(57)【要約】サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の低温誘導性遺伝子からなる群から選ばれる１つの遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に存在し、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を同定することにより、低温域においてより高い活性を有する酵母の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の表に記載されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子からなる群から選ばれる１つの遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に存在し、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片。
2004003197.tif 000046
2004003197.tif 000047
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片。
（ａ）請求の範囲１に記載のＤＮＡ断片において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたＤＮＡ
（ｂ）請求の範囲１に記載のＤＮＡ断片に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項３】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のシス配列を含み、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片。
2004003197.tif 000048
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片。
（ａ）請求の範囲３に記載のＤＮＡ断片において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたＤＮＡ
（ｂ）請求の範囲３に記載のＤＮＡ断片に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項５】
請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片を含む発現ベクター。
【請求項６】
上記ＤＮＡ断片の下流に外来遺伝子又は外来ＤＮＡ断片を含むことを特徴とする請求の範囲５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求の範囲５又は６に記載の発現ベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項８】
宿主が酵母である、請求の範囲７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求の範囲７または８に記載の形質転換体を培養温度を低下させて培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
培養温度が１０℃以下である、請求の範囲９に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求の範囲７または８に記載の形質転換体を培養温度を低下させて培養することを特徴とするＲＮＡ生産制御方法。
【請求項１２】
培養温度が１０℃以下である、請求の範囲１１に記載のＲＮＡ生産制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、酵母の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片に関する。
【背景技術】  酵母は、ビール、日本酒などのアルコール飲料やパンなどの発酵を利用した食品などの製造に用いられる他、アミノ酸などの代謝産物の製造、さらには組換えＤＮＡ技術を利用して同種あるいは他種生物のタンパク質生産の宿主として広く用いられている。組換えＤＮＡ技術によるタンパク質生産における酵母の特長は、従来食品産業に用いられてきた実績から推定される生物としての安全性、大腸菌などの原核生物とは異なり真核生物であることからヒトなどの動物のタンパク質の発現に成功する確率が比較的高いこと、また、遺伝子組換え技術が非常によく整備されていることにある。
一般にビール製造あるいは吟醸酒製造においては、１０℃以下などの低温で発酵させることにより香りや味が洗練され、食品としての品質が向上することが既に知られている。この香りや味の向上にはそれらを与える化学物質の存在が推定されることから、温度が低下することによって、化学物質を合成する酵素の遺伝子の働きが適切に制御されたと考えられる。しかしながら、低温で働く酵母の遺伝子については限られた情報しかなく、どのような遺伝子が働くことが食品の香りや味の向上に重要なのかは未だ不明である。
一方、酵母や大腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術においては、タンパク質生産のために、従来通常の培養温度（酵母で３０℃、大腸菌で３７℃）において働くプロモーターが用いられてきた。一般により多くのｍＲＮＡを生産する強力なプロモーターが使われている。低温で培養することは遺伝子組換え技術によるタンパク質生産においては不利になると思われているが、実際には意図的に低温を利用してタンパク質の生産を行う場合がある。例えば、通常の温度で生産されたタンパク質が正しい立体構造を形成しない場合であり、この場合には低温で生産することにより正しい立体構造を有したタンパク質が生産されることがあり、これを期待して培養温度を通常より１０℃程低めにしてタンパク質生産を行うことがある（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．２，４３２−４４１（１９９１））。また、生産されたタンパク質が宿主のプロテアーゼによって分解されることを抑えるという効果も期待される。このように低温においてタンパク質を生産させることにはメリットがあると考えられるが、一方で現在用いられている常温型プロモーターは温度の低下に応じてそのプロモーター活性も低下すると考えられる。したがって、効率的な低温でのタンパク質生産システムを確立するには、低温域において高い活性を示すプロモーターを用いることが適切である。
これまでに、ＹＢＲ０６７Ｃ（ＴＩＰ１）、ＹＥＲ０１１Ｗ（ＴＩＲ１）、ＹＧＲ１５９Ｃ（ＮＳＲ１）、ＹＧＬ０５５Ｗ（ＯＬＥ１）、ＹＯＲ０１０Ｃ（ＴＩＲ２）、ＹＫＬ０６０Ｃ（ＦＢＡ１）、ＹＩＬ０１８Ｗ（ＲＰＬ２Ｂ）、ＹＤＬ０１４Ｗ（ＮＯＰ１）、ＹＫＬ１８３Ｗ、ＹＫＬ０１１ＷおよびＹＤＲ２９９Ｗ（ＢＦＲ２）のそれぞれのｍＲＮＡが酵母を低温処理することによって増加することが報告されているが、それぞれの遺伝子のプロモーターがどの程度強い低温誘導性を示すのかは精査されていない。
【発明の開示】
本発明は、酵母の低温誘導性遺伝子をより多く同定、分析することにより、例えば低温域（例えば１０℃以下）においてより高い活性を有する酵母の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の低温誘導性を示す遺伝子を同定し、それぞれの遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を見出すことで、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の表１に記載されるサッカロミセス・セレビシエの遺伝子からなる群から選ばれる１つの遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に存在し、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片である。
2004003197.tif 000002
2004003197.tif 000003
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片である。
（ａ）表１に記載されるサッカロミセス・セレビシエの遺伝子からなる群から選ばれる１つの遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に存在し、低温誘導性プロモーター機能を有するＤＮＡ断片において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたＤＮＡ
（ｂ）表１に記載されるサッカロミセス・セレビシエの遺伝子からなる群から選ばれる１つの遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に存在し、低温誘導性プロモーター機能を有するＤＮＡ断片に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
さらに本発明は、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のシス配列を含み、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片である。
（ａ）ＤＮＡ配列Ａ：ＧＣＴＣＡＴＣＧ
（ｂ）ＤＮＡ配列Ｂ：ＧＡＧＡＴＧＡＧ
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片である。
（ａ）前記シス配列を含み、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたＤＮＡ
（ｂ）前記シス配列を含み、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
さらに、本発明は、上記ＤＮＡ断片を含む発現ベクターあるいは該発現ベクターにおいて上記ＤＮＡ断片の下流に外来遺伝子又は外来ＤＮＡ断片を含むことを特徴とする発現ベクターである。
さらに、本発明は、前記発現ベクターによって形質転換された形質転換体である。宿主としては、酵母が挙げられる。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養温度を低下させて培養することを特徴とするタンパク質の製造方法又はＲＮＡ生産制御方法である。培養温度としては１０℃以下が挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００２年６月２８日に出願された日本国特許出願第２００２−１９１３８３号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
酵母の低温誘導性遺伝子を同定することで、本発明に係る酵母の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を同定できる。酵母の至適培養温度である３０℃から１０℃に培養温度を低下させた際にｍＲＮＡ量が増加する遺伝子を、低温誘導性遺伝子として同定する。これらの低温誘導性遺伝子を網羅的に捕捉するために、サッカロミセス・セレビシエに由来する全遺伝子（約６２００個）において増幅等の理由から調製が困難であった遺伝子を除くおよそ５８００個の遺伝子に由来するｃＤＮＡをスライドガラスに固定したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ研究所製）を用いることができる。ＤＮＡマイクロアレイに作用させるＲＮＡサンプルとしては、サッカロミセス・セレビシエの培養温度を３０℃から１０℃に低下させた後に経時的に菌体を回収し、回収した菌体からＲＮＡを抽出することで調製した複数のＲＮＡサンプルを使用することができる。このように調製した複数のサンプルを用いることで、サッカロミセス・セレビシエの培養温度を低温にシフトした直後に発現量が増加する遺伝子及び徐々に発現量が増加する遺伝子を同定することができる。これらのＲＮＡサンプルを用いてＤＮＡマイクロアレイに固定された個々の遺伝子について、ｍＲＮＡ量を低温処理前後で比較する。その結果、低温処理前のｍＲＮＡ量と比較して、低温処理後のｍＲＮＡ量が増加した遺伝子を、低温誘導性遺伝子として特定することができる。例えば、低温処理前のｍＲＮＡ量と比較して、低温処理後のｍＲＮＡ量が３倍以上に増加した遺伝子を、低温誘導性遺伝子として同定することができる。このようにして同定された低温誘導性遺伝子としては新規な遺伝子２５９個を下記の表２に示す。
2004003197.tif 000004
2004003197.tif 000005
本発明に係るＤＮＡ断片は、上記の表２に記載されたサッカロミセス・セレビシエの遺伝子のなかから選ばれる遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に存在し、低温誘導性プロモーターとして機能するものである。
表２は、２５９個の遺伝子にそれぞれ付与された１〜２５９番までの番号と、系統的遺伝子名とを関連付けて表示している。この系統的遺伝子名は、酵母ゲノムデータベース（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／）にｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｎａｍｅとして登録されている表記と一致している。したがって、表２に記載されたサッカロミセス・セレビシエの遺伝子は、系統的遺伝子名をキーとして酵母ゲノムデータベースにおけるｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｎａｍｅを検索することによって容易に特定することができる。また、表２に記載されたサッカロミセス・セレビシエの遺伝子に関する塩基配列は、酵母ゲノムデータベースを検索することによって得ることができる。さらに、表２に記載されたサッカロミセス・セレビシエの遺伝子に関するその他の情報も、酵母ゲノムデータベースを検索することによって得ることができる。
