(57)【要約】シンタキシン１ａに結合する配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはシンタキシン１ａと結合する該アミノ酸配列と少なくとも約９０％以上の相同性をするポリペプチド、これらポリペプチドの部分ペプチド、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖を提供し、さらに該ポリペプチドの生理学的作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤、これらを利用した医薬組成物を提供した。その他、遺伝子工学手法による該ポリペプチドまたはペプチドの製造法、該阻害剤・拮抗剤・賦活剤の同定方法、該ポリペプチドが関連する疾患の診断のための方法およびキットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選ばれるヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）に結合する機能を有するポリペプチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
（ｉｖ）前記（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を含んでなるペプチド。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドであって、シナプス小胞とシナプス前膜との融合に関わる、ヒトシンタキシン１ａとシナプトソーム関連２５ｋＤａタンパク質（２５ｋＤａ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびシナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）とのコンプレックス形成を促進するポリペプチドまたはペプチド。
【請求項４】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドを含む、ヒトシンタキシン１ａとの結合機能による、シナプス小胞とシナプス前膜の融合を介するエキソサイトーシスの調整剤。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドをコードする塩基配列またはその相補的配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求の範囲第５項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲第５項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項９】
組換えベクターが組換え発現ベクターである請求の範囲第８項に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
請求の範囲第８項または第９項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項１１】
請求の範囲第９項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１３】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと、該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害する請求の範囲第１２項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害する請求の範囲第１３項に記載の抗体。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと、該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化する化合物、および／または請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチド、請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第８項または第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、および請求の範囲第１２項から第１４項の何れか１項に記載の抗体から選択される少なくとも何れか一つを用いることを特徴とする同定方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化する化合物の同定方法であって、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質とが結合する条件下で、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドおよび該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質を被検物質と接触させ、次いで、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検物質が請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害または安定化する化合物の同定方法であって、該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ペプチドおよびヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）を被検物質と接触させ、次いで、該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検物質が該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害または安定化するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項１８】
請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、該ポリヌクレオチドと被検物質とを接触させ、次いで、該ポリヌクレオチドの発現により生じるシグナルの存在または不存在または変化を検出することにより、被検物質が該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１５項から第１８項の何れか１項に記載の方法で同定される化合物。
【請求項２０】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと相互作用して該ポリペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害または安定化する化合物。
【請求項２１】
請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。
【請求項２２】
請求の範囲第１項のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチド、請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第８項または第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、請求の範囲第１３項または第１４項に記載の抗体、および請求の範囲第１９項から第２１項の何れか１項に記載の化合物から選択される少なくとも何れか一つを有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項２３】
請求の範囲第２２項に記載の医薬組成物であって、神経伝達物質の放出を促進または阻害する作用を有する医薬組成物。
【請求項２４】
請求の範囲第２２項に記載の医薬組成物であって、神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止剤および／または治療剤である医薬組成物。
【請求項２５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害するまたは安定化することを特徴とする神経伝達物質の放出の促進方法または阻害方法。
【請求項２６】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害するまたは安定化することを特徴とする神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項２７】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを定量的または定性的に測定する方法。
【請求項２８】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドの発現または機能の異常に基づく疾患の診断に使用するための測定方法であって、（Ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸、および／または（Ｂ）該ポリペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方法。
【請求項２９】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドの量的異常に基づく神経伝達機能の異常に関る疾患の診断に使用するための測定方法であって、（Ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸、および／または（Ｂ）該ポリペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方法。
【請求項３０】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチド、請求の範囲第６項から第８項の何れか１項に記載のポリヌクレオチド、および請求の範囲第１３項から第１５項に記載の抗体から選ばれる少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【請求項３１】
請求の範囲第１５項から第１８項の何れか１項に記載の同定方法または請求の範囲第２７項から第２９項の何れか１項に記載の測定方法に使用するための請求の範囲第３０項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、小胞関連膜タンパク質（Ｖｅｓｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、ＶＡＭＰと訳すこともある。）相同性領域を有し、シンタキシン１ａと結合するポリペプチド、および該ポリペプチドの一部を有するペプチドに関する。また、シナプス小胞とシナプス前膜との融合に関わる、ヒトシンタキシン１ａとシナプトソーム関連２５ｋＤａタンパク質（２５ｋＤａ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、ＳＮＡＰ−２５と称することもある。）およびシナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）とのコンプレックス形成を促進するポリペプチドまたはペプチドに関する。さらに、該ポリペプチドまたは該ペプチドを含む、ヒトシンタキシン１ａとの結合機能による、シナプス小胞とシナプス前膜との融合を介するエキソサイトーシスの調整剤に関する。また、該ポリペプチドまたはペプチドをコードする塩基配列若しくはその相補的配列を含んでなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体に関する。さらに、該ポリペプチドまたはペプチドに対する抗体、該ポリペプチド若しくはペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物、これらの１つ以上を含む医薬組成物、神経伝達物質の放出制御作用を有する該医薬組成物に関する。また、該ポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を制御することによる神経伝達物質の放出制御方法並びに神経伝達物質放出の異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法に関する。さらに、該ポリペプチド若しくはペプチドまたは該ポリヌクレオチドを測定することからなる診断のための測定手段、該形質転換体または該組換えベクターを使った該ポリペプチドまたはペプチドの製造方法、該ポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合に作用する化合物または該ポリヌクレオチドの発現を調節する化合物の同定方法、該測定手段および該同定方法に使用する試薬キットに関する。
