(57)【要約】本発明により、アスペルギルス・オリゼに由来する新規なピログルタミルペプチダーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いて製造されるピログルタミルペプチダーゼ、該ピログルタミルペプチダーゼを利用した、加水分解率の高い風味のすぐれたタンパク質分解物の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのポリペプチド。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなり、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号５で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号１または５で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ
【請求項４】
以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのＤＮＡ。
（ａ）配列番号３で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で示される塩基配列の１００塩基以上の長さの部分配列を含み、プロモーターとして機能するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロモーターとして機能するＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのＤＮＡ。
（ａ）配列番号４で示される塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号４で示される塩基配列と相補的な塩基配列の１５塩基以上の長さの部分配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項６】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列または該塩基配列と相補的な塩基配列の、連続する１５塩基以上の塩基配列を含むオリゴＤＮＡ。
【請求項８】
請求項２または３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
微生物が、請求項９に記載の形質転換体である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
微生物が、糸状菌である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
糸状菌が、アスペルギウス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属およびフザリウム属からなる群から選択される１つの属に属する糸状菌である請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
アスペルギルス属に属する糸状菌が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタスおよびアスペルギルス・ニジュランスからなる群から選択される１つの種に属する糸状菌である請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
タンパク質を含む原料に、請求項１に記載のポリペプチドおよびタンパク質加水分解酵素を添加して、タンパク質を分解することを特徴とするタンパク質加水分解物の製造方法。
【請求項１６】
タンパク質を含む原料に、請求項１に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる、請求項１に記載のポリペプチドを含む培養物または該培養物の処理物、およびタンパク質加水分解酵素を添加して、タンパク質を分解することを特徴とするタンパク質加水分解物の製造方法。
【請求項１７】
微生物が、請求項９に記載の形質転換体である請求項１６に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
【請求項１８】
微生物が、糸状菌である請求項１６に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
【請求項１９】
糸状菌が、アスペルギウス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属およびフザリウム属からなる群から選択される１つの属に属する糸状菌である請求項１８に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
【請求項２０】
アスペルギルス属に属する糸状菌が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタスおよびアスペルギルス・ニジュランスからなる群から選択される１つの種に属する糸状菌である請求項１９に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
【請求項２１】
請求項１５から〜２０のいずれか１項に記載の方法により製造されるタンパク質加水分解物。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の抗体を用いて請求項１に記載のポリペプチドを検出または定量する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はタンパク質加水分解物の製造に用いられるピログルタミルペプチダーゼおよび該ピログルタミルペプチダーゼをコードするＤＮＡに関する。
背景技術
糸状菌の中でも、特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、黄麹菌）等を含む麹菌は、清酒、みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国における醸造産業において古くから利用され、直接に食されてきた菌類であり、米国のＦＤＡ（食品医薬局）によりＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ）にリストアップされている安全な遺伝子源である。このように、糸状菌、特に麹菌は、安全性の点から極めて利用価値の高い遺伝子の宝庫と言える。
タンパク質加水分解物は、タンパク質を含む原料を酸で加水分解することにより製造できるが、タンパク質加水分解物を天然調味料として使用する観点から、酸分解型に加えて酵素分解型のタンパク質加水分解物の製造法が検討されている。酵素分解により製造されるタンパク質加水分解物としては、卵白を酵素分解したもの（特開昭４８−６８７７３）、脱脂大豆を酵素分解したもの（特開昭５１−７０８５２）、チーズホエーを原料として酵素分解したもの（特開昭６２−１５１１５５）、コーングルテンミールを酵素分解したもの（特公平２−２９５４３７）などが報告されている。
しかし、タンパク質の性質とタンパク質分解に用いられる酵素によっては生成ペプチドに苦みがあり、官能的に好ましくない場合がある。そこで、加水分解の分解率が高く優れた官能特性を持つ加水分解物が求められている。分解率を向上する技術として、麹菌由来のグルタミナーゼなど各種酵素に関する技術（ＷＯ９９／６０１０４、特開２０００−１６６５４７、特表２００２−５１１７４６）が検討されている。醤油および味噌の醸造に見られるように、従来の麹菌培養物を用いた場合、タンパク質の加水分解は多大の労力と時間を要するにも拘わらず、アミノ酸遊離率も低く、特に大豆蛋白中に最も多量に含有され、かつ呈味性に重要なグルタミン酸の遊離率が低い。
ところで、タンパク質やペプチドにはＮ末端がＬ−ピログルタミン酸残基で保護されているものが多数存在している。また、タンパク質やペプチドが加水分解された際に、新しく生じたアミノ末端のグルタミンまたはグルタミン酸が非酵素的に閉環してピログルタミン酸残基が形成されることが多く、食品からも検出されている。これらの、Ｎ末端がＬ−ピログルタミン酸残基で保護されているタンパク質やペプチドはそのままではアミノペプチダーゼによる加水分解が進行しないため、該Ｌ−ピログルタミン酸残基を除去する操作が必要である。ピログルタミルペプチダーゼは、これらのタンパク質やペプチドのアミノ末端のＬ−ピログルタミン酸残基を特異的に遊離する酵素であり、種々の動物の脳、肺、血清や脳下垂体及び植物、微生物にも広く存在していることが知られている。タンパク質加水分解酵素を作用させて得たタンパク質加水分解物に、さらにピログルタミルペプチダーゼを作用させて、呈味性のすぐれたタンパク質加水分解物が製造されることが報告されている（特開平８−２５２０７５）。
微生物に由来するピログルタミルペプチダーゼとしては、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の酵素〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８４，４６７（１９７８）〕が知られており、この酵素については遺伝子が単離されて製造方法が報告されている（特開平５−１３７５７２）。また、耐熱性の高いピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の酵素についても遺伝子が単離されている（特開平７−２９８８８１）。また納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の酵素が知られている（特開平８−２５２０７５）。しかしながら、糸状菌由来のピログルタミルペプチダーゼおよびその遺伝子については未だ単離されていない。また、タンパク質加水分解物の製造にタンパク質加水分解酵素源としての麹菌の培養物とともにピログルタミルペプチダーゼを使用する場合は、納豆菌等の麹菌以外の異種生物由来のピログルタミルペプチダーゼを使用することになるため、高価となり風味も劣ると考えられる。
発明の開示
従来の酵素分解型のタンパク質加水分解物と比較して、アミノ酸遊離率、とりわけグルタミン酸の遊離率が高いタンパク質加水分解物の製造に用いることのできる、糸状菌に由来する新規なピログルタミルペプチダーゼ、該ピログルタミルペプチダーゼの製造に利用できるピログルタミルペプチダーゼ遺伝子を提供する。
