(57)【要約】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）ファミリー蛋白質、例えばＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法、該方法により同定された化合物、ＰＩＡＳファミリー蛋白質によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤、Ｔｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤、該阻害剤および／または該脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤、該阻害剤および／若しくは該脱ＳＵＭＯ化剤または該転写活性の阻害剤からなる大腸癌の防止および／または治療剤、ＰＩＡＳファミリー蛋白質によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害および／またはＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化を特徴とするＴｃｆ−４の転写活性の阻害方法並びに大腸癌の防止および／または治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）被検化合物とＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４との相互作用を可能にする条件下で、ＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、当該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項２】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第１項に記載の同定方法。
【請求項３】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第１項に記載の同定方法。
【請求項４】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（Ａ）若しくは（Ｂ）若しくは（Ｃ）若しくは（Ｄ）に記載の細胞を用い、該細胞と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出することにより、あるいはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法；
（Ａ）ＰＩＡＳ、スモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４を共発現させた細胞、
（Ｂ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｃ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、および該シグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｄ）ＰＩＡＳ、ＳＵＭＯ、およびＴｃｆ−４を共発現させた細胞。
【請求項５】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（Ｅ）または（Ｆ）に記載の細胞を用い、該細胞と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）次いでルシフェラーゼの基質を加えて、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の蛍光強度を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法；
（Ｅ）Ｔｃｆ−４とＧＦＰとの融合蛋白質、スモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）とルシフェラーゼとの融合蛋白質、およびＰＩＡＳを共発現させた細胞、
（Ｆ）Ｔｃｆ−４とルシフェラーゼとの融合蛋白質、ＳＵＭＯとＧＦＰとの融合蛋白質、およびＰＩＡＳを共発現させた細胞。
【請求項６】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、スモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）またはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ、および被検化合物を、Ｔｃｆ−４または固相に固定化したＴｃｆ−４と接触させる工程、（ｉｉ）次いでＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出することにより、あるいは当該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項７】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（ａ）または（ｂ）に記載の蛋白質を用い、該蛋白質と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）次いでＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法；
（ａ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）、およびＳＵＭＯに導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、
（ｂ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、およびＴｃｆ−４に導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ。
【請求項８】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、放射性同位体若しくはビオチン若しくはペプチドタグで標識したスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、および被検化合物を、固相に固定化したＴｃｆ−４と接触させる工程、（ｉｉ）次いで当該標識に用いた物質を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項９】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ユーロピウム（ｅｕｒｏｐｉｕｍ）で標識したスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、ユーロピウムが放射する蛍光により励起して二次蛍光を放射する物質で標識したＴｃｆ−４、および被検化合物を反応させる工程、（ｉｉ）次いでユーロピウムを励起する波長の光を照射して、当該二次蛍光強度を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項１０】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）Ｔｃｆ−４とルシフェラーゼとの融合蛋白質およびスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）とグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質、またはＴｃｆ−４とＧＦＰとの融合蛋白質およびＳＵＭＯとルシフェラーゼとの融合蛋白質に、ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、および被検化合物を反応させる工程、（ｉｉ）次いでルシフェラーゼの基質を加えて、ＧＦＰの蛍光強度を測定することにより、化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１項に記載の同定方法によって得られた化合物。
【請求項１２】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物。
【請求項１３】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物。
【請求項１４】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物。
【請求項１５】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤。
【請求項１６】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤。
【請求項１７】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤。
【請求項１８】
Ｔｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤。
【請求項１９】
請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤および／または請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤。
【請求項２０】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害すること、および／またはＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項２１】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第２０項に記載のＴｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項２２】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第２０項に記載のＴｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項２３】
請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤および／または請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、または請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる、大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項２４】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害すること、および／またはＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項２５】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第２４項に記載の大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項２６】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第２４項に記載の大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項２７】
請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤、請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、および請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含有してなる医薬組成物。
【請求項２８】
請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤、請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、および請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含有してなる大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項２９】
請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤、請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、および請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を使用することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項３０】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）および／若しくはＴｃｆ−４、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドおよび／若しくはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチド、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／若しくはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キット。
