【手続補正書】
【提出日】平成13年11月15日(2001.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】細胞溶解剤を使用せずに試料からＤＮＡを迅速に効率よく捕捉する方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】細胞溶解剤を使用せずに試料から核酸を得る方法であって、
Ａ）ｐＨ７未満において、核酸を含むと思われる試料に、
（１）アミノアルキル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニル及びキナゾリニルからなる群より選択された酸性ｐＨにおいてプロトン化され得る基を少なくとも一つ有する水溶性で弱塩基性のエチレン系不飽和重合性モノマー１５〜１００質量％と、
（２）非イオン性で親水性のエチレン系不飽和重合性モノマー０〜３５質量％と、
（３）非イオン性で疎水性のエチレン系不飽和重合性モノマー０〜８５質量％との付加重合により誘導された反復単位を含む水溶性の弱塩基性ポリマーを、溶菌液中に存在する全核酸による該弱塩基性ポリマーの水不溶性沈殿物を形成させるのに十分な量で接触させ、
Ｂ）該水不溶性沈殿物を該試料から分離させ、そして
Ｃ）該沈殿物に塩基を接触させて溶液ｐＨを７より高くすることにより、該核酸を該弱塩基性ポリマーから解離させる
という工程を含み、
前記弱塩基性ポリマーは、酸性ｐＨにおいてプロトン化され得るアミン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの一種又は二種以上の付加重合により誘導された反復単位を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】Ｄ）前記解離された核酸を含む溶液のｐＨを６〜９の範囲内に調整する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、第三アミン又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】前記弱塩基性ポリマーの工程Ａにおける使用量が０．０１質量％〜０．５質量％の範囲内にある、請求項１記載の方法。
【請求項５】工程Ｃにおいて、前記水不溶性沈殿物を５０℃〜１２５℃の範囲内に加熱すると共に、弱塩基を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項６】工程Ｃにおいて、前記水不溶性沈殿物を加熱することなく、強塩基を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項７】細胞溶解剤を使用せずに標的核酸を増幅して検出する方法であって、
Ｉ）標的核酸を含むと思われる試料を用意し、
ＩＩ）該標的核酸を含む試料に、
Ａ）ｐＨ７未満において、該標的核酸に、
（１）アミノアルキル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニル及びキナゾリニルからなる群より選択された酸性ｐＨにおいてプロトン化され得る基を少なくとも一つ有する水溶性で弱塩基性のエチレン系不飽和重合性モノマー１５〜１００質量％と、
（２）非イオン性で親水性のエチレン系不飽和重合性モノマー０〜３５質量％と、
（３）非イオン性で疎水性のエチレン系不飽和重合性モノマー０〜８５質量％との付加重合により誘導された反復単位を含む水溶性の弱塩基性ポリマーを、該標的核酸を含む該試料中に存在する全核酸による該弱塩基性ポリマーの水不溶性沈殿物を形成させるのに十分な量で接触させ、
Ｂ）該水不溶性沈殿物を該試料から分離させ、そして
Ｃ）該沈殿物に塩基を接触させて溶液ｐＨを７より高くすることにより、該標的核酸を含む核酸を該弱塩基性ポリマーから解離させる
という工程を含み、
前記弱塩基性ポリマーは、酸性ｐＨにおいてプロトン化され得るアミン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの一種又は二種以上の付加重合により誘導された反復単位を含む
という処理を施し、
ＩＩＩ）ｐＨをさらに調整することなく、該解離された標的核酸を増幅し、そして
ＩＶ）該増幅された標的核酸を検出する
という工程を含む方法。
【請求項８】前記弱塩基性ポリマーが塩基性ｐＨにおいて水不溶性であり、かつ、前記水不溶性ポリマーから前記標的核酸を解離させた後それを増幅する前に前記水不溶性ポリマーを除去する工程をさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】前記標的核酸がＫ−ｒａｓ配列である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】生物学的試料におけるＫ−ｒａｓ変異を検出するためのキットであって、
【化１】
2004508002.tif 000001
（ｇ）上記配列の任意の組合せ
からなる群より選択された診断用Ｋ−ｒａｓプライマーを含んで成るキット。
【請求項１１】オリゴヌクレオチドＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡ ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣ ＣＴＧＧＡＧＣ Ｔ（配列番号１）。
【請求項１２】オリゴヌクレオチドＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ ＧＴＧＧＴＡＧＴＴＣ ＣＡＧＣＴＧＧＴ（配列番号２）。
【請求項１３】オリゴヌクレオチドＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧ ＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧ ＧＣＡＣＴＣ（配列番号３）。
【請求項１４】オリゴヌクレオチドＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡ ＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴ Ａ（配列番号４）。
【請求項１５】オリゴヌクレオチドＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴ ＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴ ＴＧＴＴＧＧ（配列番号５）。
【請求項１６】オリゴヌクレオチドＣＴＴＧＣＴＡＴＴＡ ＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡ ＣＣＡＣＡＣＡＧＡ（配列番号６）。
【請求項１７】オリゴヌクレオチドＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡ ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣ ＣＴＧＧＡＧＣ Ｔ（配列番号１）を含んで成るＫ−ｒａｓ診断用プライマー。
【請求項１８】オリゴヌクレオチドＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ ＧＴＧＧＴＡＧＴＴＣ ＣＡＧＣＴＧＧＴ（配列番号２）を含んで成るＫ−ｒａｓ診断用プライマー。
【請求項１９】オリゴヌクレオチドＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧ ＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧ ＧＣＡＣＴＣ（配列番号３）を含んで成るＫ−ｒａｓ診断用プライマー。
【請求項２０】オリゴヌクレオチドＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡ ＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴ Ａ（配列番号４）を含んで成るＫ−ｒａｓ診断用プライマー。
【請求項２１】オリゴヌクレオチドＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴ ＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴ ＴＧＴＴＧＧ（配列番号５）を含んで成るＫ−ｒａｓ診断用プライマー。
【請求項２２】オリゴヌクレオチドＣＴＴＧＣＴＡＴＴＡ ＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡ ＣＣＡＣＡＣＡＧＡ（配列番号６）を含んで成るＫ−ｒａｓ診断用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は検出を目的とした、核酸の捕捉及び選択的解離による試料を調製するための方法に関する。具体的には、増幅の様な後続処理に適した核酸の捕捉及び解離のための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
微量の核酸を検出する技術はポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）の様な高度に精巧化された増幅技術を含め、過去２０年間に急激な進歩をとげた。研究者は、ヒト又は動物試験検体注の疾患及び遺伝的特性を示す核酸を検出するこれら方法の価値を容易に認める。これら技術でのプローブ及びプライマーの使用は、相補性の概念、即ち相補的ヌクレオチド間の水素結合（ヌクレオチドペアとしても知られる）による核酸２本鎖の結合の概念に基づく。
【０００３】
ＰＣＲは当分野の大きな進歩であり、極少量の標的核酸の検出を可能にする。ＰＣＲの詳細は例えば米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）及び米国特許第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されているが、本分野に於ける文献量は急激に増加し続けている。
【０００４】
標的核酸を効率的に増幅及び検出するためには、通常は細胞及びその他検体分解物からその核酸を単離する必要がある。凍結、プロテアーゼ（例えばプロテアーゼＫ）の様な消化酵素による処理、煮沸、及び各種界面活性剤（例えばＨｉｇｕｃｈｉにより１９８８年４月６日に出願された米国連続番号１７８，２０２、及び１９９１年、６月２２日に公開されたＥＰ−Ａ−０ ４２８ １９７号を参照）の使用、溶媒沈殿及び加熱法を含む各種溶解法が知られている。
【０００５】
