(57)【要約】血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒト組織因子阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤、及びヒト組織因子阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用の中和剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒト組織因子阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤。
【請求項２】
ヒト組織因子阻害剤が抗ヒト組織因子抗体である請求項１記載の製剤。
【請求項３】
抗ヒト組織因子抗体がヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項２記載の製剤。
【請求項４】
ヒト型化抗ヒト組織因子抗体が配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項３記載の製剤。
【請求項５】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒト組織因子阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向の抑制剤。
【請求項６】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒト組織因子阻害剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）延長作用の中和剤。
【請求項７】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とし、ヒト組織因子阻害剤と同時に、又はヒト組織因子阻害剤の投与後に投与することを特徴とする出血あるいは出血傾向の抑制剤。
【請求項８】
ヒト組織因子阻害剤と、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤とを含む抗血栓剤。
【請求項９】
ヒト組織因子阻害剤が抗ヒト組織因子抗体である請求項８記載の抗血栓剤。
【請求項１０】
抗ヒト組織因子抗体がヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項９記載の抗血栓剤。
【請求項１１】
ヒト型化抗ヒト組織因子抗体が配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項１０記載の抗血栓剤。
【請求項１２】
ヒト組織因子阻害剤と、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を含む医薬キット。
【請求項１３】
ヒト組織因子阻害剤が抗ヒト組織因子抗体である請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
抗ヒト組織因子抗体がヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
ヒト型化抗ヒト組織因子抗体が配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
ヒト組織因子阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用の抑制剤。
【請求項１７】
ヒト組織因子阻害剤が抗ヒト組織因子抗体である請求項１６の製剤。
【請求項１８】
抗ヒト組織因子抗体がヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項１７の製剤。
【請求項１９】
ヒト型化抗ヒト組織因子抗体が配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項１８の製剤。
【請求項２０】
ヒト組織因子阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制剤。
【請求項２１】
ヒト組織因子阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用の中和剤。
【請求項２２】
ヒト組織因子阻害剤を有効成分とし、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と同時に、又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の投与後に投与することを特徴とする血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制剤。
【請求項２３】
活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と、ヒト組織因子阻害剤とを含む止血剤。
【請求項２４】
ヒト組織因子阻害剤が抗ヒト組織因子抗体である請求項２３の止血剤。
【請求項２５】
抗ヒト組織因子抗体がヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項２４の止血剤。
【請求項２６】
ヒト型化抗ヒト組織因子抗体が配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒト組織因子抗体である請求項２５の止血剤。
【請求項２７】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を投与することを含む、ヒト組織因子阻害剤の抗血液凝固作用を中和する方法。
【請求項２８】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を投与することを含む、ヒト組織因子阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向を抑制する方法。
【請求項２９】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を投与することを含む、ヒト組織因子阻害剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）延長作用を中和する方法。
【請求項３０】
血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を投与することを含み、ヒト組織因子阻害剤と同時に、又はヒト組織因子阻害剤の投与後に投与することを特徴とする出血あるいは出血傾向の抑制方法。
【請求項３１】
ヒト組織因子阻害剤と、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤とを投与することを含む血栓治療方法。
【請求項３２】
ヒト組織因子阻害剤を投与することを含む、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用を抑制する方法。
【請求項３３】
ヒト組織因子阻害剤を投与することを含む、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血栓症あるいは血液凝固亢進状態を抑制する方法。
【請求項３４】
ヒト組織因子阻害剤を投与することを含む、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用を中和する方法。
【請求項３５】
ヒト組織因子阻害剤を投与することを含み、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と同時に、又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の投与後に投与することを特徴とする血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制方法。
【請求項３６】
活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と、ヒト組織因子阻害剤とを投与することを含む止血方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒト組織因子阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤に関する。また、本発明は、ヒト組織因子阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用の中和剤に関する。
背景技術
血液凝固反応はセリンプロテアーゼ前駆体が次々に活性型プロテアーゼにより活性化されて、最終的にフィブリンが形成される反応である。血栓症は、各種の病的状態の進展に伴い、血漿中の凝固・線溶系、血小板、白血球及び／又は血管内皮細胞の機能が変化することで、血液凝固反応が開始され過剰に亢進した結果として生じる。
組織因子（ＴＦ）は、細胞表面に発現される血液凝固第ＶＩＩ因子受容体であり、血液凝固反応の実質的な開始因子と位置付けられている。ＴＦは血液凝固第ＶＩＩ因子との複合体形成を通じて、血液凝固第ＩＸ因子及びＸ因子を活性化させる。ＴＦは、通常、血管内皮や血球等の血液にさらされている組織にはほとんど存在しない。一方で、ＴＦは血管外膜や結合組織には豊富に存在する。このようなＴＦは血管損傷の際に血液凝固系を活性化して止血機能を果たすと考えられている。