【請求項３１】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第３０項に記載の試薬キット。
【請求項３２】
プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第３０項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
利用分野
本発明は、プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）ファミリー蛋白質によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）とそれによっておこるＴｃｆ−４の転写機能増強を阻害する化合物および阻害剤、Ｔｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤、並びに当該化合物の同定方法に関する。さらに、ＰＩＡＳファミリー蛋白質によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害することおよび／またはＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、大腸癌の防止剤および／または治療剤並びに防止方法および／または治療方法に関する。
背景技術
ＳＵＭＯは、スモール・ユビキチンライク・モディファイヤー（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の略称であり、ユビキチンのように蛋白質修飾に用いられる蛋白質である。ＳＵＭＯが標的蛋白質に連結することをＳＵＭＯ化という。ＳＵＭＯ化の標的蛋白質としては、ＲａｎＧＡＰ１、ＰＭＬ、ＩκＢαおよびｐ５３などが知られている。
ＳＵＭＯ化は最近注目され始めた現象であり、その意義については未だ明らかではない（非特許文献１）。ＳＵＭＯ化の過程には、いくつかの酵素の関与が知られている。これらの酵素は、ユビキチン化の過程に関与する酵素とは異なる（非特許文献２）。
哺乳類のＳＵＭＯには、少なくともＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２およびＳＵＭＯ−３の３種類がある。ＳＵＭＯ−１は、Ｅ１酵素Ａｏｓ／Ｕｂａ２により活性化され、ついでＥ２結合酵素（Ｅ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ）Ｕｂｃ９に転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）され、最後にＥ３リガーゼであるプロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（以下、ＰＩＡＳと略称する。）（非特許文献３および非特許文献４）またはＲａｎＢＰ２（非特許文献５）により共に標的蛋白質に連結される。ＳＵＭＯ化は可逆的であり、例えばＳＵＭＯ特異的プロテアーゼにより脱ＳＵＭＯ化が起きる（非特許文献６）。哺乳類においては、ＳＥＮＰファミリー蛋白質など、いくつかのＳＵＭＯ特異的プロテアーゼが知られている。
ＳＵＭＯ化に係わるＥ３リガーゼであるＰＩＡＳにはいくつかのファミリー蛋白質が知られている。哺乳類では、４つのＰＩＡＳファミリー蛋白質、すなわちＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３およびＰＩＡＳｘαが同定されている。
ＰＩＡＳファミリー蛋白質は、サイトカインなどの細胞内シグナル伝達に関与する。例えば、ＰＩＡＳｙはＴｃｆファミリーの転写因子でありＷｎｔシグナル経路において機能するＬｅｆ−１（Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ１）をＳＵＭＯ化する（非特許文献４）。また、ＰＩＡＳｙは、Ｌｅｆ−１の転写活性を抑制するが、ＤＮＡまたはβ−カテニンとの結合活性には影響しない（非特許文献４）。一方、Ａｘｉｎ結合蛋白質として同定されたＡｘａｍは、β−カテニン分解を誘導することによりＷｎｔシグナル経路を負に調節する（非特許文献７）。ＡｘａｍはＳＥＮＰファミリー蛋白質の１つであり、このＡｘａｍのＷｎｔシグナル経路の調節作用にはその脱ＳＵＭＯ化活性が必要である（非特許文献８）。
ＰＩＡＳ１およびＰＩＡＳ３はそれぞれ、転写制御因子ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合を阻害する補助因子として同定された（非特許文献９）。ＰＩＡＳ１は、がん抑制遺伝子産物ｐ５３をＳＵＭＯ化する（非特許文献３）。ＰＩＡＳｘαは、アンドロゲン（ＡＲ）受容体へ結合することによりＡＲ依存的転写を負に調節する（非特許文献１０）。
上記のように、ＰＩＡＳファミリー蛋白質により標的蛋白質がＳＵＭＯ化され、それによって標的蛋白質の機能が変化することが示唆されている。このことから、ＰＩＡＳファミリー蛋白質は、ＳＵＭＯ化酵素として注目されている。
以下に、本明細書で引用した文献を列記する。
非特許文献１：斎藤寿仁、実験医学（２００１）第１９巻、第１１２−１１９頁。
非特許文献２：Ｍｕｌｌｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）２：２０２−２１０。
非特許文献３：Ｋａｈｙｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２００１）８：７１３−７１８。
非特許文献４：Ｓａｃｈｄｅｖ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００１）１５：３０８８−３１０３。
非特許文献５：Ｋｉｒｓｈ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２）２１：２６８２−２６９１。
非特許文献６：Ｙｅｈ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（２０００）２４８：１−１４。
非特許文献７：Ｋａｄｏｙａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）２２：３８０３−３８１９。非特許文献８：Ｋａｄｏｙａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）２７５：３７０３０−３７０３７。
非特許文献９：Ｌｉｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（１９９８）９５：１０６２６−１０６３１。
非特許文献１０：Ｋｏｔａｊａ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０００）１４：１９８６−２０００。
非特許文献１１：Ｋｏｒｉｎｅｋ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５：１７８４−１７８７。
非特許文献１２：Ｍｏｒｉｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５：１７８７−１７９０。
非特許文献１３：Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：１５９−１７０。
非特許文献１４：Ｔｅｔｓｕ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９８：４２２−４２６。
発明の開示
本発明においては、ＰＩＡＳファミリー蛋白質によりＳＵＭＯ化される蛋白質を見出し、該ＳＵＭＯ化を調節することにより、ＳＵＭＯ化による該蛋白質の機能変化に起因する疾患を制御する手段を提供しようと検討を重ねた。そして、ＰＩＡＳファミリー蛋白質、例えばＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαにより転写因子Ｔｃｆ−４がＳＵＭＯ化されること、およびＳＵＭＯ化によりＴｃｆ−４の機能が増強されることを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）被検化合物とＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４との相互作用を可能にする条件下で、ＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、当該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである前記同定方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙである前記同定方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（Ａ）若しくは（Ｂ）若しくは（Ｃ）若しくは（Ｄ）に記載の細胞を用い、該細胞と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出することにより、あるいはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する；（Ａ）ＰＩＡＳ、ＳＵＭＯ、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４を共発現させた細胞、
（Ｂ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｃ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、および該シグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｄ）ＰＩＡＳ、ＳＵＭＯ、およびＴｃｆ−４を共発現させた細胞。
さらにまた、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（Ｅ）または（Ｆ）に記載の細胞を用い、該細胞と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）次いでルシフェラーゼの基質を加えて、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の蛍光強度を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する；
（Ｅ）Ｔｃｆ−４とＧＦＰとの融合蛋白質、ＳＵＭＯとルシフェラーゼとの融合蛋白質、およびＰＩＡＳを共発現させた細胞、
（Ｆ）Ｔｃｆ−４とルシフェラーゼとの融合蛋白質、ＳＵＭＯとＧＦＰとの融合蛋白質、およびＰＩＡＳを共発現させた細胞。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ＳＵＭＯまたはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ、および被検化合物を、Ｔｃｆ−４または固相に固定化したＴｃｆ−４と接触させる工程、（ｉｉ）次いでＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出することにより、あるいは当該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（ａ）または（ｂ）に記載の蛋白質を用い、該蛋白質と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）次いでＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する；
（ａ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ、およびＳＵＭＯに導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、
（ｂ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、およびＴｃｆ−４に導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ。
