(57)【要約】予めプレートに設けられた穴の表面にビテロジェニンを認識する１次抗体を固相化し、該穴に環境に曝露された検体から得られた試料を注入して反応させた後、酵素により標識され、前記ビテロジェニンを認識する２次抗体を注入して反応させ、次いで発色剤を注入することにより発色反応させて該発色量を測定し、その発色量からビテロジェニン量を算出し、該ビテロジェニン量に基づいて環境を評価する。
2003104806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が注入される有底の穴を有するプレート本体と、前記穴の表面に固相化され、カエルビテロジェニンを認識する１次抗体とを有する測定プレートと、
前記１次抗体が固相化された穴に注入される標準カエルビテロジェニンと、
前記試料又は前記標準カエルビテロジェニンが注入された穴に注入され、前記カエルビテロジェニンを認識する２次抗体と
を具備することを特徴とする検出キット。
【請求項２】
前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることを特徴とする請求項１に記載の検出キット。
【請求項３】
前記２次抗体が、標識化合物により標識されていることを特徴とする請求項１に記載の検出キット。
【請求項４】
前記１次抗体は、前記穴の表面に吸着し、ブロッキング剤で前記穴の表面がブロックされていることを特徴とする請求項１に記載の検出キット。
【請求項５】
試料と、カエルビテロジェニンを認識し、標識化合物により標識された抗体が注入、混合される有底の穴を有する第１のプレートと、
前記試料と抗体の混合液が注入される有底の穴を有する第２のプレートと、
前記第２のプレートの穴の表面に抗原として固相化された標準カエルビテロジェニンと
を具備することを特徴とする検出キット。
【請求項６】
前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることを特徴とする請求項５に記載の検出キット。
【請求項７】
前記抗原は、前記第２のプレート穴の表面に固相化され、ブロッキング剤でブロックされていることを特徴とする請求項５に記載の検出キット。
【請求項８】
試料が注入される有底の穴を有するプレート本体と、
前記穴の表面に固相化され、カエルビテロジェニンを認識する１次抗体と、
を具備することを特徴とする測定プレート。
【請求項９】
試料と、カエルビテロジェニンを認識し、標識化合物により標識された抗体との混合物が注入される有底の穴を有するプレート本体と、
前記プレートの穴の表面に固相化された抗原としてのカエルビテロジェニンと  を具備することを特徴とする測定プレート
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出キットを用いてカエルビテロジェニンを検出することを特徴とする検出方法。
【請求項１１】
試料と、前記試料中に含まれるビテロジェニンを認識する１次抗体とを反応させる工程と、
前記試料中に含まれるビテロジェニンと前記抗体の複合体に、前記ビテロジェニンを認識する２次抗体とを反応させる工程と、
を具備することを特徴とする検出方法。
【請求項１２】
前記２次抗体は標識化合物により標識化されていることを特徴とする請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記複合体と結合した２次抗体と発色剤とを直接あるいは間接的に反応させて、その発色反応に基づき前記検体中のビテロジェニン量を測定する工程を更に具備することを特徴とする請求項１１又は１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
試料と、標識化合物により標識化され、前記試料中に含まれるビテロジェニンを認識する抗体とを反応させて複合体を得る工程と
前記複合体とビテロジェニンとを拮抗反応させる工程と
を具備することを特徴とする検出方法。
【請求項１５】
前記拮抗反応により得られた反応生成物と発色剤とを反応させて、その発色反応に基づき前記検体中のビテロジェニン量を測定する工程を更に具備することを特徴とする請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
試料と、前記試料中に含まれるビテロジェニンを認識する抗体とを反応させる工程と、
前記試料中に含まれるビテロジェニンと前記抗体の複合体に、標識化合物により標識され、前記ビテロジェニンを認識する２次抗体とを反応させる工程と、
前記複合体と結合した２次抗体の標識と発色剤とを反応させて、該発色量を測定する工程と、
前記発色量からビテロジェニン量を算出し、該ビテロジェニン量に基づいて評価する工程と
を具備することを特徴とする評価方法。
【請求項１７】
前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることを特徴とする請求項１６に記載の環境評価方法。
【請求項１８】
試料と、標識化合物により標識化され、前記試料中に含まれるカエルビテロジェニンを認識する抗体とを反応させて複合体を得る工程と、
前記複合体とビテロジェニンとを拮抗反応させる工程と、
前記拮抗反応により得られた反応生成物と発色剤とを反応させて、その発色反応に基づき前記検体中のビテロジェニン量を算出し、該ビテロジェニン量に基づいて評価する工程と
を具備することを特徴とする評価方法。
【請求項１９】
前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることを特徴とする請求項１８に記載の評価方法。
【請求項２０】
哺乳動物にカエルビテロジェニンを抗原として免疫し、
前記免疫した哺乳動物から抗血清を採取し、
前記抗血清からＩｇＧとして単離することにより得られることを特徴とするカエルビテロジェニンのポリクローナル抗体。
【請求項２１】
哺乳動物にカエルビテロジェニンを抗原として免疫して採取した抗血清から得られるＩｇＧをアフィニティカラムを用いて精製することにより得ることを特徴とするカエルビテロジェニン抗体の製造方法
【請求項２２】
前記アフィニティカラムが雄カエル血清タンパク質と結合していることを特徴とする請求項２１に記載のカエルビテロジェニン抗体の製造方法。
【請求項２３】
前記アフィニティカラムがカエルビテロジェニンと結合していることを特徴とする請求項２２に記載のカエルビテロジェニン抗体の製造方法。
【請求項２４】
両生類に由来する肝細胞を培養する工程と、
前記肝細胞に対し試料を投与する工程と、
前記培養肝細胞の試料に対する応答を検出する工程と、
を具備した評価方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、例えばカエルビテロジェニンを使って環境を評価する技術の分野に属するものである。また、本発明は、特にカエルビテロジェニンの検出キット、測定プレート、ビテロジェニンの検出方法、評価方法及びカエルビテロジェニンのポリクローナル抗体に関する。
背景技術
近年、ヒトをはじめとする生体及び生態系に対する様々な化学物質の影響が問題となっている。
中でも、生体の内分泌系を撹乱し、その恒常性を阻害する「内分泌撹乱化学物質」、通称、環境ホルモンの影響が深刻化している。
内分泌撹乱化学物質（以下、環境ホルモンとも言う）は、本来生体が備えているホルモンと類似の作用、あるいはその作用の阻害等を引き起こし、それにより生体に対して異常をひきおこすと考えられている。内分泌撹乱化学物質の作用点として、例えば、ホルモンレセプターとの結合、ホルモン（リガンド）との結合、ホルモンの生体内での合成、ホルモンの代謝等の局面が指摘されているが、生体に対する内分泌撹乱化学物質の作用機序は多岐に亘ることから、現在までのところ、内分泌撹乱化学物質による内分泌撹乱作用のメカニズムについては明確に把握されていない。
ところで、内分泌撹乱化学物質の生体に対する影響は、専ら、形態異常や行動異常を指標として確認されてきた。しかしながら、形態異常や行動異常を指標とした場合、これらは定量化が困難であり、かつ感度・精度も低いことから、化学物質の作用を形態異常や行動異常により見積もるのは危険が大きく、また困難である。そこで、形態異常や行動異常といった、生体の表現系に異常が生じる以前に、定量性をもって、化学物質あるいは環境の生体に対する作用を評価するための分子マーカーが求められている。
このような特性を備えた分子マーカーの一つとして、産卵性動物の卵黄蛋白前駆体であるビテロジェニンが注目されている。ビテロジェニンは通常雌個体の肝臓で繁殖期に活発に合成されるものであり、雄の血中にはビテロジェニンは通常検出されないか元々存在しない。このような特性から、ビテロジェニンは、高感度で、かつ定量性をもって化学物質あるいは環境の内分泌撹乱作用を評価できるマーカーとして注目されているのである。
このビテロジェニンを検出するため、例えば特開平２００１−２１８５８２、特開平２００１−１２２８９９、特開平２０００−１２５８６７等ではコイ、メダカ等の魚類のビテロジェニン検出方法等についての記載があり、実際にこれらビテロジェニンの検出キットも実用化されている。
発明の開示
しかしながら、化学物質の生態系全体に対する影響を把握し対処するためには、魚類のみならず、様々な栄養段階、系統進化段階に位置する生物について、化学物質の効果を正当に調査し評価しなくてはならない。
また、ビテロジェニンの構造は非常に複雑であり、また種によってかなり多様化しているため、特定の種に対して構成された既存の検査キットにより、他種に由来するビテロジェニンを測定することは非常に困難である。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、両生類、特にカエルのビテロジェニンを定量性に優れ、かつ高感度に検出し、化学物質あるいは環境評価を精度よく行うための技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、以下に示す手段により上記目的を達成した。
すなわち、本発明のカエルビテロジェニンの検出キットは、試料が注入される有底の穴を有するプレート本体と、前記穴の表面に固相化され、カエルビテロジェニンを認識する１次抗体とを有する測定プレートと、前記１次抗体が固相化された穴に注入される標準カエルビテロジェニンと、前記試料又は前記標品が注入された穴に注入され、前記カエルビテロジェニンを認識する２次抗体とを具備することを特徴とする。
また、別の観点によれば本発明の他の形態に係る検出キットは試料が注入される有底の穴を有するプレート本体と、前記穴の表面に固相化され、カエルビテロジェニンを認識する１次抗体と、前記１次抗体が固相化された穴に注入される標準カエルビテロジェニンと、前記試料又は前記標品が注入された穴に注入され、前記カエルビテロジェニンを認識する２次抗体とを具備することを特徴とする。
ここで、環境とは、環境中に存在する化学物質、又は該化学物質により汚染された環境を指す。
また、ここで言う試料とはカエルの血漿もしくは血清、組織及び細胞等である。本発明に用いることができるカエルの例としては、例えば、アカガエル（Ｒａｎａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、トノサマガエル（Ｒａｎａ  ｎｉｇｏｒｏｍａｃｕｌａｔａ）、ツチガエル（Ｒａｎａ  ｒｕｇｏｓａ）、ヒメアマガエル（Ｍｉｃｒｏｈｙｌａ  ｏｒｎａｔａ）、スズガエル（Ｂｏｍｂｉｎａ  ｂｏｍｂｉｎａ）及びアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等を用いることができる。これらの中でも、アフリカツメガエルを用いた場合には、季節を問わず大量の卵ひいては成体を得ることができ個体の維持も容易であることから好ましい。
本発明では、上記のような構成により、迅速且つ容易にカエルビテロジェニンを検出することが可能となる。
本発明では、特に、カエルビテロジェニンを認識する１次抗体がプレートの穴表面に固相化されているため、例えば後述する本発明の検出方法に係るサンドイッチ酵素免疫法でビテロジェニンを検出することが可能となる。
従来のビテロジェニン検出キットは、魚類のみを対象としたものであったが、本発明によればカエルを始めとする両生類のビテロジェニンを精度良く測定することができるので、これらの種における化学物質等の評価を正当に行うことが可能となる。
また、カエルは産卵性動物でもあり、発生過程における養分を担保するために卵内に大量の卵黄タンパク質を蓄積する。ビテロジェニンは、この卵黄タンパク質の前駆体であり、通常ならば雌個体の肝臓で合成されるものであり、雄には存在しない。しかしながら、エストロジェン等に曝露された雄個体の場合には、本来合成されることのないビテロジェニンの合成が肝臓で行われることから、該ビテロジェニンは、内分泌撹乱化学物質による内分泌撹乱作用メカニズムが不明であっても、環境における内分泌撹乱性を感度良く評価できるマーカーとして有効である。
また、カエルの生活環は水陸双方の環境に亘っているので、河川、湖沼、地下水などの水系若しくは周辺土壌の化学物質等に曝されるだけでなく、大気中の化学物質等にも曝されるという特徴がある。このため、野生生物に対する環境ホルモン等の化学物質の影響を評価する上で、カエルを利用する利点は大きい。
また、前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることを特徴とする。
本発明の検出キットに用いられる試料としては、野生若しくは環境に一定期間曝露したカエル、あるいは実験室内で化学物質に曝露したカエル等の血漿もしくは血清又はある種の組織若しくは細胞に由来した試料を用いることができる。
これらを試料として用いることにより、検出精度を向上させることが可能となる。
また、プレートは、複数の穴を設けていることが好ましく、種々の公知のプレートを使用することができる。穴が複数あることにより様々な試料を同時に処理することができるので、処理効率が向上する。
また、穴表面に抗体が固相化されているため、試料を分注することで速やかに抗原抗体反応がおこり、迅速な処理を行うことができる。
また、前記２次抗体が、標識化合物により標識されていることを特徴とする。
ここで、標識化合物とは、例えばＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）等の酵素や、ビオチン等をいう。
これにより、２次抗体あるいは２次抗体および２次抗体を認識する酵素標識検出体をプレート注入後発色剤と反応させることにより該標識酵素が発色し、この発色量を吸光度測定することによりビテロジェニン量を定量することができる。
前記１次抗体は、前記穴表面に吸着し固相化され、ブロッキング剤でブロッキングされていることを特徴とする。
これにより固相化された１次抗体は、確実に固定されるため、検出結果の信頼性も向上する。
