(57)【要約】本発明は、下記の新規なポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（ＰＡＰ）、当該酵素をコードする遺伝子及びそれらの利用に関する。（Ａ）作用：下記の２つの反応を触媒する。ＮＭＰ（ｄＮＭＰ）＋ＰｏｌｙＰ（ｎ）→ＮＤＰ（ｄＮＤＰ）＋ＰｏｌｙＰ（ｎ−１）（式中、ｎはポリリン酸の重合度を示し、１００以下の整数。）（Ｂ）基質特異性：ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰに特異的で、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ＴＭＰにも作用する。（Ｃ）分子量：約５５〜５６Ｋｄ（キロダルトン）である。（Ｄ）比活性：酵素蛋白１ｍｇ当たり、７０単位（ユニット）以上である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素。
（Ａ）作用：下記の２つの反応を触媒する。
ＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ）→ＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ−１）
ｄＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ）→ｄＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ−１）
（式中、ＮＭＰはヌクレオシドモノリン酸、ＮＤＰはヌクレオシドジリン酸、ｄＮＭＰはデオキシヌクレオシドモノリン酸、ｄＮＤＰはデオキシヌクレオシドジリン酸、ｎはポリリン酸の重合度を示し、１００以下の整数である。）
（Ｂ）基質特異性：ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰに特異的で、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ＴＭＰにも作用する。
（Ｃ）分子量：約５５〜５６Ｋｄ（キロダルトン）である。
（Ｄ）比活性：酵素蛋白１ｍｇ当たり、７０単位（ユニット）以上である。
ただし、１単位（ユニット）とは、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を示し、以下の条件で測定する。
＜測定条件＞
２０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＡＭＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＤＰを定量する。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素遺伝子。
【請求項４】
ポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものである、請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３又は４記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
【請求項６】
ヌクレオシドモノリン酸からヌクレオシドジリン酸を酵素的に製造する方法であって、酵素として請求項１又は２記載のポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素を使用し、リン酸ドナーとしてポリリン酸を使用する、ヌクレオシドジリン酸の製造法。
【請求項７】
ＡＭＰからＡＴＰを酵素的に製造する方法であって、酵素として請求項１又は２記載のポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素とアデニレートキナーゼの二種の酵素を使用し、リン酸ドナーとしてポリリン酸を使用する、ＡＴＰの製造法。
【請求項８】
ＡＭＰ、ポリリン酸、ポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの生成・再生系において、ポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素として、請求項１又は２記載の酵素を使用するＡＴＰの生成・再生系。
【請求項９】
ＡＴＰを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成したＡＭＰを、ポリリン酸、ポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの再生系を利用して再生する際、ポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素として請求項１又は２記載の酵素を使用する、ＡＭＰからＡＴＰに再生しなから当該酵素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＭＰ  Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、当該酵素をコードする遺伝子及びそれらの利用に関するものである。
背景技術
近年の遺伝子操作技術の進展により、さまざまな酵素の安価な大量調製が可能となり、従来、微生物菌体を用いた微生物変換あるいは発酵生産もしくは化学合成法により合成されてきた有用な生理活性物質が、酵素反応により安価に製造することが可能となってきている。
ところで、リン酸化反応、アミノ化反応などの高エネルギーを必要とする酵素反応には、アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）がエネルギー供与体あるいはリン酸供与体として必要である。従来の微生物変換あるいは発酵生産においては、ＡＴＰは用いた微生物の生体内より供給されるが、酵素法においてはＡＴＰを反応系に添加したり、効率的なＡＴＰの再生系を開発することが不可欠である。
しかしながら、ＡＴＰの安価な合成法は現時点で確立されておらず、市販されているＡＴＰは極めて高価である。また、ＡＴＰの再生系としてはホスホクレアチンとホスホクレアチンキナーゼとの組み合わせ、あるいはアセチルリン酸とアセテートキナーゼとの組み合わせなどが一般的に利用されるが、基質、酵素とも極めて高価であるため、その利用は実験室レベルでの利用に限定され、実用的なものではない。
また、ＡＴＰが高価であるのに対し、アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）は比較的安価に製造されうる。現在、ＡＴＰは、化学合成法あるいは微生物もしくは酵母菌体を用いてＡＭＰもしくはアデニンから合成されている。そのため、ＡＴＰを使用する酵素反応系において、高価なＡＴＰを添加するのではなく、安価なＡＭＰからＡＴＰを酵素的に生成し、且つ消費されたＡＴＰを効率的に再生する方法の開発が切望されていた。
実用的なＡＴＰの生成・再生系を構築する上で、使用するリン酸供与体も重要であり、安価かつ安定なリン酸供与体としてポリリン酸がその第１候補と考えられている。一方、ポリリン酸代謝に関連し、アデノシン系ヌクレオチドにも作用する酵素としては、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（以後「ＰＡＰ」と略記する）が知られている。
ＰＡＰは、ポリリン酸をリン酸ドナーとしてＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する酵素である（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，６４８４−６４８８（１９９１））。Ｚｅｎｈｄｅｒらは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉから該酵素を部分精製し、アデニレートキナーゼと併用することで、ＡＭＰとポリリン酸を基質とするＡＴＰ生成・再生系が機能しうることを報告している（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，２０４５−２０５１（２０００））。また、亀田らは、ＡＴＰを消費してＡＭＰを生成する酵素反応系において、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ由来のＰＡＰと大腸菌ポリリン酸キナーゼを組み合わせにより、ポリリン酸をリン酸ドナーとしたＡＭＰからのＡＴＰの再生系が効率的に機能することを報告している（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１，５５７−５６３（２００１））。
しかしながら、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの菌体内におけるＰＡＰの存在量は極めて少なく、また反応に菌体抽出液などの粗精製酵素を使用すると、反応に関与する物質（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、反応基質及び／又は反応生成物）を分解する酵素の混入も多くなり、結果として反応効率が低下するという問題が指摘されていた。この問題の解決策として、粗精製酵素ではなく、高度に精製されたＰＡＰを使用すればよいが、当該酵素は不安定であるとともに、その精製手順は極めて煩雑であり、到底実用化に耐えられるものではなかった。
本発明者らは、上記問題を解決すべくＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉのＰＡＰを組換えＤＮＡ手法で大量に生産させるで上記問題を解決できるのではと考えた。しかしながら、該酵素のアミノ酸配列及び当該酵素の遺伝子に関しては、まったく報告されていない。
発明の開示
本発明者らは、ＰＡＰの活性による遺伝子クローニングのためのスクリーニング系を構築し、そのスクリーニング系を用いることで、ＰＡＰをコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌において該酵素を大量生産することに成功した。そして、生産された組換えＰＡＰに関して解析を進めたところ、該酵素は非常に高い比活性を有しており、また、アデニレートキナーゼと組み合わせることで、効率的なＡＴＰ生成・再生系の構築が可能であることを見出した。
さらに驚くべき事に、この組換えＰＡＰは、従来のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来のＰＡＰと異なり、ＡＭＰやＧＭＰ以外のヌクレオシドモノリン酸であってもポリリン酸をリン酸ドナーとしてリン酸を転移させヌクレオシドジリン酸を生成する活性を有することを見出した。
一般に、ヌクレオシドジリン酸は、医薬あるいは化成品として使用されているポリヌクレオチドの酵素合成のための原料として有用であるものの、これを合成することは決して容易なことではない。すなわち、微生物変換法ではジリン酸体でリン酸化反応を停止させることはできないため、現状では化学的リン酸化に頼らざるを得ない。しかしながら、化学的リン酸化では、副反応も同時に進行するため、副産物も生成し、目的のヌクレオシドジリン酸を反応液から単離精製することが極めて煩雑であるという問題があった。そのため、ヌクレオシドモノリン酸の酵素的なリン酸化によるヌクレオシドジリン酸の効率的な合成法の開発が望まれており、酵素合成法に使用する酵素としてはＰＡＰも候補として考えられていた。
しかしながら、Ｚｅｈｎｄｅｒらにより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来のＰＡＰは、ＡＭＰに特異的で、ＧＭＰへは若干のリン酸転移が認められ、他のヌクレオチド（ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＩＭＰ）へのリン酸転移は全く認められなかったと報告されていることから（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，２０４５−２０５１（２０００））、ヌクレオシドモノリン酸の酵素的なリン酸化によるヌクレオシドジリン酸の合成にＰＡＰは利用できないと思われていた。
本発明者らは、上記新知見を基にさらに研究を重ね、本発明を完成させた。したがって、本発明は、下記の理化学的性質を有するＰＡＰ（本発明のＰＡＰ）に関するものである。
（Ａ）作用：下記の２つの反応を触媒する。
ＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ）→ＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ−１）
ｄＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ）→ｄＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ−１）
