(57)【要約】本発明は、ミトコンドリアＤＮＡに核ＤＮＡと適合するミトコンドリアＤＮＡ（例えば野生型ＤＮＡ）を導入するかあるいは置換した全能性細胞を使用した生殖可能な動物の効率的な作製方法およびそれにより得られる動物である。全能性細胞が近交系マウス由来ＥＳ細胞の場合、テトラプロイドレスキュー法を用いることが望ましい。キメラ動物の作製において、使用する動物に由来する全能性細胞のミトコンドリアＤＮＡを、バッククロス交配法、核置換法などの方法により、野生型のミトコンドリアＤＮＡに置換して４倍体受精卵中に注入し、得られる近交系キメラ動物が出生直後に呼吸障害などで死亡することを回避して、生殖可能な近交系キメラ動物を作製する。得られた生殖可能なキメラ動物は、煩雑な近交化の操作を行うことなく、遺伝子機能解析や動物実験等に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全能性細胞に由来した胚操作動物を作製するにあたって、核ＤＮＡと適合する適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した細胞を用いることを特徴とする動物の作製方法。
【請求項２】
全能性細胞に由来した胚操作動物が、キメラ動物である請求項１に記載の動物の作製方法。
【請求項３】
キメラ動物が近交系キメラ動物である請求項２に記載の動物の作製方法。
【請求項４】
適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞と未処理の宿主胚、未処理の全能性細胞と適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚、若しくは適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞と適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ動物の作製方法。
【請求項５】
動物の宿主胚として４倍体受精卵を、適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した細胞として全能性細胞を用いる請求項４記載の動物の作製方法。
【請求項６】
適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞を４倍体受精卵の胚盤胞中に注入し、テトラプロイドレスキュー法による請求項５に記載の動物の作製方法。
【請求項７】
適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した細胞が、ミトコンドリアＤＮＡを適合型ミトコンドリアＤＮＡに置換した細胞である請求項１〜６のいずれかに記載のキメラ動物の作製方法。
【請求項８】
ドナー細胞の核ＤＮＡに対して適合型ミトコンドリアＤＮＡをもつレシピエント卵子を用いた核移植によるクローン個体の作製方法。
【請求項９】
核ＤＮＡとの不適合が出生直後の呼吸障害を生じるものである請求項１〜８のいずれかに記載の動物の作製方法。
【請求項１０】
適合型ミトコンドリアＤＮＡが野生型由来のミトコンドリアＤＮＡである請求項１〜９のいずれかに記載の動物の作製方法。
【請求項１１】
動物がマウスである請求項１〜１０のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１２】
ミトコンドリアＤＮＡを所望のミトコンドリアＤＮＡに置換する方法が、戻し交配法又は前核置換法のいずれかである請求項１〜１１のいずれかに記載の動物の作製方法。
【請求項１３】
所望のミトコンドリアＤＮＡが野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプである請求項９〜１２のいずれかに記載の動物の作製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により作製され、ミトコンドリアＤＮＡが適合型に導入又は置換され、全能性細胞が生殖系列へ伝播され得る、生殖可能なキメラ動物。
【請求項１５】
動物がマウスである請求項１４記載の動物。
【請求項１６】
ミトコンドリアＤＮＡが適合型で、その形質が生殖系列に伝播され、生殖可能な遺伝子操作動物作製用全能性細胞。
【請求項１７】
核ＤＮＡとの適合が出生直後の呼吸障害を低減せしめるものである請求項１６記載の全能性細胞。
【請求項１８】
ミトコンドリアＤＮＡとして適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入されている請求項１６または１７記載の全能性細胞。
【請求項１９】
適合型ミトコンドリアＤＮＡが野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプである請求項１８記載の全能性細胞。
【請求項２０】
