【手続補正書】
【提出日】平成12年10月17日(2000.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】糖尿病の治療
【特許請求の範囲】
【請求項１】個人における糖尿病を治療するための方法であって、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及びＥＧＦ 受容体リガンドから成る群から選択された少なくとも１つの受容体を付与する組成物を、ランゲルハンス島前駆体細胞の成熟インスリン−分泌細胞への分化をもたらすのに十分な量、前記個人に投与することを含んで成る方法。
【請求項２】前記少なくとも１つの受容体リガンドが、ＥＧＦ１−５３，ＥＧＦ１−４８，又はそのＥＧＦ１−４７ 又はＥＧＦ１−４９ コンジェナーから成る群から選択されたＥＧＦ 受容体リガンドである請求項１記載の方法。
【請求項３】前記ＥＧＦ１−５３， ＥＧＦ１−４８， 又はそのＥＧＦ１−４７ 又はＥＧＦ１−４９ コンジェナーが、ヒトＥＧＦ１−５３， ＥＧＦ１−４８， 又はそのＥＧＦ１−４７ 又はＥＧＦ１−４９，又はそのコンジェナーである請求項２記載の方法。
【請求項４】成熟インスリン−分泌β細胞の集団を、糖尿病を有する患者に供給するための方法であって、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及び上皮成長因子受容体リガンドから成る群から選択された少なくとも１つの受容体リガンドの十分な量を、移植の前、ランゲルハンス島の成熟インスリン−分泌β細胞の増殖を誘発するために供給されている、培養されたランゲルハンス島を前記患者に移植することを含んで成る方法。
【請求項５】前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である請求項４記載の方法。
【請求項６】前記ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドがガストリンである請求項４記載の方法。
【請求項７】前記上皮成長因子受容体リガンドが、ＴＧＦ −α、又はＥＧＦ１−５３， ＥＧＦ１−４８， 又はそのＥＧＦ１−４７ 又はＥＧＦ１−４９ コンジェナーから成る群から選択されたＥＧＦ である請求項４記載の方法。
【請求項８】膵臓β細胞の集団を拡張するための方法であって、
前記膵臓β細胞の増殖を誘発するのに十分な量のガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及び上皮成長因子受容体リガンドを、前記膵臓β細胞に供給し、それにより、膵臓β細胞の拡張された集団を得ることを含んで成る方法。
【請求項９】膵臓β細胞の増殖を誘発するのに十分な量のガストン受容体アゴニスト及び上皮成長因子受容体アゴニストを、ランゲルハンス島に供給することによって得られる膵臓β細胞を含んで成る組成物。
【請求項１０】個人における糖尿病を処理するための方法であって、タンパク質性ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及びタンパク質性ＥＧＦ 受容体リガンドから成る群から選択された少なくとも１つの受容体を付与する組成物を、ランゲルハンス島前駆体細胞の成熟インスリン−分泌細胞への分化をもたらすのに十分な量、前記個人に全身的に投与することを含んで成る方法。
【請求項１１】前記タンパク質性ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドがガストリンである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】前記タンパク質性ＥＧＦ 受容体リガンドがＴＦＧ −αである請求項１０記載の方法。
【請求項１３】前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である請求項１０記載の方法。
【請求項１４】個人におけるランゲルランス島細胞新生を刺激するための方法であって、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及びＥＧＦ 受容体リガンドから成る群から選択された少なくとも１つの受容体を付与する組成物を、ランゲルハンス島前駆体細胞の成熟インスリン−分泌細胞への分化をもたらすのに十分な量、前記個人に全身的に投与することを含んで成る方法。
【請求項１５】前記個人である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】前記ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及び前記ＥＧＦ 受容体リガンドの両者が投与される請求項１４記載の方法。
【請求項１７】前記ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及び前記ＥＧＦ 受容体リガンドの少なくとも１つが、タンパク質性受容体リガンドである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】個人における糖尿病を処理するための方法であって、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及びＥＧＦ 受容体リガンドを付与する組成物を、ランゲルハンス島前駆体細胞の成熟インスリン−分泌細胞への分化をもたらすのに十分な量、前記個人に投与することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ランゲルハンス島前駆体細胞の成熟インスリン−分泌細胞への分化を、効果的に促進する、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及び／ 又はＥＧＦ 受容体リガンドを含んで成る生成物を、その必要な個人に投与することによって、その個人における糖尿病を処理するための方法に関する。前記方法は、通常のストレプトゾトシン（ＳＴＺ ）誘発された糖尿病及び遺伝的に前処理された糖尿病Ｚｕｃｋｅｒラットへの、ガストリン及び形質転換成長因子α（ＴＧＦ −α）の単独での又は組合しての投与により例示される。
【０００２】
背景
糖尿病は、すべての年齢グループ及び集団を通して最も共通する内分泌疾病の１つである。臨床学的罹病率及び死亡率の他に、糖尿病の経済的費用は、莫大であり、アメリカ合衆国のみでも１年当たり９００ 億ドルを越え、そして糖尿病の流行は２０１０年までに２倍以上に上昇することが予測される。
【０００３】
２種の次の主要形の糖尿病が存在する：すべての糖尿病の５〜１０％を占めるインスリン−依存性（Ｉ型）糖尿病（ＩＤＤＭ）、及びおよそ９０％を占める非インスリン−依存性（ＩＩ型）糖尿病（ＮＩＤＤＭ）。ＩＩ型糖尿病は年齢の上昇に関連しているが、しかしながら、ＮＩＤＤＭ として診断される、いわゆる若い人々の成長と共に開始する糖尿病（ＭＯＤＹ）の数の上昇傾向がある。Ｉ型及びＩＩ型の両者においては、膵臓におけるβ−細胞の破壊又はインスリンの欠陥分泌又は生成のいずれかを通してのインスリン分泌の損失が存在する。ＮＩＤＤＭ においては、患者は、典型的には、最適な食事のレジメ、体重の減量及び運動に従って、治療を開始する。
【０００４】
薬物治療は、それらの程度がもはや、適切な代謝調節を提供しない場合に開始される。初期薬物治療は、β−細胞インスリン分泌を刺激するスルホニルウレアを包含するが、またビグアニド、α−グルコシダーゼインヒビター、チアゾリデンジオン及び組み合わせ治療も包含する。しかしながら、ＩＩ型糖尿病において作動する疾病機構の進行性性質は制御するのに困難であることは注目すべきである。すべての薬物−処理された糖尿病の内５０％以上は、投与される薬物に関係なく、６年以内に不良な糖制御を示す。インスリン治療はＩＩ型糖尿病の処理において最後の頼りとして強く見なされており、そしてインスリンの使用に対する患者の耐性が存在する。
【０００５】
ランゲルハンス島は、外分泌膵臓に成長する多能性幹細胞を含む。胎児性小管膵臓内皮に依存する内皮幹細胞から進化する。Ｔｅｉｔｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２１： ４５４−４６６（１９８７）； Ｐｉｃｔｅｔ ａｎｄ Ｒｕｔｔｅｒ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ， ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ｒ．Ｏ．Ｇｒｅｅｐ ａｎｄ Ｅ．Ｂ．Ａｓｔｗｏｏｄ（１９７２）， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， Ｐ．２５−６６を参照のこと。ランゲルハンス島の成長は、劇的な変化により強調される胎児妊娠の間、別の成長段階を通して進行する。
【０００６】
その初期期間は、前分化された細胞によるインスリン及びグリコーゲンの発現により明らかなように、多能性幹細胞のランゲルハンス島細胞系への傾倒により特徴づけられる前分化段階であるそれらの前分化された細胞は、低レベルのランゲルハンス島特異的遺伝子生成物を発現し、そして成熟ランゲルハンス島細胞の細胞分化を欠いている傾倒されたランゲルハンス島前駆体細胞の集団を含んで成る。Ｐｉｃｔｅｔ ａｎｄ Ｒｕｔｔｅｒ，前記を参照のこと。マウス妊娠のおよそ１６日目、前分化された膵臓は、ランゲルハンス島細胞の細胞分化及びランゲルハンス島遺伝子発現の数百倍の上昇により特徴づけられる急速な増殖及び分化の相を開始する。
【０００７】
組織学的には、ランゲルハンス島形成（新生）は、膵臓管からの増殖性ランゲルハンス島芽として明らかになる（島芽細胞形成）。出産の直前、ランゲルハンス島増殖の速度は遅く、そしてランゲルハンス島新生及び島芽細胞形式はほとんど明らかになっていない。これと同時に、ランゲルハンス島は最大レベルのインスリン遺伝子発現を伴って、十分に分化された状態を達成する。従って、多くの器官と同じように、細胞分化の完結は低められた再生能力に関係しており；分化された成人膵臓は成長する膵臓と同じ再生能力又は分化能力を有さない。
【０００８】
前分化された前駆体の分化は膵臓の後期胎児成長の間に生じるので、ランゲルハンス島分化を調節する因子はたぶん、この期間、膵臓において発現される。ランゲルハンス島発生の間に発現される遺伝子の１つは、胃腸ペプチドすなわちガストリンをコードする。ガストリン胃ホルモン調節酸分泌として成人において作用するが、胎児におけるガストリン発現の主要部位は、ランゲルハンス島である。Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｆｕｌｌｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２６３： ５３４１−５３４７ （１９８８） を参照のこと。ランゲルハンス島におけるガストリンの発現は過渡的である。ランゲルハンス島発生における膵臓ガストリンの有意性は未知であるが、いくつかの臨床学的観察は、次のように、このランゲルハンス島発生におけるガストリンについての規則を示唆する。
【０００９】