（式中、ＮＭＰはヌクレオシドモノリン酸、ＮＤＰはヌクレオシドジリン酸、ｄＮＭＰはデオキシヌクレオシドモノリン酸、ｄＮＤＰはデオキシヌクレオシドジリン酸、ｎはポリリン酸の重合度を示し、１００以下の整数である。）
（Ｂ）基質特異性：ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰに特異的で、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ＴＭＰにも作用する。
（Ｃ）分子量：約５５〜５６Ｋｄ（キロダルトン）である。
（Ｄ）比活性：酵素蛋白１ｍｇ当たり、７０単位（ユニット）以上である。
また、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するＰＡＰに関するものである。
さらに、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＰＡＰ遺伝子に関するものである。
さらにまた、本発明は、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するＰＡＰ遺伝子に関するものである。
また、本発明は、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＡＰ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片に関するものである。
さらに、本発明は、ヌクレオシドモノリン酸からヌクレオシドジリン酸を酵素的に製造する方法であって、酵素として上記本発明のＰＡＰを使用し、リン酸ドナーとしてポリリン酸を使用する、ヌクレオシドジリン酸の製造法に関するものである。
さらにまた、本発明は、ＡＭＰからＡＴＰを酵素的に製造する方法であって、酵素として上記本発明のＰＡＰとアデニレートキナーゼの二種の酵素を使用し、リン酸ドナーとしてポリリン酸を使用する、ＡＴＰの製造法に関するものである。
また、本発明は、ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの生成・再生系において、ＰＡＰとして上記本発明のＰＡＰを使用するＡＴＰの生成・再生系に関するものである。
最後に、本発明は、ＡＴＰを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成したＡＭＰを、ポリリン酸、ＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの再生する系を利用して再生する際、ＰＡＰとして本発明のＰＡＰを使用する、ＡＭＰからＡＴＰに再生しなから当該酵素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法に関するものである。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明のＰＡＰ
本発明のＰＡＰは、下記の理化学的性質を有するものである（後述の実施例参照）。
（Ａ）作用：下記の２つの反応を触媒する。
ＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ）→ＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ−１）
ｄＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ）→ｄＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ（ｎ−１）
（式中、ＮＭＰはヌクレオシドモノリン酸、ＮＤＰはヌクレオシドジリン酸、ｄＮＭＰはデオキシヌクレオシドモノリン酸、ｄＮＤＰはデオキシヌクレオシドジリン酸、ｎはポリリン酸の重合度を示し、１００以下の整数である。）
（Ｂ）基質特異性：ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰに特異的で、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ＴＭＰにも作用する。
（Ｃ）分子量：約５５〜５６Ｋｄ（キロダルトン）である。
（Ｄ）比活性：酵素蛋白１ｍｇ当たり、７０単位（ユニット）以上である。
（Ｅ）至適ｐＨ：８．５付近
（Ｆ）至適温度：５０℃付近
（Ｅ）ｐＨ安定性：７〜９付近
（Ｆ）熱安定性：５０℃付近まで安定
ただし、ここで言う１単位（ユニット）とは、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を意味し、以下の条件で測定したものである。
＜測定条件＞
２０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＡＭＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＤＰを定量する。
本発明のＰＡＰは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。特に、組換えＤＮＡ法で調製された組換えＰＡＰは、酵素活性的に実質的に純粋で、ＡＭＰのリン酸化に不利なＡＭＰ分解活性を保有していない。
また、該アミノ酸配列は、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾又は付加されていてもよい。上記のアミノ酸配列の欠失、置換、修飾又は付加は、出願前周知技術である部位特異的突然変異誘発法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４６６２−５６６６（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００（１９８２）；Ｎａｔｕｒｅ  ３１６，６０１−６０５（１９８５）など）などにより実施することができる。また、本発明のＰＡＰには、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する酵素も含まれる。
本発明のＰＡＰは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉから配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子、具体的には配列番号２に示す塩基配列からなるＰＡＰ遺伝子をクローニングし、これを使用して調製する。たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来の遺伝子を具体例として挙げて説明すれば、図２及び３は図１に示す制限酵素地図中のＳａｃＩ及びＨｐａＩで切断されるＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果を示したものであり、図２及び３の塩基番号６０４〜２０３１番目に示す配列がＰＡＰの構造遺伝子に相当し、上記配列番号２に示す塩基配列と同一のものである。
本発明においては、本発明のＰＡＰを生産することができる限りにおいて、配列番号２で示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された遺伝子、又はそれらの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、さらに配列番号２で示される塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子も利用することができる。
なお、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された遺伝子とは、上述のアミノ酸配列と同様に、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換、修飾又は付加できる程度の数の塩基が欠失、置換、修飾又は付加されることを意味する。また、ストリンジェントな条件下とは、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、０．１％ｗ／ｖ  Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、０．５％ｗ／ｖブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度反応温度条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことを意味する。
さらに、本発明では、ＰＡＰをコードする遺伝子の上流にさらにＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでなる遺伝子も利用することができ、このような遺伝子を利用することで、酵素の生産量を著しく増加させることができる点で好適である。
このような遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたＰＡＰの調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））に記載の方法に従って行うことができる。
たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物から精製したＰＡＰのＮ−末端、Ｃ−末端などのアミノ酸配列の一部を既知の方法で決定し、それに相当するオリゴヌクレオチドを合成する。合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する菌体の染色体ＤＮＡよりＰＡＰをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。また、適当な制限酵素で染色体ＤＮＡを切断し、得られたＤＮＡ断片を用いて常法によりゲノムライブラリーを作成し、作成したゲノムライブラリーの中から、ＰＡＰ活性を基にスクリーニングすることで、目的とする遺伝子をクローニングすることができる。
なお、ＰＡＰは高度に精製すると失活する可能性が高いので、ＰＡＰ活性を利用したスクリーニング系を使用することが望ましい。そして、スクリーニングに利用するＰＡＰ活性としては、より高感度に検出可能とするため、ＰＡＰとポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を組み合わせたＡＭＰからＡＴＰの生成活性を利用するのが好ましい。具体的には、ＰＡＰとＰＰＫを用い、放射性同位元素で標識したポリリン酸をリン酸ドナーとして、ＡＭＰを基質としてＡＴＰを生成させ、放射標識されたＡＴＰの生成を検出すればよい。
クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザム−ギルバートの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））もしくはダイデオキシチェーンターミネーター法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０（１９８３））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
ＰＡＰを異種微生物内で大量に産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ＰＡＰの生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０，２１（１９８３）、Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２））、ｔｒｃプロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３５３９（１９８５））などを例示することができる。
ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７５））、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９８５））などを例示することができる。
作製した組換えベクターを用いて微生物を形質転換する。宿主となる微生物としては安全性が高く取扱いやすいものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作に常用されている微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌が有利であり、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１９８５））などが使用可能である。
微生物を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））により大腸菌を形質転換することができる。
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＰＡＰ遺伝子の発現を誘導して菌体内に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，２０（１９８３））、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
