(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ複製調節タンパク質であるＳｅｑＡタンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶、その製造方法、Ｘ線結晶構造解析による前記複合体の三次元立体構造、及びそのようにして得られた三次元立体構造情報を用いて前記複合体の形成を阻害する化合物のスクリーニング方法等を提供する。本発明の方法を用いることにより、ヘミメチル化による複製調節機構を有する細菌の増殖を阻害するような薬剤を開発することができる。
2003048203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、７１位から１８１位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまで、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでのアミノ酸残基がＤＮＡ結合部位を形成することを特徴とするポリペプチド断片。
【請求項２】
配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、７１位から１８１位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまで、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでのアミノ酸残基がヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位を形成することを特徴とするポリペプチド断片。
【請求項３】
配列番号２に示すアミノ酸配列の７１位から１８１位までからなるポリペプチド断片と、ヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶であって、六方晶系の空間群Ｐ６２２、格子定数ａ＝ｂ＝１５２．２±０．２Å、ｃ＝１１９．３±０．２Åを有する該複合体の結晶。
【請求項４】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶の製造方法であって、
４〜６ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ複製調節タンパク質と、ヘミメチル化ＤＮＡとを１：１〜２：１のモル比で混合した溶液を、１〜２Ｍのクエン酸３ナトリウム水和物を含有し、ｐＨ７．０〜８．０の緩衝液を用いて蒸気拡散法により結晶化する方法。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチド断片を用いて、これに結合する化合物を設計又は選択し、ＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物及び／又はヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項６】
ＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶を生成する工程、
（ｂ）該結晶を用いて重原子同型置換法又は多波長異常散乱法によりＸ線回折データを取得する工程、及び
（ｃ）該Ｘ線回折データに基づいて三次元構造座標を決定する工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造の決定方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ複製調節タンパク質がエシェリヒア属、ヘモフィルス属、パスツレラ属又はビブリオ属の細菌のＳｅｑＡタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ複製調節タンパク質若しくは該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体、又は請求項１記載のポリペプチド断片若しくはそのＤＮＡ結合部位の三次元立体構造を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）該三次元立体構造に基づいて、ＤＮＡ複製調節能を阻害する候補化合物を設計又は選択する工程、
（ｃ）該設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、
（ｄ）該候補化合物によるＤＮＡ複製調節能の阻害活性を調べるために、該候補化合物と該ＤＮＡ複製調節タンパク質とを接触させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ複製調節タンパク質がエシェリヒア属、ヘモフィルス属、パスツレラ属又はビブリオ属の細菌のＳｅｑＡタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｄ）工程におけるＤＮＡ複製調節能の阻害活性が、ゲルシフトアッセイ法により検出されることを特徴とする請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法。
【請求項１１】
前記三次元立体構造モデルが本明細書の表１に示す原子座標により実質的に規定されることを特徴とする請求の範囲第８項〜第１０項の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求の範囲第５項又は第８項〜第１１項の何れか一項に記載の方法により同定されることを特徴とするＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物。
【請求項１３】
ＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を含有する抗菌性組成物の製造方法であって、請求の範囲第５項又は第８項〜第１１項の何れか一項に記載の方法によりＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を同定する工程、及び該同定された化合物を安定化剤又は担体と混合する工程を含むことを特徴とする抗菌性組成物の製造方法。
【請求項１４】
ヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ複製調節タンパク質又は請求項２記載のポリペプチド断片と、ヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の三次元立体構造を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）該三次元立体構造に基づいて、ヘミメチル化ＤＮＡに結合する候補化合物を設計又は選択する工程、
（ｃ）該設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、
（ｄ）該候補化合物のヘミメチル化ＤＮＡへの結合能を調べるために、該候補化合物とヘミメチル化ＤＮＡとを接触させる工程、
を含むことを特徴とするヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物を同定する方法。
【請求項１５】
前記候補化合物が変異体ＤＮＡ複製調節タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の三次元立体構造を出力するコンピュータシステムであって、
（ａ）前記ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に対応するアミノ酸残基の原子座標を含むコンピュータ読み取り可能なデータを記憶保持する記憶手段と、
（ｂ）前記記憶手段に保持されたデータを読み出して、三次元立体構造モデルを導出する導出手段と、
（ｃ）前記導出結果を受けて、前記三次元立体構造モデルを出力する出力手段と、を含むことを特徴とするコンピュータシステム。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位が、配列番号２に示したアミノ酸配列の１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまで、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでの領域からなることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載のコンピュータシステム。
【請求項１８】
有効成分として、下記一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含むことを特徴とするＤＮＡ複製調節阻害剤。
2003048203.tif 000068
（上記式中、Ａはシクロヘキセン、ジメチルシクロヘキセン、ビシクロ［２，２，１］ヘプタン、ビシクロ［２，２，１］ヘプテン、オキサ−ビシクロ［２，２，１］ヘプタンからなる群から選択される何れか１種の環を、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子又はメチル基を、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）。
【請求項１９】
有効成分として、下記一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含むことを特徴とする抗菌性組成物。
2003048203.tif 000069