たとえば、ガストリン−発現ランゲルハンス島細胞腫瘍及び萎縮性胃炎により引き起こされるハイパーガストリネミア（ｈｙｐｅｒｇａｓｔｒｉｎｅｍｉａ）は、分化する胎児ランゲルハンス島に見出される島芽細胞形成に類似するその島芽細胞形成に関連する。Ｓａｃｃｈｉなど．， Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ Ｂ， ４８： ２６１−１７６ （１９８５）； 及びＨｅｉｔｚ など．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２６： ６３２−６４２ （１９７７） を参照のこと。さらに、膵臓ガストリンの異常存続が乳児性島芽細胞の形成の場合に記録されている。Ｈｏｌｌａｎｄ など．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ７１： ２５１−２６２ （１９７６） を参照のこと。いずれの観察においても、島芽細胞形成とガストリン刺激との間で確立する原因関係は存在しない。
【００１０】
従って、初期ＩＤＤＭの処理において及びＮＩＤＤＮ におけるβ−細胞欠失の防止において価値あるものであるランゲルハンス島細胞再性を刺激する剤を同定することが興味あることである。
本明細書における文献の引用は、そのような文献が従来技術である、本発明の容認としては構成されてはいない。
【００１１】
関連文献
次の３種の成長因子が胎児性膵臓の発生に包含される：ガストリン、形質転換成長因子α（ＴＧＦ −α）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｆｕｌｌｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３： ５３４１−５４３７）。ＴＧＦ −α又はガストリンのみを過剰発現するトランスジェニックマウスは、活性ランゲルハンス島細胞増殖を示さなかったが、しかしながら、両トランスジーンを発現するマウスは有意に高められたランゲルハンス島細胞量を示した（Ｗａｎｇなど， （１９９３） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９２： １３４９−１３５６ ）。
【００１２】
Ｂｏｕｗｅｎｓ ａｎｄ Ｐｉｐｅｌｅｅｒｓ （１９９８） Ｄｉａｂｅｔｏｌｉｇｉａ ４１： ６２９−６３３ は、正常な成人ヒト膵臓に高い割合の発芽性β−細胞が存在し、そしてすべてのβ−細胞の１５％が単一単位として見出されたことを報告している。単一のβ−細胞中心部分は通常、成長した（刺激されていない）ラット膵臓には見出されておらず；Ｗａｎｇなど（（１９９５） Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３８： １４０５−１４１）は、合計のβ−細胞数の約１％の頻度を報告する。
カプセルに封入されたランゲルハンス島移植の後、Ｉ型糖尿病患者におけるインスリン非依存性がＳｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ など （１９９４） Ｌａｎｃｅｔ ３３４： ９５０−５１に記載されている。
【００１３】
また、次の文献も参照のこと：Ｓａｓａｋｉなど （１９９８ Ｊｕｎ １５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５（１１）： １５１０−１５１２； Ｚｈｏｕなど （１９９８ Ｍａｙ） Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７４ （５ Ｐｔ １）： Ｃ１３５６−１３６２； Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇなど （１９９０ Ｊｕｎ） Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ ８７（８）： １３３−１３４； Ｋｅｎｄａｌｌなど （１９９６ Ｊｕｎ） Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ ２２（３）： １５７−１６３； Ｓａｎｄｌｅｒなど （１９９７ Ｊｕｎ） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６３（１２）： １７１２−１７１８； Ｓｕｚｕｋｉ など （１９９８ Ｊａｎ） Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ７（１）： ４７−５２； Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇなど （１９９３ Ｊｕｎ） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１２）； ５８４３−５８４７； Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ など （１９９２ Ｎｏｖ） Ｔｒａｎｓｕｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５４（４）： ７６９−７７４； Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎ など （１９９２ Ｏｃｔ） ＡＳＡＩＯ Ｊ ３８（４）： ８５１−８５４； Ｂｅｎｈａｍｏｕなど （１９９８ Ｊｕｎ） Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ ２４（３）： ２１５−２２４； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ など （１９９４ Ｄｅｃ） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ７９（６）： １５６１−１５６９； Ｆｒａｇａ など （１９９８ Ａｐｒ） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５（８）： １０６０−１０６６； Ｋｏｒｓｇｒｅｎなど （１９９３） Ｕｐｓ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ９８（１）： ３９−５２： Ｎｅｗｇａｒｄ など（１９９７ Ｊｕｌ） Ｄｉａｂｅｒｏｌｏｇｉｚ ４０ Ｓｕｐｐｌ ２： Ｓ４２−Ｓ４７。
【００１４】
発明の要約
本発明は、患者のランゲルハンス島前駆体細胞の成熟インスリン−分泌細胞への分化をもたらすのに十分な量、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド、ＥＧＦ 受容体リガンド、又はそれらの組み合わせを提供する組成物を投与することによって、その必要な患者における糖尿病を処理するための方法を提供する。前記組成物は、全身的に投与され、又は発現ベクターに核酸構造体を含む宿主細胞により現場発現され得、ここで前記核酸構造体はガストリンＣＣＫ 受容体リガンドのためのコード配列、又はＥＧＦ 受容体リガンドのためのコード配列、及びランゲルハンス島前駆体細胞において機能的な転写及び翻訳調節領域を含んでなる。
【００１５】
また、ランゲルハンス島における膵臓β細胞の数を高めるために、十分な量のガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド及びＥＧＦ 受容体リガンドに培養において暴露されたランゲルハンス細胞を、糖尿病患者に移植することによって、その必要な患者における糖尿病を処理するための方法及び組成物も提供され；任意には、ランゲルハンス島β−細胞の集団が、移植の前、β−細胞の集団を拡張するのに十分な時間、培養物において増殖せしめられ得る。前記方法及び組成物は、糖尿病を有する患者の処理に使用される。
【００１６】
好ましい具体例の詳細な説明
本発明は、ガストリンなどのガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド、ＴＧＦ−αなどのＥＧＦ受容体リガンド、または両者の組合せを、膵島前駆細胞の成熟インスリン分泌細胞への分化に有効な量で提供する組成物を投与することによる、それを必要とする患者において真性糖尿病を治療する方法を提供する。該組成物を全身投与する場合は一般には、生理学上許容される担体にて注射、好ましくは静脈により提供される。
【００１７】
該組成物がｉｎ ｓｉｔｕで発現させる場合、膵島前駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、膵島前駆細胞で所望の受容体リガンドを発現させる発現ベクター中の１以上の核酸発現構築体で形質転換する。一例として、発現構築体は、発現後にガストリンへとプロセッシングされるプレプロガストリンペプチド前駆体コード配列などのＣＣＫ受容体リガンドのコード配列、またはＴＧＦ−αなどのＥＧＦ受容体リガンドのコード配列を、膵島前駆細胞での発現を提供する転写および翻訳調節領域とともに含む。
【００１８】
該転写調節領域は構成的であっても、または例えばインスリン遺伝子由来の転写調節領域など、細胞内のグルコース濃度の上昇により誘導されるものであってもよい。形質転換は好適な発現ベクター、例えばアデノウイルス発現ベクターを用いて行う。形質転換をｅｘ ｖｉｖｏで行う場合、形質転換細胞を、例えば腎臓カプセルを用いて糖尿病患者に埋植する。あるいは、膵島細胞をｅｘ ｖｉｖｏにおいて十分量のガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドおよび／またはＥＧＦ受容体リガンドで処理して、糖尿病患者への埋植に先立ち膵島の膵β細胞の数を増やす。要すれば、それらを同受容体リガンドと接触させることにより、埋植に先立ち膵β細胞集団を培養で拡張する。
【００１９】
本発明は、糖尿病患者のための既存の治療計画に優る利点を与える。成熟膵を刺激して再生させる手段を提供することにより、従来の薬物療法（２型）またはインスリン療法（１型および２型）の必要性は少なくなる、またはなくなりさえするばかりか、正常血中グルコースグルコースレベルを維持することもまた、衰弱性の高い糖尿病の合併症をいくらか軽減し得る。糖尿病合併症には網膜、腎臓および神経の小血管を侵すもの（微小血管合併症）と心臓、脳、下肢に供給される大血管を侵すもの（大血管合併症）がある。
【００２０】
糖尿病性微小血管合併症は、２０〜７４歳の患者に新たに失明にする主要な原因であり、末期の腎臓病のすべての新症例の３５％を占める。６０％を超える糖尿病患者誘導体が神経障害侵されている。米国では、主として糖尿病性大血管障害の結果として、糖尿病はすべての非外傷的切断の５０％を占めており、糖尿病患者の冠状動脈疾患からの死亡率は非糖尿病患者の２．５倍である。高血糖症は糖尿病性微小血管合併症の進行を開始させ、加速化すると考えられている。現行の種々の治療計画を用いても高血糖症の制御は十分にはできず、従って糖尿病性合併症の進行を妨げるまたは遅くすることはできない。
【００２１】