また、本発明の別の形態に係る検出キットは、試料と、カエルビテロジェニンを認識し、標識化合物により標識された抗体が注入、混合される有底の穴を有する第１のプレートと、前記試料と抗体の混合液が注入される有底の穴を有する第２のプレート本体と、前記第２のプレートの穴の表面に抗原として固相化された標準カエルビテロジェニンとを具備することを特徴とする。
このような構成によれば、酵素免疫法の中でも特に拮抗法に好適なキットとなり、この方法により効率良く処理を行い、適正な結果を得ることができる。
また、前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることが好ましい。これにより効率良くビテロジェニンを検出することができる。
また、前記抗原は、前記穴表面に吸着し固相化され、ブロッキング剤でブロッキングされていることを特徴とする。
これにより非特異的抗体の結合が排除されているため、評価の信頼性も向上する。
本発明の測定プレートは、試料が注入される有底の穴を有するプレート本体と、前記穴の表面に固相化され、カエルビテロジェニンを認識する１次抗体とを具備することを特徴とする。
このような構成によれば、サンドイッチ法に係る検出キットの測定プレートとして用いることによりカエルビテロジェニンを効率良く検出することができる。
すなわち、プレート表面に予め抗体を固相化しているため、ここに試料を分注するだけで速やかに抗原抗体反応を得ることが可能となる。また、処理毎にプレートに抗体を固相化する必要もないので、結果のばらつきを防止することが可能となる。
また、本発明の別の形態に係る測定プレートは、試料とカエルビテロジェニンを認識し、標識化合物により標識された抗体との混合物が注入される有底の穴を有するプレート本体と、前記プレートの穴の表面に固相化された抗原としてのカエルビテロジェニンとを具備することを特徴とする。
このような構成によれば、この場合プレート表面には抗原を固相化しているため、拮抗法に係る検出キットの測定プレートとして用いることができ、それによりカエルビテロジェニンを効率良く検出することができる。
本発明の検出方法は、上述した検出キットを用いてカエルビテロジェニンを検出することを特徴とする。
このような構成によれば感度の良い検出キットを用いることができるので、検出の信頼性が向上する。
また、別の形態に係るカエルビテロジェニンの検出方法は、試料と、前記試料中に含まれるビテロジェニンを認識する抗体とを反応させる工程と、前記試料中に含まれるビテロジェニンと前記抗体の複合体に、標識化合物により標識され、前記ビテロジェニンを認識する２次抗体とを反応させる工程とを具備することを特徴とする。
このような構成によれば、酵素免疫法を用いてビテロジェニンを検出するので、検出精度も向上し、処理時間の短縮も可能となる。特に、本発明の検出方法は、サンドイッチ法に好適な方法であり、ビテロジェニンの検出感度を向上させることができる。
また、前記複合体と結合した２次抗体と発色剤とを反応させて、その発色反応に基づき前記検体中のビテロジェニン量を測定する工程を更に具備することを特徴とする。
これにより、サンドイッチ法により標識されたビテロジェニンを確実に定量することが可能となる。
また、本発明のカエルビテロジェニンの検出方法に係る別の形態としては、試料と、酵素により標識され前記試料中に含まれるビテロジェニンを認識する抗体とを反応させて複合体を得る工程と前記複合体とビテロジェニンとを拮抗反応させる工程とを具備することを特徴とする。
本形態に係る検出方法は、拮抗法であり、このような構成によりビテロジェニンの検出感度を試料の形態に応じて向上させることが可能となる。
また、前記拮抗反応により得られた反応生成物と発色剤とを反応させて、その発色反応に基づき前記検体中のビテロジェニン量を測定する工程を更に具備することを特徴とする。
これにより、拮抗反応により検出されたビテロジェニンを確実に定量することが可能となる。
このように、本発明の検出方法は、いわゆる酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ法）であり、サンドイッチ法、拮抗法いずれの方法であっても好適に行うことができる。
これにより、様々な試料を用いる場合でも、試料形態にあわせた感度の良い酵素免疫法を用いることが可能となる。
また、該検出方法で用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であっても良く、モノクローナル抗体であっても良い。
また、前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることが好ましい。これにより検出精度が向上する。
本発明の評価方法は、試料と、前記試料中に含まれるビテロジェニンを認識する抗体とを反応させる工程と、前記試料中に含まれるビテロジェニンと前記抗体の複合体に、標識化合物により標識され、前記ビテロジェニンを認識する２次抗体とを反応させる工程と、前記複合体と結合した２次抗体の標識酵素と発色剤とを反応させて、該発色量を測定する工程と、前記発色量からビテロジェニン量を算出し、該ビテロジェニン量に基づいて環境を評価する工程とを具備することを特徴とする。
このような構成によれば、サンドイッチ法に基づいて、的確な環境評価を行なうことが可能となる。
また、前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることが好ましい。
また、本発明に係る別の形態の評価方法は、試料と、標識化合物により標識化され、前記試料中に含まれるビテロジェニンを認識する抗体とを反応させて複合体を得る工程と、前記複合体とビテロジェニンとを拮抗反応させる工程と、前記拮抗反応により得られた反応生成物と発色剤とを反応させて、その発色反応に基づき前記検体中のビテロジェニン量を算出し、該ビテロジェニン量に基づいて環境を評価する工程とを具備することを特徴とする。
また、本形態においても、前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることが好ましい。
このような構成によれば、拮抗法に基づいて、精度よく環境評価を行なうことができる。
また、上述したように、本発明の評価方法は酵素免疫法におけるサンドイッチ法又は拮抗法両方を適宜用いることができるため、様々な試料形態に対応して評価を行なうことが可能となる。
本発明のカエルビテロジェニンのポリクローナル抗体は、哺乳動物にカエルビテロジェニンを抗原として免疫し、前記免疫した哺乳動物から抗血清を採取し、前記抗血清からＩｇＧとして単離することにより得られることを特徴とする。
このようにして得られた抗体を用いることにより、特異的且つ高感度にカエルビテロジェニンを検出し、適切な環境評価を行うことが可能となる。
本発明のポリクローナル抗体の製造方法は、哺乳動物にカエルビテロジェニンを抗原として免疫して採取した抗血清から得られるＩｇＧを、アフィニティカラムを用いて精製することにより得られることを特徴とする。
また、前記アフィニティカラムが雄カエル血清タンパク質と結合していることを特徴とする。
また、前記アフィニティカラムがカエルビテロジェニンと結合していることを特徴とする。
このような構成とすることにより、抗体そのものの結合特異性も向上するため、それにより検出、評価方法の精度も向上することができる。
本発明の別の形態に係る評価方法は、（両生類）に由来する肝細胞を培養する工程と、前記肝細胞に対し試料を投与する工程と、前記培養肝細胞の試料に対する応答を検出する工程とを具備することを特徴とする。
ここで、用いられる肝細胞は成体および幼生をはじめとする両生類のものを用いることができる。
また、評価試料とは、種々の化学物質や、例えば河川の水、工場廃水、下水処理場の処理水若しくは土壌の抽出成分等の環境試料をさす。
このような構成によれば、肝細胞を用いて、多数の試料に対して、経済的、迅速かつ簡便に、生体内のホルモン等に影響されず、肝細胞の応答が直接検定でき、厳密な曝露条件設定も可能となる。
本発明の別の形態に係る検出方法は、前記検出キットを用いてビテロジェニンを検出することを特徴とする。
ここで、応答とは、主にビテロジェニンの合成誘導を指すが、この他にもトランスフェリンやアルブミン等の誘導を指標とすることにより、他の環境ホルモンに属する化学物質の作用等を多面的に評価することが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態を図面に基づき説明する。
まず、検出キットについて説明する。この検出キットは酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ法）を用いてカエルビテロジェニンを精度良く検出するものであり、ＥＬＩＳＡ法の中でもサンドイッチ法及び拮抗法のどちらに対しても対応できるようになっている。
まず、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてカエルビテロジェニンを検出する検出キットを図に基づいて説明する。図１は本実施形態に係るビテロジェニンの検出キット１全体の構成を模式的に示す図である。
ここで、検出キット１の構成としては、試料が注入されるビテロジェニンを認識する１次抗体１２を固相化してある有底の穴１０１を有するプレート１０と、標品としての参照用カエルビテロジェニン１１と、酵素やビオチン等により標識された２次抗体１３とが含まれている。
また、これらの他に、試料を希釈する検体希釈液１４、抗体を希釈する抗体希釈液１５、２次抗体１３の標識の発色反応を行うための基質溶液と発色剤１６、処理中の液を安定させるための緩衝液１７、過剰反応を抑制する反応停止液１８あるいは所定時にプレートを洗浄するための洗浄液１９等、通常のＥＬＩＳＡ法に用いられる試薬等が含まれている。
検出キット１ではこのような構成により、プレート１０の穴１０１に、環境に曝露されたカエルから採取した試料を注入し、試料に含まれているビテロジェニンと、標品１１、１次抗体１２及び２次抗体１３との抗原抗体反応を行い、それをＥＬＩＳＡ法に基づいて検出することにより、感度良くビテロジェニンを検出することができる。
ここで、検出キット１に用いられる試料としては、野生若しくは環境に一定期間曝露したカエル、あるいは実験室内で化学物質に曝露したカエル等の体液又は組織若しくは細胞に由来した試料を用いることができる。好ましくは、後述するようにカエルの血漿、肝臓のホモジネート、初代培養肝細胞が良い。ビテロジェニンは、肝臓で合成され、血液にて運ばれるため、これらを試料とすることにより、精度よくビテロジェニンの検出を行うことができる。
また、前記試料がカエルの血漿もしくは血清であることが好ましい。また、培養肝細胞であることが好ましい。
組織の場合は肝臓ホモジネートであることが好ましく、また細胞の場合には初代培養肝細胞であることが好ましい。
これにより、カエル体内のビテロジェニンの検出感度を向上させることが可能となる。
また、これら試料、１次抗体、２次抗体及び標品ビテロジェニンは、上述した緩衝液で希釈して処理を行うようになっている。
また、２次抗体の標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やビオチン等が好ましいが、その他従来公知の標識を種々用いることができる。
図２は本実施形態に係る検出キット１のプレート１０の模式図である。
図２に示すように、この検出キットのプレート１０には、試料を注入するための穴１０１が複数設けられている。ここでは例えば１列当り８個の穴を設けたプレートが１２個つながることにより９６穴設けられており、この穴１０１内で一連の処理が行われるようになっている。この穴の部分断面図を図３に示す。
穴１０１の表面は、ここでは後述する検出方法のうちサンドイッチ法を用いることにより、予め抗体を固相化するようになっている。図３では例として１次抗体１１１が固相化されている状態を示している。
次に拮抗法に用いられる検出キットの構成について概要を説明する。キットとして用いられる試薬等はほぼサンドイッチ法と同じであるが、図４に示すように、拮抗法では、プレート２０の穴２０１には抗原としてカエルビテロジェニン２１１が固相化されており、さらに別のプレート（図示せず）で、予め試料と標識された抗体とを混合させておき、この混合物をプレート２０に注入し、その反応を測定することによりビテロジェニンを検出できるようになっている。
このように、本実施形態に係る検出キットを用いることにより、試料中に含まれるビテロジェニンの量が低濃度であっても、高感度に検出することが可能となり、それにより緻密な環境評価を行うことが可能となる。また、予め抗原若しくは抗体を固相化しておくことにより、利便性も向上し、処理も迅速化することができ、更には得られる結果の信頼性も向上させることができる。
従来のビテロジェニンを検出するためのキットはメダカやコイ等魚類のビテロジェニンの検出に限られており、魚類以上の体制を有する高等生物に対応できなかったが、この検出キットによれば、カエルという両生類のビテロジェニンを検出することが可能となり、網羅的に環境を評価することができる。
次に、カエルビテロジェニンの検出方法について説明する。
本実施形態に係る検出方法は、上述した検出キットを用いて行うものであり、酵素免疫法、すなわちＥＬＩＳＡ法に基づきビテロジェニンを検出する方法である。
ここで、ＥＬＩＳＡ法ではサンドイッチ法及び拮抗法という２つの方法が知られているが、この検出方法ではそのどちらの方法にも対応している。
以下、各方法における工程を図に基づき説明する。図４は拮抗法による検出方法の工程を説明する工程図である。図５はサンドイッチ法による検出方法の工程を説明する工程図である。
拮抗法
まず、固相抗原として標品の固相化を行う。標品ビテロジェニンを希釈してマイクロプレートに分注して、インキュベーションし（ステップ４０１）固相化を行う。所定時間経過した後にプレートを洗浄し（ステップ４０２）、ブロッキング剤を分注してプレート穴表面のブロッキングを行う（ステップ４０３）。その後余分な薬剤を除去するためプレート洗浄を行う（ステップ４０４）。
この固相化を行っている時に平行して、別のプレートでＨＲＰ標識抗体と環境に曝露した検体試料（若しくは抗原）を混合し（ステップ４００１）、インキュベーションする（ステップ４００２）。このようにして得られた抗原抗体複合体を固相化抗原プレートに分注して拮抗反応させる（ステップ４０５）。次いでプレートを洗浄し（ステップ４０６）、その後発色基質を注入して発色反応させる（ステップ４０７）。反応が終わるとマイクロリーダー等で吸光度を測定し（ステップ４０８）、その値からビテロジェニン量を算出する（ステップ４０９）。
サンドイッチ法
