(57)【要約】肥満および／または糖尿病の治療薬の有効成分物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、細胞または動物個体に候補物質を作用させ、以下の基準：（ａ）核内受容体ＥＲＲのリガンド因子ＥＲＲＬ１の発現量を増加させる；（ｂ）核内受容体ＥＲＲの転写活性を増加させる；（ｃ）ＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合を促進させる；（ｄ）ＭＣＡＤ遺伝子産物の発現量を増加させる、のいずれか１以上を満たす候補物質を目的の有効成分物質として特定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満および／または糖尿病の治療薬の有効成分物質をスクリーニングする方法であって、細胞または動物個体に候補物質を作用させ、以下の基準：
（ａ）核内受容体ＥＲＲのリガンド因子ＥＲＲＬ１の発現量を増加させる；
（ｂ）核内受容体ＥＲＲの転写活性を増加させる；
（ｃ）ＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合を促進させる；
（ｄ）ＭＣＡＤ遺伝子産物の発現量を増加させる
のいずれか１以上を満たす候補物質を目的の有効成分物質として特定することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法によって特定された１以上の物質を有効成分として含有する肥満および／または糖尿病の治療薬。
【請求項３】
核内受容体ＥＲＲのリガンド因子ＥＲＲＬ１をコードする精製ポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡに保有し、リガンド因子ＥＲＲＬ１を過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、核内受容体ＥＲＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のリガンド因子ＥＲＲＬ１発現および活性を指標として新規の肥満および／または糖尿病治療薬をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】  核内受容体によって調整される遺伝子発現の根底にあるもっとも典型的な分子機構は、その受容体のリガンド（例えば、ステロイド、レチノイン酸、甲状腺ホルモンおよびビタミンＤ３といった小さな脂溶性分子）の結合によって開始される（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８３：８３５−８３９，１９９５）。このようなリガンドの内在レベルは、多段階の酵素反応を経て産生および／または分解へと至るように厳格に調整されている（Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉ，Ｐ．＆  Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４７：３２１−３３７，２０００）。また、このようなリガンド類はまとめて脂溶性リガンドまたは内分泌系脂溶性ホルモンと呼ばれている。リガンドレベルを変えることにより、内分泌系は、体外または体内環境の変化に対して適応、つまりホメオスタシスに貢献している（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８３：８３５−８３９，１９９５；Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０：６８９−７２５，１９９９）。このシステムは、リガンドの産生が複雑に制御されているので、ゆっくりと長期に適応させるには有利に見えるが、迅速に適応させるには不利に思える。一方、ゲノム分析によって、数多くの核内受容体様分子が存在することが予測されているが、それらに固有の脂溶性リガンドが同定されているものは現在までほとんど知られていない。これらの分子は、まとめてｏｒｐｈａｎ受容体（孤児受容体）と呼ばれている（Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０：６８９−７２５，１９９９）。孤児受容体の活性化メカニズムはまったく分かっていない。エストロゲン受容体関連タンパク質１および２（ＥＲＲ１および２）がまず初めに孤児受容体として同定され（Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：９１−９４，１９８８；Ｓｈｉｇｅｔａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９：２９９−３０９，１９９７）、またその第三メンバー（ＥＲＲ３）が近年単離されている（Ｅｕｄｙ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５０：３８２−３８４，１９９８；Ｈｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２６１８−２２６２６，１９９９）。ＥＲＲおよびエストロゲン受容体は構造的に互いに類似性があるが、ＥＲＲはエストロゲンに反応しない（Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０：６８９−７２５，１９９９）。一方、ＥＲＲ１は中鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）、すなわちミトコンドリア脂肪酸β酸化の主要酵素をコードする遺伝子に対する重要な転写レギュレーターとして作用すると提唱されている（Ｓｌａｄｅｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５４００−５４０９，１９９７；Ｖｅｇａ，Ｒ．Ｂ．＆  Ｋｅｌｌｙ，Ｄ．Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１６９３−３１６９９，１９９７）。これらの知見によって、ＥＲＲに媒介される遺伝子調節が、一般的には身体的運動によって誘導される脂肪酸β酸化を調節することによって、体内におけるエネルギーバランスを制御するに重要な役割を果たしているという可能性が導き出されている（Ｈｏｒ���ｗｉｔｚ，Ｊ．Ｆ．＆  Ｋｌｅｉｎ，Ｓ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒｉ．７２：５５８Ｓ−５６３Ｓ，２０００）。従って、適切な身体的運動を毎日行うことが、肥満および糖尿病に対抗するもっとも簡単でもっとも有効な方法であるとされている（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８：３３２−３３６，２０００）。
以上のとおり、核内の孤児受容体ＥＲＲがＭＣＡＤ遺伝子発現の調節因子として作用し、このＭＣＡＤ遺伝子発現が脂肪酸β酸化を調節することによって体内におけるエネルギーバランスを制御し、これによって肥満や糖尿病に対する抵抗性を維持できると考えられる。しかしながら、このような一連のメカニズムの起点となる受容体ＥＲＲへのリガンド分子は未だ特定されていない。
一方、核内受容体分野における研究者達によって、ＳＲＣ１／ｐ１６０族（Ｏｎａｔｅ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１３５４−１３５７，１９９５）、Ｐ／ＣＡＦ（Ｂｌａｎｃｏ，Ｊ．Ｃ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：１６３８−１６５１，１９９８）およびＣＢＰ／ｐ３００（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：９９−１０３，１９９６；Ｋａｍｅｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８５：４０３−４１４，１９９６）といった数種類の転写補助因子タンパク質が核内受容体のリガンドに依存する転写を活性化させるに重要な役割を果たすということが明らかにされた。これらはいわゆる共活性因子（コアクチベーター）と呼ばれ、あまねく広く発現して、またその発現レベルは、細胞が分化している間変化することはなく、また外的および内的環境の変化に対応して変化することもないようである。さらに最近になって、ＰＰＡＲγ共活性因子−１（ＰＧＣ−１）と称されるユニークな共活性因子が同定されている（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９２：８２９−８３９，１９９８）。この共活性因子は、組織特異的かつ調整された発現をする点で他の共活性因子から区別される。すなわち、ＰＧＣ−１は褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、骨格筋、心臓、腎臓、脳において様々なレベルで発現され、ＢＡＴにおいては、寒冷ストレスに急に曝された後、あきらかに発現誘導される（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９２：８２９−８３９，１９９８）。ＰＧＣ−１はまた絶食状態下においては、肝臓（Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：１３１−１３８，２００１）および心臓（Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：８４７−８５６，２０００）中で発現誘導される。
