(57)【要約】インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングするのに有用なツールとなるリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用する蛋白質をスクリーニングする方法を開示する。前記方法により、主作用リガンド依存性ＰＰＡＲ結合分子ＥＣＨＬＰ、主作用リガンド選択的ＰＰＡＲγ作用因子ＦＬＪ１３１１１及び副作用リガンド依存性ＰＰＡＲ結合分子ＡＯＰ２を得た。ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ、ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１及びＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２を用いることにより、主作用を選択的にもたらして副作用を引き起こさないインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング系を構築しこれを開示する。また、前記スクリーニング方法により得ることができる、ＰＰＡＲの主作用促進剤、ＰＰＡＲの主作用特異的アゴニスト、ＰＰＡＲの主作用を促進するＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ阻害剤、ＰＰＡＲγの副作用を抑制する物質、ＰＰＡＲγの副作用を抑制するＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２阻害剤、ＰＰＡＲの主作用を促進するＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１活性化剤、又はＦＬＪ１３１１１発現亢進剤を有効成分とするインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖代謝改善作用惹起効果の高いＰＰＡＲリガンド存在下で、バイト（ｂａｉｔ）として配列番号２で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくとも第２０４番目から５０５番目を含む領域をコードするポリヌクレオチドを用い、プレイ（ｐｒｅｙ）としてｃＤＮＡライブラリーを用いる酵母ツーハイブリッドシステムを利用した、リガンド依存的にＰＰＡＲγと相互作用する蛋白質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
浮腫惹起効果の高いＰＰＡＲリガンド存在下で、バイト（ｂａｉｔ）として配列番号２で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくとも第２０４番目から５０５番目を含む領域をコードするポリヌクレオチドを用い、プレイ（ｐｒｅｙ）としてｃＤＮＡライブラリーを用いる酵母ツーハイブリッドシステムを利用した、リガンド依存的にＰＰＡＲγと相互作用する蛋白質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
ｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質の少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードする遺伝子、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質を発現している細胞。
【請求項４】
ｉ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質の少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域からなる融合蛋白質をコードする遺伝子、及び、ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質を発現している細胞。
【請求項５】
転写因子が酵母のＧＡＬ４蛋白質である請求の範囲３または４記載の細胞。
【請求項６】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求の範囲３または４記載の細胞。
【請求項７】
ｉ）請求項３に記載の細胞、ＰＰＡＲリガンド、及び被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該リガンド依存的な相互作用の変化または該リガンド依存的なＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、被験物質がＰＰＡＲを介した糖代謝改善作用を促進するか否かを検出する方法。
【請求項８】
ｉ）請求項３に記載の細胞、ＰＰＡＲリガンド、及び被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該リガンド依存的な相互作用の変化または該リガンド依存的なＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項９】
インスリン抵抗性改善薬が糖代謝改善剤である請求の範囲８記載のスクリーニング方法
【請求項１０】
ｉ）請求の範囲４に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、被験物質がＰＰＡＲを介する浮腫惹起活性を促進するか否かを検出する方法。
【請求項１１】
ｉ）請求の範囲４に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程、及びｉｉｉ）レポーター活性を増大させない被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする、浮腫惹起活性のないインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
インスリン抵抗性改善薬が糖代謝改善剤である請求の範囲１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ｉ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質の少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードする遺伝子、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質を発現している細胞。
【請求項１４】
ｉ）請求の範囲１３に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、被験物質がＰＰＡＲを介した糖代謝改善作用を促進するか否かを検出する方法。
【請求項１５】
ｉ）請求の範囲１３に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
インスリン抵抗性改善薬が糖代謝改善剤である請求の範囲１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ｉ）配列番号２６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号２６で表される塩基配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／または挿入されたポリヌクレオチド配列を含みかつ転写プロモーター活性を有するポリヌクレオチド
に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として被験物質による転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求の範囲１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求の範囲８、１１、１５及び／又は１７に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、リガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用する蛋白質をスクリーニングする方法、該蛋白質を利用したインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法に関する。
背景技術
インスリン抵抗性改善薬として効果が認められているチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲγ）のアゴニストとして作用することが示されている（非特許文献１参照）。チアゾリジン誘導体のＰＰＡＲγとの親和性は生体内の血糖降下作用と相関することから、該化合物群のインスリン抵抗性改善作用はＰＰＡＲγを介した作用であると考えられている（非特許文献２参照）。このためＰＰＡＲγのアゴニストの検出方法はインスリン抵抗性糖尿病治療薬をスクリーニングする有効な手法であると考えられてきた。
糖尿病は、膵臓から分泌されるインスリンの作用不足から引き起こされるが主に２つのタイプが存在する。１型糖尿病と呼ばれるものは膵臓のβ細胞が破壊されて発病し、治療にはインスリンを必要とする。一方で２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）は遺伝的な要素に過食や運動不足、ストレスなど、身体に負担となる生活習慣が加わり発病する。日本人の糖尿病では１型はごくわずかで２型が大部分を占めており、２型糖尿病患者ではインスリンによる糖代謝促進が起こりにくいインスリン抵抗性が生じている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性改善により糖代謝を促進する２型糖尿病の治療を対象とした研究が進められてきた。
ＰＰＡＲは核内受容体スーパーファミリーに属し、リガンドの結合によって活性化される転写促進因子として標的遺伝子上流にある応答配列に結合し、その転写を誘導することが知られている（非特許文献３参照）。
ＰＰＡＲには３つのサブタイプの存在が知られており、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγと称する（非特許文献４−５参照）。更に、種々の化合物について、ＰＰＡＲのサブタイプの活性化やその血糖、あるいは脂質低下作用についての報告がなされている。例えば、糖尿病治療薬であるチアゾリジン誘導体はＰＰＡＲγのリガンドであり、血清中のトリグリセリドレベルを有意に低下させることが知られている（非特許文献６−９参照）。一方、古くから脂質低下薬として用いられているフィブレート系薬剤は、ＰＰＡＲαのリガンド効果を有することが知られており、臨床では、強い血清トリアシルグリセロールレベルの低下が認められている（非特許文献１０−１１参照）。
ＰＰＡＲγアゴニストは細胞の増殖を停止し、細胞分化を促進することが報告されている（非特許文献１２参照）。ＰＰＡＲγは特に脂肪組織で発現が認められ（非特許文献１３−１４参照）、ホモ欠損型マウスでは脂肪細胞の分化誘導が起こらない。またＰＰＡＲγのアゴニストとして作用するチアゾリジン誘導体の投与は大型脂肪細胞の減少と小型脂肪細胞の増加を引き起こす（非特許文献１５参照）。以上の知見から、チアゾリジン誘導体がインスリン抵抗性を改善する機構はＰＰＡＲγアゴニストが急速に脂肪細胞の分化を促進する結果、インスリン抵抗性誘発原因物質であるＴＮＦαの産生抑制、末梢組織でのグルコーストランスポーター発現の促進、遊離脂肪酸産生の抑制が起こり、結果、細胞内への糖取り込みが亢進して高血糖が改善されると考えられている。（非特許文献１６参照）。
近年チアゾリジン誘導体を用いた臨床での知見から、ＰＰＡＲγのアゴニスト作用を持つ従来の合成リガンドは、インスリン抵抗性改善作用のみでなく、いずれも生体内の循環血漿量を増大させて浮腫を惹起することが報告された（非特許文献１７−１８参照）。このＰＰＡＲγの合成アゴニストによる浮腫の惹起は心肥大等をもたらす重篤な副作用であり、インスリン抵抗性改善という主作用との乖離が強く望まれている。しかしながら、これまでＰＰＡＲγとリガンドの複合体がどのようなシグナル経路を介して前述の脂肪細胞の分化及びインスリン抵抗性改善と、浮腫の惹起という異なる応答を誘導するのか、そこに至る分子メカニズムは解明されていない。
ＰＰＡＲの転写因子活性には他の核内受容体同様に転写共役因子群との相互作用が必要であり、ＰＰＡＲと相互作用する因子を同定しようとする試みがなされて来た。実際に、生化学的な手法により、既存の核内受容体相互作用因子とＰＰＡＲγとの結合が調べられており、ＳＲＣ−１（非特許文献１９参照）、ＣＢＰ／ｐ３００（非特許文献２０参照）、ＤＲＩＰ２０５、ＴＲＡＰ２２０（非特許文献２１参照）、ＳＭＲＴ（非特許文献２２参照）、Ｇａｄｄ４５（非特許文献２３参照）、ＲＩＰ１４０（非特許文献２４参照）など複数の分子がＰＰＡＲγと相互作用することが報告されている。同じく生化学的な手法で、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ：ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）がＰＰＡＲとリガンドの存在依存的にヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子上流の応答配列に結合することが報告されている（非特許文献２５参照）。しかしながら、これらの共役因子群のアゴニスト依存性や、下流のシグナル経路にどのように関わるか、その詳細な機構は明らかでない。
一方、新規の核内受容体の相互作用因子を網羅的に探索する方法として、リガンドを介在させた、酵母ツーハイブリッドシステム（Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）（非特許文献２６参照）を用いる手法が広く用いられてきたが、ことＰＰＡＲγに関してはこれまで酵母ツーハイブリッドシステムでリガンド依存的な結合因子を見つけることが困難であった。リガンドを介在させない酵母ツーハイブリッドシステムでＰＰＡＲγ結合因子を探索した結果では、ＰＢＰ（非特許文献２７参照）、ＰＧＣ−１（非特許文献２８参照）、ＰＧＣ−２（非特許文献２９参照）、ＳＨＰ（非特許文献３０参照）などのＰＰＡＲγ結合因子が報告されているが、いずれの因子もリガンドの非存在下においてもＰＰＡＲγと相互作用しており、明らかなリガンド依存的ＰＰＡＲγ結合因子は得られてこなかった。また酵母ツーハイブリッドシステムでＰＰＡＲγと相互作用因子の結合におけるリガンド依存性を検出したとするわずかな報告例は、いずれも既存の核内受容体の相互作用因子をＰＰＡＲγとともに発現させた酵母を培養、濃縮して相互作用を検出したもので（特許文献１及び非特許文献２４参照）、ｃＤＮＡライブラリーから明らかなリガンド依存性を有するＰＰＡＲγの相互作用因子を、酵母ツーハイブリッドシステムでスクリーニングすることに成功した事例はなかった。例えば、上述のＧａｄｄ４５及びＰＧＣ−１は、サブタイプのＰＰＡＲαを含めて核内受容体とのリガンド依存的な相互作用が酵母ツーハイブリッドシステムで検出されているにもかかわらず、ＰＰＡＲγに関しては生化学的手法でしかリガンド依存性が見られない（非特許文献２４参照）。生化学的手法と酵母を用いる手法では感度、プローブ対相互作用因子の比率が異なるため、ＰＰＡＲγリガンドの作用を酵母ツーハイブリッドシステムでは効率よく検出できないと説明されてきた（非特許文献２４参照）。しかし生化学的な手法は１対の蛋白質間の相互作用を検出するのには適しているが、特定の蛋白質に相互作用する蛋白質を網羅的に検索することが困難である。一方酵母ツーハイブリッドシステムでは特定の蛋白質と相互作用する蛋白質をライブラリー中から検索することが可能である。
以上述べたように、浮腫の惹起という副作用とインスリン抵抗性改善という主作用との乖離が強く望まれていながら、そこに至る分子メカニズムは解明されておらず、メカニズムの解明と副作用の少ないインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法が待望されていた。
一方、ＥＣＨＬＰ／Ｅｃｈ１は分子内に脂肪酸代謝に働くエノイルＣｏＡ加水酵素（ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ）とジエノイルＣｏＡ異性化酵素（ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）の２種類の酵素活性領域と予想される構造を有しており（非特許文献３１参照）、配列に関して種々の報告があるが（特許文献２−７参照）、その生理機能は明らかではなかった。ＡＯＰ２は分子内にペルオキシダーゼ様配列を持つことから抗オキシダント蛋白質２（ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１４１５）と呼称されており配列に関して種々の報告がある（特許文献８−１２参照）。実際の生理活性としてはカルシウム非依存性のフォスフォリパーゼＡ２として機能する報告があり（非特許文献３２参照）、またマウスでは同Ａｏｐ２蛋白質の遺伝子座が多嚢胞性腎症の原因遺伝子として報告されている（非特許文献３３参照）。このようにＡＯＰ２はそのアミノ酸配列構造から予想される分子機能とは異なる作用を持つことが明らかであり、その本来の生理機能は確定されていない。ＦＬＪ１３１１１の配列に関する報告はあるが（特許文献１３−１４参照）、ＦＬＪ１３１１１は機能未知の蛋白質であり、アミノ酸配列から分子内に細胞核内の存在を示唆する核標的配列やグリコシル化を受けうる部位の存在が予想される他はアミノ酸配列構造から分子機能を示唆する情報はなかった。
（特許文献１）特開平１１−５６３６９号公報
（特許文献２）国際公開第００／５５３５０号パンフレット
（特許文献３）国際公開第０２／２９１０３号パンフレット
（特許文献４）国際公開第０２／００６７７号パンフレット
（特許文献５）国際公開第０１／４９７１６号パンフレット
（特許文献６）国際公開第００／３７６４３号パンフレット
（特許文献７）国際公開第０１／７５０６７号パンフレット
（特許文献８）国際公開第９８／４３６６６号パンフレット
（特許文献９）国際公開第０２／１２３２８号パンフレット
（特許文献１０）国際公開第０２／２９０８６号パンフレット
（特許文献１１）国際公開第０２／０６３１７号パンフレット
（特許文献１２）国際公開第０１／５５３０１号パンフレット
（特許文献１３）欧州特許出願公開第１０７４６１７号明細書
（特許文献１４）国際公開第００／５８４７３
（非特許文献１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，第２７０巻，ｐ．１２９５３−１２９５６
（非特許文献２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年，第３９巻，ｐ．６６５−６６８
（非特許文献３）Ｃｅｌｌ，１９９５年，第８３巻，ｐ．８３５−８３９
（非特許文献４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４年、第９１巻、ｐ．７３５５−７３５９
（非特許文献５）蛋白質・核酸・酵素，１９９５年，第４０巻，第１３号、ｐ．５０−５５
（非特許文献６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９７年，第４６巻，ｐ．４３３−４３９
（非特許文献７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，１９９６年，第１９巻，第２号，ｐ．１５１−１５６
（非特許文献８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，１９９２年，第１５巻，第２号，ｐ．１９３−２０３
