(57)【要約】担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその一部に対して実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを調製する工程と、（ａ）前記ＤＮＡ、又は（ｂ）前記ＤＮＡとプロモーター活性を有するＤＮＡ断片とを含み、該ＤＮＡが転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を調製する工程と、該セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とを含む、木材チップの処理方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその一部に対して実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを調製する工程と、
（ａ）前記ＤＮＡ、又は
（ｂ）前記ＤＮＡとプロモーター活性を有するＤＮＡ断片とを含み、該ＤＮＡが、転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡ、
を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を調製する工程と、
該セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とを含む、木材チップの処理方法。
【請求項２】
セルロース分解酵素遺伝子が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ、糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子、糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子、糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子、及び糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される１種以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離されたセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１又は３において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項４】
セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離されたセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号７、９又は１１で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号７、９又は１１において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項５】
セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離されたセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号１４で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１４において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項６】
糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号１８で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１８において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項７】
糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号２０で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖素分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２０において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項８】
糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号２４で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２４において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項９】
糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号２８で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２８において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１０】
担子菌が、コリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）又はファネロケエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞がコリオラス・ヒルスタスである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって得られる木材チップ。
【請求項１３】
請求項１２に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって得られるパルプ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、セルロース分解酵素をコードする遺伝子のアンチセンス遺伝子を利用した木材チップの処理方法に関する。
背景技術
紙パルプ工業で製造されているパルプは、その製造方法により機械パルプと化学パルプに分けられる。
機械パルプは機械的エネルギーを用いて木材繊維を物理的に摩砕して製造する。木材成分をほとんどそのまま含んでいるため、高い収率で製造することができ、薄く不透明度の高い紙を作ることができる。しかしながら、摩砕のために大きな電力を必要とすると共に、紙力強度が出にくいという欠点がある。
前記のような問題を解決し、かつパルプ収率を低下させない微生物のスクリーニングが広く行われている。例えば、ハンノキの一次解繊サーモメカニカルパルプ（ＴＭＰ）を担子菌であるファネロケエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）によりグルコース存在下で処理した後、二次解繊を行った場合、２５から３０％解繊エネルギーが減少したという報告がある（Ｂａｒ−Ｌｅｖ  ａｎｄ  Ｔ．Ｋ．Ｋｉｒｋ，Ｔａｐｐｉ  Ｊ．，６５，１１１，１９８２）。また、ファネロケエテ・クリソスポリウムとディコミタス・スクアレンス（Ｄｉｃｈｏｍｉｔｕｓ  ｓｑｕａｌｅｎｓ）を用い、アスペン材を処理した際には、コントロールと比べて紙力強度が増加している（Ｍｙｅｒｓ．，Ｔａｐｐｉ  Ｊ．，１０５，１９８８）。Ａｋａｍａｔｈｕらは、コリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）を含む白色腐朽菌１０株を用いポプラ材上に培養し、パルプ収率、解繊エネルギー、パルプ強度について調べている。その結果、コリオラス・ヒルスタスでは解繊エネルギーが減少し、結晶化度が増加するなど、用いた菌株の中ではチップの前処理菌として好ましいことが示されたが、同時に収率が約７％であった（Ａｋａｍａｔｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｋｕｚａｉ  ｇａｋｋａｉｓｈｉ，３０（８）６９７−７０２，１９８４）。また、Ｎｉｓｈｉｂｅらは、白色腐朽菌６１種、８５株から予備選抜した１０種類の腐朽菌を使って、サワグルミ木片と針葉樹２次離解ＴＭＰを微生物分解し、選択的に脱リグニンを行い、パルプ繊維の崩壊が少ないコプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、ファネロケエテ・クリソスポリウムを選抜し、グルコースと尿素の存在下では紙力強度の低下が抑えられることを示した。しかし、パルプ収率の低下が、１４日間、３０℃の処理でそれぞれ６．３％、９．７％であった。コリオラス・ヒルスタスを用いた場合、収率減は７．５％であった（Ｎｉｓｈｉｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｐａｎ  Ｔａｐｐｉ，４２（２），１９８８）。Ｋａｓｈｉｎｏらは、白色腐朽菌ＩＺＵ−１５４を自然界からスクリーニングし、ファネロケエテ・クリソスポリウムやトラメテス・ベルシカラ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）より選択的にリグニンを分解し、広葉樹を７日間処理した場合、解繊エネルギーが１／２〜２／３減少することを確認した。また、パルプ強度は約２倍増加した。針葉樹を１０〜１４日間処理した場合では解繊エネルギーが１／３減少し、強度増加も得られた。培地を加えた場合には７日間で同等の結果を得ることができた（Ｋａｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｐｐｉ  Ｊ．，７６（１２），１６７，１９９３）。さらに、米国では最近、ＵＳＤＡ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのグループを中心に研究機関、紙パルプ産業数社から成るリグニンコンソーシアムを形成し、リグニン分解力が高く、セルロース分解力の低い菌株のスクリーニングを行い、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）を自然界から新たに単離した。この株を用いて機械パルプの動力削減を検討し、例えば、ＴＭＰの製造エネルギー���４０％近くを削減でき、このときの収率の低下が３〜５％程度であり、心配される紙の強度への悪影響はなく、むしろ強度が上がっていると報告している。ＵＳＤＡ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでは既にパイロットプラントを建設し、単離したセリポリオプシス・サブバーミスポラの実証試験を行っているが、米国内の工場を想定し、工場のチップヤードで微生物処理を行うことを考えている（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｐｐｉ  Ｊ．，８１．１２．１５３，１９９８）。しかし、チップを保存しているパイル内部が高温となるため、高温で効果の得られる菌株が必要とされているが、この単離したセリポリオプシス・サブバーミスポラは３２℃までの温度でしか効果が得られず、実用面での使用には不適切である。
また、これまでスクリーニングで得られてきた微生物はリグニン分解の選択性が必ずしも高くなく、リグニンのみでなく、セルロースも分解されてしまうため、パルプ収率や紙力低下を生じる。従って、リグニン分解の選択性を高めた微生物、すなわち、リグニン分解能力には優れるが、セルロース分解は抑制する微生物の取得・作製がさらに求められている。
リグニン分解の選択性を高めた変異体はＡｎｄｅｒらにより作製されている。彼らは、ＵＶ照射によりスポロトリチュム・プルベルレンタム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｍ）に変異処理を行い、セルラーゼ活性が弱い株であるＣｅｌ４４の菌株の開発している。野生株とこのセルラーゼ欠損株Ｃｅｌ４４とを用いてカバ材木片の分解を行ったところ、前者がリグニン及びキシランをよく分解するのに対し、後者はリグニン及びキシランをよく分解するが、グルカンをほとんど分解しなかった（Ａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓｖｅｎｓｋ  Ｐａｐｐｅｒｓｔｉｄｎｉｎｇ，１８，６４３，１９７５）。このＣｅｌ４４を用いてバーチ材を６週間処理した後、機械パルプの製造を行ったところ、紙力強度の増加が見られた（Ａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓｖｅｎｓｋ  Ｐａｐｐｅｒｅｔｉｄｎｉｎｇ，１８，６４１，１９７５）。また、バーチ材とパイン材を用いて実験を行い、処理時間を増加させることによって、繊維のフィブリル化とリファイニングのエネルギーが３０％減少したと報告している（Ｅｒｉｋｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｌｌａｎｄｅｒ．，Ｓｖｅｎｓｋ  Ｐａｐｐｅｒｓｔｉｄ，８５，Ｒ３３，１９８２）。彼らはフィレビア・ラヂアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）においても同様にセルラーゼ活性の弱い株Ｃｅｌ２６を作製した。このＣｅｌ２６でパイン材のチップとパルプを処理した後、機械パルプを製造した際、いずれの場合も紙力の改善は見られなかったものの、解繊エネルギーの低下が見られた。また、重量減少は２％以下であった（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｖｅｎｓｋ  Ｐａｐｐｅｒｓｔｉｄ，８，２２１，１９８０）。
上記のようにセルラーゼ活性の弱い変異株の作製が行われ、機械パルプ処理への利用の検討が行われているが、これらの変異株は紫外線照射により変異処理しているため、変異株の成長速度が遅く、分解処理に長時間かかってしまうという問題がある。このため、成長速度には影響せずセルロース分解活性のみを抑える変異株の作製が望まれている。
一方、化学パルプは、化学薬品を用いて木材中のリグニンを溶出させセルロース、ヘミセルロースを取り出す製造方法である。現在では水酸化ナトリウムと硫化ナトリウムを用いて脱リグニンを行うクラフトパルプが主流となっている。クラフトパルプにおいても機械パルプと同様に微生物処理を行い、蒸解前に脱リグニンを行うことでの製造エネルギーの削減、パルプ品質の向上が試みられている。
例えばファネロケエテ・クリソスポリウムを用いて、レッドオーク材やアスペン材を３０日間処理すると、同一Ｋａ価における収率が向上し、叩解エネルギーが削減すること、また、引張り強度と破裂強度が増加するという報告がある（Ｏｒｉａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｐｐｉ，７３，１４７，１９９０）。同じく、ファネロケエテ・クリソスポリウムを用いた実験において、破裂強度、引裂き強度の増加が報告されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｏｄ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓｃｉ．，２７．１９８，１９９５）。Ｍｏｌｉｎａらはラジアータパインをトラメタス・ベルシコラとフルオロータス・オストリータス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）で処理した際には、１１〜１４％の製造エネルギーが削減できると報告している。しかしながら、トラメテス・ベルシコラの場合にはパルプ強度の減少が見られる（Ｍｏｌｉｎａ，５０ｔｈ  Ａｐｐｉｔａ  Ａｎｎｕａｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｐ．５７−６３，１９９６；Ｍｏｌｉｎａ，５１ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｐ．１９９−２０６）。Ｂａｊｐａｉらは、セリポリオプシス・サブバーミスポラを用いた実験において活性アルカリを１８％削減し、蒸解時間を３３％削減し、白液中の硫化度を３０％削減することができることを報告している（Ｐ．Ｂａｊｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｐａｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：２７（７），２３５−２３９，２００１）。
上記のように、クラフトパルプにおける微生物処理は蒸解性を向上させエネルギーの削減をもたらすが、収率や紙力強度を低下させる場合があり、機械パルプと同様に微生物処理を実用化するには、リグニンを分解する能力には優れるが、セルロースを分解する能力は抑制されている、リグニン分解の選択性を高めた微生物の取得・作製が必要となっている。
そのセルロースを分解する酵素（セルロース分解酵素）の中で、セルラーゼと総称される酵素はβ−１，４−グルカン（セルロース）又はその誘導体のβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する酵素であり、高等植物、菌類、細菌などの微生物、軟体動物などに広く分布している。セルラーゼは、セルロース主鎖のβ−１，４−グルコピラノシル結合をエンド型に加水分解する、いわゆるエンドグルカナーゼ（ＣＭＣアーゼ）と、セルロース主鎖のうち末端から主にセロビオース残基を切り取る、いわゆるエキソグルカナーゼ（アビセラーゼ）とに大別されることが知られている。そして、これらの加水分解酵素がセルロースに相乗的に作用することによりセルロース基質が低分子化してセロビオースを生じ、さらにβ−グルコシダーゼが関与することにより、グルコース単位まで分解される。
また、セロビオースデヒドロゲナーゼは、セロビオースやセロオリゴ糖を酸化してセロビオノラクトンを生成すると同時にキノン、鉄などの金属錯体、フェノキシラジカル、酸素などを還元する酸化還元酵素である。この酵素は、微生物がセルロースを分解するときにセルラーゼと同時に産生される（Ｅｒｉｋｓｓｏｎｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４９，２８２−２８５，１９７４）こと、セロビオースによるセルラーゼ活性の阻害、すなわち生成物阻害を解除する（Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５３，１０１，１９９８）ことから、セルラーゼとの共役でセルロース分解を促進すると考えられている。また、セロビオースデヒドロゲナーゼは強力にセルロースを分解するハイドロキシラジカルを発生するＦｅｎｔｏｎ反応を引き起こすため、セルロース分解に深く関与していると考えられている。このことはＤｕｍｏｎｃｅａｕｘらによるセロビオースデヒドロゲナーゼ活性を抑制した変異株の作製ならびにその諸性質の検討結果によっても示唆されている。彼らは、抗生物質であるフェロマイシンを指標にした相同組換え法によるセロビオースデヒドロゲナーゼ欠損株の作製を行い、セロビオースデヒドロゲナーゼ欠損株では非晶性セルロースを炭素源とした場合には野生株と成長速度が変わらないが、結晶性セルロース上で培養した際には生育速度が著しく遅くなること、セロビオースデヒドロゲナーゼ欠損株においても広葉樹未漂白パルプのリグニンや合成リグニンである１４Ｃ−ＤＨＰを野生株と同等に分解することを報告している（Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂ．２９，４７８−４８９，２００１）。
