(57)【要約】本発明は、染色体のセントロメアに発現する蛋白質ＣＥＮＰ−ＡのＮ末端の１／３のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原とする抗体、特にモノクローナル抗体、及びその製造方法を提供する。染色体のセントロメアに発現するＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の部分長のペプチド、好ましくはＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、２７〜４０番目のアミノ酸配列を含むペプチド、又は１２６〜１４０番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体、及びその製造方法に関する。さらに本発明は、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＭＮａｓｅ処理によりセントロメアクロマチンの完全性を保存した形で可溶化する方法を提供する。抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を担体に化学結合し、免疫沈降法によって、単離精製する抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体の利用法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の部分長のペプチドに対する抗体。
【請求項２】
ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のＮ末端部分の１／３のアミノ酸配列の一部を含んでいるペプチドに対する抗体である請求の範囲第１項に記載の抗体。
【請求項３】
ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の部分長のペプチドが、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、２７〜４０番目のアミノ酸配列を含むペプチド、又は１２６〜１４０番目のアミノ酸配列を含むペプチドである請求の範囲第１項又は第２項に記載の抗体。
【請求項４】
ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の部分長のペプチドが、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチドである請求の範囲第３項に記載の抗体。
【請求項５】
ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質が、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質である請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、モノクローナル抗体である請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
細胞融合法によりモノクローナル抗体を製造する方法において、抗原としてＣＥＮＰ−Ａ蛋白質を用いミエローマ細胞としてマウスの骨髄腫細胞であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を使用し、かつ培地としてＧＩＴ培地を使用することを特徴とするＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項８】
抗原としてＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のＮ末端部分を使用する請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
セントロメアクロマチンをＭＮａｓｅを用いて可溶化する方法。
【請求項１０】
ＭＮａｓｅの濃度が１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬであり、処理時間が１〜１００分間である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】
セントロメアクロマチンをＭＮａｓｅを用いて可溶化し、次いで得られた可溶化物を抗ＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降する方法。
【請求項１２】
抗ＣＥＮＰ抗体が、担体に固定化されている抗体である請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＣＥＮＰ抗体が、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体である請求の範囲第１１項又は第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
セントロメアクロマチンをＭＮａｓｅを用いて可溶化し、次いで得られた可溶化物を抗ＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降し、沈殿したタンパク質を検出・同定する方法。
【請求項１５】
検出・同定されるタンパク質が、分化に関連するタンパク質である請求の範囲第１１項又は第１４項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の抗体、その製造方法及びその利用法に関する。より詳細には、染色体のセントロメアに発現する蛋白質ＣＥＮＰ−ＡのＮ末端の１／３のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原とするモノクローナル抗体、その製造方法、及びその利用方法に関する。また、本発明はクロマチンタンパク質の可溶化方法、及びそれを用いたクロマチンタンパク質の検出、同定、定量方法に関する。本発明の抗体は、染色体異常の検出や同定に有用であり、またセントロメアの構造や機構の解明に有用である。
背景技術
セントロメアは、有糸分裂をする真核細胞のＭ期の紡錘体に結合して、極への移動に重要な役割を果たすものである。有糸分裂においては、セントロメアの両端に動原体と呼ばれるタンパク質複合体が形成され、この動原体に紡錘体を形成する微小管（動原体微小管）が結合する。脊椎動物の細胞における有糸分裂において、動原体で形成され紡錘体の微小管への付着部位であるキネトコアは、密な内部プレート、中間の透明な領域、そして密な外部プレートから成る３層の円盤状の構造体である。
今日までに知られている動原体タンパクには、細胞周期を通して動原体に存在するＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｈのような構成的タンパク、ならびにＣＥＮＰ−Ｅ、−Ｆ、ＩＮＣＥＮＰ、Ｍａｄ１、Ｍａｄ２、Ｂｕｂ１、Ｂｕｂ２およびＲｕｂＲ１のようなＭ期の開始後に現われる過渡的タンパクが含まれる。構成的タンパクは、「プレキネトコア」と呼ばれるＳ期で核の中に点として現われるが、これはそのうちの少なくとも１つがＭ−期で内部キネトコアプレートの中に位置していると報告されているからである。
ＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子は、ヒトのα−サテライトおよびマウスのマイナーサテライトＤＮＡ中に存在しＣＥＮＰ−Ｂボックスとして知られている１７−ｂｐＤＮＡモチーフと結合する８０−ｋＤａタンパクをコードし、ＣＥＮＰ−Ｂボックス領域の周辺に位置するヌクレオソームのポジショニング（塩基配列上の決まった位置に整列すること）をもたらす。この遺伝子のノックアウトマウスは、成長および形態的に如何なる明白な欠陥なしに生育するので、ＣＥＮＰ−Ｂ遺伝子は必須のものではないと考えられている。
ＣＥＮＰ−Ｃ遺伝子は染色体分離に必須であり、その遺伝子生産物（１４０−ｋＤａタンパク）は明らかな配列特異性のないＤＮＡ−結合タンパクである。ＣＥＮＰ−Ｃは電子顕微鏡により内部のキネトコアプレートで検出され、一方ＣＥＮＰ−Ｂは対を成す領域中に位置すると報告された。
ＣＥＮＰ−Ａ遺伝子はヒストンＨ３の変種をコードしており、ＣＥＮＰ−ＡのＣ末端の２／３はヒストンＨ３と高度に相同であるが、１／３のそれ以外のアミノ端末はＣＥＮＰ−Ａに固有のものである。Ｃ−末端領域に位置するヒストン類似配列から成る領域は、ＣＥＮＰ−Ａを動原体領域へ標的とするために必須のものである。マウスのＣＥＮＰ−Ａ遺伝子は、ジーンターゲッティング法により必須の遺伝子であることが示されている。ＣＥＮＰ−ＡホモログであるＣＳＥ４は、出芽酔母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離され、そして染色体の分離のために必須であることもまた示された。点変異による分析により、Ｃｓｅ４ｐの機能的な領域は、ヒストンＨ４との相互作用に必要なヒストンフォルドドメインならびにアミノ末端３３ペプチドにわたって分布していることが示された。ＣＥＮＰ−Ａのホモログは線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、および分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）中で同定されており、また染色体分離のためにも必須である。
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてセントロメア領域は、“ＣＥＮ配列”として知られている１２５ｂｐ  ＤＮＡ配列が遺伝的に定義され、Ｃｓｅ４ｐを含めて８以上の動原体と関連するタンパクがこのＤＮＡ領域に局在し、ヌクレアーゼ攻撃に抵抗性のある高次のクロマチン複合体を形成する。分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）においては、数十キロ塩基の逆方向反覆配列に囲まれた４−７ｋｂの固有の配列（ｃｃ領域）から成る更に長いＤＮＡ配列（４０−１２０ｋｂ）が、セントロメア領域を形成する。何らかの高次クロマチン構造がｃｃ領域内で形成されるであろう事が推測される。何故ならばこの領域内ではＭＮａｓｅ開裂によるヌクレオソームラダー（ｌａｄｄｅｒ）は活性セントロメアを形成したときにスミアー（ｓｍｅａｒ）となるからである。高等真核生物の動原体は、数百から数千キロベースの縦に反覆されたＤＮＡ配列を含んでいる。ただし、それらの配列と単位長さは種によって全く異なる（５２）。
ヒトにおいては、５００ｋｂから５Ｍｂまで変化するα−サテライト（アルフォイド）配列がセントロメア領域で見出される。α−サテライト配列は、それぞれの染色体は、１７１ｂｐα−サテライト反復配列がさらに数個のそれぞれ染色体固有の各型を含む高次配列からなり、さらにそれが繰り返され、数メガベースにわたる長大な配列をなし配列中及び高次反覆配合における染色体特異的な変化を示す１７１ｂｐのモノマーの反覆から成る。しかしながら安定なネオセントロメアが、α−サテライト等の反覆ＤＮＡ配列の無い真性クロマチン領域で見出されている。
ネオセントロメアのエピジェネティカルな確立はヒト、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、および分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）で報告されており、このことはＤＮＡ−タンパク複合体の形成、特にＣＥＮＰ−Ａヌクレオソームの形成が活性動原体の形成のために決定的に重要であることを示唆している。ＣＥＮＰ−Ａを含有するヌクレオソームは、セントロメアクロマチンを真正クロマチンまたはヘテロクロマチンから区別するものであろうし、また機能的なキネトコアの形成を促進する。本発明者らは、試験管内ヌクレオソーム再構築系においてＣＥＮＰ−ＡはヒストンＨ３を置き換え可能であることを示してきた。また、ＣＥＮＰ−Ａヌクレオソームの基本構造は、ヌクレオソームＤＮＡがその周囲をまいたコアヒストンオクタマー（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂ）から構成されるＨ３ヌクレオソームと同様であることを示してきた。したがって、本発明者らは、ＣＥＮＰ−Ａヌクレオソーム及びその他のセントロメアタンパクから成るセントロメアクロマチン複合体がプレキネトコア複合体を構成していることを提唱する。
これらのことをより解明してゆくために、ＨｅＬａ細胞からセントロメアクロマチン複合体を単離し、さらにＣＥＮＰ−ＡヌクレオソームはＣＥＮＰ−Ｂボックスを含むα−サテライト上に選択的に形成されること、及びＣＥＮＰ−Ｂおよび−ＣはヌクレオソームＤＮＡと結合してＡ／Ｂ／Ｃプレキネトコアクロマチン複合体を形成することを明らかにしてゆくために、クロマチン免疫沈澱法（ＣＨＩＰ）などの手法が求められている。
ところで、特定のタンパク質を同定したり、単離するためには抗体を使用する方法が極めて有用である。様々な哺乳動物を用いて抗体を作製する方法が広く応用されている。抗体を用いてタンパク質複合体を単離して、その構成因子を網羅的に解析しようとするタンパク質工学いわゆるプロテオミクスを実施する上で、抗体の特異性の高さや、品質の均一性への要求が極めて高くなってきており、特にモノクローナル抗体に対する要望が大きくなってきている。
モノクローナル抗体は、抗体を産生するハイブリドーマ細胞をいったんクローン化して樹立してしまえば、その細胞は不死化した細胞（腫瘍細胞）なので永久に増殖を続け抗体を産生し続ける。従って、均一な抗体を無制限に得ることが可能となる。
しかし、従来のモノクローナル抗体の製造方法においては、目的とする抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別、樹立が極めて煩雑であった。とりわけ、抗原として合成されたアミノ酸鎖の比較的短いペプチドを使用する場合には、エピトープ（抗体が認識する部位）をはっきりと限定できる反面、実際に抗体として使用できるかどうかを煩雑な方法でモノクローナル抗体を作製してみなければわからないことから、多数の比較的短いペプチドを用意して煩雑な作業を長時間に亘って行わなければならなかった。
発明の開示
本発明は、染色体のセントロメアに発現する蛋白質ＣＥＮＰ−ＡのＮ末端の１／３のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原とする抗体、特にモノクローナル抗体、及びその製造方法を提供する。
本発明は、染色体のセントロメアに発現するＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の部分長のペプチドに対する抗体に関する。
