(57)【要約】ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７−１７２番目及び２０２−２０７番目のアミノ酸の少なくとも１個が変異された弱毒化ベロ毒素、その弱毒化ベロ毒素のＡサブユニット、そのＡサブユニットとリガンドとの複合体、それらを用いた抗癌剤、癌治療方法、上記弱毒化ベロ毒素又はそのＡサブユニットをコードする遺伝子、それを用いた遺伝子治療剤、及び遺伝子治療方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７−１７２番目の配列及び２０２−２０７番目の配列の少なくとも１種の配列が変異された弱毒化ベロ毒素。
【請求項２】
ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７−１７２番目の配列及び２０２−２０７番目の配列の少なくとも１種の配列が置換又は欠失された、請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
【請求項３】
ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７、１７０、１７２及び２０２番目の配列の少なくとも１種の配列が置換又は欠失された、請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
【請求項４】
ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７番目のグルタミン酸がグルタミンに、及び／又は１７０番目のアルギニンがロイシンに置換された、請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
【請求項５】
ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１７２番目のアルギニンがロイシンに置換された、請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
【請求項６】
ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２０２番目のトリプトファンがロイシン又はヒスチジンに置換された、請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
【請求項７】
請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニット。
【請求項８】
請求項７に記載のＡサブユニットをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニット又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
【請求項１１】
請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
【請求項１２】
請求項７に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニットと癌細胞に特異的又は選択的に結合するためのリガンドとを含む複合体。
【請求項１３】
請求項７に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニットとトロポニンＩを含む融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項８に記載のＤＮＡ及びトロポニンＩをコードするＤＮＡを含む融合遺伝子。
【請求項１５】
請求項８に記載のＤＮＡ及びトロポニンＩをコードするＤＮＡを含む融合遺伝子を有するベクター。
【請求項１６】
請求項１に記載の弱毒化ベロ毒素と癌細胞に特異的又は選択的に結合するためのリガンドとを含む複合体。
【請求項１７】
請求項１２に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
【請求項１８】
請求項１３に記載の融合タンパク質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
【請求項１９】
請求項１０、１１、１７又は１８に記載の抗癌剤を用いる癌の治療方法。
【請求項２０】
請求項９又は１５に記載のベクターを有効成分とする癌の遺伝子治療剤。
【請求項２１】
請求項２０に記載の遺伝子治療剤を用いる癌の遺伝子治療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、弱毒化したベロ毒素、そのＡサブユニット、それらを有効成分とする抗癌剤及び該抗癌剤を用いた癌の治療方法に関する。また、本発明は、上記弱毒化ベロ毒素又はそのＡサブユニットをコードするＤＮＡ、それらのＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該ベクター又は該宿主細胞を有効成分とする癌の遺伝子治療剤、及び該遺伝子治療剤を用いた癌の遺伝子治療方法に関する。更に、本発明は、上記弱毒化ベロ毒素又はそのＡサブユニットと、癌細胞に特異的又は選択的に結合するためのリガンドとを含む複合体、及び該複合体を有効成分とする抗癌剤に関する。
背景技術
ベロ毒素（Ｖｅｒｏ  ｔｏｘｉｎ：ＶＴ）は、病原性大腸菌の一種である腸管出血性大腸菌が産生するタンパク質性外毒素である。該毒素は、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットとから構成され、Ａサブユニットは毒性を有し、Ｂサブユニットはレセプターへの結合性を有することが知られている。
また、ベロ毒素には、志賀赤痢菌の１型菌が産生するシガトキシンと同一の１型ベロ毒素（ＶＴ１）と、ＶＴ１と約６０％の相同性を示す２型ベロ毒素（ＶＴ２）とが存在する。
現在では、ベロ毒素ファミリーとして、ＶＴ１（Ｖｅｒｏ  ｔｏｘｉｎ  １）（「ＳＬＴ−Ｉ（ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ  ｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ）」ともいう。）、ＶＴ２（Ｖｅｒｏ  ｔｏｘｉｎ  ２）（「ＳＬＴ−ＩＩ（ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ  ｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ）」ともいう。）、ＶＴ２ｖｈａ（ＶＴ２  ｖａｒｉａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａ）、ＶＴ２ｖｈｂ（ＶＴ２  ｖａｒｉａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂ）、ＶＴ２ｖｐ１（ＶＴ２  ｖａｒｉａｎｔ  ｐｏｒｃｉｎｅ  １）、ＶＴ２ｖｐ２（ＶＴ２  ｖａｒｉａｎｔ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ２）等が知られている。
ベロ毒素はＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有しており、真核細胞由来のリボゾームの６０Ｓ亜粒子を構成する２８ＳリボゾーマルＲＮＡの５’末端から４３２４番目のアデノシン残基のグリコシド結合を加水分解し、アデニンを遊離させる。その結果、伸長因子１（ＥＦ−１）依存性アミノアシルｔＲＮＡのリボゾームへの結合が阻害されることにより、タンパク質合成が阻害され、細胞が死滅する。このようにして、ベロ毒素は出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群、脳症等の重篤な疾患を引き起こす。
上述したように、ベロ毒素はタンパク質合成阻害作用を有することが知られているにも関わらず、ワクチンとしての利用以外は、ほとんど研究されていないのが現状である。
そこで、本発明の主な目的は、癌に対して有効な弱毒化ベロ毒素、そのＡサブユニット、又はそれらとリガンドとの複合体等を提供することである。
発明の開示
本発明者は、ベロ毒素を弱毒化することにより、抗癌剤として使用できることを見出した。すなわち、本発明は、下記の項１〜２１に関する。
項１．ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７−１７２番目の配列及び２０２−２０７番目の配列の少なくとも１種の配列が変異された弱毒化ベロ毒素。
項２．ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７−１７２番目の配列及び２０２−２０７番目の配列の少なくとも１種の配列が置換又は欠失された、上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
