(57)【要約】発光反応の利用に適した発光用マイクロアレイプレートとそれを用いた発光検出装置である。個々のマイクロアレイ微小反応区域の周囲に隔壁を設け、周囲の発光の混入を防ぎ、光伝導ガイドで当該微小区域の発光を検出することで、周囲からの発光の混入を削減し、精度と感度を改善する。
2003031952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微小ウェルが所定の間隔で整列したマイクロアレイプレートの前記微小ウェル中に捕捉された発光反応物質を検出する発光検出装置であって、
前記マイクロアレイプレートを保持する保持手段と、
前記マイクロアレイプレートに形成された微小ウェルの間隔と同じ間隔で先端を前記微小ウェルに挿入可能な複数の光伝導ガイドと、前記光伝導ガイドと組み合わされて個々の微小ウェルに発光反応の基質溶液を導入するための基質溶液注入手段とを有し、前記保持手段の上方に位置し前記保持手段に対して上下動可能な発光検知ユニットと、
前記発光検知ユニットを前記保持手段に対して上下方向に駆動する駆動手段と、
前記駆動手段によって下方に駆動される発光検知ユニットを、前記光伝導ガイドの先端が前記マイクロアレイプレートの微小ウェルに挿入され、しかも前記微小ウェルの底面に接触しない所定位置に停止させる手段と、
前記発光検知ユニットで受光された前記微小ウェルからの発光を個別に検出可能な光検出手段とを備えることを特徴とする発光検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の発光検出装置において、隣接する前記光伝導ガイド間の中心間隔は４０〜２０００μｍの範囲であることを特徴とする発光検出装置。
【請求項３】
請求項１又は２記載の発光検出装置において、前記光伝導ガイドの先端が前記マイクロアレイプレートの微小ウェルに挿入され、しかも前記微小ウェルの底面に接触しない所定位置に停止させた後、基質溶液注入手段によって前記微小ウェルに発光基質溶液を添加し、発光強度を計測する制御手段を備えることを特徴とする発光検出装置。
【請求項４】
平坦な表面を有する基板と、所定の間隔で整列された複数の貫通穴を有し前記基板の平坦な表面上に接着された不透明シートとを備え、前記不透明シートの貫通穴の底に露出した前記基板表面に反応性物質固定区域を設定することを特徴とする発光検出用マイクロアレイプレート。
【請求項５】
請求項４記載の発光検出用マイクロアレイプレートにおいて、前記不透明シートは撥水性を有することを特徴とする発光検出用マイクロアレイプレート。
【請求項６】
請求項４又は５記載の発光検出用マイクロアレイプレートにおいて、前記貫通穴は直径が１０μｍから１０００μｍの範囲にあることを特徴とする発光検出用マイクロアレイプレート。
【請求項７】
所定の間隔で複数の微小ウェルが形成されたマイクロアレイプレートの前記微小ウェルにターゲット生体高分子を捕捉する反応性物質を固定した微粒子群を沈降させるステップと、
試料溶液を前記微小ウェルに分注するステップと、
前記試料が分注されたマイクロアレイプレートを所定時間、所定温度に保持するするステップと、
前記ターゲット生体高分子と結合する発光標識プローブ核酸鎖を前記微小ウェルに添加するステップと、
前記微小ウェルに発光反応の基質溶液を添加し、発光を検出するステップとを含むことを特徴とするターゲット生体高分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体試料中の核酸やたんぱく質の発光検出法に関し、微量な試料中の遺伝子やたんぱく質の測定に好適な技術に関する。
背景技術
