(57)【要約】これまでに、培養細胞がジベレリンに応答するとは、当業者においては全く考えられていなかった。しかし、ジベレリン応答性遺伝子を網羅的、かつ、簡便に同定・単離するには、均一で扱いやすい培養細胞が好適である。このような培養細胞の利点に鑑み、本発明者は、あえて、培養細胞を利用してジベレリン応答性遺伝子を同定・単離する方法の開発を試みた。培養細胞をオーキシンを含まない培地であらかじめ培養した後、遺伝子発現の変化が検出されるか否かの検討を行った。その結果、驚くべきことに、いくつかの遺伝子について、ジベレリン処理後に、発現の変化が検出されることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ジベレリン応答性遺伝子の同定方法。
（ａ）植物培養細胞にジベレリンを接触させる工程
（ｂ）ジベレリンが接触された植物培養細胞において、遺伝子の発現を検出する工程
（ｃ）ジベレリンを接触させない場合と比べ発現が変化している遺伝子を同定する工程
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ジベレリン応答性遺伝子のスクリーニング方法。
（ａ）植物培養細胞にジベレリンを接触させる工程
（ｂ）ジベレリンが接触された植物培養細胞において、遺伝子の発現を検出する工程
（ｃ）ジベレリンを接触させない場合と比べ発現が変化している遺伝子を同定する工程
（ｄ）工程（ｃ）で同定された遺伝子を単離する工程
【請求項３】
被験遺伝子のジベレリン応答性の有無を評価する方法であって、
（ａ）植物培養細胞にジベレリンを接触させる工程、
（ｂ）ジベレリンが接触された植物培養細胞における被験遺伝子の発現を測定する工程、
を含み、上記被験遺伝子の発現が、ジベレリンを接触させない場合と比べ変化している場合に、被験遺伝子がジベレリン応答性を有すると判定される方法。
【請求項４】
オーキシンを含まない培地で培養した植物細胞を用いる、請求項１〜３にいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物培養細胞を用いたジベレリン応答性遺伝子の同定方法およびスクリーニング方法、並びに、植物培養細胞を用いて、被験遺伝子のジベレリン応答性の有無を評価する方法に関する。
背景技術
ジベレリンは、植物ホルモンの一種で、植物の発芽、伸長成長、花芽形成等のライフサイクルに重要な役割をもつ。よって、ジベレリンに応答性を示す遺伝子は、上記の発芽、伸長成長、花芽形成等が修飾された組み換え作物の作製などへの応用が期待されている。
これまでに、ジベレリンによって発現が誘導される遺伝子としては、発芽種子におけるデンプン分解酵素（αアミラーゼ）遺伝子、オオムギＧａｍｙｂ（αアミラーゼ遺伝子の転写調節因子）、イネＯｓＣａ−ａｔｐａｓｅ（Ｃａ２＋  ＡＴＰａｓｅ）、イネＵＢＣ（Ｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）、オートムギＡｓｐｋ１０（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）、イネＯｓ−Ｅｘｐ２  ａｎｄ  ４（ｅｘｐａｎｓｉｎ；ａ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、イネｃｙｃＯｓ１，２（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｙｃｌｉｎ）、イネｃｄｃ２Ｏｓ−２（ｃｄｃ２  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）、イネＲ２（ｃｄｃ２  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ）、イネＲＰＡ１（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ１）、キュウリＣＨＲＣ（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アラビドプシスＧＡＳＡ１およびＧＡＳＡ４、並びに、キュウリＣＲＧ１６が報告されている（山口信次郎、植物ホルモンのシグナル伝達、植物細胞工学シリーズ１０、福田裕穂、町田泰則、神谷勇治、服部束穂  監修、１９９８年、ｐ９７−１０６）。また、イネｅｘｐａｎｓｉｎ  ｇｅｎｅのうち、ＯｓＥＸＰＢ３、ＯｓＥＸＰＢ４、ＯｓＥＸＰＢ６、およびＯｓＥＸＰＢ１１の四種類がジベレリンによって誘導されることが報告されている（Ｌｅｅ，Ｙ．ａｎｄ  Ｋｅｎｄｅ，Ｈ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００１，６４５−６５４．）。さらに、ジベレリンによって発現が抑制される遺伝子としては、ジベレリン生合成に関与する遺伝子、オートムギＡｓｐｋ９（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ）、アズキＡＢ−ＡＣＯ１（ＡＣＣ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アラビドプシスＧＡ４（ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ３ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、および、アラビドプシスＡｔ２３０１（ＧＡ５；ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ２０−ｏｘｉｄａｓｅ）が報告されている（山口信次郎、植物ホルモンのシグナル伝達、植物細胞工学シリーズ１０、福田裕穂、町田泰則、神谷勇治、服部束穂  監修、１９９８年、ｐ９７−１０６）。
これら遺伝子は、すべて、植物体またはその切片を利用して、ジベレリン応答性が同定されたものである。しかしながら、植物体またはその切片は不均一な細胞から構成されており、また、扱いにくいため、これらを利用して、ジベレリン応答性遺伝子を網羅的かつ簡便に同定し、単離することは困難であった。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ジベレリン応答性遺伝子を網羅的かつ簡便に同定し、単離することが可能な方法を提供することにある。
これまでに、培養細胞がジベレリンに応答するとは、当業者においては全く考えられていなかった。しかし、ジベレリン応答性遺伝子を網羅的かつ簡便に同定し、単離するには、均一で扱いやすい培養細胞が好適である。このような培養細胞の利点に鑑み、本発明者は、あえて、培養細胞を利用してジベレリン応答性遺伝子を同定・単離する方法の開発を試みた。具体的には、本発明者は、まず、イネの懸濁培養細胞にジベレリンの一つＧＡ３を処理することで、遺伝子発現の変化が検出されるか否かを検討した。しかしながら、遺伝子発現の変化は検出されなかった。培養細胞の培地には細胞の分裂能を維持するために植物によって代謝されにくいオーキシンが含まれている。そこで、本発明者は、オーキシンがジベレリンの作用を抑制している可能性を考え、次に、培養細胞をオーキシンを含まない培地であらかじめ培養した後、遺伝子発現の変化が検出されるか否かの検討を行った。その結果、驚くべきことに、いくつかの遺伝子について、ジベレリン処理後、短時間で、発現の変化が検出されることが判明した。
ジベレリンはｅｎｔジベラン骨格をもつ化合物の総称であるが、これらの遺伝子発現誘導には活性型ジベレリンのみが有効であった。このことは、これらの遺伝子の発現誘導がジベレリンの受容体を介したシグナル伝達を介するものであることを強く示唆していた。また、タンパク質リン酸化酵素阻害剤、およびタンパク質脱リン酸化酵素阻害剤を用いた解析結果から、遺伝子発現に至るシグナル伝達過程ではタンパク質リン酸化酵素、およびタンパク質脱リン酸化酵素が関与していることが示唆された。また、このようなジベレリン依存的な遺伝子発現に関し、植物体の緑葉と培養細胞との間に相関が認められた。このことは、植物体におけるジベレリン応答性遺伝子を、培養細胞を用いて同定し、単離することができることを示すものである。