項３．ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７、１７０、１７２及び２０２番目の配列の少なくとも１種の配列が置換又は欠失された、上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
項４．ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７番目のグルタミン酸がグルタミンに、及び／又は１７０番目のアルギニンがロイシンに置換された、上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
項５．ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１７２番目のアルギニンがロイシンに置換された、上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
項６．ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２０２番目のトリプトファンがロイシン又はヒスチジンに置換された、上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素。
項７．上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニット。
項８．上記項７に記載のＡサブユニットをコードするＤＮＡ。
項９．上記項８に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
項１０．上記項７に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニット又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
項１１．上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
項１２．上記項７に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニットと癌細胞に特異的又は選択的に結合するためのリガンドとを含む複合体。
項１３．上記項７に記載の弱毒化ベロ毒素のＡサブユニットとトロポニンＩを含む融合タンパク質。
項１４．上記項８に記載のＤＮＡ及びトロポニンＩをコードするＤＮＡを含む融合遺伝子。
項１５．上記項８に記載のＤＮＡ及びトロポニンＩをコードするＤＮＡを含む融合遺伝子を有するベクター。
項１６．上記項１に記載の弱毒化ベロ毒素と癌細胞に特異的又は選択的に結合するためのリガンドとを含む複合体。
項１７．上記項１２に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
項１８．上記項１３に記載の融合タンパク質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。
項１９．上記項１０、１１、１７又は１８に記載の抗癌剤を用いる癌の治療方法。
項２０．上記項９又は１５に記載のベクターを有効成分とする癌の遺伝子治療剤。
項２１．上記項２０に記載の遺伝子治療剤を用いる癌の遺伝子治療方法。
発明の詳細な記述
ベロ毒素とは、腸管出血性大腸菌が産生するタンパク質性外毒素のことであり、Ａサブユニット及びＢサブユニットから構成される。該毒素が由来する大腸菌の種類は限定されない。毒素の種類としても限定されず、例えば、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、ＶＴ２ｖｐ１及びＶＴ２ｖｐ２等が挙げられ、好ましくはＶＴ２ｖｐ１である。
参考として、配列番号１、２及び図１にＶＴ２ｖｐ１のＡサブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号３、４及び図２にＶＴ２ｖｐ１のＢサブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。また、ベロ毒素ファミリーのメンバーのアミノ酸配列を図３に示す。
なお、配列番号１又は図１に示したＡサブユニットにおいて、Ｎ末端から２２個のアミノ酸（図１中の括弧内）がリーダーシークエンスであるので、本明細書におけるアミノ酸の配列中の番号は、リーダーシークエンスを除いた番号で表すこととする。すなわち、本明細書においてＮ末端からｘ番目のアミノ酸とは、配列番号１ではＮ末端から（ｘ＋２２）番目を意味する。例えば、本明細書においてＮ末端から１０番目のアミノ酸とは、配列番号２ではＮ末端から３２番目のアミノ酸のことである。
同様に、配列番号４又は図２に示されたＢサブユニットアミノ酸配列においては、Ｎ末端から１９個のアミノ酸（図２中の括弧内）がリーダーシークエンスである。
また、本明細書において、ＤＮＡ配列の場合、ＡサブユニットのＤＮＡ配列では５’末端からｙ番目の塩基とは、配列番号１では（ｙ＋６６）番目の塩基を意味する。同様に、ＢサブユニットのＤＮＡ配列（配列番号３）では、５’末端からｚ番目の塩基とは、（ｚ＋５７）番目の塩基を意味する。
本発明の弱毒化ベロ毒素
本発明における弱毒化したベロ毒素（以下、「弱毒化ベロ毒素」又は「変異毒素」ということがある。）とは、正常細胞に対するタンパク質合成作用への影響等の細胞毒性をできる限り少なくし、癌組織細胞のタンパク質合成に対して阻害作用を示すようにしたベロ毒素のことをいう。
弱毒化ベロ毒素は、Ａサブユニット及びＢサブユニットを含むが、Ａサブユニット単独でもよい。また、ＡサブユニットとＢサブユニットの組み合わせ方も限定されず、同種のベロ毒素のサブユニット同士の組み合わせでも良いし、例えば、ＶＴ２ｖｐ１のＡサブユニットとＶＴ２ｖｐ２のＢサブユニットの組み合わせというように、異なる種類のベロ毒素のサブユニット同士を組み合わせることもできる。
本発明は、ベロ毒素のＡサブユニットの１６７番目及び１７０番目のアミノ酸が毒性の活性中心であることに基いて、それらの部位又はその他の部位のアミノ酸変異させることによって、ベロ毒素を弱毒化させ、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗菌剤等として用いることができるようにしたものである。
本発明の弱毒化ベロ毒素は、Ａサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７−１７２、２００−２０７番目の配列のうちの少なくとも１種、好ましくは１又は数種の配列を変異させた弱毒化ベロ毒素である。
本明細書において、変異とは置換、欠失、挿入又は付加を示す。例えば、ベロ毒素のアミノ酸配列中にアミノ酸を挿入する場合、１６６番目の配列と１６７番目の配列の間にアミノ酸を挿入すると、１６７番目の配列にアミノ酸を挿入したことになる。また、１７２番目の配列と１７３番目の配列の間にアミノ酸を挿入すると、１７２番目の配列にアミノ酸を挿入したことになる。上記のようにアミノ酸を挿入すると、２００−２０７番目の配列も変異されたことになる。
アミノ酸配列の２００−２０７番目の配列中にアミノ酸を挿入する際についても上記と同様に考えることができる。
付加するアミノ酸の数は、１個以上、好ましくは１又は数個であるが、細胞毒性が抑制され、抗癌作用を有している限り限定されない。
アミノ酸を付加する場合、ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に１個以上のアミノ酸を付加することができる。付加するアミノ酸の数は、好ましくは１又は数個が例示できるが、細胞毒性が抑制され、抗癌作用を有している限り限定されない。
好ましくは、ベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１６７−１７２、２００−２０７番目の配列のうちの少なくとも１種、好ましくは１又は数種の配列を置換又は欠失させた弱毒化ベロ毒素である。
より好ましくは、ＡサブユニットのＮ末端から１６７、１７０、１７２及び２０２番目の配列の少なくとも１個が、置換又は欠失した弱毒化ベロ毒素が挙げられ、最も好ましくは、１６７、１７０、１７２及び２０２番目のアミノ酸の少なくとも１個が置換された弱毒化ベロ毒素が挙げられる。
例えば、ＡサブユニットのＮ末端から１６７番目のグルタミン酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン等の中性アミノ酸に置換することが好ましい。
１７０番目のアルギニン及び１７２番目のアルギニンも、上で例示したような中性アミノ酸に置換することが好ましい。２０２番目のトリプトファンは、上に例示したような中性アミノ酸又はリジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸に置換することが好ましい。
