｐのバンドは得られなかった（第１３図）。これにより、種子由来カルスにおいては動いていないことが明らかにされた。約１．２ｋｂのバンドの得られる確率は、６４カルス中、０カルス（０％）であった。
実施例７
本実施例では、自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を持っていない品種を探し、自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）の有無による非自立的トランスポゾン遺伝子の転移の差異を明らかにするため、自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を持っていない品種の葯由来カルスを誘導し、非自立的トランスポゾン遺伝子の転移を調べた。
イネ品種、日本晴、コシヒカリ、台中６５号、カサラスの４品種を用い、それぞれの品種の葉より、ＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１．０％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画し、アルカリブロッテイング法でナイロンメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＮ＋）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に転写した。サザンハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ発光検出キット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。プローブの作製には、ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。自立的トランスポゾン遺伝子に特異的な内部領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１６と配列番号１７のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いプローブを作製した。サザンハイブリダイゼーションの結果、日本晴とコシヒカリには、それぞれ自立的トランスポゾン遺伝子が１コピーゲノム中に存在するが、台中６５号とカサラスには、存在しないことが分かった（第１４図）。
次に、台中６５号の葯由来カルスを誘導し、非自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号１）の転移を調べた。
イネ品種、台中６５号の出穂前の穂を採取し、１０℃の温度で、１０日間の低温処理を行った後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、頴花から、葯を摘出し、５０個の葯を３ｍｌ液体培地の入った３５×１０ｍｍのシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２、４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）を含む液体培地を使用した。誘導培養３〜４週間目に、誘導された葯由来カルスは、２０−３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ｋｉｎｅｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。それぞれ増殖培養２週間目の葯由来カルスより、既報（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４５−４８）に記載の方法に従い、ＤＮＡを抽出した。トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１８と配列番号１９（Ｌ０２）、配列番号２０と配列番号２１（Ｌ０６）、配列番号２２と配列番号２３（Ｌ０７）のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社）、１０μｌ  ＧｅｎｅＡｍｐ  １０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｃｏｎｔａｉｎｓ  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０μｌ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、２００ｐｍｏｌ  ｐｒｉｍｅｒが含まれる。ＰＣＲの条件は、９６℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、２％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画した。その結果、自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号１）を持たない台中６５号では、Ｌ０２、Ｌ０６、Ｌ０７遺伝子座に存在する非自立的トランスポゾン遺伝子の転移が起こらなかった（表２上）。しかし、下記比較例３に示すように、葯由来カルスにおいて自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を持つ日本晴では、１０．９−３１．３％と高頻度に非自立的トランスポゾン遺伝子が転移した。
2003040363.tif 000003
比較例３
日本晴の出穂前の穂を採取し、１０℃の温度で、１０日間の低温処理を行った後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、頴花から葯を摘出し、５０個の葯を３ｍｌ液体培地の入った３５×１０ｍｍのシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロル−フェノキシ酢酸（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）を含む液体培地を使用した。誘導培養３〜４週間目に、誘導された葯由来カルスは、２０〜３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ｋｉｎｅｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇスクロース（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
増殖培養２週間目の葯由来カルスよりＤＮＡを抽出した。トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、実施例７と同様にＰＣＲプライマーとして配列番号５と配列番号１のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社）、１０μｌ  ＧｅｎｅＡｍｐ  １０×ＰＣＲバッファー（ｃｏｎｔａｉｎｓ  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０μｌ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、２００ｐｍｏｌプライマーが含まれる。ＰＣＲの条件は、９６℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、２％ＬＯ３アガロース（ＴａＫａＲａ社）で分画した。その結果、約８５０ｂｐと約４２０ｂｐの２本のバンドが得られた。約８５０ｂｐのバンドは、トランスポゾン遺伝子が挿入されたままのサイズである。一方、約４２０ｂｐのバンドは、トランスポゾン遺伝子が欠失したことを示す。約４２０ｂｐのバンドの得られる確率は、６４カルス中、１１カルス（１７．２％）であった。
実施例８
