(57)【要約】本発明はＧＣ−Ａ遺伝子における転写開始点よりも上流配列におけるグアニル酸シクラーゼ−Ａの発現を低下させ得る多型を検出する工程を含む高血圧症の素因を検出する方法を提供する。転写開始点よりも上流配列における多型としては、−３００領域付近におけるＣＴの繰返し数の多型、−５４９領域におけるＡがＧに置換された多型である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニル酸シクラーゼ−Ａ遺伝子における転写開始点より上流配列におけるグアニル酸シクラーゼ−Ａの発現を低下させ得る多型を検出する工程を含む、高血圧症の素因を検出する方法。
【請求項２】
多型が繰返し配列の数における多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
翻訳開始点より−３００領域付近におけるｃｔジヌクレオチド繰返し配列の数における多型である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多型が一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
翻訳開始点より−５４９領域付近における多型である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ試料からグアニル酸シクラーゼ−Ａの転写開始点よりも上流配列を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡを対照と比較することにより多型を検出する工程
【請求項７】
高血圧症の遺伝的素因を検査するための検査薬であって、
配列番号１における翻訳開始点から−８８領域よりも上流配列又はその少なくとも１５ヌクレオチド以上の一部配列からなる核酸を含む、検査薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、高血圧症の素因を検出する方法および検査薬に関し、特に、グアニル酸シクラーゼ−Ａの上流制御配列における多型に基づき高血圧症の遺伝的素因を検出することに関する。
背景技術
ナトリウム利尿ペプチド系は、体液量調節等により血圧を調節することから、ナトリウム利尿ペプチド系に関連する遺伝子群が高血圧症の原因遺伝子として着目されている。
高血圧症は、原因の明らかな二次性高血圧症と原因が明らかにされていない本態性高血圧症とに分類される。二次性高血圧症の一部は、単一遺伝子上の異常が原因して生じることが明らかとなっており、このような二次性高血圧症はメンデルの法則に従う。一方、本態性高血圧症は、複数の遺伝子と環境因子とが関与して生じるため、その遺伝はメンデルの法則に従わない。そのため、その原因を探索することは二次性高血圧症に比べ困難と考えられている。しかし、本態性高血圧症は環境因子も関与するが、遺伝的因子が深く関与すると考えられているため、その高血圧症の成因遺伝子の解明が鋭意進められている。
この高血圧症成因候補遺伝子の一群として、ナトリウム利尿ペプチドファミリーが挙げられる。ナトリウム利尿ペプチドには、産生する組織等の違いから、大きく３種類、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウムペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドに分類されている。このうち、ＡＮＰは生体に投与することにより速やかに降圧作用、利尿、ナトリウム利尿作用を示し、交感神経抑制作用、レニン・アルドステロン分泌抑制作用をも有していることが示されている。
また、これらリガンドに対する受容体も同定されている。これらはナトリウム利尿ペプチド−Ａ（ＮＰＲ−Ａ）、ナトリウム利尿ペプチド−Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）、クリアランス受容体（Ｃ受容体）の３種類である。このうちＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−Ｂとはいずれも膜１回貫通型受容体で、その基本構造はきわめて類似し、４４１アミノ酸からなる細胞外ドメインと、２１アミノ酸から膜貫通ドメインを、５６７アミノ酸からなる細胞内ドメインから構成される。両者は、細胞内ドメインとして酵素活性を有するグアニル酸シクラーゼドメインを有しており、この酵素活性から従来よりグアニル酸シクラーゼ−Ａ（ＧＣ−Ａ）と、グアニル酸シクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）とも称されていた。
ＮＰＲ−Ａ（以下、「ＧＣ−Ａ」と統一して表示する）は、ＡＮＰ、ＢＮＰに選択性の高い受容体であり、ＡＮＰ、ＢＮＰとの結合により強力にｃＧＭＰ産生を誘導する。一方、ＮＰＲ−Ｂ（以下、「ＧＣ−Ｂ」と統一して表示する）は、ＣＮＰに選択性の高い受容体で、ＣＮＰにより強力にｃＧＭＰ産生が誘導される。また、Ｃ受容体は、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰのクリアランスに関与する。
本態性高血圧症とナトリウム利尿ペプチドとの関連性を調べるために本態性高血圧症患者および高血圧症モデル動物におけるナトリウム利尿ペプチドの血中濃度が測定された。ヒト本態性高血圧症では、血中ＡＮＰレベルは正常対照と比較して軽度ではあるが有意に上昇し、また、高血圧症モデル動物、例えば、高血圧症自然発症ラット、その亜系である脳卒中易発性高血圧症自然発症ラットやＤＯＣＡ−Ｓａｌｔ高血圧症ラットなどにおいても、対照ラットと比較して血中ＡＮＰ濃度が上昇していることが示された。
