(57)【要約】本発明は、グルコキナーゼを結晶化し、その三次元構造を解析し、得られる三次元構造座標に基づいてグルコキナーゼに結合する化合物を設計する。具体的には、グルコキナーゼのＮ末端側のアミノ酸残基の一部を欠失させることによってグルコキナーゼを結晶化し、この結晶についてＸ線結晶構造解析によってその三次元構造を解明することによって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化に用いることを特徴とする、グルコキナーゼタンパク質。
【請求項２】
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質の結晶。
【請求項４】
前記タンパク質がグルコキナーゼタンパク質である、請求項３に記載の結晶。
【請求項５】
配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の結晶である、請求項３に記載の結晶。
【請求項６】
格子定数が、下記式（１）〜（４）：
ａ＝ｂ＝７９．９±４オングストローム  …（１）
ｃ＝３２２．２±１５オングストローム  …（２）
α＝β＝９０°  …（３）
γ＝１２０°    …（４）
を満たす、請求項３に記載の結晶。
【請求項７】
空間群がＰ６５２２である、請求項６に記載の結晶。
【請求項８】
表１に記載の三次元構造座標データによって特定されるタンパク質の結晶。
【請求項９】
表１に記載の三次元構造座標データの少なくとも一つのデータを変更した三次元構造座標データにおいて、表１に記載の三次元構造座標データで示されるアミノ酸の主鎖の原子（Ｃα原子）と、該Ｃα原子と対応する前記変更した三次元構造座標データで示されるＣα原子との平均二乗偏差が、０．６オングストローム以下である結晶。
【請求項１０】
化合物結合部位が、配列番号５に示すアミノ酸配列における、チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９のアミノ酸残基の少なくともひとつによって構成されている、請求項３〜９のいずれかに記載の結晶。
【請求項１１】
配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質と該タンパク質に結合可能な化合物との複合体を含む結晶。
【請求項１２】
前記化合物が、式（Ｉ）で表される、請求項１１に記載の結晶。
2003097824.tif 000282
［式中、Ｒ１は、ハロゲン原子、−Ｓ−（Ｏ）ｐ−Ａ、−Ｓ−（Ｏ）ｑ−Ｂ又は−Ｏ−Ｂを示し（ここで、ｐ及びｑは同一又は異なって、０〜２の整数を示し、Ａは置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基を示し、Ｂは置換されていてもよい五員環又は六員環のアリール基又はヘテロアリール基を示し、
Ｒ２は水素原子又はハロゲン原子を示し、
2003097824.tif 000283
は、アミド基に結合した炭素原子の隣に窒素原子を有する、置換されていてもよい単環の又は双環のヘテロアリール基を示す）
【請求項１３】
前記化合物が、式（ＩＩＩａ）〜式（ＩＩＩｃ）で表されるいずれかの化合物である請求項１２に記載の結晶。
2003097824.tif 000284
【請求項１４】
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質の結晶。
【請求項１６】
前記タンパク質がグルコキナーゼタンパク質である、請求項１５に記載の結晶。
【請求項１７】
配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の結晶である、請求項１５に記載の結晶。
【請求項１８】
格子定数が、下記式
ａ＝ｂ＝１０３．２±５オングストローム  …（５）
ｃ＝２８１．０±７オングストローム      …（６）
α＝β＝９０°  …（７）
γ＝１２０°    …（８）
を満たす、請求項１５に記載の結晶。
【請求項１９】
空間群がＰ６５２２である、請求項１８に記載の結晶。
【請求項２０】
表２に記載の三次元構造座標データによって特定されるタンパク質の結晶。
【請求項２１】
表２に記載の三次元構造座標データの少なくとも一つのデータを変更した三次元構造座標データにおいて、表２に記載の三次元構造座標データで示されるアミノ酸の主鎖の原子（Ｃα原子）と、該Ｃα原子と対応する前記変更した三次元構造座標データで示されるＣα原子との平均二乗偏差が、０．６オングストローム以下である結晶。
【請求項２２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端、Ｃ末端のいずれかまたは両方から、１〜５０個のアミノ酸残基を欠損したアミノ酸配列を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記タンパク質製造工程で得られたタンパク質と結合する化合物と、前記タンパク質製造工程で得られたタンパク質とを反応させるタンパク質反応工程とを含む、
タンパク質及びそのタンパク質と結合する化合物の複合体を含む結晶の製造方法。
【請求項２３】
タンパク質の結晶を製造する方法であって、
配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含みグルコキナーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質に結合可能な化合物を用いることを特徴とする、結晶の製造方法。
【請求項２４】
前記タンパク質に結合可能な化合物が、式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする、請求項２３に記載のタンパク質の結晶の製造方法。
2003097824.tif 000285
［式中、Ｒ１は、ハロゲン原子、−Ｓ−（Ｏ）ｐ−Ａ、−Ｓ−（Ｏ）ｑ−Ｂ又は−Ｏ−Ｂを示し（ここで、ｐ及びｑは同一又は異なって、０〜２の整数を示し、Ａは置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基を示し、Ｂは置換されていてもよい五員環又は六員環のアリール基又はヘテロアリール基を示し、
Ｒ２は水素原子又はハロゲン原子を示し、
2003097824.tif 000286
は、アミド基に結合した炭素原子の隣に窒素原子を有する、置換されていてもよい単環の又は双環のヘテロアリール基を示す）
【請求項２５】
共結晶法又はソーキング法による、請求項２３、又は請求項２４に記載の結晶の製造方法。
【請求項２６】
タンパク質の立体構造情報に基づいて該タンパク質に結合する化合物の構造をデザインするドラッグデザイン方法であって、
該タンパク質の立体構造情報が、請求項３〜１３、請求項１５〜２１のうちのいずれか一項に記載の結晶を解析することによって得られる情報であることを特徴とする、ドラッグデザイン方法。
【請求項２７】
前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、
前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位に適合する化合物を、化合物ライブラリより選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする、請求項２６に記載のドラッグデザイン方法。
【請求項２８】
前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、
前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位に適合する化合物の構造を構築する化合物構造構築工程と、
を含むことを特徴とする、請求項２６に記載のドラッグデザイン方法。
【請求項２９】
前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、
前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位と該化合物結合部位に適合する化合物とが相互作用するように化合物の構造を目視によりデザインするデザイン工程と、
を含むことを特徴とする、請求項２６に記載のドラッグデザイン方法。
【請求項３０】
前記化合物結合部位が、配列番号５に示すアミノ酸配列における、チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９のアミノ酸残基の少なくともひとつによって構成されている、請求項２６〜２９のうちのいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法。
【請求項３１】
さらに、前記化合物結合部位に適合すると推定される候補化合物の生理活性を測定する工程を含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法。
【請求項３２】
さらに、前記化合物結合部位に適合すると推定される候補化合物と、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とを接触させ、その候補化合物が該タンパク質に結合するか否か判定する結合判定工程を含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法。
【請求項３３】
請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法によって選択された化合物群を化合物アレイとして組み合わせることを含む化合物アレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なグルコキナーゼタンパク質（以下、「ＧＫタンパク質」ともいう）の結晶、その結晶を用いて得られる三次元構造座標を用いたドラッグデザイン方法などに関する。
背景技術
グルコキナーゼ（ＡＴＰ：Ｄ−ｈｅｘｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｚｅ，ＥＣ２．７．１．１）は、哺乳類の４種のヘキソキナーゼアイソザイムのうちの一つ（ヘキソキナーゼＩＶ）である。これらのアイソザイムは同じ反応を触媒するが、グルコースに対するＫｍ値に差がある。すなわち、ヘキソキナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩのＫｍ値は１０−６〜１０−４Ｍであるのに対し、グルコキナーゼともよばれるヘキソキナーゼＩＶのグルコースに対するＫｍ値はずっと大きく、約１０−２Ｍである。ヘキソキナーゼは、解糖系の初期段階に関与する酵素であり、グルコースからグルコース６リン酸への反応を触媒する。
グルコキナーゼは、主に肝臓と膵臓ベータ細胞に発現が限局しており、それらの細胞におけるグルコース代謝の律速段階を制御することで、体全体の糖代謝に重要な役割を果たしている。肝臓と膵臓ベータ細胞のグルコキナーゼは、それぞれスプライシングの違いによりＮ末端の１５アミノ酸の配列が異なっているが、酵素学的性質は同一である。
１０年ほど前から、グルコキナーゼは膵臓ベータ細胞や肝臓のグルコースセンサーとして働くという仮説が提唱されている（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ：Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２４７（３Ｐｔ２）：Ｒ５２７−５３６，１９８４）。最近のグルコキナーゼ遺伝子操作マウスの結果から、実際にグルコキナーゼは全身のグルコース恒常性に重要な役割を担うことが明らかになっている。
グルコキナーゼ遺伝子を破壊したマウスは、生後まもなく糖尿病で死亡する（Ｇｒｕｐｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ  ８３：６９−７８．１９９５）。一方、グルコキナーゼを過剰発現させたマウスは血糖値が低くなる（Ｆｅｒｒｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：７２２５−７２３０．１９９６）。グルコース濃度上昇によってグルコキナーゼ活性が上昇すると、膵臓ベータ細胞と肝細胞の反応は異なるが、いずれも血糖を低下させる方向に作用する。膵臓ベータ細胞は、より多くのインスリンを分泌するようになり、肝臓は糖を取り込みグリコーゲンとして貯蔵すると同時に糖放出を低下させる。
このようにグルコキナーゼ酵素活性の変動は、肝臓および膵臓ベータ細胞を介した哺乳類のグルコースホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしている。ＭＯＤＹ２（ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ）と呼ばれる若年に糖尿病を発症する症例においてグルコキナーゼ遺伝子の突然変異が発見され、グルコキナーゼ活性の低下が血糖上昇の原因となっている（Ｖｉｏｎｎｅｔ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：７２１−７２２，１９９２）。一方グルコキナーゼ活性を上昇させる突然変異をもつ家系も見つかっており、このような人たちは低血糖症状を示す（Ｇｌａｓｅｒ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ：Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８：２２６−２３０，１９９８）。
