(57)【要約】ＲＡの診断、ＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質のスクリーニングに有用なオキシダーゼ遺伝子を開示する。また、ＲＡ診断法として有用な検査方法を開示する。更に、前記新規オキシダーゼ遺伝子を利用することによるＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法を開示する。また、前記スクリーニング方法により得ることができる、前記オキシダーゼ阻害剤を有効成分とするＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求の範囲１または、請求の範囲２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求の範囲３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求の範囲４に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
（１）被験者における、
ｉ）請求の範囲３に記載の塩基配列を含む遺伝子、又は
ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子
の発現レベルを測定する工程、及び
（２）健常者における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする、関節リウマチの検査方法。
【請求項７】
ｉ）請求の範囲３に記載の塩基配列を含む遺伝子、又は
ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子
を特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向プライマーを含む関節リウマチ検査用キット。
【請求項８】
（１）請求の範囲１若しくは請求の範囲２に記載のポリペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、前記ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求の範囲１若しくは請求の範囲２に記載のポリペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドの活性を抑制する物質が関節リウマチ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質である、請求の範囲８記載のスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求の範囲８又は請求の範囲９に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、ＲＡ治療用及び／又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なオキシダーゼであるポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞、関節リウマチ（ＲＡと略す）診断に有用な検査方法及びＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼはＮＡＤＰＨから電子を受け取り、それを最終的に酸素分子に渡して活性酸素種（ＲＯＳと略す）を生成する酵素である。生理的には主に食細胞に存在する前記酵素は微生物等の異物の侵入に対し、ＲＯＳを生成し殺菌するような生体防御に重要な働きをしている。しかし、この酵素によるＲＯＳの過剰な生成はタンパク質、ＤＮＡの切断や過酸化脂質による膜の損傷などを引き起こし、細胞および組織の障害、ひいては炎症性疾患、血管病、神経変性疾患、癌、心疾患などをはじめとする様々な疾患の原因となることが知られている（非特許文献１、非特許文献２参照）。しかしながら、ＲＯＳを生成するＮＡＤＰＨオキシダーゼはその発現が全身性に分布するため、創薬の標的としては副作用が懸念されていた。
一方、最近の研究により非食細胞に存在するＮＡＤＰＨオキシダーゼファミリー、ＮＯＸ１が同定され、食細胞以外にもＲＯＳが組織特異的に生成されていることが報告された（非特許文献３参照）。ＮＯＸ１は大腸に多量に存在し、細胞増殖や様々な遺伝子発現誘導を引き起こすことが報告され、大腸における様々な疾患に関わることが示唆されている。
ＮＯＸ１と高い相同性を有するアミノ酸配列及び該配列をコードする塩基配列については種々の報告がある。データベースにおいてアクセッション番号ＡＦ１６６３２８（ＧＥＮＰＥＰＴ）、ＡＪ４３８９８９（ＧＥＮＰＥＰＴ）、ＨＳＡ４３８９８９（ＧＥＮＢＡＮＫ）、ＡＦ１２７７６３（ＧＥＮＰＥＰＴ）、ＡＦ１６６３２７（ＧＥＮＰＥＰＴ）、Ｑ９Ｙ５Ｓ８（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）、及びＱ９ＷＶ８７（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）として登録され、非特許文献４、特許文献１、特許文献２に報告されている。これらの文献には当該分子は大腸癌の診断、大腸癌治療薬の開発に有用である等、大腸に存在し機能する因子として記載されている。特許文献３には、ＮＯＸ１と相同性の高い配列が記載され、当該配列が活性酸素の産生に関わること、癌、前立腺肥大症等の異常細胞増殖に関わる疾患の治療に有用であることが記載されている。
ＲＡは滑膜組織に病変の主座を持ち、関節の発赤、腫脹、熱感、疼痛、運動制限、および破壊をもたらす原因不明の慢性炎症性疾患である。ＲＡの滑膜組織では、インターロイキン−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１、ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカイン、一酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ、ＮＯ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ、ＰＧｓ）などの過剰産生が知られている（非特許文献５参照）。近年、モノクローナル抗体、可溶性受容体などを用い、ＩＬ−１、ＩＬ−６やＴＮＦ−αを標的とした治療法が開発されその有効性が注目を集めている（非特許文献６参照）。しかし、従来の治療標的分子を機序とする治療法では完全寛解導入には至らない患者群が存在する（非特許文献７参照）。従って、既存の報告とは異なる新しい治療標的分子の同定が望まれている。
ＲＯＳは酸化還元制御を介して（非特許文献８参照）、様々な分子を発現誘導する転写因子であるＮＦκＢを活性化することが知られている。ＮＦκＢにより発現誘導を受ける分子のうち炎症性サイトカインとして知られるＴＮＦαは抗ＲＡ薬の標的として（非特許文献９参照）、プロスタグランジンの合成酵素として知られるＣＯＸ−２はＲＡや変形性関節炎の治療薬の標的として広く臨床においても認知されている（非特許文献１０参照）。
一方、米国の大学からＲＡの分類に関する基準が定義されているが（非特許文献１１参照）、これらの基準は単なるランドマークであり、その病状パターンが多様であるため、ＲＡの診断、特に定量的かつ簡便な診断は困難であるとされてきた。定量的かつ簡便なＲＡの診断方法が待望されている。
