(57)【要約】本発明は、イソマルトース及びイソマルチトールの新規な製造方法とそれらの用途を提供することを課題とし、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、特定の微生物由来のα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させてイソマルトースを製造する方法、この製造方法により得られるイソマルトースを用いてイソマルチトールを製造する方法、これらの製造方法により得られるイソマルトース及び／又はイソマルチトール含有混合糖質、及びそれらの用途を確立することにより、前記課題を解決するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）及び／又はアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）由来のα−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非在下で、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）、及びアルスロバクター  ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）由来の一種又は二種以上のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質、及び／又は、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法。
【請求項２】
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させるに際し、α−イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及び澱粉枝切酵素から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のイソマルトースの製造方法。
【請求項３】
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後に、α−イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及び澱粉枝切酵素から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のイソマルトースの製造方法。
【請求項４】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質である請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載のイソマルトースの製造方法。
【請求項５】
サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）、α−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース及びパノースから選ばれる２種以上の混合糖質に、イソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法。
【請求項６】
サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）、α−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース及びパノースが、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に酵素を作用させて得られたものであることを特徴とする請求の範囲第５項記載のイソマルトースの製造方法。
【請求項７】
α−イソマルトシル転移酵素が、下記の理化学的性質を有する酵素である請求の範囲第１項乃至第６項記載のイソマルトースの製造方法。
（１）作用
非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）の構造を有する環状四糖を生成する
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約８２，０００乃至１３２，０００ダルトン
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約５．０乃至６．１
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、約４５乃至５０℃
（５）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応で、ｐＨ約５．５乃至６．０
（６）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、約４０℃まで安定
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約４．０乃至９．０
【請求項８】
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が、下記の理化学的性質を有する酵素である請求の範囲第１項乃至第６項記載のイソマルトースの製造方法。
（１）作用
非還元性末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元性末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約１１７，０００乃至１６０，０００ダルトン
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約４．７乃至５．７
（４）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、約４０乃至４５℃
１ｍＭＣａ２＋存在下では、約４５乃至５０℃
（５）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至６．５
（６）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、約３５乃至４０℃まで安定
１ｍＭＣａ２＋存在下では、約４０乃至４５℃まで安定
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約４．５乃至１０．０
【請求項９】
イソマルトースを採取する工程に於いて、アルカリ金属形及び／又はアルカリ土類金属形強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８項記載のイソマルトースの製造方法。
【請求項１０】
得られるイソマルトースが、固形物当たりイソマルトースを４０％（ｗ／ｗ）以上含有するイソマルトース高含有物である請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得ることのできる、固形物当たりイソマルトースを４０乃至９９％（ｗ／ｗ）含有すると共に、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、澱粉部分加水分解物、α−イソマルトシルグルコ糖質、及びα−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコースから選ばれる１種又は２種以上の糖質を１乃至６０％（ｗ／ｗ）含有することを特徴とするイソマルトース含有混合糖質。
【請求項１２】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトース含有混合糖質を含む飲食物又は健康食品。
【請求項１３】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得ることのできるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトース含有混合糖質を含む飼料又は餌料。
【請求項１４】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトース含有混合糖質を含む化粧品。
【請求項１５】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトース含有混合糖質を含む医薬品。
【請求項１６】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトース含有混合糖質を用いることを特徴とする飲食物又は健康食品の製造方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトースを含有混合糖質用いることを特徴とする飼料又は餌料の製造方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトース含有混合糖質を用いることを特徴とする化粧品の製造方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第１１項記載のイソマルトース含有混合糖質を用いることを特徴とする医薬品の製造方法。
【請求項２０】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質及び／又はサイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、これをそのまま又はイソマルトースを採取した後に水素添加してイソマルチトールを生成させ、この生成したイソマルチトールを採取することを特徴とするイソマルチトールの製造方法。
【請求項２１】
α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させるに際し、α−イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、及び澱粉枝切酵素から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求の範囲第２０項記載のイソマルチトールの製造方法。
【請求項２２】
α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後に、α−イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、及び澱粉枝切酵素から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求の範囲第２０項記載のイソマルチトールの製造方法。
【請求項２３】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質である請求の範囲第２０項、第２１項又は第２２項記載のイソマルチトールの製造方法。
【請求項２４】
サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）、α−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース及びパノースから選ばれる２種以上の混合糖質に、イソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、これをそのまま又はイソマルトースを採取した後に水素添加してイソマルチトールを生成させ、この生成したイソマルチトールを採取することを特徴とするイソマルチトールの製造方法。
【請求項２５】
サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）、α−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース又はパノースが、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と共に、α−イソマルトシル転移酵素、イソマルトース遊離酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、及び澱粉枝切酵素から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させて得られたものであることを特徴とする請求の範囲第２４項記載のイソマルチトールの製造方法。
【請求項２６】
α−イソマルトシル転移酵素が、下記の理化学的性質を有する酵素である請求の範囲第２０項乃至第２３項及び第２５項のいずれかに記載のイソマルチトールの製造方法。
（１）作用
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）の構造を有する環状四糖を生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約８２，０００乃至約１３６，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．７乃至約８．３。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、約４５乃至約５０℃の範囲に至適温度を有する。
（５）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下に於いて、ｐＨ約５．５乃至約６．５の範囲内に至適ｐＨを有する。
（６）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、約４５℃以下に温度安定域を有する。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ約３．６乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
【請求項２７】
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が、下記の理化学的性質を有する酵素である請求の範囲第２０項乃至第２３項及び第２５項のいずれかに記載のイソマルチトールの製造方法。
（１）作用
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度が３以上の糖質を生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃至７．８の範囲内に等電点を有する。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、約４０乃至約５０℃の範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至約５５℃の範囲内に至適温度を有する。
（５）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至８．４の範囲内に至適ｐＨを有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応で、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応で１ｍＭＣａ２＋存在下、６５℃に至適温度を有する。
（６）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、約４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約５０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、約５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ約４．５乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ領域を有する。
【請求項２８】
イソマルトースを採取する工程及び／又はイソマルチトールを採取する工程に於いて、アルカリ金属形及び／又はアルカリ土類金属形強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを用い、更に、必要に応じて、粉末化工程又は結晶化工程を含むことを特徴とする請求の範囲第２０項乃至第２７項のいずれかに記載のイソマルチトールの製造方法。
【請求項２９】
イソマルチトールを採取する工程に於いて、イソマルチトールをシラップ状、粉末状又は結晶状で採取することを特徴とする請求の範囲第２０項乃至第２８項のいずれかに記載のイソマルチトールの製造方法。
【請求項３０】
得られるイソマルチトールが、固形物当たりイソマルチトールを４０％（ｗ／ｗ）以上含有するイソマルチトール含有物である請求項２０乃至２９のいずれかに記載のイソマルチトールの製造方法。
【請求項３１】
イソマルチトールと共に、イソマルトース、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）、α−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース、及びα−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−ソルビトールから選ばれる１種又は２種以上の糖質を含むことを特徴とするイソマルチトール含有混合糖質。
【請求項３２】
ソルビトール、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、澱粉部分加水分解物に由来する糖アルコール、及びα−イソマルトシルグルコ糖質に由来する糖アルコールから選ばれる１種又は２種以上の糖質を更に含むことを特徴とする請求の範囲第３１項記載のイソマルチトール含有混合糖質。
【請求項３３】
固形物当たりイソマルチトールを４０乃至９９％（ｗ／ｗ）含有すると共に、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）、α−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース、α−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−ソルビトール、ソルビトール、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、澱粉部分加水分解物に由来する糖アルコール、及びα−イソマルトシルグルコ糖質に由来する糖アルコールから選ばれる１種又は２種以上の糖質を１乃至６０％（ｗ／ｗ）含有することを特徴とする請求の範囲第３１項又は第３２項記載のイソマルチトール含有混合糖質。
【請求項３４】
請求の範囲第２０項乃至第３０項のいずれかに記載のイソマルチトールの製造方法により得ることのできる、請求項３０、３１又は３２記載イソマルチトール含有混合糖質。
【請求項３５】
請求の範囲第３１項乃至第３４項のいずれかに記載のイソマルチトール含有混合糖質含む組成物。
【請求項３６】
組成物が、飲食物、健康食品、飼料、餌料、化粧品又は医薬品である請求の範囲第３５項記載の組成物。
【請求項３７】
請求の範囲第３１項乃至第３４項のいずれかに記載のイソマルチトール含有混合糖質を含有せしめることを特徴とする組成物の製造方法。
【請求項３８】
組成物が、飲食物、健康食品、飼料、餌料、化粧品又は医薬品である請求の範囲第３７項記載の組成物の製造方法。
【請求項３９】
配列表における配列番号２６に併記したアミノ酸配列に於ける第５０乃至第１１２１番目のアミノ酸配列を有するバチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）由来のα−イソマルトシル転移酵素。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、イソマルトース及びイソマルチトールの新規な製造方法とそれらの用途に関し、より詳細には、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質からイソマルトース及び／又はイソマルチトールを高収率で得るための製造方法とそれらの用途に関する。
背景技術
イソマルトースは、天然界に於いては、醗酵食品などに微量存在するに過ぎない希少糖質で、工業的には、酸触媒を用いるデキストランの部分加水分解反応、デキストラナーゼやイソマルトデキストラナーゼなどを用いる酵素反応、グルコースからのグルコアミラーゼ又は酸触媒を用いる逆合成反応、マルトース又はマルトデキストリンからのα−グルコシダーゼを用いるグルコース糖転移反応などによる製造方法が知られている。しかしながら、従来法により得られる反応液中のイソマルトース含有量は、固形物当たり約１０乃至約２５％（ｗ／ｗ）（以下、本明細書に於いては、特にことわらない限り、「％（ｗ／ｗ）」を単に「％」と略記する。）程度に過ぎず、イソマルトースの工業的製造方法としては純度が低く、到底満足できるものではなかった。この問題点を改善する方法として、例えば、特開昭５８−７２５９８号公報に開示されたカラムクロマトグラフィーがある。この方法によれば、固形物当たり、イソマルトース含有量が約１０乃至約２５％の原料糖液から、高純度イソマルトースを得ることができる。しかしながら、このイソマルトースの製造方法に於いても、得られるイソマルトースの純度、収率は、原料糖液中のイソマルトース含有量に依存せざるを得ないとの問題点があった。
斯かる状況下、イソマルトースを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る新規な製造方法の確立が鶴首されていた。
また、イソマルチトールは、非還元性で低甘味の保湿性を有する糖アルコールで、従来、ソルビトール、マルチトール、グルコシル−１，６−マンニトールなどとの混合糖質として、各種食品、化粧品、医薬品等に幅広く使用されている有用な糖アルコールである。
イソマルチトールは、理論的には、還元性オリゴ糖のイソマルトースまたはパラチノースの還元基を水素添加（還元反応）してアルコール基化することにより生成し得る。とりわけ、イソマルチトールは、イソマルトースから高収率で得ることができるものの、原料として用いるイソマルトースの工業的供給には難点があった。イソマルトースは、酸触媒を用いるデキストランの部分加水分解反応、デキストラナーゼやイソマルトデキストラナーゼなどを用いる酵素反応、グルコースからのグルコアミラーゼ又は酸触媒を用いる逆合成反応、マルトース又はマルトデキストリンからのα−グルコシダーゼを用いるグルコース糖転移反応などにより得られることが知られている。しかしながら、従来法により得られる反応液中のイソマルトース含有量は、固形物当たり約１０乃至約２５％（ｗ／ｗ）（以下、本明細書に於いては、特にことわらない限り、「％（ｗ／ｗ）」を単に「％」と略記する。）程度に過ぎず、これを水素添加して得られるイソマルチトールの純度は低く、イソマルチトールの工業的製造方法としては満足できるものではなかった。この問題点を改善する方法として、例えば、特開昭５８−７２５９８号公報には、カラムクロマトグラフィーによれば、固形物当たりのイソマルトース含有量が約１０乃至約２５％の比較的低含有量の原料糖液から高純度イソマルトースを得ることができ、これを水素添加することによりイソマルチトールを製造することができる。しかしながら、このイソマルチトールの製造方法に於いても、得られるイソマルトースの収率、製造コストは、原料糖液中のイソマルトース含有量に依存し、低収率、高製造コストとならざるを得ないという欠点があった。
一方、パラチノースからイソマルチトールを製造する場合、原料としてのイソマルトースの供給に関し、パラチノースは、スクロースからα−グルコシルトランスフェラーゼを用いてグルコース糖転移反応などにより得られることが知られている。しかしながら、得られる反応液中には、異性体としてのトレハルロースや加水分解物としてのグルコース、フラクトースなどが副成し、パラチノース含量は固形物当たり約８５％にとどまる。更に、パラチノースからイソマルチトールを製造する場合、イソマルチトールと共にグルコシル−１，６−マンニトールが生成し、両者の生成重量比は、通常、１：１であり、結果的に、イソマルチトールの純度、収率が低くなるとの欠点があった。
斯かる状況下、イソマルチトールを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る新規な製造方法の確立が鶴首されていた。
発明の開示
本発明は、斯かる従来技術に鑑み、イソマルトース及びイソマルチトールを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得るそれらの製造方法と用途を確立することを課題とする。即ち、本発明は、イソマルトース及びイソマルチトールを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得るそれらの製造方法、イソマルトース及び／又はイソマルチトール含有混合糖質、及びそれらの用途を確立することを課題とする。
