(57)【要約】グリオーマの診断・治療に応用することができる、グリオーマ抗原と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質やそれをコードする遺伝子等を提供するものである。精巣から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによって構築したλファージｃＤＮＡライブラリーとグリオーマ患者の血清とを反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出し、検出した陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認した陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原とグリオーマ患者血清、健常人血清等とを用いて血清スクリーニングを行い、グリオーマの診断・治療に応用することができる、グリオーマ抗原と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質やそれをコードする遺伝子を調製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、又は配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１若しくは３に示される塩基配列又はそれらの相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ又はかかるＤＮＡに対応するＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質の発現を阻害しうることを特徴とするオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸。
【請求項５】
配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項５記載のタンパク質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチド。
【請求項７】
請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
【請求項８】
請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドに対する抗体。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドを過剰発現する非ヒト動物。
【請求項１２】
請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドと被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価することを特徴とする免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
以下の（１）〜（５）の工程により得られる、グリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質。
（１）精巣組織から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；
（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；
（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；
（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；
（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；
【請求項１４】
ＫＵ−ＧＢ−４、ＫＵ−ＧＢ−３、ＳＯＸファミリー分子、ジンクフィンガーホメオボックス、ＡＤＰリボシル化因子、又はＭフェーズホスホプロテイン１（Ｍ−ｐｈａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １）からなることを特徴とする請求項１３記載の精巣由来の抗原タンパク質。
【請求項１５】
ＳＯＸファミリー分子が、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、又はＳＯＸ１３であることを特徴とする請求項１４記載の精巣由来の抗原タンパク質。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質の全部若しくは一部、及び／又は該タンパク質の全部若しくは一部に特異的に結合する抗体を含有することを特徴とするグリオーマ検出用診断薬。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質の全部若しくは一部に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とするグリオーマの診断方法。
【請求項１８】
血清を被検試料とし、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット法を用いることを特徴とする請求項１７記載のグリオーマの診断方法。
【請求項１９】
細胞組織を被検試料とし、免疫組織化学的分析法を用いることを特徴とする請求項１７記載のグリオーマの診断方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を含有することを特徴とするグリオーマ検出・診断用プローブ。
【請求項２１】
請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質の全部若しくは一部、及び／又は該グリオーマ抗原の全部若しくは一部に特異的に結合する抗体を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項２２】
請求項２１記載の抗腫瘍剤を用いることを特徴とする腫瘍の予防・治療剤。
【請求項２３】
免疫組織化学的分析においてグリオーマを特異的に認識することを特徴とするグリオーマ認識抗体。
【請求項２４】
抗ＳＯＸ６抗体であることを特徴とする請求項２３記載のグリオーマ認識抗体。
【請求項２５】
抗ＳＯＸ６抗体が、ＳＯＸ６のＨＭＧボックスを特異的に認識する抗体であることを特徴とする請求項２４記載のグリオーマ認識抗体。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか記載のグリオーマ認識抗体を含有することを特徴とするグリオーマ検出用診断薬。
【請求項２７】
請求項２３〜２５のいずれか記載のグリオーマ認識抗体を用いることを特徴とするグリオーマの診断方法。
【請求項２８】
血清を被検試料とし、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット法を用いることを特徴とする請求項２７記載のグリオーマの診断方法。
【請求項２９】
細胞組織を被検試料とし、免疫組織化学的分析法を用いることを特徴とする請求項２７記載のグリオーマの診断方法。
【請求項３０】
請求項２３〜２５のいずれか記載のグリオーマ認識抗体を用いることを特徴とするグリオーマの診断方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトの悪性脳腫瘍であるグリオーマに発現し免疫反応を示すグリオーマ抗原と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質やその遺伝子、それらグリオーマ抗原やその遺伝子を用いた、免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、グリオーマ検出・診断用プローブや、抗腫瘍剤等に関する。
背景技術
免疫療法は古くから期待され、様々な試みがなされてきたが、未だ十分な抗腫瘍効果を示すには至っていない。従来、癌の免疫療法は非特異的免疫療法を中心として行われてきたが、近年、Ｔ細胞が生体内での腫瘍拒絶に重要な役割を果たすことがヒトメラノーマにおいて明らかになり、さらにＭＡＧＥ−１抗原（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１６４３−７，１９９１）が１９９１年にベルギーのグループより報告されて以来、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を誘導しうるＴ細胞認識腫瘍抗原の単離とＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープの決定に努力がそそがれている。本発明者らはメラノーマの腫瘍反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８＋Ｔ細胞認識抗原を単離し（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，３５１５−３５１９，１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，６４５８−６４６２，１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，３４７−３５２，１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，３９６１−３９６８，１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓ．１６，３１３−３４０，１９９７）、この抗原を用いた特異的免疫療法により、一部のメラノーマに対して抗腫瘍効果が認められることを報告している（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２，８０３−８１３，１９９８、Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｐ．Ｆ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，ＲＦ．Ｗａｎｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｕｐｄａｔｅ．Ｖ．ＤｅＶｉｔａ，Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｄｓ．Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ１−２０，１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４，３２１，１９９８）。またＴ細胞が認識する抗原は、ＭＨＣ分子に結合したペプチドであり、しかもペプチドの起源は細胞表面タンパクである必要がなく、核内タンパクや細胞質タンパクでも抗原として認識されることが明らかになっている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０，２８１−７，１９９９）。