播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は、血管内での血液凝固系の活性化によって、全身の主として細小血管内に微小血栓が多発する疾患である。後天性の極端な凝固性亢進状態と見なすことができる。多発した微小血栓は重要臓器で微小循環不全をきたし、臓器に不可逆的な機能障害を残すことがある。一方、血小板や血液凝固因子が消費されて低下することにより、血栓とは逆の現象である出血が生じることも少なくない。それ故、ＤＩＣの予後は不良となることが多く、重篤な疾患と認識されている。ＤＩＣは急性白血病、悪性リンパ腫、感染症などの種々の疾患に合併して発症するが、その原因物質は共通であり、それがＴＦである。すなわち、急性白血病や悪性リンパ腫、固形癌においては腫瘍細胞のＴＦの生成・発現の異常亢進、感染症（特にグラム陰性菌性敗血症）においては単球・血管内皮細胞におけるＴＦ産生・発現亢進、劇症肝炎では壊死した肝組織からのＴＦの血中への流入、大動脈瘤・心臓瘤・巨大血管腫では血管内面でのＴＦ形成、産科的疾患（羊水栓塞、常位胎盤早期剥離）では胎盤組織内ＴＦの血中への流入、手術・外傷・火傷においては傷害組織中ＴＦの血中への流入が、ＤＩＣの発症機序と考えられている。
現在のＤＩＣ治療法としては、ヘパリン製剤などを用いた抗血液凝固療法や、濃縮血小板血漿などを用いた補充療法が行われている。最近、ＤＩＣ治療の新しい試みとして、抗ＴＦ抗体などを用いてＴＦの活性を中和する方法が研究されている。抗ＴＦ抗体は出血傾向等の副作用の少ない安全で有効な抗血液凝固薬となることが期待されている。特にヒト型化された抗ＴＦ抗体は安全で有効かつ、血中存在期間が長い優れた治療薬であると期待されている。
動脈血栓は硬化が進展した血管に血栓が生じる疾患であり、脳や心臓などの重要な臓器で発症するとしばしば致命的となる。特に、不安定狭心症や急性心筋梗塞などの冠動脈症候群は、突然死に移行しやすい危険な病態と考えられている。最近はその発症機序として動脈硬化プラークの破綻とそれに伴う血栓形成が重要な要因であることが明らかとなってきた。さらに、血栓形成の開始因子であるＴＦがプラーク内の細胞表面や細胞外間質に過剰に発現されていることが明らかとなり、プラークの破綻に伴うＴＦの血液への露出が血栓形成の主要な要因であると考えられている。
また、静脈血栓では、その発症機序として、静脈血流の遅滞、静脈壁の損傷および血液凝固能の亢進が重要と考えられている。特に、手術や分娩、外傷などの侵襲は血管壁への物理的損傷や凝固・線溶系の異常を招き、術後の臥床は静脈血流の遅滞をもたらす。その結果生じた静脈血栓は四肢の循環不全をもたらすのみならず、血栓そのものが血流に乗って肺動脈に流入することで致死的な肺塞栓症を来すため、静脈血栓そのものの予防が重要とされている。
本出願人は、ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とからなるヒト／マウスキメラ抗体、さらにはヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及び重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相捕性決定領域がヒト抗体に移植されているヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を作製して、これらが優れたＤＩＣ、動脈血栓症及び静脈血栓症治療薬として期待できることを報告した（ＷＯ９９／５１７４３、ＷＯ０１／２４６２６）。
しかしながら、抗ＴＦ抗体が出血傾向の少ない抗血液凝固剤であるとはいえ、実際の臨床の現場で上述したような様々な疾患に対して使用する過程で、予想されないアクシデントが起こる可能性もある。そこで、万が一、抗ＴＦ抗体投与により出血傾向が引き起こされた場合等に備えて、抗ＴＦ抗体の活性を中和する簡便且つ迅速な手段が存在することは、薬剤の安全性の観点から重要である。
活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤は、インヒビターを保有する血友病患者の出血抑制剤として販売されている。血友病患者では、遺伝的に、活性型血液凝固第ＶＩＩＩ因子／活性型血液凝固第ＩＸ因子複合体による血液凝固第Ｘ因子活性化能が欠如している。血友病患者が出血した場合、通常の治療として、血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤（血友病Ａの場合）または血液凝固第ＩＸ因子製剤（血友病Ｂの場合）が補充される。しかしながら、重症血友病患者にとっては、それら製剤に含まれる血液凝固因子は「異物」であり、それ故インヒビター（抗体）が生じてしまうことがある。そうなると、それら製剤の効果は著しく低下してしまう。
活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤は、そのようなインヒビターを保有する血友病患者においても、ＴＦ存在下で血液凝固第Ｘ因子を活性化させうるため、止血作用を惹起させることができる。しかしながら、一方で、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用によると考えられる血栓症出現の報告もある。
最近では、血友病患者のみならず、クモ膜下出血、脳出血、動脈瘤破裂、外傷のような一般の重篤な出血に対しても、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤は有効であると考えられるようになってきた。例えば、交通事故による大量出血患者に対して、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤が非常に画期的な止血効果を示したという報告が、臨床現場から複数出されている。大量出血は一命に関わる病態であり、それに対する活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の有効性は疑うべくもないと思われる。しかし、一方で、そのような患者においては、感染症、あるいは傷害組織の血中流入等によって、血液凝固亢進状態が惹起されることも多いのである。血液凝固亢進状態はＤＩＣや血栓症等重篤な病態に移行する可能性がある。この場合、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤は、それらを悪化させる方向に働いてしまう。
従って、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤による止血が完遂された後、再出血を惹起することなく、速やかに活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用を中和することは、臨床上非常に有用であると考えられる。
本発明の目的は、抗ＴＦ抗体などの組織因子阻害剤が万が一出血傾向を誘導した場合あるいは誘導する恐れのある場合に、組織因子阻害剤の活性を中和可能な予防又は治療剤を提供することである。また、本発明の目的は、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤が血栓症あるいは血液凝固亢進状態を誘導した場合あるいは誘導する恐れのある場合に、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の活性を中和可能な予防または治療剤を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、抗ＴＦ抗体が万が一出血傾向を誘導した場合あるいは誘導する恐れのある場合に、抗ＴＦ抗体の活性を中和可能な予防又は治療剤を開発すべく鋭意研究した結果、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を投与することにより、抗ＴＦ抗体の抗血液凝固作用を中和することが可能なことを見出して本発明を完成した。
また、本発明者らは、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤が、血栓症あるいは血液凝固亢進状態を誘導した場合あるいは誘導する恐れのある場合に、その活性を中和可能な予防または治療剤を開発すべく鋭意研究した結果、ヒトＴＦ阻害剤を投与することにより、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用を中和することを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤を提供する。
本発明はさらに、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒトＴＦ阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向の抑制剤を提供する。
本発明はさらに、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とする、ヒトＴＦ阻害剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）延長作用の中和剤を提供する。
本発明はさらに、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を有効成分とし、ヒトＴＦ阻害剤と同時に、又はヒトＴＦ阻害剤の投与後に投与することを特徴とする出血あるいは出血傾向の抑制剤を提供する。
本発明はさらに、ヒトＴＦ阻害剤と、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤とを含む抗血栓剤を提供する。
本発明はさらに、ヒトＴＦ阻害剤と、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を含む医薬キットを提供する。