マイクロプレートの各穴に１次抗体の希釈液を分注し、所定時間インキュベーションする（ステップ５０１）。その後プレートを洗浄し（ステップ５０２）、ブロッキング剤を分注して固相化する（ステップ５０３）、次いで、環境に曝露した検体試料若しくは標品ビテロジェニン（希釈液）を分注して、反応する（ステップ５０４）。その後、プレートを洗浄し（ステップ５０５）、次いで２次抗体を分注、反応させる（ステップ５０６）。次いでプレートを洗浄し（ステップ５０７）、その後発色基質を分注して発色反応させる（ステップ５０８）。発色反応後、マイクロリーダー等により吸光度を測定し（ステップ５０９）、その結果に基づきビテロジェニン量を算出する（ステップ５１０）。
上述したように、この検出方法では２通りの検出方法を用いることが可能であり、様々な検体を用いることができる。また、これにより検出感度も向上させることができる。
次に、環境評価方法について説明する。
本実施形態に係る環境評価方法は、上述した検出キットと検出方法を用いることにより、従来検出できなかったカエルビテロジェニンを用いることを可能として環境中の環境ホルモン等内分泌撹乱性化学物質及び種々の化学物質の影響を評価するものである。
現在実用化されているビテロジェニン検出キットとしてはメダカやコイ等の魚類に対応したものしかなく、魚類以外の生物を含めた網羅的な環境評価ができないという不具合があったが、本発明の環境評価方法ではカエルを用いているため、カエルから検出されるビテロジェニン量に基づいて、網羅的に環境を評価できるという利点がある。
ここで、検体として用いるカエルを環境に曝露する方法としては、飼育水への対象物質の添加や、各個体への直接注入等の方法が用いられる。また、野生に存在しているカエルを採取して、そこから試料を得ることにより、容易且つ高精度に自然環境そのものを評価できるので、様々な環境に対する評価が可能となる。
本実施形態に係る環境評価方法では、このようにして得られた検体及び対照区で飼育した検体のそれぞれから試料を作製し、検体中のビテロジェニン量を測定、対照区と比較することで対象物質の内分泌撹乱作用や化学物質の毒性を判断することができる。すなわち、評価対象となる化学物質（例えばビスフェノールＡ，フタル酸エステル等）の存在下で雄のカエルを飼育し、経時的に血漿中のビテロジェニン量を測定し、対照区のカエルから得られた血清中のビテロジェニン量と比較する。その結果、実験区の両生類から得られたビテロジェニン量が対照区の量と比較して高い場合は、評価対象となる化学物質が内分泌撹乱作用を有すると判断される。あるいは、雄のカエルを、基準となるエストロジェンと評価対象となる化学物質との共存下で飼育した後、血液などを採取し、試料中に含まれるビテロジェニンを本発明の抗体と反応させてビテロジェニン量を測定し、得られた測定値の大小により、化学物質の毒性（例えば内分泌撹乱作用）を評価することができる。すなわち、評価対象となる化学物質の存在したで雄のカエルを飼育し、経時的に血清中のビテロジェニン量を測定し、対照区のカエルから得られた血清中のビテロジェニン量と比較する。その結果、実験区のカエルから得られたビテロジェニン量が対照区の量と比較して低い場合、評価対象となる化学物質は、内分泌撹乱作用を有すると判断される。
また、ある濃度のエストロジェン存在下で飼育したときのビテロジェニン濃度と、評価対象となる化学物質存在下で飼育したときのビテロジェニン濃度とを比較することにより、評価対象となる化学物質の内分泌撹乱作用の強度をエストロジェンと相対化して評価することが可能である。すなわち、ある濃度（例えば１．０ｐｐｍ）のエストロジェン存在下で飼育したときのビテロジェニン量が、内分泌撹乱作用の強度が不明であって、ある濃度（例えば０．１ｐｐｍ）の化学物質の存在下で飼育したときのビテロジェニン量と同じである場合は、当該化学物質の内分泌撹乱作用はエストロジェンに対して１０倍強いと判断することができる。
また、当該評価方法によれば、評価対象となる河川や湖沼等に生息する雄のカエルの体液中のビテロジェニン量を測定することにより、内分泌撹乱作用を有する化学物質による環境の汚染状態を評価することも可能である。
次にカエルビテロジェニンのポリクローナル抗体について説明する。
上記カエルビテロジェニンのポリクローナル抗体は、従来公知の様々な方法のいずれかによって製造することができる（例えばＳａｍｂｒｒｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）が、以下に示すポリクローナル抗体の製造方法により製造された抗体が好ましい。以下、その製造方法に基づきこのポリクローナル抗体の説明をして行く。
哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギ等にカエルビテロジェニンを抗原として投与し、免疫する。抗原の動物１匹当りの投与量は、例えばアジュバントを用いるときは５００〜１０００μｇである。アジュバントとしてはフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等があげられる。免疫は、主として皮下注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは初回免疫から３週間後に、２週間間隔で１〜２回免疫を行う。そして、最終免疫日から５〜２０日後、好ましくは７〜１４日後に抗血清を採取する。次いで、得られた抗血清から硫安分画法およびＤＥＡＥ−セファデックスカラムクロマトグラフイーによりＩｇＧを得る。
ここで、ビテロジェニン特異抗体を得るためにはカエル血清タンパク質と結合した吸着カラムを用いて吸着精製させ、更にカエルビテロジェニンと結合したカラムを用いてアフィニティ精製することが望ましい。
このように、単に抗血清よりＩｇＧを単離するだけでなく、アフィニティ精製することにより、ポリクローナル抗体の特異性と感度向上が可能となる。
本実施形態に係るビテロジェニンの製造方法では、カエル体内でビテロジェニンの合成誘導を行い、前記カエルから血液を採取して上清を採取し、前記上清を分離精製するようになっている。ここで、上清の分離精製方法としては、遠心分離や、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、効率良く、且つ精度良くビテロジェニンを製造することができる。
（実施例）
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されないことは言うまでもない。
＜実施例１．アフリカツメガエルを用いたビテロジェニンアッセイ法＞
（１）装置：タンパク精製システム、マイクロプレートリーダー（東ソー社製）
（２）材料：アフリカツメガエル雄成体
１７β−エストラジオール：ＣＡＳ  Ｎｏ．：５０−２８−２、分子式、分子量：２７２．４
Ｌｏｔ  Ｎｏ．：１９Ｃ−０５１９（入手先：ＳＩＧＭＡ）
抗ビテロジェニンウサギ抗血清：１９７９年に作成され−８０℃保存していたものを用いた
（３）ビテロジェニン抗原の製造例
ビテロジェニンタンパク質を得るために、アフリカツメガエル成体雄に１０ｍｇ／ｍｌ  １７β−エストラジオール（以下Ｅ２ともいう）を含むプロピレングリコール溶液を３０μｇ／ｇ  ＢＷ（Ｂｏｄｙ  Ｗｅｉｇｈｔ）の濃度で注射し、ビテロジェニンの合成誘導をおこなった。８日間の飼育後に採取した血液を凝固させ、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清（血清）を採取した。この血清サンプル１ｍｌずつを陰イオン交換クロマトグラフィーシステム（ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄエコノシステム）で分離精製し、ビテロジェニン標品を得た。ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を標準タンパク質としてＢＣＡ試薬により定量し、０．５ｍｇ／ｍｌの５０％グリセロールＰＢＳ溶液として、−２０℃で保存した。これを以下の実験の標準ビテロジェニン溶液として用いた。
（４）ビテロジェニン抗体の製造例
−８０℃凍結保存の抗ビテロジェニンウサギ抗血清１０ｍｌから、硫安分画によりＩｇＧ抗体を回収した。ビテロジェニンに対する抗体の純化のため、回収したＩｇＧ抗体液を、アフリカツメガエル正常雄血清を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ吸着カラムで精製した。また、精製したビテロジェニン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムによってアフィニティ精製を行った。標識抗体作製のため、精製抗体に過ヨウ素酸酸化法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を共有結合させた（ＨＲＰ標識ポリクローナル抗体）。
以上のようにして、吸収精製ポリクローナル抗体およびアフィニティ精製ＨＲＰ標識ポリクローナル抗体の２種類を、以下の実験の抗体溶液として用いた。
（５）ウェスタンブロッティングによるビテロジェニン検出法（比較例）
ＳＤＳ−７．５％アクリルアミドゲルを作成し、上述したようにＥ２を注射により投与したアフリカツメガエル成体雄血清および正常雄血清をそれぞれ０．０５μｌと、精製ビテロジェニン抗原７．５−７５０ｎｇ範囲の希釈系列を電気泳動し、ゲル中の分離タンパク質をセミドライ法によりメンブレンにブロッティングした。ビテロジェニンポリクローナル抗体１μｇ／ｍｌで免疫反応を行ったのち、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体と反応させ、化学蛍光発色法によりビテロジェニンをＸ線フィルム上で検出した。これにより、抗体の特異性およびウェスタンブロッティングによる検出感度を検証した。
（６）ＥＬＩＳＡによるビテロジェニン検出法
ＥＬＩＳＡによるビテロジェニンの検出はａ）サンドイッチ法、ｂ）拮抗法の２種類で行い、精製したビテロジェニン標品の希釈系列を用いて検出感度を比較検討した。
それぞれの検出手順は、予備実験ののち下記の通りに設定した。
実施例１ａ：拮抗法
１．ビテロジェニン抗原の固相化
ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍｌの標準ビテロジェニンを５０μｌずつマイクロプレートに分注し３７℃で２時間インキュベートする
１．プレート洗浄（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）
２．プレートのブロッキング（０．５％  Ｉ−Ｂｌｏｃｋ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）
３．ＨＲＰ標識ポリクローナル抗体に対する抗原の拮抗反応
別のプレート上で、抗原３０μｌと１μｇ／ｍｌ  ＨＲＰ標識ポリクローナル抗体３０μｌ（ブロッキング液希釈）を混合し、１時間室温でインキュベートする
４．固相化プレートの洗浄（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）
５．固相化抗原への抗体結合反応
４．の混合液５０μｌを固相化プレートに移し、１時間室温でインキュベートする
６．プレート洗浄（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）
７．発色基質ＡＢＴＳを用いたペルオキシダーゼ反応
８．プレートリーダーによる４０５ｎＭの吸光度測定
実施例１ｂ：サンドイッチ法
１．ビテロジェニン抗体の固相化
ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍｌの抗ビテロジェニン抗体を５０μｌずつマイクロプレートに分注し４℃で一晩インキュベートする
２．プレート洗浄（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）
３．プレートのブロッキング（０．５％  Ｉ−Ｂｌｏｃｋ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）
検体あるいは標準抗原と固相化抗体の反応：室温２時間、抗原はブロッキング液で希釈する。
４．プレート洗浄（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）
５．ＨＲＰ標識ビテロジェニンポリクローナル抗体との反応
ブロッキング液で希釈した２μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ビテロジェニン抗体を５０μｌ加え、室温１時間インキュベートする。
６．プレート洗浄（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）
７．発色基質ＡＢＴＳを用いたペルオキシダーゼ反応
８．プレートリーダーによる４０５ｎＭの吸光度測定
（８）実験結果
○ポリクローナル抗体の特異性
Ｅ２を注射したアフリカツメガエル成体雄の血清、および正常成体雄の血清を用いてウェスタンブロッティングを行い、本抗体による免疫染色を行った。精製前の抗体を用いると、それぞれの血清に共通するタンパク質が検出された（図６−Ａ）。一回の吸収カラム精製により抗体のビテロジェニンに対する特異性が高まり、正常成体雄の血清タンパク質とは免疫反応を示さなくなった（図６−Ｂ）。
○ＥＬＩＳＡの検出感度
本抗体を用いたビテロジェニン検出方法において、ＥＬＩＳＡ拮抗法、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法、ウェスタンブロット法の３つについて、現在用いている条件設定での検出感度を比較した。
ＥＬＩＳＡによる二つの方法について、標準ビテロジェニン濃度を０．１〜４０００ｎｇ／ｍｌの範囲で設定し、検出感度を検証したところ、拮抗法では最低検出限界（３ＳＤ）が２０ｎｇ／ｍｌ程度（図７−Ａ）であったのに対し、サンドイッチ法では最低検出限界（３ＳＤ）が３ｎｇ／ｍｌ程度（図７−Ｂ）となり、低濃度側のビテロジェニンを検出するためにはサンドイッチ法がより検出感度が高いことを示す結果となった。ただし、直線性を示す定量限界は３０ｎｇ／ｍｌ程度であった。
また、比較例としてビテロジェニン量を７．５−７５０ｎｇの範囲に設定し、ウェスタンブロッティングにより検出した結果、１０ｎｇ程度で検出可能であった（図８）。
（８）考察
環境物質のビテロジェニン合成への影響評価を行うには、雄成体内で合成されたビテロジェニンをできるだけ低濃度で検出できる測定法が必要であると考えられる。そのため以下の検討を行った。
凍結保存されていた抗血清を、正常雄血清タンパク質結合カラムで吸収操作を施すことにより、ビテロジェニンに対する特異性が格段に上昇した。特異性をあげることは、低濃度のビテロジェニン検出に有効であると考えられる。