低温誘導性プロモーターとは、酵母の至適培養温度におけるプロモーター活性と比較して、酵母の至適培養温度よりも低い温度で高いプロモーター活性を示すプロモーターを意味する。具体的に、低温誘導性プロモーターは、酵母の至適培養温度におけるプロモーター活性と比較して、酵母の至適培養温度よりも低い温度で３倍以上のプロモーター活性を示す。ここで、酵母の至適培養温度は、約３０℃である。また、酵母の至適培養温度よりも低い温度とは、３０℃未満の温度、例えば約１０℃を意味するが、２０℃以下、好ましくは１５℃以下の温度であればこの温度に限定されない。
プロモーター活性は、定法に従って測定することができる。例えば、プロモーターの下流に発現可能にレポーター遺伝子を連結した発現ベクターを構築する。次に、発現ベクターで適当な宿主（例えば、酵母）を形質転換する。得られた形質転換体を所定の条件下で培養し、レポーター遺伝子の発現量をｍＲＮＡレベル或いはタンパク質レベルで定量することによって、当該条件下におけるプロモーター活性を測定することができる。
また、５’上流側の非翻訳領域とは、上述したように特定された遺伝子のコーディング鎖における５’末端側に存在し、且つ、タンパク質へ翻訳されない領域を意味する。言い換えれば、非翻訳領域とは、いわゆるＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）に含まれない領域を意味する。
所定の遺伝子（以下、対象遺伝子と呼ぶ）の５’上流側の非翻訳領域は、酵母ゲノムデータベースを用いて具体的に特定することができる。すなわち、先ず、対象遺伝子の系統的遺伝子名をキーとして酵母ゲノムデータベースを検索する。次に、検索の結果として対象遺伝子に関する各種情報が得られ、この各種情報の中から対象遺伝子の染色体上の位置を特定する。次に、対象遺伝子の染色体上の位置に基づいて、酵母ゲノムデータベースに登録された染色体地図から、対象遺伝子の５’上流側に位置する遺伝子（５’上流隣接遺伝子と呼ぶ）を特定する。このように特定された対象遺伝子及び５’上流隣接遺伝子に挟まれる領域は、タンパク質へ翻訳されない領域であり、ＯＲＦを含まない領域である。すなわち、以上の工程によって、対象遺伝子及び５’上流隣接遺伝子に挟まれる領域を、対象遺伝子の５’上流側の非翻訳領域として特定することができる。
このように特定された対象遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に関する塩基配列は、酵母ゲノムデータベースに登録された酵母ゲノム全塩基配列情報を検索することによって得ることができる。また、特定された対象遺伝子の５’上流側の非翻訳領域は、２０塩基程度の該領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用い、酵母から抽出したゲノムを鋳型としたＰＣＲによって容易に得ることができる。
本発明に係るＤＮＡ断片は、５’上流側の非翻訳領域の全部であっても良いし、低温誘導性プロモーターとしての機能を示す限り、５’上流側の非翻訳領域の一部であっても良い。
さらに本発明に係るＤＮＡ断片は、上記ＤＮＡ断片において１又は数個（例えば１〜１０個、１〜５個）の塩基が欠失、置換若しくは付加されたＤＮＡを含み、かつ低温誘導性プロモーターの機能を有するものであっても良い。
さらに上記ＤＮＡ断片に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、かつ低温誘導性プロモーターの機能を有するものも本発明に係るＤＮＡ断片に含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばリン３２で標識したプローブＤＮＡを用いる場合には、５  Ｘ  ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５  Ｘ  デンハルト試薬（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなるハイブリダイゼーション溶液中で、温度が４５℃〜６５℃、好ましくは５５℃〜６５℃である。また洗浄ステップにおいては、２  Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる洗浄溶液中で温度が４５℃〜５５℃、より好ましくは０．１  Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる洗浄溶液中で温度が４５℃〜５５℃である。ＡｌｋＰｈｏｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ（アマシャムバイオテク）のキットを用いて酵素標識したプローブＤＮＡを用いる場合には、該キットのマニュアルに記載されている組成のハイブリダイゼーション溶液（０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび４％ブロッキング試薬を含む）中で温度が５５℃〜７５℃である。また洗浄ステップにおいては、該キットのマニュアルに記載されている一次洗浄液（２Ｍ  尿素を含む）中で５５℃〜７５℃、かつ二次洗浄液中で室温である。また、他の検出法であってもよく、その場合にはその検出法の標準的な条件であってよい。
一方、本発明に係るＤＮＡ断片は、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のＤＮＡを含み、且つ低温誘導性プロモーターとして機能するものであっても良い。
（ａ）ＤＮＡ配列Ａ：ＧＣＴＣＡＴＣＧ
（ｂ）ＤＮＡ配列Ｂ：ＧＡＧＡＴＧＡＧ
これら（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡは、上記のＤＮＡマイクロアレイおよび方法を用いて初期に低温誘導性を示す遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に共通する配列（シス配列と呼ぶ）である。例えば、まず初期に低温誘導性を示す遺伝子を、１０℃に培養温度を低下させてから１５分後にシグナルが２倍以上に上がった遺伝子として同定することができる。同定された４１個の遺伝子を下記の表３に示す。
2004003197.tif 000006
2004003197.tif 000007
表３は、４１個の遺伝子にそれぞれ付与された１〜４１番までの番号と、系統的遺伝子名とを関連付けて表示している。なお系統的遺伝子名は、表２と同様に上記の酵母ゲノムデータベースにｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｎａｍｅとして登録されている表記と一致している。
次いでＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いて、これらの各々の遺伝子のＯＲＦから６００ｂｐ上流までの間に存在するシス配列を検索する。その結果、これらの遺伝子の一部に共通して存在するＤＮＡ配列として得ることができる。具体的には、上記のＤＮＡ配列ＡがＹＮＬ１１２Ｗ、ＹＧＲ１５９Ｃ、ＹＧＬ０５５Ｗ、ＹＮＲ０５３Ｃ、ＹＰＬ０９３Ｗ、ＹＨＲ１７０ＷおよびＹＨＲ１４８Ｗ（表３の番号２９〜３５に対応する）に共通して存在するシス配列として、またＤＮＡ配列ＢがＹＢＲ０３４Ｃ、ＹＯＬ０１０Ｗ、ＹＫＬ０７８Ｗ、ＹＭＲ２９０Ｃ、ＹＤＲ１０１ＣおよびＹＢＬ０５４Ｗ（表３の番号３６〜４１に対応する）に共通して存在するシス配列として見出すことができる。
さらに上記ＤＮＡ断片は、上記ＤＮＡ断片において１又は数個（例えば１〜３個）の塩基が欠失、置換若しくは付加されたＤＮＡを含み、かつ低温誘導性プロモーターの機能を有するものであっても良い。
さらに上記ＤＮＡ断片に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、かつ低温誘導性プロモーターの機能を有するものも本発明に係るＤＮＡ断片に含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばリン３２で標識したプローブＤＮＡを用いる場合には、５  Ｘ  ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５  Ｘ  デンハルト試薬（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなるハイブリダイゼーション溶液中で、温度が４５℃〜６５℃、好ましくは５５℃〜６５℃である。また洗浄ステップにおいては、２  Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる洗浄溶液中で温度が４５℃〜５５℃、より好ましくは０．１  Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる洗浄溶液中で温度が４５℃〜５５℃である。ＡｌｋＰｈｏｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ（アマシャムバイオテク）のキットを用いて酵素標識したプローブＤＮＡを用いる場合には、該キットのマニュアルに記載されている組成のハイブリダイゼーション溶液（０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび４％ブロッキング試薬を含む）中で温度が５５℃〜７５℃である。また洗浄ステップにおいては、該キットのマニュアルに記載されている一次洗浄液（２Ｍ尿素を含む）中で５５℃〜７５℃、かつ二次洗浄液中で室温である。また、他の検出法であってもよく、その場合にはその検出法の標準的な条件であってよい。
一旦本発明に係るＤＮＡ断片の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって本発明に係るＤＮＡ断片を得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明に係るＤＮＡ断片の変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。
なお、本発明に係るＤＮＡ断片に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
本発明に係る発現ベクターは、適当なベクターに本発明に係るＤＮＡ断片を挿入することにより得ることができる。本発明に係るＤＮＡ断片を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入することなどによって複製可能となるＤＮＡ断片であってもよい。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３などのＹＥｐ系、ＹＣｐ５０などのＹＣｐ系等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明に係るＤＮＡ断片を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。またベクターと本発明に係るＤＮＡ断片のそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、ＰＣＲなどを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ法または酵母などを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ法によって両者を連結する方法であってもよい。
本発明に係る発現ベクターは、本発明に係るＤＮＡ断片の下流にさらに外来遺伝子又は外来ＤＮＡ断片を挿入することができる。外来遺伝子又は外来ＤＮＡ断片を挿入する方法は、ベクターに本発明に係るＤＮＡ断片を挿入する方法と同様である。
本発明に係る発現ベクターにおいて、本発明に係るＤＮＡ断片の下流に置かれる外来遺伝子としては、いかなるタンパク質、ペプチドであっても良いが、特に低温生産に適しているタンパク質が例として挙げられる。より具体的には、低温において機能する不凍タンパク質、熱に不安定で変性しやすい低温活性酵素、蛍光タンパク質ＧＦＰなどが挙げられる。さらに本発明に係るＤＮＡ断片の下流に置かれる外来ＤＮＡ断片としては、ＲＮＡ自体が機能するアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムなどが挙げられる。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、プロモーター及び外来遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、本発明における宿主としては酵母が挙げられる。また酵母としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ、実験酵母、醸造用酵母、食用酵母および工業用酵母などが挙げられる。
酵母への本発明に係る発現ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、ＹＩｐ系などのベクターあるいは染色体中の任意の領域と相同なＤＮＡ配列を用いた染色体への置換・挿入型の酵母の形質転換法であっても良い。さらに酵母細胞への本発明に係る発現ベクターの導入方法は、一般的実験書または学術論文などに記載されたいかなる方法によってもよい。
本発明に係る発現ベクターを、上記酵母宿主に導入するのみならず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌、ＣＯＳ細胞等の動物細胞、Ｓｆ９等の昆虫細胞、あるいはアブラナ科等に属する植物などに導入して形質転換体を得ることもできる。細菌を宿主とする場合は、本発明に係る発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、本発明に係るＤＮＡ断片、リボソーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
細菌への本発明に係る発現ベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞などが用いられる。動物細胞への本発明に係る発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への本発明に係る発現ベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。
植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞などが用いられる。植物への本発明に係る発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法およびＰＥＧ法等が挙げられる。