１９９５年にドイツのＰｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈや米国のＯｌｄらのグループにより、腫瘍及びＣＴＬを必ずしも必要とせず、細胞株の樹立が困難である癌腫において適用できる、癌患者血清中のＩｇＧ抗体が認識する癌抗原タンパクを検出するＳＥＲＥＸ法（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｎｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９２，１１８１０−１１８１３，１９９５）が報告されている。この方法によって多くの腫瘍抗原が単離されているが、本方法を用いて単離された抗原の中にはＣＴＬを誘導するＭＡＧＥ−１やチロシナーゼなどの抗原がみられることから、細胞性免疫が認識する抗原を検出する方法としても有用であることが指摘されている。また、上記方法を用いて、メラノーマ、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等において、患者ＩｇＧ抗体が認識する癌抗原を単離した報告もなされている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２，９６５−９７１，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，１０３４−１０４１，１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９，６５２−６５８，１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１４，７０３−７０８，１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，４７６６−４７７２，１９９６、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ  ６，３３−３９，１９９７）。これらの抗原にはＣＴ（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原（ＳＳＸ２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＣＰ−１、ＣＴ７など）、分化抗原（ｇａｌｅｃｔｉｎ−４／ＮＹ−ＣＯ−２７）、変異抗原（ｐ５３など）等の重要な抗原がある。これらの抗原の中で特にＮＹ−ＥＳＯ−１はＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープが決定されている。また、ＳＥＲＥＸ法を用いて単離された抗原の中には、ｅｌＦ−４γやＨＥＲ２／ｎｅｕのように癌に高発現する分子もあり、これら分子は癌化に関連している可能性がある。このような癌に高発現する分子は、治療に応用しうるだけではなく診断のマーカーや再発、予後を推定しうるマーカーとなる可能性がある。
他方、中枢神経系は免疫学的寛容の場として知られていたが、近年、活性化されたリンパ球が、血液脳関門を通過して脳内に侵入し、脳内抗原と反応することが示されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，２３１８−２６，１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，５８０４−１６，１９９８）。また本発明者らにより、脳内の腫瘍抗原に対する特異的な免疫誘導は新しい有効な治療法となる可能性が示唆されている（Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １，Ｓ１０５，１９９９）。現在、悪性脳腫瘍であるグリオーマの診断法として、ＭＲＩ等による画像解析と手術検体を用いた病理組織解析が中心に行われているが、近年の分子細胞生物学の進歩により、グリオーマの発生に関与する遺伝子も明らかになりつつあり、それらを解析する遺伝子診断の可能性も示唆されている（Ｇｌｉａ．１５，３０８−２７，１９９５）。
ＳＯＸ遺伝子ファミリーは、配列特異的ＤＮＡ結合を仲介するよく保存されたＳＲＹ関連のＨＭＧボックス領域によって定義される転写因子である（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７，３３８−３４４，１９９７；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，１４０９−１４２０，１９９９）。１９９０年のＳＲＹ遺伝子（Ｙ染色体上の男性を決める精巣決定遺伝子）の発見がきっかけとなり、ＳＲＹのＨＭＧボックスと高いホモロジー（＞６０％）を示す遺伝子群が、交差ハイブリダイゼーションやＰＣＲ法により同定され、ＨＭＧボックススーパーファミリーのなかで新たな１つのサブファミリーを形成している。ＳＯＸ遺伝子は、ヒトとマウスを含む脊椎動物から無脊椎動物（ショウジョウバエ）まで幅広い種において見い出され、マウスでは少なくとも２０種類以上のＳＯＸ遺伝子の存在が報告されている。
ＳＯＸタンパク質の既知の機能は、幅広くかつ複雑であり、Ｓｒｙは性決定に関与し（Ｎａｔｕｒｅ  ３６４，７１３−７１５，１９９３）、ＳＯＸ１−３はレンズ発達に関与し（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，２５２１−２５３２，１９９８）、ＳＯＸ４は心臓における心内膜先端形成及びＰｒｏ−Ｂ細胞増殖に関与し（Ｎａｔｕｒｅ３８０，７１１−７１４，１９９６）、ＳＯＸ９は軟骨形成及び性決定に関与し（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２，８５−８９，１９９９；Ｃｅｌｌ  ７９，１１１１−１１２０，１９９４．）、そしてＳＯＸ１０は神経冠細胞分化に関与する（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８，６０−６４，１９９８；Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８，１７１−１７３，１９９８）。以上の研究によりＳＯＸ遺伝子が発達経路において調節的役割を果たしていることが裏付けられる。
また、ＳＯＸ６タンパク質の機能は、他のＳＯＸ遺伝子の行動と同様に、胚発育を規制し細胞運命を決定することにあるとされている。マウスＳＯＸ６は、胚形成期間中に中枢神経系において発現すると報告されており、交配後１２．５日まで発現するが、成体脳からは検出されない（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３３６５−３３７２，１９９５）。ＳＯＸ６、ＳＯＸ５、及びＳＯＸ９はマウス胚の軟骨部位すべてにおいて軟骨形成初期段階から同時に高レベルで発現していた（Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７，５７１８−５７３３，１９９８）。従前の報告（Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７，５７１８−５７３３，１９９８、Ｇｅｎｅ  ２６５，１５７−１６４，２００１）によると、マウスＳＯＸ６は胎児脳及び一次（ｐｒｉｍａｒｙ）軟骨細胞において発現するが、かかる発現は精巣での発現より低い。
また、マウス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，４１８０−４１８５，２０００）、ラット（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５，７０５−７０９，２００２）及びヒト（Ｇｅｎｅ  ２６５，１５７−１６４，２００１）においてＳＯＸ６転写物の２つの主要な大きさのクラスが報告されている。短い転写物はおよそ３ｋｂであり、長い転写物は８−９ｋｂである。これらの転写物の違いは３’と５’のＵＴＲ（非翻訳領域）双方の大きさが異なることによって引き起こされると報告されている（Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７，５７１８−５７３３，１９９８）が、異なるプロモーターや異なるＲＮＡプロセッシングに起因している可能性も否定されていない。
現在、死亡原因の第一位となっている癌においては、その発生機序、診断法、治療法が進歩したにもかかわらず、未だに多くの進行癌を治療できないのが現状である。特に悪性脳腫瘍は極めて治療が困難な疾患で、近年の脳外科手術、放射線治療の進歩にもかかわらず、現在まで有効な治療法がなかった。これを改善するためには、新しい早期診断法と治療法の開発が必要とされている。本発明の課題は、グリオーマの診断・治療に応用することができるグリオーマ抗原と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質やそれをコードする遺伝子等を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、精巣由来のｃＤＮＡライブラリーとグリオーマ患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ法により、グリオーマ患者血清とのみ反応を示す精巣由来の新規抗原タンパク質や、多くのグリオーマ患者血清と反応を示し健常人の血清の抗体とはほとんど反応を示さない精巣由来の新規抗原タンパク質を得た。かかるグリオーマ抗原を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、グリオーマ抗原と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質やそれをコードするＤＮＡがグリオーマの診断・治療に有用であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
発明の開示
すなわち本発明は、配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、又は配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号１若しくは３に示される塩基配列又はそれらの相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む塩基配列からなるＤＮＡ（請求項２）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、請求項３記載のＤＮＡ又はかかるＤＮＡに対応するＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質の発現を阻害しうることを特徴とするオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（請求項４）に関する。
また本発明は、配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項５）や、請求項５記載のタンパク質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチド（請求項６）や、請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド（請求項７）や、請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドに対する抗体（請求項８）や、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター（請求項９）や、請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１０）や、請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドを過剰発現する非ヒト動物（請求項１１）や、請求項５記載のタンパク質又は請求項６記載のペプチドと被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価することを特徴とする免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１２）に関する。