本実施例では、自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を含むゲノム領域を単離し、これを自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を持っていない品種（台中６５号）に導入し、非自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号１）の転移を調べた。
イネ品種、日本晴より自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を含むゲノム領域を単離するため、配列番号２で表される塩基配列をはさむように配列番号２４と配列番号２５のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチド設計し、ＰＣＲのプライマーに用いた。日本晴の葉より、ＣＴＡＢ法によって抽出したＤＮＡを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）、１０μｌ  １０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、６μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８μｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、１００ｐｍｏｌ  ｐｒｉｍｅｒが含まれる。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６８℃で１２分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、０．８％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画した。自立的トランスポゾン遺伝子が挿入されている約６．６ｋｂｐのバンドが得られた。
このＤＮＡ断片（約６．６ｋｂｐ）をゲルから回収し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。次に、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯに存在するマルチクローングサイト（ＡｐａＩとＫｐｎＩ）を利用し、選抜マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子をもつ植物感染用のバイナリーベクターにサブクローニングし、エレクトロポレーション法により、アグロバクテリアＥＨＡ１０１に導入した。感染に用いる３日前にカナマイシン（Ｗａｋｏ）とハイグロマイシン（Ｗａｋｏ）を含むＡＢ培地にストリークし、葯由来カルスへの感染に用いた。
次に、アグロバクテリアを介し、イネ品種、台中６５号の葯由来カルスに、上記で得た自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を含むゲノム領域（約６．６ｋｂｐ）を導入した。
イネ品種、台中６５号の出穂前の穂を採取し、１０℃の温度で、１０日間の低温処理を行った後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、頴花から、葯を摘出し、５０個の葯を３ｍｌ液体培地の入った３５×１０ｍｍのシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）を含む液体培地を使用した。誘導培養３〜４週間目に、誘導された葯由来カルスは、２０−３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ｋｉｎｅｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
増殖培養２週間目の台中６５号の葯由来カルスにアグロバクテリアを感染させた。ＡＢ培地に塗布後３日のアグロバクテリアをさじでかき取り、１０ｍｇ／ｌのアセトシリンゴンを添加したＡＡＭ培地（２５ｍｌ）に入れよく振りまぜ、混ぜた感染用の液をシャーレ（ＩＷＡＫＩ）にいれた。増殖培養２週間目の葯由来カルスを金網に入れ、２分間感染用の液に浸した。金網を滅菌したキムタオルの上に置き、余分な水分を除去後、ピンセットでろ紙を敷いた共存培地にカルスをのせ、サージカルテープでシールして２８℃暗黒下で３日間培養した。共存培地は、１Ｌの培地中に４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇ  Ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、１０ｇ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｕｍａ社）、２ｇ  Ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）、１０ｍｇ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅを含む固体培地を使用した。共存培養３日のカルスを１００ｍｌ滅菌水の入った三角フラスコに入れよく振り混ぜた後、水のみ捨てる。滅菌水での洗浄を数回くり返したのち、５００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを入れた洗浄液で洗った後、選抜培地にカルスを１シャーレに９個置床、サージカルテープでシールし２５℃明所で１ヶ月培養した。選抜培地は、１Ｌの培地に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇ  Ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、０．３ｇ  Ｃａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、２．８７８ｇ  Ｐｒｏｒｉｎ（ＩＣＮ）、０．１ｇ  Ｍｉｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（Ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｕｍａ社）、５００ｍｇ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｗａｋｏ）、５０ｍｇ  Ｃａｒｂｅｎｉｓｉｌｌｉｎ（Ｗａｋｏ）、２ｇ  Ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。
次に、選抜培地置床３−４週間後、増殖してきたハイグロマイシン耐性カルスについて、日本晴の自立的トランスポゾン遺伝子の導入と非自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号１）の転移を調べた。
耐性カルスより、既報（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：４５−４８）に記載の方法に従い、ＤＮＡを抽出した。配列番号２で表される塩基配列をはさむように設計した配列番号２４と配列番号２５のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーに用いてＰＣＲ反応を行った。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）、１０μｌ  １０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、６μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８μｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、１００ｐｍｏｌ  ｐｒｉｍｅｒが含まれる。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６８℃で１２分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、０．８％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画した。結果、耐性カルスにおいて、日本晴の自立的トランスポゾン遺伝子の導入を確認することができた（第１５図）。
