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　特願２０００−５９２３９１「トランスジェニック動物における分泌型ヒトアルファ−フェト蛋白質の発現」拒絶査定不服審判事件〔平成１２年　７月１３日国際公開、ＷＯ００／４０６９３、平成１４年１０月１５日国内公表、特表２００２−５３４０７７〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．出願の経緯および本願発明
　本願は、平成１２年１月６日を国際出願日（パリ条約による優先権主張外国庁受理１９９９年１月６日　米国）とする出願であって、その請求項１に係る発明は、平成２２年４月１６日付手続補正書により補正された明細書の記載からみて、その特許請求の範囲第１項に記載された、以下のとおりのものである。
　
「以下のものを含む実質的に純粋な核酸分子：（i）組換えヒトアルファ-フェト蛋白質（rHuAFP）をコードする核酸配列、（ii）rHuAFPコード配列に利用可能なように結合させたミルク特異的プロモーター、および（iii）哺乳動物のミルクの中に乳腺上皮細胞によって該rHuAFPの分泌を可能にする蛋白質分泌シグナルをコードするリーダー配列。」（以下、「本願発明」という。）
　
２．引用例
（１）引用例５の記載
　原査定の拒絶の理由で、引用文献５として引用された本願優先日前の１９９０年３月２２日に頒布された刊行物である特表平０２−５００７９８号公報（以下、「引用例５」という。）には、
（i）「本発明は、哺乳動物のミルクにおける組換蛋白の産生に関するものである。特に本発明は、信号ペプチドおよび所望の組換蛋白生産物をコードするＤＮＡ配列に作用結合した少なくとも１種のミルク特異性蛋白プロモータからなる発現系に関するものである。この種の系を哺乳動物中にトランスジェニック的（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ）に組込むと、授乳期のトランスジェニック哺乳動物のミルクに組換蛋白が発現される。さらに本発明は、所望の組換生産物をミルク中に産生するトランスジェニック哺乳動物に関するものである。本発明の発現系およびトランスジェニック改変した哺乳動物により産生される組換生産物は、慣用の組換蛋白産生技術によるよりも顕著に低いコストで製造することができる。
［従来の技術］
　組換ＤＮＡ技術は、
医学上および農業上重要な蛋白
　しかしながら、これら重要な蛋白の多くは大分子（３０Ｋｄを越える分子量）で分泌され、適正な折畳みを維持するにはスルフヒドリル結合を必要とし、グリコシル化されておりかつプロテアーゼに対し感受性である。その結果、原核細胞におけるこの種の生産物の組換産生は、所望の組換蛋白が不適正に処理され、適正なグリルシル化を欠如し、或いは不適正に折畳まれるので、満足しうるものでないことが判明している。したがって、これらの組換蛋白は培養された真核細胞にて産生させねばならなかった。この技術は、細胞培養法の変動に基づき高価となりかつしばしば信頼性がないと判明した。たとえば、平均収率は培地１ｌ当たり組換蛋白１０mgであり、その結果コストは典型的には組換蛋白１ｇ当たり１０００ドルを越える。したがって、これら組換蛋白は培養された真核細胞にて産生させねばならなかった。」（第２頁左上欄第３行〜右上欄第１４行：下線は当審による）、
（ii）「本発明は、組換蛋白を製造するための方法、ＤＮＡ配列、組成物およびトランスジェニック哺乳動物に関するものである。より詳細には本発明は、乳房組織にて所望の組換蛋白の分泌および成熟を可能にするような信号ペプチドをコードするＤＮＡ配列を介し、所望の組換蛋白をコードするＤＮＡ配列に作用結合したミルク特異性蛋白プロモータ或いは乳房組織にて特異的に賦活されたプロモータ配列を含む構造の１つもしくはそれ以上のコピーをトランスジェニック的に組込むことに関する。この構造は哺乳動物の胎芽中にトランスジェニック的に組込まれ、次いで組換蛋白生産物を発現して授乳期のトランスジェニック哺乳動物のミルク中にまたはミルクと共に分泌される。
　本発明には、任意の哺乳動物を有効に用いることができる。好ましくは、多量のミルクを産生しかつ長い授乳期間を有する哺乳動物が好適である。好適哺乳動物は牛、羊、山羊、ネズミ、雄牛、ラクダおよび豚である。」（第２頁右下欄第４行〜第１９行）、と記載されている。
