(57)【要約】本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＴ；その遺伝子及びこれらを含有する医薬に関する。ＲｈｏＴは優れた神経突起形成及び／又は伸長作用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＴ。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＴの遺伝子。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列、又は当該塩基配列に対して１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列を有するものである請求項２記載のＲｈｏＴの遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子を有効成分とする医薬。
【請求項５】
神経突起形成及び／又は神経突起伸長薬である請求項４記載の医薬。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子の医薬製造のための使用。
【請求項７】
医薬が、神経突起形成及び／又は神経突起伸長薬である請求項６記載の使用。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子の有効量を必要とする患者に投与することを特徴とする神経突起形成及び／又は神経突起伸長による治療方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子を含有する神経突起形成及び／又は神経突起伸長剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規なＲｈｏファミリー低分子量ＧＴＰａｓｅの一つであり、優れた神経突起形成及び神経突起伸長誘導作用を有するＲｈｏＴ及びその遺伝子に関する。
背景技術
Ｒｈｏファミリーに属する低分子量ＧＴＰａｓｅは現在、細胞形態、細胞遊走能、細胞運動性、細胞質分裂、および細胞接着を規定するアクチン細胞骨格とそれに結合した細胞構造の中心的なレギュレーターと考えられている。更にこれらは、遺伝子転写、細胞形質転換、分化、およびアポトーシスを調節するシグナル経路にも関与している。本ファミリーは、現在のところおよそ１４のメンバーから構成され、それらは６つのサブファミリーに分類される：Ｒｈｏ（ＲｈｏＡ，ＲｈｏＢ，ＲｈｏＣ）、Ｒａｃ（Ｒａｃ１，Ｒａｃ２，Ｒａｃ３，ＲｈｏＧ）、Ｃｄｃ４２（Ｃｄｃ４２，Ｔｃ１０）、ＲｈｏＥ／Ｒｎｄ（ＲｈｏＥ，Ｒｎｄ１，Ｒｎｄ２）、ＲｈｏＤ、およびＲｈｏＨ。
これらのうちＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２について最も詳しく研究されている。線維芽細胞では、細胞外リガンドのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）でＲｈｏＡを活性化すると、収縮性のアクチン・ストレスファイバーの会合とそれに伴う接着斑が生じる。これに対して、外因性に発現された構成的活性型のＲｈｏＤ、ＲｈｏＥおよびＲｎｄ１は、ＲｈｏＡと拮抗することによりこれらの細胞骨格構造を脱会合させる。血小板由来成長因子またはインスリンにより活性化されたＲａｃ１は、アクチンフィラメント網目構造の会合を促し、波状膜（層状仮足）と特異的な斑状複合体を形成する。アクチンフィラメントを含む微小突起（糸状仮足）とそれに伴う斑状複合体の形成は、ブラジキニンにより活性化されたＣｄｃ４２のはたらきである。加えてＣｄｃ４２はＲａｃ１を活性化しうる。その結果生じる糸状仮足の伸長は、それに一致した層状仮足の拡張を伴う。Ｃｄｃ４２と近縁のＴｃ１０は、Ｃｄｃ４２により形成される糸状仮足よりもさらに長い周辺突起の伸長をもたらす（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１１５１−１１６０（１９９８））。
神経細胞では、更にこれらの低分子量ＧＴＰａｓｅは、神経突起の伸長または成長円錐の再構成という重要な役割を果たしている。そのエフェクタードメインをＡＤＰリボシル化することによりＲｈｏＡを不活化する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｃ３細胞外酵素は、ＰＣ１２褐色細胞腫細胞とＮ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫細胞の神経突起の伸長を誘導する。一方、構成的活性型のＲｈｏＡまたはその標的タンパク質であるＲＯＣＫ／Ｒｈｏ−ｋｉｎａｓｅ／ＲＯＫを、神経突起が伸長しつつあるＰＣ１２もしくはＮ１Ｅ−１１５細胞に微量注入すると、これらの細胞をＬＰＡで処理した場合と同じく、神経突起の退縮と成長円錐の崩壊が生じる（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４１：１６２５−１６３６（１９９８））。Ｃｄｃ４２とＲａｃ１の微量注入は、Ｎ１Ｅ−１１５細胞の神経突起に沿った部位と成長円錐において、各々、糸状仮足と層状仮足の形成を促す（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：１２０１−１２１１（１９９７））。神経細胞の成長円錐は、糸状仮足と層状仮足を絶えず突出・後退させることで、神経突起をターゲットに向かって伸長させるガイドとなる（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４：４３−４８（１９９４）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１：３３９−３４５（１９９１））。糸状仮足は成長円錐をガイドするセンサーとしてはたらくのに対して、層状仮足は神経突起の伸長と膜の拡張による細胞運動に関連する。ドミナントネガティブ型のＣｄｃ４２（Ｔ１７Ｎ）またはＲａｃ１（Ｔ１７Ｎ）は、Ｃ３細胞外酵素または神経成長因子（ＮＧＦ）により誘導される神経突起伸長を阻害する。従って、Ｃｄｃ４２とＲａｃ１は、成長円錐における糸状仮足と層状仮足の形成を介する神経突起伸長に不可欠である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７４：１９９０１−１９９０５（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：１２０１−１２１１（１９９７））。Ｃｄｃ４２の標的タンパク質であり糸状仮足形成に不可欠の役割をはたすＮ−ＷＡＳＰのドミナントネガティブ変異体は、ＰＣ１２と海馬ニューロンの神経突起伸長を阻止する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１９８７−１１９９２（２０００））。ところが、Ｃｄｃ４２またはＲａｃ１は、神経突起伸長に重要な役割を果たしているにもかかわらず、いずれも単独ではシグナル経路を活性化して神経突起を伸長させるのに十分ではない。
従って、単独でシグナル経路を活性化して神経突起を伸長させる作用を有する物質が望まれている。
発明の開示
そこで本発明者は、新たな神経突起伸長因子を見出すべく種々検討した結果、Ｃｄｃ４２サブファミリータンパクに分類される新規なタンパクＲｈｏＴのクローニングに成功した。そして、ＲｈｏＴは、既知のタンパクＴｃ１０と類似していたが、ＲｈｏＴはＴｃ１０に比べて顕著に長く太い神経突起を誘導することから、新規な低分子量ＧＴＰａｓｅであることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＴを提供するものである。