培養中にＰＡＰ遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。
このようにして調製した培養物から膜分離あるいは遠心分離処理などにより菌体を回収する。回収した菌体は、菌体それ自体をＰＡＰとして利用することも可能であるが、回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離により除去して無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液をＰＡＰとして利用する方が好適である。この無細胞抽出液内にはＰＡＰが過剰に存在しているため、特に精製処理を施さなくとも酵素源として利用可能であるが、さらに、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、又は数種組み合わせて得られる粗精製物又は精製物をＰＡＰとして利用してもかまわない。
（２）本発明のＰＡＰの利用
このようにして調製した本発明のＰＡＰは、ヌクレオシドジリン酸又はデオキシヌクレオシドジリン酸の合成、ＡＴＰの合成もしくは再生等に利用可能である。
まず、ヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）又はデオキシヌクレオシド５’−ジリン酸（ｄＮＤＰ）の合成に使用するヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）又はデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸（ｄＮＭＰ）は、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
また、使用するポリリン酸も市販のものが使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、ポリリン酸の重合度（ｎ）としては、１００以下、好ましくは１０〜５０程度の重合度のものが好ましい。
ＮＤＰ又はｄＮＤＰの合成反応は、ｐＨ４〜９の範囲の適当な緩衝液中にＮＭＰ又はｄＮＤＰとポリリン酸を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍｌの本発明のＰＡＰを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜４０℃で１〜５０時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
生成したＮＤＰ又はｄＮＤＰの単離精製は、各種クロマトグラフィー処理など公知の方法により行うことができる。
次に、ＡＴＰの合成は、ポリリン酸の存在下、本発明のＰＡＰとアデニレートキナーゼを併用し、ＡＭＰをＡＤＰ続けてＡＴＰに変換することで実施することができる。
反応液に添加するＡＭＰは、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
また、添加するポリリン酸も市販のものが使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、ポリリン酸の重合度（ｎ）としては、１００以下、好ましくは１０〜５０程度の重合度のものが好ましい。
ＡＴＰの合成反応は、ｐＨ４〜９の範囲の適当な緩衝液中に、ＡＭＰ及びポリリン酸を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍｌの本発明のＰＡＰ、及び０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１００ユニット／ｍｌ以上のアデニレートキナーゼを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜４０℃で１〜５０時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
生成したＡＴＰの単離精製は、各種クロマトグラフィー処理など公知の方法により行うことができる。
なお、アデニレートキナーゼ活性の単位（ユニット）は次の方法で測定、算出する。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＡＭＰ、及び１０ｍＭ  ＡＴＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させる。ＨＰＬＣを用いて反応液中のＡＤＰを定量し、３７℃で１分間に２μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
また、ＡＭＰ、ポリリン酸、本発明のＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの生成・再生系は、微量ＡＴＰの存在を検出し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できる生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法に応用可能である（ＷＯ０１／５３５１３等参照）。
さらに、ＡＴＰを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成したＡＭＰを、ポリリン酸、本発明のＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの再生する系を利用することで、ＡＭＰからＡＴＰに再生しなから目的とする化合物の酵素合成反応を効率的に行うことができる。
このようなＡＴＰ再生系と組み合わせ可能な酵素反応系としては、たとえば、ガラクトキナーゼを用いたガラクトース−１−リン酸合成系、ＵＭＰキナーゼを用いたＵＤＰ合成系、コリンキナーゼを用いたホスホコリン合成系などを例示することができるが、これに限定されず、ＡＴＰを消費する酵素反応であれば適用可能である。
このようなＡＴＰ合成系と酵素反応との反応条件は、小規模試験にて適宜決定すればよく、また目的化合物の単離精製も公知の方法により行うことができる。
実施例
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ＩＩ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））に従って行った。また、制限酵素、及びＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡ関連酵素はすべて宝酒造（株）より入手した。さらに、反応液中のヌクレオチド類の定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍリン酸一カリウム溶液を用いた。
実施例１；本発明ＰＡＰの調製
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０株のＰＡＰ遺伝子のクローニング
（１−１）大腸菌ポリリン酸キナーゼ及び放射性標識ポリリン酸の調製
文献（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１，５５７−５６３（２００１））に記載された方法で大腸菌ポリリン酸キナーゼを調製した。さらに調製した大腸菌ポリリン酸キナーゼを用いて秋山らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，６３３−６３９（１９９３））に従い放射性標識ポリリン酸を調製した。
（１−２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉゲノムライブラリーの作製とスクリーニング
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株をＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。遠心分離により菌体を回収し、染色体ＤＮＡを精製した。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心により分画し、約７−１０Ｋｂの画分を回収した。該ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩで切断したプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（東洋紡より購入）をＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅにより連結し、該ＤＮＡ液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体６０００株を単離し、５０ずつグループ化した。
各グループをＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、遠心分離により菌体を回収後２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で菌体を洗浄し、同緩衝液で菌体を再縣濁した。菌体縣濁液に等量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（宝酒造より購入）を加え、室温で３０分放置し溶菌させたのち、３倍容の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて、菌体抽出液とした。
先に調製した放射性標識ポリリン酸（リン酸として０．２４ｍＭ）を含有する活性検出液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０），４０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＡＭＰ）２０μｌに菌体抽出液１μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。該反応液を薄層クロマトグラフィー（展開液：０．７５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．５））にかけ、ホスホイメージアナライザーＢＡＳＳ２０００（Ｆｕｊｉｘ製）でＡＤＰの生成を検出することで、得られた形質転換体のスクリーニングを行い、６０００株中１クローンにＰＡＰ活性が検出された。
得られたクローンより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株のＰＡＰ遺伝子が挿入されたプラスミドｐＰＡＰ２を得た（図１）。なお、プラスミドｐＰＡＰ２は、約１０ｋｂのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株の染色体ＤＮＡが挿入されており、プラスミドＤＮＡ（ｐＰＡＰ２）の表記で、平成１４年（２００２）５月２１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６））にブタペスト条約に基づく国際寄託がなされ、受託番号としてＦＥＲＭ  ＢＰ−８０４７を与えられている。
（１−３）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０株のＰＡＰ遺伝子の解析
ｐＰＡＰ２の含有する１０ＫｂのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株のＤＮＡを種々のプラスミドにサブクローニングし、それら形質転換体のＰＡＰ化活性を前述の方法で測定した結果、約２．５ｋｂのＳａｃＩ−ＨｐａＩ  ＤＮＡ断片にＰＡＰ遺伝子が存在することが、確認された（図１）。このＤＮＡ断片の塩基配列をダイデオキシチェインターミーネーター法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２９５（１９８１））で決定した。その結果、ＰＡＰ遺伝子は、４７５アミノ酸から成るポリペプチド（分子量；５５．８ｋｄ）をコードしていることが判明した（図２及び３）。
（２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＰＡＰの調製
プラスミドｐＰＡＰ２を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有する２ｘＹＴ培地で２８℃で一晩培養した。遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８），１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液に縣濁し、超音波処理後、遠心分離により菌体抽出液を回収した。得られた抽出液中のＰＡＰの活性を測定したところ、ＰＡＰは、培養液１ｍｌ当たり１８．１ユニットの生産量であり、対照（プラスミドを保持していない大腸菌ＪＭ１０９）の約９０００倍の活性であった。