２種のＥＬＩＳＡ検出方法による感度の違いを抗原の最低検出濃度で比較した。ＥＬＩＳＡ拮抗法では２０ｎｇ／ｍｌ程度であったのに対し、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法では３ｎｇ／ｍｌ程度であった。拮抗法では、低濃度側での測定値のばらつきが大きく、サンドイッチ法では少ないので、サンドイッチ法がより低濃度抗原の検出に有効であった。また、抗体の固相化を十分に行うことにより抗原と抗体との衝突頻度を高めることが好感度化には有効であると考えられ、プレートに薬品処理を施す等抗体の固相化効率を上げることが有効であると思われる。
また、比較例としてウェスタンブロッティングの検出感度を検討した。その結果、約１０ｎｇ以上で定量的に検出された。ウェスタンブロッティングはＥＬＩＳＡ法より検出感度が低い傾向があり、操作が煩雑で検出に時間がかかるが、抗原を定性的に確認することができるという利点がある。ビテロジェニンは分解されやすく、同法では分解産物を検出できない可能性もあり、ＥＬＩＳＡとウェスタンブロッティングの両方法を組み合わせることで、ビテロジェニン合成への環境物質の影響を正しく評価することができると考えられる。
＜実施例２．アフリカツメガエルビテロジェニンアッセイ＞
実施例２−１：曝露試験方法の比較
曝露試験は飼育水へのＥ２の添加および、個体へのＥ２の注入の２種類の方法で行い比較検討した。
１）材料と曝露方法
Ａ．水中曝露方法
同一年齢（二歳半）の成熟雄アフリカツメガエルを用い、２０Ｌの脱塩素水道水にＤＭＳＯに溶かしたＥ２を添加したもの（実験群）および脱塩素水道水に溶媒であるＤＭＳＯを同量添加したもの（対照群）を充填したガラス水槽内で５匹ずつ飼育することにより実施した。Ｅ２の曝露濃度は０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭの５段階で実施し、７日間の飼育の間、３．５日目に１回飼育水の交換を行った。水温は２２℃、明暗期ともに１２時間に設定するとともに、試験期間内は給餌を行わなかった。
Ｂ．注射法
Ａと同一年齢の成熟雄アフリカツメガエルを用い、Ｅ２溶液を注射により注入したもの（実験群）および溶媒としたプロピレングリコールを約２００μｌ注射により注入したもの（対照群）を２０Ｌの脱塩素水道水を充填したガラス水槽内で５匹ずつ飼育することにより実施した。Ｅ２の曝露濃度は０．００２μｇ／ｇ  ＢＷ、０．０２μｇ／ｇ  ＢＷ、０．２μｇ／ｇ  ＢＷ、２μｇ／ｇ  ＢＷ、２０μｇ／ｇ  ＢＷの５段階で実施し、７日間の飼育の間に１回（３．５日目）再注入を行った。水温は２２℃、明暗期ともに１２時間に設定するとともに、試験期間内は給餌を行わなかった。
なお、注射に際しては各個体について体重を測定し、設定濃度になるように２００μｌ前後のＥ２溶液を注射した。
２）検体採取方法
ビテロジェニンの検出は、血漿試料および肝臓ホモジネート試料の２種類の試料を用いて行い、比較検討した。
Ａ．血漿の採取
１．カエル腹腔へ麻酔薬（２０ｍｇ／ｍｌ  ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を０．５〜１．０ｍｌ注射する
２．開腹し、拍動する心臓から注射器で血液を０．２ｍｌ、チューブに採取し氷上に置く
３．１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清の血漿を採る
４．２０ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ溶液で１０倍希釈して冷蔵保存（長期保存の場合は冷凍保存）
希釈試料はＥＬＩＳＡサンドイッチ法でビテロジェニンを定量した
Ｂ．肝臓ホモジネートの採取
１．上記採血後に肝臓片を０．０５〜０．１ｇ程度切り取り、重さを測る
２．肝臓片を入れたチューブに、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ溶液を１ｍｌ加える
３．氷上で肝臓をホモジナイズする
４．１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を採り、冷蔵保存する（長期保存の場合は冷凍保存）。
希釈試料はＥＬＩＳＡサンドイッチ法でビテロジェニンを定量した
３）結果と考察
水中曝露法では１０ｎＭから応答が見られ、１００ｎＭで明らかに上昇した（図９）。１０００ｎＭで合成が増加しないのは、１０００ｎＭより低濃度で合成が最大になるという培養肝細胞の知見と一致する。水中曝露法の場合は、今回７日間の曝露としたが、曝露期間については、検討する必要がある。また、今回は１０倍の濃度変化で試験を行ったが１ｎＭ前後の濃度依存的な応答を認めるためには、使用濃度を細かく設定し、多数の個体を用いた曝露実験が必要であると考えられる。
また、注射法では体重あたり０．０２μｇ投与から応答が見られ、その後投与量依存的に増加した（図１０）。水中曝露法と注射法とを直接比較することはできないが、注射法では広範囲で投与量依存性を認めた。逆に水中曝露法では１０〜１００ｎＭでの急激な上昇が見られた。注射法では投与されたＥ２が個体内にどのように拡散するか不明であるが、もし個体内に均一に分散したとすると、ここで用いた投与量は体内で７．３ｎＭ〜７３μＭに相当する。一方水中曝露法ではビテロジェニン産生量は１００ｎＭで約１３０００μｇ／ｍｌであり、注射法による７３ｎＭでは約１４０００μｇ／ｍｌであった。このことは水中曝露法の方が格段に低濃度でエストロジェン作用を検出できることを示す。注射法では、注射されたＥ２の一部しか体内では作用していないことが考えられる。なお、定量したビテロジェニン濃度を対数で示すことにより、より低濃度側でのＥ２濃度依存的な影響を視覚的に表すことができた（図９及び１０右グラフ）。
検体採取方法の検討では、肝臓ホモジネートを用いると、血漿を用いたときよりもビテロジェニン測定値が低く出る傾向が見られ、バラツキが大きいが、応答曲線のパターンはほぼ同一と言える。したがって、採血可能な成体を用いるときには血漿を利用した方が良好な結果を得られると考えられるが、幼生など小さい個体を用いるときには肝臓ホモジネートの利用も有効であることが示された。
実施例２−２：初代培養肝細胞を用いた試験
１）材料と方法
Ａ：薬品
○１０×灌流液（０．１４％ＫＣｌ、５．５％ＮａＣｌ、０．４４％ｐｙｒｕｖａｔｅ、１％ｇｌｕｃｏｓｅ、２．３８％ＨＥＰＥＳ、５％ＢＳＡ、０．２％ＮａＨＣＯ３）
○コラゲナーゼ灌流液（１×灌流液をフェノールレッドでｐＨ７．２〜７．５にあわせ、０．１％コラゲナーゼ溶液とする。ろ過滅菌）
○培養液（５０％Ｌ−１５、１μｇ／ｍｌインシュリン、０．５％グルコース、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）
Ｂ：肝細胞採取方法
１．カエルを過マンガン酸カリウム（５ｍｇ／ｍｌ）の中で２時間以上消毒する（表皮が褐色になる）
２．腹腔へ麻酔薬（２０ｍｇ／ｍｌ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ））を０．５〜１．０ｍｌ注射する
３．腹側皮膚をアルコール棉でよく消毒し、開腹する
４．心臓を露出させ、心室から注射針を差込み、肝静脈を通してコラゲナーゼ灌流液をペリスタポンプで送り込んで肝臓を灌流する
５．肝臓を取り出しビーカーに移し、はさみで細かく切る
６．少量のコラゲナーゼ灌流液とともにＬ型チューブに移す
７．２４℃のインキュベータで３０〜６０分震盪する
８．ピペットでよく懸濁し、ナイロン網を通してろ過する
９．培養液を少量加え、３００ｒｐｍで１〜２分間遠心する
１０．遠心上清を吸引除去し、培養液を加え再度遠心する（この操作を２回繰り返す）
１１．細胞濃度を血球計測板で測定し、１ｍｌあたり１０万〜２０万個まで希釈する
１２．マイクロプレートに１００〜３００μｌずつ蒔く（２万個／ｗｅｌｌ程度がよい）
１３．２４℃インキュベータ中で培養する
Ｃ：試験方法
培養液中に試験物質を加えて培養する方法で処理を行う。
培養１日目くらいから肝細胞は機能回復し、細胞のプレートへの接着・伸展がおこるため、培養２日目あたりから試験物質を含む培養液に交換し、８日目の培養液を採取してＥＬＩＳＡ法によるビテロジェニン検出に用いる。培養液は３日に一回交換する（多く細胞を蒔きすぎると交換を頻繁に行わなければいけない）。Ｅ２処理の場合、処理３日目あたりから培養液中のビテロジェニンを検出することができることが知られているが、生着した培養肝細胞は３週間は安定しているため、作用性の低い物質の試験にはより長期間のアッセイを行う。
２）結果と考察
培養肝細胞を用いたアッセイの場合、Ｅ２  ０．６ｎＭ以上の曝露濃度で、濃度に依存して有意なビテロジェニン濃度の増加が認められた（図１１）。また、個体を用いる場合より測定値のバラツキが少なく、再現性が高い。特に、個体を用いた水中曝露実験よりも低濃度側でのＥ２濃度依存的なビテロジェニン合成が認められた。
その他、培養肝細胞を用いる利点としては、
・多数の試料を一度に検定でき、経済的である。
・分泌蛋白質なので培養液をそのまま検定に使用すれば良く、迅速かつ簡便である。
・生体内のホルモン等に影響されず、肝細胞の応答が直接検定できる。
・厳密な曝露条件設定が可能である。
・検出システムをマニュアル化でき、特別な技能を要さない。
などが挙げられる。
＜実施例３．ビテロジェニンアッセイの高感度化＞
実施例３では、雌性ホルモン作用を有する化学物質の両生類に対する影響評価を行うための、アフリカツメガエル雄を用いたビテロジェニン（ＶＴＧ）アッセイの高感度化をはかるため、アフリカツメガエルのＶＴＧポリクローナル抗体を新たに作製し、アフリカツメガエルのＶＴＧ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの最適化を行うと共に、ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを作製し、測定精度の評価を行った。
Ａ．方法
１．アフリカツメガエルのＶＴＧポリクローナル抗体の作製
（１）アフリカツメガエルＶＴＧ抗原の精製
アフリカツメガエル成体雄に１０ｍｇ／ｍｌ  １７β−エストラジオール（Ｅ２）を含むプロピレングリコール溶液を３０μｇ／ｇ体重相当の量で注射し、ＶＴＧの合成誘導を行った。１０日間の飼育後に採取した血清０．５ｍｌずつを陰イオン交換クロマトグラフィーシステム（ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄエコノシステム）で分離精製した。
分離条件
カラム：ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ５０をＡ液（下記参照）で膨潤させ、直径１ｃｍ、長さ１０ｃｍのオープンカラムにつめる
流速  ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
分画  ：３ｍｌ／試験管
バッファーグラジェント条件
・Ａ液：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）
・Ｂ液：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ
ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）  ％Ｂ液
０                    ０
２０                  ０
２００          ０−８０
２６０−            ８０
ＶＴＧ溶液の濃縮には、ゲルろ過担体（Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５）を用いた。濃度定量にはＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて行い、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）換算量とした。また、純度の確認のため、ＳＤＳ−７．５％アクリルアミドゲル電気泳動／ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色を行った。このＶＴＧ精製品は、免疫用抗原およびＥＬＩＳＡ標準品作製用として用い、残りを０．５ｍｇ／ｍｌの５０％グリセロール溶液として、−２０℃で保存した。
（２）免疫、および抗体の精製と標識
ポリクローナル抗体作製のため、ウサギへの免疫を行った。抗体価が上昇したウサギから順次全採血を行い、ＩｇＧ分画とした。アフリカツメガエルのＶＴＧに対する抗体の純化のため、吸収精製用カラムおよび、アフィニティ精製用カラムを作製した。
吸収精製用カラムの作製
アフリカツメガエル正常雄血清２ｍｌ（約１００ｍｇのタンパク質を含む）と、５ｇのＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂとを、カップリング反応により共有結合させた。
アフィニティ精製用カラムの作製
アフリカツメガエルのＶＴＧ抗原５０ｍｇと、７．５ｇのＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂとを、カップリング反応により共有結合させた。
図１３に示すように、抗ＶＴＧウサギ血清ＩｇＧ画分（およそ２００ｍｇ分）を上記吸収精製用カラムと混合し、室温で３０分振とうした。これをろ過することにより、アフリカツメガエル正常雄血清中のタンパク質に対する抗体を除去した。さらに、このろ過液を上記アフィニティ精製用カラムと混合し、４℃で一晩振とうした後、カラムに結合した抗体を溶出した。精製による抗体価の上昇はＥＬＩＳＡ法により確認した。
さらに、得られたアフィニティ精製ポリクローナル抗体の一部を、過ヨウ素酸酸化法（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１．１．２）により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共有結合させ、ＨＲＰ標識ポリクローナル抗体を作製した。
（３）抗体の特異性の確認
ＳＤＳ−７．５％アクリルアミドゲルを作製し、Ｅ２（約１ｍｇ）を注射により投与したアフリカツメガエル成体雄血清およびアフリカツメガエル正常雄血清をそれぞれ０．０２５μｌ相当と、精製ＶＴＧ抗原１００ｎｇ相当を電気泳動し、ゲル中の分離タンパク質をセミドライ法によりメンブレンにブロッティングした。抗ＶＴＧアフィニティ精製ポリクローナル抗体１μｇ／ｍｌで免疫反応を行ったのち、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）と反応させ、化学蛍光発色法によりＶＴＧをＸ線フィルム上で検出した。これにより抗体の特異性を検証した。
２．ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの最適化