即ち、本発明は以下の各態様に示すポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに係るものである。本発明のポリペプチドおよびＤＮＡのうち、米国のＦＤＡによりＧＲＡＳにリストアップされている微生物であるアスペルギルス・オリゼに由来するものは、安全性及び経済性の点から極めて利用価値の高いものである。
本発明は、以下の（１）〜（２３）を提供する。
（１）以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのポリペプチド。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなり、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼのピログルタミルペプチダーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と全アミノ酸配列にわたってアラインメントして比較した場合に、全体の平均で約３０％以上、好ましくは約５０％以上、更に好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上のアミノ酸が同一であるようなアミノ酸配列を意味する。
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列とは、好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列からなるものを意味する。
ポリペプチドのピログルタミルペプチダーゼ活性は、以下のようにして測定できる。５ｍｍｏｌ／ｌのピログルタミン酸−パラニトロアニリドを含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を基質溶液として調製する。ポリペプチドを含むサンプル溶液を調製し、基質溶液１００μｌに対し２０μｌのサンプル溶液を加えて、３７℃で１０分間反応させた後、分光光度計により４０５ｎｍの吸光度を測定する。パラニトロアニリンのモル吸光係数（１０５００）より、反応時間１分あたりのパラニトロアニリンの遊離量を計算し、３７℃で１分間に１μモルのパラニトロアニリンを遊離する活性を１単位とする。
上記の配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、およびＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
なお、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。また、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドの例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末に４１アミノ酸が付加したアミノ酸配列である配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげることができる。
（２）（１）に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
（３）以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号５で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号１または５で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ
（２）および（３）のＤＮＡはピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする領域としての機能を有するものである。これらのＤＮＡがコードするアミノ酸配列の一例は、配列番号２で示される。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ  ４０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２７３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９３５に移管））のゲノム塩基配列に基づき、遺伝子領域（遺伝子の場所）を特定する為の様々な情報（ＯＲＦ、エキソン／イントロン領域、及び、発現配列タグ（ＥＳＴ）等）に基づき決定されたものである。配列番号１で示される塩基配列は、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ  ４０株のピログルタミルペプチダーゼ遺伝子、そのプロモーター領域を含むゲノムＤＮＡの塩基配列である。配列番号５で示される塩基配列は、配列番号１の塩基配列から、５’および３’の非翻訳領域およびイントロンを除いた塩基配列であり、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ  ４０株のピログルタミルペプチダーゼｃＤＮＡのピログルタミルペプチダーゼをコードする領域の塩基配列と一致する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍｎｏｌ／ｌ、好ましくは６００〜９００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ６〜８であるような条件をあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。配列番号１または５で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡには、例えば、アスペルギルス・オリゼ以外の糸状菌に由来するピログルタミルペプチダーゼをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が含まれる。
（４）以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのＤＮＡ。
（ａ）配列番号３で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で示される塩基配列の１００塩基以上の長さの部分配列を含み、プロモーターとして機能するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロモーターとして機能するＤＮＡ
これらのＤＮＡの配列は、糸状菌のゲノムＤＮＡにおいて、本発明のポリペプチドをコードする領域、たとえば配列番号１で示される塩基配列１００１〜１１１１番目の塩基配列の５’上流に位置するものである。
これらの中には、その３’下流領域にあるコード領域においてＥＳＴが現実に確認されている（発現条件：２％グルコースを含む完全液体培地による培養、２％マルトースを含む完全液体培地による培養、炭素源を含まない合成液体培地による培養、２％グルコースを含む完全液体培地を用いた高温（３７℃、他は特に指示のない限り３０℃）での培養、固体培養（小麦ふすま）での培養、２％グルコースを含むアルカリ性（ｐＨ１０）合成培地での培養、ポテトデキストロース寒天培地上で２８℃で胞子を８日間培養した発芽直後の培養、あるいは、大豆・小麦混合培地で３４時間培養後２５℃で３時間の固体培養のいずれか）ことから明らかなように、プロモーター領域（コアプロモーター又は基本プロモーター、及び上流プロモーター要素等の、各種ポリメラーゼ、基本転写因子又は転写因子と相互作用する配列）を含むものがある。
従って、このようなプロモーター領域を含み得る部分配列としては、例えば、上記各配列の３’側から、好ましくは２００塩基対以上、より好ましくは５００塩基対以上、更に好ましくは８００塩基対以上、特に好ましくは９００塩基対以上のものが適当である。あるいは、上記各配列中の適当な中間部分において上記の長さの塩基対を有する部分配列をあげることができる。
ＤＮＡがプロモーターとして機能するかどうかは、例えば以下のような方法で確認できる。レポーターとなるポリペプチドをコードするＤＮＡの上流に、試験するＤＮＡをつなげたＤＮＡを調製して、アスペルギルス・オリゼのアセトアミダーゼ遺伝子または硝酸還元酵素遺伝子等の形質転換マーカー遺伝子を有する適当なベクター〔Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７４，３８９（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９）〕に挿入し、組換えベクターを作製する。得られた組換えベクターを用いて、文献〔Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７４，３８９（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９）〕に記載の方法でアスペルギルス・オリゼを形質転換し、形質転換体において、レポーターとなるポリペプチドを測定する。該ポリペプチドが検出された場合は、レポーターとなるポリペプチドをコードするＤＮＡの上流につなげたＤＮＡがプロモーターとして機能することが確認される。レポーターとなるポリペプチドとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのβ−グルクロニダーゼ、グリーン蛍光蛋白質、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ等をあげることができる。形質転換体またはその培養上清におけるβ−グルクロニダーゼ、グリーン蛍光蛋白質、β−ガラクトシダーゼは文献〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，２４８２（１９９５）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６，２５２（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，２１１（１９９３）〕に記載の方法で検出することができる。
