(57)【要約】本発明は、副作用がなく安全で、非病原性の口腔内常在菌の生育に影響を与えることなく歯周病菌に対して優れた除菌効果を有する抗歯周病菌組成物、抗歯周病用飲食物及び口腔用洗浄剤を提供する。抗歯周病菌組成物に、カカオマス中に含まれるココア分、該ココア分の熱水抽出物、該ココア分由来のポリフェノール又は該ココア分由来の遊離脂肪酸類を有効成分として含有させ、この抗歯周病菌組成物を飲食物又は口腔用洗浄剤に配合する。前記ココア分は、ココア及び／又はカカオマスであることが好ましい。また、前記遊離脂肪酸類は、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸から選ばれた少なくとも１種以上を含むものであることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオマス中に含まれるココア分を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物。
【請求項２】
カカオマス中に含まれるココア分の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物。
【請求項３】
カカオマス中に含まれるココア分由来のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物。
【請求項４】
カカオマス中に含まれるココア分由来の遊離脂肪酸類を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物。
【請求項５】
カカオマス中に含まれるココア分由来のポリフェノール及びココア分由来の遊離脂肪酸類を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物。
【請求項６】
前記遊離脂肪酸類は、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸から選ばれた少なくとも１種を含むものである、請求項４又は５記載の抗歯周病菌組成物。
【請求項７】
前記ココア分は、ココア及び／又はカカオマスである、請求項１〜６のいずれか一つに記載の抗歯周病菌組成物。
【請求項８】
非病原性の口腔内常在菌の生育を阻害することなく、歯周病菌に対して抗菌作用を有する、請求項１〜７のいずれか一つに記載の抗歯周病菌組成物。
【請求項９】
前記歯周病菌は、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フゾバクテリウム属又はアクチノバシルス属のいずれかに属する菌である、請求項１〜８のいずれか一つに記載の抗歯周病菌組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の抗歯周病菌組成物を含有することを特徴とする抗歯周病用飲食物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の抗歯周病菌組成物を含有することを特徴とする口腔用洗浄剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、カカオマス中に含まれるココア分を有効成分として含有する抗歯周病菌組成物、該抗歯周病菌組成物を含有する抗歯周病用飲食物及び口腔用洗浄剤に関する。
背景技術
歯周炎や歯槽膿漏等の歯周病は、成人の歯損失の主原因であり、厚生労働省も１９８８年から歯周病予防に取り組んでいるが、その罹患率は年々上昇している。例えば、３５〜６４歳の日本人の８０％前後が歯肉炎（歯周病初期）や歯周炎（歯周病後期）を疑われており、２５〜３４歳までの若い世代でも歯肉炎は約６０％に達し、歯周炎に進行している患者も１０％以上いると言われている。
また、米国歯周病学会の調査によると、歯周病患者は健常人に比べ、心筋梗塞を引き起こすリスクが約２．８倍高く、更に、女性の場合、早産のリスクが約７．５倍にもなることが判明している。また、肺炎、ぜんそく、咽頭炎などの呼吸器疾患を起こしやすくなったり、血糖値のコントロールが困難になり、結果として糖尿病を悪化させることになるとも言われている。
歯周病の主な原因は、歯周ポケットに蓄積する歯垢中の細菌である。通常、健常者の歯周ポケットではグラム陽性菌が大部分を占めているが、歯周病が進行するにしたがって、ポルフィロモナス（バクテロイデス）・ジンジバリス、フゾバクテリウム・ヌクレイタム、アクチノバシルス・アクチノミセテムコミタンス等のグラム陰性菌が増加する。そして、重度の成人歯周病者の病巣部からは高い割合でグラム陰性菌、特に、ポルフィロモナス・ジンジバリスが検出され、該菌に対する患者血清中の抗体価も上昇している例が多い。また、動物にポルフィロモナス・ジンジバリスを接種すると、歯周の炎症を悪化させることが示されており、これらの結果から、ポルフィロモナス・ジンジバリスが歯周疾患の成立と進行に重要な働きをしていることが示唆され、歯周病の病原菌（歯周病菌）として有力視されている。
歯周病の症状改善方法としては、抗炎症効果による歯周炎予防あるいは治療が挙げられるが、これらは対症療法であり、抗菌作用による予防あるいは治療はより根本的な原因除去である。
したがって、歯周病の症状改善のためには、歯周ポケットにおけるポルフィロモナス・ジンジバリス等のグラム陰性菌の生育を阻害することが重要であり、これらの菌に対して有効な様々な抗菌性物質を配合した歯磨き剤や含そう剤等が開発され、市販されている。
例えば、特開平３−２１８３２０号公報（特許文献１）には、茶の水乃至熱水抽出物若しくはエタノール等の親水性有機溶媒抽出物を有効成分とする抗歯周病及び口臭の予防剤が開示されている。
また、特開平４−７７４２４号公報（特許文献２）には、歯周病病原菌バクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の特異的な生育阻害作用を有し、更にバクテロイデス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼ阻害作用を有する抗歯周病剤であって、没食子酸、（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキンガレート及びこれらの二量体、三量体等の茶（Ｃａｍｅｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）より抽出されたカテキン類を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病剤が開示されている。
また、特開平６−５６６８７号公報（特許文献３）には、茶葉の水乃至熱水抽出物若しくはエタノール等の親水性有機溶媒抽出物を有効成分とする歯垢除去剤及び歯石沈着防止剤が開示されている。
また、特開平７−２３８０２８号公報（特許文献４）には、アルカリ剤を用いて、アルカリ処理したカカオマスまたは該カカオマスより搾油して得られるココアパウダーから極性溶媒で抽出した抽出物又はその分解物を含有することを特徴とする歯垢形成抑制剤が開示されている。
また、特開平８−８１３８０号公報（特許文献５）には、重量平均分子量が８００〜１０，０００、重合度が３〜３０であるポリフェノールを有効成分とする抗歯周病剤が開示されている。
上記特許文献１〜３、５に開示されているように、これまで茶の抽出物を有効成分とする抗歯周病剤等は多く提案されているものの、カカオマス中に含まれるココア分やその抽出物が歯周病菌に対して抗菌効果を有することは報告されていない。例えば、上記特許文献４には、アルカリ剤を用いて、アルカリ処理したカカオマスまたは該カカオマスより搾油して得られるココアパウダーの抽出物又はその分解物が、う蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンスによるグルカンの歯への付着蓄積（歯垢形成）を抑制することが記載されているが、歯周病菌への抗菌効果については何ら記載されていない。
