【事件の表示】
　特願２００３−４１６８０３「カルシウム結合型発光蛋白質の保存方法等」拒絶査定不服審判事件〔平成１７年　６月３０日出願公開、特開２００５−１６８４６３〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、平成１５年１２月１５日の出願であって、平成２１年１２月４日付けで拒絶査定がなされ、これに対して、平成２２年２月２６日に拒絶査定不服審判の請求がなされ、平成２４年１０月２日付けで当審の拒絶理由通知がなされ、平成２４年１２月７日に意見書が提出されるとともに、同日付けで手続補正がなされたものである。
　
第２　本願発明
　本願の請求項１ないし請求項５に係る発明は、平成２４年１２月７日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１ないし請求項５に記載された事項により特定されるとおりのものと認められ、そのうち請求項１は、以下のとおりのものである。（以下、請求項１に係る発明を「本願発明」という。）
　
「【請求項１】１．０〜１．５Ｍの範囲の濃度で硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥させることを特徴とする、イクオリンの保存方法。」
　
第３　引用刊行物とその記載事項
　当審の拒絶理由で引用された、本願出願前に頒布された刊行物１には、以下の事項が記載されている。以下、下線は当審で付加した。
　
（１）引用文献１：Osamu Shimomura and Frank H.Johnson「Properties of the Bioluminescent Protein Aequorin」,Biochemistry,Vol.8,No.10,October 1969,pp.3991-3997）の記載事項
　
（１ａ）「Results and Discussion
Stability of aequorin. As noted above and previously (Shimomura etal., 1962), aequorin even with EDTA, is extremely sensitive to Ca2+, the solutions usually faintly luminescing spontaneously (presumably due to contaminating Ca2+) resulting in a gradual loss of capacity to luminesce. When an aequorin solution containing a low concentration of EDTA, e.g., less than 10-4 M, was transferred from a thoroughly cleaned plastic to a thoroughly cleaned Pyrex glass container, light emission brightened at once to a new steady level, probably indicating the presence of Ca2+ leached from the glass. Spontaneous luminescence, with the accompanying decrease in activity, could be practically eliminated by saturating the aequorin plus EDTA solutions with (NH4)2SO4 and keeping in a deep freezer at -20°, but at ordinary temperatures a highly sensitive light-measuring device could detect light being emitted at a rate which, if maintained uniformly, according to our calculations, would exhaust the calibrated photon content in about 300 years (G. Calleja and G. T. Reynolds, 1968, personal communication).
　Aequorin solution (1 ml) in 10-4 M EDTA, which had an absorbance of 2.56 at 280 mμ, was found to contain 1 mg of protein (corrected for EDTA present) after freeze drying in a vacuum desiccator over P205,in a room at 25°.However, this 1 mg of protein was found to have an absorbance of only 2.25 at 280 mμ when redissolved in 1 ml of buffer, indicating that a chemical change in the aequorin had taken place. 
Thus, when aequorin in 10
-4
