(57)【要約】耐性いもち病菌に関する研究等に広範囲に使用することが出来る遺伝子を提供する。以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、シタロン脱水酵素阻害剤の存在下でシタロン脱水酵素活性を示すタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、シタロン脱水酵素阻害剤の存在下でシタロン脱水酵素活性を示すタンパク質。
【請求項２】
上記シタロン脱水酵素阻害剤は、メラニン生合成経路におけるシタロンから１，３，８−トリヒドロキシナフタレンへの脱水反応を阻害することを特徴とする請求の範囲１記載の遺伝子。
【請求項３】
上記シタロン脱水酵素阻害剤は、カルプロパミドであることを特徴とする請求の範囲１記載の遺伝子。
【請求項４】
請求の範囲１記載の遺伝子によりコードされるシタロン脱水酵素。
【請求項５】
請求の範囲１記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求の範囲５記載の組換えベクターを形質転換してなる形質転換体。
【請求項７】
以下の工程を有するいもち病菌のシタロン脱水酵素阻害剤に対する感受性評価方法。
（ａ）評価対象のいもち病菌におけるシタロン脱水酵素のアミノ酸配列における、配列番号４に示すアミノ酸配列の７５番目のバリンに相当するアミノ酸を同定する工程。
（ｂ）上記（ａ）工程の結果に基づいて、評価対象のいもち病菌のシタロン脱水酵素阻害剤に対する感受性を評価する工程。
【請求項８】
上記（ｂ）工程では、上記（ａ）工程で同定した上記アミノ酸がメチオニンである場合に、野生型のいもち病菌と比較して、評価対象のいもち病菌がシタロン脱水酵素阻害剤に対して低い感受性を示すと評価することを特徴とする請求の範囲７記載の感受性評価方法。
【請求項９】
請求の範囲４記載のシタロン脱水酵素を含む、阻害剤スクリーニングキット。
【請求項１０】
配列番号４で示すアミノ酸配列における７５番目のバリンに相当するアミノ酸をコードする塩基配列を挟むように設計した一対のプライマーを備える、シタロン脱水酵素阻害剤抵抗性いもち病菌評価キット。
【請求項１１】
配列番号４で示すアミノ酸配列における７５番目のバリンに相当するアミノ酸をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを備える、シタロン脱水酵素阻害剤抵抗性いもち病菌評価キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、イネに発症するいもち病の原因菌として知られているいもち病菌におけるシタロン脱水酵素をコードする遺伝子に関する。
背景技術
いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ，Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）によって引き起こされるイネいもち病はイネを栽培しているほとんどの国で認められているが、特に日本をはじめとする高温多湿な気候の地域では、農業上重大な病気の一つに挙げられる。従って高収量の稲作を達成するためには、イネいもち病の防除は必要不可欠である。近年、治療効果を持つ薬剤に代わり、予防効果のある箱処理型の薬剤の使用によって、いもち病菌防除における農家の労力が省力化される傾向にある。このような剤としてカルプロパミド（ｃａｒｐｒｏｐａｍｉｄ；（（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，２−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ）−１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ））に代表されるシタロン脱水酵素（以下、ＳＣＤＨ）阻害剤を挙げることができる（Ｋｕｒａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ，２３，２２−２８，１９９８；Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ，２３，５８−６１，１９９８）。ＳＣＤＨはメラニン生合成経路におけるシタロンから１，３，８−トリヒドロキシナフタレン（以下１，３，８−ＴＨＮ）への脱水反応を触媒する酵素である。
いもち病菌がイネ葉表面のクチクラ層を破り侵入する際、感染特異的器官である付着器中のグリセロール濃度を８０気圧にも上昇させるが、このグリセロールを付着器中に閉じこめるために細胞壁のメラニン層が必要不可欠となる（鎌倉ら，化学と生物，３９，３４０−３４７，２００１）。メラニンの生合成が阻害されると、付着器が形成できなくなる。従ってＳＣＤＨ阻害剤は直接的に殺菌力を示す薬剤ではなく、病原性を抑えることで防除活性を現わす非殺菌性の薬剤である。
糸状菌のＳＣＤＨ遺伝子については、最初にＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅで解明されたが、その塩基配列は公開されずにＳＣＤＨタンパク質の３次元構造だけが報告された（Ｌａｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，９３７−９４４，１９９４）。その後、Ｃｏｌｌｅｔｏｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ（ウリ類炭素病菌）（Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６２，４３４０−４３４４，１９９６；アクセッション番号Ｄ８６０７９）で報告され、続いて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌ，２６，１７５−１８３，１９９７；アクセッション番号Ｕ９５０４２）、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ（Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２，５６４−５６６，１９９８；アクセッション番号ＡＢ００４７４１）そしてＯｐｈｉｏｓｔｏｍａｆｌｏｃｃｏｓｕｍ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，アクセッション番号ＡＦ３１６５７５）で報告されている。また、カルプロパミドが結合したＳＣＤＨタンパク質の３次元構造についても報告されている（Ｎａｋａｓａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，９９３１−９９３９，１９９８；Ｗａｗｒｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎｅｔ，３５，４２５−４３９，１９９９）。
発明の開示
ところで、近年、カルプロパミド等のＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性が低下したいもち病菌（以下、「耐性いもち病菌」と称する。）が見出された。上述したように、カルプロパミド等のＳＣＤＨ阻害剤は稲作において非常に重要な薬剤であるため、耐性いもち病菌における感受性決定要因を究明し、且つ、耐性いもち病菌の防除対策を立てることは、安定した稲作を継続する上で非常に重要である。
しかしながら、耐性いもち病菌における感受性決定要因の解明や、耐性いもち病菌の生息地域の特定等、耐性いもち病菌に関する研究はほとんどなされていないのが現状である。
上述した目的を達成するために、本発明者が鋭意検討した結果、耐性いもち病菌における感受性決定要因を解明することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、シタロン脱水酵素阻害剤の存在下でシタロン脱水酵素活性を示すタンパク質。
（２）上記シタロン脱水酵素阻害剤は、メラニン生合成経路におけるシタロンから１，３，８−トリヒドロキシナフタレンへの脱水反応を阻害することを特徴とする（１）記載の遺伝子。
（３）上記シタロン脱水酵素阻害剤は、カルプロパミドであることを特徴とする（１）記載の遺伝子。
（４）（１）記載の遺伝子によりコードされるシタロン脱水酵素。
（５）（１）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（６）（５）記載の組換えベクターを形質転換してなる形質転換体。
（７）以下の工程を有するいもち病菌のシタロン脱水酵素阻害剤に対する感受性評価方法。
（ａ）評価対象のいもち病菌におけるシタロン脱水酵素のアミノ酸配列における、配列番号４に示すアミノ酸配列の７５番目のバリンに相当するアミノ酸を同定する工程。
（ｂ）上記（ａ）工程の結果に基づいて、評価対象のいもち病菌のシタロン脱水酵素阻害剤に対する感受性を評価する工程。
（８）上記（ｂ）工程では、上記（ａ）工程で同定した上記アミノ酸がメチオニンである場合に、野生型のいもち病菌と比較して、評価対象のいもち病菌がシタロン脱水酵素阻害剤に対して低い感受性を示すと評価することを特徴とする（７）記載の感受性評価方法。
（９）（４）記載のシタロン脱水酵素を含む、阻害剤スクリーニングキット。
（１０）配列番号４で示すアミノ酸配列における７５番目のバリンに相当するアミノ酸をコードする塩基配列を挟むように設計した一対のプライマーを備える、シタロン脱水酵素阻害剤抵抗性いもち病菌評価キット。