血液中のＤＮＡは血清及び血漿中に検出されている。正常被験者ではナノグラム量が検出され（Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｃ．Ｒ．， Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ５６；５１２−５１５， １９７５及びＲａｐｔｉｓ， Ｌ．，ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．６６：１３９１−１３９９， １９８０）、慢性自己免疫疾患（Ｌｅｏｎ， Ｓ． Ａ．， ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３７； ６４６−６８０， １９７７）及び癌患者（Ｓｔｒｏｕｎ， Ｍ．，ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２８： ７０７−７１２， １９８７； Ｍａｅｂｏ， Ａ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｄｉｓ． ２８： １０８５−１０９１， １９９０； Ｆｏｕｒｎｉｅ， Ｇ． Ｊ．， ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．， ９１： ２２１−２２７， １９９５； Ｌｉｎ， Ａ．， ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：（６）） ９３７−９４０， １９９８；及びＳｏｒｅｎｏｓｏｎ， Ｇ． Ｄ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ３：６７−７１．， １９９４）ではレベル増加が検出されている。最近遊離型細胞外ＤＮＡが血清中に存在すること、及び血漿が遺伝子型分析（Ｌｉｎ． Ａ．，ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（６） ９３７−９４０， １９９８）や癌の検出（Ｍｕｌｃａｈｙ， Ｈ． Ｅ．，ら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４：２７１−２７５， １９９８）に使用できること、及び母体血清中のＤＮＡが出生前診断に利用できる可能性があること（Ｌｏ  Ｄｅｎｎｉｓ， ら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ． ６２；７６８−７７５， １９９８）が明らかになった。原発性腫瘍中に存在する突然変異は血漿または血清ＤＮＡ由来ＤＮＡを利用し検出できることが多い（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ， ， Ｇ． Ｄ．，ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ３：６７−７１．， １９９４； Ｖａｓｙｕｋｈｉｎ， Ｖ．，ら， Ｉｎ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． ５， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， Ｒ． Ｖｅｒｎａ及びＳｈａｍｏｏ編集， １４１−１５０， Ａｅｒａ−Ｓｅｒｏｎｏ Ｓｙｍｐｏｓｉａ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｒｏｍｅ； Ｍｕｌｃａｈｙ， Ｈ． Ｅ．，ら、上記；Ｋｏｐｒｅｓｋｉ， Ｍ． Ｓ．，ら、Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７６：１２９３−１２９９， １９９７； Ｃｈｅｎ， Ｘ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２： １０３３−１０３５， １９９６； Ｖａｓｉｏｕｋｉｎ， Ｖ．，ら．， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ８６： ７７４−７７９， １９９４；及びＴａｄａ， Ｍ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ２４７２−２４７４）。即ち、血清及び血漿中に存在するＤＮＡは、ガン診断、予防及び治療に関する情報の、侵襲性が最も小さい情報源である。
【０００６】
標的核酸を効率的に増幅し検出するために、通常は問題の試料中に存在する妨害物質から核酸を分離する必要がある。血清または血漿からのＤＮＡの濃縮及び精製には各種方法が利用されている。これら方法の多くはフェノール、エーテル、及びクロロホルム処理、透析、多糖類除去のためのコンカナバリンＡ−セファロースカラムの通過、及び塩化セシウム勾配中での遠心分離（Ｖａｓｙｕｋｈｉｎ， Ｖ．，ら、上記）を含む多くの段階を含んでいる。最近、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）はスピンカラム法に基づくＤＡＮ濃縮及び精製に関するシステムを商品化した。キアゲン法は複雑で、シリカスピンカラムの遠心分離段階以外に合計８段階が含まれており、プロテアーゼによる処理、７０℃でのインキュベーションを含み、また最低３種類の緩衝液を必要とする。
【０００７】
最近Ｇｏｅｃｋｅら（ＷＯ ９７／３４０１８）は核酸増幅アッセイを利用した血漿及び血清中の細胞外腫瘍関連核酸の検出を報告した。かれらの好適方法では、ＤＮＡはゼラチンによる初期の共沈殿、続く溶媒処理及び遠心分離を含む多段階法を利用し、血漿及び血清から共沈殿される。ガラスビーズ、シリカ粒子又は珪藻土の使用を含む時間のかかる、複雑なその他方法も記載されている。
【０００８】
核酸の捕捉及び選択的解離に関する弱塩基性ポリマーの使用は米国特許第５，６２２，８２２号（Ｅｋｅｚｅら）、米国特許第５，５８２，９８８号（Ｂａｃｋｕｓら）、及び米国特許第５，４３４，２７０号（Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｏら）に記載されている。上記特許記載の方法は、細胞溶解剤又は細胞溶解段階の使用に依存する。細胞溶解剤として界面活性剤がしばしば利用される。界面活性剤及びその他溶解剤の使用は、細胞からの核酸及び細胞成分の血液中への解離をもたらす；これがバックグランドＤＮＡの強い濃縮を招く。
発明の概要
従来法に於ける溶解剤又は溶解段階の使用に関係する問題は本発明の方法により克服される。
【０００９】
本発明の方法は、捕捉及びポリマーからの捕捉核酸の選択的解離を目的とするが、しかし従来方法を利用し実施される場合の様な溶解段階又は溶解剤を使用しない上記米国特許記載の弱塩基性ポリマーの使用を包含する。
【００１０】
発明の観点の一つによれば、血清及び血漿からＤＮＡを回収するための単純化され使用が簡便な方法が提供される。方法は血清又は血漿の様な試料からＤＮＡを結合することを目的とする弱塩基性ポリマーの使用を包含する。ＤＮＡ結合後、ポリマーは不溶性となる。ポリマー結合ＤＮＡは次に不所望の不溶性物質を含む混合液より分離される。次にＤＮＡはアルカリ付加によりポリマーから解離される。即ち本発明の方法は３段階：（ａ）試料と緩衝液との接触、（ｂ）段階（ａ）にて形成された混合液と弱塩基性ポリマーとの接触及びインキュベーション、及び（ｃ）アルカリ接触による段階（ｂ）のポリマー結合ＤＮＡの解離、のみを必要とする。方法はアルコール又はその他溶媒及びフェノール又はクロロホルムの様な有毒物質による抽出を排除し、また溶解剤を使用しない。方法はＤＮＡ回収を簡便化するだけでなく、増幅可能な目標ＤＮＡの収率も改善する。方法は好ましくは試料として血清及び血液と共に使用されるが、もとよりこれらに限定されないが尿、胆汁、髄液、気管支洗浄液（ＢＡＬ）、結腸洗浄液、及び便を含むその他体液にも応用できる。更に、動物、ヒト、環境及び微生物試料から採取されたこれらのものを含むいかなるタイプの試料も利用できる。
【００１１】
別の観点では、本発明は上記記載のＤＮＡ回収法を利用した目標ＤＮＡの増幅と検出に関する。
【００１２】
本発明の発明方法は次の段階を含み：
Ａ）  ｐＨ７未満にて核酸を含むと思われる試料を、試料中に存在する全ての核酸が弱塩基性ポリマーと水不溶性沈殿を形成するのに十分な量の水溶性、弱塩基性ポリマーと接触せしめる段階、
Ｂ）  試料から水不溶性沈殿を分離する段階、及び
Ｃ）  沈殿を塩基と接触せしめ、溶液のｐＨを７より高くし、それにより弱塩基性ポリマーから核酸を解離させる段階、
弱塩基性ポリマーは酸性ｐＨにてプロトン化できるアミン基を有する１又はそれ以上のエチレン飽和な重合性モノマーの付加重合により誘導された反復単位を含む。
【００１３】
本発明はまた以下を含む標的核酸の増幅及び検出に関する方法も提供する：
Ｉ）  次の段階を利用して標的核酸を提供すること：
Ａ）  ｐＨ７未満にて核酸を含むと思われる試料を、試料中に存在する全ての核酸が弱塩基性ポリマーと水不溶性沈殿を形成するのに十分な量の水溶性、弱塩基性ポリマーと接触せしめる段階、
Ｂ）  試料から水不溶性沈殿を分離する段階、及び
Ｃ）  沈殿を塩基と接触せしめ、溶液のｐＨを７より高くし、それにより弱塩基性ポリマーから核酸を解離させる段階、
弱塩基性ポリマーは酸性ｐＨにてプロトン化できるアミン基を有する１又はそれ以上のエチレン不飽和な重合性モノマーの付加重合により誘導された反復単位を含む。
ＩＩ）  解離された核酸中に存在する標的核酸を増幅すること、及び
ＩＩＩ）  増幅された核酸を検出すること。
【００１４】
標的核酸の増幅に関する試験キットは以下の個別梱包を含む：
ａ）  １またはそれ以上の増幅試薬を含む増幅反応混合物、及び
ｂ）  酸性ｐＨにてプロトン化できるアミン基を有する１又はそれ以上のエチレン不飽和な重合性モノマーの付加重合により誘導された反復単位を含む弱塩基性ポリマー。
【００１５】
本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅法の様なその他処理に適した核酸を選択に単離し、提供するための迅速、単純且つ効果的な方法を提供する。本発明は、ポリエチレンアミンの使用を含む通常の単離手段に関連する上記問題を解決する。更に、フッ素化リン酸エステル界面活性剤と組合せたポリエチレンアミン使用により生ずる問題も、界面活性剤を必要としないことから回避される。本発明の試料調製方法は時間がかからず、最小段階のみを必要とするため、より容易に自動化できる。通常は約１５分以内に実施できる（好ましくは１０分以内）。
【００１６】
これら利点はポリエチレンアミンに替わって酸性ｐＨでは陽イオン性かつ水溶性であるが、ポリマーのｐＫａより有意に高い塩基性ｐＨでは脱プロトン化される“弱塩基性”ポリマーを使用することで提供される。“弱塩基性”とはポリマーのｐＫａが７未満、より好適には６．５未満であることを意味する。即ちポリマーは、陽イオン性ポリマーと陰イオン性の核酸リン酸骨格とのイオン性相互作用により、低ｐＨにて核酸沈殿に使用できる。
【００１７】
非複合体化物質を除いた後、ｐＨを塩基性条件に調節することで核酸は沈殿の弱塩基性ポリマーより解離し（又は脱複合体化し）、増幅の様なその他処理に利用できる。増幅方法は塩基性条件下に実施できる。
発明の詳細な説明
本発明は動物、ヒト、環境又は微生物検体からの採集された何れかのタイプの試料中に存在する１またはそれ以上の標的核酸の抽出及び検出に特に適している。得られた核酸は、それらを通常の当分野で良く知られている方法であるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば米国特許第４，９９４，３７３号、ハイブリダイゼーション技術に関し参照されここに取り込まれている）にかけることで更に処理できる。
【００１８】
しかし、簡潔のために、その他考察は核酸が増幅法、特にＰＣＲにかけられる好適実施態様にて論じられるだろう。しかし、その他増幅法（例えばＬＣＲ）も利用できることから、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００１９】
