(57)【要約】マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下で培養することを特徴とするＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養方法、Ｍ−ＣＳＦ存在下でＬｉｎ陰性または弱陽性細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法、該増幅方法により得られる造血幹細胞集団、Ｍ−ＣＳＦを含有するＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養キット、Ｍ−ＣＳＦを含有する造血幹細胞の増幅促進剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下で培養することを特徴とするＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養方法。
【請求項２】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下でＬｉｎ陰性または弱陽性細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法で得られる造血幹細胞集団。
【請求項４】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含有するＬｉｎ陰性または弱陽性細胞培養用キット。
【請求項５】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含有する造血幹細胞の増幅促進剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を用いる造血幹細胞の増幅方法に関する。より詳しくは、Ｍ−ＣＳＦ存在下で培養することを特徴とするＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養方法、Ｍ−ＣＳＦ存在下でＬｉｎ陰性または弱陽性細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法、該増幅方法により得られる造血幹細胞集団、Ｍ−ＣＳＦを含有するＬｉｎ陰性または弱陽性細胞培養用キット、Ｍ−ＣＳＦからなる造血幹細胞の増幅促進剤に関する。
背景技術
造血幹細胞は赤血球、白血球、血小板、Ｔ及びＢリンパ球などのすべての血球細胞を産生する能力（多分化能）を有するとともに、自分自身を複製する能力（自己複製能力）を兼ねあわせる細胞と定義される。骨髄移植は、移植骨髄中に含まれる造血幹細胞がその中心的役割を担うので、造血幹細胞移植とも置き換えることができる。現在この骨髄移植は、各種血液疾患、癌、免疫不全症、先天性代謝異常症等多くの難治性疾患に対する根治的治療法として確立されている。しかし、移植のためにはドナーと患者のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が合致しなければならず、ドナー不足が社会的問題になっている。
最近、骨髄に代わる造血幹細胞源として末梢血がしばしば用いられている。健常人の末梢血には造血幹細胞を含むＣＤ３４陽性細胞はごく少数しか存在していないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を連続投与すると大量に骨髄から末梢血に動員される。この時期の末梢血から血液成分分離装置を用いて大量に末梢血造血幹細胞／造血前駆細胞を採取し、移植に用いる。しかし、末梢血への造血幹細胞動員の効率およびドナーの安全面で解決すべき問題を有する。
さらに造血幹細胞源として臍帯血を用いる臍帯血幹細胞移植も行われている。しかし、臍帯血に含まれる造血幹細胞数が少ないのでその適用が小児に限られている。
このような背景から、造血幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増幅させる技術が求められており、これまでにも様々な方法が試みられている。たとえば、造血幹細胞を増幅するために、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３（Ｆｌｔ−３）リガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）等のサイトカイン存在下で培養した結果が報告されている。造血前駆細胞およびさらに分化した細胞はこれらのサイトカインや増殖因子などと共に培養することにより高い増幅度で増幅可能であるが、造血幹細胞の増幅度は数倍程度であり満足できるレベルではない（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３６４８−１３６５３，１９９７、Ｍａｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２，４５２−４６１，１９９８、Ｂｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９６，１７４８−１７５５，２０００）。造血前駆細胞は一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコロニー形成能を有する細胞と定義づけられるが、自己複製能を保有しておらず、長期にわたって、血液細胞を産生することができないため、血球細胞源としての移植には応用できない。
さらに、骨髄間質細胞との共培養によって造血幹細胞を増幅することも試みられているが、その増幅度も数倍程度である（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，８９，４３３７−４３４７，１９９７）。
一方で、サイトカイン、増殖因子等を生体に直接投与することにより、造血幹細胞の大幅な増幅が可能であれば、たとえば、少量の造血幹細胞しか含まない臍帯血などを移植源とすることもできるが、その成功例の報告はない。