（上記式中、Ａはシクロヘキセン、ジメチルシクロヘキセン、ビシクロ［２，２，１］ヘプタン、ビシクロ［２，２，１］ヘプテン、オキサ−ビシクロ［２，２，１］ヘプタンからなる群から選択される何れか１種の環を、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子又はメチル基を、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＤＮＡ複製調節タンパク質の結晶化、該結晶を用いたＸ線結晶構造解析によるＤＮＡ複製調節タンパク質の三次元構造の決定、及びその使用に関し、特に、その立体構造に基づく該タンパク質への結合化合物、又はヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物の合理的なスクリーニングに関する。
背景技術
大腸菌の染色体ＤＮＡには約１９００個のＧＡＴＣ配列が存在する。このＧＡＴＣ配列は通常Ｄａｍメチラーゼによりメチル化されている。このＤａｍメチラーゼは、メチル基供与体であるＳ−アデノシルメチオニンからアデニン塩基の６位のアミノ基にメチル基を転移させる。大腸菌のＤａｍメチラーゼはｄａｍ（ＤＮＡ  Ａｄｅｎｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子によってコードされており、分子量３１ｋＤａのモノマー酵素である（Ｂｏｙｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，１６８２−１６８５）。
染色体ＤＮＡの複製時には新生鎖がＤａｍメチラーゼによりメチル化されるまでヘミメチル化状態となる。すなわち、複製直後のＤＮＡは、新生鎖のＧＡＴＣ配列は未だメチル化されていないが、その相補鎖（旧鎖）はメチル化されている状態（半メチル化状態）にあるが、このヘミメチル化ＤＮＡにＤａｍメチラーゼが作用すると、両方の鎖共にメチル化されたフルメチル化ＤＮＡとなる。ＳｅｑＡタンパク質は複製直後にヘミメチル化状態となったＧＡＴＣ配列を特異的に認識し、結合する（Ｂｒｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１４，４０８３−４０８９、及びＳｌａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８２，９２７−９３６参照）。大腸菌の複製開始点であるｏｒｉＣ領域にはＧＡＴＣ配列が１１ヶ所存在しており、ＳｅｑＡはヘミメチル化状態のｏｒｉＣ領域に結合することによって、Ｄａｍメチラーゼによるメチル化を遅延させると同時に、ヘミメチル化ｏｒｉＣの膜への結合にも関与している。また、ＳｅｑＡタンパク質はｏｒｉＣからの複製開始を同調させる働きを担い、複製を負に制御すると考えられている。
この複製の負の制御（又は複製開始点の隔離）にはＳｅｑＡ以外の他の因子も関与しているが、試験管内においてＳｅｑＡタンパク質は単独でヘミメチル化ＤＮＡと強く結合する活性を示し、このＳｅｑＡタンパク質の結合には少なくとも二個のヘミメチル化ＧＡＴＣ配列の存在が必要であることが報告されている（Ｂｒｅｎｄｌｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，２３０４−２３１０）。
このようなＤａｍメチラーゼとＳｅｑＡタンパク質は、ヒトを初めとする哺乳類には存在せず、ペスト菌、コレラ菌、赤痢菌、ネズミチフス菌および大腸菌Ｏ１５７等の病原性細菌を含むグラム陰性菌の特殊なグループに存在するのみである（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ，５，３２７−３４１参照）。従って、そのＤＮＡ複製調節機構、即ち、ＤａｍメチラーゼやＳｅｑＡタンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合を阻害することによって、これらの細菌の増殖を特異的に抑制できる可能性がある。また、Ｄａｍメチラーゼを欠損したネズミチフス菌がマウスで生ワクチンとして働くことも報告されている（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ，５，３２７−３４１参照）ことから、ヘミメチル化ＤＮＡに特異的に結合し、Ｄａｍメチラーゼの働きを阻害する薬剤の開発によって、上記細菌の病原性を低下させ、感染した宿主を発病させることなく上記細菌に対する抗体の産生を促進できる可能性もある。
しかし、そのためにはＳｅｑＡタンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの詳細な結合様式やこれら複合体の結合と解離の機構についての情報が必要となるが、これまでＳｅｑＡタンパク質の立体構造、特に、ヘミメチル化ＤＮＡとの結合に関する立体構造の知見は得られていない。
本発明は、ＤＮＡ複製調節タンパク質の一つである大腸菌ＳｅｑＡタンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の単結晶を取得し、Ｘ線結晶構造解析によりその立体構造を明らかにしてＳｅｑＡタンパク質による複製の調節機構を明らかにすることを目的とする。
また、本発明はＳｅｑＡタンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の構造に基づいて、該複合体の形成を阻害する化合物や、ヘミメチル化ＤＮＡに特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供すること等を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、ＳｅｑＡタンパク質の機能ドメインを明らかにするために、種々の欠失変異を持つｓｅｑＡ遺伝子を構築し、これらを大腸菌で発現させて変異体タンパク質の種々の物性やヘミメチル化ＤＮＡとの結合能を解析したところ、Ｃ末端側にヘミメチル化ＤＮＡとの結合に関与する機能ドメインを有することを明らかにした。また、これらの機能ドメインとヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶化及び該結晶を用いたＸ線結晶構造解析を行い、該複合体の三次元立体構造を初めて明らかにすることによって本発明を完成した。
即ち、本発明は、ＤＮＡ複製調節タンパク質であるＳｅｑＡタンパク質の結晶、その製造方法、それを用いた三次元立体構造の解析、及びそのようにして得られた三次元立体構造を用いて該複合体の形成を阻害する化合物や、ヘミメチル化ＤＮＡに特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法等に関し、より具体的には、
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、７１位から１８１位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまで、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでのアミノ酸残基がＤＮＡ結合部位を形成することを特徴とするポリペプチド断片。
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、７１位から１８１位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド断片であって、１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまで、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでのアミノ酸残基がヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位を形成することを特徴とするポリペプチド断片。
（３）配列番号２に示すアミノ酸配列の７１位から１８１位までからなるポリペプチド断片と、ヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶であって、六方晶系の空間群Ｐ６２２、格子定数ａ＝ｂ＝１５２．２±０．２Å、ｃ＝１１９．３±０．２Åを有する該複合体の結晶。
（４）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶の製造方法であって、
４〜６ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ複製調節タンパク質と、ヘミメチル化ＤＮＡとを１：１〜２：１のモル比で混合した溶液を、１〜２Ｍのクエン酸３ナトリウム水和物を含有し、ｐＨ７．０〜８．０の緩衝液を用いて蒸気拡散法により結晶化する方法。
（５）（１）に記載のポリペプチド断片を用いて、これに結合する化合物を設計又は選択し、ＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物及び／又はヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法。
（６）ＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶を生成する工程、
（ｂ）該結晶を用いて重原子同型置換法又は多波長異常散乱法によりＸ線回折データを取得する工程、及び
（ｃ）該Ｘ線回折データに基づいて三次元構造座標を決定する工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造の決定方法。
（７）前記ＤＮＡ複製調節タンパク質がエシェリヒア属、ヘモフィルス属、パスツレラ属又はビブリオ属の細菌のＳｅｑＡタンパク質であることを特徴とする（６）に記載の方法。
