(57)【要約】優れた薬理活性を有し、消化管から吸収され易い新規な組成物または健康食品を提供する。細胞のアポトーシスを誘導する組成物であって、カワリハラタケの抽出液を含む。この組成物は薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含し得る。代表的には上記細胞は癌細胞である。上記組成物は、分化誘導剤をさらに含も得る。好ましくは、この分化誘導剤はビタミンＡ誘導体である。このビタミンＡ誘導体はトレチノインであり得る。上記カワリハラタケの抽出物は、カワリハラタケの子実体を熱水抽出する工程、抽出物を透析処理する工程および透析外液をクロマトグラフィー処理する工程によって得られる分子量１００〜２０００のクロマトグラフィー主溶出画分を有効成分として含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のアポトーシスを誘導する組成物であって、カワリハラタケの抽出物を含む組成物。
【請求項２】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞が癌細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
分化誘導剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記分化誘導剤が、ビタミンＡ誘導体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ビタミンＡ誘導体がトレチノインである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記カワラリハラタケの抽出物が、カワリハラタケの子実体を熱水抽出する工程、得られる抽出物にエタノールを加えて混合し、遠心分離して沈殿物と上澄液に分ける工程、該上澄液にエタノールを加えて混合し、遠心分離して沈殿物と上澄液に分ける工程、該沈殿物を蒸留水に溶解して透析処理する工程を包含する方法によって得られる透析外液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、カワリハラタケの抽出物を含む組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が癌細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が分化誘導剤をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記分化誘導剤が、ビタミンＡ誘導体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミンＡ誘導体がトレチノインである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
癌細胞のアポトーシスを誘導するための組成物の調製のためのカワリハラタケの抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、カワリハラタケを抽出処理して得られる物質を含有するアポトーシスを誘導する方法およびそのための組成物に関する。
背景技術
アポトーシス（プログラム細胞死）は、個体発生における形態形成の過程や成長した個体の組織の恒常性の維持などに重要な役割を果たしている。例えば、消化管上皮細胞の更新、自己抗原を認識するＴ細胞の破壊、いったん過剰に形成されてから特定の部位で細胞死が起ることにより特有な層構造が形成される中枢神経系などがその例である。一般に、細胞のアポトーシスによる死は、細胞内での新たなタンパク質合成を必要とし、細胞死を誘導する遺伝子は自殺遺伝子と呼ばれている。
一般に、癌細胞は何らかの遺伝子変異により自律増殖を獲得し、無制限に増殖し続ける。近年、アポトーシスの研究が進み、アポトーシスの分子機構が明らかになりつつある。前骨髄性白血病細胞株であるＨＬ６０細胞株は、アポトーシス誘導物質のスクリーニングに好適なモデルとしてよく用いられている。またこのＨＬ６０細胞株は、分化誘導物質のスクリーニングにも最適なモデルである。ＨＬ６０細胞株は分化誘導されると、増殖が抑制され、最終分化により造腫瘍作用を失う（脱癌状態）。癌治療において、アポトーシスの誘導ならびに分化誘導が有効な手段として考えられている。ある種の抗癌剤やレチノイン酸誘導体はすでに臨床応用されている。抗腫瘍効果を有する植物由来の物質もまた多く見出されている。近年では、タキサン系抗癌剤、ビンカアルカロイド系抗癌剤、カンプトテンシン（アルカロイド）などが開発され、臨床で成果を上げている。
ハラタケ属担子菌Ａｇａｒｉｃｕｓｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ（カワリハラタケ）は、一般にアガリクス茸と呼ばれ、抗腫瘍活性を有することが知られている。カワリハラタケの粉末または種々の抽出物は、健康食品として経口的に利用されている。カワリハラタケ由来の成分に関し、β−Ｄ−グルカンに代表される多糖類、タンパク質などの高分子物質の作用に関する報告が多数ある。しかし、タンパク質、多糖類などの高分子物質は、一般に、必ずしも消化管からの吸収が良いとは限らない。これまで、一般に、カワリハラタケの菌体成分は消化され難いことが知られており、医薬品および健康食品として、優れた生理活性を有し、かつ経口投与が可能なカワリハラタケ由来の物質が求められている。
発明の開示
カワリハラタケ由来の素材について、細胞増殖抑制作用、分化誘導作用、またはアポトーシス誘導作用を確認し、優れた生理活性を有し、かつ経口投与が可能な医薬品および健康食品の材料となるカワリハラタケ由来の素材を提供する。
本発明は、細胞のアポトーシスを誘導する組成物に関し、この組成物は、カワリハラタケの抽出物を含む。
好ましくは、上記組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する。
好ましくは、上記細胞は癌細胞である。
好ましくは、上記組成物は、分化誘導剤をさらに含む。
好ましくは、上記分化誘導剤はビタミンＡ誘導体である。
好ましくは、上記ビタミンＡ誘導体は、トレチノインである。
上記ビタミンＡ誘導体はまた、カロテノイドであり得る。
本発明はまた、細胞のアポトーシスを誘導する方法に関し、この方法は、カワリハラタケの抽出物を含む組成物を被験体に投与する工程を包含する。
好ましくは、上記組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する。
好ましくは、上記細胞は癌細胞である。
好ましくは、上記組成物は分化誘導剤をさらに含む。