（１１）配列番号４で示すアミノ酸配列における７５番目のバリンに相当するアミノ酸をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを備える、シタロン脱水酵素阻害剤抵抗性いもち病菌評価キット。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る遺伝子は、シタロン脱水酵素阻害剤（以下、ＳＣＤＨ阻害剤）の存在下でシタロン脱水酵素活性を示すシタロン脱水酵素（以下、「変異ＳＣＤＨ酵素」と呼ぶ）をコードするものである。なお、以下の説明において、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下でシタロン脱水酵素活性が低下するシタロン脱水酵素を、単にＳＣＤＨ酵素或いは野生型ＳＣＤＨ酵素と呼ぶ。
ＳＣＤＨ阻害剤としては、例えば、カルプロパミド（ｃａｒｐｒｏｐａｍｉｄ；（２，２−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−（１−（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ）−１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、フェノキサニル（１−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｏｘｙ−Ｎ−（１−ｃｙａｎｏ−１，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｅｔｈａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ジクロシメット（Ｎ−［１−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］−１−ｃｙａｎｏ−２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）等が挙げられる。ＳＣＤＨ阻害剤は、通常、いもち病菌のイネに対する感染阻害剤として使用され、ＳＣＤＨ酵素の活性を阻害する。具体的に、ＳＣＤＨ酵素は、図１に示すメラニン生合成経路において、シタロンから１，３，８−トリヒドロキシナフタレン（以下、「１，３，８−ＴＨＮ」と呼ぶ）への脱水反応、及び、バーメロンから１，８−ジヒドロキシナフタレンへの脱水反応を触媒する。
ＳＣＤＨ阻害剤は、このＳＣＤＨ酵素の活性を阻害することによって、いもち病菌における付着器の形成を阻害し、イネに対する病原性を抑制することができる。すなわち、ＳＣＤＨ阻害剤は、いもち病菌の感染力を低下させることによって、いもち病の発生を防止する。これに対して、変異ＳＣＤＨ酵素は、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下であっても、上述した酵素活性を示すことによって、いもち病菌に対してＳＣＤＨ阻害剤に対する抵抗性を付与している。したがって、変異ＳＣＤＨ酵素を発現するいもち病菌（以下、「耐性いもち病菌」又は「抵抗性株」と呼ぶ）は、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下であってもメラニン生合成が阻害されず、付着器を形成することができ、イネ葉表面のクチクラ層を破り侵入することができる。すなわち、耐性いもち病菌は、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下であっても高い感染力を示す。
変異ＳＣＤＨ酵素としては、配列番号２のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。また、変異ＳＣＤＨ酵素は、配列番号２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、シタロン脱水酵素阻害剤の存在下でシタロン脱水酵素活性を示すものであってもよい。ここで、１以上とは、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個を意味する。
野生型ＳＣＤＨ酵素又は変異ＳＣＤＨ酵素における酵素活性は、シタロンから１，３，８−ＴＨＮへの脱水反応、或いは、バーメロンから１，８−ジヒドロキシナフタレンへの脱水反応を測定することによって評価できる。すなわち、野生型ＳＣＤＨ酵素又は変異ＳＣＤＨ酵素と基質（シタロン又はバーメロン）とを含む反応溶液で酵素反応を進行させ、基質の減少量及び／又は反応産物（１，３，８−ＴＨＮ又は１，８−ジヒドロキシナフタレン）の増加量を測定することによって、野生型ＳＣＤＨ酵素又は変異ＳＣＤＨ酵素の酵素活性を評価できる。
具体的には、シタロンから１，３，８−ＴＨＮへの酵素反応を分光的に測定することができる。例えば、シタロンの減少量を測定するには、Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ，２３，５８−６１，１９９８に準じて行うことができる。
一方、１，３，８−ＴＨＮの増加量は、基質であるシタロンと生成物である１，３，８−ＴＨＮのそれぞれのＵＶ吸収スペクトル（図２に示す）から、２００〜３００ｎｍでは１，３，８−ＴＨＮの吸収はシタロンの吸収と被さっているが、３４０〜３６０ｎｍではシタロンの吸収がほとんど無視できるため、３４０〜３６０ｎｍでのＵＶ吸収スペクトルで測定することができる。なお、３４０〜３６０ｎｍでのＵＶ吸収スペクトルで測定する方法では、酵素反応を１００秒間測定することによるレートアッセイにより行うことにより、ＳＣＤＨ阻害剤に対する野生型ＳＣＤＨ酵素又は変異ＳＣＤＨ酵素の感受性を測定することができる。
この方法によれば、所定の濃度でＳＣＤＨ阻害剤（例えばカルプロパミド）を添加した反応溶液において酵素反応を進行させ、３４０〜３６０ｎｍでのＵＶ吸収スペクトルを測定することによって、反応産物である１，３，８−ＴＨＮの合成量を測定できる。そして、測定した１，３，８−ＴＨＮの合成量を、ＳＣＤＨ阻害剤の非存在下における１，３，８−ＴＨＮの合成量で除算することによって、ＳＣＤＨ阻害剤の当該濃度における阻害率とする。そして、野生型ＳＣＤＨ酵素及び変異ＳＣＤＨ酵素について、ＳＣＤＨ阻害剤の濃度を変化させて阻害率を測定し、各酵素におけるＩ５０値を算出する。野生型ＳＣＤＨ酵素のＩ５０値と変異ＳＣＤＨ酵素のＩ５０値とから、Ｒ／Ｓ比を算出することによって、変異ＳＣＤＨ酵素におけるＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性を評価することができる。例えば、算出したＲ／Ｓ比が２以上である場合、変異ＳＣＤＨ酵素は野生型ＳＣＤＨ阻害剤と比較して、ＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性が低いと定義できる。
なお、変異ＳＣＤＨ酵素の酵素活性は、上述した方法に限定されず、如何なる方法を適用して測定しても良い。変異ＳＣＤＨ酵素の酵素活性方法としては、例えば、酵素反応生成物である１，３，８−トリヒドロキシナフタレンのＨＰＬＣによる分析定量等を用いた方法を例示することができる。
変異ＳＣＤＨ酵素をコードする遺伝子（以下、「変異ＳＣＤＨ遺伝子」と呼ぶ）は、上述した変異ＳＣＤＨ酵素をコードする塩基配列を含むものであれば、イントロンを含むゲノムＤＮＡから得たものでも良いし、イントロンを含まないｃＤＮＡから得られたものであっても良い。
変異ＳＣＤＨ遺伝子は、例えば、いもち病菌のＳＣＤＨ酵素のｃＤＮＡ配列から設計したプライマーと、ＳＣＤＨ阻害剤に抵抗性を示すいもち病菌（以下、「耐性いもち病菌」と呼ぶ）のゲノムＤＮＡとを用いたＰＣＲによって得ることができる。また、変異ＳＣＤＨ遺伝子は、上記プライマーと、耐性いもち病菌から抽出したｍＲＮＡとを用いたＲＴ−ＰＣＲによって得ることもできる。なお、いもち病菌のＳＣＤＨ酵素のｃＤＮＡ配列は公知であり、ＭｏｔｏｙａｍａらのＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２，５６４−５６６，１９８８（ＤＮＡデータバンク、アクセッション番号ＡＢ００４７４１）に記載されている。
このような方法によって得られた変異ＳＣＤＨ遺伝子は、例えば、配列番号１に示すような塩基配列を含んでいる。変異ＳＣＤＨ遺伝子及び野生型ＳＣＤＨ酵素をコードする遺伝子（以下、ＳＣＤＨ遺伝子と呼ぶ）の塩基配列（ｃＤＮＡ）を比較した結果を図３に示す。また、ゲノムＤＮＡにおける変異ＳＣＤＨ遺伝子及びＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列を比較した結果を図４に示す。図３及び図４に示すように、変異ＳＣＤＨ遺伝子においては、ＳＣＤＨ遺伝子における２２３番目のＧ（グアノシン）がＡ（アデノシン）にホモに変異している。この変異は、野生型ＳＣＤＨ酵素における７５番目のバリン（Ｖａｌ）がメチオニン（Ｍｅｔ）へ変異することを意味している。
また、変異ＳＣＤＨ遺伝子及びＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列を比較した結果、変異ＳＣＤＨ遺伝子においては、４５０番目のＴ（チミジン）がＣ（シチジン）に変異していた。但し、この変異はアミノ酸変異を伴っていない。
また、図３及び図４の比較から、変異ＳＣＤＨ遺伝子は、変異ＳＣＤＨ酵素のアミノ酸配列における４２番目及び４３番目の間と１４１番目及び１４２番目の間とに、それぞれ８１塩基と約８９塩基のイントロンを有している。なお、後者のイントロン（変異ＳＣＤＨ酵素のアミノ酸配列における１４１番目及び１４２番目の間）はポリＡ鎖が連なっていたため、ＰＣＲを行った際、長さの異なるものが生成してきてしまい明確な長さを決定できなかったため、約８９塩基となっている。