なお、この生産性は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ＪｏｈｎｓｏｎｉｉによるＰＡＰの生産性の約１５０倍に相当する。該抽出液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８），０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配）で分画することで、ＰＡＰを部分精製し、回収された画分を酵素標品とした。なお、該画分におけるＰＡＰの比活性は、８０．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
（３）ＰＡＰの諸性質の解析
（３−１）各種ＮＤＰの合成（基質特異性の解析）
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）、５ｍＭ各種ＮＭＰまたｄＮＭＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に種々の濃度でＰＡＰを添加し、３７℃で１０分間保温した。１００℃で１分間の熱処理により反応を停止させ、反応終了液をＨＰＬＣにて生成したＮＤＰもしくはｄＮＭＰを定量した。ＡＭＰのリン酸化におけるＰＡＰの比活性を１００％として、各種ＮＭＰもしくはｄＮＭＰにおける比活性の相対値を表１に示す。
2003100056.tif 000002
（３−２）ｐＨ安定性
各ｐＨに設定した５０ｍＭマレイン酸塩あるいは５０ｍＭトリス塩酸緩衝液中、１００ｍＭ塩化マグネシウム存在下で３７℃で１０分間保温し、残存活性を測定した。残存活性は、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＡＭＰ、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）存在下で３７℃で１０分間の反応を行い、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで測定した。
その結果、図４に示すように、ｐＨ８の酵素活性を１００とした場合、本酵素はｐＨ７〜９で８０％以上の酵素活性を示すことが判明した。
（３−３）至適ｐＨ
各ｐＨに設定した５０ｍＭマレイン酸塩あるいは５０ｍＭトリス緩衝液中、１００ｍＭ塩化マグネシウム、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）、５ｍＭ  ＡＭＰ存在下で３７℃で１０分間反応を行い、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで測定した。
その結果、図５に示すように、本酵素の至適ｐＨは８．５であった。
（３−４）熱安定性
１００ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）存在、もしくは非存在下で各温度に設定した湯浴中にて１０分間保温して、上述の方法で残存活性を測定した。
その結果、図６に示すように、ポリリン酸存在下で、本酵素は５０℃まで安定であることが判明した。
（３−５）至適温度
１００ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）及び５ｍＭ  ＡＭＰ存在下で各温度に設定した湯浴中にて１０分間保温し、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで酵素活性を測定した。
その結果、図７に示すように、本酵素の至適反応温度は５０℃であることが判明した。
実施例２：ＰＡＰとアデニレートキナーゼによるＡＴＰの合成
（１）大腸菌アデニレートキナーゼの調製
大腸菌アデニレートキナーゼは、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４１６８−１４１７１（２０００））記載の方法で調製した。ただし、超音波処理により調製された菌体抽出液を酵素液とし、該酵素液におけるアデニレートキナーゼの比活性は、１２．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
（２）ＡＴＰの合成
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）、１０ｍＭ  ＡＭＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に、ＰＡＰを１．５ユニット／ｍｌ、アデニレートキナーゼを０．４ユニット／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６０分保温した。反応終了後反応液中のヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて定量した。
その結果、図８に示すように、ＡＭＰはＰＡＰにより速やかにリン酸化されＡＤＰが生成し、さらに共存するアデニレートキナーゼの触媒により生成したＡＤＰは速やかにＡＴＰとＡＭＰに変換され、このサイクルを繰り返すことで、ＡＴＰが蓄積することが確認された。
実施例３：ＰＡＰとアデニレートキナーゼの組み合わせからなるＡＴＰ再生系によるガラクトース−１−リン酸の合成
（１）大腸菌ガラクトキナーゼの調製
大腸菌ガラクトキナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＤＲ５４０（Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２）、ファルマシア社より入手）を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０８菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。菌体縣濁液を超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離により菌体残さを除去した。回収液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８），０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配）で分画することで、ガラクトキナーゼを部分精製し、回収された上清をガラクトキナーゼ酵素液とした。酵素液におけるガラクトキナーゼの比活性は、６．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
なお、ガラクトキナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭガラクトースを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させる。糖分析装置（ダイオネックス社）を用いて反応液中のガラクトース−１−リン酸を定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのガラクトース−１−リン酸を生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（２）ガラクトース−１−リン酸の合成
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）、５ｍＭ  ＡＭＰ及び５０ｍＭ（ｄ）ガラクトースを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に０．２ユニット／ｍｌ  ＰＡＰ及び０．２ユニット／ｍｌアデニレートキナーゼを添加し、さらに０．５ユニット／ｍｌとなるようにガラクトキナーゼを添加し、３７℃で８時間保温した。なお、反応中２時間後及び４時間後にポリリン酸を無機リン酸として２０ｍＭとなるように添加した。反応終了液を糖分析装置（ダイオネックス社）を用いて分析したところ、３７．８ｍＭのガラクトース−１−リン酸の生成が確認された。
実施例４：ヌクレオチドジリン酸の合成
（１）各種ＮＤＰの合成
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）、１０ｍＭ各種ＮＭＰ（ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，ＵＭＰ，ＩＭＰ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に、１６ユニット／ｍｌとなるようにＰＡＰを添加し、３７℃で３０分間保温した。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果を表２に示す。なお、対照に大腸菌ＪＭ１０９の菌体抽出液を用いた場合、ＮＤＰの生成は認められなかった。
2003100056.tif 000003
（２）ＩＤＰの酵素合成
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ポリリン酸（無機リン酸として６５ｍＭ）、４０ｍＭ  ＩＭＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に、１６ユニット／ｍｌとなるようにＰＡＰを添加し、３７℃で１９時間保温した。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、２１．２ｍＭのＩＤＰの生成が確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、新規なＰＡＰ及びその遺伝子が提供され、従来大量調製が不可能であったＰＡＰを容易に大量に調製することが可能となった。このことから、ＡＭＰからの効率的かつ安価にＡＴＰを合成又は再生することが可能となり、ＡＴＰを消費する酵素反応系と組み合わせることにより、消費されたＡＴＰを再生し、効率的に目的とする化合物を合成することも可能となった。
また、本発明のＰＡＰは従来のＰＡＰと異なり、ＡＭＰ以外の他のヌクレオシド５’−モノリン酸又はデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の合成のリン酸化活性も有しており、各種ヌクレオシド５’−ジリン酸又はデオキシヌクレオシド５’−ジリン酸を酵素的に容易に調製可能である。
【配列表】
2003100056.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
図１は、取得されたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株のＰＡＰ遺伝子を含有する約１０ＫｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。ＰＡＰ遺伝子は、ＳａｃＩ−ＨｐａＩ  ＤＮＡ断片中に含まれる。
図２は、ＰＡＰ遺伝子を含む２．５ｋｂ  ＤＮＡ断片の塩基配列及びＰＡＰのアミノ酸配列を示す（その１）。
図３は、ＰＡＰ遺伝子を含む２．５ｋｂ  ＤＮＡ断片の塩基配列及びＰＡＰのアミノ酸配列を示す（その２）。
図４は、本発明ＰＡＰのｐＨ安定性の結果を示す。
図５は、本発明ＰＡＰの至適ｐＨの結果を示す。
図６は、本発明ＰＡＰの熱安定性の結果を示す。
図７は、本発明ＰＡＰの至適温度の結果を示す。
図８は、ポリリン酸をリン酸ドナーとしたＰＡＰとアデニレートキナーゼによるＡＭＰからのＡＤＰ及びＡＴＰの合成を示す。
【図１】
2003100056.tif 000009
【図２】
2003100056.tif 000010
【図３】
2003100056.tif 000011
【図４】
2003100056.tif 000012
【図５】
2003100056.tif 000013
【図６】
2003100056.tif 000014
【図７】
2003100056.tif 000015
【図８】
2003100056.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月30日(2003.7.30)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
用いたＵＤＰ合成系、コリンキナーゼを用いたホスホコリン合成系などを例示することができるが、これに限定されず、ＡＴＰを消費する酵素反応であれば適用可能である。
このようなＡＴＰ合成系と酵素反応との反応条件は、小規模試験にて適宜決定すればよく、また目的化合物の単離精製も公知の方法により行うことができる。
実施例
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ＩＩ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））に従って行った。また、制限酵素、及びＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡ関連酵素はすべて宝酒造（株）より入手した。さらに、反応液中のヌクレオチド類の定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍリン酸一カリウム溶液を用いた。
