(57)【要約】ヒトプロテインＣ活性化能力が高く、抗凝固作用を示すヒトメゾトロンビン類似体、および該ヒトメゾトロンビン誘導体を生じ得るヒトプロトロンビン誘導体。ヒトプロ（又はメゾ）トロンビンの配列における１５５、２７１、２８４位のＡｒｇ及び４６６〜４７３位のアミノ酸の全部又は一部に変更が加えられているペプチドからなるヒトプロトロンビン又はヒトメゾトロンビンの類似体。ヒトメゾトロンビンの場合は、ペプチドが２本鎖よりなり、凝固促進活性を実質的に有さず、プロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べて高く、ヒトトロンビンに実質的に変換されない性質を示す。ヒトプロトロンビン類似体の場合は、ペプチドが１本鎖であって、３２０位のＡｒｇが切断されて活性化された場合、上記性質を示し、ヒトメゾトロンビン類似体を生ずることができる。抗凝固剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトメゾトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸に変更が加えられており、且つヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において変更が加えられている２本鎖のペプチドからなるヒトメゾトロンビン類似体であって、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べ高い性質であり、さらにトロンビンに実質的に変換されないことを特徴とするヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項２】
ヒトメゾトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸の変更が、Ａｌａへの置換であることを特徴とする請求項１に記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項３】
ヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の全部または一部の変更であることを特徴とする請求項１または２に記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項４】
ヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の全部または一部の変更であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項５】
ヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の全部または一部の欠失であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項６】
ヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の全部または一部の欠失であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項７】
ヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１から３または５のいずれかに記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項８】
ヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項９】
ヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｒｐ４６８を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のヒトメゾトロンビン類似体。
【請求項１０】
ヒトプロトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸に変更が加えられており、且つヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において変更が加えられている１本鎖のペプチドからなるヒトプロトロンビン類似体であって、Ａｒｇ３２０が切断されて活性化された場合に、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べ高い性質であり、さらにトロンビンに実質的に変換されないことを特徴とするヒトメゾトロンビン類似体を生じ得るヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１１】
ヒトプロトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸の変更が、Ａｌａへの置換であることを特徴とする請求項１０に記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１２】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の全部または一部の変更であることを特徴とする請求項１０または１１に記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１３】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の全部または一部の変更であることを特徴とする請求項１０から１２のいずれかに記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１４】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の全部または一部の欠失であることを特徴とする請求項１０から１２のいずれかに記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１５】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の全部または一部の欠失であることを特徴とする請求項１０から１４のいずれかに記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１６】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１０から１２または１４のいずれかに記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１７】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１０から１５のいずれかに記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１８】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｒｐ４６８を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１０から１５のいずれかに記載のヒトプロトロンビン類似体。
【請求項１９】
ヒトプロトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸に変更が加えられており、且つヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において変更が加えられている１本鎖のペプチドからなるヒトプロトロンビン類似体であって、Ａｒｇ３２０が切断されて活性化された場合に、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べ高い性質であり、さらにトロンビンに実質的に変換されないことを特徴とするヒトメゾトロンビン類似体を生じ得るヒトプロトロンビン類似体をコードするＤＮＡ。
【請求項２０】
ヒトプロトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸の変更が、Ａｌａへの置換であることを特徴とする請求項１９に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の全部または一部の変更であることを特徴とする請求項１９または２０に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の全部または一部の変更であることを特徴とする請求項１９から２１のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の全部または一部の欠失であることを特徴とする請求項１９から２１のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の全部または一部の欠失であることを特徴とする請求項１９から２３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２５】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１９から２１または２３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２６】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１９から２４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２７】
ヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部の変更が、Ｇｌｕ４６６−Ｔｒｐ４６８を形成するアミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１９から２４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２８】
請求項１９から２７のいずれかに記載のＤＮＡを含有するプラスミド。
【請求項２９】
請求項１９から２７のいずれかに記載のＤＮＡを含有し、ヒトメゾトロンビン類自体を生産する細胞。
【請求項３０】
請求項１〜９のいずれかに記載のヒトメゾトロンビン類似体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１０〜１８のいずれかに記載のヒトプロトロンビン類似体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項３２】
医薬組成物が抗血液凝固剤である請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトメゾトロンビン類似体、ヒトプロトロンビン類似体、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含有するプラスミド、および該プラスミドを含有する宿主細胞に関する。さらに本発明は、そのような類似体を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】  トロンビンは、血栓形成において最も重要な役割を果たしている凝固促進因子である（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＣＭ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ＆  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＡＬ  Ｂｌｏｏｍら編、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）。トロンビンの最も特徴的な作用は、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し血液を凝固させる作用である。また、血液凝固ＸＩＩＩ因子を活性化してフィブリンを架橋させる作用、血液凝固第Ｖ因子や第ＶＩＩＩ因子を活性化する作用、血小板を活性化し凝集させる作用も併せ持つ（松田道生、鈴木宏治編集、７  第２因子（プロトロンビン）、止血・血栓・線溶  中外医学社）。またトロンビンは、トロンボモジュリンと結合し、プロテインＣを活性化することにより抗凝固因子としても働いている（Ｓａｄｌｅｒ  ＪＥ、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７８  ３９２−３９５）。さらに、その結果生じる活性化プロテインＣは強い抗凝固活性を示し、活性化プロテインＣ自身が有用な医薬品として臨床的に用いられている（Ｋａｎｊｉ  Ｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２１、１３８９−１４０２）。