ポリメラーゼチェインリアクションを用いた核酸の増幅及び検出に関する一般原理及び条件は良く知られており、その詳細は米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）、米国特許第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）及びＷＯ−Ａ−９１／１２３４２号を含む数多くの参考資料に提供されている。上記米国特許は参照されここに取り込まれている。当分野の教示及びここに備えられた具体的教示の見解では、当業者は本発明の準備法をポリメラーゼチェインリアクション法、又はその他当分野既知の増幅法と組合せ本発明を実施することに困難はない。
【００２０】
本発明の実施に使用できるその他増幅法にはＥＰ−Ａ−０ ３２０ ３０８号（１９８７年１２月公開）及びＥＰ−Ａ−０ ４３９ １８２号（１９９０年１月公開）のリガーゼチェインリアクション法が含まれるが、これに限定されない。
【００２１】
試験検体（“試料”）には体液又は遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡを含むその他材料が含まれる。標的核酸は好適なヒト、動物、微生物、ウイルス又は植物の供給源より抽出できる。
【００２２】
ここに開示される進歩は、ここに規定の弱塩基性ポリマーとの接触前に試料からの核酸の抽出が必要ないこと目的とする。一方、従来技術は当分野既知の各種溶解法を教示する（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ， ｐｐ．５３８−５４０（Ｓｅｐ． ３， １９８８）のＬａｕｒｅら、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｐｐ． ２８０−２８１ （１９８２）、Ｇｒｏｓｓ−Ｓｅｌｌａｎｄら、 ｉｎ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３６， ３２ （１９７３）及び米国特許第４，９６５，１８８号（上記）記載の方法を含む）。全血又はその成分からのＤＮＡ抽出は、例えばＥＰ−Ａ−０ ３９３ ７４４（１９９０年１０月２４日公開）、米国特許第５，２３１，０１５号（Ｇｕｍｍｉｎｓら）及び米国特許第５，３３４，４９９号（Ｂｕｒｄｉｃｋら）；に記載されている；溶解法は核酸供給源として使用される検体のタイプに依存する；好ましい溶解法は好適非イオン性界面活性剤存在下での試料の加熱を含み、多くのものが当分野で良く知られている。その他有益な溶解法は米国連続番号０９／０６３ １６９（Ｅｋｅｚｅ及びＫｅｒｓｃｈｎｅｒにより１９９３年、５月１８日出願）に記載されており、そこでは全血試料が緩衝化塩化アンモニウム液と混合され、続いて塩化アンモニウムとの第２混合を含む追加段階が実施されるものであり、当該発明方法は溶解段階を実施しない。
【００２３】
試料はまず希釈され、約７．０より低いｐＨの緩衝液と混合されてから試料中の全核酸と複合体を形成し、水不溶性沈殿を形成するのに十分な量の弱塩基性ポリマー（以下規定の）と混合される。このポリマーは酸性ｐＨでは水溶性である。一般に存在するポリマーの量は少なくとも０．０１重量％であり、約０．０５ないし約０．５重量％が好ましい。もちろん当業者は核酸量に適応するポリマー量を調節する方法を知っているだろう。混合は好適手段により好適温度（一般には１５°ないし３５℃）にて３０分まで（一般には５分未満）実施できるだろう。
【００２４】
試料との混合に好適な緩衝液には、ｐＫ６．１のＭＥＳ（２−Ｎ−［モルホリノ］エタンスルホン酸）、ｐＫ６．５のビス−トリス（ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン；ｐＫ６．６のＡＤＡ（Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノ二酢酸）［ヒドロキシメチル］−１，３−プロパンジオール）；Ｎ−［カルバモイルメチル］イミノ二酢酸；ｐＫ６．８のＡＣＥＳ（Ｎ−［カルバモイルメチル］−２−アミノエタンスルホン酸；Ｎ−［２−アセトアミド］−−２−アミノエタンスルホン酸）；ｐＫ６．８のＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，ｎ’−ビス［２−エタンスルフィド］；１，４−ピペラジン時エタンスルホン酸）；ｐＫ６．９のＭＯＰＳＯ（３−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）；ｐＫ６．８のビス−トリスプロパン（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン）、ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）及びトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含む、ｐＫａが７未満である、より好ましくはｐＫａが６．５未満である緩衝液が含まれ、弱塩基性ポリマーはその水溶性遊離形状で使用でき、またはアフィニティーカラムの様な水不溶性基質に結合でき、あるいはポリマー性、ガラス又はその他無機微粒子に結合することができる。即ち、ポリマーは通常の手段（例えば吸着、共有結合又は特異的結合反応）を利用しガラス、ポリマー性又は磁性ビーズ、フィルター又はフィルムを含む好適基質に結合することができる。弱塩基性ポリマーが塩基性ｐＨに於いてもまだ水不溶性である場合には、それは核酸分離後に濾過、遠心分離又はその他通常の方法によって取り除くことができる。
【００２５】
しかし弱塩基性ポリマーへ結合している間、核酸は有用ではない。大量の細胞分解物と過剰のポリマーを含むであろう試料の残余から、水不溶性沈殿を分離する必要がある。この分離は、遠心分離または濾過してリガンドを廃棄することを含む各種通常の方法を使用し達成できる。本発明の実施では遠心分離が好ましく、約１，０００×ｇより大きい、１分ないし５分間の操作で実施できる。
【００２６】
分離段階後、沈殿を加熱あり又はなしにて塩基と接触させることで、核酸は弱塩基性ポリマーから脱複合体化又は解離できる。強塩基は加熱することなく利用できる、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、第３級アミン（トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びルチジンの様な）、トリシン、ビシン又はその当業者に容易に明らかである他有機又は無機塩基を含むが、これらに限定されない。有益なより弱い塩基にはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（又はその酸付加塩）Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−グリシン及びその他当分野に良く知られている様な塩基性緩衝液が含まれるだろう。弱塩基を使用する場合には加熱が必要だろう。
【００２７】
この様な加熱は、好適圧の持ち、少なくとも約５０℃、好ましくは約９５℃ないし約１２５℃である温度にて１５分間（一般には５分未満）実施できるだろう。本関連で使用する場合、“約”とは＋／−５℃を表す。
【００２８】
好適実施態様では、弱塩基は沈殿から核酸を解離するために加熱と共に利用できる。これによりその他処理なしに増幅に利用可能な核酸を含む溶液が提供される。この様な弱塩基はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩の様な緩衝液であることができる。
【００２９】
幾つかの実施態様では、これら実施態様に使用されるポリマーは塩基性ｐＨにても水不溶性である様なポリマー（以下規定）である。この様なポリマーは必要に応じ核酸分離後、増幅前にシステムより取り除くことができる。
【００３０】
こうして得た分離核酸を含む液は塩基性のｐＨを有する。幾つかの例では、核酸は更に追加のｐＨ調節なしに処理することができる。強塩基を使用する他実施態様では、液のｐＨはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン及び当業者に容易に明らかになるであろうその他の様な好適な酸又は緩衝液を用い、約６ないし約９（好ましくは約７．５ないし約９）に調節されるだろう。所望ｐＨを達成するのに必要なこれら物質の量は当業者にとって容易に明らかになるだろう。
【００３１】
塩基性ｐＨでは、核酸の捕捉に使用されるポリマーは水溶性又は水不溶性のいずれでもよく、これら特性の提供に必要なモノマーは以下に記載される。
【００３２】
本発明の核酸を捕捉し、解離する記載の方法は典型的には約２０分以内、好ましくは約１０分以内に実施される。
【００３３】
ここで使用する場合、特記ない限り修飾語“約”は表記値の１１０％の偏差を表す。ｐＨ値に使用する場合、“約”は＋／−０．５ｐＨ単位を表す。
【００３４】
本発明の好適実施態様では、標的核酸の増幅及び検出に関する方法は次を含む：
Ｉ）  標的核酸を含むと思われる試料を提供すること、
ＩＩ）  次の段階に標的核酸をかけること：
Ａ）  ７未満のｐＨにて標的核酸を、弱塩基性ポリマーと試料中の標的核酸を含む全核酸との水不溶性沈殿の形成に十分な量の水溶性の弱塩ポリマーとを接触せしめる段階、
Ｂ）  水不溶性沈殿を試料から分離する段階、及び
Ｃ）  沈殿を塩基と接触せしめ、溶液のｐＨを７より高くし、それにより弱塩性
ポリマーから核酸を解離させる段階、
弱塩基性ポリマーは酸性ｐＨにてプロトン化できるアミン基を有する１又はそれ以上のエチレン不飽和な重合性モノマーの付加重合により誘導された反復単位を含む。
ＩＩＩ）  ｐＨの更なる調節なしに解離された標的核酸を増幅すること、及び
ＩＶ）  増幅された標的核酸を検出すること。
【００３５】
前記方法に於いて、弱塩基性ポリマーは塩基性ｐＨにて水不溶性であること、及び方法が目標核酸の分離後であるがその増幅前に水不溶性ポリマーを分離する段階を含むことが更に好ましい。
【００３６】
本発明の実施に使用される弱塩基性ポリマーは１またはそれ以上のエチレン不飽和な重合性モノマーにあって、少なくともその一つが酸性ｐＨにてプロトン化できるアミン基を有するものである重合性モノマーより調整される。即ち、酸性ｐＨでは、ポリマーはプロトン化されアミンの酸付加塩を形成する。塩基性ｐＨでは、ポリマーは遊離塩基として存在する。
【００３７】
本発明にて有用な重合性モノマーの一部となり得る具体的“弱塩基性基”には酸性ｐＨにてプロトン化できる環状アミン基、又は第１、第２又は第３アミノアルキル基が含まれるが、これに限定されない。有益な環状アミンにはイミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニル及びキナゾリニル基が含まれるが、これらに限定されるものではない。好適基は芳香族である環状基であり、イミダゾリル基が最適である。有用なアミノアリルキル又は環状アミン基は、アルキレン、アミド又はエステル基を含む通常の結合基を使用してモノマーのビニル基に結合され、そして複数のアルキレン基はイミノ、オキシ、アミド、カルボニル又はエステル基と共に結合することができる。
【００３８】
一般に核酸捕捉に有用なポリマーは、以下の付加重合により誘導される反復単位を含む；
ａ）  酸性ｐＨにてプロトン化できる基であり、アミノアルキル、イミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニル及びキナゾリニルより成るグループから選択される基を少なくとも１持つ、約１５ないし１００重量％の水溶性、弱塩基性のエチレン不飽和な重合モノマー、
ｂ）  ０ないし約３５重量％の非イオン性、親水性エチレン不飽和重合性モノマー
ｃ）  ０ないし約８５重量％の非イオン性、疎水性エチレン不飽和重合性モノマー。