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
本発明に係るタンパク質の製造方法は、本発明に係るＤＮＡ断片及び本発明に係るＤＮＡ断片の下流に外来遺伝子を連結した発現ベクターを宿主に導入することによって形質転換体を作製し、該形質転換体を培養温度を低下させて培養することにより下流にある外来遺伝子にコードされたタンパク質を生産する方法である。培養温度としては例えば１０℃以下が挙げられる。例えば、低温域に棲息する生物が有する低温活性酵素および不凍タンパク質などの中には、熱に非常に不安定であるために常温で生産することにより変性してしまう場合がある。このような場合において、本発明に係る低温誘導性プロモーターの下流に上記低温活性酵素又は不凍タンパク質をコードする遺伝子を連結した発現ベクターを酵母に導入し、その系の温度を酵母の至適培養温度約３０℃から低温（例えば１０℃）に低下させることにより、本発明に係るＤＮＡ断片の下流の遺伝子に対するｍＲＮＡを増加させることができ、活性型タンパク質の効率的な発現系を構築することが可能となる。
さらにタンパク質分解酵素のように、生産するタンパク質（酵素）が細胞障害性を示す場合においては、組換え体の成長を阻害するために生産することが非常に困難である。この場合、本発明に係るタンパク質の製造方法を用いることで、まず至適培養温度（約３０℃）において外来遺伝子産物の生産量を抑えつつ組換え体を増殖させ、十分に菌体が得られた時点で温度を低下させることによって、細胞毒性を抑えつつ誘導生産することが可能となる。また、近年細胞内タンパク質の動態解析やバイオモニタリングのために繁用される蛍光タンパク質ＧＦＰにおいては、組換え体内で生産された際に、蛍光を発するタンパク質構造に変化するために成熟過程を必要とすることが知られている。この成熟過程が低温において促進されると考えられており、実際通常の培養温度よりも低温で生産させることにより、より高い蛍光が得られる（松崎ら、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３「ＧＦＰとバイオイメージング」羊土社（２０００）ｐｐ．３１−３７）。したがって本発明に係るタンパク質の製造方法によって、より高感度にＧＦＰを利用したバイオモニタリングを行うことが可能となる。
また本発明に係るＲＮＡ生産制御方法は、本発明に係るＤＮＡ断片及び本発明に係るＤＮＡ断片の下流に外来ＤＮＡ断片を連結した後、宿主に導入することによって形質転換体を作製し、該形質転換体を培養温度を低下させて培養することにより下流にある外来ＤＮＡ断片によってＲＮＡ生産を制御する方法である。培養温度としては１０℃以下が挙げられる。例えば本発明に係る低温誘導性プロモーターの下流に特定の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子を連結した発現ベクターを酵母に導入し、その系の温度を酵母の至適培養温度約３０℃から低温（例えば１０℃）に低下させることにより、本発明に係るＤＮＡ断片の下流の遺伝子に対応するアンチセンスＲＮＡの含量を増加させることで、特定の遺伝子の発現を制御することが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１は、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＨＳＰ１２  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図２は、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＤＢＰ２  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図３は、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＮＳＲ１  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図４は、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＡＡＨ１  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図５は、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＹＫＲ０７５Ｃ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図６は、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＯＬＥ１  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図７は、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＡＣＴ１  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図８は、ｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５をレポーターベクターとして、ＤＢＰ２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰ  ＤＮＡの５’側上流に連結したプラスミドの構造を示したものである。またＤＮＡ配列Ａ（ＧＣＴＣＡＴＣＧ）の位置と、この配列を除去するためのＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲのプライマー（ＲＰＣ１９−ＤＢＰ２  ＩＧＲ−ｃｉｓ  ＦおよびＲＰＣ１９−ＤＢＰ２  ＩＧＲ−ｃｉｓＲについては、それぞれＤＢＰ２−ｃｉｓ  ＦおよびＤＢＰ２−ｃｉｓ  Ｒと略記されている）の位置も示している。
図９は、ＤＢＰ２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片とＥＧＦＰ  ＤＮＡとを連結した際の、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１０は、ＤＢＰ２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰ  ＤＮＡに対して逆方向に連結した際の、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１１は、ＨＭＴ１のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片とＥＧＦＰ  ＤＮＡを連結した際の、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１２は、ＨＭＴ１のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰ  ＤＮＡに対して逆方向に連結した際の、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１３は、ＨＳＰ１２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片とＥＧＦＰ  ＤＮＡを連結した際の、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１４は、ＨＳＰ１２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰ  ＤＮＡに対して逆方向に連結した際の、培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１５は、ＤＮＡ配列Ａ（ＧＣＴＣＡＴＣＧ）を含むＤＢＰ２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片から該配列を除いた改変されたＤＢＰ２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片（右）および完全なＤＢＰ２のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片（左）を用いた培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１６は、ＤＮＡ配列Ｂ（ＧＡＧＡＴＧＡＧ）を含むＨＭＴ１のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片から該配列を除いた改変されたＨＭＴ１のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片（右）と完全なＨＭＴ１のプロモーターの機能を有するＤＮＡ断片（左）を用いた培養温度を３０℃から１０℃に低下させた時のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の変化を示すノーザンブロット分析の結果である。上部に低温処理後の培養時間を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがｍＲＮＡ量を示している。
図１７は、上段にＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーターまたはＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドの構築物、中段および下段にＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片の転写活性を、酵母においてＡＤＨ１プロモーターおよびＴＤＨ３プロモーターの転写活性と比較するために行った、ノーザンブロット分析の結果を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量を示している。
図１８は、上段にＴＤＨ３プロモーターまたはＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドの構築物、下段にはＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いた場合のタンパク質生産能を、酵母においてＴＤＨ３プロモーターのタンパク質生産能と比較するために行った、ウエスタンブロット分析の結果を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがＥＧＦＰタンパク質量を示している。
図１９は、上段にＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片、ＥＧＦＰのＯＲＦおよびＣＹＣ１ターミネーターを含む発現カセットを、それぞれの本来のプロモーターを除いたセントロメアを複製開始点とするｐＵＧ３５、２μを複製開始点とするｐＹＥＳ２、または２μを複製開始点としかつ弱いロイシン合成酵素遺伝子（ｌｅｕ２−ｄ）を有するｐＹＥＸ−ＢＸに挿入した発現プラスミドの構築物、中段および下段にＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片の転写活性化能がプラスミド自体の構造に依存しないことを示すノーザンブロット分析の結果を示す。各レーン中のドットの濃さおよび大きさがＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量を示している。
図２０は、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片のタンパク質生産能が、プラスミド自体の構造に依存しないことを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果である。各レーン中の矢印で示したバンドの濃さおよび大きさがＥＧＦＰタンパク質量を示している。
図２１は、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片のタンパク質生産能が、酵母サッカロミセス・セレビシエの株に依存しないことを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果である。各レーン中の矢印で示したバンドの濃さおよび大きさがＥＧＦＰタンパク質量を示している。
図２２は、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現ベクターのタンパク質生産能が、酵母の既存の発現ベクターよりも優れていることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果である。各レーン中の矢印で示したバンドの濃さおよび大きさがＥＧＦＰタンパク質量を示している。
図２３は、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現ベクターのタンパク質生産能が、広い低温域で誘導されることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果である。各レーン中の矢印で示したバンドの濃さおよび大きさがＥＧＦＰタンパク質量を示している。
図２４は、メタノール酵母ピキア・パストリスにＨＳＰ１２プロモーター、ＥＧＦＰのＯＲＦ、ＣＹＣ１ターミネーターを含むカセットを組み込み、ＥＧＦＰタンパク質がピキア・パストリス内で低温により誘導生産されたことを示すウエスタンブロット分析の結果である。
図２５は、不凍タンパク質ＲＤ３が、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片により可溶性タンパク質として発現したことを示すウエスタンブロット分析の結果である。各レーンのバンドの濃さおよび大きさがＲＤ３タンパク質量を示している。
図２６は、２種の蛍光タンパク質、ＥＣＦＰおよびＤｓＲｅｄを、ｐＬＴｅｘ３２１を用いて低温誘導により発現させた結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１  低温誘導性遺伝子の同定
酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入）を１０ｍｌのＹＥＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％バクトイーストエクストラクト、２％グルコース）に一白金耳植菌し、３０℃で２日間振とう培養した。この培養液から５ｍｌを１０００ｍｌのＹＥＰＤ培地に植菌し、６００ｎｍにおける吸光度が約２になるまで３０℃で振とう培養した（培養液１）。
この培養液１から５０ｍｌを分取して集菌し（低温処理前サンプル）、酵母菌体を液体窒素で凍結させ、−８０℃ディープフリーザーにてＲＮＡ調製時まで保管した。培養液１の残りはすみやかに予め１０℃に設定した振とう水浴に浸し、３０分間振とうして、急冷した。次いで、予め１０℃に設定しておいた低温恒温槽に移し、１０℃での振とう培養を続けた。１０℃の振とう水浴に培養液を浸した時点を０分として、１５分、３０分、２時間、４時間、８時間後に上記と同じ方法で５０ｍｌの培養液を分取し（低温処理後サンプル）、酵母菌体を回収し、−８０℃で保管した。
回収した酵母菌体からのＲＮＡ調製は、ホットフェノール法に従って行った。回収した酵母菌体に予め６５℃に加温したＮａＯＡｃ／ＳＤＳ溶液（２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）、０．５％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１０ｍｌを加え、さらに６５℃に加温した２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）飽和フェノールを加えた。６５℃で１０分間よく撹拌し、次いで氷中で５分間冷却した。遠心分離をして水層を回収した後、エタノール３０ｍｌを加え、−８０℃で３０分間冷却し、遠心分離によりＲＮＡを回収した。上層を捨てた後、７０％エタノールを加えて洗浄後、再び遠心分離し、ＲＮＡを沈殿として回収した。このＲＮＡをＮａＯＡｃ／ＳＤＳ  １ｍｌに溶かした後、フェノール抽出を２回行った。次いで２−プロパノール５００μｌを加えて−８０℃で２０分間冷却し、遠心分離によってＲＮＡを回収し、上記のように７０％エタノールで洗浄した。さらに沈殿として回収されたＲＮＡをＮａＯＡｃ／ＳＤＳ  ２００μｌに溶解し、上記のようにエタノール沈殿および７０％エタノール洗浄を行った。最終的に蒸留水２００μｌにＲＮＡを溶かした後、小分子ＲＮＡを除去するために、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、添付のプロトコルに従ってＲＮＡを精製した。
蛍光色素で標識されたＤＮＡは、上記のように調製した酵母全ＲＮＡ１５μｇとオリゴ（ｄＴ）５μｇを用い、ＤＮＡチップ研究所のマニュアルに従って作製した。蛍光色素標識にはアマシャムバイオテク社のＣｙ３−ｄＵＴＰ（低温処理前サンプル）、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（低温処理後サンプル）を用いた。また、ＤＮＡマイクロアレイと標識したｃＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡチップ研究所のマニュアルに従って行った。
ハイブリダイゼーションを行い、洗浄したＤＮＡマイクロアレイはＡｘｏｎ社ＧｅｎｅＰｉｘ４０００ＡおよびＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏプログラムを用いて分析し、ＤＮＡマイクロアレイ上にスポットされた各遺伝子にハイブリダイズしているＣｙ３由来の蛍光およびＣｙ５由来の蛍光の強度を測定した。次いで、得られたデータをＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇプログラムで解析し、データの平均化、標準化、および時系列解析を行った。操作法はこれらのプログラムのマニュアルに従った。
この解析を行った結果、１５分、３０分、２時間、４時間、８時間のいずれかの時点でＣｙ５（低温処理後サンプル）の蛍光強度がＣｙ３（低温処理前）サンプルの蛍光強度の３倍以上である遺伝子スポットについて低温誘導性プロモーターに支配された遺伝子と判定し、ＤＮＡチップ研究所から提供された遺伝子の配置図から遺伝子名を特定した。このようにして同定された低温誘導性遺伝子としては新規な遺伝子を以下の表４に記載する。
2004003197.tif 000008
2004003197.tif 000009
2004003197.tif 000010
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表４には、酵母の系統的遺伝子名、通称名（与えられている場合のみ）（これらの遺伝子名および通称名は、酵母ゲノムデータベース（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／）を参照されたい）および低温処理前サンプルの蛍光強度の標準化した値に対する各時間の低温処理後サンプルの蛍光強度の標準化した値の比を併記してある。
実施例２  低温誘導性遺伝子の低温誘導性の確認
ＤＮＡマイクロアレイ解析によって同定された低温誘導性遺伝子について、その低温誘導性を確認するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの方法に従ってノーザンブロット分析を行った。ノーザンブロット分析によってＲＮＡの量を測定するために、まず目的とするＲＮＡを特異的に検出するためのプローブＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって調製した。本実施例においては、実施例１において同定された低温誘導性遺伝子の１つであるＹＦＬ０１４Ｗ（ＨＳＰ１２）のＤＮＡプローブを作製した際の方法を具体的に示す。サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株のゲノムＤＮＡならびにＨＳＰ１２遺伝子のＯＲＦ内の塩基配列に相補的なＨＳＰ１２−ＦプライマーおよびＨＳＰ１２−Ｒプライマーを用い、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して、マニュアルに従ってＴａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰによりＨＳＰ１２フラグメント約３３０塩基を増幅した。
プライマーの配列は、以下の通りである。なおプライマーの位置については、上述の酵母ゲノムデータベースを参照されたい。
2004003197.tif 000015
またＰＣＲは、各々のプライマー３００ｎＭ、ｄＮＴＰ（４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液）２００μＭ、サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株のゲノムＤＮＡ  １００ｎｇならびにＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍに添付されたバッファー（１  Ｘ）およびＥｘｐａｎｄ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ２．６Ｕを含む反応溶液１００μｌを用いて、第１ステップ：９５℃で２分、第２ステップ：９５℃で３０秒（変性）、５５℃で３０秒（アニーリング）および７２℃で１分（伸長）のサイクルを３５サイクルおよび第３ステップ：７２℃で５分で行った。
次いで、調製したＨＳＰ１２フラグメントをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と連結し、該ベクターを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。幾つかの形質転換体を試験管で培養した後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素による切断パターンから目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。次に得られた形質転換体を８０ｍｌの培養液で培養し、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）を用いてプラスミドを調製した。得られたＨＳＰ１２フラグメントの塩基配列をＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析を行い、得られた塩基配列をゲノムデータベース（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／）のＨＳＰ１２の塩基配列と比較して同定した。次いで、ＨＳＰ１２フラグメントを含むｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクターから制限酵素によりＨＳＰ１２フラグメントを切りだし、低融点アガロース（ＦＭＣ社）を用いたアガロース電気泳動によりＨＳＰ１２フラグメントを分離、回収した。このＨＳＰ１２フラグメントをＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ（アマシャムバイオテク社）を用いて、添付のプロトコルに従ってアルカリフォスファターゼ標識した。
同様にして、ＹＮＬ１１２Ｗ（ＤＢＰ２）、ＹＧＲ１５９Ｃ（ＮＳＲ１）、ＹＮＬ１４１Ｗ（ＡＡＨ１）、ＹＫＲ０７５Ｃ、ＹＧＬ０５５Ｗ（ＯＬＥ１）、およびＹＦＬ０３９Ｃ（ＡＣＴ１）についてもそれぞれＯＲＦ内の塩基配列に相補的なプライマーを用いて、同様な操作によりノーザンブロット用プローブを作製した。
プライマーの配列は以下の通りである。
2004003197.tif 000016
2004003197.tif 000017
ＮＳＲ１、ＡＡＨ１及びＹＫＲ０７５ＣのＰＣＲは、上記のＨＳＰ１２フラグメントの増幅と同様の条件で行った。ＤＢＰ２のＰＣＲは、上記のＨＳＰ１２フラグメントの増幅の条件において、第２ステップのアニーリング温度を５５℃から４７℃および伸長反応時間（７２℃）を１分から１．５分に変更したこと以外は同様の条件で行った。ＯＬＥ１とＡＣＴ１については、ＰＣＲは各々のプライマー２００ｎＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株のゲノムＤＮＡ  １μｇならびに１  Ｘ天然型Ｐｆｕポリメラーゼバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを含む反応溶液１００μｌを用いて、第１ステップ：９４℃で２分、第２ステップ：９４℃で３０秒（変性）、５５℃で３０秒（アニーリング）および７２℃で３分（伸長）のサイクルを２５サイクルおよび第３ステップ：７２℃で５分で行った。なおＯＬＥ１とＡＣＴ１については、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡはリン酸化せずに、直接ＥｃｏＲＶによって予め切断したｐＺＥｒ０２ベクター（インビトロゲン）にサブクローニングした。
次いで実施例１のように調製したＲＮＡ  １０μｇを用いて、１％変性アガロースゲル電気泳動を行い、次いでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムバイオテク社）に一晩でＲＮＡを転写した。このフィルターと調製した標識ＨＳＰ１２フラグメントのハイブリダイゼーションをＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅのプロトコルに従って行い、次いでＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャムバイオテク社）を用いて、ハイブリッド形成したＨＳＰ１２  ｍＲＮＡをＸ線フィルムへの感光によって検出、定量した。また同様に、ＥＣＦ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、精製した蛍光物質の濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ社Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  Ｐｒｏにより検出、定量を行った。その結果を図１に示す。図１よりＨＳＰ１２  ｍＲＮＡが培養温度を１０℃に低下させた後４時間以降増加していることが明らかとなった。同様にして、ＤＢＰ２、ＮＳＲ１、ＡＡＨ１、ＹＫＲ０７５Ｃ、ＯＬＥ１およびＡＣＴ１についてのノーザンブロット分析の結果を図２、３、４、５、６、７に示す。ＤＢＰ２、ＮＳＲ１、ＡＡＨ１、ＹＫＲ０７５Ｃでは培養温度を１０℃に低下させて１時間後に低温処理前サンプルよりもｍＲＮＡ量が増加していた。一方、ＯＬＥ１では同様に低温処理による増加を示し、２時間で最大のｍＲＮＡ量となった。なお、ＤＮＡマイクロアレイの結果において、低温処理によってもｍＲＮＡが変化しない陰性対照としてＡＣＴ１を用いてノーザンブロット分析を行った場合には、やはり低温処理によりそのｍＲＮＡ量はほとんど変化しなかった（図７）。これらの結果より、ＨＳＰ１２、ＤＢＰ２、ＮＳＲ１、ＡＡＨ１、ＹＫＲ０７５Ｃ、およびＯＬＥ１の全ての場合において、ＤＮＡマイクロアレイによって得られた低温処理によるｍＲＮＡ量の増加をノーザンブロット分析によって確認することができた。従って、これらの遺伝子について、低温に応答してｍＲＮＡ量を増産させるプロモーターがそれぞれの遺伝子の５’上流側の非翻訳領域に存在することが示された。
実施例３  低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片による下流のＤＮＡ配列の低温誘導
低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を単離し、異種のＤＮＡを下流側に連結することにより、下流のＤＮＡからのＲＮＡの生産を低温処理により誘導できることを以下のように確認した。まず、ＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を単離した。ＤＢＰ２の５’上流隣接遺伝子はＹＮＬ１１３Ｗ（ＲＰＣ１９）であるため、このＲＰＣ１９及びＤＢＰ２に挟まれた領域（すなわち、ＤＢＰ２の５’上流側の非翻訳領城）を、それぞれＲＰＣ１９のＯＲＦに隣接した３’下流側の２４塩基（ＲＰＣ１９−ＤＢＰ２  ＩＧＲ  Ｆ）及びＤＢＰ２のＯＲＦに隣接した５’上流側の２８塩基（ＲＰＣ１９−ＤＢＰ２  ＩＧＲ  Ｒ）からなるプライマーならびにサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって単離した。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000018
