(57)【要約】式Ｉ：2004018494.tif 000029［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］の化合物，および式ＩＩ：2004018494.tif 000030［式中，Ｂ’はアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］の化合物，これらのヌクレオシド三リン酸を合成する方法，ならびにこれらのヌクレオシド三リン酸を用いてオリゴヌクレオチドを製造する方法が提供される。
2004018494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
2004018494.tif 000019
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物。
【請求項２】
式ＩＩ：
2004018494.tif 000020
［式中，Ｂ’はアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物。
【請求項３】
式Ｉ：
2004018494.tif 000021
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物を合成する方法であって，式ＩＩＩ：
2004018494.tif 000022
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基であり，Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してヒドロキシル基の保護基である］
の化合物を，式ＩＶ：
2004018494.tif 000023
の化合物と反応させ，得られた中間体をピロリン酸と反応させ，次にヨード酸化，加水分解および脱保護することにより式Ｉの化合物を得ることを含む方法。
【請求項４】
式ＩＩ：
2004018494.tif 000024
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物を合成する方法であって，式Ｖ：
2004018494.tif 000025
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基であり，Ｒ２はヒドロキシル基の保護基である］
の化合物を，式ＩＶ：
2004018494.tif 000026
の化合物と反応させ，得られた中間体をピロリン酸と反応させ，次にヨード酸化，加水分解および脱保護することにより式Ｖの化合物を得ることを含む方法。
【請求項５】
式ＶＩ：
2004018494.tif 000027
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
のヌクレオチド単位を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって，請求項１の化合物または請求項３に記載の方法により製造される化合物の存在下で，ＲＮＡ合成酵素によりＲＮＡ鎖伸長反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項６】
式ＶＩＩ：
2004018494.tif 000028
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
のヌクレオチド単位を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって，請求項２の化合物または請求項４記載の方法により製造される化合物の存在下で，ＤＮＡ合成酵素によりＤＮＡ鎖伸長反応を行うことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は，ヌクレオチド類似体およびその製造方法に関する。より詳細には，本発明は，４’−チオリボヌクレオチドおよび４’−チオ−２’−デオキシヌクレオチド，これらのヌクレオチド類似体の製造方法，ならびにこれらのヌクレオチド類似体を用いてオリゴヌクレオチドを製造する方法に関する。
【背景技術】  ４’−チオヌクレオシドはフラノース環の酸素原子が硫黄原子に置換されたヌクレオシドの総称である。
2004018494.tif 000003
４’−チオリボヌクレオシドまたは４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含むＲＮＡまたはＤＮＡは，種々のヌクレアーゼに対して抵抗性を示すため，研究試薬および診断または治療用の薬剤として有用であることが示唆されている。
Ｂｅｌｌｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９９２，１８４，７９７−８０３）は，１−（４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）チミンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの合成を記載する。Ｂｅｌｌｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，１５８７−１５９３），Ｌｅｙｄｉｅｒら（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１９９５，５，１６７−１７４）およびＬｅｙｄｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，１０２７−１０３０）は，４’−チオ−β−Ｄ−オリゴリボヌクレオチドが高いヌクレアーゼ耐性を有することを記載する。
Ｄｕｋｈａｎら（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９９，１８  １４２３−１４２４）は，４種の４’−チオリボヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの合成を記載する。
Ｂｅｌｌｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，１５８７−１５９３）は，４’−チオウリジンのみからなるＲＮＡの分解酵素に対する抵抗性を調べ，天然型Ｕ６と比較して，４’−ＳＵ６が種々の分解酵素に対して遙かに強い抵抗性を示すことを報告している。
一方，デオキシリボヌクレオシドに関しても，いくつかの合成例が報告されている。Ｈａｎｃｏｘら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，３４８５−３４９１）は，４’−チオ−２’−デオキシチミジンおよびこれを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成を記載する。Ｂｏｇｇｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９６，２４，９５１−９６１）は，４’−チオ−２’−デオキシチミジンを含む合成ＤＮＡオリゴマーの構造を記載する。Ｊｏｎｅｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９６，２４，４１１７−４１２２）およびＪｏｎｅｓら（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９７，７，１２７５−１２７８）は，４’−チオ−２’−デオキシヌクレオチドを含む合成ＤＮＡオリゴマーを記載する。Ｋｕｍａｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，２７７３−２７８３）は，４’−チオ−２’−デオキシシチジンを含む合成ＤＮＡオリゴマーを記載する。
しかし，これらのいずれのオリゴリボヌクレオチド，オリゴデオキシリボヌクレオチドも化学合成により製造されている。この方法では，長鎖のオリゴヌクレオチドを得ることは困難であり，かつコストが高い。
４’−チオヌクレオシドからＲＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡポリメラーゼ，リバーストランスクリプターゼ等の酵素を用いてオリゴヌクレオチドを合成するためには，４’−チオヌクレオシドを三リン酸化することが必要である。
Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａら（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｙ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９５，７，２３７−２４２）は，４’−チオ−５−エチル−２’−デオキシウリジン  ５’−三リン酸の合成およびこれがＤＮＡ合成酵素により認識されることを記載する。しかし，この特定の塩基以外の４’−チオデオキシリボヌクレオシド三リン酸または４’−チオリボヌクレオシド三リン酸はこれまでに得られていない。これは，立体選択的合成の困難性のためであると考えられる。
したがって，当該技術分野においては，ＲＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素により認識され伸長されることができる４’−チオヌクレオチドを合成するための新規かつ改良された方法が求められている。
したがって，本発明は，新規ヌクレオシド三リン酸，およびこれを合成する方法，ならびにこれらのヌクレオシド三リン酸を用いてオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明は，式Ｉ：
2004018494.tif 000004
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
で表される４’−チオリボヌクレオチドを提供する。
本発明はまた，式ＩＩ：
2004018494.tif 000005
［式中，Ｂ’はアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
で表される４’−チオ−２’−デオキシヌクレオチドを提供する。
本発明の４’−チオヌクレオチド類は，ＲＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素により認識され伸長されることができるため，ヌクレアーゼに対して抵抗性を有するＲＮＡまたはＤＮＡを合成するためのモノマー単位として有用である。
別の観点においては，本発明は，式Ｉ：
2004018494.tif 000006
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
で表される４’−チオリボヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は，式ＩＩＩ：
2004018494.tif 000007
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基であり，Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してヒドロキシル基の保護基である］
の化合物を，式ＩＶ：
2004018494.tif 000008
の化合物と反応させ，得られた中間体をピロリン酸と反応させ，次にヨード酸化，加水分解および脱保護することを含む。
さらに別の観点においては，本発明は，式ＩＩ：
2004018494.tif 000009
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
で表される４’−チオ−２’−デオキシヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は，式Ｖ：
2004018494.tif 000010
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基であり，Ｒ２はヒドロキシル基の保護基である］
の化合物を，式ＩＶ：
2004018494.tif 000011
の化合物と反応させ，得られた中間体をピロリン酸と反応させ，次にヨード酸化，加水分解および脱保護することを含む。
本発明のさらに別の観点においては，本発明は，式ＶＩ：
2004018494.tif 000012
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
のヌクレオチド単位を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。該方法は，本発明の４’−チオリボヌクレオチドの存在下で，ＲＮＡ合成酵素によりＲＮＡ鎖伸長反応を行うことを特徴とする。ＲＮＡ合成酵素としては，ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本発明のさらに別の観点においては，本発明は，式ＶＩＩ：
