(57)【要約】従来より工業的に用いられてきた生体材料からの抽出法に比較して簡便な合成法であり、且つ、反応液からの生成物の単離精製が容易なコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法を提供するものである。採取されたコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は化粧品、医薬品および医用材料等の材料として工業的に有用である。オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめることを特徴とするコンドロイチン又はコンドロイチン酸誘導体の製造法を構成とする。
2003070960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめることを特徴とするコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法。
2003070960.tif 000016
（上式中Ｒは水素、アルキル基、任意に置換されたアルキル基、フェニル基、任意に置されたフェニル基を表す。）
【請求項２】
前記オキサゾリン誘導体が、２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−ガラクトピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンである請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
ヒアルロン酸分解酵素が、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼである請求項１又は２に記載の製造法。
【請求項４】
ほ乳類由来のヒアルロニダーゼが、ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼあるいは羊睾丸由来ヒアルロニダーゼである請求項３に記載の製造法。
【請求項５】
ｐＨを５〜１０にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
前記オキサゾリン誘導体の濃度が０．１重量％以上にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
温度が５〜６０℃にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒアルロン酸分解酵素を利用したコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の酵素的製造法に関する。更に詳しくは、ヒアルロン酸分解酵素であるほ乳類由来のヒアルロニダーゼを触媒とし、コンドロシンオキサゾリン誘導体をモノマー基質として酵素的に重合させてコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体を製造する方法に関する。
背景技術
コンドロイチンは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンの二糖が直鎖状に交互に結合した枝分かれのない高分子多糖である。コンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は、化粧品、医薬品あるいは医用材料等として幅広く利用できる。
コンドロイチンは、牛の眼の角膜やスルメイカの皮等に含まれる他、軟骨組織に多量に存在するコンドロイチン硫酸Ａ又はＣの脱硫酸により得られることが知られている。コンドロイチンの製造法としては、含有量が比較的高いスルメイカの皮等からの抽出法が一般的であるが、純度を高くするためには多くの工程を要するため、経済的に不利である。また、前述のようにコンドロイチン硫酸Ａ又はＣの脱硫酸によっても製造することが可能であるが、コンドロイチン硫酸も軟骨組織等から抽出・精製する必要があるため有利な方法とは言い難い。
しかしながら、従来のコンドロイチンの製造方法である生体材料からの抽出法に替わりうる酵素化学的合成手法の開発は幾多の試行の結果においても、これまで達成されていないという課題があった。
本発明者らは、実用レベルにおいても有用性の高いコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の新規な製造法の開発について鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸分解酵素を用いた酵素化学的手法によるコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の新規な製造法を初めて見出した。
更に詳しくは、本発明者らは酵素化学的手法によるコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造において、本来ヒアルロン酸を分解する酵素として知られているヒアルロニダーゼを酵素重合触媒とし、コンドロシンオキサゾリン誘導体をモノマー基質とした場合に、モノマー基質が酵素的に重合されて高分子量のコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体が収率よく生成することを見出し本発明を完成するに至った。
発明の開示
即ち、本発明は、以下の構成を有することを特徴とする。
（１）下記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめることを特徴とするコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法。
2003070960.tif 000003
（上式中Ｒは水素、アルキル基、任意に置換されたアルキル基、フェニル基、任意に置されたフェニル基を表す。）
（２）前記オキサゾリン誘導体が２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−ガラクトピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンである上記（１）記載の製造法。
（３）ヒアルロン酸分解酵素が、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼである上記（１）又は（２）記載の製造法。
（４）ほ乳類由来のヒアルロニダーゼが、ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼあるいは羊睾丸由来ヒアルロニダーゼである上記（３）記載の製造法。
（５）ｐＨを５〜１０にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
（６）前記オキサゾリン誘導体の濃度が０．１重量％以上にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造法。
（７）温度が５〜６０℃にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造法。
発明を実施するための最良の形態
以下、さらに詳しく本発明を説明する。
本発明で使用する基質モノマーの一つであるコンドロシンオキサゾリン誘導体（６）を例に挙げ、合成の手順を以下に記す。また、図１に合成スキームを示す。
すなわち、メチル（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート）ウロネートを糖供与体、ベンジル  ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを糖受容体として用い、ジクロロメタン中、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）を活性化剤として、アルゴン雰囲気下−２０℃で１時間反応させることにより、ベンジル  ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１）を合成した。（１）をチオ酢酸に溶解させ、乾燥雰囲気下室温で２４時間反応させることにより、ベンジル  ２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２）を合成した。（２）を酢酸と水に溶解させ、８０℃で１時間撹拌し、ベンジル  ２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを得た。続いて脱水ピリジン中、無水酢酸を０℃で滴下し、室温で３時間反応させることにより、ベンジル  ２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３）を得た。（３）を脱水メタノール中、水素雰囲気下で１０％水酸化パラジウム炭素を触媒とする接触水素還元によりベンジル基の脱保護を行い、続いて脱水ピリジン中、無水酢酸を作用させ、２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（４）を得た。続いて脱水ジクロロメタン中、アルゴン雰囲気下、室温にて１２時間、（４）にＴＭＳＯＴｆを作用させ、その後０℃にてトリエチルアミンを作用させることで、２−メチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１，ｄ］−２−オキサゾリン（５）を得た。（５）を脱水メタノール中、ナトリウムメトキシドを作用させてすべてのアセチル基を脱保護し、反応溶液を減圧濃縮後、乾固させ、これを炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ１０．６）中で１時間撹拌することでメチルエステルを脱保護し、目的とする基質モノマーである２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１，ｄ］−２−オキサゾリン（６）を得た。
かくして得られたコンドロシンオキサゾリン誘導体は重合触媒としてのヒアルロン酸分解酵素の基質モノマーとして好適に使用される。酵素反応時の基質モノマー濃度は実用面から０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上で用いられる。
反応ｐＨは酵素の反応性と基質モノマーの安定性を考慮し、５〜１０望ましくは６．５〜９．５が好適に採用される。反応温度は５℃〜６０℃で、好ましくは、２０℃〜４０℃が用いられる。
使用するヒアルロン酸分解酵素としては、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼが好ましく、具体的にはエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）に分類されるウシ睾丸由来又は羊睾丸由来ヒアルロニダーゼなどが好適であり、該酵素を適当な担体に固定化した固定化酵素の形態で使用することも可能である。バッチ反応あるいは連続反応形式いずれも採用される。
反応は水溶媒あるいは水溶媒にメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール等のアルコール類、グリセリン、ポリエチレングリコール等のポリオール類、ジメチルスルフォキシド、ジメチルフォルムアミド、酢酸エチル、ジオキサン、反応に悪影響を及ぼさない各種無機塩類又はｐＨ緩衝剤等を適宜添加した条件下でも進行する。
基質モノマーとしては、２−メチル−コンドロシンオキサゾリン誘導体（６）に限定されることはなく、ヒアルロニダーゼによる重合反応が進行するコンドロシンオキサゾリン基本構造を有する、前記一般式（Ｉ）のコンドロシンオキサゾリン誘導体であれば本発明に含まれる。