その中でも特に好ましい態様としては、ベロ毒素のＡサブユニットのＮ末端から１６７番目のグルタミン酸をグルタミン及び／又は１７０番目のアルギニンをロイシンに置換した弱毒化ベロ毒素、１７２番目のアルギニンをロイシンに置換した弱毒化ベロ毒素、２０２番目のトリプトファンをロイシン又はヒスチジンに置換した弱毒化ベロ毒素等が例示できる（図４参照）。
本発明の弱毒化ベロ毒素の製造方法
本発明の弱毒化ベロ毒素又はそのＡサブユニット（以下、「本発明タンパク質」ということもある。）を得る方法としては、何ら限定されず、公知の生物学的方法又は化学的方法を用いることができる。
（１）生物学的方法
（ｉ）本発明ＤＮＡ
本発明タンパク質を得るための生物学的方法としても特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
例えば、ベロ毒素又はそのＡサブユニットをコードするＤＮＡを、公知の手段を用いて改変することにより、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう。）を作製し、得られた本発明ＤＮＡを用いて公知の遺伝子工学的手段により本発明タンパク質を得ることができる。
ベロ毒素のＤＮＡの改変は、例えば、部位特異的突然変異誘発〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕等の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。この方法は、例えば、ＴＯＹＯＢＯ社の部位特異的突然変異導入キット“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  ＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ”を用いて行うこともできる。
本発明の部位特異的突然変異誘発法において、好ましくは、表１に示す変異塩基導入オリゴヌクレオチドがプライマーとして使用できる。
また、化学的ＤＮＡ合成法としては、例えば、リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法等の公知の化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）〕、及びそれらの組合せ方法等が使用できる。
より具体的には、ＤＮＡはホスホロアミダイト法又はトリエステル法を利用した化学合成法によって合成することもでき、また、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置等を利用して合成することもできる。
以上のようにして、本発明ＤＮＡ、好ましくは図４で示される配列のＤＮＡを得ることができる（図４は、本発明の弱毒化ベロ毒素のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの配列がワイルドタイプと異なる部位を示す）。
例えば、変異毒素Ｅ１６７Ｑ−Ｒ１７０Ｌ（ベロ毒素のＡサブユニットのＮ末端から１６７番目のグルタミン酸をグルタミン及び１７０番目のアルギニンをロイシンに置換した弱毒化ベロ毒素）をコードするＤＮＡの場合は、ベロ毒素のＤＮＡ配列の４９９番目のＧがＣに、５０１番目のＡがＧに、５０９番目のＧがＴに改変されている。ここで、「Ａ」はアデニンを示し、「Ｔ」はチミンを示し、「Ｇ」はグアニンを示し、「Ｃ」はシトシンを示す。
変異毒素Ｅ１６７Ｑ（ベロ毒素のＡサブユニットのＮ末端から１６７番目のグルタミン酸をグルタミンに置換した弱毒化ベロ毒素）をコードするＤＮＡの場合は、ベロ毒素のＤＮＡ配列の４９９番目のＧがＣに改変されている。
変異毒素Ｒ１７０Ｌ（ベロ毒素のＡサブユニットのＮ末端から１７０番目のアルギニンをロイシンに置換した弱毒化ベロ毒素）をコードするＤＮＡの場合は、ベロ毒素のＤＮＡ配列の５０９番目のＧがＴに改変されている。
変異毒素Ｒ１７２Ｌ（ベロ毒素のＡサブユニットのＮ末端から１７２番目のアルギニンをロイシンに置換した弱毒化ベロ毒素）をコードするＤＮＡの場合は、ベロ毒素のＤＮＡ配列の５１４番目のＡがＣに、５１５番目のＧがＴに改変されている。
Ｗ２０２Ｌ（ベロ毒素のＡサブユニットのＮ末端から２０２番目のトリプトファンをロイシンに置換した弱毒化ベロ毒素）をコードするＤＮＡの場合は、ベロ毒素のＤＮＡ配列の６０４番目のＴがＣに、６０５番目のＧがＴに改変されている。
Ｗ２０２Ｈ（ベロ毒素のＡサブユニットのＮ末端から２０２番目のトリプトファンをヒスチジンに置換した弱毒化ベロ毒素）をコードするＤＮＡの場合は、ベロ毒素のＤＮＡ配列の６０４−６０６番目の「ＴＧＧ」が「ＣＡＣ」に改変されている。
本発明ＤＮＡは、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）〕によりＤＮＡを好適に増幅させることができる。また、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６），３５（１９９４）〕、５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８，８９９８（１９８８）〕等も用いることができる。
ＰＣＲ法において使用されるプライマーは、本発明において得られた本発明ＤＮＡの配列情報に基づいて適宜設定することができ、常法に従って合成することができる。なお、増幅させたＤＮＡの単離精製も常法に従うことができる。例えば、ゲル電気泳動法等によることができる。
上記方法により得られる本発明ＤＮＡは、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３（１９７７）〕、マキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）〕等の常法に従って、その塩基配列を決定することができる。また、簡便には、市販のシークエンスキット等を用いて、その塩基配列を決定することができる。
（ｉｉ）本発明タンパク質
本発明タンパク質は、本発明ＤＮＡの配列に基いて、通常の遺伝子組換え技術〔例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，５９９０（１９８３）等参照〕に従って調製することができる。
より詳細には、本発明タンパク質は、本発明ＤＮＡが宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより得ることができる。
宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができる。原核生物の宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌等の一般的に用いられるものが広く挙げられる。好適には大腸菌、とりわけエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２株に含まれるものが用いられる。
真核生物の宿主細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば、脊椎動物、酵母等の細胞を用いることができる。脊椎動物の細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｅａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７７：４２１６（１９８０）〕等を好適に使用できる。酵母の細胞としては、例えばサッカロミセス属酵母細胞等を好適に利用できる。
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明ＤＮＡが発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更にタンパク合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。
上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等がよく用いられるが、これらに限定されず公知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えば、ｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を例示できる。
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明ＤＮＡの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。
該発現ベクターの例としては、具体的には、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１：８５４（１９８１）〕等が例示できる。
上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Ｃｌｏｎｔｒｅｃｈ社）、ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の動物細胞用ベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の昆虫細胞用ベクター等が挙げられる。
