(57)【要約】ＤＮＡチップ上で捕捉されたターゲット遺伝子に対して効率良くＰＡＬＳＡＲ法によりシグナルの増幅を確立させ、さらに、ＰＡＬＳＡＲ法に用いる一対のＨＣＰのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにしたＤＮＡチップのシグナル増幅方法を提供する。オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させる。
2003029441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とするＤＮＡチップのシグナル増幅方法。
【請求項２】
前記自己集合反応が、互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、２本鎖の自己集合体を形成させるものであることを特徴とする請求項１記載のシグナル増幅方法。
【請求項３】
前記自己集合反応が、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第１の系と、
Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第２の系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させるものであることを特徴とする請求項１記載のシグナル増幅方法。
【請求項４】
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項３記載のシグナル増幅方法。
【請求項５】
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項３記載のシグナル増幅方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡチップが、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型の支持体を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項７】
前記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項８】
前記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項９】
前記ターゲット遺伝子にＳＮＰｓ（一塩基多形）を用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１０】
前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめターゲット遺伝子と相補的な配列にすることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１１】
前記ターゲット遺伝子と前記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と自己集合体の形成に使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つジョイント・プローブを用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１２】
前記ターゲット遺伝子に結合したオリゴヌクレオチドの自己集合反応により形成された自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１３】
前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項１２記載のシグナル増幅方法。
【請求項１４】
前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１５】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１６】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、前記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１７】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載のシグナル増幅方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＤＮＡチップのシグナル増幅方法に関し、更に詳しくは、自己集合体を形成する一対のオリゴヌクレオチドを利用して、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合しておく支持体又は基板（以下、支持体と称する）として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、電気伝導性の基板型等の支持体を用いたＤＮＡチップ（以下、総称してＤＮＡチップという場合がある。）上のターゲット遺伝子の検出感度を向上させることができる遺伝子のシグナル増幅方法に関する。
背景技術
ＤＮＡチップは、表面を特殊加工したマイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、電気伝導性の固相基板型の支持体に多数の異なったＤＮＡプローブを高密度に固定した後、核酸（ターゲット）をハイブリダイゼーション（Ｊｕｄｙ，Ｍ．，Ｇｅｏｆｆｒｅｙ，Ｗ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３８，２６７−２８４，１９８４，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．，Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ：  ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，２７−３１，１９９８，ＪＰ４１３５４９８，ＪＰ４１３５５００，ＪＰ４１３５４９８，ＪＰ４１３５５００，ＵＳ００５９５２１７２Ａ，ＵＳ６３４６３８７Ｂ１及びＵＳ６１８０３４６Ｂ１参照）させ、核酸（ターゲット）のシグナルを測定して遺伝子を検出するものである。
現在、この技術は遺伝子の発現解析や変異遺伝子等の検出などに用いられているが、従来から用いられてきたサザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｍｏｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｇｅｌ  ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３−５１７，１９７５）と比較して、検出感度が十分の一（村松正明ら、ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、秀潤社、８５−８６，２０００）と低く、反応時間が長いという課題があった。
また、ターゲット遺伝子の検出感度を上げるために耐熱性ＤＮＡリガーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するＬＣＲ法（ＵＳＰ５，７９２，６０７）や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．，Ｓ．Ｓｃｈａｒｆ，Ｆ．Ｆａｌｏｏｎａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０，１３５０−１３５４（１９８５））などの遺伝子増幅法を用いて、事前にターゲット遺伝子を増幅する方法があるが、煩雑な操作が必要であり、且つ高コストであった。