以上より、グルコキナーゼはヒトにおいてもグルコースセンサーとして働き、グルコース恒常性に重要な役割を果たしている。一方、多くのＩＩ型糖尿病患者のグルコキナーゼは変位を受けていないので、グルコキナーゼセンサーシステムを利用した血糖調節は可能と考えられる。グルコキナーゼ活性化物質には膵臓ベータ細胞のインスリン分泌促進作用と肝臓の糖取り込み亢進および糖放出抑制作用が期待できるので、ＩＩ型糖尿病患者の治療薬として有用と考えられる。
近年、膵臓ベータ細胞型グルコキナーゼが、ラット脳、なかでも特に摂食中枢である視床下部腹内側核（Ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ，ＶＭＨ）に限局して発現していることが明らかにされた。ＶＭＨの約２割の神経細胞は、グルコースレスポンシブニューロンと呼ばれ、従来から体重コントロールに重要な役割を果たすと考えられてきた。ラットの脳内へグルコースを投与すると摂食量が低下するのに対して、グルコース類縁体のグルコサミンの脳内投与によってグルコース代謝を抑制すると過食となる。電気生理学的実験からグルコースレスポンシブニューロンは生理的なグルコース濃度変化（５−２０ｍＭ）に呼応して活性化されるがグルコサミン等でグルコース代謝を抑制すると活性抑制が認められる。ＶＭＨのグルコース濃度感知システムには膵臓ベータ細胞のインスリン分泌と同様なグルコキナーゼを介したメカニズムが想定されている。従って肝臓、膵臓ベータ細胞に加えＶＨＭのグルコキナーゼ活性化を行う物質には血糖是正効果のみならず、多くのＩＩ型糖尿病患者で問題となっている肥満をも是正できる可能性がある。
一方、ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ｖｏｌ．４８，１６９８−１７０５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９にはヘキソキナーゼＩからグルコキナーゼの立体構造を予測した旨が記載されているが、実際に結晶化はされていないし、実用的なものではなかった。
以上より、グルコキナーゼの三次元立体構造を明らかにし、グルコキナーゼと相互作用する化合物を効率的に見いだすことを可能にすることは、例えば、糖尿病の治療剤、又は予防剤；網膜症、腎症、神経症、虚血性心疾患、動脈硬化等の糖尿病の慢性合併症の治療剤、又は予防剤；肥満の治療剤、又は予防剤の開発に大きな進展をもたらすと考えられる。
現在ではタンパク質の活性中心の解析や反応機作の予測といった作業にコンピュータを利用したＣＡＲＤＤ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｉｄｅｄ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）が実用的なレベルで活用されるようになっている。
ＣＡＲＤＤによる創薬システムにおいては、ターゲットとなるタンパク質の３次元構造解析データに基づき、タンパク質の活性部位の構造が予測される。そして、その活性部位の構造と結合し得る化合物の候補に関する情報が化合物データベースから取得される。その後、ターゲットとなるタンパク質の活性部位と候補化合物の３次元構造や物理的性質を考慮し、ターゲットとなるタンパク質に結合しうる化合物の候補を選択する。これらの工程が、いわゆるインシリコスクリーニング工程である。
インシリコスクリーニング工程で選択された化合物が、ターゲットとなるタンパク質と結合し、その活性を変化させるかどうかは、実際の試験（ウエット実験）により調べられる。そして、実際にターゲットとなるタンパク質の活性を変化させる化合物が医薬の有効成分となる。これにより、実験室で無数の化合物を標的タンパク質に一つ一つ作用させて相互作用を確認するという操作を行うことなく、標的タンパク質と相互作用する化合物を効率よく探し出される。
インシリコスクリーニングは、ターゲットとなるタンパク質と結合する化合物の候補を大幅に絞ることができるため医薬品開発に有効な手段であるといえる。
ＣＡＲＤＤによる創薬システムにおいては、ターゲットとなるタンパク質のＸ線構造解析による３次元構造解析データが重要な情報となる。Ｘ線構造解析による３次元構造解析には、解析試料としてターゲットとなるタンパク質の結晶が必要である。したがってＣＡＲＤＤによる創薬システムに基づいてＧＫに関連する創薬の開発を進めるためには、ＧＫの結晶が必要である。しかしながら、前述のとおりＧＫは結晶化が困難で、ＣＡＲＤＤに必要な情報を与えうるものではなかった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、グルコキナーゼの結晶を得ること、及び、当該結晶から得られた情報に基づいてグルコキナーゼに結合する化合物を設計することを目的とする。
発明の開示
上記目的の少なくともひとつ以上は、以下の発明により解決される。
［１］結晶化に用いることを特徴とする、グルコキナーゼタンパク質。
［２］配列番号５に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記［１］に記載のタンパク質。
［３］配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質の結晶。
［４］前記タンパク質がグルコキナーゼタンパク質である、前記［３］に記載の結晶。
［５］配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の結晶である、前記［３］に記載の結晶。
［６］格子定数が、下記式（１）〜（４）
ａ＝ｂ＝７９．９±４オングストローム  …（１）
ｃ＝３２２．２±１５オングストローム  …（２）
α＝β＝９０°  …（３）
γ＝１２０°    …（４）
を満たす、前記［３］に記載の結晶。
［７］空間群がＰ６５２２である、前記［６］に記載の結晶。
［８］表１に記載の三次元構造座標データによって特定されるタンパク質の結晶。
［９］表１に記載の三次元構造座標データの少なくとも一つのデータを変更した三次元構造座標データにおいて、表１に記載の三次元構造座標データで示されるアミノ酸の主鎖の原子（Ｃα原子）と、該Ｃα原子と対応する前記変更した三次元構造座標データで示されるＣα原子との平均二乗偏差が、０．６オングストローム以下である結晶。
［１０］化合物結合部位が、配列番号５に示すアミノ酸配列における、チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９のアミノ酸残基の少なくともひとつによって構成される、［３］〜［９］のいずれかに記載の結晶。
［１１］配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質と該タンパク質に結合可能な化合物との複合体を含む結晶。
［１２］前記化合物が、式（Ｉ）で表される、前記［１１］に記載の結晶。
2003097824.tif 000002
［式中、Ｒ１は、ハロゲン原子、−Ｓ−（Ｏ）ｐ−Ａ、−Ｓ−（Ｏ）ｑ−Ｂ又は−Ｏ−Ｂを示し（ここで、ｐ及びｑは同一又は異なって、０〜２の整数を示し、Ａは置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基を示し、Ｂは置換されていてもよい五員環又は六員環のアリール基又はヘテロアリール基を示し、
Ｒ２は水素原子又はハロゲン原子を示し、
2003097824.tif 000003
は、アミド基に結合した炭素原子の隣に窒素原子を有する、置換されていてもよい単環の又は双環のヘテロアリール基を示す］
［１３］前記化合物が、式（ＩＩＩａ）〜式（ＩＩＩｃ）で表されるいずれかの化合物である前記［１２］に記載の結晶。
2003097824.tif 000004
2003097824.tif 000005
［１４］  配列番号８に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記［１］に記載のタンパク質。
［１５］  配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質の結晶。
［１６］  前記タンパク質がグルコキナーゼタンパク質である、前記［１５］に記載の結晶。
［１７］  配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の結晶である、前記［１５］に記載の結晶。
［１８］  格子定数が、下記式
ａ＝ｂ＝１０３．２±５オングストローム  …（５）
ｃ＝２８１．０±７オングストローム      …（６）
α＝β＝９０°  …（７）
γ＝１２０°    …（８）
を満たす、前記［１５］に記載の結晶。
［１９］  空間群がＰ６５２２である、前記［１８］に記載の結晶。
［２０］  表２に記載の三次元構造座標データによって特定されるタンパク質の結晶。
［２１］  表２に記載の三次元構造座標データの少なくとも一つのデータを変更した三次元構造座標データにおいて、表２に記載の三次元構造座標データで示されるアミノ酸の主鎖の原子（Ｃα原子）と、該Ｃα原子と対応する前記変更した三次元構造座標データで示されるＣα原子との平均二乗偏差が、０．６オングストローム以下である結晶。
［２２］  配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端、Ｃ末端のいずれかまたは両方から、１〜５０個のアミノ酸残基を欠損したアミノ酸配列を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記タンパク質製造工程で得られたタンパク質と結合する化合物と、前記タンパク質製造工程で得られたタンパク質とを反応させるタンパク質反応工程とを含む、
タンパク質及びそのタンパク質と結合する化合物の複合体を含む結晶の製造方法。
［２３］  タンパク質の結晶を製造する方法であって、
配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含みグルコキナーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質に結合可能な化合物を用いることを特徴とする、結晶の製造方法。
［２４］  前記タンパク質に結合可能な化合物が、式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする、前記［２３］に記載のタンパク質の結晶の製造方法。
2003097824.tif 000006
［式中、Ｒ１は、ハロゲン原子、−Ｓ−（Ｏ）ｐ−Ａ、−Ｓ−（Ｏ）ｑ−Ｂ又は−Ｏ−Ｂを示し（ここで、ｐ及びｑは同一又は異なって、０〜２の整数を示し、Ａは置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基を示し、Ｂは置換されていてもよい五員環又は六員環のアリール基又はヘテロアリール基を示し、
Ｒ２は水素原子又はハロゲン原子を示し、
2003097824.tif 000007
は、アミド基に結合した炭素原子の隣に窒素原子を有する、置換されていてもよい単環の又は双環のヘテロアリール基を示す）
［２５］  共結晶法又はソーキング法による、前記［２３］、又は［２４］に記載の結晶の製造方法。
［２６］  タンパク質の立体構造情報に基づいて該タンパク質に結合する化合物の構造をデザインするドラッグデザイン方法であって、
該タンパク質の立体構造情報が、前記［３］〜［１３］、又は［１５］〜［２１］のうちのいずれか一項に記載の結晶を解析することによって得られる情報であることを特徴とする、ドラッグデザイン方法。
［２７］  前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、
前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位に適合する化合物を、化合物ライブラリより選択する選択工程と、
を含むことを特徴とする、前記［２６］に記載のドラッグデザイン方法。
［２８］  前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、
前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位に適合する化合物の構造を構築する化合物構造構築工程と、
を含むことを特徴とする、前記［２６］に記載のドラッグデザイン方法。
［２９］  前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、
前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位と該化合物結合部位に適合する化合物とが相互作用するように化合物の構造を目視によりデザインするデザイン工程と、