本発明は、不十分であったｅｘ  ｖｉｖｏでの、サイトカイン、増殖因子による造血幹細胞の増幅レベルをさらに増加させて、ｅｘ  ｖｉｖｏ増幅した造血幹細胞の臨床応用を可能とすることを目的とする。さらには、サイトカイン直接投与による生体内での造血幹細胞の増幅を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、造血幹細胞を含むと考えられる、系統特異的抗原マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｍａｒｋｅｒ：Ｌｉｎ）が陰性または弱陽性の細胞をマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびその他のサイトカインで刺激することによって、造血幹細胞の増幅レベルを増加できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下で培養することを特徴とするＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養方法に関する。
また、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下でＬｉｎ陰性または弱陽性細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法に関する。
さらに、上記方法により得られる造血幹細胞集団に関する。
また、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含有するＬｉｎ陰性または弱陽性細胞培養キットに関する。
さらに、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含有する造血幹細胞の増幅促進剤に関する。
発明の実施の態様
本発明の培養方法および増幅方法は、Ｍ−ＣＳＦ存在下でＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養を行うことを特徴とする。発明者らは、Ｍ−ＣＳＦ存在下でＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養を行って、造血幹細胞が増幅されるかどうかを検討した。その結果、Ｍ−ＣＳＦ非存在下で培養した場合と比べ、Ｍ−ＣＳＦ存在下で培養した場合、有意な造血幹細胞の増幅が誘導されることを見出した。したがって、本発明の培養方法は造血幹細胞の増幅に応用できる。さらに本発明の増幅方法により増幅された造血幹細胞集団は、増血幹細胞移植源として用いることができる。
Ｌｉｎ陰性または弱陽性細胞は、細胞表面マーカーを指標として採集するとよい。Ｌｉｎとは系統特異的抗原マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｍａｒｋｅｒ）を意味し、たとえば、赤血球マーカーであるＴｅｒ１１９、顆粒球マーカーであるＧｒ−１、単球・マクロファージ系細胞マーカーであるＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）、Ｔ細胞マーカーであるＬｙ１などが挙げられる。造血幹細胞はＬｉｎ陰性または弱陽性画分に存在するとされている。
Ｌｉｎ陰性または弱陽性細胞の採取は、単細胞浮遊液とした骨髄細胞をＬｉｎ認識標識抗体で処理し、フローサイトメーターなどのセルソーターを用いて、標識された細胞を除去することにより、行うことができる。たとえば、マウス細胞では、造血前駆細胞調製用抗体カクテルを含むＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で、処理した細胞がＬｉｎ陰性または弱陽性細胞として広く用いられている。実施例では、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭを用いて得た細胞は処理前細胞の０．５％程度であった。
かくして得られた細胞をＭ−ＣＳＦ存在下で培養する際、用いる培地、培養期間、培養プレート等の培養条件は特に限定されず、細胞が良好な状態で保たれる条件を適宜選択すべきである。たとえば、実施例では、得られたＬｉｎ陰性または弱陽性細胞を組織培養用６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）に１ウェルあたり４×１０４個で播種し、５％ＦＢＳと１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて５％ＣＯ２存在下、３７℃の条件で６日間培養したが、これに限定されない。
Ｍ−ＣＳＦはＰｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．などから購入することができるが、Ｍ−ＣＳＦをコードする遺伝子を適当な蛋白質発現用ベクターに組み込み、通常の遺伝子工学的手法により製造することもでき、特に限定されない。また、用いる動物細胞の種に合わせたＭ−ＣＳＦを用いることが望ましいが、反応性が得られる範囲で、他種由来のＭ−ＣＳＦを用いることもあり得る。
また、細胞培養時には、適当なサイトカインおよび増殖因子を添加することがより好ましい。添加するサイトカインおよび増殖因子としては、造血幹細胞の維持、増殖促進、分化誘導等に有効であることが報告されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３６４８−１３６５３，１９９７、Ｍａｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２，４５２−４６１，１９９８、Ｂｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９６，１７４８−１７５５，２０００）、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ、ＴＰＯ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）等が考えられるが、特に限定するものではない。
造血幹細胞は前述したように、すべての血球細胞を産生する能力（多分化能）を有するとともに、自分自身を複製する能力（自己複製能力）を兼ねあわせる細胞と定義される。したがって、造血幹細胞が増幅されるかどうかの確認方法としては、この二つの能力が確認できる方法が好ましい。たとえば、マウス細胞を用いるのであれば、Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（長期骨髄再構築法）により行うことができる。本方法は、実施例の欄でより詳細に述べるが、造血幹細胞を含む細胞群をある動物に移植して、長期にわたりその幹細胞由来の血液細胞がその動物の血液に存在するかを確認するものであり、造血幹細胞の定量法として現在もっとも信頼性の高い方法である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２１，２０６−２１９，１９９３）。
