(57)【要約】細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物を製造する方法、および該方法に用いることができる細胞。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
【請求項２】
細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、請求の範囲１に記載の方法。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
【請求項３】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求の範囲２に記載の方法。
【請求項４】
蛋白質の活性の低下または欠失が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる手法により行われたものである、請求の範囲２または３に記載の方法。
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的にした遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法。
【請求項５】
蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法が、ＲＮＡｉである、請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質、または以下の（ｉ）〜（ｎ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲３〜５のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項７】
ＲＮＡｉ法が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする方法である、請求の範囲５または６に記載の方法。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることで、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させた、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、請求の範囲７に記載の方法。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
【請求項９】
２本鎖ＲＮＡが、請求の範囲７または８に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡならびにその相補ＤＮＡを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、請求の範囲７または８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
【請求項１１】
細胞が、抗体分子をコードする遺伝子を導入した細胞である、請求の範囲１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求の範囲１１に記載の方法。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項１３】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、請求の範囲１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求の範囲１４に記載の方法。
【請求項１６】
糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求の範囲１５に記載の方法。
【請求項１７】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が、マウスミエローマ細胞である、請求の範囲１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
マウスミエローマ細胞が、ＮＳＯ細胞またはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である請求の範囲１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｄ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
（ｅ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｆ）胚性幹細胞；
（ｇ）受精卵細胞。
【請求項２２】
抗体分子をコードする遺伝子を導入した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞。
【請求項２３】
細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞である、請求の範囲２２記載の細胞。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
【請求項２４】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求の範囲２３に記載の細胞。
【請求項２５】
蛋白質の活性の低下または欠失が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる手法により行われたものである、請求の範囲２３または２４に記載の細胞。
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的にした遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法。
【請求項２６】
蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法が、ＲＮＡｉである、請求の範囲２５に記載の細胞。
【請求項２７】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質、または以下の（ｉ）〜（ｎ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲２４〜２６のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２８】
ＲＮＡｉ法が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする方法である、請求の範囲２５または２６に記載の細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
【請求項２９】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることで、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させた、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、請求の範囲２８に記載の細胞。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
【請求項３０】
２本鎖ＲＮＡが、請求の範囲２８または２９に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、請求の範囲２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が、少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲２２〜３０のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
【請求項３２】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求の範囲２２〜３１のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む融合蛋白質。
【請求項３３】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲２２〜３２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３４】
抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、請求の範囲２２〜３３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３５】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求の範囲３４に記載の細胞。
【請求項３６】
糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求の範囲３５に記載の細胞。
【請求項３７】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲３５に記載の細胞。
【請求項３８】
細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲２２〜３７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３９】
細胞が、マウスミエローマ細胞である、請求の範囲２２〜３７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４０】
マウスミエローマ細胞が、ＮＳＯ細胞またはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である請求の範囲３９に記載の細胞。
【請求項４１】
細胞が、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲２２〜３８のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｄ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
（ｅ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｆ）胚性幹細胞；
（ｇ）受精卵細胞。
【請求項４２】
請求の範囲２２〜４１のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
【請求項４３】
親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を生産する、請求の範囲４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求の範囲４３に記載の方法。
【請求項４５】
糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求の範囲４４に記載の方法。
【請求項４６】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性であるマウスミエローマ細胞。
【請求項４８】
以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した、請求の範囲４７記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
【請求項４９】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求の範囲４８記載のマウスミエローマ細胞。
【請求項５０】
蛋白質の活性の低下または欠失が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる手法により行われたものである、請求の範囲４８または４９記載のミエローマ細胞。
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的にした遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法。
【請求項５１】
蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法が、ＲＮＡｉである、請求の範囲５０記載のマウスミエローマ細胞。
【請求項５２】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質、または以下の（ｉ）〜（ｎ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲４９〜５１のいずれか１項に記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項５３】
ＲＮＡｉ法が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする方法である、請求の範囲５１または５２記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
【請求項５４】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることで、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させた、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、請求の範囲５１に記載のミエローマ細胞。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
【請求項５５】
２本鎖ＲＮＡが、請求の範囲５０または５１に記載のにＲＮＡに対応するＤＮＡならびにその相補ＤＮＡを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、請求の範囲５３または５４に記載の細胞。
【請求項５６】
少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲４７〜５５のいずれか１項に記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
【請求項５７】
マウスミエローマ細胞が、以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる細胞である、請求の範囲４７〜５６のいずれか１項に記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）ＮＳＯ細胞；
（ｂ）ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞。
【請求項５８】
マウスミエローマ細胞が、抗体分子をコードする遺伝子を導入した細胞である、請求の範囲４７〜５７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５９】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求の範囲５８に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項６０】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲５８または５９に記載の細胞。
【請求項６１】
抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、請求の範囲５８〜６０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６２】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求の範囲６１に記載の細胞。
【請求項６３】
糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求の範囲６２に記載の細胞。
【請求項６４】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲６２に記載の細胞。
【請求項６５】
請求の範囲５８〜６４のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
【請求項６６】
親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を生産する、請求の範囲６５に記載の方法。
【請求項６７】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求の範囲６６に記載の方法。
【請求項６８】
糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求の範囲６７に記載の方法。
【請求項６９】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【請求項７１】
請求の範囲４２〜４６のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【請求項７２】
請求の範囲６５〜６９のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【請求項７３】
請求の範囲７０〜７２のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項７４】
医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、請求の範囲７３に記載の医薬。
【請求項７５】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡ。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
【請求項７６】
請求の範囲７５に記載されたＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡ。
【請求項７７】
ＲＮＡに対応するＤＮＡが配列番号６３または６４である請求の範囲７６に記載のＤＮＡ。
【請求項７８】
請求の範囲７６または７７に記載されたＤＮＡならびにその相補ＤＮＡをベクターに含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項７９】
請求の範囲７５に記載された２本鎖ＲＮＡを発現させるために構築されている、請求の範囲７８に記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項８０】
請求の範囲７８または７９に記載の組換え体ＤＮＡを細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項８１】
請求の範囲７３または７４に記載の医薬を製造するための、請求の範囲７０〜７３のいずれか１項に記載の抗体組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗体組成物の製造方法、抗体組成物の製造に用いる細胞に関する。
背景技術
抗体の糖鎖に関して、ボイド（Ｂｏｙｄ）らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）或いはマウスミエローマ細胞由来のＮＳＯ細胞で生産したヒト型相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲとも略記する）移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）を各種糖分解酵素で処理し、糖鎖の抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）、補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）に対する影響を検討した結果、非還元末端のシアル酸の除去は、両活性に影響を与えないが、更にガラクトース残基を除去することでＣＤＣ活性のみが影響を受け、約５０％程度活性が低下すること、糖鎖の完全な除去は、両活性を消失させることを報告している（モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３２，１  ３１１（１９９５））。また、ライフリー（Ｌｉｆｅｌｙ）らは、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞或いはラットミエローマＹＯ細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）の糖鎖の分析およびＡＤＣＣ活性を測定した結果、ＹＯ細胞由来のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈが最も高いＡＤＣＣ活性を示し、その活性にはバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃとも表記する）が重要であることを示唆している（グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）およびＷＯ９９／５４３４２）。
さらに、抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加修飾によって、抗体のＡＤＣＣ活性が大きく変化することが報告されている（ＷＯ００／６１７３９）。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしていることを示している。
一般的に、医薬への応用が考えられているヒト化抗体の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞やマウスミエローマ細胞由来のＮＳＯ細胞などを宿主細胞として用いて製造されている。上述したように、抗体のエフェクター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、宿主細胞によって発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違いが観察されることから、より高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望まれている。
宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節し、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変する一つの方法として、糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤を応用することが試みられている。
糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の前駆体であるコアオリゴ糖形成の最初のステップであるＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌの形成を選択的に阻害するツニカマイシン、グリコシダーゼＩの阻害剤であるカスタノスペルミンやＮ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、グルコシダーゼＩＩの阻害剤であるブロモコンヅリトール、マンノシダーゼＩの阻害剤である１−デオキシノジリマイシンや１、４−ジオキシ−１、４−イミノ−Ｄ−マンニトール、マンノシダーゼＩＩの阻害剤であるスワンソニンなどが知られている。糖転移酵素の特異的な阻害剤としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）などに対する基質のデオキシ誘導体が開発されつつある（グライコバイオロジーシリーズ２−糖鎖の細胞における運命（講談社サンエンティフィック）永井克孝・箱守仙一朗・木幡陽編（１９９３））。また、１−デオキシノジリマイシンはコンプレックス型糖鎖の合成を抑え、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖の割合を増加させることが知られている。実際に、カスタノスペルミン、Ｎ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、スワンソニンあるいはツニカマイシンなどの阻害剤を培地に添加することでハイブリドーマが生産するＩｇＧの糖鎖構造が変化し、抗原結合性やＡＤＣＣ活性などが変化することが報告されている（モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），２６，１１１３，（１９８９））。しかしながら、これら阻害剤の特異性は弱く、また標的とする酵素を十分に阻害することも難しいため、生産抗体の糖鎖構造を確実に制御することは難しい。
また、糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられており、その具体的な例としては、１）ラットのβ−ガラクトシドα２、６−シアリルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が可能であること（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８，１９８９）、２）ヒトのβ−ガラクトシド２−αフコシルトランスフェラーゼをマウスＬ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃ  α１−２Ｇａｌ  β１−）の発現が可能であること（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８，１９９１）、３）β１、４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を生産することでＮ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること、ＧｎＴＩＩＩを導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、ＧｎＴＩＩＩ未導入の親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性を示したことが（グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）およびＷＯ９９／５４３４２）が報告されている。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩまたはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すと報告されているため、抗体医薬の生産には適切ではない。
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産できることが報告されている。具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）の活性が欠損しているＣＨＯ細胞変異株を用いて、ハイマンノース型糖鎖構造を有する抗体を生産できることが知られている（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８）。また、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターやＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、ガラクトースの付加のない抗体の発現が報告されている（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８）。しかしながら、医薬への応用に適した、エフェクター作用が向上した抗体の発現には成功していない。また、これら変異株は、変異剤処理によりランダムに変異が導入された株であり、医薬品製造に用いる株としては適切ではない。
このように、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節する試みがなされている。しかしながら、実際には糖鎖の修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難い。特に、抗体のエフェクター機能は糖鎖構造により大きな影響を受けることが明らかになりつつあるが、最適な糖鎖構造で修飾された抗体分子を生産しうる宿主細胞の取得には至っていない。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（８１）に関する。
（１）細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
（２）細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、（１）に記載の方法。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
（３）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（２）に記載の方法。
（４）蛋白質の活性の低下または欠失が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる手法により行われたものである、（２）または（３）に記載の方法。
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的にした遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法。
（５）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法が、ＲＮＡｉである、（４）に記載の方法。
（６）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質、または以下の（ｉ）〜（ｎ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（３）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（７）ＲＮＡｉ法が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする方法である、（５）または（６）に記載の方法。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（８）以下の（ａ）、（ｃ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることで、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させた、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、（７）に記載の方法。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
（９）２本鎖ＲＮＡが、（７）または（８）に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡならびにその相補ＤＮＡを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）細胞が、少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
（１１）細胞が、抗体分子をコードする遺伝子を導入した細胞である、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、（１１）に記載の方法。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（１３）抗体分子のクラスがＩｇＧである、（１１）または（１２）に記載の方法。
（１４）抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、（１４）に記載の方法。
（１６）糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である（１５）に記載の方法。
（１７）フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）細胞が、マウスミエローマ細胞である、（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の方法。
（２０）マウスミエローマ細胞が、ＮＳＯ細胞またはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である（１９）に記載の方法。
（２１）細胞が、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（１８）のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｄ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
（ｅ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｆ）胚性幹細胞；
（ｇ）受精卵細胞。
（２２）抗体分子をコードする遺伝子を導入した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞。
（２３）細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞である、（２２）に記載の細胞。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
（２４）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（２３）に記載の細胞。
（２５）蛋白質の活性の低下または欠失が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる手法により行われたものである、（２３）または（２４）に記載の細胞。
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的にした遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法。
