(57)【要約】本発明は、競合的ＰＣＲ法に好適に用いられる競合核酸断片、遺伝子組換え体遺伝子の定量用キット、競合的ＰＣＲ法による遺伝子組換え体遺伝子の定量方法を提供する。遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子部分に対応する少なくとも１つの第１競合核酸分子と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子部分に特異的な遺伝子に対応する少なくとも１つの第２競合核酸分子を結合し、同一核酸上に配置した競合核酸断片；該競合核酸断片と、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子と第１競合核酸分子とを増幅するための第１プライマー対と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子と第２競合核酸分子とを増幅するための第２プライマー対とを含む、遺伝子組換え体遺伝子の定量に使用するためのキット；及び該競合核酸断片又は該キットを使用して競合的ＰＣＲ法を行うことを特徴とする、遺伝子組換え体遺伝子の定量方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子部分に対応する少なくとも１つの第１競合核酸分子と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子部分に特異的な遺伝子に対応する少なくとも１つの第２競合核酸分子を結合し、同一核酸上に配置した競合核酸断片。
【請求項２】
第１競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子配列内部に部分的に、ヌクレオチドの挿入、欠失又は変異を有するものであり、第２競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子配列内部に部分的に、ヌクレオチドの挿入、欠失又は変異を有するものである、請求項１記載の競合核酸断片。
【請求項３】
第１競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子配列の両端のプライマー結合領域と同一のプライマー結合領域を両端に有し、前記内在性遺伝子配列とは異なる分子量を有するものであり、第２競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子配列の両端のプライマー結合領域と同一のプライマー結合領域を両端に有し、前記組換え遺伝子配列とは異なる分子量を有するものである、請求項１記載の競合核酸断片。
【請求項４】
内在性遺伝子がダイズのレクチン遺伝子である請求項１〜３のいずれか１項記載の競合核酸断片。
【請求項５】
内在性遺伝子部分がＬｅ１である請求項１〜４のいずれか１項記載の競合核酸断片。
【請求項６】
組換え遺伝子部分が遺伝子組換えダイズＲＲＳ（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙｂｅａｎ）に特異的な部分である請求項１〜５のいずれか１項記載の競合核酸断片。
【請求項７】
配列番号１の塩基配列を有する請求項１記載の競合核酸断片。
【請求項８】
配列番号２の塩基配列を有する請求項１記載の競合核酸断片
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の競合核酸断片と、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子と第１競合核酸分子とを増幅するための第１プライマー対と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子と第２競合核酸分子とを増幅するための第２プライマー対とを含む、遺伝子組換え体遺伝子の定量に使用するためのキット。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項記載の競合核酸断片を使用して競合的ＰＣＲ法を行うことを特徴とする、遺伝子組換え体遺伝子の定量方法。
【請求項１１】
請求項９記載のキットを使用して競合的ＰＣＲ法を行うことを特徴とする、遺伝子組換え体遺伝子の定量方法。
【請求項１２】
被験液中に存在する遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子のコピー数が、５００〜５００００となるように調整することを特徴とする請求項１０又は１１記載の遺伝子組換え体遺伝子の定量方法。