ところで、プロトロンビンは、メゾトロンビンを経由してトロンビンへ変換されるが、メゾトロンビン自体も、トロンビンと同様に凝固促進活性を含む酵素活性を有している（Ｗａｌｋｅｒ  ＲＫら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９、２７４４１−２７４５０）。ヒトプロトロンビンは６２２アミノ酸の前駆体として生産され（例えば、配列表配列番号２が例示される）、Ｎ末端から４３個のアミノ酸がプロセッシングを受けて５７９アミノ酸の成熟体となり（例えば、配列表配列番号１が例示される）、血中に通常１００〜１５０ｍｇ／Ｌ程度存在する（松田道生、鈴木宏治編集、７  第２因子（プロトロンビン）、止血・血栓・線溶  中外医学社  １９９４年）。プロトロンビンは、プロトロンビナーゼ複合体（血液凝固活性化第Ｘ因子、血液凝固活性化第Ｖ因子、リン脂質およびＣａ２＋からなる複合体の通称）や蛇毒などの酵素により、Ａｒｇ３２０が切断され、３２０アミノ酸のＡ鎖と２５９アミノ酸のＢ鎖がＳ−Ｓ結合で架橋されている２本鎖からなるメゾトロンビンに変換され、さらに、プロトロンビナーゼ複合体、トロンビンやメゾトロンビンそれ自身などにより、メゾトロンビンのＡ鎖のＡｒｇ２８４が切断され（その他にもＡ鎖のＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１が切断される）トロンビンを生成する。
プロトロンビンは、ビタミンＫ依存性蛋白であり、通常１０個（Ｇｌａ６、Ｇｌａ７、Ｇｌａ１４、Ｇｌａ１６、Ｇｌａ１９、Ｇｌａ２０、Ｇｌａ２５、Ｇｌａ２６、Ｇｌａ２９、Ｇｌａ３２：アミノ酸位置番号は、プロトロンビンの成熟体での番号として示した）のＧｌａ（ガンマカルボキシグルタミン酸）残基を有している（配列表においてはＧｌｕとして表示されている）。上述のプロトロンビン中のＧｌａは、Ｃａ２＋を介してプロトロンビナーゼ複合体中のリン脂質と結合し、その結果、プロトロンビンがプロトロンビナーゼ複合体により切断されメゾトロンビンを経由してトロンビンへ変換されるのを促進する（同上）。このように切断されて生成されるトロンビンは、通常３６アミノ酸のＡ鎖と２５９アミノ酸のＢ鎖とがＳ−Ｓ結合で架橋されている２本鎖からなっている（Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｂら、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｂｅｒｌｉｎｅｒ  ＬＪ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２年）。
メゾトロンビンは、トロンビンに比べ高いプロテインＣ活性化能力を有しているものの、生理的な条件下では容易にトロンビンに変換されることから生理的半減期が短く、またトロンビンに変換されて凝固促進活性を示すとともに、メゾトロンビン自体も凝固促進活性を示すことから、メゾトロンビン自体を抗凝固剤として使用することは困難であった。ちなみに、本発明に類似する先行文献として、Ｃｏｔｅ  ＨＣＦらによるメゾトロンビン類似ポリペプチドがある（ＵＳＰ  ５，５１０，２４８）。Ｃｏｔｅらは、プロトロンビン配列のＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４をアラニンに変更したポリペプチドが、活性化を受けると、メゾトロンビン類似体を生じ、このメゾトロンビン類似体のフィブリノーゲン凝固時間で示されるところの凝固促進活性がヒトトロンビンに比べ６．８％になることを示している。Ｃｏｔｅらは、このメゾトロンビン類似体がプロテインＣ活性化剤となりうることを示唆しているが、このメゾトロンビン類似体は、ヒトトロンビンに比べて弱いとは言え、依然として臨床上問題となる凝固促進活性を有しており、実質的には抗凝固剤として使用できないものと言わざるをえない。
従って、従来より、有用かつ安全性の高い医薬組成物、特に抗凝固剤が求められている。
【発明の開示】
上記課題を解決するために、本発明者らは種々のヒトプロトロンビン類似体を作成し、その活性を研究した。その結果、ヒトプロトロンビンの配列のＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４およびＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸に変更を加えたヒトプロトロンビン類似体が、体内等の生理環境下においてヒトメゾトロンビン類似体に変換されるが、さらにトロンビンに実質的に変換されることはないものであり、さらにまたこのヒトメゾトロンビン類似体自体は凝固促進活性を実質的に有さず、かつ、強力なプロテインＣ活性化能力を有する性質であることを確認した。つまり、このヒトメゾトロンビン類似体が有用な抗凝固剤となりえること、また、このヒトメゾトロンビン類似体の前駆体であるヒトプロトロンビン類似体についても、生理環境下において、このヒトメゾトロンビン類似体を生ずることから、有用な抗凝固剤となりえることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ヒトメゾトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸に変更が加えられており、且つヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において変更が加えられている２本鎖のペプチドからなるヒトメゾトロンビン類似体であって、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べ高い性質であり、さらにトロンビンに実質的に変換されないことを特徴とするヒトメゾトロンビン類似体に関する。
また、本発明は、ヒトプロトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸に変更が加えられており、且つヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において変更が加えられている１本鎖のペプチドからなるヒトプロトロンビン類似体であって、Ａｒｇ３２０が切断されて活性化された場合に、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べ高い性質であり、さらにトロンビンに実質的に変換されないことを特徴とするヒトメゾトロンビン類似体を生じ得るヒトプロトロンビン類似体である。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒトプロトロンビンおよび、本発明または比較例のプロトロンビン類似体およびメゾトロンビン類似体の構造、変更部位および切断活性化の説明図である。ＡはトロンビンのＡ鎖を示し、ＢはトロンビンのＢ鎖を意味する。Ｆ１はフラグメント１、Ｆ２はフラグメント２を意味し、ヒトプロトロンビンは、Ｆ１，Ｆ２，Ａｒｇ２７１−Ａｒｇ２８４のフラブメント、Ａ、Ｂにより構成されていることを示す。
図２は、本発明または比較例のプロトロンビン類似体の発現を確認するための電気泳動図（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
図３は、本発明または比較例のプロトロンビン類似体の活性化後の状態、構造を確認するための電気泳動図（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。（Ａ）は還元条件下、（Ｂ）は非還元条件下を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  天然のヒトプロトロンビンは、血液中あるいは血管内等の生理的な条件下、蛋白分解酵素によりＡｒｇ３２０において切断、活性化され、ヒトメゾトロンビンを生ずる。ヒトメゾトロンビンは、このように、ヒトプロトロンビンがＡｒｇ３２０において切断された２本鎖のポリペプチドからなり、それぞれのポリペプチドが、互いにジスルフィド結合（Ａ鎖Ｃｙｓ２９３とＢ鎖Ｃｙｓ４３９）により架橋されている。
生理的な凝固プロセスにおいて実質的にプロトロンビンを切断しうる通常の蛋白分解酵素としては、例えばプロトロンビナーゼ複合体、膜上プロトロンビンアクチベーター、トロンビンやメゾトロンビンが挙げられる。
ヒトにおいては通常多くの変異が認められることから、本発明においても、ヒトプロトロンビンの配列は、ヒトから取得される限り特に限定されないが、例示すれば、成熟体のヒトプロトロンビンのアミノ酸配列としては、例えば、配列表配列番号１の１−５７９のアミノ酸配列が例示される。また、その塩基配列としては配列表配列番号３の１−１７３７の塩基配列が例示される。
本発明において示されるアミノ酸の附番は、成熟体のヒトプロトロンビンのアミノ酸配列のＡｌａを１とする附番であり、２本鎖のメゾトロンビン類似体においても、便宜上ヒトプロトロンビン配列（成熟体）に基づく附番を使用している。
本発明におけるアミノ酸の変更としては、欠失、置換等が挙げられる。
本発明において、アミノ酸の変更の仕方、例えば欠失があっても、共通するヒトプロトロンビンの配列に基づく附番を便宜上使用する。また、ペプチドのＮ末またはＣ末にさらなるアミノ酸が付加されることも許されるが、その場合においても、ヒトプロトロンビンの配列を基準として表現している。
本発明のヒトメゾトロンビン類似体は、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べて高い性質があり、さらにトロンビンに実質的に変換されないことを特徴とするヒトメゾトロンビン類似体であれば特に限定されない。
本発明のメゾトロンビン類似体は、特に、血液中等の生理的な条件下で、トロンビンに実質的に変換されなければ特に限定されないが、例えば、緩衝液中において、検出可能な量のトロンビン（ヒトトロンビンあるいはヒトトロンビン様物質）に変換されないことと理解することも好ましい。検出可能な量としては、本発明のメゾトロンビン類似体を緩衝液中に加え、一定時間一定温度、好ましくは１時間、３７℃で放置したのち、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、クマッシーブルーなどの染料により可視化した際にバンドとして検出できる量と理解することができる。この時、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける蛋白量として、１〜１００μｇが可能であるが、より好ましい量として１０μｇを例としてあげることができる。
また本発明のメゾトロンビン類似体自体は、凝固促進活性を実質的に有さないが、例えば、凝固計を用いて、２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを含む緩衝液中に試験化合物を加え、凝固時間を測定し、ヒトトロンビンを加えた場合の凝固時間との検量線を用いてトロンビン活性に換算する方法により測定すればよい。本発明のメゾトロンビン類似体を加えた場合の、凝固時間から求められる凝固促進活性が、同量のヒトトロンビンに対してほとんど無視できる程度であればよい。本発明のメゾトロンビン類似体の凝固促進活性としては、同量のヒトトロンビンの２％以下が好ましい例として挙げられ、１％以下がより好ましい例として挙げられ、０．１％以下がさらに好ましい例として挙げられる。また別の観点に立てば、例えば、１．５％以下が好ましい例として挙げられ、１．０％以下がより好ましい例として挙げられ、０．１％以下がさらに好ましい例として挙げられる。また、抗凝固剤としての薬効を示しうる量のメゾトロンビン類似体を、ヒトあるいは動物に静脈内投与した際、凝固反応、すなわち血栓が生じたことを示すマーカー、例えばＤ−ｄｉｍｅｒ（Ｍａｔｓｕｏ  Ｔら  Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２６  １０１−１０７、２０００）が正常域内の数値を示すことが、本発明における「凝固促進活性を実質的に有さない」という性質の、より好ましい具体的な例示として理解できる。前述の正常域は、正常状態と判断される範囲であって、多数の健常人サンプルにより決定される正常範囲を示す。市販の測定キットにおいてはその正常域が、レファレンス値として通常開示されている。使用する測定キットあるいは測定方法により異なるが、例えば、Ｄ−Ｄｉ  ｔｅｓｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉａ  Ｓｔａｇｏ社製）においては、０．５μｇ／ｍｌとされている。