【００３９】
好ましくは、弱塩基性ポリマーは約２０ないし約１００重量％のａ）、０ないし約２５重量％のｂ）及び０ないし約８０重量％のｃ）の反復単位を含む。
【００４０】
上記ａ）に有用なモノマーのより具体的な分類は、構造（Ｉ）により表される分類にあって、
【００４１】
【化２】
2004508002.tif 000002
【００４２】
式中のＲ３が水素又はメチルであり、Ｘがオキシ又イミノである分類である。更に、Ｒ４は鎖中に１ないし８個の炭素及びヘテロ原子を有し、１またはそれ以上のアルキレン基（メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン及びｎ−ペンチレン）を含み、２以上のアルキレン基が存在するときには、Ｒ４において、１またはそれ以上のカルボニル、オキシ、イミノ、エステル又はアミド基によって実施可能な組合せにおいて結合される２価炭化水素結合基である。“実施可能な組合せ”とは、これら基が化学的に可能な配置にアルキレン基と組み合わさることができること、及び化学的に可能な様式（オキシカルボニル、カルボンアミド及びその他当業者に容易に明らかになるもの）にて組合せて利用できることを意味する。Ｒ４がカルボニル、オキシ、イミノ、エステル又はアミノ基で終止できるとも理解できる。
【００４３】
Ｒ５は環状アミン又は上記の第１、第２又は第３アミノアルキル基であり、酸性ｐＨにてプロトン化できる。
【００４４】
有用なタイプａ）モノマーの例には１−ビニルイミダゾール、２−メチル−１−ビニルイミダゾール、２−ビニルピリジン、１−ヒドロキシ−６−ビニル−１Ｈ−ベンゾトリアゾール、メタクリル酸２−アミノエチル塩酸塩、アクリル酸２−アミノエチル塩酸塩、Ｎ−（３アミノプロピル）メタクリアミド、２−ビニルキノリン、Ｎ−（３イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−イミダゾリルエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−Ｎ−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（イミダゾリルメチル）アクリルアミド、１−ビニルピロリジノン、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート及び上記遊離塩基の酸付加塩。
【００４５】
本発明のタイプａ）の新規モノマーの分類はホモポリマー又はコポリマーのいずれの調製にも利用できる。これらモノマーは構造（ＩＩ）により定義されるものであって；
【００４６】
【化３】
2004508002.tif 000003
【００４７】
式中のＲが水素又はメチルであるものである。好ましくはＲはメチルである。更に、Ｒ１は１ないし３個の炭素原子を持つ分岐状又は直鎖状のアルキレンである（メチレン、エチレン、トリメチレン又はプロピレンの様な）。Ｒ１は２または３個の炭素原子を持つアルキレンである。より好ましくはＲ１はトリメチレンである。
【００４８】
構造（ＩＩ）を有する特に有用なモノマーは、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−イミダゾリルエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−Ｎ−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（イミダゾリルメチル）アクリルアミド、及びその酸付加塩を含むが、これらに限定されない。ここに記載の新規モノマーのうち、第１の化合物が最適である。
【００４９】
好ましいタイプａ）モノマーには１−ビニルイミダゾール及びＮ−２−メチル−１−ビニルイミダゾールが含まれる。
【００５０】
タイプａ）のモノマーが低水溶性を示すか、又は全く水溶性を示さない場合にはそれらは酸付加塩の形（塩酸塩又は臭化水素酸塩の様な）に重合することもできる。
【００５１】
タイプｂ）とされるモノマーは、ここで“親水性”と規定されるモノマーであり、ホモポリマー化する時ｐＨ７以上で水溶性であるホモポリマーを提供するモノマーを意味する。一般に、この様なモノマーはヒドロキシ、アミン（第１、第２、第３及び環状）、アミド、スルホンアミド及びポリエチレンオキシ基の様な親水性基を有するが、当該ホモポリマーが水溶性パラメーターに合致しているのであればこれら基を含む必要なない。
【００５２】
タイプｂ）の代表的モノマーにはアクリルアミド、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリ（エチレンオキシ）エチルメタクリレート（２ないし１０個のエチレンオキシ基を有する）及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを含むが、これらに限定されない。好適なモノマーはアクリルアミドである。
【００５３】
タイプｃ）モノマーとされるモノマーは、ここでは“疎水性”と規定されるモノマーであり、それらが側鎖を持つ場合にはその種類に関係なく、ホモポリマー化する時ｐＨ７以上で水不溶性であるホモポリマーを提供するモノマーを意味する。
【００５４】
タイプｃ）の代表的モノマーにはメタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ｔ−ブチルメタクリルアミド、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、メチルメタクリレート、スチレン、ビニルトルエン及びその他ビニル芳香族体、及び当業者に容易に明らかになるその他のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適モノマーは２−ヒドロキシエチルメタクリレートである。
【００５５】
新規でないタイプａ）、ｂ）及びｃ）のモノマーは一般には市販供給源より入手可能であるか、又は通常の方法及び材料を使い調整できる。
【００５６】
構造（ＩＩ）の新規モノマーは一般には当業者に容易に明らかになる適当な条件を用い、１−（アミノアルキル）イミダゾールと塩化（メタ）アクリロイルとを重合することで調整できる。好適モノマーの代表的調整法は下記実施例中に提供されている。これらモノマーに関するより詳細は、“弱塩基性重合性モノマー及びそれより調製されたポリマー”と名称が付けられたＰｏｎｔｉｃｅｌｌｏらの周知の米国特許第５，４３４，２７０号より得ることができる。
【００５７】
ここに記載のホモポリマー及びコポリマーは、以下実施例に提供される調製方法に例示される特定の好適条件はあるものの、当業者に良く知られている通常の液重合技術を利用し調製できる。各種モノマーの比は当業者既知の如くに調節でき、塩基性ｐＨでは水溶性または水不溶性であるが、酸性ｐＨでは水溶性を維持する様なポリマーを提供することができる。
【００５８】
溶液重合は一般には、好適フリーラジカル開始体存在下に好適溶媒（水又は各種水混和性有機溶媒）中にモノマーを溶解し、混合することを含む。生じたポリマーは酸性ｐＨにて水溶性であるため、その後の使用に備えアセトンの様な溶媒を用い沈殿され、精製され、再度水に溶解される。
【００５９】
特に有用なここに記載のポリマーは、ポリ［Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド塩酸塩−コ−アクリルアミド］、ポリ［Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート］、ポリ（１−ビニルイミダゾール）、ポリ（２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（１−ビニルイミダゾール塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ［Ｎ−（１，１−ジメチル−３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド］ポリ（Ｎ−２−メチル−１−ビニルイミダゾール）及び遊離塩基ポリマーの酸付加塩を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
好適実施態様では、使用ポリマーは塩基性ｐＨでは水不溶性である。これらポリマーはタイプａ）モノマー及びタイプｃ）モノマーを利用し調製されるが、塩基性ｐＨでのポリマーの可溶化を防ぐために少量（１５重量％未満のタイプｂ）のモノマと共に使用される。このタイプの代表的ポリマーにはポリ［Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）−メタクリルアミド塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート］、ポリ（１−ビニルイミダゾール）、ポリ（２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）及びポリ（１−ビニルイミダゾール塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明はまた上記の如く解離された１またはそれ以上の標的核酸中に存在する１又はそれ以上の特異的核酸配列の増幅又は検出を目的とする。更に各特異的核酸に適したプライマー及び検出法の対応するセットを利用することで、複数の標的核酸を同時に増幅し、検出することができる。同一核酸配列中の複数配列も増幅し、検出することができる。
【００６２】
“ＰＣＲ試薬”とはＰＣＲでの使用に一般的に有効であると考えられている試薬、即ち各目標核酸に適したプライマーのセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ補助因子、及び２またはそれ以上のデオキシリボヌクレシド−５’−３リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）を表す。
【００６３】
ここにてプライマー又はプローブを表す場合に使用される場合、用語“オリゴヌクレオチド”は４またはそれ以上の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子を表す。その正確な大きさは重要ではないが、オリゴヌクレオチドの最終的利用または機能を含む多くの要素に依存している。オリゴヌクレオチドは当分野既知の方法により演繹されるだろう。
【００６４】
用語“プライマー”は天然に生じた、又は合成され生成されたものであり、核酸鎖（即ち鋳型）に相補的であるプライマー延長産物の合成が誘導される条件の下に置かれた時に、合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを意味する。この様な条件にはヌクレオチド（４種類の標準的デオキシリボヌクレオチド−５’−３リン酸の様な）、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ補助因子の存在、及び好適温度やｐＨが含まれる。通常これら条件は、非特異的増幅が最小化される“高厳密”条件として当分野で知られる条件である。プライマーはＤＮＡポリメラーゼ存在下に延長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。各プライマーの正確な長さは使用目的、目標配列の複雑さ、反応温度及びプライマーの起源に依存し変わるだろう。一般に本発明に使用されるプライマーは１０ないし６０ヌクレオチドであろう。
【００６５】