また、従来の抗菌性物質を配合した歯磨き剤や含そう剤等では、充分な除菌効果が得られない場合も多かった。一方、例えば、テトラサイクリン等の抗生物質は優れた抗菌活性を有するものの、耐性菌の出現や副作用等の問題からその使用には制限があった。更に、抗生物質は歯周病菌だけでなく非病原性の口腔内常在菌の生育までも阻害してしまうため、口腔内常在菌叢のバランスに悪影響を与えてしまうという問題もあった。
このように、歯周病の治療は、歯科医学における最も難しい問題のひとつであり、これまでに歯周病の効果的な予防策はなく、今後、老齢化が進むなかで歯周疾患の予防は重要な問題となっている。
したがって、本発明の目的は、副作用がなく安全で、非病原性の口腔内常在菌の生育に影響を与えることなく歯周病菌に対して優れた除菌効果を有する抗歯周病菌組成物、抗歯周病用飲食物及び口腔用洗浄剤を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、ココアがポルフィロモナス・ジンジバリス等の歯周病菌の生育を阻害し、優れた抗歯周病菌活性を有することを発見し、この事実に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１は、カカオマス中に含まれるココア分を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物を提供するものである。
上記第１の発明によれば、チョコレートやココアの原料として古くから摂取されているココア分を有効成分とするので、副作用の心配がなく安全で、優れた除菌効果を有する抗歯周病菌組成物を提供できる。また、ココア分は、栄養的にも優れた素材であり、ピロリ菌に対する除菌効果なども有しているため（特許第３１１００２０号公報参照）、栄養補給効果や健康維持効果も同時に期待することができる。
本発明の第２は、カカオマス中に含まれるココア分の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物を提供するものである。
上記第２の発明によれば、より優れた除菌効果を有する抗歯周病菌組成物を提供できる。また、ココア分の熱水抽出物は不溶性成分を含まないので、飲食物等に容易に配合することができる。
本発明の第３は、カカオマス中に含まれるココア分由来のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物を提供するものである。
本発明の第４は、カカオマス中に含まれるココア分由来の遊離脂肪酸類を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物を提供するものである。
本発明の第５は、カカオマス中に含まれるココア分由来のポリフェノール及びココア分由来の遊離脂肪酸類を有効成分として含有することを特徴とする抗歯周病菌組成物を提供するものである。
上記第３、４、５の発明によれば、優れた除菌効果を有すると共に使い勝手のよい抗歯周病菌組成物を提供できる。
本発明の第６は、上記第４又は５の発明において、前記遊離脂肪酸類は、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸から選ばれた少なくとも１種を含むものである抗歯周病菌組成物を提供するものである。
本発明の第７は、上記第１〜６の発明のいずれかにおいて、前記ココア分がココア及び／又はカカオマスである抗歯周病菌組成物を提供するものである。
本発明の第８は、上記１〜７の発明のいずれかにおいて、非病原性の口腔内常在菌の生育を阻害することなく、歯周病菌に対して抗菌作用を有する抗歯周病菌組成物を提供するものである。
本発明の第９は、上記第１〜８のいずれかの発明において、前記歯周病菌は、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フゾバクテリウム属又はアクチノバシルス属のいずれかに属する菌である抗歯周病菌組成物を提供するものである。
本発明の抗歯周病菌組成物は、非病原性の口腔内常在菌の生育を阻害することなく歯周病患者の病巣部から高い割合で検出される歯周病菌を効率よく除菌することができる。
本発明の第１０は、前記第１〜９のいずれか一つに記載された前記抗歯周病菌組成物を含有することを特徴とする抗歯周病用飲食物を提供するものである。
本発明の第１１は、前記第１〜８のいずれか一つに記載された前記抗歯周病菌組成物を含有することを特徴とする口腔用洗浄剤を提供するものである。
上記第１０、１１の発明によれば、ココア分に由来する成分を有効成分として含有する抗歯周病菌組成物を含有させることにより、安全で手軽に歯周病の予防ができる抗歯周病用飲食物及び口腔用洗浄剤を提供できる。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、ココア分とは、カカオマスからココアバターを除いた成分を意味し、主としてタンパク質、糖質、食物繊維（水溶性難消化性多糖類、ヘミセルロース、セルロース、リグニン等）、リン脂質、無機質（リン、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、銅、カリウム、ナトリウム等）、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＥ（各種トコフェロール等）、ナイアシン、シュウ酸、クエン酸、りんご酸、コハク酸、乳酸、酢酸、ポリフェノール類（タンニン、エピカテキン、カテキン、ケルセチン等）、無水カフェイン、テオブロミン、各種遊離脂肪酸類（パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等）等を含有している。
上記ココア分としては、具体的には、カカオマスからココアバターを搾油して得られるココア（ココアパウダー）や、カカオマス自体を好ましく用いることができる。
また、ココア分の熱水抽出物とは、上記ココア分を熱水で抽出して得られるココア分の水溶性画分であり、ココア分に含まれる上記有機酸類、遊離脂肪酸類、ビタミン類、ポリフェノール類等の水溶性成分を含有している。ココア分の熱水抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば、ココアパウダーあるいはカカオマスに、適量（通常、ココア分の質量の５〜１００倍量）の水、好ましくは温水を加えて均一に分散させ、オートクレーブ等で加熱処理（通常、４０〜１３０℃、１〜３０分間）した後、濾過、遠心分離等の手段により不溶性画分を除去して得られた抽出液をそのまま用いることができ、必要に応じて濃縮してもよく、更に乾燥して用いることもできる。
また、ココア分由来のポリフェノールは、例えば、ココア又はカカオマスを水に懸濁した後、等量のヘキサンを加えてよく混合してヘキサン層と水層とに分画して水層を回収し、回収した水層に等量の５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液を加えてよく混合して、その上清を回収してメタノールを除去することにより調製することができる。
また、ココア分由来の遊離脂肪酸類とは、上記ココア分に含まれている各種遊離脂肪酸を意味し、具体的には、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、パルミトレイン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等が挙げられる。本発明においては、上記の各種遊離脂肪酸を含む混合物が好ましく用いられ、中でもパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸から選ばれた少なくとも１種以上を含む混合物がより好ましく用いられる。該混合物中における各遊離脂肪酸の割合は、特に制限されないが、上記ココア分中に含まれる全遊離脂肪酸における各遊離脂肪酸の割合に基づいて決めることが好ましい。具体的には、全遊離脂肪酸中における各遊離脂肪酸の割合が、パルミチン酸１０〜５０質量％、ステアリン酸１０〜５０質量％、オレイン酸１０〜７０質量％、リノール酸１〜５０質量％、リノレン酸１〜１０質量％、パルミトレイン酸１〜１０質量％、ミリスチン酸１〜１０質量％、ラウリン酸１〜１０質量％を含む混合物が好ましく用いられる。