遺伝子やたんぱく質の測定件数は近年ますます増加しており、測定の自動化、簡便化が強く要望されるようになってきた。しかし、測定試料は貴重であり、少量での計測が望まれている。また、そのような試料においては、測定対象物質の濃度も低いことが多く、高感度な測定が望まれる。化学発光や生物発光といった発光検出法は、蛍光法や吸光法に比べ一桁以上の高感度化が可能である。従来、発光検出方法には、マイクロプレートや光学セルを用いることが多かった（特開平６−２２５７５２号公報、特開平６−１０２１８２号公報）。しかしながら、近年、マイクロアレイと呼ばれるスライドグラス上に百から数万といった多種類のＤＮＡやたんぱく質をスポットとして固定し、特定の核酸やたんぱく質を捕捉、検出する技術が脚光を浴びている（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ）２０００年等参照）。
マイクロアレイは、特定の核酸やたんぱく質を固定した領域サイズの直径が１００〜１０００μｍ程度であり、スライドグラス上の幅１０〜３０ｍｍ、長さ２０〜５０ｍｍ程度の面積にわたり、スポット領域を等間隔で設置してある。このようなマイクロアレイ上のスポットに対し、蛍光検出する技術がよく用いられているが、微小区域の表面から発生する蛍光を観測するので感度が不足する場合があり、感度において蛍光法にまさる発光法に適した検出方法が望まれている。
しかしながら、発光計測の場合、微小区域からの発光を、位置精度良く計測するのが難しく、周囲からの迷光による妨害も大きい。マイクロアレイプレート全体をＣＣＤカメラや写真フィルムで計測する方法もあるが（Ｄ．Ｌ．Ｗｉｅｄｂｒａｕｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｈ．Ｆａｒｋａｓ編“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”、第７章‘Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ’，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）、１９９５年参照）、マイクロアレイのような、直径１ｍｍ以下の微小スポットが、ある面積内に多数隣接して並置されている場合、個々の微小区域の発光強度を精度良く計測するのは困難である。一方、微小スポット間の距離を離せば、周囲の微小発光区域からの影響は少なくなるが、数千個所以上という多数の微小反応区域を同一のスライドグラス上に設けてあるマイクロアレイにとって、微小反応区域の数が減ることになり、出来るだけ多数の微小反応区域で捕捉ハイブリダイゼーション反応を同時に行わせようとする目的に対して、不都合である。また処理能力を上げるために、複数の微小区域で同時に発光反応を行おうとすると、やはり隣接する微小発光区域からの影響を少なくする必要がある。しかしながら、化学発光は発光の寿命時間も短いので、発光基質を添加した後、短時間のうちに計測する必要があり、発光反応開始後の微小区域走査方式による計測は精度が良くない。
このような従来法の問題点を解決するべく、本発明は、直径２０〜５００μｍの複数の微小区域内からの発光を、同時に高感度で精度良く検出する方法を検討して考案されたものである。本発明は、特に、マイクロアレイに適した、発光反応開始直後から周辺妨害発光の影響を低減しながら測定するための技術を提供することを目的とする。また、本発明は、マイクロプレートのような直径数ｍｍのウェルに比較して直径がその１／１０以下である微小反応区域を化学発光法等の発光法で検出する上で好適な技術を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明では発光反応をマイクロアレイプレートに設けた微小ウェル内で行い、しかも発光の受光に光伝導ガイドを用い、光伝導ガイドの受光端と反応面との距離を極小にして検出発光光量の損失を減らすとともに、周囲の他の微小ウェルからの発光混入を低減するように工夫した。微小ウェルに対応した細い光伝導ガイド（光ファイバー利用）を用い、ガイド先端面と微小ウェル内の反応面の距離を狭めることにより、発光の損失を低減でき、また少量の試薬で検出できるようにした。
