(57)【要約】インスリン抵抗性改善薬及び糖代謝改善薬のスクリーニングに有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を開示する。前記ポリペプチドは骨格筋で特異的に発現する蛋白質であり、同蛋白質を高発現させた脂肪細胞では糖の取り込み能が増大する。前記ポリペプチドを用いたインスリン抵抗性改善薬及び糖代謝改善薬のスクリーニング方法並びに該スクリーニング方法により得られる物質を有効成分とするインスリン抵抗性改善用及び糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチド、あるいは（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２に結合する蛋白質であるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求の範囲４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求の範囲５に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項７】
請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び
前記結合を促進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合促進剤をスクリーニングする方法。
【請求項８】
結合促進剤がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である請求の範囲７に記載のスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定する工程である請求の範囲７又は請求の範囲８に記載のスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求の範囲７乃至請求の範囲９に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ａｋｔ２に結合する新規なポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び該ベクターを含有する形質転換細胞に関する。
【背景技術】  インスリンは膵臓ランゲルハンス島のβ細胞より分泌され、主に筋肉、肝臓、脂肪に作用して血中の糖を細胞に取り込ませて貯蔵、消費させることにより血糖値を降下させる。糖尿病は、このインスリンの作用不足から引き起こされるが、患者にはインスリンの生産・分泌に障害をもつ１型と、インスリンによる糖代謝促進が起こりにくい２型の２つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖値が健常人より高くなるが、１型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対して、２型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の取り込み・消費が促進されないインスリン抵抗性が生じている。２型糖尿病は遣伝的素因に加えて過食や運動不足、ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣病である。今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの２型糖尿病患者が急激に増加しており、日本では糖尿病患者の９５％をしめている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性改善により糖代謝を促進する２型糖尿病の治療を対象とした研究の必要性が高まっている。
現在１型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。一方２型患者にも処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膵臓のβ細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤（ＳＵ剤）や、嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つビグアナイド系血糖降下剤の他、糖質の消化吸収を遅らせるα−グルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にインスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内でのブドウ糖利用が促進されるとともに、細胞内へのブドウ糖の取り込みが促進される。このチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲγ）のアゴニストとしてとして作用することが示されている（非特許文献１参照）。しかしチアゾリジン誘導体はインスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮腫を惹起する副作用が知られている（非特許文献２参照、非特許文献３参照）。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用であり、インスリン抵抗性改善のために、ＰＰＡＲγにかわるより有用な創薬標的分子が求められていた。
インスリンの作用は細胞膜上にあるインスリン受容体を介して細胞内へとシグナルが伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の２経路が存在する（非特許文献４参照）。第一経路は活性化したインスリン受容体からＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、Ｐ１３キナーゼ、及びＰＤＫ１を介してＡｋｔ１（ＰＫＢα）若しくはＡｋｔ２（ＰＫＢβ）、またはＰＫＣλ若しくはＰＫＣζへ順次シグナルが伝達され、結果として細胞膜上のグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４を介した細胞外からの糖の取り込みを促進する（非特許文献５参照）。一方、第二経路ではインスリン受容体からｃ−ＣｂＩ蛋白質及びＣＡＰ蛋白質を介してＣｒＫ  ＩＩ，Ｃ３Ｇ，及びＴＣ１０へ順次シグナルが伝達され、結果ＧＬＵＴ４による糖の取り込みを促進する（非特許文献６参照）。これらインスリンシグナル伝達経路の詳細はいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構を経てグルコーストランスポーターを介した細胞の糖取り込みを促進するのか明らかではない。
Ａｋｔ２は前述のインスリンシグナル第一経路に存在し、インスリンの刺激によりＰＤＫ１を介してリン酸化され活性化する。活性化したＡｋｔ２はキナーゼとして基質となる蛋白質をリン酸化することによりシグナルを伝達する。Ａｋｔ２蛋白質をコードする遺伝子を人為的に欠失させたホモノックアウトマウスは主に筋肉、肝臓においてインスリンの感受性が低下し２型糖尿病様の表現形を示すことが報告されている（非特許文献７参照）。これらの事実から、Ａｋｔ２はインスリンシグナルに応答した細胞内への糖取り込みに関与するシグナル仲介因子であり、その機能の欠損はインスリンによるシグナル伝達を部分的に遮断させるためにインスリン抵抗性を惹起し、２型糖尿病様態を引き起こすと考えられている。
一方Ａｋｔ２と直接相互作用してその活性を調節する分子はこれまでに知られていなかった。
【非特許文献１】「（ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、（米国）、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１２９５３−１２９５６
【非特許文献２】「ダイアビーティーズ  フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１１−８１８
【非特許文献３】「ダイアビーティーズ  フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１９−８２４