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば、酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０：１（１９８３）〕等が例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えば、ｐＰＩＣＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＰＩＣＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）なとが包含される。
プロモーターとしても特に限定されず、エシェリキア属菌を宿主とする場合は、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーター等を好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等を好適に利用できる。
また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーター等を例示できる。
本発明ＤＮＡの発現ベクターとしては、通常の融合タンパク発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパクとして発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等を例示できる。
成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が例示できる。本発明タンパク質の製造には、これらの配列を利用することもできる。また、本発明タンパク質の製造に当たっては、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列（ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ）、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン（ＨＡ）・タグ等を利用することもできる。
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法としては特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
形質転換体は常法に従って培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的タンパク質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
培養に用いられる培地としては、用いる宿主細胞に応じて通常使用される各種の培地を適宜選択利用できる。培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
このようにして得られる本発明の組換えタンパク質は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３（１９８７）等参照〕により分離、精製できる。
該方法としては、例えば、通常の再構成処理、タンパク沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示できる。特に好ましい方法としては、本発明タンパク質に対して特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィー等を例示することができる。
（２）化学的方法
本発明タンパク質はまた、例えば図４に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。このような方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。
このようなペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく、いわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明タンパク質の合成はそのいずれによってもよい。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も常法に従うことができ、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（添加物：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。
これら各方法に利用できる溶媒も、ペプチド縮合反応に使用されることが知られている一般的なものから適宜選択することができる。例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸又はペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えば、メチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えば、ベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル等のアラルキルエステル等として保護することができる。
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えば、チロシン残基等の水酸基は、必要に応じて、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基等で保護することができる。更に、例えば、アルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明タンパク質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、例えば接触還元法、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等の公知の方法に従って行うことができる。
合成の各段階における縮合反応の進行の程度は、例えばニンヒドリン反応法のような公知の方法によって調べることができる。また、得られた本発明タンパク質は、例えば、イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法等の公知の方法に従って、適宜精製を行うことができる。
リガンド
本発明には、本発明タンパク質と癌細胞に特異的又は選択的に結合できるようなリガンドと含む複合体も含まれる。
該リガンドとしては、癌細胞、癌組織中の血管内皮細胞等に特異的又は選択的に結合できるものであれば特に限定されず、生物学的なリガンドであっても化学的なリガンドであってもよい。
例えば、リガンドは、癌細胞の表層に発現している物質と親和性を有する物質で、細胞表層物質に対して、静電相互作用、疎水相互作用、ファンデルワールス相互作用等により特異的又は選択的に結合するものが好ましい。
血管内皮細胞に特異的又は選択的に結合するリガンドとしては、トロポニンＩのような塩基性タンパク質が挙げられる。
また、細胞表層物質に特異的又は選択的に結合するものとしては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の抗原認識部位を含むフラグメント、細胞表層レセプター、レセプターのリガンド結合部位を含むフラグメント、糖鎖、ポリペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、脂質等が挙げられる。
より詳細には、例えば、抗インテグリン抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＭＵＣ−１抗体、抗サイトケラチン抗体、抗上皮細胞増殖因子抗体、抗インシュリン様増殖因子抗体、抗インシュリン様増殖因子レセプター抗体等の抗体、抗原認識部位を含む抗体の一部、コラーゲン等のポリペプチド又はオリゴペプチド、ＲＧＤ配列を含むオリゴペプチド、フィブロネクチン等の糖タンパク質、ヒアルロン酸、ホスホマンナン等の多糖、マンノース−６−リン酸五量体等のオリゴ糖、マンノース−６−リン酸等の単糖、レチノイン酸等のビタミン酸等が挙げられる。
白血球、赤血球等の正常細胞と相互作用しないという点で、抗インシュリン様増殖因子レセプター抗体、マンノース−６−リン酸五量体等が好適に用いられる。
化学的リガンドとしては、例えば、合成有機化合物、合成高分子化合物のリガンドが利用できる。
上記リガンドを本発明タンパク質に結合させる方法は特に限定されず、リガンドの種類等に応じて適宜選択することができる。