また、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＴの遺伝子を提供するものである。
また本発明は、このＲｈｏＴ又はその遺伝子を有効成分とする医薬を提供するものである。
さらに本発明は、このＲｈｏＴ又はその遺伝子の医薬製造のための使用を提供するものである。
さらに本発明はこのＲｈｏＴ又はその遺伝子の有効量を必須とする患者に投与することを特徴とする神経突起形成及び／又は神経突起伸長による治療方法を提供するものである。
さらにまた、本発明はこのＲｈｏＴ又はその遺伝子を含有する神経突起形成及び／又は神経突起伸長剤を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＲｈｏＴは、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は（２）当該アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するものである。
ＲｈｏＴは、ＧＴＰａｓｅ活性とＧＤＰ／ＧＴＰ結合に関連する保存的なモチーフを含んでいる（図１）。
前記アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパクには、それがＧＴＰａｓｅ活性を有し、実質的に配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＲｈｏＴと同様な性質を有するものである限り含まれる。これらの改変は、例えば配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上、特に９０％以上のホモロジーを有するものであることが好ましい。
本発明のＲｈｏＴ遺伝子は、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は（２）当該アミノ酸配列に対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものである。その塩基配列としては、配列番号２で示される塩基配列、又は当該塩基配列に対して１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列が挙げられる。
この塩基配列の改変も、前記アミノ酸配列の改変と同様の範囲であり、前記ＲｈｏＴと同様な性質を有するポリペプチドをコードする限り、含まれる。これらの改変は、例えば配列番号２の塩基配列に対して８０％以上、特に９０％以上のホモロジーを有するものであることが好ましい。
本発明の遺伝子は、ヒトを含む脊椎動物、例えばマウスの筋細胞を用いてｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望のクローンを選択する方法により得ることができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７８，６６１３（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）など〕。
本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生されるタンパク（ＲｈｏＴ）に対して、該ＲｈｏＴの特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、これらの組合せなどを例示できる。
本発明遺伝子によれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、ＲｈｏＴを容易に大量に、安定して製造することができる。
ＲｈｏＴの製造は、より詳細には、該ＲｈｏＴ遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、ついで得られる培養物から回収することにより行なわれる。
上記宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２株を例示できる。また、真核成分の宿主細胞には、脊髄動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７７：４２１６（１９８０）〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。
またＲｈｏＴは、配列番号１のアミノ酸配列に従いペプチド合成法によっても製造することができる。
次に後記の実施例の結果に基づいて、ＲｈｏＴの機能について説明する。
Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰａｓｅは、アクチン細胞骨格の再構成を通して多様な細胞機能を調節していることが知られている。それらのうちＣｄｃ４２とＴｃ１０は、培養細胞の糸状仮足または周辺突起を誘導する。そしてＴｃ１０は骨格筋、心臓および脳に強く発現しており、Ｃ２骨格筋細胞の分化とＰＣ１２とＮ１Ｅ−１１５細胞の神経細胞分化の過程で著明に誘導された。これに対し、本発明のＲｈｏＴは主として心臓と子宮で発現され、Ｎ１Ｅ−１１５細胞の神経細胞分化の過程で誘導された。線維芽細胞に外因性に発現されたＴｃ１０は、Ｃｄｃ４２で形成された糸状仮足よりも長いアクチンフィラメントを含む周辺突起を生成したが、ＲｈｏＴは、それよりもはるかに長く太いアクチンフィラメントを含む突起を生成した。またＲｈｏＴとＴｃ１０はいずれも、ＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞の神経突起伸長を誘導したが、Ｃｄｃ４２単独では誘導は見られなかった。酵母での２ハイブリッド相互作用アッセイおよびプルダウンアッセイでは、ＲｈｏＴとＴｃ１０が、Ｃｄｃ４２と同様にＮ−ＷＡＳＰのＮ末端ＣＲＩＢモチーフを含む領域に結合することが示された。ＲｈｏＴとＴｃ１０による周辺突起と神経突起の形成は、Ｎ−ＷＡＳＰのドミナントネガティブ（優性阻害）変異体の同時発現により阻害された。従って、ＲｈｏＴとＴｃ１０が誘導する周辺突起と神経突起の形成には、Ｎ−ＷＡＳＰが不可欠である。ジブチリルサイクリックＡＭＰと血清飢餓でそれぞれ誘導される、ＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞の神経細胞分化は、ドミナントネガティブ型のＣｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴで阻害された。かようにＲｈｏＴはＴｃ１０とはそのアミノ酸配列で異なるだけでなく、神経突起形成能において著明に優れている。
従って、本発明のＲｈｏＴ又はその遺伝子は神経突起形成及び／又は神経突起伸長剤として有用である。また、本発明のＲｈｏＴ又はその遺伝子は、神経細胞の伸長を必要とする疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷等の疾患の治療薬として有用である。
本発明の医薬をヒトを含む哺乳類に投与するには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。かかる投与形態としては注射用製剤が好ましい。また薬学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これら医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化するが、ＲｈｏＴ蛋白質量として０．１μｇ〜１０ｍｇ／日程度であろう。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
