(57)【要約】本発明により、（１）哺乳動物の視床下部およびランゲルハンス氏島由来の多様な細胞株、（２）該細胞株を宿主として用いた、活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ペプチドの生産法、（３）該細胞株を用いた、該細胞に作用する物質の探索法や評価法、（４）該細胞株を用いた有用遺伝子または有用ペプチドの探索法および取得法、（５）上記の発現クローニング系で使用する高感度で簡便なＧＰＣＲリガンドのアッセイ系が提供される。
2003087366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（５）の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
（１）任意のｃＤＮＡまたは染色体由来のＤＮＡを内分泌細胞由来の細胞株に導入して形質転換株を取得する
（２）上記（１）の形質転換株を培養し、導入したＤＮＡを発現させた後、該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身を、目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
（３）該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
（４）該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身が目的の活性を示した形質転換株を選択する
（５）上記（４）の形質転換株に導入したＤＮＡを、形質転換株に目的の活性を与えるＤＮＡとして同定する
【請求項２】
下記（１）〜（７）の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
（１）発現ベクターを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを１〜１００００のクローンずつのプールに分ける
（２）各プールに由来するｃＤＮＡクローンの混合物を内分泌細胞由来の細胞株に導入して形質転換株を取得する
（３）上記（２）の形質転換株を各プールごとに培養して、導入したｃＤＮＡを発現させた後、該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身を、プールごとに目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
（４）該受容体に基づく細胞の応答反応をプールごとに検出する
（５）該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身が目的の活性を示したプールを選択し、選択したプールを（１）よりも細かいプールに分ける
（６）（２）〜（５）の操作をプールが１クローンごとになるまで繰り返す
（７）形質転換株に目的の活性を与えるｃＤＮＡを同定する
【請求項３】
任意のｃＤＮＡまたは染色体由来の遺伝子が、活性ペプチド前駆体をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項４】
受容体がＧ蛋白質共役型受容体である、請求項１または２に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項５】
Ｇ蛋白質共役型受容体がオーファンＧ蛋白質共役型受容体である、請求項４に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項６】
内分泌細胞由来の細胞株が、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子を発現する内分泌細胞由来の細胞株である、請求項１または２に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項７】
内分泌細胞由来の細胞株が、ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原遺伝子を発現する内分泌細胞由来の細胞株である、請求項１または２に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８】
内分泌細胞由来の細胞株が、非ヒト・トランスジェニック動物細胞由来の細胞株である、請求項１、２、６または７に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項９】
非ヒト・トランスジェニック動物がトランスジェニックラットである請求項８に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１０】
ＳＶ４０の温度感受性変異株がＳＶ４０ｔｓＡ５８である請求項７に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１１】
内分泌細胞由来の細胞株が、視床下部またはランゲルハンス氏島由来の細胞株である、請求項１、２、６、７または８に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１２】
内分泌細胞由来の細胞株が、レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）遺伝子、プレプロニューロメディンＵ遺伝子、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）プレプロ蛋白質遺伝子、プレプロオレキシン遺伝子、プレプロオピオメラノコルチン遺伝子、プレプロニューロペプチドＹ遺伝子、プレプロニューロペプチドＦＦ遺伝子、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプログレリン遺伝子、プレプロメラニン凝集ホルモン遺伝子、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）遺伝子、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）遺伝子、ＲＦＲＰ受容体遺伝子、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）遺伝子、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）遺伝子、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）遺伝子、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）遺伝子、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）遺伝子、グレリン受容体遺伝子、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）遺伝子、プレプロアグーチ関連ペプチド遺伝子、スルホニルウレア受容体遺伝子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体遺伝子、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）遺伝子、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）遺伝子、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）遺伝子、１型アンジオテンシンＩＩ受容体遺伝子、ガラニン受容体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、およびグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現する視床下部由来細胞である、請求項１、２、６、７または８に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１３】
内分泌細胞由来の細胞株が、レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）、ニューロメディンＵ、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）蛋白質、オレキシン、オピオメラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＦＦ、コルチコトロピン放出ホルモン、サイロトロピン放出ホルモン、グレリン、メラニン凝集ホルモン、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）、ＲＦＲＰ受容体、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）、グレリン受容体、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）、アグーチ関連ペプチド、スルホニルウレア受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体、ガラニン受容体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体、およびエンドルフィンからなる群より選ばれるペプチドの少なくとも１つのペプチドを内因性に発現する視床下部由来の細胞である、請求項１、２、６、７または８に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１４】
内分泌細胞由来の細胞株の細胞が、プレプロインスリン遺伝子、プレプログルカゴン遺伝子、プレプロソマトスタチン遺伝子、プレプロ膵ポリペプチド遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ１（ＰＣ１）遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ２（ＰＣ２）遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、ニューロジェニン３遺伝子、ニューロＤ遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、２型グルコーストランスポーター遺伝子、ベータセルリン遺伝子、スルホニルウレア遺伝子、Ｐ２Ｙ１受容体遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、１型ソマトスタチン受容体遺伝子、２型ソマトスタチン受容体遺伝子、３型ソマトスタチン受容体遺伝子、４型ソマトスタチン受容体遺伝子、５型ソマトスタチン受容体遺伝子、インスリン受容体遺伝子、グルコーストランスポーター遺伝子、およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現するランゲルハンス氏島由来細胞である、請求項１、２、６、７または８に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１５】
受容体を発現する細胞が、下記の（１）〜（３）の少なくとも１つが染色体ＤＮＡに組み込まれた、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である、請求項１または２に記載のＤＮＡの取得方法。
（１）誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するためのＤＮＡコンストラクト
（２）転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクト
（３）Ｇα蛋白質またはキメラＧα蛋白質を発現するためのＤＮＡコンストラクト
【請求項１６】
Ｂ細胞株が、無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１７】
無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞である、請求項１６に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１８】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項１９】
転写因子の応答配列が、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答配列、または血清応答配列（ＳＲＥ）である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項２０】
レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項２１】
Ｇα蛋白質が、Ｇα１６、Ｇα１５、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｇｕｓｔ、Ｇαｔ、およびＧα１４からなる群より選ばれるの少なくとも１つのＧα蛋白質である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項２２】
キメラＧα蛋白質が、下記の（１）〜（２０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのキメラＧα蛋白質である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
（１）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（２）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（３）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（４）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（５）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（６）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（７）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαＧｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（８）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（９）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１０）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１１）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｓのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１２）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１３）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１４）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１５）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１６）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１７）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαＧｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１８）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１９）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（２０）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
【請求項２３】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項２４】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子であり、キメラＧα蛋白質が、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質またはＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質である、請求項１５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項２５】
細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、請求項１または２に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項２６】
目的とする受容体を発現する細胞との接触が、該細胞を形質転換株上に重層することによる接触である、請求項１または２に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項２７】
レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）遺伝子、プレプロニューロメディンＵ遺伝子、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）プレプロ蛋白質遺伝子、プレプロオレキシン遺伝子、プレプロオピオメラノコルチン遺伝子、プレプロニューロペプチドＹ遺伝子、プレプロニューロペプチドＦＦ遺伝子、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプログレリン遺伝子、プレプロメラニン凝集ホルモン遺伝子、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）遺伝子、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）遺伝子、ＲＦＲＰ受容体遺伝子、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）遺伝子、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）遺伝子、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）遺伝子、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）遺伝子、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）遺伝子、グレリン受容体遺伝子、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）遺伝子、プレプロアグーチ関連ペプチド遺伝子、スルホニルウレア受容体遺伝子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体遺伝子、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）遺伝子、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）遺伝子、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）遺伝子、１型アンジオテンシンＩＩ受容体遺伝子、ガラニン受容体遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、およびグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
【請求項２８】
レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）、ニューロメディンＵ、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）蛋白質、オレキシン、オピオメラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＦＦ、コルチコトロピン放出ホルモン、サイロトロピン放出ホルモン、グレリン、メラニン凝集ホルモン、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）、ＲＦＲＰ受容体、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）、グレリン受容体、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）、アグーチ関連ペプチド、スルホニルウレア受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体、ガラニン受容体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体、およびエンドルフィンからなる群より選ばれるペプチドの少なくとも１つのペプチドを内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
【請求項２９】
細胞株が、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子を発現する細胞株である、請求項２７または２８に記載の細胞株。
【請求項３０】
細胞株が、ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原遺伝子を発現する細胞株である、請求項２７または２８に記載の細胞株。
【請求項３１】
細胞株が、非ヒト・トランスジェニック動物細胞由来の細胞株である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項３２】
ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原遺伝子を導入した非ヒト・トランスジェニック動物の視床下部またはランゲルハンス氏島から得られる不死化した細胞株。
【請求項３３】
ランゲルハンス氏島から得られる不死化した細胞株が、プレプロインスリン遺伝子、プレプログルカゴン遺伝子、プレプロソマトスタチン遺伝子、プレプロ膵ポリペプチド遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ１（ＰＣ１）遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ２（ＰＣ２）遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、ニューロジェニン３遺伝子、ニューロＤ遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、２型グルコーストランスポーター遺伝子、ベータセルリン遺伝子、スルホニルウレア遺伝子、Ｐ２Ｙ１受容体遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、１型ソマトスタチン受容体遺伝子、２型ソマトスタチン受容体遺伝子、３型ソマトスタチン受容体遺伝子、４型ソマトスタチン受容体遺伝子、５型ソマトスタチン受容体遺伝子、インスリン受容体遺伝子、グルコーストランスポーター遺伝子、およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現する細胞株である、請求項３２に記載の細胞株。
【請求項３４】
ＳＶ４０の温度感受性変異株がＳＶ４０ｔｓＡ５８である請求項３０または３２に記載の細胞株。
【請求項３５】
非ヒト・トランスジェニック動物がトランスジェニックラットである請求項３１または３２に記載の細胞株。
【請求項３６】
下記（１）および（２）の工程を有する、ペプチドの製造方法。（１）請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の細胞株を培養し、該細胞株が内在的に発現しているペプチドを培養物中に生成蓄積させる
（２）上記（１）で得られた培養物から該ペプチドを採取する
【請求項３７】
下記（１）〜（３）の工程を有する、ペプチドの製造方法。
（１）請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の細胞株を宿主細胞として用い、該宿主細胞に目的とするペプチドをコードするＤＮＡを導入し、形質転換株を取得する
（２）該形質転換株を培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させる
（３）上記（２）で得られた培養物から該ペプチドを採取する
【請求項３８】
培養を、ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原の活性を抑制しない温度で行うことを特徴とする、請求項３６または３７に記載の製造法。
【請求項３９】
製造において、無血清培地、２％以下の血清を含む培地、または無血清培地にＮ−サプリメントを添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４０】
製造において、５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含有する培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４１】
製造において、宿主細胞で発現されている、受容体、トランスポーターまたはチャネルの、アゴニストまたはアンタゴニストを添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４２】
受容体が、Ｇ蛋白質共役型受容体、核内受容体、増殖因子受容体、スルホニルウレア受容体、ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ受容体、レプチン受容体、サイトカイン受容体、またはスルホニルウレア受容体であることを特徴とする、請求項４１に記載の製造法。
【請求項４３】
トランスポーターがグルコーストランスポーターであることを特徴とする、請求項４１に記載の製造法。
【請求項４４】
チャネルが、Ｃａチャネル、Ｋチャネル、ＣｌチャネルまたはＮａチャネルであることを特徴とする、請求項４１に記載の製造法。
【請求項４５】
製造において、宿主細胞で発現されている受容体のシグナルを代替することのできる物質を添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４６】
受容体のシグナルを代替することのできる物質が、アデニレートシクラーゼ、プロテインキナーゼ、ホスホジエステラーゼ、低分子量Ｇ蛋白質、細胞内ｃＡＭＰまたは細胞内Ｃａ２＋含量を変動する物質、フォルスコリン、８−ブロモ−サイクリックＡＭＰ（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチンよりなる群より選ばれる物質の少なくとも１つの物質である、請求項４５に記載の製造法。
【請求項４７】
製造において、ラミニンまたはゼラチンをコートしたディッシュ上で培養を行う工程を有することを特徴とする、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４８】
スクシニル化コンカナバリンＡを添加した培地を用いて培養を行うことを特徴とする、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４９】
アクチビン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、フォリスタチン、グルコース、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ニコチンアミド、ベータセルリン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ｉｓｌｅｔ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ）、繊維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）およびＲｅｇ蛋白質からなる群より選ばれる物質の少なくとも１つの物質を添加した培地を用いて培養を行うことを特徴とする、請求項３６〜４８のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５０】
培養物中に活性ペプチドを生成蓄積させた後に分泌刺激剤を添加することを特徴とする、請求項３６〜４９のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５１】
分泌刺激剤が、カリウム、グルコース、ＴｏｌｂｕｔａｍｉｄｅまたはＡＴＰである、請求項５０に記載の製造法。
【請求項５２】
一種類以上のペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、複数のペプチドを製造することを特徴とする、請求項３７〜５１のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５３】
下記（１）〜（４）の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドの検出または取得方法。
（１）請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法で、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドをコードするＤＮＡを取得する
（２）該ＤＮＡがコードするペプチドまたは部分ペプチドを、目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
（３）該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
（４）上記（３）で応答反応を与えることの示されたペプチドまたは部分ペプチドを同定する
【請求項５４】
下記（１）〜（４）の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドの検出または取得方法。
（１）請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の製造方法でペプチドを取得する（２）該ペプチドを、目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
（３）該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
（４）上記（３）で応答反応を与えることの示されたペプチドを同定する
【請求項５５】
受容体がＧ蛋白質共役型受容体である、請求項５３または５４に記載の検出または取得方法。
【請求項５６】
Ｇ蛋白質共役型受容体がオーファンＧ蛋白質共役型受容体である、請求項５５に記載の検出または取得方法。
【請求項５７】
受容体を発現する細胞が、下記の（１）〜（３）の少なくとも１つが染色体ＤＮＡに組み込まれた、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である、請求項５３または５４に記載の検出または取得方法。
（１）誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するためのＤＮＡコンストラクト
（２）転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクト
（３）Ｇα蛋白質またはキメラＧα蛋白質を発現するためのＤＮＡコンストラクト
【請求項５８】
Ｂ細胞株が、無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
【請求項５９】
無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞である、請求項５８に記載の検出または取得方法。
【請求項６０】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
【請求項６１】
転写因子の応答配列が、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答配列、または血清応答配列（ＳＲＥ）である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
【請求項６２】
レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
【請求項６３】
Ｇα蛋白質が、Ｇα１６、Ｇα１５、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、ＧαＧｕｓｔ、Ｇαｔ、およびＧα１４からなる群より選ばれるの少なくとも１つのＧα蛋白質である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
【請求項６４】
キメラＧα蛋白質が、下記の（１）〜（２０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのキメラＧα蛋白質である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
（１）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（２）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（３）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（４）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（５）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（６）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（７）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（８）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（９）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１０）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１１）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｓのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１２）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１３）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１４）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１５）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１６）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１７）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１８）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１９）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（２０）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
【請求項６５】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
【請求項６６】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子であり、キメラＧα蛋白質が、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質またはＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質である、請求項５７に記載の検出または取得方法。
【請求項６７】
細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、請求項５３または５４に記載の検出または取得方法。
【請求項６８】
下記の（１）〜（３）の少なくとも１つが染色体ＤＮＡに組み込まれた、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株由来の細胞株。
（１）誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するためのＤＮＡコンストラクト
（２）転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクト
（３）Ｇα蛋白質またはキメラＧα蛋白質を発現するためのＤＮＡコンストラクト
【請求項６９】
細胞株が、無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞である、請求項６８に記載の細胞株。
【請求項７０】
無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞である、請求項６９に記載の細胞株。
【請求項７１】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、請求項６８に記載の細胞株。
【請求項７２】
転写因子の応答配列が、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答配列、または血清応答配列（ＳＲＥ）である、請求項６８に記載の細胞株。
【請求項７３】
レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子である、請求項６８に記載の細胞株。
【請求項７４】
Ｇα蛋白質が、Ｇα１６、Ｇα１５、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｇｕｓｔ、Ｇαｔ、およびＧα１４からなる群より選ばれるの少なくとも１つのＧα蛋白質である、請求項６８に記載の細胞株。
【請求項７５】
キメラＧα蛋白質が、下記の（１）〜（２０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのキメラＧα蛋白質である、請求項６８に記載の細胞株。
（１）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（２）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（３）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（４）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（５）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（６）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（７）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（８）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（９）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１０）ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１１）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｓのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１２）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１３）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１４）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１５）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１６）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１７）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１８）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（１９）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（２０）ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
【請求項７６】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項６８に記載の細胞株。
【請求項７７】
誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子であり、キメラＧα蛋白質が、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質またはＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質である、請求項６８に記載の細胞株。
【請求項７８】
下記（１）〜（４）の工程を有する、被検物質に反応するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
（１）請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株に、任意のｃＤＮＡまたは染色体由来のＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
（２）導入したｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（３）導入したｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（４）上記（２）と（３）の応答反応を比較し、異なる応答反応を示す形質転換株を選択し、該株に導入したＤＮＡを同定する
【請求項７９】
下記（１）〜（７）の工程を有する、被検物質に反応するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
（１）発現ベクターを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを１〜１００００のクローンずつのプールに分ける。
（２）各プールに由来するｃＤＮＡクローンの混合物を、請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株に導入して形質転換株を取得する、
（３）各プールごとに、導入したｃＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（４）各プールごとに、導入したｃＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（５）上記（３）と（４）の応答反応を比較し、異なる応答反応を示すプールを選択し、選択したプールを（１）よりも細かいプールに分ける。
（６）（２）〜（５）の操作をプールが１クローンごとになるまで繰り返す。
（７）被検物質の存在下と非存在下で異なる応答反応を示す形質転換株を同定し、該株に導入したＤＮＡを同定する
【請求項８０】
細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、請求項７８または７９に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８１】
被検物質が、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の細胞株を培養することにより得られる被検物質である、請求項７８または７９に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８２】
ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原の活性を抑制または消失させる温度で培養を行うことを特徴とする、請求項７８〜８１のいずれか１項に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８３】
下記（１）〜（５）の工程を有する、ペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
（１）請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株から選ばれる、転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクトが染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
（２）該宿主細胞に、任意のｃＤＮＡまたは染色体由来のＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
（３）上記（２）で取得された形質転換株において、導入したｃＤＮＡまたはＤＮＡを発現させたときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
（４）宿主細胞における、あるいは上記（２）で取得された形質転換株において、導入したｃＤＮＡまたはＤＮＡを発現させていないときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
（５）上記（３）と（４）のレポーター遺伝子の発現量を比較し、異なるレポーター遺伝子の発現量を示す形質転換株を選択し、該株に導入したＤＮＡを同定する
【請求項８４】
下記（１）〜（８）の工程を有する、ペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
（１）誘導発現ベクターを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを１〜１００００のクローンずつのプールに分ける
（２）請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株から選ばれる、転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクトが染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
（３）上記（１）で分けた、各プールに由来するｃＤＮＡクローンの混合物を、上記（２）で取得した宿主細胞に導入して、各プールごとに形質転換株を取得する
（４）上記（３）の各プールごとの形質転換株において、導入したｃＤＮＡを発現させたときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
（５）上記（３）の各プールごとの形質転換株において、導入したｃＤＮＡを発現させないときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
（６）上記（４）および（５）のレポーター遺伝子の発現量をプールごとに比較し、
（４）のレポーター遺伝子の発現量の多いプールの形質転換株を選択し、選択したプールを（１）よりも細かいプールに分ける
（７）上記（２）〜（６）の操作をプールが１クローンごとになるまで繰り返す
（８）導入したｃＤＮＡを、発現させないときよりも発現させたときのレポーター遺伝子の発現量の多い形質転換株を同定し、該株に導入したＤＮＡを同定する
【請求項８５】
ペプチドが、受容体、転写因子、シグナル伝達分子、または酵素である、請求項７８、７９、８３または８４に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８６】
受容体がＧ蛋白質共役型受容体である、請求項８５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８７】
受容体が構成活性型のＧ蛋白質共役型受容体である、請求項８５に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８８】
Ｇ蛋白質共役型受容体がオーファンＧ蛋白質共役型受容体である、請求項８６または８７に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項８９】
ペプチドが、転写因子の応答配列を有するプロモーターの活性を増加させる活性を有する転写因子、シグナル伝達分子、または酵素である、請求項７８、７９、８３または８４に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項９０】
ｃＤＮＡが変異Ｇ蛋白質共役型受容体をコードするランダム変異導入ｃＤＮＡ、ペプチドが構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体あることを特徴とする、請求項７８、７９、８３または８４に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項９１】
ランダム変異を導入する部位が、Ｇ蛋白質共役型受容体の第３膜貫通領域の後半から第２細胞内領域の前半部分あるいは第３細胞内領域の後半から第６膜貫通領域の前半部分であることを特徴とする、請求項９０に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項９２】
ランダム変異を導入する部位が、Ｇ蛋白質共役型受容体における保存アミノ酸残基の一つである第６膜貫通領域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリン残基に相応するアミノ酸残基よりＮ末側に２０残基目または２２残基目のアミノ酸であることを特徴とする、請求項９０または９１に記載のＤＮＡの取得方法。
【請求項９３】
請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の方法を用いて取得される構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体。
【請求項９４】
Ｇ蛋白質共役型受容体における保存アミノ酸残基の一つである第６膜貫通領域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリン残基に相応するアミノ酸残基よりＮ末側に２０残基目または２２残基目のアミノ酸に変異を有する構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体。
【請求項９５】
ＯＧＲ１のＮ末端より２２１番目のセリンをアスパラギンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＯＧＲ１のＮ末端より１１８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＯＧＲ１のＮ末端より１１８番目のアスパラギン酸をアラニンに、かつ２２１番目のセリンをアスパラギンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＲＥ２のＮ末端より１２４番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＧＰＲ３５のＮ末端より１１３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＧＰＣＲ２５のＮ末端より１１１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＰＧＭＯ３３４のＮ末端より１３５番目のグルタミン酸をフェニルアラニン、グルタミンまたはアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＰＧＭＯ３３４のＮ末端より２５９番目のアスパラギン酸をセリンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＧＰＲ４３のＮ末端より２１７番目のアルギニンをプロリンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、およびＧＰＲ４３のＮ末端より２１７番目のアルギニンをプロリンに、かつ１０６番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体からなる群より選ばれる構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体。
【請求項９６】
１型メラノコルチン受容体（ＭＣ１Ｒ）および、ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−２０  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ）またはＰＡＭＰのＮ末端から９〜２０番目のアミノ酸残基からなるペプチドを用いた、ＭＣ１Ｒのアンタゴニストの探索法または取得法。
【請求項９７】
オーファンＧ蛋白質共役型受容体ＧＰＲ４３および、酢酸、プロピオン酸、酢酸塩、またはプロピオン酸塩を用いた、ＧＰＲ４３のアンタゴニストの探索法または取得法。
【請求項９８】
オーファンＧ蛋白質共役型受容体ＧＰＲ４１および、シクロプロパンカルボン酸、プロピオン酸、シクロプロパンカルボン酸塩、またはプロピオン酸塩を用いた、ＧＰＲ４１のアンタゴニストの探索法または取得法。
【請求項９９】
オーファンＧ蛋白質共役型受容体Ｇ１０ｄおよび、α−メラノサイト刺激ホルモンまたは副腎皮質刺激ホルモンを用いた、Ｇ１０ｄのアンタゴニストの探索法または取得法。
【請求項１００】
下記（１）〜（４）の工程を有する、Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストの取得法。
（１）請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株に、任意のＧ蛋白質共役型受容体をコードするＤＮＡ導入して形質転換株を取得する
（２）導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（３）導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（４）上記（２）と（３）を比較し、応答反応の変化を誘発する被検物質をアゴニストとして取得する
【請求項１０１】
下記（１）〜（４）の工程を有する、Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストの取得法。
（１）請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株に、任意のＧ蛋白質共役型受容体をコードするＤＮＡ導入して形質転換株を取得する
（２）導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストの存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（３）導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストと被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（４）アゴニストに基づく該形質転換株の応答反応を消失させる被検物質をアンタゴニストとして取得する
【請求項１０２】
細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、請求項１００または１０１に記載のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストまたはアンタゴニストの取得法。
【請求項１０３】
下記（１）〜（５）の工程を有する、Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたはインバースアゴニストの取得法。
（１）請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株から選ばれる、転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクトが染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
（２）該宿主細胞に、任意の構成活性型Ｇ蛋白質共役型受容体をコードするＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
（３）被検物質の非存在下、導入したＤＮＡを発現させた形質転換株でのレポーター遺伝子の発現量を測定する
（４）被検物質の存在下、導入したＤＮＡを発現させた形質転換株でのレポーター遺伝子の発現量を測定する
（５）上記（３）および（４）のレポーター遺伝子の発現量を比較し、レポーター遺伝子の発現量を低下させる被検物質を、（２）のＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたはインバースアゴニストとして取得する
【請求項１０４】
下記（１）〜（４）の工程を有する、転写因子、シグナル伝達分子および酵素からなる群より選ばれるペプチドの活性化剤または阻害剤の取得法。
（１）請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株に、任意の転写因子、シグナル伝達分子および酵素からなる群より選ばれるペプチドをコードするＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
（２）導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（３）導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
（４）上記（２）と（３）を比較し、応答反応を変動させる被検物質を、該ペプチドの活性化剤または阻害剤として取得する
【請求項１０５】
細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、請求項１０４に記載の取得法。
【請求項１０６】
宿主細胞として請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の細胞株を、ベクターとして任意のプロモーターとエプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のｏｒｉＰを有する発現ベクターを用いることを特徴とする、宿主・ベクター系。
【請求項１０７】
任意のプロモーターがＧａｌ４ｐ応答性の誘導発現プロモーターである、請求項１０６に記載の宿主・ベクター系。
【請求項１０８】
発現ベクターが、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏ−ｎｄ、ｐＡＭｏ−ｄ、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ、またはｐＡＧａｌ９−ｄであることを特徴とする、請求項１０６または１０７に記載の宿主・ベクター系。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法、該ペプチドの検出または取得方法、これらの方法に用いる内分泌細胞由来の細胞株、該内分泌細胞由来の細胞株を用いたペプチドの製造方法、上記の方法に用いる受容体を発現させるＢ細胞株、該Ｂ細胞株を用いた被検物質に反応するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法、該Ｂ細胞株を用いたペプチドをコードするＤＮＡの取得方法、該取得方法により得られる構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、該Ｂ細胞株を用いたＧ蛋白質共役型受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストの取得方法、該Ｂ細胞株を用いたペプチドの活性化剤または阻害剤の取得法。該Ｂ細胞株を宿主として用いる宿主・ベクター系に関する。
背景技術
一般に、ペプチド性のホルモンや神経伝達物質は、前駆体（プレプロ体）として生産された後、複数のプロセシング酵素や修飾酵素が作用することにより、最終的に活性型のペプチドとなることが知られている〔Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２，３１（１９９８）〕。
特定のプロセシング酵素や修飾酵素は、特定の内分泌細胞にしか発現していないため、例えば視床下部、脳下垂体、あるいは膵臓のランゲルハンス氏島の神経細胞や内分泌細胞で生産される活性ペプチド（例えばバソプレッシンやグルカゴン）の前駆体遺伝子を、遺伝子発現によく使用されるＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞などの非内分泌系の細胞で発現させても、一般に活性型のペプチドは生産されない。
内分秘細胞のように、もともと特定の活性ペプチドを生産する能力のある細胞は、該活性ペプチドのプロセシング酵素や修飾酵素を発現しているため、該細胞を宿主として該ペプチドの前駆体遺伝子を発現させれば、該ペプチドを活性のある形で発現することが可能と考えられる。また、該細胞で発現しているプロセシング酵素や修飾酵素によって正常のプロセシングや修飾を受けることのできる他の活性ペプチドに関しても、該細胞を宿主としてその前駆体遺伝子を発現させることにより、活性のあるペプチドを発現することができると考えられる。