セロビオースデヒドロゲナーゼの総説（Ｇ．Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８（２０００）９３−１１３）等によれば、セロビオースデヒドロゲナーゼを生産する微生物としてはファネロケエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、トラメテス・ベルシコラ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、スキゾフィラム・コミュネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、コネオフォラ・プテアナ（Ｃｏｎｅｏｐｈｏｒａ  ｐｕｔｅａｎａ）、ミセリオプトレ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒｅ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｆｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）等の木材腐朽菌が挙げられている。
また、セロビオースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子と称する）については、例えば、ファネロケエテ・クリソスポリウムでは、Ｋ３株のｃＤＮＡ（Ｒａｉｃｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６９，２３３−２３８，１９９５）、ＯＧＣ１０１株ではｃＤＮＡ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２（４），１３２９−１３３５，１９９６）、染色体遺伝子のクローニングが行われている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（２），７９６−７９９，１９９７）。また、トラメテス・ベルシカラ（Ｔ．Ｊ．Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．２１０．２１１−２１９（１９９８））や、ピクノポラス・シンナバリナス（Ｓ．Ｍ．Ｍｏｕｋｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３４，２３−３３，１９９９）においてもセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子が報告されている。
しかしながら、上記のようにセロビオースデヒドロゲナーゼやそれをコードする遺伝子の開示はあるが、機械パルプや化学パルプ製造における微生物処理にあたって、リグニン分解の選択性を高めた微生物の取得・作製に必要なコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼをはじめとするセルロース分解酵素やセルロース分解酵素遺伝子の解明、並びに該遺伝子を用いた遺伝子組換え技術は報告されていない。また、そのような技術によって得られる形質転換体を用いての効果的なパルプ処理方法についても開示はされていない。
一方、セルロース分解酵素の利用に対しても、以前から強い関心が持たれている。例えば、家庭用洗剤への添加、繊維などのセルロース系高分子材料の表面処理による改質、古紙からの脱インク処理、食品の加工処理など、極めて多方面での利用が検討されてきている。このため、セルロース分解酵素を高生産する方法が求められており、セロビオースデヒドロゲナーゼの高生産に関する試みとしては、ファネロケエテ・クリソスポリウムのセロビオースデヒドロゲナーゼー１遺伝子の上流に構成的に働くプロモーターであるＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼを連結させた報告がある（Ｌｉ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７０，１４１−１４６，２０００）。しかしながら、ファネロケエテ・クリソスポリウムは日本では有害菌に指定されているため利用することはできない。従って、有害でない微生物を用いたセロビオースデヒドロゲナーゼをはじめとするセルロース分解酵素を高生産し得る技術の開発が求められているが、これまで、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子等のセルロース分解酵素遺伝子を用いたそのような技術の報告はなされていない。
発明の開示
本発明は、セルロース分解酵素をコードする遺伝子のアンチセンス遺伝子を利用した木材チップの処理方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために、セロビオースデヒドロゲナーゼ等をはじめとするセルロース分解酵素生産菌を求め、広範なスクリーニングを行い鋭意研究を行った結果、コリオラス・ヒルスタスがセルロース分解酵素を生産することを見い出した。更に、それらのセルロース分解酵素をコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。また、該遺伝子のアンチセンス遺伝子を利用した該遺伝子の発現を制御する方法を開発し、該方法を用いて木材チップでパルプを製造した際、収率や紙力強度低下を抑制することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）  担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその一部に対して実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを調製する工程と、
（ａ）前記ＤＮＡ、又は
（ｂ）前記ＤＮＡとプロモーター活性を有するＤＮＡ断片とを含み、該ＤＮＡが、転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡ、
を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を調製する工程と、
該セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とを含む、木材チップの処理方法。
（２）  セルロース分解酵素遺伝子が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ、糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子、糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子、糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子、及び糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される１種以上である、（１）に記載の方法。
（３）  セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離されたセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１又は３において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（４）  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離されたセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号７、９又は１１で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号７、９又は１１において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（５）  セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離されたセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号１４で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１４において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（６）  糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号１８で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１８において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（７）  糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号２０で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖素分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２０において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（８）  糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号２４で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２４において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（９）  糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号２８で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２８において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（１０）  担子菌が、コリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）又はファネロケエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  宿主細胞がコリオラス・ヒルスタスである、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  （１）〜（１１）のいずれかに記載の方法によって得られる木材チップ。
（１３）  （１２）に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
（１４）  （１３）に記載の方法によって得られるパルプ。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−４８６７５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号５はプラークハイブリダイショーン用プローブである。
配列番号６はプラークハイブリダイショーン用プローブである。
配列番号１３はプラークハイブリダイショーンに用いたプローブである。
配列番号１６はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号１７はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号２２はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号２３はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号２６はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号２７はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３０はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３１はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３２はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３３はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３４はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３５はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３６はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３７はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３８はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号３９はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４０はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４１はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４２はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４３はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４４はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４５はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４６はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４７はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４８はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号４９はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号５０はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号５１はＰＣＲ反応用プライマーである。
配列番号５２はＰＣＲ反応用プライマーである。
発明を実施するための形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその一部に対して実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを調製する工程と、（ａ）前記ＤＮＡ、又は（ｂ）前記ＤＮＡとプロモーター活性を有するＤＮＡ断片とを含み、該ＤＮＡが、転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を調製する工程と、該セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とを含む、木材チップの処理方法、を提供する。
本明細書において、担子菌とは、セルロース分解能を有する属種であればいかなる菌も利用可能であるが、特に、和名をアラゲカワラタケと称するコリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）が好適である。
また、セルロース分解酵素遺伝子とは、セルロースを分解し得る酵素であれば特に限定されないが、例えば、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子が好ましい。具体的には、以下の１．〜７．に示すような各種遺伝子を使用することができる。なお、これらの遺伝子は単独で使用することもできるが、１種以上を組み合わせて使用してもよい。
１．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む、単離されたセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１又は３において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
２．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む、単離されたセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子。
（ａ）配列番号７、９又は１１で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号７、９又は１１において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
３．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む、単離されたセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子。
（ａ）配列番号１４で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１４において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
４．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む、単離された糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１８で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵素分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１８において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ酵素分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
５．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む、単離された糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２０で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵素分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２０において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ酵素分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
