(57)【要約】活性化ヒトリンパ球などを同種のヒト補体を介して溶解させることを特徴とするＨＩＶ感染細胞にも反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を得た。得られたモノクローナル抗体を用いて、活性化リンパ球に特異的に反応し同種補体を介した細胞溶解を誘導するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を含有する免疫反応制御治療剤等を提供、及び活性化ヒトリンパ球に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を用いて、活性化リンパ球を溶解排除することにより、Ｔリンパ球の過剰反応に起因する移植拒絶反応や自己免疫病態の治療する他にＨＩＶ感染症も治療することを特徴とするＨＩＶ治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種のヒト補体を介して溶解させることを特徴とする活性化ヒトリンパ球やＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体。
【請求項２】
活性化ヒトリンパ球に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を用いて、異常活性化リンパ球を溶解排除することにより、Ｔリンパ球の過剰反応に起因する移植拒絶反応や自己免疫病態の治療することを特徴とする免疫抑制剤及びＨＩＶ治療剤。
【請求項３】
活性化ヒトリンパ球やＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体がＨ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号１の核酸配列を有する９Ｆ１１であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体。
【請求項４】
活性化ヒトリンパ球やＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体のＬ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号２の核酸配列を有する９Ｆ１１抗体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体。
【請求項５】
同種のヒト補体を介して溶解させることを特徴とする活性化ヒトリンパ球やＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を産生する寄託番号がＦＥＲＭ  ＰＢ−８３７９である細胞株。
【請求項６】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７９である細胞株が産生することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、活性化リンパ球の分化抗原に反応し活性化リンパ球を同種のヒト補体を介して溶解させるＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体とそれを含有する自己免疫病態の治療剤に関する。
【背景技術】  膠原病、自己免疫疾患、臓器移植拒否反応などにおける生体の免疫反応を制御するためにサイクロスポリン、ＦＫ５０６など種々の免疫抑制剤が開発されている。しかし、前記のような免疫抑制剤は免疫担当細胞以外にも働くため、副作用への配慮が必要である。
一方、標的とする細胞に特異的に反応する抗体を用いるために種々の検討が行われている。例えば、抗体が反応した標的細胞には補体が反応して細胞を溶解することが期待される。しかし、ヒトの細胞膜の上には、種特異的補体制御膜因子群（ＤＡＦ，Ｄｅｃａｙ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＭＣＰ，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＲＦ２０，２０ｋＤａ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒなど）が存在し、同種のヒト補体の反応を防ぐために、補体反応を介した細胞溶解反応を起こさない。
一方、ＨＩＶ感染細胞に反応するヒト血清中のＩｇＭ抗体は、ＨＩＶ感染細胞を補体制御膜因子群に打ち勝ってヒト補体を介した細胞溶解反応起こせることを発見した。ＨＩＶ感染により発現が高まるＧＭ２やＧｇ４などのガングリオシドに対するＩｇＭ抗体がそのような作用を発揮することを報告した（特開平９−２２７４０９）。