例えば、前記一般式（Ｉ）のＲで水素あるいはメチルのかわりにエチル、プロピル、ブチル等のアルキル基、フェニル基、ハロゲン置換アルキル基、又はハロゲン置換フェニル基等が使用可能である。
また、基質モノマーは、フリーの酸、ナトリウム，カリウム等の金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩等の形であれば特に限定されない。生成したコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は基質モノマーのグルクロン酸の塩の形態に依存し、フリーな酸あるいはナトリウム，カリウム等の金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの形態が含まれる。
上記条件下でバッチ反応を開始した場合、条件によって一概に規定できないが、数時間〜数日で反応は完了する。反応終了後、反応液を遠心分離、限外濾過、精密濾過、各種吸着カラム、溶媒沈殿及びクロマト分離などの公知精製手段を組み合わせることで高純度のコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体を単離精製することが出来る。かくして得られたコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は化粧品、医薬品あるいは医用材料等として幅広く利用できる。
実施例
以下に本発明の詳細な内容について実施例で説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
ベンジル  ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１）の合成
遮光二口フラスコ中で、ベンジル  ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１９０ｍｇ，０．４８８ｍｍｏｌ）とメチル（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル  トリクロロアセトイミデート）ウロネート（２８０ｍｇ，０．５８５ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（５．００ｍｌ）に溶解させ、モレキュラーシーブス４Ａ（ＭＳ４Ａ；１．００ｇ）を加え、アルゴン雰囲気下、−２０℃で３０分撹拌した。これにトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ；０．１０６ｍｌ，０．５８５ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（１．００ｍｌ）で希釈したものを−２０℃で滴下し、１時間撹拌した。反応終了後トリエチルアミン（０．１００ｍｌ）を加え、セライト濾過によりＭＳ４Ａを除去し、濾液をクロロホルムで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをセライトろ過により除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝３：１−１：１）にて精製し、白色結晶状のベンジル  ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２７０ｍｇ，０．３８６ｍｍｏｌ，収率７９％）を得た。
分析データは、以下の通りである。
［α］Ｄ−１０°（ｃ＝１．０，ＣＨＣｌ３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；７．５４−７．５２（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．３８−７．３１（８Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．５６（１Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ），５．２６−５．２２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’），５．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝７．５２Ｈｚ，Ｊ２’，３’＝８．５２Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄ，ＰｈＣＨ２，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝７．５２Ｈｚ），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＰｈＣＨ２，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ），４．３７−４．２９（３Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−１，Ｈ−４），４．０９−４．０２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ｂ，Ｈ−５’），３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２，Ｊ１，２＝８．０４Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．５Ｈｚ），３．７２（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３，Ｊ２，３＝１０．５０Ｈｚ，Ｊ３，４＝３．５２Ｈｚ），３．３７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５），２．０６−２．０１（９Ｈ，ｍ，Ａｃ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝７００．２３５４  ｍ／ｚ（Ｃ３３Ｈ３８Ｎ３Ｏ１４）
実測値  ７００．２３５７  ｍ／ｚ（＋０．５ｐｐｍ）
実施例２
ベンジル  ２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２）の合成
ナスフラスコ中で、ベンジル  ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２５０ｍｇ，０．３５８ｍｍｏｌ）をチオ酢酸（２．５０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、室温で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：トルエン／酢酸エチル＝１：０−１：３）にて精製し、白色結晶状のベンジル  ２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２２０ｍｇ，０．３０７ｍｍｏｌ，収率８６％）を得た。
分析データは、以下の通りである。
［α］Ｄ−９．０°（ｃ＝１．０，ＣＨＣｌ３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；７．５７−７．５２（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．３７−７．３０（８Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．７５（１Ｈ，ｄ，ＮＨ，ＪＮＨ，２＝７．０３Ｈｚ），５．５７（１Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ），５．２３−５．１９（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−３’，Ｈ−１），５．０１（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．２９Ｈｚ），４．９６−４．９１（２Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ２，Ｈ−１’），４．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３，Ｊ２，３＝１１．５Ｈｚ，Ｊ３，４＝３．５３Ｈｚ），４．５６（１Ｈ，ｄ，ＰｈＣＨ２，Ｊ＝１２．１０Ｈｚ），４．３８−４．３５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−４），４．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６ｂ，Ｊ５，６ｂ＝１．５１Ｈｚ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．８０Ｈｚ），４．０１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５’，Ｊ４’，５’＝９．５４Ｈｚ），３．６９（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），３．５２−３．４６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５），２．０２−２．０１（９Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ），１．９２（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３ＣＯＮＨ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝７１６．２５５４  ｍ／ｚ（Ｃ３５Ｈ４２ＮＯ１５）
実測値  ７１６．２５５４  ｍ／ｚ（＋０．０ｐｐｍ）
実施例３
ベンジル  ２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３）の合成
ナスフラスコ中でベンジル  ２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９６０ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）を酢酸（１２．０ｍｌ）と水（３．００ｍｌ）に溶解させ、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝１０：１）にて精製し、ベンジル  ２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７６０ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ，収率９０％）を得た。次に、得られた化合物（７６０ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）をピリジン（１０．０ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（０．４６７ｍｌ，４．８４ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、乾燥雰囲気下、室温で３時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈し、４％（ｗ／ｖ）硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをセライト濾過により除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：２−１：４）にて精製し、白色結晶状のベンジル  ２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７００ｍｇ，０．９８４ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。
