(57)【要約】本発明の放線菌由来のプラスミドは、ストレプトマイセス・ロチェイ由来の線状プラスミド（ｐＳＬＡ２−Ｌ）であり、配列表の配列番号１から配列番号１４３までのアミノ酸配列、または、上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を生成する塩基配列を有し、二次代謝物を生産するためのものである。上記プラスミドおよびそれを用いた二次代謝物の製造方法は、抗生物質等の二次代謝物を選択的に効率よく産生できる。
2004001039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・ロチェイ由来の線状プラスミド（ｐＳＬＡ２−Ｌ）であり、配列表の配列番号１から配列番号１４３までのアミノ酸配列、または、上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列に対応する塩基配列を有し、二次代謝物を産生するためのものであることを特徴とする放線菌由来のプラスミド。
【請求項２】
ストレプトマイセス・ロチェイ由来の線状プラスミド（ｐＳＬＡ２−Ｌ）であり、配列表の配列番号１から配列番号１８まで、配列番号２４から配列番号５３まで、配列番号６２から配列番号７０まで、および配列番号１０４から配列番号１１０までのアミノ酸配列、または、上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列に対応する塩基配列を有し、二次代謝物を産生するためのものであることを特徴とする放線菌由来のプラスミド。
【請求項３】
配列表の配列番号３から配列番号２３までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ランカサイジン類を産生するためのものであることを特徴とする放線菌由来のプラスミド。
【請求項４】
配列表の配列番号３から配列番号１８までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ランカサイジン類を産生するためのものであることを特徴とする放線菌由来のプラスミド。
【請求項５】
さらに、配列表の配列番号７５に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を調節遺伝子として有している請求の範囲第３項記載の放線菌由来のプラスミド。
【請求項６】
さらに、配列表の配列番号７５に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を調節遺伝子として有している請求の範囲第４項記載の放線菌由来のプラスミド。
【請求項７】
配列表の配列番号２４から配列番号５３までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ランカマイシン類を産生するためのものであることを特徴とする放線菌由来のプラスミド。
【請求項８】
配列表の配列番号７５に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を調節遺伝子として有している請求の範囲第７項記載の放線菌由来のプラスミド。
【請求項９】
配列表の配列番号６２から配列番号７０までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ミスラマイシン様物質を産生するためのものであることを特徴とする放線菌由来のプラスミド。
【請求項１０】
配列表の配列番号１０３から配列番号１１０までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、カロチノイド類を産生するためのものであることを特徴とする放線菌由来のプラスミド。
【請求項１１】
配列表の配列番号７１に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を調節遺伝子として有している請求の範囲第１０項記載の放線菌由来のプラスミド。
【請求項１２】
請求の範囲第１項ないし第１１項の何れか１項に記載の放線菌由来のプラスミドを用いることを特徴とする二次代謝物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、有用な抗生物質等の二次代謝物の産生に好適な、放線菌由来のプラスミドおよびそれを用いた二次代謝物の製造方法に関するものである。
【背景技術】  従来、生物の増殖・生長・維持に必須のタンパク質、いわゆる一次代謝物をコードする遺伝子とその利用に比べると、それを産出する生物、例えば植物や微生物にとっては非必須の抗生物質やビタミン等で代表される二次代謝物をコードする遺伝子とその利用については、それほど知られていない。
放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、以下、Ｓ．と略記する）は、抗生物質を含む多くの役に立つ二次代謝物を作り出す糸状性の土壌中に存在するバクテリアである。放線菌における、抗生物質のための生合成遺伝子は、遺伝子群を形成していて、通常、染色体の上に位置している。
しかしながら、放線菌において、線状プラスミドが抗生物質産生にかかわることが三例知られている。その三例とは、ＳＣＰ１と、ｐＳＬＡ２−Ｌと、ｐＰＺＧ１０３である。ＳＣＰ１は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来で、メチレノマイシン産生のためのものである。ｐＳＬＡ２−Ｌは、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ由来で、ランカサイジンとランカマイシン産生のためのものである（Ｋｉｎａｓｈｉ．Ｈ．，Ｍｏｒｉ，Ｅ．，Ｈａｔａｎｉ，Ａ．＆  Ｎｉｍｉ，Ｏ．（１９９４）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｖｏｌ．４７，ｐｐ１４４７−１４５５，Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｉ．Ｓ．，Ｈａｔａｎｉ，Ａ．，Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．＆  Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｈ．（１９９８）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６２  ｐｐ１８９２−１８９７，Ｓｕｗａ，Ｍ．，Ｓｕｇｉｎｏ，Ｈ．，Ｍｏｒｉ，Ｅ．，Ｓａｓａｏｋａ，Ａ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｈ．，Ｎｉｍｉ，Ｏ．＆  Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｈ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｖｏｌ．２４６，ｐｐ１２３−１３１）。ｐＰＺＧ１０３は、Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ由来で、オキシテトラサイクリン産生のためのものである。
Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ７４３４ＡＮ４株では、構造的に互いに無関係な２個のポリケタイド抗生物質が産生されることが知られている。つまり、１４−員環のマクロライド（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）であるランカマイシン（ｌａｎｋａｍｙｃｉｎ，ＬＭ、図５（ａ）参照）、珍しい１７−員環のマクロライドであるランカサイジン（ｌａｎｋａｃｉｄｉｎ，ＬＣ、図５（ａ）参照）である。ランカサイジンは、豚の赤痢（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）の感染を予防するため、また、感染した場合に治療するために飼料に添加されて使用される。
しかしながら、二次代謝物の産生に有用と考えられた、ｐＳＬＡ２−Ｌの全塩基配列については、完全には解明されていなかった。