上述したように、ＥＬＩＳＡ拮抗法に比べＥＬＩＳＡサンドイッチ法がより低濃度の感度が良いことがわかったため、サンドイッチ法に基づいたＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを作製することとした。サンドイッチ法の概略は以下に示す。そして、新たに作製したアフリカツメガエルのＶＴＧポリクローナル抗体について、このＥＬＩＳＡ法の各反応段階についての最適化を試みた。
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法概略
１．マイクロプレートの固相化（吸収精製ＶＴＧ抗体５０μｌ、４℃、一晩）
洗浄：洗浄液３００μｌ  ３回、３０分間
２．ブロッキング剤によるプレートのブロッキング
３．試料または標準液の反応  ５０μｌ、室温１時間
洗浄：洗浄液３００μｌ、３回
４．標識抗体の反応（ＨＲＰ標識抗ＶＴＧ抗体５０μｌ、室温１時間）
洗浄：洗浄液３００μｌ、３回
５．発色（発色液１００μｌ、室温  ３０分〜１時間放置）
６．４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定
（１）ＥＬＩＳＡ反応条件の最適化
ｉ）固相化ＶＴＧ抗体の濃度
プレートの固相化に用いるアフィニティ精製ＶＴＧポリクローナル抗体の濃度を、１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、および５μｇ／ｍｌに設定し、１時間室温で固相化を行い、標準ＶＴＧ  ０〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で標準曲線を作成した。また、適正化された１．４μｇ／ｍｌの濃度で一晩４℃で固相化したものを用いて、同時に標準曲線を作成した。結果を比較し、最適な固相化ＶＴＧ抗体濃度を検討した。
ｉｉ）ＨＲＰ標識ＶＴＧ抗体の濃度
本ＶＴＧポリクローナル抗体へのＨＲＰ標識効率によって、ＥＬＩＳＡの検出感度が左右されることが考えられるため、ＨＲＰ標識ＶＴＧ抗体の使用濃度の最適化は必要である。今回作製したＨＲＰ標識ＶＴＧ抗体について、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、および４μｇ／ｍｌの濃度で条件を設定し、ＥＬＩＳＡにおける本ＨＲＰ標識ＶＴＧ抗体の最適な濃度を検討した。
ｉｉｉ）血漿サンプル希釈液の組成  −添加回収試験−
アフリカツメガエルの血漿サンプル中のＶＴＧ測定時に関わる条件検討を行うため、添加回収実験を行い、ＥＬＩＳＡの改良を行った。正常雄血漿について希釈系列（１／２０，１／２００，１／１０００，１／５０００，１／２００００，１／１０００００）を作製し、それぞれに５００ｎｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ，２０ｎｇ／ｍｌとなるように標準ＶＴＧを加えた試料を作製した。血漿希釈に用いる希釈液には、サンプル希釈液（０．５％雪印ブロックエース−０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）と、サンプル希釈液にＢＳＡを最終１％になるように加えたものを用いた。それぞれの希釈液を用いた標準曲線をもとにして試料中のＶＴＧ濃度を定量し、添加量に対する回収率を求めた。さらに、希釈直線性の確認のため、１％ＢＳＡを加えた希釈液を用いて、血漿サンプル１および血漿サンプル２（いずれも、１０ｎＭ  Ｅ２を７日間水中曝露した雄の血漿）を１／４００希釈から１／２希釈系列で測定し、ＶＴＧ定量を行った。
（２）血漿サンプル調整方法の最適化
ｉ）生体からの採血方法（採血箇所の検討）
アフリカツメガエルの生体からの採血方法として、皮下の血管が密集している脇下、血管が見やすい水掻き、および爪切除面の３箇所からの採血方法を比較し、最適化の検討を行った。
３．ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの評価
（１）標準曲線の作成
本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを用いて標準曲線の作成を行った。１０００ｎｇ／ｍｌとしたＶＴＧ溶液から１／３もしくは１／２希釈系列（１０００ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌ）を作製し、キットプロトコルに基づいて行った。
（２）精度の評価
アフリカツメガエルＶＴＧ標準液を用いて、４重測定で標準曲線を作成し、９５％信頼できる最低検出限界値（ＶＴＧ濃度ゼロ点の平均値＋２×標準偏差（２ＳＤ））を求め、感度の評価を行った。また、各測定点における相対標準偏差（％ＣＶ）を求め、精度の評価を行った。
４．その他（新たな知見、および本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの応用方法について）
（１）標識法に関する新たな知見
本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴのさらなる高感度化につながる知見として、ビオチン化抗体−ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いたＥＬＩＳＡに関する結果を得た。
（２）種間交差反応性
本抗体の、アフリカツメガエル以外のカエルのＶＴＧに対する交差反応性とその程度を調べるため、Ｘｅｎｏｐｕｓ属の近縁種であるトロピカリス、Ｂｏｍｂｉｎａ属であるスズガエルおよびＲａｎａ属であるツチガエル、ヌマガエル、トノサマガエル、およびＨｙｌａ属のニホンアマガエル、Ｒｈａｃｏｐｈｏｒｕｓ属のシュレーゲルアオガエルに対して、Ｅ２（約１ｍｇ）を注射し、６日間飼育した後、血清を採取した。各血清を１／２００から段階的に希釈しＥＬＩＳＡによるＶＴＧ定量を行い、アフリカツメガエルのＶＴＧ標準曲線からＶＴＧ濃度を求め、他種カエルＶＴＧの換算量を求めた。次に、この換算量を元に、本抗体により認識されるＶＴＧ量が等量となるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥでそれぞれのカエル血清タンパク質を分離し、ＣＢＢ染色を行った。ＣＢＢ染色ゲル写真における約２００ｋＤａの位置のバンドの濃さの比較によって、交差反応度を表した。
（３）アフリカツメガエル初代培養肝細胞
本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの用途として、アフリカツメガエルの肝細胞培養液中のＶＴＧ濃度定量への応用についても検討した。上述した実施例と同様の方法を用いて、アフリカツメガエル成体雄の肝細胞を初代培養し、Ｅ２、エストロン（Ｅ１）、エストリオール（Ｅ３）など、既知のエストロジェン作用物質を含む培養液で培養した。培養開始から６日後（３日目に交換）の培養液について、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴによるＶＴＧ濃度定量を行った。
Ｂ．結果
１．アフリカツメガエルのＶＴＧポリクローナル抗体の作製
（１）ＶＴＧ抗原の精製
Ｅ２の注射によりＶＴＧが合成誘導されたアフリカツメガエル成体雄の血清０．５ｍｌずつを、陰イオン交換クロマトグラフィーシステムで分離精製した。（図１４）のように、約１４０分後あたりからＶＴＧを含むＵＶレコーダーのピークが出現する。最後のピークがＶＴＧで、その前のピークが血清アルブミンである。
ＶＴＧ濃度のピークを含む１０本前後のフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色で確認し（図１４）、血清アルブミンを含まないフラクションを集めた。
ＢＣＡ試薬により、ＢＳＡ換算量としてＶＴＧ溶液の濃度を決定した。８回の多重測定の結果、変動は１．５％未満であった（図１５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色の結果、およそ２００ｋＤａの分子量の位置に検出された（図１６）。決定した新しいＶＴＧ標準品の濃度を元に、旧標準品とのＥＬＩＳＡ法による比較を行ったところ、標準曲線は一致した（図１７）。以上の適正化を精製ロット毎に行うことにより、ＶＴＧ標準品の安定供給が行える。また、ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ作製に用いたＶＴＧ標準品以外は、５０％グリセロール溶液とし、−２０℃で保存することとした。これより、ＶＴＧの変性沈殿を避けることができるため、長期保存が可能であることがわかった。最終的に、アフリカツメガエルに３０μｇ／ｇ体重相当の量でＥ２を注射した成体雄の血清から、約１３ｍｇのＶＴＧが精製できた。
（２）抗体の精製と標識
ＶＴＧ抗原を免疫したウサギから得られたＩｇＧ分画を、吸収精製およびアフィニティ精製した。その結果、アフリカツメガエルＶＴＧポリクローナル抗体について約１０倍程度の抗体価の上昇が見られた（図１８）。また、１９７９年に作製されたアフリカツメガエルのＶＴＧポリクローナル抗体（ＩｇＧ精製前の抗血清の状態で−８０℃保存していたもの）を吸収精製およびアフィニティ精製したものと抗体価を比較すると、ほぼ等しい抗体価であった（図１９）。これは、異なる免疫によって得られたポリクローナル抗体でも、アフィニティ精製を行うことによって、同程度の免疫反応を示す抗体を得ることができることを示している。
（３）抗体の特異性の確認
Ｅ２を注射したアフリカツメガエル成体雄の血清、および正常な成体雄の血清からそれぞれ０．０２５μｌ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し（図２０（ａ））、新たに作製した抗体による免疫染色を行った。アフィニティ精製により抗体のＶＴＧに対する特異性が確かになり、正常成体雄の血清タンパク質とは免疫反応を示さなかった（図２０（ｂ））。これにより、ＶＴＧに非常に特異性の高いポリクローナル抗体が得られたことが確認された。また、アフリカツメガエル血清中のＶＴＧは分解されやすく、低分子側に分解産物がわずかに見られた。
２．ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの最適化
（１）ＥＬＩＳＡ反応条件の最適化
ｉ）固相化ＶＴＧ抗体の濃度
プレートの固相化に用いるアフィニティ精製ＶＴＧ抗体の濃度を１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌで１時間の固相化、および１．４μｇ／ｍｌの濃度で一晩の固相化、に設定し標準曲線を作成した（図２１）。その結果、２．６μｇ／ｍｌ以上で充分な反応が得られたが、１．４μｇ／ｍｌの濃度でも、一晩固相化させることによって、５μｇ／ｍｌの固相化条件の結果に近い反応性が得られた。このような検討の結果、本ＥＬＩＳＡでの固相化条件は、アフィニティ精製ＶＴＧ抗体１μｇ／ｍｌを５０μｌ／ｗｅｌｌ、４℃一晩、とした。
ｉｉ）ＨＲＰ標識ＶＴＧ抗体の濃度
今回作製したＨＲＰ標識ＶＴＧ抗体について、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、および４μｇ／ｍｌの濃度条件でＥＬＩＳＡを行い、標準曲線を作成した（図２２）。その結果、図のように、ＨＲＰ標識抗体の濃度が濃くなるほど全体的な発色度が強くなったが、抗体濃度が濃すぎると陰性対照の非特異的な反応が増加することや、同ロットから作製できる抗体の量などを考慮して、本ロットでは抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で使用することが最適であると判断した。
ｉｉｉ）血漿サンプル希釈液の組成  −添加回収試験−
アフリカツメガエルの正常雄血漿を１／２０から１／１０００００までの希釈系列をつくり、それぞれに５００ｎｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ，２０ｎｇ／ｍｌとなるように標準ビテロジェニンを加えた試料を作成し、定量した。
血漿はかなり高い反応阻害効果を示し、１／２０希釈では約８５％の阻害が見られた。血漿を希釈するにつれて、回収率が高くなり、１／１０００００以上の希釈で期待値に近いビテロジェニン定量値となった（図２３（ａ））。また添加したビテロジェニン量の違いに関わらず、血漿希釈倍率によって回収率がほぼ一定で、±１０％の誤差程度であった。なお、正常雄血清中のビテロジェニンはＥＬＩＳＡの検出限界以下であった。次に、ＢＳＡを０．５％および１％の濃度で加え、上記同様の方法でＶＴＧの添加回収実験を行ったところ、ＢＳＡ濃度が濃いほど、回収率における血漿阻害効果が軽減した（図２３（ａ）〜（ｃ））。測定サンプル中の最終濃度が１％となるようにＢＳＡを加えた場合、血漿を少なくとも２００倍希釈することによって、回収率が９０％以上となった（図２３（ｃ））。このような回収率の改善は、あらかじめ標準曲線に反応阻害を織り込んでいることに起因する（図２３（ｄ））。
また、実際にＥ２曝露によりＶＴＧ誘導を行った成体雄の血漿を希釈しＶＴＧ定量を行ったところ、１／４００以下の希釈率からＶＴＧ濃度の希釈直線性が得られた（図２４）。
以上のことから、検体希釈液に最終濃度１％となるようにＢＳＡを加えることを決定した。
以上の検討の結果、ＥＬＩＳＡの条件は以下のように設定した。なお、ブロッキング剤および発色基質について変更を加えた。
１）固相化用アフィニティ精製ＶＴＧ抗体溶液（１μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）を５０μｌずつウェルに加え、４℃で一晩おく（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｎｏ  ＰｌａｔｅＩＩ）
２）ウェルの溶液を捨て、洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）３００μｌで３回洗浄
３）ブロッキング液（０．５％雪印ブロックエース−０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）３００μｌを加え、室温１時間
４）ウェルの溶液を捨て、洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）３００μｌで１回洗浄
５）サンプル希釈液で検体および標準ＶＴＧ抗原を希釈した溶液を５０μｌずつウェルに加え、室温１時間。
・標準曲線は、１０００ｎｇ／ｍｌとしたＶＴＧ溶液から１／３希釈系列（１０００ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌ）を作製する。