遺伝子操作動物がマウスである請求項１６〜１９のいずれかによる胚性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明は、ノックアウトマウスなどの遺伝子改変動物を作製する場合に、生殖系列への伝播性を示す生殖可能な胚操作動物を効率的に作製する方法に関する。より具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの全能性細胞を作製する場合に、バッククロス交配、細胞融合、ミトコンドリアインジェクション、前核置換、体細胞核移植などにより作製した所望するタイプのミトコンドリアＤＮＡを導入または置換した全能性細胞由来の動物を作製する方法に関する。特に動物種がマウスの場合には、その出生個体の出生率および生存率を改善して生殖可能な近交系生殖系列キメラマウスを効率的に作製する方法に関する。
さらにまた本発明は、上述のいずれかの方法により作製され、ミトコンドリアＤＮＡが核ＤＮＡと不適合が生じない遺伝型である適合型ミトコンドリアＤＮＡであって、全能性細胞が生殖系列へ伝播され、生殖可能なマウスに関する。
［背景技術］
従来、ノックアウトマウスなどのいわゆるジーンターゲッティングされたマウスの作製に先行する技術としてキメラマウスの作製技術がある。キメラマウスの作製は、生殖系列への伝播実績のあるＥＳ細胞を使用して行われている。このような伝播実績があるＥＳ細胞としては、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＢＡマウスの交雑系マウスから樹立したＥＳ細胞株であるＴＴ２細胞や非基準系統（マウスの基準系統はＢＡＬＢ／ｃ，Ｃ５７ＢＬ／６，Ｃ３Ｈの３系統をいう）の１２９系マウスから樹立したＥＳ細胞が使用される。このため遺伝子機能解析などにおける表現型解析や実験動物として利用する場合には、作製した遺伝子改変を行ったマウスにおける目的の遺伝子改変をバッククロス交配法により近交系マウスに導入する必要がある。すなわち、交雑系統や非基準系統のＥＳ細胞を用いて遺伝子改変ＥＳ細胞を作製し、この細胞を用いて生殖系列キメラマウスを作製した後に、得られたヘテロ型の遺伝子改変マウス（通常は雄を使用）をＣ５７ＢＬ／６などの基準系統の近交系マウスへのバッククロス交配を繰り返して行い基準系統に近交化するという煩雑な作業が必要であった。
これに対し、近交系マウスからＥＳ細胞を樹立して近交系の生殖系列キメラマウスを直接作製することが試みられている。しかし上述のＣ５７ＢＬ／６などの近交系マウス由来のＥＳ細胞から、生殖系列キメラマウスを得ることができたという報告はあるものの、実用化には到っておらず、上述のように交雑系を使用しているのが現状である。したがって生殖系列キメラマウスを得るための良好な近交系マウスのＥＳ細胞を取得することは実質的に困難である。
またＥＳ細胞のみで個体発生させることは実質的に不可能といわれている。
一方、ＥＳ細胞からキメラマウスを選択的に作製する方法としてテトラプロイドレスキュー法が考案された（Ｎａｇｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０，８１５−８２１（１９９０））。これは４倍体の受精卵にＥＳ細胞を注入すると、４倍体細胞は胎盤へと発生し、ＥＳ細胞のみが個体へと発生したという知見に基づくものである。この手法をテトラプロイドレスキュー法とよんでいる。しかし、最近のテトラプロイドレスキュー法と核移植の技術を比較検討した報告では、ほとんどの出生個体が出生後に呼吸障害で死亡し、テトラプロイドレスキュー法で作製して得ることができた近交系キメラマウスはＢＡＬＢ／ｃマウスから樹立したＥＳ細胞を用いた場合の１例だけであったと述べられている（Ｅｇｇａｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９８，６２０９−６２１４（２００１））。更に、体細胞核移植技術を用いたクローンマウスの作製においても得られた近交系マウスの出生個体の多くは出生後に呼吸障害で死亡し、生存個体を得ることができたクローンマウスは交雑系マウスの細胞核を使用した場合であることが報告されている（Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，３６９−３７４（１９９８），Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９６，１４８４−１４９８（１９９９），Ｈｕｍｐｈｅｒｙｓ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，９５−９７（２００１））。この様にテトラプロイドレスキュー法により近交系マウスのＥＳ細胞のみから発生したキメラマウスや近交系マウスの体細胞核に由来するクローンマウスでは見かけ上の異常が認められなくても多くの場合呼吸障害が原因で死亡するのである。このような問題は動物種をマウス以外の哺乳動物に変更した場合にも同様の問題が生じると推測される。
