(57)【要約】本発明は、被験物質と、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドとを接触させ、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を測定し、該被験物質と接触させない場合と比較して、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性が低下する被験物質を選択することを特徴とする、皮膚炎の予防または治療剤に使用される物質のスクリーニング方法、該物質を含有する皮膚炎の予防または治療剤、および該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害することを特徴とする皮膚炎の予防または治療方法に関する。（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質と、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドとを接触させ、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を測定し、該被験物質と接触させない場合と比較して、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性が低下する被験物質を選択することを特徴とする、皮膚炎の予防または治療剤に使用される物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
【請求項２】
被験物質と、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを発現する細胞とを接触させ、インキュベートし、該ポリペプチドの発現量を測定し、該被験物質と接触させない場合と比較して、該ポリペプチドの発現量を低下させる被験物質を選択することを特徴とする、皮膚炎の予防または治療剤に使用される物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
【請求項３】
該ポリペプチドの発現量の測定が、該ポリペプチドを認識する抗体を用いる測定である、請求の範囲第２項記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
抗体を用いる測定が、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウエスタンブロット法および免疫組織染色法から選ばれる測定法を用いる測定である、請求の範囲第３項記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
該ポリペプチドの発現量の測定が、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を測定することによる測定である、請求の範囲第２項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ｍＲＮＡの量の測定が、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を用いる測定である、請求の範囲第５項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
該ポリペプチドの発現量の測定が、該ポリペプチドをコードするＤＮＡと連結したレポーター遺伝子の発現量を測定することによる測定である、請求の範囲第２項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子である、請求の範囲第７項記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを認識する抗体を有効成分として含有する皮膚炎の予防または治療剤。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
【請求項１０】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求の範囲第９項記載の皮膚炎の予防または治療剤。
【請求項１１】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの断片、該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０の塩基配列からなるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体を有効成分として含有する皮膚炎の予防または治療剤。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
【請求項１２】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、請求の範囲第１１項記載の皮膚炎の予防または治療剤。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドの誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、請求の範囲第１１項記載の皮膚炎の予防または治療剤。
【請求項１４】
以下の（ａ）または（ｂ）のＰＬＡ２活性を阻害することを特徴とする皮膚炎の予防または治療方法。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
【請求項１５】
該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の阻害が、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質による阻害である、請求の範囲第１４項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
【請求項１６】
該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、下記一般式（１）で示される化合物である、請求の範囲第１５項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
2003076935.tif 000033
〔式中、Ｒ１は水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、非芳香族炭化水素環もしくは非芳香族複素環と縮合しているアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリール；Ｚは−Ｓ−、−ＳＯ−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ２）−（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル低級アルキル、またはアラルキル）、または単結合；Ｘ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ−（式中、ｑは０〜３の整数）、−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキル、ｒは０〜３の整数）、−ＣＨ２ＮＨＳＯ２−、−（ＣＨ２）５−Ｎ（Ｒ４）−ＣＯ−（式中、Ｒ４は水素原子または低級アルキル、ｓは０〜３の整数）、−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ５）ＣＯＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ５は水素原子または低級アルキル）、−ＣＨ２ＮＨＣＳ−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ６）−ＣＨ２−（式中、Ｒ６は水素原子または低級アルキル、またはアシル）、アルキレン、アルケニレン、または単結合；Ｘ２は置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、複素環ジイル、−Ｃ≡Ｃ−、または単結合；Ｘ３はアルキレン、アルケニレン、または単結合；Ａ、Ｂ、およびＥは、それぞれ独立して酸素原子または硫黄原子；Ｄは水素原子またはヒドロキシ低級アルキル；Ｙ１は−（ＣＨ２）ｍＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ−、−（ＣＨ２）ｍＣＳＮＨ−、−（ＣＨ２）ｍＳＯ２−、−（ＣＨ２）ｍＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＳＯ２−、または単結合、ｍは０〜３の整数、ｎは１〜３の整数；Ｙ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級シクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または置換もしくは非置換のアミノを表し、破線（−−−）は結合の存在または不存在を示し、波線（〜）はＤがＥに対してシスまたはトランスの関係にあることを示す〕
【請求項１７】
該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、下記式（２）に示される化合物である、請求の範囲第１５項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
2003076935.tif 000034
【請求項１８】
該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、該ポリペプチドを認識する抗体である、請求の範囲第１５項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
【請求項１９】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求の範囲第１８項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
【請求項２０】
該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの断片、または該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体である、請求の範囲第１５項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
【請求項２１】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、請求の範囲第２０項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドの誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、請求の範囲第２０または２１項記載の皮膚炎の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、皮膚炎の予防または治療剤、皮膚炎の予防または治療方法、および該予防または治療剤に使用される物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
皮膚炎は外的、内的要因による皮膚の炎症反応であり、皮膚疾患の中で最も多い。皮膚炎には、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、Ｖｉｄａｌ苔癬、自家感作性皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、皮脂欠乏性湿疹、乾癬などが含まれる。
これらの皮膚炎に対する治療剤としては、例えば、ステロイド剤、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤等が用いられているが、いずれも副作用が懸念されるか、あるいは有効性の点で満足できる治療結果が得られていない。
アトピー性皮膚炎、乾癬等の皮膚炎の発症および病態の進行には、脂質メディエイターの産生が関与している可能性が指摘されている〔Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ，９，５２９（２０００）、Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ編，３９〜５３頁，（１９９９），Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ社〕。さらに、脂質メディエイターの産生には、ホスホリパーゼＡ２（以下、ＰＬＡ２と略す）が関与していることが示唆されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１６７０９（１９９７）〕。
したがって、ＰＬＡ２を阻害する物質を見出し、皮膚炎の予防や治療に使用することが望まれている。
細胞質ホスホリパーゼＡ２α（以下、ｃＰＬＡ２αと略す）は皮膚を含む多くの組織で発現が認められるＰＬＡ２である。したがって、皮膚炎を効果的に予防あるいは治療するためにはｃＰＬＡ２を阻害する物質を使用することが好ましい。
ｃＰＬＡ２には、さらにｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β、およびｃＰＬＡ２γの３つのサブタイプがあることが知られている。ｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β、およびｃＰＬＡ２γはそれぞれ分子量８５キロダルトン、１１０キロダルトン、および６０キロダルトンの酵素であり、いずれも殆どの組織で普遍的に発現している〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，８８２３（１９９９）〕。また、ｃＰＬＡ２は触媒ドメイン中に５つのアミノ酸からなる保存性の高い領域を有しており、それぞれ、該領域のＮ末端側から２番目のアミノ酸が、ｃＰＬＡ２αではロイシンであり、ｃＰＬＡ２βではアラニンであり、ｃＰＬＡ２γではバリンとなっている以外は共通であることがわかっている。
各サブタイプの機能として、ｃＰＬＡ２αは、刺激に伴って惹起された細胞内Ｃａ２＋濃度の一過的な上昇により核周辺膜へ移行し、アラキドン酸を持つ膜リン脂質を選択的に加水分解することが知られている。遊離されたアラキドン酸は核膜周辺に局在しているシクロオキシゲナーゼ−２や５−リポキシゲナーゼなどのアラキドン酸代謝関連酵素により脂質メディエイターに代謝される。すなわち、ｃＰＬＡ２αは刺激による脂質メディエイター産生に関与していると考えられている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１６７０９（１９９７）〕。一方、ｃＰＬＡ２βおよびｃＰＬＡ２γの生理的機能はまだ分かっていない。
ｃＰＬＡ２αを阻害する物質としては、ピロリジン誘導体〔ＷＯ０１／３０３８７、ＷＯ９８／３３７９７、ＷＯ９７／０５１３５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，１０４１（２０００）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１，５８７（２０００）、またはＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１５１３，１６０（２００１）〕、トリフルオロメチルケトン誘導体（ＷＯ９９／１５１２９）、インドール誘導体（ＷＯ９８／０５６３７、ＷＯ９９／４３６５４、ＷＯ９９／４３６７２）、置換ピリミジン誘導体（ＷＯ００／２７８２４）、オキサ（チア）ゾリジン誘導体（ＷＯ０１／７２７２３）などが知られており、ＢＭＳ−２２９７２４〔４−［４−［２−［２−［ｂｉｓ（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］−１，１，１−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ−２−ｂｕｔａｎｏｎｅ〕が皮膚炎モデルで有効性を示すことが報告されている〔Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９８，３７６（２００１）〕。