本明細書において「ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド」は、ガストリン／ＣＣＫ受容体を刺激する化合物を包含する。かかるガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドの例としては、ガストリン３４（大ガストリン）、ガストリン１７（小ガストリン）およびガストリン８（ミニガストリン）などの種々の形態のガストリン；ＣＣＫ５８、ＣＣＫ３３、ＣＣＫ２２、ＣＣＫ１２およびＣＣＫ８などの種々の形態のコレシストキニン；および単独またはＥＧＦ受容体リガンドと組み合わせて成熟膵の細胞の分化を誘導しインスリン分泌膵島細胞を形成するその他のガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドが挙げられる。
【００２２】
有効な類似体、断片および前記のその他の改変型も考えられる。かかるリガンドとしては、内生ガストリン、コレシストキニン、または組織貯蔵部位由来の類似の有効なペプチドの分泌を高める化合物もまた含まれる。これらの例としては、胃酸分泌を阻害するオメプラゾールおよびＣＣＫ刺激を高めるダイズトリプシン阻害剤が挙げられる。
【００２３】
本明細書において「ＥＧＦ受容体リガンド」は、同組織または隣接する組織において、あるいは同個体においてもガストリン／ＣＣＫ受容体を刺激した際にインスリン産生膵島細胞の再生が誘導されるようにＥＧＦ受容体を刺激する化合物を包含する。かかるＥＧＦ受容体リガンドの例としては、ＥＧＦＩ−４８、ＥＧＦＩ−５２、ＥＧＦＩ−４９をはじめとする、ＥＧＦＩ−５３ならびにその断片および有効類似体が挙げられる。例えばＵＳＰＮ５，４３４，１３５を参照。
【００２４】
その他の例としては、１−４８、１−４７をはじめとするＴＧＦ−α受容体リガンド（１−５０）ならびにその断片および有効類似体、およびアンフィレグリンおよびポックスウイルス増殖因子などのその他のＥＧＦ受容体リガンド、ならびにガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドによる同一の相乗活性を示すその他のＥＧＦ受容体リガンドが挙げられる。これらには有効留自体、断片および前記の改変型が含まれる。さらなる背景としては、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｗａｈｌ， Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ （Ｅｄｓ． Ｓｐｏｒｍ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， （１９９０）を参照。
【００２５】
本発明の主要な態様は、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドおよび／またはＥＧＦ受容体リガンドを含む組成物を、膵島前駆細胞を成熟インスリン分泌細胞へ分化させるに十分な量で個体に投与することにより、それを必要とする個体において真性糖尿病を治療する方法である。このように分化した細胞は膵管の残存潜伏膵島前駆細胞となる。１つの具体例は、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドおよびＥＧＦ受容体リガンド、好ましくはＴＧＦ−αの分化再生上の量を単独または組み合わせて個体へ投与、好ましくは全身投与することを含んでなる。
【００２６】
もう１つの具体例は、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドおよび／またはＥＧＦ受容体リガンドを、哺乳類の外植した膵組織の膵島前駆細胞へ与え、このように刺激した膵組織を哺乳類へ再導入することを含んでなる。
さらに本発明は、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドおよび／またはＥＧＦ受容体リガンドを哺乳類由来の外植膵組織の膵島前駆細胞へ与えてβ細胞集団を拡張することを含んでなる。
【００２７】
もう１つの具体例では、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド刺激は、かかる前駆細胞に導入された、インスリンプロモーター−ガストリン融合遺伝子キメラ構築体の一時的発現により達成される。もう１つの具体例では、ＥＧＦ受容体リガンド刺激は、該哺乳類に導入された、ＥＧＦ受容体リガンド遺伝子の一時的発現により達成される。ＥＧＦ遺伝子の配列はＵＳＰＮ５，４３４，１３５に示されている。
もう１つの具体例では、ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドおよびＥＧＦ受容体リガンドによる刺激は、哺乳類に安定的に導入された（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子および（ｉｉ）ＥＧＦ受容体リガンド遺伝子の同時発現により達成される。
【００２８】
もう１つの具体例では、本発明は、哺乳類の膵島前駆細胞をガストリン／ＣＣＫ受容体リガンドおよびＥＧＦ受容体リガンドの組合せで刺激することにより、かかる細胞の分化を果たす方法に関する。この態様の好ましい具体例では、ガストリン刺激は哺乳類に安定的に導入されたプレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子の発現により達成される。発現はインスリンプロモーターの制御下にある。ＥＧＦ受容体リガンド、例えばＴＧＦ−α刺激は哺乳類に一時的に導入されたＥＧＦ受容体リガンドの発煙により達成される。前記の促進においては、ガストリンおよびＴＧＦ−αによる刺激は好ましくは哺乳類に導入された（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子および（ｉｉ）ＥＧＦ受容体リガンドの同時発現により達成される。
【００２９】
該遺伝子の転写を指示することができる適当なプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターの双方がある。ウイルスプロモーターとしては、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０）、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ （１９８１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １；８５４−８６４）およびアデノウイルス２由来の主要後期プロモーター（ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ （１９８２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２：１３０４−１３１９９）が挙げられる。ガストリン／ＣＣＫ受容体リガンド遺伝子およびＥＧＦ受容体リガンド遺伝子の一方または双方の発現はインスリンプロモーターの制御下にあることが好ましい。
【００３０】
本発明のもう１つの態様は形質転換構築体である。この構築体は、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列およびインスリン転写調節配列が含まれ、これは５’方向であって、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする配列の転写を助けるに有効なものである。インスリン転写調節配列は少なくともインスリンプロモーターを含んでいることが好ましい。好ましい具体例では、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列は、ヒトガストリン遺伝子のエキソン２および３を含み、所望によりイントロン１および２も含むポリヌクレオチド配列を含んでなる。
【００３１】
本発明のもう１つの具体例は、（ｉ）哺乳類ＥＧＦ受容体リガンド、例えばＴＧＦ−αをコードする核酸配列およびその転写調節配列、ならびに（ｉｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列およびその転写調節配列を含んでなる発現カセットである。ＥＧＦ受容体リガンドの転写調節配列はメタロチオネインプロモーターなどの強力な非組織特異的プロモーターであるのが好ましい。プレプロガストリンペプチド前駆体の転写調節配列はインスリンプロモーターであるのが好ましい。この具体例の好ましい形態は、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列が、ヒトガストリン遺伝子のイントロン１および２、ならびにエキソン２および３を含むポリヌクレオチド配列を含んでなるものである。
【００３２】
本発明のもう１つの態様は、プレプロガストリンペプチド前駆体コード配列を含んでなる発現カセットを含むベクターに関する。このベクターはｐＧｅｍ１などのプラスミドであってもよいし、またはインスリンプロモーターを含む転写調節配列を有するファージであってもよい。
【００３３】
本発明のもう１つの態様は、（１） 強力な非組織特異的プロモーター、例えばメタロチオネインプロモーターの制御下にある、哺乳類ＥＧＦ受容体リガンド、例えばＴＧＦ−αをコードする核酸配列、およびインスリンプロモーターの制御下にあるプレプロガストリンペプチド前駆体コード配列を含むベクター組成物に関する。各ベクターはプラスミドｐＧｅｍ１などのプラスミドであってもよいし、またはこの態様におけるファージであってもよい。
【００３４】
あるいは、該発現カセットまたはベクターはまた、適当な組織ｔｒｏｐｈｉｓｍを有するウイルスベクターに挿入できる。ウイルスベクターの例としてはアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レチノウイルスなどが挙げられる。Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５ Ｓｐｅｃ． Ｎｏ：１３９７−４０４；およびＲｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：３５−４０を参照。アデノウイルスを介する遺伝子治療は嚢胞性繊維症患者の鼻の上皮における塩化物輸送欠陥を首尾よく一時的に修復した。Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６を参照。
【００３５】
本発明のもう１つの態様は、安定的に組み込まれたプレプロガストリンをコードする遺伝子を発現させることができる非ヒト哺乳類または細胞を含めその哺乳類組織である。この態様のもう１つの具体例は、非ヒト哺乳類、哺乳類組織または細胞に安定的に組み込まれた（ｉ）プレプロペプチド前駆体遺伝子および／または（ｉｉ）ＥＧＦ受容体リガンド、例えばＴＧＦ−α遺伝子を同時発現することができる非ヒト哺乳類である。該哺乳類組織または細胞はヒト組織または細胞であり得る。
【００３６】
療法上の投与および組成物
投与モードは下記のものを包含するが、これらに限定されない：経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、および経口の経路。組成物は、任意の好都合な経路により、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜、およびその他）を通る吸収により投与することができ、そして他の生物学的に活性な成分と一緒に投与することができる。