（非特許文献９）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１９９６年，第３９巻，ｐ．７０１−７０９
（非特許文献１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７年，第９４巻、ｐ．４３１２−４３１７
（非特許文献１１）Ｄｒｕｇｓ，１９９０年，第４０巻，第２号，ｐ．２６０−２９０
（非特許文献１２）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９年，第９０巻，ｐ．７５
（非特許文献１３）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，１９９４年，第８巻，ｐ．１２２４−１２３４
（非特許文献１４）Ｃｅｌｌ，１９９４年，第７９巻，ｐ．１１４７−１１５６
（非特許文献１５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１９９９年，第４巻，ｐ．５９７−６０９
（非特許文献１６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，第２７０巻，ｐ．１２９５３−１２９５６
（非特許文献１７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ，１９９９年，第１０巻，ｐ．８１１−８１８
（非特許文献１８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ，１９９９年，第１０巻，ｐ．８１９−８２４
（非特許文献１９）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．，１９９６年，第６巻，ｐ．１８５−１９５
（非特許文献２０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，ｐ．７６８１−７６８８
（非特許文献２１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２０巻，ｐ．８００８−８０１７
（非特許文献２２）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，ｐ．２９２０−２９２５
（非特許文献２３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０００年，第２７２巻，第１号，ｐ．１９３−１９８
（非特許文献２４）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９８年，第１２巻，第６号，ｐ．８６４−８８１
（非特許文献２５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９９６年，第１２巻，ｐ．３３５−３６３
（非特許文献２６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１年，第８８巻，ｐ．９５７８−９５８２
（非特許文献２７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，ｐ．７６８１−７６８８
（非特許文献２８）Ｃｅｌｌ，１９９８年，第９２巻，ｐ．８２９−８３９
（非特許文献２９）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９９年，第１８巻，第１３号，ｐ．３６７６−３６８７
（非特許文献３０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９９７年，第１巻，第１３５０号，ｐ．２７−３２
（非特許文献３１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年，２７３巻１号：ｐ．３４９−３５５
（非特許文献３２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７年，２７２巻１６号ｐ．１０９８１
（非特許文献３３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７年，４２巻３号ｐ．４７４−４７８
発明の開示
本発明者らは、酵母ツーハイブリッドシステムに、活性の高いＰＰＡＲγアゴニストを高濃度で介在させる独自の手法により、糖代謝改善作用（主作用）惹起効果の高いアゴニストの存在に依存してＰＰＡＲγに結合する蛋白質群、および浮腫（副作用）惹起効果の高いアゴニストの存在に依存してＰＰＡＲγに結合する蛋白質群を同定した。その結果、主作用アゴニストに依存してＰＰＡＲγに結合する分子として、ＥＣＨ−１（ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ）様蛋白質（ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＣＨＬＰ）を、副作用アゴニストに依存してＰＰＡＲγに結合する分子として、ヒト抗オキシダント蛋白質２（ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２またはｎｏｎ−ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ａｃｉｄｉｃ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１４１５、以下ＡＯＰ２と略記する）を見出した。
細胞中でＥＣＨＬＰが過剰に発現するとリガンド依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性を顕著に抑制することを見出した。さらに同蛋白質は糖尿病モデルマウスにおいて血糖値の変動に関わらず発現量が亢進していることを遺伝子チップ法で測定し、同蛋白質が糖尿病態の原因因子であることを確認した。また、細胞中でＡＯＰ２が過剰に発現するとリガンド依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性を顕著に促進することを見出した。さらにＡＯＰ２は糖尿病モデルマウスにおいてその蛋白質量が増大していることを２次元電気泳動法で検定し、糖尿病態における同蛋白質の過剰な存在が、ＰＰＡＲγを介して浮腫をもたらす特定の遺伝子群の発現を亢進させることを確認した。
同様に上記の酵母ツーハイブリッドシステムに活性の高いＰＰＡＲγアゴニストを高濃度で介在させる独自の手法により、主作用アゴニストに依存してＰＰＡＲγに結合する分子として、ＦＬＪ１３１１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０２３１７３）を見出した。さらに細胞中でＦＬＪ１３１１１蛋白質が過剰に発現すると主作用アゴニストに依存してＰＰＡＲγの転写誘導活性が顕著に亢進することを見出した。さらに、ＦＬＪ１３１１１遺伝子は、糖尿病モデルマウスの筋肉において発現が顕著に減少していることを確認した。ＦＬＪ１３１１１のプロモーター領域を新規に取得し、ＦＬＪ１３１１１のプロモーターアッセイを構築した。該アッセイは、ＰＰＡＲγ蛋白質を利用せずにＰＰＡＲγリガンドあるいはインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングするために利用できる。
これらの知見をもとにして、ＰＰＡＲを介して主作用に特異的に寄与し、副作用を惹起しない物質を検出する新しいインスリン抵抗性改善薬の同定およびスクリーニング方法を提供し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）糖代謝改善作用惹起効果の高いＰＰＡＲリガンド存在下で、バイト（ｂａｉｔ）として配列番号２で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくとも第２０４番目から５０５番目を含む領域をコードするポリヌクレオチドを用い、プレイ（ｐｒｅｙ）としてｃＤＮＡライブラリーを用いる酵母ツーハイブリッドシステムを利用した、リガンド依存的にＰＰＡＲγと相互作用する蛋白質をスクリーニングする方法、
（２）浮腫惹起効果の高いＰＰＡＲリガンド存在下で、バイト（ｂａｉｔ）として配列番号２で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくとも第２０４番目から５０５番目を含む領域をコードするポリヌクレオチドを用い、プレイ（ｐｒｅｙ）としてｃＤＮＡライブラリーを用いる酵母ツーハイブリッドシステムを利用した、リガンド依存的にＰＰＡＲγと相互作用する蛋白質をスクリーニングする方法、
（３）ｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質の少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードする遺伝子、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質を発現している細胞、
（４）ｉ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質の少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域からなる融合蛋白質をコードする遺伝子、及び、ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質を発現している細胞、
（５）転写因子が酵母のＧＡＬ４蛋白質である（３）または（４）記載の細胞、
（６）レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である（３）または（４）記載の細胞、
（７）ｉ）（３）に記載の細胞、ＰＰＡＲリガンド、及び被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該リガンド依存的な相互作用の変化または該リガンド依存的なＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、被験物質がＰＰＡＲを介した糖代謝改善作用を促進するか否かを検出する方法、
（８）ｉ）（３）に記載の細胞、ＰＰＡＲリガンド、及び被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該リガンド依存的な相互作用の変化または該リガンド依存的なＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
（９）インスリン抵抗性改善薬が糖代謝改善剤である（８）記載のスクリーニング方法、
（１０）ｉ）（４）に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、被験物質がＰＰＡＲを介する浮腫惹起活性を促進するか否かを検出する方法、
（１１）ｉ）（４）に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程、及びｉｉｉ）レポーター活性を増大させない被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする、浮腫惹起活性のないインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
（１２）インスリン抵抗性改善薬が糖代謝改善剤である（１１）記載のスクリーニング方法
（１３）ｉ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質の少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードする遺伝子、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号２または配列番号６で表されるＰＰＡＲ蛋白質を発現している細胞、
（１４）ｉ）（１３）に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、被験物質がＰＰＡＲを介した糖代謝改善作用を促進するか否かを検出する方法、
（１５）ｉ）（１３）に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として該被験物質による相互作用の変化または該被験物質によるＰＰＡＲの転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
（１６）インスリン抵抗性改善薬が糖代謝改善剤である（１５）記載のスクリーニング方法、
（１７）ｉ）配列番号２６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号２６で表される塩基配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／または挿入されたポリヌクレオチド配列を含みかつ転写プロモーター活性を有するポリヌクレオチド
に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として被験物質による転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
（１８）レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である（１７）に記載の方法、
（１９）（８）、（１１）、（１５）及び／又は（１７）に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
配列番号４からなるＥＣＨＬＰの全長又は部分配列と高い相同性を有するアミノ酸配列及び該配列をコードする塩基配列については種々の報告（ＷＯ００／５５３５０、ＷＯ０２／２９１０３、ＷＯ０２／００６７７、ＷＯ０１／４９７１６、ＷＯ００／３７６４３、ＷＯ０１／７５０６７）があるが、いずれにもＥＣＨＬＰがインスリン抵抗性に関与するとの記載はない。配列番号８からなるＡＯＰ２の全長又は部分配列及びそれらと高い相同性を有するアミノ酸配列及び該配列をコードする塩基配列については種々の報告（ＷＯ９８／４３６６６、Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．１９９９  Ｗｉｎｔｅｒ；１（４）：５７１−８４．Ｒｅｖｉｅｗ．、ＷＯ２００２１２３２８、ＷＯ２００２２９０８６、ＷＯ２００２０６３１７）があるが、いずれにもＡＯＰ２がインスリン抵抗性に関与するとの記載はない。ＷＯ０１／５５３０１には本発明者らが同定したＡＯＰ２と同一の配列が示され、該配列の機能を調整する物質の用途として多数の疾患の治療が列挙された中に糖尿病治療が含まれるが、該配列が糖尿病に関与するとの裏付けの実施例及び記載はない。配列番号１７からなるＦＬＪ１３１１１と同一のアミノ酸配列及び該配列をコードする塩基配列については、ＥＰ１０７４６１７において開示されているが、同報告においてはＦＬＪ１３１１１の関与する特定の疾患名の記載がない。ＦＬＪ１３１１１の塩基配列と相同性を有する配列はＷＯ００／５８４７３に開示されており、該配列の機能を調整する物質の用途として多数の疾患の治療が列挙された中に糖尿病治療が含まれるが、該配列が糖尿病に関与するとの裏付けの実施例及び記載はない。従って、ＥＣＨＬＰ、ＡＯＰ２、及びＦＬＪ１３１１１がＰＰＡＲと結合することは本発明者らが初めて見出した知見であり、更には、これらを用いることによりＰＰＡＲを介して主作用に特異的に寄与し、副作用を惹起しない物質を検出する新しいインスリン抵抗性改善薬スクリーニングは本願発明者らが初めて行った発明である。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「主作用」は「糖代謝改善作用」を、「副作用」は「浮腫を惹起する作用」を表す。糖代謝改善作用とは、細胞内に血液中の糖（グルコース）を取り込んでエネルギーとして消費したり、グリコーゲンのようなエネルギー貯蔵物質として蓄積する機能を促進する作用をいう。浮腫を惹起する作用とは、細胞外液が間質に蓄積、貯留して浮腫（むくみ）を惹起させる効果をいう。「主作用リガンド」は「糖代謝改善作用（主作用）惹起効果の高いリガンド」を、「副作用リガンド」は「浮腫（副作用）惹起効果の高いリガンド」を表す。糖代謝改善作用惹起効果の高いリガンドとしては、Ｍｉｗａ  Ｉらの血糖測定法（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３７巻５３８頁１９７２年）において、より好ましくは、実施例１の条件の下で、対照群に比較して血糖値を２５％低下させるのに必要な化合物濃度が従来型のＰＰＡＲγリガンド（例えばピオグリタゾン）に比較して、５分の１以下の低濃度、より好ましくは、１０分の１以下の低濃度であるものが好ましい。例えば、後述のＧＷ−７２８２やＧＩ−２６２５７０などを例示できる。なおＭｉｗａ  Ｉらの血糖測定法とは、ムタローゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法により血糖値を測定するものである。浮腫惹起効果の高いリガンドとしては、Ｂｒｉｚｚｅｅ  ＢＬらの循環血漿量測定法（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６９（６）：２０９１−２０９６，１９９０）において、より好ましくは実施例１の条件の下で、１００ｍｇ／ｋｇの化合物を投与したときに二週間で対照群に比較して２５％以上の循環血漿量の増大をもたらすもの、あるいは従来型のＰＰＡＲγリガンド（例えばピオグリタゾン）に比較して１５％以上の循環血漿量の増大をもたらすものが好ましい。例えば、後述のＧＷ−７２８２やＧＬ−１０００８５などを例示できる。「試験用細胞」は「ＰＰＡＲとＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰとのリガンド依存的な相互作用をレポーター遺伝子の発現を指標として測定できる細胞」、「ＰＰＡＲとＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２とのリガンド依存的な相互作用をレポーター遺伝子の発現を指標として測定できる細胞」、または「ＰＰＡＲとＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１とのリガンド依存的な相互作用をレポーター遺伝子の発現を指標として測定できる細胞」を表す。「酵母ツーハイブリッドシステム」は、酵母の転写活性化因子にはＤＮＡ結合領域と転写活性化領域が存在し、転写活性化の開始には両者の相互作用が必要であることを利用し、▲１▼前記ＤＮＡ結合領域に結合させた標的蛋白質と▲２▼前記転写活性化領域に結合させた蛋白質の相互作用を検出するシステムである。酵母ツーハイブリッドシステムにおいて、バイト（ｂａｉｔ）はＤＮＡ結合領域に結合させた標的蛋白質を、プレイ（ｐｒｅｙ）は転写活性化領域に結合させた蛋白質を示す。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、細胞内で合成されている数万種類のｍＲＮＡ（遺伝子情報の写しでタンパク質のアミノ酸配列を指令する）を抽出・分離し、逆転写酵素によりそのｍＲＮＡに相補なＤＮＡを合成し、末端の加工をへてベクターへ組み込んだものである。本明細書において、「ＰＰＡＲリガンド結合領域」はＰＰＡＲのリガンドが結合する領域であって��配列番号２記載のヒトＰＰＡＲγ２アミノ酸配列では第２０４番から第５０５番目までを含む領域、ヒトＰＰＡＲαアミノ酸配列では第１６７番から第４６８番目までを含む領域をそれぞれ示す。「ＤＮＡ結合領域」は、ＤＮＡに結合するために機能する領域であり、応答配列に対するＤＮＡ結合能を有するが、単独で転写活性化能を有しないものを示す。ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合領域は、Ｎ末端側（およそ第１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）に存在する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書の試験用細胞作製用のＰＰＡＲ相互作用蛋白質遺伝子に含まれるポリヌクレオチドによりコードされるＰＰＡＲ相互作用ポリペプチドには、