分析データは、以下の通りである。
［α］Ｄ−２０°（ｃ＝１．０，ＣＨＣｌ３）
融点：１７３−１７４℃
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；７．３７−７．２９（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．６４（１Ｈ，ｄ，ＮＨ，ＪＮＨ，２＝７．０３Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝３．０１Ｈｚ），５．２２−５．１４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−３’），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝８．０３Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．５３Ｈｚ），４．８９（１Ｈ，ｄ，ＰｈＣＨ２，Ｊ＝１１．８０Ｈｚ），４．７０−４．６５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１’，Ｈ−３），４．５８（１Ｈ，ｄ，ＰｈＣＨ２，Ｊ＝１１．８０Ｈｚ），４．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６ａ，Ｊ５，６ａ＝６．２８Ｈｚ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．２９Ｈｚ），４．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６ａ，Ｊ５，６ａ＝６．２８Ｈｚ，Ｊ５ａ，６ａ＝１１．２９Ｈｚ），３．９８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５’，Ｊ４’，５’＝９．５４Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｔ，Ｈ−５，Ｊ５，６ａ＝Ｊ５，６ｂ＝６．２８Ｈｚ），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），３．４６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｈ−２，Ｊ１，２＝８．０３Ｈｚ，ＪＮＨ，２＝７．０３Ｈｚ，Ｊ２，３＝９．２８Ｈｚ），２．０９−２．００（１５Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ），１．８９（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３ＣＯＮＨ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝７１２．２４５３  ｍ／ｚ（Ｃ３２Ｈ４２ＮＯ１７）
実測値  ７１２．２４５３  ｍ／ｚ（＋０．０ｐｐｍ）
実施例４
２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−ガラクトピラノシルアセテート（４）の合成
ナスフラスコ中で、ベンジル  ２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７００ｍｇ，０．９８４ｍｍｏｌ）をメタノール（２０．０ｍｌ）に溶解させ、１０％水酸化パラジウム炭素（２００ｍｇ）を加え、室温で水素雰囲気下、３時間撹拌した。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより１０％水酸化パラジウム炭素を除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣を減圧下、一晩乾燥させ、得られた白色非晶状物質をピリジン（１０．０ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（０．３１５ｍｌ，３．２３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、乾燥雰囲気下、室温で３時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、４％（ｗ／ｖ）硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライト濾過により硫酸マグネシウムを除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル）にて精製し、無色非晶状の２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（６８０ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ，α／β＝１／１）を定量的に得た。
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；６．３４−６．３２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１α，ＮＨα），５．８９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１β，Ｊ１，２＝８．５３Ｈｚ），５．７８（１Ｈ，ｄ，ＮＨβ，Ｊ２，ＮＨ＝８．０３Ｈｚ），５．４９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４β，Ｊ３，４＝３．０１Ｈｚ），５．２９−５．１３（７Ｈ，ｍ，Ｈ−４α，Ｈ−３’αβ，Ｈ−４’αβ，Ｈ−２’α），５．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２’β，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ，Ｊ２’，３’＝８．５３Ｈｚ），４．８６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’α，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．７７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’β，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．５５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｈ−２α，Ｊ１，２＝３．５２Ｈｚ，Ｊ２，ＮＨ＝７．０３Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．５３Ｈｚ），４．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３β，Ｊ２，３＝１０．７９Ｈｚ，Ｊ３，４＝３．０１Ｈｚ），４．２４−３．９７（１１Ｈ，ｍ，Ｈ−３α，Ｈ−６αβ，Ｈ−５’αβ，Ｈ−２β，Ｈ−５αβ），３．７６（６Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．１９−２．０２（３６Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ），１．９３−１．９０（６Ｈ，ｄ，ＣＨ３ＣＯＮＨ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６６４．２０８９  ｍ／ｚ（Ｃ２７Ｈ３８ＮＯ１８）
実測値  ６６４．２０９２  ｍ／ｚ（＋０．４ｐｐｍ）
実施例５
２−メチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（５）の合成
二口フラスコ中で、アルゴン雰囲気下、２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（２００ｍｇ，０．３０１ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタンに溶解させ、０℃でＴＭＳＯＴｆ（０．１１０ｍｌ，０．６０３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、０℃でトリエチルアミン（０．２００ｍｌ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：２−２：５）にて精製し、無色非晶状の２−メチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１６１ｍｇ，０．２６８ｍｍｏｌ，収率８９％）を得た。
分析データは、以下の通りである。
［α］Ｄ＋３４°（ｃ＝１．０，ＣＨＣｌ３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝６．５３Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝３．５１Ｈｚ），５．３０−５．２０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．０３Ｈｚ），４．１８−４．１２（３Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−５），４．０８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５’，Ｊ４’，５’＝９．５３Ｈｚ），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３，Ｊ２，３＝６．５３Ｈｚ，Ｊ３，４＝３．５１Ｈｚ），３．８３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２，Ｊ１，２＝Ｊ２，３＝６．５３Ｈｚ），３．７６（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．０８−２．０２（１８Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ，ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６０４．１８７７  ｍ／ｚ（Ｃ２５Ｈ３４ＮＯ１６）
実測値  ６０４．１８７９  ｍ／ｚ（＋０．３ｐｐｍ）
実施例６
２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（６）の合成
二口フラスコ中で、アルゴン雰囲気下、２−メチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（２４０ｍｇ，０．３９８ｍｍｏｌ）をメタノール（１．００ｍｌ）に溶解させ、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５００ｍｌ，０．０７９５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、凍結乾燥させた。これを炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ１０．６，３．９８ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間撹拌し、これをそのまま凍結乾燥させることにより、２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１６０ｍｇ，純度８２％）を得た。