【００３７】
本発明は、また、医薬組成物を提供する。このような組成物は治療的に有効な量の療法上および薬学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体は下記のものを包含するが、これらに限定されない：生理食塩水、緩衝液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合わせ。処方物は投与モードに適合すべきである。本発明において使用する薬学上許容される担体および処方物は、下記の文献に記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州フィラデルフィア、第１７版（１９８５）、これは引用することによって本明細書の一部とされる。薬剤送出法の簡単な概観については、下記の文献を参照のこと：Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
【００３８】
本発明の医薬組成物の製造において、本発明の組成物を変性して、それらの薬物速度論および成体内分布を変更することが望ましいことがある。薬物速度論の一般的論考については、下記の文献を参照のこと：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｓｕｐｒａ、Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３７−３９。薬物速度論および成体内分布を変更する多数の方法はこの分野において知られている（例えば、Ｌａｎｇｅｒ、ｓｕｐｒａ、参照）。このような方法の例は、基質、例えば、タンパク質（例えば、リポソーム）、炭水化物、または合成ポリマーから構成された小胞中の活性成分の保護を包含する。
【００３９】
例えば、本発明の活性成分をリポソームの中に取込んで、薬物速度論および成体内分布の特性を増強することができる。リポソームを製造する種々の方法は、例えば、下記の文献に記載されているように、入手可能である：Ｓｚｏｋａｌ他（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号および米国特許第４，８３７，０２８号、これらすべては引用することによって本明細書の一部とされる。種々の他の送出系は既知であり、そして本発明の治療剤、例えば、微小粒子、マイクロカプセルおよびその他を投与するために使用することができる。
【００４０】
組成物は、必要に応じて、また、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含有することができる。組成物は、液体の溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出性処方物、または粉剤であることができる。組成物は、伝統的結合剤および担体、例えば、トリグリセリドを使用して、坐剤として処方することができる。経口処方物は、標準的担体、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、およびその他を含むことができる。
【００４１】
好ましい態様において、組成物、例えば、人間に静脈内投与のために適合する医薬組成物は日常的手順に従い処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、また、可溶化剤および注射部位の疼痛を改善するために局所麻酔剤を含むことができる。一般に、成分は別々にまたは一緒に混合して単位投与形態で、例えば、気密密閉された容器、例えば、活性成分の量を示すアンプルまたは袋中の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃厚物として供給される。組成物を注入により投与する場合、それは無菌の薬学的等級の水または生理食塩水を含有する注入びんで小出しすることができる。組成物を注射により投与する場合、成分を投与前に混合できるように、注射用の無菌の水または生理食塩水のアンプルを準備することができる。
【００４２】
本発明の治療剤は中性または塩の形態で処方することができる。薬学上許容される塩は、遊離アミノ基で形成された塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびその他から誘導された塩、および遊離カルボキシル基で形成された塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムおよび他の２価のカチオン、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、およびその他から誘導された塩を包含する。
【００４３】
特定の障害または症状の治療において有効である本発明の治療剤の量は、障害または症状の特質に依存し、そして標準的臨床的技術により決定することができる。処方物において使用すべき正確な投与量は、また、投与経路、および疾患または障害の程度に依存し、実施者の判断および各患者の環境に従い決定されるべきである。しかしながら、静脈内投与に適当な投与量の範囲は、一般に約２０〜５００μｇの活性化合物／ｋｇ体重である。鼻内投与に適当な投与量の範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重である。有効投与量はｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系から誘導された投与量−応答曲線から外挿することができる。坐剤は一般に活性成分を０．５〜１０重量％の範囲で含有する；経口処方物は好ましくは１０〜９５％の活性成分を含有する。
【００４４】
本発明の遺伝子療法において、療法上の転写または発現ベクターを哺乳動物の宿主に、脂質担体、特にカチオン性脂質担体に対して複合化された、またはウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルスの中に導入された、裸ＤＮＡとして、導入することによって、ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションは得られる。哺乳動物の宿主の中への導入は、いくつかの経路、例えば、静脈内または腹腔内注射、気管内、胞膜内、非経口、動脈内、鼻内、筋肉内、局所的、経皮、粘膜表面への適用、角膜点滴注入、およびその他によることができる。療法上の発現ベクターを循環体液または体の開口部または腔の中に導入することは、特に重要である。
【００４５】
こうして、ベクターはこのような投与経路後広く散在されうるので、静脈内投与および胞膜内投与は特に重要であり、そして体の開口部または腔の中への導入にエーロゾル投与が使用される。投与経路および投与部位に依存して、特定の細胞および組織をターゲットすることができる。例えば、任意の特定のターゲッティングの非存在において、血流方向における注射部位に最も近い組織をトランスフェクトすることができる。脂質担体を使用する場合、部位特異的化合物を使用して、複合体を特定の型の細胞ので向けるように、脂質担体を変性することができる。こうして、特定の表面タンパク質に関連するターゲット細胞とともに、特定のレセプターまたは他の細胞表面のタンパク質に対する抗体またはリガンドを使用することができる。
【００４６】
ＤＮＡ、組換えウイルスベクターまたは脂質担体を投与するために、医薬組成物について前述したように、投与経路に依存して、任意の生理学上許容される媒質、例えば、脱イオン水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、水中の５％デキストロース、およびその他を使用することができる。他の成分、例えば、緩衝剤、安定剤、生物致死剤、およびその他を添加することができる。これらの成分は文献において広範に例示されており、特にここで記載する必要はないであろう。複合体を凝集させる希釈剤または希釈剤の成分、例えば、強い塩、キレート化剤、およびその他を回避すべきである。
【００４７】
使用する療法上のベクターの量は、ターゲット組織において療法的レベルの発現を提供するために十分な量であろう。療法的レベルの発現は、正常レベルに向かう血糖を減少させるために十分な量である。さらに、使用する核酸の投与量は影響を受けた組織中のｉｎ ｖｉｖｏのトランスジーンの所望の発現レベルを産生するために十分な量である。他のＤＮＡ配列、例えば、アデノウイルスＶＡ遺伝子を投与媒質に添加し、問題の遺伝子と共トランスフェクトすることができる。アデノウイルスＶＡ遺伝子をコードする遺伝子の存在は、発現カセットを望む場合、これから転写されたｍＲＮＡの翻訳を有意に増強することができる。
【００４８】
多数の因子はトランスフェクトされた組織中の発現量に影響を与えので、特定の目的に適合するように発現レベルを変更するために、これらの因子を使用することができる。高い発現レベルを望む場合、すべての因子を最適化することができ、低い発現レベルを望む場合、所望の発現レベルが達成されるように、１またはそれ以上のパラメーターを変更することができる。例えば、高い発現が療法的ウィンドウを超える場合、最適より低い条件を使用することができる。
【００４９】
組換え遺伝子のレベルおよび組織の発現レベルを、前述したように、ｍＲＮＡレベルにおいて、および／またはポリペプチドまたはタンパク質のレベルにおいて決定することができる。遺伝子産物の組織における生物学的活性を測定することによって、遺伝子産物を定量することができる。例えば、前述したイムノアッセイにより、生物学的アッセイ、例えば、血糖のアッセイにより、または免疫染色技術によるトランスフェクトされた細胞中の遺伝子産物の同定、例えば、発現カセットの中に存在する遺伝子産物またはリポーター遺伝子産物を特異的に認識する抗体を使用するプロービングにより、タンパク質の活性を測定することができる。
【００５０】
典型的には、療法的カセットは患者のゲノムの中に組込まれない。必要に応じて、達成された結果に依存して、治療を特別に反復することができる。治療を反復する場合、悪い免疫または治療に対する他の応答が存在しないこと保証するために、患者をモニターすることができる。
【００５１】
本発明は、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける膵臓β−細胞の集団を拡張する方法を提供する。適当なドナーから膵臓を単離し、細胞を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる。使用する細胞は哺乳動物のドナー、例えば、ヒトの死体、ブタ胎児または他の適当な膵臓細胞源からの試料から得る。ヒト細胞を使用する場合、可能ならば細胞は受容体に対して主として組織適合性である。単離された膵臓の酵素的（例えば、コラゲナーゼ）消化により、細胞を精製することができる。精製された細胞を培地中で増殖させる。
【００５２】
この培地は細胞の生き残りを可能とするために十分な栄養素を含有し、かつインスリン分泌膵臓β−細胞の形成を可能とするために十分な量において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドを含有するβ−細胞増殖誘導組成物を含有する。本発明によれば、刺激後、インスリン分泌膵臓β−細胞を培養により直接的に拡張した後、それを必要とする患者に移植するか、あるいはβ−細胞誘導組成物で治療した後、直接的に移植することができる。