（８）ＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ複製調節タンパク質若しくは該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体、又は（１）のポリペプチド断片若しくはそのＤＮＡ結合部位の三次元立体構造を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）該三次元立体構造に基づいて、ＤＮＡ複製調節能を阻害する候補化合物を設計又は選択する工程、
（ｃ）該設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、
（ｄ）該候補化合物によるＤＮＡ複製調節能の阻害活性を調べるために、該候補化合物と該ＤＮＡ複製調節タンパク質とを接触させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を同定する方法。
（９）前記ＤＮＡ複製調節タンパク質が、エシェリヒア属、ヘモフィルス属、パスツレラ属又はビブリオ属の細菌のＳｅｑＡタンパク質であることを特徴とする（８）に記載の方法。
（１０）前記（ｄ）工程におけるＤＮＡ複製調節能の阻害活性が、ゲルシフトアッセイ法により検出されることを特徴とする（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）前記三次元立体構造モデルが本明細書の表１に示す原子座標により実質的に規定されることを特徴とする（８）〜（１０）何れか一に記載の方法。
（１２）（５）又は（８）〜（１１）の何れか一に記載の方法により同定されることを特徴とするＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物。
（１３）ＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を含有する抗菌性組成物の製造方法であって、上記（５）又は（８）〜（１１）の何れか一に記載の方法によりＤＮＡ複製調節能を阻害する化合物を同定する工程、及び該同定された化合物を安定化剤又は担体と混合する工程を含むことを特徴とする抗菌性組成物の製造方法。
（１４）ヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ複製調節タンパク質又は（２）に記載のポリペプチド断片と、ヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の三次元立体構造を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）該三次元立体構造に基づいて、ヘミメチル化ＤＮＡに結合する候補化合物を設計又は選択する工程、
（ｃ）該設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、
（ｄ）該候補化合物のヘミメチル化ＤＮＡへの結合能を調べるために、該候補化合物とヘミメチル化ＤＮＡとを接触させる工程、
を含むことを特徴とするヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物を同定する方法。
（１５）前記候補化合物が変異体ＤＮＡ複製調節タンパク質であることを特徴とする（１４）に記載の方法。
（１６）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の三次元立体構造を出力するコンピュータシステムであって、
（ａ）前記ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に対応するアミノ酸残基の原子座標を含むコンピュータ読み取り可能なデータを記憶保持する記憶手段と、
（ｂ）前記記憶手段に保持されたデータを読み出して、三次元立体構造モデルを導出する導出手段と、
（ｃ）前記導出結果を受けて、前記三次元立体構造モデルを出力する出力手段と、を含むことを特徴とするコンピュータシステム。
（１７）前記ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位が、配列番号２に示したアミノ酸配列の１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまで、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでの領域からなることを特徴とする（１６）に記載のコンピュータシステム。
（１８）有効成分として、下記一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含むことを特徴とするＤＮＡ複製調節阻害剤。
2003048203.tif 000003
（上記式中、Ａはシクロヘキセン、ジメチルシクロヘキセン、ビシクロ［２，２，１］ヘプタン、ビシクロ［２，２，１］ヘプテン、オキサ−ビシクロ［２，２，１］ヘプタンからなる群から選択される何れか１種の環を、Ｒ１及びＲ２は水素原子又はメチル基を、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）。
（１９）有効成分として、上記一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含むことを特徴とする抗菌性組成物。
である。
発明の実施の形態
本発明において、「ＤＮＡ複製調節タンパク質」とは、複製直後の染色体ＤＮＡの複製開始領域に結合して細胞周期が同調するまで新たな複製開始を抑止することによってＤＮＡ複製を調節するタンパク質をいう。大腸菌におけるこのような調節は、ｓｅｑＡ遺伝子の発現産物であるＳｅｑＡタンパク質により行われることが知られており、すでにその塩基配列やタンパク質の一次構造が明らかにされている（Ｌｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ，７７，４１３−４２６，ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０７６５１）。ＳｅｑＡタンパク質は大腸菌をはじめ、Ｄａｍメチラーゼを有する種々の細菌に存在し、例えば、エシェリヒア属、ヘモフィルス属、パスツレラ属又はビブリオ属等の細菌であり、特に、ペスト菌、コレラ菌、赤痢菌、ネズミチフス菌、大腸菌Ｏ１５７等の病原性細菌を含む。更に、少なくとそれらの一部であって、ＤＮＡ複製調節機能を有するタンパク質も本発明における「ＤＮＡ複製調節タンパク質」の中に実質的に含まれる。
また、本発明において「ヘミメチル化ＤＮＡ」とは、ＧＡＴＣ配列を有する二本鎖ＤＮＡにおいて、一方の鎖のアデニンのみがＮ６位にメチル化を受けたＤＮＡをいい、生体由来ものであっても化学合成したものであってもどちらでも良い。生体由来のものとしては、例えば、大腸菌の複製開始領域であるｏｒｉＣがある。２４５ｂｐからなるｏｒｉＣは、１１個のＧＡＴＣ配列が存在し、半保存的な複製直後には、新生鎖がＤａｍメチラーゼによりメチル化されるまで片方の鎖のみがメチル化されたヘミメチル化状態として存在する。一方、化学合成により任意の長さの二本鎖オリゴヌクレオチドを設計し、一方の鎖のＧＡＴＣ配列のアデニンのみがＮ６メチル化されたオリゴヌクレオチドを合成し、これを相補鎖とアニールさせることによっても調製することができる。
本発明において、ＤＮＡ複製調節タンパク質の「変異体」とは、配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも１つ欠失、付加、挿入若しくは置換又は修飾されたアミノ酸配列を有し、ヘミメチル化ＤＮＡとの結合活性の少なくとも一部を保持する改変されたタンパク質をいう。
（ＳｅｑＡタンパク質の機能ドメインの探索）
図１（ａ）は、ＳｅｑＡタンパク質のＮ末端側及びＣ末端側から種々の長さのアミノ酸配列を欠失した２０種類の変異体ＳｅｑＡタンパク質を示す。これらをコードする変異体ｓｅｑＡ遺伝子を有するプラスミドを構築し、大腸菌に導入してＧＳＴ融合タンパク質を合成することにより、全長ＳｅｑＡタンパク質とＮ末端欠失変異ＳｅｑＡタンパク質を発現するプラスミド５種類において、それらのプラスミドのコピー数が極端に減少していることが分かった。Ｃ末端欠失変異ＳｅｑＡタンパク質を発現するプラスミドに関しては、Ｃ末端を５アミノ酸残基削っただけで、ｓｅｑＡ遺伝子が入っていないベクターのみのプラスミドと同等のコピー数に回復した。このことから、ＳｅｑＡタンパク質は大腸菌の染色体ｏｒｉＣだけでなくコリシンＥ１プラスミドの複製にも関与していることが示唆される。また、ＳｅｑＡタンパク質はＣ末端側にＤＮＡ結合ドメインを持つことも明らかになった（図１（ｂ））。
（ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体結晶の調製）