背景技術
シンタキシン１は、主に脳中に存在し、神経伝達物質の放出機構に関与するタンパク質であり、シンタキシン１ａおよび１ｂのアイソフォームが知られている。神経伝達物質の放出（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）時に、シンタキシン１はシナプトソーム関連２５ｋＤａタンパク質（ＳＮＡＰ−２５）、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ、ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎとも称する。）、シナプトタグミン／ｐ６５とコンプレックスを形成し、シナプス小胞とシナプス前膜とのドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）および／または融合（ｆｕｓｉｏｎ）過程に関与する。このコンプレックスにおいて、ＶＡＭＰはシナプス小胞に局在してＶ−可溶性Ｎ−エチルマレイミド・センシティブ・ファクター・アタッチメント受容体（ｖ−ＳＮＡＲＥ、ｖｅｓｉｃｌｅ−ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として機能し、シンタキシン１とＳＮＡＰ−２５は主にシナプス前膜に局在してｔ−ＳＮＡＲＥ（ｔａｒｇｅｔ−ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として機能する。ＳＮＡＲＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）形成は、シンタキシン１と結合するＭＵＮＣ−１８により阻害される。
シンタキシンの中でも主要な分子として存在するシンタキシン１ａとｍ−トモシンとの結合は次のような点で重要な意味を持つ可能性を有する。神経伝達物質のエキソサイトーシスにおいてシナプス小胞のドッキングと膜融合に関わる多数のタンパク質の中でシンタキシンは主たる役割を果している分子と考えられているｔ−ＳＮＡＲＥである。シンタキシン１がもう一つのｔ−ＳＮＡＲＥであるＳＮＡＰ−２５、そしてＶＡＭＰ、シナプトタグミンの２つのｖ−ＳＮＡＲＥと共に７Ｓ（Ｓ：沈降係数）コンプレックスを構成し、最終的にこの中のシナプトタグミンがα−ＳＮＡＰ（Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＮＳＦ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＮＳＦ（Ｎ−ｅｔｈｉｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）と置き換わって２０Ｓコンプレックスが構成されることが上記ドッキングと膜融合の開始において極めて重要であると考えられている。
フジタらはラット大脳ＬＰ２フラクションをグリセロールグラジェント分画したものについて、抗トモシン抗体を含む各ＳＮＡＲＥ構成タンパク質抗体を用いて各分画における構成タンパク質を解析した。そして、ｍ−トモシンがシンタキシン、ＳＮＡＰ−２５、シナプトタグミンとともに１０Ｓコンプレックスを形成していることを明らかにし、さらにｍ−トモシンは、シンタキシンとＭＵＮＣ−１８からなるコンプレックスからＭＵＮＣ−１８を解離させてシンタキシンと結合することを示唆するデータを示した（非特許文献１）。またｍ−トモシンのＰＣ１２細胞での高レベル発現はカルシウム依存的エキソサイトーシスを約３０％減少させた（非特許文献１）。ＭＵＮＣ−１８とシナプトフィシン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）は、シンタキシン、ＶＡＭＰとそれぞれ結合することでＳＮＡＲＥの形成を抑制的に制御していると考えられている。ｍ−トモシンはＭＵＮＣ−１８にとって代わり、ＭＵＮＣ−１８に比べ高親和性にシンタキシン１ａと結合することにより１０Ｓコンプレックスを形成し、それが何らかのステップを経て７Ｓコンプレックス、さらに２０Ｓコンプレックスへと順次変化し最終的にシナプス小胞とシナプス前膜が融合すると考えられている。
すなわち、シナプス小胞とシナプス前膜の融合において中心的役割を果すと考えられているシンタキシンとの結合親和性が高いタンパク質であるｍ−トモシンは、シナプス小胞のドッキングと融合において極めて重要な役割を果している可能性があると考えられている。
以下に、本明細書で引用した文献を列記する。
特許文献１：組換えバキュウロウィルス発現ベクターの製法「日本国特許第２１２９４８７号」。
特許文献２：ポリペプチドの合成方法「日本国特許第２６４４４４７号」。
非特許文献１：Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｍｏｓｙｎ：ａ  ｓｙｎｔａｘｉｎ−１−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ「Ｎｅｕｒｏｎ」（１９９８）２０，ｐ．９０５−９１５。
非特許文献２：Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｅｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｌｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｏｍｏｓｙｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｓｙｎｔａｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９９）２５６，ｐ．２１８−２２２。
非特許文献３：Ｍａｓｕｄａ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｍｏｓｙｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔ−ＳＮＡＲＥ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｖｉａ  ａ  ＶＡＭＰ−ｌｉｋｅ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ「Ｎｅｕｒｏｎ」（１９９８）２１，ｐ．４７９−４８０。
非特許文献４：Ｌｅｈｍａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｏｍｏｓｙｎ  ａｎｄ  Ｌｅｔｈａｌ  ｇｉａｎｔ  ｌａｒｖａｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＳＮＡＲＥ，Ｓｅｃ９「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）１４６，ｐ．１２５−１４０。
非特許文献５：サムブルック等編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９
非特許文献６：村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８。
非特許文献７：エールリッヒ，Ｈ．Ｅ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス，１９８９。
非特許文献８：Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９８３）２１９，ｐ．６６６−６７１。
非特許文献９：「Ｎａｔｕｒｅ」（１９５７）１７９，ｐ．１６０〜１６１。
非特許文献１０：Ｈａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｕｎｃ−１８  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｓｙｎｔａｘｉｎ（１９９３）「Ｎａｔｕｒｅ」（１９９３）３６６，ｐ．３４７−３５１。
非特許文献１１：Ｈａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｍｕｎｃ−１８  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｎｔａｘｉｎｓ「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（１９９５）２７０，ｐ．１３０２２−１３０２８。
非特許文献１２：Ｋｅｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，，Ｄｉｓｉｎｃｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔａｘｉｎ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ「Ｎｅｕｒｏｎ」（１９９５）１４，ｐ．９９１−９９８。
非特許文献１３：Ｋｅｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｎ  ｓｙｎｔａｘｉｎ「Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」（１９９６）１６，ｐ．１９７５−１９８１。
発明の開示
かかる現状において本発明は、ヒトシンタキシン１ａに結合するポリペプチドまたはペプチドを見出し、提供することを目的とした。また、ヒトシンタキシン１ａに結合するポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、遺伝子工学手法による、ヒトシンタキシン１ａに結合するポリペプチドまたはペプチドの製造法を提供することを目的とした。さらに本発明は、ヒトシンタキシン１ａに結合するポリペプチドまたはペプチドに対する抗体、ヒトシンタキシン１ａに結合するポリペプチドまたはペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合阻害剤・結合安定化剤を提供することを目的とした。さらにまた本発明は、上記のものを利用してヒトシンタキシン１ａに結合するポリペプチドまたはペプチドに対する抗体、ヒトシンタキシン１ａとヒトシンタキシン１ａと結合するポリペプチドまたはペプチドとの結合阻害剤・結合安定化剤の同定を行うこと、またこれらを利用した医薬組成物、並びに診断のための測定方法および試薬キットを提供することを目的とした。
そして上記目的を達成すべく本発明者らは鋭意努力し、かずさＤＮＡ研究所のヒト長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ）にて公開されているＫＩＡＡ１００６クローン（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号：ＡＢ０２３２２３）の一部がラットｍ−トモシンのＶＡＭＰ相同性領域と高い相同性を有していることを見出した。より具体的には、かずさＤＮＡ研究所のヒト長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベースに対して、ラットｍ−トモシンにおいてシンタキシン１ａとの結合に重要であることが指摘されているＶＡＭＰ相同性領域についての相同性検索を行い、ＫＩＡＡ１００６を選出した。そして、ＫＩＡＡ１００６遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を決定し、該遺伝子を昆虫細胞を用いた遺伝子発現系で発現させて該遺伝子がコードする遺伝子産物であるポリペプチドを得た。さらに、得られたポリペプチドがヒトシンタキシン１ａと結合することを実証した。また、該ポリペプチドの機能または生理学的作用を調節することによる該ポリペプチドに起因する疾患のための医薬用組成物および該疾患の診断のための測定手段を提供することによって本発明を完成した。
すなわち、本発明の一態様は、下記（ｉ）から（ｉｖ）の群より選ばれるヒトシンタキシン１ａに結合するポリペプチドに関する；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
（ｉｖ）前記（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するポリペプチド。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を有するペプチドに関する。
