(57)【要約】本発明は、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド又はタンパク質、該ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、該ペプチド又はタンパク質と転写因子とが連結したキメラタンパク質、該ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子と転写因子をコードする遺伝子とが連結したキメラ遺伝子、該キメラ遺伝子を有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを含む形質転換体に関する。本発明の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドは、極めて短いサイズであるため、その合成は極めて簡単であり、特定の遺伝子のみを標的にした転写抑制を効率的に行うことができるので、ガン遺伝子の発現の抑制、色素代謝系の酵素をコードする遺伝子の発現を制御など、極めて広範な分野において適用可能でかつ有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
2003055903.tif 000100
（式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
【請求項２】
下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
2003055903.tif 000101
（式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
【請求項３】
下記式（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
2003055903.tif 000102
（式中、Ｚ１はＬｅｕ又はＡｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０から１０個のアミノ酸残基を表す。）
【請求項４】
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
（式中、Ｚ４はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表す。）
【請求項５】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質
（ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号６１に示すアミノ酸配列
（ｄ）配列番号６１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【請求項６】
下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
2003055903.tif 000103
（式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
【請求項７】
下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
2003055903.tif 000104
（式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
【請求項８】
下記式（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
2003055903.tif 000105
（式中、Ｚ１はＬｅｕ又はＡｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０から１０個のアミノ酸残基を表す。）
【請求項９】
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
（式中、Ｚ４はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表す。）
【請求項１０】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号６１に示すアミノ酸配列
（ｄ）配列番号６１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１１】
請求項１から５のいずれかに記載のペプチド又はタンパク質をコードする部分を含み、その両端部に制限酵素部位を有する二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかに記載のペプチド又はタンパク質と転写因子とを連結したキメラタンパク質。
【請求項１３】
請求項６から１０のいずれかに記載の遺伝子と転写因子をコードする遺伝子とを連結したキメラ遺伝子。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキメラ遺伝子を有する組み換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組み換えベクターを含む植物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド又はタンパク質、該ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、該ペプチド又はタンパク質と転写因子とが連結したキメラタンパク質、該ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子と転写因子をコードする遺伝子とが連結したキメラ遺伝子、該キメラ遺伝子を有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを含む形質転換体に関する。
背景技術
これまで生体遺伝子のｍＲＮＡへの転写を抑制又は該遺伝子の発現を抑制する手段として、アンチセンス法又はリボザイム法が知られており、これらは、例えば、発癌遺伝子等疾病の原因となる遺伝子の発現の抑制又は植物の改良等への利用に関して研究が進められている。アンチセンス法では、転写を抑制しようとする標的遺伝子又はこれを転写したｍＲＮＡ等の特定部位と相補的なアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡが用いられるが、調製されたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは該標的遺伝子以外の遺伝子の発現抑制には使用できず、他の標的遺伝子に対してはその配列に合わせて新たにアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを調製する必要がある。一方、リボザイム法では、標的ＤＮＡ又はｍＲＮＡをリボザイムにより切断するには、該標的ＤＮＡ又はｍＲＮＡと結合するための相補的な配列を有し、かつ所定位置で切断可能なようにリボザイムを設計する必要がある。また、標的遺伝子を切断するように設計されたリボザイムであっても、例えば、これを、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等のプロモーター及び転写終結配列に連結して導入ベクターを構築し、実際に植物細胞中に導入すると、転写されたリボザイムに余分な配列が付加されてリボザイム活性が失われる場合がある。また、これらの従来技術においては、当然のことながら標的遺伝子の特定、塩基配列の決定が不可欠となっていた。このほか、遺伝子ノックアウト法により遺伝子の発現を抑える方法もあるが、この方法によっては例えば複２倍体植物においては適用ができなかった。
一方、上記従来技術とは全く別のアプローチとして、本発明者等は、シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３、ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７、及びＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（特開２００１−２６９１７７号、２００１−２６９１７８号、２００１−２９２７７６号、及び２００１−２９２７７７号公報）。さらに、本発明者等は、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３（特開平２００１−２６９１７６号公報）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質をコードする遺伝子（特開平２００１−２６９１７９号公報）、及びＺｎフィンガータンパク（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についてもまた、上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見い出している。そして、これらの遺伝子の塩基配列はまちまちではあるが、これらの遺伝子がコードするタンパク質又はペプチドには、（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐなる共通のモチーフ（但し、Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す。）が存在することを明らかにした（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１３，１９５９−１９６８，Ａｕｇｕｓｔ，２００１）。
従って、本発明の課題は、従来のアンチセンス法又はリボザイム法のように標的遺伝子の塩基配列に合わせてその都度ＤＮＡ又はＲＮＡの設計を行う必要がなく、簡便でかつ広く適用可能な遺伝子の転写抑制手段を提供することにある。また、本発明のもう一つの課題は、上記転写抑制タンパク質に関する研究をさらに進めて、遺伝子の転写抑制を行う場合において実際に必要となる最も基本的なアミノ酸配列部分を確定し、遺伝子の転写抑制をさらに簡便に行うためのペプチド及びその遺伝子を提供することにある。
発明の開示
本発明者等は、上記課題を解決するため、上記の共通のモチーフを有するタンパク質について鋭意研究の結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するという驚くべき発見をした。本発明者等はまた、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮ（以下、ＳＵＰという場合がある。）タンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
2003055903.tif 000002
（式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（２）下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
2003055903.tif 000003
（式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（３）下記式（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
2003055903.tif 000004
（式中、Ｚ１はＬｅｕ又はＡｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０から１０個のアミノ酸残基を表す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド。
（式中、Ｚ４はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表す。）
（５）以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質
（ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号６１に示すアミノ酸配列
（ｄ）配列番号６１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
（６）下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
2003055903.tif 000005
（式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（７）下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
2003055903.tif 000006
（式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（８）下記式（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
2003055903.tif 000007
（式中、Ｚ１はＬｅｕ又はＡｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０から１０個のアミノ酸残基を表す。）
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドをコードする遺伝子。
（式中、Ｚ４はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表す。）
（１０）以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号６１に示すアミノ酸配列
（ｄ）配列番号６１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
（１１）上記（１）から（５）のいずれかのペプチド又はタンパク質をコードする部分を含み、その両端部に制限酵素部位を有する二本鎖ＤＮＡ。
（１２）上記（１）から（５）のいずれかのペプチド又はタンパク質と転写因子とを連結したキメラタンパク質。
（１３）上記（６）から（１０）のいずれかの遺伝子と転写因子をコードする遺伝子とを連結したキメラ遺伝子。
（１４）上記（１３）のキメラ遺伝子を有する組み換えベクター。
（１５）上記（１４）の組み換えベクターを含む形質転換体。
（１６）上記（１４）の組み換えベクターを含む植物。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明においては、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが提供される。
2003055903.tif 000008
（式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
上記式（Ｉ）中、Ｘ１についてアミノ酸残基の数は０〜１０個であればよいが、使用するペプチドの合成のし易さからみれば、短い方がよく、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
また、Ｘ３のアミノ酸残基の数は重要であるが、驚くべきことに最低６個あれば上記機能を示すことが見いだされた。さらに、これらＸ１及びＸ３においてはアミノ酸の種類はどのようなものであってもよく、例えば、Ｘ３については、上記従来技術に示したペプチドの共通モチーフ（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）ＰのうちＰ（プロリン）は必要なく、単にアラニンを並べたものであってもよい。
これに対して、ＬＤＬＮＬ（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ）、又はＬＤＬＮ（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ）のみの配列では上記機能を示さず、また、Ｘ２については５個又は６個のアミノ酸残基を有するよう設計したものは、極めて顕著な上記機能を示すのに対して３個のアミノ酸残基を有するように設計したものは上記機能を示さない。
本発明においてはまた、下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが提供される。