６．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む、単離された糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２４で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵素分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２４において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ酵素分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
７．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む、単離された糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２８で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵素分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２８において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ酵素分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
上記１．に記載のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
コリオラス・ヒルスタスから、Ｙｅｌｔｏｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１４７０（１９８４））等の通常の染色体ＤＮＡの抽出法を用いて染色体ＤＮＡを調製する。次に、得られた染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ等の適当な制限酵素で処理し、部分分解を行った後ショ糖密度勾配超遠心法で分画して１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得る。同じ付着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージＤＮＡに、上記で得られたＤＮＡ断片を連結する。ファージＤＮＡとしては、例えば、ＥＭＢＬ３（Ａ−Ｍ，Ｆｒｉｓｈａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０，８２７（１９８３））λファージＤＮＡが用いられる。得られたＤＮＡ断片連結ファージについてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングを行い、染色体ＤＮＡライブラリーとする。また、サブクローニングには、常用のクローニングベクター、好ましくは大腸菌ベクター、例えば、ｐＵＣ系であるｐＵＣ１８（Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５））等のプラスミドを用いることができる。クローニングベクターは、上記例示のものに制限されず、市販されるか、文献記載の公知のものが使用できる。
上記で得られた染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離にあたっては、精製後のコリオラス・ヒルスタスのセロビオースデヒドロゲナーゼをリジルエンドペプチダーゼを用いて完全消化し、アミノ酸シークエンスを行い、このアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に基づいて作製した合成ＤＮＡプローブを用い、プラークハイブリダイゼーションによりセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むクローンを選択する。選択したクローンからセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、制限酵素地図の作成および配列決定を行う。配列決定は、上記のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む断片を適当なクローニングベクター（例えばｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター）に挿入し、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））によって行うことができる。
上記の手順により、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼをコードする配列番号１及び３で表される塩基配列が決定された。３４２０ｂｐの塩基配列からなる配列番号１及び３４８０ｂｐの塩基配列からなる配列番号３を有する遺伝子は、それぞれコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ１遺伝子とセロビオースデヒドロゲナーゼ２遺伝子と命名した７２０７ｂｐと５３４５ｂｐからなるセロビオースデヒドロゲナーゼゲノム遺伝子の構造遺伝子である。
配列番号１で表されるセロビオースデヒドロゲナーゼ１遺伝子の構造遺伝子部分は、１６個のエキソンと１５個のイントロンに（介在配列）によって構成されている。
具体的には、エキソン１は１２９〜１７７、イントロン１は１７８〜２３９、エキソン２は２４０〜４９８、イントロン２は４９９〜５５７、エキソン３は５５８〜６６７、イントロン３は６６８〜７１６、エキソン４は７１７〜８３３、イントロン４は８３４〜８８５、エキソン５は８８６〜１０２８、イントロン５は１０２９〜１０７７、エキソン６は１０７８〜１２４２、イントロン６は１２４３〜１３０１、エキソン７は１３０２〜１３７４、イントロン７は１３７５〜１４２５、エキソン８は１４２６〜１４８０、イントロン８は１４８１〜１５３４、エキソン９は１５３５〜２１６５、イントロン９は２１６６〜２２２３、エキソン１０は２２２４〜２３５１、イントロン１０は２３５２〜２４０７、エキソン１１は２４０８〜２４５６、イントロン１１は２４５７〜２５０９、エキソン１２は２５１０〜２５９８、イントロン１２は２５９９〜２６５３、エキソン１３は２６５４〜２７９９、イントロン１３は２８００〜２８５９、エキソン１４は２８６０〜２９３０、イントロン１４は２９３１〜２９９５、エキソン１５は２９９６〜３１００、イントロン１５は３１０１〜３１５７、エキソン１６は３１５８〜３２７４にそれぞれ存在している。さらにヌクレオチド番号３２７５〜はターミネーターを含む３’非翻訳領域である。
さらに、塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、７６８アミノ酸残基からなる配列番号２で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
また、配列番号３で表されるセロビオースデヒドロゲナーゼ２遺伝子の構造遺伝子部分は、１６個のエキソンと１５個のイントロンによって構成されている。
具体的には、エキソン１は１５９〜２０７、イントロン１は２０８〜２６９、エキソン２は２７０〜５２８、イントロン２は５２９〜５８７、エキソン３は５８８〜６９７、イントロン３は６９８〜７４６、エキソン４は７４７〜８６３、イントロン４は８６４〜９１５、エキソン５は９１６〜１０５８、イントロン５は１０５９〜１１０７、エキソン６は１１０８〜１２７２、イントロン６は１２７３〜１３３１、エキソン７は１３３２〜１４０４、イントロン７は１４０５〜１４５５、エキソン８は１４５６〜１５１０、イントロン８は１５１１〜１５６４、エキソン９は１５６５〜２１９５、イントロン９は２１９６〜２２５３、エキソン１０は２２５４〜２３８１、イントロン１０は２３８２〜２４３７、エキソン１１は２４３８〜２４８６、イントロン１１は２４８７〜２５３９、エキソン１２は２５４０〜２６２８、イントロン１２は２６２９〜２６８３、エキソン１３は２６８４〜２８２９、イントロン１３は２８３０〜２８８７、エキソン１４は２８８８〜２９５８、イントロン１５は２９５９〜３０２５、エキソン１５は３０２６〜３１３０、イントロン１５は３１３１〜３２０８、エキソン１６は３２０９〜３３２５、ヌクレオチド番号３３２６〜はターミネーターを含む３’非翻訳領域である。
さらに、塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、７６８アミノ酸残基からなる配列番号４で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
また、セロビオースデヒドロゲナーゼ１遺伝子では、配列番号１で表される塩基配列のうちの第１２９番目〜第３２７４番目の塩基を含んでなるセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子が有用であり、セロビオースデヒドロゲナーゼ２遺伝子では、配列番号３で表される塩基配列のうちの第１５９番目〜第３３２５番目の塩基を含んでなるセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子が特に有用である。
コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片は、上記セロビオースデヒドロゲナーゼ染色体遺伝子を含むＤＮＡ断片からＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、配列番号１、３で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば、配列番号３１で表されるセンスプライマー、配列番号３２で表されるアンチセンスプライマーを使用することができる（実施例１２参照）。
なお、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子配列を含むゲノムＤＮＡを保有する大腸菌形質転換株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＣＤＨ１及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＣＤＨ２は、２００２年２月８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７８、ＦＥＲＭ  Ｂ−８２７９が付与されている。これらの寄託株に含まれる配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡも、本発明に包含される。
また、上記２．に記載のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
上記１．に記載の遺伝子の調製と同様の手順でプラークハリブリダイゼーションを行い、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むクローンを調製する。選択したクローンからセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、制限酵素地図の作成および配列決定を行う。配列決定は、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター（例えばｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター）に挿入し、Ｓａｎｇｅｒらの方法（前述）によって行うことができる。
上記の手順により、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩをコードする配列番号７、９、１１で表される塩基配列が決定され、各々をセロビオヒドロラーゼＩ−１遺伝子とセロビオヒドロラーゼＩ−２遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩ−３遺伝子と命名した。
さらに、各々の塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、４５６アミノ酸残基からなる配列番号８で表されるアミノ酸配列、４５６アミノ酸残基からなる配列番号１０で表されるアミノ酸配列、また、４５７アミノ酸残基からなる配列番号１２で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
上記のセロビオヒドロラーゼＩ−１〜３遺伝子のＤＮＡ断片は、上記セロビオヒドロラーゼＩ−１〜３の各染色体遺伝子を含むＤＮＡ断片からＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、各遺伝子の前記塩基配列（配列番号７、９、１１）及びその相補的配列に基づく、約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。
また、上記３．に記載のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
上記１．に記載の遺伝子の調製と同様の手順でプラークハリブリダイゼーションを行い、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むクローンを調製する。選択したクローンからセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、制限酵素地図の作成および配列決定を行う。配列決定は、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター（例えばｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター）に挿入し、Ｓａｎｇｅｒらの方法（前述）によって行うことができる。
上記の手順により、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩＩをコードする配列番号１４で表される塩基配列が決定された。さらに、塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、４５３アミノ酸残基からなる配列番号１５で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子のＤＮＡ断片は、セロビオヒドロラーゼＩＩＩ染色体遺伝子を含むＤＮＡ断片からＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、前記塩基配列及びその相補的配列に基づく、約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。
また、上記４．に記載の糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
コリオラス・ヒルスタスを木材チップ上で生育させた菌体からｍＲＮＡを回収し、通常の方法に準じてｃＤＮＡライブラリーを作製する。得られたｃＤＮＡライブラリーからの糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子の単離にあたっては適切な寒天培地上でプラークを形成させ、無作為にプラークを単離し、適切な２種類のプライマーによりコリオラス・ヒルスタス由来のｃＤＮＡ部分を増幅させ、塩基配列を解析することにより糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することができる。
上記の手順により、コリオラス・ヒルスタス由来の糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼをコードする配列番号１８で表される塩基配列が決定された。さらに、塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、３７４アミノ酸残基からなる配列番号１９で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片は、上記糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片からＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、配列番号１８で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。
また、上記５．に記載の糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
上記４．に記載の遺伝子の調製と同様の手順で無作為にｃＤＮＡライブラリーからプラークを単離し、コリオラス・ヒルスタス由来のｃＤＮＡ部分を増幅後、塩基配列を解析することにより糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を単離することができる。
上記の手順により、コリオラス・ヒルスタス由来の糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼをコードする配列番号２０で表される塩基配列が決定された。さらに、塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、少なくとも２１５アミノ酸残基からなる配列番号２１で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
コリオラス・ヒルスタス由来の糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片は、上記糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片からＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、配列番号２０で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。
また、上記６．に記載の糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
担子菌ファネロケエテ・クリソスポリウムを適切な培地で培養し、上記１．に記載のＹｅｌｔｏｎらの方法により染色体ＤＮＡを回収する。得られた染色体ＤＮＡに対し、ファネロケエテ・クリソスポリウムの染色体ＤＮＡデータ・ベースから予想される適切な２つのＰＣＲ用プライマーを作製し、常法により目的ＤＮＡ断片を増幅し、糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を得ることができる。
上記の手順により、ファネロケエテ・クリソスポリウム由来の糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼをコードする配列番号２４で表される塩基配列が決定された。さらに、塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、３８６アミノ酸残基からなる配列番号２５で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
ファネロケエテ・クリソスポリウム由来の分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片は、上記糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片からＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、配列番号２４で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。
