(57)【要約】本発明者らは、抗ＲＣＡＳ１抗体が、ＲＣＡＳ１タンパク質発現細胞であるヒト卵巣癌細胞に対して補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を有することを見出した。このことは、抗ＲＣＡＳ１抗体が、腫瘍細胞の傷害という作用機序を有する抗腫瘍剤になりうることを示している。本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍の治療において有効な抗腫瘍剤になりうるものと大いに期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分として含有する細胞傷害活性を有する薬剤。
【請求項２】
抗腫瘍剤である請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性である、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
細胞傷害活性が抗体依存性細胞性細胞傷害活性である、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項５】
抗体がＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項６】
抗体がヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
抗ＲＣＡＳ１抗体を投与することを特徴とする、細胞に傷害を引き起こす方法。
【請求項８】
抗ＲＣＡＳ１抗体を投与することを特徴とする、細胞の傷害による腫瘍抑制方法。
【請求項９】
抗体がＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体である請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞傷害活性を有する薬剤に関する。
背景技術
ＲＣＡＳ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ＳｉＳｏ）タンパク質はヒト癌細胞の表面に発現する膜抗原分子である。すでに、ＲＣＡＳ１のｃＤＮＡは、クローニングされており（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：９３８−９４２，１９９９）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等の免疫細胞にはＲＣＡＳ１受容体が存在していることが知られている。
癌細胞に発現するＲＣＡＳ１は、免疫細胞などのＲＣＡＳ１受容体陽性細胞の増殖を抑制するとともに、これらの免疫細胞にアポトーシスによる細胞死を誘導することにより、癌細胞の免疫機構からのエスケープに関係していることが報告されている（上記Ｎａｋａｓｈｉｍａらの文献、渡辺武，実験医学，１７：２５５８−２５６０）。
また、Ｎａｋａｓｈｉｍａらの文献では、ＲＣＡＳ１を認識するモノクローナルＩｇＭ抗体（２２−１−１抗体）により、ＲＣＡＳ１と受容体陽性細胞との結合が阻害され、ＲＣＡＳ１による免疫細胞増殖抑制効果が阻害されたことが報告されている。これによりＮａｋａｓｈｉｍａらは、「ＲＣＡＳ１の作用を阻止する抗体の開発は癌に対する有望な治療に結びつくかもしれない」ことを示唆している（上記「実験医学」２５６０頁）。
しかしながら、これまでに、抗ＲＣＡＳ１抗体がＲＣＡＳ１タンパク質を発現している細胞に対して、直接的に傷害を引き起こすことについては全く知られていなかった。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗ＲＣＡＳ１抗体がＲＣＡＳ１タンパク質を発現している細胞に対して、直接的に傷害を引き起こすことを見出すことにある。より詳しくは、本発明は、抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分とする細胞傷害活性を有する薬剤、該抗体を有効成分とする抗腫瘍剤、並びに、該抗体を投与することを特徴とする細胞に傷害を引き起こす方法を提供することにある。
本発明者らは、抗ＲＣＡＳ１抗体の機能を解明する過程で、抗ＲＣＡＳ１抗体が、ＲＣＡＳ１タンパク質発現細胞を直接的に傷害する機能を有することを新たに見出した。具体的には、抗ＲＣＡＳ１抗体が、ＲＣＡＳ１タンパク質発現細胞であるヒト卵巣癌細胞に対して補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を有することを明らかにした。このことは、抗ＲＣＡＳ１抗体が、腫瘍細胞の傷害という作用機序を有する抗腫瘍剤になりうることを示している。上記の抗腫瘍剤は、腫瘍の治療において有効な抗腫瘍剤になりうるものと大いに期待される。
即ち、本発明は、抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分とする細胞傷害活性を有する薬剤、該抗体を有効成分とする抗腫瘍剤、並びに、該抗体を投与することを特徴とする細胞に傷害を引き起こす方法に関し、より具体的には、
〔１〕  抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分として含有する細胞傷害活性を有する薬剤、
〔２〕  抗腫瘍剤である〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕  細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性である、〔１〕または〔２〕に記載の薬剤、
〔４〕  細胞傷害活性が抗体依存性細胞性細胞傷害活性である、〔１〕または〔２〕に記載の薬剤、
〔５〕  抗体がＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の薬剤、
〔６〕  抗体がヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片からなる群より選択される、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕  抗ＲＣＡＳ１抗体を投与することを特徴とする、細胞に傷害を引き起こす方法、
〔８〕  抗ＲＣＡＳ１抗体を投与することを特徴とする、細胞の傷害による腫瘍抑制方法、
〔９〕  抗体がＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体である〔７〕または〔８〕に記載の方法、
〔１０〕  抗体がヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片からなる群より選択される、〔７〕〜〔９］のいずれかに記載の方法、を提供するものである。
本発明者らは、抗ＲＣＡＳ１抗体が、細胞傷害活性を有することを初めて明らかにした。よって、本発明は、抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分として含有する細胞傷害活性を有する薬剤を提供する。
本発明において抗ＲＣＡＳ１抗体が細胞傷害活性を示す細胞は、ＲＣＡＳ１タンパク質を発現している細胞であり、好ましくは腫瘍細胞を挙げることができる。具体的には、子宮腺癌、子宮扁平上皮癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、食道癌、膵臓癌、乳癌等が挙げられ、特に浸潤性の強い腫瘍細胞が好適な標的細胞となり得る。よって本発明の抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分として含有する細胞傷害活性を有する薬剤には、細胞傷害活性を有する抗腫瘍剤が含まれる。