また従来のノックアウトマウス作製の成功例は交雑系統のマウス或は非基準系統の１２９系マウスに由来するＥＳ細胞を使用して得られる生殖系列キメラであって、近交系マウスではない。極く稀に、近交系マウス由来のＥＳ細胞を使用した場合にはキメラマウスが作製できたことが報告されているが、その後の報告はない。また成功例の多くの場合は生殖系列への伝播がなく、生殖系列キメラマウスを得ることは、実質的に不可能であった。そして上述のように、テトラプロイドレスキュー法が、近交系キメラマウスの作製に付きまとうこの問題を解決する唯一の手段のように考えられたが、得られた個体の多くは出生直後に呼吸障害により死亡する（Ｅｇｇａｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９８，６２０９−６２１４（２００１））ものであり、実際に生殖可能なキメラマウスを得ることはできなかったのである。
［発明の開示］
本発明者らは上述の状況を鑑み、ミトコンドリアＤＮＡが適合型（核ＤＮＡと不適合が生じないミトコンドリアＤＮＡ、例えば野生型ミトコンドリアＤＮＡ）であって、全能性細胞が生殖系列へ伝播され、生殖可能なキメラ動物等の胚操作動物、特にキメラマウスの作製について鋭意研究を行った。
すなわち、本発明の課題は生殖可能なキメラ動物等の胚操作動物、特に近交系キメラ動物、就中近交系キメラマウス個体を効率的に得ることである。とりわけ、テトラプロイドレスキュー法により得られるキメラ動物作製に使用した近交系動物由来のＥＳ細胞などの全能性細胞から派生する近交系キメラ動物、特に近交系キメラマウスの出生直後の呼吸障害による死亡を回避して、近交系キメラ動物、特に近交系キメラマウスを作製する方法を開発することにある。
特に、本発明の課題はテトラプロイドレスキュー法によるキメラ動物の作製において、使用した近交系動物由来の全能性細胞、例えばＥＳ細胞から派生する近交系キメラ動物、特に近交系キメラマウスの出生直後の呼吸障害による死亡を回避し、生殖可能な近交系キメラ動物、特に近交系キメラマウスを効率的に作製する方法を提供することにある。
また本発明の第二の課題は、上記の作製方法によって得られるキメラ動物等の胚操作動物であって、特に出生直後の呼吸障害による死亡率が低い、ミトコンドリアＤＮＡが適合型ミトコンドリアＤＮＡであって、全能性細胞が生殖系列へ伝播され、生殖可能な近交系キメラマウスを提供することにある。
さらに、本発明の第三の課題は、このような胚操作動物を作製する際に使用する全能性細胞、特に胚性幹細胞に関する。
本発明における全能性細胞は、いかなる細胞にも分化しうる能力を持つ未分化の細胞をいい、このような細胞には、胚性幹細胞、核移植胚などがある。
本発明の特徴は、前記のように生殖可能な胚操作動物、特に生殖可能な生殖系列キメラ動物の作製方法、その方法により作製された生殖可能なキメラ動物、特にキメラマウス、生殖可能な近交系キメラマウス、及びその作製に使用される全能性細胞に関する。
すなわち、本発明は、いわゆるノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスを作製するなどの胚操作された動物、特にキメラマウスに使用可能な方法であって、注入細胞のミトコンドリアＤＮＡに適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入又は置換するか、あるいは宿主胚のミトコンドリアＤＮＡを適合型ミトコンドリアＤＮＡに導入又は置換した細胞を用いるところにある。この場合、適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞と未処理の宿主胚、未処理の全能性細胞と適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚、又は適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞と適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚等を用いることができる。このように作製したキメラ動物は適合型ミトコンドリアＤＮＡを持つこととなる。このような適合型ミトコンドリアＤＮＡには、野生型由来のミトコンドリアＤＮＡ、野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプであるＤＮＡ等が例示される。近交系動物から作製されたＥＳ細胞などの全能性細胞由来の生殖系列キメラ動物、特に完全にＥＳ細胞由来キメラマウスを作製する場合に、４倍体の受精卵に注入する細胞としてミトコンドリアＤＮＡを導入または置換した近交系マウスのＥＳ細胞等の全能性細胞を用いる。かくすることで、得られた近交系キメラマウスは出生直後に呼吸障害などで死亡することを回避でき、かつ生殖可能な近交系キメラマウスが効率的に作製される。