（４）のＤＮＡは、さらに、例えば、外来遺伝子等を挿入して発現させるための領域としての有用性を有する。
（５）以下の（ａ）から（ｃ）のうちのいずれか１つのＤＮＡ。
（ａ）配列番号４で示される塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号４で示される塩基配列と相補的な塩基配列の１０塩基以上の長さの部分配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
このＤＮＡは、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ  ４０株のゲノムＤＮＡにおいては配列番号１で示される塩基配列の１９０２〜２２０１番目の塩基配列を有する３’非翻訳領域のＤＮＡであり、特に配列番号１で示される塩基配列を有するピログルタミルペプチダーゼ遺伝子から転写されるｍＲＮＡとハイブリッドさせてそれらを検出する際のプローブとして使用することができる。該ｍＲＮＡの、配列番号５で示される塩基配列に相当する、ピログルタミルペプチダーゼをコードする領域は、コードするポリペプチドの機能と関連して往々にして他のｍＲＮＡと相同性の高い配列を含むのに対して、この部分の塩基配列は、配列番号５と何ら関りのない任意性の高い配列からなる。したがって、（５）のＤＮＡをプローブとして使用することによって、細胞から抽出したＲＮＡの集団の中から、ピログルタミルペプチダーゼのｍＲＮＡを極めて高い特性を持って分別検出および定量することが可能である。また、この領域内の配列を有するＰＣＲのプライマーを作製することにより、ＰＣＲによっても分別検出および定量することが可能である。
そのようなプローブとして使用する本発明のＤＮＡ又はその部分配列の領域としては、上記配列の５’側から、好ましくは３００塩基の範囲、より好ましくは２００塩基対の範囲、特に好ましくは約１００塩基対の範囲が適当である。又、部分配列の長さは、使用目的等に応じて、当業者が適宜選択することができるが、検出及び定量感度の点からは、上記各範囲において、一般的に長い程良い。
（６）ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、（２）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
（７）（２）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列または該塩基配列と相補的な塩基配列の、連続する１５塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
（８）（２）または（３）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（９）（８）に記載の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体。
（１０）（１）に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
（１１）微生物が、（９）に記載の形質転換体である（１０）に記載の製造方法。
（１２）微生物が、糸状菌である（１０）に記載の製造方法。
（１３）糸状菌が、アスペルギウス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属およびフザリウム属からなる群から選択される１つの属に属する糸状菌である（１２）に記載の製造方法。
（１４）アスペルギルス属に属する糸状菌が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタスおよびアスペルギルス・ニジュランスからなる群から選択される１つの種に属する糸状菌である（１３）に記載の製造方法。
（１５）タンパク質を含む原料に、（１）に記載のポリペプチドおよびタンパク質加水分解酵素を添加して、タンパク質を分解することを特徴とするタンパク質加水分解物の製造方法。
（１６）タンパク質を含む原料に、（１）に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる、（１）に記載のポリペプチドを含む培養物または該培養物の処理物、およびタンパク質加水分解酵素を添加して、タンパク質を分解することを特徴とするタンパク質加水分解物の製造方法。
（１７）微生物が、（９）に記載の形質転換体である（１６）に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
（１８）微生物が、糸状菌である（１６）に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
（１９）糸状菌が、アスペルギウス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属およびフザリウム属からなる群から選択される１つの属に属する糸状菌である（１８）に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
（２０）アスペルギルス属に属する糸状菌が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタスおよびアスペルギルス・ニジュランスからなる群から選択される１つの種に属する糸状菌である（１９）に記載のタンパク質加水分解物の製造方法。
（２１）（１５）から（２０）のいずれか１項に記載の方法により製造されるタンパク質加水分解物。
（２２）（１）に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
（２３）（２２）に記載の抗体を用いて（１）に記載のポリペプチドを検出または定量する方法。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡとしては、例えば配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡは、アスペルギルス・オリゼのゲノムを出発材料として用いて、例えば、実施例で記載したショットガン・クローニング法によって調製することができる。その際、断片化された各染色体ＤＮＡは、その長さ等に応じて、プラスミドベクターまたはファージ等の適当なクローニングベクターに連結し、これを用いてエレクトロポレーション法等の適当な方法によって大腸菌等の適当な宿主細胞を形質転換し、該断片化各染色体ＤＮＡをクローニングするための、クローンライブラリーを調製することができる。
さらに、化学分解法（マキサム−ギルバート法）及びジデオキシ法等の公知の方法に従って、かかるクローンライブラリーから得られる断片化各染色体ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
また、配列番号１または５で示される塩基配列または該塩基配列と相補的な塩基配列の、連続する１５塩基以上の塩基配列を含むオリゴＤＮＡをプライマーとして使用したＰＣＲにより増幅して調製することもできる。例えば、配列番号８および９で示された塩基配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーセットとして用い、アスペルギルス・オリゼのｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことにより、配列番号５で示される塩基配列を含むＤＮＡを増幅し、単離することができる。
また、本発明のＤＮＡの塩基配列の連続する１５塩基以上の塩基配列を含むオリゴＤＮＡおよび本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列の連続する１５塩基以上の塩基配列を含むオリゴＤＮＡをプライマーセットして、ＰＣＲを行うことにより、本発明のＤＮＡの断片を増幅し、検出または単離することができる。プライマーは、増幅する領域を選択し、好ましくは、その領域の５’端１５〜５０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡおよび、この領域の３’端１５〜５０塩基の配列と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡを作製して用いる。テンプレートとしては、例えば微生物、好ましくは糸状菌の染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いることができる。糸状菌としては、好ましくは、アスペルギルス属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属から選択されるいずれか１つ属に属する微生物をあげることができ、特に好ましくは、アスペルギルス属に属する糸状菌をあげることができる。アスペルギウス属に属する糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・パラシティクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｏｍｉｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）があげられ、好ましくはフラビ節に属するものがあげられる。フラビ節に属するアスペルギルス属糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウスがあげられる。このうち、例えばアスペルギウス・オリゼＲＩＢ  ４０株（ＡＴＣＣ番号：４２１４９）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東一丁目１−１  中央第６）に平成１３年３月２８日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−１８２７３として寄託されており、さらに平成１４年３月４日に国際寄託としてＦＥＲＭ  ＢＰ−７９３５に移管されている。
配列番号３または４で示される塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡの部分断片であり、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で示される塩基配列に基づくプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅し、単離することができる。
