(57)【要約】本発明は、植物胚芽を細分化する工程を衝撃又は切断により行う、及び／又は抽出溶媒の存在下に行う、植物胚芽抽出液の製造方法、及び当該方法によって得られる無細胞タンパク質の合成に不要な、あるいは悪影響を及ぼす不純物の少ない胚芽抽出液を提供し得る。本発明によれば安定で高い効率の無細胞タンパク質合成が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボヌクレアーゼ活性が低減された、植物胚芽抽出液。
【請求項２】
リボヌクレアーゼ活性がＲＮａｓｅＡ換算で１０ｐｇ／μｌ以下である、請求の範囲１記載の胚芽抽出液。
【請求項３】
抽出溶媒非存在下に植物胚芽を摩砕または圧砕して細分化する工程を含む方法により得られる胚芽抽出液と比較してリボヌクレアーゼ活性が８０％以下に低減された請求の範囲１または２記載の胚芽抽出液。
【請求項４】
２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であることを特徴とする植物胚芽抽出液。
【請求項５】
２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の総脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）含有量の合計量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である植物胚芽抽出液。
【請求項６】
２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であり、かつ総脂肪酸含有量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である植物胚芽抽出液。
【請求項７】
植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の胚芽抽出液。
【請求項８】
植物胚芽を衝撃又は切断により細分化する工程を含む、植物胚芽抽出液の製造方法。
【請求項９】
抽出溶媒の存在下に植物胚芽を細分化する工程を含む、植物胚芽抽出液の製造方法。
【請求項１０】
抽出溶媒が、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びチオール基の酸化防止剤からなる群より選択される１以上を含むものである請求の範囲９記載の製造方法。
【請求項１１】
細分化が衝撃又は切断により行われるものである、請求の範囲９記載の製造方法。
【請求項１２】
植物胚芽が、胚乳成分が実質的に夾雑しないものである請求の範囲８〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲８〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求の範囲８〜１３のいずれか１項に記載の製造方法により得られる植物胚芽抽出液。
【請求項１５】
請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を使用することを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。
【請求項１６】
請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
【請求項１７】
請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を含有する無細胞タンパク質合成用溶液であって、ｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
【請求項１８】
請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
【請求項１９】
請求の範囲１６または１７記載の無細胞タンパク質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、無細胞タンパク質合成用の胚芽抽出液及びその製造方法に関する。更に詳しくは合成効率の高い無細胞タンパク質合成用胚芽抽出液及びそれを工業的に効率よく製造するための方法等に関するものである。
背景技術
細胞内でおこなわれているタンパク質の合成反応は、まず遺伝情報をもつＤＮＡからその情報がｍＲＮＡに転写され、そしてリボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳して、タンパク質を合成するという工程で進行している。現在、この細胞内におけるタンパク質合成を試験管等の生体外で行う方法として、例えばリボソームを生物体から抽出し、これらを用いて試験管内でタンパク質合成反応を行わせしめる、無細胞タンパク質合成の研究が盛んに行われている（特開平６−９８７９０号公報、特開平６−２２５７８３号公報、特開平７−１９４号公報、特開平９−２９１号公報、特開平７−１４７９９２号公報）。この方法には、リボソームの原料として、大腸菌、植物胚芽、家兎網状赤血球等が用いられてきた。
植物胚芽からリボソームを含有する無細胞タンパク質合成用胚芽抽出液を得る方法としては、通常、植物種子を粉砕した後、種皮や胚乳画分を取り除いて粗胚芽画分を取得し、更に洗浄により胚乳成分を除去した後、粉砕、抽出、精製する方法が行われている。
従来の胚芽の微粉砕方法としては、リボソームやｔＲＮＡ等のタンパク質合成成分を含む水溶性成分の抽出の効率化を図るために、胚芽をできるだけ細かく粉砕することが必要だと考えられていた。しかしながら、胚芽は小さく強度も高いため容易に粉砕することができない。従って、従来は、洗浄後の胚芽を予め液体窒素等で凍結した後、乳鉢、スタンプミル、ボールミル等で摩砕又は圧砕することにより微粉砕する方法が広く用いられており、このように微粉砕された胚芽に抽出溶媒を加えて攪拌した後、遠心分離等により胚芽抽出物含有液（胚芽抽出液）を回収、精製したものを無細胞タンパク質合成反応のための“酵素原液”として利用していた。この“酵素原液”中には、タンパク質合成反応に関与しない不要な成分が多く含まれており、またタンパク質合成阻害作用を有するものが存在している可能性がある。
また、上記従来法によって得られた抽出液にはタンパク質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれていないことから、別途調製したｔＲＮＡを追加することが必須要件であった。さらに、上記従来法では短時間に大量の抽出液を得ることが困難であった。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するために、無細胞タンパク質合成系に使用する胚芽抽出液のタンパク質の合成効率を上げるとともに、その抽出液を工業的に実施可能な程度に効率的に製造し、植物胚芽から効率的にタンパク質合成に必要な因子を抽出する方法について検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）リボヌクレアーゼ活性が低減された、植物胚芽抽出液。
（２）リボヌクレアーゼ活性がＲＮａｓｅＡ換算で１０ｐｇ／μｌ以下である、上記（１）記載の胚芽抽出液。
（３）抽出溶媒非存在下に植物胚芽を摩砕または圧砕して細分化する工程を含む方法（以下、単に従来法ともいう）により得られる胚芽抽出液と比較してリボヌクレアーゼ活性が８０％以下に低減された上記（１）または（２）記載の胚芽抽出液。
（４）２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であることを特徴とする植物胚芽抽出液。
（５）２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の総脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）含有量の合計量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である植物胚芽抽出液。
（６）２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であり、かつ総脂肪酸含有量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である植物胚芽抽出液。
（７）植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の胚芽抽出液。
（８）植物胚芽を衝撃又は切断により細分化する工程を含む、植物胚芽抽出液の製造方法。
（９）抽出溶媒の存在下に植物胚芽を細分化する工程を含む、植物胚芽抽出液の製造方法。
（１０）抽出溶媒が、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びチオール基の酸化防止剤からなる群より選択される１以上を含むものである上記（９）記載の製造方法。
（１１）細分化が衝撃又は切断により行われるものである、上記（９）記載の製造方法。
（１２）植物胚芽が、胚乳成分が実質的に夾雑しないものである上記（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１３）植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である上記（８）〜（１２）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１４）上記（８）〜（１３）のいずれか１項に記載の製造方法により得られる植物胚芽抽出液。
