(57)【要約】ｙｅｄＡ遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強することによってＬ−アミノ酸生産性が増強されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミノ酸を該培地中から採取することにより、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニン又はＬ−スレオニンを製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、同細菌によるＬ−アミノ酸生産性が、同細菌の細胞内において以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が増強されたことによって増強された細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質であって、細菌のＬ−アミノ酸および／またはアミノ酸アナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が、同タンパク質をコードするＤＮＡによる前記細菌の形質転換により、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列の改変により増強された請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記形質転換は、前記ＤＮＡを含むマルチコピーベクターにより行われる請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌を培地で培養し、同培地中に生成および蓄積したＬ−アミノ酸を培地から採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
製造されるＬ−アミノ酸が、Ｌ−フェニルアラニンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌のフェニルアラニン生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
製造されるＬ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニンである請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌のスレオニンオペロンの発現が増強された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌であって、Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、得られたＬ−フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体から、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法。
【請求項１０】
さらに、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化し、このＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを前記アスパラギン酸の誘導体としてＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物と縮合させ、この反応混合物からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成させることを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、バイオテクノロジーに関し、特に発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法、より具体的にはエシェリヒア・コリ由来の遺伝子に関する。同遺伝子は、Ｌ−アミノ酸生産性、例えばＬ−フェニルアラニンおよびＬ−スレオニン生産性の改良のために有用である。
背景技術
従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界から得られた微生物菌株、または、それらの菌株のＬ−アミノ酸生産性を増強するように改変された変異株を利用する発酵方法により、工業的に生産されてきた。
Ｌ−アミノ酸生産能を増強するための多くの技術が開示されており、例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換によるものがある（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号参照）。これらの技術は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性の増加、および／または、生産されるＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害からの目的とする酵素の脱感作に基づいている（例えば、特開昭５６−１８５９６号（１９８１）、ＷＯ９５／１６０４２、または米国特許第５，６６１，０１２号および第６，０４０，１６０号参照）。
他方で、Ｌ−アミノ酸生産株の生産能は、アミノ酸排出活性の増強によって改良し得る。Ｌ−リジン排出遺伝子（ｌｙｓＥ遺伝子）の発現が増強されたコリネバクテリウム属細菌のリジン生産株が開示されている（ＷＯ９７２３５９７Ａ２）。さらに、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリンまたはチアゾリジン誘導体の分泌に適した流出タンパク質をコードする遺伝子も開示されている（米国特許第５，９７２，６６３号）。
現在のところ、Ｌ−アミノ酸生産性を増強する推定上の膜タンパク質をコードする数個のエシェリヒア・コリの遺伝子が開示されている。ｒｈｔＢ遺伝子のコピー数を増加させることによって、細菌はＬ−ホモセリンに対してより耐性になり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンの生産性が増強される（欧州特許公開第９９４１９０Ａ２号）。ｒｈｔＣ遺伝子のコピー数を増加させることによって、細菌はＬ−ホモセリンおよびＬ−スレオニンに対してより耐性となり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−ロイシンの生産性が増強される（欧州特許公開第１０１３７６５Ａ１号）。ｙａｈＮ、ｙｅａＳ、ｙｆｉＫおよびｙｇｇＡ遺伝子は、コピーを増加させることによって、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンの生産性を増強する（欧州特許公開第１０１６７１０Ａ２号）。