また、上記７．に記載の糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
上記６．に記載の遺伝子の調製と同様の手順で適切なＰＣＲプライマーにより糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むクローンを調製する。選択したクローンから糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、制限酵素地図の作成および配列決定を行う。配列決定は、糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター（例えばｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター）に挿入し、Ｓａｎｇｅｒらの方法（前述）によって行うことができる。
上記の手順により、ファネロケエテ・クリソスポリウム由来の糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼをコードする配列番号２８で表される塩基配列が決定された。さらに、塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、５９２アミノ酸残基からなる配列番号２９で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片は、上記糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片からＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、配列番号２８で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。
本方法の第１の工程においては、上記の担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその一部に対して実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを調製する。
本明細書において「アンチセンスＲＮＡ」とは、上記セルロース分解酵素遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの全部又はその一部に対して実質的に相補的な配列を含んでなる塩基配列であって、細胞内に存在した場合に、相補的となるセルロース分解酵素遺伝子のｍＲＮＡと結合し、それによってセルロース分解酵素遺伝子の翻訳を阻害し、発現を抑制する配列を意味する。
また、「実質的に」とは、このアンチセンスＲＮＡがｍＲＮＡと結合して二本鎖を形成し、それがｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する限り、この配列に欠失、置換又は付加等の変化があってもよいことを意味する。
該配列の長さは、本発明のいずれかのセルロース分解酵素遺伝子の発現を抑制し得る長さであれば適宜設定可能であり、セルロース分解酵素遺伝子の塩基配列の全部と等しい長さである必要は必ずしもなく、該配列の一部に該当する長さであってよい。例えば、セルロース分解酵素遺伝子の発現を抑制する場合、配列番号２及び４のヘム結合部位である８０番目、１２８番目のアミノ酸、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合部位である２３６から２４１番目のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれることが好ましい。
アンチセンスＲＮＡの調製及び該配列を利用する方法については、当業者に公知の常法によって実施することができる。具体的には、セルロース分解酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡは、セルロース分解酵素遺伝子の塩基配列のエキソン部分が得られるようにＰＣＲ法を行ったり、セルロース分解酵素遺伝子を適当な制限酵素で切断して得ることができる。また、セルロース分解酵素遺伝子のｃＤＮＡからも取得可能である。さらには、このアンチセンスＲＮＡは、セルロース分解酵素遺伝子の塩基配列情報をもとに人工的に作られた合成ＲＮＡであっても良い。
本方法の第２の工程においては、（ａ）前記のようにして得られたアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、または（ｂ）前記のようにして得られたアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡと、プロモーター活性を有するＤＮＡ断片とを含み、該ＤＮＡが、転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する。
本明細書において、「転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように」とは、宿主内でプロモーターの作用下でアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡのｍＲＮＡへの転写が生じた際に、本発明のセルロース分解酵素遺伝子からのｍＲＮＡに対して結合して二本鎖を形成し、該セルロース分解酵素遺伝子の発現を抑制させることができるアンチセンスＲＮＡが生成されることを意味する。
アンチセンスＲＮＡが生成され得るように結合するには、プロモーター配列を有するＤＮＡ断片の下流にアンチセンスの方向（逆向き方向）にアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを結合し、プロモーターの作動によりｍＲＮＡに転写させればよい。得られるｍＲＮＡは、セルロース分解酵素遺伝子の塩基配列のアンチセンスＲＮＡである。
プロモーター遺伝子としては、プロモーターの作用を有する遺伝子断片であれば特に限定されることなく、あらゆる遺伝子を使用することができる。例えばＧＰＤプロモーター、ｒａｓ遺伝子プロモーターなどが挙げられる。これらのプロモーター遺伝子は、ジーンバンクに登録される配列、文献記載の配列等に基づいて周知のゲノムクローニングまたはＰＣＲ法によっても取得可能である。あるいは、寄託されている遺伝子については、分譲請求により入手可能なものを利用することができる。
プロモーター配列を含む遺伝子とセルロース分解酵素遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、必要に応じて制限部位の導入、平滑末端化または付着末端化後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて連結することができる。クローニング、連結反応、ＰＣＲ等を含む組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及びＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されるものを利用することができる。
ベクターの種類は特に限定されないが、このベクターによって形質転換される宿主の種類に応じて選択される。ベクターとしては、原核または真核生物宿主細胞において自律複製可能または染色体中に相同組換え可能なベクターを使用することができる。プラスミド、ファージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクターは、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリリンカー、エンハンサー、リボゾーム結合部位などを適宜含むことができる。細菌、真菌、酵母、動物、植物などの原核および真核生物用の種々のベクターが市販されているか、あるいは、文献等に記載されており、これらを利用して本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ又は組換えＤＮＡをベクターに導入することができる。
ＤＮＡ導入は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載される技術を使用して実施することができる。なお、本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ又は組換えＤＮＡをベクターに導入するにあたっては、上述のように、転写によりセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように導入する。
本方法の第３の工程においては、前記ベクターを用いた形質転換を行い、セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を調製する。
ここで宿主細胞は、担子菌、真菌類、酵母類を含む菌類だけではなく、他の真核細胞（動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、藻類など）や原核細胞（細菌、藍藻など）であっても、本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの発現においてプロモーター活性を発揮できるならば、いずれの宿主細胞も使用可能である。このうち、好ましい宿主細胞は担子菌であり、特に好ましくはコリオラス・ヒルスタスである。例えば、具体的には、後述の実施例に記載されているコリオラス・ヒルスタスのオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性を欠損している栄養要求性変異株ＯＪＩ−１０７８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を宿主として使用できる。
形質転換法としては、塩化カルシウム／ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポーレション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法などを例示できるが、これらに限定されない。
本方法の第４の工程においては、前記セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップに接種して処理する。
本明細書において「木材チップ」とは、木材を機械的に２〜３ｃｍの大きさに小片化したものであり、マツ、スギ、モミ、トウヒ、ダグラスファー、ラジアータパイン等の針葉樹及びブナ、カバ、ハンノキ、カエデ、ユーカリ、ポプラ、アカシア、ラワン、ゴム等の広葉樹を含む木材から得られ、パルプ等の原料として用いることができるものであればいずれの材種のチップをも用いることができる。
木材チップはセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞で処理する。セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞が十分に生育するのであれば、木材チップは前処理なくそのまま用いることができるが、他の微生物を殺菌する前処理を実施した方がセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞が生育しやすいのであれば、オートクレーブやスチーミング等を用いて殺菌の前処理を行うのが好ましい。
木材チップをセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞で処理する温度は１０〜６０℃が好ましく、さらに好ましくは２０〜３０℃である。木材チップ中の水分は２０〜８０％、好ましくは３０〜５０％とするのが良い。木材チップへの空気供給量はセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞が十分に生育可能であれば必要ないが、通常、対チップ容積１Ｌ当たりに供給する空気量が毎分０．００１〜１Ｌ／（ｌ・ｍｉｎ）（以下、空気供給量の単位Ｌ／（ｌ・ｍｉｎ）をｖｖｍと称する）とするのが良く、好ましくは、対チップ容積当たり０．０１ｖｖｍ〜０．１ｖｖｍである。
セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞の木材チップへの接種量は、パルプ収率や紙力を軽減することがない限り、適宜設定することができる。
セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞は、滅菌水とともに粉砕し、木材チップに対して植菌して培養することができるが、木材チップに培地を添加して処理してもよい。培地は、セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞が生育できるのであればいずれの培地をも用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、セロビオース、非晶性セルロース等を使用することができる。また、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆、コーンスティープリカー、各種無機窒素などの窒素化合物を用いることができる。さらに、必要に応じて、各種塩類やビタミン、ミネラル等を適宜用いることができる。
セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞によって処理した木材チップは、サーモメカニカルパルプ（ＴＭＰ）、グラウンドパルプ（ＧＰ）、リファイナーグラウンドパルプ（ＲＧＰ）などの機械パルプにおいては解繊エネルギーの減少や紙力の増加が認められ、クラフトパルプやサルファイトパルプなどの化学パルプの製造においては蒸解性の向上や紙力の増加が得られる。
さらに、本発明の方法において利用するセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞は、適当な培地で培養し、生成したセルロース分解酵素を回収することを含んで成るセルロース分解酵素の製造においても有用である。
この場合、セルロース分解酵素は、シグナルペプチドとの融合形態で発現・翻訳されるときには分泌形態で産生され、培地から直接単離することができるが、一方、セルロース分解酵素が非分泌形態で産生されるときには、細胞を分離し、超音波処理、ホモゲナイジング等の処理により細胞を破壊して抽出液を得、この抽出液からセルロース分解酵素を単離することができる。単離・精製は、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈殿、限外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの方法を単独にまたは組み合わせて行うことができる。
例えば、本発明のセルロース分解酵素遺伝子の上流にＧＰＤプロモーター、ｒａｓプロモーターを連結し、組換えＤＮＡ技術により、セルロース分解酵素を大量に生産することができる。前記プロモーターは、例えば、コリオラス・ヒルスタス由来ＧＰＤプロモーター遺伝子を含む大腸菌組換え体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＧＰ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０１５）、コリオラス・ヒルスタス由来ｒａｓプロモーター遺伝子を含む大腸菌組換え体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＣＨＲＡＳ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３５２）から調製することが可能である。
本発明の方法において用いられるセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質（セロビオースデヒドロゲナーゼ）は、以下の理化学的性質を有する。
▲１▼作用
Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｏｌ１６０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ．Ｃａｌｆｏｒｎｉａ）に記載の方法により、セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。すなわち、ジクロロフェノールインドフェノール（シグマ社製）、セロビオース（関東化学株式会社製）を、それぞれ０．３３ｍＭ、０．６７ｍＭとなるように溶解したｐＨ５、５０ｍＭの酢酸緩衝液にセロビオースデヒドロゲナーゼを添加し、３７℃にて反応させた。反応開始後、ジクロロフェノールインドフェノールの極大吸収波長５５０ｎｍにおける吸光度（光路長１ｃｍ）を連続的に測定したところ、図１に示すような結果を得た。
図１に示されるようにセロビオースデヒドロゲナーゼの還元反応によりジクロロフェノールインドフェノールの減少が観察された。反応系からセロビオース、セロビオースデヒドロゲナーゼのいずれかが欠如してもジクロロインドフェノールの減少が観察されないこと、ジクロロインドフェノールの代替品としてシトクロムＣやＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸錯体を用いても同様に還元反応が観察されることから、本酵素はセロビオースデヒドロゲナーゼであることは明らかである。
▲２▼力価の測定方法
セロビオースデヒドロゲナーゼ活性測定は次のように行った。０．６７ｍＭジクロロフェノールインドフェノール（シグマ社製）、３．３３ｍＭセロビオース（関東化学株式会社製）、ｐＨ５、２５０ｍＭの酢酸緩衝液をそれぞれ２５０ｕｌ、１００ｕｌ、１００ｕｌを混合した溶液に被検液５０ｕｌを添加し、３７℃にて反応させた。反応開始後、ジクロロフェノールインドフェノールの極大吸収波長５５０ｎｍ（モル吸光係数３９６５Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍ）における吸光度（光路長１ｃｍ）を連続的に測定した。セロビオースデヒドロゲナーゼの活性単位については上記の条件で１分間に１ｕｍｏｌのジクロロフェノールエンドフェノールを減少させる酵素量を１ｕｎｉｔ（ユニット：Ｕ）とした。
▲３▼基質特異性
セロビオース、セロオリゴ糖の他、セルロースを含有するアビセル、広葉樹クラフトパルプに作用する。
▲４▼至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
反応至適ｐＨ及びｐＨ安定性を、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２〜４）、酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）を用いて測定した。それぞれのｐＨで酵素活性を測定した。結果を図２に示す。
図２により、酵素反応の至適ｐＨは４〜６であった。また、それぞれ５０ｍＭの所定緩衝液中に４℃で２４時間保持した後に酵素活性を測定した。結果を図３に示す。本酵素はｐＨ２〜５で安定であった。
▲５▼作用適温の範囲
反応温度を変えて各酵素の酵素活性を測定した。結果を図４に示す。本酵素は２０〜４０℃において高い活性を示した。また、所定の温度で５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）中に各酵素を３０分放置した後に酵素活性を測定した。結果を図５に示す。