タンパク質の立体構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基に、該タンパク質の立体構造を明らかにしていくものである（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ，ｐ．１−５６５，（１９７６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加し、または溶媒量を蒸発等によって減少させる等の操作によって、タンパク質が溶液状態から非溶液状態になる場合において、ある特定の条件において結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度、塩濃度、水素イオン濃度（ｐＨ）、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子が関与している。更には、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法、透析法、蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ，ｐ．５９−８２，（１９７６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。例えば、蒸気拡散法は、気相を通じて拡散によって揮発性の溶媒や沈殿剤が移動するようなしくみである。タンパク質溶液が沈殿剤溶液とのあいだで蒸気拡散することにより、タンパク質濃度と沈殿剤濃度が共に高まって過飽和の領域で結晶化が起こる。タンパク質溶液の液滴をどうつくるかによって、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法等の方法がある。このようにＸ線結晶解析に適したタンパク質の結晶を得るには、それぞれのタンパク質において、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における種々の因子や結晶化法を最適化する検討が必要になる。特に高純度のタンパク質の調製は結晶化を成功させるための重要な因子である。このために、クローン化した遺伝子を効率的な発現系で発現させることにより迅速かつ均一なタンパク質を調製することができる。
本発明のＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶は、以下のようにして調製される。大腸菌ＳｅｑＡタンパク質をコードする塩基配列は既に公知であり、組換えＤＮＡ技術を用いて本来の宿主である大腸菌やその他の種々の宿主において容易に発現させることができる。
本発明の一つの実施形態において、組換え大腸菌を用いた系により大腸菌ＳｅｑＡタンパク質を大量発現させることができる。組換え大腸菌において遺伝子を大量に発現させるための種々のプラスミドベクター等が市販されている。例えば、強力なＴ７ファージプロモーターの下流に発現させたい遺伝子を導入し、宿主大腸菌により供給されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）等を用いることができる。このシステムでは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は宿主大腸菌染色体に組み込まれており、ｌａｃＵＶ５プロモーター下流にあるためＩＰＴＧ添加による誘導で発現をコントロールすることができる。また、大腸菌ＳｅｑＡタンパク質のＮ末端側やＣ末端側に種々のタグ配列を導入しておくことによって、金属キレート樹脂（ヒスチジンタグ）や抗体（Ｔ７タグ、ＣＢＤタグ等）等を使って簡単に精製することができる。精製された融合タンパク質は、エンテロキナーゼやトロンビン等のプロテアーゼを用いて更に大腸菌ＳｅｑＡタンパク質部分のみを回収することが可能である。
また、大腸菌ＳｅｑＡタンパク質を発現する組換え大腸菌を、重金属原子であるセレンを含有したセレノメチオニンあるいはセレノシステインを含む培地で生育、培養することにより大腸菌ＳｅｑＡタンパク質中のメチオニンあるいはシステイン残基がセレノメチオニン又はセレノシステインに置換された変異体タンパク質が取得される。
更に結晶化に適するように、これらのタンパク質を高純度に精製する。精製法としては、カラムクロマトグラフィー（アフィニティー、疎水、イオン交換、ゲルろ過等）、塩析、遠心分離、電気泳動等、当業者においてタンパク質を精製する方法として一般的に行われている方法を単独で又は組み合わせて用いることができる。
次いで、ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶を調製する。ＳｅｑＡタンパク質のようなＤＮＡ結合タンパク質の機能を解析する場合には特定のオリゴヌクレオチドと複合体を形成したようなモデル化した系で結晶化することが必須である。例えば、大腸菌のＳｅｑＡタンパク質と１０〜５０塩基対程度のヘミメチル化二本鎖ＤＮＡとを１：１〜２：１のモル比であらかじめ混合しておくことが好ましい。
上記セレン含有培地で培養することによる重金属原子のタンパク質中への導入方法の他に、天然型のタンパク質結晶を、金、白金、イリジウム、オスミウム、水銀、鉛、ウラン、サマリウム等を含む金属塩又は有機金属化合物の溶液に浸漬することによっても重原子誘導体結晶を作製することができ、重原子同型置換法及び多波長異常分散法を適用する場合に利用される。
配列番号２に示したアミノ酸配列の７１位から１８１位までを有するＳｅｑＡタンパク質と１０塩基対のヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶は、六方晶系の空間群Ｐ６２２に属するもので、単位格子としてａ軸、ｂ軸の方向に１５２．２３８Å、ｃ軸の方向に１１９．３３８Åの大きさを有する。
（ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体結晶のＸ線結晶構造解析）
このようにして得たＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶の構造を当業者に知られたＸ線結晶構造解析技術を用いて解析する。類縁タンパク質の立体構造が未知であり、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能な本発明のような立体構造決定においては、重原子置換法又は多波長異常分散法（ＭＡＤ法）が適用され得る。本発明の一つの実施態様に於いて、Ｘ線結晶解析は、ＭＡＤ法であり、これに用いられるＸ線は、シンクロトロン放射光から得られる０．３〜３．０Åの波長である。ＭＡＤ法は、入射Ｘ線エネルギー近傍の吸収端をもつ重原子同型置換結晶から、複数の波長によるＸ線回折データを得る方法である。Ｘ線と該重原子の電子殻との共鳴でＸ線の散乱に差を生じ、これによってタンパク質の構造解析での位相問題を解決することができる。この方法の原理はすでに古くから知られていたが、波長可変であるシンクロトロン放射光の出現によって始めてタンパク質の構造決定に使用されるようになり、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎらがこの方法によって初めてタンパク質の構造解析に成功した（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４，７７−８８，１９８８及び、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５，１６６５−１６７２，１９９０参照）。
シンクロトロン放射光とは、蓄積リングに打ち込まれた電子を磁場によって加速して得られる放射光であり、通常のＸ線発生装置よりも極めて強いエネルギーを有する。理研播磨研究所の第三世代大型放射光設備ＳＰｒｉｎｇ−８（８ＧｅＶ）等が使用可能である。
測定した回折画像データは、プログラムＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）又は同様な画像処理プログラムを用いて、反射強度データに処理される。天然型結晶の反射強度データ、複数波長での重原子置換結晶の反射強度データから、差パターソン図を利用して結晶中のタンパク質に結合した重原子の位置を求めた後、プログラムＰＨＡＳＥＳ若しくはＣＣＰ４又は同様の回折データ解析プログラムを用いて重原子位置パラメータを精密化することにより初期位相が決定される。決定された初期位相は、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ）又は同様な位相改良プログラム（電子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法に従って、信頼性の高い位相へと改良される。
ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造モデルは、プログラムＯにより３次元グラフィックス上に表示した電子密度図から、以下の手順で構築し得る。まず、特徴的なアミノ酸配列を有する複数の領域を電子密度図上で探し出す。次に、見出した領域を起点にしてアミノ酸配列を参照しながら、電子密度に適合するアミノ酸残基の部分構造をプログラムＯを用いて三次元グラフィックス上で構築する。
順次この作業を繰り返すことにより、ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体のすべてのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、複合体全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密化プログラムであるＸＰＬＯＲの精密化プロトコルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化される。精密化の進行状況や分子モデルのチェックは、以下の指標により確認することができる。信頼度因子（Ｒ因子）は、回折強度測定で得られた結晶構造因子の絶対値と分子モデルから計算した結晶構造因子の絶対値の一致度を示す尺度であり、精密化が正常に進行すると小さな値となる。また、タンパク質の主鎖の二面角を計算しそれらをプロットしてそれらの値が許容される領域にあるかどうかを確認する方法（ラマチャンドランプロット）も用いられる。
このようにして本発明であるＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の３次元原子座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）が初めて得られる。得られた原子座標を当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクのテキスト形式に従って表１に示す。