また、本発明の別の態様では、平坦なマイクロアレイプレート基板を用い、これに所定の配列で貫通穴を設けた不透明なシートを貼り合わせ、シートの貫通穴の部分を微小ウェルとして利用することで、微小反応区域間に隔壁を設け、妨害光を低減できるようにした。貫通穴の直径を光伝導ガイドに近い寸法にすると、周囲からの妨害発光の影響をさらに低減することができる。貫通穴の形状や寸法を変化させたり、異なるサイズの貫通穴を組み合わせることにより、必要に応じた多種類の計測が可能になる。
微小ウェルを有するマイクロアレイプレートは顕微鏡スライドグラスを加工して製造することができるが、これに限定されない。微小反応区域（微小ウェル）間の隔壁は化学発光反応液の拡散を防ぐとともに、微小反応区域間の発光を遮り、妨害発光の混入を低減する役割を果たす。このような限られた微小空間の発光を個別に測定するには、光ファイバー・ケーブルを用いた光伝導ガイドが好適である。
発光反応には、化学発光物質を標識する方法、酵素標識して発光性の反応産物を生じさせる方法、酵素反応で生物発光を生じさせる方法などがあるが、本発明は、いずれの方法にも適用できる。酵素反応を利用した発光の場合、反応生成物が水溶液中に拡散していき、通常の平坦なマイクロアレイでは発光区域が特定できなくなるが、隔壁があれば拡散を防止でき、スポットの特定が容易である。
微小ウェルの形状は円形とするのが最も簡単であるが、円形に限定されない。また微小ウェル内に数マイクロメータ以下の磁性微粒子を多数分散させ、その粒子表面に反応性の核酸やたんぱく質を固定しておくことで微小反応区域を設定してもよい。ウェルの肩部は、ウェル外への発光の散乱を防ぐために、ウェル開口端は鋭利な角度を持ち、滑らかな表面を有するのが好ましい。
また、発光の時間的減衰を考慮し、発光寿命の長い発光物質と短い発光物質をそれぞれ異なる対象の標識として用い、一定時間間隔をおいて複数の発光画像を測定すると、異なる核酸鎖やたんぱく質分子を容易に区別することができる。化学発光標識物質としては、ルミノール、アクリジニウムエステル、酵素では、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ等が発光反応に使用できる。感度をさらに上げる方法としては、ホタル・ルシフェラーゼを標識に用いる生物発光法も使用できる。
本発明は、所定の間隔で整列したマイクロアレイプレートの複数の微小ウェル中に捕捉された発光反応物質を検出する発光検出装置であり、この装置は、マイクロアレイプレートを保持する保持手段と、マイクロアレイプレートに形成された微小ウェルの間隔と同じ間隔で先端を微小ウェルに挿入可能な複数の光伝導ガイド及び光伝導ガイドと組み合わされて個々の微小ウェルに発光反応の基質溶液を導入するための基質溶液注入手を有し、保持手段の上方に位置し保持手段に対して上下動可能な発光検知ユニットと、発光検知ユニットを保持手段に対して上下方向に駆動する駆動手段と、駆動手段によって下方に駆動される発光検知ユニットを、光伝導ガイドの先端がマイクロアレイプレートの微小ウェルに挿入され、しかも微小ウェルの底面に接触しない所定位置に停止させる手段と、発光検知ユニットで受光された微小ウェルからの発光を個別に検出可能な光検出手段とを備えることを特徴とする。
光伝導ガイド間の中心間隔は約４０〜２０００μｍの範囲である。
前記装置は、光伝導ガイドの先端がマイクロアレイプレートの微小ウェルに挿入され、しかも微小ウェルの底面に接触しない所定位置に停止させた後、基質溶液注入手段によって微小ウェルに発光基質溶液を添加し、発光強度を計測する制御手段を備える。
本発明による発光検出用マイクロアレイプレートは、平坦な表面を有する基板と、所定の間隔で整列された複数の貫通穴を有し基板の平坦な表面上に接着された不透明シートとを備え、不透明シートの貫通穴の底に露出した基板表面に反応性物質固定区域を設定することを特徴とする。