実施例１；本発明ＰＡＰの調製
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０株のＰＡＰ遺伝子のクローニング
（１−１）大腸菌ポリリン酸キナーゼ及び放射性標識ポリリン酸の調製
文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，６３３−６３９（１９９３））に記載された方法で大腸菌ポリリン酸キナーゼを調製した。さらに調製した大腸菌ポリリン酸キナーゼを用いて秋山らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１，５５７−５６３（２００１））に従い放射性標識ポリリン酸を調製した。
（１−２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉゲノムライブラリーの作製とスクリーニン


【手続補正００２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）、５ｍＭ各種ＮＭＰまたｄＮＭＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に種々の濃度でＰＡＰを添加し、３７℃で１０分間保温した。１００℃で１分間の熱処理により反応を停止させ、反応終了液をＨＰＬＣにて生成したＮＤＰもしくはｄＮＭＰを定量した。ＡＭＰのリン酸化におけるＰＡＰの比活性を１００％として、各種ＮＭＰもしくはｄＮＭＰにおける比活性の相対値を表１に示す。
2003100056.tif 000017
（３−２）ｐＨ安定性
各ｐＨに設定した５０ｍＭマレイン酸塩あるいは５０ｍＭトリス塩酸の各緩衝液中、１００ｍＭ塩化マグネシウム存在下で３７℃で１０分間保温し、残存活性を測定した。残存活性は、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＡＭＰ、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）存在下で３７℃で１０分間の反応を行い、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで測定した。
その結果、図４に示すように、ｐＨ８の酵素活性を１００とした場合、本酵素はｐＨ７〜９で８０％以上の酵素活性を示すことが判明した。
（３−３）至適ｐＨ
各ｐＨに設定した５０ｍＭマレイン酸塩あるいは５０ｍＭトリス塩酸の各緩衝液中、１００ｍＭ塩化マグネシウム、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）、５ｍＭ


【手続補正００３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ＡＭＰ存在下で３７℃で１０分間反応を行い、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで測定した。
その結果、図５に示すように、本酵素の至適ｐＨは８．５付近であった。
（３−４）熱安定性
１００ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）存在、もしくは非存在下で各温度に設定した湯浴中にて１０分間保温して、上述の方法で残存活性を測定した。
その結果、図６に示すように、ポリリン酸存在下で、本酵素は５０℃付近まで安定であることが判明した。
（３−５）至適温度
１００ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）及び５ｍＭ  ＡＭＰ存在下で各温度に設定した湯浴中にて１０分間保温し、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで酵素活性を測定した。
その結果、図７に示すように、本酵素の至適反応温度は５０℃付近であることが判明した。
実施例２：ＰＡＰとアデニレートキナーゼによるＡＴＰの合成
（１）大腸菌アデニレートキナーゼの調製
大腸菌アデニレートキナーゼは、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４１６８−１４１７１（２０００））記載の方法で調製した。ただし、超音波処理により調製された菌体抽出液を酵素液とし、該酵素液におけるアデニレートキナーゼの比活性は、１２．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
（２）ＡＴＰの合成
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）、１０ｍＭ  ＡＭＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に、ＰＡＰを１．５ユニット／ｍ




【手続補正書】
【提出日】平成17年2月7日(2005.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＭＰ  Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、当該酵素をコードする遺伝子及びそれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子操作技術の進展により、さまざまな酵素の安価な大量調製が可能となり、従来、微生物菌体を用いた微生物変換あるいは発酵生産もしくは化学合成法により合成されてきた有用な生理活性物質が、酵素反応により安価に製造することが可能となってきている。
【０００３】
ところで、リン酸化反応、アミノ化反応などの高エネルギーを必要とする酵素反応には、アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）がエネルギー供与体あるいはリン酸供与体として必要である。従来の微生物変換あるいは発酵生産においては、ＡＴＰは用いた微生物の生体内より供給されるが、酵素法においてはＡＴＰを反応系に添加したり、効率的なＡＴＰの再生系を開発することが不可欠である。
【０００４】
しかしながら、ＡＴＰの安価な合成法は現時点で確立されておらず、市販されているＡＴＰは極めて高価である。また、ＡＴＰの再生系としてはホスホクレアチンとホスホクレアチンキナーゼとの組み合わせ、あるいはアセチルリン酸とアセテートキナーゼとの組み合わせなどが一般的に利用されるが、基質、酵素とも極めて高価であるため、その利用は実験室レベルでの利用に限定され、実用的なものではない。
【０００５】
また、ＡＴＰが高価であるのに対し、アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）は比較的安価に製造されうる。現在、ＡＴＰは、化学合成法あるいは微生物もしくは酵母菌体を用いてＡＭＰもしくはアデニンから合成されている。そのため、ＡＴＰを使用する酵素反応系において、高価なＡＴＰを添加するのではなく、安価なＡＭＰからＡＴＰを酵素的に生成し、且つ消費されたＡＴＰを効率的に再生する方法の開発が切望されていた。
【０００６】
実用的なＡＴＰの生成・再生系を構築する上で、使用するリン酸供与体も重要であり、安価かつ安定なリン酸供与体としてポリリン酸がその第１候補と考えられている。一方、ポリリン酸代謝に関連し、アデノシン系ヌクレオチドにも作用する酵素としては、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（以後「ＰＡＰ」と略記する）が知られている。
【０００７】
ＰＡＰは、ポリリン酸をリン酸ドナーとしてＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する酵素である（非特許文献１）。Ｚｅｎｈｄｅｒらは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉから該酵素を部分精製し、アデニレートキナーゼと併用することで、ＡＭＰとポリリン酸を基質とするＡＴＰ生成・再生系が機能しうることを報告している（非特許文献２）。また、亀田らは、ＡＴＰを消費してＡＭＰを生成する酵素反応系において、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ由来のＰＡＰと大腸菌ポリリン酸キナーゼを組み合わせにより、ポリリン酸をリン酸ドナーとしたＡＭＰからのＡＴＰの再生系が効率的に機能することを報告している（非特許文献３）。
【非特許文献１】
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，６４８４−６４８８（１９９１）
【非特許文献２】
Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，２０４５−２０５１（２０００）
【非特許文献３】
Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１，５５７−５６３（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉやＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓの各菌体内におけるＰＡＰの存在量は極めて少なく、また反応に菌体抽出液などの粗精製酵素を使用すると、反応に関与する物質（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、反応基質及び／又は反応生成物）を分解する酵素の混入も多くなり、結果として反応効率が低下するという問題が指摘されていた。この問題の解決策として、粗精製酵素ではなく、高度に精製されたＰＡＰを使用すればよいが、当該酵素は不安定であるとともに、その精製手順は極めて煩雑であり、到底実用化に耐えられるものではなかった。
【０００９】
本発明者らは、上記問題を解決すべくＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉのＰＡＰを組換えＤＮＡ手法で大量に生産させるで上記問題を解決できるのではと考えた。しかしながら、該酵素のアミノ酸配列及び当該酵素の遺伝子に関しては、まったく報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＰＡＰの活性による遺伝子クローニングのためのスクリーニング系を構築し、そのスクリーニング系を用いることで、ＰＡＰをコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌において該酵素を大量生産することに成功した。そして、生産された組換えＰＡＰに関して解析を進めたところ、該酵素は非常に高い比活性を有しており、また、アデニレートキナーゼと組み合わせることで、効率的なＡＴＰ生成・再生系の構築が可能であることを見出した。
【００１１】
さらに驚くべき事に、この組換えＰＡＰは、従来報告されていたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来のＰＡＰと異なり、ＡＭＰやＧＭＰ以外のヌクレオシドモノリン酸であってもポリリン酸をリン酸ドナーとしてリン酸を転移させヌクレオシドジリン酸を生成する活性を有することを見出した。
【００１２】
一般に、ヌクレオシドジリン酸は、医薬あるいは化成品として使用されているポリヌクレオチドの酵素合成のための原料として有用であるものの、これを合成することは決して容易なことではない。すなわち、微生物変換法ではジリン酸体でリン酸化反応を停止させることはできないため、現状では化学的リン酸化に頼らざるを得ない。しかしながら、化学的リン酸化では、副反応も同時に進行するため、副産物も生成し、目的のヌクレオシドジリン酸を反応液から単離精製することが極めて煩雑であるという問題があった。そのため、ヌクレオシドモノリン酸の酵素的なリン酸化によるヌクレオシドジリン酸の効率的な合成法の開発が望まれており、酵素合成法に使用する酵素としてはＰＡＰも候補として考えられていた。
【００１３】
しかしながら、Ｚｅｈｎｄｅｒらにより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来のＰＡＰは、ＡＭＰに特異的で、ＧＭＰへは若干のリン酸転移が認められ、他のヌクレオチド（ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＩＭＰ）へのリン酸転移は全く認められなかったと報告されていることから（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，２０４５−２０５１（２０００））、ヌクレオシドモノリン酸の酵素的なリン酸化によるヌクレオシドジリン酸の合成にＰＡＰは利用できないと思われていた。
【００１４】
本発明者らは、上記新知見を基にさらに研究を重ね、本発明を完成させた。したがって、本発明は、下記の理化学的性質を有するＰＡＰ（本発明のＰＡＰ）に関するものである。
（Ａ）作用：下記の２つの反応を触媒する。
ＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ(n)→ＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ(n-1)
ｄＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ(n)→ｄＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ(n-1)
（式中、ＮＭＰはヌクレオシドモノリン酸、ＮＤＰはヌクレオシドジリン酸、ｄＮＭＰはデオキシヌクレオシドモノリン酸、ｄＮＤＰはデオキシヌクレオシドジリン酸、ｎはポリリン酸の重合度を示し、１００以下の整数である。）
（Ｂ）基質特異性：ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰに特異的で、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ＴＭＰにも作用する。
（Ｃ）分子量：約５５〜５６Ｋｄ（キロダルトン）である。
（Ｄ）比活性：酵素蛋白１ｍｇ当たり、７０単位（ユニット）以上である。
【００１５】
また、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するＰＡＰに関するものである。
【００１６】
さらに、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＰＡＰ遺伝子に関するものである。
【００１７】
さらにまた、本発明は、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するＰＡＰ遺伝子に関するものである。
【００１８】
また、本発明は、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＡＰ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１９】
さらに、本発明は、ヌクレオシドモノリン酸からヌクレオシドジリン酸を酵素的に製造する方法であって、酵素として上記本発明のＰＡＰを使用し、リン酸ドナーとしてポリリン酸を使用する、ヌクレオシドジリン酸の製造法に関するものである。
【００２０】
さらにまた、本発明は、ＡＭＰからＡＴＰを酵素的に製造する方法であって、酵素として上記本発明のＰＡＰとアデニレートキナーゼの二種の酵素を使用し、リン酸ドナーとしてポリリン酸を使用する、ＡＴＰの製造法に関するものである。
【００２１】
また、本発明は、ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの生成・再生系において、ＰＡＰとして上記本発明のＰＡＰを使用するＡＴＰの生成・再生系に関するものである。
【００２２】
最後に、本発明は、ＡＴＰを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成したＡＭＰを、ポリリン酸、ＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの再生する系を利用して再生する際、ＰＡＰとして本発明のＰＡＰを使用する、ＡＭＰからＡＴＰに再生しなから当該酵素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、新規なＰＡＰ及びその遺伝子が提供され、従来大量調製が不可能であったＰＡＰを容易に大量に調製することが可能となった。このことから、ＡＭＰからの効率的かつ安価にＡＴＰを合成又は再生することが可能となり、ＡＴＰを消費する酵素反応系と組み合わせることにより、消費されたＡＴＰを再生し、効率的に目的とする化合物を合成することも可能となった。
また、本発明のＰＡＰは従来のＰＡＰと異なり、ＡＭＰ以外の他のヌクレオシド５’−モノリン酸又はデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の合成のリン酸化活性も有しており、各種ヌクレオシド５’−ジリン酸又はデオキシヌクレオシド５’−ジリン酸を酵素的に容易に調製可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（１）本発明のＰＡＰ
本発明のＰＡＰは、下記の理化学的性質を有するものである（後述の実施例参照）。
（Ａ）作用：下記の２つの反応を触媒する。
ＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ(n)→  ＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ(n-1)
ｄＮＭＰ＋ＰｏｌｙＰ(n)→ｄＮＤＰ＋ＰｏｌｙＰ(n-1)
（式中、ＮＭＰはヌクレオシドモノリン酸、ＮＤＰはヌクレオシドジリン酸、ｄＮＭＰはデオキシヌクレオシドモノリン酸、ｄＮＤＰはデオキシヌクレオシドジリン酸、ｎはポリリン酸の重合度を示し、１００以下の整数である。）
（Ｂ）基質特異性：ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰに特異的で、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ＴＭＰにも作用する。
（Ｃ）分子量：約５５〜５６Ｋｄ（キロダルトン）である。
（Ｄ）比活性：酵素蛋白１ｍｇ当たり、７０単位（ユニット）以上である。
（Ｅ）至適ｐＨ：８．５付近
（Ｆ）至適温度：５０℃付近
（Ｇ）ｐＨ安定性：７〜９付近
（Ｈ）熱安定性：５０℃付近まで安定
ただし、ここで言う１単位（ユニット）とは、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を意味し、以下の条件で測定したものである。
【００２５】
＜測定条件＞
２０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＡＭＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＤＰを定量する。
【００２６】
本発明のＰＡＰは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。特に、組換えＤＮＡ法で調製された組換えＰＡＰは、酵素活性的に実質的に純粋で、ＡＭＰのリン酸化に不利なＡＭＰ分解活性を保有していない。
【００２７】
また、該アミノ酸配列は、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾又は付加されていてもよい。上記のアミノ酸配列の欠失、置換、修飾又は付加は、出願前周知技術である部位特異的突然変異誘発法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４６６２−５６６６（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００（１９８２）；Ｎａｔｕｒｅ  ３１６，６０１−６０５（１９８５）など）などにより実施することができる。また、本発明のＰＡＰには、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する酵素も含まれる。
【００２８】
本発明のＰＡＰは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉから配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子、具体的には配列番号２に示す塩基配列からなるＰＡＰ遺伝子をクローニングし、これを使用して調製する。たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来の遺伝子を具体例として挙げて説明すれば、図２及び３は図１に示す制限酵素地図中のＳａｃＩ及びＨｐａＩで切断されるＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果を示したものであり、図２及び３の塩基番号６０４〜２０３１番目に示す配列がＰＡＰの構造遺伝子に相当し、上記配列番号２に示す塩基配列と同一のものである。
【００２９】
本発明においては、本発明のＰＡＰを生産することができる限りにおいて、配列番号２で示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された遺伝子、又はそれらの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、さらに配列番号２で示される塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子も利用することができる。
【００３０】
なお、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された遺伝子とは、上述のアミノ酸配列と同様に、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換、修飾又は付加できる程度の数の塩基が欠失、置換、修飾又は付加されることを意味する。また、ストリンジェントな条件下とは、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、０．１％ｗ／ｖ  Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％  ｗ／ｖ  ＳＤＳ、０．５％  ｗ／ｖブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度反応温度条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことを意味する。
【００３１】
さらに、本発明では、ＰＡＰをコードする遺伝子の上流にさらにＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでなる遺伝子も利用することができ、このような遺伝子を利用することで、酵素の生産量を著しく増加させることができる点で好適である。
【００３２】
このような遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたＰＡＰの調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））に記載の方法に従って行うことができる。
【００３３】
たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物から精製したＰＡＰのＮ−末端、Ｃ−末端などのアミノ酸配列の一部を既知の方法で決定し、それに相当するオリゴヌクレオチドを合成する。合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する菌体の染色体ＤＮＡよりＰＡＰをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。また、適当な制限酵素で染色体ＤＮＡを切断し、得られたＤＮＡ断片を用いて常法によりゲノムライブラリーを作成し、作成したゲノムライブラリーの中から、ＰＡＰ活性を基にスクリーニングすることで、目的とする遺伝子をクローニングすることができる。
【００３４】
なお、ＰＡＰは高度に精製すると失活する可能性が高いので、ＰＡＰ活性を利用したスクリーニング系を使用することが望ましい。そして、スクリーニングに利用するＰＡＰ活性としては、より高感度に検出可能とするため、ＰＡＰとポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を組み合わせたＡＭＰからＡＴＰの生成活性を利用するのが好ましい。具体的には、ＰＡＰとＰＰＫを用い、放射性同位元素で標識したポリリン酸をリン酸ドナーとして、ＡＭＰを基質としてＡＴＰを生成させ、放射標識されたＡＴＰの生成を検出すればよい。
【００３５】
クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザム−ギルバートの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））もしくはダイデオキシチェーンターミネーター法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０（１９８３））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００３６】
ＰＡＰを異種微生物内で大量に産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ＰＡＰの生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０，２１（１９８３）、Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２））、ｔｒｃプロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３５３９（１９８５））などを例示することができる。