（２６）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法が、ＲＮＡｉである、（２５）に記載の細胞。
（２７）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質、または以下の（ｉ）〜（ｎ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（２４）〜（２６）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（２８）ＲＮＡｉ法が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする方法である、（２５）または（２６）に記載の細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（２９）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることで、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させた、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、（２８）に記載の細胞。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
（３０）２本鎖ＲＮＡが、（２８）または（２９）に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、（２８）または（２９）に記載の方法。
（３１）細胞が、少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、（２２）〜（３０）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
（３２）抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、（２２）〜（３１）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む融合蛋白質。
（３３）抗体分子のクラスがＩｇＧである、（２２）〜（３２）のいずれか１項に記載の細胞。
（３４）抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、（２２）〜（３３）のいずれか１項に記載の細胞。
（３５）抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、（３４）に記載の細胞。
（３６）糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である（３５）に記載の細胞。
（３７）フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（３５）に記載の細胞。
（３８）細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、（２２）〜（３７）のいずれか１項に記載の細胞。
（３９）細胞が、マウスミエローマ細胞である、（２２）〜（３７）のいずれか１項に記載の細胞。
（４０）マウスミエローマ細胞が、ＮＳＯ細胞またはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である（３９）に記載の細胞。
（４１）細胞が、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選ばれる細胞である、（２２）〜（３８）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｄ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
（ｅ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｆ）胚性幹細胞；
（ｇ）受精卵細胞。
（４２）（２２）〜（４１）のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
（４３）親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を生産する、（４２）に記載の方法。
（４４）抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、（４３）に記載の方法。
（４５）糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である（４４）に記載の方法。
（４６）フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（４４）または（４５）に記載の方法。
（４７）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性であるマウスミエローマ細胞。
（４８）以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した、（４７）記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
（４９）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（４８）記載のマウスミエローマ細胞。
（５０）蛋白質の活性の低下または欠失が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる手法により行われたものである、（４８）または（４９）記載のミエローマ細胞。
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的にした遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法。
（５１）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法が、ＲＮＡｉである、（５０）記載のマウスミエローマ細胞。
（５２）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質、または以下の（ｉ）〜（ｎ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（４９）〜（５１）のいずれか１項に記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（５３）ＲＮＡｉ法が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする方法である、（５１または５２記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ。
（５４）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることで、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させた、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、（５１）に記載のミエローマ細胞。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
（５５）２本鎖ＲＮＡが、（５０）または（５１）に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡならびにその相補ＤＮＡを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、（５３）または（５４）に記載の細胞。
（５６）少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、（４７）〜（５５）のいずれか１項に記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
（５７）マウスミエローマ細胞が、以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる細胞である、（４７）〜（５６）のいずれか１項に記載のマウスミエローマ細胞。
（ａ）ＮＳＯ細胞；
（ｂ）ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞。
（５８．マウスミエローマ細胞が、抗体分子をコードする遺伝子を導入した細胞である、（４７）〜（５７）のいずれか１項に記載の細胞。
（５９）抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、（５８）に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体の断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（６０）抗体分子のクラスがＩｇＧである、（５８）または（５９）に記載の細胞。
（６１）抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、（５８）〜（６０）のいずれか１項に記載の細胞。
（６２）抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、（６１）に記載の細胞。
（６３）糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である（６２）に記載の細胞。
（６４）フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（６２）に記載の細胞。
（６５）（５８）〜（６４）のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
（６６）親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を生産する、（６５）に記載の方法。
（６７）抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、（６６）に記載の方法。
（６８）糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である（６７）に記載の方法。
（６９）フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（６７）または（６８）に記載の方法。
（７０）（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
（７１）（４２）〜（４６）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
（７２）（６５）〜（６９）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
（７３）（７０）〜（７２）のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
（７４）医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、（７３）に記載の医薬。
（７５）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡ。
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
（７６）（７５）に記載されたＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡ。
（７７）ＲＮＡに対応するＤＮＡが配列番号６３または６４である（７６）に記載のＤＮＡ。
（７８）（７６）または（７７）に記載されたＤＮＡならびにその相補ＤＮＡをベクターに含む組換え体ＤＮＡ。
（７９）（７５）に記載された２本鎖ＲＮＡを発現させるために構築されている、（７８）に記載の組換え体ＤＮＡ。
（８０）（７８）または（７９）に記載の組換え体ＤＮＡを細胞に導入して得られる形質転換体。
（８１）（７３）または（７４）に記載の医薬を製造するための、（７０）〜（７３）のいずれか１項に記載の抗体組成物の使用。
本発明の細胞を用いて抗体組成物を製造する方法としては、ハイブリドーマ細胞を用いてモノクローナル抗体を製造する方法、抗体遺伝子を導入した宿主細胞を用いてヒト抗体およびヒト化抗体を製造する方法、抗体遺伝子を導入したヒト以外の動物の胚性幹細胞または受精卵細胞をヒト以外の動物の初期胚へ移植後、発生させたトランスジェニック非ヒト動物を用いてヒト抗体を製造する方法などを包含する。
したがって、本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など抗体組成物を製造することができる細胞であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞であればいかなる細胞でもよいが、具体的には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、ハイブリドーマ細胞、ヒト抗体およびヒト化抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック非ヒト動物を製造するための胚性幹細胞および受精卵細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック植物を製造するための植物カルス細胞、ミエローマ細胞、トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞などがあげられる。ミエローマ細胞はハイブリドーマ細胞を製造する際に融合細胞として用いることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物に抗原を免疫し、該動物の脾臓細胞を取り出し、ハイブリドーマ細胞を製造するために用いることができる。
レクチンに耐性な細胞とは、培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を行ったときにも、生育が阻害されない細胞をいう。
本発明において、生育が阻害されないレクチン有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌである。親株細胞に変異を導入した場合のレクチンの有効濃度とは、該親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上の濃度をいう。
親株細胞とは、何らかの処理を施す前の細胞、すなわち本発明で用いるレクチン耐性細胞を選択する工程を行う前の細胞、上述した酵素活性を低下または欠失するために遺伝子工学的な処理を行う前の細胞をいう。
親株細胞としては、特に限定はないが、種々の細胞株の親株細胞の具体例として、以下に示す。
ＮＳＯ細胞の親株細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳＯ細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳＯ細胞株（ＲＣＢＯ２１３）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞などがあげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
本発明において、レクチン耐性細胞としては、一定の有効濃度のレクチン存在下で生育が阻害されない細胞であれば、いずれでもよいが、例えば、以下にあげる少なくとも１つの蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞などがあげられる。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質（以下、「ＧＤＰ−フコース合成酵素」と表記する）；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質（以下、「α１，６−フコース修飾酵素」と表記する）；
（ｃ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質（以下、「ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質」と表記する）。
ＧＤＰ−フコース合成酵素としては、細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含し、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素などがあげられる。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースは、ｄｅ  ｎｏｖｏの合成経路あるいはＳａｌｖａｇｅ合成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素はすべてＧＤＰ−フコース合成酵素に包含される。
ｄｅ  ｎｏｖｏの合成経路に関与するＧＤＰ−フコース合成酵素としては、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＤＰ−マンノース  ４−デヒドラターゼ；以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＤＰ−ケトデオキシマンノース  ３，５−エピメラーゼ，４−リダクターゼ；以下、Ｆｘと表記する）などがあげられる。
Ｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与するＧＤＰ−フコース合成酵素としては、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ；以下、ＧＦＰＰと表記する）、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅ（フコキナーゼ）などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明において、ＧＭＤとしては、
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号８５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号８５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｃ）配列番号８６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ）配列番号８６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質
（ｅ）配列番号８６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質
等があげられる。
また、ＧＭＤのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号８５で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８５で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、Ｆｘとしては、
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号８７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号８７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｃ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質
（ｅ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質
等があげられる。
また、Ｆｘのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号８７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８７で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ＧＦＰＰとしては、
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号８９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号８９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡまたは、
（ｃ）配列番号９０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ）配列番号９０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質
（ｅ）配列番号９０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質
等があげられる。
また、ＧＦＰＰのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号８９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８９で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
α１，６−フコース修飾酵素としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素であればいかなる酵素も包含される。具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼやα−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素としては、上述のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明において、α１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、
下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｊ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｋ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｌ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｎ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、α１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号７９、８０、８１または８２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７９、８０、８１または８２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質であればいかなる蛋白質も包含され、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
本発明のＧＤＰ−フコーストランスポーターとしては、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質があげられる。
（ａ）配列番号９３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９５で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号９７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号９８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号９３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号９５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号９７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号９８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
さらに、本発明のＧＤＰ−フコーストランスポーターとしては、以下の（ｉ）〜（ｔ）からなる群から選ばれる蛋白質があげられる。
（ｉ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号９６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号９９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｌ）配列番号１００で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｍ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号９６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｏ）配列番号９９で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｐ）配列番号１００で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｑ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｒ）配列番号９６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｓ）配列番号９９で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｔ）配列番号１００で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白質もＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に包含され、具体的には上述の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性に影響を与えたり、発現に影響を与える蛋白質などがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、上記配列番号のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記配列番号のいずれかで表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、上記配列番号のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、上記配列番号のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、用いられる蛋白質が、上記活性を有するためには、上記配列番号のいずれかで表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する。
本発明の製造方法に用いられる細胞を取得する方法としては、本発明のレクチン耐性細胞を選択することができる手法であればいかなる手法でも用いることができる。具体的には、上述した蛋白質の活性を低下または欠失させる手法などがあげられる。上述の蛋白質の活性を低下または欠失させる手法としては、
（ａ）蛋白質の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法；などがあげられる。
本発明において、抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物をいう。
抗体は、重鎖および軽鎖（以下、それぞれ「Ｈ鎖」および「Ｌ鎖」と表記する）の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。Ｈ鎖のＮ末端側の約４分の１とＬ鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域（以下、「Ｖ領域」と表記する）と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。Ｖ領域以外の部分の大半は定常領域（以下、「Ｃ領域」と表記する）と呼ばれる。抗体分子はＣ領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスはＣ領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
Ｈ鎖はＮ末端側よりＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｃ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体などの糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の構造式（Ｉ）に示す基本となる共通のコア構造を有する［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］。
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上記構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式（Ｉ）のコア構造を有するものであればいかなるものでもよいが、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明において、本発明のレクチン耐性細胞を用いて製造した抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が高いほど、抗体組成物のＡＤＣＣ活性が高くなる。ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％の抗体組成物があげられる。
また、本発明は、親株細胞が生産する抗体組成物よりＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物の製造方法に関する。
抗体分子のＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い場合、親株細胞が生産する抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
親株細胞よりもＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物を製造する方法としては、上記のレクチン耐性株を用いて抗体組成物を製造する方法があげられる。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ  ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することでも決定することができる。
抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質などがあげられる。
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体をいう。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物あるいはヒト抗体トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を採取することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。ヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギ等があげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
抗体の断片は、上記抗体の少なくともＦｃ領域の一部を含んだ断片をいう。Ｆｃ領域とは、抗体のＨ鎖のＣ末端側の領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともＦｃ領域の一部とは、好ましくはＣＨ２領域を含む断片、より好ましくはＣＨ２領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）らのＥＵ  Ｉｎｄｅｘ［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］のナンバリングで２２６番目のＣｙｓからＣ末端、あるいは２３０番目のＰｒｏからＣ末端までを意味する。抗体の断片としては、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域の一部を有する融合蛋白質とは、抗体のＦｃ領域の一部を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質（以下、Ｆｃ融合蛋白質と称す）を意味する。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の製造に用いる細胞の作製
本発明の抗体組成物の製造に用いる細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられる。
本発明の抗体組成物の製造に用いる細胞は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である細胞を選択する手法を用いることにより作製することができる。または、あらかじめ細胞に抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換株から、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である形質転換株を選択することにより、本発明の細胞を製造することができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である細胞を選択する方法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いて選択する方法が挙げられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