Ａ．材料と方法
（１）細胞培養
マウスＣ２骨格筋細胞（Ｎａｔｕｒｅ  ２７０：７２５−７２７（１９７７））は既知の方法で培養した（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：３２１−３２９（１９９２））。増殖中の筋芽細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ修正Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥ）（増殖培地）中で３７℃にて維持した。最終的な分化を誘導するために、約２×１０５個の細胞（約２０％コンフルーエント状態）を増殖培地を入れた１００ｍｍディッシュ中に置き、１６〜２４時間維持したのち、培養液を、５％ウマ血清（ＨＳ）を添加したＤＭＥ培地（分化培地）に換えた。分化培地に変更してから９６時間後までに筋管細胞が多数形成された。マウスＢａｌｂ／３Ｔ３（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７２：１４１−１４８（１９６８））およびＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２（１０Ｔ１／２）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３３：３２３１−３２３８（１９７３））線維芽細胞は増殖培地中で培養した。ラットＰＣ１２褐色細胞腫細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：２４２４−２４２８（１９７６））は１０％ＦＢＳと５％ＨＳを含むＤＭＥ培地中で維持した。分化を誘導するために、培地を、５０ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦ（２．５Ｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ）もしくは、１０％ＦＢＳ、５％ＨＳ、および０．５ｍＭジブチリルサイクリックＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥ培地に交換した。マウスＮ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２５８−２６３（１９７２））は増殖培地中で維持した。分化を誘導するために、細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥ培地または２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増殖培地に移した。
（２）ｃＤＮＡクローニングと塩基配列解析細胞質
ＲＮＡをすでに報告されている方法（Ｃｅｌｌ  ４９：５１５−５２６（１９８７））でマウスＣ２筋管細胞より調製し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  Ｓｕｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。一本鎖ｃＤＮＡプールは、オリゴ（ｄＴ）プライマーでプライムした２μｇの鋳型ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（−）逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて合成した。マウスＴｃ１０  ｃＤＮＡ断片は、ヒトＴｃ１０  ｃＤＮＡ配列由来のセンス（ＧＴＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＧＣＡＧＴＣＡ）およびアンチセンス（ＧＣＴＡＴＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＣ）の各プライマー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１７９３−１７９８（１９９０））（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｍ３１４７０）を用いて、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによりｃＤＮＡプールからクローニングした。増幅反応はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＺｙｍｏｒｅａｃｔｏｒ  ＩＩ（Ａｔｔｏ）にて行った。ＲｈｏＴ  ｃＤＮＡ断片も同様に、マウス発現配列タグ（ＥＳＴ）クローン（アクセス番号ＡＡ９２０３４５）由来のセンス（ＧＴＧＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧ）およびアンチセンス（ＣＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣ）の各プライマーを用いてクローニングした。ＢｃａＢＥＳＴ標識キット（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ）を使用して、λＺＡＰＩＩを用いて構築したＣ２筋管細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：２４０９−２４１７（１９９７））を、これらの［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（＞１１１  ＴＢｑ／ｍｍｏｌ，ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）標識ｃＤＮＡ断片でスクリーニングした。各々、Ｔｃ１０とＲｈｏＴの全コーディング領域を含む、４．００ｋｂと１．８５ｋｂのｃＤＮＡがクローニングされた。ｉｎ  ｖｉｖｏ切断により、クローニングされたｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ファージミドが得られた。得られたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＬＣ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＬＩ−ＣＯＲ  ４０００自動ＤＮＡ塩基配列解析システムにて決定した。得られたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃソフトウェア（Ｖｅｒ．１０．１，Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．）により解析した。
（３）ノーザンブロッティングと定量的ＲＴ−ＰＣＲ