を含むことを特徴とする、前記［２６］に記載のドラッグデザイン方法。
［３０］  前記化合物結合部位が、配列番号５に示すアミノ酸配列における、チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９のアミノ酸残基の少なくともひとつによって構成されている、前記［２６］〜［２９］のうちのいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法。
［３１］  さらに、前記化合物結合部位に適合すると推定される候補化合物の生理活性を測定する工程を含む、前記［２６］〜［３０］のいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法。
［３２］  さらに、前記化合物結合部位に適合すると推定される候補化合物と配列番号５に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とを接触させ、その候補化合物が該タンパク質に結合するか否か判定する結合判定工程を含む、前記［２６］〜［３０］のいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法。
［３３］  前記［２６］〜［３０］のいずれか一項に記載のドラッグデザイン方法によって選択された化合物群を化合物アレイとして組み合わせることを含む化合物アレイの製造方法。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、蛋白質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及び蛋白質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
以下、本発明の各実施態様について詳細に説明する。
（グルコキナーゼタンパク質）
まず、本発明は、結晶化に用いることを特徴とする、グルコキナーゼタンパク質を提供する。グルコキナーゼタンパク質（ＧＫタンパク質）は、上述のように、生体内で極めて重要な糖の代謝に関与している。したがって、ＧＫタンパク質の三次元構造を明らかにし、ＧＫタンパク質の活性部位を解明することによって、ＧＫタンパク質に結合する化合物（すなわち、活性化剤又は阻害剤）を探索することができる。よって、ＧＫタンパク質の三次元構造を明らかにすることは重要である。
タンパク質の３次元構造を明らかにする手法として、Ｘ線結晶構造解析が良く知られている。即ち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像をもとに、該タンパク質の３次元構造を解明する（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ，１−５６５頁，（１９７６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ＧＫタンパク質のＸ線結晶構造解析に供するために、まず、ＧＫタンパク質を結晶化する必要がある。
ここで、本発明の「ＧＫタンパク質」とは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するヒト由来の肝臓型グルコキナーゼと、配列番号２と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をいう。ここで当該実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、グルコキナーゼ活性を有するものが好ましい。したがって、本明細書では、ＧＫタンパク質は、ヒト由来の肝臓型グルコキナーゼのみならず、ヒト由来の膵臓型グルコキナーゼ、マウス、ラット、サル等の非ヒト由来ＧＫタンパク質をも含む。本発明では、ヒト肝臓型グルコキナーゼが好ましく用いられる。ヒト由来のグルコキナーゼにおいて、肝臓型と膵臓型ではＮ末端の１５アミノ酸残基が相違する。ここで、「グルコキナーゼ活性」とは、グルコースからグルコース６リン酸への反応を触媒する活性をいう。
タンパク質の結晶化が一般的に困難なことは良く知られており、ＧＫタンパク質をそのまま結晶化することはできなかった。本発明者らは、種々、試行錯誤による実験の結果、ＧＫタンパク質のＮ末端側のアミノ酸を１１個、又は１５個を欠失させることによって、始めてＧＫタンパク質の結晶化に成功した。欠失させた領域は、結晶化を試みた際に球状のＧＫタンパク質分子より突出し、その結果、結晶内で隣接するＧＫタンパク質分子との間で立体的な障害となりＧＫタンパク質が結晶となるのを妨げていたと考えられる。すなわち、本発明では、アミノ酸配列が既知でありながら結晶化には成功していなかったグルコキナーゼにおいて、Ｎ末端側の１１個のアミノ酸残基を欠失させたＧＫタンパク質（配列番号５）、又はＮ末端側の１５個のアミノ酸残基を欠失させたＧＫタンパク質（配列番号８）を用いることにより、ＧＫタンパク質の結晶を得た。ただし、欠失させるアミノ酸は、隣接する結晶との間で立体的な障害がなくなる範囲であればその数は限定されない。具体的には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側の１〜５０個、好ましくは３〜３０個、より好ましくは５〜２５個、さらに好ましくは８〜１８個、特に好ましくは１１〜１５個のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列などが本発明において用いられる。また、Ｃ末端側の１〜８個、好ましくは１〜７個、より好ましくは２〜６個のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列などが本発明において用いられる。
（グルコキナーゼタンパク質の結晶及びその製造方法）
次に、本発明においては、配列番号５、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む結晶を提供する。
上述したように、結晶化に供するＧＫタンパク質としては、配列番号５、及び／又は配列番号８で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質などが用いられる。
配列番号５、及び／又は配列番号８で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質と併せて「ＧＫタンパク質」と略すこともある）は、結晶化が可能であればよく、そのアミノ酸配列は特に制限されない。ここで、配列番号５、及び／又は配列番号８に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質は、グルコキナーゼ活性を有している必要はなく、ドラッグデザインに必要な情報を得ることができる結晶構造を有するものであれば、不活性な変異体（例えば、ＡＴＰの結合部位に変異を有することにより不活性化した変異体）であってもよい。ここで、配列番号２又は５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質としては、配列番号２又は５で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。また、配列番号２又は５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質として、例えば、配列番号２又は５に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列が例示される。
ＧＫタンパク質の３次元構造解析は、例えば、次のようにして行う。まず、タンパク質を精製する。そして、結晶化、Ｘ線回折強度データ収集、各回折斑点の位相決定、電子密度計算、分子モデル作成、構造の精密化などの一連の工程を行う。タンパク質構造解析を行うための主要な設備として、結晶化用インキュベーター、双眼顕微鏡、Ｘ線回折計、３次元コンピュータグラフィックス装置などが用いられる。具体的にタンパク質の結晶を作製する実験過程は、タンパク質を大量に（数ｍｇ以上が好ましい。）精製する段階、結晶が得られる条件を広く検索する段階、Ｘ線解析に適した良質の結晶を得る段階に分けられる。以下、各工程について具体的に説明する。
結晶化に際しては、ＧＫタンパク質を、高純度に精製する。精製方法としては、公知のものが利用でき、例えば、カラムクロマトグラフィー、塩析、遠心分離などが用いられる。
精製されたＧＫタンパク質は、結晶化し、Ｘ線結晶構造解析のための試料とする。結晶化は、蒸気拡散法や透析法等の公知の方法に基づいて行われる。タンパク質の結晶を得る際に、タンパク質の純度・濃度、温度、ｐＨ、使用する沈殿剤濃度等多くの要素を検討する必要がある。結晶化条件の検討は、市販のスクリーニング試薬を使用して広い範囲で行うことができ、１つの条件に１〜２％濃度のタンパク質溶液を１〜２μＬずつ使用して検索することが好ましい。こうして微結晶などが得られた場合には、さらに条件を精密化することが好ましい。
なお、ＧＫタンパク質の結晶を得るためには非常に多くの条件を検索しなければならない。従って、結晶化条件の検討のためにも、タンパク質の大量発現系を構築することが好ましい。一般にタンパク質のうち、結晶になるものの多くは、溶液状態で単分散であり、多分散のものは大体において結晶化しない。そこで、ＧＫタンパク質のＮ末端を順次切除し、得られたタンパク質について、光散乱装置を用いてタンパク質溶液の単分散性を判定し、試料が結晶化に適しているかどうかを検討しても良い。
次に，得られたＧＫタンパク質の結晶を用いて、Ｘ線回折強度測定を行う。最近では、結晶を細い糸の輪などですくって液体窒素温度に急速冷却してそのまま低温で測定する方法も利用されている。回折Ｘ線の強度測定は、通常、イメージングプレートなどの２次元検出器によって行う。Ｘ線を当てながら結晶を回転させることで発生する多くの回折線をイメージングプレートに記録し、記録された回折強度をレーザーを当てることにより読み取る。
次に、重原子ソーキング法や共結晶化法により重原子同型置換体を調製することが好ましい。これを使用して多重同型置換法（ＭＩＲ法）によりタンパク質結晶の位相を決定することができる。重原子を導入する代わりに、複雑な波長のＸ線による回折強度データに基づいて位相を決定する多波長異常散乱法（ＭＡＤ法）も利用できる。類似構造を有する分子が既に解析されている場合には、その分子構造を結晶中にあてはめて初期構造を得ることができ、これをもとにフーリエ合成図を描き、残りの部分の構造を解明して全構造を決定する分子置換法（ＭＲ法）も知られている。
位相が上記の方法で決定したならば、これより電子密度を求める。この精度は、反射の数（分解能）と使用した反射の精度による。分解能は使用する反射の最小面間隔で表す。この電子密度図から分子モデルを組み立てる。分子モデルを組み立てると原子座標が得られるので、これより構造因子の計算値を求め、この大きさを観測値に近づける最小自乗法により原子パラメータの精密化を行う。このようにしてできるだけ妥当な構造情報を取得する。
本発明においては、配列番号５に示すＧＫタンパク質の結晶を調製することに成功している（後述の実施例参照）。そしてこのようにして得られたＧＫタンパク質の結晶は、格子定数が、下記式（１）〜（４）：
ａ＝ｂ＝７９．９±４オングストローム  …（１）
ｃ＝３２２．２±１５オングストローム  …（２）
α＝β＝９０°  …（３）
γ＝１２０°    …（４）
を満たすものであった。また、この結晶は、空間群がＰ６５２２であることが解明された。ここで、前記ａ＝ｂは７９．９±３オングストロームであることが好ましく、７９．９±２オングストロームであることがより好ましく、７９．９±１オングストロームであることがさらに好ましい。また、前記ｃは３２２．２±１０オングストロームであることが好ましく、３２２．２±８オングストロームであることがより好ましく、３２２．２±５オングストロームであることがさらに好ましい。
このようにして得られたＧＫタンパク質結晶の３次元構造座標を表１に示す。
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なお、表１は、当業者によって慣用されているプロテイン・データ・バンクの表記方法に準拠して作成されている。表１中、ＧＬＣはグルコース分子を表し、ＣＰ１は式ＩＩＩａで表される化合物を表し、ＨＯＨは水分子を表す。
また、本発明においては、配列番号８に示すＧＫタンパク質の結晶を調製することに成功している（後述の実施例参照）。そしてこのようにして得られたＧＫタンパク質の結晶は、格子定数が、下記式（５）〜（８）：
ａ＝ｂ＝１０３．２±５オングストローム  …（５）
ｃ＝２８１．０±７オングストローム      …（６）
α＝β＝９０°                          …（７）
γ＝１２０°                            …（８）
