(57)【要約】本発明により、アクチン関連新規細胞骨格タンパク質ＬＡＣＳ及び該タンパク質をコードする遺伝子が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）より選択されるタンパク質。
（ａ）配列番号：１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号：１記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入により改変されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：２記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含むタンパク質
（ｄ）配列番号：１記載のアミノ酸配列と、６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質、またはその一部をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２記載の塩基配列を含む、請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質を含む医薬。
【請求項５】
心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、または虚血性心疾患の予防、改善、または治療に用いられる請求項４記載の医薬。
【請求項６】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含む医薬。
【請求項７】
心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、または虚血性心疾患の予防、改善、または治療に用いられる請求項６記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はアクチン関連新規細胞骨格タンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。また、該タンパク質または遺伝子を活性成分として含有する医薬等、本発明のタンパク質及び遺伝子を利用した発明に関する。
【背景技術】  ２種類の一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ；ｃＮＯＳ（構成型）及びｉＮＯＳ（誘導型）；Ｂｒｅｄｔ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６８２−５（１９９０）；Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２２９６４（１９９２）；Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６３７０−４（１９９２））により血管内皮細胞からアルギニンを基質としてＬ−シトルリンと共に産生される一酸化窒素（ＮＯ）（Ｍｏｎｃａｄａ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２１（４）：３６１−７４（１９９１））は心血管系、神経系及び免疫系において種々の生理学的役割を担うメッセンジャー分子である（Ｇｒｉｆｆｌｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ  １２：７９７−８０６（１９９８））。ＮＯは、（１）血管内皮細胞を介した血管拡張（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８３：２０１２−２０（１９９１））、（２）血管内膜肥厚抑制作用（Ｇａｒｇ  ａｎｄ  Ｈａｓｓｉｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１７７４−７（１９８９））、（３）非アドレナリン非コリン神経における血管拡張の媒介、（４）神経細胞死、（５）神経伝達物質としての作用、（６）記憶の長期増強及び長期抑圧、（７）マクロファージや好中球による殺菌作用、（８）膵臓β細胞からのインシュリン放出（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４９：Ｌ２１３−７（１９９１））、（９）発癌（Ｇａｓｔｏｌｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０３：１２６０−６（１９９２））、（１０）血小板凝集阻害作用（Ｒａｄｏｍｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：５１９３−７（１９９０））等への関与が報告されている。ＮＯは、心血管系においても様々な抗動脈硬化・心保護作用を有し、ＮＯ合成阻害薬投与により心血管組織に炎症性・増殖性変化、中膜肥厚、血管周囲繊維化・心肥大等の心血管リモデリングを生じる。
Ｌ−ＮＡＭＥ（ＮＧ−Ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）は、広く用いられているｃＮＯＳ及びｉＮＯＳを阻害するＮＯ合成阻害剤である。ラットへのＬ−ＮＡＭＥの継続的投与によりＮＯ産生阻害ラットを作製することができる。このようなモデルラットでは、Ｌ−ＮＡＭＥ投与から１週間以内に血圧上昇と心血管の炎症性増殖性変化（単球／マクロファージの浸潤、ＭＣＰ−１の増加、ＮＦ−κＢ活性の上昇等）が生じ、さらに４週目以降には心血管リモデリングが認められる。最終的には、心不全、腎不全、脳梗塞等により死に至る。ＮＯ産生阻害ラットの炎症性増殖性変化及び動脈硬化性病変は、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）またはＭＣＰ−１の作用を抑制することにより消失することが知られている。
Ｒｈｏは、細胞と細胞外基質及び血管内皮の接着を制御する低分子量Ｇタンパク質であり、細胞基質間接着、細胞移動、神経突起の退縮、細胞質分裂、細胞周期のＧ１→Ｓ期への進行等の様々な作用を奏する。これらの作用の多くは、アクチン細胞骨格の再編成によるものである。細胞のアクチン細胞骨格はＲｈｏにより制御される接着を支点として調節され、細胞の組織内の遊走、細胞間隙の通りぬけを可能としている。ＲｈｏはＧＤＰ結合型のときは不活性であり、ＧＴＰとの結合により活性型となる。ＧＴＰ結合型の活性型Ｒｈｏは、経路のより下流のエフェクター分子へと作用する。タンパク質リン酸化酵素であるＲｈｏ結合キナーゼ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ＲＯＣＫ）は、このＲｈｏ下流エフェクターの一つである。Ｒｈｏによるアクチン細胞骨格の誘導は、細胞周期特異的に異なった場所、そして異なった特異的形態の骨格を作るように行われる。
ＲＯＣＫは、分子量１６０Ｋのセリン・スレオニンリン酸化酵素である。Ｎ末端にキナーゼドメインを、中央部にコイルド・コイル形成領域、そして、Ｃ末端に膜結合ドメインを有している。これまでの解析から、ＲＯＣＫがいくつかの経路においてアクチン骨格を制御していることが判明している（Ｍ．Ｍａｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：８９５−８（１９９９））。その一つが、ミオシン脱リン酸化酵素を不活性化し、さらにミオシン軽鎖を直接リン酸化することによりミオシンを活性化してアクトミオシンの収縮を誘導する経路である。別の経路としては、ＬＩＭキナーゼの活性化である。活性化されたＬＩＭキナーゼは、アクチン結合タンパク質コフィリンをリン酸化することにより不活性化する。その結果、コフィリンによるアクチン脱重合活性が抑制され、繊維化アクチンが増加する。さらに別の経路としては、１型Ｎａ＋／Ｈ＋交換体のリン酸活性化が挙げられる。活性化により交換体はＥＲＭ（Ｅｚｒｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ）タンパク質の結合を促進し、アクチンの細胞膜への結合が誘導される。このような経路を経て、ＲＯＣＫは細胞膜に結合したアクトミオシン束の形成に寄与していると考えられている。
【発明の開示】