さらに本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたはペプチドであって、シナプス小胞とシナプス前膜との融合に関わる、ヒトシンタキシン１ａとシナプトソーム関連２５ｋＤａタンパク質およびシナプトタグミンとのコンプレックス形成を促進するポリペプチドまたはペプチドに関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドを含む、ヒトシンタキシン１ａとの結合機能による、シナプス小胞とシナプス前膜との融合を介するエキソサイトーシスの調整剤に関する。
また本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドをコードする塩基配列またはその相補的配列を含んでなるポリヌクレオチドに関する。
さらに本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドに関する。
また本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。
さらに本発明の一態様は、組換えベクターが組換え発現ベクターである前記組換えベクターに関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記組換えベクターを導入されてなる形質転換体に関する。
また本発明の一態様は、前記組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドの製造方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドを免疫学的に認識する抗体に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドと、これらポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害する前記抗体に関する。
また本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害する前記抗体に関する。
さらに本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドと、これらポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化する化合物、および／または前記何れかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、前記ポリペプチドまたは前記ペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記形質転換体および前記抗体より選ばれる少なくとも何れか一つを用いることを特徴とする同定方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドと、これらポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化する化合物の同定方法であって、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドと、これらポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質が結合する条件下で該ポリペプチドまたは該ペプチド、これらポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質、および被検物質とを接触させ、次いで、該ポリペプチドまたはペプチドと、該ポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検物質が該ポリペプチドまたは該ペプチドと、これらポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
また本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害または安定化する化合物の同定方法であって、該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ペプチド、ヒトシンタキシン１ａ、および被検物質とを接触させ、次いで、該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検物質が該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害または安定化するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記何れかのポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、該ポリヌクレオチドと被検物質とを接触させ、次いで、該ポリヌクレオチドの発現により生じるシグナルの存在または不存在または変化を検出することにより、被検物質が該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記何れかの同定方法で同定される化合物に関する。
また本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたはペプチドと相互作用して該ポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害または安定化する化合物に関する。
さらに本発明の一態様は、前記何れかのポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記形質転換体、前記抗体および前記化合物より選択される少なくとも何れか一つを含有することを特徴とする医薬組成物に関する。
また本発明の一態様は、前記医薬組成物であって、神経伝達物質の放出を促進または阻害する作用を有する医薬組成物に関する。
さらに本発明の一態様は、前記医薬組成物であって、神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止剤および／または治療剤である医薬組成物に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害するまたは安定化することを特徴とする神経伝達物質の放出の促進方法または阻害方法に関する。
また本発明の一態様は、前記ポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害するまたは安定化することを特徴とする神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止方法および／または阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記ポリペプチドの発現または機能の異常に基づく疾患の診断に使用するための測定方法であって、（Ａ）前記ポリペプチドをコードしている核酸、および／または（Ｂ）該ポリペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記ポリペプチドの量的異常に基づく神経伝達機能の異常に関わる疾患の診断に使用するための測定方法であって、（Ａ）前記ポリペプチドをコードしている核酸、および／または（Ｂ）該ポリペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方法に関する。
また本発明の一態様は、前記ポリペプチドまたは前記ペプチド、前記ポリヌクレオチドおよび前記抗体から選ばれる少なくとも何れか１つを含んでなる試薬キットに関する。
さらに本発明の一態様は、前記同定方法または前記測定方法に使用するための試薬キットに関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第２００２−７５５５１号からの優先権を請求するものである。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
（ポリペプチドまたはペプチド）
本発明において提供するポリペプチドは、ラットｍ−トモシンにおいてシンタキシン１ａとの結合に関わることが指摘されているＶＡＭＰ相同性領域（非特許文献２および非特許文献３）についての相同性検索を行い、公開されているかずさＤＮＡ研究所のヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーから選出した遺伝子、ＫＩＡＡ１００６がコードするものである。該ポリペプチドは、ＫＩＡＡ１００６のＯＲＦ部分をバキュロウイルスと昆虫細胞ｓｆ９とを用いた遺伝子発現系で発現させて可溶性タンパク質として得た。ＫＩＡＡ１００６遺伝子のＯＲＦ全長は３５５８塩基対、該遺伝子の遺伝子産物は１１８６アミノ酸残基からなり、ラットｍ−トモシンとの相同性は、ヌクレオチドレベルで５７．６％、アミノ酸レベルで６７．９％であった。本発明においては、該ポリペプチドがヒトシンタキシン１ａに結合することを明らかにした。以下、ＫＩＡＡ１００６のＯＲＦ部分をＫＩＡＡ１００６ポリペプチドと称することもある。
ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドは、上述の通り、ラットｍ−トモシンと高い相同性を示していることから、ヒトにおいてｍ−トモシンと同様に機能しているものと考えられる。
神経伝達物質のエキソサイトーシスにおいては、１）シンタキシンに結合したＭＵＮＣ−１８がトモシンに置き換わるステップ、２）１０Ｓコンプレックスの形成、３）７Ｓコンプレックスの形成、４）２０Ｓコンプレックスの形成、を順次経て、シナプス小胞とシナプス前膜が融合する（図１参照）（非特許文献２および非特許文献３）。コンプレックス形成の促進とは、１０Ｓコンプレックス形成の促進であっても７Ｓコンプレックス形成の促進であってもよく、ひいては２０Ｓコンプレックス形成促進も意味する。これらコンプレックスの形成過程でシンタキシンと結合するタンパク質の中で、ｍ−トモシンはシンタキシンに対する親和性が最も高いタンパク質であり、したがって、神経伝達物質のエキソサイトーシスにおいて中心的な役割を担っている。本発明に係るポリペプチドおよびペプチドも、ｍ−トモシンと同様、これらのコンプレックス形成を促進する作用を有すると考えられる。
ｍ−トモシン高発現ＰＣ１２細胞においてカルシウム依存的エキソサイトーシスが３０％抑制される（非特許文献１）。また、ｍ−トモシンの酵母ホモログ欠損株においては、エキソサイトーシスが抑制され、増殖抑制がかかる（非特許文献４）。これらの事実から、ｍ−トモシンが、本ステップにおいて調整的役割を演じていることがわかる。すなわち、過剰発現したトモシンは１０Ｓコンプレックス形成に抑制的な効果を生じる。また、逆にトモシンが存在しない場合は、本ステップは進行せず、結果として、過剰発現した場合と同様にエキソサイトーシスの抑制がかかることになる。本発明に係るポリペプチドおよびペプチドも、シンタキシンと結合することにより、ｍ−トモシンと同様に本ステップを調整する機能を有していると考えられる。
ＫＩＡＡ１００６は、脳において特異的に発現していることが、上記データベース上にて公開・報告されている。したがってＫＩＡＡ１００６ポリペプチドは、ラットｍ−トモシンと同様、ヒトにおいてシンタキシンを介したシナプス小胞のドッキングと融合を調節する重要な因子であると考えられる。
本発明に係るポリペプチドは、ＫＩＡＡ１００６  ｃＤＮＡの塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号：ＡＢ０２３２２３）に基づいて公知の遺伝子工学的手法により得ることが可能である。例えば、上述あるいは後述の実施例に記載したように、かずさＤＮＡ研究所より購入したＫＩＡＡ１００６を含むプラスミドｈｋ１００８４をテンプレートとして用い、ＫＩＡＡ１００６遺伝子ＯＲＦ部分をコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅し、これを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９に感染させ発現誘導することにより得ることができる。また、上記ＫＩＡＡ１００６  ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づき公知の方法で設計した適切なプライマーを用い、例えばヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして用いて目的の遺伝子を増幅し、得られた遺伝子を公知の遺伝子工学的手法を用いて発現することにより、本発明に係るポリペプチドを取得することも可能である。
ここで、ポリペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち、タンパク質等の長鎖ペプチドを意味し、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを単にペプチドという。