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，Ａｃｅｔｏｎｅ）：δ（ｐｐｍ）；５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝７．０３Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．００（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝３．５２Ｈｚ），３．８０−３．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５），３．６４−３．５２（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−６，Ｈ−５’），３．３４−３．３２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−３’），３．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ，Ｊ２’，３’＝９．０３Ｈｚ），１．８４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋４０２．１０１２  ｍ／ｚ（Ｃ１４Ｈ２０ＮＮａＯ１１）
実測値  ４０２．１０１８  ｍ／ｚ（＋１．４ｐｐｍ）
実施例７
酵素触媒重合によるコンドロイチンの合成
基質モノマーである２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（５．００ｍｇ，１２．５μｍｏｌ）をリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５，１２５μｌ）に溶解させ、羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製，Ｌｏｔ  Ｎｏ．６８３０Ｂ，２１６０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，以降、Ｈ−ＯＴＨと記す）を０．５００ｍｇ加え、３０℃で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液を９０℃の湯浴中にて３分間加温することにより酵素を失活させ、次いで過剰量のＴＨＦを加え、生じた沈殿を遠心分離することにより回収した。得られた沈殿を再び純水に溶解させ、重合生成物の水溶液を得た。重合生成物の基質モノマーに対する収率と分子量は、得られた水溶液のＧＰＣ測定結果より、収率＝５０％，Ｍｎ＝２１００，Ｍｗ＝２５００であった。なお、ＧＰＣ測定において、分子量は、分子量マーカーとしてヒアルロン酸ナトリウム塩（Ｍｎ＝８００，２０００，４０００）を用いて作成した検量線を用いて算出し、収率は、天然のコンドロイチン硫酸を脱硫酸することにより調製されたコンドロイチンナトリウム塩（生化学工業社製，Ｍｎ＝４０００，Ｍｗ＝５０００）を用いて作成した検量線を用いて算出された濃度より求めた。ＧＰＣ測定条件を以下に示す。
ＧＰＣ条件
検出器    ：示差検出計
カラム    ：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｏｈｐａｋ  ＳＢ−８０３ＨＱ
カラム温度：４０℃
移動相    ：０．１Ｍ  硝酸ナトリウム
流量      ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
上記の水溶液から、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０サイズ排除クロマトグラフィーを用いて生成コンドロイチンを精製した。得られたコンドロイチンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図２に、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図３及び図４（図３の糖骨格部分の拡大図）に示す。これらのスペクトルは天然由来のコンドロイチンのスペクトルと一致した。
ＮＭＲスペクトルのピークの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，Ａｃｅｔｏｎｅ）：δ（ｐｐｍ）；４．３１（２Ｈ，ｂｓ，Ｈ−１，Ｈ−１’），３．９２（１Ｈ，ｂｓ，Ｈ−４），３．８０（１Ｈ，ｂｔ，Ｈ−２），３．６３−３．５０（６Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５’，Ｈ−６，Ｈ−５），３．４１（１Ｈ，ｂｔ，Ｈ−３’），３．１７（１Ｈ，ｂｔ，Ｈ−２’），１．８２（１Ｈ，ｓ，ＣＨ３ＣＯ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，Ａｃｅｔｏｎｅ）：δ（ｐｐｍ）；１７４．５５（Ｃ−６’），１７３．９１（ＣＨ３ＣＯ），１０３．９０（Ｃ−１’），１００．４３（Ｃ−１），７９．８７（Ｃ−３），７９．２６（Ｃ−４’），７５．８２（Ｃ−５’），７４．５３（Ｃ−５），７３．２６（Ｃ−３’），７１．９８（Ｃ−２’），６７．３０（Ｃ−４），６０．６３（Ｃ−６），５０．５６（Ｃ−２），２２．０４（ＣＨ３ＣＯ）
実施例８
種々の酵素を用いたコンドロイチンの合成
重合反応における触媒酵素として、羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製，Ｌｏｔ  Ｎｏ．９３０３Ｂ，５６０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，以降、ＯＴＨと記す），牛精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製，Ｌｏｔ  Ｎｏ．３０Ｋ７０４９，３３０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，以降、ＢＴＨと記す），Ｈ−ＯＴＨ，又は牛精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製，Ｌｏｔ  Ｎｏ．３８Ｈ７０２６，１０１０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，以降、Ｈ−ＢＴＨと記す）を用い、反応時間を２３時間又は４０時間とした以外は実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表１に示す。いずれのヒアルロニダーゼを用いてもコンドロイチンの合成が可能であった。
2003070960.tif 000004
実施例９
コンドロイチン合成における反応ｐＨの影響
重合反応において、触媒酵素として３種のヒアルロニダーゼ（ＯＴＨ，ＢＴＨ又はＨ−ＯＴＨ）を用い、表２中に示す反応時間とし、表２中に示すｐＨのリン酸緩衝液を用いることにより反応ｐＨを変更した以外は実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表２に示す。また、ヒアルロニダーゼとしてＯＴＨ又はＢＴＨを用いたｐＨ７．０と８．０の反応液における基質モノマーの残存率の経時変化を表３，表４及び図５に示す。この基質モノマーの残存率は、一定時間毎に反応液から３０μｌを採取し、以下のＨＰＬＣ条件で保持時間７．３〜７．４分に現われるピークの面積比から算出した。
ＨＰＬＣ条件
検出      ：ＵＶ  ２２０ｎｍ
カラム    ：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ
カラム温度：３０℃
移動相    ：リン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．０）３０％  ＋  アセトニトリル  ７０％
流量      ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
表３，表４及び図５に示す結果から、ＯＴＨ又はＢＴＨを添加した系では添加していない系と比較して有意にモノマー消費が促進されていることが明らかとなり、コンドロシンオキサゾリン誘導体が両酵素により認識され、オキサゾリン環の開環反応が起こっていることが明らかとなった。
2003070960.tif 000005
2003070960.tif 000006
2003070960.tif 000007
実施例１０
コンドロイチン合成における酵素濃度の影響
重合反応において、触媒酵素であるＨ−ＯＴＨの添加量と反応時間を表５に記載の条件に変更した以外は、実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表５に示す。
2003070960.tif 000008
実施例１１
コンドロイチン合成における反応温度の影響
重合反応において、反応温度及び反応時間を表６に記載の条件に変更した以外は、実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表６に示す。
2003070960.tif 000009
実施例１２
コンドロイチン合成における基質モノマー濃度の影響
重合反応において、基質モノマーである２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］−［２，１，ｄ］−２−オキサゾリンの添加量及び反応時間を表７に記載の条件に変更した以外は、実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表７に示す。
2003070960.tif 000010
実施例１３
ベンジル４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）の合成
実施例１で得た、ベンジル  ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１）（５５５ｍｇ，０．７９３ｍｍｏｌ）を８０％酢酸水溶液（１５ｍｌ）に溶解させ、８０℃で１時間反応させる事により、４，６−Ｏ−ベンジリデン基を脱保護した。続いて、反応溶液を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：３）にて精製し、ベンジル  ２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４５３ｍｇ，０．７４１ｍｍｏｌ，収率９３％）を得た。次に、得られた化合物（４５３ｍｇ，０．７４１ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、０℃にて無水酢酸（０．４３１ｍｌ，４．４４ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で４時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈し、４％（ｗ／ｖ）硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをセライトろ過により除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）にて精製し、白色結晶状のベンジル  ４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）（４７８ｍｇ，０．６８７ｍｍｏｌ，収率９３％）を得た。分析データは以下の通りである。
［α］Ｄ＋０．１２°（ｃ＝１．０，ＣＨＣｌ３）
ｍｐ  １４４−１４５℃
