(57)【要約】ＭＲＳＡなどの予防及び治療に有効なファージ製剤のためのバクテリオファージ、その溶菌酵素及び細菌表面レセプターに対するリガンドを提供するものであり、該バクテリオファージは（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ配列又は（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する単離されたバクテリオファージ；及び（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ配列又は（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細菌表面レセプターに対するリガンドの機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する単離されたバクテリオファージである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする単離されたバクテリオファージ；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする単離されたバクテリオファージ；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細菌表面レセプターに対するリガンドとしての機能を有する蛋白質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列と、以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを有することを特徴とする単離されたバクテリオファージ；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細菌表面レセプターに対するリガンドとしての機能を有する蛋白質。
【請求項４】
黄色ブドウ球菌の溶菌活性を有するものである請求項１−３のいずれかに記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である請求項４に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
配列番号：３のＤＮＡ配列からなる単離されたバクテリオファージ。
【請求項７】
配列番号：７のＤＮＡ配列からなる単離されたバクテリオファージ。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載のバクテリオファージを有効成分として、製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物。
【請求項９】
黄色ブドウ球菌感染症の予防および治療剤である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＭＲＳＡ感染症の予防および治療剤である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腹腔内投与形態、皮下投与形態および鼻腔内投与形態から選ばれる形態である請求項８−１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
黄色ブドウ球菌による感染症を予防もしくは治療するための方法であって、該感染症に罹患しているかそのおそれのある哺乳動物に請求項１−６のいずれかに記載のバクテリオファージの有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１３】
以下に示される各工程を含む請求項１−６のいずれかに記載のバクテリオファージの製造方法；
（ａ）黄色ブドウ球菌からマイトマイシンＣ誘発によって溶原バクテリオファージを含有する試料を得る工程、
（ｂ）該試料をフィルターに通してバクテリオファージを通過させる工程、
（ｃ）フィルターを通過したバクテリオファージを精製する工程、
（ｄ）精製されたバクテリオファージを、黄色ブドウ球菌を含有する培地中で増殖させる工程、
（ｅ）増殖したバクテリオファージを単離する工程、
（ｆ）単離されたバクテリオファージを精製する工程。
【請求項１４】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
【請求項１５】
配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子である請求項１４に記載の遺伝子。
【請求項１６】
配列番号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子である請求項１４に記載の遺伝子。
【請求項１７】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
【請求項１８】
配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質である請求項１７に記載の蛋白質。
【請求項１９】
配列番号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質である請求項１７に記載の蛋白質。
【請求項２０】
請求項１７−１９のいずれかに記載の蛋白質を有効成分として、製剤学的に許容される担体と共に含有する酵素製剤。
【請求項２１】
黄色ブドウ球菌感染症の予防または治療剤である請求項２０に記載の酵素製剤。
【請求項２２】
ＭＲＳＡ感染症の予防および治療剤である請求項２１に記載の酵素製剤。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の酵素製剤の有効量を、黄色ブドウ球菌による感染症に罹患しているかそのおそれのある哺乳動物に投与することを特徴とする黄色ブドウ球菌感染症の予防または治療方法。
【請求項２４】
黄色ブドウ球菌に対する除菌剤である請求項２０に記載の酵素製剤。
【請求項２５】
ＭＲＳＡに対する除菌剤である請求項２４に記載の酵素製剤。
【請求項２６】
配列番号：２のアミノ酸配列からなる黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対するリガンドをコードする遺伝子。
【請求項２７】
配列番号：２のアミノ酸配列からなる黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対するリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）感染症、特にＭＲＳＡ（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の予防および治療に有用なバクテリオファージ、該黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素および細胞表面レセプターに対するリガンド並びにこれらの医療分野における利用に関する。
【背景技術】  バクテリオファージ（ファージ）は、２０世紀の初めに発見された細菌に感染するウイルスである。該ファージは、現在、分子生物学（例えば遺伝子ベクターとして）、医療診断（例えば細菌のファージタイピング）などの分野で広く使用されてきている。
また近年、ファージ療法が、従来の抗生物質療法に代わる新たな細菌感染症の治療法として再認識されつつある。これは、各種の抗生物質に耐性を獲得した細菌、例えば多剤耐性型黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性ＭＲＳＡ（ＶＲＳＡ，ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＭＲＳＡ）などによる難治性感染症（ＭＲＳＡ院内感染）の出現、バイオテクノロジー技術の急速な進歩などの理由による。
ファージは、抗生物質とは本質的に異なる溶菌機構を持ち、宿主細菌を特異的に溶菌すること、新たな耐性菌を産む危険が少ないこと、真核細胞には感染せず、元来ヒト体内に常在し生体に対して安全であることなどの理由から、抗生物質に代わる理想的な抗菌活性物質と考えられる。
従って、新たなファージ療法の開発ないしはこれに利用できるファージの探索が、医療分野において要望されている。このような新しいファージが提供できれば、ファージ感染機構、溶菌活性発現機序などの解明が可能であり、また遺伝子改変による更に改良されたファージやファージに由来する溶菌活性酵素剤などの作製も可能であると考えられる。
【発明の開示】
本発明の目的は、バクテリオファージ療法のためのバクテリオファージ、特にＭＲＳＡなどの多剤耐性型黄色ブドウ球菌による感染症の治療に有効な、非毒性で宿主特異的で且つ宿主範囲の広いバクテリオファージを提供することにある。
本発明の他の目的は、上記バクテリオファージが保有する溶菌活性酵素、即ち黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記バクテリオファージ由来の細菌細胞表面レセプターに対するリガンドを提供することにある。
本発明の他の目的は、上記バクテリオファージ、細胞壁分解酵素およびリガンドの製造方法並びにこれらの酵素およびリガンドをコードするＤＮＡ分子を提供することにある。
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた。その結果、該目的に合致する新たなバクテリオファージの単離に成功すると共に、その投与がマウスにおけるＭＲＳＡ感染症を有意に防御できることを見出した。
また、本発明者は、該ファージのゲノム上にコードされる溶菌活性酵素および細菌細胞表面レセプターに対するリガンドの各ＤＮＡ配列のシークエンシングおよび単離に成功し、これらのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を解明した。
本発明は、上記知見を基礎として完成されたものである。その要旨は、以下の項１−２７に示されるとおりである。
項１．以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする単離されたバクテリオファージ；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
項２．以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする単離されたバクテリオファージ；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細菌表面レセプターに対するリガンドとしての機能を有する蛋白質。
項３．以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列と、以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを含むことを特徴とする単離されたバクテリオファージ；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細菌表面レセプターに対するリガンドとしての機能を有する蛋白質。
項４．黄色ブドウ球菌の溶菌活性を有するものである項１−３のいずれかに記載のバクテリオファージ。
項５．黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である項４に記載のバクテリオファージ。
項６．配列番号：３のＤＮＡ配列からなる単離されたバクテリオファージ。
項７．配列番号：７のＤＮＡ配列からなる単離されたバクテリオファージ。
項８．項１−７のいずれかに記載のバクテリオファージを有効成分として、製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物。
項９．黄色ブドウ球菌感染症の予防および治療剤である項８に記載の医薬組成物。
項１０．ＭＲＳＡ感染症の予防および治療剤である項９に記載の医薬組成物。
項１１．腹腔内投与形態、皮下投与形態および鼻腔内投与形態から選ばれる投与形態である項８−１０のいずれかに記載の医薬組成物。
項１２．黄色ブドウ球菌による感染症を予防もしくは治療するための方法であって、該感染症に罹患しているかそのおそれのある哺乳動物に項１−７のいずれかに記載のバクテリオファージの有効量を投与することを特徴とする方法。
項１３．以下に示される各工程を含む項１−７のいずれかに記載のバクテリオファージの製造方法；
（ａ）黄色ブドウ球菌からマイトマイシンＣ誘発によって溶原バクテリオファージを含有する試料を得る工程、
（ｂ）該試料をフィルターに通してバクテリオファージを通過させる工程、
（ｃ）フィルターを通過したバクテリオファージを精製する工程、
（ｄ）精製されたバクテリオファージを、黄色ブドウ球菌を含有する培地中で増殖させる工程、
（ｅ）増殖したバクテリオファージを単離する工程、
（ｆ）単離されたバクテリオファージを精製する工程。
項１４．以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
項１５．配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子である項１４に記載の遺伝子。
項１６．配列番号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子である項１４に記載の遺伝子
項１７．以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
項１８．配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質である項１７に記載の蛋白質。
項１９．配列番号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質である項１７に記載の蛋白質。
項２０．項１７−１９のいずれかに記載の蛋白質を有効成分として、製剤学的に許容される担体と共に含有する酵素製剤。
項２１．黄色ブドウ球菌感染症の予防または治療剤である項２０に記載の酵素製剤。
項２２．ＭＲＳＡ感染症の予防および治療剤である項２１に記載の酵素製剤。
項２３．項２１または２２に記載の酵素製剤の有効量を、黄色ブドウ球菌による感染症に罹患しているかそのおそれのある哺乳動物に投与することを特徴とする黄色ブドウ球菌感染症の予防または治療方法。
項２４．黄色ブドウ球菌感染症の除菌剤である項２０に記載の酵素製剤。
項２５．ＭＲＳＡの除菌剤である項２４に記載の酵素製剤。
項２６．配列番号：２のアミノ酸配列からなる黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対するリガンドをコードする遺伝子。
項２７．配列番号：２のアミノ酸配列からなる黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対するリガンド。
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）および当該分野における慣用記号に従う。
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ分子」とは、２本鎖ＤＮＡおよびそれを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡの両者を包含する趣旨で用いられる。またその長さに特に制限されるものではない。従って、本明細書における遺伝子（ＤＮＡ分子）には、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）およびこれらの断片のいずれもが含まれる。