さらにまた、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、放射性同位体若しくはビオチン若しくはペプチドタグで標識したＳＵＭＯ、および被検化合物を、固相に固定化したＴｃｆ−４と接触させる工程、（ｉｉ）次いで当該標識に用いた物質を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ユーロピウム（ｅｕｒｏｐｉｕｍ）で標識したＳＵＭＯ、ユーロピウムが放射する蛍光により励起して二次蛍光を放射する物質で標識したＴｃｆ−４、および被検化合物を反応させる工程、（ｉｉ）次いでユーロピウムを励起する波長の光を照射して、当該二次蛍光強度を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）Ｔｃｆ−４とルシフェラーゼとの融合蛋白質およびＳＵＭＯとグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質、またはＴｃｆ−４とＧＦＰとの融合蛋白質およびＳＵＭＯとルシフェラーゼとの融合蛋白質に、ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、および被検化合物を反応させる工程、（ｉｉ）次いでルシフェラーゼの基質を加えて、ＧＦＰの蛍光強度を測定することにより、化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、前記いずれかの同定方法によって得られた化合物に関する。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、ＰＩＡＳｙによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物に関する。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、ＰＩＡＳｙによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤に関する。
また、本発明の一態様は、Ｔｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤に関する。
さらに、本発明の一態様は、前記いずれかのＳＵＭＯ化の阻害剤および／または前記脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害すること、および／またはＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害方法に関する。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである前記Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙである前記Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害方法に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、前記いずれかのＳＵＭＯ化の阻害剤および／または前記脱ＳＵＭＯ化剤、または前記転写活性の阻害剤からなる、大腸癌の防止剤および／または治療剤に関する。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害すること、および／またはＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである前記大腸癌の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙである前記大腸癌の防止方法および／または治療方法に関する。
また、本発明の一態様は、前記いずれかの化合物、前記いずれかのＳＵＭＯ化阻害剤、前記脱ＳＵＭＯ化剤、および前記転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含有してなる医薬組成物に関する。
さらに、本発明の一態様は、前記いずれかの化合物、前記いずれかのＳＵＭＯ化阻害剤、前記脱ＳＵＭＯ化剤、および前記転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含有してなる大腸癌の防止剤および／または治療剤に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、前記いずれかの化合物、前記いずれかのＳＵＭＯ化阻害剤、前記脱ＳＵＭＯ化剤、および前記転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を使用することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法に関する。
また、本発明の一態様は、ＰＩＡＳおよび／若しくはＴｃｆ−４、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドおよび／若しくはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチド、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／若しくはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キットに関する。
さらに、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである前記試薬キットに関する。
さらにまた、本発明の一態様は、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳｙである前記試薬キットに関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００２−５５７９６号および同第２００２−２７１５２７号からの優先権を請求するものである。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物などの資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
本発明においては、ＰＩＡＳファミリー蛋白質、例えばＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαにより転写因子Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化が促進されること、およびＳＵＭＯ化によりＴｃｆ−４の機能が増強されることを見出した。Ｔｃｆ−４はＴｃｆファミリーに属するＤＮＡ結合蛋白質である。Ｔｃｆ−４は、Ｗｎｔシグナル経路の下流に位置し、β−カテニンと結合して転写因子として作用する。Ｔｃｆ−４の転写活性のβカテニン依存的な増強はＰＩＡＳｙにより相乗的に増強された。また、β−カテニンの分解を抑制することによりシグナルの増強効果を示すＷｎｔシグナルに依存的なＴｃｆ−４の転写活性増強も、ＰＩＡＳｙにより相乗的に増強された。さらに、脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍ蛋白質（非特許文献７および非特許文献８）によりＴｃｆ−４の転写活性のβカテニン依存的な増強が阻害されたことから、Ｔｃｆ−４の機能増強がＳＵＭＯ化によるものであることが明らかになった。これらの結果は、ＰＩＡＳｙを用いて得られたものであるが、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαもＴｃｆ−４をＳＵＭＯ化することから、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによっても同様にＴｃｆ−４の転写活性が増強されると考えられる。
これらから、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害および／またはＳＵＭＯ化したＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化により、増強されたＴｃｆ−４の機能、例えばその転写活性を抑制することができる。β−カテニン／Ｔｃｆ−４を介するシグナル伝達系は細胞増殖に関与していると考えられている。したがって、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害および／またはＳＵＭＯ化したＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化により、さらにはＴｃｆ−４が関与する細胞増殖を抑制することが可能である。
Ｔｃｆ−４は、正常および腫瘍性の大腸上皮組織、並びに検討した全ての大腸癌細胞株で発現している（非特許文献１１）。また、β−カテニン／Ｔｃｆ複合体による転写活性が数多くの大腸癌で恒常的に活性化していること（非特許文献１１）；大腸癌においてβ−カテニンやがん抑制遺伝子ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｉｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）の変異によりβ−カテニン／Ｔｃｆシグナルが活性化していること（非特許文献１２および非特許文献１３）；大腸癌細胞においてβ−カテニンが細胞周期の進行に係るサイクリンＤ１の発現を調節していること（非特許文献１４）が報告されている。
β−カテニン／Ｔｃｆシグナル伝達系における転写活性の増強と大腸癌との関連性が高いことから、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害および／またはＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化によってＴｃｆ−４の転写活性を阻害することにより、大腸癌の治療が可能になると考えられる。
上記発見に基づいて、本発明においては、下記のものが提供可能である：ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤；ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤；当該ＳＵＭＯ化の阻害剤および／または当該脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤；当該ＳＵＭＯ化の阻害剤および／若しくは当該脱ＳＵＭＯ化剤または当該転写活性の阻害剤からなる大腸癌の防止剤および／または治療剤；ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害および／またはＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化を特徴とするＴｃｆ−４の転写活性の阻害方法；並びにＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害および／またはＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化を特徴とする大腸癌の防止方法および／または治療方法。
本発明において、ＰＩＡＳとは、ＰＩＡＳファミリー蛋白質に属する蛋白質をいう。本発明において、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化に関与するＥ３リガーゼは、ＰＩＡＳのいずれであってもよく、好ましくは、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαであり、より好ましくはＰＩＡＳｙである。あるいは、ＰＩＡＳのうちの２つ以上であってもよい。
また、本発明において、「ＳＵＭＯ」はＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３などのＳＵＭＯファミリー全てを含む。
ここで、Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害剤とは、Ｔｃｆ−４の特定ＤＮＡ配列への結合、Ｔｃｆ−４と協同して転写を行う他因子との結合など、Ｔｃｆ−４を含む転写活性装置になんらかの形で作用することにより、最終的にＴｃｆ−４が関与する転写活性を阻害するものを意味する。
本発明においては、上記知見に基づいて、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物の同定方法を提供する。ＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４と被検化合物との相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下でＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４と被検化合物とを接触させ、次いでＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出することにより、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物を同定可能である。
Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化の検出は、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を上記同定方法に導入し、このシグナルおよび／またはマーカーを検出することにより実施可能である。かかるシグナルおよび／またはマーカーは、ＳＵＭＯおよび／またはＴｃｆ−４に導入して用いることが可能である。ＳＵＭＯは、ＳＵＭＯファミリーに属するものであればいずれも用いることができるが、好ましくはＳＵＭＯ−１を用いる。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出されるものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出されるものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｐｒｏｔｉｎ；以下、ＧＦＰと略称する）、ユーロピウム（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ）、および放射性同位体（１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓなど）などが挙げられる。マーカーとしては、レポーター遺伝子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）、検出用のｔａｇ（６×Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＥＥ−ｔａｇ、Ｅｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ、およびＶ５−ｔａｇなど）、またはビオチンなど公知のものが利用できる。シグナルおよびマーカーは上記の例に限らず、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の検出が可能なものであれば使用することができる。これらのシグナルまたはマーカーの検出方法は、当業者には周知である。
または、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を、抗Ｔｃｆ−４抗体などで検出することもできる。Ｔｃｆ−４が予め別の蛋白質やペプチドなどで修飾されているときには、当該蛋白質やペプチドなどに対する抗体を用いて、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出することができる。例えば、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４と、ＳＵＭＯ化されていないＴｃｆ−４との分子量の違いを、電気泳動における移動度の変化を利用して、ウェスタンブロット法などの公知の蛋白質検出法により検出することによりＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出可能である。
あるいは、Ｔｃｆ−４がＳＵＭＯ化されるとその転写活性が増強されることから、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化の測定を、Ｔｃｆ−４の転写活性を指標にして行うことができる。Ｔｃｆ−４の転写活性は、レポーター遺伝子、例えばＴｃｆにより認識を受ける塩基配列を有するＤＮＡを上流に配置したレポータープラスミド（以下、本明細書においてＴｃｆ応答型プラスミドと称することがある）などを用いて、転写因子の活性を測定する公知の方法を利用して測定可能である。
Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物は、上記同定方法において、被検化合物が存在しない条件下でのＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の量と、被検化合物が存在する条件下でのＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の量とを比較し、その量が低減されたものを選択することにより得ることができる。かかる比較は、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより行なうことができる。あるいは、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４と、ＳＵＭＯ化されないＴｃｆ−４との分子量の違いを公知の方法、例えばウエスタンブロッティング法などで測定することにより、かかる比較の実施が可能である。
かかる同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。当該同定方法に使用するＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４およびＳＵＭＯは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、これらは、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化が阻害されなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質またはペプチド、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧなどの免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＥＥ−ｔａｇ、Ｅｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ、Ｖ５−ｔａｇ、またはＦｌａｇ−ｔａｇなどが、直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて連結されたものであってもよい。被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＰＩＡＳおよびＴｃｆ−４の立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物などが挙げられる。
上記同定方法としては、ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４およびＳＵＭＯを遺伝子工学的手法で細胞に発現させて細胞内でＳＵＭＯ化を起こさせる系（ｉｎ  ｓｉｔｕ系）、またはＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４およびＳＵＭＯを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＵＭＯ化を起こさせる系のいずれも利用できる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系においてＳＵＭＯ化を起こすためには、ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４およびＳＵＭＯ以外に、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素および／またはＥ２  ＳＵＭＯ結合酵素をさらに加えることが好ましい。
ｉｎ  ｓｉｔｕ系としては、下記（Ａ）若しくは（Ｂ）若しくは（Ｃ）若しくは（Ｄ）に記載の細胞を用い、該細胞と化合物とを接触させ、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出する、あるいはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出する系が例示できる；
（Ａ）ＰＩＡＳ、ＳＵＭＯ、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４を共発現させた細胞、
（Ｂ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｃ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、および該シグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｄ）ＰＩＡＳ、ＳＵＭＯ、およびＴｃｆ−４を共発現させた細胞。
上記細胞として、好ましくは一般的に遺伝子導入に使用される細胞が使用できるが、より好ましくは動物細胞、さらに好ましくはヒト大腸癌細胞を用いる。
かかる系として具体的には、例えば、ＰＩＡＳ、Ｍｙｃ−ｔａｇを付加したＴｃｆ−４、およびＳＵＭＯを発現させた細胞を用い、該細胞と被検化合物を接触させた後に、細胞を常法により処理して電気泳動を行い、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４に相当するバンドを抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット法で検出することにより、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害する化合物を同定可能である（実施例１参照）。
また、ＨＡ−ｔａｇを付加したＴｃｆ−４、ＰＩＡＳ、ＳＵＭＯ、β―カテニン、Ｔｃｆ応答型プラスミドを発現させた細胞を用い、該細胞と被検化合物を接触させた後に、Ｔｃｆ応答型プラスミド由来のシグナルおよび／またはマーカーを検出することにより、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害し、Ｔｃｆ−４の転写活性を阻害する化合物を同定可能である（実施例２参照）。
レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼとＧＦＰを用いる方法においては、ＧＦＰとＴｃｆ−４との融合蛋白質（ＧＦＰ−Ｔｃｆ−４）およびレニラルシフェラーゼとＳＵＭＯとの融合蛋白質（Ｒｅｎｉｌｌａ−ＳＵＭＯ）を恒常的に発現する細胞を用いる。ＰＩＡＳによるＳＵＭＯ化によりＧＦＰ−Ｔｃｆ−４にＲｅｎｉｌｌａ−ＳＵＭＯが付加された状態で、レニラルシフェラーゼの基質を細胞に添加すると、レニラルシフェラーゼによる発光反応で生じた光が、Ｔｃｆ−４に結合したＧＦＰに照射され二次蛍光を発する。この二次蛍光強度を測定することにより、細胞内におけるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化が定量できる。したがって、この細胞と被検化合物を接触させ、一定時間後にＧＦＰの蛍光強度を測定することでＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の程度が確認できる。この方法は、Ｒｅｎｉｌｌａ−ＳＵＭＯの発現調節をエクダイソン誘導発現系などを用いて行うことにより、すでに生成しているＧＦＰ−Ｔｃｆ−４／Ｒｅｎｉｌｌａ−ＳＵＭＯによるバックグラウンドの上昇を防ぐことができるため、有用性が高い。このとき、Ｔｃｆ−４とレニラルシフェラーゼとの融合蛋白質（Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｔｃｆ−４）およびＳＵＭＯとＧＦＰとの融合蛋白質（ＧＦＰ−ＳＵＭＯ）の組み合わせを用いた方法であっても、上記方法と同様に用いることができる。ルシフェラーゼはレニラルシフェラーゼに限らず、公知のルシフェラーゼであれば使用可能である。また、かかる同定方法において、Ｔｃｆ−４およびＳＵＭＯと融合させる物質の組み合わせは、ＧＦＰとレニラルシフェラーゼに限らず、一方の物質が発するシグナル、例えば蛍光などが他方の物質に作用して当該シグナルとは異なったシグナル、例えば別波長の蛍光を発生させる組み合わせであれば用いることができる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系としては、ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ＳＵＭＯまたはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ、および被検化合物を、Ｔｃｆ−４または固相に固定化したＴｃｆ−４と接触させ、次いでＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出する、または当該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出する系を例示できる。ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４、ＳＵＭＯ、ＥＩ  ＳＵＭＯ活性化酵素、およびＥ２  ＳＵＭＯ結合酵素は、無細胞系合成産物、化学合成産物、またはこれらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。
ＳＵＭＯに導入するシグナルおよび／またはマーカーとしては、放射性同位体、ビオチン、またはペプチドタグなどが挙げられる。放射性同位体は、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、または３５Ｓなどが使用可能である。ペプチドタグは、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＥＥ−ｔａｇ、Ｅｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ、またはＶ５−ｔａｇなどが使用可能である。これらシグナルおよび／またはマーカーのＳＵＭＯへの導入方法は、公知方法により実施できる。
上記シグナルおよび／またはマーカーの検出は常法により可能である。例えば、放射性同位体は、その放射活性を市販の測定器を使用して測定することにより検出できる。ビオチンは、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したストレプトアビジンをビオチンに結合させ、ＡＰまたはＨＲＰの基質を加えてその酵素活性を測定することにより検出できる。ペプチドタグは、当該ペプチドタグに対する抗体にＡＰまたはＨＲＰを標識したものを用い、これをペプチドタグに結合させ、ＡＰまたはＨＲＰの基質を加えてその酵素活性を測定することにより検出できる。ＡＰまたはＨＲＰの基質は、当業者に一般的に知られているものを使用できる。