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）；７．３９−７．３１（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．３３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝３．０１Ｈｚ），５．２３−５．２１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−３’），４．９９−４．９３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’，ＰｈＣＨ２），４．８０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．７０（１Ｈ，ｄ，ＰｈＣＨ２，Ｊ＝１２．０５Ｈｚ），４．２９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝８．０３Ｈｚ），４．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６ａ，Ｊ５，６ａ＝５．５２Ｈｚ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．５４Ｈｚ），４．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６ａ，Ｊ５，６ａ＝７．０２Ｈｚ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．５４Ｈｚ），３．９８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５’，Ｊ４’，５’＝１０．０４Ｈｚ），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），３．７３−３．６４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−２），３．５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３，Ｊ２，３＝１０．５４Ｈｚ，Ｊ３，４＝３．０１Ｈｚ），２．１１−２．０１（１５Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６９６．２２５２  ｍ／ｚ（Ｃ３０Ｈ３８Ｎ３Ｏ１６）
実測値  ６９６．２２４９  ｍ／ｚ（−０．４ｐｐｍ）
実施例１４
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−プロパンアミド−Ｄ−ガラクトピラノシルアセテート（８）の合成
ベンジル  ４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）（１００ｍｇ，０．１４４ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍｌ）に溶解させ、１０％水酸化パラジウム炭素（５０ｍｇ）を加え、室温で水素雰囲気下、４時間反応させる事によりアジド基をアミノ基へ変換し、同時にベンジル基の脱保護を行った。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより１０％水酸化パラジウム炭素を除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（１０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、０℃にてトリエチルアミン（１ｍｌ）、続いて無水プロピオン酸（０．１８０ｍｌ，１．４４ｍｍｏｌ）を加え、その後室温で２時間反応させた。反応終了後、ピリジン（１ｍｌ）を加え、反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を減圧下、一晩乾燥させた。乾燥後、得られた白色非晶状物質をピリジン（１０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、０℃で無水酢酸（０．０８４ｍｌ，０．８６３ｍｍｏｌ）を滴下し、その後室温で３時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、４％（ｗ／ｖ）硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：４）にて精製し、無色非晶状の４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−プロパンアミド−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（８）（３７．０ｍｇ，０．０５４６ｍｍｏｌ，収率３８％，α／β＝５／１）を得た。分析データは以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）；６．３４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１α，Ｊ１，２＝３．５１Ｈｚ），６．１６（１Ｈ，ｄ，ＮＨα，Ｊ１，２＝８．０３Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１β，Ｊ１，２＝８．５２Ｈｚ），５．６２（１Ｈ，ｄ，ＮＨβ，Ｊ２，ＮＨ＝８．５２Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４α），５．２５−５．１３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３’α，Ｈ−４’α，Ｈ−２’α），４．８５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’α，Ｊ１’，２’＝８．０４Ｈｚ），４．５７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｈ−２α，Ｊ１，２＝３．５１Ｈｚ，Ｊ２，ＮＨ＝８．０３Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．５３Ｈｚ），４．２３−４．１９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３α，Ｈ−６ａα），４．１１−４．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’α，Ｈ−６ｂα），４．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−５α，Ｊ５，６ａ＝６．５３Ｈｚ，Ｊ５，６ｂ＝１１．５４Ｈｚ），３．７６（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．１９−２．０１（２０Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＮＨ），１．０９（３Ｈ，ｔ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＮＨ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６７８．２２４５  ｍ／ｚ（Ｃ２８Ｈ４０ＮＯ１８）
実測値  ６７８．２２４８  ｍ／ｚ（＋０．４ｐｐｍ）
実施例１５
２−エチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１１）の合成
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−プロパンアミド−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（８）（１００ｍｇ，０．１４８ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタンに溶解させ、アルゴン雰囲気下、０℃でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ；０．０４０４ｍｌ，０．２２１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１８時間撹拌した。反応終了後、０℃でトリエチルアミン（０．１ｍｌ）を加え、室温で３０分撹拌した後、反応溶液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：２−２：５，トリエチルアミン０．５％）にて精製し、無色非晶状の２−エチル［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１１）（７５．０ｍｇ，０．１２１ｍｍｏｌ，収率８２％）を得た。分析データは以下の通りである。
［α］Ｄ＋２０°（ｃ＝０．７５，ＣＨＣｌ３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）；５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝７．０２Ｈｚ），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝３．５１Ｈｚ，Ｊ４，５＝２．００Ｈｚ），５．３１−５．２０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝７．５２Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝７．５２Ｈｚ，Ｊ２’，３’＝８．５３Ｈｚ），４．１６−４．１１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−５），４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５’，Ｊ４’，５’＝９．５３Ｈｚ），３．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３，Ｊ２，３＝７．０２Ｈｚ，Ｊ３，４＝３．５１Ｈｚ），３．８３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２，Ｊ１，２＝Ｊ２，３＝７．０２Ｈｚ），３．７６（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．３２（２Ｈ，ｑ，ＣＨ３ＣＨ２  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ），２．０８−２．０２（１５Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ），１．１８（３Ｈ，ｔ，ＣＨ３ＣＨ２  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６１８．２０３４  ｍ／ｚ（Ｃ２６Ｈ３６ＮＯ１６）
実測値  ６１８．２０３５  ｍ／ｚ（＋０．１ｐｐｍ）
実施例１６
２−エチル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１４）