（１５）上記（１）〜（７）および（１４）のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を使用することを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。
（１６）上記（１）〜（７）および（１４）のいずれか１項に記載の胚芽抽出液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
（１７）少なくとも、上記（１）〜（７）および（１４）のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を含有する無細胞タンパク質合成用溶液であって、ｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
（１８）少なくとも、上記（１）〜（７）および（１４）のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
（１９）少なくとも、上記（１６）または（１７）記載の無細胞タンパク質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明で用いられる植物胚芽は、植物種子より取得できる。用い得る植物種子としては、通常、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物から選択される植物の種子が挙げられる。これらの中でも、本発明に好適な植物種子として、上記コムギ、オオムギ、イネまたはコーンが挙げられ、特に好適なものとしてコムギが挙げられる。
植物種子に含まれる胚芽の量は少ないため、胚芽を効率的に取得するためには胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、植物種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。植物種子に加える力は、植物種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。
通常は、公知の粉砕装置を用いて、植物種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
植物種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよいが、例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られた植物種子粉砕物から、自体公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から、例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常、胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。
洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄するのがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、例えば０．５％の濃度で使用することができる。
水又は水溶液による洗浄処理および界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
上記のように植物種子を粉砕して得られた粉砕物から植物胚芽を選別した後、洗浄して得られた無傷（発芽能を有する）の胚芽を抽出溶媒の存在下または非存在下に細分化して、後者の場合、さらに該細分化された植物胚芽を抽出溶媒で抽出することによって胚芽抽出物を得、胚芽抽出物含有液（以下単に胚芽抽出液）を分離・精製する。
本発明において細分化は、摩砕、圧砕等の胚芽の粉砕方法として従来公知の方法を用いて行うこともできるが、衝撃または切断により胚芽を細分化することがより好ましい。特に、抽出溶媒の非存在下に胚芽を細分化するに際しては、衝撃または切断によることが望ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕又は圧砕と比べて最小限に止めうる条件で植物胚芽を破壊することを意味する。
衝撃または切断により胚芽を細分化する際に用いることのできる装置や方法としては、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いることが好ましい。刃状物の回転数は、通常１０００ｒｐｍ以上、好ましくは５０００ｒｐｍ以上であり、また、通常３００００ｒｐｍ以下、好ましくは２５０００ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常１０分以下、好ましくは５分以下である。細分化する際の温度は、胚芽のタンパク質合成能力が失われない温度であれば特に限定されないが、好ましくは１０℃以下で細分化の操作が可能な温度範囲、特に好ましくは４℃程度が適当である。
一方、摩砕、圧砕により胚芽を細分化する場合には、乳鉢と乳棒、スタンプミル、ボールミル等の公知の装置を用いて、抽出溶媒の存在下で胚芽を磨り潰し又は圧し潰すことにより行うことができる。この場合の溶媒としては上記したものと同様のものが好ましい。
特に好適な細分化法としては、上述のように衝撃または切断による細分化が挙げられるが、かかる手法を用いることにより、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁を全て破壊してしまうのではなく、少なくともその一部を破壊することなく残すことが可能になる。即ち、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることがないため、それらに含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の混入が少なく、細胞質に局在するタンパク質合成に必要なＲＮＡやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から抽出することができる。
胚芽の細分化は抽出溶媒の存在下あるいは非存在下で行うことができる。
胚芽の細分化を抽出溶媒の存在下で行う場合には、具体的には以下のような手順で行なわれる。
胚芽を細分化（好ましくは、衝撃または切断により）する際に抽出溶媒を存在させることにより、植物胚芽を細分化する工程と細分化された植物胚芽を抽出溶媒で抽出する工程とを同時に行う。この場合、胚芽と抽出に必要な量の抽出溶媒とを混合し、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽１ｇに対して、通常０．１ミリリットル以上、好ましくは０．５ミリリットル以上、より好ましくは１ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽１ｇに対して、１０ミリリットル以下、好ましくは５ミリリットル以下である。混合物を遠心分離等により分離し、得られる上清を胚芽抽出液として回収する。さらにゲルろ過等の精製工程に付してもよい。
細分化と溶媒抽出とを同時に一つの工程として行えば、効率的に胚芽抽出液を得ることができ、細分化後に抽出を行う場合に比べて、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁の破壊が抑えられた状態でも細胞質に局在するタンパク質合成に必要な因子を十分に抽出することができる。
また、胚芽の細分化を抽出溶媒の非存在下で行う場合には、具体的には以下のような手順で行われる。まず細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されないように、細分化した、好ましくは、衝撃又は切断により細分化した胚芽に抽出溶媒を加えて攪拌した後、混合物を遠心分離等により分離し、得られる上清を胚芽抽出液として回収する。さらにゲルろ過等の精製工程に付してもよい。使用する抽出溶媒の量やその上限は、上記した抽出溶媒の存在下で胚芽を細分化する場合と同様な値が設定される。
細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいし、凍結させていないものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのが好ましい。
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びチオール基の酸化防止剤のうちの少なくとも１つを含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用の胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
ゲルろ過としては、例えば予め溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む溶媒）で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度もそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用の胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
ゲルろ過後の胚芽抽出液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が排除可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子サイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＭｉｎｉｓａｒｔＴＭ等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、先ずポアサイズが大きめのフィルターを用い、次に混入する可能性のある微生物が排除可能なポアサイズのフィルターを用いて、ろ過するのが好ましい。