本発明は、ｐＳＬＡ２−Ｌの全塩基配列を、完全に解明することで、有用な二次代謝物を選択的に効率よく産生でき、また、二次代謝物の産生に関与している遺伝子の塩基配列を一部変えることで、より有用な二次代謝物を産生できることを目的としている。
【発明の開示】
本発明の放線菌由来のプラスミドは、以上の課題を解決するために、ストレプトマイセス・ロチェイ由来の線状プラスミド（ｐＳＬＡ２−Ｌ）であり、配列表の配列番号１から配列番号１４３までのアミノ酸配列、または、上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列に対応する塩基配列を有し、二次代謝物を産生するためのものであることを特徴としている。
本発明の他の放線菌由来のプラスミドは、前記の課題を解決するために、ストレプトマイセス・ロチェイ由来の線状プラスミド（ｐＳＬＡ２−Ｌ）であり、配列表の配列番号１から配列番号１８まで、配列番号２４から配列番号５３まで、配列番号６２から配列番号７１まで、および配列番号１０４から配列番号１１０までのアミノ酸配列、または、上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列に対応する塩基配列を有し、二次代謝物を産生するためのものであることを特徴としている。
本発明のさらに他の放線菌由来のプラスミドは、前記の課題を解決するために、配列表の配列番号３から配列番号２３まで、または配列表の配列番号３から配列番号１８までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ランカサイジン類を産生するためのものであることを特徴としている。
上記放線菌由来のプラスミドにおいては、配列表の配列番号７５に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を調節遺伝子として有していることが好ましい。
本発明のさらに他の、放線菌由来のプラスミドは、前記の課題を解決するために、配列表の配列番号２４から配列番号５３までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ランカマイシン類を産生するためのものであることを特徴としている。
上記放線菌由来のプラスミドでは、配列表の配列番号７５に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を調節遺伝子として有していることが望ましい。
本発明のさらに他の放線菌由来のプラスミドは、前記の課題を解決するために、配列表の配列番号６２から配列番号７１までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ミスラマイシン様物質を産生するためのものであることを特徴としている。
本発明のさらに他の放線菌由来のプラスミドは、前記の課題を解決するために、配列表の配列番号１０３から配列番号１１０までのアミノ酸配列に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、カロチノイド類を産生するためのものであることを特徴としている。
上記放線菌由来のプラスミドでは、配列表の配列番号７１に対応する塩基配列、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を調節遺伝子として有していることが好ましい。
本発明の二次代謝物の製造方法は、前記の課題を解決するために、上記の何れかに記載の放線菌由来のプラスミドを用いることを特徴としている。
上記構成によれば、プラスミド（ｐＳＬＡ２−Ｌ）により、有用な抗生物質などの二次代謝物を選択的に効率よく産生できる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明に係る放線菌由来のプラスミドである、ｐＳＬＡ２−Ｌに関する全ヌクレオチド配列の決定によって、判別された各ＯＲＦのロケーションと、それらの機能的な分類を示すリニアマップを示すブロック図である。
図２は、上記ｐＳＬＡ２−Ｌに関する全ヌクレオチド配列の決定のために用いたコスミドライブラリー作製の手順を示すフローチャートである。
図３は、上記ｐＳＬＡ２−Ｌに関する全ヌクレオチド配列の決定方法に用いた各コスミドと、ＰｓｔＩ断片地図との関係を示すブロック図である。
図４は、上記リニアマップを他の形式で示すブロック図である。
図５（ａ）は、上記ｐＳＬＡ２−Ｌにて産生される抗生物質である、ランカサイジンＣを示す構造式である。
図５（ｂ）は、上記ｐＳＬＡ２−Ｌにて産生される抗生物質である、ランカマイシンを示す構造式である。
図６（Ａ）は、上記ｐＳＬＡ２−Ｌにコードされた調節タンパクの、Ｎ−端末領域のアミノ酸配列を、他の放線菌由来の配列とを比較するためのＴｅｔＲファミリーレプレッサータンパクの配列と比較するための配列表である。
図６（Ｂ）は、上記ｐＳＬＡ２−Ｌにコードされた調節タンパクの、Ｎ−端末領域のアミノ酸配列を、他の放線菌由来の配列とを比較するためのＳＡＲＰファミリー調節タンパクの配列と比較するための配列表である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
本発明に係る、放線菌由来のプラスミドは、ストレプトマイセス・ロチェイ（Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ）７４３４ＡＮ４株由来の、線状のプラスミドｐＳＬＡ２−Ｌである。本発明者らにより、初めて完全なヌクレオチド配列が決定された上記プラスミドｐＳＬＡ２−Ｌは、全長が２１０，６１４  ｂｐ（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）であり、７２．８％のＧＣ含量をもち、両端にそれぞれ１，９９２ｂｐの末端逆位配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ，ＴＩＲ）を備え、配列表の配列番号１から配列番号１４３までに示すように、１４３個の各ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）を有することが分かった。本明細書では、各配列番号は、ＯＲＦの番号に、例えば配列番号１がＯＲＦ１にというように、それぞれ、１：１にて対応している。
特に、ｐＳＬＡ２−ＬのＤＮＡの３／４が二次代謝物（抗生物質やビタミンやビタミン誘導体等）産生に関連した遺伝子によって占められているのは、注目に値する。すなわち、プラスミドｐＳＬＡ２−ＬのＤＮＡは、後に詳述するように、抗生物質であるランカサイジンとランカマイシンのための、２つのＩ型ポリケタイドシンターゼ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰＫＳ）遺伝子群、ミスラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ，ｍｔｍ）シンターゼのようなＩＩ型のＰＫＳ遺伝子群、カロチノイドの生合成遺伝子群、および、上記各二次代謝物の産生を調節する多くの調節遺伝子を有している。
プラスミドｐＳＬＡ２−Ｌの各遺伝子群や各遺伝子は、それら単独または組み合わせて、あるいは培養された寄主微生物の細胞内で増殖し得る形式を備えたベクターＤＮＡに組み込まれて、寄主微生物内に導入した、組み換え微生物によって、前記の各二次代謝物をそれぞれ選択的に効率よく産生できるものである。プラスミドｐＳＬＡ２−Ｌの各遺伝子群や各遺伝子を、寄主微生物に導入する方法については、既知の何れの方法も適用可能である。寄主微生物としては、放線菌である、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
また、プラスミドｐＳＬＡ２−Ｌの各遺伝子群や各遺伝子については、それらの機能を阻害しない範囲で、それらの塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有したものでもよい。これにより、より有用な二次代謝物を得ることが可能となる。
ｐＳＬＡ２−Ｌの塩基配列（上記塩基配列に基づくアミノ酸配列）を決定するための実験に用いた、材料および方法、バクテリアのストレイン、コスミドおよびプラスミドについて、以下に説明する。