培養細胞の細胞質ＲＮＡはすでに報告された方法（Ｃｅｌｌ  ４９：５１５−５２６（１９８７））で調製した。マウス組織の全ＲＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（１１）で調製した。ノーザンブロッティングはすでに報告された方法（Ｃｅｌｌ  ４９：５１５−５２６（１９８７））で行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲはすでに述べた方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２８：９４１−９４９（２０００））で実施した。増幅反応は、ステッププログラム（９５℃６０秒、５８℃１５秒、および７２℃６０秒）に従って実施した。ＲｈｏＴ増幅に使用したプライマーはクローニングに使用したプライマーと同じである。対照のグリセリルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して用いたプライマーについては以前報告したものを用いた（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２８：９４１−９４９（２０００））。各々５０および１７サイクルの増幅後、増幅産物量は直線範囲に入っていた。ＰＣＲ産物の解析はアガロースゲル電気泳動で行った。
（４）エピトープタギング、ＥＧＦＰタギングおよびトランスフェクション
構成的活性型の変異体Ｔｃ１０（Ｇ１８Ｖ）およびＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）、ならびにドミナントネガティブ変異体Ｔｃ１０（Ｔ２３Ｋ）およびＲｈｏＴ（Ｔ３５Ｎ）を生成する点変異を、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ部位特異的変異導入キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてｃＤＮＡに導入した。野生型（ｗｔ）および変異型タンパク質のコーディング配列は、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＭｙｃベクターのＮ末端Ｍｙｃタグにインフレームに融合された。これらは更にｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にもライゲーションした。これらの組換えプラスミドは、すでに記載されたリン酸カルシウムを用いる方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７８５５−２７８６２（１９９６））で、ガラス製のカバースリップ上で増殖した培養細胞にトランスフェクションした。一過性トランスフェクションをした細胞は免疫蛍光顕微鏡（Ｊ．Ｃｅｌｌ  ｓｃｉ．１１１：１０８１−１０９３（１９９８））による観察用に処理された。固定・透過処理を行った細胞は、Ｍｙｃタグを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｍｙｃ１−９Ｅ１０（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−３６１６（１９８５））（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）とともにインキュベートしたのち、更にイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（アフニティー精製済み、Ｃａｐｐｅｌ）とインキュベートした。アクチンフィラメントを同定するために、第２抗体にはローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を加えた。標本はＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡で観察した。
（５）酵母２ハイブリッド相互作用アッセイ
ｗｔ、構成的活性型Ｃｄｃ４２、Ｔｃ１０、ＲｈｏＴ変異体、およびドミナントネガティブ型Ｃｄｃ４２、Ｔｃ１０、ＲｈｏＴ変異体をコードするｃＤＮＡを、ｐＧＢＴ９ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインにライゲーションさせた。Ｎ−ＷＡＳＰ（ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：５３２６−５３３５（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：９３−９６（１９９８））のＮ末端部分（アミノ酸１〜２７５）をコードしているｃＤＮＡ断片は、ｐＡＣＴ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＧａｌ４活性化ドメインに融合させた。続いて、酵母Ｙ１９０株をベイト・アンド・プレイプラスミドで形質転換した。二重形質転換体を、ロイシンとトリプトファンを含まない最小合成脱落培地（ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ）のプレート上で選択した。βガラクトシダーゼ・コロニーリフト・フィルターアッセイにより、ｌａｃＺリポーター遺伝子の活性化を解析した。
（６）プルダウンアッセイ
野生型低分子量ＧＴＰａｓｅのコーディング配列を、ｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグに、インフレームにライゲーションした。ＧＳＴタグ付きの組換えタンパク質は大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株中で発現させ、グルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でアフィニティー精製した。Ｎ−ＷＡＳＰの全長をコードしているｃＤＮＡを、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＨＡベクターの赤血球凝集素（ＨＡ）３タグにインフレームに融合させた。この組換えプラスミドをＢａｌｂ／３Ｔ３にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、１ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭフェニルメチルスルホニル・フルオリド、および４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％Ｎａ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅおよび０．１％ＳＤＳ）で細胞を溶解し、１６，０００×ｇにて１５分間遠心したのち、上清を回収した。前もって精製したＧＳＴタグ付き低分子量ＧＴＰａｓｅは、１ｍＭ  ＧＴＰγＳまたはＧＤＰのいずれかとともにグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに再アプライした。細胞溶解液を低分子量ＧＴＰａｓｅ結合レジンにアプライし、ＲＩＰＡ緩衝液で十分洗滌したのち、結合タンパク質を５ｍＭグルタチオンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、更に、抗ＨＡタグ・ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（ＭＢＬ）、第２抗体のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、およびＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅウエスタンブロット・ケミルミネセンス試薬Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたイミュノブロッティングによりＨＡタグ付きのＮ−ＷＡＳＰを検出した。
Ｂ．結果
（１）ＲｈｏＴはＣｄｃ４２サブファミリーのメンバーである
