【誤訳訂正書】
【提出日】平成13年2月22日(2001.2.22)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】免疫免除された抗原に対する細胞性免疫の検出および調整のための方法および薬剤
【特許請求の範囲】
【請求項１】個体における免疫免除された抗原に対する細胞性免疫応答の存在および程度を測定する方法であって、前記細胞性免疫応答が病的状態と直接または間接的に結び付いており、前記個体からの体液検体中の、前記免疫免除された抗原またはそのフラグメントに特異的なＴリンパ球の存在および程度を定量することを含む方法。
【請求項２】前記病的状態が異常増殖性疾患、腫瘍随伴性症候群、または自己免疫疾患である請求項１記載の方法。
【請求項３】前記免疫免除された抗原が、腫瘍随伴性抗原、ニューロンに特異的な抗原、精巣に特異的な抗原、および眼に特異的な抗原より成る群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】前記腫瘍随伴性抗原が腫瘍神経抗原である請求項３記載の方法。
【請求項５】前記腫瘍神経抗原がｃｄｒ２、Ｈｕ抗原、およびＮｏｖａ抗原より成る群より選ばれることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】前記Ｔリンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球であって、前記免疫免除された抗原が腫瘍神経抗原である請求項１記載の方法。
【請求項７】前記腫瘍神経抗原がｃｄｒ２である請求項６記載の方法。
【請求項８】前記免疫免除された抗原に特異的な前記Ｔリンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球であり、前記方法が前記抗原を認識することができるＴリンパ球受容体の発現の程度を検出することを含む請求項１記載の方法。
【請求項９】前記免疫免除された抗原に特異的な前記Ｔリンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球であり、前記方法が前記抗原への露出に対するＴリンパ球の活性化の程度を検出することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】前記免疫免除された抗原に特異的な前記Ｔリンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球であり、前記方法が前記細胞傷害性Ｔ細胞による、前記抗原を発現している標的細胞または標的分子の認識の程度を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】前記免疫免除された抗原に特異的な前記Ｔリンパ球がキラーＴ細胞であり、前記方法が前記抗原を発現しているキラーリンパ球受容体の発現の程度を検出することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１２】前記免疫免除された抗原に特異的な前記Ｔリンパ球が記憶Ｔ細胞であり、前記方法が前記抗原を提示している抗原提示細胞への露出の後に、前記記憶Ｔ細胞の活性化の程度を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１３】前記免疫免除された抗原に特異的な前記Ｔリンパ球が記憶Ｔ細胞であり、前記方法が、前記記憶Ｔ細胞を、前記抗原を提示している抗原提示細胞へ露出した後に、前記抗原またはそのフラグメントを発現している標的細胞の認識の程度を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１４】前記免疫免除された抗原に特異的な前記Ｔリンパ球が記憶Ｔ細胞であり、前記方法が、前記記憶Ｔ細胞を、前記抗原を提示している抗原提示細胞へ露出した後に、前記抗原またはそのフラグメントを運んでいる標的分子の認識の程度を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１５】免疫免除された抗原に対する細胞性免疫応答によって引起される病的状態の初期の発症または発症の性向について個体をスクリーニングするための、請求項１記載の方法。
【請求項１６】個体における新生物が、免疫免除された抗原を発現するかどうかを、前記抗原またはそのフラグメントに特異的な、前記個体からのＴリンパ球を定量することによって測定するための、請求項１記載の方法。
【請求項１７】免疫免除された抗原を発現している腫瘍をもつ患者が、当該腫瘍を抑制するべく充分な抗原特異Ｔリンパ球の集団を有するか、または抗癌療法の候補者であるのかを、前記抗原またはそのフラグメントに特異的なＴリンパ球を定量することによって測定するための、請求項１記載の方法。
【請求項１８】患者における免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球の集団を調整するべく指示された治療の有効性を、抗原特異Ｔリンパ球の数を測定することによって監視するための、請求項１記載の方法。
【請求項１９】免疫免除された抗原を発現している腫瘍をもつ患者の、腫瘍随伴性症候群に対する感受性を、前記患者の体液中のサイトカインレベルを定量することによって測定する方法。
【請求項２０】末梢血中の免疫免除された抗原に特異的なＴ細胞の量を測定するための方法であって、
ｉ）前記血液検体中の樹状細胞を成熟させること；
ｉｉ）前記成熟した樹状細胞を、免疫免除された抗原を発現している無関係な細胞からのアポトーシス性破片に対して露出すること；
ｉｉｉ）前記免疫免除された抗原に露出された樹状細胞を、前記患者の末梢血リンパ球と共にインキュベートすること；および、
ｉｖ）前記リンパ球から放出されたインターフェロン−γ量を、当該検体中の免疫免除された抗原に特異的なＴ細胞の数と相関すること、
の段階を含む方法。
【請求項２１】前記免疫免除された抗原がｃｄｒ２である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】免疫免除された抗原を発現している前記無関係な細胞が、免疫免除された抗原を発現するべく安定にトランスフェクトされた細胞である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】前記免疫免除された抗原がｃｄｒ２である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】前記インターフェロン−γ放出がＥＬＩＳＰＯＴ検定法によって測定される請求項２０記載の方法。
【請求項２５】免疫免除された抗原またはそのフラグメントに特異的なＴリンパ球の定量のための診断用キットであって、免疫免除された抗原のフラグメント、前記免疫免除された抗原またはそのフラグメントを発現している標的細胞、ＨＬＡとの４量体複合体中の免疫免除された抗原フラグメント、およびそれらの組合わせより成る群から選ばれる一つまたはそれより多い試薬を含むキット；前記キットはさらに、必要であれば付加的な成分と、前記キットの使用のための使用説明書とを含む診断用キット。
【請求項２６】患者における新生物を治療するための方法であって、前記新生物が免疫免除された抗原を発現し、前記患者に存在している免疫免除された抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の数または活性化された状態を亢進することによる方法。
【請求項２７】
ｉ）前記患者からの血液検体から、ある量の抗原提示細胞を単離すること；
ｉｉ）前記抗原提示細胞をインヴィトロにおいて、前記免疫免除された抗原またはそのフラグメントに対して露出すること、
ｉｉｉ）前記抗原露出された抗原提示細胞を、前記患者に再導入すること、
の段階による請求項２６記載の方法。
【請求項２８】前記抗原露出された抗原提示細胞をインヴィトロにおいて、前記患者の血液から単離されたある量のＴリンパ球に露出すること、および前記Ｔリンパ球を前記患者に再導入することをさらに含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】前記免疫免除された抗原またはそのフラグメントの、前記抗原提示細胞に対する露出が、前記免疫免除された抗原またはそのフラグメントを発現している細胞を用いてエクスヴィヴォにおいて行なわれることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】前記免疫免除された抗原を発現している前記細胞が、アポトーシス性細胞か、またはＭＨＣクラスＩ分子を発現している人工的な抗原提示細胞か、あるいは免疫免除された抗原ペプチドを用いてパルスされた細胞である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】前記免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球が、ドナー個体、患者と同じＨＬＡ表現型の不死化された細胞系、および患者と同じＨＬＡ表現型の、薬剤感受性の不死化された細胞系から成る群より選ばれた、ＨＬＡ適合性細胞源から調製されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３２】前記免抗原提示細胞が、ドナー個体、患者と同じＨＬＡ表現型の不死化された細胞系、およびＭＨＣ Ｉおよび免疫免除された抗原を発現するべくトランスフェクトされたショウジョウバエ細胞から成る群より選ばれた、ＨＬＡ適合性細胞源から調製されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３３】哺乳類における病的状態を治療するための方法であって、前記病的状態が、免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球が前記哺乳類に存在することによって引おこされ、前記免疫免除された抗原を発現している細胞に特異的な活性化されたＴリンパ球の集団または活性を減少させる有効量の薬剤を投与することを含む方法。
【請求項３４】前記薬剤がタクロリムス、サイクロスポリン、免疫抑制性サイトカイン、コルチコステロイド、またはアザチオプリンである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】前記免疫免除された抗原がｃｄｒ２またはそのフラグメントか、あるいはＨｕ抗原またはそのフラグメントである請求項３３記載の方法。
【請求項３６】前記病的状態が腫瘍随伴性神経疾患であり、前記薬剤が中枢神経系へ投与されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３７】非腫瘍細胞上の免疫免除された抗原の発現を減じるための方法であって、前記抗原の発現を抑制する有効な量の薬剤の投与を含む方法。
【請求項３８】前記薬剤がサイトカイン拮抗薬である請求項３７記載の方法。
【請求項３９】細胞傷害性Ｔリンパ球による、免疫免除された抗原を発現している細胞の致死を低下させる方法であって、前記免疫免除された抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球に対する前記細胞の感受性を減じることによる方法。
【請求項４０】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として同定される単離されたペプチド配列。
【請求項４１】患者の検体中の免疫免除された抗原に特異的なＴ細胞の数を測定するための診断用キットであって：
ｉ）免疫免除された抗原を発現している細胞、
ｉｉ）ガンマインターフェロンについてＥＬＩＳＰＯＴ検定法を行なうための試薬および材料；および
ｉｉｉ）前記キットを使用するための使用説明書、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府援助）
本発明に導く研究は、少なくとも一部は国防総省、乳癌研究補助金Ｎｏ．ＤＡＭＤ０１７−９４−Ｊ−４２７７、国立予防衛生研究所補助金Ｎｏ．Ｍ０１ ＲＲ００１０２、および国立多発性硬化症協会からの補助金によって援助されている。したがって、政府は本発明において一定の権限を有する。
【０００２】
（発明の属する技術分野）
本発明は免疫免除された抗原に対する細胞性免疫の発生に基づく診断および治療法と、腫瘍随伴性神経疾患および腫瘍免疫の病因における、数ある他の条件の中での、その役割に関する。
【０００３】
（発明の背景）
身体の免疫系に接近可能な構造物のエピトープをくまなく絶え間なく監視することは、「自己」を認識し維持するため、および感染性微生物等の、身体を侵すかまたは病気を発生するエピトープおよびそのキャリアの破壊のための、非常に有効な手段を提供する。免疫監視の一つの重要な役割は、身体内に常に発生すると信じられ、かつそのほとんどが検出可能になる前に免疫系によって除去される新生物細胞を認識かつ破壊することである。しかしながら、天然に発生する腫瘍免疫の実例は巧みに回避していた。細胞傷害性Ｔ細胞は、有効な免疫監視における重要な関係者であるが、活発な腫瘍をもつ患者においては、たとえこれらの腫瘍が黒色腫のＭＡＧＥ／ＭＡＲＴ抗原等の腫瘍特異抗原であると信じられているものを発現している場合でも増殖しない。
【０００４】
しかしながら、腫瘍随伴性神経疾患（ＰＮＤ）をもつ個体においては有効な腫瘍免疫が報告されている。これらの症候群はあまりよく理解されていない疾病であり、体内の癌の深刻な影響が、直接的な腫瘍の関与なしに神経系に生じる。ＰＮＤ患者は典型的には医者にとって、神経性の機能障害をもつように見え、彼等が腫瘍を隠していることには気付かない。たとえば、腫瘍随伴性小脳変性（ＰＣＤ）を発症している卵巣または乳房の癌をもつ患者は、有効な腫瘍免疫応答を有しており（３，４，５；１，２，６に総説）、さらに当該腫瘍はニューロンに特異的なタンパク質（抗原）を発現する。このような患者は、循環内および脳脊髄液（ＣＳＦ）内にこれらの腫瘍細胞抗原に対する抗体を有しており、それはまた腫瘍神経抗原と呼ばれる、ニューロンに発現される同じタンパク質と交差反応する。高力価の抗体は、ＰＣＤ患者に存在する卵巣または乳房の腫瘍に発現された細胞内抗原ｃｄｒ２を認識する（１０）；また小脳のプルキンエニューロンにおいても当該抗原を認識する（１０）。しかしながら、下文に詳しく述べられるように、この抗体の存在はＰＮＤの病理発生も、有効な腫瘍の致死も供給しない。
