(57)【要約】本発明は、所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物の作製方法、ならびに所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物またはその子孫に関する。本発明はまた、上記のキメラ非ヒト動物を用いて、その表現型を対応の野生型のものと比較することによって、所望の蛋白質または該蛋白質をコードする遺伝予の機能を解析する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ非ヒト動物の作製方法であって、
１）少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する工程、
２）前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚に、前記工程１で作製した分化多能性を有する細胞を注入してキメラ胚を得る工程、
３）前記工程２で得たキメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、ならびに
４）前記工程３で移植した後得られた仔動物の中から、少なくとも前記特定の細胞および／または組織において所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程、
を含むものである、前記方法。
【請求項２】
所望の蛋白質をコードする核酸配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
所望の蛋白質をコードする核酸配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンの下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に配置されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
インターナルリボゾーマルエントリーサイトと所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ポリＡシグナル領域、プロモーター配列および所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーター配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
プロモーター配列、所望の蛋白質をコードする核酸配列およびポリＡシグナル領域を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に配置されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーター配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と、前記プロモーター配列との距離が１Ｋｂを超えないものである、請求７記載の方法。
【請求項１０】
分化多能性を有する細胞が、少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムと、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子が不活性化されているゲノムの両方を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
分化多能性を有する細胞が胚性幹細胞である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
キメラ非ヒト動物が、マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
キメラ非ヒト動物がマウスである請求項１記載の方法。
【請求項１４】
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および／または組織との組み合わせが、以下の（１）〜（７）からなる群から選択されるものである、請求項１記載の方法。
（１）免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、Ｂリンパ球細胞、
（２）Ｔ細胞受容体遺伝子と、Ｔリンパ球細胞、
（３）ミオグロビン遺伝子と、筋肉細胞、
（４）クリスタリン遺伝子と、眼球の水晶体、
（５）レニン遺伝子と、腎臓組織、
（６）アルブミン遺伝子と、肝臓組織、および
（７）リパーゼ遺伝子と、膵臓組織
【請求項１５】
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および／または組織との組み合わせが、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とＢリンパ球細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により作製されたキメラ非ヒト動物から交配によって前記所望の蛋白質を発現することができるその子孫を得ることを含む、所望の蛋白質を発現する非ヒト動物の作製方法。
【請求項１７】
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞と、前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚とに由来するキメラ非ヒト動物であって、少なくとも前記特定の細胞および／または組織において前記所望の蛋白質を発現することができる、前記キメラ非ヒト動物。
【請求項１８】
所望の蛋白質をコードする核酸配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置されたものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項１９】
所望の蛋白質をコードする核酸配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンの下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に配置されたものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２０】
インターナルリボゾーマルエントリーサイトと所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置されたものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２１】
ポリＡシグナル領域、プロモーター配列および所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置されたものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２２】
前記プロモーター配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものである、請求項２１記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２３】
プロモーター配列、所望の蛋白質をコードする核酸配列およびポリＡシグナル領域を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に配置されたものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２４】
前記プロモーター配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものである、請求項２３記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２５】
前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と、前記プロモーター配列との距離が１Ｋｂを超えないものである、請求項２３記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２６】
分化多能性を有する細胞が、少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムと、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子が不活性化されているゲノムの両方を含むものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２７】
分化多能性を有する細胞が胚性幹細胞である請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２８】
マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２９】
マウスである請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項３０】
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した細胞および／または組織との組み合わせが、以下の（１）〜（７）からなる群から選択されるものである、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
（１）免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、Ｂリンパ球細胞、
（２）Ｔ細胞受容体遺伝子と、Ｔリンパ球細胞、
（３）ミオグロビン遺伝子と、筋肉細胞、
（４）クリスタリン遺伝子と、眼球の水晶体、
（５）レニン遺伝子と、腎臓組織、
（６）アルブミン遺伝子と、肝臓組織、および
（７）リパーゼ遺伝子と、膵臓組織
【請求項３１】
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した細胞および／または組織との組み合わせが、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とＢリンパ球細胞である、請求項１７記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項３２】
請求項１７〜３１のいずれか１項に記載のキメラ非ヒト動物、もしくは所望の蛋白質を発現することができる前記キメラ非ヒト動物の子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型非ヒト動物の表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物の作製方法、ならびに所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物またはその子孫に関する。
本発明はまた、上記のキメラ非ヒト動物を用いて、その表現型を対応の野生型のものと比較することによって、所望の蛋白質または該蛋白質をコードする遺伝子の機能を解析する方法に関する。
背景技術
ヒトゲノム全塩基配列決定という歴史的な研究成果（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２１，２００１）は、同時に膨大な数の新規遺伝子の機能解明という新たな研究課題をもたらした。例えば２４本のヒト染色体中２番目に小さく、最初に全塩基配列が決定されたヒト２２番染色体（Ｄｕｎｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，４０２：４８９−４９５，１９９９）を例にとれば、合計５４５個の遺伝子（偽遺伝子を除く）の存在が推定された。その内訳は、塩基配列およびアミノ酸配列が既知の遺伝子が２４７個、既知遺伝子と相同性を示す新規遺伝子が１５０個、Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｓｅ  Ｔａｇ（ＥＳＴ）データベースに登録されている機能未知の配列と相同な新規遺伝子が１４８個であった。加えてゲノム配列から遺伝子を直接予測するソフトウェア（ＧＥＮＥＳＣＡＮ）による解析では、さらに３２５個の転写産物未確認の新規遺伝子が予測された（Ｄｕｎｈａｍら、前記）。遺伝子とその産物である蛋白質の生体内における機能を明らかにすることは、生命活動のプログラムを理解する上で重要なばかりでなく、様々なヒト疾患を克服するための新たな医薬品の開発につながる可能性がある。すなわち、新規遺伝子の効率的な機能解析のための技術開発は、ポストゲノム時代の生命科学、医学研究における大きな課題である。
哺乳動物遺伝子の生体内機能を調べる最も直接的な手法としては、外来遺伝子をマウス染色体に挿入し、過剰発現させるトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：７３８０−７３８４，１９８０）や、内因性遺伝子を破壊するノックアウト（ＫＯ）マウス（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）などが広く利用されてきた。
Ｔｇマウスは通常、発現させようとする遺伝子（以下、導入遺伝子と称する）のｃＤＮＡと適当なプロモーターおよびポリＡ付加部位からなる発現ユニットを含む精製ＤＮＡをマウス受精卵核に直接注入することにより作製される（Ｇｏｒｄｏｎら、前記）。ラット由来成長ホルモン遺伝子を導入したＴｇマウスは通常の２倍近い大きさになる（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３００：６１１−６１５，１９８２）ことが示されて以来、数多くの遺伝子（およびその産物蛋白質）の生体内機能検討のためにＴｇマウスが利用されてきた。Ｔｇマウスにおける導入遺伝子は、本来の発現制御系とは異なるプロモーター等の作用により、本来発現する部位とは異なる部位でより多量に発現する場合があり、これを一般に異所性の過剰発現と称することがある。導入遺伝子の異所性の過剰発現により引き起こされる個体レベルの反応は、当該蛋白質の生体内機能を推定する上で非常に重要な情報といえる。
さらに１９８０年代半ばより、分化全能性を持つマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の樹立、相同組換えによる標的遺伝子改変技術の開発などが達成され、１９９０年頃には特定の遺伝子が人為的に破壊されたマウス（ＫＯマウス）の作製が可能になった（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，５：７０−７６，１９８９）。例えば、血球幹細胞および血管内皮で発現する転写因子ＧＡＴＡ−２が破壊されたＫＯマウスのホモ接合体は、発生初期に貧血によって死亡することから、この転写因子の造血における重要性が示された（Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３７１：２２１−２２６，１９９４）。これまでに多くの研究者によって多数のＫＯマウスが作製されてきたが、その解析結果は基礎生物学から臨床医学に至る広範な分野に重要な情報をもたらしてきただけでなく、多数のヒト疾患モデル動物を提供してきた。ＫＯマウスは今日においても遺伝子の生体内機能解明のために最も広く用いられている手法である。
しかしながらＴｇマウスおよびＫＯマウスは共に１つの遺伝子を扱うだけでも多大な時間と労力を必要とする手法であり、この問題点は現在に至るまで解決されていない。よってこれらの手法を、前述したようなゲノム配列情報から導き出される多数の新規遺伝子の網羅的な機能検討に利用することは現実的ではないと考えられてきた。
遺伝子機能解明のためのさらに簡便な方法として、目的遺伝子の発現ユニットを含むウイルスベクターやプラスミドＤＮＡを動物個体の適当な部位に投与して、その遺伝子発現によって引き起こされる表現型の検討も行われてきた（Ｃａｎｎｉｚｚｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：５７０−５７３，１９９７；Ｏｃｈｉｙａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５：７０７−７１０，１９９９）。しかしながら現状では、導入効率、抗原性、発現の安定性など多くの問題があり、機能未知の新規遺伝子解析のための手法として満足できるものではない。
また液性因子や膜蛋白質の機能解析の場合、組換え体蛋白質や特異的抗体の実験動物への投与は機能解析の有効な手段だが、多種の機能未知遺伝子産物について精製蛋白質調製あるいは抗体取得を行うことは、前述のＴｇおよびＫＯマウス作製と同様、現実的な手段とは言えないであろう。
ホルモン、増殖因子、サイトカイン等の分泌性蛋白質、または膜蛋白質を分泌性に改変した蛋白質の機能を解析するためには、血中または局所的な有効濃度を人為的に高めて、その効果を検討することが有効な手段の一つである。有効濃度を高める方法としては、前述した通りＴｇマウスにおける異所性発現、組換え体蛋白質の投与、または個体への遺伝子導入などが従来利用されてきた。中でもＴｇマウスにおける過剰発現は最も広く用いられている方法であり、機能既知の遺伝子の過剰発現の影響検討（Ｐａｌｍｉｔｅｒら，前記）や、多くはないが新規遺伝子の機能同定に利用された例もある。Ｓｉｍｏｎｅｔら（Ｃｅｌｌ，１８：３０９−３１９，１９９７）は、肝臓特異的に発現するＡｐｏＥ遺伝子プロモーターの制御のもとに機能未知な新規遺伝子ｃＤＮＡを発現するＴｇマウスを作製して表現型を解析した結果、高発現により骨量増加の効果を示すオステオプロテグリン（ＯＰＧ）を見い出した。
しかしながら、Ｔｇマウス作製における大きな問題は、導入遺伝子の宿主染色体への挿入がランダムであり、その発現は挿入箇所の影響を受けてしまうことである。例えば構成的な強発現を示すハウスキーピング遺伝子のプロモーターを利用した場合でも、期待される高発現個体を得ることは容易ではない。一般的には、外来ＤＮＡを注入した受精卵から誕生する第一世代の個体（Ｆ０個体）が導入ＤＮＡを保持する効率は１０％〜２０％程度、さらに期待通りの発現を示す個体はＤＮＡ導入個体のさらに０〜２０％程度とされている。また、導入遺伝子のコピー数のコントロールができない問題も、多コピー挿入による導入遺伝子不活化現象（Ｇａｒｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１８：５６−５９，１９９８）をもたらす可能性があり、発現個体取得の困難さの一因となっている。さらに導入遺伝子を発現するＴｇマウス系統を確立するために多数のマウスを長期間維持繁殖する必要があることも大きな問題である。前述したようにＴｇマウス作製において目的とする発現個体が得られる確率は通常数％以下であり、多数のＦ０マウスを作製する必要がある。また尻尾組織由来ＤＮＡの解析等により導入遺伝子の保持が確認されたＦ０マウスをそのまま発現解析または表現型解析に用いることは後述するように適当でなく、通常は野性型マウスと交配して得られるＦ１マウスを得て初めて詳細な解析を行うことができる。
前述したＴｇマウスにおける宿主染色体へのランダム挿入およびコピー数のコントロール不能という問題点は、マウスＥＳ細胞におけるジーンターゲティング（相沢慎一、前記；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、前記）の利用により解決することができると考えられた。すなわち、内因性遺伝子プロモーターの下流に目的遺伝子を挿入（ノックイン）し、その制御下に発現させれば、挿入位置による発現への影響を回避することができる。従来、ノックインは主として以下に示すような場合に利用されてきた。
（１）ターゲット遺伝子と外来遺伝子（マーカー遺伝子等）を置換する形で挿入する。この場合、ターゲット遺伝子は破壊され、代わりにマーカー遺伝子等がターゲット遺伝子同様の特異性で発現する。遺伝子破壊の表現型を検討すると同時にプロモーターの特異性を調べるような場合に用いられる。
（２）ターゲット遺伝子の正常型を変異型（あるいは類似の遺伝子）に置き換える。この手法は特定の遺伝子の変異型の発現による疾患モデルマウス作製や、遺伝子機能の互換性検討などに用いられる。
上記（１）に関する初期の報告として、Ｌｅ  Ｍｏｕｅｌｌｉｃら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４７１２−４７１６，１９９０）は、Ｈｏｘ−３．１遺伝子座に大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を挿入したＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、ＬａｃＺ遺伝子産物がＨｏｘ−３．１同様の特異性で発現することを示した。また、Ｊｉｎら（ＢＢＲＣ．２７０：９７８−９８２，２０００）は、大脳皮質特異的に発現するＥｍｘ１遺伝子に上記同様ＬａｃＺ遺伝子を挿入するだけでなく、さらにその下流にインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ；Ｊａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：２６３６−２６４３，１９８８）と連結したＣｒｅ遺伝子を挿入して大脳皮質でＣｒｅ蛋白質が発現していることを示した。
一方、上記（２）の例としては、抗体重鎖遺伝子の特定の領域に組換え済みの機能的な重鎖ＶＤＪ可変領域遺伝子断片を挿入することにより、共通の可変領域を持つ全てのクラスの抗体を産生するマウスを作製した報告がある。単独あるいは特定の軽鎖との組み合わせで自己抗原反応性を持つＶＤＪ断片が重鎖定常領域上流に挿入されたマウスでは、正常なＢ細胞の発生および分化が起こり、単一の重鎖可変領域を発現する以外は、極めて生理的に近い抗体産生が認められた（Ｓｏｎｏｄａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６：２２５−２３３，１９９７）。
さらに上記（１）、（２）とも異なる例として、ヒツジ胎児由来線維芽細胞のα１（Ｉ）プロコラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）遺伝子の下流非翻訳領域（ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の終止コドンとポリＡ付加部位の間）にＩＲＥＳに連結したＧ４１８耐性遺伝子を挿入した最近の報告がある（ＭｃＣｒｅａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ，４０５：１０６６−１０６９，２０００）。ヒツジ個体は上記線維芽細胞クローン由来の細胞核をヒツジの未受精卵に移植することにより作製された。この場合、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子は正常に発現し、さらに同様の特異性でＧ４１８耐性遺伝子が発現する。
以上に述べたように、ノックインは、Ｔｇマウス作製法の欠点を解消するために有効な手法と考えられたが、網羅的な遺伝子解析に利用する場合には依然としていくつかの問題があると考えられた。まず、マウスＥＳ細胞における相同組換えの頻度は通常数％以下であり、１種の遺伝子について適当なプロモーター下流にノックインされた相同組換えクローンを得るだけでも多大な労力を要する。また、後述するようにノックインＥＳ細胞株から作製されるキメラマウスにおいては、個体毎にキメラ率（ノックインＥＳ細胞の貢献率）が異なる。この場合、導入遺伝子を発現する細胞集団の割合は、各個体および各組織によって変化するが、その割合は毛色から判断されるキメラ率と一致しない場合もあるので表現型解析結果の解釈には困難が伴う。よって、上記ノックイン遺伝子座が子孫伝達したマウスの利用が望まれる。