ＰＣＲは当業者に周知の条件及び手段を用いて、行うことができるが、ＰＣＲの反応条件としては、例えば、９４℃で２分の反応の後、９４℃で１０秒、５５℃で２６秒、７２℃で２分からなる反応サイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で５分反応させる条件、９４℃で５分間の反応の後、９４℃で２分、５６℃で３０秒、７２℃で１分３０秒からなる反応サイクルを３０サイクル行う条件があげられる。なお、サーマルサイクラーとしては、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製９６００、アステック社製プログラム・テンプ・コントロール・システムＰＣ−７００など一般のサーマルサイクラーを用いることができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）などの一般の市販品を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従って実施することができる。
上記のＤＮＡの増幅用プライマーセットに用いる各プライマーの塩基の長さに特に制限はなく、その使用目的等に応じて当業者が適宜選択することができるが、通常、１５〜５０塩基、好ましくは２０〜３０塩基の長さである。プライマーの数は、増幅の対象となるＤＮＡが含まれる菌種の麹菌との近縁度及び混在度を考慮して最小限の数を決定することができるが、少なくとも１組（２本）、好ましくは２〜４組である。また、プライマーの設計に当っては、増幅する対象となる配列の長さ、特徴等を考慮する。オリゴＤＮＡは当業者に周知の化学合成、例えば、アプライド・バイオシステムズ社製のＤＮＡ合成装置等を使用して調製することができる。
本発明のＤＮＡの部分断片、あるいは本発明のＤＮＡの塩基配列または本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列の連続する１５塩基以上の塩基配列を含むオリゴＤＮＡを放射性同位体、ジゴキシゲニン、ビオチン等で標識したものをプローブとして、ハイブリダイゼーションにより、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。本発明のＤＮＡの部分断片は、上記に記載したＰＣＲにより調製することができ、オリゴＤＮＡはプライマーに用いるオリゴＤＮＡと同様に化学合成やＤＮＡ合成装置により調製できる。プローブの長さは、検出対象などに応じて当業者が適宜選択することができるが、通常、１５〜３０００塩基、好ましくは２０〜１０００塩基の長さである。
ハイブリダイゼーションは、例えば、電気泳動ゲルあるいはコロニーなどからＤＮＡあるいはｍＲＮＡをニトロセルロースあるいはナイロンメンブレン上に転写し、真空中で８０℃、２時間反応させるかあるいは紫外線照射処理することによって、ＤＮＡをメンブレン上に固定化する。この時、必要に応じて０．５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ、１．５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌを含むアルカリ性溶液を用いた変性および０．５ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌの溶液を用いた中和を行う。このメンブレンを５０％フォルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液で、４２℃、２時間プレハイブリを行った後、上記プローブを添加した同ハイブリダーゼーション溶液で、４２℃、一昼夜ハイブリダイゼーションを行う。このメンブレンを、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液で室温、２分間で３回洗浄した後、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液中で５０℃、２時間で３回洗浄する。洗浄後のメンブレンは風乾した後、−７０℃で２時間から一昼夜、Ｘ線フィルムに露光させ、現像して可視化する。また、基板上にオリゴＤＮＡまたはＤＮＡ断片を固定化し、標識したｍＲＮＡあるいはＤＮＡとハイブリダイズさせた後、ドットとして検出するＤＮＡチップ〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６，６３９（１９９６）〕によっても本発明のＤＮＡまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。
（２）本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、例えば以下の方法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより、製造することができる。具体的な遺伝子操作的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）等に記載された方法等を用いることができる。
（１）で得られた本発明のＤＮＡから、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡを調製する。また、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。
該ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび転写終結配列が連結された構造を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，，４３０６（１９８５）〕、ｐＴｒＳ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・バイオサイエンス社製）、ｐＥＴ１４（ノバジェン社製）、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ（クロンテック社製）ｐＲＳＥＴ  Ｃ（インビトロジェン社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモータ、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
糸状菌を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えばｐＰＴＲＩ（白鶴酒造社製）、ｐＰＴＲＩＩ（白鶴酒造社製）、ｐＡＵＲ３１６（宝酒造社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、糸状菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えばａｍｙＢプロモーター、ｅｎｏＡプロモーター、ｇｐｄプロモーター、ｍｅ１０プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍｕｃｏｒ属等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては糸状菌にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、プロトプラスト法〔ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ｏｆ  ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ  ＮＩＤＵＬＡＮＳ：ＥＭＢＯ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，８（１９８８）〕等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クロンテック社製）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３  １９９０）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１（ストラタジーン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＭＳＧ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）〕等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに該組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（ともにインビトロジェン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ９（クロンテック社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許公報２６０６８５６号、特許公報２５１７８１３号）等をあげることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母、糸状菌等の真核微生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、小麦蛋白質および小麦蛋白質加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｍｉｍｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、Ｄａｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨバイオサイエンス社製）、Ｇｒａｃｅの昆虫培地〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて本発明のポリペプチドを生産することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量の本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、本発明のポリペプチドを生産することができる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。ｐＲＳＥＴ系ベクター（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＸ系ベクター（アマシャム・バイオサイエンス社製）等、該ポリペプチドにタグをつけて発現させた場合、ニッケルレジン、グルタチオンセファロースなどの適当な担体を用いてアフィニティ精製することもできる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中のポリペプチド変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される本発明のポリペプチドとして、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげることができる。
