(57)【要約】被検試料中の可溶化グリピカン３（ＧＰＣ３）を検出することができる、可溶化ＧＰＣ３に対する抗体である。被検試料中の可溶化ＧＰＣ３をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することにより被検体が癌、特に肝臓癌に罹患しているか否かを診断することができる。さらに、細胞、特に癌細胞を破壊することができるＧＰＣに対する抗体であり、該抗体を含む細胞破壊剤または抗癌剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＣ３のＮ端ペプチドに対する抗体。
【請求項２】
ＧＰＣ３のＮ端ペプチドが血中可溶化ペプチドである請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ＧＰＣ３のＮ端ペプチドがＧＰＣ３の第１番目のアミノ酸から第３７４番目のアミノ酸からなるペプチド又は第１番目のアミノ酸から第３５８番目のアミノ酸からなるペプチドである請求項２記載の抗体。
【請求項４】
ＧＰＣ３のＮ端ペプチドがＧＰＣ３の第１番目のアミノ酸から第３５８番目のアミノ酸からなるペプチドである請求項３記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
不溶性支持体に固定されていることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項７】
標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項８】
ＧＰＣ３のＣ端ペプチドに対する抗体。
【請求項９】
ＧＰＣ３のＣ端ペプチドがＧＰＣ３の第３５９番目のアミノ酸から第５８０番目のアミノ酸からなるペプチド又は第３７５番目のアミノ酸から第５８０番目のアミノ酸からなるペプチドである請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
ＧＰＣ３のＣ端ペプチドがＧＰＣ３の第３５９番目のアミノ酸から第５８０番目のアミノ酸からなるペプチドである請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である請求項８から１０いずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
キメラ抗体である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
細胞傷害抗体である請求項７から１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項７から１３のいずれか１項に記載の抗体を含む細胞破壊剤。
【請求項１５】
細胞が癌細胞である請求項１４記載の細胞破壊剤。
【請求項１６】
請求項８から１３のいずれか１項に記載の抗体を含む抗癌剤。
【請求項１７】
請求項８から１３のいずれか１項に記載の抗体を細胞と接触させることを含む、細胞傷害を引き起こす方法。
【請求項１８】
細胞が癌細胞である請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はＧＰＣ３のＮ端ペプチドまたはＣ端ペプチドに対する抗体に関する。具体的には、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質に見られる約４０ｋＤａのＧＰＣ３Ｎ端ペプチドに対する抗体に関する。また、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質に見られる約３０ｋＤａのＧＰＣ３Ｃ端ペプチドに対する抗体に関する。
【背景技術】  細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンの新しいファミリーとしてグリピカンファミリーの存在が報告されている。現在までのところ、グリピカンファミリーのメンバーとして、５種類のグリピカン（グリピカン１、グリピカン２、グリピカン３、グリピカン４およびグリピカン５）が存在することが報告されている。このファミリーのメンバーは、均一なサイズ（約６０ｋＤａ）のコアタンパク質を持ち、特異的でよく保持されたシステインの配列を共有しており、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより細胞膜に結合している。
グリピカン３（ＧＰＣ３）は、発生における細胞分裂やそのパターンの制御に深く関わっていることが知られている。又、ＧＰＣ３遺伝子が肝癌細胞において高発現しており、ＧＰＣ３遺伝子が肝細胞癌マーカーとして利用できる可能性があること知られている。
以前、本発明者らは抗ＧＰＣ３抗体がＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有しており肝癌の治療に有用であることを見出し、特許出願を行った（特願２００１−１８９４４３）。
しかしながら、ＧＰＣ３は膜結合タンパク質であり分泌型のＰＧＣ３タンパク質が存在することは報告されておらず、ＧＰＣ３タンパク質自体を血中の癌マーカーとして用いることは検討されていなかった。
【発明の開示】
本発明者らは、グリピカン３（ＧＰＣ３）が３５８番目のアミノ酸部位、若しくは３７４番目のアミノ酸部位、若しくはそれらの近傍領域で切断される事実を見出し、可溶型ＧＰＣ３が肝癌患者の血中に分泌されるという仮説を立て、ＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡ系を確立し、ＧＰＣ３高発現であるヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２の培養上清中に分泌型ＧＰＣ３の存在を明らかにした。さらに、ＨｅｐＧ２を移植したマウス血漿中のみならずヒト肝癌患者血清中の可溶型ＧＰＣ３測定にも成功した。ＧＰＣ３は肝癌マーカーであるＡＦＰよりも早期の肝癌で遺伝子発現が認められるので、ＧＰＣ３の検出は癌の診断として有用であると考えられた。また可溶型ＧＰＣ３はＣ末端ペプチド断片側を認識する抗ＧＰＣ３抗体では検出しにくい傾向にあることから、分泌型ＧＰＣ３はＮ端ペプチド断片優位と推定された。従って、分泌型ＧＰＣ３の検出には、Ｎ端を認識する抗ＧＰＣ３抗体を用いるのが好ましいと考え、ＧＰＣ３のＮ端ペプチドを認識する抗体を開発することを試み、本発明を完成させるに至った。さらに、ＧＰＣ３のＣ末端に対する抗体が高い細胞傷害活性を有することを見出し、癌細胞の破壊、すなわち癌の治療には、Ｃ末端を認識する抗ＧＰＣ３抗体を用いるのが好ましいと考え、ＧＰＣ３のＣ端ペプチドを認識する抗体を開発することを試み、本発明を完成させるに至った。
ＧＰＣ３は肝癌細胞株以外に、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫などの癌細胞株においても発現が確認されているので、肝癌以外の診断にも適用できる可能性がある。
すなわち、本発明はＧＰＣ３のＮ端ペプチドに対する抗体である。
また、本発明はＧＰＣ３のＮ端ペプチドが血中可溶化ペプチドである前記抗体である。
さらに、ＧＰＣ３のＮ端ペプチドがＧＰＣ３の第１番目のアミノ酸から第３７４番目のアミノ酸からなるペプチド又は第１番目のアミノ酸から第３５８番目のアミノ酸からなるペプチドである前記抗体である。
さらに、本発明はモノクローナル抗体である前記抗体である。
さらに、本発明は不溶性支持体に固定されていることを特徴とする前記抗体である。
さらに、本発明は標識物質で標識されていることを特徴とする前記抗体である。
さらにまた、本発明はＧＰＣ３のＣ端ペプチドに対する抗体である。
さらに、ＧＰＣ３のＣ端ペプチドがＧＰＣ３の第３５９番目のアミノ酸から第５８０番目のアミノ酸からなるペプチド又は第３７５番目のアミノ酸から第５８０番目のアミノ酸からなるペプチドである前記抗体である。
さらに、本発明はモノクローナル抗体である上記抗体である。
さらに、本発明はキメラ抗体である上記抗体である。
さらに、本発明は細胞傷害抗体である上記抗体である。
さらに、本発明は上記の抗体を含む細胞破壊剤である。
さらに、本発明は細胞が癌細胞である上記細胞破壊剤である。
さらに、本発明は上記の抗体を含む抗癌剤である。
さらに、本発明は上記の抗体を細胞と接触させることを含む、細胞傷害を引き起こす方法である。
さらに、本発明は細胞が癌細胞である上記方法である。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、被検試料中の可溶化グリピカン３（ＧＰＣ３）を検出することができる可溶化ＧＰＣ３に対する抗体である。被検試料中の可溶化ＧＰＣ３をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することにより被検体が癌、特に肝臓癌に罹患しているか否かを診断することができる。
検出とは、定量的又は非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にＧＰＣ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＧＰＣ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＧＰＣ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、ＧＰＣ３タンパク質の濃度の測定、ＧＰＣ３タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
被検試料とは、ＧＰＣ３タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
本発明のＧＰＣ３のＮ端ペプチドに対する抗体を用いて診断される癌は、特に制限されず、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができるが、好ましいのは肝癌である。