（特許文献１）国際公開ＷＯ０２／０６５１５号パンフレット
（特許文献２）国際公開ＷＯ０１／９６３９０号パンフレット
（特許文献３）国際公開ＷＯ００／２８０３１号パンフレット
（非特許文献１）「トレンド・イン・ファーマコロジカル・サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，（米国），２０００年，第２１巻，ｐ．１１９−１２０
（非特許文献２）「フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサエティー（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ・Ｓｏｃｉｅｔｙ）」，（独国），１９９１年，第２８１巻，ｐ．９−１９
（非特許文献３）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９９９年，第４０１巻，ｐ．７９−８２
（非特許文献４）「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国），２０００年，第２８７巻，ｐ．１３８
（非特許文献５）「ザ・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，（米国），１９９１年，第１７３巻，ｐ．５６９−５７４
（非特許文献６）「カレント・ファーマシューティカル・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），２０００年，第１巻，ｐ．２１７−２３３
（非特許文献７）「ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，（英国），２００２年，第２巻，ｐ．３６４−３７１
（非特許文献８）「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９９３年，第２６８巻，ｐ．１１３８０−１１３８８
（非特許文献９）「アースライティス・アンド・リウマティズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）」，（米国），１９９９年，第３６巻，ｐ．１６８１−１６９０
（非特許文献１０）「アースライティス・アンド・リウマティズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）」，（米国），１９９８年，第４１巻，ｐ．１５９１−１６０２
（非特許文献１１）ジェー・アックスフォード（Ｊ．Ａｘｆｏｒｄ）編，「メディシン（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，（米国），ブラックウエルサイセンス（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９６年，ｐ３．１８−３．２２
発明の開示
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ヒトＲＡ患者由来滑膜細胞から新規なオキシダーゼ（ＮＯＸ１−ｂと称する）遺伝子全長配列を取得することに成功した。さらに、ＮＯＸ１−ｂ遺伝子は、健常人由来滑膜細胞には発現しておらず、ＲＡ患者由来滑膜細胞に特異的に発現していることを見出し、ＮＯＸ１−ｂ特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを用いることによりＲＡ診断法として有用な検査方法を可能にした。加えて、ＮＯＸ１−ｂ遺伝子を利用することによりＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質のスクリーニング方法を構築した。ＮＯＸ１−ｂが発現していない細胞に比較してＮＯＸ１−ｂが発現している細胞において、ＲＡや変形性関節症治療薬の標的として知られるＣＯＸ−２及びＲＡ治療薬の標的として知られるＴＮＦαの発現が有為に亢進していること、また、このＣＯＸ−２及びＴＮＦαの発現亢進はＮＯＸ１−ｂ阻害剤により阻害されることを明らかにした。これらの結果、新規オキシダーゼＮＯＸ１−ｂ、ＲＡの診断に有用な検査方法及びＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質のスクリーニング方法を提供し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］［１］または、［２］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［４］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［５］［４］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［６］（１）被験者における、
ｉ）［３］に記載の塩基配列を含む遺伝子、又は
ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子
の発現レベルを測定する工程、及び
（２）健常者における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする、関節リウマチの検査方法、
［７］ｉ）［３］に記載の塩基配列を含む遺伝子、又は
ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子
を特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向プライマーを含む関節リウマチ検査用キット、
［８］（１）［１］若しくは［２］に記載のポリペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、前記ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法、
［９］［１］若しくは［２］に記載のポリペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドの活性を抑制する物質が関節リウマチ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質である、［８］記載のスクリーニングする方法、
［１０］［８］又は［９］に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、ＲＡ治療用及び／又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方法
に関する。