また、本発明のメゾトロンビン類似体のプロテインＣ活性化能力は、生体条件下においてプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンより高ければ特に限定されない。本発明のメゾトロンビン類似体のプロテインＣ活性化能力は、ヒトトロンビンに対して５倍以上であることが好ましい例として挙げられ、さらに好ましくは１０倍以上が例示される。生体条件下の他、簡便な試験方法を例示すれば、例えば、試験化合物とともにトロンボモジュリンを並存させる条件下にて、通常のプロテインＣ活性化能力測定を行う例が挙げられる。すなわち、この可溶性トロンボモジュリンと、測定すべき試験化合物とを混合し、一定時間、好ましくは３０秒間静置したのち、プロテインＣを加え、さらに一定時間、好ましくは５分間静置したのち、トロンビンの阻害剤を加え、さらに一定時間、好ましくは５分間静置したのち、活性化プロテインＣ用の発色基質を添加することにより、測定可能である。
通常、メゾトロンビン類似体あるいはヒトトロンビンに対して、トロンボモジュリンはモル比で１０倍以上存在せしめる条件が例示される。測定に際して使用されるトロンボモジュリンとしては、可溶性トロンボモジュリンを使用することが好ましく、例えば、特開昭６４−６２１９号公報または特許第２７６６４７３号公報の各実施例、特に実施例２０の可溶性トロンボモジュリンを使用することが好ましい。トロンビンの阻害剤としては、アルガトロバンやヒルジン、アンチトロンビンなどが使用可能である。また、発色基質としては、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡなどが、良く用いられる。
本発明のヒトメゾトロンビン類似体における変更として、ヒトメゾトロンビンの配列（結局ヒトプロトロンビンの配列を基準とするが）におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸に変更が加えられており、且つヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において変更が加えられているが、２本鎖のペプチドからなる通常のヒトメゾトロンビン配列においては、Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４はＡ鎖に属し、Ｇｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸はＢ鎖に属する。
上述のヒトメゾトロンビン類似体は、１本鎖のペプチドからなるヒトプロトロンビン類似体のＡｒｇ３２０が切断されて生じ得るものである。本発明のヒトプロトロンビン類似体は、天然のヒトプロトロンビンと同様に、生理的な条件下、あるいは人為的な条件下において蛋白分解酵素によりＡｒｇ３２０において切断、活性化され、メゾトロンビン類似体を生じる性質を有する。生理的な条件下としては、血液中あるいは血管内における環境条件が例示され、人為的な条件下としては前述の測定条件が例示される。蛋白分解酵素としては、生理的な凝固プロセスにおいて実質的にプロトロンビンを切断しうる蛋白分解酵素、例えばプロトロンビナーゼ複合体、膜上プロトロンビンアクチベーター、トロンビンやメゾトロンビン、さらには本発明のメゾトロンビン類似体自身を例としてあげることができる。さらに、メゾトロンビン類似体を体外で産生させることを目的として、緩衝溶液中において、前記の酵素類やエカリンなどの蛇毒を反応させることも可能である。
Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４は、ヒトプロトロンビンがトロンビンに変換される際に切断される箇所であり、ヒトメゾトロンビンにおいては切断されていない箇所である。本発明のヒトメゾトロンビン類似体およびヒトプロトロンビン類似体は、この部分において変更されており、この変更は、ヒトメゾトロンビン類似体およびヒトプロトロンビン類似体に関する定義上の特徴に影響がなければ、特に限定されない。通常は、これらの箇所が酵素的に切断されなければよく、Ａｒｇの欠失、またはＡｒｇ以外のアミノ酸に置換、さらにはこれらの組み合わせにより変更されていればよい。最も好ましい例としてはＡｌａに置換することが例示される。また、これらのＡｒｇが削除される例も挙げられる。Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の全てがＡｌａに置換されたものが好ましいものとして例示される。
また、本発明のヒトプロトロンビン類似体およびヒトメゾトロンビン類似体においては、Ｇｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３が変更されており、その箇所における変更は、その定義上の特徴に影響がない限りどこでもよい。このＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３の変更として、８個のアミノ酸全ての欠失が好ましい。また、任意の７個のアミノ酸の欠失が好ましく、任意の６個のアミノ酸の欠失も好ましい。或いは、任意の５個のアミノ酸の欠失が好ましい。さらに、任意の４個のアミノ酸の欠失が好ましく、任意の３個のアミノ酸の欠失も好ましい。さらには、任意の２個のアミノ酸の欠失も好ましく、任意の１個のアミノ酸の欠失も好ましい。任意の７個のアミノ酸の欠失としては、例えば、Ｇｌｕ４６６−Ｖａｌ４７２の欠失が好ましい。任意の６個のアミノ酸の欠失としては、例えば、Ｇｌｕ４６６−Ａｓｎ４７１の欠失が好ましい。また、任意の５個のアミノ酸の欠失としては、例えば、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０の欠失が好ましい。また、任意の４個のアミノ酸の欠失としては、例えば、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４６９の欠失が好ましい。また、任意の３個のアミノ酸の欠失としては、例えば、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４６８の欠失が好ましい。また、任意の２個のアミノ酸の欠失としては、例えば、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６７、又はＴｈｒ４６７−Ｔｒｐ４６８の欠失が好ましい。また、任意の１個のアミノ酸の欠失としては、例えば、Ｇｌｕ４６６、Ｔｈｒ４６７、又はＴｒｐ４６８の欠失が好ましい。
さらに、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４７３の１個ないし８個の任意のアミノ酸の欠失及び／又は他のアミノ酸への置換も好ましい。特に、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９の任意の２個のアミノ酸の欠失及び／又は他のアミノ酸への置換が好ましく、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６８の任意の２個のアミノ酸の欠失及び／又は他のアミノ酸への置換がさらに好ましい。
また、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９の任意の１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６８の任意の１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換がさらに好ましい。特に好ましい変更位置として、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６７、Ｔｈｒ４６７−Ｔｒｐ４６８、Ｇｌｕ４６６、Ｔｈｒ４６７、Ｔｒｐ４６８が挙げられる。
なお、Ｇｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３に関連して、Ｇｌｕ４６６−Ｌｙｓ４７４はトロンビンのループ２あるいはＡｕｔｏｌｙｓｉｓ  ｌｏｏｐと呼ばれる構造で、トロンビンがナトリウムと相互作用を示す部位であり、この部分が完全に欠失したトロンビンはその生理活性、すなわち凝固促進活性、及びプロテインＣ活性化能力が共に野性体に比べて低下することが報告されている（ＱＣ  ＤａｎｇらＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，  １９６４９−１９６５１，１９９７）。
つまり、トロンビンにおいてループ２を削除すれば凝固促進活性ばかりでなく、プロテインＣ活性化能力も低下させるため、凝固促進活性がなく、且つプロテインＣ活性化能力が高いというヒトメゾトロンビン類似体、そのヒトメゾトロンビン類似体に変化するプロヒトメゾトロンビン類似体を提供する本発明の効果は、単純に求められるものではないことが明らかである。
現に、本発明者らは、ヒトメゾトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸をＡｌａに変更し、且つヒトメゾトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７４を形成するアミノ酸の全部を欠失したヒトメゾトロンビン類似体を作成したが、そのプロテインＣ活性化能力は、ヒトトロンビンに対して１／５程度であることを確認した。
本発明のヒトメゾトロンビン類似体およびヒトプロトロンビン類似体としては、Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の全てがＡｌａに置換され、且つ、Ｇｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ｖａｌ４７２を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ａｓｎ４７１を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ｔｒｐ４６８を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６７を欠失、あるいはＴｈｒ４６７−Ｔｒｐ４６８を欠失、あるいはＧｌｕ４６６又はＴｈｒ４６７又はＴｒｐ４６８を欠失させたものが好ましい例として挙げられ、Ｇｌｕ４６６−Ａｌａ４７０を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を欠失、あるいはＧｌｕ４６６−Ｔｒｐ４６８を欠失させたものが特に好ましい例として挙げられる。
本発明のヒトプロトロンビン類似体およびメゾトロンビン類似体は、その配列内にＧｌａ（γカルボキシルグルタミン酸）はヒトプロトロンビンやメゾトロンビンと同様に包含されていても良い。Ｇｌａの数および箇所は定義上の特徴に影響を与えない限り、特に限定されないが、野生型ヒトプロトロンビンやメゾトロンビンと同様であることが好ましい。
本発明のヒトメゾトロンビン類似体およびヒトプロトロンビン類似体は、ヒトプロトロンビンまたはヒトメゾトロンビンの配列と類似する配列を実質的に含み、その定義上の特徴、すなわち凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べ高い性質であり、さらにトロンビンに実質的に変換されないこと、またはその性質を有するヒトメゾトロンビン類似体を生じ得ることに特別に影響がない限り、糖鎖が付加していてもよく、また、Ｎ末端やＣ末端にさらに１個あるいは複数個のアミノ酸を有していても構わない。例えば、糖鎖としては、Ｎ型糖鎖、Ｏ型糖鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが例示される。宿主細胞の種類によって付加する糖鎖が変化し、また、化学的方法により付加することもできる。化学的にＰＥＧをつける方法としては、例えば、特開２００１−６４３００号公報に記されている方法が例示される。また、１個あるいは複数個のアミノ酸が付加してもよいが、その付加してもよいアミノ酸、アミノ酸配列としては、例えばＴａｇの例が挙げられる。Ｔａｇをつけると、後述する従来公知の精製工程が採用でき、簡便であって好ましい。Ｔａｇとしては、ＨＩＳ−Ｔａｇが一般的であり、これはＮｉキレートカラムを用いて精製が可能となる、その他に、ＧＳＴ−Ｔａｇなども一般的に用いられ、グルタチオン固定カラムを用いての精製が可能となる。