具体的には、１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地にで１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である細胞を選択することができる。
レクチンに耐性である細胞を選択する方法としては、細胞を突然変異誘発処理することによって生じた耐性株を選択する方法、自然発生的に生じた耐性株を選択する方法などいかなる方法でもよい。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術  第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた耐性株としては、元々自然界に耐性株として存在する細胞株、特別な突然変異誘発処理を施さず、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることにより、自然発生的に生じる突然変異体などをあげることができる。
また、本発明の細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法、ドミナントネガティブ体を導入する方法、転写または翻訳を抑制する方法を用いることにより作製することができる。
遺伝子破壊の方法あるいは転写または翻訳を抑制する方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も用いることができるが、その具体的な例としては、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法、アンチセンス法、リボザイム法、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）法等があげられる。
（１）アンチセンス法またはリボザイム法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、上述の遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９，（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７，（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３，（１９９５）、細胞工学，１３，２５５，（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
標的遺伝子のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、標的遺伝子の翻訳領域の部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を得ることもできる。
本発明の細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞が挙げられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
標的遺伝子がコードする蛋白質の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列、に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、標的遺伝子の遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、標的遺伝子のｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
標的遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、標的遺伝子の遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が標的遺伝子であることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、標的遺伝子のｃＤＮＡを取得することができる。
また、標的遺伝子の遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、標的遺伝子のｃＤＮＡを取得することもできる。
取得した標的遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中で標的遺伝子がコードする蛋白質と同様の機能を有する蛋白質をコードしている遺伝子を決定することもできる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、標的遺伝子のｃＤＮＡを取得することもできる。
標的遺伝子のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法が挙げられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性が低下した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、標的遺伝子がコードする蛋白質の機能を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
また、標的遺伝子がコードする蛋白質の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などが挙げられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の５．に記載の方法が挙げられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、上述の、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法が挙げられる。
また、発現ベクターを用いず、標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、標的遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（２）相同組換え法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
標的遺伝子のゲノムＤＮＡを調製する。
該ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
標的遺伝子のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などが挙げられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
（３）ＲＤＯ方法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を標的とし、ＲＤＯ（ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
標的遺伝子のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、標的遺伝子の翻訳領域の部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした蛋白質に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的遺伝子のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
標的遺伝子のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした蛋白質、すなわち、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）に記載の、標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述の５．に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６，（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５，（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２，（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９，（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８，（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３，（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（４）ＲＮＡｉ方法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。ＲＮＡｉ法とは、２本鎖のＲＮＡを細胞中に導入して、細胞中に存在する該ＲＮＡの配列に相同なｍＲＮＡを分解破壊し、遺伝子発現を抑える方法をいう。
標的遺伝子のｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、標的遺伝子の翻訳領域の部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼＩＩＩにより転写が行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）に記載の方法が挙げられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法が挙げられる。
標的遺伝子がコードする蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、前記１の（１）に記載された「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．），２，７０，（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
本発明のＲＮＡｉ法に用いられるＲＮＡとしては、
（ａ）ＧＤＰ−フコース合成酵素；
（ｂ）α１，６−フコース修飾酵素；
（ｃ）フコース輸送蛋白質。
などをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。好ましくはα１，６−フコース修飾酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼであるＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、具体的には
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列からなるＤＮＡなどがあげられる。
本発明のＲＮＡｉ法で使用されるＲＮＡとしては、ＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡであればいかなるものでもよいが、ＲＮＡの長さとしては、好ましくは１〜３０、より好ましくは５〜２９、さらに好ましくは１０〜２９、最も好ましくは１５〜２９の連続したＲＮＡがあげられる。具体的には、
（ａ）配列番号７９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８２で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
があげられ、より好ましくは
（ａ）配列番号８３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号８４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｃ）配列番号８３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号８４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ。
上述の「配列番号８３または配列番号８４と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ」としては、配列番号８３または配列番号８４で表されるＲＮＡと、α１，６−フコシルトランスフェラーゼに対する同様のＲＮＡｉ活性を有するものであればいかなるものでもよく、ＲＮＡの長さなどの量的要素は異なっていてもよい。
１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列とは、配列番号８３または配列番号８４の両端の塩基が１または数個欠失および／または付加された塩基配列をいう。塩基配列の長さとしては、好ましくは１〜３０、より好ましくは５〜２９、さらに好ましくは１０〜２９、最も好ましくは１５〜２９の連続したＲＮＡがあげられる。
また、これらＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡも本発明に包含され、ＲＮＡに対応するＤＮＡとして、具体的には配列番号６３または６４で表される塩基配列からなるＤＮＡがあげられる。さらに、該ＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをベクターに含む組換え体ＤＮＡおよび該組換え体ＤＮＡを細胞に導入して得られる形質転換体も、本発明に包含され、該２本鎖ＲＮＡを発現させるために用いることができる。
（５）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする遺伝子（ＧＤＰ−フコース合成酵素をコードする遺伝子、α１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子、またはフコース輸送蛋白質をコードする遺伝子）を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的とする遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）に記載の方法が挙げられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法が挙げられる。
（６）ドミナントネガティブ体を導入する手法による、本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素、またはフコース輸送蛋白質を標的とし、該蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。
ドミナントネガティブ体の具体的な例として、フコース輸送蛋白質の例が挙げられる。
細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターは、小胞体およびゴルジ体の膜上においてダイマーを形成して機能していることが知られている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８，２０００］。また、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を細胞内で強制発現させることにより、野生型トランスポーターとヘテロダイマーを形成し、形成したヘテロダイマーは野生型ホモダイマーに対して阻害活性を示すことが報告されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８，２０００］。従って、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を作製し細胞内に導入することで、ドミナントネガティブ体として機能させることが可能である。このような変異体の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
本発明の細胞は、上述のように作製した標的蛋白質のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
標的蛋白質のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
標的蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）に記載の方法が挙げられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法が挙げられる。
２．本発明の製造に用いるトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明の抗体組成物の製造に用いるトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、１．に記載の手法を用いて作製した本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物細胞より、公知の方法を用い作製することができる。
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖修飾を認識するレクチンに耐性である本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
具体例としては、染色体上のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンなどがあげられる。作製した胚性幹細胞（例えば、該変異クローン）を用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖修飾を認識するレクチンに耐性であるトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。具体的には、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をＧ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない）ことにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−Ｄｉｌ−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ、ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨ  ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ等があげられる。
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖修飾を認識するレクチンに耐性である受精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、全身の細胞がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖修飾を認識するレクチンに耐性であるトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルスまたは細胞に、１．に記載の手法を施すことでＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖修飾を認識するレクチンに耐性である植物細胞からなるカルスを作製することができる。
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖修飾を認識するレクチンに耐性であるトランスジェニック植物を作製することができる。
３．抗体分子をコードする遺伝子の細胞への導入方法
抗体分子をコードする遺伝子を細胞に導入する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法に従い、例えば、以下のように行うことができる。
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調製した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の形質転換体を得ることができる。
ｃＤＮＡは、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
宿主細胞として、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする抗体遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
本発明の抗体組成物の製造法に用いられる宿主細胞としては、上記１．で作製した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である上記各種宿主細胞を挙げることができる。
発現ベクターとしては、上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合の、発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６号、日本特許第２５１７８１３号］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等があげられる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合の、発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６号、日本特許第２５１７８１３号］等をあげることができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に目的とする抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、目的とする抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養やホロファイバー培養などの培養法を用い、数日から数ヶ月に渡って培養することもできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡおよび抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば、抗体組成物が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質をあげることができる。
以下に、抗体組成物の取得についてのより具体的な例として、ヒト化抗体組成物およびＦｃ融合蛋白質の取得について記すが、他の抗体組成物を上述の方法または当該方法に準じて取得することもできる。
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１  β  ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体をするハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング第２版］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング第２版］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１（以下、シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレストと略記する）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製において、該抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定することが、最も重要な点である。抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸を同定する方法としては、Ｘ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等の抗体の立体構造の構築および解析方法があげられる。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらした。しかしながら、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されていない。したがって、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項３の（５）に記載のＰＣＲ法により行うことができる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、本発明の抗体組成物の製造法に用いられる宿主細胞としては、上記１．で作製した細胞を挙げることができる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４、モノクローナル・アンティボディズ］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８、モノクローナル・アンティボディズ］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、ヒト化抗体を精製することができる。精製されたヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２、モノクローナル・アンティボディズ］等で測定することができる。
Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造
（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（レキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１  β  ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
前記の（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主細胞とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、宿主細胞内に抗体分子を発現する遺伝子が組み込まれている場合には、上記１．に記載の方法を用いて、該宿主細胞をＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性にした後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、本発明の抗体組成物を製造することができる。
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
５．抗体組成物の糖鎖の分析
宿主細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
６．抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
抗体組成物は、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。本発明の抗体組成物は、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株であるＮＳＯ細胞が生産する抗体組成物より高い抗体組成物であり、高いＡＤＣＣ活性を示す特徴を有している。このような抗体組成物は、上記４．に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ． ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  Ｂａｌｋ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ Ｈｙｂｒｉｄ  Ｌｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ  Ａｇ  ｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）があげられる。
これらレクチンを用いることで、抗体のＦｃ領域に結合されたＮ−グリコシド結合糖鎖のタイプが複合型か否か判定することができる。
さらに、Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることで詳細な糖鎖構造が可能となる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）を挙げることができる。
７．本発明により得られる抗体組成物の利用
本発明により得られる抗体組成物は高いＡＤＣＣ活性を有する。高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、本発明の抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１−３３６，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０−２６６，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１−１５１６，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３−４９７，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７−３９５，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９−２９１１，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１−９９１５，１９８９）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６−２４０１，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９，１９９７）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８−２１４６，２０００）などが挙げられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１−３８１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２−５６７，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１−５０，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３−１９０，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７−２４５，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３−１３８１，１９９７）などが挙げられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００−１７４０４，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８−１１６４，２０００）などが挙げられる。
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１−６８，２０００）などが挙げられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５−３９５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５−２０７６，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体または抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６−３９９，１９９９）などが挙げられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１．レクチン耐性ＮＳＯ細胞の作製と該細胞を用いた抗体組成物の生産
（１）レクチン耐性ＮＳＯ株の取得
マウスミエローマＮＳＯ細胞（ＲＣＢＯ２１３）を、体積比１０％の牛胎児血清（インビトロジェン社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）（以下、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地と表記）にて浮遊培養用フラスコ７５ｃｍ２（岩城硝子社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。本培養液中の細胞に、１×１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、未添加または０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎ（以下、ＭＮＮＧと表記、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、浮遊培養用９６穴プレート（岩城硝子社製）に１０００細胞／ウエルの密度で播種した。各ウエルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍｌのレンズマメレクチン（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したレクチン耐性コロニーをレクチン耐性ＮＳＯ株として取得した。
以後、それら株をＮＳＯ−ＬＣＡ株と名付けた。
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現細胞の作製
ＷＯ０１／６４７５４記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