配列番号２からなるＮＯＸ１−ｂの全長アミノ酸配列及び該配列をコードする塩基配列と同一な配列に関する報告はないが、高い相同性を有するアミノ酸配列及び該配列をコードする塩基配列については種々の報告がある。データベースＧＥＮＰＥＰＴ及びＧＥＮＢＡＮＫにおいてアクセッション番号ＡＦ１６６３２８として本発明のＮＯＸ１−ｂ配列と１アミノ酸、１塩基異なる配列が登録されている。また、データベースＧＥＮＰＥＰＴ及びＧＥＮＢＡＮＫにおいてアクセッション番号ＡＪ４３８９８９及びＨＳＡ４３８９８９として本発明のＮＯＸ１−ｂ配列と２アミノ酸、４塩基異なる配列が登録されている。しかしながら、いずれにもこれらの配列からなる蛋白質がＲＡ患者の滑膜に発現することやＲＡ治療の標的になることを示唆する記載はない。本発明のポリペプチドと高い相同性を有する蛋白質（配列番号２の第４３２番と第４３３番の間に４９アミノ酸が挿入）がデータベースＧＥＮＰＥＰＴにおいてアクセッション番号ＡＦ１２７７６３、ＡＦ１６６３２７、データベースＳＷＩＳＳＰＲＯＴにおいてアクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｓ８、Ｑ９ＷＶ８７として登録され、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：１３８（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ４０１：７９（１９９９）、ＷＯ０２／０６５１５に報告されている。また、本発明のポリペプチドと高い相同性を有する蛋白質（配列番号２の第８０番と第８１番の間に１６アミノ酸が挿入、第４３２番と第４３３番の間に４９アミノ酸が挿入）がＷＯ０１／９６３９０に報告されている。しかしながら、これらの文献には当該分子は大腸癌の診断、大腸癌治療薬の開発に有用である等、大腸に存在し機能する因子として記載されており、ＲＡとの関連については記載されていない。ＷＯ００／２８０３１には、本発明のポリペプチドと高い相同性を有する蛋白質（配列番号２の第４３２番と第４３３番の間に４９アミノ酸が挿入）が記載され、当該配列が活性酸素の産生に関わることが記載されている。前記蛋白質は大腸に特異的に高発現し、癌、前立腺肥大症などの異常細胞増殖に関わる疾患の治療に有用であることが記載されている。ＲＡは滑膜で診断する必要があるが、当該国際公開パンフレットでは滑膜組織における前記蛋白質の発現は確認しておらず、ＲＡ患者特異的に発現しているか否かも確認していない。更には、前記蛋白質が、ＲＡの原因であるＴＮＦα及びＣＯＸ−２発現量を亢進させるか否かも確認しておらず、ＲＡの検査やＲＡ治療の標的として有用であるという情報はない。
従って、本発明のポリペプチドが健常人由来滑膜には存在せずＲＡ患者由来滑膜に特異的に存在すること、本発明のポリペプチドがＲＡ治療の標的となることは本発明者が初めて見出した知見であり、更には、これらを用いることによりＲＡを検査する方法、ＲＡ治療用物質をスクリーニングする方法は本願発明者が初めて行った発明である。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「ＲＡ」は「関節リウマチ」の略語として用いる。従来ＲＡの日本語訳は「慢性関節リウマチ」であったが、２００２年の日本リウマチ学会においてＲＡの日本語訳を「慢性関節リウマチ」から「関節リウマチ」と変更するとの発表がなされているので、本明細書ではそれに従った。
＜本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチド＞
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド；（以下、機能的等価改変体と称する）
が含まれる。
「本発明の機能的等価改変体」としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド」、あるいは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド」が好ましい。
以上、本発明のポリペプチドについて説明したが、配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド及び本発明の機能的等価改変体を総称して、以下、「本発明のポリペプチド」と称する。「本発明のポリペプチド」のうち、配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＮＯＸ１−ｂ蛋白質」と称する。
本発明のポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」がより好ましい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるＮＯＸ１−ｂ蛋白質、その機能的等価改変体をコードする塩基配列なら何れでもよい。好ましくは、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１記載の塩基配列である。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、新規酵素の発明を開示したＷＯ０１／３４７８５の記載と同様に実施できる。ただし、上記特許出願明細書における「本発明の新規蛋白」を本発明のポリペプチド（例えばＮＯＸ−１ｂ蛋白質）、「本発明の遺伝子」を本発明のポリヌクレオチド（例えばＮＯＸ１−ｂ）と読み替える。詳細には、
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞あるいは組織、例えば、ヒトＲＡ患者由来滑膜からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば配列番号５及び配列番号６で表される配列をプライマーとして、実施例１に記載の方法により目的遺伝子を増幅する。ついで、増幅した遺伝子がＲＡ患者特異的に発現しているか否かを例えば実施例４に記載の方法により確認し、健常人に比してＲＡ患者特異的に発現している遺伝子を本発明のポリヌクレオチドとして選択することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
本発明の発現ベクター、宿主細胞、蛋白質の製造方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。より具体的には、本発明の発現ベクターはほ乳類動物細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢを用い実施例２に記載の方法で、本発明の宿主細胞及び蛋白質はＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクション試薬で形質転換する実施例３に記載の方法で製造できる。
本発明のポリヌクレオチドは、それ自体後述のＲＡの検査方法においてハイブリダイズプローブとして用いることができ、ＲＡの検査に有用である。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の作製や、発現レベルを検出及び／又は定量する際のコントロールとして用いることができる。
＜ＲＡの検査方法／ＲＡ検査用キット＞
後述のように、健常者由来のサンプルにはＮＯＸ１−ｂが発現しておらず、ＲＡ患者由来のサンプルに特異的にＮＯＸ１−ｂが発現していることを見出したことから、この発現を利用してＲＡ疾患を検出することが出来る。具体的には、次の工程を含む態様が例示される。すなわち、
［１］被験者における、