上記の各遊離脂肪酸を含有する混合物は、上述した熱水抽出、アルコール抽出、ヘキサン抽出、アセトン抽出等の方法により、上記ココア分に含まれる各種遊離脂肪酸を抽出することにより得ることができる。例えば、上記ココア分の熱水抽出物中には、各遊離脂肪酸が上記のような割合で含まれており、この熱水抽出物をそのまま用いることができ、必要に応じて該熱水抽出物から遊離脂肪酸類を更に精製して用いてもよい。また、上記のココア分中に含まれる全遊離脂肪酸における各遊離脂肪酸の割合に基づいて、各遊離脂肪酸を所定の割合で配合して調製することもできる。
本発明の抗歯周病菌組成物は、ココア分、ココア分の熱水抽出物、ココア分由来のポリフェノール及び／又はココア分由来の遊離脂肪酸類を有効成分として含有するものであり、上記のようにして調製したココア分、ココア分の熱水抽出物、ココア分由来のポリフェノール及び／又はココア分由来の遊離脂肪酸類をそのまま抗歯周病菌組成物として用いることができる。また、必要に応じて、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、蛋白質（乳蛋白、大豆蛋白等）、ビタミン類、ミネラル類、糖質（デキストリン等）、抗歯周病菌活性を有する乳酸菌や生薬等を含むことができる。中でも、栄養学的見地から乳蛋白及びビタミン類を含むことが好ましい。
本発明の抗歯周病菌組成物は、有効成分としてココア分を用いる場合は、該ココア分を０．０１〜５０質量％含むことが好ましく、０．０１〜１０質量％含むことがより好ましい。
また、有効成分としてココア分の熱水抽出物を用いる場合には、該熱水抽出物を固形物換算で０．００１〜２０質量％含むことが好ましく、０．１〜１０質量％含むことがより好ましい。
また、有効成分としてココア分由来のポリフェノールを用いる場合には、該ポリフェノールを０．０００１〜１０質量％含むことが好ましく、０．００１〜１質量％含むことがより好ましい。
また、有効成分としてココア分由来の遊離脂肪酸類を用いる場合には、該遊離脂肪酸類を０．０００１〜１質量％含むことが好ましく、０．００１〜０．２質量％含むことがより好ましい。
また、有効成分としてココア分由来のポリフェノールと遊離脂肪酸類を併用する場合は、該ポリフェノールを０．０００１〜１０質量％、該遊離脂肪酸類を０．０００１〜１質量％含むことが好ましく、該ポリフェノールを０．０１〜１質量％、該遊離脂肪酸類を０．００１〜０．２質量％含むことがより好ましい。
本発明の抗歯周病菌組成物の有効投与量は、成人１日当たり、ココア分（カカオマス）換算で１ｇ以上であり、より好ましくは１０ｇ以上である。また、ココア分の熱水抽出物（固形物）換算で０．１〜１０ｇであり、より好ましくは１〜１０ｇである。また、ココア分由来のポリフェノール換算で０．０１〜１ｇであり、より好ましくは０．１〜１ｇである。また、ココア分由来の遊離脂肪酸類換算で０．０１〜１ｇであり、より好ましくは０．１〜１ｇである。
本発明の抗歯周病菌組成物は、後述する実施例に示されるように非病原性の口腔内常在菌の生育を阻害することなく歯周病患者の病巣部から高い割合で検出されるポルフィロモナス属、プレボテラ属、フゾバクテリウム属又はアクチノバシルス属に属する歯周病菌を効率よく除菌することができる。したがって、口腔内常在菌叢のバランスに悪影響を与えるおそれもない。
ポルフィロモナス属に属する歯周病菌としては、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ポルフィロモナス・アサッカロリティカ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ポルフィロモナス・エンドドンタリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ）等が挙げられる。また、プレボテラ属に属する歯周病菌としては、例えば、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）等が挙げられる。また、フゾバクテリウム属に属する歯周病菌としては、例えば、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フソバクテリウム・ネクロフォルム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、フソバクテリウム・ナビフォルム  ＡＡ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎａｖｉｆｏｒｍｅ）等が挙げられる。また、アクチノバシルス属に属する歯周病菌としては、例えば、アクチノバシルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）等が挙げられる。
一方、非病原性の口腔内常在菌としては、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）等が例示できる。
本発明の抗歯周病菌組成物の製剤形態は、特に制限はなく、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤等が例示でき、使用形態に合わせて選択できる。
固形製剤化の担体としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等の界面活性剤、ステアリン酸塩等の滑沢剤等を使用できる。なお、錠剤の場合は必要に応じて糖衣錠、フィルムコーティング錠とすることもできる。
また、液剤、乳剤、懸濁剤等の形態に成形するには、希釈剤として例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等の通常の溶解補助剤、緩衝剤等を用いてもよいが、ココア分の熱水抽出物の物性との兼ね合いの点からプロピレングリコールが特に好ましく用いられる。
本発明の抗歯周病菌組成物は、例えば、チョコレート、ココア飲料等の各種飲料（ゼリー飲料も含む）、ガム、キャンディー（ハードキャンディー、ソフトキャンディー）、錠菓、各種レトルト食品等の飲食物に添加することができる。
飲食物中における抗歯周病菌組成物の添加量は、上記の有効投与量に基づいて適宜設定できるが、ココア分（カカオマス）換算で０．０１〜５０質量％が好ましく、５〜３０質量％がより好ましい。また、ココア分の熱水抽出物（固形物）換算で０．１〜２０質量％が好ましく、０．２〜１０質量％がより好ましい。また、ココア分由来のポリフェノール換算で０．００１〜５質量％が好ましく、０．１〜３質量％がより好ましい。また、ココア分由来の遊離脂肪酸類換算で０．０１〜１質量％が好ましく、０．０５〜０．５質量％がより好ましい。
また、本発明の抗歯周病菌組成物は、例えば、歯磨き剤、含そう剤等の口腔用洗浄剤に添加することもできる。口腔用洗浄剤中における抗歯周病菌組成物の添加量も上記の有効投与量に基づいて適宜設定できるが、ココア分換算で０．０１〜１０質量％が好ましく、０．１〜５質量％がより好ましい。また、ココア分の熱水抽出物（固形物）換算で０．００１〜３質量％が好ましく、０．０１〜２質量％がより好ましい。また、ココア分由来のポリフェノール換算で０．０００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜１質量％がより好ましい。また、ココア分由来の遊離脂肪酸類換算で０．００１〜１質量％が好ましく、０．０１〜０．５質量％がより好ましい。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。
