(57)【要約】本発明は、イネＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子を提供することを目的とする。本発明の遺伝子は、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸を含む。本発明の遺伝子は、好ましくは配列番号６９−７４、８０−８５又は配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に記載の塩基配列を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入することにより、イネの稔性を回復する方法。
【請求項２】
配列番号７５のアミノ酸配列をコードする核酸をイネに導入することにより、イネの稔性を回復する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸が、以下のａ）−ｐ）の核酸から選択される、請求項１又は２に記載の方法：
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
【請求項４】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸が、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす、請求項３に記載の方法：
１）配列番号６９の塩基１７６９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号７０の塩基１７６７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号７１の塩基１７７２に相当する塩基がＡである；
４）配列番号７２の塩基１７６２に相当する塩基がＡである；
５）配列番号７３の塩基１７０３に相当する塩基がＡである；
６）配列番号７４の塩基１７７９に相当する塩基がＡである；
７）配列番号８０の塩基１７８３に相当する塩基がＡである；
８）配列番号８１の塩基１７２９に相当する塩基がＡである；
９）配列番号８２の塩基１７８１に相当する塩基がＡである；
１０）配列番号８３の塩基１７７４に相当する塩基がＡである；
１１）配列番号８４の塩基１７２８に相当する塩基がＡである；又は
１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する塩基がＡである。
【請求項５】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸を利用して被検定イネ個体又は種子が稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１遺伝子）を有するか否かを識別する方法。
【請求項６】
以下のａ）−ｐ）の核酸；
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸
のいずれかを利用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸が、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす場合に被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有すると判断する、請求項５又は６に記載の方法：
１）配列番号６９の塩基１７６９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号７０の塩基１７６７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号７１の塩基１７７２に相当する塩基がＡである；
４）配列番号７２の塩基１７６２に相当する塩基がＡである；
５）配列番号７３の塩基１７０３に相当する塩基がＡである；は
６）配列番号７４の塩基１７７９に相当する塩基がＡである；
７）配列番号８０の塩基１７８３に相当する塩基がＡである；
８）配列番号８１の塩基１７２９に相当する塩基がＡである；
９）配列番号８２の塩基１７８１に相当する塩基がＡである；
１０）配列番号８３の塩基１７７４に相当する塩基がＡである；
１１）配列番号８４の塩基１７２８に相当する塩基がＡである；又は
１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する塩基がＡである。
【請求項８】
ｉ）以下のいずれかの塩基、
１）配列番号６９の塩基１７６９に相当する塩基；
２）配列番号７０の塩基１７６７に相当する塩基；
３）配列番号７１の塩基１７７２に相当する塩基；
４）配列番号７２の塩基１７６２に相当する塩基；
５）配列番号７３の塩基１７０３に相当する塩基；
６）配列番号７４の塩基１７７９に相当する塩基；
７）配列番号８０の塩基１７８３に相当する塩基；
８）配列番号８１の塩基１７２９に相当する塩基；
９）配列番号８２の塩基１７８１に相当する塩基；
１０）配列番号８３の塩基１７７４に相当する塩基；
１１）配列番号８４の塩基１７２８に相当する塩基；及び
１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する塩基
を含む隣接領域の塩基配列に基づいて、上記塩基と隣接領域の双方を増幅するようにプライマー対を作成し；
ｉｉ）被検定イネ個体又は種子のゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い；そして
ｉｉｉ）前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子の有無を識別する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｉｉｉ）が、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす場合に被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有すると判断する、請求項８に記載の方法：
１）配列番号６９の塩基１７６９に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
２）配列番号７０の塩基１７６７に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
３）配列番号７１の塩基１７７２に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
４）配列番号７２の塩基１７６２に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
５）配列番号７３の塩基１７０３に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
６）配列番号７４の塩基１７７９に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
７）配列番号８０の塩基１７８３に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
８）配列番号８１の塩基１７２９に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
９）配列番号８２の塩基１７８１に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
１０）配列番号８３の塩基１７７４に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
１１）配列番号８４の塩基１７２８に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；又は
１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない。
【請求項１０】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも１００塩基の長さのアンチセンスを導入することにより、Ｒｆ−１遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法。
【請求項１１】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸が、以下のａ）−ｐ）の核酸から選択される、請求項１６に記載の方法：
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
【請求項１２】
配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸。
【請求項１３】
以下のａ）−ｐ）の核酸から選択される、請求項１１に記載の核酸：
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、イネＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子に関する。
本出願は、２００２年７月５日に提出された日本特許出願  特願２００２−１０７５６０号を基礎とする優先権主張出願である。当該日本特許出願の内容は全て本明細書に援用される。
【背景技術】  イネは自殖性植物であるため、品種間で交雑を行う場合には、まず自家受精を避けるためにイネの穎花が開花する直前に穎花内の雄しべを全て取り除き、次いで交雑をする花粉親品種由来の花粉を用いて受精させる必要がある。しかしながら、このような手作業による交雑方法で商業的規模での大量の雑種種子を生産することは不可能である。
そこで、ハイブリッドライスの生産には、細胞質雄性不稔を利用する三系法が利用されている。三系法とは、雄性不稔細胞質を保有する系統である不稔系統、Ｒｆ−１遺伝子を保有する系統である回復系統、および核遺伝子は不稔系統と同一であって不稔細胞質を保有しない系統である維持系統とを使用する方法をいう。これらの３系統を用いて、（ｉ）不稔系統に回復系統の花粉を受精させることによりハイブリッド種子を獲得することができ、（ｉｉ）一方、不稔系統に維持系統の花粉を受精させることにより不稔系統を維持することができる。
三系法でＢＴ型雄性不稔細胞質を利用するにあたっては、回復系統のイネを育成するために、育種における各過程で育成中のイネがＲｆ−１遺伝子を保有すること、また、最終段階ではＲｆ−１遺伝子をホモで保有することを確認する必要がある。また、三系法において、回復系統に使用する品種が確実にＲｆ−１遺伝子を保有することを調べたり、得られたハイブリッド種子が稔性を回復しているか確認するために、Ｒｆ−１遺伝子の存在を調べる必要が生じる場合もある。
従来、植物体中でのＲｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定するためには、まず、検定系統と交配を行った交配種子から植物体（Ｆ１）を形成し、次いでＦ１植物を自殖させてその種子の形成率が一定以上（例えば７０〜８０％以上）である個体の出現頻度を調査する必要があった。なお、検定系統とは、維持系統、不稔系統あるいは両系統のセットを指し、目的とする被検定個体の細胞質がＢＴ型か通常細胞質か、あるいは不明かにより適宜選択するものである。不稔系統を検定系統として用いる場合は母親として、維持系統を検定系統として用いる場合は父親として、それぞれ被検定個体に交配する。
しかしながら、これらの方法を行うには、莫大な労力と時間を要する。また、種子稔性は、環境要因の影響を受けやすいので、低温・日照不足などの不良環境で調査すれば、遺伝子型の構成によらず不稔になる場合があり、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型推定が正確に行えないという問題を有していた。
このような問題を解消するために、最近では、分子生物学的方法によりＲｆ−１遺伝子の存在を判別する方法も提案されている。それは、Ｒｆ−１遺伝子と連鎖する塩基配列（以下、ＤＮＡマーカーという）を検出することにより、Ｒｆ−１遺伝子の存在または不存在を調べる方法である。因みに、Ｒｆ−１遺伝子のＤＮＡ配列は未解読であるため、直接Ｒｆ−１遺伝子を検出することは、現在の技術では不可能であった。
例えば、イネのＲｆ−１遺伝子座は第１０染色体上に存在し、そして、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析に使用することができるＤＮＡマーカー（ＲＦＬＰマーカー）座Ｇ２９１とＧ１２７との間であることが報告されている（Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｊｐｎ  Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２（ｓｕｐｌ．１）１６４−１６５）。このため、Ｒｆ−１遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカー座Ｇ２９１およびＧ１２７の遺伝子型を調査することにより、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定することが可能である。
しかしながら、従来の分子生物学的方法にはいくつかの問題が存在する。第一の問題は、従来の方法では、使用するマーカーがＲＦＬＰマーカーであり、これを検出するためにはサザンブロット解析を行う必要があるという点である。サザンブロット解析を行うためには、被検定個体から数マイクログラム単位の精製されたＤＮＡを必要とし、さらに制限酵素処理、電気泳動、ブロッティング、プローブとのハイブリダイゼーション、およびシグナルの検出からなる一連の作業手順を行う必要があるため、多大な労力が必要であるうえに、検定結果を得るまでに１週間程度かかっていた。
第二の問題は、ＲＦＬＰマーカー座Ｇ２９１とＧ１２７の間の遺伝子地図距離は約３０ｃＭ（イネＤＮＡでは約９０００ｋｂｐに相当する）と長いため、二重組換えが起こる可能性が数％程度はあると考えられ、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型が必ずしも正確に推定できないことである。
さらに第三の問題は、Ｒｆ−１遺伝子の存在をＲＦＬＰマーカー座Ｇ２９１およびＧ１２７の遺伝子型を調査することにより推定する場合、選抜の結果育成される稔性回復系統には、Ｒｆ−１遺伝子と共に、ＲＦＬＰマーカー座Ｇ２９１とＧ１２７の間の遺伝子領域も導入されるという点である。その結果、導入ＤＮＡ配列は３０ｃＭ以上のＲｆ−１遺伝子ドナー親由来の染色体領域を有することになり、導入ＤＮＡ領域中に存在する可能性がある劣悪遺伝子をＲｆ−１遺伝子と同時に導入してしまう危険性があった。
このような問題を解決するため、Ｒｆ−１遺伝子座と連鎖する優性ＤＮＡマーカー（特開平７−２２２５８８）および共優性ＤＮＡマーカー（特開平９−３１３１８７）が開発されている。これらのマーカーは、Ｒｆ−１遺伝子座とそれぞれ、１．６±０．７ｃＭ（イネＤＮＡでは約４８０ｋｂｐに相当）および３．７±１．１ｃＭ（イネＤＮＡでは約１１１０ｋｂｐに相当）の遺伝的距離で連鎖しており、両座はＲｆ−１遺伝子座を挟む位置関係にある。そのため、優性ＰＣＲマーカー座および共優性ＰＣＲマーカー座は、これらが両方とも存在することを検出することにより、Ｒｆ−１遺伝子の存在を推定することができる。また、共優性ＰＣＲマーカーの使用は、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型がホモかヘテロかも推定することを可能にする。
しかしながら、これらのＰＣＲマーカーを使用する場合にも、依然としていくつかの問題がある。この共優性マーカーはＲｆ−１遺伝子座と３．７±１．１ｃＭの遺伝距離を有するため、Ｒｆ−１遺伝子座との間での組換え頻度が高いという問題が十分には解決されていない。その結果、共優性マーカー自体についてはホモ型またはヘテロ型まで正確に検出することができるが、共優性マーカー座とＲｆ−１遺伝子座との間で組換えが生じる場合に、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型の推定、特にホモ型またはヘテロ型までの推定を正確に実施できないという問題がある。一方、優性マーカーを使用してＲｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定する場合、優性マーカーではＲｆ−１遺伝子がホモの個体（Ｒｆ−１／Ｒｆ−１）およびヘテロの個体（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の両方を区別することなく検出してしまう。そのため、上記共優性マーカーと優性マーカーとを組み合わせて利用してＲｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定したとしても、Ｒｆ−１遺伝子に関するホモ型とヘテロ型とを正確に識別することはできない。また、優性マーカーを用いて行うＰＣＲでは、ＰＣＲ産物が得られなかった場合には、実験操作上の問題に起因する可能性も否定できない。さらに、これらの共優性マーカーと優性マーカーとの間の遺伝的距離が約５．３ｃＭ（約１５９０ｋｂｐ）と離れているため、Ｒｆ−１遺伝子ドナー親からの導入染色体領域長を短い長さに限定することができないので、この領域中に含まれる劣悪遺伝子の持ち込みを抑制できないという問題点も有している。
さらに、特開２０００−１３９４６５には、イネ第１０染色体のＲｆ−１遺伝子の近傍に座乗するＲＦＬＰマーカーの塩基配列に基づいて開発された、共優性ＰＣＲマーカーが記載されている。しかしながら、それらのＰＣＲマーカーは、依然としてＲｆ−１遺伝子からの遺伝的距離が約１ｃＭより離れているという問題を有している。
【発明の開示】
本発明は、イネの稔性を回復する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入する、ことを含む。本発明の方法の、好ましい一態様において、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸は、以下のａ）−ｐ）の核酸から選択される：
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
本発明の方法において、上記配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸は、好ましくは、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす：
１）配列番号６９の塩基１７６９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号７０の塩基１７６７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号７１の塩基１７７２に相当する塩基がＡである；
４）配列番号７２の塩基１７６２に相当する塩基がＡである；
５）配列番号７３の塩基１７０３に相当する塩基がＡである；
６）配列番号７４の塩基１７７９に相当する塩基がＡである；
７）配列番号８０の塩基１７８３に相当する塩基がＡである；
８）配列番号８１の塩基１７２９に相当する塩基がＡである；
９）配列番号８２の塩基１７８１に相当する塩基がＡである；
１０）配列番号８３の塩基１７７４に相当する塩基がＡである；
１１）配列番号８４の塩基１７２８に相当する塩基がＡである；又は
１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する塩基がＡである。
本発明はまた、上記配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸を利用して、被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有するか否かを識別する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、一態様において、好ましくは、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸が、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす場合に被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有すると判断する：
１）配列番号６９の塩基１７６９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号７０の塩基１７６７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号７１の塩基１７７２に相当する塩基がＡである；
４）配列番号７２の塩基１７６２に相当する塩基がＡである；
５）配列番号７３の塩基１７０３に相当する塩基がＡである；
６）配列番号７４の塩基１７７９に相当する塩基がＡである；
７）配列番号８０の塩基１７８３に相当する塩基がＡである；
８）配列番号８１の塩基１７２９に相当する塩基がＡである；
９）配列番号８２の塩基１７８１に相当する塩基がＡである；
１０）配列番号８３の塩基１７７４に相当する塩基がＡである；
１１）配列番号８４の塩基１７２８に相当する塩基がＡである；又は
１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する塩基がＡである。
本発明は、さらに、Ｒｆ−１遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法を提供することを目的とする。本発明の抑制方法は、一態様において、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも１００塩基の長さのアンチセンスを導入する、ことを含む。
本発明はさらにまた、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、を提供することを目的とする。本発明は、一態様において、以下のａ）−ｐ）
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸
から選択される核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＲＦＬＰマーカー座Ｓ１２５６４を起点とする染色体歩行の結果を示す。
図２は、ＢＡＣクローンＡＣ０６８９２３とラムダクローンコンティグとの位置関係を示す。
図３は、Ｒｆ−１座極近傍組換え型花粉（いずれも稔性あり）のＲｆ−１座極近傍の染色体構成を、その花粉から生じた１０個体（ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＣ１−８）のマーカー座の遺伝子型に基づき、明らかにした結果を示したものである。白抜き部分はジャポニカ型領域を、黒部分はインディカ型領域を示す。
図４は、第１０染色体上のマーカー座とＲｆ−１座との連鎖分析の結果に基づき、Ｒｆ−１座の連鎖地図上での位置を示したものである。地図距離は、１０４２Ｆ１個体の分離データから算出した。
図５は、相補性試験によるＲｆ−１領域の同定のために使用した、１０個のゲノムクローン由来の断片を示す。染色体歩行により得られたλクローン（細い線）を用いて、太い直線で示した染色体領域について相補性試験を行った。ＸＳＦ１８は、欠失を含むクローンであることが分かったので、その欠失部分は点線で示した。
図６は、ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ（実施例１０）及びＸＳＦ１８由来の１６．２ｋｂ断片（実施例８）を用いた相補性試験の結果を示す。ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂでは稔性が回復し、稲穂がたれている。
図７は、Ｒｆ−１遺伝子構造の模式図を示す。白棒部分および黒線部分は、それぞれエキソンおよびイントロンを示す。エキソン部分については、塩基対数を示してある。
図８は、相補性試験を行ったＩＲ２４ゲノム断片、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに用いたプローブ及び単離したｃＤＮＡから推定したＲｆ−１遺伝子の位置関係の模式図を示す。Ｒｆ−１遺伝子の白棒部分および黒線部分は、それぞれ、エキソンおよびイントロンを示す。エキソン部分については、塩基対数を示してある。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者らは、まず、Ｒｆ−１の存在部位を第１０染色体上の極めて狭い範囲に特定した。その結果に基づいて、Ｒｆ−１遺伝子座の近傍に存在するＰＣＲマーカーを開発し、これらのＰＣＲマーカーが、Ｒｆ−１遺伝子座と連鎖することを利用して、Ｒｆ−１遺伝子を検出する方法が見出された。具体的には、Ｒｆ−１遺伝子座が、イネ第１０染色体上に存在するＰＣＲマーカー座Ｓ１２５６４Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間に座乗することを利用して、近傍に存在する新規のＰＣＲマーカー座の遺伝子型を調査することにより、Ｒｆ−１遺伝子の有無の調査およびＲｆ−１遺伝子ホモ型個体の選抜を実施する。当該Ｒｆ−１遺伝子を検出する方法につき、本発明者らは、平成１２年８月１７日に特願２０００−２４７２０４として特許出願を行っている。当該出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。
Ｉ．  特願２０００−２４７２０４に記載のＲｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定する方法
特願２０００−２４７２０４は、Ｒｆ−１遺伝子座がイネ第１０染色体上のＲＦＬＰマーカー座Ｓ１２５６４座とＣ１３６１座との間に座乗することを利用して、被検定イネ個体または種子がＲｆ−１遺伝子を持つか否かを識別する方法について記載している。
マーカー
Ｒｆ−１遺伝子座の近傍に存在する特定の領域に対して設計したプライマー対を用いてＰＣＲを行い、その産物を特定の制限酵素で処理後電気泳動にかけると、ジャポニカ系統とインディカ系統との間で、異なる大きさのバンドが観察されることがある。そのような場合、インディカ系統に特徴的なバンドをＲｆ−１連鎖バンドとする。本発明者らにより、Ｒｆ−１遺伝子座は、イネ第１０染色体上に存在するＰＣＲマーカー座Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間に座乗することが明らかにされ、その周辺でのＰＣＲマーカーは当業者が適宜開発して使用可能となった。
例えば、下記の群から選択されるＰＣＲマーカーの少なくとも１個を被検体イネのゲノム中に存在するか否か検出することにより、被検定個体がこれらのＰＣＲマーカーと連鎖するＲｆ−１遺伝子を持つか否かを識別する：