本発明のプロトロンビン類似体のＣ末端にＴａｇをつける場合には、通常、数個のアミノ酸リンカーの後にＴａｇの配列が接続されることが多い。例えば、ＨＩＳ−Ｔａｇをつける場合は、ヒトプロトロンビン類似配列のＣ末端に、数個のアミノ酸リンカー、さらにそのＣ末端に、Ｈｉｓが数個、通常は６個程度接続される。ＨＩＳ−Ｔａｇを付加する場合には、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社２０００−２００１年版カタログ３００頁参照）を利用することが簡便であり好ましい例としてあげることができる。またＧＳＴ−Ｔａｇを用いる場合は、ヒトプロトロンビン類似配列のＣ末端に、数個のアミノ酸リンカー、さらにそのＣ末端に、Ｇｌｕｔｈａｔｉｏｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅが接続される。ＧＳＴ−Ｔａｇを付加する場合には、Ｔａｋａｒａ社キット（Ｔａｋａｒａ社２００２−２００３年版カタログＣ５９−Ｃ６５頁参照）を利用することが簡便であり好ましい例としてあげることができる。リンカーとしては任意の公知のリンカーを選択することができるが、使用するベクターとＤＮＡ配列の入れ方により選択することができる。あらかじめ、リンカー部分に、エンテロキナーゼの認識部位を入れたベクターを選択することも好ましい。例えば、Ｔａｋａｒａ社製、ｐＥＴ１９ｂベクター（Ｔａｋａｒａ社２００２−２００３年版カタログＣ５９−Ｃ６５頁参照）を用いると、精製後に、エンテロキナーゼと接触させることにより、容易にＴａｇを切断することが可能であって好ましい。本発明においては、Ｔａｇの付いたペプチドも、またＴａｇ等をはずした後に残る少量のアミノ酸配列等を含むペプチドも、本発明のヒトメゾトロンビン類似体およびヒトプロトロンビン類似体に包含される。
さらに本発明は、上述のヒトプロトロンビン類似体をコードするＤＮＡに関する。さらに場合によっては上述のヒトメゾトロンビン類似体を与え得るＤＮＡも包含してもよい。
すなわち、ヒトプロトロンビンの配列におけるＡｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４の各アミノ酸に変更が加えられており、且つヒトプロトロンビンの配列のＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において変更が加えられている１本鎖のペプチドからなるヒトプロトロンビン類似体であって、Ａｒｇ３２０が切断されて活性化された場合に、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比べ高い性質であり、さらにトロンビンに実質的に変換されないことを特徴とするヒトメゾトロンビン類似体を生じ得るヒトプロトロンビン類似体をコードするＤＮＡである。
本発明のヒトプロトロンビン類似体をコードするＤＮＡを取得する方法としては、例えば、ヒトプロトロンビンをコードする塩基配列に対して、Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４をコードするコドンを、Ａｒｇ以外の他のアミノ酸をコードするコドンにより置換するか、欠失させ、またＧｌｕ４６６−Ｇｌｙ４７３を形成するアミノ酸の全部または一部において置換または欠失させるように、種々の公知の遺伝子操作技術を用いて行うことができる。ヒトプロトロンビンをコードする塩基配列としては、例えば配列表配列番号３の１−１７３７の塩基配列が例示される。適当なシグナルペプチドを接続させた前駆体として生産させることが可能であり、各種のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を付加することが可能であるが、好ましくは、天然のヒトプロトロンビン前駆体の４３個アミノ酸配列をコードするシグナルペプチドが例として挙げられる。具体的には、配列表配列番号４の１−１２９の塩基配列が例示される。
アミノ酸の変更方法としては、例えば、Ａｒｇを示すコドンであるＣＧＣ、ＣＧＴ、ＡＣＧを、Ａｌａを示すコドンであるＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧのいずれかに変更すればよいが、例えば、ＰＣＲを用いたポイントミューテーション法が利用でき、市販のキット（例えば、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ  Ｋｉｔ）を用いて行う方法がより実用的である。例えば、Ａｒｇ１５５をＡｌａに置換するためには、５’−ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  Ｇ−３’を作成し、前述の市販キット用いて作成することが可能である。また、Ａｒｇ１５５をＶａｌに置換するためには、上述の変異プライマーにおいて、ＧＣＴをＧＴＣとした変異プライマーを用いて作成することが可能であり、さらに他のアミノ酸を示すコドンを用いれば全てのアミノ酸への変更が可能である。また、ＰＣＲによるミスリードを防ぐために、変異を入れるコドンの前後に、もとのヒトプロトロンビンの正しいコドンと、翻訳されるアミノ酸は同じだが配列の異なるコドンを導入することも場合によっては必要とされ、また好ましい例である。
欠失する方法としては、置換と同様にＰＣＲを用いたミューテーション法が利用できる。すなわち、欠失させようとするアミノ酸のコドンを取り除いたオリゴヌクレオシドを用いればよく、例えば、Ｇｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を欠失させるためには、この４アミノ酸のコドンを取り除いたオリゴヌクレオシド（５’−ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ−３’）を作成し、前述の市販キット用いて作成することが可能である。また、ヒトプロトロンビンの５’末端のＤＮＡ配列と欠失させたいアミノ酸の前のＤＮＡ配列、および、欠失させたいアミノ酸の後のＤＮＡ配列とヒトプロトロンビンの３’末端のＤＮＡ配列のオリゴヌクレオシドをそれぞれ用いて、ＰＣＲを用いて２本のＤＮＡを作成し、それを接続させる方法も可能である。例えばＧｌｕ４６６−Ｔｈｒ４６９を欠失させるためには、５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣ−３’と５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ−３’の組み合わせ、および５’−ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ−３’と５’−ＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴ−３’の組み合わせを用いて、ヒトプロトロンビンｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて、２本のＤＮＡを作成し、それを接続することにより作成することができる。同様な手法を用いて、Ｇｌｕ４６６−Ｌｙｓ４７４を構成するアミノ酸の任意のアミノ酸の欠失が可能である。
また、本発明のヒトプロトロンビン類似体またはヒトメゾトロンビン類似体としては、Ｔａｇが付いていてもよく、付加されたＴａｇによって精製が容易となるが、Ｔａｇを付加するに際しては、前述のＤＮＡに、Ｔａｇの配列をコードするＤＮＡ配列を付加すればよい。具体的にはｐＳＥＣＴａｇ２キット（インビトロジェン社製）を用いてＨＩＳ  Ｔａｇを付加することができ、Ｎｉキレートカラムにより蛋白の精製が簡便化される。またＴ７ＴａｇやＧＳＴ−Ｔａｇなども一般的に用いられる。例えば、ｐＥＴ３ベクター（タカラバイオメデイカル製）を用いてＴ７Ｔａｇを導入し、Ｔ７に対する抗体カラム（Ｔ７Ｔａｇａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて精製する方法や、ｐＥＴ４１ベクター（タカラバイオメデイカル製）を用いてＧＳＴ−Ｔａｇを導入し、グルタチオン固定化樹脂（ＧＳＴ  Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて精製する方法などがそれぞれ例示される。
本発明においては、上述のＤＮＡを、宿主中で機能し得る公知のプラスミドに結合させることにより、本発明のヒトプロトロンビン類似体をコードするＤＮＡを含み、ヒトプロトロンビン類似体またはヒトメゾトロンビン類似体を発現させることに利用し得るプラスミドが得られる。
また本発明によれば、上記のプラスミドを適宜の宿主細胞に移入し形質転換を行った形質転換体が提供される。
本発明のヒトプロトロンビン類似体またはヒトメゾトロンビン類似体を製造する方法は、例えば以下の方法が好ましい例として挙げられるが、他の方法によることも本発明が達成される限り特に限定されない。
（ａ）前述のペプチドをコードするＤＮＡと複製可能なプラスミドを連結して、該ＤＮＡと該複製可能なプラスミドとからなる複製可能な組換え体ＤＮＡを得、
（ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、
（ｃ）該形質転換体を該細胞の親細胞から選別し、
（ｄ）該形質転換体を培養して、該ＤＮＡを含有し該ペプチドを生産する細胞を増殖させ、そして
（ｅ）該細胞が生産した該ペプチドを、培養した該細胞から単離する。
本発明のＤＮＡを発現して本発明のペプチドを製造するためには、通常は脊椎動物の細胞などの真核生物の細胞を宿主細胞として用いることが好ましく、それらの宿主に対する公知の宿主−ベクター系を使用することができる。真核細胞の例としては動物細胞が好ましく、例えば、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞株等が挙げられる。本発明のＤＮＡを前述の真核細胞で発現させるために、本発明の組換え体ＤＮＡは一般に遺伝子発現を制御するための機能配列、例えば、複製起源、本発明のＤＮＡの上流に位置すべきプロモーター、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位や転写終配列を含有している。本発明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるのに用いることのできるそのような機能配列はウィルスやウィルス性物質から得ることができる。
例えば、本発明で用いることのできるプロモーターは、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などから得ることができる。特に、アデノウィルス２の主後期プロモーターやＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ＣＭＶプロモーターが好ましい例としてあげることができる。
複製起源については、外来性の起源、例えば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）等のウィルス由来の複製起源を用いることができる。また、宿主染色体に組み込まれるような性質を有するプラスミドを用いる場合、宿主染色体の複製起源を利用することができる。
本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換された細胞は、前述のとおり、組換え体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種の表現型によって形質転換されずに残った親細胞から選別される。表現型は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換え体ＤＮＡに挿入することによって与えることができる。また複製可能な発現ベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子の例としては、例えば、ネオマイシンやＺｅｏｃｉｎ耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼ（以下“ＤＨＦＲ”と称する）をコードする遺伝子などが挙げられる。
形質転換した細胞は、通常の栄養培地を用いて通常の公知の方法で培養することにより本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有し、該ペプチドを生産する細胞を増殖させることができる。該細胞は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを発現して本発明のペプチドを製造することができる。培養後、本発明のペプチドは形質転換体の培養物から通常の公知の方法、例えばカラムクロマトグラフィーなどを用いて単離することができる。
本発明の範囲には、このように形質転換体が培養されて増殖した、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有し、該ペプチドを生産する細胞も含まれる。
精製に当たっては、公知の精製方法が採用できるが、例えば、公知のヒトプロトロンビンの精製方法に準じて行うことができ、Ｂａｊａｊ  ＳＰらの、バリウム沈殿と硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーを組み合わせる方法（Ｐｒｅｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１  ３９７−４１２，１９８１）を例示することができる。