2004018494.tif 000013
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
のヌクレオチド単位を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって，本発明の４’−チオ−２’−デオキシヌクレオチドの存在下で，ＤＮＡ合成酵素によりＤＮＡ鎖伸長反応を行うことを特徴とする。ＤＮＡ合成酵素としては，ＤＮＡポリメラーゼ，リバーストランスクリプターゼ，ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが挙げられる。
本発明の方法により製造される，４’−チオリボヌクレオシドまたは４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含むＲＮＡまたはＤＮＡは，種々のヌクレアーゼに対して抵抗性を示すため，研究試薬および診断または治療用の薬剤として有用である。本発明にしたがえば，酵素を用いてオリゴヌクレオチドを合成することができるため，従来の化学合成方法と比較して，より長い鎖のオリゴヌクレオチドを簡便に製造することができる。また，本発明の方法により製造される，４’−チオリボヌクレオシドを含むＲＮＡは，逆転写酵素により認識されるため，これをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成することができ，したがって，インビトロセレクションにおいて用いるのにきわめて有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は，実施例９に記載される４’−チオＵＴＰの合成スキームを示す。
図２は，実施例１０に記載される４’−チオＣＴＰの合成スキームを示す。
図３は，実施例１１に記載される４’−チオＡＴＰの合成スキームを示す。
図４は，実施例１２に記載される４’−チオＧＴＰの合成スキームを示す。
図５は，実施例１３に記載される４’−チオ−２’−デオキシＵＴＰの合成スキームを示す。
図６は，実施例１４に記載される４’−チオ−２’−デオキシＣＴＰ，４’−チオ−２’−デオキシＡＴＰおよび４’−チオ−２’−デオキシＧＴＰの合成スキームを示す。
図７は，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる４’−チオＵＴＰの取り込み実験の概要を示す。
図８は，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる４’−チオＵＴＰの取り込み実験の結果を示す。
図９は，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰの取り込み実験の概要を示す。
図１０は，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰの取り込み実験の結果を示す。
図１１は，４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰを含有するＲＮＡからの逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成実験の概要を示す。
図１２は，４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰを含有するＲＮＡからの逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成実験の結果を示す。
図１３は，４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰを含有するＲＮＡのＲＮａｓｅ耐性を示す。
発明の詳細な説明
本発明のヌクレオシド三リン酸は，公知の４−チオ糖から出発して，糖に塩基を立体選択的に導入し，次に５’位に選択的にリン酸基を導入することにより製造することができる。
４’−チオウリジンは，４−チオ糖
2004018494.tif 000014
の２，３および５位のヒドロキシル基を適切に保護し，プンメラー（Ｐｕｍｍｅｒｅｒ）反応を用いて塩基を立体選択的に導入することにより得ることができる。
2004018494.tif 000015
［式中，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は，独立してヒドロキシル保護基であり，Ｒ１とＲ２，およびＲ２とＲ３は一緒になって二官能性のヒドロキシル保護基であってもよい］。
Ｒ３は，電子供与性の置換基をもつアシル保護基であるほど立体選択性が向上し，好ましくは２，４−ジメトキシベンゾイル基である。
プンメラー反応によって得られた１８のウリジン誘導体は，フッ化アンモニウム，メチルアミンを用いて脱保護をおこない，１９の４’−チオウリジンへと変換することができる。次に，１９の４’−チオウリジンより４’−チオＵＴＰを合成する（図１）。
１９の化合物の５’位をモノメトキシトリチル化および２’，３’位をアセチル化して化合物２０を得る。続いて脱モノメトキシトリチル化を行い，２１のアセチル体を得る。得られた化合物２１より，Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの方法（Ｌｕｄｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，６３１−６３５）を応用して，２４の４’−チオＵＴＰを合成する。すなわち，サリチルホスホロクロリダイトを用いて２２の中間体へと導き，ピロリン酸で処理して２３のシクロトリホスファイト体へ誘導する。次にヨード酸化，加水分解および脱アセチル化を経て，目的物の４’−チオＵＴＰを得ることができる。
２８の４’−チオＣＴＰは，２５のＮ４−ベンゾイル−４’−チオシチジンから，上述の４’−チオＵＴＰと同様の工程により製造することができる（図２）。
４’−チオＩＴＰは，４’−チオヒポキサンチンから，上述の４’−チオＵＴＰと同様の工程により製造することができる。
４’−チオＡＴＰおよび４’−チオＧＴＰは，図３および図４に記載されるスキームにより製造することができる。すなわち，２’，３’位のヒドロキシル基およびプリン環のアミノ基を適切に保護した後，４’−チオＣＴＰの製造と同様に，Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの方法（上述）にしたがってサリチルホスホロクロリダイトと反応させ，次にピロリン酸と反応させてシクロトリホスファイト中間体を得る。続いてヨード酸化，加水分解および脱保護を行うことにより，３２の４’−チオＡＴＰおよび３７の４’−チオＧＴＰを得ることができる。
４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸は，４’−チオリボヌクレオシド三リン酸と同様に製造することができる。出発物質としては４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシドを用い，次に，サリチルホスホロクロリダイトと反応させ，得られた中間体をピロリン酸と反応させ，次にヨード酸化，加水分解および脱保護することにより，目的とする４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を得ることができる（図５，６）。
本発明の４’−チオヌクレオチド類は，ポリメラーゼを用いるＤＮＡまたはＲＮＡの合成反応の基質として用いることができる。本発明の４’−チオリボヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼにより認識されることを確認するためには，適切なテンプレートの存在下でＲＮＡポリメラーゼを作用させて，４’−チオリボヌクレオチドがオリゴマー中に取り込まれるか否かを調べる。実施例１５および１６に示されるように，本発明にしたがって合成した４’−チオヌクレオチドはＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識され，天然のヌクレオチドと同様に合成オリゴマー鎖中に取り込まれることが見いだされた。
すなわち，本発明の別の観点においては，本発明は，４’−チオヌクレオチド類を用いるオリゴヌクレオチドの製造方法を提供する。オリゴヌクレオチドは，本発明の４’−チオヌクレオシド三リン酸の存在下で，ＲＮＡまたはＤＮＡ合成酵素ＲＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素によりオリゴヌクレオチド鎖を伸長させることにより製造することができる。ＲＮＡ合成酵素としては，種々の生物に由来する各種のＲＮＡポリメラーゼを用いることができ，ＤＮＡ合成酵素としては種々の生物に由来するＤＮＡポリメラーゼ，リバーストランスクリプターゼ，ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ等を用いることができる。伸長反応の条件は，用いるポリメラーゼにより様々であるが，当業者は適切な反応条件を選択することができる。反応においては，本発明の４’−チオヌクレオシド三リン酸に加えて，天然のヌクレオシド三リン酸または当該技術分野において知られる修飾ヌクレオシド三リン酸が存在していてもよい。
本発明の方法により得られるオリゴヌクレオチドは，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，プライマー，アプタマー，アンチジーン，ＲＮＡｉ，ｓｉＲＮＡ，プローブ等として，診断，治療および研究試薬として使用することができる。好ましくは，本発明のオリゴヌクレオチドは約６から約５０ヌクレオチドの長さである。本発明のより好適な実施態様においては，オリゴヌクレオチドは約１２から約２０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは，修飾された糖，例えば２’位に置換基を有する糖を含んでいてもよく，アデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシル以外の核酸，例えばヒポキサンチン，５−アルキルシチジン，５−アルキルウリジン，５−ハロウリジン，６−アザピリミジン，６−アルキルピリミジン等を含んでいてもよい。また，ホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合，例えばホスホロチオエート結合を含んでいてもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ耐性および熱安定性が高いため，インビトロおよびインビボにおいて使用するのに適しており，特に遺伝子治療において有用である。また，本発明の４’−チオリボヌクレオシドを含むＲＮＡは逆転写酵素により認識されてｃＤＮＡが合成されるため，インビトロセレクションにおいて用いるのにきわめて有用である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００２−２４２２５９号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
実施例においては，次の略号を用いる
Ｂｚ  ベンゾイル
ＤＭＡＰ  ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＢｚ  ジメトキシベンゾイル
ＤＭＴｒ  ４，４’−ジメトキシトリチル
ＭＭＴｒ  ４−メトキシトリチル
Ｍｓ  メタンスルホニル
Ｔｆ  トリフルオロエタンスルホニル
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＴＩＰＤＳ  １，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル
ＴＭＳ  トリメチルシリル
Ｔｓ  ｐ−トルエンスルホニル
実施例１  ２，３，５−トリ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−Ｄ−リビトール（３）の合成