本発明においては、好ましくは抽出溶媒の存在下で胚芽の細分化を行い、特に好ましくは抽出溶媒の存在下で衝撃又は切断化による胚芽の細分化を行う。
このようにして得られた胚芽抽出液は、原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ、ホスファターゼ等の、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳因子タンパク質やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳が実質的に夾雑せず、純化されている。ここで、「胚乳が実質的に夾雑しない」とは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
また、当該胚芽抽出液中に混入し得る低分子量のタンパク質合成機能を抑制する物質を透析等により排除する工程を実施することにより、よりタンパク質合成能に優れた胚芽抽出液が得られる。かかる排除工程はＡＴＰやＧＴＰ、アミノ酸等の安定化成分の存在下で実施することが好ましい。
さらに本発明の胚芽抽出液、例えば上記した手順により得られる胚芽抽出液は、リボヌクレアーゼ活性が低減されていることを特徴とする。ここで「低減された」とは、従来公知の胚芽抽出液の調製方法によって得られた無細胞タンパク質合成用の植物胚芽抽出液と比較した場合にその活性がより低いことを意図し、具体的には植物胚芽の細分化を、抽出溶媒非存在下に摩砕又は圧砕して行う方法（即ち、従来法）により得られた胚芽抽出液と比較してリボヌクレアーゼ活性がＲＮａｓｅＡ換算で８５％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは７５％以下に抑えられた胚芽抽出液が該当する。例えば本発明のリボヌクレアーゼが低減された胚芽抽出液は、リボヌクレアーゼ活性がＲＮａｓｅＡ換算で１０ｐｇ／μｌ以下である。
リボヌクレアーゼ活性はそれ自体既知の方法で測定することができるが、具体的にはリボヌクレアーゼの基質としてｍＲＮＡ（当該ｍＲＮＡの種類は特に限定されず、本発明の胚芽抽出液と対照となる胚芽抽出液（従来の抽出法により得られる胚芽抽出液）とによる比較実験において同種のものを使用する限り適宜選択し得ることは当業者には明らかである）を用い、当該ｍＲＮＡを各胚芽抽出液で処理した際のＲＮＡ分解の程度を調べることによって本発明の胚芽抽出液に混入しているリボヌクレアーゼ活性を相対的に知ることができるし、また、その際、標準品として濃度既知のリボヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅＡによるＲＮＡ分解の程度と比較することによって本発明の胚芽抽出液に混入しているリボヌクレアーゼの量を知ることができる。本明細書において「ＲＮａｓｅＡ換算で」とは、その値が、標準品として用いる濃度既知のリボヌクレアーゼとしてＲＮａｓｅＡを用いた場合に得られたものであることを示している。具体的手法は後述する。
また、本発明の胚芽抽出液、例えば上記した手順により得られる胚芽抽出液は２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下、好ましくは２００μｇ／ミリリットル以下、より好ましくは１８０μｇ／ミリリットル以下である。本発明において、ＤＮＡの含有量は以下の方法により測定した値である。
ＤＮＡ含有量の測定方法
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（モレキュラープローブ社製）を用い、Ｃａｌｆ  Ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ファルマシアバイオテク社製）を標準試料として、マイクロプレート蛍光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ，モレキュラーデバイス社製）を用いて測定する。
まず、試料２００マイクロリットルにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１０ｍｇ／ミリリットル）を１０マイクロリットル加え、５５℃で一晩反応させる。反応液を等量のフェノールで抽出後、さらに等量のフェノール・クロロフォルム（１：１）で抽出して除蛋白し、１／１０量の３モル／リットル酢酸ナトリウムおよび２倍量のエタノールを加えてエタノール沈澱を行う。７０％エタノールで洗浄後、１ミリモル／リットル  エチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む１０ミリモル／リットル  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＥ）に溶解する。この溶液にＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ミリリットル）を５マイクロリットル加えて３７℃で一晩反応させ、上記と同様にフェノールおよびフェノール・クロロフォルムで抽出してＲＮＡを除去する。試料はエタノール沈澱・洗浄し、ＴＥ２００マイクロリットルに溶解する。ＴＥで２００倍に薄めたＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔとＴＥで適当な濃度に薄めた試料を１：１の比率で混ぜ、励起／蛍光波長４８５／５３０ｎｍで蛍光度測定して、標準曲線からＤＮＡ含有量を算出する。
また、本発明の胚芽抽出液は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の総脂肪酸含有量が０．０３ｇ／１００ｇ以下、好ましくは０．０２ｇ／１００ｇ以下、より好ましくは０．０１８ｇ／１００ｇ以下である。本発明において、総脂肪酸含有量は以下の方法（ガスクロマトグラフ法）により測定した値である。本発明において、総脂肪酸含有量とは、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸含有量の合計量である。
総脂肪酸含有量の測定法
試料５．０ｇに、ヘプタデカン酸２ｍｇ（内標準）、エタノール４ミリリットル、イオン交換水６．７ｍｌ及び１２モル／リットルの塩酸８．３ミリリットルを添加し、酸分解を行う。次いで、エタノール１６ミリリットルを添加し、ジエチルエーテル−石油エーテル混液（容量比１：１）１００ミリリットルを添加して抽出処理し、該混液６０ミリリットルによる抽出処理を２回行う。水洗、抽出溶媒留去の後、ＡＣＯＳ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅ  １ｂ−８９（１９９７）に準じて、けん化及びメチルエステル化を行った後、下記の操作条件でガスクロマトグラフによる測定を行う。
＜ガスクロマトグラフ操作条件＞
測定機種：島津製作所製  ＧＣ−１７Ａ
検出器  ：ＦＩＤ
カラム  ：Ｊ＆Ｗ製  ＤＢ−２３，φ０．２５ｍｍ×３０ｍｍ，ｄｆ．０．２５μｍ
カラム温度：７０℃（１分間保持）→１７０℃（１０℃／分昇温）→２１０℃（１．２℃／分昇温）
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２５０℃
ガス流量：ヘリウム  １．５ミリリットル／分
ガス圧力：水素  ６０ｋＰａ、空気  ５０ｋＰａ
導入系：スプリットレス
得られた測定値から下記式により、各脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）の含有量を計算し、これらから総脂肪酸含有量を算出する。
各脂肪酸含有量（ｇ／１００ｇ）＝（Ｅ×Ｆ×Ｈ／Ｄ×Ｇ）×０．１
（上記式中、Ｄはヘプタデカン酸のピーク面積、Ｅは各脂肪酸のピーク面積、Ｆはヘプタデカン酸添加量（ｍｇ）、Ｇは試料採取量、Ｈは感度補正係数（予め測定したヘプタデカン酸に対する各脂肪酸の感度）を表す。）
さらに、本発明の胚芽抽出液、例えば上記した手順により得られる胚芽抽出液は、それを用いて無細胞タンパク質合成を行う際、従来の抽出法により得られる胚芽抽出液を用いた場合に比べ、ＡＴＰ等のエネルギー源の消費を抑えることが可能である。このことは、本発明の胚芽抽出液のホスファターゼ活性が低減されている可能性を示唆するものである。
本発明はまた、本発明の胚芽抽出液を使用することを特徴とする無細胞タンパク質の合成方法を提供する。
当該無細胞タンパク質合成方法は、上記のようにして得られた胚芽抽出液を使用する点を除き、従来と同様の方法で行うことができる。この方法は、公知のバッチ法であってもよいし、Ｓｐｉｒｉｎら（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４）や横山らの（木川ら、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）の連続式無細胞系タンパク質合成システムのようなアミノ酸、エネルギー源の連続供給系であってもよい。バッチ法ではタンパク質合成を長時間行うと反応が停止することがあるため、後者のアミノ酸、エネルギー源の連続供給系を使用することにより、反応を長時間維持させることができ、更なる効率化が可能となる。また、連続供給系でタンパク質を合成する場合には、透析法を使用することもできる。例えば、本発明の胚芽抽出液を透析内液に、エネルギー源やアミノ酸を含む混合液を透析外液に用いた限外濾過膜透析系では、タンパク質を連続的に大量調製することが可能である。ここで、エネルギー源としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。