１０μｇの抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を４×１０６細胞の親株細胞であるＮＳＯ株あるいはＮＳＯ−ＬＣＡ株にエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，１９９０］により導入後、１０ｍｌのＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の蓄積量を実施例１の（３）に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量を実施例１の（３）に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭ、５００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。ＮＳＯ株、およびＮＳＯ−ＬＣＡ株それぞれから形質転換株を一株ずつ選択した。得られた形質転換株は、ＮＳＯ株由来の形質転換株をＮＳＯ／ＣＣＲ４株、ＮＳＯ−ＬＣＡ株由来の形質転換株をＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４株と名付けた。なおＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４株については、平成１４年３月１４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９６４として寄託されている。
（３）ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡによる培養上清中の抗体の定量
培養上清中の抗ＣＣＲ４抗体の濃度は以下のようにして測定した。
１ｍｇの抗ヒトイムノグロブリンＧ（以下、ＩｇＧと表記）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を１２００ｍｌのＰＢＳバッファーに溶解した。該溶液の５０μｌを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、４℃にて一晩放置後、ウエル内の溶液を捨て、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したキメラ抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ  ４１５と表記する）を測定した。
実施例２．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製と活性評価
（１）抗体発現細胞株の培養および抗体の精製
実施例１．の（２）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換細胞を、ＭＴＸを終濃度５００ｎＭ、牛血清アルブミン（インビトロジェン社製）を終濃度０．２％で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）に２×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、浮遊培養用フラスコ（岩城硝子製）に播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養して培養上清を回収した。それぞれの培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムおよびゲルろ過法を用いて、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。得られた抗体は、ＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４株が生産する抗体をＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４抗体、ＮＳＯ／ＣＣＲ４株が生産する抗体をＮＳＯ／ＣＣＲ４抗体と名付けた。
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の活性評価
（２−１）ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
（２−１−１）抗原ペプチドの調製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４（ｈＣＣＲ４）細胞外領域ペプチドとして、化合物１（配列番号１）を選択し、以下のように合成した。
略号
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１３８巻，９頁（１９８４年）〕に従った。
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸
Ａｓｘ：Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギン
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｘ：Ｌ−グルタミン酸またはＬ−グルタミン
Ｇｌｙ：グリシン
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン
Ｖａｌ：Ｌ−バリン
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎγ−トリチル−Ｌ−アスパラギン
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎδ−トリチル−Ｌ−グルタミン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
化合物１（配列番号１）（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＯＨ）の合成
Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、１６．８μｍｏｌが結合した担体樹脂（クロロトリチル樹脂、ＡｎａＳｐｅｃ社製）３０ｍｇを自動合成機（島津製作所社製）の反応容器に入れ、１ｍｌのＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）を加えて１０分間攪拌し溶液を排出し、さらに１ｍｌのＤＭＦを加えて１分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１６８μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１６８μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ  １水和物（１６８μｍｏｌ）およびＮＭＭ（２５２μｍｏｌ）をＤＭＦ（５８８．２μｌ）中で５分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を６０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｂ）担体樹脂を７０７μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、これを５回繰り返した。こうして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が担体上に合成された。
次に以下のＦｍｏｃ基脱保護工程を行った。
（ｃ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液７０７μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｄ）担体樹脂を７０７μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
こうして、Ｆｍｏｃ基を除去したＨ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の結合した担体樹脂を得た。
次に、（ａ）の工程でＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程、次いで（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を経て、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が担体上に合成された。以下、工程（ａ）において、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍ  ｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した。次に工程（ａ）においてＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｂ）の洗浄工程を経て、再び工程（ａ）のＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いた縮合反応、（ｂ）の洗浄工程を繰り返してから、（ｃ）、（ｄ）の脱保護工程を行った。引き続き、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、ＴＦＡ（９０％）、チオアニソール（５％）、１，２−エタンジチオール（５％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で２時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍｌを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、減圧下乾燥させて、粗ペプチドとして６３．７ｍｇを取得した。
この粗生成物を６０ｍｇのＤＴＴ存在下２ｍｌのＤＭＦに溶解後、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ  ２５ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ  ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を２．５ｍｇ得た。
質量分析［ＦＡＢＭＳ］；ｍ／ｚ＝３２２７．５（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  １．２（１），Ｇｌｘ  ２．７（２），Ｓｅｒ  ３．１（３），Ｐｒｏ  ２．２（２），Ｔｙｒ  ３．８（４），Ｌｅｕ  １．２（１），Ｌｙｓ  １．２（１），Ｉｌｅ  ２．０（２），Ｃｙｓ  １．２（１）
（２−１−２）抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号１）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ｍＬに、１００ｍｌの２５ｍｇ／ｍＬ  ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液をｖｏｒｔｅｘしながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬ  ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬ  ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ  ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）をｖｏｒｔｅｘ下で添加して３時間ゆっくり攪拌した。
反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、２０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後ＯＤ４１５を測定した。
上記実施例２．の（１）で得られた２種類の精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４抗原ペプチドに対する結合活性を上記ＥＬＩＳＡ法により測定した。第１図は、添加する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第１図に示したように、２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体は同等のＣＣＲ４ペプチドに対する結合活性を示した。
（２−２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）の測定
抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、ヒトＣＣＲ４高発現細胞株であるＣＣＲ４／ＥＬ−４（ＷＯ０１／６４７５４）を標的細胞として用い、以下のようにして測定した。
（２−２−１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地に５００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８硫酸塩（ナカライテスク社製）を添加した培地で培養したＣＣＲ４−ＥＬ４株の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で９０分間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２．５×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
（２−２−２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（２−２−３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（２−２−１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２−２−２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２５：１となる）添加した。更に、実施例２．の（１）で取得した各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度０．００２５〜２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式（１）により求めた。
2003085118.tif 000003
その結果を第２図に示した。ＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４抗体の活性が、ＮＳＯ／ＣＣＲ４抗体と比較して有意に向上していることが確かめられた。
実施例３．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖解析
上記実施例２．の（１）で精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖解析を行った。精製抗体を、ウルトラフリー０．５−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４に溶液を置換した。置換倍率は８０倍以上になるように行なった。溶液を置換した抗体は、ＵＶ−１６００（島津製作所製）を用いて濃度を測定した。抗体のアミノ酸配列から式（２）［アドバンスズ・イン・プロテインケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１２，３０３，１９６２］を用いてモル吸光定数を算出し、２８０ｎｍの吸光度１．０を１．３８ｍｇ／ｍｌとして濃度を決定した。
2003085118.tif 000004
１００μｇの抗体をヒドラクラブＳ−２０４用試験管に入れ、遠心濃縮機にて乾固した。サンプルを乾固させた試験管をホーネン社製ヒドラクラブにてヒドラジン分解を行なった。ヒドラジンはホーネン社製ヒドラジン分解試薬を用い、１１０℃、１時間反応させた［メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３（１９８２）］。反応後ヒドラジンを減圧留去させて、反応容器を３０分間放置して室温に戻した。試験管にアセチル化試薬（ホーネン社製）を２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ入れてよく攪拌させ、室温で３０分間反応させた。さらにアセチル化試薬を２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ加えてよく攪拌させ、室温で１時間反応させた。試料を−８０℃のフリーザーで凍結させ、約１７時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料から、ＴａＫａＲａ社製セルロースカートリッジ  グリカンプレパレーションキットを用いて糖鎖を回収した。試料糖鎖溶液を遠心濃縮機にて乾固後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］。２−アミノピリジン溶液は２−アミノピリジン１ｇに対しＨＣｌ  ７６０μｌを加え（１×ＰＡ溶液）、その溶液を逆浸透精製水で１０倍に希釈したものを用いた（１０倍希釈ＰＡ溶液）。シアン化水素化ホウ素ナトリウム溶液は、シアン化水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇに対し１×ＰＡ溶液２０μｌ、逆浸透精製水４３０μｌを加えて調製した。試料に１０倍希釈ＰＡ溶液を６７μｌ入れて１００℃、１５分間反応させ、放冷後にシアン化水素化ホウ素ナトリウム溶液を２μｌ入れて９０℃、１２時間反応させて試料糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識した糖鎖群（ＰＡ化糖鎖群）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ  １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。溶離液は１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、流速は０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行なった。試料添加後２０分から３０分の溶出液を回収し、遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製φ６．０ｎｍ×１５０ｎｍ）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った。カラム温度は５５℃、流速は１ｍｌ／ｍｌ、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行った。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）でカラムを平衡化し、０．５％１−ブタノールの直線濃度勾配にて８０分間溶出した。各ＰＡ化糖鎖の同定は、分取した各ＰＡ化糖鎖のピークのマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）におけるポストソース分解（Ｐｏｓｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ）分析、ＴａＫａＲａ社製ＰＡ化糖鎖スタンダードとの溶出位置の比較、並びに各種酵素を用いて各ＰＡ化糖鎖を消化後、逆相ＨＰＬＣ分析により行った。ＨＰＬＣの分析チャートを第３図に示す。緩衝液Ａとして１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、緩衝液Ｂとして１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）＋０．５％１−ブタノールを用い、以下のグラジエントで��析した。
2003085118.tif 000005
図中、▲１▼〜▲８▼のピークは、以下の構造（１）〜（８）をそれぞれ示す。
2003085118.tif 000006
2003085118.tif 000007
ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。糖鎖含量は、逆相ＨＰＬＣ分析における各ＰＡ化糖鎖のピーク面積より算出した。還元末端がＮ−アセチルグルコサミンでないＰＡ化糖鎖は、不純物由来であるか、ＰＡ化糖鎖調製中の副反応物であるため、ピーク面積の算出から除外した。
第３図において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースが結合していない糖鎖群（以下、α１，６−フコースを持たない糖鎖群と略記する）の割合は、▲１▼〜▲８▼ピークのうち▲１▼〜▲４▼のピークが占める面積、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースが結合した糖鎖群（以下、α１，６−フコースが結合した糖鎖群と略記する）の割合は、▲１▼〜▲８▼のうち▲５▼〜▲８▼のピークが占める面積から算出した。
第１表にその結果を示した。
2003085118.tif 000008
ＮＳＯ／ＣＣＲ４株が生産した抗体のα１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は２５％であったが、ＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４が生産した抗体のα１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は４８％と有意に上昇していた。
実施例４．レクチン耐性ＳＰ２／０細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
１．レクチン耐性ＳＰ２／０株の取得
特開平５−３０４９８９に記載の抗ＧＤ３キメラ抗体を生産するマウスミエローマＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）の形質転換細胞クローンＫＭ−８７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５１２）を、体積比１０％の牛胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）（以下、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地と表記）を用いて浮遊培養用フラスコ７５ｃｍ２（岩城硝子社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。
本培養液中の細胞に、１×１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎ（ＭＮＮＧ、シグマ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ（ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＡＰＰＬＩＡＮＣＥ  ＣＯＭＰＡＮＹ製）内で３７℃にて３日間放置後、浮遊培養用９６穴プレート（岩城硝子社製）に１０００細胞／ウエルの密度で播種した。各ウエルには培地中終濃度で２ｍｇ／ｍｌのレンズマメレクチン（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したレクチン耐性コロニーをレクチン耐性ＳＰ２／０株として取得した。この株をＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ株と名付けた。なお、ＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ株はＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡの株名で、平成１４年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７５として寄託されている。
２．レクチン耐性ＳＰ２／０株の培養および抗体の精製
実施例４．の第１項で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞
ＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ株およびその親株であるクローンＫＭ８７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５１２）を、牛血清アルブミン（インビトロジェン社製）を終濃度０．２％で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）に３×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ株が生産する抗体をＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ抗体、クローンＫＭ−８７１が生産する抗体をＳＰ２／０／ＧＤ３抗体と名付けた。
３．精製した抗ＧＤ３抗体の活性評価
（１）精製抗ガングリオシドＧＤ３抗体のＧＤ３に対する結合活性
実施例４．の第２項で得られた精製抗ガングリオシドＧＤ３抗体のＧＤ３に対する結合活性を、以下に記載の方法に従って測定した。
ガングリオシドＧＤ３（雪印乳業製）４ｎｍｏｌを１０μｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ社製）と５μｇのコレステロール（ＳＩＧＭＡ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。該溶液の２０μｌ（４０ｐｍｏｌ／ウェルとなる）を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清或いは精製したキメラ抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ抗体とＳＰ２／０／ＧＤ３抗体で有為な差は観察されず、両者は同等のＧＤ３に対する結合活性を示した。
（２）精製抗ＧＤ３抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性
また、実施例４．の第２項で得られた精製抗ＧＤ３抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を、以下に記載の方法に従って測定した。
（２−１）標的細胞溶液の調製
ＦＢＳを体積比１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地と表記）で培養したヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４２４）の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
（２−２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（２−３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（２−１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２−２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＧＤ３キメラ抗体を各最終濃度２．５〜２５００ｎｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンター（パッカード社製）にて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は上式（１）により求めた。
その結果、ＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ抗体はＳＰ２／０／ＧＤ３抗体と比較して高い活性を有していることが分かった。
更に、実施例４．の２で得られた精製抗ＧＤ３抗体の糖鎖構造解析を、実施例３．に記載の方法に従って行った。その結果、α１，６−フコースが結合した糖鎖の割合が、ＳＰ２／０／ＧＤ３−ＬＣＡ抗体ではＳＰ２／０／ＧＤ３抗体に比べて有為に低下していることが分かった。
実施例５．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
（１）レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株の取得
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地［ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を１倍濃度含むＩＭＤＭ培地］にて接着培養用フラスコ７５ｃｍ２（グライナー社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。５ｍｌのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、ダルベッコＰＢＳで希釈した０．０５％トリプシン（インビトロジェン社製）を１．５ｍｌ添加して３７℃にて５分間放置し、細胞を培養器底面から剥離させた。剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心分離操作により回収し、１×１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、未添加または０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤であるＭＮＮＧ（シグマ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、培養上清を除き、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地に懸濁後、接着培養用９６穴プレート（岩城硝子社製）に１０００細胞／ウエルの密度で播種した。各ウエルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍｌのレンズマメレクチン（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ；以下、ＡＡＬと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのインゲンマメレクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、Ｌ−ＰＨＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したコロニーをレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株として取得した。取得したそれぞれのレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株については、ＬＣＡ耐性株をＣＨＯ−ＬＣＡ株、ＡＡＬ耐性株をＣＨＯ−ＡＡＬ株、Ｌ−ＰＨＡ耐性株をＣＨＯ−ＰＨＡ株と名付けた。取得したこれら株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、ＣＨＯ−ＬＣＡ株はＡＡＬに対しても耐性であり、ＣＨＯ−ＡＡＬ株はＬＣＡに対しても耐性であった。さらに、ＣＨＯ−ＬＣＡ株およびＣＨＯ−ＡＡＬ株は、ＬＣＡやＡＡＬが認識する糖鎖構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位とフコースの１位がα結合で付加された糖鎖構造を認識するレクチンに対しても耐性を示した。具体的には、終濃度１ｍｇ／ｍｌのエンドウマメレクチン（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＰＳＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地でもＣＨＯ−ＬＣＡ株およびＣＨＯ−ＡＡＬ株は耐性を示し生存することがわかった。また、アルキル化剤ＭＮＮＧ無添加の場合でも、レクチン耐性株を取得することが可能であった。
（２）抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞の作製
上記（１）で得られた３種類のレクチン耐性株に、参考例１に記載した方法で、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を導入し、薬剤ＭＴＸによる遺伝子増幅を行い、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産株を作製した。抗体発現量の測定は参考例１の２に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて行い、ＣＨＯ−ＬＣＡ株、ＣＨＯ−ＡＡＬ株、ＣＨＯ−ＰＨＡ株、それぞれから抗体を発現した形質転換株を取得した。取得したそれぞれの形質転換株については、ＣＨＯ−ＬＣＡ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株、ＣＨＯ−ＡＡＬ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株、ＣＨＯ−ＰＨＡ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株と名付けた。なおＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株はＮｅｇａ−１３の株名で、平成１３年９月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５６として寄託されている。
（３）レクチン耐性ＣＨＯ細胞による高ＡＤＣＣ活性抗体の生産