変異ＳＣＤＨ遺伝子としては、配列番号１の塩基配列には限定されず、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、或いは、配列番号２のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、シタロン脱水酵素阻害剤の存在下でシタロン脱水酵素活性を示すタンパク質をコードする塩基配列であればいかなるものであってもよい。このような塩基配列としては、例えば、配列番号１の塩基配列において、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が生じた塩基配列を挙げることができる。
また、変異ＳＣＤＨ遺伝子としては、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列であって、シタロン脱水酵素阻害剤の存在下でシタロン脱水酵素活性を示すタンパク質をコードする塩基配列からなるものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜５５℃での条件をいう。
変異ＳＣＤＨ遺伝子は、例えば、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下でもイネに対して感染するいもち病菌から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、所定の配列を有する一対のプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができる。ゲノムＤＮＡの調製法としては、何ら限定されないが、例えば、ＣＴＢＡ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を抽出液として用いる方法、ＳＤＳ／フェノール又はフェノール／クロロホルム抽出による方法、また市販のキット、例えばＱｉａｇｅｎ社のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＮｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅキット等を挙げることができる。
さらに、変異ＳＣＤＨ遺伝子は、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下でもイネに対して感染するいもち病菌から全量ｍＲＮＡを抽出し、全量ｍＲＮＡ及び所定の配列を有する一対のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによっても得ることができる。いもち病菌からの全量ｍＲＮＡの抽出方法としては、何ら限定されないが、例えば、グアニジウム法、ＳＤＳ−フェノール法、フェノール／クロロホルム抽出、若しくは市販の例えばＱｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ等を挙げることができる。
上述したＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲに使用する一対のプライマーは、例えば遺伝子バンクに登録されているいもち病菌のゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＳＣＤＨ遺伝子を挟み込むように設計することができる。一対のプライマーは、いもち病菌のゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて更に機能的な配列を付加して設計することもできる。機能的な配列とは、ベクターに連結するための制限酵素の認識配列や、フレームを合わせるための挿入配列等を挙げることができる。
例えば、一対のプライマーとしては、以下のものを挙げるがこれに限定されるものではない。
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なお、プライマー１、４、６及び７はセンスプライマーであり、プライマー２、３及び５はアンチセンスプライマーである。したがって、一対のプライマーとしては、一方をセンスプライマーから選択し、他方をアンチセンスプライマーから選択する。
プライマー２は、公知文献（Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２，５６４−５６６，１９８８）に開示された塩基配列に基づいて合成しため、アンダーラインで示した塩基が「Ｇ」となっている。しかしながら、ＤＮＡデータバンクのアクセッション番号ＡＢ００４７４１に記載された相当する塩基は「Ｃ」である。当該塩基は「Ｃ」が正しいが、当該塩基が「Ｇ」であっても、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲの結果には影響しない。プライマー３及びプライマー７中のアンダーラインで示した文字はＥｃｏ  ＲＩ認識配列を示している。このＥｃｏ  ＲＩ認識配列は、タンパク発現ベクター等に組み込む際利用することができる。プライマー３及びプライマー７において、Ｅｃｏ  ＲＩ認識配列より５’側の塩基配列は、Ｅｃｏ  ＲＩがＥｃｏ  ＲＩ認識配列を認識するように余裕を持たせるために付加した塩基配列である。プライマー７において、Ｅｃｏ  ＲＩ認識配列より３’側の２個の塩基配列（すなわち、プライマー７における１８番目及び１９番目の「ＧＴ」）は、タンパク質発現ベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ）に組み込む際のフレーム合わせ用の塩基配列である。
例えば、プライマー７とプライマー３を用い全量ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ生成物をＥｃｏ  ＲＩ処理後、予めＥｃｏ  ＲＩ消化とアルカリフォスファターゼでのＢＡＰ処理を行ったｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に組み込んでなるプラスミドを調製することができる。このプラスミドはＲｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｍｕｔａｎｔ  ＳＣＤＨ  ｃＤＮＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９４８）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成２００２年３月８日付でブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
このプラスミド（Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｍｕｔａｎｔ  ＳＣＤＨ  ｃＤＮＡ）は、大腸菌等の宿主内でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと呼ぶ）との融合タンパク質としてＳＣＤＨ酵素を発現することができる。なお、無細胞系のタンパク質発現システムに適用できるように、変異ＳＣＤＨ遺伝子を有するプラスミドを構築してもよい。
さらにまた、変異ＳＣＤＨ遺伝子は、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下でもイネに対して感染するいもち病菌由来のｃＤＮＡライブラリー及び所定のプローブを用いて得ることができる。
さらにまた、変異ＳＣＤＨ遺伝子は、野生型ＳＣＤＨ遺伝子に対して突然変異を誘発して得ることもできる。例えば、野生型ＳＣＤＨ遺伝子における７５番目のバリン（Ｖａｌ）をコードするコドンを、メチオニン（Ｍｅｔ）をコードするコドンに変異させるように設計したプライマーを用いた、いわゆる部位特異的突然変異法によって、変異ＳＣＤＨ遺伝子を得ることができる。部位特異的突然変異法を用いて変異ＳＣＤＨ遺伝子を得るには、市販のキットを使用することができる。市販のキットとしては、例えば、宝酒造社のＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ等を挙げることができる。
ところで、上述した変異ＳＣＤＨ遺伝子は、後述する実施例で示すように、耐性いもち病菌の感染力を低下させるような新規なＳＣＤＨ阻害剤をスクリーニングする際に有効である。特に、上述した変異ＳＣＤＨ遺伝子を発現可能な状態で組み込んだ発現ベクターを用いて、当該変異ＳＣＤＨ酵素を発現させ、新規ＳＣＤＨ阻害剤としての候補物質が存在する条件下で、発現した変異ＳＣＤＨ酵素の酵素活性を測定する。当該候補物質が存在する場合に、変異ＳＣＤＨ酵素の酵素活性が低下しているか否かを判定することで新規なＳＣＤＨ阻害剤をスクリーニングすることができる。
特に、従前の判定方法では、候補物質の存在下における、いもち病菌の付着器形成阻害を、イネそのものを使用したいわゆるポット試験やシャーレ寒天上に貼ったセロハンを付着器が破るのを観察する試験で評価しており、迅速なＳＣＤＨ阻害剤のスクリーニングを行うことが困難であった。これに対して、上述した方法によれば、簡便な方法によってＳＣＤＨ酵素の酵素活性を測定できるため、新規なＳＣＤＨ阻害剤の迅速なスクリーニングを行える。