Ｄ−リボース（６０ｇ，０．４ｍｏｌ）をアリルアルコール（１．８Ｌ，２６．４ｍｏｌ）に溶解し，濃硫酸（６．４ｍＬ，０．１２ｍｏｌ）を０℃にて加え，その後室温にてオーバーヘッドで撹拌した。次いで反応液に重曹を加えて中和し，反応液をセライト濾過した。得られたろ液を減圧下にて溶媒留去し減圧乾燥して，黄色油状の残渣を得た。続いて水素化ナトリウム（６４ｇ，１．６ｍｏｌ）のＴＨＦ（７００ｍＬ）溶液に，０℃下にてＤＭＦ（３００ｍＬ）に溶解した残渣を３時間かけてカニュレーションした。反応液を再び室温に戻し４時間撹拌した後，再度０℃下にて塩化パラメトキシベンジル（１９０ｍＬ，１．４ｍｏｌ）を１０ｍＬ／１５ｍｉｎの速度で滴下した。１００ｍＬ滴下したところで室温に戻しＨ２の発生状況をみながら，慎重に滴下をつづけた。滴下終了後，室温にて撹拌し，１３時間後水素化ナトリウム（４．０ｇ，０．１ｍｏｌ）と塩化パラメトキシベンジル（３０ｍＬ，０．２２ｍｏｌ）を加えて２４時間撹拌し，反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液にて中和した。つづいて酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を水（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。ついで綿栓ろ過後に溶媒を留去し，得られた褐色の残渣を減圧乾燥後，クロロホルム（１．２Ｌ）に溶解し，酸素を封入した。そこに水（８００ｍＬ）を加え塩化パラジウム（２１．２ｇ，０．１２ｍｏｌ）を加え，５０℃にてオーバーヘッドで撹拌した。９時間後に塩化パラジウム（７．０ｇ，０．０４ｍｏｌ）を加え，２８時間後に反応液を室温に戻してセライトろ過し，濃縮した後酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を水（×２），飽和食塩水（×１）で洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。ついで綿栓ろ過後に溶媒を留去し得られた褐色の残渣を減圧乾燥した。残渣を乾燥後，メタノール（１．２Ｌ）に溶解し，アルゴン雰囲気下，０℃にて水素化ホウ素ナトリウム（３０．３ｇ，０．８ｍｏｌ）を加え２０分撹拌後，室温に戻して撹拌した。１時間後，再び０℃にて水素化ホウ素ナトリウム（７．８ｇ，０．２ｍｏｌ）を加え，次いで室温に戻して撹拌した。１．５時間後，反応液の溶媒を留去し，残渣をメタノールにて２回共沸し，残渣を酢酸エチルに溶解し水で分液した。有機層を水（×２），飽和食塩水（×１）で洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。ついで綿栓ろ過後に溶媒を留去し，残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝５：１→１：１）により精製し，化合物３（１６２．４ｇ，７９％）を無色透明の油状物質として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．３０−６．８１（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ），４．６６−４．４０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２），３．９４−３．５３（ｍ，１６Ｈ，Ｈ−１，２，３，４，５，ＭｅＯ×３），２．７１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，４−ＯＨ），２．３６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，１−ＯＨ）．
実施例２  １，４−アンヒドロ−２，３，５−トリ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−４−チオ−Ｄ−リビトール（５）の合成
アルゴン雰囲気下，化合物３（１６２ｇ，０．３２ｍｏｌ）のピリジン溶液（９００ｍＬ）に０℃にて塩化メシル（１２２ｍＬ，１．６ｍｏｌ）を加え，同温度で３０分撹拌した。次いで反応溶液に氷を加え２０分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×２），飽和食塩水（×１）にて洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し，トルエンで３回共沸した。残渣を減圧乾燥した後，アルゴン雰囲気下ＭＥＫ（１Ｌ）に溶解し，室温にて臭化リチウム（２７８ｇ，３．２ｍｏｌ）を加えて加熱還流した。１２時間後反応液を室温に戻し，酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を水（×２），飽和食塩水（×１）にて洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し，得られた残渣を減圧乾燥した後，アルゴン雰囲気下ＤＭＦ（１Ｌ）に溶解し，室温にて硫化ナトリウム・九水和物（９２．２ｇ，０．３８ｍｏｌ）を加え１００℃にて３０分撹拌した。次いで反応溶液を室温に戻し，酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を水（×２），飽和食塩水（×１）にて洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し，得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１０：１→１：１）で粗精製した後，ヘキサン，酢酸エチルより再結晶した。化合物５（６９．１ｇ，４２％）を白色の結晶として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．２６−６．８１（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ），４．５２−４．３８（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２），４．０１−３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．９１（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３，Ｊ３，２＝４．０，Ｊ３，４＝４．０Ｈｚ），３．８０（ｓ，９Ｈ，ＭｅＯ×３），３．６６−３．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．４５−３．４０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ａ，Ｈ−５ｂ），３．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１ａ，Ｊ１ａ，１ｂ＝１０．６，Ｊ１ａ，２＝６．５Ｈｚ），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１ｂ，Ｊ１ｂ，１ａ＝１０．６，Ｊ１ｂ，２，＝５．２Ｈｚ）．
実施例３  １，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（４−メトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−Ｄ−リビトール（１３ｂ）の合成
アルゴン雰囲気下化合物１２（９９７ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１５ｍＬ）に０℃にて，塩化４−メトキシベンゾイル（７２３μＬ，５．１ｍｍｏｌ）を加え，室温にて１８．５時間撹拌した。反応液に氷を加え１０分間撹拌した。次いで，酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し，トルエンで３回共沸した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝５０：１→３５：１）で精製し，化合物１３ｂ（１．３ｇ，９６％）を無色油状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ５２７（ＭＨ＋）．
ＦＡＢ−ＨＬＲＳ  計算値Ｃ２５Ｈ４２Ｏ６ＳＳｉ２（ＭＨ＋）５２７．２３１９．実測値５２７．２３１１．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９５−６．６１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ），５．７１−５．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３  Ｊ３，２＝３．５，Ｊ３，４＝９．４Ｈｚ），４．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５ａ，Ｊ５ａ，４＝２．９，Ｊ５ａ，５ｂ＝１２．６Ｈｚ），３．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５ｂ，Ｊ５ｂ，４＝３．２，Ｊ５ｂ，５ａ＝１２．６Ｈｚ），３．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１β，Ｊ１β，２＝３．２，Ｊ１β，１α＝１２．６Ｈｚ），３．０４（ｍ，６Ｈ，Ｍｅ２Ｎ），２．９１（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１α，Ｊ１α，１β＝１２．６Ｈｚ），１．１３−０．８７（ｍ，２８Ｈ，ＴＩＰＤＳ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６６．４０，１５３．５９，１３１．７３，１１７．３４，１１０．９４，１１０．８１，７５．９５，７５．２１，６０．１６，５１．２９，４０．４４，３１．６０，１７．８４，１７．７７，１７．７０，１７．６６，１７．５２，１７．４５，１３．８７，１３．７５，１３．１５，１３．０９．
実施例４  １，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（４−ジメチルアミノベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−Ｄ−リビトール（１３ｃ）の合成
アルゴン雰囲気下４−ジメチルアミノ安息香酸（１．１ｇ，６．４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（４０ｍＬ）に，塩化チオニル（９３３μＬ，１２．８ｍｍｏｌ）を加えて２時間加熱還流しながら撹拌し，室温に戻して減圧下溶媒を留去した。得られた残渣（５３３ｍｇ）をアルゴン雰囲気下化合物１２（３７５ｍｇ，０．９６ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）に０℃にて加え，室温にて８時間撹拌した。８時間後再び先の残渣を（３５５ｍｇ）を加え，２１時間後ピリジン（５ｍＬ）を加えて５０℃にて６時間加熱した。反応液に氷を加え１０分間撹拌した。次いで，酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し，トルエンで３回共沸した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝５０：１→２０：１）で精製し，化合物１３ｃ（４７６ｍｇ，９２％）を無色油状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ５４０（ＭＨ＋）．
ＦＡＢ−ＨＬＲＳ  計算値Ｃ２６Ｈ４５ＮＯ５ＳＳｉ２（ＭＨ＋）５４０．２６３５．実測値５４０．２６３７．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９５−６．６１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ），５．７１−５．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３  Ｊ３，２＝３．５，Ｊ３，４＝９．４Ｈｚ），４．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５ａ，Ｊ５ａ，４＝２．９，Ｊ５ａ，５ｂ＝１２．６Ｈｚ），３．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５ｂ，Ｊ５ｂ，４＝３．５，Ｊ５ｂ，５ａ＝１２．６Ｈｚ），３．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１β，Ｊ１β，２＝３．２，Ｊ１β，１α＝１２．６Ｈｚ），３．０４（ｍ，６Ｈ，Ｍｅ２Ｎ）２．９１（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１α，Ｊ１α，１β＝１２．６Ｈｚ），１．１３−０．８７（ｍ，２８Ｈ，ＴＩＰＤＳ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６６．４０，１５３．５９，１３１．７３，１１７．３４，１１０．９４，１１０．８１，７５．９５，７５．２１，６０．１６，５０．０３，４０．４４，３１．６０，１７．８４，１７．７７，１７．７１，１７．６７，１７．５２，１７．４５，１３．８７，１３．７５，１３．１５，１３．０９．