本発明はさらに、ヒトＴＦ阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用の抑制剤を提供する。
本発明はさらに、ヒトＴＦ阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制剤を提供する。
本発明はさらに、ヒトＴＦ阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用の中和剤を提供する。
本発明はさらに、ヒトＴＦ阻害剤を有効成分とし、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と同時に、又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の投与後に投与することを特徴とする血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制剤を提供する。
本発明はさらに、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と、ヒトＴＦ阻害剤とを含む止血剤を提供する。
これらの中和剤、抑制剤、抗血栓剤、医薬キットにおいて、ヒトＴＦ阻害剤が抗ヒトＴＦ抗体であることが好ましく、さらにはヒト型化抗ヒトＴＦ抗体であることがより好ましい。最も好ましいのは、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体が配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒトＴＦ抗体である。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、ヒトＴＦ阻害剤とは、ヒトＴＦに作用して、抗血液凝固作用を示す物質であれば特に制限されないが、抗ヒトＴＦ抗体が好ましい。これらの抗ヒトＴＦ抗体の認識するヒトＴＦは、単体のヒトＴＦであってもよく、また生理活性因子との複合体であってもよい。生理活性因子の例としてはヒトＴＦと結合し血液凝固の状態を惹起するような生理活性因子が好ましい。前記生理活性因子の例としては血液凝固因子が挙げられる。さらに好ましくは血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第Ｘ因子であり、前記の血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第Ｘ因子は活性型であってもまた活性型でなくてもよい。
抗ヒトＴＦ抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。
又、抗ヒトＴＦ抗体はマウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などを適宜用いることができるが、好ましくはヒト型化抗ヒトＴＦ抗体であり、特に好ましくは配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを組合せた、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体である（ＷＯ９９／５１７４３に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンｉ及びヒト型化Ｌ鎖バージョンｂ２）。
抗ヒトＴＦ抗体については、既に多数報告されている（ＷＯ９９／５１７４３、ＷＯ８８／０７５４３、ＷＯ９６／４０９２１、ＷＯ９８／４０４０８、ＷＯ０１／７０９８４、ＷＯ０３／０３７９１１）。又、抗原となるＴＦは既に知られているので（Ｉｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，６９１−６９６，（１９９３））、当業者に公知の方法で作製することが可能である。
本発明のヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤又はヒトＴＦ阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向の抑制剤の有効成分は血液凝固因子複合体製剤又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤である。
本発明でいう血液凝固因子複合体製剤には、血液凝固因子複合濃縮製剤（日本薬局方記載一般名：乾燥人血液凝固第ＩＸ因子複合体）、活性型血液凝固因子複合濃縮製剤（日本薬局方記載一般名：乾燥人血液凝固因子抗体迂回活性複合体、活性化プロトロンビン複合体）などが挙げられる。現在、市販されている血液凝固因子複合体製剤には例えば以下のものが含まれる。
１）血液凝固因子複合濃縮製剤（日本薬局方記載一般名：乾燥人血液凝固第ＩＸ因子複合体）としては、日本で市販されているものとしてＰＰＳＢ−ＨＴ「ニチヤク」（登録商標）（日本製薬−武田）、プロプレックスＳＴ（登録商標）（バクスター）、ベノビールＴＩＭ４（登録商標）（バクスター）；及び海外で市販されているものとしてＫｏｎｙｎｅ８０（登録商標）（Ｂａｙｅｒ）、Ｐｒｏｐｌｅｘ  Ｔ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）、Ｐｒｏｆｉｌｎｉｎｅ  ＨＴ（登録商標）（Ａｌｐｈａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）、Ｂｅｂｕｌｉｎ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏ）；
２）活性型血液凝固因子複合濃縮製剤（日本薬局方記載一般名：乾燥人血液凝固因子抗体迂回活性複合体、活性化プロトロンビン複合体）としては、日本で市販されているものとしてファイバ（登録商標）（バクスター）、ファイバ「イムノ」（登録商標）（日本臓器）、オートプレックス（登録商標）（バクスター）；及び海外で市販されているものとしてＡｕｔｏｐｌｅｘ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）、ＦＥＩＢＡ  ＶＨ  Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏ）などがある。
活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤（遺伝子組換え活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤）としては、日本で市販されているものとしてノボセブン（登録商標）（ノボノルディスク）；及び海外で市販されているものとしてＮｏｖｅＳｅｖｅｎ（登録商標）又はＮｉａＳｔａｔｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）などが挙げられる。本発明でいう活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤とは、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤が含まれていればよく、その他の成分を含有していてもよい。
また、血液凝固第ＶＩＩ因子製剤としては活性型の方が優れている。現在のところ市販されているのは活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤のみであるが、活性型でない血液凝固第ＶＩＩ因子製剤であっても本発明の抑制作用や中和作用を有する限り、それらの製剤も本発明に含まれる。
これらの血液凝固因子複合体製剤又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の１種又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。
血液凝固因子複合体製剤又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤が、ヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用を中和するか否かは、若しくはヒトＴＦ阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向を抑制するか否かは、プロトロンビン時間（以下においてＰＴということもある）を指標に判断することができる。又、ヒトＴＦ阻害剤が抗血液凝固作用を示すか否かについても同様にしてプロトロンビン時間を指標に判断することができる。さらに、ヒトＴＦ阻害剤が、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用を抑制するか否か、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血栓症あるいは血液凝固亢進状態を抑制するか否か、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用を中和するか否かについても同様にしてプロトロンビン時間を指標に判断することができる。なお、プロトロンビン時間とは、外因系凝固動態を総合的に検査する方法で、検査対象のクエン酸血漿サンプルに組織トロンボプラスチンと塩化カルシウムを加えてフィブリンの析出するまでの時間を測定することにより行う。具体的には後述する実施例に記載するようなヒト血漿を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験にて測定することが可能である。ヒトＴＦ阻害剤投与によるプロトロンビン時間延長作用を中和する（プロトロンビン時間を短くする）ものが、本発明のヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤として適しており、またヒトＴＦ阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向の抑制剤として適している。また、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用を抑制する（プロトロンビン時間を長くする）ヒトＴＦ阻害剤が、本発明の活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用の抑制剤、又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用の中和剤として適している。