【非特許文献４】「ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、（米国）、２０００年、第１０６巻（２）、ｐ．１６５−１６９
【非特許文献５】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９９年、第２７４巻（４）、ｐ．１８６５−１８６８
【非特許文献６】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」（英国）、２０００年、第４０７巻（６８０１）、ｐ．２０２−２０７
【非特許文献７】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、（米国）、２００２年、第２９２巻、ｐ．１７２８−１７３１
【発明の開示】
本発明者らは、上述の知見からＡｋｔ２の働きを増強させることができれば、インスリン抵抗性を改善する方向に作用すると考えた。この目的のためにはＡｋｔ２自身の活性を増大させるか、あるいはＡｋｔ２の活性を制御している細胞内因子を同定してその作用を調節するかの何れかの方法が考えられた。しかしＡｋｔ２はキナーゼであり、その酵素活性を薬剤によって増強する方向に調節することは困難である。そこで、本発明者らは、Ａｋｔ２に結合する蛋白質を、酵母ツーハイブリッドシステムにより同定した。その結果、骨格筋で特異的に発現する蛋白質ＡＫＢＰ１（Ａｋｔ２  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）をコードする新規な塩基配列のｃＤＮＡのクローニングに成功した。さらに同蛋白質マウスオルソログは糖尿病モデルマウスの脂肪組織において血糖値の変動に関わらず発現量が顕著に減少していること、同蛋白質を脂肪細胞で過剰に発現させると糖の取り込みが促進されることを明らかにすることにより、同蛋白質の減少及び同蛋白質とＡｋｔ２との結合の減少が糖尿病態の原因であることを見出した。
これらの結果、本発明者らはインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、並びに、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチド、あるいは（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２に結合する蛋白質であるポリペプチド、
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［４］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［６］［５］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞
［７］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び
前記結合を促進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合促進剤をスクリーニングする方法、
［８］結合促進剤がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である［７］に記載のスクリーニングする方法、
［９］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定する工程である［７］又は［８］に記載のスクリーニングする方法、
［１０］［７］乃至［９］に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
Ａｋｔ２と直接相互作用してその活性を調節する分子はこれまでに知られていなかった。また、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性の高い配列はこれまでに知られていなかった。本発明者らは本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、その蛋白質の減少及びＡｋｔ２との結合の減少が糖尿病態の原因であることを初めて明らかにした。また、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明者らが初めて見出した方法である。
【図面の簡単な説明】  図１は、培養細胞におけるヒトＡＫＢＰ１の発現を示す図面である。
図２は、糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ及びｄｂ／ｄｂと正常マウスにおける脂肪組織でのＡＫＢＰ１発現量の比較を示す図面である。図の縦軸はＡＫＢＰ１発現量を示す。
図３は、ヒトＡＫＢＰ１を過剰発現させた脂肪細胞における糖取り込み量を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
＜本発明のポリペプチド＞
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２に結合するポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２に結合するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２に結合する蛋白質であるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２に結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ  ７３、２３７−２４４、１９９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、４６７３−４６８０、１９９４）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ  ｔｕｐｌｅ  １
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ３
Ｗｉｎｄｏｗ  ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ  Ｓａｖｅｄ  ５
また、本発明のポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ブタなどの哺乳動物由来のものも包含する。
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、その機能的等価改変体、または、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。また、同じ分子種として同定されるものであればいずれの種由来のものであってもよい。好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列である。なお、本明細書におけるポリヌクレオチドには、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、これらによってコードされる本発明のポリペプチドの機能を実質的に変更しないあらゆる変異体を含むことが出来る。より具体的には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加及び挿入を有する変異体を含むことが出来る。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変及び／又は作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及び手段を問わず、上記特性を有する全ての変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）１５４、３５０，３６７−３８２）等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６８）１５０，１７８）、及びそれらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うＤＮＡを得ることが可能である。あるいはＰＣＲ法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりＤＮＡ分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されていると同様に実施できる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト骨格筋を挙げることができる。