好ましくは、上記分化誘導剤は、ビタミンＡ誘導体である。
好ましくは、上記ビタミンＡ誘導体はトレチノインである。
代表的には、上記カワリハラタケの抽出物は、カワリハラタケの子実体を熱水抽出することにより得られる。
上記カワリハラタケの抽出物は、カワリハラタケの子実体を熱水抽出する工程、抽出物を透析処理する工程および透析外液をクロマトグラフィー処理する工程によって得られる分子量１００〜２０００のクロマトグラフィー主溶出画分を有効成分として含み得る。
あるいは、上記カワリハラタケの抽出物は、カワリハラタケの子実体を熱水抽出する工程、抽出物にエタノールを加えて混合し、混合物を遠心分離して沈殿と上澄液に分ける工程、上澄液にエタノールを加えて混合し、混合物を遠心分離して沈殿と上澄液に分ける工程および沈殿物を蒸留水に溶解して透析処理する工程によって得られる透析外液を有効成分として含み得る。
上記カワリハラタケの抽出物は、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと配合された形態であり得る。このような薬学的に受容可能なキャリアは当業者に公知であり、制限されないで、例えば、以下を包含する：リンゲル溶液、ハンクス溶液、または緩衝化生理食塩水などの緩衝液；ゴマ油などの脂肪酸、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル；ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖類；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモなどの植物由来デンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴム、トラガカントゴムなどのゴム；ゼラチン、コラーゲンなどのタンパク質；架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩など。
本発明はまた、癌細胞のアポトーシスを誘導するための組成物の調製のためのカワリハラタケの抽出物の使用に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の細胞のアポトーシスを誘導するカワリハラタケ由来の素材または組成物の製法について説明する。
本発明で用いられるカワリハラタケは、カワリハラタケの子実体または菌糸体部分であって、天然物であっても人工培養物であってもよい。市販されている乾燥物もまた便利に利用できる。カワリハラタケは、そのまま、または裁断され、または粉砕されて、カワリハラタケの抽出物の調製に供される。
カワリハラタケの抽出物は、溶媒として水、低級アルコールなどを用いて得たカワリハラタケ由来成分を含むカワリハラタケの抽出物であって、代表的には、水、エタノール、含水エタノールなどが用いられるが、細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する画分が抽出される限り任意の溶媒を用い得る。一般に、上記溶媒は、上記乾燥子実体またはその粉末の重量に対して２〜１０倍の重量で添加されて抽出操作が行われる。上記溶媒の例として、水、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、１，３−ブチレングリコール、酢酸エチル、ヘキサン、塩化メチレン、メタノールまたはそれらの混合物が挙げられる。
代表的には、カワリハラタケの抽出物は、上記溶媒として水を用い、カワリハラタケを熱水抽出することによって得られる。
代表的には、カワリハラタケの熱水抽出は、乾燥子実体に５から１０倍の水を加えて１〜３時間加熱還流することによって行われる。カワリハラタケの熱水抽出は、熱水抽出残渣についてもさらに加熱還流を繰り返して行われ得る。このようにして得られる熱水抽出液は、凍結乾燥、スプレードライなど、当業者に公知の方法によって乾燥物（以下乾燥物Ａという）とする。この乾燥物に、５〜２０倍の水を加え、透析チューブに入れ数倍の蒸留水で１０〜１５時間透析し、透析外液を凍結乾燥することによって、細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する乾燥物（以下乾燥物Ｃという）を得ることができる。
次に、透析内液についても、さらに流水中で２０〜４０時間透析し、そして蒸留水で２回各数時間透析した後に得られる透析内液を上記と同様に乾燥物とすることにより、細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する乾燥物（以下乾燥物Ｂという）を得ることができる。
次に、得られた上記乾燥物Ｃを、約１０倍の蒸留水に溶解し、蒸留水を流出溶媒としてクロマトグラフィーを行い、２０ｍＬずつ分取し、多くの画分を得る。得られた画分の中程の主溶出画分で、ゲル濾過法によって分子量１００〜２０００の画分が、本発明の細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する画分である。
これらの画分は、さらにＯＤＳ（オクタデシルシラン化シリカゲル）を用いる逆相クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０を用いるイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて分析すると、アルギニン、リジン、マンニトールの他、数種の成分を含んでいることが確認されている。
また、上記の方法で得られる熱水抽出液に等量のエタノールを加えて混合し、遠心分離処理して沈殿と上澄液に分ける。得られる上澄液にさらにその１から３倍量のエタノールを加えて混合し、遠心分離処理して得られる沈殿を蒸留水に溶解し、この溶液を透析処理して得られる透析外液もまた低分子画分であって、本発明の細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する画分である。
このようにして得られた細胞のアポトーシスを誘導する活性を示すカワリハラタケの抽出物またはその画分は、そのまま、あるいは経口医薬製剤の製造に用いられる種々の賦形剤と共に医薬製剤の製造に用いることができる。また、この細胞のアポトーシスを誘導する活性を示すカワリハラタケの熱水抽出物またはその画分は、そのまま、または他の食品と共に健康飲食品として利用することができる。
本発明の組成物は、代表的には、生体適合性の薬学的キャリア（例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水など）とともに経口的に摂取され得る。本発明の組成物は、単独または他の薬剤もしくは食品素材と組み合わせて摂取され得る。