しかし、ｃＰＬＡ２αを阻害する物質がすべて、抗皮膚炎活性を有するかどうかは確認されていない。
一方、ｃＰＬＡ２αと相同性の高いＰＬＡ２活性を有するポリペプチドがいくつか報告され（ＷＯ０１／５３３２６、ＷＯ０２／０４４９０）、該ポリペプチドのアンタゴニストの多岐にわたる用途の一つとして皮膚疾患の治療があげられている（ＷＯ０２／０４４９０）が、これらのアンタゴニストが、皮膚疾患に実際に使用できることは実証されていない。
発明の開示
本発明の目的は、皮膚炎の予防または治療剤、皮膚炎の予防または治療方法、および該予防または治療剤に使用される物質のスクリーニング方法を提供することにある。
即ち、本発明は以下の（１）〜（２２）の発明に関する。
（１）  被験物質と、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドとを接触させ、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を測定し、該被験物質と接触させない場合と比較して、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性が低下する被験物質を選択することを特徴とする、皮膚炎の予防または治療剤に使用される物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（２）  被験物質と、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを発現する細胞とを接触させ、インキュベートし、該ポリペプチドの発現量を測定し、該被験物質と接触させない場合と比較して、該ポリペプチドの発現量を低下させる被験物質を選択することを特徴とする、皮膚炎の予防または治療剤に使用される物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（３）  該ポリペプチドの発現量の測定が、該ポリペプチドを認識する抗体を用いる測定である、上記（２）のスクリーニング方法。
（４）  抗体を用いる測定が、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウエスタンブロット法および免疫組織染色法から選ばれる測定法を用いる測定である、上記（３）のスクリーニング方法。
（５）  該ポリペプチドの発現量の測定が、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を測定することによる測定である、上記（２）のスクリーニング方法。
（６）  ｍＲＮＡの量の測定が、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を用いる測定である、上記（５）のスクリーニング方法。
（７）  該ポリペプチドの発現量の測定が、該ポリペプチドをコードするＤＮＡと連結したレポーター遺伝子の発現量を測定することによる測定である、上記（２）のスクリーニング方法。
（８）  レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子である、上記（７）のスクリーニング方法。
（９）  以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを認識する抗体を有効成分として含有する皮膚炎の予防または治療剤。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（１０）  抗体が、モノクローナル抗体である、上記（９）の皮膚炎の予防または治療剤。
（１１）  以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの断片、または該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０の塩基配列からなるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体を有効成分として含有する皮膚炎の予防または治療剤。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（１２）  配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（１１）の皮膚炎の予防または治療剤。
（１３）  オリゴヌクレオチドの誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、上記（１１）の皮膚炎の予防または治療剤。
（１４）  以下の（ａ）または（ｂ）のＰＬＡ２活性を阻害することを特徴とする皮膚炎の予防または治療方法。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（１５）  該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の阻害が、該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質による阻害である、上記（１４）の皮膚炎の予防または治療方法。
（１６）  該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、下記一般式（１）で示される化合物である、上記（１５）の皮膚炎の予防または治療方法。
2003076935.tif 000002
〔式中、Ｒ１は水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、非芳香族炭化水素環もしくは非芳香族複素環と縮合しているアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリール；Ｚは−Ｓ−、−ＳＯ−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ２）−（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル低級アルキル、またはアラルキル）、または単結合；Ｘ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ−（式中、ｑは０〜３の整数）、−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキル、ｒは０〜３の整数）、−ＣＨ２ＮＨＳＯ２−、−（ＣＨ２）ｓ−Ｎ（Ｒ４）−ＣＯ−（式中、Ｒ４は水素原子または低級アルキル、ｓは０〜３の整数）、−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ５）ＣＯＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ５は水素原子または低級アルキル）、−ＣＨ２ＮＨＣＳ−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ６）−ＣＨ２−（式中、Ｒ６は水素原子または低級アルキル、またはアシル）、アルキレン、アルケニレン、または単結合；Ｘ２は置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、複素環ジイル、−Ｃ≡Ｃ−、または単結合；Ｘ３はアルキレン、アルケニレン、または単結合；Ａ、Ｂ、およびＥは、それぞれ独立して酸素原子または硫黄原子；Ｄは水素原子またはヒドロキシ低級アルキル；Ｙ１は−（ＣＨ２）ｍＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ−、−（ＣＨ２）ｍＣＳＮＨ−、−（ＣＨ２）ｍＳＯ２−、−（ＣＨ２）ｍＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＳＯ２−、または単結合、ｍは０〜３の整数、ｎは１〜３の整数；Ｙ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級シクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または置換もしくは非置換のアミノを表し、破線（−−−）は結合の存在または不存在を示し、波線（〜）はＤがＥに対してシスまたはトランスの関係にあることを示す〕
（１７）  該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、下記式（２）に示される化合物である、上記（１５）の皮膚炎の予防または治療方法。
2003076935.tif 000003
（１８）  該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、該ポリペプチドを認識する抗体である、上記（１５）の皮膚炎の予防または治療方法。
（１９）  抗体が、モノクローナル抗体である、上記（１８）の皮膚炎の予防または治療方法。
（２０）  該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する活性を有する物質が、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの断片、該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０の塩基配列からなるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体である、上記（１５）の皮膚炎の予防または治療方法。
（２１）  配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（２０）の皮膚炎の予防または治療方法。
（２２）  オリゴヌクレオチドの誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、上記（２０）または（２１）の皮膚炎の予防または治療方法。
（ａ）本発明に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡ
本発明に用いられるポリペプチドとして、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列情報をもとにして、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により製造することができる。また、アドバンスド・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、プロテイン・テクノロジー・インストルメント（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）社、シンセセル・ベガ（Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ）社、パーセプティブ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換えベクターを造成し、該組換えベクターを宿主細胞に導入することにより、該ポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、該ポリペプチドを製造し、取得することもできる。
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡは、配列番号２記載の塩基配列情報に基づき、ＤＮＡ合成機で化学合成して取得することができる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、ホスホアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅ１３９２等をあげることができる。
本発明に用いられるポリペプチドとして、さらに、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列において配列番号１記載のアミノ酸配列をコードしている領域の塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性のある塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
該ＤＮＡは、例えば、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡに、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、部位特異的変異を導入して得てもよいし、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等のＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成して得てもよい。
ＰＬＡ２活性の触媒ドメインとは、ポリペプチドが、グリセロリン脂質のｓｎ−２位のエステル結合を加水分解し、脂肪酸とリゾリン脂質を生成する活性（ＰＬＡ２活性）を呈するために必要なドメインを示す。例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３１４〜５６２番目のアミノ酸配列および第６６１〜８４９番目のアミノ酸配列をあげることができる。
配列番号１８に示されるアミノ酸配列は、ｃＰＬＡ２のサブタイプにおいて、Ｎ末端側から２番目のアミノ酸以外は共通するアミノ酸配列であって、本発明に用いられるポリペプチドでは、該２番目のアミノ酸は、バリンである。
なお、本発明に用いられるポリペプチドの保存領域とｃＰＬＡ２のサブタイプの一つである、ｃＰＬＡ２γの保存領域は同一のアミノ酸配列を有しているが、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡとｃＰＬＡ２γをコードする塩基配列の相同性は４７％であり、上記ストリンジェントな条件下では互いにハイブリダイズしないことから、ｃＰＬＡ２γは本発明に用いられるポリペプチドには包含されない。
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＰＬＡ２活性を有するポリペプチドであって、かつ該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の触媒ドメイン中に配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列情報をもとにして、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により製造することができる。また、アドバンスド・ケムテック社、パーキン・エルマー社、ファルマシア社、プロテイン・テクノロジー・インストルメント社、シンセセル・ベガ社、パーセプティブ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。さらに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換えベクターを造成し、該組換えベクターを宿主細胞に導入することにより、該ポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、該ポリペプチドを製造し、取得することもできる。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記のように化学合成して得ることもできるが、例えば、配列番号２記載の塩基配列情報をもとに該ＤＮＡの一部の塩基配列を含有するプローブを作製し、各種臓器または各種細胞由来のｃＤＮＡライブラリーに対してコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）等を行うことにより、該ＤＮＡを有するｃＤＮＡクローンを選択して得ることもできる。
各種臓器または各種細胞由来のｃＤＮＡライブラリーは、常法または市販されているキットに従って作製することができる。例えば以下に示す方法で作製できる。