また、当該「遺伝子」または「ＤＮＡ分子」には、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ分子」だけでなく、これらによりコードされる蛋白質と生物学的機能が同等である蛋白質（例えば、同族体、変異体、誘導体など）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ分子」も包含される。具体的には、ストリンジェントな条件下で前記特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ分子」とハイブリダイズするものを挙げることができる。なお、遺伝子またはＤＮＡ分子は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
本明細書において「蛋白質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定塩基配列の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列からなる「蛋白質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等である「蛋白質」または「（ポリ）ペプチド」（例えば、同族体、変異体、誘導体など）が包含される。その例としては、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体および人為的に欠失、置換もしくは付加されることによって改変されたアミノ酸配列からなる変異体が包含される。かかる変異体としては、変異のない蛋白質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９８％相同なものを挙げることができる。なお、アミノ酸配列の相同性は、アミノ酸配列相同性検索のための既知のプログラムであるＦＡＳＴＡもしくはＢＬＡＳＴプログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ，Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５，３０７−３１８（１９９４））によって検索されるものとする。
以下、本発明バクテリオファージ（以下、単に「ファージ」ということがある）、溶菌活性酵素（細胞壁分解酵素）および細菌細胞表面レセプターに対するリガンドにつき順次詳述する。但し、以下の説明および例は、本発明の好適な実施態様を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）本発明バクテリオファージ
本発明バクテリオファージは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、以下単に「細菌」ということがある）の細胞壁分解酵素（溶菌酵素）をコードする特定のＤＮＡ配列および／または細菌細胞表面レセプターに対してリガンドとして機能する蛋白質をコードする特定のＤＮＡ配列を保有することにより特徴づけられる。
上記溶菌酵素をコードする特定のＤＮＡ配列としては、代表的には、配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。このＤＮＡ配列は、後記実施例において詳述するφＭＲ１１の保有する溶菌酵素をコードしており、配列番号：３に示されるφＭＲ１１の全ＤＮＡ配列の４０，５２７−４１，９６９番目のＤＮＡ配列（ＯＲＦ６５、全長１４４３ｂｐｓ）に相当する。
本発明ファージの有する溶菌酵素をコードするＤＮＡ配列は、上記φＭＲ１１が保有する配列番号：１のアミノ酸配列をコードするものに限定されず、該配列番号：１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質をコードするものであることができる。
ここで「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列」におけるアミノ酸配列の改変は、改変されたアミノ酸配列からなり蛋白質が、配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質と同一の機能、即ち細菌細胞壁分解酵素活性を有する同効物であることを前提として、その程度および位置を任意に選択することができる。かかるアミノ酸配列の改変（変異）は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあり、また天然由来の遺伝子（例えばφＭＲ１１の有する遺伝子）の配列を人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因および手段を問わず、上記細菌細胞壁分解酵素活性を有する改変アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を包含する。
該改変アミノ酸配列の一具体例としては、後述する実施例に示される本発明ファージφＭＲ２５の有するＤＮＡ配列（配列番号：７に示す全配列）中、ＯＲＦ６８によってコードされるアミノ酸配列を挙げることができる。該アミノ酸配列は、配列番号：８で示されるとおり、４８１アミノ酸残基からなっており、ファージφＭＲ１１のＯＲＦ６５によってコードされるアミノ酸配列とは、９８．１％の相同性を有している（図１３参照）。その詳細は、後記実施例４の（３）において説明する。
配列番号：１のアミノ酸配列の好適な改変アミノ酸配列としては、元のアミノ酸配列と一定の相同性を有するもの、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有するものを挙げることができる。
かかる特定の細菌細胞壁分解酵素（溶菌酵素）をコードするＤＮＡ配列を有する本発明ファージは、特に強い溶菌活性を有しており且つＭＲＳＡに対して有効であることを利用して、細菌、殊にＭＲＳＡを十分に死滅させる効果を奏し得る。従って、該ファージは細菌感染症、特にＭＲＳＡの予防および治療剤として有用である。
また、本発明ファージの保有する細菌細胞表面レセプターに対してリガンドとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡ配列としては、代表的には、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。このＤＮＡ配列は、本発明ファージφＭＲ１１が保有するものであり、配列番号：３に示されるφＭＲ１１の全ＤＮＡ配列の３６，５９３−３８，４６４番目のＤＮＡ配列（ＯＲＦ６１、全長１８７２ｂｐｓ）に相当する。より詳しくは、該ＤＮＡ配列はそのＣ末端側が溶菌酵素（ｌｙｓｉｎ）をコードしており、Ｎ末端側がレセプターに対するリガンドをコードしている。
本発明ファージの有する上記特定のリガンドをコードするＤＮＡ配列は、φＭＢ１１が保有する配列番号：２のアミノ酸配列をコードするものに限定されず、該配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対してリガンドとして機能する蛋白質をコードするものであることができる。
かかる特定のリガンドとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する本発明ファージは、該リガンドとしての機能が特に広範囲の宿主細菌に対するものである。この性質を利用して、該ファージは広範な宿主細菌に特異的且つ効果的に吸着することができる。従って、該ファージは、その広範囲に亘る細菌吸着能を利用して、例えば、新たに開発される抗菌有効成分や細菌に対する毒素などを含む各種の外来ＤＮＡを、宿主細菌に輸送、伝達することができる。
特に本発明ファージは、例えばφＭＲ１１のように、特定の溶菌酵素をコードするＤＮＡ配列（ＯＲＦ６５）と、特定のリガンドをコードするＤＮＡ配列（ＯＲＦ６１）との両者を有するものであるのが好ましい。
本発明ファージの溶菌機構につき、上記φＭＲ１１を例にとり詳述すれば、該ファージφＭＲ１１は、そのリガンド（ＯＲＦ６１のＮ末端側がコードするもの）の作用により標的細菌（黄色ブドウ球菌）に吸着すると共に、細菌細胞壁を破壊（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ、ＯＲＦ６１のＣ末端側がコードする溶菌酵素による）して、そのゲノムを細菌細胞内に注入して感染を成立させる。その後、細菌細胞内のファージゲノムは、これが溶菌サイクルに入ったときに溶菌酵素（ＯＲＦ６５がコードするもの）を産生し、該酵素はｈｏｌｉｎ（ＯＲＦ６４がコードするもの）のいわゆる「穴あけ」作用によって細菌細胞壁を経て菌体外に放出され、細胞壁を菌体外から破壊して（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｉｎ）、細菌自体を溶菌により死滅させ、また菌体内に産生された子ファージを菌体外に放出させる。このように、本発明ファージφＭＲ１１におけるＯＲＦ６１は、リガンドをコードするものであると同時に菌体内にゲノムを注入するために細胞壁を一部溶解させる溶菌酵素（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ）をコードするＤＮＡ配列であり、ＯＲＦ６５は、ファージの複製増殖の繰り返しによって産生され続けて、最終的に標的菌を完全に死滅させる溶菌酵素（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｉｎ）である。両者は、細菌を死滅させ、ひいては細菌感染症を予防および治療するためのファージにとって重要なものである。
本発明ファージφＭＲ１１の他の特徴点としては、溶菌サイクルのスイッチのオン／オフに関与する抑制蛋白（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，ＯＲＦ４）をコードする配列の結合部位（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ，ＲＢＳ）が、ＯＲＦ４とＯＲＦ４．１（溶菌サイクルの開始に最初に必要な遺伝子）とに挟まれた部位に存在すると考えられる点である。更に、本発明ファージφＭＲ１１は、溶原化に必須の部位特異的組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）として、既知のファージが有するｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙに属する酵素群とは異なって、ファージ或いは宿主菌由来の他の蛋白因子を必要としないｒｅｓｏｌｖａｓｅ  ｆａｍｉｌｙに属する新しい酵素をコードするＤＮＡ配列を有している。このφＭＲ１１の部位特異的組換えシステムはユニークなものであると考えられる。更に、本発明ファージφＭＲ１１は、他のファージにみられることがある毒素遺伝子や薬剤耐性遺伝子を有していない点をも特徴としている。これらのことがらも本発明φＭＲ１１は、医療分野における利用に好適なものである。
本発明ファージは、黄色ブドウ球菌を含む微生物の存在下で増殖させることにより調製することができる。より詳しくは、本発明ファージは、
（ａ）黄色ブドウ球菌からマイトマイシンＣ誘発によって溶原ファージを含有する試料を得る工程、
（ｂ）該試料をフィルターに通してファージを通過させる工程、
（ｃ）フィルターを通過したファージを精製する工程、
（ｄ）精製されたファージを、黄色ブドウ球菌を含有する培地中で増殖させる工程、
（ｅ）増殖したファージを単離する工程、および
（ｆ）単離されたバクテリオファージを精製する工程により調製することができる。
各工程は、以下の記載および後記実施例の記載から明らかである。
本発明バクテリオファージは、代表的には細菌感染症に感染した哺乳動物由来の細菌含有試料、例えば血液、尿、便、髄液、鼻粘膜、皮膚、咽頭や気管の洗浄液などから得ることができる。好ましくは、本発明ファージはＭＲＳＡ由来の細菌感染試料から得ることができる。より好ましくは該試料にマイトマイシンＣを添加して溶原ファージを誘発させて得ることができる。また、本発明ファージは、種々の保存機関に保存されている細菌から得ることもできる。
本発明ファージの単離は、例えば、細菌中で繰り返し増殖させた後、プラーク形成単位から、常法に従いファージを選択することにより実施できる。より詳しくは、一般的な方法、例えば、濾過、プラーク形成、およびショ糖、フィコール、パーコールもしくは塩化セシウムのような勾配液中の分析的密度勾配遠心分離に従ってファージを単離することができる。これらの詳細は、後記実施例において説明する。
また、得られるファージはさらに精製処理することができる。該精製は例えば限外濾過、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーのような、当分野における公知の方法に従って行うことができる。
本発明ファージは、黄色ブドウ球菌の溶菌活性を有しており、該細菌を死滅させることができる。従って、これは、ファージ療法剤として細菌感染症の治療および予防に特に、ＭＲＳＡ院内感染の予防および治療に有効である。
本発明はかかる細菌感染症治療および予防剤などの医薬組成物を提供する。
本発明医薬組成物は、その有効成分として本発明ファージを含有することを必須の要件として、他は、基本的には従来知られているファージ療法剤などと同様のものとすることができる。通常、該組成物は、その投与に適した製剤形態に調製され、治療もしくは予防処置を必要とする感染症患者または健常者に投与される。
製剤形態は、投与経路に応じて適宜決定することができる。該投与経路の具体例としては、腹腔内投与、皮下投与、鼻腔内投与、経口投与、静脈内投与など、好ましくは腹腔内投与、皮下投与および鼻腔内投与を挙げることができる。これらの投与経路に適した製剤形態は、一般には注射剤形態、エアゾール剤形態などの液剤形態を挙げることができる。勿論、本発明医薬組成物は、これらの形態に限定されるものではなく、例えば有効成分とする本発明ファージをリポソームに包埋したリポソーム製剤形態や、脂溶性マイクロカプセル、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ）などの形態とすることもできる。これらの形態の調製は、常法に従うことができる。
各製剤形態は、常法に従い、本発明ファージを製剤学的に許容される適当な担体（医薬担体ないしは希釈剤）と共に利用して調製することかできる。注射剤形態に調製される場合、医薬担体乃至希釈剤としては、通常のリン酸緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、蒸留水、リンゲル液その他の細胞保存液などの水性媒体、およびプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な非水性媒体を挙げることができる。また、製剤には、一般的な蛋白製剤などと同様に、安定化剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤、不活性ガスなどを適宜添加配合することもできる。
本発明組成物中に含有される活性成分としてのファージの配合量、これを含む組成物の投与量などは、該組成物の投与によって細菌感染症が治療もしくは予防できる限り特に限定されるものではなく、その投与経路、処置を必要とする細菌（感染症）の種類および数などに応じて当業者にとり適宜決定することができる。例えば、後述する実施例に示すマウスを利用した試験例では、標的細胞に対して１−２００  ＭＯＩの腹腔内投与量で、所望の効果が認められており、この投与量を目安とすることかできる。一般に、本発明ファージの投与量は、約１０６−１０１３ＰＦＵ／ｋｇ／ｄａｙの範囲から選択することができる。