本発明に係るポリペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなりヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）に結合する機能を有するポリペプチドである。
また、本発明に係るポリペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有しヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）に結合するポリペプチドであってもよい。
また、本発明に係るポリペプチドは、配列表の配列番号１に記載のポリペプチドと、アミノ酸配列上で９０％以上の相同性を有し、かつヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）に結合するものであってもよい。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法またはｃＤＮＡの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が有用である。ヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合の有無は、後述する実施例に記載した方法により判定することができる。
さらに、このように特定されたポリペプチドを基にして、ヒトシンタキシン１ａとの結合の有無を指標にすることにより、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも提供できる。かかる変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。例えば成書に記載の方法（非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（非特許文献８）を利用することもできる。
上記のような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
本発明に係るペプチドは、配列表の配列番号１に記載のポリペプチドの部分配列を含んでなるペプチドを包含する。該ペプチドは、その最小単位として好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは８個以上のアミノ酸、さらに好ましくは１２個以上、とくに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸からなるものである。これらのペプチドは、自体公知のペプチドの製造方法を用いて、アミノ酸配列情報に従って製造することができる。例えば、ペプチドの化学合成方法としては固相合成方法、液相合成方法等が知られているが何れを用いることもできる。または、遺伝子工学的手法を用いて、上述のポリペプチドと同様の方法で取得することも可能である。あるいは、本発明に係るポリペプチドを、適当なペプチダーゼにより切断することによっても得ることができる。
これらの手法により得られたペプチドは、試薬または標準物質等として利用できる。これらのペプチドのうち、シンタキシン１ａに結合するものは、本発明に係るポリペプチドとシンタキシン１ａとの結合を阻害する物質として、または本発明に係るポリペプチドの活性を調節する物質のスクリーニング等において有用である。また、免疫学的に認識され得るペプチド、例えばエピトープペプチドは後述するように本発明に係るポリペプチドに特異的な抗体を作製するための抗原として単独でまたはキャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたは卵白アルブミン）と結合して使用できる。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、さらに好ましくは、シナプス小胞とシナプス前膜との融合に関わるタンパク質のコンプレックス形成、例えば、シンタキシン１ａとＳＮＡＰ−２５およびシナプトタグミンとのコンプレックス形成を促進する機能を有するものであることが望ましい。かかる機能を有するポリペプチドまたはペプチドは、ヒトシンタキシン１ａとの結合機能による、シナプス小胞とシナプス前膜との融合を介するエキソサイトーシスの調整を可能にする。すなわち、該ポリペプチドまたはペプチドを含むエキソサイトーシスの調整剤も本発明の範囲に含まれる。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの機能、例えばシンタキシン１ａとの結合が阻害されない限りにおいて、Ｎ末端側やＣ末端側に別のタンパク質やペプチド等を直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、該ポリペプチドまたは該ペプチドの基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加するタンパク質やペプチド等としては、例えばグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、グリーン蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光物質類、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ断片、ビオチン、あるいは放射性同位元素等が挙げられるが、これらに限定されない。これら標識化に用いたタンパク質またはペプチド等の物質自体、またはその機能を測定することにより、例えば本発明に係るポリペプチドとシンタキシン１ａの結合を検出することが可能であり、また本発明に係るポリペプチドの検出または精製が容易になる。
（ポリヌクレオチド）
一つの態様において本発明は、上記ポリペプチドまたはペプチドをコードする塩基配列またはその相補的配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。例えば、該ポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補的配列を含んでなるポリヌクレオチドであり得る。ここで、あるポリヌクレオチドの相補的配列からなるポリヌクレオチドを相補鎖と称することもある。これらは例えば上記ポリペプチドまたはペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬または標準品としても利用できる。
別の態様において本発明は、上記ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列またはその相補的配列を含んでなるポリペプチドの対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（非特許文献５）等に従うことができる。これらポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするものであれば目的のポリヌクレオチドの相補的配列でなくてもよい。例えば、ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドをコードするＫＩＡＡ１００６遺伝子の塩基配列またはその相補的配列に対する相同性において好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を示すポリヌクレオチドであり得る。
また本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの指定された塩基配列の領域の連続する１０個以上のヌクレオチド、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明に係るポリヌクレオチドはその機能、例えばコードするポリペプチドの発現や、発現されたポリペプチドの機能が阻害されない限りにおいて、５’末端側やＣ’末端側に、例えば、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、またはグリーン蛍光タンパク質等の遺伝子が付加されたものであってもよい。
これらポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド等の製造に有用である。さらに、本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子またはｍＲＮＡの検出のためのプローブまたはプライマーとして、または該遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって本発明に係るポリペプチド遺伝子の発現を特異的に阻害するためには、本発明に係るポリペプチド遺伝子に固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。
またここで、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドの選択は、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現タンパク質の確認を行い、その機能、特にヒトシンタキシン１ａとの結合を指標にして行うことができる。タンパク質発現系としては、無細胞タンパク質発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（非特許文献９）。
（組換えベクター）
上記ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換えベクターを得ることができる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等が挙げられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製する。ベクターＤＮＡにポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
後述する実施例では、かずさＤＮＡ研究所より購入したＫＩＡＡ１００６を含むプラスミドｈｋ１００８４をテンプレートとして、ＫＩＡＡ１００６のＯＲＦ全長あるいはＣ末端欠失部分をＰＣＲにて増幅し、これをｐＦａｓｔＢａｃＩへ組み込んだバキュロウイルス発現プラスミドｐＦＢ−１００６（全長）とｐＦＢ−１００６（Ｃ末端欠失）を得た。これら２クローンをそれぞれＤＨ１０ＢＡＣにトランスポジションすることでバックミドＢａｃ−１００６とＢａｃ−１００６Ｔを得た。本実施例はバキュロウイルスベクターを用いているが、無論これに限定されるものではない。
（形質転換体）
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターＤＮＡを、自体公知の宿主に自体公知の方法で導入することにより形質転換体が得られる。宿主に導入するベクターＤＮＡは、１種のベクターＤＮＡであってもよく、２種以上のベクターＤＮＡを導入してもよい。宿主としては、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞または動物細胞等が例示できる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法（非特許文献５）により実施できる。より好ましい方法としては、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。後述する実施例においては、昆虫細胞を利用したが、無論これに限定されるものではない（特許文献１および特許文献２）。
宿主に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で培養する。培養は、形質転換体により発現される該ポリペプチドまたはペプチドの機能、例えばヒトシンタキシン１ａとの結合を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された該ポリペプチドまたはペプチド量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはパッチ培養を行ってもよい。
（ポリペプチドまたはペプチドの回収）
形質転換体を培養した培地または形質転換体からの本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの回収および／または精製は、該ポリペプチドまたはペプチドの機能、例えばヒトシンタキシン１ａへの結合の有無を指標にして実施できる。回収および／または精製の方法としては、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段、ゲルろ過、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられ、これらを単独でまたは組み合わせて使用する。好ましくは、回収および／または精製しようとするポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法を使用する。