次に、非自立的トランスポゾン遺伝子を含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１８と配列番号１９（Ｌ０２）、配列番号２０と配列番号２１（Ｌ０６）、配列番号２２と配列番号２３（Ｌ０７）のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ反応液は、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。ＰＣＲの条件は、９６℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で１分間のアニール、７２℃で２分間の伸長反応を１サイクルとし、４５サイクル反応させた。反応後、２％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ）で分画した。その結果、３８個の自立的トランスポゾン遺伝子が導入されたカルスについて非自立的トランスポゾン遺伝子の欠失を調べたところ、Ｌ０６遺伝子座において欠失したと思われるサイズのバンドが得られた（第１６図）。Ｌ０２、Ｌ０６、Ｌ０７遺伝子座に存在する非自立的トランスポゾン遺伝子の欠失頻度は、０〜５．３％程度であった（表２下）。
Ｌ０２とＬ０６遺伝子座に存在する非自立的トランスポゾン遺伝子が欠失したと思われるサイズのバンドのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。得られたクローンついて、塩基配列を３１０  ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて決定した。非自立的トランスポゾン遺伝子配列は見られなかった（第１７図、第１８図）。
この結果は、日本晴の自立的トランスポゾン遺伝子を導入することで台中６５号の葯由来カルスにおいて非自立的トランスポゾン遺伝子の転移を誘発したことを示している。これにより、配列番号２で表される塩基配列から成るトランスポゾンは、葯由来カルスにおいて自立的に転移するとともに、非自立的トランスポゾン遺伝子の転移を制御すると結論できる。
実施例９
本実施例では、配列番号３で表される塩基配列の転移活性を、葯由来カルスと５−アザシチジン処理した胚盤由来カルスについて調べた。
イネ品種、日本晴の出穂前の穂を採取し、１０℃の温度で、１０日間の低温処理を行った後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、頴花から、葯を摘出し、５０個の葯を３ｍｌ液体培地の入った３５×１０ｍｍのシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ社）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）を含む液体培地を使用した。誘導培養３〜４週間目に、誘導された葯由来カルスは、２０−３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ社）内に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ社）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ａ−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、２ｍｌ  ｋｉｎｅｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ社）、３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。それぞれ増殖培養２週間目の葯由来カルスより、既報（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４５−４８）に記載の方法に従い、ＤＮＡを抽出した。
イネ品種、日本晴の種子を、３％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５〜３０分間の殺菌、滅菌水で洗浄し、９個の種子を２０−３０ｍｌ培地の入った９０×２０ｍｍのシャーレ（ｉｗａｋｉ）内に置床し、３０℃の温度、２４時間明所で誘導培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇ  ｐｒｏｒｉｎｅ（ＷＡＫＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。誘導培養１０日目に、誘導された種子由来カルスは、５−アザシチジン（ｓｉｇｕｍａ）を０ｍＭ、０．１ｍＭ  ０．５ｍＭの濃度で含む増殖培地に移植し、３０℃の温度、２４時間明所で増殖培養した。１Ｌの培地中に、４ｇのＣＨＵ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｓｉｇｕｍａ）、１ｍｌ  ＭＳ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｕｍａ）、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｓｉｇｕｍａ）、０．３ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）、０．１ｇ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ｓｉｇｕｍａ）、２．８７８ｇ  ｐｒｏｒｉｎｅ（ＷＡＫＯ）、３０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）、２ｇ  ｇｅｌｒｉｔｅ（ＷＡＫＯ）を含む固体培地を使用した。増殖培養２週間目の種子由来カルスより、Ｄｎｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを抽出した。
トランスポゾンＤＮＡを含む領域をＰＣＲ法によって増幅するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号２６と配列番号２７のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。反応液１００μｌ中には、２００ｎｇ  ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）、１０μｌ  １０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、６μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８μｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）、１００ｐｍｏｌ  ｐｒｉｍｅｒが含まれる。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６８℃で１２分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、０．８％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ社）で分画した。
その結果、葯由来カルス及び胚盤由来カルスにおいては、配列番号３で表される塩基配列を有するトランスポゾンは転移しないが、５−アザシチジンで処理をした胚盤由来カルスにおいて高頻度に転移が起こった（表３）。