即ち、本発明者は、世界で初めて植物の培養細胞を用いてジベレリン応答性遺伝子を同定し、単離する方法を開発することに成功し、本発明を完成した。本発明は、より具体的には、
〔１〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ジベレリン応答性遺伝子の同定方法、
（ａ）植物培養細胞にジベレリンを接触させる工程
（ｂ）ジベレリンが接触された植物培養細胞において、遺伝子の発現を検出する工程
（ｃ）ジベレリンを接触させない場合と比べ発現が変化している遺伝子を同定する工程
〔２〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ジベレリン応答性遺伝子のスクリーニング方法、
（ａ）植物培養細胞にジベレリンを接触させる工程
（ｂ）ジベレリンが接触された植物培養細胞において、遺伝子の発現を検出する工程
（ｃ）ジベレリンを接触させない場合と比べ発現が変化している遺伝子を同定する工程
（ｄ）工程（ｃ）で同定された遺伝子を単離する工程
〔３〕被験遺伝子のジベレリン応答性の有無を評価する方法であって、
（ａ）植物培養細胞にジベレリンを接触させる工程、
（ｂ）ジベレリンが接触された植物培養細胞における被験遺伝子の発現を測定する工程、
を含み、上記被験遺伝子の発現が、ジベレリンを接触させない場合と比べ変化している場合に、被験遺伝子がジベレリン応答性を有すると判定される方法、
〔４〕オーキシンを含まない培地で培養した植物細胞を用いる、〔１〕〜〔３〕にいずれかに記載の方法、
を提供するものである。
本発明においては、植物培養細胞を利用したジベレリン応答性遺伝子の同定方法を提供する。本発明の同定方法においては、まず、植物培養細胞にジベレリンを接触させる。
本発明において「ジベレリン応答性遺伝子」とは、ジベレリンに依存して発現が変化する遺伝子を意味する。ここで、「発現が変化する」とは、発現が増加または減少することを意味する。さらに、発現が増加または減少する場合には、一過的に増加または減少する場合も含まれる。また、発現が減少する場合には、発現が完全に停止する場合も含まれる。
本発明における「ジベレリン」は、ｅｎｔジベランと称される基本構造を有する四員環ジテルペノイドカルボン酸を意味する。これまでに、ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４、ＧＡ１３、ＧＡ１７、ＧＡ１８、ＧＡ１９、ＧＡ２０、ＧＡ２１およびＧＡ２２を含む約１２０個のジベレリンが知られている。本発明におけるジベレリンとしては、上記のジベレリン群を例示できるが、これらに制限されるものではない。
本発明におけるジベレリンは、天然型ジベレリンであれば、所望の植物から、公知の方法で精製することが可能である。また、ＧＡ１、ＧＡ３およびＧＡ４であれば、和光純薬の市販品（ｃａｔ  ＃０７７−０４１９１，０７５−０２８１１，０７２−０２８２１）を使用できる。また、合成型ジベレリンの調製方法は、当業者らに周知である。
本発明において用いる培養細胞の由来する植物としては、特に限定されず、例えば、穀類、野菜、および果樹等の有用農作物、観葉植物等の鑑賞用植物等が挙げられる。具体的には、該植物として、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ、キク、バラ、カーネーション、シクラメン等を例示することができる。好ましくは、イネ科植物であり、最も好ましくはイネである。
また、本発明における植物培養細胞の調製方法としては、特に制限はない。例えば、イネ（主として日本晴）では、籾殻を除去した種子（玄米）を、市販のＭＳ培地に２，４Ｄ（２，４  ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：２，４ジクロロフェノキシ酢酸）を２ｍｇ／Ｌ添加した寒天培地（１％寒天）上で２５℃暗黒化で２週間程度保温することでカルスを得、これを２，４Ｄ（１ｍｇ／Ｌ）を含むＬ培地（Ｎ６に類似）液体培地中で継代培養して得ることが可能である。また、細胞は週一回新しい培地に継代し、２５℃１２０ｒｐｍで旋回培養する。上記Ｌ培地は、ＫＮＯ３：２８３０ｍｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：４６３ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ：１６６ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ：１８５ｍｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：４００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ：５．６ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２／ＥＤＴＡ：７．５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４／４Ｈ２Ｏ：４．４ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ：１．５ｍｇ／Ｌ、ＫＩ：０．８ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３：１．６ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４／５Ｈ２Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４／２Ｈ２Ｏ：０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２／６Ｈ２Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ：０．５ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ：０．１ｍｇ／Ｌ、Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ：０．５ｍｇ／Ｌ、ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ：１００ｍｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｉｎｅ：２ｍｇ／Ｌ、２，４Ｄ：１ｍｇ／Ｌおよびショ糖３０ｇ／Ｌを溶かしてＫＯＨでｐＨを５．８に調整後、オートクレーブすることで調製することができる。
また、植物細胞の培養条件としては、特に制限はなく、所望の植物細胞に適した培養条件を適宜選択することができる。
植物細胞は、遺伝子発現の検出前に、シベレリンへの応答を阻害する物質を含まない培地で培養する。培地は、好ましくは、オーキシンを含まない培地である。本発明において「オーキシン」とは、植物ホルモンの一種であり、植物の茎の先端で合成され、極性的に移動しながら植物の成長を促進・調節する物質、および、それと同等の活性を示す合成化合物を意味する。本発明におけるオーキシンとしては、特に制限はなく、天然型オーキシンであるインドール酢酸、合成型オーキシンである２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等が例示できる。