（１）マーカー１：  配列番号１および配列番号２の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＲ１８７７  ＥｃｏＲＩ；
（２）マーカー２：  配列番号３および配列番号４の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＧ４００３  ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１９）；
（３）マーカー３：  配列番号５および配列番号６の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＭｗｏＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＣ１３６１  ＭｗｏＩ（配列番号２０）；
（４）マーカー４：  配列番号７および配列番号８の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＭｗｏＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＧ２１５５  ＭｗｏＩ（配列番号２１）；
（５）マーカー５：  配列番号９および配列番号１０の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＭｓｐＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＧ２９１  ＭｓｐＩ（配列番号２２）；
（６）マーカー６：  配列番号１１および配列番号１２の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＢｓｌＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＲ２３０３  ＢｓｌＩ（配列番号２３）；
（７）マーカー７：  配列番号１３および配列番号１４の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＢｓｔＵＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＳ１００１９  ＢｓｔＵＩ（配列番号２４）；
（８）マーカー８：  配列番号１５および配列番号１６の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素ＫｐｎＩ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＳ１０６０２  ＫｐｎＩ（配列番号２５）；および
（９）マーカー９：  配列番号１７および配列番号１８の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、得られた産物中の、制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉ認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディカ系統のイネの間の多型を検出する、ＰＣＲマーカーＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ（配列番号２６）。
なお、上記ＰＣＲマーカーは、Ｒｆ−１遺伝子座が、イネ第１０染色体上の９個のＲＦＬＰマーカー領域Ｒ１８７７、Ｇ２９１、Ｒ２３０３、Ｓ１２５６４、Ｃ１３６１、Ｓ１００１９、Ｇ４００３、Ｓ１０６０２、およびＧ２１５５付近に座乗する可能性が高いと考え（Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｊｐｎ  Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２（ｓｕｐｌ．１）１６４−１６５によるＲＦＬＰ連鎖解析結果、およびＨａｒｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４８  ４７９−４９４によるイネＲＦＬＰ連鎖地図を参照）、これらのＲＦＬＰマーカーを、後記参考例１に記載するようにして、共優性ＰＣＲマーカーであるＣＡＰＳマーカーまたはｄＣＡＰＳマーカー（Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ａｎｄ  Ａｍａｓｉｎｏ  １９９８，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４（３）３８１−３８５；Ｎｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４（３）  ３８７−３９２）に変換した。この変換により、上記ＰＣＲマーカーが得られた。
これらのＰＣＲマーカーのうち、ＰＣＲマーカーＲ１８７７  ＥｃｏＲＩ、Ｇ２９１  ＭｓｐＩ（配列番号２２）、Ｒ２３０３  ＢｓｌＩ（配列番号２３）およびＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ（配列番号２６）からなる群と、ＰＣＲマーカーＣ１３６１  ＭｗｏＩ（配列番号２０）、Ｓ１００１９  ＢｓｔＵＩ（配列番号２４）、Ｇ４００３  ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１９）、Ｓ１０６０２  ＫｐｎＩ（配列番号２５）、およびＧ２１５５  ＭｗｏＩ（配列番号２１）からなる群とは、第１０染色体上でＲｆ−１遺伝子座を挟んで反対側に存在する。
従って、一態様において、（ａ）ＰＣＲマーカーＲ１８７７  ＥｃｏＲＩ、Ｇ２９１  ＭｓｐＩ、Ｒ２３０３  ＢｓｌＩおよびＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉからなる群から選択される少なくとも１個のＰＣＲマーカー、並びに（ｂ）ＰＣＲマーカーＣ１３６１  ＭｗｏＩ、Ｓ１００１９  ＢｓｔＵＩ、Ｇ４００３  ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ１０６０２  ＫｐｎＩ、およびＧ２１５５  ＭｗｏＩからなる群から選択される少なくとも１個のＰＣＲマーカーによりＲｆ−１連鎖バンドを検出することにより、Ｒｆ−１遺伝子の存在を検出する。その際、上記（ａ）の群からＲｆ−１遺伝子に最も近いマーカーとして、少なくともＰＣＲマーカーＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉおよび上記（ｂ）の群から少なくともＣ１３６１  ＭｗｏＩを使用することが好ましい。被検定イネのゲノム中に、（ａ）のＰＣＲマーカーによるＲｆ−１連鎖バンドと（ｂ）のＰＣＲマーカーによるＲｆ−１連鎖バンドの両方が検出されれば、そのイネがＲｆ−１遺伝子を有する可能性を高い確率で推定することができる。
別の態様においては、上記（ａ）の群から少なくとも二つのＰＣＲマーカー、及び（ｂ）の群から少なくとも二つのＰＣＲマーカーによりＲｆ−１連鎖バンドを検出する。例えば、（ａ）及び（ｂ）の群のマーカーのうち、図１に示す遺伝子地図において、Ｒｆ−１遺伝子により近いマーカーによりＲｆ−１連鎖バンドが検出され、それよりＲｆ−１遺伝子から遠いマーカーによりＲｆ−１連鎖バンドが検出されないイネ個体を選抜することにより、Ｒｆ−１遺伝子を有するが、不要な遺伝子領域をできるだけ含まないイネを選抜することが可能である。この場合も、（ａ）及び（ｂ）の各群のマーカーのうち少なくとも一つは、それぞれＰＣＲマーカーＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９ＩおよびＣ１３６１  ＭｗｏＩであることが好ましい。すなわち、２種のＰＣＲマーカー座Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１  ＭｗｏＩは、マーカー座間距離にして０．３ｃＭ離れている。この性質を利用することにより、Ｒｆ−１遺伝子ドナー親から導入する染色体領域を１ｃＭ程度に狭めることができる。その結果、ドナー親のＲｆ−１遺伝子近傍に存在する可能性がある劣悪遺伝子が回復系統に導入される可能性を最小限に抑えることができる。
Ｒｆ−１遺伝子の検出
被検定イネゲノム中のＲｆ−１遺伝子を検出するには、上記配列番号１−１８のプライマーを用いて、被検定イネゲノムから上記ＰＣＲマーカーのいずれかをＰＣＲで増幅させ、ポリメラーゼ連鎖反応−制限酵素断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法で検出する。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、比較する品種系統間において、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片配列中の制限酵素認識部位に多型が存在する場合に、その制限酵素による切断パターンからいずれの型であるかを簡便に決定する方法である（Ｄ．Ｅ．Ｈａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ（１９９８）９７：３２７−３３６）。
制限酵素による切断パターンとしては、可視化されたゲル上に、使用したプライマー対に応じて、以下の表１のようなバンドの存在の有無が確認される。
2004005515.tif 000002
2004005515.tif 000003
2004005515.tif 000004
ＩＩ．  Ｒｆ−１遺伝子座領域の特定
以上、特願２０００−２４７２０４において、Ｒｆ−１遺伝子座がＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間に座乗することが本発明者らにより明らかにされ、これを利用したＲＦＬＰ−ＰＣＲ用マーカーが記載されている。Ｒｆ−１遺伝子を持たない通常のジャポニカ品種に、戻し交雑によりＲｆ−１遺伝子を導入することにより回復系統が育成される。その過程で、特願２０００−２４７２０４に記載のＲｆ−１遺伝子座の識別方法を用いると、回復系統の育成が効率的（必要期間は２〜３年）になるだけでなく、導入断片長を制御することができる。
しかしながら、交雑による導入では、Ｒｆ−１極近傍領域をも同時に導入することは避けられない。特願２０００−２４７２０４において、Ｒｆ−１遺伝子座がＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間に座乗することが解明されたが、両遺伝子座は約０．３ｃＭ、即ち約９０ｋｂｐである。仮にＲｆ−１極近傍に劣悪遺伝子が存在すれば、Ｒｆ−１遺伝子ともにその劣悪遺伝子も導入される可能性が否定できない。
そこで、本発明者らはＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１  ＭｗｏＩ座の間の領域について、Ｒｆ−１遺伝子座とＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉとが密接連鎖することを手がかりに、染色体歩行および遺伝学的解析を行うことにより、Ｒｆ−１遺伝子と連鎖する領域を調べた。その結果、Ｒｆ−１遺伝子を含むＲｆ−１遺伝子座領域を約７６ｋｂまで特定し、そして当該領域の全塩基配列を決定することに成功した。本発明により、ＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子の機能を遺伝子工学的に導入することが可能となった。
具体的には、特願２０００−２４７２０４では、ＭＳコシヒカリにＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１座ヘテロ）の花粉をかけて作成した集団１０４２個体を用いて連鎖分析を行い、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を２個体見出した（本明細書中の参考例１−２）。本発明では、上記集団をさらに４１０３個体追加し、合計５１４５個体として解析を行った。その結果、新たに、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を６個体見出し、それぞれの組換え個体の合計を２個体および８個体とした。これら１０個体をＲｆ−１座極近傍組換え個体として、本発明の高精度分離分析に供試することとした（実施例１）。
Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体が２個体に対し、Ｃ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体が８個体という上記の組換え個体出現頻度は、Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座とを比較すると、Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座のほうが遺伝学的にＲｆ−１座に近いことを意味する。遺伝的距離（組換え価ｃＭが単位）と物理的距離（塩基対数ｂｐが単位）とは必ずしも比例しないが、通常は遺伝的距離が短ければ物理的距離も短いと期待できる。
そこで、Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座を起点に染色体歩行を行うことにより、Ｒｆ−１座を単離することとした（実施例２）。染色体歩行には、インディカ品種ＩＲ２４およびジャポニカ品種あそみのりのゲノムＤＮＡを用いてλ  ＤＡＳＨ  ＩＩベクターにより作成したゲノミックライブラリーを供試した。ＩＲ２４はＲｆ−１保有品種、あそみのりはＲｆ−１非保有品種である。染色体歩行を進めた結果、ＩＲ２４のゲノミッククローンにより約７６ｋｂの染色体領域をカバーするコンティグ（複数のクローンを重複部分で重ね合わせて染色上での順に整列化したもの）を作成することができ、その全塩基配列（７６３６３ｂｐ）を決定した。
次いで、得られた塩基配列情報等を利用することにより、新たに１２個のマーカーを開発し、既述のＲｆ−１座極近傍組換え個体１０個体を用いて、高精度分離分析を行った（実施例３）。その結果、上記の約７６ｋｂの染色体領域に含まれる６５ｋｂの配列がＲｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列を包含することが示された。この領域は、８個のゲノミッククローンから構成されるコンティグによりカバーされている。各クローンの長さは、約１２〜２２ｋｂであり少なくとも４．７ｋｂの重複部を持つ。一方、イネの遺伝子の長さについては、短いものから長いものまであることが知られているが、大部分の遺伝子は数ｋｂ以内であると考えられる。そのため、これら８個のゲノミッククローンのうち、少なくともひとつは完全長のＲｆ−１遺伝子を包含すると予測される。
本発明者らはさらに、上記７６ｋｂの染色体領域のうち、Ｒｆ−１遺伝子領域をさらに絞り込むと共に、稔性回復能の存在を直接的に証明するために、相補性試験を行った。
具体的には、雄性不稔系統であるＭＳコシヒカリの未熟種子に、上記７６ｋｂ領域内の１０個の部分断片（各１０〜２１ｋｂ）を、別々に遺伝子工学的に導入した（図５）。使用された１０個の部分断片のうち、８個は先に染色体歩行で得られた８個のゲノミッククローン（図１、実施例３に記載のＸＳＥ１、ＸＳＥ７、ＸＳＦ４、ＸＳＦ２０、ＸＳＧ２２、ＸＳＧ１６、ＸＳＧ８及びＸＳＨ１８）に由来するものである。これらに加えて、さらに２個のクローンＸＳＦ１８およびＸＳＸ１に由来する断片についても相補性試験を行った。ＸＳＦ１８はＸＳＦ２０と５’末端及び３’末端（各々、配列番号２７の塩基２０３２８及び４１９２１）が同一だが、途中の塩基３３９４７−３８５９１を欠いている。これは、最初にクローンＸＳＦ１８が単離されたが、単離後の増殖の過程で上記欠失を生じたことが判明したため、再度増殖をやり直すことにより、完全型のクローンを単離し、ＸＳＦ２０と命名したことに因る（実施例８）。また、ＸＳＸ１は、クローンＸＳＧ８とＸＳＨ１８の重複部分がやや小さいため（約７ｋｂ）、制限酵素処理およびライゲーションにより両クローンから、重複部分を十分に含むようなクローンを新たに作成したものである（実施例１３）。
Ｒｆ−１は優性遺伝子であるので、導入した断片がＲｆ−１遺伝子を完全に包含している場合には、形質転換植物当代において稔性が回復する。相補性試験において、各断片について形質転換植物の種子稔性調査を行い、λファージクローンＸＳＧ１６に由来する１５．６ｋｂ断片（配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（実施例１０）。他の断片については、形質転換植物はすべて不稔であった。これらの結果から、上記１５．６ｋｂ断片がＲｆ−１遺伝子を完全に包含していることが示された。さらに、本発明により、Ｒｆ−１遺伝子を遺伝子工学的に導入する方法が提供され、その有効性が実証された。
本発明者は、λファージクローンＸＳＧ１６のどの部分がＲｆ−１遺伝子を含むかをさらに特定するために、前述の１５．６ｋｂ断片（配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３を含む）よりも短い断片について相補性試験による種子稔性調査を行った。その結果、ＸＳＧ１６に由来する１１．４ｋｂ断片（配列番号２７の塩基４２３５７−５３７４３を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（実施例１０（２））。さらに、より短い６．８ｋｂ断片（配列番号２７の塩基４２１３２−４８８８３を含む）を導入した形質転換体においても、種子稔性が回復した（実施例１０（３））。これらの結果から、上記６．８ｋｂ断片がＲｆ−１遺伝子を包含していることが示された。
本発明者らは、さらに研究をすすめ、稔性回復機能を有する核酸を特定し、それによってコードされるアミノ酸配列も明らかとなった。具体的には、実施例１４−１５に記載したように、先ず、配列番号２７の４３７３３−４４０３８及び４８３０６−５０２２６に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて作成した。これらの２種の断片をプローブ（プローブＰ及びＱ）として、コシヒカリにＲｆ−１を導入した系統より作成したｃＤＮＡをライブラリーをスクリーニングした。その結果、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致し、Ｒｆ−１遺伝子を含むクローンとして単離され、塩基配列が解析された（配列番号６９−７４）。
配列番号６９−７４のいずれの配列も、配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードする。具体的には、各々配列番号６９の塩基２１５−２５８７、配列番号７０の塩基２１３−２５８５、配列番号７１の塩基２１８−２５９０、配列番号７２の塩基２０８−２５８０、配列番号７３の塩基１４９−２５２１及び配列番号７４の塩基２２５−２５９７が、いずれも配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
配列番号７５のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（Ｒｆ２）の推定アミノ酸配列（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）と比較したところ、Ｎ末端の７アミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）が一致した。これら７アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。これらのことから、今回単離したｃＤＮＡはＲｆ−１遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネＲｆ−１とトウモロコシＲｆ２とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。
また、今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号２７）と比較し、Ｒｆ−１遺伝子のエキソンとイントロンの構造を明らかにした（図７）。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリＡ付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。Ｒｆ−１遺伝子のコード領域内には、イントロンは介在しない。
本発明者は、実施例１０（３）の相補性実験で種子稔性を回復した６．８ｋｂ断片について、さらに相補性実験を行った。具体的には、実施例１６において、前記６．８ｋｂ断片中のＲｆ−１遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片（配列番号２７の塩基４２１３２−４６３１８）を用いて、相補性実験を行ったところ、種子稔性が回復した。
さらに、実施例１７において稔性回復機能を有する核酸を含むクローンを新たに６個取得した。具体的には、先ず、配列番号２７の塩基４５５２２−４５５４５及び４５９５５−４５９３２に相当する２種類のプライマーを用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をプローブＲとして、前記プローブＰとともにプラークハイブリダイゼーションを行なった。プローブＰおよびプローブＲのどちらでも陽性を示すプラークから、新たに６個のクローンを得た（＃７−＃１２）。その結果を配列番号８０−８５に示す。
配列番号８０−８５のいずれの配列も、配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号８０の塩基２２９−２６０１、配列番号８１の塩基１７５−２５４７、配列番号８２の塩基２２７−２５９９、配列番号８３の塩基２２０−２５９２、配列番号８４の塩基１７４−２５４６及び配列番号８５の塩基９０−２４６２が、いずれも配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（特願２００１−２８５２４７配列番号２７）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図８）。今回単離したｃＤＮＡのなかには、予想翻訳領域とは関係のないエキソンを含まず、単一エキソンからなるものも３個存在した（＃１０−＃１２、配列番号８３−８５）。
ＩＩＩ．  Ｒｆ−１遺伝子座を含む核酸
本発明は、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸を提供する。
本発明の稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸は、配列番号２７の塩基配列を有する核酸、又は配列番号２７の塩基配列と少なくとも７０％同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸を含む。さらに、実施例１０に記載したように、配列番号２７の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３にＲｆ−１遺伝子が完全に含まれていると確認された。Ｒｆ−１遺伝子を含む領域はさらに、好ましくは、配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３、より好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、さらに好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８と特定された。
本発明者らはさらに、研究を進め、Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸として以下の領域を特定した。
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７、
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５、
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０、
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０、
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１、
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７、
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１、
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７、
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９、
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２、
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６及び
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２。
上記塩基配列は、ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に対応し、そして、いずれも配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１をコードする。
以下、本明細書中、文脈により「配列番号２７の塩基配列」という用語は、配列番号２７全体、あるいは、その一部であって稔性回復機能に関与する部分、特に、塩基３８５３８−５４１２３を示す。より好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、さらに好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８を示す。そして、特に好ましくは、ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２のいずれかを示す。