また、ＢＮＰは主として心室で生合成・分泌がされるため、その血中濃度は敏感に心室への負荷や心室の病態を反映することが考えられた。例えば、本態性高血圧症ではその重症度に比例して心肥大を合併する。血中ＢＮＰ濃度の上昇は心肥大を合併した症例、特に求心性心肥大の合併を示唆し、本態性高血圧症とＢＮＰとの関連性が注目されている。
さらに近年では、発生工学的手法を用いてナトリウム利尿ペプチド系の高血圧症との関連が研究されている。
ＡＮＰ又はＢＮＰを肝で大量発現させたトラスジェニックマウスでは、血圧の低下および心重量の低下が示されている（Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ  Ｍ．Ｅ．らＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １６：３０１−３０７（１９９０）、Ｏｇａｗａ  Ｙ．らＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１９１１−１９２１（１９９４）、Ｂａｒｂｅｅ  Ｒ．Ｗ．らＣｉｒｃ．Ｒｅｓ．７４：７４７−７５１（１９９４））。また、ＡＮＰを遺伝的に欠損させたＡＮＰノックアウトマウスでは、２％食塩食ではホモ接合体で血圧が上昇し、８％食塩食ではヘテロ接合体でも血圧が上昇した。また、２％食塩食で飼育するとホモ接合体は野生型に比して４０％心重量の増加が観察されている（Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｗ．Ｍ．らＳｃｉｅｎｃｅ  ２６７：６７０−６８１（１９９５））。これらＡＮＰ又はＢＮＰの過剰発現マウスおよびＡＮＰノックアウトマウスを用いた研究は、ナトリウム利尿ペプチドが利尿、降圧作用を有し、血圧・体液量調節を行っていることを示している。
一方、ＡＮＰ、ＢＮＰに対して選択性の高い受容体ＧＣ−Ａについてもノックアウトマウス、過剰発現マウスを用いて高血圧症との関係が解析された。ＧＣ−Ａノックアウトマウスでは、血圧上昇および心肥大が観察され（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｉ．らＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．６：５８−６３（１９９７）、Ｌｏｐｅｚ  Ｍ．Ｊ．らＮａｔｕｒｅ  ３７８：６５−６８（１９９５）、Ｏｌｉｖｅｒ  Ｐ．Ｍ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１４７３０−１４７３５（１９９７））、ＧＣ−Ａ遺伝子を過剰発現する遺伝子変異動物では野生型と比較して有意に血圧が低下し、ＧＣ−Ａ遺伝子と血圧変動との間にｇｅｎｅ−ｄｏｓｅ  ｅｆｆｅｃｔがあることが報告されている（Ｏｌｉｖｅｒ  Ｐ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：２５４７−２５５１（１９９８））。
このようにマウスにおいてＧＣ−Ａ遺伝子と血圧変動との間にｇｅｎｅ−ｄｏｓｅ  ｅｆｆｅｃｔが確認されたことから、ヒトでもＧＣ−Ａタンパク質および遺伝子発現の差が実際に血圧の差となって現われる可能性が示唆された。この予測を支持する報告が中山らによりなされている（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：８４１−８４５（２０００））。すなわち、本態性高血圧症患者において有意に高い頻度（本態性高血圧症患者４％（８／２００）、正常人０．５％（１／２００）で、ＧＣ−Ａ遺伝子の５’−フランキング領域に８塩基の欠失変異が検出された。この変異は転写開始点とエクソン１との間の転写因子（ＡＰ−２、Ｚｅｓｔｅ）の結合部位内に位置し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写活性を野生型の３０％までに低下させるものであった。
発明の開示
上述の通り、ＧＣ−Ａの転写の低下と高血圧症との関連性を支持する報告がなされているが、この変異は本態性高血圧症の４％であり、全ての高血圧症を説明するものではない。そのため、他の高血圧症の成因となる変異を検索し発見することが、高血圧症発症の原因を知る上で、また高血圧症の遺伝的な診断を可能にする上でも求められている。
特に、本態性高血圧症においては遺伝的な成因と環境因子との双方が原因となり生じるため、本態性高血圧症の遺伝的な素因を有するか否かを早期に知ることができれば、より厳密な環境因子のコントロールにより、その発症を抑制することも可能となる。
そこで、本発明は、高血圧症の素因を検出し得るＣＧ−Ａにおける新たな多型を検出し、その多型に基づき高血圧症の素因を検出する方法および検出薬を提供することを目的とする。