また、本発明のＧＰＣ３のＣ端ペプチドに対する抗体は、高い細胞傷害活性を有するので、癌細胞の破壊、すなわち癌の治療に用いることができる。該抗体を用いて治療し得る癌は、特に制限されず、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができるが、好ましいのは肝癌である。
１．抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体または抗ＧＰＣ３のＣ端ペプチド抗体の作製
ＧＰＣ３のアミノ酸配列及び塩基配列はＬａｇｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８８（１９９７），１５１−１５６、又はＧｅｎＢａｎｋ：Ｚ３７９８７を用いることができる。
本発明で用いられる抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体および抗ＧＰＣ３のＣ端ペプチド抗体はそれぞれＧＰＣ３タンパク質のＮ端ペプチドおよびＧＰＣ３タンパク質のＣ端ペプチドに特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。
ＧＰＣ３が切断点において切断された場合、約４０ｋＤａのペプチドと約３０ｋＤａのペプチドとなり、Ｎ端側が約４０ｋＤａ、Ｃ端側が約３０ｋＤａとなる。ＧＰＣ３切断点は３５８番目のアミノ酸部位、若しくは３７４番目のアミノ酸部位、若しくはそれらの近傍領域で切断される。主な切断点は３５８番目のアミン酸部位であると考えられる。
ＧＰＣ３のＮ端ペプチドは、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質に見られる約４０ｋＤａのＧＰＣ３Ｎ端ペプチドである。上記切断点から、Ｎ端ペプチドは好ましくはアミノ酸１番目のＭｅｔからアミノ酸３７４番目のＬｙｓまでのアミノ酸配列からなるペプチドまたはアミノ酸１番目のＭｅｔからアミノ酸３５８番目のＡｒｇまでのアミノ酸配列からなるペプチドであり、さらに、主な切断点が３５８番目のアミノ酸部位と予測されることから、より好ましくはアミノ酸１番目のＭｅｔからアミノ酸３５８番目のＡｒｇまでのアミノ酸配列からなるペプチドである。また本発明においては、それらＮ端ペプチドの断片でもよい。本明細書においてＮ端ペプチドは、Ｎ端断片、Ｎ端ペプチド断片ともいう。
すなわち、本発明のＧＰＣ３のＮ端ペプチドに対する抗体は、ＧＰＣ３タンパク質のＮ端ペプチドに存在するエピトープを認識する抗体であり、その認識するエピトープの部位は限定されない。
ＧＰＣ３のＣ端ペプチドは、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質に見られる約３０ｋＤａのＧＰＣ３Ｃ端ペプチドである。上記切断点から、Ｃ端ペプチドは好ましくはアミノ酸３５９番目のＳｅｒからアミノ酸５８０番目のＨｉｓまでのアミノ酸配列からなるペプチドまたは３７５番目のＶａｌからアミノ酸番号５８０番目のＨｉｓまでのアミノ酸配列からなるペプチドであり、さらに、主な切断点が３５８番目のアミン酸部位と予測されることから、より好ましくはアミノ酸３５９番目のＳｅｒからアミノ酸５８０番目のＨｉｓまでのアミノ酸配列からなるペプチドである。また本発明においては、それらＣ端ペプチドの断片でもよい。本明細書においてＣ端ペプチドは、Ｃ端断片、Ｃ端ペプチド断片ともいう。
すなわち、本発明のＧＰＣ３のＣ端ペプチドに対する抗体は、ＧＰＣ３タンパク質のＣ端ペプチドに存在するエピトープを認識する抗体であり、その認識するエピトープの部位は限定されない。
抗体はポリクローナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であることが好ましい。
さらに、本発明で使用される抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体または抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＧＰＣ３抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＧＰＣ３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＧＰＣ３を、Ｌａｇｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８８（１９９７），１５１−１５６に開示されたＧＰＣ３（ＭＸＲ７）遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ＧＰＣ３をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＧＰＣ３タンパク質を公知の方法で精製する。
また、天然のＧＰＣ３を精製して用いることもできる。
次に、この精製ＧＰＣ３タンパク質を感作抗原として用いる。ＧＰＣ３タンパク質の全体を感作抗原として用いてもよく、この場合はＧＰＣ３タンパク質のＮ端ペプチドに対する抗体もＣ端ペプチドに対する抗体も誘起されるので、その中からＧＰＣ３タンパク質のＮ端ペプチドに対する抗体およびＣ端ペプチドに対する抗体を別々に選択すればよい。あるいは、ＧＰＣ３のＮ端側の部分ペプチドまたはＧＰＣ３のＣ端側の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＧＰＣ遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＧＰＣ３をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＧＰＣ３の部分はＧＰＣ３のＮ端ペプチドであり、この部分のエピトープを含むより小さいペプチド断片を用いることもできる。さらに、部分ペプチドとしてＧＰＣ３のＣ端ペプチドを用いればよいし、この部分のエピトープを含むより小さいペプチド断片を用いることもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては、ＧＰＣ３のＮ端ペプチドもしくはその断片またはＧＰＣ３のＣ端ペプチドもしくはその断片をスクリーニング用抗原として用いればよい。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＰＣ３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＧＰＣ３Ｎ端ペプチドまたはＧＰＣ３Ｃ端ペプチドへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＧＰＣ３を投与して抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体産生細胞または抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＧＰＣ３Ｎ端ペプチドに対するヒト抗体またはＧＰＣ３Ｃ端ペプチドに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。具体的には、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を産生するハイブリドーマまたは抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体または抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体または抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体または抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体（ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、など）を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。本発明の抗体を治療用抗体として使用する場合には、遺伝子組換え型抗体を用いることが好ましい。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、可変領域にヒト以外の哺乳動物由来抗体の配列を含み、定常領域にヒト抗体由来の配列を含むことが好ましい。
ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト化抗体などのキメラ抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＧＰＣ３Ｎ端ペプチドまたはＧＰＣ３Ｃ端ペプチドに結合する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、標識物質、トキシン、放射性物質等の各種分子と結合した抗グリピカン抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はＧＰＣ３Ｎ端ペプチドまたはＧＰＣ３Ｃ端ペプチド上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＧＰＣ３Ｎ端ペプチドまたはＧＰＣ３Ｃ端ペプチドを認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
さらに、本発明においては、細胞傷害活性を増強する目的などで、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１ａ（ＨＥＦ１ａ）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１ａプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
２．ＧＰＣ３の検出
本発明のＧＰＣ３Ｎ端側ペプチドに対する抗体を用いて、被検試料中のＧＰＣ３を検出することができる。