ＰＰＡＲγは、脂質生成の重要レギュレーターであることが知られており（Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７９：１１４７−１１５６，１９９４）、その発現は脂肪細胞分化中に増大する。また、糖尿病におけるインスリン抵抗性改善薬として開発されたチアゾリジン（ＴＺＤ）がこのＰＰＡＲγのリガンドとして働くことが示され（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２９５３−１２９５６，１９９５）、ＰＰＡＲγの転写能活性化を指標とする新規糖尿病薬のスクリーニングが広く行われている。
しかしながらＰＰＡＲγの共活性因子であるＰＧＣ−１  ｍＲＮＡ量は、３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞分化中には極めて低レベルである。従って、脂肪細胞分化中に機能するＰＧＣ−１とよく似た分子の存在が推定されていたが、この出願の発明者らは、ＰＰＡＲγの新規結合因子ＰＧＣ２を同定し、インスリン抵抗性糖尿病薬を開発するための手段として、ＰＧＣ２−ＰＰＡＲγ複合体の転写活性を調節するリガンド（特に、ＰＧＣ２−ＰＰＡＲγ複合体の活性を低下させるリガンド）のスクリーニング方法を特許出願している（特開２００２−０５８４８９号公報）。
【発明の開示】
この出願の発明者らは、肥満や糖尿病に対する抵抗性遺伝子ＭＣＡＤの発現調節因子である核内受容体ＥＲＲのリガンド因子を探索した結果、この因子が、ＰＰＡＲγのリガンド因子として先に同定されたＰＧＣ２であることを見出し、このタンパク質因子をＥＲＲＬ１（ＥＲＲ  ｌｉｇａｎｄ１の略）と命名した。
この出願の発明は、発明者らによるこのような新規な知見に基づくものであり、ＰＰＡＲγの作用機序とは全く異なり、核内受容体ＥＲＲおよびその標的遺伝子ＭＣＡＤが関与する抗肥満および抗糖尿病の内在性経路をターゲットとする薬剤スクリーニング方法を提供することを課題としている。
この発明は、前記の課題を解決するものとして、肥満および／または糖尿病の治療薬の有効成分物質をスクリーニングする方法であって、細胞または動物個体に候補物質を作用させ、以下の基準：
（ａ）核内受容体ＥＲＲのリガンド因子ＥＲＲＬ１の発現量を増加させる；
（ｂ）核内受容体ＥＲＲの転写活性を増加させる；
（ｃ）ＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合を促進させる；
（ｄ）ＭＣＡＤ遺伝子産物の発現量を増加させる
のいずれか１以上を満たす候補物質を目的の有効成分物質として特定することを特徴とする方法を提供する。
またこの発明は、前記のスクリーニング方法によって特定された１以上の物質を有効成分として含有する肥満および／または糖尿病の治療薬を提供する。
さらにこの発明は、核内受容体ＥＲＲのリガンド因子ＥＲＲＬ１をコードする精製ポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡに保有し、リガンド因子ＥＲＲＬ１を過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
なおこの発明において、「ポリヌクレオチド」とはプリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が結合した分子を意味する。具体的には、タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡである。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。また「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＥＲＲＬ１およびＰＧＣ−１の間の一次アミノ酸配列の比較である。星印は同一のアミノ酸を示す。数字は、最初のメチオニンを１としたアミノ酸の位置を示す。ＬＸＸＬＬモチーフは太字で表す。下線はグルタミン酸（Ｅ）繰り返しおよびセリン−アルギニン（ＳＲ）に富む領域である。推定ＲＮＡ結合モチーフは箱で囲まれている。暫定的ドメインの境界は垂直線で示される。今回新たに同定したＥＲＲＬ１のスプライシング変異体は、３９のアミノ酸（１５６番目のロイシンから１９４番目のリジン）が欠けていた。
図２は、ＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡの発現プロフィル。Ａは、様々な成熟マウス組織由来の２０μｇの全ＲＮＡをＥＲＲＬ１、ＰＧＣ−１、ＰＲＣ、ＥＲＲ１、ＥＲＲ３  ｃＤＮＡをプローブとして使用して分析した結果である。２８Ｓ  ＲＮＡのエチジウムブロマイド染色も示す。Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１細胞をデキサメタゾン、１−メチル−３−イソブチルキサンチンおよびインシュリン（０日目に添加）による処理によって脂肪細胞に分化誘導し、ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析した結果である。ブロットは続いて、それぞれのプローブとハイブリダイズした。Ｃは、３Ｔ３−Ｌ１および１０Ｔ１／２細胞中のＥＲＲＬ１、ＥＲＲ１およびＭＣＡＤ  ｍＲＮＡの発現（−：前脂肪細胞、＋：成熟脂肪細胞）を観察した結果である。
図３は、ＰＧＣ−１およびＥＲＲＬ１の種々の核内受容体の「タンパク質リガンド」としてのプロフィル。様々な核内受容体に対するＰＧＣ−１（Ａ）およびＥＲＲＬ１（Ｂ）の転写活性化能をトランスフェクションアッセイで調べた。実験を三連で行い、得られた平均値を誘導倍率として示し、ここでは、ＰＧＣ−１およびＥＲＲＬ１の非存在下での各々のＧＡＬ４融合核内受容体のＬｕｃ活性が基準値とされている。エラー・バーは標準偏差。Ｃは、ＥＲＲＥを介する完全長ＥＲＲが媒介する転写に対するＥＲＲＬ１の投与量に依存した活性。様々な量のｐＣＭＸ−ＥＲＲＬ１（０−から２００ｎｇ）は、ＣＶ−１細胞における２５０ｎｇのＴＫ−ＬｕｃまたはＥＲＲＥ−Ｌｕｃの存在下、３０ｎｇのｐＣＭＸ−ＥＲＲ１またはｐＣＭＸ−ＥＲＲ３と共にトランスフェクトされた。実験を三連で行いその平均値が誘導倍率として示される。ここでは、ＥＲＲＬ１の非存在下でＴＫ−ＬｕｃのＬｕｃ活性が基準値となる。エラー・バーは標準偏差。Ｄは、３５Ｓ標識ＥＲＲＬ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＳＴ−ＥＲＲ１およびＧＳＴ−ＥＲＲ３と強力な相互関係を示すことを確認した結果である。オートラジオグラフは、プルダウンされたタンパク質（ＧＳＴ−ＥＲＲ１およびＧＳＴ−ＥＲＲ３）、およびＧＳＴプルダウン分析に対して使用された３５Ｓ標識ＥＲＲＬ１の全量の１０％（Ｉｎｐｕｔ）を示す。この分析に使用されたＧＳＴ融合タンパク質を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＣＢＢ染色も示されている。Ｅは、１０Ｔ１／２細胞におけるＥＲＲ１またはＥＲＲ３と組み合わされたＥＲＲＬ１またはＰＧＣ−１の外来性発現によるＭＣＡＤ  ｍＲＮＡの発現増加を示した結果である。細胞が集密後一日して、全ＲＮＡを単離し、ＭＣＡＤおよびＥＲＲＬ１  ｃＤＮＡをプローブとして使用してノーザン・ブロット（レーンあたり２０μｇ）によって分析した。ＭＣＡＤ  ｍＲＮＡの相対的デンシメトリー値も各レーンの下に記載した。
図４は、ＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスの作成。Ａは、ＥＲＲＬ１トランスジーンおよびサザンブロット（プローブ１）およびノーザンブロット（プローブ１およびプローブ２）に使用されたプローブの位置の概略図を示す。Ｂは、二つのトランススジェニック系（Ａ１およびＡ２）において、各々トランスジーンの１０および１２のコピーが含まれていることを示す結果である。Ｃは、ＥＲＲＬ１マウス（Ａ１系）および同腹子のコントロールマウス由来の各組織におけるＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析の結果である。各レーンは、２０μｇの全ＲＮＡを含んでいる。Ｄは、ＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスおよび野生型コントロールマウスの骨格筋におけるＥＲＲＬ１、ＭＣＡＤ、ＡＣＣ２およびＵＣＰ−３の発現を測定した結果である。各グループの３匹のマウスを調べた。ノーザンシグナルの定量値（コントロールは１００％）を右に示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ（＊はｐ＜０．０５）。