例えば、本発明タンパク質とリガンドとを混合して複合体を形成させることもできるし、また、上述したような公知の遺伝子工学的方法により、例えば、弱毒化ベロ毒素のＡサブユニットのＤＮＡ及びリガンドをコードするＤＮＡを含む融合遺伝子をプラスミドに構築する等して得ることもできる。このとき、融合遺伝子において、本発明ＤＮＡとリガンドをコードするＤＮＡはどちらが５’末端に位置してもよいが、本発明ＤＮＡが５’に位置する（すなわち、弱毒化ベロ毒素のＢサブユニットの代わりにリガンドが位置する）方が好ましい。
本発明における特に好ましい態様としては、弱毒化ベロ毒素のＡサブユニットとリガンドとしてトロポニンＩの融合タンパク質が挙げられる。このとき、ＡサブユニットとトロポニンＩのどちらがＮ末端に位置してもよいが、好ましくはＡサブユニットがＮ末端に位置する方がよい。
医薬組成物（抗癌剤）
本発明において抗癌剤とは、癌細胞（腫瘍細胞）の増殖を抑制したり、癌細胞（腫瘍細胞）を死滅させたりすることができる医薬組成物を意味する。
抗癌剤としては、Ａサブニット及びＢサブユニットを含む形で有効成分として使用することもできるし、Ａサブユニットを有効成分とすることもできる。また、Ａサブニット及びＢサブユニットを含む形においては、それらを同時に使用することもできるし、別々に用いることもできる。
本発明の医薬組成物において、抗癌剤の有効成分である本発明タンパク質又は本発明複合体には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩は当業界で周知の方法により調製される。例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が包含される。
更に、有効成分化合物がアミノ基等の官能基を有する場合、上記塩には、本発明の有効成分と適当な有機酸又は無機酸との反応による酸付加塩も包含される。代表的酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレート等が例示される。
本発明の抗癌剤は、例えば、本発明タンパク質又は本発明複合体の薬学的有効量を、適当な担体、賦形剤又は希釈剤と共に含有することができる。
ここで、担体、賦形剤又は希釈剤としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される公知のものが使用される。担体としては、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等を例示できる。
タンパク質を活性成分とする場合、医薬製剤は、好ましくは、通常のタンパク製剤に使用される各種成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製される。
ここで安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミン、Ｌ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、活性成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
Ｌ−アミノ酸には、例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等が含まれる。
糖としては、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等及びそれらの誘導体等を使用できる。
界面活性剤は、イオン性及び非イオン性界面活性剤のいずれでもよく、これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が含まれる。
セルロース誘導体としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を使用できる。
上記糖類の添加量は、活性成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１−１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、活性成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１−０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、活性成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１−０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、活性成分１μｇ当り約０．００１−１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、活性成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１−０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
医薬製剤中に含まれる活性成分量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１−７０重量％、好ましくは０．０００１−５重量％程度の範囲から選ばれるのが適当である。
また医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤等を添加することもできる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及び／又はそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥して保存し得る状態にした後、用時に水、生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製して使用することも可能である。
医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調整される。
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシル等を包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤等の助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液等への調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油等の植物油等を使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチル等を配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤等を添加することもできる。
滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理等により実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン及び半合成グリセライド等を使用できる。
ペースト、クリーム、ゲル等の軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト及びオリーブ油等の植物油等を使用できる。
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
なお、本発明抗癌剤（医薬組成物）中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品等を含有させることもできる。
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
上記医薬製剤中に含有されるべき活性成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件等に応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、成人１日当たり約０．１ｎｇ−１０００ｍｇ程度、好ましくは約０．５ｎｇ−１００ｍｇ程度、更に好ましくは１ｎｇ−１００ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１回投与することができ、また数回に分けて投与することもできる。
本発明の抗癌剤の対象となる癌の種類としては限定されるものではなく、あらゆる種類の癌に用いることができる。例えば、胃癌、肺癌、食道癌、乳癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、皮膚癌、喉頭癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫等が例示できる。