上記目的を達成すべく、本願発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、高血圧症患者に有意に高い頻度でＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点よりも上流配列にＧＣ−Ａの転写を低下させ得る多型を検出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、▲１▼  グアニル酸シクラーゼ−Ａ遺伝子における転写開始点よりも上流配列におけるグアニル酸シクラーゼ−Ａの発現を低下させ得る多型を検出する工程を含む高血圧症の素因を検出する方法、▲２▼  ▲１▼における多型が繰返し配列の数における多型である方法、▲３▼  ▲２▼における多型が翻訳開始点より−３００領域付近におけるｃｔジヌクレオチド繰返し配列の数における多型である方法、▲４▼  ▲１▼における多型が一塩基多型である方法、▲５▼  ▲４▼における一塩基多型が翻訳開始点より−５４９領域付近におけるＡがＧに置換されている方法、▲６▼  上記▲１▼〜▲５▼における方法において、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：（ａ）被験者からＤＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）前記ＤＮＡ試料からグアニル酸シクラーゼ−Ａの転写開始点よりも上流配列を含むＤＮＡを単離する工程、（ｃ）単離したＤＮＡを対照と比較することにより多型を検出する工程を含む方法、である。
また、本発明は、配列番号１における−８８領域よりも上流配列又はその少なくとも１５ヌクレオチド以上の一部配列からなる核酸を含む、高血圧症の素因を検査するための検査薬である。
本願発明者らは、高血圧症患者において、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点よりも上流配列にグアニル酸シクラーゼ−Ａの発現を低下させ得る多型を検出し、高血圧症の素因を検出する新たな方法を提供することが可能となった。すなわち、本発明は、グアニル酸シクラーゼ−Ａ遺伝子における転写開始点よりも上流配列におけるグアニル酸シクラーゼ−Ａの発現を低下させ得る多型を検出する工程を含む、高血圧症の遺伝的素因を検出する方法である。
ここで「高血圧症」とは、１９９９年ＷＴＯ／ＩＳＨの定義によれば、降圧薬非服用下において収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上と定義されるが、本明細書ではこの定義に制限されず、正常高値血圧（収縮期血圧１３０〜１３９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧８５〜８９ｍｍＨｇ）を含めることができる。また、高血圧症は、軽症、中等症、重症に分類されることがあるが、これらのいずれを含めることもできる。また、本発明では、高血圧症の遺伝的素因を検出する方法であり、被験者が測定時に上記高血圧症に該当している必要は無く、測定時に正常血圧であってもよい。さらに、高血圧症であれば、二次性高血圧症と本態性高血圧症との双方を含めることができる。またさらに、本明細書において「高血圧症」には、高血圧症に伴う合併症も含めることができる。この合併症としては、心臓では左室肥大、狭心症、心筋梗塞の既往、心不全など、脳では脳出血、脳梗塞、一過性脳虚血発作など、腎臓では蛋白尿、腎障害、腎不全など、血管では動脈硬化症プラーク、大動脈解離、閉塞性動脈疾患など、眼底では高血圧性網膜症などが挙げられる。こうした合併症を伴う高血圧症の遺伝的素因を判定するために、本発明の方法を用いることもできる。
「ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点」は、種々研究されており、これら研究を通して同定されている転写開始点、例えば、中山ら（前掲）により同定された転写開始点、配列番号１におけるＧＣ−Ａ遺伝子の５’隣接領域中、翻訳開始点より−８８領域に位置する「ｇ」などとすることができる。したがって、「ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流配列」とは、転写開始点として同定された位置よりも上流の意味し、例えば、上記中山らが同定された転写開始点を基準とした場合には、配列番号１におけるＧＣ−Ａ遺伝子の５’隣接領域中、翻訳開始点より−８８領域に位置する転写開始点「ｇ」よりも上流の配列を意味する。よって、転写開始点よりも下流における、中山ら（前掲）により既に報告されている変異（翻訳開始点より−６０から−６７領域にかけての８塩基欠失変異）とは、本発明は明らかに区別される。
また、「多型」とは、遺伝学的には人口中１％以上の頻度で存在している一遺伝子における塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含まれ、また多型の種類も、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失、挿入若しくは置換している多型、繰返し数における多型等も含まれる。さらに、本発明における「多型」部位の数は、１箇所に限定されず、複数箇所に多型が存在していてもよい。
また、本発明における「多型」は、ＧＣ−Ａの発現を低下させ得るものであれば上記多型の種類のいずれでもよく、例えば、配列番号１における翻訳開始点より−３００領域付近（配列番号１における１７００番付近）におけるｃｔジヌクレオチドの繰返し数が減少するような多型や−５４９領域付近（配列番号１における１４６４番付近）における「ａ」が置換されたような変異が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、ここで「付近」としているのは、周囲の変異、例えば、繰返し配列の多型などによっては、翻訳開始点からの距離が変化し得るためである。