上記（２）で得られた３種類の形質転換株を用い、参考例１の３に記載した方法で精製抗体を取得した。各抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品の抗原結合活性は参考例１の２に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。いずれの形質転換株が生産する抗体も、参考例１で作製した通常のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主とした組換え細胞株（５−０３株）が生産する抗体と同等の抗原結合活性を示した。それら精製抗体を用い、参考例１の７に記載した方法にしたがって各抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品のＡＤＣＣ活性を評価した。その結果を第４図に示した。５−０３株が生産した抗体と比較して、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産した抗体では、約１００倍程度のＡＤＣＣ活性の上昇が観察された。一方、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体では有意なＡＤＣＣ活性の上昇は観察されなかった。また、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株とＹＢ２／０株が生産した抗体のＡＤＣＣ活性を参考例１の７に記載した方法にしたがって比較したところ、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体は参考例１の１で作製したＹＢ２／０細胞株が生産した抗体ＫＭ２７６０−１と同様に、５−０３株が生産した抗体に比べ高いＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった（第５図）。
（４）レクチン耐性ＣＨＯ細胞が生産する抗体の糖鎖解析
上記（３）で精製した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の糖鎖解析を実施例３と同様に分析した。逆相ＨＰＬＣ分析の結果を第６図に示す。糖鎖含量は、逆相ＨＰＬＣ分析における各ＰＡ化糖鎖のピーク面積より算出した。還元末端がＮ−アセチルグルコサミンでないＰＡ化糖鎖は、不純物由来であるか、ＰＡ化糖鎖調製中の副反応物であるため、ピーク面積の算出から除外した。
第６図において、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のピークは、実施例３に記載の構造（１）〜（８）をそれぞれ示す。
実施例３に記載した方法で分析し、ピークの面積から計算した、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合（％）を第２表に示す。
2003085118.tif 000009
５−０３株が生産した抗体と比較して、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体では、分析チャートのピークの面積から計算すると、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が、９％から４８％まで上昇していた。ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産した抗体では、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が、９％から２７％まで上昇していた。一方、ＰＨＡ耐性株では５−０３株と比較して、糖鎖分析チャートおよびα１，６−フコースを持たない糖鎖の割合に殆ど変化は認められなかった。
実施例６．レクチン耐性ＣＨＯ細胞株の解析
１．抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡにおけるＧＭＤ酵素の発現量の解析
実施例５で取得した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡにおける、フコース生合成酵素として知られるＧＭＤ、ＧＦＰＰ、Ｆｘおよびフコース転移酵素であるα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８と表記する）の各遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
（１）各種細胞株からのＲＮＡ調製
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、参考例１の１（２）で取得した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株５−０３、実施例５（２）で取得した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡをそれぞれ３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内にて継代後４日間培養した。培養後、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、各１×１０７細胞より添付の使用説明書に従ってＲＮＡを調製した。続いて、ＳＵＰＥＲ  ＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用い、添付の使用説明書に従って各ＲＮＡ５μｇより２０μｌの反応液中にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＧＭＤ遺伝子の発現量解析
ＧＭＤ  ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、参考例３の１で示すＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より、配列番号２で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーと配列番号３で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーを作製した。
続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号２と３の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約３５０ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＧＦＰＰ遺伝子の発現量解析
ＧＦＰＰ  ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、参考例２の２で取得したＣＨＯ細胞由来ＧＦＰＰのｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号４で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーと配列番号５で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーを作製した。
続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号４と５の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２４サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約６００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＦＸ遺伝子の発現量解析
ＦＸ  ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、参考例２の１で取得したＣＨＯ細胞由来ＦＸのｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号６で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーと配列番号７で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーを作製した。
続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号６と７の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２２サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約３００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（５）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＦＵＴ８遺伝子の発現量解析
ＦＵＴ８  ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号４２と４３の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２０サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約６００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（６）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたβ−アクチン遺伝子の発現量解析
β−アクチンｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号４４と４５の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを１４サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約８００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（７）各細胞株におけるＧＭＤ、ＧＦＰＰ、ＦＸ、ＦＵＴ８遺伝子の発現量
本項（２）から（５）で測定した各細胞株におけるＧＭＤ、ＧＦＰＰ、ＦＸ、ＦＵＴ  ｃＤＮＡ由来ＰＣＲ増幅断片量の値を、本項（６）各細胞株におけるβ−アクチンのｃＤＮＡ由来ＰＣＲ増幅断片量の値で割り、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＰＣＲ増幅断片量を１とした場合の５−０３株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株における各遺伝子のＰＣＲ増幅断片量を求めた。結果を第３表に示す。
2003085118.tif 000010
第３表で示したようにＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＧＭＤ遺伝子の発現量が他の細胞株と比べ１／１０程度に低下していた。なお、本実験は独立して２回行い、その平均値を使用した。
２．ＧＭＤ遺伝子を強制発現させた抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡを用いた解析
（１）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ２４９ＧＭＤの構築
参考例３の１で取得したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤのｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号８で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマー、および配列番号９で示される塩基配列を有する２９ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、参考例３の１で作製したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号８と９の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、５８℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２２サイクル反復した。反応終了後、該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約６００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｍｔ−Ｃを得た（第７図参照）。
次に、参考例３の１で取得したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤのｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号１０で示される塩基配列を有する４５ｍｅｒのプライマー、および配列番号１１で示される塩基配列を有する３１ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、参考例３の１で作製したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ一本鎖ｃＤＮＡ  ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号１０と１１の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、５７℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２２サイクル反復した。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約１５０ｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドＡＴＧを得た（第８図参照）。
次に、参考例３の１で作製した３μｇのプラスミドＣＨＯ−ＧＭＤを制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画後、約９００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。１．４μｇのプラスミドｍｔ−Ｃを制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約３．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＷＴ−Ｎ（−）を得た（第９図参照）。
次に、２μｇのプラスミドＷＴ−Ｎ（−）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＷＴ−Ｎ（−）ｉｎ  ｐＢＳを得た（第１０図参照）。
次に、２μｇのプラスミドＷＴ−Ｎ（−）ｉｎ  ｐＢＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。２μｇのプラスミドＡＴＧを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＷＴ  ｉｎ  ｐＢＳを得た（第１１図参照）。
次に、２μｇのプラスミドｐＡＧＥ２４９を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（共に宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。２μｇのプラスミドＷＴ  ｉｎ  ｐＢＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（共に宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを得た（第１２図参照）。
（２）ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡにおけるＧＭＤ遺伝子の安定発現
制限酵素ＦｓｐＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で切断することにより直鎖状としたＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを５μｇ、１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭの濃度で含む３０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地を１０％含むＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）］に懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。培養後、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に培地交換してさらに１９日間培養し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株のコロニー群を取得した。
また同様に、ｐＡＧＥ２４９ベクターを上記と同じ方法でＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株へ導入し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株のコロニー群を取得した。
（３）ＧＭＤ遺伝子を発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株の培養および抗体の精製
本項（２）で取得したＧＭＤを発現している形質転換細胞群をＭＴＸ（ＳＵＧＭＡ社製）を２００ｎＭ、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地を用いて、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍｌのＰＢＳバッファー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にて細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を３５ｍｌ注入した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。
また同様に、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入した形質転換細胞群を上記と同じ方法で培養後、培養上清より抗ＣＣＲ４キメラ抗体を回収、精製した。
（４）形質転換細胞群におけるレクチン耐性度の測定
本項（２）で取得したＧＭＤ遺伝子を発現している形質転換細胞群を、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭ、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に６×１０４細胞／ｍｌになるように懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に５０μｌ／ウェルずつ分注した。続いて、このウェルにＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭ、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に０ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌの濃度でＬＣＡ（ＬＥＮＳ  ＣＵＬＩＮＡＲＩＳ  ＡＧＧＬＵＴＩＮＩＮ：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を懸濁した培地を５０μｌずつ加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で９６時間培養した。培養後、ＷＳＴ−Ｉ（ベーリンガー社製）を１０μｌ／ウェルになるよう加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間放置して発色させたのち、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度（以下ＯＤ４５０、ＯＤ５９５と表記する）を測定した。また同様に、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入した形質転換細胞群も上記と同じ方法で測定した。以上の実験は独立して２回行なった。
上記で測定したＯＤ４５０からＯＤ５９５を引いた値を各細胞群の生存数とし、ＬＣＡを加えていないウェルの細胞生存数を１００％とした場合の各ウェルの細胞生存数を％で表記し第１３図に示した。第１３図に示したように、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株ではＬＣＡ耐性度の低下が観察され、０．２ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下での細胞生存率は４０％程度、０．８ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下での細胞生存率は２０％程度であった。一方、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株では、０．２ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下での細胞生存率は１００％、０．８ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下においても細胞生存率は８０％程度であった。以上の結果より、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株はＧＭＤ遺伝子の発現量が低下しており、その結果ＬＣＡに対する耐性を獲得していることが示唆された。
（５）ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
本項（３）で得られた精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
ｉ）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に５００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８硫酸塩（ナカライテスク製）を添加した培地で培養したＣＣＲ４−ＥＬ４株（参考例１の７参照）の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で９０分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２．５×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
ｉｉ）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記ｉ）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いでｉｉ）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２５：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体（本項（３）で精製された抗ＣＣＲ４キメラ抗体、および参考例１第３項記載のＫＭ２７６０−１、ＫＭ３０６０）を最終濃度０．００２５〜２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は前記式（Ｉ）により求めた。
ＡＤＣＣ活性測定の結果を第１４図に示した。第１４図に示したように、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、参考例１で取得したＫＭ３０６０と同程度にまで低下していた。一方、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体と同程度のＡＤＣＣ活性を有していた。以上の結果より、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株はＧＭＤ遺伝子の発現量が低下しており、その結果ＡＤＣＣ活性の高い抗体を生産出来ることが示唆された。
（６）ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖解析
本項（３）で得られた精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖解析を実施例５（４）に示す方法に従って行ない、その解析結果を第１５図に示した。実施例５で作製したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡより取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体と比較して、ＧＭＤ遺伝子を発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体では、分析ピークの面積から計算するとα１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が９％に低下していた。以上より、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株にＧＭＤ遺伝子を発現させることによって、該細胞の生産する抗体のα１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が５−０３株の生産する抗体と同程度まで低下することが示された。
実施例７．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体の作製
１．抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の構築
抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＧＤ３キメラ抗体とも表記する）のＬ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約４．０３ｋｂの断片と動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＧ４１８耐性遺伝子およびスプライシングシグナルを含む約３．４０ｋｂの断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング第２版］を形質転換してプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を構築した。
次に、上記で構築したプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、更にＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約５．６８ｋｂの断片と抗ＧＤ３キメラ抗体のＨ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＧＭ４［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、更にＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＨ鎖ｃＤＮＡを含む約８．４０ｋｂの断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング第２版］を形質転換して抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を構築した。
２．抗ＧＤ３キメラ抗体安定生産細胞の作製
実施例７．の第１項で作製した抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の４μｇを、１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４株、および実施例５．の（１）で作製したＣＨＯ−ＬＣＡ株へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、体積比１０％の透析牛胎児血清（インビトロジェン社製）を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地と表記）１０ｍｌに懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で２週間培養した。培地中の核酸成分に非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を、実施例４．の第３項（１）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、メトトレキセート（Ｓｉｇｍａ社製、ＭＴＸと表記）を５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させ、３７℃で２週間培養して、２００ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を５００ｎＭに上昇させ、３７℃で２週間培養して、５００ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。最終的にＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する安定な形質転換体を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行いクローン化株を取得した。ＣＨＯ−ＬＣＡ株を遺伝子導入の宿主細胞として得られたクローン化株をＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株と名付けた。ＣＨＯ／ＤＧ４４株宿主細胞として得られたクローン化株をＣＨＯ／ＧＤ３株と名付けた。ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株は、平成１４年１１月１１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３６として寄託されている。
３．抗ＧＤ３キメラ抗体の精製
実施例７．の第２項で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株とＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株について、市販無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）に１×１０６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に３５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製された抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１株の生産抗体をＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１抗体、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２株の生産抗体をＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２抗体と名付けた。なお、比較対照として用いた、通常のＣＨＯ／ＤＧ４４株の生産抗体は、ＣＨＯ／ＧＤ３抗体と名付けた。
４．抗ＧＤ３キメラ抗体のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
実施例７．第３項で生産、精製された３種類の抗ＧＤ３キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０，１９７０］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動）し、分子量および精製度を解析した。その結果、精製された各抗ＧＤ３キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４、モノクローナル・アンティボディズ］と一致し、各抗ＧＤ３キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
５．抗ＧＤ３キメラ抗体の糖鎖解析
実施例７．の第３項にて精製された抗ＧＤ３キメラ抗体の糖鎖解析を実施例５．の（４）に記載の方法に従って行った。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を第１６図に示した。図中、▲１▼〜▲８▼のピークは、実施例３に記載のの構造（１）〜（８）をそれぞれ示す。実施例３に記載した方法で分析し、分析チャートのピーク面積から計算した、α１，６−フコースを持たない複合二本鎖型糖鎖の割合（％）を第４表に示した。
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第４表に示した通り、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１抗体では、通常のＣＨＯ／ＧＤ３抗体と比較して、α１，６−フコースを持たない複合二本鎖型糖鎖の割合が、９％から４２％まで上昇した。また、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２抗体では、α１，６−フコースを持たない複合二本鎖型糖鎖の割合が、９％から８０％まで上昇していた。
実施例８．抗ＧＤ３キメラ抗体の活性評価
１．抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
実施例７．の第３項で得られた３種類の精製抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３に対する結合活性を実施例４の第３項（１）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。第１７図は、添加する抗ＧＤ３キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第１７図に示したように、３種類の抗ＧＤ３キメラ抗体は、ガングリオシドＧＤ３に対しほぼ同等の結合活性を示した。この結果は、ＬＣＡレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の生産抗体の抗原結合活性は、通常のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が生産する抗体と同等であることを示している。