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なお、表１に示した原子座標は、大腸菌のＳｅｑＡタンパク質（７１−１８１）と１０塩基対のヘミメチル化ＤＮＡ（ＳｅｑＡ  ｂｓＣ−１０）との複合体の結晶構造であるが、この情報を用いることによって大腸菌と類縁の他の細菌が有するＳｅｑＡタンパク質の立体構造も容易に決定することができる。大腸菌と類縁の細菌としては、例えば、エシェリヒア属、ヘモフィルス属、パスツレラ属及びビブリオ属等が挙げられ、図４に示したように、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ＰＭ７０、及びＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅのＳｅｑＡタンパク質は、大腸菌ＳｅｑＡタンパク質とアミノ酸配列の相同性が非常に高い。このような相同性の高いタンパク質の立体構造を決定する方法として、分子置換法がある。本発明と同様な方法で上記類縁菌のＳｅｑＡタンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶を作製し、Ｘ線回折データを取得した後、分子置換法により上記類縁タンパク質の立体構造を決定することができ、これらも本発明の一形態として含まれる。
（ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造モデルを表示するコンピュータシステム）
本発明によるＤＮＡ複製調節タンパク質又は該タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶から得られる原子座標を、分子の３次元構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の３次元的な構造を詳細に表現することが可能になる。
図２はこれらのコンピュータシステムの一実施形態を表した概略図である。図２を参照すると、本発明のコンピュータシステムとして、記憶手段と、導出手段と、出力手段とが示されている。記憶手段としては、ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に対応するアミノ酸残基の原子座標を含むコンピュータ読み取り可能なデータを、導出手段によって読み出し可能なように記憶保持するものであれば特に限定されるものではない。例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープ等の記憶媒体に該データを記憶保持させることで実現される。
ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に対応するアミノ酸残基の原子座標を含むコンピュータ読み取り可能なデータを、記憶手段へ入力する方法は、種々の方法により行うことができる。例えば、フレキシブルディスクドライブやＣＤ−ＲＯＭドライブからこれらの記録媒体に記録されたデータを読み込むことができる。あるいはまた、ネットワークを介して例えばＰＤＢのようなデータベースから所望のデータを受け取ることもできる。
上記記憶手段から読み出したデータに基づいて、導出手段はＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の少なくとも一部を表す三次元立体構造モデルを導出する。導出手段の構成は、特に限定するものではないが、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６，７６５−７８４）或は、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．４，１８７−２１７）等のプログラムを所望のコンピュータにインストールすることで実現される。更に、これらの分子モデルを生成するステップに続いて、該複合体の配座エネルギーを計算してエネルギーを最小化するプログラムとしては、上記ＣＨＡＲＭＭやＡＭＢＥＲ等が用いられる。
上記導出手段によって導出された結果を受けて、ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位の三次元立体構造モデルを出力する出力手段は、従来より用いられている種々の装置を用いることができる．例えば、ＣＲＴと呼ばれるディスプレイ装置に、例えばＱＵＡＮＴＡのようなプログラムを用いて画像的に表示することもできる。このような画像を紙に表示するプリンターや他の記憶媒体に保存するためのディスクドライブも含まれる。
図３は、このようにして３．０Åの分解能で得られた大腸菌ＳｅｑＡタンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造をリボンモデルで示したものである。図３より明らかなように、得られた結晶は、ＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質と１０塩基対のヘミメチル化ＤＮＡとの複合体が２回回転軸で対称な２量体の結晶である。立体構造から確認されたＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質のドメイン構造を図４に示した。図４に示したように、ＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質は７ヶ所のα−ヘリックス構造と２ヶ所のβ−シート構造を有しており、１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンを含むループ領域、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンを含むループ領域で、ヘミメチル化ＤＮＡのＧ（ｍ６Ａ）ＴＣ配列部分と結合していることが分かる（図３参照）。
（立体構造の使用）
本発明が提供するＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の原子座標のすべて又は一部を、分子の立体構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はその記憶媒体に入力することで、ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に結合し、該複合体の形成を阻害する化合物、又はＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位と類似した立体構造を有し、ヘミメチル化ＤＮＡと強く結合する化合物を同定、検索、評価又は設計することが可能となる。化合物は、天然物化合物、合成化合物の何れでもよく、高分子化合物、低分子化合物の何れでも良い。
このような方法は、まず候補化合物とＤＮＡ複製調節タンパク質とをコンピュータモデルにより表示し、視覚的観察によりＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に良く適合する形状又は化学構造をもつ候補化合物（リード化合物）を見つけ出す段階が含まれる。分子モデルを作成、表示するためには、前記ＱＵＡＮＴＡやＳＹＢＹＬ等のプログラムが利用できる。更に、ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位との親和性、反発力、及び立体的障害等を推定するための種々のコンピュータプログラムが使用できる。これらのプログラムの例としては、例えば、生体高分子についてエネルギー的に好適な結合部位を決定するためのＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．，（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐ．８４９−８５７）、機能的結合部位を探索するためのＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，ｐ．２９−３４）、あるいは高分子とリガンドとの相互作用を幾何学的に解析し、自動的にドッキングさせるＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２）、及びＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１，２６９−２８８）等が挙げられる。
これらの候補化合物（リード化合物）が見つけ出されると、続いて、ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位を表示したコンピュータ画面上で候補化合物との立体的な相互作用を視覚的に検討し、更に最適化することができる。前述したＱＵＡＮＴＡやＳＹＢＹＬ等のプログラムを用いて候補化合物を最適化するためのモデルを構築することができる。これらの他に、分子モデリングの最適化のために有用な種々のプログラムが利用でき、例えば、ＣＡＶＥＡＴ（Ｌａｕｒｉ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．，Ｊ．（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．８，５１−６６）やＨＯＯＫ（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９，１９９−２２１）等が挙げられる。