ヒト骨格筋からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドによれば、例えば該ポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法として具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロッティング解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの常法に従って行うことが出来る。ＲＴ−ＰＣＲによって本発明のポリヌクレオチドを検出する場合に用いられるプライマーは、該遺伝子のみを特異的に増幅できるものである限り特に制限は無く、本発明のポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することが出来る。本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーは、本発明のポリヌクレオチドを検出するための特異プライマー及び特異プローブとして利用できる。
＜本発明の発現ベクター及び細胞＞
上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］に記載の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で産生する本発明のポリペプチド発現系が構築できる。
具体的には上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’側にある本発明のポリペプチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリペプチドの発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。例えば、宿主細胞には、限定されるわけではないが、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャーＲＮＡレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性のＡｋｔ２が豊富に存在する脂肪由来細胞、肝由来細胞、あるいは筋由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
宿主細胞を形質転換し、遣伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例２に記載のように所望のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターをリポフェクトアミン法を用いてＣＯＳ−１細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ−１細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。本発明のポリペプチドは公知の方法（例えば、岡田雅人及び宮崎香編、「改訂タンパク質実験ノート上・下」、羊土社、１９９９）により分離精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。あるいは所望により、該蛋白質の物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。
本発明のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を１個ずづ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは前記した各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全部または一部を包含する任意のウイルスベクターを作製し、該ベクターを骨格筋組織に感染させて本発明のポリヌクレオチドを作動させることにより、細胞内で本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現を強制的に亢進させることが出来る。これにより骨格筋における本発明のポリペプチド蛋白質量を増大させることでＡｋｔ２の活性を調整し、インスリンシグナル第一経路を介した糖取り込みを制御することが可能となる。この結果として糖代謝を制御し、つまりは糖尿病の進展を制御することが可能となる。
ウイルスベクター利用において、骨格筋における強制発現の具体的な方法としては、例えば骨格筋アクチン、ミオシン重鎖、クレアチンキナーゼなどのプロモーターの利用を例示できる。
ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター（ＭｃＬａｃｈｌｉｎ  ＪＲ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，９１，６１８６−６１９６）、アデノウイルスベクター（Ｔｏｎｇ−Ｃｈｕａｎ  Ｈｅ，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，９５，２５０９−２５１４）の利用を例示できる。
＜本発明のスクリーニングする方法＞
本発明のスクリーニングする方法には、本発明のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び前記結合を促進する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合促進剤をスクリーニングする方法が含まれる。
本発明のポリペプチドの一つであるＡＫＢＰ１はＡｋｔ２と結合すること、糖尿病モデルマウスでマウスオルソログの発現が減弱していること、及びＡＫＢＰ１を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが亢進していることから、本発明のポリペプチドはＡｋｔ２との結合を介してインスリンシグナルを正に制御していることがわかった。従って、上述のスクリーニングする方法によりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。
上述のスクリーニングする方法における本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程は、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を直接検出することによって実施でき、また、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定することによっても実施できる。
本発明のスクリーニングする方法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５））によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
上記スクリーニングする方法として限定はされないが具体的には以下のスクリーニング方法が挙げられる。
１）Ａｋｔ２のリン酸化を利用したスクリーニング方法
Ａｋｔ２は分子内のＳｅｒ４７３がリン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている。これを利用し、Ａｋｔ２のＳｅｒ４７３のリン酸化状態を抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体を用いたウエスタンブロットにより検出することでＡｋｔ２の活性の有無が検出できる。
本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。試験物質を未処理又は処理した細胞を溶解し、これを試料として抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体を用いるウエスタンブロット法、スポットウエスタンブロット法などを利用することによりＡｋｔ２のリン酸化、すなわちＡｋｔ２の活性の有無を検出することができる。この検出系において、試験物質を未処理の試料に比較してＡｋｔ２のリン酸化（すなわちＡｋｔ２の活性化）の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を促進する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ法を利用したスクリーニング法
