(57)【要約】本発明は、高精度で、再現性があり、且つ経済性および環境面に配慮した酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法、その測定方法、及びこれらを実施するための分析装置を提供することを目的とする。ＤＮＡ又はＲＮＡ中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法であって、試料中に含まれる酸化的損傷グアニンヌクレオシドを陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程を有することを特徴とする酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法。試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧの精製方法であって、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏを加えて、精製することを特徴とする８−ＯＨ−ｄＧの精製方法。上記精製方法によって得られた精製酸化的損傷グアニンクレオシドを測定する測定工程を有することを特徴とする酸化的損傷グアニンヌクレオシドの測定方法。
2003076925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ又はＲＮＡ中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法であって、試料中に含まれる酸化的損傷グアニンヌクレオシドを陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程を有することを特徴とする酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法。
【請求項２】
前記酸化的損傷グアニンヌクレオシドが、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）であることを特徴とする請求項１記載の酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法。
【請求項３】
試料中に含まれる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の精製方法であって、予め、試料に８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）を８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカーとして加えて、精製を行うことを特徴とする８−ＯＨ−ｄＧの精製方法。
【請求項４】
試料中に含まれる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の精製方法であって、予め、試料に８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）を加えて、該試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程と、第１の精製工程で得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を逆相クロマトグラフィーによって更に精製する第２の精製工程とを有することを特徴とする８−ＯＨ−ｄＧの精製方法。
【請求項５】
前記試料が尿であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法。
【請求項６】
前記試料が尿であることを特徴とする請求項３又は４に記載の８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の精製方法。
【請求項７】
更に、請求項１、２又は５記載の精製方法によって得られた精製酸化的損傷グアニンヌクレオシドを測定する測定工程を有することを特徴とする酸化的損傷グアニンヌクレオシドの測定方法。
【請求項８】
請求項３、４又は６記載の精製方法によって得られた精製８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）を測定する測定工程を有することを特徴とする８−ＯＨ−ｄＧの測定方法。
【請求項９】
前記精製８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の測定が、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて
（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク認識、
（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、
（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、
（４）適宜、８−ＯＨ−ｄＧ分画のミキシング、
の順序で行われ、ついで、
逆相カラムへ注入して行われることを特徴とする請求項８に記載の８−ＯＨ−ｄＧの測定方法。
【請求項１０】
８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の精製および測定を実施するための装置であって、
試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）と、
８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）の溶出位置を感知するＵＶ検出器と、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）と、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定する検出器とを具備することを特徴とする分析装置。
【請求項１１】
試料中に含まれる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）をカラムクロマトグラフィーにより回収する処理を制御するためのプログラムであって、