本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与は、局所、皮膚塗布、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内投与を含む。好ましくは、本発明の組成物は、静脈注射および動脈注射により投与される。本発明の薬学的組成物の処方および投与の詳細は、例えば、当該分野における教科書「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載に従って行なわれ得る。
経口投与のための組成物は、投与に適した投与形態で当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、得られる組成物が、患者による摂取に適した、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
本発明の組成物は、カワリハラタケ抽出物を、アポトーシスを誘導するに有効な量で含む。「薬理学的に有効な量」は、当業者に十分に認識される用語であり、意図される癌症状を軽減するために有効なカワリハラタケ抽出物の量をいう。従って、薬学的に有効な量は、アポトーシスを誘導するのに十分な量である。
「薬理学的に有効な量」を確認する有用なアッセイの例は、被験体における癌症状の軽減の程度を測定することである。実際に投与されるカワリハラタケ抽出物の量は、処置が適用される個体の健康状態などに依存し、所望の効果が達成されるように最適化された量である。薬学的に有効な量を決定することは、当業者にとって慣用的な手順である。
薬学的に有効な量は、まず、細胞培養によるインビトロアッセイまたは適切な動物モデルによって評価され得る。次に、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な量および投与の経路を決定し得る。
アポトーシスを誘導するのに十分な量の目安は、制限されないで、本発明のアポトーシスを誘導する画分の乾燥固形分として、成人に対し、０．１〜３０ｇ／人／日、好ましくは３〜１５ｇ／人／日となる量である。
また、上記のアポトーシスを誘導する活性を有するカワリハラタケの抽出物またはその画分は、その機能を発揮するに十分な量で、選択された１種またはそれ以上の食品素材と混合される。選択された１種またはそれ以上の食品素材は、当業者に公知の形態、通常粉末形態で、この免疫賦活活性を有する画分と混合される。そしてこれらは、用途または好みに応じて、液状の食品として供することができる。あるいはハードカプセル、ソフトカプセルなどのカプセル剤、錠剤もしくは丸剤としてか、または粉末状、顆粒状、茶状、ティーバック状もしくは、飴状などの形状に成形され得る。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限するものではない。
実施例
（実施例１）
Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ  ３００ｇ（協和アガリクス茸）に蒸留水２Ｌを加え、２時間加熱還流を行った。得られた液を濾過して濾液（熱水抽出液）と残査とに分けた。残査には再び蒸留水２Ｌを加え、さらに２時間加熱還流して熱水抽出を行い濾液を得た。さらに残った残査についてもう一度同様の熱水抽出を行った。得られた濾液を合わせて凍結乾燥し、乾燥物Ａ（１５３ｇ：抽出率５１％）を得た。
５０ｇの乾燥物Ａに５００ｍＬの蒸留水を加え、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ５０×３１、８ｍｍ  ｉｄ  ×３０ｍ、ＦＥ−０５２６−６５）に入れた。これを３Ｌの蒸留水に対して１２時間透析した。得られた透析外液を凍結乾燥して乾燥物Ｃ（２７ｇ：抽出率５３％）を得た。透析内液についてはさらに流水中で３０時間透析し、その後蒸留水で２回（各４時間、合計８時間）透析した後、透析内液を凍結乾燥し、乾燥物Ｂ（１１ｇ：抽出率２２％）を得た。続いて、３ｇの乾燥物Ｃを３０ｍＬの蒸留水に溶かし、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ４０Ｃ（４０ｍｍ  ｉｄ  ×  ４２０ｍｍ）を用いるクロマトグラフィーを行った。流出溶媒はすべて蒸留水を用いた。各フラクションについてそれぞれ２０ｍＬずつ分取し、画分１〜３０を得た。それらのフラクションは薄層クロマトグラフィーを参考にして以下の５群に分けた。重量は次の通りであった。画分１〜１１（７５ｍｇ、２．５％）、画分１２〜１５（９２０ｍｇ、３０．７％）、画分１６〜１７（１５７０ｍｇ、５２．３％）、画分１８〜１９（２７０ｍｇ、９％）、画分２０〜２８（９７ｍｇ、３．２％）。
画分１６（以下１ＳＹ−１６という）の赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）データは以下の通りであった。
画分１６：ＩＲ（ＫＢｒ）３３９０、３３２５、３２８５、２９４０、２９２０、１６４１、１６３４、１６２２、１６１５、１６００、１５９５、１４０５、１３９４、１０８４、１０２０：分子量（ゲル濾過法）１００〜２０００。
（実施例２）
実施例１と同様の熱水抽出を実施して、合わせた濾液（熱水抽出液）６Ｌを得た。この濾液を減圧濃縮して１Ｌとし、これに多糖を分離する目的でエタノール１Ｌを加えて混合し、遠心分離して沈殿と上澄液を得た。この上澄液にさらにエタノール３Ｌを加えて混合し、遠心分離して得られる沈殿を蒸留水に溶解し、透析処理した。得られた透析外液を凍結乾燥し、得られた粉末をＡＢＭＫ−２２とした。
（実施例３）
アガリクス熱水抽出物の透析外液の凍結乾燥粉末（ＡＢＭＫ−２２）の細胞増殖抑制作用（試験１）、細胞分化誘導作用（試験２）、およびアポトーシス誘導作用（試験３）を調べた。
各々の生理活性試験は以下の方法により実施した。
１．細胞増殖抑制作用（試験１）：ＣＤ−ＤＳＴ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｒｕｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔ）法および血球計数計算板を用いて調べた。
ＣＤ−ＤＳＴ法は、Ｈ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの方法（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ  １１：４４９−４５５、１９９７）に従って実施した。