【００３７】
ベクターとしては、種々のプラスミドべクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７５））、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９８５））などを例示することができる。
【００３８】
作製した組換えべクターを用いて微生物を形質転換する。宿主となる微生物としては安全性が高く取扱いやすいものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作に常用されている微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌が有利であり、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１９８５））などが使用可能である。
【００３９】
微生物を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））により大腸菌を形質転換することができる。
【００４０】
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＰＡＰ遺伝子の発現を誘導して菌体内に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，２０（１９８３））、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００４１】
培養中にＰＡＰ遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。
【００４２】
このようにして調製した培養物から膜分離あるいは遠心分離処理などにより菌体を回収する。回収した菌体は、菌体それ自体をＰＡＰとして利用することも可能であるが、回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離により除去して無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液をＰＡＰとして利用する方が好適である。この無細胞抽出液内にはＰＡＰが過剰に存在しているため、特に精製処理を施さなくとも酵素源として利用可能であるが、さらに、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、又は数種組み合わせて得られる粗精製物又は精製物をＰＡＰとして利用してもかまわない。
【００４３】
（２）本発明のＰＡＰの利用
このようにして調製した本発明のＰＡＰは、ヌクレオシドジリン酸又はデオキシヌクレオシドジリン酸の合成、ＡＴＰの合成もしくは再生等に利用可能である。
【００４４】
まず、ヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）又はデオキシヌクレオシド５’−ジリン酸（ｄＮＤＰ）の合成に使用するヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）又はデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸（ｄＮＭＰ）は、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
【００４５】
また、使用するポリリン酸も市販のものが使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、ポリリン酸の重合度（ｎ）としては、１００以下、好ましくは１０〜５０程度の重合度のものが好ましい。
【００４６】
ＮＤＰ又はｄＮＤＰの合成反応は、ｐＨ４〜９の範囲の適当な緩衝液中にＮＭＰ又はｄＮＭＰとポリリン酸を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍｌの本発明のＰＡＰを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜４０℃で１〜５０時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００４７】
生成したＮＤＰ又はｄＮＤＰの単離精製は、各種クロマトグラフィー処理など公知の方法により行うことができる。
【００４８】
次に、ＡＴＰの合成は、ポリリン酸の存在下、本発明のＰＡＰとアデニレートキナーゼを併用し、ＡＭＰをＡＤＰ続けてＡＴＰに変換することで実施することができる。
反応液に添加するＡＭＰは、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
【００４９】
また、添加するポリリン酸も市販のものが使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、ポリリン酸の重合度（ｎ）としては、１００以下、好ましくは１０〜５０程度の重合度のものが好ましい。
【００５０】
ＡＴＰの合成反応は、ｐＨ４〜９の範囲の適当な緩衝液中に、ＡＭＰ及びポリリン酸を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍｌの本発明のＰＡＰ、及び０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１００ユニット／ｍｌ以上のアデニレートキナーゼを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜４０℃で１〜５０時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００５１】
生成したＡＴＰの単離精製は、各種クロマトグラフィー処理など公知の方法により行うことができる。
【００５２】
なお、アデニレートキナーゼ活性の単位（ユニット）は次の方法で測定、算出する。すなわち、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＡＭＰ、及び１０ｍＭ  ＡＴＰを含有する５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させる。ＨＰＬＣを用いて反応液中のＡＤＰを定量し、３７℃で１分間に２μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００５３】
また、ＡＭＰ、ポリリン酸、本発明のＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの生成・再生系は、微量ＡＴＰの存在を検出し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できる生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法に応用可能である（ＷＯ０１／５３５１３等参照）。
【００５４】
さらに、ＡＴＰを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、生成したＡＭＰを、ポリリン酸、本発明のＰＡＰ及びアデニレートキナーゼから成るＡＴＰの再生する系を利用することで、ＡＭＰからＡＴＰに再生しながら目的とする化合物の酵素合成反応を効率的に行うことができる。
【００５５】
このようなＡＴＰ再生系と組み合わせ可能な酵素反応系としては、たとえば、ガラクトキナーゼを用いたガラクトース−１−リン酸合成系、ＵＭＰキナーゼを用いたＵＤＰ合成系、コリンキナーゼを用いたホスホコリン合成系などを例示することができるが、これに限定されず、ＡＴＰを消費する酵素反応であれば適用可能である。
【００５６】
このようなＡＴＰ合成系と酵素反応との反応条件は、小規模試験にて適宜決定すればよく、また目的化合物の単離精製も公知の方法により行うことができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ＩＩ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））に従って行った。また、制限酵素、及びＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡ関連酵素はすべて宝酒造（株）より入手した。さらに、反応液中のヌクレオチド類の定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍ  リン酸一カリウム溶液を用いた。
【００５８】
実施例１；本発明ＰＡＰの調製
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０株のＰＡＰ遺伝子のクローニング
（１−１）大腸菌ポリリン酸キナーゼ及び放射性標識ポリリン酸の調製
文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，６３３−６３９（１９９３））に記載された方法で大腸菌ポリリン酸キナーゼを調製した。さらに調製した大腸菌ポリリン酸キナーゼを用いて秋山らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１，５５７−５６３（２００１））に従い放射性標識ポリリン酸を調製した。
【００５９】
（１−２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉゲノムライブラリーの作製とスクリーニング
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株をＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。遠心分離により菌体を回収し、染色体ＤＮＡを精製した。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ染色体ＤＮＡを制限酵素  Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心により分画し、約７−１０Ｋｂの画分を回収した。該ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩで切断したプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（東洋紡より購入）をＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅにより連結し、該ＤＮＡ液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体、６０００株を単離し、５０ずつグループ化した。
【００６０】
各グループをＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、遠心分離により菌体を回収後２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で菌体を洗浄し、同緩衝液で菌体を再縣濁した。菌体縣濁液に等量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（宝酒造より購入）を加え、室温で３０分放置し溶菌させたのち、３倍容の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて、菌体抽出液とした。
【００６１】
先に調製した放射性標識ポリリン酸（リン酸として０．２４ｍＭ）を含有する活性検出液（５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．０），４０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，４ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ＡＭＰ）２０μｌに菌体抽出液１μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。該反応液を薄層クロマトグラフィー（展開液：０．７５Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ３．５））にかけ、ホスホイメージアナライザーＢＡＳＳ２０００（Ｆｕｊｉｘ製）でＡＤＰの生成を検出することで、得られた形質転換体のスクリーニングを行い、６０００株中１クローンにＰＡＰ活性が検出された。
【００６２】
得られたクローンより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株のＰＡＰ遺伝子が挿入されたプラスミドｐＰＡＰ２を得た（図１）。なお、プラスミドｐＰＡＰ２は、約１０ｋｂのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株の染色体ＤＮＡが挿入されており、プラスミドＤＮＡ（ｐＰＡＰ２）の表記で、平成１４年（２００２）５月２１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６））にブタペスト条約に基づく国際寄託がなされ、受託番号としてＦＥＲＭ  ＢＰ−８０４７を与えられている。