【請求項１３】
被験液中に存在する遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子と競合させるための競合核酸断片の濃度が２０コピー／μｌ〜４０００コピー／μｌの範囲であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の遺伝子組換え体遺伝子の定量方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、作物中の遺伝子組換え作物混入量の定量に利用される競合的ＰＣＲ法に好適に用いられる競合核酸断片、これを含む遺伝子組換え体遺伝子の定量用キット、及びこれを用いた競合的ＰＣＲ法による遺伝子組換え体遺伝子の定量方法に関する。
背景技術
ダイズやトウモロコシ等の農作物中の遺伝子組換え作物混入量の定量には競合的ＰＣＲ法が良く利用されている。競合的ＰＣＲ法は、定量の内部標準となる競合核酸分子を合成して被験液に加え、同一のプライマー対を加えて競合的にＰＣＲを行わせ、生成した標的核酸分子と競合核酸分子の量（バンド濃度）が等しくなったときの内部標準として加えた競合核酸分子の量を被験液中の標的核酸分子の量と推定する方法である。このとき用いる競合核酸分子は、標的核酸分子の配列と同一のプライマー対で増幅するようにデザインされている。従って、競合核酸分子は、同一のプライマー対で増幅させた時に標的核酸分子由来のバンドと判別がつくように、標的核酸分子に短い配列を挿入したり、一部の配列を欠失させてその長さを変化させるか、あるいは特定の制限酵素部位を導入又は欠失させたものが用いられている。
競合核酸分子と標的配列のＰＣＲにおける増幅率が等しい場合には、２種類のＤＮＡ断片は共通のプライマーを奪い合うため競合の度合いが高く、プライマーの枯渇による増幅反応の停止がほぼ同時に起こる。この場合はプラトーに達した後の両者の比が初期鋳型量を反映したものになる。
従来行われていた競合的ＰＣＲ法による遺伝子組換え作物の定量においては、あらかじめ遺伝子組換え作物混入量の分かっている試料から得られたＤＮＡ溶液を含む被験液に、段階的に希釈した競合核酸分子を加えてＰＣＲ反応を行い、等量点を突き止めることによって標的核酸分子の量が決定されていた。この測定法を行うには１００％遺伝子組換えである種子と１００％非組換えの種子を入手する必要があり、そのような種子の入手は一般に非常に困難である。また、添加する競合核酸分子の量は標的とする配列（内在性遺伝子又は遺伝子組換え作物に特異的な遺伝子）によってそれぞれ異なり、またコピー数ではなくＤＮＡの量で規定されていて、定量分析操作が煩雑で精度の点でも問題があった。
発明の開示
本発明の第１の目的は、競合的ＰＣＲ法に好適に用いられる競合核酸断片を提供することである。
本発明の第２の目的は、遺伝子組換え体遺伝子の定量用キットを提供することである。
本発明の第３の目的は、競合的ＰＣＲ法による遺伝子組換え体遺伝子の定量方法を提供することである。
本発明の第１は、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子部分に対応する少なくとも１つの第１競合核酸分子と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子部分に特異的な遺伝子に対応する少なくとも１つの第２競合核酸分子を結合し、同一核酸上に配置した競合核酸断片である。
本発明の第２は、第１競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子配列内部に部分的に、ヌクレオチドの挿入、欠失又は変異を有するものであり、第２競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子配列内部に部分的に、ヌクレオチドの挿入、欠失又は変異を有するものである、上記１記載の競合核酸断片である。
本発明の第３は、第１競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子配列の両端のプライマー結合領域と同一のプライマー結合領域を両端に有し、前記内在性遺伝子配列とは異なる分子量を有するものであり、第２競合核酸分子が、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子配列の両端のプライマー結合領域と同一のプライマー結合領域を両端に有し、前記組換え遺伝子配列とは異なる分子量を有するものである、上記１記載の競合核酸断片である。