ガングリオシドのＧＭ２に対するヒトＩｇＭモノクローナル抗体としては、ＥＢウイルスで不死化したヒトＢリンパ芽球株が産生するＬ５５が報告されており、このヒトＩｇＭモノクローナル抗体を作用させたＨＩＶ感染細胞はヒト補体の反応を介して細胞溶解を起こすことがわかった。
【発明の開示】
本発明は、活性化リンパ球に特異的に反応し同種補体を介した細胞溶解を誘導するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を含有する免疫反応制御治療剤等を提供することにある。
上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、本発明は上記課題を解決するために、活性化ヒトリンパ球などを同種のヒト補体を介して溶解させることを特徴とするＨＩＶ感染細胞にも反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を提供する。
また、本発明は課題を解決するために、ＨＩＶ感染細胞や活性化リンパ球に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を用いて、活性化リンパ球を溶解排除することにより、Ｔリンパ球の過剰反応に起因する移植拒絶反応や自己免疫病態を治療すると共にＨＩＶ感染症も治療することを特徴とするＨＩＶ治療剤を提供する。
さらに、本発明は課題を解決するために、活性化リンパ球やＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体がＨ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号１の核酸配列を有する９Ｆ１１であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体を提供する。
さらに、本発明は課題を解決するために、活性化リンパ球やＨＩＶ感染細胞に反応するヒトＩｇＭモノクローナル抗体のＬ鎖の可変領域の核酸配列が配列番号２の核酸配列を有する９Ｆ１１抗体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヒトＩｇＭモノクローナル抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は９Ｆ１１抗体の特異性を示す図面である。
フローサイトメトリー法で解析した結果、非感染細胞は９Ｆ１１抗体で染色されずＨＩＶ感染細胞が染色されていることを示す。
図２は９Ｆ１１抗体の末梢血リンパ球への特異性を示す図面である。
９Ｆ１１抗体は通常の末梢血リンパ球には反応しないが、ＰＨＡ刺激で活性化したリンパ球には反応したことを示す。（ＰＢＭＣ：  末梢血リンパ球）
図３は９Ｆ１１抗体による補体介在性細胞障害性反応を示す図面である。
（Ａ）ＨＩＶ−１感染細胞ＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢに９Ｆ１１抗体２μｇ／ｍｌと新鮮ヒト血清（補体成分含有）を添加後４時間でのほとんどの細胞か死滅している。また、血清を添加しなかった場合や、非感染細胞ＭＯＬＴ−４に対しては全く影響がなかったことを示す。
（Ｂ）ＰＨＡを用いて末梢血リンパ球を活性化すると９Ｆ１１抗原が誘導され、ＨＩＶ−１感染細胞と同等に９Ｆ１１抗体と補体による細胞障害を受けるようになることを示す。
（ＦＨＳ：新鮮ヒト血清（補体ソースとして使用）  ＰＨＡ：リンパ球活性化試薬％５１Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅ＝死細胞率  ＰＢＭＣ：末梢血リンパ球）
図４は９Ｆ１１μ鎖発現プラスミド構築模式図を示す。
発明を実施するための形態
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
本発明者らは、ヒトの免疫グロブリンに関する遺伝子を含む染色体を導入したキリンビール社製のマウス（ＴＣマウス：ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍｏｕｓｅ）にＨＩＶ感染細胞を免疫して、ＨＩＶ感染細胞に反応するヒト抗体を産生するマウスをえた。この免疫マウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを定法に従って作成し、そのハイブリドーマの中からＨＩＶ感染細胞に反応して、ヒト補体の存在下で感染細胞を溶解させるモノクローナル抗体を産生するクローンを選び出した。そのハイブリドーマクローンを９Ｆ１１細胞株と命名した。９Ｆ１１細胞株が産生する抗体である９Ｆ１１抗体はヒトμ鎖とヒトκ鎖からなるヒトＩｇＭモノクローナル抗体であった。