（抗体）
抗体は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は該ポリペプチドまたはペプチド、またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。該ポリペプチドおよび／またはペプチドに特異的な抗体を作成するためには、該ポリペプチドまたはペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも該ポリペプチドまたはペプチドのものと相同または同一である必要はなく、その立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に該ポリペプチドおよび／またはペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定できる。
抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等が例示できる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせを例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、本発明に係るポリペプチドおよび／またはペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られた、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを認識し結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ポリペプチドまたはペプチドの精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本発明に係るポリペプチドの機能を阻害する抗体は、該ポリペプチドの機能制御に使用でき、該ポリペプチドの異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および／または治療のために有用である。例えば該ポリペプチドとシンタキシン１ａの結合を阻害する抗体は、例えば神経伝達物質の放出制御に使用でき、そのため神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の解明、防止、改善および／または治療に有用である。
（化合物の同定・スクリーニング）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターが導入されてなる形質転換体、これらを用いるタンパク質合成系、または該ポリペプチドおよび／またはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドと該ポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合阻害剤または結合安定化剤、あるいは該ポリヌクレオチドの発現阻害剤または発現促進剤の同定・スクリーニングに有効な手段を提供する。該方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。例えば該ポリペプチドまたはペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、タンパク質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤または促進剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が可能である。
詳しくは、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドと該ポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合をシグナル（マーカー）として検出することのできる系を導入し、被検物質が存在するまたは存在しない条件においてそのシグナル（マーカー）の存在、不存在、またはその変化を検出することにより、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドと該ポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化する化合物を同定可能である。
一例として、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を指標にして、その結合に影響を与え得る化合物を選別すればよい。本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合は公知の免疫学的手法等を用いた結合試験系により検出することが可能である。
例えば、後述する実施例で用いた方法を用いることができる。すなわち、遺伝子工学的手法を用いて取得したＧＳＴ融合シンタキシン１ａをグルタチオンセファロースに結合させ、これに結合する本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの量を、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドに対する抗体、例えばＨＲＰ（ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を用いて定量することができる。または、タグペプチドを融合した本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを用いれば、抗タグ抗体を用いて定量することもできる。勿論、本発明に係るポリペプチドを上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で直接標識してもよい。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。
被検物質を共存させた場合の本発明に係るポリペプチドまたはペプチドのシンタキシン１ａへの結合量を、被検物質を共存させなかった場合の本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの結合量と比較することにより、該被検物質が本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとシンタキシン１ａとの結合に及ぼす効果を判定することができる。被検物質を共存させた場合の本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの結合量が、被検物質を共存させなかった場合の本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの結合量と比較して減少した場合、該被検物質には本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとシンタキシン１ａとの結合を阻害する作用があると判定できる。一方、被検物質を共存させた場合の本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの結合量が、被検物質を共存させなかった場合の本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの結合量と比較して増加した場合、該被検物質には本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとシンタキシン１ａとの結合を安定化する作用があると判定できる。
あるいは公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いることも可能である。例えば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとＤＮＡ結合タンパク質を融合タンパク質として発現するプラスミド、シンタキシン１ａと転写活性化タンパク質を融合タンパクとして発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母、真核細胞等に導入し、被検物質を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検物質非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより達成できる。被検物質を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検物質非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合には、該被検物質には本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとシンタキシン１ａとの結合を阻害する作用があると判定できる。一方、被検物質を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検物質非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して増加した場合には、該被検物質には本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとシンタキシン１ａとの結合を安定化する作用があると判定できる。
あるいは、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとシンタキシン１ａとの結合に影響を与え得る化合物を同定することも可能である。
あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、本発明に係るポリペプチドあるいはペプチドとシンタキシン１ａとの結合に影響を与えうる化合物を同定することも可能である。
これらのスクリーニング系で用いるシンタキシン１ａは、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドとの結合に影響がない限りにおいて、一部を欠損、あるいは別のタンパク質が付加されたものであってもよい。
また、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を可能にする条件を選別し、該条件下で該ポリヌクレオチドと被検物質とを接触させ、該発現の有無を検出することのできるシグナルを使用する系を導入し、このシグナルの、存在、不存在またはその変化を検出することにより、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を促進または阻害する化合物を同定可能である。シグナルとしては、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、またはグリーン蛍光タンパク質等を用いることができる。
あるいは、例えば本発明に係るペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域の下流に、該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検物質とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の有無および変化により、本発明に係る遺伝子の発現に影響を与える化合物を同定可能である。レポーター遺伝子としては、レポーターアッセイで慣用されている遺伝子を使用可能であるが、例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼなどの酵素活性を有する遺伝子を用いることができる。レポーター遺伝子の発現の検出は、該遺伝子の遺伝子産物の活性、例えば、上記に例示した遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施可能である。
（化合物）
このようにして同定された化合物は、本発明に係るポリペプチドに関する結合阻害剤、結合拮抗剤または結合安定化剤の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの上記ポリペプチドに対する発現阻害剤または発現促進剤の候補化合物としても利用可能である。これら候補化合物は、本発明に係るポリペプチドの発現や活性の増加、減少または欠失等に起因する各種病的症状の防止および／または治療効果を期待できる。例えば該候補化合物は、神経伝達物質の放出調節に使用できるため、神経伝達物質の放出異常、ひいては神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止および／または治療効果を期待できる。