また、例えば、抗ヒトプロトロンビン抗体を用いた精製方法を用いることができ、抗ヒトプロトロンビン抗体としてはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良く、また抗体の種としては、マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギなど利用可能な動物種であればなんでもよい。このような抗体としては、コスモバイオ社製のヤギ抗ヒトプロトロンビンポリクローナル抗体ＩＣＮ−６８１００１を例示することができる。また精製に用いる抗体を結合する担体として、セファロース担体、アガロース担体、ポリスチレン担体、ガラス担体など、ゲル状あるいはビーズ状の公知の担体であればなんでもよい。抗体を結合させるため、あらかじめ活性化された担体であれば、より好ましい。このような担体として、ＮＨＳ活性化セファロース担体（ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｌａｂ  Ｐａｃｋｓ、アマーシャム社製）やＣＮＢｒ活性化セファロース担体（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  Ｌａｂ  Ｐａｃｋｓ）を例示することができる。
また、例えば、Ｔａｇ等の精製に利用できるアミノ酸配列が付加している場合には、それぞれのアミノ酸配列に特有な精製法を適用することができる。例えば、ＨＩＳ−Ｔａｇを取り付けた場合には、Ｎｉキレート樹脂を用いて精製することが可能であり、通常精製キットを用いて行われる。このような、キットとしてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＰｒｏＢｏｎｄニッケルキレートレジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社２０００−２００１年版カタログ３９５頁参照）を例示することができる。また、ＧＳＴ−Ｔａｇを取り付けた場合は、グルタチオン固層化樹脂を用いて精製することが可能であり、通常精製キットを用いて行われる。このような、キットとしてはＣｌｏｎｔｅｃｈ社製，Ｇｌｕｔｈａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社２００２年版カタログ２２９頁参照）を例示することができる。精製後、Ｔａｇ等を削除する必要がある場合には、それぞれに適した方法を適宜採用することが出来、例えば、エンテロキナーゼ配列を組み込んだ場合は、エンテロキナーゼで処理し、該エンテロキナーゼ等を除去することによりＴａｇを切除することができる。通常キットを用いて行われるが、このようなキットとしては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のエンテロキナーゼＭａｘおよびＥＫ−Ａｗａｙレジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社２０００−２００１年版カタログ、それぞれ４０３頁および４０４頁参照）を例示することができる。ヒトメゾトロンビン類似体を取得するためには、例えば、上述の通り、ヒトプロトロンビン類似体を発現させ、その後任意の過程において、ヒトプロトロンビン類似体が切断され活性化される条件に置いてヒトメゾトロンビン類似体となすことが好ましい。精製に当たっては、本発明の医薬組成物として使用できる程度に実質的に精製することが好ましい。
さらに、本発明は、これらのヒトプロトロンビン類似体またはヒトメゾトロンビン類似体を有効成分とする医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、治療上有効量のヒトプロトロンビン類似体あるいはヒトメゾトロンビン類似体単独、またはその両方を用い、これに医薬上許容されるキャリアと混合して調製することができる。医薬上許容されるキャリアとしては、賦形剤、カルボキシメチルセルロースなどの結合剤、添加剤、安定剤、等張剤、緩衝剤などが例示され、また蒸留水等の溶媒が含有されていてもよい。
本発明の医薬組成物をヒトに投与する際は、静脈内、皮下、筋肉内、経肺、経鼻などの非経口経路にて投与することができる。また場合によっては経口投与することもできる。通常、微紛剤、マイクロカプセル剤、注射剤等が例示される。さらに、製剤的な工夫により徐放化することも可能である。本発明の化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、症状の度合いによっても変わるが、一般には成人１日当たり、０．００１から１０００ｍｇを、より好ましくは、０．１から１００ｍｇを１回又は数回に分けて投与されることが例示される。投与期間は、数日間から数ヶ月の連日投与が一般的であるが、患者の症状により、１日投与量、投与期間ともに増減することができる。
本発明の医薬組成物有効成分である化合物は、生体蛋白であり血液中に大量（１００−２００ｍｇ／ｄｌ）に存在するヒトプロトロンビンの類似物質である。このことから、生体に安全に投与することが可能であると考えられる。実際に、マウス５匹にＫｇあたり１０ｍｇの本発明の医薬組成物を投与したところ、全例生存しており、特に問題となる症状は確認されなかった。
本発明の医薬組成物は、抗血液凝固剤として有効である。従って本発明の医薬組成物は、血栓症、エンドトキシン血症、敗血症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全症（ＭＯＦ）、成人呼吸器不全症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症亢進症候群（ＳＩＲＳ）などの疾患を治療あるいは予防する際に用いることができる。血栓症とは、生体のいずれかの臓器の血管内に血栓が発生し、該臓器に障害を与える疾患の総称であり、具体的には、心筋梗塞、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再閉塞、心房膜異常あるいは心房膜手術後の塞栓症、川崎病、脳梗塞、脳塞栓症、脳血栓症、脊椎損傷、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、移植後の肝静脈閉塞症（ＶＯＤ）、肝炎、血栓性抹消動脈閉塞症（バージャー病、ＴＡＯ）、動脈硬化性抹消動脈閉塞症（ＡＳＯ）、脳梗塞後、頭部損傷、脊椎損傷および手術後などの深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、エコノミークラス症候群、肺塞栓症、抹消動脈血栓症、抹消動脈塞栓症、腎炎、妊娠中毒症、全身性ループスエリトマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、ループスアンチコアギュラント、ベーチェット病などを例として挙げる事ができる。
また本発明の医薬組成物は、凝固反応の抑制とともに、その凝固反応に付随する炎症反応を抑制する効果も有する。同じように活性化プロテインＣが提供されるトロンボモジュリンが用いられる疾患に使用することが可能である。すなわち、特に、敗血症やエンドトキシン血症、多臓器不全症（ＭＯＦ）、成人呼吸器不全症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症亢進症候群（ＳＩＲＳ）等の疾患が例示される。
本発明の医薬組成物の有効性は、病態モデルを用いた動物実験を使用すれば容易に確認することができる。すなわち、本発明の医薬組成物の抗凝固剤としての有効性を示すための病態モデルとしては、腹部大静脈をうっ滞させるモデル、腹部大静脈をＴＦや塩化鉄で処理するモデル、腹部大静脈にコイルを入れるモデルも例示され、具体的には、例えばＳｏｌｉｓ  ＭＭらの方法（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ７３、３８５−３９４  １９９４）が挙げられ、このモデルでは、特に、ＤＶＴなどの静脈血栓症の有効性が判断できる。また、頚動脈をバルーニングするモデル、ＡＶシャントモデルやコルツモデルも例示され、具体的には、例えばＧｒｕｂｅｒ  Ａらの方法（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２、５７８−５８５  １９９０）やＨｉｅｂｅｒｔ  ＬＭらの方法（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ３０、１９６−２０３  ２０００）が挙げられ、このモデルでは、特に、心筋梗塞や脳梗塞、不安定狭心症、抹消動脈閉塞症などの動脈血栓症の有効性が判断できる。さらに、ＴＦを投与するモデルが例示され、具体的には、例えばＭｏｈｒｉ  Ｍらの方法（Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ４５、２９８−３０３  １９９４））が例示され、このモデルでは、特に、ＤＩＣの有効性が判断できる。本発明の医薬組成物の炎症抑制作用を確認するための病態モデルとしては、グラム陰性菌あるいはエンドトキシンを投与するモデルが挙げられ、具体的にはＵｃｈｉｂａ  Ｍらの方法（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１、Ｌ４７０−４７５  １９９６）、Ｇｏｎｄａ  Ｙらの方法（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ７１，３２５−３３５，１９９３）が例示され、このモデルでは、特に、敗血症やエンドトキシン血症、多臓器不全症（ＭＯＦ）、成人呼吸器不全症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症亢進症候群（ＳＩＲＳ）の有効性が判断できる。
本発明の医薬組成物は、ヒトプロトロンビン類似体からのヒトメゾトロンビン類似体の生成、ヒトメゾトロンビン類似体の抗凝固作用を、さらに増強する作用を有する化合物を含有することができる。化合物としては、抗凝固作用を有するものならなんでも用いることができるが、好ましくはプロテインＣ活性化経路に関する化合物であり、さらに好ましくはヒトプロテインＣ、ヒト活性型プロテインＣ、プロタック（ＰＲＯＴＡＣ）、ヒトトロンボモジュリン、可溶性トロンボモジュリンが例としてあげることができる。可溶性トロンボモジュリンとしては、例えば、特開昭６４−６２１９号公報の各実施例のトロンボモジュリンや、特公平７−９８８４０号公報、ＷＯ９２／００３２５号公報等のトロンボモジュリンが例示される。また、これらのタンパクは医薬組成物として使用可能な製法によるものが好ましく、遺伝子組み換え、血液や尿からの分取、精製ばどの製法の如何を問わない。また、これらの医薬組成物を投与する方法としては、同じ製剤で同時に投与することが望ましいが、別の製剤で投与することも、時間をおいての投与も可能である。例えば、プロテインＣあるいはヒト可溶型トロンボモジュリンを投与した翌日に、ヒトプロトロンビン類似体あるいはヒトメゾトロンビン類似体を投与することや、あるいはその逆順が例としてあげることができる。
【実施例】  以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】  ヒトプロトロンビン類似体のｃＤＮＡの調製方法
ヒトプロトロンビンのｃＤＮＡは、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ（クローンテック社製）から、２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、５’プライマー（５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣ−３’および３’プライマー（５’−ＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴ−３’を用いてＰＣＲ法により取得した。このｃＤＮＡ（１．９ｋｂ）を、ｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイト、ＳｍａＩ切断部位に導入して作成したｐＵＣ／ｈＰＴのＤＮＡ配列はＤＳＱ２０００Ｌ  ＤＮＡシークエンサー（島津製作所製）を用いて確認した。このｐＵＣ／ｈＰＴに挿入されたｃＤＮＡ断片には、配列表配列番号４のヒトプロトロンビン（前駆体）の塩基配列が含まれることを確認した。ｐＵＣ／ｈＰＴをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られたｃＤＮＡ断片はアガロース電気泳動で分離し、ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。