本発明では、市販されている種々の血液凝固因子複合体製剤を用いて試験した結果、血友病Ｂインヒビターおよび血友病Ａインヒビター治療剤であるＰｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ（登録商標）、血友病Ｂインヒビター治療剤であるＰＰＳＢ−ＨＴ（登録商標）、血友病Ａインヒビター治療剤であるＡｕｔｏｐｌｅｘ（登録商標）それぞれ１．８８Ｕ／ｍＬ（１００Ｕ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与相当）存在下で、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は消失し、ＰＴは正常範囲（１１〜１３秒）以下のレベルまで低下した。これら３剤は血液凝固因子複合体製剤であり、添付文書によればＰｒｏｐｌｅｘ  ＳＴにはプロトロンビン（第ＩＩ因子）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子が含まれ、Ａｕｔｏｐｌｅｘにはプロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子の他に活性型第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ因子が含まれている（ＰＰＳＢ−ＨＴについては添付文書に成分の記載がない）。これらの血液凝固因子複合体製剤がヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用を中和することが確認されたことから、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体投与によって出血傾向が認められた場合、血液凝固因子複合体製剤であるＰｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ、ＰＰＳＢ−ＨＴ、Ａｕｔｏｐｌｅｘを用いることがその改善に有効であると考えられる。
また、血液凝固因子を単独で含む製剤であるＮｏｖａｃｔ  Ｍ（登録商標）（血液凝固第ＩＸ因子製剤）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）（血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤）、これら２剤併用のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用に対する効果も同様に検討した。
Ｎｏｖａｃｔ  ＭもしくはＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅそれぞれ１．８８Ｕ／ｍＬ（１００Ｕ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与相当）存在下で、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は抑制されなかった。また、Ｎｏｖａｃｔ  Ｍ／Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ併用時でも、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は抑制されなかった。これら２剤単独存在下もしくは併用時で、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用はむしろ有意に増強することが認められた。加えて、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体非存在下でもこれら２剤併用時で有意にＰＴが延長した。これらの結果から、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用を血液製剤が中和する場合には、少なくとも血液凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の関与は小さいと考えられる。
さらに、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子の、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用に対する効果も同様に検討した。活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤であるノボセブン（登録商標）存在下では、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は中和された。
血液凝固第ＶＩＩ因子は、細胞表面に発現される血液凝固第ＶＩＩ因子受容体であるＴＦと複合体形成を通じて活性化され、血液凝固反応を促進する。血液凝固第ＶＩＩ因子は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用の中和活性を有する血液凝固因子複合体製剤Ｐｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ、Ａｕｔｏｐｌｅｘ中にも含まれていることから、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用の中和には血液凝固第ＶＩＩ因子が有効であると考えられる。
以上の知見から、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体投与によって出血傾向が認められた場合、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子及び該因子を含む血液凝固因子複合体製剤を用いることがその改善に有効であると考えられる。
さらに、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子によるＰＴ短縮作用に対する効果を検討した。ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体非存在下では、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤であるノボセブン（登録商標）はＰＴ時間を短縮したが、ここにヒト型化抗ヒトＴＦ抗体を添加すると、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子によるＰＴ時間短縮作用は中和された。従って、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子の血液凝固作用の中和には、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体などのヒトＴＦ阻害物質が有効である。
以上の知見から、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子による血液凝固亢進状態又は血栓症が認められた場合、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体などのヒトＴＦ阻害物質を用いることがその改善に有効であると考えられる。
本発明の血液凝固因子複合体製剤又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を含む、ヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤又はヒトＴＦ阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向の抑制剤は、特に限定されないが、ヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用が強い場合やヒトＴＦ阻害剤に起因する出血傾向が観察される場合などに投与することができる。又、ヒトＴＦ阻害剤投与の際に、それらの状況が予想される場合には予防の為に、あらかじめ、同時に、もしくは連続して、又は時間間隔をおいて投与することも可能である。本発明において、出血傾向とは、出血は明白に確認されないが、潜在的な出血が疑われる状態、あるいは出血しやすい状態であることが明白な状態（例えばヘモグロビン値が低下した状態など）をいう。
また、本発明のヒトＴＦ阻害剤を含む、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用の抑制剤、又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用の中和剤は、特に限定されないが、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用が強い場合などに投与することができる。又、活性型血液凝固因子第ＶＩＩ因子製剤投与の際に、それらの状況が予想される場合には予防の為に、あらかじめ、同時に、もしくは連続して、又は時間間隔をおいて投与することも可能である。