【００５３】
移植法は、得られたインスリン分泌膵臓β−細胞を、免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリンと組み合わせて、それを必要とする患者に移植することを含む。また、移植前に、インスリン産生細胞を半透過性膜の中にカプセル封入することができる。このような膜はカプセル封入された細胞からのインスリンの分泌を可能とすると同時に、免疫攻撃から細胞を保護する。移植すべき細胞の数は、１０，０００〜２０，０００のインスリン産生β−細胞／ｋｇの患者であると推定される。必要に応じて、インスリン分泌細胞の療法的に有効な数を維持するために、移植の反復が必要であることがある。また、本発明によれば、移植されたインスリン分泌β−細胞の増殖を誘導するために十分な量のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドを移植受容体に投与することができる。
【００５４】
次のようにして糖尿病の治療効果を評価することができる。可能ならば、治療の理学療法の生物学的効能ならびに臨床的効能の両方を評価する。例えば、疾患は血糖の増加によりそれ自体発現し、したがって、治療の生物学的効能は、例えば、評価された血糖が正常に向かって戻ることを観測することによって、評価することができる。臨床的効能、すなわち、根元的な効果を有する治療が疾患過程の変更において有効であるかどうか、は、測定がいっそう困難であることがある。生物学的効能の評価は臨床的効能についての変わりの終点として大いに役立つが、決定的ではない。こうして、例えば、６カ月期間後、β−細胞の再生を示すことができる、臨床的終点の測定は、治療養生法の臨床的効能を示すことができる。
【００５５】
本発明の組成物は、１またはそれ以上の手順においてに使用するためのキットとして提供することができる。遺伝子療法のキットは、通常、ミトコンドリアターゲッティング配列のペプチドを含むか、あるいは含まない裸ＤＮＡとして、組換えウイルスベクターとしてまたは脂質担体に対して複合化された、療法上のＤＮＡ構築物を含むであろう。さらに、準備されたＤＮＡと複合化するために、脂質担体は別の容器の中に入れて提供することができる。キットは濃厚物として有効な因子からなる組成物（凍結乾燥された組成物を包含する）を含み、この濃厚物は使用前にさらに希釈することができるか、あるいは使用する濃度で提供することができ、ここでバイアルは１またはそれ以上の投与量を含むことができる。
【００５６】
好都合には、キットにおいて、医師がバイアルを直接使用できるように、単一投与量を無菌バイアルの中に提供することができ、ここでバイアルは所望の量および濃度の薬剤を有するであろう。バイアルが直接的使用のための処方物を含有する場合、通常、この方法とともに使用する他の試薬を必要としないであろう。このようなキットに、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された警告を添付することができ、このような警告はヒトへの投与のための製造、使用または販売の政府機関による承認を反映する。
下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００５７】
実施例
材料および方法
特記しない限り、下記の実施例において報告される研究において、下記材料および方法を使用した。
動物  マウス、ＦＶＢおよびＣＤ系統をタコニック・ファームズ・インコーポレーテッド（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ジャーマンタウン）から入手した。ＴＧＦ−αトランスジェニック系統ＭＴ−４２を使用し、これは高いレベルのＴＧＦ−αをメタロチオネインプロモーターから発現し、Ｊｈａｐｐａｎ他、Ｃｅｌｌ、６１：１１３７−１１４６（１９９０）に記載されている。正常ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）およびズッカー（Ｚｕｃｋｅｒ）ラットに水へ自由にアクセスできるようにして通常の食物を任意に与え、各研究の開始前にラットを１週間順化させた。
【００５８】
糖尿病の誘導後５〜７日間新しく製造されたストレプトゾトシンを８０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で静脈内投与により投与し、ラットを引き続く処置のためにグループにランダムに割り当てた。０．１％のＢＳＡを含有する無菌の通常の生理食塩水中で、ホルモン、ＴＧＦ−αおよびラットガストリンを再構成した。異なる研究のために前もって決定したスケジュールに従い、各動物にＴＧＦ−αまたはガストリン単独（４．０μｇ／ｋｇ体重）または１：１（ｗ／ｗ）の組合わせ（合計８．０μｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを１０日間１日１回腹腔内注射した。
【００５９】
ＩＮＳＧＡＳトランスジーン構築物  ラットインスリンＩ遺伝子のヌクレオチド−３７０〜＋３８からなるＰｖｕｌＩ−ＲｓａＩフラグメント（Ｃｏｒｄｅｌｌ、Ｂ．Ｇ．他、Ｃｅｌｌ、１８：５３３−５４３（１９７９））をｐＧｅｍ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、ウイスコンシン州マディソン）の中に結合した。プレプロガストリンペプチド前駆体をコードするヒトガストリン遺伝子の１．５ｋｂのイントロン１および２およびエクソン２および３を含有する４．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離し、ｐＧｅｍ１（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のラットインスリンＩフラグメントの下流にサブクローニングした。このフラグメントは下記の文献に記載されている：Ｗｉｂｏｒｇ、Ｏ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１０６７−１０６９（１９８４）およびＩｔｏ、Ｒ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８１：４６６２−４６６６（１９８４）。インスリンプロモーター−プレプロガストリンＩＮＳＧＡＳトランスジーン構築物を４．８ｋｂのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切除した。
【００６０】
トランスジェニックマウスの世代および特性決定  前述したように作ったフラグメントを次のようにしてマイクロインジェションのために調製した。それをアガロースゲル電気泳動により単離し、ＣｓＣｌ勾配精製により精製し、注射緩衝液（５ｍＭのＮａＣｌ；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に対して広範に透析した。ＦＶＢ同系交配マウスからの受精卵母細胞（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．、ｓｕｐｒａ）を単細胞段階において標準的技術に従いマイクロインジェクトした。下記の文献を参照のこと：Ｈｏｇａｎ、Ｂ．他、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８６）。次いでＨｏｇａｎ他の手順に従い、生存する胚をＣＤ１（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州ウィルミントン）乳母の輸卵管の中に移植した。
【００６１】
個々のマウスの尾から単離したＤＮＡおよびランダムプライミングにより３２ｄＣＴＰで標識化したヒトガストリンのエクソン２プローブを使用してＤＮＡブロット技術により、トランスジェニックファウンダー（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスを同定した。Ｆ１マウスおよびそれらの子孫を同様に同定した。
ＣＤ−１マウス系統（Ｊｈａｐｐａｎ、ｓｕｐｒａ）に由来するＭＴ−ＴＧＦ−αトランスジーンを含有するホモ接合ＭＴ−４２マウスを、ヘテロ接合ＩＮＳＧＡＳマウスと交雑させた。離乳後、メタロチオネインプロモーターを誘導するために前述したように酸性化５０ｍＭのＺｎＣｌ２上に子孫を配置した（Ｊｈａｐｐａｎ、ｓｕｐｒａ）。
【００６２】
ノザンブロットハイブリダイゼーションアッセイ  ノザンアッセイのために、Ｃａｔｈａｌａ他、ＤＮＡ ２：３２９−３３５（１９８３）の方法により、全体のＲＮＡを組織から抽出した。２０μｇの全体のＲＮＡの試料を１％のアガロース変性ゲル上で分割し、ニトロセルロースに移した。内因的マウスガストリンｍＲＮＡと交差ハイブリダイゼーションしなかったヒトガストリンの３２Ｐ標識化ＴＧＦ−αリボプローブと、ＲＮＡブロットはハイブリダイゼーションした。
【００６３】
ガストリンのペプチドラジオイムノアッセイ  組織を抽出し、下記の文献に記載されているように、ガストリンラジオイムノアッセイにおいて生物学的に活性なＣ末端がアミド化されたガストリンに対して特異的である抗２６０４を使用して、前述したように、ラジオイムノアッセイによりガストリン免疫学的に反応性についてアッセイした：Ｒｅｈｆｅｌｄ、Ｊ．Ｆ．、Ｓｃａｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．３０：３６１−３６８（１９７２）。チロシンモノヨード化ヒトガストリン１７トレーサーをすべてのアッセイにおいて使用し、そして合成ヒトガストリン１７を標準として使用した。
【００６４】
ＴＧＦ−αのペプチドラジオイムノアッセイ  下記の文献に記載されているように、組織を液体窒素中で凍結させ、乳鉢および乳棒で粉末に粉砕し、酸−エタノール抽出した：Ｔｏｄａｒｏ、Ｇ．Ｊ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７７：５２５８−５２６２（１９８０）。抽出物を水で再構成し、クーマッシーブルー色素結合アッセイによりタンパク質濃度を測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュレス）。膵臓からのアリコートをＴＧＦ−αラジオイムノアッセイにおいて二重反復実験し、これによりラットＴＧＦ−αのＣ末端に対して発生させた固相ウサギ抗体に対する結合について１２５ＩＴＧＦ−αとの競合を測定した（Ｂｉｏ Ｔｏｐｅ、ワシントン州シアトル、からのキット）。
【００６５】
血糖  一夜の断食後またはＩＰＧＴＴ後に、グルコースオキシダーゼ法により血糖を測定した。
組織インスリン分析  各研究の終わりにおいて、動物を殺し、膵臓を取出した。免疫組織化学、タンパク質、およびインスリンの測定のために、膵臓全体を通して別々の代表的な部位から、小さいバイオプシーを取り、直ちに液体窒素中でスナップ凍結させた。スナップ凍結させた膵臓試料（ｎ＝５）を急速融解し、脱イオン水中で超音波処理により崩壊させ、アリコートをタンパク質測定のために取り、ホモジネートを酸／エタノール抽出しした後、ＲＩＡによりインスリンを測定した。