上記の問題点に鑑み、本発明者等は酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した（ＵＳＰ６，２６１，８４６、日本特許第３２６７５７６号及びＥＰ１，００２，８７７Ａ）。この方法は、３個所の領域から構成される１対のオリゴヌクレオチド（ＨｏｎｅｙＣｏｍｂ  Ｐｒｏｂｅ、以下、ＨＣＰと称する）を用いる方法であり、第１ＨＣＰと第２ＨＣＰの各々の３個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のＨＣＰを反応させた場合、お互いにハイブリダイズし、ＨＣＰの自己集合反応により集合体を形成させることができる（Ｐｒｏｂｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、このＨＣＰの自己集合反応による集合体の形成法をＰＡＬＳＡＲ法と称する）。
発明の開示
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、上記したＰＡＬＳＡＲ法を用いて、ＤＮＡチップの検出感度を高くすべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものである。
本発明は、ＤＮＡチップ上で捕捉されたターゲット遺伝子に対して効率良くＰＡＬＳＡＲ法によりシグナルの増幅を確立させ、さらに、ＰＡＬＳＡＲ法に用いる一対のＨＣＰのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにしたＤＮＡチップのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記問題を解決するため、本発明のＤＮＡチップのシグナル増幅方法は、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させるものである。
上記自己集合反応として、第一に、互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、２本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。
上記自己集合反応として、第二に、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第１の系と、
Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第２の系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブ（ダイマー形成用プローブ及び該架橋プローブをプローブと総称する）をハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。
上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
また、上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
上記ＤＮＡチップが、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックやポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやブラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極やＩＴＯ電極（ｉｎｄｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ電極）などを使用することができる。
上記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。
上記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。
上記ターゲット遺伝子にＳＮＰｓ（一塩基多形）を用いることができる。
上記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめターゲット遺伝子と相補的な配列にすることが好ましい。
上記ターゲット遺伝子と上記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と自己集合体の形成に使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つジョイント・プローブを用いることが好ましい。
上記ターゲット遺伝子に結合したオリゴヌクレオチドの自己集合反応により形成された自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することが可能である。
標識プローブとしては、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。
上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、上自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することが可能である。
上記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱しない限り種種の変形が可能なことはいうまでもない。
図１〜図４は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例を原理的に示す模式図である。第１の例は、互いに相補的な３領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（即ち、一対のＨＣＰ；ＨＣＰ−１，ＨＣＰ−２）を用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したＤＮＡチップのシグナル増幅方法であり、且つターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、あらかじめ蛍光物質で標識された一対のＨＣＰを用いる例を示す。
図１に示した如く、支持体として使用したスライドガラス（符号Ａ）上にターゲット遺伝子に相補的な領域を持つ捕捉用ＤＮＡプローブ（符号Ｂ）を結合させる（ステップ１００）。次に図２に示した如く、ターゲット遺伝子（符号Ｃ）を捕捉した後（ステップ１０２）、図３に示した如く、そのターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質で標識された片方のＨＣＰ−１（符号Ｄ）を結合させる（ステップ１１０）。図３に示したこのＤＮＡチップを対象にして、図４に示した如く、もう一方のＨＣＰ−２（符号Ｅ）を加えて（ステップ１１２）、自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることができる（ステップ１１４）。なお、ステップ１１０とステップ１１２を同時に行うことも可能である。
図５及び図６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例を原理的に示す模式図である。第２の例は、一対のＨＣＰを用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したＤＮＡチップのシグナル増幅方法であり、且つターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、蛍光物質で標識されていない一対のＨＣＰを用いる例を示す。
上記した第１の例と同様にして、ステップ１００及びステップ１０２を行った後、一対のＨＣＰを添加し、自己集合体を形成させた後（ステップ１２０）、図５に示した如く、形成された自己集合体に対してインターカレーター（符号Ｆ）を挿入し（ステップ１２２）、図６に示した如く、シグナルを増幅させることができる（ステップ１２４）。なお、ステップ１２０とステップ１２２を同時に行うことも可能である。