また「ＧＣ−Ａの発現を低下させる」とは、本発明ではＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流配列における多型を対象としていることから、主としてｍＲＮＡの生成を低下させることを意味するが、このｍＲＮＡの産生の低下によりＧＣ−Ａタンパク質を低下させることをも含まれる。従って、ＧＣ−Ａの発現を低下させ得る多型であるか否かは、直接被験者におけるＧＣ−Ａ  ＲＮＡ量またはＧＣ−Ａタンパク質量もしくはＧＣ−Ａの酵素活性を測定し、対照と比較することにより判定することができる。
被験者のＧＣ−Ａ  ＲＮＡ量を測定するには、被検者よりＲＮＡ試料を調製し、該ＲＮＡ試料に含まれるＧＣ−Ａタンパク質をコードするＲＮＡの量をノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法（新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅、羊土社、ｐ２８０−２８４）等により測定することができる。
ＧＣ−Ａタンパク質発現量の測定は、被検者からタンパク質試料を調製し、ＧＣ−Ａタンパク質試料に含まれるＧＣ−Ａタンパク質の量をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにＧＣ−Ａタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法などを用いて測定することにより実施することができる。
その他のＧＣ−Ａの発現量を測定方法としては、レポーター遺伝子を利用した方法がある。この方法では検出された多型を含むＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流配列を含むＤＮＡを単離し、このＤＮＡをレポーター遺伝子の上流に連結させる。ここで調製されたＤＮＡを細胞に導入し、細胞内でのレポーター遺伝子の発現を測定する。レポーター遺伝子としては、例えば、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等を用いることができる。これらレポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
また、ＧＣ−Ａ酵素活性の測定は、ＧＴＰ（グアノシン−３リン酸）を基質とし、ｃＧＭＰの産生をＲＩＡなどで測定することができる。また、このｃＧＭＰの産生量の測定は、市販のキット（ヤマサ醤油社製品）などを用いて簡便に測定することができる。
本発明において、多型を「検出」する方法としては、被験者のＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流の塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
この方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
次いで、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、例えば、上記調製した染色体ＤＮＡあるいはＲＮＡを鋳型とし、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いたＰＣＲ等によって行うことが可能である。ここで用いるプライマーは、配列番号１に示した塩基配列より選択、調製することができ、また、配列番号２および配列番号３のプライマーを用いることができる。
次いで、上記単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
上記決定されたＤＮＡの塩基配列は最終的に対照と比較される。ここで「対照」としては、正常な（野生型）ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡ配列、例えば、配列番号１を用いることができ、また、配列番号１と異なる健常人由来あるいはＧｅｎＢａｎｋ等に野生型として登録されているＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡの配列を用いることもできる。このような対照と比較した結果、被検者のＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡの配列中にＧＣ−Ａの発現を低下させ得る多型が存在しているかが決定される。ここでＧＣ−Ａの発現を低下させ得る多型としては、−３００領域における（ｃｔ）繰返し数が１０以下、好ましくは、８以下、より好ましくは６に減少した多型、又は、−５４９領域における「Ａ」が他のヌクレオチドに置換された多型などを例示できるが、これらには限定されない。このような多型が被験者において検出された場合には、高血圧症を発症していない被験者に対しては高血圧症を発症する疑いがあるものと判定され、高血圧症を発症している被検者では、その原因がＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域の多型であると判定される。
多型検出の他の態様として、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用することができる。この方法は、先ず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。この方法では制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。