また、上述した変異ＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列解析から、ＳＣＤＨ酵素における７５番目のバリン（Ｖａｌ）がメチオニン（Ｍｅｔ）へ変異した変異ＳＣＤＨ酵素において、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下で酵素活性を示すため、ＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析することによって、解析対象のＳＣＤＨ遺伝子がＳＣＤＨ阻害剤に対して耐性を有するか否かを調べられる。
すなわち、所定の地域等で採取されたいもち病菌（解析対象のいもち病菌）がＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性があるか否かを検討する際、当該いもち病菌におけるＳＣＤＨ遺伝子（解析対象のＳＣＤＨ遺伝子）の、ＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸を同定することによって、当該いもち病菌のＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性を評価できる。
解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を決定する際には、如何なる方法を用いても良く、特に限定されない。ＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を決定する際には、例えば、少なくともＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列を挟み込むように設計された一対のプライマーと、鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を用いて、鋳型ＤＮＡの所定の領域について塩基配列を決定する。決定した塩基配列に基づいて、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸を同定することができる。
解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を決定する際には、特に、解析対象のいもち病菌を固体培養した後、糸状菌糸体をとり、当該菌糸体に対してマイクロウェーブを照射することで、鋳型となるゲノムＤＮＡを得ることが好ましい。マイクロウェーブを照射するには、例えば、電子レンジ等を使用することができる。この方法により鋳型となるゲノムＤＮＡを得た場合には、解析対象のいもち病菌を液体培養した後に集菌し、定法に従ってゲノムＤＮＡを抽出する方法と比較して、非常に短時間でゲノムＤＮＡを得ることができる。
さらに、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を決定する際には、特に、一方のプライマーを、７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列の近傍、例えば４０塩基上流にハイブリダイズするように設計することが好ましい。これにより、非常に短時間に解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を決定することができる。
さらにまた、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を決定する際には、配列番号４で示すアミノ酸配列における７５番目のバリンに相当するアミノ酸をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することができる。例えば、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸がメチオニンである場合に、当該ＳＣＤＨ酵素をコードする遺伝子にこのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドを設計する。そして、このオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションやサザンハイブリダイゼーション等の方法により、解析対象のいもち病菌におけるＳＣＤＨ酵素の７５番目のアミノ酸を同定することができる。この方法によっても、解析対象のいもち病菌におけるＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性を評価することができる。
さらにまた、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸を解析する際には、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（以下、ＳＳＣＰと呼ぶ）を利用することもできる。すなわち、予め、野生型のＳＣＤＨ遺伝子と耐性ＳＣＤＨ遺伝子とにおける、一本鎖高次構造の相違に起因する泳動パターンの違いを検出しておき、解析対象のＳＣＤＨ遺伝子の一本鎖高次構造に基づく泳動パターンと比較する。これによって、解析対象のＳＣＤＨ遺伝子が、ＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードする塩基配列を同定することができる。解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸を解析する際にＳＳＣＰを利用することによって、解析対象のいもち病菌のＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性を極めて短時間に判別することができる。
さらにまた、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸を解析する際には、改変したＰＣＲ−制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法（以下、「改変ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法」と呼ぶ）を適用することもできる。すなわち、改変ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析法によって、解析対象いもち病菌のＳＣＤＨ酵素における、７５番目のバリン（Ｖａｌ）からメチオニン（Ｍｅｔ）への変異（以下、Ｖａｌ７５Ｍｅｔ変異と呼ぶ）を簡易的に検定することもできる。
改変ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析法に際して、ＰＣＲに用いる一方のプライマーとしては、２２３番目の塩基（ＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸をコードするコドンに含まれる塩基）を含まず、且つ、２２３番目塩基の種類によっては、３’末端側に制限酵素認識配列を有するように設計する。このとき、当該一方のプライマーは、前記制限酵素認識配列を含むように、鋳型となるゲノムＤＮＡ或いはｃＤＮＡの塩基配列と一部ミスマッチする塩基を含んでいても良い。制限酵素認識配列としては、特に限定されないが、Ｘｂａ  Ｉが認識する配列を使用することができる。
改変ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析法では、先ず、上述したように設計した一対のプライマーと、鋳型となるゲノムＤＮＡ或いはｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲに際しては、温度や時間等の各種条件を適宜設定することによって、鋳型とミスマッチする塩基が含まれているプライマーを用いても、所望の鋳型の領域を増幅することができる。ＰＣＲによって得られた産物は、２２３番目の塩基によっては上記一方のプライマーとともに制限酵素認識配列を含んでおり、また、２２３番目の塩基によっては制限酵素認識配列を含まないものとなる。
次に、ＰＣＲによって得られた産物を、上記一方のプライマーに含まれる制限酵素認識配列を認識する制限酵素で処理する。この制限酵素処理によれば、２２３番目の塩基の違いによって得られる断片長が異なることとなる。次に、制限酵素処理によって得られた断片長を、例えば、電気泳動等の方法によって検出することによって、２２３番目の塩基を同定することができ、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸を解析することができる。
さらにまた、解析対象のＳＣＤＨ酵素における７５番目のアミノ酸を解析する際には、一般的に知られている一塩基多型タイピング方法を適用することもできる。一塩基多型タイピング方法としては、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＮａＰｓｈｏｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｋｉｔ（シングルプライマー伸長反応）、Ｑｉａｇｅｎ社のＭａｓｓｃｏｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ（質量分析システム）、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム、宝酒造社のＵＣＡＮ法、Ｃｌｅａｖａｓｅを用いたインベーダー法、マイクロアレイを使用した方法等が挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例〕
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１