本発明の胚芽抽出液（抽出溶媒の存在下に胚芽の細分化を行うことを特徴とする方法によって得られる胚芽抽出液、あるいは抽出溶媒非存在下に胚芽を衝撃又は切断によって細分化し、その後抽出溶媒で抽出することを特徴とする方法によって得られる胚芽抽出液）においては、その調製の際に胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁等の必要以上の破壊が抑えられているので、例えばリボヌクレアーゼの混入が極めて低減化されている。このように、タンパク質合成に必要なｔＲＮＡがリボヌクレーゼによる分解を受けることが少ないので、本発明の胚芽抽出液にはタンパク質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが通常含まれているため、従来のように、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。このような胚芽抽出液は、少なくとも植物胚芽抽出物を含有する無細胞タンパク質合成用溶液として機能し、タンパク質合成に必須あるいは適当とされる成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等が存在すればｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有するものである。ここで、「ｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有する」無細胞タンパク質合成用溶液とは、後記実施例で示す通り、ｔＲＮＡを添加しなくとも従来の植物胚芽を予め液体窒素等で凍結し、乳鉢等で摩砕又は圧砕した後で溶媒抽出して調製した胚芽抽出液に十分量（タンパク質合成量がプラトーに達する量）のｔＲＮＡを添加したものと少なくとも同等のタンパク質合成活性を有する無細胞タンパク質合成用溶液、好ましくは、ｔＲＮＡ無添加の場合のタンパク質合成活性が、ｔＲＮＡを添加した際のタンパク質合成活性と同等あるいは同等以上である当該溶液を意味する。
さらに、上記したｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有するような本発明の胚芽抽出液と、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等のタンパク質合成に必須あるいは適当とされる成分とを含有する水溶液はレディーメイド型無細胞タンパク質合成溶液として、簡便に使用することができる。上記成分の含有量は特に限定されず、無細胞タンパク合成反応を行いうる濃度であればよい。このようなレディーメイド型無細胞タンパク質合成溶液は、タンパク質合成に際して従来のように反応溶液の調製を必要とせず、目的とする翻訳鋳型（ｍＲＮＡ）を添加するだけで、簡便に、効率的に、大量にタンパク質を合成することができる。該タンパク質合成用溶液は、溶媒として上記抽出溶媒を用い、それに必要に応じて上記成分を添加することにより調製できる。
本発明の無細胞タンパク質合成を行うためのキットは、少なくとも上記胚芽抽出液または無細胞タンパク質合成用溶液を含み、任意の要素として、無細胞タンパク質合成に必要な他の試薬類や反応容器、例えば希釈液（緩衝液）、透析液、エネルギー源、発現ベクター、陽性コントロール用発現ベクター、基質となるアミノ酸、透析チューブ等を含んでいてもよい。また、該試薬キットにはＲＮＡポリメラーゼ等の転写系に用いる試薬が含まれていてもよい。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、１はリットル、ｍｌはミリリットル、Ｍはモル／リットル、ｍＭはミリモル／リットル、μｇはマイクログラムをそれぞれ表す。
実施例１ ワーリングブレンダーによる微粉砕抽出（１）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製Ｒｏｔｏｒ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍｉｌｌ  ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ  １４型）に添加し、回転数７０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。この破砕処理を４回繰り返して行った。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液［四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１（容量比）］を用いた重液選別によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機ＢＬＭ−３００Ｋ（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別排除する手段を有する装置である。
色彩選別機のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／ｍ２となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのＣＣＤラインセンサー（２０４８画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を排除するために、ベージュ色のベルトを取り付け、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、濃緑色のベルトに取り替えて胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別した。
上記によって得られた小麦胚芽５０ｇを４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
次いで、以下の操作を４℃で行い、胚芽抽出液（小麦胚芽抽出物含有液）を得た。まず、洗浄した小麦胚芽を抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１００ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後再び５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒粉砕する作業を２回行った。得られた胚芽粉砕物の粒径分布をレーザー散乱方式粒度分布装置（堀場製作所製ＬＡ−９２０）を用いて測定した。その結果を図１に示す。
得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取する操作を５回繰り返し濁りのない上清を得た。これをあらかじめ溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間の遠心をかけ上清を採取し、これを小麦胚芽抽出物含有液とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が８０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）になるように抽出溶媒で調整した。
実施例２ 透析法による小麦胚芽無細胞タンパク質合成系の調製
実施例１で得られた小麦胚芽抽出物含有液を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるよう抽出溶媒で濃度調整し、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）の合成を“Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｊａｎｕａｒｙ  １８，２０００／ｖｏｌ．９７／ｎｏ．２／５５９−５６４”に記載の方法に準じて行った。ＧＦＰ活性は、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０  Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて、４９０ｎｍの励起波長で５１０ｎｍの蛍光強度から定量した。図３に示すように（図３中、ブレンダー法と表示）蛍光強度が２４時間後に約３５００００、４８時間後に４８００００と観察され、ＧＦＰが合成されていることが確認できた。
実施例３ 小麦胚芽抽出物含有液の分析（１）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用いて、実施例１と同様の方法で小麦胚芽抽出物含有液を調製した。試料を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるように抽出溶媒で濃度調整し、各試料のＤＮＡ及びＲＮＡの含有量を測定した。その結果を以下に示す。
2003064671.tif 000002
なお、ＤＮＡ及びＲＮＡの含有量の測定方法は以下の通りである。
ＤＮＡ含有量の測定方法
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（モレキュラープローブ社製）を用い、Ｃａｌｆ  Ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ファルマシアバイオテク社製）を標準試料として、マイクロプレート蛍光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ，モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。