各種臓器または各種細胞から全ＲＮＡを、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）〕、酸性グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）、及び実験医学９，１９３７（１９９１）〕等を用いて調製する。
全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）やオリゴｄＴラテックスを用いる方法等を用いて調製する。
ファースト・トラック・ｍＲＮＡ単離キット〔Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ精製キット〔Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕等のキットを用いて組織や細胞から直接ｍＲＮＡを調製することもできる。
得られた全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを用い、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法として、モレキュラー  クローニング  第２版やカレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕を用いる方法等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。
具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ〔クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）、λＥｘＣｅｌｌ〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕等を挙げることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに属する微生物であればいずれも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＳＯＬＲＴＭ  Ｓｔｒａｉｎ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いることができる。
上記方法により作製したｃＤＮＡライブラリーに加え、市販のｃＤＮＡライブラリーも利用することができる。
市販のｃＤＮＡライブラリーとして、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社、ライフテックオリエンタル社等のヒト、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等由来の各臓器ｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
上記で作製したｃＤＮＡライブラリーより、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを有するｃＤＮＡクローンを、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法〔モレキュラー  クローニング  第２版〕等により選択することができる。
上記で得られた本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製し、宿主細胞に導入することにより、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを有する形質転換体を作製することができる。
宿主細胞としては、微生物（細菌、酵母等）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、本発明に用いられるポリペプチドを発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）〕社製、ｐＧＥＭＥＸ−１〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕、ｐＱＥ−８〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）〕社製、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節した発現ベクターを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明に用いられるポリペプチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターの例としては、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡを有するプラスミドであるｐ５２６９＋Ｃ５をあげることができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを宿主細胞に導入して得られた細菌として、プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入して得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐ５２６９＋Ｃ５をあげることができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐ５２６９＋Ｃ５は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８１として、平成１２年８月２５日付けで、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌体中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する微生物、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換えベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに該組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる組換えベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換えベクターとバキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
また、上記の形質転換法以外の方法として、例えば、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡまたは、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報をもとにｉｎ ｖｉｔｒｏで調製したｃＲＮＡを、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入し、本発明に用いられるポリペプチドを発現させることができる。
ｃＲＮＡはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の各種ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成することができる。アフリカツメガエルの卵母細胞への導入方法としては卵母細胞にｃＲＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えばマイクロインジェクション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０７，２２５（１９９２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２５４，４５８（１９９５）〕等をあげることができる。
本発明に用いられるポリペプチドの発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明に用いられるポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明に用いられるポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）〕社製、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地〔ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）〕社製、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもジェイ・アール・エイチ・バイオサイエンス（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）〕社製、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
アフリカツメガエルの卵母培養にｃＲＮＡを導入して得られた細胞の培養は、通常、Ｂａｒｔｈ変法溶液〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１６１８４（１９９８）〕等を用い４〜２５℃、好ましくは１８〜２２℃で行う。
培地は毎日交換することが好ましい。また、培養中必要に応じてペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加しても良い。
卵母細胞を用いた場合の、本発明に用いられるポリペプチドの発現方法は、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
本発明に用いられるポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明に用いられるポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明に用いられるポリペプチドの触媒ドメインを含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明に用いられるポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明に用いられるポリペプチドを製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
動物個体を用いて本発明に用いられるポリペプチドを製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明に用いられるポリペプチドを生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明に用いられるポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明に用いられるポリペプチドを製造する方法としては、例えば、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを生産する方法があげられる。
上記形質転換体により製造された本発明に用いられるポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明に用いられるポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明に用いられるポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの断片、または該ＤＮＡの有する塩基配列の連続した５〜６０の塩基配列からなるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体は、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの有する塩基配列情報を用いて、常法あるいは上記のＤＮＡ合成機により調製することができる。また、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを制限酵素等を用いて切断することにより取得することもできる。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの断片としては、該ＤＮＡの有する塩基配列の連続した６１塩基以上の塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
オリゴヌクレオチドとして、例えば、配列番号１５または１６記載のオリゴヌクレオチドをあげることができる。
該オリゴヌクレオチドの誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクルオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
（ｂ）本発明に用いられる抗体
（ｂ−１）ポリクローナル抗体
本発明に用いられるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは該ポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用いることにより、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、本発明に用いられるポリペプチドを認識する抗体を作製することができる。
本発明に用いられるポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは該ポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やウシチログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ｂ−２）モノクローナル抗体
免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を抗体産生細胞の供給源として用いる。
該抗体価を示した動物に抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
ハイブリドーマの作製に用いられる骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞が好ましく用いられる。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）〔シー・エス・エル（ＣＳＬ）社製、１０％〕を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、抗体産生細胞数：骨髄腫細胞数＝５：１〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、抗体産生細胞数１０８あたり、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９８８）等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明に用いられるポリペプチドに特異的に反応する抗体を生産するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明に用いられるポリペプチドの全長または部分断片の精製標品を適当なプレートにコートし、得られたハイブリドーマの培養上清もしくは後述する精製抗体を第一抗体として反応させる。さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行う。本発明に用いられるポリペプチドに特異的に反応する培養上清を該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ由来の培養上清として選択する。以上の方法により本発明で用いるポリペプチドに対する抗体を生産するハイブリドーマを選択する。
得られたハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返す。この時、１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）を用い、２回目は、正常培地を用いる。限界希釈法の結果、安定して強い抗体価の認められたものを該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
プリスタン〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育（プリスタン処理）した８〜１０週齢のマウスまたはヌードマウスに、得られた本発明に用いられるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、マウスまたはヌードマウス１匹あたり５×１０６〜２０×１０６細胞となるように腹腔内に注射する。１０〜２１日間で該マウスは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナル抗体の調製で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。
（ｃ）本発明に用いられるポリペプチドの発現または該ポリペプチドの有するＰＬＡ２活性を阻害する物質のスクリーニング
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの転写または該ポリペプチドへの翻訳を抑制する物質（以下、本発明の発現抑制物質という）、または該ポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する物質（以下、本発明の活性阻害物質という）を探索する方法（スクリーニング方法）としては、以下の方法をあげることができる。
本発明の発現抑制物質のスクリーニング方法としては、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示す方法があげられる。
（ｉ）ポリペプチドの発現量を測定する方法
本発明に用いられるポリペプチドを発現する細胞と、被験物質の存在下、本発明に用いられるポリペプチドを発現する細胞を、上記（ａ）に記載の培養法で２時間〜１週間インキュベートする。細胞中に発現した本発明に用いられるポリペプチドの量を、上記（ｂ）で得られた、本発明の抗体を用いて測定する。被験物質の存在しない場合と比較し、該ポリペプチドの量を低下させる物質を選択することにより、本発明の発現抑制物質を取得することができる。
本発明の抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウエスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法等をあげることができる。
被験物質は、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、これらの誘導体、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等、いかなる物質でもよい。
（ｉｉ）ｍＲＮＡの発現量を測定する方法
本発明に用いられるポリペプチドを発現する細胞を、該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、上記（ｉ）の被験物質を該培地に添加し、上記（ａ）の培養法で２時間〜１週間インキュベートする。培養後、該細胞中の発現した本発明に用いられるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量を、通常の方法、例えば、モレキュラー・クローニング第２版記載のノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーション法等のハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕等を用いて測定する。
被験物質を添加しない場合と比較し、本発明に用いられるポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現量を低下させる物質を選択することにより、本発明の発現抑制物質を取得することができる。
ハイブリダイゼーション法に用いることのできるプローブおよびＲＴ−ＰＣＲ法に用いることのできるプライマーとして、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をあげることができる。具体的には、上記（ａ）記載のオリゴヌクレオチドをあげることができる。
（ｉｉｉ）レポーター遺伝子を用いる方法
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡまたは上記（ａ）のオリゴヌクレオチドをプローブとして公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、本発明に用いられるポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域を取得する。
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において、本発明に用いられるポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関するすべてのプロモーター領域があげられる。
該プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミドをモレキュラー・クローニング第２版等に記載の方法により作製する。上記（ａ）の方法に従って、該プラスミドを動物細胞に導入し、形質転換体を取得する。該形質転換体および上記（ｉ）の被験物質の存在下で、該形質転換体を上記（ａ）の培養法に準じて２時間〜１週間インキュベートする。細胞中のレポーター遺伝子の発現量を公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学プロトコール、秀潤社（１９９３年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）等に記載の方法〕を用いて測定する。
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
被験物質を添加しない場合と比較し、該レポーター遺伝子の発現量を低下させる物質を選択することにより、本発明の発現抑制物質を取得することができる。
本発明の活性阻害物質のスクリーニング方法としては、本発明に用いられるポリペプチドを含む酵素源および該酵素源の基質を、上記（ｉ）記載の被験物質の存在下または非存在下で接触させて、インキュベートして反応させ、被験物質が存在する場合に、該酵素源の活性が低下する物質を選択、取得する方法があげられる。
本発明に用いられるポリペプチドを含む酵素源としては、上記（ａ）で得られる形質転換体、該形質転換体の培養物、該培養物の処理物等をあげることができる。
形質転換体の培養物としては、上記（ａ）の形質転換体を上記（ａ）記載の方法に準じて培養して得られる培養物をあげることができる。
該形質転換体の培養物の処理物としては、該形質転換体の、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
酵素源の基質は、放射性試薬、蛍光試薬、または比色試薬等によって標識されていることが好ましい。
該基質としては、例えば、１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリン、１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルエタノールアミン、１−ステアロイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリン、１−ステアロイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルエタノールアミン、Ｂｉｓ−ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ１１−ＰＣ（モレキュラープローブ社）等をあげることができる。
上記酵素源、基質および被験物質の接触は、水性媒体中で行うことが好ましい。
水性媒体としては、水、各種緩衝液をあげることができる。
緩衝液としては、酵素反応を阻害しないかぎり、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕塩酸緩衝液等いずれの緩衝液でもよい。
上記酵素源、基質および被験物質を水性媒体に添加して混合して反応させる。
反応条件は、ＰＬＡ２活性を測定できる条件であればいずれの条件であってもよい。例えば、反応温度は、２０〜５０℃が好ましく、反応液のｐＨは４〜１０が好ましい。反応時間は、通常、１分間〜１０時間である。
本発明に用いられるポリペプチドのＰＬＡ２活性は、例えば、１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリンを基質として用いた場合、加水分解産物である［１−１４Ｃ］アラキドン酸を液体シンチレーションカウンター等で定量して算出することができる。１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリン以外の物質を基質として用いた場合は、反応により生成する物質を定量して算出する〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７，３（１９９１）〕。
また、基質の分解にともなって変化する反応液中のｐＨを測定してもよい〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７，３（１９９１）〕し、ＰＬＡ２アッセイキット（ケイマン社製）等の市販のキットを用いて測定してもよい。
形質転換体の細胞を酵素源として用いる場合は、放射性標識されたアラキドン酸で細胞を標識後、カルシマイシン、イオノマイシンなどのカルシウムイオノフォア、またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−αなどのサイトカインなどの刺激に対して細胞外に放出されてくる標識代謝物の量を液体シンチレーションカウンターによって測定することにより、本発明に用いられるポリペプチドのＰＬＡ２活性を測定することができる。また、カルシウムイオノフォアまたはサイトカインなどを、反応液に添加した場合に生成される代謝物の量をそれぞれの抗体を用いた酵素免疫測定法を使って測定することもできる。このような代謝物としては、例えば基質としてアラキドン酸を使用した場合、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどがあげられる。
いずれの測定法を用いた場合でも、被験物質添加の有無における測定値の比較により、被験物質の中から本発明に用いられるポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
このようなスクリーニングによって得られる物質としては、例えば、下記一般式（１）記載の化合物（ＷＯ９８／３３７９７）をあげることができる。
2003076935.tif 000004
〔式中、Ｒ１は水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、非芳香族炭化水素環もしくは非芳香族複素環と縮合しているアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリール；Ｚは−Ｓ−、−ＳＯ−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ２）−（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル低級アルキル、またはアラルキル）、または単結合；Ｘ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ−（式中、ｑは０〜３の整数）、−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキル、ｒは０〜３の整数）、−ＣＨ２ＮＨＳＯ２−、−（ＣＨ２）ｓ−Ｎ（Ｒ４）−ＣＯ−（式中、Ｒ４は水素原子または低級アルキル、ｓは０〜３の整数）、−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ５）ＣＯＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ５は水素原子または低級アルキル）、−ＣＨ２ＮＨＣＳ−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ６）−ＣＨ２−（式中、Ｒ６は水素原子、低級アルキル、またはアシル）、アルキレン、アルケニレン、または単結合；Ｘ２は置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、複素環ジイル、−Ｃ≡Ｃ−、または単結合；Ｘ３はアルキレン、アルケニレン、または単結合；Ａ、Ｂ、およびＥは、それぞれ独立して酸素原子または硫黄原子；Ｄは水素原子またはヒドロキシ低級アルキル；Ｙ１は−（ＣＨ２）ｍＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ−、−（ＣＨ２）ｍＣＳＮＨ−、−（ＣＨ２）ｍＳＯ２−、−（ＣＨ２）ｍＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＳＯ２−、または単結合、ｍは０〜３の整数、ｎは１〜３の整数；Ｙ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級シクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または置換もしくは非置換のアミノを表し、破線（−−−）は結合の存在または不存在を示し、波線（〜）はＤがＥに対してシスまたはトランスの関係にあることを示す〕
上記一般式（１）の各基の定義において、「低級アルキル」とは、直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルを意味する。例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等があげられる。Ｒ２における「Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル低級アルキル」とは、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）で置換された前記「低級アルキル」を意味する。例えば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなどがあげられる。「シクロアルキル」とは、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルを意味する。例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等があげられる。「シクロアルケニル」とは、環内に不飽和結合を１個以上有するＣ３〜Ｃ７シクロアルケニルを意味する。例えば、シクロプロペニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル等があげられる。「非芳香族複素環」とは、任意に選ばれる、酸素原子、硫黄原子又は窒素原子を環内に１個以上含む非芳香族の５〜７員環または２個以上縮合した環からなり、かつ酸素原子、硫黄原子又は窒素原子を環内に１個以上含む環を意味する。例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、オクタヒドロキノリン、テトラヒドロキノリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン等があげられる。「アリール」および「アリールカルボニル」の「アリール」部分は、単環状芳香族炭化水素基、または単環状芳香族炭化水素が２個以上連続して存在する基を意味する。例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、インデニル、２−ｐ−テルフェニリル、２−ｍ−テルフェニリル、２−ｏ−テルフェニリル、アントリル、フェナントリル等があげられる。「非芳香族炭化水素環と縮合しているアリール」としては、例えばインダニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル等があげられる。「非芳香族複素環と縮合しているアリール」としては、例えばインドリル、イソインドリル、２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−，５Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉ，ｊ］キノリル、イソクロマニル、クロマニル等があげられる。