ジベレリンの植物培養細胞への接触は、通常、植物培養細胞の培養液にジベレリンを添加することにより行うが、植物培養細胞のジベレリンへの応答を誘導できる限り特に制限はない。
本発明の同定方法においては、次いで、ジベレリンが接触された植物培養細胞において、遺伝子の発現を検出する。
本発明における「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。転写量（ｍＲＮＡ量）を指標にした検出方法としては、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡディスプレー法等が挙げられるが、これらの方法に限定されない。該ＤＮＡマイクロアレイ法では、例えば、細胞より抽出したｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡをｃｙ５−ｄＣＴＰ存在下逆転写して一本鎖ｃＤＮＡプローブを作成し、ハイブリダイゼーションの結果をアレイスキャナー（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒ  ＦＬＡ８０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ））を用いて解析することで遺伝子発現を検出することができる。また、上記のＲＮＡディスプレー法では、抽出したＲＮＡの逆転写産物を任意のプライマーを用いてＰＣＲで増幅しその産物を比較することで遺伝子発現を検出することができる。
また、翻訳量を指標にした検出方法としては、特に制限はなく、例えば、タンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、二次元電気泳動法等の電気泳動法で検出する方法が挙げられる。
本発明の同定方法においては、次いで、ジベレリンを接触させない場合（対照）と比べ発現が変化している遺伝子を同定する。特定の遺伝子の発現が、対照と比べ増加している場合には、該遺伝子はジベレリンに応答して発現が誘導される遺伝子として同定される。一方、対照と比べ減少している場合には、該遺伝子はジベレリンに応答して発現が抑制される遺伝子として同定される。
本発明は、また、ジベレリン応答性遺伝子のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法においては、上記同定方法で同定された遺伝子を単離する。遺伝子の単離方法としては、特に制限はない。例えば、遺伝子発現の検出において、ＤＮＡマイクロアレイ法を使用した場合は、誘導されると判定されたスポットに対応するクローンを（ジーンバンク等から）入手することで遺伝子を単離することができる。また、ＲＮＡディスプレー法を使用した場合は、増幅が確認されたバンドをゲルから切り出してＰＣＲで増幅し、クローニング後、ライブラリーをスクリーニングして全長鎖ｃＤＮＡを得ることができる。単離された遺伝子は、ノーザンハイブリダイゼーション法などを利用して、ジベレリン依存的な発現の誘導を確認することが好ましい。
本発明は、さらに、被験遺伝子について、ジベレリン応答性の有無を評価する方法を提供する。
本発明の評価方法においては、まず、植物培養細胞にジベレリンを接触させる。被験遺伝子としては、特に制限はない。ジベレリン応答性の有無を評価したい所望の遺伝子を被験遺伝子とすることができる。用いる植物培養細胞の由来および調製、用いるジベレリン、およびジベレリンの植物培養細胞への接触は、上記本発明の同定方法と同様である。
本発明の評価方法においては、次いで、ジベレリンが接触された植物培養細胞における被験遺伝子の発現を測定する。
被験遺伝子の発現は、本発明の同定方法と同様に、転写レベルで検出しても翻訳レベルで検出してもよい。転写レベルでの検出は、例えば、ジベレリンを接触させた培養細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡに対して、被検遺伝子に対応するｍＲＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーション反応を行うノーザンハイブリダイゼーション法、また上記のようにして抽出したｍＲＮＡを鋳型に、被検遺伝子に対応するｍＲＮＡにハイブリダイズする一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行うＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって行うことができる。
一方、翻訳レベルでの検出は、被験遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティング法、二次元電気泳動法によるスポットの出現位置などを利用して行うことができる。検出に用いる抗体は、当業者に公知の方法で調製することができる。
本発明の評価方法においては、次いで、上記被験遺伝子の発現が、ジベレリンを接触させない場合（対照）と比べ変化している場合に、被験遺伝子がジベレリン応答性を有すると判定される。即ち、被験遺伝子の発現が、対照と比べ増加している場合には、該遺伝子はジベレリンに応答して発現が誘導される遺伝子として同定される。一方、被験遺伝子の発現が、対照と比べ減少している場合には、該遺伝子はジベレリンに応答して発現が抑制される遺伝子として同定される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、実施例は、下記の材料および方法に従って実施した。
（１）イネ培養細胞；  イネ培養細胞は発芽イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ  Ｎｉｐｐｏｎｎｂａｒｅ）種子より１ＰＰＭの２，４Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含むＮ６寒天培地上で誘導し、Ｎ６液体培地で以下のように継代した。週に一度生体積約１ｍｌ程度の細胞を１５０ｍｌのＮ６培地に植え継いだ。２週に一度２０−ｍｅｓｈの金網を通して細胞塊を小さくする操作を行った。ノーザンブロットのＲＮＡ抽出に供する細胞は裏ごししないで３０ｍｌの培地に植え継いだ細胞を４〜６日間振とう培養したものを用いた。
（２）ＲＮＡ抽出；  イネ培養細胞および緑葉からの全ＲＮＡ抽出はフェノールＳＤＳ法に従って行った。組織体積の約１０倍以上のフェノール（水で９０％程度飽和させたもの）およびこれと等量の抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０，１％ＳＤＳ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ）存在下ポリトロンホモジェナイザーで組織を磨砕した。遠心分離によって得た水層を繰り返しフェノール抽出した後、０．６容のイソプロパノールを加えて攪拌し、全核酸を沈殿させた。これを水に溶かした後その０．２５容の１０Ｍ  ＬｉＣｌを加えて氷冷し高分子ＲＮＡを遠心分離によって回収した。これを７０％エタノールで洗浄したのち少量の水に溶解させてＲＮＡ標品とした。
（３）培養細胞および緑葉のジベレリン処理方法；  培養細胞をあらかじめ２，４Ｄを含まないＮ６培地で数回洗浄後同じ培地に懸濁し２５℃で２時間浸透した。ジベレリン（ＧＡ３：エタノール溶液）をそれぞれの終濃度になるように加えて所定時間振とう培養後ＲＮＡ抽出に供した。播種後３週間の日本晴植物体にジベレリンをスプレーで噴霧処理しタイムコースを追って３，４葉をサンプリングし、全ＲＮＡを抽出した。エリシター処理はイネ培養細胞に直接エリシター水溶液を投与することにより行った。