完全なコーディング配列を含むマウスＴｃ１０  ｃＤＮＡ配列がデータベースに登録されていなかったため、われわれは、まず最初に、ヒトＴｃ１０  ｃＤＮＡ配列（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１７９３−１７９８（１９９０））由来のプライマーを使用して、マウスＣ２骨格筋筋管細胞ｃＤＮＡプールから、ＲＴ−ＰＣＲによりマウスＴｃ１０  ｃＤＮＡをクローニングした。次に、得られたＰＣＲ産物でＣ２筋管細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、３，９６６ｂｐのｃＤＮＡをクローニングした。このマウスＴｃ１０  ｃＤＮＡは、２０５アミノ酸からなる算定Ｍｒ２２，６５９の完全長のコーディング配列を含む（図１Ａ）。この配列およびＥＳＴデータベースによると、マウスＴｃ１０はヒトＴｃ１０とは異なり、Ｎ末端の８つのアミノ酸を欠如している。マウスＥＳＴデータベースを検索したところ、アクセス番号ＡＡ９２０３４５のマウスＴｃ１０様タンパク質の部分ｃＤＮＡ配列を入手することができた。この配列に基づき、Ｃ２筋管細胞ｃＤＮＡプールから、ＲＴ−ＰＣＲによりこのｃＤＮＡ断片をクローニングした。得られたＰＣＲ産物を用いて、Ｃ２筋管細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、２１４アミノ酸をコードする算定Ｍｒ２３，７６６の完全長のコーディング配列を含む、１，８４６ｂｐのＣＤＮＡを得た（図１、配列番号２）。ヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸配列は、Ｔｃ１０およびＣｄｃ４２のアミノ酸配列と、各々７８．６％および６４．６％一致し、このタンパク質はＲｈｏファミリータンパク質の中でＴｃ１０と分子進化上最も近縁だった（図２）。よって、われわれはこのタンパク質をＲｈｏＴと呼ぶこととする。ＲｈｏＴ、Ｔｃ１０およびＣｄｃ４２はＣｄｃ４２サブファミリーを構成していた。
ＲｈｏＴは、ＧＴＰａｓｅ活性とＧＤＰ／ＧＴＰ結合に関連する保存的なモチーフを含んでいた（図１Ａ）。スイッチＩおよびＩＩ領域は、ＧＴＰおよびＧＤＰ結合によりかなりの構造変化を受ける（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：９３９−９４５（１９９０））。スイッチＩ領域の配列は、エフェクタードメインとほとんど一致しており、各サブファミリー間で比較的よく保存されている。スイッチＩ領域の配列はＴｃ１０とＲｈｏＴで同一だった。スイッチＩＩ領域の配列はＲｈｏファミリータンパク質間で高度に保存されているが、ＲｈｏＴはこの領域に、荷電アミノ酸（ＤＲ）の代わりに非荷電アミノ酸（ＮＱ）を含んでいた。１３個のアミノ酸からなるＲｈｏ挿入領域はＲｈｏファミリータンパク質に特異的なもので、エフェクタータンパク質とＲｈｏＧＤＩの結合に関与することが示されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９７９４−１９８０１（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１７３２−２１７３７（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６１５３−２６１５８（１９９７））。この領域の配列の関連性は非常に低いが、Ｔｃ１０とＲｈｏＴに関しては関連性が高かった。しかしながら、Ｔｃ１０のこの領域の２つのアミノ酸（ＮＤ）は、ＲｈｏＴでは類似性のないアミノ酸ＬＹに置き換えられていた。Ｃ末端のＣａａＸモチーフ（Ｃ、システイン；ａ、脂肪族アミノ酸；Ｘ、任意のアミノ酸）は、翻訳後修飾の３つのタイプ、すなわちイソプレニル化、タンパク分解、およびメチル化のシグナルであるが（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：１８１−２０５（１９９４）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：２４１−２６９（１９９６））、他のＲｈｏファミリータンパク質の場合と同じくＲｈｏＴでも保存されていた。Ｔｃ１０とＲｈｏＴでは、各々、２つまたは３つのＣｙｓ残基がＣａａＸモチーフの上流に存在していたが［すなわち、−（ＣＸＸ）ＣＸＸＣＣａａＸ］、これはＲｈｏＢの対応する２つのＣｙｓ残基と類似していた。これらの上流Ｃｙｓ残基はＲｈｏＢではパルミトイル化されていることから（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００３３−２００３８（１９９２））、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴでもこれらがパルミトイル化されている可能性がある。Ｔｃ１０とＲｈｏＴはＣ末端配列に加えて、Ｎ末端にもきわめてユニークな配列を有していた。更に、ＲｈｏＴは、ＲｈｏＤ、ＲｈｏＥおよびＲｎｄ１同様、長いＮ末端部分を有していた。
（２）Ｔｃ１０とＲｈｏＴは筋または脳で特徴的に発現され、筋形成ないし神経分化の過程で誘導される
Ｃｄｃ４２サブファミリーメンバーの組織・細胞内発現レベルをノーザンブロッティングで検討した。２．２ｋｂ  Ｃｄｃ４２  ｍＲＮＡが、調べたさまざまなマウス組織に普遍的に存在していたのに対し、１．８ｋｂ  ｍＲＮＡは脳に特異的に発現していた（図３）。２．２ｋｂ  ｍＲＮＡ量は、Ｃ２骨格筋細胞の分化過程を通じてほぼ一定で、１０Ｔ１／２線維芽細胞においても一定だった。加えて、１．０ｋｂ  ｍＲＮＡもこれらの培養細胞にとりわけ多く検出された（図３）。ＮＧＦまたｄｂｃＡＭＰで誘導されるラット褐色細胞腫細胞ＰＣ１２の神経細胞分化過程、および血清飢餓により誘導されるマウスＮ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫細胞の分化過程では、２．２ｋｂ  ｍＲＮＡ量はダウンレギュレートされていた（図４）。これに対して、ＤＭＳＯで誘導されるＮ１Ｅ−１１５細胞の分化過程では２．２ｋｂ  ｍＲＮＡ量はほとんど不変だった（図４）。
Ｔｃ１０  ｍＲＮＡ（４．４および３．４ｋｂ）は、脳に加えて、３つのタイプの筋組織、すなわち脚部骨格筋、心臓（心筋）および子宮（平滑筋）でも高度に発現されていた（図３）。この発現パターンは従来の報告（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１１５１−１１６０（１９９８）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：４１３８−４１４４（２０００））と矛盾しない。Ｔｃ１０  ｍＲＮＡは未分化のＣ２筋芽細胞には中等度存在したが、分化誘導から４８時間後以内に著明に誘導され、最終分化した筋管細胞中にも高いレベルで維持されていた。また、Ｔｃ１０  ｍＲＮＡは、ＮＧＦまたはｄｂｃＡＭＰで刺激されたＰＣ１２細胞の分化過程でも徐々に誘導され、９６時間後以内に高いレベルで蓄積された（図４）。Ｔｃ１０  ｍＲＮＡは、Ｎ１Ｅ−１１５細胞でも、血清飢餓ないしＤＭＳＯ処理による分化の進行とともにアップレギュレートされていた（図４）。