内分泌細胞より樹立した株化細胞（以下、内分泌細胞株と呼ぶ）に既知の活性ペプチド前駆体遺伝子を導入して発現させ、活性ペプチドを生産させる方法として、放射線照射により誘発したラットのランゲルハンス氏島の癌細胞より樹立されたＲＩＮ細胞に、プレプロインスリン遺伝子またはプレプロアミリン遺伝子を導入して発現させ、インスリンやアミリンを生産させる方法（ＵＳ６１９４１７６、ＵＳ６１１０７０７）、トランスジェニックマウスに生じた腫瘍β細胞から樹立されたＭＩＮ６細胞株に、プレプロインスリン遺伝子を導入して発現させ、Ｃペプチドを生産する方法〔Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，８０５（２０００）〕等が知られている。
上記のように、内分泌細胞株を用いた既知の活性ペプチドの生産方法は幾つか知られているが、該分泌細胞株が新規の活性ペプチドを探索するために有用であることを記載あるいは示唆する文献はない。
また、新たな活性を有するペプチドや該ペプチドをコードする遺伝子を効率良く見出すためには、遺伝子発現用の宿主として使用する内分泌細胞株、遺伝子ソースとして使用する内分泌細胞株、およびペプチドの活性を検出するためのアッセイ系などに関してさらなる改善が求められている。
内分泌細胞株としては、これまでに下記のような（１）視床下部由来あるいは（２）ランゲルハンス氏島由来の細胞株が知られている。
（１）視床下部由来の細胞株
視床下部由来の細胞株として、下記（ｉ）〜（ｖ）の細胞株が知られている。
（ｉ）マウス胎児（胎生１４日目）の視床下部由来の初代培養細胞をＳＶ４０に感染させることにより取得された不死化細胞
上記不死化細胞として、ＨＴ９、該ＨＴ９細胞由来のシングルクローン細胞（ＨＴ９−Ｃ７）等が知られている。ＨＴ９−Ｃ７はニューロフィジンおよびバソプレッシンを発現する〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１，３５７５（１９７４）〕。
（ｉｉ）ラット胎児（胎生１６日目）の視床下部由来の初代培養細胞をＳＶ４０に感染させることにより取得された不死化細胞株
上記不死化細胞として、ＲＣＦ−８、ＲＣＡ−６、ＲＣＦ−２７、ＲＣＤ−１５、Ｄ１２等が知られている。これらの細胞株はエストロゲン受容体を発現する〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２６，２３５（１９９０）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２３９２８（１９９９）〕。
（ｉｉｉ）ラット胎児（胎生１５日および１６日目）の視交差上核由来の初代培養細胞を、アデノウイルス２とアデノウイルス５のハイブリッドＥ１Ａ  １２Ｓを発現可能なレトロウイルスに感染させることにより取得された、２種の視交差上核由来の不死化細胞株
上記不死化細胞として、ＳＣＮ１．４、ＳＣＮ２．２等が知られている〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，３９，１（１９９９）〕。ＳＣＮ１．４およびＳＣＮ２．２の細胞株の大部分はグリア細胞様の形態を示すが、グリア細胞特異的抗原の発現は限られている。また、一部の細胞は神経細胞に特徴的な性質を示し、神経細胞特異的抗原や視交差上核の神経細胞で発現している神経ペプチドであるソマトスタチン、ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）、ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）、またはアルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ）を発現し、視交差上核の神経細胞では発現のみられないオキシトシンやコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）は発現しない。細胞の分化を促す条件下で培養すると、上記で発現のみられた神経ペプチドを発現する細胞の数が増加する。
（ｉｖ）視床下部で発現するゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）遺伝子のプロモーターを用いてＳＶ４０ラージＴ抗原を発現させたトランスジェニックマウスの後脳にできた腫瘍から樹立された細胞株
上記細胞株として、ＧＴ１、ＧＴ１−１、ＧＴ１−３、ＧＴ１−７等が知られている〔Ｎｅｕｒｏｎ，５，１（１９９０）〕。ＧＴ１−１およびＧＴ１−７細胞はＧｎＲＨ産生能を保持しており、ＧｎＲＨの発現調節機構の解析に使用されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１８５２（１９９２）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，（１９９９）〕。
（ｖ）視床下部で発現するＧｎＲＨ遺伝子のプロモーターを用いてＳＶ４０ラージＴ抗原を発現させたトランスジェニックマウスの嗅球にできた腫瘍から樹立された細胞株
上記細胞株として、ＧＮ等が知られている。ＧＮ細胞はＧｎＲＨを発現している〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，３４０２（１９９１）〕。
内在性のレプチン受容体を発現する視床下部由来の細胞株が取得できれば、個々の神経細胞に対するレプチンの生物学的機能を解析することが可能になるが、上記視床下部由来の細胞株はいずれも、レプチン受容体を発現しておらず、これまでに内在性のレプチン受容体を発現する視床下部由来の細胞株は知られていない〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４９，１４４３（２０００）、Ｎｅｕｒｏｎ，５，１（１９９０）〕。
レプチンは抗肥満薬や抗糖尿病薬として開発が進んでいるが、レプチン抵抗性の問題から、レプチンに変わる薬物の開発が求められている。レプチンの作用メカニズムの解明は、新たな生理活性物質の発見や創薬ターゲットの同定につながると考えられる。内在性のレプチン受容体を発現する視床下部由来の細胞株が取得できれば、該細胞株を用いて上記薬物のスクリーニングや評価を行うことも可能となる。
レプチン受容体遺伝子だけでなく、プレプロニューロメディンＵ遺伝子、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）プレプロ蛋白質遺伝子、プレプロオレキシン遺伝子、プレプロオピオメラノコルチン遺伝子、プレプロニューロペプチドＹ遺伝子、プレプロニューロペプチドＦＦ遺伝子、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプログレリン遺伝子、プレプロメラニン凝集ホルモン遺伝子、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）遺伝子、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）遺伝子、ＲＦＲＰ受容体遺伝子、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）遺伝子、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）遺伝子、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）遺伝子、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）遺伝子、２型コルチコトロビン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）遺伝子、グレリン受容体遺伝子、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）遺伝子、スルホニルウレア受容体遺伝子またはプレプロアグーチ関連ペプチド遺伝子、あるいはこれら遺伝子にコードされたポリペプチドを発現する視床下部由来の細胞株も知られていない。
視床下部は生命を維持するために最も重要な統制的機能を有しており、薬物のターゲット部位としても注目されている。したがって、機能を保持した視床下部由来の細胞株が取得できれば、個々の視床下部神経細胞の機能を、細胞レベルおよび分子レベルで研究することが可能になる。また、視床下部神経細胞をターゲットとした薬物の開発にも極めて有用である。視床下部に存在する内分泌性細胞は様々な活性ペプチドを生産していることが知られているため、多様な視床下部由来細胞株は、新たな活性ペプチドを探索する上でも非常に有用なソースとなると考えられる。
（２）ランゲルハンス氏島由来の細胞株
これまで、ランゲルハンス氏島由来の細胞株として、下記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の細胞株が知られている。
（ｉ）放射線で誘発したランゲルハンス氏島由来の癌から樹立された細胞株
上記樹立株として、ＲＩＮ−ｍ細胞（ラット細胞）、ＩＮＳ−１細胞（ラット細胞）、ＲＩＮ−ｍ細胞由来のシングルクローン細胞（ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＩＮ−１４Ｂ、ＲＩＮ−ｍ５Ｆ）等が知られている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，６２８（１９７７）；Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１７５，３５（１９８４）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１６７（１９９２）〕。放射線による癌の誘発頻度は低いため、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞（β細胞等）しか癌化しないと考えられる。従って、上記樹立株は特定の細胞の癌化細胞由来と考えられる。
（ｉｉ）ハムスターのインスリノーマから樹立された細胞株
上記樹立株として、Ｉｎ−Ｒ１−Ｇ１、Ｉｎ−Ｒ１−Ｇ３、Ｉｎ−Ｒ１−Ｇ７、Ｉｎ−Ｒ１−Ｇ９、Ｉｎ−Ｒ１−Ｇ１０、Ｉｎ−Ｒ１−Ｇ１１等が知られている〔Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２２，１２０（１９８６）〕。これら樹立株も、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
（ｉｉｉ）ランゲルハンス氏島の初代培養細胞をＳＶ４０でトランスフォームすることによって樹立された細胞株
上記樹立株として、ハムスター由来のＨＩＴ細胞等が知られている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，４３３９（１９８１）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１９，５４７（１９８４）〕。ＳＶ４０による形質転換頻度は低く、また細胞の種類により該頻度が異なることより、これら樹立株も、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞（β細胞等）の癌化細胞株と考えられている。
（ｉｖ）インスリンプロモーターのコントロール下にＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するトランスジェニックマウスに生じたβ細胞由来と考えられる腫瘍から樹立された細胞株
上記樹立株として、βＴＣ細胞、ＮＩＴ−１細胞、ＭＩＮ６細胞等が知られている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，９０３７（１９８８）；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４０，８４２（１９９１）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６（１９９０）〕。ここでＳＶ４０ラージＴ抗原は、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞（β細胞等）でのみ発現するため、特定の細胞のみが不死化されていると考えられる。従って、これら樹立株も、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
（ｖ）インスリンプロモーターのコントロール下に転写因子を発現するトランスジェニックマウスと該転写因子で活性化されるプロモーターのコントロール下にＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するトランスジェニックマウスを掛け合せることによって生まれたマウスに生じたβ細胞由来と考えられる腫瘍から樹立された細胞株
上記樹立株として、βＴＣ−ｔｅｔ細胞等が知られている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３５７６（１９９５）〕。上記（ｉｖ）同様、これら樹立株も、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
（ｖｉ）プレグルカゴンプロモーターのコントロール下にＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するトランスジェニックマウスに生じたアデノーマから樹立された細胞株
上記樹立株として、αＴＣ１細胞〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３９，４０６（１９９０）；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３９，４１５（１９９０）〕、αＴＣ１細胞由来のシングルクローン細胞αＴＣ１  ｃｌｏｎｅ  ９等が知られている。ここでＳＶ４０ラージＴ抗原は、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞（α細胞等）でのみ発現するため、特定の細胞のみが不死化されていると考えられる。従って、これら樹立株も、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
（ｖｉｉ）ｅｌａｓｔａｓｅ−１プロモーターのコントロール下にＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するトランスジェニックマウスに生じた膵臓癌から樹立された細胞株
上記細胞株として、ＴＧＰ５２がある〔Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１５，６１（１９９４）〕。ここでＳＶ４０ラージＴ抗原は、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞でのみ発現するため、特定の細胞のみが不死化されていると考えられる。従って、この樹立株も、ランゲルハンス氏島に存在する特定の細胞の癌化細胞株と考えられている。
上記ランゲルハンス氏島の細胞より樹立した細胞株はいずれも、癌細胞あるいは癌由来の細胞であるため、正常の細胞とは異なる性質を有する可能性がある。
新たな生理活性物質、受容体、リガンド、あるいは活性ペプチドなどを探索する上では、正常の細胞の性質を保持したさらに多様な細胞株の取得が望まれる。ランゲルハンス氏島の各種細胞はお互いを制御し合っていると考えられているため、多様な細胞株を取得し、それらを共培養することで個々の細胞の役割を解析することが可能になる。
また、同じ遺伝的バックグラウンドを有するランゲルハンス氏島由来の多様な細胞株が取得できれば、個々の細胞株の分化ステージや機能を比較解析する上でも有用である。これまでは、同じ遺伝的バックグラウンドを有する、ランゲルハンス氏島由来の多種の不死化細胞は存在しなかった。
ランゲルハンス氏島に存在する内分泌性細胞は、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、膵ポリペプチドをはじめ、様々な活性ペプチドを生産していることが知られているため、該内分泌性細胞は新たな活性ペプチドを探索する上でも非常に有用なソースとなると考えられる。
内分泌細胞株または任意の遺伝子を導入した内分泌細胞から生産されるペプチドの活性を効率良く調べるためには、該ペプチドの活性を検出できる高感度で簡便なアッセイ系が必要である。新たな活性を有するペプチドや該ペプチドをコードする遺伝子を効率良く見出すためには、高感度で簡便な、多様なアッセイ系が必要となる。また、多様な内分泌細胞株をペプチドソースまたは遺伝子ソースとして用いることにより、新たな活性を有するペプチドや該ペプチドをコードする遺伝子を効率良く見出すことができると考えられる。
これまでに多くのアッセイ系が構築されている。感度のよいアッセイ系として、例えばバイオアッセイ系等をあげることができる。
バイオアッセイ系の場合、どのような細胞を使用するかにより検出感度、シグナル／ノイズ比、汎用性、および簡便性が大きく変わる。該細胞として形質転換体を使用する場合には、遺伝子導入効率がよいか、遺伝子の発現量が高いか、遺伝子の誘導発現が可能か、該誘導発現の倍率が高いか等で、アッセイ効率に大きな影響を与える。動物細胞を使用する場合には、無血清培地で培養が可能か、生育が良好な非接着性細胞（浮遊系細胞）であるか等で、アッセイ効率が大きく変わる。
活性ペプチド（リガンド）の探索に使用可能なアッセイ系の例としては、Ｇ蛋白質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲと略すこともある）を利用したバイオアッセイ系が知られている。該ＧＰＣＲバイオアッセイ系により、新規リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストが取得されている。ＧＰＣＲは、Ｇα、Ｇβ、Ｇγの３種のＧ蛋白質（ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）から構成されるヘテロ三量体Ｇ蛋白質と共役し、Ｇ蛋白質の活性化を通して細胞内にシグナルを伝達する。ＧＰＣＲは７個の膜貫通領域を有することから、７回膜貫通型受容体とも呼ばれる。
該ＧＰＣＲバイオアッセイ系には、細胞内Ｃａ２＋量の増加を検出する方法、レポーター系を用いる方法等多くの方法が知られている。
ＧＰＣＲは共役するＧ蛋白質のサブタイプの違いによって、異なるシグナルを流す。レポーター系を用いる方法の場合、レポーター遺伝子を発現させるためのプロモーターとしてどのようなものを使用するかにより、検出できるシグナル、感度、シグナル／ノイズ比等が異なる。
プロモーターとしては、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）を有するプロモーター、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答性プロモーター、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーター、血清応答配列（ＳＲＥ）を有するプロモーター等が利用されている。
ＧＰＣＲと共役するＧαの立体構造は既に明らかにされており、ＧＰＣＲとの相互作用に重要であるＧα蛋白質のＣ末端のアミノ酸を他のＧα蛋白質の対応するアミノ酸に置換することにより、本来共役しないＧＰＣＲと共役できるようになることが知られている〔Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，１３（２０００）〕。
例えば、ＧαｑのＣ末端の５アミノ酸をＧαｉのものに置換したキメラＧα蛋白質（Ｇαｑ−ｉ）は、Ｇαｉに共役してシグナルを流すＧＰＣＲと、ＧαｓのＣ末端の５アミノ酸をＧαｑのものに置換したキメラＧα蛋白質（Ｇαｓ−ｑ）は、Ｇαｑに共役してシグナルを流すＧＰＣＲと、ＧαｓのＣ末端の５アミノ酸をＧαｉのものに置換したキメラＧα蛋白質（Ｇαｓ−ｉ）は、Ｇαｉに共役してシグナルを流すＧＰＣＲと共役することができるようになる。
ＧＰＣＲには、細胞内で過剰に発現すると、リガンドが存在しなくてもシグナルを流す、構成活性型ＧＰＣＲと呼ばれるＧＰＣＲが知られている。リガンド非存在時に流れるシグナルのことを構成的活性と呼ぶ。構成活性型ＧＰＣＲには、天然に存在するものと、アミノ酸の置換、欠失などの変異を導入することにより造成された変異ＧＰＣＲ〔Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，８９０（２０００）；ＷＯ９８／４６９９５〕がある。該変異ＧＰＣＲは、アゴニストとの親和性が増加する場合があるため、リガンドの探索に有用である〔Ｊ−Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８２２（１９９７）〕。
ＧＰＣＲバイオアッセイ系では、アッセイ用の細胞として、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞等の動物細胞、カエルのメラノフォア〔Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，１２５（２０００）〕あるいは酵母〔Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４８７（１９９７）；Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，４９−６８（２０００）〕等が利用されている。
上記のＧＰＣＲバイオアッセイ系は優れたアッセイ系であるが、検出感度、シグナル／ノイズ比、汎用性、簡便性、および使用する宿主・ベクター系などに関して更なる改善が求められている。
上記のようなアッセイ細胞を宿主として発現クローニングを行えば、有用な遺伝子を効率的に取得することが可能であり、これまでにレポーター遺伝子の発現を指標にして、インターフェロンγ受容体のβ鎖やＰＡＣＡＰ（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｙｌｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）受容体の遺伝子が取得されている〔Ｎａｔｕｒｅ，３６５，１７０（１９９３）；Ｃｅｌｌ，７６，８０３（１９９４）〕。しかし、該発現クローニング法に関してもＧＰＣＲバイオアッセイ系と同様の改善が求められている。また、構成活性型のＧＰＣＲ遺伝子を発現クローニング法により取得可能であることに関する記載も示唆もない。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（５）を提供することを課題としている。
（１）哺乳動物の内分泌細胞由来の多様な細胞株。
（２）該細胞株を宿主として用いた、活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ペプチドの生産法。
（３）該細胞株を用いた、該細胞に作用する物質の探索法や評価法。
（４）該細胞株を用いた有用遺伝子、有用ペプチドの探索法および取得法。
（５）上記の発現クローニング系で使用する高感度で簡便なＧＰＣＲリガンドのアッセイ系。
本発明は以下の（１）〜（１０６）に関する。
（１）下記［１］〜［５］の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
［１］任意のｃＤＮＡまたは染色体由来のＤＮＡを内分泌細胞由来の細胞株に導入して形質転換株を取得する
［２］上記［１］の形質転換株を培養し、導入したＤＮＡを発現させた後、該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身を、目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
［３］該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
［４］該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身が目的の活性を示した形質転換株を選択する
［５］上記［４］の形質転換株に導入したＤＮＡを、形質転換株に目的の活性を与えるＤＮＡとして同定する
（２）下記［１］〜［７］の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
［１］発現ベクターを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを１〜１００００のクローンずつのプールに分ける
［２］各プールに由来するｃＤＮＡクローンの混合物を内分泌細胞由来の細胞株に導入して形質転換株を取得する
［３］上記［２］の形質転換株を各プールごとに培養して、導入したｃＤＮＡを発現させた後、該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身を、プールごとに目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
［４］該受容体に基づく細胞の応答反応をプールごとに検出する
［５］該形質転換株の培養上清、細胞抽出液、膜画分、または該形質転換株自身が目的の活性を示したプールを選択し、選択したプールを［１］よりも細かいプールに分ける
［６］［２］〜［５］の操作をプールが１クローンごとになるまで繰り返す
［７］形質転換株に目的の活性を与えるｃＤＮＡを同定する
（３）任意のｃＤＮＡまたは染色体由来の遺伝子が、活性ペプチド前駆体をコードする遺伝子である、（１）または（２）に記載のＤＮＡの取得方法。
（４）受容体がＧ蛋白質共役型受容体である、（１）または（２）に記載のＤＮＡの取得方法。
（５）Ｇ蛋白質共役型受容体がオーファンＧ蛋白質共役型受容体である、（４）に記載のＤＮＡの取得方法。
（６）内分泌細胞由来の細胞株が、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子を発現する内分泌細胞由来の細胞株である、（１）または（２）に記載のＤＮＡの取得方法。
（７）内分泌細胞由来の細胞株が、ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原遺伝子を発現する内分泌細胞由来の細胞株である、（１）または（２）に記載のＤＮＡの取得方法。
（８）内分泌細胞由来の細胞株が、非ヒト・トランスジェニック動物細胞由来の細胞株である、（１）、（２）、（６）または（７）に記載のＤＮＡの取得方法。
（９）非ヒト・トランスジェニック動物がトランスジェニックラットである（８）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１０）ＳＶ４０の温度感受性変異株がＳＶ４０ｔｓＡ５８である（７）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１１）内分泌細胞由来の細胞株が、視床下部またはランゲルハンス氏島由来の細胞株である、（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１２）内分泌細胞由来の細胞株が、レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）遺伝子、プレプロニューロメディンＵ遺伝子、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）プレプロ蛋白質遺伝子、プレプロオレキシン遺伝子、プレプロオピオメラノコルチン遺伝子、プレプロニューロペプチドＹ遺伝子、プレプロニューロペプチドＦＦ遺伝子、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプログレリン遺伝子、プレプロメラニン凝集ホルモン遺伝子、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）遺伝子、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）遺伝子、ＲＦＲＰ受容体遺伝子、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）遺伝子、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）遺伝子、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）遺伝子、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）遺伝子、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）遺伝子、グレリン受容体遺伝子、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）遺伝子、プレプロアグーチ関連ペプチド遺伝子、スルホニルウレア受容体遺伝子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体遺伝子、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）遺伝子、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）遺伝子、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）遺伝子、１型アンジオテンシンＩＩ受容体遺伝子、ガラニン受容体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、およびグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現する視床下部由来細胞である、（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１３）内分泌細胞由来の細胞株が、レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）、ニューロメディンＵ、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）蛋白質、オレキシン、オピオメラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＦＦ、コルチコトロピン放出ホルモン、サイロトロピン放出ホルモン、グレリン、メラニン凝集ホルモン、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）、ＲＦＲＰ受容体、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）、グレリン受容体、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）、アグーチ関連ペプチド、スルホニルウレア受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体、ガラニン受容体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体、およびエンドルフィンからなる群より選ばれるペプチドの少なくとも１つのペプチドを内因性に発現する視床下部由来の細胞である、（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１４）内分泌細胞由来の細胞株の細胞が、プレプロインスリン遺伝子、プレプログルカゴン遺伝子、プレプロソマトスタチン遺伝子、プレプロ膵ポリペプチド遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ１（ＰＣ１）遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ２（ＰＣ２）遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、ニューロジェニン３遺伝子、ニューロＤ遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、２型グルコーストランスポーター遺伝子、ベータセルリン遺伝子、スルホニルウレア遺伝子、Ｐ２Ｙ１受容体遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、１型ソマトスタチン受容体遺伝子、２型ソマトスタチン受容体遺伝子、３型ソマトスタチン受容体遺伝子、４型ソマトスタチン受容体遺伝子、５型ソマトスタチン受容体遺伝子、インスリン受容体遺伝子、グルコーストランスポーター遺伝子、およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現するランゲルハンス氏島由来細胞である、（１）、（２）、（６）、（７）または（８）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１５）受容体を発現する細胞が、下記の［１］〜［３］の少なくとも１つが染色体ＤＮＡに組み込まれた、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である、（１）または（２）に記載のＤＮＡの取得方法。
［１］誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するためのＤＮＡコンストラクト
［２］転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクト
［３］Ｇα蛋白質またはキメラＧα蛋白質を発現するためのＤＮＡコンストラクト
（１６）Ｂ細胞株が、無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１７）無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞である、（１６）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１８）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（１９）転写因子の応答配列が、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答配列、または血清応答配列（ＳＲＥ）である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（２０）レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（２１）Ｇα蛋白質が、Ｇα１６、Ｇα１５、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｇｕｓｔ、Ｇαｔ、およびＧα１４からなる群より選ばれるの少なくとも１つのＧα蛋白質である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（２２）キメラＧα蛋白質が、下記の［１］〜［２］からなる群より選ばれる少なくとも１つのキメラＧα蛋白質である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
［１］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［２］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［３］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［４］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［５］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［６］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［７］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［８］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［９］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１０］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１１］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｓのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１２］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１３］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１４］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１５］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１６］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１７］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１８］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１９］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［２０］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（２３）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（２４）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子であり、キメラＧα蛋白質が、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質またはＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質である、（１５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（２５）細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、（１）または（２）に記載のＤＮＡの取得方法。
（２６）目的とする受容体を発現する細胞との接触が、該細胞を形質転換株上に重層することによる接触である、（１）または（２）に記載のＤＮＡの取得方法。
（２７）レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）遺伝子、プレプロニューロメディンＵ遺伝子、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）プレプロ蛋白質遺伝子、プレプロオレキシン遺伝子、プレプロオピオメラノコルチン遺伝子、プレプロニューロペプチドＹ遺伝子、プレプロニューロペプチドＦＦ遺伝子、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプログレリン遺伝子、プレプロメラニン凝集ホルモン遺伝子、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）遺伝子、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）遺伝子、ＲＦＲＰ受容体遺伝子、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）遺伝子、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）遺伝子、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）遺伝子、１型コルチコトロビン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）遺伝子、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）遺伝子、グレリン受容体遺伝子、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）遺伝子、プレプロアグーチ関連ペプチド遺伝子、スルホニルウレア受容体遺伝子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体遺伝子、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）遺伝子、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）遺伝子、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）遺伝子、１型アンジオテンシンＩＩ受容体遺伝子、ガラニン受容体遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、およびグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
（２８）レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）、ニューロメディンＵ、ＲＦａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＦＲＰ）蛋白質、オレキシン、オピオメラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＦＦ、コルチコトロピン放出ホルモン、サイロトロピン放出ホルモン、グレリン、メラニン凝集ホルモン、ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）、２型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）、ＲＦＲＰ受容体、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）、１型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）、５型ニューロペプチドＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）、２型ニューロペプチドＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２）、１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）、２型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−２）、グレリン受容体、１型メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ１）、アグーチ関連ペプチド、スルホニルウレア受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、１型ニューロメディンＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体、ガラニン受容体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）受容体、およびエンドルフィンからなる群より選ばれるペプチドの少なくとも１つのペプチドを内因性に発現する視床下部由来の細胞株。
（２９）細胞株が、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子を発現する細胞株である、（２７）または（２８）に記載の細胞株。
（３０）細胞株が、ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原遺伝子を発現する細胞株である、（２７）または（２８）に記載の細胞株。
（３１）細胞株が、非ヒト・トランスジェニック動物細胞由来の細胞株である、（２７）〜（３０）のいずれか１項に記載の細胞株。
（３２）ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原遺伝子を導入した非ヒト・トランスジェニック動物の視床下部またはランゲルハンス氏鳥から得られる不死化した細胞株。
（３３）ランゲルハンス氏島から得られる不死化した細胞株が、プレプロインスリン遺伝子、プレプログルカゴン遺伝子、プレプロソマトスタチン遺伝子、プレプロ膵ポリペプチド遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ１（ＰＣ１）遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ２（ＰＣ２）遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、ニューロジェニン３遺伝子、ニューロＤ遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、２型グルコーストランスポーター遺伝子、ベータセルリン遺伝子、スルホニルウレア遺伝子、Ｐ２Ｙ１受容体遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、１型ソマトスタチン受容体遺伝子、２型ソマトスタチン受容体遺伝子、３型ソマトスタチン受容体遺伝子、４型ソマトスタチン受容体遺伝子、５型ソマトスタチン受容体遺伝子、インスリン受容体遺伝子、グルコーストランスポーター遺伝子、およびネスチン遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を内因性に発現する細胞株である、（３２）に記載の細胞株。
（３４）ＳＶ４０の温度感受性変異株がＳＶ４０ｔｓＡ５８である（３０）または（３２）に記載の細胞株。
（３５）非ヒト・トランスジェニック動物がトランスジェニックラットである（３１）または（３２）に記載の細胞株。
（３６）下記［１］および［２］の工程を有する、ペプチドの製造方法。
［１］（２７）〜（３５）のいずれか１項に記載の細胞株を培養し、該細胞株が内在的に発現しているペプチドを培養物中に生成蓄積させる
［２］上記［１］で得られた培養物から該ペプチドを採取する
（３７）下記［１］〜［３］の工程を有する、ペプチドの製造方法。
［１］（２７）〜（３５）のいずれか１項に記載の細胞株を宿主細胞として用い、該宿主細胞に目的とするペプチドをコードするＤＮＡを導入し、形質転換株を取得する
［２］該形質転換株を培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させる
［３］上記［２］で得られた培養物から該ペプチドを採取する
（３８）培養を、ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原の活性を抑制しない温度で行うことを特徴とする、（３６）または（３７）に記載の製造法。
（３９）製造において、無血清培地、２％以下の血清を含む培地、または無血清培地にＮ−サプリメントを添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、（３６）〜（３８）のいずれか１項に記載の製造法。
（４０）製造において、５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含有する培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、（３６）〜（３９）のいずれか１項に記載の製造法。
（４１）製造において、宿主細胞で発現されている、受容体、トランスポーターまたはチャネルの、アゴニストまたはアンタゴニストを添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、（３６）〜（４０）のいずれか１項に記載の製造法。
（４２）受容体が、Ｇ蛋白質共役型受容体、核内受容体、増殖因子受容体、スルホニルウレア受容体、ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ受容体、レプチン受容体、サイトカイン受容体、またはスルホニルウレア受容体であることを特徴とする、（４１）に記載の製造法。
（４３）トランスポーターがグルコーストランスポーターであることを特徴とする、（４１）に記載の製造法。
（４４）チャネルが、Ｃａチャネル、Ｋチャネル、ＣｌチャネルまたはＮａチャネルであることを特徴とする、（４１）に記載の製造法。
（４５）製造において、宿主細胞で発現されている受容体のシグナルを代替することのできる物質を添加した培地を用いて培養を行う工程を有することを特徴とする、（３６）〜（４４）のいずれか１項に記載の製造法。
（４６）受容体のシグナルを代替することのできる物質が、アデニレートシクラーゼ、プロテインキナーゼ、ホスホジエステラーゼ、低分子量Ｇ蛋白質、細胞内ｃＡＭＰまたは細胞内Ｃａ２＋含量を変動する物質、フォルスコリン、８−ブロモ−サイクリックＡＭＰ（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチンよりなる群より選ばれる物質の少なくとも１つの物質である、（４５）に記載の製造法。
（４７）製造において、ラミニンまたはゼラチンをコートしたディッシュ上で培養を行う工程を有することを特徴とする、（３６）〜（４６）のいずれか１項に記載の製造法。
（４８）スクシニル化コンカナバリンＡを添加した培地を用いて培養を行うことを特徴とする、（３６）〜（４６）のいずれか１項に記載の製造法。
（４９）アクチビン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、フォリスタチン、グルコース、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ニコチンアミド、ベータセルリン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ｉｓｌｅｔ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ）、繊維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）およびＲｅｇ蛋白質からなる群より選ばれる物質の少なくとも１つの物質を添加した培地を用いて培養を行うことを特徴とする、（３６）〜（４８）のいずれか１項に記載の製造法。
（５０）培養物中に活性ペプチドを生成蓄積させた後に分泌刺激剤を添加することを特徴とする、（３６）〜（４９）のいずれか１項に記載の製造法。
（５１）分泌刺激剤が、カリウム、グルコース、ＴｏｌｂｕｔａｍｉｄｅまたはＡＴＰである、（５０）に記載の製造法。
（５２）一種類以上のペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、複数のペプチドを製造することを特徴とする、（３７）〜（５１）のいずれか１項に記載の製造法。
（５３）下記［１］〜［４］の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドの検出または取得方法。
［１］（１）〜（２６）のいずれか１項に記載の方法で、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドをコードするＤＮＡを取得する
［２］該ＤＮＡがコードするペプチドまたは部分ペプチドを、目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
［３］該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
［４］上記［３］で応答反応を与えることの示されたペプチドまたは部分ペプチドを同定する
（５４）下記［１］〜［４］の工程を有する、目的とする受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するペプチドの検出または取得方法。
［１］（３６）〜（５２）のいずれか１項に記載の製造方法でペプチドを取得する
［２］該ペプチドを、目的とする受容体を発現する細胞と接触させる
［３］該受容体に基づく細胞の応答反応を検出する
［４］上記［３］で応答反応を与えることの示されたペプチドを同定する
（５５）受容体がＧ蛋白質共役型受容体である、（５３）または（５４）に記載の検出または取得方法。
（５６）Ｇ蛋白質共役型受容体がオーファンＧ蛋白質共役型受容体である、（５５）に記載の検出または取得方法。
（５７）受容体を発現する細胞が、下記の［１］〜［３］の少なくとも１つが染色体ＤＮＡに組み込まれた、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である、（５３）または（５４）に記載の検出または取得方法。
［１］誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するためのＤＮＡコンストラクト［２］転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクト［３］Ｇα蛋白質またはキメラＧα蛋白質を発現するためのＤＮＡコンストラクト
（５８）Ｂ細胞株が、無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞である、（５７）に記載の検出または取得方法。
（５９）無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞である、（５８）に記載の検出または取得方法。
（６０）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、（５７）に記載の検出または取得方法。
（６１）転写因子の応答配列が、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答配列、または血清応答配列（ＳＲＥ）である、（５７）に記載の検出または取得方法。
（６２）レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子である、（５７）に記載の検出または取得方法。
（６３）Ｇα蛋白質が、Ｇα１６、Ｇα１５、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｇｕｓｔ、Ｇαｔ、およびＧα１４からなる群より選ばれるの少なくとも１つのＧα蛋白質である、（５７）に記載の検出または取得方法。
（６４）キメラＧα蛋白質が、下記の［１］〜［２０］からなる群より選ばれる少なくとも１つのキメラＧα蛋白質である、（５７）に記載の検出または取得方法。
［１］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［２］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［３］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［４］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［５］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［６］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［７］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［８］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［９］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１０］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１１］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｓのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１２］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１３］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１４］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１５］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１６］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１７］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１８］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１９］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［２０］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（６５）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子である、（５７）に記載の検出または取得方法。
（６６）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子であり、キメラＧα蛋白質が、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質またはＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質である、（５７）に記載の検出または取得方法。
（６７）細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、（５３）または（５４）に記載の検出または取得方法。
（６８）下記の［１］〜［３］の少なくとも１つが染色体ＤＮＡに組み込まれた、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株由来の細胞株。
［１］誘導発現系の構築に必要な転写因子を発現するためのＤＮＡコンストラクト
［２］転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクト
［３］Ｇα蛋白質またはキメラＧα蛋白質を発現するためのＤＮＡコンストラクト
（６９）細胞株が、無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞である、（６８）に記載の細胞株。
（７０）無血清馴化Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞である、（６９）に記載の細胞株。
（７１）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質である、（６８）に記載の細胞株。
（７２）転写因子の応答配列が、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答配列、または血清応答配列（ＳＲＥ）である、（６８）に記載の細胞株。
（７３）レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子である、（６８）に記載の細胞株。
（７４）Ｇα蛋白質が、Ｇα１６、Ｇα１５、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｇｕｓｔ、Ｇαｔ、およびＧα１４からなる群より選ばれるの少なくとも１つのＧα蛋白質である、（６８）に記載の細胞株。
（７５）キメラＧα蛋白質が、下記の［１］〜［２０］からなる群より選ばれる少なくとも１つのキメラＧα蛋白質である、（６８）に記載の細胞株。
［１］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［２］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［３］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［４］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［５］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［６］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［７］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［８］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［９］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１０］ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１１］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｓのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１２］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１３］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｏのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１４］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｚのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１５］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１２のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１６］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１３のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１７］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｇｕｓｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１８］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧαｔのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［１９］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１４のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