2003055903.tif 000009
（式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
上記式（ＩＩ）中、Ｙ１についてアミノ酸残基の数は０〜１０個であればよいが、使用するペプチドの合成のし易さからみれば、短い方がよく、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
また、Ｙ３のアミノ酸残基の数も、最低６個あれば上記機能を示すことが見いだされた。さらに、これらＹ１及びＹ３においてはアミノ酸の種類はどのようなものであってもよい。
本発明においてはさらに、下記式（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが提供される。
2003055903.tif 000010
（式中、Ｚ１はＬｅｕ又はＡｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表す。）
上記式（ＩＩＩ）中、Ｚ３についてアミノ酸残基の数は０〜１０個であればよいが、使用するペプチドの合成のし易さからみれば、短い方がよく、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。Ｚ３の具体例としては、例えばＧ、ＧＦＦ、ＧＦＡ、ＧＹＹ、ＡＡＡ等が挙げられるが、これらに限定はされない。上記（ＩＩＩ）で表されるペプチドは、従来技術に示したペプチドの共通モチーフ（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐとは異なるＤＬＥＬＲＬなるモチーフを有し、これはＳＵＰタンパク質の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ）に相当する。全ペプチド数はペプチド合成のし易さからみれば、多くても合計で２０アミノ酸以下のものが望ましい。例えば下記の各ペプチドが例示される。
2003055903.tif 000011
さらに、本発明の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドとしては、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕなる最小配列を有するペプチドであってもよい。
上記のペプチドにおいて、最小配列部分のグルタミン酸（Ｅ）はグルタミン（Ｑ）又はアスパラギン酸（Ｄ）に置き換えたものでもよく、例えば、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕなるペプチドの転写抑制効果も極めて優れている。これに対して、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕなる配列では転写抑制機能がない。
以上のことから、上記式（Ｉ）から（ＩＩＩ）で表されるペプチドにおいて、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を発揮するために必要な最小限のペプチドのアミノ酸残基の数は、わずか５から６個にすぎない。
さらに、本発明においては、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するタンパク質が提供される。
（ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号６１に示すアミノ酸配列
（ｄ）配列番号６１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
上記の「配列番号３１（又は配列番号６１）に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異が導入される。
配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するＳＵＰタンパク質及びそれをコードする遺伝子はそれ自体公知である。該アミノ酸配列の１９５〜１９９番目の配列（塩基配列の５８３〜５９７に相当）は、ロイシン（Ｌ）−アスパラギン酸（Ｄ）−ロイシン（Ｌ）−グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）であり、また、この配列の３末端下流側にはプロリン残基を含まず、上記従来技術に示した（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐなるモチーフとは異なるアミノ酸配列を有する。
また、本発明において転写因子を転写抑制因子に変換するために使用されるタンパク質は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するタンパク質に限られず、その部分配列を有するタンパク質又はペプチドであってもよい。
その部分配列を有するタンパク質としては、例えば、配列番号６１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５〜２０４番目のアミノ酸配列）を有するタンパク質が挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（ＩＩＩ）で表されるペプチドが挙げられる。
本発明によればまた、上記のいずれかのペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
本発明においては、上記のいずれかのペプチド又はタンパク質と転写因子とが連結したキメラタンパク質；上記のいずれかのペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子と転写因子をコードする遺伝子とが連結したキメラ遺伝子も提供される。このキメラ遺伝子を含む組み換えベクターを用いて形質転換した形質転換体においては、該キメラ遺伝子に対応するキメラタンパク質が生成される。このキメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合領域は標的遺伝子と結合するが、この場合、転写因子の機能は、転写抑制機能に変換され、該標的遺伝子の転写が抑制され、標的遺伝子の発現は起こらない。
本発明のキメラタンパク質による転写抑制機能は遺伝子の種類を問わず作用する。本発明のキメラタンパク質の転写抑制機能は標的遺伝子との結合が必要であるから、上記のペプチド又はタンパク質コードする遺伝子（以下、本発明の遺伝子という場合がある）は、特定の標的遺伝子に結合する転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合させてキメラ遺伝子とし、特定の遺伝子のみを標的にした転写抑制を行うことができる。
すなわち、本発明のキメラ遺伝子は、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド又はタンパク質と転写因子とが連結したキメラタンパク質を発現し、該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが結合する遺伝子の転写を特異的に抑制する。したがって、ある特定の遺伝子の転写抑制を行う場合、該遺伝子の転写を支配している転写因子を選び、該転写因子をコードする遺伝子の末端又はＤＮＡ結合ドメインに本発明の遺伝子を連結させてキメラ遺伝子を構築し、該遺伝子を適当なベクターに連結して、上記特定の遺伝子の転写を抑制したい生体部位に導入して、上記特定の遺伝子の転写を抑制すればよい。
さらに、本発明の上記キメラ遺伝子により生ずるキメラタンパク質は、その転写因子のＤＮＡ結合ドメインが結合する遺伝子の転写を特異的に抑制し、この抑制は優性形質として現れる。すなわち、この遺伝子の転写に重複して関与する他の転写因子の機能をも抑制する。
この点については、ＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤＣＯＴＹＬＥＤＯＮ１（ＣＵＣ１）転写因子を用いた（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，９，８４１，１９９７）場合を例にしてさらに詳細に説明する。
ＣＵＣ１は、同じＮＡＣドメインを持つＣＵＣ２と共に、芽生えの頂芽の形成を制御する転写因子であり、ＣＵＣ１とＣＵＣ２遺伝子の両方に変異を持つ場合にのみ、その植物体の子葉がカップ状の形態（ｃｕｐ−ｓａｈｐｅｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）を示し、かつ頂芽の分裂組織の形成が行われないことが明らかになっている。一方、ＣＵＣ１又はＣＵＣ２の一方だけに変異が入っているものは正常であることから、ＣＵＣ１とＣＵＣ２は、機能的に重複した（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）因子であることが知られている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６，１５６３，１９９９；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８，１１２７，２０００）。これら重複した機能を持つＣＵＣ１とＣＵＣ２転写因子の遺伝子のうち、一方の遺伝子、例えばＣＵＣ１遺伝子に、本発明のペプチドをコードする遺伝子を結合させたキメラ遺伝子を植物体で発現させた場合、発現したキメラタンパク質は、ＣＵＣ１転写因子ばかりでなく、機能的に重複したＣＵＣ２転写因子の転写活性をも抑制し、ＣＵＣ１転写因子が制御する遺伝子の発現を抑制することができる。この場合、その植物体の子葉はｃｕｃ１／ｃｕｃ２の二重変異体の形質であるカップ状（ｃｕｐ−ｓｈａｐｅｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）の形状になり、また、頂芽分裂組織は形成されない。後記実施例５では、本発明のペプチドＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（該ペプチドをＳＲＤと称する）をコードする遺伝子とＣＵＣ１遺伝子とを融合させたキメラ遺伝子を構築し（図１４）、キメラ遺伝子でシロイヌナズナ植物を形質転換した結果、ｃｕｃ１／ｃｕｃ２の二重欠損株である特徴を示すカップ状（ｃｕｐ−ｓｈａｐｅｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）の形質（図１５：右）を示すこと、及びＣＵＣ１転写因子によって制御されている頂芽分裂細胞の形成を制御するＳＴＭ遺伝子の欠損株と同様に、頂芽分裂組織の形成がみられないことが確認された。このことは、転写活性化機能を有するＣＵＣ１転写因子が、本発明の上記ペプチドＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡとの融合により、転写抑制因子に機能変換したことを示し、さらにＣＵＣ１転写因子ばかりでなく、機能的に重複するＣＵＣ２転写因子の活性をも優先的に抑制し、下流の遺伝子の発現を抑制していることを示す。
以上のことから理解されるように、本発明のペプチド及びそれをコードする遺伝子は、任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有し、さらに機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性も抑制する能力を有する。
一方、植物の転写因子は、多くの場合、ＣＵＣで示されたように、機能的に重複した複数の転写因子を持つ場合が多く、本発明により機能変換した転写抑制因子は、優性形質（ドミナント）で作用することから、本発明によれば、これまで一遺伝子のノックアウトでは明らかにされなかった転写因子の機能解析が可能となり、また、コムギなどの複二倍体ゲノムを持つ植物にも有効に作用できる等の点で、極めて有用な手段である。
上記したように、本発明のキメラ遺伝子は、該遺伝子に対応するキメラタンパク質を生成させ、このキメラタンパク質が標的遺伝子と結合することにより、該標的遺伝子の転写を抑制するものであるから、このキメラタンパク質を別途合成し、これを直接標的遺伝子が存在する生体部位に導入してもよい。
このキメラタンパク質の合成には、通常の遺伝子工学的手法を用いて行えばよく、例えば、上記キメラ遺伝子を適当なベクターに組み込み、これを用いて形質転換させた微生物を培養することにより、上記キメラタンパク質を多量に合成することができる。
本発明の遺伝子の転写因子に対する結合位置は、該転写因子中のＤＮＡ結合ドメインをコードする領域の下流側である。本発明の遺伝子を転写因子をコードする遺伝子に挿入しようとする場合、転写因子をコードする遺伝子の切断、本発明の遺伝子の連結、再結合等の面倒な操作を伴うので、単に該転写因子のタンパク質コード領域の下流側末端に、本発明の遺伝子を結合するのが簡便である。この点は本発明の利点の一つでもある。
なお、本発明の遺伝子は、上記式（Ｉ）から（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、あるいは配列番号３１又は６１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであれば塩基配列はどのようなものであってもよい。また、本発明の遺伝子は、転写因子をコードする遺伝子と連結するための連結部位を設けてもよく、また本発明の遺伝子のアミノ酸読み枠と転写因子をコードする遺伝子読み枠が一致しない場合には、一致するように遺伝子を設計する。したがってそのための付加的な塩基配列を有していてもよい。
本発明において遺伝子の転写を抑制するには、上記キメラタンパク質を、直接生体に導入してもよいが、例えば植物の品種改良等を行う場合、恒常的に特定遺伝子の転写を抑制し、該遺伝子の発現を抑制する必要があり、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに連結させ、この組換えベクターを用いて植物等を形質転換するのがより効果的である。これにより、キメラタンパク質をコードする遺伝子は植物体内で恒常的に発現し、生成されたキメラタンパク質は、遺伝子の転写を抑制し続ける。
さらに、この転写抑制について、転写因子としてシロイヌナズナＥＴＨＬＥＮ−ＩＮＳＥＳＩＴＩＶＥ３遺伝子（以下、ＥＩＮ３遺伝子という。）を用いた場合を例にとり、具体的に説明する。なお、このＥＩＮ３遺伝子及びその産生タンパクの配列を配列番号５２に示す。
ＥＩＮ３遺伝子産物であるＥＩＮ３タンパク質因子は、転写因子として機能し、植物ホルモンであるエチレンによって誘導される生理作用である黄化芽生えの形態変化（トリプルレスポンス）、伸長阻害、エチレン応答性遺伝子の発現などを媒体するエチレンシグナル伝達因子である。
このＥＩＮ３遺伝子のＤＮＡ結合ドメインをコードする領域に、本発明の上記ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子断片を連結してキメラ遺伝子とし、これを、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを有する植物形質転換用ベクターに連結し、この組み換えベクターを用いてシロイヌナズナを形質転換する。シロイヌナズナ野生株が、エチレン又はその前駆体である１−アミノシクロプロパン−Ｄ−カルボン酸の存在下、黄化芽生えの形態変化（トリプルレスポンス）、伸長阻害を示すのに対して、上記形質転換されたシロイヌナズナは、これらのエチレン応答性の生理作用が著しく抑制される。従って、本発明の遺伝子は、ＦＩＮ３の転写活性化機能を抑制機能に変換する。