本発明者等は、ＮＯによる心血管リモデリングの変化が心臓組織局所のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）活性の増加により生じ、ＡＣＥ阻害薬及びアンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１Ｒ）拮抗薬によりほぼ完全に抑制できることを報告してきた。しかしながら、局所におけるレニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）が活性化する機序、シグナリング以降の心血管の構築変化の機序等については依然として不明な点が多い。心血管病変を形成する上で重要な役割を果たす遺伝子の解明が望まれる。このような遺伝子、及び該遺伝子によりコードされるタンパク質は心疾患の予防・治療の面でも重要と考えられる。
本発明者らは心血管病変の形成において重要な役割を果たす新規遺伝子の単離と同定を目標とした。そこで、まず、心血管病変部位で発現が亢進している遺伝子に着目し、特に心臓局所において発現の亢進している遺伝子のサブトラクション法（Ｓｗａｒｏｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１９５４（１９９１）参照）による単離を試みた。その結果、ＮＯ合成酵素阻害薬であるＬ−ＮＡＭＥ投与後に心臓で発現が増加している全長約１２ｋｂの新規遺伝子をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離した。得られた新規遺伝子をＬＡＣＳ（Ｌ−ＮＡＭＥ  ｒｅｌａｔｅｄ  ＡｃｔｉｎＣｙｔｏＳｋｅｌｅｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子と名付けた。ノーザンブロット解析の結果、該遺伝子の発現は、心臓及び骨格筋に認められた。そして、特に心臓では、心筋細胞でｍＲＮＡが多く発現していることが確認された。細胞内での分布を見ると、アクチンストレスファイバーの一部に共局在して発現されていた。免疫沈降によりアクチンファイバーと（直接または間接的に）結合していることが示され、分画からも骨格分画に属していることがウェスタンブロットにより示された。さらに、該遺伝子の塩基配列から予測されたアミノ酸配列について、機能・属性等についての推測を行った。その結果、シグナル配列、膜貫通領域等の特徴的配列は認められなかった。しかしながら、Ｃ末端側にはプロリンに富む配列が存在し、ＳＨ３結合ドメインに対して相同性を示すことが明らかとなった。
以上の結果、また、その遺伝子サイズが大きいこと等からも、ＬＡＣＳは細胞骨格に関係する構造タンパク質であることが示された。ＬＡＣＳ  ｍＲＮＡは複数の高血圧・心肥大モデル動物（Ｌ−ＮＡＭＥラット、ＡｎｇＩＩ  ｉｎｆｕｓｉｏｎラット、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ））の心臓で血圧非依存性に高発現していた。また、培養心筋細胞においては肥大性アゴニスト刺激によりＬＡＣＳ  ｍＲＮＡ発現の増加が認められた。さらに、その発現メカニズムにＡｎｇＩＩ−ＡＴ１Ｒ経路、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ系が関与していることが示唆された。そして、ＬＡＣＳの発現は肥大性刺激によってアクチンに沿って増加し、アクチンと直接的または間接的に結合し、アクチンの機能調節を行うことによってアクチンファイバーの再編（ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に関与していると考えられた。上述のようなアンジオテンシン（ＡｎｇＩＩ）、Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ、エンドセリン−１等によるｍＲＮＡ発現の増加は、ＬＡＣＳ発現の少なくとも一部がＧタンパク質連結型レセプター以降のシグナリングにより制御されていることを示唆するものである。
このような、高血圧及び心肥大モデル動物で高発現し、肥大性アゴニスト刺激により培養心筋細胞で発現が増加する遺伝子であって、さらにアクチン重合調節に関係することが示唆されたタンパク質をコードする該遺伝子は、心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、または虚血性心疾患等の心疾患に対する医薬になると期待される。
従って、本発明は、
（１）  以下の（ａ）〜（ｄ）より選択されるタンパク質、
（ａ）配列番号：１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号：１記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入により改変されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：２記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含むタンパク質
（ｄ）配列番号：１記載のアミノ酸配列と、６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
（２）  （１）記載のタンパク質、またはその一部をコードするポリヌクレオチド、
（３）  配列番号：２記載の塩基配列を含む、（２）記載のポリヌクレオチド、
（４）  （１）記載のタンパク質を含む医薬、
（５）  心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、または虚血性心疾患の予防、改善、または治療に用いられる（４）記載の医薬、
（６）  （２）記載のポリヌクレオチドを含む医薬、
（７）  心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、または虚血性心疾患の予防、改善、または治療に用いられる（６）記載の医薬、を提供するものである。
本発明により、心血管病変において重要な役割を果たす新規遺伝子ＬＡＣＳが提供される。ＬＡＣＳ  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に、該塩基配列より予想される該ｃＤＮＡによりコードされるＬＡＣＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。
本発明のタンパク質は、配列番号：１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質である。該タンパク質は例えば、該タンパク質に対する抗体を結合したアフィニティークロマトグラフィー等により、該タンパク質を産生する細胞より得ることができる。また、ＬＡＣＳタンパク質の分子量（３７３ｋＤａ）、及びアクチンとの結合性に基づいて、公知のタンパク質精製技術により精製することも可能である。ＬＡＣＳタンパク質は培養心筋細胞からの発現がＬ−ＮＡＭＥ投与により誘導できることから、Ｌ−ＮＡＭＥにより誘導したＬＡＣＳタンパク質は、塩析；ゲル濾過、イオン交換、逆相、アフィニティー、疎水性、吸着等のクロマトグラフィー；ゲル電気泳動；限外濾過；再結晶；蒸留；透析；等電点電気泳動；フィルター濾過；免疫沈降；溶媒抽出；溶媒沈澱等により単離、精製可能である（ｅｄ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）参照）。
さらに、このような配列番号：１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質には、融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質としては、遺伝子組換え技術により該タンパク質を発現させた場合に、その精製を容易にするために宿主細胞からの分泌を指示するシグナル配列を本発明のタンパク質に付加したもの、並びに、回収を容易にするＦＬＡＧ、ヒスチジン残基から成るもの等のタグ、及び検出のためのＧＦＰ等のタグを付加した融合タンパク質を例示することができる。このような融合タンパク質においては、本発明のタンパク質に相当する以外の部分を必要に応じて削除できるよう、周知技術に基づきトロンビンまたはファクターＸａ等により切断可能なように作成することも可能である。