また、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アプライド・バイオシステムズ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養することによっても製造することができる。微生物としては、本発明のポリペプチドを生産する能力を有する微生物であれば、いかなる微生物を用いてもよく、好ましくは糸状菌、さらに好ましくはアスペルギウス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属およびフザリウム属からなる群から選択される１つの属に属する糸状菌、さらに好ましくは、アスペルギルス属に属する糸状菌であるアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタスおよびアスペルギルス・ニジュランスからなる群から選択される１つの種に属する糸状菌を用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドを生産する能力を有する微生物は、野生株、形質転体、突然変異株等いずれであってもよいが、形質転換、突然変異処理等を行って、本発明のポリペプチドを生産する能力が増大した微生物が好ましい。なお、突然変異の処理方法としては、紫外線照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの突然変異誘発剤による処理があげられる。微生物の培養およびポリペプチドの精製は、上記の微生物の形質転換体の培養およびポリペプチドの精製と同様に行なうことができる。
（３）タンパク質加水分解物の製造方法
タンパク質を含む原料に、本発明のピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドおよびタンパク質加水分解酵素を添加して混合し、通常２０℃〜６０℃、好ましくは３０℃〜５０℃にて２４〜２６４時間、好ましくは４８〜２４０時間反応させることにより、タンパク質加水分解物を製造することができる。また、タンパク質を含む原料に最初にタンパク質加水分解酵素を添加して混合し、通常２０℃〜６０℃、好ましくは３０℃〜５０℃にて、２４〜２６４時間、好ましくは４８〜２４０時間反応させてタンパク質の加水分解反応を行なった後、本発明のピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを添加して混合し、さらに通常２０℃〜６０℃、好ましくは３０℃〜５０℃にて、５〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間反応させることによっても、製造することができる。後者の場合、本発明のピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを添加する際にさらにタンパク質加水分解酵素を添加して反応させてもよい。反応時のｐＨは、本発明のピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドおよびタンパク質加水分解酵素が作用できるｐＨであればよいが、好ましくはｐＨ５〜８に調整する。
この製造方法で用いる、ピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドとしては、上記（２）に記載した方法で精製したポリペプチドを用いることもできるし、ポリペプチドを精製せずに、上記（２）に記載した本発明のピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを含む上記の形質転換体、または本発明のピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる、本発明のピログルタミルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを含む培養物または該培養物の処理物を用いることもできる。
タンパク質加水分解酵素としては、フレーバーザイム（ノボノルディスク社製）、麹菌の培養物等を用いることができる。麹菌としては、醸造工業で用いられるものであれば、いかなる種類の麹菌でもよいが、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ等をあげることができる。本発明の製造方法に用いる原料に含まれるタンパク質は、特に限定されないが、グルダミン酸含量の高いものが好ましい。また、タンパク質を含む原料は、タンパク質を多く含むものであればよく、精製したタンパク質である必要はない。例えば、小麦グルテン、脱脂大豆、分離大豆タンパク質等があげられる。反応終了後、未反応の原料タンパク質、菌体などを除去後、必要に応じて濃縮、乾燥することにより加水分解率の高いタンパク質加水分解物を得ることができる。
（４）本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の製造
（ａ）ポリクローナル抗体の調製
上記（２）に記載の方法により取得した本発明のポリペプチドの全長または部分断片の精製標品、あるいは本発明のポリペプチドの一部のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として用い、動物を免疫することにより、本発明のポリペプチドと特異的に結合するポリクローナル抗体を作製することができる。免疫する方法としては、動物の皮下、静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、抗原性の高いキャリアタンパク質を抗原に結合させて投与する、あるいは適当なアジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。
抗原とするペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢＯＣ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法あるいは、アプライド・バイオシステムズ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することができる。
キャリアタンパク質としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン、ウシチログロブリン等があげられ、アジュバンドとしては、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。
免疫動物としては、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスターなどの非ヒト哺乳動物があげられる。
抗原の投与は、１回目４の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血して血清を調製し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）〔酵素免疫測定法（第３版）、医学書院（１９８７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）〕等で確認する。抗原の投与量は動物１匹に投与１回当たり５０〜２００μｇが好ましい。
免疫に用いた抗原に対し、血清が充分な抗体価を示した動物より全血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧカラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ｂ）モノクローナル抗体の調製
（ｉ）抗体産生細胞の調製
上記（ａ）において、免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したマウスまたはラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭで３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｉｉ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ  １６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍＬ  ８−アザグアニンを加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの作製
（ｉ）で取得した抗体産生細胞と（ｉｉ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭまたはＰＢＳ（１．８３ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌリン酸一カリウム、７．６５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００  ２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ１〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地に０．４ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１５μｍｏｌ／Ｌチミジンおよび０．４μｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり、ＥＬＩＳＡにより、培養上清中の本発明のポリペプチドに結合する抗体を検出することにより、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択する。