本発明において、転写抑制因子に変換される転写因子及びその遺伝子は、上記ＥＩＮ３とその遺伝子、酵母ＧＡＬ４、ＥＲＦ４、ＣＢＦ１、ＥＲＦ２、ＥＲＥＢ１，ＣＵＣ１、ＣＵＣ２等のタンパク質又はその遺伝子等が挙げられるが、本発明は特にこれらに限定されるものではなく、広く動植物、微生物の転写因子及びその遺伝子が利用可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１においては、（ｉ）酵母のＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域を結合させた種々の合成遺伝子断片を、植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないでエフェクタープラスミドを構築するとともに、（ｉｉ）カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域とＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列とカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳプロモーターのＴＡＴＡ領域をプロモーター領城に結合したルシフェラーゼ遺伝子からなるリポーター遺伝子を構築した。これらのエフェクタープラスミドとリポーター遺伝子とを同時にシロイヌナズナ葉にパーティクルガンを用いて導入し、リポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の活性を測定することによって合成した遺伝子断片の転写抑制能を調べたものである。
実施例２は、ＳＵＰの全アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、ＳＵＰの１７５−２０４アミノ酸配列を有するＳＵＰ部分タンパク質をコードする遺伝子の転写抑制能をリポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の測定により調べたものである。
実施例３は、ＳＵＰの１７５−２０４アミノ酸配列を有するＳＵＰ部分タンパク質をコードする遺伝子によるＥＩＮ３の転写機能の抑制を植物体において調べたものである。
実施例４は、ＥＲＦ３の１９１−２２５のアミノ酸配列を有するＥＲＦ３部分タンパク質をコードする遺伝子によるＥＩＮ３の転写機能の抑制を植物体において調べたものである。
実施例５は実際の植物における転写因子であるＣＵＣ１遺伝子にＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤ；ＳＵＰＥＲＭＡＮリプレッションドメイン１９４−２０４）をコードする遺伝子断片を結合させ、これをカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないで形質転換プラスミドを構築し、該プラスミドによりシロイヌナズナ植物体を形質転換させ、その発芽後の子葉の形態を観察することにより、ＣＵＣ１遺伝子及び該遺伝子と機能的に重複するＣＵＣ２遺伝子に対する上記遺伝子断片の転写機能抑制効果を調べたものである。
実施例６はＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤ１；ＳＵＰＥＲＭＡＮリプレッションドメイン１９５−２０４）、及びＬＤＬＮＬＡＰＰＭＥＦ（ＲＤ１；ＥＲＦ３リプレッションドメイン２１５−２２５）をコードする遺伝子を植物における転写因子であるＥＩＮ３遺伝子に結合し、同様にしてシロイヌナズナ植物体を形質転換させ、エチレン存在下における植物の形態を観察することにより、ＥＩＮ３遺伝子に対する上記遺伝子断片の転写機能抑制効果を調べたものである。
実施例７は、ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ−ＯＦ−ＡＮＴＨＯＣＹＡＮＩＮ−ＰＩＧＭＥＮＴ１（ＰＡＰ１）［Ｂｏｒｅｖｉｔｚ  Ｊ．Ｏ．，Ｘｉａ  Ｙ．，Ｂｌｏｕｎｔ  Ｊ．，Ｄｉｘｏｎ  Ｒ．Ａ．＆  Ｌａｍｂ  Ｃ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＭＹＢ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２，２３８３（２０００）］のカルボキシル末端にＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡのアミノ酸配列で示される１２アミノ酸からなるペプチド（ＳＲＤＸ）を付与したキメラリプレッサー（３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸ）をシロイヌナズナ植物体に導入して、形質転換体植物を作製し、該植物におけるアントシアニン合成系遺伝子の転写抑制効果を調べたものである。
実施例８は、ＡｔＭＹＢ２３転写因子［Ｋｉｒｉｋ  Ｖ．，Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ  Ａ．，Ｒａｄｃｈｕｋ  Ｖ．，Ａｄｌｅｒ  Ｋ．，Ｈｕｌｓｋａｍｐ  Ｍ．＆  Ｂａｕｍｌｅｉｎ  Ｈ．，Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＭＹＢ２３  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２３５，３６６（２００１）；ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＭＹＢ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２，２３８３（２０００）］のカルボキシル末端にＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡのアミノ酸配列で示される１２アミノ酸からなるペプチド（ＳＲＤＸ）を付与したキメラリプレッサー（３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸ）をシロイヌナズナ植物体に導入することによって形質転換体植物を作製し、トリコームの発生を制御する遺伝子の転写抑制効果を調べたものである。
実施例９は、タバコ葉およびペチュニアにおいて転写抑制実験を行ったものである。
（実施例１）リプレッションドメインとして機能するペプチドの同定
（１）エフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤの構築（図１）
クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｈｏＩとＳａｃＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端処理した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下ＣａＭＶ  ３５Ｓという）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓターミネーター、以下Ｎｏｓ−ｔｅｒという）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
クローンテック社製のｐＡＳ２−１ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域（１−１４７アミノ酸残基）をコードする７４８  ｂｐのＤＮＡ断片（以下ＧＡＬ４ＤＢＤという）をアガロースゲル電気泳動によって単離した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理をした。このＧＡＬ４ＤＢＤコード領域を含むＤＮＡ断片を、先ほどの３５Ｓ−ＮｏｓのＤＮＡの３５ＳプロモーターとＮｏｓターミネーター間の平滑末端にした部位に挿入し、３５Ｓプロモニターに対して酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域のＯＲＦが順方向に並んでいるものを選抜してｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤベクターを構築した。
ＧＡＬ４ＤＢＤのアミノ酸読み枠（フレーム）と読み枠が一致するように設計した調査するペプチドをコードする両鎖ＤＮＡを合成した。以下に合成したＤＮＡの塩基配列と、それらがコードしているアミノ酸配列を示す。
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これらのペプチドをコードするＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいたｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込み、エフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤを構築した。
（２）レポーター遺伝子の構築
（２−１）ｐＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子の構築（図２）
プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｓｔＩで消化した。ｐＢＩ２２１プラスミド（クローンテック社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｓｔＩで消化し、Ｎｏｓ−ｔｅｒ（ｎｏｐａｌｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）領域を含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。得られた断片を制限酵素ＥｃＱＲＩとＳｓｔＩで消化しておいたプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ部位に挿入した。カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターＴＡＴＡボックスを含む相補鎖のＤＮＡ１：
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を合成した。
合成したＤＮＡを９０℃２分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。Ｎｏｓ−ｔｅｒを持つｐＵＣ１８プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化した。合成した２本鎖ＤＮＡをｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ＴＡＴＡ−ｂｏｘとＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドを構築した。
このプラスミドを制限酵素ＳｓｔＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。
ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターＰＧＶ−ＣＳ２（東洋インキ社製）を制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片を上記のＴＡＴＡボックスとＮｏｓターミネーターを含むプラスミドに挿入し、ｐＴＡＴＡ−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築した。
酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を５コピー持つプラスミドｐＧ５ＣＡＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。ＴＡＴＡ−ＬＵＣベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に平滑末端化した５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片を挿入し、得られたプラスミドのうちＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リポーター遺伝子ｐＧＡＬ４−ＬＵＣを構築した（図２参照）。
（２−２）ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣの構築（図３）
プラスミドｐＢＩ１２１を鋳型として、５末アッパープライマー：
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３末ローワープライマー：
ＡＡＧＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＴＣ（配列番号２８）を用いてＰＣＲを行い、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−８００〜−４６領域を含むＤＮＡ断片を得た。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−８００〜−４６領域含む７６０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。このＨｉｎｄＩＩＩ断片を、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたリポーター遺伝子ｐＧＡＬ４−ＬＵＣに挿入し、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターＤＡＮが順方向に向いているものを選抜し、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築した（図３参照）。
（３）レファレンス遺伝子の構築
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセットベクターｐＲＬ−ｎｕｌｌを制限酵素ＮｈｅＩとＸｂａＩ制限酵素で切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含む９４８ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片をエフェクタープラスミドの構築の際に用いたＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩ２２１ベクターのＧＵＳ遺伝子があった領域に挿入した。得られたプラスミドのうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子が順方向に向いているものを選抜した（ｐＰＴＲＬの構築）。
（４）レポーター遺伝子の活性測定法
シロイヌナズナ植物にリポーター遺伝子とエフェクタープラスミドをパーティクルガン法を用いて導入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を測定することによって調べた。
（５）パーティクルガンによる遺伝子導入
上記で作成したｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子とエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤのＤＮＡを各１．２ｍｇと、リファレンス遺伝子プラスミド０．３２ｍｇを直径１ｍｍの金粒（ＢｉｏＲａｄ社製）５１０ｍｇにコーティングした。生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉７枚を、水で湿らせた濾紙をおいた９ｃｍシャーレにならべ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機を用いてＤＮＡを打ち込んだ。２２℃で６時間明所で静置した後、レポーター遺伝子の活性を測定した。
（６）ルシフェラーゼ活性測定