要約すれば、まず、被験細胞（ＨＬ６０細胞株）の懸濁液を、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  ＣＤ、Ｎｉｔｔａ  Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｉｎｃ．））、再構築緩衝液および培養培地（例えば、濃縮Ｆ−１２培地）と氷冷下で混合し、被験細胞をコラーゲンゲルに包埋する。得られた混合液を、多ウェルプレートのウェル中に、ウェルあたり１０３〜１０４細胞（コラーゲンゲルドロップとして約３滴）となるように入れ、ＣＯ２インキュベータ中３７℃で一晩培養する。次いで、被験薬剤を所定の濃度で添加し、２４時間培養する。その後、薬剤を除去し、ウェル中の細胞を緩衝液ですすいで培地を添加しさらに７日間インキュベートする。培養終了後、コララーゲンゲル中に生育したコロニーをニュートラルレッドで染色する。さらに、各コラーゲンゲルドロップを１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、水で洗浄した後、風乾して画像解析する。細胞増殖抑制効果は癌細胞の増殖形態とニュートラルレッド染色度の差異を利用して癌細胞コロニーのみの補完体積値を算出し、ＡＢＭＫ−２２非処理群と処理群との相対増殖率の比を求めた。ＣＤ−ＤＳＴ法は、主に固形癌のｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔ法として開発されたが、ｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓａｙ法であるため、細胞の増殖状態の測定に応用可能である。
血球計数計算板を用いる方法は、臨床検査法提要第３０版（平成５年８月２０日発行、金原出版株式会社、東京）に記載の方法に従って行った。
２．細胞分化誘導作用（試験２）：ＮＢＴ（ニトロブルー・テトラゾリウム）還元能で判定した。
ＮＢＴ還元能は、Ｓ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓらの方法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：２５、２１３−２１８頁（１９８０））に準じて行った。要約すれば、ＨＬ６０細胞の約２×１０５細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した後、０．１％ＮＢＴおよび１００ｎｇ／ｍｌのｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ（ＴＰＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、３７℃で４０分間培養する。これを顕微鏡下に観察し、青黒色の沈着物を有する細胞を、分化した細胞として評価した。
３．アポトーシス誘導作用（試験３）：ＴＵＮＥＬ法（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄＵＴＰ）−ｂｉｏｔｉｎ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定した。ＴＵＮＥＬ法は、１９９２年、Ｇａｖｒｉｅｌｉら（Ｙａｅｌ  Ｇａｖｒｉｅｌｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１９巻、Ｎｏ．３、１９９２年１１月、４９３−５０１頁）によって報告された、組織切片上アポトーシスを指摘する方法である。種々の病態における個々の細胞レベルでのアポトーシスの観察、形態変化との対比を可能にする方法として知られている。ＴＵＮＥＬ法は、Ｇａｖｒｉｅｌｉら（前述）の方法に準じ、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗａｋｏ（和光純薬工業株式会社）を用い、ＨＬ−６０細胞株に対して行った。
４．細胞増殖抑制作用（試験１）の測定結果
ＨＬ６０細胞株を用いた測定の結果、ＣＤ−ＤＳＴ法は、浮遊系細胞の増殖状態を測定するには適当でないことが明らかとなった。従って、細胞増殖抑制作用は、血球計数計算板を用いて測定した。
まず、ＨＬ６０細胞株の増殖を、種々の濃度のＡＢＭＫ−２２の存在下で調べ、ＨＬ６０株の増殖曲線を得た。すなわち、ＨＬ６０細胞株の初期細胞数を２０万／ｍＬとし、ＡＢＭＫ−２２を、それぞれ、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、２、２．５、３、４、および５ｍｇ／１ｍＬの濃度となるように添加して培養し、４日間経時的に細胞数を測定した。
図１に、各濃度のＡＢＭＫ−２２存在下における、ＨＬ６０細胞の増殖曲線を示す。図１中の各シンボルは、図１の下に示した各シンボルに対応して記載された数字のＡＢＭＫ−２２濃度（ｍｇ／ｍｌ）存在下での細胞数測定結果を示す（個／ｍｌ）。図２〜図５は、それぞれ培養１日目、２日目、３日目および４日目の細胞数測定結果を、培養日数毎にＡＭＢＫ−２２の濃度に対してプロットしたものである。
図２に示すように、培養１日目では、１ｍｇ／ｍＬまでの濃度のＡＢＭＫ−２２は、ＨＬ６０細胞の増殖には影響を示さず、２ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で、ＡＢＭＫ−２２は、濃度依存的にＨＬ６０細胞の増殖を抑制した。
図３に示すように、培養２日目では、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度のＡＢＭＫ−２２は、コントロールに比べ、濃度依存的にＨＬ６０細胞の増殖を抑制した。
図４に示すように、培養３日目では、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＡＢＭＫ−２２は、コントロールに比べ、ＨＬ６０細胞の増殖を約５０％抑制した。また、増殖が抑制された細胞は、形態学的にも細胞死を引き起こしていた。そして０．２５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度のＡＢＭＫ−２２存在下では、コントロールに比べ、生細胞が著しく低減し、優れた殺細胞効果を示した。
図５に示すように、培養４日目では、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＡＢＭＫ−２は、コントロールに比べ、ＨＬ６０細胞の増殖を約８４％抑制した。また増殖が抑制された細胞は、形態学的にも細胞死を引き起こしてした。そして０．２５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度のＡＢＭＫ−２２は、培養３日目と同様、ＨＬ６０細胞に対し優れた殺細胞効果を示した。