本発明医薬組成物は、細菌感染した哺乳動物の処置、即ち細菌微生物を十分に死滅または排除して当該微生物の宿主動物への感染を無効にする処置に使用することができる。特に、本発明組成物は広範な各種細菌微生物のいずれに感染した哺乳動物の処置にも適用できる利点があり、更にＭＲＳＡ、ＶＲＳＡなどの細菌感染症の処置にも適用できる利用がある。
本発明医薬組成物は、その単独投与によって（ファージ療法）、充分に各種細菌感染症の処置を行い得るものではあるが、必要に応じて、各種抗生物質を利用した化学療法などと組合せて細菌感染症の処置に利用することも可能である。
（２）細菌細胞壁溶解酵素およびこれをコードする遺伝子
本発明は、ファージ療法に有用なバクテリオファージ自体と共に、これが保有する細菌細胞壁分解酵素（溶菌酵素）および該酵素をコードする遺伝子をも提供する。
上記細菌細胞壁分解酵素は、細菌細胞壁を溶解し、該細菌を死滅させる作用を奏し得るものであり、従って、その利用（投与）によって細菌感染症に罹患した哺乳動物の感染症を治療することができ、また、哺乳動物が細菌感染症に罹患するおそれを未然に予防することができる。特に、本発明の溶菌酵素は、ＭＲＳＡを死滅させるのに有効である。本発明溶菌酵素は、細菌との接触によって該細菌を死滅させ得るものであり、例えば病院などにおいて殺菌消毒液（除菌液）として利用することによって、医療従事者や入院患者などがＭＲＳＡに院内感染するおそれなどを未然に防止することができる。
本発明溶菌酵素の具体例としては、配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。このものは本発明ファージφＭＲ１１のＤＮＡ配列によってコードされている。より詳しくは、後記実施例４の（３）に説明する通り、ＯＲＦ６５として示されるφＭＲ１１のＤＮＡ配列の４０，５２７−４１，９６９番目のＤＮＡ配列がコードするものである。
本発明溶菌酵素は、該配列番号：１のアミノ酸配列に限らず、該配列番号：１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質であることができる。その具体例としては、例えば図１３に示す本発明ファージφＭＲ２５のＤＮＡ配列によってコードされるアミス酸配列を挙げることができる。この蛋白質（改変されたアミノ酸配列を有するもの）は、配列番号：８（全４８１アミノ酸残基）で示されるアミノ酸配列からなっており、そのアミノ酸配列は、配列番号：１のアミノ酸配列（全４８１アミノ酸残基）と９８．３％同一である。
本発明蛋白質は、これをコードするＤＮＡ配列を利用して、常法に従い、遺伝子工学的手法により製造することができる。
本発明蛋白質の遺伝子工学的手法において利用されるＤＮＡ配列は、これを保有する起源、例えば本発明ファージから、常法に従いｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記ＤＮＡ配列に特有の適当なプローブや抗体などを用いて所望クローンを選択することにより単離することかできる。所望クローンの選択のための一般的方法としては、特異抗体を利用する免疫的スクリーニング方法、プローブを用いるプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法などを挙げることができる。所望ＤＮＡ配列の取得は、好適には、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法によることができ、その精製は例えばゲル電気泳動法によることができる。また、各操作におけるＤＮＡ断片の配列の決定は、ジデオキシ法、マキサム−ギルバート法、市販シークエンスキットを用いる方法などによることができる。
上記ＤＮＡ配列を利用した本発明蛋白質の製造は、例えば該ＤＮＡ断片を宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養する方法によることができる。ここで、宿主細胞としては、一般には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株などの原核生物、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母細胞、昆虫細胞などの真核生物がよく用いられる。本発明では、特に該宿主細胞として、黄色ブドウ球菌を用いることもできる。組換えＤＮＡの調製、その宿主細胞への導入および所望蛋白質の発現方法（形質転換体の培養方法）も、基本的に一般的方法に従うことができる。得られる蛋白質の分離、精製も一般的技術に従うことかできる。
尚、本発明蛋白質の製造のための遺伝子発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用することができる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ヒスチジン・タグ融合蛋白質として発現させるためのヒスチジンリピートを付与したものなどを例示することができる。特に、ｐＧＥＸの利用によれば、得られる融合蛋白質は、ＧＳＴがグルタチオンと結合する性質を利用して、アフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製することができる利点がある。また、所望の蛋白質のＮ末端あるいはＣ末端にＨｉｓの６個をタグ（目印）として結合させた融合蛋白質は、コバルトなどの金属やニッケルＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）アガロースに特異的に吸着する性質がある。この性質を利用して、タグのついた組換え蛋白質のみを一段階で且つ高純度に精製することができる利点がある。
上記で得られる組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作［「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４−８２７７（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３−３２１（１９８７）など参照］により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。特に好ましい分離、精製方法としては所望の蛋白質を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーを例示できる。
また、本発明蛋白質は、そのアミノ酸配列情報に基づいて、一般的なペプチド合成方法に従って化学合成することも可能である。
本発明蛋白質は、細菌細胞壁溶解酵素（溶菌酵素）活性を有しており、特に該酵素活性が強くしかもＭＲＳＡに対して有効な該酵素活性を有しており、従って該蛋白質は、細菌感染症の治療および予防に、殊にＭＲＳＡ感染症の治療および予防に利用することかできる。
本発明はかかる特定の溶菌酵素活性を有する蛋白質を有効成分とする医薬組成物（細菌感染症治療および予防のための酵素製剤）を提供する。
該医薬組成物は、前述した本発明ファージを有効成分とする医薬組成物と同様に、製剤学的に許容される担体を利用して、投与に適した各種の製剤形態に調製され、治療もしくは予防処置を必要とする感染症患者または健常者に、腹腔内投与、皮下投与、鼻腔内投与、経口投与、静脈内投与、皮膚塗布などに従い投与できる他、局所投与することもできる。その投与量は、投与経路、処置対象細菌、特にＭＲＳＡなどの黄色ブドウ球菌の種類や量などに応じて異なるが、処置対象細菌を殺菌、死滅できる範囲から適宜決定することかできる。
更に、本発明酵素は、一般的な殺菌、消毒剤（除菌剤）と同様にして、処置を必要とする細菌の殺菌、消毒剤として、例えば病院内の各種設備、手術用具などの殺菌消毒や、医者、患者などの手指、衣服などの殺菌、消毒に利用することもできる。かくして、院内感染を未然に防ぐことができる。該殺菌、消毒剤（除菌剤）は、その有効成分として本発明酵素を利用することを除いて、一般的な殺菌、消毒剤と同様に、製剤学的に許容される担体を用いて、適当な製剤形態に調製される。製剤形態中に配合される本発明酵素の量は、得られる製剤の形態、用いる担体の種類、適用箇所などに応じて適宜決定することができる。その際には、本発明酵素がその１０μｇ（精製酵素剤として、濃度約０．１μｇ／μＬ）で、１０７個の黄色ブドウ球菌を完全破壊することができる優れた殺菌効果を奏し得ることを考慮することができる。
（３）細菌細胞表面レセプターに対するリガンドおよびこれをコードする遺伝子
本発明は、細菌細胞表面レセプターに対してリガンドとして機能する蛋白質およびこれをコードするＤＮＡ配列をも提供する。該リガンドとして機能する蛋白質の代表例としては、本発明ファージφＭＲ１１が保有している配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることかできる。この蛋白質（リガンド）は、より詳しくは、後記実施例４の（４）に記載するとおり、本発明ファージφＭＲ１１が保有する配列番号：３のＤＮＡ配列中、ＯＲＦ６１として示される３６，５９３−３８，４６４のＤＮＡ配列（全長１８７２ｂｐｓ）によってコードされるものである。
本発明リガンドは、上記φＭＲ１１が保有する配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質に限らず、該配列番号：２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対してリガンドとして機能する蛋白質であることもできる。
本発明リガンドは、該リガンドとしての機能が特に広範囲の宿主細菌に対するものであることを利用して、免疫原性の異なる各種ファージにこれを組み込むことによって、該ファージに広範な宿主細菌に対して特異的且つ効果的に吸着する性質を付与することができ、ファージの繰り返し投与の際の中和抗体による失活のおそれを最小限に抑えることができる。また、かくして得られるリガンドを有する本発明ファージは、広範囲に亘る細菌吸着能を利用して、例えば、新たに開発される抗菌有効成分や細菌に対する毒素、自殺遺伝子などを含む各種の外来ＤＮＡを、宿主細菌に輸送、伝達することができる。
【発明の効果】
本発明によれば、特にＭＲＳＡなどの多剤耐性型黄色ブドウ球菌による感染症の治療に有効な、非毒性で宿主特異的で且つ宿主範囲の広いバクテリオファージ、並びに該バクテリオファージに由来する溶菌活性酵素、即ち黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）および該バクテリオファージに由来する細菌細胞表面レセプターに対するリガンドが提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明ファージφＭＲ１１の電子顕微撮影結果を示す。
図２は、実施例１の（４）に従い本発明ファージφＭＲ１１の細菌に対する吸着速度、潜伏期間およびバーストサイズを調べた結果を示すグラフである。
図３は、実施例１の（７）に示す試験における細菌の感染マウスに対する致死量を求めた結果を示すグラフである。
図４は、細菌感染マウスの生存率を調べた結果を示すグラフである。
図５は、実施例１の（９）に従って細菌感染マウスに対する本発明ファージの延命効果を調べた結果を示すグラフである。
図６は、実施例１の（１１）に従って細菌感染マウスに対する本発明ファージの投与時期と保護効果との関連を調べた結果を示すグラフである。
図７は、実施例１の（１２）に従う試験における循環血流中に存在するファージ数および細菌数を調べた結果を示すグラフである。
図８は、実施例１の（１３）に従って求められたＭＲＳＡ感染マウスに対する本発明ファージの有効性を調べた結果を示すグラフである。
図９は、実施例２の（１）に従う腹腔内投与後の本発明ファージの各種臓器および組織への分布を示すグラフである。
図１０は、実施例２の（２）に従う本発明ファージの投与経路と血中ファージ濃度との関連を示すグラフである。
図１１は、実施例３に従う本発明ファージの延命効果（細菌致死抑制効果）を調べた結果を示すグラフである。
図１２は、本発明ファージφＭＲ１１のゲノムＤＮＡの特徴を示す図である。
図１３〜２０は、それぞれ、本発明細菌細胞壁分解酵素のアミノ酸配列を他の溶菌酵素のそれと対比した図である。
図２１〜２５は、それぞれ、細菌表面レセプターに対する本発明リガンドのアミノ酸配列を他の蛋白のそれと対比した図である。
図２６は、本発明細菌細胞壁溶解酵素の遺伝子工学的製造のための、プライマーおよび発現ベクター（ｐＴｒｃ９９Ａ／６５）の概略を示す図である。
図２７（２７−１〜２７−４）は、本発明細菌細胞壁分解粗酵素の各種黄色ブドウ球菌に対する溶菌活性を調べたグラフである。
図２８（２８−１および２８−２）は、本発明細菌細胞壁分解粗酵素の黄色ブドウ球菌以外の各種菌に対する溶菌活性を調べたグラフである。
図２９は、本発明細菌細胞壁溶解酵素の遺伝子工学的製造のための、プライマーおよび発現ベクター（ｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓ）の概略を示す図である。
図３０（３０−１〜３０−４）は、本発明細菌細胞壁分解粗酵素の各種黄色ブドウ球菌に対する溶菌活性を調べたグラフである。
図３１（３１−１および３１−２）は、本発明細菌細胞壁分解粗酵素の黄色ブドウ球菌以外の各種菌に対する溶菌活性を調べたグラフである。
図３２は、本発明細菌細胞壁分解粗酵素のＭＲＳＡ株８５／２０８２に対する溶菌活性の長期効果を調べたグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
尚、各例で利用した試薬および培地は、特筆しない限り、ナカライテスク社から購入した。ＴＢＳ培地（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ）およびＨＩＢ培地（ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ）は、ディフコ社（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のものを用いた。ＴＳＢＭはＴＳＢ培地に２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した培地である。ＨＩＢＭＣ培地は、ＨＩＢ培地に２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した培地である。
また、ファージプラーク形成およびスポットテストには、アガロースの１．５％および０．５％を含有するＴＳＢＭ−固体培地をそれぞれ下層および上層として用いた。
細菌の増殖は、Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎカラーメーター（フィルター＃５４）にて濁度を測定することによりモニターした。１Ｋｌｅｔｔ単位は６．４×１０６個／ｍｌに相当する。この換算は、予めＰｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｓｅｒ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）にて直接測定した細菌数と上記濁度との標準化された関連を基礎としている。
【実施例１】（１）黄色ブドウ球菌株およびその調製
利用した黄色ブドウ球菌は、メチシリン感受性（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）４３株（株番号の頭にＳＡを付して呼ぶ）、標準ＭＳＳＡ株（２０９Ｐ株）およびＭＲＳＡ３０株（株番号の頭にＭＲを付して呼ぶ）の合計７４株である。