本発明のタンパク質はまた、該配列番号：１記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び挿入により改変されたアミノ酸配列を含むタンパク質である。このようなタンパク質は、配列番号：１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを慣用の遺伝子技術により改変、発現させることにより得ることができる。遺伝子を改変する技術としては、例えば、部位特異的変異誘発法（ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５（１９８７））を挙げることができる。このように改変されたタンパク質もまた必要に応じて上述したように融合タンパク質とすることができる。
さらに、本発明のタンパク質は、配列番号：２記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含むタンパク質である。このようなタンパク質は、例えば、配列番号：２記載の塩基配列に基づいて作成したプローブを基に哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー等をハイブリダイゼーション法（ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４（１９８７））によりスクリーニングして得たポリヌクレオチドを発現させて得ることができる。しかしながら、本発明の「配列番号：２記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」という記載は、このようなポリヌクレオチドの製造方法をハイブリダイズ法に得られるものに限定することを意図したものではない。従って、前述の部位特異的変異等の技術により作成することができるポリヌクレオチドであっても、配列番号：２記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであれば該定義に包含される。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、洗浄時の条件を低塩濃度または高温とした条件であり、例えば１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃（あるいは５５℃）等の条件を示すことができる。
また、本発明のタンパク質には、配列番号：１記載のアミノ酸配列と、５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より一層好ましくは９０％以上、そして最も好ましくは９５％以上（例えば、９６、９７、９８、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が包含される。このようなタンパク質は、上述の部位特異的変異法及びハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法（ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４（１９８７））等により得ることができる。本発明の相同性は、アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７（１９９３））により決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて開発されたＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））等のプログラムが知られている。具体的な解析手法については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照することができる。
本発明のＬＡＣＳタンパク質は、複数の高血圧・心肥大モデル動物の心臓において高発現しており、ＮＯ合成阻害剤Ｌ−ＮＡＭＥの投与により心臓局所において発現の上昇する遺伝子によりコードされる。従って、該タンパク質の発現に基づきＮＯＳの発現または活性の阻害を検出することができ、ＮＯＳの発現または活性低下により誘起される疾患の診断が可能となる。このようなタンパク質の発現は、これに限定される訳ではないが、該タンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。本発明のタンパク質に対する抗体は、配列番号：１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は当然ながら、該タンパク質の抗原性を有する上述の本発明のタンパク質、並びに、該タンパク質の一部を用いて慣用手段により作成することが可能である。従って、本発明のタンパク質及びその一部であるペプチド断片は、ＮＯＳの発現または活性低下により誘起される疾患の診断を可能とする抗体の作成にも使用することができる。本発明のタンパク質をヒトへの医薬として用いる場合、これに限定される訳ではないがヒト由来のＬＡＣＳタンパク質を用いることが望ましい。ヒト由来のＬＡＣＳタンパク質は、本発明のＬＡＣＳタンパク質及び遺伝子の配列情報を基にプローブまたはプライマーを作成し、上述したハイブリダイズ法、種々のＰＣＲ法を用いて所望のタンパク質をコードする遺伝子を取得し、発現させることにより得ることができる。
また、本発明のタンパク質は、配列番号：１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含む。本明細書中、「配列番号：１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する」とは、アクチンの重合、架橋、束形成を促進または抑制する活性を有することを意味する。このような配列番号：１記載のアミノ酸配列からなるＬＡＣＳタンパク質と同等の機能を有するタンパク質は、上述の部位特異的変異法、ハイブリダイズ法、ＰＣＲ法等を利用して得られるタンパク質を含むものである。
さらに、本発明により、本発明のタンパク質またはその一部をコードするポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、並びに、化学合成ＤＮＡ及びＲＮＡ等が含まれる。本発明のタンパク質の一つをコードするポリヌクレオチドは、遺伝暗号に縮重が存在することから複数考えられるが、本発明のポリヌクレオチドにはそれらの縮重が包含される。本発明のポリヌクレオチドは例えば、配列番号：２記載の本発明のＬＡＣＳタンパク質をコードする塩基配列全部、またはその一部を基にプローブ、プライマー等を作成し、ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等の周知技術に基づいて天然由来の本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。さらに必要に応じ、得られたポリヌクレオチドを制限酵素による消化、部位特異的変異誘発法、適当な断片（リンカー、開始コドン、終止コドンを含む）の付加等により改変したり、融合タンパク質を発現可能なように他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと連結したり、または、適当なベクター（発現ベクター、クローニングベクター等）に組み込んだポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
さらに、本発明は、配列番号：２記載の塩基配列、またはその相補鎖の連続する配列に対して相補的な少なくとも１３塩基を含むポリヌクレオチドを提供する。このような相補的なポリヌクレオチドは、配列番号：２記載の塩基配列またはその相補鎖に対して完全に相補的である必要はなく、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より一層好ましくは９５％以上の相同性を有するものであればよい。相同性の決定は、前述した方法に従って行うことができる。このようなポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡの検出、増幅にプローブまたはプライマーとして用いることができる。プライマーとして使用する場合には、必要に応じ、例えば５’末端に制限酵素認識配列及び／またはタグ等を付加することもできる。また、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム等としても使用し得る。アンチセンスヌクレオチド及びリボザイムは、本発明のタンパク質の発現を阻害または抑制するのに用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドを適当な発現ベクターのエンハンサー、プロモーター等を含む発現制御領域下に組み込み、適当な宿主細胞に導入することにより本発明のタンパク質を得ることができる。宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞が挙げられる。原核細胞としては大腸菌を用いる系が良く知られている。大腸菌を宿主とした場合のプロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−６（１９９８））、ａｒａプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−３（１９８８））が挙げられる。本発明のタンパク質を大腸菌を宿主として遺伝子工学的手法により製造する場合、精製をより簡便にするために、ペリプラズムへの産生を可能にするシグナル配列を付加することが望ましい。シグナル配列としては、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４３７９（１９８７））が例示される。その他、大腸菌用の発現ベクターはＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等由来の複製起点、アミノグリコシドトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等の選択マーカーを含むことができる。大腸菌以外、枯草菌を宿主とした原核細胞発現系も公知である。
真核細胞宿主としては、酵母細胞系、植物細胞系、昆虫細胞、両生類細胞、哺乳動物を含む動物細胞系が知られている。汎用される酵母細胞系としては、サッカロミセス属の酵母、アスペルギルス属の糸状菌を宿主とした系が挙げられる。植物細胞系では、ニコチナ・タバカム由来の細胞を宿主とする系が知られている。植物細胞系では、カルス培養によるタンパク質の産生のみならず、所望の遺伝子を導入した細胞から植物体を再生し、植物の葉、根、茎等より目的とするタンパク質を得ることも可能である（Ｊｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１３１−８（１９９４））。哺乳動物細胞としては、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ミエローマ、３Ｔ３等がある。両生類細胞としては、アフリカツメガエル卵母細胞（ＶＡｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：３５８−４０（１９８１））が知られており、昆虫細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５等が公知である。構築したベクターは、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−６７（１９７３））、エレクトポーション法（ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−５（１９８２））等の公知の方法により宿主へ導入する。
また、動物を使用して本発明のタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで産生させることもできる（Ｌｕｂｏｎ，Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．４：１−５４（１９９８）参照）。動物としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：６９９−７０２（１９９４））等の家畜及びマウス等の哺乳動物、並びに、カイコのような昆虫を挙げることができる。哺乳動物における外来タンパク質の産生では、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡをβカゼイン等の乳汁中に特異的に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子とする。次に、該融合遺伝子を動物の胚へ注入し、染色体上への組換えを起こさせる。この胚を雌の動物の子宮へ移植することにより生まれてくるトランスジェニック動物、またはその子孫から得られる乳汁中からの目的タンパク質の取得が可能となる。一方、カイコでは、所望のタンパク質をコードする遺伝子をバキュロウイルスに組み込み、該バキュロウイルスを用いてカイコを形質転換することにより、所望タンパク質をカイコの体液から得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２−４（１９８５））。
遺伝子工学的手法により宿主内に、または、宿主より分泌されたタンパク質は、天然のタンパク質の場合と同様に精製することができる。精製を簡便にする等の便宜として任意に修飾を加えたタンパク質については、タンパク質の精製前または後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させ修飾したペプチド部分を除去することもできる。
本発明のタンパク質またはその一部を用いて、本発明のタンパク質に対する抗体を得ることもできる。本明細書中における抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−４０（１９８３））及び抗体断片を含むものである。本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体は、例えば、本発明のタンパク質の抗原となる部分を感作した哺乳動物の血液から得た血清であり得る。また、該血清をさらに精製し、ポリクローナル抗体を含む画分とすることもできる。一方、モノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、骨髄腫細胞等の永久増殖能を有する細胞と融合させたハイブリドーマをクローニングし、その培養物よりモノクローナル抗体を回収するハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））により製造できる。
また、抗体断片とは抗体の抗原結合領域または可変領域を含む断片のことである。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片等が挙げられる。Ｆａｂとは抗体分子のパパイン消化により得られる断片である。また、抗体のペプシン消化によっては、Ｆ（ａｂ’）２断片を得られる。その他の抗体断片としては、ダイアボディー（Ｈｏｌｌｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−８（１９９３））、線状抗体、ｓｃＦＶのような一本鎖抗体（Ｐｌｕｃｋｔｕｎ，″Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ″，Ｖｏｌ．１１３，ｅｄ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））、多特異性抗体（ＬｅＤｏｕｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５８−６２（１９９２）；Ｐａｕｌｕｓ，Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．７８：１１８−３２（１９８５）；Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−９（１９８３）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０５：１７６−２６０（１９８６）；Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４３：９４４−９（１９８９））等が挙げられる。さらに、本発明の抗体はポリエチレングリコール等の分子により修飾してもよい。作成された抗体は、その他のタンパク質の精製の場合と同様の方法により精製することができる（ｅｄ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。