本発明はまた、（１）精巣組織から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；の工程により得られる、グリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質（請求項１３）や、ＫＵ−ＧＢ−４、ＫＵ−ＧＢ−３、ＳＯＸファミリー分子、ジンクフィンガーホメオボックス（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １Ｂ）、ＡＤＰリボシル化因子（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ｌｉｋｅ）、又はＭフェーズホスホプロテイン１（Ｍ−ｐｈａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １）からなることを特徴とする請求項１３記載の精巣由来の抗原タンパク質（請求項１４）や、ＳＯＸファミリー分子が、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、又はＳＯＸ１３であることを特徴とする請求項１４記載の精巣由来の抗原タンパク質（請求項１５）や、請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質の全部若しくは一部、及び／又は該タンパク質の全部若しくは一部に特異的に結合する抗体を含有することを特徴とするグリオーマ検出用診断薬（請求項１６）や、請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質の全部若しくは一部に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とするグリオーマの診断方法（請求項１７）や、血清を被検試料とし、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット法を用いることを特徴とする請求項１７記載のグリオーマの診断方法（請求項１８）や、細胞組織を被検試料とし、免疫組織化学的分析法を用いることを特徴とする請求項１７記載のグリオーマの診断方法（請求項１９）や、請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を含有することを特徴とするグリオーマ検出・診断用プローブ（請求項２０）や、請求項１３〜１５のいずれか記載のタンパク質の全部若しくは一部、及び／又は該グリオーマ抗原の全部若しくは一部に特異的に結合する抗体を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤（請求項２１）や、請求項２１記載の抗腫瘍剤を用いることを特徴とする腫瘍の予防・治療剤（請求項２２）に関する。
さらに本発明は、免疫組織化学的分析においてグリオーマを特異的に認識することを特徴とするグリオーマ認識抗体（請求項２３）や、抗ＳＯＸ６抗体であることを特徴とする請求項２３記載のグリオーマ認識抗体（請求項２４）や、抗ＳＯＸ６抗体が、ＳＯＸ６のＨＭＧボックスを特異的に認識する抗体であることを特徴とする請求項２４記載のグリオーマ認識抗体（請求項２５）や、請求項２３〜２５のいずれか記載のグリオーマ認識抗体を含有することを特徴とするグリオーマ検出用診断薬（請求項２６）や、請求項２３〜２５のいずれか記載のグリオーマ認識抗体を用いることを特徴とするグリオーマの診断方法（請求項２７）や、血清を被検試料とし、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット法を用いることを特徴とする請求項２７記載のグリオーマの診断方法（請求項２８）や、細胞組織を被検試料とし、免疫組織化学的分析法を用いることを特徴とする請求項２７記載のグリオーマの診断方法（請求項２９）や、請求項２３〜２５のいずれか記載のグリオーマ認識抗体を用いることを特徴とするグリオーマの診断方法（請求項３０）に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明のグリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質としては、例えば、（１）精巣組織から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；を含む調製方法により得られる抗原タンパク質を挙げることができる。また、上記工程（４）で得られた陽性クローンのｃＤＮＡインサートをＰＣＲにより増幅し、配列を決定して、既存の遺伝子データベース等を利用して相同性検索をすることが好ましく、工程（５）においては、グリオーマ患者血清、健常人血清の他、他の脳疾患患者や他の癌患者等の血清を用いて血清スクリーニングをすることが好ましい。
かかる精巣由来の抗原タンパク質として、具体的には、グリオーマ患者血清とのみ反応する、あるいは高い反応性を示すＫＵ−ＧＢ−３や、ＫＵ−ＧＢ−４や、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６９４０）、ＳＯＸ６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３３２６）、ＳＯＸ１３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５６８６）等のＳＯＸファミリー分子や、ジンクフィンガーホメオボックス（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １Ｂ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４７９５）や、ＡＤＰリボシル化因子（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ｌｉｋｅ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３３２６）などのグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）群と、グリオーマ患者血清との反応で特異性がみられないＭフェーズホスホプロテイン１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５）等のグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）群から選ばれる１又は２以上の精巣由来の抗原タンパク質を挙げることができる。これら精巣由来の抗原タンパク質を用いると、強力な抗原提示細胞である樹状細胞にインビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原発現樹状細胞投与により免疫誘導を行うことができる。
本発明のタンパク質としては、上記グリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質のうち新規な抗原タンパク質やそのアイソフォームを例示することができ、具体的には、配列表の配列番号２に示される精巣由来の抗原タンパク質ＫＵ−ＧＢ−３や、配列番号４に示される精巣由来の抗原タンパク質ＫＵ−ＧＢ−４や、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質を例示することができ、ここで免疫誘導活性とは、抗体産生、細胞性免疫、免疫寛容等の免疫反応を誘導する活性をいい、かかる免疫誘導活性の中でも、末梢血の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）前駆細胞の頻度を上昇させるＴ細胞誘導活性を有するものが特に好ましい。
本発明のペプチドとしては、上記タンパク質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチドを例示することができ、かかるペプチドは特に制限されるものではないが、抗体の認識部位や、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の認識部位を構成するペプチドを好適に例示することができる。上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチドに加えて、これらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体に対して特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドも本発明に含まれ、これらを総称して、以下「本件グリオーマ抗原」ということがある。なお、本件グリオーマ抗原の由来はヒトに限定されるものではなく、また本件グリオーマ抗原は、腫瘍検出用診断薬又は治療薬や、後述するように免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法に有用である。
本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができ、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる精巣由来の抗原タンパク質ＫＵ−ＧＢ−３をコードするＤＮＡ、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる精巣由来の抗原タンパク質ＫＵ−ＧＢ−４をコードするＤＮＡ、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１若しくは３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。また、増幅に使用可能なオリゴヌクレオチド配列、またはプローブもしくはマーカーとして使用可能な条件でハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡも本発明に包含される。これらのＤＮＡ又はＲＮＡは、本件グリオーマ抗原の発現又は機能に関連した、グリオーマ等の癌疾患又はかかる疾患に対する感受性の診断のために、本件グリオーマ抗原の発現量の変化を検査することに使用できる。
また、配列番号１若しくは３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種グリオーマ細胞由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、ＫＵ−ＧＢ−３、ＫＵ−ＧＢ−４等の抗原タンパク質と同効な目的とする免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲内である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明のオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸としては、配列番号１又は３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ、又はかかるＤＮＡに対応するＲＮＡと、特異的にハイブリダイズし、本件グリオーマ抗原の発現を阻害しうるもの（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１，１９９４を参照）であれば、特に制限されるものではない。上記「ペプチド核酸」とは、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）に替わる化学合成核酸アナログを意味し、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有するものをいう。かかるペプチド核酸の塩基は、相補的な塩基配列を持つ核酸に対し、非常に特異的でかつ強力に結合し、本件グリオーマ抗原の発現を阻害しうる点で好ましい。また、上記「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、又は本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分等から生成されたオリゴヌクレオチド又はその類似体をいい、かかる天然に存在する塩基、又は本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分等から生成されたオリゴヌクレオチドとは、天然に存在する種若しくは天然に存在するサブユニット、又はそれらの同族体から生成された合成種をいう。また、上記サブユニットとは、隣接するサブユニットに対してホスホジエステル結合又は他の結合によって結合した塩基−糖の組合せをいう。