殆どのＭＳＳＡは健常者１６２名の鼻腔スワップ由来であり且つ全てのＭＲＳＡは高知大学病院患者の臨床サンプル由来である。鼻腔スワップおよび臨床サンプルは卵黄加マンニット食塩培地（黄色ブドウ球菌の選択的且つセミ特異的増殖培地、Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）上に拡散させた。
全ての単離した株が黄色ブドウ球菌であることは、ＡＰＩ−ＳＴＡＰＨ同定キット（Ｂｉｏｍ▲ｅ▼ｒｉｅｕｘ社）を用いて、また凝固酵素試験および顕微鏡観察によって確認された。
ＭＲＳＡ株の同定は、オキサシリン（ｏｘａｃｉｌｌｉｎ）６μｇ／ｍｌを含む選択塩寒天プレート（ＭＳＯ培地、Ｎｉｓｓｕｉ社）上コロニー形成により行った。ＭＳＯプレート上にコロニーを形成した株は、更にＰＣＲ検出キット（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いてｍｅｃＡ遺伝子試験（ＭｅｃＡ  ｔｅｓｔ“Ｗａｋｕｎａｇａ”，Ｗａｋｕｎａｇａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）を行った。
ＭＳＯ上で生育し得ない株をＭＳＳＡと判定した。標準ＭＳＳＡ株としての２０９Ｐ株（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｏｓａｋａ  Ｕｎｕｖｅｒｓｉｔｙから入手）および２種のＶＲＳＡ株（Ｍｕ３（ｈｅｔｅｒｏ−ＶＲＳＡ）およびＭｕ５０（ＶＲＳＡ），Ｋ．Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  ｏｆ  Ｊｕｎｔｅｎｄｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手、Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９７；３５０：１６７０−１６７３．参照）も使用した。
本例では、ＭＳＳＡ株ＳＡ３７（ＭｅｃＡ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）を健常者の鼻孔から単離し、本発明ファージの伝搬宿主および／または試験的標的とした。また、動物試験のためにＳＡ３７の２種の変異株を確立した。その一つは生体内における細菌動態試験のために、リファンピシン耐性（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）変異株（ＳＡ３７−ＲＩＦ２）を使用した。該変異株は、ＳＡ３７親株をリファンピシン２μｇ／ｍｌ含有する選択ＴＳＢ寒天培地に播種することによって単離した。この変異株はＳＡ３７と同じ増殖性およびファージＭＲ１１に対する感受性より確認した。もう一つの変異株であるＳＡ３７のＭＲ１１−溶原（ＭＲ１１−ｌｙｓｏｇｅｎ）株（ＳＡ３７／φＭＲ１１は、φＭＲ１１の生体内効果の比較試験に利用した。この変異株はＴＳＢＭプレートに拡散させたφＭＲ１１−暴露ＳＡ３７細胞の中で希に出現する細菌コロニーに由来する。
ＳＡ３７／φＭＲ１１におけるφＭＲ１１の溶原性を、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＸｂａＩ消化分析結果が元のφＭＲ１１のそれと同じであることから、予備確認した。該消化分析は、後記するマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）誘発によってＳＡ３７／φＭＲ１１から放出されるファージの開裂ＤＮＡ断片パターンを示す。この溶原性は親株ＳＡ３７と同じ生物学的性質であった。
（２）マイトマイシンＣ誘発溶原ファージの調製
以下の手順に従って、各種黄色ブドウ球菌から、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）誘発により溶原ファージを分離した。
即ち、黄色ブドウ球菌ＭＲ１１株を液体ＴＳＢ培地に、６×１０７個／ｍｌ接種後、３７℃で２時間振盪培養して菌数を６×１０８個／ｍｌとした後、培養液にマイトマイシンＣを１μｇ／ｍＬ添加し更に３０分間培養を継続した。その後、培養液を８０００×ｇで１０分間遠心し、得られる菌ペレットに等量の新鮮ＴＳＢ培地を加えてよく懸濁させた後、再遠心し、菌ペレットに新鮮ＴＳＢ培地を加えて培養を再開した。菌が約３×１０９個／ｍｌまで増殖した後、内在ファージの放出が始まり、培養再開後約４時間で溶菌は完了した。
培養物（溶菌液）を、遠心し、フィルター（孔径０．４５μｍ）で濾過し、濾液を希釈後、黄色ブドウ球菌を宿主としてプラーク（１個のファージに由来する溶菌斑）を作らせて、単一ファージを分離した。
（３）スポットテスト
上記（２）で得られた溶菌液濾液（上清）を細菌溶解活性のためのスポットテストスクリーニングに供した。該スクリーニングには７３の黄色ブドウ球菌（野生型）、標準ＭＳＳＡ株（２０９Ｐ）、ＶＲＳＡ株（Ｍｕ３およびＭｕ５０株）を用いた。もし、上清がファージを含むなら、このスクリーニングはその細菌溶解性宿主範囲の確立にも利用できる。
各上清１白金耳（約５μＬ）を直接細菌株のローン（ｌａｗｎ）上に置き、３７℃で２４時間インキュベーション後、溶菌スポットの形成を評価した。
上記スポットテストによって選別された溶菌活性陽性の培養上清を、次に、適当な宿主菌を用いたｓｉｎｇｌｅ−ｐｌａｑｕｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎに供した。選び取ったプラークをより大容量の培地で大量培養した。
その結果、次のことが明らかとなった。
（ａ）７２の上清中、３６サンプルが、少なくとも一つの細菌のローン上に溶菌スポットを産生し、ＭＭＣによる溶原性ファージの複製が誘導されたことを明らかにした。該３６のスポット陽性上清の内で、８つが大部分の細菌ローン上に溶菌スポットを形成し、広宿主域ファージを含有することを明らかにした（後記プラーク形成アッセイおよび電子顕微鏡写真にて確認）。
（ｂ）その内の一つ、即ちφＭＲ１１と名付けた最も広い宿主範囲を有するファージは、試験した殆ど全ての黄色ブドウ球菌に対してスポットを形成した。従ってこのものは、黄色ブドウ球菌の表面に普遍的に発現されるレセプター分子を介して、広範な黄色ブドウ球菌に効果的に吸着できることが明らかとなった。
（ｃ）更に、このφＭＲ１１は、最も数多くの細菌（試験した７５株中の３０株）上に大きくて鮮明なプラークを産生した。
（ｄ）また、φＭＲ１１と同様に広い宿主範囲を有する他の一つとしてφＭＲ２５と名付けたファージを得た。
上記スポットテストの結果とプラーク形成分析結果との相違は、ファージの細菌溶解性（ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｓｉｓ）に２つの異なるメカニズムがあることを反映している（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，２００１；９８：４１０７−４１１２，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９２；５６：４３０−４８１参照）。
即ち、溶菌スポット形成は、ファージ複製サイクル（ｐｈａｇｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ｌｙｔｉｃ）ｃｙｃｌｅ）に関連する菌体内部からの溶菌（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｉｎ）と、ファージが細菌に結合すること（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９２；５６：４３０−４８１参照）によって惹起される菌体外からの溶菌（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ）との両者の総和を表している。一方、プラーク形成は、上記菌体内部からの溶菌メカニズムのみを示している（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９２；５６：４３０−４８１参照）。従って、スポット陽性であるがプラーク陰性という結果を呈した菌株では、単にファージが細菌表面に吸着したことによって溶菌が引き起こされており、引き続く子ウイルスの増殖過程が溶菌サイクルのいずれかのステップで抑制されていることを示している。
以下の試験には、このファージφＭＲ１１またはφＭＲ２５（いずれもＳＡ３７株を宿主として単離された単一ファージ）を利用した。
（４）φＭＲ１１の生物学的およびウイルス学的特徴
φＭＲ１１の電子顕微撮影結果を図１に示す。
図１は、ＳＭＣ中の精製ファージサンプルを５％ホルマリンで固定し、２％酢酸ウラニル（ｐＨ４．０）を用いてネガティブ染色後、トランスミッション電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７１００，Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて７５ｋＶにて撮影したものであり、図中、黒棒は１００ｎｍを示す。
該図より、ファージφＭＲ１１は、直径５６±２ｍｍの等角的六角頭および長さ１７５±５ｍｍの非収縮性の尾を有し、尾部の遠心位末端にノブ状構造を持つことが判る。従って、形態学的に、シフォビリデ（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）形態型Ｂ１（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  Ｈ−Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）ファミリーに分類される。
上記と同様にして、本発明ファージφＭＲ２５を電子顕微鏡観察した結果、このファージは、φＭＲ１１と実質的に同等の形状、構造を有していることが確認された。
また、φＭＲ１１の吸着速度、潜伏期間およびバーストサイズを、アダムスらの方法（Ａｄａｍｓ，Ｋ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９５９）に従って決定した。全ての分析のためのインキュベーションは、ＴＳＢＭ培地中で３７℃下に実施した。
吸着速度の試験では、φＭＲ１１の１．５×１０３ＰＦＵをＳＡ３７細胞１０９個／ｍｌと混合し、クロロホルム処理（Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９５；１２５：１０１−１０６）後に菌に吸着せずに残った感染性ファージ粒子の数を計数した。
潜伏期間およびバーストサイズの試験では、ＳＡ３７細胞５．８×１０８個／ｍｌを、φＭＲ１１の２．４×１０３ＰＦＵと５分間接触させ、冷ＴＳＢＭ培地で十分に洗浄して非結合ファージを除去した後、菌を新鮮な培地に再浮遊させ、得られる細胞浮遊液の一定量を３７℃で所定時間培養した。培養後、各々の培養液をＳＡ３７のローン上に接種し、新たに産生された遊離ファージおよび細胞結合性ファージの両者を一括してファージビリオン数として計測した。
吸着速度の試験結果を図２に示す。
図２中、Ａは吸着速度（縦軸：試験開始時のファージ数に対する非吸着ファージ数の％、横軸：時間（分）を示す）の結果であり、Ｂは潜伏期間およびバーストサイズ（縦軸：新たに産生されたファージ数（ｌｏｇ１０）、横軸：時間（分）を示す）の結果である。
図２に示されるとおり、φＭＲ１１は、（１）迅速な吸着速度、（２）短い潜伏期間および（３）１００以上の比較的大きいバーストサイズを有することが明らかとなった。即ち、感受性細菌宿主が十分な数で存在する場合、９０％を越えるφＭＲ１１粒子が１分以内にそれらに結合（図２のＡ参照）し、約２５分の短い潜伏期間を経て、親φＭＲ１１粒子１個当たり１００以上の子ファージ粒子を新たに産生する能力があることが判った（図２のＢ参照）。
φＭＲ１１の効果的な宿主細胞溶解能は、典型的な溶菌ファージ、例えば大腸菌のＴ偶数ファージ（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  Ｈ−Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）と類似の高い溶菌能を示唆する。一般に、ファージの増殖は、感受性宿主細菌の増殖が休止期に入ると、それに同調して低下するが、興味深いことに、φＭＲ１１はたとえ宿主細菌の増殖が休止する安定飽和状態にあっても、効率的に増殖する能力、即ち溶菌能を有している。
（５）ファージ粒子の精製
φＭＲ１１ファージを、基本的には数種のＴ４型ファージを用いる方法（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｓ，，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２；３６：９３−９７、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１９９８；２４２：３１４−３１８、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９８；２２２：２５−３０、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９；１４４：１６４７−１６５１、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９；１４４：２００７−２０１２、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００；４４：９５３−９５６参照）に従って精製した。
即ち、ＴＳＢＭ培地５００ｍｌに１．２×１０８細胞／ｍｌの濃度で懸濁させたＳＡ３７宿主細胞を、φＭＲ１１の粗含有物を０．０１の感染価（ＭＯＩ）にて接種し、約４時間３７℃で激しく振盪して完全に溶菌させた。３７℃下に１％クロロホルムで５分間処理した後、培養液を８０００×ｇで１０分間、４℃下に遠心して細胞残渣を除去した。得られた上清にポリエチレングリコール（平均分子量６０００）およびＮａＣｌをそれぞれ終濃度が１０％および０．５Ｍとなるように加え、３日間４℃に放置し、沈殿させた。かくしてファージ粒子を含有する沈殿を、８０００×ｇで２０分間、４℃下に遠心分離して集め、ＴＭバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２）に再懸濁させ、２０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｔｙｐｅ  ＩＩ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）および１０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｔｙｐｅ  ＩＡ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）にて３０分間、３７℃で処理した。
次いで、得られたファージ懸濁液を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）不連続密度勾配（ρ＝１．３，１．５および１．７）上に置き、１０００００×ｇにて１時間、４℃下に遠心分離した。ファージ粒子の濃縮バンドを回収し、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＳＭＣ）を含む生理食塩水に対して２時間、４℃で透析した。塩化セシウム不連続密度勾配分離および透析（１時間）を再度繰り返し、更にＨＩＢＭＣ培地に対する透析を１時間、４℃下に実施した。