本発明における細胞傷害活性とは、例えば、補体依存性細胞傷害活性、抗体依存性細胞性細胞傷害活性等を挙げることができる。本発明において、補体依存性細胞傷害活性とは補体系による細胞傷害活性を意味し、抗体依存性細胞性細胞傷害活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着したさい、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。抗ＲＣＡＳ１抗体が、補体依存性細胞傷害活性を有するか否かは、例えば実施例に記載のような方法で判定することができる。また、抗ＲＣＡＳ１抗体が、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性（抗体依存性マクロファージ介在性細胞傷害活性）を有するか否かは、当業者においては一般的な方法に従って測定することが可能である。
本発明において、「抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分として含有する」とは、抗ＲＣＡＳ１抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗ＲＣＡＳ１抗体の含有率を制限するものではない。
さらに本発明は、抗ＲＣＡＳ１抗体を投与することを特徴とする細胞に傷害を引き起こす方法、ならびに抗ＲＣＡＳ１抗体を投与することを特徴とする細胞の傷害による腫瘍抑制方法を提供する。
上記方法における抗ＲＣＡＳ１抗体の投与の形態としては、例えば、後述の製剤化した本発明の薬剤の経口投与または非経口投与の形態を挙げることができる。
本発明において、抗ＲＣＡＳ１抗体としては、特に制限はないが、好ましくは、ヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）等が挙げられる。また、抗ＲＣＡＳ１抗体のアイソタイプとしては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等が挙げられるが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭである。
また、本発明の上記「ヒト型化抗体」とはマウス等のヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造で置き換えた抗体を言う。キメラ抗体とは、異種抗体由来のＦａｂ領域とＦｃ領域とを有する抗体を意味する。
また、本発明における抗ＲＣＡＳ１抗体としては、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体を用いることも可能である。
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む慣用な（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を有する限り、このような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、それぞれ１つの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。
ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、及び、重鎖の細胞の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で異なる。
本発明において、「ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖中で２つのドメインの間を結合できない位に短いリンカーを用いると、２つのドメインはもう一方の鎖の定常ドメインとペアを形成し、２つの抗原結合部位が創り出される。Ｄｉａｂｏｄｙはより詳細に、例えば、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、及びＨｏｌｌｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））に記載される。
一本鎖抗体（以下、一本鎖Ｆｖ若しくはｓＦｖとも呼ぶ）、またはｓＦｖ抗体断片には、抗体のＶＨ及びＶＬドメインが含まれ、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、それによりｓＦｖは、抗原結合のために必要な構造が形成できる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））参照。
多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体）、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）であり得る。
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹膜内（ｉｐ）注射により非ヒト哺乳動物で作られる。免疫化される種に対して免疫原性の蛋白質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、仔ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、例えば、マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、塩化チオニル、若しくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＣＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）等の二機能性の薬剤若しくは誘導剤を用いて関連抗原を結合させることもできる。
例えば、１００μｇ若しくは５μｇの蛋白質若しくはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスについての量）を３倍量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバントと合わせ、溶液を複数回、皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化する。一ヶ月後、動物をもとのＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの１／５〜１／１０量を複数の部位に皮下注射することにより追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。好ましくは、動物の追加免疫の際には、同じ抗原ではあるが異なる蛋白質に、及び／または、異なる交差結合試薬を介して結合されたコンジュゲートを用いる。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養蛋白質融合で作成することもできる。また、免疫応答を増幅するため、ミョウバン等の凝集剤が好ましくは用いられる。選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、及び競合分析（例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。
所望のポリクローナル抗体のスクリーニング法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｙ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅｅｄｉｔ．（１９８８））に記載されるような慣用の交差結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５））を行ってもよい。ポリペプチドまたは抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量化を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて抗体の１若しくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。