６時間静置したシロイヌナズナ葉を、液体窒素中で粉砕し、Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付されているＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌに懸濁した後、遠心して上清を回収した。この細胞抽出液２０μｌをＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付されている測定バッファー１００μｌに混合し、ルミノメーター（ＴＤ２０／２０，Ｔｕｒｅｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ社製）を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。ホタル・ルシフェラーゼ及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を測定キットの説明書に従って１０秒間の発光を積分モードでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値をリポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるＲｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆａｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙを測定値として求めた。実験は、エフェクタープラスミドの種類ごと３回個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差を求めた。エフェクターを入れない場合のｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子の活性の相対値を１００として、エフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにリポーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効果を調査した。すなわち、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子と各ペプチド配列をコードするＤＮＡを組み込んだエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤを導入したとき、リポーターの活性値が減少すれば、そのペプチドは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。以下、リポーターの活性値を測定して、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーターの相対活性値が１００以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレッサー機能が存在すると判断した。
（７）リプレッサードメインの同定
図４Ａに、リポーター遺伝子とエフェクタープラスミドの構造を示す。図４Ｂ及び下記表１にリポーター遺伝子の活性の測定結果を示す。
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上記結果に示されるように、ＬＤＬ（Ｎ／Ｅ）Ｌ又はＦＤＬＮ（Ｆ／Ｉ）を含み、Ｃ−末端側に少なくとも６個のアミノ酸を持つペプチド、あるいはＤＬ（Ｅ／Ｑ／Ｄ）ＬＲＬを含むペプチドは、リポーター遺伝子の活性をエフェクターを導入しないリポーター遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ８５％〜９８％減少させたことから、これらのペプチドは転写抑制能を持つ機能ペプチドとして機能することが証明された。
対照実験として行ったペプチド配列を含まないｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤは、リポーター遺伝子の活性を低下させなかった。このことは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに結合した上記ペプチドが、転写を抑制するリプレッサーとして機能していることを示している。
（実施例２）ＳＵＰ遺伝子含有エフェクタープラスミドによる転写抑制
（１）ＳＵＰ遺伝子の単離
ＳＵＰ遺伝子の塩基配列は、すでに報告されている。シロイヌナズナＳＵＰ遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、ＳＵＰ遺伝子を含むＴＡＣライブラリーＫ１４Ｂ１５クローン（かずさＤＮＡ研究所より譲渡）を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＳＵＰ遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。全塩基配列を決定し、すでに報告されているＳＵＰ遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。なお上記ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして２５サイクル行った。
（２）エフェクタープラスミドの構築
（２−１）ＳＵＰ遺伝子の全タンパク質コード領域を含むエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰの構築（図５）
クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｈｏＩとＳａｃＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端処理した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、ＣａＭＶ  ３５ＳとＮｏｓ−ｔｅｒを含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
クローンテック社製のｐＡＳ２−１ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母における転写活性化因子であるＧＡＬ４ＤＢＤをアガロースゲル電気泳動によって単離した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理をした。このＧＡＬ４ＤＢＤコード領域を含むＤＮＡ断片を、先ほどの３５Ｓ−ＮｏｓのＤＮＡの３５ＳプロモーターとＮｏｓターミネーター間の平滑末端にした部位に挿入し、３５Ｓプロモーターに対して酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域のＯＲＦが順方向に並んでいるものを選抜してｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤベクターを構築した。
ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したＳＵＰ遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１（配列番号２９：ＳＵＰ遺伝子・塩基配列１−１８に結合）：ＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣと、
制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ２（配列番号３０：ＳＵＰ遺伝子塩基配列６０２−６４１に結合）：
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を用いてＳＵＰ遺伝子の全タンパク質コード領域（配列番号３１：アミノ酸配列１−２０４）をＰＣＲ法によって増幅し、ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応℃４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして２５サイクル行った。以下全てのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離した。このＳＵＰをコードするＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいたｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込み、エフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰを構築した。
（２−２）ＳＵＰのアミノ酸配列１７５−２０４を含むエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−１７５／２０４ＳＵＰの構築
ＧＡＬ４ＤＢＤをコードするフレームと読み枠が一致するように設計した５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ３（配列番号３２：結合部位ＳＵＰ塩基配列５２２−５３９）：ＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＧと、
制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ２（配列番号３０：結合部位ＳＵＰ塩基配列６０２−６４１）：
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を用いてＳＵＰのアミノ酸配列１７５−２０４コード領域に該当する塩基配列５２３−６１２の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、塩基配列を決定した。このＳＵＰのアミノ酸配列１７５−２０４をコードするＤＮＡ断片（ＤＮＡ領域５２３−６１２）を、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込み、エフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−１７５／２０４ＳＵＰを構築した。
（２−３）比較対照エフェクタープラスミドの構築（図６）
シロイヌナズナＡｔＥＲＦ５ｃＤＮＡを含むクローンｐＡｔＥＲＦ５を鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ４：
2003055903.tif 000021
３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ５：
2003055903.tif 000022
を用いてＡｔＥＲＦ５全タンパク質コード領域をＰＣＲ法によって増幅した。このＤＮＡ断片を、上記に示した平滑末端にした３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片に組み込み、エフェクタープラスミドｐ３５Ｓ−ＡｔＥＲＦ５を構築した。
また、これとは別に，ＳＵＰ遺伝子及び１７５／２０４ＳＵＰを用いない他は上記手段と同様にしてエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢを構築した。
（３）レポーター遺伝子の構築
リポーター遺伝子として、以下の手法により、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣ及びｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣの２種を構築した。
（３−１）ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣの構築（図２及び図３）
ａ．ｐＧＡＬ４−ＬＵＣの構築（図２）
プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｓｔＩで消化した。一方、ｐＢＩ２２１プラスミド（クローンテック社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｓｔＩで消化し、Ｎｏｓ−ｔｅｒ（ｎｏｐａｌｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）領域を含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。得られた断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｓｔＩで消化しておいたプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ部位に挿入した。次いで、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターＴＡＴＡボックスを含む相補鎖のＤＮＡ１：
2003055903.tif 000023
を合成した。合成したＤＮＡを９０℃２分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。Ｎｏｓを持つｐＵＣ１８プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化した。合成した２本鎖ＤＮＡをｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ＴＡＴＡ−ｂｏｘとＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドを構築した。
このプラスミドを制限酵素ＳｓｔＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。
一方、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターＰＧＶ−ＣＳ２（東洋インキ社製）を制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片を上記のＴＡＴＡボックスとＮｏｓターミネーターを含むプラスミドに挿入しｐＴＡＴＡ−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築した。
さらに、酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を５コピー持つプラスミドｐＧ５ＣＡＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。ＴＡＴＡ−ＬＵＣベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に平滑末端化した５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片を挿入し、得られたプラスミドのうちＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リポーター遺伝子ｐＧＡＬ４−ＬＵＣを構築した（図２参照）。
ｂ．ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣの構築（図３）
プラスミドｐＢＩ１２１を鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ６：
2003055903.tif 000024
３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ７：
2003055903.tif 000025
を用いてＰＣＲを行い、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−８００〜−４６領域を含むＤＮＡ断片を得た。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−８００〜−４６領域含む７６０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。このＨｉｎｄＩＩＩ断片を、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたリポーター遺伝子ｐＧＡＬ４−ＬＵＣに挿入し、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターＤＮＡが順方向に向いているものを選抜し、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築した（図３参照）。
（３−２）ｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣの構築（図７及び図８）
４個のＧＣＣ  ｂｏｘ配列（ＡＧＣＣＧＣＣ）を含む４５ｂｐＤＮＡの相補鎖（下記）を合成し、７０℃で１５分間加熱した後、室温で６０分放置し、アニールさせ、２本鎖ＤＮＡとした。
2003055903.tif 000026