６）ウェルの溶液を捨て、洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）３００μｌで３回洗浄する
７）ＨＲＰ標識抗体を抗体希釈液（０．５％雪印ブロックエース−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）で希釈し、２μｇ／ｍｌとした溶液を５０μｌずつウェルに加え、室温１時間
８）ウェルの溶液を捨て、洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）３００μｌで３回洗浄する
９）発色液（ＴＭＢＺ発色基質液を発色基質希釈液で１００倍希釈）を１００μｌずつウェルに加え、室温１時間
１０）反応停止液（１Ｎ硫酸）を１００μｌずつウェルに加える
１１）４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定（大日本製薬：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＪＸ）
（２）血漿サンプル調整方法の最適化
ｉ）生体からの採血方法（採血箇所の検討）
アフリカツメガエルの生体からの採血方法として、皮下の血管が密集している脇下、血管が見やすい水掻き、および爪切除面の３箇所からの採血方法を比較し、最適化の検討を行った。その結果、水掻きの血管からの採血は、▲１▼染み出る血液量が少ないこと、▲２▼染み出た血液がにじんでしまい、採血しづらいこと、▲３▼切断した血管がかなり治癒しづらいことが分かり、採血法に適していないと判断した。また、爪切除による採血は、▲１▼染み出る血液量が少ないこと、▲２▼切断面の治癒が遅いことが分かり、採血法に適していない。脇の下から脇腹にかけて注射針を刺す採血法は、▲１▼染み出た血液が玉状になるため採血しやすい、▲２▼刺し傷が治癒しやすい、などの理由から、採血方法として適していると判断した。さらに、採血方法の最適化を行った結果、以下の方法が採血方法の例としてあげられた。
採血方法（図２５参照）
１）マイクロチューブにサンプル希釈液２００μｌを入れ、氷上に準備しておく
２）カエルをティッシュペーパーなどで包み、手でしっかりと捕まえる
３）ティッシュペーパー等で、カエルの脇下の水分を取り除く
４）脇腹の、背側と腹側の境界線部分を注射針で軽く刺す
５）出てきた血液をマイクロピペットで１〜１０μｌ測り取り、氷上に用意していたサンプル希釈液に入れ、遠心するまで氷上で保存する
６）マイクロチューブを４℃、８０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を別のマイクロチューブに移し、血漿サンプルとして測定時まで凍結保存する
３．ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの評価
（１）標準曲線の作成
本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを用いて標準曲線の作成を行った。１０００ｎｇ／ｍｌとしたＶＴＧ溶液から１／２希釈系列（１０００ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌ）を作製し、ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴプロトコル（巻末添付）に基づいて行った結果、図２６のような標準曲線が描かれた。
得られた標準曲線は、ＶＴＧ濃度０から１２５ｎｇ／ｍｌまで一次直線性が見られ、１２５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌまで対数直線性が見られた。また、図には示していないが、両対数グラフを作成した場合、８〜１２５ｎｇ／ｍｌで直線性が見られた。
各測定点の吸光度の平均値、および標準偏差（ＳＤ）相対標準偏差（％ＣＶ）は図２７に示す結果となった。
（２）精度の評価
図２６に示した標準曲線および図２７の数値から、精度の評価を行った。
４重測定時の９５％信頼できる標準ＶＴＧの最低検出限界濃度を、《ＶＴＧ濃度ゼロ点の平均値＋２ＳＤ》として求めた結果、およそ２ｎｇ／ｍｌとなった。また、測定値のバラツキを％ＣＶ値で表した結果、バラツキは平均して５％で、良好であった。これより、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴは２ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で定量性があることがわかった。
４．その他（新たな知見および本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの応用方法について）
（１）標識法に関する新たな知見
本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴのさらなる高感度化につながる知見として、ビオチン化抗体−ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いたＥＬＩＳＡ法について、新たな知見が得られた。ビオチン化したアフィニティ精製ＶＴＧポリクローナル抗体とＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いたＥＬＩＳＡ法により標準曲線を作成した結果、図２８のような標準曲線が描かれた。
（２）種間交差反応性
抗体の交差反応性について、ＥＬＩＳＡとＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色実験を行い、本ＥＬＩＳＡキットがアフリカツメガエル以外のカエルのＶＴＧ検出にも応用できる可能性について検討した。Ｅ２（約１ｍｇ）を種々のカエルに注射し、６日間飼育後に血清を採取した。各血清１／２００希釈から希釈系列を作製し、ＥＬＩＳＡを行った（図２９（ａ））。アフリカツメガエルのＶＴＧ標準品を用いた標準曲線から、各種カエル血清中の、アフリカツメガエルＶＴＧ換算量を求めた。次に、この換算量が等量となるように各種カエル血清を希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色を行った（図２９（ｂ））。このＣＢＢ染色においてＶＴＧを示すバンドの濃さが、アフリカツメガエルＶＴＧのバンドの濃さと同じであれば、そのカエル種のＶＴＧは本抗体と交差反応度が１００％に近いことを示している。今回の結果からは、アフリカツメエルの近縁種であるトロピカリスにおいてのみ、１００％に近い交差反応度を示すことがわかった。また、スズガエルＶＴＧにも比較的高い交差反応性を示した。その他の種については、交差反応性は低かった（データは示していない）。
（３）初代培養肝細胞
初代培養肝細胞への曝露試験と、本ＥＬＩＳＡとの組み合わせにより、種々の化学物質の定量的エストロジェン活性のスクリーニングシステムへの応用について検討した。アフリカツメガエル成体雄の初代培養肝細胞を使って、エチニルエストラジオール（ＥＥ２）、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、１７βエストラジオール（Ｅ２）、１７αエストラジオール（α−Ｅ２）、エストリオール（Ｅ１）、エストロン（Ｅ３）など、既知のエストロジェン作用物質６物質および、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）、ノニルフェノール（ＮＰ）、オクチルフェノール（ＯＰ）などの内分泌撹乱物質と疑われている物質について、ＶＴＧ誘導活性を測定した。
（実施例２−２）と同様の方法を用いて、アフリカツメガエル成体雄の肝細胞を初代培養し、上記化学物質を含む培養液で培養し、６日後の培養液を用いて、本ＥＬＩＳＡにより培養液中ＶＴＧ濃度を定量した。
その結果、各物質とも濃度依存的なＶＴＧ合成誘導が認められ（図３０）、各物質のエストロジェン活性の強さの違いには、既知のヒトエストロジェンレセプターを用いたレポーター遺伝子アッセイにおけるエストロジェン活性と一致する特徴が見られた。また、およそ０．１ｎＭ  Ｅ２相当のエストロジェン活性が検出可能であった。また、ビオチン化抗体を用いたＥＬＩＳＡにて定量を行った場合、およそ０．０３ｎＭ相当のエストロジェン活性が検出可能であった。このように、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴは初代培養肝細胞試験への応用も可能である。
さらに、本アッセイシステムを用いることにより、対象物質のアンタゴニスト活性を評価することができた。たとえば、５ｎＭのＥ２と同時にＢＰＡ、ＮＰ、ＯＰなどを加えた培養液で培養したところ、５ｎＭのＥ２のみによるＶＴＧ合成誘導に対して、加えたＢＰＡ、ＮＰ、ＯＰ濃度が高くなるにつれ、アンタゴニスティックな活性を示した（図３１）。この結果から、培養肝細胞を用いたビテロジェニンアッセイは、様々な化学物質についてエストロジェン活性のみでなく、抗エストロジェン活性についても評価できることが示唆された。
Ｃ．まとめと考察
○新たにアフリカツメガエルのＶＴＧポリクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを製作した。本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴにおけるＶＴＧ濃度定量範囲は２−１０００ｎｇ／ｍｌとなった。
新たに作製したポリクローナル抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法の条件設定を行い、標準曲線を得た。昨年度は９５％信頼できる最低検出限界《ｎ＝４、ＶＴＧ濃度ゼロ点の平均値＋２ＳＤ》が３ｎｇ／ｍｌ程度で３００ｎｇ／ｍｌ程度まで定量的であったのに対し、この新たな抗体を用いた場合は９５％信頼できる最低検出限界が２ｎｇ／ｍｌ程度で、上限も１０００ｎｇ／ｍｌ程度まで定量的であり、感度の上昇が見られた。定量範囲の拡大については、プレートへの固相化抗体を吸収精製抗体からアフィニティ精製抗体へ変更したためと思われる。また、低濃度側の感度上昇は、発色剤をＡＢＴＳ基質からＴＭＢＺ基質へ変更したことに起因すると考えられる。メダカモノクローナル抗体よるＥＬＩＳＡ法（２−１００ｎｇ／ｍｌ）と比べると、検出感度は同程度で定量可能範囲は広かった。また、新たな知見から、ビオチン化抗体と標識ストレプトアビジンを用いた方法でＥＬＩＳＡの感度が３０倍程度上がることが見込まれた。今後、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴのさらなる感度向上の必要があれば、本抗体のビオチン化抗体の作製、もしくは、特異的でアフィニティの高いモノクローナル抗体を作製する必要がある。
○血漿による阻害効果は、サンプル希釈液にＢＳＡを加えて軽減した。また、ＶＴＧの回収率は、血漿を１／２００以上に希釈することにより、ほぼ１００％となった。血漿阻害効果を考慮すると、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴによる、血漿中のＶＴＧ濃度の最低検出限界は、少なくとも４００ｎｇ／ｍｌである。
血漿はかなり高い反応阻害効果を示し、１／２０希釈では約８５％の阻害が見られた。血漿を希釈するにつれて、回収率が高くなり、１／１０００００以上の希釈で期待値に近いビテロジェニン定量値となった。実際に血漿サンプルを定量する場合、この回収率をもとに換算する必要があるが、作業の煩雑化が否めない。そこで、血漿の阻害効果を軽減させるべく、サンプル希釈液の組成の検討を行った。血漿中に含まれるタンパク質により、ＶＴＧと抗ＶＴＧ抗体との反応が何らかの原因で阻害されていると考えられる。血漿中に多く含まれるのは血清アルブミンであるため、サンプル希釈液にあらかじめＢＳＡを添加することを検討した結果、ＶＴＧの回収率は、血漿を１／２００以上に希釈することにより、ほぼ１００％となった。
なお、標準ＶＴＧにおける最低検出限界が２ｎｇ／ｍｌであることから、血漿を少なくとも２００倍希釈した場合、実際の血漿中ＶＴＧ濃度の最低検出限界は、４００ｎｇ／ｍｌとなる。ただし図９ｃに示されるように血漿１／２０希釈時の回収率が約６０％であるため、血漿中ＶＴＧ濃度が低いと予想される場合はサンプル調整を血漿１／２０希釈に設定し、定量値を回収率６０％で換算することも可能である。この場合、実際の血漿中ＶＴＧ濃度の最低検出限界は、約７０ｎｇ／ｍｌとなる。
○本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴは、アフリカツメガエル成体雄を１ｎＭ以上のＥ２に、７日間の水中曝露を行った時の、血漿ＶＴＧが検出可能である。
上記考察より、最初の実施例におけるアフリカツメガエル成体雄へのＥ２の水中曝露実験の結果とあわせると、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴでは、アフリカツメガエル成体雄を１ｎＭ以上のＥ２に、７日間の水中曝露を行った時の、ＶＴＧ合成誘導が検出可能であると言える。今後は、本ＫＩＴを用いて、曝露期間によるＶＴＧ誘導量の変化など、試験プロトコルの最適化を行うとともに、必要に応じてＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの高感度化が必要であると考えられる。
○本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴに用いた抗体は、アフリカツメガエル以外の他種カエル（トロピカリス、スズガエル、ツチガエル、ヌマガエル、ニホンアマガエル、シュレーゲルアオガエル、トノサマガエル）のＶＴＧにも交差反応を示すことを確認した。
トロピカリス、スズガエルにおいては、交差反応性が高いことが確認された。これら２種については、それぞれのＶＴＧを精製することによって、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを用いたＶＴＧ定量が可能であると考えられる。その他の種について本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの適用性を確認するためには、交差反応性をより詳細に検討する必要がある。そのためには、対象とするカエルのＶＴＧを精製するなどして、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴの活用の範囲と限界を明確にするとともに、交差反応度の低いカエルについては、必要に応じて種特異的な抗体を作製する必要があると考えられる。ただし当面、ビオチン化抗体と標識ストレプトアビジンを用いれば、高感度化が可能となり、交差反応度の低い他種カエルにも適用可能かもしれない。