実施例５  １，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（４−メトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−Ｄ−リビトール−１−オキシド（１４ｂ）の合成
化合物１３ｂ（１．１ｇ，２．３ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（２０ｍＬ）に−７８℃にてオゾンガスを２０分間バブリングした。反応液にオゾン臭が消えるまでアルゴンをバブリングした後，室温まで昇温した。減圧下溶媒を留去した後，残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝４：１→１：３）で精製し，化合物１４ｂ（１．０ｇ，８２％）を無色あめ状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ５４３（ＭＨ＋）．
ＦＡＢ−ＨＬＲＳ  計算値Ｃ２５Ｈ４２Ｏ７ＳＳｉ２（ＭＨ＋）５４３．２２５３．実測値５４３．２２５１．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．０６−６．９０（ｍ，４Ｈ，Ａｒ），５．８４−５．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５ａ，Ｊ５ａ，５ｂ＝１２．９Ｈｚ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５ｂ，Ｊ５ｂ，４＝２．９，Ｊ５ｂ，５ａ＝１２．９Ｈｚ），４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３  Ｊ３，２＝３．５，Ｊ３，４＝１２．０Ｈｚ），３．８６（ｓ，３Ｈ，ＭｅＯ），３．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１β，Ｊ１β，２＝５．３，Ｊ１β，１α＝１５．５Ｈｚ），３．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ４，５ｂ＝２．１，Ｊ４，３＝１２．０Ｈｚ），２．９３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１α，Ｊ１α，１β＝１５．５Ｈｚ），１．０９−０．８７（ｍ，２８Ｈ，ＴＩＰＤＳ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６５．４２，１６３．８４，１３２．２０，１２２．２４，１１３．９６，７３．３１，７３．１５，６８．４８，５５．７９，５５．７５，５４．５９，１７．７２，１７．６４，１７．５８，１７．５４，１７．５３，１７．４９，１７．３１，１７．３０，１３．８１，１３．５１，１３．０２，１３．００．
実施例６  １−［２−Ｏ−（４−メトキシトリチル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（１５ｂ）
アルゴン雰囲気下，ウラシル（４０８ｍｇ）のトルエン懸濁液（２０ｍＬ）に室温にてトリエチルアミン（１．０ｍＬ，７．３ｍｍｏｌ），ＴＭＳＯＴｆ（２．６ｍＬ，１４．６ｍｍｏｌ）を加え，反応液が二層の溶液になるまで撹拌した。この反応溶液に塩化メチレン（１０ｍＬ）を加え，一層の溶液とし，室温にてこの反応溶液を化合物１４ｂ（９８７ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（２０ｍＬ）に１５分かけて滴下した。続いてトリエチルアミン（１．０ｍＬ，７．３ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０ｍＬ）を室温にて５分かけて滴下した。反応溶液に氷を加え，１０分間撹拌した後酢酸エチルで希釈し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝４９：１→１：１）で精製し，化合物１５ｂ（９０４ｍｇ，７７％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＢＭＳ  ｍ／ｚ  ６３７（ＭＨ＋）．
ＦＡＢ−ＨＬＲＳ  計算値Ｃ２９Ｈ４４Ｎ２Ｏ８ＳＳｉ２（ＭＨ＋）６３７．２４３５．実測値６３７．２４３５．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．２８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ６，５＝８．２），８．０２−６．９４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ），６．０１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ５，６＝８．２，Ｊ５．ＮＨ＝２．１Ｈｚ），５．６２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−２’．Ｊ２’，３’＝３．５），４．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’Ｊ３’，２’＝３．５，Ｊ３’，４’＝９．４Ｈｚ），４．１８−４．０６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ），３．８７（ｓ，３Ｈ，ＭｅＯ），３．７３−３．７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），１．１５−０．８６（ｍ，２８Ｈ，ＴＩＰＤＳ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６４．０１，１６３．３８，１６３．１０，１５０１３，１４０．６５３，１３１．７９，１２１．７３，１１３．５３，１０２．１９，１０２．１７，７８．０６，７１．２４，６２．５４，５７．９２，５５．４０，５５．３９，５０．６９，１７．４７，１７．３６，１７．３４，１７．２７，１６．９９，１６．９６，１６．８３，１６．７９，１３．３４，１３．１８，１３．１０，１３．４８．
実施例７  １−［５−Ｏ−（４−メトキシトリチル）−２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（２０）
アルゴン雰囲気下，１−（４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（１３１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ；化合物１５をＮＨ４Ｆ／ＭｅＯＨ，ＭｅＮＨ２／ＭｅＯＨで脱保護することにより製造）のピリジン（４ｍＬ）溶液に塩化４−メトキシトリチル（２３２ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を加え，室温にて１４時間撹拌した。アルゴン雰囲気下無水酢酸（１８８μＬ，２ｍｍｏｌ），ＤＭＡＰ（５ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を加え室温にて２時間撹拌した。メタノールを加えて３０分撹拌し，反応液を減圧下溶媒留去した。残渣を酢酸エチルに溶解し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝２：１→１：１）で精製し，化合物２０（２１４ｍｇ，７０％）を無色透明の固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．０７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ６，５＝７．９），７．４７−６．８５（ｍ，１４Ｈ，ＭＭＴｒ），６．３７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝７．３），５．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ２’，１’＝７．３，Ｊ２’，３’＝４．０），５．５４−５．５１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），５．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ５，６＝７．９，Ｊ５，ＮＨ＝２．６Ｈｚ），３．８１（ｓ，３Ｈ，ＭｅＯ），３．６２−３．５３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，Ｈ−４’），３．４０−３．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ），２．１２−２．００（ｍ，６Ｈ，ＡｃＯ×２）．
実施例８  １−（２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（２１）
化合物２０（１９９ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を８０％酢酸水溶液に溶解し，室温にて１１時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に滴下し，酢酸エチルで分液した。水層をクロロホルムで７回抽出し，有機層を飽和食塩水（×１）で洗浄し，Ｎａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝２：１→ＡｃＯＥｔ）で精製し，化合物２１（９３ｍｇ，８４％）を白色泡状物質として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．２３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ６，５＝７．９），６．３６（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝７．３），５．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），５．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ２’，１’＝７．３，Ｊ２’，３’＝４．０），５．４９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．１６−４．０４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ａ），３．８６−３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ），３．５６−３．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），２．４２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ），２．１７（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ），２．０６（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ）
実施例９  ４’−チオウリジン５’−三リン酸（２４）
化合物２１（８９ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）をピリジン共沸し，ピリジン（２６０μＬ）に溶解した。アルゴン雰囲気下，ジオキサン（７８０μＬ）を加え，室温にて撹拌した。サリチルホスホロクロリダイト（５８ｍｇ，２．９ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液を加えて１０分撹拌した。０．５Ｍビスブチルアンモニウムピロリン酸のＤＭＦ溶液（７８０μＬ）を加え，ブチルアミン（２６０μＬ）を素早く加え１０分攪拌した。ピリジン／水（９８／２，ｖ／ｖ）中１％ヨウ素（５ｍＬ）を加え，５分攪拌した。５％亜硫酸水素ナトリウム水溶液を数滴加え４０分攪拌した。反応液にアンモニア水を（８ｍＬ）加え３．５時間攪拌し，減圧下溶媒留去した。残渣を水３００ｍＬに溶解し，イオン交換クロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ→１Ｎ  ＴＥＡＢ）にて精製したのち，塩交換カラム（Ｈ＋型）にて精製し，減圧下溶媒留去した。残渣を水５ｍＬに溶解し，塩交換カラム（Ｎａ＋型）にて精製し，減圧下溶媒留去した。化合物２４（８０ｍｇ，５５％）を薄黄色油状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｎａ３Ｏ１４Ｐ３Ｓ（Ｍ＋）５６３．８８９３．実測値５６３．８８９２