予め試料中に加えておいたマーカー（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）のピークシグナルをＵＶ検出器より受け、一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ溶出時にサンプラーに接続されたバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、
次いで、得られた８−ＯＨ−ｄＧ分画を第二の精製カラムへ注入するためのシグナルを出力し、カラムから溶出する被検出物質（８−ＯＨ−ｄＧ）を精製・回収する処理
をコンピュータに行われるための制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酸化的損傷グアニンヌクレオシド、特に８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下、８−ＯＨ−ｄＧと略す）の精製方法、その測定方法、及びこれらを実施するための分析装置に関する。
背景技術
近年、生体内での活性酸素の作用について多くの研究がなされている。通常、活性酸素は生体内に異物が侵入した際、防御システムとして働いている。しかしながら、食品添加物（発ガン性物質）、大気汚染、喫煙、ストレス等によって過剰に活性酸素が発生すると、それらはＤＮＡの損傷を引き起こし、酸化的ＤＮＡ損傷産物の一種である８−ＯＨ−ｄＧを生成する。この８−ＯＨ−ｄＧは突然変異を誘発し、発癌過程で重要な役割を演じていると考えられている。また、活性酸素は、発癌だけでなく様々な疾患や老化の原因として注目されている。
そのため、生体内における活性酸素量を知ることにより、個人個人の発癌リスク評価や、活性酸素関連の様々な疾患の予測・診断、老化度、あるいは一般健康の評価を行うことができる。
しかしながら、生体内における活性酸素は不安定であり、それらを直接検出するのは困難である。そのため、活性酸素の指標として活性酸素によって生成される８−ＯＨ−ｄＧを測定することが提案されている。
これまでに報告されている８−ＯＨ−ｄＧの分析方法は６種類に大別できる。（１）８−ＯＨ−ｄＧに対する抗体を結合させたアフィニティ−カラムで精製した分画をＨＰＬＣ−ＥＣＤで分析する方法、（２）３本又は４本のカラムを接続してカラムスイッチング法により、最終的に８−ＯＨ−ｄＧをＨＰＬＣ−ＥＣＤにより検出する方法、（３）ＥＬＩＳＡ法により尿を直接分析する方法、（４）ＧＣ−ＭＳ（内部標準物質が必要）による方法、（５）ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ（内部標準物質が必要）による方法、（６）サンプリングインジェクター（一定分画を分取し、攪拌後、一定量をカラムに注入する装置）を介してマルチファンクションカラム（逆相カラム、陽イオン交換カラムの機能を併せ持つゲル濾過カラム）と、逆相カラムを接続しＥＣＤにより検出する方法が挙げられる。
しかしながら、（１）の方法は回収率が低いため、尿中濃度を計算するのに放射性の内部標準物質を用いる必要がある。
また、（２）の方法は前処理が煩雑である。また、バルブ切り替えのタイミングの決定が困難であり、８−ＯＨ−ｄＧのピーク付近に夾雑物が出る場合が多い。また、多量の溶離液、洗浄液が必要となるだけではなく、多量の有毒の廃液が生じるため環境面においても好ましくない。
また、（３）の方法は、特異性に問題があり、再現性がよくない。
また、（４）および（５）の方法は、測定機器が高価であり経済的に好ましくなく、さらに回収率が不安定なため内部標準物質を必要とするが、それらは入手困難なものである。
また、（６）の方法は、一検体あたりの分析時間が１６５分と長く、連続運転による大量処理が困難である。さらに、クロマトグラフィーによる分析の際、８−ＯＨ−ｄＧのピークに重なるような夾雑物が検出される確率が高い。そのため、いずれの方法においても測定の精度が不十分である。本発明は、高精度で、再現性があり、且つ経済性および環境面に配慮した酸化的損傷グアニンヌクレオシド、特に８−ＯＨ−ｄＧの精製方法、その測定方法、及びこれらを実施するための分析装置を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者は、陰イオン交換カラムを用いることにより８−ＯＨ−ｄＧ、８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（以下、８−ＯＨ−ｒＧｕｏと略す）等の酸化的損傷グアニンヌクレオシドを特異的に吸着・回収できることを見出した。更に、８−ＯＨ−ｄＧにおいては、８−ＯＨ−ｒＧｕｏを内部標準マーカーとして用いることにより８−ＯＨ−ｄＧを正確に分取できること、その結果、８−ＯＨ−ｄＧを高精度で、且つ再現性よく測定でき、さらに経済性および環境面にも優れていることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明の酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法であって、試料中に含まれる酸化的損傷グアニンヌクレオシドを陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程を有することを特徴とする。また、上記酸化的損傷グアニンヌクレオシドが８−ＯＨ−ｄＧであることが好ましい。本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、試料中に含まれる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の精製方法であって、予め、試料に８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）を８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカーとして加えて、精製を行うことを特徴とする。本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、試料中に含まれる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の精製方法であって、予め、試料に８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）を加えて、該試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程と、第１の精製工程で得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を逆相クロマトグラフィーによって更に精製する第２の精製工程とを有することを特徴とする。