本発明者等は以前に、エシェリヒア・コリＫ−１２株について、最小培地中の高濃度のスレオニン又はホモセリンに対する耐性に関連する変異ｔｈｒＲ（本明細書中ではｒｈｔＡ２３と称する）を有する突然変異株を得た（Ａｓｔａｕｒｏｖａ，Ｏ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１，６１１−６１６，１９８５）。この変異は、Ｌ−スレオニン（ＳＵ特許第９７４８１７号）、ホモセリンおよびグルタミン酸（Ａｓｔａｕｒｏｖａ，Ｏ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，５５６−５６１，１９９１）を生産するエシェリヒア・コリのそれぞれのアミノ酸生産性を改善する。
さらに本発明者等は、ｒｈｔＡ遺伝子は、グルタミン輸送系の構成成分をコードするｇｌｎＨＰＱオペロンに近接するエシェリヒア・コリ染色体上の１８ｍｉｎに存在すること、及び、ｒｈｔＡ遺伝子はｐｅｘＢとｏｍｐＸ遺伝子の間にあるｙｂｉＦ  ＯＲＦと同一であることを明らかにしている。このＯＲＦによりコードされるタンパク質を発現するユニットは、ｒｈｔＡ（ｒｈｔ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ：ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性）遺伝子と命名されている。
さらに、ｒｈｔＡ遺伝子の増幅は、ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性を付与することを本発明者等は見出した。ｒｈｔＡ２３突然変異は、ＡＴＧ開始コドンに対して−１の位置でのＧからＡへの置換である（ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ  ｏｆ  １７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙならびに１９９７  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ａｕｇｕｓｔ  ２４−２９，１９９７，ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．４５７）。ＳＤ配列と開始コドンの間のスペーサーのヌクレオチド組成、特に開始コドンのすぐ上流の配列は、ｍＲＮＡ翻訳能力に多大な影響を及ぼすことが知られている。開始コドンの前の３つのヌクレオチドの性質に応じて、発現レベルの２０倍の変化が見出されている（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，３６５−４０３，１９８１；Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，６２３−６２９，１９８４）。したがって、ｒｈｔＡ２３突然変異はｒｈｔＡ遺伝子発現を増加させる、ということが示唆され得る。
ｒｈｔＡ遺伝子は２９５アミノ酸残基からなるタンパク質をコードし、１０個の予想上の膜貫通セグメントを含む高疎水性タンパク質である。エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリＫ−１２株のヌクレオチド配列のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４（１９９７））により、ＲｈｔＡと相同の少なくとも１０個のタンパク質が明らかにされた。それらの中には、ｙｄｅＤおよびｙｅｄＡ遺伝子によりコードされるタンパク質が含まれる。以前に、ｙｄｅＤ遺伝子がシステイン経路代謝物質の流出に関与することが示された（Ｄａｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６，１１０１−１１１２，２０００；米国特許第５，９７２，６６３号）。ｙｅｄＡ遺伝子産物は推定上の膜貫通サブユニットとして知られており、ｙｅｄＡ遺伝子は機能的に未知のタンパク質をコードしている可能性がある（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＥ０００２８７  Ｕ０００９６の塩基配列の塩基番号８０３７〜８９５７）。
発明の開示
本発明は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を増強すること、およびこれらの株を用いたＬ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニンおよびＬ−スレオニンの製造方法を提供することを課題とする。
上記課題は、ＲｈｔＡと相同であり、膜タンパク質をコードし、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路に関与しないが、その野生型対立遺伝子を微生物内においてマルチコピーベクターで増幅すると、いくつかのアミノ酸およびアミノ酸アナログに対する耐性が微生物に付与されるｙｅｄＡ遺伝子を同定することによって、達成された。さらに、ｙｅｄＡ遺伝子は、コピー数を増加させてそれぞれのアミノ酸の生産株の細胞に導入すると、アミノ酸生産性を増強することができる。本発明はこうして完成された。
本発明は、以下のとおりである：
１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、同細菌によるＬ−アミノ酸生産性が、同細菌の細胞内において以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が増強されたことによって増強された細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列中において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質であって、細菌のＬ−アミノ酸（例えばフェニルアラニン、スレオニン、ホモセリンまたはシステイン）、および／またはアミノ酸アナログ（例えばｐ−フルオロ−フェニルアラニン、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン、Ｓ−（２−アミノエチル）システインまたは４−アザ−ＤＬ−ロイシン）に対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質（以下、上記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質を、「本発明のタンパク質」と称することがある）。
２）前記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が、同タンパク質をコードするＤＮＡによる前記細菌の形質転換により、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列の改変により増強された、前記細菌。
３）前記形質転換は、前記ＤＮＡを含むマルチコピーベクターにより行われる、前記細菌。