モノクローナル抗体は単一の抗原部位を認識する抗体であり、均一な特異性により、一般的に多数の異なる抗原部位を認識する抗体を含むポリクローナル抗体よりも有用である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））または、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）等により製造することができる。
ハイブリドーマ法では、マウス、または、ハムスター若しくはアカゲザル等の他の適当な宿主動物を免疫化に使用した蛋白質に対して特異的に結合する抗体を産生するか、または、産生できるリンパ球を誘導するために上述と同様に免疫化する。また、公知の方法によりＲＣＡＳ１遺伝子を阻害したＲＣＡＳ１ノックアウトマウス等のＲＣＡＳ１ノックアウト動物を用いて免疫化を行うことも可能である。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてリンパ球を免疫化することもできる。その後、リンパ球をポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９０−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））。製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の生育または成長を阻害する１またはそれより多くの物質を含む適当な培養培地に植え、生育する。例えば、もし親ミエローマ細胞がヒポキサンチン  グアニン  ホスホリボシル  トランスフェラーゼ酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマのための培養培地には、典型的には、ＨＧＲＰＴ欠損細胞の生育を阻止する物質ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンが含まれる（ＨＡＴ培地）。好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞において、安定で高いレベルで抗体を産生し、そして、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性の細胞である。これらの中で好ましいミエローマセルラインは、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）から入手できるＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞、並びに、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡ）から入手できるＳＰ−２、またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウスミエローマラインである。ヒトミエローマ、及び、マウス−ヒトｈｅｔｅｒｏｍｙｃｌｏｍａセルラインも、ヒトモノクローナ抗体の産生に用いられてきた（Ｋｏｚｂａｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
次に、ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、または、放射免疫分析（ＲＩＡ）若しくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合分析により測定する。所望の特異性、親和性及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限定的希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により生育する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目的に適した培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＩＭ−１６４０培地である。さらに、ハイブリドーマ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物中の腹水腫瘍として生育させることもできる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、好ましくは培養培地、腹水液、または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー等の慣用な免疫グロブリン精製方法により分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリン蛋白を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１））、及びＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））は、各々、ファージライブラリーを用いたマウス及びヒト抗体の単離について記載する。次の文献は、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））について、そして、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染、及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））について記載する。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖、及び軽鎖の定常ドメインのコード配列をそれに対するマウス配列に代えて置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンポリペプチドを共有結合により結合させることにより改変することができる。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、１つの抗原に対して特異性を有する抗原結合部位、及び、異なる抗原に対して特異性を有する抗原結合部位を有するキメラ二特異性抗体を構築するため、抗体の定常ドメインで置換するか、または、抗体の抗原結合部位の可変ドメインを置換する。
従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５））が、現在は組換技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片の形態に化学的結合させることもできる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。さらにまた別の方法としては、Ｆ（ａｂ’）２断片を直接、組換宿主培養物から単離することもできる。その他、一本鎖抗体等の断片の作製方法も公知である一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。