また、上記酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法において、試料が尿であることが好ましい。また、上記８−ＯＨ−ｄＧの精製方法において、試料が尿であることが好ましい。本発明の酸化的損傷グアニンヌクレオシドの測定方法は、更に、上記精製方法によって得られた精製酸化的損傷グアニンヌクレオシドを測定する測定工程を有することを特徴とする。本発明の８−ＯＨ−ｄＧの測定方法は、更に、上記精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定する測定工程を有することを特徴とする。また本発明の８−ＯＨ−ｄＧの測定方法は、前記精製８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の測定が、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）適宜、８−ＯＨ−ｄＧ分画のミキシング、の順序で行われ、ついで、逆相カラムへ注入して行われることを特徴とするものである。
本発明の分析装置は、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）の精製および測定を実施するための装置であって、
試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）と、
８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）の溶出位置を感知するＵＶ検出器と、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）と、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定する検出器とを具備することを特徴とする。
本発明の制御プログラムは、試料中に含まれる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）をカラムクロマトグラフィーにより回収する処理を制御するためのプログラムであって、予め試料中に加えておいたマーカー（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）のピークシグナルをＵＶ検出器より受け、一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ溶出時にサンプラーに接続されたバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、次いで、得られた８−ＯＨ−ｄＧ分画を第二の精製カラムへ注入するためのシグナルを出力し、カラムから溶出する被検出物質（８−ＯＨ−ｄＧ）を精製・回収する処理をコンピュータに行わせることを特徴とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、生体内における活性酸素量を評価するために、その指標となる酸化的損傷グアニンヌクレオシド、特に８−ＯＨ−ｄＧを精度よく測定するための精製方法、その測定方法およびこれらを実施するための分析装置である。
８−ＯＨ−ｄＧをはじめ酸化的損傷ヌクレオシドとは、生体内の活性酸素（酸素ラジカル）等によってＤＮＡやＲＮＡが損傷を受けた結果生じるものであり、活性酸素の指標として用いられる。８−ＯＨ−ｄＧ以外の酸化的損傷ヌクレオシドとしては、２−ヒドロキシデオキシアデノシン（２−ＯＨ−ｄＡ）、５−ヒドロキシデオキシシチジン（５−ＯＨ−ｄＣ）、５−ホルミルデオキシウリジン（５−ＣＨＯ−ｄＵ）、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等が挙げられる。これら酸化的損傷ヌクレオシドは、不要物として尿により生体外へ排出される。また、これらのうち８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等の酸化的損傷グアニンヌクレオシドは負の電荷を帯びているため、後段で説明する陰イオン交換カラムにより容易に精製、回収することができる。これらの中でも活性酸素の指標として、特に８−ＯＨ−ｄＧを用いることが好ましい。なお、本明細書における酸化的損傷グアニンヌクレオシドとは、ＤＮＡ又はＲＮＡ中のグアニンが活性酸素によって損傷を受けた結果生じるものであり、酸化的損傷とはヒドロキシル化されることを示す。
本発明の酸化的損傷グアニンヌクレオシド（８−ＯＨ−ｄＧを含む）の精製方法、及び測定方法に使用される試料としては、尿、血清、髄液、唾液、細胞培養後の培地等、全ての生体試料を挙げることができる。これらの中でも、尿は採取し易く、また尿中で酸化的損傷グアニンヌクレオシドは安定であるため、特に尿が好ましい。
以下、本発明の精製方法、測定方法、及びこれらを実施するための分析装置について、８−ＯＨ−ｄＧに則して説明する。
本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧの精製及び測定を実施するための装置は、８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）と、８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置の指標となる８−ＯＨ−ｒＧｕｏを感知するＵＶ検出器と、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）と、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定する検出器を具備する。図１は、分析装置の一例を示す模式図である。図中符号１１は陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）であり、ＵＶ検出器１４、カラムスイッチングバルブ１６を介して、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２と接続している。また、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１の上流には、試料を注入するオートサンプラー１７が接続されたカラムスイッチングバルブ１５が接続している。