内在性のＡｋｔ２基質を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ法によってもＡｋｔ２活性を検出することができる。具体的には、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降により活性化したＡｋｔ２蛋白質を濃縮することができる。タグをつけて精製したＡｋｔ２の内在性基質、例えば、ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（Ａｋｔが生理的基質としているＧＳＫ３−ｂｅｔａの配列のＧＳＴ融合タンパク）と濃縮Ａｋｔ２蛋白質とを混合することにより、基質のリン酸化を指標としてＡｋｔ２のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。キナーゼ測定は、トータルキーナーゼアッセイ法（Ｗａｇａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９０，ｐｐ７１−７７，１９９６）を利用することにより大規模な数の化合物のスクリーニング方法として使用が可能である。この測定系において、試験物質を未処理の試料に比較してＡｋｔ２のキナーゼ活性の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を促進する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
３）本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を利用したスクリーニング方法
本発明のポリペプチドはＡｋｔ２との結合を介してインスリンシグナルを正に制御していることから、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を指標とした以下のスクリーニング方法が挙げられる。具体的には、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域、あるいはＧＳＴやＦｌａｇ、ＨＩＳなどのタグを融合させた本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降によりＡｋｔ２蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られたＡｋｔ２およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより本発明のポリペプチドの量を測定することにより、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２の結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。ここで用いる抗体は、本発明のポリペプチド或いはその部分配列をもとに作製した本発明のポリペプチドに対する抗体（例えば抗ＡＫＢＰ１抗体）、あるいは上記タグを認識する抗体を利用することができる。また上述と同様に本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液に試験物質を添加あるいは未添加したものから、ＧＳＴなどのタグをつけて精製したＡｋｔ２蛋白質を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏのプルダウン法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁  松七五三ら）と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもＡｋｔ２と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。あるいはここで本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液を用いずに、本発明のポリペプチドの発現プラスミド（例えば実施例１（５）で作製したＡＫＢＰ１発現プラスミド）から直接本発明のポリペプチドである蛋白質（例えばＡＫＢＰ１蛋白質）をＴＮＴキット（プロメガ社）等を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものを用いても同様にＡｋｔ２と本発明のポリペプチド（例えばＡＫＢＰ１）の結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウエスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。また上述と同様のタグを融合させて発現させた本発明のポリペプチドおよびＡｋｔ２を同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知のＥＬＩＳＡ法に従ってもＡｋｔ２と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択するスクリーニングが可能である。また公知の哺乳類細胞におけるツーハイブリッドシステム（クロンテック社）を利用して、ベイトにＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と融合させたＡｋｔ２を、プレイ側にＶＰ１６の転写促進領域を融合させた本発明のポリペプチドを配置することにより、既存のＣＡＴあるいはルシフェラーゼ活性の検出によりＡｋｔ２と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を大多数の母集団からスクリーニングし選択することが可能である。
インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法として本発明のポリペプチドの発現量を測定することによるスクリーニング方法が挙げられる。糖尿病モデルマウスでＡＫＢＰ１のマウスオルソログの発現が減弱していること（実施例４）、およびＡＫＢＰ１を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが亢進していること（実施例６）から、内在性のＡＫＢＰ１の発現量を試験物質により増加させることが可能であれば、該試験物質はインスリン抵抗性を改善する作用を持つことが予想される。このような物質は具体的には以下の方法によって選択することができる。
まず試験物質で未処理又は処理した細胞から実施例４（１）に示した方法に従ってＲＮＡを調製することができる。該細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。このＲＮＡ調製液から公知の方法に従ってアガロースゲル電気泳動によりＲＮＡを分離した後、ニトロセルロース膜に転写し、これを本発明のポリヌクレオチドの配列を含むラベルした短鎖ＤＮＡプローブを用いたノーザンプロット解析により、試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡの発現量の増減を検出できる。これにより本発明ポリペプチドの発現量を増加させる物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることができる。あるいは本発明のポリヌクレオチドの配列を含む短鎖ＤＮＡプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法によっても試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡの発現量の増減を定量的に検出できる。リアルタイムＰＣＲはより具体的には実施例４の方法に従って実施できる。これにより本発明のポリペプチドの発現量を増加させる物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることが可能である。本発明のポリヌクレオチドは本スクリーニング方法に利用することができる。