２−エチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１１）（７５ｍｇ，０．１２１ｍｍｏｌ）をメタノール（１．２１ｍｌ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、０℃でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２．３４ｍｇ，０．０１２１ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分、その後室温で３０分撹拌することにより全てのＯ−アセチル基を脱保護した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた。続いて化合物を炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ１０．６，１．２１ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間撹拌することによりメチルエステルを脱保護した。反応終了後、反応液をそのまま凍結乾燥させ、２−エチル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１４）（５６ｍｇ，純度９３％）を得た。分析データは以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ａｃｅｔｏｎｅ）δ（ｐｐｍ）；５．９１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝７．５３Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．００（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４），３．７８−３．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５），３．６３−３．５２（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−６，Ｈ−５’），３．３４−３．３２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−３’），３．２２（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．０３Ｈｚ），２．１６（２Ｈ，ｑ，ＣＨ３ＣＨ２  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｔ，ＣＨ３ＣＨ２  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１６．１１６９  ｍ／ｚ（Ｃ１５Ｈ２３ＮＯ１１Ｎａ）
実測値  ４１６．１１６１  ｍ／ｚ（−１．８ｐｐｍ）
実施例１７
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−（２−メチルプロパンアミド）−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（９）の合成
実施例１３で得たベンジル  ４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）（３１５ｍｇ，０．４５３ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍｌ）に溶解させ、１０％水酸化パラジウム炭素（１５０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で３．５時間反応させる事によりアジド基をアミノ基へ変換し、同時にベンジル基の脱保護を行った。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより１０％水酸化パラジウム炭素を除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（３０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、０℃でトリエチルアミン（１ｍｌ）、続いて無水イソ酪酸（０．２４０ｍｌ，１．４４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、ピリジン（３ｍｌ）を加え、反応溶液を減圧乾固させた。乾燥後、得られた白色非晶状物質をピリジン（３０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、０℃で無水酢酸（０．２６５ｍｌ，２．７２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で６時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、４％（ｗ／ｖ）硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：２−１：３）にて精製し、無色非晶状の４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−（２−メチルプロパンアミド）−Ｄ−ガラクトピラノシルアセテート（９）（１２９ｍｇ，０．１８７ｍｍｏｌ，収率４１％，α／β＝２０／３）を得た。分析データは以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）；６．３５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１α，Ｊ１，２＝３．５１Ｈｚ），６．１０（１Ｈ，ｄ，ＮＨα，Ｊ１，２＝７．５３Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１β，Ｊ１，２＝８．５４Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４α，Ｊ３，４＝２．００Ｈｚ），５．２６−５．１３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３’α，Ｈ−４’α，Ｈ−２’α），４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’α，Ｊ１’，２’＝８．５３Ｈｚ），４．５５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｈ−２α，Ｊ１，２＝３．５１Ｈｚ，Ｊ２，ＮＨ＝７．５３Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．５３Ｈｚ），４．２５−４．２０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３α，Ｈ−６ａα），４．１１−４．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’α，Ｈ−６ｂα），４．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−５ａ，Ｊ５，６ａ＝６．５２Ｈｚ，Ｊ５，６ｂ＝１１．０４Ｈｚ），３．７６（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．２７（１Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＯＮＨ），２．１９−１．９５（１８Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ），１．１０−１．０４（６Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＯＮＨ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６９２．２４０２  ｍ／ｚ（Ｃ２９Ｈ４２ＮＯ１８）
実測値  ６９２．２４０２  ｍ／ｚ（＋０．１ｐｐｍ）
実施例１８
２−イソプロピル［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１２）の合成
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−（２−メチルプロパンアミド）−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（９）（１１８ｍｇ，０．１７１ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタンに溶解させ、アルゴン雰囲気下、０℃でＴＭＳＯＴｆ（０．０４７ｍｌ，０．２５６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、０℃でトリエチルアミン（０．１ｍｌ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：１，トリエチルアミン  ０．５％）にて精製し、無色非晶状の２−イソプロピル［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１２）（８２．０ｍｇ，０．１３０ｍｍｏｌ，収率７６％）を得た。分析データは以下の通りである。
［α］Ｄ＋１７°（ｃ＝０．８２，ＣＨＣｌ３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）；５．９１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝７．０３Ｈｚ），５．３６（１Ｈ，ｔ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝Ｊ４，５＝２．５１Ｈｚ），５．３１−５．１９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝８．５３Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．５３Ｈｚ），４．１５−４．０９（３Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−５），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５’，Ｊ４’，５’＝９．５４Ｈｚ），３．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３，Ｊ２，３＝７．０３Ｈｚ，Ｊ３，４＝２．５１Ｈｚ），３．８３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２，Ｊ１，２＝Ｊ２，３＝７．０３Ｈｚ），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．５８（１Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＯＮＨ），２．０８−２．０２（１５Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ），１．２０−１．１８（６Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＯＮＨ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６３２．２１９０  ｍ／ｚ（Ｃ２７Ｈ３８ＮＯ１６）
実測値  ６３２．２１８６  ｍ／ｚ（−０．７ｐｐｍ）
実施例１９
２−イソプロピル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１５）の合成