本発明のタンパク質は、心筋細胞特異的に発現し、左室肥大等の病的状態に伴って増加するため、例えば、心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、または虚血性心疾患等の心疾患の予防、改善、または治療に用いることができる。従って、本発明のタンパク質の機能を増加させたり、制御することによって、これらの心疾患の予防剤、改善剤、または治療剤として製剤化することができる。タンパク質を医薬として使用する場合、タンパク質を直接、単独で患者に投与する形態とすることもできるが、公知の製剤法により製剤化して用いてもよい。そのような方法としては、例えば、ＰＢＳ等の中性溶液へ溶解した形態が挙げられる。さらに必要に応じ、薬学的に許容される安定剤、緩衝剤、甘味剤、希釈剤、矯味剤、増量剤、着色剤、乳化剤、賦形剤、崩壊剤、芳香剤、保存剤、溶解補助剤等を添加してもよい。担体を併用することにより、本発明のタンパク質を液剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、散剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、トローチ、乳剤等の形態に調製することができる。
このような本発明のタンパク質を含む医薬の投与量は、患者の体重、年齢、症状等、及び投与方法、投与形態等の諸要因により異なるが、当業者であれば適当な投与量を設定することができる。投与は例えば、皮下投与、経口投与、動脈内注射、静脈内注射等により行うことができる。該タンパク質は、成人（体重６０ｋｇとした場合）で一日当たり、通常１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１０μｇ〜１ｇ、より好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇの投与を行うことが考えられる。また、ヒト以外の動物への投与を行う場合には、体重当たりで計算される投与量を与えることができる。
本発明のタンパク質に代えて、該タンパク質をコードするポリペプチドを医薬として用いることも可能である。このような遺伝子を有効成分とした医薬は、本発明のタンパク質を含む医薬と同様に心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患等の心疾患の予防、改善、または治療に用いることができる。以下に、本発明のポリヌクレオチドを用いた遺伝子治療における遺伝子導入法、導入形態及び導入量について詳述する。
本発明のＬＡＣＳ遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する方法は、非ウイルスベクターを用いる方法と、ウイルスベクターを用いる方法の２つに大別できる。実験手引書等にベクターの調製法、投与法等が詳しく解説されている（別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社（１９９６）；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社（１９９７）；日本遺伝子治療学学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス（１９９９））。
慣用の非ウイルス遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞及び組織に導入することができる。細胞への遺伝子導入法としてはリポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法等が挙げられる。また、組織への遺伝子導入法としてはウイルス−エンベロープ法、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクルガンで担体（金属粒子）と共にＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法により組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることができる。
このうちＨＶＪ−リポソームは脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームを不活性化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ；ＨＶＪ）とを融合させたものである。当該ＨＶＪ−リポソーム法は従来のリポソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、特に好ましい導入形態の一つである。ＨＶＪ−リポソームの調製法については、別冊実験医学『遺伝子治療の基礎技術』（羊土社（１９９６））、別冊実験医学『遺伝子導入＆発現解析実験法』（羊土社（１９９７））、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１４５８−６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｒ１２１２−２０（１９９６）等に詳しく述べられている。またＨＶＪリポソーム法とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０：１４４０−８（１９９３）、実験医学１２：１８２２−６（１９９４）、蛋白質・核酸・酵素４２：１８０６−１３（１９９７）等に記載の方法であり、好ましくはＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）：４７９−８２（１９９５）に記載の方法が挙げられる。
また、本発明のＬＡＣＳ遺伝子の投与において特に好ましい方法としてウイルス−エンベロープを用いる方法を挙げることができる。ウイルス−エンベロープは精製されたウイルスに所望の発現ベクターを界面活性剤存在下で混和するか、または、ウイルスと発現ベクターとの混和液を凍結融解することにより調製することができる（特開２００１−２８６２８２号公報）。
ウイルス−エンベロープ法において用いることができるウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、ヘパドナウイルス等の科に属するウイルス、中でも好ましくはＨＶＪが挙げられる。ここで、ウイルスとしては、野生型及び組換え型のいずれのウイルスを用いることができる。特にＨＶＪとしては、Ｈａｓａｎ  Ｍ．Ｋ．ら（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２０（１９９７））、またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ  Ｙ．ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：９７０−３（２０００））等により報告されている組換え型のＨＶＪを用いることもできる。
一般に、ＨＶＪ−リポソーム法及びＨＶＪ−エンベロープ法において用いるＨＶＪとしてはＺ株（ＡＴＣＣより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７やＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５等）も用いることができる。また、ウイルスエンベロープを調製する際に、精製されたウイルスをＵＶ照射等により不活性化した後に、所望の発現ベクターを混和してもよい。ウイルスと発現ベクターを混和する際に用いることができる界面活性剤としては、例えば、オクチグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０等が挙げられる。このようにして調製されたウイルスエンベロープベクターは、注射等により治療、予防または改善の標的となる組織に導入することができる。また、−２０℃で凍結することにより、少なくとも２〜３ヶ月保存することも可能である。
ここで用いることができ発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良い。例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−２００（１９９１））、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の発現ベクターを例示することができる。