コスミドライブラリーは、図２に示すように、ベクターであるＳｕｐｅｒｃｏｓ  １とＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｕｒｅ  ２を用いて、プラスミドｐＳＬＡ２−Ｌのみを有する変異株である、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ５１２５２株の全ＤＮＡに対して構築され、次に、ｐＳＬＡ２−ＬのＤＮＡをプローブとして用いて、サブライブラリを得た（Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｓ．，＆  Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｈ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．２６３，ｐｐ１０１５−１０２１．）。
ｐＳＬＡ２−Ｌのサブライブラリ中における４０個のコスミドが、ＲＮＡ（リボ核酸）エンドプローブを使用しながら、クロスハイブリダイゼーションの繰り返しによって、順序づけられ、最終的には６つのコスミド（Ｂ１０、Ａ１、１４Ｆ１、Ａ８、Ｃ７、およびＡ７）が、図３に示されるリニアマップ上に並べられた。
左端および右端の領域が、３つのプラスミド、ｐＥ４、ｐＨｉｎｄＥおよびｐＥ３において、以前にクローニングされている（（１９９８）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６２  ｐｐ１８９２−１８９７．）。こうして本発明者らは、塩基配列の決定のために、ｐＳＬＡ２−Ｌの全体の領域を備えたＤＮＡ断片を入手した。ｐＳＬＡ２−Ｌの左端と右端については、最近、報告されている（Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｓ．，＆  Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｈ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．２６３，ｐｐ１０１５−１０２１）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢｌｕｅとｐＵＣ１９は、クローニング、一連のＤＮＡ欠失、および塩基配列決定のために使用された。
ヌクレオチドの配列の決定とその分析については以下の通りである。配列の決定のためには、以下に示す２つの戦略の組み合わせが使用された。
１）整列化された各コスミドのＳａｕ３ＡＩ部分的消化物のショットガンクローニング。
２）ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲｌおよびＫｐｎＩ断片のエキソヌクレアーゼーＩＩＩによる欠失クローニング。
ヌクレオチドの配列は、４２００型シーケンサ（ＬＩ−ＣＯＲ社製、リンカーン（ネブラスカ州）、ＮＥ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、または、ＡＢＩ−３７３Ｓシーケンサ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤＹＥｎａｍｉｃ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ジデオキシターミネーション（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）によって決定された。
各配列のデータがＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ３．１．１（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって再構成され、ＧＥＮＥＴＹＸプログラム（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ東京）およびＦｒａｍｅＰｌｏｔプログラムによって分析された（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｊ．＆  Ｈｏｔｔａ，Ｋ．（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ．１７４，ｐｐ２５１−２５３）。遺伝子予測は放線菌のユニークなコドン用法に基づいて行った（Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｉｎｄｌａｙ，Ｐ．Ｒ．＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｗ，（１９８４）Ｇｅｎｅ  Ｖｏｌ．３０，ｐｐ１５７−１６６）。
開始コドン（ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＣＴＧまたはＴＴＧ）の選択が可能な位置では、それらを選んだ。上記開始コドンの上流側に、リボソーム結合部位が位置している。このことを確認できない場合、最も上流側の開始コドンが選ばれた。
ＤＮＡ操作・遺伝子破壊およびバイオアッセイは下記の通りである。放線菌の総ＤＮＡは、前述した（（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｖｏｌ．２４６，ｐｐ１２３−１３１６）にて記述されているように、中性（ｎｅｕｔｒａｌ）法によって調製された。
遺伝子破壊のための破壊（ターゲット）ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７（ｄａｍ  ｄｃｍ  ｈｓｄＭ）中で増やして調製されたシャトル・ベクターｐＲＥＳ１８（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｊ．，Ｎｉｉｎｏ，Ｙ．，Ｈｏｔｔａ，Ｋ．（１９９６）ＦＥＭＳ  Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ．１４５，ｐｐ１１３−１１６）を用いて調製され、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ５１２５２株内に導入された。抗生物質生成能の破壊株は、指標細菌としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓを使用して、バイオオートグラフィによって活性が調べられた。
次に、ｐＳＬＡ２−Ｌの塩基配列の基本的な特徴について説明する。
ｐＳＬＡ２−Ｌは、両端部に、１，９９２ｂｐの末端逆位配列を備え、２１０，６１４ｂｐの線状プラスミドであると決定された。ｐＳＬＡ２−ＬのＧＣ含量は７２．８％であり、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）のトータルＧＣ含量７２．１％と似ていた。
ｐＳＬＡ２−Ｌは、図１に示すように、左端から順に番号が付与された１４３個の各ＯＲＦを有している。１４３個の各ＯＲＦの多く（１１１個の各ＯＲＦ、７８％）では、各ＯＲＦはデータベースの類似性からその機能が予測される一方、残余の３２個の各ＯＲＦについては、仮定の、または未知のものである。仮定または未知の各ＯＲＦは、主に、ｐＳＬＡ２−Ｌの右端の近傍に位置している。
ｐＳＬＡ２−Ｌの最も興味深い特徴は、そのＤＮＡの３／４が二次代謝物のための生合成遺伝子群によって占められていることである。遺伝子群の範囲は主に類似した遺伝子群と比較することによって割り当てられているが、将来においては、改められる可能性がある。
ランカサイジンのための遺伝子群（ｌｋｃ，ＯＲＦ３−ＯＲＦ１８またはＯＲＦ３−ＯＲＦ２３、より好ましくはＯＲＦ４−ＯＲＦ１８）とランカマイシン（ｌｋｍ，ＯＲＦ２４−ＯＲＦ５３）のための２つの大きい、Ｉ型のＰＫＳ遺伝子群はｐＳＬＡ２−Ｌの左の半分を占める。これらの遺伝子群（クラスタ）に続いて、別のＩ型のＰＫＳ遺伝子群とＩＩ型のＰＫＳ遺伝子群が位置している。興味深いことに、これらの各遺伝子群の全てが、長い介在配列なしで互いに密に配置されている。
３組の複製開始タンパク（ＯＲＦ８７とＯＲＦ８９、ＯＲＦ９３とＯＲＦ９４、ＯＲＦ９５とＯＲＦ９６）は、右端から５０ｋｂ−６３ｋｂの位置にて見出され、２つの各パーティション（分配）遺伝子（ｐａｒＡとｐａｒＢ）が、ＯＲＦ９８とＯＲＦ９７とにそれぞれ位置している。