図７〜図９は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第３の例を原理的に示す模式図である。第３の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したＤＮＡチップのシグナル増幅方法であり、ターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、あらかじめ蛍光物質で標識された一対のダイマー形成用プローブ（ダイマー形成用プローブ−１、２）を用いる例を示す。
上記した第１の例と同様にして、ステップ１００及びステップ１０２を行った後、図７に示した如く、そのターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、自らダイマーを形成するダイマー形成用プローブ−１、２（符号Ｇ、Ｈ）とターゲット遺伝子をハイブリダイゼーションさせる（ステップ１３０）。続いて、図８に示した如く、ダイマーを形成したダイマー形成用プローブ−１、２に対して相補的領域を有する架橋プローブ−１、２（符号Ｉ、Ｊ）をハイブリダイゼーションさせ（ステップ１３２）、図９に示した如く、ダイマー形成用プローブと架橋プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることができる（ステップ１３４）。なお、ステップ１３０とステップ１３２を同時に行うことも可能である。
図１０は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第４の例を原理的に示す模式図である。第４の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したＤＮＡチップのシグナル増幅方法であり、ターゲット遺伝子と相補的な領域を持つ一対のダイマー形成用プローブ（ダイマー形成用プローブ−１、２）を用いて、ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを標識しない場合である。
上記した第１の例と同様にして、ステップ１００及びステップ１０２を行った後、一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを添加し、自己集合体を形成させた後（ステップ１４０）、図１０に示した如く、形成された自己集合体に対してインターカレーター（符号Ｆ）を挿入し（ステップ１４２）、シグナルを増幅させることができる（ステップ１４４）。なお、ステップ１４０とステップ１４２を同時に行うことも可能である。
本発明のシグナル増幅方法において、一対のオリゴヌクレオチド・プローブにあらかじめ検出のための標識物質として、例えば、Ｉ１２５やＰ３２等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジウム・エステル等の発光物質やＣｙ３・Ｃｙ５等の蛍光物質、４−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。
また、核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。図５、図６及び図１０に示した如く、インターカレーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲット遺伝子を検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｓｔａｉｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ  ｓｔａｉｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｇｏｌｄ  ｓｔａｉｎ、Ｖｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｔａｉｎ、Ｇｅｌｓｔａｒ  ｓｔａｉｎ、Ｒａｄｌａｎｔ  Ｒｅｄ  ｓｔａｉｎ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｌＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｂｉｓ−Ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｌｏｄｉｄｅ、ＹＯ−ＰＲＯ−１  ｌｏｄｉｄｅ、ＹＯ−ＰＲＯ−３  ｌｏｄｉｄｅ（以上、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、臭化エチジウム、Ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ  Ａ、ＴＯＴＯ、Ｐｓｏｒａｌｅｎ、アクリニジウムオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、ＡＯＡＯ（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）等が使用できる。
上記した一対のオリゴヌクレオチドを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ＷＯ９２／２０７０２）やＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８．５４，３６０７−３６３０．，Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８．１２０，１３２５２−１３２５３．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．２０００．９７，５６３３−５６３８．）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
オリゴヌクレオチド・プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
本発明は、ＤＮＡチップで捕捉したターゲット遺伝子に対して、相補的な領域を有する一対のＨＣＰ又は一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブで集合体を形成させるものである。使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、１０２〜１０１５本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃である。
本発明におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅したＤＮＡ及び／またはＲＮＡ等の核酸も使用できる。
実施例
以下に、本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、この実施例は例示的に示されるもので、限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
（１）材料
以下に実施例において用いたオリゴヌクレオチド・プローブを示す。
［１］プローブ１；捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａ
2003029441.tif 000003
［２］プローブ２；ターゲット遺伝子−１
2003029441.tif 000004
［３］プローブ３；ＨＣＰ−１
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［４］プローブ４；ＨＣＰ−２