また、これまで近交系マウスのＥＳ細胞を用いてテトラプロイドレスキュー法により選択的にＥＳ細胞から派生する近交系キメラマウスを作製した場合には、得られたキメラマウスの殆どが出生直後に呼吸障害を起こして死亡する。実際にテトラプロイドレスキュー法により生殖可能なキメラマウスを得ることはできなかった。そしてこのテトラプロイドレスキュー法によって得られた出生産仔の殆どが呼吸障害で死ぬ理由として、ＤＮＡのメチル化パターン異常があげられている（Ｄｅａｎ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，２２３７−２２８２（１９９８））。しかし、本発明者らは、前記理由以外にミトコンドリアＤＮＡと核ＤＮＡの不適合が原因であることを初めて確認することができ、近交系マウスに由来するＥＳ細胞のミトコンドリアＤＮＡを野生型マウスのミトコンドリアＤＮＡに変換して核ＤＮＡと適合させることで、出生直後の死亡を回避することができた。そしてこの技術を、近交系の動物（マウス）に応用したところ、生殖系列キメラマウスを効率的に作製できた。胚操作によって作製される動物に適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入されればクローン動物および通常の２倍体キメラ動物でも同様の効果が期待できると考える。
本発明は、以下のような方法、その方法によって作製される胚操作動物、特にキメラ動物、及び全能性細胞を提供するものである。
１．全能性細胞に由来した胚操作動物を作製するにあたって、核ＤＮＡと適合する適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した細胞を用いることを特徴とする動物の作製方法。
２．全能性細胞に由来した胚操作動物が、キメラ動物である前記１の動物の作製方法。
３．  キメラ動物が近交系キメラ動物である前記２の動物の作製方法。
４．適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞と未処理の宿主胚、未処理の全能性細胞と適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚、若しくは適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞と適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した宿主胚を用いる前記１〜３のいずれかの動物の作製方法。
５．動物の宿主胚として４倍体受精卵を、適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した細胞として全能性細胞を用いる前記４の動物の作製方法。
６．適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した全能性細胞を４倍体受精卵の胚盤胞中に注入し、テトラプロイドレスキュー法による前記５の動物の作製方法。
７．適合型ミトコンドリアＤＮＡを導入した細胞が、適合型ミトコンドリアＤＮＡに置換した細胞である前記１〜６のいずれかの動物の作製方法。
８．ドナー細胞の核ＤＮＡに対して適合型ミトコンドリアＤＮＡをもつレシピエント卵子を用いた核移植によるクローン個体の作製方法。
９．核ＤＮＡとの不適合が出生直後の呼吸障害を生じるものである前記１〜８のいずれかの動物の作製方法。
１０．適合型ミトコンドリアＤＮＡが野生型由来のミトコンドリアＤＮＡである前記１〜９のいずれかの動物の作製方法。
１１．動物がマウスである前記１〜１０のいずれかに記載の作製方法。
１２．ミトコンドリアＤＮＡを所望のミトコンドリアＤＮＡに置換する方法が、戻し交配法又は前核置換法のいずれかである前記１〜１１のいずれかの動物の作製方法。
１３．所望のミトコンドリアＤＮＡが野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプである前記９〜１２のいずれかの動物の作製方法。
１４．前記１〜１３のいずれかの方法により作製され、ミトコンドリアＤＮＡが適合型に導入又は置換され、全能性細胞が生殖系列へ伝播され得る、生殖可能なキメラ動物。
１５．動物がマウスである前記１４の動物。
１６．ミトコンドリアＤＮＡが適合型に導入又は置換されており、その形質が生殖系列に伝播され、生殖可能な遺伝子操作動物作製用全能性細胞。
１７．核ＤＮＡとの適合が出生直後の呼吸障害を低減せしめるものである前記１６の全能性細胞。
１８．ミトコンドリアＤＮＡとして適合型ミトコンドリアＤＮＡが導入されている前記１６または１７の全能性細胞。
１９．適合型ミトコンドリアＤＮＡが野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプである前記１８記載の全能性細胞。
２０．遺伝子操作動物がマウスである前記１６〜１９のいずれかによる胚性幹細胞。
［発明を実施するための最良の形態］