【０００５】
脳、眼、および精巣等の身体のある領域は、免疫監視から防護されており、これらの部位は免疫免除されていると呼ばれる。上記の観察を基盤にすると、正常に免疫免除された抗原ｃｄｒ２（１０）が婦人科の腫瘍において発現されると、免疫系がそれを認識することによりＰＣＤを開始することが提案される。臨床的にはこの免疫応答は有効な腫瘍免疫と結びついており、ｃｄｒ２を発現しているプルキンエニューロンの認識および破壊に導くと信じられている。標的抗原のいくつかをコード化しているｃＤＮＡがクローン化されており、たとえばｃｄｒ２は正しい腫瘍抗原であることが示されている（９，５４）。しかしながら、標的であるニューロンの抗原は細胞質性であるため、これらの抗原に対する循環中の、および脳脊髄液（ＣＳＦ）の抗体の、ＰＣＤの病理発生における役割は疑わしい。さらに、抗体の受動的または能動的な輸送により当該疾患を再生する試みは失敗した（１１，１２，１３）。標的臓器としては、脳は免疫免除されており、さらに標的抗原は細胞質性であり、腫瘍随伴性症候群の病因は一致することがむずかしい。このことは、全般的な腫瘍抗原に対する細胞性免疫応答の明らかな欠如と、ＰＣＤにおける細胞性免疫応答の明らかな欠如とによってさらに確認される。ＰＣＤの患者においては、自己由来の樹状細胞を用いても、ｃｄｒ２タンパク質に対する細胞傷害性Ｔリンパ球は見られなかった（４７）。ＰＮＤにおける腫瘍免疫の病因は謎めいている。
【０００６】
上述のように、腫瘍随伴性症候群は腫瘍に関連した深刻な状態であり、しばしば中枢神経系を冒す；このような疾患は正しくは腫瘍随伴性神経疾患（ＰＮＤ）と呼ばれる。たとえば、乳癌または卵巣癌の患者に見られる一般的な腫瘍随伴性疾患の一つは腫瘍随伴性小脳変性、またはＰＣＤであり、そこでは進行性の深刻な機能傷害が小脳を巻込んで起こり、手足の共同運動不全、眩暈、および複視に導く。しばしば、これらの症候群は癌の診断より前に現われる。神経変性のもう一つの例であるＨｕ症候群は、小細胞肺癌と、腫瘍神経抗原Ｈｕに対する抗体とに結びついている。他の例では、眼球クローヌス、または自発的な無秩序の眼球運動と、筋クローヌス、律動性身体運動とは、乳癌、ファロピウス管癌、または小細胞肺癌を併発してよく、また腫瘍神経抗原Ｎｏｖａに対する抗体と関連している。
【０００７】
標的である腫瘍神経抗原は、腫瘍随伴性であると信じられているいくつかの疾患についてはまだ同定されていない。ホジュキン病および他のリンパ腫の患者は、亜急性の小脳変性を発症することがあるが、それは免疫を介するものと信じられている（２２，２４）。イートン・ランバート症候群は四肢の衰弱を引起こす状態であるが、肺癌等の胸腔内の腫瘍もまた併発することがあり、免疫を介するものと信じられている（２）。脊髄機能障害（たとえばミエロパシー）、運動ニューロン疾患、失明、および他の神経症状を発症している患者は、裏に潜む腫瘍という特異的なセットを有しており、既知の、または部分的に性質のわかった腫瘍神経抗原に対する免疫性を有すると信じられている（２，３７）。まだよくわかっていないが、筋肉疾患である皮膚筋炎および多発性筋炎の発生率は、癌患者では増加している。皮膚病の状態である白斑は、皮膚の色素を産生するメラノサイトが破壊されるが、黒色腫の発生率の減少と結び付いているようである。したがって、腫瘍および、ある場合には腫瘍免疫と、腫瘍随伴性疾患の症状部位との間には、おそらくある共通の抗原の存在を介した関連性が存在することは明白である。
【０００８】
いくつかの系列の証拠は、ＰＮＤ患者における自然発生腫瘍免疫の存在を示唆している。ＰＮＤに関連する腫瘍は典型的には潜在性である（２４，２５）；それらはいくつかの症例では、診査手術に続く罹患臓器の顕微鏡分析によるか、または剖検においてのみ同定されてきた。ＰＮＤと結び付いた腫瘍をもつ患者は、ＰＮＤと結び付いていない組織学的に同等な腫瘍をもつ患者に比較して、有意に限定された疾病と改良された腫瘍予後とを有する（２０，２４，２６〜２８）。いくつかの症例では、 ＰＮＤに関連した腫瘍は、自己免疫性神経疾患の発症と共に、退行することが記録されている（７）。
【０００９】
抗腫瘍免疫に関する明確なデータは、いくつかのＰＮＤについて取得可能である。腫瘍随伴性脳脊髄炎の患者は、Ｈｕと呼ばれる高力価の抗体および小細胞肺癌（ＳＣＬＣａ）を隠している；それらの腫瘍は典型的には単一の小結節に限定されている（公開された最も完全な研究では５３／５５［９６％］の患者（３））。このことは、非選別の一組（６０％を超える）からのＳＣＬＣａ患者のほとんどが、診断時には広範囲の転移性疾患を有する（また検出可能な力価のＨｕ抗体はない）とすれば、驚くべき発見である。加えて、ＰＮＤのないＳＣＬＣａ患者の１５パーセントは、それにもかかわらず検出可能な力価のＨｕ抗体を有する（２０）。このような患者は、病気が限定された疾患、化学療法に対する完全な応答、および、より長い生存の頻度において、統計学的に有意な増加がある（３，５）。これらの結果は抗ＰＮＤ抗体が、神経疾患との関連とは無関係に増殖する腫瘍の抑制と結びつけられてよいことを示唆している。
【００１０】
ＰＮＤ患者におけるＮｏｖａ（Ｒｉ）（２８）およびＹｏ（１０）の存在と、臨床上限定された悪性度との間には確固とした結びつきがある。両抗体は共に婦人科癌のある婦人に発見される。乳癌または卵巣癌のある５２人のＹｏ抗体陽性患者のうち（４）、３分の２（３４／５２）が癌の診断以前に神経症状を呈し、診断時には８７％（４５／５２）が限定された腫瘍学的疾患を有していた；同様にＮｏｖａ陽性患者の４／７が神経症状を呈し、６／７が病期の限定された疾患を有しており、一人の患者には腫瘍は発見することができなかった（２８）。比較によれば、選別されない乳癌患者の５０〜６０％が、また卵巣癌では２５％が病期の限定された疾患を呈するにすぎない（８）。
【００１１】
実験による観察は、ＰＮＤに腫瘍細胞の免疫認識があるという臨床上の証拠を支持する。高力価の高ＰＮＤ抗体がＰＮＤ患者の血清および脳脊髄液に見出だされる。インヴィトロでは、これらの抗体はＰＮＤ患者の細胞から取得された腫瘍標本ならびに、臨床的に冒された神経系の領域からのニューロンと特異的に反応する（２４，２５，２９）。たとえば、Ｙｏ陽性患者からの乳房または卵巣の腫瘍の１０／１０は、ビオチニル化されたＹｏ抗血清と免疫反応性であり（４）、Ｎｏｖａ陽性患者からの乳房または卵管の腫瘍の３／４は、ビオチニル化されたＮｏｖａ抗血清と免疫反応性であった（２８）。これらの観察を合わせると、ＰＮＤ抗体が神経疾患または腫瘍細胞の存在のマーカーどころか、有効な抗腫瘍免疫応答のマーカーであって、おそらく部分的にそれを反映するものであることを示唆している。
【００１２】
ＰＮＤにおける抗腫瘍および抗ニューロン免疫応答の免疫学的基盤は未知である。ニューロンとの結合特異性をもつ自己抗体の発見と、末梢神経系の自己免疫神経疾患の観察とは、ＰＮＤの病理発生におけるＢ細胞の役割に研究を集中させてきた。重傷筋無力症（ＭＧ）およびランバート・イートン筋無力症候群（ＬＥＭＳ）においては、抗ニューロン抗体は動物において自己免疫疾患を受動的に移すことが見出されている（３０，３１）。ＰＮＤでは、比較的高い力価の抗体は血清よりもむしろＣＳＦにあり（ＩｇＧ指数＞１）（３２）、ＣＮＳ区画内での活発なＢ細胞の炎症性反応が示唆される。さらに、データは完全に強要するものではないが、ＰＮＤ抗体がインヴィトロにおいて神経毒性であってよいこと、また抗体がニューロンによって取込まれることが可能でもよいという数多くの報告がある（３３，３４）。これらの観察は臨床家に、ＰＮＤの治療をＰＮＤ抗体の除去に集中させてきた。不運にもこのような試みは一様に失敗に終わった（２４，３２，３５）。ＰＮＤのいくつかの特徴は、それをＭＧおよびＬＥＭＳから区別させ、またＢ細胞がＰＮＤの発生にとって必要ではあっても充分ではないことを示唆している。ＰＮＤ抗体は、ＭＧ（アセチルコリン受容体）またはＬＥＭＳ（シナプス前カルシウムチャネル）における標的抗原とは異なり、細胞質性（Ｙｏ、βＮＡＰ）であるか、または核（Ｎｏｖａ、Ｈｕ）タンパク質であることがわかっている（２）。このような観察を、ＰＮＤ自己免疫においてはＰＮＤ抗体が主な役割を果たしているという前提と一致させることは困難である。さらに、ＰＮＤの動物モデルを作る試みは、ＣＳＦへの抗体の注入、およびクローン化された融合タンパク質を用いた免疫化を含め失敗している（１１，１２）。
【００１３】
したがって、腫瘍随伴性症候群の病因は現在まだわかっていない免疫学的基盤をもつものと考えられる。本発明は、個体における腫瘍および腫瘍随伴性疾患の検出を全般に改良することと、免疫免除抗原を発現している腫瘍および関連する症候群の両者に対する改良された治療を提供することを目的として、腫瘍随伴性神経疾患の病因のさらなる理解と、有効な腫瘍免疫と免疫免除部位における新生物というこれらの深刻な遠隔の合併症との間の関連性の確立とに向けられている。
【００１４】
（発明の概要）
本文において本発明者らは、腫瘍随伴性神経疾患をもつ患者において、腫瘍抗原特異Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の存在という驚くべき、かつ注目すべき発見を行なった。この発見は、細胞を主体とする望ましくかつしばしば有効な、腫瘍に対する免疫学的攻撃と、ＣＴＬによる腫瘍随伴性疾患である遠隔の標的器官に対する有効ではあるが望ましくない攻撃とを理解するための基盤を提供する。これらの遠隔組織による、腫瘍細胞に発現されかつＴリンパ球が標的とするものと同一の免疫免除抗原の発現は、ＰＮＤの病因を初めて説明する。腫瘍および遠隔の抗原に特異的な、活性化されたＣＴＬと記憶Ｔ細胞とが共に検出されている。この発見は免疫免除抗原が免疫系に対し、特有の一連の標的を差出すという認識を提供する。もし腫瘍において発現されれば、それらは有効な抗腫瘍免疫にとって標的を提供する。もしこれらの抗原に対する免疫免除または耐性が、たとえば有効な抗腫瘍免疫の設定中に壊されれば、自己免疫疾患という結果に終わるかもしれない。容易にかつ特異的に検出され、増幅され、あるいは阻害されることの可能な免疫免除抗原に対する細胞性免疫応答の同定は、本文に開示された診断および治療への実用化のための基盤を提供する。この発見に基づき、免疫免除された抗原に対する細胞性免疫の検出ならびに監視について、診断への実用化が開示され、また抗腫瘍免疫の有効性を亢進するため、および免疫を介する病理学から免疫免除部位を保護するための治療法が述べられる。本文の発見に基づき、免疫免除抗原に対する免疫応答を検出および調整するべく、免疫系についての既知の診断および治療のための手法および操作が変更される。
【００１５】
下文にさらに詳細に述べられるように、免疫免除抗原に対する特異的なＴリンパ球反応を有する患者、特に腫瘍をもつ人の、ごく一部が明白な腫瘍随伴性疾患を呈するにすぎないが、かかる患者は、未だ検出されない自己免疫疾患または他の潜在性の疾患を、発症する危険にさらされているか、または有してもよい。本発明によれば、免疫免除抗原に対する細胞性の免疫応答の存在および程度を、各個体において測定するための方法が提供され、細胞性の免疫応答は直接または間接的に病的状態と結びつけられる。病的状態の実例は、異常増殖疾患、腫瘍随伴性症候群、および自己免疫疾患を含むがこれらに制限されない。当該方法は、免疫免除抗原またはそのフラグメントに特異的なＴリンパ球の存在および程度を、個体からの体液標本において定量することを含む。好ましい方法は腫瘍随伴性抗原を、最も好ましくはｃｄｒ２およびＨｕ抗原等の腫瘍神経抗原を、認識するＴリンパ球の検出を含む。検出手段の一例は、抗原への露出に際してのＴリンパ球の活性化の程度を、サイトカイン産生の測定により決定することを含む；もう一つの方法は、細胞傷害性Ｔ細胞による、当該抗原を発現している標的細胞の認識の程度を検出することを含む。また免疫免除抗原の受容体をもつＴリンパ球の検出法も提供される。
【００１６】
検出されるべきＴリンパ球が記憶Ｔ細胞である例では、当該方法は免疫免除抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）に露出した後に、記憶Ｔ細胞の活性化の程度の検出することを含む。もう一つの態様においては、当該抗原を発現している標的細胞の認識の程度は、記憶Ｔ細胞を免疫免除抗原を提示しているＡＰＣに露出した後に測定される。
【００１７】
本発明はさらに、免疫免除抗原を発現している腫瘍の存在について個体をスクリーニングするための、および免疫免除抗原に対する細胞性の免疫応答によって引きおこされる病的状態を発症させる初期の徴候または傾向を検出するための方法を提供する。この方法は、免疫免除抗原に特異的なＴリンパ球の存在および程度を測定することを含む。さらに、ある新生物が免疫免除抗原を発現するかどうかを、当該抗原またはそのフラグメントに特異的なＴリンパ球を定量することにより、測定するための方法を提供する。もう一つの態様においては、免疫免除抗原を発現している腫瘍をもつ患者が、腫瘍を抑制するべく充分な数の抗原特異Ｔリンパ球を有しているのか、あるいは抗癌治療の候補者であるのかを決定するための方法が開示される。この方法は、当該抗原またはそのフラグメントに特異的なＴリンパ球を定量することを含む。さらにもう一つの態様においては、患者における免疫免除抗原に特異的なＴリンパ球の数を調整するべく指示された療法の、有効性を監視するための方法が述べられており、その中で抗原に特異的なＴリンパ球の数が定量される。
【００１８】
本発明においては、免疫免除された標的をコード化しているｃＤＮＡ、ならびにそれらが発現されたタンパク質およびそれらのフラグメントは、本文に述べられた診断および治療法を実行するための試薬を提供するべく、また診断用キットの一部として用いられてよい。前文に述べたように、ｃｄｒ２の配列ならびにｃＤＮＡは既知である（９，５４）；ＨＬＡと複合体を形成するそのフラグメントは以下に述べられている。
【００１９】
患者の標本中における、免疫免除抗原に特異的なＴ細胞の数の同定のためのスクリーニング法のさらなる実例においては、以下の段階が実行されてよい：