本例では、先ず、ＳＣＤＨ酵素を抽出する際に用いる糸状菌糸体を調製した。標準（野性）菌株のイネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）及びカルプロパミド耐性を示すイネいもち病菌（抵抗性株（Ａ及びＢ））の胞子溶液（１０５／ｍｌ）を、それぞれｙｅａｓｔ抽出物（５ｇ）、グルコース（２０ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．５ｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（０．５ｇ）及びＣａＣｌ２（０．５ｍｇ）を含むＹＧＰＣａ液体培養液（ｐＨ６．５）２００ｍｌに接種し、２７℃で４〜５日培養した。
培養後、培養液を遠心分離にかけて糸状菌糸を収集後、蒸留水で洗浄し、菌糸重量の５倍量の冷アセトンを加え、Ｗａｒｉｎｇ  ｂｌｅｎｄｅｒでホモジナイズした。ホモジネートを遠心し（１５，０００ｘｇ、２０分）、沈降物を４℃で乾燥してアセトンパウダーを得た。このアセトンパウダーを−８５℃で保存した。
得られたアセトンパウダーを用いて、ＳＣＤＨ酵素を含む粗酵素液を調製し、当該ＳＣＤＨ酵素の酵素活性を測定した。ＳＣＤＨ酵素を含む粗酵素液を調製する際には、アセトンパウダーを２０ｍｌの１／１５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）に懸濁し、氷冷下、３０分撹拌した後、１５，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。遠心分離により得られた上澄みを粗酵素液とした。
次に、粗酵素液を用いてＳＣＤＨ酵素の酵素活性を測定する際には、先ず、１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）１，３００μｌ、２０ｍＭシタロン（エタノール溶液）３０μｌ、適当な濃度のカルプロパミドのエタノール溶液３０μｌおよび超純水１，４４０μｌを混合し、２７℃で２分間プレインキュベートした。次に、粗酵素液２００μｌを添加して酵素反応を開始した。酵素反応によりシタロンから生成された１，３，８−ＴＨＮ量をＵＶ３５０ｎｍでの吸光度上昇として、１００秒間モニタリングすることにより粗酵素液に含まれるＳＣＤＨ酵素に起因する酵素活性を測定した。なお、基質のシタロンはカルプロパミド存在下で標準（野性）菌を液体培養し、得られた菌糸体から常法（Ｋｕｒａｈａｓｈｉ  ｗｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ，２３，２２−２８，１９９８）により調製した。
結果を図５に示す。この結果を用いて５０％阻害濃度（Ｉ５０値）をプロビット解析により算出した。その結果、標準（野性）菌から抽出された粗酵素液ではカルプロパミドに対するＩ５０値が７．４５ｎＭであったのに対し、抵抗性菌株Ａ及びＢではそれぞれ１６３ｎＭ及び１５７ｎＭであった。これらの値から、Ｒ／Ｓ比はおおよそ２１．５であった。このことは、抵抗性菌株Ａ及びＢにおけるカルプロパミド耐性の要因が、カルプロパミドのターゲットであるシタロン脱水酵素の感受性が低下したことによることを示唆した。
実施例２
本例では、先ず、いもち病菌からゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを抽出するため、以下のように糸状菌糸体を調製した。先ず、標準（野性）菌及びカルプロパミド耐性を示すいもち病菌（抵抗性株（Ａ及びＢ））をオートミール培地上でそれぞれ培養した。培養後、菌糸体部分を２０ｍｌのｐｏｔａｔｏ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＰＤ）液体培地に接種し、２８℃で３日間、前培養した。前培養によって生長した糸状菌糸が団子状となるため、これを滅菌したＷａｒｉｎｇ  ｂｌｅｎｄｅｒでホモジナイズし、その内１ｍｌずつを２０ｍｌのＰＤ液体培地中で更に３〜５日間培養した。菌糸体を減圧濾過により濾別後、蒸留水で洗浄した。これらの菌子体を液体窒素下、乳鉢ですりつぶし、微粉末とし、−８５℃で保存した。これにより、標準（野性）菌由来の微粉末、抵抗性株Ａ由来の微粉末及び抵抗性株Ｂ由来の微粉末が得られた。
抵抗性株Ａ由来の微粉末を用いて全量ＲＮＡを抽出する際には、Ｒｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコルに従った。得られた微粉末を用いてゲノムＤＮＡを抽出する際には、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコルに従った。ＲＮＡ濃度は分光光度計でＯＤ２６０での吸光度を測定することにより定量した。ＤＮＡ濃度は１％アガロースゲル上での明度の様子か、Ｈｏｅ  ３３２５８（ヘキスト社製）を用いた蛍光スペクトルの測定によった。
次に、得られた全量ＲＮＡを用いて抵抗性株の変異ＳＣＤＨ遺伝子を含むｃＤＮＡを調製した。変異ＳＣＤＨ遺伝子を含むｃＤＮＡを調製する際には、先ず、得られたＲＮＡ（２μｇ）を、最終容量が５０μｌとなるように、２μｌのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、各々２μｌのプライマー１（５’−ＧＣＡＧＴＧＡＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＡＡＧ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びプライマー２（５’−ＴＴＡＴＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＴＣＣ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）並びにＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と混合し反応溶液を調製した。反応は以下の条件に従って行った。ｃＤＮＡの合成として４２℃で３０分、続いて９５℃で３０分反応した。続いて、合成したｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応として９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で１分からなるステップを３５サイクル繰り返し、最終サイクルの後、７２℃で７分間反応を完結させた。反応後の反応溶液を、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製することによってＲＴ−ＰＣＲ生成物を得た。なお、標準菌株のＳＣＤＨ遺伝子を含むｃＤＮＡ及び抵抗性株ＢのＳＣＤＨ遺伝子を含むｃＤＮＡも上述した方法と同様にして、得ることができた。
一方、得られたゲノムＤＮＡを用いて抵抗性株Ａの変異ＳＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡを調製した。変異ＳＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡを調製する際には、先ず、得られたゲノムＤＮＡ４μｌを、最終容量が２５μｌとなるように、各々１μｌのプライマー１（５’−ＧＣＡＧＴＧＡＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＡＡＧ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びプライマー３（５’−ＡＧＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びＰＣＲ  ｂｅａｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と混合して反応溶液を調製した。反応は以下の条件に従って行った。ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応として、９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で２分からなるステップを４０サイクル繰り返し、最終サイクルの後、７２℃で７分間反応を完結させた。反応後の反応溶液をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製することによってＰＣＲ生成物を得た。なお、標準菌株のＳＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ及び抵抗性株ＢのＳＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡも上述した方法と同様にして、得ることができた。
次に、得られたＲＴ−ＰＣＲ産物及びＰＣＲ産物を用いて、変異ＳＣＤＨ遺伝子を含むｃＤＮＡ及び変異ＳＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列の決定に際しては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いた。