［２０］ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をＧα１６のＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質
（７６）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子である、（６８）に記載の細胞株。
（７７）誘導発現系の構築に必要な転写因子が、酵母のＧａｌ４ｐとエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質であり、転写因子の応答配列を有するプロモーターが、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を有するプロモーターであり、レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子であり、キメラＧα蛋白質が、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質またはＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質である、（６８）に記載の細胞株。
（７８）下記［１］〜［４］の工程を有する、被検物質に反応するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
［１］（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株に、任意のｃＤＮＡまたは染色体由来のＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
［２］導入したｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［３］導入したｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［４］上記［２］と［３］の応答反応を比較し、異なる応答反応を示す形質転換株を選択し、該株に導入したＤＮＡを同定する
（７９）下記［１］〜［７］の工程を有する、被検物質に反応するペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
［１］発現ベクターを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを１〜１００００のクローンずつのプールに分ける
［２］各プールに由来するｃＤＮＡクローンの混合物を、（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株に導入して形質転換株を取得する
［３］各プールごとに、導入したｃＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［４］各プールごとに、導入したｃＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［５］上記［３］と［４］の応答反応を比較し、異なる応答反応を示すプールを選択し、選択したプールを［１］よりも細かいプールに分ける
［６］［２］〜［５］の操作をプールが１クローンごとになるまで繰り返す
［７］被検物質の存在下と非存在下で異なる応答反応を示す形質転換株を同定し、該株に導入したＤＮＡを同定する
（８０）細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、（７８）または（７９）に記載のＤＮＡの取得方法。
（８１）被検物質が、（２７）〜（３５）のいずれか１項に記載の細胞株を培養することにより得られる被検物質である、（７８）または（７９）に記載のＤＮＡの取得方法。
（８２）ＳＶ４０の温度感受性変異株のラージＴ抗原の活性を抑制または消失させる温度で培養を行うことを特徴とする、（７８）〜（８１）のいずれか１項に記載のＤＮＡの取得方法。
（８３）下記［１］〜［５］の工程を有する、ペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
［１］（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株から選ばれる、転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクトが染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
［２］該宿主細胞に、任意のｃＤＮＡまたは染色体由来のＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
［３］上記［２］で取得された形質転換株において、導入したｃＤＮＡまたはＤＮＡを発現させたときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
［４］宿主細胞における、あるいは上記［２］で取得された形質転換株において、導入したｃＤＮＡまたはＤＮＡを発現させていないときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
［５］上記［３］と［４］のレポーター遺伝子の発現量を比較し、異なるレポーター遺伝子の発現量を示す形質転換株を選択し、該株に導入したＤＮＡを同定する
（８４）下記［１］〜［８］の工程を有する、ペプチドをコードするＤＮＡの取得方法。
［１］誘導発現ベクターを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを１〜１００００のクローンずつのプールに分ける
［２］（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株から選ばれる、転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクトが染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
［３］上記［１］で分けた、各プールに由来するｃＤＮＡクローンの混合物を、上記［２］で取得した宿主細胞に導入して、各プールごとに形質転換株を取得する
［４］上記［３］の各プールごとの形質転換株において、導入したｃＤＮＡを発現させたときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
［５］上記［３］の各プールごとの形質転換株において、導入したｃＤＮＡを発現させないときの、レポーター遺伝子の発現量を測定する
［６］上記［４］および［５］のレポーター遺伝子の発現量をプールごとに比較し、［４］のレポーター遺伝子の発現量の多いプールの形質転換株を選択し、選択したプールを［１］よりも細かいプールに分ける
［７］上記［２］〜［６］の操作をプールが１クローンごとになるまで繰り返す
［８］導入したｃＤＮＡを、発現させないときよりも発現させたときのレポーター遺伝子の発現量の多い形質転換株を同定し、該株に導入したＤＮＡを同定する
（８５）ペプチドが、受容体、転写因子、シグナル伝達分子、または酵素である、（７８）、（７９）、（８３）または（８４）に記載のＤＮＡの取得方法。
（８６）受容体がＧ蛋白質共役型受容体である、（８５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（８７）受容体が構成活性型のＧ蛋白質共役型受容体である、（８５）に記載のＤＮＡの取得方法。
（８８）Ｇ蛋白質共役型受容体がオーファンＧ蛋白質共役型受容体である、（８６）または（８７）に記載のＤＮＡの取得方法。
（８９）ペプチドが、転写因子の応答配列を有するプロモーターの活性を増加させる活性を有する転写因子、シグナル伝達分子、または酵素である、（７８）、（７９）、（８３）または（８４）に記載のＤＮＡの取得方法。
（９０）ｃＤＮＡが変異Ｇ蛋白質共役型受容体をコードするランダム変異導入ｃＤＮＡ、ペプチドが構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体あることを特徴とする、（７８）、（７９）、（８３）または（８４）に記載のＤＮＡの取得方法。
（９１）ランダム変異を導入する部位が、Ｇ蛋白質共役型受容体の第３膜貫通領域の後半から第２細胞内領域の前半部分あるいは第３細胞内領域の後半から第６膜貫通領域の前半部分であることを特徴とする、（９０）に記載のＤＮＡの取得方法。
（９２）ランダム変異を導入する部位が、Ｇ蛋白質共役型受容体における保存アミノ酸残基の一つである第６膜貫通領域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリン残基に相応するアミノ酸残基よりＮ末側に２０残基目または２２残基目のアミノ酸であることを特徴とする、（９０）または（９１）に記載のＤＮＡの取得方法。
（９３）（９０）〜（９２）のいずれか１項に記載の方法を用いて取得される構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体。
（９４）Ｇ蛋白質共役型受容体における保存アミノ酸残基の一つである第６膜貫通領域中に存在するプロリン残基もしくは該プロリン残基に相応するアミノ酸残基よりＮ末側に２０残基目または２２残基目のアミノ酸に変異を有する構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体。
（９５）ＯＧＲ１のＮ末端より２２１番目のセリンをアスパラギンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＯＧＲ１のＮ末端より１１８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＯＧＲ１のＮ末端より１１８番目のアスパラギン酸をアラニンに、かつ２２１番目のセリンをアスパラギンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＲＥ２のＮ末端より１２４番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＧＰＲ３５のＮ末端より１１３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＧＰＣＲ２５のＮ末端より１１１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＰＧＭＯ３３４のＮ末端より１３５番目のグルタミン酸をフェニルアラニン、グルタミンまたはアラニンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＰＧＭＯ３３４のＮ末端より２５９番目のアスパラギン酸をセリンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、ＧＰＲ４３のＮ末端より２１７番目のアルギニンをプロリンに置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体、およびＧＰＲ４３のＮ末端より２１７番目のアルギニンをプロリンに、かつ１０６番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体からなる群より選ばれる構成活性型変異Ｇ蛋白質共役型受容体。
（９６）１型メラノコルチン受容体（ＭＣ１Ｒ）および、ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−２０ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ）またはＰＡＭＰのＮ末端から９〜２０番目のアミノ酸残基からなるペプチドを用いた、ＭＣ１Ｒのアンタゴニストの探索法または取得法。
（９７）オーファンＧ蛋白質共役型受容体ＧＰＲ４３および、酢酸、プロピオン酸、酢酸塩、またはプロピオン酸塩を用いた、ＧＰＲ４３のアンタゴニストの探索法または取得法。
（９８）オーファンＧ蛋白質共役型受容体ＧＰＲ４１および、シクロプロパンカルボン酸、プロピオン酸、シクロプロパンカルボン酸塩、またはプロピオン酸塩を用いた、ＧＰＲ４１のアンタゴニストの探索法または取得法。
（９９）オーファンＧ蛋白質共役型受容体Ｇ１０ｄおよび、α−メラノサイト刺激ホルモンまたは副腎皮質刺激ホルモンを用いた、Ｇ１０ｄのアンタゴニストの探索法または取得法。
（１００）下記［１］〜［４］の工程を有する、Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストの取得法。
［１］（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株に、任意のＧ蛋白質共役型受容体をコードするＤＮＡ導入して形質転換株を取得する
［２］導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［３］導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［４］上記［２］と［３］を比較し、応答反応の変化を誘発する被検物質をアゴニストとして取得する
（１０１）下記［１］〜［４］の工程を有する、Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストの取得法。
［１］（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株に、任意のＧ蛋白質共役型受容体をコードするＤＮＡ導入して形質転換株を取得する
［２］導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストの存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［３］導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストと被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［４］アゴニストに基づく該形質転換株の応答反応を消失させる被検物質をアンタゴニストとして取得する
（１０２）細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、（１００）または（１０１）に記載のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストまたはアンタゴニストの取得法。
（１０３）下記［１］〜［５］の工程を有する、Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたはインバースアゴニストの取得法。
［１］（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株から選ばれる、転写因子の応答配列を有するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡコンストラクトが染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞株を宿主細胞として選択する
［２］該宿主細胞に、任意の構成活性型Ｇ蛋白質共役型受容体をコードするＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
［３］被検物質の非存在下、導入したＤＮＡを発現させた形質転換株でのレポーター遺伝子の発現量を測定する
［４］被検物質の存在下、導入したＤＮＡを発現させた形質転換株でのレポーター遺伝子の発現量を測定する
［５］上記［３］および［４］のレポーター遺伝子の発現量を比較し、レポーター遺伝子の発現量を低下させる被検物質を、［２］のＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたはインバースアゴニストとして取得する
（１０４）下記［１］〜［４］の工程を有する、転写因子、シグナル伝達分子および酵素からなる群より選ばれるペプチドの活性化剤または阻害剤の取得法。
［１］（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株に、任意の転写因子、シグナル伝達分子および酵素からなる群より選ばれるペプチドをコードするＤＮＡを導入して形質転換株を取得する
［２］導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の非存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［３］導入したＤＮＡを発現させた形質転換株を用いて、被検物質の存在下で該形質転換株の応答反応を測定する
［４］上記［２］と［３］を比較し、応答反応を変動させる被検物質を、該ペプチドの活性化剤または阻害剤として取得する
（１０５）細胞の応答反応が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖、レポーター遺伝子の発現量、およびマーカー遺伝子の発現量からなる群より選ばれる少なくとも１つの応答反応である、（１０４）に記載の取得法。
（１０６）宿主細胞として（６８）〜（７７）のいずれか１項に記載の細胞株を、ベクターとして任意のプロモーターとエプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のｏｒｉＰを有する発現ベクターを用いることを特徴とする、宿主・ベクター系。
（１０７）任意のプロモーターがＧａｌ４ｐ応答性の誘導発現プロモーターである、（１０６）に記載の宿主・ベクター系。
（１０８）発現ベクターが、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏ−ｎｄ、ｐＡＭｏ−ｄ、ｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ９−ｄであることを特徴とする、（１０６）または（１０７）に記載の宿主・ベクター系。
本明細書において、ペプチドとは２つ以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した物質を意味し、ポリペプチド、オリゴペプチドを包含する。
［１］活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ペプチドの効率的な生産系の構築
活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ペプチドの効率的な生産系は以下のようにして構築することができる。
１．内分泌細胞由来の株化細胞の取得
活性ペプチドの前駆体からのプロセシング様式やプロセシング後の修飾は、各ペプチドによって異なり多様である。ＭＩＮ６等の既存の内分泌細胞株を宿主として利用することもできるが、活性ペプチドの前駆体遺伝子を宿主細胞に導入して、活性ペプチドを効率的に生産させたり、発現したペプチドの活性を指標に該前駆体遺伝子をクローニングするためには、多種類の内分泌細胞株を取得し、その中から該活性ペプチドに適したプロセシング酵素や修飾酵素を発現している細胞を選択して宿主として利用するのが望ましい。内分泌細胞株は下記方法により樹立することができる。
（１）内分泌細胞由来の株化細胞の樹立
本発明の内分泌細胞由来の株化細胞は、癌遺伝子を導入した非ヒト・トランスジェニック動物由来の内分泌細胞を含有する組織から細胞を単離し、培養することにより樹立することができる。
非ヒト・トランスジェニック動物として、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックブタ、トランスジェニックウサギ等をあげることができる。
癌遺伝子としては、ＳＶ４０、アデノウイルス等ウイルス由来の癌遺伝子をあげることができ、例えば、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ等をあげることができる。具体的には、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８由来のラージＴ抗原遺伝子、アデノウイルス２とアデノウイルス５のハイブリッドのＥ１Ａ  １２Ｓ等をあげることができる。優良な株化細胞を樹立するためにはＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を用いることが好ましい。癌遺伝子を内分泌細胞で発現させるためには、癌遺伝子産物をコードする領域の上流に内分泌細胞で働く適当なプロモーターが存在することが必要である。プロモーターとしては、ウイルス由来の癌遺伝子自体の内在性のプロモーター、内分泌細胞で発現する動物由来の遺伝子のプロモーター等を用いることもできる。例えば、ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子の内在性プロモーター、Ｈ−２ＫｂクラスＩプロモーター等を用いることができる。
ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスは、特開平０５−２９２９５８、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８２，１３４４（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５０９６（１９９１）に記載の方法により、作製することができる。またＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットは特開２０００−２２８９３０またはＥｘｐ．Ａｎｉｍ．，４８，２５５（１９９９）に記載の方法により作製することができる。具体的には、ＳＶ４０ｔｓＡ５８の全ゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環してプラスミドｐＢＲ３２２に挿入したプラスミドＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，１６５（１９９１）〕を制限酵素ＢａｍＨＩで切断してベクター部位を除去することによって、ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を含むＤＮＡ（５，２４０ｂｐ）を調製する。該ＤＮＡにはＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子のプロモーターが内在するため、該ＤＮＡを導入された体細胞においてＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現することになる。ラットの全能性細胞である前核期受精卵の雄性前核に、上記のＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を含むＤＮＡをマイクロインジェクションして得られる卵子を仮親の卵管に移植して産仔を得た後、注入した該遺伝子を持つ産仔を選出し、安定的に該遺伝子が組み込まれた個体を得ることで、個体発生時にＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれたトランスジェニックラットを効率よく作出することができる。
癌遺伝子を導入した非ヒト・トランスジェニック動物由来の内分泌細胞を含有する組織から細胞を単離する方法としては、公知の方法を用いることができる。
例えば、視床下部由来の細胞は、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．３６，４５−５２（１９９６）等に記載の酵素法により、ランゲルハンス氏島細胞は、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６，１７５５（１９９７）等に記載の方法により、単離することができる。
単離した細胞の培養は、通常の動物細胞の培養方法に準じて実施することができる。
該細胞を培養するための培地として、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕、またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニック動物由来の細胞を増殖させるためには、温度感受性のラージＴ抗原変異体の活性を阻害しない温度（３０〜３３℃、好ましくは３３℃）で培養することが好ましい。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
２〜３ヶ月間細胞を継代することにより、不死化した細胞を取得することができる。
上記方法により、視床下部由来細胞株、ランゲルハンス氏島由来細胞株等、内分泌細胞由来の細胞株を多数取得することができる。
視床下部、ランゲルハンス氏島等の内分泌組織には異なる多種類の紐胞が存在するが、上記方法により、多種類の不死化細胞株を取得することができる。
特に、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニック動物〔Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．４８，２５５（１９９９）〕の内分泌細胞より、極めて効率的に、しかも再現良く多種類の不死化細胞株を多数取得することができることを、本発明において初めて見出した。
取得した細胞株の混合物は、通常の動物細胞の凍結保存法に準じて凍結保存することが可能であり、必要な時に細胞を起して各種の解析や実験に使用することができる。
上記で取得した細胞株の混合物を、コロニー形成法〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，４０８４（１９９５）〕等の常法に準じて、シングルクローン化することにより個々の細胞株として単離することができる。
上記方法で取得される細胞株として、下記実施例で取得された視床下部由来の７９８個のシングルクローン（第２表〜表５−２表に示したクローンを含む）、ランゲルハンス氏島由来の２６１個のシングルクローン（Ｒ−１〜Ｒ−４５、Ｍ−１〜Ｍ−６３、Ｆ−１〜Ｆ−９、Ｄ−１〜Ｄ−７２、Ｄ２−１〜Ｄ２−７２）等をあげることができる。これら細胞株と同等の性質を有する細胞株は、上記本発明の方法により再現良く取得することができる。
（２）内分泌細胞株の選択
上記（１）で取得した多種類の不死化細胞株について、内分泌細胞で発現していることが知られている各種のプロセシング酵素や修飾酵素の遺伝子の発現や、該遺伝子産物の発現を調べることにより、目的とする活性ペプチドの発現に適した内分泌細胞を選択することができる。
例えば、視床下部由来細胞株やランゲルハンス氏島細胞株由来の細胞に関しては、プロホルモンコンベルターゼ（Ｐ１／Ｐ３、ＰＣ２、ｆｕｒｉｎ、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６、ＰＣ７／ＳＰＣ７／ＬＰＣ／ＰＣ８）、カルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）、あるいはペプチジルグリシンα−アミデイティングモノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）等の遺伝子の発現や、該遺伝子産物の発現を調べることにより目的に適した内分泌細胞株を選択できる。
また、上記の細胞株について、内分泌細胞で発現している活性ペプチド（例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチドなど）の発現を調べることにより、目的とする活性ペプチドの発現に適した内分泌細胞を選択することもできる。
さらに、上記の細胞株に、下記３．に記載した方法に準じて、任意の活性ペプチド前駆体遺伝子を導入し、活性型のペプチドが生産されるか調べることにより、任意の活性ペプチドの発現に適した内分泌細胞株を選択することもできる。
各種遺伝子の発現を調べる方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロット法をあげることができる。各種遺伝子産物の発現あるいは活性ペプチドの生産を調べる方法としては、各種抗体を用いた細胞染色やウエスタンブロットをあげることができる。
上記のようにして取得した内分泌細胞株は、多様な活性ペプチドを探索するためのペプチドソース、ｃＤＮＡソースとしても極めて有用である。
（３）不死化細胞株のキャラクタライゼーション
上記（１）で取得した多種の不死化細胞株、および上記（２）で選択した内分泌細胞株のキャラクタライゼーションは、該細胞株が由来する組織の細胞で発現することが知られている遺伝子や該遺伝子産物の発現を調べることにより行うことができる。
例えば、視床下部由来の細胞株においては、レプチン受容体遺伝子、プレプロオピオメラノコルチン遺伝子、ＣＡＲＴ遺伝子、プレプロアグーチ関連ペプチド遺伝子、プレプロニューロメディンＵ遺伝子、ＲＦＲＰプレプロ蛋白質遺伝子、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプロメラニン凝集ホルモン遺伝子、プレプロオレキシン遺伝子、プレプログレリン遺伝子、プレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝子、プレプロニューロペプチドＦＦ遺伝子、ＭＣ４Ｒ遺伝子、ＮＰＹ１Ｒ遺伝子、ＮＰＹ５Ｒ遺伝子、ＮＭＵ２Ｒ遺伝子、ＲＦＲＰ受容体遺伝子、ＣＲＨＲ−１遺伝子、ＣＲＨＲ−２遺伝子、ＭＣＨＲ１遺伝子、グレリン受容体遺伝子、ＮＰＦＦ２遺伝子等の発現を調べることにより、キャラクタライゼーションを行うことができる。
ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、プレプロインスリン遺伝子、プレプログルカゴン遺伝子、プレプロソマトスタチン遺伝子、プレプロ膵ポリペプチド遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ１（ＰＣ１）遺伝子、プロホルモンコンベルターゼ２（ＰＣ２）遺伝子、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体遺伝子、ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、ニューロジェニン３遺伝子、ニューロＤ遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、２型グルコーストランスポーター遺伝子等の発現を調べることにより、キャラクタライゼーションを行うことができる〔Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４７，２５５（２０００）〕。
各種遺伝子の発現および各種遺伝子産物の発現は下記２．の方法に準じて行うことができる。
また、上記細胞株のキャラクタライゼーションは、該細胞株が由来する組織の細胞で発現することが知られている受容体に対するリガンド、アゴニスト、あるいはアンタゴニストへの反応性を調べることにより行うこともできる。具体例を以下に示す。
〔レプチン受容体〕
細胞をレプチンで刺激後、抗ＳＴＡＴ抗体（ＮＥＢ社製）または抗リン酸化ＳＴＡＴ抗体を用いた細胞染色またはウエスタンブロットを行うことにより、あるいは、ｃ−ｆｏｓ遺伝子やＳＯＣＳ−３遺伝子の発現変動を調べることにより、機能的なレプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）が細胞に発現しているか調べることができる。また、ＳＴＡＴレポーターを利用してレポーター遺伝子の発現変動を調べることにより、該レプチン受容体が機能を有しているか確認できる。
〔ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）受容体〕
細胞をＣＮＴＦで刺激後、抗ＳＴＡＴ抗体または抗リン酸化ＳＴＡＴ抗体を用いた細胞染色やウエスタンブロットを行うことにより、機能的なＣＮＴＦ受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
〔Ｇαｑ蛋白質、Ｇα１１蛋白質、Ｇα１５蛋白質、またはＧα１６蛋白質に共役するＧＰＣＲ〕
細胞をリガンドやアゴニストで刺激後、細胞内Ｃａ２＋量が増加するか調べることにより、機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
Ｃａ２＋量の増加あるいはプロテインキナーゼＣの活性化で発現が増加するレポーター遺伝子をあらかじめ細胞に導入しておくことにより、レポーター遺伝子の発現を調べることにより、機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
このような受容体として、視床下部由来の細胞株においては、１型ＮＭＵ受容体（ＮＭＵ１Ｒ）、２型ＮＭＵ受容体（ＮＭＵ２Ｒ）、グレリン受容体、１型オレキシン受容体（ＯＸ１Ｒ）、２型オレキシン受容体（ＯＸ２Ｒ）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体等を、ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、Ｐ２Ｙ１受容体等あげることができる。
〔Ｇαｓ蛋白質に共役するＧＰＣＲ〕
細胞をリガンドやアゴニストで刺激後、細胞内ｃＡＭＰ量が増加するか調べることにより、機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
ｃＡＭＰ量の増加で発現が増加するレポーター遺伝子をあらかじめ細胞に導入しておくことにより、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をレポーター遺伝子の発現で調べることもできる。
このような受容体として、視床下部由来の細胞株においては、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）、１型ＣＲＨ受容体（ＣＲＨＲ−１）、２型ＣＲＨ受容体（ＣＲＨＲ−２）、ガラニン受容体、ＧＬＰ−１受容体、ＧＬＰ−２受容体等を、ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、ＧＬＰ−１受容体等をあげることができる。
〔Ｇαｉ蛋白質に共役するＧＰＣＲ〕
細胞をフォルスコリン単独で刺激した場合と、フォルスコリンおよびリガンド（またはアゴニスト）で刺激した場合の細胞内のｃＡＭＰ量を比較し、後者において細胞内ｃＡＭＰ量の増加が減少することを調べることにより、機能的な受容体が細胞に発現していることを調べることができる。
ｃＡＭＰ量の増加で発現が増加するレポーター遺伝子をあらかじめ細胞に導入しておくことにより、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をレポーター遺伝子の発現で調べることもできる。
このような受容体としては、視床下部由来の細胞株においては、１型ＮＰＹ受容体（ＮＰＹ１Ｒ）、５型ＮＰＹ受容体（ＮＰＹ５Ｒ）、ＲＦＲＰ受容体、２型ＮＰＦＦ受容体（ＮＰＦＦ２Ｒ）等を、ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、５種（１〜５型）のソマトスタチン受容体等あげることができる。
〔スルホニルウレア受容体〕
細胞をスルホニルウレアで刺激後、細胞内Ｃａ２＋量が増加するか調べることにより、機能的な受容体が細胞に発現しているか調べることができる。
Ｃａ２＋量の増加で発現が増加するレポーター遺伝子をあらかじめ細胞に導入しておくことにより、細胞内Ｃａ２＋量の増加をレポーター遺伝子の発現で調べることもできる。
〔インスリン受容体〕
細胞をインスリンで刺激後、インスリン受容体のリン酸化、ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  １（ＩＲＳ−１）あるいはＩＲＳ−２のリン酸化を調べることにより、機能的なインスリン受容体が細胞に発現しているかどうかを調べることができる。
〔グルコーストランスポーター〕
細胞を高濃度（１５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ）のグルコースで刺激後、細胞内のＣａ２＋濃度が上昇するか調べることにより、機能的なグルコーストランスポーターが細胞に発現しているか調べることができる。細胞の膜電位を測定することによっても調べることができる。
ランゲルハンス氏島には、β細胞のように、高濃度（１５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ）のグルコースに反応して細胞が活性化（例えば細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇）し、インスリンの合成や分泌が促進される細胞が存在する。従って、ランゲルハンス氏島由来の細胞株については、グルコース反応性を調べることによっても、各細胞株のキャラクタライゼーションを行うことができる。
また、α細胞のマーカーとして利用できるグルカゴン、β細胞のマーカーとして利用できるインスリン、δ細胞のマーカーとして利用できるソマトスタチン、γ細胞のマーカーとして利用できる膵ポリペプチド、多能性幹細胞のマーカーとして利用できるネスチン〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０，５２１（２００１）〕の発現を調べることにより、キャラクタライゼーションを行うこともできる。
（４）不死化細胞株の分化形質の制御
上記１．（１）で取得した不死化細胞株を異なる条件下で培養することにより、該細胞株の分化形質を制御することができる。また、分化形質を変化させた細胞株に関して、上記（２）または（３）に示した方法を用いて、内分泌細胞株の選択または不死化細胞株のキャラクタライゼーションを行うことができる。
分化形質を制御するための培養方法として、例えば、以下（ａ）〜（ｈ）に記載する培養方法およびこれらの方法を組み合わせた培養方法をあげることができる。
（ａ）上記不死化細胞株の取得の際に使用した癌遺伝子の発現や癌遺伝子産物の活性を阻害しない条件で培養する。
例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原の温度感受性変異体を発現する不死化細胞株においては、該変異体の活性を阻害しない温度（３０〜３３℃、好ましくは３３℃）で培養することにより、分化形質を制御し、該細胞株を増殖させることができる。
分化形質を誘導したいときには、該癌遺伝子の発現や癌遺伝子産物の活性を阻害する条件で培養すればよい。即ち、ＳＶ４０ラージＴ抗原の温度感受性変異体を発現する不死化細胞株では、３７〜３９℃、好ましくは３７℃で培養すればよい。
（ｂ）無血清培地、２％以下の血清を含む培地、または無血清培地に低濃度（１％）のＮ−２サプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）を添加した培地で培養する。
下記６．の活性測定法において、血清が存在するとバックグラウンドのレポーター活性が上昇する場合があるため、このように無血清または低血清の培地を用いた培養法は、活性ペプチドの活性測定が必要な場合には好ましい培養法である。
（ｃ）上記不死化細胞株で発現している受容体、トランスポーターまたはチャネルのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは該トランスポーターまたはチャネルの基質を添加して培養する。
受容体として、例えば、視床下部由来の宿主細胞株においては、ＧＰＣＲ（ＧＬＰ−１受容体等）、核内受容体、増殖因子受容体、またはレプチン受容体等を、ランゲルハンス氏島由来細胞株においては、ＧＰＣＲ（ＧＬＰ−１受容体等）、核内受容体、増殖因子受容体（インスリン受容体等）、サイトカイン受容体（アクチビンＡ受容体等）、スルホニルウレア受容体等をあげることができる。
トランスポーターとしてはグルコーストランスポーターをあげることができる。
チャネルとしてはＣａチャネル、Ｋチャネル、Ｃｌチャネル、Ｎａチャネル等をあげることができる。
例えば、５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを添加して培養することにより、細胞の分化形質や遺伝子の発現を制御して培養することができる。
（ｄ）上記不死化細胞株で発現している受容体のシグナルを代替することのできる物質を添加して培養する。
受容体のシグナルを代替することのできる物質として、例えば、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＢ、プロテインキナーゼＣ、ＭＡＰキナーゼ等のプロテインキナーゼ、低分子量Ｇ蛋白質を活性化または抑制する物質、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナルを代替することのできるフォルスコリン、８−ブロモ−サイクリックＡＭＰ（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、およびイオノマイシン等をあげることができる。
（ｅ）神経細胞やグリア細胞の分化を制御する培養法で培養する。
該培養法として、ラミニンをコートしたディッシュ上で培養する方法、スクシニル化コンカナバリンＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ  ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）を添加して培養する方法〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，３９，１，（１９９９）〕等をあげることができ、視床下部由来の細胞株の培養に適している。
（ｆ）ランゲルハンス氏島細胞の分化を制御する培養法で培養する。
該培養法として、ゼラチンをコートしたディッシュ上で培養する方法〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４８，１４０２（１９９９）〕、アクチビン、ＧＬＰ−１、フォリスタチン、グルコース）肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ニコチンアミド、ベータセルリン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ｉｓｌｅｔ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ）、繊維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、あるいはＲｅｇ蛋白質を添加して培養する方法〔最新医学，５４，２５２２（１９９９）；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，２７８（２０００）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７，９７１（２０００）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６３６０（１９９９）；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，３，２４７（１９９９）〕等をあげることができ、ランゲルハンス氏島由来の細胞株の培養に適している。
（ｇ）上記不死化細胞株で発現している受容体のリガンドやアンタゴニストを発現している細胞と共培養する。
（ｈ）上記不死化細胞株で発現している受容体の細胞内シグナル伝達に関与しているシグナル伝達分子または転写因子の遺伝子、あるいは、該不死化細胞株の分化や機能発現に重要な転写因子の遺伝子を導入、発現させて培養する。
転写因子遺伝子として、例えば、視床下部細胞由来の細胞株においては、Ｇｓｈ−１遺伝子を、ランゲルハンス氏島由来の細胞株においては、ＰＤＸ１遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、ニューロジェニン３遺伝子、ニューロＤ遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、ＩｓＩ−１遺伝子、ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ遺伝子等をあげることができる〔Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４７，２５５（２０００）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４１，３１５（１９９９）〕。また、上記の受容体、シグナル伝達分子、または転写因子の構成活性型変異体やドミナントネガティブ変異体の遺伝子を導入、発現させてもよい。遺伝子導入は下記３．の方法に準じて行うことができる。
２．活性ペプチド前駆体遺伝子の取得
活性ペプチド前駆体遺伝子としては、活性ペプチド前駆体をコードするＤＮＡであればいかなるものも用いることができる。活性ペプチド前駆体をコードするＤＮＡは以下のようにして取得できる。活性ペプチド前駆体のｃＤＮＡの塩基配列を元にして、該活性ペプチド前駆体をコードする領域を含む該ｃＤＮＡの領域を適当に選択する。選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成する。該活性ペプチドが発現している組織や細胞からｃＤＮＡを調製する。調製したｃＤＮＡを鋳型とし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより該活性ペプチド前駆体をコードするＤＮＡを増幅し単離することができる。組織や細胞からのｃＤＮＡの調製、およびＰＣＲはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と称する）に記載の方法に従って行うことができる。
また、該活性ペプチド前駆体遺伝子内の活性ペプチドをコードする領域を任意のペプチドをコードするＤＮＡで置き換えることにより、以下の３．および５．に記載の方法を用いて、任意のペプチドを発現し生産することができる。また、上記の方法で任意のペプチドをコードするＤＮＡとして、ランダムな配列を有する複数のＤＮＡの混合物を用いることにより、ランダムペプチドライブラリーを作製することもできる。
３．活性ペプチド前駆体遺伝子の発現ベクターの造成と宿主への導入
遺伝子発現用の宿主細胞として上記１．で選択した内分秘細胞株を使用し、活性ペプチド前駆体遺伝子を適切な発現ベクターのプロモーター下に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを該宿主細胞に導入することにより、活性ペプチド前駆体遺伝子の発現系を構築することができる。
（１）プラスミドベクターを用いた遺伝子の導入
活性ペプチド前駆体遺伝子を発現するためのプラスミドベクターに必要な構成要素として、発現させる外来遺伝子用の発現ユニット（プロモーターの下流に目的の活性ペプチド前駆体をコードするＤＮＡを挿入できる制限酵素サイトとポリＡ付加シグナルを順に連結した構造）を有するプラスミドがあげられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、メタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、６．（２）に後述する特定の転写因子に応答する配列を有するプロモーターも用いることができる。上記プロモーターと共に、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等も用いることができる。また、プロモーターとしては、動物細胞中で、特定の転写因子に反応し機能するプロモーターも用いることができる。
この場合、該転写因子を発現することのできる動物細胞あるいは、該転写因子を発現することのできるように該転写因子の発現プラスミドを導入した動物細胞を利用する必要がある。
このようなプロモーターとして、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の転写因子Ｇａｌ４ｐに応答するプロモーター等をあげることができる。
Ｇａｌ４ｐに応答するプロモーターは、Ｇａｌ４ｐのみならず、Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域と任意の転写因子の転写活性化領域のキメラ蛋白質にも反応する。
転写因子の転写活性化領域としては、ｈｅｌｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓのＶＰ１６の転写活性化領域（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）〔Ｎａｔｕｒｅ，３３５，５６３（１９８８）〕、エストロジェン受容体のリガンド結合領域〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１６５７（１９９３）〕をあげることができる。エストロジェン受容体のリガンド結合領域を利用する場合、エストロジェンを細胞に添加することにより転写を開始させることができる。
ポリＡ付加シグナルとしては、いかなるポリＡ付加シグナルも利用できるが、例えば、ＳＶ４０初期遺伝子のポリＡ付加シグナル、ウサギβグロビン遺伝子のポリＡ付加シグナル、ウシ成長ホルモンのポリＡ付加シグナル等を用いることができる。
宿主に導入した発現プラスミドのコピー数を増加させるため、あるいは宿主に導入した発現プラスミドをプラスミド状態で維持させるためには、動物細胞での複製に必要な複製開始点を有するプラスミドベクターを使用する。複製開始点としては、ＳＶ４０の複製開始点やエプスタイン・バー・ウイルスの複製開始点。ｏｒｉＰを用いることができる。ＳＶ４０の複製開始点を有するプラスミドベクターは、ＳＶ４０のラージＴ抗原を発現する宿主中ではコピー数が増加するため、目的の遺伝子を高発現させる上で好適である。上記１．で取得したＳＶ４０の温度感受性ラージＴ抗原を発現する不死化細胞株に関しては、該ラージＴ抗原が機能する条件下で培養された細胞株中においては、ＳＶ４０の複製開始点を有するプラスミドベクターを用いることで、目的の遺伝子を高発現することができる。ｏｒｉＰを含むベクターは、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）を発現する宿主中では宿主の染色体に組み込まれず、染色体外に維持される。
ｏｒｉＰを含むベクターが染色体外に安定に維持されるかどうかは宿主に依存している。ＥＢＮＡ−１を発現するＢ細胞株を宿主とした場合、該ベクターは一般に染色体外に安定に維持される。もともとＥＢＮＡ−１を発現しない細胞でも、外来的にＥＢＮＡ−１遺伝子を導入して発現させることにより、ｏｒｉＰを含むベクターがプラスミド状態で維持されるようになる場合があることが知られている。
さらにプラスミドベクターには、大腸菌〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）〕用の内在性プロモーターを含む薬剤耐性遺伝子、大腸菌中での複製に必要な複製開始点が、大腸菌を用いたベクターの調製のために必要である。大腸菌用の薬剤耐性遺伝子としては、大腸菌由来のアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ遺伝子）、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。大腸菌での複製に必要な複製開始点としては、ｐＢＲ３２２の複製開始点、ｃｏｌＥ１の複製開始点等があげられる。
一過性の発現でなく安定した形質転換株の取得のためには、さらに動物細胞用の薬剤耐性遺伝子の発現ユニット（プロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子とポリＡ付加シグナルを順に連結した構造）を有するプラスミドが望ましい。動物細胞用の薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等があげられる。プロモーターとポリＡ付加シグナルは活性ペプチド前駆体遺伝子を挿入する発現ユニットに用いられるものと同様のものを用いることができる。
発現用のプラスミドベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１（−）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ〔以上全てインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３、ｐＡＭｏｈ（実施例１９）、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ（下記実施例１８参照）、ｐＡＧａｌ９−ｄ（下記実施例１８参照）等をあげることができる。
活性ペプチド前駆体をコードするＤＮＡを外来遺伝子用の発現ユニットのプロモーターの下流に挿入し、組換えベクターを造成する。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
また、市販のＤＮＡ導入試薬を用いることもできる。該ＤＮＡ導入試薬として、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｐｌｕｓ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、ＬｉｐｏｒｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＤｕｏＦｅｃｔ（Ｑ−ｂｉｏｇｅｎｅ社製）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（ＢｉｏＳＥＰＲＡ社製）等をあげることができる。
上記方法による遺伝子導入において、宿主として使用する内分泌細胞株ごとに、できるだけ発現量の高い発現ベクターを使用することが好ましい。従って、使用する宿主ごとに、最適な発現ベクター、プロモーター、および遺伝子の導入法の最適化を試みることが好ましい。
６．に後述するレポーター系を用いたアッセイ方法を利用し、生産されたペプチドの活性を高感度で検出することにより、遺伝子導入のための最適条件を決定することができる。該アッセイ系において、９６穴プレートを利用し、各穴ごとに遺伝子導入条件を設定することにより、極めて効率良く遺伝子導入のための最適条件を決定することができる。
（２）ウイルスベクターを用いた遺伝子の導入
目的とする活性ペプチド前駆体遺伝子を発現するためのウイルスベクターとしてはパッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、宿主細胞株で目的の遺伝子を発現させるために好適なプロモーターを含有しているものを用いることができ、例えば、ＭＦＧ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７（１９９５）〕、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，３５８７−３５９６（１９９０）〕、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８１５０−８１５７（１９９８）〕、およびｐＡｄｅｘ１〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３８１６−３８２１（１９９５）〕等をあげることができる。これらウイルスベクターは、該ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つが欠損している。
パッケージングに必要なタンパク質として、レトロウイルスベクターの場合にはマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等、レンチウイルスベクターの場合にはＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ等、アデノウイルスベクターの場合にはアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ等、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）等の蛋白質をあげることができる。
プロモーターとしては、上記（１）に記載のプロモーターを使用することができる。
活性ペプチド前駆体遺伝子をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入し、組換えウイルスベクターを造成する。
造成した該組換えウイルスベクタープラスミドを、該ウイルスベクタープラスミドに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケージング細胞としては、該ウイルスベクターが欠損する上記遺伝子のコードするパッケージングに必要なタンパク質を補給できる細胞であればいかなるものも用いることができ、例えば、該遺伝子を発現させたヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３等を用いることができる。
上記組換えウイルスベクターを上記パッケージング細胞に導入し、組換えウイルスを生産する。
上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクターの導入法として、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
生産された組換えウイルスを宿主細胞に感染させることにより、宿主にウイルスベクターを導入することができる。
使用する宿主ごとに、最適な発現ベクター、プロモーター、および遺伝子の導入法の最適化を試みることが好ましく、上記（１）と同様の方法で、遺伝子導入のための最適条件を決定することができる。
４．活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系
活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系は以下のようにして構築することができる。
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系では、特定の活性ペプチド前駆体遺伝子のかわりに、細胞や組織から単離したｃＤＮＡを発現ベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡソースとして、ヒトまたは動物のいかなる組織や細胞も使用することができるが、活性ペプチドを探索するためには、活性ペプチドを発現する能力のある細胞や該細胞を含む組織を用いることが好ましい。
例えば、全脳、脳の各種部位（視床下部、視床、下垂体、小脳、海馬、線条体、黒質、尾状核、扁桃体、脳梁）、副腎、腎臓、小腸、大腸、心臓、リンパ節、脊髄、気管、膵臓、骨髄、肝臓、乳腺、子宮、肺、胎盤、胃、甲状腺、骨格筋、膵臓ランゲルハンス氏島、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞などを使用することができる。また、上記１．で取得した不死化細胞株を使用することもできる。
上記の組識または細胞よりｍＲＮＡを取得し、該ｍＲＮＡより２本鎖ｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを３．（１）に記載の発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製する。該組換えベクターを大腸菌に導入してｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。このような方法で作製されたｃＤＮＡライブラリーとしては、例えば、誘導発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｎｄを用いて作製したヒト視床下部由来のｃＤＮＡライブラリー（実施例２３参照）等をあげることができる。該ｃＤＮＡライブラリーを適当な濃度に希釈して寒天培地上で培養し、出現した個々のコロニーをクローン（大腸菌）として単離することができる。また、各クローン（大腸菌）からプラスミド（組換えベクター）を単離することにより、ｃＤＮＡクローン（プラスミド）を取得することができる。プラスミドはモレキュラー・クローニング第３版等に記載の常法あるいはＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）等のキットを用いて単離できる。
（２）活性ペプチド前駆体をコードするｃＤＮＡの探索
該ｃＤＮＡライブラリーから単離したクローン（大腸菌）を１〜１００００クローンずつ、好ましくは１０〜１００クローンずつのプールに分け、各プールごとに大腸菌を培養しプラスミド（ｃＤＮＡクローンの混合物）を単離する。得られた各プール由来のプラスミド（組換えベクター）をそれぞれ、１．で取得した細胞を宿主細胞として、３．に記載の方法で宿主細胞へ導入する。得られた形質転換株を後述する５．（１）に記載の方法で培養し、各ｃＤＮＡクローンがコードする蛋白質を発現させる。該形質転換株あるいは培養上清を試料として、後述する６．に記載の方法で活性測定を行い、活性が検出されたプールを選択する。選択したプールについて再度より細かくプール分けし、同様の操作を行う。この工程を繰り返し、最終的に１クローンごとに上記の操作を行なうことにより、目的の活性ペプチド前駆体をコードするｃＤＮＡを同定することができる。