ヒト細胞を用いる場合にはＮＯＤ／ＳＣＩＤ（Ｎｏｎ−Ｏｂｅｓｅ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ／Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）マウスやβ２−マイクログロブリンが欠損したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを移植動物として使用する方法を適用することができる（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２，１３２９−１３３７，１９９６、Ｋｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９５，３１０２−３１０５，２０００）。
細胞培養時に添加するＭ−ＣＳＦの濃度は０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度が好ましく、１〜５０ｎｇ／ｍｌ程度がより好ましく、５〜２０ｎｇ／ｍｌ程度がさらに好ましい。Ｍ−ＣＳＦの濃度を０、１、１０、１００ｎｇ／ｍｌで添加して造血幹細胞の増幅能を検討したところ、１０ｎｇ／ｍｌでは、有意な増幅促進作用を示したのに対し、１００ｎｇ／ｍｌでは、かえって増幅を抑制する作用を示した。このことは、Ｍ−ＣＳＦの造血幹細胞増幅作用には至適濃度が存在することを示唆する。
また、Ｌｉｎ陰性または弱陽性細胞に対し、造血幹細胞マーカーとして知られるｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１マーカー陽性としてさらに選別を加えた細胞では、Ｍ−ＣＳＦ処理による造血幹細胞の増幅効果は観察されなかった。Ｌｉｎ陰性または弱陽性細胞の中で、造血幹細胞はＭ−ＣＳＦレセプター（ｃ−ｆｍｓ）陰性画分に認められた。これらのことから、発明者は、Ｍ−ＣＳＦによる造血幹細胞の増幅効果は、Ｍ−ＣＳＦが直接的に造血幹細胞に働くのではなく、ｃ−ｆｍｓ陽性細胞など何らかの細胞やその細胞由来の因子等を介する間接的作用であると考えている。
さらに、本発明は、Ｍ−ＣＳＦを含有するＬｉｎ陰性または弱陽性細胞培養用キットを提供する。本培養用キットは、たとえば、適当なサイトカイン、培地等とともに、Ｍ−ＣＳＦを含有するので、Ｌｉｎ陰性または弱陽性細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養に用いることができる。
また、Ｍ−ＣＳＦは上記のように造血幹細胞を含む細胞群の増幅を促進するので、造血幹細胞の増幅促進剤として用いることができる。Ｍ−ＣＳＦを含有する造血幹細胞増幅促進剤は、Ｍ−ＣＳＦと共に適当なサイトカインや増殖因子を含んでもいい。これら造血幹細胞増幅促進剤を添加して培養することにより、造血幹細胞の十分なｅｘ  ｖｉｖｏ増幅が可能となれば、少量の骨髄、末梢血、臍帯血からｅｘ  ｖｉｖｏ増幅させた細胞を造血幹細胞源として用いることができる。さらには、Ｍ−ＣＳＦを生体に直接投与することによる造血幹細胞の大幅な増幅が可能であれば、移植時の造血幹細胞数は少量で足りることとなり、たとえば、臍帯血移植などを小児のみならず成人へも適用できることとなる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これに限定されるべきでない。
実施例  １
（骨髄細胞の採取）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎラボラトリーズ）の大腿骨と脛骨より採取した骨髄細胞を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，免疫生物研究所）を含むハンクス平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）（以下ＨＢＳＳと略す）に懸濁後、２２ゲージの注射針を取り付けた１ｍｌのシリンジを用いて細胞浮遊液を調製し、ポアサイズ４０μｍのナイロンメッシュ（ファルコン）に通して細胞塊を除去した。１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心による洗浄後、ＨＢＳＳに懸濁して単細胞浮遊液とした。
（Ｌｉｎ陰性または弱陽性細胞の取得）
マウス造血前駆細胞調製用のＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて分化抗原陰性または弱陽性（Ｌｉｎ＜弱陽性）細胞を添付マニュアルに従って調製した。まず、単細胞浮遊液に分化抗原に対するビオチン標識抗体カクテルを加え、氷上で２０分間反応後、ＨＢＳＳで洗浄し、１，１００ｒｐｍ、５分間遠心処理した。細胞をＨＢＳＳで再懸濁し、ビオチン標識抗体結合用Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ抗体複合体カクテルを加え、氷上で４０分間反応後、磁気コロイドを加え、さらに、４０分間反応させた。ＭＡＣＳ  ＬＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．）に細胞懸濁液を通すことにより、標識細胞を吸着させ、未標識細胞を回収した。回収した細胞の一部にＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識したストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加後、ＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメーター（ベックマンコールター）により解析を行った。回収した細胞は第１図に示すようにＬｉｎ＜弱陽性である未熟な細胞集団であった。
（培養）