 M EDTA was freeze dried as above, 50-60% loss of activity was found, and the same percentage of activity was again lost after redissolving and redrying. When aequorin was in 10
-3
 and 10
-2
 M EDTA, the loss in activity by freeze drying was 20 and 5 %, respectively, and when the solution with 10
-2
M EDTA contained a small amount of (NH
4
)
2
SO
4
, almost no loss in activity was detected
（日本語訳：結果及びディスカッション
イクオリンの安定性
上述および過去の論文（シモムラetal.、1962）に記載のとおり、EDTAと共にあってさえ、イクオリンはCa2+にとても敏感であり、溶液は通常自発的にかすかに発光し（おそらくCa2+の汚染による）、その結果、発光能力が段階的に喪失する。例えば、10-4M未満のEDTAを低濃度を含んでいるイクオリン溶液を、完全にクリーンにされたプラスチックから完全にきれいにされたパイレックス・ガラス容器へ移したとき、光放射は新しい安定レベルに瞬時に明るくなり、恐らくガラスから浸出するCa2+の存在を示すであろう。イクオリンプラスEDTA溶液を（NH4）2SO4で飽和させて、-20°の超低温槽で保存することにより、自然発生的な発光は、活性の付随的な減少と共に、ほとんど除かれる。しかし、我々の計算では、常温において、一様に維持されるならば、およそ300年間で調整された光子含有量を使い果たすだろう率で放射された光を、高感度の光測定装置で検出できる（G. CallejaとG. T.レノルズ、1968、個人的コミュニケーション）。
　280mμで2.56の吸収度と持つ、10-4MのEDTA中のイクオリン溶液（1ml）は、25℃の部屋で、真空デシケーター内でP205上で凍結乾燥した後、1mgのタンパク質（EDTAの存在で補正）を含むことが分かった。しかしながら、この1mgのタンパク質は、1mlのバッファ中で再融解されるとき、280mμでわずか2.25の吸収度を有することが分かり、これは、イクオリンの化学変化が起こったことを示している。このように、
10
-4
MのEDTA中のイクオリンが上述のように凍結乾燥されると、活動の50-60%の活性損失があることが分かり、また、活性の同程度のパーセンテージは再融解し再乾燥させた後に再び失われる。イクオリンが10
-3
Mと10
-2
MのEDTA中にあったとき、それぞれ、凍結乾燥による活性損失は20と5%であり、そして、10
-2
MのEDTAが少量の（NH
4
）
2
SO
4
を含んだときは、ほとんど活性損失は検出されなかった
　
（１ｂ）「Further purification of aequorin was accomplished by chromatographing alternately on DEAE-celluolse and Sephadex G-100 columns theree time on each.・・・略・・・The eluate from the Sephadex G-100 column could be added directly to the next DEAE-cellulose column after diluting with five columes of 0.005 M EDTA. The eluate from the DEAE-cellulose column was saturated with （NH4）2SO4 ,centrifuged  ,and the precipitate was dissolved in a small amount of  0.05 M EDTA before adding to the next Sephadex G-100 column.」
(日本語訳：イクオリンのさらなる精製は、DEAE-celluolse とSephadex G-100 カラムでそれぞれ３回ずつ交互にクロマトグラフィーを行うことによって達成された。・・・略・・・ Sephadex G-100カラムからの溶出液は、５容量分の0.005MのEDTAによって希釈した後、次のDEAE-celluloseカラムに直接加えられる。DEAE- celluloseカラムからの溶出液は（NH4）2SO4で飽和させ、遠心分離し、その後、沈殿物を次のSephadex G-100に加える前に、少量の0.05ＭのEDTAに溶解させた。）
　
第４　対比・判断
　刊行物１には、10-4MのEDTA中のイクオリンを凍結乾燥させると50-60%の活性損失があるが、イクオリンが10-3Mと10-2MのEDTA中にあったとき、それぞれ、凍結乾燥による活性損失は20、5%となり、また、10-2MのEDTAが少量の（NH4）2SO4を含んだときは、ほとんど活性損失は検出されなかったことが記載され（1a）、少量の（NH4）2SO4 を含んだ10-2MのEDTA中でイクオリンを凍結乾燥するとほとんど活性損失が検出されなかったことが記載されている。
　そうすると、刊行物１の上記記載事項（特に上記（1a））から、刊行物１には、
「少量の（NH4）2SO4 を含んだ10-2MのEDTA中でイクオリンを凍結乾燥することによって、ほとんど活性損失が検出されない凍結乾燥方法」の発明（以下、「刊行物１発明」という。）が記載されていると認められる。