後述する実施例では、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸として、Ｒｆ−１遺伝子を含むインディカ米のＩＲ２４のゲノムライブラリーより核酸が単離され、配列番号２７の塩基配列が決定された。しかしながら、本発明の、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸の由来は、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種由来のものであれば特に限定されない。Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種は、特に限定されず、例えば、ＩＲ２４、ＩＲ８、ＩＲ３６、ＩＲ６４、Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ、ＢｏｒｏＩＩが含まれる。Ｒｆ−１遺伝子を有しないジャポニカ型品種としては、例えば、限定されるわけではないが、あそみのり、コシヒカリ、きらら３９７、アキヒカリ、あきたこまち、ササニシキ、キヌヒカリ、日本晴、初星、黄金晴、ヒノヒカリ、ミネアサヒ、あいちのかおり、ハツシモ、アケボノ、フジヒカリ、峰の雪もち、ココノエモチ、ふくひびき、どんとこい、五百万石、ハナエチゼン、トドロキワセ、はえぬき、どまんなか、ヤマヒカリ等が知られている。「インディカ型品種」も「ジャポニカ型品種」も当業者に周知であり、当業者はどのようなイネ品種が本発明の対象となり得るか容易に判断できる。
本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡと共に、そのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡ（その対応するｃＤＮＡも含む）、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
本発明のＲｆ−１遺伝子を含む核酸は、好ましくは配列番号２７の塩基配列を有する。１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号２７と完全には一致していないＤＮＡ配列が、配列番号２７と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体ＤＮＡ配列は、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
本発明のＲｆ−１遺伝子は、好ましくは配列番号７５に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。、稔性回復機能を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。Ｒｆ−１遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、配列番号７５に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。本発明のＲｆ−１遺伝子は、稔性回復機能を有する限り、配列番号２７の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。「稔性回復機能を有する」とは、当該ＤＮＡ断片が導入された場合に、イネ個体又は種子に稔性を付与することを意味する。稔性回復は、Ｒｆ−１遺伝子よりタンパク質が発現されることに因ってもよく、あるいはＲｆ−１遺伝子の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）自体が稔性の付与に何らかの機能をしていてもよい。
限定されるわけではないが、Ｒｆ−１遺伝子の相同体、変異体が稔性回復機能を有するか否かは、例えば、以下のように調べることが可能である。ＭＳコシヒカリ（不稔系統）にコシヒカリの花粉をかけることにより得た未熟種子を供試して、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９４），６（２），ｐ．２７２−２８２）の方法に従い、被検定核酸断片を導入する。得られた形質転換体を通常の条件で栽培すると、被検定核酸断片が稔性回復機能を有する場合にのみ、種子が稔る。
Ｒｆ−１遺伝子を有しないジャポニカ型のあそみのりの対応する領域に由来する核酸は、配列番号２８に示した塩基配列を有する。配列番号２８と配列番号２７の対応する部分は、全体として約９８％の同一性を有する。よって、本発明の稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸は、配列番号２７と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。「配列番号２７」は、特に好ましくは、ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２のいずれかを意図する。
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
本発明の核酸はまた、配列番号２７の塩基配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸、並びに、配列番号２７の塩基配列に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸を含む。
本明細書において使用されるように、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に示されている。例えば、ニトロセルロースフィルターに関し、５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０℃ないし６０℃での、１×ＳＳＣないし６ＸＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばスターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。また、例えば、ハイブリダイゼーション溶液が約５０％ホルムアミドを含む場合、上記ハイブリダイゼーション温度は約１５℃ないし２０℃低めとなる。非常にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般に、非常にストリンジェントな条件は、上記中程度にストリンジェントな条件よりも、より高い温度及び／又はより低い塩濃度でのハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を含む、例えば、約６０℃ないし６５℃での０．１×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件、および／又は約６５℃ないし６８℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件を含む。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。
「配列番号２７」は、特に好ましくは、ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２のいずれかを意図する。
同様に、本発明のＤＮＡには、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号２７の塩基配列とは異なるが稔性回復機能を有する核酸を含む。稔性回復機能を有する限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１個ないし数千個、より好ましくは１個ないし千個、さらにこのましくは１個ないし５００個、さらにより好ましくは１個ないし２００個、最も好ましくは１個ないし１００個である。
本明細書の記載に基づいてＲｆ−１遺伝子がより特定され、当業者がＲｆ−１遺伝子以外の部分またはＲｆ−１遺伝子内のイントロン部分などの核酸を除いて使用することが可能である。また、既定のアミノ酸（特に配列番号７５に記載のアミノ酸配列）を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
本発明者らは、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型のＩＲ２４（塩基配列２７）と、有しないジャポニカ型のあそみのり（塩基配列２８）およびＧｅｎＢａｎｋに登録されている日本晴ＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）とを比較した。その結果、Ｒｆ−１遺伝子を含むインディカ型のＲｆ−１領域は少なくとも、以下の１塩基多型（ＳＮＰ）を有することを見出した。
１）配列番号２７の塩基１２３９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号２７の塩基６２２７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号２７の塩基２０６８０に相当する塩基がＧである；
４）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；
５）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである；
６）配列番号２７の塩基５６３６８に相当する塩基がＴである；
７）配列番号２７の塩基５７６２９に相当する塩基がＣである；及び
８）配列番号２７の塩基６６２６７に相当する塩基がＧである。
よって、本発明のＲｆ−１領域を含む核酸は、好ましくは上記条件１）−８）の１つないし全てを満たす。
なお、後述の実施例３において、Ｒｆ−１遺伝子極近傍組換え個体（ＲＳ１−ＲＳ２、ＲＣ１−ＲＣ８）についてそのＲｆ−１領域の染色体構成を調べた。その結果、配列番号２７の塩基１２３９ないし６６２６７の塩基配列、即ち、最大限に見積もってもＰ４４９７  ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１  ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）（図３）に、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることが明らかにされた。ただし、Ｒｆ−１遺伝子の一部の遺伝子型がインディカ型であることが、Ｒｆ−１遺伝子の遺伝子機能発現に重要であり、残りの部分はジャポニカ型でもインディカ型でも遺伝子機能に大きな差異を生じない可能性がある。極端な場合、ジャポニカ・インディカ間でコーディング領域は完全に同一で、プロモーター領域だけに差違があり、そして、プロモーター領域及びコーディング領域の一部のみが上記Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１  ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）に含まれることもあり得る。よって、上記共有インディカ型領域（配列番号２７の塩基１２３９ないし６６２６７）がＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含するとは、断定できない。しかしながら、以下の理由、
１）遺伝子の大きさは通常数ｋｂであり１０ｋｂを超えることは稀である；
２）本発明で明らかにしたＩＲ２４のゲノム塩基配列（配列番号２７）は、上記共有インディカ型領域を完全に包含する；
３）配列番号２７の５’末端は、上記共有インディカ型領域の５’末端から１２３８ｂｐ上流に位置し、別の遺伝子（Ｓ１２５６４）の一部である；および
４）配列番号２７の３’末端は、上記共有インディカ型領域の３’末端から１００９６ｂｐ下流に位置する
により、少なくとも配列番号２７はＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含すると考えられる。
このように、本発明者らは、まずＲｆ−１遺伝子領域を７６ｋｂまで絞り込むことに成功した。よって、本発明のＲｆ−１遺伝子領域を含む核酸は、従来技術の特開２０００−１３９４６５に記載のＲｆ−１遺伝子からの遺伝子距離が約１ｃＭ（約３００ｋｂ）ある共優性マーカー座を用いて選抜した場合よりも、Ｒｆ−１遺伝子の近傍に存在する他の遺伝子を含む可能性が格段に低い。さらに、本発明者らの先の特願２０００−２４７２０４に記載のＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１  ＭｗｏＩ座（両遺伝子座の距離は約０．３ｃＭ）を用いて選抜した場合よりも他の遺伝子を含む可能性が低い。
さらに、本発明者らは相補性試験を行うことにより、配列番号２７の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３にＲｆ−１遺伝子が完全に含まれていることを確認した。よって、本発明の一態様において、配列番号２７の塩基配列又は配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３の塩基配列と、少なくとも７０％同一の塩基配列は、以下の条件１）及び２）の少なくとも一つを満たす：
１）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；及び
２）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである。
本発明者らはさらに、Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸として以下の領域を特定した。
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７、
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５、
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０、
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０、
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１、
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７、
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１、
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７、
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９、
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２、
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６、及び
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２。
上記塩基配列は、ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。本発明の核酸はさらに、
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
を含む。
上記の配列番号２７の塩基４５４６１は、１）配列番号６９の塩基１７６９；２）配列番号７０の塩基１７６７；３）配列番号７１の塩基１７７２；４）配列番号７２の塩基１７６２；５）配列番号７３の塩基１７０３；６）配列番号７４の塩基１７７９；７）配列番号８０の塩基１７８３；８）配列番号８１の塩基１７２９；９）配列番号８２の塩基１７８１；１０）配列番号８３の塩基１７７４；１１）配列番号８４の塩基１７２８；及び１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する。よって、特に好ましくは、本発明の方法に使用する核酸は、好ましくは、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす：
１）配列番号６９の塩基１７６９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号７０の塩基１７６７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号７１の塩基１７７２に相当する塩基がＡである；
４）配列番号７２の塩基１７６２に相当する塩基がＡである；
５）配列番号７３の塩基１７０３に相当する塩基がＡである；
６）配列番号７４の塩基１７７９に相当する塩基がＡである；
７）配列番号８０の塩基１７８３に相当する塩基がＡである；
８）配列番号８１の塩基１７２９に相当する塩基がＡである；
９）配列番号８２の塩基１７８１に相当する塩基がＡである；
１０）配列番号８３の塩基１７７４に相当する塩基がＡである；
１１）配列番号８４の塩基１７２８に相当する塩基がＡである；又は
１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する塩基がＡである。
ＩＶ．  イネの稔性の回復方法
本発明は、配列番号２７の塩基配列を有する核酸、又は配列番号２７の塩基配列と少なくとも７０％同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入することにより、イネの稔性を回復する方法を提供する。本発明の方法はまた、配列番号２７の一部、特に、配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３の塩基配列を有する核酸、又は配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８の塩基配列と少なくとも７０％同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入してもよい。
本発明の方法は特に好ましくは、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入する。最も好ましくは、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸は、以下のａ）−ｐ）の核酸から選択される：
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
本発明において、イネに導入されうる稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸は、先の「ＩＩＩ．Ｒｆ−１遺伝子座を含む核酸」において記載の核酸を使用しうる。核酸のイネへの導入方法は特に限定されず、公知の方法を使用することが可能である。本発明の核酸は公知の遺伝子工学的な方法によって導入しても、あるいは交配によっても導入してもよい。隣接する他の遺伝子の導入を防げる、育種年限を短縮できる、という観点より遺伝子工学的な方法の使用が好ましい。
遺伝子工学的手法による形質導入のためにはいかなる適切な発現系を使用してもよい。組換え発現ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、本発明のイネに導入されうる稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸を含む。
制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。イネにおいて複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
さらに、必要に応じて適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレームで本発明の核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい
本発明によればまた、木発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞であるイネに導入される。
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本願発明の核酸断片を用いてイネに稔性を付与する場合には、特に、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物たるイネの形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，１６５−１７４（１９９６））などが例示される。
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本願発明の核酸断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（本願発明の核酸配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって形質転換することができる。
特に植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））、ＰＥＧ法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，２７１７（１９８４））、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０２，１７９（１９８６））、微小物衝突法（ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９２３（１９８８））などが挙げられる。所望の植物に核酸を導入する方法であれば特に限定されない。
一方、交配による導入の場合には、例えば、以下のようにして行うことが可能である。先ず、Ｒｆ−１供与親とジャポニカ品種とを交雑して得られたＦ１に、ジャポニカ品種を戻し交雑する。得られた個体のなかから、Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座がジャポニカ型ホモ、Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ座及びＢ５３６２７ＢｓｔＺ１７Ｉ座がヘテロの個体を選別し、さらなる戻し交雑に供試する。得られた個体のなかから、Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ座及びＢ５６６９１  ＸｂａＩ座がヘテロ、Ｂ５３６２７  ＢｓｔＺ１７Ｉ座がジャポニカ型ホモの個体を選抜し、さらなる戻し交雑に供試する。以後は、戻し交雑各世代で、Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ座及びＢ５６６９１  ＸｂａＩ座がヘテロの個体を選抜し、次の戻し交雑に供試する、という工程を１０回程度繰り返す。最後に、Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ座及びＢ５６６９１  ＸｂａＩ座がヘテロの個体を自殖させ、得られた個体から両座がインディカ型ホモの個体を選抜することにより、Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１  ＸｂａＩ座までの限定された染色体領域をＲｆ−１供与親から引き継ぐ回復系統を得ることができる。
本発明において、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸が単離されたことにより、Ｒｆ−１遺伝子を遺伝子工学の技術を用いてイネ品種に導入し、回復系統を育成することが可能となった。本発明ではＲｆ−１領域を先ず７６ｋｂ以下にまで絞り込むことに成功した。よって本発明のＲｆ−１遺伝子座を含む核酸は、従来技術と比較して、Ｒｆ−１遺伝子の近傍に存在する他の遺伝子を含む可能性が格段に低い。さらに、本発明はＲｆ−１遺伝子を含む領域の全塩基配列を明らかにした。当業者は、本明細書の記載に基づきＲｆ−１遺伝子自体の解析することが進めることができる。よって、隣接する遺伝子を全く含まずにＲｆ−１遺伝子のみを導入することも可能となった。これは、隣接遺伝子が劣悪形質をもたらす遺伝子である場合に特に重要である。さらに、交雑の場合より早く、１〜２年の短期間での回復系統を育成も可能となった。
そして、本明細書中の実施例４−１３及び１７に記載の相補性試験では実際に、図５に記載の１０個のクローン由来の断片を用い、アグロバクテリウムを用いる方法によりＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）を形質転換した。その結果、配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８の塩基配列を含む核酸によって、稔性回復系統が育成されることが証明された。
限定されるわけではないが、アグロバクテリウムを用いるイネの回復系統の作成方法は、例えば、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，Ｐ．２７１−２８２（１９９４）、Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）、Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：ｐ．７３４７−７３５１（１９８０）等に記載されている。
先ず、所期の挿入したい核酸断片を含むプラスミドベクターを作成する。プラスミドベクターは、例えば、前記Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）らにプラスミドマップが記載されている、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等が使用可能である。あるいは、当業者は例えば前記ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等のプラスミドベクターを基に、自ら適当なベクターを構築する事も可能である。本明細書後述する実施例では、ｐＳＢ１１を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクターｐＳＢ２００を作成して使用した。具体的には、先ず、ユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）を接続した。これより得られたＰｕｂｉ−ｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ接続体のｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ間に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＹＧ（Ｒ））を挿入することにより、Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ−ＨＹＧ（Ｒ）−Ｔｎｏｓからなる接続体を得た。この接続体を、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に接続することにより、ｐＫＹ２０５を得た。このｐＫＹ２０５のＰｕｂｉ上流に存在するＨｉｎｄＩＩ１部位にＮｏｔＩ、ＮｓｐＶ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を追加するためのリンカー配列を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有するｐＳＢ２００を得た。