ＰＣＲは、上記のＨＳＰ１２フラグメントの増幅と同様の条件で行った。
次いで単離したＤＮＡをレポータープラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５中の改良緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＯＲＦの上流に以下のようにして挿入した。なお、ｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５プラスミドはｐＵＧ３５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｐｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｐｒｏｊ／ｙｅａｓｔ／ｉｎｆｏ／ｔｏｏｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）をＸｂａ  ＩとＳａｃ  Ｉで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、自己環状化させることによって作製した。ｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５プラスミドをＳａｌ  Ｉで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端へ変換した。次いで、ＰＣＲによって単離したＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡキナーゼおよびＡＴＰを用いて両末端の水酸基をリン酸化した。このＤＢＰ２のプロモーターの機能を有するリン酸化したＤＮＡ断片と平滑末端化したｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５プラスミドとをＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて、添付のプロトコルに従って連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた幾つかの形質転換体を３ｍｌの培養液で一晩培養した後に、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを調製し、制限酵素の切断パターンから目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。なお、この際にＥＧＦＰ  ＯＲＦに対して上流にＤＢＰ２プロモーターが隣接した位置関係にあるプラスミド（正方向；図８）、および逆にＲＰＣ１９側に隣接していた領域がＥＧＦＰのＯＲＦに対して直ぐ上流に連結されたプラスミド（逆方向）の両方を単離した。次にそれぞれについて得られた形質転換体を８０ｍｌの培養液で培養し、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを調製した。このプラスミドを用いて酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００を形質転換した。この形質転換はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従った。得られた形質転換酵母を３０℃で培養し、６００ｎｍの吸光度が１となった時点で０分のサンプルリングを行い、続けて培養温度を３０℃から１０℃に低下させて培養を続け、同様にサンプリングを行った。
これらのサンプルから実施例２と同様の方法で酵母からＲＮＡを調製し、ノーザンブロット分析でＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量を測定した。なお、ノーザンブロット分析のためのプローブは、ｐＧＦＰｕｖ（クロンテック社）を制限酵素Ｐｓｔ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩで切断し、ＧＦＰフラグメントを回収して用いた。実施例２と同様の方法でノーザンブロット分析を行い、この結果を図９に示す。図９より、ＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いることで、その下流に配置したＤＮＡの転写を低温処理によって増加させることができることが証明された。また、ｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５にＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を逆向きに挿入した場合には低温誘導性が見られなかったため（図１０）、図９に示される低温による転写活性化はＤＢＰ２プロモーターの働きによることが確認された。
同様に実施例１で低温誘導性遺伝子として同定されたＹＢＲ０３４Ｃ（ＨＭＴ１）及びＹＦＬ０１４Ｗ（ＨＳＰ１２）の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片についても低温誘導性を確認した。
まず上記のＤＢＰ２と同様に、ＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を単離した。ＨＭＴ１の５’上流隣接遺伝子はＹＢＲ０３５Ｃ（ＰＤＸ３）であるため、ＰＤＸ３及びＨＭＴ１に挟まれる領域（すなわち、ＨＭＴ１の５’上流側の非翻訳領域）を、それぞれＰＤＸ３のＯＲＦに隣接した３’下流側の２５塩基（ＰＤＸ３−ＨＭＴ１  ＩＧＲ  Ｆ）及びＨＭＴ１のＯＲＦに隣接した５’上流側の２５塩基（ＰＤＸ３−ＨＭＴ１  ＩＧＲ  Ｒ）からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によって単離した。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000019
ＰＣＲは、第２ステップにおいてアニーリング温度を５５℃から５０℃に変更した以外は上記のＨＳＰ１２フラグメントの増幅と同様の条件で行った。
上記のＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片の場合と同じ方法により得られたＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５に挿入し（このとき、逆方向に該ＤＮＡ断片が挿入されたものも調製した）、上記同様にＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ増加を指標として低温誘導性の確認を行った。その結果、ＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰのすぐ上流に正しい方向に配置した場合には低温誘導性が確認できたが（図１１）、逆方向に挿入した場合には低温誘導性が見いだされなかった（図１２）。以上のことから、ＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いることにより、下流のＤＮＡの転写を低温により誘導することができることが示された。
さらにＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を単離した。ＨＳＰ１２の５’上流隣接遺伝子はＹＦＬ０１５Ｃであったが、両遺伝子が近接しておりまたＤＮＡの反対鎖にコーディング領城があったため、ＹＦＬ０１５Ｃ遺伝子を一部を含むＹＦＬ０１５Ｃ及びＨＳＰ１２に挟まれる領域（すなわち、ＨＳＰ１２の５’上流側の非翻訳領域）を、それぞれＹＦＬ０１５ＣのＯＲＦ内アンチセンス鎖内の１９塩基（−６１０  ＨＳＰ１２）及びＨＳＰ１２のＯＲＦに隣接した５’上流側の２８塩基（ＨＳＰ１２  ＩＧＲ  Ｒ）からなるプライマーを用いてＰＣＲ法によって単離した。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000020
ＰＣＲは第２ステップにおいてアニーリング温度を５５℃から５０℃に変更した以外は上記のＨＳＰ１２フラグメントの増幅と同様の条件で行った。
上記のＤＢＰ２又ＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片の場合と同じ方法により得られたＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５に挿入し（このとき、逆方向に該ＤＮＡ断片が挿入されたものも調製した）、上記同様にＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ増加を指標として低温誘導性の確認を行った。その結果、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰのすぐ上流に正しい方向に配置した場合は低温誘導性が確認できたが（図１３）、逆方向に挿入した場合には低温誘導性が見いだされなかった（図１４）。以上のことからＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いることにより、下流のＤＮＡの転写を低温により誘導することができることが示された。
実施例４  低温誘導性シス配列の同定
初期に低温誘導性を示す遺伝子の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片におけるシス配列は以下のように同定した。実施例１の実験において、まず１０℃に培養温度を低下させてから１５分後にシグナルが２倍以上に上がった遺伝子を同定した。同定された４１個の遺伝子を下記の表５に示す。
2004003197.tif 000021
表５には、表４と同様に酵母の系統的遺伝子名、通称名（与えられている場合のみ）および低温処理前サンプルの蛍光強度の標準化した値に対する１５分間の低温処理後サンプルの蛍光強度の標準化した値の比を併記してある。
次いでＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いて、それらの各々の遺伝子のＯＲＦから６００ｂｐ上流までの間に存在するシス配列を検索した。その結果、これらの遺伝子の一部に共通して存在するＤＮＡ配列として得ることができた。
シス配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000022
具体的には、上記のＤＮＡ配列ＡはＹＮＬ１１２Ｗ（ＤＢＰ２）、ＹＧＲ１５９Ｃ（ＮＳＲ１）、ＹＧＬ０５５Ｗ（ＯＬＥ１）、ＹＮＲ０５３Ｃ、ＹＰＬ０９３Ｗ（ＮＯＧ１）、ＹＨＲ１７０Ｗ（ＮＭＤ３）およびＹＨＲ１４８Ｗ（ＩＭＰ３）（表５の番号２９〜３５に対応する）に共通して存在するシス配列として、またＤＮＡ配列ＢがＹＢＲ０３４Ｃ（ＨＭＴ１）、ＹＯＬ０１０Ｗ（ＲＣＬ１）、ＹＫＬ０７８Ｗ、ＹＭＲ２９０Ｃ（ＨＡＳ１）、ＹＤＲ１０１ＣおよびＹＢＬ０５４Ｗ（表５の番号３６〜４１に対応する）に共通して存在するシス配列として見出された。
実施例５  低温誘導性シス配列の低温誘導性の確認
実施例４で得られたＤＮＡ配列Ａ（ＧＣＴＣＡＴＣＧ）が低温誘導性を有していることを確認するために、該配列が存在するＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片から該配列を除去することによって低温誘導性が失われるか否かを確認した。まず、実施例３においてＰＣＲ法によって調製したＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片とｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクターとをＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、該ベクターを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、配列解析を行い、塩基配列を確認した。次いで、該プラスミド中のＤＮＡ配列Ａの両隣に位置する配列に相補的な外向きのプライマーを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲによって、ＤＮＡ配列Ａを除くプラスミド全体を増幅した（図８参照）。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000023
ＰＣＲは、上記のＨＳＰ１２フラグメントの増幅の条件において、第２ステップでアニーリング温度を５５℃から５０℃および伸長反応時間（７２℃）を１分から５分に変更し、ならびに第３ステップで時間を５分から１０分に変更したこと以外は同様の条件で行った。
増幅されたＤＮＡをＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて自己環状化し、再び大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。次いで、得られた幾つかの形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を決定することによって、ＤＮＡ配列Ａのみが除去され、ＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片の他の塩基配列は変化していないクローンを同定した。次いでその改変クローンを鋳型として、実施例３と同じ方法により改変されたＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、リン酸化した後ｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５に挿入して、レポータープラスミドを作製した。酵母サッカロミセス・セレビシエをこのレポータープラスミドを用いて形質転換し、実施例３と同様にしてサンプルを調製し、ノーザンブロット分析を行った。その結果を図１５に示す。図１５に示されるように、完全なＤＢＰ２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰ  ＤＮＡの上流に連結した場合（図１５  ＋ｃｉｓ）に比べて、前記ＤＮＡ断片からＤＮＡ配列Ａを除去することにより低温誘導性が弱くなった（図１５  −ｃｉｓ）ことから、ＤＮＡ配列Ａが低温誘導に関与しているシス配列であることが確認できた。