このキットを用いたシークエンス反応は、鋳型のＲＴ−ＰＣＲ或いはＰＣＲ産物、３．２ｐｍｏｌのプライマー（プライマー１，プライマー３，プライマー５及びプライマー６）及び８μｌのｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｐｒｅ−ｍｉｘを混合して総量２０μｌの反応溶液中で行った。反応条件としては、９６℃で１０秒、５０℃で５秒及び６０℃で４分からなるステップを４０サイクル繰り返し、最終サイクルの後、６０℃で７分間反応を完結させた。反応終了後、反応溶液に残存するダイターミネータ等の成分をＡｕｔｏ  Ｓｅｑ  Ｇ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いたゲル濾過により除去した。その後、反応生成物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡＢＩ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで解析して塩基配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型として決定した変異ＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、変異ＳＣＤＨ遺伝子によりコードされる変異ＳＣＤＨ酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
ＲＴ−ＰＣＲ産物を鋳型として変異ＳＣＤＨ遺伝子のｃＤＮＡについて解析した結果を図３に示した。図３は遺伝子バンクに登録されているいもち病菌のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（登録番号ＡＢ００４７４１、上段）と、標準菌株から得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を用いて解析されたＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（中段）と、抵抗性株Ａから得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を用いて解析された変異ＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（下段）とを比較した図である。
また、ＰＣＲ産物を鋳型として、ゲノムＤＮＡに存在する変異ＳＣＤＨ遺伝子について解析した結果を図４に示した。図３は遺伝子バンクに登録されているいもち病菌のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（登録番号ＡＢ００４７４１、上段）と、標準菌株から得られたＰＣＲ産物を用いて解析されたＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（中段）と、抵抗性株Ａから得られたＰＣＲ産物を用いて解析された変異ＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（下段）とを比較した図である。
これら図３及び図４から、抵抗性株Ａにおいては、ＳＣＤＨ遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列における２２３番目のＧ（グアノシン）がＡ（アデノシン）にホモに変異していることが判った。これは、標準菌株のＳＣＤＨ酵素のアミノ酸配列における７５番目のバリン（Ｖａｌ）がメチオニン（Ｍｅｔ）へ変異することを意味していた。またｃＤＮＡ塩基配列における４５０番目の塩基が登録されている塩基配列（登録番号ＡＢ００４７４１、図３において上段）ではＴ（チミジン）であったが、標準菌株及び抵抗性株ではＣ（シチジン）であった。但しこのｃＤＮＡ塩基配列における４５０番目の塩基の変異は、アミノ酸変異を伴っていないので、ＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性には何ら関与していないと考えられる。
また、図４から、配列番号３に示した塩基配列における４２番目と４３番目の間及び１４１番目と１４２番目の間に、それぞれ８１塩基と約８９塩基のイントロンを確認した。後者はポリＡ鎖が連なっていたため、ＰＣＲを行った際、長さの異なるものが生成してきてしまい明確な長さは確認できなかったため、約８９塩基となっている。
実施例３
いもち病菌のＳＣＤＨ酵素における、７５番目のバリン（Ｖａｌ）からメチオニン（Ｍｅｔ）への変異（以下、Ｖａｌ７５Ｍｅｔ変異と呼ぶ）の簡易検定法を検討した。
オートミール培地（５％オートミール、２％シュークロース及び１．５％寒天）上、２８℃で生育させたイネいもち菌の菌体を爪楊枝で取り、１．５μｌのマイクロチューブに移した。蓋をして、電子レンジ（６００Ｗ）で５〜７分、マイクロウェーブを照射した。この処理によって、菌体の細胞壁を破壊した。
次に、マイクロチューブ内に５０μｌのＴＥバッファー（ｐＨ８．０）を加え、激しく攪拌し、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遊離したゲノムＤＮＡが溶け込んだ上澄み中を、別のマイクロチューブに移し、−２０℃で保存した。１〜５μｌの上澄みを、最終容量が  ２５μｌとなるように、各々１μｌのプライマー４（５’−ＡＴＧＧＧＴＴＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）、プライマー５（５’−ＧＴＧＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びＰＣＲ  ｂｅａｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と混合して反応溶液を調製した。ＰＣＲ反応としては、９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で２分からなるステップを４０サイクル繰り返し、最終サイクルの後、７２℃で７分間反応を完結させた。反応溶液をＩｎｖｉｓｏｒｂ  Ｓｐｉｎ  ＰＣＲａｐｉｄ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｋ社製）を用いて精製し、ＰＣＲ産物を得た。反応溶液に含まれるＰＣＲ産物は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてシークエンス反応を行った。
シークエンス反応に際しては、鋳型となるＰＣＲ産物、３．２ｐｍｏｌのプライマー６（５’−ＡＣＡＡＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧ−３’）及び８μｌのｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｐｒｅ−ｍｉｘを混合し、総量２０μｌの反応溶液を調製した。シークエンス反応としては、９６℃で１０秒、５０℃で５秒及び６０℃で４分からなるステップを４０サイクル繰り返し、最終サイクルの後、６０℃で７分間反応を完結させた。反応終了後、反応溶液に残存するダイターミネータ等をＡｕｔｏ  Ｓｅｑ  Ｇ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲル濾過により除去した。その後、反応生成物を同社のＡＢＩ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒでシークエンス解析した。この際、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の４７ｃｍ  ｘ  ５０μｍのショートキャピラリーカラムを用いることにより、１サンプル当たり約３５分という短時間で７５番目のアミノ酸がバリンからメチオニンに変異していることを判定できた。
実施例４
一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析法を適用した、いもち病菌のＳＣＤＨ酵素における、７５番目のバリン（Ｖａｌ）からメチオニン（Ｍｅｔ）への変異（以下、Ｖａｌ７５Ｍｅｔ変異と呼ぶ）の簡易検定法を検討した。
実施例３と同様に、いもち病菌糸状菌糸体をマイクロウェーブ照射してゲノムＤＮＡ溶液を簡易に調製した。このゲノムＤＮＡ溶液５μｌを、最終容量が２５μｌとなるように、各々１μｌのプライマー６（５’−ＡＣＡＡＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）、プライマー５（５’−ＧＴＧＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びＰＣＲ  ｂｅａｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と混合して反応溶液を調製した。ＰＣＲ反応としては、９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で２分からなるステップを４０サイクル繰り返し、最終サイクルの後、７２℃で７分間反応を完結させた。この反応の結果、２１５ｂｐのＰＣＲ生成物を得た。ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、反応溶液に残存するｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅやプライマー等を除去した。
その後、ＳＳＣＰのためのｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとして、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．４ｍｌ、ブロモフェノールブルー１０ｍｇ及びホルムアミド１０ｍｌを混合したものを調製した。反応溶液とｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとを１：１で混合し、８５℃で１５分加熱した後、一気に氷冷した。これにより、反応溶液に含まれるＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡとした。