また、本発明は、細胞融合法によりモノクローナル抗体を製造する方法において、ミエローマ細胞としてマウスの骨髄腫細胞であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を使用し、かつ培地としてＧＩＴ培地を使用することを特徴とするＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のモノクローナル抗体の製造方法に関する。
本発明は、セントロメアのクロマチンの可溶化方法に関し、より詳細にはミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）で処理することによりセントロメアのクロマチンを可溶化する方法に関する。本発明の可溶化はクロマチンの全体性を保持したまま可溶化できることを特徴とするものである。
さらに、本発明は、可溶化されたセントロメアのクロマチンタンパク質類をＣＥＮＰ類の抗体、好ましくはＣＥＮＰ−Ａの抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて免疫沈降させてセントロメアのクロマチンに含有されているタンパク質を検出、同定又は定量する方法に関する。本発明によれば、クロマチンの中には細胞分裂に関連するタンパク質のみならず分化に関連するタンパク質などが含有されていることが明らかにされ、セントロメアのクロマチンに含有されているタンパク質を解析することにより、癌などの各種の疾患の診断が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、細胞融合法におけるモノクローナル抗体の製造方法において、ハイブリドーマ細胞の選別、樹立をできるだけ簡略化する方法を検討してきたところ、ミエローマ細胞として融合効率の高いマウスの骨髄腫細胞であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を使用し、細胞培養培地として牛胎児血清を少ししか必要としないＧＩＴ培地（日本製薬）を使用することにより、第一次選別に際して従来の半分以下の培地面積で選別できることを見出した。例えば、９６ウエルプレートとして、その約半分のハーフウエルプレートを使用することができ、顕微鏡でのクローンの出現数を確認するときに、ウエル全体を一視野で観察することができ、迅速なスクリーニングが可能となった。
本発明者らは、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質は抗原性を有する活性部位を特定することが困難な蛋白質であり、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の全長を用いて抗体を作製してもＣＥＮＰ−Ａ蛋白質に有効に反応する抗体を作製することは困難であった。そこで、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質に有効に反応する抗体を作製するために、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の各種の断片を用いて抗体を作製した。即ち、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列からなる断片（＃３−１９）、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の１２〜２５番目のアミノ酸配列からなる断片（＃１２−２５）、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の２７〜４０番目のアミノ酸配列からなる断片（＃２７−４０）、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３９〜５３番目のアミノ酸配列からなる断片（＃３９−５３）、及びヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の１２６〜１４０番目のアミノ酸配列からなる断片（＃１２６−１１０）を各々抗原として用いて、モノクローン抗体産生ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行った。
この結果、抗ＣＥＮＰ−Ａペプチド（＃３−１９）抗体、抗ＣＥＮＰ−Ａペプチド（＃２７−４０）抗体、及び抗ＣＥＮＰ−Ａペプチド（＃１２６−１４０）抗体が極めて有効な抗体であることがわかった。特に、抗ＣＥＮＰ−Ａペプチド（＃３−１９）抗体は、ウエスタンブロット法、間接蛍光抗体染色法、免疫沈降法において極めて優れた結果を与えることがわかった。
これらの多数のペプチド断片に対する抗体の作製方法として、本発明の前記した抗体作製方法が極めて有効であることもわかった。
同様にして、抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体及び抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体を作製した。即ち、ＣＥＮＰ−Ｂ蛋白質のＮ末端側の半分のアミノ酸配列を有するペプチドを大腸菌発現系を用いて発現させた組換えペプチドを抗原とし、またＣＥＮＰ−Ｃ蛋白質のＮ末端側の半分のアミノ酸配列を有するペプチドをバキュロウイルス系を用いて発現させた組換えペプチドを抗原として抗体を作製した。
次に本発明者らは、得られた本発明の抗体が有効に反応していることを確認し、その応用例を示すために次の実験を行った。
まず、本発明者らは、セントロメアクロマチンがＨｅＬａ細胞核から可溶化する条件を検討した。ＮａＣｌによる可溶化を検討した結果を図１Ａのレーン１〜３に示す。核を０．３Ｍ  ＮａＣｌ処理することによる結果を第１図Ａのレーン１に示す。この条件ではＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃどれも可溶性画分に溶出しないことが確認された。０．６Ｍ  ＮａＣｌ処理による上澄液の結果を第１図Ａのレーン２に、沈殿物の結果を第１図Ａのレーン３に示す。この結果、ＣＥＮＰ−Ｂ及びＣＥＮＰ−Ｃが可溶化したことは見られたが（第１図Ａのレーン２）、ＣＥＮＰ−Ａの可溶化は見られなかった。次に、核を０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でミクロコッカルヌクレアーゼ（（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）ＭＮａｓｅ）で消化した場合の上澄液の結果を第１図Ａのレーン４に、沈殿物の結果を第１図Ａのレーン６にそれぞれ示す。この結果、ＭＮａｓｅで処理した場合にはＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃがいずれも３０〜５０％が可溶化することがわかった。なお、ウェスタン解析において、それぞれのバンドがセントロメア蛋白であることは、サンプル中にＡＣＡ−ビーズを加えると各々のバンドが除去されることによって確定した（第１図Ａのレーン５）。
これらの結果から、ＣＥＮＰ−Ａを含むセントロメアクロマチンはバルククロマチンと同様にＭＮａｓｅ消化によって可溶性画分に溶出することができることがわかった。
次に、ＨｅＬａ細胞の核ペレットをミクロコッカルヌクレアーゼ（（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）ＭＮａｓｅ）で消化した後、放出されたセントロメアクロマチンの程度を見出すためにＣＥＮＰ−Ａの動的研究を行なった。単離されたＨｅＬａ細胞を、様々な程度（４０−３６００単位／ｍｌ・分）にまでＭＮａｓｅで消化した。この結果を第１図Ｂに図面に変わる写真で示す。第１図Ｂは、ＭＮａｓｅ消化後の各サンプルにおけるＤＮＡのサイズ分布を示すものである。３７℃でＨｅＬａ核をＭＮａｓｅによって消化し、可溶性画分から抽出したＤＮＡを１％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウム染色によってＤＮＡを検出した結果を示す。ＭＮａｓｅ消化の条件は次のとおりである。レーン１は、２０単位／ｍｌ、２分（４０単位／ｍｌ・分、以下これをサンプル＃１という。）、レーン２は、２０単位／ｍｌ、４分、（８０単位／ｍｌ・分、以下これをサンプル＃２という。）、レーン３は、４０単位／ｍｌ、５分、（２００単位／ｍｌ・分、以下これをサンプル＃３という。）、レーン４は、８０単位／ｍｌ、４５分（３６００単位／ｍｌ・分、以下これをサンプル＃４という。）。
また、ＭＮａｓｅ消化後の可溶性画分と不溶性画分のバルククロマチンタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画しクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって検出した結果を第１図Ｃの上側の図面に代わる写真で示す。この際、バルククロマチンの相対量をヒストンＨ４のバンド強度で測定した。セントロメアクロマチンの相対量はＣＥＮＰ−Ａの量で測定した。分画した蛋白を膜に転写後ＡＣＡ抗体を用いた免疫染色によってＣＥＮＰ−Ａを同定した結果を第１図Ｃの下側の図面に代わる写真で示す。第１図Ｃのレーン１〜４は上澄液からのものであり、レーン５〜８は沈殿物からのものであり、レーンＭはＣＥＮＰ−Ａの位置を示すものである。
これらの結果は、ＣＥＮＰ−Ａを含むセントロメアクロマチンはバルククロマチンと同じ様にＭＮａｓｅ消化によって可溶化することができることを示している。
次にＣＥＮＰ−Ａを含む動原体クロマチン複合体の構造と組成を調べるために、本発明の抗ＣＥＮＰ−Ａモノクローナル抗体とのクロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）を行なった。トリヌクレオソーム及びそれ以上のヌクレオソームを含むクロマチンを第１図Ｂのサンプル＃３の５−２０％グリセリン勾配沈降で回収し、そして抗ＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃと免疫沈降させた。スロット−ブロット分析により、α−サテライトＤＮＡは濃縮されていることがわかった（データは示していない）。結果を第２図に示す。第２図は、ＣＥＮＰ−Ｂボックス含有α−サテライトＤＮＡを抗ＣＥＮＰ−Ａ、抗ＣＥＮＰ−Ｂまたは抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体とともに免疫沈降したクロマチンに含まれるＤＮＡ配列の分布を示す。第２図の右側３カラムのＩＰは、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体（第２図ではαＣＡと示されている。）、抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体（第２図ではαＣＢと示されている。）、または、抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体（第２図ではαＣＣと示されている。）により免疫沈降したＤＮＡ断片をＴｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｏｎ社）にクローン化し、塩基配列決定したものの分布を示す。クローン化した断片の８０％以上が５００ｂｐより長かった。第２図の左側の「ＩＰ前（Ｂｅｆｏｒｅ  ＩＰ）」は免疫沈降する前の可溶化バルククロマチンから作製したクローンを示している。黒線はＣＥＮＰ−Ｂボックス含有α−サテライトＤＮＡを有するクローン数を示す。白抜きの線はそれ以外のクローン数を示しているが、このクローンはユニーク配列であり、ほかの反復配列を含まず、ＣＥＮＰ−Ｂボックスを含有しないα−サテライトＤＮＡすら含まない。
第２図に要約されるように、ＣＥＮＰ−Ｂボックスを含むα−サテライトＤＮＡを３つの抗体の各々を用いるＣＨＩＰによって濃縮できた。ＣＥＮＰ−ＢはＣＥＮＰ−Ｂボックスと優先的に結合することが既に示されている。したがって、抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体を用いるＣＨＩＰはα−サテライトＤＮＡとＣＥＮＰ−Ｂボックスと沈降する（２０クローン；全クローンの３１％）ことが期待され、他の４３のクローン（６９％）ＤＮＡはバックグラウンドであろうと考えられ、それはこの抗ＣＥＮＰ−Ｂモノクローナル抗体の質を反映するであろう。抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体を用いるＣＨＩＰは、α−サテライトＤＮＡのＣＥＮＰ−Ｂボックスを顕著に濃縮し（２６％）、他方抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いるＣＨＩＰは著しく高い割合（７６％）でＣＥＮＰ−Ｂボックス含有α−サテライトＤＮＡを沈降させた。すべてのＣＨＩＰ解析を通じて、ＣＥＮＰ−Ｂボックスのないα−サテライトＤＮＡ画分は回収されなかった。これらの結果は、ＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃを含有する動原体クロマチン複合体は、ＨｅＬａ細胞内でＣＥＮＰ−Ｂボックスを含むα−サテライトＤＮＡ（αＩ−タイプの配列）上に選択的に形成されることを示唆するものである。
次に、第１図Ｂに示すサンプル＃３および＃４の可溶化クロマチンの免疫沈降での共沈降を検討した。結果を第３図に図面に代わる写真で示す。第３図Ａは、作成した抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体、及び抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体が極めて特異性高くＭ期染色体のセントロメアを染めることを示している。これらの抗体を用いて第３図Ｂで、可溶化クロマチンを抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体（レーン１、２）あるいは抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体（レーン３、４）によって免疫沈降した後７．５％（第３図Ｂの上段のもの）あるいは１２．５％（第３図Ｂの下段のもの）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＡＣＡ血清を用いてウェスタンブロッティングで分析した。レーン１、３はサンプル＃３を用いた場合を示し、レーン２、４はサンプル＃４の場合を示す。サンプル＃３ではＣＥＮＰ−Ｂ、−Ｃ（レーン１）あるいはＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ（レーン３）が共沈殿していることを示す。しかし、強いＭＮａｓｅ消化をしたサンプル＃４では共沈殿するセントロメア蛋白は大きく減少している（レーン２、４）。これらの結果は０．３Ｍ  ＮａＣｌでＣＥＮＰ−ＢとＣＥＮＰ−ＣがＤＮＡを介してＣＥＮＰ−Ａヌクレオソームを相互作用していることを示している。