以上に示したＴｇおよびノックインは共に、通常は導入遺伝子が子孫に伝達した後に個体の解析が望まれる。しかし、実験期間およびマウス飼育に必要な設備や労力を考慮すると、多種の遺伝子解析を効率的に行うためには第一世代（Ｔｇの場合Ｆ０個体、ノックインの場合キメラ個体）で解析できることが望まれる。ランダム挿入に頼るＴｇのＦ０個体の場合、導入遺伝子が同じ部位に同じコピー数挿入された個体を再度得ることは不可能なので、第２世代であるＦ１個体の利用は必須である。一方、ノックインの場合、１種のＥＳクローンから多数のキメラ個体を得ることは容易だが、前述したようにキメラ率は個体によって大きく異なるのが普通であり、導入遺伝子の高発現を保証するための高いキメラ率の個体を多数得ることは容易ではない。また、キメラ率は通常毛色で判断するが、導入遺伝子が発現する組織のキメラ率は必ずしもこれと一致しない場合がある。
キメラマウスにおいて、ある組織の細胞が全てＥＳ細胞に由来するようなシステムが近年考案された。これはブラストシストコンプリメンテーション（以後ＢＣ法と記載する）と呼ばれ、免疫系ＴまたはＢ細胞（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０：４５２８−４５３２，１９９３）やレンズ（Ｌｉｅｇｅｏｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３：１３０３−１３０７，１９９６）などにおいて成功例がある。例えばＴまたはＢ細胞のＢＣ法は、通常法でノックアウトすると致死となるような遺伝子の、ＴまたはＢ細胞における機能を検討することを目的として考案された。ＴまたはＢ細胞の発生初期に起こる部位特異的組換えに必須であるＲＡＧ２遺伝子のＫＯマウスは機能的なＴまたはＢ細胞を産生できない。ＲＡＧ２−ＫＯマウス胚を宿主として野生型のＥＳ細胞とのキメラを作製すると、多くのキメラマウスにおいてはキメラ率に関わらず正常に近いレベルのＴまたはＢ細胞（ＥＳ細胞由来）が観察される。すなわち、胚性致死の遺伝子を両アレル共にＫＯしたＥＳ細胞を用いれば、キメラマウスにおいてその遺伝子のＴまたはＢ細胞における機能のみを検討することができる。
ヒトゲノム全塩基配列が決定した現在、望まれるのは、多数の新規遺伝子について網羅的な生体内機能解析を行うことができるようなシステムである。そのためには導入遺伝子を高レベルで発現する動物個体を確実、容易、かつ多種類同時に作製できることが必要である。一方、以上に述べたように、Ｔｇマウス、ノックイン等の従来の方法ではこの要求に答えることができないため、ゲノム配列情報から得られた膨大な数の遺伝子機能解析について決定的な方法はないと考えられてきた。また個体そのものを多数の遺伝子機能のスクリーニングに利用するということは困難とされてきた。ヒトゲノム情報がもたらす新規遺伝子のうち、サイトカイン、増殖因子、ホルモンなどと相同性を持つ分泌性の蛋白質をコードするものは、そのものが医薬品となり得る点で非常に興味深い研究対象といえる。すなわち、分泌性蛋白質をコードする遺伝子とその産物の生体内機能解析のための新たな効率的手法の開発は、ヒト疾患治療のための医薬品開発を大きく進展させることができると想像される。
前述したように特定遺伝子がジーン・ターゲティングにより破壊された胚性幹（ＥＳ）細胞から作製される変異マウス（ノックアウト／ＫＯマウス）は、遺伝子の機能解明における必須の手法として広く利用されている（相沢慎一、前記）。
一方、初めてのＫＯマウスが作製されてから１０年以上を経た現在においても、ＫＯマウス作製は非常に手間と時間のかかる作業と多くの研究者に認識されている。その大きな理由の一つにはＥＳ細胞における相同組換え体取得の困難さがあげられる。ノックアウト（ＫＯ）ベクターの構造は、一般的に一定の大きさ（５ｋｂ）以上の目的遺伝子ゲノムＤＮＡ断片の中に、薬剤耐性マーカーが目的遺伝子エクソンと置換あるいは同エクソンに挿入される形で存在している。通常のプロトコールで採用される電気パルス法においては、使用したＥＳ細胞の１万個から１００万個に１個の割合で上記薬剤に耐性のコロニーが得られる。しかし耐性クローンのほとんどは、導入ベクターがマウス染色体にランダム挿入されたものであり、相同組換えはランダム挿入クローン１万個から１００個に１個程度とされている。ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を向上させるために、これまで様々な検討がなされてきた。例えばベクターに含まれる相同領域ゲノムＤＮＡの長さが長いほど好ましいこと（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３３６５−７１，１９９２）、あるいはターゲティングを行うマウスＥＳ細胞の系統と同じマウス系統のゲノムＤＮＡ（アイソジェニックＤＮＡ）を用いることが好ましいことなどが報告された（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ、前記）。さらに現在最も広く用いられている方法は、上記選択マーカーに加えて、相同領域ゲノムＤＮＡの外側にネガティブ選択マーカーを含むＫＯベクターを用いることである。この方法は、ランダム挿入体においては有毒なネガティブマーカーが発現して細胞が死ぬが、相同組換え体ではそれが起こらないという現象を利用している。ネガティブ選択マーカーとしてはＭａｎｓｏｕｒらにより報告（Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２，１９８８）されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（培地中にガンシクロビル、ＦＩＡＵなどのチミジンアナログを入れる必要がある）、またはＹａｇｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７７−８６，１９９３）により報告されたＤＴ−Ａ（ジフテリア毒素Ａ鎖）などが知られている。このネガティブ選択法が理論通りに機能した場合、全てのコロニーが相同組換え体という結果が予想されるが、実際には報告により大きなばらつきがあり、その濃縮効果は一般的に数倍程度とされている。実際にノックアウト実験においてネガティブ選択法が常用されている現在においても千個〜百個のランダム挿入体を取得し、その中から相同組換え体を選抜することは日常的に行われている。
変異ＥＳ細胞からのマウス作製だけでなく、相同組換えにより遺伝子改変、破壊が施された哺乳動物細胞株は、それ自体が該遺伝子の機能を解明する上で重要な材料となる。さらに、相同組換えは遺伝子欠損や変異に起因する疾患（遺伝性疾患）の究極的な治療法と考えられてきた。しかし、哺乳動物細胞株または初代培養細胞における相同組換え体とランダム挿入体の比率は、マウスＥＳにおける比率と同等か、さらに低いものであり、細胞レベルの遺伝子機能解析や遺伝子治療での応用は、上記比率の改善が望まれていた（Ｙａｎｅｚ  ＆  Ｐｏｔｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：１４９−１５９，１９９８）。相同組換え体、ランダム挿入体の比率改善に関する前記以外の試みとしては、（１）ＤＮＡ組換えや修復に関わる蛋白質（遺伝子）の高発現、不活化、阻害等、（２）ターゲット遺伝子への特異的なダメージ、などが検討されてきたが、染色体遺伝子における相同組換え比率の劇的な向上をもたらし、かつ簡便で再現性の高い方法は未だ知られていない（Ｙａｎｅｚ  ＆  Ｐｏｔｅｒ、前記；Ｖａｓｑｕｅｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：８４０３−８４１０，２００１）。
発明の開示
本発明は、遺伝子機能を解析するための簡便かつ再現性の高い方法を提供することを目的とする。
本発明においては、相同組換えによるジーン・ターゲティングを利用して、キメラ非ヒト動物のいずれかの細胞および／または組織において発現する遺伝子座、例えばマウスＩｇκ遺伝子座へ所望の遺伝子を挿入する。ジーン・ターゲティングとは、相同組換えを利用して染色体中の特定遺伝子の改変を行うことを指して言うが、相同組換えを起こした細胞を効率良く取得することも、解決されるべき課題として重要である。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、今回、分泌性蛋白質をコードする構造遺伝子が免疫グロブリン軽鎖遺伝子の下流に挿入されたマウスのＥＳ細胞と、Ｂリンパ球欠損系統由来の宿主胚とのキメラマウスを作製し、該キメラマウスのＢ細胞において、前記分泌性蛋白質が高発現することを実証した。さらに哺乳動物細胞におけるターゲティングベクターのランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を改善するための簡便な方法を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の方法により作製されたキメラ動物においては、毛色のキメラ率にかかわらず、導入された構造遺伝子由来の産物の過剰発現効果が観察された。このシステムの利用により、従来法と比較して効率良くかつ確実に導入遺伝子を高発現するキメラ動物を得ることができる。従来法と比較した効率の高さは、主として、Ｂリンパ球欠損宿主胚の利用によって、キメラ動物のＢリンパ球がキメラ率に関わらず全てＥＳ細胞に由来する点に基いている。また特に免疫グロブリン軽鎖遺伝子の制御領域を利用した場合の効率の高さは、以下の点に基づいている：
（１）Ｉｇκ遺伝子座における相同組換え効率が５％以上の効率で起こる。
（２）免疫グロブリンの発現系を利用している。
（３）免疫グロブリンの発現は発生初期には非常に少なく、離乳期以降に爆発的な増加を示すため、高発現が胚性致死をもたらすような遺伝子を導入する場合でも、成体におけるその遺伝子の機能を検討することができる。
すなわち、本発明は以下のとおり要約される。
本発明は、その第１の態様において、キメラ非ヒト動物の作製方法を提供するものであり、該方法には、
１）少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する工程、
２）前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚に、前記工程１で作製した分化多能性を有する細胞を注入してキメラ胚を得る工程、
３）前記工程２で得たキメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、ならびに
４）前記工程３で移植した後得られた仔動物の中から、少なくとも前記特定の細胞および／または組織において所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程、が含まれる。
本発明の一実施形態において、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。また別の実施形態においては、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンの下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に配置される。
さらに別の実施形態においては、インターナルリボゾーマルエントリーサイトと前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置される。
また別の実施形態においては、ポリＡシグナル領域、プロモーター配列および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリＡシグナル領域は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
さらにまた別の実施形態において、プロモーター配列、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列およびポリＡシグナル領域を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリＡシグナル領域は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらに前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と、前記プロモーター配列との距離は、１Ｋｂを超えないことが好ましい。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は、少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムと、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子が不活性化されているゲノムの両方を含むものである。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は胚性幹細胞である。
さらに本発明の一実施形態において、キメラ非ヒト動物は、マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである。本発明の好ましい実施形態においては、キメラ非ヒト動物はマウスである。
本発明のさらなる実施形態において、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および／または組織との組み合わせは、以下の（１）〜（７）からなる群から選択されるものである：
（１）免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、Ｂリンパ球細胞、
（２）Ｔ細胞受容体遺伝子と、Ｔリンパ球細胞、
（３）ミオグロビン遺伝子と、筋肉細胞、
（４）クリスタリン遺伝子と、眼球の水晶体、
（５）レニン遺伝子と、腎臓組織、
（６）アルブミン遺伝子と、肝臓組織、および
（７）リパーゼ遺伝子と、膵臓組織。
本発明の好ましい実施形態においては、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および／または組織との組み合わせは、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とＢリンパ球細胞である。
本発明はその第２の態様において、前記キメラ非ヒト動物の作製方法により作製されたキメラ非ヒト動物から交配によって前記所望の蛋白質を発現することができるその子孫を得ることを含む、所望の蛋白質を発現する非ヒト動物の作製方法を提供する。
また本発明は、その第３の態様において、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞と、前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚とに由来するキメラ非ヒト動物であって、少なくとも前記特定の細胞および／または組織において前記所望の蛋白質を発現することができる、前記キメラ非ヒト動物を提供する。
本発明の一実施形態において、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。また別の実施形態においては、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンの下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に配置される。
さらに別の実施形態においては、インターナルリボゾーマルエントリーサイトと前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置される。
また別の実施形態においては、ポリＡシグナル領域、プロモーター配列および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域との間に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリＡシグナル領域は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
さらにまた別の実施形態において、プロモーター配列、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列およびポリＡシグナル領域を含む配列が、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリＡシグナル領域は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらに前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域と、前記プロモーター配列との距離は、１Ｋｂを超えないことが好ましい。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は、少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムと、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子が不活性化されているゲノムの両方を含むものである。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は胚性幹細胞である。
さらに本発明の一実施形態において、キメラ非ヒト動物は、マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである。本発明の好ましい実施形態においては、該動物はマウスである。
本発明のさらなる実施形態において、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および／または組織との組み合わせは、以下の（１）〜（７）からなる群から選択されるものである：
（１）免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、Ｂリンパ球細胞、
（２）Ｔ細胞受容体遺伝子と、Ｔリンパ球細胞、
（３）ミオグロビン遺伝子と、筋肉細胞、
（４）クリスタリン遺伝子と、眼球の水晶体、
（５）レニン遺伝子と、腎臓組織、
（６）アルブミン遺伝子と、肝臓組織、および
（７）リパーゼ遺伝子と、膵臓組織。
本発明の好ましい実施形態においては、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および／または組織との組み合わせは、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とＢリンパ球細胞である。
また本発明は、その第４の態様において、前記キメラ非ヒト動物もしくは所望の蛋白質を発現することができる前記キメラ非ヒト動物の子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする遺伝子の核酸配列を含まない対応の野生型非ヒト動物の表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。
さらに本発明は、その第５の態様において、前記いずれかのキメラ非ヒト動物に由来する組織または細胞を提供するものであり、該細胞または組織は、該細胞または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含み、所望の蛋白質を発現することができるものである。
本発明の一実施形態において、前記組織または細胞は、Ｂリンパ球細胞、Ｔリンパ球細胞、筋肉細胞、眼球の水晶体、腎臓組織、肝臓組織および膵臓組織からなる群より選択される。
本発明はまた、その第６の態様において、前記組織または細胞に由来する細胞と、増殖可能な腫瘍細胞細胞との融合により作製されたハイブリドーマを提供する。
さらに、本発明は、その第７の態様において、前記キメラ非ヒト動物、前記組織または細胞、あるいは前記ハイブリドーマのいずれかを用いて所望の蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む、所望の蛋白質を製造する方法を提供する。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中で使用される「非ヒト動物」という用語は、ヒトを含まない動物を意味し、一般に魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類からなる脊椎動物、好ましくは哺乳類から選ばれる。本発明ではキメラ非ヒト動物の作製において、分化多能性を有する細胞として胚性幹細胞を利用することが好ましいため、胚性幹細胞の樹立が可能な非ヒト動物（たとえばマウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、サル、ヤギ、ウサギ、ラットなど）、および将来的に胚性幹細胞の樹立が可能であろうその他の非ヒト動物のすべてが、本発明の意図する非ヒト動物に包含される。「キメラ非ヒト動物」とは、分化多能性を有する細胞（後述する）に由来する分化した細胞と、宿主胚に由来する分化した細胞の両者から成り立つ動物を意味する（Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−６，１９８４）。実験的には、すべての細胞が宿主胚に由来する動物（０％キメラ）や、すべての細胞が分化多能性を有する細胞に由来する動物（１００％キメラ）も誕生しうるものであり、厳密にはこれらの動物は「キメラ」ではないが、便宜上「キメラ非ヒト動物」に包含されるものとする。
本明細書中で使用される「分化多能性を有する細胞」とは、上述したキメラ非ヒト動物を作製するにあたり、宿主胚への注入、あるいは集合胚形成によって、キメラ非ヒト動物の２種類以上の細胞または組織に分化可能な細胞を意味する。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）などが挙げられる。
本明細書中で使用される「胚性幹細胞」とは、ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とも称され、未分化性（全能性）を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。すなわち胚性幹細胞は、動物の初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。また「胚性生殖細胞」とは、ＥＧ細胞とも称され、上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。胚性生殖細胞は、受精後数日〜数週間、例えばマウスの場合には約８．５日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。
本明細書中で使用される「所望の蛋白質」とは、本発明の方法により作製されるキメラ非ヒト動物の少なくとも１種類の細胞および／または組織において発現させることが試みられる蛋白質であり、その機能については既知である場合も、未知である場合もある。前記所望の蛋白質は、哺乳動物由来の機能性分泌蛋白質、機能性膜蛋白質、機能性細胞内または核内蛋白質、分泌シグナルが付加された機能性膜蛋白質の可溶性部分などとすることができる。ここで「機能性」とは、生体内において特定の働き、作用または機能をもつことを意味する。
機能既知の蛋白質の場合は、当該蛋白質がキメラ非ヒト動物の少なくとも１種類の細胞および／または組織における高発現の影響を観察することによって、蛋白質の機能の相互的関連について新たな知見を得られる可能性がある。機能未知の蛋白質の場合は、同じく高発現の影響を観察することによって、当該蛋白質の機能解明につながる知見を得られる可能性がある。本発明において「所望の蛋白質」は、導入するキメラ非ヒト動物において発現するが、発現させる対象となる特定の細胞および／または組織においては発現しないかもしくはわずかにしか発現しないものあってもよいし、または異種動物由来のものであってもよく、関心のあるものであればその種類を問わないものとする。
本明細書中で使用される「所望の蛋白質をコードする核酸配列」は、内因性または外因性ＤＮＡのいずれでもよく、また外因性ＤＮＡにはヒト由来ＤＮＡが包含される。また本明細書においては、「所望の蛋白質をコードする構造遺伝子」という用語も同義として用いる。