一方、上記天然に存在する塩基、又は本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分等から生成されたオリゴヌクレオチドの類似体とは、上記オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在していない塩基、例えば、ジヒドロウリジン、イノシン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン等の修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドや、リン酸基、糖部分、３’，５’末端に化学修飾を施し、安定性を増加させたオリゴヌクレオチドなどをいう。上記リン酸基、糖部分、３’，５’末端に化学修飾を施こす方法としては、例えば、ヌクレオチド間におけるホスホジエステル基の酸素原子の１つを硫黄に置換し、オリゴホスホロチオエートを得る方法や、ヌクレオチド間におけるホスホジエステル基の酸素原子の１つを−ＣＨ３に置換し、オリゴメチルホスホネートを得る方法や、ホスホジエステル結合部位を非イオン性かつ非キラル性である他の構造に置換する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記オリゴヌクレオチドは、当業者であれば公知の合成法、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などの合成装置を用いる固相合成法により製造することができる。また、同様の方法を用いて、他のオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエートやアルキル化誘導体を製造することもできる（村上  章ら、「機能性アンチセンスＤＮＡの化学合成」、有機合成化学、４８（３）：１８０−１９３，１９９０）。これらの方法により得られた、本発明のオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸は、動物における本件グリオーマ抗原の生成を抑制することが可能である。
また、上記本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、本件グリオーマ抗原等は、以下に具体的に説明するように、本件グリオーマ抗原とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド又は融合タンパク質や、本件グリオーマ抗原に対する抗体や、本件グリオーマ抗原をコードするＤＮＡを含む組換えベクターや、本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、本件グリオーマ抗原を過剰発現する非ヒト動物を作製する際に使用することができる。
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件グリオーマ抗原とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどの従来知られているマーカータンパク質を具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができるがこれらに限定されるものではない。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したＫＵ−ＧＢ−３、ＫＵ−ＧＢ−４等の抗原タンパク質の精製や、Ｔ細胞誘導活性を有するタンパク質の検出や、ＫＵ−ＧＢ−３、ＫＵ−ＧＢ−４等の抗原タンパク質に対する抗体の定量、グリオーマ等の癌の診断用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明の本件グリオーマ抗原に対する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本件グリオーマ抗原を用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点で好ましく、特にＫＵ−ＧＢ−３、ＫＵ−ＧＢ−４等のエピトープあるいは該エピトープとＨＬＡとの複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体がより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、グリオーマ等の癌の診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、グリオーマ等の悪性腫瘍の発症機構を明らかにする上で有用である。
また本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件グリオーマ抗原若しくはエピトープを含むその断片、又は該本件グリオーマ抗原、特にエピトープとＨＬＡとの複合体を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２，１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いることができる。
上記本件グリオーマ抗原に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その本件グリオーマ抗原を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件グリオーマ抗原やその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、グリオーマ等の診断や治療に使用できる可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件グリオーマ抗原に包含される。
本発明の組換えベクターとしては、本件グリオーマ抗原をコードするＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されないが、本件グリオーマ抗原を宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
本発明の本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞は、宿主細胞に本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子を導入することにより作製することができ、かかる本件グリオーマ抗原をコードするＤＮＡやかかるＤＮＡを含むベクターなどの上記発現系の宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができるが、ヒト細胞が好ましい。
そして、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。また、ＨＬＡ発現能を有する宿主細胞や、元来ＨＬＡ発現能を有さない宿主細胞にＨＬＡｃＤＮＡをトランスフェクションした宿主細胞に本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子を上記の方法で導入することにより、本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなるＨＬＡ発現能を有する宿主細胞を作製することができる。
また、発現系としては、本件グリオーマ抗原を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件グリオーマ抗原は、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、Ｆ．Ｐｉｅｔｒｉ−Ｒｏｕｘｅｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４７，１１７４−１１７９，１９９７）らの方法などを用いることができ、また、かかる本件グリオーマ抗原を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件グリオーマ抗原に対する抗体を結合させたカラムや、上記本件グリオーマ抗原に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件グリオーマ抗原を得ることができる。
本発明の本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件グリオーマ抗原を発現する機能を失った非ヒト動物をいい、また、本件グリオーマ抗原を過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件グリオーマ抗原を大量に産生する非ヒト動物をいう。そして、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件グリオーマ抗原欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、本件グリオーマ抗原のノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
例えば、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲティングベクターを作製する。
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスを作製することができる。また、本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおける本件グリオーマ抗原の発現をウェスタンブロット法等により調べる方法がある。
また、本発明のグリオーマ抗原のトランスジェニックマウスは、本件グリオーマ抗原をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
本発明の免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本件グリオーマ抗原と被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、被検物質と本件グリオーマ抗原とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、被検物質と本件グリオーマ抗原を発現している細胞膜又は細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、ＨＬＡを発現するベクターと被検ポリペプチドを発現するベクターを共にトランスフェクトした本件グリオーマ抗原発現宿主細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、被検ポリペプチドを発現するベクターをトランスフェクトしたＨＬＡ発現能を有する本件グリオーマ抗原発現宿主細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、前記ノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＴ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法等を挙げることができる。上記細胞膜又は細胞としては、前記本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物又は野生型非ヒト動物などから得られる初代培養した細胞などの細胞や、前記本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、これら細胞の細胞膜などを具体的に例示することができ、かかる細胞膜又は細胞と被検物質との接触方法としては、被検物質の存在下に本件グリオーマ抗原を発現している細胞膜又は細胞をインビトロで培養し、次いでＴ細胞と接触させる方法等を挙げることができる。Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法としては、Ｔ細胞から培地中に放出されたＩＦＮγ量を指標として評価する方法を具体的に例示することができる。また上記スクリーニング方法により得られる免疫誘導活性促進物質は、免疫誘導活性の促進を必要としている患者の治療等に用いることができ、また、免疫誘導活性抑制物質は、免疫誘導活性の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。