精製されたファージ懸濁液を濾過（０．４５μｍの孔径フィルターを使用）し、一定量に分割し、４℃で使用時まで貯蔵した。
精製ファージ標品は菌への感染の直前にＨＩＢＭＣにて適宜希釈して使用した。精製ファージ標品の感染力価（ＰＦＵ／ｍｌ）は、該標品をＳＡ３７株に接種することによって決定した。
マウスへのＭＲＳＡ株の感染実験では、φＭＲ１１の投与前に、一度φＭＲ１１を各ＭＲＳＡ内で増殖させて、細菌による制限−修飾系の可能性を最小限に抑えた。制限−修飾系はファージ複製の抑制機序のひとつとして知られているためである（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９２；９４：１９１−１９４）。ＭＲＳＡ株を用いる本感染実験においても、φＭＲ１１の精製は、前述した方法に従い実施した。尚、上記の宿主ＭＲＳＡ株に適応させた精製φＭＲ１１の感染力価は、それぞれ対応するＭＲＳＡ株を用いて新たに測定した。
（６）黄色ブドウ球菌毒素のバイオアッセイ
一部の黄色ブドウ球菌は、病原性毒素を産生する。ファージはそのうちのいくつかの毒素の遺伝子を伝達することが知られている。本試験は、φＭＲ１１およびφＭＲ２５が分離された親菌株ＭＲ１１およびＭＲ２５について、これらの菌が既知の毒素を産生するか否かを、逆受身ラテックス凝集法（ＲＰＬＡ，Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８８；５４：２３４５−２３４８）により検討した。
黄色ブドウ球菌のエンドトキシンおよび毒素性ショック症候群トキシン−１（ＴＳＳＴ−１）を、３７℃で１８−２０時間培養後のＭＲ１１およびＭＲ２５のそれぞれの培養上清を用いて測定した。該測定はアッセイキット（ＳＥＴ−ＲＰＬＡ“Ｓｅｉｋｅｎ”ａｎｄ  ＴＳＴ−ＲＰＬＡ“Ｓｅｉｋｅｎ”，Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）のプロトコールに従った。
その結果、ＭＲ１１およびＭＲ２５両菌株とも、上記毒素を産生しないことが判った。従って、ファージφＭＲ１１およびφＭＲ２５は上記毒素の遺伝子をコードしていないと判断された。この毒素遺伝子の非存在は、後述するＤＮＡ配列の解読結果からも明らかである。ファージφＭＲ１１およびφＭＲ２５が黄色ブドウ球菌について知られている毒素遺伝子を有していないという事実は、これらファージの生体内への投与の安全性を支持する。
（７）黄色ブドウ球菌の動物への感染試験
６−８週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（体重約２０ｇ）を使用した。黄色ブドウ球菌細胞をＴＳＢ培地１００ｍｌ中、３７℃で生育させ、定常状態の初期（約２５０Ｋｌｅｔｔ単位）に、８０００×ｇで５分間遠心して集菌した。細胞ペレットを生理食塩水１００ｍｌで洗浄後、同一条件下に遠心し、最終的に生理食塩水５ｍｌに浮遊させた。適当に希釈後、濁度（Ｋｌｅｔｔ単位）を測定して細胞数を計数した。
生理食塩水０．５ｍｌに浮遊させた所定数の細菌細胞をマウスの腹部の片側から腹腔内に注入し、またＨＩＢＭＣ１ｍｌに懸濁させた精製ファージ液を腹部の他方から注入した。コントロールとして、生理食塩水またはＨＩＢＭＣのみの同量を腹腔内注入した。その後、被験動物を１週間から１ヶ月間観察した。
約０．５ｍｌの血液を被験マウスの眼窩静脈穿刺によりキャピラリーチューブを用いて採取し、直ちにヘパリン５０μｌ（１０００Ｕ／ｍｌ，Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌｔｄ．）を混合した。ヘパリン加血液をＳＭＣで希釈後、ＳＡ３７−ＲＩＦ２の血中濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）をリファンピシン添加ＴＳＢプレート上で測定した。また、φＭＲ１１の血中濃度（ＰＦＵ／ｍｌ）を、宿主としてＳＡ３７を用いてＴＳＢＭプレート上で測定した。
対照としての無処置マウスについも同様に、血液サンプルを採取して検索を行い、本試験に利用したマウスが自然に、または偶発的にファージないし細菌に感染していないこと、実験操作の過程で人為的汚染、混入がないことを確かめた。
得られたデータの統計的有意差をフィッシャー正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）により検定した。
２×１０２から２×１０１０細胞の範囲の菌量でＳＡ３７株をマウスに注入して、黄色ブドウ球菌のマウスに対する致死量を求めた結果を図３に示す。
図３は、マウス１頭当たりに腹腔内注入したＳＡ３７株の菌数（横軸）別にみたマウスの生存率（％）をプロットしたグラフであり、図中、白丸は菌注入１日後の生存率を、黒丸は菌注入７日後の生存率をそれぞれ示す。また、各プロット上の数値は、被験マウス頭数を示す。尚、菌接種量「０」は、生理食塩水０．５ｍｌのみを注入したコントロール試験の結果を示す。
該図に示されるとおり、２×１０２から２×１０８個のＳＡ３７株の腹腔内注入では、注入後７日間の観察期間中マウスの生存率は低下しなかったが、３×１０８から１×１０９個では、接種菌量に依存してマウスの生存率が低下した。８×１０８のＳＡ３７の接種は２４時間以内で８０％のマウスに対して致死的であり、更に７日では１００％致死的であったので、この接種菌量がファージによる救命効果を観察するのに適した最少注入菌量と判断された。
以下の試験においては、従って、黄色ブドウ球菌の接種量は８×１０８個に固定した。
より詳細な時間追跡分析の結果を図４に示す。該図４は、被験マウス１０頭のそれぞれにＳＡ３７株（８×１０８個）を腹腔内注入し、それらの生存を２４時間に亘って観察した結果を示すグラフであり、横軸はＳＡ３７株の菌接種後の経過時間（時間）を、縦軸はマウスの生存率（％）を示す。
該図に示される結果より、８×１０８ＳＡ３７株の腹腔内接種は、菌注入後６−７時間でマウスの殆どを、菌血症を伴って死亡させることが判った。尚、上記菌注入の６時間後に、感染死したマウスを解剖した結果、巨脾症および急性腹水症を伴った重篤な全身性鬱血が認められた。
（８）黄色ブドウ球菌の物理的破砕標本液の調製
ＳＡ３７株をＴＳＢ１００ｍｌ中、３７℃で約２５０Ｋｌｅｔｔ単位となるまで培養し、１２，０００×ｇ、５分間、４℃で遠心し、生理食塩水で洗浄後、２×１０９細胞／ｍｌの濃度となるように生理食塩水に再懸濁させた。得られた懸濁液５ｍｌからの細胞ペレットを４℃下に乳鉢および乳棒を用いて機械的に粉砕し、生理食塩水を用いて全容量を５ｍｌに調製した。次いで、菌破砕液を孔径０．４５μｍの濾過膜を通して生細胞残渣を除去した。濾液を黄色ブドウ球菌の「物理的菌破砕液」として利用した。
（９）マウスにおけるＳＡ３７株に対するファージ投与の救命効果および安全性
ＳＡ３７株（８×１０８個）を腹腔内注入したマウスに、直ちに、精製φＭＲ１１を０．０１−２００の範囲の所定量（ＭＯＩ）にて、菌注入側とは異なる腹壁側から腹腔内に注射投与して、マウスの生存を観察した。
その結果を図５に示す。図５中、横軸は投与されたφＭＲ１１のＭＯＩを示し、縦軸はマウス生存率（％）を示す。また図の各プロット（黒丸）上に示された数値は、被験マウス頭数を示す。
図５に示されるように、０．１−２００ＭＯＩのφＭＲ１１の投与は、マウスのＳＡ３７感染死を顕著に阻止した。
一方、φＭＲ１１の多量（２．０×１０１１ＰＦＵ）の単独投与では、１ヶ月の観察期間中、３０頭のマウスの身体的健康状態および生存率に悪影響を与えなかった。良好な身体的健康状態と一致して、上記ファージ単独の処置６時間並びに１，７および１４日後のマウスの各種組織および臓器は、無処置のコントロールマウスおよびＨＩＢＭＣ培地のみを注射したマウスと対比して、病理学的に異なるものではなかった。
これらの知見は、φＭＲ１１それ自体が、少なくとも腹腔内接種した場合、迅速に流血（循環系）中に移行し、おそらくは更に全身の諸臓器・組織にも速やかに播種されるにもかかわらず、生体内に検出可能ないかなる副作用をも与えないことを明らかにしている（後述する図７参照）。
（１０）φＭＲ１１の救命効果のメカニズム
この試験は、観察された救命効果が、真にφＭＲ１１の溶菌活性に基づくものであるかどうかを確認するために行われたものである。
１×１０９のＳＡ３７株から調製されたファージ溶菌液のアナログである物理的菌破砕液（前記（８）で調製したもの）を、１×１０９のＳＡ３７株生菌の注入に続いて、マウスに腹腔内注入した。その結果、物理的菌破砕液はマウスの死を防止できなかった。従って、細菌成分自体は、たとえこれがファージ溶菌によって得られたものであっても、救命効果を発揮することはないと考えられる。一方、２倍の数（２．０×１０９）のＳＡ３７株から調製した物理的菌破砕液を単独でマウスに注射した場合は、なんら影響は認められなかった。このことからマウスでの致死作用は、この試験に用いた多量の菌破砕液によるものではないことが判った。
加えて、φＭＲ１１ビリオン自体が抗菌免疫応答を刺激する可能性を検討するために、標的菌としてφＭＲ１１を人工的に溶原化させたＳＡ３７亜株菌（ＳＡ３７／φＭＲ１１）を用いて次の試験を実施した。このＳＡ３７誘導体は、φＭＲ１１の溶菌活性に対して抵抗性を獲得した以外は、親ＳＡ３７株と同じ生物学的性質および遺伝的背景を有している。もし、正味の救命効果が、φＭＲ１１による溶菌作用ではなくて、ビリオン自体による免疫応答の刺激（サイトカインの生産など）を介しているならば、ファージの投与がＳＡ３７／φＭＲ１１感染に対しても、ＳＡ３７感染と同様に、治療効果を発揮するはずである。
精製φＭＲ１１（ＭＯＩ１０）の投与は、ＳＡ３７を注入接種されたマウスを救命したが、ＳＡ３７／φＭＲ１１を接種されたマウスは救命できなかった。この結果は、φＭＲ１１による直接的な溶菌活性が、マウスを用いる試験で観察される救命（治療）効果の発現に最も重要であり且つ唯一の決定因子であるという結論を支持する。
（１１）φＭＲ１１の投与時期と救命効果との関連
精製φＭＲ１１を、ＳＡ３７株（８×１０８個）注入の所定時間後（０，５，１０，２０および６０分経過後）に、マウス５頭のそれぞれにＭＯＩ２００となる量で腹腔内注入した（ファージ処理群）。コントロール（ファージ未処理群）として、ＨＩＢＭＣ培地（ファージ不含有）１ｍｌを腹腔内注射する群を設けた。
投与２４時間後（図６中Ａ）および７日後（図６中Ｂ）、両群での被験マウスの生存数を計数して生存率を求めた。
結果を図６（横軸：ＳＡ３７株注射からファージ投与までの時間間隔（分）、縦軸：マウス生存率）に示す。図中、網掛けした棒グラフはファージ処理群を示し、斜線を付した棒グラフはファージ未処理群を示す。また、※印はコントロールに対する統計学的有意差の程度がそれぞれ次の通りであることを示す。
＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００２
図６に示される結果から次のことが明らかである。即ち、ファージ処理群マウスの殆どは、検討したいずれの時間間隔で精製φＭＲ１１を投与した場合でも生存していたが、ファージ未処理群マウスでは、８０−１００％が死亡した。
尚、ＳＡ３７株を単独で注入した全てのコントロールマウスは、例えば行動力低下および体毛のケバ立ちや乱れ（ｒｕｆｆｌｅｄ  ｈａｉｒ）などの身体的変調を呈したのに対して、φＭＲ１１を注入したマウスでの治療効果は、細菌接種の６０分後でも明らかに認識可能であった。φＭＲ１１処置マウス群では、引き続く６日間の観察期間中に衰弱死したが例が少数認められたが、全ての処置マウスの生存率は、常に非処置コンドロールマウスのそれに比して有意に高いものであった（図６参照）。
（１２）変異株を用いた試験（投与ファージ並びに接種細菌の体内動態）
ＳＡ３７のリファンピシン耐性変異株であるＳＡ３７−ＲＩＦ２を標的細胞として用いて、次の試験を行った。尚、リファンピシン耐性変異株を用いたのは、マウスに常在している他の黄色ブドウ球菌と区別するためである。
ＳＡ３７−ＲＩＦ２の８×１０８個を単独で（ＳＡ３７−ＲＩＦ２単独接種群、図７中白抜き四角印で表示）、またはφＭＲ１１（１．６×１０１１ＰＦＵ）と共に（ＳＡ３７−ＲＩＦ２−φＭＲ１１併用群、図７中黒丸印または黒四角印で表示）、またはφＭＲ１１の１．６×１０１１ＰＦＵを単独で（φＭＲ１１単独接種群、図中白丸印で表示）、１群５頭からなる各群マウスに腹腔内注射した。注射の２，４，６および２４時間後に、各群マウスの１頭から末梢血を採血し、血流中におけるファージまたは細菌の数の経時変化を計測した。
結果を図７に示す。
図７は、血流中におけるファージφＭＲ１１の迅速な出現を示すグラフであり、横軸は細菌またはファージの投与後時間（時間）を、縦軸は細菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）またはファージ数（ＰＦＵ／ｍｌ）を示す。尚、図７中、６時間における白抜き四角印の上に付したマークは、ＳＡ３７−ＲＩＦ２単独接種群マウスではこの時点で全例が死亡したことを示す。
図７に示される結果から次のことが判る。即ち、マウスにおいてはファージ処置の有無に拘わらず菌血症がＳＡ３７−ＲＩＦ２注射後２時間以内に起こり、持続した。しかしながら、血液中細菌量は、試験期間中、φＭＲ１１処理マウスにおいては未処理マウスに比して有意に低下していた。前述した図４に示す結果と同様に、ＳＡ３７−ＲＩＦ２を単独注射したマウスは全例６時間以内に死亡したが、φＭＲ１１処理マウスは２４時間以内に敗血症の減退に一致して、生存することができた。他方、φＭＲ１１を腹腔内に注射２時間後では、ＳＡ３７−ＲＩＦ２感染および非感染マウスの両者の血液サンプル中に、共に多量の（それぞれ力価１．３×１０８および７．７×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）φＭＲ１１が検出された。この時点での循環血中ファージの力価の差は、おそらく投与されたφＭＲ１１が標的細菌により急激に消費されたことを反映していると考えられる。注目に値することは、２つのマウス群の間での循環血中φＭＲ１１の相対レベルがその後の経過中において逆転することである。即ち、ＳＡ３７−ＲＩＦ２を接種しなかったマウスでは、上記力価は経時的に低下するのに対して、ＳＡ３７−ＲＩＦ２接種マウスでは高値を維持する。６時間後に測定した上記力価の代表的数値は、ＳＡ３７−ＲＩＦ２非接種マウスの場合４．７×１０５ＰＦＵ／ｍｌであり、接種されたマウスの場合５．５×１０８ＰＦＵ／ｍｌである。
以上の結果は、投与されたφＭＲ１１が、共存する標的細菌によって増幅し、血流により多量のファージが移行し、更に全身に送達されるという生体内動態をよく示している。循環血中φＭＲ１１量は、標的細胞が体内から完全に駆逐されるまで有意なレベルを持続し、菌血症の進行を抑止する。黄色ブドウ球菌感染の治癒過程におけるφＭＲ１１の生体内動態はまた、他の様々な細菌感染症に対するファージの治療学的適用の可能性（Ｎａｋａｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇ．，１９９９；３７：３３−４１参照）とも合致している。
（１３）ＭＲＳＡ感染症に対するφＭＲ１１の治療効果
この試験はφＭＲ１１が致死的ＭＲＳＡ感染症に対しても有効であることを明らかにするためのものであり、以下の通り実施された。即ち、４種の臨床分離ＭＲＳＡ株（ＭＲ１，ＭＲ１３，ＭＲ１８またはＭＲ２８）を標的菌として、マウスに腹腔内接種（８×１０８細胞）した。この試験では、細菌保有の制限−修飾系の影響（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｏｌｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９２，９４：１９１−１９４参照）を最小限にとどめるために、予め対応する各ＭＲＳＡ株でφＭＲ１１を増殖させた上で、塩化セシウム密度勾配により精製したファージを用いた。該ファージ（φＭＲ１１）を、対応するＭＲＳＡ株を接種した各マウスに、その接種後直ちに腹腔内投与（ＭＯＩ＝５０）した（ファージ処理群、１０頭のマウスからなる）。また、ファージを腹腔内投与しないコントロール群（１０頭のマウスからなる）を設けた。ファージ投与７日後の各群マウスの生存率（％）を求めた。