を満たすものであった。また、この結晶は、空間群がＰ６５２２であることが解明された。ここで、前記ａ＝ｂは１０３．２±３オングストロームであることが好ましく、１０３．２±２オングストロームであることがより好ましく、１０３．２±１オングストロームであることがさらに好ましい。また、前記ｃは２８１．０±６オングストロームであることが好ましく、２８１．０±４オングストロームであることがより好ましく、２８１．０±２オングストロームであることがさらに好ましい。このようにして得られたＧＫタンパク質結晶の３次元構造座標を表２に示す。
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なお、表２は、当業者によって慣用されているプロテイン・データ・バンクの表記方法に準拠して作成されている。表２中、ＨＯＨは水分子を表す。
本発明においては、配列番号５、及び／又は配列番号８と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、グルコキナーゼ活性を有するタンパク質の結晶は本発明の範囲内である。そのような結晶としては、例えば、表１、及び／又は表２に記載の三次元構造座標データの少なくとも一つのデータを変更した三次元構造座標データにおいて、表１、及び／又は表２に記載の三次元構造座標データで示されるアミノ酸の主鎖の原子（Ｃα原子）と、該Ｃα原子と対応する前記変更した三次元構造座標データで示されるＣα原子との平均二乗偏差が、０．６オングストローム以下である結晶が挙げられる。原子の位置を表す座標の数値が異なっても、構造座標に含まれる対応する原子の位置を重ね合わせることができる二つの構造座標は、同一の三次元構造を表すものである。
なお、表１、及び／又は表２に記載のＧＫタンパク質の三次元構造座標は、ドラッグデザインのための重要な情報であり、必要に応じて、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に保存され、コンピュータでこの情報を処理してドラッグデザインを行う。したがって、本発明の別の態様によれば、コンピュータを、表１、及び／又は表２に記載のアミノ酸残基の三次元座標を記憶する三次元座標記憶手段として機能させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、コンピュータを、表１、及び／又は表２に記載のアミノ酸残基の三次元座標に関する情報を記憶した三次元座標記憶手段と、前記三次元座標記憶手段に記憶された表１、及び／又は表２に記載のアミノ酸残基の三次元座標を用いて配列番号５、及び／又は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測手段と、タンパク質と結合する化合物の種類と、当該化合物の三次元構造に関する情報を記憶した結合化合物記憶手段と、少なくとも、前記結合部位推測手段によって推測された配列番号５、及び／又は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の化合物結合部位の三次元構造に関する情報と、前記結合化合物記憶手段に記憶された化合物の三次元構造に関する情報とを用いて前記配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の化合物結合部位に適合する化合物の候補を選択する結合化合物候補選択手段、として機能させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。さらに、本発明の別の態様によれば、上記各手段を備えるコンピュータも提供される。
（ＧＫタンパク質とそれに結合する化合物との複合体の結晶）
次に、本発明の別の態様によれば、配列番号５、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質と該タンパク質に結合可能な化合物との複合体を含む結晶及びその製造方法が提供される。
ＧＫタンパク質と結合する化合物が得られた場合は、まず、ＧＫタンパク質とその化合物を、例えば、水溶液中で混合し、複合体を形成する。このような複合体の結晶は、共結晶法、ソーキング法などの公知の共結晶の製造方法が用いられる。結晶化条件、結晶化方法については、上述した方法が参照される。
ＧＫタンパク質と結合する化合物は、例えば、上記式（Ｉ）で表される化合物群から選択される。
ここで、上記式（Ｉ）のハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが例示され、これらの中でも塩素原子が好ましい。
また、上記式（Ｉ）のＡ、Ｂ及び式（ＩＩ）のヘテロアリール基における置換基としては、アミノ基、カルバモイル基、カルバモイルアミノ基、カルバモイルオキシ基、カルボキシル基、シアノ基、スルファモイル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ホルミル基、直鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基、環状のＣ３−Ｃ６炭化水素基、アラルキル基、Ｎ−アラルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジアラルキルアミノ基、アラルキルオキシ基、アラルキルカルボニル基、Ｎ−アラルキルカルバモイル基、アリール基、アリールチオ基、Ｎ−アリールアミノ基、アリールオキシ基、アリールスルホニル基、アリールスルホニルオキシ基、Ｎ−アリールスルホニルアミノ基、アリールスルファモイル基、Ｎ−アリールカルバモイル基、アロイル基、アロキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルカノイル基、Ｎ−Ｃ２−Ｃ６アルカノイルアミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基、Ｎ−Ｃ１−Ｃ６アルキルスルファモイル基、Ｎ，Ｎ−ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルスルファモイル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基、Ｎ−Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニルアミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基又はＣ１−Ｃ６アルキルアミノ基を示す）などが挙げられる。ここで用いられる好ましい置換基は、アミノ基、カルバモイル基、カルバモイルアミノ基、カルバモイルオキシ基、カルボキシル基、シアノ基、スルファモイル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ホルミル基、直鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基などが例示される。
ここで、「炭化水素基」は、炭素数１乃至６の直鎖のアルキル基を示すか、又は該アルキル基を構成する炭素原子のうち、１又は２の、好ましくは１の炭素原子が窒素原子、硫黄原子又は酸素原子で置き換わっていてもよいか、及び／又は該炭素数１乃至６の直鎖のアルキル基中の炭素原子同士が二重結合又は三重結合で結合されていてもよい基である。該二重結合又は三重結合の数は、１又は２であることが好ましく、１であることがより好ましい。
該炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基若しくはイソプロピル基、ブチル基又は下記式
2003097824.tif 000252
で表される基であることが好ましい。より好ましい炭化水素基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基又は下記式
2003097824.tif 000253
2003097824.tif 000254
で表される基である。
好ましいＡとしては（ｐ＝０の場合）、例えば、次の基が挙げられる。
2003097824.tif 000255
好ましいＢとしては、例えば、次の基が挙げられる。
2003097824.tif 000256
式（ＩＩ）で示されるヘテロアリール基としては、例えば，次の複素環基が挙げられる。
2003097824.tif 000257
なお、特に好ましい化合物は、上述した式（ＩＩＩａ）〜式（ＩＩＩｃ）で表されるいずれかの化合物である。
本発明の化合物（Ｉ）は、公知の反応手段を用いるか、或いは公知の方法に従って容易に製造することができる。なお、本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、通常の液相における合成のみならず、近年発達の目覚しい例えばコンビナトリアル合成法やパラレル合成法等の固相を用いた合成によっても製造することができる。好ましくは例えば以下の方法により製造することができる。
2003097824.tif 000258
（工程１）
本工程は、カルボン酸化合物（１）又はその反応性誘導体と前記式（２）で表される置換されていてもよい単環の、又は双環のヘテロアリール基を有するアミノ化合物又はその塩とを反応させて、化合物（３）を製造する方法である。本反応は文献記載の方法（例えば、ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫他、丸善、１９８３年、コンプリヘンシブ  オーガニック  シンセシス（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第６巻、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９１年、等）、それに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより、通常のアミド形成反応を行えばよく、即ち、当業者に周知の縮合剤を用いて行うか、或いは、当業者に利用可能なエステル活性化方法、混合酸無水物法、酸クロリド法、カルボジイミド法等により行うことができる。このようなアミド形成試薬としては、例えば塩化チオニル、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−メチル−２−ブロモピリジニウムアイオダイド、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、ジフェニルフォスフォリルクロリド、ジフェニルフォスフォリルアジド、Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルカルボネート、Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルオキザレート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、クロロギ酸エチル、クロロギ酸イソブチル又はベンゾトリアゾ−１−リル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェイト等が挙げられ、中でも例えば塩化チオニル、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はベンゾトリアゾ−１−リル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェイト等が好適である。またアミド形成反応においては、上記アミド形成試薬と共に塩基、縮合補助剤を用いてもよい。
用いられる塩基としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５−アザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）等の第３級脂肪族アミン；例えばピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、ピコリン、ルチジン、キノリン又はイソキノリン等の芳香族アミン等が挙げられ、中でも例えば第３級脂肪族アミン等が好ましく、特に例えばトリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等が好適である。
用いられる縮合補助剤としては、例えばＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド又は３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアゾール等が挙げられ、中でも例えばＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等が好適である。
用いられるアミノ化合物（２）の量は、用いられる化合物及び溶媒の種類その他の反応条件により異なるが、通常カルボン酸化合物（１）又はその反応性誘導体１当量に対して、０．０２乃至５０当量、好ましくは０．２乃至２当量である。ここにおいて、反応性誘導体としては、通常有機化学の分野において用いられる、例えば活性エステル誘導体、活性アミド誘導体等が挙げられる。
用いられるアミド形成試薬の量は、用いられる化合物及び溶媒の種類その他の反応条件により異なるが、通常カルボン酸化合物（１）又はその反応性誘導体１当量に対して、１乃至５０当量、好ましくは１乃至５当量である。