本発明のグリオーマ検出用診断薬としては、前記本発明のグリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質又はその一部を含有する試薬であれば特に制限されるものではなく、抗原タンパク質の一部としては、グリオーマ抗原の抗原認識部位等を例示することができ、また、２種以上の抗原を組み合わせて用いる場合には、ＫＵ−ＧＢ−３や、ＫＵ−ＧＢ−４や、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６９４０）、ＳＯＸ６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３３２６）、ＳＯＸ１３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５６８６）等のＳＯＸファミリーの分子や、ジンクフィンガーホメオボックス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４７９５）や、ＡＤＰリボシル化因子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３３２６）などのグリオーマ特異抗原群、又はＭフェーズホスホプロテイン１等のグリオーマ非特異抗原群の中から選択することが好ましい。また、本発明のグリオーマ検出用診断薬としては、前記本発明のグリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質又はその一部に特異的に結合するモノクローナル抗体等の抗体を含有する試薬も使用することができ、かかる抗体についても２種以上の抗体を組み合わせて用いる場合には、上記ＫＵ−ＧＢ−３や、ＫＵ−ＧＢ−４や、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）、ＳＯＸ６、ＳＯＸ１３等のＳＯＸファミリーの分子や、ジンクフィンガーホメオボックスや、ＡＤＰリボシル化因子などのグリオーマ特異抗原群、又はＭフェーズホスホプロテイン１等のグリオーマ非特異抗原群の中から選択することが好ましい。本発明のグリオーマ検出用診断薬を用いたグリオーマ等の癌の診断方法としては、標識化グリオーマ抗原を用いて検体から得られた血清中のＩｇＧ抗体と反応させ、抗体反応が認められるかどうかを調べる方法や、上記本発明のグリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質又はその一部に対する蛍光や鉄などの標識化抗体を血中投与することにより、境界が不明瞭なグリオーマ等の癌を画像診断する方法等を例示することができる。
本発明のグリオーマ検出・診断用プローブとしては、前記本発明のグリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質又はその一部をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖を含有する試薬であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＫＵ−ＧＢ−３や、ＫＵ−ＧＢ−４や、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）、ＳＯＸ６、ＳＯＸ１３等のＳＯＸファミリーの分子や、ジンクフィンガーホメオボックスや、ＡＤＰリボシル化因子などのグリオーマ特異抗原群、又はＭフェーズホスホプロテイン１等のグリオーマ非特異抗原群の中から選ばれる１種若しくは２種以上のグリオーマ抗原をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を含有する試薬等を具体的に挙げることができるが、２０ｂｐ以上からなるＤＮＡ又はＲＮＡが好ましく、また、２種以上のプローブを組み合わせて用いる場合には、上記ＫＵ−ＧＢ−３や、ＫＵ−ＧＢ−４や、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）、ＳＯＸ６、ＳＯＸ１３等のＳＯＸファミリーの分子や、ジンクフィンガーホメオボックスや、ＡＤＰリボシル化因子などのグリオーマ特異抗原群、又はＭフェーズホスホプロテイン１等のグリオーマ非特異抗原群から選ばれる１種若しくは２種以上の抗原タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の中から選択することが好ましい。本発明のグリオーマ検出・診断用プローブを用いたグリオーマの検出・診断方法としては、標識化アンチセンス鎖を用いて検体から得られた上記本発明のグリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質又はその一部のｍＲＮＡを検出する方法等が挙げられる。かかる検出・診断方法に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
本発明の抗腫瘍剤としては、前記本発明のグリオーマ抗原タンパク質と同効な免疫誘導活性を有する精巣由来の抗原タンパク質の調製方法により得られる１種若しくは２種以上の抗原タンパク質の全部又は一部を有効成分として含有する製剤を用いることができ、抗原タンパク質の一部としては、グリオーマ抗原の抗原認識部位等を例示することができ、また、２種以上の抗原を組み合わせて用いる場合には、上記ＫＵ−ＧＢ−３や、ＫＵ−ＧＢ−４や、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）、ＳＯＸ６、ＳＯＸ１３等のＳＯＸファミリーの分子や、ジンクフィンガーホメオボックスや、ＡＤＰリボシル化因子などのグリオーマ特異抗原群、又はＭフェーズホスホプロテイン１等のグリオーマ非特異抗原群の中から選択することが好ましい。また、本発明の抗腫瘍剤としては、前記グリオーマ抗原の全部又は一部に特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の抗体を有効成分として含有する製剤も使用することができ、かかる抗体についても２種以上の抗体を組み合わせて用いる場合には、上記ＫＵ−ＧＢ−３や、ＫＵ−ＧＢ−４や、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）、ＳＯＸ６、ＳＯＸ１３等のＳＯＸファミリーの分子や、ジンクフィンガーホメオボックスや、ＡＤＰリボシル化因子などのグリオーマ特異抗原群、又はＭフェーズホスホプロテイン１等のグリオーマ非特異抗原群に対する抗体の中から選択することが好ましい。本発明の抗腫瘍剤を用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら治療薬や生体防御機能増強剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができ、あるいは、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができるが、経口投与の場合は抗腫瘍剤を前述のリポソーム封入・包埋タイプとしておくことが好ましい。そしてまた、本発明のグリオーマ等の癌疾患の治療方法としては、上記抗腫瘍剤を用いる治療方法であれば特に制限されるものではなく、かかる抗腫瘍剤を経口、静脈、皮内、皮下注射等により投与すると、インビボにおけるＴ細胞誘導活性が増大することによる抗腫瘍効果が期待できる。また、本発明の抗腫瘍剤を用いてＴ細胞をインビトロで刺激することにより活性化Ｔ細胞に誘導することができ、例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球にＩＬ−２とともに本発明の抗腫瘍剤で刺激すると腫瘍反応性活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体等の抗体を用いて、選択的にグリオーマに遺伝子を導入させる遺伝子治療や、選択的にグリオーマに抗腫瘍剤を作用させるミサイル療法等を行うこともできる。
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（ＳＥＲＥＸ法による精巣由来のヒトグリオーマ抗原の同定）
［細胞株と組織］
ヒトグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、Ａ１７２）、ヒト悪性黒色腫細胞株（８８８ＭＥＬ）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＥＢＣ１）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、膵癌細胞株（ＰＫ１）、膀胱癌細胞株（ＫＵ７）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）、乳癌細胞株（ＭＤＡ２３１）、白血病細胞株（ＭＯＬＴ４）、線維芽細胞を、それぞれペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩで培養した。ヒトグリオーマ組織［ＧＢ（膠芽腫）１３、ＧＢ１７、ＧＢ１６、ＧＢ４］は、手術時に摘出された病変の一部を用いた。正常組織（脳、心臓、肺、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胎盤、筋肉、胎児脳）のＲＮＡは全てクローンテック社より購入した。
［ｃＤＮＡライブラリーの構築］
成人ヒト精巣の全ＲＮＡをＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社より購入した。オリゴデオキシチミジル酸（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ｓｕｐｅｒ、Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）でコーティングしたラテックスビーズを用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを二度精製した。５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡと、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とを用いた逆転写反応により、精巣ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ｃＤＮＡ断片を、バクテリオファージ発現ベクターλｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に挿入したところ、ライブラリーとして３×１０６の一次組換体を得た。
［血清による精巣ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング］
上記構築したｃＤＮＡライブラリーを１５０ｍｍＮＺＹアガロースプレートに１×１０４クローンで播き、４２℃で４時間培養した後３７℃で４時間培養し、大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）上で１０ｍＭのＩＰＴＧにより発現誘導されたリコンビナントタンパクを、ニトロセルロースフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−ｃ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に転写し、０．０５％のＴＷＩＮ２０を含むＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．５）でフィルターを洗浄することにより吸着したバクテリアやファージを除去した後、５％のスキムミルクを含むＴＢＳにて非特異反応を抑制した。このフィルターを４００倍に希釈した患者血清と３７℃で４時間反応させた。なお、患者血清としては、表１に示す１２人のグリオーマ患者からそれぞれ採取し、グリオーマ患者血清４人分を混合したもの［（Ｇ１，Ｇ３，Ｇ５，Ｇ８患者血清を混合）、（Ｇ２０，Ｇ２１，Ｇ２２，Ｇ２７患者血清を混合）、（Ｇ１８，Ｇ２３，Ｇ２４，Ｇ２８患者血清を混合）］を用いた。これらの患者血清は−８０℃で保存し、使用直前に５％のスキムミルクを含むＴＢＳ溶液で５倍に希釈して、さらにバクテリアに反応する抗体をあらかじめ除去するため、溶菌した大腸菌のライセートと１：２の割合で混合して４℃で８時間反応させた後、その上清を最終的に４００倍に希釈したものを用いた。