次に、反応溶液及びｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒの混合液を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ全自動電気泳動システムで電気泳動を行った。ゲル担体及びバッファー試薬として、同社のＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  １２．５とＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｔｒｉｐｓを用い、４００Ｖ、１０ｍＡ、２．５Ｗ、４℃、１００Ｖｈで前泳動した後、４００Ｖ、１０ｍＡ、２．５Ｗ、４℃、２００Ｖｈ本泳動した。その結果を図６Ａ及びＢに示した。なお、図６Ａは、上述したＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いた精製を行わずに上記電気泳動を行った場合の結果である。図６Ｂは、上述したＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製を行った後に上記電気泳動を行った場合の結果である。
図６Ａ及びＢそれぞれの一本鎖ＤＮＡの泳動パターンが異なるが、これはＰＣＲ溶液中のバッファー組成によるものと考えられる。いずれにしろ、図６Ａ及びＢから標準菌株とカルプロパミド耐性菌株では泳動パターンに違いが見られ、それぞれを識別することが可能であった。
実施例５
変異ＳＣＤＨ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築し、ＳＣＤＨ阻害剤に対する抵抗性を検討した。
タンパク質発現ベクターであるｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にいもち病菌のシタロン脱水酵素遺伝子を組み込むため、Ｅｃｏ  ＲＩ切断部位を末端に有するプライマー７（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡＧＣＣＧＣＣＡＡＣ−３’）とプライマー３（５’−ＡＧＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡ−３’）を用いＲＴ−ＰＣＲを行った。このＲＴ−ＰＣＲは、実施例１に記載した方法に準じて行った。プライマー７及び３は、それぞれＳＣＤＨ遺伝子の読み枠（ＯＲＦ）の上流及び下流に位置し、ＳＣＤＨ酵素のコード領域全てを挟み込んでいる。
ＲＴ−ＰＣＲを行う際には、先ず、標準（野性）菌或いはカルプロパミド耐性いもち菌から抽出した全量ＲＮＡ（各々２μｇ）を、２μｌのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（１０ｐｍｏｌ／μｌ）と、各々２μｌのプライマー４（２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びプライマー３（２５ｐｍｏｌ／μｌ）と、ＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とを混合し、最終容量５０μｌの反応溶液を調製した。反応は以下の条件によって行った。反応溶液を４２℃で３０分、続いて９５℃で３０分反応してｃＤＮＡ鎖を合成した。その後、引き続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で１分からなるステップを２５サイクル繰り返してＰＣＲ反応を行った。反応終了後、反応溶液をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲ生成物を精製し、その後、最終５０μｌの滅菌水で溶出した。
次に、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を含む溶液のうち３０μｌを、１０ｘＨ緩衝液（Ｔａｋａｒａ社製）４μｌ、Ｅｃｏ  ＲＩ  １μｌ（１２ｕ／μｌ、Ｔａｋａｒａ社製）と混合して最終容量４０μｌとし、３７℃で２時間制限酵素反応に供した。制限酵素反応後、反応溶液をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製し、３０μｌの滅菌水で溶出した。
一方、ＧＳＴ融合タンパク発現ベクターであるｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）１μｇを１０ｘＨ緩衝液（Ｔａｋａｒａ社製）１μｌ及びＥｃｏ  ＲＩ  １μｌ（１２ｕ／μｌ、Ｔａｋａｒａ社製）と混合して最終容量１０μｌとし、３７℃で１時間制限酵素反応に供した。この反応液にＢＡＰ緩衝液１０μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、アルカリフォスファターゼ２．５μｌ（０．４ｕ／μｌ，ＢＡＰ−１０１，ＴＯＹＯＢＯ社製）及び滅菌水７７．５μｌを加え、３７℃で２時間脱リン酸化反応に供した。
次に、２μｌのＥｃｏ  ＲＩ消化されたＲＴ−ＰＣＲ生成物、１μｌのＥｃｏ  ＲＩ／ＢＡＰ処理されたｐＧＥＸ−２Ｔ、２μｌの滅菌水及び５μｌのライゲーション緩衝液Ｉ液（Ｖｅｒ．２，Ｔａｋａｒａ社製）と混合して反応液を調製し、１６℃で１２時間ライゲーション反応に供した。反応終了後、大腸菌（ＪＭ１０９株）のコンピテントセル（Ｔａｋａｒａ社製）に添付されているプロトコルに従い、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。次に、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリン５０ｐｐｍを含むＬＢ固体培地上に広げ、３７℃で１２時間静置培養した。培養後、数点のシングルコロニーを掻き取り、ダイレクトコロニーＰＣＲを行った。そして、ダイレクトコロニーＰＣＲの結果、目的の方向にＳＣＤＨ遺伝子が挿入されたｐＧＥＸ−２Ｔをスクリーニングし、更に、塩基配列を決定することによって、挿入されたＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列に間違いがないかを確認した。以上の方法の概略を図７に示した。また、以上の方法で得られたプラスミドはＲｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｍｕｔａｎｔ  ＳＣＤＨ  ｃＤＮＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９４８）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成２００２年３月８日付けでブタペスト条約に基づき国際寄託した。
次に、ＳＣＤＨ遺伝子が正しく挿入されたｐＧＥＸ−２Ｔベクターで形質転換された大腸菌を、５０ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ液体培地２００ｍｌでＯＤ２６０が０．６〜１．０になるまで２７℃で培養した。その後、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭになるように添加し、更に２７℃で５時間激しく撹拌培養した。培養後、遠心（１０，０００ｘｇ，１０分，４℃）により大腸菌を集菌した。大腸菌を洗浄するため、冷却した１／１５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１０ｍｌに一度懸濁させた後、再度遠心（１０，０００ｘｇ，１０分，４℃）により大腸菌を集菌した。その後、再度、冷却した１／１５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）５ｍｌに懸濁し、氷冷しながらマイクロチップで超音波処理した後、４℃、１５，０００ｘｇで２０分遠心し、その上澄を粗酵素溶液とした。
この粗酵素溶液を用いて、カルプロパミドに対する感受性を測定した。カルプロパミドに対する感受性は、上述した実施例１と同様にして測定した。その結果を図８に示した。なお図８において、白抜きの円を結んだグラフ及び塗りつぶしの円を結んだグラフは、実施例１において測定したカルプロパミドに対する感受性の測定結果である。
図８から、大腸菌中で発現させたＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素は、標準菌とカルプロパミド耐性菌の両方ともに、いもち病菌から抽出した粗酵素液に含まれるＳＣＤＨ酵素と同じ薬剤感受性を示した。
さらに、ＳＣＤＨ阻害剤としてフェノキサニル及びジクロシメットについても同様に感受性を検討した。結果を図９に示す。
図９より、ＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素は、これらフェノキサニル及びジクロシメットに対しても耐性を示すことが判った。すなわち、これら図８及び図９に示した結果から、ＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素は、様々なＳＣＤＨ阻害剤の存在下において高い酵素活性を示すことが明らかとなった。したがって、ＳＣＤＨ阻害剤の存在下においてもイネに対して高い感染力を示す耐性いもち病菌を防除する薬剤を発見・開発する際に、ＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素を用いて候補物質のスクリーニングを行うことができる。詳細には、候補物質の存在下において、ＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素の酵素活性を測定し、当該酵素活性を有意に低下させた候補物質を選択する。選択された候補物質は、変異ＳＣＤＨ酵素の酵素活性を低下させ、耐性いもち病菌の感染力を低下させる。これによって、耐性いもち病菌に起因するいもち病の発生を防止できる