図５は、ＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスの表現型。Ａは、食物摂取を毎週測定し、表示された期間におけるマウスあたりの累積食物摂取を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ（動物グループあたりｎ＝６、エラー・バーは記号より小さい、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１）を示す。Ｂは、ＥＲＲＬ１トランスジェニックマウス（黒丸）と野生型コントロール（白丸）の体重変化を示す結果である。値は、体重の平均±ｓ．ｅ．ｍ（動物グループあたりｎ＝６、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１）を示す。幾つかのデータポイントにおいて、エラーバーは記号よりも小さい。Ｃは、ＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスにおける腹部脂肪の減少を示す結果である。Ｄは、野生型コントロールマウスとＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスの精巣上体のＷＡＴ重量の比較である。カラムは、ＷＡＴ重量±ｓ．ｅ．ｍ．（動物グループあたり  ｎ＝６、＊はＰ＜０．０５）を示す。Ｅは、ＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスと同腹の野生型コントロールマウスの白色脂肪組織の形態の比較である。目盛りは５０μｍを示す。Ｆは、脂肪細胞の平均直径。細胞の直径はＥに示された切片から測定された（ｎ＝２０、＊＊はＰ＜０．０１）。ＧおよびＨは、１２週齢のコントロールマウスとＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスにおける、休息時（Ｇ）および全体（Ｈ）のエネルギー消費を示した結果である。カラムはエネルギー消費の平均値±ｓ．ｅ．ｍ（動物グループにつきｎ＝６、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１）を示す。
図６Ａは、ＫＫＡｙ（＋）ＥＲＲＬ１（−）（白四角、ｎ＝８）、ＫＫＡｙ（−）ＥＲＲＬ１（−）（白丸、ｎ＝５）、ＫＫＡｙ（＋）ＥＲＲＬ１（＋）（黒四角、ｎ＝５）、ＫＫＡｙ（−）ＥＲＲＬ１（＋）（黒丸、ｎ＝５）オスマウスの体重変化を測定した結果である。各グループの体重曲線を繰り返し測定分析（スーパーＡＮＯＶＡ）によって比較した。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１。図６Ｂは、１２週齢のオスＫＫＡｙ（＋）ＥＲＲＬ１（−）（左）、ＫＫＡｙ（＋）ＥＲＲＬ１（＋）（中央）、ＫＫＡｙ（−）ＥＲＲＬ１（−）（右）マウスの典型的な写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明におけるリガンド因子ＥＲＲＬ１は、例えば特開２００２−０５８４８９号公報の配列番号１に「マウスＰＧＣ２」として開示されているマウスＥＲＲＬ１（配列番号２）である。さらにこのリガンド因子ＥＲＲＬ１としては、そのスプライシング変異体（配列番号２の１５６番目のロイシンから１９４番目のリジンまでの３９アミノ酸が欠失したもの）を対象とすることもできる。またマウスＰＧＣ２のヒトホモログとして公知のヒトＰＥＲＣ（ＰＰＡＲγ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  β１：Ｅｎｔｒｅｚ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  Ｎｏ．ＮＰ＿５７３５７０）もヒトＥＲＲＬ１としてこの発明の対象とすることができる。またマウスＥＲＲＬ１をコードするポリヌクレオチドとしては、特開２００２−０５８４８９号公報の配列番号２に塩基配列が開示されているマウスＰＧＣ２  ｃＤＮＡ（ＥＲＲＬ１  ｃＤＮＡ：配列番号１）を用いることができる。さらにヒトＥＲＲＬ１をコードするポリヌクレオチドは、前記ヒトＰＥＲＣ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿１３３２６３）を用いることができる。さらにまた、例えばヒトＰＲＲＣ遺伝子は染色体５ｑ３３．１領域に存在し、そのゲノム配列が公知である（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＴ＿０２９２８９）。従って、このゲノム遺伝子配列に存在するプロモーター領域を利用してこの発明を実施することもできる。
この発明における核内受容体ＥＲＲは、ＥＲＲ１、ＥＲＲ２またはＥＲＲ３（Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：９１−９４，１９８８；Ｓｈｉｇｅｔａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９：２９９−３０９，１９９７；Ｅｕｄｙ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５０：３８２−３８４，１９９８；Ｈｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２６１８−２２６２６，１９９９）のいずれか１以上を対象とすることができる。またそれぞれをコードするｃＤＮＡも公知である。例えばＥＲＲ１  ｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４４５１として公知であり、ゲノム遺伝子（染色体１１ｑ１３領域）の配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＴ＿０３３９０３として公知である。従って、この発明はこれらのポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび遺伝子プロモーター領域のＤＮＡ断片等）を用いて実施することができる。さらにＭＣＡＤ遺伝子もそのｃＤＮＡが公知である（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ２５１０４３）。
以上のポリヌクレオチドは、それぞれ公知のヌクレオチド配列またはその一部配列からなるＤＮＡ断片をプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。得られたポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、ｃＤＮＡの場合には、公知配列に基づいて合成したプライマーを用いて、細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても目的ｃＤＮＡを得ることもできる。
この発明の肥満および／または糖尿病の治療薬の有効成分物質をスクリーニングする方法は、細胞または動物個体に候補物質を作用させ、前記のタンパク質因子またはそれらをコードするポリヌクレオチドを対象として、以下のいずれか１以上の基準を満たす候補物質を目的物質として特定する。
（ａ）リガンド因子ＥＲＲＬ１の発現量を増加させる。
（ｂ）核内受容体ＥＲＲの転写活性を増加させる。
（ｃ）ＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合を促進させる。
（ｄ）ＭＣＡＤ遺伝子産物の発現量を増加させる。
すなわち先に説明したとおり、核内受容体ＥＲＲがＭＣＡＤ遺伝子発現の調節因子として作用し、このＭＣＡＤ遺伝子発現が脂肪酸β酸化を調節することによって体内におけるエネルギーバランスを制御し、これによって肥満や糖尿病に対する抵抗性が維持されている。そして、後記の実施例に示したように、ＥＲＲＬ１がこのような一連のメカニズムの起点となる受容体ＥＲＲへのリガンド分子であり、実際にＥＲＲＬ１の発現昂進がマウスの肥満や糖尿病に対する抵抗性獲得に顕著な効果を示すことが確認された。すなわち前記（ａ）〜（ｄ）の基準を満たす物質は、抗肥満および抗糖尿病メカニズムのプロセスにおいてそれぞれ作用する物質である。
この発明の方法において、「候補物質」とは、未知および既知の有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を含有する。「細胞」とは、株化されたヒト細胞または非ヒト動物細胞、あるいはヒトまたは非ヒト動物個体の組織から単離し、培養条件下に適切に保たれた細胞である。株化細胞としては、３Ｔ３−Ｌ１細胞株等の脂肪細胞を例示することができる。すなわち、後記実施例に示すように、ＥＲＲＬ１タンパク質の発現はこの脂肪細胞の分化中に敏感に反応するため、目的物質の探索のための好ましい細胞である。あるいは、株化細胞や細菌（大腸菌等）にＥＲＲＬ１  ｃＤＮＡおよび／またはＥＲＲ  ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞であってもよい。また、動物個体から単離した細胞としては、ＥＲＲＬ１タンパク質が高度に発現されているＢＡＴ、心臓、骨格筋または腎臓等から単離した細胞を例示することができる。一方、非ヒト動物個体（例えばマウス）を対象とする場合には、この動物個体に候補物質を投与（全身または局所）、もしくは摂食ないしは摂飲させ、その動物個体の組織または細胞における前記基準（ａ）〜（ｄ）を測定する。その際に、この発明によって提供されるトランスジェニック非ヒト動物を正の対照とすることができる。すなわち、このトランスジェニック非ヒト動物はＥＲＲＬ１タンパク質を過剰発現し、その結果として受容体ＥＲＲおよびＭＣＡＤ遺伝子を高度に発現しているため、候補物質を投与した野性型マウスがこのトランスジェニック動物と同定度に前記基準を満たすか否かを測定することによって、候補物質の効果をより正確に判定することができる。また、このトランスジェニック非ヒト動物や野性型動物個体を対象とする場合には、高脂肪食の摂取、身体運動負荷等の処置を行うことや、あるいは摂食量や体重、エネルギー消費等を判定基準に加えることもできる。