バルククロマチン画分でのＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃをウエスタンブロッティングで直接検出し定量することは高いバックグラウンドのために困難である。そのため、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体およびＡＣＡ血清を用いる２段階の免疫沈降によりＣＥＮＰ−Ａヌクレオソームと相互作用するＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃの量を測定した。その結果新たに作製された本発明の抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体は、ＣＥＮＰ−Ａクロマチンを定量的に沈降することができることが示された。第１図Ｂに記載した４つのサンプルの各々を抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体と免疫沈降させ、ついで上澄み液をＡＣＡ血清で沈澱させた。両方のセットの沈降（αＣＡおよびＡＣＡ）をＡＣＡとのウエスタンブロッティングで分析した。
結果を第４図に図面に代わる写真で示す。第４図は、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体により沈降したＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃクロマチン複合体中のＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃの含有量のＡＣＡ血清を用いたウェスタンブロッティングによる結果を示す。第１図Ｂに示す４つのＭＮａｓｅ消化サンプルを抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いて免疫沈降した（レーン１−４：αＣＡのサンプル１２μｌ）。次に、上澄み液をＡＣＡ抗体によって免疫沈降させて（レーン５−８：ＡＣＡのサンプル１２μｌ）、ＡＣＡ血清を用いて、残渣のＣＥＮＰｓを検出した。沈殿したタンパクを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットしてＡＣＡ血清を用いて免疫染色した。αＣＡサンプル中のＣＥＮＰ−Ａ（レーン２−４）が過剰であるため、１．５μｌサンプルも免疫染色し、下に示した。両方のサンプルにみられるＣＥＮＰ−ＡとＣＥＮＰ−Ｂとの間の広いスメア状のバンドは、抗体セファロースビーズから遊離したＩｇＧである。レーンＭはＣＥＮＰ−Ａ（６１ｆｍｏｌ／μｌ）、ＣＥＮＰ−Ｂ（２３ｆｍｏｌ／μｌ）およびＣＥＮＰ−Ｃ（２５ｆｍｏｌ／μｌ）を含有するＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃマーカー混合物４μｌであり、モル比はＡ／Ｂ／Ｃ＝２．６５：１：１．０９である。
第４図（レーン１−４）に示されるように、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−ＣはＣＥＮＰ−Ａと共沈降した。第４図（レーン５−８）は、ＣＥＮＰ−Ａクロマチンが上澄み液の溶液から殆ど除去されていること、ＣＥＮＰ−Ｃもまた初期の消化で殆ど消失していること（第４図、レーン５−６）、しかし可溶化ＣＥＮＰ−Ｂの４０−５０％はＣＥＮＰ−Ａクロマチンの除去後に上澄み液の中に明らかに残っていること（第４図、レーン５−６）を示している。第４図（レーン３）に示す沈澱をさらにＭＮａｓｅで消化するか又は０．６Ｍ  ＮａＣｌで処理すると、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃは上澄み液の中へ放出された（データは示してない）。これらの結果から、可溶化ＣＥＮＰ−Ｃの殆どと可溶化ＣＥＮＰ−Ｂの約半分が、ＤＮＡを介してＣＥＮＰ−Ａヌクレオソームと複合体を形成したものと結論した。
第４図に示すように、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃの量は増大し（レーン１−３）、最大値に達し（レーン３）、次いでＤＮＡ切断が進行するにつれて減少した（レーン４）。その一方でＣＥＮＰ−Ａの量は増加し続けた。これらの結果は、ＨｅＬａ細胞のＭＮａｓｅ消化は２つの現象をもたらすことを示した。すなわちそれは先ずＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ複合体を可溶性画分に放出し、その後に複合体からＣＥＮＰ−Ｂ及び／又はＣＥＮＰ−Ｃを除去する。したがって、弱いＭＮａｓｅ処理で放出された複合体の中のＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃのモル比（第１図Ｂ、＃１および＃２）は、プレ動原体ＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ複合体のモル比を表わすものであろう。プレ動原体クロマチン複合体の化学量論を測定するために、バキュロウイルス系で発現させた組換えタンパクを用いて濃度のわかっているＡ／Ｂ／Ｃ混合物を作製した。これらの組換えタンパクのＡＣＡ血清に対する反応性は、ＨｅＬａ細胞から精製したタンパクのそれと同じであることが確認された（データは示さず）。第４図のレーンＭにおける標準混合物のＣＥＮＰ−Ｃ／Ｂモル比は１．０９であったが、ＣＥＮＰ−Ｃの膜への移動の効率が低いのでＣＥＮＰ−Ｃ群の強度はＣＥＮＰ−Ｂのそれよりも僅かに弱かった。これを勘案して第４図のレーン１−４におけるＣＥＮＰ−Ｃ／Ｂのモル比を計算した結果を第５図に示す。第５図は、沈殿したＡ／Ｂ／Ｃ複合物中のＣＥＮＰ−Ｃ／Ｂのモル比の計算値を示す。第４図のレーン１−４のＣＥＮＰ−ＣおよびＣＥＮＰ−Ｂの強度をＮＩＨイメージ解析ソフトによって測定し、第４図のレーンＭ中のマーカー混合物（Ｃ／Ｂモル比＝１．０９）の強度値を用いて、ＣＥＮＰ−Ｃ／Ｂの強度比をモル値に換算した。サンプル＃１および＃４のＣ／Ｂのモル比はマーカー混合物３μｌを用いて補正し、補正値を示す（黒い三角印）。
その結果、それらは一定で約１であることを示した。一方、ＣＥＮＰ−Ａ／Ｂの強度比は実際的にそのモル比を表わした。これらのデータをもとにして、ＣＥＮＰ−Ａ／Ｂモル比のキネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を第６図に示した。第６図は、各サンプル中のＣＥＮＰ−Ａ／Ｂのモル比とＣＥＮＰ−ＡおよびＣＥＮＰ−Ｂの量を示す。サンプル＃１（第４図のレーン１）およびサンプル＃２−４のＡ／Ｂ強度比（ウェスタンブロッティングに各サンプル３μｌを用いた。）を測定し、Ａ／Ｂモル比としてプロットした（−●−）。Ａ／Ｂモル比はサンプル＃１で４．２６であり、サンプル＃２で４．１０であった。マーカープロテインとバンド強度を比較してＣＥＮＰ−ＡおよびＣＥＮＰ−Ｂの量を計算した。ＣＥＮＰ−Ａは▲印で、ＣＥＮＰ−Ｂは■印で、目盛は右軸に示す。ＭＮａｓｅ消化のそれぞれの強度（単位／ｍｌ・分）に対して、ＣＥＮＰ−Ａの１／４をプロットした。
この結果、初期消化（サンプル＃１および＃２）でのＣＥＮＰ−Ｃ／Ｂ比およびＣＥＮＰ−Ａ／Ｂのモル比は殆ど一定で、各々１．１  ０．１および４．２  ０．４であった。１０１０核当量での各サンプルでのＣＥＮＰ−ＡおよびＣＥＮＰ−Ｂの量を第６図に記した。これらの結果から、プレ動原体クロマチン複合体のＣＥＮＰ−Ａ：Ｂ：Ｃの平均モル比は概ね４：１：１であると結論できた。
ＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／ＣクロマチンはＭＮａｓｅ消化によって３〜４ｍｅｒヌクレオソームまで切り縮めることができる。
次に、ＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃクロマチンが複合体を保ったままで何処まで短く切り縮めることが出来るかを検討するため、６０Ｕ／ｍｌ、３７℃１５分ＭＮａｓｅ消化して可溶化したバルククロマチンを５−２０％グリセロル濃度勾配遠心によって分子量に従って分画した。各々の分画を抗ＣＥＮＰ−Ａまたは抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＡＣＡ血清を用いてＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃを検出した。結果を第７図に図面に代わる写真で示す。第７図Ａは、バルククロマチンの分布をクロマチンに含まれるＤＮＡラダーによって示す。第７図Ｂは各々の分画の抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体によるＣＨＩＰを、第７図Ｃは各々の分画の抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体によるＣＨＩＰを示している。抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体によるＣＨＩＰではＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃの強度分布が対応している（第７図Ｃ）。このことは抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体によるＣＨＩＰによって主にＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ複合体が免疫沈降していることを強く示唆している。第７図Ｂ及びＣの結果によるとＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ複合体のピークはフラクション７番に位置している。このフラクションは第７図ＡのＤＮＡラダーから５−６ｍｅｒヌクレオソームの沈降位置に相当する。モノヌクレオソームの分子量は約２４０ｋＤに相当する。ＣＥＮＰ−Ｂ＋ＣＥＮＰ−Ｃはおよそ２２０ｋＤでほぼモノヌクレオソームの分子量に相当する。従ってモノヌクレオソーム＋ＣＥＮＰ−Ｂ＋ＣＥＮＰ−Ｃは少なくとも４６０ｋＤ以上となる。従ってフラクション＃７はＣＥＮＰ−Ｂ、ＣＥＮＰ−Ｃの分子量を考慮すると３〜４ｍｅｒヌクレオソームのＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ複合体に相当することになる。これらの結果からＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／ＣクロマチンはＭＮａｓｅ消化によって３〜４ｍｅｒヌクレオソームまで切り縮めることが出来ると結論することが出来る。
このように、本発明のＣＥＮＰ−Ａ抗体は、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質に極めて特異的に結合し、動原体の解析などに極めて有効であることがわかった。また、本発明のＣＥＮＰ−Ａ抗体は、染色体異常についてのスクリーニングや診断に有効である。セントロメア領域を決定する第一の要因がＣＥＮＰ−Ａ蛋白質を含むヌクレオソーム（ＣＥＮＰ−Ａヌクレオソーム）の形成であることから、本発明のＣＥＮＰ−Ａ抗体はセントロメア領域を示すマーカーとして、セントロメアが形成される領域を検出、同定するための極めて有効な抗体である。さらに、具体的には、例えば、正常なセントロメア領域以外にセントロメアが形成される病気があり、このような病気に対して本発明の抗体はセントロメアの異変を確実に、かつ高感度で検出できるものである。
次に、本発明者らは、セントロメアクロマチンに含まれるＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ以外の既知セントロメア蛋白の同定を行った。本発明の方法により、ＨｅＬａ細胞単離核を０．３Ｍ  ＮａＣｌ存在下で比較的弱くミクロコッカスヌクレアーゼ処理することによってＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃクロマチン複合体を全体性を保った形で可溶性画分に溶出でき、さらに抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズを用いて単離精製出来ることを示した。この結果は、単離したＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃクロマチンにさらに他のセントロメア蛋白が構成因子として含まれている可能性を強く示唆している。
そこで、最近明らかにされた、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉ／ｈｕｍａｎ  Ｍｉｓ−６の遺伝子を調達した。ＣＥＮＰ−Ｈ遺伝子は戸所博士（理研）からの供与のものである。ＣＥＮＰ−１／Ｈ．Ｍｉｓ−６はＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅の後、クローニングによって調達した。バキュロウイルス系によってそれぞれの蛋白質を発現し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質を分離し、バンドを切り出すことによって目的の蛋白質を精製した。抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体はウサギに、抗ＣＥＮＰ−Ｉ抗体はラットに免役して抗体を作成した（オリエンタル酵母、受託）。抗ヒトＭｉｓ−１２抗体は柳田充弘博士より供与を受けた。
ＨｅＬａ細胞の核を単離し（５×１０９）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ存在下、６Ｕ／ｍｌＭＮａｓｅ、３７℃３０分の処理によってＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃクロマチン複合体を可溶化し、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズによって単離精製した。このときのＤＮＡの長さは０．３−５ｋｂｐであった。結果を第８図に図面に代わる写真で示す。第８図のレーンＭはマーカーを示す。