（１）本発明のポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子（すなわち、ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド、ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド、又はｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子）、
又は
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子
の発現レベルを測定する工程、及び
［２］健常者における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
、である。
前記（２）における「配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド」を「本発明における相同ポリペプチド」と称する。本発明における相同ポリペプチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＲＡ患者特異的に発現するポリペプチド」である限り、特に限定されるものではないが、該相同性が、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｎｇｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られたＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓ値を意味する。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、
「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、
「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」を、
それぞれ使用する。
本発明における相同ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと同様の製造方法により製造できる。本発明のポリペプチドと本発明における相同ポリペプチドとを併せて本発明のスクリーニング用ポリペプチドと称する。本発明のスクリーニング用ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが特に好ましい。
本発明のＲＡの検査方法における遺伝子の発現レベルとは、該遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。従って、本発明によるＲＡの検査方法は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＮＯＸ１−ｂ遺伝子）に対応するｍＲＮＡの発現レベル、または、該遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
工程［１］における遺伝子（例えばＮＯＸ１−ｂ遺伝子）の発現レベルを測定する方法は公知の遺伝子解析法に従って実施することが出来る。例えば、ＮＯＸ１−ｂ遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または、ＮＯＸ１−ｂ遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することが出来る。具体的には、被験者から得た滑膜細胞由来の核酸、例えばｍＲＮＡ等を用いて測定することが出来る。ｍＲＮＡ量の測定は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＮＯＸ１−ｂ配列）を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定できる。遺伝子増幅反応方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法などを利用することが出来る。より具体的には、実施例４に記載の方法により実施できる。本発明のＲＡの検査方法に用いられるプライマー、または、ＲＡ検査用キットに含まれるプライマーは、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＮＯＸ１−ｂ配列）を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＮＯＸ１−ｂ塩基配列）に基づいて設計できる。好ましくは、配列番号５及び配列番号６に記載されたオリゴヌクレオチドである。
ハイブリダイゼーション技術を利用したＲＡの検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法などを使用して行うことが出来る。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することにより実施できる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法を用いることにより、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子（例えばＮＯＸ１−ｂ遺伝子）の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いることが出来る。
また、工程［１］において、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する方法として、発現レベルを本発明のスクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質、好ましくは、ＮＯＸ１−ｂ蛋白質の検出によって測定する方法が可能である。このような検査方法としては、例えば、被験者から得た滑膜細胞由来の細胞抽出液を用いて、本発明のスクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質、好ましくはＮＯＸ１−ｂ蛋白質に結合する抗体、より好ましくはＮＯＸ１−ｂに特異的に結合する抗体を利用したウエスタンブロッティング、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することが出来る。
工程［２］においては、工程［１］で得られた発現レベルと健常者における発現レベルと比較するのであれば、比較方法は特に限定されず、例えば実施例４に記載の方法で比較できる。
本発明のＲＡ検査用キットには、少なくとも、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向プライマーが含まれる。順方向及び逆方向プライマー対の例としては、配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるプライマーが挙げられる。本発明のＲＡ検査用キットに含めることが出来る他の試薬としては、ＰＣＲを行うのに必要な試薬（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、緩衝液など）などを挙げることができる。
＜本発明のスクリーニングする方法＞