また、本発明の抗癌剤は、手術により切除できない癌、特に多発性に散在する癌組織（例えば、内臓癌、リンパ節へ転移した癌等）、手術後の再発癌（例えば、胃癌、大腸癌等）には内視鏡による注射、手術ができない状態の癌（例えば、食道癌、大腸癌等）には癌組織への直接的な注射、癌組織を支配する動脈内へのカニュールでの注射（肝臓癌）等によって投与することもできる。
更に、本発明の抗癌剤は単独で使用することもできるが、公知の抗癌剤、ホルモン剤、放射線、下記の本発明遺伝子治療剤等の１種以上と組み合わせて使用することもできる。
遺伝子治療剤
以下、本発明遺伝子治療剤につき詳述する。なお、以下の遺伝子治療の実施においては、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学における慣用的方法を利用することができる。これらの方法は、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１））、アウスベル（Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２））、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８５））、アナンド（Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９２））、グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９１））、フィンク（Ｆｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１１−１９（１９９２））等に記載されている。
本発明の遺伝子治療は、癌細胞及びその周辺の細胞において本発明ＤＮＡを導入し、本発明タンパク質を発現させることにより、癌細胞の増殖を抑制又は癌細胞を死滅させるための医薬組成物の提供を基礎としている。
本発明ＤＮＡを用いた癌患者に対する遺伝子治療は、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）等に由来するベクターに、本発明のＤＮＡを組込み、これを癌細胞（腫瘍細胞）に感染させて本発明タンパク質を発現させることにより、所望の抗癌（抗腫瘍）効果を得ることができる。
本発明ＤＮＡによる組換えおよび染色体外維持の双方のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知ベクターのいずれも使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結した本発明のＤＮＡのコピーを含み、かつ目的細胞内で本発明のＤＮＡ産物を発現できるウイルスベクター又はプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとしては、通常前述する遺伝子発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターを利用できる。
遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
その具体例としては、例えば肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７−アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿タンパク質などを例示できる。肺に対しては、活性剤タンパク質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンなどを例示できる。脳に対しては、神経膠繊維質酸性タンパク質、成熟アストロサイト特異タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、チロシンヒドロキシラーゼなどを例示できる。膵臓においては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを例示できる。膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
本発明ＤＮＡ導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入、遺伝子銃などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、それ自体で抗癌作用を有する医薬として、また治療研究のためのモデル系などとして利用することも可能である。
遺伝子治療において、本発明ＤＮＡ導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的に又は全身的に注射投与することにより、患者の標的細胞内に導入することができる。例えば、全身的投与によれば、本発明タンパク質のｍＲＮＡが発現し得るいずれの細胞にも目的ベクターを到達させることができる。形質導入されたＤＮＡが各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって所望の取り込みを行わせることができる。
本発明の遺伝子治療方法は、前述した本発明ＤＮＡ導入用の材料（本発明ＤＮＡ導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入し、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）法の両者を包含する。また、本発明遺伝子治療方法では、本発明ＤＮＡを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムを利用して遺伝子治療を行うことも可能である。
より具体的には、本発明ＤＮＡを公知の組み換えアデノウイルスの遺伝子に導入することにより、組み換えウイルス粒子を作成することができる。例えば、遺伝子治療に使用するアデノウイルスは、通常ウイルスゲノムからウイルスの増殖に必須な初期遺伝子Ｅ１Ａ−Ｅ１Ｂ遺伝子を欠損させているので、その領域に変異ベロ毒素ＡサブユニットのＤＮＡを挿入することができる。
この本発明ＤＮＡを取り込んだ組み換えアデノウイルスを、例えば、Ｅ１Ａ−Ｅ１Ｂ遺伝子を恒常的に発現している２９３細胞等で増殖させ、大量の組み換えウイルス粒子を得ることができる。これらのウイルス粒子を精製し、癌細胞に感染させることによって、本発明タンパク質を癌細胞において産生し、癌細胞の増殖を抑制又は癌細胞を死滅させることができる。
本発明遺伝子治療剤（組成物）は、製剤の使用形態に応じて、前述した医薬組成物の項で例示した各種の担体等を用いて常法に従い調製することができる。
また、本発明遺伝子治療剤（本発明ＤＮＡ導入用ベクターを含む医薬製剤）は、該ベクターをリポソームに包埋された形態、または本発明ＤＮＡが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製され、実用され得る。
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
一般には、医薬製剤としての本発明ＤＮＡ含有ウイルスベクターの投与量は、１日当り成人体重１ｋｇ当たり、例えばウイルスの力価として１×１０３ｐｆｕ程度から１×１０１５ｐｆｕ程度、好ましくは１×１０５ｐｆｕ程度から１×１０１０ｐｆｕ程度が例示できる。
該製剤は１日に１回投与することができ、また数回に分けて投与することもできる。更に１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質又はこれを含む製剤と併用投与できる。
本発明の抗癌剤の対象となる癌の種類としては限定されるものではなく、あらゆる種類の癌に用いることができる。例えば、胃癌、肺癌、食道癌、乳癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、皮膚癌、喉頭癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫等が例示できる。
また、本発明の抗癌剤は、手術により切除できない癌、特に多発性に散在する癌組織（例えば、内臓癌、リンパ節へ転移した癌等）、手術後の再発癌（例えば、胃癌、大腸癌等）には内視鏡による注射、手術ができない状態の癌（例えば、食道癌、大腸癌等）には癌組織への直接的な注射、癌組織を支配する動脈内へのカニュールでの注射（肝臓癌）等によって投与することもできる。
更に、本発明の遺伝子治療剤は単独で使用することもできるが、本発明の抗癌剤、公知の抗癌剤、ホルモン剤、放射線等の１種以上と組み合わせて使用することもできる。
参考文献：
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（７）Ｔａｋｅｄａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｓ．Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒａｇｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｔｏｘｉｎｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ，Ｖｏｌ．１８（４）：５−１７，１９９１．