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−５．６８（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０．５６（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２１．２７（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ）．
実施例１０  ４’−チオＣＴＰ（２８）の合成（図２）
Ｎ４−ベンゾイル−１−［５−Ｏ−（４−メトキシトリチル）−２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン（２６）
アルゴン雰囲気下，化合物２５（３０２ｍｇ，０．８３ｍｍｏｌ）のピリジン（１０ｍＬ）溶液に塩化４−メトキシトリチル（３８３ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）を加え，室温にて９時間撹拌した。アルゴン雰囲気下，無水酢酸（３１３μＬ，３．３２ｍｍｏｌ）を加え室温にて３時間撹拌した。メタノールを加えて５分撹拌し，反応液を減圧下溶媒留去した。残渣を酢酸エチルに溶解し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝２：１→ＡｃＯＥｔ）で精製し，化合物２６（５７９ｍｇ，９７％）を白色の泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ７２０（ＭＨ＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．８６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ６，５＝７．６），７．８９−７．８８（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ｂｚ），７．６１−７．２７（ｍ，１５Ｈ，ＭＭＴｒ，ｍ−Ｂｚ，ｐ−Ｂｚ，Ｈ−５），６．９０−６．８７（ｍ，２Ｈ，ＭＭＴｒ），６．５３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝６．２），５．７０−５．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），５．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），３．８２（ｓ，３Ｈ，ＭｅＯ），３．６３−３．５６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，Ｈ−４’），３．４６−３．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ），２．０８（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ），２．０６（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ）．
Ｎ４−ベンゾイル−１−（２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）シトシン（２７）
化合物２６（４２０ｍｇ，０５８ｍｍｏｌ）を８０％酢酸水溶液に溶解し，室温にて２４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に滴下し，クロロホルムで分液した。水層をクロロホルムで３回抽出し，有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×１），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：１→ＡｃＯＥｔ→アセトン：ＡｃＯＥｔ＝１：３）で精製し，化合物２７（２３９ｍｇ，９２％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ４４８（ＭＨ＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．１１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．７５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ６，５＝７．６），７．８６−７．８４（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ｂｚ），７．６０−７．４３（ｍ，４Ｈ，Ｈ−５，ｍ−Ｂｚ，ｐ−Ｂｚ），６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝６．７），５．８３−５．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），５．５８−５．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），４．４５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．０７−４．０４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ａ），３．９０−３．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ），３．６１−３．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），２．１１（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ），２．０１（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ）
４’−チオシチジン５’−三リン酸（２８）
化合物２４の合成と同様，化合物２７（７１ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をサリチルホスホロクロリダイト（５０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）と処理することにより，化合物２８（６８ｍｇ，７５％）を白色の粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ９Ｈ１２Ｎ３Ｎａ３Ｏ１３Ｐ３Ｓ（Ｍ−Ｈ）＋５６３．８８９３．実測値５６３．８８９２．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−６．２８（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０．４９（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２１．２４（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ）．
実施例１１  ４’−チオＡＴＰ（３２）の合成（図３）
Ｎ６−ベンゾイル−９−［５−Ｏ−（４−メトキシトリチル）−２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（３０）
アルゴン雰囲気下，化合物２９（７７ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ））のピリジン（２ｍＬ）溶液に塩化４−メトキシトリチル（９２ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）を加え，室温にて撹拌した。１２時間後，さらに塩化４−メトキシトリチル（９２ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）を加え，室温にて撹拌した。２４時間後，反応液に無水酢酸（９４μＬ，１．０ｍｍｏｌ）を加え室温にて１２時間撹拌した。反応液に氷水を加えて５分撹拌した後，減圧下溶媒留去した。残渣を酢酸エチルに溶解し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後，減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：２→ＡｃＯＥｔ）で精製し，化合物３０（１００ｍｇ，６８％）を無色のグラス状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ７３０（ＭＨ＋）．
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．９９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．７４（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．２８（ｍ，１５Ｈ），６．８６（ｍ，２Ｈ），６．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３），６．０２（ｍ，１Ｈ），５．７２（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），２．１４  ａｎｄ  １．９８（ｅａｃｈ  ｓ，ｅａｃｈ  ３Ｈ）．
Ｎ６−ベンゾイル−９−（２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニン（３１）
アルゴン雰囲気下，化合物３０（１０４ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２ｍＬ）溶液に０℃下，トリフルオロ酢酸（２０μＬ）を加えた後，室温に昇温し５時間撹拌した。反応液にトリエチルアミン（１４０μＬ）を加え減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：アセトン＝０：１→１：２）で精製し，化合物３１（５３ｍｇ，７９％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ４７２（ＭＨ＋）．
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．９８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．８１（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ），８．００（ｍ，２Ｈ），７．５９−７．４８（ｍ，３Ｈ），６．２８（ｍ，１Ｈ），６．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３），５．６９（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｍ，１Ｈ），３．６６（ｍ，１Ｈ），２．１６  ａｎｄ  １．９５（ｅａｃｈ  ｓ，ｅａｃｈ  ３Ｈ）．
４’−チオアデノシン５’−三リン酸（３２）
化合物２４の合成と同様，化合物３１（５３ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）をサリチルホスホロクロリダイト（２５ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）と処理することにより化合物３２（４５ｍｇ，６８％）を白色の粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｎａ３Ｏ１２Ｐ３Ｓ（ＭＨ＋）５８９．９２６５．実測値５８９．９２６８．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−５．３０（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０．３９（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２０．８８（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ）．
実施例１２  ４’−チオＧＴＰ（３７）の合成（図４）
Ｎ２−（Ｎ，Ｎ’−ジブチルアミノメチレン）−９−（４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン（３４）
