(57)【要約】一般式（Ｉ）：2003066617.tif 000027［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ、Ｒ’及びＲ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表し、ｎは０〜２の整数を表す。］で示されるアミド化合物を水性媒体と反応させることを含むラクトン類の製造方法。
2003066617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
2003066617.tif 000021
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ、Ｒ’及びＲ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表し、ｎは０〜２の整数を表す。］
で示されるアミド化合物を水性媒体と反応させることを含むラクトン類の製造方法。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）：
2003066617.tif 000022
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示される４−ハロ−ブチルアミドを水性媒体と反応させ、一般式（ＩＩＩ）：
2003066617.tif 000023
［Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示されるγ−ブチロラクトン類を生成せしめることを含むγ−ブチロラクトン類の製造方法。
【請求項３】
一般式（ＩＩ）で示される４−ハロブチルアミドが４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドである請求項２記載の方法。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）で示される４−ハロブチルアミドが、一般式（ＩＶ）：
2003066617.tif 000024
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示される４−ハロ−ブチロニトリルをニトリルヒドラターゼで処理して得られるものである請求項２記載の方法。
【請求項５】
ニトリルヒドラターゼが、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属及びロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属する少なくとも一種の微生物、又は一の属に属する少なくとも一種の微生物と他の属に属する少なくとも一種の微生物との混合微生物により産生されるものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
ニトリルヒドラターゼが、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を含む形質転換体により産生されるものである請求項４記載の方法。
【請求項７】
一般式（Ｖ）：
2003066617.tif 000025
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ１〜Ｒ８は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示される５−ハロ−ペンチルアミドを水性媒体と反応させ、一般式（ＶＩ）：
2003066617.tif 000026
［Ｒ１〜Ｒ８は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示されるδ−バレロラクトン類を生成せしめることを含むδ−バレロラクトン類の製造方法。
【請求項８】
反応の際の温度が、３０〜１００℃である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
反応の際のｐＨが、ｐＨ１．０〜６．０である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はラクトン類の製造方法に関する。ラクトン類は、医薬品、農薬など、様々な化合物の合成原料や溶剤等として有用である。
背景技術
ラクトンは、環内にエステル基をもつ環状化合物であり、環の員数が３、４、５、６、７のものをそれぞれα−、β−、γ−、δ−、ε−ラクトンと呼ぶ。ラクトン類の合成には多くの製法が公知であり、例えばγ−ブチロラクトン類の合成法として、４−ヒドロキシ酪酸類からの酸触媒による合成法の他、無水コハク酸類の還元、４−ハロゲン化酪酸類の加熱等の合成法が知られている。
しかしながら、製造するγ−ブチロラクトン類の種類によって異なるが、多くの場合、副産物生成、低収率、爆発性、原料が合成しにくい等の問題があり、新規合成法が切望されている。
３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の有機合成的製造法としては、例えば、グリシドールと一酸化炭素を高温高圧下で貴金属触媒を触媒として反応させる方法（米国特許第４，９６８，８１７号）、３−ブテン酸を白金触媒下で過酸化水素を作用させてエポキシ化したものを水和した後にラクトン化する方法（Ａｎｇｅｗ．ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ  ９９４−１０００（１９６６））等が知られているが、何れも爆発等の危険性が高い方法である。また、Ｌ−アスコルビン酸又はＤ−イソアスコルビン酸を出発原料として用い、７工程を経て製造する方法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ５７０−５７２（１９８７））、Ｌ−リンゴ酸から３工程で製造する方法（特開平６−１７２２５６号）等も知られているが、多工程の反応を経由するために操作が煩雑となり、収率の面でも決して望ましいものではない。
さらに、３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の生物学的製造方法としては、シュードモナス属細菌又はエンテロバクター属細菌を微生物触媒として、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルから（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造する方法〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．Ａｓｙｍ．１１．３１０９−３１１２（１９９６）等〕が知られている。しかし、いずれの方法も酵素の安定性に満足できるものではない。また、基質の調製が煩雑であり工業的に有利な方法とは言い難い。
発明の開示