不透明シートは撥水性を有することが好ましい。貫通穴は直径が１０μｍから１０００μｍの範囲にある。
また、本発明によるターゲット生体高分子の検出方法は、所定の間隔で複数の微小ウェルが形成されたマイクロアレイプレートの微小ウェルにターゲット生体高分子を捕捉する反応性物質を固定した微粒子群を沈降させるステップと、試料溶液を微小ウェルに分注するステップと、試料が分注されたマイクロアレイプレートを所定時間、所定温度に保持するするステップと、ターゲット生体高分子と結合する発光標識プローブ核酸鎖を微小ウェルに添加するステップと、微小ウェルに発光反応の基質溶液を添加し、発光を検出するステップとを含むことを特徴とする。
ターゲット生体高分子は特定の塩基配列を有する核酸や特定のたんぱく質であり、特定のたんぱく質は、例えば抗体、抗原、受容体、レクチンのいずれかとすることができる。
本発明によると、マイクロアレイプレートの微小反応区域の個々の発光量を精度・感度良く測定することができる。
発明を実施するための最良の形態
本発明をより詳細に説述するために、添付の図面に従ってこれを説明する。
図１は本発明で用いる発光検出用マイクロアレイプレートの一例を示す説明図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）はそのＡ−Ａ断面図である。
図１に示すマイクロアレイプレート１０は、スライドガラスのようなガラス板の表面の一部に浅い矩形の凹部（試料導入区域）１１が形成され、更にその矩形凹部の底面に複数の円形の窪み（微小ウェル）１２がアレイ状に形成されている。複数の微小ウェル１２はそれぞれ平坦な底部を有し、その底部の一部が試料中のターゲット核酸とハイブリダイズする核酸プローブを固定する反応分子固定化区域になっている。試料導入区域１１は多数の成分を含む１種類の試料を、この区域内に集合している全ての微小ウェル１２に同時に分注するために設けられている。個々の微小ウェル１２に試料を一定量ずつ分注できる場合には、試料導入区域１１は不要である。
試料導入区域や微小ウェルの寸法は、特に限定するものではないが、一例を挙げると、試料導入区域は、縦１５ｍｍ×横１５ｍｍ×深さ０．２ｍｍ、底面に核酸プローブ固定用の反応分子固定化区域を設けた微小ウェルは直径が約１５０μｍの円形で、深さ約１００μｍである。円形の微小ウェルの中心間距離は３００μｍである。
マイクロアレイプレート１０の材質はガラスのほか、プラスチックやシリコン等でもよい。また、透明である必要はなく、むしろ黒色など光を吸収する色に着色されていれば、光の反射も減り、隣接する反応分子固定化区域における発光同士の干渉を防止できて好適である。微小ウェル１２は切削加工や化学エッチングで形成してもよいが、モールド型で形成してもよい。
図２は、本発明で使用する発光検出用マイクロアレイプレートの他の例を示す説明図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）はそのＡ−Ａ断面図である。
このマイクロアレイプレート２０は、矩形の凹部（試料導入区域）２１を形成したガラスあるいはプラスチックからなるスライドグラス１３に、貫通穴がアレイ状に配列された不透明シート２３を接着して、図１に示したのと同様の構造としたものである。具体的には、平均厚さ約１ｍｍのスライドグラスに縦１５ｍｍ×横１５ｍｍで深さ約０．５ｍｍの矩形凹部を形成し、それとは別に、直径３５０μｍの貫通穴を所定の配列で複数個形成した縦１５ｍｍ×横１５ｍｍ、厚み約２５０μｍの黒色カーボン含有ポリエチレン製シート２３を用意した。そして、ポリエチレン製シート２３の片面にエポキシ系接着剤を塗り、スライドグラスに形成した凹部に一端から密着するよう貼り付けた。こうして製造されたマイクロアレイプレート２０は、シートに形成した貫通穴の部分が底面に微小反応区域が設定される微小ウェル２２となり、微小ウェル間に存在するシート材料が遮光壁となって、隣接する微小ウェルからの発光が妨害光となるのを防止するため、計測の再現性を向上することができる。