本発明の第４は、内在性遺伝子がダイズのレクチン遺伝子である、上記１〜３のいずれか１項記載の競合核酸断片である。
本発明の第５は、内在性遺伝子部分がＬｅ１である上記１〜４のいずれか１項記載の競合核酸断片である。
本発明の第６は、組換え遺伝子部分が遺伝子組換えダイズＲＲＳ（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙｂｅａｎ）に特異的な部分である請求項１〜５のいずれか１項記載の競合核酸断片である。
本発明の第７は、配列番号１の塩基配列を有する上記１記載の競合核酸断片である。
2003027283.tif 000002
本発明の第８は、配列番号２の塩基配列を有する上記１記載の競合核酸断片である。
2003027283.tif 000003
本発明の第９は、上記１〜８のいずれか１項記載の競合核酸断片と、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子と第１競合核酸分子とを増幅するための第１プライマー対と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子と第２競合核酸分子とを増幅するための第２プライマー対とを含む、遺伝子組換え体遺伝子の定量に使用するためのキットである。
本発明の第１０は、上記１〜８のいずれか１項記載の競合核酸断片を使用して競合的ＰＣＲ法を行うことを特徴とする、遺伝子組換え体遺伝子の定量方法である。
本発明の第１１は、上記９記載のキットを使用して競合的ＰＣＲ法を行うことを特徴とする、遺伝子組換え体遺伝子の定量方法である。
本発明の第１２は、被験液中に存在する遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子のコピー数が、５００〜５００００となるように調整することを特徴とする上記１０又は１１記載の遺伝子組換え体遺伝子の定量方法である。
本発明の第１３は、被験液中に存在する遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子と競合させるための競合核酸断片の濃度が２０コピー／μｌ〜４０００コピー／μｌの範囲であることを特徴とする請求項１０または１１記載の遺伝子組換え体遺伝子の定量方法である。
発明を実施するための最良の形態
この明細書中、「遺伝子組換え体」とは、植物体又はその種子に本来は含まれていない遺伝子すなわち外来遺伝子が遺伝子組換えによって導入された遺伝子組換え体のことを言う。遺伝子組換え体遺伝子には、植物体又はその種子中に本来存在する内在性遺伝子と、外部から組換えによって導入された、組換え体に特異的な遺伝子（外来遺伝子）および外部から組換えによって導入されたＤＮＡ配列が含まれる。本発明の遺伝子組換え体遺伝子の定量方法による定量の対象となるものとしては、遺伝子組換え体植物、例えば、ダイズ、トウモロコシ、小麦、米、菜種、ジャガイモ、綿、パパイヤのような作物、その種子、及びこれらを原料として製造された食品等が含まれる。
これまでの競合的ＰＣＲ法では、内在性遺伝子に対する競合核酸分子と組換え体に特異的な遺伝子に対する競合核酸分子は別々に構築され、それぞれの分子量を元に希釈して使用しているため、希釈が不正確な場合には測定値にばらつきが見られるという欠点がある。
しかし本発明では２種類以上の競合核酸分子を結合させ、同一の核酸断片上に構築してあるため、不正確な希釈に起因する測定値のばらつきがなくなり、分析精度が著しく向上する。
またこの競合核酸断片をプラスミドにクローニングし、このプラスミドを増殖させることによって同一の核酸分子を大量に作成することも可能である。
従来、競合的ＰＣＲ法を用いた遺伝子組換え作物の定量法において、被験液に競合核酸分子を加えて競合的にＰＣＲ反応を行わせ、初期鋳型量を反映した状態で反応がプラトーに達するためには、プライマー濃度、酵素濃度、ＤＮＡ濃度などを詳細に調査する必要があった。
これに対して本発明の反応系では、測定の結果得られたＤＮＡのコピー数が一定の範囲に入っている場合は、さらに正しい定量値を得ることができる。
本発明の遺伝子組換え体遺伝子の定量に用いる競合核酸断片は、内在性遺伝子に対応する競合核酸分子と組換え遺伝子部分に特異的な遺伝子に対応する競合核酸分子が同一核酸分子上に結合されたものである。
内在性遺伝子としては、その植物体に特異的なものが好ましく、例えば、ダイズの場合にはレクチン遺伝子、トウモロコシの場合にはツェイン遺伝子やショ糖合成酵素ＩＩｂ遺伝子など、検査対象となる植物体に固有の遺伝子が利用できる。