２．抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
実施例７．の第３項で得られた３種類の精製抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、実施例４の第３項（２）に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
その結果を第１８図に示した。第１８図に示したように、３種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のうち、ＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−２抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示し、次いでＣＨＯ／ＧＤ３−ＬＣＡ−１抗体、ＣＨＯ−ＧＤ３抗体の順に高いＡＤＣＣ活性を示した。以上の結果は、ＬＣＡレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株では、生産抗体のＡＤＣＣ活性が上昇することを示している。
実施例９．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の作製
１．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの作製
（１）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＬ鎖Ｖ領域（以下ＶＬと表記する）のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号４６に記載）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＬの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、および５３の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行ない、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で２時間反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａ  ｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第１９図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌを得た。
（２）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築  ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号４７に記載）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＨの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、および５９の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行い、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４９ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素Ｓｍａ  Ｉ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。
この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第２０図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを得た。
次に、１４番目のアミノ酸残基をＡｌａからＰｒｏへ置換するために、配列番号６０で示した合成ＤＮＡを設計し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により、以下の様に塩基の置換を行った。上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ上記の変異導入用プライマー（配列番号６０、ＧＥＮＳＥＴ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを２５サイクル行なった。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。また、同様に、上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ７  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ  ＭＵＴ  Ｂ１  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）］のＰＣＲ反応を行った。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。続いて、上記で得られた０．４４ｋｂのＰＣＲ産物と０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を０．５μＬずつ４７．５μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９０℃にて１０分間加熱した後、６０分間かけて３７℃まで冷却した後、３７℃で１５分間保持することによってＤＮＡをアニーリングさせた。２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を添加して７２℃にて３分間反応させた後、１０ｐｍｏｌずつのＴ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とＴ７  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）を添加して反応液を５０μＬとし、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行った。該反応液２５μＬをＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した後、半量を１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位の制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）１μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位のＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲ産物由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）由来のＫ  ｐｎＩ−ＳａｃＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。
こうして目的の塩基配列を有する第２０図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを得た。
（３）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５，２０００）と実施例１の１項（１）および（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８ＬおよびｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを用いて抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＣＤ２０キメラ抗体と表記する）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを以下の様にして構築した。
実施例９の１項（１）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４１ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．７５ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌ由来ＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、第２１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌを得た。
次に、実施例９の１項（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの２μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌの３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．１６ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを用いて、添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した。
得られたプラスミドを用い、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を同社のＤＮＡシークエンサー３７７を用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされている第２１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐが得られたことを確認した。
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）レクチン耐性ＣＨＯ細胞を用いた生産細胞の作製
レクチン耐性ＣＨＯ細胞としては、実施例５．の（１）で作製したＣＨＯ−ＬＣＡ株を用いた。４μｇの抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを１．６×１０６細胞のＣＨＯ−ＬＣＡ株にエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，１９９０］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地［ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地（透析ＦＢＳを１０％含むＩＭＤＭ培地）に交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、増殖の認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させた。具体的には、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（グライナー社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を取得した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。なお、培養上清中のヒトＩｇＧ抗体生産量は実施例９．の第２項（２）に記載のＥＨＳＡ法により測定し生産性の高い株を選択した。このようにして得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体を生産するＬＣＡレクチン耐性ＶＨＯ／ＤＧ４４形質転換細胞株を、Ｒ９２−３−１株と名付けた。Ｒ９２−３−１株は、平成１４年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７６として寄託されている。
（２）培養上清中のヒトＩｇＧ抗体濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）で希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＡＭＰＣ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μＬ／ｍｌで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
（３）抗ＣＤ２０キメラ抗体の培養上清からの精製
実施例９．の第２項の（１）で得られた抗ＣＤ２０キメラ抗体を発現する形質転換細胞株Ｒ９２−３−１を、２００ｎＭ  ＭＴＸ濃度のＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）でコンフルエントになるまで培養し、ダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）で洗浄後、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１（ＪＲＨ社製）に培地交換した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養して培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を精製した。得られた抗体は、Ｒ９２−３−１抗体と名付けた。
実施例１０．抗ＣＤ２０キメラ抗体の活性評価
１．抗ＣＤ２０キメラ抗体のＣＤ２０発現細胞に対する結合活性（蛍光抗体法）  上記実施例９の２（３）項で得られた精製ＣＤ２０キメラ抗体の結合活性をフローサイトメトリーを用いた蛍光抗体法によって評価した。ＣＤ２０陽性細胞であるヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を２×１０５個ずつ、９６ウェルＵ字プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に分注した。抗ＣＤ２０キメラ抗体をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて希釈した抗体溶液（濃度０．０３９〜４０μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルとして加え、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液にて２００μＬ／ウェルで２回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（コールター社製）をＦＡＣＳ用緩衝液を用いて１００倍希釈したものを５０μＬ／ウェル加えた。遮光し氷中で３０分間反応させた後、２００μＬ／ウェルで３回洗浄し、最終的に５００μＬに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。その結果を第２２図に示した。Ｒ９２−３−１抗体、ＲｉｔｕｘａｎＴＭともに抗体濃度依存的に蛍光強度の増加が認められ、ほぼ同等の結合活性を示すことが確認された。また、ＣＤ２０陰性細胞であるヒトＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１１９）に対する結合活性を抗体濃度を４０μｇ／ｍＬとして同様の方法により検討した。その結果を第２３図に示した。Ｒ９２−３−１抗体、ＲｉｔｕｘａｎＴＭともに結合せず、Ｒ９２−３−１抗体はＣＤ２０特異的に結合することが示唆された。
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例９の２（３）項で得られた精製抗ＣＤ２０キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で培養したヒトＢリンパ球培養細胞株ＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８８８５）あるいはＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９６）、Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を遠心分離操作および懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地（ＦＣＳを５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地によって、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体を各最終濃度０．３〜３０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
2003085118.tif 000012
第２４図には３種類の細胞株を標的とした結果を示した。第２４Ａ図はＲａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を、第２４Ｂ図はＲａｍｏｓ細胞を（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９６）、第２４Ｃ図はＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８８８５）を標的とした結果である。第２４図に示したように、Ｒ９２−３−１抗体はいずれの抗体濃度においてもＲｉｔｕｘａｎＴＭよりも高いＡＤＣＣ活性を示し、最高細胞障害活性値も高かった。
実施例１１．抗ＣＤ２０キメラ抗体の糖鎖解析
実施例９の２（３）項で精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体の糖鎖解析を行った。Ｒ９２−３−１抗体およびＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒドラジン分解を行い、糖鎖をタンパク質から切断した［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３（１９８２）］。減圧留去することによってヒドラジンを除去した後、酢酸アンモニウム水溶液と無水酢酸加えてＮ−アセチル化を行った。凍結乾燥後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５，１９７，１９８４］。蛍光標識した糖鎖群（以下、ＰＡ化糖鎖群と表記する）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ  １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
第２５図は、抗ＣＤ２０キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。第２５Ａ図にＲ９２−３−１抗体、第２５Ｂ図にＲｉｔｕｘａｎＴＭの溶離図をそれぞれ示す。実施例３と同様なグラジエントで分析した。
第２５図で示した▲１▼〜▲８▼のピークは、実施例３に記載の構造▲１▼〜▲８▼をそれぞれ示す。
ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。第２５図において、α１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は、▲１▼〜▲８▼の各ピークが占める面積の合計のうち▲１▼〜▲４▼のピークが占める面積の合計から算出した。また、α１，６−フコースが結合した糖鎖群の割合は、▲１▼〜▲８▼の各ピークが占める面積の合計のうち▲５▼〜▲８▼のピークが占める面積の合計から算出した。
その結果、ＲｉｔｕｘａｎＴＭのα１，６−フコースを持たない糖鎖含量は６％、α１，６−フコースが結合した糖鎖含量は９４％であった。Ｒ９２−３−１抗体のα１，６−フコースを持たない糖鎖含量は３３％、α１，６−フコースが結合した糖鎖含量は６７％であった。以上の結果から、Ｒ９２−３−１抗体はα１，６−フコースを持たない糖鎖含量の割合が多いことがわかった。
実施例１２．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入による、レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製と該細胞を用いた抗体組成物の生産
１．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏおよびＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏの構築
（１）ＲＮＡｉの標的とするＣＨＯ由来ＦＵＴ８遺伝子塩基配列の選別
ＷＯ００／６１７３９の記載に基づき、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より調整した一本鎖ｃＤＮＡより以下の手順でチャイニーズハムスター由来ＦＵＴ８  ｃＤＮＡ塩基配列を決定した。マウスＦＵＴ８のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０２５１９８）より設計した５’側非翻訳領域に特異的なプライマー（配列番号６１）および３’側非翻訳領域に特異的なプライマー（配列番号６２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、全長を含むチャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応は前述のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来一本鎖ｃＤＮＡを１μＬ分含む２５μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、４％ＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号６１および配列番号６２）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７２℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。さらに７２℃にて１０分間加熱した。
このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法によりＰＣＲ増幅断片を精製した。このＰＣＲ増幅断片の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。独立した実験で取得したＰＣＲ増幅断片（計１０クローン）の塩基配列を決定し、ＰＣＲに伴う塩基の変異を除いたチャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
上記のチャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡ塩基配列より、配列番号６３および配列番号６４で示す塩基配列をＲＮＡｉの標的配列とした。以下に、配列番号６３の塩基配列を有するｓｉＲＮＡ分子の発現プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏ、および配列番号６４の塩基配列を有するｓｉＲＮＡ分子の発現プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏの構築方法を記載する。なお、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドの基本構造はＭｉｙａｇｉｓｈｉらの方法［ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），２０，５（２００２）］に準じて設計した。
（２）プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅを構築した（第２６図）。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ０７４２５およびＭ１４４８６）より設計したプライマー（配列番号６５および配列番号６６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。ＰＣＲ反応はＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（クロンテック社製）を２００ｎｇ含む５０μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号６５および配列番号６６）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法によりＰＣＲ増幅断片を回収した。この増幅断片をＸｂａＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＸｂａＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）をコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換はこの方法を用いた）により形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれるＵ６プロモーター塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンよりＰＣＲに伴う塩基の変異が生じていないプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅと命名した。
（３）プラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩの構築
以下の手順でプラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩを構築した（第２７図）。配列番号６７および配列番号６８に示す合成オリゴＤＮＡ（それぞれ５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＳａｃＩ（宝酒造社製）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。各クローンの中からＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で切断されるプラスミドを選択し、ｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩと命名した。
（４）プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅを構築した（第２８図）。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０７４２５、Ｍ１４４８６）より設計したプライマー（配列番号６９および配列番号７０）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。ＰＣＲ反応はＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（クロンテック社製）を２００ｎｇ含む５０μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号６９および配列番号７０）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法によりＰＣＲ増幅断片を回収した。この増幅断片をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＢａｍＨＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれるＵ６プロモーター塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンよりＰＣＲに伴う塩基の変異が生じていないプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅと命名した。
（５）プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｂの構築
以下の手順でプラスミドＵ６−ｓｅｎｓｅ＿Ｂを構築した（第２９図）。配列番号７１および配列番号７２に示す合成オリゴＤＮＡ（それぞれ５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号７１および配列番号７２の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｂと命名した。
（６）プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｒの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｒを構築した（第３０図）。配列番号７３および配列番号７４に示す合成オリゴＤＮＡ（それぞれ５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号７３および配列番号７４の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｒと命名した。
（７）プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｂの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｂを構築した（第３１図）。配列番号７５および配列番号７６に示す合成オリゴＤＮＡ（それぞれ５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号７５および配列番号７６の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｂと命名した。
（８）プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｒの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｒを構築した（第３２図）。配列番号７７および配列番号７８に示す合成オリゴＤＮＡ（５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号７７および配列番号７８の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｒと命名した。
（９）プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂを構築した（第３３図）。プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿ＢをＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＢａｌＩＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３７０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＳａｌＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｂに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＦＵＴ８＿Ｂと命名した。
（１０）プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒを構築した（第３４図）。プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿ＲをＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３７０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＳａｌＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｒに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＦＵＴ８＿Ｒと命名した。
（１１）プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏを構築した（第３５図）。プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿ＢをＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断後、該反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドｐＰＵＲ（クロンテック社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏと命名した。
（１２）プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏを構築した（第３６図）。プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿ＲをＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断後、該反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドｐＰＵＲ（クロンテック社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏと命名した。
（１３）直鎖化したプラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏおよびＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏの作製
プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏおよびＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏを制限酵素ＦｓｐＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で切断することにより直鎖化した。切断後は反応液をアガロース電気泳動に供し、該プラスミドが正確に直鎖化されていることを確認した。