得られた結果を図８に示す。図８中、編みかけ印を付した棒グラフはファージ処理群の結果であり、斜線を付した棒グラフはファージ非処理群（コントロール群）の結果である。また、対となっているファージ非処理群に対するファージ処理群における有意差検定結果は、Ｐ＜０．０００２である。
図８に示されるように、φＭＲ１１（ＭＯＩ５０）を適用された被験マウスは、ＭＲＳＡ接種の７日後も全例生存していた。これに対してファージ未処理のコントロールマウスの生存率は１０％以下であった。このことから、φＭＲ１１はヒトＭＢＳＡ感染症の治療にも有効であることが明らかである。
【実施例２】（１）腹腔内投与後のφＭＲ１１の各臓器、組織における分布
ＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内に投与されたφＭＲ１１は、血中に速やかに移行し（投与２時間後には多量のファージが血中に出現する）、遅くとも４時間後には全身の臓器、組織に分布する（実施例１の（１２）参照）。
この試験は、ファージの各臓器、組織における分布の動態を調べたものである。即ち、φＭＲ１１の１．６×１０１１ＰＦＵを腹腔内投与し、その後、経時的に各臓器、組織を摘出し、直ちに２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２０ｍＭ  ＣａＣｌ２加生理食塩水にて５回洗浄して付着する血液を十分に除去した後、各臓器、組織の１ｇ当たりに存在するファージ数を計数した。得られた結果を図９（横軸：経過時間（時間）、縦軸：ファージ数／ｇ）に示す。
図９中、（１）は脾臓を示す。（２）は腎臓を示す。（３）は肝臓を示す。（４）は肺を示す。（５）は筋肉を示す。（６）は骨髄を示す。（７）は脳を示す。（８）は血液を示す。
該図９に示されるとおり、血液中に存在するファージ数と対比して、各臓器、組織におけるファージ数は、ほぼ同等もしくはこれより高値を示しており、このことはファージが血中に移行後、各臓器、組織に浸潤、拡散ないしは集積することを明らかにしている。
（２）ファージの投与経路の検討
φＭＢ１１を、以下の通り、腹腔内、皮下および経口経路により投与して、その血中への移行を検討した。
即ち、腹腔内投与および皮下投与の場合は、φＭＲ１１（１．６×１０１１ＰＦＵ）を２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するハートインフュージョンブロス（ＨＩＢＭＣ）に浮遊させた溶液０．５ｍｌを直接、マウスの腹腔内もしくは背部皮下に注入した。
経口投与の場合は、被験マウスを２時間絶食させた後、胃酸分泌抑制剤として４ｍＭ  ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ水溶液０．５ｍｌを経口投与し、更に２時間絶食させた後、φＭＲ１１（８×１０１０ＰＦＵ）をＨＩＢＭＣに浮遊させた溶液（或いはφＭＲ１１の２×１０１１ＰＦＵを１０％グリセロール加ＨＩＢＭＣ溶液に浮遊させた溶液）０．５ｍｌを直接胃内に注入した。
その後、経時的に血中ファージ濃度を測定した。
結果を図１０（横軸：投与後時間（時間）、縦軸：ファージの血中濃度（／ｍｌ））に示す。図１０中、（１）は腹腔内投与を、（２）は皮下投与を、（３）は経口投与（ＨＩＢＭＣ使用の場合）、また（４）は経口投与（グリセロール加ＨＩＢＭＣ使用の場合）を示す。
図１０から、次のことが判る。即ち、腹腔内、皮下および経口のいずれの投与経路の場合も、ファージは速やかに流血中に移行する。腹腔内および皮下投与の場合、投与されたファージは比較的高い血中濃度を保つが、経口投与の場合、血中ピーク値は比較的低い。但し、ファージの投与量を多くすれば、その改善は可能である。経口投与の場合、ファージ液にグリセロールを添加する方が、非添加に比して、投与後の血中ファージ濃度のピーク値は低いが、濃度の維持は長い。また、腹腔内投与と皮下投与とを比較した場合、血中ファージ濃度のピーク値は腹腔内投与の場合の方が大きく、血中ファージ濃度の持続は皮下投与の場合の方が長い。
（３）φＭＲ１１投与療法に対する免疫反応の検討
（３−１）φＭＲ１１単独投与の繰り返しによる副作用などの検討
φＭＲ１１（１．８×１０１２／マウス）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した後、６３日後に再度同量を腹腔内投与し、繰り返し投与による副作用などを検討した。
その結果、初回投与から８４日後において、全例健常であった。このことから、繰り返し投与によってもアナフィラキシーなどのアレルギー副反応は認められないことが明らかとなった。また、同時に血中ファージ量を測定した所、ファージ量も初回投与に測定した値とほぼ同レベルであり、このことから中和抗体などによるファージの失活は認められないことが判った。
（３−２）菌接種マウスに対するファージ投与の繰り返しによる副作用などの検討
実施例１の（７）と同様にして、黄色ブドウ球菌（８×１０８ＣＦＵ）を接種したマウスにφＭＲ１１（４×１０１０ＰＦＵ）を腹腔内投与して一旦感染死から救命し、その１０日後に、試験マウスを１群５頭からなる３群に分け、その１群（φＭＲ１１投与群）には黄色ブドウ球菌（８×１０８ＣＦＵ）接種と共にφＭＲ１１（４×１０１０ＰＦＵ）を腹腔内投与し、他の１群（φＭＲ２５投与群）には黄色ブドウ球菌（８×１０８ＣＦＵ）接種と共にφＭＲ２５（４×１０１０ＰＦＵ）を腹腔内投与し、最後の１群（ファージ非投与対照群）には黄色ブドウ球菌（８×１０８ＣＦＵ）のみを接種した。試験開始より４０日間各群マウスの生存、健康状態を観察した。
その結果、ファージ非投与対照群では５頭中４頭が死亡した（生存率：２０％）のに対して、φＭＲ１１投与群およびφＭＲ２５投与群の両群では、被験マウスの全例が生存しており（生存率：１００％）且つ健常であった。このことから、ファージの治療的再投与は、ファージの種類に拘わらず、中和抗体によるファージの失活を起こさず、またアレルギー反応などの副作用も惹起せず、従って、安全であることが判った。
【実施例３】φＭＲ２５投与による細菌感染抑制効果
φＭＲ１１に代えてφＭＲ２５を用いて実施例１の（９）と同様にして、マウスにおけるＳＡ３７株に対するファージ投与の救命効果（細菌感染抑制効果）を検討した。
その結果を、図５と同様にして図１１に示す。
図１１から明らかなとおり、マウス腹腔内に投与されたφＭＲ２５は、φＭＲ１１とほぼ同様に、延命効果、即ち細菌感染による致死に対して抑制効果を奏することが判った。
【実施例４】（１）ファージＤＮＡの調製
φＭＲ１１のゲノムＤＮＡを文献記載の方法（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２；３６：９３−９７）に従い抽出した。即ち、ＳＡ３７株を宿主として１００ｍｌ  ＴＳＢＭ培地でφＭＲ１１を増殖させ、溶菌後、遠心により細胞残渣を除去し、次いで上清に１０％ポリエチレングリコール６，０００および０．５Ｍ塩化ナトリウムを添加し、一晩４℃で静置培養した。８，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心後、ペレットをＴＭ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２）に懸濁させ、２０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅｌ（Ｓｉｇｍａ社）＋１０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社）で、３７℃、３０分間処理した。次に、得られた懸濁液を３層塩化セシウム溶液（下から密度１．７，１．５および１．３）からなる不連続密度勾配の上部に載せ、１００，０００×ｇ、４℃で１時間超遠心し、ファージバンドを回収した。その後、ＡＡＳ（１００ｍＭ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２）中で透析した。ファージ液を１００，０００×ｇ、４℃で１時間超遠心し、ファージペレットを０．１％ＳＤＳを含む０．５ｍｌ  ＴＥ液に懸濁させた後、３７℃で１０分間保温した。その後、等量の水和フェノールを加えてよく混和後、２０，０００×ｇで５分間遠心し、上部の水相を回収し、等量のエタノールを加えてよく混和させ、２０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。ペレットに１ｍｌの７０％エタノールを加えて更に２０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、１００μｌの滅菌水に溶かして、ファージＤＮＡとして使用した。
同様にして、ファージφＭＲ２５についても、そのファージゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＤＮＡシークエンシング
上記（１）で調製したファージゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化して１６断片を得、各断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩで開裂したプラスミドベクターｐＵＣ１８にＴ４リガーゼを用いて結合させ、次いでこれを大腸菌ＪＭ１０９（またはＤＨ５α）に導入して、各断片をクローニングした。
プラスミドの調製にはＦｌｅｘｉＰｒｅｐ−Ｍｉｎｉキット（ファルマシア社）を用いた。
塩基配列の決定は、上記クローンを鋳型として、フルオレッセインで標識したジデオキシチェインターミネーティングヌクレオチド（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ，ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．シークエンシング用酵素と基質とを含む混合液）を用いたＰＣＲ増幅法によって実施した。その方法および操作は製品に添付の操作プロトコールに従った。尚、初回のシークエンシング用プライマーとしては、ベクターに対応する合成プライマーを使用した。この初回のシークエンシングによって明らかとなった配列を元にして、更にプライマーを合成し、次のシークエンシングを行い、この操作をＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片が終了するまで繰り返した（この方法はプライマーウォーキング法として知られている）。
各断片の連結部の確認はファージＤＮＡをそのまま鋳型として断片両端部分を元に合成したプライマーでシークエンシングすることにより行った。
また、得られたＰＣＲ産物はＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）にて精製し、自動ＤＮＡシークエンサー（Ｍｏｄｅｌ  ３１０；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）にて解析した。
かくして、φＭＲ１１ゲノムは、塩基数４３０１１の円順列構造であることが確認された。その全配列を配列番号：３に示す。
該ゲノムＤＮＡの特徴を図１２に示すと共に、それらに含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、全６７個）の開始位置（Ｆｉｒｓｔ）および終止位置（Ｅｎｄ）並びにこれらによりコードされる蛋白のアミノ酸残基数（Ｎｏ．ａａ）を下記表１および表２に示す。
2004020635.tif 000002
2004020635.tif 000003
また、φＭＲ２５ゲノムＤＮＡを同様にしてシークエンシングした結果、これは配列番号：４、５および６に示される３つの部分ＤＮＡ配列（それぞれ１１，８４８、１３，９５４および１１０，３６５ｂｐｓ）を有することが明らかとなった。尚、各部分ＤＮＡ配列の間には約２００−２，５００のＤＮＡ配列が存在している。後記する細胞壁分解酵素をコードするＤＮＡ配列および細菌細胞表面レセプターに対するリガンドをコードするＤＮＡ配列は、いずれも配列番号：６のＤＮＡ配列中に存在しており、その位置は、それぞれ５，４２５−６，８６７番目および１，４６７−３，３６２番目であることが確認されている。
また、上記φＭＲ２５ゲノムＤＮＡの全配列は、配列番号：７に示すとおりであり、総塩基数４４，３４２であることが確認された。該ゲノムＤＮＡに含まれるＯＲＦ（全７０個）の開始位置（Ｆｉｒｓｔ）および終止位置（Ｅｎｄ）並びにこれらによりコードされる蛋白のアミノ酸残基数（Ｎｏ．ａａ）を下記表３および表４に示す。
表に示されるＯＲＦ６４が細菌細胞表面レセプターに対するリガンドをコードするＤＮＡ配列であり、φＭＲ１１のＱＲＦ６１に対応する。また、ＯＲＦ６８が細胞壁分解酵素をコードするＤＮＡ配列であり、φＭＲ１１のＯＲＦ６５に対応する。
2004020635.tif 000004
2004020635.tif 000005
（３）細胞壁分解酵素をコードするＤＮＡ配列
上記（２）に従って解析されたφＭＲ１１ファージの有する細胞壁分解酵素をコードするＤＮＡ配列は、前記表２にＯＲＦ６５として示す通り、配列番号：３の全長配列の４０，５２７−４１，９６９に位置しており（全長１，４４３ｂｐｓ）、これによりコードされる酵素の推定アミノ酸配列は、配列番号：１として示される全４８１アミノ酸残基からなるものであることが確認された。
この蛋白のアミノ酸配列を、他のファージ（本発明φＭＲ２５由来（図１３）を含む）の同種溶菌酵素（蛋白）のそれらと対比した結果を図１３−２０に示す。
図１４−２０に示される比較アミノ酸配列は、それぞれＤＤＢＪＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬに登録されたものであり、それらについての報文は次の通りである。但し、ｐｈｉ５３，ｐｈｉ８０  ａｌｐｈａの報文は未発行である。
図１３：φＭＲ２５−ＯＲＦ６５  ｌｉｋｅ：本発明φＭＲ１１のＯＲＦ６５に対応するφＭＲ２５のＯＲＦ６８ＤＮＡ配列
図１４：ｐｈｉ１１−ＡＭＩＤＡＳＥ：Ｉａｎｄｏｌｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ，ｐｈｉ１１，ｐｈｉ１２  ａｎｄ  ｐｈｉ１３  ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ８３２５．Ｇｅｎｅ２８９：１０９−１１８．
図１５：８０ＡＬＰＨＡ−ＡＭＩＤＡＳＥ：文献未発行
図１６：ＥＴＡ  ＯＲＦ６５：Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｐｈａｇｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：６９４−７０５．
図１７：ＴＷＯＲＴ−ＡＭＩＤＡＳＥ：Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇ  １９９８．Ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔｗｏｒｔ：ａ  ｌａｒｇｅ  ＴＴＧ−Ｓｔａｒｔ  ｈｏｌｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｍｉｄａｓｅ  ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６２：２６５−２７４．