本発明のスクリーニングする方法には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法と、ＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法とが含まれる。
（１）本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む限り、特に限定されるものではない：
（ｉ）本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程。
好ましくは実施例５に記載の方法により本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
（２）ＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法
背景技術の欄で述べたように炎症性サイトカインとして知られるＴＮＦαはＲＡ治療薬の標的として、プロスタグランジンの合成酵素として知られるＣＯＸ−２はＲＡや変形性関節炎の治療薬の標的として広く臨床においても認知されている。
従って、ＴＮＦα又はＣＯＸ−２の発現量を減少させる物質を選択することにより、ＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングすることができる。後述の実施例に示す様に、本発明のポリペプチドの一つであるＮＯＸ１−ｂを発現する細胞においてＣＯＸ−２発現量及びＴＮＦα発現量が有意に亢進していることが明らかとなった（実施例６及び実施例７）。また、このＣＯＸ−２発現誘導及びＴＮＦα発現誘導がＮＯＸ１−ｂの阻害剤であるＤＰＩにより阻害されたことから、本発明のポリペプチドの一つであるＮＯＸ１−ｂ由来のＲＯＳによる酸化還元制御を介してＣＯＸ−２及びＴＮＦαが発現誘導されていると考えられた。本発明のポリペプチドの活性を抑制することによりＣＯＸ−２発現及び／又はＴＮＦαの発現誘導が抑制されるという本発明者らが見出した新規な知見から、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質は、ＲＡ治療効果を有すると考えられた。即ち、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法は、ＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法として利用できる。
本発明のＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む限り、特に限定されるものではない：
（ｉ）本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程。
上記スクリーニング方法で得られた物質を、ＲＡ治療剤に関する公知の評価系あるいは、それを改良した評価系にかけることにより、ＲＡ治療用物質として有用な物質であるか否かを判定することができる。例えば、ＲＡ治療作用の確認は、コラーゲン誘発関節炎モデルマウス（Ｆｉｏｎａ  Ｈ．Ｄｕｒｉｓら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，７３，１１−１８，１９９４）を用いる方法により行なうことができる。また、上記スクリーニング方法で得られた物質を、変形性関節炎治療剤に関する公知の評価系にかけることにより、変形性関節炎治療用物質として有用な物質であるか否かを判定することができる。
本発明のスクリーニングする方法として、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を分析（測定又は検出）するために用いる方法の違いに基づいて、例えば、
（ａ）化学−生化学的方法
（ｂ）化学発光法
（ｃ）電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）法
などを挙げることができる。各スクリーニング方法について以下に説明する。
（ａ）化学−生化学的方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質、ＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質は、化学−生化学的方法を利用してスクリーニングすることができる。化学−生化学的方法としては、例えば（ｉ）のシトクロムＣ還元法を利用したスクリーニング方法、（ｉｉ）ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の還元を利用したスクリーニング方法、（ｉｉｉ）水溶性テトラゾリウム塩の還元を利用したスクリーニング方法を挙げることができる。シトクロムＣ還元法による検出は酸化型シトクロムＣが還元されると５５０ｎｍに強い吸収をもつ還元型に変わることを利用したものである（Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９））。ＮＢＴ還元法はＮＢＴがＯ２−により還元され水不溶性のブルーホルマザン（吸収極大５６０ｎｍ）を生じることを利用したものである（Ｃ．Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４，２７６（１９７１））。
本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞を調製する。試験物質を添加し、更にプローブ（例えばシトクロムＣ）を適量添加して一定時間インキュベーションする。反応後、５５０ｎｍの吸光度を測定する。試験物質を添加した場合に、還元型への転換が抑制されれば、前記試験物質は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質であると判定することができる。本方法のうちの一つであるシトクロムＣ還元法を利用したスクリーニング方法は、実施例５に記載の条件で実施することが好ましい。本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質としては、１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。
（ｂ）化学発光法
化学発光法としては、例えば（ｉ）ウミホタルルシフェリン誘導体を利用したスクリーニング法、（ｉｉ）ルミノール法を利用したスクリーニング法を挙げることができる。ウミホタルルシフェリン誘導体は中性付近の水溶液でＯ２−と反応して励起カルボニル体を生じ、それが基底状態に遷移する過程で３８０ｎｍに強く発光することを利用したものである（Ｇｏｔｏ，Ｔ：Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ  Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ７，４２１−４４１，１９６８）。ルミノール法による検出はアルカリ水溶液で、Ｏ２−またはＨ２Ｏ２の存在下でＨＯＣｌ、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｋ２Ｓ２Ｏ８、Ｆｅ２＋塩、Ｃｏ３＋などにより酸化されてアミノフタール酸ジアニオン（励起状態）を生じ、それが基底状態に遷移する過程で発光することを利用したものである（Ｒｏｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ：Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ５，４０９−４２３，１９７２）。