ＥＬＩＳＡの具体的例として、以下の方法をあげることができる。免疫の際、抗原に用いたポリペプチドまたはペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｉｖ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（抗体産生細胞がラット由来の場合は抗ラットイムノグロブリン抗体）を反応させる。標識酵素により発色する基質を添加して反応を行ない、抗原と結合した第一抗体を検出する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｉｉｉ）で取得した本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナル抗体の精製で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（５）本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いた本発明のポリペプチドの検出および定量法
（４）で得られる本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を用い、抗原抗体反応を行わせることにより、本発明のポリペプチドを免疫学的に検出および定量することができる。測定試料としては、細胞の抽出液や培養上清等が用いられる。
免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法、イムノブロット法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ〔単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）、続生化学実験講座５，免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）〕等が挙げられる。
蛍光抗体法とは、測定試料に、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質で標識した該抗体と結合する抗体（例えば本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体がマウス抗体の場合は抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片等）を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定することにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
ＥＬＩＳＡとは、測定試料に、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ等の酵素で標識した該抗体と結合する抗体を反応させた後、標識した酵素により発色する基質を加えて反応させ、発色色素を分光光度計で測定することにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
ＲＩＡとは、測定試料に、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を反応させ、さらに放射性標識を施した該抗体と結合する抗体を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで放射能量を測定することにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、細胞や組織切片等の測定試料に、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの標識を施した該抗体と結合する抗体を反応させた後、顕微鏡を用いて観察することにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
イムノブロット（ウェスタンブロット）法とは、測定試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの標識を施した該抗体と結合する抗体を反応させた後、標識物質に応じた反応を行うことにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
ドットブロッティング法とは、測定試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの標識を施した該抗体と結合する抗体を反応させた後、標識物質に応じた反応を行うことにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
免疫沈降法とは、測定試料を本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体と反応させた後、プロテインＡ−セファロース等イムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を形成させ、分離することにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡとは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を吸着させたプレートに、測定試料を反応させた後、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識した本発明のポリペプチドと特異的に結合し、上記抗体とは抗原認識部位が異なる抗体を反応させ、標識した酵素により発色する基質を加えて反応させ、発色色素を分光光度計で測定することにより本発明のポリペプチドを検出する方法である。
（２）に記載の方法で調製できる本発明のポリペプチドの精製標品の一定濃度の溶液を作製し、これを段階的に希釈したものを上記の検出方法で測定する。各濃度の標品の測定値から検量線を作成し、測定試料の測定値を比較することにより、本発明のポリペプチドの定量を行うことができる。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）に記載されている方法に従った。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ホールゲノムショットガンライブラリーの作製方法
１．インサートＤＮＡの調製
（１）染色体ＤＮＡの取得
糸状菌アスペルギルス・オリゼＲＩＢ  ４０株（ＡＴＣＣ番号：４２１４９）の胞子をＹＰＤ培地（０．５％イーストエキス、１％ペプトン、２％グルコース）に植菌し、３０℃で一晩振盪培養した。その後、飯村の方法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３（１９８７）〕に従ってゲノムＤＮＡの抽出を行った。ゲノムＤＮＡに混在しているミトコンドリアＤＮＡをＷａｔｓｏｎらの方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８，５７（１９８６）〕に従って染色体ＤＮＡのみになるよう塩化セシウム超遠心による精製を行った。
（２）染色体ＤＮＡの断片化
取得した純粋な染色体ＤＮＡをランダムＤＮＡ断片化装置ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（トミー精工）にかけ、染色体ＤＮＡを１〜２ｋｂ程度に断片化した。
（３）断片化したＤＮＡの末端処理
断片化した染色体ＤＮＡをＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（宝酒造）で処理し、その後クレノー断片（宝酒造）処理を行い、末端を平滑化した。
（４）末端へのアダプターの付加
末端を平滑化した染色体ＤＮＡ断片の両端に、５’末端をリン酸化した配列番号６および７で示される塩基配列からなるＤＮＡをアダプターとして、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を用いて連結した。
２．ベクターへのインサートＤＮＡの挿入と形質転換
ｐＵＣ１９を制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により切断を行った後、チミジン残基をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス）によりＳａｌＩ切断部分に挿入した。このようにして作製したプラスミドをアルカリ・ホスファターゼ（宝酒造）処理により脱リン酸化しベクターとして利用した。ベクターと上記で作製した染色体ＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Ｇｉｂｃｏ）にエレクトロポレーション法により形質転換を行った。
３．塩基配列の決定
大腸菌形質転換体を２×ＹＰ培地で３７℃、１０時間培養し、集菌後、滅菌水中で９９℃、１０分間加熱処理した。この上澄を鋳型ＤＮＡ水溶液として用い、９８℃で２０秒、６８℃で２分の３０サイクルのＰＣＲによって、シークエンス用プライマーがアニールする部位を含む挿入断片全長を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、サンガー法の鋳型として用い、Ｍ１３ユニバーサルプライマーあるいはＭ１３リバースプライマーと、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒシークエンシングキットを用いて、キットに添付の説明書に従ってシークエンス反応を行った。シークエンス反応産物は、ゲルろ過法などを用いて未反応のＤｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを除去した後、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製３７００ＤＮＡシークエンサーを用いて、ＤＮＡ断片の塩基配列を解読した。３７００ＤＮＡシークエンサーによって出力された波形データは、Ｐｈｒｅｄ（Ｐｈｉｌ  Ｇｒｅｅｎ）で再解析し、ベクター及びアダプター配列を除去した後、ＳＰＳ  Ｐｈｒａｐ（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用してアッセンブルし、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ−４０株のゲノムＤＮＡの塩基配列のコンティグを構築した。