　そして、実施例として、カゼインのプロモーター配列とカゼインの信号ペプチド（注：シグナルペプチド）配列を成熟ＴＰＡの配列に融合させた配列を含むプラスミドを、マウスにトランスジェニック的に組込み、マウスのミルク中にヒトＴＰＡを生産させたこと（実施例３）、および、同じプラスミドを用いて、同様にして羊のミルク中にヒトＴＰＡを生産させたこと（実施例４）が、記載されている。
　
（２）引用例１の記載
　原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願優先日前の１９９６年１２月１０日に頒布された刊行物である特表平８−５１１６７７号（以下、「引用例１」という。）には、大腸菌で生産させた組換えヒトアルファ−フェト蛋白質は不溶性であり、再可溶化を要した（第１５頁第１５行〜第１６行）こと、診断用の標準物質及び治療目的に使用することができる（第１５頁下から第３行〜下から第２行））こと、天然ヒトＡＦＰと同じ糖修飾がなされていないにもかかわらず、生物活性を有する（第７頁下から第７行）ことが、記載されている。
　
（３）引用例２の記載
　原査定の拒絶の理由で引用文献２として引用された本願優先日前の１９９７年に頒布された刊行物であるProtein Exp．Purif.(1997)Vol.10,p.10-26（以下、「引用例２」という。）には、ＡＦＰには、ある種のリンパ球に対する免疫調節効果やエストロジェン感受性の正常及び癌組織の成長を阻害する活性がある（第１１頁左欄第７行〜第１１行）こと、大腸菌で発現させた組換えヒトアルファ蛋白質は不溶性であり、再可溶化／リフォールディングを要したこと、精製した組換えヒトＡＦＰ蛋白質は、天然のタンパク質と同等の免疫抑制活性を有していた（第１０頁要約の項）こと、が記載されている。
　
３．対比
　本願発明と上記引用例５に記載された事項を比較すると、引用例５記載事項(ii)の「組換蛋白を製造するための方法、ＤＮＡ配列」、「所望の組換蛋白生産物をコードするＤＮＡ配列」、「所望の組換蛋白をコードするＤＮＡ配列に作用結合したミルク特異性蛋白プロモータ」、「乳房組織にて所望の組換蛋白の分泌および成熟を可能にするような信号ペプチドをコードするＤＮＡ配列」は、それぞれ本願発明における「実質的に純粋な核酸分子」、「組換え蛋白質をコードする核酸配列」、「コード配列に利用可能なように結合させたミルク特異的プロモーター」、「哺乳動物のミルクの中に乳腺細胞によって該組換え蛋白質の分泌を可能にする蛋白質分泌シグナルをコードするリーダー配列」に相当する。
　そうすると、両者は、「以下のものを含む実質的に純粋な核酸分子：（i）所望の組換え蛋白質をコードする核酸配列、（ii）組換え蛋白質のコード配列に利用可能なように結合させたミルク特異的プロモーター、および（iii）哺乳動物のミルクの中に乳腺細胞によって該組換え蛋白質の分泌を可能にする蛋白質分泌シグナルをコードするリーダー配列」である点で共通し、両者は、次の２点で相違する。
＜相違点１＞
　組換え蛋白質が、本願発明では、ヒトアルファ-フェト蛋白質（HuAFP）であるのに対し、引用例５では、医学上および農業上重要な蛋白質で所望のものであるが、HuAFPであることは記載されていない点。
＜相違点２＞
　乳腺細胞が、本願発明では、乳腺上皮細胞であるのに対し、引用例５には乳房組織であると記載され、乳腺上皮細胞とは記載されていない点。
　
４．当審の判断
（１）相違点１について
　引用例５記載事項（i）には、ミルク中に発現させる蛋白質としては、「医学上および農業上重要」なものであり、また、原核生物による生産では「所望の組換え蛋白が不適正に処理され、適正なグルコシル化を欠如し、或いは不適正に折畳まれる」ものが、特に想定されている。
　そうすると、上記引用例１及び２にも記載のように、医学上重要で、しかも、原核生物による発現では不溶性になり、不適正に折畳まれることが、本願優先日前既に周知の事項であるヒトアルファ−フェト蛋白質（以下、「HuAFP」という。）を、引用例５のミルク中で発現させる蛋白質として選択することは、当業者であれば容易に想到し得ることである。
　
（２）相違点２について
　乳房組織におけるミルクへの蛋白質の分泌が、乳腺上皮細胞によって行われることは、本願優先日前の技術常識であり、引用例５においても、実質的に乳腺上皮細胞によってミルク中に分泌されていると認められるから、相違点２は、実質的な相違ではない。
　
（３）本願発明の効果について