組換え遺伝子部分に特異的な遺伝子としては、組換え体に特異的な酵素を発現する遺伝子や同時に導入されたＤＮＡ配列のほか、組換え体に特異的なカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターやライスアクチンプロモーターのようなプロモーター遺伝子、ＮＯＳターミネーターのようなターミネーター遺伝子、もしくはそれらの遺伝子ではさまれた領域などが利用できる。
競合核酸分子は、標的となる遺伝子と同一のプライマー対で増幅し、且つ、標的遺伝子とは分子量や制限酵素で切断した時のパターンが異なるようにデザインされている。このためには、標的遺伝子の配列を元に、ＰＣＲ法などの手法を用いて、配列内部に、塩基の挿入、欠失又は変異を導入すればよい。分子量を長く、または短くデザインしたものを利用する場合は、１０〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基程度の配列を挿入するか欠失させることが望ましい。あるいは、配列内部に変異を導入して、特定の制限酵素部位を導入又は欠失させてもよい。
さらにまた、標的遺伝子配列の両端のプライマー結合領域と同一のプライマー結合領域を両端に有し、標的遺伝子配列とは異なる分子量を有するように、例えば、１０〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基程度長く又は短くなるようにデザインしたものも競合核酸分子として利用可能である。
つまり競合的ＰＣＲの結果、分子量の異なるバンドを同一のプライマー対で合成させうることができれば、競合核酸分子のプライマー結合領域にはさまれた内部配列は、標的配列と異なるものでもよい。
２種以上の競合核酸分子を同一核酸分子上に結合して競合核酸断片とする方法としては、接着断片を持つプライマーを用いたＰＣＲ法のほか、必要な部分を制限酵素で切り出しライゲーションする方法なども利用できる。結合の形態としては競合核酸分子を直接結合する方法の他に、競合核酸分子間に制限酵素部位を挿入することなどもできる。
また、２種以上の競合核酸分子を同一核酸分子上に結合する際の競合核酸分子の配列順序は自由に選択することができる。すなわち、内在性遺伝子部分に対応する第１競合核酸分子が、特異的な遺伝子に対応する第２競合核酸分子の上流側にあっても良く、また下流側にあっても良い。さらに、本発明の競合核酸断片には、第１競合核酸分子と第２競合核酸分子の間、又はこれらの上流側又は下流側に、他の第１競合核酸分子及び／又は第２競合核酸分子が存在しても良く、第１競合核酸分子及び第２競合核酸分子以外の核酸分子が存在しても良い。
本発明の第１競合核酸分子及び第２競合核酸分子の大きさは、特に制限されないが、好ましくは５０〜３００塩基、さらに好ましくは１００〜２００塩基程度が望ましい。
本発明の競合核酸断片の大きさも、特に制限されないが、好ましくは１００〜５０００塩基、さらに好ましくは３００〜１５００塩基程度が望ましい。
競合核酸分子の大きさは、短い方がＰＣＲにおける特異性は高くなるが、競合核酸断片を構築する際のプライマーの設計が難しくなり、長過ぎると特異性が低くなり、また構築した競合核酸断片を増幅する際にプラスミドに導入するのが困難になる。
また本発明の競合核酸断片の大きさは、結合する競合核酸分子の大きさに依存するが、長過ぎるとプラスミドに導入するのが困難になる。
このようにして構築した競合核酸断片をプラスミドにサブクローニングし、そのプラスミドを増殖させることによって同一の核酸分子を大量に作成することも可能である。競合核酸断片をプラスミドにサブクローニングさせる方法としては、制限酵素認識配列を付加させる方法やＴＡクローニングなどの方法を、その配列に応じて利用することができる。
被験液（競合的ＰＣＲ反応溶液）は、試料から抽出したＤＮＡ溶液、競合核酸断片、ｄＮＴＰ溶液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、検知用プライマー、その他ＰＣＲ反応に必要な塩類などを必要に応じて調製したものを用いる。被験液の容量は必要に応じて２５μｌから１００μｌ程度の間で設定することが望ましい。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーで温度をコントロールし、目的の標的配列及び競合核酸断片が競合的に増幅されるような温度とサイクル数を確認して、設定すればよい。