　
　そこで、本願発明と刊行物１発明とを比較する。
　
（ア）刊行物１発明の「少量の（NH4）2SO4 を含んだ10-2MのEDTA」とは、（NH4）2SO4 は硫安のことであり、10-2MのEDTAは10-2M濃度のEDTA溶液であるので、少量の硫安を含んだEDTA溶液であり、刊行物１発明は、この中でイクオリンを凍結乾燥するものである。
　一方、本願発明の「１．０〜１．５Ｍの範囲の濃度で硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥させること」について、本願の明細書の記載を参照すると、実施例１として段落【００２２】に、イクオリンの精製として、硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡを用いてイクオリン画分を収集することが記載されており、また、段落【００２４】には、実施例１の操作を繰り返すことで高純度イクオリンを含む溶液を得て凍結乾燥させることが記載されていることから、硫酸アンモニウム、つまり硫安を含み、ＥＤＴＡを含む溶液中でイクオリンを凍結乾燥させるものである。
　なお、本願の明細書の段落【００２２】に記載された工程が、「硫安を」含ませる工程であることは、当審において通知した平成２４年１０月２日付け拒絶理由通知書において、「（２）実施例における硫安の添加について 
 　本願の請求項１には「硫安を添加」すること、また、請求項２〜５には「硫安を含む」ことが記載されている。 
 　この「硫安を添加」する、あるいは「硫安を含む」ようにすることについて、本願の明細書に記載された実施例（段落【００２０】〜【００２８】）においては、「硫安を添加」するのは、段落【００２２】に記載された精製工程によるものと解釈してよいか。すなわち、精製工程において用いられた硫安のうち精製工程後にも残っているものが、添加された硫安に相当するのか。」と指摘したことに対し、平成２４年１２月７日付け意見書において、審判請求人が「審判官のご指摘通り、精製工程後にも残っている硫安が、イクオリン溶液に含まれる硫安に相当します。」と述べたとおりである。
　そうすると、本願発明の「１．０〜１．５Ｍの範囲の濃度で硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥させる」ことも、硫安を含み、ＥＤＴＡを含む溶液中でイクオリンを凍結乾燥させるものであることから、刊行物１発明の「少量の（NH4）2SO4 を含んだ10-2MのEDTA中でイクオリンを凍結乾燥する」ことと、本願発明の「１．０〜１．５Ｍの範囲の濃度で硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥させる」こととは、「硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥させる」ことである点で共通する。
　
　したがって、両者の間には、以下の一致点及び相違点がある。
　
（一致点）「硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥させる方法」
　
（相違点１）硫安を、本願発明では「１．０〜１．５Ｍの範囲の濃度」で含むのに対し、刊行物１発明では「少量」と記載されているものの、どの程度、含ませるのか不明である点。
  　
（相違点２）凍結乾燥させる方法が、本願発明では「イクオリンの保存方法」であるのに対し、刊行物１発明では保存については特に明記していない点。
　そこで、上記相違点について以下、合わせて検討する。
  
（相違点１及び相違点２について）
　刊行物１発明の「ほとんど活性損失が検出されない」ことについて、刊行物１を参照すると、イクオリンをEDTA中で凍結乾燥する際に、EDTAの濃度を10-4M、10-3M、10-2Mとすると、活性損失は50-60%、20%、5%と除々に小さくなり、さらに、10-2MのEDTA中で少量の（NH4）2SO4を含んだ場合は活性損失がほとんど検出されないことが記載されており（1a）、10-2MのEDTA中で、（NH4）2SO4、つまり硫安を少量含んで凍結乾燥すると、活性損失は5%だったのが、ほとんど検出されなくなる旨が記載されている。
　そうすると、硫安を含むと活性損失が検出されなくなることに特に着目し、イクオリンをEDTA溶液中で凍結乾燥させて保存することを考えて、硫安の濃度を測定し、活性損失が生じないための適切な濃度に最適化することも、刊行物１の上記記載から当業者が容易になし得たことである。
　　
（本願発明の効果について）
　変性がほとんどない長期間保存可能なカルシウム結合型発光蛋白質が得られるとの本願発明の効果も、刊行物１に記載された事項から当業者が予測し得たものであり、格別顕著なものとはいえない。
  　
（まとめ）
　以上のとおりであるから、本願発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるので、その余の請求項に係る発明を検討するまでもなく、本件出願は、拒絶をすべきものである。
　
第５　特許法第３６条第４項及び第６項について
（１）当審において通知した特許法第３６条第４項及び第６項違反の理由は、
「（２）本願発明の効果 
 　本願の請求項１に係る発明の効果について、本願の明細書の段落【０００９】に「本発明の保存方法を用いることで、変性がほとんどない長期間保存可能なカルシウム結合型発光蛋白質が得られる。」旨、記載されている。そして、実施例における結果として【表１】が示されている。 