まず、試料２００μｌにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加え、５５℃で一晩反応した。反応液を等量のフェノールで抽出後、さらに等量のフェノール・クロロフォルム（１：１）で抽出して除蛋白し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍量のエタノールを加えてエタノール沈澱を行った。７０％エタノールで洗浄後、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（ＴＥ）に溶解した。この溶液にＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ加えて３７℃で一晩反応させ、上記と同様にフェノールおよびフェノール・クロロフォルムで抽出してＲＮＡを除去した。試料はエタノール沈澱・洗浄し、ＴＥ２００μｌに溶解した。ＴＥで２００倍に薄めたＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔとＴＥで１００倍に薄めた試料を１：１の比率で混ぜ、励起／蛍光波長４８５／５３０ｎｍで蛍光度測定して、標準曲線からＤＮＡ含有量を算出した。  ＲＮＡ含有量の測定方法
蛍光試薬としてＢｉｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（モレキュラープローブ社製）を用い、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｓｔａｎｄａｒｄ（１６Ｓ  ａｎｄ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｉｌ）（モレキュラーブローブ社製）を標準ＲＮＡとして、マイクロプレート蛍光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ，モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。
まず、抽出液１００μｌにＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ，１Ｕ／μｌ）を３μｌ加え、３７℃で３０分反応させた。反応液に３００μｌの精製水を加え、４００μｌの水飽和フェノールで２回抽出後、さらに４００μｌのクロロフォルムで抽出してＤＮＡを除去した。そこに、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍量のエタノールを加えてエタノール沈澱を行い、１００μｌのＴＥに溶解した。さらにＴＥで１５００倍に薄めた試料１００μｌにＢｉｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔの２００倍稀釈液１００μｌを加え、励起／蛍光波長４８０／５２０ｎｍで蛍光度測定して、標準曲線からＲＮＡ含有量を算出した。
実施例４ 小麦胚芽抽出物含有液の分析（２）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用いて、実施例１と同様の方法で小麦胚芽抽出物含有液を調製した。試料を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるように抽出溶媒で濃度調整して、各試料の脂質（酸分解法）及び総脂肪酸（ガスクロマトグラフ法）の含有量を測定した。その結果を以下にに示す。
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なお、脂質及び脂肪酸の含有量の測定方法は以下の通りである。
脂質含有量の測定法（酸分解法）
容器中に試料（Ｓ）５．０ｇ及び濃塩酸１０ミリリットルを入れ、８０℃の湯浴で４０分間加熱して酸分解を行った。得られた分解物をエチルエーテルでマジョニア管に移し、ジエチルエーテル−石油エーテル混液（容量比１：１）で振とう抽出を行った。エーテル層が酸性を示さなくなるまでイオン交換水で洗浄した。エーテル層を回収して秤量容器（Ｗ１ｇ）に移し、エーテルを留去した後、さらに１０５℃で１時間乾燥処理して、秤量した（Ｗ２ｇ）。下記式により脂質含有量（ｇ／１００ｇ）を算出した。
脂質含有量（ｇ／１００ｇ）＝（Ｗ２−Ｗ１）÷Ｓ×１００
総脂肪酸含有量の測定法（ガスクロマトグラフ法）
試料５．０ｇに、ヘプタデカン酸２ｍｇ（内標準）、エタノール４ミリリットル、イオン交換水６．７ｍｌ及び１２モル／リットルの塩酸８．３ミリリットルを添加し、酸分解を行った。次いで、エタノール１６ミリリットルを添加し、ジエチルエーテル−石油エーテル混液（容量比１：１）１００ミリリットルを添加して抽出処理し、該混液６０ミリリットルによる抽出処理を２回行った。水洗、抽出溶媒留去の後、ＡＣＯＳ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅ  １ｂ−８９（１９９７）に準じて、けん化及びメチルエステル化を行った後、下記の操作条件でガスクロマトグラフによる測定を行った。
＜ガスクロマトグラフ操作条件＞
測定機種：島津製作所製  ＧＣ−１７Ａ
検出器  ：ＦＩＤ
カラム  ：Ｊ＆Ｗ製  ＤＢ−２３，φ０．２５ｍｍ×３０ｍｍ，ｄｆ．０．２５μｍ
カラム温度：７０℃（１分間保持）→１７０℃（１０℃／分昇温）→２１０℃（１．２℃／分昇温）
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２５０℃
ガス流量：ヘリウム  １．５ミリリットル／分
ガス圧力：水素  ６０ｋＰａ、空気  ５０ｋＰａ
導入系：スプリットレス
得られた測定値から下記式により、各脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）の含有量を計算し、これらから総脂肪酸含有量を算出した。
各脂肪酸含有量（ｇ／１００ｇ）＝（Ｅ×Ｆ×Ｈ／Ｄ×Ｇ）×０．１
（上記式中、Ｄはヘプタデカン酸のピーク面積、Ｅは各脂肪酸のピーク面積、Ｆはヘプタデカン酸添加量（ｍｇ）、Ｇは試料採取量、Ｈは感度補正係数（予め測定したヘプタデカン酸に対する各脂肪酸の感度）を表す。）
実施例５ 小麦胚芽抽出物含有液の分析（３）
岡山県産のシラサギ小麦（未消毒）を用いて、実施例１と同様の方法で小麦胚芽抽出物含有液を調製し、試料を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるように抽出用緩衝液で調整し、ＤＮＡ及びＲＮＡの含有量を実施例３と同様の方法で測定した。その結果を以下に示す。
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比較例１ 乳鉢による凍結微粉砕抽出（１）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を実施例１と同様の方法で、粉砕、選別して、粗胚芽画分を得、色彩選別機で胚芽の純度が９８％以上になるまで胚芽を選別した。更に、実施例１と同様の方法で胚芽を洗浄し、胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
次いで、以下の操作を４℃で行い、小麦胚芽抽出物含有液を得た。まず洗浄した小麦胚芽を液体窒素で凍結し乳鉢中で微粉砕した。得られた胚芽粉砕物の粒径分布を図２に示す。
抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１０ｍｌを乳鉢に加え混合した。得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに実施例１と同様の条件で、遠心分離して濁りのない上清を得、ゲルろ過後、遠心分離を行い、得られた上清を小麦胚芽抽出物含有液とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が１７０〜２５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）になるように抽出溶媒で濃度調整した。
比較例２ 透析法による小麦胚芽無細胞タンパク質合成系の調製
比較例１で得られた小麦胚芽抽出物含有液を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるように抽出溶媒で濃度調整し、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）の合成を“Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｊａｎｕａｒｙ  １８，２０００／ｖｏｌ．９７／ｎｏ．２／５５９−５６４”に記載の方法に準じて行った。ＧＦＰ活性は、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０  Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて、４９０ｎｍの励起波長で５１０ｎｍの蛍光強度から定量した。図３に示すように（図３中、乳鉢法と表示）蛍光強度が２４時間後に約２０００００、４８時間後に２６００００と観察され、ＧＦＰが合成されていることが確認できたが、実施例２に比べて低い値であった。
比較例３ 小麦胚芽抽出物含有液の分析（１’）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用いて、比較例１と同様の方法で小麦胚芽抽出物含有液を調製した。試料を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるように抽出溶媒で濃度調整して、各試料のＤＮＡ及びＲＮＡの含有量を実施例３と同様の方法で測定した。その結果を以下に示す。