固相としては、市販のマルチウエルプレート、アガロースビーズやセファロースビーズ、またはＳＰＡビーズなどを用いることができるが、これらに限定されない。固相へのＴｃｆ−４の固定化は、常法により可能である。例えば、Ｔｃｆ−４とＨｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質を用いる場合には、予めニッケルイオンで被覆した固相を用いて当該Ｔｃｆ−４を固定化する。Ｔｃｆ−４とＧＳＴとの融合蛋白質を用いる場合には、固相の被覆にグルタチオンを用いる。またはグルタチオンが被覆された市販のマルチウエルプレートやビーズを使用してもよい。Ｔｃｆ−４に蛋白質若しくはペプチドなどを融合しない場合、またはＴｃｆ−４に融合させた蛋白質若しくはペプチドを介して固相に固定化しない場合には、固相を抗Ｔｃｆ−４抗体で被覆しておくか、抗Ｔｃｆ−４抗体で被覆した市販のアガロースビーズやセファロースビーズを用いることにより同様にＴｃｆ−４を固相に固定可能である。
具体的な方法として、以下にＳＰＡビーズを用いた方法、グルタチオンセファロースビーズを用いた方法、およびマルチウエルプレートを用いた方法を示すが、本発明はこれらに限定されない。
ＳＰＡビーズを用いた方法においては、ヒトＰＩＡＳ、Ｕｂｃ９、Ａｏｓ１／Ｕｂａ２、ＧＳＴ融合Ｔｃｆ−４、ＳＵＭＯを、例えば遺伝子工学手法（大腸菌やバキュロウイルスの昆虫細胞への感染）を利用して発現させ、精製して用いる。ＳＵＭＯは放射性同位体、例えば１２５Ｉで標識する。これらの精製蛋白質および被検化合物を混合し、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を行う。反応液中にグルタチオンコートしたＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を添加し、静置する。この間、ＧＳＴ−Ｔｃｆ−４はグルタチオンコートしたＳＰＡビーズに結合するため、ＧＳＴ−Ｔｃｆ−４に１２５Ｉ標識されたＳＵＭＯが結合すると、１２５Ｉ由来の放射線がＳＰＡビーズに照射されてシンチレーション蛍光を発する。この蛍光を測定することでＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化が定量できる。ＳＵＭＯ化が阻害されると測定値が低くなるので、ＳＵＭＯ化を阻害する化合物を検出できる。
グルタチオンセファロースビーズを用いた方法においては、ヒトＰＩＡＳ、Ｕｂｃ９、Ａｏｓ１／Ｕｂａ２、ＧＳＴ融合Ｔｃｆ−４、ＳＵＭＯを、例えば遺伝子工学手法（大腸菌やバキュロウイルスの昆虫細胞への感染）を利用して発現させ、精製して用いる。ＳＵＭＯは放射性同位体、例えば１２５Ｉで標識する。これらの精製蛋白質および被検化合物を混合し、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を行う。反応液中にグルタチオンセファロースビーズ（Ａｍａｒｓｈａｍ社製）を添加して攪拌後に洗浄し、ＧＳＴ−Ｔｃｆ−４が結合したビーズを回収する。回収したグルタチオンセファロースビーズに液体シンチレーターを添加し、Ｔｃｆ−４に付加した１２５Ｉ−ＳＵＭＯ量を測定する。被検化合物によりＳＵＭＯ化が阻害されると、被検化合物を添加しない場合と比較して放射活性が低くなるので、ＳＵＭＯ化を阻害する化合物を検出できる。
マルチウエルプレートを用いた方法においては、ヒトＰＩＡＳ、Ｅ１ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ＳＵＭＯ、Ｔｃｆ−４とＨｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質（Ｈｉｓ−Ｔｃｆ−４）を、例えば遺伝子工学手法（大腸菌やバキュロウイルスの昆虫細胞への感染）を利用して発現させ、精製して用いる。ＳＵＭＯは放射性同位体、例えば１２５Ｉで標識する。Ｈｉｓ−Ｔｃｆ−４は、Ｎｉ＋で被覆した９６ウエルまたは３８４ウエルプレートなどに固定化する。被検化合物、ＥＩ  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、１２５Ｉ−ＳＵＭＯおよびＰＩＡＳをプレートの各ウエルに添加し、ＳＵＭＯ化反応を行う。反応終了後、プレートを洗浄し、Ｈｉｓ−Ｔｃｆ−４に付加された１２５Ｉ−ＳＵＭＯの量を計測する。被検化合物によりＳＵＭＯ化が阻害されると、被検化合物を添加しない場合と比較して放射活性が低くなるので、ＳＵＭＯ化を阻害する化合物を検出できる。
別なｉｎ  ｖｉｔｒｏ系として、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の蛋白質を用い、該蛋白質と被検化合物とを接触させ、次いでＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出する系も利用可能である；
（ａ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ、およびＳＵＭＯに導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、
（ｂ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、およびＴｃｆ−４に導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ。
具体的な方法として、ユーロピウムで標識したＳＵＭＯ（ｅｕｒｏｐｉｕｍ−ＳＵＭＯ）、およびＴｃｆ−４とＸＬ６６５との融合蛋白質（ＸＬ６６５−Ｔｃｆ−４）を用いる方法を例示する。ヒトＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ＸＬ６６５−Ｔｃｆ−４、ＳＵＭＯは、例えば遺伝子工学手法（大腸菌やバキュロウイルスの昆虫細胞への感染）を利用して発現させ、精製して用いる。ＳＵＭＯは、常法によりユーロピウムで標識する。被検化合物、ＸＬ６６５−Ｔｃｆ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ｅｕｒｏｐｉｕｍ−ＳＵＭＯ、およびＰＩＡＳをプレートの各ウエルに添加し、ＳＵＭＯ化反応を行う。反応終了後、ウエル中に３３７ｎｍの光を照射し、ユーロピウムによる蛍光放射を促し、ユーロピウムからの蛍光を受けて生じたＸＬ６６５の二次蛍光（６６５ｎｍ）を測定することでＸＬ６６５−Ｔｃｆ−４に付加されたｅｕｒｏｐｉｕｍ−ＳＵＭＯの量を計測する。被検化合物によりＳＵＭＯ化が阻害されると、被検化合物を添加しない場合と比較して二次蛍光強度が低くなるので、ＳＵＭＯ化を阻害する化合物を検出できる。
別の具体的な方法として、Ｔｃｆ−４とレニラルシフェラーゼとの融合蛋白質（Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｔｃｆ−４）およびＳＵＭＯとＧＦＰとの融合蛋白質（ＧＦＰ−ＳＵＭＯ）を用いる方法を例示する。ヒトＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｔｃｆ−４、ＧＦＰ−ＳＵＭＯは、例えば遺伝子工学手法（大腸菌やバキュロウイルスの昆虫細胞への感染）を利用して発現させ、精製して用いる。被検化合物、Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｔｃｆ−４、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ＧＦＰ−ＳＵＭＯおよびＰＩＡＳをプレートの各ウエルに添加し、ＳＵＭＯ化反応を行う。反応終了後、ウエル中にレニラルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を惹起し、当該発光反応の結果励起されたＧＦＰの蛍光を計測することによりＴｃｆ−４に結合したＳＵＭＯの量を検出する。被検化合物によりＳＵＭＯ化が阻害されると、被検化合物を添加しない場合と比較して蛍光強度が低くなるので、ＳＵＭＯ化を阻害する化合物を検出できる。
このとき、Ｔｃｆ−４とＧＦＰとの融合蛋白質（ＧＦＰ−Ｔｃｆ−４）およびＳＵＭＯとレニラルシフェラーゼとの融合蛋白質（Ｒｅｎｉｌｌａ−ＳＵＭＯ）の組み合わせを用いた方法であっても、上記方法と同様に用いることができる。
上記同定方法の具体例はいずれも本同定方法の一態様を示したものであり、本同定方法はこれらの例に限定されず、ＰＩＡＳとＴｃｆ−４の相互作用、その結果おこるＴｃｆ−４へのＳＵＭＯの付加を検出できる方法であれば、本発明の範囲に含まれる。
上記方法で得られた化合物は、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化阻害剤、およびＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化阻害によるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤として利用可能である。かかる化合物としては、ＰＩＡＳとＴｃｆ−４との相互作用を阻害する化合物、あるいはＰＩＡＳのＴｃｆ−４に対するＳＵＭＯ化活性を阻害する化合物が挙げられる。例えば、両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドまたはオリゴペプチドを例示することができる。かかるペプチドまたはオリゴペプチドは、ＰＩＡＳまたはＴｃｆ−４のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法によって合成し、上記同定方法においてＰＩＡＳとＴｃｆ−４の結合およびＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを試験することによって、同定可能である。また、ＰＩＡＳとＴｃｆ−４との相互作用を阻害する抗体も上記化合物の１つとして例示できる。該抗体は、例えば両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドまたはオリゴペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。
あるいは、ＰＩＡＳの発現および／または機能を阻害する化合物も、結果的にＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害し得るため、本発明の範囲に含まれる。ＰＩＡＳの発現を阻害する化合物の同定は、蛋白質の発現阻害剤の自体公知のスクリーニング系を用いて実施可能である。ＰＩＡＳの発現を阻害する化合物は、ＰＩＡＳ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが例示できる。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＩＡＳ遺伝子の発現系を用いて、ＰＩＡＳ遺伝子の塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドから、ＰＩＡＳ遺伝子の発現を特異的に阻害するものを選択することにより得られる。また、ＰＩＡＳの機能を阻害する化合物の同定は、ＰＩＡＳを用いてその機能、例えばＳＵＭＯ化活性を阻害する物質を、上記同定方法などにより選択して得られる。
さらに、本発明において、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の転写活性が増強することが明らかになったことから、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４からＳＵＭＯを離脱させる脱ＳＵＭＯ化剤は、Ｔｃｆ−４の転写活性の抑制、さらにはＴｃｆ−４の転写活性の増強に基づく疾患、例えば大腸癌の防止および／または治療に有用であると考えられる。脱ＳＵＭＯ化剤としては、後述する実施例に示したような脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍや、同活性を保持しているその欠失変異体などを例示できる。
かくして選別された化合物、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤、当該阻害剤および／または当該脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤を単独でまたは複数組み合わせて使用することにより試薬として使用できる。該試薬は、例えばＳＵＭＯ化やβ−カテニン／Ｔｃｆ−４シグナル伝達系の研究に有用である。
上記選別された化合物、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤、当該阻害剤および／または当該脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤は、さらに生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、医薬組成物として調製可能である。これらの化合物、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤、Ｔｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤、およびＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤は、単独で使用することもできるし、複数を組み合わせて使用することも可能である。