当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現を含むものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ（クワドローマ）は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するるものを選択する必要がある。選択はアフィニティークロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖−軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる。該分離方法については、ＷＯ９４／０４６９０参照。二特異性抗体の作成方法については、さらに、Ｓｕｒｅｓｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６））の方法を参照することができる。組換細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らしヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常ドメインのＣＨ３を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の１若しくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きさ側鎖のアミノ酸を小さなもの（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（ＷＯ９６／２７０１１）。
二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第４，６７６，９８０号；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）。このようなヘテロ共役抗体の作成に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号にもそのような例が記載されている。
また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずＦ（ａｂ’）２断片を作成し、同一分子内でのジフルフィド形成を防ぐため断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にＦ（ａｂ’）２断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のＦ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体をＦａｂ’−チオールに再還元した後、Ｆ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体及びＦａｂ’−チオールを等量混合し二特異性抗体を製造する。
組換細胞培養物から直接、二重特異性抗体を製造し、単離する方法も種々、報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。まず、Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体ヘテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、これら２つのドメイン間での対形成できない位に短いリンカーを介して連結し、相補的な別のＶＬ及びＶＨドメンと対を形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させる方法もある（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）を用いたダイマーについても報告されている（Ｇｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
ヒト型化抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。用いるヒト型化抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト型化抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公知である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）；特表平４−５０４３６５号公報：特表平７−５０９１３７号公報；日経サイエンス６：４０−５０（１９９５）；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；特表平６−５００２３３号公報等）。該ヒト型化抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物は具体的には、次のような手順により製造することができる：
（１）非ヒト哺乳動物の内在性免疫グラブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等）で置換することにより該動物内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が機能的に不活性化されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（２）非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン等）で置換することによる該動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子（特にκ鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（３）酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターに用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（４）ＹＡＣ等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（５）前期（１）〜（４）のノックアウト非ヒト哺乳動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物を任意の順序で交配することにより、非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び非ヒト哺乳動物内在性免疫黒部チン軽鎖遺伝子座がともに機能的に不活性化され、且つヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域及びヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所望の領域が共に非哺乳動物染色体上に組込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程。
上述のように、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）で相同組換えにより置換することにより該遺伝子座が再構成できないように不活性化することができる。該相同組換えを用いた不活性化には、例えば、ポジティブ・ネガティブ・セレクション（ＰＮＳ）と呼ばれる方法を用いることができる（日経サイエンス５：５２−６２（１９９４））。また、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の機能的な不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成でき、免疫グロブリン軽鎖（例えばκ鎖）の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