＜インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）ＡＫＢＰ１遣伝子のクローニングと発現ベクターの構築
（１）Ａｋｔ２のクローニング
遺伝子データベースＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号Ｍ９５９３６に記載されたヒトＡｋｔ２の全長領域をコードするｃＤＮＡ配列を参照して設計した配列番号３及び配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒト筋肉ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（ｒ）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、９５℃３分間の熱変性反応の後、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７４℃１分３０秒からなるサイクルを４０回、さらに７４℃７分間の条件で、ＰＣＲを行なった。これにより生成した約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＺＥｒＯＴＭ−２．１（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＶ認識部位に挿入することにより、ヒトＡｋｔ２ｃＤＮＡをクローニングした。ベクター上にクローニングしたＡｋｔ２  ｃＤＮＡの配列は前述の配列番号３及び４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定し、報告された配列と一致することを確認した。
（２）酵母ツーハイブリッド用発現プラスミドの作製
Ａｋｔ２のｃＤＮＡを酵母ツーハイブリッド用発現ベクターｐＤＢｔｒｐ（インビトロジェン社、選択マーカーとしてＴＲＰ１遺伝子を有する）に挿入するため、Ａｋｔ２遺伝子配列のそれぞれ５’側及び３’側にｐＤＢｔｒｐベクターのマルチクローニングサイトの前後４０ヌクレオチドと相同な領域を付加した配列番号５及び６に示すプライマーを設計した。ＰＣＲは上述でクローニングしたＡｋｔ２プラスミドを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３分）のサイクルを３５回、繰り返した。その結果得られたＤＮＡ断片はＡｋｔ２遺伝子の全コード領域を有している。
制限酵素ＳａＩＩ及びＮｃｏＩで切断して直鎖上にしたベクターｐＤＢｔｒｐ及び上記で得られたＡｋｔ２のｃＤＮＡを含むＰＣＲ断片を同時にツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３（インビトロジェン社）へ添加し、リチウム酢酸法により形質転換した（Ｃ  Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｒ  Ｆｉｎｋ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）。その結果同酵母細胞内で相同組換えが生じ、ｐＤＢｔｒｐのマルチクローニングサイトにＡｋｔ２  ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＤＢ−Ａｋｔ２と略称する）が形成された。同プラスミドを有する酵母細胞を、プラスミドの選択マーカーであるトリプトファンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選択し、同酵母細胞をザイモリエース（生化学工業）で室温にて３０分処理した後、アルカリ法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）でプラスミドを単離精製し、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、Ａｋｔ２のｃＤＮＡが、ｐＤＢｔｒｐのＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域のコード領域と翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
（３）酵母ツーハイブリッドスクリーニング
上述のｐＤＢ−Ａｋｔ２により形質転換したツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３を４００ｍｌのＹＰＤ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）に懸濁し、波長５９０ナノメートルの吸光度が０．１から０．４になるまで３０℃で約６時間振とう培養した後、リチウム酢酸法でコンピテントセルとし、最終量を１．０ｍｌの０．１Ｍリチウム−トリス緩衝液に懸濁した。同細胞をヒト骨格筋ライブラリー（いずれもクロンテック社Ｍａｔｃｈ  Ｍａｋｅｒ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ）各２０μｇで形質転換し、同細胞をｐＤＢ−ＰＰＡＲγ及びライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選別し、両プラスミドが導入された形質転換株を得た。同時に同じ形質転換細胞をトリプトファン、ロイシンのほかに、ツーハイブリッドシステムにおいて人工的に発現させたＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域の融合蛋白質に、ＧＡＬ４転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝子ＨＩＳ３が作動した細胞を選択するため、ヒスチジンを培地から除き、さらにＨＩＳ３がコードする酵素の阻害剤である３ＡＴ（３−ＡＭＩＮＯ−１，２，４−ＴＲＩＡＺＯＬＥ；シグマ社）２０ｍＭを添加した固形最小倍地（２０％アガロース）上で３０℃で５日間培養した。同条件下でＡｋｔ２に結合する蛋白質を発現していることを示す３ＡＴ耐性の酵母のコロニーを取得した。これらの酵母細胞を２４時間ＹＰＤ固形培地上で成長させた後、ＨＩＳ３とは別のツーハイブリッドシステムの結合指示レポーターであるｌａｃＺ遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β−ガラクトシダーゼ活性は培地上の酵母細胞をニトロセルロースフィルターに移し取り、液体窒素に付けて凍結させた後、室温で解凍し、フィルターを０．４％のＸ−ＧＡＬ（シグマ社）溶液を浸した濾紙上にのせて３７°Ｃで２４時間静置し、β−ガラクトシダーゼ青色変化を測定した。フィルター上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニーを選択することにより、Ａｋｔ２に結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、同細胞からクロンテック社Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従ってライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、配列番号７で表される塩基配列（ＧＡＬ４ＡＤ領域に結合する配列；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２９８９９  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＡＣＴ２由来）をプライマーとし、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した結果、配列番号１に示す塩基配列の第２６８番目の塩基以降の配列が含まれていることを確認した。
（４）ＡＫＢＰ１遺伝子の全長ｃＤＮＡのクローニング