また、カラムに吸着した分子を溶出するための溶離液（陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１に用いられる溶離液をＡ液、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２に用いられる溶離液をＢ液とする）、上記カラムスイッチングバルブ１５に接続されたガードカラム（陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１と同一の陰イオン交換樹脂を充填）を洗浄するための洗浄液（Ｃ液）を各カラムに送り込むためのポンプ２１、２２、２３が設けられ、ポンプ２１はオートサンプラー１７、ポンプ２２はカラムスイッチングバルブ１６、ポンプ２３はカラムスイッチングバルブ１５に各々接続されている。
なお、図１において、オートサンプラー１７の代わりに、８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク感知により、カラムスイッチングバルブ１６を自動的に作動させる機能を持つサンプリングインジェクター（「２３１ＸＬ」、ギルソン製）等を用いることができる。
なお、この方法を実施するために、２３１ＸＬに新たなプログラムを搭載して測定を行った。このプログラムは、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）ＨＰＬＣ−２への注入を行うものである（図６を参照）。より詳しくは、以下のフローにより機能を実現している。
（１）２３１ＸＬにより試料をＨＰＬＣ−１に注入する。
（２）設定時間（Ｔ１）だけシステムを待機させる。
（３）２３１ＸＬがＵＶ検出器シグナルのモニターを開始する。
（４）設定ＵＶレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
（５）ピーク感知後、設定時間（Ｔ２）だけシステムを待機させた後、バルブへ接点信号を出力し、ループ内に分取を開始する。
（６）設定時間（Ｔ３）後、バルブへ接点信号を出力し、分取を終了させると同時にループ内の分画をＨＰＬＣ−２に注入する。
後段でも説明するが、サンプリングインジェクター（「２３１ＸＬ」、ギルソン製）によれば、８−ＯＨ−ｒＧｕｏとの相対的位置により自動的に８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）が決定されるため、予め、８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）を設定しておく必要がない。
上記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１は、試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着するので回収率が非常に高く、且つほとんどの夾雑物を取り除くことができるため、不純物の少ない画分を得ることができる。また、上述したように、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１によれば、負の電荷を帯びている８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等の酸化的損傷グアニンヌクレオシドにおいても、容易に精製、回収することができる。陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１としては、陰イオン交換樹脂を充填剤としたものであれば、特に制限はない。具体的な充填剤としては、スチレンジビニルベンゼン系ポリマーに４級アンモニウム基が結合したもの、ポリヒドロキシメタクリレート系ポリマーに４級アンモニウム基が結合したもの等が挙げられる。また、市販品の充填剤としては、アミネックスＨＰＸ−７２Ｓ（ＢｉｏＲａｄ製）、Ｓｈｏｄｅｘカラム充填剤（昭和電工（株）製）、ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＡ０８Ｆ（三菱化成（株）製、ハミルトンＲＣＸ−１０）等を挙げることができる。
また、陰イオン交換樹脂の粒子径としては、７〜１２μｍ程度であることが好ましい。
上記陰イオン交換樹脂を充填するカラムの内径は、特に制限はないが、約１ｍｍ〜１．５ｍｍ程度であることが好ましい。また、カラムの内径が２．０〜４．６ｍｍの場合は、図２に示すように、カラムスイッチングバルブ１６に接続したサンプリングインジェクター２７（「２３３ＸＬ」、ギルソン製等）を用いて８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を自動的に逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２に注入することが好ましい。なお、この方法を実施するために、２３３ＸＬに新たなプログラムを搭載して測定を行った。このプログラムは、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）８−ＯＨ−ｄＧ分画のミキシング、（５）ＨＰＬＣ−２への注入を行うものであるが、より詳しくは以下のフローにより機能を実現している。
（１）２３３ＸＬにより試料をＨＰＬＣ−１に注入する。
（２）設定時間（Ｔ１）だけシステムを待機させる。
（３）２３３ＸＬがＵＶ検出器シグナルのモニターを開始する。
（４）設定ＵＶレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
（５）ピーク感知後、設定時間（Ｔ２）だけシステムを待機させた後、２３３ＸＬバイアルチューブ内に分取を開始する。
（６）設定時間（Ｔ３）後、分取を終了させる。
（７）得られた分画を吸引、吐出により撹拌する。
（８）分画の一部をＨＰＬＣ−２に注入する。
上記陰イオン交換樹脂を充填するカラムの長さは、特に制限はないが、陰イオン交換樹脂の粒子径、交換容量等によって、カラムを短くすることが可能であり、分析時間を短縮することができる。
上記ＵＶ検出器１４は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１から溶出される画分をモニターし、試料中に含まれる８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置を感知する。このように、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置をＵＶ検出器１４でモニターすることによって、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスイッチングバルブ１６を作動させることにより、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。