本発明者等は、前記課題を解決することを目的として鋭意研究する中、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に於いて、主として、４個のグルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合により交互に連なった構造を有するアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させて得られる、分子内にイソマルトース構造を有するサイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）の構造を有する四糖類（以下、『環状四糖』と略記することもある。）が報告された。
一方、本発明者等は、先に特願２０００−２２９５５７号明細書（国際公開番号第ＷＯ０１／９０３３８号）に開示したように、パノース等の澱粉由来の糖質から環状四糖を生成する、α−イソマルトシル転移酵素を用いる環状四糖の製造方法を確立すると共に、特願２０００−２３４９３７号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／１０３６１号）に於いては、α−イソマルトシル転移酵素と、マルトオリゴ糖等からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とを澱粉原料に作用させて環状四糖を効率よく製造する方法を確立した。更に、本発明者等は、特願２００１−１３０９２２号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／０４１６６号）に開示したように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と、イソマルトースを遊離する作用を有するイソマルトース遊離酵素とを澱粉原料に作用させてイソマルトースを高収率で製造する方法を確立した。
その後、本発明者等は、前記イソマルトースの製造方法に用いることのできるα−イソマルトシルグルコ糖質及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を新たに見出し、これらの酵素を用いることにより、イソマルトースを工業的に大量かつ安価に高収率で製造できることを見出した。更に、本発明者等は、イソマルトースからイソマルチトールを製造する方法についても研究した。即ち、本発明者等は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素の酵素反応メカニズムについて研究した結果、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトースを遊離する作用を有するイソマルトース遊離酵素とを作用させると、イソマルトースの生成収率が飛躍的に向上し、得られるイソマルトースを水素添加することにより、イソマルチトールが高収率で得られること、しかも、工業的に容易に実施し得ることを見出した。更に、本発明者等は、斯かる製造方法により得られるイソマルチトールの用途をも確立して本発明を完成した。具体的には、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６４１２号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／１０３６１号）に開示されたバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｎ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）（以下、単に、「Ｎ７５株」と言うこともある。）及び／又はアルスロバクター  グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ａ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）（以下、単に、「Ａ１９株」と言うこともある。）由来のα−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下で、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）、及びＰＣＴ／ＪＰ０１／０６４１２号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／１０３６１号）に開示されたアルスロバクター  ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｍｏｓｕｓ）Ｓ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）（以下、単に、「Ｓ１株」と言うこともある。）由来の一種又は二種以上のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質、及び／又は、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取するイソマルトースの製造方法、イソマルトース含有混合糖質、及びその用途を確立することにより本発明の課題を解決した。尚、前記バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）は、本出願人が、２００１年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターに寄託し、受託されている。また、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）は、本出願人が、２００１年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターに寄託し、受託されている。更に、アルスロバクター  ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）は、本出願人が、２００１年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターに寄託し、受託されている。
また、本発明者等は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下で、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質及び／又は環状四糖を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、これをそのまま又はイソマルトースを採取した後に水素添加してイソマルチトールを生成させ、この生成したイソマルチトールを採取するソマルチトールの製造方法、イソマルチトール含有混合糖質、及びその用途を確立することにより本発明の課題を解決した。
発明を実施するための最良の形態
本発明で用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とは、澱粉質からα−イソマルトシルグルコース（別名、パノース）、α−イソマルトシルマルトース、α−イソマルトシルマルトトリオース、α−イソマルトシルテトラオースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する酵素を意味し、具体的には、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６４１２号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／１０３６１号）に開示されたバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）（以下、単に、「Ｃ９株」と言うこともある。）、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）（以下、単に、「Ｃ１１株」と言うこともある。）、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、及びアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、更には、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／０５５７０８号）に開示された遺伝子組換え型α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド等を例示することができる。これら酵素の内、バチルスグロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、及びアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、本発明に於いては最も好適に用いることができる。尚、前記バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）は、本出願人が、２０００年４月２５日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在の独立行政法人産業技術総合研究所）特許微生物寄託センターに寄託し、受託されている。また、前記バチルスグロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）は、本出願人が、２０００年４月２５日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在の独立行政法人産業技術総合研究所）特許微生物寄託センターに寄託し、受託されている
本発明に係るα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素（本願発明に於いては、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素又はポリペプチドを、「α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素」と総称する。）は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度が３以上の糖質を生成し、デキストラン生成能を有さず、ＥＤＴＡによって活性が阻害される酵素で、詳細には、下記の理化学的性質を有する酵素である。尚、前記非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質としては、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉およびグリコーゲンから選ばれる１種または２種以上の糖質を例示できる。
（１）作用
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度が３以上の糖質を生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃至７．８の範囲内に等電点を有する。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、約４０乃至５０℃の範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至５５℃の範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応で、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応で１ｍＭＣａ２＋存在下、６５℃に至適温度を有する。
（５）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至８．４の範囲内に至適ｐＨを有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応で、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応で１ｍＭＣａ２＋存在下、６５℃に至適温度を有する。
（６）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約５０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、約５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ約４．５乃至１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
（８）Ｎ末端アミノ酸配列
チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシン、ヒスチジン−バリン−セリン−アラニン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−ロイシン、または、アラニン−プロリン−ロイシン−グリシン−バリン−グルタミン−アルギニン−アラニン−グルタミン−フェニルアラニン−グルタミン−セリン−グリシンを有する場合がある。
又、本発明で用いるα−イソマルトシル転移酵素とは、パノースやイソマルトシルマルトースのようなα−イソマルトシルグルコ糖質から環状四糖を生成する酵素を意味し、バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）、バチルス  グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）及びアルスロバクター  ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）由来のα−イソマルトシル転移酵素、更には、ＰＣＴ／ＪＰ０１／１００４４号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／４０６５９号）に開示された遺伝子組換え型α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチド等（本願発明に於いては、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素又はポリペプチドを、「α−イソマルトシル転移酵素」と総称する。）を例示することができる。これら酵素の内、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）及びアルスロバクター  ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）由来のα−イソマルトシル転移酵素は、本発明に於いては最も好適に用いることができる。これら本発明に係るα−イソマルトシル転移酵素の理化学的性質を示せば下記のとおりである。
（１）作用
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移を含む反応によって、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）の構造を有する環状四糖を生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約８２，０００ダルトン乃至約１３６，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．７乃至約８．３の範囲内に等電点を有する。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において、約４５℃乃至約５０℃の範囲内に至適温度を有する。
（５）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下において、ｐＨ約５．５乃至約６．５の範囲内に至適ｐＨを有する。
（６）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、約４５℃以下に安定温度域を有する。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ約３．６乃至約ｐＨ１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
（８）Ｎ末端アミノ酸配列
イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン、または、アスパラギン酸−スレオニン−ロイシン−セリン−グリシン−バリン−フェニルアラニン−ヒスチジン−グリシン−プロリンを有する場合がある。
更に、本発明で用いるイソマルトース遊離酵素は、α−イソマルトシルグルコ糖質や環状四糖から、イソマルトースを遊離する作用を有する酵素を意味し、例えば、『ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７５巻、１０５乃至１１２頁（１９７４年）に報告されているアルスロバクター  グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｔ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−４４２５）、東京大学応用微生物研究所から分譲提供される、アルスロバクター  グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）（ＩＡＭ  １２１０３）、及び『カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』、第８９巻、２８９乃至２９９頁（１９８１年）に報告されている、アクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）Ｒ１０（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４１１）等の微生物由来のイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ３．２．１．９４）を例示することができる。
本発明で用いる非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質とは、例えば、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質を意味する。可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉等の原料澱粉としては、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉及びそれら部分加水分解物（澱粉部分分解物）等を例示できる。本澱粉部分分解物は、通常、上記した地上乃至地下澱粉を水に懸濁して、通常、濃度１０％以上、より好ましくは、１５％乃至６５％、更に好ましくは、２０％乃至５０％の澱粉乳とし、これを加熱して液化するか、又は、上記した地上乃至地下澱粉を酸剤或いは酵素剤により液化して得ることができる。液化の程度は、比較的低く設定するのがよく、通常、ＤＥ１５未満、好ましくは、ＤＥ１０未満、より好ましくは、ＤＥ９乃至０．１の範囲とする。酸剤で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸などの酸剤により液化した後、通常、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどの１種又は２種以上のアルカリ剤を用いて所望のｐＨに中和する方法を採用する。酵素剤で液化する場合には、α−アミラーゼ、殊に、耐熱性の液化型α−アミラーゼが本発明に於いては好適に用いることができる。これら非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質、及び／又は、環状四糖を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することによりイソマルトースを高収率で得ることができる。又、α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させるに際し、α−イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下、『ＣＧＴａｓｅ』と略記する。）、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及び澱粉枝切酵素（イソアミラーゼ、プルラナーゼ等）から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させるか、又は、α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後に、α−イソマルトシル転移酵素、ＣＧＴａｓｅ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及びイソアミラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることにより、イソマルトースをより高収率で製造することができる。殊に、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて得られる環状四糖にイソマルトース遊離酵素を作用させる場合、環状四糖からのイソマルトース生��収率を最大１００％にまで高めることも可能である。本発明に於いて複数の酵素を用いる場合の順序は、イソマルトースの生成収率、反応時間、反応条件等を勘案しながら設定すればよく、複数の酵素を同時に作用させることも、又、これら酵素の必要量を数回に分けて、異なるタイミングで作用させることも可能である。本発明で用いる酵素を作用させるときのｐＨは、各酵素がそれらの酵素活性を発揮し得るｐＨであればよく、通常、ｐＨ４乃至１０、好ましくは、ｐＨ５乃至９の範囲から選択される。又、酵素を作用させるときの温度は、通常、１０乃至８０℃、好ましくは、３０乃至７０℃の範囲から選択される。酵素量は、各酵素の反応条件、反応時間を考慮して適宜増減すればよく、通常、基質固形物グラム当たり、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、それぞれ０．０１乃至１００単位の範囲から、イソマルトース遊離酵素及び澱粉枝切酵素は、それぞれ１乃至１０，０００単位の範囲から、及びＣＧＴａｓｅ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及びイソアミラーゼは、０．０５乃至７，０００単位の範囲から適宜選択して用いる。又、用いる酵素反応時間は、酵素量に依存するものの、イソマルトースの生成収率を勘案しながら適宜選択すればよく、通常、１乃至２００時間、好ましくは、５乃至１５０時間、１０乃至１００時間で全酵素反応を完結するよう設定する。尚、個々の酵素反応時のｐＨ及び温度は、本発明に於ける酵素反応が完了する迄の工程で適宜変更することも可能である。
斯くして得られる酵素反応液中のイソマルトース含有量は、固形物当たり、通常、３０％以上、好ましくは、４０％以上、より好ましくは、５０％以上、更に好ましくは、最大９９％以上にも達する。とりわけ、これら非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、α−イソマルトシル転移酵素及びイソマルトース遊離酵素を同時又はこの順序で添加するときには、固形物当たりのイソマルトース含有率が５０％以上の酵素反応液を容易に得ることができる。本酵素反応液は、通常、濾過、遠心分離などの常法により酵素反応液中の不溶物を除去し、次いで、活性炭により脱色し、Ｈ形、ＯＨ形イオン交換樹脂等で脱塩し、精製し、濃縮してシラップ状物とするか、更に、これを乾燥して固状物又は粉末状物とする。必要ならば、更に、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒を用いる分別、膜分離法等の１種又は２種以上を適宜組み合わせて精製し、イソマルトース高含有物とすることも可能である。とりわけ、イソマルトース高含有物の工業的大量製造方法としては、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーが好適である。具体的には、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報及び特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている、スルフォン基を結合したスチレン−ジビニルベンゼン架橋共重合体樹脂のＮａ＋形等のアルカリ金属形、及びＣａ２＋形、Ｍｇ２＋形等のアルカリ土類金属形の１種又は２種以上の強酸性カチオン交換樹脂を用いるイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーによるときには、イソマルトース高含有物を工業的に高収率、大量、容易かつ安価に製造することができる。前記強酸性カチオン交換樹脂の市販品としては、例えば、ダウケミカル社製の商品名『ダウエックス５０ＷＸ２』、『ダウエックス５０ＷＸ４』及び『ダウエックス５０ＷＸ８』、ローム・アンド・ハース社製の商品名『アンバーライトＣＧ−１２０』、東京有機化学工業社製の商品名『ＸＴ−１０２２Ｅ』、三菱化成工業社製の商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』、『ダイヤイオンＳＫ１０２』及び『ダイヤイオンＳＫ１０４』等を例示することができる。前記イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに於いては、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも可能である。斯かる方法によれば、イソマルトースの固形物当たりの純度を、通常、６０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９９％以上の最高純度にまで高収率で高めることが可能である。尚、最高純度のイソマルトース以外のイソマルトースとしてのイソマルトース高含有物は、通常、イソマルトースと共に、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、他の澱粉部分加水分解物、α−イソマルトシルグルコ糖質、環状四糖、及びα−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−グルコース（以下、『開環四糖』と略称することもある。）から選ばれる１種又は２���上の糖質を、固形物当たり合計、通常、１乃至６０％含んでいる。又、イソマルトースを水素添加してイソマルチトールを工業的に製造する場合には、必要に応じて、前記Ｈ形、ＯＨ形イオン交換樹脂等による脱塩、精製を省略することができる。