本発明の方法で得られる胚操作動物は近交系動物のＥＳ細胞や核移植胚などの全能性細胞を用いてテトラプロイドレスキュー法で得ることが望ましい。したがって生殖系列の細胞を含めてほとんどの細胞は、使用した近交系動物の全能性細胞から派生する動物であり、元来近交系動物である。更に、使用する近交系動物のＥＳ細胞などの全能性細胞は前核置換などにより予めミトコンドリアＤＮＡを野生種動物のそれに置換してあるため、得られるキメラ動物が出生直後に呼吸障害で死亡することなく生育する。したがって、生殖可能なキメラ動物を効率的に得ることができ、得られた生殖系列キメラ動物から遺伝子機能の解析や実験動物として利用できる近交系動物を直接得ることができる。このため近交化のために多大の時間をかけて煩雑な交配を繰り返す必要がなく極めて有用である。このような動物は、通常キメラを作製できることが報告されている動物、特に近交系動物ならば、どのような動物であっても良い。好ましくは哺乳動物が、さらに好ましくはげっ歯類が、特に好ましくはマウスが良い。
これらの動物由来のＥＳ細胞などの全能性細胞を公知の方法で調製し、本発明に使用する。以下の説明は、マウス由来のＥＳ細胞を用いた実施の形態を説明するものであるが、本発明は特に動物種をマウスに限るものではないことは言うまでもない。
マウス由来のミトコンドリアＤＮＡ置換ＥＳ細胞は上述した従来技術によって、細胞内のミトコンドリアＤＮＡの置換を行う。近交系マウスのミトコンドリアＤＮＡの置換は、バッククロス交配法或は核置換法などにより、所望するタイプのミトコンドリアＤＮＡに置換した近交系マウス（多くの場合はＣ５７ＢＬ／６，Ｃ３Ｈ，ＢＡＬＢ／ｃなどの基準系統の近交系マウス）を作製し、このマウスからＥＳ細胞を樹立することで、本発明に使用するミトコンドリアＤＮＡを置換したＥＳ細胞を得ることができる。近交系マウスＣ５７ＢＬ／６のミトコンドリアＤＮＡをバッククロス交配法により野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓと１２回以上の交雑を繰り返すと、そのミトコンドリアＤＮＡが野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置き換えた近交系マウスＢ６−ｍｔＭｕｓが作製できる。このマウスからミトコンドリアＤＮＡを適合型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのＤＮＡに置換したＥＳ細胞を樹立できる。
一方、前核置換法は、常法（ＭｃＧｒａｔｈ  Ｊ  ＆  Ｓｏｌｔｅｒ  Ｄ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２２８，３５５−３６２（１９８３））に従い、近交系マウスｍｄｘの前核期受精卵の雌雄前核を野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのミトコンドリアを有する除核した前核期受精卵に移植し、電気パルスによる核融合を行い培養した後にマウス卵管に移植して個体発生させることにより、ミトコンドリアＤＮＡをＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置き換えた近交系マウスｍｄｘ−ｍｔＭｕｓが作製できる。このマウスから同じくミトコンドリアＤＮＡを野生型に置換したＥＳ細胞を樹立できる。
ＥＳ細胞の樹立にあたっては、この様にして作製した近交系マウス例えばＢ６−ｍｔＭｕｓ又はｍｄｘ−ｍｔＭｕｓの胚盤胞期胚を採取し、常法（Ｅｖａｎｓ  ＭＪ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ  ＭＫ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５４−１５６（１９８１））によりＥＳ細胞を樹立することができる。
以上のような方法で得られた、目的とする形質を有するＥＳ細胞を受精卵の胚好ましくは４倍体の受精卵の胚盤胞期まで分裂した胚に注入してキメラマウスを作製する。
４倍体胚盤胞期胚は、過剰排卵誘起処理を施したＩＣＲマウスを同系統の雄マウスと自然交配させ、プラグを確認した個体から後期２細胞胚を卵管還流法で採取し、電気パルス法により融合処理を施して４倍体胚を調製した後にＭ１６培地、或はＣＺＢ培地中で培養して得ることができる。得られた胚盤胞期胚に対して先述の近交系マウスＢ６−ｍｔＭｕｓ又はｍｄｘ−ｍｔＭｕｓから調製したＥＳ細胞を、例えばピエゾマイクロマニピュレーターなどの顕微注入装置を使用して注入する。そして、得られたＥＳ細胞を注入した胚盤胞期胚を交配、プラグを確認した後、２．５日経過したレシピエントＩＣＲマウスの子宮に移植し、出産前夜（妊娠１８．５日目の夜）に帝王切開によりキメラマウス胎仔を取り出し、蘇生処理を行い、活発に動くことを確認した後に予め準備しておいた里親につけて保育した。得られた出生個体（キメラマウス）の多くが自発呼吸を行い、奇形もあまり認めず正常に発育した。生育したキメラマウスは、生殖系列を含む全ての細胞がＥＳ細胞由来になっており、目的とする動物を継代し、繁殖させることができた。