「アラルキル」としては、例えばベンジル、フェネチル、３−フェニル−ｎ−プロピル、ベンズヒドリル、ナフチルメチル、２−ナフチルエチル等があげられる。「アルキレン」とは、Ｃ１〜Ｃ５アルキルから導かれる２価の基を意味する。例えばメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン等があげられる。「アルケニレン」とは、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルから導かれる２価の基を意味する。例えばビニレン、プロペニレン、ブテニレン等があげられる。
「アリーレン」とは、前記「アリール」から導かれる２価の基を意味する。例えばフェニレン、ナフチレン等があげられ、１，４−フェニレンが好ましい。「ヘテロアリーレン」とは、下記「ヘテロアリール」から導かれる２価の基を意味する。例えばチオフェンジイル、フランジイル等があげられ、２，５−チオフェンジイル、２，５−フランジイル、２，５−ピリジンジイルが好ましく、２，５−チオフェンジイルがさらに好ましい。「複素環ジイル」とは、前記「非芳香族複素環」から導かれる２価の基を意味する。例えばテトラヒドロチオフェンジイル、テトラヒドロフランジイル等があげられる。「ヒドロキシ低級アルキル」としては、例えばヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル等があげられる。「ヘテロアリール」としては、例えばピロリル、ピリジル、チエニル、フリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル等があげられる。「低級アルケニル」とは、不飽和結合を１個有するＣ２〜Ｃ４アルケニルを包含する。例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル等が挙げられる。
式（１）の各基の定義において、「アシル」とは、アルキル部分が前記「低級アルキル」であるアルキルカルボニルまたはアリール部分が前記「アリール」であるアリールカルボニルを包含する。さらに「アリールカルボニル」のアリール部分は、低級アルキル、ハロゲン等で置換されていてもよい。例えば、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、トルオイル等が挙げられる。
式（１）の各基の定義において、Ｒ１における「置換アリール」とは、フェニルＣ２〜Ｃ４アルケニル（例えば、フェニルエテニル）、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、シクロアルキル（例えば、シクロペンタニル、シクロヘキサニル）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、低級アルキルオキシ（例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）、トリハロ低級アルキル（例えば、トリフルオロメチル、トリクロロエチル）、ニトロ、フェニル、置換フェニル（例えば、２−メチルフェニル、２−メチルオキシフェニル、３−トリフルオロフェニル、３−ニトロフェニル、３−ヒドロキシフェニル、エテニルフェニル）、ナフチル（例えば、１−ナフチル、２−ナフチル）、フェナンスリル（例えば、９−フェナンスリル）、ベンゾ−１，３−ジオキソラニル（例えば、４−ベンゾ−１，３−ジオキソラニル、５−ベンゾ−１，３−ジオキソラニル）、ヘテロアリール（例えば、３−ピリジル、３−チエニル、２−ベンゾチエニル）、アラルキル（例えば、ベンジル、フェネチル）、アリールオキシ（例えば、フェニルオキシ）、ヒドロキシ、アミノ、モノあるいはジ置換アミノ（例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、フェニルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノ）、ピペラジニル、前記「低級アルキル」で置換されたピペラジニル（例えば、４−メチルピペラジニル）等で１または２個以上置換された前記「アリール」を包含する。例えば、２−ビフェニル、３−ビフェニル、４−ビフェニル、２−ｐ−テルフェニル、２−ｍ−テルフェニル、２−ｏ−テルフェニル、２−イソプロピルフェニル、２−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、２−イソブチルフェニル、２−シクロペンチルフェニル、２−ブロモフェニル、３−ブロモフェニル、２−ヨードフェニル、２−（４−ベンゾ−１，３−ジオキソラニル）フェニル、２−（５−ベンゾ−１，３−ジオキソラニル）フェニル、２−フェノキシフェニル、２−ベンジルフェニル、２−（３−ピリジル）フェニル、３−ジメチルアミノフェニル、３−ジエチルアミノフェニル、３−フェニルアミノフェニル、３−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）フェニル、２−（１−ナフチル）フェニル、２−（２−ナフチル）フェニル、３−（１−ナフチル）フェニル、３−（２−ナフチル）フェニル、４−（エテニルフェニル）フェニル、２−ブロモ−６−イソプロピルフェニル、２−イソプロピル−６−フェニルフェニル、２−イソプロピル−６−（１−ナフチル）フェニル、２−ブロモ−６−ニトロフェニル、２−メチルオキシ−６−（１−ナフチル）フェニル、２′−メチル−２−ビフェニル、２′−イソプロピル−２−ビフェニル、２′−メチルオキシ−２−ビフェニル、３′−メチル−２−ビフェニル、３′−トリフルオロメチル−２−ビフェニル、３′−ニトロ−２−ビフェニル、３′−メチルオキシ−２−ビフェニル、３′−エチルオキシ−２−ビフェニル、３′−ヒドロキシ−２−ビフェニル、３−メチルオキシ−２−ビフェニル、６−フェニル−２−ナフチル、１−ブロモ−６−フェニル−２−ナフチル、１，６−ジフェニル−２−ナフチル、４−フェニル−１−ナフチル、２−（４−メチルピペラジニル）フェニル等が挙げられる。
式（１）の各基の定義において、Ｙ２における「置換アリール」とは、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル）、低級アルキルオキシ（例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）、トリハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、アルキルオキシカルボニル（例えば、メチルオキシカルボニル）、アシル（例えば、アセチル）、アミノ、モノあるいはジ置換アミノ（例えば、アシルアミノ、メチルアミノ）等で１または２個以上置換された前記「アリール」、および−ＣＯＲ５（式中Ｒ５は置換もしくは非置換のアリール（例えば、フェニル、４−フルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル）、置換もしくは非置換のヘテロアリール（例えば、２−チエニル、４−ピリジル）、置換もしくは非置換の低級シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル）、置換もしくは非置換の低級シクロアルケニル（例えば、シクロプロペニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル）で置換された前記「アリール」を包含する。さらにアリールと縮合した非芳香族炭化水素環（例えば、インダニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）またはヘテロアリールと縮合した非芳香族炭化水素環（例えば、インドリル、イソインドリル、２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−，５Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉ，ｊ］キノリル）と縮合していてもよい。
式（１）の各基の定義において、「置換アラルキル」とは、前記「低級アルキル」が、前記「Ｒ１における「置換アリール」」および／または後記「Ｒ１における「置換ヘテロアリール」」で１または２個所以上置換したものを意味する。例えば、２−ビフェニルメチル、３−ビフェニルメチル、４−ビフェニルメチル、２−ｐ−テルフェニルメチル、２−ｍ−テルフェニルメチル、２−ｏ−テルフェニルメチル、２−イソプロピルフェニルメチル、２−ｔ−ブチルフェニルメチル、２−イソブチルフェニルメチル、２−シクロペンチルフェニルメチル、２−ブロモフェニルメチル、３−ブロモフェニルメチル、２−ヨードフェニルメチル、２−（４−ベンゾ−１，３−ジオキソラニル）フェニルメチル、２−（５−ベンゾ−１，３−ジオキソラニル）フェニルメチル、２−フェノキシフェニルメチル、２−ベンジルフェニルメチル、２−フェネチルメチル、２−（３−チエニル）フェニルメチル、２−（２−ベンゾチエニル）フェニルメチル、２−（３−ピリジル）フェニルメチル、３−ジメチルアミノフェニルメチル、３−ジエチルアミノフェニルメチル、３−フェニルアミノフェニルメチル、３−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）フェニルメチル、２−（１−ナフチル）フェニルメチル、２−（２−ナフチル）フェニルメチル、３−（１−ナフチル）フェニルメチル、３−（２−ナフチル）フェニルメチル、２−（９−フェナンスリル）フェニルメチル、４−（エテニルフェニル）フェニルメチル、２−ブロモ−６−イソプロピルフェニルメチル、２−イソプロピル−６−フェニルフェニルメチル、２−イソプロピル−６−（１−ナフチル）フェニルメチル、２−ブロモ−６−ニトロフェニルメチル、２−メチルオキシ−６−（１−ナフチル）フェニルメチル、２′−メチル−２−ビフェニルメチル、２′−イソプロピル−２−ビフェニルメチル、２′−メチルオキシ−２−ビフェニルメチル、３′−メチル−２−ビフェニルメチル、４′−フルオロ−２−ビフェニルメチル、３′−トリフルオロメチル−２−ビフェニルメチル、３′−ニトロ−２−ビフェニルメチル、３′−メチルオキシ−２−ビフェニルメチル、３′−エチルオキシ−２−ビフェニルメチル、３′−ヒドロキシ−２−ビフェニルメチル、３−メチルオキシ−２−ビフェニルメチル、６−フェニル−２−ナフチルメチル、１−ブロモ−６−フェニル−２−ナフチルメチル、１，６−ジフェニル−２−ナフチルメチル、４−フェニル−１−ナフチルメチル、１−フェニル−２−ナフチルメチル、１−フェニルフェニルメチル、２−フェニルフェニルメチル、２，６−ジフェニルフェニルメチル、１，１−ビス（４−メチルオキシフェニル）フェニルメチル、１，１−ビス（３−フルオロフェニル）フェニルメチル、１，１−ジフェニル（３，５−ジフルオロフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（３，５−ジメチルフェニル）メチル、１，１−ビス（３−メチルフェニル）フェニルメチル、１，１−ジフェニル（４−メチルオキシフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（４−メチルフェニル）メチル、１，１，１−トリス（４−フルオロフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（２−メチルフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（３−メチルフェニル）メチル、１，１，１−トリス（４−クロロフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（３−イソプロピルフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（２−チエニル）メチル、１，１−ジフェニル（２−フルオロフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（３−フルオロフェニル）メチル、１，１−ジフェニル（４−フルオロフェニル）メチル等が挙げられる。
式（１）の各基の定義において、Ｒ１における「置換ヘテロアリール」とは、前記『Ｒ１における「置換アリール」』で示した置換基によって置換された前記「ヘテロアリール」を包含する。
式（１）の各基の定義において、Ｙ２における「置換ヘテロアリール」とは、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル）、低級アルキルオキシ（例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）、トリハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、アルキルオキシカルボニル（例えば、メチルオキシカルボニル）、アシル（例えば、アセチル）、アミノ、モノあるいはジ置換アミノ（例えば、アシルアミノ、メチルアミノ）等で１または２個以上置換された前記「ヘテロアリール」、および−ＣＯＲ５（式中Ｒ５は前記と同意義）で置換された前記「ヘテロアリール」を包含する。さらにアリールと縮合した非芳香族炭化水素環またはヘテロアリールと縮合した非芳香族炭化水素環と縮合していてもよい。
式（１）の各基の定義において、「置換アリーレン」とは、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル）、低級アルキルオキシ（例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）、トリハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、アルキルオキシカルボニル（例えば、メチルオキシカルボニル）、アシル（例えば、アセチル）、アミノ、モノあるいはジ置換アミノ（例えば、アシルアミノ、メチルアミノ）等で１または２個以上置換された前記「アリーレン」を包含する。例えば、２−ヒドロキシ−１，４−フェニレンが挙げられる。
式（１）の各基の定義において、「置換ヘテロアリーレン」の置換基は、前記「置換アリーレン」で示した置換基と同様である。
式（１）の各基の定義において、「置換アリールカルボニル」は、前記「置換もしくは非置換のアリール」で置換されているカルボニルを意味する。
式（１）の各基の定義において、「置換シクロアルキル」、および「置換シクロアルケニル」における置換基としては、低級アルキルオキシ（例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）、低級アルキルオキシカルボニル（例えば、メチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル）、カルボキシ、モノアルキル置換アミノ（例えば、メチルアミノ、エチルアミノ）、ジアルキル置換アミノ（例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ）等が挙げられる。
式（１）の各基の定義において、「置換アミノ」とは、前記「低級アルキル」、前記「アラルキル」、前記「アシル」等で１または２個所置換されていてもよいアミノを包含する。例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ベンジルアミノ、アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ等が挙げられる。