得られたＬｉｎ＜弱陽性細胞を組織培養用６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）に１ウェルあたり４×１０４個で播種し、５％ＦＢＳと１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて５％ＣＯ２存在下、３７℃の条件で培養した。培養液中に添加するサイトカインは、ＳＣＦ、ＩＬ−１１、ＦＬＴおよびＴＰＯをいずれも１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。更に、Ｍ−ＣＳＦの効果を検討するため、１、１０、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＭ−ＣＳＦを添加して培養した。使用したサイトカインはすべて、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入した。
（培養細胞のマウスへの移植）
サイトカイン存在下で６日間培養後、ピペッティング操作によりマイクロプレートから細胞を回収した。ＨＢＳＳで細胞を懸濁後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウス（日本クレア）から採取した１０６個の新鮮骨髄細胞を加えて１，１００ｒｐｍ、５分間遠心処理した。最終的に細胞は４００μｌの１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳに懸濁し、致死量放射線（８００レントゲン）を照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスに尾静脈から移植した。
（移植した細胞に由来する白血球の検出）
移植後６ヶ月経過したマウスの尾末端からヘパリンコート毛細管を用いて約２５μｌの末梢血を採取後、直ちに１０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含む５００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に懸濁した。上清を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心処理によって除去後、細胞を５００μｌのＨＢＳＳに懸濁した。次にＰＢＳ（−）で１０倍希釈したＦＩＴＣ標識した抗マウスＬｙ５．１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１０μｌ加えて、氷中で遮光、３０分間反応した。細胞を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心処理によって回収し、室温で１５５ｍＭ塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、１０ｍＭ重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、０．１ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）から構成される溶血溶液５００μｌに懸濁する溶血操作を２回行った。細胞をＨＢＳＳで洗浄後、１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心処理によって回収し、２μｇ／ｍｌの７アミノアクチノマイシンＤ、０．２％の牛血清アルブミン、０．０５％のアジ化ナトリウム，０．０２％のエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＨＢＳＳに懸濁してＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメーターにより解析を行った。
第２図に示すようにＭ−ＣＳＦ濃度依存的に、移植した細胞由来の白血球の割合が高かった。これは培養期間中に、造血幹細胞がより多くの自己複製を行ったことを反映したものと解される。しかし、Ｍ−ＣＳＦの作用は、高濃度では抑制効果となって現れており、Ｍ−ＣＳＦの造血幹細胞の自己複製促進効果は、濃度によって厳格に制御されていることがわかる（第２図）。
この結果を定量化したものが、表１である。１０６個の骨髄細胞と同等の骨髄再構築能を示す活性を１単位として、表中にしめした計算式を用いて、培養前とサイトカイン存在下での培養後に含まれる造血幹細胞としての骨髄再構築活性（Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ；ＲＵ）を比較した。１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの添加により、ＲＵはさらに２倍以上増加することから、Ｍ−ＣＳＦは造血幹細胞の増幅にとって有用であることが、実験的に示された。
このように造血幹細胞を高い増幅度で増幅できれば造血幹細胞移植に必要な採取幹細胞数を減らすことが可能となり、本発明はドナーの安全性確保の側面からも有用である。
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（移植した細胞に由来する白血球上の分化抗原の検出）
移植後６ヶ月経過したマウスの尾末端からヘパリンコート毛細管を用いて約１００μｌの末梢血を採取後、直ちに１０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含む２ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬに懸濁し、抗体染色のために４等分した。細胞を洗浄後、ＨＢＳＳ  ５００μｌに懸濁し、分化抗原に対する抗体としてビオチン標識した抗マウスＭａｃ−１、抗マウスＧｒ−１、抗マウスＢ２２０、抗マウスＣＤ３ｅ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｐａｎｅｌ）をそれぞれチューブあたり２μｌ添加し、氷中で２０分間抗体反応を行った。反応後、ＨＢＳＳで細胞を２回洗浄し、５００μｌのＨＢＳＳに再懸濁した。さらにＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を０．５μｌとＦＩＴＣ標識抗マウスＬｙ５．１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１μｌ添加し、氷中遮光下で２０分間反応した。