一方、ＲｈｏＴ  ｍＲＮＡ（２．５ｋｂ）は心臓と子宮に主として存在し、骨格筋と脳にはほとんど検出されなかった（図３）。ＲｈｏＴ  ｍＲＮＡ量はＣ２細胞の分化過程ではほとんど一定で、検討した細胞・組織の中では１０Ｔ１／２線維芽細胞で最も高かった。ＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞では、ＲｈｏＴ  ｍＲＮＡは分化段階にかかわらず、ノーザンブロッティングではほとんど検出されなかった。これに対して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＤＭＳＯによる分化誘導後に脳とＮ１Ｅ−１１５細胞でＲｈｏＴ  ｍＲＮＡが検出されたが、血清飢餓による分化誘導後には検出されなかった（図４）。ＰＣ１２細胞では、ＰＣＲ解析によってもｍＲＮＡは検出されなかったが、これは、使用したＰＣＲプライマーがマウスのＲｈｏＴ配列に基づいてデザインされていたために、ラットのＲｈｏＴ  ｃＤＮＡにはアニールしなかったことによる可能性がある。
（３）ＲｈｏＴはＴｃ１０よりも著明に長く太い突起を誘導する
構成的活性型Ｃｄｃ４２を線維芽細胞に微小注入またはトランスフェクションすると、アクチン細胞骨格の再構成と糸状仮足の形成が生じる（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０９：３６７−３７７（１９９６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１９４２−１９５２（１９９５）、Ｃｅｌｌ  ８１：５３−６２（１９９５））。構成的活性型Ｔｃ１０のトランスフェクションは、ストレスファイバーの脱会合と、Ｃｄｃ４２で誘導されるよりも長い周辺突起の伸長を引き起こす（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：３８３１−３８４５（１９９９）、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１１５１−１１６０（１９９８））。われわれは、アクチン細胞骨格と細胞形態に対するＲｈｏＴの作用を、Ｃｄｃ４２およびＴｃ１０の作用と比較・検討した。構成的活性型のＭｙｃタグ付きＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）またはＴｃ１０（Ｇ１８Ｖ）をＢａｌｂ／３Ｔ３および１０Ｔ１／２線維芽細胞にトランスフェクションすると、これらの細胞タイプのいずれにおいても太いストレスファイバーは消失し、円形の細胞形態と周辺突起が誘導された（図５、ａとｃ；図６、ａとｃ）。Ｔｃ１０により形成された突起は長さ１０〜２０μｍで、Ｃｄｃ４２で形成される突起（長さ〜１０μｍ）よりも長かった。これらは、ローダミン−ファロイジン染色で検出されるアクチンフィラメントを含んでいた（図５、ｂとｄ；図６、ｂとｄ）。構成的活性型のＭｙｃタグ付きＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）をこれらの細胞に発現させた場合にも、ストレスファイバーの消失と円形の細胞形態は明らかだった（図５、ｅとｆ；図６、ｅとｆ）。ＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）もアクチンフィラメントを含む突起を生成したが、これらの突起は、Ｃｄｃ４２やＴｃ１０で形成された突起よりも著明に長く（＞２０μｍ、時に４０μｍに達する）太かった。特記すべきこととして、Ｃｄｃ４２またはＴｃ１０で形成されたものと異なり、突起の先端はしばしば拡張ないし膨張していた。
（４）Ｔｃ１０とＲｈｏＴは神経突起伸長を誘導するがＣｄｃ４２は誘導しない
Ｔｃ１０とＲｈｏＴが長突起を形成し、それらのｍＲＮＡがＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞の神経細胞分化過程で誘導されたことから、次にわれわれは、これらの細胞の神経突起伸長へのＴｃ１０とＲｈｏＴの関与について検討した。Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）をＰＣ１２細胞にトランスフェクションした場合、糸状仮足は形成されたが神経突起はほとんど検出されなかった（図７、ｂ；図９）。野生型（ｗｔ）Ｃｄｃ４２では、そのような糸状仮足すらほとんど形成されなかった（図７、ａ）。一方、Ｃｄｃ４２（ｗｔ）はＮ１Ｅ−１１５細胞に糸状仮足を生成したが、Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）は糸状仮足を生成しなかった（図８、ａとｂ）。Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）は細胞形態の拡張ないし扁平化を引き起こしたが、Ｃｄｃ４２（ｗｔ）とＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）はどちらもＮ１Ｅ−１１５細胞に神経突起を生成しなかった（図８、ａとｂ；図１０）。
これとは対照的に、Ｔｃ１０（Ｇ１８Ｖ）とＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）はともにＰＣ１２細胞に神経突起を誘導したが、それらのｗｔ型では誘導は認められなかった（図７、ｃ−ｆ；図９）。ＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）の方がＴｃ１０（Ｇ１８Ｖ）よりも、著明に長い神経突起を形成する傾向があった（図７、ｄとｆ；図９）。Ｔｃ１０（ｗｔ）とＲｈｏＴ（ｗｔ）はＮ１Ｅ−１１５細胞に長い神経突起（細胞体よりも＞４倍長い）を生成した（図８、ｃとｅ；図１０）。ＲｈｏＴで誘導された神経突起は、一般にＴｃ１０誘導のものよりも長かった。一方、Ｔｃ１０（Ｇ１８Ｖ）とＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）の神経突起誘導作用は更に低かった（図８、ｄとｆ；図１０）。免疫蛍光顕微鏡所見では、ＮＧＦ処理ＰＣ１２細胞および血清飢餓Ｎ１Ｅ−１１５細胞と同様に、これらの神経突起はチューブリンとＭＡＰ２を含有する微小管を含んでいた。Ｔｃ１０（Ｔ２３Ｋ）とＲｈｏＴ（Ｔ３５Ｎ）のドミナントネガティブ変異体には神経突起形成能は認められなかった。
（５）Ｔｃ１０とＲｈｏＴはＮ−ＷＡＳＰに結合する
Ｃｄｃ４２は、その標的タンパク質であるＮ−ＷＡＳＰのＣＲＩＢモチーフ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９０７１−２９０７４（１９９５））に結合することにより、Ａｒｐ２／３複合体とプロフィリンを介するアクチン重合を活性化して糸状仮足を生成する（ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：５３２６−５３３５（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：９３−９６（１９９８）、Ｃｅｌｌ  ９７：２２１−２３１（１９９９））。Ｔｃ１０とＲｈｏＴもＮ−ＷＡＳＰに結合するかどうかを検討するために、酵母２ハイブリッド相互作用アッセイを用いた。βガラクトシダーゼ・コロニーリフト・フィルターアッセイでは、Ｃｄｃ４２の野生型と構成的活性型と同じく、Ｔｃ１０とＲｈｏＴの野生型と構成的活性型の両者はいずれも、Ｎ−ＷＡＳＰのＣＲＩＢモチーフを含むＮ末端部分に結合することが示された（図１１）。これに対して、それらのドミナントネガティブ型と、陰性対照として用いた構成的活性型のＲｈｏＡ（Ｇ１４Ｖ）はＮ−ＷＡＳＰに結合しなかった。