上記逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製するものであり、逆相カラムの性質を有するものであれば、特に制限はない。市販品としては、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（ＹＭＣ社）、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｃ  Ｃ１８  ＭＧ（Ｓ−５μｍ）（（株）資生堂製）等が挙げられる。
上記検出器１３は、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定するものであり、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２の下流に設けられている。上記検出器１３としては、電気化学検出器（ＥＣＤ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣＭＳ）等を用いることができる。また、上記電気化学検出器（ＥＣＤ）に関しては、２種類の設定電圧を選ぶことにより、８−ＯＨ−ｄＧのピークは固有の比率で表れるため、そのピークが８−ＯＨ−ｄＧであることを確認できる。
また、本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧの精製及び測定を実施するための分析装置は、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することが可能である。その場合、ガードカラム３５の洗い洗浄液（Ｃ液）は、０．５Ｍ硫酸アンモニウム：アセトニトリル＝７：３程度の組成であることが好ましい。
以上説明したように、本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧの分析装置によれば、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１が試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着し、試料中に含まれる夾雑物の大半を一度に取り除くことができる。また、ＵＶ検出器１４によって、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置に基づき、確実に精製８−ＯＨ−ｄＧを分取でき、回収率、再現性に優れているといえる。また、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することができる。また、上述した分析装置は比較的安価なため経済性にも優れている。
以下、図１に示す分析装置を用いて８−ＯＨ−ｄＧの精製方法及び測定方法の説明をする。（分取範囲（時間）の決定）８−ＯＨ−ｄＧと８−ＯＨ−ｒＧｕｏと尿との混合物を図１示す分析装置に注入し、予め、８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲を決定しておく。図３は、８−ＯＨ−ｄＧと８−ＯＨ−ｒＧｕｏと尿との混合物の分離パターンの一例であり、８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカーとなる８−ＯＨ−ｒＧｕｏの位置確認を示す。このように、分取範囲を予め決定しておくことにより、８−ＯＨ−ｄＧの正確な溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスイッチングバルブ１６を作動させるように設定することで、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。なお、上述したように、図１において、オートサンプラー１７の代わりに、サンプリングインジェクター（２３１ＸＬ）を用いた場合は、ピーク感知により８−ＯＨ−ｒＧｕｏとの相対的位置により自動的に８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）が決定されるため、分取範囲（時間）の設定をしておく必要がない。
（精製方法）
本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程を有することを特徴とする。また、上述したように、８−ＯＨ−ｄＧのみならず、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等の負の電荷を有する酸化的損傷グアニンヌクレオシドにおいても、陰イオン交換クロマトグラフィーによって容易に精製、回収することができる。
第１の精製工程における溶出条件としては、カラム温度は６０〜６５℃、内径１ｍｍのカラムの場合、流速が１７〜２０μｌ／ｍｉｎとすることが好ましい。
また、本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏを８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカーとして加えて、精製を行うことが好ましい。８−ＯＨ−ｒＧｕｏを試料中に予め添加しておくと、８−ＯＨ−ｒＧｕｏが溶出された後、一定時間後に８−ＯＨ−ｄＧが溶出されるため、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置をＵＶ検出器１４でモニターすることによって、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置（時間）が把握でき、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。
また、本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏを８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカーとして加えて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる第１の精製工程を行い、第１の精製工程で得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製すること（第２の精製工程）が好ましい。