図５より４０℃、３０分の処理で約８０％以上の酵素活性を保持し、５０℃、３０分の処理でも約３０％以上の残存活性を示す。
▲６▼等電点
ＳＥＲＶＡ社製ＰＲＥＣＯＡＴ  ｐＨ３〜１０による等電点電気泳動を行った結果、等電点は４．２であった。
▲７▼分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し、約９１，７００であった。
▲８▼金属イオン、阻害剤の影響
種々の金属塩、阻害剤など種々の物質を１ｍＭになるように酵素液に添加して、４℃で一晩保持した後、反応液中にも同種の金属塩を１ｍＭになるように添加して酵素活性を測定した。結果を表１に示す。表１よりアジ化ナトリウム、ＥＤＴＡにより弱く阻害を受け、Ｈｇ２＋、ＳＤＳにより強く阻害された。
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これに対し、従来公知のセロビオースデヒドロゲナーゼとしては以下の報告がある。
Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎらはファネロケエテ・クリソスポリウム由来の反応至適ｐＨが５．０、等電点が４．２付近、分子量が８９，０００であるセロビオースデヒドロゲナーゼを報告しているが（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６（１９９１）１０１−１０６）、該セロビオースデヒドロゲナーゼの反応至適温度は５０℃である。
Ｒｏｙらはトラメテス・ベルシコラ由来の反応至適ｐＨが５．０、等電点が４．２付近、分子量が９７，０００であるセロビオースデヒドロゲナーゼを報告しているが（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２（１９９６）４４１７−４４２７）、該セロビオースデヒドロゲナーゼの反応至適温度は５０℃である。
Ｆａｎｇらはスキゾフィラム・コミュネ由来のセロビオースデヒドロゲナーゼを報告しているが（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３５３−１（１９９８）３７−４６）、該セロビオースデヒドロゲナーゼの反応至適ｐＨは４．５、分子量は１０２，０００であり、至適温度、等電点の記載はない。
Ｓｃｈｍｉｄｈａｌｔｅｒ、Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉらはコネオフォラ・プテアナ由来の等電点が３．９付近であるセロビオースデヒドロゲナーゼを報告しているが（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３００−２（１９９３）５５９−５６３）、該セロビオースデヒドロゲナーゼの反応至適ｐＨは４．０、分子量は１１１，０００であり、反応至適温度の記載はない。
Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉらはミセリオプトレ・サーモフィラ由来の等電点が４．１付近、分子量が９１，０００であるセロビオースデヒドロゲナーゼを報告しているが（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８（１９９１）４３−５２）、該セロビオースデヒドロゲナーゼの反応至適ｐＨは７．０であり、反応至適温度の記載はない。
Ｓｈｏｕらはフミコーラ・インソレンス由来の等電点が４．０付近、分子量が９２，０００であるセロビオースデヒドロゲナーゼを報告しているが（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３０（１９９１）５６５−５７１）、該セロビオースデヒドロゲナーゼの反応至適ｐＨは７．０、反応至適温度６５℃である。
上記のように、本発明の方法において用いられるセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするセロビオースデヒドロゲナーゼは、至適温度、至適ｐＨ、分子量、等電点において公知のセロビオースデヒドロゲナーゼとは異なることから、新規なセロビオースデヒドロゲナーゼであると認定した。なお、公知のセロビオースデヒドロゲナーゼの理化学的性質を表２に示す。
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セロビオースデヒドロゲナーゼの生産能を有するコリオラス・ヒルスタスは特に限定されないが、例えば、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株を利用することができる。
コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼは、例えば、セロビオースデヒドロゲナーゼを生産するコリオラス・ヒルスタスを培地に培養し、得られる培養物からセロビオースデヒドロゲナーゼを採取することによって得られる。上記のコリオラス・ヒルスタスを培養する培地としては、該菌が増殖可能な培地であればいずれの組成の培地をも利用可能である。培地の栄養源としては、コリオラス・ヒルスタスの培養に通常用いられているものを広く用いることができる。炭素源としては同化可能なものであれば良く、グルコース、パルプ、結晶性セルロース等を使用することができる。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えば、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆、コンスティープリカー、各種無機窒素などを用いることができる。その他、必要に応じて、各種の塩類やビタミン、ミネラル等を適宜用いることができる。
培養温度及びｐＨは、コリオラス・ヒルスタスが増殖可能な範囲において適宜設定可能である。例えば、培養温度は２０〜５５℃、好ましくは２５〜３０℃であり、ＰＨは３〜９、好ましくは４〜６である。
コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼは、上記条件におけるコリオラス・ヒルスタスの培養によって培養液中に分泌生産されるので、培養後の培養物から本酵素を採取する。培養物から採取した溶液をそのままセロビオースデヒドロゲナーゼ粗酵素液として使用することができるが、塩析、限外濾過、凍結乾燥により、セロビオースデヒドロゲナーゼを濃縮又は固体化することもできる。さらに、硫安分画、ゲル濾過による分子量分画や各種イオン交換樹脂、ハイドロキシアパタイト、疎水クロマトグラム、等電点分画等を行うことによって精製することができるが、これらの方法は繰り返すことも可能であり、さらに必要に応じて他の精製手段を組み合わせて用いることもできる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
［実施例１］  コリオラス・ヒルスタス由来染色体ＤＮＡライブラリーの作製
コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株の平板寒天培養から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）２００ｍｌに植菌し、２８℃で７日間回転震盪行った。培養後菌体を集菌後、１Ｌの滅菌水で菌体を洗浄し、液体窒素で凍結した。
この凍結菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕した。粉砕した菌体を遠心管に移し、溶菌緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍ  ＭＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、さらにプロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌとなるように添加）１０ｍｌを加え、５５℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、フェノール処理、クロロホルム処理を行い、水層部分にエタノール徐々に添加しＤＮＡが析出したところで染色体ＤＮＡを巻取り、ＴＥ溶液に懸濁した。
得られた染色体ＤＮＡ１００μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、５〜２０％ショ糖密度勾配超遠心分離（３０，０００ｒｐｍ，１８時間）により分画し、２０〜４０ｋｂｐ断片区分を集めた。この断片区分を東洋紡社製ファージλＥＭＢＬ３−ＢａｍアームにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、得られたファージＤＮＡをＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ギガパックゴールドを用いてパッケージング後、大腸菌Ｐ２３２９株に感染せしめ染色体ＤＮＡライブラリーとした。
［実施例２］染色体ＤＮＡライブラリーからのセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離
上記染色体ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むクローンの選抜を行った。この一連の操作は常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））によった。プラークハイブリダイショーンに用いたプローブは次の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
2003070940.tif 000004
その結果、約４０，０００個のプラークの中から４個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＸｈｏＩで消化して得られた断片中に５．３ｋｂｐ、７．２ｋｂｐのＤＮＡバンドとしてプローブにハイブリダイズするそれぞれ異なるクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片７．２ｋｂｐ、５．３ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋のＸｈｏＩサイトにサブクローニング化し、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換した。サブクローニング化したＤＮＡを大量に調製し、超遠心操作（５０，０００ｒｐｍ、１６ｈ、１５℃）で精製し、塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製のシーケンシングキットを用いて行った。
塩基配列を配列番号１及び３に示す。その結果、上記塩基配列範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子は１５個のイントロンにより分断されていた。また、それらの塩基配列から各々推定されるアミノ酸配列（配列番号２及び４）は、これまで報告されているセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子と高い類似性が認められた。
［実施例３］染色体ＤＮＡライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ−１遺伝子の単離
実施例２と同様にプラークハイブリダイゼーションを行い、用いたプローブは他生物種から単離されているセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子の塩基配列の基づいて作製した次の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
2003070940.tif 000005
その結果、約４０，０００個のプラークの中から２個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＰｓｔＩならびにＮｈｅＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして３．９ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片３．９ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓＩＩ  ＳＫ−のＰｓｔＩ−ＳｐｅＩサイトにサブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオハイドロラーゼＩ遺伝子−１を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６を得た。サブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
塩基配列を配列番号７に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ−１遺伝子は２つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号８に示す。
［実施例４］染色体ＤＮＡライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ−２遺伝子の単離
実施例２と同様にプラークハイブリダイゼーションを行い、用いたプローブは実施例３で用いた配列番号６の塩基配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
その結果、約４０，０００個のプラークの中から３個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＳａｌＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして４．２ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片４．２ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳａｌＩサイトにサブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオハイドロラーゼＩ−２遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７を得た。サブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
塩基配列を配列番号９に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ−２遺伝子は２つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
［実施例５］染色体ＤＮＡライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ−３遺伝子の単離
実施例２と同様にプラークハイブリダイゼーションを行い、用いたプローブは実施例３で用いた配列番号６の塩基配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
その結果、約４０，０００個のプラークの中から２個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩならびにＢａｍＨＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして４．６ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片４．６ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトにサブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩ−３遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１を得た。サブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
塩基配列を配列番号１１に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ−３遺伝子は２つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
［実施例６］染色体ＤＮＡライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子の単離
実施例２と同様にプラークハイブリダイゼーションを行い、用いたプローブは他生物種から単離されているセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子の塩基配列の基づいて作製した次の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
2003070940.tif 000006
その結果、約１００，０００個のプラークの中から８個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＶならびにＮｃｏＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして５．０ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片を回収するため、制限酵素ＮｃｏＩで消化後Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化し、さらにＥｃｏＲＶで消化することにより得られる５．０ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトにサブクローン化し、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩを得た。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換した。また、前記のサブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
塩基配列を配列番号１４に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子は６つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
［実施例７］コリオラス・ヒルスタスｃＤＮＡライブラリーの作製
乾燥重量６ｇを直径９．５ｃｍのガラスシャーレに入れ１２１℃、１５分で滅菌したユーカリ・グロブラスのチップにペプトン培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）２０ｍｌ添加した培地へ、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株の平板寒天培養から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、３片を植菌し、３０℃で１０日間静置培養を行った。培養後菌体を集菌後、液体窒素で凍結した。