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上記結果から明らかな通り、ＲＮＡ含有量は実施例３で得られた胚芽抽出物含有液の値とほぼ同様（試料ａ１と試料ｂ１との比較では約１．１倍）であり、ＤＮＡ含有量は約２倍であった。
比較例４ 小麦胚芽抽出物含有液の分析（２’）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用いて、比較例１と同様の方法で小麦胚芽抽出物含有液を調製した。試料を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０になるように抽出溶媒で濃度調整し、実施例４と同様に各試料の脂質（酸分解法）及び総脂肪酸（ガスクロマトグラフ法）含有量を測定した。その結果を以下に示す。
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上記結果から明らかな通り、脂質および総脂肪酸の含有量ともに、実施例４で得られた胚芽抽出物含有液の含有量の値よりも高く、総脂肪酸含有量については、試料ａ３と試料ｂ４との比較において２倍であった。
実施例６ ワーリングブレンダーによる微粉砕抽出（２）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用い、胚芽の抽出溶媒として塩化カルシウムを含有しない抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）を用いた以外は実施例１と同様の方法で、小麦胚芽抽出物含有液を得た。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が８０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）になるように抽出溶媒で調整した。
実施例７ バッチ式小麦胚芽無細胞タンパク質合成反応（１）
実施例６で得られた小麦胚芽抽出物含有液を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が１１０になるように抽出溶媒で濃度調整し、反応溶液の調製および反応方法は既報（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００，９７，５５９−５６４）に従って、これを一部改変して行った。すなわち、下記（＊１）に示した組成の反応溶液の調製を行った。
コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系専用発現ベクター（ｐＥＵ）に組み込んだジヒドロ葉酸脱水素酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子から転写して調製したＤＨＦＲ  ｍＲＮＡ（キャップ構造なし）をモデル翻訳鋳型（ＷＯ０１／２７２６０号公報）として、６０μｇ／ｍｌ添加し、２６℃で合成反応を行った。合成活性は２６℃、２時間の反応で５μｌ反応溶液中のタンパク質に取り込まれた［１４Ｃ］−ロイシンから測定した。
ここで、ｔＲＮＡの添加要否を確認するため、ｔＲＮＡの添加量を０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌの４ケースで合成を行った結果、ｔＲＮＡを添加しなくとも十分な合成活性が得られた（図４中、ブレンダー法と表示）。また、この結果から、抽出溶媒にカルシウムが存在しなくとも充分なタンパク質合成活性を有する胚芽抽出物含有液が得られることが明らかとなった。
（＊１）コムギ胚芽無細胞タンパク質合成溶液の組成
反応溶液は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が２００の抽出液では反応容量の２４％のコムギ胚芽抽出液（従って、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が１１０の場合では４３．５％）を含み、次の成分組成である。３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、０．２５ｍＭグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｅインヒビター）。
比較例５ 乳鉢による凍結微粉砕抽出（２）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用い、胚芽の抽出溶媒として塩化カルシウムを含有しない抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）を用いた以外は実施例１と同様の方法で、小麦胚芽抽出物含有液を得た。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が１７０〜２５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）になるように抽出溶媒で調整した。
比較例６ バッチ式小麦胚芽無細胞タンパク質合成反応
比較例５で得られた小麦胚芽抽出物含有液を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が２１０になるよう濃度調整し、実施例７と同様に、反応溶液を調製して、タンパク質合成を行い、タンパク質に取り込まれた［１４Ｃ］−ロイシンを測定した。なお、反応溶液は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が２００の抽出液では反応容量の２４％のコムギ胚芽抽出液（従って、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が２１０の場合では２２．８％）を含むものを用いた。
図４から明らかな通り、実施例７と同様にｔＲＮＡの添加量を０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌの４ケースで合成を行った結果、ｔＲＮＡを添加しない場合は十分な合成活性が得られなかった（図４中、乳鉢法と表示）。
実施例８ リボヌクレアーゼ活性の測定
（１）胚芽抽出液
リボヌクレアーゼ活性測定用のコムギ胚芽抽出液として、本発明の胚芽抽出液（実施例１）と、従来法により抽出することによって得られる抽出液（比較例１）を用いた。活性測定のため、従来の胚芽抽出液は、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．８）、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭ  ホスホクレアチン、２ｍＭ  ジチオスレイトール、０．３ｍＭ  スペルミジン、０．３ｍＭ  ２０種アミノ酸、２．５ｍＭ  酢酸マグネシウム、１００ｍＭ  酢酸カリウム、０．００５％  アジ化ナトリウム（以下、Ｄ．Ｂ．と称す）を含む、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎで交換したものを用いた。本発明の抽出液は、Ｄ．Ｂ．を含んでいる。ＯＤ２６０測定値に基づいて、両胚芽抽出液（本発明の胚芽抽出液および従来法で抽出して得られる胚芽抽出液）の濃度を揃えた。
（２）反応液の調製
リボヌクレアーゼの基質として、ｐＥＵ−ＤＨＦＲ（ＷＯ０１／２７２６０号公報参照）をセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、それを鋳型に転写し得られたｍＲＮＡを用いた。転写は、８０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１６ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ  スペルミジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３ｍＭ  ＮＴＰ、１Ｕ／μｌ  ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅインヒビター（ＲＮａｓｉｎ）、１０％  ＰＣＲ産物となるように反応系４００μｌを調製し、３７℃、３時間保温した。ｍＲＮＡをラジオアイソトープ３２Ｐで標識する場合は、ＵＴＰの濃度を１．２ｍＭにした反応系４００μｌ中に［α−３２Ｐ］ＵＴＰ  ８μｌを加えた。保温後、１０，０００ｇ、２分間遠心後の、上清に７．５Ｍ酢酸アンモニウム  ５３μｌ、エタノール１ｍｌを加え、２０，０００ｇ、１５分遠心を行った。沈殿を１ｍｌの７０％エタノールで洗ったあと、８０μｌのＤ．Ｂ．に溶かしたＲＮＡを用いた。以下にそれぞれの組成を示す。
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（３）ＲＮＡ分解のコントロール（ＲＮａｓｅＡの標準品による検定）
ＲＮＡ分解のコントロールとしてｍＲＮＡ（ラジオアイソトープ無し）２μｌ、ｍＲＮＡ（ラジオアイソトープ有り）１μｌにＲＮａｓｅＡをそれぞれ３０ｐｇ、３００ｐｇ、３ｎｇ、３０ｎｇ加えて、３０μｌの反応系になるようにＤ．Ｂ．で調製し、２６℃、３０分保温した。以下にそれぞれの組成を示す。
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本発明の胚芽抽出液と従来法による胚芽抽出液に含まれるリボヌクレアーゼの活性は、反応系にｍＲＮＡ（ラジオアイソトープ無し）２μｌ、ｍＲＮＡ（ラジオアイソトープ有り）１μｌと、終濃度を４０ＯＤ２６０／ｍｌとなるようにそれぞれ８μｌあるいは１２μｌを加えＤ．Ｂ．で３０μｌにする。各４本調製し２６℃保温した。