ｉ）血液検体中の樹状細胞を成熟させること；
ｉｉ）成熟した樹状細胞を、免疫免除抗原を発現している無関係な細胞からのアポトーシス性破片に対して露出すること；
ｉｉｉ）免疫免除抗原に露出された樹状細胞を、患者からの末梢リンパ球と共にインキュベートすること；および
ｉｖ）リンパ球から放出されたインターフェロン−γ量を、検体中の免疫免除抗原に特異的なＴ細胞の数と相関させること。
【００２０】
制限しない実例としては、当該免疫免除抗原はｃｄｒ２でよい。免疫免除抗原を発現している無関係な細胞は、ｃｄｒ２等の免疫免除抗原を発現するべく安定にトランスフェクトされた細胞でよい。インターフェロン−γ放出は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析法により測定されてよい。
【００２１】
診断用のキットもまた、上記のＴリンパ球および抗原を測定することの可能な成分と共に提供され、たとえば一つまたはそれより多い以下の試薬を含む：単離された、免疫免除抗原または好ましくは免疫免除抗原のフラグメント；免疫免除抗原またはそのフラグメントを発現している標的細胞；ＨＬＡとの４量体複合体中の免疫免除抗原フラグメント；およびＨＬＡとの複合体中の免疫免除抗原フラグメントを認識する抗体または標識された抗体等の試薬。免疫免除抗原がｃｄｒ２である場合には、同定された有用な単離ポリペプチド配列はＹｏ１からＹｏ８、またはｃｄｒ２−１からｃｄｒ２−８と呼ばれるｃｄｒ２ペプチドを含み、本文においてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と同定される。キットは、細胞系または、たとえばショウジョウバエから調製された標的細胞を含んでよく、それらは免疫免除抗原を発現しており、さらにＨＬＡ分子と補助的刺激分子とを発現してもよい。キットはさらに、免疫細胞の活性化を検出するための手段として、γＩＦＮ等のサイトカイン産生を検出するための成分を含んでよい。異なるＨＬＡハプロタイプをもつ様々な患者からの検体を広くスクリーニングするため、患者のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫免除抗原に特異的なＴリンパ球を検出するべく、同一の免疫免除抗原を発現しているがＨＬＡハプロタイプの異なる種々の標的細胞が用いられてよい。
【００２２】
本発明のもう一つの目的は、新生物を治療する方法を、当該新生物が免疫免除抗原を発現している患者において提供することである。一つの好ましい態様は、患者に存在する免疫免除抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の数を増すことによって成就される。一つの制限しない実例においては、この方法はまず患者の血液検体からある量のＡＰＣを単離し、次に当該ＡＰＣをインヴィトロにおいて免疫免除抗原またはそのフラグメントに露出し、次いで抗原に露出された当該ＡＰＣを患者に再導入することによって行なわれる。もう一つの関連する態様においては、同様の方法の後に、抗原に露出されたＡＰＣをインヴィトロにおいて、患者から単離されたある量のＴリンパ球に露出し、さらに当該Ｔリンパ球を患者に再導入するという付加的な段階が続く。これらの実例は、腫瘍に対する免疫性を発生または亢進させるため、免疫免除抗原に特異的なＴリンパ球および／または免疫免除抗原を提示しているＡＰＣを患者に提供するための方法の例証である。
【００２３】
前述の方法において免疫免除抗原またはそのフラグメントのＡＰＣへの提示を遂行する方法は、いくつかの方法のうちのいずれか一つを用いて行なわれる。たとえば、ＡＰＣは免疫免除抗原またはそのフラグメントを発現しているアポトーシス性細胞が供給される。これらはｃｄｒ２抗原を発現するＨｅＬａ細胞等（９）の免疫免除抗原を発現している一般的な市販の細胞系か、または免疫免除抗原をコード化している遺伝子を発現しているショウジョウバエ細胞等のトランスフェクトされた細胞でよい。これらの細胞はまた、患者のＭＨＣ分子のハプロタイプをコード化している遺伝子を付加的に発現するべく工作され、またさらに補助的刺激分子を発現するべく工作され、抗原呈示細胞として機能するショウジョウバエ細胞が上述のようにインヴィヴォまたはエクスヴィヴォ（ｅｘ−ｖｉｖｏ）でのＴリンパ球の刺激のために有用なＡＰＣを形成するようにしてもよい。これらの細胞はまた本文に述べたように診断用の実用性をもつ。好ましい抗原は腫瘍随伴性であり、最も好ましくはｃｄｒ２およびＨｕ抗原等の腫瘍神経抗原である。さらなる態様においては、免疫免除抗原に特異的なＴリンパ球は、患者と同じＨＬＡハプロタイプのドナー個体から由来する。
【００２４】
本発明のさらなる態様においては、哺乳類における病的状態の治療法が提供されるが、当該病的状態は免疫免除抗原に特異的なＴリンパ球が、哺乳類に存在することによって引き起こされる。この方法は、免疫免除抗原を発現している細胞に特異的な活性化されたＴリンパ球の集団を減少させる有効量の薬剤の投与から成る。かかる薬剤の制限しない実例は、タクロリムス、サイクロスポリン、免疫抑制サイトカイン、コルチコステロイド、および組合わせを含む。好ましい薬剤はタクロリムスである。免疫免除抗原は好ましくは腫瘍随伴性抗原、最も好ましくはｃｄｒ２およびＨｕ抗原とそれらのフラグメント等の腫瘍神経抗原である。当該薬剤の好ましい投与経路は中枢神経経に対するものである。他の有効な投与経路も開示される。
【００２５】
本発明のさらなる態様においては、非腫瘍細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球によって殺されることとなる免疫抗原を発現する能力の減少、ならびに非腫瘍細胞上の腫瘍随伴性抗原の発現の減少のための方法が提供される。これらはいくつかの方法によって成就されてよく、たとえば冒された細胞との接触においてサイトカイン濃度を減じることによる；ＮｅｆまたはＮｅｆ様タンパク質の発現を亢進すること、 パーフォリンを介するニューロンのＣＴＬによる致死を阻害すること、および標的細胞のアポトーシスを阻害することによる。
【００２６】
もう一つの態様においては、方法ならびに薬剤は、免疫免除抗原を発現している腫瘍の、Ｔリンパ球による致死の亢進のために提供される。このような方法はサイトカインを投与すること、腫瘍におけるＦａｓリガンド発現を阻害すること、および腫瘍上のＭＨＣＩ分子の発現を誘導することを含む。患者における免疫免除Ｔリンパ球活性の亢進と組合わせて、他の方法が使用されてもよい。
【００２７】
好ましい態様においては、免疫免除抗原を発現している腫瘍をもち、身体の非腫瘍部位における同一の抗原を免疫系が認識および攻撃している腫瘍随伴性疾患または他の症候群を罹患している個体は、本文に開示された方法の制限しない実例によって例示される、当該腫瘍の免疫免除抗原の免疫認識を亢進することにより治療され、同時に一方では、本文に開示された対応する方法により、非腫瘍部位は免疫攻撃から防護される。
【００２８】
したがって本発明の腫瘍な目的は、免疫免除抗原に特異的なＴリンパ球の存在の利点を利用して、患者における病的状態の存在を検出し、またＴリンパ球による腫瘍免疫の亢進に基づく治療の有効性、ならびに非腫瘍部位における関連する症候群の治療におけるそれらの抑制を監視することである。本発明のさらなる目的は、腫瘍ならびに腫瘍随伴性症候群を検出して、かかる腫瘍の免疫的破壊を亢進し、また同一のＴリンパ球によって引きおこされる疾患に感受性の非腫瘍臓器を防護するために、診断および治療用の両用途を提供することである。
【００２９】
本発明のこれらの、また他の局面は、以下の図面および詳細な説明を参照することにより、さらに理解されよう。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」、「癌（ｃａｎｃｅｒ）」、「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」、「新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」という用語およびそれらの語源上の類縁物は、本文において細胞または細胞集団に影響を及ぼす増殖異常疾患および付随する状態を広く指すべく、交換可能に用いられる。好ましくは増殖異常細胞は、本文においては免疫免除抗原を発現することに関係する。
【００３１】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）はエフェクターＴ細胞、通常はＣＤ８＋であって、ＭＨＣ分子と結合した抗原ペプチドを運んでいる標的細胞の溶解を仲介することができる。他の細胞傷害性細胞はγ／δおよびＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞を含む。
【００３２】
免疫免除および免疫免除された抗原は、体内のある部位および抗原の免疫系からの隔離に関連しており、したがってそれに対しては免疫応答が正常に発生しない抗原を指す。異所性に（すなわち正常に免疫免除される部位以外に）発現された免疫免除された抗原は、自己免疫または腫瘍免疫という結果に終わってよい。免疫免除された抗原はいくつかの腫瘍によって発現され、その結果同一の免疫免除された抗原を発現している腫瘍および非腫瘍部位の両者に対して免疫応答する。次に続く、免疫免除された部位への免疫エフェクター細胞の接近の結果として、非腫瘍細胞への免疫攻撃を生じる。かかる免疫免除された抗原の一つの型は、ニューロンの抗原であり、そのサブセットは腫瘍神経または腫瘍随伴性の抗原であって、それに対する免疫応答が神経疾患を引起こすことになる。腫瘍神経抗原のさらに詳細な記述は、参考文献として本文に取入れられている参考文献（２）に見出されるであろう。
【００３３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞を含む細胞であり、クラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ分子と結合して抗原ペプチドをプロセスおよび提示することができ、さらにＴ細胞の活性化のために必要な補助的刺激信号を送達する。
本文では発明者らにより、腫瘍をもつ個体が身体の遠隔部位に深刻な神経傷害を導く疾患を体験するという、これまで謎であった腫瘍随伴性症候群の病因が、腫瘍抗原を標的とし、またニューロン上に発現された同一の抗原も認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および記憶Ｔリンパ球の存在によって説明されることが開示された。腫瘍細胞により発現されたかかる免疫免除された抗原は、細胞性免疫応答を誘導し、それはある場合には有効かつ望ましい腫瘍免疫を提供するが、望ましくない副作用として、同一の抗原も発現する免疫免除された部位において、正常な組織に対する免疫攻撃を仲介する。よく理解されていないのは免疫免除された部位に対してのＣＴＬの接近、ならびに非腫瘍細胞上の正常に免疫免除された抗原の発現である。上述のように、患者はしばしば腫瘍の検出以前に、遠隔の副作用を体験する。特定のＣＴＬによって認識される抗原は身体内の免疫免除された部位、たとえば腫瘍随伴性変性では脳、に局在するという理由から、本文の発明は、免疫免除された非腫瘍抗原に対する免疫系の攻撃というほとんど理解されていなかった現象に対して説明を提供する。脳に加えて、身体の他の免疫免除された部位は、精巣および眼の部分を含む。
【００３４】
本発明によれば、また以下の実施例ならびに記述において説明されるように、診断および治療の両方への利用が提供され、それによれば免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球の存在または活性が有効に用いられる。免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球の検出は、かかる抗原を発現する腫瘍の早期発見のために患者をスクリーニングする機会を提供すると共に、抗癌療法を受けている患者の監視を容易にする。かかるＴリンパ球による有効な腫瘍免疫は初期の段階で腫瘍を撲滅するかもしれないが、その背後に腫瘍随伴性症候群または自己免疫疾患を残す；細胞性の免疫応答の検出と、それが向けられている特定の抗原の同定は、神経疾患の発症前の治療介入を可能にし、また存続状態の処置を容易にするかもしれない。
【００３５】
新生物ならびに腫瘍随伴性症候群および自己免疫疾患の新規な治療法もまた、腫瘍随伴性症候群の病態生理学および免疫免除された抗原の全般的な免疫認識における、Ｔリンパ球の役割を評価することにより提供される。腫瘍により発現された免疫免除された抗原を認識する特異的なＣＴＬにより仲介される腫瘍免疫の有効性は、特定のＣＴＬまたは記憶Ｔリンパ球の集団を作り出すかまたは拡大することにより刺激または亢進される。免疫免除された抗原に露出されたＡＰＣは、免疫応答を亢進するべく用いられる。また、特に腫瘍に対する免疫応答が亢進された場合に、非腫瘍標的部位を病理から防護するべく、非腫瘍細胞を免疫攻撃から防護するための方法も提供される。
【００３６】
種々の腫瘍随伴性症候群の中でも、腫瘍随伴性小脳変性（ＰＣＤ）は卵巣および乳房の腫瘍等の婦人科の腫瘍と結付いている。以下の実施例において見られるように、ＰＣＤ患者に存在するＣＴＬは、ＰＣＤ抗原に由来するｃｄｒ２と呼ばれるペプチドを提示している標的細胞を特異的に溶解する。したがって、ｃｄｒ２抗原は、正常にはニューロン細胞の免疫免除された抗原であるが、婦人科の腫瘍において発現され、当該抗原に対する細胞性の免疫応答の誘導を可能にする。急性のＰＣＤ患者の血清から直接分析されたＴリンパ球は、慢性のＰＣＤ患者に存在する、樹状細胞に刺激された記憶Ｔ細胞と同様に、ｃｄｒ２に特異的な細胞傷害性を示す。
【００３７】