この４５ｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩで予め消化しておいた上記のＴＡＴＡ−ＬＵＣベクターと１：１のモル数になるように混合し、Ｔ４リガーゼを用いてライゲーションを行い、ＧＣＣ  ｂｏｘを含むＤＮＡ断片が順方向に入っているものを選択し、プラスミドｐＧＣＣ−ＬＵＣを構築した。このプラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った（図７参照）。
一方、酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を５コピー持つプラスミドｐＧ５ＣＡＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。このＤＮＡ断片を、平滑末端処理をした、ｐＧＣＣ−ＬＵＣプラスミドに挿入し、ＧＡＬ４配列が順方向に入っているものを選択し、ｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築した（図８参照）。
（４）パーティクルガンによる遺伝子導入
ｐＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子１．６μｇ、エフェクタープラスミドとしてｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰ、又はそのデレーションであるｐＧＡＬ４ＤＢ−１７５／２０４ＳＵＰのＤＮＡ１．２μｇ、比較対照プラスミドｐ３５Ｓ−ＡｔＥＲＦ５又はｐＧＡＬ４ＤＢ１．２μｇ、及びリファレンス遺伝子プラスミド０．３２μｇを直径１ｍｍの金粒（ＢｉｏＲａｄ社製）５１０μｇにコーティングした。生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉７枚を、水でしめらせた濾紙をおいた９ｃｍシャーレにならべ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機をもちいてＤＮＡを打ち込んだ。次いで、２２℃で６時間明所で静置した後、レポーター遺伝子の活性を測定した。
（５）ルシフェラーゼ活性測定
６時間静置したシロイヌナズナ葉を、液体窒素中で粉砕し、Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付されているＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ２００μｌに懸濁した後、遠心して上清を回収した。この細胞抽出液２０μｌをＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付されている測定バッファー１００μｌに混合し、ルミノメーター（ＴＤ２０／２０，Ｔｕｒｅｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ社製）を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。ホタル・ルシフェラーゼ及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を測定キットの説明書に従って１０秒間の発光を積分モードでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値をリポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるＲｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆａｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙを測定値として求めた。実験は、エフェクタープラスミドの種類ごと３回個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差を求めた。エフェクターを入れない場合のｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子の活性の相対値を１００、ｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣリポーター遺伝子の相対値を１として、エフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにリポーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効果を調査した。
図９Ａは、リポーター遺伝子とエフェクタープラスミドを示す図である。図９Ａにおいて、５ＸＧＡＬ４はＧＡＬ４転写因子ＤＮＡ結合配列、ＴＡＴＡはＣａＭＶ３５ＳプロモーターＴＡＴＡボックスを含む領域、ＬＵＣはルシフェラーゼ遺伝子、ＣａＭＶ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓタンパク質遺伝子プロモーター、ＧＡＬ４ＤＢは酵母ＧＡＬ４転写因子ＤＮＡ結合ドメインコード領域、Ｎｏｓはノパリン合成酵素遺伝子転写終止領域をそれぞれ表す。
図９ＢはＳＵＰ及びＳＵＰのディリーションがリポーター遺伝子の活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に及ぼす影響を示す図である。図９Ｂにおいて、左の数字（１７５／２０４等）は、ＳＵＰのアミノ酸領域を示す。真ん中のボックスは左の数字に該当するアミノ酸配列領域を示す。右のグラフは、左の領域をもつエフェクタープラスミドを導入したときのリポーター遺伝子の活性を示す。
図９Ｂの結果によれば、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子とｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰエフェクタープラスミドを導入したときのリポーターの活性値が減少することから、ｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。ｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰエフェクターは、リポーター遺伝子の活性をエフェクターを導入しないリポーター遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ７５％減少させた（図９Ｂ；１／２０４）。対照実験として行ったＳＵＰのコード領城を含まないｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢは、リポーター遺伝子の活性を低下さなかった。このことは、ＳＵＰが転写を抑制するリプレッサーとして機能していることを示している。
また、ＳＵＰ遺伝子のタンパク質コード領域をディリーションしたＤＮＡ断片をもつエフェクタープラスミドであるｐＧＡＬ４ＤＢ−１７５／２０４ＳＵＰは、ｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰを導入した場合よりもさらなる抑制効果を示し、レポーター遺伝子の活性を９５％抑えるリプレッサー機能があることが示された。（図９Ｂ；１７５／２０４ＳＵＰ）。
この結果から、ＳＵＰのリプレッサー機能を持つ領域（リプレッションドメイン）は、ＳＵＰのアミノ酸配列、１７５−２０４領域に存在することが明らかとなった。このアミノ酸配列を配列番号６１に示した。
図１０Ａは、リポーター遺伝子（ｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣ）と各種エフェクタープラスミドを示す図である。
また、図１０Ｂによれば、ｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣリポーター遺伝子と、転写活性化能を持つことが示されているｐ３５Ｓ−ＡｔＴＥＲＦ５エフェクタープラスミドをシロイヌナズナ葉にパーティクルガンで導入すると、リポーター遺伝子の活性は、エフェクタープラスミドを導入しない場合（１とする）に比べ、１５倍以上上昇した。リポーター遺伝子とｐ３５Ｓ−ＡｔＥＲＦ５さらにｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰを同時に導入した場合、リポーター遺伝子の活性は、２．５倍程度にしか上昇しなかった。よって、このことは、ＳＵＰタンパク質は、ＡｔＥＲＦ５の転写活性化能を８４％（１−２．５／１５）抑制する効果を持つことを示している。さらに、ＳＵＰのディリーション領域を持つｐＧＡＬ４ＤＢ−１７５／２０４ＳＵＰをＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣリポーター遺伝子とｐＡＴＥＲＦ５エフェクターと同時に導入した場合、リポーター遺伝子の活性を９０％抑制する効果を示した。ｐ３５Ｓ−ＡｔＥＲＦ５によるリポーター遺伝子の活性の上昇は、ｐＧＡＬ４ＤＢを導入した場合には、影響されないことから、リポーター遺伝子の転写抑制効果は、ＳＵＰタンパク質の効果であることを示している。
（実施例３）ＳＵＰリプレッションドメイン１７５−２０４をコードする遺伝子による、植物体におけるＥＩＮ３の転写活性化機能の抑制
（１）形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築
クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，ＵＳＡ）のプラスミドｐ３５Ｓ−ＧＦＰを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離し回収した。
米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ−ＨＹＧ（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２０３）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によってＧＵＳ遺伝子を除いたＤＮＡ断片を得た。
以下の配列を有するＤＮＡを合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。このＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩを有する。
2003055903.tif 000027
ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター領域をふくむＤＮＡ断片と合成した２本鎖ＤＮＡをＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ−ＨＹＧのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｔＩ部位に挿入し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ２を得た。
（２）形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤの構築
米国ソーク研究所から譲渡された、ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ８：
2003055903.tif 000028
３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ９：
ＡＴＧＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＣ（配列番号４４）を用いて、ＥＩＮ３のアミノ酸配列１−１６２コード領域に該当する塩基配列１−４８５の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、制限酵素ＳｍａＩで切断した後、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離した。この断片を制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、ｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２を得た。
ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを制限酵素ＳｍａＩとＰｓｔＩで切断し、アガロース電気泳動によってＥＩＮ３のアミノ酸配列１６３−５６５の領域をコードするＤＮＡ断片（４８７−１６９５）を単離した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩとＰｓｔＩで切断しておいたクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入しプラスミドｐＥＩＮ３−１６３／５６５を作成した。
ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１０：
2003055903.tif 000029
３末端の終止コドンＴＡＡをＣＣＣに変換した、３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１１：
ＡＴＣＣＣＧＡＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＣ（配列番号４６）を用いてＥＩＮ３のアミノ酸配列５６６−６２８コード領域に該当する塩基配列（１６９６−１８８４）の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、アガロース電気泳動によって単離した。
先に述べた実施例２（２）（２−２）と同様にアミノ酸の読み枠が一致するように作成しておいた、３’末端に制限酵素ＳａｌＩ部位を有するＳＵＰのアミノ酸配列１７５−２０４コード領域に該当する塩基配列（５２３−６１２）の領域を含むＤＮＡ断片と、ＥＩＮ３のアミノ酸配列５６６−６２８コード領域に該当する塩基配列（１６９６−１８８４）の領域を含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＰｓｔＩ、ＳａｌＩで切断しておいた上記ｐＥＩＮ３−１６３／５６５に挿入し、ｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＳｕｐＲＤを作成した。
プラスミドｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＳｕｐＲＤを、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで切断し、ＥＩＮ３のアミノ酸配列１６３−６２８領域とＳＵＰの１７５−２０４の領域をコードするＤＮＡ断片を、アガロース電気泳動によって単離した。単離した断片を、上記で述べたｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２を制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２に挿入し、３５Ｓ−ＥＩＮ３−ＳｕｐＲＤ−Ｎｏｓを含む形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤを得た。
（３）ｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤで形質転換した植物体の作成
ｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤによるシロイヌナズナ植物の形質転換は、Ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｂｙｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ）に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。プラスミドｐＥＩＮ３ＲＤを、土壌細菌［（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）（ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ  １９８６）〕株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルのＹＥＰ培地（下記表２）でＯＤ６００が１になるまで培養した。