また、検出方法としてＰＣＲ−ＲＦＬＰを利用することもできる。この方法では、被検者より調製したＤＮＡ試料を、上記ＲＦＬＰ解析を行う前に、ＰＣＲによりＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡを増幅する。この方法の場合には、目的領域を選択的に増幅することにより、他の領域由来の断片を排除し精度よく多型を検出することができる。ここで用いるＰＣＲプライマーは、配列番号１の配列などから当業者であれば容易に調製することができる。
検出方法として、ＲＦＬＰ又はＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いる場合には、制限酵素処理断片を電気泳動した後、配列番号１に記載されたＤＮＡあるいはその一部をプローブとしてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することもできる。また、制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。例えば、−５４９領域における多型を検出する場合には「ａ」から他の塩基への置換を検出し得る制限酵素を選択すればよい。
さらに別の態様として、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２  Ｊａｎ  １；１２（１）：１３９−１４６．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１  Ａｕｇ  １；６（８）：１３１３−１３１８．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ａｐｒ  １；４（５）：２７５−２８２）を利用することができる。この方法では、先ず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
上記方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。また、上記方法は、一塩基の変異をも検出することができる利点を有する。すなわち、上記方法の原理は、二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存して独自の高次構造を形成する。これを変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分画すると、それぞれの高次構造の差に応じて相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡであっても異なる位置に移動する。特に、一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することにより、ＤＮＡ断片内に一塩基の欠失、挿入もしくは置換等による多型が存在することをも検出することができ、また、ｃｔジヌクレオチド繰返し配列数の多型検出にも有用である。
上記ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する必要があるが、この増幅する長さとしては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
さらに別の態様としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）等を利用することもできる。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡをＰＣＲ等により増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤、例えば尿素等の濃度が次第に高まるゲル上で電気泳動により分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
上記ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。ここで変異が存在するＤＮＡ断片の場合には、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
さらに大量の試料における多型検出を可能とするために、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５）を用いることもできる。具体的には、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域又は該領域のうち多型を含む部分とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を調製する。プローブが固定された基板に被験者から調製されたＤＮＡを接触させる。この被験者由来のＤＮＡは、被検者の血液等から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、ＰＣＲ等によってＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡとして調製してもよい。調製したＤＮＡ試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。上記被験者由来のＤＮＡを基板と接触させた後、基板に固定されたヌクレオチドプローブとハイブリダイズしたＤＮＡを検出し、ＧＣ−Ａ遺伝子多型を検出する。
ここで「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味し、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はなく、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