実施例１〈歯周病菌に対するココアパウダーの抗菌効果の検討〉
ココアパウダー（商品名「森永純ココア」、森永製菓株式会社製）を３０％（ｗ／ｖ）又は１０％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に懸濁し、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理した。これらの溶液をココア全成分の熱水懸濁溶液として用い、以下の方法により抗菌活性の測定を行った。
ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地（ディフコ社製）に、５％（ｗ／ｖ）のＹｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ディフコ社製）と０．０５％（ｗ／ｖ）のＬ  システイン（シグマ社製）を添加した液体培地に、上記ココア全成分の熱水懸濁溶液をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）添加して培地を調製し、対照培地として、ココア全成分の熱水懸濁溶液の代わりに蒸留水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
各培地に、歯周病菌（ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）、又はフソバクリウム・ヌクレイタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ２２４８６）、又はプレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ２５６１１）、又はアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ＡＴＣＣ３３８４４））を１０５ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。
培養開始後１、３、６時間後に、それぞれ培養液をサンプリングし、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）、プレボテラ・インテルメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）はヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、フソバクリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２４８６）、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（ＡＴＣＣ３３８４４）はＢＨＩ寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。
そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。図１にポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）の結果、図２にフソバクリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２４８６）の結果、図３にプレボテラ・インテルメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）の結果、図４にアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（ＡＴＣＣ３３８４４）の結果を示す。
図１に示されるように、３０％（ｗ／ｖ）又は１０％（ｗ／ｖ）ココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したいずれの場合においても、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）は、培養時間の経過に伴って生菌数が大幅に減少していることが分かる。
また、図２に示されるように、３０％（ｗ／ｖ）又は１０％（ｗ／ｖ）ココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したいずれの場合においても、フソバクリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２４８６）は、培養時間の経過に伴い、生菌数が大幅に減少していることが分かる。
また、図３に示されるように、３０％（ｗ／ｖ）又は１０％（ｗ／ｖ）のココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したいずれの場合においても、プレボテラ・インテルメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）やフソバクリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２４８６）ほどではないが、培養時間の経過に伴い、生菌数が減少していることが分かる。
また、図４に示されるように、３０％（ｗ／ｖ）又は１０％（ｗ／ｖ）のココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したいずれの場合においても、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（ＡＴＣＣ３３８４４）は、プレボテラ・インテルメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）と同様に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）やフソバクリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２４８６）ほどではないが、培養時間の経過に伴い、生菌数が減少していることが分かる。
以上の結果から、ココア全成分の熱水懸濁溶液は、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）、フソバクリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２４８６）、プレボテラ・インテルメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（ＡＴＣＣ３３８４４）に対して優れた抗菌活性を有していることが分かった。
実施例２〈歯周病菌に対するココアパウダー熱水抽出物の抗菌効果の検討〉
ココアパウダー（商品名「森永純ココア」、森永製菓株式会社製）を１０％（ｗ／ｖ）となるように水に懸濁し、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理した。そして、室温で、１５分間遠心（×１，０００ｇ）して上清を回収した。この上清をココア分の熱水抽出溶液（固形分２〜３質量％）として用い、以下の方法により抗歯周病菌活性の測定を行った。
ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地（ディフコ社製）に、上記ココア分の熱水抽出溶液を、１％（ｖ／ｖ）又は１０％（ｖ／ｖ）添加して培地を調製し、対照培地として、ココア分の熱水抽出溶液の代わりに蒸留水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