本発明の抗体を用いて検出するＧＰＣ３は、特に限定されず、全長ＧＰＣ３でも、その断片でもよい。ＧＰＣ３断片を検出する場合には、Ｎ端ペプチド断片を検出することが好ましい。
被検試料に含まれるＧＰＣ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、本発明の抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体とＧＰＣ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を介して支持体に結合したＧＰＣ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＧＰＣ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体とＧＰＣ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＧＰＣ３タンパク質と抗ＧＰＣ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法においては、ＧＰＣ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＧＰＣ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＧＰＣ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＧＰＣ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＧＰＣ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＧＰＣ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＧＰＣ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を介して支持体に結合したＧＰＣ３タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＧＰＣ３  Ｎ端ペプチド抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ＧＰＣ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＧＰＣ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
この際、支持体に固定される抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体と標識物質で標識される抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチドＣ抗体はＧＰＣ３分子の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましい。
抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＧＰＣ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
具体的には、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＧＰＣ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＥ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体及びアビジンを用いる方法を挙げることができる。
具体的には、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＧＰＣ３タンパ々質を検出する。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法の他の態様として、ＧＰＣ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体、及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ＧＰＣ３  Ｎ端ペプチド抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＧＰＣ３タンパク質を、一次抗ＧＰＣ３抗体及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、一次抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、洗浄して、プレートに残った二次抗体を検出する。二次抗体の検出は前述の方法により行うことができる。
本発明のＧＰＣ３タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を感作した担体を用いてＧＰＣ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料を混合し、一定時間攪拌した後に、試料中にＧＰＣ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＧＰＣ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
本発明のＧＰＣ３タンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることによりＧＰＣ３タンパク質と抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体に結合するＧＰＣ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
本発明は、癌の診断のための被検試料中のＧＰＣ３タンパク質を検出するための診断薬またはキットの提供をも目的とするが、該診断薬またはキットは少なくとも抗ＧＰＣ３Ｎ端ペプチド抗体を含む。該診断薬またはキットがＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬またはキットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
３．抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を用いた癌細胞の破壊および癌の治療
（１）  抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、ＧＰＣ３Ｃ端ペプチドをコーティングしたプレートに、抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を含む試料、例えば、抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
本発明で使用される抗体の活性を確認するには、抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体の中和活性を測定する。
（２）  細胞傷害活性
治療目的の場合、本発明に使用する抗体は、細胞傷害活性として、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を有することが好ましい。
ＡＤＣＣ活性は、エフェクター細胞と標的細胞と抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を混合し、ＡＤＣＣの程度を調べることにより測定することができる。エフェクター細胞として例えば、マウス脾細胞やヒト末梢血や骨髄から分離した単核球等を利用することができ、標的細胞としてはヒト肝細胞株ＨｕＨ−７等のヒト株化細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ５１Ｃｒにより標識し、これに抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を加えインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベーションを行う。インキュベーション後上清を採取し、上清中の放射活性をカウントすることによりＡＤＣＣ活性を測定することができる。
また、ＣＤＣ活性は、上述の標識標的細胞と抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を混合し、その後補体を添加してインキュベーションを行い、培養後に上清中の放射活性をカウントすることにより測定することができる。
抗体が細胞傷害活性を発揮するには、Ｆｃ部分が必要であるので、本発明の細胞増殖阻害剤が、抗体の細胞傷害活性を利用したものである場合には、本発明に使用する抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体はＦｃ部分を含んでいることが好ましい。
（３）  細胞の破壊
本発明の抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を細胞破壊、特に癌細胞の破壊に用いることもできる。さらに本発明の抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を抗癌剤として用いることもできる。本発明の抗体により治療・予防させる癌は特に限定されず、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫などに用いることができるが、肝癌が好ましい。
（４）  投与方法および製剤
本発明の細胞破壊剤または抗癌剤は、細胞の異常増殖に基づく疾患、特に癌に対する治療又は改善を目的として使用される。
有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