実施例２  遺伝子の特定
ゲノムＤＮＡの塩基配列からの遺伝子の特定は、ゲノムＤＮＡの塩基配列のコンティグに対し、すでに取得したＥＳＴの配列情報、既知のタンパク質アミノ酸配列データベースとの相同性情報を考慮しながら、浅井潔らによるアルゴリズム〔Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，９８，２２８（１９９８）〕に基づく遺伝子領域予測システムＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒと後藤修によるアルゴリズム〔Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６，１９０−２０２（２０００）〕に基づく遺伝子領域予測システムＡＬＮを組み合わせて、以下の（１）〜（７）の方法により行なった。
（１）ＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域の抽出
ゲノムＤＮＡ塩基配列のコンティグから既知のタンパク質アミノ酸配列と高い相同性をもつ領域を抽出する。アミノ酸配列の相同性はＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２２６４（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）〕によって決定することができるが、このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されており〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，（１９９０）〕、ゲノムＤＮＡ塩基配列がアミノ酸配列に翻訳された場合に相同性が高い領域を直接検索することができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。本手法では、ゲノムＤＮＡ塩基配列のコンティグを問い合わせ配列、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴバージョン３９〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，４５（２０００）〕およびＮＲａａをデータベースとしてＢＬＡＳＴＸの検索を行い、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにおける相同性の指標であるＥ−ｖａｌｕｅで１０−３０以下の値を持つ（Ｅ−ｖａｌｕｅは値が低いほど相同性が高いことを示す）領域を抽出する。これらの領域から、より相同性の高い部分を優先させるようにして抽出した、互いに重ならない遺伝子候補領域を、ＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域とした。
（２）ＡＬＮ遺伝子候補領域の抽出
ＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域のうち、相同性の対象となるタンパク質のアミノ酸配列の全長の９０％以上の領域に対して相同性をもつものを核として、コンティグ配列に対して遺伝子領域予測システムＡＬＮを適用して抽出した遺伝子候補領域を、ＡＬＮ遺伝子候補領域とした。ＡＬＮは、相同性の対象となるタンパク質アミノ酸配列の全長を、コンティグに対して整列させながらスプライス部位を特定することにより、遺伝子領域を予測する。
（３）ＧＤ相同性遺伝子候補領域の抽出
ＢＬＡＳＴ相同性遺伝子候補領域のうち、相同性の対象となるタンパク質のアミノ酸配列の残基長の２０％以上９０％未満の領域に対して相同性を持つものを核として、コンティグ配列に対して遺伝子領域予測システムＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒを適用して抽出した遺伝子候補領域を、ＧＤ相同性遺伝子候補領域とした。ＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒは、ＢＬＡＳＴＸの、Ｅ−ｖａｌｕｅと、タンパク質コード領域の指向性の指標である２連コドン統計量を統合し、さらにスプライス部位の位置依存１次マルコフモデルによるスコアを考慮して遺伝子領域を予測する。
（４）ＥＳＴ−ＧＤ遺伝子候補領域の抽出
コンティグ配列に対応したＥＳＴによって遺伝子発現が確認されている領域については、その付近のコンティグ配列にＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒを適用することにより、ＥＳＴの配列によって決定される遺伝子領域のみならず、遺伝子領域全体を予測して抽出した遺伝子候補領域を、ＥＳＴ−ＧＤ遺伝子候補領域とする。
（５）一般ＧＤ遺伝子候補領域の抽出
（１）から（４）までの遺伝子候補領域に含まれないコンティグ配列に対して、ＧｅｎｅＤｅｃｏｄｅｒを適用することにより、遺伝子領域を予測して抽出された遺伝子候補領域を、一般ＧＤ遺伝子候補領域とする。
（６）ｔＲＮＡ遺伝子候補領域の抽出
ｔＲＮＡ−ｓｃａｎを全コンティグに適用することにより、抽出されたｔＲＮＡ遺伝子候補をｔＲＮＡ遺伝子候補領域とする。
（７）遺伝子候補領域の統合
以下の手順により、（２）から（６）までの遺伝子候補領域を統合する。まず、（２）から（６）までの遺伝子候補領域のうち、ＥＳＴによって決定されるスプライス部位と矛盾した遺伝子領域を予測するものは取り除かれる。残った遺伝子候補領域を、互いに重なるものを取り除くことによって統合する。その際、ｔＲＮＡ遺伝子候補領域、ＡＬＮ相同性遺伝子候補領域、ＧＤ相同性遺伝子候補領域、ＧＤ−ＥＳＴ遺伝子候補領域、一般ＧＤ遺伝子候補領域の順で優先させて統合する。この統合された遺伝子候補領域を、予測遺伝子のセットとする。配列番号１で示される塩基配列は、このようにして得られた予測遺伝子のうちの１つの塩基配列である。
以上の手順により、相同性の観点からは、既知タンパク質の全長にわたって相同性をもつ遺伝子、既知タンパク質と部分的に相同性をもつ遺伝子、既知タンパク質と相同性をもたない遺伝子がこの順に従った信頼性で特定されることが保証される。また、発現の確認の観点からは、ＥＳＴで発現が確認されている遺伝子、ＥＳＴで発現が確認されていない遺伝子の順に従った信頼性で特定され、また、すべての候補遺伝子がＥＳＴによって特定されるスプライス部位と矛盾しないことが保証される。
用いられた手法はすべて終始コドンをタンパク質コード領域中に含むことを許さないアルゴリズムを採用しており、偽遺伝子を遺伝子として予測する可能性は少ない。
機能決定に関しては、予測された遺伝子領域に対して、ＮｒａａをデータベースとするＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、機能を特定するために十分な相同性（Ｅ−ｖａｌｕｅで１０−３０）を閾値として機能を決定した。
さらにこの予測遺伝子の中から精度高くピログルタミルペプチダーゼを抽出するため、公知のピログルタミルペプチダーゼ遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列、上記予測遺伝子セットをデータベースとしてＢＬＡＳＴＸの検索を行った結果、ヒトのピログルタミルペプチダーゼＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＪ２７８８２８）と、配列番号１で示される塩基配列からなる予測遺伝子が、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ６．１×１０−５で相同性を有することを認めた。したがって、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡは、アスペルギルス・オリゼ由来のピログルタミルペプチダーゼをコードしていると考えられた。また、配列番号１で示される塩基配列には１個所イントロンが存在し、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードしていると考えられた。配列番号１の塩基配列のうち、プロモーターとして機能する領域を含むと考えられる５’非翻訳領域の塩基配列を配列番号３に、３’非翻訳領域の塩基配列を配列番号４に、イントロンおよび非翻訳領域の配列を除いたコード領域の塩基配列を配列番号５に示した。
実施例３  アスペルギルス・オリゼのピログルタミルペプチダーゼｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・オリゼＲＩＢ  ４０株のｃＤＮＡの調製
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ  ４０株を以下の条件で培養した。ＤＰＹ培地（２％デキストリン、２％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水）６０ｍｌに、本菌株を接種し３００ｍｌのバッフル付きの三角フラスコで、３０℃、２日間、１５０ｒｐｍで振とう培養した。培養物をろ過し得られた湿菌体１ｇを、液体窒素をいれた乳鉢に移し液体窒素で凍結後、乳棒で微細な粉末とした。
この粉末から、アールエヌイージー・ミディ・キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを取得した。