本明細書中で使用される、蛋白質の「発現」とは、その蛋白質をコードする遺伝子の発現と同等の意味を有する。
本明細書中で使用される「制御領域」とは、「制御配列」、「調節配列」、「調節領域」などの総称を意味し、遺伝子発現（転写、翻訳または蛋白質合成）を制御または調節する機能を有する領域を指す。そのような制御領域としては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどが含まれる。また本発明において「制御領域」とは、１つの機能的なエレメント（例えば１つのプロモーター配列）を含むものであってもよいし、または複数のエレメントを含むもの（例えば、１つのプロモーター配列と１つのエンハンサー配列など）であってもよい。さらに「プロモーター配列」とは、当業者に周知の制御領域の１種であり、転写開始時にＲＮＡポリメラーゼが結合する構造遺伝子上流の塩基配列を指す。
本明細書中で使用する「インターナルリボゾーマルエントリーサイト」とは、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）と略称され、ポリシストロニックな発現を可能にするエレメントとして知られており、特殊なＲＮＡ二次構造を形成し、その下流にある開始コドンからのリボソームによる翻訳開始を可能にする部位を指す。哺乳動物の場合、ＩＲＥＳはリボゾームのデコードサブユニットに結合し、これにより隣接する蛋白質コード領域をデコード部位に引き込むような立体構造変化を起こして、翻訳および蛋白質合成を開始する事象に関わると推定されている（Ｓｐａｈｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１９５９，２００１）。
本明細書中で使用する「ポリＡシグナル領域」とは、転写領域の終わりの部分に位置し、転写後ｍＲＮＡ前駆体の３’非翻訳領域へポリアデニル酸（Ａ）鎖付加を指令する塩基配列部分を指す。
本明細書中で使用する「上流」および「下流」とは、ゲノム、ポリヌクレオチドなどの核酸配列において、それぞれ５’末端及び３’末端への方向を指す。
本明細書中で使用する「ｂｐ（塩基対）」及び「Ｋｂ（キロ塩基対）」とは、核酸配列の長さ及び距離を指し、１ｂｐが１つの塩基対を表し、１Ｋｂは１０００ｂｐに相当する。
本明細書中で使用する「対立遺伝子」とは、倍数体のゲノムを有する生物において、相同染色体の相同な領域に位置し、機能的にも相同な遺伝子をいう。対立遺伝子は通常全てが発現される。また「対立遺伝子排除」とは、生物個体で考えた場合、対立遺伝子の両方に由来する形質が表現されているにもかかわらず、個々の細胞では対立遺伝子のどちらかのみがランダムに発現し、他方の発現が排除されていることをいう。例えば抗体やＴ細胞受容体の遺伝子に見られ、一方の可変領域遺伝子の組換えが信号となって完全な遺伝子が１つしか完成されないことによる。
本明細書中で使用する「分泌シグナルを付加された膜蛋白質の可溶性部分」という用語は、膜蛋白質分子のうち、分泌シグナル（またはシグナル配列）が結合した細胞外ドメインを意味する。
本明細書中で使用する「免疫グロブリン軽鎖遺伝子」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の軽鎖（またはＬ鎖）をコードしている遺伝子を指す。軽鎖にはκ鎖とλ鎖が含まれており、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域から構成されている。また軽鎖遺伝子は、１個のＣ領域遺伝子、複数のＶ領域遺伝子、および複数の結合（Ｊ）領域遺伝子から構成されている。
本明細書中で使用する「特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚」または「欠損宿主胚」という用語は、分化多能性を有する細胞を注入するための宿主非ヒト動物胚であって、当該細胞および／または組織を欠損する胚を意味する。
本明細書中で使用するキメラ非ヒト動物の「子孫」とは、本発明のキメラ非ヒト動物同士、あるいは本発明のキメラ非ヒト動物と同種の非ヒト動物との交配により得られ、少なくとも特定の細胞および／または組織において所望の蛋白質を発現する非ヒト動物を意味する。
本明細書中で使用する「表現型」とは、動物が本来持つ形質、または導入遺伝子の結果現れる動物の形質を指す。
本明細書中で使用する「増殖可能な腫瘍細胞」とは、腫瘍化することにより永続的な増殖能を有する細胞を意味し、例えば免疫グロブリンを産生する形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞など）が挙げられる。
本明細書中で使用する「ハイブリドーマ」という用語は、本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫からの組織または細胞に由来する細胞と、上記増殖可能な腫瘍細胞とを融合させてできる雑種細胞を指す。
本明細書中で使用する「ノックインベクター」とは、相同組換えにより目的とする遺伝子座位に所望の蛋白質をコードする遺伝子を導入し、該所望の蛋白質を発現させるために用いるベクターを指す。また「ノックイン」もしくは「遺伝子ノックイン」とは、目的とする遺伝子座位に相同組換えにより所望の蛋白質をコードする核酸配列を導入し、該所望の蛋白質を発現させることを意味する。
本明細書中で使用する「ノックアウトベクター」とは、相同組換えにより非ヒト動物の目的とする遺伝子を破壊または不活性化するためのベクターを指す。また「ノックアウト」もしくは「遺伝子ノックアウト」とは、目的とする遺伝子座位に相同組換えにより当該遺伝子の発現を阻害する構造を導入し、該目的の遺伝子を破壊または不活性化することを意味する。
本明細書中で使用する「ターゲティングベクター」とは、相同組換えにより非ヒト動物のゲノムの目的とする位置に導入されうるベクターを指す。「ターゲティングベクター」という用語は、上記「ノックインベクター」および「ノックアウトベクター」を包含する。また「ターゲティング」もしくは「遺伝子ターゲティング」とは、相同組換えにより非ヒト動物のゲノムの目的とする位置に所望の遺伝子構造を導入することを意味する。
本明細書中で使用する「ポリアミン」とは、第一級アミノ基を２つ以上持つ直鎖の脂肪族炭化水素の総称である。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００１年１１月１５日に出願された日本国特許出願第２００１−３５０４８１号およびその優先権を主張して２００２年２月１９日に出願された日本国特許出願第２００２−４２３２１号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明者は、キメラ率に大きく影響されることなく、所望の蛋白質を少なくともある特定の細胞および／または組織において高発現するキメラ非ヒト動物を作製する方法を、前述したＢＣ法を応用することにより考案した。すなわち、本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法は、
１）少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する工程、
２）前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚に、前記工程１で作製した分化多能性を有する細胞を注入してキメラ胚を得る工程、
３）前記工程２で得たキメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、ならびに
４）前記工程３で移植した後得られる仔動物の中から、少なくとも前記特定の細胞および／または組織において所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明の方法では、前述したブラストシスト・コンプリメンテーション（ＢＣ）により、宿主胚において欠損する細胞および／または組織が、分化多能性を有する細胞により補填される。すなわち、作製されたキメラ非ヒト動物個体全体のキメラ率に関わらず、当該細胞および／または組織のすべてが、分化多能性を有する細胞に由来するものとなる。その結果、該分化多能性を有する細胞が、上記細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御配列によって制御されるように所望の蛋白質をコードする遺伝子（核酸配列）を保持していれば、キメラ非ヒト動物の当該細胞および／または組織における所望の蛋白質の高発現が期待できる。
１．分化多能性を有する細胞の作製
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、まず、所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子）が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する。この核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるように配置されたものである。
本発明において分化多能性を有する細胞としては、上記定義に挙げたものを利用することができるが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が好ましく、特にマウスＥＳ細胞が好ましい。
また、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子は、組織特異的に発現するものであってもよいし、または構成的に発現するものであってもよい。例えば組織特異的に発現する遺伝子としては、免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、ミオグロビン遺伝子、クリスタリン遺伝子、レニン遺伝子、リパーゼ遺伝子、アルブミン遺伝子などが挙げられる。また構成的に発現する遺伝子としては、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子などが挙げられる。当該遺伝子がキメラ非ヒト動物において組織特異的に発現する遺伝子の場合には、後述する宿主胚として、当該遺伝子の発現する細胞および／または組織が欠損した系統の胚を採用する。当該遺伝子が構成的に発現する遺伝子の場合は、後述する宿主胚として、任意の細胞および／または組織が欠損した系統の胚を採用する。
所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子）の配置（連結または挿入）は、少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるような形態である必要がある。従って、該核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。
あるいは、該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列の間に、インターナルリボゾーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を配置し、そのＩＲＥＳの下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、ＩＲＥＳと機能的に連結された状態で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列との間に存在する。ノックインベクターの構築に際して、ポリＡシグナル領域は上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域を用いることができるが、これに限定されるものではない。例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリＡシグナル領域などの当技術分野で公知の他のポリＡ配列を用いることもできる。
また該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列の間に、第２のポリＡシグナル領域をコードする配列、そのポリＡシグナル領域の下流にプロモーター配列を配置し、さらに該プロモーター配列の下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、プロモーター配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在し、かつもともとゲノム上に存在する特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子もまたそのプロモーター配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在する。ノックインベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。またノックインベクターにプロモーターが２つ存在する場合には、その２つのプロモーターは、同じ細胞および／または組織において発現を制御するものであれば、同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらにノックインベクターの構築において使用されるポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またプロモーターの場合と同様に、ノックインベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
さらにまた前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に、プロモーター配列、核酸配列、およびポリＡシグナル領域をコードする配列の順に配置することもできる。すなわち、該核酸配列は、プロモーターおよびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（カセット形式）で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナルの下流に存在する。ノックインベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。さらにノックインベクターの構築においてポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またノックインベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の３’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の５’端の距離は、上記特定の細胞および／または組織において該核酸配列の発現が可能であれば特に限定されるものではないが、距離が離れるに従い、転写産物であるｍＲＮＡの安定性に好ましくない影響が生じる可能性があり、またターゲッティングベクターの構造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。これらの理由からポリＡシグナル領域の３’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の５’端の距離は１Ｋｂ以内であることが好ましい。
所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子）を前記制御領域の下流に配置する場合には、核酸配列を該制御領域の下流に挿入してもよいし、または、ＥＳ細胞の片側のアレルについて、単に当該細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御配列の直下に、本来の構造遺伝子を置換するような態様で配置することもできる。所望の蛋白質をコードする核酸配列に置換された本来の構造遺伝子は、もう片側のアレルによって発現されるので、細胞および／または組織は正常な状態を保ちうる。しかしながら、免疫グロブリン遺伝子のように、対立遺伝子排除が働くような遺伝子においては、ＥＳ細胞の両側のアレルにおいて、本来の構造遺伝子の終止コドンの後に、ＩＲＥＳ配列を介在させた後、所望の蛋白質をコードする核酸配列を配置することができる。また、本来の構造遺伝子の片側のアレルをＥＳ細胞においてあらかじめ不活化しておき、不活化されていないアレルの本来の構造遺伝子の終止コドンの後に、ＩＲＥＳ配列を介在させた後、所望の蛋白質をコードする核酸配列を配置することもできる。この場合、不活化されていないアレルが独占的に発現し、同時に所望の蛋白質をコードする核酸配列も高発現することが期待される。
免疫グロブリンκ鎖遺伝子の発現は、前述した通り多数のＶおよびＪ遺伝子断片が、組換えにより結合することより起こる。この結合の結果、各Ｖ遺伝子断片の上流近傍にあるプロモーター配列はＪ断片下流に存在するエンハンサー配列の近傍に配置される。このような状況において、エンハンサー配列は初めて該プロモーターを活性化することができる（Ｐｉｃａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３０７：８０−２，１９８４）。すなわち、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、人為的に免疫グロブリンκ鎖遺伝子のプロモーター配列と連結した形で、前記エンハンサー配列の近傍に配置することもできる。免疫グロブリンκ鎖遺伝子座には前記エンハンサー配列以外にもさらに下流にエンハンサー配列が存在することが知られており（Ｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１９５９−６４，１９８９）、該遺伝子はこのように複数のエンハンサーの影響のもとＢ細胞において高発現する。
上述したような所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を、以下ノックイン細胞またはノックインＥＳ細胞とも呼び、これらの細胞は、限定するものではないが、例えば以下に記載するように得ることができる。
（１）ターゲティングベクター（ノックインベクター）の構築
最初に、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の下流に、所望の蛋白質をコードする核酸配列が挿入されたノックインベクター、あるいは上記遺伝子の下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に、所望の蛋白質をコードする核酸配列が挿入されたノックインベクターを構築する。
導入する核酸配列は、開始コドンから終止コドンまでを含んでいればｃＤＮＡでもイントロンを含むゲノムＤＮＡであってもよく、該核酸配列によってコードされる蛋白質の種類はいかなるものでもよい。本発明で使用される核酸配列は、それによってコードされる蛋白質の高発現・分泌のために使用されてもよいし、該蛋白質の機能を解明するために使用されてもよい。したがって、導入する核酸配列はその塩基配列が特定されるならば、いずれの種類のものでも使用可能である。核酸配列（構造遺伝子）の例としては、哺乳動物、好ましくはヒト、由来の機能性蛋白質をコードする遺伝子、たとえば分泌蛋白質をコードする遺伝子、膜蛋白質をコードする遺伝子、細胞内または核内蛋白質をコードする遺伝子、などが挙げられる。
本発明において利用可能なＩＲＥＳとしては、限定されるものではないが、脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ（Ｊａｎｇら、前記）、ｐＩＲＥＳｈｙｇ（米国クローンテック社）などが挙げられる。ＩＲＥＳおよび／または所望の蛋白質をコードする核酸配列をノックインベクターに挿入する場合、それらの挿入部位は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡ付加部位の間が望ましく、またその数は複数でもよい。ＩＲＥＳ配列が形成する二次構造が、上記遺伝子の翻訳に悪影響を与えないように、上記遺伝子の終止コドンからＩＲＥＳの間は一定の間隔（例えば数ｂｐ〜数１０ｂｐ）をあけるのが望ましい。
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように、あるいは上記遺伝子の下流にＩＲＥＳを含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように動物のゲノムを改変するために、ノックインベクターを準備し、このベクターＤＮＡに該ＩＲＥＳおよび／または該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。この目的のために使用可能なベクターの例は、プラスミド、ウイルスなどであり、当業者であればノックインベクターとして使用可能なベクターを容易に選択し、入手することができる。ベクターの具体例は、限定するものではないが、ｐＫＩκ（後述の実施例参照）である。ノックインベクターは、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡ付加部位の間（たとえば中間点付近）に、ＩＲＥＳ配列および／または目的の核酸配列ＤＮＡの挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、該制限酵素切断部位には、導入する核酸配列の開始コドンから終止コドンまでを含むＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が挿入される。また、好ましくは開始コドンの上流にコザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。更に、ベクターには、必要に応じて選択マーカー、たとえばピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等を含むことができる。
（２）非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞へのノックインベクターの導入、および相同組換え体の選択
ノックインベクターによる非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の形質転換は、当技術分野で公知の手法、例えば相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲティング、羊土社、１９９５等に記載された方法によって行うことができる。例えば、上記作製したノックインベクターを、エレクトロポレーション、リポフェクション法などにより分化多能性を有する細胞に導入することができる。
ノックイン（ターゲティング）ベクターＤＮＡの調製工程において、ターゲティングベクターＤＮＡをポリアミン類もしくはその類似化合物で処理する、またはターゲティングベクターＤＮＡとポリアミン類もしくはその類似化合物との複合体を形成させることにより、ランダム挿入に対する相同組換え比率を向上させることが可能である。そのようなポリアミン類もしくはその類似化合物による処理またはポリアミン類もしくはその類似化合物との複合体形成は、形質転換前に、ターゲティングベクターの線状化を行う前、間または後に該ベクターと少なくとも１種のポリアミンもしくはその類似化合物を接触させることにより行うことができる。例えば、ノックインベクターを線状化する際の反応バッファー中に、１ｍＭスペルミジンを添加することにより、相同組換え比率の上昇が観察される。