2003055903.tif 000030
次いで、培養液から菌体を、回収し、１リットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）（下記表３）に懸濁した。
2003055903.tif 000031
この溶液に、１４日間生育したシロイヌナズナを１分間浸し、感染させた後、再び生育させ結種させた。回収した種子を５０％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下記表４）に蒔種した。
2003055903.tif 000032
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上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体を選抜し、土壌に植え換え、次世代の種子を得た。
（４）形質転換植物のエチレン感受性の有無
得られた次世代（Ｔ２）の形質転換植物の種子を、エチレンの前駆体である１−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｄ−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＣＣ）が最終濃度１０ｕＭ添加され、滅菌された生育培地を含むＭＳプレート（下記表５）に蒔種した。
2003055903.tif 000034
上記種子を、４℃で３日間低温処理した後、暗所２２℃で３日間生育させ、定法に従って、エチレン応答を示す生理現象である黄化芽生えでのトリプルレスポンス（３重応答）を観察した。結果を図１１及び図１２に示す。
図１１及び図１２によれば、野生株であるＣｏｌ−０は、ＡＣＣの存在下で、茎長フックが屈曲し、根の伸長が抑制されるトリプルレスポンスを示すが、ｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤで形質転換した植物体（図１１；３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＳＵＰＲＤ）では、ＥＩＮ３の変異体であるｅｉｎ３植物体（図１１；ｅｉｎ３−１）と同様に、茎長の屈曲及び根の伸長阻害がみられず、エチレン非応答性の形質を示した。また、常光下で生育させた野生型植物体は、エチレンガス（１００ｐｐｍ  １ｍｌ／ｍｉｎ）常時存在下で、エチレン応答性の生理現象である矮性の植物体になるが、ｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤで形質転換した植物体（図１２；３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＳＵＰＲＤ）では、ＥＩＮ３の変異体であるｅｉｎ３植物体（図１２；ｅｉｎ３−１）よりもやや大きな植物体となった。
さらに、野生型ではエチレンで発現が誘導され、エチレン非応答性の変異体であるｅｉｎ３植物体ではエチレンで発現が誘導されない遺伝子であるＰＤＦ１．２遺伝子、塩基性キチナーゼ（ＢＣＨＮ）遺伝子及びＥｔｈｙｌｅｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｆａｃｔｏｒ１（ＥＲＦ１）遺伝子の発現について、野生型とｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤで形質転換した植物体からＲＮＡを精製し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を用いて調べた。
その結果、図１３に示すように、エチレン処理（１００ｐｐＭエチレンガス、１２時間）した野生型（図１３：Ｃｏｌ−０）では、ＰＤＦ１．２、ＥＲＦ１及びＢＣＨＮ遺伝子の発現の誘導がみられた。一方、ｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤで形質転換した植物体（図１３：３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＳＵＰＲＤ）は、エチレン処理を行っても、ｅｉｎ３変異体植物同様ＰＤＦ１．２、ＥＲＦ１及びＢＣＨＮ遺伝子の発現の誘導がみられず、エチレン非応答性の形質を示した（図中、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）は内性コントロールを示す）。
以上の結果から、ＳＵＰの１７５−２０４のアミノ酸配列を持つペプチド及びそれをコードする遺伝子は、任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有していることが明らかとなった。
（実施例４）ＥＲＦ３リプレッションドメイン１９１−２２５をコードする遺伝子による、植物体におけるＥＩＮ３の転写活性化機能の抑制
（１）形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築
形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築は実施例３（１）と同様にして行った。
（２）形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＲＤの構築
米国ソーク研究所から譲渡された、ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ８：
2003055903.tif 000035
３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ９：
ＡＴＧＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＣ（配列番号４４）を用いて、ＥＩＮ３のアミノ酸配列１−１６２コード領域に該当する塩基配列１−４８５の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、制限酵素ＳｍａＩで切断した後、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離した。この断片を制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、ｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２を得た。
ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを制限酵素ＳｍａＩとＰｓｔＩで切断し、アガロース電気泳動によってＥＩＮ３のアミノ酸配列１６３−５６５の領域をコードするＤＮＡ断片（４８７−１６９５）を単離した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩとＰｓｔＩで切断しておいたクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入しプラスミドｐＥＩＮ３−１６３／５６５を作成した。
ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１０；
2003055903.tif 000036
３末端の終止コドンＴＡＡをＣＣＣに変換した、３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１１；
ＡＴＣＣＣＧＡＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＣ（配列番号４６）を用いてＥＩＮ３のアミノ酸配列５６６−６２８コード領域に該当する塩基配列（１６９６−１８８４）の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、アガロース電気泳動によって単離した。
３’末端に制限酵素ＳａｌＩ部位を有するＥＲＦ３のアミノ酸配列１９１−２２５をコードする領域に相当する塩基配列（５７１−６７５）の領域のＤＮＡ断片を、ＥＩＮ３のカルボキシル基末端とフレームと読み枠が一致するように設計した。なお、ＥＲＦ３の全長遺伝子の塩基配列及びそのアミノ酸配列は配列番号５３に示すとおりである。５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１２（配列番号４７；結合部位ＥＲＦ３塩基配列５６９−５９３）：
2003055903.tif 000037
制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１３（配列番号４８；結合部位ＥＲＦ３塩基配列６６１−６７８）：
2003055903.tif 000038
を用いてＥＲＦ３のアミノ酸配列１９１−２２５コード領域に該当する塩基配列（５７１−６７５）の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離した。
このＥＲＦ３のリプレッションドメインをコードするＤＮＡ断片と、ＥＩＮ３のアミノ酸配列５６６−６２８をコードする塩基配列（１６９６−１８８４）のＤＮＡ断片を、制限酵素ＰｓｔＩ−ＳａｌＩで切断しておいた上記ｐＥＩＮ３−１６３／５６５に挿入し、ｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＲＤを作成した。
プラスミドｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＲＤを、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで切断し、ＥＩＮ３のアミノ酸配列１６３−６２８領域とＥＲＦ３の１９１−２２５の領域をコードするＤＮＡ断片を、アガロース電気泳動によって単離した。単離した断片を、上記で述べたｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２を制限酵素ｓｍａＩで切断したｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２に挿入し、３５Ｓ−ＥＩＮ３−ＲＤ−Ｎｏｓを含む形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＲＤを完成させた。
（３）比較対照形質転換ベクターの構築
上記と同じ方法で、下記配列のＥＲＦ３の１９１−２２５のリプレッションドメインの２１５と２１７番目のアスパラギン酸を共にアラニンに置換した変異ドメインを持つＲＤｍをコードするＤＮＡ断片を挿入しｐＥＩＮ３ＲＤｍを完成させた。
2003055903.tif 000039
アラニン置換した変異ドメインをコードするＤＮＡは、以下の両ストランドを合成した。
2003055903.tif 000040
（４）ｐＥＩＮ３ＲＤで形質転換した植物体の作成
実施例３（３）と同様にして、形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＰＲＤ及び比較対照形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＲＤｍを用いてシロイヌナズナ植物の形質転換を行い、さらにハイグロマイシンプレートで選抜し、次世代の種子を得た。
（５）形質転換植物のエチレン感受性の有無
得られた次世代（Ｔ２）形質転換植物の種子を、実施例３（４）と同様にして生育させ、エチレン応答を示す生理現象である、黄化芽生えでのトリプルレスポンス（３重応答）を観察した。同一条件下で野生株Ｃｏｌ−０及びＥＩＮ３の変異体であるｅｉｎ３植物体のエチレン応答性も観察した。結果を図１１、図１２に示す。
図１１によれば、野生株であるＣｏｌ−０は、ＡＣＣの存在下で、茎長フックが屈曲し、根の伸長が抑制されるトリプルレスポンスを示す。また、ＥＲＦ３の１９１−２２５のリプレッションドメインの２１５と２１７番目のアスパラギン酸を共にアラニンに置換した変異ドメインを持つＲＤｍを有するｐＥＩＮ３−ＲＤｍで形質転換された植物体（図１１；３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＲＤｍ）も、上記野生株Ｃｏｌ−０と同様のエチレン応答性を示す。これに対して、ｐＥＩＮ３ＲＤで形質転換された植物体（図１１；３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＲＤ）では、ＥＩＮ３の変異体であるｅｉｎ３植物体（図１１；ｅｉｎ３−１）と同様に、茎長の屈曲及び根の伸長阻害がみられず、エチレン非応答性の形質を示した。
また、図１２によれば、常光下で生育させた野生型植物体は、エチレン（１００ｐｐｍ、１２時間）常時存在下で、エチレン応答性の生理現象である矮性の植物体（図１２；Ｃｏｌ−１）になるが、ｐＥＩＮ３ＲＤで形質転換した植物体（図１２；３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＲＤ）では、ＥＩＮ３の変異体であるｅｉｎ植物体（図１２；ｅｉｎ３−１）とほとんど変わらない大きさを示した。
さらに、野生型ではエチレンで発現が誘導されるが、エチレン非応答性の変異体であるｅｉｎ３植物体ではエチレンで発現が誘導されない遺伝子であるＰＤＦ１．２遺伝子、塩基性キチナーゼ（ＢＣＨＮ）遺伝子及びＥｔｈｙｌｅｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｆａｃｔｏｒ１（ＥＲＦ−１）遺伝子の発現について、野生型とｐＥＩＮ３ＲＤで形質転換した植物体からＲＮＡを精製し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を用いて調べた。
その結果、図１３に示すように、エチレン処理（１００ｐｐＭエチレンガス、１２時間）した野生型では、ＰＤＦ１．２、ＥＲＦ−１及びＢＣＨＮ遺伝子の発現の誘導がみられる。一方、ｐＥＩＮ３ＲＤで形質転換した植物体では、エチレン処理を行っても、ｅｉｎ３変異体植物同様ＰＤＦ１．２，ＥＲＦ１及びＢＣＨＮ遺伝子の発現の誘導がみられず、エチレン非応答性の形質を示した。
以上の結果から、ＥＲＦ３の１９１−２２５のアミノ酸配列を持つペプチド及びそれをコードする遺伝子は、任意の転写活性化因子を転写抑制因子に変換できる能力を持つことが明らかとなった。
（実施例５）ペプチドＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤ；ＳＵＰリプレッションドメイン１９４−２０４に対応）をコードする遺伝子による、植物体におけるＣＵＣ１の転写活性化機能の抑制
（１）形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築
形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築は、実施例３（１）と同様にして行った。
（２）形質転換ベクターｐＣＵＣ１ＳＲＤの構築
アミノ酸ペプチドＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤという）と、転写因子ＣＵＣ−ＳＨＡＰＥＤＣＯＴＹＫＥＤＯＮ１（ＣＵＣ１）のタンパク質コード領域（配列番号５４）のカルボキシル末端とが結合した状態のアミノ酸配列（ＶＳＶＷＰＦＴＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ）になるように、かつＣＵＣ１遺伝子のコード領域から終止コドンを削除した配列とＳＲＤのコード領域との読み枠が一致するように、相補鎖（３’コンプリメントＤＮＡ）である以下の配列を合成した。
2003055903.tif 000041
一方、ＣＵＣ１遺伝子のタンパク質コード領域の５’領域に相当する以下のＤＮＡ配列を合成した。
2003055903.tif 000042
これらの２個の一本鎖ＤＮＡをプライマーとして、奈良先端大学田坂教授より譲渡されたＣＵＣ１  ｃＤＮＡの全長を含むクローンを鋳型にもちいてＰＣＲを行い、ＣＵＣ１コード領域とＳＲＤが融合したＣＵＣ１ＳＲＤ遺伝子を作成した。ＰＣＲの反応条件は、上記と同じである。
得られたＤＮＡ試料からアガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、ｐ３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤを得た。