用いられる縮合補助剤の量は、用いられる化合物及び溶媒の種類その他の反応条件により異なるが、通常カルボン酸化合物（１）又はその反応性誘導体１当量に対して、１乃至５０当量、好ましくは１乃至５当量である。
用いられる塩基の量は、用いられる化合物及び溶媒の種類その他の反応条件により異なるが、通常１乃至５０当量、好ましくは３乃至５当量である。
本工程において用いられる反応溶媒としては、例えば不活性有機溶媒であり、反応に支障のない限り、特に限定されないが、具体的には、例えば塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トリクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸エチルエステル、酢酸メチルエステル、アセトニトリル、ベンゼン、キシレン、トルエン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン又はそれらの混合溶媒が挙げられるが、好適な反応温度確保の点から、特に例えば塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、アセトニトリル又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等が好適である。
反応温度は、−１００℃乃至溶媒の沸点温度、好ましくは０乃至３０℃である。
反応時間は、０．５乃至９６時間、好ましくは３乃至２４時間である。
本工程１で用いられる塩基、アミド形成試薬、縮合補助剤は、一種又はそれ以上組み合わせて使用することができる。
化合物（３）が保護基を有している場合には、適宜当該保護基を除去することが可能である。当該補助基の除去は、文献記載の方法（プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ著、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、１９９１年、等）、それに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより行うことができる。
このようにして得られる化合物（３）は、公知の分離精製手段、例えば濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製するか又は単離精製することなく次工程に付すことができる。
（工程２）
本工程は、上記工程１で得られたアミド化合物（３）と化合物（４）とを反応させることにより化合物（５）を製造する方法である。
本反応においては、反応系中に必要に応じて塩基を加えてもよい。用いられる化合物（４）としては、好ましくはフェノール誘導体又はチオール誘導体が好ましい。該フェノール誘導体又はチオール誘導体としては、例えばフェノール、チオフェノール、チオイミダゾール、チオトリアゾール等が挙げられる。用いられる化合物（４）の量は、用いられる化合物及び溶媒の種類その他の反応条件により異なるが、通常アミノ誘導体（３）１当量に対して、２乃至５０当量、好ましくは２乃至５当量である。用いられる塩基としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５−アザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）等の第３級脂肪族アミン；例えばピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、ピコリン、ルチジン、キノリン又はイソキノリン等の芳香族アミン；例えば金属カリウム、金属ナトリウム、金属リチウム等のアルカリ金属；例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物；例えばブチルリチウム等のアルカリ金属アルキル化物；例えばカリウム−ｔｅｒｔ−ブチラート、ナトリウムエチラート又はナトリウムメチラート等のアルカリ金属アルコキシド；例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物；例えば炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩等が挙げられ、中でも例えば第３級脂肪族アミン、アルカリ金属水素化物又はアルカリ金属炭酸塩が好ましく、特に例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、水素化ナトリウム又は炭酸カリウムが好適である。
用いられる当該塩基の量は、用いられる化合物及び溶媒の種類その他の反応条件により異なるが、アミド化合物（３）１当量に対して通常０乃至５０当量、好ましくは２乃至１０当量である。該塩基は、必要に応じて一種又は２種以上用いることができる。
用いられる不活性有機溶媒としては、反応に支障のないものであれば、特に限定されないが、具体的には、例えば塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トリクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、酢酸エチルエステル、酢酸メチルエステル、アセトニトリル、ベンゼン、キシレン、水、トルエン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン又はこれらの混合溶媒等が挙げられる。
このようにして得られる化合物（５）は、公知の分離精製手段、例えば濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製することができる。
（工程３）
本工程は化合物（５）を還元して、本発明で用いる化合物（Ｉ）を製造する方法である。本工程において用いられる還元反応は、当業者に周知の方法が用いられる。本工程においてもちいられる還元反応としては、具体的には、例えば（１）水素、蟻酸、蟻酸アンモニウム、ヒドラジン水和物とパラジウム、白金、ニッケル触媒を用いる接触還元法、（２）塩酸、塩化アンモニウムと鉄を用いる還元法、（３）メタノールと塩化スズを用いる還元法等が挙げられる。
上記還元反応において用いられる還元剤の量は、用いられる化合物及び溶媒の種類その他の反応条件により異なるが、化合物（５）１当量に対して通常１乃至５０当量、好ましくは２乃至２０当量である。
用いられる反応溶媒としては、反応に支障のない限り、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、例えばジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、  テトラヒドロフラン等のエーテル類、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類、例えばジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、例えばアセトニトリル等のニトリル類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、例えばベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、水或いはこれらの混合溶媒を用いることができる。
反応温度及び反応時間は特に限定されないが、−１０乃至１００℃程度、好ましくは０乃至５０℃程度の反応温度で１乃至２０時間程度、好ましくは１乃至５時間程度反応を行う。
このようにして得られる本発明で用いる化合物（Ｉ）は、公知の分離精製手段、例えば濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製するか又は単離精製することなく、次工程に付すことができる。
上記各工程の化合物は、各置換基上に保護基を有していてもよい。当該保護基は、各工程において適宜、公知の方法これに準じた方法、又はこれらと常法とを組み合わせた方法により除去することができる。除去の態様は、化合物、反応の種類その他の反応条件により、適宜の除去反応が可能であるが、個別に各保護基を除去する場合、各保護基を同時に除去する場合等が考えられ、当業者が適宜選択可能である。当該保護基としては、例えばヒドロキシ基の保護基、アミノ基の保護基、カルボキシル基の保護基、アルデヒドの保護基、ケト基の保護基等が挙げられる。また、当該保護基の除去順序は、特に限定されるものではない。
ヒドロキシ基の保護基としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等の低級アルキルシリル基、例えばメトキシメチル基、２−メトキシエトキシメチル基等の低級アルコキシメチル基、例えばベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等のアラルキル基、例えばホルミル基、アセチル基等のアシル基等が挙げられ、これらのうち、特にｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、アセチル基等が好ましい。
アミノ基の保護基としては、例えばベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基等のアラルキル基、例えばホルミル基、アセチル基等のアシル基、例えばエトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等の低級アルコキシカルボニル基、例えばベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基等が挙げられ、これらのうち、特にニトロベンジル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が好ましい。
カルボキシル基の保護基としては、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の低級アルキル基、例えばベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等のアラルキル基等が挙げられ、これらのうち、特にメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基等が好ましい。
ケト基の保護基としては、例えばジメチルケタール基、１，３−ジオキシラン基、１，３−ジオキソラン基、１，３−ジチアン基、１，３−ジチオラン基等が挙げられ、これらのうち、ジメチルケタール基、１，３−ジオキソラン基等がより好ましい。
アルデヒド基の保護基としては、例えば、ジメチルアセタール基、１，３−ジオキシラン基、１，３−ジオキソラン基、１，３−ジチアン基、１，３−ジチオラン基等が挙げられ、これらのうちジメチルアセタール基、１，３−ジオキソラン基等がより好ましい。
本発明で用いる化合物を製造するに当たっては、反応を効率よく進行させるために、官能基に保護基を導入する場合もある。これらの保護基の導入は、当業者に適宜選択可能であり、当該保護基の除去は、前記記載のプロテクティブグループス  イン  オーガニックシンセシス等の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより行うことができる。なお、保護基の除去の順序についても、当業者が適宜選択可能である。
このようにして得られる化合物（Ｉ）は、公知の分離精製手段、例えば濃縮、減圧濃縮、結晶化、再沈殿、溶媒抽出、クロマトグラフィー等により単離精製するか又は単離精製することなく次工程に付すことができる。
また、本発明で用いる化合物である（Ｉ）は、下記の工程によっても製造することができる。
2003097824.tif 000259
上記工程４、工程５及び工程６については、試薬の量、反応溶媒、反応温度等その他の反応条件は、前記工程２、工程１及び工程３と同様にして行うことができる。
Ｒ２に保護基が必要な場合には、前記記載のプロテクティブグループス  インオーガニックシンセシス等の方法、それに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより、当業者が保護基を適宜選択することによって行うことができる。
このようにして得られる化合物（６）、（５’）は、公知の分離精製手段、例えば濃縮、減圧濃縮、結晶化、再沈殿、溶媒抽出等により単離精製するか、又は単離精製することなく次工程に付すことができる。
本発明で用いる化合物（Ｉ）は、公知の分離精製手段、例えば濃縮、減圧濃縮、結晶化、再沈殿、溶媒抽出等により単離精製することができる。
上記工程１乃至６において、保護基の除去は、当該保護基の種類及び化合物の安定性により異なるが、前記記載のプロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ著  第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、１９９１年、等）、それに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより行うことができる。例えば酸又は塩基を用いる加溶媒分解、水素化金属錯体等を用いる化学的還元又はパラジウム炭素触媒、ラネーニッケル等を用いる接触還元等により行うことができる。