ヌクレオチドの基板への固定（アレイ）方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も上記基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。すなわち、プローブは、例えば、野生型のＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域ＤＮＡ、あるいは多型を有するＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域のＤＮＡと特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡ、またはＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域の多型部位を有するＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
ｃＤＮＡ試料を基板に接触させハイブリダイズさせる条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
最終的な該ＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度の検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
上記ＤＮＡアレイ方法を利用する場合において、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  ＳｐｅｃｉｆｉｃＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法を組合せることもできる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＧＣ−ＡｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
本発明はまた、高血圧症の素因を検査するための検査薬を提供する。その一つの態様は、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらはそれぞれ遺伝子多型を指標とする検査に使用される。
該オリゴヌクレオチドは、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出するＧＣ−Ａ遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検出方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、例えば、配列番号２、３のように、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。また、該プローブにより直接多型の有無を検出する場合には、多型領域と相補するようなヌクレオチドをプローブとすることが好ましい。例えば、−５４９領域における多型を検出する場合には、この−５４９領域を含むＤＮＡに相補的なプローブを設計することができる。なお、該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
また、本発明における検査薬の別の態様は、ＧＣ−Ａ遺伝子、またはＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点より上流領域を含むＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる高血圧症の素因を検査し得る検査薬である。これらは遺伝子多型を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］高血圧症に関連したＧＣ−Ａ遺伝子多型の検出
次の条件を満たす本態性高血圧症の患者８３人、血圧に関し正常者９０人を対象としてＧＣ−Ａ遺伝子座の解析を行った。高血圧症患者：（１）年齢２０歳以上、（２）高血圧症を６０歳以下で発症、（３）高血圧症として長期に治療中又は治療を受けていない者であっても少なくとも２回の通院の際に血圧が１４０／９０ｍｍＨｇ以上であること。血圧に関し正常者：（１）年齢３０歳以上、（２）血圧１４０／９０ｍｍＨｇ以下、（３）降圧剤治療を受けていないこと。
上記高血圧症患者８３人、血圧正常者９０人より末梢血を採取した。市販キット「ＤＮＡ  ｑｕｉｃｋ  ＩＩ」（大日本製紙）を用いて、採取された各末梢血よりゲノムＤＮＡを回収した。ゲノムＤＮＡよりＧＣ−Ａの５’フランキング領域の含むＤＮＡ断片を得るためにＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーとして配列番号２および３を用い、ＧＣ−Ａ遺伝子のおよそ−１３３９領域から４９領域までの増幅断片を得た。得られた増幅断片の配列を自動シークエンサ（米国、ＡＢＩ社）を用いて決定した。ここで決定されたＧＣ−Ａ遺伝子の５’フランキング領域の塩基配列を対照である配列番号１に示した野生型の配列と比較した。
対照との比較の結果、図１に示すように、ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点よりも上流に２つの多型が検出された。一つは−３００付近にｃｔジヌクレオチド繰返し配列の数における多型であった。この（ｃｔ）ｎの繰返し数として１２、１１、１０，９、６の多型が検出された。このうち繰返し数が６という多型は、血圧正常者では２例（２．２％（＝２／９０）：ホモ接合体０人、ヘテロ接合体２人）であるのに対し、高血圧症患者では総計７例（８．４％（＝７／８３）：ホモ接合体１例（１．２％＝１／８３）、ヘテロ接合体６例（７．２％＝６／８３））であり、高血圧症患者において有意に高い頻度で（ｃｔ）繰返し数６の多型が検出された。