ターゲティングベクターとポリアミン類もしくはその類似化合物と接触させるタイミングは、上述したように、ベクターを線状化させる前にベクターを含む溶液中にポリアミン類もしくはその類似化合物を添加する、ベクターを線状化させるための制限酵素バッファー（例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）中にポリアミン類もしくはその類似化合物を添加する、ならびに／あるいは、制限酵素処理、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿、乾燥処理を行った後のＤＮＡを溶解するためのＨＢＳバッファー（例えば、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，６ｍＭ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）にポリアミン類もしくはその類似化合物を添加する、のいずれでもよい。いずれにしても電気パルス実験において細胞に添加されるＤＮＡがポリアミンもしくはその類似化合物と複合体を形成している状態であることが望ましい。ポリアミン類もしくはその類似化合物の添加濃度は０．１ｍＭ〜１０ｍＭが好ましく、さらに好ましくは１ｍＭである。１ｍＭという添加濃度は好ましい様態の一つであるが、より低い濃度、あるいはより高い濃度においても類似の効果を発揮し得る。
スペルミジン（トリアミン）以外の代表的なポリアミン類としては、プトレッシン（ジアミン）、カダベリン（ジアミン）、スペルミン（テトラアミン）などが知られている。これらのポリアミンは、スペルミジン同様の生理的作用、すなわち、１）核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化、２）種々の核酸合成系への促進作用、３）蛋白質合成の活性化、４）ヒストンのアセチル化、などを持つことが知られており、スペルミジンと類似の効果を発揮すると考えられる。ポリアミンの重要な性質として、ＤＮＡと複合体を形成すること、原核細胞由来の酵素を用いた試験管内組換え実験系における促進因子であることが知られている。さらには、外来ＤＮＡに添加することにより、当該ＤＮＡの哺乳動物細胞への導入効率を改善することも知られている。一方、ポリアミンが本発明での課題であるランダム挿入に対する相同組換え体の比率に対して影響を与えることは従来知られていなかった。上記ポリアミンは、市販されており、例えば米国シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製のスペルミジンなどを入手することができる。また、ポリアミン類の類似化合物としては、ポリアミン類と同様にＤＮＡのリン酸とイオン結合可能な化合物であれば特に限定されるものではなく、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニンなどが知られている。これらの類似化合物もまたＤＮＡのリン酸とイオン結合することによってＤＮＡの安定化と構造変化をもたらし、ポリアミン類と同様の効果を発揮すると考えられる。上記類似化合物としては市販されているものを用いることができ、例えば米国シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製のポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニンなどを入手することができる。
上述したようにポリアミン類もしくはその類似化合物を利用することによりランダム挿入に対する相同組換え比率を向上させることが可能であるから、この利用は相同組換えによる遺伝子破壊（遺伝子ノックアウト）においても効果を示すと考えられる。すなわち、本発明は、ターゲティングベクター（ノックインベクター、ノックアウトベクター）にポリアミン類もしくはその類似化合物による処理を行うことを特徴とする、遺伝子ターゲティングの方法、あるいはターゲティングベクターとポリアミン類もしくはその類似化合物の複合体を形成させることを特徴とする、遺伝子ターゲティングの方法を提供する。
本発明はさらに、遺伝子ターゲティング方法に使用するための、少なくとも１種のポリアミンもしくはその類似化合物を含む試薬または組成物を提供する。そのようなポリアミンもしくはその類似化合物の例としては、スペルミジン、カダベリン、プトレッシン、スペルミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニンが挙げられ、好ましくはスペルミジンであるが、これらに限定されない。本発明により、上記のようにポリアミン類もしくはその類似化合物で処理されたターゲティングベクターまたはポリアミン類もしくはその類似化合物と複合体を形成するターゲティングベクターを用いて非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を形質転換する場合、ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を従来のものより向上させることができる（実施例１１参照）。
さらに、ターゲティングベクター（ノックインベクター、ノックアウトベクター）の構造に、相同組換えの効率を上げるための改変を施すことができる。すなわち、ゲノム中にターゲティングベクターがランダム挿入された細胞を排除するためのネガティブセレクションマーカーが、ターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作することによって、相同組換えの効率を上げることができる。
具体的には、線状化されたターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の５’端および３’端が、ターゲティングベクターのそれぞれ５’および３’端から少なくとも１Ｋｂ、好ましくは２Ｋｂ以上離れるよう操作することが望ましい。通常、ネガティブセレクションマーカーの５’端または３’端の一方には、ゲノムとの相同組換えのための領域（相同組換え領域）が位置するため、ベクター端からの距離は３Ｋｂ以上となることがほとんどである。一方、ネガティブセレクションマーカーのもう一方の端は、ベクター端に近接している場合が多い。本発明では、ネガティブセレクションマーカーの、相同組換え領域と隣接していない端に、線状化ベクターの末端から少なくとも１ｋｂの距離を設けるよう操作し、それにより相同組換えの効率を上昇させる。ベクター端からの距離を確保するための配列としては、ターゲティングベクター構築の際に使用するｐＵＣなどのプラスミドの配列をそのまま残して（すなわち線状化する際に削除しない）利用することもできる（例えば図１〜７参照）し、また、目的とするターゲティング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブセレクションマーカーの隣に配置することも可能である。ベクターの線状化は、使用しているターゲティングベクターの制限酵素認識部位を精査し、ベクター端とネガティブセレクションマーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位を選択してベクターを線状化することによって、相同組換え効率を改善させるという効果を達成することができる。また、そのような適当な制限酵素部位が見つからない場合であっても、ＰＣＲを用いた手法（Ａｋｉｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１６，Ｅ７７．）により、適当な制限酵素認識配列をターゲティングベクターの所望の位置に導入することができる。
上述したようなターゲティングベクター構造をとることにより、ネガティブセレクションマーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、相同組換えの効率が上昇するものと考えられる。
すなわち、本発明は、ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の５’端および３’端が、線状化したターゲティングベクターのそれぞれ５’端および３’端から少なくとも１Ｋｂ、好ましくは３Ｋｂ以上離れていることを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター、ならびに該ターゲティングベクターを用いた遺伝子ターゲティング方法を提供する。前記ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとしては公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、好ましくはジフテリアトキシンＡ遺伝子である。
相同組換え体を簡便に同定するために、外来遺伝子がノックインされる位置に薬剤耐性遺伝子マーカーをあらかじめ挿入しておくこともできる。例えば、本明細書中実施例で用いられているマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆは、Ｃ５７ＢＬ／６系統とＣＢＡ系統との間のＦ１個体由来の細胞である。先述したように（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３３６５−７１，１９９２）、ノックインベクターに含まれるゲノム相同領域の配列がＣ５７ＢＬ／６に由来する場合、ＴＴ２Ｆ細胞においてはＣ５７ＢＬ／６由来のアレルにおいてより高率に相同組換えが起こると想像される。すなわち、あらかじめＣ５７ＢＬ／６由来ゲノムＤＮＡを含むターゲティングベクター（ノックインベクター）を用いてＣ５７ＢＬ／６由来のアレルに例えばＧ４１８耐性マーカーを挿入することができる。次に得られたＧ４１８耐性株について、ピューロマイシン耐性マーカーを含み、かつＣ５７ＢＬ／６由来ゲノムＤＮＡを含むノックインベクターを導入してピューロマイシン耐性かつＧ４１８感受性株を取得することができる。この株においては、ノックインベクターと、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子との相同組換えによりＧ４１８耐性遺伝子が除去され、代わりに所望の蛋白質をコードする構造遺伝子とピューロマイシン耐性マーカーが挿入されている。このような方法により、相同組み換え体同定におけるサザン解析等の手間を省くことができる。
本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（２０００年３月２日国際公開）に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムＤＮＡを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定することが可能である。ノックインベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子は、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載されたＬｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏプラスミドに由来し、その両端に順方向にＬｏｘ−Ｐ配列を含んでいる。よってＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された方法により、同耐性遺伝子をノックインされた分化多能性を有する細胞から除去することができる。
上述したノックインベクター、ならびに相同組換え効率を向上させる技術および手段は、遺伝子導入可能な細胞すべてに応用が可能であり、キメラ動物の作製に限定されない。例えば、ヒトおよびヒト細胞（例えば血液細胞や免疫細胞など）を対象とした遺伝子治療において、本明細書に記載のノックインベクターおよび相同組換え効率を向上させる技術を所望の遺伝子を破壊または導入するために使用することができる。
２．特定の細胞および／または組織が欠損した宿主胚
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、次に、前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚（以下、欠損宿主胚ともいう）を用意する。そのような欠損宿主胚としては、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を制御領域として利用する場合には、免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトによるＢ細胞欠損胚（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１８：７２２−７２７，２０００）、Ｔ細胞受容体遺伝子を制御領域として利用する場合には、Ｔ細胞受容体β鎖欠損によるＴリンパ球細胞欠損胚（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６０：２２５−２２７，１９９２）、ミオグロビン遺伝子を制御領域として利用する場合には、マイオゲニン遺伝子ノックアウトによる筋肉組織の欠損胚（Ｎａｂｅｓｈｉｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５３２−５３５，１９９３）、クリスタリン遺伝子を制御領域として用いる場合には、水晶体を欠損するマウスの突然変異体であるａｐｈａｋｉａ（ａｋ）系統由来の胚（Ｌｉｅｇｅｏｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３：１３０３−１３０７，１９９６）、レニン遺伝子を制御領域として利用する場合には、Ｓａｌｌ１遺伝子ノックアウトによる腎臓組織の欠損胚（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８：３１０５−３１１５，２００１）、アルブミン遺伝子を制御領域として利用する場合には、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子欠損による肝臓組織の欠損胚（Ｂｌａｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７６８−７７０，１９９５）、リパーゼ遺伝子を制御領域として用いる場合には、Ｐｄｘ１遺伝子ノックアウトによる膵臓組織欠損胚（Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３７１：６０６−９，１９９４）などが挙げられる。好ましい欠損宿主胚を上記例示したが、本発明で使用可能な欠損宿主胚は上記のものに限定されない。
また、効率的なキメラ非ヒト動物作製を行うための宿主胚の発生時期、遺伝的背景等の選択については、それぞれのＥＳ細胞株について既に検討された条件を用いることが望ましい。例えばマウスの場合、ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６  Ｆ１由来のＴＴ２細胞またはＴＴ２Ｆ細胞（野性色、Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４：７０−７６，１９９３）からのキメラ作製については宿主胚がＢａｌｂ／ｃ（白色、日本国日本クレア社）、ＩＣＲ（白色、日本国日本クレア社）、またはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本国日本クレア社）の遺伝的背景であることが望ましい。よって前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統とこれらの系統の戻し交配により得られる非ヒト動物の胚（例えば８細胞期胚）を欠損宿主胚として用いるのが望ましい。
宿主胚において欠損する細胞および／または組織は、ブラストシスト・コンプリメンテーション（ＢＣ）によって、分化多能性を有する細胞により補填されるため、前記宿主欠損胚は、キメラ動物を作製するための胚盤胞期まで発生しうるものであれば、胚性致死のものであってもかまわない。このような胚性致死胚は、遺伝子の欠損がヘテロである動物同士の交配によって原理的には４分の１の確率で生じるため、交配により得られた胚を複数取得して下記手順に従ってキメラ動物を作製し、その中から宿主胚が欠損胚であるものを選抜する。この選抜は、キメラ動物の体組織より抽出したＤＮＡを用いたサザン解析、ＰＣＲ解析等により行うことができる。
３．キメラ胚の作製および仮親への移植
上記「１．分化多能性を有する細胞の作製」の項目で得られたノックイン（ＥＳ）細胞株からのキメラ非ヒト動物の作製は、相沢慎一（前記）等に記載された方法で行うことができる。具体的に説明すると、作製したノックイン分化多能性細胞を、上記「２．特定の細胞および／または組織が欠損した宿主胚」の項目に記載の欠損宿主胚の胚胎盤胞または８細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞または８細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
４．キメラ非ヒト動物における導入遺伝子の発現
上記「キメラ胚の作製および仮親への移植」の項目に従って作製されるノックイン分化多能性細胞注入胚に由来する仔動物における分化多能性細胞の貢献率は、その毛色により大まかに判定することができる。例えば、ＴＴ２Ｆ細胞（野生色）由来のノックイン細胞株をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色）バックグラウンドの宿主マウス胚に注入した場合、野生色（濃茶）の割合が分化多能性細胞の貢献率を示している。ここで毛色における貢献率は、前記欠損する細胞および／または組織以外の細胞および／または組織におけるノックイン分化多能性細胞の貢献率と相関があるが、組織によっては毛色の貢献率と一致しない場合もある。一方、上記キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の前記欠損する細胞および／または組織は存在せず、ノックイン分化多能性細胞由来のもののみ存在する。ノックイン分化多能性細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における欠損細胞および／または組織の回復は、ＦＡＣＳ解析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等によって検出可能である。ノックイン分化多能性細胞由来の細胞および／または組織において挿入した核酸配列（構造遺伝子）が発現するかどうかは、当該細胞および／または組織由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８５：５６９８−５７０２，１９８８）、ノーザンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；富山・安東、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィク、１９８７）、ウエスタンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，前記）等を利用して検出できる。また、導入される核酸配列（構造遺伝子）をコードするＤＮＡを適当に改変し、抗体で検出可能なタグペプチドを付加しておけば、該タグペプチドに対する抗体等で導入した遺伝子の発現を検出できる（ＰＯＤ標識抗Ｈｉｓ６，日本国ロシュ・ダイアグノスティックス）。
上述のようにして作製されたキメラ非ヒト動物は、少なくとも特定の細胞および／または組織において、導入した核酸配列（構造遺伝子）が高発現する。発現した所望の蛋白質が、血液、乳などの分泌されるような系であれば、有用蛋白質の生産系として利用することができる。また、機能未知の蛋白質を高発現させた場合には、前記高発現に伴う所見から、当該蛋白質の機能を解明していくことができる。
さらに近年、体細胞核移植胚からの動物個体作製法と体細胞におけるジーンターゲティングとを組み合わせて、マウス以外の動物種（ウシ、ヒツジ、ブタ等）でもマウス同様の遺伝子改変が可能になった（ＭｃＣｒｅａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ，４０５：１０６６−１０６９，２０００）。例えば免疫グロブリン重鎖のノックアウトによりＢ細胞を欠損するウシを作製可能である。さらにマウス、ウシ、ヒツジ、ブタなどのＩｇ遺伝子座下流に導入遺伝子を挿入し、線維芽細胞の核を移植した未受精卵を発生させ、胚盤胞期胚よりＥＳ細胞を調製可能である。このＥＳ細胞と上記Ｂ細胞欠損宿主胚との間でキメラ非ヒト動物が作製可能であり（Ｃｉｂｅｌｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６，１９９８）、マウスだけでなくその他の動物種においても同様の発現系を利用した分泌蛋白質の高発現が可能である。大動物の利用により、遺伝子機能解析だけでなく有用物質生産への適用も考えられる。
５．キメラ非ヒト動物の子孫の作出
本発明のキメラ非ヒト動物の作出方法は、さらに、それと同種の非ヒト動物と交配させて導入した核酸配列をヘテロにもつトランスジェニック（Ｔｇ）動物を選択して得、このＴｇ動物の雄と雌を交配させて導入遺伝子をホモにもつＴｇ動物子孫を得ることを含む。
６．キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞
本発明においては、前記いずれかのキメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞を得ることができる。該細胞または組織は、該細胞または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含み、所望の蛋白質を発現することができるものである。
前記組織および細胞には、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来し、かつ所望の蛋白質を発現することができるものであればいずれの組織および細胞も含まれ、例えば、Ｂ細胞、脾臓、リンパ組織などが挙げられる。
前記組織および細胞は、当技術分野で公知の手法により採取・培養することができ、該組織および細胞が所望の蛋白質を発現しているかどうかも慣例的な手法に従って確認することができる。このような組織および細胞は、以下で記載するハイブリドーマの作製、蛋白質の製造などに有用である。
７．ハイブリドーマの作製
本発明においては、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を発現するキメラ非ヒト動物の細胞、特にＢ細胞もしくはＢ細胞を含む脾臓、リンパ節などのリンパ組織からの細胞と、増殖可能な腫瘍細胞（たとえばミエローマ細胞）とを融合することによって、ハイブリドーマを得ることができる。ハイブリドーマの作製法は、たとえば安東・千葉（単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク、１９９１）に記載される手法に基くことができる。
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることができるが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１：１−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９（１９７６）］、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）［Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３：１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｈｏｒｉｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地（例えば、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する細胞として使用可能なものは、プラズマ細胞（すなわち、形質細胞）、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する脾細胞をミエローマと融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。具体的には次のように行うことができる。脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（一般にＰＢＳと呼ばれる）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が通常約５：１〜約１０：１になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン液およびヒトインターロイキン−６を含む正常培地（一般にＨＡＴ培地と呼ばれる）中に懸濁して培養用プレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。培養途中に適宜ＨＡＴ培地を補う。