（医薬組成物）
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、医薬組成物として調製可能である。また本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチド、本発明に係るポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明に係るプラスミド、並びに上記ポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体が、診断マーカーや試薬等の疾患診断手段として、あるいは本発明に係るポリペプチドの活性および／または発現を阻害、拮抗、または促進する機能を利用した治療薬等（阻害剤、拮抗剤、促進剤等）の医薬手段として使用することができる。すなわち本発明は、これらを単独でまたは複数組み合わせて利用することによって、これらのうち少なくとも１つを含有する医薬組成物を提供する。
本発明に係る本発明に係るポリペプチドの発現およびその活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、該ポリペプチドの活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することができる。さらに、発現ブロック法を用いて内在性の該ポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成させた、あるいは別個に投与された該遺伝子のアンチセンス配列を使用して該遺伝子の発現を阻害できる。これらのオリゴヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドを基にして設計し合成できる。該オリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。
また、本発明に係るポリペプチドの発現およびその活性の減少や欠失等に関連する異常な症状の治療には、１つの方法として該ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子を活性化する治療上有効量の促進剤を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞内で該ポリペプチドを生成せしめてもよい。本発明に係るポリヌクレオチドを利用した遺伝子治療は、公知の方法が利用できる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドを組み入れた複製欠損レトロウイルスベクターを作製して遺伝子治療に利用すればよい。また、遺伝子治療において、治療に使用するタンパク質を対象中において生成させることもできる。例えば、該タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）において対象由来の細胞を処理し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。
本発明に係るポリペプチドには、シンタキシン１ａとの結合があり、特に神経伝達物質の放出異常や量的異常に基づく疾患に関連すると考えられる。従って、上記阻害剤または拮抗剤は、該疾患を防止および／または治療するために有用である。また、本発明に係るポリペプチドとシンタキシン１ａとの結合を阻害するまたは安定化することを特徴とする神経伝達物質の放出の促進方法または阻害方法、並びに神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法も本発明の範囲に包含される。
本発明に係る医薬組成物の処方は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量の本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、抗体および化合物から選択された少なくとも何れか１つに医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られている。また、処方するときには、これらを単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
投与形態は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様は、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜投与または経皮投与を用いることもできる。局所的な投与においては、膏薬、パスタ、ゲル等の形態での投与であってもよい。
必要な用量範囲は、治療上有効量の本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、抗体および化合物から選択された少なくとも何れか１つの有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断による。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．１μｇ乃至１００μｇの範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。
製剤化にあたっては、例えばポリペプチド、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、化合物等各対象の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリン等の包接体等の製剤化方法が利用できる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ＰＥＧ等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖等）が例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
（診断のための測定方法および試薬）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチド、または当該ポリペプチド若しくはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用できる。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットを提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチドまたはペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
これら試薬および試薬キットは、本発明に係る同定方法に使用できる。また、当該試薬および試薬キットは、本発明に係るポリペプチド、ペプチドまたはこれらの何れか１つをコードするポリヌクレオチドの定量的および／または定性的な測定に使用できる。当該測定のための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。ポリペプチドまたはペプチドの測定に利用できる方法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等を例示できる。また、ポリヌクレオチドは、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて核酸レベル、例えばＲＮＡレベルで検出および定量が可能である。
さらに、本発明に係るポリペプチド若しくはペプチドまたはこれらの何れか１つをコードする核酸を診断マーカーとして定性的にまたは定量的に測定することにより、該ポリペプチドの発現または活性に起因する疾患の検査または診断が可能である。当該検査または診断のための方法は、例えば当該ポリペプチドまたは当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドとの相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定すること、並びに当該ポリペプチドまたはペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、当該ポリペプチドまたはペプチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することによって実施できる。
試料は、個体由来の、例えば細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等が挙げられる。また、核酸は上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出することができる。増幅ＤＮＡを、標識した本発明に係るポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。
上記測定により本発明に係るポリペプチドおよびそれをコードする核酸の変異、減少または増加を検出することにより、当該本発明に係るポリペプチドに起因する疾患、例えば、神経伝達物質の放出異常や量的異常に基づく疾患等の診断が可能になる。
実施例
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
（遺伝子の単離）
かずさＤＮＡ研究所のヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーデータベースを用いて、ラットｍ−トモシンのＶＡＭＰ相同性領域と相同性を有するクローンを検索した。その結果、ＫＩＡＡ１００６がラットｍ−トモシンとヌクレオチドレベルで約５７．６％、アミノ酸レベルで約６７．９％の相同性を有することを見出した。
かずさＤＮＡ研究所のデータベースでは、ＫＩＡＡ１００６はＮ末端を欠失した部分配列である可能性が指摘されていた。そこで、まず、ＫＩＡＡ１００６遺伝子の上流に翻訳開始点があるか否かを確認する目的で、ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）と１００６ｒａｃｅプライマー（配列表の配列番号：２）、およびＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、５’−ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）を実施した。
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その結果、新たな上流配列は見出されなかった。また、ＫＩＡＡ１００６の塩基配列から予測されるアミノ酸配列において、最初のメチオニン以降のアミノ酸配列と、ラットｍ−トモシンのＮ末端配列との間にはアミノ酸１−１５において非常に高い相同性が認められることを考え合わせて、ＫＩＡＡ１００６の最初のメチオニンがＫＩＡＡ１００６を含む遺伝子の翻訳開始点であると判断し、以後の解析を進めた。
（ＫＩＡＡ１００６ＯＲＦ全長およびＫＩＡＡ１００６ＯＲＦ  Ｃ末端欠失欠失体発現プラスミドの構築）
ＫＩＡＡ１００６を含むプラスミドｈｋ１００８４（かずさＤＮＡ研究所より購入した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターのＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトにＫＩＡＡ１００６を挿入したプラスミド。詳しくは、ＫＩＡＡ１００６ｃＤＮＡの５’末端にＳａｌＩアダプターをライゲーションして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターのＳａｌＩサイトへ挿入し、ＫＩＡＡ１００６ｃＤＮＡの３’末端はＮｏｔＩサイトへ挿入したプラスミド。）をテンプレートとして、１００６（ｓ）（配列表の配列番号：３、Ｈｉｓ×６タグ配列を含む。）と１００６（ａ）１（配列表の配列番号：４、全長用）、または１００６（ｓ）（配列表の配列番号：３）と１００６（ａ）２（配列表の配列番号：５）（Ｃ末端欠失体用）の組み合わせで、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いてＫＩＡＡ１００６のＯＲＦ部分を増幅した。得られた２つのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、同酵素で処理したｐＦａｓｔＢａｃＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）へ組み込み、バキュロウイルス発現プラスミド、ｐＦＢ−１００６（全長アミノ酸１−１１８６をコード）とｐＦＢ−１００６ｔ（全長からＶＡＭＰ相同領域と推察される領域を欠失した、アミノ酸１−１１５７をコード）を得た。コンピテント大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）にこれらのプラスミドをトランスポジションすることでそれぞれのバックミドＢａｃ−１００６、Ｂａｃ−１００６ｔを得た。