４）前記細菌を培地中で培養し、生成および蓄積したＬ−アミノ酸を培地から採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
５）生産されるＬ−アミノ酸が、Ｌ−フェニルアラニンである、前記方法。
６）前記細菌のフェニルアラニン生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、前記方法。
７）生産されるＬ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニンである、前記方法。
８）前記細菌は、スレオニンオペロンの発現が増強された、前記方法。
９）前記細菌は、トリプトファン生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、前記方法。
１０）前記のいずれかの細菌であって、Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、得られたＬ−フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体から、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法。
１１）さらに、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化し、このＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを前記アスパラギン酸の誘導体としてＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物と縮合させ、この反応混合物からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成させることを含む、前記の方法。
本発明において、特記しない限りアミノ酸はＬ−体である。
Ｌ−アミノ酸の製造方法は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質等のような本発明のタンパク質の活性が増強された、Ｌ−フェニルアラニン生産菌を用いたＬ−フェニルアラニンの製造を含む。また、Ｌ−アミノ酸の製造方法は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質等のような本発明のタンパク質の活性活性が増強された、Ｌ−スレオニン生産細菌を用いたＬ−スレオニンの製造を含む。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、細菌の細胞内において本発明のタンパク質の活性が増強されたことにより、同細菌のＬ−アミノ酸生産性が増強された細菌である。
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、細菌を培地で培養したときに、同Ｌ−アミノ酸を生成し、培地に蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、同細菌が野生株が持つ性質として保持していてもよいし、育種によって付与されてもよい。
本発明の細菌は、目的とするＬ−アミノ酸の生産性を増強するタンパク質の活性が増強された、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌である。具体的には、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の活性が増強された、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌である。さらに具体的には、本発明の細菌は、細菌の染色体上、またはプラスミド中にあって過剰発現するｙｅｄＡ遺伝子を有するＤＮＡを保持し、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニンおよびＬ−スレオニンを生産する増強された能力を有する。
本発明のタンパク質としては、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のものが含まれる。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質であって、細菌のＬ−アミノ酸、例えばフェニルアラニン、スレオニン、ホモセリンまたはシステイン、および／またはアミノ酸アナログ、例えばｐ−フルオロ−フェニルアラニン、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン、Ｓ−（２−アミノエチル）システインまたは４−アザ−ＤＬ−ロイシンに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。
「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類によって異なる。その数は、タンパク質（Ａ）に対して、２〜３０個、好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜５個であり得る。
Ｌ−アミノ酸および／またはアミノ酸アナログに対する耐性とは、非改変株又は野生型の細菌、または細菌の親株が生育できない濃度でＬ−アミノ酸またはそのアナログを含有する最小培地上で細菌が生育する能力、あるいは非改変株又は野生型の細菌、または細菌の親株より早く、Ｌ−アミノ酸またはアミノ酸アナログを含有する培地上で細菌が生育する能力を意味する。Ｌ−アミノ酸アナログは、ｐ−フルオロ−フェニルアラニン、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン、４−アザ−ＤＬ−ロイシン等により例示される。Ｌ−アミノ酸またはアミノ酸アナログの上記の濃度は、Ｌ−ホモセリンの場合は一般に１０００〜１００００μｇ／ｍｌ、好ましくは３０００〜５０００μｇ／ｍｌ、セリンおよびシステインの場合は好ましくは５０００〜７０００μｇ／ｍｌ、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファンの場合は一般に０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜０．５μｇ／ｍｌ、ｐ−フルオロ−フェニルアラニンの場合は一般に０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ、４−アザ−ＤＬ−ロイシンおよびＳ−（２−アミノエチル）システインの場合は一般に０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌである。
本発明の細菌としては、本発明のタンパク質の活性が、（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを用いた同細菌の形質転換により、又は、同細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列の改変により増強されたものが含まれる。