【００６６】
組織学的分析  膵臓を取出し、秤量し、同様にカセット中で配向させ、ブアン溶液中で固定し、慣用手順によりパラフィンの中に埋め込んだ。
組織の調製および免疫組織化学  新しく切除した膵臓を解剖し、脂肪およびリンパ節を除去し、ブアン固定液中で固定し、次いで切断のためのパラフィンの中に埋め込んだ。日常的切片を標準的方法に従いヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。成体の１７週齢のＭＴ−ＴＧＦ−α（ＭＴ−４２）トランスジェニックマウスからの膵臓組織をインスリンについて免疫染色して、小島発育に対するＴＧＦ−αの過剰発現の作用を検査した。
【００６７】
免疫ペルオキシダーゼ染色モルモット抗ヒトインスリン血清（Ｌｉｎｃｏ、ミゾリー州フレカ）を使用して、ＴＧＦ−α誘導メタプラスチック（ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ）小管におけるインスリン陽性細胞を同定した；前免疫モルモット血清を対照として使用した。モノクローナルウサギ抗ガストリン抗体を使用するＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒのペルオキシダーゼ／抗ペルオキシダーゼ法により、５μパラフィン切片について免疫組織化学を実施した。下記の文献を参照のこと：Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、Ｌ．Ａ．、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（１９７９）ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ、１０４−１７０。
【００６８】
点計数形態測定  下記の文献に記載されている点計数法を使用して、小島、管、または腸の細胞の相対体積を定量した：Ｗｅｉｂｅｌ、Ｅ．Ｒ．、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１２：１３１−１５５（１９６３）。４００×の倍率で、切片の１つの角におけるランダムな点において開始して、２５点の眼の格子を使用してすべての他の場にスコアを付けた。段階的マイロメーターのマーキングを使用して、場のバイアスされていないが、系統的選択を達成した。血管、脂肪、管、リンパ節、または葉間の空間にわたる切片（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｓ）を減じて総膵臓面積を得た。
【００６９】
１０８の場における最小５０００の点（段階的マイロメーターを使用して系統的に選択した）を各ブロックにおいて計数し、相対的小島体積は小島組織にわたる切片の数／膵臓組織にわたる数である。絶対小島質量または小島を相対的小島体積×膵臓重量として計算した。下記の文献を参照のこと：Ｌｅｅ、Ｈ．Ｃ．他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２４：１５７１−１５７５（１９８９）。
統計学的解析  不対データのスチューデントのｔ検定を使用して、平均の間の差を有意差について比較した。
【００７０】
実施例１．ＴＧＦトランスジェニック膵臓におけるインスリン産生についてのアッセイ
免疫ペルオキシダーゼ染色において、ＴＧＦ−αトランスジェニック膵臓からのメタプラスチック管において多数のインスリン染色細胞が示された（第１Ａ図）、インスリン染色細胞は非トランスジェニック管から事実上存在しなかった（６．１％より低い）。少なくとも６００の小管細胞／動物を最終４００×の倍率でスコアを付けたとき、インスリン陽性細胞はＴＧＦ−αトランスジェニックマウスのメタプラスチック小管において６．０＋／−０．９％（ｎ＝５）の頻度で見られた。
【００７１】
時々小管細胞は隣接小島と同一強度のインスリン染色で染色されたが、大部分は低い染色であった（第１Ｂ図）。小管細胞のインスリン染色の低いレベルは、発育する膵臓の管において報告されたプロト分化（ｐｒｏｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）細胞のそれに類似する。Ｐｉｃｔｅｔ、Ｒ．およびＷ．Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ、ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｏ．ＧｒｅｅｐおよびＥ．Ｂ．Ａｓｔｗｏｏｄ編（１９７２）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ；ワシントンＤ．Ｃ．２５−６６：およびＡｌｐｅｒｔ、Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、５３：２９５−３０８（１９８８）。
【００７２】
しかしながら、メタプラスチック管におけるインスリン陽性細胞の数の増加にかかわらず、ＴＧＦ−αトランスジェニックマウスの小島質量は増加しなかった。点計数形態測定により定量された小島質量は、ＴＧＦ−αトランスジェニック膵臓において２．１４ｍｇ＋／−０．８４（ｎ＝５）であり、これに対して非トランスジェニック同腹子の質量は１．９３ｍｇ＋／−０．４６（ｎ＝５）であった。
【００７３】
こうして、ＴＧＦ−αの過剰発現単独はこれらのプロト分化管細胞の完全に分化した小島への移行を行わなかった。これが意味するように、小島の分化はＴＧＦ−αトランスジェニックマウスの成体膵臓に存在しない他の因子を必要とする。プロト分化小島前駆体の分化は後期の胎児発育の間に起こるので、この移行を調節する因子はこの期間の間に小島において発現されるようである。発育する小島において発現された因子の中には、胃腸管のペプチド、すなわち、ガストリンが存在する。
【００７４】
実施例２．ＩＮＳＧＡＳトランス遺伝子からの膵臓ガストリンの発現
島分化の制御に於けるガストリンの可能な役割を検討するために、インシュリンプロモーターがガストリントランス遺伝子の膵臓特異的発現を誘導するキメラインシュリンプロモーター−ガスとリン（ＩＮＳＧＡＳ）トランス遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製した（図２Ａ）。ガストリン遺伝子とは異なり、インシュリン遺伝子の発現はｂの後も切れない。即ち、ＩＮＳＧＡＳトランス遺伝子は成体の膵臓中に持続的なガストリン発現を起こす。
【００７５】
ＩＮＳＧＡＳトランス遺伝子は５’フランキングＤＮＡ及びラットインシュリンＩ遺伝子の最初の非コーディングエクソンの３７０ｂｐを含む。Ｃｏｒｄｅｌｌ ，Ｂ．， ら、Ｃｅｌｌ １８；５３３−５４３（１９７９）。これはプロガストリンペプチド前駆体をコードするヒトガストリン遺伝子のイントロン１及びエクソン２と３の１．５ｋｂを含むをＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１断片に連結されている。Ｗｉｂｏｒｇ， Ｏ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：１０６７−１０６９（１９８４）；及びＩｔｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：４６６２−４６６６（１９８４）。４．８ｋｂのＩＮＳＧＡＳ断片が分離され、近交系ＦＶＢの１細胞マウス胚の中にマイクロインジェクションされた。Ｈｏｇａｎ， Ｂ．ら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ； Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， （１９８６）ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．
【００７６】
トランスジェニック及び非トランスジェニックマウスの膵臓及び胃抽出物中のガストリン免疫反応性を，ガストリンの生体活性アミド化Ｃ末端に特異的である抗血清２６０４（Ｒｅｈｆｅｌｄ， Ｊ．，ら、Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ３０：３６１−３６８（１９７２））を用いた放射性免疫アッセイによりアッセイした。
ＩＮＳＧＡＳトランス遺伝子からのベータ細胞特異的なガストリン発現が、ガストリンモノクローナル抗体による膵臓組織の免疫染色に基づき観察された。
【００７７】
８週齢のＩＮＳＧＡＳトランスジェニックマウスの各種組織から分離されたＲＮＡのノーザンブロットをヒトガストリンエクソン２のプローブとハイブリダイズした。膵臓では高いレベルのガストリントランス遺伝子ｍＲＮＡが認められたが、その他の組織では認められなかった。このプローブはヒトガストリン遺伝子に特異的である；ＩＮＳＧＡＳの洞部ＲＮＡではハイブリダイゼーションは観察され、又非トランスジェニックＦＶＢマウスは高いレベルのマウスガストリンｍＲＮＡを発現した。ＩＮＳＧＡＳトランスジェニックマウスからの得た膵臓抽出物の放射免疫アッセイは、内因性のマウス遺伝子から発現された胃腔内のガストリン含有量を超える高いレベルのガストリン免疫活性を示した（図２Ｂ）。
【００７８】
非トランスジェニックのコントロールマウス抽出物についてはガスとリン性の免疫活性は検出されなかった（図２Ｂ）。ガストリン放射免疫アッセイはカルボキシルアミド化前駆体に特異的であることから、ガストリンペプチド前駆体は転写後効率的に生体活性型ペプチドに処理されることが示された。ガスとリンモノクローナル抗体による免疫組織学は、膵臓β島細胞特異的なガストリンの発現を示す。
【００７９】
ＩＮＳＧＡＳトランスジェニックマウスは出産後膵臓において高いガストリン発現を示すが（図２Ｂ）、ＩＮＳＧＡＳトランスジェニックマウスはコントロールと同じ膵臓組織を有していた。点計測形態計測法（Ｗｅｉｂｅｌ， Ｅ．Ｒ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． １２：１３１−１５５（１９６３））により定量化した島容積は、５−６週齢のＩＮＳＧＡＳマウス（１．７８±０．２１ｍｇ、ｎ＝１１）及び年齢を合わせた非トランスジェニックコントロール（１．７４±０．１８ｍｇ、ｎ＝１１）に同じであった。即ち、出産後膵臓中のガストリンの持続発現のみでは島細胞の成長を促進しない。
【００８０】
実施例３．ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−α／ＩＮＳＧＡＳ膵臓の組織学的検査
ガスとリンによる島成長の促進は、細胞集団の反応性を創造する別の成長因子による刺激を必要とするだろう。従ってガストリン刺激の効果を、原分化島前駆体に似たインシュリン発現細胞を含む化生性管を持つＴＧＦ−αトランスジェニックマウスについて研究した。ガストリンとＴＧＦ−α間の相互作用を調べるために、３グループのマウスを遺伝的背景が等しいＦＶＢ／ＣＤ１系統：非トランスジェニックコントロール、ＴＧＦ−α単独トランスジェニック、及びＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−α二重トランスジェニックと交配した。