シートの材質としては、試料や基質液の浸潤がないことが望まれ、撥水性の材料が好適である。吸水性の材料では周囲へ溶液が浸透し、計測に不適当である。ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）のようなフッ素系高分子材等もこのような目的に好適である。シート表面の色としては、黒色のような散乱光を起こしにくい色が望ましいが、必ずしも黒色に限定されない。
図３は、本発明による発光検出装置の一例を示す概略図である。ここでは、図１に示したマイクロアレイプレート１０を用いる例によって説明する。
発光検出装置は、上面にマイクロアレイプレート１０を保持するマイクロアレイプレート固定台３１、固定台３１に対して上下動可能な発光検知ユニット３２、発光検知ユニット３２を上下動させるための発光検知ユニット移動アーム３３、発光検知ユニット移動アーム３３を支持する支柱３４を備える。また、発光基質液の入った発光基質液ボトル３５、ボトル３５から発光基質液をマイクロシリンジ３７に送出するためのポンプ３６、マイクロシリンジ３７中の発光基質液をマイクロアレイプレート１０の各微小ウェルに注入するためのプランジャー押し下げ機構３８を備える。これらの要素は、外光を遮光する筐体３０中に設置されている。発光検知ユニット３２は、光伝導ガイドバンドル３９によってフォトカウンティング装置４０と接続されている。発光検知ユニット移動アーム３３、ポンプ３６、プランジャー押し下げ機構３８及びフォトカウンティング装置４０は、制御部４５によって制御される。
制御部４５は発光検知ユニット移動アーム３３の昇降を制御し、反応前に各反応区域の表面近くまで各光伝導ガイド４１を下降させ、プランジャー押し下げ機構３８の操作により、発光基質溶液を添加し、発光反応を開始させる。さらにその発光強度をフォトカウンティング装置４０で計測する。そののち、各光伝導ガイド４１先端を洗浄し、基質成分等の汚れを落とす。次にマイクロアレイプレート上の、他の微小反応区域の上に移動し、次の区域での発光反応を起こさせ、計測する。この反応、計測、洗浄を繰り返し、全微小反応区域に対して行い、その発光強度を測定し、データ処理装置にデータを送付する。
図４は、マイクロアレイプレートに接近して発光区域からの発光を検出している発光検出ユニットの模式図である。
発光検知ユニット３２は、マイクロアレイプレート１０に設けられた複数の微小ウェル１２と同じ間隔で配置された複数の光伝導ガイド４１を備える。複数の光伝導ガイド４１は、間隔を揃えた発光検知ユニット移動アーム３３の固定穴に固定され、この下方位置で同じく間隔を揃えた光伝導ガイド固定スペーサ４２の固定穴に固定されて一体化されている。また、発光検知ユニット３２は、光伝導ガイド４１に混じって発光検知ユニット移動アーム３３から下方に延びる１本あるいは数本の高さ制御用の棒状部材６２（図６参照））を備える。発光検知ユニット３２は、その光伝導ガイド４１がマイクロアレイプレート１０に設けられた複数の微小ウェル１２に位置合わせされた状態で、発光検知ユニット移動アーム３３を下降することにより、各光伝導ガイド４１の先端が微小ウェル内に挿入される。このとき、高さ制御用の棒状部材６２がマイクロアレイプレート１０に当接した位置で発光検知ユニット３２の下降を停止することにより、光伝導ガイド４１の先端は微小ウェル１２の底面に接触することはない。発光検知ユニット３２の各光伝導ガイド４１の先端受光面で受光された光は、フォトンカウンティング装置４０に内蔵されたマルチチャンネル光電子増倍管によって個別に検出される。
図５は光伝導ガイドと基質注入キャピラリーを一体化した発光検知ユニットの１本が微小ウェルに挿入された状態での横断面図であり、図６はその側断面図である。