ついで、単離精製したセントロメアクロマチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質を分離し、それぞれの抗体を用いてウェスタンブロッティングによって目的の蛋白質の同定を試みた。結果を第９図に図面に代わる写真で示す。第９図のレーンＭはマーカーを示し、レーン１〜６は各レーンの上に記載されている物の＋印で示されている物を用いたことを示す。使用した物は上から「組換えＣＥＮＰ−Ｈ」、「組換えＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｓ６」、「セントロメアクロマチン」、「ＣＥＮＰ−Ｈ抗体」、「ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｓ６抗体」、「Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｓ１２抗体」、「ＡＣＡ」である。第９図に示されるように、単離したセントロメアクロマチンはＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃを含み（レーン６）さらに、ＣＥＮＰ−Ｈ（レーン３）、ＣＥＮＰ−Ｉ／ｈｕｍａｎ  Ｍｉｓ−６（レーン４）、ｈｕｍａｎ  Ｍｉｓ−１２（レーン５）を同時に含むことが明らかとなった。
ここで、抗ＣＥＮＰ−Ａモノクローナル抗体をクロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）に用いることの意義について説明する。
以上の実験結果が示すように本発明の抗ＣＥＮＰ−Ａモノクローナル抗体はＣｈＩＰ法によってセントロメアクロマチンをその全体性をよく保存した形で単離精製することが可能であることが明らかとなった。従来のＣｈＩＰ法はホルムアルデヒドを用いて複合体をクロスリンクによって固定した後に超音波処理あるいはＭＮａｓｅ処理によってＤＮＡを切断し可溶化する方法がとられていたが、この方法では蛋白を解析することが困難であった。そこで本発明ではホルムアルデヒド処理は行わず、ＭＮａｓｅ処理によって極めてマイルドな条件で可溶化できることを見出した。本発明において重要なポイントは２点である。第１点は特異性の高い抗ＣＥＮＰ−Ａモノクローナル抗体であり、第２点は全体性を保った形でセントロメアクロマチンを可溶化する方法である。本発明は、抗ＣＥＮＰ−Ａモノクローナル抗体、及びその利用法として全体性を保ったセントロメアクロマチンの単離法を提供するものである。
本発明の可溶化方法は、ＭＮａｓｅ処理によって極めてマイルドな条件で可溶化できるものであり、使用されるＭＮａｓｅの濃度は１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬであり、処理時間は可溶化するセントロメアクロマチンの状態や使用するＭＮａｓｅの濃度や、目的とする可溶化の程度によっても異なるが、一般的には１分〜１００分、好ましくは１分〜５０分程度である。処理温度はＭＮａｓｅの活性が維持できる温度であれば特に制限はないが、体温付近が好ましい。
この処理は適当な緩衝液中で行うことができ、例えば後述する実施例に記載のようにＷＢ緩衝液を使用することができる。緩衝液には必要に応じてＮａＣｌやＣａＣｌ２などを添加することができる。
なお、本願の優先権の基礎となる特許出願の後に公表された本発明者らによる論文（Ｓａｔｏｓｈｉ  Ａｎｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．，２２（７），２２２９−２２４１（２００２））には、ＭＮａｓｅ処理によるセントロメアクロマチンの動態を詳細に解析し全体性を保ったセントロメアクロマチンの単離法が記載されている。
本発明の方法により可溶化して単離したセントロメアクロマチンを分析した例を第１０図及び第１１図に図面に代わる写真で示す。第１０図は、可溶化したセントロメアクロマチンをＣＥＮＰ−Ａ抗体で免疫沈降させ、８Ｍ尿素で（レーン２〜４）含むあるいは、次にＳＤＳ存在下で加熱（ＳＤＳ−ボイル）して溶出したサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、銀染色したものである。第１０図の右側の数字はＳＤＳ−ボイルサンプルについて銀染色法により検出されたタンパク質のバンドを示しており、これらをプロテオーム解析した。第１０図の右側の数字で示されるタンパク質のバンドを解析したプロテオーム解析の結果は以下のとおりである。
１は、未知タンパク質であり、
２は、未知タンパク質であり、
３は、検索により該当タンパク質を見出せなかった（ｎｏ  ｈｉｔ）を示し、
４は、ＣＥＮＰ−Ｃを示し、
５は、分裂期キネシン様１（ｍｉｔｏｔｉｃ  Ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ  １）を示し、
６は、分裂期キネシン様１（ｍｉｔｏｔｉｃ  Ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ  １）を示し、
７は、分裂期キネシン様１（ｍｉｔｏｔｉｃ  Ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ−１）を示し、
８は、マウスＺｆｐ９１と相同性を有する亜鉛フィンガータンパク質（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  Ｚｆｐ９１）を示し、
９は、ｒａｃＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１（ｒａｃ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）を示し、
１０は、ｒａｃＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１（ｒａｃ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）を示し、
１１は、ｒａｃＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１（ｒａｃ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）を示し、
１２は、検索により該当タンパク質を見出せなかった（ｎｏ  ｈｉｔ）を示し、
１３は、レクタクロム１（ｒｅｃｔａｃｈｒｏｍｅ  １（Ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ３））を示し、
１４は、ポリコーム複合タンパク質Ｂｍｉ−１（ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｍｉ−１）、ポリホメオティックタンパク質２（ｐｏｌｙｈｏｍｅｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＰＨＰ−２））を示し、
１５は、ヒトリングフィンガータンパク質２（ｈｕｍａｎ  Ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ｍｏｕｓｅ  Ｒｉｎｇ  １Ｂ））、ポリｃｏｍｂ複合タンパク質Ｂｍｉ−１（ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｍｉ−１）を示し、
１６は、ヒトリングフィンガータンパク質２（ｈｕｍａｎ  Ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ｍｏｕｓｅ  Ｒｉｎｇ  １Ｂ））、マクロ−ヒストンＨ２Ａ１−１（ｍａｃｒｏ−ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２Ａ１．１）を示し、
１７は、検索により該当タンパク質を見出せなかった（ｎｏ  ｈｉｔ）を示し、
１８は、フィブリラリン（ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ；３４ｋＤ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を示し、
１９は、ラミンＡ前駆体（ｌａｍｉｎ  Ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を示し、
２０は、Ｂ細胞抗原受容体（Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を示し、
２１は、ヒストンＨ４（ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ４）を示す。
第１１図は、本発明の方法により可溶化したバルククロマチンよりＣＥＮＰ−Ａ抗体で免疫沈降させ、単離したセントロメアクロマチン複合体を８Ｍ尿素で溶出（第１０図レーン３と同じサンプル）した蛋白を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した結果を示す図面に代わる写真である。第１１図の右側の数字はそれぞれのバンドをプロテオーム解析により検出されたタンパク質を示している。第１１図の右側の数字で示されるタンパク質のバンドを解析した結果は以下のとおりである。
１は、未知タンパク質であり、
２は、未知タンパク質であり、
３は、未知タンパク質であり、
４は、未知タンパク質であり、
５は、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連タンパク質（ＳＷＩ／ＳＮＦ  ｒｅｌａｔｅｄ）を示し、
６は、ＣＥＮＰ−Ｃを示し、
７は、ＤＮＡ欠損箇所結合タンパク質（ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を示し、
８は、未知タンパク質であり、
９は、検索により該当タンパク質を見出せなかった（ｎｏ  ｈｉｔ）を示し、
１０は、検索により該当タンパク質を見出せなかった（ｎｏ  ｈｉｔ）を示し、
１１は、キネシン様タンパク質５（ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ５）を示し、
１２は、未知タンパク質であり、を示し、
１３は、ＣＥＮＰ−Ｂを示し、
１４は、ＣＥＮＰ−Ｉ／ヒトＭｉｓ−６（ＣＥＮＰ−Ｉ／ｈＭｉｓ−６）、熱ショック７０ｋＤタンパク質５（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５）を示し、Ｃｕｌｌｉｎ  ４Ａを示し、
１５は、ＲａｃＧＡＰ−１を示し、
１６は、未知タンパク質であり、
１７は、ＨＤＡＣ−１を示し、
１８は、未知タンパク質であり、
１９は、未知タンパク質であり、
１９−１は、未知タンパク質であり、
１９−２は、未知タンパク質、又は、Ｒｆｐ−１ｂ、ＢＭＩ−１を示し、
１９−３は、Ｒｆｐ−２、ＢＭＩ−１、Ｚｆｐ−９１、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）を示し、
１９−４はヒストンマクロＨ２Ａ２．１（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍａｃｒｏ  Ｈ２Ａ２．１）を示し、
２０は、レクタクローム（ｒｅｃｔａｃｈｒｏｍｅ（Ｈｐｃ−３））、Ｒｆｐ−１を示し、
２１は、ＲｕｖＢ様タンパク質２（ＲｕｖＢ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ＤＥＡＤボックスタンパク質（ＤＥＡＤ−ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヒトＡｒｐＮｂｅｔａ／ＢＡＦ５３（ｈＡｒｐＮｂｅｔａ／ＢＡＦ  ５３）を示し、
２２は、未知タンパク質であり、
２３は、未知タンパク質であり、
２４は、ＣＥＮＰ−Ｈ（２０６）を示し、
２５は、ＣＥＮＰ−Ｈ（１０９）を示し、
２６は、ＣＥＮＰ−Ｈ（３３２）を示し、
２７は、ＳｏＸＬＺ／Ｓｏｘ６ロイシンジッパー結合タンパク質（ＳｏｘＬＺ／Ｓｏｘ６  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、クロモボックス相同タンパク質８（Ｃｈｒｏｍｏｂｏｘ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ８）を示す。
第１０図及び第１１図においてウェスタン解析で同定した、ＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｈ、−Ｉ／ｈＭｉｓ−６については、アミノ酸配列として同定することが出来た。さらに未知タンパク質などについては、単離したセントロメアクロマチンを用いてプロテオーム解析を続行している。さらに現在６０以上の蛋白質を同定している（１例として第１０図参照）。
さらに、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズで免疫沈降した蛋白質群がＩｇＧ抗体に非特異的に吸着した蛋白を含むか否かをチェックした。具体的には、本発明の方法で可溶化したクロマチンにマウスＩｇＧ（購入した）ビーズを加え４℃で一昼夜混ぜ合わせ、次にその上澄に抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズで免疫沈降した。それぞれのサンプルから蛋白質を溶出し前述と同様の方法でプロテオーム解析して遺伝子を同定した。その結果を第１２図に図面に変わる写真で示す。第１２図の左側のレーンはマウスＩｇＧのものであり、１〜１３の番号は検出された蛋白質のバンドを示す。これらの検出された蛋白質のプロテオーム解析の結果、バンド１はＡＴＰ−依存性］ＲＮＡヘリカーゼ（１５８６、この値は、決定したペプチドとデータベースとのホモロジーの程度を示す。以下同じ）であり、バンド２は転写制御蛋白質８０（８１６）、２本鎖ＲＮＡ−特異的アデノシンデアミラーゼ（６９９）であり、バンド３はＤＥＡＤ／Ｈボックスポリプチド３（ＤＥＡＤ／Ｈ  ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｕｔｉｄｅ  ３）（１０２２）であり、バンド４は成長制御ヌクレアーゼ６８蛋白質（Ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ６８  ｐｒｏｔｅｉｎ）（９６５）であり、バンド６はＢＡＦ５３（９１）、アクチン様蛋白質６（２２２）であり、バンド７はインターロイキンエンハンサー結合因子２（３７１）であり、バンド８はヒストンマクロＨ２ＡＩ．Ｉ（３３６）、アクチン（１９３）であり、バンド９〜１３はヘテロ核リボヌクレオプロテイン類であった。第１２図の右側のレーンはα−ＣＥＮＰ−Ａを用いた場合である。その右側のレーンＭはマーカーである。この結果、抗ＣＥＮＰ−Ａビーズから回収された蛋白質のスペクトルは第１０図、第１１図で得られた結果とほぼ同一であった。それに対してマウスＩｇＧビーズに結合した蛋白スペクトルは全く異なるものであった（第１２図参照）。両者で重なる蛋白質はヒストンＨ１、コアヒストン（Ｈ３，Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ４）、アクチン及びヒストンマクロＨ２Ａ１．１のみであった。この結果は抗ＣＥＮＰ−Ａビーズによって回収した蛋白質がセントロメアクロマチン特異的な物である事を示している。