［実施例］
以下実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
実施例１
ミトコンドリアＤＮＡを置換した近交系マウスの作製
（１）バッククロス交配法によるミトコンドリアＤＮＡをＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置換した近交系Ｂ６−ｍｔＭｕｓ及びＢ６−ＧＦＰ−ｍｔＭｕｓの作製
８週齢の雄の近交系マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊと８週齢の雌の野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓを交配して得られた雌マウス（８週齢）に対し、再び８週齢の雄の近交系マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊを交配するバッククロス交配を繰り返して行った。１２回以上の交雑を繰り返すことでミトコンドリアＤＮＡをＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置換した近交系マウスＢ６−ｍｔＭｕｓを作製した。尚、ミトコンドリアＤＮＡはＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法（Ｋａｎｅｄａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２，４５４２−４５４６（１９９５））で解析してＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置き換えられたことを確認した。
またＢ６−ｍｔＭｕｓ（Ｎ１８）雌にＢ６−ＧＦＰ＃４雄（Ｉｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．）を交配させてＢ６−ＧＦＰ−ｍｔＭｕｓマウスを作製した。
（２）前核置換法による近交系疾患モデルマウスＣ５７ＢＬ／１０Ｊ−ｍｄｘ−ｍｔＭｕｓ（ｍｄｘ−ｍｔＭｕｓ）の作製
３週齢の雌の近交系疾患モデルマウスｍｄｘ（Ｃ５７ＢＬ／１０−ｍｄｘ）および３週齢の雌の野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのミトコンドリアＤＮＡを有する交雑系マウス（♀ＢＡＬＢ−ｍｔＭｕｓ×♂Ｃ５７ＢＬ／６の交雑系マウス（ＣＢＦ１−ｍｔＭｕｓ））に過剰排卵誘起処理（妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を５ＩＵ／０．０５ｍｌ／匹の割合で投与し、その４８時間後に絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を５ＩＵ／０．０５ｍｌ／匹の割合で投与）を施し、８週齢の雄のＩＣＲマウスと同居させることで自然交配し、ｈＣＧ投与後２４時間後に採卵して前核期受精卵を調製した。得られた前核期受精卵を用いて定法（ＭｃＧｒａｔｈ  Ｊ  ＆  Ｓｏｌｔｅｒ  Ｄ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２２８，３５５−３６２（１９８３））に従い前核置換を行った。即ち、ドナー受精卵である上述の近交系疾患モデルマウスＣ５７ＢＬ／１０−ｍｄｘに由来する前核期受精卵の雌雄前核を、レシピエント受精卵である上述の野生型マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのミトコンドリアＤＮＡを有する交雑系マウスＣＢＦ１−ｍｔＭｕｓに由来する除核した前核期受精卵に移植し、電気パルスによる核融合を行い、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ添加Ｍ１６培地（９４．５９ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７８ｍＭ  ＫＣｌ，１．７１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．１９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１．１９ｍＭ  ＭｇＳＯ４，２５．０７ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２３．２８ｍＭ乳酸ナトリウム，０．３３ｍＭピルビン酸ナトリウム，１ｇ／Ｌグルコース，４ｇ／Ｌ  ＢＳＡ，１００ＩＵ／ｍＬペニシリン，５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）中で３７℃，５％  ＣＯ２−５％  Ｏ２−９０％Ｎ２の条件下で一晩培養した後にマウス卵管に移植した。卵管移植は、偽妊娠０．５日目（雌マウスを精管結紮した雄マウスと交配させ、翌日にプラグ確認を行い、その日の正午を０．