ミエローマ細胞が８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合には、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、脾臓細胞どうしの融合細胞、あるいは、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、脾臓細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残る。
得られたハイブリドーマは、前記の導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対して特異的な抗体によるＥＬＩＳＡでスクリーニングすることにより、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を産生するハイブリドーマを選択することができる。
８．蛋白質の製造方法
本発明はさらに、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫、あるいは上記の組織または細胞、あるいは上記のハイブリドーマのいずれかを用いて所望の蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む、所望の蛋白質を製造する方法を提供する。具体的に説明すると、キメラ非ヒト動物またはその子孫の個体を、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で飼育し、その後発現産物である蛋白質を動物の血液、腹水などから回収することができる。あるいはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞、あるいはそれを不死化したもの（例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブリドーマ）などを、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で培養し、その後発現産物である蛋白質を培養物、培養上清などから回収することができる。発現産物は、遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなど）、分取薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの公知の方法の１種または複数の組み合わせによって精製することができる。
９．生体内機能の解析方法
本発明はさらにまた、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型ＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物などの表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。
本方法では、遺伝子導入に対応して生体内に現れる任意の形質を物理化学的方法によって検出し、これによって導入した核酸配列または蛋白質の生体内機能を同定することができる。たとえば、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物またはその子孫、および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型のＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物の血液を採取し、血球数測定機によって分析する。測定された白血球、赤血球、血小板などの血中濃度を前記２種のキメラ非ヒト動物間で比較することによって、導入した核酸配列によってコードされる該所望の蛋白質の血球系細胞の増殖・分化に対する作用を検討することができる。後述の実施例では、導入した核酸配列としてトロンボポエチン（ＴＰＯ）をコードするＤＮＡを用いたが、この場合、キメラマウスにおいて顕著な血小板増加（形質）が観察された。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の好ましい実施形態として、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用したシステムを例に挙げて記載する。
免疫グロブリン（Ｉｇ）は血清中に分泌される蛋白質の中でも最も大量に生産されるものの一つである。例えばヒトにおいては血清蛋白質の１０〜２０％を占め、その濃度は１０〜１００ｍｇ／ｍｌに達する。ＩｇはＢ細胞、主にその終末分化型であるプラズマ細胞において多量に生産されるが、Ｉｇ遺伝子座における高い転写活性、ｍＲＮＡの安定性、蛋白質の分泌生産に特化したプラズマ細胞の機能など、様々な要因がそのＩｇの高レベルの発現に寄与している。さらに、成体において、Ｂ細胞は骨髄で発生し、成熟すると共に脾臓、小腸パイエル板、リンパ節など全身のリンパ組織に移行することから、Ｂ細胞のＩｇ遺伝子の制御領域下で産生された導入遺伝子産物はＩｇ同様に血中またはリンパ液中に放出され、全身に速やかに行き渡る。本発明においては、このような高発現をもたらすＩｇの発現系を利用して所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子）を発現させることに利点を有する。
導入遺伝子の効率的な発現のための導入遺伝子挿入箇所は、Ｉｇ軽鎖、好ましくはκ軽鎖が望ましいと考えられる。例えば、マウス免疫グロブリンの９５％はκ軽鎖を含み、その定常領城遺伝子は１つしか存在しない。一方で、軽鎖λは５％であり、４種の異なる遺伝子が存在してそのいずれかが使用される。また、重鎖においても定常領域はμ、γ（４種）、αおよびεの計７種あり、通常、導入遺伝子の挿入は１箇所であることを考慮すると、κ鎖の利用が好ましい。
発現形態としては、機能的なＩｇ軽鎖が産生される条件でさらに導入した核酸配列が発現することが望ましい。Ｉｇ遺伝子座では対立遺伝子排除の機構により、機能的なＩｇ発現が他の対立遺伝子の発現を抑えられることが知られているが、組換えに失敗して終止コドンが本来の終止コドンより上流に現れるようなｍＲＮＡは不安定化すると考えられている。よって、導入した核酸配列の発現を最大化するためには、機能的なＩｇ軽鎖と導入核酸配列（構造遺伝子）が１つのｍＲＮＡにあるような状態が望ましい。
本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列の終止コドンの下流にこのＩＲＥＳが配置され、ＩＲＥＳの下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列（導入遺伝子）が配置されてなる遺伝子をゲノム上に含むことが好ましい。ＩＲＥＳ＋導入遺伝子の挿入部位は、Ｉｇ軽鎖の終止コドンとポリＡ付加部位の間が望ましく、またその数は複数でもよい。ＩＲＥＳ配列が形成する二次構造が、Ｉｇ軽鎖遺伝子の翻訳に悪影響を与えないように、Ｉｇ軽鎖遺伝子の終止コドンからＩＲＥＳの間は一定の間隔（例えば数ｂｐ〜数１０ｂｐ）をあけるのが望ましい。
免疫グロブリン軽鎖遺伝子の下流にＩＲＥＳを含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように動物のゲノムを改変するために、ノックインベクターを準備し、このベクターＤＮＡに該ＩＲＥＳと該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。このベクターとしては、ｐＫＩκ（実施例１参照）が好ましい。ノックインベクターは、軽鎖の終止コドンとポリＡ付加部位の間（たとえば中間点付近）に、ＩＲＥＳ配列および導入する核酸配列の挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、該制限酵素切断部位には導入する核酸配列の開始コドンから終止コドンまでを含むＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が挿入される。また、好ましくは開始コドンの上流にコザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。さらに、相同組換え体を簡便に同定するために、外来遺伝子がノックインされる位置に薬剤耐性遺伝子マーカー、好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子をあらかじめ挿入しておくこともできる。このノックインベクターＤＮＡの調製工程においては、スペルミジンなどのポリアミン類もしくはその類似化合物による処理を行うことが好ましい。
ノックインベクターによる非ヒト動物ＥＳ細胞の形質転換は、相沢慎一（前記）等に記載された方法によって行うことができる。本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（２０００年３月２日国際公開）に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムＤＮＡを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定する。ノックインベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子はＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載されたＬｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏプラスミドに由来し、その両端に順方向にＬｏｘ−Ｐ配列を含んでいる。よってＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された方法で同耐性遺伝子をノックインされたＥＳ細胞から除去することができる。
本発明において、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用する場合、ＥＳ細胞注入のための欠損宿主胚としては、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された免疫グロブリン重鎖遺伝子破壊についてホモである非ヒト動物系統を用いることが好ましい。
作製したノックインＥＳ細胞を、上記欠損宿主胚の胚胎盤胞または８細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞または８細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の成熟Ｂリンパ球は存在せず、ノックインＥＳ細胞由来のもののみ存在する。これは、宿主胚として用いる免疫グロブリン重鎖ノックアウト非ヒト動物は、成熟Ｂリンパ球（Ｂ２２０陽性）を欠損し、血中に免疫グロブリンが検出されないことによる（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７，２０００）。ノックインＥＳ細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における成熟Ｂリンパ球および抗体産生の回復は、ＦＡＣＳ解析、ＥＬＩＳＡ法等によって検出可能である。ノックインＥＳ細胞由来Ｂ細胞において挿入した核酸配列が発現するかどうかは、挿入したアレル（対立遺伝子ともいう）のＩｇ軽鎖遺伝子において、部位特異的組換え反応が起こるかどうかに依存している。すなわち挿入アレルのＩｇ軽鎖遺伝子の組換えが成功し、そのｍＲＮＡが機能的な軽鎖をコードする場合、ｍＲＮＡ上に同時に存在する挿入核酸配列（構造遺伝子）もＩＲＥＳの働きにより蛋白質に翻訳される。さらに、挿入アレルのκ鎖遺伝子の組換えが失敗し、もう一方のアレルのκ鎖あるいはλ鎖が機能的な軽鎖をコードする場合でも、非機能的なκ鎖および導入核酸配列をコードするｍＲＮＡの転写は起こるため、挿入核酸配列由来の蛋白質は発現する。挿入核酸配列の発現が起こらないのは、もう一つのアレルのκ鎖あるいはλ鎖が先に機能的な組換えに成功し、挿入アレルのＩｇκ鎖の組換えが対立遺伝子排除の機構によりシャットオフされる場合である。非ヒト動物においてＢ細胞は胎生１２日目頃より胎児肝組織に出現するが、出生と共に発生の場は骨髄に移動する。胎児期においてはＢ細胞は発生の初期段階、すなわち膜型免疫グロブリン受容体を発現する細胞が主体である。成体と比較してＢ細胞自体の数が少ないことおよび膜型Ｉｇを主に発現する細胞では免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡ量自体が少ないことによって、挿入核酸配列の発現も成体と比較して非常に少ないと考えられる。抗体産生は離乳期（３週齢）より増加するが、終末分化段階であるプラズマ細胞の増加によるものと想像される。以後、Ｂ細胞は、脾臓、リンパ節、小腸パイエル板などのリンパ組織に移動して抗体および挿入核酸配列を発現する。挿入核酸配列がコードする所望の蛋白質は免疫グロブリン同様、血液やリンパ液中に分泌され、全身に行き渡る。
導入核酸配列のＢ細胞における発現は以下のようにして確認される。導入遺伝子を含むポリシストロニックｍＲＮＡの発現は例えば脾臓、末梢血有核細胞など、Ｂ細胞を含む組織や細胞集団由来ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法等を利用して検出できる。また、導入核酸配列をコードするＤＮＡを適当に改変して抗体で検出可能なタグペプチドを付加すれば、該タグペプチドに対する抗体等で導入核酸配列の発現を検出できる。
上述のようにして得られたキメラ非ヒト動物は、効率よくかつ確実に導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を高発現する。この効率の高さは、前述したが、主として以下の点に基づく：
（１）Ｂリンパ球欠損宿主胚の利用によって、キメラ動物のＢリンパ球がキメラ率に関わらず全てＥＳ細胞に由来する。
（２）Ｉｇκ遺伝子座における相同組換え効率が５％以上の効率で起こる。
（３）免疫グロブリンの発現系を利用している。
（４）免疫グロブリンの発現は発生初期には非常に少なく、離乳期以降に爆発的な増加を示すため、高発現が胚性致死をもたらすような遺伝子を導入する場合でも、成体における機能を検討することができる。
実施例
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
〔実施例１〕ノックインベクターｐＫＩκの作製
（１）クローニング部位近傍断片の作製
マウスイムノグロブリンカッパ鎖（Ｉｇκ）遺伝子の終止コドン部分とポリアデニレーションシグナル（ＰｏｌｙＡシグナル）の間にインターナルリボゾーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）および導入対象の所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入するための制限酵素認識配列（ＳａｌＩ認識配列）を導入し、ＰｏｌｙＡシグナル下流にピューロマイシン耐性遺伝子を導入したゲノム断片を作製した。以下にその方法を具体的に記す。
（１．１）クローニング部位上流の断片の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇＧκ遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000002
５’側プライマーであるｉｇｋｃ１の末端にはＸｈｏＩ認識配列を、３’側プライマーであるｉｇｋｃ２にはＥｃｏＲＩ認識配列を付加した。ＴａｋａＬａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてＩｇ軽鎖Ｃκ−Ｊκを含むλクローン由来ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ（＋）（日本国東洋紡）クローニングしたもの（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット）２５ｎｇを添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒および６８℃３分を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収して増幅断片Ａを得た。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ２  ＫＳ−ベクター（米国ストラタジーン）に該増幅断片Ａを挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡを取得した。
（１．２）クローニング部位下流の断片の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇＧκ遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000003
５’側プライマーであるｉｇｋｃ３の末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を、３’側プライマーであるｉｇｋｃ４にはプライマーの５’側からＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，およびＳａｌＩ認識配列を付加した。ＴａｋａＬａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてＩｇ軽鎖Ｃκ−Ｊκを含むλクローン由来ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ（＋）（日本国東洋紡）クローニングしたもの（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット）２５ｎｇを添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収して増幅断片Ｂを得た。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＩｇＣκＡベクターに得られた増幅断片Ｂを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡＢを取得した。
（１．３）ピューロマイシン耐性遺伝子の導入
Ｌｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏプラスミド（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてｌｏｘＰ−ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。ｐＩｇＣκＡＢをＳａｌＩで消化して末端平滑化したプラスミドに、得られたｌｏｘＰ−ピューロマイシン耐性遺伝子断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡＢＰを取得した。
（１．４）ＩＲＥＳ遺伝子の導入
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（脳心筋炎ウイルス）由来のＩＲＥＳ遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000004
５’側プライマーであるｅＩＲＥＳＦＷの末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を、３’側プライマーであるｅｓＩＲＥＳＲＶにはプライマーの５’側からＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ認識配列を付加した。ＴａｋａＬａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてｐＩＲＥＳｈｙｇプラスミド（米国クロンテック）１５０ｎｇを添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収した。ｐＧＥＭ−Ｔベクター（米国プロメガ）に得られたＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドＩＲＥＳ−Ｓａｌ／ｐＧＥＭを取得した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収した。ｐＩｇＣκＡＢＰをＥｃｏＲＩで消化したプラスミドに、得られたＩＲＥＳ遺伝子を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡＢＰＩＲＥＳを取得した。
（２）ｐΔＣκＳａｌプラスミドの作製
ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載されている免疫グロブリン遺伝子軽鎖κノックアウト用ターゲティングベクタープラスミドをＳａｃＩＩで消化した後、ＥｃｏＲＩを用いて部分消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動にてＬｏｘＰ−ＰＧＫＰｕｒｏ部分を切り出した残りの１４．６ＫｂのＤＮＡを分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて回収した。得られたＤＮＡに以下の合成ＤＮＡを挿入することにより、ＳａｌＩ認識配列を導入した。
2003041495.tif 000005
得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入し、得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐΔＣκＳａｌを取得した。
（３）ノックインベクターｐＫＩκの作製
上記（１．４）で得られたｐＩｇＣκＡＢＰＩＲＥＳプラスミドをＸｈｏＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてＣκ−ＩＲＥＳ−ｌｏｘＰ−ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。上記（２）で作製されたｐＣκＳａｌをＳａｌＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、前記ＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、プラスミドｐＫＩκを取得した。ｐＫＩκの構造を図１に示す。ｐＫＩκベクター構造の概略は以下のとおりである。
すなわち、５’側から、Ｊ断片下流に存在するエンハンサー配列およびＩｇκ軽鎖Ｃ領域を含むマウスＩｇκゲノムＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ、約５．３Ｋｂ）、インターナルリボゾーマルエントリーサイト（約０．６Ｋｂ）、インターナルリボゾーマルエントリーサイト３’末端直下に位置するクローニングサイト（ＳａｌＩ）、マウスＣκポリＡシグナル領域（約０．３Ｋｂ）、ピューロマイシン耐性遺伝子カセット（約１．８Ｋｂ）、マウスＣκポリＡシグナル領域の下流に位置するマウスＩｇκゲノムＤＮＡ（約７．７Ｋｂ）、ジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）遺伝子カセット（約１．０Ｋｂ）、ＰＵＣ１８  ＤＮＡ（約２．７Ｋｂ）で構成される。上記ノックインベクターについて、後述する実施例２以降の操作を同様に行うことにより、ノックインＥＳ細胞を作製する。ノックインＥＳ細胞では、マウスＩｇκのＣκ構造遺伝子の終止コドン直下の位置にインターナルリボゾーマルエントリーサイトが配置され、インターナルリボゾーマルエントリーサイト３’末端直下に位置するクローニングサイトに所望の構造遺伝子が配置される。さらにその直下の位置にマウスＣκポリＡシグナル領域が配置される。ＩＲＥＳを用いることにより、マウスＩｇκのＣκ構造遺伝子の終止コドン下流に配置された構造遺伝子の翻訳効率は飛躍的に向上する（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．４，２０００，３７６−３８２．）。