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かかる処理血清とニトロセルロースフィルターにブロットしたリコンビナントタンパクとを３７℃で４時間反応させ、血清中の抗体が反応したリコンビナントタンパクを、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）とインキュベーションした。ニトロブルーテトラゾリウム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）を用いて、結合した二次抗体を酵素検出した。次いで、発色反応陽性部位に一致する陽性クローンを前記１５０ｍｍＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％のｇｅｌａｔｉｎ；ｐＨ７．５）に溶解させた。さらにこのスクリーニングを数回繰り返し行い、陽性クローンの抗体反応性を確認した。患者血清１人あたり５×１０５個のファージクローンからスクリーニングして、５８個の陽性クローンを単離した。
［単離抗原遺伝子の相同性検索］
上記得られた５８個のファージに組み込まれたｃＤＮＡインサートをＥｘＴａｑキット（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）を使用したＰＣＲ法により増幅し、各塩基配列を決定した。反応酵素にはＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）を用い、センスプライマーにＴ３（５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’；配列番号５）、アンチセンスプライマーにＴ７（５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；配列番号６）を用いた。なお、反応条件は、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて最初のみ９４℃で５分間変性させ、その後９４℃で１分間熱変性させ、５５℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間伸張反応させるというサイクルを３５回繰り返し行い、最後に７２℃で７分間伸張させた。得られたＰＣＲ産物を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０オートシークエンサーとを用いてＤＮＡシークエンスを行い、５’側の塩基配列を３００〜５００ｂｐ程決定した。この決定したＤＮＡを、米国国立生体工学情報センターの遺伝子データベース又はＥＳＴデータベースにおいて登録されている遺伝子情報との間で比較し、既知の遺伝子との相同性を検索した。この結果、上記５８個の陽性クローンは、１１種類の既知タンパク質をコードするｃＤＮＡと４種類の新規タンパク質をコードするｃＤＮＡの１５種類の抗原ｃＤＮＡであることがわかった。患者別の１５種類の抗原ｃＤＮＡ数を表１に示す。
［血清スクリーニング］
単離された１５種類の抗原を発現する各クローン用いて、グリオーマの血清診断への応用を検討するために、グリオーマ患者２９人（膠芽腫１２人、退形成星細胞腫７人、退形成稀突起星細胞腫４人、星細胞腫４人、稀突起星細胞腫２人）、他の脳疾患患者１４人（悪性リンパ腫２人、脳膿瘍１人、くも膜下出血１人、パーキンソン病２人、髄膜腫４人、神経細胞腫１人、頭蓋咽頭腫１人、転移性脳腫瘍２人）、及び健常人３７人の１００倍に希釈した各血清を用いてスクリーニングを行い、これら血清中に各単離グリオーマ抗原に対するＩｇＧ抗体が検出しうるかどうかについて調べた。この結果、グリオーマ患者血清とのみ反応を示すか、又は多くのグリオーマ患者血清と反応を示し健常人の血清とはほとんど抗体反応を示さない６種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）と、グリオーマ患者血清との反応で特異性は認められなかったが、グリオーマ患者血清と反応を示す１種のグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）を得ることができた。６種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）は、表２に示されるように、新規なＫＵ−ＧＢ−４の他、ＫＵ−ＧＢ−３、ＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｉｏｎ  Ｙ  ＢＯＸ６）、ＳＯＸ６、ジンクフィンガーホメオボックス、ＡＤＰリボシル化因子であった。また１種のグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）は、表３に示されるように、Ｍフェーズホスホプロテイン１であった。上記Ｍフェーズホスホプロテイン１は血清反応では特異性は認められなかったが、６種のグリオーマ特異抗原は、グリオーマ患者血清と特異的に反応することから、グリオーマの血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。
さらに表２に示したように、別に単離したＳＯＸ１３を発現するクローンを用いて、グリオーマ患者２９人（膠芽腫１２人、退形成星細胞腫７人、退形成稀突起星細胞腫４人、星細胞腫４人、稀突起星細胞腫２人）の１００倍に希釈した各血清を用いてスクリーニングを行い、これら血清中に各単離グリオーマ抗原に対するＩｇＧ抗体が検出しうるかどうかについて調べた結果、ＳＯＸ５及びＳＯＸ６と全く同様の患者血清に対して反応が検出された。ＳＯＸ１３はＳＯＸ５，ＳＯＸ６と同様にＳＯＸファミリーの中のＳＯＸ  Ｄグループに属する分子であり、これらＳＯＸ  Ｄグループ分子群はグリオーマの血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。
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［抗原の塩基配列とアミノ酸配列の決定］
単離されたクローンの塩基配列を、自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＬＦ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；ファーマシアバイオテク社製）を用いて調べた結果、ＫＵ−ＧＢ−３は８６５個のアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を含む全長２８９８ｂｐの塩基配列（配列番号１）から構成され、ＫＵ−ＧＢ−４は３９９個のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする遺伝子を含む全長１７４８ｂｐの塩基配列（配列番号３）から構成されていることがわかった。なお、ＫＵ−ＧＢ−３遺伝子は胎盤由来のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号ＡＫ００１９７３）に登録されているが、グリオーマ抗原としては知られていなかった。
［グリオーマ抗原の発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法］
次にグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−３、ＫＵ−ＧＢ−４、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ジンクフィンガーホメオボックス、Ｍフェーズホスホプロテイン１遺伝子の各正常組織、グリオーマ細胞株及び組織並びに他の腫瘍細胞株における発現特異性をＲＴ−ＰＣＲ法により調べてみた。脳、心臓、肺、胃、大腸、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胎盤、筋肉、胎児脳等の正常組織由来のＲＮＡ（全てクローンテック社製より購入）、４種のグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１７、ＧＢ１６、ＧＢ４）由来のＲＮＡ、４種のグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１、Ａ１７２）由来のＲＮＡ、培養した線維芽細胞由来のＲＮＡを、各５μｇづつ使用し、トリ骨髄芽球ウイルス逆転写酵素（ＴＡＫＡＲＡ社製）と、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて、全反応量２００μｌ、４２℃でＲＴ−ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡのパネルを作製した。また、ＫＵ−ＧＢ−４遺伝子の発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法においては、各５μｇの悪性黒色腫細胞株（８８８ＭＥＬ）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＥＢＣ１）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、膵癌細胞株（ＰＫ１）、膀胱癌細胞株（ＫＵ７）、前立腺癌（ＰＣ３）、乳癌（ＭＤＡ２３１）及び白血病細胞株（ＭＯＬＴ４）のＲＮＡを用いた。
ＫＵ−ＧＢ−３検出用には、センスプライマーとして（５’−ＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴ−３’；配列番号７：Ｐ１）を、アンチセンスプライマーとして（５’−ＧＧＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣ−３’；配列番号８：Ｐ２）を、ＫＵ−ＧＢ−４検出用には、センスプライマー（５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣ−３’；配列番号９：Ｐ３）、アンチセンスプライマー（５’−ＡＧＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧ−３’；配列番号１０：Ｐ４）を、ＳＯＸ５検出用には、センスプライマー（５’−ＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴ−３’；配列番号１１：Ｐ５）、アンチセンスプライマー（５’−ＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＴＧＡＴＡＡＧＧＧＴＣ−３’；配列番号１２：Ｐ６）を、ＳＯＸ６検出用には、センスプライマー（５’−ＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣ−３’；配列番号１３：Ｐ７）、アンチセンスプライマー（５’−ＴＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＴＧＡ−３’；配列番号１４：Ｐ８）を、ジンクフィンガーホメオボックス検出用には、センスプライマー（５’−ＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＴＡＧ−３’；配列番号１５：Ｐ９）、アンチセンスプライマー（５’−ＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＴ−３’；配列番号１６：Ｐ１０）を、Ｍフェーズホスホプロテイン１検出用には、センスプライマー（５’−ＡＡＣＧＡＧＣＣＡＡＡＣＧＧＡＡ−３’；配列番号１７：Ｐ１１）、アンチセンスプライマー（５’−ＧＴＡＴＣＣＡＴＣＣＣＣＴＣＡＡＧＣ−３’；配列番号１８：Ｐ１２）を用いた。コントロールとしてのβアクチン検出用（５５１ｂｐ）には、センスプライマーとして（５’−ＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡ−３’；配列番号１９：Ｐ１３）とアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧ−３’；配列番号２０：Ｐ１４）を用いた。これらのＰＣＲプライマーを用い、反応酵素にＥＸＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９４℃で１分間熱変性させ、アニーリングの後に７２℃で３０秒間伸張反応させるというサイクルで３０サイクル（ＫＵ−ＧＢ−３の場合は２８サイクル）繰り返し行った。アニーリング温度はプライマーのＴｍ値［ＫＵ−ＧＢ−３は５９℃、ＫＵ−ＧＢ−４は６２℃、ＳＯＸ５は６３℃、ＳＯＸ６は６１℃、ジンクフィンガーホメオボックスは６２℃、Ｍフェーズホスホプロテイン１は６２℃、コントロールとしてのβアクチンは６８℃］に設定し３０秒間行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（２．０％）にかけ、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、２５４ｎｍの紫外線照射によりバンドを検出した。