９Ｆ１１抗体はＨＩＶ感染細胞に反応してヒト補体を介して細胞溶解反応を起こしたが、非感染リンパ球でもリンパ球が活性化したものに対しても同様な溶解反応を起した。したがって、ＨＩＶ感染細胞への反応はＨＩＶ感染によりある種の活性化状態になり、９Ｆ１１に反応する抗原（９Ｆ１１抗原）が分化抗原として発現するためにＨＩＶ感染細胞もヒト補体を介して溶解したと理解できた。すなわち９Ｆ１１抗原はリンパ球が活性化したときに発現する分化抗原であり、それに反応して補体を介した溶解反応を誘導する９Ｆ１１抗体は活性化リンパ球を特異的に補体を介して溶解する。そこで、９Ｆ１１抗体を含有する治療剤が活性化リンパ球を抑制する治療法に活用できることが明らかとなり、本発明を完成するに至った。本発明９Ｆ１１抗体を産生する細胞株９Ｆ１１は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に２００３年５月８日に国際寄託して、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７９が付与された。
９Ｆ１１抗体をコードするκ鎖及びμ鎖それぞれにおける可変領域の遺伝子の塩基配列についての解析結果は、表１に示すごとくである。定常領域については、既報の塩基配列とほぼ同様である。
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本発明の活性化リンパ球に特異的に反応し、同種補体を介した細胞溶解を誘導するヒトＩｇＭモノクローナル抗体を含有する免疫反応制御治療剤等に利用するための組成物は、生理学的なキャリアと組み合わせることによって得ることができる。生理学的に受容可能なキャリアは当該分野で周知であり、そして生理学的緩衝化食塩水もしくは他の緩衝作用を有する水溶液、又は溶媒、あるいはグリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）、又は注射可能な有機エステルのような溶剤を含む。生理学的に受容可能なキャリアはヒトＩｇＭ抗体を安定化させるか、吸収を増大させる化合物をも含む。このような生理学的に受容可能な化合物は、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン等の糖類、アスコルビン酸、又はグルタチオン等の抗酸化剤、キレート剤、アルブミン等のタンパク質、あるいは他の安定化剤、又は賦形剤を含む。また、サイクロスポリン、ＦＫ５０６など種々の免疫抑制剤等の他の免疫抑制剤を添加することも可能である。生理学的に受容可能なキャリアの選択は、投与経路、対象疾患によりそれぞれに組み合わせることができる。
実施例１．  ９Ｆ１１抗体の特異性
被験細胞を１ｘ１０６／ｍｌの濃度に培養液中に浮遊し、これに１０μｇ／ｍｌの９Ｆ１１抗体を等容量加えて３０分間反応後、被験細胞を洗浄して、結合した９Ｆ１１を蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗体で染色し、これをフローサイトメトリーにかけて解析した。その結果、ヒト細胞株であるＭＯＬＴ−４細胞、ＣＥＭ細胞等は染色されないが、ＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株やＭＮ株等を感染させると強く染色され、９Ｆ１１抗原がＨＩＶ感染により発現することがわかった（図１）。ＨＩＶ感染はリンパ球活性化を誘導するので、正常人の末梢血液細胞のリンパ球にフィトヘモアグルチニン（ＰＨＡ）を添加して３日間培養した活性化リンパ球などについても検討を行った。末梢血液細胞と未刺激の末梢血リンパ球では染色性は認められなかったが、ＰＨＡで刺激した活性化Ｔリンパ球では強い染色性が認められ、９Ｆ１１抗原は活性化Ｔリンパ球に発現してくる分化抗原であることが明らかとなった（図２）。
実施例２．  ９Ｆ１１抗体による補体介在性細胞障害反応
被検細胞を予め放射性同位元素の５１Ｃｒで標識しておき、この標識被験細胞（５ｘ１０５／ｍｌの濃度に培養液中に浮遊）４０μｌに、種々濃度の９Ｆ１１抗体４０μｌと２０μｌのヒト新鮮血清（補体血清）を加えてマイクロタイタープレート上にて４時間反応させた。反応後、プレートを遠心して細胞を沈下させ、細胞溶解によって上清中に放出された５１Ｃｒの放射能活性を、細胞溶解反応の指標として測定した。ＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢ（ＨＩＶ−１を感染したＭＯＬＴ−４細胞）及び、ＰＨＡで活性化した末梢血由来リンパ芽球など、９Ｆ１１抗原を発現している細胞は２μｇ／ｍｌの９Ｆ１１が存在すると補体を介した細胞溶解を起こした。これに対し、ヒト血清を５６度Ｃで加熱しておいた非働化血清あるいはＣ９欠損ヒト新鮮血清を用いたときには細胞溶解は起こらない。このＣ９欠損ヒト新鮮血清に精製したＣ９を添加すると細胞溶解が起こるようになるので、９Ｆ１１による細胞溶解反応にはヒト補体反応が不可欠であった（図３）。