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的である。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８０：３５−４７（１９９８）；Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：Ｅ２６−３３（１９９９）；Ｊ．Ｒｅｃｅｐ．Ｓｉｇｎａｌ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９：６７３−８６参照）に目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって細胞内に遺伝子を導入することができる。前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からはアデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法及び患者からある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法が挙げられる（日経サイエンス、１９９４年４月号：２０−４５；月刊薬事３６（１）：２３−４８（１９９４）；実験医学増刊１２（１５）：（１９９４）；日本遺伝学治療学会編  遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス（１９９９））。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が特に好ましい。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤等）を取り得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤として製剤する場合、このような注射剤は定法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。必要に応じて、注射剤には慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソーム製剤としては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等の形態が挙げられる。
このような本発明のポリヌクレオチドを含む医薬の投与量は、患者の体重、年齢、症状等、及び投与方法、投与形態等の諸要因により異なるが、当業者であれば適当な投与量を設定することができる。投与は例えば、皮下投与、経口投与、動脈内注射、静脈内注射等により行うことができる。該ポリヌクレオチドは、成人（体重６０ｋｇとした場合）で一日当たり、通常１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１０μｇ〜１ｇ、より好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇの投与を行うことが考えられる。また、ヒト以外の動物への投与を行う場合には、体重当たりで計算される投与量を与えることができる。
特に、本発明のポリヌクレオチドをＨＶＪ−エンベロープ法により投与する場合には、反復して投与を行うことが可能であることから、１回のみ投与するのではなく、より良い治療、予防または改善効果を得るために複数回、例えば２、３回にわたって遺伝子の投与を行うことができる。このようなＨＶＪエンベロープを用いた複数回にわたる投与も本発明に包含される。
本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを含む医薬は、治療目的の疾患、症状に応じた適当な投与方法及び投与部位が選択される。投与方法は限定されないが、心筋内投与または筋肉投与が好ましい。
本発明のＬＡＣＳ遺伝子は複数の高血圧・心肥大のモデル動物の心臓での増加が認められたことから、患者における高血圧、心肥大の有無についての診断を行うために使用することができる。このような診断は、本発明のＬＡＣＳ遺伝子の配列情報を基に作成したプローブまたはプライマー等を用いて該遺伝子より転写された細胞内のｍＲＮＡを検出することにより行うことが考えられる。生体試料からのｍＲＮＡの抽出は市販のキット（例えば、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等）も利用できる。その他、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−９（１９７９））、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９（１９８７））等の総ＲＮＡ調製法が周知である。他方、該遺伝子より発現されたタンパク質を、前述の本発明のタンパク質に対する抗体を用いて検出する方法も考えられる。細胞における指標遺伝子の発現について調べる場合、その発現レベルは通常、細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子、例えば、βアクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）等がよく用いられる）の発現レベルの測定値に基づいて補正される。
本発明のＬＡＣＳタンパク質及びＬＡＣＳ遺伝子は、心血管系の疾患に対する医薬となり得る化合物のスクリーニング用いることができる。本発明において示されたように、ＬＡＣＳタンパク質はＮＯ合成阻害薬または肥大性アゴニストの投与に応答して生体内での発現が増大する。従って、ＬＡＣＳタンパク質に対して結合する化合物は、心血管系の疾患に対する医薬の候補となり得る。このような化合物は、例えば、
（１）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被験化合物を接触させ、
（２）該タンパク質またはその部分ペプチドと被験化合物との結合を検出し、そして
（３）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する被験化合物を選択することによりスクリーニングすることができる。
または、上記（１）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドとの接触に代えて、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能に保持する宿主細胞、または宿主細胞の培養物と接触させ、本発明のタンパク質と被験化合物との結合を調べることもできる。
本発明において、ＬＡＣＳタンパク質はアクチンと結合していることが示された。ＬＡＣＳタンパク質とアクチンの結合を阻害することにより、アクチンの重合を促進または抑制することができると考えられる。従って、ＬＡＣＳタンパク質とアクチンの結合を阻害する化合物は、心血管系の疾患に対する医薬の候補となり得る。ＬＡＣＳタンパク質の結合を阻害する化合物のスクリーニングでは、該タンパク質とアクチンとの結合を指標とすることができる。より具体的には、例えば、
（１）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドと被験化合物をアクチン存在下で接触させ、
（２）該タンパク質またはその部分ペプチドとアクチンとの結合を検出し、そして
（３）該タンパク質またはその部分ペプチドとアクチンとの結合を抑制または阻害する被験化合物を選択することにより、そのような化合物をスクリーニングすることができる。ここで、部分ペプチドを用いる場合には、該部分ペプチドはＬＡＣＳタンパク質のアクチンとの結合に関与している部分を含む必要がある。このような部分ペプチドは、ＬＡＣＳタンパク質を消化して作成した種々の断片についてアクチンとの結合性を調べることによって容易に取得することができる。また、ＬＡＣＳタンパク質とアクチンとの結合は、これに限定される訳ではないが、実施例７において示すようなＬＡＣＳ抗体及びアクチン抗体を用いた方法により行うことが可能である。
また、本発明により本発明のタンパク質の発現を制御する化合物をスクリーニングする方法が提供される。ＬＡＣＳタンパク質の発現を促進または抑制する化合物は、心血管系の疾患に対する医薬となり得る。このようなスクリーニングは、ＬＡＣＳ遺伝子を発現する心筋細胞、平滑筋細胞を用いて次のようにして行うことができる。
（１）ＬＡＣＳ遺伝子を発現する細胞に被験化合物を接触させる、
（２）ＬＡＣＳ遺伝子の発現を検出し、そして
（３）被験化合物が存在しない場合と比べてＬＡＣＳ遺伝子の発現を促進または抑制する被験化合物を選択する。