図１８：ＳＬＴ  ＯＲＦ４８４：Ｎａｒｉｔａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｐｈａｇｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  ｉｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ＰＶＬ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｐｈａｇｅ，ｐｈｉ  ＳＬＴ．，Ｇｅｎｅ  ２６８：１９５−２０６．
図１９：φ１２  ａｍｉｄａｓｅ：ｌａｎｄｏｌｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｐｈｉ１１，ｐｈｉ１２  ａｎｄ  ｐｈｉ１３  ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ８３２５．，Ｇｅｎｅ  ２８９：１０９−１１８．
図２０：φ１３ａｍｉｄａｓｅ：同上。
また、同様にして解析されたφＭＲ２５ファージの有する細胞壁分解酵素のアミノ酸配列（φＭＲ１１−ＯＲＦ６５に対応するＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列）は、配列番号：８に示す通りであり、全４８１アミノ酸残基からなるものであることが確認された。
（４）細菌細胞表面レセプターに対するリガンドをコードするＤＮＡ配列の決定
上記（２）に従って解析されたφＭＲ１１ファージの有する細菌細胞表面レセプターに対するリガンドをコードするＤＮＡ配列は、前記表２にＯＲＦ６１として示すとおり、配列番号：３の全長配列の３６，５９３−３８，４６４に位置しており（全長１，８７２ｂｐｓ）であり、これによりコードされる蛋白質の推定アミノ酸配列は、配列番号：２として示される全６２４アミノ酸残基からなるものであることが確認された。
この蛋白のアミノ酸配列を、他のファージ（本発明φＭＲ２５由来を含む）の同種リガンド（蛋白）のそれらと対比した結果を図２１−２５に示す。
各図に示される比較アミノ酸配列は、それぞれＤＤＢＪＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬに登録されたものであり、それらについての報文は、次の通りである。但し、ｐｈｉ５３，ｐｈｉ８０  ａｌｐｈａの報文は未発行である。
図２１：φＭＲ２５−ＯＲＦ６１  ｌｉｋｅ：本発明φＭＲ１１のＯＲＦ６１に対応するφＭＲ２５のＯＲＦ６４ＤＮＡ配列
図２２：ＥＴＡ  ＯＲＦ６１：Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，２０００．Ｐｈａｇｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：６９４−７０５．
図２３：１８７−ＰＬＹ１８７：Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｈｏｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆｕｌｌｙ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｆｒａｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  １８７．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４４５２−４４６０．
図２４：ｐｈｉ１１−ＯＲＦ６１  ｌｉｋｅ：Ｉａｎｄｏｌｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｐｈｉ１１，ｐｈｉ１２  ａｎｄ  ｐｈｉ１３  ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ８３２５．，Ｇｅｎｅ  ２８９：１０９−１１８．
図２５：ｐｈｉ５３−６１  ｌｉｋｅ：文献未発行
また、同様にして解析されたφＭＲ２５ファージの有する細菌細胞表面レセプターに対するリガンド部分のアミノ酸配列（φＭＲ１１−ＯＲＦ６１に対応するＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列）は、配列番号：９に示す通りであり、全６３２アミノ酸残基からなることが確認された。
【実施例５】ファージ製剤の調製
例えば、精製ファージ調製物φＭＲ１１をリポソームマイクロカプセルにパッケージングして、全身感染の処置のための経口投与用ファージ製剤を調製する。このものはスプレー形態として経鼻噴霧投与することもできる。
【実施例６】φＭＲ１１の有する細胞壁分解酵素（ＯＲＦ６５によりコードされるアミノ酸配列のポリペプチド、以下「ｇｐ６５」という）の溶菌活性と特異性の検討
（１）細胞壁分解酵素遺伝子のクローニング
φＭＲ１１ゲノム中のＯＲＦ６５の塩基配列をもとに、完全長の遺伝子（以下「ｇｅｎｅ６５」という）を増幅するために、配列番号：１０および１１に示す塩基配列のプライマー１および２のプライマー対を自動合成機により作成した。
これらのプライマーの塩基配列の詳細は、図２６に示すとおりであり、各プライマーは、その後のクローニングに使用するために、５’端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位およびリボソーム結合部位が生じるように、また３’端にＢａｍＨＩ認識部位が生じるように、それぞれの塩基配列を付加したものである。
これらのプライマーを使用して、φＭＲ１１ＤＮＡ（配列番号：３）を鋳型にしてＰＣＲ反応を行った。
得られた増幅産物をはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（４１７６ｂｐｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、目的遺伝子発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／６５（５６７６ｂｐｓ、クローン化ｇｅｎｅ６５プラスミド）を調製した。このものの概略を、原料として用いた起源ベクターｐＴｒｃ９９Ａのそれと共に、図２６に示す。
図２６中、Ｉａｃｌｑはレプレッサー遺伝子を、ｏｒｉは複製開始起源配列を、Ｐｔａｃは転写プロモーターを、ＭＣＳはマルチクローニング部位を、ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
なお、目的遺伝子発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／６５の有するｇｅｎｅ６５は、その塩基配列を解読した結果、元のφＭＲ１１が有するＯＲＦ６５の塩基配列と一致することが確認された。
上記で調製した発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／６５を用いて、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換し、形質転換株をアンピシリン耐性で選択して、目的の細胞壁分解酵素遺伝子導入大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ｐＴｒｃ９９Ａ／６５））を得た。
（２）細胞壁分解酵素の発現誘導および粗酵素液試料の調製
（１）で得られた目的遺伝子導入大腸菌を５ｍＬ  ＬＢ培地に接種（開始濁度ＫＵ＝１０となる濃度、約６×１０７個／ｍＬ）し、３７℃で約２．５時間振盪培養し、培養液のＫＵが１２０に達した時点で、ｇｅｎｅ６５の発現を誘導するために、終濃度が１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；ｌｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を培地に添加し、更に３７℃で２時間振盪培養を継続した。培養終了後、培養液５ｍＬをとり、２００００×ｇ、４℃、１分間遠心処理して菌ペレットを得た。
得られた菌ペレットをＰＢＳ（生理食塩加リン酸緩衝液）５ｍＬに再懸濁させ、同条件で再度遠心処理した。この操作を繰り返した。
最終的に得られた菌ペレットを１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ加ＰＢＳの１ｍＬに懸濁させた後、超音波処理（２００Ｗ、５０％パルス、５分間）して菌体を破砕した。この菌体破砕液を２００００×ｇ、４℃、１０分間遠心処理し、上清を粗酵素液として引き続く酵素活性測定試験に使用した。尚、上記で得られた上清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、ｇｐ６５の存在が確認された。
また、酵素活性測定試験のための対照試料として、前記（１）と同様にして起源ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａにて形質転換した大腸菌ＢＬ２１株を同様に培養して、培養上清を調製した。
（３）酵素活性測定
酵素活性測定は、次の通り実施した。即ち、上記（２）で得た粗酵素液および対照試料（培養上清）の各５０μＬと、別個に調製した標的菌（各黄色ブドウ球菌株を丁ＳＢ培地中、３７℃でＫＵ＝６０となるまで培養したもの）５０μＬとを混合し、混合直後および３７℃で所定時間放置後の混合物の波長６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）をマイクロプレートリーダーにて測定して、溶菌活性を求めた。
標的菌としては、以下の黄色ブドウ球菌を用いた。
・メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）計２株
２０９Ｐ株：黄色ブドウ球菌の標準株。大阪大学微生物研究所付属菌株保存施設より分与。菌株番号ＩＩＤ６７１。
ＳＡ３７株：当教室にてヒト健康人鼻腔より分離し、φＭＲ１１の増殖用宿主菌として使用。
・メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）計３４株
高知医大付属病院で分離されたＭＲＳＡ２９株および順天堂大学より分与された臨床分離株５株。
・バンコマイシンヘテロ耐性ＭＲＳＡ株Ｍｕ３およびバンコマイシン低感受性ＭＲＳＡ株Ｍｕ５０
順天堂大学より分与（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．．Ｌａｎｃｅｔ，３５０：１６７０−１６７３，１９９７参照）。
（４）結果
ｇｅｎｅ６５クローン化プラスミド（ｐＴｒｃ９９Ａ／６５）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ｐＴｒｃ９９Ａ／６５より調製した本発明酵素（ｇｐ６５）含有溶液試料、および同様にベクタープラスミド（ｐＴｒｃ９９Ａ）のみで形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ｐＴｒｃ９９Ａより調製した対照試料を用いて、両者の各黄色ブドウ球菌に対する溶菌活性を比較検討した結果を、図２７（−１〜−４）に示す。
図２７に示される結果から次のことが判る。即ち、検討したすべてのＭＳＳＡ株（計２株）、ＭＲＳＡ臨床分離株（計３４株）およびＭｕ３株に対して、本発明酵素ｇｐ６５溶液試料のみが強い溶菌活性を示した（酵素液添加後１５−３０分以内で、ほぼ濁度が０に近くなる）。この成績は、ｇｐ６５が普遍的に黄色ブドウ球菌を溶菌できることを示している。
なお、Ｍｕ５０株に対しては増殖阻害のみが認められたが、これは通常のＭＲＳＡに比べ、Ｍｕ５０の細胞壁が突然変異により肥厚しており（Ｈａｎａｋｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４２（２）：１９９−２０９，１９９８）、今回用いた酵素量が相対的に少なかったためと予想される。本発明酵素が、Ｍｕ５０株に対しても溶菌活性を示すことは、後記実施例８に示す試験から明白である。
【実施例７】ヒト皮膚、口腔内に常在する表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に対する本発明酵素ｇｐ６５の影響
実施例６の（２）で調製した本発明酵素ｇｐ６５試料（粗酵素液）を用いて、実施例６の（３）と同様にして、該酵素の黄色ブドウ球菌以外の各菌に対する酵素活性（細胞壁分解活性）を測定した。即ち、本発明酵素ｇｐ６５液５０μＬと、別個に調製した下記供試菌（各菌株をＴＳＢ培地中、３７℃でＫＵ＝６０となるまで培養したもの）５０μＬとを混合し、混合直後および所定時間３７℃で放置後の混合物の波長６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）をマイクロプレートリーダーにて測定して、溶菌活性を求めた。
供試菌としては、以下の菌を用いた。
・表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）
標準株（ＩＩＤ８６６、大阪大学微生物病研究所付属菌株保存施設より分与）および健康人の口腔、皮膚より分離された１３株（高知学園短大より分与）の計１４株。
・Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＧＩＦＵ３１７０標準株（岐阜大より分与）
・Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ  ＧＩＦＵ３１７１標準株（岐阜大より分与）
・Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ  ＧＩＦＵ９１２７標準株（岐阜大より分与）
・Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ  ＥＮＴ１（高知医大付属病院で分離同定したもの）
得られた結果を、図２７と同様にして、図２８（−１および−２）に示す。
図２８から、本発明酵素ｇｐ６５は、検討したすべての表皮ブドウ球菌に対して溶菌活性を示さなかった。但し、供試菌の種類によっては、増殖開始の遅延が若干認められるものがあった。
また、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓに対しては溶菌活性を示さなかった。更に、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓに対しては弱い溶菌が認められた。このことから、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓには細胞壁組成にＳ．ａｕｒｅｕｓとの類似性があると推測される。
実施例６および７に示した試験の結果から、本発明に係るφＭＲ１１由来の細胞壁分解酵素ｇｐ６５は、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡを含む黄色ブドウ球菌株に対して強い溶菌活性を発揮することが判った。また、該酵素の溶菌活性は、黄色ブドウ球菌に対して非常に高い特異性を示しており、黄色ブドウ球菌以外の例えば表皮ブドウ球菌などのヒトの皮膚、口腔内に常在する菌に対しては実質的に認められず、このことから菌交代症は起こり難いことが確認できた。従って、本発明酵素ｇｐ６５は、黄色ブドウ球菌のみを標的とする除菌薬として有用であると考えられる。
【実施例８】ヒスチジン・タグ（Ｈｉｓ  ｔａｇ）を付加したφＭＲ１１の有する細胞壁分解酵素（ｇｐ６５−６ｘＨｉｓ）の精製、溶菌活性およびその特異性
（１）Ｃ末端にヒスチジン・タグ（６ｘＨｉｓ）を付加したφＭＲ１１由来溶菌酵素（６５−６ｘＨｉｓ）の精製