Ｈｉｓ−Ｔａｇ標識したヒトプロトロンビン（ＰＴ−Ｔａｇ）を得るために、ｐＵＣ／ｈＰＴをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩにより切断して得た１．９ｋｂのｃＤＮＡ断片を、分泌発現ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＣＡ  ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位に導入した。
また、ヒトプロトロンビンの変異体は、上述のｐＵＣ／ｈＰＴに対して、変異コドンを有する変異オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法により、以下の各種のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡを作成し、野生株と同様に分泌発現ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ）に導入した。すなわち、Ａｒｇ１５５をＡｌａに置換するためには、５’−ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  Ｇ−３’（アミノ酸配列  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ１５５  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ）からなる変異オリゴヌクレオチドを用い、Ａｒｇ１５５を示すコドンＣＧＣをＧＣＴに変更した。以下同様に、「変更するアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸６個のネイティブなコドン配列−変更するアミノ酸のコドン配列−変更するアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸２個のネイティブなコドン配列からなる塩基配列」を用い、Ａｒｇ２７１を示すコドンＣＧＴをＧＣＣに、Ａｒｇ２８４を示すコドンＡＧＧをＧＣＧに変更した。
また、Ｇｌｕ４６６からＴｈｒ４６９までの４アミノ酸配列を欠失させるためには、この４アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ−３’を用いて作成した。
さらに、Ｇｌｕ４６６からＡｌａ４７０までの５アミノ酸配列を欠失させるためには、この５アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＣ−３’を用い、Ｇｌｕ４６６からＴｒｐ４６８までの３アミノ酸配列を欠失させるためには、この３アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧＴＧＧを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ−３’を用いて作成した。
さらには、Ｇｌｕ４６６からＡｌａ４７１までの６アミノ酸配列を欠失させるためには、この６アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＣを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ−３’を用い、Ｇｌｕ４６６からＡｌａ４７２までの７アミノ酸配列を欠失させるためには、この７アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ−３’を用い、Ｇｌｕ４６６からＡｌａ４７３までの８アミノ酸配列を欠失させるためには、この８アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＧＴを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ−３’を用いて作成した。
また、Ｇｌｕ４６６からＴｈｒ４６７までの２アミノ酸配列を欠失させるためには、この２アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ−３’を用い、Ｔｈｒ４６７からＴｒｐ４６８までの２アミノ酸配列を欠失させるためには、この２アミノ酸のコドン、ＡＣＧＴＧＧを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ−３’を用い、Ｇｌｕ４６６を欠失させるためには、このアミノ酸のコドン、ＧＡＧを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ−３’を用い、Ｔｈｒ４６７を欠失させるためには、このアミノ酸のコドン、ＡＣＧを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ−３’を用い、Ｔｒｐ４６８を欠失させるためには、このアミノ酸のコドン、ＴＧＧを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ−３’を用いて作成した。
また、Ｇｌｕ４６６からＬｙｓ４７４までの９アミノ酸配列を欠失させるためには、この９アミノ酸のコドン、ＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＧＴＡＡＧを欠失させたオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ−３’を用いて作成した。
ＰＴ−ＲＡ１５５；Ａｒｇ１５５をＡｌａに変更した比較例のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ＲＡ２７１；Ａｒｇ２７１とＡｒｇ２８４をＡｌａに置換した比較例のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ＭＴ；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換した比較例のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ（ＵＳＰ  ５，５１０，２４８号公報に記述のポリペプチド）。
ＰＴＤＡ５５４；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１、Ａｒｇ２８４に加えてＡｓｐ５５４をＡｌａに置換した比較例のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴＤＬ５５４；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ａｓｐ５５４をＬｅｕに置換した比較例のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ、を各々作成した。
また、ＰＴ−ｄｅｌｔａ４６９；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＴｈｒ４６９を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７０）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＡｌａ４７０を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４６８）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＴｒｐ４６８を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４６７）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＴｈｒ４６７を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６７−４６８）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｔｈｒ４６７からＴｒｐ４６８を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６７）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｔｈｒ４６７を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６８）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｔｒｐ４６８を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７１）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＡｓｎ４７１を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７２）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＶａｌ４７２を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７３）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＧｌｙ４７３を欠損させた本発明のヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７４）；Ａｒｇ１５５、Ａｒｇ２７１およびＡｒｇ２８４をＡｌａに置換し、Ｇｌｕ４６６からＬｙｓ４７４を欠損させたヒトプロトロンビン類似体ｃＤＮＡ。
を作成した。
変異場所および、酵素により活性化した後に結果として得られるヒトメゾトロンビン類似体の模式図を参考として図１に示す。本発明のヒトプロトロンビン類似体の代表例として、ＰＴ−ｄｅｌｔａ４６９を示した。
【実施例２】（１）ヒトプロトロンビン類似体の発現と精製
前述の比較例を含むヒトプロトロンビン類似体のｃＤＮＡを含む発現ベクターを、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ＩＮ  ＵＳＡ）を用いてＣＯＳ−７細胞に導入した。細胞は１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）および１０μｇ／ｍｌのビタミンＫ（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した後、さらに１０μｇ／ｍｌのビタミンＫを含む無血清のＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。培地を回収し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｎ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化し、蛋白精製用高速液体クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ、ファルマシア製）に接続したＮｉ結合樹脂カラム（Ｎｉ−ＮＴＡカラムＳＦ、ＱＩＡＧＥＮ社製；８ｍｌ）に加えた。カラムを５倍容量のＢｕｆｆｅｒ  Ｎで洗浄し、２段階グラジエント（０−４０ｍＭと４０−２５０ｍＭのイミダゾールを含むＢｕｆｆｅｒ  Ｎ、流速２ｍｌ／ｍｉｎ）で溶出し、ヒトプロトロンビン類似体を含む画分を回収した。
画分をＴＢＳ（２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で透析し、タンパク濃度を蛋白定量試薬（ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ＣＡ  ＵＳＡ）にて決定した。画分は２ｘＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ６．８，３０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％  ＳＤＳ，５％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，０．２％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ、シグマ社製）で２倍に希釈し、１０％−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。タンパクをポリビニリディンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ＦｉｎｅＴｒａｐ  ＮＴ−３２、日本泳動社製）に移し、抗ｍｙｃ抗体（１０００倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で４℃にて１夜処理した。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、蛋白染色キット（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ社製，ＣＡ  ＵＳＡ）とペルオキシダーゼ蛋白染色キット（ＰＯＤ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  ｓｅｔ、和光純薬社製）で処理し、可視化した（図２）。ＰＴ−Ｔａｇとほぼ同一の場所にバンドが出現し、ヒトプロトロンビン類似体が作成できていることが確認された。本発明のヒトプロトロンビン類似体の代表例として、ＰＴ−ｄｅｌｔａ４６９を示した。他の本発明のヒトプロトロンビン類似体及びＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７４）ヒトプロトロンビン類似体においても同様に、作成できていることが確認された。