（４）ハイブリダイゼーション；  ノーザンハイブリダイゼーションのためのＲＮＡ変性はグリオキサル法によった。１０μｇの全ＲＮＡ（３．７μｌ）に２．７μｌのグリオキサル（終濃度１Ｍ）、１．６μｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、終濃度１０ｍＭ）、８μｌのジメチルスルフォキシド（終濃度５０％）を加えて５０℃で１時間保温したのち１．４％アガロース（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０）中で電気泳動した。泳動後ＲＮＡをナイロン膜（バイオダインＡ）にブロットし８０℃、２時間処理をしてＲＮＡを膜に固定した。ハイブリダイゼーションは５０％フォルムアミド、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，５ｘＳＳＰＥ（０．９ＭＮａＣｌ，５０ｍＭリン酸ナトリウム，５ｍＭＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）、５ｘデンハルト溶液（０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン）中で４２℃一昼夜行い、その後０．１ｘＳＳＣ（１５ｍＭＮａＣｌ，１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）で、室温で５分間３回、６５℃で３０分間、２回洗浄した後Ｘ線フィルムに露光した。
（５）ＤＮＡマイクロアレイ解析；  マイクロチップ（ｈｔｔｐ：／／ｃｄｎａ０１．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＲＭＯＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）はイネゲノムプロジェクトにより１２６５クローンのイネＥＳＴを用いて作成された。エリシター無処理および１５分処理した細胞より抽出したｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡをｃｙ５−ｄＣＴＰ存在下逆転写して一本鎖ｃＤＮＡプローブを作成し、その結果をアレイスキャナー（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒ  ＦＬＡ８０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ））を用いて解析した。
［実施例１］
これまでに、イネイモチ病菌細胞壁の主要成分の一つ、キチンのオリゴマー（Ｎ−アセチルキトオリゴ糖）がイネ培養細胞に対して種々の防御反応を低濃度で誘導する、すなわち強力なエリシター（生体防御反応を誘導する物質）として作用することが見出されている（Ｙａｍａｄａ，Ａ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｏ．，ａｎｄ  Ａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５７，４０５−４０９．）。その過程で、これまでも知られていた防御関連酵素遺伝子、ＰＡＬ、キチナーゼ、グルカナーゼが発現すること（Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｙａｚａｋｉ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｔａｋａｉ，Ｒ．，Ｙａｍａｄａ，Ｋ．，Ｓａｋａｎｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ，Ｎ−ａｃｅｔｈｙｌｃｈｉｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔ．，１９９８，１２，１１６７−１１７４．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ａ．，Ｈｉｂｉ，Ｔ．，Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，３９，９０７−９１４．）、これ以外により速いタイムコースでＥＬ２、ＥＬ３、ＥＬ５という３種の新規な初期遺伝子が発現することを見出されている（Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．，Ｋｕｃｈｉｔｓｕ，Ｋ．，Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｋｏｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｍｉｄｏｈ，Ｎ．，Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．Ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｓ  ｒａｐｉｄｌｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ，ａ  ｂｉｏｔｉｃ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９６，３７，５６３−５６７．Ｔａｋａｉ，Ｒ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｋ．，Ｋａｋｕ，Ｋ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａ  ｒｉｃｅ  ｇｅｎｅ，��Ｌ５，ｗｈｉｃｈ  ｓｈｏｗｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ＡＴＬ  ｆａｍｉｌｙ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，２００１，１６０，５７７−５８３．）。
本発明者は、ＤＮＡマイクロアレイでエリシター処理１５分でシグナルが有意に増加した２つのＥＳＴ（ｃ７２４９５，ＡＵ０９４８６０）を農林水産ジーンバンクより入手して全塩基配列を解読し、両者の推定アミノ酸配列について、既知配列との相同性検索を行った。その結果、既知のＧＲＡＳファミリー遺伝子と相同性を有することが判明した（図１および図２）。
ＧＲＡＳとは、シロイヌナズナの根および茎の断面構造形成を司る遺伝子であり、転写因子と推定されている遺伝子（Ｓｃａｒｅｃｒｏｗ）（Ｌａｕｒｅｎｚｉｏ，Ｌ．，Ｄ．，Ｗｙｓｏｃｋａ−Ｄｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｍａｌａｍｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｐｙｓｈ，Ｌ．，Ｈｅｌａｒｉｕｔｔａ，Ｙ．，Ｆｒｅｓｈｏｕｒ，Ｇ．，Ｈａｈｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．Ｔｈｅ  ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｏｏｔ．Ｃｅｌｌ，１９９６，８６，４２３−４３３．）、アラビドプシスにおいて、ジベレリンのシグナルを負に制御する２種類の遺伝子（ＧＡＩ、ＲＧＡ）（Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｃａｒｏｌ，Ｐ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｋｉｎｇ，Ｋ．Ｅ．，Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｒｂｅｒｄ，Ｎ．Ｐ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９７，１１，３１９４−３２０５．Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｉａｍｐａｇｌｉｏ，Ｃ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｔ−Ｐ．Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＧＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８，１０，１５５−１６９．）の頭文字をとって命名された遺伝子ファミリーである（Ｐｙｓｈ，Ｌ．Ｄ．，Ｗｙｓｏｃｋａ−Ｄｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ，Ｃ．，Ｂｏｕｃｈｅｚ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．Ｔｈｅ  ＧＲＡＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ−ＬＩＫＥ  ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１９９９，１８，１１１−１１９．）。ＧＲＡＳファミリーのアミノ酸配列は、相同性の低いＮ末領域、ロイシンヘプタド構造，ＶＨＩＩＤ領域等によって特徴づけられる。このような構造は動物や微生物では知られておらず、植物に特有のものである。
エリシター処理によって誘導された両遺伝子はＶＨＩＩＤ領域を有し、Ｃ末側のアミノ酸配列はＳｃａｒｅｃｒｏｗおよびそのファミリーとの間でよく保存されていたが典型的なロイシンヘプタド構造は認められなかった。またジベレリンシグナルリプレッサーに特徴的であり、ジベレリンのシグナルをキャッチする上で重要な働きをしているＤＥＬＬＡ配列（Ｈｅｒｂａｒｄ，Ｎ．Ｐ．，Ｋｉｎｇ，Ｋ．，Ｅ．，Ｃａｒｏｌ，Ｐ．，Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｅｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｅ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９９８，２０，１００１−１００８．）は存在しなかった。以後、Ｃ７２４９５をＣＩＧＲ１遺伝子（塩基配列を配列番号：１、アミノ酸配列を配列番号：２に記す）、ＡＵ９４８６０をＣＩＧＲ２遺伝子（塩基配列を配列番号：３、アミノ酸配列を配列番号：４に記す）と命名した。ヌクレオチドレベルでの両者の相同性は５７％、アミノ酸配列レベルでの相同性は４０％であった。ゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果、両遺伝子はそれぞれ１コピー存在するものと考えられた（図３）。
図４は両遺伝子産物ならびにこれまでに構造が明らかになったＧＲＡＳファミリー遺伝子産物の推定分子進化系統を示す。ＣＩＧＲ２遺伝子はＣＩＧＲ１遺伝子よりもむしろアラビドプシスのＡｔＳＣＬ５に近縁であると考えられた。またジベレリンシグナルリプレッサーは一つのサブファミリーを形成し、イネＯｓＧＡＩ（ＳＬＲ）はＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子よりもトウモロコシやアラビドプシスのリプレッサーにより近縁であることが示唆された。
［実施例２］
ＧＲＡＳファミリー遺伝子産物は転写調節因子であると考えられているがそれらがどのような遺伝子発現の調節に関わっているかについての知見は得られていない。アラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗは典型的な核移行シグナルをもたないが、Ｎ末側にセリン、スレオニン、プロリン、グルタミンが多いこと等の理由から転写因子と推測された。アラビドプシスのジベレリンシグナルリプレッサーの一つ、ＧＡＩおよびそれと極めてよく似た遺伝子ＧＲＳには核移行シグナル様の配列が存在した（Ｐｅｎｇ，Ｊ．，Ｃａｒｏｌ，Ｐ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｋｉｎｇ，Ｋ．Ｅ．，Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｒｂｅｒｄ，Ｎ．Ｐ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９７，１１，３１９４−３２０５．）。またもう一つのリプレッサーであるＲＧＡが、ＧＦＰとの融合タンパク質を用いた実験で核に局在することが示された（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｉａｍｐａｇｌｉｏ，Ｃ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｔ−Ｐ．Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＧＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８，１０，１５５−１６９．）。ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子についてその細胞内局在性を検討するためこれらの翻訳領域をＧＦＰにｉｎ  ｆｒａｍｅで連結したキメラプラスミドをパーティクルガン法によってタマネギ表皮細胞に導入し、融合タンパク質の挙動をＧＦＰの蛍光を指標として追跡したところ、ＣＩＧＲ２・ＧＦＰ融合タンパク質が細胞核に局在している像が観察された（図５）。またＧＦＰ単独ではそのような像は観察されなかったことから、ＣＩＧＲ２遺伝子産物は核に局在すると結論した。
［実施例３］
ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子はいずれもＤＮＡマイクロアレイ解析によってエリシター応答性遺伝子として同定された。そこでこれらの両遺伝子のエリシター応答性をノーザンブロットハイブリダイゼーション法によって解析した。両遺伝子ともキチン７量体処理５分後にそのｍＲＮＡ量の顕著な増加が観察されはじめ９０分に至るまで発現量は増加し続けた（図６ａ）。キチンオリゴマーのイネに対するエリシター活性はそのサイズに依存し、７または８量体がもっとも強い活性をもつこと、脱アセチル体であるキトサンオリゴマーは活性が極めて低いことがこれまでの研究により明らかになっている。そこで１〜７量体のキチンオリゴマーおよび４，７量体のキトサンオリゴマーを処理したときのこれら両遺伝子の発現誘導を調べた。両者ともキチンの７量体にもっとも強く応答し、キトサンのオリゴマーには有意な応答を示さなかった（図６ｂ）。
［実施例４］