前述（３）の結果、配列番号１で表される塩基配列の第２６８番目の塩基以降の配列を含む遺伝子断片を含むライブラリー由来のプラスミドが得られ、Ａｋｔ２に結合する因子の存在が示された。そこで配列番号１で示された塩基配列の第６９０番目から第７１１番目の塩基配列の相補鎖に相当する配列番号８に示すプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーと前述配列番号９で表される塩基配列のプライマーを用いて前述の骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリー中からＰＣＲ法により全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２．５分）の後、９４°Ｃ（５秒）・７２°Ｃ（４分）のサイクルを５回、９４°Ｃ（５秒）・７０°Ｃ（４分）のサイクルを５回、９４°Ｃ（５秒）・６８°Ｃ（４分）のサイクルを２５回、それぞれ繰り返した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約８００塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ／インビトロジェン社；配列番号１０）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示すＤＮＡ配列を含むクローンであることを確認した。配列番号１よりさらに５’側上流に５０数塩基対のＤＮＡ断片の付随が認められたが、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡのトリプレットに従うと配列番号１の初めにあるＡＴＧ（開始コドン）より上流には別の開始コドンは認められず、ストップコドンのトリプレットが存在した。これにより配列番号１に示す遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子をＡＫＢＰ１遣伝子と名付けた。
（５）ＡＫＢＰ１発現ベクターの作製
前述（４）で得られたＡＫＢＰ１遣伝子の全長配列を含むプラスミドから、配列番号１に示す塩基配列情報に従い、正味ＡＫＢＰ１蛋白質をコードするＡＫＢＰ１  ｃＤＮＡを、配列番号９、及び配列番号８を用いてＰＣＲ法により増幅した。これら２種類のＤＮＡプライマーはそれぞれ配列番号１に示すＡＫＢＰ１遺伝子の５’側、３’側の短い配列部分と相同な塩基配列を有する。これらのプライマーはＡＫＢＰ１蛋白質のＮ末端側にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）が、Ｃ末端側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｒｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０１０４−１０１０８）及びＨＩＳ６タグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｐ（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，１４０−１４９）がそれぞれ融合されるように設計した。したがって配列番号９に示すプライマーはクローニング後、ＡＫＢＰ１のＮ末端側のＦｌａｇタグが翻訳されるように開始コドンを該タグの直前へ移動するよう設計した。配列番号８に示すプライマーはクローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープがＡＫＢＰ１遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くようにＡＫＢＰ１のストップコドン配列が除かれるよう設計した。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８°Ｃ（５秒）、５５°Ｃ（３０秒）、７２°Ｃ（３分）のサイクルを３５回繰り返した。その結果得られた７４３塩基対のＡＫＢＰ１  ｃＤＮＡをふくむＤＮＡ断片を前述の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯにクローニングした。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を上述（４）と同様にして決定した結果、配列番号１に示すＤＮＡ配列の３’側のストップコドンを除いたＤＮＡが挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ１と略記する。
（実施例２）ＡＫＢＰ１蛋白質を発現する培養細胞の作製
（１）ＡＫＢＰ１発現細胞の作製
上述の実施例１（５）で作製した発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ１をＣＯＳ−１細胞に導入した。ＣＯＳ−１細胞は６ウェル培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ）の培養皿に各ウェル２ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ  Ｌら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻４５６頁１９７３年、新井直子、遺伝子導入と発現／解析法１３−１５頁１９９４年）により、ｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ１（１．０μｇ／ウェル）を一過性にトランスフェクトした。４８時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後にウェルあたり０．１ｍｌの細胞溶解液（１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。
（２）ＡＫＢＰ１蛋白質の検出
上述＜実施例２＞（１）のＡＫＢＰ１発現細胞の溶解液１０μｌに１０μｌの２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％ラウレル硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、０．１４Ｍ  βメルカプトエタノール、０．０２％ブロムフェノルブルー）を添加し、１００℃で２分間処理した後、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いてポリアクリルアミド中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ニトロセルロース上のＡＫＢＰ１蛋白質の検出を行った。一次抗体にはＡＫＢＰ１のＣ末端に融合させたＶ５エピトープを認識するモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用い、二次抗体にはラビットＩｇＧ−ＨＲＰ融合抗体（バイオラッド社）を用いた。結果図１に示す通り、２９０アミノ酸からなるＦｌａｇ−ＡＫＢＰ１−Ｖ３−ＨＩＳ６融合蛋白質を示す約３２ｋＤａの蛋白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ１の存在に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のＡＫＢＰ１遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとることが明らかになった。
（実施例３）ＡＫＢＰ１遺伝子の組織別発現分布解析
ＡＫＢＰ１蛋白質はＡｋｔ２と相互作用することから、該蛋白質はインスリンに応答する組織で発現し、インスリンシグナル第一経路に作用することが予想された。そこで配列番号１１、及び配列番号１２に示すＡＫＢＰ１に相同な一対のプライマーを用いて、配列番号１に示すＡＫＢＰ１遺伝子の第３６０番目から第６４７番目までの２８８塩基対のＡＫＢＰ１部分ＤＮＡ断片を、各種組織由来ｃＤＮＡからＰＣＲ反応を用いて増幅を試み、各種組織におけるＡＫＢＰ１の発現の有無を調べた。ヒト骨髄、脳、軟骨、心臓、腎臓、白血球、肝臓、肺、リンパ球、乳腺、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、骨格筋、ＨｅＬａ細胞由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）各１μｇをテンプレートとしてＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ（ｒ）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；アプライドバイオシステム社）を用い、９４°Ｃ（２．