次いで、挿入核酸を含む組換えベクターを用いて大腸菌（例えばＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＭＶ１１８４等、いずれも例えばＴＡＫＡＲＡ社より購入可能）を形質転換する。
さらに、形質転換された大腸菌を用いて、アグロバクテリウム菌株を好ましくはヘルパー大腸菌株とともに、例えば、Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｔｉｎｇ）を行う。限定されるわけではないが、アグロバクテリウムは例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＮＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ３等を使用することが可能である。いずれも前述のＫｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）にプラスミドマップが記載されており、当業者は例えば自らベクター構築を行うことにより使用可能である。限定されるわけではないが、ヘルパー大腸菌は、例えばＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（クローンテック社より入手可能）等が使用可能である。また、より一般的ではないがｐＲＫ２０７３を保有する大腸菌もヘルパー大腸菌として使用可能との報告がある（Ｌｅｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  １９９２，２７，ｐ．１６１−１６３）。
次いで、所期の交配が生じたアグロバクテリウムを用いて、例えば、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４）の方法に準拠し、雄性不稔イネの形質転換を行う。形質転換に必要なイネ未熟種子は、例えば、雄性不稔イネにジャポニカ品種の花粉をかけることにより作成できる。
形質転換植物の稔性回復は、例えば出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査することによって調べることが可能である。立毛調査とは、圃場などで栽培されている状態で観察する方法である。あるいは、実験室で穂の稔実率を調べる稔実率調査を行ってもよい。
Ｖ．  Ｒｆ−１遺伝子の存在の有無の識別方法
本発明においてＲｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が、イネ第１０染色体上の約６５ｋｂの多型検出用マーカー座Ｐ４４９７  ＭｂｏＩとＢ５６６９１  ＸｂａＩの間に存在することが明らかにされた。さらに、相補性試験により、配列番号２７の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３にＲｆ−１遺伝子が完全に含まれていることが確認された。
また、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種（ＩＲ２４）（配列番号２７）と当該遺伝子を有しないジャポニカ型品種（あそみのり（配列番号２８）および日本晴ＢＡＣクローンＡＣ０６８９２３）の塩基配列を比較し、両者に複数の多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が存在することが明らかになった。その結果、Ｒｆ−１遺伝子近傍領域における塩基配列の多型を利用することにより、被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有するか否かを、簡便、迅速かつ正確に識別することが可能となった。
よって、本発明はまた、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列がイネ第１０染色体上の多型検出用マーカー座Ｐ４４９７  ＭｂｏＩとＢ５６６９１  ＸｂａＩの間に存在することを利用して、被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有するか否かを識別する方法を提供する。
多型の検出は公知の任意の方法を使用して行うことが可能である。例えば、制限酵素断片長の多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＲＦＬＰ）を調べる方法、塩基配列の決定により直接的に決定する方法、ゲノムＤＮＡを８塩基認識制限酵素で切断後、末端を放射能標識し、さらに、６塩基および４塩基認識制限酵素で切断し、２次元電気泳動で展開する方法（ＲＬＧＳ法、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ）等が知られている。さらに、ＲＦＬＰをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅・検出するＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；Ｐ．Ｖｏｓ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２３，ｐ．４４０７−４４１４（１９９５））分析も開発されている。
例えば、従来より以下に例示するようなＲＦＬＰをＰＣＲ増幅を用いて検出する方法（ＲＦＬＰマーカーのＰＣＲマーカー化）、マイクロサテライトの多型をＰＣＲ増幅を用いて検出する方法（マイクロサテライトマーカー）が採用されてきた。
ＲＦＬＰマーカーのＰＣＲマーカー化
Ａ．  ＲＦＬＰプローブ対応ゲノム領域の多型を利用してＰＣＲマーカー化する方法（Ｄ．Ｅ．Ｈａｒｒｙ，Ｂ．Ｔｅｍｅｓｇｅｎ，Ｄ．Ｂ．Ｎｅａｌｅ；Ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｐｐｅｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９８）９７：ｐ．３２７−３３６）。これは、ＲＦＬＰマーカープローブ配列（「ＲＦＬＰ」は、あるＤＮＡ断片をプローブに用いてサザン解析を行った場合に観察される多型である。プローブに用いたＤＮＡ断片の塩基配列を「ＲＦＬＰマーカープローブ配列」と呼ぶ。）に対して設計したプライマーを用いてゲノムＰＣＲを行った後、次の二方法のいずれかによりＰＣＲマーカー化できる。第１は、産物を一連の制限酵素で処理し、断片長多型を生じる制限酵素を探索する手法であり、第２は、産物の塩基配列を品種間比較して多型を探索し、その多型を利用してＰＣＲマーカー化する方法である。
Ｂ．  ＲＦＬＰ原因部位を同定してＰＣＲマーカー化する方法。これは、ＲＦＬＰマーカープローブ配列内あるいはその周辺（通常数ｋｂ以内）に存在するＲＦＬＰ原因部位（比較する２品種の一方のみが持つ制限酵素認識部位）を同定することにより、ＰＣＲマーカー化する方法である。
マイクロサテライトマーカー
マイクロサテライトとは、（ＣＡ）ｎのような２ないし４塩基程度の繰り返し配列であり、ゲノム中に多数存在している。繰り返し数に品種間多型がある場合、隣接領域に設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うと、ＰＣＲ産物長に多型が観察され、ＤＮＡ多型を検出することが可能となる。マイクロサテライトを利用した多型検出マーカーは、マイクロサテライトマーカーと呼ばれている（Ｏ．Ｐａｒｎａｕｄ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｒ．ＭｃＣｏｕｃｈ，  ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９６）２５２：ｐ．５９７−６０７）。
本発明において多型の検出方法は特に限定されない。効率、簡便性の観点より、ＰＣＲとＲＦＬＰを組み合わせて、比較する品種系統間において、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片配列中の制限酵素認識部位に多型が存在する場合に、その制限酵素による切断パターンからいずれの型であるかを決定するＰＣＲ−ＲＦＬＰ法が好ましい。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法とも呼ばれる。多型が見出される部位に適当な制限酵素認識部位が存在しない場合、ＰＣＲの際に制限酵素部位を導入するＣＡＰＳの修飾法、ｄＣＡＰＳ（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｌｅａｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）も使用可能である（Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｓ．Ｄ．ａｎｄ  Ａｍａｓｉｎｏ，Ｒ．Ｍ．（１９９８），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４（３）３８１−３８５；Ａ．Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら，（１９９３），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（２）ｐ．４０３−４１０；Ｎｅｆｆ，Ｍ．Ｍ．，Ｎｅｆｆ，Ｊ．Ｄ．，  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｒ，Ａ．Ｅ．（１９９８），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４（３）３８７−３９２）。以下、より詳細に説明する。
ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法
限定されるわけではないが、本発明の識別方法では
ｉ）Ｒｆ−１遺伝子座において、インディカ品種とジャポニカ品種の塩基配列において多型が見出される部位およびその隣接領域の塩基配列に基づいて、当該塩基配列を増幅するようにプライマー対を作成し；
ｉｉ）被検定イネ個体又は種子のゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い；そして
ｉｉｉ）前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて、被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有するか否かを判断する。
工程ｉ）におけるプライマー対の作成は、好ましくは
ａ）前記核酸増幅産物の多型中に欠失領域を有する型が存在する場合、当該欠失領域の両側に欠失領域を挟むように核酸増幅用プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする；
ｂ）前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存在する場合、当該塩基置換部位の両側に置換部位を挟むように核酸増幅用プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする；または
ｃ）前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じない塩基置換が存在する場合、当該塩基置換部位を含み、そして、当該塩基置換部位を含む領域を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更するようなミスマッチ導入用プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする；
のいずれかの手段を含む。
限定されるわけではないが、本発明において、Ｒｆ−１遺伝子の存在を識別するために利用可能な適当な多型部位は、例えば、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種（ＩＲ２４）（配列番号２７）と当該遺伝子を有しないジャポニカ型品種（あそみのり（配列番号２８）およびＢＡＣクローンＡＣ０６８９２３）の塩基配列を比較し、以下のように多型検出用マーカーの作成が可能となるように、適宜選択することができる。
例えば、見出された多型が制限酵素認識部位に差異を生じる場合、当該多型部位の両側に多型部位を挟むように核酸増幅プライマーを作成し、多型検出用に用いる。プライマーを設計する際は、不要な産物を避けるために、反復性の高い配列に対して設計しない方が好ましい。見出された多型が制限酵素認識に差異を生じない場合、記述のｄＣＡＰＳ法を適用することにより、マーカーを作成することができる。ｄＣＡＰＳマーカーのプライマーを設計する際は、反復配列に対して設計しない方が好ましいことに加え、多型を識別しやするするため産物長が、好ましくは５０−３００塩基、より好ましくは１００塩基程度となるようにするとよい。
見出された多型がマイクロサテライトに関するものであれば、当該マイクロサテライトを挟むように核酸増幅用プライマーを作成し、多型検出用に用いる。この場合も、反復配列に対してプライマーを設計しない方が好ましい。
１）核酸増幅
本発明では、好ましくは、解明された被検定イネ個体又は種子のＲｆ−１遺伝視座の核酸配列の塩基配列に基づいて、多型を含む隣接領域を増幅するようにプライマー対を作成する。当該プライマーを使用して、被検定イネ個体又は種子のゲノムＤＮＡを鋳型に核酸増幅反応を行う。核酸増幅反応は好ましくは、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）である。
核酸増幅のためのプライマー対は、多型部位およびその隣接領域の塩基配列に基づき公知の方法により作成することが可能である。具体的には、限定されるわけではないが、例えば、多型部位およびその隣接領域の塩基配列に基づき、以下の条件：
１）各プライマーの長さが１５−３０塩基であること；
２）各プライマーの塩基配列中のＧ＋Ｃの割合が３０−７０％であること；
３）各プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの分布が部分的に大きく偏らないこと；
４）プライマー対によって増幅される核酸増幅産物の長さが５０−３０００塩基、好ましくは５０−３００塩基であること；そして
５）各プライマー自身の塩基配列中、又はプライマー同士の塩基配列間に相補的な配列部分が存在しないこと
を満たすように、多型部位およびその隣接領域の塩基配列と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、必要であれば多型部位およびその隣接領域の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により、プライマー対を作成できる。
本発明において増幅される、多型部位の「隣接領域」とは、多型とその隣接領域の双方を含む領域が、好ましくは、ＰＣＲ法等の核酸増幅が可能な距離の範囲内にあることを意味する。限定されるわけではないが、好ましくは増幅される隣接領域が約５０塩基ないし約３０００塩基、より好ましくは約５０塩基ないし約２０００塩基の範囲内にある。多型を識別しやするするためは、産物長が好ましくは５０−３００塩基、より好ましくは１００塩基程度となるようにするとよい。限定されるわけではないが、隣接領域は、多型部位の５’側または３’側に好ましくは約０塩基ないし約３０００塩基、より好ましくは約０塩基ないし約２０００塩基、より好ましくは約０塩基ないし約１０００塩基の範囲内にある。
核酸増幅反応の手順及び条件は特に限定されず、当業者に周知である。当業者は、多型部位およびその隣接領域の塩基配列、プライマー対の塩基配列および長さ等の種々の要因に応じて適宜、条件を採用することが可能である。一般には、プライマー対の長さが長い程、Ｇ＋Ｃの割合が高いほど、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの分布の偏りが小さい程よりストリンジェントな条件（より高温度でのアニーリング反応および核酸伸長反応、より少ないサイクル数）で核酸増幅反応を行うことが可能である。よりストリンジェントな条件の採用により、特異性の高い増幅反応が可能となる。
増幅反応は、限定されるわけではないが、例えば、鋳型として使用するゲノムＤＮＡ５０ｎｇ、ｄＮＴＰ各２００μＭ、ＥｘＴａｑＴＭ（ＴＡＫＡＲＡ）５Ｕを使用し、例えば、９４℃にて２分を１サイクル行った後、９４℃にて１分、５８℃にて１分、７２℃にて２分を１サイクルとして３０サイクル行い、最後に７２℃にて２分を１サイクル行うことにより行うことができる。あるいは、９４℃にて２分を１サイクル行った後、９４℃にて１分、５８℃にて１分、７２℃にて１分を１サイクルとして３０サイクル行い、最後に７２℃にて２分を１サイクル行うことにより行うこともできる。あるいは、別の態様においては、９４℃にて２分を１サイクル行った後、９４℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を１サイクルとして３５サイクル行い、最後に７２℃にて２分を１サイクル行うことにより行うこともできる。
ＰＣＲの鋳型として使用する被検定イネゲノムのＤＮＡは、Ｅｄｗａｒｄｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８（６）：１３４９，１９９１）の方法で、個体又は種子より簡易に抽出することができる。より好ましくは、標準的な方法により精製したＤＮＡを用いるのがよい。ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ  Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８（１９）：４３２１−５，１９８０）は、特に好ましい抽出法である。ＰＣＲを行うための鋳型として使用するＤＮＡの濃度は、終濃度で０．５ｎｇ／μｌが好ましい。
２）多型検出用マーカーの作成
上記プライマー対を用いた核酸増幅反応により、増幅産物に多型が検出されるか否かを調査し、見出された多型に基づいて多型検出用マーカーを作成する。限定されるわけではないが、増幅産物に検出されうる多型としては以下のようなものがある。
ａ）前記核酸増幅産物の多型中に欠失領域を有する型が存在する場合
このような場合、欠失領域の両側に欠失領域を挟むように核酸増幅用プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする。欠失領域の大きさが十分な場合、例えば増幅産物をアガロースゲル電気泳動又はアクリルアミドゲル電気泳動等することにより、泳動度の差により多型の検出が可能である。例えば、アガロースゲル電気泳動の場合には塩基対数に約５％以上の差がある場合、シーケンス用アクリルアミドゲル電気泳動の場合には約１塩基以上長さに差がある場合検出可能である。または、欠失領域外の塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはＤＮＡ断片を解析用プローブとして、核酸増幅産物に対してハイブリダイゼーションを行うことにより、多型を検出することができる。あるいは、必要に応じ、増幅産物の塩基配列を決定して多型を確認してもよい。核酸の電気泳動、ハイブリダイゼーション、塩基配列の決定等は公知の方法を使用でき、当業者は適宜採用可能である。このような場合は、増幅産物の長さの相違が直接多型を生じるので、これを利用した多型検出用マーカーをＡＬＰ（ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーと言う。
ｂ）前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存在する場合
このような場合、当該塩基置換部位の両側に置換部位を挟むように核酸増幅用プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする。このような場合、核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存在する、即ち、核酸増幅産物中に、特定の１または複数の制限酵素で切断されるものとされないものが存在する。よって、得られた増幅産物を制限酵素処理し、例えばアガロースゲル等で電気泳動し、泳動度の差により多型を検出することが可能である。必要に応じ、増幅産物の塩基配列を決定して多型を確認してもよい。
このような場合、ＰＣＲ等による増幅産物の制限酵素断片の長さの相違が多型を生じるので、これを利用した多型検出用マーカーをＣＡＰＳマーカーまたはＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーという（Ａ．Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら，上述）。
後述する実施例１のプライマー対Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ、Ｐ２３９４５  ＭｂｏＩ、Ｐ４１０３０  ＴａｑＩ、Ｐ４５１７７  ＢｓｔＵＩ、Ｂ５９０６６  ＢｓａＪＩ及びＢ５６６９１  ＸｂａＩがこのような場合に相当する。なお、前記ａ）の核酸増幅産物の長さで多型を検出可能な場合であっても制限酵素処理を併用することにより、多型がより検出しやすくなる場合がある。
ｃ）前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じない塩基置換が存在する場合
このような場合、当該塩基置換部位を含み、そして、当該塩基置換部位を含む領域を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更するようなミスマッチ導入プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする。
具体的には、天然のＲｆ−１遺伝子近傍領域の塩基配列に基づくプライマー対では核酸増幅産物に多型を生じるが制限酵素認識に差異を生じないため、片方のまたは双方のプライマーにミスマッチを導入し、当該塩基置換部位（多型）を含む領域を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更する。例えば、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異の導入による特定ヌクレオチドの置換、欠失又は付加の一般的な技術は、例えばＭｉｋａｅｌｉａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：３７６．１９９２に記載された方法を用いることができる。上記ミスマッチ導入プライマーを多型検出用マーカーとして用いた増幅産物では、ミスマッチ導入部位において制限酵素認識に差異を有するため、核酸増幅産物中に、特定の１または複数の制限酵素で切断されるものとされないものが存在する。よって、上述のｂ）の場合と同様に得られた増幅産物を制限酵素処理し、例えばアガロースゲル等で電気泳動し、泳動度の差により多型を検出することが可能である。
ミスマッチの導入は、プライマーの標的植物ゲノムへの結合性を失わせず、また、多型を生じている塩基置換を変化させるものであってもならない。多型を生じている塩基置換を利用してその近傍にミスマッチを導入して、塩基置換とミスマッチの双方の組み合わせにより制限酵素認識に差異が生じるようにする。このようなミスマッチの導入法は当業者に公知であり、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｓ．Ｄ．ａｎｄ  Ａｍａｓｉｎｏ，Ｒ．Ｍ．（１９９８）、Ｎｅｆｆ，Ｍ．Ｍ．，Ｎｅｆｆ，Ｊ．Ｄ．，Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｒ，Ａ．Ｅ．（１９９８）等に詳述されている。
このような場合のマーカーは、前述のｂ）のＣＡＰＳマーカーの改良であり、ｄＣＡＰＳ（ｄｅｒｉｖｅｄ  ＣＡＰＳ）マーカーという。後述する実施例３のＰ９４９３  ＢｓｌＩがこのような場合に相当する。
なお、上記のｂ）またはｃ）の場合において、品種間の多型とは無関係の余分な制限酵素部位が多く存在すると、多型に基づく制限酵素部位認識の相違が識別しにくくなる場合がある。このような場合、必要に応じプライマーにミスマッチを導入し、不必要な制限酵素部位をつぶしてもよい。例えば、実施例３のＢ６０３０４  ＭｓｐＩでは、Ｒプライマーにミスマッチを導入して多型と無関係なＭｓｐＩ部位をつぶしている。
限定されるわけではないが、ＣＡＰＳ法又はｄＣＡＰＳ法は、他のＲＦＬＰ法等と比較していくつかの利点を有する。具体的には、例えば、ＲＦＬＰ法と比較して、少量のサンプルで分析できる。分析に要する時間および労力を大きく軽減できる、といった利点がある。マイクロサテライトマーカーと比較しても、作成したＰＣＲマーカーの多型検出がアクリルアミド電気泳動よりも容易なアガロースゲル電気泳動で行えるという利点がある。
本発明の識別方法の好ましい実施態様
以下、例示のために本発明の被検定イネがＲｆ−１遺伝子を有するか否かを識別する方法の好ましい態様を記載する。本明細書の実施例においてＲｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種ＩＲ２４の塩基配列（配列番号２７）において、ジャポニカ型品種の対応する領域と比較した結果、少なくとも以下の１）−８）の多型を有することを見出した。
１）配列番号２７の塩基１２３９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号２７の塩基６２２７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号２７の塩基２０６８０に相当する塩基がＧである；
４）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；
５）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである；
６）配列番号２７の塩基５６３６８に相当する塩基がＴである；
７）配列番号２７の塩基５７６２９に相当する塩基がＣである；及び
８）配列番号２７の塩基６６２６７に相当する塩基がＧである。
よって、本発明の好ましい実施態様において、上記１）−８）の条件のいずれか１つないし全部を満たす場合に、被検定イネの個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有すると判断する。
さらに、本発明者らは配列番号２７の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８にＲｆ−１遺伝子の機能発現に必須の領域が含まれていることを確認した。よって、本発明の一態様において、配列番号２７の塩基配列又は配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３の塩基配列と、少なくとも７０％同一の塩基配列が、以下の条件１）及び２）の少なくとも一つを満たす場合に、被検定イネの個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有すると判断する：