取得した全ＲＮＡからオリゴテックス・ｄＴ３０スーパー・ｍＲＮＡ精製キット（ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、宝酒造社製）に従い、０．６μｇ／ｍｌのｍＲＮＡ溶液を１００μｌ取得した。この溶液に１０μｌの３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）と２５０μｌの９９．５％エタノールを添加し、激しく攪拌後、−２０℃で２時間静置した。１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、沈殿を２００μｌの７０％エタノールで洗った後、６μｌのジエチルピロカーボネート処理水に溶解した。
回収したｍＲＮＡは、ゲートウェイ技術を用いたｃＤＮＡ合成およびクローニング用スーパースクリプト・プラスミド・システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、インビトロジェン社製）を用いて第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡの合成を行ないＰＣＲのテンプレートに供した。
（２）ＰＣＲによるアスペルギルス・オリゼのピログルタミルペプチダーゼｃＤＮＡのクローニングおよびピログルタミルペプチダーゼ発現用プラスミドの構築
配列番号１に示す塩基配列から設計した配列番号８および配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーを設計し、合成した。
ＰＣＲは、上記のプライマー、テンプレートとしての（１）で調製したアスペルギルス・オリゼｃＤＮＡ、およびプレミックスＴａｑ（Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ、宝酒造社製）を用いて、プログラム・テンプ・コントロール・システム（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔｅｍｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）ＰＣ−７００（アステック社製）により行った。まず９４℃で５分間加熱しテンプレートのＤＮＡを変性させた後、９４℃で２分、５６℃で３０秒、７２℃で１分３０秒の反応を３０サイクル行った。反応液を０．８％アガロースゲルで電気泳動した結果、約８５０ｂｐのＤＮＡ断片を検出した。
該ＤＮＡ断片をジーンクリーン・キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｋｉｔ、Ｑバイオジーン社製）に従い精製した後、制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、同様にＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩで切断した原核生物発現用プラスミドベクターｐＲＳＥＴ  Ｃ（インビトロジェン社製）にライゲーションした。ライゲーションはライゲーション・キット・バージョン２（宝酒造社製）に従い行った。得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０）〕によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）で選択した。
この培地上の生育株（形質転換体）を常法により液体培養し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩにより切断し、アガロースゲル電気泳動により挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＲＳＥＴ  Ｃの２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片に加え、約８５０ｂｐの挿入断片を検出した。該プラスミドをｐＰＧＰと名づけた。ｐＰＧＰは、Ｔ７プロモーターの制御下で、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する、アスペルギルス・オリゼのピログルタミルペプチダーゼのＮ末にポリヒスチジン・タグを含む４１アミノ酸が付加したポリペプチドを発現するためのプラスミドである。
実施例４  大腸菌によるピログルタミルペプチダーゼの生産
実施例３（２）で構築したピログルタミルペプチダーゼ発現用プラスミドｐＰＧＰを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１をカルシウム法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０）〕により形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）で選択した。
得られた形質転換体を６０ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、２５℃で対数域まで増殖後、終濃度１ｍｍｏｌ／ｌとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略す）を添加し、さらに２５℃で３時間培養した。
培養後集菌し、菌体を１ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に懸濁した後、超音波破砕し、遠心により不溶性画分を除去して粗タンパク質抽出液を得た。粗タンパク質抽出液は１ｍｌの平衡化した５０％濃度のＮｉ−ＮＴＡレジン（インビトロジェン社製）と混合し４℃で３０分間インキュベート後、カラムに導入した。Ｎｉ−ＮＴＡレジンを０．０２ｍｏｌ／ｌイミダゾールを含むリン酸緩衝液８ｍｌで２回洗浄後、０．２５ｍｏｌ／ｌイミダゾールを含むリン酸緩衝液１ｍｌで溶出することにより約３５ｋＤａのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一のバンドとして精製した。また、プロテイン・アッセイ・キット（バイオラッド社製）により回収されたタンパク質量を求めたところ、９１．８μｇであった。
ピログルタミン酸−パラニトロアニリド（以下、ＰＣＡ−ｐＮＡと略す）を基質としてピログルタミルペプチダーゼ活性の測定を行った。ＰＣＡ−ｐＮＡを終濃度５ｍｍｏｌ／ｌとなるよう５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し基質溶液とした。１００μｌの基質溶液に２０μｌの酵素液を加え、３７℃で１０分間反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。モル吸光係数１０５００よりパラニトロアニリンの遊離量を計算し、１単位（Ｕ）は３７℃にて１分間に１μモルのパラニトロアニリンを遊離する量とした。上記方法にて精製タンパク質溶液の活性を測定した結果、６．６ｍＵ／ｍｌの活性を有していた。一方、ＩＰＴＧを添加しない菌体に対し同様の精製操作を行って得られた溶液の活性は５０分の１以下となり、ピログルタミルペプチダーゼ活性はＩＰＴＧによる発現誘導に依存的であった。したがって、ｐＰＧＰに挿入されたＤＮＡ断片は、ピログルタミルペプチダーゼをコードしており、ピログルタミルペプチダーゼの製造に用いることができること、配列番号１０で示されるアミノ酸配列（配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末に４１アミノ酸が付加したアミノ酸配列）からなるポリペプチドは、ピログルタミルペプチダーゼ活性を有することが確認された。
実施例５  ピログルタミルペプチダーゼ作用によるタンパク質加水分解物の製造  １０％の小麦グルテン（プロミックＧＴ、協和発酵工業社製）水溶液２００ｍｌにフレーバーザイム（ノボノルディスク社製）１．０ｇを添加して４８℃にて３日間酵素分解を行い、ろ過後、９０℃で加熱処理をし、タンパク質加水分解物を得た。
実施例４と同様にして、ｐＰＧＰを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１を培養し、精製タンパク質溶液を調製した。得られた０．５Ｕのピログルタミルペプチダーゼ活性を有する精製タンパク質溶液及び０．１ｇのフレーバーザイムを含む溶液を、孔径０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過したタンパク質加水分解物２０ｍｌに加え、４０℃にて２日間酵素分解を行った（試験区Ａ）。上記分解物について、全窒素、遊離アミノ酸量、分解率を分析し、ピログルタミルペプチダーゼ活性を有さない溶液及びフレーバーザイムを添加した分解物（試験区Ｂ）と比較した結果を第１表に示す。
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上記結果から明らかなように本発明のピログルタミルペプチダーゼの添加により加水分解率の高いタンパク質分解物を得ることができる。
産業上の利用可能性
本発明により、アスペルギルス・オリゼに由来する新規なピログルタミルペプチダーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いて製造されるピログルタミルペプチダーゼが提供される。該ピログルタミルペプチダーゼを利用することにより、加水分解率の高い風味のすぐれたタンパク質分解物を得ることができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号６−アダプター
配列番号７−アダプター
配列番号８−アスペルギルス・オリゼのピログルタミルペプチダーゼｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号９−アスペルギルス・オリゼのピログルタミルペプチダーゼｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号１０−配列番号２のアミノ酸配列のＮ末にポリヒスチジンタグを含む４１アミノ酸が付加したアミノ酸配列
【配列表】
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【国際調査報告】
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