５日目とした）のＩＣＲ雌マウスの卵管に片側８個づつ計１６個を移植した。その結果、雌３匹と雄２匹の産仔を得た。得られた雌３匹をファウンダーとして８週齢以降に雄のｍｄｘ（Ｃ５７ＢＬ／１０−ｍｄｘ）マウスと同居させ交雑第２代目を得た。同様に交雑第２代目の雌と、雄のｍｄｘマウスとを交配して交雑第３代目を得た。得られた交雑第３代目のミトコンドリアＤＮＡをＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で検定を行った。Ｄ−ｌｏｏｐ内に共通プライマーを設計して（Ｋａｎｅｄａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２，４５４２−４５４６（１９９５）を参考にプライマー作製：５’−ＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣ−３’（配列表配列番号１），５’−ＡＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＡＴＴＧ−３’（配列表配列番号２））、増幅して得られた２６２ｂｐ断片をＤｒａ１制限酵素処理し、断片化されないＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓタイプと１２２ｂｐと１４０ｂｐに断片化されるＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプを検定した。得られた交雑第３代目マウスのミトコンドリアＤＮＡがＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプに置換されたことを確認し、近交系疾患モデルマウスＣ５７ＢＬ／１０Ｊ−ｍｄｘ−ｍｔＭｕｓ（ｍｄｘ−ｍｔＭｕｓ）を作製した。
実施例２
Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのミトコンドリアＤＮＡに置換した近交系マウスからのＥＳ細胞の作製
実施例１の（１）で得られたＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのミトコンドリアＤＮＡに置換した近交系マウスＢ６−ｍｔＭｕｓの雌（Ｎ１５）を雄のＣ５７ＢＬ／６マウスと自然交配させた。プラグを確認した日から３日目の個体の子宮をＭ２培地で灌流し、２０個の胚盤胞期胚を回収し、得られた胚を用いて常法（Ｅｖａｎｓ  ＭＪ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ  ＭＫ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５４−１５６（１９８１））に従いＥＳ細胞を樹立した。即ち、ＥＳ培地（８０％（ｖ／ｖ）ＤＭＥＭ，２０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ，１％（ｖ／ｖ）１００ｍＭピルビン酸溶液（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．１１３６０−０７０），１％（ｖ／ｖ）１００Ｘ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．１１１４０−０２７），１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−６２５０），１０３  Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦを分注した４穴プレートのフィーダー細胞上に先に得られた胚を１個づつ移して３７℃，５％  ＣＯ２−５％  Ｏ２−９０％Ｎ２の条件下で培養した。培養５日目に増殖したＩＣＭ細胞塊を選抜した。０．１２５％トリプシン／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ処理を行い細胞を分散した後に新しく準備した４穴プレートのフィーダー細胞上に播種して培養した。２回目の継代ではＥＳ細胞様コロニーのみを選抜し、１回目と同じ方法で新しい４穴プレートに播種して培養した。３回目の継代はウェル全体をトリプシン／ＥＤＴＡ処理し、新しい３．５ｃｍ培養皿に播種して、良好に増殖する２ラインを得た。ここまで到達できた細胞は、その後も安定して増殖することができたため細胞株として凍結保存した。
また、実施例１の（２）で得られたＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプのミトコンドリアＤＮＡに置換した近交系疾患モデルマウスｍｄｘ−ｍｔＭｕｓから得た６個の胚盤胞期胚を用いて同様の操作を行なうことで４ラインのＥＳ細胞を樹立した。
上述の２系統のマウスから樹立したＥＳ細胞のミトコンドリアＤＮＡを検査したところＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓタイプであることを確認した。