各ｃＤＮＡクローンが含むｃＤＮＡの塩基配列が明らかな場合は、活性ペプチド前駆体をコードする可能性の高いｃＤＮＡを選択して上記の操作を行うことにより、目的の活性を有するＤＮＡを効率的に探索することができる。活性ペプチド前駆体をコードする可能性の高いｃＤＮＡとしては、シグナル配列を有し、８０〜２５０アミノ酸からなり、シグナル配列以外の領域に塩基性アミノ酸が２つ連続した配列を有し、膜結合領域を持たないと推定されるという特徴を有するペプチドをコードするものがあげられる。各ｃＤＮＡがコードし得るアミノ酸配列について、上記の特徴を解析することにより、活性ペプチド前駆体をコードする可能性の高いｃＤＮＡを選択することができる。シグナル配列や膜貫通領域は、ＰＳＯＲＴ〔Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２４，３４（１９９９）〕やＳｉｇｎａｌＰ〔ＳｉｇｎａｌＰ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）〕等のプログラムや、解析ソフトＭａｃＭｏｌｌｙ  ３．５（アロカ社）、解析ソフトＳＯＳＵＩ  ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒ１．０／１０（三井情報開発）等を用いてアミノ酸配列から予測することができる。
５．活性ペプチドの生産
（１）形質転換株を用いた活性ペプチドの生産
上記３．で取得された形質転換株を培養することにより得た培養液、細胞、または該細胞の抽出液から、目的とする活性ペプチドを取得することができる。
培養は、上記１．（１）の培養法、あるいは上記１．（４）の不死化細胞株の分化形質を制御した培養方法に準じて行うことができる。
（２）内分泌細胞株を用いた活性ペプチドの生産
上記１．に記載した方法で樹立された多種類の内分泌細胞株を、上記１．（１）または１．（４）の方法に準じて培養することにより、各細胞株特有の活性ペプチドを生産することができる。
例えば、視床下部由来の細胞株が生産する既知の活性ペプチドとしては、ＮＰＹ、α−ＭＳＨ、ＮＰＦＦ、ＣＲＨ、ＴＲＨ等を、ランゲルハンス氏島由来の細胞株が生産する既知の活性ペプチドとしては、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、グレリン等をあげることができる。上記１．に記載した方法で樹立された多種類の内分泌細胞株からは、新規な活性ペプチドも生産されると考えられ、該細胞株は新規な活性ペプチドの探索にも極めて有用である。
（３）分泌刺激による活性ペプチドの放出
内分泌細胞においては、活性ペプチドは分泌顆粒に蓄積され、適当な分泌刺激が加わると一気に細胞外へ放出されることが知られている。従って、本発明の内分泌細胞由来の細胞株を用いた活性ペプチドの生産においても、該細胞に適当な分泌刺激を施すことが好ましい場合がある。
分泌刺激剤としては、高カリウム（例えば５０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、高グルコース（例えば２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ（例えば１００μｍｏｌ／Ｌ）、ＡＴＰ（例えば１μｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ）等をあげることができる。
また、分泌刺激剤として使用できる物質を、以下のようにして選択することもできる。
内分泌細胞由来の細胞株に被検物質を添加し、細胞内のＣａ２＋濃度を増加させる活性を有する被検物質を選択する。Ｃａ２＋濃度の測定は、公知の方法にしたがって、ＣＡＦ−１１０器機（日本分光社製）、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）、ＦＤＳＳ６０００システム（浜松ホトニクス社製）等の機器を用いて測定することができる。
内分泌細胞株に任意の活性ペプチド前駆体遺伝子（例えば、バソプレッシン前駆体遺伝子またはＣＲＨ前駆体遺伝子）を導入し、２〜４日培養後、該被検物質を添加し、培地中の活性ペプチド（例えば、バソプレッシンまたはＣＲＨ）の量を測定する。該被検物質を添加しない場合と比較し、添加することにより活性ペプチドの量が増加する物質を分泌刺激剤として選択する。
最終的に使用する分泌刺激剤としては、活性の検出に影響のないものを選択することが重要である。下記６．のレポーター系を用いるアッセイ細胞の場合には、該アッセイ細胞に作用してレポーター活性を上昇させない刺激剤を選択する必要がある。
できるだげ少量の培地を用い、適当な分泌刺激剤を添加してペプチドを一気に放出させることにより、高濃度のペプチド溶液を取得することができる。このような高濃度ペプチド溶液は、上記アッセイ系において、効率よく活性を検出できるため好ましい。
また、下記６．のアッセイ細胞を重層してアッセイする場合は、少量の培地を用いなくとも、適当な分泌刺激剤を添加することによりアッセイ細胞周辺のペプチド濃度を高めることができるため、分泌刺激剤を使用しない場合と比較し、より効率よく活性を検出できる。
生産される活性ペプチドの分泌顆粒への蓄積は培養条件により制御することが可能な場合がある。
例えば、マウス由来のβ細胞株であるＭＩＮ６のインスリン生産において、高グルコース（２５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース）含有培地で培養すると、インスリンは高生産されるものの恒常的に培地中に分泌されるが、低グルコース（５．５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース）含有培地で培養した場合には、生産量は低いもののインスリンは分泌顆粒に蓄積される。
従って、活性ペプチド前駆体遺伝子を発現させたＭＩＮ６を高グルコース含有培地〔例えばＤＭＥＭ（ＨＧ）培地：２５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、１５％牛胎児血清、２５Ｕ／ｍｌペニシリン、および２５μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬製）〕で培養した後、低グルコース含有培地〔例えばＤＭＥＭ（ＬＧ）培地：５．５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、１５％牛胎児血清、２５Ｕ／ｍｌペニシリン、および２５μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（日水製薬製）培地〕で培養することにより生産された活性ペプチドを分泌顆粒に蓄積させ、その後適当な分泌刺激を行うことにより、一気に多量の活性ペプチドを放出させることができる。
（４）活性ペプチドの修飾
１．で取得した内分泌細胞株、特に１．（２）に記載の各種のプロセシング酵素や修飾酵素の遺伝子を発現している内分泌細胞株を用いて５．（１）または（２）に記載の方法でペプチドを生産させることにより、ペプチドの活性に必要な適切な修飾を受けることができる。このようなペプチドの修飾としてはＣ末端のアミノ酸のアミド化、Ｎ末端へのピログルタミン酸の付加、脂肪酸の付加、糖鎖の付加等をあげることができる。
６．ペプチドの活性測定
活性ペプチド前駆体遺伝子を内分泌細胞に導入して発現させた後、該細胞の培養上清、該細胞の細胞抽出液、該細胞の膜画分、または該細胞自身を用いて、ペプチドの活性を測定することができる。活性の測定法としては、活性を測定できるいかなる方法も使用することができるが、できるだけ感度の高い方法を用いることが望ましい。例えば、該活性ペプチドと結合する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、該活性ペプチド特異的なバイオアッセイ法等をあげることができる。
例えば、活性ペプチドがＧＰＣＲのような受容体のリガンドである場合は、受容体を利用したアッセイ系により、活性ペプチドを高感度、高シグナル／ノイズ比で、簡便に検出することができる。
以下、受容体を利用したアッセイ系で、レポーター遺伝子を用いた具体例を示す。アッセイに用いる細胞（以下アッセイ細胞ともいう）は、ＧＰＣＲ等の受容体からのシグナルに応答するプロモーターの下流に連結されたレポーター遺伝子を有し、活性ペプチドの受容体遺伝子の発現ユニットを有する細胞である。活性ペプチドとアッセイ細胞上の受容体が結合すると、受容体からシグナルが流れ、レポーター遺伝子の発現が誘導される。したがって、アッセイ細胞に試料を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定することにより、試料中の活性ペプチドを検出することができる。活性ペプチドの受容体が細胞内Ｃａ２＋上昇を引き起こすタイプのＧＰＣＲである場合は、アッセイ細胞に試料を接触させ、細胞内Ｃａ２＋上昇を測定することによっても、試料中の活性ペプチドを検出することができる。アッセイ細胞は以下の方法で構築することができる。
（１）活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを発現させるための宿主・ベクター系の構築
活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを発現させるための宿主・ベクター系は、モレキュラー・クローニング第３版等に記載の通常の方法により構築することができる。本発明において構築されたエプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株を宿主として、エプスタイン・バー・ウイルスの複製開始点ｏｒｉＰを有するプラスミドをベクターとする系は、ベクターが宿主細胞の染色体外にプラスミド状態で安定に存在し、アッセイ細胞の構築上望ましい以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示す性質をもつ。
（ｉ）ベクターの宿主細胞への導入効率が高い。（ｉｉ）宿主細胞および得られるアッセイ細胞が非接着性細胞（浮遊系細胞）のため、培養操作が簡便で、アッセイの簡便性と汎用性が高い。ペプチドの発現を調べたい細胞が接着性細胞の場合、該細胞の上にアッセイ細胞を重層してアッセイすることが簡便にできるため、アッセイ方法によっては、アッセイ系の検出感度を上げることができる。（ｉｉｉ）宿主細胞および得られるアッセイ細胞を無血清で培養することができる。種々の成分を含むためアッセイ系のバックグラウンドを上昇させる場合がある血清をアッセイ系に用いる必要がないので、アッセイ系の検出感度、シグナル／ノイズ比、汎用性、および簡便性が高い。以下、本発明において構築された系について示す。
（ａ）エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株の取得
エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現するＢ細胞株としては、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現するＢ細胞株であればいかなるＢ細胞株でも用いることができるが、安全面からは、エプスタイン・バー・ウイルスを産生しない細胞株を使用するのが好ましい。該細胞としては、例えば、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４３２）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８６）、Ｄａｕｄｉ細胞を（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１３）を使用することができる。より好適には、Ｎａｍａｌｗａ細胞を使用することができる。公知の方法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，９９，１５３（１９９９）；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５３，３５５（１９９２）；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，３（１９９１）；Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３４，９５（１９８７）；特許１６５３９８６号〕に従って、上記細胞株を無血清馴化することにより、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株を取得することができる。エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現し、無血清馴化したＢ細胞株としては、好ましくは無血清馴化したＮａｍａｌｗａ細胞、より好ましくはＮａｍａｌｗａ細胞を無血清馴化することによって取得したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕が用いられる。
エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕、またはこれら培地に無血清培養用の添加物を添加した培地〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，９９，１５３（１９９９）；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５３，３５５（１９９２）；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，３（１９９１）；Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３４，９５（１９８７）〕等が用いられる。また、市販の無血清培養用の培地を用いることもできる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また、以降に記載するように該細胞に薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドを導入した場合は、対応する薬剤を培地に添加して培養してもよい。
（ｂ）ベクターの構築
活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを挿入する発現用ベクターとしては、宿主動物細胞で該ＤＮＡを発現できるベクターで、動物細胞中での複製に必要な複製開始点として、エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有するものをあげることができる。このような発現用ベクターとして、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＭｏｈ等、あるいは上記３．（１）の発現ベクターに該ｏｒｉＰを導入したもの等をあげることができる。
発現用ベクター中の外来遺伝子用の発現ユニットのプロモーターの下流に活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを挿入し、該受容体発現プラスミドを造成する。該受容体をコードするＤＮＡは、以下のようにして取得できる。該受容体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を元にして、該受容体をコードする領域を含む該ｃＤＮＡの領域を適当に選択する。選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成する。該受容体が発現している組織や細胞からｃＤＮＡを調製する。調製したｃＤＮＡを鋳型とし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより該受容体をコードするＤＮＡを増幅し単離することができる。組織や細胞からのｃＤＮＡの調製、およびＰＣＲはモレキュラー・クローニング第３版に記載の方法に従って行うことができる。
（ｃ）宿主への発現プラスミドの導入と形質転換株の取得
発現プラスミドを、上記３．（１）に記載の方法により６．（１）（ａ）で取得した宿主細胞に導入する。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている公知の方法に準じて行なうことができる。
（２）活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを誘導発現させる宿主・ベクター系の構築
上記６．（１）で取得したエプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株を宿主、エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有するプラスミドをベクターとする宿主・ベクター系に、活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡの誘導発現系を組み込むことにより、該ＤＮＡの効率的な誘導発現が可能な宿主・ベクター系を構築することができる。外来の活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを発現させた細胞はしばしば生育が悪くなるが、アッセイに用いるまで該ＤＮＡの発現を抑えておくことにより、アッセイ細胞を良好に生育させることができる。また、受容体がＧＰＣＲの場合、下記［ＩＩ］の（２）に記載するように、誘導発現系を用いてＧＰＣＲを一過的に高発現させることにより、ＧＰＣＲの構成的活性を検出することができるようになる。
誘導発現系は、特定の薬剤の添加等により活性化される転写因子を発現させた宿主に、該活性化された転写因子に応答するプロモーターの下流に任意のＤＮＡを連結した構造を有する誘導発現ベクターを導入し、薬剤の添加等により該ＤＮＡを誘導発現させる系である。誘導発現系としては、例えばエストロジェンを用いる系〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，１６５７（１９９３）〕、テトラサイクリン耐性オペロンを用いる系〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５５４７（１９９２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８３，１５９（１９９７）〕、昆虫ホルモンエクジソンを用いる系〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，３３４６（１９９６）〕、ラクトースオペロンを用いる系〔Ｃｅｌｌ，４８，５５５（１９８７）〕等を用いることができる。
エストロジェンを用いる系〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１６５７（１９９３）〕では、宿主に発現させる転写因子として酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の転写因子Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（Ｇａｌ４−ＥＲ）を用い、発現ベクターのプロモーターとして、Ｇａｌ４ｐ応答性プロモーターを用いる。本系では、エストロジェンの添加により、該プロモーター下にある任意の遺伝子の発現を誘導することができる。また、使用するエストロジェンの濃度を変えることにより、遺伝子の発現量を制御することができる。
また、テトラサイクリン耐性オペロンを用いる系〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５５４７（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，１７６６（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８３，１５９（１９９７）〕では、宿主に発現させる転写因子として、テトラサイクリン−コントロールド・トランスアクチベーター〔大腸菌のテトラサイクリン・レプレッサーとＨＳＶのＶＰ１６の転写活性化領域のキメラ蛋白質〕またはリバース・テトラサイクリン・コントロールド・トランスアクチベーター（テトラサイクリンとの結合時に転写を活性化するような変異型のテトラサイクリン・レプレッサーとＨＳＶのＶＰ１６の転写活性化領域のキメラ蛋白質）を用い、発現ベクターのプロモーターとして、テトラサイクリン応答配列を有するプロモーターを用いる。本系では、テトラサイクリン・コントロールド・トランスアクチベーターを用いた場合はテトラサイクリンまたはドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）の除去により、リバース・テトラサイクリン・コントロールド・トランスアクチベーターを用いた場合は該薬剤の添加により、上記プロモーター下にある任意のＤＮＡの発現を誘導することができる。また、存在する該薬剤の濃度を変えることにより、遺伝子の発現量を制御することができる。
大腸菌のラクトースオペロンを用いる系では、宿主に発現させる転写因子として、大腸菌のラクトース・レプレッサーを用い、ベクターのプロモーターとして、ラクトースオペレーターを有するプロモーターを用いる。本系では、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドの添加により、該プロモーター下にある任意のＤＮＡの発現を誘導することができる。
昆虫のホルモンを用いる系では、宿主に発現させる転写因子として、ショウジョウバエ由来のエクジソン受容体とレチノイン酸受容体ＲＸＲのヘテロダイマーを用い、ベクターのプロモーターとして、エクジソン応答配列を有するプロモーターを用いる。本系では、ムリステロンＡ（Ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ）またはポナステロンＡ（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ）の添加により、該プロモーター下にある任意のＤＮＡの発現を誘導することができる。
誘導発現ベクターは、例えば以下の方法で構築することができる。
６．（１）（ｂ）記載の発現用プラスミドベクターに、宿主に発現させる転写因子に対応する応答配列を有する上記プロモーターを導入する。
該プロモーターは、例えば３．（１）に記載した外来遺伝子の発現用プロモーターに１つ以上の応答配列を含むＤＮＡを挿入することにより構築することもできる。例えば、５つのＧａｌ４ｐ応答配列を有するＧａｌ４ｐ応答性プロモーター（転写因子Ｇａｌ４−ＥＲに対応）（実施例１８のｐＡＧａｌＳｄ１等）、テトラサイクリン応答配列の下流にＣＭＶプロモーターを連結したテトラサイクリン応答配列を有するプロモーター（クロンテック社製のｐＴＲＥ２等）、ＲＳＶのＬＴＲプロモーターの下流にラクトースオペレーターを連結したラクトースオペレーターを有するプロモーター（ストラタジーン社製のｐＯＲＳＶＩ／ＭＣＳ等）、５つのエクジソン応答配列の下流にヒートショックプロモーターを連結したエクジソン応答配列を有するプロモーター（ストラタジーン社製のｐＥＧＳＨ、インビトロジェン社製のｐＩＮＤ等）をあげることができる。
該プロモーター中の応答配列およびＴＡＴＡ配列に関して、それぞれの配列、数、位置を検討することによって、感度やシグナル／ノイズ比の最適化を行うことができる。６．（３）に後述するように、検討するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を挿入したレポーター誘導発現プラスミドを造成し、それぞれのレポーター誘導発現プラスミドを宿主細胞に導入して形質転換株を取得し、該形質転換株でレポーターを誘導発現させ、非誘導時のレポーターの発現量が低く、非誘導時に対する誘導時のレポーター発現量の倍率が高いプロモーターを選ぶことにより、プロモーターの最適化を行うことができる。
このようなプロモーターの最適化を行なった誘導発現用ベクターとして、ｐＡＧａｌ９−ｄ、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ（いずれも実施例１８）等をあげることができる。
上記誘導発現用のプロモーターの下流に活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを挿入し、活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを誘導発現することのできるプラスミドを造成することができる。
該ＤＮＡの誘導発現を行なうための転写因子を発現する宿主は、以下のように構築することができる。
発現プラスミド構築のためのベクターとしては、動物細部で該転写因子を発現できるベクターであればいずれも用いることができ、例えば３．（１）記載のベクターをあげることができる。このように構築される転写因子の発現プラスミドをモレキュラー・クローニング第３版等の常法に準じて造成する。このような転写因子の発現プラスミドとして、Ｇａｌ４−ＥＲの発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２（実施例１８）、テトラサイクリン・コントロールド・トランスアクチベーターの発現プラスミドｐＴｅｔ−Ｏｆｆ（クロンテック社製）、リバース・テトラサイクリン・コントロールド・トランスアクチベーターの発現プラスミドｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）、ラクトース・レプレッサーの発現プラスミドｐＣＭＶＬａｃＩ（ストラタジーン社製）、エクジソン受容体とレチノイン酸受容体ＲＸＲの発現プラスミドｐＥＲＶ３（ストラタジーン社製）、ｐＶｇＲＸＲ（インビトロジェン社製）等があげられる。
転写因子を発現させるための上記ベクターにおいて使用する動物細胞用の薬剤耐性遺伝子は、上述の誘導発現用ベクターに用いる動物細胞用の薬剤耐性遺伝子とは別の薬剤耐性遺伝子を用いることが望ましい。
転写因子の発現プラスミドを、６．（１）で取得したエプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株に、６．（１）に記載した方法を用いて導入し、多数の形質転換株を取得する。上記の誘導発現用ベクターに、活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡの代わりに、後述する６．（３）に記載のレポーター遺伝子を挿入したレポーター誘導発現プラスミドを作製し、これらの形質転換株に導入する。取得された形質転換株各々につき、転写を誘導するための薬剤等を添加することによりレポーター遺伝子の発現を誘導し、誘導しない時と誘導時のレポーター遺伝子の発現量を測定し、誘導発現の倍率（誘導時のレポーター発現量／非誘導時のレポーター発現量）を算出する。アッセイ細胞の構築において優れた性質を有する形質転換株（非誘導時の発現量が低く、誘導発現の倍率の高い形質転換株）を宿主細胞として選択する。
多数の形質転換株から選択しても、優れた性質を有する宿主細胞が得られない場合は、転写因子を発現するためのプロモーターの強さや、誘導発現プラスミド中のプロモーター配列等を検討し、再度、上記方法により宿主細胞の選定を行うとよい。
上記の方法で取得した優れた性質を有する宿主細胞として、Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２をＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞に導入して染色体ＤＮＡに組み込んだ細胞株ＫＪＭＧＥＲ８（実施例１８）等があげられる。
ＫＪＭＧＥＲ８を宿主、ｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ９−ｄを誘導発現用ベクターとして用いる宿主・ベクター系は、非誘導時の遺伝子発現のもれがなく、かつ遺伝子発現の誘導倍率が高い、極めて優れた誘導発現系である。
（３）レポーター系を組み込んだ宿主の構築
（ａ）レポータープラスミドの造成
レポーター遺伝子を挿入する発現用ベクターは、３．（１）に記載した活性ペプチド前駆体遺伝子を発現させるために用いるプラスミドベクターに、転写因子に対応する応答配列を有するプロモーターを導入することにより構築することができる。該プロモーターは、例えば３．（１）に記載した外来遺伝子の発現用プロモーターに１つ以上の応答配列を含むＤＮＡを挿入することにより構築することもできる。
受容体のシグナルに応じたレポーター系の場合にはレポーター遺伝子の発現用プロモーターとしては、受容体のシグナルに応じた応答配列を有するものを用いる。例えば受容体がＧＰＣＲの場合、測定する活性ペプチドと結合するＧＰＣＲが共役するＧ蛋白質の種類に応じた応答配列を用いる。具体的には、Ｇαｓと共役するＧＰＣＲの場合はリガンドとの結合により細胞内ｃＡＭＰを増加させるので、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を、Ｇαｉと共役するＧＰＣＲの場合はリガンドとの結合により細胞内ｃＡＭＰを減少させたり、ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化するので、ＣＲＥあるいは血清応答配列（ＳＲＥ）を、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１５またはＧα１６と共役するＧＰＣＲの場合は、リガンドとの結合によりプロテインキナーゼＣを活性化したり、細胞内Ｃａ２＋を増加させるので、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）またはＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）応答配列を有するプロモーターを用いることができる。
プロモーター中の応答配列およびＴＡＴＡ配列に関しては、それぞれの配列、数、位置を検討することによって、感度やシグナル／ノイズ比の最適化を行うことができる。具体的には、検討するプロモーターを有するレポータープラスミドをそれぞれ造成し、（ｂ）に後述するように、それぞれのレポータープラスミドを宿主細胞に導入して形質転換株を取得し、該形質転換株を刺激してレポーターを発現させ、非刺激時のレポーターの発現量が低く、非刺激時に対する刺激時のレポーター発現量の倍率が高いプロモーターを選ぶ。
レポーター遺伝子としては、いかなるレポーター遺伝子も利用できるが、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子を用いることができる〔Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，２９（１９９９）；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍｉ．，７０，５７９Ａ（１９９８）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１９，３９５（１９９９）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，２０，１８９（２０００）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３０，１６５（２０００）〕。
動物細胞用の薬剤耐性遺伝子は、本レポータープラスミドを導入する宿主細胞にすでに導入されている動物細胞用の薬剤耐性遺伝子〔６．（１）もしくは（２）に記載した活性ペプチドの受容体をコードするＤＮＡの発現プラスミドまたは６．（２）に記載した転写因子の発現用プラスミドに用いた動物細胞用の薬剤耐性遺伝子〕とは異なる動物細胞用の薬剤耐性遺伝子を用いるのが好ましい。レポーター遺伝子発現ユニットのプロモーターの最適化を行う際には、動物細胞での複製に必要な複製開始点として、宿主細胞の染色体外でプラスミドが安定に存在するエプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを用いるのが好ましい。
以上のようにして造成されたレポータープラスミドとしては、ＧＰＣＲのシグナルに応じた応答配列である１６個のＣＲＥを有するプロモーターの制御下でホタル・ルシフェラーゼを発現するｐＡＣＲＥｐｌｕｃ、同じく１６個のＣＲＥを有するプロモーターの制御下でウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するｐＡＣＲＥＲｌｕｃをあげることができる。
（ｂ）宿主細胞へのレポーター系の組み込みとすぐれた形質転換株の選択
上記（ａ）に記載の方法で造成したレポータープラスミドを、上記（１）または（２）に記載の方法で構築した宿主細胞に導入し、多くの安定形質転換株を取得する。この中から、以下のようにして、アッセイ細胞の構築上すぐれた性質（刺激に対する応答性がよくバックグラウンドが低い）をもつ形質転換株を選択し、アッセイ細胞構築の宿主細胞とする。レポータープラスミドの導入法は、上記３．（１）に記載した方法を用いることができる。レポータープラスミドにエプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰが含まれている場合は、制限酵素切断によりｏｒｉＰを除去またはｏｒｉＰの機能を破壊した後に宿主細胞に導入することにより、該プラスミドを宿主細胞の染色体に組み込むことができる。
取得された該形質転換株について、転写を誘導するための薬剤等で誘導した時と誘導しなかった時のレポーター遺伝子の発現量を比較し、刺激に対する応答性がよい細胞株を選択する。例えば、ＧＰＣＲを発現させる宿主細胞においてＣＲＥを有するプロモーターを用いた場合は、フォルスコリンで細胞を刺激することによりレポーター遺伝子を発現させることができる。同様の宿主細胞でＴＲＥを用いた場合は、ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）でレポーター遺伝子を発現させることができる。その際、該応答配列からの転写を促す物質で刺激しない時のレポーター遺伝子の発現量（バックグラウンド）ができるだけ低い細胞株を選択する。ＧＰＣＲのリガンドまたはアゴニストで細胞を刺激した時と刺激しなかった時のレポーター遺伝子の発現量を比較し、刺激に対する応答性がよい細胞株を選択することもできる。その際、刺激しない時のレポーター遺伝子の発現量（バックグラウンド）ができるだけ低い細胞株を選択する。例えば、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１およびＫＪＭＧＥＲ８はＧαｓと共役する２ａ型アデノシン受容体（Ａ２ａ）を内在的に発現しているので、これらの細胞に応答配列としてＣＲＥを含むレポータープラスミドを導入した形質転換株の場合は、Ａ２ａのアゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）を刺激物質として用いることができる。
レポーター遺伝子の発現量は、公知の方法〔Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，２９（１９９９）；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍｉ．，７０，５７９Ａ（１９９８）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１９，３９５（１９９９）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，２０，１８９（２０００）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３０，１６５（２０００）〕にしたがって、レポーターポリペプチドの量や活性を指標に測定することができる。
以上のようにして作製した、レポーター系を組み込んだ、刺激に対する応答性がよくバックグラウンドの低い形質転換株として、例えばＣＲＥの制御下にホタル・ルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドであるｐＡＣＲＥｐｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８に導入したＧＢＣ７、およびＣＲＥの制御下にウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドであるｐＡＣＲＥＲｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８に導入したＧＢＣＲ２等をあげることができる。
（４）Ｇα蛋白質またはキメラＧα蛋白質を組み込んだ宿主の構築
活性ペプチドと結合するＧＰＣＲが共役するＧ蛋白質によりシグナルが異なるため、いろいろなペプチドの活性測定を行う場合は、一般にはアッセイ方法を変える必要がある。すなわち、共役するＧ蛋白質ごとに、それに適したレポータープラスミドと該レポータープラスミドを導入した宿主細胞を構築する必要がある。その際、使用する宿主細胞によって、各Ｇα蛋白質の発現量が異なるため、Ｇα蛋白質を一緒に発現させた方がレポーター系の感度やシグナル／ノイズ比が上昇する場合がある。発現させるＧα蛋白質としては、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇαｉ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、Ｇαｏ、Ｇαｚ、ＧαｔまたはＧαｇｕｓｔがあげられる。また、Ｇα１５またはＧα１６は、多くのＧＰＣＲと共役してＧαｏと同様のシグナルを流すことが知られている。したがって、Ｇα１５またはＧα１６を宿主細胞で発現させることにより、多くのＧＰＣＲのシグナルをＮＦＡＴ応答配列やＴＲＥを用いたレポーター系で検出することができるようになる。Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１５またはＧα１６と共役するＧＰＣＲの場合は、ＧＰＣＲからのシグナルを細胞内Ｃａ２＋の上昇を指標にして検出することもできるが、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１５またはＧα１６を発現させた宿主細胞においては、リガンド刺激による細胞内Ｃａ２＋の上昇をより検出しやすくなる場合がある。
一方、ＧαｓのＣ末端の５アミノ酸を他のＧα（Ｇαｑ、Ｇαｉ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇαｔ、またはＧαｇｕｓｔ）の対応するアミノ酸に置換したキメラＧαｓを宿主細胞で発現させることにより、本来Ｇαｓ以外のＧαに共役するＧＰＣＲが該キメラＧαｓと共役するようになり、該ＧＰＣＲからのシグナルをＧαｓを介したシグナルと同様にＣＲＥを用いたレポーター系で検出することができる。
また、ＧαｑのＣ末端の５アミノ酸を他のＧα（Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、Ｇαｏ、Ｇαｚ、ＧαｔまたはＧαｇｕｓｔ）の対応するアミノ酸に置換したキメラＧαｑを宿主細胞で発現させることにより、本来Ｇαｑ以外のＧαに共役するＧＰＣＲが該キメラＧαｑと共役するようになり、該ＧＰＣＲからのシグナルをＧαｑを介したシグナルと同様に、ＮＦＡＴ応答配列やＴＲＥを用いたレポーター系で検出することができる。この時、細胞内Ｃａ２＋の上昇を指標にしてＧＰＣＲからのシグナルを検出することもできる。
したがって、例えばＧαｓのＣ末端の５アミノ酸をＧαｑの対応するアミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質とＧαｓのＣ末端の５アミノ酸をＧαｉの対応するアミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質の両者を、６．（３）で作製したＣＲＥの制御下でレポーター遺伝子を発現する宿主細胞で発現させることにより、Ｇαｓと共役するＧＰＣＲだけでなく、Ｇαｉと共役するＧＰＣＲおよびＧαｑと共役するＧＰＣＲのシグナルも検出可能なアッセイ細胞の構築に有用な、汎用性のある宿主細胞を作製することができる。
上記６．（１）〜（３）に記載の方法で構築したＧＰＣＲを発現するための宿主となる形質転換株（例えばＧＢＣ７またはＧＢＣＲ２）にキメラＧα蛋白質遺伝子の発現ユニットを、以下の（ａ）および（ｂ）に記載した方法により組み込むことができる。
（ａ）キメラＧα蛋白質の発現プラスミドの造成
キメラＧα蛋白質をコードするＤＮＡは公知の方法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，６６２（１９９０）；Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４（１９９３）；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５０，８８５（１９９６）；ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．，４０６，１６５（１９９７）；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，１３（２０００）〕に準じて造成することができる。
該キメラＧα蛋白質をコードするＤＮＡを、上記３．（１）に記載した発現ベクターのプロモーターの下流に組み込むことにより、該キメラＧα蛋白質の発現プラスミドを造成することができる。該キメラＧα蛋白質発現プラスミドに用いる動物細胞用の薬剤耐性遺伝子は、６．（１）に記載した発現ベクター、６．（２）に記載した誘導発現ベクター、６．（２）に記載した転写因子の発現プラスミド、および６．（３）に記載したレポータープラスミドに用いた動物細胞用の薬剤耐性遺伝子とは異なる動物細胞用の薬剤耐性遺伝子を用いることが好ましい。
例えば、ＧαｓのサブタイプであるＧαｓ４のＣ末端の５アミノ酸をＧαｑのＣ末端の５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質（Ｇαｓ−ｑ）をコードするＤＮＡを、発現プラスミドｐＡＭｏｈに組み込むことにより、Ｇαｓ−ｑの発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑを造成することができる。また、Ｇαｓ４のＣ末端の５アミノ酸をＧαｉのＣ末端の５アミノ酸に置換したキメラＧα蛋白質（Ｇαｓ−ｉ）をコードするＤＮＡを発現プラスミドｐＡＭｏｈに組み込むことにより、Ｇαｓ−ｉの発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉを造成することができる。また、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑおよびｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉを用いて、Ｇαｓ−ｑおよびＧαｓ−ｉを共発現するためのプラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成することができる。
プラスミドの代わりに、該キメラＧα蛋白質を発現するウイルスを使用することもできる。
（ｂ）宿主細胞へのキメラＧα蛋白質遺伝子発現ユニットの組み込み
上記（ａ）に記載の方法で造成された任意のキメラＧα蛋白質発現プラスミドを、上記６．（１）〜（３）に記載の方法で構築した宿主細胞に３．（１）に記載の方法に準じて導入することにより、安定形質転換株を取得することができる。キメラＧα蛋白質発現プラスミドにエプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰが含まれている場合は、制限酵素切断によりｏｒｉＰを除去またはｏｒｉＰの機能を破壊した後に宿主細胞に導入することにより、キメラＧα蛋白質発現プラスミドを宿主細胞の染色体に組み込むことができる。
６．（３）に記載の方法で構築したレポーター系を組み込んだ宿主細胞にキメラＧα蛋白質発現プラスミドを導入して取得した安定形質転換株の場合は、上記６．（３）（ｂ）に記載の方法と同様にして、ＧＰＣＲのリガンドまたはアゴニストで刺激した時と刺激しなかった時のレポーター遺伝子の発現量を指標として、性質の優れた（刺激に対する応答性がよく、バックグラウンドが少ない）形質転換株を選択することができる。
６．（１）または（２）に記載の方法で構築したレポータープラスミドを組み込んでいない宿主細胞にキメラＧα蛋白質発現プラスミドを導入して取得した安定形質転換株の場合は、個々の形質転換株にＧＰＣＲ発現プラスミドとキメラＧα蛋白質に対応した応答配列を有するレポータープラスミドを共導入し、上記と同様にして性質の優れた（刺激に対する応答性がよく、バックグラウンドが少ない）形質転換株を選択することができる。
以上のようにして構築した宿主細胞として、例えばＧＢＣ７にｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを導入した形質転換株から選択されたＧＢＣＣ１３、ＧＢＣＲ２にｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを導入した形質転換株から選択されたＧＢＣＲＣ６等をあげることができる。ＧＢＣＣ１３を用いることにより、Ｇαｓ、ＧαｑおよびＧαｉに共役するＧＰＣＲからのシグナルを、ホタル・ルシフェラーゼの活性を指標に検出することができる。ＧＢＣＲＣ６を用いることにより、Ｇαｓ、ＧαｑおよびＧαｉに共役するＧＰＣＲからのシグナルを、ウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を指標に検出することができる。
（５）アッセイ系の構築
（ａ）レポーターを用いるアッセイ系
６．（１）（ｂ）または（２）（ａ）に記載した方法で活性ペプチドの受容体の発現プラスミドを作製し、該プラスミドを６．（３）または（４）で構築した宿主細胞に導入して得られる安定形質転換株をアッセイ細胞として用いることができる。
６．（１）または（２）で構築した宿主細胞に、上記活性ペプチドの受容体の発現プラスミドと上記（３）（ａ）に記載した方法で構築できるレポータープラスミドを共導入して得られる安定形質転換株をアッセイ細胞として用いることもできる。
６．（１）または（２）で構築した宿主細胞に、上記活性ペプチドの受容体の発現プラスミド、上記レポータープラスミド、および上記６．（４）（ａ）に記載した方法で構築できるキメラＧα蛋白質の発現プラスミドを共導入して得られる安定形質転換株をアッセイ細胞として用いることもできる。上記レポータープラスミドと上記キメラＧα蛋白質の発現プラスミドの代わりに、キメラＧα蛋白質の発現ユニットを組み込んだレポータープラスミドを用いることもできる。
６．（３）で構築した宿主細胞に、上記活性ペプチドの受容体の発現プラスミドと上記キメラＧα蛋白質の発現プラスミドを共導入して得られる安定形質転換株をアッセイ細胞として用いることもできる。
６．（２）〜（４）で構築した宿主細胞は、それぞれの細胞に組み込まれたベクターが有する薬剤耐性遺伝子に応じた選択用薬剤を適当な量添加した培地を用いて培養するのが好ましい。培養は６．（１）（ａ）に記載の方法で行うことができる。例えば、ＫＪＭＧＥＲ８はブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）を添加した培地、ＧＢＣ７およびＧＢＣＲ２はブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）とハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）を添加した培地、ＧＢＣＣ１３およびＧＢＣＲＣ６はブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびピューロマイシン（２．０μｇ／ｍｌ）を添加した培地で培養することが好ましい。
安定形質転換株の取得は、導入したプラスミドに含まれる薬剤耐性遺伝子に応じた選択用薬剤を適当な量添加した培地で培養することにより行うことができる。例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子を有するｐＡＧａｌ９−ｎｄを用いた発現ベクターを宿主細胞ＧＢＣＲＣ６に導入した場合、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン含む培地を用いる。該培地には、上記の宿主を培養する際に添加するのが好ましい薬剤も同時に添加するのが好ましい。
活性ペプチドの受容体の誘導発現を行う場合は、（２）に記載したように誘導発現に必要な転写因子を発現する宿主細胞を用い、該転写因子に対応した応答配列を有する誘導発現用ベクターを用いる。例えば、ＧＢＣＣ１３またはＧＢＣＲＣ６のように誘導発現のためにＧａｌ４−ＥＲを発現させた宿主細胞を用いる場合は、Ｇａｌ４ｐ応答配列を含む誘導発現ベクターであるｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ９−ｄ等を活性ペプチドの受容体の発現プラスミドの造成に用いる。
６．（１）（ｂ）に記載した発現プラスミドのように構成的プロモーターによる発現の場合は、アッセイ細胞を培養するだけで、活性ペプチドの受容体をアッセイ細胞の細胞表面に発現させることができる。誘導発現の場合は６．（２）に記載した誘導発現に必要な薬剤を添加して、上記で構築したアッセイ細胞を培養することにより、活性ペプチドの受容体をアッセイ細胞の細胞表面に発現させる。例えば、Ｇａｌ４−ＥＲを発現させた宿主細胞にＧａｌ４ｐ応答配列を含む活性ペプチドの受容体の誘導発現プラスミドを導入して得られるアッセイ細胞の場合は、０．１〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの、好ましくは０．１〜１０ｎｎｍｏｌ／Ｌの１７−βエストラジオールを添加して、３時間以上、好ましくは６〜４８時間培養することにより、活性ペプチドの受容体をアッセイ細胞の細胞表面に発現させることができる。
細胞表面に活性ペプチドの受容体を発現したアッセイ細胞に、活性を測定する試料を添加して２〜２４時間、好ましくは６時間培養後、公知の方法〔Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，２９（１９９９）；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍｉ．，７０，５７９Ａ（１９９８）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１９，３９５（１９９９）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，２０，１８９（２０００）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３０，１６５（２０００）〕にしたがって、レポーター遺伝子の発現量、レポーターポリペプチドの発現量、またはレポーターポリペプチドの活性を測定する。コントロールとして、種々の濃度の活性ペプチド標品、該活性ペプチドを含まない試料、または活性ペプチド前駆体遺伝子を導入しない細胞株の培養上清等を用いて同様のアッセイを行う。コントロールの結果と比較することにより、試料中の活性ペプチドを検出、測定することができる。
既知のＧＰＣＲの代わりに、ペプチドをリガンドとすることが明らかになっていないＧＰＣＲ、あるいはオーファンＧＰＣＲを用いたアッセイ細胞を構築した場合には、該ＧＰＣＲのリガンドペプチドを同定することができる。また、上記４．で記載した活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニングの際に、これらのアッセイ細胞を用いて活性測定を行うことにより、新規な活性ペプチド前駆体遺伝子を探索することができる。
（ｂ）レポーターを用いないアッセイ系
６．（１）（ｂ）または（２）（ａ）に記載した方法で活性ペプチドの受容体の発現プラスミドを作製し、該プラスミドを６．（１）〜（４）で構築した宿主細胞に導入して得られる安定形質転換株をアッセイ細胞として用いることができる。アッセイ細胞の取得、培養、および細胞表面へのペプチド受容体の発現は、上記（ａ）と同様にして行うことができる。また、上記１．で取得した不死化細胞をアッセイ細胞として用いることもできる。
受容体への活性ペプチドの結合により生ずるアッセイ細胞内でのシグナルを測定することによって、試料中の該ペプチドを検出することができる。細胞内でのシグナルは受容体に依存しており、例えばアラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質（例えば、ＣＲＥＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＭＡＰキナーゼ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、Ｉκ−Ｂα、Ｉκ−Ｂβ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８等）のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞内ｐＨの変動、細胞増殖等をあげることができ、文献に記載の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８５７（１９９６）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，９８（１９９５）；Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２７４（１９９５）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８２２（１９９７）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１７，５７（１９９７）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８，１４００（１９９７）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８，１４７１（１９９７）；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，１３３４（１９９８）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５１，４７１（１９９８）；Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２５１３８７（１９９８）；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４８７（１９９７）；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５２，１１５（１９９７）；Ｎａｔｕｒｅ，３５８，３２５（１９９２）；Ｎａｔｕｒｅ，３９３，２７２（１９９８）；Ｃｅｌｌ，９２，５７３（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２７４９７（１９９７）；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，４３０（１９９７）；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２０，３７０（１９９９）；ＷＯ９８／４６９９５〕に準じて測定できる。また、受容体への活性ペプチドの結合により、発現量が変動する遺伝子あるいは発現量や状態が変動する蛋白質を測定することにより、受容体に結合する活性ペプチドを検出することもできる。
既知のＧＰＣＲの代わりに、ペプチドをリガンドとすることが明らかになっていないＧＰＣＲ、あるいはオーファンＧＰＣＲを用いたアッセイ細胞を構築した場合には、該ＧＰＣＲのリガンドペプチドを同定することができる。また、上記４．で記載した活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニングの際に、これらのアッセイ細胞を用いて活性測定を行うことにより、新規な活性ペプチド前駆体遺伝子を探索することができる。
［ＩＩ］宿主・ベクター系の利用
上記［Ｉ］６．で構築した宿主・ベクター系は、活性ペプチドの受容体のアッセイ系の構築だけでなく、以下のことにも利用できる。
１．任意のＧＰＣＲのアッセイ系の構築と該アッセイ系を用いた任意のＧＰＣＲのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストの探索
（ａ）レポーターを用いるアッセイ系
［Ｉ］６．（１）（ｂ）または［Ｉ］６．（２）（ａ）に記載した方法と同様にして任意のＧＰＣＲの発現プラスミドを作製し、［Ｉ］６．（５）（ａ）と同様にしてアッセイ細胞を構築し、該ＧＰＣＲを細胞表面に発現させる。該細胞に、ペプチド、化合物等任意の物質を被検物質として添加して培養後、レポーター遺伝子の発現量を測定し、コントロール（物質を溶解させた溶媒のみを添加して培養した場合）と比べてレポーター遺伝子の発現量が増加する物質を選択することにより、該ＧＰＣＲのリガンドまたはアゴニストを取得することができる。
該被検物質に関しては、ＧＰＣＲ遺伝子を挿入していないコントロールベクターを導入したアッセイ細胞を用いて同様の被検物質の添加実験を行い、レポーター遺伝子の発現量を増加させない場合に、該物質がＧＰＣＲの情報伝達系やレポーター遺伝子の転写に作用しているのでなく、ＧＰＣＲに作用するリガンドまたはアゴニストであることを確認できる。該リガンドまたはアゴニストに関して、他のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該リガンドまたはアゴニストのＧＰＣＲ特異性を評価することができる。
また、任意のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞に、該ＧＰＣＲのリガンドまたはアゴニストおよび被検物質として任意の物質を添加して培養後、レポーター遺伝子の発現量を測定し、コントロール（リガンドまたはアゴニストのみを添加した場合）と比べてレポーター遺伝子の発現量が減少する物質を選択することにより、該ＧＰＣＲのアンタゴニストを取得することができる。
該物質に関しては、他のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞と該ＧＰＣＲのアゴニストを用いて同様の実験を行い、レポーター遺伝子の発現量を減少させない場合に、該物質がＧＰＣＲの情報伝達系やレポーター遺伝子の転写に作用しているのでなく、特定のＧＰＣＲのみに作用するアンタゴニストであることが確認できる。
（ｂ）レポーターを用いないアッセイ系
上記（ａ）において、レポーター遺伝子の発現を測定する代わりに、［Ｉ］６．（５）（ｂ）に記載したアッセイ細胞内でのシグナルを測定する方法を用いて測定を行うことにより、任意のＧＰＣＲのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストの探索を行うことができる。
２．任意のＧＰＣＲの構成的活性の評価
誘導発現系を用いたＧＰＣＲのアッセイ系において、任意のＧＰＣＲ遺伝子を一過的に高発現させることにより、該ＧＰＣＲの構成的活性を測定することができる。
ＧＰＣＲの誘導発現に必要な転写因子を発現し、レポーター系を組み込んだ［Ｉ］６．（３）または［Ｉ］６．（４）に記載の方法で構築された宿主細胞に、［Ｉ］６．（２）（ａ）に記載した方法で作製した任意のＧＰＣＲの誘導発現プラスミドを導入して得られる安定形質転換株を評価用の細胞として用いる。
［Ｉ］６．（５）と同様にして、該形質転換細胞の該ＧＰＣＲを誘導発現させ、ＧＰＣＲを誘導発現させない場合とでレポーター遺伝子の発現量を比較する。ＧＰＣＲを誘導発現した時にレポーター遺伝子の発現量が増加する場合、該ＧＰＣＲは構成的活性を有すると判定できる。このようにして、構成的活性を示すＧＰＣＲ（構成活性型ＧＰＣＲ）を選択することができる。
３．構成活性型ＧＰＣＲを用いたインバースアゴニストまたはアゴニストの探索  ２．と同様にして任意の構成活性型ＧＰＣＲを誘導発現できるアッセイ細胞を構築する。該細胞に、ペプチド、化合物等任意の物質を被検物質として添加後、該ＧＰＣＲを誘導発現させ、レポーター遺伝子の発現量を測定し、コントロール（物質を溶解させた溶媒のみを添加した場合）と比べてレポーター遺伝子の発現量が減少する物質を選択することにより、該構成活性型ＧＰＣＲのインバースアゴニストを取得できる。
コントロールと比べてレポーター遺伝子の発現量が増加する物質を選択することにより、該構成活性型ＧＰＣＲのアゴニストを取得できる。
該物質に関しては、ＧＰＣＲ遺伝子を挿入していないコントロールベクターを導入したアッセイ細胞を用いて同様の被検物質の添加実験を行い、レポーター遺伝子の発現量を変化させない場合に、該被検物質がＧＰＣＲの情報伝達系やレポーター遺伝子の転写に作用しているのでなく、ＧＰＣＲに作用するインバースアゴニストまたはアゴニストであることを確認できる。該インバースアゴニストまたはアゴニストに関して、他の構成活性型ＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該インバースアゴニストまたはアゴニストのＧＰＣＲ特異性を評価することができる。
また、［ＩＩ］１．と同様にして該構成活性型ＧＰＣＲのアゴニストと任意の物質を添加して培養後、レポーター遺伝子の発現量を測定し、コントロール（アゴニストのみを添加した場合）と比べてレポーター遺伝子の発現量が減少する物質を選択し、さらにアゴニストを添加しないで該物質のみを添加した場合には、アゴニストも該物質も添加しない場合と比較して、レポーター遺伝子の発現量が減少しない物質を該ＧＰＣＲのアンタゴニスト（ニュートラルアンタゴニスト）として選択することができる。該アンタゴニストに関して、他の構成活性型ＧＰＣＲを導入したアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該アンタゴニストのＧＰＣＲ特異性を評価することができる。
４．発現クローニング
細胞や組織から単離したｃＤＮＡを［Ｉ］６．（１）（ｂ）または［Ｉ］６．（２）（ａ）に記載した発現ベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡソースとして、ヒトまたは動物のいかなる組織や細胞も使用することができる。例えば、ヒトや動物由来の各種組織、細胞、または細胞株を用いることができる。
これら細胞よりｍＲＮＡを取得し、該ｍＲＮＡより２本鎖ｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを［Ｉ］６．（１）（ｂ）または［Ｉ］６．（２）（ａ）に記載した発現用ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製後、該組換えベクターを大腸菌に導入してＣＤＮＡライブラリーを作製する。以上のｃＤＮＡライブラリーの作製はモレキュラー・クローニング第３版、特開平０５−３３６９６３等に記載の公知の方法に準じて行うことができる。得られたｃＤＮＡライブラリー（該組換えベクターを導入した大腸菌）を適当な濃度に希釈して寒天培地上で培養し、出現した個々のコロニーをクローンとして単離することができる。また、各クローン（大腸菌）からそれぞれｃＤＮＡクローンとしてプラスミド（組換えベクター）を単離できる。プラスミドはモレキュラー・クローニング第３版等に記載の常法あるいはＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）等のキットを用いて単離できる。