前記の基準（ａ）〜（ｄ）の判定は、それぞれの遺伝子発現をその転写産物（ｍＲＮＡやタンパク質）の量を公知の方法によって測定することによって行うことができる。例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２５，１６９−１９３（２０００）、およびそこで引用されている文献）、ＤＮＡアレイ解析法（Ｍａｒｋ  Ｓｈｅｎａ編、”Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年３月））などの公知の方法によって前記の基準（ａ）〜（ｄ）の判定が可能である。こうした技術を利用した肥満および／または糖尿病の治療薬の有効成分物質のスクリーニング、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明に含まれる。具体的は判定としては、例えば以下の方法が例示される。
（Ａ）リガンド因子ＥＲＲＬ１の発現量を増加させる物質のスクリーニング
ＥＲＲＬ１遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼｃＤＮＡと融合させたレポータープラスミッドを作成し、このレポータープラスミッドを細胞にトランスフェクション後、検討する候補物質を細胞に添加し、数日後に培養細胞抽出液内でのルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼの活性を測定する。候補物質の添加によって、ルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼの上昇が観察されれば、この物質には、ＥＲＲＬ１遺伝子のプロモーターを活性化させる能力がある可能性が強く示唆される。つぎに、この候補物質を培養細胞に添加し、その後ＥＲＲＬ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量の増加をノーザンブロット法や定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等で評価する。同様に培養細胞を用いてＥＲＲＬ１タンパク質の発現量の増加を抗ＥＲＲＬ１抗体を用いたウエスタンブロット法で評価することもできる。あるいは、候補物質を非ヒト動物に摂取させ、動物から単離した細胞（例えば、ＢＡＴ、心臓、骨格筋または腎臓等）におけるＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡ量やＥＲＲＬ１タンパク質量の増加を同様に評価してもよい。
（Ｂ）核内受容体ＥＲＲの転写活性を増加させる物質のスクリーニング
培養細胞に、プロモーター領域にＥＲＲ応答配列もしくは、ｇａｌ４応答配列を持つルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼのレポータープラスミッドを、それぞれ全長ＥＲＲ蛋白質、もしくはＥＲＲのリガンド結合領域とｇａｌ４のＤＮＡ結合領域とを融合させた蛋白質の発現ベクターと一緒にトランスフェクション後、検討する候補物質を細胞に添加し、数日後に培養細胞抽出液内でのルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼの活性を測定する。候補物質の添加によって、応答配列の存在に依存してルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼの上昇が観察されれば、この物質には、ＥＲＲの転写を活性化させる能力がある可能性が強く示唆される。つぎに、この候補物質を培養細胞に添加し、ＥＲＲの標的遺伝子、たとえばＭＣＡＤ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の増加をノーザンブロット法や定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等で評価する。同様に培養細胞を用いてＥＲＲの標的遺伝子産物、たとえばＭＣＡＤ蛋白質の発現量の増加を抗ＭＣＡＤ抗体を用いたウエスタンブロット法で評価する。あるいは、候補物質を非ヒト動物に摂取させ、動物から単離した細胞（例えば、ＢＡＴ、心臓、骨格筋または腎臓等）におけるＭＣＡＤ  ｍＲＮＡ量やＭＣＡＤタンパク質量の増加を同様に評価してもよい。
（Ｃ）ＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合を促進させる物質のスクリーニング
イーストもしくは動物の培養細胞で、Ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ法を用いて、ＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合をルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼの活性として定量する。その系に検討する候補物質を添加した時、非添加の場合に比べてルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼが上昇した場合、この物質には、ＥＲＲＬ１とＥＲＲとの結合を活性化させる能力がある可能性が強く示唆される。続いて、免疫沈降法やＧＳＴ−ｐｕｌ  ｄｏｗｎアッセイにこの薬物を添加した場合、共沈するＥＲＲＬ１とＥＲＲのタンパク質量をウエスタンブロット法で評価する。一方、ＥＲＲタンパク質とＥＲＲ応答配列を含むオリゴＤＮＡを用いたゲルレターデイションアッセイで、ＥＲＲＬ１の添加によってｓｕｐｅｒ  ｓｈｉｆｔするシグナルの量がこの候補物質の添加によって増強するかどうかを指標に、この物質にＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合を促進させる効果があるかどうかを確認することができる。さらに、Ｂｉａｃｏｒｅ等の装置を用いた相互作用の検出アッセイ系にこの候補物質を添加することによって、この物質にＥＲＲＬ１とＥＲＲの結合を促進させる効果があるかどうかを確認することができる。
（Ｄ）ＭＣＡＤ遺伝子産物の発現量を増加させる物質のスクリーニング
ＭＣＡＤ遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼｃＤＮＡと融合させたレポータープラスミッドを作成し、このレポータープラスミッドを細胞にトランスフェクション後、検討する候補物質を細胞に添加し、数日後に培養細胞抽出液内でのルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼの活性を測定する。候補物質の添加によって、ルシフェラーゼやβギャラクトシダーゼの上昇が観察されれば、この物質には、ＭＣＡＤ遺伝子のプロモーターを活性化させる能力がある可能性が強く示唆される。つぎに、この候補物質を培養細胞に添加し、その後ＭＣＡＤ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の増加をノーザンブロット法や定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等で評価する。同様に培養細胞を用いてＭＣＡＤタンパク質の発現量の増加を抗ＭＣＡＤ抗体を用いたウエスタンブロット法で評価する。あるいは、前記（Ｂ）の方法と同様に、非ヒト動物におけるＭＣＡＤ  ｍＲＮＡ量やＭＣＡＤタンパク質量の増加を評価してもよい。
なお、前記の各方法において使用する遺伝子組換え技術（組換えＤＮＡ技術）については、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｂ）＆  １０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｅ）＆  １５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２１８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）；Ｊ．Ｃ．Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
また、前記（Ａ）の方法で使用する抗ＥＲＲＬ１抗体、および前記（Ｂ）および（Ｄ）の方法で使用する抗ＭＣＡＤ抗体は、それぞれＥＲＲＬ１タンパク質およびＭＣＡＤタンパク質を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれのタンパク質のエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、精製ＥＲＲＬ１タンパク質やＭＣＡＤタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として用いて動物を免疫した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエローマと融合させてハイブリドーマを作製すれば、モノクローナル抗体を産生することができる。このような抗体の調製は文献（新生化学実験講座１２、分子免疫学、ＩＩＩ抗原・抗体・補体、南江堂、１９９２年；「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”Ｊａｍｅｓ  Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６等）に記載の公知の方法によって行うことができる。さらに、このような抗体を用いた測定方法については、例えば、入江  寛編，「ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和４９年発行；入江  寛編，「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和５３年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２版），医学書院，昭和５７年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和６２年発行；Ｈ．Ｖ．Ｖｕｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ａ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１７８（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｍｉｃｒｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｎｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）など、あるいはそこで引用された文献を参考に実施することができる。