３’−末端側に連続する６個のヒスチジン残基のコドンを付加した溶菌酵素遺伝子（ｇｅｎｅ６５−６ｘＨｉｓ）発現用クローン化プラスミド（ｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓ）を、以下の通り作製した。尚、ヒスチジン・タグを付加した融合蛋白は、該ヒスチジン・タグがコバルト（Ｃｏ）などの金属に特異的に吸着するので、精製が非常に容易となる利点がある。
即ち、配列番号：１２および１３に示す塩基配列のプライマー３および４のプライマー対を自動合成機により作成した。これらのプライマーの塩基配列の詳細は、図２９に示すとおりであり、各プライマーは、その後のクローニングに使用するために、５’端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位およびリボソーム結合部位が生じるように、また３’端にＢａｍＨＩ認識部位が生じるように、それぞれの塩基配列を付加したものである。
これらのプライマーを使用して、φＭＲ１１ＤＮＡ（配列番号：３）を鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化後、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（４１７６ｂｐｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、目的遺伝子発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓ（５６５６ｂｐｓ、クローン化ｇｅｎｅ６５−６ｘＨｉｓプラスミド）を調製した。このものの概略を、原料として用いた起源ベクターｐＴｒｃ９９Ａのそれと共に、図２６と同様に図２９に示す。図２９中の各記号は図２６のそれらと同じである。
得られた目的遺伝子発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓは、シークエンシングの結果、元のφＭＲ１１が有するＯＲＦ６５と同一の塩基配列に６個のヒスチジン・コドンが付加されていることを確認した。
上記で調製した発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓを用いて、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換し、形質転換株をアンピシリン耐性で選択して、目的の細胞壁分解酵素遺伝子導入大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓ））を得た。
（２）細胞壁分解酵素の発現誘導および精製酵素液試料の調製
（１）で得たｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓで形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ｐＴｒｃ９９Ａ／６５−６ｘＨｉｓを２００ｍＬ  ＬＢ培地に接種（開始濁度ＫＵ＝１０となる濃度、約６×１０７個／ｍＬ）し、３７℃で約２．５時間振盪培養し、培養液のＫＵが１２０に達した時点で、ｇｅｎｅ６５−６ｘＨｉｓの発現を誘導するために、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを培地に添加し、更に３７℃で２時間振盪培養を継続した。培養終了後、培養液を１２０００×ｇ、４℃、１０分間遠心処理して菌ペレットを得た。
得られた菌ペレットをＰＢＳ（生理食塩加リン酸緩衝液）５０ｍＬに再懸濁させ、同条件で再度遠心処理した。この操作を繰り返した。
最終的に得られた菌ペレットをＮａ−ＰＢＳ（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ）の２５ｍＬに懸濁させた後、超音波処理（２００Ｗ、５０％パルス、５分間）して菌体を破砕した。この菌体破砕液を１２０００×ｇ、４℃、１０分間遠心処理し、上清２５ｍＬに１ｍＬのコバルト−セファロースレジン（ＴＡＬＯＮ，Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を加え、４℃で３０分間反応させた後、反応したレジンをカラムに充填し、Ｎａ−ＰＢＳ２００ｍＬで洗浄し、１５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ加Ｎａ−ＰＢＳで目的酵素を溶出させて、得られた６つの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、酵素の精製状態を確認した。
その結果、画分１−４に塩基配列から予想されるサイズ５５ｋＤａの単一の蛋白バンドが検出された。これらの画分を精製酵素（ｇｐ６５−６ｘＨｉｓ）試料として引き続く酵素活性測定試験に使用した。
（３）酵素活性測定
上記（２）で得た精製酵素試料５０μＬ（蛋白０．１μｇ／μＬ）を用いて、実施例６−（３）と同様にして、標的菌に対する上記精製酵素の溶菌活性を求めた。
標的菌としては、実施例６−（３）に記載の黄色ブドウ球菌を用いた。
（４）結果
結果を、図３０（−１〜−４）に示す。
図３０に示される結果から次のことが判る。即ち、溶出に使用した１５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ加Ｎａ−ＰＢＳ溶液を対照にして、検討したすべてのＭＳＳＡ株（計２株）、ＭＲＳＡ臨床分離株（計３４株）およびＭｕ３株に対して、本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓ試料は強い溶菌活性を示した。またＭｕ５０に対しても弱いながらも溶菌活性を示した。これらのことから本発明酵素は、普遍的に黄色ブドウ球菌を溶菌できることが明らかとなった。
【実施例９】ヒト皮膚、口腔内に常在する表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に対する本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓの影響
実施例８の（２）で調製した本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓ（精製酵素、画分２−３）試料５０μＬ（蛋白０．１μｇ／μＬ）を用いて、実施例８の（３）と同様にして、該酵素の黄色ブドウ球菌以外の各菌に対する酵素活性（細胞壁分解活性）を測定した。
供試菌は実施例７で用いたものと同一であり、表皮ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＧＩＦＵ３１７０標準株）Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ  ＧＩＦＵ３１７１標準株、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ  ＧＩＦＵ９１２７標準株およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ  ＥＮＴ１株を用いた。
得られた結果を、図３０と同様にして、図３１（−１および−２）に示す。
図３１から、本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓは、検討したすべての表皮ブドウ球菌に対して溶菌活性を示さなかった。但し、供試菌の種類によっては、増殖速度への影響が若干認められるものがあった。
また、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓに対しては溶菌活性を示さなかった。Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓに対しては溶菌が認められた。これは該株がその細胞壁組成において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓと類似性を有するためと推測される。
実施例８および９に示す試験の結果から、本発明に係るφＭＲ１１由来の細胞壁分解酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓは、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡを含む黄色ブドウ球菌株に対して強い溶菌活性を発揮することが判った。また、該酵素の溶菌活性は、黄色ブドウ球菌に対して非常に高い特異性を示しており、黄色ブドウ球菌以外の例えば表皮ブドウ球菌などのヒトの皮膚、口腔内に常在する菌に対しては実質的に認められず、このことから菌交代症は起こり難いことが確認できた。従って、本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓは、黄色ブドウ球菌のみを標的とする除菌薬として有用であると考えられる。
【実施例１０】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌８５／２０８２株に対する本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓの長期効果
実施例８の（２）で調製した本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓ（精製酵素）試料５０μＬ（蛋白０．１μｇ／μＬ）を用いて、実施例８の（３）と同様にして、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ８５／２０８２株（順天堂大より分与）に対する酵素活性（細胞壁分解活性）を測定した。
得られた結果を、図３０と同様にして、図３２に示す。
図３２から、ＭＲＳＡ８５／２０８２株については、本発明酵素ｇｐ６５−６ｘＨｉｓによる処理後１５分でＯＤ６００が０となった。即ち、当初存在した菌数１×１０７個は酵素試料の添加により速やかに完全溶菌したと考えられる。また、試験開始より４時間後まで全く菌の再増殖を認めなかった。更にその後４８時間経過観察を継続したが、全く再増殖は認められなかっ。このことから、本発明酵素は、ＭＲＳＡ８５／２０８２株を速やかに且つ完全に死滅させる強い溶菌活性を示することが判った。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月24日(2004.2.24)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする単離されたバクテリオファージ。
【請求項２】配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする単離されたバクテリオファージ。
【請求項３】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列と、以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを有することを特徴とする単離されたバクテリオファージ；
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細胞壁分解酵素活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、黄色ブドウ球菌の細菌表面レセプターに対するリガンドとしての機能を有する蛋白質。
【請求項４】黄色ブドウ球菌の溶菌活性を有するものである請求項１−３のいずれかに記載のバクテリオファージ。
【請求項５】黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である請求項４に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】配列番号：３のＤＮＡ配列からなる単離されたバクテリオファージ。
【請求項７】配列番号：７のＤＮＡ配列からなる単離されたバクテリオファージ。
【請求項８】請求項１−７のいずれかに記載のバクテリオファージを有効成分として、製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物。
【請求項９】黄色ブドウ球菌感染症の予防および治療剤である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】ＭＲＳＡ感染症の予防および治療剤である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】腹腔内投与形態、皮下投与形態および鼻腔内投与形態から選ばれる形態である請求項８−１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】黄色ブドウ球菌による感染症を予防もしくは治療するための方法であって、該感染症に罹患しているかそのおそれのある哺乳動物に請求項１−７のいずれかに記載のバクテリオファージの有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１３】以下に示される各工程を含む請求項１−７のいずれかに記載のバクテリオファージの製造方法；
（ａ）黄色ブドウ球菌からマイトマイシンＣ誘発によって溶原バクテリオファージを含有する試料を得る工程、
（ｂ）該試料をフィルターに通してバクテリオファージを通過させる工程、
（ｃ）フィルターを通過したバクテリオファージを精製する工程、
（ｄ）精製されたバクテリオファージを、黄色ブドウ球菌を含有する培地中で増殖させる工程、
（ｅ）増殖したバクテリオファージを単離する工程、
（ｆ）単離されたバクテリオファージを精製する工程。
【請求項１４】配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１５】（削除）
【請求項１６】配列番号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１７】配列番号：１のアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項１８】（削除）
【請求項１９】配列番号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項２０】請求項１７又は１９に記載の蛋白質を有効成分として、製剤学的に許容される担体と共に含有する酵素製剤。
【請求項２１】黄色ブドウ球菌感染症の予防または治療剤である請求項２０に記載の酵素製剤。
【請求項２２】ＭＲＳＡ感染症の予防および治療剤である請求項２１に記載の酵素製剤。
【請求項２３】請求項２１または２２に記載の酵素製剤の有効量を、黄色ブドウ球菌による感染症に罹患しているかそのおそれのある哺乳動物に投与することを特徴とする黄色ブドウ球菌感染症の予防または治療方法。
【請求項２４】黄色ブドウ球菌に対する除菌剤である請求項２０に記載の酵素製剤。
【請求項２５】ＭＲＳＡに対する除菌剤である請求項２４に記載の酵素製剤。
【請求項２６】配列番号：２のアミノ酸配列からなる黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対するリガンドをコードする遺伝子。
【請求項２７】配列番号：２のアミノ酸配列からなる黄色ブドウ球菌の細胞表面レセプターに対するリガンド。




【国際調査報告】
2004020635.tif 000115
2004020635.tif 000116
2004020635.tif 000117
2004020635.tif 000118
2004020635.tif 000119
2004020635.tif 000120