ＬＡＣＳ遺伝子の発現には、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、卵細胞、哺乳動物細胞等、種々のものを利用し得る。前述の患者の生体内におけるＬＡＣＳ遺伝子の発現の検出と同様に、転写されたｍＲＮＡ、タンパク質を慣用の手法に従って検出することができる。
また、ＬＡＣＳ遺伝子を発現する細胞に代えて、ＬＡＣＳ遺伝子の上流域の発現制御配列にレポーター遺伝子を作動可能に連結させた発現ベクターにより形質転換された細胞を使用することもできる。ＬＡＣＳ遺伝子の上流域の発現制御配列とは、プロモーター、エンハンサー及びＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等が挙げられる。例えば、配列番号：２記載の塩基配列を基にプローブを作成し、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりＬＡＣＳ遺伝子の発現制御配列を含むゲノムＤＮＡクローンを取得する。このクローン中の発現制御配列部分を制限酵素処理等により切り出し、適当なレポーター遺伝子の上流に作動可能に連結されるようにクローニングする。レポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓ  ｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等が例示される。得られたＬＡＣＳ遺伝子の発現制御配列下にレポーター遺伝子が連結された構築物は、上述した何れかの方法により適当な宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）に導入して使用する。宿主細胞の染色体への該構築物の挿入を意図する場合には、相同組換えを利用することができる。
レポーター遺伝子の発現は、採用したレポーター遺伝子の種類に適した方法に従って検出する。例えば、ＣＡＴ遺伝子を用いた場合には、遺伝子発現産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出して、ＣＡＴ遺伝子発現量を測定する。また、ｌａｃＺ遺伝子を使用する場合には、遺伝子発現産物中の色素化合物の発色触媒作用を発現量の指標として測定する。レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合には、遺伝子発現産物の触媒作用により生じる蛍光化合物の蛍光を検出し、その発現量の指標とすることができる。ＧＦＰタンパク質は蛍光を発することから、ＧＦＰ遺伝子をレポーター遺伝子とした場合には、発現産物中の蛍光量により発現量を測定する。成長ホルモン遺伝子を使用した場合は、遺伝子発現産物の細胞への効果（成長促進、増殖促進等）を検出して、発現量の定量化を行う。
上述の各スクリーニング方法で使用する被験化合物としては、天然化合物、合成化合物、無機化合物、有機化合物、精製・未精製または粗精製タンパク質、ペプチドまたは非ペプチド化合物が挙げられ、さらに複数の化合物を含む化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発光微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、生体組織抽出物等も使用可能である。被験化合物がタンパク質やペプチドである場合には、担体と結合させたり、他のポリペプチドと融合したり、細胞膜上に発現させた膜画分として利用することもできる。これらの被験化合物は必要に応じ、放射標識、蛍光標識等により標識して用いられる。
上述の各スクリーニング方法に必要とされる細胞、発現ベクター、被験化合物、プローブ、プライマー、抗体、レポーター遺伝子発現測定用の基質等は適宜組合わせてキットとすることもできる。さらに、キットには必要に応じ細胞培養のための培地や容器、コントロールとして用いることができる試料、キットの使用説明書等も含めることができる。そして、上述の各スクリーニングにより選択された被験化合物は、直接単独で患者に対して用いる医薬とすることもできるが、必要に応じ、周知の製剤法に従って製剤化して用いることも可能である。化合物がＤＮＡ等のポリヌクレオチドである場合、または、ＤＮＡによりコード可能なポリペプチドである場合、ポリヌクレオチドを前述の遺伝子治療の方法に従って投与することも考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明についてより詳細に検討するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
［実施例１］Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＳＨ）による遺伝子単離
雄ＷＫＹラットのＬ−ＮＡＭＥ（１００ｍｇ／Ｌ）一週間経口投与群、及びＬ−ＮＡＭＥ投与を行っていない対照群の心臓からＲＮＡを抽出し、サブトラクション法によりＬ−ＮＡＭＥで発現が亢進しているｃＤＮＡのクローニングに用いた。その結果、新規遺伝子ＬＡＣＳ（Ｌ−ＮＡＭＥ  ｒｅｌａｔｅｄ  ＡｃｔｉｎＣｙｔｏＳｋｅｌｅｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の単離に成功した。該遺伝子について、心臓組織でのｍＲＮＡ発現をＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で検討したところ、Ｌ−ＮＡＭＥ投与から１〜３日後をピークに増加し、７日目からは減少し、さらに、投与から２８日後にはベース近くまで漸減した。さらに、心臓以外の組織におけるｍＲＮＡ発現もＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ法により検討した。その結果、心臓及び骨格筋におけるＬＡＣＳ  ｍＲＮＡの発現が観察された。特に心臓では、ＬＡＣＳ  ｍＲＮＡの発現が心筋細胞で見られることが確認された。
［実施例２］全長ｃＤＮＡの単離
ｃＤＮＡライブラリーを作成し、スクリーニングによりＬＡＣＳをコードする全長ｃＤＮＡを単離した。具体的には、ランダムプライマーを用い、Ｌ−ＮＡＭＥ投与後１日目のＷＫＹラットから得たｐｏｌｙ  ＲＮＡよりλＺＡＰＩＩ  ｃＤＮＡライブラリーを作成した。続いてＬＡＣＳ遺伝子の断片をプローブとしたスクリーニングを繰り返すことにより、全長約１２ｋｂのｃＤＮＡをＬＡＣＳ遺伝子として取得した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、該ｃＤＮＡの配列決定を行った。得られた塩基配列を配列番号：１に示す。該塩基配列から予測されたアミノ酸配列（配列番号：２）には、シグナル配列や膜貫通領域等の特徴的な配列は見られず、ＬＡＣＳの属性、機能を配列のみから推定することは困難であった。但し、予測アミノ酸配列のＣ末側には、プロリンに富む配列が存在し、ＳＨ３（Ｓｒｃキナーゼファミリーに見られる約７０アミノ酸からなる相同性部分）が結合するドメイン（通常、１０アミノ酸程度のプロリン残基に富む配列からなる）との相同性が示された。
［実施例３］高血圧モデル心臓におけるｍＲＮＡ発現
ＡｎｇＩＩ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔ（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ：０．７ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）並びに４週齢及び２４週齢のＳＨＲの心臓組織を用いた。ＡＴ１Ｒアンタゴニスト（ＡＲＢ）及びヒドラジン（Ｈｙｄ）を降圧剤として用いた。各降圧剤は血圧を下げるのに十分とされる量で用いた（ＡＲＢ，１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ；Ｈｙｄ，１２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）。
その結果、ＡｎｇＩＩ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔでは、ＡｎｇＩＩ投与から３日後にはＬＡＣＳの発現が上昇し、７日後には減少するという傾向が認められた。この発現上昇の大部分はヒドラジンの同時投与によって抑制されず、ＡＲＢの同時投与によって抑制される傾向が観察された。一方ＳＨＲでは、高血圧発症前の若年齢ラットではＬＡＣＳ  ｍＲＮＡの有意な発現増加が観察されなかったのに対し、心肥大の進行する高血圧発症後の成年齢ラットで有意な発現増加が認められた。