芦刈ら（Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｙａｎｏ，Ｍ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，ａｎｄ  ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．Ｒｉｃｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｗａｒｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｄｗａｒｆ  １  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，１０２８４−１０２８９．）、藤澤ら（Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ａｓａｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｉｗａｓａｋｉ，Ｙ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｄｗａｒｆｉｓｍ，ｉｎ  ｒｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，７５７５−７５８０．）は独立に、イネわい性変異体ｄ１の原因遺伝子（Ｄ１）が３量体型Ｇタンパク質αサブユニットをコードしていることを見いだした。動物細胞においては３量体型Ｇタンパク質は７回膜貫通型受容体と共役して細胞外の情報を伝達する重要な役割をもつことが知られている（Ｎｅｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｔｏｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｏｒｇａｎｉｚｅｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ．１９９５，Ｃｅｌｌ  ５０，１０１１−１０１９．）。
一方、エリシターシグナルの伝達過程においてはこの阻害剤あるいは活性化剤を用いた研究からその関与が示唆されている（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ，Ｌ．，Ｈｅｉｎｓｙｅｉｎ，Ｐ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｕｒｓｔ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，２０１４０−２０１４７．）がこれらの阻害剤はその特異性が必ずしも明確でないなどの問題点が指摘されており（Ｅｐｈｒｉｔｉｋｈｉｎｅ，Ｇ．，Ｐｒａｄｉｅｒ，Ｊ．−Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｕｅｒｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ＧＴＰγＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３，３１，５７３−５８４．）、Ｄ１遺伝子産物の関与についても明確な結論は得られていない。
塚田らはｄ１系統の種子由来のカルスにおけるエリシター応答性諸反応を野生型と詳細に比較し、有意な差が認められないことを示した（Ｔｓｕｋａｄａ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．Ｒｉｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｈｉｔｉｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃｏｕｐｌｅ  ｔｏ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｄａｉｋｏｋｕ  ｄｗａｒｆ（ｄ１）ｍｕｔａｎｔｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  α−ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔｒｕｍ，２００２，１１６，３７３−３８２）。
予備的実験の結果からＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のｄ１系統におけるエリシター誘導も野生型と同じタイムコースをたどることを確認した。
一方、上口−田中ら（Ｕｅｇｕｃｈｉ−Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｍ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．Ｒｉｃｅ  ｄｗａｒｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｄ１，ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  α  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００，９７，１１６３８−１１６４３．）は発芽種子アリューロンにおけるαアミラーゼの誘導を指標として、ジベレリンのシグナル伝達にＤ１遺伝子が関与していることを示した。これより先にＳｃｈｕｍａｃｈｅｒら（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｔ．，Ｒｏｓｓｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｔｈｅｒｅｓ，Ｋ．Ｔｈｅ  Ｌａｔｅｒａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｌｓ）ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＨＩＩＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，２９０−２９５．）はトマトの腋芽抑制遺伝子の産物がＳｃａｒｅｃｒｏｗと同じ遺伝子ファミリーに属することを明らかにし、その形態形成における役割の考察においてこの遺伝子産物とジベレリンとの何らかの相互作用の可能性を指摘した。
そこでＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子についてそのジベレリン応答性を検討した。懸濁培養細胞に活性型ジベレリンの一つＧＡ３を処理し、タイムコースを追ってこれら両遺伝子の発現変化を解析したが、処理３時間後まで見る限りでは両遺伝子ともその発現量に有意な変化は認められなかった。培養細胞の培地には細胞の分裂能を維持するために植物によって代謝されにくいオーキシンの一つである２，４Ｄが含まれている。これがジベレリンの作用を抑制している可能性が考えられたため、細胞を２，４Ｄを含まない培地であらかじめ洗浄した後、同じ培地中で２時間前培養し、ＧＡ３を処理したところ、処理１０分後をピークとする一過的な発現が観察された（図７）。
これまで、ジベレリンシグナル伝達の研究は穀物種子のアリューロン組織におけるαアミラーゼの誘導を指標とした解析が中心であり、培養細胞を用いた例は上記の結果が初めてである。そこでジベレリンによるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の培養細胞での発現を指標としてその応答性をさらに詳細に解析した。
図８はこれら両遺伝子の発現誘導に対するＧＡ３の濃度効果をみたものである。両遺伝子とも１０−６ＭのＧＡ３処理によってその発現が誘導されはじめ、１０−４Ｍでほぼ飽和に達した。Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙら（Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙ，Ｍ．，Ｏｖａｄｉｓ，Ｍ．，Ｉｔｚｈａｋｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．ＣＨＲＣ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２，２４７４７−２４７５０．）はキュウリ花弁色素体のカロチノイド結合タンパク質、ＣＨＲＣのジベレリンによる誘導には少なくとも１０−７ＭのＧＡ３が必要で、１０−４Ｍまでほぼ直線的に発現量が増大することを報告しており、材料、遺伝子が異なるがＧＡ３の有効濃度に関しては似たような結果となっている。
［実施例５］