アルゴン雰囲気下，化合物３３（１０６ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液にＮ，Ｎ’−ジブチルホルムアミドジメチルアセタール（３０２μＬ，０，９２ｍｍｏｌ）を加え，室温にて３．５時間撹拌した。反応液を減圧下溶媒留去した後，残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（２０％ＭｅＯＨ  ｉｎ  ＣＨＣｌ３）で精製し，化合物３４（１３９ｍｇ，６９％）を白色の固体として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ１９Ｈ３０Ｎ６Ｏ４Ｓ（ＭＨ＋）４３９．２１５３．実測値４３９．２１５６．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．５４（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），８．０８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８），５．７４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝６．６），５．４８（ｄ，１Ｈ，２’−ＯＨ，Ｊ２’−ＯＨ’，２’＝６．０），５．３１（ｄ，１Ｈ，３’−ＯＨ，Ｊ３’−ＯＨ’，３’＝４．５），５．１４（ｍ，１Ｈ，５’−ＯＨ），４．６０−４．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），４．１９−４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．８０−３．５５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，ｂ），３．４８−３．４８（ｍ，５Ｈ，Ｈ−４’，ｎ−Ｂｕ），１．５６−０．８２（ｍ，１４Ｈ，ｎ−Ｂｕ）．
Ｎ２−（Ｎ，Ｎ’−ジブチルアミノメチレン）−９−［５−Ｏ−（４−メトキシトリチル）−２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］グアニン（３５）
アルゴン雰囲気下，化合物３４（１３５ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）のピリジン（４ｍＬ）溶液に塩化４−メトキシトリチル（１４３ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を加え，室温にて撹拌した。２３時間後，さらに塩化４−メトキシトリチル（４７ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）を加え，室温にて撹拌した。７１時間後，反応液に無水酢酸（１１７μＬ，１．２４ｍｍｏｌ）を加え室温にて３時間撹拌した。反応液にメタノールを加えて５分撹拌した後，減圧下溶媒留去した。
残渣を酢酸エチルに溶解し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後，減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：２→ＡｃＯＥｔ）で精製し，化合物３５（１５８ｍｇ，６４％）を白色の泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ４３Ｈ５０Ｎ６Ｏ７Ｓ（ＭＨ＋）７９５．３５２８．実測値７９５．３５１９．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６４（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），８．４４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．００（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８），７．４７−７．４４（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ｂｚ），７．３５−７．２１（ｍ，１４Ｈ，ＭＭＴｒ，ｍ−Ｂｚ，ｐ−Ｂｚ），６．８６−６．８３（ｍ，２Ｈ，ＭＭＴｒ），６．０８−６．０５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），５．８７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝４．３），５．５６−５．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），３．８０（ｓ，３Ｈ，ＭｅＯ），３．７７−３．７０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ａ），３．４８−３．２９（ｍ，６Ｈ，Ｈ−４’，ｎ−Ｂｕ，Ｈ−５’ｂ），２．０８（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ），２．０１（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ），１．６５−０．９４（ｍ，１４Ｈ，ｎ−Ｂｕ）．
Ｎ２−（Ｎ，Ｎ’−ジブチルアミノメチレン）−９−（２，３−Ｏ−ジアセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン（３６）
アルゴン雰囲気下，化合物３５（１５０ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（３ｍｌ）溶液に０℃下，トリフルオロ酢酸（３０μＬ）を加えた後，室温に昇温し５時間撹拌した。次いで，反応液にトリエチルアミン（１２０μＬ）を加え減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：アセトン＝３：１→１：１）で精製し，化合物３６（９３ｍｇ，９２％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ２３Ｈ３４Ｎ６Ｏ６Ｓ（ＭＨ＋）５２３．２３３９．実測値５２３．２３４６．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．６０（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），８．０７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８），６．１３−６．１１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝６．２），５．６９−５．６７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），５．４３−５．４１（ｍ，１Ｈ，５’−ＯＨ），３．８４−３．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ａ），３．７４−３．６６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ），３．５９−３．５４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．４８−３．３４（ｍ，４Ｈ，ｎ−Ｂｕ），２．０８（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ），１．９７（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯ），１．６１−０．８９（ｍ，１４Ｈ，ｎ−Ｂｕ）．
４’−チオグアノシン５’−三リン酸（３７）
化合物２４の合成と同様，化合物３６（５２ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をサリチルホスホロクロリダイト（２０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）と処理することにより化合物３７（２５ｍｇ，４１％）を白色の粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ１０Ｈ１４Ｎ５Ｎａ３Ｏ１３Ｐ３Ｓ（ＭＨ＋）６０５．９２１５．実測値６０５．９２１４．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−５．１５（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０．４１（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２０．７９（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ），
実施例１３  ４’−チオ−２’−デオキシＵＴＰ（４５）の合成（図５）
１−［２−ブロモ−２−デオキシ−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４０）
化合物３９（７５７ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液にジメチルアミノピリジン（７３３ｍｇ，６．０ｍｍｏｌ），トリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．５ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ）を加え，室温で１０分撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をトルエンで共沸した後，１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）に溶解した。その溶液に臭化リチウム（１９５ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）と三フッ化ホウ素−ジエチルエーテルコンプレックス（２８５μＬ，２．２５ｍｍｏｌ）を加え，５０℃で１．５時間加熱した。反応液に酢酸エチルを加え，水で分液した。有機層を飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝２：１→１：１）で精製し，化合物４０（５６１ｍｇ，６６％）を白色の泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ５６６，５６８（ＭＨ＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６），５．９９（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０  ａｎｄ  ８．６），４．３１（ｍ，１Ｈ），４．１４−３．９８（ｍ，３Ｈ），３．６７（ｍ，１Ｈ），１．５７−０．９２（ｍ，２８Ｈ）．
１−［２−デオキシ−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４１）
化合物４０（５１９ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に水素化トリブチルスズ（３７１μＬ，１．３８ｍｍｏｌ）続いてＶ−７０（５７ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を加え室温で１０分間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１０：１→２：１）で精製し，化合物４１（４４０ｍｇ，９８％）を白色の泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ４８７（ＭＨ＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６），５．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），５．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０  ａｎｄ  ８．６），４．３７（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３  ａｎｄ  １２．５），３．３０（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｍ，１Ｈ），１．６１−０．９４（ｍ，２８Ｈ）．