さらにまた、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）の方法において非ヒト動物個体を対象としてスクリーニングを行う場合には、この発明によって提供されるトランスジェニック非ヒト動物を正の対照とすることができる。すなわちこの発明のこのトランスジェニック非ヒト動物はＥＲＲＬ１タンパク質を過剰発現し、その結果として受容体ＥＲＲおよびＭＣＡＤ遺伝子を高度に発現して抗肥満および抗糖尿病特性を示す。従って、このトランスジェニック動物細胞の遺伝子発現をコントロールとして候補物質の個体内作用を判定することができる。
この発明のトランスジェニック非ヒト動物は、公知のトランスジェニック動物作製法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０）に従って作成することができる。すなわち、前記のマウスＥＲＲＬ１ポリヌクレオチドまたはヒトＥＲＲＬ１（ヒトＰＥＲＣ）ポリヌクレオチド（以下、「導入遺伝子」と記載することがある）を非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。非ヒト動物としてはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の実験動物として利用されている動物を対象とすることができるが、近交系が確立しているマウスの使用が好ましい。また、導入遺伝子には、その発現を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー配列を連結する。このプロモーター／エンハンサー配列の選択によって、ＥＲＲＬ１タンパク質を全身性に発現させることもでき、また特定の組織で選択的に発現させることもできる。このような導入遺伝子は、前記のポリヌクレオチドやプロモーター／エンハンサー配列を、導入遺伝子の発現調節に有効な位置関係となるように環状ＤＮＡベクターに挿入連結することによって構築することができる。そして、このベクターＤＮＡを制限酵素で切断した後、ベクター部分を除去したものを全能性細胞に導入する。遺伝子を導入する全能性細胞としては、受精卵、や初期胚、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いることができる。また全能性細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、ＤＮＡの物理的注入（マイクロインジェクション）法が最適である。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認する。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体を野生型動物または他のＦ１動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作成することができる。このようにして作出されたトランスジェニック動物は、全ての体細胞または特定の組織においてＥＲＲＬ１タンパク質を過剰発現し、後記実施例に示したように摂食亢進性でありながら痩身であり、またエネルギー消費が顕著に高いというユニークな特徴を有している。このようなトランスジェニック動物は、前記のスクリーニング方法におけるコントロールとしてばかりか、抗肥満や抗糖尿病の全身レベルでのメカニズムの解明にとっても有用なモデル動物である。
この出願の発明はさらに、前記のスクリーニング方法によって特定された１以上の物質を有効成分として含有する新規の肥満治療薬および／または糖尿病治療薬を提供する。すなわち、この薬剤は、第１にはＥＲＲＬ１発現を増加させる作用、第２にはＥＲＲの転写活性を増加させる作用、第３にはＥＲＲＬ１とＥＲＲの間の相互作用を増加させる作用、第４にはＭＣＡＤ遺伝子産物の発現量を増加させる作用の少なくとも１以上を有するものである。
この発明の治療薬は、前記の有効物質と、薬理学的に許容しうる担体とを均一に混合して製剤化することができる。担体は、薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜に選択することができるが、この発明の薬剤は、経口的にまたは注射により投与しうる単位服用形態にあることが望ましい。懸濁剤およびシロップ剤のような経口液体調製物は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトール類の賦形剤、デンプン、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤およびカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の製剤における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセルを製造する際には、固体の製薬担体が用いられる。また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】１．方法
１．１．データベース探索
ＥＳＴ相同性探索は、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）を使用して行った。
１．２．ＲＮＡ分析
文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，７．２−７．８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）の記載に従ってノーザン・ブロット分析を行った。ＭＣＡＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０７１５９）のｃＤＮＡプローブ、ＰＲＣ（ＢＣ０１３７２０）、ＥＲＲ１（Ｕ８５２５９）、ＥＲＲ２（Ｓ８２４５８）、ＥＲＲ３（ＡＦ１１７２５４）、ＡＣＣ２（ＡＦ２９０１７８）、およびＵＣＰ−３（ＡＦ０３２９０２）はＲＴ−ＰＣＲによって得た。
１．３．転写活性分析
トランスフェクションおよびレポーター分析は、文献（Ｔａｋａｄａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：７３３−７４０，２０００）の記載に従って行った。すなわち、ＧＡＬ４結合配列の４コピーを含むレポーター遺伝子（（ＵＡＳ）４−Ｌｕｃ）を、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と核内受容体のリガンド結合領域を融合したキメラ受容体の発現ベクター（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−核内受容体）の存在または非存在下でＣＶ−１細胞にトランスフェクションして、ＧＡＬ４−核内受容体融合タンパク質の転写活性を測定した（Ｔａｋａｄａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：７３３−７４０，２０００）。すべてのルシフェラーゼ活性を共トランスフェクトされたβガラクトシダーゼ活性によって正常化した。次に述べる核内受容体のリガンド結合ドメインに融合したＧＡＬ４のアミノ酸１−１４７が使用された。マウスＡＲ（アミノ酸６０７−８９９、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ５９５９２）、ヒトＥＲα（ａ．ａ．２５１−５９５，Ｘ０３６３５）、ヒトＧＲ（ａ．ａ．４８９−７７７，Ｍ１０９０１）、ラットＦＸＲ（ａ．ａ．１９０−４６９，Ｕ１８３７４）、ヒトＲＡＲα（ａ．ａ．１２６−４３２，Ｘ０６５３８）、ヒトＲＸＲα（ａ．ａ．２２２−４６２，Ｘ５２７７３）、マウスＰＰＡＲα（ａ．ａ．１５６−４６８，Ｘ５７６３８）、ヒトＰＰＡＲγ１（ａ．ａ．１７６−４７８，Ｌ４０９０４）、ヒトＰＸＲ（ａ．ａ．１１０−４３４，ＡＦ０８４６４５）、ヒトＥＲＲ１（ａ．ａ．１４７−４２２，Ｌ３８４８７）、ヒトＥＲＲ２（ａ．ａ．１７１−４３３，Ｘ５１４１７）、ヒトＥＲＲ３（ａ．ａ．１７３−４３６，ＡＦ０５８２９１）、ヒトＨＮＦ４α（ａ．ａ．１２５−４６５，Ｘ７６９３０）、ヒトＮＯＲ（ａ．ａ．３６１−６２６，Ｄ７８５７９）、ヒトＮＵＲＲ１（ａ．ａ．２６４−５３５，Ｓ７７１５４）、ヒトＲＯＲα１（ａ．ａ．１４０−５２３，Ｕ０４８９７）、ヒトＳＦ１（ａ．ａ．６４−４６１，Ｕ７６３８８）、ヒトＣＯＵＰ（ａ．ａ．１５６−４２３，Ｘ１２７９５）、ヒトＴＲ２−１１（ａ．ａ．１４９−６０３，Ｍ２９９６０）、ヒトＲｅｖＥｒｂＡ（ａ．ａ．１９９−６１４，Ｍ２４８９８）。なお、それぞれの核内受容体の省略名称はＧｅｎｂａｎｋファイルを参照している（Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０：６８９−７２５，１９９９）。ＧＡＬ４−核内受容体の発現プラスミドは、Ｋ．Ｕｍｅｓｏｎｏ博士から供与された。マウスＰＧＣ−１  ｃＤＮＡは、マウスの胎児ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得た。ヒトＥＲＲ１、２、３の完全長のｃＤＮＡは、ＲＴ／ＰＣＲによって得た。増幅産物をｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＭＸ発現ベクター中にサブクローニングし、シークエンシングによって確認した。