（３）ｐ３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤで形質転換した植物体の作成
実施例３（３）と同様にして、ｐ３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤによるシロイヌナズナ植物の形質転換を行った。
（４）形質転換植物の発芽体の形質
得られた形質転換植物（３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤ）の発芽体の形質を図１５（右）に示す。
また、比較として、野生株Ｃｏｌ−０及びｃｕｃ１／ｃｕｃ２の二重変異体における子葉の形態を図１５（左）及び図１５（中）にそれぞれ示す。
野生株Ｃｏｌ−０の子葉は、２枚に別れており、基部、葉体部のいずれにおいても融合は見られなかった。一方、ｃｕｃ１／ｃｕｃ２の二重変異体では、２枚の子葉が、その両片部のほとんどの領域で融合しており、カップ状の形質（ｃｕｐ−ｓｈａｐｅｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）を示した。
ｐ３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤで形質転換したシロイヌナズナ植物体ではハイグロマイシン存在下で生育する全ての発芽体において、子葉の基部から葉状部にかけて、一部ないし大部分が融合した形状を示した。この形質は、ｃｕｃ１／ｃｕｃ２の二重欠損株で見られる形状と非常に似ている。また、子葉の一部が融合した形質は、ｃｕｃ１／ｓｔｍ−１の二重欠損株で見られる形状とほぼ同様であった（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，９，８４１，１９９７；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６，１５６３，１９９９；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８，１１２７，２０００）。さらに、これらの形質転換植物においては、ほとんどのもので、頂芽分裂組織の形成が見られなかった。
以上の結果から、ＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＵＰリプレッションドメイン１９４−２０４に対応）のアミノ酸配列を持つペプチド及びそれをコードする遺伝子は、任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有していることが明らかとなった。
（実施例６）ペプチドＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤ１；ＳＵＰリプレッションドメイン１９５−２０４に対応）、及びペプチドＬＤＬＮＬＡＰＰＭＥＦ（ＲＤ１；ＥＲＦ３リプレッションドメイン２１５−２２５に対応）をコードする遺伝子による、植物体におけるＥＩＮ３の転写活性化機能の抑制
（１）形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築
形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築は実施例３（１）と同様にして行った。
（２）形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＳＵＰＲＤの構築
米国ソーク研究所から譲渡された、ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ８；
2003055903.tif 000043
３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ９；
ＡＴＧＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＣ（配列番号４４）を用いて、ＥＩＮ３のアミノ酸配列１−１６２コード領域に該当する塩基配列１−４８５の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、制限酵素ＳｍａＩで切断した後、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離した。この断片を制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、ｐＢＩＧＩＩ−ＥＩＮ３−１／１６２を得た。ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを制限酵素ＳｍａＩとＰｓｔＩで切断し、アガロース電気泳動によってＥＩＮ３のアミノ酸配列１６３−５６５の領域をコードするＤＮＡ断片（４８７−１６９５）を単離した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩとＰｓｔＩで切断しておいたクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入しプラスミドｐＥＩＮ３−１６３−５６５を作成した。
ＥＩＮ３ｃＤＮＡの全長を含むｐＥＩＮ３クローンを鋳型として、
５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１０：
2003055903.tif 000044
３末端の終止コドンＴＡＡをＣＣＣに変換した、３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１１：
2003055903.tif 000045
を用いてＥＩＮ３のアミノ酸配列５６６−６２８コード領域に該当する塩基配列（１６９６−１８８４）の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅し、制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、アガロース電気泳動によって単離した。
前記実施例２（２）（２−２）と同様にアミノ酸の読み枠が一致するように作成しておいた、３’末端に制限酵素ＳａｌＩ部位を有するＳＲＤ１（ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ）のアミノ酸配列をコードするように設計したＤＮＡの両鎖である配列：
2003055903.tif 000046
又は、アミノ酸の読み枠が一致するように作成しておいた、３’末端に制限酵素ＳａｌＩ部位を有するＲＤ１（ＬＤＬＮＬＡＰＰＭＥＦ）のアミノ酸配列をコードするように設計したＤＮＡの両鎖である配列：
2003055903.tif 000047
を、実施例２で示した方法でアニーリングしたＤＮＡと、ＥＩＮ３のアミノ酸配列コード領域に該当する塩基配列１６９６−１８８４の領域を含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＰｓｔＩ、ＳａｌＩで切断しておいた上記ｐＥＩＮ３−１６３／５６５に挿入し、ｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＳＲＤ１及びｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＲＤ１を作成した。
プラスミドｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＳＲＤ１及びｐＥＩＮ３−１６３／６２８−ＲＤ１を、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで切断し、ＳＲＤ１又はＲＤ１をコードする領域とＥＩＮ３のアミノ酸配列１６３−６２８領域を融合させたＤＮＡ断片を、アガロース電気泳動によって単離した。単離した断片を、実施例３（２）と同様にして得たｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２を制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２−ＥＩＮ３−１／１６２に挿入し、ＣａＭＶ３５Ｓ−ＥＩＮ３−ＳｕｐＲＤ−Ｎｏｓを含む形質転換ベクターｐＥＩＮ３ＳＲＤ１及びｐＥＩＮ３ＲＤ１を得た。
（３）ｐＥＩＮ３ＳＲＤ１又はｐＥＩＮ３ＲＤ１で形質転換した植物体の作成
実施例３（３）と同様にしてｐＥＩＮ３ＳＲＤ１又はｐＥＩＮ３ＲＤ１によるシロイヌナズナ植物の形質転換を行い、次世代の種子を得た。
（４）形質転換植物のエチレン感受性の有無
実施例３（４）と同様にして種黄化芽生えでのトリプルレスポンス（三重応答）を観察した。結果を図１６及び図１７に示す。
図１６及び図１７によれば、野生株であるＣｏｌ−０は、ＡＣＣの存在下で、茎長フックが屈曲し、根の伸長が抑制されるトリプルレスポンスを示すが、ｐＥＩＮ３ＳＲＤ１又はｐＥＩＮ３ＲＤ１で形質転換した植物体（図１６；３５Ｓ：ＥＩＮ３ＳＲＤ１，３５Ｓ：ＥＩＮ３ＲＤ１）では、ＥＩＮ３の変異体であるｅｉｎ３植物体（図１６；ｅｉｎ３−１）と同様に、茎長の屈曲及び根の伸長阻害がみられず、エチレン非応答性の形質を示した。また、常光下で生育させた野生型植物体は、エチレンガス（１００ｐｐｍ）常時存在下で、エチレン応答性の生理現象である矮性の植物体になるが、ｐＥＩＮ３ＳＲＤ１又はｐＥＩＮ３ＲＤ１で形質転換した植物体（図１７；ＳＲＤ１，ＲＤ１）では、ＥＩＮ３の変異体であるエチレン非感受性突然変異体ｅｉｎ３植物体（図１７；ｅｉｎ３）をエチレン存在下で生育させた植物と同様な大きさを示した。
以上の結果から、ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ及びＬＤＬＮＬＡＰＰＭＥＦのアミノ酸配列を持つペプチド及びそれをコードする遺伝子は、任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有していることが明らかとなった。
（実施例７）ペプチド：ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ；ＳＵＰリプレッションドメイン１９３−２０４に対応）をコードする遺伝子による、植物体におけるＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ−ＯＦ−ＡＮＴＨＯＣＹＡＮＩＮ−ＰＩＧＭＥＮＴ１（ＰＡＰ１）転写因子の機能変換
（１）形質転換用ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸの構築
（１−１）ＰＡＰ１ｃＤＮＡの単離
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーより、以下のプライマーを用いて終止コドンを除くＰＡＰ１のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅し、アガロース電気泳動により分離し回収した。なお、ＰＣＲの条件は実施例３と同様である。
５’プライマー：
2003055903.tif 000048
３’プライマー：
2003055903.tif 000049
得られたＰＡＰ１遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号６６に示す。
（１−２）ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードする遺伝子の合成
一方、１２アミノ酸ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードし、３‘末端に終止コドンＴＡＡを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、実施例３と同様にアニールして２本鎖ＤＮＡとした。
2003055903.tif 000050
（１−３）形質転換ベクターの作成
上記で得たＰＡＰ１遺伝子タンパク質コード領域のみを含むＤＮＡ断片とＳＲＤＸのコード領域を含むＤＮＡ断片を、実施例３と同様にして、制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、形質転換ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸを得た。
（２）形質転換ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸにより形質転換した植物体の作成
形質転換ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸにより形質転換して得たシロイヌナズナ植物の次世代種子と、比較のための野生株（Ｃｏｌ−０）の種子とを、３％のショ糖を含むＭＳ寒天培地及びショ糖を含まないＭＳ寒天培地上に蒔種し、実施例３と同様の条件下で生育させた。その結果、野生型の発芽体では、ストレスを与える条件である３％のショ糖を含むＭＳ寒天培地において、アントシアニンの特徴を示す赤紫色の色素を蓄積した。これに対して、ｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナ植物の発芽体では、この色素の蓄積が見られなかった（図１８Ａ）。
また、アントシアニンの合成系であるフェニルプロパノイド合成に関わる遺伝子であるｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＤＦＲ）遺伝子の発現を後記参考例のＲＴ−ＲＣＴ法を用いて調べた結果、野生型では、この遺伝子の発現が、ストレス処理と同時に上昇するのに対し、ｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナ植物体では、このような発現上昇は認められなかった（図１８Ｂ）。これらのことは、ＳＲＤＸペプチドを付与されたＰＡＰ１転写因子が、リプレッサーに変換され、植物体内でＤＦＲ遺伝子の発現を抑制することにより、アントシアニン合成を抑制していることを示している。また、このことは、このリプレッサーを用いた遺伝子発現抑制システムが、二次代謝物の合成抑制にも利用できることを示している。
（実施例８）ペプチド：ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードする遺伝子による、植物体におけるＡｔＭＹＢ２３転写因子の機能変換
（１）形質転換ベクターｐ３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸの構築
（１−１）ＡｔＭＹＢ２３  ｃＤＮＡの単離
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーより、以下のプライマーを用いて終止コドンを除くＡｔＭＹＢ２３のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅し、アガロース電気泳動により分離し回収した。なお、ＰＣＲの条件は実施例３と同様である。
５’プライマー：
2003055903.tif 000051
３’プライマー：
2003055903.tif 000052
得られたＡｔＭＹＢ２３遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号６９に示す。
（１−２）ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードする遺伝子の合成
一方、１２アミノ酸ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードし、３‘末端に終止コドンＴＡＡを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、実施例３と同様にアニールして２本鎖ＤＮＡとした。
2003055903.tif 000053
（１−３）形質転換ベクターの作成
上記で得たＡｔＭＹＢ２３遺伝子のタンパク質コード領域のみを含むＤＮＡ断片とＳＲＤＸのコード領域を含むＤＡＮ断片を、実施例３と同様にして、制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、形質転換ベクターｐ３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸを得た。