更に、上記のプログラムの他にＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位の立体構造から直接（ｄｅ  ｎｏｖｏ）、自動的に候補化合物を構築し、その構造を出力することも可能である。これらのためには、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．Ｊ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ．）やＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７，８９８５）等のプログラムも利用できる。
続いて、上記候補化合物又は最適化された化合物が、ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの結合を阻害するかどうかを種々の方法で確認する。例えば、両者を水溶液中で混合する等の方法で接触させ、その後、電気泳動等を行うことにより、ＤＮＡ複製調節タンパク質がヘミメチル化ＤＮＡと結合できるか否かを確認する。上記候補化合物又は最適化された化合物がＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの結合を阻害することができれば、ＤＮＡ複製調節タンパク質による複製調節能もまた阻害されるものと考えられる。
あるいは、上記候補化合物とＤＮＡ複製調節タンパク質との相互作用を、ＮＭＲや質量分析法等を用いて分光学的に検出することもできる。一般的に、ＮＭＲシグナルは分子の局所的環境変化（リガンドとの結合、構造変化等）を敏感に反映するから、リガンドと相互作用するタンパク質を混合してＮＭＲスペクトルを測定した場合、リガンドシグナルのブロード化や消失、化学シフト値の変化などが確認される。反対に、リガンドと結合した状態のタンパク質の構造を特異的に検出することもできる。１５Ｎで均一にラベルしたタンパク質を用いた１５Ｎ−１ＨＨＳＱＣスペクトルを利用すれば、タンパク質のＮＭＲシグナルのみを観測することができ、リガンドと相互作用するアミノ酸残基等の局所構造を見出すことができる。
次に、ヘミメチル化ＤＮＡと特異的に結合する化合物を同定するためには、ＤＮＡ複製調節タンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合に関与する領域の立体構造が重要な手がかりとなる。上述したように、配列番号２に示したＳｅｑＡタンパク質の１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまでの領域、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでの領域は、表１に示した原子座標によって規定され、図３に示した立体構造を形成することによってヘミメチル化ＤＮＡのＧ（ｍ６Ａ）ＴＣ配列部分と相互作用していることが分かる。通常の二本鎖ＤＮＡにおいては、塩基部分は相補鎖と水素結合しているため二重らせん構造の内部に存在するが、ヘミメチル化ＤＮＡではアデニンの６位のアミノ基がメチル化されることによって、アデニンとチミンとの水素結合が弱まり、二重らせん構造が部分的に開いた構造をとるものと考えられる。この微妙な構造のゆらぎをＳｅｑＡタンパク質のＤＮＡ結合部位が認識し、これと特異的に結合することが分かる。このヘミメチル化ＤＮＡとの結合に関与する立体構造情報はヘミメチル化ＤＮＡと結合する化合物を同定するための重要な手がかりとなる。
このような候補化合物の一つとして、変異体ＤＮＡ複製調節タンパク質が挙げられる。例えば、ヘミメチル化ＤＮＡと結合する上記２つのループ領域（１１５位のグリシンから１１８位のアルギニンまでの領域、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンまでの領域）を含み、その結合部分の立体構造を保持するような任意のタンパク質又はペプチドである。該結合部分の立体構造は、表１に示す原子座標により実質的に規定される。或は、ＳｅｑＡタンパク質の上記ＤＮＡ結合部位を形成するアミノ酸残基又はその近傍領域のアミノ酸を他のアミノ酸に置換又は化学修飾を行って、ヘミメチル化ＤＮＡとの結合能力が向上した変異体タンパク質を作製することができる。ここに、「その近傍領域」とは、該アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデアワールス相互作用、水素結合などに関与する領域、具体的にはおよそ５Å以内にある領域をいう。
このようにして設計された変異体タンパク質は、多くの方法によって調製され得る。例えば、本発明の変異体をコードするＤＮＡを部位特異的変異導入法やＰＣＲ、化学合成等の当業者において公知の方法により、又はこれらを組み合わせて調製することができる。これらの変異体タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、該発現ベクターを更に適当な細胞に導入して得られた形質転換体を培養し、変異体タンパク質を発現させることが可能である。
以上の手法において設計された阻害剤については、その化合物に応じて、一般的に用いられている化学合成の手法を用いることで得ることができる。また、その阻害剤をＤａｍメチラーゼを有する病原性細菌の増殖阻害剤として用いる場合には、一般に製薬的に許容される担体と混合することによって、医薬組成物を調製することができる。医薬組成物用担体としては、特に制限はなく、例えば，乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルアルコール、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖，酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エアステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース，卵黄、界面活性剤、単シロップ、クエン酸、蒸留水、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等があり、目的とする製剤、例えば、注射薬や錠剤等の形態に応じて、本発明の方法によって同定された阻害剤と混合して使用される。
実施例
（実施例１）大腸菌ＳｅｑＡタンパク質の種々の欠失変異体の調製
配列番号１に示した大腸菌ｓｅｑＡ遺伝子（Ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ５４３ｂｐ）が、プラスミドｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入されたプラスミドｐＭＹ９０３を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質を発現する種々の欠失変異体プラスミドを作製した。
まず、プラスミドｐＭＹ９０３を鋳型とし、図１（ａ）に示したＳｅｑＡタンパク質の種々の欠失変異体をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。各ＤＮＡ断片がコードするタンパク質のＮ末端側にＢａｍＨＩ、Ｃ末端側にＥｃｏＲＩの制限酵素部位を付加したそれぞれ２種類のプライマーと組換えＴａｑポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）とを用いて各ＤＮＡ断片を増幅した後、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて増幅したＤＮＡ断片を精製した。この増幅された二本鎖ＤＮＡ断片の各３’末端には、鋳型配列とは関係なく一塩基のデオキシアデノシン（Ａ）が付加されることから、これと相補的な一塩基のチミジン（Ｔ）の突出末端を有するプラスミドｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（登録商標、ＰＲＯＭＥＧＡ社）にＴＡクローニングした。このクローン化されたＤＮＡの塩基配列を確認した後、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切り出した各ＤＮＡ断片をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化してＳｅｑＡタンパク質の種々の欠失変異体のＮ末端にＧＳＴが融合して発現する種々のプラスミドを構築した。
完全長ＳｅｑＡ及び上記方法により作製した種々の欠失変異体遺伝子を有する大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ）をＬＢ培地で培養し、対数増殖期に最終濃度で１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えてタンパク質の発現を誘導した。その後、４〜６時間培養して菌体を集め、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む緩衝液（ｐＨ８．０）中、氷冷下で超音波により細胞を破砕して発現したタンパク質を回収した。一方、同じ培地で一晩培養した培養液３ｍｌからプラスミドＤＮＡを抽出し、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。このようにして得られたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化したのち、アガロースゲル電気泳動してプラスミドＤＮＡの収量を求めた。菌体破砕液から可溶性タンパク質が回収されたクローンは、そのタンパク質をコードするプラスミドの収率が著しく悪いことが分かった。この実験に用いたプラスミドはコリシンＥ１系（ＣｏｌＥ１系）のプラスミドであり、大腸菌のｏｒｉＣとは異なり、ＲＮＡＩ、ＲＮＡＩＩで制御される別の複製機構が存在するが、上記結果からは、ＳｅｑＡタンパク質もこの複製機構に関与していることが示唆された。
（実施例２）ＳｅｑＡ欠失変異体の精製