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［５］プローブ５；ＨＣＰ−３
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［６］プローブ６；ＨＣＰ−４
2003029441.tif 000008
［７］プローブ７；ダイマー形成用プローブ−１
2003029441.tif 000009
［８］プローブ８；ダイマー形成用プローブ−２
2003029441.tif 000010
［９］プローブ９；架橋プローブ−１
2003029441.tif 000011
［１０］プローブ１０；架橋プローブ−２
2003029441.tif 000012
「１１］プローブ１１；捕捉用ＤＮＡプローブ−２ａ
2003029441.tif 000013
2003029441.tif 000014
［１２］プローブ１２；捕捉用ＤＮＡプローブ−１ｂ
2003029441.tif 000015
［１３］プローブ１３；ターゲット遺伝子−２
2003029441.tif 000016
［１４］プローブ１４；ＨＣＰ−５
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［１５］プローブ１５；ＨＣＰ−６
2003029441.tif 000018
［１６］プローブ１６；捕捉用ＤＮＡプローブ−２ｂ
2003029441.tif 000019
ハイブリッド液として、（０．８μｇ／μＬポリｄＡ、０．１μｇ／μＬ酵母ｔＲＮＡ、０．１５μｇ／μＬヒトＣｏｔ−Ｉ  ＤＮＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｓａｒｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ、０．２％ＳＤＳ、６×ＳＳＣ）のハイブリッド液を用いた。
（実施例１〜３及び比較例１〜３）
（１）目的
Ｃｙ３標識した一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）によるシグナル増幅の効果を調べた。
（２）材料
（実施例１〜３）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（実施例１）、５０ｎｇ／μＬ（実施例２）、５ｎｇ／μＬ（実施例３）に調製したターゲット遺伝子−１と相補的な領域を有する捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、５０ｎｇのターゲット遺伝子−１をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱し１次ハイブリ液Ａを調製した。
（ｃ）２次ハイブリ液として、２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したＨＣＰ−１と２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したＨＣＰ−２をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱し２次ハイブリ液Ａを調製した。
（比較例１〜３）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（比較例１）、５０ｎｇ／μＬ（比較例２）、５ｎｇ／μＬ（比較例３）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したＨＣＰ−１をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱し２次ハイブリ液Ｂを調製した。
（３）方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に１次ハイブリ液２５μＬを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて４２℃で２４時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でカバーグラスを外し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでスライドグラスをすすいだ。更に１×ＳＳＣ中、室温の０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に２次ハイブリ液１０μＬを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて４２℃で１６時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でカバーグラスを外し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでスライドグラスをすすいだ。更に１×ＳＳＣ中、室温の０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
（４）検出方法
上記スライドグラスを、蛍光顕微鏡（５８０ｎｍ）で観察を行った。
（５）結果
実施例１〜３及び比較例１〜３の結果を図１１に示す。図１１に示されるように、自己集合体を形成する実施例１〜３は、自己集合体を形成しない比較例１〜３に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Ｃｙ３標識した一対のＨＣＰによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、ＤＮＡチップのシグナルが著しく増幅された。
（実施例４〜６及び比較例４〜６）
（１）目的
一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによる検出を行った。
（２）材料
（実施例４〜６）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（実施例４）、５０ｎｇ／μＬ（実施例５）、５ｎｇ／μＬ（実施例６）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、２５ｐｍｏｌのＨＣＰ−１と２５ｐｍｏｌのＨＣＰ−２をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱し２次ハイブリ液Ｃを調製した。
（比較例４〜６）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（比較例４）、５０ｎｇ／μＬ（比較例５）、５ｎｇ／μＬ（比較例６）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、２５ｐｍｏｌのＨＣＰ−１をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱し２次ハイブリ液Ｄを調製した。
（３）方法
実施例１〜３及び比較例１〜３と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
（４）検出方法
原液を０．５×ＴＢＥで１０００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で３分間静置した。室温の０．５×ＴＢＥで３回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡（４７５ｎｍ）で観察を行った。
（５）結果