各培地に、歯周病菌（プレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３）又はフゾバクテリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２５８６））を１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌとなるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。培養開始後１、３、６時間後にそれぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天プレートに、段階稀釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。図５にプレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３）の結果、図６にフゾバクテリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２５８６）の結果を示す。
図５に示されるように、プレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３）においては、ココア分の熱水抽出溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合、培養時間の経過の伴い、生菌数が大幅に減少していることが分かる。
また、図６に示されるように、フゾバクテリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２５８６）においては、ココア分の熱水抽出溶液を１％（ｖ／ｖ）又は１０％（ｖ／ｖ）添加したいずれの場合においても、培養時間の経過の伴い、生菌数が大幅に減少していることが分かる。
以上の結果から、ココア分の熱水抽出液は、歯周病菌であるプレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３）、フゾバクテリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２５８６）に対して優れた抗菌活性を有していることが分かった。
実施例３〈非病原性口腔内常在菌に及ぼすココアパウダーの影響の検討〉
実施例１で調製した３０％（ｗ／ｖ）ココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を実施例１と同様にして調製し、対照培地として、ココア全成分の熱水懸濁溶液の代わりに蒸留水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
この培地に、非病原性の口腔内常在菌（ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ  ＡＴＣＣ３３３９７７）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ  ＡＴＣＣ７０７５）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  ＡＴＣＣ１０５５６））を１０５ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。培養開始後４時間後に、それぞれ培養液をサンプリングし、ＢＨＩ寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。図７にストレプトコッカス・アンギノーサス（ＡＴＣＣ３３９７７）の結果、図８にストレプトコッカス・サリバリウス（ＡＴＣＣ７０７５）の結果、図９にストレプトコッカス・サングイニス（ＡＴＣＣ１０５５６）の結果を示す。
図７に示されるように、３０％（ｗ／ｖ）のココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（ＡＴＣＣ３３９７７）は、培養時間が経過しても生菌数の減少が見られないことが分かる。
また、図８に示されるように、３０％（ｗ／ｖ）のココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合において、ストレプトコッカス・サリバリウス（ＡＴＣＣ７０７５）も、培養時間が経過しても生菌数の減少が見られないことが分かる。
また、図９に示されるように、３０％（ｗ／ｖ）のココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合において、ストレプトコッカス・サングイニス（ＡＴＣＣ１０５５６）も、培養時間が経過しても生菌数の減少がみられないことが分かる。
以上の結果から、ココア全成分の熱水懸濁溶液は、非病原性の口腔内常在菌であるストレプトコッカス・アンギノーサス（ＡＴＣＣ３３９７７）、ストレプトコッカス・サリバリウス（ＡＴＣＣ７０７５）、ストレプトコッカス・サングイニス（ＡＴＣＣ１０５５６）に対しては全く抗菌活性を示さないことが分かった。
実施例４〈短時間におけるココアパウダーの抗歯周病菌効果の検討〉
実施例１で調製した３０％（ｗ／ｖ）のココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を実施例１と同様にして調製し、対照培地として、ココア全成分の熱水懸濁溶液の代わりに水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
各培地に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）を１０５ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。培養開始後５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０分後に、それぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。なお、実験は２回行った。それらの結果を図１０に示す。
図１０に示されるように、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）においては、３０％（ｗ／ｖ）ココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合において、培養１０分後までは生菌数はほとんど変わらないが、培養１５分後には生菌数が大幅に減少し、培養３０分後には生菌が検出されないことが分かる。
以上の結果から、ココア全成分の熱水懸濁溶液は、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）に対して、短時間で優れた抗菌活性を発揮することが分かった。したがって、通常の飲用でも歯周病菌に対して充分な抗菌活性が期待できることが示唆された。
実施例５〈歯周病菌の臨床分離株に対するココアパウダーの抗菌効果の検討〉
実施例１で調製した３０％（ｗ／ｖ）又は１０％（ｗ／ｖ）のココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を実施例１と同様にして調製し、対照培地として、ココア全成分の熱水懸濁溶液の代わりに水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
鶴見大学付属病院で治療を受けている歯周病患者の病巣より、ペーパーポイントを用いて歯周病菌群を採取し、その中よりヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地上に黒色コロニーを形成する菌株を選択し、ＰＣＲ法を用いた同定法（Ａ．Ａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｃ．Ｃｈｅｎ，Ｉ．Ｂａｋｋｅｒ，Ｊ．Ｓｌｏｔｓ，．Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９６  Ａｕｇ；１１（４）：２６６−７３）によって、表１に示す５株のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）臨床分離株（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  １１３Ｈ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ８２３Ｄ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  １１１３Ｃ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  １１１３Ｄ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  １４３３Ｆ）を単離した。