２．ＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の取得
次に、本項１．で構築したｓｉＲＮＡ発現プラスミドを３２−０５−０９、および３２−０５−１２株へ導入し、α１，６−フコース特異的レクチンであるＬＣＡ耐性株の取得した。上記３２−０５−０９株および３２−０５−１２株は、参考例１．第１項（２）に記載の方法で取得した、抗ＣＣＲ４ヒト化抗体を高生産するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のクローンである。
３２−０５−０９株および３２−０５−１２株へのｓｉＲＮＡ発現プラスミドの導入はエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、３２−０５−０９、３２−０５−１２株をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０６個／ｍｌとし、細胞懸濁液２００μｌ（１．８×１０６個）を本項１．で調製した線状化プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏおよびＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏ  １０μｇと混和した。該細胞ＤＮＡ混和液をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移した後、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧０．３５ＫＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。
該細胞懸濁液を基本培地（１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および５０μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍｌに混和し、接着細胞用１０ｃｍディッシュ（岩城硝子社製）に１０ｍｌずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養後、培地を除去し、１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地１０ｍｌを添加した。さらに６日間培養した後に培地を除去し、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＬＣＡ（ＥＹ  Ｌａｂｏ．社製）、１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を１０ｍｌずつ添加した。コロニーが出現するまで、さらに８日間培養した。
８日後、出現したレクチン耐性コロニーを以下の手順で採取した。まず、１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、１２ｍｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて１週間培養した。培養後、上記プレートの各クローンに対し、１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて拡大培養を行ない、３２−０５−０９株にＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏを導入したレクチン耐性クローン９Ｒ−３、３２−０５−１２株にＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏを発現させたレクチン耐性クローン１２Ｂ−５を取得した。これらは以下の３項、４項に記載する解析に供し、１本あたり１×１０７ｃｅｌｌｓの細胞を１ｍｌ  １０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）／ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁した凍結バイアルを作製した。なお、９Ｒ−３株および１２Ｂ−５株は、それぞれＣＨＯ／９Ｒ−３およびＣＨＯ／１２Ｂ−５の株名で、平成１５年３月４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３１１およびＦＥＲＭ  ＢＰ−８３１２として寄託されている。
３．ＦＵＴ８標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株におけるＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の定量
本項２．で得たレクチン耐性株９Ｒ−３、１２Ｂ−５株を１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを添加した基本培地に３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ２５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に播種して３日間培養した。トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を除去した。ＰＢＳ緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を２回行った後、−８０℃で凍結した。親株３２−０５−０９株、３２−０５−１２株についても基本培地を用いて同様の操作を行った。
細胞を室温で融解後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し全ＲＮＡを抽出した。方法は添付の説明書に従った。全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、４０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた各々の全ＲＮＡ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。競合的ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子転写量またはβ−アクチン遺伝子転写量の定量には該反応液の５０倍希釈水溶液を用い、各々使用するまで−８０℃で保管した。ＷＯ００／６１７３９に記載の競合的ＰＣＲによる転写量の定量の方法に従い、各細胞株由来全ｃＤＮＡを鋳型とした競合的ＰＣＲを実施し、各細胞株由来全ＲＮＡ中のＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量およびβ−アクチンｍＲＮＡ量を測定した。異なる細胞間でβ−アクチン転写量は均一であると考え、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の相対値を算出し、その値を比較した結果を第３７図に示した。ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入により得られた９Ｒ−３株および、１２Ｂ−５株ではそれぞれの親株の２０％および３０％までＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量が低下していることが示された。
４．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株が生産する抗体の取得
取得したレクチン耐性株が生産する抗ＣＣＲ４ヒト化抗体の取得を以下の手順で行った。まず、本項２．で得たレクチン耐性株９Ｒ−３、１２Ｂ−５を、１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを添加した基本培地へ３×１０５個／ｍｌの密度で懸濁後、３０ｍｌを接着細胞培養用Ｔ１８２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種し、１００％コンフルエントになるまで培養した。各株の培地全量を除去して、ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を同量入れてから再度除去し、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３０ｍｌへ交換した。さらに７日間培養後、各細胞懸濁液を回収した。懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２ｍｍ孔径ＰＥＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて濾過した。
０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．５ｍｌを充填し、精製水３．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌを順次通筒した。さらに、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清３０ｍｌをカラムに通筒した後、０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１．２５ｍｌを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。始めに溶出する２５０μｌの画分を廃棄し、次に得られる溶出画分１ｍｌを回収して２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２００ｍｌと混合して中和した。取得した溶出液に対し、１０ｍｏｌ／ｌクエン酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２ｍｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。
５．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物の単糖組成分析
本項４．で精製した抗ＣＣＲ４ヒト化抗体に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従って単糖組成分析を行った。第５表に各抗体の単糖組成比より計算される、全複合型糖鎖に占める、フコースを持たない複合型糖鎖の割合を示した。ｓｉＲＮＡ導入に供した親株３２−０５−０９株および３２−０５−１２株の生産する抗体のフコースを持たない糖鎖の割合がそれぞれ８％および１２％であったのに対し、ｓｉＲＮＡ導入レクチン耐性株９Ｒ−３株および１２Ｂ−５株の生産する抗体のフコースを持たない糖鎖はそれぞれ５６％、６５％と大幅に上昇していることが示された。
以上の結果より、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡの導入により、宿主細胞の生産する抗体のα１，６−フコースの含量を制御できることが示された。
2003085118.tif 000013
実施例１３．レクチン耐性ＳＰ２／０細胞の作製と該細胞を用いた抗ＧＭ２キメラ抗体の生産
１．レクチン耐性ＳＰ２／０株の取得
特開平６−２０５６９４に記載の抗ＧＭ２キメラ抗体を生産するマウスミエローマＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）の形質転換細胞クローン（ＫＭ９６８）を、１０ｖ／ｖ％の牛胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８、５００ｎＭ  ＭＴＸを含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）（以下、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地と表記）にて浮遊培養用フラスコ２５ｃｍ２（岩城硝子社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。本培養液中の細胞に、１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎ（以下、ＭＮＮＧと表記、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ（タバイ  エスペック社製）内で３７℃にて３日間放置後、接着培養用９６穴プレート（グライナー社製）に１ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。各ウェルには培地中終濃度で２ｍｇ／ｍｌのレンズマメ凝集素（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したレクチン耐性コロニーをレクチン耐性ＳＰ２／０株として取得した。以後、それら株をＳＰ２／０／ＧＭ２−ＬＣＡ株と名付けた。なお、ＳＰ２／０／ＧＭ２−ＬＣＡ株はＳＰ２／０／ＧＭ２−ＬＣＡの株名で、平成１５年３月４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３１３として寄託されている。
２．レクチン耐性ＳＰ２／０株の培養および抗体の精製
実施例１３．の第１項で得られた抗ＧＭ２キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＳＰ２／０／ＧＭ２−ＬＣＡ株およびその親株であるクローンＫＭ９６８を、終濃度５％のＵｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ牛胎児血清（インビトロジェン社製）および５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８、５００ｎＭ  ＭＴＸを含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に３ｘ１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、浮遊培養用フラスコ２２５ｃｍ２（岩城硝子社製）に５０ｍｌずつ分注した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＭ２キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＭ２キメラ抗体は、ＳＰ２／０／ＧＭ２−ＬＣＡ株が生産する抗体をＳＰ２／０／ＧＭ２−ＬＣＡ抗体、クローンＫＭ９６８が生産する抗体をＳＰ２／０／ＧＭ２抗体と名付けた。
３．精製した抗ＧＭ２抗体の糖鎖構造解析
実施例１３．の第２項で選られた精製抗ＧＭ２抗体の糖鎖構造解析を、実施例３．に記載の方法に従って行った。その結果、α１，６−フコースが結合した糖鎖の割合が、ＳＰ２／０／ＧＭ２−ＬＣＡ抗体では１０％未満とＳＰ２／０／ＧＭ２抗体に比べて有意に低下していることがわかった。
参考例１．α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の活性評価
１．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞の作製
ＷＯ０１／６４７５４記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
１０μｇの抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）［ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社製）を５％含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、得られたクローン化株をＫＭ２７６０＃５８−３５−１６と名付けた。尚、ＷＯ００／６１７３９に示すＦＵＴ８遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し用いた。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量を参考例１の２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株は５−０３株と名付けた。
２．ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号１）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ｍＬに、１００ｍｌの２５ｍｇ／ｍＬ  ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液をｖｏｒｔｅｘしながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬ  ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬ  ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ  ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）をｖｏｒｔｅｘ下で添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、２０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後ＯＤ４１５を測定した。参考例１の１項で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、ＣＣＲ４に対する結合活性を示した。
３．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製
（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
参考例１の１項（１）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ２７６０＃５８−３５−１６を２００ｎＭ  ＭＴＸ、Ｄａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬製）を５％の濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（インビトロジェン社製）培地に２×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、スピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて３７℃の恒温室内でＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ攪拌培養した。８−１０日間培養して回収した培養上清より、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムおよびゲルろ過法を用いて、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体をＫＭ２７６０−１と名づけた。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
参考例１の１項（２）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞株５−０３株をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地中で、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍｌのＰＢＳバッファーにて細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を３５ｍｌ注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体はＫＭ３０６０と名付けた。
ＫＭ２７６０−１およびＫＭ３０６０のＣＣＲ４に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより測定した結果、同等の結合活性を示した。
４．精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体の解析
参考例１の１項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０，１９７０］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量および精製度を解析した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス］と一致し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
５．α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の調製
参考例１の３項（１）で調製した、ＹＢ２／０細胞由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０−１と、参考例１の３項（２）で調製した、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ３０６０の糖鎖分析を、実施例３の方法に従って行った。α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、ＫＭ２７６０−１は８７％、ＫＭ３０６０は８％であった。以下、これらの試料を、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８７％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）と表記する。
さらに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８７％）と抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）を用い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８７％）：抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）＝１：３９、１６：６７、２２：５７、３２：４７、４２：３７の割合で混合した。これらの試料を実施例３の方法にしたがって糖鎖分析を行なった。α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、それぞれ９％、１８％、２７％、３９％、４６％であった。以下、これらの試料を抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）と表記する。
第３８図には、各試料の糖鎖分析の結果を示した。第３８図において、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のピークは、実施例３に記載の構造（１）〜（８）をそれぞれ示す。α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、２回の結果を平均した値を用いた。
６．ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の評価（ＥＬＩＳＡ法）
参考例１の５項で調製したα１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性は参考例１の２に記載の方法に従って測定した。
その結果、第３９図に示したように、６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、いずれも同等のＣＣＲ４に対する結合活性を示し、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、抗体の抗原結合活性に影響を与えないことが明らかとなった。
７．ヒトＣＣＲ４高発現細胞株に対するＡＤＣＣ活性の評価
抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒトＣＣＲ４高発現細胞であるＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞（ＷＯ０１／６４７５４）に対するＡＤＣＣ活性は、以下のようにして測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトＣＣＲ４を発現しているＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞の１．５×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を５．５５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間３０分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、培地を用いた懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を７．５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血６０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．６ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。培地で３回遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ヒトエフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。さらに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度０．０００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性（％）は前記式（Ｉ）により求めた。
第４０図および第４１図には、α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の各種濃度（０．００１〜１０μｇ／ｍＬ）におけるＡＤＣＣ活性を２名の健常人ドナー（Ａ，Ｂ）のエフェクター細胞を用いて測定した結果をそれぞれ示した。第４０図および第４１図に示したように、抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性はいずれの抗体濃度においてもα１，６−フコースを持たない糖鎖の割合に比例して上昇する傾向を示した。抗体濃度が低ければ、ＡＤＣＣ活性は低下する。抗体濃度が０．０１μｇ／ｍｌでは、α１，６−フコースを持たない糖鎖が２７％、３９％および４６％のＡＤＣＣ活性はほぼ同様の高い活性を示したが、α１，６−フコースを持たない糖鎖が２０％未満の抗体では、ＡＤＣＣ活性は低かった。本結果は、エフェクター細胞のドナーが異なっても同様であった。
参考例２．ＣＨＯ細胞由来の糖鎖合成に係わる各種酵素遺伝子の取得
１．ＣＨＯ細胞のＦＸ  ｃＤＮＡ配列の決定
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全ＲＮＡの抽出
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、培養２日目に１×１０７個を回収後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により添付の説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全一本鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製した全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた各々の全ＲＮＡ３μｌに対しＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＧＦＰＰおよびＦＸのクローニングには該反応液の５０倍希釈水溶液を使用した。使用するまで−８０℃で保管した。
（３）チャイニーズハムスターＦＸのｃＤＮＡ部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターＦＸのｃＤＮＡ部分断片を取得した。
まず公的データーベースに登録されているヒトＦＸのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｕ５８７６６）およびマウスのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｍ３０１２７）に共通の塩基配列に対して特異的なプライマー（配列番号１２および配列番号１３に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１２および配列番号１３）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片３０１ｂｐをＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した（以下、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いた）。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αをコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）、６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）により形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），７，１５１３（１９７９）］（以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いる）に従って、プラスミドＤＮＡを単離し、ＦＸ  ｃＤＮＡ部分断片が組み込まれた２クローンを得た。各々ｐＣＲＦＸクローン８、ｐＣＲＦＸクローン１２と称す。
ＦＸクローン８、ＦＸクローン１２に挿入されたｃＤＮＡの塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入ｃＤＮＡがチャイニーズハムスターのＦＸのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）部分配列をコードすることを確認した。
（４）ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの合成
本項（１）で抽出したＣＨＯ／ＤＧ４４全ＲＮＡからの５’および３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製を、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて行った。方法は添付の説明書に従った。ただしＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を逆転写酵素として用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは各々、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。
（５）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＦＸ全長ｃＤＮＡの決定
上記（３）項で決定したチャイニーズハムスターＦＸの部分配列をもとにチャイニーズハムスターＦＸに特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＦＸＧＳＰ１−１（配列番号１４）およびＦＸＧＳＰ１−２（配列番号１５）、チャイニーズハムスターＦＸ特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＦＸＧＳＰ２−１（配列番号１６）およびＦＸＧＳＰ２−２（配列番号１７）を設計した。
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本項（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌチャイニーズハムスターＦＸ特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲは９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より１μｌをとりＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで５０倍に希釈した水溶液１μｌをテンプレートとして使用し、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。一回目および２回目のＰＣＲで用いたテンプレート、プライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長をに示した。
2003085118.tif 000014
ＰＣＲ後、皮応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片をＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、チャイニーズハムスターＦＸの５’領域を含むｃＤＮＡ５クローンを得た。各々をＦＸ５’クローン２５、ＦＸ５’クローン２６、ＦＸ５’クローン２７、ＦＸ５’クローン２８、ＦＸ５’クローン３１、ＦＸ５’クローン３２と称す。
同様にチャイニーズハムスターＦＸの３’領域を含むｃＤＮＡ５クローンを得た。各々ＦＸ３’をＦＸ３’クローン１、ＦＸ３’クローン３、ＦＸ３’クローン６、ＦＸ３’クローン８、ＦＸ３’クローン９と称す。