光伝導ガイド４１は、コア４１ａ、クラッド４１ｂ及び被覆４１ｃからなる。コア４１ａの直径は約５０μｍ、被覆４１ｃの外径は約１２０μｍである。光伝導ガイド４１には、それぞれ基質注入キャピラリー５１が一体化して設けられている。基質注入キャピラリー５１は、例えば外径３０μｍ、内径２０μｍのガラス細管であり、光伝導ガイド４１の被覆表面に接着剤層５２で固定してある。個々の基質注入キャピラリー５１の上端には、マイクロシリンジ３７がシリコンゴム管等で接続されており、このマイクロシリンジ３７のプランジャーにプランジャー押し下げ機構３８からわずかな一定の圧力を加えることで、注入キャピラリー５１の下端から微小ウェル１２に発光反応基質液を注入することができる。注入キャピラリー５１の先端は光伝導ガイド４１の先端面に揃えてあり、発光反応基質液が表面を伝わり、微小ウェル１２の底面に設けられた反応分子固定化区域６１との間隙に浸透するようになっている。図６は、マイクロアレイプレート１０の微小ウェル１２に、基質溶液注入キャピラリーから注入された化学発光反応の基質溶液６５が溜まっている状態を示している。
高さ制御用の棒状部材６２は、光伝導ガイド４１と基質溶液注入キャピラリー５１の先端を微小ウェル１２の底面から一定の高さで停止させるために用いられる。光伝導ガイド４１の先端面が微小ウェル１２内の反応分子固定化区域６１と接触していると、気泡、空隙などにより化学発光反応基質溶液６５が標識酵素等に接触しにくくなるため、反応分子固定化区域６１表面と光伝導ガイド４１の先端面との間に一定の距離をおくのが望ましい。図示の例の場合、高さ制御用の棒状部材６２は先端が光伝導ガイド４１の先端よりも上方にあり、各光伝導ガイド４１の先端が微小ウェルに整列して挿入されたとき、微小ウェル外の位置でマイクロアレイプレート表面と接触するように設計されている。この例では、高さ制御用の棒状部材６２の先端部がマイクロアレイプレート表面と接触した状態で、光伝導ガイド４１の先端面とウェル底面との間に約２０μｍの隙間が生じるように設定した。これにより多数の微小反応区域での同時測定が可能となり、処理能力が大幅に向上出来た。
高さ制御用ガイドを光伝導ガイドで構成することも可能である。その場合には、検知用光源から高さ制御用光伝導ガイドを通じて導入した光が微小ウェル１２の底面で反射し、再び高さ制御用光伝導ガイドを戻ってくる反射光強度に大きな変化が生じることで、高さ制御用光伝導ガイドの先端面がマイクロアレイプレートに接触したことを検知することができる。高さの制御は反射光での検知以外に、メカニカルな上下移動距離測定でも行うことができる。また、高さ制御用部材は、微小ウェル１２の底面と接触するように設計することもできる。その場合には、高さ制御用部材の先端を、光伝導ガイド４１より下方に突出させておく。
次に、本発明によるマイクロアレイプレート及び発光計測装置を用いた実験例について説明する。
図１に示したマイクロアレイプレート１０を洗浄後、各微小ウェル１２の底面に、スルフヒドリル（ＳＨ）基を有するシラン化剤を反応させ、ＳＨ基を表面に導入した。次に。アミノ基を末端に導入した捕捉用核酸プローブを含む溶液とｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル溶液を混合・反応させたのち、マイクロアレイ作成装置（アレイヤー）を用いて各スポット領域に１ｎｌずつスポットし、微小ウェル１２の底面に設定した反応分子固定化区域６１の中央に導入したＳＨ基と反応させ、固定化した。固定化捕捉用核酸プローブは、乾燥後、固定されなかった不要試薬と共存成分を純水で洗浄し、清浄なマイクロアレイプレートとした。