カロチノイドの生合成遺伝子群は３つの各複製起点の右側に存在している。二次代謝物産生のための調節遺伝子はプラスミドの全体の領域にわたって分散して配置されている。ＴＴＡコドンは５つの各ＯＲＦ（ＯＲＦ８９、ＯＲＦ１１２、ＯＲＦ１３１、ＯＲＦ１３８およびＯＲＦ１３９）でそれぞれ見出されたので、それらの翻訳は、ｂｌｄＡ（Ｌｅｓｋｉｗ，Ｂ．Ｋ．，Ｌａｗｌｏｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｂａｌｏｓ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ，Ｆ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８８，ｐｐ２４６１−２４６５）によってコード化されたｔＲＮＡに依存している。
ＯＲＦ８９を除く、上記の各ＯＲＦは、仮のタンパクをコード化している。上記ＯＲＦ８９は、上述したように、複製開始タンパクをコードしている。４つの主な各生合成遺伝子群に分類される各遺伝子の予測された機能は下記の表１ないし４に要約して示した。
2004001039.tif 000003
2004001039.tif 000004
2004001039.tif 000005
2004001039.tif 000006
上記表１および表２では、ＰＫＳ遺伝子群およびＮＲＰＳ遺伝子群における、各領域の順序をカッコ内にて示した。また、上記表２における、ＫＲ＊は，機能しない（ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ＫＲ領域を示す。ｐＳＬＡ２−Ｌのヌクレオチドの完全な配列は、添付した配列表にアミノ酸として示すと共に、本発明の詳細な説明の欄の末尾に記載されているように、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出された各データにより示されている。
ランカサイジンシンターゼ（ｌｋｃ）遺伝子群（ＯＲＦ３−ＯＲＦ１８またはＯＲＦ３−ＯＲＦ２３、より好ましくはＯＲＦ４−ＯＲＦ１８）について以下に説明する。幾つかのＩ型の各ＰＫＳ遺伝子がｐＳＬＡ２−Ｌの左端の近くにて見出されたが、ｅｒｙＡＩプローブは、上記左端の近くの領域にハイブリダイズしなかった。
これらの遺伝子の機能を明らかにするために、破壊用プラスミドｐＣ１０ＰＲがコスミドＣ１０から組み立てられた（図３）。ｐＣ１０ＰＲでは、コスミド挿入断片の左右の端だけが維持されて、中央の３５−ｋｂ領域はカナマイシンカセットに置き換えられた。このプラスミドを使用することによって、ＰｓｔＩの各フラグメントＥ１、Ｃ、Ｂ上に延びるｐＳＬＡ２−ＬのＤＮＡは削除された。このような遺伝子破壊株は、ＬＣおよびＬＭを生産しなかった。それらのことは、削除された領域が、ｌｋｍ遺伝子群の左側の部分と共に、ｌｋｃ遺伝子群を有していることを示している。
ｌｋｃ遺伝子群の範囲は以下の通り決定された。ＯＲＦ３の各破壊株は、ＬＭとＬＣとの両方を生産する一方、ＯＲＦ７の各破壊株はＬＭだけを生産した。ＯＲＦ４−ＯＲＦ８は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）合成のための遺伝子群（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｊ．Ｍ．，Ｓｅｌｌｉｎｋ，Ｅ．，Ｒｉｅｇｍａｎ，Ｎ，Ｈ．＆  Ｐｏｓｔｍａ，Ｐ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．２３２，ｐｐ２８４−２９４）であるので、ｌｋｃ遺伝子群の左端はＯＲＦ４に位置していると決定された。ＯＲＦ７の破壊株の液体培養に対して、ＰＱＱが、２μｇ／ｍｌの最終濃度となるように添加したところ、上記破壊株でもＬＣの合成が回復した。これにより、上記決定が正しいことは裏付けられた。
ＬＣの珍しい１７−員環のラクトンリングはイミド結合のＣ１８位へのＣ２位の親核反応によって形成される可能性がある。ＰＱＱに依存する酸化が上記反応中間体の形成に関与していると考えられた。ＰＱＱ合成遺伝子は、以前においては、グラム陰性のバクテリアのみにて見出されていたが、本発明において、グラム陽性バクテリアから初めて見出された。
ＯＲＦ１８の破壊株は、ＬＣを生産しなかったがＬＭを生産した。一方、ＯＲＦ１９の破壊株は、上記両方の抗生物質（ＬＣおよびＬＭ）を生産した。この結果は、ｌｋｃ遺伝子群の右端が、ＯＲＦ１８に位置し、上記遺伝子群のサイズが３１ｋｂであることを決定した。
各ｌｋｃ−ＰＫＳ遺伝子は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内にて見出され、その機能がはっきりさせられなかった、Ｉ型の各ｐｋｓ−ＰＫＳ遺伝子（Ｋｕｎｓｔ，Ｆ．，Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｎ．，Ｍｏｓｚｅｒ，Ｉ．，Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．，Ａｌｌｏｎｉ，Ｇ．，Ａｚｅｖｅｄｏ，Ｖ．，Ｂｅｒｔｅｒｏ，Ｍ．Ｇ．，Ｂｅｓｓｉｅｒｅｓ，Ｐ．，Ｂｏｌｏｔｉｎ，Ａ．，Ｂｏｒｃｈｅｒｔ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｖｏｌ．３９０，ｐｐ２４９−２５６）によく類似している。
ＬＣのマクロライド骨格は、最初、グリシン分子に対して８個の酢酸分子が順次付加されて合成されることが知られている（Ｕｒａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｏｔａｋｅ，Ｎ．，Ｃａｒｙ，Ｌ．，＆  Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．（１９７８）Ｊ  Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１００，ｐｐ３６１６−３６１７）。上記のＬＣにおける、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−１０、およびＣ−１６の各位における全てのメチル基は、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）起源ではなく、Ｃ−メチル化によるメチオニン起源である。この事実は、従来の普通のモジュラー型の各ＰＫＳ遺伝子と本発明に係るｌｋｃ−ＰＫＳとを互いに区別する。ＯＲＦ１８（遺伝子群における最初のＰＫＳ遺伝子）は非リボソーム性ペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）とＰＫＳの融合タンパク質をコード化している。
ＮＲＰＳ領域は、縮合、アデニル化（ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）およびチオール化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）（ＰＣＰ）のための領域を有している一方、ＰＫＳ領域はＫＳ領域のみ有している。アデニル化領域は、各アミノ酸を認識するために重要な１０個の各位置に（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ，Ｔ．，Ｍｏｏｔｚ，Ｈ．Ｄ．，＆  Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．６，ｐｐ４９３−５０５）、ＤＩＬＱＴＬＶＥＡＫというアミノ酸残基を含んでいる。