（１）配列番号４、配列番号８、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号４、配列番号８、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質であるポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号４、配列番号８または配列番号１７で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、リガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質であるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。
機能的等価改変体としては、「配列番号４、配列番号８、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含み、しかもリガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質であるポリペプチド」、「配列番号４または配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、主作用リガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質であるポリペプチド」あるいは「配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、副作用リガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質であるポリペプチド」が好ましい。
相同ポリペプチドは、配列番号４、配列番号８、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、リガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質である限り、特に限定されるものではないが、配列番号４または配列番号１７で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができ、好ましくは主作用リガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質であり、配列番号８で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができ、好ましくは副作用リガンド依存的にＰＰＡＲに結合する蛋白質である。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ  ７３、２３７−２４４、１９９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、４６７３−４６８０、１９９４）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ  ｔｕｐｌｅ  １
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ３
Ｗｉｎｄｏｗ  ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ  Ｓａｖｅｄ  ５
以上、本明細書の試験用細胞に含まれるＰＰＡＲ相互作用ポリペプチドについて説明したが、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、その機能的等価改変体、及びその相同ポリペプチドを総称して、以下、「ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ」と称する。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、その機能的等価改変体、及びその相同ポリペプチドを総称して、以下、「ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２」と称する。また、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、その機能的等価改変体、及びその相同ポリペプチドを総称して、以下、「ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１」と称する。
また、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ、ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２、またはＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号８、または配列番号１７記載のアミノ酸配列で示されるポリヌクレオチド、その機能的等価改変体、または、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなら何れでもよい。好ましくは、配列番号４、配列番号８、または配列番号１７記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号３、配列番号７、または配列番号１６記載の塩基配列である。
本発明の、副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする為に有用なツールとなるリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用する蛋白質をスクリーニングする方法、該蛋白質を利用した副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法を以下に記載する。
＜リガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用する蛋白質のスクリーニング方法＞
本発明においては、ＰＰＡＲγとリガンド依存的に相互作用する因子を酵母ツーハイブリッドシステムを利用したレポーター遺伝子の発現を指標としてｃＤＮＡライブラリー中から網羅的に同定することができる。本発明ではＰＰＡＲとその転写共役因子のリガンド依存的な相互作用を検出し、ＰＰＡＲ自身の転写誘導能の検出を必要としないため、同転写誘導能発現に関与する哺乳動物固有の因子群の存在を要しない。従って試験用細胞として特に哺乳動物細胞を用いる必要がなく、真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞などでもよい。これらのうち、酵母細胞は培養が容易で迅速に実施できる上、外来遺伝子の導入など遺伝子組換え技術を適用するのが容易である。またＰＰＡＲと相互作用因子との結合におけるリガンド依存性は同じ酵母ツーハイブリッドシステムを利用した方法で効率よく追試、検出することができる。
酵母ツーハイブリッドシステムは、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして蛋白−蛋白質間相互作用を検出する方法である。一般に転写因子はＤＮＡ結合領域と転写活性化領域という機能の異なる２つの領域を有するが、ツーハイブリッドシステムでは、２種類の蛋白質ＸとＹの相互作用を調べるために、転写因子のＤＮＡ結合領域とＸからなる融合蛋白質、および、転写因子の転写活性化領域とＹからなる融合蛋白質の２種類を同時に酵母細胞内で発現させる。蛋白質ＸとＹが相互作用すると２種類の融合蛋白質が１つの転写複合体を形成し、これが細胞の核内において該転写因子の応答配列（特異的に結合するＤＮＡの部位）と結合してその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。
酵母ツーハイブリッドシステムは、通常、特定の蛋白質をプローブとしてこれと相互作用する未知蛋白質の遺伝子同定に用いられる。しかしながら核内受容体とその一部の転写共役因子群に見られるような、両者の結合が受容体リガンドの存在に依存して起こる場合には、リガンドを外部から添加したツーハイブリッドシステムを用いる必要がある。しかしながら、従来の技術の項で前述した通り、酵母ツーハイブリッドシステムではＰＰＡＲγと相互作用因子のリガンド依存性の検出が困難であり、リガンド依存性のＰＰＡＲγ相互作用因子の網羅的なスクリーニングは成功していなかった。この理由を本発明者らは、酵母の性質上ＰＰＡＲγアゴニストの細胞内へ透過性が低く、リガンド依存性の検出感度が低いためと予見し、報告された中でＰＰＡＲγアゴニストとして最も活性の高い化合物群を高濃度で酵母に作用させることにより、ＰＰＡＲγと相互作用因子のリガンド依存性の検定やスクリーニングに適用できる酵母ツーハイブリッドシステムの独自の方法を完成した。より具体的には実施例２に記載の方法で本スクリーニングを実施できる。
ＰＰＡＲγのリガンド依存的相互作用因子を検出し、該相互作用に対する被験物質の作用を測定することを特徴とする方法の別の実施態様としては、例えば、ＰＰＡＲγと相互作用因子とのリガンド依存的結合を、生化学的に検出する方法がある。このような方法では、例えばＲＩなどで標識した培養細胞の抽出液から、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質とＰＰＡＲγのリガンド結合領域からなる融合タンパク質と結合する蛋白質を被験物質の存在下で直接的に検出し、該結合蛋白質を精製し、アミノ酸配列決定により同定することで実施できる。
＜リガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用する蛋白質を利用した、糖代謝改善作用の検出方法・インスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法；リガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用する蛋白質を利用した、浮腫惹起活性の検出方法・浮腫惹起活性のないインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法＞
１．ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰを利用した糖代謝改善作用の検出法・インスリン抵抗性改善薬スクリーニング法
本発明の一つの実施態様としては、（ｉ）ＰＰＡＲαまたはγの少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域の融合遺伝子、あるいはＰＰＡＲαまたはγ分子の全長域をコードする遺伝子、（ｉｉ）ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰをコードする遺伝子、及び（ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に連結されたレポーター遺伝子、あるいはＰＰＡＲαまたはγが結合し得る応答配列に連結されたレポーター遺伝子で形質転換された試験用細胞を用い、ＰＰＡＲリガンド存在下でこれを被験物質と共存させ、試験用細胞における、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰによるＰＰＡＲの転写活性化能抑制作用の被験物質による変化をレポーター遺伝子の発現を指標として検出し、測定することからなるＰＰＡＲを介する主作用を選択的に促進するか否かの検出方法が挙げられる。また、同検出方法により検出するレポーター活性を増大させる化合物を選択することにより、ＰＰＡＲを介する主作用を選択的に促進する化合物をスクリーニングする方法が挙げられる。
２．ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２を利用した浮腫惹起活性の検出法・浮腫惹起活性のないインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング法
本発明の一つの実施態様としては、（ｉ）ＰＰＡＲαまたはγの少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域の融合遺伝子、あるいはＰＰＡＲαまたはγ分子の全長域のコード遺伝子（ｉｉ）ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２のコード遺伝子、及び（ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に連結されたレポーター遺伝子、あるいはＰＰＡＲαまたはγが結合し得る応答配列に連結されたレポーター遺伝子で形質転換された試験用細胞を用い、これを被験物質と共存させ、試験用細胞における、ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２によるＰＰＡＲの転写活性化能促進作用の被験物質による変化をレポーター遺伝子の発現を指標として検出し、測定することからなるＰＰＡＲを介する副作用を有する化合物を検出する方法、同レポーター系により、副作用と乖離した、主作用を選択的に促進する化合物を選択、スクリーニングする方法が挙げられる。
３．ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１を利用した糖代謝改善作用の検出法・インスリン抵抗性改善薬スクリーニング法
本発明の一つの実施態様としては、（ｉ）ＰＰＡＲγの少なくともリガンド結合領域と転写因子のＤＮＡ結合領域の融合遺伝子、あるいはＰＰＡＲγ分子の全長域をコードする遺伝子、（ｉｉ）ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１をコードする遺伝子、及び（ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に連結されたレポーター遺伝子、あるいはＰＰＡＲαまたはγが結合し得る応答配列に連結されたレポーター遺伝子で形質転換された試験用細胞を用い、これを被験物質と共存させ、試験用細胞における、ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１によるＰＰＡＲの転写活性化亢進作用の被験物質による変化をレポーター遺伝子の発現を指標として検出し、測定することからなるＰＰＡＲを介する主作用を選択的に促進するか否かの検出方法が挙げられる。また、同検出方法により検出するレポーター活性を増大させる化合物を選択することにより、ＰＰＡＲを介する主作用を選択的に促進する化合物をスクリーニングする方法が挙げられる。
上記１、２、または３の実施態様において、ＰＰＡＲの転写誘導能を検出するために用いられる転写因子は、細胞核内で特定のＤＮＡ配列に結合する領域を有する真核生物の転写因子であれば限定されない。また転写因子のＤＮＡ結合領域は、応答配列に対するＤＮＡ結合能は有するが、単独で転写活性化能を有しないものであればよい。このような転写因子としては、例えば、酵母のＧＡＬ４蛋白質（Ｋｅｅｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３１巻、第６９９−７０４頁、１９８６年、Ｍａら、Ｃｅｌｌ、第４８巻、第８４７−８５３頁、１９８７年）が挙げられる。ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合領域および転写活性化領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）に存在する。
応答配列は、転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得るＤＮＡ配列を用いる。遺伝子の上流域からその領域を切り出して用いる、あるいはその配列を化学合成により合成して用いてもよい。
応答配列の下流に配置されるレポータ遺伝子は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポータ遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結される。
ＰＰＡＲαまたはγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ、ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２、またはＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１をコードするポリヌクレオチドは、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより、ｃＤＮＡライブラリーから単離できる。ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰは、同じ分子種として同定されるもので、ＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用して該受容体の転写誘導能に影響を与えるものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＬＯＣ１１５２８９；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＸＭ＿００８９０４、ＨＰＸＥＬ；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ１６６６０、ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ  ＤＲら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９５年２７巻（３）：４５７−４６６頁）、マウス（Ｅｃｈ１；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０１６７７２）、ラット（ＨＰＸＥＬ；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０２２５９４、ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ  ＤＲら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９５年２７巻（３）：４５７−４６６頁）などの哺乳動物由来のものが挙げられる。
ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２は、同じ分子種として同定されるもので、ＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用して該受容体の転写誘導能に影響を与えるものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＡＯＰ２／ＫＩＡＡ０１０６；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＸＭ＿００１４１５、Ｄ１４６６２）、マウス（ＡＯＰ２／１−Ｃｙｓ  Ｐｒｘ／ｎｏｎｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ００４６７０、ＡＦ０９３８５２、Ｙ１２８８３）、ラット（ＡＯＸ２；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ０１４００９）、ウシ（ＧＰＸ／ＰＨＧＰｘ；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ０８０２２８、ＡＦ０９０１９４）などの哺乳動物由来のものが挙げられる。
ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１は、同じ分子種として同定されるもので、ＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用して該受容体の転写誘導能に影響を与えるものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＦＬＪ１３１１１；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＫ０２３１７３、ＮＭ＿０２５０８２）、マウス（ヒトＦＬＪ１３１１１様蛋白質；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＸＭ＿１３４５９８）などの哺乳動物由来のものが挙げられる。
ＰＰＡＲγは、同じ分子種として同定されるもので、核内レセプターとしての生体内での機能を果たすものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物由来のものの他、アフリカツメガエル由来のものなどが挙げられる。ＰＰＡＲγ（Ｄｒｅｙｅｒら、Ｃｅｌｌ、第６８巻、第８７９−８８７頁、１９９２年、Ｚｈｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６８巻、第２６８１７−２６８２０頁、１９９３年、Ｋｌｉｅｗｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、第７３５５−７３５９頁、１９９４年、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７２巻、第８０７１−８０７６頁、１９９７年、Ｅｌｂｒｅｃｈｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２２４巻、第４３１−４３７頁、１９９６年、Ｃｈｅｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１９６巻、第６７１−６７７頁、１９９３年、Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第８巻、第１２２４−１２３４頁、１９９４年、Ａｐｅｒｌｏら、Ｇｅｎｅ、第１６２巻、第２９７−３０２頁、１９９５年）の遺伝子配列およびアミノ酸配列はすでに報告されている。また、ＰＰＡＲγには、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の二種のアイソフォームが存在し、ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較するとＮ末端側の３０アミノ酸が欠失しているが、その他のアミノ酸配列は全く同じであり、いずれも脂肪組織に発現していることが知られている。
ＰＰＡＲα若しくはγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ、ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２、またはＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１をコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］でも得ることができる。
該蛋白質を産生する能力を有する細胞あるいは組織、例えば脂肪組織から該蛋白をコードするものを包含するｍＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。ＰＰＡＲα若しくはγ、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ、ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２、またはＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１の産生能力を有する細胞あるいは組織は、該蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング法、該蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えばｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製することができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出せずとも、市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いても良い。
次に、精製されたｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマー、例えばＰＰＡＲγには配列番号９と配列番号１０、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰには配列番号１２と配列番号１３、ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２には配列番号１４と配列番号１５、ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１には配列番号１８と配列番号１９を用いてＰＣＲに供し、目的とする遺伝子配列を増幅する。また、市販のｃＤＮＡライブラリーを用い、同様の目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し、目的とする遺伝子配列を増幅することもできる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、上記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。具体的には実施例２，４，５，７，８，１０，１１記載の方法により得られる。
これまで述べた方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］に記載の方法により、これら各領域をコードするＤＮＡを単独、あるいは連結し、適当なプロモーターの下流に連結することでＰＰＡＲαまたはγ及びＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰの試験細胞内での発現系、並びに、ＰＰＡＲαまたはγ及びＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２の試験細胞内での発現系が構築できる。同様にしてＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１の試験細胞内での発現系が構築できる。
具体的には上述のように得られたポリヌクレオチドは、適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すればよい。これらは、両者が一つのプラスミド上に含まれるよう構成してもよく、あるいは各々別々のプラスミド上に含まれるよう構成してもよい。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
応答配列に連結されたレポーター遺伝子も、一般的な遺伝子組換え技術を用いて構築し、この構成をベクタープラスミド中に組込んだ上、得られた組換えプラスミドを宿主細胞中に導入したものを用いる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
ＰＰＡＲは外部から導入しても良いが、内在性のＰＰＡＲγが豊富に存在する脂肪由来細胞、あるいは腎由来細胞を宿主細胞として用いる場合は、上述の構成のうち、ＰＰＡＲγを省いて、応答配列に連結されたレポーターとＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰからなる構成のみ、ＰＰＡＲγを省いて、応答配列に連結されたレポーターとＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２からなる構成のみ、あるいは、ＰＰＡＲγを省いて、応答配列に連結されたレポーターとＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１からなる構成のみを導入してもよい。
より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能である。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞および同細胞にＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ＶｉｒｕｓのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではなく、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰによるＰＰＡＲαまたはγの転写誘導能阻害、ＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２によるＰＰＡＲαまたはγの転写誘導活性、あるいはＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１によるＰＰＡＲγの転写誘導活性を検出できるものであればよい。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４）、ヒトのｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒプロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２）、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を例示できるが、これに限定されない。
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ、（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．（１９９０）Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２）、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２）等が挙げられる。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７）、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５）等によりＧＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１）等をコトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより該蛋白質群を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの発現ベクターを用いて所望の形質転換細胞を得ることができる。
上記で得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内に目的の蛋白質群が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であればＲＰＭＩ−１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に必要に応じ牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したものを使用できる。また、上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
試験用細胞を被験物質の存在下で培養し、ＰＰＡＲαまたはγの転写誘導能に対するＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰの抑制作用が被験物質により阻害されることをレポーター遺伝子の発現により検出し測定することができる。▲１▼被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰあるいはＰＰＡＲに作用し、その作用に依存してＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰのＰＰＡＲ転写誘導活性に対する抑制効果の減弱を生じるとき、発現するレポーター活性の増大が観察される。このような被験物質は、ＰＰＡＲの主作用促進剤として同定される。また、例えば▲２▼被験物質がＰＰＡＲと結合して転写誘導能を促進し、一方でＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰによる抑制効果を阻害するとき、発現するレポーター活性の増大が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲの主作用特異的アゴニストとして同定される。また、例えば▲３▼被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰと結合してＰＰＡＲの転写誘導能抑制効果を阻害するとき、あるいは被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰの発現を阻害したり分解を促進するとき、やはり発現するレポーター活性の増大が観察される。このような物質はＰＰＡＲの主作用を促進するＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰ阻害剤として同定される。これら▲１▼、▲２▼及び▲３▼はいずれもＰＰＡＲアゴニストがもたらす副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬として作用することが期待される。より具体的には実施例５、９に記載の方法でインスリン抵抗性改善薬を同定・スクリーニングできる。例えば、実施例９に記載の条件で、ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくは１μＭ以下の物質をインスリン抵抗性改善薬として選択することができる。
試験用細胞を被験物質の存在下で培養し、ＰＰＡＲαまたはγの転写誘導能に対するＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２の促進作用が被験物質により抑制されることをレポーター遺伝子の発現により検出し測定することができる。▲１▼被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２あるいはＰＰＡＲγに作用し、その作用に依存してＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２のＰＰＡＲγ転写誘導活性に対する促進効果の減弱を生じるとき、発現するレポーター活性の減少が観察される。このような被験物質は、ＰＰＡＲγの副作用を抑制する物質として同定される。また、例えば▲２▼被験物質がＰＰＡＲγと結合して転写誘導能を促進し、一方でＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２による促進効果を阻害するとき、発現するレポーター活性はＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２を共発現させない状態と同じレベルにまで減少することが観察される。このような被験物質はＰＰＡＲγの、副作用と乖離した主作用選択的アゴニストとして同定される。また、例えば▲３▼被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２と結合してＰＰＡＲγの転写誘導能促進効果を阻害するとき、あるいは被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２の発現を阻害したり分解を促進するとき、やはり発現するレポーター活性の減少が観察される。このような物質はＰＰＡＲγの副作用を抑制するＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２阻害剤として同定される。これらはいずれもＰＰＡＲγアゴニストがもたらす副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬として作用することが期待される。一方で、例えば被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２あるいはＰＰＡＲγに作用し、その作用に依存してＰＰＡＲ相互作用ＡＯＰ２のＰＰＡＲγ転写誘導活性に対する促進効果を亢進させるとき、発現するレポーター活性の増大が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲγの副作用を強く惹起する物質として同定されることから、レポーター活性を増大させない被験物質を選択することにより、浮腫惹起活性のないインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
試験用細胞を被験物質の存在下で培養し、ＰＰＡＲγの転写誘導能に対するＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１の促進作用が被験物質により亢進されることをレポーター遺伝子の発現により検出し測定することができる。▲１▼被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１あるいはＰＰＡＲγに作用し、その作用に依存してＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１のＰＰＡＲγ転写誘導活性に対する促進効果の増強を生じるとき、発現するレポーター活性の増大が観察される。このような被験物質は、ＰＰＡＲγの主作用促進剤として同定される。また、例えば▲２▼被験物質がＰＰＡＲと結合して転写誘導能を促進し、かつＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１による促進効果を増強するとき、発現するレポーター活性の増大が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲの主作用特異的アゴニストとして同定される。また、例えば▲３▼被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１と結合してＰＰＡＲの転写誘導能促進効果を増強するとき、あるいは被験物質がＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１の発現を促進したり分解を抑制するとき、やはり発現するレポーター活性の増大が観察される。このような物質はＰＰＡＲの主作用を促進するＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１活性化剤として同定される。これら▲１▼、▲２▼及び▲３▼はいずれもＰＰＡＲアゴニストがもたらす副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬として作用することが期待される。より具体的には実施例１１、１２に記載の方法でインスリン抵抗性改善薬を同定・スクリーニングできる。例えば、実施例１２に記載の条件で、ＥＤ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくは１μＭ以下の物質をインスリン抵抗性改善薬として選択することができる。