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上記の各培地に、各臨床分離株を１０５ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。培養開始後１、３、６時間後に、それぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。
その結果、３０％（ｗ／ｖ）又は１０％（ｗ／ｖ）ココア全成分の熱水懸濁溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したいずれの場合においても、全てのポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の臨床分離株は、培養時間の経過に伴い、タイプストレインであるポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）と同様に生菌数が大幅に減少していた。
この結果から、歯周病菌ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対するココアパウダーの抗菌効果の実用性が確認された。
実施例６〈ココアパウダー中の抗菌成分の同定−１〉
ココアパウダー（商品名「レッドココア」、森永製菓株式会社製）を、１０％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に懸濁した。以下、この溶液を「ココア溶液」とする。
上記ココア溶液に、等量のヘキサンを加えて脂肪分を分離した。脂肪分を除いた残りの水溶性画分に、等量の１００％メタノールを加えて１０分間振蘯し、遠心分離して上清を分離した。その沈渣に５０％メタノールを加えて１０分間振蘯し、遠心分離して上清を分離した。この作業を２回繰り返し、集めた上清をエバポレーターにかけ、メタノールを完全に蒸発させた後、１０％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当となるように蒸留水に懸濁した。この画分を、以下「５０％メタノール抽出画分」とする。この画分には、ココア中のポリフェノール類が含まれていると考えられる。
上記１０％（ｗ／ｖ）ココア溶液、上記１０％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当５０％メタノール抽出画分懸濁液を１０％（ｗ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を調製し、対照培地として、ココア溶液の代わりに水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
各培地に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）を１０５ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。培養開始後１、３、６時間後に、それぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。その結果を図１１に示す。
図１１に示されるように、１０％（ｗ／ｖ）ココア溶液、１０％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当の５０％メタノール抽出画分を１０％（ｖ／ｖ）添加したいずれの場合においても、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）は、培養時間の経過に伴い、生菌数が大幅に減少していることが分かる。
以上の結果から、ココアの抗菌主成分はポリフェノール類である可能性が高いと考えられたため、ポリフェノール類等のフェノール基を持つ物質を吸着する樹脂であるＰＶＰＰを用いて以下のような実験を行った。
上記の方法で得た５０％メタノール抽出画分を遠心分離して水溶性の上清を分離、回収した。これを「ＰＶＰＰ処理前画分」とする。この画分に、ＰＶＰＰを１ｇ／上清１０ｍｌ加えて３７℃で３０分間振蘯し、遠心分離して上清とＰＶＰＰを分離し、上清を回収した。これを「ＰＶＰＰ処理後画分」とする。
上記のＰＶＰＰ処理前画分、又はＰＶＰＰ処理後画分を１０％（ｗ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を調製し、対照培地として、ＰＶＰＰ処理前画分の代わりに水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
各培地に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）を１０５ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。培養開始後１、３、６時間後に、それぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。その結果を図１２に示す。
図１２に示されるように、ＰＶＰＰ処理前画分を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）の生菌数は大幅に減少したが、ポリフェノールを除去したＰＶＰＰ処理後画分を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合には生菌数は大幅には減少していないことが分かる。これは各画分のポリフェノール濃度を測定した結果とも一致していた。以上の結果から、ココアの抗菌主成分はＰＶＰＰによって吸着されるポリフェノール類であることが確認された。
実施例７（ココア由来のポリフェノールと茶カテキンの抗菌効果の比較）
エピガロカテキン等を含む茶由来ポリフェノール（商品名「サンフェノン」、太陽化学株式会社製）を０．０５％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に懸濁し、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理した。この溶液を以下「茶カテキン溶液」とする。
上記茶カテキン溶液と、実施例６における「５０％メタノール抽出画分」のポリフェノール濃度を測定し、「茶カテキン溶液」に含まれるポリフェノール量（０．３１３ｍｇ／ｍｌ）と同濃度となるように「５０％メタノール抽出画分」を１．２５％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当に調整した。
「茶カテキン溶液」と調整した「５０％メタノール抽出画分」を、それぞれ１０％（ｗ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を調製した。
上記各培地に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）を１０６ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気性条件下３７℃で培養した。培養開始後、１、３、６時間後にそれぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。その結果を図１３に示す。