細胞を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって回収し、室温で１５５ｍＭ塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、１０ｍＭ  重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、０．１ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）から構成される溶血溶液５００μｌに懸濁する溶血操作を２回行った。ＨＢＳＳを用いて細胞を洗浄後、１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心処理によって細胞を回収し、２μｇ／ｍｌの７アミノアクチノマイシンＤ、０．２％の牛血清アルブミン、０．０５％のアジ化ナトリウム，０．０２％のエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＨＢＳＳに懸濁してＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメーターにより解析を行った。
前にも述べたように、造血幹細胞は自己複製する能力とすべての血液細胞に分化する能力を持つ細胞である。もし、造血幹細胞が存在しなければ、移植細胞由来の血球細胞は移植後３ヶ月程度で消失するはずである。第３図に示すように、移植後６ヶ月を経過したマウスにおいても、移植した細胞由来（Ｌｙ５．１マウス骨髄由来）で骨髄球、リンパ球の分化抗原をしめす細胞が検出されることから、移植した細胞集団の中に造血幹細胞が含まれていることが明確になった。（第３図）。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正をくわえることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は２００１年１０月３０日出願の日本特許出願（特願２００１−３３１９４０）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
産業上の利用可能性
本発明の培養方法、増幅方法、該方法により得られる造血幹細胞集団、培養キット、増幅促進剤により、ｅｘ  ｖｉｖｏでの造血幹細胞の増幅が可能となり、造血幹細胞移植に応用できる。さらには、増幅促進剤の直接投与により、より少量の造血幹細胞数での移植が可能となる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＳｔｅｍＳｅｐＴＭを用いて抗Ｌｉｎ抗体カクテルで標識したマウス骨髄由来細胞群をフローサイトメトリーにより解析した図である。カラム処理前はＭＡＣＳ  ＬＳ＋カラムで処理する前の細胞群の解析結果を示し、カラム処理後は同カラムで処理後の細胞群の解析結果を示す。ＳｔｅｍＳｅｐＴＭで処理することにより系統特異的抗原マーカー（Ｌｉｎ）陰性あるいは弱陽性である細胞が得られたことが分かる。
第２図はＭ−ＣＳＦによる細胞増幅促進作用を示す図である。図中、ドナー細胞（％）（Ｐｅｒｃｅｎｔ  ｄｏｎｏｒ  ｃｅｌｌｓ）は、Ｌｙ５．１マウス由来Ｌｉｎ陰性あるいは弱陽性細胞を各種サイトカインで処理後、Ｌｙ５．２マウス由来細胞と共に致死量放射線照射Ｌｙ５．２マウスに移植し、移植から６ヶ月経過後の末梢血中のＬｙ５．１マウス由来細胞の割合を示す。Ｆｒｅｓｈはサイトカイン処理無し、ＳＣＦ＋ＩＬ−１１＋ＦＬＴはＭ−ＣＳＦとともに、ＳＣＦ、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ−３リガンドを同時添加して培養したことを示す。ＳＣＦ＋ＩＬ−１１＋ＴＰＯはＭ−ＣＳＦとともに、ＳＣＦ、ＩＬ−１１、ＴＰＯを同時添加して培養したことを示す。
第３図はＬｉｎ陰性または弱陽性細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとともに、ＳＣＦ、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ−３リガンドで培養し、得られた細胞を移植して６ヶ月目のマウス末梢血白血球の各種分化マーカーの発現を示す図である。ビオチン標識した各種分化マーカーに対する抗体とＰＥ標識ストレプトアビジンで末梢血白血球を染色後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＬｙ５．１抗体で二重染色しフローサイトメトリーにより解析した。図中、縦軸は、それぞれＭａｃ−１、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ３ｅの分化マーカー発現量を示し、横軸はＬｙ５．１（移植細胞由来）の発現量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月12日(2003.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下で培養することを特徴とするＬｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養方法。
【請求項２】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下でＬｉｎ陰性または弱陽性細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法で得られる造血幹細胞集団。
【請求項４】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含有するＬｉｎ陰性または弱陽性細胞培養用キット。
【請求項５】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含有する造血幹細胞の増幅促進剤。
【請求項６】
造血幹細胞の増幅を目的として、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下で培養することを特徴とする、Ｌｉｎ陰性または弱陽性細胞の培養方法。
【請求項７】
造血幹細胞の増幅に用いる、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含有するＬｉｎ陰性または弱陽性細胞培養キット。
【国際調査報告】
2003038077.tif 000006
2003038077.tif 000007