本発明によって提供されるベンズアミド化合物は、薬学的に許容される塩として存在することができる。当該塩は、常法に従って製造することができる。具体的には、上記化合物（Ｉ）が、当該分子内に例えばアミノ基、ピリジル基等に由来する塩基性基を有している場合には、当該化合物を酸で処理することにより、相当する薬学的に許容される塩に変換することができる。
当該酸付加塩としては、例えば塩酸塩、フッ化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、炭酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルキルスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のアリールスルホン酸塩；フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸等の有機酸である酸付加塩を挙げることができる。また、本発明の化合物が酸性基を当該基内に有している場合、例えばカルボキシル基等を有している場合には、当該化合物を塩基で処理することによっても、相当する薬学的に許容される塩に変換することができる。当該塩基付加塩としては、例えば例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、グアニジン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基による塩が挙げられる。さらに本発明の化合物は、遊離化合物又はその塩の任意の水和物又は溶媒和物として存在してもよい。
本発明においては、実施例の記載にて詳述するように、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＧＫタンパク質と上記式（ＩＩＩａ）〜式（ＩＩＩｃ）との化合物の複合体の結晶が得られている。これらの、結晶の３次元構造座標を解析することによって、配列番号５で示すＧＫタンパク質においては、化合物結合部位が、チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９のアミノ酸残基から構成されることが解明されている。
なお、本発明の別の態様によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から、上述のようにＮ末端側、および／またはＣ末端側の所定の数のアミノ酸残基を欠損したアミノ酸配列を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、前記タンパク質製造工程で得られたタンパク質と結合する化合物と、前記タンパク質製造工程で得られたタンパク質とを反応させる工程とを含む、タンパク質及びそのタンパク質と結合する化合物の複合体を含む結晶を製造する方法が提供される。
上記タンパク質製造工程において製造されるタンパク質としては、結晶内で隣接するＧＫタンパク質との間で立体的な障害がなくなる範囲であればその数は限定されない。具体的には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側の１〜５０個、好ましくは３〜３０個、より好ましくは５〜２５個、さらに好ましくは８〜１８個、特に好ましくは１１〜１５個のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列などが挙げられる。また、Ｃ末端側の１〜８個、好ましくは１〜７個、より好ましくは２〜６個のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列などが挙げられる。
（３次元構造座標を用いるドラッグデザイン方法）
上記のようにして得られる本発明のＧＫタンパク質の３次元構造は、ＣＡＲＤＤ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｉｄｅｄ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）による創薬システムのための重要な情報である。このＧＫタンパク質の活性中心、及びアロステリック部位を明らかにし、その部位に適合し、ＧＫタンパク質と相互作用することにより、ＧＫタンパク質を阻害、または活性化する物質を検索することは、ＧＫタンパク質をターゲットとする創薬開発の重要なステップである。
すなわち、本発明の別の態様によれば、タンパク質の立体構造情報に基づいて該タンパク質に結合する化合物の構造をデザインするドラッグデザイン方法であって、該タンパク質の立体構造情報が、上述のようにして得られる結晶を解析することによって得られる情報であることを特徴とする、ドラッグデザイン方法が提供される。このようなドラッグデザイン方法としては、エネルギー計算、若しくはこれに類似する活性予測値、又はファルマコフォアを用いてドラッグデザインする手法と、コンピュータグラフィックスの技術を用いて視覚的にドラッグデザインをする手法がある。
エネルギー計算、若しくはこれに類する活性予測値、又はファルマコフォアを用いる手法による方法としては、（１）上述したようにして得られる立体構造情報に基づいて、上記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位に適合する化合物を、化合物ライブラリより選択する選択工程とを含むことを特徴とするドラッグデザイン方法、（２）前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位に適合する化合物の構造を構築する化合物構造構築工程とを含むことを特徴とする、ドラッグデザイン方法などが例示される。
上記タンパク質の化合物結合部位を推測する方法としては、例えば、化合物との共結晶においてリガンドが結合している部位をコンピュータのディスプレイ上で目視で確認して特定する方法の他、リガンドが結合していない状態で解かれたタンパク質結晶構造に対してリガンドが結合しそうな部位を推定して特定する方法が挙げられる。いずれの方法においても公知の方法や市販のコンピュータソフトウエアを用いることができる。前者の方法においては、例えば、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．），ＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．），ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）等のソフトウエアを用いることができる。一方、後者の方法においては、例えば、Ｃａｖｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｃａｖｉｔｙ−ｌｉｋｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ．４（４）：３３７−５４，１９９０）等の公知の手法を用いることができ、ＳｉｔｅＩＤ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．）等のソフトウエアを用いて実施することができる。
タンパク質における化合物との結合部位が推測できたら、その推測された結合部位に適合し得る化合物を選択する。この化合物候補を選択する方法としては、既存の化合物ライブラリからの化合物の構造情報を入手して、そのライブラリ中の化合物の構造情報と上記のようにして推測された結合部位の構造情報とを比較することによって、結合可能化合物候補を選択する。
より具体的には、配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基（チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９）から１つないしは２つ以上の残基もしくは複合体中のリガンドの官能基から形成される水素結合性または疎水性などのファルマコフォアと、蛋白構造またはその一部の側鎖の配向を改変させた構造から作成される蛋白表面を検索条件として、化合物ライブラリより各化合物の配座、配向を網羅的に探索しながら条件を満たすかどうかを判断して選択する。
他の代替方法として、化合物ライブラリより各化合物の配座、配向を網羅的に探索しながら、アミノ酸残基（チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９）から構成されるリガンド結合部位の構造またはその一部の側鎖の配向を改変させた構造に対して候補化合物をバーチャルでドッキングさせ、アミノ酸残基（チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９）から１つないしは２つ以上の残基と４オングストローム以下で近接した相互作用を形成したものを選択したり、エネルギー評価関数を用いた選択を行う。
一方、候補化合物は、上記のようにして推測された結合部位の構造情報に基づいて結合可能化合物を設計することによっても選択することができる。より具体的には、配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基（チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９）から構成される化合物結合部位の構造またはその一部の側鎖の配向を改変させた構造に対して、１つないしは２つ以上の残基と相互作用するように各種原子種、官能基を種々つなぎ合わせて化合物構造を構築する。この方法としては、メチル、エチル等の化学基を活性部位に並べて適合する化合物を探す方法と、原子を活性部位にコンピュータプログラムを用いて結合させていく方法とが知られている。
なお、コンピュータによるエネルギー評価による方法では、例えば分子力場計算を用いて化合物と、ＧＫタンパク質との結合のエネルギーを求める方法が挙げられる。その計算をデータベースの中の各化合物に適用し、安定に結合できる化合物候補を、ライブラリ化合物の中から求める。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＬｕｄｉなどコンピュータプログラムによっては、蛋白質分子において相互作用するアミノ酸残基の３次元構造座標を与えると、自動的に結合可能な化合物の候補を選択し出力するものもあり、好適に利用することができる。
また、分子の３次元構造に基づくドラッグデザインについては、医薬品の開発・第７巻「分子設計」（廣川書店）をはじめとして数多くの文献が知られている。具体的には、第一にＦｌｅｘｉＤｏｃｋ、ＦｌｅｘＸ等のフレキシブルリガンドバインディングシミュレーションソフトウエアを用いて、低分子（分子量１０００以下）化合物のライブラリ（たとえば約１５００００種）をコンピュータでスクリーニングすることができる。このライブラリ内の化学物質はＣＯＮＣＯＲＤ等のプログラムで３次元構造を構築し、活性部位に適合する化合物を選択することができる。
一方、目視的によりドラッグデザインする方法としては、前記立体構造情報に基づいて、前記タンパク質の化合物結合部位を推測する結合部位推測工程と、前記結合部位推測工程で推測された化合物結合部位と該化合物結合部位に適合する化合物とが相互作用するように化合物の構造を目視によりデザインするデザイン工程とを含むことを特徴とする、ドラッグデザイン方法が挙げられる。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基（チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９）から構成されるリガンド結合部位の構造またはその一部の側鎖の配向を改変させた構造に対して、これらの残基のうち１つないしは２つ以上の残基と相互作用するように目視による構造構築、もしくは構造改変を行う。
具体的には、視覚的方法では、まずコンピュータの画面上にＧＫタンパク質とそれに結合する化合物との複合体の結晶の構造を、得られた構造座標に従って表示する。そして、コンピュータ上で化学的相互作用を考慮しながら、ライブラリ中にある化合物とＧＫタンパク質との結合可能性を順次検討する。ここで考慮すべき化学的相互作用は静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用などである。すなわち、該化合物の３次元空間での構造が、その官能基群においてカルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン基などの陰性電荷を帯びやすい基が、ＧＫタンパク質のリジン、アルギニン、ヒスチジンといった正電荷を持つアミノ酸残基に相互作用するように、アミノ基、イミノ基、グアニジル基などの陽性電荷を帯びやすい基が、ＧＫタンパク質のグルタミン酸、アスパラギン酸といった負電荷を持つアミノ酸残基に相互作用するように、脂肪族基や芳香族基といった疎水性の官能基が、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンといった疎水性のアミノ酸残基と相互作用するように、水酸基、アミド基などの水素結合に関与する基が、ＧＫタンパク質の主鎖や側鎖部分と水素結合ができるように、更には、該化合物とＧＫタンパク質の結合において立体的な障害が生じないように、また、更には、空隙部分がなるべくできないように空隙部分が充填され、ファンデルワールス相互作用が大きくなるようになど、相互作用に好ましい構造になっているかを総合的に考慮する。このように、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などの因子を、コンピュータ画面上で視覚的に総合的に考慮して、最終的に候補化合物がＧＫタンパク質に結合し得るか否かの判断を行う。