斯くして得られるイソマルトース又はイソマルトース含有物を還元触媒下で水素添加することによってイソマルチトール又はイソマルチトール含有物を高収率で得ることができる。具体的には、例えば、濃度４０乃至６０％のイソマルトース水溶液にラネーニッケル触媒を加え、これを耐圧性容器内に入れ、この容器内に水素を充填し、加圧し、温度１００乃至１２０℃にて水素が消費されなくなるまで攪拌して水素添加する。この際、イソマルトースはイソマルチトールに還元されるとともに、イソマルトース含有物中に含まれる還元性糖質、例えば、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、他の還元性澱粉部分加水分解物、還元性α−イソマルトシルグルコ糖質、及び開環四糖も同時に還元されて糖アルコールとなる。尚、環状四糖は非還元性糖質であり、水素添加しても変化は受けない。得られたイソマルチトール溶液をラネーニッケル触媒と分離し、常法にしたがって活性炭により脱色し、Ｈ形、ＯＨ形イオン交換樹脂等で脱塩し、精製し、濃縮してシラップ状物とするか、更に、これを乾燥して粉末状物とする。必要ならば、更に、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、結晶化、アルコール及びアセトンなど有機溶媒を用いる分別、膜分離法等の１種又は２種以上の方法を適宜組み合わせて精製し、イソマルチトール含有混合糖質とすることも可能である。イソマルチトールの結晶化方法は、通常、温度４０乃至９５℃のイソマルチトール過飽和溶液を助晶缶にとり、これに種晶を、通常、０．１乃至２０％の割合で添加し、ゆっくり攪拌しつつ徐冷し、晶出を促してマスキットとする。次いで、分密方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などの公知の方法により、このマスキットから粉末状結晶イソマルチトール（通常、無水結晶イソマルチトール）を得ることができる。例えば、分蜜方法は、通常、マスキットをバスケット型遠心分離機により、結晶イソマルチトールと蜜とを分離する方法で、必要に応じて、該結晶に少量の冷水をスプレーして洗浄することも容易であり、より高純度の非吸湿性結晶イソマルチトールを製造するのに好適である。他の３つの方法は、蜜を分離しないので、得られる含蜜結晶中のイソマルチトール純度の向上は見られないが、生成収量が多い特徴を有している。従って、このような製品の場合には、結晶イソマルチトール以外に、通常、ソルビトール、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、他の澱粉部分加水分解物に由来する糖アルコール、α−イソマルトシルグルコ糖質に由来する糖アルコール、環状四糖、及びα−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−ソルビトール（以下、『還元開環四糖』と略称することもある。）から選ばれる１種又は２種上の糖質が含まれている。噴霧乾燥の場合には、通常、濃度７０乃至８５％、晶出率２５乃至６０程度のマスキットを高圧ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶融しない温度、例えば、６０乃至１００℃の温風で乾燥し、次いで、３０乃至６０℃の温風で約１乃至２０時間熟成すれ��、非吸湿性乃至難吸湿性の含蜜結晶を容易に得ることができる。又、ブロック粉砕方法は、通常、濃度８５乃至９５％、晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを０．５乃至５日間静置して全体をブロック状に晶出固化させ、これを破砕又は切削などの方法により粉砕し、乾燥すれば、非吸湿性乃至難吸湿性の含蜜結晶を容易に製造することができる。
斯かる晶出方法によれば、イソマルチトールの固形物当たりの純度が、通常、４０％以上、好ましくは、６０％以上、より好ましくは、９９％以上のイソマルチトールを高収率で得ることができる。又、イソマルチトールと共に、通常、ソルビトール、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、他の澱粉部分加水分解物に由来する糖アルコール、α−イソマルトシルグルコ糖質に由来する糖アルコール、環状四糖、及び還元開環四糖から選ばれる１種又は２種上の糖質を、固形物当たり合計、通常、７０％以下、好ましくは、６０％以下、好ましくは、１乃至５０％含むイソマルチトール含有混合糖質を容易に得ることができる。以上述べてきたイソマルチトール含有混合糖質の内、イソマルチトールと共に、環状四糖、還元開環四糖、ソルビトール、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、他の澱粉部分加水分解物に由来する糖アルコール、α−イソマルトシルグルコ糖質に由来する糖アルコールから選ばれる１種又は２種上の糖質を含むイソマルチトール含有混合糖質は新規な組成物である。本発明の製造方法により得られるイソマルチトール及びイソマルチトール含有混合糖質の形態としては、液状、ペースト状、シラップ状、粒状、粉末状、固体状又は粉末状などの種々の形態を例示できる。
本発明の製造方法により得られるイソマルトース、イソマルチトール、イソマルトース及び／又はイソマルチトール含有混合糖質、及び結晶イソマルチトール（以下、単に、「本発明の糖質」と総称することもある。）は、良質で上品な甘味を有すると共に、斯くして得られる本発明の糖質は、良質で上品な甘味を有すると共に、虫歯の原因の一つである虫歯菌による酸生成が起こりにくい性質を有しており、虫歯を起こしにくい甘味料として好適に利用される。又、本発明の糖質は、イソマルトース及びイソマルチトールの純度により多少変動するも、実質的に非吸湿性乃至難吸湿性で、良好な流動性を有し、粘着、固着の懸念もなく、非還元性であるため、それ自体、保存安定性が優れているだけでなく、アミノ酸、タンパク質などのアミノ化合物存在下でもメイラード反応を起こすことがなく、共存する成分を損ねたり、自体、着色したりすることが殆どない。殊に、イソマルチトール含有混合糖質又は結晶イソマルチトール含有製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの公知の１種又は２種以上の結合剤と併用して、錠剤の糖衣剤としても有利に用いることができる。又、本発明の糖質は、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防止性などの有用な性質をも兼備している。従って、本発明の糖質は、甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、風味保持剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、健康食品や健康補助食品を含む食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などの各種組成物に有利に用いることができる。
本発明の糖質は、各種物品の甘味付けのための調味料としても用いることができる。必要に応じて、例えば、粉飴、ブドウ糖、フラクトース、ラクトスクロース、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース（別名、ネオトレハロース）、β，β−トレハロース、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュガー、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、スクラロース、アセスルファムＫ、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種又は２種以上と併用することも、更に必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などの増量剤の１種又は２種以上を併用することも随意である。
又、本発明の糖質、とりわけ、イソマルチトールの結晶粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、適宜の増量剤、賦形剤、結合剤、甘味料などの１種又は２種以上と併用して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体状、錠剤状、フィルム状又はシート状などの各種形状に成型して用いることも随意である。
更に、本発明の糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、自体、耐酸性、耐熱性も大きいので、各種飲食物の甘味付け、呈味改良に、又品質改良を目的として用いることができる。具体的には、例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に利用できる。又、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、ヨークシャープディング、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、焼酎、酎ハイ、合成酒、リキュール、カクテル、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、ジュース、スポーツ飲料、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品、健康食品などの各種飲食物に有利に利用できる。更に、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚類、甲殻類（エビ、カニなど）などの飼育動物用の飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤などの各種固形物用甘味剤として、又はそれらの呈味改良剤、矯味剤、品質改良剤、安定剤、保湿剤などとして有利に利用できる。
本発明の糖質は、実質的に非還元性であるため、メイラード反応を起こさない非メイラード性の糖アルコールで、アミノ化合物などの有効成分などを損ねることが少なく、品質改良剤及び／又は安定剤として、有効成分、活性成分又は生理活性物質を含む健康食品、医薬品などに配合することにより、安定で高品質の液状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品を得ることができる。前記有効成分や生理活性物質としては、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンなどのリンホカイン、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、スプレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、α−グリコシルアスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロール、ルチン、α−グリコシルルチン、ナリンジン、α−グリコシルナリンジン、ヘスペリジン、α−グリコシルヘスペリジンなどのビタミン類、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素、用人参エキス、笹エキス、梅エキス、松エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ローヤルゼリーなどを例示することができる。
以上述べた各種組成物に、本発明の糖質を含有させる方法は、これらの組成物が完成するまでの工程で含有させればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、前記組成物重量当たり、０．１％以上、好ましくは、１％以上、より好ましくは、２乃至９９．９％配合する。
以下、本発明のイソマルトース及びイソマルチトールの製造方法について実験で説明する。
実験１＜培養物からの非還元性環状糖質の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学株式会社製造）５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清を１２０℃で１５分間オートクレーブし、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。
得られた上清中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す。）を行ない、上清中の糖質を分離した。検出法として、分離した全糖質を硫酸−メタノール法で発色し、又、還元糖質をジフェニルアミン−アニリン法で発色して調べたところ、Ｒｆ値が約０．３１の位置に硫酸−メタノール法で陽性、ジフェニルアミン−アニリン法で陰性の非還元性糖質が検出された。
先に得た上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製造）を固形物１グラム当たり１，５００単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当たり７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し２時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＰＫ２１８』と『ダイヤイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレータで濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約０．６ｇの糖質粉末を得た。得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、「ＨＰＬＣ」と略称する。）で調べたところ、図１に示すように、溶出時間約１０．８４分に単一ピークのみが検出され、純度は９９．９％以上で極めて高純度であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、『ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用いカラム温度６０℃、水の流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。又、還元力をソモギー・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断された。
実験２＜非還元性糖質の構造解析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、高速原子衝撃法による質量分析（通称「ＦＡＢ−ＭＳ」）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が６４８であることが判明した。又、常法に従って、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、本糖質の構成糖はＤ−グルコースであること、また、質量数を考慮すると、本糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であることが解った。さらに、本糖質を用いて核磁気共鳴法（通称、「ＮＭＲ」）を行ったところ、図２に示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図３に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを既知糖質のものと異同を比較したところ、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載されている非還元性環状糖質サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）のスペクトルと一致し、本糖質の構造が図４に示す環状四糖、即ち、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）であることが判明した。
実験３＜バチルス  グロビスポルスＣ９からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製造）４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、（アサヒビール株式会社製造）１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．４５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．５単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．４５単位／ｍｌの活性（総活性約８，１１０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．５単位／ｍｌの活性（総活性約２６，９００単位）で、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌ（総活性約１７，１００単位）であった。なお、酵素活性は次のようにして測定した。即ち、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマルトシルマルトースとマルトースのうち、このマルトース量を、実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量と定義した。本明細書を通じて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性は、以上のようにして測定される活性（単位）を意味する。
又、α−イソマルトシル転移酵素の酵素活性の測定は、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量することによって行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義した。本明細書を通じて、α−イソマルトシル転移酵素の酵素活性は、以上のようにして測定される活性（単位）を意味する。
又、環状四糖生成活性の測定は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製造）を濃度２ｗ／ｖ％となるよう５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１００℃で１０分間熱処理して反応を停止させた後、更に、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬製造）７０単位／ｍｌとグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）２７単位／ｍｌとを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを加えて、５０℃で６０分間処理し、その液を１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。環状四糖生成活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状四糖を生成する酵素量と定義した。本明細書を通じて、環状四糖生成活性は、以上のようにして測定される活性（単位）を意味する。
実験４＜バチルス  グロビスポルスＣ９由来酵素の調製＞
実験４−１＜バチルス  グロビスポルスＣ９由来酵素の精製＞
実験３で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，１１０単位と、α−イソマルトシル転移酵素活性を２４，７００単位と、環状四糖生成活性を約１５，６００単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１，０００ｍｌ）に供した。この際、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、α−イソマルトシル転移酵素および環状四糖のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不純物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０Ｍ付近に溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近に溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。又、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないこと、又、得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とα−イソマルトシル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すことから、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
実験４−２＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
実験４−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
2003033717.tif 000002
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
実験４−３＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験４−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
2003033717.tif 000003
実験５＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験５−１＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験４−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１４０，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図６（温度の影響）、図６（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４０℃（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０乃至６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約３５℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。
2003033717.tif 000004
2003033717.tif 000005
表３の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
実験５−２＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験４−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．５±０．５であった。