次に、プロテオーム解析で検出したポリコーム複合体の構成因子であるＲＮＦ２と、癌関連遺伝子としても知られているＢＭＩ１について抗体を調達し、まず単離したＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ複合体にこれら蛋白が含まれることをウェスタンブロット法によって確認した。結果を第１３図に図面に変わる写真で示す。第１３図の１〜７の各レーンセットの左がαＣＡビーズサンプル、右がＩｇＧビーズサンプルである。各レーンセットの１次抗体は、レーンセット１がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体、レーンセット２がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体とＡＣＡ抗体、レーンセット３がマウス抗マウスＲｉｎｇ１Ｂ抗体（モノクローン抗体）、レーンセット４がウサギ抗ヒトＲＮＦ２抗体、レーンセット５がマウス抗ヒトＢＭＩ−１抗体、レーンセット６がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ６抗体、レーンセット７がウサギ抗Ｈ．Ｍｉｓ１２抗体である。２次抗体はそれぞれ西洋ワサビパーオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合の、抗ヒトＩｇＧ抗体（レーン２）、抗マウスＩｇＧ抗体（レーン３、５）、抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。発色はコニカイムノステインを用いたものである。レーンセット１でＣＥＮＰ−Ｈが、レーンセット２でＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ａ，−Ｂ，−Ｃが検出される。０．６Ｍ  ＮａＣｌでは本来ＣＥＮＰ−Ａは溶出しないが、大量のＣＥＮＰ−Ａが存在するためその一部がもれて来ている。実際２Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．５で大量のＣＥＮＰ−Ａが溶出している。レーンセット３、４で同じ移動度のバンドが検出されている。ヒトＲＮＦ２はマウスＲｉｎｇ１Ｂのホモログで９９％のホモロジーがあるため両方で同定されている。レーンセット３、４で検出されている蛋白はＲＮＦ−２と結論される。レーンセット５でＢＭＩ−１が３本のバンドとして検出されている。レーン６セットでＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ６が検出されている。レーンセット７で極めて薄いがＩｇＧのバンドのすぐ下に検出されている。レーンセット３、５でそれぞれＲＮＦ２，ＢＭＩ−１の下方に出ているバンドはビーズからもれ出したマウスＩｇＧ抗体である。レーンセット３、５では抗マウスＩｇＧを用いているために染色されている。他のレーンセットは動物種が異なる抗ＩｇＧ抗体であるために極めて薄いバンドとして検出されている。第９図では８Ｍ尿素によって溶出した蛋白に対するウェスタン解析であるが、ＣＥＮＰ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−Ｈ，−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ６，Ｈ．Ｍｉｓ１２は再現的に同定されている。ここではさらにＲＮＦ２，ＢＭＩ−１が同定されたことになる。
さらに同じ抗体を用いてＨｅＬａ細胞を免疫染色した。この結果を第１４図及び第１５図に図面に変わる写真で示す。第１４図Ａ（左上）は抗ＣＥＮＰ−Ｃで染色したものを示し、第１４図Ｂ（右上）は抗ＢＭＩ１で染色したものを示し、第１４図Ｃ（左下）はＤＡＰＩにより核酸の染色を示し、第１４図Ｄ（右下）はこれらを重ねあわせたものである。第１５図Ａ（左上）は抗ＣＥＮＰ−１で染色したものを示し、第１５図Ｂ（右上）は抗ＢＭＩ１で染色したものを示し、第１５図Ｃ（左下）はＤＡＰＩを示し、第１５図Ｄ（右下）はこれらを重ねあわせたものである。この結果、ＲＮＦ２は核内に多数のドットが出たが、セントロメアと重なるドットが有るか否かは判別できなかった（データは示していない）。それに対してＢＭＩ１は同様に核内にドットとして観察されしかもそれらのドットはＣＥＮＰ−Ｃ、ＣＥＮＰ−Ｈ或いはＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ６の示すドットと完全に重なった。従ってＢＭＩ１蛋白質がセントロメア構成蛋白質である事が初めて証明されたことになる。ポリコーム複合体は染色体をヘテロクロマチン化して特定の遺伝子の転写を押さえる機能を持ち、細胞の分化、個体の形態形成に深く関与していることが知られている。従って、本発明によってセントロメア構造体が何らかの形で細胞分化、個体の形態形成に深く関与する事を示唆する結果が得られたことになる。
次に、第１１図１４番バンドに対応するキュリン４（Ｃｕｌｌｉｎ４）に対する抗体を調達し、ＨｅＬａ細胞を免疫染色した。この結果を第１６図及び第１７図に図面に変わる写真で示す。第１６図Ａ（左上）は抗ＣＥＮＰ−Ａで染色したものを示し、第１６図Ｂ（右上）は抗キュリン４で染色したものを示し、第１６図Ｃ（左下）はＤＡＰＩによる染色体の染色を示し、第１６図Ｄ（右下）はこれらを重ねあわせたものである。第１７図は、第１６図と同様の方法によりＭ期（各図の左側）とＳ期（各図の右側）の細胞を、各々第１６図と同様に染色したものである。
この結果、核内にドットとして観察されこれらのドットはＣＥＮＰ−Ａの示すドットと完全に一致した。キュリン（Ｃｕｌｌｉｎ）はユビキチンリガーゼとして作用することが知られておりターゲットの蛋白質をユビキチン化しプロテオソーム経路を通して速やかにターゲット蛋白を消失させる機能を有する。本発明のこの発見で興味深い点はＨｅＬａ細胞で検出されるキュリン４（Ｃｕｌｌｉｎ４）はＳ期に比較的ハッキリと同定されＭ期から細胞分裂期には消失する点である（第１６図、第１７図）。Ｍ期から染色体分離期に入る際にＡＰＣ複合体（Ａｎａｐｈａｓｅ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）の存在が知られており、ある種の蛋白質がユビキチン経路を通して分解する事が染色体分裂開始の引き金となる事が知られている。今回の発見はキュリン４（Ｃｕｌｌｉｎ４）がこうした細胞周期制御に重要な役割を果たしている事を予想させる極めて興味深い知見である。キュリン４（Ｃｕｌｌｉｎ４）がセントロメアに局在するという知見は本発明により初めて明らかにされたものである。キュリン４Ａ（Ｃｕｌｌｉｎ４Ａ）に関して興味深い知見は肺ガン細胞ではキュリン４Ａ（Ｃｕｌｌｉｎ４Ａ）遺伝子の増加あるいは転写量の増加が観察される事である。キュリン４Ａ（Ｃｕｌｌｉｎ４Ａ）はＤＤＢ１と結合することが知られているが、キュリン４Ａ（Ｃｕｌｌｉｎ４Ａ）のＤＤＢ１への結合量が増加することが何らかの形で発がんに繋がる可能性を示している。第１１図の７番バンドがＤＤＢ１に相当し、ＤＤＢ１もセントロメア構成蛋白と考えられ、本発明による方法が癌の診断や発ガン機構の解明に極めて重要であることが示された。
本発明者らは、ＨｅＬａ細胞単離核を出発材料としているのでＭ−期細胞ではなく、間期におけるセントロメアクロマチンを単離している。従って単離したセントロメアクロマチンに含まれる蛋白は間期核におけるセントロメアの機能を示唆するものである。多くの未知蛋白のほかに既知蛋白をも含んでいた。その中には、ポリコーム遺伝子関連蛋白が含まれていた（ＢＭＩ−１、ＲＮＦ２、ＭＰＣ３など）。ポリコーム遺伝子群は遺伝子発現を負に制御する分化制御に広く関連するものであり、この遺伝子群が間期の核セントロメアに存在するということは、セントロメア領域が細胞の将来の姿を決める分化に対しても重要な役割を果たす可能性を示すものである。この点は、セントロメアが染色体の均等分配のみならず、細胞の姿を決める際にシグナルを受け答えし、細胞全体を監視する管制塔あるいは情報センターの役割を果たすことが考えられる。これはセントロメアの役割として全く新しい視点を与えるものであり極めて画期的である。
このようなセントロメアの機能の医学的意義としては、セントロメア機能の欠損は、娘染色体の均等分配の欠損の場合は殆どが死に至るであろうが、分化制御機能の欠損の場合は癌細胞化すると考えられる。従って、本発明により癌研究、特に細胞の癌化に新しい道を開くのと同時に、癌細胞の診断に役立つものと考えられる。したがって、本発明は、細胞のセントロメアクロマチンを可溶化し、これを抗ＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降させたタンパク質から癌などの疾患に関連するタンパク質を検出・同定することからなる癌などの疾患の診断方法を提供するものである。
本発明の免疫沈降に使用される抗体としては、抗ＣＥＮＰ抗体を使用することができ、好ましくは抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体が使用される。これらの抗体は担体、例えばビーズ状などの形状をした担体に固定化して使用することもできる。この方法により沈殿してきたタンパク質は、このままで解析することもできるし、適当な、例えば尿素溶液などで溶出処理してから解析することもできる。解析法としてはＳＤＳ−ＰＡＧＥなどに展開して解析することもできるし、目的のタンパク質の抗体を用いた抗体による検出法を使用することもできる。あるいは、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５、０．１Ｍグリシンで段階的に溶出することもできる。
本発明は、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のＮ末端部分のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、及びその製造方法を提供するものである。本発明の抗体は、従来の方法でも製造することができるが、好ましくは本発明のモノクローナル抗体の製造方法により製造される。
抗原として使用するペプチドは、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の部分長のアミノ酸配列からなるペプチドを用いることを特徴としている。ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のＣ末端側の２／３はヒストンコアーを形成しているＨ３蛋白質と相同であるアミノ酸配列からなっていることから、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のＮ末端側の約１／３のＣＥＮＰ−Ａ蛋白質固有の配列を用いるほうが好ましい。好ましいアミノ酸配列としては、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、２７〜４０番目のアミノ酸配列を含むペプチド、及び１２６〜１４０番目のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。より好ましいペプチドとしては、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、さらに好ましくは３〜１９番目のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
本発明の抗体の製造方法は、通常の細胞融合法におけるモノクローナル抗体の製造方法を使用するものであるが、その際にミエローマ細胞としてマウスの骨髄腫細胞であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を使用し、かつ培地としてＧＩＴ培地を使用することを特徴とするものである。ＧＩＴ培地は、日本製薬株式会社より市販されているがこれに限定されるものではなく、牛胎児血清を必要としない同種の培地であれば本発明の方法に使用することができる。
本発明の方法における抗原としては、通常の方法で抗体を製造することができる各種の抗原を使用することができる。例えば、大腸菌発現系を用いたＣＥＮＰ−Ｂ蛋白質、そのＮ末端側のペプチドなどの組換え蛋白質、バキュロウイルス系系を用いたＣＥＮＰ−Ｃ蛋白質などの組換え蛋白質などや、その他の蛋白質又はそれらの断片を使用することができる。
実施例
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１  （ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質のＮ末端側ペプチドのモノクローナル抗体の製造）
種々のアミノ酸長のヒトのＣＥＮＰ−Ａペプチド（アミノ末端から３−１９のアミノ酸）を化学的に合成し、ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の各種の断片を用いて抗体を作製した。即ち、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列からなる断片（＃３−１９）、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の１２〜２５番目のアミノ酸配列からなる断片（＃１２−２５）、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の２７〜４０番目のアミノ酸配列からなる断片（＃２７−４０）、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３９〜５３番目のアミノ酸配列からなる断片（＃３９−５３）、及びヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の１２６〜１４０番目のアミノ酸配列からなる断片（＃１２６−１１０）を各々抗原として用いた。
各々のペプチドをキーホールリムペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）と共有結合させた。マウスの骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）を用いて、ＧＩＴ培地（日本製薬）で融合細胞を培養した。融合方法、スクリーニング方法などの具体的な手順は、コリガンらの方法に従った（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
選択されたハイブリドーマ細胞は、ウエスタンブロット分析によりＣＥＮＰ−Ａタンパクを特異的に認識するＩｇＧを生産していた。そして間接的免疫蛍光顕微鏡検査によりＳ−期とＭ−期の動原体領域を標識した（第３図Ａ参照）。