本発明の目的は、容易に合成可能なアミド類を原料とし、穏和な条件下で、より工程が少なく、かつ副生成物の少ない、工業的に有利なラクトン、特にγ−ブチロラクトン類又はδ−バレロラクトン類の製造方法を提供することにある。
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、驚くべきことに、４−ハロ−ブチルアミド類を水と反応させると、ハロゲンとアンモニアが速やかに脱離し、対応するγ−ブチロラクトン類が高収率で生成することを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、一般式（Ｉ）：
2003066617.tif 000003
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ、Ｒ’及びＲ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表し、ｎは０〜２の整数を表す。］
で示されるアミド化合物を水性媒体と反応させることを含むラクトン類の製造方法である。
また、本発明は、一般式（ＩＩ）：
2003066617.tif 000004
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示される４−ハロ−ブチルアミドを水性媒体と反応させ、一般式（ＩＩＩ）：
2003066617.tif 000005
［Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示されるγ−ブチロラクトン類を生成せしめることを含むγ−ブチロラクトン類の製造方法である。
前記方法において、一般式（ＩＩ）で示される４−ハロブチルアミドとしては、例えば４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドが挙げられる。また、一般式（ＩＩ）で示される化合物としては、一般式（ＩＶ）：
2003066617.tif 000006
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示される４−ハロ−ブチロニトリルをニトリルヒドラターゼで処理して得られるものが挙げられる。「ニトリルヒドラターゼで処理」するとは、ニトリルヒドラターゼの触媒作用により水和することを意味する。
ここで、ニトリルヒドラターゼとしては、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属及びロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属する少なくとも一種の微生物、又は一の属に属する少なくとも一種の微生物と他の属に属する少なくとも一種の微生物との混合微生物により産生されるものが挙げられる。また、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を含む形質転換体によりニトリルヒドラターゼを産生させてもよい。
さらに、本発明は、一般式（Ｖ）：
2003066617.tif 000007
［Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ１〜Ｒ８は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示される５−ハロ−ペンチルアミドを水性媒体と反応させ、一般式（ＶＩ）：
2003066617.tif 000008
［Ｒ１〜Ｒ８は、それぞれ独立して、水素原子又は任意の置換基を表す。］
で示されるδ−バレロラクトン類を生成せしめることを含むδ−バレロラクトン類の製造方法である。
前記方法において、反応の際の温度は、例えば３０〜１００℃であり、反応の際のｐＨは、例えばｐＨ１．０〜６．０である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、前記一般式（Ｉ）で示されるアミド化合物を水性媒体と反応させることにより、ハロゲン原子とアンモニアの脱離反応を起こさせて、目的のラクトン類を得るというものである。本発明により、工程が少なく、かつ高収率なラクトン類の製造方法を提供できる。特に、４−ハロ−ブチルアミド類からγ−ブチロラクトン類が製造できることは全く予想できなかったことである。
ここで、式（Ｉ）において、ｎは０〜２の整数を表し、Ｘはハロゲン原子を表す。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味するが、塩素原子が好ましい。ｎが０のときは、原料となるアミド化合物は一般式（ＩＩ）：
2003066617.tif 000009
で示される４−ハロ−ブチルアミドであり、生成するラクトン類は、一般式（ＩＩＩ）：
2003066617.tif 000010
で示されるγ−ブチロラクトン類である。ｎが１のときは、原料となるアミド化合物は一般式（Ｖ）：
2003066617.tif 000011
で示される５−ハロ−ペンチルアミドであり、生成するラクトン類は、一般式（ＶＩ）：
2003066617.tif 000012
で示されるδ−バレロラクトン類である。そして、ｎが２のときは、原料となるアミド化合物は６−ハロ−ヘキシルアミドであり、生成するラクトン類は、ε−カプロラクトン類である。
式（Ｉ）〜式（ＶＩ）において、Ｒ１〜Ｒ８並びにＲ及びＲ’（式（Ｉ）においてｎが１のときは、Ｒ及びＲ’はそれぞれＲ７、Ｒ８に対応する）は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は任意の置換基をいう。ここでいう「任意の置換基」とは、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０（Ｃ１〜Ｃ２０）の炭化水素基、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０（Ｃ７〜Ｃ２０）のアルキルアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいシリル基又は水酸基である。また、置換基を有していてもよいアルキルチオ基、置換基を有していてもよいアリールチオ基、置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアリールスルホニル基であってもよい。
炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であっても飽和又は不飽和の環式であってもよい。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６〜Ｃ１８アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基などが含まれる。
Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基であることが好ましい。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル基は、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル基であることが好ましい。アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチルアリル基、２−ブテニル基等が挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル基は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル基であることが好ましい。アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
Ｃ４〜Ｃ２０アルキルジエニル基は、Ｃ４〜Ｃ１０アルキルジエニル基であることが好ましい。アルキルジエニル基としては、例えば１，３−ブタジエニル基等が挙げられる。
Ｃ６〜Ｃ１８アリール基は、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基であることが好ましい。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、インデニル基、ビフェニル基、アントリル基、フェナントリル基等が挙げられる。
Ｃ６〜Ｃ２０アルキルアリール基は、Ｃ６〜Ｃ１２アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基としては、例えばｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、２，３−キシリル基、２，４−キシリル基、２，５−キシリル基、ｏ−クメニル基、ｍ−クメニル基、ｐ−クメニル基、メシチル基等が挙げられる。
Ｃ６〜Ｃ２０アリールアルキル基は、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。
Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１０シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルケニル基は、Ｃ４〜Ｃ１０シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基としては、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基等が挙げられる。
Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基であることが好ましい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ６〜Ｃ２０アリールオキシ基は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールオキシ基であることが好ましい。アリールオキシ基としては、例えばフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ７〜Ｃ２０アルキルアリールオキシ基は、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリールオキシ基であることが好ましい。アルキルアリールオキシ基としては、例えばメチルフェニルオキシ基、エチルフェニルオキシ基、プロピルフェニルオキシ基、ブチルフェニルオキシ基、ジメチルフェニルオキシ基、ジエチルフェニルオキシ基、ジプロピルフェニルオキシ基、ジブチルフェニルオキシ基、メチルエチルフェニルオキシ基、メチルプロピルフェニルオキシ基、エチルプロピルフェニルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ２０アルコキシカルボニル基は、Ｃ２〜Ｃ１０アルコキシカルボニル基であることが好ましい。アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、２−メトキシエトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等が挙げられる。
置換基を有していてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノ基、メチルフェニルアミノ基、フェニルアミノ基等が挙げられる。
置換基を有していてもよいシリル基としては、例えばジメチルシリル基、ジエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基、ジフェニルメチルシリル基、トリフェニルシリル基、トリフェノキシシリル基、ジメチルメトキシシリル基、ジメチルフェノキシシリル基、メチルメトキシフェニル基等が挙げられる。
本発明においては、溶媒として、他の有機溶媒に比べて極めて安価かつ安全に取り扱える水性媒体を使用することに特徴を有する。水性媒体としては、水道水、蒸留水などのほか、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、硼酸緩衝液等が挙げられる。
本発明の反応に際して使用するアミド類（例えば４−ハロ−ブチルアミド類）及び水性媒体は、任意の割合で混合することができ、水性媒体の使用量に特に制限はない。通常は、化合物（Ｉ）に対して１〜１０００重量倍の範囲であるのが好ましく、２〜１００重量倍の範囲であるのがより好ましい。これらの反応溶液の調製は、水性媒体とアミド類とをまとめて混合してもよく、あるいは所定量の水性媒体中にアミド類を分割添加して混合することもできる。
また反応液中には、ｐＨ調整を容易にする等の目的ため、反応液中に適当な緩衝液を存在させたり、４−ハロ−ブチルアミド類の溶解度を高める等の目的で、適当な有機溶剤を存在させることも可能である。
反応温度は原料の安定性等を考慮して適宜選択でき、例えば３０〜１００℃であり、好ましくは５０〜７０℃であり、さらに好ましくは７０℃である。
反応を実施するための反応ｐＨは、例えばｐＨ１．０〜６．０であり、好ましくは１．２〜５であり、さらに好ましくは３．５である。また、反応中にｐＨが低下した場合は、適当なアルカリ、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、アンモニア等により調整することが有効である。例えば、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドから３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成する反応に際して、アルカリによりｐＨ１．２〜５に調整することで、ｐＨを調整しない場合より高収率で３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを得ることができる。
反応液中に生成蓄積したラクトン類は、公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、γ−ブチロラクトン類を製造する場合において、目的のγ−ブチロラクトン類が非水溶性のときは相分離により、水溶性のときは水を留去するか又は適当な溶媒で抽出することにより、得ることができる。