【００８１】
いずれの３マウスグループも３週齢時に５０ｍＭ ＺｎＣｌ２上に置いた。１７週齢時に動物を屠殺し、膵臓を取り出し組織検査にかけた。ＴＧＦ−α及びＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−αマウスの膵臓は似た大きさの形態学的外観を示した；柔らかく広がったコントロールの膵臓に対し、弾性のある固く、コンパクトなものであった。ノーザンブロット分析（データ未提示）及び放射免疫アッセイで測定したところ、ＴＧＦ−αの発現は、ＴＧＦ−α及びＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−αグループで等しかった。膵臓のＴＧＦ−α免疫反応性ペプチドのレベルは、ＴＧＦ−α及びＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−αマウスそれぞれについて１２．２±１及び１８．９±８ｎｇ／ｍｇタンパク質（平均±ＳＤ）であった。
【００８２】
これら試験した３グループ（Ａ： ＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−α；Ｂ：ＦＶＢ／ＣＤ１コントロール；及びＣ：ＴＧＦ−α）のマウスの膵臓のヘマトキシリン染色パラフィン切片の光学顕微鏡像を作製した。ＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−α膵臓は、小管複合体増加域と間質細胞充実性の僅かな増加域を有した；示した像（図３Ａ）には５匹の動物の中に見られた最も重症な異常形態が見られる；大部分の膵臓はコントロールと区別できなかった（図３Ｂ）。これに対し、ＴＧＦ−α膵臓像は典型例であり、上記Ｊｈａｐｐａｎら、が記した病勢盛んな管状異形成を伴う間質細胞充実性と繊維化を示した。
【００８３】
膵臓ガスとリンはＴＧＦ−αと相乗的に相互作用し、島質量を増加し、ＴＧＦ−α過剰発現により誘導された管性異形成を阻害する。ホモ接合体ＭＴ−ＴＧＦ−α（ＭＴ−４２）マウス（ＴＧＦ−α）をヘテロ接合体ＩＮＳＧＡＳマウスと交配させ、ヘテロ接合性ＴＧＦ−α単独トランスジェニック体と、ＩＮＳＧＡＳとＴＧＦ−αトランス遺伝子の両方を持つ二重トランスジェニック体（ＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−α）を得た。ＩＮＳＧＡＳはＦＶＢ系統であり、ＴＧＦ−αはＣＤ１系統であることから、ＴＧＦ−αホモ接合体とＣＤ１コントロール（ＣＯＮ）を共にＦＶＢと交配させ、３マウスグループに関するバックグランドとなるＦＶＢ／ＣＤ１系統を作製した。マウスを３週齢から５０ｍＭのＺｎＣｌ２で処理し、１７週齢までに屠殺した。
【００８４】
膵臓を取り出し、重量を測定し、カセットの中に同方向に配置、Ｂｏｕｉｎ’ｓ液で固定し、パラフィンに包埋した。各動物から無作為に１μ切片を選び利用し、点測定形態測量法を用いて管部及び島部の相対容積を定量かした（Ｗｅｉｂｅｌ， Ｅ．Ｒ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．， １２：１３１−１５５（１９６３））。１７０倍の倍率で、５０ポイントグリッドの交点として組織全体で少なくとも２０００点を測定した：全切片は重複しないようにカバーされた。管部又は島部のしつりょうは、相対容積に動物の膵臓重量をかけて計算した。体重の違いを正規化するために、質量はμｇ／ｇ体重で表した。結果はスチューデントのｔ試験（ｐ＜０．０５）により決定した、各グループ当たり５−６匹の動物の平均値と標準誤差である。
【００８５】
ＩＮＳＧＡＳトランス遺伝子からのガストリンの発現は、ＴＧＦ−αの過剰発現による管異形成を軽減した。１７週時では、ＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−αマウスの膵臓組織（図３Ａ）は、ＴＧＦ−αマウス（図３Ｃ）よりもコントロールの膵臓（図３Ｂ）により似ていた。
これはＴＧＦ−α及びＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−αトランスジェニックマウス及びＦＶＢ／ＣＤ１コントロールに於ける膵臓管部質量を、点測定形態測量法により定量し、確認された（図４Ａ）。ＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−α膵臓に於けるガストリンとＴＧＦ−αの共発現もコントロールに比べる島質量を有意に増加した（図４Ｂ）が、ＴＧＦ−α又はガスとリントランス遺伝子単独の発現では島質量は増加しなかった。血液グルコース濃度について３マウスグループ間に有意な差は無かった。
【００８６】
実施例４．正常ラットに於ける膵臓インシュリン含有量に及ぼすＴＧＦ−α及びガスとリンの効果
本実験はＴＧＦ−α、ガストリン又はＴＧＦ−αとガストリンの組合せが非糖尿病動物に於ける膵臓インシュリン含有量に及ぼす作用を、コントロール動物（未処理）と比較研究するために計画された。正常ウイスターラットグループ（ｎ＝５）を以下の４処理グループの何れかに割り付けた。
【００８７】
グループＩ：ＴＧＦ−α：組換え体ヒトＴＧＦ−αを０．１％ＢＳＡを含む滅菌生理食塩水で調製し、０．８μｇ／日の用量で１０日間皮下投与した。
グループＩＩ：ガストリン：合成ラットガストリンＩを極めて薄い水酸化アンモニア液に溶解し、０．１％ＢＳＡを含む滅菌生理食塩水で調製した。これを０．８μｇ／日の用量で１０日間皮下投与した。
グループＩＩＩ：ＴＧＦ−α＋ガストリン：上記調剤の組合せを上記投与レベルにて１０日間皮下投与した。
グループＩＶ：賦形剤のみを１０日間皮下注射したコントロール動物。
【００８８】
試験期間（１０日間）終了時、全ての動物を屠殺し、膵臓サンプルを以下の様にして取り出した：各ラット膵臓の離れた場所から膵臓組織の生検検体（１−２ｍｇ）を５検体採取し、インシュリン含有量分析の為にすぐに液体窒素内で凍結した。膵臓インシュリン含有量の分析に際しては、凍結膵臓サンプルを速やかに解凍し、蒸留水中に超音波処理して破壊し、タンパク質測定の為にその一部を取り出し、インシュリン放射免疫アッセイ前に酸／エタノール抽出した（Ｇｒｅｅｎら、（１９８３）Ｄｉａｂｅｔｅ ３２：６８５−６９０）。膵臓インシュリン含有量は蛋白含有量で補正され、最終的にはμｇインシュリン／ｍｇ膵臓タンパク質として表された。全ての値は平均値±ＳＥＭとして計算され、統計有意差はスチューデント２サンプルｔ−試験により検証された。
【００８９】
表１
2004506591.tif 000001
【００９０】
上記表１に示すように、膵臓インシュリン含有量はコントロール動物に比べるとＴＧＦ−α＋ガストリン処理動物で有意に増加していた（Ｐ＝０．００７）；コントロール動物に比べると、膵臓インシュリン含有量は約３倍に増加していた。これらのデータは、ＴＦＧ−αとガスとリンの組合せが機能的島β細胞の容積を増加させるという仮説を支持するものである。この増加は、β細胞の肥大化（個々のβ細胞の大きさの増加）というよりも、β細胞の過形成（数の増加）にある全体状態を反映している。
【００９１】
実施例５．糖尿病動物における膵臓インシュリン濃度に及ぼすＴＧＦ−（およびガストリンの組合せの影響
糖尿病動物におけるインシュリン濃度
ＴＧＦ−（およびガストリンの組合せが、糖尿病動物（ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置）の膵臓インシュリン濃度を通常（非ＳＴＺ処置）動物の濃度に相当するレベルまで減少できるかどうかを決定するために、第２の実験を計画した。
【００９２】
通常のウィスターラットに、ＳＴＺを体重１Ｋｇあたり８０ｍｇの用量で単回静脈注射した。ＳＴＺのこの用量は、実験動物が糖尿病になるが、機能を保つ一方でβ細胞量が減少するように決めた。ＳＴＺを、氷冷した１０Ｍｍクエン酸緩衝液に投与の直前に溶解した。動物は毎日観察したが、持続的な糖尿病が糖尿により示され、非絶食時血中グルコース測定により確認された。糖尿病の誘起の１週間後に、ラットを以下のとおり２群（ｎ＝６）に無作為に割り付けた。
【００９３】
第１群：ＴＧＦ−（＋ガストリン：ＳＴＺ糖尿病ラットを、組換え型ヒトＴＧＦ−（および合成ラットガストリン１の組合せの単回腹膜注射により処置した。両製剤とも、０．８μｇ／日の用量で１０日間投与した。
第２群：対照：ＳＴＺ糖尿病ラットに、溶媒のみの腹膜注射を１０日間行った。
実験期間の終わりに、全動物を屠殺し、実施例４と同様に膵臓のサンプルをとって分析し、その結果を表２に示す。
【００９４】
表２
2004506591.tif 000002
ＳＴＺによる糖尿病の誘起は成功し、重度ではないが持続した過血糖症を引き起こした。実験動物が機能を有するがβ細胞量は減少したことを確実にするため全ｉｎｓｕｌｉｎｏｐａｅｎｉａを求めた。
【００９５】
上記の表２に示されるとおり、対照ストレプトゾトシン処置ラットの膵臓インシュリン濃度は、ＳＴＺによるβ細胞の破壊の結果、通常のラット（２０．６±６．０ｍｇインシュリン／ｍｇタンパク、上記表１参照）の３分の１未満であった。ＴＧＦ−（およびガストリンの組合せで処置したＳＴＺ動物では、膵臓インシュリン濃度はＳＴＺのみを投与された動物の４倍を超え、統計的に通常ラットと同じであった。
【００９６】
糖尿病は、背後にある生理学的な欠陥が、自己免疫系によるβ細胞の破壊または高いグルコース循環濃度から生じる慢性的な刺激によるβ細胞が分裂する能力の消耗の結果としてのβ細胞の不足である病気である。後者は、最後には、β細胞の再生および／または置換プロセスが、全体的なβ細胞の減少およびそれに伴う膵臓のインシュリン濃度の低下が見られる程度にまで損なわれる状況になる。上記の結果は、ＴＧＦ−（およびガストリンの組合せが、成熟β細胞の生産を刺激して膵臓インシュリン濃度を非糖尿病レベルに戻すことにより、糖尿病の治療に利用できることを示している。
【００９７】
実施例６．ＳＴＺ誘起糖尿病動物中のＩＰＧＴＴに及ぼすＴＧＦ−（およびガストリンの影響
２群（平均体重１０３ｇ）のＳＴＺ誘起糖尿病ウィスターラット（ｎ＝６／群）を、ＴＧＦ−（およびガストリンの組合せまたはＰＢＳのいずれかの毎日の腹膜注射により１０日間処置した。０，６，１０日に全ラットについて絶食時血中グルコースを測定した。このインシュリンが分泌され機能性であることを立証するため、ＩＰＧＴＴ試験を実施した。１０日に、終夜の絶食の後、腹膜内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。
【００９８】
体重１Ｋｇあたり２ｇの用量での腹膜内グルコース注射の投与の前および３０，６０および１２０分後に、血液サンプルを尾の静脈から採取した。血中グルコース測定は上記のとおり行った。血中グルコース濃度は、時間０では両実験群で似ていたが、ＴＧＦ−（およびガストリン処置ラットでは、腹膜内グルコース投与の後３０，６０および１２０分後で、対照ラットに比較し、血中グルコース値は５０％の減少を示した（図５参照）。
【００９９】
実施例７．糖尿病になりやすい動物における体重増加およびインシュリン濃度に及ぼすＴＧＦ−（およびガストリンの影響