１）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；及び
２）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである。
上記の条件を満たすか否かは、公知の多型の検出方法を使用することが可能である。上記配列を含む隣接領域の塩基配列を直接決定してもよい。しかしながら、迅速性、簡便性の観点より、上述したＣＡＰＳ法又はｄＣＡＰＳ法を採用することが好ましい。ＣＡＰＳ法又はｄＣＡＰＳ法は、例えば以下のように行うことが可能である。
ｉ）以下のいずれかの塩基、
１）配列番号２７の塩基１２３９に相当する塩基；
２）配列番号２７の塩基６２２７に相当する塩基；
３）配列番号２７の塩基２０６８０に相当する塩基；
４）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基；
５）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基；
６）配列番号２７の塩基５６３６８に相当する塩基；
７）配列番号２７の塩基５７６２９に相当する塩基；及び
８）配列番号２７の塩基６６２６７に相当する塩基
を含む隣接領域の塩基配列に基づいて、上記塩基と隣接領域の双方を増幅するようにプライマー対を作成し；
ｉｉ）被検定イネ個体又は種子のゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い；そして
ｉｉｉ）前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子の有無を識別する。
核酸増幅反応産物の多型の検出は、限定されるわけではないが、例えば以下の１）−８）の１つないし全てを満たす場合に被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有すると判断する、ことによって行う。
１）配列番号２７の塩基１２３９に相当する塩基を含む領域が、ＭｂｏＩ認識配列を有しない；
２）配列番号２７の塩基６２２７に相当する塩基を含む領域が、ＢｓｌＩ認識配列を有しない；
３）配列番号２７の塩基２０６８０に相当する塩基を含む領域が、ＭｂｏＩ認識配列を有する；
４）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；
５）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基を含む領域が、ＢｓｔＵＩ認識配列を有しない；
６）配列番号２７の塩基５６３６８に相当する塩基を含む領域が、ＭｓｐＩ認識配列を有しない；
７）配列番号２７の塩基５７６２９に相当する塩基を含む領域が、ＢｓａＪＩ認識配列を有しない；及び
８）配列番号２７の塩基６６２６７に相当する塩基を含む領域が、ＸｂａＩ認識配列を有しない。
ただし、上記１）−８）の領域の各多型を検出可能な制限酵素であれば、上記に限定されるものではない。
本発明の識別方法は、好ましくは、
ｉ）以下のいずれかの塩基、
１）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基；又は
２）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基；
を含む隣接領域の塩基配列に基づいて、上記塩基と隣接領域の双方を増幅するようにプライマー対を作成し；
ｉｉ）被検定イネ個体又は種子のゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い；そして
ｉｉｉ）前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子の有無を識別する。限定されるわけではないが、工程ｉｉｉ）が、以下の条件１）及び２）の少なくとも一つを満たす場合に被検定イネ個体又は種子がＲｆ−１遺伝子を有すると判断する：
１）配列番号２７の塩基４５４６１に相当する塩基を含む領域が、ＴａｑＩ認識配列を有しない；及び
２）配列番号２７の塩基４９６０９に相当する塩基を含む領域が、ＢｓｔＵＩ認識配列を有しない。
上記の配列番号２７の塩基４５４６１は、１）配列番号６９の塩基１７６９；２）配列番号７０の塩基１７６７；３）配列番号７１の塩基１７７２；４）配列番号７２の塩基１７６２；５）配列番号７３の塩基１７０３；６）配列番号７４の塩基１７７９；７）配列番号８０の塩基１７８３；８）配列番号８１の塩基１７２９；９）配列番号８２の塩基１７８１；１０）配列番号８３の塩基１７７４；１１）配列番号８４の塩基１７２８；及び１２）配列番号８５の塩基１６４４に相当する。
増幅反応に使用するプライマー対は、配列番号２７の塩基配列に基づき、好ましくは前述した条件を満たすように当業者が適宜選択可能である。好ましくは、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び４２、配列番号４３及び４４、配列番号４５及び４６、配列番号４７及び４８、配列番号４９及び５０、配列番号５１及び５２、並びに配列番号５３及び５４からなるグループから選択される塩基配列を有するいずれかのプライマー対を使用する。より好ましくは、プライマー対は、配列番号４５及び４６、並びに配列番号４７及び４８からなるグループから選択される。または、必要であれば上記プラーマー対の配列に基づき、多型部位およびその隣接領域の塩基配列に対する結合特異性を失わないように置換、欠失又は付加を施した配列をプライマーとして採用することも可能である。
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素断片長多型に関して調べるため、それぞれのＰＣＲマーカーに存在する制限部位に対応する制限酵素で切断する。この切断は、用いる制限酵素の推奨反応温度で数時間〜一昼夜インキュベーションすることにより行う。制限酵素で切断したそれぞれの増幅ＰＣＲサンプルは、例えば約０．７％ないし２％アガロースゲルあるいは約３％のＭｅｔａＰｈｏｒＴＭアガロースゲルで電気泳動することにより解析する。例えば、ゲルをエチジウムブロマイド中紫外線下で可視化する。
本発明の最も好ましい態様において、制限酵素による切断パターンとしては、可視化されたゲル上に、使用するプライマー対に応じて、以下の表２のようなアンドの存在の有無が確認される。
2004005515.tif 000005
2004005515.tif 000006
なお、後述の実施例３において、花粉稔性を有するＲｆ−１遺伝子極近傍組換え個体（ＲＳ１−ＲＳ２、ＲＣ１−ＲＣ８）について、上記８種のプライマー対を含めた１４種の多型マーカーを使用して、Ｒｆ−１領域の染色体構成を調べた。その結果、いずれの個体もＰ９４９３  ＢｓｌＩないし５９０６６  ＢｓａＪＩの間については、インディカ型品種由来のＲｆ−１遺伝子を有することが確認された。この結果から、図３で示したような染色体構成をもつ組換え型花粉において、花粉の受精能力があること、すなわち、Ｒｆ−１遺伝子が機能していることが示された。これは、これらの組換え型花粉が共有するインディカ型領域、すなわち、最大限に見積もってもＰ４４９７  ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１  ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）に、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることを意味する。
なお、本発明では、交雑による個体の出現頻度からＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＲｆ−１座とが非常に近接しているとの予測に基づき、染色体歩行を始めた。実際、本発明の高精度分離分析の結果、両座の遺伝的距離は約０．０４ｃＭと算出された。現在公知となっているＲｆ−１座連鎖マーカーのなかで、最も密接に連鎖しているマーカーは、先述の特開２０００−１３９４６５に記載されているマーカーのひとつであるが、そのマーカーでもＲｆ−１座との遺伝的距離は１ｃＭと記載されている。イネの場合、平均すると１ｃＭは３００ｋｂに相当すると考えられており、特開２０００−１３９４６５のマーカーを起点に染色体歩行を開始したのでは、Ｒｆ−１遺伝子領域の絞込みに相当の時間を要したと考えられる。
ＶＩ．  Ｒｆ−１遺伝子の稔性回復機能の抑制方法
本発明において、稔性回復機能を有する核酸を含む、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸が単離され、その全塩基配列が決定されたことにより、Ｒｆ−１遺伝子の稔性回復機能を遺伝子工学的に制御することが可能となった。よって、本発明は、さらに、Ｒｆ−１遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法を提供する。
本発明のＲｆ−１遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法は、例えば、配列番号２７の塩基配列を有する核酸、又は配列番号２７の塩基配列と少なくとも７０％同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも１００塩基の長さのアンチセンスを導入する、ことを含む。
本発明のＲｆ−１遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法は、一態様において、配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３の塩基配列を有する核酸、又は配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８の塩基配列と少なくとも７０％同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも１００塩基の長さのアンチセンスを導入することを含む。
本発明のＲｆ−１遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法は、特に、好ましい一態様において、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも１００塩基の長さのアンチセンスを導入することを含む。
最も好ましくは、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸は、以下のａ）−ｐ）の核酸から選択される：
ａ）配列番号６９の塩基２１５−２５８７を含む核酸；
ｂ）配列番号７０の塩基２１３−２５８５を含む核酸；
ｃ）配列番号７１の塩基２１８−２５９０を含む核酸；
ｄ）配列番号７２の塩基２０８−２５８０を含む核酸；
ｅ）配列番号７３の塩基１４９−２５２１を含む核酸；
ｆ）配列番号７４の塩基２２５−２５９７を含む核酸；
ｇ）配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９を含む核酸；
ｈ）配列番号８０の塩基２２９−２６０１を含む核酸；
ｉ）配列番号８１の塩基１７５−２５４７を含む核酸；
ｊ）配列番号８２の塩基２２７−２５９９を含む核酸；
ｋ）配列番号８３の塩基２２０−２５９２を含む核酸；
ｌ）配列番号８４の塩基１７４−２５４６を含む核酸；
ｍ）配列番号８５の塩基９０−２４６２を含む核酸；
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
アンチセンスは、少なくとも１００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上、最も好ましくは１０００塩基以上の長さである。導入の技術上の簡便性等の観点より、好ましくは１００００塩基以下、より好ましくは５０００塩基以下である。アンチセンスは、公知の方法により合成することが可能である。アンチセンスのイネへの導入は公知の方法により、例えば、Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００  Ｊｕｌ，４１（７），ｐ．８８１−８８８）に記載の方法により行うことが可能である。
また、限定されるわけではないが、Ｔｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，ｐ．７７８３−７７８８）などの転移因子の挿入変異系統のなかから、配列番号２７の塩基配列内に転移因子が挿入された系統を選抜することにより、Ｒｆ−１が破壊された系統を育成することも可能であると考えられる。さらに、植物においても相同組換えにより遺伝子破壊が研究されている。その系の確立により、配列番号２７の塩基配列を有する核酸、または配列番号２７の塩基配列と少なくとも７０％同一である核酸を用いて、Ｒｆ−１遺伝子を変異型Ｒｆ−１遺伝子に置換することにより、稔性回復機能を抑制することも可能であると考えられる。
参考文献
１．  Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｊｐｎ  Ｊ．  Ｂｒｅｅｄ．４２（ｓｕｐｌ．１）ｐ．１６４−１６５
２．  特開平７−２２２５８８
３．  特開平９−３１３１８７
４．  特開２０００−１３９４６５
５．  Ｈａｒｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４８  ｐ．４７９−４９４
６．  Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ａｎｄ  Ａｍａｓｉｎｏ  １９９８，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４（３）ｐ．３８１−３８５
７．  Ｎｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４（３）ｐ．３８７−３９２
８．  Ｄ．Ｅ．Ｈａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ（１９９８）９７：ｐ．３２７−３３６
９．  Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９４），６（２），ｐ．２７２−２８２
１０．  Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９６）１０，ｐ．１６５−１７４
１１．  Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ（１９８０），７７：ｐ．７３４７−７３５１
１２．  Ｐ．Ｖｏｓ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２３，ｐ．４４０７−４４１４（１９９５）
１３．  Ｏ．Ｐａｒｎａｕｄ，Ｘ．ら  ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９６）２５２：ｐ．５９７−６０７
１４．  Ａ．Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら，（１９９３），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（２）ｐ．４０３−４１０
１５．  Ｅｄｗａｒｄｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８（６）：１３４９，１９９１
１６．  Ｍｕｒｒａｙ  Ｍ．Ｇ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，８（１９）：４３２１−５，１９８０
１７．  Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００  Ｊｕｌ，４１（７），ｐ．８８１−８８８
１８．  Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，ｐ．７７８３−７７８８
１９．  Ｃｕｉ，Ｘ．，Ｗｉｓｅ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓｃｈａｎｂｌｅ，Ｐ．Ｓ．（１９９６）Ｔｈｅ  ｒｆ２  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｔｏｒｅｒ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｍａｌｅ−ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔ−ｃｙｔｏｐｌａｓｍｍａｉｚｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１３３４−１３３６
２０．  Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｃｕｉ，Ｘ．，Ｈｏｒｎｅｒ，Ｈ．Ｔ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．ａｎｄ  Ｓｃｈｎａｂｌｅ，Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１３，１０６３−１０７８
【実施例】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
参考例
以下の参考例は、本出願入の先の特許出願  特願２０００−２４７２０４（２０００年８月１７日出願）に記載された実施例に基づく。
参考例１  Ｒｆ−１遺伝子座周辺ＲＦＬＰマーカーのＰＣＲマーカー化
本参考例においては、Ｒｆ−１遺伝子座周辺ＲＦＬＰマーカー９個（Ｒ１８７７、Ｇ２９１、Ｒ２３０３、Ｓ１２５６４、Ｃ１３６１、Ｓ１００１９、Ｇ４００３、Ｓ１０６０２、Ｇ２１５５）をＰＣＲマーカー化した。
（１）材料および方法
Ｒｆ−１遺伝子座周辺ＲＦＬＰマーカー９個（Ｒ１８７７、Ｇ２９１、Ｒ２３０３、Ｓ１２５６４、Ｃ１３６１、Ｓ１００１９、Ｇ４００３、Ｓ１０６０２、Ｇ２１５５）を農林水産省農業生物資源研究所から購入し、ベクター内の挿入塩基配列を決定した後、以下の手順で実験を行った。なお、本文中のイネ品種のうち、あそみのりはジャポニカ米であり、ＩＲ２４はインディカ米である。
（２）ゲノミックライブラリーの作製
あそみのりの緑葉から、ＣＴＡＢ法により各々トータルＤＮＡを抽出した。Ｍｂｏｌで部分消化後、ＮａＣｌ密度勾配遠心（６〜２０％直線勾配、２０℃、３７０００ｒｐｍ、４時間、全容量１２ｍｌ）によりサイズ分画を行った。各分画（約０．５ｍｌ）の一部を電気泳動にかけ、１５〜２０ｋｂのＤＮＡを含む分画を選抜・精製した。ライブラリーの作製は、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をベクターに用いて、付属プロトコールに準拠して行った。パッケージングには、Ｇｉｇａ  Ｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。パッケージング後、ＳＭ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５００μｌおよびクロロフォルム２０μｌを添加した。遠心後の上清にクロロフォルム２０μｌを添加し、ライブラリー溶液とした。
ライブラリー溶液の５０倍希釈液５μｌを用いて、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）に感染させた。その結果、あそみのりについては８３個のプラークが出現した。ライブラリーあたりでは、４．１５×１０５ｐｆｕとなり、平均挿入断片長を２０ｋｂとすると、８．３×１０９ｂｐをカバーする計算になる。これは、イネゲノム（４×１０８ｂｐ）に対して十分な大きさのライブラリーであると考えられた。
（３）Ｒ１８７７、Ｃ１３６１およびＧ４００３対応ゲノミッククローンの単離
Ｃ１３６１およびＧ４００３については、ＲＦＬＰマーカープローブを含むプラスミドを単離した後、制限酵素処理・電気泳動により、ＲＦＬＰマーカープローブ部分を分離し、ＤＮＡ回収フィルター（Ｔａｋａｒａ  ＳＵＰＲＥＣ−０１）を用いて目的のＤＮＡを回収した。Ｒ１８７７については、マーカープローブ両端部に対してプライマーを設計し、あそみのりトータルＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、産物を電気泳動後、前述の方法で回収した。回収したＤＮＡは、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブとした。なお、ＰＣＲは常法により行った（以下、同様）。
ライブラリーのスクリーニングは、プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にブロットした後、常法により行った。１ｓｔスクリーニング後、陽性プラーク周辺を打ち抜き、ＳＭバッファーに懸濁し、２ｎｄスクリーニングに供試した。２ｎｄスクリーニング後、陽性プラークを打ち抜き、さらに３ｒｄスクリーニングを行い、単一プラークを分離した。
分離した目的プラークをＳＭバッファーに懸濁後、プレートライセート法によりファージを一次増殖した。得られたファージ増殖液を用いて、振とう培養法により二次増殖を行った後、Ｌａｍｂｄａ  ｓｔａｒｔｅｒ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてファージＤＮＡを精製した。
各マーカーについて、８枚のプレートを用いて１ｓｔスクリーニングを行った。プレート１枚につきライブラリー溶液を１０μｌ使用した。３ｒｄスクリーニングまで行った結果、Ｒ１８７７、Ｃ１３６１およびＧ４００３対応ゲノミッククローンを、それぞれ、４個、３個および３個単離した。
（４）Ｒ１８７７のＰＣＲマーカー化
単離したゲノミッククローンを解析し、ＲＦＬＰの原因部位、即ち、ＩＲ２４（インディカ米）には存在しあそみのり（ジャポニカ米）には存在しないＥｃｏＲＩ部位を同定することにより、ＰＣＲマーカー化を行った。
具体的には、単離した４クローンについて以下の解析を行った。まず、Ｔ３およびＴ７プライマーを用いて、各クローンの挿入断片の両末端の塩基配列を明らかにした。つぎに、マーカープローブ両端部に対して外向きのプライマーを設計し、Ｔ３およびＴ７プライマーと組合わせ（合計４プライマー組合せ）、各クローンをテンプレートにＰＣＲを行った。
また、各クローンをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後、電気泳動することにより、挿入断片長および各ＥｃｏＲＩ断片長を推定した。
これらの解析の結果、各クローンの位置関係を明らかにすることができた。一方、ＲＦＬＰ解析ではマーカープローブＲＩ８７７により日本晴（ジャポニカ米）では２０ｋｂ、Ｋａｓａｌａｔｈ（インディカ米）では６．４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が検出されること（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｓｔａｆｆ．ｏｒ．ｊｐ／ｐｕｂ／ｇｅｎｅｔｉｃｍａｐ９８／ｐａｒｅｎｔｓｏｕｔｈｅｒｎ／ｃｈｒ１０／Ｒ１８７７．ＪＰＧ）ことが知られている。これらの事実を併せ考えることにより、ＩＲ２４には存在しあそみのりには存在しないＥｃｏＲＩ部位のおおよその位置が推定できた。そこで、その周辺を増幅するように設計したプライマー組合わせ（配列番号１と配列番号２）を用いて、９４℃にて１分、５８℃にて１分、７２℃にて２分を１サイクルとし３０サイクルのＰＣＲ条件にてゲノミックＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ処理した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動した。
その結果、あそみのり−ＩＲ２４間で期待通りの多型が観察された。すなわち、ＰＣＲ産物（約３２００ｂｐ）のＥｃｏＲＩ処理により、ＩＲ２４では１５００ｂｐと１７００ｂｐとに切断されるのに対し、あそみのりでは切断されなかった。あそみのり−ＩＲ２４のＲＩＬ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｉｎｂｒｅｄ  Ｌｉｎｅ）を用いてこのＰＣＲマーカーをマッピングした結果、ＲＦＬＰマーカー座Ｒ１８７７と同一領域に位置づけられ、ＲＦＬＰマーカーＲ１８７７がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＲ１８７７ＥｃｏＲＩと命名した。
（５）Ｇ４００３のＰＣＲマーカー化
単離したゲノミッククローンを解析し、ＲＦＬＰの原因部位、即ち、あそみのりには存在しＩＲ２４には存在しないＨｉｎｄＩＩＩ部位を同定することにより、ＰＣＲマーカー化を行った。
Ｒ１８７７と同様の解析を行い、単離した３クローンの位置関係を明らかにした。ＲＦＬＰ解析ではマーカープローブＧ４００３により日本晴（ジャポニカ米）では３ｋｂ、Ｋａｓａｌａｔｈでは１０ｋｂ（インディカ米）のＨｉｎｄＩＩＩ断片が検出されること（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｓｔａｆｆ．ｏｒ．ｊｐ／ｐｕｂ／ｇｅｎｅｔｉｃｍａｐ９８／ｐａｒｅｎｔｓｏｕｔｈｅｒｎ／ｃｈｒ１０／Ｒ１８７７．ＪＰＧ）ことが知られている。これらの事実を併せ考えることにより、あそみのりには存在しＩＲ２４には存在しないＨｉｎｄＩＩＩ部位が、２個の候補部位のいずれかであると推定された。そこで、各ＨｉｎｄＩＩＩ部位周辺を増幅するように設計したプライマー組合せ（配列番号３および配列番号４）を用いて、９４℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を１サイクルとし３５サイクルの条件で、ゲノミックＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ処理後、２％アガロースゲルで電気泳動したところ、マーカープローブ内部のＨｉｎｄＩＩＩ部位が多型部位であることが示された。すなわち、ＰＣＲ産物（３６２ｂｐ）のＨｉｎｄＩＩＩ処理により、あそみのりでは９５ｂｐと２６７ｂｐとに切断されるのに対し、ＩＲ２４では切断されなかった。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＧ４００３がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＧ４００３  ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１９）と命名した。
（６）Ｃ１３６１のＰＣＲマーカー化