式（１）で示される化合物は特定の異性体に限定するものではなく、全ての可能な異性体およびそれらの混合物も含まれる。
上記一般式（１）記載の化合物としては、例えば、下記式（２）記載の化合物〔塩野義製薬社製、ピロフェノン（ｐｙｒｒｏｐｈｅｎｏｎｅ）、ＷＯ０１３０３８７〕をあげることができる（以下、化合物１と称する）。
2003076935.tif 000005
（ｄ）本発明の皮膚炎の予防または治療剤および皮膚炎の予防または治療方法
上記（ｂ）で得られた本発明に用いられるポリペプチドを認識する抗体または上記（ｃ）のスクリーニング方法により選択された本発明の発現抑制物質あるいは本発明の活性阻害物質は、そのまま皮膚炎の予防または治療剤として用いてもよいし、薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製剤を製造し、該製剤を皮膚炎の予防または治療剤として用いてもよい。
該皮膚炎の予防または治療剤の投与方法としては、予防または治療に際し最も効果的な方法を使用することが望ましく、経口投与または、経皮、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与による方法を用いることができる。
該予防または治療剤の剤形としては、軟膏剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、テープ剤等をあげることができる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等をあげることができる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造することができる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用い製造することができる。
非経口投与に適当な製剤としては、経皮剤、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
経皮剤（外用剤）の剤形としては、通常用いられる種々の液剤、軟膏剤、クリーム剤、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、ゲル剤等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
外用剤中には、必要に応じて適当量の保存剤、酸化防止剤、安定化剤、親水性高分子、多価アルコール、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、保湿剤等を添加することができる。
保存剤としては、パラベン類等があげられる。
酸化防止剤としては、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ロンガリット等の亜硫酸塩、Ｌ−アスコルビン酸、エリソルビン酸等のアスコルビン酸類、システイン、アセチルシステイン、チオグリセロール等のチオール誘導体、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ−α−トコフェロール、ノルジヒドログアヤレチック酸、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、チロシン、アセチルチロシン等があげられる。
安定化剤としては、エデト酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、オキシベンゾン、アスコルビン酸、トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピルまたは亜硫酸水素ナトリウム等があげられる。
親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロースもしくはその塩類、ポリアクリル酸もしくはその塩類、カルボキシビニルポリマーもしくはその塩類、アルギン酸もしくはその塩類、アルギン酸プロピレングリコールエステル、キトサン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミドポリマー、ポリビニルメタクリレート、ポリエチレングリコール、プルロニック、ゼラチン、メチルビニルエーテル無水マレイン酸共重合体、可溶性デンプン、プルラン、アクリル酸メチルまたはアクリル酸−２−エチルヘキシル共重合体等があげられる。
多価アルコールとしては、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、ソルビトールまたはマンニトール等があげられる。
吸収促進剤としては、エタノール、イソプロピルアルコール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル、カプリン酸プロピレングリコール、中鎖脂肪酸トリグリセリドまたはスクワラン等があげられる。
ｐＨ調節剤としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、塩酸、リン酸、酢酸、フマル酸、マレイン酸、水酸化ナトリウム、アンモニア、尿素、エチレンジアミン、イソプロパノールアミン、ジエタノールアミン、トリイソパノールアミンまたはトリエタノールアミン等があげられる。
乳化剤としては、レシチン、レシチン誘導体、プロピレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはプルロニック等があげられる。
防腐剤としては、メチルパラベン、エチルパラベンもしくはプロピルパラベン等のパラベン類、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムまたはクロロブタノール等があげられる。
保湿剤としては、グリセリン、ヒアルロン酸、尿素等があげられる。
上記物質の他に、例えば、パップ剤では、必要に応じて、カオリン、軽質無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、無水ケイ酸、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、タルク、ベントナイト、炭酸カルシウム、酸化チタン、アルミニウムグリシネート、酸化亜鉛等が添加される。
また、軟膏剤では、必要に応じて、セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリン酸、白色ワセリン、親水軟膏、吸水軟膏、プラスチベース、親水性プラスチベース、マクロゴール、軽質無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、無水ケイ酸、酸化チタンまたは酸化亜鉛等が添加される。
また、液剤では、必要に応じて、セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリン酸、軽質無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、無水ケイ酸または酸化チタン等が添加される。
注射剤は、例えば、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製することができる。
座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製することができる。
噴霧剤は、上記で取得された予防または治療剤をそのまま噴霧剤として用いることが可能であるが、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製した噴霧剤が好ましい。
担体として、具体的には乳糖、グリセリン等を例示することができる。
上記で取得された予防または治療剤、および担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤を調製することが可能である。
これらの非経口剤においても、経口剤で添加剤として例示した成分を添加することができる。
本発明の発現抑制物質または本発明の活性阻害物質が、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの断片、該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０の塩基配列からなるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドの誘導体である場合は、該物質はそのまま本発明の皮膚炎の予防または治療剤として用いてもよいし、基剤を添加して本発明の皮膚炎の予防または治療剤として用いてもよい。また、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの全部または断片、該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入し、遺伝子治療用ベクターを作製し、該遺伝子治療用ベクターに基剤を添加して、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）等に記載の方法に準じて製剤を製造し、これを本発明の皮膚炎の予防または治療剤として用いてもよい。
基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウムあるいは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液あるいは塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。
また、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油、またはレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて溶液、懸濁液、分散液として、注射剤を常法に従い調製してもよい。
これらの注射剤を、凍結乾燥等による粉末化等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの断片、該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０の塩基配列からなるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドの誘導体を含有する皮膚炎の予防または治療剤が液体の場合はそのままで、固体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して治療に使用することができる。該予防または治療剤の投与方法としては、患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法をあげることができる。
また、非ウイルス遺伝子移入法によっても目的とする治療部位にＤＮＡを輸送することができる。
非ウイルス遺伝子移入法としては、リン酸カルシウム共沈法〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４（１９８０）〕、マイクロインジェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２（１９８１）〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８（１９８９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６（１９８９）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，２６７（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７（１９９２）〕あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体−媒介ＤＮＡ移入法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５（１９８９）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１４７（１９９１）〕等があげられる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている〔Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，３９９（１９９２）〕。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの断片、該ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０の塩基配列からなるＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドの誘導体を含有する皮膚炎の予防または治療剤を使用する方法としては、例えばアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕、トリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）〕、リボザイム技術〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２７４（１９９９）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２３，２５７（１９９９）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４，Ｄ４９７（１９９９）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，Ｒ３３（１９９９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，５２３７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，４３８（１９９８）〕、デコイＤＮＡ法〔Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５６，５６３（１９９８）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８２，１０２３（１９９８）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，５，４２９（１９９７）、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５４，２５８３（１９９６）〕等をあげることができる。
上記本発明の皮膚炎の予防または治療剤を投与することにより、皮膚炎を効果的に予防または治療することができる。
本発明の皮膚炎の予防または治療剤を適用できる皮膚炎としては、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、Ｖｉｄａｌ苔癬、自家感作性皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、皮脂欠乏性湿疹、乾癬等をあげることができる。
本発明の皮膚炎の予防または治療剤の投与量、投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示す。
なお、以下の実施例中では、遺伝子操作は、特に断らない限り、モレキュラー・クローニング  第２版に記載されている方法に準じて行なった。
実施例１
ヒト小腸から、ファルマシア社製のＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（＃２７−９２７０−０１）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、モレキュラー・クローニング  第２版に記載されているｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ精製法に準じて、ｍＲＮＡを抽出し精製した。