更にわれわれは、これらのＣｄｃ４２サブファミリータンパク質のＮ−ＷＡＳＰへの結合をプルダウンアッセイにより検定した。ＧＴＰγＳとともにロードされたＧＳＴタグ付きのＣｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴは、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞に発現されたＨＡタグ付きのＮ−ＷＡＳＰと結合した。しかし、ＧＤＰをロードしたＣｄｃ４２サブファミリータンパク質は、ＧＴＰγＳまたはＧＤＰをロードしたＲｈｏＡと同じく、Ｎ−ＷＡＳＰに対する結合能を示さなかった（図１２）。総合的に見ると、これらの結果は、Ｃｄｃ４２のみならずＴｃ１０とＲｈｏＴもＧＴＰ依存的にＮ−ＷＡＳＰと結合し、従ってエフェクタータンパク質としてＮ−ＷＡＳＰを利用することを示唆する。
（６）Ｔｃ１０とＲｈｏＴは周辺突起形成と神経突起伸長にＮ−ＷＡＳＰを必要とする
Ｔｃ１０とＲｈｏＴがＮ−ＷＡＳＰに結合することから、この結合がＴｃ１０とＲｈｏＴの機能に不可欠かどうかの検討は重要である。Ｎ−ＷＡＳＰのＣＲＩＢモチーフ内のＨｉｓ２０８をＡｓｐで置換（Ｈ２０８Ｄ）すると、Ｃｄｃ４２のＮ−ＷＡＳＰへの結合は消失する（Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：９３−９６（１９９８））。Ｎ−ＷＡＳＰのコフィリン相同領域は、隣接する酸性領域と協調して、Ａｒｐ２／３複合体の結合によるアクチン重合に関与する（Ｃｅｌｌ  ９７：２２１−２３１（１９９９）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４：１８０１−１８０９（２００１））。この領域の４アミノ酸欠失（Δｃｏｆ）はＡｒｐ２／３複合体活性化能を消失させる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１９８７−１１９９２（２０００）、Ｃｅｌｌ  ９７：２２１−２３１（１９９９））。これら２つの変異体はＮ−ＷＡＳＰのドミナントネガティブ変異体として作用することから（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１９８７−１１９９２（２０００））、われわれは、Ｔｃ１０とＲｈｏＴによる周辺突起形成と神経突起伸長へのＮ−ＷＡＳＰの関与の検討にこれらを使用した。
Ｎ−ＷＡＳＰ（Ｈ２０８Ｄ）またはＮ−ＷＡＳＰΔｃｏｆを、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞内でＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）と共発現させると、糸状仮足の形成が阻害された（図１３とＢ、ａとｂ）。これらの結果は、ＣＯＳ−７細胞を用いた以前の観察結果と矛盾しない（Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：９３−９６（１９９８））。これらのＮ−ＷＡＳＰ変異体のいずれかをＴｃ１０（Ｇ１８Ｖ）と共発現させた場合にも、Ｔｃ１０による長突起の形成が抑制された（図１３と１４、ｃとｄ）。これらのＮ−ＷＡＳＰ変異体をＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）と共発現させた場合にも、ＲｈｏＴによる長く太い突起の形成は阻害された（図１３と１４、ｅとｆ）。１０Ｔ１／２細胞でも同様の結果が得られた。これらの結果は、Ｃｄｃ４２により誘導される糸状仮足形成のみならず、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴを介する突起形成にもＮ−ＷＡＳＰが必要であることを示す。
Ｎ−ＷＡＳＰ（Ｈ２０８Ｄ）またはＮ−ＷＡＳＰΔｃｏｆを、ＰＣ１２細胞内でＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）と共発現させた場合にも糸状仮足の形成が阻害された（図１５と１６、ａとｂ）。更に、Ｔｃ１０（Ｇ１８Ｖ）で誘導される神経突起伸長は、Ｎ−ＷＡＳＰ（Ｈ２０８Ｄ）またはＮ−ＷＡＳＰΔｃｏｆとの共発現により妨げられた（図１５と１６、ｃとｄ；図１７）。同様に、ＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）で誘導される神経突起伸長は、Ｎ−ＷＡＳＰのドミナントネガティブ変異体との共発現により遅延した（図１５と１６、ｅとｆ；図１７）。これらのドミナントネガティブＮ−ＷＡＳＰ変異体は、Ｔｃ１０またはＲｈｏＴにより誘導されるＮ１Ｅ−１１５細胞の神経突起伸長も阻害した。従って、Ｎ−ＷＡＳＰは、線維芽細胞における突起形成だけでなく、Ｔｃ１０またはＲｈｏＴによる神経突起伸長にも不可欠の役割を果たしている。
（７）Ｔｃ１０とＲｈｏＴはＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞の神経細胞分化に不可欠である
次にわれわれは、神経突起伸長に代表されるＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞の神経細胞分化に、Ｃｄｃ４２サブファミリータンパク質が必要か否かを検討した。ＰＣ１２細胞はｄｂｃＡＭＰ刺激で分化が誘導された（図１８、ａ，ｃ，ｅおよびｇ参照）。ｄｂｃＡＭＰで刺激したＰＣ１２細胞に、ドミナントネガティブ型のＣｄｃ４２（Ｔ１７Ｎ）を発現させると、神経突起の伸長が妨げられたが（図１８、ｃとｄ；図２０）、一方、空のベクターをモック・トランスフェクションしても、神経突起伸長には何の作用も及ぼさなかった（図１８、ａとｂ）。更に、ドミナントネガティブのＴｃ１０（Ｔ２３Ｋ）もしくはＲｈｏＴ（Ｔ３５Ｎ）を発現させた場合にも、神経突起の伸長が阻害された（図１８、ｅ−ｈ；図２０）。
Ｎ１Ｅ−１１５細胞は血清飢餓により分化が誘導された（図１９、ａ，ｃ，ｅ，およびｇ参照）。血清を飢餓させたＮ１Ｅ−１１５細胞にドミナントネガティブ型Ｃｄｃ４２（Ｔ１７Ｎ）を発現させると、神経突起の伸長が妨げられたが（図１９、ｃとｄ；図２１）、空のベクターのモック・トランスフェクションは、神経突起伸長に作用しなかった（図１９、ａとｂ）。この結果は以前の観察結果と矛盾しない（Ｋｏｚｍａら、１９９７）。更に、ドミナントネガティブ型のＴｃ１０（Ｔ２３Ｋ）またはＲｈｏＴ（Ｔ３５Ｎ）の発現も神経突起の伸長を阻害した（図１９、ｅ−ｈ；図２１）。これらの結果は、ｗｔもしくは構成的活性型変異体での結果と合わせ、ＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞のいずれの神経突起伸長にも、Ｔｃ１０とＲｈｏＴが必要であることを示唆する。
産業上の利用可能性
本発明のＲｈｏＴは優れた神経突起形成及び／又は神経突起伸長誘導作用を有し、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷などの神経疾患の再生治療および遺伝子治療の医薬として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウスＣｄｃ４２、マウスＴｃ１０、マウスＲｈｏＴ、ヒトＲｈｏＧ、マウスＲａｃ１、マウスＲｈｏＡ、ヒトＲｈｏＥ、ヒトＲｎｄ１、マウスＲｈｏＤおよびヒトＲｈｏＨのアミノ酸配列の比較を示す。
一致度＞５０％のアミノ酸位置は黒色のボックスで示す。Ｇ１〜Ｇ４：ＧＴＰａｓｅ活性とＧＤＰ／ＧＴＰ結合に必要なコアモチーフ。Ｅ：エフェクタードメイン。スイッチＩ、スイッチＩＩ、Ｒｈｏ挿入領域およびＣａａＸモチーフについても示す。
図２は、Ｒｈｏファミリータンパク質の分子進化上の関連性を示す。
図３は、種々の組織、分化中のＣ２細胞、および１０Ｔ１／２細胞における、Ｃｄｃ４２（Ａ）、Ｔｃ１０（Ｂ）およびＲｈｏＴ（Ｃ）の発現を示すノーザンブロッティング、並びに全ＲＮＡおよび細胞質ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の臭化エチジウム染色パターン（Ｄ）を示す。