抽出溶媒としては、ピロリドン類、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ヘキサン、トルエン等が挙げられ、これらの溶媒を適宜選択する。また、反応液にハロゲン化アンモニウムが生成するので、必要に応じて適当な塩類を追加することでハロゲン化アンモニウムを分相させることができる。これにより、アセトニトリルやｔｅｒｔ−ブタノールなど水溶性溶媒を用いた場合でも分相が可能であり、特に親水性の高いγ−ブチロラクトン類の製造には有効である。また、蒸留等によりさらに精製することもできる。
本発明において、アミド類（例えば４−ハロブチルアミド類）は、一般的なアミド合成法、例えば、酸塩化物若しくは酸無水物又はそれらのエステル物にアンモニアを作用させたり、高温下におけるカルボン酸とアンモニアとの脱水縮合、対応する４−ハロブチロニトリル類の鉱酸またはアルカリによる水和によって得られる。
但し、ニトリル類をニトリルヒドラターゼの作用により水和する方法が、収率、純度に優れている点でより好ましい。
以下、４−ハロブチルニトリル類を水和する場合を例に説明する。
この際、使用されるニトリルヒドラターゼとしては、下記一般式（ＩＶ）：
2003066617.tif 000013
で示される４−ハロブチルニトリル類を下記一般式（ＩＩ）：
2003066617.tif 000014
で示される４−ハロブチルアミド類に変換できるものであればいずれも含まれる。
これらニトリルヒドラターゼを含む微生物としては、例えば、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。具体的には、アースロバクター  オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＩＦＯ  １２１３８、ブレビバクテリウム  ヘルボラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ  ｈｅｌｖｏｌｕｍ）ＡＴＣＣ  １１８２２、コリネバクテリウム  フラベシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ  １６４２、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ  １２５４０、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ１２５３９などが挙げられ、これらの微生物は、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）または東京大学分子細胞生物学研究所（ＩＡＭ）から容易に入手することができる。
また、アースロバクター  ｓｐ．ＳＫ１０３、カセオバクター  ｓｐ．ＢＣ２３、ロドコッカス  ロドクロウス  Ｊ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）、１９８７年９月１８日付）、シュードモナス  ｓｐ．ＢＣ１５−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３２０：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）、１９９１年３月１８日付）、シュードモナス  ｓｐ．ＳＫ３１、シュードモナス  ｓｐ．ＳＫ８７、シュードモナス  ｓｐ．ＳＫ１３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３２５：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）、１９９１年３月１８日付）、ロドコッカス  ｓｐ．ＳＫ７０、ロドコッカス  ｓｐ．ＨＲ１１、ロドコッカス  ｓｐ．ＳＫ４９などを例示することもできる。これらの微生物は、第３０１４１７１号特許公報に記載されており、当業者は当該公報を参照して容易に取得することが可能である。さらに、これらの微生物のうち、ロドコッカス  ロドクロウス  Ｊ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）、シュードモナス  ｓｐ．ＢＣ１５−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３２０）及びシュードモナス  ｓｐ．ＳＫ１３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３２５）は、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。寄託情報一覧は以下の通りである。
2003066617.tif 000015
本発明においては、前記いずれかの属に属する微生物を単独で又は複数種組み合わせて使用することが可能である。また、一の属に属する一種又は複数種の微生物と、他の属に属する一種又は複数種の微生物とを組み合わせて、混合微生物として使用することもできる。
さらに、前記の微生物からニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を採取し、適当な宿主−ベクター系で発現させた微生物の使用も可能である。
例えば、前記微生物から染色体ＤＮＡを調製し、適当なプラスミドベクターを用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。ニトリルヒドラターゼ遺伝子のクローニングは、例えばコロニーハイブリダイゼーション等により行うことができる。ニトリルヒドラターゼの部分アミノ酸配列（例えばＮ末端配列）から設計されたＰＣＲ用プライマーを用いて、染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによって、目的のＤＮＡ断片を得ることができる。なお、ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡの塩基配列は、市販の塩基配列決定装置を用いて決定される。
得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子を用いてニトリルヒドラターゼを生産するためには、まず当該遺伝子を適当な発現ベクターに連結してプラスミドを作製し、これを、例えば適当な宿主に導入して形質転換体を得る。
ニトリルヒドラターゼ遺伝子のクローニング及び遺伝子組換え技術は、当分野において周知である（例えば第２８４０２５３号特許公報、第２９０７４７９号特許公報を参照）。
次に、この形質転換体を培養することにより、ニトリルヒドラターゼが宿主細胞内に著量生産される。この酵素は菌体のまま変換反応に使用することもできるが、菌体を破砕して無細胞抽出液として、あるいは精製酵素として使用する。