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図９（温度の影響）、図１０（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約４５℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性はｐＨ約４．０乃至９．０であった。
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
2003033717.tif 000006
表４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。又、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−アスパラギン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
実験６＜バチルス  グロビスポルスＣ１１からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．５１単位／ｍｌの活性（総活性約９、１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．７単位／ｍｌの活性（総活性約３０，４００単位）で、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌ（総活性約１９，４００単位）であった。
実験７＜バチルス  グロビスポルスＣ１１由来酵素の調製＞
実験７−１＜バチルス  グロビスポルスＣ１１由来酵素の精製＞
実験６で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位、環状四糖生成活性を約１７，７００単位を有することが判明した。この粗酵素液を、実験４−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成いずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近で溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験４に記載のＣ９株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、又、得られたα−イソマルトシル転移酵素画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
実験７−２＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
実験７−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
2003033717.tif 000007
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
実験７−３＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験７−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表６に示す。
2003033717.tif 000008
実験８＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験８−１＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
又、本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図１３（温度の影響）、図１４（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４５℃（Ｃａ２＋非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１５（温度安定性）、図１６（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表７に示す。
2003033717.tif 000009
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表７の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列Ｎ末端チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−１のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のＮ末端配列と比較すると同一であることが判明し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開第ＷＯ０２／０５５７０８号）に詳細に開示されていることから割愛するが、実験７−２で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開第ＷＯ０２／０５５７０８号）に開示されているポリペプチドと同様、配列表に於ける配列番号２１に併記したアミノ酸配列に於ける第３６乃至１２８４番目のアミノ酸配列を有する。
実験８−２＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１０２，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．６±０．５であった。
又、本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図１７（温度の影響）、図１８（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１９（温度安定性）、図２０（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
更に、本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
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表８の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。又、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−２のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端配列と比較して、α−イソマルトシル転移酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願２０００−３５０１４２号明細書（国際公開第ＷＯ０２／４０６５９号）に詳細に開示されていることから割愛するが、実験７−３で得たα−イソマルトシル転移酵素は、特願２０００−３５０１４２号明細書（国際公開第ＷＯ０２／４０６５９号）に開示されているとおり、配列表に於ける配列番号２２に併記したアミノ酸配列に於ける第３０乃至１０９３番目のアミノ酸配列を有する。
実験９＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素のアミノ酸配列＞
実験９−１＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−２の方法で得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのトリプシン（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ６４（保持時間約６４分）、Ｐ８８（保持時間約８８分）、Ｐ９９（保持時間約９９分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号５乃至７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表９に示す。
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実験９−２＜α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−３の方法で得られた精製α−イソマルトシル転移酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ２２（保持時間約２２分）、Ｐ６３（保持時間約６３分）、Ｐ７１（保持時間約７１分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号８乃至１０に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１０に示す。
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実験１０＜バチルス  グロビスポルスＮ７５からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌し、冷却して、温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約０．３４単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．１単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．６９単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．３３単位／ｍｌの活性（総活性約５，９４０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．１単位／ｍｌの活性（総活性約１９，８００単位）で、環状四糖生成活性は約０．６７単位／ｍｌ（総活性約１２，１００単位）であった。
実験１１＜バチルス  グロビスポルスＮ７５由来の酵素の調製＞
実験１１−１＜バチルス  グロビスポルスＮ７５由来酵素の精製＞
実験１０で得られた培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を４，７１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位、環状四糖生成活性を約９，５９０単位を有することが判明した。この粗酵素液を、実験４−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いるイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、セパビーズゲルに吸着し、α−イソマルトシル転移酵素活性は、セパビーズゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。続いて、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．２５Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験４に記載のＣ９株の場合および実験７に記載のＣ１１株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないこと、又、得られたα−イソマルトシル転移酵素画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すことから、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
実験１１−２＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
実験１１−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、セファクリルゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル−トヨパール（ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、前記セファクリルゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１１に示す。
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精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
実験１１−３＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験１１−１に記載のイオン交換クロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ  Ｓ−２００）』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。さらに、酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ）』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル−トヨパールゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。この回収液を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｃ』ゲルを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、スーパーＱ−トヨパールゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出し、得られた溶出画分を回収し、最終精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表１２に示す。
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精製したα−イソマルトシル転移酵素標品を７．５％ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
実験１２＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１２−１＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験１１−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３６，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約７．３±０．５であった。
又、本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図２１（温度の影響）、図２２（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約５０℃（Ｃａ２＋非存在）、約５５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図２３（温度安定性）、図２４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４５℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約５０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表１３に示す。
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表１３の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。又、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列Ｎ末端ヒスチジン−バリン−セリン−アラニン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−ロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−１のバチルス  グロビスポルスＣ９由来及び実験８−１のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のＮ末端配列と比較すると、第１番目及び第４番目、第９番目のアミノ酸が異なるものの類似性が高いことが判明した。詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開第ＷＯ０２／０５５７０８号）に詳細に開示されていることから割愛するが、実験１１−２で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開第ＷＯ０２／０５５７０８号）に開示されているポリペプチドと同様、配列表に於ける配列番号２３に併記したアミノ酸配列に於ける第３６乃至１２８６番目のアミノ酸配列を有する。
実験１２−２＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１１−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約７．８±０．５であった。
更に、本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図２５（温度の影響）、図２６（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図２７（温度安定性）、図２８（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４５℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至１０．０であった。本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表１４に示す。
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表１４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。又、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−２のバチルス  グロビスポルスＣ９由来及び実験８−２のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端配列と比較して、α−イソマルトシル転移酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。詳細なアミノ酸配列の分析方法については、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０４２７６号明細書に詳細（国際公開第ＷＯ０１／９０３３８号）に開示されていることから割愛するが、実験１１−３で得たα−イソマルトシル転移酵素は、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０４２７６号明細書（国際公開第ＷＯ０１／９０３３８号）に開示されているポリペプチドと同様、配列表に於ける配列番号２４に併記したアミノ酸配列に於ける第３０乃至１０９３番目のアミノ酸配列を有する。
実験１３＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素のアミノ酸配列＞
実験１３−１＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験１１−２の方法で得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−３６％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［ＰＮ５９（保持時間約５９分）、ＰＮ６７（保持時間約６７分）、ＰＮ８７（保持時間約８７分）］を分取し、それぞれ真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号１２乃至１４に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１５に示す。
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実験１３−２＜α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験１１−３の方法で得られた精製α−イソマルトシル転移酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−４％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４２．４％アセトニトリル溶液の９０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［ＰＮ２１（保持時間約２１分）、ＰＮ３８（保持時間約３８分）、ＰＮ６９（保持時間約６９分）］を分取し、それぞれ真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基まで（但し、ＰＮ２１は６残基まで）アミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号１５乃至１７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１６に示す。
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実験１４＜アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至９．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約１．１単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．７単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．３５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約１．０６単位／ｍｌの活性（総活性約１９，１００単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．６単位／ｍｌの活性（総活性約２８，８００単位）で、環状四糖生成活性は約０．２７単位／ｍｌ（総活性約４，８６０単位）であった。なお、アルスロバクターグロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定は、基質のための緩衝液として１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた以外、実験３に記載の方法と同様に行った。
実験１５＜アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来酵素の調製＞
実験１５−１＜アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来酵素の精製＞
実験１４で得られた培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約８５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，２１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位、環状四糖生成活性を約２，０９０単位を有することが判明した。この粗酵素液を、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲルを用いるイオン交換カラムクロマログラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。酵素活性は、ＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、ＮａＣｌ濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．２Ｍ付近に溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性はＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近に溶出した。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを別々に集め回収した。又、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないこと、又、得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とα−イソマルトシル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すことから、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