この凍結菌体を用いてグアニジン塩酸法による全ＲＮＡの回収を行い、次いで宝酒造製のＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ〈ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。さらにＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成し、５’側にＥｃｏＲＩサイト、また３’側にＸｈｏＩサイトを付加し、λＺＡＰＩＩベクターのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトへ挿入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔによりｃＤＮＡライブラリーとした。
［実施例８］コリオラス・ヒルスタスｃＤＮＡライブラリーからの糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子の単離
実施例７で作製したｃＤＮＡライブラリー液をシャーレ上でプラークが単離できるように適当に希釈しＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株へ感染させ、３７℃で１晩培養することにより、プラークを形成させた。得られたシングルプラークをＳＭバッファーに懸濁し、シークエンス用ユニバーサルプライマーであるＭ１３（−２０）プライマー（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ：配列番号１６）並びにＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ：配列番号１７）を用いてＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡ断片を増幅した。このようにして得られたｃＤＮＡ断片をランダムに塩基配列の解析を行った。その結果、糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡ遺伝子を見出した。塩基配列を配列番号１８に、また推定されるアミノ酸配列を配列番号１９に示す。
［実施例９］コリオラス・ヒルスタスｃＤＮＡライブラリーからの糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子の単離
実施例７で作製したｃＤＮＡライブラリー液をシャーレ上でプラークが単離できるように適当に希釈しＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株へ感染させ、３７℃で１晩培養することにより、プラークを形成させた。得られたシングルプラークをＳＭバッファーに懸濁し、シークエンス用ユニバーサルプライマーであるＭ１３（−２０）プライマー（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ：配列番号１６）並びにＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ：配列番号１７）を用いてＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡ断片を増幅した。このようにして得られたｃＤＮＡ断片をランダムに塩基配列の解析を行った。その結果、糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡ遺伝子を見出した。塩基配列を配列番号２０、また推定されるアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
［実施例１０］担子菌ファネロケエテ・クリソスポリウム染色体ＤＮＡからの糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子の単離
グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）１００ｍｌの培地へ、ファネロケエテ・クリソスポリウムＡＴＣＣ  ３４５４１株の平板寒天培養から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、５片を植菌し、３０℃で５日間振盪培養を行った。培養後菌体を集菌し、液体窒素で凍結した。この凍結菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕した。粉砕した菌体を遠心管に移し、溶菌緩衝液（１００ｍＭ  トリス（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、さらにプロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌとなるように添加）１０ｍｌを加え、５５℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、フェノール処理、クロロホルム処理を行い、水層部分にエタノール徐々に添加しＤＮＡが析出したところで染色体ＤＮＡを巻取り、ＴＥ溶液に懸濁し、ファネロケエテ・クリソスポリウム染色体ＤＮＡ溶液とした。
次に以下に示す２つのＤＮＡプライマーを用いて、上記ファネロケエテクリソスポリウム染色体ＤＮＡ溶液に対し、ＰＣＲ反応を行い、糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ染色体遺伝子を得た。
2003070940.tif 000007
得られた塩基配列を配列番号２４に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてファネロケエテ・クリソスポリウム由来糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子は１５個のイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２５に示す。
［実施例１１］担子菌ファネロケエテ・クリソスポリウム染色体ＤＮＡからの糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子の単離
実施例１０で調製したファネロケエテ・クリソスポリウム由来の染色体ＤＮＡ溶液に対して、以下に示す２つのＤＮＡプライマーを用いて、上記ファネロケエテ・クリソスポリウム染色体ＤＮＡ溶液に対し、ＰＣＲ反応を行い、糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ染色体遺伝子を得た。
2003070940.tif 000008
得られた塩基配列を配列番号２８に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてファネロケエテ・クリソスポリウム由来糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子は７個のイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
［実施例１２］コリオラス・ヒルスタス由来グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるコリオラス・ヒルスタス由来セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタスのプロモーターの下流にセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の構造遺伝子領域を連結し、本来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子からグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域に置換しセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターとした。
具体的にはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ染色体遺伝子ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化により得られる３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片（断片１）を得た。ファージベクターＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて前記断片１を連結し、これを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、一本鎖ファージＤＮＡを調製した。
次に、配列番号３０に示すＤＮＡプライマーを合成し、上記一本鎖ファージＤＮＡにアニーリングを行い、プライマー伸長法によりＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域だけを合成し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断することにより０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片（断片２）を調製した。
2003070940.tif 000009
一方、セロビオースデヒドロゲナーゼの成熟型酵素をコードしている遺伝子領域だけを取り出すため、プラスミドｐＣＨＣＤＨ１を鋳型にし、配列番号３１、３２に示すプライマーでＰＣＲ反応により伸長させ約３．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（断片３）。
2003070940.tif 000010
大腸菌ベクターのｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ（宝酒造社製）で切断し、上記２種類のＤＮＡ断片を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片の２及び３の２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＣＤＨ１と命名した。
［実施例１３］セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１２と同様の方法を用いグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域０．９ｋｂ断片２を得た。得られた断片２をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩサイトへＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片の２が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＣＨＧＰ１と命名した。このｐＣＨＧＰ１を制限酵素ＮｃｏＩ−ＸｂａＩで消化し、ベクター部分を調製した（断片４）。
また、コリオラス・ヒルスタス由来セロビオースデヒドロゲナーゼ１遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＤＨ１から以下に示す２つのプライマー（配列番号３３、３４）を用いてＰＣＲ法により、コリオラス・ヒルスタス由来セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の８番目のエクソンを含む約６５０ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化したＤＮＡ断片を得た（断片５）。
2003070940.tif 000011
上記断片４と断片５を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片５のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰａｎｔｉＣＤＨ１と命名した。このｐＧＰａｎｔｉＣＤＨ１を制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター部分とした（断片６）。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンパーオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＭＰＯＧ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３）を以下に示す２つのプライマー（配列番号３５、３６）を用いてＰＣＲ法によりマンガンパーオキシダーゼのＣ末側非翻訳領域の増幅を行い、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得た（断片７）。
2003070940.tif 000012
上記断片６と断片７を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片７のＤＮＡ断片が順方向で挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＣＤＨＡＭと命名した。
［実施例１４］コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例３で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６に対し、次に２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片９）。
2003070940.tif 000013
上記断片８と断片９を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片９のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＣＢＨＩ２６ＡＭと命名した。
［実施例１５］コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例４で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７に対し、次に２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片１０）。
2003070940.tif 000014
上記断片８と断片１０を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片１０のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＣＢＨＩ２７ＡＭと命名した。
［実施例１６］コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例５で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１に対し、次に２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片１１）。
2003070940.tif 000015
上記断片８と断片１１を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片１１のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＣＢＨＩ３１ＡＭと命名した。
［実施例１７］コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例６で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩに対し、次に２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約６００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片１２）。
2003070940.tif 000016
上記断片８と断片１２を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片１２のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＣＢＨＩＩＡＭと命名した。
［実施例１８］コリオラス・ヒルスタス由来ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例１２で得られたコリオラス・ヒルスタス由来の糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼｃＤＮＡ遺伝子に対し、次の２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約６００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片１３）。
2003070940.tif 000017
上記断片８と断片１３を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片１３のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＥＧ６１ＡＭと命名した。
［実施例１９］コリオラス・ヒルスタス由来ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例９で得られたコリオラス・ヒルスタス由来の糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼｃＤＮＡ遺伝子に対し、次の２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片１３）。
2003070940.tif 000018
上記断片８と断片１３を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片１３のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＥＧ１２ＡＭと命名した。
［実施例２０］ファネロケエテ・クリソスポリウム由来ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例１０で得られたファネロケエテ・クリソスポリウム由来の糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ遺伝子に対し、次の２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約６００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片１５）。
2003070940.tif 000019
上記断片８と断片１５を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片１４のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＰＣＥＧ５ＡＭと命名した。
［実施例２１］ファネロケエテ・クリソスポリウム由来ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミドの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＧＰＣＤＨＡＭを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化し、ベクター部分のＤＮＡ断片を調製した（断片８）。次に、実施例１１で得られたファネロケエテ・クリソスポリウム由来の糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ遺伝子に対し、次の２つのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで消化することによりＤＮＡ断片を得た（断片１６）。