実施例６
いもち病菌のＳＣＤＨ酵素における、Ｖａｌ７５Ｍｅｔ変異の簡易検定法について、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を応用して検討した。実施例３と同様に、いもち病菌糸状菌糸をマイクロウェーブ照射してゲノムＤＮＡ溶液を簡易に調製した。このゲノムＤＮＡ溶液５μｌを、最終容量が２５μｌとなるように、各々１μｌのプライマー８（配列番号１２、５’−ＴＴＣＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＡＧ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）、プライマー５（５’−ＧＴＧＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴ−３’，２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びＰＣＲ  ｂｅａｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と混合して反応溶液を調製した。
プライマー８中の下線を付した塩基「ＴＣＴ」は、鋳型となるゲノムＤＮＡの塩基配列とはミスマッチであり、３’側に隣接する塩基「ＡＧ」と後述のＰＣＲにより増幅される最初の塩基とともに、制限酵素Ｘｂａ  Ｉの切断認識部位（「ＴＣＴＡＧＡ」）となりうるために設計された配列である。すなわち、ＰＣＲにより増幅される最初の塩基がＡである場合には、プライマー８により増幅される断片には、制限酵素Ｘｂａ  Ｉの切断認識部位が含まれることとなる。一方、ＰＣＲにより増幅される最初の塩基がＡ以外である場合には、増幅断片に制限酵素Ｘｂａ  Ｉの切断認識部位が存在しないこととなる。
ＰＣＲ反応としては、９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で２分からなるステップを４０サイクル繰り返し、最終サイクルの後、７２℃で７分間反応を完結させた。この反応の結果、１８３ｂｐのＰＣＲ生成物を得た。ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＰＣＲ生成物を精製し、その後、最終２０μｌの滅菌水で溶出した。この内、７．５μｌを、１０ｘＭ緩衝液（Ｔａｋａｒａ社製）１μｌ、０．１％ＢＳＡ溶液１μｌ、Ｘｂａ  Ｉ  ０．５μｌ（１２ｕ／μｌ、Ｔａｋａｒａ社製）と混合して最終容量１０μｌとし、３７℃で１時間制限酵素反応に供した。反応液全量を３％アガロースに泳動した結果を図１０に示した。なお、図１０において、レーン２は標準菌株から抽出したゲノムＤＮＡを用いた反応液であり、レーン３は抵抗性菌株から抽出したゲノムＤＮＡを用いた反応液であり、レーン４は標準菌株から抽出したゲノムＤＮＡを用い制限酵素反応を行わなかった反応液であり、レーン５は抵抗性菌株から抽出したゲノムＤＮＡを用い制限酵素反応を行わなかった反応液である。
図１０より明らかなように、抵抗性株由来のＰＣＲ生成物のＸｂａ  Ｉ処理サンプルでは２５塩基程短い断片となっていた。この結果から、標準菌株（野性株）と抵抗性菌株の区別がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を応用して可能であることが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、ＳＣＤＨ阻害剤に対する耐性いもち病菌に関する研究等に広範囲に使用することができる遺伝子を提供することができる。また、この遺伝子は、新規なＳＣＤＨ阻害剤のスクリーニングや、解析対象のいもち病菌におけるＳＣＤＨ阻害剤に対する感受性の評価等に使用することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号５〜１２は、合成プライマーである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、いもち病菌におけるメラニン生合成経路を説明する図である。
図２は、シタロンと１，３，８−ＴＨＮとのＵＶ吸収スペクトルを示す特性図である。
図３は、遺伝子バンクに登録されているいもち病菌のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列、標準菌株のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（ｃＤＮＡ）及び抵抗性株のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（ｃＤＮＡ）を比較して示す図である。
図４は、遺伝子バンクに登録されているいもち病菌のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列、標準菌株のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（ゲノムＤＮＡ）及び抵抗性株のＳＣＤＨ遺伝子の塩基配列（ゲノムＤＮＡ）を比較して示す図である。
図５は、標準菌株及び抵抗性株（Ａ及びＢ）それぞれから抽出した粗酵素液について、カルプロパミド濃度とＳＣＤＨ酵素活性の阻害率との関係を示す特性図である。図中、○は標準菌株由来の粗酵素液を示し、△は抵抗性株Ａ由来の粗酵素液を示し、□は抵抗性株Ｂ由来の粗酵素液を示す。
図６は、実施例４で行った一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析法の結果を示す電気泳動写真であり、Ａ（左側）はＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いた精製を行わずに電気泳動を行った場合の結果である。Ｂ（右側）はＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製を行った後に電気泳動を行った場合の結果である。
図７は、プラスミドＲｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  ｗｉｌｄ  ＳＣＤＨ  ｃＤＮＡ及びＲｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｍｕｔａｎｔ  ＳＣＤＨ  ｃＤＮＡの作製方法を概略的に示す図である。
図８は、標準菌株のｃＤＮＡを大腸菌中で発現させたＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素、抵抗性株のｃＤＮＡを大腸菌中で発現させたＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素、標準菌株の粗酵素液及び抵抗性株の粗酵素液とについて、カルプロパミド濃度とＳＣＤＨ酵素活性の阻害率との関係を示す特性図である。図中、○は標準菌株由来の粗酵素液を示し、△は標準菌株ｃＤＮＡから発現したＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素を示し、●は抵抗性株由来の粗酵素液を示し、▲は抵抗性株ｃＤＮＡから発現したＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素を示している。
図９は、標準菌株のｃＤＮＡを大腸菌中で発現させたＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素及び抵抗性株のｃＤＮＡを大腸菌中で発現させたＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素について、フェノキサニル及びジクロシメットの濃度と阻害率との関係を示す特性図である。図中、○は標準菌株ｃＤＮＡから発現したＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素に対するフェノキサニルによる阻害を示し、△は抵抗性株ｃＤＮＡから発現したＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素に対するフェノキサニルによる阻害を示し、●は標準菌株ｃＤＮＡから発現したＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素に対するジクロシメットによる阻害を示し、△は抵抗性株ｃＤＮＡから発現したＧＳＴ融合ＳＣＤＨ酵素に対するジクロシメットによる阻害を示している。
図１０は、実施例６で行ったＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を応用してＳＣＤＨ酵素における、Ｖａｌ７５Ｍｅｔ変異を解析した結果を示す電気泳動写真（３％アガロースゲル）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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