実験１５−２＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
実験１５−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、セファクリル（ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０．２Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収し、最終精製標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１７に示す。
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精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
実験１５−３＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験１５−１に記載のイオン交換クロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表１８に示す。
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精製したα−イソマルトシル転移酵素標品を７．５％ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
実験１６＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１６−１＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験１５−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約９４，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約４．３±０．５であった。
又、本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図２９（温度の影響）、図３０（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ８．４、６０分間反応で約６０℃（Ｃａ２＋非存在）、約６５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約８．４であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを８．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図３１（温度安定性）、図３２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約５５℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約６０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。
更に、本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表１９に示す。
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表１９の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害されることが判明した。本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１８に示すアミノ酸配列Ｎ末端アラニン−プロリン−ロイシン−グリシン−バリン−グルタミン−アルギニン−アラニン−グルタミン−フェニルアラニン−グルタミン−セリン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／０５５７０８号）に詳細に開示されていることから割愛するが、実験１５−２で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／０５５７０８号）に開示されているポリペプチドと同様、配列表に於ける配列番号２５に併記したアミノ酸配列に於ける第３７乃至９６５番目のアミノ酸配列を有する。
実験１６−２＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１５−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１３，０００±２０，０００ダルトンであった。
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約４．２±０．５であった。
更に、本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図３３（温度の影響）、図３４（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図３５（温度安定性）、図３６（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４５℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１９に示すアミノ酸配列のアスパラギン−スレオニン−ロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−トリプトファン−ヒスチジン−アスパラギン−プロリン−チロシン−グリシン−アラニン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン−チロシン−アラニン−スレオニン−グルタミンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった
実験１６−３＜α−イソマルトシル転移酵素の全アミノ酸配列＞
特願２００１−５４４１号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／０５５７０８号）に記載の方法でアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株から染色体ＤＮＡを抽出・精製した後、制限酵素ＮｏｔＩで分解し、断片化した。別途、プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌ  ＳＫ（＋）』（ストラタジーン・クローニング・システム株式会社製）を制限酵素ＮｏｔＩを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクターと先に得たＤＮＡ断片とを『ＤＮＡライゲーション・キット』（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』（ストラタジーン・クローニング・システム株式会社製）を形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。別途、実験１６−２の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号１９に示すアミノ酸配列における第１番目より第１８番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＡＡＹＡＣＮＣＴＮＧＡＹＧＧＮＧＴＮＴＧＧＣＡＹＡＡＹＣＣＮＴＡＹＧＧＮＧＣＮＧＡＹＧＡＲＣＴＮＴＧＧＡＣ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブとして、先に得られた遺伝子ライブラリーを用いて、特願２００１−５４４１号明細書（国際公開番号第ＷＯ０２／０５５７０８号）に記載の方法に準じてコロニーハイブリダイゼーション法を行い、プローブと顕著な会合を示す１種類の形質転換体を選択し、この形質転換体を『ＡＧＡ４』と命名した。常法により、この形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株に由来する、鎖長６１５３塩基対の、配列表に於ける配列番号２６に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。第３７図に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素ＮｏｔＩによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、配列表に於ける配列番号２６に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例１６−２の方法で確認されたα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端アミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号１９に示すアミノ酸配列は、配列番号２６に併記したアミノ酸配列に於ける第５０乃至６９番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号２６に於ける第４６４４乃至４６４６番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（５′−ＴＧＡ−３′）をコードしていることから、α−イソマルトシル転移酵素のＣ末端は、その直前のアルギニン（配列表に於ける配列番号２６に於ける第１１２１番目のアミノ酸）であることが判明した。これらの結果は、実験１５−３で得たα−イソマルトシルグ転移酵素は、配列表に於ける配列番号２６に併記したアミノ酸配列に於ける第５０乃至１１２１番目のアミノ酸配列を有し、配列表に於ける配列番号２６に示す塩基配列に於ける第１４２８乃至４６４３番目の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号２６に併記したアミノ酸配列における第１乃至４９番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号２６に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号２６に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＡＧＡ４』と命名した。
実験１７＜アルスロバクター  ラモサスＳ１からのα−イソマルトシル転移酵素の産生＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター  ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本酵素活性は約０．４５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は、０．４４単位／ｍｌ（総酵素活性約７，９２０単位）であった。
実験１８＜アルスロバクター  ラモサスＳ１からのα−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験１７で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して、本酵素活性を６，０００単位含む粗酵素液約３８０ｍｌを得た。この粗酵素液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を、遠心分離して不溶物を除いた後、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント及び、これに続いてマルトテトラオース０ｗ／ｖ％から５ｗ／ｖ％のリニアグラジエントで溶出させたところ、マルトテトラオース濃度約２ｗ／ｖ％付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル・トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル・トヨパール６５０Ｍゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収して、精製標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素の活性量、比活性、収率を表２０に示す。
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７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、本実験で精製したα−イソマルトシル転移酵素標品の純度を検定したところ、本酵素標品の蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
実験１９＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１８の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１６，０００±２０，０００ダルトンであった。
又、本精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％『アンフォライン』（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐＩ）は約４．２±０．５であった。
更に、本酵素の酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。その結果を図３８（温度の影響）、図３９（ｐＨの影響）に示した。本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨの異なる５０ｍＭ緩衝液中で、４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図４０（温度安定性）、図４１（ｐＨ安定性）に示した。これらの図に示すとおり、本酵素の上記の条件下における安定温度域は約４５℃以下であり、又、本酵素の上記の条件下における安定ｐＨ域はｐＨ約３．６乃至約９．０であった。
又、本酵素の活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表２１に示す。
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表２１の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋でも阻害された。又、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないことも判明した。
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析した。本酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号２０に示す、アスパラギン酸−スレオニン−ロイシン−セリン−グリシン−バリン−フェニルアラニン−ヒスチジン−グリシン−プロリンで表される配列であることが判明した。
実験２０＜各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、α、α−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製した。これらの溶液に、実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、または実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、又は実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を基質固形物１グラム当たり２単位加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験１記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表２２に示す。
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表２２の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。又、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、及びエルロースにも僅かに作用することが判明した。
実験２１＜マルトオリゴ糖からの生成物＞
実験２１−１＜生成物の調製＞
濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、又はマルトペンタオースのそれぞれ水溶液に実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、それぞれ固形物１グラム当たり２単位（マルトースおよびマルトトリオース）、０．２単位（マルトテトラオース）、０．１単位（マルトペンタオース）加え、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ワイ・エム・シー・パック（ＹＭＣ  Ｐａｃｋ）ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（株式会社ワイ・エム・シー製造）を用いカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。その結果を表２３に示す。
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表２３の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）とが生成し、基質マルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）とが生成し、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）、生成物Ｘが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘとが生成し、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、生成物Ｙが生成することが判明した。基質マルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙとが生成し、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ、生成物Ｚが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘ、並びに基質マルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの単離・精製を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ワイ・エム・シー・パック（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ）ＯＤＳ−Ａ  Ｒ３５５−１５Ｓ−１５  １２Ａ』（株式会社ワイ・エム・シイ製）を用いて精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物、マルトペンタオースからの反応物それぞれから、純度９９．９％以上の生成物Ｘ標品を固形物当たり収率約８．３％で、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物当たり収率約１１．５％で単離した。
実験２１−２＜生成物の構造解析＞
実験２１−１の方法で得た生成物Ｘおよび生成物Ｙを用いて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析を行なった。メチル化分析の結果は表２４にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４２（生成物Ｘ）、図４３（生成物Ｙ）に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４４（生成物Ｘ）、図４５（生成物Ｙ）に、生成物Ｘ、Ｙの帰属を表２５にまとめた。
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これらの結果から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコース基がα結合した５糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルマルトトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
構造式１：
α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃｐ
又、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコシル基がα結合した６糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルマルトテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
構造式２：
α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃｐ
以上のことから、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のマルトオリゴ糖に対する作用は以下のように判断された。
（１）本酵素は、基質として、α−１，４結合からなるグルコース重合度が２以上のマルトオリゴ糖に作用し、その非還元末端のグルコシル残基を他の分子の非還元末端のグルコシル残基の６位に転移する作用を有する分子間の６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
（２）本酵素は、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
実験２２＜還元力生成試験＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が還元力生成能を有するかどうかを調べるため、以下の試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素および実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で測定し、又、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアントロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％）は以下の計算式を用いて算出した。
計算式：
2003033717.tif 000034
結果を表２６に示す。
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表２６の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、マルトテトラオースを基質として作用させると、反応物の還元力を実質的に増加しないこと、即ち、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は加水分解作用を示さないか若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。