単離したゲノミッククローンの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計した。あそみのりおよびＩＲ２４のトータルＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、産物を電気泳動後、既述の方法で回収した。回収したＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３１０により各品種の塩基配列を解読し、多型作出に利用可能な変異を探索した。
Ｒ１８７７と同様の解析を行い、単離した３クローンのおおよその位置関係を明らかにすることはできた。しかし、Ｃ１３６１マーカー周辺にはＰＣＲ増幅しにくい領域や塩基配列を解読できない領域が存在することが明らかになり、ＲＦＬＰ原因部位を同定することは困難であると考えられた。そこで、比較的長いＰＣＲ産物（２．７ｋｂ）が得られる領域に着目し、ｄＣＡＰＳ化を試みることにした。
具体的には、あそみのり、コシヒカリ（以上、ジャポニカ米）及びＫａｓａｌａｔｈ、ＩＲ２４（以上、インディカ米）を用いて、前記領域のゲノミックＰＣＲ産物の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米・インディカ米間で多型を示す部位を６ヶ所見出すことができた。そのうちのひとつについて、ｄＣＡＰＳ化を行った。この過程で、プライマーとして配列番号５および配列番号６を用い、９４℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を１サイクルとし３５サイクルのＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＭｗｏＩ処理後、３％ＭｅｔａＰｈｏｒＴＭアガロースで電気泳動することにより解析した。あそみのりでは２箇所で切断され、約２５ｂｐ、５０ｂｐ、７９ｂｐのバンドが観察され、ＩＲ２４では１箇所で切断され、約５０ｂｐ、１０７ｂＰのバンドが観察された。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＣ１３６１がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＣ１３６１  ＭｗｏＩ（配列番号２０）と命名した。
（７）Ｇ２１５５のＰＣＲマーカー化
マーカープローブ両端部に対してプライマーを設計し、あそみのり、コシヒカリ、ＩＲ２４およびＩＬ２１６（戻し交雑によりコシヒカリにＲｆ−１遺伝子を導入した系統、遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ−１）のトータルＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の精製および多型作出に利用可能な変異の探索は、既述の方法で行った。
具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、Ｒｆ−１遺伝子保有品種系統（ＩＲ２４およびＩＬ２１６）とＲｆ−１遺伝子非保有品種系統（あそみのりおよびコシヒカリ）との間の変異が３ヶ所見出された。そのうちのひとつを利用して、ｄＣＡＰＳ化を行った。この過程で、プライマーとして配列番号７及び配列番号８を用い、９４℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を１サイクルとし３５サイクルのＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＭｗｏＩ処理後、３％ＭｅｔａＰｈｏｒＴＭアガロースで電気泳動することにより解析した。あそみのりでは１箇所で切断され、約２５ｂｐ及び１０５ｂｐのバンドが観察され、ＩＲ２４では２箇所で切断され、約２５ｂｐ、２７ｂｐ及び７８ｂｐのバンドが観察された。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＧ２１５５がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＧ２１５５  ＭｗｏＩ（配列番号２１）と命名した。
（８）Ｇ２９１のＰＣＲマーカー化
マーカープローブ内部配列に対してプライマーを設計し、種々のプライマー組合わせでＰＣＲを行い、期待される大きさの増幅産物が得られるプライマー組合わせを探索した。探索により見出したプライマー組合わせで、あそみのり、コシヒカリ、ＩＲ２４およびＩＬ２１６のトータルＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の精製および多型作出に利用可能な変異の探索は、既述の方法で行った。
具体的には、マーカープローブ配列に対して設計したプライマーを用いて、供試品種のゲノミックＰＣＲを行い、産物の塩基配列を比較した。その結果、Ｒｆ−１遺伝子保有品種系統（ＩＲ２４およびＩＬ２１６）とＲｆ−１遺伝子非保有品種系統（あそみのりおよびコシヒカリ）との間の変異が４ヶ所見出された。そのうちのひとつを利用して、ｄＣＡＰＳ化を行った。この過程で、プライマーとして配列番号９及び配列番号１０を用い、９４℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を１サイクルとし３５サイクルのＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＭｓｐＩ処理後、３％ＭｅｔａＰｈｏｒＴＭアガロースで電気泳動することにより解析した。Ｒｆ−１遺伝子保有品種系統では２箇所で切断され、約２５ｂｐ、４９ｂｐ及び５５ｂｐのバンドが観察され、Ｒｆ−１遺伝子非保有品種系統では１箇所で切断され、約２５ｂｐ及び１０４ｂｐのバンドが観察された。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＧ２９１がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＧ２９１  ＭｓＰＩ（配列番号２２）と命名した。
（９）Ｒ２３０３のＰＣＲマーカー化
マーカープローブ内部配列に対してプライマーを設計し、あそみのり（ジャポニカ米）、ＩＲ２４およびＫａｓａｌａｔｈ（インディカ米）のトータルＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行った。産物の精製および多型作出に利用可能な変異の探索は、既述の方法で行った。
供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米−インディカ米間の変異が見出された。この変異は、ＢｓｌＩ認識部位に生じていたので、そのままＣＡＰＳマーカーとした。この過程で、プライマーとして配列番号１１及び配列番号１２を用い、９４℃にて１分、５８℃にて１分、７２℃にて２分を１サイクルとし３０サイクルのＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＢｓｌＩ処理後、２％アガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポニカ米では１箇所で切断され、約２３８ｂｐ及び１３３４ｂｐのバンドが観察され、インディカ米では２箇所で切断され、約２３８ｂｐ、６５５ｂｐ及び６７９ｂｐのバンドが観察された。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＲ２３０３がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＲ２３０３  ＢｓｌＩ（配列番号２３）と命名した。
（１０）Ｓ１００１９のＰＣＲマーカー化
Ｓ１００１９のＰＣＲマーカー化は、上記Ｒ２３０３のＰＣＲマーカー化の方法（９）にしたがって行った。
具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米−インディカ米間の変異が見出された。この変異は、ＢｓｔＵＩ認識部位に生じていたので、そのままＣＡＰＳマーカーとした。この過程で、プライマーとして配列番号１３及び配列番号１４を用い、９４℃にて１分、５８℃にて１分、７２℃にて１分を１サイクルとし３０サイクルのＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＵＩ処理後、２％アガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポニカ米では１箇所で切断され、約１３０ｂｐ及び４６２ｂｐのバンドが観察され、インディカ米では２箇所で切断され、約１３０ｂｐ、２１８ｂｐ及び２４４ｂｐのバンドが観察された。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＳ１００１９がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＢｓｔＵＩ（配列番号２４）と命名した。
（１１）Ｓ１０６０２のＰＣＲマーカー化
Ｓ１０６０２のＰＣＲマーカー化は、上記Ｒ２３０３のＰＣＲマーカー化の方法（９）にしたがって行った。
具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米−インディカ米間の変異が見出された。その変異を利用して、ＣＡＰＳ化を行った。この過程で、プライマーとして配列番号１５及び配列番号１６を用い、９４℃にて１分、５８℃にて１分、７２℃にて１分を１サイクルとし３３サイクルのＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩ処理後、２％アガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポニカ米では１箇所で切断され、約１１７ｂｐ及び６０７ｂｐのバンドが観察され、インディカ米では切断されず、７２４ｂｐのバンドが観察された。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＳ１０６０２がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＳ１０６０２  ＫｐｎＩ（配列番号２５）と命名した。
（１２）Ｓ１２５６４のＰＣＲマーカー化
Ｓ１２５６４のＰＣＲマーカー化は、Ｒ２３０３のＰＣＲマーカー化の方法にしたがって行った。
具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米−インディカ米間の変異が見出された。その変異を利用して、ｄＣＡＰＳ化を行った。この過程で、プライマーとして配列番号１７及び配列番号１８を用い、９４℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を１サイクルとし３５サイクルのＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＴｓｐ５０９Ｉ処理後、３％ＭｅｔａＰｈｏｒＴＭアガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポニカ米では２箇所で切断され、２６ｂｐ、４１ｂｐ及び９１ｂｐのバンドが観察され、インディカ米では１箇所で切断され、４１ｂｐ及び１１７ｂｐのバンドが観察された。マッピングの結果、ＲＦＬＰマーカーＳ１２５６４がＰＣＲマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーをＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ（配列番号２６）と命名した。
参考例２  Ｒｆ−１遺伝子座のマッピング
ＭＳコシヒカリにＭＳ−ＦＲコシヒカリの花粉をかけて作成したＦ１集団１０４２個体の幼苗からＤＮＡを抽出し、分析に供試した。ここで、ＭＳコシヒカリとは、細胞質をＢＴ型雄性不稔細胞質に置換したコシヒカリである（世代：ＢＣ１０Ｆ１）。また、ＭＳ−ＦＲコシヒカリとは、ＩＲ８（農業生物資源研究所より入手）に由来するＲｆ−１遺伝子をＭＳコシヒカリに導入した系統である（Ｒｆ−１遺伝子座ヘテロ）。
まず、Ｒｆ−１遺伝子座を挟むと考えられる、参考例１に記載の２個のマーカー座Ｒ１８７７  ＥｃｏＲＩおよびＧ２１５５  ＭｗｏＩにおける各個体の遺伝子型を調査した。Ｒ１８７７  ＥｃｏＲＩ座またはＧ２１５５  ＭｗｏＩ座に関してジャポニカ米型ホモ個体を、これら２マーカー座間での組換え体とみなした。つぎに、各組換え体について、さらに、Ｇ２９１  ＭｓｐＩ座、Ｒ２３０３  ＢｓｌＩ座、Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座、Ｃ１３６１  ＭｗｏＩ座、Ｓ１００１９  ＢｓｔＵＩ座、Ｇ４００３  ＨｉｎｄＩＩＩ座およびＳ１０６０２  ＫｐｎＩ座の遺伝子型を調査し、組換え位置を同定した。
Ｒ１８７７  ＥｃｏＲＩ座およびＧ２１５５  ＭｗｏＩ座に関する遺伝子型調査の結果、稔性を回復した４６個体がＲｆ−１遺伝子座付近での組換え体であることが明らかになった。これら組換え体について、Ｒｆ−１遺伝子座近傍マーカー座の遺伝子型を調査した結果を表３に示す。
2004005515.tif 000007
表３に示されたように、Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉマーカーがジャポニカ型である個体８と、Ｃ１３６１  ＭｗｏＩ座マーカーがジャポニカ型である個体９および個体１０が得られた。いずれも稔性を回復した個体であることから、前者はＲｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体と解し、Ｒｆ−１遺伝子はＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間に存在することが判明した。上記交配において、ＢＴ型雄性不稔細胞質を持つ個体では、Ｒｆ−１遺伝子をもつ花粉のみが受精能力を持つとの報告（Ｃ．Ｓｈｉｎｊｙｏ，ＪＡＰＡＮ．Ｊ．ＧＥＮＥＴＩＣＳ  Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．３：１４９−１５６（１９６９））に基づいて、Ｒｆ−１遺伝子座を詳細連鎖地図上に位置づけることができた（図４）
実施例１  Ｒｆ−１座極近傍組換え個体の獲得
（材料および方法）
ＭＳコシヒカリ（世代：ＢＣ１０Ｆ１）にＭＳ−ＦＲコシヒカリ（世代：ＢＣ９Ｆ１、Ｒｆ−１座ヘテロ）の花粉をかけて作成したＢＣ１０Ｆ１集団４１０３個体を用い、各固体からＤＮＡを抽出し、上記参考例２と同様に、Ｓ１２５６４Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１  ＭｗｏＩ座の遺伝子型を調査した。Ｓ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換えにより生じた個体とみなし、Ｃ１３６１  ＭｗｏＩ座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、Ｒｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換えにより生じた個体とみなした。
（結果および考察）
４１０３個体を調査した結果、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を６個体見出した。一方、上記参考例２において交配により得られた１０４２個体を調査した結果、表３に示したように、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を２個体見出している。
合計すると、５１４５個体から、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を２個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を８個体獲得できたことになる。これら１０個体を以下の実施例における高精度分離分析に供試することにした。
実施例２  染色体歩行
（１）１回目染色体歩行
（材料および方法）
ジャポニカ品種あそみのり（Ｒｆ−１非保有品種）のゲノムＤＮＡを用いて、参考例１に記載したようにＬａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ  ＩＩベクターによりゲノミックライブラリーを作成し、染色体歩行に供試した。
ＲＦＬＰプローブ  Ｓ１２５６４の部分塩基配列（アクセッション番号Ｄ４７２８４）に対して次のプライマー対：
2004005515.tif 000008
を設計し、あそみのりトータルＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１２００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡは、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＡ、図１）とした。
ライブラリーのスクリーニングは、プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にブロットした後、常法により行った。単一プラークを分離した後、Ｌａｍｂｄａ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプレートライセート法によりファージＤＮＡを精製した。
（結果および考察）
スクリーニングにより４個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＡ１およびＷＳＡ３）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＡ１およびＷＳＡ３に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した（ＤＮＡシーケンサー３７７、ＡＢＩ社）。
（２）２回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーに加え、インディカ品種ＩＲ２４（Ｒｆ−１保有品種）のゲノムＤＮＡから同様に作成したＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
（１）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：
2004005515.tif 000009
を設計し、ＷＳＡ３のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた５２４ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＥ、図１）とした。
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより１５個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（ＷＳＥ８）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＥ８に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより７個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＸＳＥ１およびＸＳＥ７）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＥ１およびＸＳＥ７に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
（３）３回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーおよびＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
（２）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：
2004005515.tif 000010
を設計し、ＷＳＥ８のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた１１５９ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＦ、図１）とした。
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより８個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＦ５およびＷＳＦ７）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＦ５およびＷＳＦ７に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１３個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＸＳＦ４およびＸＳＦ２０）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＦ４およびＸＳＦ２０に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
（４）４回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーおよびＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
（３）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対してプライマー対：
2004005515.tif 000011
を設計し、ＷＳＦ７のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた４５６ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＧ、図１）とした。
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより６個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＧ２およびＷＳＧ６）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＧ２およびＷＳＧ６に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１４個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちの３クローン（ＸＳＧ８、ＸＳＧ１６およびＸＳＧ２２）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＧ８、ＸＳＧ１６およびＸＳＧ２２に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
（５）５回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
本発明者らは、ＴＩＧＲ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の公開ホームページを閲覧し、ＲＦＬＰマーカーＳ１２５６４を包含するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）が公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されていることを見出した。このＢＡＣクローンは、ジャポニカ品種日本晴のゲノムＤＮＡを含むものであり、塩基配列を比較したところ、（１）−（４）で作成したあそみのりおよびＩＲ２４のコンティグ領域を完全に包含することが示された（図２）。
そこで、このＢＡＣクローンの一部を増幅する次のプライマー対：
2004005515.tif 000012
を設計し、ＩＲ２４トータルＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約６００ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＨ、図１）とした。
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
（結果および考察）
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１５個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（ＸＳＨ１８）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＨ１８に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
実施例３  高精度分離分析
（１）ＰＣＲマーカーＰ４４９７  ＭｂｏＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２８）とを比較した結果、配列番号２７の１２３９番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２８の１２６３１番目の塩基はＧであることを見出した。
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000013
および
Ｐ４４９７  ＭｂｏＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000014
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約７３０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｂｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列（ＧＡＴＣ）をもたず、ＭｂｏＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列をもち、ＭｂｏＩ処理により切断されるため、ＭｂｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（２）ＰＣＲマーカーＰ９４９３  ＢｓｌＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２８）とを比較した結果、配列番号２７の６２２７番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２８の１７６２７番目の塩基はＣであることを見出した。