微小ウェル１２を含む試料導入区域１１（縦１５ｍｍ×横１５ｍｍ×深さ０．２ｍｍ）全体に一様に被験試料を４０μｌ分注し、各微小ウェル内の固定化捕捉用核酸プローブと反応させた。測定対象としてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のゲノムＤＮＡを用いた。捕捉用及び標識用の核酸プローブには合成したオリゴヌクレオチド（塩基長５０ｂｐ）各種を用いた。ハイブリダイゼーション反応はマイクロアレイプレートを密封し、約４５℃に加温したインキュベータ内に静置して約５時間行った。
測定対象の核酸鎖をサンドイッチアッセイで２種類のプローブを用いて捕捉・計測した。測定対象のターゲット核酸鎖の捕捉プローブ未結合部位と反応する標識核酸プローブには、常法で予め西洋わさびペルオキシダーゼを結合させておいた。ハイブリダイゼーション後、未結合の標識核酸プローブ液をマイクロピペットで吸いあげ、次に洗浄液４０μｌを数回に分けて注入と排出を繰り返した。次に標識プローブ結合核酸プローブを添加し、さらに５時間インキュベーションを行った。ハイブリダイゼーション後、未結合の核酸プローブ液をマイクロピペットで吸いあげ、次に洗浄液４０μｌを数回に分けてマイクロピペットで注入と排出を繰り返した。
図７は、標識プローブ、試料核酸鎖、捕捉プローブの相互関係を示す反応模式図である。
微小ウェル１２に設けられた反応分子固定化区域の表面７１には、ＳＨ基が露出したプローブ固定部７２があり、そこに捕捉用核酸プローブ７３が固定される。試料中のターゲット核酸７４は、ハイブリダイゼーション反応によって核酸プローブ７３とハイブリダイズする。ターゲット核酸７４の捕捉プローブとの未結合部位には、発光標識物質７６が結合した標識核酸プローブ７５が結合している。
最後の洗浄液を吸い上げた後、マイクロアレイプレート１０を図３に示した発光検出装置のマイクロアレイプレート固定台３１上に置いた。発光検知ユニット３２をマイクロアレイプレート１０の微小ウェル（直径１５０μｍ）へ位置決めし、発光検知ユニット移動アーム３３を駆動して発光検知ユニット３２を下降させた。図示した例の発光検知ユニット３２中には１６本の光伝導ガイド４１が組み込まれている。発光検知ユニット３２中の高さ制御用棒状部材６２の先端がマイクロアレイプレート１０の表面に接触したところで発光検知ユニット３２の動きを止めた。この状態で、発光検知ユニット３２の光伝導ガイド４１及び基質注入キャピラリー５１は微小ウェル１２内に挿入され、その先端が微小ウェル１２の底面から２０μｍの高さのところで停止している。次に、各光伝導ガイド４１の下面と微小ウェル１２の反応分子固定化区域６１との間の隙間に、注入キャピラリー５を用いて酵素反応基質ルミノールと過酸化水素を含む反応液を約１ｎｌ添加して発光反応を開始し、反応液注入時点から１０秒経過後までの発光強度を、１６チャンネル光電子増倍管（浜松ホトニクス社）を内蔵したフォトンカウンティング装置４０で測定した。
その結果、ターゲット核酸鎖を濃度１０ｐｍｏｌ／ｌで含む試料溶液を反応させたスポットでは、含まない試料に比較して約６０倍の相対発光強度を得た。また隣接する微小区域にて反応させたターゲット核酸鎖を１０ｐｍｏｌ／ｌ含む試料溶液の発光強度の影響は５％以下であり、無視できた。マイクロアレイプレート全体の発光強度分布は、各光伝導ガイドからの出力をプロットすることで、見ることができる。
また、マイクロアレイプレートとして図２に示したものを用いた以外、上記と同様な試薬反応条件で発光を計測した。その結果、ターゲット核酸鎖を１０ｐＭ含む試料溶液を反応させたスポットでは、含まない試料での発光強度に比較して約５０倍の相対発光強度を得た。
上記と同様の実験を、標識酵素としてアルカリ性フォスファターゼを西洋ワサビ・ペルオキシダーゼの替わりに用いて行うことができた。基質としては、たとえば、ジオキセタン化合物のＬｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）を用いると、長寿命の発光計測が実現でき、同一時間で従来の基質の約１０倍の光量が得られた。