実施例３．  抗体の遺伝子工学的手法を用いた再構築の方法例
表１に示した９Ｆ１１抗体可変領域の塩基配列をもとにすれば以下に示したｓｈｏｔ−ｇｕｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１３，３３０５−３３１６（１９８５））等の遺伝子工学的手法を用いて９Ｆ１１抗体を産生する細胞株を樹立することができる。
表記の塩基配列を翻訳し、９Ｆ１１抗体の可変領域のアミノ酸配列を得る。９Ｆ１１抗体可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列はオリジナルの９Ｆ１１抗体可変領域の塩基配列に加えてその使用コドンを変化させることにより、表２に示すように多種存在する。それらの中からオリゴヌクレオチドとして化学合成可能な適当な長さ毎に、ある種の制限酵素認識断片を持つものを選び出した（表２）。
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制限酵素認識断片ごとに区切られた塩基配列を基にオリゴヌクレオチドを化学合成した。合成したオリゴヌクレオチドを順次それぞれの制限酵素で消化後、ライゲーションしていくことにより９Ｆ１１抗体可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列全長を得た。Ｈ鎖、Ｌ鎖とも同様に得られた９Ｆ１１抗体可変領域のｃＤＮＡ断片（それぞれｒＶμ９Ｆ１１，ｒＶκ９Ｆ１１）をキメラ抗体作成法と同様にヒトＩｇＭ抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖の定常領域遺伝子配列（Ｃμ，Ｃκ）を有するベクターに組み込みリコンビナント９Ｆ１１μ鎖，κ鎖発現プラスミド（それぞれｒＶμ９Ｆ１１−Ｃμ，ｒＶκ９Ｆ１１−Ｃκ）を得た（図４）。
実施例４．  リコンビナント抗体の発現
この再構成９Ｆ１１抗体遺伝子発現プラスミドによって得られる抗体活性をＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）における一時発現系で検討した。これら２種のプラスミド（ｒＶμ９Ｆ１１−Ｃμ，ｒＶκ９Ｆ１１−Ｃκ）とヒトＩｇＭ抗体Ｊ鎖発現プラスミド（Ｃｊ）の混合物をＧＩＢＣＯ社製リポフェクトアミン試薬を用いプロトコールどおりに遺伝子導入した。その後通常培養条件下で２日間培養を続け遺伝子導入細胞の培養上清を回収した。培養上清を抗ヒトμ抗体、抗ヒトκ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにかけ、培養上清中に存在するリコンビナント９Ｆ１１抗体を確認した。またこの培養上清を用いてＵ９３７細胞、ＭＯＬＴ−４細胞およびＵ９３７細胞にＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株を感染させたＵ９３７／ＩＩＩＢ、ＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢなどを用いてＦＡＣＳ解析を行い同様の特異性を示す抗体であることを確認した。更に蛍光標識した基の９Ｆ１１抗体とこの培養上清を同時にＵ９３７／ＩＩＩＢ、ＭＯＬＴ−４／ＩＩＩＢに作用させる競合阻害試験によりリコンビナント９Ｆ１１抗体の活性を確認した。
したがって、表１に示された９Ｆ１１抗体のμ鎖、κ鎖可変領域の塩基配列がＨＩＶ感染細胞にも発現する活性化リンパ球分化抗原に対する抗体活性を担う極めて重要な領域であることが確認された。
この結果から、これらのμ鎖可変領域の塩基配列、及びκ鎖可変領域の塩基配列をコードする遺伝子はリコンビナント抗ＨＩＶ抗体や抗活性化リンパ球抗体を作成するにあたり極めて有用な遺伝子であることが確認された。
【産業上の利用可能性】  活性化リンパ球に発現する分化抗原に対する本発明のヒトＩｇＭモノクローナル抗体は、活性化リンパ球を補体反応を介して溶解する機能を発揮するので、体内で異常に活性化したリンパ球を制御する治療剤として活用することが出来る。また、リコンビナント抗活性化リンパ球抗体を作成するにあたり極めて有用なμ鎖可変領域の塩基配列、及びκ鎖可変領域の塩基配列をコードする遺伝子を提供する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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