上記の結果を、図１（ＫＵ−ＧＢ−３）、図２（ＫＵ−ＧＢ−４）、図３（ＳＯＸ５）、図４（ＳＯＸ６）、図５（ジンクフィンガーホメオボックス）、図６（Ｍフェーズホスホプロテイン１）にそれぞれ示すが、基本的にいずれも精巣において強い発現が認められた。ＫＵ−ＧＢ−３のＲＴ−ＰＣＲでは、肺、ＧＢ１７、ＧＢ１６における発現、及び膵臓、ＧＢ４、及びＴ９８Ｇにおける弱い発現が認められ（図１）、ＫＵ−ＧＢ−４のＲＴ−ＰＣＲでは、ＬＵ９９（肺癌細胞株）、ＥＢＣ１（肺癌細胞株）、ＫＵ７（膀胱癌細胞株）、ＰＣ３（前立腺癌細胞株）、ＭＤＡ２３１（乳癌細胞株）などにおいて弱い発現が認められた（図２）。ＳＯＸ５のＲＴ−ＰＣＲでは、ＧＢ１３、ＧＢ４、胎児脳において強い発現が認められ、脳、ＧＢ１６、Ｕ２５１における発現、及び膵臓、ＧＢ１７における弱い発現が認められた（図３）。ＳＯＸ６のＲＴ−ＰＣＲでは、ＧＢ１３及びＧＢ１７において強い発現が認められ、ＧＢ４において弱い発現が認められた（図４）。ジンクフィンガーホメオボックスのＲＴ−ＰＣＲでは、肺、ＧＢ１７、ＧＩ−１において強い発現が認められ、筋肉、ＧＢ１３、ＧＢ１６、ＧＢ４、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１における発現、及び膵臓、腎臓、胎盤における弱い発現が認められた（図５）。Ｍフェーズホスホプロテイン１のＲＴ−ＰＣＲでは、ＧＩ−１、Ｕ２５１において強い発現が認められた（図６）。
上記の結果から、ＫＵ−ＧＢ−３、ＫＵ−ＧＢ−４、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ジンクフィンガーホメオボックス、Ｍフェーズホスホプロテイン１の遺伝子は、グリオーマを含む癌の遺伝子診断薬や治療薬として有用であることがわかった。なお、精巣における発現については、免疫系から隔離された組織であることから、ＫＵ−ＧＢ−３、ＫＵ−ＧＢ−４、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ジンクフィンガーホメオボックス、Ｍフェーズホスホプロテイン１抗原を実際に免疫療法等に用いる際に精巣の障害が問題となる可能性は殆どないと考えられる。
実施例２（精巣由来のヒトグリオーマ抗原ＳＯＸ６の特性）
ＳＥＲＥＸ法により精巣由来のヒトグリオーマ抗原として同定されたＳＯＸ６の特性についてより詳細に調べてみた。
［組換えＳＯＸ６ＨＭＧボックスタンパク質の調製］
ＳＯＸ６ＨＭＧボックスのｃＤＮＡをｐＥＴ３２ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、かかるタンパク質を、大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）で発現させた。アフィニティ−ＨｉｓであるＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を使用して、組換えＳＯＸ６を精製した。
［ＳＯＸ６ＨＭＧボックスに対する血清反応を評価するためのウェスタンブロット］
精製した組換えＳＯＸ６ＨＭＧボックスと、２％のＳＤＳ、１０％のβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＴｒｉｓ及び２４０ｍＭのグリシンから成る同量のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−サンプル緩衝液をｐＨ８．５で混合し、３分間煮沸した。同量の全タンパク質（１０μｇ）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）の各レーンに添加した。電気泳動を行った後、電気ブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により、かかるゲルをニトロセルロースシート（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に移した。５％のスキムミルクで２時間ブロッキングした後、かかるシートをグリオーマ患者から得た１：１００に希釈した血清を用いて、室温で１時間インキュベーションした。洗浄処理後、かかるブロットを、１：２０００に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）とインキュベーションした。結合した二次抗体を酵素検出するため、ニトロブルーテトラゾリウム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）を使用した。
［ＳＯＸ６ＨＭＧボックスに対する血清反応を調べるためのＥＬＩＳＡ］
１ウェル当たり１００ｎｇの精製した組換えＳＯＸ６ＨＭＧボックスを、９６ウェルのプレートで一晩吸収させた。対照として用いるウェルを、精製した組換えタンパク質ｐＥＴ３２ａプラスミドでコーティングした。ウェルを２％のＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄及びブロッキングを行った後、１００μｌの希釈したヒト血清を添加し、４℃で１時間インキュベーションした。血清を、１：１００から１：５０，０００の範囲の希釈で検査した。ウェルをヒトＩｇＧに対するパーオキシダーゼ結合抗体で１時間洗浄及びインキュベーションした。その後、ＴＭＢ基質（Ｄａｋｏ社製）と反応させ、４５０ｎｍの吸光度で測定した。
［定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット］
蛍光色素であるＳＹＢＲグリーンを使用し、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、文献記載の方法（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，１３２９−１３３３，１９９８）で定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。サーマルサイクラーのパラメータは、９５℃では１０分間であり、また、９５℃で３０秒間の変性を５０サイクル、６０℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１分間の伸長であった。ＳＯＸ６の相対発現量は、以下の手順に従って計算した。すなわち、各組織のβ−アクチンを標準化とし、各サンプルの（ＣＴ）（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｖａｌｕｅ）を正常な脳のＣＴ値によって割ることにより算出した。ＣＴ値は蛍光シグナルがバックグラウンド閾値以上に増加するとき、実際のＰＣＲサイクルとして定義され、それは標的遺伝子のコピー数を示す。
ノーザンブロット法を行うため、１０μｇの全ＲＮＡを１％のホルムアルデヒドアガロースゲル内で電気泳動を行って分画し、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に移した。Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて、放射性同位体で標識したｃＤＮＡ断片を調製した。Ｑｕｉｃｋ  Ｈｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、６５℃で３０分間の前ハイブリダイゼーションを行い、プローブを用いたハイブリダイゼーションを６５℃で一晩行った。かかる膜に対して、０．１％のＳＤＳ中の２ｘＳＳＣを用いて、室温で１５分間、２度の洗浄処理を行った。次に、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ内で、６０℃で３０分間、さらに洗浄処理をした。放射性シグナルは、ＢＡＳ５０００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて検出した。
［２９３Ｔ細胞へのＳＯＸ６の感染］
完全長ＳＯＸ６ｃＤＮＡを、哺乳類発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングした。２９３Ｔ細胞株に、リポフェクタミンＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、線状化したｃＤＮＡを遺伝子導入した。
［核抽出物の単離］
ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．より購入した正常脳組織、グリオーマ組織及び２９３Ｔ細胞を、０．２５Ｍのスクロース中で均質化し、１０分間遠心分離機にかけた。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を補充した０．２５Ｍのスクロース内に、ペレットを再び懸濁した。
［ポリクローナル抗体］
ヒトＳＯＸ６のペプチド（アミノ酸３４９残基〜３６４残基）を認識するウサギ抗ＳＯＸ６アフィニティー精製ポリクローナル抗体を、ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．より購入した。
［ＳＯＸ６の発現を確認するためのウェスタンブロット及びブロッキング］
グリオーマ及び正常脳におけるＳＯＸ６の発現について、上記のアッセイを用いて調べた。２０μｇの全タンパク質を各レーンに添加した。第１の抗体は、ウサギ抗ヒトＳＯＸ６アフィニティー精製ポリクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）であり、第２の抗体は、１：２０００に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｃａｐｐｅｌ社製）であった。ブロッキング実験のため、希釈したＳＯＸ６ポリクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を、１％のＰＢＳ、０．５％のスキムミルク中で２０μｇ／ｍｌの最終濃度でＳＯＸ６を発現する２９３Ｔ細胞でインキュベーションし、その後、上記の通りウェスタンブロットを行った。
［免疫組織化学染色］
腫瘍サンプル及び正常脳組織を１０％のホルマリン中で固定し、免疫組織化学分析のためにパラフィン包埋した。切り取った切片（５μｍ）をポリＬリジンでコーティングした顕微鏡スライド上に載せた。載せた組織切片のパラフィンをキシレンで取り除き（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄ）、再び水和させた。文献記載の通り、抗原を賦活化した（Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８３，１１６−１２３，１９９７）。メタノール中の０．３％の過酸過水素でインキュベーションして、内因性過酸化水素をブロックし、次にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄処理を行った。５％のＢＳＡを含む０．０２ＭのＰＢＳ及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで１時間インキュベーションすることにより、抗体の非特異的結合をブロックした。その後、かかるスライドを、同じブロッキング溶液中で希釈した抗ヒトＳＯＸ６ウサギポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を用いて、４℃で一晩インキュベーションした。スライドを第２の抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ、抗ウサギ抗体；Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｉｎ  ＭＡＸ  ＰＯ（Ｒ）、ＮＩＣＨＩＲＥＩ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社製）で、３７℃で３０分間インキュベーションし、ＤＡＢを用いてＨＲＰ標識を可視化した。これらの切片を、ヘマトキシリンで軽く対比染色した。各工程の後で、ＰＢＳ中で３回洗浄処理を行った。