実施例４〜６及び比較例４〜６の結果を図１２に示す。図１２に示されるように、自己集合体を形成する実施例４〜６は、自己集合体を形成しない比較例４〜６に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のＨＣＰによる自己集合体形成反応を利用し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、ＤＮＡチップのシグナルが著しく増幅された。
（実施例７〜９及び比較例７〜９）
（１）目的
一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いて、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによる検出を行った。
（２）材料
（実施例７〜９）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（実施例７）、５０ｎｇ／μＬ（実施例８）、５ｎｇ／μＬ（実施例９）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、上記２次ハイブリ液Ｃを用いた。
（比較例７〜９）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（比較例７）、５０ｎｇ／μＬ（比較例８）、５ｎｇ／μＬ（比較例９）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、上記２次ハイブリ液Ｄを用いた。
（３）方法
上記実施例１〜３及び比較例１〜３の（３）と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
（４）検出方法
原液をＴＥで２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で３０分間静置した。室温の０．５×ＴＢＥで３回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡（４７５ｎｍ）で観察を行った。
（５）結果
実施例７〜９及び比較例７〜９の結果を図１３に示す。図１３に示されるように、自己集合体を形成する実施例７〜９は、自己集合体を形成しない比較例７〜９に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のＨＣＰによる自己集合体形成反応を利用し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、ＤＮＡチップのシグナルが著しく増幅された。
（実施例１０〜１２及び比較例１０〜１２）
（１）目的
一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いて、ＥｔＢｒによる検出を行った。
（２）材料
（実施例１０〜１２）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（実施例１０）、５０ｎｇ／μＬ（実施例１１）、５ｎｇ／μＬ（実施例１２）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、上記２次ハイブリ液Ｃを用いた。
（比較例１０〜１２）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（比較例１０）、５０ｎｇ／μＬ（比較例１１）、５ｎｇ／μＬ（比較例１２）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、上記２次ハイブリ液Ｄを用いた。
（３）方法
上記実施例１〜３及び比較例１〜３の（３）と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
（４）検出方法
１０μｇ／μＬのＥｔＢｒをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で３０分間静置した。室温の０．５×ＴＢＥで３回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡（５８０ｎｍ）で観察を行った。
（５）結果
実施例１０〜１２及び比較例１０〜１２の結果を図１４に示す。図１４に示されるように、自己集合体を形成する実施例１０〜１２は、自己集合体を形成しない比較例１０〜１２に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のＨＣＰによる自己集合体形成反応を利用し、ＥｔＢｒにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、ＤＮＡチップのシグナルが著しく増幅された。
（実施例１３〜１５及び比較例１３〜１５）
（１）目的
実施例１〜３のＨＣＰとは異なる一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−３及びＨＣＰ−４）を用いて、Ｃｙ３標識した一対のＨＣＰによるシグナル増幅の効果を調べた。
（２）材料
（実施例１３〜１５）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（実施例１３）、５０ｎｇ／μＬ（実施例１４）、５ｎｇ／μＬ（実施例１５）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したＨＣＰ−３と２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したＨＣＰ−４をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱し２次ハイブリ液Ｅを調製した。
（比較例１３〜１５）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（比較例１３）、５０ｎｇ／μＬ（比較例１４）、５ｎｇ／μＬ（比較例１５）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液として、２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したプローブ５をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱し２次ハイブリ液Ｆを調製した。
（３）方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に１次ハイブリ液２５μＬを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて４２℃で２時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でカバーグラスを外し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでスライドグラスをすすいだ。更に１×ＳＳＣ中、室温の０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に２次ハイブリ液１０μＬを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて５４℃で６時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でカバーグラスを外し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでスライドグラスをすすいだ。更に１×ＳＳＣ中、室温の０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
（４）検出方法
上記スライドグラスに対して、蛍光顕微鏡（５８０ｎｍ）で観察を行った。
（５）結果