ジベレリンはオーキシンやサイトカイニンと異なり、生理活性ではなくｅｎｔジベラン骨格をもつ化合物として定義されているため、その活性には大きな差がある。これまで述べてきたＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のＧＡ３による発現誘導がその生理活性に基づくものかそれともｅｎｔジベラン骨格自体にこの両遺伝子を誘導する活性があるのかを調べるために活性型（ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４）、不活性型（ＧＡ１３、ＧＡ１７）のジベレリン（Ｃｒｏｚｉｅｒ，Ａ．，Ｋｕｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｄｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｐｈａｒｉｓ，Ｒ．Ｐ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ２６  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ  ｉｎ  ｎｉｎｅ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ．Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ  １９７０，４８，８６７−８７７．）によるこれら両遺伝子の発現誘導を解析した。その結果、両遺伝子とも活性型ジベレリンによってのみその発現が誘導された（図９）。この結果はこれまでに述べてきたジベレリンによるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の発現誘導がジベレリンの受容体を介したシグナル伝達を介するものであることを強く示唆している。
［実施例６］
培養細胞はオーキシン存在下で脱分化状態にあると考えられており、葉緑体をもたないために従属栄養条件下で生育するなど、植物体とは組織学的、生理学的に大きく異なるものである。したがってこれまで述べてきたＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のジベレリンによる誘導現象は培養細胞における特殊な現象である可能性が否定できない。そこでイネ緑葉において両遺伝子がジベレリンにどのように応答するかを解析した。播種後３週間のイネの３，４葉にＧＡ３（５０μＭ）をスプレーしタイムコースを追って全ＲＮＡを抽出して両遺伝子の発現量変化を解析した。その結果両遺伝子ともスプレー後３０分をピークとする極めて迅速な一過的発現を示した（図１０）。したがって培養細胞における、ジベレリン受容体を介したシグナルは培養細胞特有のものではなく、イネ植物体においても機能していることが強く示唆された。
［実施例７］
Ｋｕｏら（Ｋｕｏ，Ａ．，Ｃａｐｐｅｌｌｕｔｉ，Ｓ．，Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｈ，Ｄ．Ｓ．Ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｂｌｏｃｋｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｇｅｓ，ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ａｌｅｕｒｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９６，８，２５９−２６９．）はコムギアリューロン層におけるαアミラーゼのジベレリンによる誘導がタンパク質脱リン酸化酵素阻害剤の一つであるオカダ酸によって特異的に阻害されることを見いだした。オカダ酸は動物のタンパク質脱リン酸化酵素のうちＰＰ１、ＰＰ２Ｂを阻害することが知られている。
一方タンパク質リン酸化酵素阻害剤であるスタウロスポリン、Ｋ−２５２−Ａはほとんど阻害しなかったことから、ジベレリンからαアミラーゼ遺伝子に至るシグナル伝達にはタンパク質リン酸化、特にタンパク質脱リン酸化酵素が重要な関与をしていると推測した。
一方、これまでの我々の結果ではエリシター応答性遺伝子の発現誘導はＫ−２５２−Ａの前処理によって強く阻害されることが明らかになっている（Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｙａｚａｋｉ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｔａｋａｉ，Ｒ．，Ｙａｍａｄａ，Ｋ．，Ｓａｋａｎｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ，Ｎ−ａｃｅｔｈｙｌｃｈｉｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔ．１９９８，１２，１１６７−１１７４．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ａ．，Ｈｉｂｉ，Ｔ．，Ｈｅ，Ｄ．−Ｙ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉ，Ｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，３９，９０７−９１４．）。
そこでイネ培養細胞におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のジベレリンおよびエリシターによる誘導における種々の阻害剤の影響を検討した。まずＫｕｏらの結果を参照してオカダ酸を前処理した細胞では両遺伝子のキチン７量体による誘導はほとんど阻害されなかったのに対してＧＡ３による誘導はほぼ完全に阻害された（図１１Ｂ）ことから、イネ培養細胞におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子へのジベレリンからのシグナル伝達にはタンパク質脱リン酸化酵素の関与が推定された。つぎにタンパク質リン酸化酵素阻害剤について検討した。受容体型チロシンキナーゼの阻害剤として知られるラベンダスチンＡはオカダ酸とほぼ同様の阻害を示し、キチン７量体による誘導をほとんど阻害しないのに対しＧＡ３による誘導をほぼ完全に阻害した（図１１Ｃ）。タンパク質セリン・スレオニンリン酸化酵素、タンパク質チロシンリン酸化酵素のいずれをも阻害するとされるＫ−２５２−Ａは両遺伝子のキチン７量体およびＧＡ３による誘導をほぼ完全に阻害した（図１１Ｄ）。
コムギアリューロン層におけるαアミラーゼのジベレリンによる誘導はオカダ酸によって阻害されるがＫ−２５２−Ａによっては阻害されないと報告されている（Ｋｕｏ，Ａ．，Ｃａｐｐｅｌｌｕｔｉ，Ｓ．，Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｓｈ，Ｄ．Ｓ．Ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｂｌｏｃｋｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｇｅｓ，ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ａｌｅｕｒｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９６，８，２５９−２６９．）。