上記の化合物、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤、Ｔｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤、Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害剤、および医薬組成物は細胞増殖に起因する疾患、例えばがんの防止および／または治療に利用することができる。さらに、Ｔｃｆ−４が大腸癌において活性化されていることが報告されていることから、上記医薬組成物は、大腸癌の防止および／または治療に有用である。
本発明に係るＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化の阻害剤、ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤、当該阻害剤および／または当該脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤、並びに医薬組成物の処方は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量の上記化合物、上記ＳＵＭＯ化の阻害剤、上記脱ＳＵＭＯ化剤、上記転写活性の阻害剤、および／または上記医薬組成物、さらに医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られている。
上記ＳＵＭＯ化の阻害剤、上記転写活性の阻害剤、上記脱ＳＵＭＯ化剤、および上記医薬組成物は、単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物と一緒に使用してもよい。
投与形態は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様は、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を用いることもできる。局所的な投与のときは、膏薬、パスタ、ゲルなどの形態を利用できる。
必要な用量範囲は、上記ＳＵＭＯ化の阻害剤、上記脱ＳＵＭＯ化剤、上記転写活性の阻害剤、および上記医薬組成物の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断による。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇの範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。
製剤化にあたっては、例えばペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、化合物など各対象の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法が利用できる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ＰＥＧなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油、ＭＣＴなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
本発明は、さらに、ＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドおよび／またはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチド、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／またはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キットを提供する。当該試薬キットは上記同定方法に使用可能である。ＰＩＡＳおよびＴｃｆ−４は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または当該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化が阻害されなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質またはペプチド、例えばグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧなどの免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、またはＦｌａｇ−ｔａｇなどが、直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて付加されたものであってもよい。ＰＩＡＳまたはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。ＰＩＡＳまたはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターＤＮＡ、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。当該試薬キットはさらに、ＰＩＡＳとＴｃｆ−４との相互作用、例えばＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化、あるいはＰＩＡＳによるＴｃｆ−４の機能増強を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、例えばＳＵＭＯまたは別の蛋白質若しくはペプチドにより修飾されたＳＵＭＯ、ＳＵＭＯをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを保持するベクターなど、並びにバッファーなど、上記同定方法に必要な物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
実施例
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
まず、下記実施例に用いるプラスミドを構築した。
哺乳類細胞用蛋白質発現ベクターに、Ｍｙｃ−ｔａｇを持つヒトＴｃｆ−４のｃＤＮＡを導入し、Ｍｙｃ−Ｔｃｆ−４発現プラスミドを構築した。
ＨＡ−ｔａｇ配列を有する哺乳類細胞用蛋白質発現ベクターに、ＳＵＭＯのｃＤＮＡを導入し、ＨＡ−ＳＵＭＯ発現プラスミドを構築した。
サイトメガロウイルスプロモーターを有する哺乳類細胞用蛋白質発現ベクターに、Ｆｌａｇ−ｔａｇを持つＰＩＡＳｙのｃＤＮＡを導入し、Ｆｌａｇ−ＰＩＡＳｙ発現プラスミドを構築した。また、ＰＩＡＳｙのアミノ酸配列中第３４２番目と第３４７番目のシステイン（Ｃ）をアラニン（Ａ）に変わるようにｃＤＮＡを変異させた（ＰＩＡＳｙＣＡ）プラスミドもあわせて構築した。
ベクターｐＵＣ１９−ＥＦ１αのＫｐｎＩ／ＳａｌＩサイトにＨＡ−ｔａｇを持ち、Ｎ末端のＧＳＫ−３βのリン酸化部位をアラニンに変異させたβ−カテニンのｃＤＮＡを導入しＨＡ−β−カテニンＳＡ（ＨＡ−β−ｃａｔｅｎｉｎｅＳＡ）発現プラスミドを構築した。
哺乳類細胞用蛋白質発現ベクターに、Ａｘａｍ（非特許文献８）またはその欠失変異体のｃＤＮＡ（第５図）を導入し、それぞれの発現プラスミドを構築した。
実施例１
（Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加の検出）
細胞数３×１０５のヒト胎児性腎（Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞（以下、ＨＥＫ２９３細胞と略称する）をφ３５ｍｍディッシュに播種し、２４時間培養後、Ｍｙｃ−Ｔｃｆ−４発現プラスミド  １μｇ、ＨＡ−ＳＵＭＯ−１発現プラスミド  ０．２５μｇ、Ｆｌａｇ−ＰＩＡＳｙ発現プラスミド  ０．０２μｇを、第１図Ａおよび第１図Ｂに示す組み合わせで、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いて導入した。また、Ｆｌａｇ−ＰＩＡＳｙ発現プラスミドの代わりにＦｌａｇ−ＰＩＡＳｙＣＡ発現プラスミドを用いて同様に遺伝子導入を行った。なお、導入方法については同社の推奨するプロトコールに従った。遺伝子導入後、細胞を４０時間培養し、次いで２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理し電気泳動用のサンプルとした。細胞内に発現したＭｙｃ−ｔａｇを持つＴｃｆ−４を抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット法にて検出した（第１図Ａ）。
また、上記同様に各遺伝子を導入して蛋白質を発現させた上記ＨＥＫ２９３細胞を、ＲＩＰＡバッファー〔１０ｍＭ  ナトリウム−リン酸バッファー，ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ナトリウム−デオキシコーレート（Ｎａ−ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌ  アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）およびロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍＭ  ＮａＦ、０．４ｍＭ  ソジウム−オルソバナデート（Ｎａ−ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）、並びに１０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（Ｎ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）〕を添加して溶解し、細胞溶解液を作成した。２００μｇの総蛋白量の細胞溶解液にウエスタンブロット法で用いた抗Ｍｙｃ抗体を添加して２時間反応させた後に、プロテインＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を添加して抗Ｍｙｃ抗体と結合したＭｙｃ−Ｔｃｆ−４蛋白質を免疫沈降した。次いで、回収された蛋白質を抗Ｍｙｃ抗体および抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した（第１図Ｂ）。
その結果、ＨＥＫ２９３細胞においては、Ｔｃｆ−４、ＳＵＭＯ−１、およびＰＩＡＳｙ存在下で、Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加に伴う移動度変化が検出された（第１図Ａ）。この移動度変化は、ＳＵＭＯ化活性の無い不活性型のＰＩＡＳｙＣＡでは認められなかったこと、移動したバンドにＨＡ−ｔａｇのついたＳＵＭＯ−１が付加していることが確認されたこと（第１図Ｂ）から、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化によるものであると考えられる。すなわちＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化は、ＰＩＡＳｙにより促進されることが判明した。
実施例２
（Ｔｃｆ−４転写活性に対するＰＩＡＳｙの効果検出）
細胞数３×１０５のＨＥＫ２９３細胞をφ３５ｍｍディッシュに播種し、２４時間培養後、Ｔｃｆ応答型プラスミド（０．５μｇ）をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いて導入した。このときに一部の細胞には、Ｗｎｔ−３ａ発現プラスミド（０．５μｇ）、ＰＩＡＳｙ若しくはＰＩＡＳｙＣＡ発現プラスミド、およびＨＡ−β−ｃａｔｅｎｉｎＳＡの発現プラスミドを、第２図に記載の組み合わせと用量（μｇ）で、同時に添加した。プラスミド導入後４０時間培養し、次いで東洋ビーネット社製のＰｉｃａＧｅｎｅを基質として用いて、細胞内に生成したＴｃｆ応答型プラスミド由来のホタルルシフェラーゼの活性を双葉メディカル社（東京）のルミフォトメーターを用いて検出した。また、ｐＭＥ１８Ｓ／ｌａｃＺ由来のβ−ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性を測定し、トランスフェクション効率の違いによる誤差を補正した（第２図）。
ＨＥＫ２９３細胞において、β−カテニンやＷｎｔ−３を発現させると、レポーター活性が増強される。ＰＩＡＳｙは単独でレポーター活性を増強し、さらに、β−カテニンやＷｎｔ−３依存性のレポーター活性を相乗的に増強した。一方、ＳＵＭＯ化活性の無い不活性型ＰＩＡＳｙＣＡは、β−カテニン依存性のレポーター活性の増強を抑制した。これらのことから、ＰＩＡＳｙが単独でＴｃｆ−４の転写活性を増強し、さらに、β−カテニンやＷｎｔ−３依存性のＴｃｆ転写活性化を相乗的に増強することが判明した。
実施例３
（β−カテニン依存的なＴｃｆ−４転写活性に対するＰＩＡＳｙ、ＳＵＭＯ−１、Ａｘａｍの効果）