また、抗生物質ＴＡ（Ｐａｉｔａｎ，Ｙ．，Ａｌｏｎ，Ｇ．，Ｏｒｒ，Ｅ．，Ｒｏｎ，Ｅ．Ｚ．＆  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２８６，ｐｐ４６５−４７４）とサフラマイシンＭｘ１（Ｐｏｓｐｉｅｃｈ，Ａ．．Ｃｌｕｚｅｌ，Ｂ．，Ｂｉｅｔｅｎｈａｄｅｒ，Ｊ．＆  Ｓｃｈｕｐｐ，Ｔ．（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１４１，ｐｐ１７９３−１８０３）は、グリシン分子を組み込んでおり、それらのアデニル化領域は、それぞれ、同様な各残基、ＤＩＬＱＬＲＬＶＥＴＫおよびＤＩＬＱＴＬＶＥＴＡを含んでいる。これらの結果はグリシン認識のために特徴的な配列を示している。上記の配列は、前述した（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ，Ｔ．，Ｍｏｏｔｚ，Ｈ．Ｄ．，＆  Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．６，ｐｐ４９３−５０５）では決定されていない。したがって、ＯＲＦ１８はグリシンと酢酸との初期の縮合反応に関与している可能性がある。
酢酸の８回縮合反応がランカサイジン骨格の合成には必要であるが、５つのＫＳ領域だけがｌｋｃ遺伝子群（ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１６、ＯＲＦ１３×２、ＯＲＦ１２）の中で見出された。さらに、Ｉ型の各ＰＫＳ遺伝子（ＯＲＦ５６−ＯＲＦ６１）がｐＳＬＡ２−Ｌの中央部に位置することが見出されたが、これら各ＰＫＳ遺伝子の破壊株は、ＬＣ合成に対して後述するように何ら影響しなかった。
したがって、そのようなｌｋｃ−ＰＫＳは、モジュラー型と繰り返し型との混合物である可能性が有り、５つのＫＳ領域を使用することによって、８回の縮合反応を実行するものである。また、ｌｋｃ−ＰＫＳ（ＫＲ−ＡＣＰ−ＫＳ）の各領域の順番が、Ｉ型の典型的な、各ＰＫＳ遺伝子群（ＫＳ−ＡＴ−ＫＲ−ＡＣＰ）と異なっていることも注目に値する。
ｌｋｃ−ＰＫＳは、ＡＴ、ＤＨおよびＥＲの各領域のいずれも含んでいないが、代わりに、ＡＴとＤＨの各遺伝子はＯＲＦ１５とＯＲＦ１７とに別々にそれぞれ位置している。ＯＲＦ１６のＭＴ領域はＣ−メチル化で機能する可能性が有り、ＯＲＦ１２のＴＥ領域はラクトン形成に関与している可能性がある。また、ＯＲＦ１６は、２つの同じＡＣＰ領域をタンデム配列にて有していることも興味深い。同様のタンデム配列となっている各ＡＣＰ領域はアルビシディン（ａｌｂｉｃｉｄｉｎ）シンターゼ遺伝子群（Ｈｕａｎｇ，Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．＆  Ｂｉｒｃｈ，Ｒ．Ｇ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１４７，ｐｐ６３１−６４２）の中に見出されたが、それは繰り返し反応に関与していることが示唆された。
ランカサイジン生合成（ｌｋｃ）遺伝子群における、他の利用について、以下に説明する。ランカサイジン骨格は通常のＩ型ボリケタイドとは異なり、グリシンに８個の酢酸が次々に縮合して生合成される。スターターであるグリシンはピルビン酸によってアシル化されているが、遺伝子改変によって遊離のアミノ体を得ることができれば、それをアシル化して様々な誘導体を調製することができる。一例として、水溶性のアシル基を導入して、水に溶けやすいより有効な誘導体を調製することが可能である。これ以外に、ｌｋｃ−ＰＫＳのＡＴ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ等の様々なドメインを改変することによって、より活性の高い誘導体を調製することが期待される。
続いて、ランカマイシンシンターゼ（ｌｋｍ）遺伝子群（ＯＲＦ２４−ＯＲＦ５３）について説明する。
ランカマイシンシンターゼ（ｌｋｍ）遺伝子群は、図１および図４に示すように、ＯＲＦ２４からＯＲＦ５３までの６８ｋｂ上に広がって存在していることが分かった。３つの大きいモジュラー型の各ＰＫＳ遺伝子（ｌｋｍＡＩ（ＯＲＦ３５）、ｌｋｍＡＩＩ（ＯＲＦ３４）およびｌｋｍＡＩＩＩ（ＯＲＦ３３））がそれぞれｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩおよびｅｒｙＡＩＩＩに相同である。
Ｄ−チャルコース（Ｄ−ｃｈａｌｃｏｓｅ）および４−アセチル−Ｌ−アルカノース（４−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｒｃａｎｏｓｅ）の合成と、マクロライドリングへのそれらの修飾（付加）とのための多くの遺伝子がｌｋｍＡＩ−ＡＩＩＩの両側に位置している。
ＬＭとエリスロマイシン（ＥＭ）のマクロライドリング構造は、不斉中心を有する炭素の立体化学に関しては、よく似ている。それらの間の相違点は、Ｃ−６位、Ｃ−８位およびＣ−１２位におけるヒドロキシル化、およびＣ−１３での置換（図５（ｂ））である。最後の位置では、ＬＭはＥＭの中のエチル基に代わって１（ｓ）−メチル−２（ｓ）−ヒドロキシプロピル基を含んでいる。
ｌｋｍ−ＰＫＳのモジュラー型の構造に基づいて、我々は、余分なＣ２ユニットの付加を担当する別のモジュールの存在を遺伝子群の先頭に想定した。しかしながら、実際はそうではなかった。したがって、ｌｋｍ−ＰＫＳが有するモジュールは、従来のものと異なった特異性を有する可能性がある。つまり、２−メチル−３−ヒドロキシブチレートがスターターとして認識されるか、または、２−メチルブチレートは最初に、アベルメクチン合成（Ｈａｆｎｅｒ，Ｅ．Ｗ．，Ｈｏｌｌｅｙ，Ｂ．Ｗ．，Ｈｏｌｄｏｍ，Ｋ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｗａｘ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｅｃｋ，Ｄ．，ＭｃＡｒｔｈｕｒ，Ｈ．Ａ．Ｉ．＆  Ｗｅｒｎａｕ，Ｗ．Ｃ．（１９９１）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｖｏｌ．４４，ｐｐ３４９−３５６）の場合のように取り込まれ、次に、Ｃ−１５位でヒドロキシ化されることが想定された。
ｌｋｍ遺伝子群の中の、Ｐ４５０のような、２つのヒドロキシラーゼ遺伝子（ＯＲＦ２６とＯＲＦ３７）が、Ｃ−８位かＣ−１５位でのヒドロキシル化で機能している可能性がある。
以下に、ランカマイシン生合成（ｌｋｍ）遺伝子群の、他の利用について説明する。エリスロマイシンは細菌感染症の薬として世界中で最も多く使われている抗生物質の一つである。ランカマイシンはエリスロマイシンと構造がよく似ているが、後者がＣ−１３位にエチル基をもつのに対して、前者はＣ２単位だけ長い１−メチル−２−ヒドロキシプロピル基をもつ。ｌｋｍ−ＰＫＳはモジュラー型ＰＫＳに属するので、その頭の部分には余分なＣ２単位に対応するｅｘｔｒａｍｏｄｕｌｅがあると予想された。しかし、全塩基配列決定によってこの可能性は否定された。
それ故、ｌｋｍ−ＰＫＳのｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅはスターター分子としてプロピオン酸基ではなく、２−メチル−３−ヒドロキシブチル酸基（２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）を認識して取り込むものと思われる。
このような結果に基づいて、エリスロマイシン生合成遺伝子群（ｅｒｙ−ＰＫＳ）のｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ部分をｌｋｍ−ＰＫＳのそれに置き換えることによって、Ｃ−１３位にランカマイシン型の側鎖をもつエリスロマイシンを創製することができる。
これ以外に、ｌｋｍ−ＰＫＳのＡＴ、ＫＴ、、ＤＨ、ＥＲ等の様々なドメインを改変することによって、より活性の高い誘導体を調製することができる。
次に、Ｍｔｍ様のＩＩ型のＰＫＳ遺伝子群（ＯＲＦ６２−ＯＲＦ７０またはＯＲＦ６２−ＯＲＦ７１）について説明する。
ｐＳＬＡ２−Ｌにおいて、ＩＩ型のＰＫＳ遺伝子群が、ＯＲＦ６２からＯＲＦ７０までにて見出され、ミスラマイシンシンターゼ（ｍｔｍ）遺伝子群（Ｐｒａｄｏ，Ｌ．，Ｌｏｍｂｏ，Ｆ．，Ｂｒａｎａ，Ａ．Ｆ．，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｃ．，Ｒｏｈｒ，Ｊ．＆  Ｓａｌａｓ，Ｊ．Ａ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．２６１，ｐｐ２１６−２２５）と最も近いものであることが分かった。上記ＩＩ型のＰＫＳ遺伝子群の最も興味深い特徴は、ミニマムＰＫＳ遺伝子（ＯＲＦ６７−ＯＲＦ６９）の上流側に位置する、チオエステラーゼ（ＴＥ）遺伝子（ＯＲＦ７０）の存在である。