＜ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１プロモーターを利用してインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法＞
ｉ）配列番号２６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号２６で表される塩基配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／または挿入されたポリヌクレオチド配列を含みかつ転写プロモーター活性を有するポリヌクレオチドに融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に被験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として被験物質による転写活性誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴として、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、１９９３年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。被験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１のプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１の発現調節に対する被験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。配列番号２６で表される塩基配列からなるＦＬＪ１３１１１のプロモーター領域と融合された「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、配列番号２６で表される塩基配列からなるＦＬＪ１３１１１のプロモーター領域と機能的に融合されていればよい。ＰＰＡＲ相互作用ＦＬＪ１３１１１のプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に被験物質を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより被験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析することができる。上記工程を実施することにより、ＦＬＪ１３１１１の発現を亢進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質のスクリーニングを実施できる。具体的には、実施例１４に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。
本発明のスクリーニング法で使用する被験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５））によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
＜インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち、ＬＴＲＰＣ２タンパク質の活性化を阻害する物質、あるいは、本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
実施例
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）主作用リガンド及び副作用リガンドの同定
ＰＰＡＲγのアゴニストとして作用することが報告されている５種類のチアゾリジン誘導体、ＧＷ７２８２（（Ｓ）−３−［４−［２−（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）エトキシ］フェニル］−２−（１−ピロリル）プロピオン酸；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｄｒｕｇ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐ  ２００１，２３（９）：８８９）、ＧＩ−２６２５７０（（Ｓ）−２−［（２−ベンゾイルフェニル）アミノ］−３−［４−［２−（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）エトキシ］フェニル］プロピオン酸；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，ＷＯ００／３８８１１）、ＧＬ−１０００８５（２−（３−（２−（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）エトキシ）フェニルメチルチオ）酢酸；小野薬品工業、ＷＯ９９／４６２３２）、ロジグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ、（±）−５−［４−［２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ］エトキシ］ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン  マレエート；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，ＷＯ０１／４７５２９）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ、（＋）−５−［４−［２−（５−エチル−２−ピリジニル）エトキシ］ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン；武田薬品工業，特開昭６１−２６７５８０）の各化合物について作用メカニズムを解明するために、これらをそれぞれの化合物の特許明細書または文献報告の方法に従って合成し、それらの存在下における主作用および副作用を動物個体を用いてそれぞれ測定し、数値化した。なお、主作用の指標として血糖降下作用を、浮腫を惹起する作用の指標として循環血漿量の増加（荒川正昭、最新内科学大系  第三巻  主要症状−症候から診断へ−２６０−２６６、１９６６；金澤ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ、第１０巻、８１１−８１８頁、１９９９年；岩本、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ、第１０巻、８１９−８２４頁、１９９９年）を測定した。
（１）化合物群の血糖降下作用の測定
７−８週齢のＫＫＡｙ／Ｔａマウス（日本クレア社）に対し、０．５％メチルセルロース（ＭＣ）に懸濁後、濃度調製（１−１０ｍｇ／ｋｇ）した各化合物を１日１回、４日間連続経口投与した。対照群には０．５％  ＭＣのみを投与した。最終投与１６時間後にマウス尾静脈より採血を行い、血糖値をムタローゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法（Ｍｉｗａ  Ｉら  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３７巻５３８頁  １９７２年  参照）を用いた市販キット（グルコースＣＩＩテストワコー、和光純薬工業）により測定した。対照群の血糖値を１００％とし、各化合物投与群における結果より、対照群の血糖値を２５％低下させると推測される化合物濃度（ＥＤ２５）を最小自乗法を用いた線形回帰により算出した（表１）。
（２）化合物群の浮腫惹起活性の測定
ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ；オス、３週齢）に、被験化合物を１００ｍｇ／ｋｇ（０．５％Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅに懸濁）の用量で、一日一回で二週間連続経口投与した。血漿容量の測定は、基本的にＪ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６９（６）：２０９１−２０９６，１９９０に示された方法に従って測定した。エーテル麻酔下で下腿静脈より０．２５％エバンスブルー（Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ）溶液（生理食塩水）を０．２５ｍｌ（０．６２５ｍｇ）／ラットで注入し、５分後、腹部下大静脈より採血した。血漿を水で希釈し、その吸光度（６２０ｎｍ）から得られたエバンスブルー濃度（ｍｇ／ｍｌ）を注入量（０．６２５ｍｇ）で割った値を血漿容量とした。さらに、血漿容量を体重で補正した値において、対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）に対する量（％）を算出した（表１）。
これらの結果、ＧＷ７２８２は主作用、副作用ともに強く惹起した。一方ＧＩ−２６２５７０は主作用の惹起は比較的高い値を示すが、副作用は弱い。またＧＬ−１０００８５は主作用の惹起は弱いが、副作用を強く惹起した。
【表１】ＰＰＡＲγアゴニストの血糖低下作用と循環血漿量増加作用
2003062427.tif 000002
（実施例２）ＰＰＡＲγとリガンド依存的に相互作用する蛋白質の同定
（１）ＰＰＡＲγ遺伝子の単離
ＰＰＡＲγのＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域を含むＣ末端側３０２アミノ酸をコードするｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社；Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ）からポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）によって取得した。遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｕ７９０１２に記載されたヒトＰＰＡＲγ２の遺伝子配列を元に、酵母ツーハイブリッド用発現ベクターｐＤＢｔｒｐ（インビトロジェン社、選択マーカーとしてＴＲＰ１遺伝子を有する）に挿入するため、同ベクターのマルチクローニングサイトの前後４０ヌクレオチドとの相同領域を付加し、さらに挿入されたＰＰＡＲγの遺伝子断片の両側にそれぞれ制限酵素Ｋｐｎ  ＩとＳｍａ  Ｉの認識サイトが形成されるように配列番号９及び１０に示したプライマーを設計した。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）／５５℃（３０秒）７２℃（３分）のサイクルを３５回、繰り返した。その結果得られた１００４塩基対のＤＮＡ断片はＰＰＡＲγ２の第２０４アミノ酸から終止コドン直前までの３０２アミノ酸からなるＰＰＡＲγのコード領域を有している。
（２）酵母ツーハイブリッド用発現プラスミドの作製
制限酵素ＳａｌＩおよびＮｃｏＩで切断して直鎖上にしたベクターｐＤＢｔｒｐ及び（１）で得られたＰＰＡＲγのｃＤＮＡを含むＰＣＲ断片を同時にツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３（インビトロジェン社）へ添加し、リチウム酢酸法により形質転換した（Ｃ  Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｒ  Ｆｉｎｋ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）。その結果、同酵母細胞内で相同組換えが生じ、ｐＤＢｔｒｐのマルチクローニングサイトにＰＰＡＲγ  ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＤＢ−ＰＰＡＲγと略称する）が形成された。同プラスミドを有する酵母細胞を、プラスミドの選択マーカーであるトリプトファンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選択し、同酵母細胞をザイモリエース（生化学工業）で室温にて３０分間処理した後、アルカリ法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）でプラスミドを単離精製し、シーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ社）およびシーケンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、ＰＰＡＲγのｃＤＮＡがｐＤＢｔｒｐのＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域のコード領域と翻訳のフレームが一致して挿入されているものを選択した。
（３）酵母ツーハイブリッドスクリーニング
上述のｐＤＢ−ＰＰＡＲγにより形質転換したツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３を４００ｍｌのＹＰＤ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）に懸濁し、波長５９０ナノメートルの吸光度が０．１から０．４になるまで３０℃で約６時間振とう培養した後、リチウム酢酸法でコンピテントセルとし、最終量を１．０ｍｌの０．１Ｍリチウム−トリス緩衝液に懸濁した。同細胞をヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー、ヒト肝臓ライブラリー、またはヒト骨格筋ライブラリー（いずれもクロンテック社Ｍａｔｃｈ  Ｍａｋｅｒ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ）各２０μｇで形質転換し、同細胞をｐＤＢ−ＰＰＡＲγおよびライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選別し、両プラスミドが導入された形質転換株を得た。同時に同じ形質転換細胞をトリプトファン、ロイシンのほかに、ツーハイブリッドシステムにおいて人工的に発現させたＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域の融合蛋白質に、ＧＡＬ４転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝子ＨＩＳ３が作動した細胞を選択するため、ヒスチジンを培地から除き、さらにＨＩＳ３がコードする酵素の阻害剤である３ＡＴ（３−ＡＭＩＮＯ−１，２，４−ＴＲＩＡＺＯＬＥ；シグマ社）２０ｍＭを添加した固形最小倍地（２０％アガロース）上で３０℃で５日間培養した。同培地中には主作用、副作用ともに強く惹起するＰＰＡＲγのアゴニストＧＷ７２８２を最終濃度１．５μＭ添加しておき、同アゴニストの存在下でＰＰＡＲγに結合する蛋白質を発現していることを示す３ＡＴ耐性の酵母のコロニーを取得した。これらの酵母細胞を２４時間ＹＰＤ固形培地上で上述のアゴニストＧＷ７２８２を１５μＭの濃度で添加、あるいは非添加の状態で成長させた後、ＨＩＳ３とは別のツーハイブリッドシステムの結合指示レポーターであるｌａｃＺ遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β−ガラクトシダーゼ活性は培地上の酵母細胞をニトロセルロースフィルターに移し取り、液体窒素に付けて凍結させた後、室温で解凍し、フィルターを０．４％のＸ−ＧＡＬ（シグマ社）溶液を浸した濾紙上にのせて３７℃で２４時間静置し、β−ガラクトシダーゼによる青色変化を測定した。フィルター上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニーを選択することにより、上述のアゴニストの存在に依存してＰＰＡＲγに結合する蛋白質を発現している酵母細胞を複数特定し、同細胞からクロンテック社Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従ってライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、配列番号１１で表される塩基配列（ＧＡＬ４ＡＤ領域に結合する配列；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２９８９９  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＡＣＴ２由来）をプライマーとし、シーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ社）およびシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した結果、上述３種類のいずれのライブラリーからも配列番号３に記載のＥＣＨＬＰの部分配列を��むクローンが含まれていることをＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）によるホモロジー検索により確認した。また腎臓由来ライブラリーからは核内受容体の転写共役因子として知られているＳＲＣ−１（Ｓｍｉｔｈ  ＣＬらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，２０巻９３（１７）号８８８４−８８８８頁  １９９６年：），Ｎ−ＣｏＲ（Ｎａｇｙ  ＬらＣｅｌｌ，８９巻３号３７３−３８０頁１９９７年）の遺伝子断片を含むクローンが含まれており、上記のスクリーニングでリガンド依存性のＰＰＡＲγの共役因子が取得できることが確認された。
また、同様の酵母ツーハイブリッドスクリーニングを以下の条件のもとで行った。ライブラリーとしてはヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した細胞を用いた。ＧＷ７２８２は最終濃度１μＭとなるように添加し、同アゴニスト存在下でＰＰＡＲγに結合する蛋白質を発現している酵母細胞を２４時間ＹＰＤ固形培地上でＧＷ７２８２を１０μＭの濃度で添加した状態で成長させた。β−ガラクトシダーゼ活性測定により、上述のアゴニストの存在に依存してＰＰＡＲγに結合する蛋白質を発現している酵母細胞を複数特定し、同細胞からライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を決定した結果、配列番号７に記載のＡＯＰ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１４１５）の部分配列を含む独立したクローン２個が含まれていた。また核内受容体の転写共役因子として知られているＳＲＣ−１（Ｓｍｉｔｈ  ＣＬらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，２０巻９３（１７）号８８８４−８８８８頁  １９９６年：），Ｎ−ＣｏＲ（Ｎａｇｙ  ＬらＣｅｌｌ，８９巻３号３７３−３８０頁１９９７年）の遺伝子断片を含むクローンが含まれており、上記のスクリーニングでリガンド依存性のＰＰＡＲγの転写共役因子を取得できることが確認された。