【００６３】
（１−３）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０株のＰＡＰ遺伝子の解析
ｐＰＡＰ２の含有する１０ＫｂのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株のＤＮＡを種々のプラスミドにサブクローニングし、それら形質転換体のＰＡＰ化活性を前述の方法で測定した結果、約２．５ｋｂのＳａｃＩ−ＨｐａＩ  ＤＮＡ断片にＰＡＰ遺伝子が存在することが、確認された（図１）。このＤＮＡ断片の塩基配列をダイデオキシチェインターミーネーター法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２９５（１９８１））で決定した。その結果、ＰＡＰ遺伝子は、４７５アミノ酸から成るポリペプチド（分子量；５５．８ｋｄ）をコードしていることが判明した（図２及び３）。
【００６４】
（２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＰＡＰの調製
プラスミドｐＰＡＰ２を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有する２ｘＹＴ培地で２８℃で一晩培養した。遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．８），１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液に縣濁し、超音波処理後、遠心分離により菌体抽出液を回収した。得られた抽出液中のＰＡＰの活性を測定したところ、ＰＡＰは、培養液１ｍｌ当たり１８．１ユニットの生産量であり、対照（プラスミドを保持していない大腸菌ＪＭ１０９）の約９０００倍の活性であった。
【００６５】
なお、この生産性は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ＪｏｈｎｓｏｎｉｉによるＰＡＰの生産性の約１５０倍に相当する。該抽出液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．８），０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配）で分画することで、ＰＡＰを部分精製し、回収された画分を酵素標品とした。なお、該画分におけるＰＡＰの比活性は、８０．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
【００６６】
（３）ＰＡＰの諸性質の解析
（３−１）各種ＮＤＰの合成（基質特異性の解析）
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）、５ｍＭ各種ＮＭＰまたｄＮＭＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に種々の濃度でＰＡＰを添加し、３７℃で１０分間保温した。１００℃で１分間の熱処理により反応を停止させ、反応終了液をＨＰＬＣにて生成したＮＤＰもしくはｄＮＤＰを定量した。ＡＭＰのリン酸化におけるＰＡＰの比活性を１００％として、各種ＮＭＰもしくはｄＮＭＰにおける比活性の相対値を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2003100056.tif 000018
【００６８】
（３−２）ｐＨ安定性
各ｐＨに設定した５０ｍＭ  マレイン酸塩あるいは５０ｍＭトリス塩酸の各緩衝液中、１００ｍＭ  塩化マグネシウム存在下で３７℃で１０分間保温し、残存活性を測定した。残存活性は、５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＡＭＰ、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）存在下で３７℃で１０分間の反応を行い、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで測定した。
【００６９】
その結果、図４に示すように、ｐＨ８の酵素活性を１００とした場合、本酵素はｐＨ７〜９で８０％以上の酵素活性を示すことが判明した。
【００７０】
（３−３）至適ｐＨ
各ｐＨに設定した５０ｍＭ  マレイン酸塩あるいは５０ｍＭトリス塩酸の各緩衝液中、１００ｍＭ  塩化マグネシウム、ポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）、５ｍＭ  ＡＭＰ存在下で３７℃で１０分間反応を行い、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで測定した。
その結果、図５に示すように、本酵素の至適ｐＨは８．５付近であった。
【００７１】
（３−４）熱安定性
１００ｍＭ  塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）存在、もしくは非存在下で各温度に設定した湯浴中にて１０分間保温して、上述の方法で残存活性を測定した。
その結果、図６に示すように、ポリリン酸存在下で、本酵素は５０℃付近まで安定であることが判明した。
【００７２】
（３−５）至適温度
１００ｍＭ  塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でポリリン酸（無機リン酸として１０ｍＭ）及び５ｍＭ  ＡＭＰ存在下で各温度に設定した湯浴中にて１０分間保温し、生成したＡＤＰをＨＰＬＣで定量することで酵素活性を測定した。
その結果、図７に示すように、本酵素の至適反応温度は５０℃付近であることが判明した。
【００７３】
実施例２：ＰＡＰとアデニレートキナーゼによるＡＴＰの合成
（１）大腸菌アデニレートキナーゼの調製
大腸菌アデニレートキナーゼは、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４１６８−１４１７１（２０００））記載の方法で調製した。ただし、超音波処理により調製された菌体抽出液を酵素液とし、該酵素液におけるアデニレートキナーゼの比活性は、１２．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
【００７４】
（２）ＡＴＰの合成
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）、１０ｍＭ  ＡＭＰを含有する５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に、ＰＡＰを１．５ユニット／ｍｌ、アデニレートキナーゼを０．４ユニット／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６０分保温した。反応終了後反応液中のヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて定量した。
その結果、図８に示すように、ＡＭＰはＰＡＰにより速やかにリン酸化されＡＤＰが生成し、さらに共存するアデニレートキナーゼの触媒により生成したＡＤＰは速やかにＡＴＰとＡＭＰに変換され、このサイクルを繰り返すことで、ＡＴＰが蓄積することが確認された。
【００７５】
実施例３：ＰＡＰとアデニレートキナーゼの組み合わせからなるＡＴＰ再生系によるガラクトース−１−リン酸の合成
（１）大腸菌ガラクトキナーゼの調製
大腸菌ガラクトキナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＤＲ５４０（Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２）、ファルマシア社より入手）を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。菌体縣濁液を超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離により菌体残さを除去した。回収液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．８），０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配）で分画することで、ガラクトキナーゼを部分精製し、回収された上清をガラクトキナーゼ酵素液とした。酵素液におけるガラクトキナーゼの比活性は、６．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
【００７６】
なお、ガラクトキナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ガラクトースを含有する１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させる。糖分析装置（ダイオネックス社）を用いて反応液中のガラクトース−１−リン酸を定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのガラクトース−１ーリン酸を生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００７７】
（２）ガラクトース−１−リン酸の合成
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）、５ｍＭ  ＡＭＰ及び５０ｍＭ（ｄ）ガラクトースを含有する５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に０．２ユニット／ｍｌ  ＰＡＰ及び０．２ユニット／ｍｌ  アデニレートキナーゼを添加し、さらに０．５ユニット／ｍｌとなるようにガラクトキナーゼを添加し、３７℃で８時間保温した。なお、反応中２時間後及び４時間後にポリリン酸を無機リン酸として２０ｍＭとなるように添加した。反応終了液を糖分析装置（ダイオネックス社）を用いて分析したところ、３７．８ｍＭのガラクトース−１−リン酸の生成が確認された。
【００７８】
実施例４：ヌクレオチドジリン酸の合成
（１）各種ＮＤＰの合成
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）、１０ｍＭ  各種ＮＭＰ（ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，ＵＭＰ，ＩＭＰ）を含有する５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液に、１６ユニット／ｍｌとなるようにＰＡＰを添加し、３７℃で３０分間保温した。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果を表２に示す。なお、対照に大腸菌ＪＭ１０９の菌体抽出液を用いた場合、ＮＤＰの生成は認められなかった。
【００７９】
【表２】
2003100056.tif 000019
【００８０】
（２）ＩＤＰの酵素合成
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ポリリン酸（無機リン酸として６５ｍＭ）、４０ｍＭ  ＩＭＰを含有する５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液に、１６ユニット／ｍｌとなるようにＰＡＰを添加し、３７℃で１９時間保温した。反応液をＨＰＬＣにて分析した結果、２１．２ｍＭのＩＤＰの生成が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】取得されたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０Ａ株のＰＡＰ遺伝子を含有する約１０ＫｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。ＰＡＰ遺伝子は、ＳａｃＩ−ＨｐａＩ  ＤＮＡ断片中に含まれる。
【図２】ＰＡＰ遺伝子を含む２．５ｋｂ  ＤＮＡ断片の塩基配列及びＰＡＰのアミノ酸配列を示す（その１）。
【図３】ＰＡＰ遺伝子を含む２．５ｋｂ  ＤＮＡ断片の塩基配列及びＰＡＰのアミノ酸配列を示す（その２）。
【図４】本発明ＰＡＰのｐＨ安定性の結果を示す。
【図５】本発明ＰＡＰの至適ｐＨの結果を示す。
【図６】本発明ＰＡＰの熱安定性の結果を示す。
【図７】本発明ＰＡＰの至適温度の結果を示す。
【図８】ポリリン酸をリン酸ドナーとしたＰＡＰとアデニレートキナーゼによるＡＭＰからのＡＤＰ及びＡＴＰの合成を示す。
【配列表】
2003100056.tif 000020
2003100056.tif 000021
【国際調査報告】
2003100056.tif 000022
2003100056.tif 000023