ここで有用なプライマーは数多くの供給源より得ることができ、または既知技術及び装置、例えばＡＢＩ ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）より販売されてる）又はバイオサーチ８６００シリーズ又は８８００（ミリジェン−バイオサーチ社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）より販売）及びそれらの使用に関する既知方法（例えば米国特許第４，９６５，１８８号に記載の様な）を使用し調整することができる。生物供給源より単離された天然発生プライマーもまた有用である（制限エンドヌクレアーゼ消化の様な）。ここで使用される場合、用語“プライマー”はプライマーの混合体も表す。即ち、特定標的核酸に関するプライマーの各セットは各向きあった鎖に関する２またはそれ以上のプライマーを含むだろう。
【００６６】
１方または両方のプライマーは増幅産物の検出または捕捉に適した同一、又は異なる標識体で標識することができる。標識体を結合させる方法及びプライマーを調整する方法は当分野で良く知られており、例えばＡｇｒａｗａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １４． ｐｐ．６６２７−４５ （１９８６）、ビオチン標識体に関する米国特許第４，９６２，２１０号（Ｌｅｖｅｎｓｏｎら）、及びここに記した参考資料に記載されている。有用な標識体は放射性同位元素、電子密度試薬、色素原、蛍光原、燐光成分、フェリチン及びその他磁性粒子（Ｏｗｅｎらの米国特許第４，７９５，６９８号及びＰｏｙｎｔｏｎらの米国特許第４，９２０，０６１号を参照）、化学発光成分（ルミノールの様な）及びその他特異的結合種（アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、糖又はレクチン）も包含する。好適標識体は酵素、放射性同位元素及び特異的結合種（ビオチンの様な）である。有用な酵素はグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリホスファターゼ及びその当分野既知の酵素を包含し、既知方法を用いオリゴヌクレオチドに結合できる。これらの酵素により発色または化学発光シグナルを提供する試薬は良く知られている。
【００６７】
標識体がペルオキシダーゼの様な酵素の場合、アッセイに幾つかの点にて過酸化水素及び好適色素形成組成体が加えられ、検出可能な色素がもたらされる。例えば色素提供試薬には、テトラメチルベンジジン及びその誘導体、及び水不溶性トリアリルイミダゾールロイコ色素（Ｂｒｕｓｃｈｉｎｏ米国特許第４，０９９，７４７号に記載の様な）の様なロイコ色素、またはペルオキシダーゼ及び過酸化水素存在下に反応し色素を提供するその他化合物を含む。特に有用な色素提供組成体はＥＰ−Ａ−０ ３０８ ２３６号（１９８９年、３月２２日公開）に記載されている。ペルオキシダーゼとの反応に於ける化学発光シグナルは、適当な試薬を利用しても生成することができる。
【００６８】
もし一方又は両方のプライマーがビオチン化されている場合、増幅核酸は検出可能に標識されたアビジンまたはその等価物（ストレプトアビジンの様な）を利用し、検出できる。例えばアビジンは既知方法により酵素標識でき、又は放射性同位元素を持つことができる。増幅産物上のビオチンはアビジンと複合体を形成し、放射活性、発色、または化学発光シグナルを検出するための適当な検出技術が利用される。
【００６９】
ここで用いる捕捉“プローブ”は、標的核酸の１またはそれ以上の鎖の核酸配列に実質相補的であるオリゴヌクレオチドであり、増幅核酸の不溶性化に利用される。プローブオリゴヌクレオチドは一般に、ポリマービーズ又はガラスビーズ、マイクロタイタープレートウエル、薄層ポリマーフィルム又は薄層セルロースフィルム、あるいは当業者に容易に明らかになるその他材料の様な好適水不溶性基質に結合される。オリゴヌクレオチドは一般に１２ないし約４０ヌクレオチド長であるが、その長さは重要ではない。
【００７０】
ＤＮＡポリメラーゼはプライマー及び鋳型複合体中にあるプライマーの３＋−ヒドロキシ末端にデオキシヌクレオシド１リン酸分子を付加する酵素であるが、この付加は鋳型依存的な様式（即ち、鋳型中の特異的ヌクレオチドに依存して）におこなわれる。多くの有用なＤＮＡポリメラーゼが当分野で知られている。好ましくはポリメラーゼは“熱安定型”であり、これは熱、特にＤＮＡ鎖の変性に際し使用される高温に対し安定であることを意味している。より具体的には、熱安定型ＤＮＡポリメラーゼはここに記載のＰＣＲで使用される高温により実質的に不活性化されない。
【００７１】
参照されここに取り込まれている米国特許第４，９６５，１９９号（上記）及び米国特許第４，８８９，８１８号（Ｇｅｌｆａｎｄら）に記載のものを含め、数多くの熱安定型ＤＮＡポリメラーゼが当分野で報告されている。特に有用なポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｕｍｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｆ ｌａｖｕｓの様な各種Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌種から得られたものである。その他有用な熱安定型ＤＮＡポリメラーゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． を含む各種その他微生物供給源より得られ、またＷＯ−Ａ−８９／０６６９１（１９８９年６月２７日公開）に記載のものである。幾つかの有益ポリメラーゼが市販されている。生物体より天然に生ずるポリメラーゼを単離するための方法、及び組換え体技術を使用し遺伝的に加工された酵素の製造に関する方法は、本文中に引用の分野に記される如く数多く知られている。
【００７２】
ＤＮＡポリメラーゼ補助因子は、酵素がその活性のために依存する非蛋白質性成分を意味する。数多くのこの様な物質が補助因子として知られており、マンガン及びマグネシウム塩が含まれる。有用な補助因子には、塩化マンガン及びマグネシウム、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩（例えば酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸及びラウリン酸塩）が含まれるが、これらに限定されない。より小さな塩、即ち塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。
【００７３】
また２またはそれ以上のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ又はｄＴＴＰの様なデオキシリボヌクレオチド−５’−３リン酸もまたＰＣＲに必要である。一般に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ全てがＰＣＲに使用される。ｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＣＴＰの様な類似体も有用である。
【００７４】
発明の実施には、ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体にあって、約５０℃より低い温度にて酵素活性を阻害するが高温では不活性化される抗体も有用である。この様な特性を有する代表的モノクローナル抗体は参照されここに取り込まれている米国特許第５，３３８，６７１号（Ｓｃａｌｉｃｅら）に記載されている。それらが等価の特性を有する場合には、全体分子に替わって抗体断片も使用できる。
【００７５】
ここに記載のＰＣＲ試薬は目標核酸の増幅を与える好適濃度でＰＣＲに提供され、用いられる。ＤＮＡポリメラーゼの最小量は一般には少なくとも約１単位／溶液１００μｌであり、約４ないし約２５単位／１００μｌが好適である。“単位”は、ここでは７４℃、３０分間に延長中の核酸鎖に全ヌクレオチド（ｄＮＴＰ’ｓ）の１０ｎｍｏｌｅを取り込ませるのに必要な酵素活性量として規定されている。各プライマーの濃度は少なくとも約０．０７５μモルであり、約０．２ないし約１μモルが好ましい。全てのプライマーは約同量存在している（各１０％の偏差にて）。補助因子は一般に反応混合液中に約１ないし約１５ミリモル量存在するが、各ｄＮＴＰは一般には約０．１ないし約３．５ミリモル存在している。本文に使用される場合、修飾語“約”は記載値の＋／−１０％の偏差を表す。
【００７６】
ＰＣＲ試薬は個別に、又は好適緩衝液にて約７ないし約９の範囲のｐＨを持つ緩衝化溶液として供給できる。
【００７７】
増幅および検出される標的核酸は通常２本鎖形状にあることから、プライミングが起こる前に２本鎖を分離（即ち変性）しなければならない。これは抽出工程中におこなうことができるが、その後別段階で実施されることが好ましい。好適温度まで加熱すること（ここでは“第１温度”またはＴ１として特定される）が変性に好適な方法である。一般にこの第１温度は約８５℃ないし約１００℃の範囲に好適時間、例えば１ないし約２４０秒（好ましくは１ないし約４０秒）である。この初期変性段階は第１増幅サイクル中に含ませることができる。この場合、第１サイクル中の変性はより長く（例えば２４０秒まで）なるが、その後のサイクルはより短い（例えば３０秒まで）変性段階を持つことができる。
【００７８】
変性された鎖は次に、反応混合液を一般には約５５℃ないし約７０℃の範囲にある第２温度、Ｔ２まで冷却することで、適当なプライマーセットによりプライムされる。冷却は可能な限り迅速に実施されることが望ましいが、現在既知の装置を使用する場合には冷却には一般に約５ないし約４０秒間かかり、より好ましくは約５ないし約２０秒間である。
【００７９】
変性鎖が冷却された後、ＰＣＲ試薬を含む反応混合液は第３温度Ｔ３に、一般に１ないし約１２０秒、好ましくは１ないし約８０秒間インキュベーションされ、プライマー延長産物の形成がおこなわれる。一般に、第３温度は約５５°ないし約７４℃の範囲にある。好ましくは第３温度は約６２°ないし約７０℃の範囲である。
【００８０】
最適実施態様では、第２及び第３温度は同一であり、約６２°ないし約７０℃の範囲内にある。即ちプライミング及びプライマー延長は好ましくは同一段階で実施される。
【００８１】
即ち、増幅サイクルは上記の変性、プライミング（又はアニーリング）及びプライマー延長段階を含む。一般に、具体的使用者の自由裁量の範囲にて、最大サイクル数による本発明の実施では、この様な増幅サイクルは少なくとも１５回実施される。多くの場合、方法では１５ないし５０増幅サイクルが用いられ、１５ないし４０サイクルが好適である。各増幅サイクルは一般には約２０ないし約３６０秒であり、約３０ないし約１２０秒のサイクル時間が好適であり、約３０ないし約９０秒のサイクル時間が更に好ましい。しかし、必要に応じより長い又は短いサイクル時間が利用できる。
【００８２】
増幅法の特定段階に関する時間表示に使用される場合、用語“約”はその時間値の＋／−１０％を表す。更に、温度を表す場合に使用される場合には、用語“約”は＋／−０．５℃を表す。
【００８３】
増幅産物の検出は、米国特許第４，９６５，１８８号（上記）に記載の様なサザンブロッティング法を含む既知方法、または当分野既知である様な標識化プローブ又はプライマーを使用することで実施できる。
【００８４】
あるいは上記実施態様に替わって、増幅産物はプライマー延長産物の一方に相補的である標識化オリゴヌクレオチドを利用し検出できる。
【００８５】