本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞を調製する。試験物質を添加し、更にプローブ（例えばウミホタルルシフェリン誘導体）を適量添加して一定時間作用させる。反応後、３８０ｎｍの発光を測定する。試験物質を添加した場合に、発光が抑制されれば、前記試験物質は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質であると判定することができる。本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質としては、１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。
（ｃ）電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）法
Ｏ２−のＥＳＲシグナルは、スピントラップ法を用いることで間接的に測定することができる。つまりＥＳＲ法は短い寿命のラジカル種をトラップ剤と反応させ、生成する安定なラジカルとし、そのＥＳＲスペクトルを解析することを利用したものである。現在用いられている最も汎用性の高いスピントラップ剤は５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）である（Ｙ．Ｎｏｄａ，Ｋ．Ａｎｚａｉ，Ａ．Ｍｏｒｉ，Ｍ．Ｋｏｈｎｏ，Ｍ．Ｓｈｉｎｍｅｉ  ａｎｄ  Ｌ．Ｐａｃｋｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，４２，３５（１９９７））。
本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞を調製する。試験物質を添加し、更にスピントラップ剤（例えばＤＭＰＯ）を適量添加して一定時間作用させる。反応後、ラジカル付加体のスペクトル解析をする。試験物質を添加した場合に、ラジカル付加体のシグナルが抑制されれば、前記試験物質は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質であると判定することができる。本発明のスクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質としては、１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法によって選択対象とする試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の天然成分（例えば、培養上清又は組織抽出物）などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
＜ＲＡ治療用及び／又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、ＲＡ治療用及び／又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニングする方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち、本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
実施例
以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｉｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）等の遺伝子操作実験マニュアルや試薬等に添付のマニュアルに従った。
（実施例１）新規オキシダーゼＮＯＸ１−ｂの取得と全長オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）配列の決定
キアゲン社のＲＮＡ抽出キット（ＲＮＡｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いて東洋紡績社のＲＡ患者由来滑膜細胞（ＨＳ−ＲＡ）よりｍＲＮＡを精製し、スーパースクリプトＩＩ（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いｃＤＮＡに転換することにより作製した自家製のｃＤＮＡを鋳型とした。配列番号３と配列番号４で表されるＮＯＸ１のＯＲＦの外側をコードするオリゴＤＮＡを合成し、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＬＡＴＩＮＵＭＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；インビトロジェン社）を用いて、９４℃１分の後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、６８℃３分のサイクルを３５回のＰＣＲ反応を行った。この反応により得られたｃＤＮＡをクローニングベクター（ＴＡクローニングキット；インビトロジェン社）に挿入（ＮＯＸ１ベクター）し、ジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００  ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）で解析し、ＯＲＦ配列を決定した。この遺伝子をＮＯＸ１−ｂと名付けた。該遺伝子の全長塩基配列を配列番号１に、推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。ＮＯＸ１−ｂのＯＲＦ配列はＮＯＸ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１２７７６３）の第４３３番目から第４８１番目までがスプライシングアウトされた新規蛋白質をコードしていた。
（実施例２）ＮＯＸ１−ｂ全長ＯＲＦのクローニングと蛋白質発現プラスミドの構築
実施例１で作製したＮＯＸ１−ｂベクターをＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切断し、蛋白質発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢ；インビトロジェン社）のＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入して、全長蛋白質発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢ・ＮＯＸ１−ｂを完成した。
（実施例３）ＨｉｓＢ・ＮＯＸ１−ｂの動物細胞株での発現