〔実施例２〕ｐＫＩκへのＴＰＯ遺伝子の挿入
（１）ｐＫＩκ導入用マウストロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子の調製
マウスＴＰＯ遺伝子配列（国際公開ＷＯ  ９５／１８８５８号パンフレット）より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000006
５’側プライマーであるｔｐｏＮの末端には５’側からＸｈｏＩ認識配列およびＫｏｚａｋ配列を、３’側プライマーであるｔｐｏＲの末端にはＸｈｏＩ認識配列を付加した。
ＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書に従って反応液を調製し、１００μＬ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ，米国クロンテック）１００ｐｇを添加し、９４℃で３０秒保温したのち、９８℃１秒、５０℃３０秒および７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけてＰＣＲ増幅断片を分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的のＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をＸｈｏＩで３７℃にて３時間処理後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）で回収した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（日本国東洋紡）をＸｈｏＩ処理後にＣＩＡＰ（日本国宝酒造）処理して得られたｐＢｌｕｅＸｈｏＩＣＩＡＰプラスミド４２ｎｇ、ＸｈｏＩ処理して得られたＰＣＲ増幅断片１０８ｎｇおよびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（日本国宝酒造）１０μＬを混合し、１６℃で３０分間インキュベーションした後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＴＰＯ）を調製し、塩基配列を確認した。ｐＢｌｕｅＴＰＯ９．６μｇをＸｈｏＩで３７℃にて４時間消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＴＰＯ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。回収したＴＰＯ断片を再度０．８％アガロースゲルにて分離回収することでｐＫＩκ導入用マウスＴＰＯ遺伝子を調製した。
（２）マウスＴＰＯ遺伝子導入ノックインベクターの調製
実施例１で調製したｐＫＩκ２１μｇをＳａｌＩで３７℃にて４時間消化後、エタノール沈殿でベクターを回収した。回収されたベクターを１０μＬのＴＥに溶解後、ＣＩＡＰ（日本国宝酒造）を用いて末端脱リン酸化したｐＫＩκ−ＳａｌＩ−ＣＩＡＰを調製した。このｐＫＩκ−ＳａｌＩ−ＣＩＡＰ  ４０ｎｇ、上記（１）で調製したｐＫＩκ導入用マウスＴＰＯ遺伝子４ｎｇ、およびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（日本国宝酒造）１．８μＬを混合し、１６℃にて１８時間インキュベーション後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（日本国東洋紡）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認後、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いてマウスＴＰＯ遺伝子導入ノックインベクターを調製した。
（３）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用マウスＴＰＯ遺伝子導入ノックインベクターの調製
上記（２）で調製したマウスＴＰＯ遺伝子導入ノックインベクター１５０μｇをＸｈｏＩを用いて３７℃にて６．５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノールおよび０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＸｈｏＩで一本鎖化させたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存して、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用マウスＴＰＯ遺伝子導入ノックインベクターの調製を行った。
〔実施例３〕ＴＰＯノックインＥＳ細胞株の取得
ＴＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例２で作製したＴＰＯノックインベクターを制限酵素ＸｈｏＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従ってマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）へ導入した。
ＴＴ２Ｆの培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計１２４個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのＧピューロマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、１２４株中２株（２％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例５８参照））が、ピューロマイシン耐性株＃６および＃１１においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にＴＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
〔実施例４〕ＴＰＯノックインマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例３で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にＴＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたピュローマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞株＃１１を凍結ストックより立ち上げ、それを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。計１８０個の注入胚を移植した結果、１６匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＴＴ２Ｆ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した１６匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は１０匹であった。また、最高の貢献率は２個体における１００％であった。この結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にＴＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているピュローマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞株＃１１はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
〔実施例５〕ＴＰＯノックインＥＳ細胞由来キメラマウスにおける血小板増加
上記実施例４で作製されたＴＰＯノックインＥＳ細胞株＃１１由来のキメラマウス計１０匹（キメラ率１００〜５％）および非キメラマウス５匹より、６週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置（日本国シスメックス（株）製、Ｆ−８２０）を用いて末梢血血球数を測定した。キメラマウス群では、キメラ率にかかわらず非キメラマウスと比較して平均１１．０４倍の血小板数の増加が認められた。キメラマウス群では白血球数も同様に平均２．０３倍の増加が認められたが、赤血球数は逆に平均０．７６倍の減少が認められた。
従って、ＴＰＯ遺伝子によってコードされる蛋白質は、血中の血小板数を調節する機能を持つと考えられた。この結果は、従来示されていたＴＰＯ遺伝子産物の機能（加藤ら、血液・腫瘍科、３３：１−１０、１９９６）と一致していた。すなわち、本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析に有用であることが示された。
〔実施例６〕ＴＰＯノックインＥＳ細胞由来キメラマウスからのＴＰＯ産生ハイブリドーマの取得
上記実施例５において血小板増加が観察されたキメラマウス個体ＴＰＯ（１１３）（キメラ率７０％）から生後１０週目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの作製法は、確立されている方法（安東、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク、１９９１）に従い、ミエローマ細胞としてはＳＰ２／０（ＲＩＫＥＮ  ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ，ＲＣＢ０２０９）を使用した。作製したハイブリドーマを９６穴プレート３枚にまき、１０日間培養後、培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析した。ＥＬＩＳＡ法はＮｉｓｈｉｙａｍａらの報告（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８５：１５２−１５９，２００１）に記載された通り実施した。まず抗マウスＴＰＯウサギＩｇＧ抗体を４℃にて一晩インキュベーションすることによりマイクロタイタープレート（Ｓｕｍｉｌｏｎ、日本国住友ベークライト）に固定化した後、洗浄した。次にハイブリドーマ上清をプレートに加え、４℃にて一晩インキュベーション後、洗浄した。マウスＴＰＯは、最終的にはビオチン化抗マウスＴＰＯトリＩｇＧ抗体、アルカリフォスファターゼラベルされたストレプトアビジン、およびＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ（日本国Ｗａｋｏ）により検出した。その結果、ＨＡＴ耐性ハイブリドーマの存在するウェルのうち約１５％においてマウスＴＰＯの発現が検出された。さらに、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇκ鎖の発現を検討したところ、ＨＡＴ耐性ウェルのうち約２５％がＩｇκ鎖陽性であり、Ｉｇκ陽性ウェル中約６０％がマウスＴＰＯ陽性であった。クローニングされたＴＰＯ陽性ハイブリドーマ上清におけるＴＰＯ濃度を、前述したＥＬＩＳＡ法により定量したところ、約１０ｎｇ／ｍｌであった。
〔実施例７〕ＴＰＯノックインＥＳ細胞由来キメラマウスからのＴＰＯノックイン免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の子孫伝達
上記実施例４で作製されたＴＰＯノックインＥＳ細胞株＃１１由来キメラマウスのうち、１００％のキメラ率を示しかつ雌である個体ＴＰＯ（１０８）について、雄ＭＣＨ（ＩＣＲ）系統マウス（日本国日本クレア社）との交配によりＥＳ細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。この交配において、ＭＣＨ（ＩＣＲ）雄マウス（アルビノ、劣性）由来の精子と受精した、キメラマウス中のＴＴ２Ｆ細胞（野生色、優性）由来の卵子からは野生色の仔マウスが、キメラマウス中のＭＣＨ（ＩＣＲ）由来の卵子からは白色の仔マウスが誕生する。この交配によって得られた仔マウス計７匹の全てがＥＳ細胞由来の毛色である野生色を示し、ＴＰＯノックインＥＳ細胞の効率的な生殖系列への伝達が示された。３週齢の野生色仔マウス７匹について、上記実施例５と同様に血小板数の測定を行ったところ、７匹中３匹（４３％）で血小板数の顕著な増加（５×１０６／μｌ以上）が観察された。ＥＳ細胞においては片側の免疫グロブリン遺伝子座にのみＴＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されており、野生色マウス中挿入されたＴＰＯ遺伝子を保持する確率は５０％と推測される。上記の結果はこの推測とほぼ一致し、導入されたＴＰＯ遺伝子の子孫伝達が示された。以上の結果は、本明細書に記載の方法により所望の分泌蛋白質を本来発現される部位とは異なる細胞、組織において発現するマウス系統を確立できることを示している。
〔実施例８〕ｐＫＩκへのヒトＣＤ２０遺伝子の挿入
（１）ｐＫＩκ導入用ヒトＣＤ２０遺伝子の調製
ヒトＣＤ２０遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ，Ｍ２７３９４）より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000007
ヒトＣＤ２０遺伝子の増幅は、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ，ｈｕｍａｎ  ｓｐｌｅｅｎ（米国クローンテック社）を鋳型として、上記実施例２と同様に実施した。ＰＣＲ反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけてＰＣＲ増幅断片を分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的のＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をＸｈｏＩで３７℃にて３時間処理後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）で回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（日本国東洋紡）をＸｈｏＩ処理後にＣＩＡＰ（日本国宝酒造）処理して得られたｐＢｌｕｅＸｈｏＩＣＩＡＰプラスミド４２ｎｇ、上述のとおりＸｈｏＩ処理して得られたＰＣＲ増幅断片１０８ｎｇおよびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（日本国宝酒造）１０μＬを混合し、１６℃にて３０分間インキュベーション後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＣＤ２０）を調製し、塩基配列を確認した。ｐＢｌｕｅＣＤ２０  ９．６μｇをＸｈｏＩで３７℃にて４時間消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＣＤ２０断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。回収したＣＤ２０断片を再度０．８％アガロースゲルにて分離回収することでｐＫＩκ導入用ヒトＣＤ２０遺伝子を調製した。
（２）ヒトＣＤ２０遺伝子導入ノックインベクターの調製
実施例１で調製したｐＫＩκ２１μｇをＳａｌＩで３７℃にて４時間消化後、エタノール沈殿でベクターを回収した。回収されたベクターを１０μＬのＴＥに溶解後、ＣＩＡＰ（日本国宝酒造）を用いて末端脱リン酸化したｐＫＩκ−ＳａｌＩ−ＣＩＡＰを調製した。
上記ＫＩ−ＳａｌＩ−ＣＩＡＰ  ４０ｎｇ、上記（１）で調製したノックインベクター導入用ヒトＣＤ２０遺伝子４ｎｇ、およびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（日本国宝酒造）１．８μＬを混合し、１６℃にて１８時間インキュベーション後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（日本国東洋紡）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認後、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いてヒトＣＤ２０遺伝子導入ノックインベクターを調製した。
（３）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ヒトＣＤ２０遺伝子導入ノックインベクターの調製
（２）で調製したヒトＣＤ２０遺伝子導入ノックインベクター１５０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ，ｐＨ．７．０，米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）およびスペルミジン無添加バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用いてそれぞれＸｈｏＩ消化（３７℃、６．５時間）し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノールおよび０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＸｈｏＩで線状化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え１時間室温で保存し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ヒトＣＤ２０遺伝子導入ノックインベクターの調製を行った。
〔実施例９〕ヒトＣＤ２０ノックインＥＳ細胞株の取得
ヒトＣＤ２０−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、上記実施例８で調製したヒトＣＤ２０ノックインベクター２種（スペルミジン添加および無添加）をそれぞれ、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従って、マウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）へ導入した。ＴＴ２Ｆの培養法は、記載された方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち、計８０個（スペルミジン無添加）および５６個（スペルミジン添加）をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して、１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのＧピューロマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、上記実施例３に示したプローブで相同組換え体を検出した。その結果、スペルミジン無添加では８０株中０株（０％）、スペルミジン添加の場合には５６株中５株（９％）が相同組換え体であるという結果を得た。
〔実施例１０〕ノックインベクターへのヒトＦＧＦ２３遺伝子の挿入
ヒトＦＧＦ２３（繊維芽細胞増殖因子２３）遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000008
ヒトＦＧＦ２３  ｃＤＮＡの増幅はＳｈｉｍａｄａらの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：６５００−６５０５，２０００）に記載された、全長ＦＧＦ２３  ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡベクターを鋳型として、上記実施例２と同様に実施した。ＰＣＲ反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけてＰＣＲ増幅断片を分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的のＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をＸｈｏＩで３７℃にて３時間処理後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）で回収した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（日本国東洋紡）をＸｈｏＩ処理後にＣＩＡＰ（日本国宝酒造）処理して得られたｐＢｌｕｅＸｈｏＩＣＩＡＰプラスミド４２ｎｇ、上述のようにＸｈｏＩ処理して得られたＦＧＦ２３  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ増幅断片１０８ｎｇおよびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（日本国宝酒造）１０μＬを混合し、１６℃にて３０分間インキュベーション後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＦＧＦ２３）を調製し、塩基配列を確認した。ｐＢｌｕｅＦＧＦ２３  ９．６μｇをＸｈｏＩで３７℃にて４時間消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＦＧＦ２３断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。回収したＦＧＦ２３断片を再度０．８％アガロースゲルにて分離回収することでｐＫＩκ導入用ヒトＦＧＦ２３遺伝子を調製した。
末端脱リン酸化したベクターｐＫＩκ−ＳａｌＩ−ＣＩＡＰ（実施例２）４０ｎｇ、上記ノックインベクター導入用ヒトＦＧＦ２３遺伝子４ｎｇ、およびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（日本国宝酒造）１．８μＬを混合し、１６℃にて１８時間インキュベーション後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（日本国東洋紡）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認後、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いてヒトＦＧＦ２３遺伝子導入ノックインベクターを調製した。ヒトＦＧＦ２３遺伝子導入ノックインベクター１５０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ，ｐＨ．７．０，米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）およびスペルミジン無添加バッファー（前記）を用いてそれぞれＸｈｏＩ消化（３７℃、６．５時間）し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノールおよび０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＸｈｏＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ヒトＦＧＦ２３遺伝子導入ノックインベクターの調製を行った。
〔実施例１１〕ＦＧＦ２３ノックインＥＳ細胞株の取得