図１３に示されるように、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）においては、１．２５％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当の「５０％メタノール抽出画分」１０％を添加した場合、培養１時間後には生菌は検出されなかったが、茶カテキン溶液１０％を添加した場合は、０．３％ＣＦＵ程度まで減少するにとどまった。なお、その後、培養時間以下に伴い、両サンプルにおいて生菌数が大幅に減少した。
以上の結果から、同量の茶カテキンとココア由来のポリフェノールの抗菌効果を比較した場合、ココア由来のポリフェノールの方がより高い比活性を有していることが示唆された。
実施例８〈ココアパウダー中の抗菌成分の同定−２〉
１０％（ｗ／ｖ）ココア溶液を２Ｎ塩酸によってｐＨ２に調整した。この操作によって、ココア溶液中の水分に塩となって溶け込んでいる遊離脂肪酸が、すべて油分に移行する。
上記ココア溶液に、等量のヘキサンを加えて室温で１０分間振蘯した後、遠心分離してヘキサン画分を分離した。撹拌と遠心分離の操作を３回繰り返し、集めたヘキサン画分をエバポレーターにかけ、ヘキサンを完全に蒸発させた後、１０％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当となるように蒸留水に懸濁し、更に８Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨを元に戻した。この画分に４倍量の１００％メタノールを加えて、６５℃に加温しながら１５分間振蘯した後、遠心分離して油層と水層を分離した。撹拌と遠心分離の操作を２回繰り返し、集めた水層をエバポレーターにかけ、メタノールを完全に蒸発させた後、１０％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当となるように蒸留水に懸濁した。この画分を以下「ヘキサン−メタノール抽出画分」とする。この画分には、ココア中の遊離脂肪酸が含まれていると考えられる。
上記１０％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当のヘキサン−メタノール抽出画分懸濁液を１０％（ｗ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を調製し、対照培地として、ヘキサン−メタノール抽出画分懸濁液の代わりに水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
各培地に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）を１０５ＣＦＵ／ｍｌ前後となるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。培養開始後１、３、６時間後に、それぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。その結果を図１４に示す。
図１４に示されるように、１０％（ｗ／ｖ）ココアパウダー相当のヘキサン−メタノール抽出画分を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）は、培養時間の経過に伴い、生菌数が減少していることが分かる。以上の結果から、ココアに含まれる遊離脂肪酸にも抗菌効果があると考えられた。
実施例９
実施例２と同様にしてココア分の熱水抽出溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加したＢＨＩ培地を調製し、対照培地として、ココア分の熱水抽出溶液の代わりに蒸留水を加えたＢＨＩ培地を調製した。
また、表２に示す割合で遊離脂肪酸を精製水に添加した遊離脂肪酸組成物（以下、「ＦＦＡｃｏｍｐ．」という）を調製し、これをＢＨＩ培地に１０％（ｖ／ｖ）添加して培地を調製した。この「ＦＦＡｃｏｍｐ．」は、マススペクトル等で分析した純ココア中の遊離脂肪酸組成に基づいて、その主要な遊離脂肪酸４種類を精製水に添加し、ココア分中の遊離脂肪酸組成を人工的に再現したものであり、各遊離脂肪酸を上記ココア分の熱水抽出溶液と同等量含有するものである。
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これらの培地に、歯周病菌（ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）、又はプレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３））を１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌとなるように懸濁し、嫌気条件下、３７℃で培養した。そして、培養開始後１、３、６時間後にそれぞれ培養液をサンプリングし、ヘミンメナジオン含有ブルセラ血液寒天平板培地に、それぞれ段階希釈した培養液を一定量接種して培養し、出現したコロニー数を計測した。そして、培養液１ｍｌ中の生菌数を求め、最初の生菌数に対する割合（％ＣＦＵ）を求めた。図１５にポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）の結果、図１６にプレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３）の結果を示す。
図１５に示されるように、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）においては、ココア分の熱水抽出溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合、培養時間の経過に伴い、生菌数が大幅に減少していることが分かる。また、「ＦＦＡｃｏｍｐ．」を添加した場合も、培養時間の経過に伴い、生菌数が大幅に減少していることが分かる。
また、図１６に示されるように、プレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３）においては、図５に示す結果と同様に、ココア分の熱水抽出溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加した場合、培養時間の経過に伴い生菌数が減少していることが分かる。一方、「ＦＦＡｃｏｍｐ．」を添加した場合も、コントロールに比べると、生菌数が減少していることが分かる。
以上の結果から、ココア分の熱水抽出物及びココア分由来の遊離脂肪酸類は、歯周病菌の種類によってその有効濃度が異なるものの、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）、プレボテラ・ニグレセンス（ＡＴＣＣ３３５６３）、フゾバクテリウム・ヌクレイタム（ＡＴＣＣ２２５８６）に対して優れた抗菌活性を有していることが分かった。
実施例１０
下記表３の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有するチョコレートを製造した。
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実施例１１
下記表４の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有するチューインガムを製造した。
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実施例１２
下記表５の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有するキャンディーを製造した。