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ９４９３  ＢｓｌＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000015
および
Ｐ９４９３  ＢｓｌＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000016
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い１２６ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓｌＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｌＩの認識配列（ＣＣＮＮＮＮＮＮＮＧＧ）をもたず、ＢｓｌＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＢｓｌＩの認識配列をもち、ＢｓｌＩ処理により切断されるため、ＢｓｌＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法（Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ａｎｄ  Ａｍａｓｉｎｏ  １９９８，Ｎｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）を適用した。具体的には、前記Ｐ９４９３  ＢｓｌＩ  Ｒプライマーの使用により、配列番号２７の６２３６および配列番号２８の１７６３６のａがｇに置換される。これにより、あそみのりＤＮＡ由来の断片は、配列番号２８の１７６２６−１７６３６の部分の配列がＣＣｔｔｔｃｃｔｔＧＧとなり、ＢｓｌＩ処理により切断される。
（３）ＰＣＲマーカーＰ２３９４５  ＭｂｏＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２８）とを比較した結果、配列番号２７の２０６８０番目の塩基がＧであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２８の３２０７９番目の塩基はＡであることを見出した。
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ２３９４５  ＭｂｏＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000017
および
Ｐ２３９４５  ＭｂｏＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000018
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い２６０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｂｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列（ＧＡＴＣ）をもち、ＭｂｏＩ処理により切断されるのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列をもたず、ＭｂｏＩ処理により切断されないため、ＭｂｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（４）ＰＣＲマーカーＰ４１０３０  ＴａｑＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２８）とを比較した結果、配列番号２７の４５４６１番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２８の４９１６４番目の塩基はＧであることを見出した。
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４１０３０  ＴａｑＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000019
および
Ｐ４１０３０  ＴａｑＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000020
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い２８０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＴａｑＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＴａｑＩの認識配列（ＴＣＧＡ）をもたず、ＴａｑＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＴａｑＩの認識配列をもち、ＴａｑＩ処理により切断されるため、ＴａｑＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（５）ＰＣＲマーカーＰ４５１７７  ＢｓｔＵＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２８）とを比較した結果、配列番号２７の４９６０９番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２８の５３３１１番目の塩基はＧであることを見出した。
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４５１７７  ＢｓｔＵＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000021
および
Ｐ４５１７７  ＢｓｔＵＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000022
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い８１２ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓｔＵＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＵＩの認識配列（ＣＧＣＧ）を２個所もち、ＢｓｔＵＩ処理により３個の断片に切断されるのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＵＩの認識配列を３個所もち、ＢｓｔＵＩ処理により４個の断片に切断されるため、ＢｓｔＵＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（６）ＰＣＲマーカーＢ６０３０４  ＭｓｐＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号２７の５６３６８番目の塩基がＴであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ６０３０４  ＭｓｐＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000023
2004005515.tif 000024
および
Ｂ６０３０４  ＭｓｐＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000025
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約３３０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｓｐＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｐＩの認識配列（ＣＣＧＧ）をもたず、ＭｓｐＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｐＩの認識配列をもち、ＭｓｐＩ処理により切断されるため、ＭｓｐＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。具体的には、Ｂ６０３０４  ＭｓｐＩ  Ｒプライマーの使用により、配列番号２７の５６４６３のｇがｔに置換される。これにより、配列番号２７の５６４６０−５６４６３のＭｓｐＩの認識配列ＣＣＧＧがｃｃｇｔとなり、ＭｓｐＩによって切断されなくなる。よって、ＩＲ２４由来の断片はＭｓｐＩの認識配列を一つも有さず、一方、日本晴由来のＤＮＡは、配列番号２７の５６３６７−５６３７０に対応する領域に１箇所ＭｓｐＩの認識配列を有することとなる。
（７）ＰＣＲマーカーＢ５９０６６  ＢｓａＪＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号２７の５７６２９番目の塩基がＣであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣＣであることを見出した。
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５９０６６  ＢｓａＪＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000026
および
Ｂ５９０６６  ＢｓａＪＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000027
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約４２０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓａＪＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓａＪＩの認識配列（ＣＣＮＮＧＧ）をもたず、ＢｓａＪＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＢｓａＪＩの認識配列をもち、ＢｓａＪＩ処理により切断されるため、ＢｓａＪＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（８）ＰＣＲマーカーＢ５６６９１  ＸｂａＩの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号２７の６６２６７番目の塩基がＧであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５６６９１  ＸｂａＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000028
および
Ｂ５６６９１  ＸｂａＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000029
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約６７０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＸｂａＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＸｂａＩの認識配列（ＴＣＴＡＧＡ）をもたず、ＸｂａＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＸｂａＩの認識配列をもち、ＸｂａＩ処理により切断されるため、ＸｂａＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（９）ＰＣＲマーカーＢ５３６２７  ＢｓｔＺ１７Ｉの開発
実施例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２７）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号２７の６９３３１番目の塩基がＴであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５３６２７  ＢｓｔＺ１７Ｉ  Ｆ：
2004005515.tif 000030
および
Ｂ５３６２７  ＢｓｔＺ１７Ｉ  Ｒ：
2004005515.tif 000031
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約６２０ｂｐの断片を増幅する。
増幅産物をＢｓｔＺ１７Ｉ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＺ１７Ｉの認識配列（ＧＴＡＴＡＣ）をもち、ＸｂａＩ処理により切断されるのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＺ１７Ｉの認識配列をもたず、ＢｓｔＺ１７Ｉ処理により切断されないため、ＢｓｔＺ１７Ｉ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（１０）ＰＣＲマーカーＢ４０９３６  ＭｓｅＩの開発
以下の（１０）−（１２）のＰＣＲマーカーの開発はいずれも、配列番号２７の３’末端７６３６３よりもさらに下流（３’末端）側に相当する塩基配列についての研究に関する。
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
2004005515.tif 000032
および
2004005515.tif 000033
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１座の遺伝子型はＲｆ−１  Ｒｆ−１）およびコシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１３００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ４０９３６  ＭｓｅＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000034
および
Ｂ４０９３６  ＭｓｅＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000035
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＭｓｅＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−Ｉ  Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｅＩの認識配列（ＴＴＡＡ）をもち、ＭｓｅＩ処理により切断されるのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＭｓｅＩの認識配列をもたず、ＭｓｅＩ処理により切断されないため、ＭｓｅＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。
（１１）ＰＣＲマーカーＢ１９８３９  ＭｗｏＩの開発
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
2004005515.tif 000036
および
2004005515.tif 000037
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１  Ｒｆ−１）およびコシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１２００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ１９８３９  ＭｗｏＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000038
および
Ｂ１９８３９  ＭｗｏＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000039
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＭｗｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１  Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＭｗｏＩの認識配列（ＧＣＮＮＮＮＮＮＮＧＣ）をもたず、ＭｗｏＩ処理により切断されないのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＭｗｏＩの認識配列をもち、ＭｗｏＩ処理により切断されるため、ＭｗｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。
（１２）ＰＣＲマーカーＢ２３８７  ＢｆａＩ  の開発
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
2004005515.tif 000040
および
2004005515.tif 000041
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１  Ｒｆ−１）およびコシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１３００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ２３８７  ＢｆａＩ  Ｆ：
2004005515.tif 000042
および
Ｂ２３８７  ＢｆａＩ  Ｒ：
2004005515.tif 000043
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＢｆａＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１  Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＢｆａＩの認識配列（ＣＴＡＧ）をもたず、ＢｆａＩ処理により切断されないのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＢｆａＩの認識配列をもち、ＢｆａＩ処理により切断されるため、ＢｆａＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（１３）分離分析
実施例１で得られた、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体２個体（ＲＳ１およびＲＳ２）およびＲｆ−１座とＣ１３６１  ＭｗｏＩ座との間での組換え個体８個体（ＲＣ１からＲＣ８）について、上記（１）ないし（１２）で開発した１２個のＤＮＡマーカー座の遺伝子型を調査した。結果を、各個体のＳ１２５６４  Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１  ＭｗｏＩ座の遺伝子型とともに表４に示した。
2004005515.tif 000044
表４は、いずれの個体もＰ９４９３  ＢＳｌＩないし５９０６６  ＢｓａＪＩの間については、インディカ型品種由来のＲｆ−１染色体領域を有することを示す。この結果から、図３で示したような染色体構成をもつ組換え型花粉において、花粉の受精能力があること、すなわち、Ｒｆ−１遺伝子が機能していることが示された。これは、これらの組換え型花粉が共有するインディカ型領域、すなわち、最大限に見積もってもＰ４４９７  ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１  ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）に、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることを意味する。
ただし、Ｒｆ−１遺伝子の一部の遺伝子型がインディカ型であることが、Ｒｆ−１遺伝子の遺伝子機能発現に重要であり、残りの部分はジャポニカ型でもインディカ型でも遺伝子機能に大きな差異を生じない可能性がある。よって、上記共有インディカ型領域（配列番号２７の塩基１２３９ないし６６２６７）がＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含するとは、断定できない。しかしながら、以下の理由、
１）遺伝子の大きさは通常数ｋｂであり１０ｋｂを超えることは稀である；
２）本発明で明らかにしたＩＲ２４のゲノム塩基配列（配列番号２７）は、上記共有インディカ型領域を完全に包含する；
３）配列番号２７の５’末端は、上記共有インディカ型領域の５’末端から１２３８ｂｐ上流に位置し、別の遺伝子（Ｓ１２５６４）の一部である；および
４）配列番号２７の３’末端は、上記共有インディカ型領域の３’末端から１００９６ｂｐ下流に位置する
により、少なくとも配列番号２７はＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含すると考えられる。
実施例４  ＸＳＥ１由来の９．７ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＥ１（図１および５）をＮｏｔＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された９．７ｋｂの断片（配列番号２７の塩基１−９６５７を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクターｐＳＢ２００を作成した。具体的には、先ず、ユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）を接続した。これより得られたＰｕｂｉ−ｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ接続体のｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ間に、ハイグロマイシン体制遺伝子（ＨＹＧ（Ｒ））を挿入することにより、Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ−ＨＹＧ（Ｒ）−Ｔｎｏｓからなる接続体を得た。この接続体を、ｐＳＢ１１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に接続することにより、ｐＫＹ２０５を得た。このｐＫＹ２０５のＰｕｂｉ上流に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位にＮｏｔＩ、ＮｓｐＶ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を追加するためのリンカー部位を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有するｐＳＢ２００を得た。
上記プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＥ１由来の９．７ｋｂ断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振盪培養（３７℃、１時間）した後、スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの２４個についてプラスミドを単離した。その制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、組換えプラスミドにより形質転換された所望の大腸菌を選抜した。
上記により選抜した大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｔｉｎｇ）を行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、４８個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植３〜４週間後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４８個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した９．７ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例５  ＸＳＥ７由来の１４．７ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＥ７（図１および５）をＥｃｏＲＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１４．７ｋｂの断片（配列番号２７の塩基２６１８−１７２６１を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＳａｃＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＥ７由来の１４．７ｋｂ断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４８個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した１４．７ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例６  ＸＳＦ４由来の２１．３ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＦ４（図１および５）をＮｏｔＩで部分消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された２１．３ｋｂの断片（配列番号２７の塩基１２４７８−３３７５０を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＦ４由来の２１．３ｋｂの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４８個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した２１．３ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例７  ＸＳＦ２０由来の１３．２ｋｂ断庁に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＦ２０（図１及び５）をＳａｌＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１３．２ｋｂの断片（配列番号２の塩基２６８０９−４００５５を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＥｃｏＲＶで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＦ２０由来の１３．２ｋｂの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４４個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した１３．２ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例８  ＸＳＦ１８由来の１６．２ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＦ１８はＸＳＦ２０と５’末端及び３’末端（各々、配列番号２７の塩基２０３２８及び４１９２１）と同一だが、途中の塩基３３９４７−３８５９１を欠いている。よって、配列番号２７の塩基２０３２８−３３９４６及び３８５９２−４１９２１を含む。これは、最初にクローンＸＳＦ１８が単離されたが、単離後の増殖の過程で上記欠失を生じたことが判明したため、再度増殖をやり直すことにより、完全型のクローンを単離し、ＸＳＦ２０と命名したことに因る。