競合的ＰＣＲ反応後のＰＣＲ産物の解析は、電気泳動法などを用いて分画されたＤＮＡバンドを測定することによって行うことができる。競合核酸分子由来のＤＮＡバンド、標的配列由来のＤＮＡバンドを測定し、その強度からコピー数を導き出すことで、試料中の標的遺伝子の定量が可能となる。
本発明の遺伝子組換え体遺伝子の定量に使用するためのキットは、上記本発明の競合核酸断片と、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子と第１競合核酸分子とを増幅するための第１プライマー対と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子と第２競合核酸分子とを増幅するための第２プライマー対とを含んでいる。さらに、好ましくは、ｄＮＴＰ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、塩類等のＰＣＲ反応に必要な試薬類を含むことが望ましい。
内在遺伝子のコピー数と組換え遺伝子のコピー数を求め、それらの比を計算することによって試料ＤＮＡ溶液中に含まれる遺伝子組換え作物の含量が計算できる。遺伝子組換え作物含量を計算する場合には、１００％遺伝子組換え作物から得られたＤＮＡ溶液で同様の測定を行い内在性遺伝子と組換え遺伝子の比率をあらかじめ求めておく。これを内標比といい、測定で得られた値をこの比率で補正することで、より正確な定量が可能となる。内標比による補正は以下のように行う。
ある組換え品種Ａに１ゲノム当たり２個の組換え遺伝子が挿入されている場合、内在性遺伝子の数：組換え遺伝子の数＝１：２と表すことができる。内在性遺伝子１つあたりで考えると組換え遺伝子の数／内在性遺伝子の数＝２となり、これを組換え品種Ａの内標比という。また別の品種Ｂでは内在性遺伝子の数：組換え遺伝子の数＝１：１という場合もあり、その場合の内標比は１となる。このように同じ作物でも組換え品種によって内標比が異なっているので、あらかじめ品種を明らかにして定量することが必要である。
組換え品種Ａが１０％混入している試料について、内在性遺伝子の数と組換え遺伝子の数を測定し、たとえば内在性遺伝子のコピー数が１０，０００コピーとなった場合、組換え遺伝子のコピー数は２，０００コピーとなる。この場合の混入率は、２，０００／１０，０００／内標比（２）×１００＝１０（％）と計算することができる。
内在性遺伝子と遺伝子組換え体に特異的な遺伝子の量比（内標比）は、その遺伝子組換え作物によって一定の値を示すことが知られている。例えば、ダイズの場合はほぼ１：１であり、トウモロコシの場合は３：１から１：２あたりの値を示す。
本発明の遺伝子組換え体遺伝子の定量方法は、遺伝子組換え体が１〜５％程度混入されたものの遺伝子組換え体の含有量を測定するのに好適である。このためには、試料から抽出したＤＮＡ溶液中の内在性遺伝子のコピー数は５００コピー以上であることが望ましい。しかし、コピー数が多すぎると、一方的に反応が進み競合状態が得られない場合があるので、５０，０００コピー以下、好ましくは３０，０００コピー以下とすることが望ましい。例えば、ダイズを測定する場合には、試料から抽出したＤＮＡ溶液中の内在性遺伝子のコピー数を５，０００〜５０，０００、好ましくは５，０００〜２０，０００となるように調整したものを用いるとよい。
内在性遺伝子のコピー数を競合的ＰＣＲ法で測定する場合は、内在性遺伝子のコピー数よりも多い量の競合核酸断片を反応液中に加えておく必要がある。被験液に加える競合核酸断片のコピー数としては、試料由来の内在性遺伝子コピー数の２倍量程度のコピー数を加える必要があり、その場合の被験液中での競合核酸断片の濃度は、２０コピー／μｌ〜４，０００コピー／μｌに調整するとよい。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
実施例１
遺伝子組換えダイズの競合核酸断片の構築
内在性遺伝子部分Ｌｅ１に対応する競合核酸分子と、組換え遺伝子部分が遺伝子組換えダイズＲＲＳ（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ｓｏｙｂｅａｎ）に特異的な部分に対応する競合核酸分子を、Ｍｅｙｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ  ２０３：３３９−３４４（１９９６）とＳｔｕｄｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  Ａ  ２０７：２０７−２１３（１９９８）を参考にして作成した。