ＰＣＤ抗原は、ニューロンの細胞および婦人科の腫瘍において発現されたタンパク質、ｃｄｒ２として同定されている（９，５４）。Ｔリンパ球に対するＡＰＣによる提示のためのｃｄｒ２抗原のプロセシングについての本発明者らによる研究は、ＰＣＤ患者において天然に生じるＣＴＬの標的である、ｃｄｒ２のポリペプチドフラグメントの同定に導いた。このようなペプチドは、細胞性免疫の発生の中で、樹状細胞によって提示されるものであると信じられている。８つのペプチド、すなわちｃｄｒ２−１またはＹｏ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｃｄｒ２−２またはＹｏ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ｃｄｒ２−３またはＹｏ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ｃｄｒ２−４またはＹｏ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ｃｄｒ２−５またはＹｏ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ｃｄｒ２−６またはＹｏ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ｃｄｒ２−７またはＹｏ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、またはｃｄｒ２−８またはＹｏ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）が合成により調製されており、本発明の実行において診断および治療用に用いられている。さらに、下文に詳細に述べられるように、これらのペプチドを発現するべく細胞を工作することは、癌および腫瘍随伴性疾患の検出および治療において、さらなる診断および治療用の有用性をもつ。
【００３８】
他のいくつかの疾病においては、腫瘍によって発現された抗原に対する細胞性免疫は、同じ抗原を発現している非腫瘍細胞に対する攻撃の原因または推定される原因である。前文に述べたように、これらの症候群は亜急性または急性で、深刻な合併症を引き起こすことがある。Ｈｕ抗原は小細胞肺癌によって発現される；Ｈｕ症候群は免疫免除された抗原に対する細胞性免疫によってもたらされる神経疾患のもう一つの実例である。本発明者らによる、このような疾病の病因における細胞性免疫の役割の同定は、非腫瘍抗原に冒された部位における非腫瘍抗原の発現と、腫瘍における当該抗原の発現との間に関連性を提供する。
【００３９】
前文に述べたように、ｃｄｒ２に特異的なＣＴＬが広範囲の婦人科腫瘍に存在することは、ｃｄｒ２を発現している乳房または卵巣の腫瘍細胞がＰＣＤの開始の原因となることを示唆している。しかしながら、非ＰＣＤ関連性の腫瘍に高いパーセントでｃｄｒ２が検出されることは、腫瘍免疫の成功の原因となる付加的な因子があることを示している。関連性のある因子には、腫瘍細胞のＭＨＣ−Ｉ発現（ＰＮＤに関連した腫瘍において証明されている；参考文献１８）および、交差初回免疫に必要であるとされるアポトーシス性腫瘍に対する樹状細胞（ＤＣ）の近接（１９）が含まれる。非ＰＮＤ関連性の小細胞肺癌をもつ患者の１５％が力価の低いＰＮＤ Ｈｕ抗体を隠していること、およびこの抗体反応が、限定された腫瘍の進展と化学療法に対する完全な応答とを予言することが報告されている（５，２０）。本文に述べられた発明は、かかる患者におけるＨｕに特異的なＣＴＬの存在にまで拡張される。同様に、ｃｄｒ２を発現している、非ＰＮＤ関連性の婦人科の腫瘍をもつ患者の有意なパーセントが、本発明の特別の態様による診断および治療を受けることができ、それによりこのような患者においてｃｄｒ２に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の存在が検出され、かつそれらの活性がこのような患者において調整されることが期待される。本発明は免疫免除された抗原を全般的に含むものであり、Ｎｏｖａ、βＮＡＰ、その他）に加えて本文に述べられ、本発明によって関連があることが教示されたものに限定されない。
【００４０】
したがって本発明が目指すところは、免疫免除された抗原に対するＴリンパ球の応答の検出ならびに調整である。免疫応答の亢進は抗腫瘍活性の有効性を高める。免疫応答の抑制は腫瘍随伴性または自己免疫性の疾患を緩和する。免除抗原に対する細胞性免疫応答の結果として生じる疾患および症候群は、腫瘍随伴性神経変性、腫瘍随伴性小脳変性、Ｈｕ症候群、Ｒｉ症候群（乳房、ファロピウス管、および小細胞肺癌に、またＲｉまたはＮｏｖａ抗原に関連する眼球クローヌス−ミオクローヌス失調症）、神経芽細胞腫に関連する眼球クローヌスおよびミオクローヌス失調症、白斑、重症筋無力症、亜急性運動ニューロン疾患、亜急性壊死ミエロパシー、多発性神経炎、イートン・ランバート症候群、皮膚筋炎、および多発性筋炎を含むがこれらに限定されない。これらの状態は、検出不能か、顕性か、または自発性に退行した腫瘍の結果としてであっても、患者における新形成に直接または間接的に関係するように見える。いくつかの場合には、抗原の本質はまだはっきりしていないが、疾患の経過と、新形成および他のさらによく研究されている疾患との関係とから、当該疾患の病因における未同定の免疫免除された抗原の役割が示唆される。さらに、上述の疾患ならびに種々の自己免疫疾患は、新生物に対する細胞性免疫応答から事実上生じてよく、それは当該免疫応答によって効果的に根絶されるが、免除抗原を攻撃し、また当該新生物が根絶されたずっと後に、ある症候群を喚起するＴリンパ球を生じる結果となる。腫瘍随伴性疾患に向けられた本発明の診断および治療法はまた、自己免疫疾患を含め、他の免疫免除された抗原に関連する疾患の診断および治療においても効用を見出すであろう。
【００４１】
本発明の一つの態様においては、免疫免除された抗原に特異的な細胞傷害性および記憶Ｔリンパ球の定量は、腫瘍の存在および程度を確認するべく、あるいは腫瘍随伴性かまたは、自己免疫疾患、たとえば白斑等の、他の症候群の診断を確証するべく行なわれる。この検査は、スクリーニングテストかまたは、個体にとっては身体検査を受けるような日常的な分析法として行なわれる。それはまた、新生物または、免疫免除された抗原に対する細胞性免疫応答に関係する疾患を有することが疑われる個体において行なわれてもよい。この検査を行なうためには、血液かまたは、脳脊髄液（ＣＳＦ）等の、リンパ球を含んでいる他の適当な体液検体が取得される。
【００４２】
特定の免疫免除された抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の存在を測定するためには、いくつかの種類の検定法のうちのいずれか一つが行なわれるが、それらはすべて当業者には周知である。制限しない単なる実例としては、免疫免除された抗原、すなわちＨＬＡ４量体に複合された当該抗原のペプチドフラグメントを認識するＴリンパ球受容体の存在を確認する検定が行なわれる（５１）。この検定においては、ＨＬＡと複合した免疫免除された抗原のペプチドを認識する特異的な抗体試薬が調製される；この試薬は当該特定の受容体を発現しているＴリンパ球を検出するべく用いられる。当該試薬は患者の特定のＨＬＡハプロタイプに特異的でなけらばならない。慣例的なスクリーニングテストにおいては、免疫免除された抗原とＨＬＡハプロタイプの種々の組合わせが捜し求められる。検出は数ある手段の中のいずれかを用いて成遂げられ、たとえば蛍光細胞分離分析（ＦＡＣＳ）技術を用いた蛍光標識試薬によるか、または放射性または酵素のタグ等の検出可能な標識を用いることにより、また検体中のＴリンパ球に対する当該試薬の結合を、標準的な技術により定量することによる。これらの種々の方法は、免疫免除された抗原を認識するＣＴＬの検出を主体とする本発明の実施を説明するための、制限しない例として提供される。
【００４３】
免疫免除された抗原に特異的なＣＴＬの検出手段のもう一つの実例においては、かかるＣＴＬが当該免疫免除された抗原またはそのペプチドをＨＬＡという状況の中で発現している標的細胞を溶解する能力が用いられる。かかる細胞のＣＴＬによる溶解は、当業者に周知の方法により検出される。適当なＨＬＡハプロタイプＨＬＡ抗原ペプチドを発現している標的細胞の調製には、いくつかの方法のうちのいずれかが用いられる。たとえば、標的細胞は細胞系Ｔ２（ＴＡＰ−／−ＨＬＡ−Ａ２．１＋）等のＨＬＡを発現するものでよく、ＨＬＡ複合体にペプチドを取込むこととなる。細胞は、本文に述べたｃｄｒ２ペプチド等の免疫免除された抗原ペプチドを用いてパルスされ、続いて特異的なＣＴＬを検出するための標的として用いられる。ＣＴＬによる標的細胞の特異的な認識を検出するべく、標的細胞の溶解が測定される。たとえば、標的細胞はあらかじめＮａ５１ＣｒＯ４等のマーカーを用いて前負荷される；標的細胞の溶解は標識の放出という結果に終わる。別法として、たとえば乳酸デヒドロゲナーゼ等の細胞内マーカーの放出によって溶解が検定される。このような種々の方法は当業者には周知である。前述の方法の特別の態様においては、以下の段階が実行される：
【００４４】
ｉ）体液検体を取得すること；
ｉｉ）検体からＴリンパ球を単離すること；
ｉｉｉ）細胞表面上に、免疫免除された抗原またはそのフラグメントをＨＬＡの状況の中に運んでいる標的細胞の検体を調製すること；
ｉｖ）単離されたＴリンパ球を標的細胞とインキュベートすること；
ｖ）標的細胞の生存度を定量すること；および
ｉｖ）前記標的細胞の生存度を、検体中の、免疫免除された抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の存在と相関すること。
【００４５】
さらなる好ましい態様においては、免疫免除された抗原に特異的なＣＴＬの同定は、Ｔリンパ球を上記の標的細胞と共にインキュベートし、続いて特異的な認識とそれに続く活性化の指標であるＣＴＬからの特異的なメディエイタの放出を検出することにより、容易に測定される。ＣＴＬがその標的とする抗原に出会うと、γ−インターフェロンおよびＴＮＦ−αＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよび他のケモカインを含む他のサイトカインを放出すること、ならびに当該抗原を運んでいる標的細胞を溶解することが知られている。この好ましい方法の実施の実例として、以下の段階が実行される：
【００４６】
ｉ）個体からＴリンパ球を含む体液検体を取得すること；
ｉｉ）検体からＴリンパ球を任意に単離すること；
ｉｉｉ）体液検体または単離されたＴリンパ球を、ＨＬＡの状況の中にある免疫免除された抗原またはフラグメントに露出すること；
ｉｖ）Ｔリンパ球によって産生されるメディエイタの濃度を定量すること。
【００４７】
本発明のこれらの態様の実施にとって有用な、特定の免疫免除された抗原を発現している細胞は、ＨｅＬａ細胞により発現されるｃｄｒ２等の免疫免除された抗原を天然に発現する細胞； 所望の抗原を発現する結果となる遺伝子をトランスフェクトされた、ショウジョウバエ細胞等の細胞；他の実例は当業者には周知のものを含むがそれに限定されない。上述のように、かかるトランスフェクトされた細胞は特定のＨＬＡハプロタイプ分子を発現するべく付加的に工作されてよく、さらに補助的刺激分子を発現してもよい。したがってこれらの細胞は、免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球の同定にとって有用な、当該抗原をＨＬＡ分子の状況において発現する標的細胞として機能してよい。一連のかかる細胞が調製されてよく、スクリーニングにおける使用のため、各々の細胞は異なるＨＬＡハプロタイプを発現している。
【００４８】
γ−インターフェロンまたは産生された他のメディエイタは、検体中に存在する免疫免除された抗原またはそのフラグメントに特異的なＴリンパ球の数に直接関係する。この値は次に、患者に腫瘍があるのか、またはかつて存在していたのかを、さらには腫瘍随伴性症候群または、免疫免除された抗原に特異的なＣＴＬの存在によって特徴づけられる他の疾患を発症する可能性を同定するべく用いられる。抗原特異ＣＴＬを検出するための他の方法は、ＣＴＬに特異的な免疫免除された抗原を測定することに適した本発明の実施に適用できる。本発明を説明するために提供された実例は制限されることを意図していない。たとえば、免疫免除された抗原に対するＣＴＬを直接的に同定するための上記の方法は、ＨＬＡ分子と免疫免除された抗原ペプチドとを含んでいる４量体を検出することが可能なＴリンパ球受容体表面について検出することを含む。本発明の検定のための免疫免除された抗原またはそのフラグメントの選択は、一般的なものか、または検出されるべき特定の症候群に特異的であってもよい。一般的なスクリーニング用には、たとえば癌については、検査は種々の既知の腫瘍随伴性抗原またはフラグメントの混合物を含む。ある患者が抗原の混合物に対して特異的なＣＴＬを有するとして同定された後、特定の抗原を正確に指摘するべくさらなるスクリーニングが行なわれる。次いで、かかるスクリーニングとさらなる同定とが、患者の将来の治療過程を指示するべく、たとえば特定の腫瘍に対するＣＴＬを増加させるべく、また身体の非腫瘍部位におけるＣＴＬによる腫瘍随伴性症候群の苦しさを減じるべく用いられる；このような治療上の有効性は下文にさらに詳細に述べられている。
【００４９】
本発明者らにより、腫瘍随伴性抗原に特異的な記憶Ｔ細胞が腫瘍随伴性症候群をもつ個体に存在することも発見されている。患者の検体中の記憶Ｔ細胞の存在および程度をスクリーニングまたは検出するためには、疑わしい記憶Ｔリンパ球が、免疫免除された抗原を提示しているＡＰＣに対して露出されなければならない。結果として生じる活性化されたＴリンパ球の検出は、上記のような、患者の検体における直接的なＣＴＬの検出と同様な様式にて定量される。この方法の一般的な実例として、検定は以下の段階により行なわれる：
【００５０】
ｉ）Ｔリンパ球を含んでいる体液検体を取得すること；
ｉｉ）体液検体から任意にＴリンパ球を単離すること；
ｉｉｉ）プロセスされ、かつ免疫免除された抗原を提示している分化したＡＰＣを調製すること；
ｉｖ）免疫免除された抗原を提示しているＡＰＣを、当該検体または単離されたＴリンパ球と共にインキュベートすること；
ｖ）免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球を測定すること。
【００５１】