また、同様の酵母ツーハイブリッドスクリーニングを以下の条件のもとで行った。ライブラリーとしてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した細胞を用いた。ＧＷ７２８２は最終濃度１μＭとなるように添加し、同アゴニスト存在下でＰＰＡＲγに結合する蛋白質を発現している酵母細胞を２４時間ＹＰＤ固形培地上でＧＷ７２８２を１０μＭの濃度で添加した状態で成長させた。β−ガラクトシダーゼ活性測定により、上述のアゴニストの存在に依存してＰＰＡＲγに結合する蛋白質を発現している酵母細胞を複数特定し、同細胞からライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を決定した結果、配列番号１６に記載の新規遺伝子（ＦＬＪ１３１１１類似遺伝子；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０２３１７３の１塩基置換体）の部分配列を含むクローンが含まれていた。
（実施例３）ＰＰＡＲγとＥＣＨＬＰまたはＡＯＰ２のリガンド選択的相互作用の検出
実施例２で得たＥＣＨＬＰ、ＡＯＰ２をはじめとする蛋白質群とＰＰＡＲγの相互作用に対するアゴニストの依存性を、上述の主作用、副作用に対する効果が異なる２種のアゴニストＧＩ−２６２５７０（最終濃度５μＭ、又は０．５μＭ）とＧＬ−１０００８５（最終濃度５μＭ、又は０．５μＭ）を用いて、酵母ツーハイブリッドシステムのβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として測定した（図１；矢尻は黒が主作用選択的な化合物、縞が副作用選択的な化合物の濃度差により相互作用が大きく変化するものをそれぞれ示す。白の矢尻は主・副作用いずれに選択的な化合物でも濃度差による相互作用の変化が大きいものを示す。）。用いたアゴニスト以外の方法の詳細は実施例２と同様である。その結果、主作用に高い効果を持つ化合物ＧＩ−２６２５７０は、濃度を５μＭから０．５μＭに減じても同様にＰＰＡＲγとＥＣＨＬＰの結合を誘導したが（図１ｂ）、副作用に比較的高い効果を持つ化合物ＧＬ−１０００８５では濃度を５μＭから０．５μＭに減じるとＰＰＡＲγとＥＣＨＬＰの結合は大きく減退した（図１ｃ）。一方、副作用に比較的高い効果を持つ化合物ＧＬ−１０００８５は、濃度を５μＭから０．５μＭに減じても同様にＰＰＡＲγとＡＯＰ２の結合を誘導し（図１ｃ）、主作用に高い効果を持つ化合物ＧＩ−２６２５７０添加では濃度を５μＭから０．５μＭに減じるとＰＰＡＲγとＡＯＰ２の結合は大きく減弱した（図１ｂ）。これらは、アゴニストＧＩ−２６２５７０、ＧＬ−１０００８５の存在によってＰＰＡＲγとＥＣＨＬＰ、あるいはＰＰＡＲγとＡＯＰ２のリガンド依存的相互作用がおこったことによると考えられ、この結果から、ＥＣＨＬＰはＰＰＡＲγと主作用に高い効果を持つアゴニストにより高い感度で相互作用することが明らかとなった。一方ＡＯＰ２は副作用に高い効果を持つアゴニストにより高い感度で相互作用することが明らかとなった（図１ｃ）。これらの結果はアゴニストの主作用、副作用に相関してアゴニスト依存的にＰＰＡＲγに相互作用する共役因子があることを示唆している。ＥＣＨＬＰは主作用の強く現れるアゴニストに、より選択的に応答して相互作用しており、このＰＰＡＲγとＥＣＨＬＰのリガンド依存的相互作用を利用することで主作用に高い効果をもつアゴニストを選択的に検出できるものと考えられた。一方クローン＃１，４，５，６，７およびＮ−ＣｏＲはアゴニストＧＩ−２６２５７０、ＧＬ−１０００８５いずれの濃度減少でもＰＰＡＲγとの結合が減弱し、アゴニストの主作用−副作用に相関が見られなかった。
（実施例４）正常および糖尿病モデルマウスにおけるＥＣＨＬＰ発現量の測定
上述の知見に基づき、ＥＣＨＬＰとＰＰＡＲγの相互作用がＰＰＡＲγアゴニストを介した主作用である糖代謝改善に関わることが予想された。そこで２種類の糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（Ｉｗａｔｓｕｋａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐｏｎ．、第１７巻、第２３−３５頁、１９７０年、Ｔａｋｅｔｏｍｉら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．、第７巻、第２４２−２４６頁、１９７５年）、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ、第８４巻、第４９１−４９５頁、１９９６年、Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７９巻、第６３２−６３５頁、１９９６年、Ｋａｋｕら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第３２巻、第６３６−６４３頁、１９８９年）の骨格筋、脂肪におけるＥＣＨＬＰ遺伝子のマウスオルソログｅｃｈ１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量をＤＮＡアレイ（アフィメトリクス社）を用いて測定し（ｄｅ  Ｓａｉｚｉｅｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、第４５−４８頁、１９９８年、Ｗｏｄｉｃｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、第１３５９−１３６７頁、１９９７年、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、第１６７５−１６８０頁、１９９６年）、正常個体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−＋ｍ／＋ｍのそれと比較することにした。
（１）マウスの組織の摘出：日本クレア社よりオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＫＫＡｙ／Ｔａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−＋ｍ／＋ｍ及びＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスを各８匹購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは普通食で１５週齢になるまで集団飼育した。ＫＫＡｙ／Ｔａマウスは高カロリー食（ＣＭＦ，Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で１５週齢になるまで単独飼育した。Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−＋ｍ／＋ｍマウス及びＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスは普通食で１２週齢になるまで集団飼育した。ＫＫＡｙ／ＴａマウスおよびＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスが正常マウスと比較して高血糖、高体重になっていることを確認した（ＫＫＡｙ／Ｔａマウス：血糖値５１４．２±１８．２ｍｇ／ｄｌ、体重４９．９±０．７ｇ、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウス：血糖値４２３．７±１４．１ｍｇ／ｄｌ、体重４８．６±０．５ｇ）。血糖値はマウス尾静脈より採血を行い、血糖値をグルコースオキシダーゼ法を用いた市販キット（オートパックＡ・グルコース試薬、ベーリンガー・マンハイム社）により測定した。これらの４種類のマウスをジエチルエーテルで麻酔し、副睾丸脂肪とひふく筋を摘出した。摘出直後に液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
（２）ｍＲＮＡの抽出：組織は凍結プレス破砕装置ＣＲＹＯ−ＰＲＥＳＳ  ＣＰ−１００（マイクロテック・ニチオン社）を用いて破砕した。ＲＮＡ抽出用試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を加え、ホモジナイザーＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−８（ＩＫＡ  ＬＡＢＯＲＴＥＣＨＮＩＫ社）を用いてホモジネートした。メーカー添付のプロトコールに従い、これらのサンプルからＲＮＡを抽出した。これをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン社）で処理し、混入しているＤＮＡを分解した。その後、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏに溶解した。ＲＮＡ調製試薬ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャム社）を用いて添付プロトコールに従いｍＲＮＡを抽出した。
（３）ラベル化ｃＲＮＡの調製：アフィメトリクス社のプロトコール（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）に従って、ｍＲＮＡから第１ストランドｃＤＮＡ合成、第２ストランドｃＤＮＡ合成、ビオチンラベル化ｃＲＮＡの合成、ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化を行った。
（４）ハイブリダイゼーション：アフィメトリクス社のＤＮＡアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ７４）は３枚のサブアレイＡ、Ｂ、Ｃからなっている。アフィメトリクス社の上記プロトコールに従って、ＤＮＡアレイにラベル化ｃＲＮＡをハイブリダイズした後、洗浄し、各プローブの蛍光強度を測定した。
（５）アレイ間の測定値の補正：測定値については、サンプル間の補正を行った後、サブアレイ間の補正を行った。サンプル間の補正は、特定のサブアレイ上の遺伝子の蛍光強度の合計値をサンプル間で求め、最も高い蛍光強度の合計値を示したアレイと等しくなるようにその他のアレイの各遺伝子の測定値にアレイごとに一定の倍率をかけた。サブアレイ間の補正は、サブアレイごとにＡＦＦＸプローブの蛍光強度の平均値を求め、サブアレイＡ、Ｂ、Ｃでそれらの平均値が同じになるようにサブアレイごとに各遺伝子の測定値に一定の倍率をかけた。
その結果ＫＫＡｙ／Ｔａマウスでは、発症が進行していない５週齢の個体、あるいは正常個体と比較して病態発症が顕著な１５週齢の個体ではｅｃｈ１  ｍＲＮＡの発現量が２倍以上に増大していることが確認された（図２）。同様にｄｂ／ｄｂマウスでも正常個体に比較してｅｃｈ１発現量が２倍以上に増大していた。また１５週齢のＫＫＡｙ／Ｔａマウスにおけるｅｃｈ１発現量の亢進は腎尿細管糖輸送における再吸収阻害剤として知られるフロリジン（ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ）を１００ｍｇ／ｋｇの用量で３０分おきに３回、腹腔内投与し、血糖値が短期的に正常レベルになった最初の投与から７時間後の組織でも変化がないことから、ｅｃｈ１は、糖尿病態の結果としておこる血糖値の変動に起因して発現が亢進しているのではなく、その発現の亢進が糖尿病態を惹起する原因因子の一つであると考えられた。
上述と同じＤＮＡアレイを用いて１２週齢、オスの正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ個体の臓器毎にｅｃｈ１のｍＲＮＡ発現量を測定した結果、ｅｃｈ１は主要臓器のうちＰＰＡＲγの作用がある脂肪、筋肉、肝臓、腎臓と、ほかに心臓、肺での発現が顕著であった（図３）。これにより発現部位からもＥＣＨＬＰ／Ｅｃｈ１がＰＰＡＲγの共役因子であることが裏付けられた。
（実施例５）ＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対するＥＣＨＬＰの調節作用の検出
上述の結果から、ＥＣＨＬＰはＰＰＡＲγとリガンドを介して相互作用し、主作用（糖代謝改善）に関わること、さらにその発現亢進が糖尿病の病態と関連することが示された。そこでＥＣＨＬＰがＰＰＡＲγの有する転写誘導活性にどのような影響を及ぼすか、培養細胞ＣＯＳ−１を用いたレポーターアッセイで調査した。
（１）動物細胞発現用プラスミドＧＡＬ−ＰＰＡＲγの作製
ヒトＰＰＡＲγ２のリガンド結合領域をコードするｃＤＮＡを酵母Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域（１−１４７アミノ酸）のＣ末端側に融合したキメラ蛋白質をコードする遺伝子を動物細胞発現ベクターｐＺｅｏＳＶ（インビトロジェン社）のマルチクローニングサイトに組み込んだ発現プラスミドＧＡＬ−ＰＰＡＲγを作製した。まずプラスミドｐＧＢＴ９（クロンテック社）からＧａｌ４のＤＮＡ結合領域をコードする遺伝子断片を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｓｍａ  Ｉを用いて切り出し、これをｐＺｅｏＳＶのマルチクローニングサイトのサイトに挿入した（以下ｐＺｅｏ−ＤＢと略記する）。次に前述のプラスミドｐＤＢ−ＰＰＡＲγからＰＰＡＲγのリガンド結合領域をコードするＤＮＡ断片をＫｐｎ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉを用いて切り出し、これをｐＺｅｏ−ＤＢのマルチクローニングサイトにあるＫｐｎＩ、Ｐｖｕ  ＩＩサイトの間に組み込み、動物細胞発現用プラスミドＧＡＬ−ＰＰＡＲγを作製した。
（２）動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＥＧＨＬＰの作製
配列番号１２及び１３に示したプライマーを用いて、ヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法によりＥＣＨＬＰの全長域をコードする９８７ｂｐ（ベースペア）を含むｃＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）／５５℃（３０秒）７２℃（３分）のサイクルを３５回、繰り返した。これをｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨＩＳ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）にｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えによるＴＯＰＯクローニング法（インビトロジェン社）により挿入して動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＥＣＨＬＰを作製した。なおＥＣＨＬＰには終止コドンを挿入せず、Ｃ末端側にベクター由来のＶ５エピトープおよびＨＩＳ６タグが融合されるようにプライマーを設計した。
（３）ＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対するＥＣＨＬＰの調節作用の検出
培養細胞ＣＯＳ−１細胞は６ウェル培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ）の培養皿に各ウェル２ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ  ＬらＶｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻４５６頁１９７３年、新井直子、遺伝子導入と発現／解析法１３−１５頁１９９４年）により、上述のＧＡＬ−ＰＰＡＲγ（０．１５μｇ／ウェル）、およびＧＡＬ４結合配列を８個繰り返しルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置したレポーターコンストラクト（ＲＥ×８−Ｌｕｃｉ，；下川ら、国際公開番号ＷＯ９９／０４８１５）（０．８μｇ／ウェル）をｐｃＤＮＡ−ＥＣＨＬＰ（０．０５−０．２μｇ／ウェル）とともに一過性にコトランスフェクトした。ＰＰＡＲγアゴニスト２μＭあるいは被験化合物を培地に添加して４８時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後にウェルあたり０．４ｍｌの細胞溶解液（１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。この細胞溶解液１００μｌにルシフェラーゼ基質溶液１００μｌ（ピッカジーン社）を添加し、ＡＢ−２１００型化学発光測定装置（アトー社）を用いて１０秒間の発光量を測定した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子と同時にβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子をもつプラスミドｐＣＨ１１０（アマシャムファルマシアバイオテク社）０．４μｇ／ウェルを細胞にコトランスフェクトし、β−ガラクトシダーゼ活性検出キットＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  ＰｌｕｓＴＭｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し数値化した。これを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、ＰＰＡＲγのアゴニスト依存的な転写誘導活性は、細胞にトランスフェクトしたＥＣＨＬＰ発現プラスミドの用量に依存して著しい阻害が認められた（図４）。これによりＰＰＡＲγとＥＣＨＬＰのリガンド依存的な相互作用がおこると、ＰＰＡＲγの転写誘導活性が抑制されることが明らかになった。この事実は、前述の糖尿病モデルマウスにおいて、過剰なＥＣＨＬＰ／Ｅｃｈ１が病態の原因因子であることを示した結果とよく一致する。すなわち、糖尿病の病態ではＥＣＨＬＰ／Ｅｃｈ１の過剰発現が生じたことによってＰＰＡＲγ転写誘導活性の抑制が起こり、その結果ＰＰＡＲγによって誘導されるべき下流遺伝子の発現が十分でないために糖代謝が阻害されると考えられた。
ＥＣＨＬＰ／Ｅｃｈ１は分子内に脂肪酸代謝に働くエノイルＣｏＡ加水酵素（ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ）とジエノイルＣｏＡ異性化酵素（ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）の２種類の酵素活性領域と予想される構造を有する（Ｆｉｌｐｐｕｌａ  ＡらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３巻１号：３４９−３５５頁１９９８年）。また脂肪酸代謝酵素の阻害剤は糖尿病態マウスにおいて血糖値を降下させることが以前から知られていた（Ｃｏｌｌｉｅｒ  ＲらＨｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，２５巻１号：９−１２頁１９９３年）。この事実と、ＥＣＨＬＰがＰＰＡＲγ活性の抑制作用をもつという上述の知見から、ＥＣＨＬＰは過剰に存在するとＰＰＡＲγを介する糖代謝を抑えて自らの脂肪酸代謝酵素活性により脂質からのエネルギー生成を促進し、減少するとＰＰＡＲγ活性を解除して糖代謝へ生体のエネルギー源をシフトさせる、糖・脂肪代謝の拮抗的な調節を担う分子であると考えられた。これを利用して、ＰＰＡＲ相互作用ＥＣＨＬＰの量を減じれば、あるいは相互作用ＥＣＨＬＰによるＰＰＡＲγに対する抑制作用を阻害すれば、生体のエネルギー源を糖代謝へ向かわせ血糖値を降下させることが可能である。同時にＥＣＨＬＰを用い、そのような作用を持つ化合物を容易に選択することが可能である。
（実施例６）正常および糖尿病モデルマウスにおけるＡＯＰ２蛋白量の比較