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保温１０分、３０分後に、液体窒素で凍らし反応を停止する。Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水  ２５５μｌ、１０％ＳＤＳ  １５μｌ、フェノール／ｍｉｌｌｉ  Ｑ水  ３００μｌを加え１０分間ボルテックスをかけ、２０，０００ｇで１０分間遠心した。水相３００μｌを新しいチューブに移し、フェノール／ｍｉｌｌｉ  Ｑ  ３００μｌを加え１０分間ボルテックスをかけ、２０，０００ｇで１０分間遠心した。水相３００μｌを新しいチューブに移し、クロロホルム３００μｌを加え１０分間ボルテックスをかけ、２０，０００ｇ、１分間遠心した。水相３００μｌを新しいチューブに移し、５Ｍ塩化ナトリウム３０μｌ、エタノール  ７５０μｌを加え、２０，０００ｇ、１５分遠心した。沈殿を１ｍｌの７０％エタノールで洗ったあと、５４μｌのｍｉｌｌｉ  Ｑ水に溶かし６μｌの１０×Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．２５％ブロモフェノールブルー、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６％グリセロール）を加え、５μｌのサンプルを１．２％アガロースで電気泳動を行った。オートラジオグラム（ＦＵＪＩＦＩＬＭ：ＢＡＳ−２５００）でＲＮＡの分解の有無を確認した。結果を図５に示す。Ｍはマーカーを表す。（Ａ）は、基質であるｍＲＮＡを、濃度を４段階に変えて調製したＲＮａｓｅＡ含有溶液で処理した場合のＲＮＡ分解の様子を示した図である。（Ｂ）は、基質であるｍＲＮＡを、本発明の胚芽抽出液あるいは従来法による抽出によって得られる胚芽抽出液で処理した場合のＲＮＡの分解を示す図である。
ＲＮａｓｅＡ処理においては、１００ｐｇ／ｍｌのＲＮＡａｓｅＡでｍＲＮＡはほぼ完全に分解された。本発明の胚芽抽出液と従来の胚芽抽出液のそれぞれのバンド強度は、ＲＮａｓｅＡ未処理のものを１００％としてＩｍａｇｅＧａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ：ＢＡＳ２５００）のＰＬＳから算出した。結果を図６に示す。本発明の抽出液あたりのリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅＡ換算で１０ｐｇ／μｌ以下であることが分かる。
本発明により、上記した優れた特性を有する胚芽抽出液が得られる理由は必ずしも明確ではないが、次の通りと考えられる。
植物胚芽中のタンパク質合成系（リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ酵素、翻訳因子等）は、発芽時の細胞核における転写に続いて細胞質へ移送されるｍＲＮＡの供給に呼応して始動する活発なタンパク質合成に備えて準備されているが、そのすべての因子は、翻訳反応の生じる細胞質内にのみ局在している。即ち、タンパク質合成に関与する因子は、細胞質以外の部分（胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁等）には存在していない。細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁等にはタンパク質合成に関与しない不要なＤＮＡや脂質が含まれているため、従来のように凍結した胚芽を、乳鉢、スタンプミル、ボールミル等によって摩砕又は圧砕することにより微粉砕し、その後で抽出溶媒で抽出するという方法によって得られた胚芽抽出物含有液にはこれらのタンパク質合成反応に関与しない不要な成分が多く含まれている。
タンパク質合成反応に関与しない成分には、タンパク質合成反応を阻害したり、合成産物の高次構造形成や、機能解析において妨害作用を示したりするものがある。例えば、ＤＮＡは酸性のポリマーであり、リボソームタンパク質等の塩基性タンパク質に結合して翻訳反応を阻害し得るし、さらにＤＮＡ結合タンパク質合成時においては、胚芽由来のＤＮＡ断片の中にこれに強く結合する塩基配列を有するものがあり得る。また、脂肪成分は一般的にタンパク質の精製過程の妨害物質であることが多く、通常、前処理操作で除去することが必要となっている。その他、低分子量物質の中にはタンパク質合成阻害作用を有するものも存在している可能性がある。
又、リボヌクレアーゼの混入は、鋳型ｍＲＮＡの分解を招き、ホスファターゼの混入はＡＴＰ等のエネルギー源の分解を招く。
本発明では細分化を抽出溶媒存在下に行うか、あるいは衝撃または切断により胚芽を細分化した後抽出溶媒を添加し抽出する、胚芽抽出液（無細胞タンパク質合成系に有用である）を提供する。細分化にあたり衝撃または切断という従来用いられてこなかった新しい手法を利用することにより、細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁等が必要以上に破壊されることなく、従って、従来法で問題となっていたタンパク質合成反応に関与しない不要な成分あるいは悪影響を及ぼす成分が抽出されるのを防ぐことができる。また、細分化を摩砕や圧砕といった従来法を利用して胚芽抽出液を調製する場合でも、当該細分化を抽出溶媒存在下で行うことにより、より迅速な抽出が可能となり、それに伴って細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁等が必要以上に破壊されることなく、従って、やはりタンパク質合成反応に関与しない不要な成分あるいは悪影響を及ぼす成分が抽出されるのを防ぐことができる。
産業上の利用可能性
本発明によれば、タンパク質合成に必要な因子を効率的に細胞質から抽出し、細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁等に含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の少ない胚芽抽出液を得ることができるため、安定で高い効率の無細胞タンパク質合成用胚芽抽出液および無細胞タンパク質合成用溶液を提供することができる。本発明のタンパク質合成用胚芽抽出液またはタンパク質合成用溶液を用いることにより、安定で高い効率の無細胞タンパク質合成が達成できる。また、短時間に高純度の胚芽抽出液を大量に製造することができるため、タンパク質の無細胞系での大量調製、たとえば、進化分子工学の分野での新しい酵素や抗体の大量調製に極めて有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００２−２３１３８、特願２００２−２３１３９及び特願２００２−２３１４０を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で得られた胚芽粉砕物の粒径分布を示す図である。
図２は、比較例１で得られた胚芽粉砕物の粒径分布を示す図である。
図３は、実施例２及び比較例２で合成したＧＦＰの蛍光強度を示す図である。
図４は、実施例７及び比較例６でのＤＨＦＲの合成結果を示す図である。縦軸はタンパク質に取り込まれた放射活性（［１４Ｃ］−ロイシン取り込み量：ｄｐｍ／５μｌ）を、横軸はｔＲＮＡの添加量を示す。
図５は、本発明の胚芽抽出液および従来法による抽出によって得られる胚芽抽出液のリボヌクレアーゼ活性を測定した結果を表す電気泳動像である。（Ａ）は、基質であるｍＲＮＡを、濃度を４段階に変えて調製したＲＮａｓｅＡ含有溶液で処理した場合のＲＮＡ分解の様子を示した図である。（Ｂ）基質であるｍＲＮＡを、本発明の胚芽抽出液および従来法による抽出によって得られる胚芽抽出液でそれぞれ処理した場合のＲＮＡの分解を示す図である。尚、Ｍはマーカーを表す。
図６は図５で得られた電気泳動像においてバンドの濃さを測定し、ＲＮａｓｅＡ未処理の場合を１００％（ＲＮＡは分解しない）として、残存するＲＮＡの量を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月21日(2003.11.21)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の胚芽抽出液。


【手続補正００２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１】植物胚芽を衝撃又は切断により細分化する工程を含む、請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の植物胚芽抽出液の製造方法。


【手続補正００３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】抽出溶媒の存在下に植物胚芽を細分化する工程を含む、請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の植物胚芽抽出液の製造方法。


【手続補正００４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２３】抽出溶媒が、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びチオール基の酸化防止剤からなる群より選択される１以上を含むものである請求の範囲２２に記載の製造方法。


【手続補正００５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２４】細分化が衝撃又は切断により行われるものである、請求の範囲２２に記載の製造方法。