上記、５’および３’ＲＡＣＥにより取得した各クローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法より決定した各ｃＤＮＡの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターＦＸｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。決定した配列（配列番号１８）に示す。
２．ＣＨＯ細胞のＧＦＰＰ  ｃＤＮＡ配列の決定
（１）チャイニーズハムスターＧＦＰＰのｃＤＮＡ部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターＧＦＰＰのｃＤＮＡ部分断片を取得した。
まず公的データーベースに登録されているヒトＧＦＰＰのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＦ０１７４４５）、該配列と相同性の高いマウスＥＳＴ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＩ４６７１９５、ＡＡ４２２６５８、ＢＥ３０４３２５、ＡＩ４６６４７４）、およびＲａｔ  ＥＳＴ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＢＦ５４６３７２、ＡＩ０５８４００、ＡＷ１４４７８３）の塩基配列を比較し、３種間で保存性の高い領域にラットＧＦＰＰに特異的なプライマーＧＦＰＰ  ＦＷ９およびＧＦＰＰ  ＲＶ９（配列番号１９および配列番号２０）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項１（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記ＧＦＰＰ特異的プライマーＧＦＰＰ  ＦＷ９およびＧＦＰＰＲＶ９（配列番号１９および配列番号２０）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片１．４ＫｂｐをＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、ＧＦＰＰ  ｃＤＮＡ部分断片が組み込まれた３クローンを得た。各々ＧＦＰＰクローン８、ＧＦＰＰクローン１１、ＧＦＰＰクローン１２と称す。
ＧＦＰＰクローン８、ＧＦＰＰクローン１１、ＧＦＰＰクローン１２に挿入されたｃＤＮＡの塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入ｃＤＮＡがチャイニーズハムスターのＧＦＰＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の部分配列をコードすることを確認した。（２）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＧＦＰＰ全長ｃＤＮＡの決定
本項２（１）で決定したチャイニーズハムスターＦＸの部分配列をもとにチャイニーズハムスターＦＸに特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＧＦＰＰ  ＧＳＰ１−１（配列番号２２）およびＧＦＰＰ  ＧＳＰ１−２（配列番号２３）、チャイニーズハムスターＧＦＰＰ特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＧＦＰＰ  ＧＳＰ２−１（配列番号２４）およびＧＦＰＰ  ＧＳＰ２−２（配列番号２５）を設計した。
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本項（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡ１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌチャイニーズハムスターＧＦＰＰ特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲは９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より１μｌをとりＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで５０倍に希釈した水溶液１μｌをテンプレートとして、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。一回目および２回目のＰＣＲで用いたテンプレート、プライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長を第７表に示した。
2003085118.tif 000015
ＰＣＲ後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片をＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、チャイニーズハムスターＧＦＰＰの５’領域を含むｃＤＮＡ４クローンを得た。各々をＧＦＰＰ５’クローン１、ＧＦＰＰ５’クローン２、ＧＦＰＰ５’クローン３、ＧＦＰＰ５’クローン４と称す。
同様にチャイニーズハムスターＧＦＰＰの３’領域を含むｃＤＮＡ５クローンを得た。各々をＧＦＰＰ３’クローン１０、ＧＦＰＰ３’クローン１６、ＧＦＰＰ３’クローン２０と称す。
上記、５’および３’ＲＡＣＥにより取得した各クローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。塩基配列決定後、各ｃＤＮＡの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターＧＦＰＰ  ｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。決定した配列（配列番号２１）に示す。
参考例３．ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子の取得
１．ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列の決定
（１）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子のｃＤＮＡ取得（５’および３’末端配列を除く部分ｃＤＮＡの取得）
ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０４２３７７）をクエリーとして、げっ歯類由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡを公的データベース（ＢＬＡＳＴ）を用いて検索した結果、３種類のマウスＥＳＴ配列が得られた（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＥ９８６８５６、ＢＦ１５８９８８、ＢＥ２８４７８５）。これらＥＳＴ配列を連結させることにより、推定されるマウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列を決定した。
このマウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より、配列番号２６で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマー、配列番号２７で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒのプライマー、配列番号２８で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマー、配列番号２９で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、配列番号３０で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。
続いて、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡを増幅するために以下の方法でＰＣＲを行なった。実施例６の１項（１）で作製したＣＨＯ細胞由来一本鎖ｃＤＮＡ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの合成ＤＮＡプライマー２種類］を調製した。なお、合成ＤＮＡプライマーには配列番号２６と配列番号２７、配列番号２８と配列番号２７、配列番号２６と配列番号２９、配列番号２６と配列番号３０の組み合わせを用いた。該反応液をＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
このＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画した結果、配列番号２６と配列番号２７の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１．２ｋｂｐ、配列番号２８と配列番号２７の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１．１ｋｂｐ、配列番号２６と配列番号２９の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約３５０ｂｐ、配列番号２６と配列番号３０の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。これらＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド２２−８（配列番号２６と配列番号２７の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）、２３−３（配列番号２８と配列番号２７の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）、３１−５（配列番号２６と配列番号２９の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を有する）、３４−２（配列番号２６と配列番号３０の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）を得た。これらプラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した（５’末端側の開始メチオニンより下流２８塩基の配列、および３’末端側の終了コドンより上流２７塩基の配列は合成オリゴＤＮＡ配列由来のため、マウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列である）。
さらに、プラスミド２２−８と３４−２に含まれるＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡを組み合わせたプラスミドを作製するため、以下の工程を行った。１μｇのプラスミド２２−８を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。２μｇのプラスミド３４−２を制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片を、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で末端を脱リン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドＣＨＯ−ＧＭＤを得た（第４２図参照）。
（２）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの５’末端配列の決定
ＣＨＯ細胞由来ヒトおよびマウスＧＭＤ  ｃＤＮＡの５’末端側非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）領域の塩基配列より配列番号３１で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、およびＣＨＯ由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より配列番号３２で示される塩基配列を有する３２ｍｅｒのプライマーを作製し、ｃＤＮＡを増幅するために以下の方法でＰＣＲを行なった。実施例１５の１項（１）で得られたＣＨＯ細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３１と配列番号３２の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間のサイクルを２０サイクル行なった後、さらに９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを１８サイクル行なった。該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付の説明書に従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド５’ＧＭＤを得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用い、該プラスミドに含まれるＣＨＯ由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの開始メチオニンより下流２８塩基の配列を決定した。
（３）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの３’末端配列の決定
ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの３’末端ｃＤＮＡ配列を得るため、以下の方法でＲＡＣＥ法を行なった。実施例６の１項（１）で取得したＣＨＯ細胞由来ＲＮＡより、３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製をＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、添付の説明書に従って行なった。ただし、逆転写酵素にはＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。
続いて、上記３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡ１μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３３で示す２４ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマー［本項（１）で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より作製］、１倍濃度のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液より１μｌを取り、Ｔｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）で２０倍希釈した水溶液１μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３４で示す２５ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマー［本項（１）で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より作製］、０．５μＭのＮｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約７００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド３’ＧＭＤを得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用い、該プラスミドに含まれるＣＨＯ由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡの終止コドンより上流２７塩基の配列、および３’側のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ領域４１５ｂｐの塩基配列を決定した。
以上、本項（１）、（２）、（３）より決定したＣＨＯ由来ＧＭＤ遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号３５、それに対応するアミノ酸配列を配列番号４１に示す。
２．ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＧＭＤ遺伝子を含むゲノム配列の決定
参考例３の１項で決定したマウスＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より、配列番号３６で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、以下の方法でＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡを取得した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ＫＣ８６１株をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地［ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地］に３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌ／ウェルずつ分注した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内でコンフルエントになるまで培養したのち、該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３（１９７６）］に従ってゲノムＤＮＡを調製し、ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ）１５０μｌに一晩溶解した。
上記で取得したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号２９と配列番号３６の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約１００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｅｘ３を得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用いて該プラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号３７に示した。
次に、参考例３の１項で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列より、配列番号３８で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマー、および配列番号３９で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４由来ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、２０μｌの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３８と配列番号３９の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約２００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｅｘ４を得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用いて該プラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号４０に示した。
産業上の利用可能性
本発明は、細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のｎ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有することを特徴とする、抗体組成物の製造方法を提供することができる。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、親株であるＮＳＯ細胞株およびレクチン耐性ＮＳＯ株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を示した結果を示した図である。グラフの縦軸は、波長４９０ｎｍにおける吸光度、横軸は抗ＣＣＲ４キメラ抗体の反応液中の濃度を示す。△はＮＳＯ／ＣＣＲ４抗体、●はＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４抗体の抗原結合活性を示す。
第２図は、親株であるＮＳＯ細胞株およびレクチン耐性ＮＳＯ株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を示したものである。グラフの縦軸は、標的細胞の細胞障害活性、横軸は抗ＣＣＲ４キメラ抗体の反応液中の濃度を示す。△はＮＳＯ／ＣＣＲ４抗体、●はＮＳＯ／ＬＣＡ−ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
第３図は、精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第４図は、レクチン耐性株が生産した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示した結果を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□は５−０３株、■はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株、◆はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株、▲はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。
第５図は、レクチン耐性株が生産した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を示したものである。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□はＹＢ２／０株（ＫＭ２７６０＃５８−３５−１６）、△は５−０３株、●はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。
第６図は、精製した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。第６Ａ図は５−０３株が生産する抗体、第６Ｂ図はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産する抗体、第６Ｃ図はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産する抗体、および第６Ｄ図はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体の分析結果を示す。
第７図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第１の工程を示した図である。
第８図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第２の工程を示した図である。
第９図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第３の工程を示した図である。
第１０図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第４の工程を示した図である。
第１１図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第５の工程を示した図である。
第１２図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第６の工程を示した図である。
第１３図は、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＬＣＡレクチンに対する耐性度を示した図である。ＬＣＡレクチンを添加せずに培養した細胞群の生存率を１００％とし、２回測定を行った図である。図中２４９は、発現ベクターｐＡＧＥ２４９を導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＬＣＡレクチンに対する生存率を示す。ＧＭＤはＧＭＤ発現ベクターｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＬＣＡレクチンに対する耐性度を示す。
第１４図は、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株の細胞群が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。
第１５図は、ＧＭＤ遺伝子を発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第１６図は、精製した抗ＧＤ３キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第１７図は、抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を評価した結果を示したものである。グラフの縦軸は、ＥＬＩＳＡ反応における波長４９０ｎｍでの吸光度を、横軸は抗ＧＤ３キメラ抗体の反応液中の濃度を示す。
第１８図は、抗ＧＤ３キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を示したものである。グラフの縦軸は、標的細胞の細胞障害の程度を、実施例２の２項に示した式で算出した値、横軸は抗ＧＤ３キメラ抗体の反応液中の濃度を示す。
第１９図は、プラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの構築過程を示した図である。
第２０図は、プラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの構築過程を示した図である。
第２１図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの構築過程を示した図である。
第２２図は、蛍光抗体法を用いて、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｒ９２−３−１抗体およびＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０発現細胞Ｒａｊｉ細胞との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した結果である。各濃度における相対蛍光強度を縦軸に、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＲ９２−３−１抗体の活性をそれぞれ示す。
第２３図は、蛍光抗体法を用いて、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｒ９２−３−１抗体およびＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０陰性細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞との結合活性を測定した図である。
第２４図は、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体ＫＭ３０６５およびＲｉｔｕｘａｎＴＭのヒトＣＤ２０発現細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。ＡはＲａｊｉ細胞、ＢはＲａｍｏｓ細胞、ＣはＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞にしたものである。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がＲｉｔｕｘａｎＴＭ、○がＲ９２−３−１抗体の活性をそれぞれ示す。
第２５図は、精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体Ｒ９２−３−１抗体およびＲｉｔｕｘａｎＴＭからＰＡ化糖鎖を調製し、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第２６図は、プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅの構築を示した図である。
第２７図は、プラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩの構築を示した図である。
第２８図は、プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅの構築を示した図である。
第２９図は、プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｂを構築示した図である。
第３０図は、プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｒを構築した図である。
第３１図は、プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｂを構築した図である。
第３２図は、プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｒを構築した図である。
第３３図は、プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂを構築した図である。
第３４図は、プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒを構築した図である。
第３５図は、プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏを構築した図である。
第３６図は、プラスミドＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏを構築した図である。
第３７図は、ＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ導入株におけるＦＵＴ  ｍＲＮＡ量の減少を示した図である。各細胞株において発現しているＦＵＴ８ｍＲＮＡ量をβ−アクチンｍＲＮＡ量に対する比を示す。
第３８図は、６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第３９図は、α１，６−フコースを持たない糖鎖抗体分子の割合が異なる６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４に対する結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＣＣＲ４との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）、□が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、▲が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、△が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、●が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、○が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）の活性をそれぞれ示す。
第４０図は、ドナーＡのエフェクター細胞を用いた、α１，６−フコースを持たない糖鎖抗体分子の割合が異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）、□が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、▲が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、△が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、●が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、○が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）の活性をそれぞれ示す。
第４１図は、ドナーＢのエフェクター細胞を用いた、α１，６−フコースを持たない糖鎖抗体分子の割合が異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣ  Ｒ４／ＥＬ−４細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）、□が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、▲が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、△が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、●が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、○が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）の活性をそれぞれ示す。
第４２図は、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ  ｃＤＮＡクローン２２−８の５’末端にクローン３４−２の５’末端を導入したプラスミドＣＨＯ−ＧＭＤの作製工程を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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