免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球の測定は、この技術において既知の多くの方法のいずれか一つによって達成される。たとえば、ＨＬＡペプチド４量体を認識する受容体の発現が測定されるか、またはＴリンパ球からのメディエイタの分泌の程度が測定されてよい；別法として、免疫免除された抗原をＨＬＡという状況において発現している標的細胞に対する、Ｔリンパ球の細胞溶解活性が検出されてもよい。
【００５２】
制限しない実例としては、ＡＰＣは樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、小膠細胞、繊維細胞、ＭＨＣを含んでおり、数ある中でも補助的刺激分子を分泌している工作された細胞でよい。所望のペプチドを発現している標的細胞を調製するべく、種々の既知の方法が用いられる；たとえばそれは、抗原またはペプチドフラグメントを発現するアポトーシス性細胞を介した抗原送達によるか、タンパク質をＭＨＣに指向させる熱ショックタンパク質の使用によるか、またタンパク質またはペプチドを用いた細胞の直接的なパルシングによって達成されてもよい。これらの実例は本発明の実施の実例の単なる例証にすぎず、制限されることを意図するものではない。
【００５３】
特別の実例においては、γ−インターフェロン産生等のメディエイタが検定の読出しとして用いられ、その濃度は患者の検体中の記憶Ｔリンパ球の数に直接的に関係することとなり、したがってそれは前記個体中の新生物の存在および程度と、あるいは新生物が以前に存在したことと相関関係がある。細胞溶解および特異的な受容体の定量もまた同様のデータを提供する。
【００５４】
本発明のもう一つの局面においては、ｃｄｒ２に特異的なＴ細胞の検出のための検定法が提供される。この検定法は迅速であり、ｃｄｒ２に特異的なＴ細胞の存在について、多数の患者の検体をスクリーニングする能力を、キットの形状において提供する。この方法の段階は次のとおりである：
【００５５】
ｉ）血液検体を取得すること；
ｉｉ）血液検体中の樹状細胞を成熟させること；
ｉｉｉ）成熟した樹状細胞を、免疫免除された抗原を発現している無関係な細胞からのアポトーシス性破片に対して露出すること；
ｉｖ）免疫免除された抗原に露出された樹状細胞を、患者の末梢血リンパ球と共に培養すること；および
ｖ）刺激の測定として、当該リンパ球から放出されたインターフェロン−γ定すること。
【００５６】
免疫免除された抗原を与えられた樹状細胞によって刺激されたＴ細胞の数は、患者の末梢血中の免疫免除された抗原に特異的なＴ細胞の数の指標である。樹状細胞がそれに対して露出されるアポトーシス性破片は、制限しない例として、ｃｄｒ２等の免疫免除された抗原を発現しているトランスフェクトされたアポトーシス性細胞でよい。ネガティブな対照、たとえば同じ細胞系であるが当該抗原を発現していないものがこの検定法に使用されてよい。
【００５７】
上記の方法の実施の実例としては、患者の末梢血が取得され、さらに実施例１に述べたように樹状細胞が成熟される。次にこれらの細胞は、ｃｄｒ２タンパク質を発現するかまたはしない無関係の（マウス）細胞からのアポトーシス性破片が与えられた。ｃｄｒタンパク質を発現しているかかる細胞は、たとえば以下の実施例６に述べたＰＣ７またはＥＣ２細胞のように、ｐｃＤＮＡ−ｃｄｒ２を用いてＥＬ４細胞を安定にトランスフェクトすること、およびウェスタンブロット分析により行なわれるタンパク質発現の測定により調製されてよい。これらの給餌されたＤＣ細胞は、次に患者の末梢血リンパ球と共にインキュベートされ、刺激の指標としてインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）の放出が測定される。ＩＮＦ−γ放出は数ある方法のどの一つにて測定されてもよいが、標準的なＥＬＩＳＰＯＴ検定は迅速な方法を提供する。たとえば、１０５個のＴ細胞が、あらかじめＩＮＦ−γの特異的なモノクローナル抗体でコートされた９６ウェルプレートに置かれ、１０４個の放射線照射された刺激細胞（ＥＣ２またはＥＬ４等の）と共にインキュベートされる。２０時間後、細胞は洗浄され、ビオチニル化された抗ＩＮＦ−γ抗体と、ＨＲＰ−ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチル−カルバゾール）染色法とを用いてＩＮＦ−γのスポット形成細胞（ＳＦＣ）が検出される。ＳＦＣは１００万細胞当りに報告される。
【００５８】
この実施例では、ニトロセルロース底のウェルにはＩＮＦ−γに対する抗体が置かれ、放出は２０時間行なわれ、プレートは洗浄され、さらに比色による検出を可能にするべくビオチンと結合された二次的な抗ＩＮＦ−γ抗体が添加される。 ＩＮＦ−γを分泌しているスポットの数は、ＤＣによって刺激される、この検定におけるＴ細胞の数に対応する。ＥＬ４を与えられたＤＣ（ネガティブな対照）によって刺激されるＴ細胞の数を、ＥＬ２を与えられたＤＣによって刺激される数と比較することにより、患者の末梢血中のｃｄｒ２に特異的なＴ細胞の数が測定される。
【００５９】
個の検定法にはいくつかの利点がある。第一に、Ｔ２（ＨＬＡ Ａ２．１）標的が殺されるＣＴＬ検定に必要とされるようなＨＬＡの制限がないため、どのＭＨＣハプロタイプの患者もこの方法により検定することができる。第二に、当該検定法は比較的簡単であり、末梢血の採血から行なうことができ、自動化されたＥＬＩＳＰＯＴロボットおよびリーダーによって行なうことが可能である。第三に、現在の方法は単回の５０ｍｌの末梢血の採血からＤＣを成長させるが、この検定法は結局は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、ＤＣなしに行なわれることが可能であり、混合された細胞集団として、Ｔ細胞を刺激するべく充分なＡＰＣを有する末梢血単球を用いる。
【００６０】
さらに、前文に述べた検定法は、免疫免除された抗原を発現している腫瘍をもつ患者が、当該腫瘍を抑制するための抗原特異なＴリンパ球の充分な集団をもつかどうか、あるいは抗癌療法の候補者であるかどうかを、当該特定の抗原に特異的なＴリンパ球を定量することにより決定するために有用である。さらにこの方法は、上記の方法に従って細胞傷害性および記憶Ｔリンパ球の数を測定することにより、患者における抗原特異Ｔリンパ球の集団を調整することを意図した治療法すなわち、抗癌療法のためには当該集団を増し、非腫瘍部位の防護のためおよび、たとえば腫瘍随伴性症候群の緩和のためには当該集団を減じること、の有効性を監視するために用いることができる。当該検定の読出しは、健康管理の専門家が検定結果に基づいて適切な治療のコースを指示することを可能にするべく、あらかじめ確立された標準および範囲と比較されてよい。
【００６１】
腫瘍随伴性症候群におけるＣＴＬの役割の発見の結果として、本発明者らは悪化を監視するか、または下文に述べたような免疫免除された抗原ＣＴＬを主体とする治療の潜在的な可能性を予測するための、およびサイトカインの関与の結果としての症候群発症の性向を測定するための、さらなる診断様式を本文において同定した。サイトカインはＭＨＣ−Ｉ分子を介して細胞質抗原の発現を促進することが知られており（２１，２２）、したがってサイトカインの濃度の増加は、本発明の治療法による腫瘍細胞の致死の有効性を亢進してもよい。逆に、新生物または腫瘍随伴性症候群等の病的状態に存在するサイトカインは、非腫瘍細胞上の抗原の発現を促進することによって当該疾患の過程を加速または悪化させることが可能である。このことは、腫瘍細胞上の抗原の発現から生ずる、免疫免除された抗原に特異的なＣＴＬが、いかにして第一に中枢神経等の正常に免疫免除された身体の部位に、おそらくサイトカインを介する内皮バリアの弱体化によって接近できるのか、また第二に当該抗原が正常には細胞質性であって表面上に発現されないニューロンおよび他の細胞を認識および攻撃することができるのか、というまだあまりよく理解されていない現象を説明する助けとなるかもしれない。したがって腫瘍随伴性症候群に冒された組織と接触してのサイトカイン濃度の測定は、当該疾患の厳しさまたは潜在的な厳しさを査定する上で有用である。
【００６２】
診断用キットは本発明によって具体化され、それは上記の種々の方法に従って、体液検体中の抗原特異Ｔリンパ球の検出において使用するための、特別の免疫免除された抗原またはフラグメントを提供する。たとえば、制限しない実例としての、ＨＬＡの結合ドメインに結合すると予測されている前述のｃｄｒ２のいくつかのペプチド等の、免疫免除された抗原ペプチドが、抗原ペプチドをＨＬＡに関連して運んでいる標的細胞の調製用のキットに含まれてよい。キットのもう一つの成分は、 ＨＬＡ分子およびペプチドを含んでいる、標識されたかまたは４量体の複合体を、当該複合体に特異的な受容体をもつＣＴＬの直接的な検出用に含んでいる。キットの構成要素は、行なわれるべき検定の様式および、検出されるべき免疫免除された抗原の型または複数の型に特異的なものとなる。
【００６３】
腫瘍随伴性症候群の悪化と腫瘍免疫の両者におけるＴリンパ球の役割についての、本文における本発明者らの発見の結果として、腫瘍に対する免疫応答の亢進と、冒された非腫瘍組織の部位における免疫応答の抑制とに向けられたいくつかの治療様式が提供される。これらの治療様式は一般的に免除された抗原に対する細胞性免疫応答の亢進または減退のいずれかに向けられ、癌の治療、腫瘍随伴性症候群、および免疫免除された抗原に対する不適切な免疫応答の結果、病理、たとえば自己免疫疾患を生ずる他の疾患において効用を有する。
【００６４】
患者の状態に依存して、これらの治療法の各々の適用の程度は適当でよい；これらは理想的には、細胞免疫の抗癌性の利益を最適化するためと同時に、一方では非腫瘍細胞を免疫破壊から防護するために適用されてよい。本発明の結果として開示されたこれらの治療法の有効性は、細胞性免疫の有効性を増すための他の既知の手段を同時に供給することにより亢進される。
【００６５】
患者における免疫免除された抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の数または活性化状態を亢進することによる、患者における腫瘍細胞の亢進された致死という治療用の養生法は、かかる細胞傷害性Ｔ細胞が亢進されるが動物は神経学的に傷つけられないという動物モデルを開発する能力によって実験的に支持される。以下の実施例５においてさらに詳細に示されるように、このことはアポトーシス性腫瘍細胞を用いて免疫化されたマウスを用いて成し遂げられ、その結果強力なｃｄｒ２特異キラーＴ細胞を発生する。当該アポトーシス性腫瘍細胞はｐｃＤＮＡ−ｃｄｒ２を用いて安定にトランスフェクトするＥＬ４細胞（Ｔ細胞リンパ腫）によって発生される細胞系（ＰＣ７）であり、タンパク質発現の測定はウェスタンブロット分析法により測定された。マウスは放射線照射されたＰＣ７細胞を用いて免疫化され、次に初回免疫された、および未処理の、同腹の子の脾臓を収穫した。初回免疫されたＴ細胞を再刺激する目的のため、ＭＨＣの合致する標的細胞、ＥＣ２細胞、またはＴＩＢ８４細胞を用いて混合リンパ球／腫瘍細胞培養が確立された。５日後、反応性Ｔ細胞が集められ、標準的なクロム放出検定法において種々の比率にて検査された。別法としてＣＤ８＋Ｔ細胞は、初回免疫された、および未処理の、マウスの脾臓から、ＭＡＣＳ細胞分離システムを用いて精製された。簡単に言えば、鉄を結合されたマイクロビーズに連結された抗ＣＤ８抗体が脾細胞と共にインキュベートされ、ＣＤ８＋Ｔ細胞は細胞を磁気カラムに通すことによりポジティブに選択される。ポジティブに選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞はＥＬＩＳＰＯＴ検定に直接使用された。
【００６６】
この実験の結果は、ｃｄｒ２を発現しているＭＨＣの合致する標的細胞、ＥＣ２細胞を溶解するが、ｃｄｒ２の発現を欠くＭＨＣの合致する細胞は溶解しないというＴリンパ球の能力によって説明されるような特異性を示した。ＰＣ７細胞は、それが免疫化されたＣ５７／Ｂ６マウスに関してＭＨＣ不適合であるため、このモデルシステムはＰＣＤをもつ患者において明らかな腫瘍細胞の交差初回免疫に類似していると信じられている。
【００６７】
致死検定に加えてＩＦＮ−γ放出は、ＰＣ７で免疫されたマウスから精製されたＴ細胞からも証明された。この短期間の検定は、高濃度のＣＴＬ先駆体が免疫されたマウスに存在することを確証した。免疫されなかったマウスは神経性の機能障害の徴候を呈したため、これらのデータは腫瘍免疫を自己免疫性神経変性から分離する能力を示している。上記のように、ｃｄｒ２に特異的なキラーＴ細胞は有効な腫瘍抑制およびＰＣＤのある患者において同定されている。さらに、神経学的には正常な患者に存在する有意な数の乳房および卵巣の腫瘍が、ｃｄｒ２標的抗原を発現する。したがってこのモデルにおいて本研究は、ｃｄｒ２を発現している腫瘍細胞を殺することができるＴ細胞の刺激が、自己免疫性の神経疾患を誘導することなく可能であることを証明する。
【００６８】
第一の態様においては、免疫免除された抗原を発現している新生物をもつ患者に対して、免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球の数を当該患者において増加させることにより、亢進された抗腫瘍療法が提供される。刺激されるべきＴリンパ球は、インヴィヴォまたはエクスヴィヴォのいずれかにおいて刺激された患者自身の細胞でよく、あるいはそれらは以下に述べられるような他の源からのＨＬＡ適合性の細胞でよい。この増加は、患者から単離された樹状細胞等のＡＰＣをエクスヴィヴォにおいて、特定の抗原の一つまたはそれより多いペプチドに対して露出することによるか、それによって当該抗原がＴリンパ球への提示されるようにになる他の既知の手段により果たすことができる。抗原に露出されたＡＰＣは、次に特異的なＴリンパ球の活性をインヴィヴォにおいて刺激するべく当該患者に再導入されるか、あるいはＡＰＣ、たとえば樹状細胞は、当該患者から単離されたＴリンパ球に対し、インヴィトロにおいてさらに露出され、それによりＴリンパ球への提示が抗原特異ＣＴＬの活性化を誘導するようにする。Ｔリンパ球または樹状細胞は当該患者に再導入され、そこでＣＴＬは抗腫瘍活性を増進し、また樹状細胞は追加のＣＴＬをインヴィヴォにおいて刺激することとなる。
【００６９】
たとえば、第一の方法を実施するためには、以下の段階が続けられる：