実施例１で作製した欠失変異体のうち、ＳｅｑＡ（１−５９）、ＳｅｑＡ（７−１８１）、ＳｅｑＡ（１８−１８１）、ＳｅｑＡ（４２−１８１）、ＳｅｑＡ（６０−１８１）、ＳｅｑＡ（７１−１８１）の６種類の変異体を選択してそれらのタンパク質を精製した。
上記各変異体ＳｅｑＡタンパク質を発現する大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ）を２．５リットルのＬＢ培地で培養し、実施例１と同様の方法で発現させて菌体破砕液を調製した。これを５ｍｌのＧＳＴｒａｐＦＦカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）に添加し吸着させ、開始バッファーでカラムを洗浄した後、０〜２０ｍＭのグルタチオンの濃度勾配を有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてＧＳＴ融合タンパク質を溶出した。この溶出画分を透析してグルタチオンを除去した後、ＧＳＴタグを切断するためにタンパク質１００μｇ当たり１ユニット（Ｕ）のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社）と、４℃で１２〜１８時間反応させた。続いて、ＧＳＴタグを除去するために、反応液を再び５ｍｌのＧＳＴｒａｐＦＦカラムに添加して、非吸着画分（Ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ画分）を分取した。更に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにより６種類のタンパク質を精製した。
対照として発現させた完全長ＳｅｑＡタンパク質は、上記方法によりＧＳＴタグを切るとほとんど凝集してしまい、微量しか精製できなかった。ＳｅｑＡ（７−１８１）、ＳｅｑＡ（１８−１８１）はＧＳＴタグを切ると分解する傾向があった。ＳｅｑＡ（１−５９）は多量体として存在することが示唆された。これらの結果より、ＳｅｑＡタンパク質の二量体化はＮ末端領域を介して起こることが分かった。ＣＤスペクトルの測定を行ったところ、何れのタンパク質も高次構造を保持していることが示された。
（実施例３）ゲルシフトアッセイによるヘミメチル化ＤＮＡとの結合活性の測定
実施例２で精製した種々の欠失ＳｅｑＡタンパク質がヘミメチル化ＤＮＡに結合する活性をゲル電気泳動による移動度の変化（ゲルシフトアッセイ）により測定した。４μｇの変異体ＳｅｑＡを含む２０μｌの結合溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｈ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）に種々のヘミメチル化、又はフルメチル化ＤＮＡを加え、２５℃で３０分以上静置した後に１×ＴＢＥ、１２％アクリルアミドゲルで５０Ｖ定電圧で電気泳動を行い、ゲルをエチジウムブロマイド染色した。
まず、これまでにＳｅｑＡタンパク質は２個以上のヘミメチル化Ｇ（ｍ６Ａ）ＴＣ配列に結合することが分かっていたので、配列番号３〜８に示した６種類の一本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、それぞれ相補鎖をアニールして以下の３種類の二本鎖ＤＮＡを合成した。
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フルメチル化、及びヘミメチル化ＤＮＡとしては、上記ＧＡＴＣ配列のアデニンのＮ６位をメチル化したオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングしたものを使用した。例えば、配列番号３のＧＡＴＣ配列（枠で囲んだ部分）のアデニンをメチル化した一本鎖オリゴヌクレオチドと配列番号４の非メチル化オリゴヌクレオチドとアニーリングさせるとヘミメチル化ＤＮＡ（ＳｅｑＡ  ｂｓＡ−３７（Ｍ＋／Ｍ−）と表す。）が調製される。一方、配列番号６の一本鎖オリゴヌクレオチドをメチル化し、配列番号５の非メチル化オリゴヌクレオチドとアニーリングさせるとヘミメチル化ＤＮＡ（ＳｅｑＡ  ｂｓＢ−２６（Ｍ−／Ｍ＋）と表す。）を調製することができる。ＳｅｑＡ  ｂｓＣ−１４と種々の欠失変異体ＳｅｑＡタンパク質を用いて行ったゲルシフトアッセイの結果を図５に示した。図中、１〜４の各レーンに用いたＤＮＡは、１：Ｍ＋／Ｍ＋、２：Ｍ＋／Ｍ−、３：Ｍ−／Ｍ＋、４：Ｍ−／Ｍ−のフルメチル、ヘミメチル又は非メチル化ＤＮＡを添加したことを、又各電気泳動パターンの下に示した数字は変異体ＳｅｑＡタンパク質を構成するアミノ酸残基を示す。図５より、ＳｅｑＡタンパク質のＮ末端領域のみ（１〜５９位）ではＤＮＡ結合能がないことが分かる。一方、Ｎ末端から７個〜７０個のアミノ酸が欠失した変異体でもヘミメチル化ＤＮＡとの結合能を有する。即ち、ＳｅｑＡタンパク質のＤＮＡ結合領域はＮ末端から７１番目以降のＣ末端領域であることが分かった。また、ヘミメチル化部位が１ヶ所でもＳｅｑＡはヘミメチル化ＤＮＡと結合できることが分かった。
（実施例４）結晶化とＸ線結晶構造解析データの収集
実施例３の結果より、Ｎ末端部分を最も大きく欠失した変異体ＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質をＸ線結晶構造解析のために精製し、ヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の結晶を作製した。
実施例２と同様の方法により、５リットルの培養液からＧＳＴと融合した変異体ＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質を回収し、５ｍｌのＧＳＴｒａｐＦＦカラムに吸着させ、０〜２０ｍＭのグルタチオン濃度勾配で溶出した後、透析によるグルタチオンの除去、及びＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅによるＧＳＴタグの除去を行った。続いて５ｍｌのＧＳＴｒａｐＦＦカラムに通してＧＳＴタグを除去した後、更にＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにより変異体ＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質を精製した。
このタンパク質を種々の長さの二本鎖ヘミメチル化ＤＮＡと１．５：１のモル比で混合し、濃縮して結晶化を行ったところ、以下の１０塩基対からなるヘミメチル化二本鎖ＤＮＡとの複合体が六角柱状の結晶を作ることが分かった。
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上記ＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質とＳｅｑＡ  ｂｓｃ−１０（Ｍ＋／Ｍ−）との複合体は、ハンギングドロップ法により、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．５）、１．４Ｍクエン酸３ナトリウム水和物を含む溶液にて結晶化した。得られた結晶は、ＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質と１０塩基対のヘミメチル化ＤＮＡとの複合体が２回回転軸で対称な２量体であり、対称性の高い六方晶系のＰ６２２であった。なお、格子定数は、ａ＝ｂ＝１５２．２３８Å、ｃ＝１１９．３３８Å、単位格子はα＝β＝９０°、γ＝１２０°であった。
天然型及びセレノメチオニン置換体結晶の両方のデータセットを、理研播磨研究所の８ＧｅＶの大型放射光施設（ＳＰｉｎｇ−８）のビームラインＩ（ＢＬ４１ＸＵ）で収集した。
セレノメチオニンによる重原子置換体結晶から得られたデータを用いて、多波長異常散乱法（ＭＡＤ法）により位相決定を行い、天然型結晶のデータを用いて拡張（Ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）を行い、最終的に３．０Åの電子密度マップが得られた。立体構造のグラフィック表示はプログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴ及びＳＰＯＣＫを用いて行った。
（実施例５）ＳｅｑＡタンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に結合する化合物のインシリコスクリーニング
〈データベース最適化〉
低分子化合物データベースの対照データベースとしては、ＳＰＥＣＳ社から提供されている低分子化合物カタログデータベースを用いた。１エントリーに複数分子含むものは１分子ごとに分割した上で、重複を除いたライブラリをスクリーニングの母集団（１５２３２３分子）とした。次に、”Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ５”に基づき、上記低分子化合物データベースについてのターゲット非依存最適化を行った。ここで用いた絞込条件は以下の通りである。
１．分子量１００以上５００以下
２．計算ＬｏｇＰ値（ｏ／ｗ）５以下（ＸＬＯＧＰ−１アルゴリズム使用）、
３．水素結合アクセプター原子数（低分子化合物に含まれるＮとＯの数）１０以下
４．水素結合ドナー原子数（低分子化合物に含まれるＮＨとＯＨの数）５以下
更にドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
１．回転可能な単結合数が２１以上のもの
２．ラジカルを含むもの
３．Ｈ，Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｆ，Ｓ，Ｐ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ以外の元素を含むもの。