プライマーＬｅ１ｎ０１−５’，Ｌｅ１ｎ０１−３’で合成される部分よりも外側に広いプライマーＬｅ１ｏｕｔ−５’とＬｅ１ｏｕｔ−３’を設計した。次にＬｅ１ｎ０１−５’，Ｌｅ１ｎ０１−３’で合成される配列を中央付近で切断すると仮定し、その断面に対するプライマーを作成した。そのプライマーの５’側に２１ｂｐの接着部となる部分を設け、Ｌｅ１Ｍｕ１−５’，Ｌｅ１Ｍｕ１−３’とした。Ｌｅ１ｏｕｔ−５’とＬｅ１ｏｕｔ−３’で合成したＰＣＲ産物を鋳型として、Ｌｅ１ｏｕｔ−５’とＬｅ１Ｍｕ１−３’、Ｌｅ１Ｍｕ１−５’とＬｅ１ｏｕｔ−３’でそれぞれＰＣＲを行った。この結果、接着部分を持ったＰＣＲ産物が合成された。このＰＣＲ産物を混合すると、接着部分が相補的な配列となっているため接着部分で結合され、内部に２１ｂｐのヌクレオチドが挿入された塩基配列が構築された。Ｌｅ１ｏｕｔ−５’とＬｅ１ｏｕｔ−３’で再度ＰＣＲを行って増幅しＰＣＲ産物を得た。
ＲＲＳの競合核酸分子も同様に作成した。配列番号１に含まれるＲＲＳ特異的な競合核酸分子を構築する際にはＲＲｏｕｔ−５’とＲＲｏｕｔ−３’、及びＲＲＭｕ１−５’とＲＲＭｕ１−３’を用いた。
2003027283.tif 000004
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上記二種類の競合核酸分子を、接着断片を持つ下記の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ手法によって結合させた。
Ｌｅ１に特異的な競合核酸分子を鋳型としてＬｅ１ｎ０１−５’とＲＲ＋Ｌｅ１−３’でＰＣＲを行った。同様にＲＲＳに特異的な競合核酸分子を鋳型としてＬｅ１＋ＲＲ−５’とＲＲ０５−３’でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を混合し、Ｌｅ１ｎ０１−５’とＲＲ０５−３’でＰＣＲを行い、同一核酸分子上に二種類の競合核酸分子が存在する競合核酸断片を構築した。その塩基配列は配列番号１に示すとおりである。
2003027283.tif 000006
構築した競合核酸断片は、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）を用いてプラスミドＰＣＲＲ２．１−ＴＯＰＯＲにクローニングした。プラスミドは付属のコンピテントセルと混合し、ブルー／ホワイトセレクション処理したアンピシリン添加のＬＢ寒天培地に植菌した。植菌した培地は３７℃で２４時間培養し、インサートされているホワイトコロニーをひろってマスタープレートに植菌した。同時にＬｅ１ｎ０１−５’とＬｅ１ｎ０１−３’またはＲＲ０４−５’とＲＲ０５−３’を加えてあるＰＣＲ反応液に菌体を加え、ＰＣＲを行ってデザインされた長さのバンドが得られることを確認した。
希望の長さのバンドが得られたコロニーをＬＢブイヨン培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で増菌後「ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ」（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いて精製した。得られた環状ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ  Ｓｈｕｚｏ  ＣＯ．，ＬＴＤ．）で処理して直鎖状にし、競合核酸断片とした。また同時にシークエンス解析を行い全塩基配列に変化がないことを確認した（配列番号１）。
また配列番号５、６とは異なる組換え遺伝子部分を検知するプライマー（配列番号７、８）を用いて、同様に競合核酸断片を構築した。シークエンス解析を行い全塩基配列に変化がないことを確認した（配列番号２）。
＜組換え体遺伝子の定量＞
競合核酸断片を含む溶液の２６０ｎｍの吸光度を測定し、その結果と分子量を元に所定のコピー数となるように希釈して用いた。
分析試料からのＤＮＡ抽出には「ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ」（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いた。抽出したＤＮＡ溶液は２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定した。ＤＮＡの純度は２６０／２３０＝１．８以上、２６０／２８０＝１．８から２．０を目安として使用の可不可を判断した。またＤＮＡ溶液の２６０ｎｍの吸光度が１．０の時を５０ｍｇ／ｍｌとして濃度を計算し、２０ｎｇ／μｌに希釈して分析に用いた。希釈には滅菌蒸留水を用いた。