ｉ）ある量の樹状細胞を患者の血液検体から単離すること；
ｉｉ）樹状細胞をインヴィトロにおいて免疫免除された抗原フラグメントに対して露出すること；
ｉｉｉ）抗原に露出された樹状細胞を患者に再導入すること。
【００７０】
前記のエクスヴィヴォにおける療法は、当業者に周知のいくつかの制限しない方法のどの一つによっても成遂げられてよい。たとえば、記憶Ｔリンパ球は、所望の免疫免除された抗原を提示している樹状細胞に対して露出することにより、エクスヴィヴォにおいて活性化されてよい。もう一つの制限しない実例においては、免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球は、上記のＨＬＡ４量体を用いて単離されてよく、次いで患者への再導入に先立ち、サイトカイン、たとえばＩＬ−２を用いるか、または樹状細胞の存在下に拡張される。患者から単離された粗Ｔ細胞が、抗原を提示している樹状細胞に対して露出されてよい；次いで活性化され、次いで抗原特異性の細胞傷害性Ｔリンパ球が患者に再導入されてよい。
【００７１】
前述のように、これらの方法はＴリンパ球による殺傷の有効性を増加させる併用療法によって亢進されてよい。制限しない実例は、サイトカイン濃度を増すこと、アポトーシスを阻止するための、腫瘍細胞上でのＦａｓリガンド発現（４４）の発現を阻害すること、腫瘍上でのＭＨＣ Ｉ分子の発現を、たとえばＮｅｆインヒビターまたはＮｅｆ様タンパク質（４１）を用いて誘導すること、放射線療法、腫瘍化学療法、腫瘍におけるＢａｘ誘導（５２）、およびＦＬＩＰインヒビター（４９）を用いて腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することを含む。
【００７２】
上記の実例のさらなる態様においては、ＰＮＤの発症の危機にあるかまたは徴候を表わしている癌患者に対する細胞性免疫を主体とする治療の亢進において、本発明の目的を遂げるため、上記のＴリンパ球および／または樹状細胞は、ガンシクロビル等の薬物に対して感受性となるべく、当業者に既知の方法により工作されてよい（５３）。患者に免疫細胞を導入した後は、ＰＮＤのいかなる誘導または悪化も、当該細胞がそれに対して感受性である薬剤を投与することで、導入された免疫細胞の集団を抑えることにより抑制されてよい。
【００７３】
上記の方法の実施においては、ある免疫免除された抗原は、樹状細胞によって細胞表面上での提示では適切に取上げられないか、または完全な抗原またはそのペプチドに対する樹状細胞の露出がプロセシングおよび提示を可能にしないことがある。さらなる態様においては、当該抗原は容易にプロセスおよび提示される形状にて提供される。免疫原性に乏しいかまたは充分にプロセスされない抗原による抗原提示を亢進するための周知の種々の手段の中で、ウイルスベクター、むきだしかまたはプラスミドのＤＮＡ、ＲＮＡ、それにより樹状細胞をトランスフェクトするための核酸をもつリポソームの使用（５０）等の他の既知の手段に加えて、所望の抗原を発現しているアポトーシス性細胞を、樹状細胞に対して抗原を送達するべく用いること（１７）が述べられてきた。好ましい態様においては、送達はすでに所望の抗原を発現している細胞；たとえば、ｃｄｒ２を発現するという理由から、ＰＮＤの治療のための上記の方法において有用であるＨｅＬａ細胞、を用いて成遂げられた。このような免疫免除された抗原を発現している細胞は、ＡＰＣに対する露出の前にアポトーシス性となるべく誘導される。
【００７４】
本発明のもう一つの態様においては、腫瘍随伴性症候群があるかまたは、免疫免除された抗原に対して他の不適切な細胞性免疫応答をもつ患者の治療法は、抗原特異ＣＴＬによる非腫瘍細胞の攻撃を調停するべく、細胞性免疫の抑制が所望されるところに提供される。かかる治療方法は、特異的な免疫免除された抗原に対する細胞性の免疫応答の低下または抑制に向けられる。この治療法にとって有用な薬剤は、ＣＴＬを除去することが示されているタクロリムス、サイクロスポリン、コルチコステロイド、およびアザチオプリン等の薬剤を含むが、これらに制限されない。このような薬剤は、本文に述べた腫瘍随伴性症候群の治療に有用であり、それにより免疫免除された抗原を標的とするＣＴＬは除去される。さらなる態様においては、脳等の免疫免除された部位におけるＣＴＬ攻撃の抑制は、血液脳関門を封鎖することにより成遂げられる。このことは、この技術において周知の種々の薬剤、たとえばコルチコステロイドの使用により果たされてよい。免疫免除を維持するべく脳を防護することもまた、上向き調節をするＦａｓリガンドの発現によって成遂げられてよい（４０）。
【００７５】
免疫免除された抗原に対する細胞性免疫応答を抑制するための薬剤の投与は、身体全体かまたは、亢進された有効性のための特別の場所、たとえば腫瘍随伴性症候群の場合には、頭蓋内またはクモ膜下への投与により、中枢神経系に向けられる。かかる薬剤は、非経口注射によるか、または口、肺、鼻への、または他の投与形式によって投与されてよい。様々な患者における様々な状態の治療に適した線量レベルは普通の技術の作業者により、受容者の治療状況、年齢、および全身の健康を考慮して確認されるであろう。
【００７６】
腫瘍随伴性症候群におけるＣＴＬの役割の発見の結果、本発明者らは本文において非腫瘍細胞による免疫免除された抗原の発現を制限することにより、当該症候群の発症または悪化を調停するためのさらなる治療様式を同定した。このことは、サイトカインがＭＨＣ−Ｉ分子を介して内在抗原の発現を促進するとされていることから（２１，２２）、非腫瘍細胞と接触しているサイトカインの濃度を減じることによって成遂げられる。コルチコステロイド等のサイトカイン産生阻害剤か、または抗サイトカイン抗体等の抗サイトカイン薬剤を用いた治療は、制限しない実例として提供される。ＣＴＬが中枢神経系のニューロン細胞を攻撃するＰＮＤの実例においては、ＣＮＳに送達される抗サイトカイン療法は、上記のクモ膜下投与等の手段によって提供される。
【００７７】
さらなる態様においては、非腫瘍細胞を、リンパ球による腫瘍随伴性抗原の認識を妨害する薬剤と接触させることにより、腫瘍随伴性抗原に特異的なＴリンパ球による、腫瘍随伴性抗原を発現している非腫瘍細胞の認識を低下させるための方法が提供される。かかる薬剤はＭＨＣの発現を抑制する薬剤と、Ｔｈ１反応をＴｈ２反応に切替えてよい薬剤等の、抗原提示を抑制する他の薬剤とを含む。
【００７８】
さらなる態様においては、ＣＴＬに対する非腫瘍細胞の感受性を減じる手段が知られており、本発明の方法ならびに薬剤と共に用いられてよい。制限しない実例としては；パーフォリンを介するＣＴＬの致死は阻害されてよい（４３）；アポトーシスは、たとえばＦＬＩＰの阻害剤（３９）により阻害されてよい；ニューロンにおけるＢａｘ発現の低下（４５）；ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βは、免疫免除された状態を促進するサイトカインが投与されてよい（４６）；またＭＨＣ Ｉ発現は減じられてよい（４１）。
【００７９】
上述のように、細胞性免疫を主体とする抗癌療法を必要としている患者のための最適な治療用プログラムは、抗癌治療の亢進と、治療からの非腫瘍組織ならびに細胞の防護とを共に提供する。したがって、非腫瘍細胞をＣＴＬの攻撃から防護しながら、ＣＴＬ集団を刺激または拡張するための治療が望ましい。ＣＴＬは正常にはＣＳＦ内にはほとんど移行しないため、何ら追加的な治療上の調停は必要とされないであろう；もし付加的な測定が必要であれば、このことは、たとえばＣＴＬの導入に先立ち、上記のような抗サイトカイン薬剤を患者に投与することによるか、または上記のように特異的に不活性化されてよいＣＴＬ集団を提供することにより、ＣＴＬ療法の有効な期間を限定することによって成就されることが可能である。制限しない実例としては、不死化された、免疫免除された抗原に特異的なＣＴＬが、患者と同じＨＬＡ型の不死化された細胞系から調製されることが可能である。当該抗原特異ＣＴＬはインヴィトロにおいて拡張され、さらに患者に導入される。患者の中のこれらの細胞集団を調節し、またこれらの細胞による非腫瘍細胞の強力な攻撃をそむけるためには、当該細胞はガンシクロビル等のある種の薬物に対して感受性となるべく工作されることが可能である（５３）。腫瘍をもち、他の点では神経学的に正常である患者においては、かかる調節は不要であってよい。別法として、現存するＰＮＤをもつ患者のためにかかる細胞を用いる治療の過程の一例においては、患者はまず抗サイトカイン薬剤を用いて、さらに血液脳封鎖薬剤を、非腫瘍細胞上の免除抗原の発現を減じるため、および脳に対するＣＴＬの接近を制限するために各々処置されてよい。脳を保護するための他の手段は、脳におけるＦＡＳリガンドの発現（４０）、ニューロンにおけるＢａｘ発現の低下（４５）、および脳におけるサイトカイン濃度の低下（４６）を含む。ガンシクロビル感受性の（５３）、免疫免除された抗原に特異的な、不死化されたＣＴＬ系が次に導入され、腫瘍の攻撃が可能となる。患者は腫瘍随伴性症候群の出現または再燃について詳細に監視され、もしそれが出現し始めれば、当該治療を部分的または完全に抑制するべく、ガンシクロビルが患者に投与される。予期されるように、ほとんどの免疫免除された腫瘍の患者はＰＮＤをもつことはなく、かかる患者の監視にはこの方法が好ましい。
【００８０】
上記のように、本発明者らは本文において、ｃｄｒ２のフラグメントである、ｃｄｒ２−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびｃｄｒ２−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）等の、天然にプロセスされ、ＣＴＬが標的とするｃｄｒ２ペプチドになると信じられている腫瘍随伴性抗原の、一定のペプチドフラグメントを同定した。現状では、これらのペプチドは、本文に提供された抗原特異Ｔリンパ球用の診断法における効用ならびに、樹状細胞および特異的なペプチドを提示している他のＡＰＣの産生における治療用の効用を有する。
【００８１】
本発明の上記の治療用の効用に基づき、付加的な態様は、本文に述べた一つまたはそれより多い治療様式を実施するためのキットを含む。一つの態様においては、免疫免除された抗原に特異的なＴリンパ球の産生を刺激するためのキットは、免疫免除された抗原ならびに、治療されるべき患者のＭＨＣに一致するＭＨＣ分子を発現する細胞を含む；当該細胞はさらに補助的刺激分子を発現してよい。これらの細胞はショウジョウバエの細胞系等の細胞系から由来してよい。当該細胞は、インヴィヴォまたはエクスヴイヴォにおけるＴリンパ球の刺激に用いられてよい。当該キットはさらに、腫瘍に対する細胞性免疫応答のさらなる刺激に参加するべく、患者と同じＨＬＡハプロタイプをもつドナーからのＴリンパ球を含んでよい。
【００８２】
本発明は、本発明の代表として提供されている以下の制限しない実施例を参照することにより、さらに理解されよう。以下の実施例は、本発明の好ましい態様をさらに充分に説明するために提示されている。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８３】
（全体的な方法）
末梢血は、ＨＬＡ Ａ２．１＋のＰＣＤ患者および正常な供血者から、ヘパリン処理された注射器にて、あるいは白血球搬出法により取得された。ＰＭＢＣはフィコール・ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（ファルマシア・バイオテック）を用いて単離された。Ｔ細胞を豊富にされた（ＥＲ＋）、およびＴ細胞を除去された（ＥＲ−）集団は、ノイラミニダーゼ処理されたヒツジ赤血球細胞を用いたロゼット形成により、先に述べたように（１４）調製された。Ｔ細胞は、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＢ細胞を先に述べたように（１４）除去することにより、ＥＲ＋細胞からさらにＣＴＬ再生検定用に精製された。ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ（イムネックス社（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．））およびＩＬ−４（シェリング・プラウ社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐ．））の存在下にＥＲ−細胞を７日間培養し、次に単球のならし培地（１５）中で４日間培養することにより、末梢血先駆体から発生させた。
【００８４】
活性化されたＣＴＬは、精製の後に、通常のＮａ５１ＣｒＯ４の放出検定において、を用いてＴ細胞をエフェクター細胞として用いて直接検出された。Ｔ２細胞（ＴＡＰ−／−、ＨＬＡ−Ａ２．１＋、クラスＩＩ細胞系）は、１ｍＭの種々のペプチドを用いて１時間にわたってパルスされ、Ｎａ５１ＣｒＯ４が負荷され、標的として用いられた（１４）。別法として、１ｍＭの種々のペプチドを用いて４時間にわたってパルスされたＤＣを用いて、記憶ＣＴＬ反応が刺激された。７日後、反応性のＴ細胞は細胞傷害性活性について検定された。再び、ペプチドを用いてパルスされたＴ２細胞が標的として役立てられた。特異的な溶解は、パルスされていないＴ２細胞のパーセント細胞傷害性（０〜３％）を引き算することにより測定された。ｃｄｒ２−１（ＫＬＶＰＤＳＬＹＶ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびｃｄｒ２−２（ＳＬＬＥＥＭＦＬＴ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と名付けられたＰＣＤペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２．１についてのアンカー残基を基盤として予測され、合成された（バイオシンテシス社（Ｂｉｏｓｙｓｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ））。ｃｄｒ２からの他の６つのペプチドが検査された（データは示さず）。これらの実験の対照は、免疫優性インフルエンザマトリックスペプチド、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の使用を含む。