ＴａｑＭａｎアッセイ実施に必要な全ての試薬はカリフォルニア州、フォスター市、パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．，）の一部門であるアプライドバイオシステムス社より販売されており、次のものが含まれる；β−アクチン検出試薬（カタログ番号、４０１８４６）、ＤＮＡ鋳型試薬（カタログ番号４０１９７０）及びＴａｑＭａｎ ＰＣＲ コアリージェントキット（Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ）（カタログ番号Ｎ８０８−０２２８）。アッセイはメーカー提供のＰＣＲマスターミックス及びβ−アクチンＴａｑＭａｎアッセイに関するプロファイルを用いて実施された。１マイクロリットルのＤＮＡ鋳型試薬をＡＢＩプリズム７７００シークエンス検出システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（アプライドバイオシステムス）内の４９μＬのＰＣＲβ−アクチンマスターミックスに加え、４０ＰＣＲサイクル中に蛍光を測定した。
【００８６】
図１は閾値サイクルカウントに対する各種開始ＤＮＡレベルのキャリブレーション曲線を示しており、その値は装置により決定され、事前に選択された蛍光シグナルが得られた時点の推定ＰＣＲサイクル数を表している。即ち、βアクチン遺伝子断片に関するＴａｑＭａｎアッセイは、試料中に存在するＤＮＡ濃度を測定するための良好な分析手段を提供する。
【００８７】
実施例では続いて１コピー（細胞当たり）のβ−アクチン遺伝子からのＤＮＡが発明の方法を使い、又は細胞溶解試薬を利用する指示従来法を利用し指示サンプルから抽出された。こうして抽出されたβ−アクチンＤＮＡはＰＣＲマスターミックス及びメーカー推奨の温度サイクルプロフィールと方法によるＴａｑＭａｎ検出を利用し増幅された。
【００８８】
本発明の不均一検出システムでは、増幅産物は幾種類かの水不溶性基質上に捕捉され、反応混合液中のその他物質は濾過、遠心分離、洗浄またはその他装置技術の様な好適手段により取り除かれる。
【００８９】
捕捉プローブは既知結合技術（吸着及び共有反応を含む）を利用し水不溶性支持体に結合することができる。これら技術の一つはＥＰ−Ａ−０ ４３９ ２２２号（１９９１年９月１８日公開）に記載されている。その他技術は、例えば米国特許第４，７１３，３２６号（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら）、米国特許第４，９１４，２１０号（Ｉｅｖｅｎｓｏｎら）及びＥＰ−Ｂ−０ ０７０ ６８７号（１９８３念、１月２６日公開）に記載されている。有用な分離手段は、ポール（Ｐａｌｌ）コーポレーションより販売されているポリアミドミクロ細孔膜の様な膜による濾過を含む。
【００９０】
しかし、有用固相支持体は捕捉プローブ及び時にハイブリダイゼーション産物の固定に使用でき、マイクロタイタープレート、試験管、ビーカー、磁性またはポリマー粒子、金属、セラミックス及びガラスウール等を包含する。特に有用な材料は捕捉プローブを共有結合にて固定するのに有用な反応基を持つ磁性又はポリマー粒子である。この様な粒子は一般には約０．００１ないし約１０μメートルである。これら物質の例に関する更なる詳細は米国特許第４，９９７，７７２号（Ｓｕｔｔｏｎら）、米虚空特許第５，１４７，７７７号（Ｓｕｔｔｏｎら）、米国特許第５，１５５，１６６号（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら）及び米国特許第４，７９５，６９８号（Ｏｗｅｎら）に提供されており、これらは全て参照されここに取り込まれている。
【００９１】
捕捉プローブはポリマーフィルム、膜、濾紙、又は樹脂コーティング又は非コーティングペーパーの様な平坦支持体に固定できる。ポリマー粒子に固定された捕捉プローブもまた好適手段、例えば乾燥沈着、熱融合または接着剤による接着によりこれら平坦支持体に固定化できる。捕捉プローブは、例えば本発明の自己充足型試験装置内の平坦支持体に固定できる。これら物質のその他詳細はＥＰ−Ａ−０ ４０８ ７３８号（１９９１年１月２３日公開）、ＷＯ９２／１６６５９号（１９９２年１０月１日公開）及び米国特許第５，１７３，２６０号（Ｓｕｔｔｏｎら）に提供されている。
【００９２】
捕捉プローブは好適支持体にいかなる配置、例えば円形列またはストライプ状に沈着、配置することができる。
【００９３】
本発明はまた、標的核酸を捕捉試薬を必要することなく検出する“均一型”増幅法として知られる方法にも利用できる。この様なアッセイの詳細はＥＰ−Ａ−０ ４８７ ２１８号（１９９２年５月２７日公開）及びＥＰ−Ａ−０ ５１２ ３３４（１９９２年１１月１１日公開）の如く当分野既知である。
【００９４】
増幅反応組成体は各種増幅アッセイに関し有用である試験キットの個別包装成分の一つとして含めることができる。キットは本発明の方法に有用であるその他試薬、溶液、装置、及び指示書を含むことができ、水不溶性基質上に固定された捕捉試薬、洗浄液、検出試薬及び当業者に容易に明白なるその他材料が含まれる。更に、試験キットは上記の様な個別包装された弱塩基性ポリマー、緩衝液、弱又は強塩基、及び増幅と検体試料調整のいずれか、又は両方に必要なその他試薬を含むことができる。試験キットはまた１またはそれ以上の他キット成分を含む試験器具を含むこともできる。試験器具は好ましくは“自己充足型”であり、この用語は当分野で理解される如くの意味である。その他キットはここに記載の弱塩基性ポリマー及びハイブリダイゼーションアッセイに使用される１またはそれ以上の試薬（検出又は捕捉プローブの様な）。
【００９５】
以下の実施例は本発明の実際を例示するために加えられており、いかなる形の限定も意味しない。いずれのパーセンテージも特記無い限り重量％である。
実施例に関する材料と方法
Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）−メタクリレートの調製
本法は上記の構造（Ｉ）の新規モノマーの調製を示すが、本調製は本発明の範囲にあるその他モノマーが容易に調製できることを示す例示である。
【００９６】
溶媒混合液は、水酸化ナトリウム（１２，８ｇ、０．３２モル）を含む水（１００ｍｌ）及び１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（３７．５ｇ、０．３モル）を含むジクロロメタン（２００ｍｌ）を混合し、次に氷槽中に冷却して調整された。この冷却された混合液に、窒素雰囲気下に強く攪拌しながらメタクリロイル（３４．８ｇ、０．３モル）のジクロロメタン（１００ｍｌ）液を一度に全量加えた。発熱が起こり、混合液温度は約６０℃まで上昇し、更に１０分間混合液を激しく攪拌してから有機層を分離した。水層をジクロロメタン（各１００ｍｌ）にて２回抽出した。合わせた有機溶液（有機溶媒層及び抽出物）を飽和塩化名という無（１００ｍｌ）液にて洗浄し、無水硫酸ナトリウム上にて簡素、濾過して有機溶媒を取り除いた。残査をクロロホルム（５０ｍｌ）に溶解し、更にエチルエーテル（５０ｍｌ）をくもり点まで加えた。
【００９７】
得られた反応産物は約０℃にて結晶化し、濾過されて４５°−４６℃の融点を持つ白色固体を得た。収率は７０％であった。
【００９８】
分析データは次の通りである：ｍ／ｅ（Ｍ−１０３）
１ＮＭＲ（ＤＭＳＯ ｄ６） １．８（ｍ，２Ｈ， Ｃ− −ＣＨ２ −Ｃ， ＣＨ３）， ３．０２ （ｍ， ２Ｈ， Ｎ− ＣＨ２）， ３．９５ （ｔ， ２Ｈ， ｉｍ−ＣＨ２）， ５．２５及び５．６（ＡＢ， ２Ｈ，ビニル−ＣＨ２）， ６．８２及び７．１５（ ＡＢ， ２Ｈ， ４， ５−Ｈのｉｍ）， ７．６（ｓ， １Ｈ， ２−Ｈのｉｍ）、７．９５（ｍ、１ Ｈ， ＮＨ）。
ホモポリマーの調製
ここに記載の新規モノマーより調製された好適ホモポリマーは、窒素雰囲気下に維持しながら２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（３００ｍｇ）をＮ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド（１２．５ｇ、０．０６５モル）の水（９０ｍｌ）及びイソプロパノール（１０ｍｌ）液に加えることで調整された。得られた溶液は水層中にて攪拌しながら６５°−７０℃に３時間加熱された。開始後約１．５時間目に濃ＨＣｌ（３ｍｌ）を加え、残り時間を窒素下に攪拌を継続した。次に溶液をロータリーエバポレーターにて約２５ｍｌまで濃縮し、得られたポリマー産物をアセトン（４リットル以上）中に沈殿させ、濾過し、脱イオン水（８０ｍｌ）に溶解した。溶液は１２％の固形物を含んだ。
【００９９】
第１コポリマーの調製
ポリ［Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド塩酸塩−コ−アクリルアミド］（９０：１０重量比）は、窒素雰囲気下に維持されながら２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（４００ｍｇ）をＮ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド（１８ｇ、０．０９モル）及びアクリルアミド（２ｇ、０．０２８モル）の脱イオン水（１２０ｍｌ）及びイソプロパノール（１５ｍｌ）の溶液に加えることで調整された。溶液は攪拌しながら４時間、６５°−７０℃に加熱され、続いて希釈ＨＣｌを加えｐＨを約２まで下げてから一晩室温になるまで放置された。
【０１００】
溶液はロータリーエバポレーターにて約７５ｍｌまで濃縮され、得られたポリマーはアセトン（約４リットル）中に沈殿され、濾過され、脱イオン水（１５０ｍｌ）に溶解された。更に約１２５ｍｌまで濃縮され、残存アセトンを除いた。ポリマーは１５．５％の固形物を含んだ。
【０１０１】
第２コポリマーの調製
ポリ［２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート］（２０：８０重量比）は、窒素雰囲気下に維持されながら２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（４００ｍｇ）を２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩（４ｇ、０．０２モル）及び２−ヒドロキシエチルメタクリレート（１６ｇ、０．１２モル）の脱イオン水（１８０ｍｌ）及びエタノール（２０ｍｌ）溶液に加えることで調整された。溶液は攪拌しながら４時間、６５°−７０℃に加熱された。更に１時間、攪拌及び加熱し続けてから溶液を一晩室温になるまで放置した。
【０１０２】
溶液はアセトン（約４リットル）中に沈殿され、濾過され、脱イオン水（１５０ｍｌ）に溶解された。更に約１２５ｍｌまで濃縮され、残存アセトンを除いた。ポリマーは５．６％の固形物を含んだ。
【０１０３】
第３コポリマーの調製
ポリ［１−ビニルイミダゾール−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート］（５０：５０重量比）は、窒素雰囲気下に維持されながら２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（３５０ｍｇ）を１−ビニルイミダゾール（１０ｇ、０．１モル）及び２−ヒドロキシエチルメタクリレート（１０ｇ、０．０７７モル）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１６０ｍｌ）溶液に加えることで調整された。溶液は攪拌しながら７時間、６５°−７０℃に加熱された。