このように目視によって化合物候補を選択するプログラムとしては、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩやＭＯＥ等のシミュレーションプログラムが例示される。ＧＫタンパク質と相互作用する化合物の有力候補を挙げるために、候補化合物とＧＫタンパク質と接触させ、ＧＫタンパク質の活性を測定する。有力候補化合物を実際にＧＫタンパク質と混合し、結晶化し適合するかどうかを検討する。更に適合した複合物を有機合成を用いて修飾することにより、より望ましい構造とする。
なお、視覚的手法と、エネルギーを考慮した手法は、適宜組合わせて用いることもできる。そのようなコンピュータソフトウエアとしては、ＦｌｅｘｉＤｏｃｋ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．）、ＦｌｅｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．）、ＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．）、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）、ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）などが挙げられる。
なお、本発明においては、上述したドラッグデザイン方法によって選択された化合物を実際に合成し、これらの化合物群を化合物アレイ（又は化合物ライブラリ）として提供することができる。このような化合物アレイを利用すれば、ハイスループットスクリーニングの技術などを用いて、一度に大量の候補化合物をアッセイすることができるので、グルコキナーゼの活性化剤又は阻害剤を効率良くスクリーニングすることができる。
（本発明の方法によって得られる化合物及びそれを含む治療剤）
上記のドラッグデザイン方法によって設計される化合物は、グルコキナーゼと結合する能力を有するので、グルコキナーゼの活性化化合物又はグルコキナーゼ阻害化合物として用いることができる。また、このような化合物を含有する治療剤又は医薬組成物は、グルコキナーゼ活性が関与する疾患の治療剤（例えば、糖尿病治療剤）として有効に用いることができる。
上記医薬組成物は、本発明のグルコキナーゼと結合する化合物を有効成分として、その薬学的有効量を、適当な薬学的に許容される担体ないし希釈剤と共に含有する。上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる薬学的に許容できる担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などが例示される。これらの担体は、得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
本発明の医薬組成物の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
非経口投与用の液体投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン及び半合成グリセライドなどを使用できる。
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト及びオリーブ油などの植物油などを使用できる。
経鼻又は舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、投与量は、通常、１日当り体重６０ｋｇ当り、約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜１００ｍｇとするのがよく、１日に１〜数回に分けて投与することができる。
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒト由来肝臓型グルコキナーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒト由来肝臓型グルコキナーゼのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒト由来β細胞グルコキナーゼのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒト由来肝臓型グルコキナーゼのＮ末端側のアミノ酸残基１１個を欠失させたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ヒト由来肝臓型グルコキナーゼのＮ末端側のアミノ酸残基１１個を欠失させたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用した、プライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用した、プライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒト由来肝臓型グルコキナーゼのＮ末端側のアミノ酸残基１５個を欠失させたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用した、プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用した、プライマーの塩基配列を示す。
（実施例）
以下、本発明を、実施例を用いて具体的に説明する。
（変異型酵素の精製方法）
Ｈｕｍａｎグルコキナーゼには、プロモーターの違いよって肝臓型と膵臓型が存在し、Ｎ末端の１５残基が異なる。三次元構造解析を目的に結晶化を行うために、この部分の一部あるいはすべてを欠損した変異型酵素を以下の方法で作成した。
ｐＣＲ２．１（ＩＮＴＲＯＧＥＮ社製）上にクローニングされたＨｕｍａｎ肝臓型グルコキナーゼのｃＤＮＡと２種のプライマーセット
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を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物のＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ断片をｐＦＬＡＧ・ＣＴＣベクター（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）のＨｉｎｄＩＩＩ，Ｅｃｏ  ＲＩ部位にクローニングされていた肝臓型ＧＫのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｃｌａ  Ｉ領域と置換することで、肝臓型ＧＫの１〜１１残基を欠損する変異型ＧＫ（Δ１−１１）、及び１〜１５残基を欠損する変異型ＧＫ（Δ１−１５）をコードするｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡの配列を確認した後、これらのベクターを発現ベクターとし、大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造社製）を形質変換した。
形質変換体をＬＢ培地で６００ｎｍの吸収が０．８になるまで３７℃で培養した後、終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド（和光純薬社製）を加え、２５℃で１６時間、タンパク質の生産誘導を行った。
培養された大腸菌を遠心機で収集し、以下の成分を含む緩衝液（５０ｍＭリン酸カリ（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｐＨ７．５，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ（関東化学社製）、ａｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｒｏｃｈｅ社製））に懸濁した。
収集した大腸菌は、超音波破砕法によって破砕し、可溶化画分を上記の緩衝液に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐＱカラム（アマシャム社製）により精製した。ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムより塩化カリウムのグラジエントにより溶出されたＧＫ画分を希釈により塩濃度５０ｍＭに希釈した。
希釈されたＧＫ画分を論文（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（２），１６３−１７８（１９９０））に示されている方法で作製したＧｌｕｃｏｓａｍｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにより精製した。ＧＫ画分をＧｌｕｃｏｓａｍｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ１００ｍＭ塩化ナトリウムで不純物を除いた後、１Ｍのグルコースにより溶出させた。
溶出されたＧＫ画分は、ＭｏｎｏＱ１０／１０カラムにより精製した。ＭｏｎｏＱ１０／１０カラム（アマシャム社製）より塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出されたＧＫ画分を、移動層として５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２，５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（アマシャム社製）により精製した。
（結晶化方法）
（変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体の結晶）
変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体の結晶は、以下に示す蒸気拡散の手法を用いて得た。なお、変異型ＧＫ（Δ１−１１）は、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するグルコキナーゼを意味する。
すなわち、高純度に精製された変異型ＧＫを濃縮し、最終的に１０ｍｇ／ｍｌ程度の変異型ＧＫの溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＴＣＥＰ）とした。これに最終濃度２０ｍＭのグルコース、及び最終濃度０．３ｍＭのＧＫを活性化する下記化合物１（式ＩＩＩａの化合物）を加え、結晶化に用いた。タンパク質溶液１〜５μｌに結晶化溶液として２８〜３０％ＰＥＧ１５００、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．６）を等量加えて混合した溶液を０．５〜１ｍｌの結晶化溶液を入れた密閉容器に、両溶液が触れ合わないように収め、２０℃で静置した。およそ３日〜１ヶ月の静置の後に、試料溶液中に最大０．４ｍｍ×０．４ｍｍ×０．７ｍｍ程度の結晶が得られた（実施例１）。
さらに上記の方法で得られた結晶を下記化合物２（式ＩＩＩｂで表される化合物）が０．３ｍＭの濃度で含まれるようにして、２８〜３０％ＰＥＧ１５００、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．６）溶液に３〜７日程度浸透することによって、下記化合物２と上記変異型ＧＫの複合体結晶を得た（実施例２）。
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また、前記化合物１に代えて化合物３（式ＩＩＩｃで表される化合物）を用いた以外は、実施例１と同様にして結晶化を試みた結果、それぞれ実施例１と同様な結晶が得られた（実施例３）。
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得られた結晶を１０％のグリセロールを加えた結晶化溶液に浸し、続いて液体窒素中で急速に凍結した。シンクロトロン施設ＫＥＫ−ＰＦのＢＬ６Ｂにおいて振動法により、凍結した結晶のＸ線回折データを１００Ｋ窒素気流中で収集した。得られた回折像から、ＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（ＨＫＬ社製）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。この段階で結晶は六方晶系で空間群はＰ６５２２あるいはＰ６１２２を有し、結晶の単位格子は、ａ＝ｂ＝７９．９オングストローム，ｃ＝３２２．２オングストローム，α＝β＝９０°，γ＝１２０°であるとわかった。