前記の微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものならばいずれも使用することができる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース、シュークロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の一般天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用でき、この他無機塩、微量金属類、ビタミン等が必要に応じて適宜使用される。
この際、より高いニトリルヒドラターゼ活性を誘導させるために、ｎ−プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、ベンジルシアニドなどの各種ニトリル化合物、ｎ−プロピオンアミド、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミドなどの各種アミド化合物、γ−ブチロラクタム、δ−バレロラクタム、ε−カプロラクタムなどのラクタム化合物などを培地に添加することも有効な場合がある。
前記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ４〜１０、温度１０〜４０℃の範囲にて好気的に１０〜１８０時間培養する。培養は、液体培養、固体培養のいずれで行うこともできる。
前記反応において、ニトリルヒドラターゼは、粗酵素、精製酵素、あるいは培養して得た微生物の培養液、ろ過または遠心分離等により得た菌体、菌体破砕物、菌体抽出物等の形態で使用される。また前記形態物を、アクリルアミド、カラギーナン、アガロース等の適当な担体に固定化、またはイオン交換樹脂等に吸着させることもできる。前記使用形態は、反応様式により適宜選択される。反応様式には、反応基質を添加して微生物培養と同時に反応を行う方法、これらのニトリルヒドラターゼを必要に応じて適当な水性媒体に懸濁して基質に添加する方法、これらのニトリルヒドラターゼを懸濁した水性媒体に基質を添加する方法などがある。
ニトリルヒドラターゼ反応に使用する水性媒体は、水のほか、水に有機酸、リン酸、ホウ酸、アミン類等の塩からなる緩衝液、他塩類、有機溶媒等を必要に応じ添加して調製したものが挙げられる。反応温度や反応ｐＨは特に限定するものではないが、それぞれ０〜５０℃、ｐＨ３〜１０の範囲で行うことが望ましい。
また、ニトリルヒドラターゼにより４−ハロブチロニトリル類から４−ハロブチルアミド類を得る反応と、同時および／または反応後に、４−ハロブチルアミド類をγ−ブチロラクトン類に変換することもできる。
この場合、高収率でγ−ブチロラクトン類を得るためには、０〜５０℃でニトリルヒドラターゼの触媒する反応を実施し、４−ハロブチロニトリル類ができるだけ消費された後、３０〜１００℃に設定し、γ−ブチロラクトン類への変換反応を実施することが好ましい。
４−ハロ−ブチロニトリル類から４−ハロ−ブチルアミド類を得る反応、および４−ハロ−ブチルアミド類からγ−ブチロラクトンを得る反応は、いずれも通常、発熱反応であるため、反応槽は、ジャケット、内部コイル、熱交換器等で必要に応じて冷却する。
また、これらの反応、回収、精製等の操作は、回分、連続のいずれも可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
３４．５質量％の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド水溶液１００ｍｌを、７０℃の水浴中にて３時間反応した。
反応液中のβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの確認は、反応液から酢酸エチルで抽出を行い、溶媒を減圧下留去した後、残渣をＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。各化合物の定量は、高速液体クロマトグラフィーを使用し下記条件で行った。
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６ｍｍＩＤ×２５ｍｍ）ジーエルサイエンス社製
移動相：０．１％リン酸水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：示差屈折検出器（日本分光社製）
その結果、残存している４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドは初期量の１％以下、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン収率は６５．２％、反応終了液のｐＨは０．９であった。また、反応中、反応後において、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。
〔実施例２〕
２０ｍＭのリン酸緩衝液を含む３４．５質量％の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド水溶液１００ｍｌを、７０℃の水浴中にて、３時間反応した。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４質量％ＮａＯＨにて、ｐＨを１．２、２．０、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５に保持し、ｐＨをコントロールしないものと比較した。
実施例１と同様に反応液中のβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの定量を行ったところ、残存している４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドはいずれも初期量の１％以下であり、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン収率は表１の通りであった。なお、ｐＨコントロールしないものの終了時のｐＨは１．０であった。
また、いずれも、反応中、反応後において、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。
2003066617.tif 000016
〔実施例３〕
２０ｍＭのリン酸緩衝液を含む３４．５質量％の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド水溶液１００ｍｌを、３０、５０、７０、１００℃の水浴中にて、残存している４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドが初期量の１モル％以下となるまで反応させた。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４質量％ＮａＯＨにて、ｐＨを３．５に保持した。