得られたｍＲＮＡを用いて、オリゴキャップ法〔Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）〕によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。
配列番号５記載の塩基配列を有するＯｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒおよび配列番号６記載の塩基配列を有するＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを用いて、蛋白質  核酸酵素，４１，１９７（１９９６）、Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）に記載の方法に準じてＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、および一本鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。
次いで、配列番号７記載の塩基配列を有する５’末端側プライマーと配列番号８記載の塩基配列を有する３’末側プライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換した後、制限酵素ＳｆｉＩで切断した。
得られたｃＤＮＡを、ＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ，３３９２ｂｐ）に組み込み、組換えベクターを得た。この際、ｃＤＮＡは発現が可能なように一方向に組み込まれた。
得られた組換えベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。得られた形質転換体から、常法に従ってプラスミドを取得した。配列番号９および１０記載の塩基配列を有するＤＮＡを合成し、得られた合成ＤＮＡをプライマーとして用い、得られたｃＤＮＡの塩基配列をキット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列情報を得た。
決定した各ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列を、ブラストサーチ相同性検索ソフトウェアを用いて解析し、公知のｃＰＬＡ２αの塩基配列と相同性の認められる塩基配列を見出した。公知のｃＰＬＡ２αの塩基配列と相同性を有するｃＤＮＡを有するクローン（ｃ−ｈｓｉ０５２６９）の全塩基配列を決定したところ、プラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９には、配列番号４に記載された約１．５ｋｂの塩基配列を有するｃＤＮＡが含まれていた。該塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
プラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９に存在するｃＤＮＡの塩基配列情報をもとに配列番号１１および配列番号１２記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。
Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  ２μＬ、配列番号１１記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーおよびＡＰ１（キットに添付）のプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ポリメラーゼ混合液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）０．５μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１５秒間、７２℃で４分間の工程を１サイクルとして５サイクル、９４℃で１５秒間、７０℃で４分間の工程を１サイクルとして５サイクル、９４℃で１５秒間、６８℃で４分間の工程を１サイクルとして２０サイクル行なった。
得られたＰＣＲ反応液の１００倍希釈液５μＬ、配列番号１２記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーおよびＡＰ２（キットに添付）のプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ポリメラーゼ混合液１μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１５秒間、６８℃で４分間の工程を１サイクルとして３０サイクル行なった。
得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約２．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、該キットに添付のマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとｐＣＲ２．１  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（インビトロジェン社製）５０ｎｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、該形質転換された大腸菌より、常法に従ってプラスミドｐＰＬ−Ｃを得た。
プラスミドｐＰＬ−Ｃに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従って決定したところ、挿入されたＤＮＡ断片は挿入された断片中のＡｃｃＩ部位でｃ−ｈｓｉ０５２６９のＡｃｃＩ部位と連結可能であることが分かった。
プラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９  ２μｇを１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間保持した。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間保持した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）を精製した。
また、プラスミドｐＰＬ−Ｃ  ２μｇを１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間保持した。
フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間保持した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＡｃｃＩ−ＮｏｔＩ断片（２．２ｋｂ）を精製した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（−）〔ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）〕社製  ２μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で６時間保持した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片（３．０ｋｂ）を精製した。
上記で得られたプラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９由来のＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）５０ｎｇ、プラスミドｐＰＬ−Ｃ由来のＡｃｃＩ−ＮｏｔＩ断片（２．２ｋｂ）５０ｎｇおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（−）由来のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片（３．０ｋｂ）５０ｎｇをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて該キットに添付のマニュアルに従って結合し、組換えプラスミド（ｐ５２６９＋Ｃ５）を得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換された大腸菌から、常法に従ってプラスミドｐ５２６９＋Ｃ５を得た。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を第２図に示す。
プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５を保有する大腸菌ＪＭ１０９株は、ブダペスト条約に基づき、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐ５２６９＋Ｃ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２８１）として、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に、平成１２年８月２５日付で寄託されている。
プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５の塩基配列を常法に従って決定した。プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５は配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を有しており、配列番号２記載の塩基配列は配列番号１記載のアミノ酸配列をコードしていた。
配列番号１記載のアミノ酸配列の情報を用いて、既知タンパク質配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）に対してＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ検索を行なったところ、ｃＰＬＡ２αファミリーの蛋白質との相同性が検出された。そこで、ヒトｃＰＬＡ２αのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６０１０５）、ヒトｃＰＬＡ２βのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ７８８３６）を選択してアライメントを作製したところ、ｃＰＬＡ２αファミリーに共通したアミノ酸配列である配列番号１８記載のアミノ酸配列を有することが認められた。
配列番号２記載の塩基配列の情報をもとに、配列番号１４および配列番号１５記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを合成した。
プラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９  １０ｎｇ、配列番号１４および配列番号１５記載の塩基配列を有するプライマー各々０．３μｍｏｌ／Ｌ、各成分３００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、硫酸マグネシウム液  １ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ライフテクノロジー社製）酵素０．５μＬおよび１×Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１分間、６８℃で１分間の工程を１サイクルとして２５サイクル行なった後、６８℃で５分間の反応を行なった。
得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、該キットに添付のマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換された大腸菌から常法に従ってプラスミドｐＭＦ２を得た。
配列番号２記載の塩基配列の情報をもとに配列番号１６および配列番号１７に記載された塩基配列を有するＤＮＡプライマーを合成した。
プラスミドｐＰＬ−Ｃ  １０ｎｇ、配列番号１６および配列番号１７記載の塩基配列を有するプライマー各々０．３μｍｏｌ／Ｌ、各成分３００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、硫酸マグネシウム液１ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ライフテクノロジー社製）酵素溶液０．５μＬおよび１×Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１分間、６８℃で１分間の工程を１サイクルとして２５サイクル行なった後、６８℃で５分間の反応を行なった。得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、該キットに添付のマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、該キットに添付のマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドを得た。組み換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＣ５ＰＣＲを得た。
プラスミドｐＭＦ２およびプラスミドｐＣ５ＰＣＲに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従って決定した。
プラスミドｐＭＦ２２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間保持した。フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間保持した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）を精製した。
また、プラスミドｐＣ５ＰＣＲ  ２μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間保持した。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間保持した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１．４ｋｂ）を精製した。
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間保持した。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間保持した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（５．４ｋｂ）を精製した。
得られたプラスミドｐＭＦ２由来のＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）５０ｎｇと、プラスミドｐＣ５ＰＣＲ由来のＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１．４ｋｂ）５０ｎｇおよびｐｃＤＮＡ３．１由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（５．４ｋｂ）５０ｎｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、該キットに添付のマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＰＬＡＨ−３．１を得た。
得られたプラスミドｐＰＬＡＨ−３．１２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間保持した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＢａｍＨＩ断片（２．７ｋｂ）を精製した。