【０１０４】
室温にて一晩攪拌した後、ポリマーはアセトン（約４リットル）中に沈殿され、濾過され、濃ＨＣｌ（８．５ｍｌ）を含む脱イオン水（２００ｍｌ）に溶解された。更に濃縮され、残存アセトンを除いた。ポリマーは１２．４％の固形物を含んだ。
【０１０５】
第４コポリマーの調製
ポリ（１−ビニルイミダゾール−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート］（２５：７５重量比）は、“第３コポリマー”と同様にして調整された。得られた溶液は１３．７％の固形物を含んだ。
【０１０６】
デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ’ｓ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び凍結乾燥ウシ胸腺ＤＮＡはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）より得た。
【０１０７】
ゲル電気泳動は、増幅産物混合体（６．７５μｌ）をエチジウムブロマイド（０．４ｍｇ／ｍｌ最終濃度）にて前染色しておいたアガロースゲル（２．５％）に加えて実施された。ゲルはエチジウムブロマイド（０．４ｍｇ／ｍｌ最終濃度）を含む電気泳動緩衝液（６００ｍｌ）を利用し、約８ボルト／ｃｍにて約１時間電気泳動された。緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ホウ酸及びエチレンジアミン４酢酸の混合体であった。得られたバンドは通常の分子量マーカーと比較され、産物バンドの強度を０が検出シグナル無しを表し、５が最大シグナルを表す０ないし５のスケールで記録された（ＨＩＶ１については１１５−ｍｅｒ及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに関しては３８３−ｍｅｒ）。
【０１０８】
その他試薬及び材料は、市販品から入手するか、又は容易に入手できる材料及び通常の方法を利用し調整した。
【０１０９】
発明はその好適実施態様を具体的に参照しながら詳細記載されるが、発明の精神及び範囲内にて変型及び改良できることが理解されるだろう。
【０１１０】
実施例１−弱塩基性ホモポリマーを利用したＤＮＡの捕捉及び解離
本実施例はポリ（１−ビニルイミダゾール）を用い核酸を捕捉し及び解離する、本発明の実際を例示する。
【０１１１】
各種容積のポリ（１−ビニルイミダゾール）［２．４％保存液（ｐＨ２．３）の１：１０希釈液の］をウシ胸腺ＤＮＡ（１００μｌ、０．５μｇ／μｌ）と混合し、かき混ぜて核酸及びポリマーの沈殿を形成した。次に１分間遠心分離をおこなった。ポリマーの追加量（２．４％保存液１０μｌ）を各上清に加え、得られた混合液をかきまぜ、遠心して第１沈殿が定量的であるか決定した。下表Ｉは各資料について使用したポリマーの量及び観察された沈殿のタイプを示す。
【０１１２】
表Ｉ
2004508002.tif 000004
沈殿は酸性条件（ｐＨ２．３）にて起こること、及びポリマー保存液の１：１０希釈液５０μｌを使用するとほぼ定量的様式にウシ胸腺ＤＮＡ液（０．５μｇ／μｌ）シグマケミカル社、セントルイス、ミズリーを沈殿できることが観察された。この観察結果は更に通常のゲル電気泳動法を使用し確認された。
【０１１３】
実験は、以後の利用を目的として核酸を解離するための沈殿溶解方法を決定するために実施された。下表ＩＩは試みた各種ペレット可溶化条件と得られたペレットの大きさを示している。最も有効な技術は、塩基性ｐＨと組合せ熱を利用することであった（ペレット無し）。通常のゲル電気泳動は、塩基性ｐＨではポリマー及び核酸が遊離物質として存在していることを明瞭に示した。即ち、核酸はＰＣＲの様なその後の利用に使用可能であった。
【０１１４】
表ＩＩ
2004508002.tif 000005
＊”ＴＥ”緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）中にエチレンジアミン４酢酸（１モル）を含む。
【０１１５】
下表ＩＩＩはポリマー（保存液の１：１０希釈体５０μｌ）及びウシ胸腺ＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ液１００μｌ）間の沈殿形成に及ぼすｐＨの作用を示す。沈殿形成による核酸の効果的捕捉には酸性ｐＨが明瞭に求められた。
表ＩＩＩ
2004508002.tif 000006
実施例２−溶解試薬有り無しでのＤＮＡのポリマー捕捉の比較
溶解試薬に接触させた白血球から解離されたＤＮＡ量（コントロール）と、溶解試薬と接触させていない（発明の方法）以外は同一に処理された細胞から解離された量とを比較した。
【０１１６】
本実施例では、血液１０ｍＬをＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ ＣＰＴ細胞調整用チューブ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｃｏ．，），  フランクリンレークス、ニュージャージー（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ））に採取し、白血球（ＷＢＣ）をメーカー推奨法に従って遠心分離法にて分離した。最終ＷＢＣ濃度は顕微鏡より３．５×１０５／ｍＬと決定された。
【０１１７】
２００マイクロリットルのＷＢＣ懸濁液を８本の１．５ｍＬ微量遠心分離チューブ（エッペンドルフノースアメリカ社、マジソン、ウイスコンシン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））それぞれに加えた。白血球は遠心分離され、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ、−．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５）にて３回洗浄された。
コントロール−溶解試薬の使用
溶解試薬と接触させる試料に関しては、４本別々のチューブ内にあるペレットに次の様な処理を加えた：８０マイクロリットルの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ， ｐＨ８．０及び０．５％ ＴＷＥＥＮ ２０）を加え、続いて１０μＬの熱安定性プロテアーゼＰｒｅ−Ｔａｑ、（１Ｕ／μＬ、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルス、インディアナポリス、インディアナ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を加え、チューブを１００℃に５分間加熱した。加熱処理後、１０μＬの２５０ｍＭ ＮａＯＨを加え、チューブを再度１０５℃にて１０分間加熱し、その後１４，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。
発明の方法−溶解試薬不使用
溶解試薬に接触させない試料は、次の様に処理された；４本別々のチューブから得たペレットは１００μＬのＰＢＳに懸濁された。
【０１１８】
上記方法を用い調製された試料はその後同一に処理された：チューブは１４，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離され、各チューブの上清液が注意深く新規チューブにデカンテーションされ、分析にかけるまで室温にて保管された。各チューブのＤＮＡ含有量は上記のＴａｑＭａｎβ−アクチンアッセイ及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００シークエンスディテクターを使い、パーキンエルマー社販売のＤＮＡ標準物質に基づくキャリブレーションを利用し分析された。結果は表ＩＶにまとめられている。
表ＩＶ
溶解試薬処理有り無しで白血球から解離されたＤＮＡの比較
【０１１９】
【表１】
2004508002.tif 000007
【０１２０】
これらデータは溶解試薬存在状態では、約３００倍の量のＤＮＡが白血球から解離されることを示している。白血球から解離されたＤＮＡは原発性腫瘍からの血液中に循環している変異体、欠失またはその他ガンマーカーを有しているとは考えられないことから、これら非標的関連ＤＮＡが非特異的バックグランドを上昇させ、その結果癌に伴うＤＮＡの特異的変化の検出に基づく体液中の遊離型循環ＤＮＡに関するアッセイに有害な影響を及ぼす。
実施例３−血清からのＤＮＡ抽出に関するキアゲン社キットと発明との比較
以下実施例は、同一血清プールからのＤＮＡ抽出に関する市販のキアゲン社キットと本発明の方法の比較を示す。
【０１２１】
発明の方法に基づく血清又は血漿からのＤＮＡ単離に関して、全ての初期段階は血清ヌクレアーゼによるＤＮＡの分解の可能性を最小限にするため、氷上にて実施された。シグマケミカル社、セントルイス、ミズリーより得たＡＣＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）は２５０ｍＭ保存液、ｐＨ６．８より調整された。ＤＮＡ捕捉ポリマー、モノマー重量比７６：２４、個体成分率２．４％のポリ（１−ビニルイミダゾール塩酸塩−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）は米国特許大５，５８２，９８８号記載の方法により合成された。これはアゾ開始体を用いたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中での通常の溶液共重合を利用し作製されたランダムリニアービニル付加ポリマーである。このコポリマー（または単純ポリマー）は過剰の水と混合され、さらに透明な液体が得られるまで濃ＨＣｌが加えられた。次に溶液は透析濾過された。
【０１２２】
２００マイクロリットルの血清又は血漿が１．５ｍＬの微量遠心チューブに加えられ、続いて１００μＬのＡＣＥＳ保存緩衝液が加えられた。ボルテックスミキサーにて混合した後１５μＬの水性捕捉ポリマー液がチューブに加えられ、ボルテックスミキサーにて試料は５秒間再度混合された。チューブはエッペンドルフマイクロセントリフュージモデル５４１Ｓ（ブリンクマンインスツルメント、ウエストバリー、ニューヨーク（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， Ｎ．Ｙ．）を用い、最大速度、２分間で遠心分離され、上清液がデカンテーションされた。１００マイクロリットルの２０ｍＭＮａＯＨがペレットを含むチューブに加えられ、このチューブをボルテックスミキサーにて混合した後１００℃にて５分間加熱した。試料は４℃に維持されるか抽出直後にアッセイされ、又は使用前まで凍結保存された。
【０１２３】
比較のためＤＮＡは同時にキアゲン社、チャットワース、カリフォルニア（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐ，．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）製のＱＩＡｍｐ血液キットをメーカー推奨法に従い使用し、血清または血漿より抽出された。緩衝液ＡＬ、ＡＷ及びＡＥはキット内に提供された。２００マイクロリットルの血清をキット内に提供される２００μＬの緩衝液ＡＬ及び２５μＬのプロテナーゼＫ液（溶解試薬）と組合せ、内容物を直ぐに１５秒間ボルテックスミキサーを用い混合した。７０℃にて１０分間インキュベーションした後、２１０μＬのエタノールが加えられ、試料は再度ボルテックスミキサーを用い混合された。ＤＮＡはＱＩＡａｍｐスピンカラムにより２ｍＬの採取用チューブに抽出された。試料を加えた後、チューブは６，０００×ｇにて１分間遠心分離された。路液を含むチューブは廃棄された。５００マイクロリットルの緩衝液ＡＷが加えられ、再度カラムは１分間遠心分離され、路液を含むチューブは廃棄された。カラムは更に緩衝液ＡＷにて１回洗浄され、続いてカラムは７０℃に予熱された２００μＬの緩衝液ＡＥ又は蒸留水にて溶出された。緩衝液又は水を加えた後、チューブは室温にて１分間インキュベーションされ、続いて６，０００×ｇで１分間遠心分離された。