以上のように複数の高血圧・心肥大のモデル動物の心臓でＬＡＣＳ  ｍＲＮＡの発現増加が認められ、高血圧を是正してもその発現は完全には抑制されなかった。これらの事実は、局所におけるＲＡＳ系の活性化によりＬＡＣＳ  ｍＲＮＡの発現が増幅される可能性を示唆するものである。そこで実施例６において、ＡｎｇＩＩ刺激による細胞応答について検討した。
［実施例４］ＬＡＣＳタンパク質の局在
ＬＡＣＳに対する抗体をＬＡＣＳのＣ末端側を用いて作成した。該ペプチド抗体を用いた細胞染色によりＬＡＣＳの細胞内局在を検討した。
（１）心臓における局在
ＬＡＣＳは心臓組織ではバンド状に染色され、介在板と一致しているように見えた。介在板に存在する代表的なタンパク質であるカドヘリンと二重染色し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、その局在がほぼ一致していたことから、ＬＡＣＳは介在板付近に存在すると思われた。
（２）培養心筋細胞における局在
新生児ラット（生後１〜３日目）を用い、トリプシン、コラゲナーゼを用い心筋細胞を単離し、初代培養した。最初の２４〜４８時間は血清を含む培地中で培養を行い、その後、無血清培地で２４時間培養した。
培養心筋細胞をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法により調べたところ、ＬＡＣＳタンパク質は細胞骨格成分（ＴｒｉｔｏｎＸ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分画した。免疫染色では、アクチンファイバーに沿った染色が観察され、特に細胞間接着部位の付近が染色される。細胞間接着部位は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける介在板様構造であると言われており、ＬＡＣＳは細胞間接着部位のアクチンファイバーに沿って存在すると考えられた。
以上の結果から、ＬＡＣＳは細胞骨格タンパク質であることが明らかとなった。
［実施例５］ＬＡＣＳ発現
ＬＡＣＳにｃ−ｍｙｃ  ｔａｇを付加し、発現ベクターに導入した。発現ベクターとして、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いた。作成した発現ベクターをＣＯＳ−１細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  ＤＩａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて遺伝子導入し、一過性に過剰発現させた。４８時間後、ｃ−ｍｙｃに対するＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔにより、ＬＡＣＳの塩基配列から理論的に推定された分子量に相当する３７４ｋＤａ付近にバンドを検出した。また、細胞固定後に行ったｃ−ｍｙｃの免疫染色により細胞単位でのｃ−ｍｙｃ融合ＬＡＣＳタンパク質の発現が確認された。
［実施例６］培養心筋細胞への肥大性アゴニスト刺激によるＬＡＣＳ発現の増加
実施例４と同じ方法により培養した心筋細胞を用いた。まず、代表的な肥大性アゴニストである、ＡｎｇＩＩ、Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ、及びＥｎｄｏｔｈｅｒｉｎ−１を用いて細胞を刺激した。各培養細胞について、ＬＡＣタンパク質発現を検出したところ、いずれの肥大性アゴニストを用いた場合であっても、発現が増加していることが判明した。
また、ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ刺激により増加するＬＡＣＳ発現は、１０μＭ  Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の同時投与により抑制された。これは、ＬＡＣＳ遺伝子の発現にＲｈｏ／ＲＯＣＫ系が関与していることを示唆するものである。Ｒｈｏは、アクチンフィラメントの再編性を介して平滑筋の収縮や細胞質分裂、細胞運動、細胞形態の制御に関与する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（ｓｍａｌｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。
［実施例７］アクチンの検出
ＬＡＣＳ抗体による免疫沈降を行い、培養心筋細胞より沈降タンパク質を得た。得られたタンパク質についてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔにより、アクチンタンパク質のバンド（抗アクチン抗体により）を検出することができた。
この結果は、ＬＡＣＳとアクチンが結合していることを示すものである。実施例４の免疫染色でのカドヘリンとの局在と一致から、ＬＡＣＳとカドヘリンが相互作用している可能性も考えられたが、上記実験ではカドヘリンに対応するバンドは検出されず、直接カドヘリンと結合している可能性は否定された。
［実施例８］頚動脈におけるＬＡＣＳ発現
ＲＴ−ＰＣＲによるＬＡＣＳ  ｍＲＮＡの発現分析により、頚動脈にその発現が認められた。バルーン傷害後、ｍＲＮＡ発現は徐々に増加し、７日後にピークに達した。これは、平滑筋にＬＡＣＳが存在する可能性を示唆するものである。平滑筋は培養が容易であり、また安定であることからＬＡＣＳのさらなる機能解析を行うのに好都合である。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、アクチン関連新規細胞骨格タンパク質ＬＡＣＳ及び該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。ＬＡＣＳタンパク質は複数の高血圧・心肥大のモデル動物の心臓で発現が増加していること、肥大性アゴニスト投与により発現が増大すること、及び、細胞内においてアクチンと結合していることが本発明により明らかにされた。これらの事実は、ＬＡＣＳタンパク質がアクチン重合の促進または抑制により、心血管系の維持において一定の役割を果たしていることを示唆するものである。従って、本発明のタンパク質及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アクチン重合の関与する心不全、心肥大、心筋炎、心筋症、動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患等の心疾患の予防、改善、または治療に有効であると考えられる。
【配列表】
2004022753.tif 000002
2004022753.tif 000003
2004022753.tif 000004
2004022753.tif 000005
2004022753.tif 000006
2004022753.tif 000007
2004022753.tif 000008
2004022753.tif 000009
2004022753.tif 000010
2004022753.tif 000011
2004022753.tif 000012
2004022753.tif 000013
2004022753.tif 000014
2004022753.tif 000015
2004022753.tif 000016
2004022753.tif 000017
2004022753.tif 000018
2004022753.tif 000019
2004022753.tif 000020
2004022753.tif 000021
2004022753.tif 000022
2004022753.tif 000023
2004022753.tif 000024
2004022753.tif 000025
2004022753.tif 000026
2004022753.tif 000027
2004022753.tif 000028
2004022753.tif 000029
2004022753.tif 000030
2004022753.tif 000031
2004022753.tif 000032
2004022753.tif 000033
2004022753.tif 000034
【国際調査報告】
2004022753.tif 000035
2004022753.tif 000036
2004022753.tif 000037
2004022753.tif 000038