実験２３＜デキストラン生成試験＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素がデキストラン生成作用を有するかどうかを調べるため、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、１６９乃至１７３（１９９２年）に記載の方法に準じて試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たＣ９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素および実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の酵素標品の場合、ｐＨ８．４）で４時間および８時間作用させた後、１００℃で１５分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の５０μｌを遠心管に入れ、それに３倍量のエタノールを加え十分に攪拌した後、４℃で３０分間静置した。次いで、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し、その上清を除去した後、１ｍｌの７５ｗ／ｗ％のエタノールを加え攪拌して洗浄した。再度、遠心分離してその上清を除き、真空乾燥した後、１ｍｌの脱イオン水を加え十分に攪拌した。その液中の全糖量（グルコース換算）をフェノール硫酸法で測定し、試験の全糖量とした。反応のブランクとして、１００℃で１０分間熱処理し失活させたバチルス  グロビスポルスＣ９由来またはバチルス  グロビスポルスＣ１１由来、バチルス  グルビスポルスＮ７５由来、及びアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて同様に行い、ブランクの全糖量とした。デキストラン生成量は以下の計算式で計算した。
計算式：
デキストラン生成量（ｍｇ／ｍｌ）＝［（試験の全糖量）−（ブランクの全糖量）］×２０
結果を表２７に示す。
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表２７の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトテトラオースに作用させてもデキストランを生成しないこと、つまり、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、デキストラン生成作用を実質的に有さないか、その生成量は検出限界以下であることが判明した。
実験２４＜転移受容体特異性＞
各種糖質を用いて、本酵素の転移受容体になりうるかどうかの試験をした。Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ソルビトール、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセロール、マルチトール、ラクトース、スクロース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリン、Ｌ−アスコルビン酸の溶液を調製した。これらの受容体溶液（濃度１．６％）に、糖供与体として澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（濃度４％）を加え、実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品または実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、又は実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を糖供与体固形物１グラム当たり１単位加え、これを３０℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９酵素の場合、ｐＨ８．４）で２４時間作用させた。酵素反応後の反応液を、受容体が単糖または二糖の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＬＣ法」と略する。）で、受容体が三糖以上の場合はＨＰＬＣ法で分析し、それぞれの糖質が本酵素の転移受容体になるかを確認した。なお、ＧＬＣに於いて、ＧＬＣ装置は『ＧＣ−１６Ａ』（株式会社島津製作所製）、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレス製カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン検出器で分析した。ＨＰＬＣでは、ＨＰＬＣの装置は東ソー株式会社製『ＣＣＰＤ』、カラムは『ＯＤＳ−ＡＱ−３０３』（株式会社ワイエムシィー社製）、溶離液は水を流速０．５ｍｌ／分で、検出は示差屈折形で分析した。結果を表２８に示す。
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表２８の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、転移受容体として種々の糖質が利用でき、バチルス  グロビスポルスＣ９、Ｃ１１、Ｎ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特に、Ｄ−／Ｌ−キシロース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトースおよびスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−フコース、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グリセロールおよびＬ−アスコルビン酸に転移し、更には、Ｄ−アラビノースにも転移することが判明した。アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特に、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、α，α−トレハロース、セロビオース、マルチトール、ラクトースおよびスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−／Ｌ−キシロース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、イソマルトース、ゲンチビオース、グリセロールおよびＬ−アスコルビン酸に転移し、更には、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコースおよびイソマルトトリオースにも転移することが判明した。
以上に述べたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質について、先に報告されている６−グルコシル転移作用を有する酵素、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、１６９乃至１７３頁（１９９２年）に記載のデキストリン・デキストラナーゼおよび『日本農芸化学会誌』、第３７巻、６６８乃至６７２頁（１９６３年）に記載のトランスグルコシダーゼと比較した。その結果を表２９にまとめた。
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表２９から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、既知のデキストリン・デキストラナーゼやトランスグルコシダーゼとは全く異なる新規な理化学的性質を有することが判明した。
実験２５＜環状四糖の生成＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）またはグリコーゲン（カキ由来、和光純薬株式会社販売）の溶液を調製した。  これらの水溶液（濃度０．５％）に、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当たり１０単位とを加え、これらを３０℃、ｐＨ６．０で作用させた。作用条件は、以下の４つの系で行った。
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、α−イソマルトシル転移酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（３）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（４）α−イソマルトシル転移酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験１と同様にして、α−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３０に示す。
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表３０の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素又はα−イソマルトシル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を併用すると環状四糖が生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にα−イソマルトシル転移酵素を作用させた場合には、約１１％以下と比較的に少ないのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用すると、いずれの糖質の場合も環状四糖の生成量は向上し、特に、グリコーゲンの場合、約８７％に増加し、澱粉部分分解物の場合には約６４％に増加することが判明した。
このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用による環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖を生成する。
（２）α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖を生成する。
（３）続いて、α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基をα−１，４グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖を生成する。
（４）切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）から（３）の反応を受けることによって、更に、環状四糖が生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用し、環状四糖の生成量が増加すると推察された。
実験２６＜澱粉液化程度の影響＞
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』（ノボ社製）を澱粉１グラム当たり０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃で２０分間オートクレーブし、約３５℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり２単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当たり２０単位とを加え、３５℃で２４時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３１に示す。
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表３１の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用による環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度に依存し、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度は約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
実験２７＜澱粉部分分解物濃度の影響＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至約５）の最終濃度０．５乃至４０％の水溶液を調製し、それぞれに、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当たり１０単位加え、両酵素を併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３２に示す。
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表３２の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が０．５％の低濃度では、環状四糖の生成量は約６４％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、環状四糖の生成量は約４０％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物が低濃度であるほど高まる傾向にあることが判明した。
実験２８＜シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（濃度１５％）を調製し、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たＣ１１株由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当たり１０単位と、バチルスステアロサーモフィルス由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を固形物１グラム当たり０乃至０．５単位加え、両酵素を併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３３に示す。
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表３３の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅを添加することによって、環状四糖の生成量が増加することが判明した。
実験２９＜イソマルトース遊離酵素の調製＞
デキストラン３．０ｗ／ｖ％、ペプトン０．７ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌し、冷却して、アルスロバクター  グロビホルミスＴ６（ＩＡＭ  １２１０３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、７２時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のイソマルトース遊離酵素としてのイソマルトデキストラナーゼの活性は約１６．５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、本酵素は約１６単位／ｍｌの活性（総活性約２８８，０００単位）であった。尚、イソマルトデキストラナーゼ活性の測定は、濃度０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む濃度１．２５ｗ／ｖ％デキストラン水溶液４ｍｌを基質液とし、その基質液に酵素液１ｍｌ加えて、４０℃で２０分間酵素反応し、その反応液から１ｍｌを採り、それをソモギー銅液２ｍｌに加えて反応を停止させた後、生成したイソマルトースの還元力をソモギー・ネルソン法で定量することにより行った。イソマルトデキストラナーゼの活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのイソマルトースに相当する還元力を生成する酵素量と定義した。培養上清約１８ＬをＵＦ膜で約２Ｌに濃縮した後、８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した。その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液を『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いるイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量２Ｌ）に供した。イソマルトデキストラナーゼ活性は、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した。その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解後、同緩衝液に対して透析して、イソマルトデキストラナーゼ活性として１６１，０００単位を含む部分精製酵素液約５００ｍｌを得た。
実験３０＜α−イソマルトシルグルコ糖質及び環状四糖からのイソマルトースの調製＞
最終固形物濃度０．２％のパノース、α−イソマルトシルマルトース、α−イソマルトシルトリオース、α−イソマルトシルテトラオース、又は環状四糖水溶液に、実験２９の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを、固形物グラム当たり１００単位（環状四糖の場合、１００単位又は３，０００単位）を加えて、４０℃、ｐＨ５．５で２４時間作用させ、１００℃で２０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＭＣＩゲル（ＭＣＩＧＥＬ）ＣＫ０４ＳＳ』カラム（三菱化学株式会社製）を用い、カラム内温度８０℃、溶離液としての水の流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製）を用いて行なった。その結果を表３４に示す。
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表３４の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質にイソマルトデキストラナーゼを作用させた結果、基質としてのパノースからは、グルコースとイソマルトースのみが生成し、基質としてのα−イソマルトシルマルトースからは、イソマルトースとマルトースとのみが生成し、基質としてのα−イソマルトシルトリオースからは、イソマルトースとマルトトリオースのみが生成し、基質としてのα−イソマルトシルテトラオースからは、イソマルトースとマルトテトラオースのみが生成することが判明した。一方、基質としての環状四糖からは、生成物Ａを中間体として、イソマルトースのみが生成することが判明した。
次いで、基質としての環状四糖からの中間体である生成物Ａの精製と単離を行った。即ち、分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＲ３５５−１５Ｓ−１５  １２Ａ』（株式会社ワイエムシイ社製）を用いて生成物Ａを精製し単離することにより、上記の環状四糖からの反応物から、純度９８．２％以上の生成物Ａを固形物当たり収率約７．２％で得た。
生成物Ａについて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析とを行なった。メチル化分析結果は表３５にまとめた。ＮＭＲ分析結果につていては、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４６に示した。又、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４７に示し、それらの帰属を表３６にまとめた。
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これらの結果から、イソマルトデキストラナーゼによる環状四糖からイソマルトースを生成する際の中間体である生成物Ａは、環状四糖のα−１，３結合のいずれか一つが加水分解して開環化した四糖類で、構造式３で表わされるα−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース（開環四糖）であることが判明した。
構造式３：
α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ
以上のことから、イソマルトデキストラナーゼのα−イソマルトシルグルコ糖質に対する作用は以下のように判断される。
イソマルトデキストラナーゼは、基質として、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するα−イソマルトシルグルコ糖質に作用し、その非還元末端のイソマルトシル残基とグルコース（マルトオリゴ糖）残基間のα−１，４結合を特異的に加水分解して、イソマルトースとグルコース（マルトオリゴ糖）とを生成する。又、イソマルトデキストラナーゼは、基質として、環状四糖にも作用し、そのα−１，３結合を加水分解して、開環して、中間体として開環四糖を生成し、さらに、開環四糖にも作用し、そのα−１，３結合を加水分解して、イソマルトースを生成する。
実験３１＜各種基質からのイソマルトースの生成＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びイソマルトデキストラナーゼの作用によるイソマルトースの生成について試験した。即ち、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、又は澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）と塩化カルシウムを用いて、それぞれ水溶液の糖質最終濃度が５％、塩化カルシウム最終濃度が１ｍＭとなるように調製した。次いで、実験７−２で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり０．２単位と、実験２９の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当たり１００単位とを加え、これらを４０℃、ｐＨ５．５で反応させた。反応条件は、下記２つの系で行った。
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を糖質に６５時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、イソマルトデキストラナーゼを６５時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（２）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとを併用で糖質に６５時間作用させた後、両酵素を加熱失活させた。次いで、加熱処理した酵素反応液中のイソマルトース生成量をＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表３７に示す。
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表３７の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質からも、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼの作用によってイソマルトースが生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にイソマルトデキストラナーゼを作用させた場合には、約１５％以下と比較的に低いのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとを共に作用させると、いずれの糖質に於いても、イソマルトースの生成量は向上し、特に、マルトヘプタオース、アミロース、澱粉部分分解物では６０％以上にまで増加することが判明した。このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとの併用におけるイソマルトースの生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推定される。
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、アミロースや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖を生成する。
（２）イソマルトデキストラナーゼは、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基とα−１，４グルカン鎖間α−１，４結合を加水分解して、イソマルトースとグルコース重合度が２減じたグルカン鎖とを生成する。
（３）切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）乃至（２）の反応を受けることによって、新たにイソマルトースが生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとの併用で、上記したように、両酵素が繰り返し作用してイソマルトースの生成量が増加すると推定される。