上述の知見に基づき、ＡＯＰ２とＰＰＡＲγの相互作用がＰＰＡＲγアゴニストを介した副作用である浮腫の惹起に関わることが予想された。そこで糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（Ｉｗａｔｓｕｋａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐｏｎ．、第１７巻、第２３−３５頁、１９７０年、Ｔａｋｅｔｏｍｉら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．、第７巻、第２４２−２４６頁、１９７５年）と正常個体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの脂肪に含まれる蛋白質含量を蛍光標識２次元ディファレンス電気泳動
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Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第１巻、第３７７−３９６頁、２００１年）を用いて比較した。病態モデルマウスにおいて蛋白質含量に２倍以上の差異が認められる蛋白質群について、質量分析法を用いて各蛋白質を同定した。
（１）マウスの組織の摘出
日本クレアよりオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＫＫＡｙ／Ｔａマウスを購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは普通食で１２週齢になるまで集団飼育した。ＫＫＡｙ／Ｔａマウスは高カロリー食（ＣＭＦ，オリエンタルイースト社）で１２週令になるまで単独飼育した。ＫＫＡｙ／Ｔａマウスが正常マウスと比較して高血糖、高体重になっていることを確認した（ＫＫＡｙ／Ｔａマウス：血糖値５１４．２±１８．２ｍｇ／ｄｌ、体重４９．９±０．７ｇ）後、これら２種類のマウスをジエチルエーテルで麻酔し、副睾丸脂肪を摘出した。摘出直後に液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
（２）蛋白質試料の調製
凍結した副睾丸脂肪をウレア、両性界面活性剤を含むトリス緩衝液中でホモジナイザーＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−８（ＩＫＡ  ＬＡＢＯＲＴＥＣＨＮＩＫ社）を用いてホモジネートした。メーカー添付のプロトコールに従い、これらのサンプルから遠心分離操作により上清を得て以下の二次元電気泳動用の試料とした。
（３）２次元電気泳動
アマシャムファルマシアバイオテクのプロトコールに従った。それぞれの試料に対して吸光度を測定することにより含有蛋白質量を決定し、それらから約５０μｇの蛋白質を含む量をとり、それぞれ異なる蛍光色素（Ｃｙ３およびＣｙ５、アマシャムファルマシアバイオテク社）による標識を行った後に混合し、ＩＰＧストリップ（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて一次元目の等電点電気泳動を行った。二次元目の電気泳動の前に、ＩＰＧストリップをウレア、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセロール、ジチオスレイトールを含むトリス緩衝液で平衡化し、さらにヨードアセトアミドを溶解したウレア、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセロール、ジチオスレイトールを含むトリス緩衝液で平衡化した。二次元目の電気泳動はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動を用いて行った。二次元電気泳動が終了したゲルを蛍光イメージ解析装置（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて、それぞれの蛍光色素に特異的な励起・検出波長を使用して、それぞれの二次元電気泳動像を得た。それら二つの泳動像を解析ソフトウエア（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて定量化し、病態モデル動物において蛋白質含量に２倍以上の差異が認められるスポットを特定し、スポットピッキング装置（アマシャムファルマシアバイオテク社）により切り出し、トリプシンを用いてゲル内酵素消化法（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６８巻、第８５０−８５８頁、１９９６年）によりタンパク質を断片化し、ペプチド混合物をゲルより回収した。
（４）マススペクトル法による蛋白質の同定
得られたペプチド混合物をキャピラリー逆相液体クロマトグラフィーカラム（直径０．０７５ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、エルシーパッキング社）を用い、０．２％ギ酸存在下、流速を毎分約２００ｎＬに設定し、アセトニトリル勾配溶出法にて各ペプチドを分離した。液体クロマトグラフ装置（マイクローム・バイオリソース社）に直接接続したエレクトロスプレーイオン源を有する四重極イオントラップ型質量分析装置（サーモクエスト社）により、自動的に各ペプチドの分子イオンを選択しそのプロダクトイオンスペクトルを測定する方法を用いて各ペプチドのプロダクトイオンスペクトルを得た。
ＫＫＡｙ／Ｔａマウスの副睾丸脂肪において正常個体と比較して２倍の含量増加を確認した蛋白質の断片ペプチドの個々のプロダクトイオンスペクトルを、公共の蛋白質データベースＭＳＤＢ（リリース２００１０４０１）を用い、解析ソフトＭａｓｃｏｔ（マトリクスサイエンス社）にて検索照合した結果、マウスＡＯＰ２蛋白質（ＡＯＰ２／１−Ｃｙｓ  Ｐｒｘ／ｎｏｎｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ００４６７０、ＡＦ０９３８５２、Ｙ１２８８３）中の４カ所の部分アミノ酸配列が一致し、マウスＡＯＰ２蛋白質であることが判明した。これにより糖尿病態においてはＡＯＰ２蛋白質含量が増加することが明らかとなった。
（実施例７）組織によるＡＯＰ２発現量の比較
配列番号１４及び１５に示したプライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）／５５℃（３０秒）７２℃（３分）のサイクルを３５回繰り返した）によりＡＯＰ２をコードする６７３ｂｐ（ベースペア）のｃＤＮＡ断片の増幅をアガロースゲル電気泳動法により検出した。その結果、ＡＯＰ２は主要臓器のうちＰＰＡＲγの作用がある脂肪、筋肉、肝臓、腎臓と、ほかに心臓での発現が顕著であった。これにより発現部位からもＡＯＰ２がＰＰＡＲγの転写共役因子であることが裏付けられた。
（実施例８）ＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対するＡＯＰ２の調節作用の検出
上述の結果から、ＡＯＰ２はＰＰＡＲγとリガンドを介して相互作用し、浮腫の惹起に関わること、さらにその発現亢進が糖尿病の病態と関連することが示された。そこでＡＯＰ２がＰＰＡＲγの有する転写誘導活性にどのような影響を及ぼすか、培養細胞ＣＯＳ−１を用いたレポーターアッセイで調査した。
（１）動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＡＯＰ２の作製
配列番号１４及び１５に示したプライマーを用いて、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）／５５℃（３０秒）７２℃（３分）のサイクルを３５回繰り返した）によりＡＯＰ２の全長域をコードする６７３ｂｐを含むｃＤＮＡ断片を取得した。これをｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）にｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えによるＴＯＰＯクローニング法（インビトロジェン社）により挿入して動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＡＯＰ２を作製した。なおＡＯＰ２には終止コドンを挿入せず、Ｃ末端側にベクター由来のＶ５ｅｐｉｔｏｐｅおよびＨｉｓ６タグが融合されるようにプライマーを設計した。
（２）ＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対するＡＯＰ２の調節作用の検出
培養細胞ＣＯＳ−１細胞は６ウェル培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ）の培養皿に各ウェル２ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ  ＬらＶｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻４５６頁１９７３年、新井直子、遺伝子導入と発現／解析法１３−１５頁１９９４年）により、実施例５（１）により作製したＧＡＬ−ＰＰＡＲγ（０．１５μｇ／ウェル）、およびＧＡＬ４結合配列を８個繰り返しルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置したレポーターコンストラクト（ＲＥ×８−Ｌｕｃｉ，；下川ら、国際公開番号ＷＯ９９／０４８１５）（０．８μｇ／ウェル）をｐｃＤＮＡ−ＡＯＰ２（０．０５−０．２μｇ／ウェル）とともに一過性にコトランスフェクトした。ＰＰＡＲγアゴニストＧＷ７２８２を２ｍＭあるいは被験化合物を培地に添加して４８時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後にウェルあたり０．４ｍｌの細胞溶解液（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。この細胞溶解液１００μｌにルシフェラーゼ基質溶液１００μｌ（ピッカジーン社）を添加し、ＡＢ−２１００型化学発光測定装置（アトー社）を用いて１０秒間の発光量を測定した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子と同時にβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子をもつプラスミドｐＣＨ１１０（アマシャムファルマシアバイオテク社）０．４μｇ／ウェルを細胞にコトランスフェクトし、β−ガラクトシダーゼ活性検出キットＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  ＰｌｕｓＴＭｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し数値化した。これを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、ＰＰＡＲγのアゴニスト依存的な転写誘導活性は、細胞にトランスフェクトしたＡＯＰ２発現プラスミドの用量に依存した促進が認められた（図５）。これにより、ＰＰＡＲγとＡＯＰ２のアゴニスト依存的な相互作用が起こるとＰＰＡＲγの転写誘導活性が亢進することが明らかになった。
この事実と、腎臓を含む組織でＡＯＰ２の発現があり、糖尿病モデルマウスにおいてＡＯＰ２蛋白量が病態で亢進している前述の結果から、糖尿病の病態では細胞中のＡＯＰ２存在量が亢進し、それに伴う腎臓など特定組織での過剰なＰＰＡＲγ活性の促進が副作用（浮腫）をもたらすと考えられた。
ＡＯＰ２はアミノ酸配列の相同性から分子内にペルオキシダーゼ様配列を持つことから抗オキシダント蛋白質２（ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１４１５）と呼称されているが、実際の生理活性としてはカルシウム非依存性のフォスフォリパーゼＡ２として機能する報告があり（ａｃｉｄｉｃ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２；Ｋｉｍ  ＴＳら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２巻１６号１０９８１頁１９９７年）、またマウスでは同Ａｏｐ２蛋白質の遺伝子座が多嚢胞性腎症の原因遺伝子として報告されている（ＬＴＷ４／Ａｏｐ２；ｌａｋｏｕｂｏｖａ  ＯＡ，らＧｅｎｏｍｉｃｓ  ４２巻３号  ４７４−４７８頁１９９７年）。このようにＡＯＰ２はそのアミノ酸配列構造から予想される分子機能とは異なる作用を持つことが明らかであり、その本来の生理機能は確定されていない。ＡＯＰ２がＰＰＡＲγとリガンド依存的に結合し、その転写共役因子として機能するという本発明者による発見は、該分子の機能における新規の知見である。このＡＯＰ２を利用することにより、ＰＰＡＲγの作動薬から浮腫を惹起するものを発見し除去することが可能である。
（実施例９）ＰＰＡＲγを介した主作用を選択的に亢進する化合物のスクリーニング系
以上の知見から、実施例５におけるレポーターアッセイ系で検出可能なＥＣＨＬＰとＰＰＡＲγの相互作用、およびＥＣＨＬＰによるＰＰＡＲγのリガンド依存転写促進能の抑制は、これを阻害する化合物をスクリーニングすることによって糖代謝を改善し、糖尿病態の回復に寄与する新規の糖尿病治療薬のスクリーニングが可能である。さらにそこで得られる被験物質の中から、実施例８におけるレポーターアッセイ系で検出できるＡＯＰ２とＰＰＡＲγの相互作用、およびＡＯＰ２によるＰＰＡＲγのリガンド依存転写促進能の亢進を引き起こさない物質をスクリーニングすることにより、副作用である浮腫を引き起こさずに糖尿病態の回復に寄与する糖尿病治療薬のスクリーニングが可能である。
すなわち実施例５、８と全く同様のレポーター活性測定系で被験化合物をスクリーニングできるが、より大量の被験化合物を効率よくスクリーニングするために下記のレポーターアッセイ系を構築した。
方法の詳細は前述の実施例５に示したものと同一とし、ＰＰＡＲアゴニストの存在によりＥＣＨＬＰによるＰＰＡＲγの転写活性化能抑制が認められる条件下において、過剰量の被験化合物を並存させ競合させることで該転写活性化能抑制作用を阻害する化合物をスクリーニングした。具体的には６ウェル培養プレートに培養細胞ＣＯＳ−１細胞を１０％牛胎児血清を含む最少必須培地ＤＭＥＭ中で７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。同細胞にリン酸カルシウム法でＧＡＬ−ＰＰＡＲγ（０．１５μｇ／ウェル）、およびＲＥ×８−Ｌｕｃｉ（０．８μｇ／ウェル）を、ｐｃＤＮＡ−ＥＣＨＬＰ（０．１５μｇ／ウェル）とともにコトランスフェクトした。ここへＰＰＡＲγアゴニストとして最終濃度０．１μＭのＧＷ７２８２を添加した条件下で、被験化合物（１０−１．０μＭ）をさらに培地に添加して並存させるかたちで４８時間培養した後、細胞をＰＢＳで洗浄した後にウェルあたり０．４ｍｌの細胞溶解液を添加して溶解した。同液１００μｌを９６ウェルプレートに移して前述実施例５の方法に従いルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してＰＰＡＲγの活性化を数値化した。ＰＰＡＲγアゴニストとして添加した低濃度のＧＷ７２８２（０．１μＭ）が存在する条件下で認められるＥＣＨＬＰの発現によるリガンド依存的なＰＰＡＲγの転写誘導能抑制（補正したルシフェラーゼ活性値の比）を基準とし、そこへ過剰の被験化合物１０あるいは１．０μＭを加えた条件で前記転写誘導能抑制を阻害する化合物をスクリーニングした。このＥＣＨＬＰによるＰＰＡＲγ転写誘導能抑制を阻害する物質をスクリーニングする基準は、阻害活性強度（ＩＣ５０）において、好ましくは１０μＭ以下、さらに好ましくは１．０μＭ以下である。本スクリーニング系により、先に記載した化合物ＧＩ−２６２５７０は、１０μＭでＥＣＨＬＰによるリガンド（０．１μＭ  ＧＷ７２８２）依存的なＰＰＡＲγ転写誘導能抑制を一部阻害した（図６ａ）。一方化合物ＧＬ−１０００８５は、１０μＭでも同転写誘導能抑制を阻害せず、ＧＩ−２６２５７０はＰＰＡＲγの主作用に特異性が高く、ＧＬ−１０００８５の同主作用が低い化合物として実際に選択することができた。
続いてさらに同スクリーニング系で選択した各被験化合物（１０−１．０μＭ）をここでは単独で、同スクリーニング系のｐｃＤＮＡ−ＥＣＨＬＰをｐｃＤＮＡ−ＡＯＰ２（０．１５μｇ／ウェル）に置き換えて構築したスクリーニング系に添加し、ＡＯＰ２によるＰＰＡＲγの転写誘導能に対する被験化合物依存的な促進が存在するか上述と同様に補正したルシフェラーゼ活性を測定することにより検定した。このスクリーニング系により、上述の化合物ＧＷ７２８２およびＧＬ−１０００８５は、１．０−１０μＭでその存在依存的にＡＯＰ２の共存下でＰＰＡＲγの転写誘導能を約４−５倍あるいは４−６倍に促進することを確認した。一方で化合物ＧＩ−２６２５７０は１．０μＭ、１０μＭいずれにおいても同転写誘導能を３．５倍程度にしか促進しなかった（図６Ｂ）。これにより、本スクリーニング系を用いてＰＰＡＲγの副作用に特に特異性が高い化合物としてＧＬ−１０００８５を、また副作用惹起に比較的特異性の低い化合物としてＧＩ−２６２５７０を、実際に選択することが可能であった。
（実施例１０）組織によるＦＬＪ１３１１１の発現量の比較
配列番号１８及び配列番号１９に示したプライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）／５５℃（３０秒）７２℃（３分）のサイクルを３５回繰り返した）によりＦＬＪ１３１１１をコードするｃＤＮＡ断片の増幅をアガロースゲル電気泳動法により検出した。その結果、ＦＬＪ１３１１１は主要臓器のうちＰＰＡＲγの作用がある筋肉、肝臓のほか、乳腺、肺、胎盤、卵巣、リンパ球、白血球での発現が顕著であったが、ＰＰＡＲγリガンドの浮腫の惹起にかかわる腎臓では殆ど発現が見られなかった。これにより発現部位からＦＬＪ１３１１１はＰＰＡＲγの転写共役因子であることが裏付けられた。
（実施例１１）ＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対するＦＬＪ１３１１１の調節作用の検出
上述の酵母ツーハイブリッド解析の結果から、ＦＬＪ１３１１１はＰＰＡＲγとリガンドを介して相互作用することが示された。そこでＦＬＪ１３１１１がＰＰＡＲγの有する転写誘導活性にどのような影響を及ぼすか、培養細胞ＣＯＳ−１を用いたレポーターアッセイで調査した。
（１）動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＦＬＪ１３１１１の作製
配列番号１８及び配列番号１９に示したプライマーを用いて、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）／５５℃（３０秒）７２℃（３分）のサイクルを３５回繰り返した）により配列番号１６に示すＦＬＪ１３１１１をコードする８９７ｂｐを含むｃＤＮＡ断片を取得した。これをｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）にｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えによるＴＯＰＯクローニング法（インビトロジェン社）により挿入して動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＦＬＪ１３１１１を作製した。なおＦＬＪ１３１１１には終止コドンを挿入せず、Ｃ末端がわにベクター由来のＶ５ｅｐｉｔｏｐｅおよびＨｉｓ６タグが融合されるようにプライマーを設計した。
（２）ＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対するＦＬＪ１３１１１の調節作用の検出