また、本発明の治療剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。
本発明の抗本発明の抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗本発明の抗ＧＰＣ３Ｃ端ペプチド抗体を抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐを用いたＧＰＣ３ｍＲＮＡの発現解析の結果を示す図であり、図１ＡはＧＰＣ３の発現を、図１Ｂはアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現を示す。横軸のＮＬ、ＣＨ、ＬＣ、ＷＤ、ＭＤおよびＰＤはそれぞれ正常肝臓、肝炎症部位、肝硬変部位、高分化癌、中分化癌および低分化癌を示す。
図２は、精製ヘパラン硫酸付加型のＧＰＣ３及びＧＰＣ３コアタンパク質のＣＢＢ染色像を示す図である。
図３は、ヒト肝臓癌におけるＧＰＣ３遺伝子の発現を示す図である。
図４は、抗ＧＰＣ３抗体を用いて行った可溶型コアタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
図５は、抗ＧＰＣ３抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの原理を示す図である。
図６は、Ｍ６Ｂ１およびＭ１８Ｄ４を用いたＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡのスタンダードカーブを示す図である。
図７は、ＧＰＣ３の構造を示す模式図である。
図８は、ＥＬＩＳＡにおける抗ＧＰＣ３抗体の組み合わせを示す図である。
図９は、様々な組み合わせの抗ＧＰＣ３抗体を用いたＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡ系のスタンダードカーブを示す図である。
図１０は、抗ＧＰＣ３Ｃ末端ペプチド抗体のＡＤＣＣ活性測定の結果を示す図である。
図１１は、抗ＧＰＣ３Ｃ末端ペプチド抗体のＣＤＣ活性測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本願明細書記載の実施例において、以下の材料を用いた。
可溶型ＧＰＣ３、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質の発現ベクターとして、ｐＣＡＧＧＳにＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだｐＣＸＮＤ２、ｐＣＸＮＤ３を用いた。
ＤＸＢ１１はＡＴＣＣより購入した細胞を用い、培養には５％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １００９９−１４１，ＬＯＴ＃  Ａ０２７５２４２）／Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ（＋））（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １２５７１−０７１）／１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １５１４０−１２２）を用いた。ＤＸＢ１１を用いた発現株の選抜には、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １０１３１−０２７）／５％ＦＢＳ／αＭＥＭ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １２５６１−０５６）（αＭＥＭ（−））／ＰＳあるいは同培地に終濃度２５ｎＭとなるようにＭＴＸを加えたものを用いた。
ＨｅｐＧ２はＡＴＣＣより購入した細胞を用い、１０％ＦＢＳ／ダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １１９９５−０６５）／ＰＳで培養を行った。
ハイブリドーマは１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０／１  ｘ  ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃  Ｈ−０２６２）／０．５  ｘ  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  ＣＡＴ＃  １０８８９４７）で培養した。
実施例１  ヒトＧＰＣ３（ＧＰＣ３）ｃＤＮＡのクローニングおよび発現解析
ヒトグリピカン３（以下ＧＰＣ３）をコードする全長ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＧＰＣ３をコードする全長ｃＤＮＡは、大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２より常法により調製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とし、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社  Ｃａｔ．Ｎｏ．８４３０−１）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。すなわち、２μｌのＣａｃｏ２由来ｃＤＮＡ、１μｌのセンスプライマー（配列番号１）、１μｌのアンチセンスプライマー（配列番号２）、５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ２  １０ｘＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（１．２５ｍＭ）、１．０μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを含む５０μｌの反応液を、９４℃で１分、６３℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回行った。ＰＣＲ反応による増幅産物は（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）を用いてＴＡベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに挿入した）ＡＢＩ３１００  ＤＮＡシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトＧＰＣ３の全長をコードするｃＤＮＡを単離した。配列番号３で表される配列はヒトＧＰＣ３遺伝子の塩基配列を、配列番号４で表される配列はヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
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ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いたヒトＧＰＣ３  ｍＲＮＡ発現解析
２４例の肝臓癌腫瘍部（高分化癌：ＷＤ、中分化癌：ＭＤ、低分化癌：ＰＤ）、１６例の肝臓癌非癌部（肝炎部位：ＣＨ、肝硬変部位：ＬＣ）、８例の正常肝臓：ＮＬ（インフォームドコンセント取得済み、東京大学医学部及び埼玉癌センターにおいて入手）におけるｍＲＮＡ発現解析をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＵＧ−９５Ａ  Ｔａｒｇｅｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）を用いて行った。すなわち、上記各組織よりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いてトータルＲＮＡを調製した後、それぞれ１５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用し、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。
その結果、図１に示すようにヒトＧＰＣ３遺伝子（Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  ＩＤ：３９３５０＿ａｔ）は肝癌の分化の程度に関わらず多くの症例においてｍＲＮＡの発現量が正常肝組織に比べ明らかに高いことが確認された。さらに、現在最もよく肝癌の診断マーカーとして使用されているアルファフェトプロテイン（Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  ＩＤ：４０１１４＿ａｔ）のｍＲＮＡ発現と比較した結果、アルファフェトプロテインのｍＲＮＡ発現がほとんどみられない高分化癌においてもＧＰＣ３は十分なｍＲＮＡの発現の亢進が認められ、かつｍＲＮＡ発現亢進している割合がＧＰＣ３において高いことが明らかとなった。以上のことより、ＧＰＣ３の検出は肝癌の早期診断法として有用と考えられる。
実施例２  抗ＧＰＣ３抗体の作製
可溶型ヒトＧＰＣ３の作製
抗ＧＰＣ３抗体作製のための材料として、Ｃ末端側の疎水性領域を欠損させた可溶型ＧＰＣ３タンパク質を作製した。