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配列番号３で表される塩基配列を有するトランスポゾンは、構造上、トランスポゼースをコードする自立的トランスポゾン遺伝子であり、５−アザシチジンの処理により活性化し、非自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号１）の転移を制御していると考えられる。
実施例１０
イネ品種、カサラスの成葉から、Ｄｎｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを抽出した。挿入しているトランスポゾンＤＮＡの隣接領域をＰＣＲによって増幅するためｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法を用いた。Ｉｎｖｅｒｓｅ用のＰＣＲプライマーとして配列番号１の５’末端から１５塩基の塩基配列のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＡＴＴＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣ−３’）を用いた。ＰＣＲには、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム（ＡＢＩ社）を使用して行った。ＰＣＲ反応液は，ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した．ＰＣＲの条件は，９６℃で３０秒間のディネーチャー，４４〜５８℃で１分間のアニール，７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし，４５サイクル反応させた．反応後，２％ＬＯ３  ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ）で分画した．増幅されたＤＮＡ断片をＴＡクローニングキット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングした．得られたクローンの塩基配列を３１０  ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて決定した。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、アクセッションナンバーＡＰ００２８４３の遺伝子配列の一部（配列番号６）を示す。トランスポゾンに特徴的な逆向き反復配列がＬＴＲの直後の１４４４５９−１４４４７３及び１４４８７４−１４４８８８の場所に存在している。
第２図は、４種のイネ品種の成葉のトランスポゾンＤＮＡを含む領域（アクセッションナンバーＡＰ００２８４３）のアガロースゲル電気泳動を示す（実施例２）。日本晴において約８５０ｂｐのバンドが得られ、トランスポゾン遺伝子（４３０ｂｐ）が挿入されていることを示す。一方、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヤマホウシでは約４２０ｂｐのバンドが得られ、トランスポゾン遺伝子が挿入されていないことを示す。
第３図は、日本晴の種子由来カルスのトランスポゾンＤＮＡを含む領域（アクセッションナンバーＡＰ００２８４３）のアガロースゲル電気泳動を示す（比較例１）。
第４図は、日本晴の葯由来カルスのトランスポゾンＤＮＡを含む領域（アクセッションナンバーＡＰ００２８４３）のアガロースゲル電気泳動を示す（実施例３）。４２０ｂｐのバンドはトランスポゾン遺伝子が欠失していることを示す。
第５図は、日本晴の葯由来カルスのアガロースゲル電気泳動を示す（実施例４）。Ｎｏ．１は日本晴（コントロール）、Ｎｏ．２〜１０は葯由来カルスからの再分化植物体を示す。トランスポゾンＤＮＡ中の配列から成るプローブを用いた。Ｎｏ．２とＮｏ．６に、コントロールの日本晴品種にはない新たな位置にバンド（矢印）が確認できる。
第６図は、実施例４にて再分化した稲のなかに、形質が変異したものがあることを示す写真である。この稲は葉が縮れて短い。
第７図は、日本晴の種子由来カルスのトランスポゾンＤＮＡを含む領域のアガロースゲル電気泳動を示す（実施例５）。上段の数字は５−アザシチジンの濃度を示す。３００ｂｐのバンドはトランスポゾン遺伝子（４３０ｂｐ）が欠失していることを示す。
第８図は、トランスポゾン遺伝子（４３０ｂｐ）が欠失している４種のクローンの塩基配列を示す。
第９図は、配列番号２及び３で表される塩基配列を有するトランスポゾン遺伝子の構造を示す。
第１０図は、ジャポニカ（ＡＰ００４７５３及びＡＰ００３７１４）とインディカ（Ｓｃａｆｆｏｌｄ６９６２）における配列番号３で表される塩基配列の相同性を示す。
第１１図は、インディカにおけるトランスポゾン（配列番号１、４３０ｂｐ）の変異頻度を示す。
第１２図は、配列番号２のＯＲＦＩＩと配列番号３のＯＲＦＩＩのアミノ酸配列の比較を示す。これらの相同性は７５％以上（７７．８％）であり（図中、相同箇所を＊印で示す。）、共にＤＸＧ／ＡＦ／Ｆ  ｍｏｔｉｆとＹＲＥＫ  ｍｏｔｉｆを有する。上段は配列番号４のアミノ酸配列（配列番号２のＯＲＦＩＩに相当する。）、下段は配列番号５のアミノ酸配列（配列番号３のＯＲＦＩＩに相当する。）を示す。
第１３図左は、日本晴の葯由来カルスのトランスポゾンＤＮＡを含む領域（アクセッションナンバーＡＰ００４２３６）のアガロースゲル電気泳動を示す（実施例６）。１．２Ｋｂのバンドはトランスポゾン遺伝子が欠失していることを示す。第１３図右は、日本晴の種子由来カルスのトランスポゾンＤＮＡを含む領域（アクセッションナンバーＡＰ００４２３６）のアガロースゲル電気泳動を示す（比較例２）。
第１４図は、各品種における自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２、図の上に示す。）の有無を示す電気泳動図である（実施例７）。日本晴（１）とコシヒカリ（２）には自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を示すバンド（矢印）が見られるが、台中６５号（３）とカサラス（４）にはこのバンドが見られない。
第１５図は、日本晴の自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を導入した台中６５号の葯由来カルスの電気泳動図である（実施例８）。台中６５号には見られなかった自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を示すバンド（矢印）が自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を導入した台中６５号の葯由来カルス（Ｎｏ．３−６）に確認される。
第１６図は、日本晴の自立的トランスポゾン遺伝子（配列番号２）を導入した台中６５号の葯由来カルスの非自立的トランスポゾン遺伝子を含む領域の電気泳動図である（実施例８）。Ｌ０６遺伝子座において非自立的トランスポゾン遺伝子が欠失したと思われるサイズのバンドが観察された（矢印）。
第１７図は、Ｌ０２遺伝子座に存在する非自立的トランスポゾン遺伝子が欠失したと思われるサイズのバンドのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。非自立的トランスポゾン遺伝子配列（配列番号１）が欠失している。
第１８図は、Ｌ０６遺伝子座に存在する非自立的トランスポゾン遺伝子が欠失したと思われるサイズのバンドのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。非自立的トランスポゾン遺伝子配列（配列番号１）が欠失している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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