上記第２の精製工程としては、逆相クロマトグラフィーにより精製することが好ましい。逆相クロマトグラフィーに用いられる溶出液（Ｂ液）、温度条件等は、使用する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２によって異なるため、それらは適宜決定される。例えば、逆相カラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（ＹＭＣ社）を用いてヒト尿を分析する場合は、カラム温度が約４０℃、流速が０．９ｍｌ／ｍｉｎ程度とすることが好ましい。
（測定方法）
本発明の測定方法は、上述した精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧの量を測定する測定工程を有し、上述した電気化学検出器（ＥＣＤ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣＭＳ）等を用いて精製８−ＯＨ−ｄＧ量を測定できる。なお、上記測定方法は、８−ＯＨ−ｄＧのみならず、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等の精製酸化的損傷グアニンヌクレオシドの測定にも適用できる。
また、連続運転を行う場合、図１に示すようなオートサンプラー１７を具備した装置においても、図２に示すようなサンプリングインジェクター２７を具備した装置においても、定期的に８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置をチェックすることが好ましい。
以上説明したように、本発明の酸化的損傷グアニンヌクレオシドの精製方法によれば、精製酸化的損傷グアニンヌクレオシドを回収率良く得られる。更に、第１の精製工程における陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）の流速が微量であるため、溶離液（Ａ液、Ｂ液）、洗浄液（Ｃ液）の消費が極めて少なく、精製後の廃液量も少量で済むため、環境保全の面からも好ましい。本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法によれば、確実に精製８−ＯＨ−ｄＧを分取でき、８−ＯＨ−ｄＧのピーク付近において夾雑物がほとんどない画分を得ることができる。また、連続運転を行っても、８−ＯＨ−ｒＧｕｏピーク感知により、サンプル毎の分取範囲のズレに対応して、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。また、本発明の測定方法は、上記精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧ又は８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等の精製酸化的損傷グアニンヌクレオシドを測定するので、非常に精度が高く、再現性を有する。
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。例えば、溶離液（Ａ液、Ｂ液）、洗浄液（Ｃ液）の組成等は、使用するカラム（充填剤）により適宜変更可能である。
本発明の酸化的損傷グアニンヌクレオシドの測定方法は、例えば、個人個人の発癌リスクの評価、活性酸素関連の様々な疾患（糖尿病等）の予測・診断、老化度、あるいは一般的健康の評価に用いることができる。
上記測定方法により得られた結果の評価方法として、例えば８−ＯＨ−ｄＧの場合、８−ＯＨ−ｄＧ標準溶液を随時、尿試料の他に分析装置に注入し、そのピーク面積との比較により算出された試料中の８−ＯＨ−ｄＧ濃度をクレアチニンなどの標準物質の濃度で割った値、あるいは２４時間分の尿中の８−ＯＨ−ｄＧ量として算出する。
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（実施例１）
〈尿試料１の調製〉
ヒトの尿を１ｍｌずつ２本のエッペンドルフチューブに取り、−２０℃で凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その１００μｌを取り、微酸性溶液（組成；０．６ｍＭ硫酸を９６ｍｌ、アセトニトリル４ｍｌ）で２倍に希釈し、８−ＯＨ−ｄＧ及び８−ＯＨ−ｒＧｕｏを各１２μｇ加えた。更に２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を６．７μｌ加え、ｐＨを７以下にした。これをよく攪拌した後、１５０００回転、５分間遠心分離を行い、その上清を尿試料１とした。
上記のように調製した尿試料１を１０μｌ陰イオン交換カラム（充填剤（Ｂｉｏ  Ｒａｄ製）の粒径１２μｍ、内径１ｍｍ、ガードカラムの長さ４ｃｍ、本カラムの長さ１２ｃｍ）によって精製した。この分離パターンを図３に示す。なお、この分離パターンは、ＵＶ検出器（「ＵＶ−８０２０」、東ソー製）（吸光波長２５４ｎｍ）を用いて検出した。
図３に示すように、８−ＯＨ−ｄＧは、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出から一定の時間差を置いて溶出された。そのため、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出をモニターすることにより、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置を把握でき、確実に８−ＯＨ−ｄＧを有する画分を得ることが可能である。
（実施例２）
〈尿試料２の調製〉
ヒトの尿を１ｍｌずつ２本のエッペンドルフチューブに取り、−２０℃で凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その１００μｌを取り、微酸性溶液（組成；０．６ｍＭ硫酸を９６ｍｌ、アセトニトリル４ｍｌ）で２倍に希釈し、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ１２μｇ加えた。更に２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を６．７μｌ加え、ｐＨを７以下にした。これをよく攪拌した後、１５０００回転、５分間遠心分離を行い、その上清を尿試料２とした。
〈陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製〉