東大先端研より供与された完全長ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを用い、可溶型ＧＰＣ３  ｃＤＮＡ発現プラスミドＤＮＡを構築した。Ｃ末端側の疎水領域（５６４−５８０アミノ酸）を除くように設計した下流プライマー（５’−ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  Ｃ−３’（配列番号５））とＥｃｏＲＩ認識配列、Ｋｏｚａｋ配列を加えた上流プライマー（５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  Ｃ−３’（配列番号６）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片（１７１１ｂｐ）をｐＣＸＮＤ２−Ｆｌａｇにクローニングした。作製された発現プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０７０９一０１）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーにより溶出した。次に、Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃Ａ−２２２０）を用いてアフィニティー精製を行った。溶出は２００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドにより行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃４３０４）による濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−１０８８−０１）によるゲルろ過を行いＦＬＡＧペプチドを除去した。最後にＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを用いて濃縮し、同時にＴｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳ（５００ｍＭのＮａＣｌを含む）で溶出を行うことによりバッファー置換を行った。
可溶型ヒトＧＰＣ３コアタンパク質の作製
上記野生型ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡをテンプレートとし、アッセンブリーＰＣＲ法によって４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させたｃＤＮＡを作製した。この際、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されるようにプライマーを設計し、得られたｃＤＮＡをｐＣＸＮＤ３ベクターにクローニングした。作製された発現プラスミドＤＮＡをＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０５１０−０１）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファーにより溶出した。次に、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０５７５−０１）を用いてアフィニティー精製を行った。１０〜１５０ｍＭのイミダゾールでグラジエント溶出を行った。最後にＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて濃縮し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファーにより溶出した。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、５０〜３００ｋＤａのスメアなバンドと、約４０ｋＤａのバンドが得られた。図２に電気泳動の結果を示す。ＧＰＣ３は６９ｋＤａのＣ末端にヘパラン硫酸付加配列を有するプロテオグリカンである。スメアなバンドはヘパラン硫酸修飾を受けたＧＰＣ３であると考えられた。約４０ｋＤａのバンドはアミノ酸シークエンスの結果、ＧＰＣ３のＮ末端側断片を起点としており、ＧＰＣ３は何らかの切断を受けていることが予想された。
以下のハイブリドーマのスクリーニングにおいてヘパラン硫酸に対する抗体を排除するため、ヘパラン硫酸付加シグナル配列である４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させた可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を作製した。同様にＣＨＯ高発現株を構築し、培養上清よりＨｉｓタグを利用したアフィニティー精製を行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、７０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａの３つのバンドが得られた。アミノ酸シークエンスの結果、３０ｋＤａのバンドはＧＰＣ３のＣ末端側断片であることが判明した。Ｃ末端断片は、３５９番目のセリン、もしくは３７５番目のバリンより開始しており、何らかの酵素的な切断を受けている事が予想された。ヘパラン硫酸付加型ＧＰＣ３でこの３０ｋＤａのバンドが見られなかったのは、ヘパラン硫酸が付加しているためスメアなバンドになっていたためと思われる。ＧＰＣ３が特定のアミノ酸配列で酵素的な切断を受けることは新しい知見であり、生物学的意義に関しては明らかにされていない。
本発明者らは、この結果より肝癌患者においても膜上のＧＰＣ３が切断を受け、可溶型としてＧＰＣ３が血中に分泌されるという仮説を立てた。ＧＰＣ３は肝癌腫瘍マーカーであるＡＦＰと比較してより早期肝癌患者で遺伝子の発現が高値であることを見出した（図１）ので、ＡＦＰより臨床的有用性の高い新しい腫瘍マーカーとしての可能性について検討するため、実施例２以降に記載のように、抗ＧＰＣ３抗体を作製し、サンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。
抗ＧＰＣ３抗体の作製
ヒトＧＰＣ３とマウスＧＰＣ３のホモロジーはアミノ酸レベルで９４％の高い相同性を示すため、通常のマウスに免疫しても抗ＧＰＣ３抗体を得難い可能性を考え、自己免疫疾患マウスであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスを免疫動物として用いた。ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ＣＲＬ）５匹に可溶型ＧＰＣ３を免疫した。初回免疫には免疫タンパク質を１００μｇ／匹となるように調製し、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２３１１３１））を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／匹となるように調製したものをＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２６３９１０））でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計５回行った。最終免疫については５０μｇ／匹となるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。ＧＰＣ３コアタンパク質をコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＧＰＣ３に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞を混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック、ｃａｔ＃７８３  ６４１）により細胞融合を行った。９６穴培養プレートに播種し、翌日よりＨＡＴ培地で選択後培養上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、拡大培養を行い培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、ＧＰＣ３コアタンパク質との結合活性を指標に行い、強い結合能を有する抗ＧＰＣ３抗体を６クローン得た。
抗体の精製はＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃１７−０４０４−０１）を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出は中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに行い直ちに中和した。抗体画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。
抗ＧＰＣ３抗体の解析
抗体濃度はヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃  ６２−６６００）とアルカリフォスファハターゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃  ６２−６６２２）を用いたマウスＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、市販の精製マウスＩｇＧ１抗体（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃０２−６１００）をスタンダードとして定量した。
抗ＧＰＣ３抗体のアイソタイピングは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃  ３７５０２）を用い、方法は添付のマニュアルに従った。アイソタイピングの結果全てＩｇＧ１タイプであった。