本発明の細菌の改変のために用いられるＤＮＡは、Ｌ−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードし得る。さらに具体的には、ＤＮＡはｙｅｄＡ遺伝子により代表される。ｙｅｄＡ遺伝子は、例えば配列番号１に示すヌクレオチド配列に基づいたプライマーを用いたＰＣＲにより得られる。
本発明のＤＮＡとしては、タンパク質の活性を失わない限り、タンパク質（Ａ）上の１つまたはそれ以上の位置における１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類によって異なるが、その数は、タンパク質（Ａ）に対して、２〜３０個、好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜５個であり得る。（Ａ）に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されるように、部位特異的突然変異法を用いた（Ａ）に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変により得られる。このような改変されたＤＮＡは、突然変異を生じさせる試薬および条件による処理を用いた従来の方法により得られ得る。このような処理としては、ヒドロキシルアミンを用いたタンパク質をコードするＤＮＡの処理、又は、当該ＤＮＡを保持する細菌のＵＶ照射、または、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたは亜硝酸のような試薬を用いた処理が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、自然界の多様性により、エシェリヒア属細菌の異なる菌株および変種で見い出される得る変異体を含む。このような変異体をコードするＤＮＡは、ｙｅｄＡ遺伝子または遺伝子の一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸生産性を増強するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られる。「ストリンジェントな条件」という用語は、本明細書中では、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドは形成されない条件として言及される。例えばストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば互いに７０％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の普通の条件、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、を含む条件がが挙げられる。変異体をコードし、ｙｅｄＡ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡに対するプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列も用いられ得る。このようなプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて作製されるオリゴヌクレオチド、および鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を用いたＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐの長さのＤＮＡ断片がプローブとして用いられる場合、ハイブリダイゼーションの洗浄の条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳが挙げられる。
タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換は、例えば、常法により、細菌細胞へＤＮＡを導入し、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加し、細菌細胞内におけるタンパク質の活性を増強することを意味する。
遺伝子発現の増強方法としては、遺伝子コピー数の増加を含む。エシェリヒア属細菌中で機能し得るベクターへの遺伝子の導入は、同遺伝子のコピー数を増加させる。このような目的のために、マルチコピーベクターが好ましく用いられ得る。マルチコピーベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂ等が挙げられる。
さらに、遺伝子発現の増強は、例えば相同組換え法等による細菌染色体への遺伝子のマルチコピーの導入により達成され得る。
２つ以上の遺伝子の発現が増強される場合、各遺伝子は同一プラスミド上に一緒に保持されてもよく、あるいは異なるプラスミド上に別々に保持されてもよい。また、各遺伝子のうちの１つが染色体上に保持され、他方がプラスミド上に保持されてもよい。
一方、遺伝子発現の増強は、固有のプロモーターの代わりに、強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを置くことにより達成され得る。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，Ｕ．，Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｗ．，Ｇｅｎｔｚ，Ｒ．，Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８６，５，２９８７−２９９４）等に記載されている。例えば、ＰＬプロモーターが強力な構成的プロモーターとして知られている。その他ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。強力なプロモーターの使用は、遺伝子コピーの増幅と組合せてもよい。
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化および連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に既知の一般的方法でよい。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）等に記載されている。
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を生来有するエシェリヒア属細菌に上記のＤＮＡを導入することにより得られる。あるいは、本発明の細菌は、上記のＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌にＬ−アミノ酸を生産する能力を付与することにより得られる。