陰イオン交換カラムを用いて、ヒトの尿試料２の精製を行い、８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分（３４〜４１分）を得た。なお、０．３ｍＭ硫酸、２％アセトニトリル溶離液（Ａ液）を用い、カラム温度は６５℃、流速は１７μｌ／ｍｉｎとした。このときの分離パターンを図４に示す。なお、上記陰イオン交換カラムは、アミネックスＨＰＸ−７２Ｓカラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ製）（３００×７．８ｍｍ、粒径１２μｍ、架橋度８％、ｓｕｌｆａｔｅ型）の充填剤を内径１ｍｍのカラム（ガードカラムの長さ４ｃｍ、本カラムの長さ１２ｃｍ）に詰めかえて作製したものである。また、この分離パターンは、ＵＶ検出器（「ＵＶ−８０２０」、東ソー製）（吸光波長２５４ｎｍ）を用いて検出した。
〈逆相クロマトグラフィーによる精製〉
陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分（３４〜４１分）１１９μｌを自動的に逆相クロマトグラフィーに注入した。なお、逆相カラムとして、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（Ｓ−５μｍ）（２５０×４．６ｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７；これは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を希釈して調製したものであり、ｐＨは多少異なる）、５％ＭｅＯＨ溶離液（Ｂ液）を用い、カラム温度は４０℃、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎとした。その分離パターンを図５に示す。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（「ＥＳＡ  Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩ」、ｅｓａ社）（電圧：ガードセル３５０ｍＶ；チャンネル１、１５０ｍＶ；チャンネル２、３００ｍＶ）を用いて検出した。
（実施例３）
＜陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製＞
ヒト尿試料２のほかの分離例を図６に示す。ヒト尿試料２を２０μｌ注入した。分離条件は、カラムＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＡ０８Ｆ（７μｍ）；内径１．５ｍｍ、長さ（ガードカラム）５ｃｍ、（本カラム）１５ｃｍ；温度、６５℃；流速、３６μｌ／分；溶離液、０．３ｍＭ硫酸、２％アセトニトリル（Ａ液）であり、ＵＶ検出器（「ＵＶ−８０２０」、東ソー製）（吸光波長２５４ｎｍ）を用いて検出した。
（実施例４）
＜逆相クロマトグラフィーによる精製＞
陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を逆相クロマトグラフィーにより分析した他の例を図７に示す。なお、逆相カラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（２５０×４．６ｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；これは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を希釈して調製したものであり、ｐＨは多少異なる）、５％ＭｅＯＨ溶離液（Ｂ液）を用い、カラム温度は４０℃、流速０．９ｍｌ／ｍｉｎとした。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（「ＥＳＡ  Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩ」、ｅｓａ社）（電圧：ガードセル３５０ｍＶ；チャンネル１、１５０ｍＶ；チャンネル２、３００ｍＶ）を用いて検出した。
図５及び図７から明らかなように、上述した方法によれば、精製８−ＯＨ−ｄＧのピーク付近には夾雑物がなく、８−ＯＨ−ｄＧの測定の精度に優れていた。
（実施例５）
〈尿試料３の調製〉
ラットの尿を１ｍｌずつ２本のエッペンドルフチューブに取り、−２０℃で凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その１００μｌを取り、微酸性溶液（組成；０．６ｍＭ硫酸を９６ｍｌ、アセトニトリル４ｍｌ）で２倍に希釈し、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ１２μｇ加えた。更に２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を６．７μｌ加え、ｐＨを７以下にした。これをよく攪拌した後、１５０００回転、５分間遠心分離を行い、その上清を尿試料３とした。
〈陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製〉
陰イオン交換カラムを用いて、ラットの尿試料３の精製を行い、８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を得た。なお、０．３ｍＭ硫酸、２％アセトニトリル溶離液（Ａ液）を用い、カラム温度は６５℃、流速は１７μｌ／ｍｉｎとした。また、上記陰イオン交換カラムは、アミネックスＨＰＸ−７２Ｓカラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ製）（３００×７．８ｍｍ、粒径１２μｍ、架橋度８％、ｓｕｌｆａｔｅ型）の充填剤を内径１ｍｍのカラム（ガードカラムの長さ５ｃｍ、本カラムの長さ１５ｃｍ）に詰めかえて作製したものである。
〈逆相クロマトグラフィーによる精製〉