実施例１と同様に反応液中のβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの定量を行ったところ、収率は表２の通りであった。また、いずれも、反応中、反応後において、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。
2003066617.tif 000017
〔実施例４〕
２０ｍＭのリン酸緩衝液を含む１１．５、２３、３４．５質量％の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド水溶液１００ｍｌを、７０℃の水浴中にて、残存している４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドが初期量の１モル％以下となるまで反応させた。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４％ＮａＯＨにて、ｐＨを３．５に保持した。
実施例１と同様に反応液中のβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの定量を行ったところ、収率は表３の通りであった。また、いずれも、反応中、反応後において、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。
2003066617.tif 000018
〔実施例５〕
２０ｍＭのリン酸緩衝液を含む２３質量％の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド水溶液１００ｍｌを、７０℃の水浴中にて、残存している４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドが初期量の１モル％以下となるまで反応させた。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４％ＮａＯＨにて、ｐＨを３．５に保持した。
反応終了液５０ｍＬに、５０ｍＬのメチルエチルケトンを加え、激しくかくはんした後、分相させ、有機層を採取した。この操作を３回繰り返し、取得した約１７０ｍＬの有機層を、ロータリーエバポレーターを使用し、水浴温度６０℃、１０ｔｏｒｒにて揮発成分を留去することで澄明な液を得た。
実施例１と同様にβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの定量を行ったところ、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度は９４．５％、カールフィッシャー法による水分測定結果は０．２％であった。
さらに、この液に２００ｍＬのメチルエチルケトンを加えたところ、塩安を主成分とする白濁が生じたため、１μｍのろ紙にて加圧ろ過し、上記と同様に揮発成分を留去し、澄明な液を得た。β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度は９８．１％、水分は０．１％以下であった。初期仕込み４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドからのβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの総合収率は６４．０％であった。
〔実施例６〕
２０ｍＭのリン酸緩衝液を含む２３質量％の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド水溶液１００ｍｌを、７０℃の水浴中にて、残存している４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドが初期量の１モル％以下となるまで反応させた。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４％ＮａＯＨにて、ｐＨを３．５に保持した。
反応終了液５０ｍＬに、５０ｍＬのシクロヘキサノンを加え、ロータリーエバポレーターを使用し、水浴温度６０℃、６０ｔｏｒｒにて、水および揮発成分を留去した。塩安を主成分とする白濁が生じたので、１μｍのろ紙にて加圧ろ過し、ロータリーエバポレーターを使用し、水浴温度６０℃、１０ｔｏｒｒにて、残りの揮発成分を留去した。
実施例１と同様にβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの定量を行ったところ、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度は９２．３％、水分は０．１％以下であった。初期仕込み４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドからの、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの総合収率は９０．４％であった。
〔実施例７〕
グルコース１０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ポリペプトン７．５ｇ／ｌからなる培地（ｐＨ７．２）１０ｍｌを試験管に入れて、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロドコッカス  ロドクロウス  Ｊ−１菌株を接種して、２８℃で４８時間振とう培養し、これを前培養液とした。
上記組成の培地に、尿素１５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２  １０ｍｇ／ｌを加えた培地（ｐＨ７．２）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れて、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した後、前培養液４ｍｌを接種して、２８℃で９６時間振とう培養した。
上記の方法により培養して得た菌体を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）を加え、遠心分離にて集菌した後、１０ｍｌの同緩衝液に菌体を懸濁した。
上記菌体懸濁液１０ｇ、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル３０ｇ、および２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含む水溶液１００ｇを調製し、３０℃で１時間反応させた。途中、液温度が上昇したので、適宜水冷し３０℃に保持した。
実施例１と同様に反応液中の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドの定量を行ったところ、収率は９９％であった。
この溶液を、７０℃の水浴中にて、３時間反応させた。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４質量％ＮａＯＨにてｐＨを３．５に保持した。