２−イソプロピル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１２）（８２．０ｍｇ，０．１３０ｍｍｏｌ）をメタノール（１．２９ｍｌ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、０℃でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２．５ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間、室温で１時間撹拌後、さらにナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２．５ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させる事により全てのＯ−アセチル基を脱保護した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた。乾燥後、化合物を炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ１０．６，１．３ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間攪拌する事によりメチルエステルを脱保護した。反応終了後、反応液をそのまま凍結乾燥させ、２−イソプロピル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１５）（６５ｍｇ，純度８３％）を得た。分析データは以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ａｃｅｔｏｎｅ）δ（ｐｐｍ）；５．９１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝７．０３Ｈｚ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．０１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝２．０１Ｈｚ），３．７７−３．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５），３．６５−３．５２（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−６，Ｈ−５’），３．３６−３．３０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−３’），３．２３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．０３Ｈｚ），２．４５（１Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＯＮＨ），１．０１−０．９７（６Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＯＮＨ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３０．１３２５  ｍ／ｚ（Ｃ１６Ｈ２５ＮＯ１１Ｎａ）
実測値  ４３０．１３２３  ｍ／ｚ（−０．５ｐｐｍ）
実施例２０
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−ベンズアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（１０）の合成
実施例１３で得たベンジル  ４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）（３００ｍｇ，０．４３１ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍｌ）に溶解させ、１０％水酸化パラジウム炭素（１５０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で３．５時間反応させる事によりアジド基をアミノ基へ変換し、同時にベンジル基の脱保護を行った。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより１０％水酸化パラジウム炭素を除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（３０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、０℃でトリエチルアミン（１ｍｌ）と塩化ベンゾイル（０．１ｍｌ，０．８６３ｍｍｏｌ）を加え、１時間反応させた。反応終了後、ピリジン（３ｍｌ）を加え、反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を減圧下、一晩乾燥させた。乾燥後、得られた白色非晶状物質をピリジン（３０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、０℃で無水酢酸（０．２５２ｍｌ，２．５９ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、４％（ｗ／ｖ）硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１：１−１：２）にて精製し、無色非晶状の４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−ベンズアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−ガラクトピラノシルアセテート（１０）（１８０ｍｇ，０．２４８ｍｍｏｌ，収率５８％，α／β＝５／２）を得た。分析データは以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）；７．７２−７．３７（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．５５（１Ｈ，ｄ，ＮＨα，Ｊ２，ＮＨ＝７．５３Ｈｚ），６．４４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１α，Ｊ１，２＝３．０１Ｈｚ），６．１６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１β，Ｊ１，２＝９．０４Ｈｚ），５．３７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４α，Ｊ３，４＝２．００Ｈｚ），５．２３−５．１０（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３’α，Ｈ−４’α，Ｈ−２’α），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’α，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），４．８３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｈ−２α，Ｊ１，２＝３．０１Ｈｚ，Ｊ２，ＮＨ＝７．５３Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．５４Ｈｚ），４．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３α，Ｊ２，３＝８．５４Ｈｚ，Ｊ３，４＝２．００Ｈｚ），４．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６ａα，Ｊ５，６ａ＝５．５２Ｈｚ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．０４Ｈｚ），４．１４（１Ｈ，ｄｄ，，Ｈ−６ｂα，Ｊ５，６ｂ＝７．０３Ｈｚ，Ｊ６ａ，６ｂ１１．０４Ｈｚ），４．０６−４．００（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ−５’α，Ｈ−５α），３．６２（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．２０−１．９１（１８Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝７２６．２２４５  ｍ／ｚ（Ｃ３２Ｈ４０ＮＯ１８）
実測値  ７２６．２２４８  ｍ／ｚ（＋０．３ｐｐｍ）
実施例２１
２−フェニル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１３）の合成
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−ベンズアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−ガラクトピラノシル  アセテート（１０）（１８０ｍｇ，０．２４８ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（９ｍｌ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、０℃でＴＭＳＯＴｆ（０．０６８０ｍｌ，０．３７２ｍｍｏｌ）を滴下し、その後室温で１２時間撹拌した。反応終了後、０℃でトリエチルアミン（０．２ｍｌ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：トルエン／酢酸エチル＝３：１−２：１，トリエチルアミン  ０．５％）にて精製し、無色非晶状の２−フェニル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１３）（１０５ｍｇ，０．１５８ｍｍｏｌ，収率６４％）を得た。分析データは以下の通りである。
［α］Ｄ＋３０°（ｃ＝１．０，ＣＨＣｌ３）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）；７．９６−７．４３（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝６．０２Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４），５．３３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−３’，Ｊ２’，３’＝Ｊ３’，４’＝８．２９Ｈｚ），５．２７−５．１９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，１Ｈ−１’），５．０４（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．２９Ｈｚ），４．１７（３Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−５），４．１１−４．０２（３Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−２，Ｈ−３），３．７２（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．１０−２．０４（１５Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６６６．２０３４  ｍ／ｚ（Ｃ３０Ｈ３６ＮＯ１６）
実測値  ６６６．２０４３  ｍ／ｚ（＋１．３ｐｐｍ）
実施例２２
２−フェニル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１６）の合成