本発明によるマイクロアレイプレート及び発光計測装置を用いた別の実験例について説明する。
粒径が平均４．０μｍの０．０１％（Ｗ／Ｗ）シリカ粒子懸濁液に、１％γ−アミノプロピルトリエトキシシランのエタノール溶液を１／１０量添加し、６０℃で３時間加温し、表面にアミノ基を導入した。アビジンたんぱく質溶液をアミノ化処理を施したシリカ粒子に加え、１％グルタールアルデヒドを添加して固定した。次に、末端をビオチン修飾した捕捉用プローブ核酸鎖を各種用意し、分割したアビジン固定シリカ微粒子懸濁液と反応させ、捕捉プローブ核酸鎖固定シリカ粒子を作製した。
図２に示したマイクロアレイプレート２０を用い、図８に示すように、異なる核酸鎖固定化シリカ粒子８１を１ｎｌずつ、微小ウェル２２に分注した。本例のマイクロアレイプレート２０は、各微小ウェル２２の底面には何も固定されていない。シリカ微粒子懸濁液を空気乾燥させたあと、マイクロアレイプレートの試料導入区域２１に測定対象核酸を含む試料を４０μｌ注入し、各微小ウェル２２に分注し、測定対象核酸鎖を、これを捕捉するシリカ微粒子に結合させた。４０℃、１２時間のハイブリダイゼーション後、充分に洗浄を行った。
次に、マイクロアレイプレートを図３に示した発光検出装置に設置し、発光標識酵素アルカリ性フォスファターゼを結合させた発光標識プローブ核酸鎖を各微小ウェルに加え、前記と同様にして各微小ウェルからの発光を検出した。その結果、測定対象のＤＮＡ鎖を１ｎＭの濃度で含む試料からは、対象とするＤＮＡ鎖を含まない試料に比較して約３０倍の発光強度が得られた。この例の場合、シリカ粒子を置く反応分子固定化区域の場所は複数の微小ウェルに自由に設定、変更できる。また、注入シリカ粒子量を変化させ、捕捉容量を変えることも容易である。さらにシリカ微粒子を洗い落とせば、マイクロアレイプレートを再利用することも可能である。
産業上の利用可能性
本発明によれば、複数の反応分子固定化区域を有するマイクロアレイの発光検出に際し、反応区域を取り囲む隔壁を、各反応分子固定化区域の周囲に設けることにより、個々の微小区域からの発光強度を感度及び精度良く、低試薬コストで検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明で用いる発光検出用マイクロアレイプレートの一例を示す説明図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）はそのＡ−Ａ断面図である。
図２は、本発明で使用する発光検出用マイクロアレイプレートの他の例を示す説明図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）はそのＡ−Ａ断面図である。
図３は、本発明による発光検出装置の一例を示す概略図である。
図４は、マイクロアレイプレートに接近して発光区域からの発光を検出している発光検出ユニットの模式図である。
図５は、光伝導ガイドと基質注入キャピラリーを一体化した発光検知ユニットの１本が微小ウェルに挿入された状態での横断面図である。
図６は、図５の側断面図である。
図７は、標識プローブ、試料核酸鎖、捕捉プローブの相互関係を示す反応模式図である。
図８は、本発明によるマイクロアレイプレート及び発光計測装置を用いた別の実験例についての説明図である。
【図１】
2003031952.tif 000003
【図２】
2003031952.tif 000004
【図３】
2003031952.tif 000005
【図４】
2003031952.tif 000006
【図５】
2003031952.tif 000007
【図６】
2003031952.tif 000008
【図７】
2003031952.tif 000009
【図８】
2003031952.tif 000010
【国際調査報告】
2003031952.tif 000011
2003031952.tif 000012
2003031952.tif 000013