該ｃＤＮＡライブラリーを１〜１００００クローン（大腸菌）ずつ、好ましくは１０〜１００クローンずつのプールに分け、各プールごとに大腸菌を培養しプラスミド（ｃＤＮＡクローンの混合物）を単離する。得られた各プール由来の組換えベクターをそれぞれ、［１］６．（３）（ｂ）または［Ｉ］６．（４）（ｂ）で作製したレポーター系を組み込んだ宿主細胞に、［Ｉ］３．（１）に記載の方法で導入し、［Ｉ］６．（５）に記載の方法で安定形質転換株を得る。
得られた安定形質転換株を［Ｉ］６．（５）に記載の方法で培養し、各ｃＤＮＡクローンを発現させる。該形質転換株のレポーター遺伝子の発現量を測定し、同時にＣＤＮＡを発現させない場合（誘導発現の場合は発現を誘導しない場合、構成的発現の場合は空ベクターを導入した宿主細胞）のレポーター遺伝子の発現量も測定する。両者を比較し、ｃＤＮＡを発現させた場合にレポーター遺伝子の発現量が上昇したプールを選択する。選択したプールについて、再度より細かくプール分けし、同様の操作を行う。この工程を繰り返し、最終的に１クローンごとに上記の操作を行なうことにより、宿主細胞中のレポーター遺伝子の発現を制御している応答配列からの転写を増加させる活性を有する分子（例えば、構成活性型ＧＰＣＲ、転写因子、シグナル伝達分子、または酵素等）をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
また、上記と同様にして形質転換株に各プールのｃＤＮＡを発現させた後、該形質転換株に任意の物質を添加して２〜１２時間（好ましくは６時間）培養後、レポーター遺伝子の発現量を測定し、同時に任意の物質を添加しないで培養した場合のレポーター遺伝子の発現量も測定する。両者を比較し、任意の物質を添加した場合にレポーター遺伝子の発現量が上昇したプールを選択する。選択したプールについて、再度より細かくプール分けし、同様の操作を行う。この工程を繰り返し、最終的に１クローンごとに上記の操作を行なうことにより、任意の物質に反応してレポーター遺伝子の発現を制御している応答配列からの転写を増加させるペプチド（例えば、任意の物質をリガンドまたはアゴニストとするＧＰＣＲ、任意の物質が存在した時に活性化または不活性化する転写因子、任意の物質が存在した時に活性化または不活性化するシグナル伝達分子、あるいは任意の物質が存在した時に活性化または不活性化する酵素等）をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
また、以下のようにしてプール分けしないで発現クローニングを行うこともできる。
上記の方法で調製した全ｃＤＮＡライブラリーから常法あるいはＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアジェン社製）等のキットを用いてプラスミドを調製する。該プラスミドを、細胞表面分子あるいはＧＦＰ等の生きた細胞のままで検出可能な分子をレポーターとして発現することのできる宿主細胞に導入して、安定形質転換株を取得する。上記と同様にしてｃＤＮＡを発現後、これら検出可能な分子の発現の高い細胞を取得する。あるいは、ｃＤＮＡを発現させた細胞に任意の物質を添加して培養した後、該分子の発現の高い細胞を取得する。該分子が細胞表面分子の場合は、該分子を認識する抗体で細胞を染色した後、蛍光活性化セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ；以下、ＦＡＣＳと略記する）を用いて、抗体への結合能が高い細胞を分取する。該分子がＧＦＰの場合は、ＦＡＣＳを用いてＧＦＰの発現量が高い細胞を分取する。分取した細胞を培養後、同様の操作を繰り返すことにより、ｃＤＮＡを発現した時に該分子の発現が増加する細胞、あるいは任意の物質を添加した時に該分子の発現が増加する細胞を濃縮することができる。該細胞から、公知の方法、例えば、ハート法〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，２８３７（１９８８）〕により、導入プラスミドを回収することができる。該プラスミドを再度宿主細胞に導入し、同様の操作を行うことにより、該プラスミド中のｃＤＮＡを発現した時に該分子の発現が増加するかどうか、あるいは該ｃＤＮＡを発現した細胞に任意の物質を添加した時に該分子の発現が増加するかどうかを確認することができる。
上記の方法により取得されたｃＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素等で切断後、モレキュラー・クローニング第３版等に記載の常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕、あるいは市販のキット（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，アプライド・バイオシステムズ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（アプライド・バイオシステムズ社製）等のＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。該塩基配列より、取得したｃＤＮＡがコードするペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。
このようにして得られたペプチドの発現プラスミドを、［ＩＩ］１．または［ＩＩ］３．に記載の方法に準じて作製し、アッセイ細胞を構築する。ペプチドが構成的にあるいは活性化を受けて転写を活性化する作用を有する場合は、任意の物質を添加して培養後、レポーター遺伝子の発現量を測定することにより、該ペプチドの阻害剤または活性化剤を選択し、取得することができる。
５．構成活性型の変異ＧＰＣＲの造成
構成活性型ではないＧＰＣＲをコードするＤＮＡに、文献〔モレキュラー・クローニング第３版；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９８７−２００１）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと称す）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）；Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７，（１９９６）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２５，９５８（１９９８）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２５，９５８（１９９８）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４，４２８（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９６７０（１９９６）〕に記載の方法に準じて、部位特異的変異あるいはランダム変異を導入する。
変異導入したＧＰＣＲをコードするＤＮＡを、［Ｉ］６．（２）（ａ）に記載した誘導発現用ベクターのプロモーターの下流に挿入して、多数の変異導入ＤＮＡのライブラリーを作製する。［ＩＩ］４．記載の方法と同様にして、該変異導入ＤＮＡライブラリーをプール分けした後、各プールのＤＮＡを［Ｉ］６．（３）または［Ｉ］６．（４）記載のレポーター系および誘導発現に必要な転写因子の発現ユニットを組み込んだ宿主細胞に導入し、安定形質転換株を取得する。［ＩＩ］２．記載の方法にしたがって、ＤＮＡの発現を誘導した時としない時のレポーター遺伝子の発現を比較し、発現を誘導した時にレポーター遺伝子の発現量が増加するプールを選択する。選択したプールについて再度より細かくプール分けし、同様の操作を行う。この工程を繰り返し、最終的に１クローンごとに上記の操作を行なうことにより、構成活性型の変異ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを取得することができる。［ＩＩ］４．記載の方法を用いて、ＦＡＣＳを用いて選択を行うこともできる。
変異の部位や変異するアミノ酸の種類によって該変異導入ＤＮＡがコードするＧＰＣＲの構成的活性の強さや、リガンド、アゴニスト、またはアンタゴニストに対する反応性が変化する。インバースアゴニストやアゴニストの探索のためには、リガンド、アゴニスト、およびアンタゴニストに対する特異性が天然型ＧＰＣＲと変わらないことが望ましいが、このような変異型ＧＰＣＲは、これまでの知見〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８５７（１９９６）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，９８（１９９５）；Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２７４（１９９５）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８２２（１９９７）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１７，５７（１９９７）；Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１７，１０９（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１８５７４（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，７６１５（２０００）；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，８９０（２０００）；ＷＯ９８／４６９９５〕を参考に、リガンド、アゴニスト、およびアンタゴニストに対する特異性が天然型ＧＰＣＲと比較して変化しない確率の高い部位〔例えば、第３膜貫通領域の後半から第２細胞内領域の前半部分、上記領域中に存在し、多くのＧＰＣＲで保存された（ＡｓｐまたはＧｌｕ）−Ａｒｇ  Ｔｙｒ配列（以下、Ｄ／ＥＲＹモチーフとよぶ）に対応する各アミノ酸、第３細胞内領域の後半から第６膜貫通領域の前半部分〕にランダムに変異導入することにより取得することができる。また、第６膜貫通領域中に存在する多くのＧ蛋白質共役型受容体で保存されたプロリン残基（プロリン残基が保存されていないＧ蛋白質共役型受容体の場合は該プロリン残基の位置に対応するアミノ酸残基）から数えて（該プロリン残基を０番目として）Ｎ末側に２０残基目あるいは２２残基目のアミノ酸にランダムに変異導入することにより取得することができる。また、ＧＰＣＲをコードするＤＮＡの全域に渡ってランダムに変異を導入して、その中から構成活性型のＧＰＣＲを選択し、目的にあった変異体かどうかを評価することにより、インバースアゴニストを感度よく、高いシグナル／ノイズ比で探索するのに適した、構成的活性の強い変異体を選択することができる。
構成活性型になった変異型ＧＰＣＲに導入された変異の部位と種類（アミノ酸置換、欠失、付加）を決定することにより、任意のＧＰＣＲの構造と活性の相関についての情報を得ることができる。構成活性型の変異ＧＰＣＲは、しばしば疾患の原因となっているため、該情報をもとに疾患との関連を調べることができる。
また、使用した転写因子応答配列（例えば、ＣＲＥやＮＦκＢ応答配列）からの転写を直接または間接的に増加させる活性を有する分子（例えば、転写因子、シグナル伝達分子、または酵素等）に関しても、上記と同様にしてランダム変異を導入することにより、構成活性型の変異体を取得することができる。
また、上記分子にランダム変異を入れることによって、構成的活性を示さなくなった変異体やドミナントネガティブ変異体を取得することもできる。
［ＩＩＩ］視床下部および膵臓ランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株の利用
１．本発明の細胞株を用いた、薬物、生理活性物質、受容体の探索法または評価法
本発明の方法により、内分泌細胞、例えば視床下部細胞、ランゲルハンス氏島細胞等の形質を保持する多種の細胞株を取得することにが可能となったため、これらの細胞株を用いると、様々な内分泌細胞、例えば視床下部細胞、ランゲルハンス氏島細胞等に作用する物質（ペプチド、化合物、薬物等）を効率よく探索または評価することが初めて可能となった。
また、本発明の細胞株を用いれば、特定の内分泌細胞を多量に増やすことが可能なため、特定の内分泌細胞で発現する受容体や生理活性物質を取得することが可能である。
以下（ａ）および（ｂ）に視床下部由来あるいはランゲルハンス氏島由来の細胞株を用いた具体例をあげる。
（ａ）上記［Ｉ］１．（１）で取得した多種類の視床下部由来細胞株の混合物あるいは個々の視床下部由来細胞株、または多種類のランゲルハンス氏島由来細胞株の混合物あるいは個々のランゲルハンス氏島由来細胞株と任意の物質（ペプチド、化合物、薬物等）を接触させ、任意の物質に対する該細胞の反応性を調べることにより、該細胞株に作用する物質を探索または評価することができる。
細胞の培養法としては上記［Ｉ］１．（１）あるいは［Ｉ］１．（４）に示した方法を使用することができる。
任意の物質への細胞の反応性の測定は、例えば、上記［Ｉ］６．（５）（ｂ）で記載したアッセイ細胞の反応を測定する方法に準じて行うことができる。
細胞と接触させる薬物としてはいかなる薬物も使用することができるが、例えば、視床下部に作用して薬効を示す薬物（抗肥満薬、悪液質治療薬、抗アレルギー薬、抗免疫薬、抗炎症薬、腫瘍治療薬、ウイルス治療薬、および精神神経作用薬等）、ランゲルハンス氏島に作用して薬効を示す薬物（抗糖尿病薬、悪液質治療薬、抗免疫薬、抗炎症薬、腫瘍治療薬、ウイルス治療薬、および抗肥満薬等）、視床下部あるいはランゲルハンス氏島での副作用が問題となる薬物、あるいは視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞に発現する分子（例えば種々の受容体等）を標的とした薬物を使用することができる。
細胞と接触させるペプチドとしてはいかなるペプチドも使用できるが、例えば、受容体未知のペプチド、あるいは機能未知の分泌蛋白質、膜蛋白質、ペプチドを使用することができる。該ペプチドの代わりに、該ペプチドを発現する細胞を用いることもできる。
細胞と接触させる化合物としてはいかなる化合物も使用できるが、例えば、動物の生体中に存在することが知られている物質を使用することができる。
該細胞株に作用する物質が見つかった場合は、該物質に反応する細胞株から、該物質と相互作用する分子（受容体、酵素、転写因子等）を取得することができる。該物質と相互作用する分子の取得法としては、例えば、該物質との親和性を利用した精製法、あるいは発現クローニング法を使用することができる。
（ｂ）本発明の細胞株を各種条件下で培養した後の培養液、細胞、または該細胞の抽出液を用いて、生理活性物質を探索することができる。培養法としては、上記［Ｉ］１．（１）あるいは［Ｉ］１．（４）に記載した方法を用いることができる。
例えば、任意の蛋白質（受容体、酵素、転写因子等）を発現させた細胞および該蛋白質を発現させていない細胞に、それぞれ上記の細胞株の培養液、細胞、または該細胞の抽出液を接触させ、任意の蛋白質（受容体、酵素、転写因子等）を発現させた細胞の方が強く反応するかどうかを調べることによって、任意の蛋白質に作用する生理活性物質を探索することができる。
細胞の反応性の測定は、例えば、上記［Ｉ］６．（５）（ｂ）に記載したアッセイ細胞の反応を測定する方法に準じて行うことができる。
培養液中、細胞中、または細胞抽出液中に活性が検出された場合は、一般的な方法〔Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９７）〕を用いて、生理活性物質を単離し、その構造（全構造または部分構造）を決定することができる。生理活性物質がペプチドである場合は、一般的な方法〔遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析、東京化学同人、（１９９３）〕を用いて決定した構造（全構造または部分構造）を基に、対応する遺伝子を取得することができる。生理活性物質がペプチドである場合は、活性を示した細胞をソースとして作製したｃＤＮＡライブラリーや遺伝子ライブラリーを用いた発現クローニングによって活性物質をコードする遺伝子を取得し、活性物質の構造を明らかにすることができる。
２．視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞で発現する有用遺伝子、有用ペプチドの取得法
視床下部およびランゲルハンス氏島には多種の細胞が存在しており、それぞれの細胞は生体の恒常性の維持に重要な特定の機能を果たしていると考えられる。それらの機能は、視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞が発現する各種の受容体や各種の生理活性物質の働きを介して発揮される。特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特異的に発現する遺伝子やペプチドは、その細胞特異的な機能に関与していると考えられる。中でも特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特異的に発現する分泌ペプチドは、生理活性物質として機能している可能性が高い。また、視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞を刺激した時に発現が変動する遺伝子も、視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞の機能を調節する上で重要な受容体や生理活性物質をコードしている可能性が高いと考えられる。
したがって、特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特異的に発現する遺伝子やペプチドを探索することによって、該細胞の機能発現に重要なペプチド（各種受容体、各種生理活性物質、各種転写因子等）あるいはそれらをコードする遺伝子を取得できると考えられる。本発明で取得した視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞の形質を保持する細胞株を用いれば、１種類の視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞を多量に増やすことが可能なため、特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞で特異的に発現している遺伝子やペプチドを取得することが可能になる。本発明では、視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞の形質を保持する多種の細胞株を取得することに成功したため、様々な視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞で特異的に発現している遺伝子やペプチド、特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞を刺激した際に発現が変動する遺伝子やペプチド、あるいは特定の視床下部細胞あるいはランゲルハンス氏島細胞で発現される分泌蛋白質等の探索と取得が可能となった。以下（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に具体例をあげる。また、（ａ）〜（ｄ）の方法で取得したラット視床下部細胞あるいはラットランゲルハンス氏島細胞由来の遺伝子への相同性を利用して、ヒトやマウス等の他の哺乳類の対応する遺伝子を取得することができる。
（ａ）シグナルシーケンストラップ法を用いた分泌シグナル配列を有するペプチドをコードする遺伝子の取得
ペプチド性のリガンドや、細胞表面に存在する受容体は、一般にシグナル配列を有していることから、本発明の任意の細胞株をソースとして用いてシグナルシーケンストラップ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，６００（１９９３）；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，４８７（１９９９）〕を行うことにより、該細胞株で発現しているリガンドや受容体を効率的に取得することができる。
神経ペプチドやホルモン、あるいはそれらの受容体は、各種の刺激でその遺伝子の発現量が変動することが知られている。したがって、各種の刺激を行った本発明の細胞株をソースとしてシグナルシーケンストラップ法を行うことにより、該細胞株で発現しているリガンドや受容体をより効率的に取得することができる。
細胞株の培養法または刺激法としては、上記［Ｉ］１．（１）および［Ｉ］１．（４）に記載した方法を用いることができる。
シグナルシーケンストラップ法で使用するｃＤＮＡは部分断片であるため、該ｃＤＮＡの配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションにより全長ｃＤＮＡを取得する。該全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、該ｃＤＮＡがコードするペプチドを同定することができる。
該ペプチドのアミノ酸配列対して、相同性検索、モチーフ検索、あるいは疎水性検索を行うことによって、該ペプチドの機能を推定することができる。例えば、上記解析により、該ペプチドが、受容体、リガンド、トランスポーター、酵素等として機能するかどうかを推定することができる。分泌シグナル配列や膜貫通領域を有するかどうかを調べることにより、該ペプチドが分泌蛋白質か膜蛋白質かを確認することもできる。
該ペプチドをコードするＤＮＡを適当な細胞で発現させることにより、該ペプチドを生産し、該ペプチドの活性を実験的に調べることができる。例えば、発現方法として、下記３．で示す方法に準じた方法をあげることができる。
（ｂ）特定の細胞株で特異的に発現している遺伝子の取得
該取得方法としては、二つの異なるサンプル間で発現が異なる遺伝子を取得する方法である、サブトラクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５７３８（１９８８）〕やｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，５６４０（１９９４）〕による方法をあげることができる。また、ＤＮＡチップ法〔蛋白質核酸酵素，４５，１８４１（２０００）；日本臨床，５７，４６５（１９９９）〕等を用いて個々の細胞株で発現している遺伝子を解析し、他の細胞株で発現している遺伝子と比較することにより、各細胞株で特異的に発現している遺伝子を同定することができる。
以下、サブトラクション法を用いた例を記す。
本発明の任意の細胞株より作製したｃＤＮＡライブラリーに対して、該細胞株以外の細胞（例えば、同じ組織（視床下部またはランゲルハンス島）由来で異なる形質を示す細胞株、または別の組織由来の細胞または細胞株）より取得したｍＲＮＡを用いてサブトラクションを行う。該細胞株特異的な遺伝子を濃縮した差分化ｃＤＮＡライブラリーを調製した後、該差分化ｃＤＮＡライブラリー中の挿入ｃＤＮＡの塩基配列を５’側からランダムに決定する。決定した配列に特異的なプライマーを作製し、該プライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、差分化に使用した２種類の細胞における該配列を有する遺伝子の発現量を調べることができる。これにより、該細胞株において特異的に発現する遺伝子を同定することができる。
特異的に発現する遺伝子に対応するｃＤＮＡの全塩基配列を決定することにより、該ｃＤＮＡがコードするペプチドを同定することができる。差分化ライブラリー中のｃＤＮＡが部分断片である場合、該ｃＤＮＡの配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、全長ｃＤＮＡを取得することができる。該全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、該ｃＤＮＡがコードするペプチドを同定することができる。
該ペプチドのアミノ酸配列に対して、相同性検索、モチーフ検索、あるいは疎水性検索を行うことによって、該ペプチドの機能を推定することができる。例えば、上記解析により、該ペプチドが、受容体、リガンド、転写因子、トランスポーター、酵素等として機能するかどうかを推定することができる。分泌シグナル配列や膜貫通領域を有するかどうかを調べることにより、該ペプチドが分泌蛋白質か膜蛋白質かを決定することもできる。
該ペプチドをコードするＤＮＡを適当な細胞で発現させることにより、該ペプチドを生産し、該ペプチドの活性を実験的に調べることができる。
また、差分化したｃＤＮＡを用いて、上記のシグナルシーケンストラップ法を行うことにより、本発明の任意の細胞株で特異的に発現しているリガンドや受容体を効率よく取得することができる。サブトラクションが可能なベクターを用いてシグナルシーケンストラップ用のライブラリーを作製することにより、サブトラクションとシグナルシークエンストラップを効率的に行うことができる。
（ｃ）リガンドや受容体をコードする遺伝子の効率的取得
神経ペプチドやホルモン、あるいはそれらの受容体は、各種の刺激でその遺伝子の発現量が変動することが知られている。したがって、各種の刺激を行った本発明の任意の細胞株について、各種刺激を行った場合と行わない場合で発現が変動する遺伝子を比較することによってリガンドや受容体をコードする遺伝子をより効率的に取得することができる。具体的な方法としては、上記（ｂ）で記載したサブトラクション法、ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ法、またはＤＮＡチップ法を用いることができる。培養法および刺激法としては、上記［Ｉ］１．（１）および［Ｉ］１．（４）に記載した方法を用いることができる。
サブトラクション法で取得した差分化したｃＤＮＡを用いて、上記のシグナルシーケンストラップ法を行うことにより、本発明の任意の細胞株を刺激した際に発現が変動するリガンドや受容体を効率よく取得することができる。サブトラクションが可能なベクターを用いてシグナルシーケンストラップ用のライブラリーを作製することにより、サブトラクションとシグナルシークエンストラップを効率的に行うことができる。
（ｄ）特定の細胞株で特異的に発現しているペプチドや、あるいは特定の細胞株を刺激した際に発現が変動するペプチドの同定および取得
一般に知られているプロテオミクスの手法〔Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０００）〕を用いて解析し、特定の細胞株で特異的に発現しているペプチド、あるいは特定の細胞株を刺激した際に発現が変動するペプチドを同定することができる。市販されている機器を用いることもできる。
例えば、本発明の任意の細胞株を各種条件下で培養後、培養液または細胞の抽出液中に存在するペプチドを解析する。他の細胞株の培養液または抽出液中に存在するペプチドについても同様の解析を行い、両者の結果を比較することで、特定の細胞株で特異的に発現しているペプチドを同定することができる。視床下部由来細胞株で特異的に発現している分泌ペプチドは、神経ペプチドやホルモンとして作用することが期待される。したがって、視床下部由来細胞株の培養液中に特異的に存在するペプチドを同定することにより、神経ペプチドやホルモンを取得することが可能と考えられる。
また、神経ペプチドやホルモンは各種の刺激で発現量や分泌量が変動することが知られている。したがって、任意の視床下部細胞株を異なる条件下で培養し、培養条件により発現が変動する分泌ペプチドを同定することにより、神経ペプチドやホルモンを効率的に取得することが可能と考えられる。
培養法または刺激法としては、上記［Ｉ］１．（１）および［Ｉ］１．（４）に記載した方法を用いることができる。
上記で取得したペプチドの部分アミノ酸配列は公知の方法を用いて決定することができる。また、公知の方法を用いて、該アミノ酸配列を基に対応する遺伝子を取得することができる。
３．視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するペプチドの生産法
［Ｉ］４．または［ＩＩＩ］２．に記載の方法で取得されたペプチドをコードする遺伝子あるいは、該遺伝子との相同性を利用して取得される、ヒトやマウス等の他の哺乳類の対応する遺伝子を適当な宿主細胞中で発現させることにより、該遺伝子がコードするペプチドを製造することができる。方法としては、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用いることができる。
即ち、本発明の細胞株が発現するペプチドをコードする遺伝子を適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、該ペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、該ペプチドを製造することができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、発現させる遺伝子（仮にＡ遺伝子と呼ぶ）の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、Ａ遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ａ遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＬＥＸ（インビトロジェン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＣＡＬ−ｎ（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ５３４２７７５）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＧＥＸ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＥＴ３−ａ（ノバジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランド・バイオラブズ社）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で転写を開始できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＨプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
Ａ遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌株中で転写を開始できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞とする形質転換体は［Ｉ］３．に記載の方法により取得することができる。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞またはＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３、２９３等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等をあげることができる。
上記［Ｉ］の３．に記載したように、本発明の不死化細胞株を用いることもできる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）、モレキュラー・バイオロジー第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法によって、ペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）、ｐＶＬ１３９３（ファーミンジェン社製）、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）〕等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ  Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて本発明の細胞株が発現するペプチドを生産することができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で転写を開始できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）；特開昭６０−２５１８８７〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明の細胞株が発現するペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）；Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて、該ペプチドをコードする遺伝子を導入した動物中に該ペプチドを生産することができる。
プロモーターとしては、動物で転写を開始できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明の細胞株が発現するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ペプチドを採取することにより、該ペプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ペプチドを採取することにより、該ペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、該ペプチドをコードする遺伝子を保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ペプチドを採取することにより、該ペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、該ペプチドをコードする遺伝子を保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ペプチドを採取することにより、該ペプチドを製造することができる。
該ペプチドを製造するための形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等がを用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
該ペプチドを製造するための形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地にＦＣＳ等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ギブコ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、グレース（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
遺伝子の発現方法としては、ペプチド全長を発現させる以外に、部分ペプチドを発現させることもできる。
上記のペプチド全長または部分ペプチドは、細胞内に単独で発現させる以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌タンパク質または融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔実験医学，１３，４６９（１９９５）〕。
本発明の細胞株が発現するペプチド（部分ペプチドを含む）の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
該ペプチド（部分ペプチドを含む）が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、該ペプチド（部分ペプチドを含む）の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、目的のペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。さらに、シグナルペプチドと該ペプチドの間、または該ペプチドのＣ末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。
精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩＧＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔実験医学，１３，４６９（１９９５）〕。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
該ペプチド（部分ペプチドを含む）を製造するための形質転換体の培養物から、該ペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、該ペプチドが形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
また、該ペプチド（部分ペプチドを含む）が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ペプチドを回収後、該ペプチドの不溶体をペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ペプチド変性剤を含まないあるいはペプチド変性剤の濃度がペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ペプチドを正常な立体構造に再構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外に該ペプチドが分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離精製法と同様の手法により、該ペプチドの精製標品を得ることができる。
また、該ペプチド（部分ペプチドを含む）を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔実験医学，１３，４６９（１９９５）〕。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、該ペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、該ペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。
さらに、該ペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて該ペプチドを生産することができる。
さらに、該ペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（Ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社、アプライド・バイオシステムズ社、アマシャムバイオサイエンシズ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した該ペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば「遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析」（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
４．視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するペプチドを認識する抗体の取得法
［Ｉ］５．または［ＩＩＩ］３．に記載した方法で取得されたペプチドを抗原として用いて、視床下部細胞やランゲルハンス島細胞で発現するペプチドを認識する抗体を取得することができる。合成したペプチドを抗原として用いることもできる。また、本発明の細胞株あるいは該細胞株から調製した細胞膜画分を抗原として用いることにより、該細胞株の表面抗原を特異的に認識する抗体を取得することができる。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製法を下記（ｉ）および（ｉｉ）に記す。
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上記３．の方法により取得したペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは該ペプチドの一部のアミノ酸配列を有するペプチド（部分ペプチド）を抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。また、本発明の細胞株あるいは該細胞株から調製した細胞膜画分を抗原として用いることもできる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、３〜２０週令のラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。部分ペプチドを用いる場合は、部分ペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とする部分ペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。本発明の細胞株を抗原として用いる場合は、動物１匹当たり３〜５×１０５ｃｅｌｌｓを投与する。該細胞株から調製した細胞膜画分を抗原として用いる場合は、動物１匹当たり１〜１０ｍｇを投与する。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）〔酵素免疫測定法：医学書院刊１９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
（ｉ）で免疫に用いた本発明の細胞株が発現するペプチドまたは該ペプチドの部分断片、部分ペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したマウスまたはラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ１６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍＬ  ８−アザグアニンを加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍｌおよびジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、さらに１〜２分間ごとにＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１５μｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（０．４μｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％  ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとりＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）等に述べられているＥＬＩＳＡにより、本発明の細胞株が発現するペプチドと特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
ＥＬＩＳＡの具体的例として、以下の方法をあげることができる。免疫の際、抗原に用いた本発明の細胞株が発現するペプチド、該ペプチドの部分断片または部分ペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識酵素に応じた発色反応を行ない、プレートにコートしたペプチド、該ペプチドの部分断片または部分ペプチドに特異的に反応するものを、本発明の細胞株が発現するペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを、本発明の細胞株が発現するペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明の細胞株が発現するペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
５．視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するペプチドを認識する抗体の利用法
上記４．で取得した抗体を用いて、細胞または組織を染色することにより、視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するペプチドを発現している細胞を同定することができる。また、上記４．で取得した抗体を用いて細胞を染色後、ＦＡＣＳを用いて、視床下部細胞またはランゲルハンス氏島細胞で発現するペプチドを発現している細胞を単離することができる。
すなわち、上記［ＩＩＩ］４．で取得した抗体を用いて、特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞の分布を調べたり、特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞を単離することができる。また、神経幹細胞、体性幹細胞、あるいはＥＳ細胞を各種培養条件で培養後、該抗体を用いて特定の視床下部細胞あるいは特定のランゲルハンス氏島細胞に分化した細胞を検出、単離することができる。
抗体を用いて抗原を免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫抗体法（ＥＩＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織化学染色法や免疫細胞化学染色法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ〔単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）；続生化学実験講座５，免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）〕等があげられる。
蛍光抗体法とは、本発明の細胞株が発現するペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、該ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらにフルオロセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質で標識した該抗体と反応する抗体（例えば、該ペプチドまたはペプチドを特異的に認識する抗体がマウスＩｇＧクラスの場合、抗マウスＩｇＧ抗体）を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
ＥＩＡとは、本発明の細胞株が発現するペプチドを含む測定試料に、該ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼなどの酵素で標識した該抗体と反応する抗体（例えば、該ペプチドまたはペプチドを特異的に認識する抗体がマウスＩｇＧクラスの場合、抗マウスＩｇＧ抗体）を反応させた後、酵素による発色反応を行い、発色量を分光光度計で測定する方法である。
ＲＩＡとは、本発明の細胞株が発現するペプチドを含む測定試料に、該ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらに放射性同位体で標識した該抗体と反応する抗体（例えば、該ペプチドを特異的に認識する抗体がマウスＩｇＧクラスの場合、抗マウスＩｇＧ抗体）を反応させた後、放射能量をシンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫組織化学染色法や免疫細胞化学染色法とは、本発明の細胞株が発現するペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、該ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ等の酵素、ビオチンなどで標識した該抗体と反応する抗体（例えば、該ペプチドを特異的に認識する抗体がマウスＩｇＧクラスの場合、抗マウスＩｇＧ抗体）あるいはその断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
ウェスタンブロッティング法とは、本発明の細胞株が発現するペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に該ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ等の酵素、ビオチンなどで標識した該抗体と反応する抗体（例えば、該ペプチドを特異的に認識する抗体がマウスＩｇＧクラスの場合、抗マウスＩｇＧ抗体）あるいはその断片を反応させた後、標識物質に応じた反応を行う方法である。
ドットブロッティング法とは、本発明の細胞株が発現するペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に該ペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ等の酵素、ビオチンなどで標識した該抗体と反応する抗体（例えば、該ペプチドを特異的に認識する抗体がマウスＩｇＧクラスの場合、抗マウスＩｇＧ抗体）あるいは結合断片を反応させた後、標識物質に応じた反応を行う方法である。
免疫沈降法とは、本発明の細胞株が発現するペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を、該ペプチドを特異的に認識する抗体と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等イムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡとは、本発明の細胞株が発現するペプチドを特異的に認識する抗体を吸着させたプレートに、該ペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を反応させた後、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識した該ペプチドを特異的に認識する抗体（上記抗体とは抗原認識部位が異なる）を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］ラット胎児視床下部由来細胞株の樹立
Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．，４８，２５５（１９９９）に記載の方法で作製した温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットの胎児（胎生１４日、１７日、および２１日の胎児；各１０〜１５匹）より視床下部を含む領域を摘出した。視床下部を含む領域の摘出は既知の方法〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，５６５１（１９９６）〕に準じて行った。トランスジェニックラットは、ワイエスニューテクノロジー研究所から入手した。
視床下部由来細胞の分離と回収は酵素法を用い、以下のように行った。摘出した視床下部をＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地（ギブコ社製）で洗浄し、はさみで小さく刻んだ後に、８００回転／分で５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、５ｍｌの０．２５％トリプシン溶液（ギブコ社製）および１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製〕を５０μｌ加え、振とうしながら３７℃で１０分間酵素処理した。倒立型顕微鏡下で該酵素処理の進行状態を確認した後、４℃に冷却したウシ胎児血清を２ｍｌ添加してよく懸濁した。該懸濁液を８００回転／分で５分間遠心分離し、細胞を回収した。
該細胞を、１０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地〔１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む、ＤＭＥＭ培地とＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地の等比率混合培地（ギブコ社製）〕に懸濁した。
該細胞懸濁液を、ポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュ（ベクトン・ディッキンソン社製）１枚にまき、３３℃、炭酸ガス濃度５％、湿度１００％の条件下で培養した。細胞が増殖して飽和した時点で、培養面に対する細胞密度が約７０％になるように、ポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュに継代した。約３ヶ月間培養を継続し、視床下部由来の不死化細胞株の混合物を得た。取得した視床下部由来の不死化細胞株の混合物を、チューブを２１本に約１×１０６個の細胞となるように分注し、公知の方法で凍結保存した。
細胞のシングルクローン化はコロニー形成法を用いて行った。ポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュに１００個あるいは５００個の細胞をまき、コロニーが形成されるまで培養した。培養後、顕微鏡下で観察しながらチップの先で各コロニーを剥がし、同時にチップ内に吸引して細胞を回収した。回収した各コロニー由来の細胞は、ポリ−リジンでコートされた２４穴プレートにまき、培養した。細胞が増殖して飽和した時点で、６穴プレートおよび１００ｍｍディッシュ（いずれもポリ−リジンでコートされたもの）に順次スケールアップして、培養した。このようにして、最終的に４個のシングルクローン化した細胞株を取得した。該細胞株をそれぞれＥＡ−１、ＥＡ−２、ＥＡ−４、ＥＡ−８と命名した。ＥＡ−１は胎生１４日、ＥＡ−２とＥＡ−４は胎生２１日、ＥＡ−８は胎生１７日の胎児に由来する細胞株である。取得した４個の細胞株はそれぞれ公知の方法で凍結保存した。取得した細胞株のダブリングタイムは３６〜７２時間であった。また、樹立後１年以上経過した後も、細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかった。
［実施例２］ラット新生児視床下部由来細胞株の樹立
実施例１と同様にして、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットの新生児（生後０日の新生児１３匹）から視床下部を摘出し、得られた細胞を約３ヶ月間培養し、視床下部由来の不死化細胞株の混合物を得た。取得した視床下部由来の不死化細胞株の混合物を、チューブ２０本に、約１×１０６個の細胞となるように分注し、公知の方法で凍結保存した。
該凍結保存株より、実施例１に記載の方法に準じて１４１個のシングルクローン化した細胞株を取得した。取得した１４１個の細胞株も上記同様凍結保存した。取得した細胞株のダブリングタイムは３６〜７２時間であった。また、樹立後１年以上経過した後も、細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかった。
［実施例３］成体ラット視床下部由来細胞株の樹立
温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットの成体（生後８週齢：雄１匹、雌２匹）を頚椎脱臼により致死させた後、脳を摘出した。その脳を正中線で２等分し、髄膜を含まないように留意して視床下部を摘出した。視床下部の摘出は以下のように行った。
ラットを断頭後、頭蓋骨を露出させるために、頭部より皮膚ならびに筋肉を丁寧に除去した。断頭部より正中線に沿って頭蓋骨にはさみをいれて切断した後、最初の切断面と直角にはさみをいれることで、頭蓋骨上部を除去し、脳を露出させた。脳底に慎重にはさみをいれ視交差を切除し、脳を頭蓋骨から取り出した。取り出した脳は腹側を上にし、「カラーアトラス  ラットの解剖ガイドブック」（廣川書店）の５２頁の図を参考にして、脳底中心部にある下垂体を同定した。本下垂体を指標にして、Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）の図を参考に、視床下部領域を摘出した。
実施例１と同様にして、摘出した雄または雌の視床下部由来の細胞を別々に約３ヶ月間培養し、不死化した視床下部由来細胞株の混合物を得た。取得した成体雄または雌の視床下部由来の不死化細胞株の混合物を、それぞれチューブ１１本に、約１×１０６個の細胞となるように分注し、公知の方法で凍結保存した。
該成体雄の視床下部由来の不死化細胞株の混合物より、実施例１に記載の方法に準じて、３７３個のシングルクローン化した細胞株を取得した。取得した３７３個の細胞株をそれぞれ公知の方法で凍結保存した。取得した細胞株のダブリングタイムは３６〜７２時間であった。また、樹立後１年以上経過した後も、細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかった。
同様にして、成体雌の視床下部由来の不死化細胞株の混合物より２８０個のシングルクローン化した細胞株を取得した。取得した２８０個の細胞株をそれぞれ公知の方法で凍結保存した。取得した細胞株のダブリングタイムは３６〜７２時間であった。また、樹立後１年以上経過した後も、細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかった。
［実施例４］視床下部由来細胞株におけるＳＶ４０ラージＴ抗原の発現解析
実施例１〜３で取得したラットの胎児、新生児、成体雄、および成体雌の視床下部由来の不死化細胞株の混合物に対して、免疫染色法を用いてＳＶ４０ラージＴ抗原の蛋白質レベルでの発現を検討した。
上記の各不死化細胞株の混合物を用いて、実施例１に記載の方法に準じて培養した後、培地を除き、４％パラフォルムアルデヒド溶液を加え、４℃で１０分間反応させ細胞を固定した。該固定化細胞を０．３％トリトンＸ−１００溶液で処理した後、１０倍希釈したＳＶ４０ラージＴ抗原に対する抗体〔オンコジーン（ＯＮＣＯＧＥＮＥ）社製〕を添加し、３７℃で６０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで１回洗浄し、４０倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ社製）を添加し、室温で６０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで１回洗浄し、１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２溶液〔ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（カルビオケム）社製〕を添加し、室温で５分間反応させて核を染色した。
該核染色細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、乾燥させ、退色防止剤を含む溶液〔９０％グリセロールおよび２．５％１，４−ジアザビシクロ−［２，２，２］−オクタン（ＤＡＢＣＯ）を含むＰＢＳ、以下「退色防止剤溶液」とよぶ〕でマウントし、蛍光顕微鏡下で観察した。第１図に示したように、ほとんどの細胞においてＳＶ４０ラージＴ抗原の発現を示す陽性の染色が確認された。
以上の結果より、実施例１〜３で取得したラットの胎児、新生児、成体雄、および成体雌の視床下部由来の不死化細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原が発現されることにより不死化したものと考えられた。
さらに、３９℃培養条件下で同様に染色を行ったところ、３３℃培養条件下と比較して明らかにシグナルの低下が認められた。結果を第２図に示した。この結果より、取得した細胞群は温度感受性のＳＶ４０ラージＴ抗原を発現していると考えられた。
［実施例５］視床下部由来細胞株の培養法の検討
実施例１〜３で取得したラットの胎児、新生児、成体雄、および成体雌の視床下部由来の不死化細胞株を用い、細胞の形態を指標として、細胞の分化形質に及ぼす培養法の影響を検討した。
（１）培養温度の検討
上記の各不死化細胞株（シングルクローンおよび混合物）を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、約２×１０４個の細胞をポリ−リジンでコートされた３５ｍｍディッシュにまき、３３℃、３７℃または３９℃で５日間培養し、その形態を顕微鏡で観察した。
その結果、３７℃または３９℃で培養することにより細胞の形態が変化し、神経細胞、オリゴデンドロサイト、またはアストロサイトに特徴的な形態を示す細胞が出現した。この結果は、３７℃または３９℃で培養することにより、上記視床下部由来不死化細胞株を分化させることが可能なことを示している。実施例３で取得した成体雄の視床下部由来の不死化細胞株（ＡＭＮ２−１００）を用いて行った実験結果を第３図に示した。
（２）培地の検討
上記の各不死化細胞株（シングルクローンおよび混合物）を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、約２×１０４個の細胞をポリ−リジンでコートされた３５ｍｍディッシュにまき、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｎ２）培地〔ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地の１０％ウシ胎児血清の代わりに１％のＮ−２サプリメント（ギブコ社製）を添加した培地〕、または血清成分を添加しないＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地〔以下ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地と呼ぶ〕で５日間培養し、その形態を顕微鏡で観察した。