【００８５】
以下の抗原に対するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）が使用された：ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、αβＴＣＲ、ＣＤ２５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ２、ＩＬ４、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ（ベクトン・ディッキンソン（ＢｅｃｔｐｍＤｉｃｋｉｎｓｏｎ））；ＣＤ８３（コウルター社（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．））。末梢血および脊髄液からの細胞集団は、前文にリストされたＭｏＡｂの顔ぶれを用いた表現型によって分類され、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン）で分析された。さらに、患者から調製されたＤＣは、表現型マーカー（ＣＤ１４−、ＣＤ８３＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋）について検定された。死んだ細胞および混入している赤血球は、前方および側方散乱特性により除外された。細胞内サイトカインのプロフィールは、デユアルレーザーフルオロサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）を用いて査定された。細胞は分泌阻害剤であるＢＦＡによって処理され、次に細胞の固定および透過性化と、蓄積されたサイトカインの細胞質内染色が続けられた（２３）。対照として、ＰＢＭＣがＢＦＡで処理され、サイトカイン産生はホルボール１２−ミリステート１３−アセテート［ＰＭＡ］およびイオノマイシン［Ｉ］（２３）を用いて刺激された。Ｔヘルパー細胞はＣＤ３＋ＣＤ４＋表現型によって詳細に描かれ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ２、およびＩＬ−４のレベルが測定された。
【００８６】
（実施例）
実施例１：  腫瘍随伴性小脳変性をもつ患者におけるｃｄｒ２に特異的な細胞傷害性および記憶Ｔリンパ球の同定
３人のＰＣＤ患者が、血清および脊髄液中の免疫応答の性質を精密に調査するべく研究された。すべての患者はＨＬＡ−Ａ２．１＋の表現形を有していた。一人（患者１）は急性疾患を、または二人（患者２および３）は慢性疾患を有していた（小脳機能不全の発病後１８日、９ヵ月、および６ヵ月の各々に見られた）。ＰＣＤの診断は、各々の患者におけいて、クローン化された融合タンパク質と反応性のある高力価のｃｄｒ２抗体の存在を証明することにより確認され（図１）、細胞性免疫の検定のため、末梢血リンパ球が取得された。ＣＤ８＋ＣＴＬがＰＣＤにおける腫瘍免疫に深くかかわっている可能性は、標準的なクロム放出検定においてｃｄｒ２に由来するペプチドエピトープを用いて調査された。標的細胞はｃｄｒ２ペプチド（測定されたアンカー残基に基づきＨＬＡ−Ａ２．１について予測された）を用いてパルスされたＴ２細胞、ＴＡＰ−／−ＨＬＡ−Ａ２．１＋細胞系であり、Ｎａ５１ＣｒＯ４を負荷された。エフェクターＴ細胞は末梢血から取得され（１４）、直接に標的と、種々のエフェクター：標的比においてインキュベートされた。患者１においては、ｃｄｒ２に特異的なＣＴＬが検出され、ｃｄｒ２−２に、また、より低い程度まででｃｄｒ２−１ペプチドに特異性を示した（図２Ａ）。ＨＬＡ−Ａ２．１＋の正常な対照（図２Ａ）または慢性のＰＣＤをもつ患者には何ら応答が検出されないため（データは示さず）、この応答は急性ＰＣＤについて力価測定可能でありかつ特異的であった。
【００８７】
記憶Ｔ細胞がＰＣＤ患者の末梢血中に存在するかどうかを調べるため、インヴィトロでの再生検定が確立された。患者は白血球搬出され、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の源が提供された。終末まで分化した樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞を除去された単核細胞の分画を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ４）中にて７日間、次いで単球のならし培地（１５）中にて４日間培養することにより調製された。発生したＤＣは典型的な星状の形態を有しており、非接着性であり、特徴的な成熟マーカー（すなわちＣＤ８３）を発現し、刺激者の応答者に対する比が３００：１またはそれより小さい、という割合での混合白血球反応において、強力なＴ細胞刺激能を有していた。
【００８８】
これらの血液由来のＤＣは、８つの異なるｃｄｒ２ペプチドによりパルスされ、精製された同系のＴ細胞（１４）と共に培養された。７日後、反応しているＴ細胞は、ｃｄｒ２エピトープに特異的な細胞傷害活性について、ペプチドパルスされたＴ２細胞を標的として用いて検査された。患者２および３（慢性ＰＣＤをもつ）においては、ｃｄｒ２に特異的なＣＴＬがｃｄｒ２−１およびｃｄｒ２−２ペプチドを用いて検出された（図２Ｂ）。このＣＴＬ活性は、４人の対照個体または患者１（急性ＰＣＤをもつ）においては検出されなかった（図２Ｂおよびデータは示さず）。これらの実験の対照として、インフルエンザマトリックスタンパク質由来の免疫優性ＨＬＡ−Ａ２．１エピトープに特異的なＣＴＬ反応が測定された（データは示さず）。
【００８９】
実施例２  腫瘍随伴性小脳変性をもつ患者の脳脊髄液中の細胞傷害性Ｔリンパ球の検出；タクロリムスを用いた治療
脳脊髄液（ＣＳＦ）分析は、初見時に患者１がＣＳＦ細胞増加症をもっていたことを明らかにした（９９ＷＢＣ／ｍｍ３）。このことは、細胞間接撮影法と表現型細胞マーカーに特異的なモノクローナル抗体とを用いてＣＳＦ細胞を直接分析することにより、患者の疾患の自己免疫の神経性成分の評価を可能にした。存在した細胞の７５％より多くがＣＤ３＋αβＴ細胞であった（図３Ａ）；これらのおよそ４０％が活性化されたＴ芽細胞（ＣＤ２５＋ＣＤ３＋）であった。５％より少ない細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり（ＣＤ５６＋）、１０％はＢ細胞であり（ＣＤ１９＋）、これらの２％より少ない細胞はＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞であった（図３Ａ）。この患者の疾患の急性の性質の結果と、いくつかの臨床上顕性の残存性の小脳機能、および彼女のＣＳＦ（ＣＤ２５＋ＣＤ３＋表現型によって特徴づけられる）における活性化されたＴ細胞の存在のため、患者１はＴ細胞の活性化とＣＳＦへの嗜好的分配とを阻害する薬剤である、タクロリムス（ＦＫ５０６）で処置された（１６）。当該患者は副作用なしに１０日間の治療に耐えた；しかしながら、小脳機能の回復の証拠は観察されなかった。１１日目に治療は中断され、分析のためＣＳＦが取得されたが、それはＣＤ２５＋Ｔ細胞が根絶されていたことを示した（図３Ａ）。これらの結果はタクロリムスが、ＰＣＤ患者のＣＳＦにおいて、活性化されたＴ細胞を効果的に抑制することができることを示しており、Ｂ細胞の抑制または抗体の除去を目的とする治療に対する有効な別法となるかもしれない。過剰のプルキンエ細胞の死の前に臨床的疾患を制止するため、初期の関与が必要であろう。
【００９０】
実施例３  患者１のＣＳＦ細胞の細胞内サイトカイン染色
患者１のＣＳＦに存在する活性化された細胞集団をさらに明らかにするため、細胞内サイトカイン染色が行なわれ、細胞は４色性サイトフルオログラフィーによる分析によって検定された。このことは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生したがＩＬ−４は産生しなかったものが（− − Ｔｈ１細胞の特徴的なサイトカインプロフィール）、ＣＳＦ内に存在するヘルパーＴ細胞であることを示している（図３Ｂ）。さらに、これらのサイトカインの産生の原因となる細胞が、活性化されたＴ芽細胞（亢進された前方散乱に基づき選択された）であることを証明することが可能であった。対照的に、同じ患者の末梢血から単離されたＣＤ３＋ ＣＤ４＋細胞は、分析に先立ちホルボール１２−ミリステート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（Ｉ）を用いて刺激しない限りサイトカインを産生しなかった（図３Ｂ）。
【００９１】
実施例４  婦人科腫瘍上のｃｄｒ２抗原の証明
腫瘍随伴性神経疾患の珍しさにもかかわらず、かかる疾患の人における標的ＰＣＤ抗原（Ｈｕ抗原）は、それに関連した腫瘍型（小細胞肺癌）に遍在的に発現されることがわかっている。ｃｄｒ２抗原が、ＰＣＤの珍しさから示唆されるよりもさらに広い一連の婦人科腫瘍に存在するかどうかを査定するため、神経学的には正常な個体から取得された卵巣および乳房の腫瘍を、ｃｄｒ２の発現に関してウェスタンブロット分析法により調べられた。卵巣上皮細胞起源の１９の腫瘍のうち１２がＰＣＤ抗血清と免疫反応性のある健全な量のタンパク質を発現した（図４Ａ、およびデータは示さず）。この抗原がｃｄｒ２抗原と一致することを確認するべく、小脳からの免疫反応性抗原の移動度が、腫瘍検体からのそれと、２ＤＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較された（図４Ｂ）。これらの実験は、免疫反応性のｃｄｒ２のバンドが脳および腫瘍組織において共に移動することを確証し、非ＰＣＤ卵巣腫瘍のうちの高いパーセントがｃｄｒ２腫瘍抗原を発現することを証明している。同様の結果が、非ＰＣＤと関連した乳房の腫瘍検体に見られており、腫瘍の少なくとも２５パーセントがｃｄｒ２抗原を発現する。
【００９２】
実施例５  免疫免除された抗原を抗原提示細胞へ送達するためのアポトーシス性細胞の使用
ＭＣ（９７−０９）ＤＣは、アポトーシス性未感染ＨｅＬａ細胞および同系のＴ細胞と共に培養された。７日後、反応性のＴ細胞が、種々のＹｏペプチド、Ｙｏ１からＹｏ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対応し、まらｃｄｒ２−１からｃｄｒ２−８と呼ばれる）を用いてパルスされたＴ２細胞を用いて検査された。ネガティブな対照は、マトリックスペプチド（Ｍ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）でパルスされたＴ２細胞（ＨｅＬａ細胞は未感染）の検査を含んでいた。これらの結果は、あるｃｄｒ２ペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球の応答の好結果の誘導が、標的抗原を送達しているアポトーシス性細胞の使用によって成遂げられてよいことを示している。
【００９３】
実施例６  当該疾患において自己免疫神経疾患がない場合に腫瘍免疫の様相を繰返すマウスモデルの生成
ＰＣＤのマウスモデルであって、自己免疫神経疾患がない場合に、当該疾患において腫瘍免疫の様相を繰返すモデルが生成された。マウスはアポトーシス性腫瘍細胞であるＰＣ７を用いて免疫化され、その結果、強力なｃｄｒ２特異キラーＴ細胞が生成される。以下の細胞系が、このモデルの査定のために用いられた。たとえば、ＥＣ２細胞はｐｃＤＮＡ−ｃｄｒ２を用いてＥＬ４細胞を安定にトランスフェクトすることにより生成され、タンパク質発現の測定はウェスタンブロット分析法により行なわれた。
【００９４】
【表１】
2004510950.tif 000001
【００９５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは１０７個の放射線照射されたＰＣ７細胞を用いて皮下に免疫化され、次に１週間の間隔をおいて合計２回の注射により免疫化された。２回目の注射の１〜３週間後、初回免疫された未使用のひと腹の子の脾臓が採取された。混合リンパ球／腫瘍細胞の培養は、初回免疫されたＴ細胞を再刺激する目的のために、ＥＣ２またはＴＩＢ８４細胞を用いて確立された。５日後、反応しているＴ細胞が集められ、標準的なクロム放出検定法において種々の比率にて検査された。標的細胞は、ｃｄｒ２キラーＴ細胞の発生を証明するＥＣ２およびＥＬ４（Ａ）と、自己ＭＨＣ−Ｉという状況にある副組織適合性抗原を認識することが可能なアロ反応性Ｔ細胞の発生を証明するＴＩＢ８４およびＥＬ４（Ｂ）とを含んでいた。３重の実験用ウェルからの平均値（Ｅ）は、自発性（Ｓ）および全体（Ｔ）の放出に対し、次のように比較された；％細胞傷害性＝（（Ｅ−Ｓ）／（Ｔ−Ｓ））ｘ１００。ネガティブな対照として未使用のひと腹の子が使用された。別法として、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、初回免疫された未使用のマウスの脾臓から、ＭＡＣＳ細胞分離システムを用いて精製された。簡単に言えば、鉄を結合されたマイクロビーズに結合された抗ＣＤ８抗体は、脾臓細胞と共にインキュベートされ、細胞を磁気カラムに通すことにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞がポジティブに選別される。ポジティブに選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞は直接にＥＬＩＳＰＯＴ検定に用いられた。１０５個のＴ細胞が、ＩＦＮ−に特異的なモノクローナル抗体によりあらかじめコートされた９６ウェルプレートに置かれ、さらに１０４個の放射線照射された刺激細胞（ＥＣ２またはＥＬ４）と共にインキュベートされた。２０時間後、細胞は洗浄され、ビオチニル化された抗ＩＦＮ抗体と、ＨＲＰ−ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチル−カルバゾール）染色法とを用いて、ＩＦＮ−スポット形成細胞（ＳＦＣ）が検出された。ＳＦＣは百万細胞当りで示されている。（Ｃ）