腫瘍の増殖活性度を評価するため、切片をモノクローナル抗体であるＭＩＢ−１で染色した。ｐＨ７の１０ｍＭのクエン酸緩衝液中のワックスを取り除き再び水和させた切片を、６００ワットの電子レンジで４分間、５回処理した。３％のウマ血清を含む５％のウシ血清アルブミンを用いて、室温で１時間の処理を行った後、切片をＭＩＢ−１（１：５０に希釈、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）で一晩、４℃でインキュベーションした。ＤＡＢを用いたアビジン−ビオチン複合手法（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により、１次抗体を可視化した。切片を、ヘマトキシリンで軽く対比染色した。免疫陽性の核を最も多く発現した３つ以上の領域の１０００個以上の腫瘍細胞を用いて、増殖細胞指数を分析した。かかる分析は、コンピュータでアシストされた画像分析機（Ｌｕｚｅｘ，Ｆ，Ｎｉｒｅｃｏ社製）を用いて行った。
［ＳＯＸ６に特異的なＩｇＧ抗体の存在を調べるための健常者、グリオーマ患者及び各種癌患者由来の血清の分析］
各種患者に対してＳＥＲＥＸ法を用いた血清スクリーニングを行い、ＳＯＸ６に応答する抗体の特異性及び関連性を確認した。年齢２０〜７８歳の、グリオーマ患者３６人、他の脳疾患患者１４人、各種癌患者５４人及び健常人３７人から得た血清を１００倍に希釈して、ＳＯＸ６に特異的なＩｇＧ抗体のスクリーニングに用いた。ＳＯＸ６の転写産物は、３６人のグリオーマ患者のうち１２人（３３．３％）において血清応答を誘導した。しかしＳＯＸ６の転写産物は、１４人の他の脳疾患患者のうち０人（０％）及び５４人の他の癌患者のうち１人（１．９％）でしか血清応答を誘導しなかった。成人健常人３７人から得た血清では、１人を除いて前記タンパク質に対する抗体は検出されなかった（表４）。
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［ＳＯＸ６タンパク質の免疫原性エピトープ］
ＳＯＸ６のＤＮＡ結合部位である保存されたＨＭＧボックスドメインがグリオーマ患者血清由来のＩｇＧによって認識される可能性があることが示唆されたので、ＳＯＸ６のＨＭＧボックスをコードする配列をｐＥＴ３２ａベクター中でサブクローニングを行い、Ｈｉｓタグ化された組換えタンパク質を調製した。まず、ＳＯＸ６のＨＭＧボックスに対する血清反応性をウェスタンブロット法で調べた。ＳＥＲＥＸ法でもってＳＯＸ６に対する血清反応が陽性であったグリオーマ患者８人のうち３人から得た血清中のＩｇＧは、組換えにより発現したＨＭＧボックスに対応する３０ｋＤａタンパク質を検出した（図７）。予測される免疫原性エピトープをさらに定量的に確認するために、ＳＯＸ６ＨＭＧボックスタンパク質に対する血清学的反応をＥＬＩＳＡ法で調べた。その結果、Ｈｉｓに対する血清学的反応性は、健常人においてもＳＯＸ６に対する抗体を有するグリオーマ患者においてもほとんど観察されなかった。一方、血清抗体のＳＯＸ６のＨＭＧボックスに対する反応性については、ウェスタンブロット法による結果と同様に、健常人と前記グリオーマ患者との間では有意な差が観察された（図８）。
［ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロットを用いたグリオーマ組織及び正常組織中のＳＯＸ６遺伝子発現の分析］
グリオーマ組織及び健常成人組織におけるＳＯＸ６遺伝子発現量を調べるために、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、グリオーマと健常成人脳との間のＳＯＸ６遺伝子発現に関する違いを評価した。健常成人脳と比較して分析を行った全てのグリオーマ組織において、ＳＯＸ６が著しく多量に発現した（図９）。
これまでに、長短２つの転写物が、マウスＳｏｘ６遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，４１８０−４１８５，２０００；Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７，５７１８−５７３３，１９９８）及びヒトＳＯＸ６遺伝子（Ｇｅｎｅ  ２６５，１５７−１６４，２００１）から検出されることが報告されている。かかる転写物の長さの違いは、３’末端の非翻訳領域及び５’末端の非翻訳領域の両方の大きさが異なることにより生じるようである（Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７，５７１８−５７３３，１９９８）。短い転写物は成人精巣において特異的に発現し、長い転写物はマウス脳（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３３６５−３３７２，１９９５）や軟骨細胞（Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７，５７１８−５７３３，１９９８）の発達時に発現するが、該転写物は成人のかかる組織では消滅している。
どの転写物がグリオーマ中で発現するかを調べるため、ノーザンブロット法によりヒトグリオーマ中のＳＯＸ６ｍＲＮＡの発現を調べた（図１０）。ＳＯＸ６の長い転写物は、ヒト胎児脳において発現するが、成人の脳では発現しなかった。短い転写物は、主に精巣で発現した。グリオーマ組織において、長い転写物は、非常に多量に発現していた。結論的には、ＳＯＸ６遺伝子は、ヒト神経発達の初期段階において発現し、成人精巣及びグリオーマにおいては選択的に発現していた。
［グリオーマにおけるＳＯＸ６タンパク質の選択的発現］
ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法で、ＳＯＸ６タンパク質の発現を評価した。該抗体は、ＳＯＸ６ｃＤＮＡを感染させた２９３Ｔ細胞においてＳＯＸ６タンパク質の９０ｋＤａのバンドを検出した。一方、該抗体は、ＳＯＸｃＤＮＡを感染させていない２９３Ｔ細胞においてかかるバンドを検出しなかった（図１１左）。ＳＯＸ６タンパク質はグリオーマにおいて発現していたが、健常な脳組織において発現しなかった。このようなグリオーマにおけるＳＯＸ６タンパク質の選択的発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲ法及びノーザンブロット法によって得られた結果と一致していた。
ＳＯＸ６を発現する２９３Ｔ細胞と上記ポリクローナル抗体と共にインキュベーションすることにより、この抗体の特異性を確認した。免疫ブロット法における９０ｋＤａシグナルがこのポリクローナル抗体を用いたブロッキング実験において消失している（図１１右）が、このことは前記抗体がＳＯＸ６を特異的に認識することを示している。
［グリオーマにおけるＳＯＸ６の免疫組織化学的分析］
ＳＯＸ６に対する抗体を用いて、ホルマリンで固定した腫瘍から切片化した試料を分析し、またＭＩＢ抗原を用いて増殖活性を評価した。分析した１８種類のグリオーマ組織全てが核腫瘍細胞中でＳＯＸ６を発現していた。一方、大脳皮質由来の非腫瘍性組織において、ＳＯＸ６陽性の細胞は検出されなかった（図１２及び表５）。図１２には、大脳皮質由来の非腫瘍性組織（図１２Ａ）、びまん性星細胞腫（ケースＯＡ４；図１２Ｂ）、退形成星細胞腫（ケースＡＡ１；図１２Ｃ）、膠芽腫（ケースＧＢ４；図１２Ｄ）の各組織におけるＳＯＸ６発現の免疫組織化学的分析の結果が示されている。
グリオーマにおける組織的悪性腫瘍、増殖及び血清反応性とＳＯＸ６発現との相互関連が表５としてまとめられている。ＳＯＸ６に対するＩｇＧ抗体を有する患者から得た全ての腫瘍組織において、ＳＯＸ６の発現が確認された。さらに、グリオーマにおけるＳＯＸ６の発現と増殖活性との関連性の可能性を評価したが、両者の間に明確な関連性はみられなかった。
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上記実施例から、３３％以上のグリオーマ患者において免疫反応を引き起こす新規のグリオーマ発現抗原としてＳＯＸ６を明らかにした。ＳＯＸ６タンパク質に対する高頻度の免疫応答はＳＯＸ６遺伝子の高発現によって生起すると思われる。さらに、ＳＯＸ６は正常組織での発現は限定されるが、グリオーマ組織において主に発現する。以上の結果により、ＳＯＸ６がグリオーマの診断手段及び治療の開発における有用な標的となりうることが示された。
産業上の利用可能性
本発明の精巣由来のグリオーマ抗原及び／又はグリオーマ抗原遺伝子は、グリオーマ等の癌に対する治療や診断に有用であり、またグリオーマ発症に関する基礎的知見を得る上でも有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＲＴ−ＰＣＲによるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−３の発現解析の結果を示す写真である。
第２図は、ＲＴ−ＰＣＲによるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−４の発現解析の結果を示す写真である。
第３図は、ＲＴ−ＰＣＲによるＳＯＸ５（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｏｎ  Ｙ−ＢＯＸ５）の発現解析の結果を示す写真である。
第４図は、ＲＴ−ＰＣＲによるＳＯＸ６（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｏｎ  Ｙ−ＢＯＸ６）の発現解析の結果を示す写真である。
第５図は、ＲＴ−ＰＣＲによるジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １Ｂ）ホメオボックスの発現解析の結果を示す写真である。
第６図は、ＲＴ−ＰＣＲによるＭフェーズホスホプロテイン１の発現解析の結果を示す写真である。
第７図は、組換えＳＯＸ６ＨＭＧボックスタンパクに対するグリオーマ患者血清中のＩｇＧ抗体反応のウェスタンブロット解析による結果を示す写真である。
第８図は、組換えＳＯＸ６ＨＭＧボックスタンパクに対するグリオーマ患者血清中のＩｇＧ抗体反応のＥＬＩＳＡ解析による結果を示す図である。図中のバーは中央値を示し、ａＰ＜０．０１はｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔを示す。
第９図は、ＲＴ−ＰＣＲによるＳＯＸ６（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｅｏｎ  Ｙ−ＢＯＸ６）の発現解析の結果を示す図である。
第１０図は、グリオーマ組織におけるＳＯＸ６のノーザンブロット解析の結果を示す写真である。左パネルは正常組織（精巣、胎児脳、及び成人脳）におけるＳＯＸ６の発現を示し、右パネルはグリオーマ組織標本におけるＳＯＸ６の発現を示す。
第１１図は、グリオーマ組織におけるＳＯＸ６のウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。右パネルはＳＯＸ６抗体に対する吸収反応後の結果を示す。
第１２図は、グリオーマ及び正常脳組織におけるＳＯＸ６発現の免疫組織化学的分析の結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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