ヒトＦＧＦ２３−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株を取得するため、上記実施例１０で調製したＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ヒトＦＧＦ２３ノックインベクター２種（スペルミジン添加および無添加）をそれぞれ、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従ってマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）へ導入した。ＴＴ２Ｆの培養法は、記載された方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち、計８０個（スペルミジン無添加）および５６個（スペルミジン添加）をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、上記実施例３に示したプローブで相同組換え体を検出した。その結果、スペルミジン無添加では８０株中０株（０％）、スペルミジン添加の場合４０株中３株（８％）が相同組換え体であるという結果を得た。以上の結果は、ベクターＤＮＡ調製時のスペルミジン添加が、ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を上昇させる効果を持つことを示している。
〔実施例１２〕Ｃκ鎖ノックアウトベクターｐΔＣκＮｅｏの作製
ｐＳＴｎｅｏＢ（Ｋａｔｏｈら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１２：５７５，１９８７；Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＪＣＲＢ），Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＶＥ０３９）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳｃａ  Ｉで消化し、ｎｅｏ耐性遺伝子を含む断片を０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収してｎｅｏ断片とした。前記実施例１の（２）で作製したｐΔＣκＳａｌをＳａｌＩで消化した後、大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、前記ｎｅｏ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認してプラスミドｐΔＣκＮｅｏを取得した。ｐΔＣκＮｅｏの構造を図２に示す。
〔実施例１３〕ＥＳΔΔκｎｅｏ細胞株の取得
前記実施例２および実施例３に記載された方法と同様にして、ｐΔＣκＮｅｏベクター（実施例１２）により内因性Ｉｇκ遺伝子の片側のアレルが破壊されたマウスＥＳ（ＴＴ２Ｆ）細胞を取得した。ｐΔＣκＮｅｏベクター内のＩｇκゲノム相同領域はＣ５７ＢＬ／６系統に由来するので、ＴＴ２Ｆ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡ系統のＦ１由来）においては、同ベクターがＣ５７ＢＬ／６アレルに優先的に挿入される。このＥＳ細胞株（ＥＳΔκｎｅｏ）について、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例７６参照）に記載された抗体軽鎖ターゲティングベクターおよび同パンフレットに記載された方法を用いて、さらにもう一方（ＣＢＡ）の内因性Ｉｇκ遺伝子アレルが破壊されたマウスＥＳ細胞（ＥＳΔΔκｎｅｏ／ｐｕｒｏ）を取得した。ＥＳΔΔκｎｅｏ／ｐｕｒｏ株について、さらにＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された方法（実施例７８参照）に従ってｐｕｒｏ遺伝子のＣｒｅ組換え酵素による除去を行った。最終的に得られるＧ４１８耐性、ピューロマイシン感受性かつ内因性のＩｇκ遺伝子が両アレルとも破壊されたＥＳ細胞株（ＥＳΔΔκｎｅｏ）を得た。前記実施例３に記載されたノックインＥＳ細胞株の取得において、ＴＴ２Ｆ細胞株の代わりにＥＳΔΔκｎｅｏを用いてＥＳ細胞株を取得した。ノックインベクター内のＩｇκゲノム相同領域はＣ５７ＢＬ／６系統に由来するので、得られる相同組換え体において、同ベクターはＧ４１８耐性遺伝子の存在するＣ５７ＢＬ／６アレルにおいてＧ４１８耐性遺伝子と優先的に置換される。よって相同組換え体をＧ４１８感受性によって簡便にスクリーニングすることができた。また、得られる相同組換え体においては内因性Ｉｇκ遺伝子ＣＢＡアレルが既に破壊されているため、ノックインベクターにより外来遺伝子が挿入されたＣ５７ＢＬ／６アレルのＩｇκ遺伝子が独占的に発現した。
〔実施例１４〕Ｉ型ノックインベクターｐＫＩ−Ｉ−１およびｐＫＩ−Ｉ−２の作製
（１）クローニング部位近傍断片の作製
マウス免疫グロブリンカッパ鎖（Ｉｇκ）遺伝子の終止コドン部分とポリアデニレーションシグナル（ＰｏｌｙＡシグナル）の間にＳＶ４０  ＰｏｌｙＡシグナル、Ｉｇκプロモーター領域１ないし２および目的遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を導入し、ｐｏｌｙＡシグナル下流にピューロマイシン耐性遺伝子を導入したＤＮＡ断片を作製した。以下にその方法を具体的に示す。
（１．１）クローニング部位上流の断片１の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナル領域配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000009
５’側プライマーであるＳＶｐｏｌｙ５の末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を、３’側プライマーであるＳＶｐｏｌｙ３の末端にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加した。Ｔａｋａｒａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてｐＳＴｎｅｏＢを１０ｎｇ添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒および６８℃３０秒を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿した後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離した。その後、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収し増幅断片１とした。
（１．２）クローニング部位上流の断片２および３の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇκプロモーター領域遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000010
５’側プライマーであるＣκｐｒｏｍ１−５およびＣκｐｒｏｍ２−５にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を、３’側プライマーであるＣκｐｒｏｍ１−３およびＣκｐｒｏｍ２−３にはＸｂａＩ認識配列を付加した。マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット（Ｃκｐｒｏｍ１−５、Ｃκｐｒｏｍ１−３）、およびプライマーセット（Ｃκｐｒｏｍ２−５、Ｃκｐｒｏｍ２−３）を用いてＴａｋａｒａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）により増幅されたＤＮＡ断片２および３を取得した。
（１．３）マルチクローニング部位断片４の調製
ＸｂａＩ，ＳａｌＩ，ＮｏｔＩ，ＦｓｅＩ，ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩを含むようなマルチクローニング部位断片を調製するため以下のＤＮＡ断片を合成した。
2003041495.tif 000011
上記２種のＤＮＡ断片をアニーリングして、ＤＮＡ断片４とした。
（１．４）クローニング部位下流断片５の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇκ遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000012
５’側プライマーであるＣκｐｏｌｙＰ５の末端にはＳｐｅＩ認識配列を、３’側プライマーであるＣκｐｏｌｙＰ３の末端にはＢｇｌＩＩ認識配列を付加した。マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、上記プライマーＣκｐｏｌｙＰ５およびＣκｐｏｌｙＰ３を用いてＴａｋａｒａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）により増幅されたＤＮＡ断片５を取得した。
（１．５）ＤＮＡ断片１，２，４，５ないし１，３，４，５を含むＤＮＡ断片ＩないしＩＩの調製
上記各ＤＮＡ断片の５’および３’側に付加した認識配列を切断する制限酵素で処理した後、フェノール／クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿したサンプルをＴＥに溶解した。ＤＮＡ断片１，２，４，５ないし１，３，４，５を制限酵素処理した断片をＬｉｇａｔｉｏｎ反応でそれぞれ結合した後、エタノール沈殿で回収し、ＤＮＡ断片ＩないしＩＩを調製した。
（２）Ｉ型ノックインベクターｐＫＩ−Ｉ−１およびｐＫＩ−Ｉ−２の作製
（２．１）ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳプラスミドの作製
前記実施例１に記載したｐＩｇＣκＡＢＰ  ＩＲＥＳを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで処理し、ｌｏｘＰ−ピューロマイシン耐性遺伝子断片がＢｇｌＩＩによって切断されていないＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離回収し、プラスミドｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ断片を取得した。
（２．２）ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩないしｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＩの作製
ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳにＤＮＡ断片Ｉを挿入してｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩを調製し、ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳにＤＮＡ断片ＩＩを挿入してｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＩを調製した。
（２．３）Ｉ型ノックインベクターｐＫＩ−Ｉ−１およびｐＫＩ−Ｉ−２の作製
ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩおよびｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＩを制限酵素ＸｈｏＩで処理し、マルチクローニング部位を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離回収し、得られたＤＮＡ断片を、ｐΔＣκＳａｌ（実施例１）をＳａｌＩで消化した後大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認してプラスミドｐＫＩ−Ｉ−１およびｐＫＩ−Ｉ−２を取得した。ｐＫＩ−Ｉ−１およびｐＫＩ−Ｉ−２の構造を図３および図４に示す。ベクター構造の概略は以下のとおりである。
すなわち、５’側から、Ｊ断片下流に存在するエンハンサー配列およびＩｇκ軽鎖Ｃ領域を含むマウスＩｇκゲノムＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ、約５．３Ｋｂ）、ＳＶ４０ポリＡシグナル領域（約０．４Ｋｂ）、マウスＩｇκプロモーター１（ｐＫＩ−Ｉ−１の場合。ｐＫＩ−Ｉ−２ではマウスＩｇκプロモーター２）を含む領域（約０．２Ｋｂ）、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む領域（約０．０２Ｋｂ）、マウスＣκポリＡシグナル領域（約０．４Ｋｂ）、ピューロマイシン耐性遺伝子カセット（約１．８Ｋｂ）、マウスＣκポリＡシグナル領域の下流に位置するマウスＩｇκゲノムＤＮＡ（約７．７Ｋｂ）、ジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）遺伝子カセット（約１．０Ｋｂ）、ｐＵＣ１８  ＤＮＡ（約２．７Ｋｂ）で構成される。上記ノックインベクターについて、前記実施例２以降の操作を同様に行うことにより、ノックインＥＳ細胞を作製する。ノックインＥＳ細胞では、マウスＩｇκのＣκ構造遺伝子の終止コドン直下の位置にＳＶ４０ポリＡシグナル領域が配置され、さらにその直下の位置にマウスＩｇκプロモーター１（または２）および所望の構造遺伝子が配置され、さらにその直下の位置にマウスＣκポリＡシグナル領域が配置される。マウスＩｇκプロモーター直下の位置に構造遺伝子が配置されることから、ＩＲＥＳを用いたベクターｐＫＩκの場合と同等ないしそれ以上の、所望の遺伝子の高発現が予想される（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．４，２０００，３７６−３８２．）。以上により得られるノックインベクターを前記実施例１のｐＫＩκの代わりに使用して前記実施例２以降の操作を同様に行うことにより、ノックインＥＳ細胞を作製した。
〔実施例１５〕ＩＩ型ノックインベクターｐＫＩ−ＩＩ−１およびｐＫＩ−ＩＩ−２の作製
（１）クローニング部位近傍断片の作製
マウス免疫グロブリンカッパ鎖（Ｉｇκ）遺伝子の終止コドン部分とＣκポリアデニレーションシグナル（ＰｏｌｙＡシグナル）の間にＣκＰｏｌｙＡシグナル、Ｃκプロモーター領域１ないし２および目的遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を導入し、ＣκｐｏｌｙＡシグナル下流にピューロマイシン耐性遺伝子を導入したゲノム断片を作製した。以下にその方法を具体的に示す。
（１．１）クローニング部位上流の断片６の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したＣκｐｏｌｙＡシグナル領域配列より以下のＤＮＡを合成した。
2003041495.tif 000013
５’側プライマーであるＣκｐｏｌｙＴ５の末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を、３’側プライマーであるＣκｐｏｌｙＴ３の末端にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加した。Ｔａｋａｒａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてマウスゲノムＤＮＡを１０ｎｇ添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒および６８℃３０秒を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿した。その後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収して増幅断片６とした。
（１．２）ＤＮＡ断片６，２，４，５ないし６，３，４，５を含むＤＮＡ断片ＩＩＩないしＩＶの調製
上記各ＤＮＡ断片の５’および３’側に付加した認識配列をおのおの切断する制限酵素で処理した後、フェノール／クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿したサンプルをＴＥに溶解した。ＤＮＡ断片６，２，４，５ないし６，３，４，５を制限酵素処理した断片をＬｉｇａｔｉｏｎ反応でそれぞれ結合した後、エタノール沈殿で回収し、ＤＮＡ断片ＩＩＩないしＩＶを調製した。
（２）ＩＩノックインベクターｐＫＩ−ＩＩ−１およびｐＫＩ−ＩＩ−２の作製
（２．１）ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＩＩないしｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＶの作製
ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳにＤＮＡ断片ＩＩＩを挿入してｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＩＩを調製し、ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳにＤＮＡ断片ＩＶを挿入してｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＶを調製した。
（２．２）ＩＩ型ノックインベクターｐＫＩ−ＩＩ−１およびｐＫＩＩ−Ｉ−２の作製
ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＩＩおよびｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＩＶを制限酵素ＸｈｏＩで処理し、マルチクローニング部位を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離回収した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＣκＳａｌをＳａｌＩで消化した後大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入し、これを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認してプラスミドｐＫＩ−ＩＩ−１およびｐＫＩ−ＩＩ−２を取得した。ｐＫＩ−ＩＩ−１およびｐＫＩ−ＩＩ−２の構造を図５および図６に示す。ベクター構造の概略は以下のとおりである。
すなわち、５’側から、Ｊ断片下流に存在するエンハンサー配列およびＩｇκ軽鎖Ｃ領域を含むマウスＩｇκゲノムＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ、約５．３Ｋｂ）、マウスＣκポリＡを含む領域（約０．４Ｋｂ）、マウスＩｇκプロモーター１（ｐＫＩ−ＩＩ−１の場合。ｐＫＩ−ＩＩ−２ではマウスＩｇκプロモーター２）を含む領域（約０．２Ｋｂ）、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む領域（約０．０２Ｋｂ）、マウスＣκポリＡを含む領域（約０．４Ｋｂ）、ピューロマイシン耐性遺伝子カセット（約１．８Ｋｂ）、マウスＣκポリＡの下流であるマウスＩｇκゲノムＤＮＡ（約７．７Ｋｂ）、ジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）遺伝子カセット（約１．０Ｋｂ）、ｐＵＣ１８  ＤＮＡ（約２．７Ｋｂ）で構成される。上記ノックインベクターについて、前記実施例２以降の操作を同様に行うことにより、ノックインＥＳ細胞を作製する。ノックインＥＳ細胞では、マウスＩｇκのＣκ構造遺伝子の終止コドン直下の位置にマウスＣκポリＡシグナル領域が配置され、さらにその直下の位置にマウスＩｇκプロモーター１（または２）および所望の構造遺伝子が配置され、さらにその直下の位置にマウスＣκポリＡシグナル領域が配置される。マウスＩｇκプロモーター直下の位置に構造遺伝子が配置されることから、ＩＲＥＳを用いたベクターｐＫＩκの場合と同等ないしそれ以上の、所望の遺伝子の高発現が予想される（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．４，２０００，３７６−３８２．）。以上により得られるノックインベクターを前記実施例１のｐＫＩκの代わりに使用して前記実施例２以降の操作を同様に行うことにより、ノックインＥＳ細胞を作製した。
〔実施例１６〕ミオグロビン遺伝子の制御配列を利用した外来遺伝子の筋肉組織における高発現
ミオグロビンは筋肉中に多量に存在する酸素結合性のヘムタンパク質であり、その発現は骨格筋や心臓などの筋肉組織に限定されている（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３−４３，１９９７）。前述したように、ミオグロビン遺伝子制御配列の制御下に発現させるべく配置された外来遺伝子を含むマウスＥＳ細胞を、筋肉組織形成能を欠損するマウス系統由来（例えばミオゲニン遺伝子欠損ホモ接合体、Ｎａｂｅｓｈｉｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５３２−５，１９９３）の胚に注入することにより、キメラ個体およびその子孫において当該外来遺伝子を高レベルで発現させることができる。
例えばコザック配列を開始コドンの直前に配置した目的遺伝子断片は、相同組換えによりミオグロビン遺伝子の開始コドンを含むエクソンに挿入することができる。この場合、当該遺伝子が挿入されたアレルのミオグロビン遺伝子は正常に発現しないが、ミオグロビン遺伝子ノックアウトマウスは正常である（Ｇａｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３９：５９０５−８，１９９８）ので、同遺伝子の一方のアレルが発現しないことは、キメラマウス個体の表現型に影響を及ぼさないと考えられる。また、ミオグロビン遺伝子の終止コドンの下流３’非翻訳配列内に、前記実施例１と同様にしてＩＲＥＳ＋コザック配列＋目的遺伝子を挿入することができる。この場合、目的遺伝子が挿入されたアレルのミオグロビン遺伝子もまた発現することができる。
上記のごとく改変されたＥＳ細胞を、ミオゲニン遺伝子が破壊されたマウス系統（Ｎａｂｅｓｈｉｍａら、前記）のヘテロ接合体同士の交配により得られる８細胞期胚に注入することによりキメラマウスを作製することができる。胚は、２５％の確率でホモ接合体（すなわち、筋肉組織形成能を欠損する）であるので、誕生したキメラマウスの２５％において、筋肉組織は主としてノックインＥＳ細胞に由来する。また、当該個体においてはノックインＥＳ細胞より分化した筋肉細胞において、ミオグロビン遺伝子制御配列のコントロールのもと外来遺伝子が高発現する。
〔実施例１７〕マウスＦＧＦ２３ノックアウトベクター作製
（１）マウスＦＧＦ２３ゲノム領域断片の取得
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＦＧＦ２３（繊維芽細胞増殖因子２３）遺伝子配列より以下のＤＮＡ（プライマー）を合成した。
2003041495.tif 000014
Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中に上記プライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてマウスＴＴ２Ｆ細胞由来のゲノムＤＮＡ２５ｎｇを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃３０秒、６０℃３０秒、および７２℃２０秒を１サイクルとして３５サイクル増幅した。得られた反応液から２％アガロースゲル電気泳動で１７３ｍｅｒのＰＣＲ増幅断片を回収した。切り出されたゲルよりＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収し、ＦＧＦ２３ゲノム領域を含むＢＡＣクローン選択に用いるプローブＦＧＦ２３Ｐを取得した。