 　しかしながら、【表１】については、以下の点が不明であり、実際にどのような実験を行ったのか不明確であって、本願発明の効果が理解し難い。
ア　「イクオリンを吸水性高分子に浸透させた時点」などとの【表１】の項目やその結果は、それぞれ実施例として説明されたどの事項と対応するのか。
イ　【表１】中には、「連続発光」や「瞬間発光」と記載されているが、どのように測定されたどのような値なのか。 
ウ　【表１】に「未処理」と記載された下から２つの行のものについて、段落【００２８】には「吸水性高分子未処理」と記載されていることから、吸水性高分子を加えていないものと解釈できるが、そうすると、吸水性高分子を加えて評価したと解釈できる「イクオリンを吸水性高分子に浸透させた時点」、「膨潤複合体時点」「TE緩衝液に溶かした時の吸水性高分子の状態」「膨潤複合体０．１ｍｌ当たりＣａ２+添加発光」の項目に示された値は何を意味するのか。「未処理」とはどのようなものを示したものであるのか。」というものである。
（２）これに対し、審判請求人は平成２４年１２月７日付け意見書において、表１に記載の「未処理（1.2M (NH4)2SO4含む）」および「未処理」については、以下のとおりに説明している。
「・「未処理（1.2M (NH4)2SO4含む）」
　本項目は、実施例１の操作を繰り返すことで得た高純度イクオリン１４０μｇを含む５０ μｌ溶液を指します。すなわち、ブチルセファロース４ファーストフローゲルより得られたイクオリン溶液（2.8 mg/mL= 0.28%）です。
　・「未処理」
　本項目は、上記ブチルセファロース４ファーストフローゲルより得られたイクオリン溶液から硫安を脱塩処理することにより除去したイクオリン溶液を指します。
　硫安の脱塩処理には、常法（特開2004-35449の実施例2, 3に記載の高速限外濾過フィルター（分画分子量10,000）用いた方法）を用いました。」
　さらに、「連続発光」については、
「・「連続発光」
　イクオリンの近くに低濃度（１０-７Ｍ）のカルシウムイオンが存在すると、カルシウムイオンがイクオリンに結合するスピードが低いため、発光パターンは瞬間発光とはならず、非常に弱い連続発光を示します。これが「連続発光」と呼ばれております。イクオリン−吸収性高分子の場合は、吸収性高分子中に非常に低濃度カルシウムイオンが不純物として含まれるため、連続発光が生じます。
　連続発光を、常法に従い「アトー社製のルミノメーター　モデルＡＢ２２００」（実施例２に記載）を用いて測定しました。」
と説明している。
　
　以上から、審判請求人は、「未処理」と記載された【表１】の下から２つの行のものについては、いずれもイクオリンの「溶液」を指すこと、また、「連続発光」については、吸収性高分子中には非常に低濃度カルシウムイオンが不純物として含まれるため連続発光が生じ、これを常法に従い測定した旨、説明している。
　
（３）しかしながら、「未処理」と記載された【表１】の下から２つの行のものは「溶液」であって吸水性高分子処理をされないものであり、吸収性高分子中に含まれる非常に低濃度カルシウムイオンを不純物として含むものではないため、【表１】の吸収性高分子中に含まれる低濃度のカルシウムイオンによって生じる連続発光を測定したとする、「イクオリンを吸水性高分子に浸透させた時点」「凍結乾燥時点」「膨潤複合体時点」の項目の値は、どのようにカルシウムを含ませて測定した値なのか不明である。よって、これらの値を用いた表１のデータの比較によって、硫安添加の効果あるいは吸水性高分子処理の効果が確認できない。
　
（４）さらに、吸水性高分子処理を行った「KIゲル201K」の欄の値は、硫安を含んで凍結乾燥させたものの値と思われるが、「膨潤複合体時点」では、「未処理」の欄の値（「305」）よりも連続発光の強度が低く（「49」）、これらの値の比較からも、凍結乾燥時における硫安の添加の効果あるいは吸水性高分子処理の効果が確認できない。
　
（５）以上のとおり、本願明細書の発明の詳細な説明に記載された事項及び本願の出願時の技術常識からは、硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥させることによって、変性が少なく長期の保存が可能なカルシウム結合型発光蛋白質を得るとの課題を解決できると当業者が認識することができず、よって、本願の請求項１に記載されたイクオリンの保存方法の発明、および請求項２に記載されたイクオリン溶液の凍結乾燥物の発明、並びに、請求項２を引用する請求項３〜５に係る発明の特許請求の範囲の記載は、本願明細書の発明の詳細な説明の記載および出願時の技術常識に照らして当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものとはいえない。
　したがって、本願明細書の特許請求の範囲の請求項１〜５記載は、特許を受けようとする発明が発明の詳細な説明に記載したものではない。また、この出願の発明の詳細な説明は、当業者が請求項１〜５に係る発明を実施することができる程度に明確かつ十分に記載されたものでない。 
  
（まとめ）
　以上のとおり、本願の特許請求の範囲の請求項１〜５の記載は、特許法３６条第６項第１項に違反し、さらに、本願明細書の発明の詳細な説明の記載は特許法第３６条第４項に違反するので、本件出願は、拒絶をすべきものである。
　
第６　むすび
　よって、結論のとおり審決する。