この結果得られた、抗ＣＥＮＰ−Ａペプチド抗体（＃３−１９、＃２７−４０、＃１２６−１４０）が極めて有用な抗体であることが明らかになった。特に＃３−１９抗体は、ウエスタンブロッティング法、間接蛍光抗体染色、免疫沈降法で優れた結果を与えた。
実施例２  （ＣＥＮＰ−Ｂ蛋白質のＮ末端側ペプチドのモノクローナル抗体の製造）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で発現し包接体として単離したＣＥＮＰ−Ｂのアミノ末端部分を抗原として、実施例１と同様な方法で抗体を製造した。
実施例３  （抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体の作製）
ヒトのＣＥＮＰ−Ｃ（アミノ酸１−４２６）のアミノ末端半分をコードするＤＮＡ配列を、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いてのＰＣＲで増幅し、ＮｃｏｌおよびＥｃｏＲＩでの消化後にｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴベクター（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）の中へクローン化した。使用したプライマーは、５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＧＧＴＣＴＧＧＡと、５’−ＡＴＡＧＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＣＡＴであった。単離したクローンはＤＮＡ配列を読み、そしてアミノ酸置換のないクローンを選択した。ＣＥＮＰ−Ｃのアミノ末端半分を、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いてＳＦ９細胞内で発現させ、Ｎｉ−カラム上で精製した。ポリクローナルモルモット抗体をＣＮ−Ｂｒ活性化したセファロース４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）へ連結した同一のタンパクでアフィニティー精製した。
実施例４  （クロマチンの可溶化）
ＨｅＬａ  Ｓ３細胞を、５％牛血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（東京、日本））で、５×１０５細胞／ｍＬの濃度になるまで培養した。培養した細胞の核を分離した。
ＨｅＬａ細胞の核ペレット（核  １×１０９コ）を、氷冷した０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有するＷＢ（ＷＢ：２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０；２０ｍＭ  ＫＣｌ；０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５ｍＭ  ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＤＴ））、０．０５ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ））５ｍｌに懸濁した。この核懸濁液を、最終濃度２ｍＭのＣａＣｌ２を添加した後に、３７℃でミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）で消化した。急冷と共に最終濃度１０ｍＭのＥＧＴＡの添加により反応を停止させた。消化物を、４℃において１０分間、１０，０００ｇでＲ２０Ａ２ローター（日立）を用いて遠心分離した。可溶化されたクロマチンは、上澄み液中へ回収された。ペレットは、５ｍｌの同じ緩衝液へ再懸濁した。
結果を第１図に示す。第１図Ａは、セントロメアクロマチンがＨｅＬａ細胞核から可溶化する条件を検討した結果を示し、第１図Ｂは、ＭＮａｓｅ消化後のクロマチン内ＤＮＡのサイズ分布を示し、第１図Ｃは、バルククロマチンタンパクをＭＮａｓｅ消化後の可溶性画分と不溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画しクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって検出した結果（第１図Ｃの上側）、分画した蛋白を膜に転写後ＡＣＡ抗体を用いた免疫染色によってＣＥＮＰ−Ａを同定した結果（第１図Ｃの下側）を示す。
実施例５  （免疫沈降）
ＡＣＡ血清（ＭＩ）は、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ、ＣＥＮＰ−Ｃを認識するＩｇＧ抗体を含む。これらのＩｇＧを、プロテイン−Ｇ−セファロース  カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に吸着させ精製した。モルモットの抗ＣＥＮＰ−Ｃ  ＩｇＧ（ｇｐαＣＣ）を、ＣＥＮＰ−Ｃ−結合したセファロース４Ｂのカラム上でアフィニティー精製した。これらＩｇＧ類の各々（各〜１０ｍｇ）をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（乾燥粉末１ｇ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と連結した。
これらのＩｇＧ−結合セファロースビーズ（５０μｌ）を、０．１％のＮＰ−４０を補った実施例４で製造した可溶化クロマチンサンプル（１ｍｌ）へ添加するか又はグリセリン勾配沈降（２ｍｌ）からの各画分へ添加し、そして回転しながら４℃で６時間培養した。抗ＣＥＮＰ−Ｂ抗体とのＣＨＩＰのために、抗ＣＥＮＰ−Ｂ  ＩｇＧおよびプロテイン−Ｇ−セファロースをサンプルに添加し、回転しながら４℃で７時間培養した。培養後にビーズを、０．１％のツイーン２０を含有する０．３ＭのＮａＣｌ−ＷＢにより室温で３分間、５回洗浄し、５０−１００μｌのＳＤＳ−緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；２５ｍＭ  ＤＴＴ；１％  ＳＤＳ；１５％  グリセリン）の中へ再懸濁した。得られたタンパクは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン  ブロッティングで分析した。
実施例６  （ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン  ブロッティング）
実施例５の方法で得られたタンパクを１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、公知の方法でポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ移した。膜を１０％の脱脂乳（Ｗａｋｏ）で前処理し、４℃で一晩ＡＣＡ血清（Ａ．Ｋ．，１：３０００希釈）と反応させ、次いで西洋ワサビ  ペルオキシダーゼ（１：３０００希釈）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と結合したヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と４℃で一晩反応させた。発色をコニカ  インムノステイン（コニカ）で行なった。クーマシーブリリアントブルー又は西洋ワサビペルオキシダーゼで染色されたタンパクの一群の強度を測定するために、画像をスキャナーでディジタル化しＮＩＨイメージ１．５５によって分析した。
結果を第４図に示す。第４図は、本発明の抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体により沈殿したサンプル（αＣＡ）および、上澄をさらに、ＡＣＡ抗体ＩｑＧによって沈殿したサンプル（ＡＣＡ）のＡＣＡ血清を用いたウェスタンブロッティングによるＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃの結果を示すものである。第５図は、第４図の沈殿したＡ／Ｂ／Ｃ複合物中のＣＥＮＰ−Ｃ／Ｂのモル比を計算した結果をグラフ化したものである。また、第６図は、第４図の結果の各サンプル中のＣＥＮＰ−Ａ／Ｂのモル比とＣＥＮＰ−ＡおよびＣＥＮＰ−Ｂの量をグラフ化したものである。
実施例７  （グリセリン勾配沈降）
実施例４により可溶性クロマチン溶液３ｍｌを、１ｍｌの５０％グリセリン上に積層された５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＮＰ−４０、２ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する５〜２０％のグリセリン３４ｍｌに添加し、４℃で１５．５時間にわたり２２，０００ｒｐｍでＳＷ２８ローター（ベックマン）を用いて遠心分離した。２ｍｌの分取を底部から分画し、そしてＤＮＡとタンパクをそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動またはＳＤＡ−ＰＡＧＥによって分離した。
結果を第７図に示す。  第７図Ａは、第１図Ｂのサンプル＃３のバルククロマチンの分布をヌクレオソームＤＮＡラダーによって示したものであり、第７図Ｂおよび第７図Ｃは、抗ＣＥＮＰ−Ａ（第７図Ｂ）抗体または抗ＣＥＮＰ−Ｃ（第７図Ｃ）抗体とともに各画分を免疫沈降し、ＡＣＡ血清を用いてウェスタンブロッティング法によりＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃの分布を検出したものである。
実施例８  （抗ＣＥＮＰ−Ａ、ＢまたはＣ抗体を用いてＣＨＩＰにより回収されたＤＮＡのクローニングと配列決定）
ＨｅＬａ核（２×１０８コ／ｍｌ、１５ｍｌ）を３７℃で１０分間、４０単位／ｍｌのＭＮａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で消化した。小さなＤＮＡの画分と遊離のタンパクを除去するために、消化物の可溶性画分を５−２０％のグリセリン勾配で遠心分離し、トリヌクレオソームよりも重い画分をプールし、抗ＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃ抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降のあと、ビーズをプロテイナーゼＫで処理し、次いでＤＮＡをフェノール抽出で精製した。沈澱したＤＮＡおよび精製したＣＥＮＰ−Ｂを用いてのゲルシフト競合アッセイを行なった。ＤＮＡを、Ｔａｑポリメラーゼでの処理の後にＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い３’ｄＴ−末端ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯの中へクローニングして相補３’Ａ末端を付加した。ＤＮＡ配列は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  分析器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。この配列をＮＣＢＩでＢＬＡＳＴサーバーを用いてデータベースと比較した。α−サテライトＤＮＡと相同性を示すクローンを、Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖほかの分類に従って区別した。
実施例９  （Ａ／Ｂ／Ｃ対照混合物の作製）
ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−ＣをバキュロウイルスＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ系（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて発現させ、次のようにして精製した。ＣＥＮＰ−ＡとヒストンＨ４をアミノ末端で６ヒスチジンと共発現させ、そしてＮｉ−カラムを用いてＣＥＮＰ−Ａ／ｈｉｓ６  Ｈ４複合体を精製した。ＣＥＮＰ−ＢはＱ−セファロースカラム上で精製した。全長ＣＥＮＰ−Ｃを符号化するＣＥＮＰ−Ｃ遺伝子を、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてのＰＣＲで増幅し、ｐＦａｓｔＢａｃベクターと結合した。全長ＣＥＮＰ−Ｃをバキュロウイルス系の中で発現させ、包接体として単離した。これを６Ｍの尿素で可溶化し、そしてヘパリン−セファロースカラムで精製した。各々のタンパクの濃度は、ウシの血清アルブミン（ＥＳＡ）を標準として用いＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色後にタンパク群の強度から計算した。Ａ／Ｂ／Ｃ対照混合物は６１ｆｍｏｌ／ｍｌのＣＥＮＰ−Ａ、２３ｆｍｏｌ／ｍｌのＣＥＮＰ−Ｂ、および２５ｆｍｏｌ／ｍｌのＣＥＮＰ−Ｃを含有しており、Ａ／Ｂ／Ｃの比率は２．６５：１：１．０９となる。タンパク取扱い中の損失を防ぐために、ＢＳＡおよびコアヒストンを各々７５ｎｇ／ｍｌおよび３７ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。ＨｅＬａ細胞から精製したＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃを用い、ウエスタンブロッティングの結果との直接比較によって組換えタンパクのＡＣＡ血清との反応性は同等であることを確認した。
実施例１０
実施例４に記載の方法に準じて、ＨｅＬａ細胞単離核をＭＮａｓｅ消化（６Ｕ／ｍｌ、３７℃、３０分）し可溶化した。得られたバルククロマチンから抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズを用いて、実施例５に記載の方法に準じてセントロメアクロマチンを単離した。
ここで単離されたセントロメアクロマチンに含まれるＤＮＡの分析結果を第８図に示す。
次いで、単離したセントロメアクロマチンをプロテアーゼＫで蛋白を消化し、フェノール処理によってＤＮＡを抽出した。γ３２Ｐ−ＡＴＰ、ポリヌクレオチドキナーゼによってＤＮＡを放射能標識し、１％アガロースゲルに流した。
ここで単離されたセントロメアクロマチンは、ＣＥＮＰ−Ｈ、ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ−６、Ｈ．Ｍｉｓ−１２を含むものであった。結果を第９図に示す。
実施例１１
実施例１０で得られた可溶化されたセントロメアクロマチンを、実施例５に記載の方法に準じてα−ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いて免疫沈降した。