　本願明細書には、「HuAFPをコードする核酸配列」、「ヤギベータ−カゼイン」遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡベクターが記載され、その断片核酸分子を使用して、トランスジェニックヤギを作製すること、そのヤギのミルクからrHuAFPを精製すると記載されているが、実際に本願発明の核酸分子を用いてトランスジェニックヤギを作製したことも、ミルク中にrHuAFPを発現させて精製し取得したことも記載されていないから、本願発明において奏される効果が、引用例１、２及び５の記載から予測し得ない程の格別なものとはいえない。
　さらに、トランスジェニックヤギの作製、及びそのミルクからrHuAFPを精製すること自体は、５．（２）及び（３）で詳述するように予測し得る効果であるから、この点からも、本願発明において奏される効果は格別なものとはいえない。
　
（４）小活
　以上のとおり、本願請求項１に係る発明は、引用例１、２及び５の記載から当業者が容易に想到し得たものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
５．審判請求人の主張
（１）審判請求人の主張の概要
　審判請求人は、平成２２年６月７日付審判請求書の手続補正書において、
＜主張１＞「引用文献１−９には、非ヒトトランスジェニック哺乳動物のミルクへの組換えrHuAFPの発現について教示も示唆もされていないため、当業者が引用発明に基づいて本願発明に容易に想到することはできなかったこと」、
＜主張２＞「出願当時、遊離脂肪酸がAFPの活性を阻害することが周知であったことから、本願発明に係るrHuAFPが生物学活性の低下もなく有意な量を回収できるという効果は本願発明は技術常識を超えた顕著なものであること」、
＜主張３＞「本願発明の組換えrHuAFPは、ミルク中に発現されることから、精製が容易で、毒性物質混入のリスクがないこと」、
＜主張４＞添付資料５として提出した、本願出願後の文献である［Parker(2004)“Purification and characterization of a recombinant version of human α-fetoprotein expressed in the milk of transgenic goats” Protein Expr. Purif. 38:177-183］の記載に基づき、「本願発明にかかる組換えrHuAFPが天然のヒトAFPと機能的に類似し」、「rhAFPは標識されたAFPとの競合について、臍帯血hAFPよりも高い効果を示した（図６）こと」、
＜主張５＞宣誓書及び上記添付資料５に基づき、「セクション４では、本願明細書に開示された方法と既知の実験手法に基づいてrHuAFPをミルク中に分泌するトランスジェニックマウス及びヤギの作製に成功したこと」、および「本願発明の方法により得られる組換えrHuAFPは、その発現量において、当業者の予測を超えた顕著な効果を有すること」、と主張している。
　
　一方、本願明細書には、本願発明の核酸分子を用いてトランスジェニック哺乳動物を作製したことも、組換えHuAFPを生産させたことも具体的に記載されておらず、このような本願明細書中で生産されたことが確認されていない組換えHuAFP自体の効果については、本願明細書に記載されていない効果についての主張であり、参酌できないものである。
　したがって、上記主張２〜５については反論する必要はないが、念のため、以下上記各主張について検討しておく。
　
（２）主張１について
　トランスジェニック哺乳動物のミルク中に所望の組換え蛋白質を発現させることは、上記引用例５以外にも、原査定の拒絶の理由で引用された引用文献４、６、７（特表昭６４−５００１６２号公報、特開平０９−２９４５８６号公報、特開昭６３−０００２９１号公報）にも記載され、また、本願優先日前の１９９６年には、概説（Am J Clin Nutr 1996;63:629S-645S、以下「参考文献１」という。）も発行されているように、有用蛋白質の発現方法として、本願優先日前既に周知の方法であった。
　そして、上記４．（１）で述べたとおり、HuAFPが有用タンパク質であることは本願優先日前既に知られていたから、HuAFPの発現方法として上記引用例５に記載の周知方法を適用することは、当業者にとって自然な発想であるといえる。
　
（３）主張２について