競合的ＰＣＲ法による定量は以下の様に行った。被験液（ＰＣＲ反応液）は、反応終濃度が１×ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．）、０．１６ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．５μｍｏｌ／Ｌ検知用プライマー（内在性遺伝子と第１競合核酸分子とを増幅するための第１プライマー対（２種類のプライマーの合計）又は、組換え遺伝子と第２競合核酸分子とを増幅するための第２プライマー対（２種類のプライマーの合計）のいずれか一方）、０．６２５ｕｎｉｔｓ  Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．）になるように混合し、測定対象のＤＮＡ溶液２．５μｌと所定のコピー数の競合核酸断片を加えて、全量を２５μｌとした。ここで使用した検知用プライマーは前述の通りである。
ＰＣＲ反応条件は、９６℃に１０分保った後、９６℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして、４０サイクルの増幅を行なった後、７２℃７分間保持した。ＰＣＲ産物の解析にはＡｇａｒｏｓｅＬ０３「ＴＡＫＡＲＡ」（ＴａＫａＲａ  Ｓｈｕｚｏ  ＣＯ．，ＬＴＤ．）または「ＡｇａｒｏｓｅＸ」（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ  ＣＯ．，ＬＴＤ．）を用いた。電気泳動後のゲルの画像はＣＣＤカメラで取り込み、画像解析装置によってバンドの強度を測定し数値化した。
競合核酸断片を鋳型として、Ｌｅ１ｎ０１−５’とＬｅ１ｎ０１−３’のプライマー対でＰＣＲを行った場合、得られるＰＣＲ産物の分子量は１３９ｂｐとなる。ダイズＤＮＡを鋳型に用いた場合は、その分子量は１１８ｂｐとなった。一方、競合核酸分子を鋳型としてＲＲ０４−５’とＲＲ０５−３’のプライマー対でＰＣＲを行うと、得られるＰＣＲ産物の分子量は２０１ｂｐとなり、ＲＲＳから得られたＤＮＡを鋳型に用いた場合は、１８０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
測定後の数値は次のように計算し、各遺伝子のコピー数に換算した。競合的ＰＣＲ法での測定では、ひとつのレーンに二本のバンドが現れる。一本は競合核酸分子由来、もう一本は標的配列由来のバンドである。実施例１では、競合核酸分子の分子量が標的配列よりも２１ｂｐ程度長くなるようにデザインされているので、上に競合核酸分子由来のバンド、下に標的配列由来のバンドが現れる。
画像解析装置によって数値化された競合核酸分子由来のバンド強度をＡ、標的配列由来のバンド強度をＢとする。この実施例では、被験液に加える競合核酸断片の量を５水準設定して行った。得られたデータからＡ／Ｂの値を求めＣとする。競合核酸分子５水準でそれぞれ５個のＣ値（Ｃ１からＣ５）が得られるので、ｌｏｇ（競合核酸分子のコピー数）を横軸に、ｌｏｇ（Ｃ）の値を縦軸にとると近似直線が得られる。通常相関係数（ｒ２）＝０．９９程度の値が得られる。近似直線がＹ＝０になる点、すなわちｌｏｇ（競合核酸分子のコピー数）＝ｌｏｇ（Ｃ）となる点が等量点と呼ばれる値で、試料ＤＮＡ溶液中に含まれる標的配列のコピー数である。得られたコピー数の比を計算し、試料ＤＮＡ溶液中に含まれる遺伝子組換えダイズの含有量を求める。
試験例１
本発明の組換え体遺伝子の定量法精度を確認する目的で、遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）含量をあらかじめ１％、３％、５％、１０％に調製したダイズ粉末から得られたＤＮＡ溶液を用いて測定を行った。試験は実施例１で構築した競合核酸断片を用いて、上記の定量方法で行なった。同一の試料について５回分析した。結果を以下に示す。
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表１から明らかなように、本発明方法の定量の精度は非常に高いことが確認された。
比較試験例１
遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）含量をあらかじめ０．５％、１％、５％に調製した試料を用いて同様の実験を行った。競合核酸分子は、内在性遺伝子に対するものと組換え遺伝子に対するものを別々のプラスミドにクローニングし、精製したものを用いた。その他の分析方法は上記に示した通りである。結果を以下に示す。