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実施例１３
下記表６の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有するスポーツ飲料を製造した。
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実施例１４
下記表７の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有するローヤルゼリー飲料を製造した。
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実施例１５
下記表８の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有するレトルトパウチ入り小豆粥を製造した。
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実施例１６
下記表９の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有するトローチ剤を製造した。
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実施例１７
下記表１０の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有する含そう剤を製造した。
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実施例１８
下記表１１の配合により、本発明の抗歯周病菌組成物を含有する練り歯磨き粉を製造した。
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産業上の利用可能性
以上説明したように本発明によれば、カカオマス中に含まれるココア分、該ココア分の熱水抽出物、該ココア分由来のポリフェノール及び／又は該ココア分由来の遊離脂肪酸類を有効成分として含有させることにより、副作用の心配がなく安全で、優れた除菌効果を有する抗歯周病菌組成物を提供できる。この抗歯周病菌組成物は、歯周病患者の病巣部から高い割合で検出されるポルフィロモナス属、プレボテラ属、フゾバクテリウム属又はアクチノバシルス属に属する歯周病菌に対して短時間で優れた抗菌活性を示し、該菌の増殖を抑制することにより、歯周炎や歯肉炎等の歯周病の予防、治療効果が期待できる。また、非病原性の口腔内常在菌の生育を阻害することがなく、口腔内常在菌叢のバランスの改善に役立つ。
したがって、この抗歯周病菌組成物を飲食物や口腔用洗浄剤等に含有させることにより、安全で手軽に歯周病の予防ができる抗歯周病用飲食物及び口腔用洗浄剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ココア全成分の熱水懸濁溶液を添加した培地で、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図２は、ココア全成分の熱水懸濁溶液を添加した培地で、歯周病菌であるフソバクリウム・ヌクレイタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ２２５８６）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図３は、ココア全成分の熱水懸濁溶液を添加した培地で、歯周病菌であるプレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ２６６１１）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図４は、ココア全成分の熱水懸濁溶液を添加した培地で、歯周病菌であるアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ＡＴＣＣ３３８４４））を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図５は、ココア分の熱水抽出溶液を添加した培地で、歯周病菌であるプレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ３３５６３）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図６は、ココア分の熱水抽出溶液を添加した培地で、歯周病菌であるフゾバクテリウム・ヌクレイタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ２２５８６）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図７は、ココア分の熱水抽出溶液を添加した培地で、非病原性の口腔内常在菌であるストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ  ＡＴＣＣ３３３９７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図８は、ココア分の熱水抽出溶液を添加した培地で、非病原性の口腔内常在菌であるストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ  ＡＴＣＣ７０７５）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図９は、ココア分の熱水抽出溶液を添加した培地で、非病原性の口腔内常在菌である、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  ＡＴＣＣ１０５５６）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図１０は、ココア全成分の熱水懸濁溶液を添加した培地で、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図１１は、ココア溶液、又はココア溶液から抽出したポリフェノール画分（５０％メタノール抽出画分）を添加した培地で、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図１２は、前記５０％メタノール抽出画分の水溶性画分（ＰＶＰＰ処理前画分）、又は該画分からポリフェノールを吸着除去した画分（ＰＶＰＰ処理後画分）を添加した培地で、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図１３は、前記５０％メタノール抽出画分（ココア由来のポリフェノール）、又は茶カテキンを添加した培地で、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図１４は、ココア溶液から抽出した遊離脂肪酸画分（ヘキサン−メタノール抽出画分）を添加した培地で、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図１５は、ココア分の熱水抽出溶液、又は「ＦＦＡｃｏｍｐ．」を添加した培地で、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ３３２７７）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
図１６は、ココア分の熱水抽出溶液、又は「ＦＦＡｃｏｍｐ．」を添加した培地で、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ３３５６３）を培養した際の生菌数の経時的変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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