第１０図は、ＭＮａｓｅ処理により可溶化されたセントロメアクロマチン（第８図、第９図と同一サンプル）を、α−ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いた免疫沈降（ＣＨＩＰ）により沈殿したきた物質のプロテオーム解析の結果を示した、図面に代わる写真である。
レーン２、３、４は、沈殿した物質を８Ｍ尿素で溶出させた画分の番号を示す。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの銀染色である。レーンＭは分子量マーカーであり、右端のＳＤＳはボイル（ｂｏｉｌ）したものであり、右端の数字は各ＳＤＳ−ボイルサンプルでプロテオーム解析したバンドの番号である。各バンドのタンパク質についての説明は本文中に記載されている。
第１１図は、第１０図で８Ｍ尿素で溶出したレーン３サンプルを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質の分離を行い、クマシー染色した結果を示した、図面に代わる写真である。
実施例１２  （ＩｇＧ結合ビーズによる非特異的吸着）
ＨｅＬａ細胞（５ｘ１０９）から核を単離精製し、０．３Ｍ  ＮａＣｌ存在下でＭＮａｓｅで消化しバルククロマチンを可溶化した。これにＩｇＧ−セファロースビーズを加え一晩４℃で回転によって混ぜつつ吸着をすすめた。次に反応後の上澄を抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体−セファロースビーズで同様に混ぜつつ一晩放置しビースを回収した。それぞれのビーズを０．３Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーで３回洗った後に、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で段階的に蛋白を溶出した。それぞれのビースを０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶出したサンプルについて１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離しクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した。
結果を第１２図に示す。第１２図の左のレーンＩｇＧ；ＩｇＧビーズ  中央のレーンαＣＥＮＰ−Ａ；抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズ  右のレーンＭ；分子量マーカー。図の左側番号はＩｇＧレーンの主要なバンドを示し、これらのバンドのプロテオーム解析による解析結果を示してある。実際はすべてのゲルを切り出して網羅的に解析した。２００に及ぶアミノ酸配列の結果を得ているが、ここでは主要な蛋白のみを示してある。
さらに、得られた各ビーズから０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶出したサンプル（αＡ及びＩｇ）を１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥして分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、図の上段に示した抗体で免疫染色した。
結果を第１３図に示す。第１３図の各レーンセットの左がαＣＡビーズサンプル、右がＩｇＧビーズサンプルである。１次抗体は、レーンセット１がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体、２がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体とＡＣＡ抗体、３がマウス抗マウスＲｉｎｇ１Ｂ抗体（モノクローン抗体）、４がウサギ抗ヒトＲＮＦ２抗体、５がマウス抗ヒトＢＭＩ−１抗体、６がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ６抗体、７がウサギ抗Ｈ．Ｍｉｓ１２抗体である。２次抗体はそれぞれＨｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合の、抗ヒトＩｇＧ抗体（レーン２）、抗マウスＩｇＧ抗体（レーン３、５）、抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。発色はコニカイムノステインを用いた。
産業上の利用可能性
本発明は、高感度で、かつ確実にＣＥＮＰ−Ａ蛋白質と反応する抗体を提供するものである。本発明の抗体は、セントロメアヌクレオソームに対する特異的親和性が高く、セントロメア領域構造体（動原体）の構成因子を網羅的に単離することが可能である。例えば、本発明の抗体（＃３−１９）は、ミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）を用いてＨｅＬａ細胞クロマチンを可溶化しクロマチン免疫沈降法（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣＨＩＰ）解析により、確実にかつ高感度で目的のＣＥＮＰ−Ａ蛋白質を認識した。その結果ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ、ＣＥＮＰ−Ｃが複合体を形成しキネトコア領域の基本構造体を形成している事が明らかとなった。他の抗体も同様の目的に有効であると予想される。これら抗体を組み合わせて利用する事によってセントロメアクロマチンをさらに高純度に精製が出来、今後セントロメア／キネトコア複合体の単離、構成因子の網羅的解析、遺伝子同定（プロテオミクス）に利用可能であると期待される。
また、本発明の抗体の製造方法により、多数の抗原からのモノクローナル抗体を簡便にスクリーニングすることができる。
また、本発明はクロマチンを可溶化する方法を提供するものであり、本発明の可溶化はクロマチンを断片化するが、クロマチンの全体的な特性を保持して断片化、可溶化されることを特徴するものである。かつ、本発明の可溶化の方法は簡便でかつ再現性に優れており、クロマチン蛋白質類の解析に優れた効果を奏するものである。したがって、本発明は本発明の方法により可溶化されたクロマチンの免疫沈降法、及び当該免疫沈降法によるクロマチン蛋白質類の解析法を提供するものでもある。クロマチン蛋白質類の解析により細胞の分化の状態や細胞の変成、癌化などを分析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、セントロメアクロマチンの可溶化（第１図Ａ）、可溶化されたセントロメアクロマチン内のＤＮＡのサイズ分布（第１図Ｂ）、及びバルククロマチンタンパクをＭＮａｓｅ消化後の可溶性画分と不溶性画分における染色結果（第１図Ｃ上段）及びウェスタンブロッティングによるＣＥＮＰ−Ａの染色結果（第１図Ｃ下段）を示す図面に代わる写真である。
第１図Ａは、セントロメアクロマチンがＨｅＬａ細胞核から可溶化する条件を検討した結果を示す図面に代わる写真である。第１図ＡのレーンＭはＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃのバンドの位置を示す。第１図Ａのレーン１は核を０．３Ｍ  ＮａＣｌで処理した上澄液の結果を示し、第１図Ａのレーン２は０．６Ｍ  ＮａＣｌ処理による上澄液の結果を示し、第１図Ａのレーン３はその場合の沈殿物の結果を示し、第１図Ａのレーン４は核を０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でミクロコッカルヌクレアーゼ（（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）ＭＮａｓｅ）で消化した場合の上澄液の結果を示し、第１図Ａのレーン５はそれにＡＣＡ−ビーズを加えた場合の結果を示し、第１図Ａのレーン６は核を０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でＭＮａｓｅで消化した場合の沈殿物の結果をそれぞれ示す。
第１図Ｂは、ＭＮａｓｅ消化後のクロマチン内ＤＮＡのサイズ分布を示す図面に代わる写真である。レーン１は２０単位／ｍｌで２分（４０単位／ｍｌ・分、サンプル＃１）、レーン２は２０単位／ｍｌで４分（８０単位／ｍｌ・分、サンプル＃２）、レーン３は４０単位／ｍｌで５分（２００単位／ｍｌ・分、サンプル＃３）、レーン４は８０単位／ｍｌで４５分（３６００単位／ｍｌ・分、サンプル＃４）のものを示す。
第１図Ｃは、バルククロマチンタンパクをＭＮａｓｅ消化後の可溶性画分と不溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画しクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって検出した結果（第１図Ｃの上側）、分画した蛋白を膜に転写後ＡＣＡ抗体を用いた免疫染色によってＣＥＮＰ−Ａを同定した結果（第１図Ｃの下側）を示す図面に代わる写真である。第１図Ｃのレーン１〜４は可溶性画分からのものであり、レーン５〜８は不可溶性画分からのものであり、レーンＭはＣＥＮＰ−Ａの位置を示すものである。
第２図は、ＨｅＬａ核からＭＮａｓｅ消化によって可溶化したバルククロマチンを本発明の抗ＣＥＮＰ−Ａ、抗ＣＥＮＰ−Ｂまたは抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体とともに免疫沈降しＤＮＡのクローニング、塩基配列決定によって得られたＤＮＡ配列の分布を示す。第２図の黒線はＣＥＮＰ−Ｂボックス含有α−サテライトＤＮＡを有するクローン数を示す。白抜きの線はそれ以外のクローン数を示している。
第３図Ａは、ＨｅＬａ細胞の有糸分裂期の染色体を免疫蛍光染色した顕微鏡写真であり、図面に代わる写真である。第３図Ａの上段左側は、抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体による染色であり、第３図Ａの上段右側は、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体による染色である。これらの染色は２次抗体としてＣＥＮＰ−Ａ抗体については抗マウスＩｇＧ−蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、ＣＥＮＰ−Ｃ抗体については抗モルモットＩｇＧ−ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）を用いた。第３図Ａの下段左側は染色体を４’，６’−ジアミジノ−３−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）でＤＮＡを染色したものである。第３図Ａの下段右側は、前記の３種の染色を重ねあわせ（Ｍａｒｇｅｄ）たものである。
第３図Ｂは、可溶化クロマチンを本発明の抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体又は抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体によって免疫沈降（ＣＨＩＰ）したときに、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体又はＣＥＮＰ−Ｃと共沈降したＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃをウェスタンブロット法により検出した結果を示す図面に代わる写真である。単離されたＨａＬａ細胞の核を４０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅで５分間処理したサンプル（レーン１及び３）、８０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅで４５分間処理したサンプル（レーン２及び４）である。そして、可溶化されたサンプルを抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いて免疫沈降（ＣＨＩＰ）したもの（レーン１及び２）、抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体を用いて免疫沈降（ＣＨＩＰ）したもの（レーン３及び４）である。沈殿したタンパク質は、ＣＥＮＰ−Ｂ及びＣＥＮＰ−ＣについてはＳＤＳ−７．５％で、ＣＥＮＰ−ＡにつてはＳＤＳ−１２．５％で分離した。タンパク質の検出はＡＣＡ血清（ＡＫ）を用いたウエスタンブロットによる。レーンＭはＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ及びＣＥＮＰ−Ｃの位置を示すマーカーである。
第４図は、本発明の抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体により沈殿したサンプル（αＣＡ）および、上澄をさらに、ＡＣＡ抗体ＩｇＧによって沈殿したサンプル（ＡＣＡ）のＡＣＡ血清を用いたウェスタンブロッティングによるＣＥＮＰ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃの結果を示す図面に代わる写真である。レーン１−４は第１図Ｂに示す４つのサンプルを示し、レーン５−８は各サンプルをＡＣＡＩｇＧとともに沈殿させた場合を示す。レーンＭはＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃを含有するＣＥＮＰ−Ａ／Ｂ／Ｃマーカー混合物である。
第５図は、第４図の沈殿したＡ／Ｂ／Ｃ複合物中のＣＥＮＰ−Ｃ／Ｂのモル比を計算した結果をグラフ化したものである。
第６図は、第４図の結果の各サンプル中のＣＥＮＰ−Ａ／Ｂのモル比とＣＥＮＰ−ＡおよびＣＥＮＰ−Ｂの量をグラフ化したものである。●印はＣＥＮＰ−Ａ／Ｂモル比を示し、▲印はＣＥＮＰ−Ａを示し、■印はＣＥＮＰ−Ｂを示す。
第７図は、５〜２０％グリセロール濃度勾配遠心により抗ＣＥＮＰ−Ａまたは抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体とともに免疫沈澱した動原体クロマチンのサイズ分布を示す図面に代わる写真である。
第７図Ａは、第１図Ｂのサンプル＃３のバルククロマチンの分布をヌクレオソームＤＮＡラダーによって示したものであり、第７図Ｂおよび第７図Ｃは、抗ＣＥＮＰ−Ａ（第７図Ｂ）抗体または抗ＣＥＮＰ−Ｃ（第７図Ｃ）抗体とともに各画分を免疫沈降し、ＡＣＡ血清を用いてウェスタンブロッティング法によりＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−ＢおよびＣＥＮＰ−Ｃの分布を検出したものである。