実施例
実施例１
表１の中欄（上から順に配列番号５〜１０）に示す変異塩基オリゴヌクレオチドを、プライマー合成機（ｍｏｄｅｌ  ３９１  ＰＣＲ−Ｍａｔｅ）を用いて合成し、これらを用いて部位特異的突然変異誘発を行った。
ＶＴ２ｖｐ１遺伝子を含む１．９ｋｂのＳａｕ３ＡＩ断片をＭ１３ｍｐ１８にサブクローニングし（得られたプラスミドを「Ｍ１３ｍｐ１８．ＣＩ」という。）、このＭ１３ｍｐ１８．ＣＩを大腸菌ＣＪ２３６にトランスフォーメーションし、次いで、この大腸菌からＭ１３ｍｐ１８．ＣＩの一本鎖ＤＮＡを調製した。
変異塩基導入用オリゴヌクレオチドとこの一本鎖ＤＮＡとをアニーリングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでポリメラーゼとリガーゼ反応することにより、二本鎖のＤＮＡを得た。得られたＤＮＡをＢＭＨ７１−８１  ｍｕｔＳ大腸菌にトランスフォーメーションし、クローンを得た。
得られた大腸菌のクローンからファージを調製し、ＭＶ１１８４大腸菌に感染させた。この大腸菌から得た二本鎖ＤＮＡをスクリーニングし、変異導入させたＶＴ２ｖｐ１遺伝子を含むＭ１３ｍｐ１８．ＣＩを選び出した。
以上のようにして、図４に示す６種類の変異毒素の遺伝子（ＤＮＡ）を作製した。図４はそれぞれ、遺伝子配列（上）及びアミノ酸配列（下）のワイルドタイプと異なる部分を示す。
これらの弱毒化ベロ毒素遺伝子とワイルドタイプのベロ毒素遺伝子を、Ｍ１３ｍｐ１８．ＣＩから変異毒素を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１１８にサブクローニングし、大腸菌ＨＢ１０１のトランスフォーメーションした。
得られた大腸菌ＨＢ１０１を３７℃で４８時間培養した後、１分間超音波で処理することにより菌体を破壊し、遠心分離し、上清を粗毒素液として調製した。得られた本発明の弱毒化ベロ毒素のアミノ酸配列を図４に示す（文献１）。
１×１０４個のベロ細胞を９６ｗｅｌｌの各ｗｅｌｌに播き、一晩培養した後、同量の各粗毒素液を添加した。２４時間後、ベロ毒素のベロ細胞に対する影響を顕微鏡で確認した。比活性は、ベロ毒素を死滅させる変異毒素液の希釈倍数と、ベロ毒素を死滅させるワイルドタイプの毒素の希釈倍数に対する比として計算した。
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実施例２
実施例１で得られた６種の変異毒素の中で、特にベロ細胞毒性の比活性の低い３種の毒素（Ｅ１６７Ｑ−Ｒ１７０Ｌ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ）及びワイルドタイプの毒素をコードするＤＮＡを、実施例１と同様に大腸菌に組み込み、その大腸菌を３７℃で４８時間培養し、超音波で潰した。その後、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングクロマトグラフィー、ＨＰＬＣで毒素を精製した（文献１）。得られた変異毒素は、それぞれ図４で表される本発明の変異毒素（Ｅ１６７Ｑ−Ｒ１７０Ｌ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ）であった。
これらの変異毒素のタンパク質をＢｅａｄ−ＥＬＩＳＡ（文献２）により定量して、以下の実験を行った。
ベロ毒素試験：
９６穴のプレートで一晩培養したベロ細胞の培地に、段階希釈した各変異毒素とワイルドタイプのベロ毒素をそれぞれ添加した。４８時間後、顕微鏡で観察した。細胞を死滅させた最小の毒素量と細胞を致死に至らしめなかった最大の毒素量の中間値をＣＤ５０とした（文献３）。結果を表２に示す。
マウス致死活性：
５匹ずつのｄｄＹマウス（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏ．，Ｋｙｏｔｏ）をグループにわけ、段階希釈したそれぞれの本発明弱毒化ベロ毒素（Ｅ１６７Ｑ−Ｒ１７０Ｌ、Ｅ１６７Ｑ及びＲ１７０Ｌ）とワイルドタイプのベロ毒素をそれぞれマウスの腹腔に注射し、死んだマウスの時間と匹数によってマウスのＬＤ５０を計算した（文献３）。結果を下の表２に示す。
タンパク質合成抑制活性：
ウサギ網状赤血球ライゼートにおける細胞フリーグロビン合成抑制実験を行った。１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．６）、１５μＭヘミン、１００ｍＭ酢酸カリウム、１．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭスペルミジン、２ｍＭジチオスレイトール、０．２ｍＭグルコース−６−リン酸、１．５ｍＭ  ＡＴＰ、０．３ｍＭ  ＧＴＰ、８ｍＭクレアチンリン酸、７．５μｇのクレアチンキナーゼ、５μｇのラット肝ｔＲＮＡ、０．６μｇグロビンｍＲＮＡ、１５μｌのヌクレアーゼ処理された網状赤血球ライゼート、０．１μＣｉ［１４Ｃ］ロイシン、３０ｍＭの他の１９種類のアミノ酸からなる５０μｌの反応液中に、各量の弱毒化ベロ毒素とワイルドタイプのベロ毒素をそれぞれ添加し、３７℃で３０分間反応させた。一部の反応液を取って放射活性を測定し、タンパク質合成抑制活性を計算した（文献４）。結果を表２に示す。
また、本発明ベロ毒素及びワイルドタイプの毒素において、各毒素量のタンパク質合成抑制活性に対する影響を図５に示す。
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実施例３
癌組織の成長と共に血管細胞が増殖するので、新生血管内皮細胞の増殖を抑えると、癌の成長を抑制できると考えられる。そこで、本発明の弱毒化ベロ毒素Ｅ１６７Ｑ−Ｒ１７０ＬのＡサブユニットとトロポニンＩタンパクの複合体を作り、その複合体の血管内皮細胞の増殖に対する影響について調べた。
トロポニンＩは血管内皮細胞の増殖抑制機能を有することが知られており、血管内皮に結合することができる。ここでは、ＶＴ２ｖｐ１の変異毒素Ｅ１６７Ｑ−Ｒ１７０Ｌ（ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍ）遺伝子のＢサブユニットを取り除いて、ヒトのトロポニンＩ（ＴｎＩ）の遺伝子（文献５）をＡサブユニットの上流又は下流にそれぞれ繋げて、ＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡとＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩという融合遺伝子を以下のようにして作った。
上流の終止コドンのない遺伝子断片をＰＣＲ反応で作る時、５’側にＥｃｏＲＩ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｉｔｅを導入した遺伝子の５’−ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１１又は配列番号１３）と、終止コドンを含まないでその代わりにＢａｍＨＩ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｉｔｅを導入した３’−Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１２又は配列番号１４）を用いて、上流遺伝子断片を作った。
該遺伝子断片を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化してから、ｐＵＣ１１９のｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ中のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの間に導入した。このように作ったプラスミドをｐＵＣ１１９−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ又はｐＵＣ１１９−ＴｎＩと命名した。
下流の開始コドンのない遺伝子断片をＰＣＲ反応で作る時、開始コドンを含まないでその代わりにＢａｍＨＩ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｉｔｅを導入した遺伝子の５’−ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１５又は配列番号１７）と、３’側にＨｉｎｄＩＩＩ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｉｔｅを導入した３’−ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１６又は配列番号１８）を用いて、下流遺伝子の断片を作った。