５分）の後、９４°Ｃ（３０秒）、５５°Ｃ（３０秒）、７２°Ｃ（１分）のＰＣＲサイクルを３５回繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、骨格筋、ＨｅＬａ細胞、乳腺由来の各ｃＤＮＡライブラリーからは所望するＡＫＢＰ１の部分断片を含むと思われる約３００塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたが、骨髄、脳、肺、胎盤由来の各ｃＤＮＡライブラリーからは約５００塩基対のＤＮＡ断片、軟骨、白血球のそれらからは約４００塩基対のＤＮＡ断片、前立腺のそれからは約１０００塩基対のＤＮＡ断片がそれぞれ増幅された。これらのＤＮＡ断片を各々アガロースゲル中から分離した後、上述の＜実施例１＞（４）に記した方法に従い該ＤＮＡ断片の塩基配列をそれぞれ決定した。骨髄、脳、肺、胎盤由来の各ｃＤＮＡから増幅された断片、軟骨、白血球由来ｃＤＮＡから得られた断片、前立腺から得られた断片、乳腺から得られた断片、及びＨｅＬａ細胞由来の断片は、それぞれ配列番号１３〜１７に示される、各５００塩基対、４００塩基対、１０００塩基対の配列であった。配列番号１に示したＡＫＢＰ１と同一の配列を有するものは骨格筋由来ｃＤＮＡから増幅されたもののみであり、骨髄、脳、肺、胎盤、軟骨、白血球、前立腺において発現しているものは該由来組織に特有のＡＫＢＰ１のスプライシングバリアントであることが明らかになった。
これら配列番号１３から１７に示される上述の組織由来のポリヌクレオチドを配列番号１に示されたＡＫＢＰ１遺伝子の第３６０番目の塩基から６４７番目の塩基部分に置き換えると、上述の組織由来のＡＫＢＰ１スプライシングバリアントは、配列番号２に示されたＡＫＢＰ１蛋白質の第１２１番目に相当するアミノ酸以降からストップコドンまでそれぞれ配列番号１８〜２２に示されるポリペプチドをコードしており、いずれもＡＫＢＰ１蛋白質と同一のものを発現する配列は存在しなかった。このことから、配列番号１及び２で示される本発明ＡＫＢＰ１遺伝子及びＡＫＢＰ１蛋白質の発現は、インスリンシグナルに応答する骨格筋などごく限定された臓器で特異的に制御されていることが判明した。
（実施例４）正常及び糖尿病モデルマウスにおけるＡＫＢＰ１発現量の測定
上述の知見に基づき、本発明のＡＫＢＰ１蛋白質はＡｋｔ２と相互作用し、その発現は骨格筋などの、インスリン応答組織で特異的に制御されていることが判明し、本発明ＡＫＢＰ１蛋白質はインスリンシグナル第一経路に作用する因子であり、その作動の様態がインスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで２種類の糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（Ｉｗａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐｏｎ．，１７，２３−３５，１９７０、Ｔａｋｅｔｏｍｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，７，２４２−２４６，１９７５）、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８４，４９１−４９５，１９９６、Ｌｅｅ  ｅｔ  ｌａ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７９，６３２−６３５，１９９６、Ｋａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３２，６３６−６４３，１９８９）の脂肪における本発明のＡＫＢＰ１遺伝子のマウスオルソログ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を測定し、その比較を行った。
遺伝子発現量の測定は本発明ＡＫＢＰ１遺伝子のマウスオルソログの部分配列に対して行い、同時にグリセルアルデヒド  ３−リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ））遺伝子の発現量を測定して補正した。測定はのＰＲＩＳＭＴＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて測定した。この原理は、ＰＣＲで増幅された２本鎖ＤＮＡがとりこむＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素の蛍光量をリアルタイムに定量することにより遣伝子発現量を検出するシステムである。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡの調製
全ＲＮＡはＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ；ニッポンジーン社）を用いて説明書に従い、１５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＫＫＡｙ／Ｔａマウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｍ＋／ｍ＋マウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｄｂ／ｄｂマウス（いずれも日本クレアより購入）の副睾丸脂肪から調製した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスとＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｍ＋／ｍ＋マウスは健常マウス、ＫＫＡｙ／ＴａマウスとＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｄｂ／ｄｂマウスは２型糖尿病モデルマウスとしてよく知られている。調製した全ＲＮＡはその後デオキシリボヌクレアーゼ［ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＤＮａｓｅ；ニッポンジーン社）］処理を行い、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解し−２０℃で保存した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、０．２５μｇのＲＮＡを逆転写反応用キット（ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、−２０℃で保存した。以下に述べる遺伝子発現量の測定には１００倍希釈したｃＤＮＡを使用した。
（３）ＰＣＲプライマーの作製
配列番号１に示すＡＫＢＰ１遺伝子の全長配列をマウス遺伝子のデータベースに対してホモロジー検索（ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ）を行い、配列番号２３に示すマウスＡＫＢＰ１オルソログの遣伝子断片を見出した。該マウスＡＫＢＰ１オルソログのポリヌクレオチド配列は配列番号１のヒトＡＫＢＰ１遺伝子の第２９９番目から第４２１番目の塩基までの配列部分に相当する。この配列情報をもとに配列番号２４及び２５に示すマウスＡＫＢＰ１オルソログの遺伝子断片を増幅できるプライマー一対を設計した。配列番号２４及び２５に示すプライマー対により、実施例３に示したスプライシングバリアントのオルソログは増幅されず、ＡＫＢＰ１オルソログのみ特異的に増幅される。別にマウスＧ３ＰＤＨの遺伝子断片を増幅するプライマー（配列番号２６及び２７）を設計した。これら配列番号２４、２５、及び配列番号２６、２７に示した各一対のプライマーを組み合わせ、ＰＲＩＳＭＴＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲでマウスＡＫＢＰ１オルソログ及びマウスＧ３ＰＤＨの各遺伝子断片を増幅した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は２５μｌの系で説明書に従って行った。各系において先述の１００倍希釈した１本鎖ｃＤＮＡは５μｌ、２ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ試薬を１２．５μｌ、各プライマーは７．５ｐｍｏｌ使用した。なお検量線作成には、１本鎖ｃＤＮＡに代えて０．１μｇ／μｌのマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を１０倍から３００００倍まで適当に希釈したものを５μｌ用いた。ＰＣＲは、５０℃１０分に続いて９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃１分間の２ステップからなる工程を４０サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウスＡＫＢＰ１遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遣伝子の発現量で補正した。