ＧＰＣ３コアタンパク質を用いたウエスタンブロッティングにより抗ＧＰＣ３抗体のエピトープ分類を行った。１００ｎｇ／レーンとなるように可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（ＴＥＦＣＯ  ＣＡＴ＃０１−０７５）にチャージし、電気泳動（６０Ｖ  ３０ｍｉｎ，１２０Ｖ  ９０ｍｉｎ）後、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてイモビロン−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃ＩＰＶＨ  Ｒ８５  １０）へトランスファーした（１５Ｖ  ６０ｍｉｎ）。ｍｅｍｂｒａｎｅをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ＴＢＳ）で軽く洗った後、５％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで１時間（室温）あるいは一晩（４℃）振とうした。ＴＢＳ−Ｔで約１０分間振とうした後、１％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで０．１〜１０μｇ／ｍＬに希釈した各抗ＧＰＣ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗い（１０分間ｘ３回）、１％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで１．１０００に希釈したＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃ＮＡ９３１）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った（１０分ｘ３回）。発色はＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ２１３２）を用いて行い、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  ＲＰＮ２１０３Ｋ）を用いて現像した。図４にウエスタンブロット解析の結果を示す。４０ｋＤａのバンドに反応する抗体はＮ末端にエピトープを有し、３０ｋＤａのバンドに反応する抗体はＣ末端にエピトープを有すると判断し分類した。Ｎ末端側を認識する抗体としてＭ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ１９Ｂ１１、Ｃ末端側を認識する抗体としてＭ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ３Ｂ８を得た。ＢＩＡＣＯＲＥを用いた解析の結果、各抗体のＫＤ値は０．２〜１７．６ｎＭであった。
実施例３  可溶性ＧＰＣ３の検出
マウス異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデル
６週令雌性のＳＣＩＤマウス（Ｆｏｘ  ＣＨＡＳＥ  Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ  Ｊｃｌ、日本クレア株式会社）およびヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ、日本クレア株式会社）の腹部皮下へヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を３００万個移植した。腫瘤が充分に形成された５３日後にＨｅｐＧ２移植ＳＣＩＤマウス＃１，３，４の後大静脈より全採血し、ＥＤＴＡ−２Ｎａとアプロチニン存在下（ニプロネオチューブ真空採血管、ＮＩＰＲＯ、ＮＴ−ＥＡ０２０５）で血漿を調製し、測定日まで−２０℃で保管した。なお、ＨｅｐＧ２移植ＳＣＩＤマウス＃２はＨｅｐＧ２移植６２日後に、ＨｅｐＧ２移植ヌードマウス＃１，２は移植６６日後に後大静脈より全採血した。対照として、同週令の正常ＳＣＩＤマウスから同様の操作で血漿を調製した。
サンドイッチＥＬＩＳＡ
血中の可溶型ＧＰＣ３を検出するため、ＧＰＣ３のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。９６ウェルプレートにコートする抗体にはＭ６Ｂ１を、Ｍ６Ｂ１に結合したＧＰＣ３を検出する抗体としてビオチンで標識したＭ１８Ｄ４を用いた。発色には高い検出感度を達成するためＤＡＫＯ社のＡＭＰＡＫを用いた。
９６ウェルイムノプレートに１０μｇ／ｍＬとなるように抗ＧＰＣ３抗体をコーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６），０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で希釈したものをコートし、４℃で一晩インキュベートした。翌日３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、２００μＬの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）を加えブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、マウス血漿、あるいは培養上清を希釈バッファーで適当に希釈したものを加え１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ウェルのＲＢで３回洗浄後、希釈バッファーで１０μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン標識した抗ＧＰＣ３抗体を加え１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ウェルのＲＢで３回洗浄後、希釈バッファーで１／１０００に希釈したＡＰ−ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ）を加え、１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファーで５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＡＭＰＡＫ（ＤＡＫＯ  ＣＡＴ＃Ｋ６２００）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
抗体のビオチン化にはＲｏｃｈｅ社のＢｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＣＡＴ＃  １４１８  １６５）を用いた。また、サンプル中の可溶型ＧＰＣ３濃度の換算には、表計算ソフトＧｌａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（ＧｌａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．ｖｅｒ．３．０）を用いて解析した。図５に本実施例のサンドイッチＥＬＩＳＡの原理を示す。
精製可溶型ＧＰＣ３を用いてスタンダードカーブを作製した結果、検出限界が数ｎｇ／ｍＬの系を構築することができた。図６にＭ６Ｂ１およびＭ１８Ｄ４を用いたＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡのスタンダードカーブを示した。この系を用い、前述のＨｅｐＧ２の培養上清、及びヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を移植したマウス血清中の分泌型ＧＰＣ３の検出を試みた。コントロールの培地、及びコントロールマウス血清では可溶型ＧＰＣ３は検出限界以下であったのに対し、ＨｅｐＧ２の培養上清、及びヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を移植したマウス血清中に可溶型ＧＰＣ３が検出された。精製可溶型ＧＰＣ３の濃度に換算すると、ＨｅｐＧ２培養上清では１．２μｇ／ｍＬ、マウス血清でも２３〜９０ｎｇ／ｍＬであった（表１）。
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分泌型ＧＰＣ３の構造
先に立てた仮説通り、血中可溶化ＧＰＣ３がＮ末端断片の構造をとっているかについて検討を行った。分泌型ＧＰＣ３がＮ末端断片であった場合、Ｎ末端認識抗体とＣ末端認識抗体の組み合わせのサンドイッチＥＬＩＳＡでは検出できないと考えられる。Ｎ末端断片を認識する抗体及びＣ末端側断片を認識する抗体それぞれ３種ずつを用いて、様々な組み合わせのサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。図７に分泌可溶化型ＧＰＣ３の構造を、図８に抗体の組み合わせを示す。図９にこのサンドイッチＥＬＩＳＡのスタンダードカーブを示す。表１に測定結果を示すが、表１に示すようにＨｅｐＧ２の培養上清、及びヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を移植したマウス血清中の分泌型ＧＰＣ３の検出はＮ末端側断片認識抗体同士の組み合わせでは高い値を示し、Ｃ末端断片認識抗体を含む系では多くのマウスで検出限界以下であった。このことから、今回明らかになった分泌型ＧＰＣ３はＮ末端断片が優位であることが予想された。すなわち、ＧＰＣ３のアミノ酸第１番目から第３７４番目のアミノ酸配列に対する抗体を用いる事により、血中可溶化ＧＰＣ３の検出が高感度に行われる可能性が考えられた。
実施例４  抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の作製
ヒトＧＰＣ３に結合する抗体（ヒトＧＰＣ３−Ｃ末端認識抗体：Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１Ｅ０７、ヒトＧＰＣ３−Ｎ末端認識抗体：Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ１８Ｄ０４、Ｍ５Ｂ０９、Ｍ１０Ｄ０２）を産生するハイブリドーマより抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１×１０７細胞のハイブリドーマより抽出した。１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、マウスＩｇＧ１定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１（配列番号：７）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドｋａｐｐａ（配列番号：８）を用い、５’末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応した。ＰＣＲ溶液５０μｌは、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（以上、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、２．５μＬの逆転写反応産物、１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１またはｋａｐｐａを含有し、９４℃の初期温度にて３０秒間そして９４℃にて５秒間、７２℃にて３分間のサイクルを５回反復し、９４℃にて５秒間、７０℃にて１０秒間、７２℃にて３分間のサイクルを５回反復し、さらに９４℃にて５秒間、６８℃にて１０秒間、７２℃にて３分間のサイクルを２５回反復した。最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。各ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングし、塩基配列を決定した。