さらに、本発明では、ヒトＴＦ阻害剤と、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤とを含む抗血栓剤の形で製剤化することも可能である。
さらに、本発明では、ヒトＴＦ阻害剤と、血液凝固因子複合体製剤または活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を含む医薬キットの形で製剤化することも可能である。
さらに、本発明では、ヒトＴＦ阻害剤と、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を含む止血剤の形で製剤化することも可能である。
さらに、本発明では、ヒトＴＦ阻害剤と、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤を含む医薬キットの形で製剤化することも可能である。
血液凝固第ＶＩＩ因子製剤及びヒトＴＦ阻害剤を含む製剤又は医薬キットは、患者の状態（出血、出血傾向、血栓症、血液凝固亢進状態、等）や、血液凝固第ＶＩＩ因子製剤とヒトＴＦ阻害剤の比率、投与のタイミングなどにより、抗血栓剤にも止血剤にもなり得る。本発明の血液凝固第ＶＩＩ因子製剤及びヒトＴＦ阻害剤を含む製剤又は医薬キットを抗血栓剤として用いるか、若しくは止血剤として用いるかは、当業者ならば、患者の状態や、成分の比率、投与タイミングなどを考慮して適宜選択することが可能である。
本発明の中和剤、抑制剤、抗血栓剤又は止血剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与される。
本発明のヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤又はヒトＴＦ阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向の抑制剤又は抗血栓剤中に含まれる血液凝固因子複合体製剤又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、血液凝固因子の総量として一般には０．０００１〜１０００Ｕ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１０Ｕ／ｋｇ体重である。
本発明のヒトＴＦ阻害剤の抗血液凝固作用の中和剤又はヒトＴＦ阻害剤に起因する出血あるいは出血傾向の抑制剤は、抗ヒトＴＦ抗体などのＴＦ阻害剤が万が一出血傾向を示した場合に、ＴＦ阻害剤の活性を中和可能な治療剤又は出血あるいは出血傾向の抑制剤となりうる。
本発明のヒトＴＦ阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の血液凝固亢進作用の抑制剤に用いるヒトＴＦ阻害剤としては、抗ヒトＴＦ抗体が好ましく、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体がさらに好ましい。好適なヒト型化抗ヒトＴＦ抗体としては、配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒトＴＦ抗体が挙げられる。
本発明のヒトＴＦ阻害剤を有効成分とする、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制剤又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤に起因する血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用の中和剤、あるいはヒトＴＦ阻害剤を有効成分とし、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と同時に、又は活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の投与後に投与することを特徴とする血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制剤に用いるヒトＴＦ阻害剤としては、抗ヒトＴＦ抗体が好ましく、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体がさらに好ましい。好適なヒト型化抗ヒトＴＦ抗体としては、配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒトＴＦ抗体が挙げられる。
本発明の活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤と、ヒトＴＦ阻害剤とを含む止血剤に用いるヒトＴＦ阻害剤としては、抗ヒトＴＦ抗体が好ましく、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体がさらに好ましい。好適なヒト型化抗ヒトＴＦ抗体としては、配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含んでなるヒト型化抗ヒトＴＦ抗体が挙げられる。
本発明の血液凝固亢進作用の抑制剤、血栓症あるいは血液凝固亢進状態の抑制剤、血液凝固時間（プロトロンビン時間）短縮作用の中和剤、止血剤中に含まれるヒトＴＦ阻害剤の量は、ヒトＴＦ阻害物質の種類、治療すべき患者の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、例えば、ヒトＴＦ阻害剤がヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の場合には、総量として一般には、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。
本出願は特願２００２−１４９４９４に基づく優先権を主張するものであり、前記出願の内容の全てを参照として本出願に包含する。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
実施例１：ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼす血液凝固因子複合体製剤の効果
１．被検物質
１）乾燥人血液凝固第ＩＸ因子複合体
（１）Ｐｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ（登録商標）
供給元：Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
（２）ＰＰＳＢ−ＨＴ「ニヤャク」（登録商標）
供給元：日本製薬株式会社
２）活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤
Ａｕｔｏｐｌｅｘ（登録商標）
供給元：Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
３）乾燥濃縮人血液凝固第ＩＸ因子
Ｎｏｖａｃｔ  Ｍ（登録商標）
供給元：財団法人化学及血清療法研究所
４）遺伝子組換え型血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）
供給元：Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
５）加熱ヒト血漿たん白製剤
ＫＥＮＫＥＴＵ  ＡＬＢＵＭＩＮＡＴＥ−ＮＩＣＨＩＹＡＫＵ（登録商標）
供給元：日本製薬株式会社
２．ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体
ＷＯ９９／５１７４３記載の方法により作製したヒト型化抗ヒトＴＦ抗体であって、配列番号１に記載のヒト型化Ｈ鎖バージョンと配列番号２に記載のヒト型化Ｌ鎖バージョンとを含むものを使用した（中外製薬製）。前記抗体はＷＯ９９／５１７４３明細書の実施例５に記載があるように、ヒトＴＦに加えて、ヒトＴＦと血液凝固第ＶＩＩ因子の複合体を認識することが知られている。ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体は溶媒（２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．０）中で保存した。
３．試料の調製方法
１）ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体はヒト型化抗ヒトＴＦ抗体原液を１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ又は３．３３ｍｇ／ｍＬ濃度となるように上記溶媒で希釈して調製した。
２）Ｐｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ（登録商標）は付属の注射用水を用いて濃度：５０Ｕ／ｍＬに調製した。
３）ＰＰＳＢ−ＨＴ（登録商標）は付属の注射用水を用いて濃度：５０Ｕ／ｍＬに調製した。
４）Ａｕｔｏｐｌｅｘ（登録商標）は付属の注射用水を用いて濃度：５０Ｕ／ｍＬに調製した。
５）Ｎｏｖａｃｔ  Ｍ（登録商標）は付属の注射用水を用いて濃度：１００Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬに調製した（１００Ｕ／ｍＬはＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅとの併用実験に用いた）。
６）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）は付属の注射用水を用いて濃度：１００Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬに調製した（１００Ｕ／ｍＬはＮｏｖａｃｔ  Ｍとの併用実験に用いた）。