該遺伝子断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化してから、ｐＵＣ１１９−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ又はｐＣＵ１１９−ＴｎＩ中のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの間に導入した。作ったプラスミドをｐＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩ或いはｐＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡと命名した。各プライマーは日本製粉株式会社製である。
その後、これらの融合遺伝子をプラスミド（ｐＴｒｃ９９Ａ）に導入し、大腸菌（ＪＭ１０５）の中で大量に発現させた。それらの融合タンパク質産物をウエスタンブロット法で確認し、精製した（文献６）。
８００個の胎児臍帯静脈内皮細胞を９６穴プレイトに播き、５％血清（ｃａｌｆ−ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ培地で３時間インキュベートし、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，３０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
その後、トロポニンＩタンパク質、ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡタンパク質（本発明弱毒化ベロ毒素Ｅ１６７Ｇ−Ｒ１７０Ｌタンパク）、ＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡタンパク質（トロポニンＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡの融合タンパク質）、ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩタンパク質（ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−トロポニンＩの融合タンパク質）を種々濃度で添加した。
ＶＥＧＦのみを添加したウェルの細胞をコントロールとして、５日後のコントロールの細胞数に対する各タンパク質の内皮細胞の増殖抑制率を計算した。結果を図６に示す。
１ｍｌ培地中のＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡの量が２００ｎｇに達しても細胞増殖抑制効果はなかった。一方、内皮細胞の増殖の５０％抑制活性に達するには、トロポニンＩタンパク質の量は６０ｎｇ、ＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ融合タンパク質は５０ｐｇ、ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩ融合タンパク質は１０ｐｇであった。つまり、ＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡとＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩ融合タンパク質の内皮細胞の増殖抑制活性は、それぞれ、トロポニンＩタンパク質の抑制活性より１２００倍、６０００倍に高くなった。
この実験結果から、本発明弱毒化ベロ毒素のＡサブユニットが、増殖している血管内皮細胞の中に入ることにより、その細胞に対する増殖抑制効果が非常に高くなることが示唆された。
実施例４
動物に接種した癌組織の抑制実験を行った。
６−８週齢、雌のヌードマウスの腹腔に２×１０６個の人の卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）を接種した。これらのマウスを４群に分けて、各群に４匹マウスを使用した。
肉眼で癌塊が確認できる８日目と１０日目に２回にわたって、コントロールとしての０．８ｍｌのＰＢＳ、３μｇのトロポニンＩタンパク質、３μｇのＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ融合タンパク質及び３μｇのＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩ融合タンパク質をそれぞれのマウスの腹腔内に投与した。
５０日間観察した結果、ＰＢＳを注射したコントロールのマウスの癌の大きさに比べて、トロポニンＩ及びＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ融合タンパク質をそれぞれ投与したマウスの癌はわずかに小さかった。
一方、ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩ融合タンパク質を投与したマウスの癌組織の成長は顕著に抑制され、５０日目の癌の大きさは、ＰＢＳを投与したコントロールのマウスのものに比べて著しく小さく、ＰＢＳ群に対する統計学的有意差（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定）が認められた（ｐ＜０．０５）。
また、どの群のマウスにも、体重の低下、食餌量の減少、行動の異常は見られなかった。
以上の結果より、本発明の弱毒化ベロ毒素Ｅ１６７Ｑ−Ｒ１７０Ｌ（ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍ）のＡサブユニットのＣ末端側にトロポニンＩを結合させた融合タンパク質が、癌の血管内皮細増殖を有意に抑制し、癌組織の成長を抑制することがわかった（図７）。
産業上の利用可能性
本発明の弱毒化ベロ毒素、そのＡサブユニット又はそれらとリガンドとの複合体を用いることにより、毒性を生じることなく有効に癌を治療又は癌細胞の増殖を抑制することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＶＴ２ｖｐ１毒素Ａサブユニットの構造遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す。括弧内におけるＮ末端から２２アミノ酸残基又は５’末端から６６塩基は、リーダーシークエンスを示す。
図２は、ＶＴ２ｖｐ１毒素Ｂサブユニットの構造遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す。括弧内におけるＮ末端から１９アミノ酸残基又は５’末端から５７塩基は、リーダーシークエンスを示す。
図３は、６種類のベロ毒素Ａサブユニットのの推定アミノ酸配列を示す。▼はプロセッシングを受ける位置を示し、−はＶＴ２と同じアミノ酸であることを示し、＋はアミノ酸が欠失していることを示す（文献７）。
図４は、ワイルドタイプのベロ毒素及び部位特異的突然変異誘発法で作製した各弱毒化ベロ毒素（変異毒素）の塩基配列（上）及びアミノ酸配列（下）を示す。図中の数字はベロ毒素のＡサブユニットのアミノ酸残基の位置を示す。＃は２２のリーダーアミノ酸を除いたＮ末端からのアミノ酸残基の位置を示す。また、−はワイルドタイプのベロ毒素と同じ塩基又はアミノ酸残基を示す。
図５は、ウサギ網状赤血球ライゼート系における細胞フリーグロビン合成において精製した、ワイルドタイプＶＴ２ｖｐ１毒素と３種類の本発明ベロ毒素（変異ＶＴ２ｖｐ１毒素）によるタンパク質合成抑制のアッセイの結果を示す。縦軸はタンパク質合成活性（％）を、横軸は毒素の量（μｇ）を示す。
図６は、胎児臍帯静脈内皮細胞におけるトロポニンＩタンパク質による細胞増殖の抑制率（図Ａ）、及びＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ（○）及びＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩ（●）による細胞増殖の抑制率（図Ｂ）を示す。縦軸はコントロールに対する内皮細胞の増殖の抑制率（％）を、横軸は培地１ｍｌ中に添加したタンパク質の量（図Ａはｎｇ、図Ｂはｐｇ）を示す。
図７は、２×１０６個の人の卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）を接種した雌のヌードマウスの腹腔に、コントロールとしてのＰＢＳ（●）、３μｇのトロポニンＩタンパク質（○）、３μｇのＴｎＩ−ＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ融合タンパク質（▼）、及び３μｇのＶＴ２ｖｐ１−ｄｍＡ−ＴｎＩ融合タンパク質（▽）をマウスの腹腔内に投与したときの結果を示す。縦軸は癌体積（ｍｍ３）を、横軸はマウスに癌細胞を接種してからの日数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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