エシェリヒア属細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するか、又は付与され得るものであれば特に制限されない。エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。
エシェリヒア属に属するアミノ酸生産細菌の例を以下に記載する。
＜フェニルアラニン生産菌＞
本発明のタンパク質の活性が増強される親株として、エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産菌、例えばエシェリヒア・コリＡＪ１２７３９（ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０，ｔｙｒＲ）（ＶＫＰＭ  Ｂ−８１９７）、ｐｈｅＡ３４遺伝子を保持するＨＷ１０８９（ＡＴＣＣ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ，５５３７１）（米国特許第５，３５４，６７２号）、変異株ＭＷＥＣ１０１−ｂ（ＫＲ８９０３６８１）、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４１、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４５、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４６およびＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４７（米国特許第４，４０７，９５２号）等を用いることができる。
また、本発明のタンパク質の活性が増強される親株として、エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産細菌であるエシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５６６）、エシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２６５９）、エシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２６６２）およびＡＪ１２６０４と命名されたエシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５７９）も用いられ得る（欧州特許第４８８４２４Ｂ１号）。
＜スレオニン生産細菌＞
本発明のタンパク質の活性が増強される親株として、エシェリヒア属に属するスレオニン生産細菌株、例えばＭＧ４４２（ＶＫＰＭ  Ｂ−１６２８）（Ｇｕｓｙａｔｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｋａ（ｉｎ  Ｒｕｓｓｉａｎ），１４，９４７−９５６，１９７８；米国特許第４，２７８，７６５号）、ＶＫＰＭ  Ｂ−３９９６（米国特許第６，１６５，７５６号）、ＶＫＰＭ  Ｂ−５３１８（米国特許第６，１３２，９９９号）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７５６およびＦＥＲＭ  ＢＰ−４０７２（米国特許第５，４７４，９１８号）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５１９及びＦＥＲＭ  ＢＰ−３５２０（米国特許第５，３７６，５３８号）等が用いられ得る。
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、培地中にＬ−アミノ酸を生成および蓄積させる工程と、培地からＬ−アミノ酸を採取する工程を含むＬ−アミノ酸の製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、培地中にＬ−フェニルアラニンを生成および蓄積させる工程と、培地からＬ−フェニルアラニンを採取する工程を含むＬ−フェニルアラニンの製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、培地中にＬ−スレオニンを生成および蓄積させる工程と、培地からＬ−スレオニンを採取する工程を含む方法Ｌ−スレオニンの製造法を含む。
本発明において、培養、培地からのＬ−アミノ酸の採取および精製等は、微生物を用いてアミノ酸を生産する従来の発酵法と同様の方法で実施され得る。培養のために用いられる培地は、培地が炭素源および窒素源および無機質、ならびに必要な場合には微生物が生育に必要とする適量の栄養素を含む限り、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、種々の炭水化物、例えばグルコースおよびシュークロース、ならびに種々の有機酸が挙げられる。用いられる微生物の資化性によって、アルコール、例えばエタノールおよびグリセロールが用いられ得る。窒素源としては、種々のアンモニウム塩、例えばアンモニアおよび硫酸アンモニウム、その他の窒素化合物、例えばアミン、天然窒素源、例えばペプトン、ダイズ加水分解物、および消化発酵微生物が用いられる。無機質としては、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が用いられる。いくつかの付加的栄養素が、必要な場合には培地に添加され得る。例えば微生物が生育のためにチロシンを必要とする場合（チロシン栄養要求株）、十分量のチロシンが培養のための培地に添加され得る。
培養は、好ましくは好気性条件下で、例えば振盪培養および通気撹拌培養で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で実施される。培養のｐＨは通常は５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基および緩衝液を用いて調整され得る。通常、１〜５日の培養により、液体培地中に目的とするＬ−アミノ酸が蓄積する。
培養後、固体、例えば細胞は、遠心分離または膜分離法により液体培地から除去され、次に目的とするＬ−アミノ酸がイオン交換、濃縮および結晶化法等の常法により採取、精製され得る。
本発明の方法によって製造されたフェニルアラニンは、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステル（「アスパルテーム」とも呼ばれる）の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、Ｌ−フェニルアラニンを原料として用いるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造法を含む。同方法は、上記の本発明の方法によって製造されたＬ−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する工程を含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