実施例１３〜１５及び比較例１３〜１５の結果を図１５に示す。図１５に示されるように、自己集合体を形成する実施例１３〜１５は、自己集合体を形成しない比較例１３〜１５に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Ｃｙ３標識した一対のＨＣＰによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、ＤＮＡチップのシグナルが著しく増幅された。実施例１〜３との比較より、一対のＨＣＰの塩基配列及び反応条件を調節することにより、より検出感度を向上させることが可能なことがわかる。
（実施例１６〜１８及び比較例１６〜１８）
（１）目的
Ｃｙ３標識した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブによるシグナル増幅の効果を調べた。
（２）材料
（実施例１６〜１８）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（実施例１６）、５０ｎｇ／μＬ（実施例１７）、５ｎｇ／μＬ（実施例１８）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液を以下の如く調製した。２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したダイマー形成用プローブ−１と２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したダイマー形成用プローブ−２をハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱後、４５℃で１６時間静置した。これに５０μＭの架橋プローブ−１溶液及び５０μＭの架橋プローブ−２溶液を０．５μＬ加え２次ハイブリ液Ｇを調製した。
（比較例１６〜１８）
（ａ）捕捉用プローブは、５００ｎｇ／μＬ（比較例１６）、５０ｎｇ／μＬ（比較例１７）、５ｎｇ／μＬ（比較例１８）に調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−１ａをそれぞれ用いた。
（ｂ）１次ハイブリ液として、上記１次ハイブリ液Ａを用いた。
（ｃ）２次ハイブリ液を以下の如く調製した。２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したダイマー形成用プローブと２５ｐｍｏｌのＣｙ３標識したダイマー形成用プローブをハイブリッド液１０μＬで溶解し９５℃で２分間加熱後、４５℃で１６時間静置した。これに蒸留水０．５μＬを加え２次ハイブリ液Ｈを調製した。
（３）方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に１次ハイブリ液２５μＬを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて４２℃で２時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でカバーグラスを外し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでスライドグラスをすすいだ。更に１×ＳＳＣ中、室温の０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に２次ハイブリ液１０μＬを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて５８℃で２時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でカバーグラスを外し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでスライドグラスをすすいだ。更に１×ＳＳＣ中、室温の０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
（４）検出方法
上記スライドグラスに対して、蛍光顕微鏡（５８０ｎｍ）で観察を行った。
（５）結果
実施例１６〜１８及び実施例１６〜１８の結果を図１６に示す。図１６に示されるように、自己集合体を形成する実施例１６〜１８は、自己集合体を形成しない比較例１６〜１８に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Ｃｙ３標識した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、ＤＮＡチップのシグナルが著しく増幅された。
（実験例１〜４）
（１）目的
Ｃｙ３標識した一対のＨＣＰ２種（ＨＣＰ−３とＨＣＰ−４、ＨＣＰ−５とＨＣＰ−６）を用いて、ＨＣＰによるシグナル増幅の特異性を調べた。
（２）材料
（ａ）捕捉用プローブは、５０ｐｍｏｌ／μＬ又は５ｐｍｏｌ／μＬにそれぞれ調製した、ターゲット遺伝子−２に相補的な領域を有する捕捉用ＤＮＡプローブ−２ａもしくはターゲット遺伝子−１と相補的な領域を有する捕捉用ＤＮＡプローブ−１ｂを用いた。
（ｂ）実験例１では、１次ハイブリ液として、下記の如く調製した１次ハイブリッド液Ｂを用いた。ターゲット遺伝子−１；３ｐｍｏｌをハイブリ液Ｘ（５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ、０．２％ＳＤＳ、６×ＳＳＣ）３０μＬに溶解し、９５℃で２分加熱し、１次ハイブリッド液Ｂを調製した。
実験例２では、１次ハイブリ液として、下記の如く調製した１次ハイブリッド液Ｃを用いた。ターゲット遺伝子−２；３ｐｍｏｌをハイブリ液Ｘ：３０μＬに溶解し、９５℃  ２分加熱し、１次ハイブリッド液Ｃを調製した。
実験例３では、１次ハイブリ液として、下記の如く調製した１次ハイブリッド液Ｄを用いた。ターゲット遺伝子−１とターゲット遺伝子−２それぞれ３ｐｍｏｌをハイブリ液Ｘ：３０μＬに溶解し、９５℃  ２分加熱し、１次ハイブリッド液Ｄを調製した。
実験例４では、１次ハイブリ液として、下記の如く調製した１次ハイブリッド液Ｅを用いた。ターゲット遺伝子を加えないハイブリ液Ｘ：３０μＬを９５℃  ２分加熱し、１次ハイブリッド液Ｅを調製した。
（ｃ）２次ハイブリ液として、Ｃｙ３標識したＨＣＰ−５とＣｙ３標識したＨＣＰ−６とＣｙ３標識したＨＣＰ−３とＣｙ３標識したＨＣＰ−４それぞれ３０ｐｍｏｌをハイブリ液Ｘ：３０μＬに溶解し、９５℃２分加熱し、２次ハイブリ液Ｘを調製した。
（３）方法
捕捉用ＤＮＡプローブ−２（５０ｐｍｏｌ／μＬ又は５ｐｍｏｌ／μＬ）又は捕捉用ＤＮＡプローブ−１ｂ（５０ｐｍｏｌ／μＬ又は５ｐｍｏｌ／μＬ）をそれぞれスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。同様にスポットしたスライドガラス４枚のそれぞれに一次ハイブリ液Ｂ〜Ｅ：２５μＬをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ用チャンバー内に滴下した後、シールし、４２℃で２時間静置した。その後、チャンバーをはずし、室温での２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで２度すすいだ。続いて１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分静置した後、エアスプレーでスライドを乾燥させた。
次に２次ハイブリ液２５μＬをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ用チャンバー内に滴下した後、シールし、５７．７℃２時間静置した。その後、チャンバーをはずし、室温での２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで２度すすいだ。続いて１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ２分静置した後、エアスプレーでスライドを乾燥させ、蛍光顕微鏡（５８０ｎｍ）で観察を行った。