ツッカーラットを生後３０日、肥満の発生１０〜１５日前に入手した。糖尿病になりやすいツッカーラット（遺伝子型ｆａ／ｆａ、肥満および糖尿病の常染色体劣性突然変異）の他に、細身の非糖尿病同腹子（遺伝子型＋／＋）を以下のとおり実験に含めた。体重および血中グルコースを測定することにより肥満および糖尿病の発生がないか、ラットを毎日観察した。ツッカーラットの糖尿病の発症は通常４５〜５０日であり、同齢の細身の対照のレベルと比較して血中グルコース濃度の著しい上昇により確認した。
【０１００】
実験は、表３に示すとおりそれぞれ５匹のラット５群により行った。第１群および第２群（細身で非糖尿病）は、ＴＧＦ−（およびガストリンの組合せまたはＰＢＳのいずれかで０日から１０日までそれぞれ処置され、第３群、第４群および第５群は、肥満で初期糖尿病ツッカーラット、遺伝子型ｆａ／ｆａを用いた。第３群には、糖尿病の発症前に１５日間（−１５日から０日）および糖尿病発症後引き続きさらに１０日間（０日から１０日）組合せ前処置を与えた。第４群は、糖尿病発症後１０日間ＴＧＦ−（およびガストリンの組合せにより処置し、第５群は同じ期間ＰＢＳで処置した。実験の終わりに、ラットを屠殺し膵臓を取り出した。小さな生検材料を、上記のとおり別々な代表的な部位から採取し、タンパクおよびインシュリン測定に供した。
【０１０１】
前処置、処置のみまたは食塩水を与えた（表３の第３，４，５群の）肥満の糖尿病ツッカーラットの体重増加は、群の間で有意な差を示さなかった。ＴＧＦ−（およびガストリンで長期の処置（２５日、第３群）を行っても、通常の体重増加に対する影響がなかったことは興味深い。誤差限界内で、体重増加は全ての群で同じであった。
【０１０２】
肥満ツッカーラットにおける絶食時血中グルコースに及ぼす、ＴＧＦ−（およびガストリン処置の影響を、相当するＰＢＳ対照と比較した。絶食時血中グルコースは、最初に１５日までに著しく上昇し（４．０±０．６対５．０±０．２）、この時期がＰＢＳ対照またはＴＧＦ−（およびガストリンによる１０日間処置期間の開始時間として選ばれた。絶食時血中グルコースレベルは、ＴＧＦ−（およびガストリン処置またはＰＢＳ処置により有意に変化していなかった。絶食時血中グルコース値は、発育因子またはＰＢＳによる処置にかかわらず、肥満のラットと比較して細身のラットの方が低かった。
【０１０３】
【表１】
2004506591.tif 000003
２型糖尿病ツッカーラットモデルにおけるＴＧＦ−（およびガストリン処置の結果は、おそらく長時間（１８時間）の絶食のあとの一時的な低血糖効果を反映して、処置と対照群の血中グルコースレベルの間に有意な差を示さなかった。免疫組織化学的な実験は、対照動物に比べて、ＴＧＦ−（およびガストリンで処置された動物中でインシュリン含有細胞の単一病巣の数が著しく減少することを明らかにした。これらの知見は、ＴＧＦ−（およびガストリン処置の後の成体ラット膵臓の単β細胞の増加を示している。興味深いことに、そのような単β細胞病巣は、（刺激を受けていない）成体ラット膵臓には通常見られない。治療はβ細胞の新生および複製を目標としているので、これらの知見は１型および２型糖尿病におけるＴＧＦ−（およびガストリンの治療上の役割を支持する。
【０１０４】
本発明は、部分的に、ＴＧＦ−（誘起化生小管中に多くのインシュリン染色細胞を示した研究に基づいている。化生管細胞における低レベルの外分泌および内分泌遺伝子発現は、胎児の膵臓発生の初期に見られる初期分化管細胞のそれに類似していた。小島の形成（新生）は、これらの初期分化されたインシュリン発現細胞の増殖と分化による。組織学的には、膵管から発芽するように出現する小島（島細胞症）として、これは明らかである。ＭＴ−４２ＴＧＦ−αトランスジェニックマウスでは、小管化生は出生直後には見られず生後４週で見られる。
【０１０５】
これは、ＴＧＦ−（過発現が、胎児の膵管に見られる小島前駆体の残留を長引かせるよりも管上皮でインシュリン発現を誘起したことを表している。化生小管はインシュリン陽性細胞を数多く含んでいるが、ＴＧＦ−（トランスジェニックマウスの小島質量は、対照に比べて増えていなかった。上記で報告した研究は、完全な小島細胞新生が、ガストリンなどのガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよび／またはＴＧＦ−（などのＥＧＦレセプターリガンドの刺激により、成体膵臓の小管上皮において哺乳類でｉｎ ｖｉｖｏに再活性化されることを示している。
【０１０６】
膵臓内のＴＧＦ−（およびガストリンのトランスジェニックな過発現に関する研究が報告されているが、それらは小島発生における膵臓ガストリン発現の役割を解明し、ＴＧＦ−（およびガストリンがそれぞれ小島発生を制御する役割を果たしていることを示している。したがって、残された多能性膵管細胞の成熟したインシュリン分泌細胞への再生分化は、膵臓中でそれらのｉｎ ｓｉｔｕ発現を提供する因子または組成物のこの組合せの治療上の投与による糖尿病治療の重要な方法である。
本発明は、本明細書に記載した特定の実施態様により限定されない。上記の記載および添付する図より明らかになる変更は、特許請求範囲の範囲内にある。
様々な出版物が本明細書に引用されたが、その開示は参照により全部組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、イムノペルオキシダーゼ染色に基づいて、 ＴＧＦ−αトランスジェニック膵臓からの化生管における細胞を染色する多くのインスリンを示す像である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、ほとんどの小管細胞はインスリンに対して低い強度で染色されるが、ところが時々、小管は、隣接するランゲルハンス島と同じ強度のインスリン染色で染色されたことを示す像である。
【図２Ａ】
図２Ａは、キメラインスリンプロモーター−ガステリン（ＩＮＳＧＡＳ）トランスジーンの構造を図的に示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、ＩＮＳＧＡＳトランスジェニックからの膵臓抽出物のラジオイムノアッセイが、内因性ネズミ遺伝子から発現された噴門端におけるガストリン含有率を超える高いレベルのガストリン免疫反応性を示すことを例示する。ＩＮＳＧＡＳトランスジェニックマウスは、生後膵臓におけるガストリンの高い発現を有した。
【図３Ａ】
図３Ａは、例３により報告される研究に使用されるＩＮＳＧＡＳ／ＩＧＦ−αマスクの膵臓組織学の像である。ＩＮＳＧＡＳ／ＩＧＦ−α膵臓は、高められた小管複合体のわずかに高められた介在細胞性のいくつかの領域を有した。そこに示される部分は、使用される５匹の動物において最も強い異常組織学を有した。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、例３からの対照マウスの膵臓組織学の像である。
【図３Ｃ】
図３Ｃは、例３からの ＴＧＦ−αマウスの膵臓組織学の像である。例３に報告される研究からの ＴＧＦ−αマウス膵臓のこの部分は典型的であり、そしてＪｈａｐｐａｎ，など．前記により記載される病勢盛んな小管化生と組み合わされた介在細胞性及び線維増多を示した。
【図４Ａ】
図４Ａは、例３に報告される研究に基づいて、１７週で、ＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−αマウスの膵臓が ＴＧＦ−αマウスの膵臓よりも低い管塊状物を有したことを確証した点＝計数体型測定データをグラフ的に示すヒストグラムである。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、対応する非トランスジェニック対照マウスのランゲルハンス島塊状物に比較して、ＩＮＳＧＡＳ／ＴＧＦ−α膵臓におけるガストリン及び ＴＧＦ−αの同時発現がランゲルハンス島塊状物を有意に高められたことを示す点＝計数体系測定データをグラフ的に示すヒストグラムである。さらに、 ＴＧＦ−αは単独で、ランゲルハンス島塊状物を高めない。それらのデータは、例３に示される研究に基づかれている。
【図５】
図５は、ＰＢＳ（空白の丸）又は ＴＧＦ−α及びガストリンの組み合わせ（空白の四角）により、１０日間、毎日、ｉ．ｐ．処理された、ストレプトゾトシンにより誘発された糖尿病Ｗｉｓｔａｒラットにおけるグルコース耐性に対する ＴＧＦ−α及びガストリン効果を示す。
【図６】
図６は、例７に記載のような３種のグループの処理されたＺｕｃｋｅｒラット、及びそれらの対応するＰＢＳ 対照（ｎ＝６／グループ）におけるβ−細胞新生に対する ＴＧＦ−α及びガストリン処理の効果を示す。１によりラベルされる棒はｌｅａｎ ＴＦＧ＋ガストリンを表し、４によりラベルされる棒はｏｂ ＴＧＦ＋ガストリンを表し、５によりラベルされる棒はｏｂ ＰＢＳ対照を表し、３によりラベルされる棒はｐｒｅ ＴＧＨ＋ガストリンを表し、そして２によりラベルされる棒はｌｅａｎ ＰＢＳ対照を表す。 ＴＧＦ−α及びガストリンは、 ＰＢＳ−処理された対照動物に比較して、研究されたすべてのグループにおける単一のβ−細胞の相対的割合を有意に高めた。グループ４及び５は、グループ１及び２（ｐ＜０．００４１）と同じように、有意に異なっている（ｐ＜０．００１５）。
【図７】
図７は、ｌｅａｎ及びｏｂｅｓｅ Ｚｕｃｋｅｒラットにおけるβ−細胞新生に対する、 ＴＧＦ−α及びガストリン処理の効果を示す。β−細胞新生は、合計のβ細胞及び新しく生成されたβ−細胞の示差計数により定量化され、そして計数された合計のβ−細胞の％として示される。成長因子の組み合わせにより処理されたｌｅａｎ Ｚｕｃｋｅｒラットにおける単一のβ細胞の％は、その対応するＰＢＳ 対照における３．９ ±１．１（Ｐ＝０．００４ ）に比較して、１０±０．９ であった（図７Ａ及び７Ｂ）。ｏｂｅｓｅ Ｚｕｃｋｅｒラットにおいては、前処理グループにおける単一のβ−細胞の％は、対応する対照グループにおける４．２ ±１．１（ｐ＝０．００１５）に対して８．７ ±１．３ であった（図７Ｃ及び７Ｄ）。図７Ｅは、図７Ｃの小管領域の４００ の倍率であり（矢印により示される）、そしてβ−細胞新生の特徴を示す小管上皮細胞からのインスリン−含有β−細胞の発芽の明白な証拠を提供する。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ａ】
2004506591.tif 000004
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｂ】
2004506591.tif 000005
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ａ】
2004506591.tif 000006
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｂ】
2004506591.tif 000007
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2004506591.tif 000008
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2004506591.tif 000009