（２）形質転換ベクターｐ３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸにより形質転換した植物体の作成
形質転換ベクターｐ３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズ植物のの次世代種子と、比較のための野生株（Ｃｏｌ−０）の種子とを、ＭＳ寒天培地上に蒔種し、実施例３と同様の条件下で生育させた。その結果、ｐ３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸで形質転換した植物体は、野生型植物であるＣｏｌ−０では表皮に存在するトリコームが無いか、若しくは著しくその数が野生型に比べて著しく減少している植物体となった（図１９Ａ）。
また、トリコームの発生に関わる遺伝子であるＧＬＡＢＲＡ１（ＧＬ１），ＧＬＡＢＲＡ２（ＧＬ２），ＴＲＡＮＳＰＡＲＥＮＴ  ＴＥＳＴＡ  ＧＬＡＢＲＡ１（ＴＴＧ１）の発現を後記参考例のＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。野生型ではこれら３種の遺伝子は同様に発現しているのに対し、ｐ３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸで形質転換したトリコームを持たない植物体においては、ＧＬ２の発現が著しく抑制されていることが明らかになった（図１９Ｂ）。これらのことは、ＳＲＤＸペプチドを付与されたＡｔＭＹＢ２３転写因子が、リプレッサーに変換され、植物体内で、ＧＬ２遺伝子の転写を抑制することにより、トリコームの発生を抑制していることを示している。
（実施例９）タバコ葉およびペチュニアにおける転写抑制実験
リポーター遺伝子としてＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＡＬ４：：ＬＵＣ、エフェクタープラスミドとしてＣａＭＶ３５Ｓ：：ＧＡＬ４ＤＢＤ：ＲＤ（ＳＵＰリプレッションドメイン１７５−２０４領域）を用い、実施例２と同様にしてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＢＹ４）種子蒔種後２週間目の植物体から採取した葉（１．５ｃｍ）にパーティクルガン法を用いて導入した後、水で湿らせた濾紙上で２５℃、１６時間静置後、リポーター遺伝子であるルシフェラーゼの活性を測定した。その結果、コントロールとして用いた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢとリポータープラスミドを導入したもの（相対値１００とする）に比べ、３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤを導入した場合、リポーター遺伝子の活性を８４％抑制する効果を示した。また、同様にして、ペチュニア種子蒔種後３週間目の植物体から採取した葉（１．０ｃｍ）に上記のエフェクタープラスミドとリポータープラスミドをパーティクルガンを用いて導入し、ルシフェラーゼの活性を測定した。その結果、コントロールとして用いた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢとリポータープラスミドを導入したもの（相対値１００とする）に比べ、３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤを導入した場合、リポーター遺伝子の活性を８２％の抑制する効果を示した。
これらの結果より、リプレッションドメインを持つキメラ遺伝子は、シロイヌナズナばかりでなく、タバコ葉およびペチュニアにおいても転写抑制機能を持つことがわかった。
（参考例）ＲＴ−ＰＣＲ方法による遺伝子発現の解析法
上記実施例７、８におけるＲＴ−ＰＣＲ方法による遺伝子発現の解析法を以下に示す。
既に述べた方法でシロイヌナズナ植物葉から、全ＲＮＡを抽出精製した。このうち１．６５ｕｇまたは２．５ｕｇの全ＲＮＡを分取し、混在するＤＮＡを除くため下記の条件でＤＮａｓｅ処理を行った。
全ＲＮＡ                                  １．６５ｕｇまたは２．５ｕｇ
１０ｘ  ＤＮａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ          ５ｕｌ
ＤＮａｓｅ  Ｉ                            １ｕｌ（５ｕ）
Ｒｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ            ０．５ｕｌ（１０ｕ）
ＤＥＰＣ処理水                            全量５０ｕｌに調整
３７℃で３０分間反応したのち、フェノール・クロロホルム溶液を加えて各酵素を失活させエタノール沈殿にてＤＮＡを除いた乾燥全ＲＮＡを調製した。
次に全ＲＮＡよりアマシャム社製Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡのｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄの合成を行った。乾燥させた１．６５ｕｇまたは２．５ｕｇの全ＲＮＡを３３ｕｌのＤＥＰＣ処理水に縣濁させ、６５℃で５分間インキュベーションした後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘの入ったチューブにＲＮＡ溶液を加え、３７℃で６０分間反応させた。この反応により理論的に全ＲＮＡがｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡに転換されたと考えられる。
合成したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として、調べたい遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。使用したプライマーの塩基配列及びＰＣＲ反応溶液の組成を以下に示す。
（ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列）
2003055903.tif 000054
2003055903.tif 000055
（ＰＣＲ反応溶液の組成）
鋳型ｃＤＮＡ                  １ｕｌ（換算すると全ＲＮＡとして５０ｎｇま
たは７５ｎｇ）
１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ    ５ｕｌ
２．５ｍＭｄＮＴＰ  ｍｉｘ    ４ｕｌ
５’プライマー                ０．５ｕｌ（１００ｐｍｏｌ／ｕｌ）
３’プライマー                ０．５ｕｌ（１００ｐｍｏｌ／ｕｌ）
ｒＴａｑポリメラーゼ          ０．２５ｕｌ（１．２５ｕ）
ＤＥＰＣ処理水                ３８．７５ｕｌ
ＰＣＲの条件は、９５℃で２分間反応させ変性させた後、９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分を一サイクルとし、調べる遺伝子により２５から３５サイクルに変化させ行った。
次に、上記の一連の操作により得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をサザン法により半定量学的に評価した。ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡの１／１００〜１／１０００量をアガロースゲル電気泳動し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。相当する遺伝子ＤＮＡをプローブとして調製し、アマシャム製ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍキットを用いて標識し、ハイブリダイゼーション及び検出を行った。検出されたバンドは調べたい遺伝子のｍＲＮＡに相当するＤＮＡ量を意味することから、これをワイルドタイプと形質転換サンプルと比較することにより、個々の遺伝子の発現量の考察を行った。この際、比較対照として内在性遺伝子β−チューブリン（ＴＵＢ）の発現量を同時に検出した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドは、極めて短いサイズであるため、その合成は極めて簡単であり、しかも、効果的に遺伝子の転写を抑制できる。
本発明の遺伝子は、特定の標的遺伝子に結合する転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合させることにより、特定の遺伝子のみを標的にした転写抑制を行うことができる。また、この抑制は優性形質として現れ、この転写因子の転写に重複して関与する他の転写因子の機能をも抑制する。したがって、一遺伝子のノックアウト法では明らかにされなかった転写機能解析に非常に有効であり、また、小麦等のように複２倍体ゲノムを持つ植物にも適用できる。
本発明の遺伝子はまた、例えばガン遺伝子の転写調節領域に特異的に結合するＤＮＡと融合させて、細胞内で発現させることにより、ガン遺伝子の発現を効率的に抑制することが可能となる。
さらに、本発明の遺伝子は、例えば、植物においては、色素代謝系の酵素をコードする遺伝子の発現を制御することによってこれまでには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作することを可能にし、また、アレルゲンとなるタンパク質の発現を抑制することによってアレルゲンの少ない食物の生産を可能にする。また、さらに、リグニン合成の遺伝子の発現を抑制することによって、リグニン含量の少ない木を作り、これにより高品質のパルプを生産するも可能である。従って、本発明は極めて広範な分野において適用可能でかつ有用な技術手段を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、試験対象の各種ＤＮＡ断片を含むＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤエフェクタープラスミドを構築する手順を示す図である。
図２は、レポーター遺伝子ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣを構築する手順の前半部を示す図である。
図３は、上記レポーター遺伝子ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣを構築する手順の後半部を示す図である。
図４Ａは、リポーター遺伝子とエフェクタープラスミドを示す図である。
なお、図１から４Ａ中、５ＸＧＡＬ４：ＧＡＬ４転写因子ＤＮＡ結合配列、ＴＡＴＡ：ＣａＭＶ３５ＳプロモーターＴＡＴＡボックスを含む領域、ＬＵＣ：ルシフェラーゼ遺伝子、ＣａＭＶ  ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓタンパク質遺伝子プロモーター、ＧＡＬ４ＤＢ：酵母ＧＡＬ４転写因子ＤＮＡ結合ドメインコード領域、Ｎｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子転写終止領域を表す。
図４Ｂは、ｐＧＡＬ４ＤＢに結合した各種ペプチドがリポーター遺伝子の活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に及ぼす影響を示す図である。図中、右側のグラフは、各種ＤＮＡ断片を有するエフェクタープラスミドを導入したときのリポーター遺伝子の活性を示す（エフェクターを入れないときのリポーター遺伝子の活性を１００とした）。
図５は、エフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰの構築手順を示す図である。
図６は、エフェクタープラスミドｐＡｔＥＲＦ５の構築手順を示す図である。
図７は、レポータープラスミドｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣの構築手順の前半部を示す図である。
図８は、レポータープラスミドｐＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣの構築手順の後半部を示す図である。
図９Ａは、転写抑制試験において、レポーター遺伝子としてプラスミドに組み込まれた３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣの構造及びエフェクター遺伝子として組み込まれたＳＵＰ（Ｄ）の構造の概略を示す図である。
図９ＢはＳＵＰ遺伝子及びその断片による転写抑制試験の結果を示す図である。
図１０Ａは、転写抑制試験において、レポーターとして使用したＧＡＬ４−ＧＣＣ−ＬＵＣの構造、及びＡｔＥＲＦ５、ＧＡＬ４ＤＢ、ＧＡＬ４ＤＢ−ＳＵＰ、ＧＡＬ４ＤＢ１７５／２０４ＳＵＰを組み込んで構築されたエフェクター遺伝子の構造の概略を示す図である。
図１０Ｂは各エフェクターによる転写抑制試験の結果を示す図である。
図１１は、ＳＵＰ遺伝子及びＥＲＦ３遺伝子によるＥＩＮ３の転写活性化機能の抑制効果を、エチレン前駆体存在下における植物体の茎長及び根の伸長程度により調べた結果を示す写真である。
図１２は、ＳＵＰ遺伝子及びＥＲＦ３遺伝子による植物体におけるＥＩＮ３の転写活性化機能の抑制効果をエチレン存在下における植物体成長の程度により調べた結果を示す写真である。
図１３は、ＳＵＰ遺伝子及びＥＲＦ３遺伝子による、エチレン存在下でのＰＤＦ１．２、ＢＣＨＮ及びＥＲＦ１遺伝子の発現抑制効果を、これらエチレン誘導性遺伝子の発現を示すｍＲＮＡの検出の有無を指標にノーザンプロットハイブリダイゼーションにより調べた結果を示す写真である。
図１４は、シロイヌナズナ植物体を形質転換するためのプラスミドｐ３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤの構造を示す模式図である。
図１５は、野生型（Ｃｏｌ−０）、ｃｕｃ１／ｃｕｃ２二重変異体（ｃｕｃ１／ｃｕｃ２）及びｐ３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤで形質転換された植物体（３５Ｓ：：ＣＵＣ１ＳＲＤ）について各発芽後５日から１０日目の葉体の子葉部を撮影した写真である。
図１６は、ｐＥＩＮ３ＳＲＤ１によるシロイヌナズナ植物形質転換体（３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＳＲＤ１）、及びＥＩＮ３ＲＤ１による同形質転換体（３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＲＤ１）においてエチレン存在下で観察された植物体の茎及び根の形態を示す写真である。
図１７は、ｐＥＩＮ３ＳＲＤ１によるシロイヌナズナ植物形質転換体（３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＳＲＤ１）、及びＥＩＮ３ＲＤ１による同形質転換体（３５Ｓ：：ＥＩＮ３ＲＤ１）においてエチレン存在下で観察された植物体成長の程度を示す写真である。
図１８Ａは、ｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸ形質転換シロイヌナズナ植物及び野生株を３％ショ糖含有ＭＳ培地で生育させた各発芽体の写真である。
図１８Ｂは、上記植物体におけるＤＦＲ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す電気泳動写真である。
図１９Ａは、ｐ３５Ｓ：：ＡｔＭＹＢ２３ＳＲＤＸ形質転換シロイヌナズナ植物及び野生株の葉を撮影した写真である。
図１９Ｂは、上記植物体におけるトリコーム発生遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図６】
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【図６】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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