○アフリカツメガエルの初代培養肝細胞と本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを用いたエストロジェン活性試験では、メダカのＥ２曝露試験と同様に、およそ０．１ｎＭ  Ｅ２相当のエストロジェン活性が検出可能であった。
アフリカツメガエルの初代培養肝細胞を用いて、エストロジェン活性を持つ既知の物質について試験を行い、誘導されたＶＴＧを本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴで定量した結果、各物質のエストロジェン活性の強さの違いには、既知のヒトエストロジェンレセプターを用いたレポーター遺伝子アッセイにおけるエストロジェン活性と、ある程度一致する特徴が見られた。また、およそ０．１ｎＭ  Ｅ２相当のエストロジェン活性が検出可能であった。このように、本ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴは初代培養肝細胞試験への応用も可能である。新たな知見ではビオチン化抗体を用いたＥＬＩＳＡにて定量を行った場合、初代培養肝細胞試験では、およそ０．０３ｎＭ相当のエストロジェン活性が検出可能であり、メダカのＥ２曝露試験と同等の結果が得られた。
＜実施例４．カエルビテロジェニンＥＬＩＳＡキットの製造＞
（１）キット原料の製造
（１）−１  抗カエルビテロジェニン抗体
実施例１（４）ビテロジェニン抗体の製造例に従った。
（１）−２  ビテロジェニン標準品
実施例１（３）ビテロジェニン抗原の製造例に従った。
（１）−３  酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ  ベーリンガーＥＩＡ用  ＣｏｄｅＮｏ．８１４３９３）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１Ｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．２、０．５ｍｌに溶かした後、０．５ｍｌのＮａＩＯ４液と０．５ｍｌのＨＲＰ液を混ぜ、２時間、室温・暗所で反応させた。１．０ｍｌの抗体液（３ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ０．１Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６．８）を加え、暗所・室温で３時間保温した。ＮａＢＨ４液（５ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ０．１ｍＭ  ＮａＯＨ）を６１μｌ加え、室温・暗所で３０分保温し、さらに１７９μｌのＮａＢＨ４液を加え、６０分暗所に置いた。２ｍｌの飽和硫安を加え、氷上で撹拌３０分行った。４℃で１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿をＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．９％ＮａＣｌ）１ｍｌに溶かした。ＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ平衡化スパンカラムで脱塩後、ＢＳＡを２０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かした。なお、長期保存の場合は５０％グリセロール液とし、−２０℃で保存した。
（２）「抗カエルビテロジェニン抗体固相化マイクロプレート」の製造
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（−）（和光純薬  ＣｏｄｅＮｏ．０４１−２０２１１）に溶解した抗ビテロジェニン抗体（１μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ｗｅｌｌになるよう固相化プレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＥＩＡ／ＲＩＡ  ｐｌａｔｅ  ｓｔｒｉｐ８，＃２５９２）に分注し、４℃で一晩静置後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）３００μＬで３回洗浄した。ブッロキング液（（１％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印：ＵＫ−Ｂ８０）＋１％  Ｓｕｃｒｏｓｅ＋１０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％スラオフ７２Ｎ（武田薬品）ｉｎ  ５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、４℃で一晩静置した。アスピレーターで全量を吸引後、タッピングにより水分を除去した。脱水乾燥した固相化プレートをアルミ袋に封入し、真空乾燥機により脱気およびシールをして、２〜８℃の冷蔵庫に保存した。
（３）「ビテロジェニン標準品粉末」の製造
ビテロジェニン希釈液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％スラオフ７２Ｎ（武田薬品）＋４％ＢＳＡ＋１０％ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．４））を５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、２００μｌずつ分注後、凍結乾燥を実施した。
（４）「サンプル希釈液（３倍濃縮）」の製造
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（−）（和光  生化学用  ＣｏｄｅＮｏ．０４１−２０２１１）６袋、スラオフ７２Ｎ（武田薬品）１．５ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０  ３ｍｌ、２Ｎａ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）（同仁化学試験研究用：Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３４３−０１８６１）、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印：ＵＫ−Ｂ８０）１  ５ｇ、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ：７６３８）３０ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、２０ｍｌずつ適切な容器に分注後キャップをして、２〜８℃の冷蔵庫に保存した。
（５）「酵素標識抗体粉末」の製造
酵素標識抗体希釈液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％スラオフ７２Ｎ（武田薬品）＋４％ＢＳＡ＋１０％ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．４））に酵素標識抗体を６０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００μｌずつ分注後、凍結乾燥を実施した。
（６）「酵素標識抗体希釈液」の製造
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（−）（和光  生化学用  ＣｏｄｅＮｏ．０４１−２０２１１）２袋、スラオフ７２Ｎ（武田薬品）０．５ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０  １ｍｌ、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印：ＵＫ−Ｂ８０）５ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、７ｍｌずつ適切な容器に分注後キャップをして、２〜８℃の冷蔵庫に保存した。
（７）「洗浄液（６倍濃縮）」の製造
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（−）（和光  生化学用  ＣｏｄｅＮｏ．０４１−２０２１１）１２袋、スラオフ７２Ｎ（武田薬品）３ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０  ６ｍｌを蒸留水１Ｌに溶解し、５０ｍｌずつ適切な容器に分注後キャップをして、２〜８℃の冷蔵庫に保存した。
（８）「発色基質溶液」の作製
５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ  同仁化学  試験研究用  ＣｏｄｅＮｏ．３４６−０４０３０１）１０ｍｇを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ  和光純薬  試薬特級  ＣｏｄｅＮｏ．０４５−０２９１６）１ｍｌに溶解し、適切な褐色容器に２５０μｌずつ分注後キャップをして、２〜８℃の冷蔵庫に保存した。
（９）「発色基質希釈液」の作製
Ｕｒｅａ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ：Ｕ−１７５３）３５０ｍｇ、スラオフ７２Ｎ（武田薬品）０．１ｍｌを４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１Ｌに溶解し、適切な容器に１５ｍｌずつ分注後キャップをして、２〜８℃の冷蔵庫に保存した。
（１０）「発色停止液」の作製
１Ｎリン酸溶液を調製し、１５ｍｌずつ適切な容器に分注後キャップをして、室温で保存する。
以上のようにして作製した（１）から（９）迄のキット構成品および混合用マイクロプレート（Ｎｕｎｃ：１６７００８）、箱詰めすることにより、カエルビテロジェニンＥＬＩＳＡキットの製造が完成した。
＜実施例５．カエルビテロジェニンＥＬＩＳＡキットによる定量＞
実施例４により作成したカエルビテロジェニンＥＬＩＳＡキットを使用した定量法は下記の通りである。
（１）サンプル希釈液の調製
「サンプル希釈液（３倍濃縮）」と蒸留水を１：２の割合で混合し、「サンプル希釈液」を調製する。
（２）サンプル調製
血漿、血清等を（１）で調製した「サンプル希釈液」で定量範囲（３−１，０００ｎｇ／ｍＬ）に入るよう希釈する。
［血漿サンプルの調製法］
１）エッペンドルフチューブにサンプル希釈液２００μＬを入れ、氷上に準備する。
２）カエルを網もしくはティッシュペーパーで包み、手でしっかりと捕まえる（図２５（ａ））。
３）ティッシュペーパー等で、カエルの脇下の水分を取り除く。
４）脇下の、背側と腹側の境界線部分を注射針で軽く刺す（図２５（ｂ））。
５）出てきた血液（図２５（ｃ））をマイクロピペットで１〜１０μＬ測り取り（図２５（ｄ））、氷上に用意していたサンプル希釈液に入れる。チューブは遠心するまで氷上で保存する。
６）チューブを４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を別のマイクロチューブに移して冷蔵保存する。なお、数日中に使用しない場合は、サンプルを測定時まで凍結保存する。
（３）ビテロジェニン標準液の調製
蒸留水２００μＬを用いて「ビテロジェニン標準品粉末」を溶解する（５，０００ｎｇ／ｍＬ）。
その後、「サンプル希釈液」を用いて必要な濃度のビテロジェニン標準液を調製する。なお、５，０００ｎｇ／ｍＬ溶液は必要量だけ分取し、残りは冷蔵保存する。
［調製例］
エッペンドルフチューブ等を使用し、５，０００ｎｇ／ｍＬを「サンプル希釈液」で１／５に希釈し、１，０００ｎｇ／ｍＬに調製する。次に、マイクロプレート内で１／４ずつ希釈し、１，０００，２５０，６２．５，１５．６，３．９，０．９８ｎｇ／ｍＬを調製する。なお、０濃度には「サンプル希釈液」をそのまま用いる。
（４）抗原抗体反応−１
室温に戻した「抗カエルビテロジェニン抗体固相化プレート」に（２）、（３）で調製した「サンプル」、「ビテロジェニン標準液」をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温（１８〜２５℃）で６０分間反応させる。
（５）洗浄液の調製
抗原抗体反応時間中に、「洗浄液（６倍濃縮）」と蒸留水を１：５の割合で混合し、「洗浄液」を調製する。
（６）未反応物の除去−１
反応液を捨て、（５）で調製した洗浄液３００μＬ／ｗｅｌｌを用いてｗｅｌｌ内を３回洗浄する。３回目の洗浄液を捨てた後は、裏返したマイクロプレートをペーパータオル等の上で軽くたたいて（タッピング）、洗浄液を完全に除去する。
（７）酵素標識抗体溶液の調製
「標識抗体粉末」に、「酵素標識抗体希釈液」７ｍＬのうち３ｍＬを加えて溶解し、「標識抗体溶液」を調製する。
（８）抗原抗体反応−２
（７）で調製した「標識抗体溶液」を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温（１８〜２５℃）で６０分間反応させる。
（９）未反応物の除去−２
反応液を捨て、（５）で調製した洗浄液３００μＬ／ｗｅｌｌを用いてｗｅｌｌ内を３回洗浄する。なお、３回目の洗浄液を捨てた後は、裏返したマイクロプレートをペーパータオル等の上で軽くたたいて（タッピング）、洗浄液を完全に除去する。
（１０）発色試薬の調製
「発色基質溶液」と「発色基質希釈液」を１：１００の割合で混合し、「発色試薬」を調製する。
（１１）発色反応／反応停止
（１０）で調製した「発色試薬」を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分間反応させた後、「発色停止液」を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応を停止する。
（１２）比色および濃度計算
プレートリーダーを用い、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。標準曲線（図３２）から試料中のビテロジェニン濃度を算出する。さらに、ビテロジェニン回収率曲線（サンプル希釈倍率に対するＶＴＧ回収率）（図３３）を使用し、測定値を補正する。なお、本手法による定量範囲は３−１０００ｎｇ／ｍｌであった。また、図３３に示すように、血漿を２００倍以上希釈すれば９０−１００％の回収率が得られることが判った。
＜実施例６．アビジンビオチン化による高感度ＥＬＩＳＡキットの製造＞
実施例５のＥＬＩＳＡキットをベースにアビジンビオチン化による高感度ＥＬＩＳＡキットを製造した。
（１）キット原料の製造
（１）−１  抗カエルビテロジェニン抗体
実施例１（４）ビテロジェニン抗体の製造例に従った。
（１）−２  ビテロジェニン標準品
実施例１（３）ビテロジェニン抗原の製造例に従った。
（１）−３  ビオチン標識抗体
Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１４１８  １６５，Ｒｏｓｈｅ）を用い、付属マニュアルに従った。
（２）「抗カエルビテロジェニン抗体固相化マイクロプレート」の製造
実施例４（２）に従った。
（３）「ビテロジェニン標準品粉末」の製造
実施例４（３）に従った。
（４）「サンプル希釈液（３倍濃縮）」の製造
実施例４（４）に従った。
（５）「ビオチン標識抗体粉末」の製造
ビオチン標識抗体希釈液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％スラオフ７２Ｎ（武田薬品）＋４％  ＢＳＡ＋１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．４））に酵素標識抗体を３０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００μｌずつ分注後、凍結乾燥を実施した。
（６）「酵素標識ストレプトアビジン粉末」の製造
酵素標識ストレプトアビジン希釈液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％スラオフ７２Ｎ（武田薬品）＋４％  ＢＳＡ＋１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．４））にＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ：４３−８３２３）を７．５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００μｌずつ分注後、凍結乾燥を実施した。
（７）「標識体希釈液」の製造
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（−）（和光  生化学用  ＣｏｄｅＮｏ．０４１−２０２１１）２袋、スラオフ７２Ｎ（武田薬品）０．５ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０  １ｍｌ、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印：ＵＫ−Ｂ８０）５ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、１５ｍｌずつ適切な容器に分注後キャップをして、２〜８℃の冷蔵庫に保存した。
（８）「洗浄液（６倍濃縮）」の製造
実施例４（７）に従った。
（９）「発色基質溶液」の作製
実施例４（８）に従った。
（１０）「発色基質希釈液」の作製
実施例４（９）に従った。
（１１）「発色停止液」の作製
実施例４（１０）に従った。
以上のようにして作製した（１）から（１１）迄のキット構成品および混合用マイクロプレート（Ｎｕｎｃ：１６７００８）、箱詰めすることにより、アビジンビオチン化による高感度ＥＬＩＳＡキットが完成した。
＜実施例７．高感度ＥＬＩＳＡキットによる定量＞
実施例６により作成した高感度ＥＬＩＳＡキットを使用した定量法は下記の通りである。
（１）サンプル希釈液の調製
実施例５（１）に従う。
（２）サンプル調製
実施例５（２）に従う。
（３）ビテロジェニン標準液の調製
蒸留水２００μＬを用いて「ビテロジェニン標準品粉末」を溶解する（５，０００ｎｇ／ｍＬ）。
その後、「サンプル希釈液」を用いて必要な濃度のビテロジェニン標準液を調製する。なお、５，０００ｎｇ／ｍＬ溶液は必要量だけ分取し、残りは冷蔵保存する。
［調製例］
エッペンドルフチューブ等を使用し、５，０００ｎｇ／ｍＬを「サンプル希釈液」で１／８０に希釈し、６２．５ｎｇ／ｍＬに調製する。次に、マイクロプレート内で１／２ずつ希釈し、３１．３，１５．６，７．８，３．９，２，０．９８，０．４９，０．２４，０．１２，０．０６，０．０３，０ｎｇ／ｍＬを調製する。なお、０濃度には「サンプル希釈液」をそのまま用いる。
（４）抗原抗体反応−１
室温に戻した「抗カエルビテロジェニン抗体固相化プレート」に（２）、（３）で調製した「サンプル」、「ビテロジェニン標準液」をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温（１８〜２５℃）で６０分間反応させる。
（５）洗浄液の調製
抗原抗体反応時間中に、「洗浄液（６倍濃縮）」と蒸留水を１：５の割合で混合し、「洗浄液」を調製する。
（６）未反応物の除去−１
反応液を捨て、（５）で調製した洗浄液３００μＬ／ｗｅｌｌを用いてｗｅｌｌ内を３回洗浄する。３回目の洗浄液を捨てた後は、裏返したマイクロプレートをペーパータオル等の上で軽くたたいて（タッピング）、洗浄液を完全に除去する。
（７）ビオチン標識抗体溶液の調製
「ビオチン標識抗体粉末」に、「標識体希釈液」１５ｍＬのうち３ｍＬを加えて溶解し、「ビオチン標識抗体溶液」を調製する。
（８）抗原抗体反応−２
（７）で調製した「ビオチン標識抗体溶液」を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温（１８〜２５℃）で６０分間反応させる。
（９）未反応物の除去−２
反応液を捨て、（５）で調製した洗浄液３００μＬ／ｗｅｌｌを用いてｗｅｌｌ内を３回洗浄する。なお、３回目の洗浄液を捨てた後は、裏返したマイクロプレートをペーパータオル等の上で軽くたたいて（タッピング）、洗浄液を完全に除去する。
（１０）酵素標識ストレプトアビジン溶液の調製
「酵素標識ストレプトアビジン」に「標識体希釈液」１５ｍＬのうち３ｍＬを加えて溶解し、「酵素標識ストレプトアビジン溶液」を調製する。
（１１）ビオチンとストレプトアビジンの反応
（１０）で調製した「酵素標識ストレプトアビジン溶液」を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温（１８〜２５℃）で６０分間反応させる。
（１２）未反応物の除去−２
反応液を捨て、（５）で調製した洗浄液３００μＬ／ｗｅｌｌを用いてｗｅｌｌ内を３回洗浄する。なお、３回目の洗浄液を捨てた後は、裏返したマイクロプレートをペーパータオル等の上で軽くたたいて（タッピング）、洗浄液を完全に除去する。
（１３）発色試薬の調製
「発色基質溶液」と「発色基質希釈液」を１：１００の割合で混合し、「発色試薬」を調製する。
（１４）発色反応／反応停止
（１３）で調製した「発色試薬」を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分間反応させた後、「発色停止液」を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応を停止する。
（１５）比色および濃度計算
プレートリーダーを用い、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。標準曲線（図３４）から試料中のビテロジェニン濃度を算出する。さらに、ビテロジェニン回収率曲線（サンプル希釈倍率に対するＶＴＧ回収率）を使用し、測定値を補正する。なお、本手法による定量範囲は０．０６−６２．４ｎｇ／ｍｌで従来法に比べ、５０倍高感度化されていることがわかった。また、図３５に示すように、血漿を５０倍以上希釈すれば希釈直線性が得られることが判った。
なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではない。例えば、検出キットにおける測定プレートに代えてイムノクロマト法を用いても勿論構わない。
イムノクロマトグラフィー法は原理としてはサンドイッチ法を用いており、妊娠判定法など広く利用されている。ここで、本実施形態におけるイムノクロマトグラフィーストリップ１００７について図３６に基づき説明する。
図３６に示すように、イムノクロマトグラフィーストリップ１００７は、プラスチックカバー１００１ａ、１００１ｂとの間に、サンプルパッド１００２、コンジュゲートパッド１００３、メンブレン１００６及び吸収パッド１００８を挟持した構造となっている。メンブレン１００６には、判定ライン１００４とコントロールライン１００５用抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）がそれぞれ所定の位置に塗布されている。
プラスチックカバー１００１ａ，１００１ｂで覆われた中に検体を滴下すると、サンプルパッド１００２、その下のコンジュゲートパッド１００３の中に浸透してそこで金コロイドを標識したＶＴＧ抗体と反応しながら横方向（図中左→右）に浸透していく。
判定ライン１００４には固相化された抗体がありそこを通過するときに抗原抗体反応が起こり赤色を呈し、一部はその先のコントロールライン１００５で固相化された標識抗体特異抗体と反応し赤色を呈する。陽性では判定ラインとコントロールラインの二本、陰性ではコントロールラインの一本のみ呈色する。
次に、イムノクロマトの製造方法について説明する。
メンブレン１００６に、判定ライン１００４用抗体（抗ＶＴＧ抗体）とコントロールライン１００５用抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）をラインになるように塗布し、乾燥して固定化し非特異吸着を押さえるためのブロッキングを行い更に洗浄して抗体の塗布が終了する。そして図３６に示すように、プラスチックカバー１００１ａ、１００１ｂによりこれを含めた各種部材を挟持することで、イムノクロマトを製造している。
次に、このイムノクロマトを用いた具体的な測定方法を説明する。
はじめに、既知濃度のビテロジェニンサンプルを用いて測定し、２０ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの測定レンジであることを確認した。次に、１ｎＭ  Ｅ２で１週間暴露したアフリカツメガエル雄成体より血液を採取し、得られた血清を３段階（×１、×１００、×１０，０００）に希釈し、その１００μｌをサンプルパッド１００２に滴下した。約１５分ほど静置したのち、陰性になった希釈段階から、ビテロジェニンの濃度範囲を特定した。本キットで特定した濃度範囲は、ＥＬＩＳＡ法により定量した濃度を比較したところ、すべて一致する結果が得られた。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明の検出キット、検出方法及び環境の評価方法によれば、カエルのビテロジェニンを感度、精度ともに良好に検出することが可能となり、それにより環境中の内分泌撹乱化学物質の影響を網羅的に評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の検出キット全体を示す模式図である。
図２は、本発明の検出キットの測定プレートの全体模式図である。
図３は、本発明の検出キットのサンドイッチ法に係る測定プレートの穴の部分断面図である。
図４は、本発明の検出キットの拮抗法に係る測定プレートの穴の部分断面図である。
図５は、本発明の検出方法における拮抗法を説明する工程図である。
図６は、本発明の検出方法におけるサンドイッチ法を説明する工程図である。
図７は、本発明のビテロジェニン抗体の特異性を示す画像である。
図８は、本発明の検出方法におけるビテロジェニンの検出感度を示すグラフである。
図９は、比較例のウェスタンブロッティングにおけるビテロジェニンの検出を示すグラフ及び画像である。
図１０は、本発明の環境評価方法の水中曝露におけるビテロジェニンの合成誘導を示すグラフである。
図１１は、本発明の環境評価方法の直接注入におけるビテロジェニンの合成誘導を示すグラフである。
図１２は、培養肝細胞を使ったビテロジェニン合成誘導を示すグラフである。
図１３は、アフィニティ精製ポリクローナル抗体の溶出方法の説明図である。
図１４は、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＶＴＧの分離精製チャートパターン（上）およびフラクション溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色写真（下）である。
図１５は、ＶＴＧ標準品の濃度定量例である。
図１６は、ＶＴＧ標準品のゲル染色パターンを示す図である。
図１７は、ＥＬＩＳＡ法によるＶＴＧ標準品濃度を確認した結果を示す図である。
図１８は、アフィニティ精製後の抗体価の上昇を示す図である。
図１９は、免疫ロットの異なるアフィニティ精製ポリクローナル抗体間の抗体価の比較を示す図である。
図２０は、抗体の特異性を示すであり、（ａ）は血清サンプルのＣＢＢ染色パターン、（ｂ）はウェスタンブロッティングを示している。
図２１は、固相化抗体濃度の条件の検討結果を示す図である。
図２２は、ＨＲＰ標識抗体濃度の条件の検討結果を示す図である。
図２３は、添加回収率実験および回収率改善のためのＢＳＡ添加検討を示す図であり、（ａ）はＢＳＡなしの場合、（ｂ）０．５％ＢＳＡ添加の場合、（ｃ）は１％ＢＳＡ添加の場合、（ｄ）標準曲線をそれぞれ示している。
図２４は、サンプル希釈液最適化後の希釈直線性を示す図である。
図２５（ａ）は、カエルをティッシュペーパーで包んでいる様子を示す図である。
図２５（ｂ）は、針でカエルの脇腹を刺している様子を示す図である。
図２５（ｃ）は、カエルの脇腹から血液が玉状に出ている様子を示す図である。
図２５（ｄ）は、カエルから採血している様子を示す図である。
図２６は、ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ標準曲線を示す図である。
図２７は、ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ標準曲線における数値を示す図である。
図２８は、ビオチン化抗体によるＥＬＩＳＡ標準曲線を示す図である。
図２９は、他種カエルＶＴＧへの交差反応性を示す図であり、（ａ）はＥＬＩＳＡの場合、（ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色の場合をそれぞれ示している。
図３０は、初代培養肝細胞におけるＶＴＧ合成誘導を示す図である。
図３１は、初代培養肝細胞におけるＶＴＧ合成誘導の阻害効果を示す図である。
図３２は、ビテロジェニン（ＶＴＧ）標準曲線（その１）を示す図である。
図３３は、ビテロジェニン回収率曲線（その１）を示す図である。
図３４は、ビテロジェニン（ＶＴＧ）標準曲線（その２）を示す図である。
図３５は、ビテロジェニン希釈直線性（その２）を示す図である。
図３６は、本発明の応用例に係るイムノクロマトの分解図である。
【図１】
2003104806.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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