７）ＫＥＮＫＥＴＵ  ＡＬＢＵＭＩＮＡＴＥ−ＮＩＣＨＩＹＡＫＵ（登録商標）は溶媒を用いることなく、濃度：ヒト血清アルブミンとして、４４ｍｇ／ｍＬに調製した。
なお、Ａｌｂｕｍａｔｅは本発明の中和剤又は抑制剤に使用する血液凝固因子複合体製剤ではないが、ヒト血漿から製剤化されたものであるので、血液凝固因子を含む可能性を有しているため、被検物質に加えた。
４．試験方法
１）予め３．８ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム溶液（１０ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム水溶液を注射用水で希釈）を採血用注射筒に充填し、健常人ボランティアよりその９倍量の血液を採取した。
２）採取した血液を５０ｍＬ遠心管に移し、４℃，２０００×ｇで１０分間遠心した。
３）遠心後、上清を別の５０ｍＬ遠心管に移し、これをクエン酸血漿とした。
４）クエン酸血漿、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の溶媒、６種類の血液製剤を以下の表１に示すようにそれぞれ混和し、全量５００ｍＬの被検サンプルを調製した。
2003099324.tif 000002
2003099324.tif 000003
2003099324.tif 000004
2003099324.tif 000005
５）ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体添加濃度は次のように計算した。血液の比重を１、体重の１３分の１が血液、Ｈｔ（ヘマトクリット：血液中の赤血球容積比）が４２ｖｏｌ％と仮定すると、体重１ｋｇあたりの血漿は４４．６ｍＬであり、これはクエン酸血漿５３．２ｍＬに当たる。したがって、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体０．３，０．６，１．０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与時のクエン酸血漿中のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体濃度は、各々０．３×１０００／５３．２＝５．６４，０．６×１０００／５３．２＝１１．３，１．０×１０００／５３．２＝１８．８ｍｇ／ｍＬである。
６）血液製剤の添加濃度は次のように計算した。５）と同様に、臨床最大用量のＰｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ（血液凝固第ＩＸ因子として）１００Ｕ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与時のクエン酸血漿中の血液凝固第ＩＸ因子濃度は、１００／５３．２＝１．８８Ｕ／ｍＬである。以下ＰＰＳＢ−ＨＴ（血液凝固第ＩＸ因子として）、Ａｕｔｏｐｌｅｘ（血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害物質補正活性として）、Ｎｏｖａｃｔ  Ｍ（血液凝固第ＩＸ因子）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（血液凝固第ＶＩＩＩ因子）の場合も同様に計算した。また、臨床最大用量のＡｌｂｕｍｉｎａｔｅ（人血清アルブミンとして）８．３ｍＬ／ｋｇ  ｉ．ｖ．（＝５００ｍＬ／６０ｋｇ  ｉ．ｖ．）投与時のクエン酸血漿中のアルブミン濃度は、８．３×１００／５３．２＝１５．６ｖｏｌ％である。
７）被検サンプルのプロトロンビン時間（ＰＴ）を全自動血液凝固分析装置ＡＭＡＸ（ＡＭＥＬＵＮＧ）で１サンプルにつき１回ずつ測定した。ただし、薬物無添加クエン酸血漿のＰＴ測定は、各人由来クエン酸血漿を用いたＰＴ測定の最初と最後にそれぞれ１回ずつ行い、平均値および標準誤差の算出には最初のＰＴ値を採用し、最後のＰＴ値は確認用とした。
８）ＡＭＡＸによるＰＴ測定法は以下の通りである。予め３７℃に保温した試験管にクエン酸血漿を０．０５ｍＬとり、３７℃で１分間加温した後、３７℃で保温されたトロンボレルＳ試液（ヒト胎盤由来トロンボプラスチン：デイド・ベーリング製）０．１ｍＬを添加し、反応溶液が凝固するまでの時間（ＰＴ）を測定した。
５．統計学的解析方法
各濃度のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体０．００，５．６４，１１．３，１８．８ｍｇ／ｍＬ存在下でのＰＴに対する、血液製剤の効果をｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔで、またＰＴに対するヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の用量依存性効果をＪｏｎｃｋｈｅｅｒｅ  ｔｅｓｔで検定した。ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ７．０を、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅの用量依存性の検定はＳＡＳを用いて計算した。
６．結果
得られた結果を図１〜７に示す。なお、各図において、被検物質で処理した場合（斜線）又は処理しなかった場合（白ヌキ）のヒトクエン酸血漿のＰＴを示す。データは平均±標準偏差（Ｓ．Ｅ．）（ｎ＝３）で示す。＊は被検物質を含まない場合と比較してＰ＜０．０５であることを示す。
血友病Ｂおよび血友病Ａインヒビター治療剤であるＰｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ、血友病Ｂ治療剤であるＰＰＳＢ−ＨＴ、血友病Ａインヒビター治療剤であるＡｕｔｏｐｌｅｘそれぞれ１．８８Ｕ／ｍＬ（１００Ｕ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与相当）存在下で、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は消失し、ＰＴは正常範囲（１１〜１３秒）以下のレベルまで低下した（図１〜３）。
また、血液凝固因子を単独で含む製剤であるＮｏｖａｃｔ  Ｍ（血液凝固第ＩＸ因子製剤）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（血液凝固第ＶＩＩ因子製剤）、これら２剤併用のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用に対する効果も同様に検討した。
Ｎｏｖａｃｔ  ＭもしくはＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅそれぞれ１．８８Ｕ／ｍＬ（１００Ｕ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与相当）存在下で、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は抑制されなかった（図４，５）。また、Ｎｏｖａｃｔ  Ｍ／Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ併用時でも、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は抑制されなかった（図６）。これら２剤単独存在下もしくは併用時で、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用はむしろ有意に増強することが認められた。加えて、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体非存在下でもこれら２剤併用時で有意にＰＴが延長した。これらの結果から、血液製剤のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用の消失には、少なくとも血液凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の関与は小さいと考えられる。
Ａｌｂｕｍｉｎａｔｅ１５．６ｖｏｌ％（８．３ｍＬ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与相当）存在下で、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用は抑制されず、むしろ有意に増強することが認められた（ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体１１．３ｍｇ／ｍＬ存在下での効果を除く）（図７）。加えて、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体非存在下でも有意にＰＴが延長した。この結果から、Ａｌｂｕｍｉｎａｔｅにはヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用を抑制するような血液凝固作用は認められなかった。
以上より、Ｐｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ、ＰＰＳＢ−ＨＴ、Ａｕｔｏｐｌｅｘはヒト型化抗ヒトＴＦ抗体によるＰＴ延長作用を中和し、Ｎｏｖａｃｔ  Ｍ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、これら２剤の併用、Ａｌｂｕｍｉｎａｔｅは、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体のＰＴ延長作用を中和しないと結論づけられる。したがって、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体投与によって出血傾向が認められた場合、血液凝固因子複合体であるＰｒｏｐｌｅｘ  ＳＴ、ＰＰＳＢ−ＨＴ、Ａｕｔｏｐｌｅｘを用いることがその改善に有効であることが判明した。