その結果、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｎ２）培地またはＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地で培養することにより細胞の形態が変化し、神経細胞、オリゴデンドロサイト、またはアストロサイトに特徴的な形態を示す細胞が出現した。この結果は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｎ２）培地またはＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地のような血清を含まない培地で培養することにより、上記視床下部由来不死化細胞株を分化させることが可能なことを示している。実施例３で取得した成体雄の視床下部由来の不死化細胞株（ＡＭＦ２−２０）を用いて行った実験結果を第４図に示した。
（３）培養温度と培地の検討
上記の各不死化細胞株（シングルクローンおよび混合物）を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、約２×１０４個の細胞をポリ−リジンでコートされた３５ｍｍディッシュにまき、下記の２条件で培養後、その形態を顕微鏡で観察した。条件１は３３℃で８日間、条件２は３７℃で５日間培養後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地に交換してさらに３日間培養する条件である。
その結果、条件２では細胞の形態が変化し、神経細胞、オリゴデンドロサイト、またはアストロサイトに特徴的な形態を示す細胞が出現した。この結果は、条件２で培養することにより、上記視床下部由来不死化細胞株を分化させることが可能なことを示している。
［実施例６］視床下部由来細胞株における各種遺伝子の発現解析
実施例１〜３で取得した細胞株の、第１表に示した視床下部細胞で発現している各種遺伝子に関する発現状況を下記方法により解析した。
実施例１で取得したラット胎児由来細胞株４種、実施例２で取得したラット新生児由来細胞株５７種、実施例３で取得したラット成体雄由来細胞株４９種、および実施例３で取得したラット成体雌由来細胞株４６種を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、約１×１０５個の細胞をポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュにまき、培養温度を３３℃から３７℃にシフトして５日間培養した。
培養後、各細胞株からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて全ＲＮＡを取得した。該全ＲＮＡを５μｇ用い、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ギブコ社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。該一本鎖ｃＤＮＡを水で５０倍希釈し、ＰＣＲの鋳型として使用した。
該一本鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）に、第１表に示した遺伝子特異的プライマー（各２０ｐｍｏｌ）、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ混合液を１．６μｌ、ＤＭＳＯを１μｌ、５単位／μｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を０．１μｌ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を２μｌ添加し、滅菌水を加えて全量を２０μｌに調製した。該調製液を用い、下記条件でＰＣＲを行った。サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃５分間の熱処理後、９４℃で１分間、５５、６０、６５あるいは６７℃（各遺伝子増幅に対応する反応温度を第１表に示した）で１分間、７２℃で１分間からなる反応を２５〜３５サイクル行った。
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該反応液の一部（８μｌ）をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｉｎ〔モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社〕で染色した。増幅されたＤＮＡ断片のパターンをフルオロイメージャー〔ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ  ＳＩ；モレキュラー・ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）社製〕で解析することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。
各遺伝子の転写産物の定量は、常法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕にしたがって半定量的ＰＣＲ法により行った。ラット・グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ３ＰＤＨと略す）の転写産物を同時に定量することにより、細胞間でのｍＲＮＡ量の違いや、サンプル間での逆転写酵素によるｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡへの変換効率に大差ないことを確認した。Ｇ３ＰＤＨ転写産物の定量は、常法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）；特開平０６−１８１７５９〕にしたがって定量的ＰＣＲ法により行った。
解析結果を第２表〜第５−２表に示した。上記の（１）〜（２２）の遺伝子の発現パターンが異なる多様な細胞株が取得されていることが明らかになった。
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視床下部の弓状核、室傍核、外側野、腹内側核、背内側核に発現しているレプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）遺伝子は多くの細胞株で発現されていた。弓状核、室傍核、外側野、腹内側核、背内側核に存在するＯｂ−Ｒｂ発現細胞は、それぞれ別の機能を有していると考えられており、上記（１）〜（２２）の遺伝子の発現は細胞株によって異なることから、異なる多種のＯｂ−Ｒｂ遺伝子発現細胞株を取得することができた。
核に特徴的な遺伝子の発現を指標に、上記のＯｂ−Ｒｂ発現細胞株がどの核由来のどのような細胞かを下記のように推定することが可能である。また、Ｏｂ−Ｒｂを発現していない細胞株についても、同様にしてどの核由来の細胞かを推定することができる。
ＡＭＮ２−２５は、Ｏｂ−Ｒｂ遺伝子、プレプロニューロペプチドＹ遺伝子、プレプログレリン遺伝子、ＭＣ４Ｒ遺伝子、ＮＰＹ１Ｒ遺伝子、ＮＰＹ５Ｒ遺伝子、グレリン受容体遺伝子等を発現していることから、弓状核由来のＮＰＹ産生細胞であると推定される。
ＮＣ−１２は、Ｏｂ−Ｒｂ遺伝子、プレプロオピオメラノコルチン遺伝子、ＣＡＲＴ遺伝子、ＭＣ４Ｒ遺伝子、ＮＰＹ１Ｒ遺伝子、ＮＰＹ５Ｒ遺伝子等を発現していることから、弓状核由来のα−ＭＳＨ産生細胞であると推定される。
ＡＦＮ２−４、ＡＦＦ２−１９、ＡＦＦ２−２５は、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子およびプレプロサイロトロピン放出ホルモン遺伝子を多く発現しており、かつＭＣ４Ｒ遺伝子、ＮＰＹ１Ｒ遺伝子、ＮＰＹ５Ｒ遺伝子等も発現していることから、室傍核由来の細胞であると推定される。ＡＦＦ２−２５はＯｂ−Ｒｂ遺伝子も発現していた。
ＡＦＦ１−２１、ＡＦＦ１−３７、ＡＦＦ１−３９、ＡＦＮ１−４１１、ＡＭＦ１−４８、ＡＭＮ２−７２等プレプロオレキシン遺伝子を発現している細胞株、メラニン凝集ホルモン遺伝子を発現している細胞株（ＡＭＦ２−１４）あるいはＮＰＦＦ２遺伝子を発現している細胞株（ＡＦＦ１−１９、ＡＭＦ１−４４）は、外側野由来の細胞であると推定される。
ＣＲＨＲ−１遺伝子またはＣＲＨＲ−２遺伝子を発現している細胞株の中には、腹内側核または背内側核由来の細胞があると推定される。
［実施例７］視床下部由来細胞株における各種遺伝子産物の発現解析
（１）Ｏｂ−Ｒｂの発現解析
実施例６でＯｂ−Ｒｂ遺伝子の発現が確認された視床下部由来の不死化細胞株について、下記免疫染色法により該遺伝子産物の発現を解析した。
実施例６でＯｂ−Ｒｂ遺伝子の発現が確認された視床下部由来の不死化細胞株（混合物およびシングルクローンＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５）を、実施例１に記載の方法に準じて培養した。培養後、約１×１０３個の細胞をＣＥＬＬ−ＴＡＫ〔コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）社製〕でコートされた８チャンバーにまき、培養温度を３３℃から３７℃にシフトして５日間培養した。
培養後、培地を除き４％パラフォルムアルデヒド溶液を加え、４℃で１０分間反応させ、細胞を固定した。該固定化細胞を０．３％トリトンＸ−１００溶液で処理した後、２０倍希釈したＯｂ−Ｒｂに対する抗体〔サンタ・クルズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社製〕を添加し、３７℃で６０分間反応させた。コントロールとしては、Ｏｂ−Ｒｂに対する抗体の代わりに正常ヤギ血清を用いた。反応後、ＰＢＳで１回洗浄し、２００倍希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ヤギＩｇＧ（モレキュラー・プローブズ社製）を添加し、室温で６０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで１回洗浄し、１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２溶液（カルビオケム社製）を添加し、室温で５分間反応させて核を染色した。染色後、ＰＢＳで１回洗浄し、乾燥させ、退色防止剤溶液でマウントし、蛍光顕微鏡下で観察した。
その結果、混合物およびシングルクローンＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５のいずれにおいても、Ｏｂ−Ｒｂの発現を示す陽性の染色が確認された。成体雌の視床下部由来不死化細胞株（混合物）の結果を第５図に示した。
（２）ニューロペプチドＹの発現解析
また、実施例６でプレプロニューロペプチドＹ（プレプロＮＰＹ）遺伝子の発現が確認された視床下部由来の不死化細胞株（混合物またはシングルクローン）に関しても同様に、Ｏｂ−Ｒｂに対する抗体の代わりに２００倍希釈したＮＰＹに対する抗体〔ケミコン・インターナショナル（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社製〕および２００倍希釈したシアニン３標識抗ヤギＩｇＧ〔ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）社製〕を用いて解析した。
プレプロＮＰＹ遺伝子の発現が確認された視床下部由来の不死化細胞株は、ＮＰＹの発現を示す陽性の染色が確認された。成体雄の視床下部由来不死化細胞株ＡＭＮ２−２５の結果を第６図に示した。同様の免疫染色法により、実施例６で発現の確認された遺伝子が、蛋白質レベルでも発現されていることを確認することができる。
［実施例８］視床下部由来レプチン受容体発現細胞株におけるレプチン反応性の検討
（１）抗ＳＴＡＴ抗体を用いた免疫染色による解析
実施例７に記載の方法でレプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）蛋白質を発現していることの確認された細胞株において、機能的なＯｂ−Ｒｂが発現しているかどうかを下記方法で解析した。下記方法は、レプチン刺激により転写因子ＳＴＡＴ３がリン酸化され、細胞質から核へ移行することを利用した方法である。
レプチン受容体（Ｏｂ−Ｒｂ）蛋白質を発現しているＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５を、実施例１に記載の方法に準じて培養した。培養後、約１×１０３個の細胞をＣＥＬＬ−ＴＡＫでコートされた８チャンバーにまき、培養温度を３３℃から３７℃にシフトして３日間培養した。培養後、培地を除き、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地に交換して３７℃で１７時間培養した。培養後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地に交換した。培地交換２時間後に１００ｎｍｏｌ／Ｌのヒト・レプチン（Ｒ＆Ｄシステム社製）で３７℃、１５分間細胞を刺激した。
刺激後、抗ＳＴＡＴ抗体（ＮＥＢ社製）、および２００倍希釈したシアニン３標識抗ラビットＩｇＧ（２次抗体）を用いて免疫染色を行った。免疫染色はＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ  Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社）のマニュアルに準じて行った。また、１μｇ／ｍｌ溶液のヘキスト３３３４２（カルビオケム社製）を添加し、室温で５分間反応させることにより核染色も行った。染色後、乾燥させ、退色防止剤溶液でマウントし、蛍光顕微鏡下で観察した。
Ｏｂ−Ｒｂ蛋白質を発現しているＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５は、レプチン刺激が無い条件では細胞質が染色されたが、レプチン刺激を行うことにより核内が染色された。この結果は、ＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５は、機能的なＯＢ−Ｒｂを発現していることを示している。細胞株ＮＣ−１２の結果を第７図に示した。
（２）ｃ−ｆｏｓ遺伝子およびＳＯＣＳ−３遺伝子の発現変動の解析
視床下部細胞においてレプチン刺激により発現が上昇することが知られているｃ−ｆｏｓ遺伝子およびＳＯＣＳ−３遺伝子の発現を、ＰＣＲ法利用した下記方法により解析することにより、上記（１）で機能的なＯＢ−Ｒｂを発現していることの確認された細胞株のレプチン反応性を、別の角度から確認した。
ＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、約２×１０４個の細胞をポリ−リジンでコートされた３５ｍｍディッシュにまき、培養温度を３３℃から３７℃にシフトして５日間培養した。培養後、培地を除き、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地に交換して３７℃で１７時間培養した。培養後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地に交換した。
培地交換２時間後に１００ｎｍｏｌ／Ｌのヒト・レプチン（Ｒ＆Ｄシステム社製）を添加した。３７℃で０分間、３０分間、または１時間培養後、各細胞株からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを取得した。実施例６に記載の方法に準じて、該全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成後、該ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ｃ−ｆｏｓ遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号４５、４６の塩基配列を有する合成ＤＮＡを、ＳＯＣＳ−３遺伝子遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号４７、４８の塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現も合わせて検討した。
ＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５のいずれも、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現レベルに変化がないのに対し、ｃ−ｆｏｓ遺伝子およびＳＯＣＳ−３遺伝子はレプチン刺激により発現が上昇することが認められた。この結果も、ＮＣ−６、ＮＣ−１２およびＡＭＮ２−２５が、機能的なＯＢ−Ｒｂを発現していることを示している。またこの結果は、上記方法で機能的なＯＢ−Ｒｂを発現していることの確認された細胞株をレプチン刺激して発現が変動する遺伝子を探索することにより、レプチンに応答する遺伝子群を取得することが可能なことを示している。
［実施例９］視床下部由来細胞株を宿主としたペプチド発現系の構築
（１）プレプロバソプレッシン遺伝子の発現プラスミドの造成
鋳型としてヒト胸腺由来のｍＲＮＡ（１μＧ；クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、プレプロバソプレッシン遺伝子特異的プライマーとして、配列番号４９および配列番号５０に記載した配列を有する２種類の合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりプレプロバソプレッシン遺伝子を取得した。上記プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。上記ＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。プラスミドｐＣＤＭ８（インビトロジェン社製）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記ＰＣＲ増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片およびｐＣＤＭ８由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することにより、ｐＣＤＭ８−ＶＰを造成した。
ｐＣＤＭ８−ＶＰをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、プレプロバソプレッシン遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。該ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を、発現プラスミドｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ間に組み込むことによりｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ＶＰを構築した。
また、該ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ間に組み込むことによりｐｃＤＮＡ３．１−ＶＰを構築した。
（２）プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子の発現プラスミドの造成
鋳型としてヒト視床下部由来のｍＲＮＡ（１μＧ；クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子特異的プライマーとして配列番号５１および５２に記載した配列を有する２種類の合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりプレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子を取得した。上記プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。上記ＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。プラスミドｐＣＤＭ８をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記ＰＣＲ増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片およびｐＣＤＭ８由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することにより、ｐＣＤＭ８−ＣＲＦを造成した。
ｐＣＤＭ８−ＣＲＦをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。該ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を、発現プラスミドｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ間に組み込むことによりｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ＣＲＦを構築した。
また、該ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ間に組み込むことによりｐｃＤＮＡ３．１−ＣＲＦを構築した。
（３）シングルクローンＡＦＦ２−３４を宿主としたペプチドの発現
実施例３で取得したラット成体雄の視床下部由来の不死化細胞株（シングルクローンＡＦＦ２−３４）を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、約１×１０４個の細胞をポリ−リジンでコートされた９６穴ディッシュの１穴にまき、３３℃で１日間培養した。
培養後、リポフェクトアミン・プラス（ギブコ社製、リポフェクトアミン試薬とプラス試薬からなる）を用いて、プレプロバソプレッシン発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ＶＰ）、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ＣＲＦ）またはコントロールプラスミド（ｐＣＤＭ８）をＡＦＦ２−３４に導入した。遺伝子導入は、プラスミド０．５μｇ、リポフェクトアミン試薬０．５μｌ、プラス試薬１μｌ用い、リポフェクトアミン・プラスに添付された説明書に準じて行った。遺伝子導入したＡＦＦ２−３４株をＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地１００μｌ中で３３℃で１日間培養した。培養後、培地をＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｎ２）培地１００μｌに交換し、３３℃でさらに２日間培養した。
培養後、培養上清を取得し、該培養上清中のバソプレッシン活性およびコルチコトロピン放出ホルモン活性を測定した。バソプレッシン活性は、下記実施例２１の（１）で構築したアッセイ細胞を用いて測定した。コルチコトロピン放出ホルモン活性は、実施例２１の（２）で構築したアッセイ細胞を用いて測定した。
プレプロバソプレッシン発現プラスミドを導入した細胞由来の培養上清中にはバソプレッシン活性が、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミドを導入した細胞由来の培養上清中にはコルチコトロピン放出ホルモン活性が検出された。コントロールプラスミドを導入した細胞由来の培養上清中にはいずれの活性も検出されなかった。
以上の結果から、視床下部由来の不死化細胞株（シングルクローンＡＦＦ２−３４）を宿主として活性ペプチドの前駆体遺伝子を発現させることにより、活性ペプチドを生産できることが明らかになった。
（４）シングルクローンＡＦＦ２−４０４を宿主としたペプチドの発現
実施例３で取得したラット成体雄の視床下部由来の不死化細胞株（シングルクローンＡＦＦ２−４０４）を用い、上記（３）と同様な実験を行った。ただし、ＡＦＦ２−４０４への遺伝子導入は、プラスミドを０．２μｇ、リポフェクトアミン２０００（ギブコ社製）を０．５μｌ使用して行った。
上記同様、ＡＦＦ２−４０４を宿主として用いた場合にも、活性ペプチドの前駆体遺伝子を発現させることにより、活性ペプチドを生産できることが明らかになった。
（５）活性ペプチドの生産に適した細胞株の選択法
実施例３で取得したラット成体雄の視床下部由来の不死化細胞株（混合物）を用い、再度シングルクローン化することにより、新たに７０８個のシングルクローンを取得した。上記（３）の方法に準じて、シングルクローンにプレプロバソプレッシン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＰ）を導入した株のバソプレッシン活性を測定した。
バソプレッシンの活性が高かった６種のシングルクローン（ＡＦ２−Ｃ３、ＡＦ２−Ｃ１１、ＡＦ２−Ｅ２、ＡＦ２−Ｅ１１、ＡＦ２−Ｆ７、ＡＦ２−Ｇ５）を優良株として取得した。
（６）活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系の構築
上記（５）で取得したシングルクローンＡＦ２−Ｅ２およびＡＦ２−Ｇ５を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、約２×１０４個の細胞をポリ−リジンでコートされた９６穴デッシュの各穴にそれぞれまき、３３℃で１日間培養した。培養後、リポフェクトアミン・プラス（ギブコ社製）を用いて、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のプラスミドをそれぞれ導入した。遺伝子導入は、プラスミド０．２μｇ、リポフェクトアミン試薬０．５μｌ、プラス試薬１μｌ用い、リポフェクトアミン・プラスに添付された説明書に準じて行った。
（ｉ）コントロールプラスミド〔ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕
（ｉｉ）プレプロバソプレッシン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＰ）
（ｉｉｉ）ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＰをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で１／１０に希釈した混合プラスミド
導入後、各細胞をＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地１００μｌ中で３３℃で１日間培養した。培養後、培地をＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｎ２）培地１００μｌに交換し、３３℃でさらに２日間培養した。該培養細胞上に、実施例２１の（１）で構築したアッセイ細胞を重層後、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰを添加した。添加６時間後に、セレンテラジンｈ（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ  ｈ：モレキュラー・プローブズ社）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、ＶＩＭカメラ（ＡＲＧＵＳ−５０／２Ｄルミノメータ／ＭＰ：浜松ホトニクス社製）を用い、レポーター（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ）の活性を測定した。
プレプロバソプレッシン発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＶＰ（非希釈）を導入した場合には、いずれの細胞においても活性が検出され、ベクター〔ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のみを導入した場合は、活性は検出されなかった。
また、いずれの細胞においても、発現プラスミドをベクターで１／１０まで希釈しても活性が検出された。１／１０まで希釈しても活性が検出できることより、適当な視床下部細胞株を宿主として選択して用いることにより、少なくとも１０種の遺伝子やライブラリーを同時に宿主細胞に導入して、目的の活性を測定することができることが明らかになった。
また、活性ペプチドの生産に適した各種細胞株を宿主として、ランダムペプチドをコードする遺伝子を発現させることにより、多種のペプチドを効率よく生産することができる。例えば、任意の活性ペプチド前駆体遺伝子の活性ペプチドをコードしている遺伝子部分を、ランダムペプチドをコードする遺伝子と置換することによって、ランダムペプチドを発現する遺伝子を作製することができる。
［実施例１０］スルホニルウレアに反応する視床下部由来細胞株の同定
（１）視床下部由来の不死化細胞株（混合物）を用いたスルホニルウレアに反応する細胞株の検出
実施例３で取得したラット成体雌の視床下部由来の不死化細胞株（混合物）を、実施例１に記載した方法に準じて培養した。培養後、細胞に５μｍｏｌ／ＬのＦｕｒａ−２ＡＭを添加し、３７℃で１時間培養した。得られた細胞をＨＢＳＳバッファー（ギブコ社製）で２回洗浄後、該細胞を浮遊させた。約１×１０６個の細胞に最終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにスルホニルウレア（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ；アレキシス社製）を添加し、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を調べた。細胞内Ｃａ２＋濃度の測定は、ＣＡＦ−１１０器機（日本分光社製）を用いて行った。
その結果、上記不死化細胞株（混合物）中にスルホニルウレアに反応する細胞株が存在することが判明した。結果を第８図（ａ）に示した。
（２）視床下部由来の不死化細胞株（シングルクローン）を用いたスルホニルウレアに反応する細胞株の同定
上記（１）と同様にして、実施例３で取得したラット成体雄の視床下部由来の不死化細胞株（シングルクローンＡＭＮ２−２５）のスルホニルウレアへの反応性を調べた。第８図（ｂ）に示したように、ＡＭＮ２−２５も、スルホニルウレアに反応して細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇することが判明した。この結果は、シングルクローンＡＭＮ２−２５がスルホニルウレア受容体を発現していることを示している。
上記方法により、スルホニルウレアに反応する視床下部由来の不死化細胞株（シングルクローン）を同定または選択することができる。また、上記結果は、実施例１〜３で取得したラットの胎児、新生児、成体雄、あるいは成体雌の視床下部由来の不死化細胞株（混合物あるいはシングルクローン）を、任意の物質（蛋白質、ペプチド、化合物、薬物、細胞、細胞の培養上清、あるいは細胞の抽出液等）と接触させ、該物質に反応する視床下部由来細胞株が存在するかどうかを調べることにより、視床下部由来細胞株に反応する物質を探索することができることも示している。
［実施例１１］膵臓ランゲルハンス氏島由来細胞株の樹立
Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．４８，２５５（１９９９）に記載の方法で作製した、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット（ワイエスニューテクノロジー研究所から入手）から、既知の方法〔高木良三郎、浜口和之、小野順子、新生化学実験講座  第１８巻、細胞培養技術１５４−１５９頁〕に準じて膵臓を摘出した。即ち、ラット膵臓に、０．７ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（和光純薬社製）を含むハンクス液を注入した後、膵臓を摘出した。
該膵臓を５０ｍｌチューブに入れ、３７℃の恒温槽で３０分間振とうした後、氷冷した０．５％牛血清アルブミン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製：以下ＢＳＡと略す〕を含むハンクス液〔１３７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、１．３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ〕を８ｍｌ添加し、激しく振とうして膵組織をほぐした。
該膵組織を、日立社製の遠心分離機（ｈｉｍａｃＳＣＴ−５ＢＡ）を用いて、１２００回転／分で２分間遠心分離して沈殿を取得した。該沈殿に氷冷したハンクス液を４０ｍｌ加えて懸濁後、１２００回転／分で２分間遠心分離して沈殿を取得した。この操作を遠心後の上清に濁りがなくなるまで行った。
得られた沈殿にハンクス液を４０ｍｌ加えて懸濁後、懸濁液を金属の茶漉し（タイガークラウン社製）でろ過した。得られたろ過液に氷冷したハンクス液を２０ｍｌ加えた後、１２００回転／分で２分間遠心分離して沈殿物を取得した。この操作をさらに２回繰り返した。
得られた沈殿にヒストパーク−１０７７（シグマ社製）を１０ｍｌ加えて懸濁後、５ｍｌずつ１５ｍｌチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社）に分注した。該分注懸濁液の上に、室温のハンクス液５ｍｌを、パスツールピペットを用いて静かに重層し、室温、２３００回転／分の条件で１５分間遠心分離した。
境界面に集まったランゲルハンス氏島をパスツールピペットを用いて集め、０．５％  ＢＳＡを含むハンクス液を１０ｍｌ加えた後、１２００回転／分で２分間遠心分離して沈殿を取得した。該沈殿に０．５％  ＢＳＡを含むハンクス液を１０ｍｌ加えた後、１２００回転／分で２分間遠心分離して沈殿（ランゲルハンス氏島）を取得した。この操作をさらに１回行った。
得られたランゲルハンス氏島を、氷冷した０．５％  ＢＳＡを含むハンクス液１０ｍｌに懸濁し、８００回転／分で３０秒間遠心分離して沈殿を取得した。該沈殿を１０ｍｌのＣａ２＋・Ｍｇ２＋不含平衡塩類溶液〔８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．３ｇ／ｌ  ＫＣｌ、０．０５ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２５ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、２ｇ／ｌグルコース：以下ＣＭＦ液と略す〕に懸濁後、８００回転／分で１分間遠心分離して沈殿を取得した。
該沈殿に０．０２％  ＥＤＴＡを含むＣＭＦ液を１０ｍｌ加え、室温で５分間ゆっくりと振とうした後、１２００回転／分で１分間遠心分離して沈殿を取得した。該沈殿に１０ｍｌのＣＭＦ液を加えて懸濁後、１２００回転／分で１分間遠心分離して沈殿を取得した。該沈殿を３．３ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（三光純薬社製）を含むＣＭＦ液（１０ｍｌ）に懸濁し、室温で１５分間ゆっくり振とうした後、１２００回転／分で１分間遠心分離して沈殿（ランゲルハンス氏島由来細胞）を取得した。
得られたランゲルハンス氏島由来細胞を１０ｍｌのＣＭＦ液を用いて３回洗浄後、２つに分け、（１）１０％牛胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した、ＤＭＥＭ培地（シグマ社製：製品番号Ｄ−５７９６）〔以下、ＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地と呼ぶ；該培地には２５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースが含まれている〕、または（２）１０％牛胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬製：製品番号０５９１８）〔以下、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地と呼ぶ〕の２種の培地（１０ｍｌ）を用い、ポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュ（ベクトン・ディッキンソン社製）中、３３℃、炭酸ガス濃度５％、湿度１００％の条件下で培養した。
細胞が増殖して飽和した時点で、それぞれの培地を用いて、培養面に対する細胞密度が約７０％になるように、ポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュ中に継代した。それぞれの培地で約３ヶ月間培養を継続し、ランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株の混合物を得た。取得したランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株の混合物を、それぞれ約５×１０６細胞となるようにチューブ５本に分注し、公知の方法で凍結保存した。
凍結保存細胞を用い、下記コロニー形成法によりシングルクローン化を行った。ポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュ（ベクトン・ディッキンソン社製）に１００個あるいは５００個の細胞をまき、それぞれの培地を用いて、コロニーが形成されるまで培養した。培養後、顕微鏡下で観察しながらチップの先で各コロニーを剥がし、同時にチップ内に吸引して細胞を回収した。回収した各コロニー由来の細胞は、ポリ−リジンでコートされた２４穴プレートにまき、それぞれの培地を用いて培養した。細胞が増殖して飽和した時点で、６穴プレートおよび１００ｍｍディッシュ（いずれもポリ−リジンでコートされたもの）に順次スケールアップした。
上記コロニー形成法により、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地より１１７個の、ＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地を用いて１４４個のシングルクローン化した細胞株を取得した。ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて取得された細胞株は、それぞれＲ−１〜Ｒ−４５、Ｍ−１〜Ｍ−６３、およびＦ−１〜Ｆ−９と、ＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地を用いて取得された細胞株は、それぞれＤ−１〜Ｄ−７２、およびＤ２−１〜Ｄ２−７２と命名した。取得した細胞株をそれぞれ公知の方法で凍結保存した。取得した細胞株のダブリングタイムは３６〜７２時間であった。また、樹立後１年以上経過した後も、細胞株の増殖性に顕著な変化は見られなかった。
［実施例１２］膵臓ランゲルハンス氏島由来細胞株における各種遺伝子の発現解析
実施例１１で取得したランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株（混合物またはシングルクローン）の、ランゲルハンス氏島で発現している第６表に示した各種遺伝子に関する発現状況を下記方法により解析した。
実施例１１で取得した細胞株を、実施例１１に記載の方法に準じて培養した。培養後、約１×１０５個の細胞をポリ−リジンでコートされた１００ｍｍディッシュにまき、培養温度を３３℃で５日間培養した。
培養後、各細胞株からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを取得した。該全ＲＮＡを５μｇ用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ギブコ社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。該一本鎖ｃＤＮＡを水で５０倍希釈し、ＰＣＲの鋳型として使用した。
該一本鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）に、第６表に示した遺伝子特異的プライマー（各２０ｐｍｏｌ）、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ混合液を１．６μｌ、ＤＭＳＯを１μｌ、５単位／μｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｌｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を０．１μｌ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を２μｌ添加し、滅菌水を加えて全量を２０μｌに調製した。該調製液を用い、下記条件でＰＣＲを行った。サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃５分間の熱処理後、９４℃で１分間、６０、６５あるいは６７℃（各遺伝子増幅に対応する反応温度を第６表に示した）で１分間、７２℃で１分間からなる反応を２５〜３５サイクル行った。
該反応液の一部（８μｌ）をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｉｎ（モレキュラー・プローブズ社）で染色した。増幅されたＤＮＡ断片のパターンをフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ  ＳＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）で解析することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。
各遺伝子の転写産物の定量は、常法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕にしたがって半定量的ＰＣＲ法により行った。ラット・グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ３ＰＤＨと略す）の転写産物を同時に定量することにより、細胞間でのｍＲＮＡ量の違いや、サンプル間での逆転写酵素によるｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡへの変換効率に大差ないことを確認した。Ｇ３ＰＤＨ転写産物の定量は、常法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）；特開平０６−１８１７５９〕にしたがって定量的ＰＣＲ法により行った。
2003087366.tif 000011
解析した結果のうち、第７−１表〜第７−６表にＤ−１〜Ｄ−７２、Ｄ２−１〜Ｄ２−７２、Ｒ−１〜Ｒ−４５の各細胞株の、プレプロインスリン（表中ではＩｎｓで表した）、プレプログルカゴン（表中ではＧｌｕで表した）、プレプロソマトスタチン（表中ではＳＭで表した）、プレプロ膵ポリペプチド（表中ではＰＰで表した）、ＰＣ１、ＰＣ２、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、ＰＤＸ１、ニューロＤの各遺伝子についての発現量を＋＋＋、＋＋、＋、＋／−、−で示した。上記の（１）〜（１７）の遺伝子の発現パターンが異なる多様な細胞株が取得されていることが明らかになった。
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［実施例１３］膵臓ランゲルハンス氏島由来細胞株における各種遺伝子産物の発現解析
（１）インスリンの発現解析およびインスリン発現細胞の取得
ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて取得した実施例１１に記載の不死化細胞株の混合物（約１×１０３細胞）をＣＥＬＬ−ＴＡＫでコートされた８チャンバーのＬａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）にまき、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用い、３３℃で２日間培養した。
培養後、培地を除き、４％パラフォルムアルデヒド溶液を加え、４℃で１０分間反応させ、細胞を固定した。該固定化細胞を０．３％トリトンＸ−１００溶液で処理した後、１％牛胎児血清を含んだＰＢＳを添加し、室温で３０分間放置し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、１０００倍希釈した抗インスリン抗体（シグマ社製）を添加し、３７℃で６０分間反応させた。反応後、１％牛胎児血清を含んだＰＢＳで３回洗浄し、２００倍希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ヤギＩｇＧ（モレキュラー・プローブズ社製）を添加し、室温で６０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで２回洗浄し、１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２溶液（カルビオケム社製）を添加し、室温で５分間反応させて核を染色した。
染色後、ＰＢＳで２回洗浄し、乾燥させ、退色防止剤溶液でマウントし、蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、インスリンを発現する細胞が存在していることが判明した。
ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて取得した、実施例１１に記載の不死化細胞株の各シングルクローンについても下記方法でインスリン発現細胞の存在を確認した。
ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて取得した、実施例１１に記載の各シングルクローン（約１×１０４細胞）を９６穴プレートの１穴にまき、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて３３℃で２日間培養した。培養後、上記と同様の方法で、抗インスリン抗体を用いた免疫染色およびヘキスト３３３４２を用いた核染色を行った。その結果、シングルクローンＭ−８、Ｍ−９、およびＭ−１５がインスリンを発現していることが明らかになった。
（２）プロセシング酵素ＰＣ１の発現解析およびＰＣ１発現細胞の取得
ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて取得した実施例１１に記載の不死化細胞株の各シングルクローン（約１×１０４細胞）を９６穴プレートの１穴にまき、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて３３℃で２日間培養した。
培養後、上記（１）の方法に準じて、抗ＰＣ１抗体を用いた免疫染色およびヘキスト３３３４２を用いた核染色を行った。抗体としては、５０倍希釈した抗ＰＣ１抗体（ケミコン・インターナショナル社製）を使用した。その結果、シングルクローンＭ−９およびＭ−３３がＰＣ１を発現していることが明らかになった。
（３）プロセシング酵素ＰＣ２の発現解析およびＰＣ２発現細胞の取得
ＲＰＭＩＩ１６４０培地を用いて取得した実施例１１に記載の不死化細胞株の各シングルクローン（約１×１０４細胞）を９６穴プレートの１穴にまき、ＲＰＭＩ培地を用いて３３℃で２日間培養した。
培養後、上記（１）の方法に準じて、抗ＰＣ１抗体を用いた免疫染色およびヘキスト３３３４２を用いた核染色を行った。抗体としては、５０倍希釈したＣｈｅｍｉｃｏｎ  ＩｎｔｅＲＮＡｔｉｏｎａｌ社製の抗ＰＣ２抗体を使用した。その結果、シングルクローンＭ−９、Ｍ−１５、およびＦ−１〜Ｆ−９等多くの細胞がＰＣ２を発現していることが明らかになった。
［実施例１４］スルホニルウレアに反応するランゲルハンス氏島由来細胞株の同定
ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて取得した実施例１１に記載の不死化細胞株のシングルクローン（Ｍ−６、Ｍ−９、Ｍ−１５、Ｍ−１９、Ｍ−２０、Ｍ−３３、Ｍ−４３、Ｆ−１、Ｆ−９）約５×１０６細胞を、６０ｍｍディッシュにまき、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて３３℃で２日間培養した。
培養後、これら細胞に５μｍｏｌ／ＬのＦｕｒａ−２ＡＭを添加し、３７℃で１時間培養した。培養後、ＨＲＳＳバッファー（ギブコ社製）で２回洗浄し、細胞を浮遊させた。該細胞約１×１０６個に最終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにスルホニルウレア（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ、アレキシス社製）を添加し、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を調べた。細胞内Ｃａ２＋濃度の測定は、ＣＡＦ−１１０器機（日本分光社製）を用いて行った。
その結果、調べた全てのシングルクローンにおいて、スルホニルウレアに反応して細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇することが判明した。この結果は、調べた全てのシングルクローンがスルホニルウレア受容体を発現していることを示している。
以上の結果は、実施例１１で取得したラットのランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株（混合物あるいはシングルクローン）を、任意の物質（蛋白質、ペプチド、化合物、薬物、細胞、細胞の培養上清、あるいは細胞の抽出液等）と接触させ、該物質に反応するランゲルハンス氏島由来細胞株が存在するかどうかを調べることにより、ランゲルハンス氏島由来細胞株に反応する物質を探索することができることも示している。
［実施例１５］膵臓ランゲルハンス氏島由来細胞株の培養法の検討
（１）培地の検討
実施例１３の（３）でＰＣ２を発現していることが確認されたシングルクローン（１８クローン）を、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて３３℃で培養後、約１×１０４個の細胞を９６穴プレートの１穴にまき、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地あるいはＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地を用いて３３℃で２週間培養した。培養後、実施例１３の（２）および（３）に示した方法を用いて、ＰＣ１およびＰＣ２の発現量を検討した。
その結果、多くの細胞株において、ＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地で培養することにより、生育が遅くなり、ＰＣ１およびＰＣ２の発現が増加することが明らかになった。この結果は、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地で培養していた細胞を、ＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地に置換して２週間培養することにより、上記ランゲルハンス氏島由来細胞株の分化形質を制御することができることを示している。第９図に、細胞株Ｆ−８を用いて得られた結果を示した。
（２）培養温度の検討
上記（１）と同じシングルクローンを、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて３３℃で培養後、約１×１０４個の細胞を９６穴プレートの１穴にまき、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地またはＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地を用いて、３３℃または３７℃で２週間培養した。培養後、実施例１３の（２）および（３）に示した方法を用いて、ＰＣ１およびＰＣ２の発現量を検討した。
その結果、シングルクローンＦ−１においては、ＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地で３７℃で培養すると、同培地で３３℃で培養した場合に比較して、ＰＣ１の発現がさらに増加することが明らかになった。この結果は、３３℃で培養していた細胞を、３７℃で２週間培養することにより、上記ランゲルハンス氏島由来細胞株の分化形質を制御することが可能な場合があることを示している。
［実施例１６］ランゲルハンス氏島由来細胞株を宿主とした活性ペプチド発現系の構築
実施例１１で取得したラットのランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株（シングルクローンＦ−４、Ｆ−５、およびＦ−８）を、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地を用いて３３℃で培養後、２〜５×１０４個の細胞を９６穴プレートの１穴にまき、３３℃で１日間培養した。
培養後、リポフェクトアミン・プラス（ギブコ社製）を用いて、実施例９の（１）で作製したプレプロバソプレッシン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＰ）、実施例９の（２）で作製したプレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＲＦ）、あるいはコントロールプラスミド〔ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕を細胞に導入した。遺伝子導入は、プラスミド０．２μｇ、リポフェクトアミン試薬０．５μｌ、プラス試薬１μｌ用い、リポフェクトアミン・プラスに添付された説明書に準じて行った。
遺伝子導入した株を、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地１００μｌ中、３３℃で１日間培養した。培養後、培地を血清を含まないＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地１００μｌに交換し、３３℃でさらに２日間培養した。培養後、培養上清を取得し、該培養上清中のバソプレッシン活性およびコルチコトロピン放出ホルモン活性を測定した。バソプレッシン活性は、下記実施例２１の（１）で構築したアッセイ細胞を用いて測定した。コルチコトロピン放出ホルモン活性は、実施例２１の（２）で構築したアッセイ細胞を用いて測定した。
プレプロバソプレッシン発現プラスミドを導入した細胞由来の培養上清中にはバソプレッシン活性が、プレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミドを導入した細胞由来の培養上清中にはコルチコトロピン放出ホルモン活性が検出された。コントロールプラスミドを導入した細胞由来の培養上清中にはいずれの活性も検出されなかった。上記において、ＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地の代わりに、ＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地を用いても同様の結果が得られた。以上の結果から、ランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株（シングルクローンＦ−４、Ｆ−５、およびＦ−８）を宿主として活性ペプチドの前駆体遺伝子を発現させることにより、活性ペプチドを生産できることが明らかになった。
［実施例１７］膵臓ランゲルハンス氏島由来細胞株を宿主とした活性ペプチドの発現クローニング系の構築
（１）活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系の構築
実施例１６に記載した方法に準じて、ランゲルハンス氏島由来の不死化細胞株（シングルクローンＦ−８）に、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のプラスミドをそれぞれ導入した。
（ｉ）コントロールプラスミド〔ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕
（ｉｉ）プレプロコルチコトロピン放出ホルモン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＲＦ）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）で１／１０に希釈した混合プラスミド
（ｉｉｉ）ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＲＦをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で１／１００に希釈した混合プラスミド
導入後、各細胞を、ＤＭＥＭ（ＬＧ）培地１００μｌ中で３３℃で２日間培養した。培養後、培地を血清を含まないＤＭＥＭ（ＬＧ）培地１００μｌに交換し、３３℃でさらに２日間培養した。
得られた細胞上に、下記実施例２１の（２）で構築したアッセイ細胞を重層後、２５０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース＋１００μｍｏｌ／Ｌスルホニルウレア（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）を添加した。添加６時間後に、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、ＶＩＭカメラ（ＡＲＧＵＳ−５０／２Ｄルミノメータ／ＭＰ：浜松ホトニクス社製）を用い、レポーター（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ）の活性を測定した。その結果、いずれの希釈サンプルにおいても活性が検出され、発現ベクター〔ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のみを導入した場合は活性は検出されなかった。
１／１０〜１／１００まで希釈しても活性が検出できることより、適当な膵臓ランゲルハンス氏島由来細胞株を宿主として選択して用いることにより、多数（例えば１０〜１００種のｃＤＮＡ）を同時に宿主細胞に導入し、該細胞の培養上清、該細胞の細胞抽出液、該細胞の膜画分、または該細胞自身を用いて、目的の活性を測定することができることが明らかになった。
（２）活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング
実施例２３に記載した方法に準じて、適当な発現ベクター〔ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ（下記実施例１８）またはｐＡＧａｌ９−ｄ（下記実施例１８）〕を用いてｃＤＮＡライブラリー（大腸菌）を構築した。
該ｃＤＮＡライブラリーを１〜１００クローンずつのプールに分けて培養した後に、それぞれのプールからプラスミドを回収する。９６穴プレートを用いて、該プラスミドを適当なランゲルハンス氏島由来細胞株に導入して発現させる。
３日後に実施例２１に記載の方法に準じて作製することのできるアッセイ細胞を重層し、６時間後にレポーター活性を測定する。１００クローンずつのプールを用いた場合は、９６穴プレート１枚で９６００クローンのスクリーニングを行うことができる。活性が検出されたプールをさらに細かいプールに分け、同様の操作を行うことにより、最終的に目的の活性ペプチド前駆体遺伝子を単離することができる。
ｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ９−ｄをベクターとして造成したｃＤＮＡライブラリーを用いる時には、該ｃＤＮＡライブラリーと共に、Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域と単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６の転写活性化領域（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）のキメラ蛋白質〔Ｎａｔｕｒｅ，３３５，５６３（１９８８）〕を発現するためのプラスミド〔例えばＰＣＲ２．１／Ｇａｌ４−ＶＰ１６（インビトロジェン社製）、ｐＡＭｏ−Ｇａｌ４ＶＰ１６（下記参照）、ｐｃＤＮＡ３−Ｇａｌ４ＶＰ１６（下記参照）〕を同時に宿主細胞に導入する必要がある。
ｐＡＭｏ−Ｇａｌ４ＶＰ１６およびｐｃＤＮＡ３−Ｇａｌ４ＶＰ１６の造成について以下に記載する。
ｐＭＣ１〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，１（１９８４）〕をＢｓｔＢＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＡｃｃＩで切断することによりＶＰ１６遺伝子の３’末端側を含むＢｓｔＢＩ（平滑末端）−ＡｃｃＩ断片を取得した。ｐＣＭＶＧａｌ４〔ＥＭＢＯ  Ｊ．，８，２３３７，（１９８９）〕をＨｉｎｄＩＩＩとＣｌａＩで切断し、Ｇａｌ４遺伝子の５’末端側配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ｎｄをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりアンピシリン耐性遺伝子を含むＮｏｔＩ（平滑末端）−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＭＣ１由来のＢｓｔＢＩ（平滑末端）−Ａｃｃ断片、ｐＣＭＶＧａｌ４由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片およびｐＡＭｏ−ｎｄ由来のＮｏｔＩ（平滑末端）−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合し、Ｇａｌ４−ＶＰ１６キメラ遺伝子発現プラスミドｐＡＭｏ−Ｇａｌ４ＶＰ１６を造成した。
ｐＡＭｏ−Ｇａｌ４ＶＰ１６をＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで切断し、Ｇａｌ４−ＶＰ１６キメラ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を取得した。ｐｃＤＮＡ３．１＋（インビトロジェン社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで切断し、アンピシリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−Ｇａｌ４ＶＰ１６由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片およびｐｃＤＮＡ３．１＋由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を結合し、ｐｃＤＮＡ３−Ｇａｌ４ＶＰ１６を造成した。