［ＡＫＢＰ１補正発現量］＝［ＡＫＢＰ１遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
上述の結果、図２に示すとおり、糖尿病病態マウスの副睾丸脂肪において本発明ＡＫＢＰ１のマウスオルソログ遺伝子の発現は顕著な減少が認められた。
従って本発明のＡＫＢＰ１はその機能低下によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のＡＫＢＰ１の関与が大きいと結論づけられる。
本実施例の結果より、ＡＫＢＰ１発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。
（実施例５）ＡＫＢＰ１高発現細胞における糖取り込み能の測定
（１）アデノウイルスベクターを利用したＡＫＢＰ１高発現ウイルスの作製
ヒトＡＫＢＰ１をコードする遺伝子断片を、ｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ１ベクターより制限酵素ＢｇＩＩＩ、ＮｏｔＩを用いて切り出し、アデノウイルスベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクター（ＨｅＴ．Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５，２５０９−２５１４，１９９８）のマルチクローニングサイト（ＢｇＩＩＩおよびＮｏｔＩ）に挿入し、ＡＫＢＰ１／ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターを得た。
以下、公知のプロトコール［“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡｄＥａｓｙ  Ｓｙｓｔｅｍ”］（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ．ｈｔｍ”“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ２．ｈｔｍ”）］に従い、ＡＫＢＰ１を発現する高力価アデノウイルス液の調製を行った。コントロール用アデノウイルスは、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶより調製した。
なおウイルス量は２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を測定し、下記の計算式で換算した。
［式］  １  Ａ２６０＝１．１×１０１２ウイルス粒子＝３．３×１０１１ｐｆｕ／ｍｌ
（２）肪細胞の分化とヒトＡＫＢＰ１発現アデノウイルスの添加
３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いてヒトＡＫＢＰ１の糖とりこみに対する効果を評価した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、１．６×１０５個／穴になるようにコラーゲンコートした２４穴プレート（旭テクノグラス社）にまいた。翌日、１０μｇ／ｍｌインスリン、２５０ｎＭデキサメサゾン、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加えたＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に培地を交換して３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化を誘導した。その２日後、培地を０．４ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に戻した。その４日後、コントロール用アデノウイルス又はＡＫＢＰ１を発現させるアデノウイルスを１穴あたり１．６×１０１０ｐｆｕの濃度で培地に添加した。
（３）ヒトＡＫＢＰ１高発現細胞における糖取り込み能の測定
アデノウイルス添加して３６時間後、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭに交換して３時間おいた。その後、糖取り込みに対する効果を評価した。まず培地を所定濃度のインスリンを含むＫＲＰ緩衝液（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７ｍＭ  ＫＣｌ，１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４）０．２５ｍｌに交換し、３７℃で２０分インキュベートした。次に１ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含むＫＲＰに１ｍｌあたり１５μｌの２−デオキシ−Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（アマシャムバイオサイエンス社）を加えたものを用意し、各穴に５０μｌずつ添加して３７℃で１０分インキュベートした。その後、冷えたリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で３回洗い、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて細胞を溶解し、２ｍｌのシンチレーター（Ａｑｕａｚｏｌ−２、パッカードバイオサイエンス社）と混合して、細胞内に取り込まれたグルコース量を液体シンチレーションアナライザー（トライカーブＢ２５００ＴＲ、パッカード社）を用いて測定した。
結果を図３に示す。図中の記号「＊」はＳｔｕｄｅｎ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにおける評価を示す。「＊＊」は、コントロール群に対する有意差がｐ＜０．０１であることを、「＊＊＊」は同有意差がｐ＜０．００１であることを意味している。図の縦軸は２−Ｄ−グルコース取り込み量を示し、横軸はインスリン濃度を示す。白塗りのバーはコントロールの値を、黒塗りのバーはＡＫＢＰ１高発現細胞の値を示す。図３に示す通り、本発明のＡＫＢＰ１遺伝子を脂肪細胞に高発現させると低インスリン濃度下で糖取り込み量が増加することが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明のポリペプチドはインスリンシグナルに関わる新たな新規分子であり、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は、Ａｋｔ２の働きを増強させる物質のスクリーニングに有用である。該スクリーニングにより選択される物質はインスリン抵抗性改善薬並びに糖尿病改善薬の候補物質として有用である。また、糖尿病態において血糖値の変動に関わらず発現量が低下する本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは糖尿病の診断に有用である。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３、４、５、６、８、９、１０、１１、２４、２５、２６、２７の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号７の配列で表される塩基配列は、クローニングベクターｐＡＣＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ２９８９９）の第５１８３番目（５’）〜第５１６２番目（３’）の塩基からなる配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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