実施例１と同様に反応液中のβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの定量を行ったところ、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルからの収率は８４．３％であった。４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。
〔実施例８〕
１１．５質量％の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドおよび１０質量％の水を含むメチルエチルケトン溶液１００ｍｌを、６０℃の水浴中にて２４時間反応させた。
実施例１と同様に反応液中のβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの定量を行ったところ、収率は９２％であった。また、４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド残存率は５％であり、反応中、反応後において、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。
〔参考例１〕
特許３０１４１７１号明細書記載の条件にて、ロドコッカス  ロドクロウス  Ｊ−１を４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルから４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドを生成する反応に供し、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンが生成するか確かめた。
下記組成の培地を５ｍｌずつ試験管に分注し、１２０℃で１５分間殺菌後、イソブチロニトリルおよびイソブチルアミドの各々５（ｗ／ｖ）％の水溶液をメンブランフィルターにて除菌し０．１ｍｌずつ添加した。この培地に、ロドコッカス  ロドクロウス  Ｊ−１菌株を接種して、３０℃にて７２時間振とう培養を行った。菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１．５ｍｌを添加して洗浄後、８８ｍＭの４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌを添加し、２０℃にて２４時間反応させた。
2003066617.tif 000019
実施例１と同様に反応液中の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドの定量を行ったところ、７７．６ｍＭであった。β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、検出限界（１ｍＭ）以下であった。
〔実施例９〕
ロドコッカス  ロドクロウス  Ｊ−１菌株を実施例７と同様の方法により培養し、菌体懸濁液を調製した。
１ｇ（化学純度９２％）および菌体懸濁液１ｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）１８．９ｍｌに加え、５〜１０℃で１０時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーを使用し下記条件で４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドメタクリル酸エステルの定量を行ったところ、収率は９９％であった。
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６ｍｍＩＤ×２５ｍｍ）ジーエルサイエンス社製
移動相：０．１％リン酸−２０％アセトニトリル水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：示差屈折検出器（日本分光社製）
この溶液を、７０℃の水浴中にて、７時間反応させた。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４質量％ＮａＯＨにてｐＨをｐＨ２．５〜３．０に保持した。
反応終了後、同量のトルエンで２回抽出を行い、ロータリーエバポレーターにてトルエン層を濃縮し、油状液体０．４３ｇを取得した。
濃縮物中のβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンメタクリル酸エステルの定量を、上記の高速液体クロマトグラフィーで行ったところ、純度は６２％であった。
〔実施例１０〕
ロドコッカス  ロドクロウス  Ｊ−１菌株を実施例７と同様の方法により培養し、菌体懸濁液を調製した。
２−シアノベンジルブロミド１ｇおよび菌体懸濁液１ｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）９８ｍｌに加え、１０℃で３日間反応させた。
実施例９と同様に反応液中の４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドの定量を行ったところ、収率は９９％以上であった。
この溶液を、７０℃の水浴中にて、１６時間反応させた。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４質量％ＮａＯＨにてｐＨをｐＨ３．０に保持した。
反応液からトルエンで抽出を行い、溶媒を減圧下留去した後、残渣をＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行ったところ、下記式（ＶＩＩ）：
2003066617.tif 000020
で示されるγ−ブチロラクトン類の生成が確認され、実施例９と同様の定量を行ったところ、収率は２１％であった。
〔実施例１１〕
２０ｍＭのリン酸緩衝液を含む１０質量％の４−クロロ−２−ヒドロキシブチルアミド水溶液１００ｍｌを、７０℃の水浴中にて、３時間反応した。その際、ｐＨコントローラーを使用し、２４質量％ＮａＯＨにて、ｐＨを３．５に保持した。
反応液から酢酸エチルで抽出を行い、溶媒を減圧下留去した後、残渣をＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行ったところ、α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの生成が確認され、実施例１と同様の定量を行ったところ、残存している４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドはいずれも初期量の１％以下であり、収率は５４％であった。
産業上の利用可能性
本発明により、γ−ブチロラクトン類又はδ−バレロラクトン類の製造方法が提供される。本発明によれば、４−ハロ−ブチルアミド類等を原料とし、工程が少なく、かつ副生成物の少なく上記ラクトン類を製造することができるため、工業的に有用である。
【国際調査報告】
2003066617.tif 000028
2003066617.tif 000029