１．４．タンパク質相互作用分析
ＥＲＲ１およびＥＲＲ３をＧＳＴとを融合したコンストラクト（発現ベクター）を、文献（Ｋａｍｅｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８５：４０３−４１４，１９９６）の記載に従い、３５Ｓ−ＥＲＲＬ１（ＴＮＴ、プロメガ）と共にインキュベートした後、洗浄し、結合した３５Ｓ−ＥＲＲＬ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、オートラジオグラフィーで定量した。
１．５．安定細胞系
フェニックス２９３細胞（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｇ．Ｐ．Ｎｏｌａｎ博士から贈呈）を使用してレトロウイルスをパッケージングした（Ｇｒｉｇｎａｎｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１４−１９，１９９８）。ＥＲＲ１、ＥＲＲ３およびＧＦＰ（コントロール）のｃＤＮＡを含むｐＬＮＣＸ由来の発現プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＥＲＲＬ１、ＰＧＣ−１またはＧＦＰのｃＤＮＡを含むｐＭＸ由来の発現プラスミド（Ｍｉｓａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３０６２−３０６６，２０００）は、メーカーの指示書に従って使用した。
１．６．トランスジェニックマウスの作出
ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−２００，１９９１）にＥＲＲＬ１  ｃＤＮＡをクローニングし、トランスジーン（図４ａ）を切り取り、精製した（２ｎｇ  μ１−１）。
ＢＤＦ１オスとかけ合わされたＢＤＦ１メス（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２）から受精卵を回収し、標準法（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．，ｉｎ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｅｄｓ  Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．＆  ＤｅＰａｍｐｌｉｌｉｓ，Ｍ．Ｌ．，７４７−７７１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９３）によりトランスジーンを微量注入した。マウスの世話は発明者が属する施設のガイドラインに従って行った。
１．７．高脂肪食
常用食（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｉｎｃ．、東京、日本）あるいはカゼイン〈２０％ｗｔ／ｗｔ〉、αコーンスターチ（３０．２％）、蔗糖（１０％）、ラード（２５％）、コーン油（５％）、ミネラル（３．５％）、ビタミン（１％）、セルロース粉（５％）およびＤ、Ｌメチオニン（０．３％）を含む高脂食（Ａｏｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｓ．１：１２６−１３１，１９９３）をマウスに与えた。
１．８．エネルギー消費の測定
酸素消費および二酸化炭素の生成を、質量分析器上とコンピューターからなる間接カロリーメータシステムを使用して決定した（Ｋｏｍｅｎａｎｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．（Ｔｏｋｙｏ）４１：３９５−４０７，１９９５）。マウスを、それぞれガスマススペクトロメーター（ＷＳＭＲ−１４００、Ｗｅｓｔｒｏｎ、千葉、日本）に繋がれた開放回路型プラスチック呼吸実験箱（２４×４６×１８ｃｍ）に入れた。気流は２１／ｍｉｎで制御した。ガス分析は１０：００から次の日の９：００まで実施した。サンプルを、部屋の空気を基準として、２分毎に続けてモニターした。移動活動は、各呼吸器の下に設置されたＡｎｉｍｅｘ−ＩＩＩ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都、日本）によって１０分ごとに自動的に記録した。エネルギー消費は文献（Ｋｏｍｅｎａｎｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．（Ｔｏｋｙｏ）４１：３９５−４０７，１９９５）の記載に従って計算した。
１．９．ＫＫＡｙマウス
ＫＫＡｙマウスは、Ｃｌｅａ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．（東京）から購入した。
１．１０．統計学的分析
二つの実験グループから入手したデータの統計学的比較は、スチューデントｔ−検定を使用して行った。多数のグループからのデータは、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較し、各グループとその他のグループとの比較は、フィッシャーの制約付最小有意差（ＰＬＳＤ）検定（Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ４．０、Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ）で行った。Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１を統計学的有意差とした。
２．結果
２．１．ＥＲＲＬ１  ｃＤＮＡのクローニングとその特徴
ＰＧＣ−１関連分子についてＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ）を探索した結果、ＰＧＣ−１と極めて高い相同性を有するＥＳＴを見出し、このＥＳＴを含む完全長ｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡは、約３．４ｋｂからなり（配列番号１）、１，０１４個のアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質をコードしている。このタンパク質は、ＥＲＲの「タンパク質リガンド」としての特質（後で詳述する）をもとにＥＲＲＬ１（ＥＲＲ  ｌｉｇａｎｄ１の略）と命名した。なお、ＬｉｎらはＰＧＣ−１βと呼ばれるＰＧＣ−１相同体のクローニングを報告しているが（Ｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１６４５−１６４８，２００２）、このＰＧＣ−１βは、ＥＲＲＬ１と唯一アミノ酸が異なっている（配列番号２の２６０番目Ｌｅｕが、ＰＧＣ−１βではＰｒｏ）。ＥＲＲＬ１およびＰＧＣ−１は、ＥＲＲＬ１の中央にみられる特有の領域を除いては、高度のアミノ酸同一性を示した。相同領域は、配列同一性および推定される機能的特質に基づいて５つのドメインに分けられた（図１）。ＥＲＲＬ１のＮ末端領域（アミノ酸１−２８２）は、二つのＬＸＸＬＬモチーフ、すなわち核内受容体に対して結合すると思われるモチーフ（Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：６７７−６８４，１９９７；Ｈｅｅｒｙ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：７３３−７３６，１９９７）を含み、ＰＧＣ−１と４１％の同一性を持つ。第二番目の領域（アミノ酸２８３−５７９）は、ＥＲＲＬ１に特有で、Ｅ（グルタミン酸）繰り返しを含み、ＬＸＸＬＬモチーフを一つ含む。第三番目の領域（アミノ酸５８０−６５６）は高度に保存（４７％のアミノ酸同一性）されている。第四番目の領域（アミノ酸６５７−８８２）は保存性が低く（２２％のアミノ酸同一性）、ＰＧＣ−１中の長いＳＲドメインと比較すると非常に短いセリン−アルギニン（ＳＲ）に富むドメイン（Ｔａｃｋｅ，Ｒ．＆  Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：３５８−３６２，１９９９）をＥＲＲＬ１中に含んでいる。Ｃ末端ドメイン（アミノ酸８８３−１０１４）は、推定されるＲＮＡ結合ドメイン（Ｋｒｅｃｉｃ，Ａ．Ｍ．＆  Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：３６３−３７１，１９９９）を持ち、高度に保存されている（５２％アミノ酸同一性）。
２．２．ＥＲＲＬ１およびＥＲＲ間の類似発現パターン