（２）ヒトプロトロンビン類似体のＮ末アミノ酸解析
前述のＮｉ−ＮＴＡカラムＳＦで精製した比較例を含むヒトプロトロンビン類似体画分を２ｘＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒで２倍に希釈し、１０％−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたの後、タンパクをＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）に移した。ＰＶＤＦ膜を０．１％アミドブラック（シグマ社製）を含む５０％エタノール−１０％酢酸溶液で染色した後、バンドを切り取り、洗浄後、アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（ｍｏｄｅｌ  ４７７Ａ−１２０Ａ、Ａｐｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＣＡ  ＵＳＡ）を用いて決定した。すべてのヒトプロトロンビン類似体のＮ末端はＡｌａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕを示し、ヒトプロトロンビン類似体が作成できていることが確認された。
【実施例３】（１）活性化されたヒトプロトロンビン類似体のトロンビン活性の評価
前述のＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した比較例を含むヒトプロトロンビン類似体
画分およびヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ、シグマ社製）を０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで５０ｎＭの濃度に調製し、終濃度０．５ｎＭの蛇毒のエカリン（Ｙａｍａｄａらの方法、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，５２００−５２０７により精製）を加えて９６穴プレートを用いて、３７℃にて１５分間、活性化した。１／１０容量の２．５ｍＭ発色基質ＶａｌＰｒｏＡｒｇ−ｐＮＡ（ペプチド研究所製）を加えて、発生するパラニトロアニリン（ｐＮＡ）の量をＫｉｎｅｔｉｃ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｄｅｒ，生化学工業社製）を用いて測定した（表１）。
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その結果、本発明のすべてのヒトプロトロンビン類似体はエカリンによる活性化を受け、上述の発色基質の切断活性（表１におけるＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示すことが確認され、ヒトプロトロンビン類似体がさらに何等の活性体（ヒトメゾトロンビン類似体またはトロンビンと推測される）に変化したことが確認できた。一方、ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７４）ヒトプロトロンビン類似体はエカリンによる活性化を受けず、上述の発色基質の切断活性が１％以下であることが確認された。このことから、ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７４）ヒトプロトロンビン類似体は酵素としての能力が欠落しており、ＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７４）ヒトプロトロンビン類似体から誘導されるヒトメゾトロンビン類似体は、メゾトロンビン化によるプロテインＣ活性化能力の増強（２０倍弱）があったとしても、その能力は、ヒトトロンビンに比べ、１／５以下であることが予測された。
なお、エカリンを添加する前のプロトロンビン類似体や、エカリン自体は、特別に上記の発色基質の切断活性を示さない。
さらに３０分後、２−メルカプトエタノールを含む（還元条件下）あるいは含まない（非還元条件下）状態において２ｘＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒで２倍に希釈し、１０％−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、前述の方法を用いて、可視化した（図３（Ａ）は還元条件下、同図（Ｂ）は非還元条件下）。その結果、エカリンにより全てのヒトプロトロンビン類似体は切断を受け、ヒトトロンビンＢ鎖を生じていることが確認された（図３（Ａ）；還元条件下）。さらに、ＰＴ−ＴａｇおよびＰＴ−ＲＡ１５５はヒトトロンビンを、ＰＴ−ＲＡ２７１はヒトメゾトロンビンＤｅｓＦ１を示すバンドが生じるのに対し、ＰＴ−ＭＴ、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＡ５５４およびＰＴＤＬ５５４は元のそれぞれのヒトプロトロンビン類似体を示すバンドと同一の場所にバンドが生じることが確認された（図３（Ｂ））。すなわち、ＰＴ−ＭＴ、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＡ５５４およびＰＴＤＬ５５４は、酵素により活性化を受けるものの、トロンビンにさらに変換されることがないことを示している（図１参照のこと）。
本発明のヒトプロトロンビン類似体であるＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９は、エカリンにより活性化されて本発明のヒトメゾトロンビン類似体が作成され、図３（Ｂ）において、これに対応するバンドが検出されている。これらのバンドを切り取ることにより、精製された本発明のヒトメゾトロンビン類似体が取得出来る。なお、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９以外の本発明のヒトプロトロンビン類似体及びＰＴ−ｄｅｌｔａ（４６６−４７４）ヒトプロトロンビン類似体においても、同様に精製されたヒトメゾトロンビン類似体が取得出来る。
（２）活性化されたヒトプロトロンビン類似体の凝固活性
前述のＮｉ−ＮＴＡカラムで精製したヒトプロトロンビン類似体画分およびヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）を０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで同一の酵素活性（発色基質の切断活性）を示す濃度（およそ５００ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）に調製し、終濃度０．５ｎＭのエカリンを加えて３７℃にて３０分間、活性化した。１／１０容量の２０ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン（シグマ社製）を加え、凝固するまでの時間をｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。凝固活性はヒトトロンビンの検量線を用いて算出し、ヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）に１００％とする相対活性で表した（表１の凝固活性）。ＰＴ−ＲＡ２７１およびＰＴ−ＭＴ（比較例）が、それぞれ１６％および１２％の相対活性を示すのに対し、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）は、いずれも１％以下の相対活性を示した。したがって、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、およびＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）はほぼ完全に凝固促進活性を有しないことが認められた。なお、上記以外の本発明のヒトプロトロンビン類似体においても、同様な結果が得られた。
（３）活性化されたヒトプロトロンビン類似体のプロテインＣ活性化能力
前述のＮｉ−ＮＴＡカラムで精製したヒトプロトロンビン類似体画分およびヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）を０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで終濃度２ｎＭに調製し、終濃度０．２ｎＭのエカリンを加えて３７℃にて３０分間、活性化した。終濃度８０ｎＭのヒトプロテインＣ（コスモバイオ社製）、同じく４０ｎＭの可溶性トロンボモジュリン（旭化成社製；特開昭６４−６２１９号公報または特許第２７６６４７３号公報の実施例２０の可溶性トロンボモジュリン）および同じく１００μＭのリン脂質（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：ｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ＝３：１）を含む等容量の０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え３７℃で６０分間、活性化した。反応後、等容量の終濃度１ｍＭの発色基質ＬｙｓＳｅｒＴｈｒＡｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を加え、発生するアミノメチルクマリン（ＭＣＡ）量を蛍光プレートリーダー（Ｇｅｎｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定し、ヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）を１００％とする相対活性として表した（表１のプロテインＣ活性化能力）。ＰＴ−ＲＡ２７１が１０８％の相対活性を示すのに対し、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）は、いずれも１０００％以上の相対活性を示した。なお、ＰＴ−ＭＴ、ＰＴ−ＤＬ５５４も１０００％以上の相対活性を示した。なお、上記以外の本発明のヒトプロトロンビン類似体においても、同様な結果が得られた。
ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）および本発明のヒトプロトロンビン類似体は活性化されると、トロンボモジュリンの存在下、プロテインＣ活性化能力を有し、このプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）に比べ高いことを確認した。
（４）ヒトプロトロンビン類似体の血液における抗凝固作用（トロンビン産生抑制作用）