活性ペプチドの生産に適した各種細胞株を宿主として、ランダムペプチドをコードする遺伝子を発現させることにより、多種のペプチドを効率よく生産することができる。例えば、任意の活性ペプチド前駆体遺伝子の活性ペプチドをコードしている遺伝子部分を、ランダムペプチドをコードする遺伝子と置換することによって、ランダムペプチドを発現する遺伝子を作製することができる。
［実施例１８］新規宿主・ベクター系の構築（１）
（１）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２の造成
ｐＳＶ２ｂｓｒ（科研製薬社製）をＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して２．６ｋｂのＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。Ｇａｌ４−ＥＲキメラ遺伝子〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１６５７（１９９３）〕を含有するＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ（東京大学の加藤茂明先生より分与）をＡａｔＩＩとＮｄｅＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を取得した。上記のｐＳＶ２ｂｓｒ由来のＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片、およびＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ由来のＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を造成した。ｐＧＥＲｂｓｒＲ２は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の転写因子Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（Ｇａｌ４−ＥＲ）を発現することができる。
（２）ホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドの造成
ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。
ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３をＫｐｎＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＫｐｎＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。該プラスミドをＢｇｌＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）をＸｈｏＩとＮｓｉＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ｏｒｉＰ配列を含む２．２ｋｂのＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を取得した。上記のＸｈｏＩ切断部位とＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３由来のＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰを造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＳＥＯｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、アンピシリン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｃｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、プラスミドｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１を造成した。
ｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、０．１１ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。上記ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合し、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１を造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１をＸｈｏＩとＡｓｐ７１８で切断し、ＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。配列番号８７、８８、８９、および９０で表される塩基配列を有する４種のＤＮＡを合成した。該合成ＤＮＡは混合してアニールすることによりポリＡ付加シグナルをもつ２本鎖ＤＮＡを形成する。該合成ＤＮＡをそれぞれＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いてリン酸化後、混合してアニールさせることにより、二本鎖ＤＮＡとした。該二本鎖ＤＮＡとｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１由来のＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡを造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＦＲ−ｌｕｃ（ストラタジーン社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、０．１４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を取得した。上記のｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）断片、およびｐＦＲ−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１を作製した。ｐＡＧａｌＳｄ１は、Ｇａｌ４ｐ応答配列（ＵＡＳＧ）を５回繰り返した配列を有するプロモーターを含有している。
ｐＡＧａｌＳｄ１をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＳＥＯｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理することにより、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片を取得した。上記のｐＳＥＯｌｕｃ２由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＧａｌＳｄ１由来のＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃ内に存在する二つのＨｉｎｄＩＩＩサイトのうち、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子からより離れたＨｉｎｄＩＩＩサイトのみをＫｌｅｎｏｗ処理により消失させることにより、ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃをＡｓｐ７１８で切断後、ＳｔｕＩで部分消化しｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃ由来の９．５ｋｂのＡｓｐ７１８−ＳｔｕＩ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ処理し、自己結合させることによりプラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃを造成した。
（３）誘導発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄの造成
エプスタイン・バー・ウイルスのｏｐｉＰを有する発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、ｏｒｉＰを含む６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｃＲ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｄのＳｔｕｆｆｅｒ配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｄを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩでし６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ｎｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｎｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｎｄのＳｔｕｆｆｅｐ配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄを造成した。
（４）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２をＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞の染色体ＤＮＡに組み込んだ細胞株ＫＪＭＧＥＲ８の造成
Ｇａｌ４−ＥＲキメラ転写因子発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン４酢酸〕に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、該プラスミドをＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕に、６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞は、ＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である。
該形質転換体を、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地〔ＲＰＭＩＩ６４０培地（日水製薬社製）に、１／４０量の７．５％ＮａＨＣＯ３、３％  ２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社製）、０．５％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン社製、５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ）、３μｇ／ｍｌインシュリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１２５ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌガラクトースを添加した培地〕に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ  Ｓ）（ＫＫ−４００：科研製薬社製）を２．０μｇ／ｍｌになるように添加し、９６穴プレートに分注（５００〜２０００細胞／穴）して培養を行い、ｐＧＥＲｂｓｒＲ２が染色体ＤＮＡに組み込まれた安定形質転換株（シングルクローン）を多数取得した。各形質転換株は、２．０μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
下記に示す方法により上記安定形質転換株から、誘導倍率が高く、かつ非誘導時のバックグラウンドが低い優れた安定形質転換株ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
各形質転換株にホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃをエレクトロポレーション法により導入し、２日間培養した。培養後、１７β−エストラジオール（Ｅ８８７５：シグマ社製）（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに２４時間培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性の測定を行った。活性の測定は、ルミノメーターＬＢ９５３（ベルトールド社製）を用い、細胞溶解用緩衝液〔１％トリトンＸ−１００、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．８）、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール〕１００μｌを、上記培養液に自動注入後、基質溶液〔２５ｍｍｏｌ／Ｌグリシルグリシン（ｐＨ７．８）、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌルシフェリン〕３００μｌを自動注入し、１０秒間の発光量を測定し、ルシフェラーゼ活性とした。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
１７β−エストラジオール添加条件下のルシフェラーゼ活性と１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性を比較することにより、遺伝子発現の誘導倍率を算出し、該誘導倍率が高く、且つ１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性が低いクローンとして、ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
（５）ＫＪＭＧＥＲ８を宿主としたホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の誘導発現
ＫＪＭＧＥＲ８にホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃまたはコントロールプラスミド（ｐＡＧａｌ９−ｎｄ）を、エレクトロポレーション法により、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞（ＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃおよびＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｎｄ）を取得した。
該形質転換細胞を、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；ギブコ社製）（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１４日間培養し、安定形質転換株を取得した。該安定形質転換株は、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（ギブコ社製）（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
該安定形質転換株に１７β−エストラジオール（Ｅ８８７５：シグマ社製）（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、上記と同様にしてルシフェラーゼ活性の測定を行った。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
１７β−エストラジオール添加条件下のルシフェラーゼ活性と１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性を比較することにより、遺伝子発現の誘導倍率を算出した。その結果、ＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃにおける遺伝子発現の誘導倍率は、約１万倍であった。１７β−エストラジオール無添加条件下でのＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のルシフェラーゼ活性は非常に低かった（約６０ＲＬＵ／１０秒）。この結果は、１７β−エストラジオール無添加条件下ではほとんどルシフェラーゼ遺伝子が発現していないことを示している。
上記のように、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃを誘導発現プラスミド、ＫＪＭＧＥＲ８を宿主として用いた系においては、非誘導時のルシフェラーゼ活性が非常に低く、誘導時のルシフェラーゼ活性が非常に高かった。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃの構造は、ｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ９−ｄに誘導発現させるレポーター遺伝子として、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を挿入した構造である。したがって、ＫＪＭＧＥＲ８を宿主、ｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ−ｄを誘導発現ベクターとして用いる系は、非誘導時の遺伝子発現量が非常に低く、かつ遺伝子発現の誘導倍率が高い、極めて優れた誘導発現系であることが判明した。
［実施例１９］新規宿主・ベクター系の開発（２）
（１）ホタル・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃの造成
ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下にホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を発現することのできるレポータープラスミドであるｐＡＣＲＥｐｌｕｃを以下の方法で造成した。ｐＡＣＲＥｐｌｕｃは、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびエプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有している。
ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕をＣｌａＩで部分消化し、一カ所切断されたＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＭｌｕＩで部分消化し、９．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）〕をＣｌａＩおよびＭｌｕＩで切断し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片、およびｐＡＧＥ２４８由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＭｏｈを造成した。
ｐＡＭｏｈをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｏｒｉＰ、Ｇａｌ４ＵＡＳを含むＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および上記ｐＡＭｏｈ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌ９ｈを造成した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋（ストラタジーン社製）をＳａｌＩおよびＸｈｏＩで切断した後、フォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５、宝酒造社製）を用いて脱リン酸化処理し、アンピシリン耐性遺伝子を含むＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。配列番号９１および９２で表される塩基配列を有す合成オリゴヌクレオチドをアニールさせることにより、ＣＲＥ配列を２つ含む二本鎖ＤＮＡを調製した。該二本鎖ＤＮＡとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋由来の上記ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を２つ含むプラスミドｐＢＳ−ＣＲＥＩを造成した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩは、該二本鎖ＤＮＡが、ＳａｌＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位が再生する方向に組み込まれたプラスミドであり、上記切断部位をそれぞれ１つ有している。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を４つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を８つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＶを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を１６含むｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、１６個のＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＧａｌＳｄ１をＭｌｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１．４ｋｂのＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９ｈをＸｂａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＭｌｕＩで切断することによりＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片、ｐＡＧａｌＳｄ１由来のＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＧａｌ９ｈ由来のＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｈを作製した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｈをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＣＲＥ配列を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＣＲＥｈ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃを作製した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＸｈｏＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片、およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片をそれぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来の上記２種のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片を結合することにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃ中のＣＲＥ配列上流のＨｉｎｄＩＩＩサイトが消失したプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＨを作製した。
ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕をＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで切断し、ｌｕｃ＋遺伝子（改変型のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを作製した。
（２）レポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞の造成
レポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、該プラスミドを、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕によりＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞に、６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）  ３００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
ＣＲＥを介した遺伝子発現が起こるかどうかを確認するために、該形質転換株を、２ａ型のアデノシン受容体（Ａ２ａ）のアゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ：シグマ社製）、アデニレートシクラーゼの活性剤であるフォルスコリン（シグマ社製）、またはカルシウムイオノフォアであるＡ２３１８７〔リサーチ・バイオケミカル・インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社製〕を用いて、下記条件で刺激した。
即ち、上記安定形質転換株を４８穴プレート１穴あたり１×１０５細胞ずつ分注し、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、フォルスコリン（終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ）、またはＡ２３１８７（終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加後、ＣＯ２インキュベーター中で５時間培養し、刺激した。
刺激後、実施例１８の（４）に記載の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性測定をおこなった。
その結果、ＮＥＣＡ刺激で約７倍、フォルスコリン刺激で約１０倍のホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇がみられた。一方、Ａ２３１８７刺激ではホタル・ルシフェラーゼ活性はほとんど変化しなかった。
以上の結果から、ｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞においては、ＣＲＥからの転写を促す刺激により、ルシフェラーゼ遺伝子が発現することが明らかになった。
即ち、ｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞を用いることにより、ＣＲＥからの転写を促す活性を有する物質を探索することが可能である。
ｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞をＮＥＣＡで刺激し、６、２４、４８、７２、および９６時間後にホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した結果、６時間で活性が最大となり、２４時間でほぼ半減した。従って、該細胞を任意の物質で刺激する場合は、刺激後６時間目に活性を測定することが好ましいと考えられた。
（３）レポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
ｐＡＣＲＥｐｌｕｃ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＨｐａＩ、ＳｐｅＩ、またはＢａｌＩで切断したｐＡＣＲＥｐｌｕｃを１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、実施例１８で造成したＫＪＭＧＥＲ８に、６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに７日間培養した。生細胞数を確認後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびＫＪＭＧＥＲ８を１×１０５細胞／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、１５０細胞／ｍｌになるように希釈し、９６穴プレートに分注（平均３０細胞／穴）して培養を行い、実際に１穴当たり１コロニーを形成した穴を選択し、４２０個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（４）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
上記（３）で取得した各クローンを９６穴プレートにまき（１〜２×１０４細胞／穴）、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した。培養後、実施例１８の（４）に記載の方法を用いて各穴のホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。測定器としてはＭｉｃｒｏ  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）を使用した。活性の高かった１７クローンを選択した。
該１７クローンを用い、上記（２）と同様の方法でＮＥＣＡ刺激し、ＮＥＣＡ刺激しない場合と比較し、ルシフェラーゼ活性が６０倍以上上昇した８クローンを選択した。該８クローンをそれぞれＧＢＣ１〜ＧＢＣ８と命名した。
該８クローンにｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２〔構成活性型のＧ蛋白質共役型受容体であるＧＰＲ１２を誘導発現するためのプラスミド：下記実施例２２参照〕を、上記エレクトロポレーション法により、６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を取得した。
該形質転換細胞を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株に１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、実施例１８の（４）と同様の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
１７β−エストラジオールを添加した際のルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった３クローン（ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７）を選択した。ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７における該上昇率は、それぞれ５６、１９３、および３６４倍であった。
該３クローンに、上記と同様の方法でｐＡＧａｌ９−Ｖ２〔２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）を誘導発現するためのプラスミド：下記実施例２１の（１）参照〕を導入して安定形質転換株を取得し、１７β−エストラジオール刺激により導入遺伝子（Ｖ２遺伝子）を誘導発現させた後に、バソプレッシン刺激した際のルシフェラーゼ活性を調べた。同時に、１７β−エストラジオールｌ刺激しない場合の活性、およびバソプレッシン刺激しない場合の活性を調べた。
以上の結果、１７β−エストラジオールで刺激した時にのみバソプレッシンに反応して高いルシフェラーゼ活性（５９９倍）を示したＧＢＣ７を優良株として選択した。
（５）ウミシイタケ・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃの造成
ｐＲＬ−ＳＶ４０  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＸｂａＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ処理後、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片を取得した。上記（１）で構築したｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＲＬ−ＳＶ４０  ｖｅｃｔｏｒ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃを造成した。
（６）レポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
上記（３）で記載した方法に準じて、ｐＡＣＲＥＲｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８に導入し、９６個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（７）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、上記（４）に記載した方法に準じ、上記（６）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。
上記（６）で取得した各クローンを９６穴プレートにまき（１〜２×１０４細胞／穴）、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した。その後、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ１４２０  ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）を用いた。活性の高かった９クローンを選択した。該９クローンをそれぞれＧＢＣＲ１〜ＧＢＣＲ９と命名した。
該９クローンについて、ＮＥＣＡ刺激し、ＮＥＣＡ刺激しない時と比較し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が１８倍以上上昇した２クローンを選択した。該２クローンをそれぞれＧＢＣＲ１およびＧＢＣＲ２と命名した。
該２クローンにｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２を導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオールで２４時間刺激後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性も測定した。１７β−エストラジオールを添加した際のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった１クローン（ＧＢＣＲ２）を優良株として選択した。該上昇率は３６４倍であった。
ＧＢＣＲ２にｐＡＧａｌ９−Ｖ２を導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を、１７β−エストラジオールで刺激し、導入Ｖ２遺伝子を誘導発現させた後に、バソプレッシンで刺激し、刺激後のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合の活性、およびバソプレッシン刺激しない場合の活性を調べた。結果を第１０図に示した。
ＧＢＣＲ２を宿主細胞とした場合、１７β−エストラジオールで刺激した時にのみバソプレッシンに反応し、ＧＢＣＲ１を用いた場合よりも、高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性（１３９倍）を示し、この系においてＧＢＣＲ２が優れていることがわかった。
［実施例２０］新規宿主・ベクター系の開発（３）
（１）Ｇαｓ４の発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４の構築
実施例６に記載の方法に準じ、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１由来の全ＲＮＡ（５μｇ）から一本鎖ｃＤＮＡを調製した。上記一本鎖ｃＤＮＡ（１０μｌ）に、Ｇαｓ４遺伝子特異的プライマー（各２０ｐｍｏｌ）、２．５ｎｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、ＤＭＳＯを２．５μｌ、５単位／μｌ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を０．２５μｌ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を５μｌ添加し、滅菌水を加えて全量を５０μｌに調製した。配列番号９３および９４に記載した配列を有する合成ＤＮＡをＧαｓ４遺伝子特異的プライマーとして用いた。これらプライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＡｓｐ７１８サイトが導入されている。サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｐｃｈ社製）を用い、９５℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。プラスミドｐＡＭｏｈをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。ＰＣＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＭｏｈ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｇαｓ４の発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４を造成した。
（２）プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑの造成
上記（１）で構築したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩとＡｓｐ７１８で切断することによりｏｒｉＰを含むＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。また、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩで切断後、ＳｐｈＩで部分消化することにより、Ｃ末端を欠失したＧαｓ４をコードするＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を取得した。配列番号９５および９６で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。該二本鎖ＤＮＡ、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片およびＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑを造成した。
（３）プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉの造成
配列番号９７および９８で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、ＧαｉのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。該二本鎖ＤＮＡ、上記（２）で取得したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉを造成した。
（４）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉの造成
ｐＡＣＲＥｌｕｃをＣｌａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＣｐｏＩで切断することにより、ｏｒｉＰおよびＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分を含むＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇαｓ−ｉをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０（１９９４）〕をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＢｓｓＨＩＩで切断し、モロニー・マウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター〔以下、Ｍｏプロモーターと略する場合がある〕配列の一部を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、ｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇαｓ−ｑをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、および上記で取得したｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片、ｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを、ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＭｏプロモーターを含むＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、ＣｐｏＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＧαｓ−ｉをコードするＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、それぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを、ＮｈｅＩおよびＣｐｏＩで切断しＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片を、ＮｈｅＩおよびＮａｅＩで切断しＧαｓ−ｑをコードするＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片を、それぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉ由来のＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片およびＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片、ならびにｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑ由来のＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片およびＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片の４断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉプラスミドをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＳａｌＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片をセルフライゲーションすることにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉからＣＲＥレポーターユニットを除去したプラスミドｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＣｐｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＡｓｅＩで切断することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含まないＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を取得した。ｐＰＵＲ（クロンテック社製；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ０７６４８）をＢａｍＨＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＡｓｅＩで切断することにより、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片を取得した。ｐＰＵＲ由来のＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片、および上記ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ由来のＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を結合し、ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のハイグロマイシン耐性遺伝子を、ピューロマイシン耐性遺伝子で置き換えたｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
（５）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＧＢＣ７の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＳｐｅＩで切断したｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により上記実施例１９の（４）で造成したＧＢＣ７に、６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）、およびピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；シグマ社製）（０．２μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに７日間培養した。培養後、該形質転換株の生細胞数を確認し、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、およびＫＪＭＧＥＲ８（１×１０６細胞／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、該形質転換株が１５０細胞／ｍｌになるように希釈し、９６穴プレートに分注（３０細胞／穴）して培養を行い、９３個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）、およびピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（６）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
上記（５）で取得した９３クローンを９６穴プレートにまき（１〜２×１０４細胞／穴）、ＬｉｐｏｒｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（ギブコ社製）を用いて、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１〔下記実施例２１の（３）参照〕を各クローンに導入し、形質転換細胞を取得した。遺伝子導入の具体的方法はリポフェクトアミン２０００の説明書に従って行い、１穴当たりプラスミドを０．３μｇ、リポフェクトアミン２０００を０．８μｌ使用した。
該形質転換細胞を１日培養した後に、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、およびジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で７日間培養した。各穴へ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養した。各穴へアンジオテンシンＩＩ（ペプチド研究所社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、６時間培養後、実施例１９の（４）の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を調べた。以上の結果、アンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性を示した１０クローンを選択した。
該１０クローンに、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を上記エレクトロポレーション法により、６×１０６細胞あたり４μＧ導入し、形質転換細胞を取得した。
該形質転換細胞を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株に１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、アンジオテンシンＩＩ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに６時間培養後、上記の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。１７β−エストラジオールで刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性（８５倍）を示したＧＢＣＣ１３を優良株として選択した。
（７）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＧＢＣＲ２の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
上記（５）で記載した方法を用いて、ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＧＢＣＲ２に導入することにより、９４個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）、およびピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（８）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
上記（７）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、上記（６）に記載した方法に準じた。ウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性は、実施例１９の（７）に記載した方法に準じて測定した。
上記（７）で取得した各クローンにｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞を１７β−エストラジオールで処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。アンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示した１３クローンを選択した。
該１３クローンにｐＡＧａｌ９−ＡＴ１をエレクトロポレーション法により導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞を１７β−エストラジオールで処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。１７β−エストラジオールで刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性（１３２倍）を示したＧＢＣＲＣ６を優良株として選択した。
［実施例２１］任意のＧＰＣＲからのシグナルを検出するためのアッセイ細胞の構築と利用
（１）２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）からのシグナルを検出するためのアッセイ細胞の構築と利用
鋳型として、ヒト腎臓由来のｍＲＮＡ（１μｇ；クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、Ｖ２遺伝子特異的プライマーとして、配列番号９９および１００に記載した配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＶ２遺伝子を取得した。Ｖ２遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＡｓｐ７１８サイトが導入されている。
得られたＶ２遺伝子増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。プラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。上記Ｖ２遺伝子増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｖ２の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２を造成した。
ｐＡＧａｌ９−Ｖ２を１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕によりＧＢＣＲＣ６に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ハイグロマイシンＢ（０．３ｍｇ／ｍｌ）、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍｌ）、ビューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、およびジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ハイグロマイシンＢ（０．３ｍｇ／ｍｌ）、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、およびジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、各種濃度のバソプレッシン（Ａｒｇ８−Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を第１１図に示した。
本アッセイ系を用いることにより、Ｇαｓに共役するＶ２からのシグナルを、高感度、高シグナル／ノイズ比で検出できることが明らかになった。本アッセイ系を用いて、Ｖ２のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することができる。（２）１型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ−１）からのシグナルを検出するためのアッセイ細胞の構築と利用
ヒト視床下部由来のｍＲＮＡ（１μｇ；クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、ＣＲＨＲ−１遺伝子特異的プライマーとして、配列番号１０１および１０２に記載した配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＣＲＨＲ−１遺伝子を取得した。ＣＲＨＲ−１遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。
得られたＣＲＨＲ−１遺伝子増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。プラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記ＣＲＨＲ−１遺伝子増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することにより、ＣＲＨＲ−１の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＣＲＨＲ１を造成した。
上記（１）に記載の方法に準じ、ｐＡＧａｌ９−ＣＲＨＲ１をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、各種濃度のヒトコルチコトロピン放出ホルモン（ペプチド研究所社製）を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を第１２図に示した。
本アッセイ系を用いることにより、Ｇαｓに共役するＣＲＨＲ−１からのシグナルを、高感度、高シグナル／ノイズ比で検出できることが明らかになった。本アッセイ系を用いて、ＣＲＨＲ−１のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することができる。
（３）１型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）からのシグナルを検出するためのアッセイ細胞の構築と利用
プラスミドｐＡＲ１．８〔Ｎａｔｕｒｅ，３５１，２３０（１９９１）〕をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ウシＡＴ１遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＲ１．８由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合し、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を造成した。
上記（１）に記載の方法に準じ、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、各種濃度のヒト・アンジオテンシンＩＩ（ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ；ＢＡＣＨＥＭ社製）を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を第１３図に示した。
本アッセイ系を用いることにより、ＧαｑまたはＧαｉに共役するＡＴ１からのシグナルを、高感度、高シグナル／ノイズ比で検出できることが明らかになった。本アッセイ系を用いて、ＡＴ１のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することができる。
（４）１型ブラジキニン受容体（Ｂ１）からのシグナルを検出するためのアッセイ細胞の構築と利用
鋳型として、ヒト染色体ＤＮＡ（４０ｎｇ；クロンテック社製）を、Ｂ１遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号１０３および１０４に記載した配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＢ１遺伝子を取得した。Ｂ１遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＡｓｐ７１８サイトが導入されている。
得られたＢ１遺伝子増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。プラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。上記Ｂ１遺伝子増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｂ１の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｂ１を造成した。
上記（１）に記載の方法に準じ、ｐＡＧａｌ９−Ｂ１をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、各種濃度のＤｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニン（ペプチド研究所社製）を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を第１４図に示した。
本アッセイ系を用いることにより、Ｇαｑに共役するＢ１からのシグナルを、高感度、高シグナル／ノイズ比で検出できることが明らかになった。本アッセイ系を用いて、Ｂ１のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することができる。（５）５型ソマトスタチン受容体（ｓｓｔ５）からのシグナルを検出するためのアッセイ細胞の構築と利用
上記（１）に記載の方法に準じ、プラスミドｐＡＧａｌ９−ｓｓｔ５〔下記実施例２３の（２）参照〕をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、各種濃度のヒト・ソマトスタチン（ペプチド研究所社製）を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を第１５図に示した。
本アッセイ系を用いることにより、Ｇαｉに共役するｓｓｔ５からのシグナルを、高感度、高シグナル／ノイズ比で検出できることが明らかになった。本アッセイ系を用いて、ｓｓｔ５のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することができる。
上記方法により、Ｇαｓ、Ｇαｑ、またはＧαｉと共役する任意のＧＰＣＲからのシグナルを検出するための優れたアッセイ細胞を構築することができた。該細胞を用いて、特定のＧＰＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストを探索することができる。
［実施例２２］新規宿主・ベクター系を用いた構成活性型ＧＰＣＲの同定と利用（１）各種ＧＰＣＲの誘導発現プラスミドの造成