１０ｃｍプレートにＮＩＨ３Ｔ３細胞（大日本製薬社）を１×１０６細胞でプレーティングして１２時間培養後、実施例２において作製した発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢ・ＮＯＸ１−ｂ及び空ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢを、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ロシュ社製）を用いて添付指示書に従い、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入した。プラスミド導入後１２−１６時間で培地を無血清に置換した後、さらに４８−６０時間培養を継続した。導入細胞をＰＢＳで洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファー（Ｓ．Ｂ）で回収した。Ｓ．Ｂ中に目的蛋白質が存在することをＮＯＸ１蛋白質とＮＯＸ１−ｂ蛋白質共通のＣ末端配列をエピトープとして認識する抗体（ウサギ抗ＭＯＸ抗体；サンタクルズ社製）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、回収した上記Ｓ．ＢをＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社）に電気泳動（還元条件）後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にブロックエース（大日本製薬社）を添加してブロッキングした後、ビオチン化ウサギ抗ＩｇＧ抗体（Ｍ２；シグマ社）、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシア社製）を順次反応させた。反応後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマシャムファルマシア社）を用いて目的蛋白の発現を確認した。ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢ・ＮＯＸ１−ｂ導入細胞より得たサンプルには、分子量５２±０．５ｋＤのバンドが検出されたが、空ベクター導入細胞より得たサンプルにはバンドは検出されず、ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢ・ＮＯＸ１−ｂ導入細胞でＨｉｓＢ・ＮＯＸ１−ｂが発現していることがわかった。
（実施例４）ＲＡ患者由来滑膜細胞におけるＮＯＸ１−ｂ  ｍＲＮＡの発現上昇
実施例１で示したｍＲＮＡ抽出法を用いて、大日本製薬社の健常人由来滑膜細胞（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＳＳ  ｃｅｌｌｓ）から自家製のｃＤＮＡを作製した。配列番号５と配列番号６で表されるＮＯＸ１−ｂ特異的な配列をコードするプローブプライマーを合成し、ＲＡ患者、健常人由来の各サンプル（各鋳型ｃＤＮＡを１、１／１０、１／１００の希釈倍率で希釈したもの）に対してＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；東洋紡績社）を用いて、９４℃１分の後、９４℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを４５回の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。配列番号５で表されるプライマー配列は、ＮＯＸ１がスプライシングアウトされた接続部位、すなわちＮＯＸ１蛋白質の第４３２番目と第４８２番目を接続した部位をコードするヌクレオチド配列であり、よってＮＯＸ１を認識しない配列である。従って、配列番号５と配列番号６によるＰＣＲ産物はＮＯＸ１−ｂ特異的なものである。ＰＣＲ反応物をアガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色によりＤＮＡを検出したところ、ＮＯＸ１−ｂと予想されるサイズのバンドがＲＡ患者由来のサンプルでは認められたが、健常人のサンプルでは認めることができなかった。一方、コントロールである、配列番号７と配列番号８で表されるプライマーを用いたグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）のＰＣＲ反応においては、ＲＡ患者、健常人サンプル共に同様なＥｔＢｒ染色によるバンドが認められた（図１Ａ）。また配列番号１３と配列番号６で表される既知のＮＯＸ１特異的な配列をコードするプローブプライマーを用い、上記と同様にＲＡ患者及び健常人由来の各サンプルを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、ＮＯＸ１−ｂ特異的プローブプライマーを用いたデータと比較した。その結果、ＮＯＸ１−ｂとは異なり、ＮＯＸ１と予想されるサイズのバンドはＲＡ患者由来のサンプルだけではなく、健常人由来のサンプルでも検出された。また、ＲＡ患者由来のサンプルと健常人由来のサンプルとでＥｔＢｒで染色されるＮＯＸ１のバンド量に変化は認められなかった（図１Ｂ）。これらのことより、健常人に対し、ＲＡ患者由来滑膜細胞において、ＮＯＸ１−ｂ発現量が有意に亢進していることが明らかとなった。また、本実施例記載の方法でＲＡ診断の検査が可能であることがわかった。
（実施例５）ＮＯＸ１−ｂのＲＯＳ産生活性
実施例３で示したＮＯＸ１−ｂ発現細胞を用いてシトクロムＣ還元法によりＲＯＳ産生能を測定した。シトクロムＣ還元法によりＲＯＳを測定するために空ベクター発現細胞とＮＯＸ１−ｂ発現細胞を９６穴の細胞培養用マルチウェルプレート（マルチウェルプレートと略す）に０．５×１０６個／１００μｌ／穴の割合で撒いた。約１２時間後に各条件下において４．６２ｍｇ／ｍｌシトクロムＣを１００μｌ／穴加えて混合した後マルチウェルプレートをプレートリーダーにセットし、５５０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。１時間後の積算値を図２に示した。その結果ＮＯＸ１−ｂ発現細胞においては空ベクター発現細胞に比べ顕著なＲＯＳ産生活性を有することが明らかになった。またこの活性は、ＮＡＤＰＨ  Ｏｘｉｄａｓｅ阻害剤として知られるＤｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ  Ｉｏｄｏｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＰＩと略す）１μＭをシトクロムＣ添加の３０分前に加えることにより大きく抑制されることがわかった（図２）。これらのことによりＮＯＸ１−ｂはＲＯＳ産生活性を有し、その活性はＤＰＩにより阻害されることが明らかになった。本実施例の測定法により、ＮＯＸ１−ｂの活性を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
（実施例６）ＮＯＸ１−ｂ発現細胞におけるＣＯＸ−２  ｍＲＮＡの発現上昇