図６は、上記の結果を、コントロールに対する増殖抑制効果（Ｔ／Ｃ％）として経時的に示した結果である。縦軸は、コントロールに対する増殖抑制効果（Ｔ／Ｃ％）を、横軸は、培養に添加したＡＢＭＫ−２２の濃度を表す。図６に示されるように、ＡＢＭＫ−２２は、ＨＬ６０細胞に対して時間依存的な増殖抑制効果を示した。すなわち、培養１日目（黒丸）では２ｍｇ／ｍＬ以上、そして培養２日目（白四角）では１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で濃度依存的なＨＬ６０細胞の抑制効果が観察された。培養３日目（白三角）および４日目（白丸）では、いずれも、低濃度のＡＢＭＫ−２２でＨＬ６０細胞の優れた増殖抑制効果が観察され、この抑制効果は、細胞死によるものであることが確認された。
５．細胞分化誘導作用（試験２）の測定結果
種々の濃度のＡＢＭＫ−２２の存在下で、４日間、ＨＬ６０細胞を培養し、ＡＢＭＫ−２２の分化誘導能を測定した。各濃度のＨＬ６０細胞株の分化の指標であるＮＢＴ還元能の測定結果を図７に示した。図７に示されるように、ＡＢＭＫ−２２は、濃度依存的にＮＢＴ陽性細胞を増加させ、４ｍｇ／ｍＬ濃度では生細胞の約３３％が分化していた。この値は、ＨＬ６０細胞株の分化のコントロールとして用いられているオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の１０−８〜１０−７Ｍに相当する優れた分化誘導作用である（図８を参照のこと）。図８は、ＡＴＲＡの細胞分化誘導作用を同じアッセイ系で測定した結果である。
６．アポトーシス誘導作用（試験３）の測定結果
上記の結果から、ＡＢＭＫ−２２は、時間依存的に殺細胞効果を示し、かつ、低濃度でも殺細胞効果を示したことから、ＡＢＭＫ−２２がアポトーシスを誘導したと考えられた。そこで、ＡＢＭＫ−２２のアポトーシス誘導作用をＴＵＮＥＬ法で確認した。
ＡＢＭＫ−２２を１日間添加した上記の結果（図２）より、細胞増殖がコントロールと変わりなかった１ｍｇ／ｍＬと、増殖が著しく抑制されていた５ｍｇ／ｍＬを選び、ＡＢＭＫ−２２を１日間添加し、アポトーシスの誘導作用を測定した。結果を図９に示す。図９に示す結果は、各試験群について測定した結果を示す。図９に示されるように、ＡＢＭＫ−２２を１ｍｇ／ｍＬ添加したところ、コントロールに比べアポトーシスが誘導される傾向（ｐ＜０．０５３）を示し、５ｍｇ／ｍＬでは有意に（ｐ＜０．００１）アポトーシスが誘導されていた。１ｍｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬの比較でも、５ｍｇ／ｍＬが有意に（ｐ＜０．００１）アポトーシスを誘導していた（Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−検定）。以上の結果から、ＡＢＭＫ−２２によるＨＬ６０細胞株の細胞死は、アポトーシスが誘導された結果生じた死であることが確認された。
（実施例４）ＡＢＭＫ−２２の分化誘導剤との併用効果
ＨＬ６０細胞株に対して分化誘導作用を有する物質は、前述の活性型ビタミンＤ３製剤（ＶＤ３）とａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ；トレチノイン））がよく知られている。
ＨＬ６０細胞株は、ＶＤ３で単球・マクロファージ系に分化誘導され、そしてＡＴＲＡで顆粒球系に分化誘導される。図１０に、各種濃度のＡＢＭＫ−２２と、１０−９〜１０−１１Ｍ濃度のＡＴＲＡとの組み合わせによる、ＨＬ６０細胞株の細胞分化誘導作用をＮＢＴ還元能により評価した結果を示す。図１０に示されるように、ＡＢＭＫ−２２と低濃度（１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍ）ＡＴＲＡとの併用により、濃度依存的に分化が誘導され１０−９ＭのＡＴＲＡとの併用では、分化の著しい亢進がみられ、併用効果が認められた。
図１１は、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ濃度の１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３（活性型ビタミンＤ３、以下ＶＤ３）単独のＨＬ６０細胞株の細胞分化誘導作用をＮＢＴ還元能により評価した結果を示す。図示されるように、ＶＤ３濃度が１０−１０Ｍ以下であると、ＶＤ３単独は細胞分化誘導作用を示さない。また図８に示したように、ＡＴＲＡ濃度が１０−９Ｍ以下であるとＡＴＲＡは分化誘導能を示さない。
癌細胞の増殖、分化およびアポトーシスは互いに関連していると考えられる。ある物質による増殖抑制は、細胞周期を止める。分化は増殖抑制の後誘導される。アポトーシスは直接的に死のシグナルを押す。細胞の増殖、分化およびアポトーシスは、方向性を決定するスイッチが異なるだけではないかと考えられる。従って、ある物質の質的および量的な違いは、同時に細胞に増殖抑制、分化、アポトーシスを誘導し得る可能性がある。
癌細胞の分化誘導に対してはＶＤ３やＡＴＲＡがすでに臨床使用されているが、副作用（ＶＤ３では高カルシウム血症、ＡＴＲＡではレチノイン酸症候群）のため、ＶＤ３は主に外用薬、ＡＴＲＡはＡＰＬ（前骨髄性白血病：遺伝子変異が明らかな癌）のみに使用されている。
本明細書で示される結果、特に図８および図１０に示される結果は、これら分化誘導物質の分化誘導が発現されない低濃度条件下で、他の物質（特にカワリハラタケ）と併用することによって、分化を有意に誘導し得ることを示す。また、これらの結果は、ＡＢＭＫ−２２とビタミンＡ様物質（カロテノイド）との組み合わせによっとも併用効果によって分化を有意に誘導し得ることを示唆している。実際、本発明者らは、このことを証明している結果を得ている。
（実施例５）ＡＢＭＫ−２２に含まれる成分のアポトーシス誘導作用
実施例２で得られたＡＢＭＫ−２２中のアポトーシス誘導作用をもつ成分を同定するために、ＡＢＭＫ−２２をさらに精製および分画し、得られた成分について、上記実施例３の３．アポトーシス誘導作用（試験３）に記載の方法に従って、得られた成分のアポトーシス誘導作用を調べた。
１．ＡＢＭＫ−２２に含まれる成分の精製および分画と構造解析