今まで、ＴＥ遺伝子は、Ｉ型のＰＫＳ遺伝子群においては、よく見出されていたが、ＩＩ型のＰＫＳ遺伝子群の中では見出されていなかった。その結果、ＯＲＦ７０の生産物は、リファマイシン合成のためのＩ型のＰＫＳ中のＴＥに対して、高い類似性を示す。上記のＩ型のＰＫＳは、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ（Ａｕｇｕｓｔ，Ｐ．Ｒ．，Ｔａｎｇ，Ｌ．，Ｙｏｏｎ，Ｙ．Ｊ．，Ｎｉｎｇ，Ｓ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ，，Ｙｕ，Ｔ．Ｗ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｄ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．５，ｐｐ６９−７９）にて見出されている。
以下に、ｍｔｍ様ＩＩ型ＰＫＳ遺伝子群の他の利用について説明する。ＯＲＦ６１−ＯＲＦ７１にあるＩＩ型ＰＫＳ遺伝子群は、同じくＩＩ型ＰＫＳであるミスラマイシン生合成（ｍｔｍ）遺伝子群に最も似ているが、それが作り出すポリケタイド抗生物質の化学構造は明らかにされていない。
しかし、その遺伝子群構造からミスラマイシンと同様にアンスラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）構造を備えて抗ガン活性があるものと思われる。このポリケタイドを単離構造決定し、その制ガン剤としての可能性を追求できる。さらに、遺伝子改変によって新たな誘導体を創製し生産性の向上をはかることも可能である。
以前に報告されているように、ＯＲＦ６６（ｃｙｃｌａｓｅ）、ＯＲＦ６７（ＡＣＰ）およびＯＲＦ６８（鎖長因子）の欠失は、ＬＭおよびＬＣの生産へどのような影響も与えなかった（Ｓｕｗａ，Ｍ，，Ｓｕｇｉｎｏ，Ｈ．，Ｍｏｒｉ，Ｅ．，Ｓａｓａｏｋａ，Ａ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｈ．，Ｎｉｍｉ，Ｏ．＆  Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｈ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｖｏｌ．２４６，ｐｐ１２３−１３１）。ＯＲＦ６９（ＫＳ）とＯＲＦ７０（ＴＥ）の破壊はどちらも何ら影響を与えなかった。したがって、我々が使用した分析評価システムによっては、ＩＩ型のＰＫＳ遺伝子が関与するポリケタイド代謝物を検出することはできなかった。
他の生合成遺伝子群について以下に説明する。
ｐＳＬＡ２−Ｌにおける、ｍｔｍ様のＩＩ型ＰＫＳ遺伝子群の左側において、幾つかのＩ型のＰＫＳ遺伝子（ＯＲＦ５６−ＯＲＦ６１）が、小さな遺伝子群を形成している。また、ＯＲＦ７２およびＯＲＦ７３も、Ｉ型のＰＫＳ遺伝子である。しかしながら、それぞれのＰＫＳ遺伝子は、いくつかの機能的な領域を収容するには小さすぎ、また、上記遺伝子群は、ｍｔｍ様のＰＫＳ遺伝子群の挿入によって中断されている。その上、ＫＳ領域のみを有するＯＲＦ６０の破壊は、ＬＣおよびＬＭの合成に対して何ら影響しなかった。したがって、これらのＩ型のＰＫＳ遺伝子は、何ら機能を有していない可能性がある。
相同性検索により、８つの各ＯＲＦ（ＯＲＦ１０３−ＯＲＦ１１０）がカロチノイド生合成のためのｃｒｔ遺伝子群を形成していることが示された。７つの各ｃｒｔ遺伝子（ｃｒｔＹ，Ｔ，Ｕ，Ｖ，Ｂ，Ｉ，Ｅ）がＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ（Ｓｃｈｕｍａｎｎ，Ｇ．，Ｎｕｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．，Ｓａｎｄｍａｎｎ，Ｇ．＆  Ｋｒｕｇｅｌ，Ｈ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．２５２，ｐｐ６５８−６６６）からクローニングされ、分析された。７つの各ｃｒｔ遺伝子の内、ｃｒｔＴを除いた６つはｐＳＬＡ２−Ｌ上で確認されたが、それらの順番（ｃｒｔＶ，Ｂ，Ｉ，Ｅ，Ｙ，Ｕ）はＳ．ｇｒｉｓｅｕｓの順番と異なっている。
よって、上記ｃｒｔ遺伝子群より産生される、カロチノイド化合物は食品用色素や抗酸化剤として使用されているので、これらの化合物を機能性材料として食品に用いることが可能である。
ｐＳＬＡ２−Ｌの調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）と耐性（ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ）の各遺伝子について以下に説明する。ｐＳＬＡ２−Ｌの塩基配列決定のための上記プロジェクトに先立ち、ｌｋｃ遺伝子群を確認する本発明者らの実験において、本発明者らはＯＲＦ７０−ＯＲＦ７６を含む６．６−ｋｂ断片を削除してみた。予想外に、この領域の削除はＬＣとＬＭの両方の非生産を引き起こした。本発明者は、一番右側の１．８−ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片の削除が非生産に十分であることを見出した。この断片はＯＲＦ７４、ＯＲＦ７５およびＯＲＦ７６を含んでいる。
ＯＲＦ７４、ＯＲＦ７５およびＯＲＦ７６は、それぞれ、γ−ブチロラクトンのレセプター様のタンパク質（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．＆  Ｂｅｐｐｕ，Ｔ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．４６，ｐｐ３７７−３９８）、ＳＡＲＰファミリー調節タンパク質（Ｗｉｅｔｚｏｒｒｅｋ，Ａ．＆  Ｂｉｂｂ，Ｍ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２５，ｐｐ１１８１−１１８４）、およびＮＲＰＳのようなタンパク質をコード化している。
ＯＲＦ７４とＯＲＦ７５の個々の遺伝子破壊は、ＯＲＦ７５だけが、ｌｋｃおよびｌｋｍの各遺伝子群から離間した遠くの上流側に位置するにもかかわらず、両方の抗生物質の合成に不可欠であるのを明らかにした。
γ−ブチロラクトンレセプターは、ヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合モチーフを含んでいて、ＴｅｔＲファミリー調節タンパク質（Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．＆  Ｂｅｒｅｎ，Ｃ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．４８，ｐｐ３４５−３６９）に分類される。ＳＡＲＰファミリー調節タンパク質は、ヘリックス−ターン−ヘリックス−ループ−ヘリックスＤＮＡ結合モチーフを含んでいて、放線菌における経路特異的な調節因子として機能していると判断された。
ＯＲＦ７４とＯＲＦ７５に加えて、同様の調節遺伝子がｐＳＬＡ２−Ｌで見出された。上記調節遺伝子は、ＯＲＦ７９、ＯＲＦ８２、ＯＲＦ９２、ＯＲＦ９９、およびＯＲＦ１２６などのＴｅｔＲファミリーの各抑制遺伝子、およびＯＲＦ５５とＯＲＦ７１などのＳＡＲＰファミリー調節遺伝子である。これらの調節タンパク質の保存されたＤＮＡ結合モチーフが、他の放線菌類における同様のＴｅｔＲやＳＡＲＰ調節タンパク質と比較された（図６）。図６では、ＤＮＡの結合部位における、α−ヘリックス領域が下線にて示されている。
図６における、ＡｒｐＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０２１８８２）はＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ由来であり、ＢａｒＡ（Ｄ３２２５１）はＳ．ｖｉｒｇｉｎｉａｅ由来であり、ＦａｒＡ（ＡＢ００１６８３）はＳ．ｓｐ由来であり、ＳＡＲ（Ｙ１８８６２）はＳ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ由来であり、ＴｙｌＳ（ＡＦ１４５０４９）はＳ．ｆａｄｉａｅ由来であり、ＤｎｒＩ（Ｍ８０２３７）はＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ由来である。これらのことから、ＯＲＦ５５が、ランカマイシン産生に関与している可能性が示唆された。
Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓでは、Ａ因子カスケードはストレプトマイシン生産と胞子形成の両方を制御することが知られている（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，Ｋａｍｅｙａｍａ，Ｓ．，Ｏｎａｋａ，Ｈ．＆  Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．３４，ｐｐ１０２−１１１）。ＡｒｐＡ、γ−ブチロラクトンレセプターは、ａｄｐＡのプロモーターに結合し、抗生物質生産と胞子形成に関する活性化を抑制する。Ａ因子は、ＡｒｐＡに結合して、ａｄｐＡプロモーターから上記ＡｒｐＡを離間（リリース）させる一方、ａｆｓＡはＡ因子合成に関与している。
上記カスケードの各相同遺伝子（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）の全てがｐＳＬＡ２−Ｌ上にて見出された。すなわち、ＯＲＦ７４がａｒｐＡの相同遺伝子であり、ＯＲＦ８５はａｆｓＡに対し相同性を示し、ＯＲＦ１１６はａｄｐＡに類似したものである。
ａｆｓＡに類似したＯＲＦ８５の破壊がＬＣとＬＭの両方の非生産を引き起こしたので、上記の調節のためのカスケードはＳ．ｒｏｃｈｅｉで実際に機能していることが分かる。ＯＲＦ３はｌｋｃ遺伝子群の端に位置し、その生産物は、ストレプトマイシン生合成経路を活性化するＳｔｒＲと同様である。しかしながら、ＯＲＦ３の破壊は前述したように、ＬＣの生産に影響しなかった。
他の、転写調節遺伝子は、ＯＲＦ８８とＯＲＦ１０１に位置していることが分かった。また、５つの抗生物質耐性遺伝子が見出された。ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０およびＯＲＦ４４の位置に、ＡＢＣ輸送体遺伝子、ＯＲＦ２２の位置にテトラサイクリン排出輸送体遺伝子、および、バージニアマイシン（ｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎ）耐性のためのタンパク質をコード化するためのＶａｒＳ（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｋ．，Ｋａｍｉｔａｎｉ，Ｙ．，Ｎｉｈｉｒａ，Ｔ．＆  Ｙａｍａｄａ，Ｙ．（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｖｏｌ．１８１，ｐｐ３２９３−３２９７）様の遺伝子が、ＯＲＦ９１の位置に、それぞれ見出された。
複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）と、維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）のための各遺伝子について以下に説明する。
本発明者は、最近、ｐＳＬＡ２−Ｌの複製開始点とテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ、末端小粒）をクローニングし、それらの配列を決定した（Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｓ．＆  Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｈ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．２６３，ｐｐ１０１５−１０２１）。上記テロメアの配列は、放線菌類における典型的な染色体や線状プラスミドに相同である（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｙ．−Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．−Ｌ．，Ｈｕａｎｇ．Ｓ．−Ｗ．＆  Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｗ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２８，ｐｐ９０５−９１６）。一方、ｒｅｐＬ１とｒｅｐＬ２とを有する複製開始点（ｏｒｉ１）は、他の放線菌類の線状プラスミドの複製開始遺伝子と類似性を示さない。
その上、生体内の複製実験により、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で環状にての複製が可能な、他の２個の各フラグメントを同定した（Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．＆  Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｈ．）。上記で新たに確認された複製開始点（ｏｒｉ２とｏｒｉ３）の両方は、１組となった２つの各遺伝子を有している。上記一方の遺伝子は、ｈｅｌｉｃａｓｅ／ｐｒｉｍａｓｅのような遺伝子（ＯＲＦ９４とＯＲＦ８９）であり、他方の遺伝子は、１３０個の各アミノ酸（ＯＲＦ９３とＯＲＦ８７）をコードするためのものである。上記と同様の組の各遺伝子はＳＣＰＩの複製開始点で見出された（Ｒｅｄｅｎｂａｃｈ，Ｍ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．，Ｇｕｓｔ，Ｂ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｂ．＆  Ｓｐｙｃｈａｊ，Ａ．（１９９９）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｖｏｌ．４２，ｐｐ１７４−１８５）。Ｓ．ｒｏｃｈｅｉにおいて、３つの複製開始点の内、何れが実際に機能するかについては、現時点では不明である。
さらに、ＯＲＦ１０２は、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ中の末端タンパク遺伝子（ｔｐｇＲ１）と同じであることが分かったが、この遺伝子は、従来、染色体上にあると誤って考えられていた。ＯＲＦ９７と、ＯＲＦ９８とは、ｐａｒＢおよびｐａｒＡの各遺伝子をコードしており、細胞分裂の間において、ｐＳＬＡ２−Ｌを正しく分配させるように機能している可能性がある。
上記制御遺伝子の改変による生産性の向上について以下に説明する。ＯＲＦ７４，７９，８２，９２，９９，１２６はｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘモチーフをもつＴｅｔＲファミリー・リプレッサータンパクをコードし、ＯＲＦ５５，７１，７５はｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘモチーフをもつＳＡＲＰファミリー制御タンパクをコードしている。
前者は転写を抑制し、後者は逆に転写を活性化させる。後者に属するＯＲＦ７５を遺伝子破壊したところ、ランカサイジン・ランカマイシンがともに生産されなくなったので、この遺伝子はｐＳＫＡ２−Ｌ上でｌｋｃ，ｌｋｍ生合成遺伝子群とは遠く離れているにもかかわらず、両遺伝子群の発現を制御していることが分かった。
このようなｐＳＬＡ２−Ｌ上にある多くの制御遺伝子を改変することによって、ランカサイジン・ランカマイシン等の二次代謝物の生産性の増大をはかることが可能となる。
ｐＳＬＡ２−Ｌの生成機構について以下に説明する。ｐＳＬＡ２−Ｌの完全なヌクレオチド配列の決定は、この大きい線状プラスミドの並はずれて優れた特性を明らかにした。
１）それは３つの可能な複製開始点を含んでいること。
２）ＰＱＱ生合成遺伝子群が、グラム陽性バクテリアで見出された。
３）ランカサイジン、ランカマイシンおよびＩＩ型のＰＫＳ遺伝子群は、それら自身にて全くユニークな特性をもつこと。
４）ｐＳＬＡ２−ＬはＳ．ｇｒｉｓｅｕｓにおけるＡ因子カスケードと相同な遺伝子の全てを備えていたこと。