細胞数３×１０５のＨＥＫ２９３細胞をφ３５ｍｍディッシュに播種し、２４時間培養後、Ｔｃｆ応答型プラスミド（０．５μｇ）、ＰＭＥ１８Ｓ／ｌａｃＺ（０．５μｇ）、Ｍｙｃ−Ｔｃｆ−４（０．１μｇ）発現プラスミド、ＨＡ−β−ｃａｔｅｎｉｎＳＡ発現プラスミド（３０ｎｇ）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いて導入した。このときにＰＩＡＳｙ、ＳＵＭＯ−１、および脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍ蛋白質（変異体の場合もある）を０．５μｇ同時に添加した。４０時間培養後、東洋ビーネット社製のＰｉｃａＧｅｎｅを基質として用いて、細胞内に生成したＴｃｆ応答型プラスミド由来のホタルルシフェラーゼの活性を双葉メディカル社（東京）のルミフォトメーターを用いて検出した。また、ｐＭＥ１８Ｓ／ｌａｃＺ由来のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、トランスフェクション効率の違いによる誤差を補正した（第３〜５図）。
ＳＵＭＯ−１はβ−カテニン依存性のＴｃｆ−４の転写活性を相乗的に促進した（第３図）。したがって、Ｔｃｆ−４の転写活性の増強に、ＳＵＭＯ化が関与していると考えられる。
脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍ全長蛋白質はβ−カテニン依存性のＴｃｆ−４の転写活性を抑制した（第４図および第５図）。一方、Ａｘａｍのアミノ酸配列中第５４７番目システイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体（脱ＳＵＭＯ化活性を有さない変異体）は、Ｔｃｆ−４のβ−カテニン依存性転写活性を抑制しなかった。また、ＡｘａｍのＮ末端側のアミノ酸残基を欠失させた変異体のうち、Ａｘａｍ（７２−４００）では、β−カテニン依存性のＴｃｆ−４の転写活性が増強されたが、Ａｘａｍ（７２−５８８）またはＡｘａｍ（３８１−５８８）では完全長のＡｘａｍと比較して弱いものの抑制が観察された。
以上の結果から、ＳＵＭＯ化が促進されるとＴｃｆ−４の転写活性が促進され、逆に脱ＳＵＭＯ化が促進されるとＴｃｆ−４の転写活性が抑制されることが明らかになった。したがって、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害することにより、Ｔｃｆ−４の転写活性を抑制することができ、さらには、大腸癌でＴｃｆ−４が活性化していることが報告されていることから、大腸癌の防止および／または治療が可能になる。
実施例４
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加の検出）
ＧＳＴ−ｔａｇを持つヒトＴｃｆ−４のｃＤＮＡをバキュロウイルスベクターに導入してベクターを構築し、Ｓｆ９細胞を用いてＧＳＴ−Ｔｃｆ−４を生産した。ＧＳＴ−Ａｏｓ１／Ｈｉｓ６−Ｕｂａ２（Ｅ１）は、同様にＳｆ−９細胞を用いて生産した。ＳＵＭＯ−１ＧＧ（Ｇはグリシンを意味する）、Ｈｉｓ６−Ｕｂｃ９（Ｅ２）、ＭＢＰ−ＰＩＡＳｙ（ＷＴ）およびＰＩＡＳｙ（ＰＩＡＳｙＣＡ：  Ｃ３４２，３４７Ａ）（Ｅ３）は、それぞれ、蛋白質発現用ベクターにｃＤＮＡを導入後、大腸菌を用いて生産した。
０．３μｇのＧＳＴ−Ｔｃｆ−４とＧＳＴ−Ａｏｓ１／Ｈｉｓ６−Ｕｂａ２（Ｅ１）０．５μｇ、Ｈｉｓ６−Ｕｂｃ９（Ｅ２）０．５μｇおよびＧＳＴ−ＳＵＭＯ−１ＧＧ  １０μｇをＳＵＭＯ化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  アデノシン３リン酸（ＡＴＰ））内で混合し、３０℃にて３時間反応させた後に、抗Ｔｃｆ−４抗体を用いたウェスタンブロット法でＴｃｆ−４蛋白質を検出した。しかし、Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加に伴う移動度変化は検出されなかった。ここにＭＢＰ−ＰＩＡＳｙを０．１μｇまたは０．２μｇさらに加えてＴｃｆ−４蛋白質を同様に検出すると移動度変化が検出された。しかし、Ｕｂｃ９と結合能がないＭＢＰ−ＰＩＡＳｙ  ＣＡでは移動度変化は検出されなかった（第６図）。このことから、ＰＩＡＳｙによりＴｃｆ−４がＳＵＭＯ化されることをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実証した。
実施例５
（ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加の検出）
ヒトＴｃｆ−４発現プラスミド、Ｆｌａｇ−ＰＩＡＳ３発現プラスミ、ド、ＨＡ−ＰＩＡＳ１発現プラスミドおよびＨＡ−ＰＩＡＳｘα発現プラスミドを、組換えＤＮＡ技術により構築した。これらの発現プラスミドを用いて、実施例１と同様に、ＨＡ−ＳＵＭＯ−１発現プラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞に導入した。該細胞をインキュベーション後に１０％  ＴＣＡで処理し、得られた沈降物を電気泳動処理して、抗Ｔｃｆ−４抗体、抗Ｆｌａｇ抗体、および抗ＨＡ抗体を用いてＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出した（第７図）。
その結果、ＨＥＫ２９３細胞においては、Ｔｃｆ−４およびＳＵＭＯ−１の存在下で、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４の移動度変化が検出された（第７図、レーン４から７）。この移動度変化は、Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加によるものである。このことから、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化は、ＰＩＡＳｙのみならず、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによっても促進されることが判明した。
産業上の利用効果
本発明においては、ＰＩＡＳ、例えばＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαにより転写因子Ｔｃｆ−４がＳＵＭＯ化を受けること、ＳＵＭＯ化によりＴｃｆ−４の機能が増強されることを見出した。Ｔｃｆ−４はβ−カテニンシグナルの下流に属する転写因子であり、大腸癌において活性化されていることが知られている。これらのことから、ＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害すること、あるいはＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することによって、Ｔｃｆ−４の転写活性の促進を抑制することができるため、大腸癌の防止および／または治療が可能になると考えられる。したがって、本発明は、大腸癌の防止および／または治療、並びにＳＵＭＯ化やβ−カテニン／Ｔｃｆシグナル伝達系の研究のために非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図Ａおよび第１図Ｂは、Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加がＰＩＡＳｙにより促進したことを示す。第１図Ａでは、Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加を、各遺伝子を導入した細胞を用いて行い、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した。図中、ＷＴは野生型ＰＩＡＳｙを、ＣＡはＰＩＡＳｙのアミノ酸配列中第３４２番目および第３４７番目のシステイン（Ｃ）をそれぞれアラニン（Ａ）に置換したものを意味する。第１図Ｂでは、Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加を、各遺伝子を導入した細胞を用いて行い、当該細胞を溶解後に抗Ｍｙｃ抗体によりＭｙｃ−Ｔｃｆ−４を免疫沈降し、回収された蛋白質を抗Ｍｙｃ抗体および抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した。
第２図は、ＰＩＡＳｙが単独でＴｃｆ−４の転写活性を促進すること、さらに、Ｔｃｆ−４のβ−カテニンまたはＷｎｔ−３ａ依存性の転写活性を促進することを示す。Ｔｃｆ−４の転写活性は、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いて測定した。図中、縦軸は、ルシフェラーゼ活性の増加倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）で表される相対的ルシフェラーゼ誘導（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を示す。図中の数値は各プラスミドの添加量（μｇ）を示す。
第３図は、ＳＵＭＯ−１がＴｃｆ−４のβ−カテニン依存性転写活性を促進することを示す。図中の数値は各プラスミドの添加量（μｇ）を示す。
第４図は、Ｔｃｆ−４のβ−カテニン依存性転写活性の促進が、脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍにより阻害されるが、脱ＳＵＭＯ化活性をもたないＡｘａｍ変異体によっては阻害されないことを示す。図中、ＷＴは野生型Ａｘａｍを、ＣＳはＡｘａｍのアミノ酸配列中の第５４７番目のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に置換したＡｘａｍ変異体を、７２−５８８、７２−４００、３８１−５８８は、欠失型Ａｘａｍ変異体を示す。
第５図は、ヒトＰＩＡＳｙ、ヒトＴｃｆ−４Ｅ、Ａｘａｍ、およびＡｘａｍの各種変異体の構造を示す模式図である。
第６図は、ＰＩＡＳｙがインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）においてＴｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１付加を促進するが、ＰＩＡＳｙＣＡはＴｃｆ−４にＳＵＭＯ−１を付加しないことを示す。左側の数値は分子量を示す。
第７図は、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３およびＰＩＡＳｘαがいずれも、Ｔｃｆ−４へのＳＵＭＯ−１の付加を促進することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月24日(2004.2.24)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）被検化合物とＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４との相互作用を可能にする条件下で、ＰＩＡＳおよび／またはＴｃｆ−４と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、当該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項２】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第１項に記載の同定方法。
【請求項３】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第１項に記載の同定方法。
【請求項４】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（Ａ）若しくは（Ｂ）若しくは（Ｃ）若しくは（Ｄ）に記載の細胞を用い、該細胞と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）ＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出することにより、あるいはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法；
（Ａ）ＰＩＡＳ、スモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４を共発現させた細胞、
（Ｂ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４、およびＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｃ）ＰＩＡＳ、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、および該シグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯを共発現させた細胞、
（Ｄ）ＰＩＡＳ、ＳＵＭＯ、およびＴｃｆ−４を共発現させた細胞。
【請求項５】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（Ｅ）または（Ｆ）に記載の細胞を用い、該細胞と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）次いでルシフェラーゼの基質を加えて、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の蛍光強度を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法；