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本明細書中、（ｓ）はセンスプライマー、（ａ）はアンチセンスプライマーを意味する。
（ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドとＫＩＡＡ１００６Ｃ末端欠失ポリペプチドのｓｆ９細胞での発現および精製）
Ｂａｃ−１００６、Ｂａｃ−１００６ｔのそれぞれをｓｆ９細胞（３５ｍｍディッシュ）にＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を用いて導入し、導入３日後の培養上清を再度ｓｆ９細胞に感染させバキュロウイルスを増幅させた。ｓｆ９細胞に増幅後のウイルスを感染させ、３日後にＥＷバッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム／３００ｍＭ  ＮａＣｌ／１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０／１ｍＭ  フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ））にて細胞を溶解後、超音波破砕に附した。コバルトレジンＴＡＬＯＮ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、得られた細胞破砕抽出液からヒスチジン付加ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドとヒスチジン付加ＫＩＡＡ１００６Ｃ末端欠失ポリペプチドを精製した。抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウエスタンブロッティングにより、ほぼ同量のヒスチジン付加ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドとヒスチジン付加ＫＩＡＡ１００６Ｃ末端欠失ポリペプチドが回収できたことを確認した。
ラットｍ−トモシンは大腸菌を用いた通常の方法では発現しないため、ｓｆ９細胞およびＣＯＳ７細胞で発現させたと報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法においても得られたタンパク質は不溶性であったため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後リネーチャーしたものを解析に用いたことも記述されている。今回、発明者らが見出した本発明に係るポリペプチドの２つのフォームはどちらも可溶性タンパク質として精製でき、コバルトレジンによって精製可能であったためインビトロ結合試験が可能となった。本発現・精製法を用いれば、Ｆｕｊｉｔａらがラットｍ−トモシンについて行えなかった（非特許文献１）ヒトシンタキシン１ａと本発明に係るポリペプチドとの結合・解離定数等も測定可能である。
（ヒトシンタキシン１ａの大腸菌での発現および精製）
ヒトシンタキシン１ａを得るために、まず、ヒト脳ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）由来のｃＤＮＡをテンプレートとして下記ｓｙ１ａ４Ｔ（ｓ）（配列表の配列番号：６）、ｓｙ１ａ４Ｔ（ａ）（配列表の配列番号：７）の両プライマーを用いてシンタキシン１ａのＯＲＦ領域内１−２６６ＡＡをＰＣＲにより増幅した。これをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、同様にＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化した、ＧＳＴ融合タンパク質発現用プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）に組換え、ｐＧＥＸ−ｓｙ１ａを得た。ｐＧＥＸ−ｓｙ１ａの配列を確認し、ＰＣＲによる変異およびフレームのずれがないことを確認した。
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ｐＧＥＸ−ｓｙ１ａをトランスフォーメーションしたＤＨ５ａを増殖後期（ＯＤ  ０．５以上）に入るまで３７℃にて培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭ添加し５時間の発現誘導を行った。集めた菌をＰＢＳ（−）で洗浄し、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  トリス塩酸  ｐＨ７．５／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁後、氷中リゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（終濃度１％）添加後超音波処理で処理し、その遠心上清よりＧＳＴ−シンタキシン１ａ（１−２６６ＡＡ）をグルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて定法に従って精製した。インサートを入れていないｐＧＥＸ−４Ｔ−３を用いて同様に発現誘導を行い、ＧＳＴを発現・精製した。
ここにおいて発現させたシンタキシン１ａはＯＲＦ全長ではなく、Ｃ端側アミノ酸残基を除いた１−２６６アミノ酸からなるタンパク質である。シンタキシン１ａのＣ端側２１アミノ酸残基が極めて親水性が低く不溶化の原因になること、Ｃ端側を欠失させてもシンタキシン１ａのタンパク質としての特性が失われないことが文献的にも確認された（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２および非特許文献１３）ことから、Ｃ端側アミノ酸残基を除いた１−２６６アミノ酸からなるシンタキシン１ａを使用した。
その結果、クマーシーブリリアントブルー染色によりほぼシングルバンドとなるＧＳＴ−シンタキシン１ａ融合タンパク質の精製標品を得た。ＧＳＴに関しても同様の方法で精製標品を得た。
（ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドとシンタキシン１ａの結合解析）
コバルトレジンで精製したＫＩＡＡ１００６ポリペプチド（上述のヒスチジン付加ＫＩＡＡ１００６ポリペプチド）およびそのＣ末端欠失体（上述のヒスチジン付加ＫＩＡＡ１００６Ｃ末端欠失ポリペプチド）をＧＳＴ（１７μｇ）を結合させたグルタチオンセファロース（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  １０μｌ）と混合し、４℃で６時間回転攪拌した後これを遠心した。得られた上清（ＧＳＴ−グルタチオンセファロース非吸着画分）をＧＳＴ−シンタキシン１ａ（１７μｇ）を結合させたグルタチオンセファロース（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  １０μｌ）にそれぞれ加え、４℃でさらに１６時間回転攪拌した後これを遠心した。ＧＳＴ−グルタチオンセファロース吸着画分、ＧＳＴ−シンタキシン１ａ−グルタチオンセファロース吸着画分のそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶出し、抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いたウエスタンブロッティングでシンタキシン１ａに対するＫＩＡＡ１００６ポリペプチドとそのＣ末端欠失体の結合を解析した。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥには４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（ＮＯＶＥＸ社）を用いた。ホースラディシュ・パーオキシダーゼ標識した２次抗体の検出はＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて行った。
その結果、第２図に示すように、ＧＳＴ−グルタチオンセファロース吸着画分中には、ＫＩＡＡ１００６ポリペプチド、Ｃ末端欠失体どちらについても検出されなかった（第２図；レーン１と２）。一方、ＧＳＴ−シンタキシン１ａを結合したグルタチオンセファロースからの溶出液には、ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドを供した場合には抗ペンタＨｉｓ抗体で検出されるバンドが検出されたが、Ｃ末端欠失体を供した時は、溶出液中にＣ末端欠失体は確認できなかった（第２図；レーン４と６）。
したがって、ＫＩＡＡ１００６ＯＲＦ全長がシンタキシン１ａに結合すること、およびＣ末端欠失体はシンタキシン１ａに結合しないことが明らかとなった。これらの結果から、ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドはそのＶＡＭＰ相同性領域を通じて、シンタキシンに結合することが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
以上、かずさＤＮＡ研究所の公開されているヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーより選出したクローンＫＩＡＡ１００６がヒトシンタキシン１ａに結合するタンパク質をコードすることを見出した。この遺伝子はラットｍ−トモシンとヌクレオチドレベルで約５７．６％の相同性を有しており、アミノ酸レベルでは約６７．９％の相同性を有していた。ＫＩＡＡ１００６は脳において特異的に発現していることがデータベース上にて報告されている。シンタキシン１ａは神経伝達物質の放出に重要なタンパク質であることが知られており、これに結合し得るＫＩＡＡ１００６ポリペプチドも神経伝達物質の放出に重要な役割を担っていることが示唆される。かくして、本発明に係るＫＩＡＡ１００６、その由来物であるポリペプチド、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドに関連する疾患、例えば神経伝達物質の放出異常や量的異常に基づく疾患の防止薬および／または治療薬、並びに診断手段として有用であることを見出した。
配列表フリーテキスト
配列表配列番号１：ｃＤＮＡ配列より推定されるＫＩＡＡ１００６ＯＲＦ全長ポリペプチドのアミノ酸配列
配列表配列番号２：ＫＩＡＡ１００６のＮ末端上流を５’−ｒａｃｅ法にて解析する時に用いたプライマー
配列表配列番号３：ＰＣＲにてＫＩＡＡ１００６ＯＲＦ部分配列を増幅する時に用いたセンスプライマー
配列表配列番号４：ＰＣＲにてＫＩＡＡ１００６ＯＲＦ部分配列を増幅する時に用いたアンチセンスプライマー
配列表配列番号５：ＰＣＲにてＫＩＡＡ１００６ＯＲＦ  Ｃ末端欠失体部分配列を増幅する時に用いたアンチセンスプライマー
配列表配列番号６：ＰＣＲにてシンタキシン１ａ配列を増幅する時に用いたセンスプライマー
配列表配列番号７：ＰＣＲにてシンタキシン１ａ配列を増幅する時に用いたアンチセンスプライマー
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、神経伝達物質のエキソサイトーシスにおいて、１）シンタキシンに結合したＭＵＮＣ−１８がトモシンに置き換わるステップ、２）１０Ｓコンプレックスの形成、３）７Ｓコンプレックスの形成、４）２０Ｓコンプレックスの形成、を順次経て、シナプス小胞とシナプス前膜が融合することを説明する模式図である。以下に第１図で用いた各符号の意味を列記する。
ＰＭ：シナプス前膜
ＳＶＭ：シナプス小胞膜
Ｓｙ：シンタキシン
Ｍ：ＭＵＮＣ−１８
Ｔ：トモシン
Ｎ：ＮＳＦ
Ｓ：α−ＳＮＡＰ
２５：ＳＮＡＰ−２５
Ｖ：ＶＡＭＰ
Ｓｔ：シナプトタグミン