１−（２−デオキシ−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（４２）
化合物４１（４３７ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液にフッ化アンモニウム（６６６ｍｇ，１８ｍｍｏｌ）を加え，７０℃で加熱還流した。１時間後溶媒を留去し，残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ  ｉｎ  ＣＨＣｌ３＝５％→２５％）で精製し，化合物４２（１９３ｍｇ，８８％）を白色固体として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ２４５（ＭＨ＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６＋Ｄ２Ｏ）δ：７．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９），６．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４  ａｎｄ  ８．０），５．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９），４．３１（ｍ，１Ｈ），３．５４（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，１Ｈ），２．１３（ｍ，２Ｈ）．
１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−アセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４３）
アルゴン雰囲気下，化合物４２（１２２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）のピリジン（３ｍＬ）溶液に塩化４，４’−ジメトキシトリチル（２０３ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を加え，室温にて１２時間撹拌した。アルゴン雰囲気下，無水酢酸（１４１μＬ，３．３２ｍｍｏｌ）を加え室温にて１時間撹拌した。メタノールを加えて５分撹拌し，反応液を減圧下溶媒留去した。残渣を酢酸エチルに溶解し，水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×３），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝２：１→１：２）で精製し，化合物４３（２３３ｍｇ，７９％）を白色の泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ５８９（ＭＨ＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．２４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），７．４２−７．２５（ｍ，９Ｈ），６．８３（ｍ，４Ｈ），６．４４（ｍ，１Ｈ），５．４１（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．５９（ｍ，１Ｈ），３．４８（ｍ，１Ｈ），３．２９（ｍ，１Ｈ），２．４６（ｍ，１Ｈ），２．１１（ｍ，１Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ）．
１−［２−デオキシ−３−Ｏ−アセチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４４）
化合物４３（４２０ｍｇ，０５８ｍｍｏｌ）ジクロロメタン溶液（２ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（２００μＬ）を加え，室温で撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（×２），飽和食塩水（×１）で洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥した。綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：２→ＡｃＯＥｔ）で精製し，化合物４４（３０ｍｇ，３２％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ２８７（ＭＨ＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．２５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），６．４３（ｍ，１Ｈ），５．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），５．４１（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），２．７５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．５０（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ）．
４’−チオ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（４５）
化合物２４の合成と同様，化合物４４（２８ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をサリチルホスホロクロリダイト（３０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）と処理することにより化合物４５（４０ｍｇ，７２％）を白色の粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ９Ｈ１３Ｎ２Ｎａ３Ｏ１３Ｐ３Ｓ（ＭＨ＋）５５０．９０４４．実測値５５０．９０２３．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−６．５１（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０．４２（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２１．０８（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ）．
実施例１４  ４’−チオ−２’−デオキシＣＴＰ（４７），−ＡＴＰ（４９），および−ＧＴＰ（５１）の合成（図６）
４’−チオ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（４７）
化合物２４の合成と同様，化合物４６（３９ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をサリチルホスホロクロリダイト（３０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）と処理することにより化合物４７（３６ｍｇ，６５％）を白色の粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ９Ｈ１４Ｎ３Ｎａ３Ｏ１２Ｐ３Ｓ（ＭＨ＋）５４９．９２０４．実測値５４９．９２１９．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−６．１８（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０．３７（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２１．２１（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ）．
４’−チオ−２’−デオキシアデノシン５’−三リン酸（４９）
化合物２４の合成と同様，化合物４８（４１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をサリチルホスホロクロリダイト（３０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）と処理することにより化合物４９（３５ｍｇ，６１％）を白色の粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ１０Ｈ１４Ｎ５Ｎａ３Ｏ１１Ｐ３Ｓ（ＭＨ＋）５７３．９３１６．実測値５４９．９２３７．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−５．５４（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０，５４（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２０．６４（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ）．
４’−チオ−２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸（５１）
化合物２４の合成と同様，化合物５０（４６ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をサリチルホスホロクロリダイト（３０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）と処理することにより化合物５１（３２ｍｇ，５５％）を白色の粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ  計算値Ｃ１０Ｈ１４Ｎ５Ｎａ３Ｏ１２Ｐ３Ｓ（ＭＨ＋）５８９．９２６５．実測値５８９．９２３９．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０８ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−５．３０（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−１０．６８（ｄ，Ｊ＝２０Ｈｚ），−２０．６０（ｔ，Ｊ＝２０Ｈｚ）．
実施例１５  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる４’−チオＵＴＰのＲＮＡ鎖への取り込み
実施例９で得られた４’−チオＵＴＰを用いて，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた取り込み実験を行った。実験には，Ｔ７プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを用いた（図７）。ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰすべてのヌクレオチドが存在する場合，図に示される相補的な２６ｍｅｒのＲＮＡが合成されるはずである。
反応は，４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ８．０，８ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２ｍＭスペルミジン，５ｍＭ  ＤＴＴ，０．４ｍＭ  ＮＴＰ，１７ｎＭ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ，２．０μＭテンプレートＤＮＡおよび１００ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む２０μＬ中で行った。ＮＴＰはそれぞれ，（１）ＧＴＰ，（２）ＧＴＰ＋ＡＴＰ，（３）ＧＴＰ＋ＡＴＰ＋ＣＴＰ，（４）ＧＴＰ＋ＡＴＰ＋ＣＴＰ＋ＵＴＰ，および（５）ＧＴＰ＋ＡＴＰ＋ＣＴＰ＋４’−チオＵＴＰであった。上記の反応溶液を３７℃で３時間インキュベーションし，反応を停止した。つづいて，２０％変性ポリアクリルアミドゲル（３０×４０×０．０５ｃｍ，１８００Ｖ，１時間，１×ＴＥＢ）にて電気泳動を行い，オートラジオグラフィーにて解析した。
結果を図８に示す。レーン１では，Ｇの２ｍｅｒと３ｍｅｒに対応するバンド，およびラダーが見られた。レーン２では予測された６ｍｅｒで鎖伸長の停止したバンドが観察され，さらに１残基伸長したバンドがわずかに見られた。レーン３では予測された９ｍｅｒで鎖伸長の停止したバンドが観察され，さらに１残基伸長したバンドがわずかに見られた。レーン４では全長産物である２６ｍｅｒのバンドが観察された。ＵＴＰのかわりに４’−チオＵＴＰを用いたレーン５では，レーン４とほぼ同程度の割合で全長産物のバンドが観察された。すなわち，４’−チオＵＴＰも天然のＵＴＰと同様にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより基質として認識され，ＲＮＡ鎖に取り込まれることが示された。