同様にして、ＤＮＡ配列Ｂ（ＧＡＧＡＴＧＡＧ）が存在するＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片から該配列を除去することによってＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片の低温誘導性が失われるか否かについて検討した。ＤＮＡ配列Ａの場合と同様の方法によって、まずＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクターに挿入し、該プラスミド中のＤＮＡ配列Ｂの両隣に位置する配列に相補的な外向きのプライマーを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った後、同様の解析を行った。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000024
2004003197.tif 000025
なおＰＣＲは、上記のＤＢＰ２の５’上流側非翻訳領域からシス配列を除くためのＰＣＲと同様の条件で行った。
ノーザンブロットの分析の結果を図１６に示す。完全なＨＭＴ１の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＥＧＦＰ  ＤＮＡの上流に連結した場合（図１６＋ｃｉｓ）に比べて、前記ＤＮＡ断片からＤＮＡ配列Ｂを除去することにより低温誘導性が失われた（図１６  −ｃｉｓ）ことから、ＤＮＡ配列Ｂが低温誘導に関与しているシス配列であることを確認した。
実施例６  低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片によるタンパク質の発現および他の酵母プロモーターとの比較
低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いて、下流に連結した外来遺伝子を発現できることを以下のように確認した。また、その発現系としての有用性を実証するために、既知のプロモーターとの比較を行った。具体的には、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用い、これをアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ１）プロモーターおよびグリセロアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＴＤＨ３）プロモーターと比較した。下記のように同じプラスミド構造を持つ３種の発現ベクターを作製して比較した。
ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドは実施例３に記述したものを用いた。
ＡＤＨ１プロモーターを含むプラスミドは次のように作製した。まず、ＡＤＨ１プロモーターを有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（大阪大学佐藤名誉教授より分与；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１，１９２−２０１（１９８３））をＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）によって平滑末端化した後に、アガロース電気泳動によるＤＮＡ断片の分画を行い、ＡＤＨ１プロモーターを含む断片（約４００ｂｐ）を回収した。一方、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片の場合と同様に、プラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５をＳａｌＩで切断し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔによって平滑末端化した後に、細菌アルカリホスファターゼによる脱リン酸化を行った。上記のＡＤＨ１プロモーターを含む断片とプラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、ＡＤＨ１プロモーターを有する発現プラスミドを調製した。
ＴＤＨ３プロモーターを含むプラスミドは次のように作製した。まず、ＴＤＨ３プロモーターを有する酵母発現ベクターｐＧ−３（新日本化学株式会社  長島直氏より分与；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，３８９−３９８（１９９１））をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて平滑末端化した後に、アガロース電気泳動によるＤＮＡ断片の分画を行い、ＴＤＨ３プロモーターを含む断片（約６６０ｂｐ）を回収した。得られたＤＮＡ断片を、上記と同様の方法でプラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５のＳａｌＩ位置に挿入し、目的の構造を持つプラスミドを保有した形質転換体を選抜し、最終的にＴＤＨ３プロモーターを有する発現プラスミドを調製した。
これら３種のプラスミドはプロモーター以外は同一の構造を有している。これら３種のプラスミドを用いて、それぞれ酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００を形質転換した。得られた形質転換酵母をウラシルを含まない合成培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸を含まない）、２％グルコース、０．０２ｍｇ／ｍｌ硫酸アデニン、０．０２ｍｇ／ｍｌトリプトファン、０．０２ｍｇ／ｍｌヒスチジン、０．０３ｍｇ／ｍｌロイシン、０．０３ｍｇ／ｍｌリシン）に植菌し、３０℃で振とう培養した。ＡＤＨ１プロモーターを含む発現プラスミドで形質転換した酵母およびＴＤＨ３プロモーターを含む発現プラスミドで形質転換した酵母については、６００ｎｍの吸光度が約１．３になった時点で培養液を回収した。ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現プラスミドで形質転換した酵母は、６００ｎｍの吸光度が０．５になった時点で培養液をフラスコごと予め１０℃に設定しておいた水浴に浸し、１５分間ゆっくりと振とうしながら急冷した。このフラスコを、予め１０℃に設定しておいた低温恒温槽に移し、１０℃で振とう培養を続けた。１０℃の水浴に培養液を浸した時点を０分として、経時的にサンプリングした。酵母からのＲＮＡの抽出は実施例１と同様に行った。調製したＲＮＡ１０μｇを用いて実施例２の方法によってノーザンブロット分析を行った。その結果を図１７に示す。
図１７の中段には、３種類のプラスミドで形質転換した酵母の培養温度を３０℃あるいは３０℃から１０℃に低下させたときのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの量を示している。通常３０℃で用いられるＡＤＨ１プロモーターとＴＤＨ３プロモーターから生産されるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量を、３０℃から１０℃に温度を低下させた酵母内のＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片から生産されるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量と比較した結果を経時的に示している。下段には、中段の結果からＡＤＨ１プロモーターとの比較において相対的に強かったＴＤＨ３プロモーターについて、３０℃および、３０℃から１０℃に温度を低下させた酵母内のＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片から生産されるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量と比較した結果を経時的に示している。
この結果より、既知のプロモーターであるＡＤＨ１プロモーターまたはＴＤＨ３プロモーターを用いたときよりも、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いた場合に高いＥＧＦＰ  ｍＲＮＡレベルが得られることがわかった。
次に、ＡＤＨ１プロモーターよりも高いｍＲＮＡレベルを示したＴＤＨ３プロモーターを対照とし、タンパク質生産レベルについてＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片と比較した。サンプリングは上記と同様に行った。サンプリング後、遠心分離によって回収した酵母は、５ｍＭ  ＤＴＴ存在下で、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ  Ｙ（Ｓｉｇｍａ）およびＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、それぞれのマニュアルに記載された濃度となるように添加し、４℃で１時間激しく攪拌して溶解させた。次いで、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を全タンパク質抽出液として、以後の解析に用いた。全タンパク質抽出液３０μｇを一般的な方法（タンパク質実験ノート、岡田雅人・宮崎香編、羊土社などに記載）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）に供し、マニュアルに記載された方法により分離されたタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。その後、１０００倍希釈した抗ＧＦＰ抗体（Ｌｉｖｉｎｇ  ＣｏｌｏｒｓＴＭ  Ａ．ｖ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び、ＥＣＬ  ＰＬＵＳ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、それぞれのマニュアルに従ってウエスタンブロット分析を行い、ＥＧＦＰタンパク質を検出した。その結果を図１８に示す。
図１８の下段には、ＴＤＨ３プロモーターまたはＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドで形質転換した酵母の培養温度を３０℃から１０℃に低下させたときのＥＧＦＰタンパク質量を経時的に示している。
この結果より、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を利用して１０℃で誘導生産させた場合に、既存のＴＤＨ３プロモーターを用いて３０℃で生産させた場合よりも多量のタンパク質が生産できることが示された。
実施例７  低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む他の発現ベクターの構築と他の酵母（サッカロミセス・セレビシエ）株によるタンパク質の発現
最初に、ＥＧＦＰの前後にさまざまな制限酵素認識部位を組み込んだプラスミドを作製した。まず、プラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５を用い、ＰＣＲ法によってＥＧＦＰのＯＲＦを増幅した。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000026
ＥＧＦＰ３  ＯＲＦ  Ｆは、実施例３で用いたプラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５中ＥＧＦＰ開始コドンＡＴＧを含む下流２９ｂｐであり、ＥＧＦＰ３  ＯＲＦ  ＲはＥＧＦＰ終止コドンを含む上流２９ｂｐに相補的な配列であった。
ＰＣＲは、プラスミドｐＵＧ３５１ｎｇ、アニーリング温度を５０℃とし、３０サイクルの反応を行ったこと以外は実施例２のＨＳＰ１２フラグメントの増幅と同じ条件で行った。増幅したＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａｋａＲａ）でリン酸化した。一方、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）をＥｃｏＲＩで切断したのち、ＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔを用いて平滑末端化し、さらに細菌アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。増幅したＥＧＦＰのＯＲＦと平滑末端化したｐＹＥＳ２とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結させた後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドｐＹＥＳ２＋ＥＧＦＰ３を調製した。
次いで、セントロメアを複製開始点とするプラスミドを作製するために、プラスミドｐＹＥＳ２＋ＥＧＦＰ３をＨｐａＩおよびＭｌｕＩで切断し、約４５０ｂｐからなるＤＮＡ断片を回収した。一方、実施例３で作製したＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含むｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５（以下、ｐＵＧ３５＋ＰＨＳＰ１２と呼ぶ）を同様にＨｐａＩおよびＭｌｕＩで切断し、該ｐＵＧ３５＋ＰＨＳＰ１２（約６ｋｂ）に上記の約４５０ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドｐＵＧ３５＋ＰＨＳＰ１２＋ＭＣＳを調製した。