実施例２に記載の方法で得られたＡＢＭＫ−２２（約１３．５ｍｇ）を３０ｍＬの蒸留水に溶かし、担体としてＯＤＳ（５０ｍｍ  ｉｄ×３００ｍｍ）を用いる逆相クロマトグラフィーを行った。溶出溶媒は、蒸留水、５％メタノール／水、７０％メタノール／水、および１００％メタノールを用い、順次成分を溶出した。各フラクションについてそれぞれ２００ｍＬずつ分取し、各フラクションは、それらの薄層クロマトグラフィーによる分析結果を参考にして、以下の５群に分けた。ＡＢＭＫ２２０１（１８．７ｇ、９３．５％）、ＡＢＭＫ２２０２（４４５ｍｇ、２．２％）、ＡＢＭＫ２２０３（３６．９ｍｇ、０．１８％）、ＡＢＭＫ２２０４（３．５％）、ＡＢＭＫ２２０５（９１．３ｍｇ、０．４６％）。続いて、ＡＢＭＫ２２０２を５０ｍｇづつ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＯＤＳカラム２０ｍｍ  ｉｄ×２５０ｍｍ）に付し、５％メタノール／水で溶出させることによりＡＢＭＫ６８７３（３４．７ｍｇ、０．１７％）およびＡＢＭＫ０４１５（２．２ｍｇ、０．０１１％）をそれぞれ単離した。
ＡＢＭＫ６８７３およびＡＢＭＫ０４１５について、以下の条件の質量分析およびＮＭＲ分析に供し、その構造を解析した結果、これら２つの成分は、それぞれ、以下の構造をもつβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−ホルミルフェニルヒドラジン（以下の式Ｉで表される構造をもつ）およびＮ−（３−カルボキシプロピル）−２−ホルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（以下の式ＩＩで表される構造をもつ）、であることが確認された。
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［質量分析］
得られたピーク成分の凍結乾燥粉末を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、ｍｉｌｉ−Ｑ水を加えて水溶液とした後に測定に供した。測定装置として、ＪＥＯＬ  ＨＸ１１０／１１０Ａタンデム型質量分析計を用い、以下のＦＡＢ、ＥＩ、ＣＩおよびＨＲＦＡＢの質量分析において、それぞれ、ポジティブ（ＦＡＢ、ＥＩ、ＣＩ）、ネガティブ（ＦＡＢ、ＣＩ）およびネガティブ（ＨＲＦＡＢ）の測定モードで測定した。なお、各質量分析における分解能は、ＦＡＢ、ＥＩおよびＣＩについて１０００、そしてＨＲＦＡＢについて５０００で行った。
（１）ＦＡＢ−ＭＳ
マトリックスとしてグリセロールを用いた。試料搭載台でグリセロールと試料とを１：１（ｖ／ｖ）で混合した直後に測定を行った。質量較正には、ポジティブモードではアルカリイオンの混合物を、ネガティブモードではヨウ化セシウム（ＣｓＩ）のグリセロール溶液を使用した。
（２）ＥＩ−ＭＳおよびＣＩ−ＭＳ
試料そのものをイオン源に導入した。ＣＩではイオンガスとしてイソブタンを使用した。
（３）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ
質量較正試料としてＰＥＧ−５００を使用した。試料搭載台でグリセロールと試料とを１：１（ｖ／ｖ）で混合した後に適量のＰＥＧ−５００を添加し、直後にネガティブモードで測定を行った。質量較正は、目的ピーク（［Ｍ−Ｈ］−＝２１０）を挟む２本のＰＥＧ−５００のピークを選択して行った。
［ＮＭＲ分析］
Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ５００核磁気共鳴装置（１Ｈ５００ＭＨｚ）およびＪＥＯＬ  ＪＮＭ−Ａ４００核磁気共鳴装置（１Ｈ４００ＭＨｚ）を用いて行った。
質量分析後の試料を凍結乾燥後、重水（０．３ｍｌ）に溶解して測定に供した。また、溶媒を重クロロホルムに再置換した試料を用いた測定も行った。
［結果の解析］
ＡＢＭＫ０４１５：
上記各種質量分析モードにおけるいずれのスペクトルにおいても分子量２１１に相当するピークが観測され、この化合物の分子量は２１１と決定された。次いで、ピーク感度がより良好なネガティブモードでＨＲＦＡＢ−ＭＳ測定を行ったところ、観測された精密質量（ｍ／ｚ＝２１０．０７５７）がＣ１０Ｈ１２Ｏ４Ｎ（−１．０ｍｍｕ）とよい一致を示したことから、ピークＩ成分の分子式は、Ｃ１０Ｈ１８Ｏ４Ｎと決定された。
次に、構造情報を得る目的で各種ＮＭＲ測定を行い、ＨＭＢＣスペクトルのクロスピーク情報を基に解析した結果、上記式ＩＩで示される構造をもつと推定された。
ＡＢＭＫ６８７３：
ＦＡＢ−ＭＳにおいて、ｍ／ｚ  ２６６で偽分子イオンＭＨ＋を観察し、ＥＩ−ＭＳにおいて、トリフロオロ酢酸および酢酸誘導体については、それぞれ、ｍ／ｚ  ６４９（Ｃ２０Ｈ１１Ｆ１２Ｎ３Ｏ３）でＭ＋イオンを、ｍ／ｚ  ３３１で［Ｍ−Ｈ２Ｏ］＋イオンを観察した。Ｈ１ＮＭＲにより、アルデヒドプロトン、ｐ−置換芳香環およびグルタミン酸残基−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨが特徴付けられた。２個の芳香族プロトン（ｄ７．９１ｐｐｍ）の脱シールド、中性溶液（３１３ｎｍ）およびアルカリ性溶液（３８５ｎｍ）でのＵＶ吸収、ｍ／ｚ  １３６（Ｃ７Ｈ８Ｎ２Ｏ）における重要なイオンの発生は、ｐ−ホルミルフェニルヒドラジンユニットと一致した。
ＵＶλ１２０ｍａｘｎｍ（ｌｏｇε）；２３１（３．７９）、３１３（４．１９）；＋ＮａＯＨ  ２４８（３．７６）、３８５（４．３０）；＋ＨＣｌ  ２３１（３．７９）、３１３（４．１９）：ＦＡＢ＋ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：２６６（ＭＨ＋、１００）、２０１（６２）、１６６（１６）、１３７（２０）、１３６（１５）、１３２（３９）、１２１（１６）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００、ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）９．７３（１Ｈ、ｓ、−ＣＨＯ）、７．９１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．０３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、３．９１（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、Ｈα）、２．６７（２Ｈ、ｍ、Ｈγ）、２３１（２Ｈ、ｍ、Ｈβ）。
２．ＡＢＭＫ−２２に含まれる成分のアポトーシス誘導作用
次いで、ＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３の凍結乾燥粉末について、上記実施例３の３．アポトーシス誘導作用（試験３）に記載のようにアポトーシス誘導作用を測定した。ＡＢＭＫ０４１５は、２．０７×１０−６Ｍ〜２．０７×１０−４Ｍ濃度範囲で、そしてＡＢＭＫ６８７３は、２．７×１０−６Ｍ〜２．７×１０−４Ｍ濃度範囲で試験した。結果を、図１２および図１３に示す。