（４）結果
実験例１〜４の結果を図１７に示す。図１７に示されるように、捕捉用ＤＮＡプローブ−１ｂが固定化された場所では、ターゲット遺伝子−１が捕捉され、ＨＣＰによりシグナルが増幅された。また、捕捉用ＤＮＡプローブ−２ａが固定化された場所では、ターゲット遺伝子−２が捕捉され、ＨＣＰによりシグナルが増幅された。
（実験例５及び６）
（１）目的
支持体に微分パルスボルタンメトリー法により電流値が測定できる金電極を使用し、蛍光のインターカレーターの代わりに電気化学的に活性なインターカレーターを使用して、ＨＣＰによる遺伝子のシグナル増幅を調べた。
（実験例５）
（２）材料および方法
金電極（ＢＡＳ社製）を０．０５μｍのアルミナパウダーサスペンジョン（バイカロックス社製）により研磨し、滅菌蒸留水でリンス後、１００％エタノール中で１５分間超音波洗浄した。滅菌蒸留水でリンス後、Ａｕ表面を乾燥させ、１０ｐｍｏｌ／μＬに調製した捕捉用ＤＮＡプローブ−２ｂをＡｕ上に２μＬアプライした。乾燥を防ぐためにキャップをして、湿潤箱に入れて、室温で一晩静置した。
滅菌蒸留水でリンス後、測定バッファー［０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．６、酢酸カリウム／酢酸）、０．１Ｍ塩化カリウム、５０μＭ  Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８］中で１８０秒静置後、ＡＬＳ６３０（ＢＳＡ社製）を用いて微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した（捕捉用プローブの値：ｉ０）。
ターゲット溶液として、ターゲット遺伝子−２；１ｐｍｏｌ／μＬを含有させた５×ＳＳＣ溶液を調製した。滅菌蒸留水でリンス後、上記ターゲット溶液を２μＬ、Ａｕ電極上にアプライした。
キャップ後、湿潤箱に入れ、４５℃で１８０分静置しハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、０．２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回、１×ＳＳＣで１回、０．２×ＳＳＣで１回洗浄後、乾燥させた。
測定バッファー［０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．６、酢酸カリウム／酢酸）、０．１Ｍ塩化カリウム、５０μＭ  Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８］中で１８０秒静置後、微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した（捕捉用プローブにターゲットが結合した時の値：ｉ１）。
滅菌蒸留水でリンス後、一対のＨＣＰを含有する溶液［ＨＣＰ−５及びＨＣＰ−６を各０．１５６ｐｍｏｌ／μＬ、１２×ＳＳＣ、１０μＭ  Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８］をＡｕ電極上に２μＬアプライした。
キャップ後、湿潤箱に入れ５８℃で１２０分静置してポリマーを形成させた。
２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、０．２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回、１×ＳＳＣで１回、０．２×ＳＳＣで２回洗浄後、乾燥させ、測定バッファー［０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．６、酢酸カリウム／酢酸）、０．１Ｍ塩化カリウム、５０μＭ  Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８］中で１８０秒静置後、微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した（捕捉用プローブに結合しているターゲットにＨＣＰを結合させて自己集合させた時の値：ｉ２）。
（実験例６）
ターゲット溶液として、ターゲット遺伝子−２；１ｐｍｏｌ／μＬを含有させた５×ＳＳＣ溶液の代わりに、ターゲット遺伝子−２；０．５ｐｍｏｌ／μＬを含有させた５×ＳＳＣ溶液を調製して用いた以外は上記実験例５と同様の手順及び条件により実験を行った。
（５）結果
表１は実験例５（ターゲット遺伝子−２；１ｐｍｏｌ／μＬ）、表２は実験例６（ターゲット遺伝子−２；０．５ｐｍｏｌ／μＬ）の結果である。
表１及び表２の結果に示した如く、表１、表２ともにターゲット遺伝子のみをハイブリダイゼーションさせた時よりも、ＨＣＰを使い自己集合させた時の方が、得られる電流のピーク値の増加率が大きくなった。
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産業上の利用可能性
上述したように、本発明のオリゴヌクレオチドの自己集合反応を利用したＤＮＡチップのシグナル増幅方法により、煩雑な操作を行うことなく、簡便にＤＮＡチップのターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上させることが可能である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１〜第４の例におけるステップ１００を原理的に示す模式図である。
図２は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１〜第４の例におけるステップ１０２を原理的に示す模式図である。
図３は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ１１０を原理的に示す模式図である。
図４は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ１１４を原理的に示す模式図である。
図５は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ１２２を原理的に示す模式図である。
図６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ１２４を原理的に示す模式図である。
図７は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第３の例におけるステップ１３０を原理的に示す模式図である。
図８は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第３の例におけるステップ１３２を原理的に示す模式図である。
図９は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第３の例におけるステップ１３４を原理的に示す模式図である。
図１０は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第４の例におけるステップ１４４を原理的に示す模式図である。
図１１は、実施例１〜３及び比較例１〜３の結果を示す写真である。
図１２は、実施例４〜６及び比較例４〜６の結果を示す写真である。
図１３は、実施例７〜９及び比較例７〜９の結果を示す写真である。
図１４は、実施例１０〜１２及び比較例１０〜１２の結果を示す写真である。
図１５は、実施例１３〜１５及び比較例１３〜１５の結果を示す写真である。
図１６は、実施例１６〜１８及び比較例１６〜１８の結果を示す写真である。
図１７は、実験例１〜４の結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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