実施例１で示したｍＲＮＡ抽出法を用いて、空ベクター発現細胞及びＮＯＸ１−ｂ発現細胞から各々ｃＤＮＡを作製した。配列番号９と配列番号１０で表されるＣＯＸ−２特異的な配列をコードするプローブプライマーを合成し、空ベクター発現細胞、ＮＯＸ１−ｂ発現細胞由来の各サンプルに対してＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；東洋紡績社）を用いて、９４℃１分の後、９４℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを４５回のＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応物をアガロースゲルに電気泳動し、ＥｔＢｒ染色によりＤＮＡを検出したところ、ＣＯＸ−２と予想されるサイズのバンドが空ベクター由来のサンプルよりもＮＯＸ１−ｂ由来のサンプルで著しく上昇することが確認できた（図３）。一方、コントロールである、配列番号７と配列番号８で表されるプライマーを用いたＧ３ＰＤＨのＰＣＲ反応においては空ベクター発現細胞、ＮＯＸ１−ｂ発現細胞由来のサンプル共に同様なＥｔＢｒ染色によるバンドが認められた（図３）。したがって空ベクター発現細胞に対し、ＮＯＸ１−ｂ発現細胞はＣＯＸ−２発現量が有意に亢進していることが明らかとなった。
ＮＯＸ１−ｂ阻害剤であるＤＰＩを終濃度１μＭとなるようにＮＯＸ１−ｂ発現細胞に添加し、３時間後にｍＲＮＡ抽出法にて調製したサンプルを用いて上記と同様のＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ＮＯＸ−１ｂ発現によるＣＯＸ−２発現誘導がＤＰＩにより阻害されることが明らかになった（図３）。ＣＯＸ−２発現誘導がＤＰＩにより阻害されたことから、ＮＯＸ１−ｂ由来のＲＯＳによる酸化還元制御を介してＣＯＸ−２が発現誘導されたと考えられた。
（実施例７）ＮＯＸ１−ｂ発現細胞におけるＴＮＦα  ｍＲＮＡの発現上昇
配列番号１１と配列番号１２で表されるＴＮＦα特異的な配列をコードするプローブプライマーを合成し、実施例６で調製した各ｃＤＮＡサンプルに対してＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；東洋紡績社）を用いて、９４℃１分の後、９４℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを４５回のＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応物をアガロースゲルに電気泳動し、ＥｔＢｒ染色によりＤＮＡを検出したところ、ＴＮＦαと予想されるサイズのバンドがＮＯＸ１−ｂ発現細胞由来のサンプルでは確認できたが、空ベクター発現細胞由来のサンプルにおいては認めることができなかった。一方、コントロールである、配列番号７と配列番号８で表されるプライマーを用いたＧ３ＰＤＨのＰＣＲ反応においては空ベクター発現細胞、ＮＯＸ１−ｂ発現細胞由来のサンプル共に同様なＥｔＢｒ染色によるバンドが認められた。さらに、ＮＯＸ１−ｂ由来細胞に対しＮＯＸ１−ｂ阻害剤であるＤＰＩを１μＭ、３時間前処理するとＴＮＦα発現誘導が阻害されることが明らかになった（図４）。したがって空ベクター発現細胞に対し、ＮＯＸ１−ｂ発現細胞はＴＮＦα発現量が有意に亢進していることが明らかとなった。また、このＴＮＦα発現誘導はＤＰＩにより阻害されることからも、ＮＯＸ１−ｂ由来のＲＯＳによる酸化還元制御を介して行われていることが考えられる。
産業上の利用可能性
本発明のポリヌクレオチドは、その発現亢進が病態と結びついていることから、ＲＡ診断の指標となることが解かった。本発明のポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによってコードされる本発明のポリペプチドの発現を指標にすることによりＲＡ診断の検査を行うことが可能となった。また、本発明は、ＲＡ患者由来滑膜細胞に特異的に発現する新規オキシダーゼを提供するものであり、その特異的なプライマー配列を用いたＰＣＲによりＲＡ診断の検査へ応用できることが期待される。本発明のスクリーニング方法は、ＲＡ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質のスクリーニングに有用である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＡ患者由来滑膜細胞におけるＮＯＸ１−ｂ  ｍＲＮＡの発現上昇を示す図である。
図２は、ＮＯＸ１−ｂのＲＯＳ産生活性及びＤＰＩによる阻害を示す図である。
図３は、ＮＯＸ１−ｂ発現細胞におけるＣＯＸ−２  ｍＲＮＡの発現上昇とＤＰＩによる阻害を示す図である。
図４は、ＮＯＸ１−ｂ発現細胞におけるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現上昇とＤＰＩによる阻害を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月22日(2005.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項５】（１）被験者における、
ｉ）請求項２に記載のポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子、又は
ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が95％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、RA患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子
の発現レベルを測定する工程、及び
（２）健常者における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする、関節リウマチの検査方法。
【請求項６】ｉ）請求項２に記載のポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子、又は
ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が95％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、RA患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子
を特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向プライマーを含む関節リウマチ検査用キット。
【請求項７】（１）請求項１に記載のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、前記ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド、
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド、
請求項１に記載のポリペプチド、あるいは
配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が95％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド
を発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、関節リウマチ治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法。
【国際調査報告】
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