図１２は、種々の濃度のＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３存在下におけるＨＬ−６０細胞株の増殖曲線である。図１２中の各シンボルは、図１２の左上に示した各シンボルに対応して記載された濃度の成分の存在下における細胞数測定結果を示す（個／ｍｌ）。白丸は、アポトーシス誘導能についてポジティブコントロールのアクチノマイシンＤ（ＡＣＤ）、そして黒丸は、薬剤なしの対照試験区の測定結果である。
図１２に示されるように、ＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３のいずれもが、ほぼ濃度依存的にＨＬ−６０細胞の増殖を抑制し、特に、ＡＢＭＫ０４１５の２．０７×１０−４Ｍ存在下、およびＡＢＭＫ６８７３の２．７×１０−４Ｍ存在下では、ＨＬ−６０細胞の増殖が著しく抑制されることが示された。
図１３は、培養２日後の、ＡＢＭＫ０４１５の２．０７×１０−４Ｍ存在下およびＡＢＭＫ６８７３の２．７×１０−４Ｍ存在下における、アポトーシス陽性細胞の比率を示した図である。図１３の横軸は各試験区を、そして縦軸はアポトーシスを起こした細胞の割合を示す。図１３に示されるように、ＡＢＭＫ０４１５の２．０７×１０−４Ｍ存在下では、約３５％の細胞において、そしてＡＢＭＫ６８７３の２．７×１０−４Ｍ存在下では、約７０％の細胞においてそれぞれアポトーシスが誘導され、ＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３がアポトーシス誘導能を有していることが確認された。
（実施例６）ＡＢＭＫ−２２に含まれる成分の免疫賦活活性の測定
上記のＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３について、免疫賦活活性を測定した。
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）は、免疫の成立に関与する細胞である。樹枝状細胞、樹状白血球、Ｄ細胞とも呼ばれる。脳を除く生体内各種組織器官に分布する骨髄細胞由来の樹枝状形態をとる細胞群の総称である。この細胞群には、リンパ系樹状細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、ランゲルハンス細胞、ベール細胞、相互連結細胞、間質細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）などが含まれる。生体内で異物の侵入により開始される炎症応答に伴い、異物を取り込んで（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）局所から輸入リンパ管を経て所属リンパ節または血流に乗って脾臓へと移動する。Ｔ細胞依存性領域に達した後、抗原をクラスＩＩ抗原と結合した形で提示し特異的Ｔ細胞を活性化することにより免疫応答を開始させることが知られている。いわば免疫の根幹をつかさどる細胞である。本実施例では、ＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３の免疫賦活活性を、単球の樹状細胞への誘導能をアッセイすることにより確認した。
１．材料および方法
１．１．材料
同意を得ることのできた２人の健常人の末梢血を材料として用いた。
１．２．末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）の分離
ヘパリン加採血された全血検体からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ比重遠心法によりＰＢＭＣを分離した。
１．３．被験試料
上記ＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３を被験試料とした。各実験に使用する細胞の培養液（１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０、５％ヒトＡＢ血清加ＲＰＭＩ−１６４０）に、ＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３それぞれ２００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、孔径０．２２μｍのフィルターを通して濾過滅菌したものを被験試料とした。
１．４．免疫賦活活性の測定
新規化合物の免疫賦活活性効果を、インビトロにおけるヒト末梢血単球由来樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）誘導能から検討した。
ＰＢＭＣを炭酸ガスインキュベーターで１時間ディシュ処理し、単球に富む付着細胞分画を得た。得られた細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（ＤＩＡＣＬＯＮＥ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）およびＩＬ−４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）の各々５００Ｕ／ｍｌ存在下で、５％ヒトＡＢ血清加ＲＰＭＩ−１６４０（日研生物医学研究所製）中で培養した。
培養には、径３．５ｃｍのディッシュ（ＮＵＮＣ社製）を用いた。培養６日目にピシバニールおよび新規化合物を、それぞれ最終濃度がピシバニールについては０．１ＫＥ／ｍｌ、そしてＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３については２００μｇ／ｍｌとなるように加えた。なお、ピシバニール（中外製薬製）は、ＤＣ誘導能をもつポジティブコントロールとして用いた。ネガティブコントロールは、５％ヒトＡＢ血清加ＲＰＭＩ−１６４０を用いて同様に培養した細胞である。
ディシュ内のすべてのＤＣを培養開始７日目に回収し、その表面抗原をモノクローナル抗体（抗−ＣＤ８０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いたフローサイトメトリーで解析した。なお、有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
２．結果
検討を行った被験体で、ＤＣ培養開始６日目にＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３を添加することによって、ＣＤ８０分子の著しく強い発現誘導が認められた。その代表的パターンを示した一例を図１４および図１５に示す。