トロンビン産生抑制作用は、多くの抗凝固薬の抗凝固作用を評価する際に用いられている作用の一つであり、トロンビン産生に抑制作用を示す物質は臨床においても有効であると考えられている（Ｍｏｈｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８２，１６８７−１６９３  １９９９）。すなわち、正常人ボランティアから得た１６０μｌのフィブリノーゲン除去クエン酸ヒト血しょうに対して、２０μｌのヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）、ＰＴ−ＭＴ（比較例）あるいはヒトプロトロンビン類似体の例としてＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）を含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを、それぞれ、終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加えた。さらに２０μｌの６２５０倍希釈したウサギ脳ティッシュファクター（国際試薬社製）、０．２ｍｇのリン脂質（フォスファティディルコリン：フォスファティディルセリン：フォスファティディルエタノールアミン＝２：１：２  シグマ社製）および１２０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え、凝固反応を開始させた。反応開始５分後に、反応液を５μｌ採取し、３００μｌの１ｍＭの発色基質Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２３６６、第一化学薬品製）を含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒに加え３．５分間反応させた。３０μｌの氷酢酸を添加し、反応を停止させ、４０５ｎＭの吸光度をプレートリーダー（ＴＨＥＲＭＯｍａｘ  モレキュラーディヴァイス社製）を用いて測定した。その結果、ヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）はトロンビン産生を助長したのに対して、ＰＴ−ＭＴおよびＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）はトロンビン産生を抑制した。この結果、本発明のヒトプロトロンビン類似体はトロンビン産生抑制作用を示し、抗凝固活性を有することが確認された。
（５）活性化されたヒトプロトロンビン類似体のマウスにおける作用
ヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）およびＰＴ−ＭＴ、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）を０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで終濃度１μｇ／ｍｌに調製し、終濃度１ｎＭのエカリンを加えて３７℃にて３０分間、活性化した。これらの溶液を、そのままそれぞれ２匹の雄マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  日本チャールズリバー社製）に投与し、３０分後エーテル麻酔下、クエン酸採血し、血しょうを得た。血漿中のＤ−ｄｉｍｅｒをキット（Ｄ−Ｄｉテスト、ダイアグノスティカ社製）を用いて測定した。
その結果、ヒトプロトロンビンおよびＰＴ−ＭＴにおいて、通常有り得る濃度（１μｇ／ｍｌ）を超えるＤ−ｄｉｍｅｒが検出されたのに対して、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）では正常レベルであった。
本発明の活性化されたプロトロンビン類似体ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）（すなわち本発明のメゾトロンビン類似体）は、生体内において血栓を生ずることがないのに対して、従来公知のＵＳＰ５，５１０，２４８に記載されたヒトプロトロンビンＰＴ−ＭＴの活性化物では、生体内においては血栓の形成が無視できないことが確認された。
したがって、本発明の活性化されたプロトロンビン類似体は、凝固促進活性を実質的に有さず且つそのプロテインＣ活性化能力がヒトトロンビンに比較して高く、さらにトロンビンに実質的に変換されないことが明確であり、生体内において血栓を形成することがなく、抗凝固薬として使用し得ることが示された。
（６）ヒトプロトロンビン類似体およびヒトメゾトロンビン類似体の毒性
ヒトプロトロンビン（ｎａｔｉｖｅ）および本発明のヒトプロトロンビン類似体の例としてＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）、本発明のヒトメゾトロンビン類似体の例として、前述の方法で活性化したＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）のそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ４匹の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー社製）に静脈内投与し、投与後１週間観察した。その結果、いずれの投与群に於いても致死例は認められず、本発明のヒトプロトロンビン類似体およびメゾトロンビン類似体は安全に投与できることが示された。なお、上記以外の本発明のヒトプロトロンビン類似体においても、同様な結果が得られた。
【実施例４】ラット血栓モデルに対するヒトプロトロンビン類似体およびヒトメゾトロンビン類似体の効果
Ｓｏｌｉｓらの方法（Ｓｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １４，５９９−６０４，１９９１）によるラット血栓症モデルにより、抗凝固作用の確認を行った。すなわち、雄ＳＤラット（日本チャールズリバー社製）にペントバルビタールを投与し麻酔を施した。開腹し、腹部大静脈を露出させて、腎静脈などの枝わかれした静脈を結さつした。生食（ｎ＝４）、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）、前述の方法で活性化したＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）を尾静脈より投与し、３分後に腹部大静脈を腎静脈の枝分かれ部分で結さつ後、腹部大静脈をピンセットを用いてゆるやかに数度はさみこむことにより傷害を与えた。１５分後、上行の枝分かれ部位で再び結さつし、結さつ部位の上下で腹部大静脈を切断した。摘出した腹部大静脈は、生理食塩水に浸しながら切開し、内部に生じた血栓を摘出し、よく生理食塩水で洗浄した後、秤量した。
その結果、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、およびＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）および活性化したＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、およびＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）は血栓の生成を抑制した。この結果から、本発明のヒトプロトロンビン類似体およびヒトメゾトロンビン類似体は、生体内において抗凝固作用を示し、特に血栓症に対し有効であることが確認された。
【実施例５】ラットエンドキシンモデルに対するヒトプロトロンビン類似体およびヒトメゾトロンビン類似体の効果
ラットエンドトキシンモデル（Ｇｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ７１，３２５−３３５，１９９３）を用いて、本発明のヒトプロトロンビン類似体およびヒトメゾトロンビン類似体の凝固過程に付随する炎症反応に対する抑制作用を確認した。すなわち、雄ＳＤラット（日本チャールズリバー社製）に、エンドトキシン（Ｅ．Ｃｏｌｉ０５５：Ｂ５由来、和光純薬）を５０ｍｇ／ｋｇ４時間かけて静脈内持続投与した。生食（ｎ＝４）、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）、前述の方法で活性化したＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、あるいはＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）をエンドトキシン投与前に静脈内に投与し、エンドトキシン投与終了後、エーテル麻酔下、腹部大静脈よりクエン酸採血し、血液および血漿を得て、血液中の血小板、血漿中のフィブリノーゲンおよびｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）をそれぞれ、自動血球計測器（Ｓｙｓｍｅｘ２０００、シスメックス製）、フィブリノーゲン測定キット（イアトロセットフィブリノーゲン、ダイヤトロン社製）、ラットＴＮＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて測定した。
その結果、エンドトキシンの投与による血小板数およびフィブリン−ゲンの減少およびＴＮＦの上昇をＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、およびＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）および活性化したＰＴ−ＤＥＬＴＡ４６９、ＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４７０）、およびＰＴ−ＤＥＬＴＡ（４６６−４６８）は抑制した。つまりこの結果から、本発明のヒトプロトロンビン類似体およびヒトメゾトロンビン類似体が、抗凝固作用を有するとともに十分な炎症抑制作用を有することが確認された。特に、ラットエンドトキシン投与による凝固異常のモデルは、エンドトキシン血症、ＤＩＣ、敗血症などの動物モデルとして多用されており、特に、エンドトキシン血症、ＤＩＣや敗血症に対し、有効であることが示された。
以上の実施例により、本発明のヒトプロトロンビン類似体は、活性化されてヒトメゾトロンビン類似体を生ずるが、トロンビンに実質的に変換されないこと、またこのヒトメゾトロンビン類似体が実質的に凝固促進活性を有さず、さらに、ヒトトロンビンに比べ高いプロテインＣ活性化能力を有することが確認された。さらに、ヒトプロトロンビン類似体あるいはヒトメゾトロンビン類似体が、安全に投与可能であり、実際に動物実験において抗凝固活性を有すことが確認され、抗凝固剤として使用可能であり、且つ炎症抑制作用を併せ持ち、特に、エンドトキシン血症、ＤＩＣや敗血症、血栓症等に対して有効であることが確認された。
適用例
以下に上記の各実施例で得られた種々のペプチドの適用例を応用例をもって説明するが、本発明はそれらの応用例によりなんら限定されるものではない。
応用例１
本発明のペプチド                    １０ｍｇ
精製ゼラチン                        ２０ｍｇ
マンニトール                      １００ｍｇ
塩化ナトリウム                    ７．８ｍｇ
リン酸（１および２）ナトリウム  １５．４ｍｇ
上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条件により中性付近の注射用製剤を調製した。すなわち、前記溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒで５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は点滴静注するのに用いられる。また、得られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液１０ｍｌに溶解され、その溶解液は静注するのに用いられる。
応用例２
本発明のペプチド                  ２．５ｍｇ
アルブミン                            ５ｍｇ
マンニトール                        ２５ｍｇ
塩化ナトリウム                  １．９５ｍｇ
リン酸（１および２）ナトリウム  ３．８５ｍｇ
上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条件により中性付近の注射用製剤を調製した。すなわち、前記溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒで５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は点滴静注するのに用いられる。また、得られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液１０ｍｌに溶解され、その溶解液は静注するのに用いられる。
【産業上の利用の可能性】
本発明は、ヒトメゾトロンビン類似体、ヒトプロトロンビン類似体、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含有するプラスミド、および該プラスミドを含有する宿主細胞に関する。さらに本発明は、そのような類似体を含む医薬組成物に関し、これにより、従来よりも有用かつ安全性の高い医薬組成物、特に抗凝固剤が得られた。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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