次に各抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域配列をヒトＨ鎖およびヒトＬ鎖定常領域配列に連結した。各抗体のＨ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＮｈｅＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトＩｇＧ１定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社製）に挿入されているｐＢ−ＣＨベクターにクローニングした。ＮｈｅＩ部位により、マウスＨ鎖可変領域とヒトＨ鎖（γ１鎖）定常領域が連結している。作製されたＨ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングした。本ベクターｐＣＸＮＤ３の構築の流れについて、以下に述べる。ＤＨＦＲ−ΔＥ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）の抗体Ｈ鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）をクローニングした。このベクターをｐＣＨＯＩと命名した。ｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位をｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９；１０８：１９３−２００）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしたベクターをｐＣＸＮＤ３と命名した。本プラスミドに含まれる抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体（Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１Ｅ０７、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ１８Ｄ０４）のＨ鎖の塩基配列をそれぞれ配列番号：９、１１、１３、１５にアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１０、１２、１４、１６に示す。また、各抗体のＬ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＢｓｉＷＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトｋａｐｐａ鎖定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社製）に挿入されているｐＢ−ＣＬベクターにクローニングした。ＢｓｉＷＩ部位により、ヒトＬ鎖可変領域と定常領域が連結している。作製されたＬ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＵＣＡＧクローニングした。本ベクターｐＵＣＡＧは、ｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−２００）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られる２．６ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９ベクター（東洋紡社製）の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に連結し、クローニングしたベクターである。本プラスミドに含まれる抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体（Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１Ｅ０７、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ１８Ｄ０４）のＬ鎖の塩基配列をそれぞれ配列番号：１７、１９、２１、２３にアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１８、２０、２２、２４に示す。
抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、Ｌ鎖遺伝子断片が挿入されたｐＵＣＡＧベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる遺伝子断片をＨ鎖遺伝子が挿入されたｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体遺伝子を発現する。
ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。２５μｇの各抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体発現ベクターとＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに懸濁した。同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して２週間培養した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＧ量について以下に示す濃度定量法で測定した。高産生細胞株を順次拡大培養し、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体安定発現細胞株を取得し、大量培養を行い、培養上清を得た。
培養上清中のＩｇＧ濃度の測定は、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ＢＩＯＳＯＲＣＥ社製）とＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＩＯＳＯＲＣＥ社製）を用いたヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、市販の精製ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製）との比較により定量した。
各抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の精製は、Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて行った。抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体産生ＣＨＯ細胞株の培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに溶出し、直ちに中和した。抗体画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行い、バッファーを置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。
実施例５  抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の作製
全長ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡがクローニングされたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られるヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＯＳ２にクローニングした。本ベクターｐＣＯＳ２の構築の流れについて、以下に述べる。ＤＨＦＲ−ΔＥ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）の抗体Ｈ鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）をクローニングした。このベクターをｐＣＨＯＩと命名した。さらに、ｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を除去し、ＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１（Ｓａｔｏ  Ｋら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３１：３７１−３８１）のＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現部位を挿入した。このベクターをｐＣＯＳ２と命名した