第２図は、ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドおよびＫＩＡＡ１００６Ｃ末端欠失体のシンタキシン１ａに対する結合を示す。実施例に記載した方法に従って発現・精製した本発明に係るポリペプチドおよびＣ末端欠失体を、実施例に記載した方法に従ってグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）結合グルタチオンセファロース、ついでシンタキシン１ａ−ＧＳＴ結合グルタチオンセファロースに供した。ＧＳＴ結合グルタチオンセファロースとシンタキシン１ａ−ＧＳＴ結合グルタチオンセファロースに結合した分画を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のサンプルバッファーで溶出し、これらＧＳＴ結合グルタチオンセファロース非吸着分画と共に抗ペンタヒスチジン（ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ）抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウェスタンブロッティングで分析した。レーン１、２はＧＳＴ吸着画分、レーン３、５はＧＳＴ非吸着画分、レーン４、６は、シンタキシン１ａ−ＧＳＴ吸着画分、レーン１、３、４はＫＩＡＡ１００６ポリペプチド（１−１１８６ＡＡ）、レーン２、５、６は、ＫＩＡＡ１００６ポリペプチドＣ末端欠失体（１−１１５７ＡＡ）である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月27日(2003.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選ばれるヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）に結合する機能を有するポリペプチド；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
（ｉｖ）前記（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を含んでなるペプチド。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドであって、シナプス小胞とシナプス前膜との融合に関わる、ヒトシンタキシン１ａとシナプトソーム関連２５ｋＤａタンパク質（２５ｋＤａ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびシナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）とのコンプレックス形成を促進するポリペプチドまたはペプチド。
【請求項４】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドを含む、ヒトシンタキシン１ａとの結合機能による、シナプス小胞とシナプス前膜の融合を介するエキソサイトーシスの調整剤。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは情求の範囲第２項に記載のペプチドをコードする塩基配列またはその相補的配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求の範囲第５項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲第５項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項９】
組換えベクターが組換え発現ベクターである請求の範囲第８項に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
請求の範囲第８項または第９項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項１１】
請求の範囲第９項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１３】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと、該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害する請求の範囲第１２項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害する請求の範囲第１３項に記載の抗体。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと、該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化する化合物、および／または請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチド、請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第８項または第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、および請求の範囲第１２項から第１４項の何れか１項に記載の抗体から選択される少なくとも何れか一つを用いることを特徴とする同定方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化する化合物の同定方法であって、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質とが結合する条件下で、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドおよび該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質を被検物質と接触させ、次いで、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検物質が請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたは該ペプチドと相互作用するタンパク質との結合を阻害または安定化するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害または安定化する化合物の同定方法であって、該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ペプチドおよびヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）を被検物質と接触させ、次いで、該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検物質が該ポリペプチドまたは該ペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害または安定化するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項１８】
請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、該ポリヌクレオチドと被検物質とを接触させ、次いで、該ポリヌクレオチドの発現により生じるシグナルの存在または不存在または変化を検出することにより、被検物質が該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１５項から第１８項の何れか１項に記載の方法で同定される化合物。
【請求項２０】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと相互作用して該ポリペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合を阻害または安定化する化合物。
【請求項２１】
請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。
【請求項２２】
請求の範囲第１項のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチド、請求の範囲第５項から第７項の何れか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第８項または第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、請求の範囲第１３項または第１４項に記載の抗体、および請求の範囲第１９項から第２１項の何れか１項に記載の化合物から選択される少なくとも何れか一つを有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項２３】
請求の範囲第２２項に記載の医薬組成物であって、神経伝達物質の放出を促進または阻害する作用を有する医薬組成物。
【請求項２４】
請求の範囲第２２項に記載の医薬組成物であって、神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止剤および／または治療剤である医薬組成物。
【請求項２５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害するまたは安定化することを特徴とする神経伝達物質の放出の促進方法または阻害方法。
【請求項２６】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドとヒトシンタキシン１ａとの結合を阻害するまたは安定化することを特徴とする神経伝達物質の量的異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項２７】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを定量的または定性的に測定する方法。
【請求項２８】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドの発現または機能の異常に基づく疾患の診断に使用するための測定方法であって、（Ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸、および／または（Ｂ）該ポリペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方法。
【請求項２９】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドの量的異常に基づく神経伝達機能の異常に関る疾患の診断に使用するための測定方法であって、（Ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸、および／または（Ｂ）該ポリペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方法。
【請求項３０】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチド、請求の範囲第６項から第８項の何れか１項に記載のポリヌクレオチド、および請求の範囲第１３項から第１５項に記載の抗体から選ばれる少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【請求項３１】
請求の範囲第１５項から第１８項の何れか１項に記載の同定方法または請求の範囲第２７項から第２９項の何れか１項に記載の測定方法に使用するための請求の範囲第３０項に記載の試薬キット。
【請求項３２】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドをコードする塩基配列（ただし、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＢ０２３２２３として登録されているＤＮＡ塩基配列を除く）またはその相補的配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドを含んでなる、シナプス小胞とシナプス前膜との融合に関わる、ヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）とシナプトソーム関連２５ｋＤａタンパク質（２５ｋＤａ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびシナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）とのコンプレックス形成促進剤。
【請求項３４】
請求の範囲第１３項に記載の抗体を含んでなる、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドと該ポリペプチドまたはペプチドと相互作用するタンパク質との結合阻害剤。
【請求項３５】
請求の範囲第１４項に記載の抗体を含んでなる、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第２項に記載のペプチドとヒトシンタキシン１ａ（ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ）との結合阻害剤。
【国際調査報告】
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