実験３２＜イソアミラーゼの添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（最終濃度５％、１ｍＭ塩化カルシウム含有）を調製し、実験７−２で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり０．２単位と、実験２９で得たイソマルトデキストラナーゼを澱粉グラム当たり１００単位と、シュードモナス  アミロデラモサス由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり０乃至２５０単位加え、４０℃、ｐＨ５．５で併用で６５時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表３８に示す。
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表３８の結果から明らかなように、イソアミラーゼを添加することによって、イソマルトースの生成量が増加することが判明した。
実験３３＜澱粉部分分解物濃度の影響＞
濃度の異なる８種類の澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至約５）水溶液（最終濃度１乃至４０％の水溶液、１ｍＭ塩化カルシウム含有）を調製し、それぞれに、実験７−２で得たバチルスグロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり０．２単位と、実験２９の方法で得たイソマルトース生成酵素を固形物グラム当たり１００単位と、シュードモナス  アミロデラモサス由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物グラム当たり２５０単位加え、４０℃、ｐＨ５．５で併用で６５時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表３９に示す。
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表３９の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が１％の低濃度では、イソマルトースの生成量は約７３％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、イソマルトースの生成量は約５１％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存してイソマルトースの生成量が変化することが判明した。
実験３４＜澱粉液化程度の影響＞
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃でオートクレーブし、約４０℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに最終澱粉濃度５％、ｐＨ５．５に調整した後、実験７−２で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物グラム当たり０．２単位と、実験２９の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当たり１００単位と、シュードモナスアミロデラモサス由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物グラム当たり２５０単位を加え、４０℃で６５時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表４０に示す。
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表４０の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとによるイソマルトース生成率は、澱粉の液化度の影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からのイソマルトースの生成率は高く、逆に、液化の程度が高い、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からのイソマルトースの生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度はＤＥ約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
実験３５＜シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼとグルコアミラーゼの添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（最終濃度２０％、１ｍＭ塩化カルシウム含有）を調製し、実験７−２で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり０．２単位と、実験２９の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当たり１００単位と、シュードモナス  アミロデラモサ由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり２５０単位と、バチルス  ステアロサーモフィルス由来ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所）を０乃至０．５単位加え、これら酵素を併用して、４０℃、ｐＨ５．５で６５時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、グルコアミラーゼ（商品名『ＸＬ−４』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位加え、５０℃で２４時間作用させた後、１００℃で２０分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表４１に示す。
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表４１の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼの酵素反応系に、ＣＧＴａｓｅを添加することにより、イソマルトースの生成量が増加することが判明した。尚、前記グルコアミラーゼは、ＣＧＴａｓｅ存在下で生成した、イソマルトースに１個以上のＤ−グルコース残基を結合した糖質から、Ｄ−グルコース残基を遊離させてイソマルトースを更に生成させる目的で用いたものである。
実験３６＜イソマルトースの生成＞
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００Ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を澱粉グラム当たり１０単位加えて４８時間反応させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この酵素反応液の一部をとり、ＨＰＬＣ法により環状四糖の生成量を調べたところ、糖組成で約８４％であった。尚、ＨＰＬＣ法は、『ショウデックスＫＳ−８０１カラム』、昭和電工株式会社製）を用いカラム温度６０℃、水の流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０１２』、東ソー株式会社製）を用いて行なった。この酵素反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼ・アマノ』、天野エンザイム株式会社製）を澱粉グラム当たり１５００単位と、グルコアミラーゼ（商品名『ＸＬ−４』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり７５単位とを加えて２４時間反応させて残存する還元性オリゴ糖等を加水分解し、更に、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し、温度９０℃で１時間保持して酵素を失活させ、次いで、不溶物を濾別した。この濾液を逆浸透膜（商品名『ホロセップＨＲ５１５５ＰＩ』、東洋紡績株式会社製）を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って、脱色、脱塩、濾過、濃縮することにより、固形分約３，７００ｇを含む糖液約６．２ｋｇを得た。本糖液を、イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ＋形）型』、オルガノ社製）を充填したカラム（ゲル量約２２５Ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５Ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行った。溶出液の糖組成を前記ＨＰＬＣ法でモニターして、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、これを常法に従って、脱塩、脱色、濾過、濃縮して、固形分約２，５００ｇを含む糖液約７．５ｋｇを得た。本糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．５％であった。得られた環状四糖含有糖液をエバポレーターで濃度約５０％にまで濃縮した後、この濃縮液約５ｋｇを円筒状プラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで降下させて環状四糖を晶析させた。続いて、遠心分離機を用いて分蜜し、環状四糖結晶を湿重量として１，３６０ｇ回収し、更に、６０℃で３時間乾燥して、環状四糖結晶粉末を１，１７０ｇ得た。本結晶粉末の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖結晶粉末の純度は９９．９％以上と極めて高純度であった。
次いで、本環状四糖結晶粉末を脱イオン水に溶解し、濃度１％、ｐＨ５．５、温度５０℃に調整した後、実験２９の方法で調製したイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当たり５００単位加え、ｐＨ５．５、５０℃で７０時間反応させた。９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約５０％に濃縮して、シラップ状イソマルトース高含有物を固形物当たり約９５％の収率で得た。本シラップの糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、固形物当たり、イソマルトース９６．１％、開環四糖２．８％、及びその他の糖質を１．１％含有していた。
本シラップ状イソマルトース含有物（４００ｇ）を常法に従って、アルカリ展開したラネーニッケル（商品名『Ｎ１５４』、日揮化学社製）を固形物グラム当たり０．１グラム加えオートクレーブにいれ、水素圧を１００ｋｇ／ｃｍ２に保ち、１００℃にて４時間攪拌して、続いて１２０℃にて２時間攪拌して水素添加を行った。放冷後、オートクレーブから水素添加物を取り出し、厚さ約１ｃｍの活性炭層に通液することでラネーニッケルを濾過除去し、得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約７３％に濃縮し、この濃縮液を円筒状プラスチック容器に入れ、種晶として結晶イソマルチトール粉末を固形物当たり０．１％加え、緩やかに回転させながら温度３５℃まで約２０時間かけて徐冷しイソマルチトールを晶出させた。続いて、遠心分離機を用いて分蜜し、イソマルチトール結晶を回収し、８０℃で２０時間真空乾燥してイソマルチトール結晶を約１６８ｇ得た。
本品は、純度が、固形物当たり約９９．９％以上のイソマルチトールであった。本品の粉末Ｘ線回折図、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルについて調べた結果を、図４８乃至５０にそれぞれ示す。これらの結果から、本品は、イソマルチトールであると判断された。
以下、実施例Ａに於いて、イソマルトース又はイソマルトース含有糖質、イソマルチトール及び／又はイソマルチトール含有糖質の製造方法について、更に実施例Ｂに於いて、イソマルチトール及び／又はイソマルチトール含有糖質の用途について詳細に説明する。
実施例Ａ−１
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００Ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり１単位と、実験１１−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を澱粉グラム当たり１２単位加えて４８時間反応させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この酵素反応液の一部をとり、ＨＰＬＣ法により環状四糖の生成量を調べたところ、糖組成で約８０％であった。尚、ＨＰＬＣ法は、『ショウデックスＫＳ−８０１カラム』、昭和電工株式会社製）を用いカラム温度６０℃、水の流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０１２』、東ソー株式会社製）を用いて行なった。この酵素反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼ・アマノ』、天野エンザイム株式会社製）を澱粉グラム当たり１５００単位と、グルコアミラーゼ（商品名『ＸＬ−４』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり７５単位とを加えて２４時間反応させて残存する還元性オリゴ糖等を加水分解し、更に、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し、温度９０℃で１時間保持して酵素を失活させ、次いで、不溶物を濾別した。この濾液を逆浸透膜（商品名『ホロセップＨＲ５１５５ＰＩ』、東洋紡績株式会社製）を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って、脱色、脱塩、濾過、濃縮することにより、固形分約３，５００ｇを含む糖液約６．０ｋｇを得た。本糖液をイオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ＋形）型』、オルガノ社製）を充填したカラム（ゲル量約２２５Ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５Ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行った。溶出液の糖組成を前記ＨＰＬＣ法でモニターして、環状四糖の純度が８０％以上の画分を回収し、これを常法に従って、脱塩、脱色、濾過、濃縮して、糖液を得た。
本糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９５．５％であった。得られた環状四糖含有糖液を減圧乾燥して環状四糖含有粉末を得た。次いで、本環状四糖含有粉末を脱イオン水に溶解し、濃度１％、ｐＨ５．５、温度５０℃に調整した後、実験２９の方法で調製したイソマルトース遊離酵素を固形物グラム当たり８０単位加え、ｐＨ５．５、５０℃で７０時間反応させた。９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約４３．０％に濃縮して、シラップ状イソマルトース高含有物を固形物当たり約９５％の収率で得た。本シラップの糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、固形物当たり、イソマルトースを４３．１％、開環四糖を３７．８％、環状四糖を１３．８％含んでいた。
本品は、優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−２
実施例Ａ−１の方法で得られた環状四糖含有粉末を脱イオン水に溶解し、濃度１％、ｐＨ５．５、温度５０℃に調整した後、実験２９の方法で調製したイソマルトース遊離酵素を固形物グラム当たり５００単位加え、ｐＨ５．５、５０℃で７０時間反応させた。９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約７５％に濃縮して、シラップ状イソマルトース高含有物を固形物当たり約９０％の収率で得た。本シラップの糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、固形物当たり、イソマルトース９２．８％、開環四糖２．７％、及びその他の糖質を４．５％含有していた。
本品は、優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−３
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約５０℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり０．２単位と、実験２９の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当たり１００単位と、シュードモナス  アミロデラモサ由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり２５０単位と、バチルス  ステアロサーモフィラス由来ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所）を０．５単位加え、５０℃、ｐＨ５．５で６５時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、グルコアミラーゼ（商品名『ＸＬ−４』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位加え、５０℃で２４時間作用させた後、１００℃で２０分間熱処理して酵素を失活させた。反応物を冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約６０％に濃縮して、イソマルトース高含有シラップを固形物当たり約９５％の収率で得た。本シラップの糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、固形物当たり、イソマルトースを６２．９％、グルコースを３０．１％、その他の糖を７．０％含んでいた。
本品は、優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−４
実施例Ａ−３の方法で得られたイソマルトース高含有シラップを原糖液とし、イソマルトースの純度を高めるため、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０』（Ｎａ＋形）、オルガノ株式会社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行なった。即ち、前記樹脂を内径１２．５ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム１０本に充填し、これらカラムを直列接続して樹脂層全長を１６ｍとした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、前記シラップを樹脂量に対して１．５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターしながら、イソマルトース高含有画分を採取し、これを精製し、濃度約７５％まで濃縮して、固形物当たり、グルコース４．３％、イソマルトース９０．５％、その他の２糖類を３．５％、３糖類以上を１．７％含有するイソマルトース高含有シラップを固形物当たり約４５％の収率で得た。
本品は、優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−５
実施例Ａ−１の方法で得られたシラップ状イソマルトース含有物を実験３６の方法に準じて水素添加した後、常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約７３％に濃縮し、これを常法に従って噴霧乾燥してイソマルチトール４３．３％、還元開環四糖３７．８％、環状四糖１３．８％、及びソルビトールなどの他の糖アルコールを３．５％含むイソマルチトール高含有粉末を約８０％の収率で得た。
本品は、実質的に非還元性で、非メイラード性、非吸湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−６
タピオカ澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実験４−２の方法で得たバチルスグロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり０．２単位と、実験２９の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを澱粉グラム当たり１００単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり２５０単位と、ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり０．５単位になるように加え、ｐＨ５．５、温度４０で６４時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、温度５０℃に調整した後、グルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物グラム当たり１０単位加え、２４時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に濃度約５０％（ｗ／ｖ）まで濃縮し、グルコース１１．０％、イソマルトース６６．５％、その他の２糖類を２．４％、３糖類以上を２０．１％含有するイソマルトース高含有シラップを固形物当たり約９５％の収率で得た。
次いで、本イソマルトース高含有シラップを実験３６の方法に準じて水素添加した後、常法に従って、ラネーニッケルを除去し、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に濃縮、真空乾燥してイソマルチトール高含有粉末を固形物当たり約８５％の収率で得た。
本品は、ソルビトール１２．３％、イソマルチトール６６．７％、その他の糖アルコールを２１．０％含有していた。本品は、非還元性、非メイラード性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−７
バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を実験１の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を８．８単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を２６．７単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。とうもろこし澱粉を濃度約２７％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約４の液化液を得、これに上記α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉グラム当たり０．２５ｍｌの割合になるように加え、更に実験２９の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを澱粉グラム当たり１００単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり２５０単位と、ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり０．５単位となるように加え、ｐＨ５．５、温度４０℃で７０時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、温度５０℃に調整した後、グルコアミラゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位加え、２４時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に濃度約５０％まで濃縮して、固形物当たり、グルコース３２．６％、イソマルトース５９．４％、その他の２糖類を１．２％、３糖類以上を６．８％含有するイソマルトース高含有シラップを固形物当たり約９５％の収率で得た。
次いで、本イソマルトース高含有シラップを実験３６の方法に準じて水素添加した後、常法に従って、ラネーニッケルを除去し、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に濃度約５０％まで濃縮してイソマルチトール高含有シラップを固形物当たり約８５％の収率で得た。