本発明の方法においては、Ｌ−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にＬ−フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる（米国特許第３，７８６，０３９号）。Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このＬ−フェニルアラニンアルキルエステルを、β−カルボキシル基が保護され、α−カルボキシル基がエステル化されて活性化されたＬ−アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、Ｎ−ホルミル−、Ｎ−カルボベンゾキシ−、又はＮ−ｐ−メトキシカルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物のようなＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンと、Ｎ−アシル−β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、３７℃における酸解離定数が１０−４以下の有機酸の存在下で行うと、β−体に対するα−体の割合が上昇する（特開昭５１−１１３８４１）。続いて、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを得る。
発明を実施するための最良の形態
本発明を、実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  エシェリヒア・コリ由来のｙｅｄＡ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ−１２株の全ヌクレオチド配列はすでに決定されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４，１９９７）。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により、少なくとも１０個のｒｈｔＡパラログ（例えばｙｅｄＡ遺伝子）がエシェリヒア・コリＫ−１２のゲノム上に存在することが示された。ｙｅｄＡ遺伝子産物は、機能未知の推定上の膜貫通サブユニットをコードする。
報告されているヌクレオチド配列に基づいて、配列番号３（プライマー１）および４（プライマー２）に示すプライマーを合成した。プライマー１は、開始コドンの上流のヌクレオチド１７９から１５３までの配列と相補的な配列であり、その５’末端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位が導入されている。プライマー２は、終止コドンの下流のヌクレオチド５３から７７までの配列と相補的な配列であり、その５’末端には制限酵素ＳａｌＩ認識部位が導入されている。
通常の方法により、エシェリヒア・コリＴＧ１株の染色体ＤＮＡを調製した。以下の条件で、「パーキンエルマーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００」でＰＣＲを実行した。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用い、９５℃で４０秒、４７℃で４０秒、７２℃で４０秒を３０サイクル。
ｙｅｄＡ遺伝子とそれ自体のプロモーターを含むＰＣＲ断片を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素で処理し、同一酵素で予め処理されたマルチコピーベクターｐＵＣ１９またはｐＡＹＣＴＥＲ３に挿入した。このようにして、それぞれプラスミドｐＹＥＤＡ１およびｐＹＥＤＡ２を得た。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、プラスミドＲＳＦ１０１０をもとにして構築された適度なコピー数で非常に安定なベクターであるｐＡＹＣ３２（Ｃｈｒｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖ  Ａ．Ｙ．，Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ  Ｙ．Ｄ，Ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ＲＳＦ１０１０  Ｔｎｌ  ｐｌａｓｍｉｄ，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８６，ｖ．１６，ｐｐ．１６１−１６７）の誘導体である。
以下のように、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーおよび強力なターミネーターｒｒｎＢをｐＡＹＣ３２プラスミドへ自身のプロモーターの代わりに導入することにより、ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターを得た。最初に、配列番号５および６に示すプライマーを用いたＰＣＲにより、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーを得た。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で処理した。配列番号７および８に示すプライマーを用いたＰＣＲにより、ターミネーターｒｒｎＢも得た。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で処理した。次に、これら２つのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で予め処理したｐＡＹＣ３２プラスミドに連結した。このようにしてｐＡＹＣＴＥＲ３プラスミドを得た。
実施例２  アミノ酸およびアミノ酸アナログに対するエシェリヒア・コリＴＧ１株の耐性に及ぼすｙｅｄＡ遺伝子増幅の効果
ｐＹＥＤＡ１およびｐＹＥＤＡ２プラスミドならびにｐＵＣ１９およびｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターをエシェリヒア・コリＴＧ１株に導入した。このようにして、ＴＧ１（ｐＹＥＤＡ１）株、ＴＧ１（ｐＹＥＤＡ２）株、ＴＧ１（ｐＵＣ１９）株およびＴＧ１（ｐＡＹＣＴＥＲ３）株を得た。
次に、各株に関してこれらの株のアミノ酸およびアミノ酸アナログの存在下で生育する能力を、阻害剤の濃度勾配を含有するＭ９グルコース最小寒天プレート上で測定した。最小培地（プラスミドを有する株に対し１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加）中で生育させた一夜培養の１０６〜１０７個の細胞をプレートにスポッティングした。３７℃で４４時間インキュベーション後、生育を評価した。結果を表１に示す。
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実施例３  フェニルアラニン生産に及ぼすｙｅｄＡ遺伝子増幅の効果