また、２μを複製開始点とするプラスミドを作製するために、得られたプラスミドｐＵＧ３５＋ＰＨＳＰ１２＋ＭＣＳをＳｐｅＩおよびＭｌｕＩを用いて切断し、アガロース電気泳動により発現ユニット（約１．６ｋｂ）の分画と回収を行った。一方、ｐＹＥＳ２を同じくＳｐｅＩおよびＭｌｕＩを用いて切断し、アガロース電気泳動でｐＹＥＳ２ベクター断片（約５．１ｋｂ）の分画と回収を行った。上記の発現ユニットとｐＹＥＳ２ベクター断片とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドｐＹＥＳ２＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３を調製した。
さらに、２μを複製開始点とし、弱いロイシン合成酵素遺伝子（ｌｅｕ２−ｄ）を有するプラスミドを作製するために、上記のプラスミドｐＵＧ３５＋ＰＨＳＰ１２＋ＭＣＳをＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを用いて切断し、アガロース電気泳動によりＥＧＦＰ３発現ユニットを含むＤＮＡ断片（約１．７ｋｂ）を得た。一方、ｐＹＥＸ−ＢＸ（ＡＭＲＡＤ  Ｂｉｏｔｅｃｈより購入）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを用いて切断し、アガロース電気泳動によりｐＹＥＸ−ＢＸベクター断片（約６．３ｋｂ）の回収を行った。上記のＥＧＦＰ３発現ユニットを含むＤＮＡ断片とｐＹＥＸ−ＢＸベクター断片とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドｐＹＥＸ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１を調製した。
これら３種のプラスミドを用いて、それぞれ酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例６と同じくウラシルを含まない合成培地に植菌し、３０℃で振とう培養した。ただし、プラスミドｐＹＥＸ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１については、弱いロイシン合成酵素遺伝子を有しているため、上記の合成培地からさらにロイシンを除いた培地を用いる実験も行った。培養、サンプリング、ＲＮＡ調製、タンパク質調製、ノーザンブロット分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はいずれも実施例６と同様に行った。
図１９は、中段および下段において、これらのプラスミドで形質転換した酵母の培養温度を３０℃から１０℃に低下させたときのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの量を経時的に示している。さらに下段において、ｐＹＥＸ−ＢＸでは培養液からロイシンを除くことのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量に及ぼす効果も示している。
ノーザンブロット分析で調べた結果、複製開始点および選択マーカーの異なる３種のプラスミド（いずれもＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む）で形質転換した酵母は、いずれにおいても低温処理（１０℃）によりＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのレベルが上昇した。
また、図２０は、図１９に示されたプラスミドで形質転換した酵母の培養温度を３０℃から１０℃に低下させたときのＥＧＦＰタンパク質量を経時的に示している。さらに、ｐＹＥＸ−ＢＸでは培養液からロイシンを除くことのＥＧＦＰタンパク質量に及ぼす効果も示している。
図２０に示したように、２種のプラスミド  ｐＵＧ３５＋ＰＨＳＰ１２＋ＭＣＳおよびｐＹＥＸ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１で形質転換した酵母中におけるＥＧＦＰのタンパク質発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で調べた結果、いずれにおいても低温処理（１０℃）によりＥＧＦＰタンパク質のレベルが上昇し、多量のＥＧＦＰを生産可能であることが明らかとなった。特に、ｌｅｕ２−ｄマーカーを有したプラスミドを用い、ロイシン欠損培地を用いることにより顕著な生産量を示した。
以上の検討から、低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現プラスミドは、複製開始点および選択マーカーにかかわらず、低温によるタンパク質の誘導生産が可能であることがわかった。一方、複製開始点やマーカーの選択によって、生産量を増大させることが可能であることがわかった。
次に、酵母サッカロミセス・セレビシエの異なる株を用いたタンパク質発現を行った。異なる株として、ＹＰＨ４９９株、ＹＰＨ５０１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入）、ＳＨＹ３株、ＫＫ４株（大阪大学佐藤名誉教授より分与）、ＥＧＹ４８株（Ｔａｋａｒａ社より購入）、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、ＢＹ４７４３株（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より購入）を用いた。これらの酵母株を発現プラスミドｐＹＥＸ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１で形質転換し、実施例３と同様にそれぞれウラシルを除く必要なアミノ酸を加えた合成培地で生育させ、細胞内タンパク質を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図２１にｐＹＥＸ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１で形質転換した様々な株における培養温度を３０℃から１０℃に低下させたときのＥＧＦＰタンパク質量を示す。
全ての酵母株でＥＧＦＰの発現が観察されたことから、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片は、酵母株によらず機能することが明らかとなった。また、特にＥＧＹ４８株とＢＹ４７４３株を用いた場合にＥＧＦＰの高い生産量が得られた。
実施例８  低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現ベクターと既存の発現ベクターとの発現量の比較
ガラクトース誘導型ＧＡＬ１プロモーターを有するｐＹＥＳ２および重金属誘導型ＣＵＰ１プロモーターを有するｐＹＥＸ−ＢＸと、上記のＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現プラスミドｐＹＥＸ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１（以下、ｐＬＴｅｘ２２１＋ＥＧＦＰ３と呼ぶ）のＥＧＦＰ発現量を、それぞれの推奨誘導条件において比較した。ＥＧＦＰを含むｐＹＥＳ２については、実施例７で作製したプラスミドｐＹＥＳ２＋ＥＧＦＰ３を用いた。ＥＧＦＰを含むｐＹＥＸ−ＢＸについては、以下のように調製した。上記のプラスミドｐＹＥＳ２＋ＥＧＦＰ３をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロース電気泳動によりＥＧＦＰ３のＯＲＦ約７８０ｂｐの分画と回収を行った。一方、ｐＹＥＸ−ＢＸを、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断した。得られたＥＧＦＰ３のＯＲＦとｐＹＥＸ−ＢＸとを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドｐＹＥＸ−ＢＸ＋ＥＧＦＰ３を調製した。これら３種（ｐＹＥＳ２＋ＥＧＦＰ３、ｐＹＥＸ−ＢＸ＋ＥＧＦＰ３、ｐＬＴｅｘ２２１＋ＥＧＦＰ３）を用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株を形質転換した。得られた形質転換体を実施例６と同様な方法で培養、サンプリング、タンパク質調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図２２に示す。
図２２に示すように、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現ベクターｐＬＴｅｘ２２１＋ＥＧＦＰ３は、ｐＹＥＳ２＋ＥＧＦＰ３およびｐＹＥＸ−ＢＸ＋ＥＧＦＰ３よりもＥＧＦＰ３を多量に生産した。この結果より、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現ベクターが既存の発現ベクターよりも優れていることが明らかとなった。
実施例９  低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現ベクターを用いた場合の低温誘導条件
実施例７で作製したプラスミドｐＹＥＸ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１（ｐＬＴｅｘ２２１＋ＥＧＦＰ３）を用いて形質転換した酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株を用いて、低温誘導条件の検討を行った。本形質転換酵母を実施例８と同様な方法で培養、サンプリング、タンパク質の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。低温暴露は４℃、１０℃および２０℃で行い、サンプリングは０、６、１２、２４、４８、７２および９６時間後に行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図２３に示す。
図２３に示すように、４℃、１０℃および２０℃のいずれの温度を用いた場合にもＥＧＦＰタンパク質の生産が見られた。このことから、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いた低温誘導タンパク質生産は１０℃での低温処理のみならず、４℃あるいは２０℃でも可能であることがわかった。
実施例１０  サッカロミセス・セレビシエ以外の酵母における低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いたタンパク質生産
低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片がサッカロミセス・セレビシエ以外の酵母においても機能するか否かを調べるために、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片およびＥＧＦＰ３のＯＲＦをメタノール酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に導入した。
まず、実施例７で作製したｐＵＧ３５＋ＰＨＳＰ１２＋ＭＣＳをＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断し、アガロース電気泳動によりＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片、ＥＧＦＰ３のＯＲＦおよびＣＹＣ１ターミネーターを含むＤＮＡ断片約１．７ｋｂの分画と回収を行った。一方、ピキア・パストリス用プラスミドｐＰＩＣＺ−Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断し、ＡＯＸ１ターミネーターを除くプラスミド本体約３．０ｋｂをアガロース電気泳動により分画および回収した。上記のＤＮＡ断片とＡＯＸ１ターミネーターを除くプラスミドｐＰＩＣＺ−ＢとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドｐＰＩＣＺ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１を調製した。このプラスミドｐＰＩＣＺ＋ＰＨＳＰ１２＋ＥＧＦＰ３＋ＴＣＹＣ１を用いて、イージーセレクトＰｉｃｈｉａ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマニュアルに従い、ピキア・パストリスＧＳ１１５株を形質転換した。次いで、４ｍｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎに耐性がある株を選抜した。得られた形質転換体をＹＰＥＤ培地に植菌し、３０℃で６００ｎｍの吸光度が２．２となるまで培養した。次いで、実施例６と同様な方法で１０℃に培養温度を低下させ、３日後および１０日後にサンプリングした。タンパク質調製およびウエスタンブロット分析は実施例６と同様な方法で行った。ウエスタンブロット分析の結果を図２４に示す。図２４は、形質転換したピキア・パストリスを３０℃で培養した後に、培養温度を３０℃から１０℃に低下させて３日後および１０日後のＥＧＦＰタンパク質の発現を示している。
図２４に示すように、メタノール酵母ピキア・パストリスの培養温度を低下させることによりＥＧＦＰタンパク質が誘導生産された。この結果より、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いた低温誘導発現はサッカロミセス・セレビシエだけでなく、他の酵母でも可能であることが示された。
実施例１１  低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片によるＥＧＦＰ以外のタンパク質の発現
低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用いて、ＥＧＦＰ以外のタンパク質を発現できることを、以下のように確認した。具体的には、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を用い、このプロモーターの下流に不凍タンパク質の一種であるＲＤ３（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１３０４−１３１０（２００１））のｃＤＮＡを連結し、その発現をウエスタンブロット分析により確認した。なお、ＲＤ３タンパク質は、大腸菌を宿主とする発現系を用いた３７℃での発現では不溶化した。