第８図は、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズによって単離精製したセントロメアクロマチンに含まれるＤＮＡの鎖長分布を示す図面に代わる写真である。
第９図は、単離したセントロメアクロマチンが、ＣＥＮＰ−Ｈ、ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ−６、Ｈ．Ｍｉｓ−１２を含むものであることを示す図面に代わる写真である。
バキュロウイルス系で発現精製したＣＥＮＰ−Ｈ（レーン１）、ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ−６（レーン２）及び単離精製したセントロメアクロマチン（レーン３−６）を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体（レーン１、３）、抗ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ−６抗体（レーン２、４）、抗Ｈ．Ｍｉｓ−１２抗体（レーン５）及びＡＣＡ抗体（レーン６）を用いて免疫反応を行った。分子量マーカーを左に流した（レーンＭ）。
第１０図は、ＭＮａｓｅ処理により可溶化されたセントロメアクロマチン（第８図、第９図と同一サンプル）を、α−ＣＥＮＰ−Ａ抗体を用いた免疫沈降（ＣＨＩＰ）により沈殿したきた物質のプロテオーム解析の結果を示した、図面に代わる写真である。
レーン２、３、４は、沈殿した物質を８Ｍ尿素で溶出させた画分の番号を示す。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの銀染色である。レーンＭは分子量マーカーであり、右端のレーンは８Ｍ尿素溶出後のビーズにさらにＳＤＳを加え煮沸（ｂｏｉｌ）したものであり、右端の数字は各ＳＤＳ−ボイルサンプルでプロテオーム解析したバンドの番号である。各バンドのタンパク質についての説明は本文中に記載されている。
第１１図は、第１０図で８Ｍ尿素で溶出したレーン３サンプルを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質の分離を行い、クマシー染色した結果を示した、図面に代わる写真である。
レーンＭは分子量マーカーであり、レーンＳの右端の数字は各バンドの番号であり、これらをプロテオーム解析に供した。各バンドのタンパク質についての説明は本文中に記載されている。
第１２図は、本発明の可溶化クロマチンを比較のためにマウスＩｇＧビーズを用いて免疫沈降した結果を示す図面に変わる写真である。マウスＩｇＧのビーズ及び抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズのそれぞれのビーズを０．３Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーで３回洗った後に、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で段階的に蛋白を溶出した。それぞれのビースを０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶出したサンプルについて１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離しクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した。左のレーンＩｇＧ；ＩｇＧビーズ  中央のレーンαＣＥＮＰ−Ａ；抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体ビーズ  右のレーンＭ；分子量マーカー。図の左側番号はＩｇＧレーンの主要なバンドを示し、各バンドの詳細は本文中に記載した。
第１３図は、第１２図で説明したそれぞれのビーズから０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶出したサンプル（αＡ及びＩｇ）を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、第１３図の上段に示した抗体で免疫染色した結果を示す図面に変わる写真である。各レーンセットの左がαＣＡビーズサンプル、右がＩｇＧビーズサンプルである。１次抗体は、レーンセット１がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体、２がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体とＡＣＡ抗体、３がマウス抗マウスＲｉｎｇ１Ｂ抗体（モノクローン抗体）、４がウサギ抗ヒトＲＮＦ２抗体、５がマウス抗ヒトＢＭＩ−１抗体、６がウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｉ／Ｈ．Ｍｉｓ６抗体、７がウサギ抗Ｈ．Ｍｉｓ１２抗体である。２次抗体はそれぞれＨｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合の、抗ヒトＩｇＧ抗体（レーン２）、抗マウスＩｇＧ抗体（レーン３、５）、抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。発色はコニカイムノステインを用いた。
第１４図は、ＢＭＩ１抗体及びＣＥＮＰ−Ｃ抗体を用いてＨｅＬａ細胞を免疫染色した結果を示す図面に変わるカラー写真である。第１４図Ａ（左上）は抗ＣＥＮＰ−Ｃで染色したものを示し、第１４図Ｂ（右上）は抗ＢＭＩ１で染色したものを示し、第１４図Ｃ（左下）はＤＡＰＩによる核酸染色を示し、第１４図Ｄ（右下）はこれらを重ねあわせたものである。
第１５図は、ＢＭＩ１抗体及びＣＥＮＰ−Ｉ抗体を用いてＨｅＬａ細胞を免疫染色した結果を示す図面に変わるカラー写真である。第１５図Ａ（左上）は抗ＣＥＮＰ−Ｉで染色したものを示し、第１４図Ｂ（右上）は抗ＢＭＩ１で染色したものを示し、第１４図Ｃ（左下）はＤＡＰＩによる核酸染色を示し、第１４図Ｄ（右下）はこれらを重ねあわせたものである。
第１６図は、第１１図１４番バンドに対応するキュリン４（Ｃｕｌｌｉｎ４）に対する抗体を用いてＨｅＬａ細胞を免疫染色した結果を示す図面に変わるカラー写真である。第１６図Ａ（左上）は抗ＣＥＮＰ−Ａで染色したものを示し、第１６図Ｂ（右上）は抗キュリン４で染色したものを示し、第１６図Ｃ（左下）はＤＡＰＩによる核酸染色を示し、第１６図Ｄ（右下）はこれらを重ねあわせたものである。
第１７図は、第１６図と同様の方法によりＭ期（各図の左側）とＳ期（各図の右側）の細胞を染色した結果を示す図面に変わるカラー写真である。第１７図は、Ｍ期（各図の左側）とＳ期（各図の右側）の各々の４枚、合計８枚の写真からなるものであり、それぞれ上からＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄとなっている。第１７図Ａ（最上段）はＤＡＰＩによるＤＮＡの染色を示し、第１７図Ｂ（上から２段目）は抗ＣＥＮＰ−Ａで染色したものを示し、第１７図Ｃ（上から３段目）は抗キュリン４で染色したものを示し、第１７図Ｄ（最下段）はこれらを重ねあわせたものをそれぞれ示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2003064474.tif 000014
【図１４】
2003064474.tif 000015
【図１５】
2003064474.tif 000016
【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月7日(2003.4.7)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】（削除）
【請求項２】（削除）
【請求項３】ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、２７〜４０番目のアミノ酸配列を含むペプチド、又は１２６〜１４０番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項４】ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質が、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質である請求の範囲第３項又は第４項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】モノクローナル抗体が、可溶化したセントロメアクロマチンの免疫沈降法により、高純度でセントロメア複合体を単離・精製することができる抗体である請求の範囲第３項〜第５項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】細胞融合法によりモノクローナル抗体を製造する方法において、抗原としてＣＥＮＰ−Ａ蛋白質を用いミエローマ細胞としてマウスの骨髄腫細胞であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を使用し、かつ培地としてＧＩＴ培地を使用することを特徴とするＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、２７〜４０番目のアミノ酸配列を含むペプチド、又は１２６〜１４０番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対するモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項８】（削除）
【請求項９】セントロメアクロマチンを、ＮａＣｌの存在下にＭＮａｓｅのみで可溶化する方法。
【請求項１０】ＭＮａｓｅの濃度が１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬであり、処理時間が１〜１００分間である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】セントロメアクロマチンをＮａＣｌの存在下にＭＮａｓｅのみで可溶化し、次いで得られた可溶化物を抗ＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降する方法。
【請求項１２】抗ＣＥＮＰ抗体が、担体に固定化されている抗体である請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】抗ＣＥＮＰ抗体が、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体である請求の範囲第１１項又は第１２項に記載の方法。
【請求項１４】セントロメアクロマチンをＭＮａｓｅを用いて可溶化し、次いで得られた可溶化物を抗ＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降し、沈殿したタンパク質を検出・同定する方法。
【請求項１５】検出・同定されるタンパク質が、分化に関連するタンパク質である請求の範囲第１１項又は第１４項に記載の方法。
【請求項１６】可溶化したセントロメアクロマチンから、請求の範囲第３〜６のいずれかに記載の抗ＣＥＮＰ−Ａモノクローナル抗体を用いた免疫沈降法によりセントロメア複合体を単離・精製する方法。




【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、２７〜４０番目のアミノ酸配列を含むペプチド、又は１２６〜１４０番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項２】  ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】  ＣＥＮＰ−Ａ蛋白質が、ヒトＣＥＮＰ−Ａ蛋白質である請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】  モノクローナル抗体が、可溶化したセントロメアクロマチンの免疫沈降法により、高純度でセントロメア複合体を単離・精製することができる抗体である請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】  細胞融合法によりモノクローナル抗体を製造する方法において、抗原としてＣＥＮＰ−Ａ蛋白質を用いミエローマ細胞としてマウスの骨髄腫細胞であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を使用し、かつ培地としてＧＩＴ培地を使用することを特徴とするＣＥＮＰ−Ａ蛋白質の３〜１９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、２７〜４０番目のアミノ酸配列を含むペプチド、又は１２６〜１４０番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対するモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項６】  セントロメアクロマチンを、ＮａＣｌの存在下にＭＮａｓｅのみで可溶化する方法。
【請求項７】  ＭＮａｓｅの濃度が１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬであり、処理時間が１〜１００分間である請求項６に記載の方法。
【請求項８】  セントロメアクロマチンをＮａＣｌの存在下にＭＮａｓｅのみで可溶化し、次いで得られた可溶化物を抗ＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降する方法。
【請求項９】  抗ＣＥＮＰ抗体が、担体に固定化されている抗体である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】抗ＣＥＮＰ抗体が、抗ＣＥＮＰ−Ａ抗体である請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】セントロメアクロマチンをＭＮａｓｅを用いて可溶化し、次いで得られた可溶化物を抗ＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降し、沈殿したタンパク質を検出・同定する方法。
【請求項１２】検出・同定されるタンパク質が、分化に関連するタンパク質である請求項８又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】可溶化したセントロメアクロマチンから、請求項１〜４のいずれかに記載の抗ＣＥＮＰ−Ａモノクローナル抗体を用いた免疫沈降法によりセントロメア複合体を単離・精製する方法。
【国際調査報告】
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