図１１の結果は、培養細胞におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のジベレリン誘導においてもオカダ酸によって阻害されるタンパク質脱リン酸化酵素の関与のほかに、Ｋ−２５２−Ａ、ラベンダスチンＡによって阻害されるタンパク質リン酸化酵素の関与を示唆するものであり、アリューロン層におけるシグナル伝達との共通性、相違点が認められた。また、ジベレリンからのシグナル伝達はキチン７量体からのものとは質的に異なると考えられる。
Ｒｉｃｈａｒｄら（Ｄｏｎａｌｄ  Ｅ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊｉｎｒｏｎｇ  Ｐｅｎｇ，ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｐ．Ｈａｒｂｅｒｄ  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ｖｏｌ２２，ｐ５７３−５７７（２０００））は、ＧＲＡＳファミリーは後生動物に幅広く見いだされる転写因子、ＳＴＡＴに対応するものであるという仮説を提唱している。ＳＴＡＴではＣ末領域には動物の転写因子、ＳＴＡＴファミリーに共通したＳＨ２領域に類似した構造が見いだされる。ＳＨ２領域のＣ末端付近に動物のＳＴＡＴでもよく保存されリン酸化を受けることが知られているチロシン残基、およびこのリン酸化チロシンと静電的に相互作用するとされるアルギニン残基が保存されている。アミノ酸配列のＮ−末付近はＣ末側に比べると相同性が低くなっている。これはＧＲＡＳファミリーに一般的である。ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のヌクレオチドレベルでの相同性は５７％であった。一方、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果これら両遺伝子は１コピーずつ存在するものと推定された（図３）。イネのゲノムＤＮＡ  ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）で完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写した。これを３２Ｐで標識したＣＩＧＲ１、ＣＩＧＲ２でハイブリダイズしたところｃＤＮＡのマップと一致するパターンが得られた。
このことからｃＤＮＡの全長鎖はそれぞれ対応する遺伝子産物と特異的にハイブリダイズするものと考えられた。両遺伝子ともジベレリンシグナルの負の制御因子であるＧＡＩ／ＲＧＡサブファミリーに共通するＤＥＬＬＡ配列を有していない。
産業上の利用の可能性
本発明により、ジベレリン応答性遺伝子を網羅的かつ簡便に同定し、単離することが可能となった。また、本発明により、特定の遺伝子がジベレリン応答性を有するか否かを簡便に評価することが可能となった。本発明の方法により同定されたジベレリン応答性遺伝子は、発芽、伸長成長、花芽形成等が修飾された組み換え作物の作製などへの応用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子からコードされるアミノ酸配列とＧＲＡＳファミリーとの比較を示す図である。ＳＬＲ（ＯｓＧＡＩ）はイネジベレリンシグナルリプレッサー（配列番号：５）、Ｔｏｍａｔｏ  Ｌｓはトマト腋芽抑制因子（配列番号：６）を示す。４種類全てで保存されているアミノ酸を＊で、３種類で保存されているアミノ酸を・で示す。
図２は、図１の続きを示す図である。
図３は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。Ａは、ＣＩＧＲ１遺伝子を示す。Ｂは、ＣＩＧＲ２遺伝子を示す。
図４は、アミノ酸レベルでのＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の進化系統を示す図である。ＡｔＳＣＲはアラビドプシスＳｃａｒｅｃｒｏｗ、ＡｔＳＣＬｎはＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子、ＡｔＧＲＳはＡｔＧＡＩに類似の機能不明の遺伝子、ＡｔＧＲＡはアラビドプシスのジベレリンシグナルリプレッサー、ＡｔＧＡＩはアラビドプシスのジベレリンシグナルリプレッサー（ＧＲＡとの機能分担については不明）、ＯｓＳＬＲはイネのジベレリンシグナルリプレッサー、Ｔｏｍａｔｏ  Ｌｓはトマトの腋芽抑制因子、アラビドプシスの光シグナル伝達因子、ＡｔＳＣＬ２１はアラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子（機能不明）、ＣＩＧＲ２は本研究で報告したイネ遺伝子、ＡｔｓＣＬ１３はアラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子（機能不明）、ＡｔＳＣＬ５はアラビドプシスのＳｃａｒｅｃｒｏｗ様遺伝子（機能不明）、ＣＩＧＲ１は本研究で報告したイネ遺伝子を示す。
図５は、ＣＩＧＲ１およびＣＩＧＲ２遺伝子の核局在を示す写真である。３５Ｓ／ＣＩＧＲ１／ＧＦＰまたは３５Ｓ／ＣＩＧＲ２／ＧＦＰ融合遺伝子をパーティクルガン法でタマネギ表皮細胞に導入し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した。対照として３５Ｓ／ＧＦＰ融合遺伝子を用いた。ａは３５Ｓ／ＧＦＰ、ｂは３５Ｓ／ＣＩＧＲ１／ＧＦＰ、ｃは３５Ｓ／ＣＩＧＲ２／ＧＦＰを表す。
図６は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のキチンオリゴマーへの応答性を示す写真である。ａは、キチン７量体処理による発現のタイムコース（分）を示す。ｂは、キチンおよびキトサンオリゴマーの誘導活性を示す。
図７は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子のＧＡ３応答に対する２，４Ｄの効果を示す写真である。時間は、ＧＡ３処理後の時間を示す。
図８は、ＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の発現誘導に及ぼすＧＡ３の濃度効果を示す図および写真である。ａは、各濃度（単位はモル濃度）のＧＡ３を１０分間処理した後に抽出した全ＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション法による解析結果を示す写真である。ｂは、イメージアナライザーによるａのシグナルの定量結果を示す図である。四角がＣＩＧＲ１遺伝子、白抜き三角がＣＩＧＲ２遺伝子を示す。
図９は、ジベレリンの生理活性と遺伝子発現を示す図および写真である。イネ培養細胞に活性型（ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４）、不活性型（ＧＡ１３、ＧＡ１７）のジベレリンを１０分間処理し、全ＲＮＡを抽出した。ノーザンブロットハイブリダイゼーション法で解析した結果を写真で示す。
図１０は、ＧＡ３処理後のイネ緑葉におけるＣＩＧＲ１遺伝子およびＣＩＧＲ２遺伝子の発現を示す写真である。イネ植物体にＧＡ３をスプレー処理し、タイムコースを追って３，４葉をサンプリングした。３，４葉より抽出した全ＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイゼーション法で解析した。
図１１は、エリシター応答とジベレリン応答に対するタンパク質リン酸化阻害剤の効果を示す写真である。（Ａ）エリシター応答のポジティブコントロール、（Ｂ）オカダ酸（１μＭ）、（Ｃ）ラベンダスチンＡ（３０μＭ）、（Ｄ）Ｋ−２５２−Ａ（２０μＭ）をキチン７量体（ＧＮ７）またはジベレリン（ＧＡ３）処理１０分前に投与した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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