もう一つの多型は、−５４９領域（配列番号１における１４６４番：ｃｃａａｔボックスの逆鎖「ｇｇｔｔａ」内）にも一塩基「ａ」が「ｇ」に置換された多型である。この多型は高血圧症患者群においてのみ１例検出され、血圧正常群からは検出されなかった。
［実施例２］ＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点上流における多型によるＧＣ−Ａ遺伝子発現への影響
実施例１で検出されたＧＣ−Ａ遺伝子の転写開始点上流における二つの多型がＧＣ−Ａ遺伝子の発現に影響を与えるか否かをルシフェラーゼレポーター遺伝子解析法を用いて解析した。
（ｃｔ）の繰返し数が６あるいは−５４９領域が「ｇ」に置換されたＧＣ−Ａ遺伝子の５’フランキング領域を得るために、上記実施例１のＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られたＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクターＰＧＶ−Ｂ２（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｃ．）に挿入した。対照として、（ｃｔ）繰返し数１１、１０および既にＧＣ−Ａ転写活性が低下することが報告されている−６０領域の８塩基欠失を有する断片（中山ら、前掲）もそれぞれ同様にＰＧＶ−Ｂ２（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｃ．）に挿入した。
調製された各ベクターを導入するためのヒト大動脈平滑筋細胞は、５％ＦＢＳ添加培地中、３７度、５％ＣＯ２条件下で培養し準備された。トラスフェクション前に細胞は６ｃｍφシャーレに移され、８０％コンフルエントの状態まで生育させ、その後、各ベクターが導入された。細胞へのベクター導入は、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。また、上記各ベクター（１．０μｇ）は、チミジンキナーゼプロモーターＳｅａ  Ｐａｎｓｅｙルシフェラーゼレポータープラスミド（０．１μｇ）とともに細胞に導入された。
導入後、４８時間細胞を通常の条件下で培養し、プロモータ活性をルシフェラーゼ活性を基に測定した。ルシフェラーゼ活性は、３回の並行して実験した試料において、蛍光強度測定器（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７；Ｐｒｏｆ  Ｄｒ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ＧｍｂＨ）を用いて測定された。得られたルシフェラーゼ活性の測定値は、内部標準であるＳｅａ  Ｐａｎｓｅｙルシフェラーゼ活性を基準として相対的な蛍光ユニットとして標準化した。
図２に示すように、（ｃｔ）の繰返し数が１１、１０、６と減少するに従って、そのルシフェラーゼ活性、すなわちプロモータ活性が低下することが示された。特に、高血圧症患者群で有意に高い頻度で検出された（ｃｔ）６は、（ｃｔ）１１のほぼ半分まで活性が低下した。この結果は、ノリー（Ｎｏｒｒｉｅ）疾患遺伝子において既に報告されている５’制御領域におけるｃｔジヌクレオチドの繰返し数の減少が転写活性を低下させ得るとの結果（Ｇｅｎｅ  ２２７：１８１−１８８（１９９９））とも一致する。
また、−５４９領域における一塩基多型（「ａ」→「ｇ」）も、（ｃｔ）１１に比して、１／３以上ルシフェラーゼ活性が低下し、この一塩基多型によりＧＣ−Ａ遺伝子の発現を低下させ得ることが示された。
従って、このような「ｃｔ」の繰返し数の減少やｃｃａａｔボックスの逆鎖内における多型によりＧＣ−Ａ遺伝子の発現が低下し、これがＡＮＰ、ＢＮＰのシグナル伝達の低下をもたらし、高血圧症を引き起こすことが考えられた。特に、「ｃｔ」の繰返し数が６である割合は、調査した全高血圧症の８．４％にも及んでいた。この割合は、高血圧症の中でも割合の高い二次性高血圧症である腎性内分泌性高血圧症（１０％程度）に匹敵する割合で検出されている。従って、本発明の高血圧症の素因検出方法によれば、高血圧症患者における遺伝的素因を判定することに大きく寄与すると考えられる。
産業上の利用の可能性
上記本発明によれば、高血圧症患者において、その遺伝的素因の検出を可能にし、ＧＣ−Ａを補充する等の高血圧症治療方法を設計、提供することが可能となる。また、高血圧症を発症していない人にとっても、本発明により高血圧症の素因を検出することが可能となる。そのため、その高血圧症の素因を有すると判定された場合には、高血圧症を抑制し得るような環境下で生活することにより、高血圧症の発症を予防することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＧＣ−Ａ遺伝子の５’隣接領域内における多型を示す図である。
図２は、各多型を有するＧＣ−Ａ遺伝子の５’隣接領域のプロモータ活性をルシフェラーゼ活性により測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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