上記陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を自動的に逆相カラムに注入し分析した。その分離パターンを図８に示す。なお、逆相カラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（３００×４．６ｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；これは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を希釈して調製したものであり、ｐＨは多少異なる）、５％ＭｅＯＨ溶離液（Ｂ液）を用い、カラム温度は４０℃、流速０．９ｍｌ／ｍｉｎとした。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（「ＥＳＡ  Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩ」、ｅｓａ社）（電圧：ガードセル３５０ｍＶ；チャンネル１、１５０ｍＶ；チャンネル２、３００ｍＶ）を用いて検出した。
（実施例６）
ラット尿の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＩ、７μｍ粒子）により得た８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を逆相クロマトグラフィーにより分析したほかの例を図９に示す。尚、逆相カラムとして、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（Ｓ−５  ｍ）（２５０×４．６ｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０；これは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を希釈して調製したものであり、ｐＨは多少異なる）、２％ＭｅＯＨ溶液を用い、カラム温度は、４６℃、流速０．７５ｍｌ／分とした。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（ＥＳＡ  Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩ，ＥＳＡ社）（電圧：ガードセル４００ｍＶ；チャンネル１、２８０ｍＶ；チャンネル２、３５０ｍＶ）を用いて検出した。
図８及び図９から明らかなように、ラットの尿試料３においても、８−ＯＨ−ｄＧの測定が可能であった。
産業上の利用性
本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製方法は、８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等の酸化的損傷グアニンヌクレオシドを回収率良く、精製・回収できる。
また、特に８−ＯＨ−ｄＧの精製においては、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏを８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカーとして加えることにより、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出時間が把握でき、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。更に、第１の精製工程における陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）の流速が微量であるため、溶離液（Ａ液）、洗浄液（Ｃ液）の消費が極めて少なく、精製後の廃液量も少量で済むため、環境保全の面からも好ましい。また、本発明の測定方法は、上記精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧ、又は８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等の精製酸化的損傷グアニンヌクレオシドを測定するので、非常に精度が高く、再現性を有する。本発明の８−ＯＨ−ｄＧの分析装置によれば、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）が、試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着するため回収率が非常に高く、試料中にふくまれる夾雑物を一度に取り除くことができる。また、連続運転を行うことによって大量処理が可能である。また、この分析装置は比較的安価なため、経済性にも優れている。
【図面の簡単な説明】
図１は、８−ＯＨ−ｄＧの精製、測定を実施するための装置の一実施形態を示す模式図である。
図２は、８−ＯＨ−ｄＧの精製、測定を実施するための装置の一実施形態を示す模式図である。
図３は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）による尿と８−ＯＨ−ｄＧと８−ＯＨ−ｒＧｕｏとの混合物の分離パターンの一例であり、マーカーの位置確認を示す。
図４は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）によるヒト尿の分離パターンの一例を示す。
図５は、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）によるヒト尿の分離パターンの一例を示す。
図６は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）によるヒト尿の分離パターンの一例を示す。
図７は、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）によるヒト尿の分離パターンの一例を示す。
図８は、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）によるラット尿の分離パターンの一例を示す。
図９は、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）によるラット尿の分離パターンの一例を示す。
符号の説明
１１  陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）
１２  逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）
１３  検出器
１４  ＵＶ検出器
１５  スイッチングバルブ
１６  スイッチングバルブ
１７  オートサンプラー
２７  サンプリングインジェクター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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