成熟マウスの異なる組織におけるＥＲＲＬ１の発現パターンを調べた。長さ約１０ｋｂおよび４ｋｂの二つのＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡを観察した。ＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡは、脳、ＢＡＴ、心臓、骨格筋に豊富に存在しており、また腎臓、胃、白色脂肪組織（ＷＡＴ）においても検出された。先の報告（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９２：８２９−８３９，１９９８）と一致して、寒冷ストレスに曝した後、ＰＧＣ−１発現がマウスのＢＡＴで上昇したが、ＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡはこのストレスによってほんのわずかに発現増加するのみであった。
さらにまた、ＥＲＲＬ１の発現パターンは、ＥＲＲ１の発現パターンと非常によく類似しており（Ｓｌａｄｅｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５４００−５４０９，１９９７および図２）、つまり、両ｍＲＮＡは、細胞エネルギーの源である脂質を利用できる組織、例えばＢＡＴ、心臓、骨格筋および腎臓で高度に発現されている（図２Ａ）。なお、ＥＲＲ２  ｍＲＮＡの発現は検出されなかったが、これは以前の研究報告（Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：９１−９４，１９８８）と一致している。
次に、３Ｔ３−Ｌ１細胞が脂肪細胞へ分化する間にＥＲＲＬ１発現が増加するかどうかを調べた。確かに、ＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡは３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞中では非常に低レベルで存在しており、脂肪細胞分化中に著しく増加した。これに対して、ＰＧＣ−１および別のＰＧＣ−１関連分子であるＰＲＣ（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．＆  Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３８−３７４９，２００１）のｍＲＮＡは、この脂肪細胞分化中においては低レベルのままであった（図２Ｂ）。ＥＲＲＬ１  ｍＲＮＡが同様に増加することが、別の前脂肪細胞株の１０Ｔ１／２から分化した成熟脂肪細胞（Ｓｍａｓ，Ｃ．Ｍ．＆  Ｓｕｌ，Ｈ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０９：６９７−７１０，１９９５）においても観測された（図２Ｃ）。また、ＥＲＲ１およびそのターゲットであるＭＣＡＤの発現の様子がＥＲＲＬ１と非常に類似していたが（図２Ｂ、Ｃ）、ＥＲＲ２  ｍＲＮＡおよびＥＲＲ３  ｍＲＮＡの発現は、それらの細胞では検出されなかった。これらの結果から、ＥＲＲＬ１は脂質代謝等の成熟脂肪細胞関連機能における遺伝子調節に関与することが示唆される。
２．３．汎核内受容体アゴニストとしてのＰＧＣ−１
ＥＲＲＬ１がＰＰＡＲγの共活性因子として機能できるかどうかを、ＰＧＣ−１を共活性因子のコントロールとして調べた。予想に反して、ＥＲＲＬ１がＰＰＡＲγによって媒介される転写を活性化できることを示す証拠を見つけることができなかった。対照実験において、脂溶性リガンドを外部から加えなくても、ＰＧＣ−１が単純に発現することによってＰＰＡＲγにより媒介される転写が劇的に活性化されることが確認された。ＰＧＣ−１は、ＰＰＡＲγばかりでなく、数種の他の核内受容体とも物埋的に相互作用することが知られている（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９２：８２９−８３９，１９９８；Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：１３１−１３８，２００１；Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１６３０２−１６３０８，２０００；Ｖｅｇａ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８６８−１８７６，２０００；Ｄｅｌｅｒｉｖｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３９１３−３９１７，２００２）。更に、冷気に曝されたり（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９２：８２９−８３９，１９９８）、絶食（Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：１３１−１３８，２００１；Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：８４７−８５６，２０００）状態下等の特定の環境的変化によりＰＧＣ−１が誘導される事がわかっている。このような観察知見により、ＰＧＣ−１の単なる発現が多くの核内受容体の経路を活性化する可能性があることが高まった。予想されるこのような特徴は、核内受容体の古典的な脂溶性リガンドに類似している。そこで、このような可能性の検証に取り組むために、そのＤＮＡ結合ドメインをＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに置き換えた核内受容体を使用した。この置き換えによって、複数の核内受容体の転写活性の様相を、（ＵＡＳ）４−Ｌｕｃ等の同一のレポーター（遺伝子）で簡単に比較することができる。実際、ＰＧＣ−１は、ｏｒｐｈａｎ  ＨＮＦ４α、ＳＦ１、ＥＲＲを含む多数の核内受容体を介して転写を活性化することができた。中でもＰＧＣ−１はＨＮＦ４αをもっとも強力に活性化できた。これは最近の報告（Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：１３１−１３８，２００１）と一致する。ＰＧＣ−１は続いて、ＥＲα、ＳＦ１、ＥＲＲ、ＰＰＡＲ、ＰＸＲ、ＲＡＲαおよびＲＸＲαを活性化した（図３Ａ）。これらの観察知見により、ＰＧＣ−１は、汎用または広範な核内受容体アゴニストとして機能することが確認された。
２．４．ＥＲＲタンパク質のリガンドとしてのＥＲＲＬ１
前記と同じＧＡＬ４融合核内受容体セットを使用して、ＥＲＲＬ１の潜在パートナーを探索し、ＥＲＲに媒介される転写をＥＲＲＬ１が特異的に活性化できることを見出した。ＥＲＲ３は、ＥＲＲＬ１によって最も強力に活性化され、その次にＥＲＲ１そしてＥＲＲ２が活性化された（図３Ｂ）。そこで、完全長のＥＲＲに対するＥＲＲＬ１の転写活性化特性についてテストした。上記実験と一致して、ＥＲＲＬ１は投与量に依存して、ＭＣＡＤ遺伝子プロモーター（Ｓｌａｄｅｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５４００−５４０９，１９９７；Ｖｅｇａ，Ｒ．Ｂ．＆  Ｋｅｌｌｙ，Ｄ．Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１６９３−３１６９９，１９９７）のＥＲＲ応答性配列（ＥＲＲＥ）を経て行われる完全長ＥＲＲ３および完全長ＥＲＲ１に媒介される転写を活性化した（図３Ｃ）。前者は後者と比べてはるかに強く活性化された。
次にＥＲＲＬ１が物理的にＥＲＲと相互作用するかどうかを、細菌を使って生成したグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合ＥＲＲ（ＧＳＴ−ＥＲＲ）とインビトロで翻訳されたＥＲＲＬ１を用いたインビトロ結合分析によってテストした。ＧＳＴ単独ではなくマトリックスに結合したＧＳＴ−ＥＲＲ１およびＧＳＴ−ＥＲＲ３は、放射性標識されたＥＲＲＬ１を有効に保持した（図３Ｄ）。また、先の報告（Ｓｌａｄｅｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５４００−５４０９，１９９７；Ｖｅｇａ，Ｒ．Ｂ．＆  Ｋｅｌｌｙ，Ｄ．Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１６９３−３１６９９，１９９７）と同様に、ＥＲＲが放射性標識されたＭＣＡＤ  ＥＲＲＥオリゴヌクレオチドと結合したことをゲル移動度シフト分析で確認し、またＥＲＲ−ＤＮＡ複合体がＥＲＲＬ１タンパク質を添加したことによってスーパーシフトしたことを確認した。脂溶性ホルモンは、タンパク質合成と結合反応のどちらにおいても何も加えていないことから、これらの結果よりＥＲＲＬ１およびＥＲＲが直接ＥＲＲのターゲットプロモーターＤＮＡと相互作用できることが示唆された。
次に、１０Ｔ１／２細胞株においてＥＲＲＬ１およびＥＲＲを発現させ、ＥＲＲＬ１がＭＣＡＤ遺伝子発現をＥＲＲを介して活性化するかどうかについて調べた。ＧＦＰ（コントロール）、ＥＲＲ１、ＥＲＲ３、ＥＲＲＬ１またはＰＧＣ−１をコードするＤＮＡを含んでいる組換えレトロウイルスを組み合わせて１０Ｔ１／２細胞に感染させた。ノーザン・ブロット分析を行い、各細胞で導入された遺伝子の発現を確認した（図３ｅ）。ＥＲＲ１またはＥＲＲ３のいずれかが単独に発現すると、ＧＦＰ単独を感染させた細胞における発現と較べて、ＭＣＡＤ  ｍＲＮＡレベルは中程度に増加した。ＥＲＲ１とＥＲＲＬ１の両者またはＥＲＲ３とＥＲＲＬ１の両者を共に発現させると、ＭＣＡＤ  ｍＲＮＡレベルはさらに顕著に増加した（図３Ｅ）。これらの結果をまとめると、ＥＲＲＬ１はＥＲＲの「タンパク質リガンド」として機能し、少なくとも培養細胞中では、ＥＲＲに媒介される転写を活性化きる事が確認された。
２．５．ＥＲＲＬ１マウスの作成