本品は、固形物当たり、ソルビトール３３．４％、イソマルチトール５９．１％、その他の糖アルコールを６．４％、環状四糖を１．１％含有していた。本品は、非還元性、非メイラード性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−８
実施例Ａ−７の方法で得られたイソマルトース高含有シラップを原糖液とし、イソマルトースの純度を高めるため、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０』（Ｎａ＋形）、オルガノ株式会社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行なった。即ち、前記樹脂を内径１２．５ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム１０本に充填し、これらカラムを直列接続して樹脂層全長を１６ｍとした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、前記シラップを樹脂量に対して１．５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターしながら、イソマルトース高含有画分を採取し、これを精製し、濃度約５５％まで濃縮して、固形物当たり、グルコース４．８％、イソマルトース８８．０％、その他の２糖類を４．１％、３糖類以上を３．１％含有するイソマルトース高含有シラップを固形物当たり約５５％の収率で得た。
次いで、得られたイソマルトース高含有シラップを実験３６の方法に準じて水素添加した後、常法に従って、ラネーニッケルを除去し、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、ソルビトール４．９％、イソマルチトール８８．１％、その他の糖アルコールを７．０％含有するイソマルチトール高含有シラップを固形物当たり約９０％の収率で得た。
本イソマルチトール高含有シラップを濃度約７３％に濃縮し、この濃縮液を晶析缶に入れ、種晶として結晶イソマルチトール粉末を固形物当たり０．１％加え、温度２５℃、約２０時間でイソマルチトールを晶析させた。続いて、遠心分離機を用いて分蜜し、イソマルチトール結晶と蜜とを別々に回収した。イソマルチトール結晶を８０℃で２０時間真空乾燥して、イソマルチトール結晶粉末を固形物当たり約３９％の収率で得た。蜜は、イソマルチトールの純度を高めるため、前記方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行ない、固形物当たり、イソマルチトール約８８％含有するイソマルチトール高含有画分を採取し、これを精製し、濃縮し、結晶化し、分蜜してイソマルチトール結晶を回収し、熟成し、真空乾燥し、イソマルチトール結晶粉末を固形物当たり約２０％の収率で得、この結晶粉末と、先に得ていた結晶粉末とをよく混合することにより、両収率を合計して約５９％の固形物収率でイソマルチトール結晶粉末を得た。
本品は、固形物当たり、ソルビトール０．７％、イソマルチトール９８．０％、その他の糖アルコールを１．３％含有していた。本品は、非還元性、非吸湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−９
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００Ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり１単位と、実験１１−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を澱粉グラム当たり１２単位加えて４８時間反応させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この酵素反応液の一部をとり、ＨＰＬＣ法により環状四糖の生成量を調べたところ、糖組成で約８０％であった。尚、ＨＰＬＣ法は、『ショウデックスＫＳ−８０１カラム』、昭和電工株式会社製）を用いカラム温度６０℃、水の流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０１２』、東ソー株式会社製）を用いて行なった。この酵素反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼ・アマノ』、天野エンザイム株式会社製）を澱粉グラム当たり１５００単位と、グルコアミラーゼ（商品名『ＸＬ−４』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり７５単位とを加えて２４時間反応させて残存する還元性オリゴ糖等を加水分解し、更に、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し、温度９０℃で１時間保持して酵素を失活させ、次いで、不溶物を濾別した。この濾液を逆浸透膜（商品名『ホロセップＨＲ５１５５ＰＩ』、東洋紡績株式会社製）を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って、脱色、脱塩、濾過、濃縮して糖液を得た。本糖液を、濃度１％、ｐＨ５．５、温度５０℃に調整した後、実験２９の方法で調製したイソマルトデキストラーゼを固形物グラム当たり８０単位加え、ｐＨ５．５、５０℃で７０時間反応させた。９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約４３．０％に濃縮して、シラップ状イソマルトース含有物を固形物当たり約９５％の収率で得た。本シラップの糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、固形物当たり、イソマルトースを約３５．５％含んでいた。本シラップ状イソマルトース含有物を実験３６の方法に準じて水素添加した後、常法に従ってラネーニッケルを除去し、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、濃度約４０％まで濃縮し、この濃縮液をイオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ＋形）型』、オルガノ社製）を充填したカラム（ゲル量約２２５Ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５Ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行った。溶出液の糖組成を前記ＨＰＬＣ法でモニターして、イソマルチトールの純度が５０％以上の画分を回収し、これを常法に従って、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に脱色、濾過して、固形物濃度約５０％まで濃縮して、固形物当たりイソマルチトール６５．３％、還元開環四糖１３．８％、環状四糖５．２％、及びソルビトールなどの他の糖アルコールを１５．７％含むイソマルチトール高含有シラップを固形物当たり約７８％の収率で得��。
本品は、非メイラード性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ａ−１０
実施例Ａ−８で得られたソルビトール４．９％、イソマルチトール８８．１％、その他の糖アルコールを７．０％含有するイソマルチトール高含有シラップを濃度約８８％に濃縮した後、助晶缶にとり、イソマルチトール粉末結晶を２％加えて５０℃とし、ゆっくり攪拌しながら２時間保った後、バットに移し、２０℃で４日間静置して、晶出固化させ、次いで切削型粉砕機で粉砕し、乾燥してイソマルチトール結晶粉末を収率約９０％で得た。
本品は、非還元性、非吸湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
実施例Ｂ−１＜甘味料＞
実施例Ａ−８の方法により得たイソマルチトール結晶粉末０．８重量部に、α，α−トレハロース含水結晶（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）０．２重量部、α−グリコシルステビオシド（商品名『αＧスィート』、東洋精糖株式会社販売）０．０１重量部、及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、難吸湿性で優れた保湿性、低甘味性を有し、室温保存下、変質劣化の懸念のない安定なイソマルチトール含有甘味料である。
実施例Ｂ−２＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例Ａ−７の方法で得たイソマルチトール高含有シラップ５０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形してハードキャンディーを得た。本品はメイラード反応による着色が少なく、歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起きず、吸湿性少ない安定で高品質のハードキャンディーである。
実施例Ｂ−３＜チューインガム＞
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水結晶マルチトール２重量部、キシリトール２重量部、実施例Ａ−７の方法で得たイソマルチトール高含有シラップ２重量部、及びα，α−トレハロース含水結晶１重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装してチューインガムを得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューインガムとして好適である。
実施例Ｂ−４＜チョコレート＞
カカオペースト４０重量部、カカオバター１０重量部、及び実施例Ａ−８の方法で得たイソマルチトール結晶粉末５０重量部を混合し、得られる混合物をレファイナーに通して粘度を下げた後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げた。この間にレシチン０．５重量部を添加し充分に分散させた。次いで、温度調節器で３１℃に調節し、バターの固まる直前に型に流し込み、振動機でアワ抜きした後、１０℃の冷却トンネルを２０分間かけて通過させて固化させた。これを型抜きして包装してチョコレートを得た。
本品は、吸湿性がなく、色、光沢共に良く、内部組織も良好であり、口中で滑らかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味とを有する。また、本品は、低カロリー、低う蝕性チョコレートとして有用である。
実施例Ｂ−５＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（商品名『ハイニュートＳ』、不二製油株式会社販売）１重量部に、実施例Ａ−６の方法で得たイソマルチトール高含有シラップ２重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は、メイラード反応による着色や品質劣化が少なく、低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸材料、健康食品材料としても有用である。
実施例Ｂ−６＜浴用剤＞
ユズの皮ジュース１重量部に対して、実施例Ａ−１０の方法で得たイソマルチトール結晶粉末１０重量部、環状四糖無水結晶１０重量部の割合で混合し、環状四糖５乃至６含水結晶を晶出、熟成させた後、粉末化して、ユズの皮エキス含有イソマルチトール・環状四糖粉末を得た。
本粉末５重量部に、焼塩９０重量部、α，α−トレハロース含水結晶２重量部、無水ケイ酸１重量部及びα−グルコシル  ヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジン』、株式会社林原販売）０．５重量部を混合して浴用剤を製造した。
本品は、ユズの香りも豊かで、入浴用の湯に１００乃至１０，０００倍に希釈して利用すればよく、入浴後は、肌がしっとりしなめらかで、湯冷めしない高品質の浴用剤である。
実施例Ｂ−７＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−７の方法で得たイソマルチトール高含有シラップ２重量部、α−グルコシル  ルチン（商品名『αＧルチン』、株式会社林原販売）１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリン１０重量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部および精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
実施例Ｂ−８＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２５重量部、ポオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、実施例Ａ−７の方法で得たイソマルチトール高含有シラップ１５重量部、サッカリン０．０２重量部および防腐剤０．０５重量部を水１３重量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
実施例Ｂ−９＜流動食用固体製剤＞
実施例Ａ−５の方法で得たイソマルチトール高含有粉末１００重量部、α，α−トレハロース含水結晶２００重量部、マルトテトラオース高含有粉末２００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして流動食用固体製剤を得た。
本品は、整腸作用に優れた流動食である。使用に際しては、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解し、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管投与して用いることができる。
実施例Ｂ−１０＜錠剤＞
アスピリン５０重量部に実施例Ａ−８の方法で得たイソマルチトール結晶粉末１４重量部、コーンスターチ４重量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。
本品は、イマルチトールの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。
実施例Ｂ−１１＜糖衣錠＞
重量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実験３６の方法で得た結晶イソマルチトール４０重量部、プルラン（平均分子量２０万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部および酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて、錠剤重量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、環状四糖５乃至６含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部および水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
実施例Ｂ−１２＜外傷治療用膏薬＞
実施例Ａ−７の方法で得たイソマルチトール高含有シラップ１００重量部およびマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、イソマルチトールにより、ヨウ素、メタノールの揮散が防止され、経時変化の少ない商品価値の高い膏薬である。
又、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明は、イソマルトース及びイソマルチトールの新規な製造方法とそれらの用途に関し、より詳細には、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）及び／又はアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）由来のα−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下で、グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）、及びアルスロバクター  ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）由来の一種又は二種以上のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質、及び／又は、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法；非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の存在下又は非存在下で、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有する、グルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質、及び／又は、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、これをそのまま又はイソマルトースを採取した後に水素添加してイソマルチトールを生成させ、この生成したイソマルチトールを採取することを特徴とするイソマルチトールの製造方法；及び、イソマルトース及び／又はイソマルチトール含有混合糖質、及びそれらの用途に関する発明である。斯かる本発明によれば、斯界に於いて有用なイソマルチトール及び／又はイソマルチトール含有混合糖質を工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る。斯かる本発明によるイソマルチトール及び／又はイソマルチトール含有混合糖質は、非還元性で非メイラード反応性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明である。
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【図面の簡単な説明】
第１図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた糖質を高速液体クロマトグラフィーにかけたときの溶出パターンを示す図である。
第２図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
第３図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
第４図は、環状四糖の構造が、サイクロ｛→６｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→）であることを示す図である。
第５図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第６図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第７図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第８図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第９図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第１０図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１１図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第１２図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第１３図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第１４図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１５図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第１６図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第１７図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第１８図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１９図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第２０図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第２１図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第２２図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第２３図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第２４図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第２５図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第２６図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第２７図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第２８図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第２９図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第３０図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第３１図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第３２図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第３３図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第３４図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第３５図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第３６図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第３７図は、組換えＤＮＡの『ｐＡＧＡ４』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
第３８図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第３９図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第４０図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第４１図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第４２図は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４３図は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４４図は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４５図は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４６図は、生成物Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４７図は、生成物Ａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４８図は、本発明の製造方法により得られた結晶イソマルチトールの粉末Ｘ線回折図を示す図である。
第４９図は、本発明の製造方法により得られた結晶イソマルチトールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第５０図は、本発明の製造方法により得られた結晶イソマルチトールのの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【国際調査報告】
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