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試験例１に比較して、標準偏差が大きく、定量の精度が低いことが確認された。
試験例２
本発明の組換え体遺伝子の定量法精度を確認する目的で、実施例１の競合核酸断片を用いて試験を行なった。遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）含量をあらかじめ１％、３％、５％、１０％に調製したダイズ粉末から得られたＤＮＡ溶液を用いて測定した。内在性遺伝子に対する競合核酸断片の濃度は、２０００コピー／μｌ、１２００コピー／μｌ、８００コピー／μｌ、４００コピー／μｌ、２００コピー／μｌの５水準に設定した。その際に得られた各遺伝子のコピー数と定量の結果を以下に示す。
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Ｌｅ１のコピー数が５０００から３００００コピーの間に含まれる場合には、定量の精度がより高いことが確認された。
また、ＲＲＳ特異的な競合核酸分子を構築する際に、ＲＲｏｕｔ−５’とＲＲｏｕｔ−３’、及びＲＲＭｕ２−５’とＲＲＭｕ２−３’を用い、同様な操作を行うことで、配列番号２の競合核酸断片が得られた。この競合核酸断片を鋳型として、Ｌｅ１ｎ０１−５’とＬｅ１ｎ０１−３’のプライマー対でＰＣＲを行った場合、得られるＰＣＲ産物の分子量は１３９ｂｐとなる。ダイズＤＮＡを鋳型に用いた場合は、その分子量は１１８ｂｐとなった。一方、競合核酸分子を鋳型としてＲＲ０４−５’とＲＲ０５−３’のプライマー対でＰＣＲを行うと、得られるＰＣＲ産物の分子量は２０１ｂｐとなり、ＲＲＳから得られたＤＮＡを鋳型に用いた場合は、１８０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。また、ＲＳ０１−５’とＲＳ０１−３’のプライマー対を用いると１４２ｂｐと１２１ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
実施例２
遺伝子組換えトウモロコシの競合核酸断片の構築
遺伝子組換えトウモロコシのスクリーニング検査用競合核酸断片を作成した。トウモロコシの内在性遺伝子としてはショ糖合成酵素ＩＩｂの配列を用いた。これはＳＳ０１−５’とＳＳ０１−３’のプライマーによって増幅される部分である。この競合核酸断片は遺伝子組換えトウモロコシのスクリーニング検査に用いることを目的としているため、遺伝子組換え作物に広く用いられているカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに特異的な配列を検知するための部位と、除草剤耐性品種ＧＡ２１（開発者：モンサント社）に特異的な配列を検知するための部位を含めた。前者の領域を検知するためのプライマーがＣａＭ０１−５’，ＣａＭ０１−３’であり、後者を検知するためのプライマーがＧＡ０１−５’，ＧＡ０１−３’である。
以下に上記遺伝子組換えトウモロコシのスクリーニング検査用の競合核酸断片の配列を示す。網掛けの部分は挿入部分を示す。
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上記競合核酸断片を用いたトウモロコシの分析に用いられるプライマー配列の例を以下に示す。
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産業上の利用可能性
本発明の競合核酸断片は、遺伝子組換え体遺伝子の内在性遺伝子部分に対応する少なくとも１つの第１競合核酸分子と、遺伝子組換え体遺伝子の組換え遺伝子部分に特異的な遺伝子に対応する少なくとも１つの第２競合核酸分子を結合し、同一核酸上に配置したものであり、同一核酸断片上に必要な競合核酸分子が存在するので、これらを希釈してコントロールとした場合、複数の競合核酸分子のコピー数にずれがなくなる。このため、この競合核酸断片を用いた競合的ＰＣＲ法により組換え体遺伝子を定量すると、従来の方法と比較して希釈による精度低下が顕著に抑制され、精度良く測定することが可能になる。本発明の定量方法によれば、遺伝子組換え作物、例えば、遺伝子組換えダイズの組換え体混入率が５％前後のものの定量を、簡便に行うことができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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