鋳型として、各種ヒト臓器由来のｍＲＮＡ（クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）またはヒト染色体ＤＮＡ（１００ｎｇ；クロンテック社製）を、各種ＧＰＣＲ遺伝子特異的プライマーとして下記第８−１表及び第８−２表中に記載した配列番号の配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲにより各種ＧＰＣＲ遺伝子を取得した。酵素としては、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、またはＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ギブコ社製）を用いた。ＰＣＲを行う際の緩衝液としては、使用する酵素に付加された１０倍濃度の緩衝液を使用した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃で５分間の処理後、９４℃で１分間、アニール温度（５５、６０、６２、または６５℃）で１分間、７２℃で１分間からなる反応を２５〜３５サイクル行った。
増幅された各種ＧＰＣＲ遺伝子断片をそれぞれのクローニングに用いたプライマー上に設計された配列を切断する制限酵素（たとえばＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ）で切断した。ＧＰＣＲ遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該切断断片を、プラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄの対応する制限酵素サイト（たとえばＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ）間へ組み込むことにより、誘導発現プラスミドを構築した。下記実施例２３の（２）に記載した方法に準じて、プラスミドに組み込んだＤＮＡ断片の配列を決定し、目的のＧＰＣＲをコードしていることを確認した。
ＯＧＲ１に関しては、ＰＣＲエラーの結果、２２１番目のセリンがアスパラギンに置換した変異体（ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎと呼ぶ）も取得された。ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎのアミノ酸配列を配列番号１８７に示した。該変異体を発現するプラスミドをｐＡＧａｌ９−ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎと呼ぶ。
（２）構成活性型ＧＰＣＲの同定
（１）で造成した各種ＧＰＣＲの誘導発現プラスミドを用いて、そのＧＰＣＲの構成的活性を、下記１〜５のいずれかの方法を用いて測定した。
下記第８−１表および第８−２表に、構成活性型ＧＰＣＲであることが判明したＧＰＣＲに関してのみ、ＧＰＣＲ名、該ＧＰＣＲ遺伝子の配列情報源（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号または国際公開番号）、ＰＣＲ条件、構築したＧＰＣＲ誘導発現プラスミド名、および構成活性値を記載した。構成活性値は、１７β−エストラジオールで刺激した際のレポーター活性の誘導倍率で表した。
〔方法１〕
上記で構築したＧＰＣＲ誘導発現プラスミドおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄ（コントロールプラスミド）を、実施例２１の（１）に記載した方法に準じて、それぞれＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換細胞を得る。該細胞を９６穴プレートに分注し（約１×１０４個／穴）、３７℃で１日間培養した後、各穴へ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養する。
培養後、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）またはＶＩＭカメラ（ＡＲＧＵＳ−５０／２Ｄルミノメータ／ＭＰ：浜松ホトニクス社製）を用いる。また、１７β−エストラジオールを添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。１７β−エストラジオールを添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とする。
〔方法２〕
上記で構築したＧＰＣＲ誘導発現プラスミドおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄ（コントロールプラスミド）を、実施例２１の（１）に記載した方法に準じて、それぞれＧＢＣＣ１３に導入し、安定形質転換細胞を得る。該細胞を９６穴プレートに分注し（約１×１０４個／穴）、３７℃で１日間培養した後、各穴へ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養する。
培養後、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加して、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。活性測定には、Ａｕｔｏ  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５３（ベルトールド社）またはトップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いる。また、１７β−エストラジオールを添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。１７β−エストラジオールを添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とする。
〔方法３〕
ＧＢＣＲ２を宿主として用い、形質転換株の培養時にピューロマイシンを添加しない以外は方法１と同じＧＰＣＲの構成的活性の測定法である。
〔方法４〕
ＧＢＣ７を宿主として用い、形質転換株の培養時にピューロマイシンを添加しない以外は方法２と同じＧＰＣＲの構成的活性の測定法である。
〔方法５〕
上記で構築した誘導発現プラスミドまたはｐＡＧａｌ９−ｎｄ（コントロールプラスミド）を、実施例１９の（１）で構築したレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃと共に、実施例２１の（１）に記載した方法に準じて、ＫＪＭＧＥＲ８に導入し、安定形質転換細胞を得る。
形質転換細胞を培養する培地としては、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（０．３ｍｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した１６４０・ＩＴＰＳＧ培地を用いる。培養した形質転換細胞を９６穴プレートに分注し（約１×１０４個／穴）、３７℃で１日間培養した後、各穴へ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養する。
培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、１７β−エストラジオールを添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。１７β−エストラジオールを添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とする。
各方法とも、コントロールプラスミドを導入した細胞の誘導倍率は約１である。ＧＰＣＲ発現プラスミドを導入した細胞の誘導倍率が高いほど、該ＧＰＣＲの構成的活性は強いと判断できる。
2003087366.tif 000018
2003087366.tif 000019
上記に示したように、ＧＰＣＲの構成的活性は方法１〜５のいずれかの方法で測定可能であり、ここで取得されたＧＰＣＲは構成活性型のＧＰＣＲであることが明白となった。ＯＧＲ１自身も構成活性型ＧＰＣＲであるが、ＯＧＲ１自身の構成的活性に比較して変異体ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎの構成的活性はさらに増加していた。ＯＧＲ１の２２１番目のセリンは、第６膜貫通領域中の高度に保存されたプロリン残基から数えてＮ末側に２２残基目のアミノ酸である。最近明らかになったロドプシンの結晶構造〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，７３９（２０００）〕に当てはめると、この部位のアミノ酸は、ＧＰＣＲ全体の高次構造、活性化に重要な残基であることが予想される。ＯＧＲ１以外のＧＰＣＲに関しても該アミノ酸残基を異なるアミノ酸に置換することによって構成活性型変異体または構成的活性が増強した変異体を作製することができると考えられる。
上記の各形質転換細胞に１７β−エストラジオールを添加する前に、任意の物質を添加しておくことにより、各ＧＰＣＲの構成的活性を阻害または増加させる物質（例えば、インバースアゴニストまたはアゴニスト）を探索することができる。
［実施例２３］新規宿主・ベクター系を用いたＧＰＣＲ遺伝子の発現クローニング
（１）ヒト視床下部由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
ギブコ社製のキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いて、ヒト視床下部由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（クロンテック社製）５．０μｇから、オリゴｄＴをプライマーとして二本鎖ｃＤＮＡを合成した。該二本鎖ｃＤＮＡの両末端にリン酸化したＳｆｉＩリンカー（特開平０５−３３６９６３）を付与した後、アガロースゲル電気泳動に供し、１．０ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。
実施例１８の（３）で造成したｐＡＧａｌ９−ｎｄ（２４μｇ）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、６ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）５９０μｌに溶解後、８０単位のＳｆｉＩ（宝酒造社製、以下、特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた）を加え、３７℃で１６時間消化反応を行なった。反応後、アガロースゲル電気泳動法により該反応液より約７．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ＳｆｉＩリンカーを付与した二本鎖ＤＮＡ（１．０ｋｂ以上）をＴ４リガーゼ緩衝液２５０μｌに溶解後、該溶解液に、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ由来の約７．０ｋｂのＤＮＡ断片２μｇ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位を加えて、１６℃で１６時間結合反応を行なった。反応後、該反応液にトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）５μｇを添加し、エタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。
該溶解液を用い、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕により大腸菌ＭＣ１０６１（モレキュラー・クローニング第３版）を形質転換し、ｃＤＮＡライブラリー（大腸菌）を構築した。該ｃＤＮＡライブラリーよりアンピシリン耐性を有する形質転換体（クローン）約３×１０７個が得られた。
該ｃＤＮＡライブラリー（大腸菌）を約１００クローンずつのプールに分けて９６穴プレート（細胞培養用マルチプレート９６ＦＩＩ；住友ベークライト社製）で培養後、一部を分取し、グリセロール（最終濃度２５％）を添加して−８０℃で凍結保存した。
残りの培養液から、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、プラスミドを調製した。該プラスミドは、約０．１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
（２）コルチスタチン（ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ）に反応する受容体をコードするｃＤＮＡの発現クローニング
実施例２０で取得したＧＢＣＲＣ６に、リポフェクトアミン２０００（ギブコ社製）を用いて、上記（１）で調製した約１００クローン由来のプラスミドを各プールごとに該細胞に導入した。遺伝子導入の具体的方法はリポフェクトアミン２０００の説明書に従って行い、１穴あたりプラスミドを０．３μｇ、リポフェクトアミン２０００を０．８μｌ使用した。
１日培養後に、細胞を新たな９６穴プレートに２０分の１量ずつ分注した。ハイグロマイシンＢ（０．３ｍｇ／ｍｌ）、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（０．２μｇ／ｍｌ）、ジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に培地を交換し、３７℃で５日間培養して安定形質転換株を取得した。
各穴へ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養した。各穴へコルチスタチン（ペプチド研究所社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、６時間培養後、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）またはＶＩＭカメラ（ＡＲＧＵＳ−５０／２Ｄルミノメータ／ＭＰ：浜松ホトニクス社製）を用いた。
高い活性を示した穴に対応するプール（１００クローンの大腸菌）を、１クローンずつに分けて９６穴プレートで培養後、一部を分取し、グリセロール（最終濃度２５％）を添加して−８０℃で凍結保存した。残りの培養液から、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、プラスミドを調製した。該プラスミドは、約０．１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
該プラスミドを用いて、上記と同様のアッセイを行うことにより、コルチスタチンへの反応性を与えるプラスミドを同定した。
ｐＡＧａｌ９−ｎｄ中の配列に特異的なプライマー（配列番号１４９および１５０に示した配列を有する合成ＤＮＡ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、パーキン・エルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：アプライド・バイオシステムズ社）を使用した。その結果、該プラスミドが含むｃＤＮＡは５型ソマトスタチン受容体（ｓｓｔ５）をコードしていることが判明した。該プラスミドをｐＡＧａｌ９−ｓｓｔ５と命名した。
上記のように、本系を用いてコルチスタチン等任意の物質への反応性に影響を与える遺伝子を取得できることが明らかになった。また、ｐＡＧａｌ９−ｓｓｔ５を導入したＧＢＣＲＣ６とコルチスタチンを用いて、コルチスタチンによるｓｓｔ５の活性化を阻害する物質を探索することができる。
（３）ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−２０  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ）に反応する受容体をコードするｃＤＮＡの発現クローニング
ＰＡＭＰはアドレノメジュリンの前駆体蛋白質から切り出される２０アミノ酸からなるペプチドで、その受容体はまだ明らかになっていない〔Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９，１００（１９９８）〕。そこで、ＰＡＭＰ受容体遺伝子の発現クローニングを試みた。
コルチスタチン（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）の代わりに、ヒトＰＡＭＰ−１２（ｈｕｍａｎ  ＰＡＭＰ［９−２０］；ペプチド研究所社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を用い、上記（２）の方法に準じて、ヒトＰＡＭＰ−１２への反応性に影響を与える遺伝子のスクリーニングを行った。
その結果、ＰＡＭＰ−１２への反応性を与えるプラスミドを複数取得した。これらのプラスミドが含むｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、いずれも１型メラノコルチン受容体（ＭＣ１Ｒ）をコードしていることが判明した。該プラスミドの一つをｐＡＧａｌ９−ＭＣ１Ｒと命名した。塩基配列は、上記（２）に記載した方法により決定した。
実施例２１の（１）に記載の方法に準じて、ｐＡＧａｌ９−ＭＣ１ＲをＧＢＣＲ２に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、各種濃度のヒトＰＡＭＰ−１２またはヒトＰＡＭＰ（ｈｕｍａｎ  ＰＡＭＰ［１−２０］；ペプチド研究所社製）を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を第１６図に示した。
ＭＣ１Ｒは、非常に低濃度のヒトＰＡＭＰ−１２またはヒトＰＡＭＰに反応することが明らかになった。したがって、ＰＡＭＰ−１２またはＰＡＭＰは、生体内においてＭＣ１Ｒのリガンドとして作用していると考えられた。
本発明に基づき、ＰＡＭＰ−１２またはＰＡＭＰがＭＣ１Ｒのリガンドとして作用することを初めて見出した。本系は、ＰＡＭＰ−１２またはＰＡＭＰによるＭＣ１Ｒ受容体の活性化を阻害する物質（例えばアンタゴニスト）の探索にも有用である。
（４）構成活性型ＧＰＣＲ（２型代謝性グルタミン酸受容体：ｍＧｌｕ２）、シグナル伝達分子（Ｇαｓ１）、または転写因子（ＤＰ２とＩＤ４）をコードするｃＤＮＡの発現クローニング
ＧＢＣＲＣ６をＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁後、９６穴プレートに分注し（約１×１０４個／穴）、３７℃で１日間培養した。培養後、上記（２）に記載の方法に準じて、上記（１）で調製した各プール（約１００クローン）由来のプラスミドを各プールごとに該細胞に導入し、安定形質転換株を取得した。
各穴へ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養後、セレンテラジンｈ（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定は上記（２）に記載の方法に準じて行った。
高い活性を示した穴に対応するプール（１００クローンの大腸菌）を、１クローンずつに分けて９６穴プレート（細胞培養用マルチプレート９６ＦＩＩ、住友ベークライト社）で培養後、一部を分取し、グリセロール（最終濃度２５％）を添加して−８０℃で凍結保存した。残りの培養液から、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、プラスミドを調製した。該プラスミドは、約１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
該プラスミドを用いて、上記と同様のアッセイを行うことにより、高い活性を与えるプラスミド４種を取得した。これらプラスミドが含むｃＤＮＡの塩基配列を上記（２）に記載した方法に準じて決定した結果、これらプラスミドはそれぞれ２型の代謝性グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕ２）、シグナル伝達分子Ｇαｓ１、転写因子ＤＰ２、および転写因子ＩＤ４をコードする遺伝子を含有していた。該プラスミドをそれぞれｐＡＧａｌ９−ｍＧｌｕ２、ｐＡＧａｌ９−Ｇαｓ１、ｐＡＧａｌ９−ｄＰ２、およびｐＡＧａｌ９−ＩＤ４と命名した。
本系を用いて、構成活性型ＧＰＣＲ（例えばｍＧｌｕ２）、シグナル伝達分子（例えばＧαｓ１）および転写因子（例えばＤＰ２とＩＤ４）を取得できることが実証された。この結果は、本系を用いて、構成活性型ＧＰＣＲの他に、ＣＲＥが関与する遺伝子の転写を直接あるいは間接的に制御しうる分子を取得可能であることを示している。
目的に応じて他のレポーター系を使用すれば、該レポーターの活性を制御しうる様々な分子の遺伝子が取得可能なことが分かる。例えば、ＮＦκＢの活性化を検出するためのレポーター系を用いることにより、ＮＦκＢの活性化に関与する様々な分子（例えば、受容体、分泌蛋白質、シグナル伝達分子、転写因子など）の遺伝子を本方法により取得することが可能である。
実施例２２に記載の方法に準じて、上記で取得したペプチド（構成的活性を示す受容体、転写因子、シグナル伝達分子、酵素等）の活性を阻害または活性化する物質を探索することができる。即ち、ＧＢＣＲＣ６あるいはＧＢＣＣ１３にｐＡＧａｌ９−ｍＧｌｕ２を導入した形質転換細胞に、任意の物質を添加し、その後に１７β−エストラジオールを添加することにより、ｍＧｌｕ２の構成的活性を阻害または増加させる物質（例えば、インバースアゴニストまたはアゴニスト）を探索することができる。
ＧＢＣＲＣ６あるいはＧＢＣＣ１３にｐＡＧａｌ９−ＧαＳ１を導入した形質転換細胞に、任意の物質を添加し、その後に１７β−エストラジオールを添加することにより、Ｇαｓ１の関与するシグナル伝達を阻害または増加させる物質を探索することができる。
ＧＢＣＲＣ６あるいはＧＢＣＣ１３にｐＡＧａｌ９−ｄＰ２を導入した形質転換細胞に、任意の物質を添加し、その後に１７β−エストラジオールを添加することにより、ＤＰ２を介したＣＲＥからの転写を阻害または増加させる物質を探索することができる。
さらに、ＧＢＣＲＣ６あるいはＧＢＣＣ１３にｐＡＧａｌ９−ＩＤ４を導入した形質転換細胞に、任意の物質を添加し、その後に１７β−エストラジオールを添加することにより、ＩＤ４を介したＣＲＥからの転写を阻害または増加させる物質を探索することができる。
このように、ＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株を用いたレポーター系は、汎用性および感度が非常に高い系であり、発現クローニングや物質のスクリーニング等に、非常に有用な系である。
［実施例２４］新規宿主・ベクター系を用いた構成活性型の変異ＧＰＣＲの造成  実施例２３に記載した発現クローニングにおいて、ｃＤＮＡライブラリーの代わりに、変異ＧＰＣＲのライブラリーを使用することにより、構成活性型の変異ＧＰＣＲを効率よく造成することができる。また、特定の変異ＧＰＣＲについて、実施例２２に記載の方法に準じて一つずつ評価することにより、構成活性型の変異ＧＰＣＲを造成することもできる。
（１）ＰＧＭＯ３３４の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＰＧＭＯ３３４の造成
構成活性型でないＧＰＣＲであるＰＧＭＯ３３４の発現プラスミドｐＡＭｏ−ＰＧＭＯ３３４（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＰＧＭＯ３３４  ｃＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｎｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、約１．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ＰＧＭＯ３３４由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｎｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することにより、ＰＧＭＯ３３４の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＰＧＭＯ３３４を造成した。
（２）変異ＧＰＣＲライブラリーの造成
ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの第３膜貫通領域の後半から第２細胞内領域の前半部分、あるいは第３細胞内領城の後半から第６膜貫通領域の前半部分に、ランダム変異を導入した多数の変異体を、ＰＣＲを利用して以下のように造成した。
ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの第３膜貫通領域の後半から第２細胞内領域の前半部分（ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの１３２番目のアミノ酸から１４１番目のアミノ酸）にランダムに変異を導入するために、配列番号１５１〜１６０に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡを作製した。
ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの第３細胞内領域の後半から第６膜貫通領域の前半部分（ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの２５６番目のアミノ酸から２６５番目のアミノ酸）にランダムに変異を導入するために、配列番号１６１〜１７０に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡを作製した。
ｐＡＧａｌ９−ＰＧＭＯ３３４中のＰＧＭＯ３３４  ｃＤＮＡの５’側および３’側のベクター部分に対応するプライマーとして、配列番号１７１および１７２に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡを作製した。
ｐＡＧａｌ９−ＰＧＭＯ３３４（１ｎｇ）、配列番号１５１〜１６０に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡのいずれか一つ（２０ｐｍｏｌ）、配列番号１７２に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（２０ｐｍｏｌ）、２．５ｍｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ混合液を１．６μｌ、ＤＭＳＯを１μｌ、５単位／μｌのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を０．１μｌ、１０×反応緩衝液を２μｌ添加し、滅菌水を加えて全量を２０μｌに調製した。該調製液を用い下記条件でＰＣＲを行った。即ち、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃で５分間処理後、９４℃で１分間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応を２５サイクル行った。
該反応液より、アガロースゲル電気泳動法により増幅ＤＮＡ断片（変異ＤＮＡ１）を回収した。該ＤＮＡ断片はそれぞれＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの１３２〜１４１番目のアミノ酸のいずれか１つにランダム変異が導入されたポリペプチド（Ｃ末端側のポリペプチド）をコードするＤＮＡである。
同様にして、ｐＡＧａｌ９−ＰＧＭＯ３３４を鋳型、配列番号１６１〜１７０に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡのいずれか一つ、および配列番号１７１に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの２５６番目のアミノ酸から２６５番目のアミノ酸のいずれか１つにランダム変異が導入されたポリペプチド（Ｎ末端側のポリペプチド）をコードするＤＮＡ（変異ＤＮＡ２）を取得した。
取得した変異ＤＮＡ１の２５分の１量および変異ＤＮＡ２の２５分の１量、２．５ｍｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ混合液を１．６μｌ、ＤＭＳＯを１μｌ、５単位／μｌのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を０．１μｌ、１０×反応緩衝液を２μｌ添加し、滅菌水を加えて全量を２０μｌに調製した。該調製液を用い、下記条件でＰＣＲを行った。即ち、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９８℃で５分間処理後、９８℃で１５秒間、５０℃で２０秒間、７２℃で３０秒間からなる反応を６サイクル行った。
該反応液に、配列番号１７１に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（２０ｐｍｏｌ）、および配列番号１７２に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（２０ｐｍｏｌ）を加えた後、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃で２分間処理後、９５℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で１分間からなる反応を２３サイクル行った。
該反応液より、アガロースゲル電気泳動法により増幅ＤＮＡ断片（変異ＤＮＡ３）を回収した。変異ＤＮＡ３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、プラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ間へ組み込こむことにより、ＰＧＭＯ３３４の変異体を誘導発現することのできるＰＧＭＯ３３４変異体ライブラリーを造成した。ライブラリーの造成は、実施例２２の（１）に記載した方法に準じて行った。即ち、大腸菌ＭＣ１０６１（モレキュラー・クローニング第３版）を宿主として、約１×１０４個のアンピシリン耐性を有する形質転換体を取得し、ＰＧＭＯ３３４変異体ライブラリー（大腸菌）を構築した。
該ＰＧＭＯ３３４変異体ライブラリー（大腸菌）を１０クローンずつのプールに分けて９６穴プレート（細胞培養用マルチプレート９６ＦＩＩ；住友ベークライト社製）で培養後、一部を分取し、グリセロール（最終濃度２５％）を添加して−８０℃で凍結保存した。残りの培養液から、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、プラスミドを調製した。該プラスミドは、約０．１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
（３）構成活性型の変異ＧＰＣＲの取得
実施例２３の（２）に記載の方法にしたがって、上記（２）で調製した変異ＧＰＣＲライブラリーの１０クローン由来のプラスミドをそれぞれＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。各穴へ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養後、セレンテラジンｈ（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定は実施例２３の（２）に記載の方法を用いた。
高い活性を示した穴に対応するプール（１０クローンの大腸菌）を、１クローンずつに分けて９６穴プレート（細胞培養用マルチプレート９６ＦＩＩ、住友ベークライト社）で培養後、一部を分取し、グリセロール（最終濃度２５％）を添加して−８０℃で凍結保存した。残りの培養液から、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、プラスミドを調製した。該プラスミドは、約０．１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
該プラスミドを用いて、上記と同様のアッセイを行うことにより、高い活性を与えるプラスミドを同定した。同定後、該プラスミドが含むｃＤＮＡの塩基配列を実施例２３の（２）に記載した方法に準じて決定した。
上記のスクリーニングの結果、以下の４種の構成活性型の変異体を取得した。
（ｉ）ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの１３５番目のグルタミン酸をフェニルアラニンに置換した変異体（ＰＧＭＯ３３４Ｅ１３５Ｆと呼ぶ）：実施例２２の（２）に記載の方法（ＧＢＣＲＣ６を宿主として利用）で評価した結果、約３倍の誘導倍率を示し、構成活性型ＧＰＣＲであることが確認された。アミノ酸配列を配列番号１９３に示した。
（ｉｉ）ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの１３５番目のグルタミン酸をグルタミンに置換した変異体（ＰＧＭＯ３３４Ｅ１３５Ｑと呼ぶ）：同様に評価した結果、約３倍の誘導倍率を示し、構成活性型ＧＰＣＲであることが確認された。アミノ酸配列を配列番号１９４に示した。
（ｉｉｉ）ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの１３５番目のグルタミン酸をアラニンに置換した変異体（ＰＧＭＯ３３４Ｅ１３５Ａと呼ぶ）：同様に評価した結果、約１４倍の誘導倍率を示し、構成活性型ＧＰＣＲであることが確認された。アミノ酸配列を配列番号１９５に示した。
（ｉｖ）ＰＧＭＯ３３４ポリペプチドの２５９番目のアスパラギン酸をセリンに置換した変異体（ＰＧＭＯ３３４Ｄ２５９Ｓと呼ぶ）：同様に評価した結果、約５倍の誘導倍率を示し、構成活性型ＧＰＣＲであることが確認された。アミノ酸配列を配列番号１９６に示した。ＰＧＭＯ３３４の２５９番目のアスパラギン酸は、第６膜貫通領域中の高度に保存されたプロリン残基から数えてＮ末側に２０残基目のアミノ酸であり、多くのＧＰＣＲにおいてグルタミン酸もしくはアスパラギン酸が保存されている。最近明らかになったロドプシンの結晶構造〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，７３９（２０００）〕に当てはめると、この部位のアミノ酸は、下記（４）に述べるＤ／ＥＲＹモチーフ内のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基と立体構造上側鎖が向かい合うことになり、ＧＰＣＲ全体の高次構造、活性化に重要な残基であることが予想される。ＰＧＭＯ３３４以外のＧＰＣＲに関しても該アミノ酸残基を異なるアミノ酸に置換することによって構成活性型変異体を作製することができると考えられる。
また、使用した転写因子応答配列（例えば、ＣＲＥやＮＦκＢ応答配列）からの転写を直接または間接的に増加させる活性を有する分子（例えば、転写因子、シグナル伝達分子、または酵素等）に関しても、上記と同様にしてランダム変異を導入することにより、構成活性型の変異体を取得することができる。
また、上記分子にランダム変異を入れることによって、構成的活性を示さなくなった変異体やドミナントネガティブ変異体を取得することもできる。
（４）他の構成活性型変異体の造成
ＧＰＣＲの第３膜貫通領域細胞内側には高度に保存されたＤ／ＥＲＹモチーフが存在する。該モチーフ内のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基は、他の膜貫通領域との相互作用に重要な働きをになっていることが示唆されている〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，７３９（２０００）；ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２，１６９３（１９９３）〕。また、あるＧＰＣＲ（たとえばＶ２バソプレッシン受容体）においては該アスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基を別のアミノ酸に置換することにより構成活性型変異体を作製できることが知られている〔ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ，４４１，４７０（１９９８）〕。そこで、多種のオーファンＧＰＣＲに関して、以下のようにして該アスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基をアラニンに変換した変異体をコードするＤＮＡの造成を行い、該変異体の構成的活性を評価した。
ＧＰＣＲ遺伝子への目的とする変異導入は、変異導入キットＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を用い、該キットのプロトコールに準じて以下のようにして行った。
第９表に示したオーファンＧＰＣＲの変異体の造成においては、目的の変異を含み変異導入部位周辺と同じ配列を持つ、第９表に示した、３５塩基程度の相補的な２本のプライマーを合成した。該プライマーを用いてＧＰＣＲ発現プラスミドを鋳型とし、ＰＣＲを行った。該反応液にＤｐｎＩ（メチル化ＤＮＡを選択的に切断する制限酵素）を添加し、鋳型プラスミドを選択的に切断した。このようにして得られたＤＮＡ断片は、目的の変異が導入された遺伝子とベクター部分を含んでいる。取得された該ＤＮＡ断片を大腸菌にトランスフォームすることにより、目的の変異が導入された遺伝子を含むプラスミドが得られた。
取得されたプラスミドに含まれる遺伝子がコードする変異体ＧＰＣＲの構成的活性は、実施例２２の（２）に記載の方法１を用いて測定した。
その結果、構成的活性が増強したことが判明したオーファンＧＰＣＲの変異体を第９表に示した。
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表８−１表または第８−２表に示したように、ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎ、ＲＥ２、ＧＰＲ３５およびＧＰＣＲ２５はもともと構成活性型ＧＰＣＲであるが、上記の変異を導入することにより、構成的活性がさらに上昇することが明らかになった。一方、必ずしもこの変異により構成活性型変異体が造成できる訳ではないことも明らかになった。ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎ／Ｄ１１８Ａ、ＲＥ２Ｄ１２４Ａ、ＧＰＲ３５Ｄ１１３ＡおよびＧＰＣＲ２５Ｄ１１１Ａのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１８９、１９０、１９１および１９２にそれぞれ示した。また、ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎ／Ｄ１１８Ａと同様に、ＯＧＲ１の１１８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体ＯＧＲ１Ｄ１１８Ａ（アミノ酸配列を配列番号１８８に示した）も同様に構成活性を示すと考えられる。
［実施例２５］新規宿主・ベクター系を用いたオーファンＧＰＣＲのリガンドまたはアゴニストの探索
（１）ＧＰＲ４３の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４３の造成
実施例２０の（１）に記載した方法に準じて、ＰＣＲによりＧＰＲ４３遺伝子を取得し、該遺伝子を発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄに組み込むことにより、ＧＰＲ４３の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４３を造成した。鋳型としては、ヒト染色体ＤＮＡ（１００ｎｇ；クロンテック社製）を用いた。ＧＰＲ４３遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号１８１および１８２に記載した配列を有する合成ＤＮＡを使用した。上記プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。
ＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。プラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ＰＣＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することにより、ＧＰＲ４３の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４３を造成した。
（２）ＧＰＲ４３のリガンドまたはアゴニストの探索
実施例２１の（１）に記載した方法に準じて、ｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４３をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、１００ｎｍｏｌ／Ｌから１００μｍｏｌ／Ｌの各種物質を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、１００μｍｏｌ／Ｌの酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、プロピオン酸（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＨ）、および酢酸塩（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）が、ＧＰＲ４３のアゴニストとして作用することが判明した（レポーターの誘導倍率はそれぞれ４倍、５倍、９倍）。したがって、酢酸、プロピオン酸、酢酸塩、またはプロピオン酸塩をアゴニストとして用いて、ＧＰＲ４３のアンタゴニストの探索を行うことができる。酢酸および酢酸塩は、他のＧＰＣＲを導入したアッセイ細胞には作用しなかったことから、ＧＰＲ４３特異的なアゴニスト活性を有することが判明した。下記（４）に示すように、プロピオン酸はＧＰＲ４１に対してもアゴニスト活性を示した
（３）ＧＰＲ４１の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４１の造成
実施例２０の（１）に記載した方法に準じて、ＰＣＲによりＧＰＲ４１遺伝子を取得し、該遺伝子を発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄに組み込むことにより、ＧＰＲ４１の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４１を造成した。鋳型としては、ヒト染色体ＤＮＡ（１００ｎｇ；クロンテック社製）を用いた。ＧＰＲ４１遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号１８３および１８４に記載した配列を有する合成ＤＮＡを使用した。上記プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。
ＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。プラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ＰＣＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することにより、ＧＰＲ４１の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４１を造成した。
（４）ＧＰＲ４１のリガンドまたはアゴニストの探索
実施例２１の（１）に記載した方法に準じて、ｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４１をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、１００ｎｍｏｌ／Ｌから１０００ｎｍｏｌ／Ｌの各種物質を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、１００μｍｏｌ／Ｌのプロピオン酸（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＨ）およびシクロプロパンカルボン酸が、ＧＰＲ４１のアゴニストとして作用することが判明した（レポーターの誘導倍率はそれぞれ２１倍と２２倍）。したがって、プロピオン酸またはシクロプロパンカルボン酸をアゴニストとして用いて、ＧＰＲ４１のアンタゴニストの探索を行うことができる。シクロプロパンカルボン酸は他のＧＰＣＲを導入したアッセイ細胞には作用しなかったことから、ＧＰＲ４１特異的なアゴニスト活性を有することが判明した。ＧＰＲ４３に対してアゴニスト活性を示した酢酸や酢酸塩はＧＰＲ４１に対してはアゴニスト活性を示さなかった。
（５）Ｇ１０ｄの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｇ１０ｄの造成
実施例２０の（１）に記載した方法に準じて、ＰＣＲによりＧ１０ｄ遺伝子を取得し、該遺伝子を発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄに組み込むことにより、Ｇ１０ｄの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｇ１０ｄを造成した。鋳型としては、ヒト脾臓由来一本鎖ＤＮＡを用いた。Ｇ１０ｄ遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号１８５および１８６に記載した配列を有する合成ＤＮＡを使用した。上記プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。
ＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。プラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ＰＣＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することにより、Ｇ１０ｄの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｇ１０ｄを造成した。
（６）Ｇ１０ｄのリガンドまたはアゴニストの探索
実施例２１の（１）に記載した方法に準じて、ｐＡＧａｌ９−Ｇ１０ｄをＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後、１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは１０００ｎｍｏｌ／Ｌの各種物質を添加し、６時間後にウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、１００ｎｍｏｌ／Ｌのα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）および１００ｎｍｏｌ／Ｌの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）がＧ１０ｄのアゴニストとして作用することが判明した（レポーターの誘導倍率はそれぞれ１０倍と１１倍）。α−ＭＳＨまたはＡＣＴＨはコントロールベクター（ｐＡＧａｌ９−ｄ）を導入したＧＢＣＲＣ６には作用しなかった。α−ＭＳＨまたはＡＣＴＨをアゴニストとして用いて、Ｇ１０ｄのアンタゴニストの探索を行うことができる。
［実施例２６］ＧＰＲ４３の構成活性型変異体の造成
実施例２４に記載した方法と同様にして、ＧＰＲ４３の構成活性型変異体を造成した。
（１）ＧＰＲ４３変異体ライブラリーの造成
実施例２４（２）に記載した方法と同様にして、ＧＰＲ４３ポリペプチドの第３膜貫通領域の後半から第２細胞内領域の前半部分（ＧＰＲ４３ポリペプチドの１０３番目のアミノ酸から１１２番目のアミノ酸）、あるいは第３細胞内領域の後半から第６膜貫通領域の前半部分（ＧＰＲ４３ポリペプチドの２１３番目のアミノ酸から２２２番目のアミノ酸）に、ランダム変異を導入したＧＲＰ４３変異体ライブラリーを、造成した。ランダム変異を導入するためのＰＣＲの鋳型としては、実施例２５の（１）で造成した、ＧＰＲ４３の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４３を用いた。
（２）構成活性型のＧＰＲ４３変異体の取得
実施例２４（３）に記載した方法と同様にして、上記（１）で造成したＧＰＲ４３変異体ライブラリーを用いて、構成活性型のＧＰＲ４３変異体を選択した。その結果、ＧＰＲ４３ポリペプチドの２１７番目のアルギニンをプロリンに置換した変異体（ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐと呼ぶ）は、実施例２２の（２）に記載の方法（ＧＢＣＲＣ６を宿主として利用）で評価した結果、約２倍の誘導倍率を示し、構成活性型ＧＰＣＲであることが確認された。ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐのアミノ酸配列を配列番号１９７に示した。
（３）ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐポリペプチドにさらに変異を導入した変異体の造成
実施例２４（２）に記載したランダム変異の導入方法と同様にして、ＧＰＲ４３Ｒ２１７ＰポリペプチドのＤ／ＥＲＹモチーフ中にある１０６番目のグルタミン酸残基を他のアミノ酸に置換した変異体をコードするＤＮＡを造成した。変異導入用の鋳型としては、上記（２）で取得した、ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐを用いた。
上記で造成したＤＮＡがコードする変異体の構成活性を、実施例２２の（２）に記載の方法（ＧＢＣＲＣ６を宿主として利用）で評価することにより、構成活性がさらに上昇した変異体を選択した。その結果、ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐポリペプチドの１０６番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した変異体（ＧＰＲ４３Ｒ２１７ＰＥ１０６Ｄと呼ぶ）は、約１７倍の誘導倍率を示し、ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐポリペプチドに比較してさらに構成活性が増加していることが明らかになった。ＧＰＲ４３Ｒ２１７ＰＥ１０６Ｄのアミノ酸配列を配列番号１９８に示した。
ＧＰＲ４３Ｒ２１７ＰＥ１０６ＤをコードするＤＮＡは、ＧＰＲ４３の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４３を鋳型として、変異導入キットＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を用いて造成することもできる。
産業上の利用の可能性
本発明により、哺乳動物の内分泌細胞由来の多様な細胞株、該細胞株を宿主として用いた、活性ペプチド前駆体遺伝子の発現クローニング系および活性ペプチドの生産法、該細胞株を用いた、該細胞に作用する物質の探索法や評価法、該細胞株を用いた有用遺伝子、有用ペプチドの探索法および取得法、上記の発現クローニング系で使用する高感度で簡便なＧＰＣＲリガンドのアッセイ系が提供される。
配列表フリーテキスト
配列番号１−発明者：佐々木克敏；三浦和美；佐伯智
発明者：吉澤美佐子；岸本和也
発明者：國友博文；西達也；帯刀益夫
配列番号１−合成ＤＮＡ
配列番号２−合成ＤＮＡ
配列番号３−合成ＤＮＡ
配列番号４−合成ＤＮＡ
配列番号５−合成ＤＮＡ
配列番号６−合成ＤＮＡ
配列番号７−合成ＤＮＡ
配列番号８−合成ＤＮＡ
配列番号９−合成ＤＮＡ
配列番号１０−合成ＤＮＡ
配列番号１１−合成ＤＮＡ
配列番号１２−合成ＤＮＡ
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配列番号１４−合成ＤＮＡ
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配列番号１６−合成ＤＮＡ
配列番号１７−合成ＤＮＡ
配列番号１８−合成ＤＮＡ
配列番号１９−合成ＤＮＡ
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配列番号３１−合成ＤＮＡ
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配列番号１５９−合成ＤＮＡ
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配列番号１６０−合成ＤＮＡ
配列番号１６０−ｎはａ、ｇ、ｃまたはｔ
配列番号１６１−合成ＤＮＡ
配列番号１６１−ｎはａ、ｇ、ｃまたはｔ
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配列番号１６３−合成ＤＮＡ
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配列番号１６４−合成ＤＮＡ
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配列番号１６５−合成ＤＮＡ
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配列番号１６６−合成ＤＮＡ
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配列番号１６７−合成ＤＮＡ
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配列番号１６８−合成ＤＮＡ
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配列番号１６９−合成ＤＮＡ
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配列番号１７０−合成ＤＮＡ
配列番号１７０−ｎはａ、ｇ、ｃまたはｔ
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配列番号１７９−合成ＤＮＡ
配列番号１８０−合成ＤＮＡ
配列番号１８１−合成ＤＮＡ
配列番号１８２−合成ＤＮＡ
配列番号１８３−合成ＤＮＡ
配列番号１８４−合成ＤＮＡ
配列番号１８５−合成ＤＮＡ
配列番号１８６−合成ＤＮＡ
配列番号１８７−ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎ
配列番号１８８−ＯＧＲ１Ｄ１１８Ａ
配列番号１８９−ＯＧＲ１Ｓ２２１Ｎ／Ｄ１１８Ａ
配列番号１９０−ＲＥ２Ｄ１２４Ａ
配列番号１９１−ＧＰＲ３５Ｄ１１３Ａ
配列番号１９２−ＧＰＣＲ２５Ｄ１１１Ａ
配列番号１９３−ＰＧＭＯ３３４Ｅ１３５Ｆ
配列番号１９４−ＰＧＭＯ３３４Ｅ１３５Ｑ
配列番号１９５−ＰＧＭＯ３３４Ｅ１３５Ａ
配列番号１９６−ＰＧＭＯ３３４Ｅ２５９Ｓ
配列番号１９７−ＧＰＲ４３Ｒ２１７Ｐ
配列番号１９８−ＧＰＲ４３Ｒ２１７ＰＥ１０６Ｄ
【配列表】
2003087366.tif 000021
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2003087366.tif 000110
【図面の簡単な説明】
第１図  視床下部由来不死化細胞のＳＶ４０ラージＴ抗原の免疫染色を示す。３３℃で培養したトランスジェニックラット胎児由来の不死化視床下部細胞の混合物について、（ａ）はＳＶ４０ラージＴ抗原の免疫染色の結果を、（ｂ）は核染色の結果を示す。
第２図  トランスジェニックラット胎児由来の不死化視床下部細胞の混合物、ＳＶ４０ラージＴ抗原の免疫染色の結果を示す。（ａ）は３３℃で培養した場合、（ｂ）は３９℃で培養した場合を示す。
第３図  不死化視床下部細胞株ＡＭＮ２−１００を、１０％血清を含む培地で温度を変えて培養した場合の細胞の形態を示す。（ａ）は３３℃で培養した場合、（ｂ）は３９℃で培養した場合を示す。
第４図  不死化視床下部細胞株ＡＭＦ２−２０を、３３℃で培地を変えて培養した場合の細胞の形態を示す。（ａ）は１０％血清を含む培地で培養した場合、（ｂ）はＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｎ２）培地で培養した場合、（ｃ）はＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地で培養した場合を示す。
第５図  不死化視床下部細胞株ＡＭＦ２−２０を、培地と温度を変えて培養した場合の細胞の形態を示す。（ａ）はＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地を用いて３３℃で８日間培養した場合、（ｂ）はＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＦＣＳ）培地を用いて３７℃で５日間培養後、培地をＤＭＥＭ／Ｆ−１２（−ＦＣＳ）培地に交換してさらに３７℃で３日間培養した場合を示す。
第６図  トランスジェニックラット成体雌由来の不死化視床下部細胞の混合物について、レプチン受容体の免疫染色を行った結果を示す。
第７図  （ａ）は視床下部細胞株ＡＭＮ２−２５についてＮＰＹの免疫染色を行った結果を示す。（ｂ）は抗ＮＰＹ抗体を添加しないネガティブコントロールを示す。
第８図  不死化視床下部細胞株ＮＣ−１２についてＳＴＡＴ３の免疫染色を行った結果を示す。（ａ）はレプチン刺激をしない場合、（ｂ）はレプチン刺激を加えた場合を示す。
第９図  不死化視床下部由来細胞株のスルホニルウレア刺激による細胞内カルシウム濃度の変化を示す。（ａ）はトランスジェニックラット成体雌の視床下部由来の不死化細胞の混合物を、（ｂ）は不死化視床下部細胞株ＡＭＮ２−２５を用いた場合を示す。横軸は時間で、矢印で示した時点でＨＢＳＳバッファーまたはスルホニルウレアを細胞にそれぞれ添加した。縦軸は２励起波長での蛍光強度比でカルシウム濃度を表す。
第１０図  ランゲルハンス氏島由来不死化細胞株Ｆ−８について、ＰＣ２の免疫染色および核染色を行った結果を示す。（ａ）および（ｂ）はＰＣ２の免疫染色を、（ｃ）および（ｄ）は核染色を示し、（ａ）および（ｃ）はＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）培地で培養した場合、（ｂ）および（ｄ）はＲＰＭＩ１６４０（０５９１８）で培養した細胞をＤＭＥＭ（Ｄ−５７９６）培地に培地を置換し、２週間培養した場合を示す。
第１１図  宿主細胞株ＧＢＣＲ２にｐＡＧａｌ９−Ｖ２を導入した安定形質転換株のバソプレッシン刺激時のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示す。＋エストロジェンは、１７β−エストラジオール刺激をしてＶ２遺伝子の誘導発現を行った場合、−エストロジェンは１７β−エストラジオール刺激をしない場合、それぞれの右側のバーはバソプレッシン刺激をした場合、左側のバーはバソプレッシン刺激をしない場合の活性を示す。縦軸はバソプレッシン刺激をしない場合の活性をそれぞれ１としたときの活性比を表す。
第１２図  宿主細胞株ＧＢＣＲＣ６にｐＡＧａｌ９−Ｖ２を導入した安定形質転換株を、１７β−エストラジオールによりＶ２遺伝子発現誘導後、各種濃度のバソプレッシンで刺激したときのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示す。横軸はバソプレッシンの濃度〔ｌｏｇ（ｍｏｌ／Ｌ）〕を、縦軸はバソプレッシン刺激をしない場合の活性を１としたときの活性比を表す。
第１３図  宿主細胞株ＧＢＣＲＣ６にｐＡＧａｌ９−ＣＲＨＲ１を導入した安定形質転換株を、１７β−エストラジオールによりＣＲＨＲ１遺伝子発現誘導後、各種濃度のコルチコトロピン放出ホルモンで刺激したときのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示す。横軸はコルチコトロピン放出ホルモンの濃度〔ｌｏｇ（ｍｏｌ／Ｌ）〕を、縦軸はコルチコトロピン放出ホルモン刺激をしない場合の活性を１としたときの活性比を表す。
第１４図  宿主細胞株ＧＢＣＲＣ６にｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を導入した安定形質転換株を、１７β−エストラジオールによりＡＴ１遺伝子発現誘導後、各種濃度のアンジオテンシンＩＩで刺激したときのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示す。横軸はアンジオテンシンＩＩの濃度〔ｌｏｇ（ｍｏｌ／Ｌ）〕を、縦軸はアンジオテンシンＩＩ刺激をしない場合の活性を１としたときの活性比を表す。
第１５図  宿主細胞株ＧＢＣＲＣ６にｐＡＧａｌ９−Ｂ１を導入した安定形質転換株を、１７β−エストラジオールによりＢ１遺伝子発現誘導後、各種濃度のＤｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンで刺激したときのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示す。横軸はＤｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンの濃度〔ｌｏｇ（ｍｏｌ／Ｌ）〕を、縦軸はＤｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニン刺激をしない場合の活性を１としたときの活性比を表す。
第１６図  宿主細胞株ＧＢＣＲＣ６にｐＡＧａｌ９−ｓｓｔ５を導入した安定形質転換株を、１７β−エストラジオールによりｓｓｔ５遺伝子発現誘導後、各種濃度のソマトスタチンで刺激したときのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示す。横軸はソマトスタチンの濃度〔ｌｏｇ（ｍｏｌ／Ｌ）〕を、縦軸はソマトスタチン刺激をしない場合の活性を１としたときの活性比を表す。
第１７図  宿主細胞株ＧＢＣＲ２にｐＡＧａｌ９−ＭＣ１Ｒを導入した安定形質転換株を、１７β−エストラジオールによりＭＣ１Ｒ遺伝子発現誘導後、各種濃度のＰＡＭＰまたはＰＡＭＰ−１２で刺激したときのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示す。左側のグラフはＰＡＭＰで刺激した場合、右側のグラフはＰＡＭＰ−１２で刺激した場合を示す。横軸は左側のグラフはＰＡＭＰの濃度〔ｌｏｇ（ｍｏｌ／Ｌ）〕、右側はＰＡＭＰ−１２の濃度〔ｌｏｇ（ｍｏｌ／Ｌ）〕を、縦軸はそれぞれＰＡＭＰまたはＰＡＭＰ−１２刺激をしない場合の活性を１としたときの活性比を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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