図４は、ＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞の分化過程におけるＣｄｃ４２（Ｅ）とＴｃ１０（Ｆ）の発現を示すノーザンブロット、臭化エチジウム染色パターン（Ｇ）及び脳と、ＰＣ１２およびＮ１Ｅ−１１５細胞における、ＲｈｏＴ（Ｈ）と対照のグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）（Ｉ）の発現についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。
図５は、線維芽細胞（Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞）においてＣｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴにより生成された細胞突起の形態を示す図である。
図６は、線維芽細胞（１０Ｔ１／２細胞）において、Ｃｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴにより生成された細胞突起の形態を示す図である。
図７は、ＰＣ１２細胞にｐＥＦ−ＢＯＳ／Ｍｙｃベクターと融合した野生型（ｗｔ）または構成的活性型Ｃｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴの各ｃＤＮＡをトランスフェクションした細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。
図８は、Ｎ１Ｅ−１１５細胞に、ｐＥＦ−ＢＯＳ／Ｍｙｃベクターと融合した野生型（ｗｔ）または構成的活性型Ｃｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴの各ｃＤＮＡをトランスフェクションした。細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。
図９は、図７におけるＰＣ１２細胞の伸長の程度を示す図である。伸長の程度は、細胞体の直径の倍数で表す。値は３回の実験の平均値±ＳＤである。
図１０は、図８におけるＮ１Ｅ−１１５細胞の伸長の程度を示す図である。
図１１は、Ｎ−ＷＡＳＰのＣＲＩＢモチーフに対するＣｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴの結合を示す酵母２ハイブリッド相互作用アッセイの結果を示す（ｗｔ＝野生型、ＣＡ＝構成的活性型、ＤＮ＝ドミナントネガティブ）。
図１２は、Ｎ−ＷＡＳＰのＣＲＩＢモチーフに対するＣｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴの結合を示すプルダウンアッセイの結果を示す（ａ＝Ｎ−ＷＡＳＰのイムノブロット、ｂ＝ＧＳＴ−低分子量ＧＴＰａｓｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
図１３および１４は、Ｃｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴ誘導突起形成のドミナントネガティブＮ−ＷＡＳＰ変異体による阻害作用を示す図であり、図１３は、ｐＥＦ−ＢＯＳ／Ｍｙｃベクターに挿入されたＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）、Ｔｃ１０（Ｇ１８Ｖ）またはＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）の各ｃＤＮＡと、ｐｃＤＬ−ＳＲαベクターに挿入されたＮ−ＷＡＳＰ（Ｈ２０８Ｄ）の各ｃＤＮＡをＢａｌｂ／３Ｔ３細胞にコトランスフェトした結果であり、図１４は、これらの各ｃＤＮＡとＮ−ＷＡＳＰΔｃｏｆの各ｃＤＮＡを、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞にコトランスフェクションした結果である。
図１５および１６は、ドミナントネガティブＮ−ＷＡＳＰ変異体による、ＰＣ１２細胞のＴｃ１０およびＲｈｏＴ誘導神経突起伸長の阻害を示す図であり、図１５は、ｐＥＦ−ＢＯＳ／Ｍｙｃベクターに挿入されたＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）、Ｔｃ１０（Ｇ１８Ｖ）またはＲｈｏＴ（Ｇ３０Ｖ）の各ｃＤＮＡと、ｐｃＤＬ−ＳＲαベクターに挿入されたＮ−ＷＡＳＰ（Ｈ２０８Ｄ）をＰＣ１２細胞にコトランスフェクトした結果であり、図１６はこれらの各ｃＤＮＡとＮ−ＷＡＳＰΔｃｏｆ（Ｂ）の各ｃＤＮＡを、ＰＣ１２細胞にコトランスフェクションした結果を示す図である。
図１７は、図１５及び図１６における神経突起伸長ＰＣ１２細胞の割合を示す図である。神経突起伸長の程度は、細胞体の直径の倍数で表す。値は３回の実験の平均値±ＳＤである。
図１８〜２１は、Ｃｄｃ４２、Ｔｃ１０およびＲｈｏＴのドミナントネガティブ変異体による、ＰＣ１２細胞のｄｂｃＡＭＰ誘導による神経突起伸長とＮ１Ｅ−１１５細胞の血清飢餓誘導による神経突起伸長の抑制を示す図であり、図１８および図１９はＰＣ１２（図１８）およびＮ１Ｅ−１１５細胞（図１９）に、ｐＥＦ−ＢＯＳ／Ｍｙｃベクターに挿入されたＣｄｃ４２（Ｔ１７Ｎ）、Ｔｃ１０（Ｔ２３Ｋ）またはＲｈｏＴ（Ｔ３５Ｎ）、もしくは空のｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした結果を示し、図２０および図２１は神経突起が伸長したＰＣ１２（図２０）およびＮ１Ｅ−１１５（図２１）細胞の割合を示す。神経突起伸長の程度は、細胞体の直径の倍数で表す。値は３回の実験の平均値±ＳＤである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月23日(2002.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＴ。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲｈｏＴの遺伝子。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列を有するものである請求項２記載のＲｈｏＴの遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子を有効成分とする医薬。
【請求項５】
神経突起形成及び／又は神経突起伸長薬である請求項４記載の医薬。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子の医薬製造のための使用。
【請求項７】
医薬が、神経突起形成及び／又は神経突起伸長薬である請求項６記載の使用。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子の有効量を必要とする患者に投与することを特徴とする神経突起形成及び／又は神経突起伸長による治療方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＲｈｏＴ又はその遺伝子を含有する神経突起形成及び／又は神経突起伸長剤。
【国際調査報告】
2003031614.tif 000029
2003031614.tif 000030
2003031614.tif 000031
2003031614.tif 000032
2003031614.tif 000033