ｙｅｄＡ遺伝子を保持するプラスミドを用いた形質転換のための親株として、フェニルアラニン生産エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株を用いた。ＡＪ１２７３９株は、２００１年１１月６日付で、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＶＫＰＭ）（Ｒｕｓｓｉａ，１１３５４５  Ｍｏｓｃｏｗ，１ｓｔ  Ｄｏｒｏｚｈｎｙ  ｐｒｏｅｚｄ，１）に、受託番号ＶＫＰＭ  Ｂ−８１９７で寄託されている。
フェニルアラニン生産菌ＡＪ１２７３９株をｐＹＥＤＡ２プラスミドまたはｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターで形質転換して、ＡＪ１２７３９／ｐＹＥＤＡ２およびＡＪ１２７３９／ｐＡＹＣＴＥＲ３株を得た。これらの株を各々、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有する栄養ブロス中で３７℃で１８時間培養し、得られた培養液のうち０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する発酵培地３ｍｌに接種して、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中のフェニルアラニンの蓄積量をＴＬＣにより測定した。蛍光指示薬を含有しないＳｏｒｂｆｉｌシリカゲルの０．１１ｍｍ層で被覆した１０×１５ｃｍ  ＴＬＣプレート（Ｓｔｏｃｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｓｏｒｂｐｏｌｙｍｅｒ社，Ｋｒａｓｎｏｄａｒ，Ｒｕｓｓｉａ）を用いた。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートを、移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ）を用いて展開させた。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として用いた。結果を表２に示す。
〔発酵培地の組成（ｇ／ｌ）〕
グルコース            ４０．０
（ＮＨ４）２ＳＯ４    １６．０
Ｋ２ＨＰＯ４            １．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    １．０
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ０．０１
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ    ０．０１
チアミン−ＨＣｌ        ０．０００２
酵母抽出物              ２．０
チロシン                ０．１
ＣａＣＯ３            ３０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ３を１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。滅菌後、抗生物質を培地に添加する。
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表２から、ｙｅｄＡ遺伝子増幅によって、ＡＪ１２７３９株のフェニルアラニン生産性が改良されたことがわかる。
実施例４  スレオニン生産に及ぼすｙｅｄＡ遺伝子増幅の効果
既知のスレオニン生産エシェリヒア・コリＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａＭＧ４４２株（Ｇｕｓｙａｔｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｇｅｎｅｔｉｋａ（ｉｎ  Ｒｕｓｓｉａｎ），１４，ｐ．９４７−９５６）（ブダペスト条約にしたがって、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ）に、受託番号ＶＫＰＭ  Ｂ−１６２８のもとで寄託されている）をｐＹＥＤＡ１プラスミドまたはｐＵＣ１９ベクターで形質転換して、ＭＧ４４２／ｐＹＥＤＡ１株およびＭＧ４４２／ｐＵＣ１９株を得た。
これらの株を各々、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有する栄養ブロス中で３７℃で１８時間培養し、得られた培養液のうち０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有する発酵培地３ｍｌに接種して、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中のスレオニンの蓄積量をＴＬＣにより測定した。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートを、移動相：プロパン−２−オール：アセトン：水：２５％アンモニア水＝２５：２５：７：６（ｖ／ｖ）を用いて展開させた。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として用いた。結果を表３に示す。
〔発酵培地の組成（ｇ／ｌ）〕
グルコース            ５０．０
（ＮＨ４）２ＳＯ４    １０．０
Ｋ２ＨＰＯ４            １．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ０．４
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ０．０２
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ    ０．０２
チアミン−ＨＣｌ        ０．０００２
酵母抽出物              １．０
ＣａＣＯ３            ２０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ３を１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。滅菌後、抗生物質を培地中に添加する。
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表３から、ｙｅｄＡ遺伝子増幅によって、ＭＧ４４２株のスレオニン生産性が改良されたことがわかる。
産業上の利用の可能性
本発明により、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニンおよびＬ−スレオニンの生産性が向上したエシェリヒア属細菌、および同細菌を利用したＬ−アミノ酸の製造法が提供される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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