トランスジェニック動物は、通常の方法により製造することができる（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１から４０８頁（１９９０））。具体的には、例えば、正常な非ヒト動物胚盤胞に由来するヒポキサンチングアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）陰性胚性幹（ＥＳ）細胞を、該ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子またはその一部並びにＨＲＰＴ遺伝子が挿入されたＹＡＣベクターを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合する。該外来遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をＨＡＴセレクションにより選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を別の正常非ヒト哺乳動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１２）：７３８０−７３８４（１９８０）；米国特許第４，８７３，１９１号）。該胚盤胞を仮親となる別の非ヒト哺乳動物の子宮に移植することにより、キメラトランスジェニック非ヒト哺乳動物が誕生する。該キメラ動物を正常な非ヒト哺乳動物と交配させ、ヘテロトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得る。該ヘテロ動物同士を交配することにより、メンデルの法則に従い、ホモトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより宿主を形質転換して得られる遺伝子組換え宿主であって、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する宿主を培養することにより培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は受精卵以外の真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞である。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
抗体には治療目的として各種試薬を結合して使用することもできる。このような試薬としては、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、放射核種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ解毒素などのトキシン類を挙げることができる。治療用試薬との結合体を生産する方法および治療用に使用する方法については、米国特許５０５７３１３号、米国特許５１５６８４０号に記載されている。
本発明の薬剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。
本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状、虚血性心不全の種類や進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定されるものであるが、一般に大人では、１日当たり、０．１〜２０００ｍｇを１〜数回に分けて経口投与することができる。より好ましくは１〜１０００ｍｇ／日、更により好ましくは５０〜５００ｍｇ／日、最も好ましくは１００〜３００ｍｇ／日である。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
（１）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）をヒトアルブミンベロナール緩衝液（ｈｕｍａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｖｅｒｏｎａｌ  ｂｕｆｆｅｒ；ＨＡＶＢ、１４５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．８２ｍｍｏｌ／Ｌバルビタールナトリウム、３．１２ｍｍｏｌ／Ｌバルビタール、０．２％ヒト血清アルブミン、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、２．６８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、５．５５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース）にて２．５倍希釈し、補体溶液とした。
（２）標的細胞の調製
ＲＣＡＳ１発現ヒト卵巣癌細胞株ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ（ＪＣＲＢ  Ｎｏ．ＪＣＲＢ００９８、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に６×１０４個／ウェルの細胞濃度で播種した。培地には１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いた。炭酸ガスインキュベーター内で３７℃にて３日間培養することにより、細胞をプレートに付着させた。培養後上清を除去し、５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を０．１ｍＣｉ／ｍＬの濃度で添加した同培地を５０μＬ／ウェル加えた。１時間培養後、細胞をＨＡＶＢにて３回洗浄した。洗浄後、ＨＡＶＢを５０μＬ／ウェル加え標的細胞とした。
（３）ＲＣＡＳ１発現細胞に対する抗ＲＣＡＳ１抗体の補体依存性細胞傷害活性の測定
補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）活性の測定は文献（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３）に記載の方法に従った。
具体的には、抗ＲＣＡＳ１抗体（２２−１−１抗体、ＭＢＬ社製）をＨＡＶＢにて希釈し、標的細胞に５０μＬ／ウェル加え、氷上にて１５分間反応させた。その後、補体溶液を１００μＬ／ウェル加え、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃にて９０分間培養した。抗体の終濃度は０〜３１．６μｇ／ｍＬとした。培養後、１００μＬ／ウェルの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡ  ＩＩ  ＡＵＴＯ−ＧＡＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定した。ＣＤＣ活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めた。Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えたウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含むウェルの放射活性（ｃｐｍ）を示す。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて行い、平均値および標準偏差を算出した。検討の結果、抗ＲＣＡＳ１抗体はヒト卵巣癌細胞株ＫＵＲＡＭＯＣＨＩに対してＣＤＣ活性を示した（図１）。陰性対照に用いた５０％グリセロール含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）は明確なＣＤＣ活性を示さなかった。
産業上の利用の可能性
本発明によって、抗ＲＣＡＳ１抗体を有効成分とする細胞傷害活性を有する薬剤、および該抗体を有効成分とする抗腫瘍剤が提供された。上記の薬剤は、腫瘍の治療において非常に有効であるものと大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗ＲＣＡＳ１抗体のＫＵＲＡＭＯＣＨＩ細胞株に対するＣＤＣ活性を示す図である。白丸は抗ＲＣＡＳ１抗体、黒丸は陰性対照の５０％グリセロール含有リン酸緩衝生理食塩水を表す。
【図１】
2003028761.tif 000002
【国際調査報告】
2003028761.tif 000003
2003028761.tif 000004
2003028761.tif 000005
2003028761.tif 000006
2003028761.tif 000007
2003028761.tif 000008
2003028761.tif 000009