得られた構造因子とＨｕｍａｎヘキソキナーゼ  タイプ１の３次元構造座標を用いて分子置換法を行い構造を解析した。計算には８オングストロームから４オングストロームの分解能のデータを用い、ＣＣＰ４（Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌｓ）のＡｍｏｒｅプログラムにより行った。計算により得られた構造のＲ因子は、５３．７％であり、結晶の空間群はＰ６５２２で非対称単位に変異型ＧＫ一分子を含むことが分かった。この構造と構造因子から電子密度マップを得て、プログラムＯ（Ｄａｔ−ＯＮＯ社製）を用いて変異型グルコキナーゼの構造を決定した。
次にＣＮＸ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を用いてアミノ酸の位置の精密化を行い、プログラムＯを用いてアミノ酸残基の同定を行った。この操作を繰り返し行い、変異型グルコキナーゼのスレオニン１４からシステイン４６１までの４４８アミノ酸残基の構造座標、１分子のグルコース分子、１分子の化合物Ａ、１個のナトリウムイオン、及び１４９個の水分子を同定し構造座標を決定した。最終的に決定された構造の正確さの指標とされるＲ因子は、３０オングストロームから２．３オングストロームの分解能のデータに対してＲ＝２３．２％であり、構造の精密化の段階で計算に用いなかったデータに対するＲ因子（Ｒｆｒｅｅ）は２７．４％であった。ラマチャンドラン・プロットで確認したところ許容されない構造を持ったアミノ酸残基はなかった。
決定された変異型グルコキナーゼの構造は、アイソザイムであるヘキソキナーゼの構造と似たものであったが、グルコキナーゼを活性化する化合物１（式ＩＩＩａの化合物）の結合している部位の構造は異なっていた。この構造の相違は、現在の計算化学の能力で予想できうるものでなく、今回の構造解析により、この部位がアクティベーターの結合部位であること、そしてその詳細な立体構造が初めて明らかとなった。図１ａは、ここで解明されたグルコキナーゼの三次元構造を示すリボン図である。図１ａに示されるように、新規に見つかったアクティベーター結合部位は、ラージドメインとスモールドメインの間に位置しており、基質であるグルコースが結合しているグルコキナーゼの活性中心から、約２０オングストローム離れていた。アクティベーター結合部位を構成しているグルコキナーゼのアミノ酸残基は以下のとおりであった。チロシン６１〜セリン６９、グルタミン酸９６〜グルタミン９８、イソロイシン１５９、メチオニン２１０〜チロシン２１５、ヒスチジン２１８〜グルタミン酸２２１、メチオニン２３５、アルギニン２５０、ロイシン４５１〜リジン４５９。
また、この結合部位に対する化合物１（式ＩＩＩａの化合物）の結合様式を図２に、グルコキナーゼの結合部位の構造を図３に示す。チアゾール環は、バリン６２、バリン４５２、バリン４５５のそれぞれのアミノ酸側鎖の分子とファンデルワールス接触をしており、またチアゾール環上の窒素原子がアルギニン６３の主鎖の窒素原子と水素結合をしていた。化合物１上のアミドの窒素原子は、アルギニン６３の主鎖の酸素原子と水素結合をしていた。化合物１のベンゼン環部分はイソロイシン２１１とファンデルワールス接触をしており、ベンゼン環に置換したフッ素原子はチロシン２１４の側鎖とファンデルワールス接触をしていた。化合物１のアニリン構造は、チロシン２１５の側鎖の酸素原子と水素結合を形成していた。硫黄を介してベンゼン環と結合しているイミダゾール環部分は、メチオニン２１０、メチオニン２３５、チロシン２１４のアミノ酸側鎖部分とファンデルワールス接触をしていた。ラージドメインとスモールドメインを結んでいる、セリン６４〜セリン６９の部分は、溶液に露出した構造をしており、化合物１は、この部分が形作るアーチ状構造の下部に結合していた（図３）。
（実施例４：ドラッグデザインの実施例）
ソフトウエアＵＮＩＴＹ（トライポス社製）を用い、Ａｒｇ６３の主鎖ＮＨ，ＣＯからそれぞれ発生させた水素結合アクセプター、水素結合ドナーのファルマコフォアと、複合体を形成するリガンドのアニリン部分のフェニル基に相当する空間に形成された疎水性のファルマコフォア、および蛋白の構造を元に作成した蛋白表面を検索条件としてライブラリ化合物をスクリーニングし、下記化合物４、及び化合物５が得られ、アッセイを行ったところ、それぞれ７８０％、および５６０％の活性が認められた。なお活性が７８０％とは、グルコキナーゼの活性をコントロールを１００％としたときに、これらの化合物によって７８０％まで増強されたことを示す（グルコース２．５Ｍ及びリガンド１０μＭを使用）。
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（実施例５）
（変異型ＧＫ（Δ１−１５）の結晶）
変異型ＧＫ（Δ１−１５）（配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するグルコキナーゼ）の単体の結晶は、以下に示す蒸気拡散の手法を用いて得た。
すなわち、高純度に精製された変異型ＧＫを濃縮し、最終的に１０ｍｇ／ｍｌ程度の変異型ＧＫの溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＴＣＥＰ）とした。タンパク質溶液１〜５μｌに結晶化溶液（１．５〜１．６Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｂｉｃｉｎｅ  ＮａＯＨ（ｐＨ８．７））を等量加えて混合した溶液を０．５〜１ｍｌの結晶化溶液が入った密閉容器に、両溶液が触れ合わないように収め、２０℃で静置した。およそ３日〜１ヶ月の静置の後に、試料溶液中に最大０．０７ｍｍ×０．０７ｍｍ×０．５ｍｍ程度の大きさの結晶が得られた。
得られた結晶を２０％のグリセロールを加えた結晶化溶液に浸し、続いて液体窒素中で急速に凍結した。シンクロトロン施設Ｓｐｒｉｎｇ−８のＢＬ３２Ｂ２において、振動法により、凍結した結晶のＸ線回折データを１００Ｋ窒素気流中で収集した。得られた回折像から、Ｍｏｓｆｌｍを用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。この段階で結晶は六方晶系であり、空間群はＰ６５２２あるいはＰ６１２２を有し、結晶の単位格子は、ａ＝ｂ＝１０３．２Å，ｃ＝２８１．０Å，α＝β＝９０°，γ＝１２０°であることが明らかとなった。
次に、得られた構造因子をもちいて分子置換法を行い、構造を解析した。立体構造のモデルとして、変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体結晶により決定されたグルコキナーゼの各ドメインの３次元構造座標をそれぞれ別々に用いた。計算は、８〜４オングストロームの分解能のデータを用いて、ＣＣＰ４（Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌｓ）のＡｍｏｒｅプログラムにより行った。結晶の空間群はＰ６５２２であり、非対称単位に変異型ＧＫ（Δ１−１５）一分子を含むことが分かった。この構造と構造因子から電子密度マップを得て、プログラムＯ（Ｄａｔ−ＯＮＯ社製）を用いて変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体の構造を決定した。
次に、ＣＮＸ（モレキュラーシミュレーション社製）を用いてアミノ酸の位置の精密化を行い、プログラムＯを用いてアミノ酸残基の同定を行った。この操作を繰り返し行い、変異型グルコキナーゼのメチオニン１５からヒスチジン１５６とアスパラギン１８０からシステイン４６１までの４２４アミノ酸残基の構造座標、２分子の硫酸イオン、１個のナトリウムイオン、及び７個の水分子を同定し構造座標を決定した。最終的に決定された構造の正確さの指標とされるＲ因子は、５０〜３．４オングストロームの分解能のデータに対してＲ＝２３．８％であり、構造の精密化の段階で計算に用いなかったデータに対するＲ因子（Ｒｆｒｅｅ）は３０．６％であった。ラマチャンドラン・プロットで確認したところ、許容されない構造を持ったアミノ酸残基はなかった。
図１ａ及び図１ｂに、それぞれグルコキナーゼ（Δ１−１１）／グルコース／化合物１の構造を示すリボン図、及びグルコキナーゼ（Δ１−１５）単体の構造を示すリボン図を示す。なお、右図は、左図を回転した図である。決定された変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体の構造においてラージドメイン及びスモールドメインの主要部分の構造は、変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体結晶により決定されたグルコキナーゼにおけるそれぞれの構造と似たものであったが、２つのドメインの相対位置が大きく異なっていた。変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体構造においてスモールドメインの主要部分は、変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体構造におけるスモールドメインの位置からおよそ９９度回転していた。また、グルコキナーゼのＣ末端領域に位置し変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体構造においてはスモールドメインを構成していたα１３ヘリックスは、変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体構造においてはもはやスモールドメインを構成せず、両ドメイン間に位置していた。さらに、変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体構造における基質グルコースの結合部位及び活性化剤結合部位はどちらも２つのドメイン間に存在していたため、新たに決定した構造ではそれらの部位の構造は大きく変化していた。変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体構造では酵素活性に重要な役割を果たすアミノ酸残基が活性部位を形成しておらず、今回解析した変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体の構造は、グルコキナーゼの不活性状態の構造であった。また、変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体の構造において活性化剤結合部位は、完全に消失していた。変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体構造および変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体構造により観測されたグルコキナーゼの構造変化（約９９度のドメインの回転）は、今まで知られていたヘキソキナーゼの構造変化（約１２度のドメインの回転）と比較してはるかに大きなものであり、現在の計算化学の能力で予想でき得るものではなく、今回の構造解析により初めて明らかとなったものである。
また、不活性型である変異型ＧＫ（Δ１−１５）単体構造への構造変化を阻害する目的として、変異型ＧＫ（Δ１−１１）／グルコース／化合物複合体構造で示された化合物結合部位に結合する化合物を設計することにより、グルコキナーゼの活性化剤を設計できることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明によれば、従来は結晶化が困難であったグルコキナーゼタンパク質の結晶を得ることができた。この結晶の構造を解析することによって得られる三次元構造座標は、グルコキナーゼに結合する化合物を設計するために好適に用いることができる。また、このようにして設計される化合物は、グルコキナーゼに結合するので、グルコキナーゼ活性化剤又は阻害剤として、グルコキナーゼ活性が関与する疾患の治療剤（例えば、糖尿病治療剤）として用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、グルコキナーゼの三次元構造を示すリボン図である。
（図１ａは、グルコキナーゼ（Δ１−１１）／グルコース／化合物１（式ＩＩＩａの化合物）の構造を示すリボン図である。また、右図は、左図を回転した図である。）
（図１ｂは、グルコキナーゼ（Δ１−１５）単体の構造を示すリボン図である。また、右図は、左図を回転した図である。）
図２は、グルコキナーゼ（Δ１−１１）の結合部位に対する化合物１（式ＩＩＩａの化合物）の結合様式を示す図である。
図３は、グルコキナーゼ（Δ１−１１）の結合部位の構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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