５）最後に、二次代謝物の生成に関与する、生合成遺伝子群および遺伝子は、異常に凝縮した状態（高密度）で存在していたことである。
上記５）は、抗生物質の生合成のための各遺伝子が、原核生物の間で、また、原核生物および真核生物の間の障壁を越えて、水平方向になぜ転移されたのかという、長い間未解決の疑問に密接に関連すると考えられた。
３つの各複製開始点が右端から５０−６３ｋｂに位置しており、二次代謝物の生成のための各遺伝子の大部分は、上記複製開始点の左側に位置している。Ｈｅｌｉｃａｓｅ様の各ＯＲＦはＴＩＲ−Ｌ（ＯＲＦ１）とＴＩＲ−Ｒ（ＯＲＦ１４３）の各内側端にてそれぞれ見出された。右端のＯＲＦ１４３は、ＳＣＰ１のｈｅｌｉｃａｓｅに対して、全領域で相同性を示した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＣＡＣ３６６５７．１）。左端のＯＲＦ１のＣ−末端の半分は、ＴＩＲ−Ｌの内側端にて、丁度、削除されている。これらの結果は、生合成遺伝子群がｐＳＬＡ２−Ｌの現在の形状を発生させるようにオリジナルのプラスミドの左側に挿入されたことを示している。一連の挿入は、左端のＯＲＦ１にて、その先端部を切りつめ、また、各遺伝子群の境界でＯＲＦ５４やＯＲＦ１１１などの小さく、仮に想定されているいくつかの各遺伝子を発生させたかもしれない。
以下に本明細書にて用いた各略称をまとめて示す。
ＡＣＰ，アシルキャリアタンパク；
ＡＴ，アシルトランスフェラーゼ；
ＫＳ，β−ケトアシルシンターゼ；
ｃｒｔ，カロチノイド生合成遺伝子；
ＥＭ，エリスロマイシン；
ＫＲ，ケトレダクターゼ；
ｌｋｃ，ランカサイジンシンターゼ遺伝子；
ＬＣ，ランカサイジン；
ｌｋｍ，ランカマイシン（ｌａｎｋａｍｙｃｉｎ）シンターゼ遺伝子；
ＬＭ，ランカマイシン；
ｍｔｍ，ミスラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）シンターゼ遺伝子；
ＮＲＰＳ，非リボソーム性（ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ）ペプチドシンテターゼ；
ＯＲＦ，転写解読枠；
ＰＣＰ，ペプチジルキャリアタンパク；
ＰＫＳ，ポリケタイドシンターゼ；
ＰＱＱ，ピロロキノリンキノン（ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ）；
ＳＡＲＰ，放線菌（ストレプトマイセス）抗生物質調節タンパク；
ＴＥ，チオエステラーゼ；
ＴＩＲ，末端逆位配列；
ｐＳＬＡ２−Ｌのヌクレオチドの完全な配列を、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対し提出されたデータ形式にて以下に示す。
2004001039.tif 000007
2004001039.tif 000008
2004001039.tif 000009
2004001039.tif 000010
2004001039.tif 000011
2004001039.tif 000012
2004001039.tif 000013
2004001039.tif 000014
2004001039.tif 000015
2004001039.tif 000016
2004001039.tif 000017
2004001039.tif 000018
2004001039.tif 000019
2004001039.tif 000020
2004001039.tif 000021
2004001039.tif 000022
2004001039.tif 000023
2004001039.tif 000024
2004001039.tif 000025
2004001039.tif 000026
2004001039.tif 000027
2004001039.tif 000028
2004001039.tif 000029
2004001039.tif 000030
2004001039.tif 000031
2004001039.tif 000032
2004001039.tif 000033
2004001039.tif 000034
2004001039.tif 000035
2004001039.tif 000036
2004001039.tif 000037
2004001039.tif 000038
2004001039.tif 000039
2004001039.tif 000040
2004001039.tif 000041
2004001039.tif 000042
2004001039.tif 000043
2004001039.tif 000044
2004001039.tif 000045
2004001039.tif 000046
2004001039.tif 000047
2004001039.tif 000048
2004001039.tif 000049
2004001039.tif 000050
2004001039.tif 000051
2004001039.tif 000052
2004001039.tif 000053
2004001039.tif 000054
2004001039.tif 000055
2004001039.tif 000056
2004001039.tif 000057
2004001039.tif 000058
2004001039.tif 000059
2004001039.tif 000060
2004001039.tif 000061
2004001039.tif 000062
2004001039.tif 000063
2004001039.tif 000064
2004001039.tif 000065
2004001039.tif 000066
2004001039.tif 000067
2004001039.tif 000068
2004001039.tif 000069
2004001039.tif 000070
2004001039.tif 000071
2004001039.tif 000072
2004001039.tif 000073
2004001039.tif 000074
2004001039.tif 000075
2004001039.tif 000076
2004001039.tif 000077
2004001039.tif 000078
2004001039.tif 000079
2004001039.tif 000080
2004001039.tif 000081
2004001039.tif 000082
2004001039.tif 000083
2004001039.tif 000084
2004001039.tif 000085
2004001039.tif 000086
2004001039.tif 000087
2004001039.tif 000088
2004001039.tif 000089
2004001039.tif 000090
2004001039.tif 000091
2004001039.tif 000092
2004001039.tif 000093
2004001039.tif 000094
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明の放線菌由来のプラスミド（ｐＳＬＡ２−Ｌ）を用いることにより、有用な抗生物質やビタミン等の二次代謝物を選択的に効率よく産生できる。上記抗生物質やビタミンとしては、ランカサイジン類、ランカマイシン類、ミスラマイシン様物質、カロチノイド類が挙げられる。
【図１】
2004001039.tif 000095
【図２】
2004001039.tif 000096
【図３】
2004001039.tif 000097
【図４】
2004001039.tif 000098
2004001039.tif 000099
2004001039.tif 000100
【国際調査報告】
2004001039.tif 000101
2004001039.tif 000102
2004001039.tif 000103
2004001039.tif 000104
2004001039.tif 000105
2004001039.tif 000106
2004001039.tif 000107
2004001039.tif 000108