実施例１６  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰのＲＮＡ鎖への取り込み
４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰを用いて，Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた取込み実験を行った。実験には，Ｔ７プロモーター配列を含む４７ｍｅｒ２本鎖ＤＮＡを用いた（図９）。ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰすべてのヌクレオチドが存在する場合，図に示される３０ｍｅｒのＲＮＡが合成されるはずである。
反応は，４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，８ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭスペルミジン，５ｍＭ  ＤＴＴ，０．４ｍＭ  ＮＴＰ，１７ｎＭ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ，２．０μＭテンプレートＤＮＡおよび１００ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む２０μＬ中で行った。ＮＴＰはそれぞれ１）ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ，２）ＵＴＰの代わりに４’−チオＵＴＰを用いた系，３）ＣＴＰの代わりに４’−チオＣＴＰを用いた系，４）ＵＴＰおよびＣＴＰを４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰに置き換えた系であった。上記の反応溶液を３７℃で３時間インキュベートし，反応を停止した。つづいて，２０％変性ポリアクリルアミドゲル（３０Ｘ４０Ｘ０．０５ｃｍ，１８００Ｖ，１時間，１ＸＴＥＢ）にて電気泳動を行い，オートラジオグラフィーにて解析した。
ＵＴＰの代わりに４’−チオＵＴＰを用いた系，ＣＴＰの代わりに４’−チオＣＴＰを用いた系，両ＮＴＰを修飾ＮＴＰに置換した系のいずれにおいても，全長産物である３０ｍｅｒ  ＲＮＡが観察された。天然ＮＴＰを用いた場合の転写効率を１００とした場合の相対効率を図１０に示す。この結果から，４’−チオＵ丁Ｐおよび４’−チオＣＴＰもＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより基質として認識され，ＲＮＡ鎖に効率よく取り込まれることが示された。
実施例１７  ４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰ含有ＲＮＡ鎖からのｃＤＮＡの合成
実施例１６において転写反応によって得られた４’−チオＲＮＡをテンプレートとし，逆転写酵素を用いて，ｃＤＮＡが得られるかについて検討した。本実験を行うためには，より鎖長の長いＲＮＡが必要であり，図１１に示す７６ｍｅｒ２本鎖ＤＮＡをテンプレートとして用いた。まずＧＴＰ，ＡＴＰ，４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰ存在下，Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を行った。反応は実施例１６と同様の条件で行い，効率良く４’−チオＲＮＡへと転写できた。得られた５９ｍｅｒの４’−チオＲＮＡをテンプレートとして逆転写酵素によるｃＤＮＡへの逆転写を行った。
反応は以下の方法で行った。５’末端をラジオラベルしたプライマー４μＬ（２０ｐｍｏｌ），５９ｍｅｒＲＮＡ  ６μＬ（２０ｐｍｏｌ），を混和後それぞれの溶液に以下のｄＮＴＰを加えた。
レーン１：  プライマー
レーン２：  酵素なし
レーン３およびレーン７：  ｄＴＴＰ
レーン４およびレーン８：  ｄＴＴＰ，ｄＴＣＰ
レーン５およびレーン９：  ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ
レーン２およびレーン６およびレーン１０：  ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ
以上各々の反応溶液を７０℃，１５分インキュベートし，ただちに０℃にて１分以上インキュベートした。ついで上記の溶液に０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μＬ，５Ｘファーストストランドバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）４μＬ，ＲＮａｓｅ  Ｏｕｔ  １μＬ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ−リバーストランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを加えた。ただし，レーン２のみはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ−リバーストランスクリプターゼのかわりに滅菌水１μＬを加えた。上記の反応溶液を混和した後４２℃にて５０分間インキュベート後反応を停止し，１２％変性ポリアクリルアミドゲル（３０Ｘ３０Ｘ０．０５ｃｍ，１３００Ｖ，１時間，１Ｘ  ＴＢＥ）にて電気泳動を行い，オートラジオグラフィーにて解析した。結果を図１２に示す。
４’−チオＲＮＡをテンプレートとした場合でも逆転写反応は進行し，天然ＲＮＡをテンプレートとした場合と遜色ない効率でｃＤＮＡへと逆転写できることが明かとなった。また得られたｃＤＮＡはシークエンシングを行い，これにより配列に誤りがないことを確認した。
実施例１８  ４’−チオＵＴＰおよび４’−チオＣＴＰ含有ＲＮＡ鎖のＲＮａｓｅＡ耐性
実施例１６で得られた５９ｍｅｒの４’−チオＲＮＡの酵素耐性の実験をＲＮａｓｅ  Ａを用いて行った。
反応は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．４），５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＨ７．５），３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ＲＮａｓｅ  Ａ  ０．２５ｍＭ，天然型ＲＮＡあるいは４’−チオＲＮＡ  ８０ｐｍｏｌを含む３０μＬ中で行った。上記の反応溶液を０℃にてインキュベートした。サンプリングは３０秒，１分，３分，５分，１０分，３０分，６０分，にて反応溶液４μＬを，１０Ｍ尿素，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ＸＣ（０．１％），ＢＰＢ（０．１％），を含むローディング溶液７μＬと混和し反応を停止させた。つづいて，１６％変性ポリアクリルアミドゲル（３０Ｘ３０Ｘ０．０５ｃｍ，６００Ｖ，１時間３０分，１ＸＴＢＥ）にて電気泳動を行い，オートラジオオグラフィーにて解析した。結果を図１３に示す。
天然型ＲＮＡが３０秒で９０％以上，酵素分解を受ける条件下，４’−チオＲＮＡは高い抵抗性を示し，その半減期は１２分であった。４’−チオＲＮＡの１時間後の完全鎖長産物の残存量は，天然型ＲＮＡの３０秒後の完全鎖長産物の残存量より多いことから，ＲＮａｓｅ  Ａに対して１００倍以上安定であることが明らかとなった。
【配列表】
2004018494.tif 000016
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2004018494.tif 000018
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004018494.tif 000035
【図６】
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【図７】
2004018494.tif 000037
【図８】
2004018494.tif 000038
【図９】
2004018494.tif 000039
【図１０】
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【図１１】
2004018494.tif 000041
【図１２】
2004018494.tif 000042
【図１３】
2004018494.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月25日(2005.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004018494.tif 000044
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物。
【請求項２】
式ＩＩ：
【化２】
2004018494.tif 000045
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物。
【請求項３】
式Ｉ：
【化３】
2004018494.tif 000046
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物を合成する方法であって，式ＩＩＩ：
【化４】
2004018494.tif 000047
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基であり，Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立してヒドロキシル基の保護基である］
の化合物を，式ＩＶ：
【化５】
2004018494.tif 000048
の化合物と反応させ，得られた中間体をピロリン酸と反応させ，次にヨード酸化，加水分解および脱保護することにより式Ｉの化合物を得ることを含む方法。
【請求項４】
式ＩＩ：
【化６】
2004018494.tif 000049
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
の化合物を合成する方法であって，式Ｖ：
【化７】
2004018494.tif 000050
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基であり，Ｒ2はヒドロキシル基の保護基である］
の化合物を，式ＩＶ：
【化８】
2004018494.tif 000051
の化合物と反応させ，得られた中間体をピロリン酸と反応させ，次にヨード酸化，加水分解および脱保護することにより式Ｖの化合物を得ることを含む方法。
【請求項５】
式ＶＩ：
【化９】
2004018494.tif 000052
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，シトシン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
のヌクレオチド単位を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって，請求項１の化合物または請求項３に記載の方法により製造される化合物の存在下で，ＲＮＡ合成酵素によりＲＮＡ鎖伸長反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項６】
式ＶＩＩ：
【化１０】
2004018494.tif 000053
［式中，Ｂはアデニン，グアニン，ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群より選択される核酸塩基である］
のヌクレオチド単位を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって，請求項２の化合物または請求項４記載の方法により製造される化合物の存在下で，ＤＮＡ合成酵素によりＤＮＡ鎖伸長反応を行うことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2004018494.tif 000054
2004018494.tif 000055
2004018494.tif 000056
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