図１４はＡＢＭＫ６８７３についての試験結果を示す。図１４の上に示すチャートは、被験試料非添加の細胞のフローサイトメトリー解析結果を、図１４の下に示すチャートは、ＡＢＭＫ６８７３を添加した後の培養細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。図においてチャートの横軸は、蛍光強度（１０ｇ）を、縦軸は、細胞数を、そしてＭ１はコントロール抗体（ＩｇＧ１ＦＩＴＣ）測定値より設定した領域をそれぞれ示す。
図１４に示されるように、ＡＢＭＫ６８７３の添加により、約９２％（測定数値は示さず）のＤＣ上にＣＤ８０の発現の増加が認められ、ＡＢＭＫ６８７３の添加によって樹状細胞の活性化が誘導されることが示された。なお、ＣＤ８０の発現は、ＤＣがＭ１領域に存在することによって示される。
同様に、図１５はＡＢＭＫ０４１５についての試験結果を示す。図１５の上に示すチャートは、被験試料非添加の細胞のフローサイトメトリー解析結果を、図１５の下に示すチャートは、ＡＢＭＫ０４１５を添加した後の培養細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。示されるチャートの横軸および縦軸は図１４と同じである。
図１５に示されるように、ＡＢＭＫ０４１５の添加後により、約２０％（測定数値は示さず）のＤＣ上にＣＤ８０の発現の増加が認められ、ＡＢＭＫ０４１５の添加によって樹状細胞の活性化が誘導されることが示された。
その一方、図１６は、同じＰＢＭＣについて、ＤＣ培養開始６日目にピシバニールを添加することによって得られた結果を示す。ピシバニールはＤＣ誘導能をもつことが知られる物質である。図１６の上はピシバニール非添加、そして図１６の下はピシバニール添加により、約２６％（測定数値は示さず）のＤＣ上にＣＤ８０の発現増加が認められ、ピシバニールの添加によって樹状細胞の活性化が誘導されたことを示す。
図１４、図１５および図１６の結果により、ＡＢＭＫ０４１５およびＡＢＭＫ６８７３はともに、ＤＣ誘導能を有し、特にＡＢＭＫ６８７３は、ピシバニールよりも強いＤＣ誘導能を有することが示された。
産業上の利用可能性
癌細胞のアポトーシスを誘導する組成物およびそれを含む健康食品が提供される。カワリハラタケ抽象物は、白血病細胞株の増殖を抑制し、そしてアポトーシスを誘導する成分を含んおり、アポトーシスの誘導ならびに分化誘導は、癌治療において有効な手段であるので、癌患者に有用な医薬品および健康食品が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の効果を示す図であって、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）存在下の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）の増殖抑制効果を示す。
図２は、本発明の効果を示す図であって、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）存在下の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）の増殖抑制効果を示す。
図３は、本発明の効果を示す図であって。カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）存在下の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）の増殖抑制効果を示す。
図４は、本発明の効果を示す図であって、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）存在下の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）の増殖抑制効果を示す。
図５は、本発明の効果を示す図であって、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）存在下の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）の増殖抑制効果を示す。
図６は、本発明の効果を示す図であって、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）存在下の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）の増殖抑制効果を示す。
図７は、本発明の効果を示す図であって、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）に対する分化誘導効果を示す。
図８は、分化誘導剤（ＡＴＲＡ）の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）に対する分化誘導効果を示す図である。
図９は、本発明の効果を示す図であって、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）に対するアポトーシス誘導効果を示す。
図１０は、本発明の効果を示す図であって。カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）および分化誘導剤（トレチノイン）併用による白血病細胞株（ＨＬ−６０株）に対するアポトーシス誘導効果を示す。
図１１は、分化誘導剤（ＶＤ３）の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）に対する分化誘導効果を示す図である。
図１２は、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）に含まれる成分の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）に対する増殖抑制効果を示す図である。
図１３は、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）に含まれる成分の白血病細胞株（ＨＬ−６０株）に対するアポトーシス誘導効果を示す図である。
図１４は、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）に含まれる成分の免疫賦活活性を示す図である。
図１５は、カワリハラタケの抽出物（ＡＢＭＫ−２２）に含まれる成分の免疫賦活活性を示す図である。
図１６は、ピシバニールの免疫賦活活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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