この実験の結果は図６に示されている。特異性は、ｃｄｒ２を発現しているＭＨＣ適合性の標識細胞、ＥＣ２細胞を溶解するが、ｃｄｒ２発現を欠くＭＨＣ適合性細胞、ＥＬ４は溶解しない能力によって測定されるものとして説明された（図６Ａ）。ＰＣ７細胞は、それが免疫されたＣ５７／Ｂ６マウスに関してはＭＨＣ不適合であるため、このモデルシステムはＰＣＤにおいて明らかな腫瘍細胞の交差初回免疫に類似していると信じられている。この実験の対照は、ＣＴＬ検定における標的としてＴＩＢ８４の使用を含んでおり（図６Ｂ）、自己ＭＨＣ Ｉという状況にある副組織適合性抗原を認識することができるアロ反応性Ｔ細胞の発生を証明している。ＰＣ７細胞はまたＣ５７／Ｂ６マウスに関してアロ抗原を隠しているため、類似遺伝子系統である、ＴＩＢ８４を標的とするアロ特異Ｔ細胞を刺激することが可能であった。類似遺伝子系統は、それらが自己ＭＨＣ分子という状況において提示されるアロ抗原を含むため、有用である。上記の表１はＭＨＣハプロタイプおよびｃｄｒ２発現を提供する。
【００９６】
致死検定に加えて、ＩＦＮ−γ放出もまたＰＣ７で免疫化されたマウスから精製されたＴ細胞から証明された（図１Ｃ）。この短時間の検定は、高レベルのＣＴＬ前駆体が免疫化されたマウスに存在することを確証した。神経機能不全の徴候を示すマウスはいなかった。これらのデータは、腫瘍免疫を自己免疫神経変性から分離することができることを示している。上記のように、ｃｄｒ２特異キラーＴ細胞は有効な腫瘍抑制およびＰＣＤのある患者において同定されている。さらに、神経学的には正常な患者の、有意な数の乳房および卵巣腫瘍がｃｄｒ２標的抗原を発現する。したがって本発明は、ｃｄｒ２を発現している腫瘍細胞を殺すことができるＴ細胞の刺激が、自己免疫疾患を誘導することなく可能であることを証明する。
【００９７】
実施例７  ｃｄｒ２特異Ｔ細胞の検出のためのＥＬＩＳＰＯＴ検定法
ｃｄｒ２特異Ｔ細胞の検出のための新規な検定法が開発された。この検定法は迅速であり、多数の患者の検体をｃｄｒ２特異Ｔ細胞の存在についてスクリーニングする能力を、キットの形状にて提供する。患者から末梢血が取得され、上記のように樹状細胞が成熟された。次いでこれらの細胞は、ｃｄｒ２タンパク質を発現しなかった（ＥＬ４）か、または発現した（ＥＣ２）無関係の（マウス）細胞からのアポトーシス性破片が給餌された。ＥＣ２細胞はｐｃＤＮＡ−ｃｄｒ２を用いて安定にトランスフェクトすることにより発生され、タンパク質発現の測定はウェスタンブロット分析法によりおこなわれた；これらの細胞については実施例６の表１を参照されたい。これら給餌されたＤＣは患者の末梢血とともにインキュベートされ、さらに、刺激の指標としてインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の放出が測定された。ＩＦＮ−γの検定法は標準的なＥＬＩＳＰＯＴ検定法である。この例では検定は、ニトロセルロース底のウェルにＩＦＮγに対する抗体を置くこと、２０時間にわたって放出を行なわせること、プレートを洗浄すること、さらに比色法による検出を可能にするべくビオチンに結合された抗ＩＦＮ−γ抗体が添加すること、により手動により行なわれた。ＩＦＮ−γを分泌しているスポットの数は、当該検定における、ＤＣにより刺激された検定Ｔ細胞の数に直接に対応する。ＥＬ−４を給餌されたＤＣ（ネガティブな対照）により刺激されたＴ細胞の数を、ＥＣ２を給餌されたＤＣにより刺激された数と比較と比較することにより、患者の末梢血中のｃｄｒ２に特異的なＴ細胞の数が測定される。
【００９８】
上記の実施例においてＤＣは、ＰＣＤをもち、寛解した卵巣癌のあるＨＬＡ Ａ２．１＋患者から成長した。これらの細胞はパルスされないか、ポジティブな対照としてＨＬＡ Ａ２．１免疫優性マトリックスペプチド（ＭＰ）か、またはアポトーシス性（放射線照射された）ＥＬ４またはＥＣ２細胞手動によりパルスされた。これらのＤＣ細胞は次に、表示されたような種々のＴ細胞：アポトーシス性細胞比にてＴ細胞と共に培養された。Ｔ細胞の活性化は、記述されたように、ＩＦＮ−γの放出に対応するスポットを数えることにより測定された。この検定の結果は図７に示されている。この患者は、ＥＣ２刺激によって見られた多数のスポットと、ＥＬ４対ＥＣ２で給餌された細胞を用いて見られたスポット数の差異とによって明らかな、有意な数のｃｄｒ２＋Ｔ細胞を有していた。ネガティブな対照は、ＤＣの不在下にアポトーシス性の破片と共にインキュベートされたＴ細胞と、ＤＣともアポトーシス性破片ともインキュベートされないＴ細胞とを含む；いずれの対照もＴ細胞の刺激に至らなかった。
【００９９】
本発明は、その精神または基本的な性質から離れることなく、他の形状において具現化されてよく、あるいは他の方法で行なわれてもよい。したがってこの開示はすべての点において説明のためのものとみなされ、添付の請求項によって示される本発明の範囲を制限するものではなく、また同等の意味および範囲に入るすべての変更はそれに包含されることが意図される。
本文には種々の出版物が引用されているが、それらの開示はことごとく参考文献に取入れられている。
【０１００】
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５４．  Ｓａｋａｉ， Ｋ．， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｄ．， Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ， Ｔ．， ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ Ｌ．（１９９０）． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ２８ ： ６９２−６９８．
【図面の簡単な説明】
【図１】
クローン化されたｃｄｒ２融合タンパク質（９）に対しての、患者の血清およびＣＳＦのウェスタンブロット分析を描く説明図である。患者１（レーン１，４）、または患者２（レーン２，５）からの血清（１：１０，０００希釈）およびＣＳＦ（１：５００希釈）、または無関係なＰＮＤ（Ｈｕ症候群；１：５００希釈；レーン３）をもつ患者からの血清がブロットされた。患者３からの血清およびＣＳＦは同様の結果を示した。
【図２Ａ】
ｃｄｒ２に特異的なキラー細胞がＰＣＤ患者の末梢血中に存在することを示すグラフである。Ｔリンパ球は急性（Ａ）のＨＬＡ−Ａ２．１＋ＰＣＤ患者の末梢血から単離された。（Ａ）単離されたＴリンパ球は、ペプチドパルスされたＴ２細胞（ＴＡＰ−／−ＨＬＡ−Ａ２．１＋細胞系）を標的として用いたクロム放出分析に直接用いられた。ペプチドはＨＬＡ−Ａ２．１の結合溝についての既知のアンカー残基に基づいて予測され、ｃｄｒ２−１およびｃｄｒ２−２と名付けられた。インフルエンザマトリックスタンパク質由来のＨＬＡ−Ａ２．１免疫優性エピトープは、ＣＴＬ再生応答の発生のポジティブな対照として役立てられた（データは示さず）。エフェクター：標的比＝２０：１。パーセント細胞毒性は自発性および全放出の関数として測定される。標的細胞の致死のバックグラウンドは０〜３％であった。結果は６つの実験を代表しており、示された値は３重のウェルからの平均値を表わす。
【図２Ｂ】
ｃｄｒ２に特異的なキラー細胞がＰＣＤ患者の末梢血中に存在することを示すグラフである。Ｔリンパ球は慢性（Ｂ）のＨＬＡ−Ａ２．１＋ＰＣＤ患者の末梢血から単離された。（Ｂ）血液由来のＤＣは、ＰＣＤおよびＨＬＡ−Ａ２．１＋の適合する対照の個体から発生され、ペプチドでパルスされ、さらにＴ細胞と共に培養された。７日後、反応しているＴ細胞は、５１Ｃｒ放出分析により測定されるような、ｃｄｒ２に特異的な細胞溶解活性について検査された。インフルエンザマトリックスタンパク質由来のＨＬＡ−Ａ２．１免疫優性エピトープは、ＣＴＬ再生応答の発生のポジティブな対照として役立てられた（データは示さず）。エフェクター：標的比＝２０：１。パーセント細胞毒性は自発性および全放出の関数として測定される。標的細胞の致死のバックグラウンドは０〜３％であった。結果は６つの実験を代表しており、示された値は３重のウェルからの平均値を表わす。
【図３Ａ】
急性ＰＣＤをもつ患者のＣＳＦから単離された細胞のサイトフルオログラフィーがＴｈ１型の細胞性免疫応答を示すグラフである。（Ａ）ＣＳＦ中に存在する細胞は、表示されたモノクローナル抗体を用い、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））により種々の表現型マーカーについて分析された；ＣＤ５６はナチュラルキラー細胞のマーカーである；ＣＤ１９はＢ細胞に特異的である；ＣＤ３はすべてのＴ細胞に存在する；ＣＤ４およびＣＤ８は各々ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞のサブセットである；ＣＤ２５はＩＬ２受容体であり、活性化されたＴ細胞のマーカーである。第二の分析は患者がタクロリムスを受けた後に行なわれた。＊ｐ＜０．００５。
【図３Ｂ】
急性ＰＣＤをもつ患者のＣＳＦから単離された細胞のサイトフルオログラフィーがＴｈ１型の細胞性免疫応答を示すグラフである。（Ｂ）ＣＳＦからの細胞は、デュアルレーザーフルオロサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）を用い、それらの細胞内サイトカインのプロフィールについて分析された。細胞はブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）で処理され、表示されたモノクローナル抗体を用いて蓄積されたサイトカインの存在について染色された。Ｔ芽細胞は前方散乱に基づいて選別されたが、これらの細胞はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の約１０％を構成する。
【図３Ｃ】
急性ＰＣＤをもつ患者のＣＳＦから単離された細胞のサイトフルオログラフィーがＴｈ１型の細胞性免疫応答を示すグラフである。（Ｃ）対照として、ＰＢＭＣが同時に単離され、上記図３Ｂの（Ｂ）に述べたように分析された。さらに、ＰＢＭＣはホルボール１２−ミリステート１３−アセテートおよびイオノマイシンを用いて刺激され、サイトカイン産生がポジティブな対照として検出されるようにした。
【図４Ａ】
ヒトの卵巣腫瘍におけるｃｄｒ２発現のウェスタンブロット分析を示す説明図である。（Ａ）９つのヒト卵巣腫瘍から抽出されたタンパク質はウェスタンブロットに流され、ビオチニル化された親和性により精製されたＰＣＤ抗体でプローブされた。強いｃｄｒ２反応性が腫瘍１，２，６，７，および９、ならびにヒトのプルキンエニューロン抽出物において明らかであった；正常なヒト卵巣のタンパク質抽出物には何ら反応性がなかった。抗チューブリン抗体を用いて二重のブロットをプローブすると、免疫反応性のタンパク質が各レーンに示された。プルキンエ抽出物および卵巣腫瘍には、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と二次的にのみ反応する非特異的な（ＮＳ）バンドが存在していた（データは示さず）。
【図４Ｂ】
ヒトの卵巣腫瘍におけるｃｄｒ２発現のウェスタンブロット分析を示す説明図である。（Ｂ）ｃｄｒ２発現のＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＰＣＤ抗血清およびＨＲＰを結合された二次抗体を用いてプローブすると、マウス脳またはヒト卵巣腫瘍の抽出物中に、全く同じＭｒおよびｐＩの免疫反応性のバンドが存在する。マウスｃｄｒ２のｃＤＮＡは、ヒトのｃｄｒ２と８７％が全く等しいタンパク質をコード化しており（１０）、さらにこのタンパク質はヒトのプルキンエ抽出物中に検出されたｃｄｒ２と同様に移動する（データは示さず）。標準である１−Ｄ ＳＤＳゲル（Ａ）に見られる無関係な交差反応性のバンドは、ＩＥＦでは分解しない。
【図５】
ｃｄｒ２を発現しているアポトーシス細胞が、Ｔリンパ球に抗原を提示するべく用いられてよいことを示すグラフである。ＭＣ（９７−０９）ＤＣは、未感染のアポトーシスＨｅＬａ細胞および同系のＴ細胞と共に培養された。７日後、反応しているＴ細胞は、種々のＹｏペプチド、Ｙｏ１からＹｏ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に相当し、またｃｄｒ２−１からｃｄｒ２−８と呼ばれる）でパルスされたＴ２細胞を用いて検査された。ネガティブな対照は、マトリックスペプチド（Ｍ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）でパルスされたＴ２細胞の検査を含む（ＨｅＬａ細胞は未感染）。
【図６Ａ】
アポトーシス性ＰＣ７細胞が、ｃｄｒ２に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞をインヴィヴォにおいて交差初回免疫することが可能であることを示すグラフである。マウスはｃｄｒ２を発現するアポトーシス腫瘍細胞を用いて免疫化され、何らの神経機能不全もなく、ｃｄｒ２に特異的な強力なキラーＴ細胞が証明された。
【図６Ｂ】
アポトーシス性ＰＣ７細胞が、ｃｄｒ２に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞をインヴィヴォにおいて交差初回免疫することが可能であることを示すグラフである。マウスはｃｄｒ２を発現するアポトーシス腫瘍細胞を用いて免疫化され、何らの神経機能不全もなく、ｃｄｒ２に特異的な強力なキラーＴ細胞が証明された。
【図６Ｃ】
アポトーシス性ＰＣ７細胞が、ｃｄｒ２に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞をインヴィヴォにおいて交差初回免疫することが可能であることを示すグラフである。マウスはｃｄｒ２を発現するアポトーシス腫瘍細胞を用いて免疫化され、何らの神経機能不全もなく、ｃｄｒ２に特異的な強力なキラーＴ細胞が証明された。
【図７】
ＰＣＤ患者の血中に存在するｃｄｒ２に特異的なＴ細胞の簡便な分析の結果を示すグラフである。血液検体からの樹状細胞は成熟され、次いでｃｄｒ２を発現しているアポトーシス性細胞に露出される。続いて、当該細胞の末梢血リンパ球への露出の結果、当該個体におけるｃｄｒ２に特異的なＴ細胞の数の指標としての、Ｔリンパ球によるガンマインターフェロン産生を生じる。