　審判請求人が、平成２１年９月８日付意見書に添付した添付資料３には、「これらの結果は、ヘパリンによって誘導された血漿遊離脂肪酸の一過性の増加が、有意な、しかし
可逆的な、
　また、HuAFPに関する本願優先日前の頒布された他の文献の記載も参酌すると、例えば、J. Biochem.(1992)Vol.111,No.5,p.649-654には、「多重遺伝子の２つのメンバーである、AFPとアルブミンは、高い親和性で、
可逆的に脂肪酸に結合
穏やかな方法によって精製された場合には
　このように本願優先日前、遊離脂肪酸がHuAFPに結合し、その活性を阻害することは周知の事項であったが、同時に、遊離脂肪酸の結合が可逆的であることや、脂肪酸が残存するかどうかは精製条件に依存することも周知の事項であった。さらに、一般的な天然型のHuAFPも、胎児組織や血清、臍帯血のような、一定の遊離脂肪酸が存在する材料から取得されたものである。
　してみれば、HuAFPの活性は、使用時の環境に遊離脂肪酸が存在するか否かや、精製方法に強く依存すると当業者が認識していたはずであり、ミルクに遊離脂肪酸が存在することが、当業者がHuAFPをミルク中で発現させようとすることの阻害要因になるとはいえない。
　さらに、上記参考文献１にも記載のように、ミルク中で発現させた組換えヒト蛋白質は、その修飾及び折畳みが天然と同じであり、しかも高生産量と低コストのメリットがあることは、本願優先日前既に周知の事項であるから、たとえHuAFPのミルク中の発現に若干の問題があったと仮定しても、上記のメリットのためにHuAFPをミルク中で発現させようとすることは、当業者が容易に想到し得たことである。
　
（４）主張３について
　トランスジェニック哺乳動物のミルク中に所望のタンパク質を発現させる方法は、上記５．（２）でも記載したとおり、本願優先日前既に周知の技術であり、審判請求人の主張する効果は該方法の一般的な利点として、上記５．（３）に記載したとおり、当業者に広く知られていたことにすぎない。
　
（５）主張４について
　上記添付資料５は、本願優先日から約６年後の文献であり、参酌できないないことは上述のとおりであるが、仮に参酌したとしても、トランスジェニック哺乳動物のミルク中に所望のタンパク質を発現させる方法は、「所望の組換蛋白が不適正に処理され、適正なグリルシル化を欠如し、或いは不適正に折畳まれる」（引用例５記載事項（i））ことを、避ける目的で使用されていたものであるから、その発現産物が、天然物と機能的に類似するものであることは、当然に当業者が期待することである。しかも、大腸菌で発現させたHuAFPも活性があることが引用例１、２にも記載されている。
　また、添付資料５の図６について、対象として使用されている臍帯血由来のAFPは、該資料の記載によれば市販品であって、ヤギミルクから精製されたAFPと同等の精製を行ったものとは、記載されていない。一方、上記（３）に記載したとおり、AFPの活性が精製方法に依存することは、本願優先日前の周知事項であるから、図６の活性の差が、専ら本願発明の発現方法による効果であるとはいえない。
　また、添付資料５による精製方法は、本願明細書の実施例に記載された精製方法とは異なっており、本願明細書の実施例のとおり実験を行った場合の活性について、同様のものが得られるともいえない。
　
（６）主張５について
　本願出願後の実施に基づいており参酌できないが、仮に参酌したとしても、上記（２）で記載した参考文献１には、収量が30g/Lを超える発現例（羊）や、3g/Lの発現例（ヤギ）等が記載されており、審判請求人が提出した添付資料７に記載の170mg/L〜700mg/L（ヤギ）、及び添付資料５に記載の1.09g/L（ヤギ）という収量が、参考文献１に記載された収量に比べて顕著な効果であるとはいえない。
　また、収量については、哺乳動物により異なることは技術常識であり、仮に収量がよいとしても特定の実験条件で、トランスジェニック哺乳動物としてヤギを用いた場合の効果にすぎず、本願発明の全体にまで拡張ないし一般化できる効果とはいえない。
　
（７）小活
　以上の理由により、審判請求人の主張は、いずれも採用できない。
　
６．むすび 
　以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものであり、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。