２−フェニル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル  ２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１３）（１０５ｍｇ，０．１５８ｍｍｏｌ）をメタノール（１．５８ｍｌ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、０℃でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（３．０４ｍｇ，０．０１５８ｍｍｏｌ）を加え、０℃で０．５時間、室温で１時間撹拌後、さらにナトリウムメトキシドのメタノール溶液（３．０４ｍｇ，０．０１５８ｍｍｏｌ）を加え、室温で０．５時間撹拌することにより全てのＯ−アセチル基を脱保護した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた。乾燥後、化合物を炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ１０．６，１．５８ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間撹拌することによりメチルエステルを脱保護した。反応終了後、反応液を凍結乾燥させ、２−フェニル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１６）（６０ｍｇ，純度８７％）を得た。分析データは以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ａｃｅｔｏｎｅ）δ（ｐｐｍ）；７．７７−７．３４（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．１３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝７．０３Ｈｚ），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝７．５３Ｈｚ），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４，Ｊ３，４＝２．５１Ｈｚ），４．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２，Ｊ１，２＝７．０３Ｈｚ，Ｊ２，３＝７．５３Ｈｚ），３．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−５，Ｊ５，６ａ＝７．５３Ｈｚ，Ｊ５，６ｂ＝１１．５４Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３，Ｊ２，３＝７．５３，Ｊ３，４＝７．５３Ｈｚ），３．６８−３．５２（３Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ，Ｈ−５’），３．４５−３．３２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−３’），３．２７（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝７．５３Ｈｚ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ：計算値  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６４．１１６９  ｍ／ｚ（Ｃ１９Ｈ２３ＮＯ１１Ｎａ）
実測値  ４６４．１１７３  ｍ／ｚ（＋０．９ｐｐｍ）
実施例２３
酵素触媒重合によるコンドロイチン誘導体の合成
基質モノマーである２−エチル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１４）（５．００ｍｇ，１２．０μｍｏｌ）、２−イソプロピル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１５）（５．００ｍｇ，１１．６μｍｏｌ）、２−フェニル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１６）（５．００ｍｇ，１０．８μｍｏｌ）、をそれぞれ１２０μｌ、１１６μｌ、１０８μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、それぞれに羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（Ｈ−ＯＴＨ；２５０２ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．８８３８Ｅ）を０．５ｍｇ加え、３０℃で反応を行った。表８、表９、表１０中に示す各時間において反応液から３．０μｌを採取し、実施例９と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、保持時間６分に現れるピークの面積比からモノマー残存率を求めた。その経時変化を酵素非添加の場合と比較して表８、表９、表１０及び図７、図８、図９に示す。反応終了後、反応液を９０℃の湯浴中にて３分間加温することにより酵素を失活させ、次いで過剰量のＴＨＦを加え、生じた沈殿を遠心分離することにより回収した。得られた沈殿を再び純水に溶解させ、重合生成物の水溶液を得た。得られた水溶液のＧＰＣ測定により求めた重合生成物の基質モノマーに対する収率と分子量を表１１に示す。なお、ＧＰＣ測定及び検量線の作成は実施例７と同じ条件にて行った。基質モノマー（１４）及び（１５）を用いた反応液から得られた重合生成物の水溶液から、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０サイズ排除クロマトグラフィーを用いて重合生成物を精製した。基質モノマー（１４）から得られた生成物の１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１０及び１１に示す。これらのスペクトルより、この生成物は、図６における（１７）の構造（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ３）有するコンドロイチン誘導体であることが明らかとなった。
ＮＭＲスペクトルの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ａｃｅｔｏｎｅ）δ（ｐｐｍ）；４．３８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１，Ｊ１，２＝８．５３Ｈｚ），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），３．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４），３．８８（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２，Ｊ１，２＝８．５３Ｈｚ），３．６９−３．５２（６Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４’，Ｈ−５’，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ，Ｈ−５），３．４３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−３’，Ｊ２’，３’＝８．０３Ｈｚ），３．２２（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’，Ｊ１’，２’＝８．０３Ｈｚ），２．１６（２Ｈ，ｑ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ａｃｅｔｏｎｅ）δ（ｐｐｍ）；１７９．５４（Ｃ−６’），１７５．３５（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ），１０５．０２（Ｃ−１’），１０１．４１（Ｃ−１），８０．８６（Ｃ−３），８０．０６（Ｃ−４’），７７．１７（Ｃ−５’），７５．６９（Ｃ−５），７４．３８（Ｃ−３’），７３．２６（Ｃ−２’），６８．６０（Ｃ−４），６１．８５（Ｃ−６），５１．６０（Ｃ−２），３０．１７（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ），９．９６（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ）
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実施例２４
コンドロイチン誘導体合成反応の経時変化
基質モノマーである２−エチル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソジウム  β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−ガラクトピラノ］［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（１４）（１５．０ｍｇ，３６．０μｍｏｌ）を３６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（Ｈ−ＯＴＨ；２５０２ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．８８３８Ｅ）を１．５ｍｇ加え、３０℃で反応を行った。表１２中に示す各時間に反応液２０μｌを採取し、９０℃の湯浴中にて３分間加温することにより酵素を失活させたのち、実施例２３と同じ条件にてＨＰＬＣ，ＧＰＣ測定を行い、基質モノマーの残存率，重合生成物の基質モノマーに対する収率及び重合生成物の分子量を求めた。結果を表１２及び図１２に示す。
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産業上の利用可能性
本発明の酵素化学的コンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法は、従来より工業的に用いられてきた生体材料からの抽出法に比較して簡便な合成法であり、且つ、反応液からの生成物の単離精製が容易なコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法を提供するものである。採取されたコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は化粧品、医薬品および医用材料等の材料として工業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１：  基質モノマーの合成スキームを示す。
図２：  生成コンドロイチンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図３：  生成コンドロイチンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図４：  生成コンドロイチンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（図３の糖骨格部
分の拡大図）を示す。
図５：  反応液中の基質モノマー残存率の経時変化を示す。
図６：  基質モノマーの合成及び酵素重合反応スキームを示す。
図７：  基質モノマー（１４）残存率の経時変化を示す。
図８：  基質モノマー（１５）残存率の経時変化を示す。
図９：  基質モノマー（１６）残存率の経時変化を示す。
図１０：コンドロイチン誘導体（１７）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図１１：コンドロイチン誘導体（１７）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図１２：コンドロイチン誘導体合成反応の経時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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