プラスミドｐＶＬ１３９３（ファーミンジェン社製）２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間保持した。フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムからなる緩衝液３０μＬ中に溶解し、０．５単位のアルカリホスファターゼ（宝酒造社製；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５由来）を加えて、６０℃で３０分間脱リン酸化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＢａｍＨＩ−アルカリホスファターゼ処理済み断片（９．６ｋｂ）を精製した。上記で回収したプラスミドｐＰＬＡＨ−３．１由来のＢａｍＨＩ断片（２．７ｋｂ）５０ｎｇと、プラスミドｐＶＬ１３９３由来のＢａｍＨＩ−アルカリホスファターゼ処理済み断片（９．６ｋｂ）５０ｎｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて該キットに添付のマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換された大腸菌から常法によりプラスミドｐＰＬＡＨ−１３９３を得た。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を第４図に示す。
次に、組換えバキュロウイルスをバキュロウイルス発現ベクターシステムマニュアル（ファーミンジェン社製）に記載されている方法に準じて以下のように行なった。
即ち、２×１０６個のＳｆ９細胞を直径６ｃｍのシャーレに播種し、接着後、培地を無血清培地（Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ、ライフテック社製）に交換した。
上記で得たプラスミドｐＰＬＡＨ−１３９３またはｐＶＬ１３９３  ５μｇ、Ｌｉｎｅａｌｉｚｅｄ  Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  ＤＮＡ（ファーミンジェン社製）１５ｎｇ、リポフェクチン液（ライフテクノロジー社製）６ｎｇを含む、ＤＮＡとリポフェクチンの混合液２４μＬを、該無血清培地の入ったシャーレに均一になるように添加し２７℃で４日間培養した。血清入りの培地（Ｅｓｆ９２１、旭テクノグラス社製）を２ｍＬ添加し、さらに２７℃で３日間培養した。培養液を回収後、８００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清を得た。得られた上清を、接着させたＳｆ９細胞に添加し、２７℃で３日間培養した。培養液を回収後、８００ｒｐｍ、５分間遠心分離してウイルスを含有する上清を得た。
得られたウイルスを含有する上清２ｍＬを、１．５×１０６個／ｍＬの浮遊Ｓｆ９細胞２８ｍＬに添加し、浮遊状態で２７℃にて４日間培養した。８００ｒｐｍ、５分間遠心分離して細胞を回収し、リン酸バッファー〔ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）〕で細胞を洗浄した。得られた細胞を、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１×ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（ベーリンガーマンハイム社製）からなる緩衝液に懸濁し、超音波破砕機を用い氷上で細胞を破壊した。細胞破壊処理後、処理液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、本発明に用いられるポリペプチドを発現させた細胞の可溶性画分として以下の実験に用いた。
一方、上記本発明に用いられるポリペプチドを発現する昆虫細胞を作製した方法に準じて、ヒト由来のｃＰＬＡ２α（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ６８８７４、以下、ヒトｃＰＬＡ２αと略す）を発現する昆虫細胞を作製し、ヒトｃＰＬＡ２αを発現させた細胞の可溶性画分を得、以下の実験に用いた。
１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリン（第一化学薬品株式会社製、４８ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、２μｍｏｌ／Ｌ）、および上記で得た本発明に用いられるポリペプチドまたはヒトｃＰＬＡ２αを発現させた昆虫細胞の可溶性画分（各蛋白質量５μｇ）を含有する１００μＬの反応液〔１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、８ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）（シグマ社製、実質的に脂肪酸を含まない）、２０μｍｏｌ／ＬトリトンＸ−１００、被験物質１０μｍｏｌ／Ｌ〕を３７℃で５分間インキュベートした。可溶性画分中の蛋白質の量は、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ法を用いて定量した。ドール試薬（２−プロパノール、ヘプタンおよび硫酸を７８：２０：２の割合で含む試薬）を添加して反応を停止した。被験物質としては、化合物１（ＷＯ０１／３０３８７の記載に準じて製造）、またはアラキドニルトリフルオロメチルケトン（ａｒａｃｈｉｄｏｎｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ：以下、ＡＡＣＯＣＦ３と略す、ＢＩＯＭＯＬリサーチラボラトリー社製）を用いた。
化合物１およびＡＡＣＯＣＦ３は、ｃＰＬＡ２αの阻害剤として知られている。
反応停止後、さらにヘプタン０．３ｍＬおよび水０．２ｍＬを加え、旋回して混合した。
得られた混合物を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上層のうち０．３ｍＬをシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０、メルク社製）４０ｍｇの入ったチューブに移し、ヘプタン０．３ｍＬを添加した。チューブを旋回して混合した後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清のうち４００μＬを、ウルチマゴールド〔パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）社製〕３ｍＬを入れたシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００）を用いて放射線量を測定した。被験化合物を添加していない反応液由来の上清の放射線量を１００％として、下記式により、被験化合物によるＰＬＡ２活性の阻害率（％）を算出した。
被験物質によるＰＬＡ２活性の阻害率（％）＝〔１−（被験物質を添加した反応液由来の上清の放射線量／被験物質を添加していない反応液由来の上清の放射線量）〕×１００
各被験物質を添加した場合のＰＬＡ２活性の阻害率を第１表に示す。
2003076935.tif 000006
第１表に示されるとおり、ヒトｃＰＬＡ２αに対しては、化合物１およびＡＡＣＯＣＦ３はともに強い阻害活性を示した。しかし、本発明のポリペプチドに対しては、化合物１のみが阻害活性を示し、ＡＡＣＯＣＦ３は阻害活性を示さなかった。
実施例２
マウスオキサゾロン反復塗布モデルは、マウスの皮膚にオキサゾロンを繰り返し塗布して誘導した慢性接触性皮膚炎のモデルである。病変部では肥満細胞の増生、皮膚の肥厚化、炎症性細胞の浸潤が認められ、また、血中ＩｇＥ抗体価が上昇するなど、アトピー性皮膚炎の病態と非常に類似点が多い〔Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５，７４９（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，２４８４（１９９７）〕。
マウスオキサゾロン反復塗布モデルに対する上記被験物質の作用を調べた。
実験では、マウス（雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス、６週齢、日本チャールス・リバー社製）５匹を１群として用いた。
０．５％（ｗ／ｖ）オキサゾロン（シグマ社製）−アセトン溶液を該マウスの右耳介へ１０μＬ塗布して感作した。
感作して７日目に、同一部位に０．５％（ｗ／ｖ）オキサゾロン−アセトン溶液を１０μＬ塗布し、直後に、アセトン１０μＬに溶解した化合物１  １００μｇ、ＡＡＣＯＣＦ３  １００μｇまたはステロイド薬であるベタメサゾン（シグマ社製）１２μｇを塗布した。この操作を２日、もしくは３日間隔で計１０回行った（以下、この行為を、オキサゾロン反復塗布という）。なお、化合物１、ＡＡＣＯＣＦ３またはベタメサゾンの代わりにアセトンのみを塗布したものをコントロールとした。
オキサゾロンおよび化合物１、ＡＡＣＯＣＦ３またはベタメサゾンを全く塗布しない群には、オキサゾロン−アセトン溶液の代わりにアセトンを塗布し、オキサゾロン無処置群とした。
一方、別の群にはＡＡＣＯＣＦ３（３０ｍｇ／ｋｇ）をオキサゾロン反復塗布直後に腹腔内投与した。
オキサゾロン反復塗布を行う直前および反復塗布後のマウスの右耳介の厚さをダイヤルシックネスゲージを用いて測定し、反復塗布前後の右耳介の厚さの差を算出し、５匹の平均を耳介膨脹量として得た。
結果を第１図に示す。
第１図に示されるとおり、オキサゾロン反復塗布を１０回行った後（反復塗布開始から２１日目）の耳介腫脹量は、オキサゾロン無処置群では０．３２ｍｍであり、コントロール群では０．７９ｍｍであり、化合物１を塗布した群では０．５９ｍｍであり、ＡＡＣＯＣＦ３を塗布した群では０．８８ｍｍであり、ＡＡＣＯＣＦ３を腹腔内に投与した群では０．８６ｍｍであり、陽性対照であるベタメサゾンを塗布した群では０．３３ｍｍであった。
即ち、本発明に用いられるポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する化合物１は耳介腫脹を抑制するが、本発明に用いられるポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害しないＡＡＣＯＣＦ３は、耳介腫脹を抑制しないことが明らかである。
以上の結果から、本発明に用いられるポリペプチドの阻害活性を有する化合物は皮膚炎の抑制に対して有効であるが、公知のヒトｃＰＬＡ２αの活性を阻害する物質は必ずしも皮膚炎の抑制に対して有効ではないことが明らかである。
実施例３
ホルボールエステルにより誘発される耳浮腫はアラキドン酸代謝が関与していることが報告されている。ホルボールエステルにより耳浮腫を誘発したマウスは耳介浮腫のモデルとして用いることができる〔Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ，１７，１９７（１９８５）〕。また、該マウスでは、好中球の浸潤と表皮の増殖がみられることから、該マウスは乾癬などの皮膚炎病態モデルとしても用いることができる〔Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ，２５，３４４（１９８８）〕。
ホルボールエステルのうち１２−オルト−テトラデカノイルホルボール−１３−酢酸塩〔１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）〕により誘発された耳浮腫に対する作用を検討した。
以下の実験では、マウス（雄性ＩＣＲマウス、４週齢、日本チャールス・リバー社製）６匹を１群として用いた。
化合物１（１０μｇまたは１００μｇ）、ＡＡＣＯＣＦ３（１０μｇ、５０μｇまたは２５０μｇ）またはステロイド薬であるプレドニゾロン（シグマ社製）５０μｇをそれぞれ含む０．０１％（ｗ／ｖ）ＴＰＡアセトン溶液を右耳介内側全体に１０μＬ塗布した。４時間後に左右耳介を切除し、７．５ｍｍ直径のパンチャーで同一面積の耳介の断片を得た。左右の耳介の断片の重量を測定し、重量の差を、形成された浮腫の重量とした。
０．０１％（ｗ／ｖ）ＴＰＡのみを含むアセトン溶液を塗布した群をコントロール群とした。それぞれの群について、６匹の浮腫の重量の平均値を求めた。
その結果、コントロール群の左右の耳の断片の重量差は８．１±１．０ｍｇであり、プレドニゾロンを５０μｇ塗布した群では０．０±０．１ｍｇであった。ＡＡＣＯＣＦ３を１０μｇ、５０μｇ、または２５０μｇ塗布した群での重量差は、それぞれ、７．７±０．５ｍｇ、７．８±１．６ｍｇおよび７．３±１．１ｍｇであった。一方、化合物１を１０μｇまたは１００μｇ塗布した群での重量差は、それぞれ５．１±１．１ｍｇおよび０．４±０．２ｍｇであった。
すなわち、陽性対照であるプレドニゾロン、および本発明のポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する化合物１は耳介腫脹を抑制したが、本発明のポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害しないＡＡＣＯＣＦ３は耳介腫脹抑制効果を示さなかった。
以上の結果から、本発明のポリペプチドのＰＬＡ２活性を阻害する化合物は皮膚炎に有効であるが、公知のヒトｃＰＬＡ２αの活性を阻害する物質は必ずしも皮膚炎の抑制に対して有効ではないことが明らかである。
実施例４
下記の第２表に示した処方で下記の方法によりハードカプセル剤（１カプセルあたり３６０ｍｇ）を製造する。
2003076935.tif 000007
化合物１２００ｍｇに乳糖２５０ｍｇおよびコーンスターチ６０ｍｇを添加して混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース３０ｍｇの水溶液を添加して練合する。次いで、押し出し造粒機を用いて、常法により顆粒を製造する。この顆粒をゼラチンハードカプセルに充填することにより、ハードカプセル剤を製造する。
実施例５
下記の第３表に示した処方で下記の方法によりソフトカプセル剤（１カプセルあたり１７０ｍｇ）を製造する。
2003076935.tif 000008
大豆油１２０ｍｇに化合物１５０ｍｇを添加して混合する。次いで、ロータリー・ダイズ式自動成型機を用いて、常法に従い、ソフトカプセルに充填することにより、ソフトカプセル剤を製造する。
実施例６
下記の第４表に示した組成に従い成分を混合した後、打錠機（畑製作所製、ＨＴ−ＡＰ１５ＳＳ−Ｕ型）で打錠し、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤を製造する。
2003076935.tif 000009
産業上の利用可能性
本発明により、皮膚炎の予防または治療剤に使用される物質を容易にスクリーニングすることができ、該物質を含有する皮膚炎の予防または治療剤または予防方法もしくは治療方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号５−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、マウスオキサゾロン反復塗布モデルに対する各化合物の作用を検討した結果を示した図である。ダイヤルシックネスゲージを用いて耳介の厚さを測定して耳介膨脹量を算出した。
●はオキサゾロン無処置群を示し、□はコントロール群を示し、◇はＡＡＣＯＣＦ３を腹腔内に投与した群を示し、◆はＡＡＣＯＣＦ３を塗布した群を示し、△は化合物１を塗布した群を示し、○はベタメサゾンを塗布した群を示す。
第２図は、プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５の構築過程および制限酵素地図を示した図である。
第３図は、プラスミドｐ６００−Ｎの構築過程および制限酵素地図を示した図である。
第４図は、プラスミドｐＰＬＡＨ−１３９３の構築過程および制限酵素地図を示した図である。
符号の説明
ｋｂ：キロ塩基対（ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）Ａｐ：アンピシリン耐性遺伝子Ｔ７：Ｔ７プロモーター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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