2003070940.tif 000020
上記断片８と断片１６を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、上記断片１５のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＰＣＥＧ９ＡＭと命名した。
［実施例２２］コリオラス・ヒルスタス形質転換方法
ａ．一核菌糸体培養
直径６ｍｍ前後のガラスビーズを約３０個入れた５００ｍｌ容三角フラスコにＳＭＹ培地（シュークロース１％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）１００ｍｌを分注して滅菌後、コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株の平板寒天培地から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜きＳＭＹ培地に植菌し、２８℃で７日間静置培養した（前培養）。ただし、菌糸を細分化するために、１日に１〜２回振り混ぜた。次に、１Ｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地２００ｍｌを分注し、さらに回転子を入れ、滅菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、全量を植菌し、２８℃で培養した。なお、スターラーで１日２時間程度撹拌することにより菌糸を細分化した。この培養を４日間行った。
ｂ．プロトプラストの調製
上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、浸透圧調節溶液（０．５Ｍ  ＭｇＳＯ４、５０ｍｌマレイン酸バッファー（ｐＨ５．６））で洗浄した。次に、湿菌体１００ｍｇあたり１ｍｌの細胞壁分解酵素液に懸濁し、緩やかに震盪しながら２８℃で３時間インキュベートしてプロトプラストを遊離させた。細胞壁溶解酵素として、次の市販酵素製剤を組み合わせて使用した。即ち、セルラーゼ・オノズカ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＯＮＯＺＵＫＡ  ＲＳ）ヤクルト社製５ｍｇ、ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ）（宝酒造社製）１０ｍｇを上記浸透圧調節溶液１ｍｇに溶解して酵素液として用いた。
ｃ．プロトプラストの精製
上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高めるため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロトプラストを上記浸透圧調節溶液で１回洗浄した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠心分離（１，０００ｋ×ｇ、５分間）し、上静を除去し、４ｍｌの１Ｍシュークロース（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ６．３）で再懸濁後、遠心操作を繰り返し、上記１Ｍシュークロース溶液で２回洗浄した。沈殿物に１Ｍソルビトール溶液（２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．４）に４０ｍＭ塩化カルシウムを加えた溶液５００μｌに懸濁し、プロトプラスト溶液とした。この溶液を４℃で保存した。
プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて、直接検鏡により求めた。すべての遠心操作はスウィングローターで１，０００×ｇ、５分間、室温下で行った。
ｄ．形質転換
１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００μｌに対して、実施例１２で作製したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１（２μｇ）を添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１（特開平６−０５４６９１号公報；ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２０１）を０．２μｇ添加し３０分間氷冷した。次に、液量に対して等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。次に、０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で数日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに形質転換体からＤＮＡを調製し、目的とするセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子発現プラスミドｐＧＰＣＤＨ１が組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例２３］セロビオースデヒドロゲナーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
前記実施例２２で得られた形質転換株をグルコース・ペプトン培地（グルコース３０ｇ／ｌ、ポリペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、１００ｒｐｍで震盪培養した。上記に示すセロビオースデヒドロゲナーゼ活性測定方法を用いて、セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を経時的に測定した。コントロールでは０．０２Ｕ／ｍｌであったが、形質転換体では０．２Ｕ／ｍｌであった。
［実施例２４］セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例１３で作製したｐＧＰＣＤＨＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体は酸素漂白後広葉樹パルプ（ＬＯＫＰ）・ペプトン培地（ＬＯＫＰ１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１５％、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、１００ｒｐｍで震盪培養した。上記したセロビオースデヒドロゲナーゼ活性測定方法を用いて、セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を経時的に測定した。その結果、セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を最大で７０％抑制された形質転換体を得ることができた。
［実施例２５］セロビオースデヒドロゲナーゼを抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例２４により選抜したセロビオースデヒドロゲナーゼ活性を抑制した形質転換株をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃にて培養した後、４℃で保存した。このプレートから直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた切片を５つずつ、グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、１００ｒｐｍで１週間震盪培養した。培養後、菌体をろ別し、菌体に残存した培地を滅菌水で洗浄した。菌体は滅菌水と共に、ワーリングブレンダーで１５ｓｅｃ粉砕し、絶乾重量１ｋｇのユーカリ材に対し、菌体の乾燥重量が１０ｍｇになるように植菌した。植菌後は菌が全体に行き渡るようによく撹拌した。培養は２８℃で通気をしながら１週間静置培養を行った。チップ含水率が４０〜６５％になるように随時飽和水蒸気を通気させた。通気する際の通気量は対チップ当り、０．０１ｖｖｍになるように行った。
［実施例２６］セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
ラジアータパイン材を用い実施例２５に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップをラボ用リファイナー（熊谷理機社製）を用いて叩解して、カナディアンスタンダードフリネスを２００ｍｌとした後、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製はＴａｐｐｉ試験法Ｔ２０５ｏｍ−８１に準拠して、パルプ手抄きシートの物理試験はＴａｐｐｉ法Ｔ２２０ｏｍ−８３に準拠して行った。使用電力量はワットメーター（Ｈｉｏｋｉｄｅｎｋｉ  ｍｏｄｅｌ３１３３）と積分計（ｍｏｄｅｌ３１４１）を用いた。チップ収率測定は水分を含んだ木材チップを容器に絶乾重量で１ｋｇ分取し、処理前後のチップ絶乾重量を測定し、以下の式を用いてチップ収率を算出した。
（処理後の絶乾重量）／（処理前の絶乾重量）×１００
表３に示すようにセロビオースデヒドロゲナーゼを抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例２７］セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例２５に準じてユーカリ材のチップ処理を行った後、絶乾重量４００ｇのチップを測りとりオートクレーブ内で液比５、硫化度３０％、有効アルカリ１７％（Ｎａ２Ｏとして）となるように蒸解白液を加え、蒸解温度を１５０℃にてクラフト蒸解を行った。クラフト蒸解終了後、黒液を分離し、得られたチップを高濃度離解機によって解繊後、濾布で遠心脱水と水洗浄を３回繰り返した。次いでスクリーンにより、未蒸解物を除き、遠心脱水し蒸解未漂白パルプを得た。
上記のクラフト蒸解して得られたパルプに対して、ＮａＯＨを２．０質量％添加し、酸素ガスを注入し、１００℃、酸素ゲージ圧０．４９ＭＰａ（５ｋｇ／ｃｍ２）で６０分間処理を行った。
上記で得たパルプを下記に示すように、Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｄの４段漂白処理を行った。最初の二酸化塩素処理（Ｄ）は、パルプ濃度が１０質量％となるように調製し、二酸化塩素を０．４質量％添加し、７０℃、４０分間処理を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を１０質量％に調製し、苛性ソーダを１質量％添加し、７０℃、９０分間のアルカリ抽出処理（Ｅ）を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を１０質量％に調製し、過酸化水素０．５質量％、苛性ソーダ０．５質量％を順次添加し、７０℃、１２０分間の過酸化水素処理（Ｐ）を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を１０％に調製し、二酸化塩素０．２５質量％を添加し、７０℃、１８０分間二酸化塩素処理（Ｄ）を行った。最後にイオン交換水にて洗浄、脱水後、ＪＩＳ  Ｐ  ８１２３に準じた白色度８６．０％の漂白パルプを得た。
上記で得たパルプ濃度が４質量％のパルプスラリーをリファイナーによりフリーネスが４１０ｍｌ（ＣＳＦ）となるように叩解した。
［実施例２８］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
カッパー価の測定は、ＪＩＳ  Ｐ  ８２１１に準じて行った。パルプ物理用試験用手抄きシートの調製はＴａｐｐｉ試験法Ｔ２０５−ｏｍ８１に準拠して、パルプ手抄きシートの物理試験はＴａｐｐｉ法Ｔ２２０ｏｍ−８３に準拠して行った。表４に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表５に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例２９］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例１４で作製したｐＧＰＣＢＨＩ２６ＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体は実施例２４と同様の方法で培養し、４−ｍｅｔｈｙｌ−Ｏ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｆｅｒｙｌ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅを基質としたセロビオヒドロラーゼＩ活性測定方法を用いて、セロビオヒドロラーゼＩ活性を経時的に測定した。その結果、セロビオヒドロラーゼＩ活性を最大で６０％抑制された形質転換体を得ることができた。
［実施例３０］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例２９により選抜したセロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換株を用い実施例２５と同様の方法によりユーカリ材に対しチップ処理を行った。
［実施例３１］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
ラジアータパイン材を用い実施例２５に準じてチップ処理を行い、実施例２６同様の試験を行った。表６に示すようにセロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例３２］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例３０で処理したチップに対して実施例２７と同様の方法にて蒸解を行った。
［実施例３３］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例３２で得られたパルプを実施例２８に準じてカッパー価の測定等を行った。表７に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表８に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例３４］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例１５で作製したｐＧＰＣＢＨＩ２７ＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体は実施例２６と同様の方法にて培養を行い、４−ｍｅｔｈｙｌ−Ｏ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｆｅｒｙｌ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅを基質としたセロビオヒドロラーゼＩ活性測定方法を用いて、セロビオヒドロラーゼＩ活性を経時的に測定した。その結果、セロビオヒドロラーゼＩ活性を最大で７０％抑制された形質転換体を得ることができた。
［実施例３５］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例３４により選抜したセロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体を実施例２５と同様の方法によりユーカリ材に対し、チップ処理を行った。
［実施例３６］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例３４で得られた形質転換体を用いてラジアータパイン材に対し実施例２５に準じてチップ処理を行い、実施例２６と同様の試験を行った。表９に示すようにセロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例３７］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例２５に準じてユーカリ材のチップ処理を行った後、実施例２７と同様の方法にて処理チップの蒸解を行った。
［実施例３８］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例３７で得られたパルプを実施例２８に準じてカッパー価の測定等を行った。表１０に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表１１に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例３９］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例１６で作製したｐＧＰＣＢＨＩ３１ＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体は実施例２４と同様の方法にて培養を行い、４−ｍｅｔｈｙｌ−Ｏ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｆｅｒｙｌ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅを基質としたセロビオヒドロラーゼＩ活性測定方法を用いて、セロビオヒドロラーゼＩ活性を経時的に測定した。その結果、セロビオヒドロラーゼＩ活性を最大で７０％抑制された形質転換体を得ることができた。
［実施例４０］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例３９により選抜したセロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換株を用い実施例２５と同様の方法によりユーカリ材に対し、チップ処理を行った。
［実施例４１］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例３９で得られた形質転換体を用い、ラジアータパイン材に対し、実施例２５に準じてチップ処理を行い、実施例２６と同様の試験を行った。
表１２に示すようにセロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例４２］セロビオヒドロラーゼＩ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例３９より得られたチップを実施例２７と同様の方法にて処理チップの蒸解を行った。
［実施例４３］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例４２より得られたパルプを実施例２８に準じてカッパー価の測定等を行った。表１３に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表１４に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例４４］セロビオヒドロラーゼＩＩ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例１７で作製したｐＧＰＣＢＨＩＩＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体を実施例２３と同様の培養を行い、培養菌体を経時的にサンプリングし、ｍＲＮＡを回収し、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子の存在量を測定した。その結果、宿主細胞と比較してセロビオヒドロラーゼＩＩ活性が約５０％抑制されている形質転換体を得ることができた。