全長ヒトＧＰＣ３安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。１０μｇの全長ヒトＧＰＣ３遺伝子発現ベクターと６０μＬのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を混合し、複合体を形成させた後に、ＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株に添加することにより、遺伝子導入を行った。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むαＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、選抜を開始した。得られたＧｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性コロニーを集め、限界希釈法により細胞のクローニングを行った。それぞれの細胞クローンを可溶化し、抗ＧＰＣ３抗体を用いたウエスタンブロットにより全長ヒトＧＰＣ３の発現を確認し、安定発現細胞株を取得した。
実施例６  ヒト末梢血由来ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性の測定
（１）ヒトＰＢＭＣ溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）に重層した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。３回洗浄後、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ヒトＰＢＭＣ溶液とした。
（２）標的細胞の調製
１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＨｅｐＧ２細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いてディッシュから剥離し、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、２日間培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃１時間培養し、この細胞を培地で１回洗浄し、５０μＬの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を加え標的細胞とした。
（３）クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液５０μＬを添加し、氷上で１５分反応させた後に、ヒトＰＢＭＣ溶液１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル）を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃４時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞に２％ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞に１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて行い、ＡＤＣＣ活性（％）について平均値及び標準誤差を算出した。
その結果を第１０図に示した。６種類の抗ＧＰＣ３キメラ抗体のうち、Ｃ末端認識抗体であるｃｈ．Ｍ３Ｃ１１とｃｈ．Ｍ１Ｅ０７がＡＤＣＣ活性を示したのに対して、Ｎ末端認識抗体であるｃｈ．Ｍ１９Ｂ１１，ｃｈ．Ｍ１８Ｄ０４，ｃｈ．Ｍ５Ｅ０９，ｃｈ．Ｍ１０Ｄ０２はほとんどＡＤＣＣ活性を示さなかった。以上の結果はキメラ抗体のＡＤＣＣ活性は抗体の認識部位によって異なることを示しており、さらに、切断点よりＣ末端側を認識する抗体がＡＤＣＣ活性を示したことから、ＧＰＣ３のＣ末端認識抗体は臨床応用上有用であることが予想された。
実施例７  補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）の測定
（１）Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｖｅｒｏｎａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＡＶＢ）の作製
ＮａＣｌ（特級、和光純薬工業株式会社）１２．７５ｇ、Ｎａ−ｂａｒｂｌｔａｌ（特級、和光純薬工業株式会社）０．５６２５ｇ、ｂａｒｂｉｔａｌ（特級、和光純薬工業株式会社）０．８６２５ｇをミリＱ水に溶解し２００ｍＬとした後、オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ処理した１００ｍＬの温ミリＱ水を加え、ｐＨ７．４３を確認した（推奨ｐＨ７．５）。これを５×Ｖｅｒｏｎａｌ  Ｂｕｆｆｅｒとした。ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（特級、純正化学株式会社）０．２２０５ｇを５０ｍＬミリＱ水に溶解し０．０３ｍｏｌ／Ｌとし、ＣａＣｌ２溶液とした。ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（特級、純正化学株式会社）１．０１６５ｇを５０ｍＬミリＱ水に溶解し０．１ｍｏｌ／Ｌとし、ＭｇＣｌ２溶液とした。５×Ｖｅｒｏｎａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００ｍＬ、ヒト血清アルブミン（ブミネート登録商標２５％、ヒト血清アルブミン濃度２５０ｍｇ／ｍＬ、バクスター株式会社）４ｍＬ、ＣａＣｌ２溶液２．５ｍＬ、ＭｇＣｌ２溶液２．５ｍＬ、ＫＣｌ（特級、純正化学株式会社）０．１ｇ、ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ（＋）−グルコース、ブドウ糖無水、特級、和光純薬工業株式会社）０．５ｇをミリＱ水に溶解し５００ｍＬとした。これをＨＡＶＢとした。ろ過滅菌後、設定温度５℃にて保存した。
（２）標的細胞の調製
実施例４で作製されたＧＰＣ３を細胞膜上に発現させたＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳと０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を添加した〈−ＭＥＭ核酸（＋）培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し、細胞剥離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いてディッシュから剥離して、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、３日間培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃１時間培養し、この細胞をＨＡＶＢで２回洗浄し、５０μＬのＨＡＶＢを加え標的細胞とした。
（３）クロム遊離試験（ＣＤＣ活性）
各キメラ抗体をＨＡＶＢで希釈して４０μｇ／ｍＬの抗体溶液とした。標的細胞に抗体溶液を５０μＬずつ添加し、氷上にて１５分間静置した。続いて、各ウェルにＨＡＶＢにて希釈した幼若ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を終濃度３０％になるよう１００μＬずつ添加し（抗体の終濃度１０μｇ／ｍＬ）、５％炭酸ガスインキュベーター中に３７℃で９０分間静置した。プレートを遠心分離後、各ウェルより上清を１００μＬずつ回収し、ガンマカウンターにて放射活性を測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、ＨＡＶＢを５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞にＨＡＶＢを１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて行い、ＣＤＣ活性（％）について平均値及び標準誤差を算出した。
その結果を第１１図に示した。６種類の抗ＧＰＣ３キメラ抗体のうち、Ｃ末端認識抗体であるｃｈ．Ｍ３Ｃ１１とｃｈ．Ｍ１Ｅ０７がＣＤＣ活性を示したのに対して、Ｎ末端認識抗体であるｃｈ．Ｍ１９Ｂ１１，ｃｈ．Ｍ１８Ｄ０４，ｃｈ．Ｍ５Ｅ０９，ｃｈ．Ｍ１０Ｄ０２はいずれも低いＣＤＣ活生しか示さなかった。以上の結果はキメラ抗体のＣＤＣ活性は抗体の認識部位によって異なることを示しており、さらに、切断点よりＣ末端側を認識する抗体がＣＤＣ活性を示したことから、ＧＰＣ３のＣ末端認識抗体は臨床応用上有用であることが予想された。
【産業上の利用可能性】  実施例に示したように、肝癌細胞で高発現しているＧＰＣ３は一部分泌型として血液中に存在する可能性が示された。ＧＰＣ３は肝癌マーカーであるＡＦＰよりも早期の癌で遺伝子発現が認められるので、ＧＰＣ３の検出は癌の診断として有用であると考えられる。ＧＰＣ３は肝癌細胞株以外に、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫などの癌細胞株においても発現が確認されているので、肝癌以外の診断にも適用できる可能性がある。
また、血中可溶化ＧＰＣ３は、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質で認められた約４０ｋＤａのＮ末端断片が優位である可能性が示された。このことから診断用抗体としてはＮ末端断片認識抗体が有用と考えられる。また、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有する肝癌治療用抗体としてはＣ末端断片認識抗体を用いれば、血中の分泌型ＧＰＣ３にトラップされること無く効率的に肝癌細胞に到達することが可能であり、癌細胞破壊剤、抗癌剤として有用である。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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