λファージクローンＸＳＦ１８（図５）をＮｏｔＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１６．２ｋｂの断片（配列番号２７の塩基２１０６５−３３９４６及び３８５９２−４１９２１を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＦ１８由来の１６．２ｋｂの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４８個体は、いずれも不稔であった（図６）。このことから、導入した１６．２ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例９  ＸＳＧ２２由来の１２．６ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ２２（図１および５）をＮｏｔＩで部分消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１２．６ｋｂの断片（配列番号２７の塩基３１６８４−４４１０９を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＧ２２由来の１２．６ｋｂの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４８個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した１２．６ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例１０  ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ断片に関する相補性試験
（１）
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６（図１および５）をＮｏｔＩで部分消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１５．７ｋｂの断片（配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４７個体のうち、少なくとも３７個体は、明らかに稔性を回復していた（図６）。このことから、導入した１５．７ｋｂ断片のなかのイネ（ＩＲ２４）に由来する部分である１５５８６塩基（配列番号２７の塩基３８５３８−５４１２３）が、完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していると考えられた。
（２）  ＸＳＧ１６内部の１１．４ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６をＡｌｗＮＩおよびＢｓｉＷＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１１．４ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
プラスミドベクターｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊｐｕｒｎａｌ，１９９６）をＳｍａＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備したふたつの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振とう培養（３７℃、１時間）した後、スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの１４個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
上記により選抜した大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ４Ｕ（高倉ら、特願２００１−２６９９８２（ＷＯ０２／０１９８０３  Ａ１））およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｔｉｎｇ）を行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、１２０個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植約１か月後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、各個体から標準的な穂を１穂サンプリングし、種子稔性（総もみ数に対する稔実もみの割合）を調査した。
（結果および考察）
形質転換植物１２０個体のうち、５９個体が１０％以上の種子稔性を示し、そのうち１９個体は７０％以上の種子稔性を示した。このことから、導入した１１．４ｋｂ断片（配列番号２７の４２３５７番目の塩基から５３７４３番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須のＲｆ−１遺伝子領域を包含していると考えられた。
（３）  ＸＳＧ１６内部の６．８ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６をＨｐａＩおよびＡｌｗＮＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された６．８ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
プラスミドベクターｐＳＢ１１の調整を含め、以後の過程は上記（２）に記載の方法に準拠した。
（結果および考察）
形質転換植物１２０個体のうち、６７個体が１０％以上の種子稔性を示し、そのうち２６個体は７０％以上の種子稔性を示した。このことから、導入した６．８ｋｂ断片（配列番号２７の４２１３２番目の塩基から４８８８３番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須のＲｆ−１遺伝子領域を包含していると考えられた。
実施例１１  ＸＳＧ８由来の１６．９ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ８（図１および５）をＮｏｔＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１６．９ｋｂの断片（配列番号２７の塩基４６５５８−６３３６４を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＧ８由来の１６．９ｋｂ断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４８個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した１６．９ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例１２  ＸＳＨ１８由来の２０．０ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＨ１８（図１および５）をＮｏｔＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された２０．０ｋｂの断片（配列番号２７の塩基５６４０９−７６３６３を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＨ１８由来の２０．０ｋｂの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４４個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した２０．０ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例１３  ＸＳＧ８およびＸＳＨ１８の重複部由来の１９．７ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
実施例１１におけるライゲーションによって得られた所望の大腸菌から単離したプラスミド（ＸＳＧ８ＳＢ２００Ｆ）を、ＳａｌＩおよびＳｔｕＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１２．８ｋｂの断片（配列番号２７の塩基５０４３０−６３１９７を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
一方、実施例１２におけるライゲーションによって得られた所望の大腸菌から単離したプラスミド（ＸＳＨ１８ＳＢ２００Ｒ）を、ＳａｌＩ、ＳｔｕＩおよびＸｈｏＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された６．９ｋｂ断片（配列番号２７の塩基６３１９４−７０１１６を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
さらに、プラスミドベクターｐＳＢ２００をＥｃｏＲＶで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
上記により準備した、ＸＳＧ８由来の１２．８ｋｂの断片、ＸＳＨ１８由来の６．９ｋｂの断片、及びベクター断片の三個の断片を供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。ライゲーション産物は、ＸＳＧ８およびＸＳＨ１８の重複部由来の１９．７ｋｂ断片（配列番号２７の５０４３０−７０１１６を含む）（図５のＸＳＸ１）を含む。以後、実施例４に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成・調査した。
（結果および考察）
形質転換植物４０個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した１９．７ｋｂ断片は、少なくとも完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していないと考えられた。
実施例１４  ｃＤＮＡライブラリーの作成
先ず、戻し交雑によりコシヒカリにＲｆ−１を導入した系統ＩＬ２１６（遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ−１）を作成した。前記ＩＬ２１６を慣行法で温室栽培し、葉耳間長が−５〜５ｃｍの生育段階で幼穂をサンプリングした。ＳＤＳ−フェノール法（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ａ．（１９８２）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｉｎ  ｓｐｉｎａｃｈ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，７９，６３０４−６３０８）でトータルＲＮＡを抽出した後、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によりｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＲＮＡを精製した。
次いで、精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを供試して、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりｃＤＮＡライブラリーを作成した。作成したライブラリー（１ｍｌ）のタイターは１６００００００ｐｆｕ／ｍｌと算出され、十分な大きさであると判断された。
実施例１５  ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
（１）スクリーニング用プライマーの作成
以下の２種類のプライマー、
センスプライマー
2004005515.tif 000045
アンチセンスプライマー
2004005515.tif 000046
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号７６及び７７は各々、配列番号２７の塩基４３７３３−４３７５６及び４４０３８−４４０１５に相当する。
電気泳動後、約３００ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした（以下、「プローブＰ」と呼称する）。
また、以下の２種類のプライマー、
センスプライマー
2004005515.tif 000047
アンチセンスプライマー
2004005515.tif 000048
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号７８及び７９は各々、配列番号２７の塩基４８３０６−４８３２９及び５０２２６−５０２０３に相当する。電気泳動後、約１９００ｂｐの増幅産物を上述の方法によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、上述の方法で３２Ｐ−ラベルした（以下、「プローブＱ」と呼称する）。
（２）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例１４で作成したｃＤＮＡライブラリーを供試して、約１５０００プラークが出現した寒天培地を７０枚作成した。各寒天培地について２回ずつプラークリフトを行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。一方のメンブレンをプローブＰとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンプレンをプローブＱとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。
ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび７％  ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液にプローブを添加し、６５℃で１６時間行った。洗浄は、１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液により６５℃、１５分で２回行った後、０．１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液により６５℃、１５分で２回行った。洗浄後のメンブレンをＦＵＪＩＸ  ＢＡＳ１０００（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍｓ）で解析した。
その結果、プローブＰおよびプローブＱのどちらでも陽性を示すプラークが８個見出された。そこで、それらプラークを単離し、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手引書に従いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。８個のクローンのうち、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致した。それら６クローンの全塩基配列を決定し、結果を、配列表の配列番号６９−７４に示した。
配列番号６９−７４のいずれの配列も、配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号６９の塩基２１５−２５８７、配列番号７０の塩基２１３−２５８５、配列番号７１の塩基２１８−２５９０、配列番号７２の塩基２０８−２５８０、配列番号７３の塩基１４９−２５２１及び配列番号７４の塩基２２５−２５９７が、いずれも配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
配列番号７５のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（Ｒｆ２）の推定アミノ酸配列（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）と比較したところ、Ｎ末端の７アミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）が一致した。これら７アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これらのことから、今回単離したｃＤＮＡはＲｆ−１遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネＲｆ−１とトウモロコシＲｆ２とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。遺伝子産物がミトコンドリアに移行してからの稔性回復機構は、両者で異なるものと推測される。
また、今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号２７）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図７）。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリＡ付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。
実施例１６  相補性試験
実施例１０（３）において、稔性回復能を持つことが証明されたＩＲ２４由来の６．８ｋｂゲノム断片を含むプラスミド中の、Ｒｆ−１遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を用いて、相補性実験を行った。
先ず、上記実施例１０（３）のプラスミドをＥｃｏＲＩで処理し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片（配列番号２７の塩基４２１３２−４６３１８に相当する）を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。この４．２ｋｂ断片を、ＥｃｏＲＩ処理後ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ）処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）とともに供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振とう培養（３７℃、１時間）した後、アンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。つぎに、選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行い、Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。
一方、ＴｎｏｓＪＨ００７２（ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行った。ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子カセットとを包含する３．０ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。
Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片及びＴｎｏｓＪＨ００７２由来の断片を、前述の方法でライゲーション反応およびポレーションを行った。アンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７°Ｃ、１６時間）後、生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
さらに、上述のとおり選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、ＳｇｆＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行い、Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。この４．２ｋｂ断片を、ＰａｃＩ処理後ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ）処理したｐＳＢ２００Ｐａｃ（ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）とともに供試して、前述の方法でライゲーション反応およびポレーションを行った。スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）後、生じたコロニーのなかの１６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
以上の工程により、Ｒｆ−１のプロモーター領域とＲｆ−１の予想翻訳領域を含む断片にｎｏｓターミネーターが接続されたキメラ遺伝子が、中間ベクター内に挿入された大腸菌が得られた。この大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢ４４０４／ｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）の方法に従いｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｔｉｎｇを行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、３２個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体？ポット）、移植３〜４週間後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査した。その結果、３２個体のうち２８個体は、稔性を回復していることがわかった。
以上の結果から、予想翻訳領域を発現させることによりＲｆ−１遺伝子の機能を付与できることが、実験的に証明された。
実施例１７  ｃＤＮＡ単離
実施例１５は、プローブＰおよびプローブＱによりＩＲ２４幼穂由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、どちらのプローブでも陽性を示すプラークを単離・解析することにより、６個のｃＤＮＡを単離した。本実施例では、プローブＰおよび下記のプローブＲにより同様のスクリーニングを行うことにより、さらに６個のｃＤＮＡを単離した。詳細は、以下のとおりである。
まず、２種類のプライマー、
センスプライマー
2004005515.tif 000049
アンチセンスプライマー
2004005515.tif 000050
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号８６および８７は各々、配列番号２７の塩基４５５２２−４５５４５及び４５９５５−４５９３２に相当する。
電気泳動後、約４３０ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ  ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした（プローブＲ、図８）。
ＩＲ２４幼穂由来ｃＤＮＡライブラリーを供試して、約１５０００プラークが出現した寒天培地を２０枚作成した。各寒天培地について２回ずつプラークリフトを行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。一方のメンブレンを実施例１５のプローブＰとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンブレンをプローブＲとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。その結果、プローブＰおよびプローブＲのどちらでも陽性を示すプラークが１２個見出された。
そこで、それらプラークを単離し、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手引書に従いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。１２個のクローンのうち、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致したため、それら６クローンの全塩基配列を決定した（＃７−＃１２）。その結果を配列番号８０−８５に示す。
配列番号８０−８５のいずれの配列も、配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号８０の塩基２２９−２６０１、配列番号８１の塩基１７５−２５４７、配列番号８２の塩基２２７−２５９９、配列番号８３の塩基２２０−２５９２、配列番号８４の塩基１７４−２５４６及び配列番号８５の塩基９０−２４６２が、いずれも配列番号７５のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号２７）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図８）。今回単離したｃＤＮＡのなかには、予想翻訳領域とは関係のないエキソンを含まず、単一エキソンからなるものも３個存在した（＃１０−＃１２、配列番号８３−８５）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
2004005515.tif 000195
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2004005515.tif 000201
【国際調査報告】
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2004005515.tif 000203