上昇したＥＲＲＬ１発現の影響をｉｎ  ｖｉｖｏで調べるため、ＥＲＲＬ１トランスジェニックマウスを作成した。これらのマウスは活性化されたＥＲＲ媒介転写によって誘導されるマウスの表現型に類似したものとなると予想される。サイトメガロウイルス極初期エンハンサーを持つチキンβアクチン・プロモーター（ＣＡＧプロモーター）を使用し、マウス個体内でのマウスＥＲＲＬ１導入遺伝子の発現を促した（図４Ａ）。マウスの尾部（ｔａｉｌ）ＤＮＡのサウザン・ブロット分析を行い、導入遺伝子のコピー数を決定した（図４Ｂ）。
ＥＲＲＬ１導入遺伝子の発現を、ＥＲＲＬ１マウスおよびコントロールの８週齢、同腹のマウスの組織から単離されたＲＮＡについてノーザン・ブロット分析を行って評価した（図４Ｃ）。導入遺伝子特異的プローブ（プローブ２、図４Ａ）を使用した場合、４ｋｂの単一バンドのみが検出された。ＣＡＧプロモータは、どの組織中でも強活性を示したと報告されている（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−２００，１９９１）。しかしながら意外にも、このプロモーターを使用した結果、脳、ＢＡＴ、心臓、骨格筋、および睾丸等のいくつかの限られた組織中でＥＲＲＬ１導入遺伝子の高い発現レベルが観察されたが、肝臓では非常に低い発現しか観察されなかった（図４Ｃ）。これらの発現プロフィルは、内在性ＥＲＲＬ１発現パターンと比較的良好に一致していた（図４Ｃ）。この観察知見は、ＥＲＲＬ１発現に極めて重要な組織特異的調整ｃｉｓ配列が、このコンストラクト中のＥＲＲＬ１  ｃＤＮＡ中に存在している可能性を示唆している。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータから予測されるように、ＥＲＲＬ１マウスの骨格筋でのＥＲＲＬ１発現の上昇（図４Ｄ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＣＡＤ  ｍＲＮＡ発現を上昇させた。これに対してＥＲＲＬ１の発現の上昇は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）（Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：２６１３−２６１６，２００１）および脱共役タンパク質３（ＵＣＰ３）（Ｃｌａｐｈａｍ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：４１５−４１８，２０００）遺伝子の発現には影響しなかった。
２．６．ＥＲＲＬ１マウスは摂食亢進性であるが痩身である
ＥＲＲＬ１マウスに見られた明白な表現型は痩せであった。これは脂肪酸のβ酸化の増加から予測できるものとよく一致していた。この表現型は、マウスを高脂肪食（Ａｏｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｓ．１：１２６−１３１，１９９３）で飼育した時にもっと顕著であった。９週齢目の野生型コントロールマウス（雄、ｎ＝６）およびＥＲＲＬ１マウス（雄、ｎ＝６）に高脂肪食を自由に与え、毎週、各マウスの食糧消費量および体重を測定した。ＥＲＲＬ１マウスはコントロールマウスよりも有意に多くの食糧を消費した（図５Ａ）。しかしながら、トランスジェニックマウスの体重は、コントロールマウスよりも高脂肪食による飼育前および飼育期間中には１５から２５％少なく（図５Ｂ）、脂肪組織中には少ししか脂肪が蓄積されていなかった（図５Ｃ）。ＥＲＲＬ１マウス中の精巣上体のＷＡＴは０．９２±０．２８ｇであった。これと比べてコントロールマウスは２．０±０．３０ｇであった（図５Ｄおよび表１）。これに対して、肝臓の重さは、著しく違うことはなかった（ＥＲＲＬ１マウス：１．２３±０．０６ｇ、コントロールマウス：１．４±０．０８ｇ）。トランスジェニックマウスの脂肪細胞はコントロールマウスより小さかった（ＥＲＲＬ１マウスの脂肪細胞の平均直径：２５．１±１．１μｍ、コントロールマウス：５４．５±２．２μｍ、図５Ｅ、Ｆ）。
それらマウスの血液を採集し、血清成分を生化学的に分析した（表１）。脂肪質量の低下は、結果として血清中のレプチンの量の低下を招いた（ＥＲＲＬ１マウス：５．９±３．５ｎｇ  ｍｌ−１，コントロールマウス：２５．０±６．６ｎｇ  ｍｌ−１）。レプチンは、ＷＡＴから分泌される抗食欲ホルモンであるため（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６３２−６３４，２０００）、ＥＲＲＬ１マウスで観察されたレプチンの低下レベルはそれらが摂食亢進性であるという観測と一致している。さらに、高脂肪食を与えたコントロールマウスと比べるとトランスジェニックマウスではインシュリンのレベル低下が観察された。高脂肪食を与えた場合、マウスは、たとえ血漿インシュリンが高い濃度であっても通常ブドウ糖の取りこみに抵抗する状態になる（Ｌｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１１１５−１１２０，２０００）。つまりインシュリン抵抗性と呼ばれる同様の状態は、肥満または２型糖尿病患者によく見られる（Ｌｏｖｅｊｏｙ，Ｊ．Ｃ．Ｃｕｒｒ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｒｅｐ．１：２１５−２２０，１９９９）。ＥＲＲＬ１マウスにおいて観察された体重低下およびインシュリンレベルの低下は、ＥＲＲＬ１の発現増加が肥満に抵抗でき、またインシュリン抵抗性を克服することによってたとえ高カロリー食をとったとしても、糖尿病状態の改善に貢献できるということを示している。
２．７．ＥＲＲＬ１マウスのエネルギー消費の増加
ＥＲＲＬ１マウスにおけるエネルギー消費を調べた。それぞれマウスが入った呼吸分析用の試験槽でガス分析を行い、エネルギー消費を計算した。その結果、１２週齢のＥＲＲＬ１マウスのエネルギー消費は、コントロールマウスよりも顕著に高いことが確認された（休息時エネルギー消費：ＥＲＲＬ１マウス：１２６．３±３．８、コントロールマウス：１０１．５±６．７ｋｃａｌ  ｄａｙ−１  ｋｇ−０．７５，Ｐ＜０．０５，各グループにつきｎ＝６、全エネルギー消費：ＥＲＲＬ１マウス：２１１．２±１０．７、コントロールマウス：１５５．９±７．８ｋｃａｌ  ｄａｙ−１  ｋｇ−０．７５，Ｐ＜０．０１，各グループにつきｎ＝６）（図５Ｇ、Ｈ）。しかしながら、移動活動は著しく変化することはなかった（ＥＲＲＬ１マウス：７，３３８±７００カウント、コントロールマウス：５，３３８±３９０カウント、データは、２４時間にわたるすべての移動の計を示す）。これらの結果により、コントロールマウスおよびＥＲＲＬ１マウス間の体重差は、エネルギー消費の差にほぼ起因していることが確認された。
２．８．ＥＲＲＬ１発現が遺伝的にプログラムされた肥満に対抗できる
ＥＲＲＬ１マウスおよびＫＫＡｙマウスを交配させて、ＫＫＡｙマウスの肥満表現型がＥＲＲＬ１の発現増加により抑制されるかどうかを調べた。ＫＫＡｙマウスはＡｙの突然変異をもっており、これによってアグーチという毛皮カラータンパク質の異所性発現を招き、優性的な遺伝性シンドロームである肥満および黄色毛皮化を引き起こす（Ｓｉｒａｃｕｓａ，Ｌ．Ｄ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１０：４２３−４２８，１９９４）。アグーチタンパク質は、中枢神経系において食欲の抑制性受容体として働いていると考えられているメラノコルチン受容体のアンタゴニストとして働いている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６３２−６３４，２０００；Ｓｉｒａｃｕｓａ，Ｌ．Ｄ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１０：４２３−４２８，１９９４）。ＫＫＡｙオスをＥＲＲＬ１メスと交配させて繁殖させ、子孫を毛皮の色（黄色：ＫＫＡｙ（＋）、黒：ＫＫＡｙ（−））およびＥＲＲＬ１トランスジーン発現によって選別した。各グループの体重を比較すると、ＥＲＲＬ１トランスジーンは、ＫＫＡｙ（＋）マウスにみられる体重の増加を抑制し（図６Ａ、Ｂ）、ＥＲＲＬ１発現の増加によって、遺伝性の肥満を抑制できることが証明された。
３．考察
以上の結果から、ＥＲＲＬ１はＥＲＲの「タンパク質リガンド」として機能し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのエネルギー消費をコントロールしていることが確認された。すなわち、ＥＲＲＬ１の発現レベルを、例えば骨格筋中で上昇させれば、これが今度はＥＲＲタンパク質リガンドとして機能し、ＭＣＡＤ遺伝子発現を活性化し、脂肪酸のβ酸化の活性化を導くことを示している。脂肪酸のβ酸化が亢進すると、結果として蓄積される脂肪が少なくなる。同様の効果は、ＥＲＲの転写能を活性化させること、ＭＣＡＤ遺伝子発現を増加させることによっても達成されると考えられる。これらの効果は、運動を通して達成される生理的状態と極めて似通っている。
また以上の結果は、ＥＲＲＬ１やＥＲＲの薬理的活性化によって、通常またはそれ以上のカロリー摂取を維持したままでの体重減少が可能になることを明確に示すものである。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、核内の孤児受容体ＥＲＲとそのリガンド分子ＥＲＲＬ１との相互作用を指標として肥満や糖尿病の治療薬成分をスクリーニングする方法と、この方法によって特定された物質を有効成分とする新規薬剤が提供される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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