（２）マウスＦＧＦ２３ゲノム領域を含むＢＡＣクローンの選択
高密度フィルター：ＢＡＣマウスＣ５７／ＢＬ６（日本国倉敷紡績）を用い、取得したＦＧＦ２３ＰをプローブとしてＦＧＦ２３ゲノム領域を含むＢＡＣクローンをスクリーニングした。その結果３個のヒットクローンを得た。３種のクローンそれぞれのクローンＩＤ／アドレスは１７ｄ５、２３５Ｉ６、および２１１Ｋ１５であった。これらヒットクローン番号の情報からＢＡＣクローンを入手した。
入手したＢＡＣクローンが目的とするＦＧＦ２３ゲノム領域を含むかどうかの確認を行なった。簡単に説明すると、Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマーＰ５１およびＰ３１各１０ｐｍｏｌならびに鋳型としてＢＡＣクローンＤＮＡ１００ｎｇを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃３０秒、６０℃３０秒、および７２℃２０秒を１サイクルとして３０サイクル増幅した。得られた反応液を２％アガロースゲル電気泳動にて解析したところ１７３ｍｅｒのバンドがクローン番号２３５Ｉ６および２１１Ｋ１５を鋳型とした場合検出された。この結果から、クローン番号２３５Ｉ６および２１１Ｋ１５のＢＡＣクローンは目的とするＦＧＦ２３ゲノム領域を含んでいることが確認された。
（３）ＢＡＣクローンのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）へのサブクローニング
クローン番号２１１Ｋ１５のＢＡＣクローン由来のＤＮＡ２．５μｇにＳａｕ３ＡＩ（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）０．０５Ｕを加え、３７℃にて２０分インキュベートし、０．８％ゲルで分離後、分子量約１５〜７Ｋｂ部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＤＮＡ断片を回収した。
ＢａｍＨＩで消化した後大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（日本国東洋紡）に、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＳＴＢＬ２  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（日本国ライフテックオリエンタル株式会社）に導入した。プラスミドにＤＮＡ断片が導入されたクローンを、ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌ添加プレートを用い選択し、白色コロニー１００個を回収した。
（４）ＦＧＦ２３ゲノム領域を含むクローンの選択
Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマーＰ５１およびＰ３１各１０ｐｍｏｌならびに鋳型としてプラスミドＤＮＡ２５ｎｇを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃３０秒、６０℃３０秒、および７２℃２０秒を１サイクルとして３５サイクル増幅した。２％アガロースゲル電気泳動を用い１７３ｍｅｒの増幅断片が検出されるクローンを選択し、クローン番号３３および９４を取得した。
（５）ＦＧＦ２３エクソン１領域の５’上流約５Ｋｂの領域および３’下流約２Ｋｂの領域を含むクローンの選択
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＦＧＦ２３遺伝子配列よりＫＯ５３およびＫＯ３５を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）の遺伝子配列よりＫＯ５５およびＫＯ３３を合成した。
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ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中に、目的とする５’領域を選択する場合はプライマーＫＯ５５およびＫＯ５３各１０ｐｍｏｌ、または目的とする３’領域を選択する場合はプライマーＫＯ３５およびＫＯ３３各１０ｐｍｏｌと、鋳型としてクローン番号３３ないし９４由来のプラスミドＤＮＡ２５ｎｇを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃１５秒、６５℃２０秒、および６８℃１０分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた増幅断片のサイズを０．８％アガロースゲルで解析した。クローン番号３３由来のＤＮＡを鋳型として用いた場合、５’領域を選択するプライマーセットで約５ＫｂのＰＣＲ増幅断片を、３’領域を選択するプライマーセットで約２ＫｂのＰＣＲ増幅断片を検出した。この結果から、クローン番号３３のクローンに目的とするゲノム領域断片がサブクローニングされていることが判明した。
（６）制限酵素サイトを５’ゲノム相同領域の両端に持つＰＣＲ増幅断片５’ＫＯの作製
クローン番号３３由来のＤＮＡを用いて、サブクローニングされたＦＧＦ２３エクソン１の５’上流領域の両端それぞれ７００ｂｐ程度の塩基配列を決定した。得られた情報を基にＦＧＦ２３エクソン１の５’上流約５Ｋｂを増幅し、かつその増幅断片の５’側にＮｏｔＩサイト、３’側にＦｓｅＩサイトを付加するＰＣＲプライマーセットＮｏｔＩ５５およびＦｓｅＩ５３を設計した。
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ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてクローン番号３３のプラスミドＤＮＡ２５ｎｇを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃１５秒および６８℃１０分を１サイクルとして２５サイクル増幅し、得られた約５Ｋｂの増幅断片を０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
（７）制限酵素サイトを３’ゲノム相同領域の両端に持つＰＣＲ増幅断片３’ＫＯの作製
クローン番号３３由来のＤＮＡを用いて、サブクローニングされたＦＧＦ２３エクソン１の３’下流領域の両端それぞれ７００ｂｐ程度の塩基配列を決定した。得られた情報を基にＦＧＦ２３エクソン１の３’下流約１．８Ｋｂを増幅し、かつその増幅断片の５’側にＡｓｃＩサイト、３’側にＸｈｏＩサイトを付加するＰＣＲプライマーセットＡｓｃＩ５５およびＸｈｏＩ５３を設計した。
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ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調整し、５０μＬ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてクローン番号３３のプラスミドＤＮＡ２５ｎｇを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃１５秒および６８℃１０分を１サイクルとして２５サイクル増幅し、得られた約１．８Ｋｂの増幅断片を０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
（８）カセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａの作製
ベクターに新たな制限酵素サイトを付加するため以下のＤＮＡを合成した。
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ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（日本国東洋紡）を制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで処理した反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトＮｒｕＩ、ＳｇｒＡＩおよびＡｓｃＩを付加するため、ＬｉｎｋＡ１およびＬｉｎｋＡ２を合成した。この２つのオリゴＤＮＡからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡを取得した。
続いて、ＰＢｌｕｅＬＡを制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで処理した反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトＰａｃＩ、ＦｓｅＩおよびＳａｌＩを付加するため、ＬｉｎｋＢ１およびＬｉｎｋＢ２を合成した。この２つのオリゴＤＮＡからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢを取得した。
ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（前掲）に記載されたｐＬｏｘＰ−ＳＴｎｅｏプラスミドをＸｈｏＩ消化し、両端にＬｏｘＰ配列を持つＮｅｏ耐性遺伝子（ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ）を取得した。ＬｏｘＰ−Ｎｅｏの両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを取得した。
上記ｐＢｌｕｅＬＡＢをＥｃｏＲＶ消化後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏを取得した。
ｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（日本国ライフテックオリエンタル株式会社）をＸｈｏＩおよびＳａｌＩ消化後、０．８％アガロースゲルにアプライし、約１Ｋｂのバンドを分離回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＤＴ−Ａフラグメントを回収した。
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−ＮｅｏをＸｈｏＩ消化後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、ＤＴ−Ａフラグメントを挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、ノックアウトベクター作製に用いられるカセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａを取得した。
（９）ＦＧＦ２３ノックアウトベクターの取得
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−ＡをＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化後、得られる約７．３ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルより分離精製した後に大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、（７）で作製したゲノム断片３’ＫＯを挿入した後、大腸菌ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＳＴＢＬ２  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（日本国ライフテックオリエンタル株式会社）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、挿入したＰＣＲ増幅断片部分の塩基配列とクローン番号３３を用いて得られた塩基配列情報とを比較し、ＰＣＲ増幅による増幅エラーが含まれていないこと、および、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯを取得した。
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯをＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化後、得られる約９．１ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルより分離精製した後に大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、（６）で作製したゲノム断片５’ＫＯを挿入し、それを大腸菌ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＳＴＢＬ４  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（日本国ライフテックオリエンタル株式会社）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、挿入したＰＣＲ増幅断片部分の塩基配列とクローン番号３３を用いて得られた塩基配列情報約３Ｋｂの領域とを比較し、その範囲においてＰＣＲ増幅による増幅エラーが含まれていないこと、および、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯを取得した。マウスＦＧＦ２３ノックアウトベクター：ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯの構造を図７に示す。
（１０）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ＦＧＦ２３ノックアウトベクターの調製
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ１５０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩないしはＸｈｏＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩないしはＸｈｏＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ＦＧＦ２３ノックアウトベクターＦＧＦ−ＫＯ−ＮｏｔＩおよびＦＧＦ−ＫＯ−ＸｈｏＩの調製を行なった。ＦＧＦ−ＫＯ−ＮｏｔＩおよびＦＧＦ−ＫＯ−ＸｈｏＩはそれぞれ図７においてＮｏｔ−ＩおよびＸｈｏＩで示す末端を有することとなる。
（１１）ゲノムサザン解析用プローブの調製
クローン番号３３由来ＤＮＡを用いた塩基配列情報を基に、３’ＫＯの直下領域５２５ｍｅｒを含むオリゴＤＮＡを取得するため以下のＤＮＡを合成した。
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Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ（日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてクローン番号２１１Ｋ１５のＢＡＣ由来ＤＮＡ２５ｎｇを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃３０秒、６０℃３０秒、および７２℃１分を１サイクルとして３３サイクル増幅し、得られた５４４ｍｅｒの増幅断片を０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって３’側ゲノムサザン用プローブ、３’ＫＯ−ｐｒｏｂを回収した。
〔実施例１８〕ＦＧＦ２３ノックアウトＥＳ細胞株の取得
相同組換えにより、マウスＦＧＦ２３ノックアウトＥＳ細胞株取得のため、実施例１７において作製したｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯを制限酵素ＮｏｔＩないしはＸｈｏＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従ってマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）へ導入した。
ＴＴ２Ｆの培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁した。その後、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのＧピューロマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（日本国宝酒造）で消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ノックアウトベクター３’相同領域の直下流領域に位置するＤＮＡ断片（３’ＫＯ−ｐｒｏｂ、実施例１７の（１）参照）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＨｉｎｄＩＩＩ消化により、２本のバンド（約６Ｋｂおよび約４．５Ｋｂ）が検出された。相同組換え体においては約６Ｋｂバンドが消失して代わりに約２．５Ｋｂの新たなバンドが出ることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約２．５Ｋｂの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルのＦＧＦ２３遺伝子開始コドン領域（開始メチオニンに対応するＡＴＧのＡの位置を＋１とし、その１塩基上流を−１とした場合−１４２から＋５９の範囲）にネオマイシン耐性遺伝子（両端にはノックアウトベクター由来の制限酵素サイト部位を含む）が挿入されたものである。サザン解析の結果、ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯを制限酵素ＮｏｔＩで線状化した場合には９０株中１６株（１８％）が相同組換え体であるという結果を、またｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯを制限酵素ＸｈｏＩで線状化した場合には２８株中１株（３．６％）が相同組換え体であるという結果を得た。これらの結果はターゲッティングベクターを線状化する場合、ネガティブセレクションマーカー遺伝子ＤＴ−Ａがベクター構造の末端に位置していない場合のほうが、末端に位置する場合に比べ相同組換えに有利であることを示している（図７も参照されたい）。上記と同様のベクター構造をもち、それぞれ異なる遺伝子に対するノックアウトベクタ��６種を用いた場合においても、平均２２．３％という通常報告されている相同組換え効率（数％程度）よりも高い相同組換え効率が得られた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明により、従来法と比較して効率よく確実に所望の蛋白質を高発現するキメラ非ヒト動物（たとえばキメラマウス）を得ることができる。本発明では、導入した所望の蛋白質をコードする遺伝子が発現される細胞および／または組織が欠損した胚を宿主胚として使用するため、作製されるキメラ非ヒト動物における該細胞および／または組織は全て、導入した核酸配列（構造遺伝子）を含む分化多能性を有する細胞に由来するものであり、その結果、高効率で所望蛋白質を発現させることができる。本発明では、好ましくは免疫グロブリン軽鎖、特に好ましくはκ鎖、の発現系を利用するものであるが、このＩｇκ遺伝座における相同組換え率は５％以上であり、従来法と比べて高い効率である。これによって、本発明は、所望の蛋白質をコードする遺伝子の高発現による該蛋白質の生産、あるいは、機能未知の遺伝子または蛋白質の生体内機能解析のために使用することができる。
配列フリーテキスト
配列番号１〜６：合成オリゴヌクレオチド
配列番号７および８：ＳａｌＩ認識配列
配列番号９〜２０：合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１および２２：マルチクローニング部位
配列番号２３〜２６：合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２〜４０：合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ノックイン基本ベクターｐＫＩκの構造を示す。Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子、ＩＲＥＳ：インターナルリボゾーマルエントリーサイト、ＳａｌＩ：クローニング部位、Ｃκ  ｐｏｌｙＡ：マウスＩｇκ  ｐｏｌｙＡシグナル、Ｐｕｒｏｒ：ピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびＰＵＣ１８：クローニングベクター。
図２は、プラスミドｐΔＣκＮｅｏの構造を示す。ｐＳＴｎｅｏＢ：ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＵＣ１８：クローニングベクター。
図３は、ノックインベクターｐＫＩ−Ｉ−１の構造を示す。Ｐｒｏｍｏｔｅｒ１：マウスＩｇκプロモーター領域遺伝子１、ＭＣＳ：マルチクローニング部位、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ：ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡシグナル、Ｃκ  ｐｏｌｙＡ：マウスＩｇκ  ｐｏｌｙＡシグナル、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＵＣ１８：クローニングベクター。
図４は、ノックインベクターｐＫＩ−Ｉ−２の構造を示す。Ｐｒｏｍｏｔｅｒ２：マウスＩｇκプロモーター領域遺伝子２、ＭＣＳ：マルチクローニング部位、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ：ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡシグナル、Ｃκ  ｐｏｌｙＡ：マウスＩｇκ  ｐｏｌｙＡシグナル、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＵＣ１８：クローニングベクター。
図５は、ノックインベクターｐＫＩ−ＩＩ−１の構造を示す。Ｐｒｏｍｏｔｅｒ１：マウスＩｇκプロモーター領域遺伝子１、ＭＣＳ：マルチクローニング部位、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子、Ｃκ  ｐｏｌｙＡ：マウスＩｇκ  ｐｏｌｙＡシグナル、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＵＣ１８：クローニングベクター。
図６は、ノックインベクターｐＫＩ−ＩＩ−２の構造を示す。Ｐｒｏｍｏｔｅｒ２：マウスＩｇκプロモーター領域遺伝子２、ＭＣＳ：マルチクローニング部位、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子、Ｃκ  ｐｏｌｙＡ：マウスＩｇκ  ｐｏｌｙＡシグナル、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＵＣ１８：クローニングベクター。
図７は、マウスＦＧＦ２３ノックアウト用ベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯの構造を示す。５’ＫＯ：ＦＧＦ２３ノックアウトベクター５’相同領域、Ｎｅｏｒ：ネオマイシン耐性遺伝子、ＥＸ１：ＦＧＦ２３エクソン１部分領域（＋６０〜＋２１１）、３’ＫＯ：ＦＧＦ２３ノックアウトベクター３’相同領域、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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