ＲＤ３の発現プラスミドは次のように作製した。まず、ＲＤ３のＯＲＦを含むプラスミドｐＥＴ２０ｂ／ＲＤ３（当研究所西宮佳志氏より分与）を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔによって平滑末端化した後に、アガロース電気泳動によるＤＮＡ断片の分画を行い、ＲＤ３のＯＲＦを含むＤＮＡ断片（約４００ｂｐ）を回収した。一方、実施例３で作製したプラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５をＨｐａＩおよびＭｌｕＩで切断し、アガロース電気泳動によるＤＮＡ断片の分画を行い、約５．４ｋｂのベクター断片を回収した。同様に、実施例７で作製したｐＹＥＳ２＋ＥＧＦＰ３をＨｐａＩおよびＭｌｕＩで切断し、約４５０ｂｐからなる断片をアガロース電気泳動による分画、および回収を行った。得られた上記のベクター断片と約４５０ｂｐからなる断片とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結させた後、大腸菌ＤＨ５ａに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、目的のプラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５＋ＭＣＳを調製した。このプラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５＋ＭＣＳをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔによって平滑末端化した後に、細菌アルカリホスファターゼによる脱リン酸化を行った。その後、アガロース電気泳動により、ベクター断片（約５．１ｋｂ）を回収した。上記のＲＤ３のＯＲＦを含むＤＮＡ断片とベクター断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、ＲＤ３のＯＲＦを有するプラスミドｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５＋ＭＣＳ＋ＲＤ３を調製した。
次いで、さらにＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドを作製した。まず、実施例４の方法に従いＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後に、アガロース電気泳動によるＤＮＡ断片の分画を行い、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片（約６１０ｂｐ）を回収した。一方、ｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５＋ＭＣＳ＋ＲＤ３をＳｐｅＩで切断した後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔによって平滑末端化した後に、細菌アルカリホスファターゼによる脱リン酸化を行った。上記のＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、最終的にＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現プラスミドを調製した。
また、ＴＤＨ３プロモーターを含むプラスミドを次のように作製した。まず、ＴＤＨ３プロモーターを含む酵母発現ベクターｐＧ−３をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔによって平滑末端化した後に、アガロース電気泳動によるＤＮＡ断片の分画を行い、ＴＤＨ３プロモーターを含む断片（約６６０ｂｐ）を回収した。得られたＤＮＡ断片を、上記と同様の方法でｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５＋ＭＣＳ＋ＲＤ３のＳｐｅＩ部位に挿入し、目的の構造を持つプラスミドを保有した形質転換体を、制限酵素の切断パターンと配列解析により選抜し、最終的にＴＤＨ３プロモーターを含む発現プラスミドを調製した。
これら２種類のプラスミドは、プロモーター以外は同一の構造を有している。これら２種類のプラスミドを用いて、それぞれ酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株を形質転換した。得られた形質転換体をウラシルを含まない合成培地に植菌し、３０℃で振とう培養した。ＴＤＨ３プロモーターを含む発現プラスミドで形質転換した酵母については、６００ｎｍにおける吸光度が０．７になった時点で培養液を回収した。ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を含む発現プラスミドで形質転換した酵母については、６００ｎｍにおける吸光度が１．０になった時点で低温処理を開始した以外は、実施例６と同じ実験方法で培養およびサンプリングを行った。ウエスタンブロット分析では、５０００倍希釈した抗ＲＤ３−Ｎｌ抗体（ＲＤ３のサブユニットを認識する抗体、株式会社ホクドーに依頼して作製したもの）を用いた。形質転換した酵母を、それぞれ３０℃から１０℃に低下させた温度または３０℃で培養した場合のＲＤ３タンパク質の発現量を示すウエスタンブロット分析の結果を図２５に示す。この結果より、大腸菌発現系では不溶化するＲＤ３タンパク質も、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を利用して１０℃で誘導生産させた場合にほとんどが可溶性タンパク質として生産された。さらに既存のＴＤＨ３プロモーターを用いて３０℃で生産させた場合よりもＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を利用することで、多量のタンパク質を生産できることが確認できた。
次に、ＲＤ３と同様にＥＣＦＰおよびＤｓＲｅｄを発現させた。なお、ＥＣＦＰおよびＤｓＲｅｄを融合タンパク質ではなく、本来のタンパク質として生産させるために、それぞれｐＥＣＦＰおよびｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（いずれもクロンテック社より購入）から本来のタンパク質をコードするＯＲＦ領域をＰＣＲ法によって増幅し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社より購入）に導入した。これらの発現プラスミドを用いて大腸菌を形質転換したが、蛍光タンパク質に由来する蛍光は観察されなかった。
まず、マルチクローニングサイトを有する低温誘導発現ベクターｐＬＴｅｘ３２１の構築を行った。ｐＵＧ３５−ＭＥＴ２５＋ＭＣＳをＣｌａＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロース電気泳動により、ベクター断片（約５．１ｋｂｐ）を回収した。一方、このベクター断片を環状化させるため、下記のオリゴＤＮＡを合成し、リンカーとして用いた。
2004003197.tif 000027
該リンカーＤＮＡは、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｃＩ−ＳａｌＩ−ＣｌａＩの制限酵素サイトを含んでいる。両オリゴＤＮＡをアニーリングした後、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩで該リンカーＤＮＡの両末端を切断した。上記のベクター断片とリンカーＤＮＡとを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より目的のプラスミドを調製した。
得られたプラスミドは、さらに、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロース電気泳動でベクター断片（約５．１ｋｂ）を回収した。得られたベクター断片にＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を導入するため、下記のプライマーを用いたＰＣＲにより、ＳｐｅＩ認識配列およびＢａｍＨＩ認識配列を含むＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、実施例２におけるＨＳＰ１２フラグメントの増幅条件と同様に行った。
2004003197.tif 000028
その後、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで切断処理した後、アガロース電気泳動によって分画し、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片（約６００ｂｐ）を回収した。
上記のベクター断片とＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、目的のプラスミドを調製した。
得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＫｐｎＩで切断し、アガロース電気泳動により、ＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片、マルチクローニングサイトおよびＣＹＣ１ターミネーターを含むＤＮＡ断片（約１ｋｂ）を回収した。同様にｐＹＥＸ−ＢＸ発現ベクターをＳｐｅＩおよびＫｐｎＩで切断し、アガロース電気泳動により、ベクター断片（約６．４ｋｂ）を回収した。上記のＨＳＰ１２の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片、マルチクローニングサイトおよびＣＹＣ１ターミネーターを含むＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、発現ベクターｐＬＴｅｘ３２１を調製した。
一方、ＥＣＦＰの発現プラスミドは次のように作製した。まず、プラスミドｐＥＣＦＰからＥＣＦＰのＯＲＦをＰＣＲにより調製した。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000029
ＢＡＭＣＦＰ１は、５’側から順に４塩基のＡ、ＢａｍＨＩ認識配列、６塩基のＡ、およびｐＥＣＦＰ中のＥＣＦＰのＯＲＦの開始コドンから下流２１ｂｐを含む。また、ＨＮＤＣＦＰ２は、５’側から順に４塩基のＴ、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、ＥＣＦＰのＯＲＦの終止コドンから上流２１塩基に相補的な配列を含む。
ＰＣＲは、ｐＥＣＦＰ  １ｎｇ、各々のプライマー３００ｎＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、ＭｇＳＯ４  １ｍＭならびにＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−用の１ｘＰＣＲバッファー（東洋紡社）およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕを含む反応溶液５０μｌを用いて、第１ステップ：９４℃で２分、第２ステップ：９４℃で１５秒（変性）、４５℃で３０秒（アニーリング）および６８℃で１分（伸長）のサイクルを３０サイクルで行った。次いで、増幅されたＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。一方、上記のように作製した発現ベクターｐＬＴｅｘ３２１をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。上記のＰＣＲにより増幅されたＥＣＦＰのＯＲＦとｐＬＴｅｘ３２１ベクター断片とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社）を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、ＥＣＦＰを有するプラスミドｐＬＴｅｘ３２１＋ＥＣＦＰを調製した。
―方、ＤｓＲｅｄについては、プライマーとして下記のものを用い、ＰＣＲ用の鋳型としてｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓを用いたこと以外は上記のＥＣＦＰと同じ条件でｐＬＴｅｘ３２１＋ＤｓＲｅｄを作製した。
プライマーの配列は以下の通りであった。
2004003197.tif 000030
ＢＡＭＲＥＤ１は、５’側から順に４塩基のＡ、ＢａｍＨＩ認識配列、６塩基のＡ、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ中のＤｓＲｅｄのＯＲＦの開始コドンから下流２１ｂｐを含む。また、ＨＮＤＲＥＤ２は、５’側から順に４塩基のＡ、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、ＤｓＲｅｄのＯＲＦの終止コドンから上流２１塩基に相補的な配列を含む。
このように作製した２種類のプラスミドを用いて、それぞれ酵母サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００株を形質転換した。得られた形質転換体をウラシルとロイシンを含まない合成培地中で３０℃で振とう培養し６００ｎｍの吸光度がおよそ０．９になった時点で１０℃で低温処理し、１０℃で２４時間培養を続けた。蛍光タンパク質の発現は、ＵＶランプ（３５６ｎｍ）による蛍光にて確認した。その結果を図２６に示す。図２６に示されるように、ＥＣＦＰ発現酵母、ＤｓＲｅｄ発現酵母はいずれにおいても生産された蛍光タンパク質による強い蛍光が観察された。
本明細書中に引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明により酵母の低温誘導性プロモーターの機能を有するＤＮＡ断片が提供される。本発明に係るＤＮＡ断片は、低温によるタンパク質の製造およびＲＮＡの生産制御に使用できる点で有用である。本発明により、従来発現が困難であったタンパク質の生産など、低温の利点を生かした新規なタンパク質生産系が開発される。また、本発明により、低温誘導性の分子機構の解明が前進すると考えられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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