（Ｅ）Ｔｃｆ−４とＧＦＰとの融合蛋白質、スモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）とルシフェラーゼとの融合蛋白質、およびＰＩＡＳを共発現させた細胞、
（Ｆ）Ｔｃｆ−４とルシフェラーゼとの融合蛋白質、ＳＵＭＯとＧＦＰとの融合蛋白質、およびＰＩＡＳを共発現させた細胞。
【請求項６】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、スモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）またはＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ、および被検化合物を、Ｔｃｆ−４または固相に固定化したＴｃｆ−４と接触させる工程、（ｉｉ）次いでＳＵＭＯ化されたＴｃｆ−４を検出することにより、あるいは当該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項７】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）以下の（ａ）または（ｂ）に記載の蛋白質を用い、該蛋白質と被検化合物とを接触させる工程、（ｉｉ）次いでＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法；
（ａ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）、およびＳＵＭＯに導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、
（ｂ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、Ｔｃｆ−４のＳＵＭＯ化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＴｃｆ−４、およびＴｃｆ−４に導入されたシグナルおよび／またはマーカーを検出するためのシグナルおよび／またはマーカーを導入したＳＵＭＯ。
【請求項８】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、放射性同位体若しくはビオチン若しくはペプチドタグで標識したスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、および被検化合物を、固相に固定化したＴｃｆ−４と接触させる工程、（ｉｉ）次いで当該標識に用いた物質を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項９】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、ユーロピウム（ｅｕｒｏｐｉｕｍ）で標識したスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、ユーロピウムが放射する蛍光により励起して二次蛍光を放射する物質で標識したＴｃｆ−４、および被検化合物を反応させる工程、（ｉｉ）次いでユーロピウムを励起する波長の光を照射して、当該二次蛍光強度を測定することにより、被検化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項１０】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物の同定方法であって、（ｉ）Ｔｃｆ−４とルシフェラーゼとの融合蛋白質およびスモール・ユビキチンライク・モディファイアー（Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）とグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質、またはＴｃｆ−４とＧＦＰとの融合蛋白質およびＳＵＭＯとルシフェラーゼとの融合蛋白質に、ＰＩＡＳ、Ｅ１  ＳＵＭＯ活性化酵素、Ｅ２  ＳＵＭＯ結合酵素、および被検化合物を反応させる工程、（ｉｉ）次いでルシフェラーゼの基質を加えて、ＧＦＰの蛍光強度を測定することにより、化合物がＰＩＡＳによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化を阻害するか否かを決定する工程を含む同定方法。
【請求項１１】請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１項に記載の同定方法によって得られた化合物。
【請求項１２】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物。
【請求項１３】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物。
【請求項１４】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する化合物。
【請求項１５】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤。
【請求項１６】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαによるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤。
【請求項１７】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット・ワイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴｙ）（ＰＩＡＳｙ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤。
【請求項１８】Ｔｃｆ−４の脱ＳＵＭＯ化剤。
【請求項１９】請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤および／または請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤からなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤。
【請求項２０】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害すること、および／またはＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項２１】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第２０項に記載のＴｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項２２】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第２０項に記載のＴｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項２３】請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤および／または請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、または請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる、大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項２４】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害すること、および／またはＴｃｆ−４を脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項２５】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第２４項に記載の大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項２６】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第２４項に記載の大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項２７】請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤、請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、および請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含有してなる医薬組成物。
【請求項２８】請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤、請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、および請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を含有してなる大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項２９】請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１５項から第１７項のいずれか１項に記載のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤、請求の範囲第１８項に記載の脱ＳＵＭＯ化剤、および請求の範囲第１９項に記載の転写活性の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上を使用することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項３０】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）および／若しくはＴｃｆ−４、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドおよび／若しくはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチド、またはＰＩＡＳをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／若しくはＴｃｆ−４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを少なくとも含んでなる試薬キット。
【請求項３１】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３またはＰＩＡＳｘαである請求の範囲第３０項に記載の試薬キット。
【請求項３２】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）が、ＰＩＡＳｙである請求の範囲第３０項に記載の試薬キット。
【請求項３３】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）をＡｘａｍまたは脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍ変異体によって脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、Ｔｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項３４】脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍ変異体が、Ａｘａｍのアミノ酸配列中の７２番目から５８８番目までのアミノ酸残基からなる欠失変異体または３８１番目から５８８番目までのアミノ酸残基からなる欠失変異体である、請求の範囲第３３項に記載のＴｃｆ−４の転写活性の阻害方法。
【請求項３５】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）をＡｘａｍまたは脱ＳＵＭＯ化活性を有するＡｘａｍ変異体によって脱ＳＵＭＯ化することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項３６】プロテイン・インヒビター・オブ・アクチベーティッド・スタット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ）（ＰＩＡＳ）によるＴｃｆ−４のＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を阻害する機能を有する、Ａｘａｍのアミノ酸配列中の７２番目から５８８番目までのアミノ酸残基からなる欠失変異体または３８１番目から５８８番目までのアミノ酸残基からなる欠失変異体。
【請求項３７】請求の範囲３６に記載の欠失変異体を含んでなるＴｃｆ−４の転写活性の阻害剤。
【請求項３８】請求の範囲３６に記載の欠失変異体を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤。




【国際調査報告】
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