［実施例４５］セロビオヒドロラーゼＩＩ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例４４により選抜したセロビオヒドロラーゼＩＩ活性を抑制した形質転換株を実施例２５記載の方法によりユーカリ材に対しチップ処理をした。
［実施例４６］セロビオヒドロラーゼＩＩ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例４４で得られた形質転換体を用いラジアータパイン材に対し、実施例２５に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップを実施例２６記載の方法により紙力などの検討を行った。表１５に示すようにセロビオヒドロラーゼＩＩ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例４７］セロビオヒドロラーゼＩＩ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例４５で得られたチップを、実施例２７と同様の方法にて処理チップの蒸解を行った。
［実施例４８］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例４７で得られたパルプを、実施例２８に準じてカッパー価の測定等を行った。表１６に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表１７に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例４９］糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例１８で作製したｐＧＰＥＧ６１ＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体を実施例２３と同様の培養を行い培養液を経時的にサンプリングし、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性を測定した。その結果、宿主細胞と比較してエンドグルカナーゼ活性が約５０％抑制されている形質転換体を得ることができた。
［実施例５０］糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例４９により選抜した糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株を実施例２５に記載の方法によりユーカリ材に対しチップ処理をした。
［実施例５１］糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例４９で得られた形質転換体をラジアータパイン材に対し、実施例２５に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップを実施例２６記載の方法により紙力などの検討を行った。表１８に示すように糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
2003070940.tif 000041
［実施例５２］糖分解酵素ファミリー６１に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例５０で得られたチップを、実施例２７記載の方法により処理チップの蒸解を行った。
［実施例５３］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例５２で得られたパルプを、実施例２８記載の方法に準じてカッパー価の測定などを行った。表１９に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表２０に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例５４］糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例１９で作製したｐＧＰＥＧ１２ＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体を実施例２３と同様の培養を行い培養液を経時的にサンプリングし、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性を測定した。その結果、宿主細胞と比較してエンドグルカナーゼ活性が約５０％抑制されている形質転換体を得ることができた。
［実施例５５］糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例５４により選抜した糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株を実施例２５に記載の方法によりユーカリ材に対しチップ処理をした。
［実施例５６］糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例５４で得られた形質転換体をラジアータパイン材に対し、実施例２５に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップを実施例２６記載の方法により紙力などの検討を行った。表２１に示すように糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例５７］糖分解酵素ファミリー１２に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例５５で得られたチップを、実施例２７記載の方法により処理チップの蒸解を行った。
［実施例５８］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例５６で得られたパルプを、実施例２８記載の方法に準じてカッパー価の測定などを行った。表２２に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表２３に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例５９］糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例２０で作製したｐＧＰＰＣＥＧ５ＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体を実施例２３に記載の方法で培養を行い、培養液を経時的に回収し、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性を測定した。その結果、宿主細胞と比較してエンドグルカナーゼ活性が約２０％抑制されている形質転換体を得ることができた。
［実施例６０］糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例５９により選抜した糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株を実施例２５記載の方法によりユーカリ材に対しチップ処理をした。
［実施例６１］糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例５９で得られた形質転換体を用いてラジアータパイン材に対し実施例２５に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップを実施例２６記載の方法により紙力などの検討を行った。
表２４に示すように糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例６２］糖分解酵素ファミリー５に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例６０で得られたチップを実施例２７記載の方法により処理チップの蒸解を行った。
［実施例６３］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例６２で得られたパルプを実施例２８に準じてカッパー価などの測定を行った。表２５に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表２６に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例６４］糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体の選抜
前記実施例２２に示した形質転換法の中で示したプラスミドｐＧＰＣＤＨ１を実施例２１で作製したｐＧＰＰＣＥＧ９ＡＭに変えて形質転換を行った。得られた形質転換体を実施例２３記載の方法により培養し、培養液を経時的に回収し、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性を測定した。その結果、宿主細胞と比較してエンドグルカナーゼ活性が約３０％抑制されている形質転換体を得ることができた。
［実施例６５］糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例６４により選抜した糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株を実施例２５記載の方法によりユーカリ材に対しチップ処理をした。
［実施例６６］糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例６４で得られた形質転換体を用いラジアータパイン材に対し実施例２５に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップを実施例２６記載の方法により紙力などの検討を行った。
表２７に示すように糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例６７］糖分解酵素ファミリー９に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例６５で得られたチップを、実施例２７と同様の方法にて処理チップの蒸解を行った。
［実施例６８］Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
実施例６７で得られたパルプを、実施例２８記載の方法に準じてカッパー価などの測定を行った。表２８に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表２９に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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［実施例６９］セロビオースデヒドロゲナーゼ活性
１．  測定法の概要
セロビオースデヒドロゲナーゼ活性の測定は次のように行った。０．６７ｍＭジクロロフェノールインドフェノール（シグマ社製）、３．３３ｍＭセロビオース（関東化学株式会社製）、ｐＨ５、２５０ｍＭの酢酸緩衝液をそれぞれ２５０ｕｌ、１００ｕｌ、１００ｕｌを混合した溶液に被検液５０ｕｌを添加し、３７℃にて反応させた。反応開始後、ジクロロフェノールインドフェノールの極大吸収波長５５０ｎｍ（モル吸光係数３９６５Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍ）における吸光度（光路長１ｃｍ）を連続的に測定した。セロビオースデヒドロゲナーゼの活性単位については上記の条件で１分間に１ｕｍｏｌのジクロロフェノールエンドフェノールを減少させる酵素量を１ｕｎｉｔ（ユニット：Ｕ）とした。
２．  粗酵素液の調製（１）
酸素漂白後広葉樹クラフトパルプ（カッパー価８．５、白色度４６．０％）１．０％、ペプトン１．０％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００５％、ＫＨ２ＰＯ４０．１５％、チアミン塩酸塩２０ｐｐｂを含む液体培地（ｐＨ５．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに採り、紙栓をした後、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。これにコリオラス・ヒルスタスＩＦＯ４９１７株を白金耳植菌し、２７℃で回転振盪培養した（振幅２５ｍｍ、１２０往復／分）。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）して培養上清を分離し、セロビオースデヒドロゲナーゼの粗酵素液を得た。上記の条件で活性を測定した結果、培養上清中のセロビオースデヒドロゲナーゼ活性は、培養開始後７２時間後で０．０６Ｕ／ｍｌであった。
３．  粗酵素液の調製（２）
アビセル（フナコシ薬品株式会社製）１．０％、ペプトン１．０％、０．００５％、ＫＨ２ＰＯ４０．１５％、チアミン塩酸塩２０ｐｐｂを含む液体培地（ｐＨ５．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに採り、紙栓をした後、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。これにコリオラス・ヒルスタスＩＦＯ４９１７株を白金耳植菌し、２７℃で回転振盪培養した（振幅２５ｍｍ、１２０往復／分）。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）して培養上清を分離し、セロビオースデヒドロゲナーゼの粗酵素液を得た。上記の条件で活性を測定した結果、培養上清中のセロビオースデヒドロゲナーゼ活性は、培養開始後７２時間後で０．０７Ｕ／ｍｌであった。
４．  セロビオースデヒドロゲナーゼの精製（１）
実施例１又は実施例２で得た粗酵素液を硫安分画し、８０％沈殿画分を遠心分離（２０，０００ｒｐｍ×１０分）にて回収した後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。得られた粗酵素液について、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ（直径１．６×３ｃｍ、Ａｍａｓｈａｍ社製）を用いて疎水クロマトグラフィーを行った。
吸着画分を硫安濃度１Ｍ〜０Ｍまでの濃度勾配で２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて溶出し、９ｍｌずつ分画し、活性画分を得た。この画分をさらに１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（直径２．６×６０ｃｍ、Ａｍａｓｈａｍ社製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで行い、３ｍｌずつ分画し活性画分を得た。
この画分を集め、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＨＱ（直径４．６×１０ｃｍ、ＡＢＩ社製）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。吸着画分を０Ｍ〜１Ｍまでの濃度勾配で塩化ナトリウムを含む該緩衝液にて溶出し、９ｍｌずつ分画し活性画分を得た。
活性画分に対し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ、均一に精製されていることが確認できた。培養液に対する精製酵素の収率は４．９％、比活性は１０．５Ｕ／ｍｇであった。
５．  セロビオースデヒドロゲナーゼの精製（２）
実施例１又は実施例２で得た粗酵素液を凍結・融解を行うことにより析出するグルカン状物質を遠心分離（２０，０００ｒｐｍ×１０分）で除去した後、硫安濃度が１Ｍになるように硫安を添加した。得られた粗酵素液について、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ（直径１．６×３ｃｍ、Ａｍａｓｈａｍ社製）を用いて疎水クロマトグラフィーを行った。
吸着画分を硫安濃度１Ｍ〜０Ｍまでの濃度勾配で２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて溶出し、９ｍｌずつ分画し、活性画分を得た。この画分をさらに１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（直径２．６×６０ｃｍ、Ａｍａｓｈａｍ社製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで行い、３ｍｌずつ分画し活性画分を得た。この画分を集め、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したｍｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５（直径０．５×５ｃｍ、Ａｍａｓｙａｍ社製）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。吸着画分を０Ｍ〜０．４Ｍまでの濃度勾配で塩化ナトリウムを含む該緩衝液にて溶出し、１ｍｌずつ分画し活性画分を得た。
活性画分に対し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ、均一に精製されていることが確認できた。培養液に対する精製酵素の収率は１６．６％、比活性は１０．５Ｕ／ｍｇであった。
産業上の利用性
本発明は、担子菌由来のセルロース分解酵素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子及び該遺伝子のアンチセンス遺伝子を含む組換えベクターで形質転換された形質転換体及びその用途を提供するものであり、該セルロース分解酵素をコードする遺伝子のアンチセンス遺伝子を用いた遺伝子組換えによるセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップ処理に用いることによって、収率や紙力に優れたパルプ製造法を実施することが可能となるものである。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、セロビオースに本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼを作用させたときの反応の分析結果を示す図である。
図２は、本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼの至適ｐＨを示す図である。図中、◆はグリシン−ＨＣｌを示し、■は酢酸を示し、▲はリン酸を示す。
図３は、本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼのｐＨ安定性を示す図である。図中、◆はグリシン−ＨＣｌを示し、■は酢酸を示し、▲はリン酸を示す。
図４は、本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼの反応至適温度を示す図である。
図５は、本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼの熱安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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