実施例２：ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼす活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の影響
１．材料
・３．８ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム：チトラミン「フソー」（扶桑薬品）
・ヒトクエン酸血漿：健常人ボランティア由来。３．８ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム２．０ｍＬと血液１８．０ｍＬとの混合液を、２０００ｘｇ（４℃）で１０分間遠心し、上清、すなわちクエン酸血漿（▲１▼）を採取した。氷上に静置した。・遺伝子組換え活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤：注射用「ノボセブン」１．２ｍｇ（ノボ・ノルディスク）。実験当日、添付文書に従い、添付の溶解液で溶解（０．６ｍｇ／ｍＬ＝３０ＫＩＵ／ｍＬ活性型血液凝固第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）溶液▲２▼）。
なお、ノボセブンの１回投与量の添付文書記載最大値１２０μ／ｋｇ＝６ＫＩＵ／ｋｇであり、同量投与時、ノボセブンが全て血液中に分布するという仮定下で、クエン酸血漿中濃度は、６ＫＩＵ／ｋｇ（５３．２ｍＬ／ｋｇ＝０．１１３ＫＩＵ／ｍＬとなる。後述するが、本実験では、Ｆ．ＶＩＩａ濃度が０．１１３ＫＩＵ／ｍＬとなるよう、ヒトクエン酸血漿にノボセブンを添加し、実験を実施した。
・ＰＴ試薬：Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（デイド・ベーリング）。添付文書どおり、１瓶あたり４．０ｍＬミリＱ水で溶解後、３７℃設定のＣＯ２インキュベーター（ＣＤＰ１７００シリーズ、ヒラサワ）に１５分間静置。その後、全自動血液凝固分析装置の所定の位置にセットした。
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体溶液：溶媒を用い、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体５０００μｇ／ｍＬ溶液▲３▼、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体１５００μｇ／ｍＬ溶液▲４▼、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体５００μｇ／ｍＬ溶液▲５▼を調製した。
なお、溶媒として２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ［ｐＨ６．０］▲６▼を用いた。
２．試験方法
（１）以下のように、測定サンプルを調製した。
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体０μｇ／ｍＬサンプル▲７▼：
▲１▼９９０ｕＬ＋▲６▼１０ｕＬ
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体５．０μｇ／ｍＬサンプル▲８▼（０．２６６ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．ｂｏｌｕｓ投与直後相当）：
▲１▼９９０ｕＬ＋▲５▼１０ｕＬ
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体１５μｇ／ｍＬサンプル▲９▼（０．７９８ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．ｂｏｌｕｓ投与直後相当）：
▲１▼９９０ｕＬ＋▲４▼１０ｕＬ
2003099324.tif 000006
相当）：
▲１▼９９０ｕＬ＋▲３▼１０ｕＬ
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体０μｇ／ｍＬ／Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬサンプル：
▲７▼２６４．５ｕＬ＋▲２▼１．０ｕＬ
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体５．０μｇ／ｍＬ／Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬサンプル：
▲８▼２６４．５ｕＬ＋▲２▼１．０ｕＬ
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体１５μｇ／ｍＬ／Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬサンプル：
▲９▼２６４．５ｕＬ＋▲２▼１．０ｕＬ
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体５０μｇ／ｍＬ／Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬ：
2003099324.tif 000007
（２）全自動血液凝固分析装置にてプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した。
３．結果
結果を図８に示す。Ｆ．ＶＩＩａ無添加時には、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体用量依存的に、凝固時間（プロトロンビン時間）の延長が認められた。これは、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の抗血液凝固活性を表すものである。
ここに、臨床用量（添付文書記載の最大値）のＦ．ＶＩＩａを添加すると、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体による凝固時間延長作用は、正常域（１１−１３秒）を超え、完全に中和された。
すなわち、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の抗血液凝固活性は、Ｆ．ＶＩＩａにより中和されることが示された。
実施例３：活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤で誘導されたＰＴ短縮作用に及ぼすヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の影響
１．材料
・３．８ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム：チトラミン「フソー」（扶桑薬品）
・ヒトクエン酸血漿：健常人ボランティア由来。３．８ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム２．０ｍＬと血液１８．０ｍＬとの混合液を、２０００ｘｇ（４℃）で１０分間遠心し、上清、すなわちクエン酸血漿（▲１▼）を採取した。氷上に静置した。・遺伝子組換え活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤：注射用「ノボセブン」１．２ｍｇ（ノボ・ノルディスク）。実験当日、添付文書に従い、添付の溶解液で溶解（０．６ｍｇ／ｍＬ＝３０ＫＩＵ／ｍＬ活性型血液凝固第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）溶液▲２▼）。
なお、ノボセブンの１回投与量の添付文書記載最大値１２０μｇ／ｋｇ＝６ＫＩＵ／ｋｇであり、同量投与時、ノボセブンが全て血液中に分布するという仮定下で、クエン酸血漿中濃度は、６ＫＩＵ／ｋｇ（５３．２ｍＬ／ｋｇ＝０．１１３ＫＩＵ／ｍＬとなる。後述するが、本実験では、Ｆ．ＶＩＩａ濃度が０．１１３ＫＩＵ／ｍＬとなるよう、ヒトクエン酸血漿にノボセブンを添加し、実験を実施した。
・ＰＴ試薬：Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（デイド・ベーリング）。添付文書どおり、１瓶あたり４．０ｍＬのミリＱ水で溶解後、３７℃設定のＣＯ２インキュベーター（ＣＤＰ１７００シリーズ、ヒラサワ）に１５分間静置。その後、全自動血液凝固分析装置の所定の位置にセット。
・ＡＰＴＴ試薬：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｐｈａｌｏｐｌａｓｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（デイド・ベーリング）
・ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体溶液：１５．４ｍｇ／ｍＬ▲３▼（溶媒：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ［ｐＨ６．０］）
２．試験方法
（１）以下のように、測定サンプルを調製した。
・Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬサンプル▲４▼：
▲１▼１０５４ｕＬ＋▲２▼４．０ｕＬ
・Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬ／ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体１００μｇ／ｍＬサンプル（抗体５．３２ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．ｂｏｌｕｓ投与直後相当）：
▲４▼１９８．７ｕＬ＋▲３▼１．３ｕＬ
・Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬ／ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体２００μｇ／ｍＬサンプル（抗体１０．６４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．ｂｏｌｕｓ投与直後相当）：
▲４▼１９７．４ｕＬ＋▲３▼２．６ｕＬ
・Ｆ．ＶＩＩａ０．１１３ＫＩＵ／ｍＬ／ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体４００μｇ／ｍＬサンプル（抗体２１．２８ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．ｂｏｌｕｓ投与直後相当）：
▲４▼１９４．８ｕＬ＋▲３▼５．２ｕＬ
（２）全自動血液凝固分析装置にてプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した。
３．結果
結果を図９に示す。臨床用量（添付文書記載の最大値）のＦ．ＶＩＩａは、凝固時間（プロトロンビン時間）を短縮した。これは、すなわち、Ｆ．ＶＩＩａの血液凝固亢進作用を表している。
ここに、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体を添加すると、Ｆ．ＶＩＩａの血液凝固亢進作用は、用量依存的に抑制された。さらに、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体２００μｇ／ｍＬ存在下では、正常域（１１−１３秒）まで回復した。
すなわち、Ｆ．ＶＩＩａの血液凝固亢進作用は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体により中和されることが示された。
実施例４：手術による傷口からの再出血に及ぼすヒト型化抗ヒトＴＦ抗体及び低分子ヘパリンの影響
カニクイザル（中華人民共和国原産、雄性７頭／雌性１頭、３〜６歳、体重：２．５１〜５．９８ｋｇ）にケタラール（０．７ｍＬ、ケタミンとして３５ｍｇ）を筋肉内投与し、麻酔した。体重を測定した後、手術台に仰向けに固定した。鼻孔及び口を覆うよう吸入マスクをセットし、１ｖｏｌ％イソフルラン／笑気・酸素混合ガス（笑気２ｖｏｌ：酸素１ｖｏｌ）で吸入麻酔した。頸部、大腿部、下肢部を剃毛した。
左右両方の外側伏在静脈に留置針を設置し、実験終了まで生理食塩液を１．０ｍＬ／ｋｇ／ｈインフュージョン投与した（投与用と採血用）。温度計を肛門より直腸内にセットし、直腸温が３５．０℃を下回らないよう、必要に応じ個体の下に局所温湿布器を敷いて保温を行った。左右いずれかの大腿部の皮膚を切開し、筋層をより分け大腿動脈を露出した。動脈血圧測定のため、大腿動脈にカテーテルを挿入した。
頸部中心を正中に沿って切開し、筋層をより分け、左総頸動脈及び左内頸静脈を露出した。小出血に対しては、圧迫包帯法（ガーゼによる直接圧迫止血法）で対応した。必要に応じ、電気コアギュレーターを用い止血したが、その使用は最小限とした。切開術終了後、頸部手術部が完全に止血されていることを確認した。
頸部手術部の血液を完全に拭った後、１時間静置し、その間の、頸部手術部の再出血をペーパーガーゼで回収した。
次いで、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体０．３ｍｇ／ｋｇ、または低分子ヘパリン（Ｆｒａｇｍｉｎ、ファルマシア・アップジョン）７５ＩＵ／ｋｇ、及び／またはそれぞれの溶媒（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ［ｐＨ６．０］または生理食塩液）を、投与用静脈留置針より、静脈内投与した。
頸部手術部の血液を完全に拭った後、１時間静置し、その間の、頸部手術部の再出血をペーパーガーゼで回収した。
これを、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体または低分子ヘパリンを追加注入（用量は実験結果に記載）しながら、さらに３回繰り返した。
なお、１時間静置の開始時には、採血用静脈留置針より、採血を行った。
ヘモグロビン−Ｂテスト「ワコー」を用い、回収した出血中のヘモグロビン量及び血液中のヘモグロビン濃度から、それぞれの用量における出血量（ｍＬ／ｈ）を計算した。
実験結果は以下のようになった。
まず、無投与時の１時間当たりの再出血量に関しては、いずれの個体でもわずかであり、群間で明白な相違も観察されなかった。具体的には、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体投与群（ｎ＝３）で平均０．０５ｍＬ（標準誤差０．０１ｍＬ）、低分子ヘパリン投与群（ｎ＝３）で平均０．０４ｍＬ（標準誤差０．０１ｍＬ）、溶媒投与群（ｎ＝２）で平均０．０４ｍＬであった。
ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体投与群の動物に、０．３、１．２、６．０、３０．０ｍｇ／ｋｇのヒト型化抗ヒトＴＦ抗体投与を順次投与していったところ（累計０．３、１．５、７．５、３７．５ｍｇ／ｋｇ）、１時間当たりの再出血量は、それぞれ平均０．０４ｍＬ／ｈ（標準誤差０．００ｍＬ／ｈ）、平均０．０６ｍＬ／ｈ（標準誤差０．０１ｍＬ／ｈ）、平均０．０６ｍＬ／ｈ（標準誤差０．０２ｍＬ／ｈ）、平均０．０８ｍＬ／ｈ（標準誤差０．０２ｍＬ／ｈ）となった。無投与時と同様のわずかな出血しか観察されなかった。二元配置分散分析を行ったところ、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体投与群の再出血量に関して、個体による差も用量による差も検出されなかった（ｐ値はそれぞれ０．３２３７、０．４６７６）。
一方、低分子ヘパリン投与群の動物に、７５、３００、１５００、７５００ＩＵ／ｋｇの低分子ヘパリンを順次投与していったところ（累計７５、３７５、１８７５、９３７５ＩＵ／ｋｇ）、１時間当たりの再出血量は、それぞれ平均０．１７ｍＬ／ｈ（標準誤差０．０９ｍＬ／ｈ）、平均１．５２ｍＬ／ｈ（標準誤差０．８２ｍＬ／ｈ）、平均２．９１ｍＬ／ｈ（標準誤差１．４６ｍＬ／ｈ）、平均９．１４ｍＬ／ｈ（標準誤差４．５５ｍＬ／ｈ）となった。二元配置分散分析を行ったところ、低分子ヘパリン投与群の再出血量に関して、個体による差は検出されなかったが、用量による差が示された（ｐ値はそれぞれ０．１３９３、０．０４７４）。そこで用量に関し対応のある傾向性検定を行ったところ、再出血量に対する低分子ヘパリンの用量依存性が示された（ｐ＝０．０１２６）。
また、溶媒投与群では、上記と同様のスケジュールで溶媒を投与したところ、１時間当たりの再出血量が、順に、平均０．０６ｍＬ／ｈ、平均０．０６ｍＬ／ｈ、平均０．０７ｍＬ／ｈ、平均０．０８ｍＬ／ｈであった。無投与時と同様のわずかな出血しか観察されなかった。例数が２であるため統計学的解析は行わなかった。
以上より、手術による傷口において一旦止血がなされた後に、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体を投与しても、３７．５ｍｇ／ｋｇ（クエン酸血漿中濃度として７０５μｇ／ｍＬ相当）までは、再出血を惹起しないことが示された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼすＰｒｏｐｌｅｘ  ＳＴの効果を示す。
図２は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼすＰＰＳＢ−ＨＴの効果を示す。
図３は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼすＡｕｔｏｐｌｅｘの効果を示す。
図４は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼすＮｏｖａｃｔ  Ｍの効果を示す。
図５は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼすＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅの効果を示す。
図６は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼすＮｏｖａｃｔ  Ｍ／Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ組合せの効果を示す。
図７は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼすＡｌｂｕｍｉｎａｔｅの効果を示す。
図８は、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体で誘導されたＰＴ延長作用に及ぼす活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤の影響を示す。
図９は、活性型血液凝固第ＶＩＩ因子製剤で誘導されたＰＴ短縮作用に及ぼすヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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