実施例３
４倍体胚盤胞期胚の調製
過剰排卵誘起処理を施したＩＣＲマウスを同系統の雄マウスと自然交配させ、プラグを確認した個体から絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）投与後４４〜４６時間後に卵管還流法で後期２細胞胚を採取した。得られた後期２細胞胚を０．３Ｍマンニトール中で直流電気パルスにより融合処理（ＦＵＪＩＨＩＲＡ製ゴクウ：パルス条件は１８Ｖ，５０μｓｅｃ，９９９μｓｅｃ間隔で３回）を施し４倍体胚を調製した。４倍体胚を選別し、４倍体胚をＭ１６培地、３７℃、５％ＣＯ２−Ａｉｒ中で２日間培養して４倍体胚盤胞期胚を取得した。
実施例４
テトラプロイドレスキュー法によるキメラマウスの作製（１）
実施例３で得られた４倍体胚盤胞期胚に対して、先述の近交系マウスＢ６−ｍｔＭｕｓから調製したＥＳ細胞（性別は雄）をピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。４倍体胚盤胞期胚に対して約１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。７６個の４倍体胚盤胞期胚に注入を行い、良好に注入できた７１個の４倍体胚盤胞期胚をプラグ確認後２．５日目のレシピエントＩＣＲマウス４匹の子宮に移植し、出産前夜（妊娠１８．５日目の夜）に帝王切開によりキメラマウス胎仔を取り出した。蘇生処理を行い活発に動くことを確認した後に予め準備した里親につけて保育した。１３匹の雄の出生個体は奇形も認めず、自発呼吸を行い、４匹が正常に発育した。
実施例５
テトラプロイドレスキュー法によるキメラマウスの作製（２）
実施例３で得られた４倍体胚盤胞期胚に対して、先述の近交系疾患モデルマウスｍｄｘ−ｍｔＭｕｓから調製したＥＳ細胞（性別は雄）をピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。４倍体胚盤胞期胚に対して約１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。１０８個の４倍体胚盤胞期胚に対して注入を行い、良好に注入できた８９個の４倍体胚盤胞期胚をプラグ確認後２．５日目のレシピエントＩＣＲマウス５匹の子宮に移植し、出産前夜（妊娠１８．５日目の夜）に帝王切開により胎仔を取り出した。蘇生処理を行い活発に動くことを確認した後に予め準備した里親につけて保育した。１９匹の雄の出生個体は奇形もほとんど認めず、自発呼吸を行い、１１匹が正常に発育した。
実施例６
テトラプロイドレスキュー法により作製したキメラマウスの作製（３）
実施例３で得られた４倍体胚盤胞期胚に対して、先述の近交系マウスＢ６−ＧＦＰ−ｍｔＭｕｓから調製したＥＳ細胞（性別は雌）をピエゾマイクロマニピュレーターで注入した。４倍体胚盤胞期胚に対して約１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。７５個の４倍体胚盤胞期胚に注入を行い、良好に注入できた７５個の４倍体胚盤胞期胚をプラグ確認後２．５日目のレシピエントＩＣＲマウス３匹の子宮に移植し、出産前夜（妊娠１８．５日目の夜）に帝王切開によりキメラマウス胎仔を取り出した。蘇生処理を行い活発に動くことを確認した後に予め準備した里親につけて保育した。１２匹の雌の出生個体のうち８匹は奇形も認めず、自発呼吸を行った。レシピエントマウスによる育児放棄及び食殺により７匹は死亡したが、残った１匹の産仔は正常に発育した。
実施例７
テトラプロイドレスキュー法により作製したキメラマウスの繁殖確認
実施例１で得られた近交系疾患モデルｍｄｘ−ｍｔＭｕｓから調製したＥＳ細胞から得られたキメラマウス雄２匹を、通常のｍｄｘ−マウスの雌２匹と交配させたところ、３８匹の出生個体を得た。これらのマウスは奇形も認めず、順調に発育した。また各マウス個体はいずれも近交系疾患モデルマウスｍｄｘ（Ｃ５７ＢＬ／１０−ｍｄｘ）の典型的な特性を示し、本発明の方法によって得られたキメラマウスが次世代に正常な子孫を残すことが可能であることを確認することができた。
［産業上の利用の可能性］
本発明の実施によって、生殖可能なキメラ動物、特に近交系キメラ動物、就中近交系キメラマウス個体を効率的に得ることが可能となる。とりわけ、テトラプロイドレスキュー法により得られるキメラ動物の作製に使用した近交系動物由来のＥＳ細胞や核移植胚などの全能性細胞から派生する近交系動物、特にキメラマウスの出生直後の呼吸障害による死亡が回避されて、近交系動物を効率的に作製することが可能となる。また得られたキメラマウスは、核ＤＮＡと適合するミトコンドリアＤＮＡを持ち、全能性細胞が生殖系列へ伝播され、生殖可能な近交系マウスである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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