【０１２４】
キアゲンキット法及び発明の方法の段階比較を表Ｖに示す。発明の方法は３段階を必要とするのに対し、キアゲンキットは少なくとも８段階を必要とする。
表Ｖ
発明の方法とキアゲン法を使用したＤＮＡ抽出に含まれる段階の比較
2004508002.tif 000008
ＴａｑＭａｎ β−アクチン法（８重測定）にて測定された増幅β−アクチンＤＮＡの比較は表ＶＩに示されており、キアゲン法（２５．３ｎｇ／ｍＬ血清）に比較し発明の方法（６０．６ｎｇ／ｍＬ）を用いた場合に回収可能な増幅ＤＮＡが５８％改善されることを示している。
【０１２５】
表ＶＩ
本発明の方法とＱｉａｇｅｎ法を使ったβ−アクチンＤＮＡ抽出の比較
【０１２７】
【表２】
2004508002.tif 000009
【０１２８】
実施例４−本発明の方法を使った、膵癌と診断された個体および対照個体の血清からのβ−アクチンＤＮＡの回収
本実施例は、本明細書中の実施例８の材料と手順を使った、正常患者と膵癌患者の血清から回収されるβ−アクチンＤＮＡの量の定量方法を提供する実験の結果を示す。こうして各試料から回収されたβ−アクチンＤＮＡを、前述のＴａｑＭａｎ β−アクチンプロトコルを使って定量した。
【０１２９】
表ＶＩＩに示す通り、同一ヒト血清プールからの計８個の反復試験試料は血清１ｍＬあたり平均１２ ｎｇ（１２ ｎｇ／ｍＬ）のβ−アクチンＤＮＡを与えたのに対し、本発明の方法を使って回収された１０人の異なる膵癌患者の血清中のβ−アクチンＤＮＡは大きく増加した（平均＝１４６ ｎｇ／ｍＬ）。正常血清のものに比較して膵癌を有する個体の血清中でβ−アクチンＤＮＡが増加するという観察結果は、文献中の幾つかの報告（４，９）により裏付けられる。
【０１３０】
表ＶＩＩ
本発明の方法を使った、正常血清プールおよび膵癌を有する個体の血清からのβ−アクチンＤＮＡの抽出
【０１３１】
【表３】
2004508002.tif 000010
【０１３２】
実施例５−膵癌と診断された個体の血清からのβ−アクチンＤＮＡの回収に関する本発明の方法とＱｉａｇｅｎ法との比較
本実施例では、膵癌と確認された６人の患者からのβ−アクチンＤＮＡの回収を、本明細書中の実施例３の材料と手順に従って、本発明の方法とＱｉａｇｅｎ法を使って比較した。一般に、表ＶＩＩＩに示す通り、ＴａｑＭａｎ β−アクチンアッセイによりアッセイすると本発明の方法は同等もしくはより高レベルのβ−アクチンＤＮＡを提供した。試料によって異なるが、測定可能なＤＮＡ濃度は３１〜３１０ ｎｇ／ｍＬの範囲であった。
【０１３３】
表ＶＩＩＩ
本発明の方法とＱｉａｇｅｎ法を使った、膵癌を有する個体の血清からのβ−アクチンＤＮＡ抽出の比較
【０１３４】
【表４】
2004508002.tif 000011
【０１３５】
上記結果は、６反復測定の平均である試料１と試料２を除いて、各試料あたり４反復測定の平均である。Ｑｉａｇｅｎプロトコルを使って評価した試料２の結果は２反復測定の平均である。
【０１３６】
実施例６−本発明の方法を使った、正常個体と癌患者の血清からの循環ＤＮＡの単離
本実施例は、２０人の正常個体と３０人の癌診断された個体の血清からの循環ＤＮＡの単離に本発明の方法が利用できることを示す。癌患者血清は１０人の確定膵癌患者試料と２０人の結腸癌患者試料（８人がＤｕｋｅｓ Ｂ、５人がＤｕｋｅｓ Ｃおよび７人がＤｕｋｅｓ Ｄ）を含んだ。本明細書中の実施例２に記載の手順と同様に本発明の方法に従ってＤＮＡを単離した。ＴａｑＭａｎ β−アクチンアッセイを使ってＤＮＡを定量した。溶解試薬を使用しないポリマー捕捉は、望ましくない細胞溶解からくるＤＮＡ汚染が最小または皆無であることそして血清中に存在し得るＰＣＲ干渉物が除去されることにより、循環ＤＮＡを濃縮させることが可能であった。各血清中のＤＮＡは図１に示される標準曲線を使ってβ−アクチン遺伝子についてのＴａｑＭａｎアッセイを用いて定量した。
【０１３７】
各試料中の遊離形循環ＤＮＡについての分析結果を表ＩＸ ＡとＩＸ Ｂに示す。この結果は、正常個体からの血清に比べて癌患者からの血清においてＤＮＡレベルが上昇することを示す。
【０１３８】
表ＩＸ Ａ
癌患者の血清中のＤＮＡ含量
【０１３９】
【表５】
2004508002.tif 000012
【０１４０】
表ＩＸ Ｂ
正常個体の血清中のＤＮＡ含量
【０１４１】
【表６】
2004508002.tif 000013
【０１４２】
実施例７−膵癌患者の血清中のＫ−ｒａｓ変異の検出
本実施例では、膵癌患者の血清からのＤＮＡのポリマー捕捉を含む本発明の一態様を使用する。制限エンドヌクレアーゼ媒介選択的ＰＣＲ（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）を実施し〔Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｎ．Ｊ．他， １９９９， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７（３）： ４１８−４２２， Ｗａｒｄ， Ｒ．他， １９９８， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３ （２）： ３７３−３７９およびＷＯ ９６／３２５００〕、続いてゲル分析を使ってコドン１２のところのＫ−ｒａｓ変異（Ｋ１２−ｒａｓ）の存在を検出した。
【０１４３】
３人の膵癌患者の各々からの血清または血漿（３００μＬ）を別々の遠心管に入れ、次いで１００μＬの２５０ ｍＭ ＡＣＥＳ〔Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸〕緩衝液（２３℃でｐＨ ６．８）を添加した。１５μＬのポリ（１−ビニルイミダゾール−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（重量比７７／２３）ポリマーを添加し（米国特許第５，４３４，２７０号；同第５，５２３，３６８号および同第５，５８２，９８８号参照）、そしてＭｉｎｉ Ｖｏｒｔｅｘｅｒ（ＶＭＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎ．Ｙ．）を使って遠心管を１０秒間混合した。次いでその遠心管をエッペンドルフ超遠心機５４１５型中で最高速度において２分間遠心分離した。上澄み液（上清）をデカンテーションし、各管に１００μＬの２０ ｍＭ水酸化ナトリウムを加え、混合してペレットを再懸濁させ、そして１００℃に１０分間加熱した。
【０１４４】
各ＰＣＲ混合物は３組のプライマーを含んだ。診断プライマーは野生型ｒａｓ中にＢｓｔｎ１制限部位を誘導するがコドン１２のｒａｓ変異には該制限部位を誘導しない。よって、ＰＣＲ熱循環の間にｒａｓ野生型ＤＮＡが選択的に開裂され、コドン１２のｒａｓの変異配列が濃縮される。ＰＣＲ対照プライマー対はＰＣＲ増幅可能ＤＮＡが抽出されたことを確かめるために用いられ、そして酵素対照プライマー対は熱循環中に制限酵素が機能したことを確かめるために用いられる。反応混合物は１２単位／１００μＬの組換えＴａｑポリメラーゼ、前記ポリメラーゼに対して重量で５倍過剰（０．８４２μＬ）のＴａｑ阻害抗体ＴＰ４−９．２（米国特許第５，３３８，６７１号と同第５，５８７，２８７号参照）、１ｍＭ ＨＴ５０緩衝剤〔１００ ｍＭ塩化ナトリウム、５０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）〕ｐＨ ８．３、０．３μＭの診断プライマー（下記参照）５Ｋ１５Ｓ（配列番号１）と５Ｋ３７（配列番号２）、０．０５μＭのＰＣＲ対照プライマー対３Ｋ４２（配列番号３）と５ＢＫ５（配列番号４）、０．１μＭの酵素対照プライマー対５Ｎ１２Ａ（配列番号５）と３Ｎ１３Ａ（配列番号６）、０．２ ｍＭの全ジヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、０．３単位／μＬのＢｓｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｙ， ＭＡ）、１ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ ｍＭ塩化マグネシウム、試料（典型的には３μＬ）、および最終容量１００μＬまでの脱イオン水を含んだ。Ｔａｑポリメラーゼと抗Ｔａｑ抗体を混合し、そして１０〜１５分間インキュベートした後、その他のＰＣＲ成分を添加した。熱循環パラメーターは次の通りであった：９４℃で１００秒を１サイクル、そして９２℃で１５秒と６０℃で６０秒を３６サイクル。プライマー配列は下記の通りである：
【０１４５】
【化４】
2004508002.tif 000014
【０１４６】
４％（ｗ／ｖ）ＮＵＳｉｅｖｅアガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ）上での電気泳動により試料を分析し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ ＩＩビデオシステム（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）により画像診断した。
【０１４７】
図２は、ＲＥＭＳ−ＰＣＲ後にゲル電気泳動により測定した時のＫ−１２ ｒａｓ変異についての分析結果を示す。レーン１は、ｒａｓが野生型であるＫ−５６２についての結果を示す。レーン２は、コドン１２のＫ−ｒａｓ変異がヘテロ接合であるＣａｌｕ１ ＤＮＡ（Ｃａｐｏｎ， Ｄ．Ｊ．他， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ４０３： ５０７−５１３）と１０倍過剰のＫ−５６２野生型ＤＮＡについての結果を示す。この試料は１６７ ｂｐのところに強いＰＣＲ対照バンドと６８ ｂｐのところに強い診断バンドを示した。患者１からの血清と血漿は両方とも、６８ ｂｐの診断バンドを欠いており、Ｋ−ｒａｓ陰性である。ＰＣＲ増幅可能ＤＮＡの存在は１６７ ｂｐのところのＰＣＲ対照バンドにより示される。患者２からの血漿および血清試料は１６７ ｂｐのＰＣＲ対照バンドを欠いており、このことは、この試料中に増幅可能な循環ＤＮＡが検出可能なレベルで全く存在しないことを示唆する。膵癌患者３からの血清と血漿は共に、６８ ｂｐのところのバンドと１６７ ｂｐのところの強いＰＣＲ対照バンドにより示されるように、Ｋ−１２ ｒａｓ変異について陽性であった。１２６ ｂｐのところの酵素対照バンドは図２の全ての試料において存在せず、このことは、制限酵素がＰＣＲ循環中に活性であったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
４０回のＰＣＲサイクルを利用したβアクチン遺伝子のＴａｑＭａｎ増幅により評価した、ＤＮＡに関する標準曲線を例示する。
【図２】
実施例７によるＲＥＭＳ−ＰＣＲ後のゲル電気泳動により決定されたＫ−１２ｒａｓ突然変異に関する分析結果を例示する。