絞込み後の分子数は１０３７７３となった。
〈結合部位予測〉
大腸菌のＳｅｑＡタンパク質の中で、図３に示したヘミメチル化ＤＮＡとの結合に本質的に関わっていると推察される残基群（配列番号２に示したアミノ酸配列において１１５位のグリシンから１１８位のアルギニン、及び１４９位のスレオニンから１５３位のスレオニンを含むループ領域）を結合部位とした。
〈スクリーニング〉
（１）１次スクリーニング
Ｄｏｃｋ４．０を用いて、上記結合サイトについて、先に最適化を行った低分子化合物ライブラリー全体に対してドッキングを行った。この時、Ｄｏｃｋのエネルギースコア（ｅｎｅｒｇｙ  ｓｃｏｒｅ）に基づいて低分子化合物をランク付けした。
（２）２次スクリーニング
１次スクリーニングの結果得られた上位１００００分子とデータベース内に含まれるその類似化合物（Ｓｙｂｙｌ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｔ  ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ０．８以下）の１１１７１分子について、ＡｕｔｏＤｏｃｋ３．０．５を用いて詳細なドッキングを行った。その後、ドッキングの際に使用したスフィアーから４Å以内にある化合物に絞込み、更に計算が異常終了した分子を除去した。この結果、最終的に９９６１分子についてドッキング構造を得た。得られた化合物のうち、上述の結合部位との結合性が高い上位１００化合物をリガンド候補化合物とした。このリガンド候補化合物のΔＧ（結合自由エネルギー変化）は、−９．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であった。
（実施例６）ＮＭＲによるＳｅｑＡタンパク質のヘミメチル化ＤＮＡとの結合部位に結合する化合物のスクリーニング
実施例５で得られた各リガンド候補化合物をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、１ｍＭに調整した。実施例２で調製したＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質は緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｄ１１（ｐＨ７．５）／０．５Ｍ  ＮａＣｌとなるように重水に溶解したもの）を用いて１０３．７μＭの濃度に溶解した。これらを用いて、リガンド候補化合物単独と、そこにＳｅｑＡ（７１−１８１）タンパク質を１：１の比で加えたもの、との２種類の試料を用意した。
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リガンド候補化合物の終濃度は５０μＭとなる。
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リガンド候補化合物及びＳｅｑＡタンパク質の終濃度はそれぞれ５０μＭとなる。
上記それぞれの試料について、重水素中、２９８ＫでＢｒｕｋｅｒＤＲＸ５００ＮＭＲ分光計を用いて１次元１Ｈ−ＮＭＲを測定し、ＳｅｑＡタンパク質を添加する前後でスペクトルに変化があるかどうか観察した。その結果、リガンド候補化合物として、試料ＩＤ：ＡＫ９６８−４１１７０３３５、化合物名称：ｃｉｓ−６−［４−（４−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ］−３，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘ−３−ｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（化合物Ａ、−１０．４７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を用いた場合のＮＭＲスペクトル（７．５ｐｐｍ付近のシグナルを拡大したもの）を図６に示した。図６（ａ）は化合物Ａ単独、図６（ｂ）は化合物ＡとＳｅｑＡタンパク質とを混合したもの、図６（ｃ）は（ａ）と（ｂ）のシグナルを重ねてを比較したものである。これらの結果より、ＳｅｑＡとの相互作用により化合物Ａのベンゼン環の４個の水素に由来するシグナルが消失していることが認められ、該化合物がＳｅｑＡに結合していることが示唆された。
このような方法を用いて、実施例５で得られた１００種類のリガンド候補化合物の中からＤＭＳＯへの溶解度及びＮＭＲによるシグナルの検出可能なものについてＮＭＲスペクトルを測定した結果、ＳｅｑＡと相互作用が検出された化合物を以下の表４に示した。
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表４に示した化合物のうち、化合物Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，及びＪの化学構造は互いに類似することから、これらの化合物に共通の下記一般式（Ｉ）に示す化合物は、ＳｅｑＡのヘミメチル化ＤＮＡ結合部位に特異的に結合することが推測される。
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但し、Ａはシクロヘキセン、ジメチルシクロヘキセン、ビシクロ［２，２，１］ヘプタン、ビシクロ［２，２，１］ヘプテン、オキサ−ビシクロ［２，２，１］ヘプタンからなる群から選択される何れか１種の環を、Ｒ１及びＲ２は水素原子又はメチル基を、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。これらの化合物は、細胞内の生理的条件下においてＳｅｑＡタンパク質と結合することから塩の形態（ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等）であってもよく、分子内に不斉炭素原子を有する場合には光学活性体又はラセミ体であってもよい。
また、上記表４において、化合物Ａとは比較的化学構造の異なる化合物Ｆ，Ｉを用いた場合のＮＭＲスペクトルの測定をそれぞれ行い、図７に化合物Ｆを用いた場合の結果を示した。図７（ａ）は化合物Ｆ単独、図７（ｂ）は化合物ＦとＳｅｑＡタンパク質とを混合したもの、図７（ｃ）は（ａ）と（ｂ）のシグナルを重ねてを比較したものである。化合物Ａの場合と同様に、ＳｅｑＡタンパク質と混合することによって化合物Ｆの特徴的なシグナルが消失していることが認められ、化合物ＦについてもＳｅｑＡタンパク質との相互作用が示唆された。
更に、化合物Ｉを用いた場合にも上述と同様の特徴をもつＮＭＲスペクトルが得られ、ＳｅｑＡタンパク質との相互作用が示唆された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造モデルが提供される。本複合体の立体構造は、ヘミメチル化ＤＮＡとのタンパク質の結合様式、更に、該複合体による染色体ＤＮＡの複製の調節機構を理解する上で極めて有用である。ＤａｍメチラーゼによるＧＡＴＣ配列のメチル化は、大腸菌近縁の特殊なグループの細菌のみが有する構造であることから、本発明のＤＮＡ複製調節タンパク質による複製制御を阻害することで、上記細菌の増殖を特異的に調節できる可能性がある。本発明により明らかとなったＤＮＡ複製調節タンパク質の立体構造は、これらの薬剤を開発するためのスクリーニング方法として利用できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明において合成した種々の変異体ＳｅｑＡタンパク質の構造を模式的に示した図である。（ａ）は、２０種類の変異体ＳｅｑＡタンパク質の一次構造を示したものであり、（ｂ）は、ＳｅｑＡタンパク質の機能ドメインを示したものである。
図２は、ＤＮＡ複製調節タンパク質とヘミメチル化ＤＮＡとの複合体の立体構造モデルを表示するコンピュータシステムの一実施形態を表した概略図である。
図３は、変異体ＳｅｑＡタンパク質（７１−１８１）と１０塩基対のヘミメチル化ＤＮＡとの複合体結晶の立体構造を表したモデル図である。
図４は、大腸菌を含む種々の細菌が有するＳｅｑＡタンパク質の部分構造を、一次構造の相同性を考慮して並列して表したものである。図中、らせん構造はα−ヘリックスを矢印はβ−シートを形成する領域であることを示す。
図５は、１４塩基対のオリゴヌクレオチド（ＳｅｑＡ  ｂｓＣ−１４）と種々の変異体ＳｅｑＡタンパク質とのゲルシフトアッセイの結果を示したものである。（ａ）〜（ｆ）の各実験に用いた変異体ＳｅｑＡタンパク質は、それぞれ（ａ）：１−５９、（ｂ）：７−１８１、（ｃ）：１８−１８１、（ｄ）：４２−１８１、（ｅ）：６０−１８１、（ｆ）：７１−１８１のアミノ酸残基から構成されている。１〜４の各レーンは、それぞれ、１：Ｍ＋／Ｍ＋、２：Ｍ＋／Ｍ−、３：Ｍ−／Ｍ＋、４：Ｍ−／Ｍ−のフルメチル、ヘミメチル又は非メチル化ＤＮＡを添加したことを示す。
図６はリガンド候補化合物ＡＫ−９６８−４１１７０３３５（化合物Ａ）単独（ａ）、及び化合物ＡとＳｅｑＡタンパク質との１：１の混合物（ｂ）のプロトンＮＭＲスペクトル（７．５ｐｐｍ付近のシグナル）である。なお（ｃ）は（ａ）と（ｂ）のシグナルを重ねて比較したものである。
図７はリガンド候補化合物ＡＮ−９８９−１４０７２０１８（化合物Ｆ）単独（ａ）、及び化合物ＦとＳｅｑＡタンパク質との１：１の混合物（ｂ）のプロトンＮＭＲスペクトル（７．５ｐｐｍ付近のシグナル）である。なお（ｃ）は（ａ）と（ｂ）のシグナルを重ねて比較したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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