【手続補正００６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２５】植物胚芽が、胚乳成分が実質的に夾雑しないものである請求の範囲２１〜２５のいずれか１項に記載の製造方法。


【手続補正００７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２６】植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲２１〜２４のいずれか１項に記載の製造方法。


【手続補正００８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２７】請求の範囲２１〜２６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる植物胚芽抽出液。


【手続補正００９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２８】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液を使用することを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。


【手続補正０１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２９】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。


【手続補正０１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３０】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液を含有する無細胞タンパク質合成用溶液であって、ｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。


【手続補正０１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３１】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。


【手続補正０１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３２】請求の範囲３０または３１に記載の無細胞タンパク質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。


【手続補正０１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
2003064671.tif 000017
【手続補正０１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
2003064671.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月14日(2004.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】リボヌクレアーゼ活性が低減された、植物胚芽抽出液。
【請求項２】リボヌクレアーゼ活性がＲＮａｓｅＡ換算で１０ｐｇ／μｌ以下である、請求の範囲１記載の胚芽抽出液。
【請求項３】抽出溶媒非存在下に植物胚芽を摩砕または圧砕して細分化する工程を含む方法により得られる胚芽抽出液と比較してリボヌクレアーゼ活性が８０％以下に低減された請求の範囲１または２記載の胚芽抽出液。
【請求項４】２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であることを特徴とする植物胚芽抽出液。
【請求項５】２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の総脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）含有量の合計量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である植物胚芽抽出液。
【請求項６】２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であり、かつ総脂肪酸含有量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である植物胚芽抽出液。
【請求項７】植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の胚芽抽出液。
【請求項８】植物胚芽を衝撃又は切断により細分化する工程を含む、植物胚芽抽出液の製造方法。
【請求項９】抽出溶媒の存在下に植物胚芽を細分化する工程を含む、植物胚芽抽出液の製造方法。
【請求項１０】抽出溶媒が、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びチオール基の酸化防止剤からなる群より選択される１以上を含むものである請求の範囲９記載の製造方法。
【請求項１１】細分化が衝撃又は切断により行われるものである、請求の範囲９記載の製造方法。
【請求項１２】植物胚芽が、胚乳成分が実質的に夾雑しないものである請求の範囲８〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲８〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】請求の範囲８〜１３のいずれか１項に記載の製造方法により得られる植物胚芽抽出液。
【請求項１５】請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を使用することを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。
【請求項１６】請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
【請求項１７】請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を含有する無細胞タンパク質合成用溶液であって、ｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
【請求項１８】請求の範囲１〜７および１４のいずれか１項に記載の胚芽抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
【請求項１９】請求の範囲１６または１７記載の無細胞タンパク質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
【請求項２０】植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の胚芽抽出液。
【請求項２１】植物胚芽を衝撃又は切断により細分化する工程を含む、請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の植物胚芽抽出液の製造方法。
【請求項２２】抽出溶媒の存在下に植物胚芽を細分化する工程を含む、請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の植物胚芽抽出液の製造方法。
【請求項２３】抽出溶媒が、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びチオール基の酸化防止剤からなる群より選択される１以上を含むものである請求の範囲２２に記載の製造方法。
【請求項２４】細分化が衝撃又は切断により行われるものである、請求の範囲２２に記載の製造方法。
【請求項２５】植物胚芽が、胚乳成分が実質的に夾雑しないものである請求の範囲２１〜２４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２６】植物胚芽が、コムギ、オオムギ、イネ又はコーンの胚芽である請求の範囲２１〜２４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２７】請求の範囲２１〜２６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる植物胚芽抽出液。
【請求項２８】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液を使用することを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。
【請求項２９】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
【請求項３０】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液を含有する無細胞タンパク質合成用溶液であって、ｔＲＮＡを添加しなくとも十分なタンパク質合成活性を有することを特徴とする無細胞タンパク質合成用溶液。
【請求項３１】請求の範囲２０に記載の胚芽抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
【請求項３２】請求の範囲３０または３１に記載の無細胞タンパク質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
【国際調査報告】
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