上述実施例５（３）と同様の方法でｐｃＤＮＡ−ＥＣＨＬＰをｐｃＤＮＡ−ＦＬＪ１３１１１に置き換えることにより、ＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対するＦＬＪ１３１１１の作用をレポーターアッセイで測定する系を作製した。また、ＰＰＡＲγアゴニストとしてはロジグリタゾン１ｍＭを用いた。ロジグリタゾンを添加してルシフェラーゼ活性を測定した結果、ＰＰＡＲγのアゴニスト依存的な転写誘導活性は、細胞にトランスフェクトしたＦＬＪ１３１１１発現プラスミドの用量に依存した促進が認められた（図７）。これにより、ＰＰＡＲγとＦＬＪ１３１１１のアゴニスト依存的な相互作用が起こるとＰＰＡＲγの転写誘導活性が亢進することが明らかになった。
この事実と、ＰＰＡＲγリガンドの浮腫の惹起にかかわる腎臓でＦＬＪ１３１１１の発現が殆ど無いことから、ＦＬＪ１３１１１によるＰＰＡＲγ活性の促進は、副作用でなく主作用を増強すると考えられた。
ＦＬＪ１３１１１は機能未知の蛋白質であり、アミノ酸配列から分子内に細胞核内の存在を示唆する核標的配列（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）やグリコシル化を受けうる部位（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）の存在が予想される他は、アミノ酸配列構造から分子機能を示唆する情報はなかった。ＦＬＪ１３１１１がＰＰＡＲγとリガンド依存的に結合し、その転写共役因子として機能するという本発明者による発見は、該分子の機能における新規の知見である。このＦＬＪ１３１１１を利用することにより、ＰＰＡＲγの主作用選択的な作動薬を発見することが可能である。
（実施例１２）ＰＰＡＲγを介したＦＬＪ１３１１１のリガンド選択的作用の検出、およびＰＰＡＲγを介した主作用を選択的に亢進する化合物のスクリーニング系
以上の知見から、実施例１１におけるレポーターアッセイ系で検出可能なＦＬＪ１３１１１によるＰＰＡＲγのリガンド依存転写促進能の亢進作用を促進する化合物をスクリーニングすることによって糖代謝を改善し、糖尿病態の回復に寄与する新規の糖尿病治療薬のスクリーニングが可能である。またさらにそこで得られる被験物質の中から、実施例８におけるレポーターアッセイ系で検出できるＡＯＰ２とＰＰＡＲγの相互作用、およびＡＯＰ２によるＰＰＡＲγのリガンド依存転写促進能の亢進を阻害する物質をスクリーニングすることにより、副作用である浮腫を引き起こさずに糖尿病態の回復に寄与する糖尿病治療薬のスクリーニングが可能である。
すなわち実施例１１と全く同様のレポーター活性測定系で被験化合物をスクリーニングできるが、大量の被験化合物を効率よくスクリーニングするために下記の条件に設定しレポーターアッセイを実施した。ＧＡＬ−ＰＰＡＲγ（０．１５μｇ／ウェル）、レポーターコンストラクト（ＲＥ×８−Ｌｕｃｉ；０．８μｇ／ウェル）およびβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子をもつプラスミドｐＣＨ１１０（０．４μｇ／ウェル）をｐｃＤＮＡ−ＦＬＪ１３１１１（０．１μｇ／ウェル）とともにＣＯＳ−１細胞に一過性にコトランスフェクトした。ここへ最終濃度１０−０．１μＭの被験化合物を培地に添加して４８時間培養した後、ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してＰＰＡＲγの活性化を数値化した。上記条件以外のトランスフェクション方法およびルシフェラーゼ測定方法の詳細は実施例５及び実施例９に従った。被験化合物の添加、非添加の各条件下でＦＬＪ１３１１１の発現によるＰＰＡＲγの転写誘導能促進（補正したルシフェラーゼ活性値の比）を指標にスクリーニングした。このＦＬＪ１３１１１によるＰＰＡＲγ転写誘導能を促進する物質をスクリーニングする基準は、有効濃度（ＥＤ５０）において、好ましくは１０μＭ以下、さらに好ましくは１．０μＭ以下とした。本スクリーニング系により、ロジグリタゾンおよびピオグリタゾンは、１μＭでＦＬＪ１３１１１によるＰＰＡＲγ転写誘導能を促進した。一方化合物ＧＬ−１０００８５は、１０μＭでも同転写誘導能を促進せず、ロジグリタゾン、ピオグリタゾンはＰＰＡＲγの主作用に特異性が高く、ＧＬ−１０００８５は同主作用が低い化合物として実際に選択することが可能であった。
（実施例１３）正常マウスおよび糖尿病モデルマウスにおけるＦＬＪ１３１１１発現量の測定
上述の知見によりＦＬＪ１３１１１蛋白質とＰＰＡＲγの相互作用がＰＰＡＲγアゴニストを介した主作用である糖代謝改善に関わることが予想された。そこで前述実施例４に記載の２種類の糖尿病モデルマウス、ＫＫＡｙ／ＴａおよびＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂの筋肉におけるＦＬＪ１３１１１遺伝子のマウスオルソログ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を測定し、正常個体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−＋ｍ／＋ｍのそれと比較することにした。遺伝子発現量は、本発明のＦＬＪ１３１１１遺伝子の発現量を測定し、同時に測定したグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ））遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。本測定系においてはＰＣＲで増幅された２本鎖ＤＮＡがとりこむＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素の蛍光量をリアルタイムに検出及び定量することにより、目的とする遺伝子の発現量が決定される。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）マウスの組織の摘出およびｍＲＮＡの抽出
前述実施例４と同一の方法により調製した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、（１）で調製した１μｇのＲＮＡ（１５あるいは１２週齢のマウスの筋肉）をそれぞれ用い、逆転写反応用キット（ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、滅菌水１８０μｌを加えて−２０℃で保存した。
（３）ＰＣＲプライマーの作製
４つのオリゴヌクレオチド（配列番号２０−２４）を（４）の項で述べるＰＣＲのプライマーとして設計した。ＦＬＪ１３１１１遺伝子に対しては配列番号２０と配列番号２１の組み合せ、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対しては配列番号２２と配列番号２３の組み合わせで使用した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は２５μｌの系で説明書に従って行った。各系において１本鎖ｃＤＮＡは５μｌ、２ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ試薬を１２．５μｌ、各プライマーは７．５ｐｍｏｌ使用した。ここで１本鎖ｃＤＮＡは（１）で調製したものをＧ３ＰＤＨに関しては３０倍希釈、ＦＬＪ１３１１１に関しては１０倍希釈して使用した。なお検量線作成には、１本鎖ｃＤＮＡに代えて０．１μｇ／μｌのマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を適当に希釈したものを５μｌ用いた。ＰＣＲは、５０℃で１０分に続いて９５℃で１０分の後、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒の２ステップからなる工程を４５サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウスＦＬＪ１３１１１遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ＦＬＪ１３１１１補正発現量］＝［ＦＬＪ１３１１１遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
発現量の比較においてはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの発現量を１００とした相対量を図８に示した。図８に示す通り、ＦＬＪ１３１１１遺伝子の発現は、糖尿病モデルマウスの筋肉において発現が顕著に減少していることが判明した。従ってＦＬＪ１３１１１の筋肉における発現量減少はインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性にＦＬＪ１３１１１の関与が大きいと結論づけられる。
また本実施例の結果より、ＦＬＪ１３１１１発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。
（実施例１４）ＦＬＪ１３１１１のプロモーター配列の同定、および該配列の転写誘導活性を利用した主作用を選択的に亢進する化合物のスクリーニング系
前述実施例１１の知見から、ＦＬＪ１３１１１の存在量の増加は主作用惹起効果の高いＰＰＡＲγリガンドの作用を増強することが明らかである。この事実からＦＬＪ１３１１１遺伝子からのＦＬＪ１３１１１発現量を正に調節することにより、インスリン抵抗性を改善できる可能性が予測される。しかしＦＬＪ１３１１１遺伝子の発現調節に関わるプロモーター配列は明らかではなかった。そこでＦＬＪ１３１１１プロモーター配列の取得を試みた。まず、配列番号２４および２５に示す一対のプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて実施例１１（１）に記載のＰＣＲと同じ反応条件でＦＬＪ１３１１１のプロモーター配列の増幅を試みたところ、約１．８ｋｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅に成功した。上述の実施例と同様の方法により該断片の塩基配列を決定したところ、３’末端側にＦＬＪ１３１１１遺伝子のコード配列の一部を含む、配列番号２６に示すポリヌクレオチドであることがわかった。該ポリヌクレオチド配列がＦＬＪ１３１１１の発現を制御するプロモーター活性を有するか否か、次の方法で検討した。ルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに該ヌクレオチドを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いて挿入し、ｐＧＬ３−ＦＬＪ１３１１１ｐと名付けたレポータープラスミドを作製した。該プラスミドをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトし、前記ポリヌクレオチドを含まないｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（空ベクター）をトランスフェクトした場合と比較することにより、該ポリヌクレオチドのプロモーターとしての発現誘導活性をルシフェラーゼの活性を指標に測定した。細胞へのトランスフェクション効率の補正及びルシフェラーゼアッセイの詳細は前述実施例５（３）に記載の方法と同じものを用いた。その結果、図９に示すように前記ポリヌクレオチドの存在に依存した有意なプロモーター活性が確認された。さらにこのプロモーター活性はトランスフェクトした細胞にＰＰＡＲγのリガンドであるピオグリタゾン（０．１μＭ）を加えた場合に亢進されることが明らかになった。また本実験において前述のＦＬＪ１３１１１発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ−ＦＬＪ１３１１１をコトランスフェクトすると図９に示す通り前記ポリヌクレオチドのプロモーター活性は低下した。これらの事実から、クローニングしたポリヌクレオチドにはＦＬＪ１３１１１の発現を制御するプロモーター配列が含まれており、このプロモーターはインスリン抵抗性を低減させるピオグリタゾンなどのＰＰＡＲγリガンドによって正に制御され、ＦＬＪ１３１１１自身の存在によって負に制御されていることを示している。これにより、ＦＬＪ１３１１１はリガンドを介してＰＰＡＲγの活性を亢進させるのみでなく、インスリン抵抗性を低減させる効果が知られるＰＰＡＲγのリガンドによってＦＬＪ１３１１１自身の発現量が亢進することにより、相乗的にインスリン抵抗性の低減に作用していることが予想された。
以上の知見から、本実施例におけるＦＬＪ１３１１のプロモーターアッセイは、ＰＰＡＲγ蛋白質を利用せずにＰＰＡＲγリガンドあるいはインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングするために利用できる。
（実施例１５）ＥＣＨＬＰ過剰発現細胞における脂肪細胞分化能の測定
上述の通り、ＥＣＨＬＰ蛋白質はＰＰＡＲγのリガンドの存在に依存してＰＰＡＲγに結合し、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を抑制することことが判明した。さらにＥＣＨＬＰは糖尿病態において発現量が増加していることから、その過剰発現がＰＰＡＲγの活性抑制を介してインスリン抵抗性を惹起し、２型糖尿病の原因となっていることが予想された。一方、ＰＰＡＲγはリガンドに依存した転写活性の誘導により脂肪細胞の分化を促進し、その結果分化した脂肪細胞が血糖を取り込むことにより糖代謝が改善され、インスリン抵抗性が低減されることが知られている。そこで、実際にＥＣＨＬＰの細胞中での過剰発現がインスリン抵抗性にリンクする脂肪細胞の分化に影響を与えるか否かを以下の実験により調査した。
（１）ＥＣＨＬＰ過剰発現Ｌ１細胞の樹立
Ｃ末端にＤＹＫＤＤＤＤＫからなるＦＬＡＧ配列を付加したＥＣＨＬＰをレトロウイルスベクターｐＣＬＮＣＸ（イムジェネックス社）に組み換えるため、ｐｃＤＮＡ−ＥＣＨＬＰプラスミドより制限酵素を用いて約１−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を調製した。また、ＮｏｔＩ部位−ＦＬＡＧ配列−ＸｂａＩ部位からなるＤＮＡ断片を調製するため、配列番号２７と配列番号２８に示す２本の合成オリゴＤＮＡを混合し加熱、徐冷して２本鎖ＤＮＡ断片とした。これらのＤＮＡ断片を、ｐＣＬＮＣＸのＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位で組み換え、ｐＣＬＮＣＸ−ＥＣＨＬＰ−ＦＬＡＧベクターを得た。このｐＣＬＮＣＸ−ＥＣＨＬＰ−ＦＬＡＧベクターとｐＣＬ−Ｅｃｏベクター（イムジェネックス社）を共に、２９３細胞にリン酸カルシウム法により遺伝子導入した。遺伝子導入後２４および４８時間に、培養上清中の組み換えウイルスを回収した。未使用の細胞培養液（最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社））により２倍希釈し、更に最終濃度８μｇ／ｍｌとなるようにポリブレン（シグマ社）を添加してマウス培養前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１（ＡＴＣＣ）細胞に感染させた。感染後４８時間より、１．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（ナカライ）によりウイルス感染細胞を選別し、ＥＣＨＬＰ−ＦＬＡＧ安定発現Ｌ１細胞を樹立した。コントロールとして、ｐＣＬＮＣＸベクター（空ベクター）を感染させた細胞も同様に作製した。樹立細胞におけるＥＣＨＬＰ−ＦＬＡＧの発現は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ社）を用いたウエスタンブロット法により確認した。具体的には、上述のＥＣＨＬＰ−ＦＬＡＧ発現細胞の溶解液１０μｌに１０μｌの２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％ラウレル硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、０．１４Ｍ  β−メルカプトエタノール、０．０２％ブロムフェノルブルー）を添加し、１００℃で２分間処理した後、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いてポリアクリルアミド中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ニトロセルロース上のＥＣＨＬＰ蛋白質の検出を行った。一次抗体にはＥＣＨＬＰのＣ末端に融合させたＦＬＡＧエピトープを認識するモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用い、二次抗体にはラビットＩｇＧ−ＨＲＰ融合抗体（バイオラッド社）を用いた。その結果ＥＣＨＬＰ−ＦＬＡＧ融合蛋白質を示す蛋白質がＥＣＨＬＰ−ＦＬＡＧ発現ベクターの細胞導入に依存して検出されることを確認した。
（２）ピオグリタゾンによる脂肪細胞分化
上記の方法により樹立した空ベクター感染Ｌ１細胞又はＥＣＨＬＰ感染Ｌ１細胞を、９６穴プレートに１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで培養し、４８時間後よりインスリン（１μｇ／ｍｌ）およびピオグリタゾン（０．１−３μＭ）を用いて脂肪細胞へ分化誘導した。脂肪細胞への分化の程度は細胞中に取り込まれたトリグリセリド量を指標とし、分化誘導開始後７日目の細胞を、トリグリセリド含量の測定に供与した。
（３）細胞内トリグリセリド量の測定
２穴の細胞を４０μｌの０．１％ＳＤＳ溶液中に溶解し、１ｍｌのトリグリセリド測定試薬（トリグリセリドＧ−テストワコー、和光純薬工業）を加え、３７℃にて１０分間加温した。反応液の波長５０５ｎｍの吸光度（ＯＤ５０５）を測定した。その結果、図１０に示すとおりコントロール細胞（空ベクター感染Ｌ１細胞）ではピオグリタゾン（０．１−３μＭ）により用量依存的に細胞内トリグリセリドが増加し、脂肪細胞への分化が認められた。一方ＥＣＨＬＰ過剰発現細胞（ＥＣＨＬＰ感染Ｌ１細胞）においては、ピオグリタゾン（０．１−３μＭ）により誘導されたトリグリセリド増加は、いずれのピオグリタゾン用量においてもコントロール細胞における増加量の４３−５７％に抑制された。
脂肪細胞の分化抑制は脂肪細胞によって引き起こされる糖取込の総量を減少させる。したがって上記の結果からＥＣＨＬＰの過剰発現は脂肪細胞分化を抑制することにより２型糖尿病の原因因子として作用していることが明らかになった。
（実施例１６）ＦＬＪ１３１１１とＰＰＡＲγの結合を選択的に誘導するリガンドの同定
上述実施例１２に示したものと同一のレポーターアッセイによるスクリーニングを行った結果、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する化合物ＸＦが得られた（図１１）。その力価は１０μＭでピオグリタゾンの０．１μＭにほぼ匹敵することがわかった。さらにこの化合物ＸＦによるＰＰＡＲγの転写活性化能の促進作用はピオグリタゾンの場合と同様にＦＬＪ１３１１１の過剰発現（０．１μｇ／ウェル）によって亢進することがわかった。
また、前述の実施例２に示したリガンド依存的なＰＰＡＲγとＦＬＪ１３１１１の結合を酵母ツーハイブリッド法により検出する系において、同一の条件下でＧＷ７２８２を化合物ＸＦに置き換える形で実験したところ、化合物ＸＦは前述のＳＲＣ−１、ＥＣＨＬＰ，ＡＯＰ２などの蛋白質とＰＰＡＲγの結合は誘導せずに、ＦＬＪ１３１１１とＰＰＡＲγの結合のみを誘導することを見出した。
（実施例１７）ＦＬＪ１３１１１選択的ＰＰＡＲγリガンドによるナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素発現量の測定
ＰＰＡＲγリガンドによる浮腫は循環血漿量の増大によって引き起こされるが、これは腎細胞におけるナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素の発現量上昇とリンクして起こることが知られている。そこで、化合物ＸＦが浮腫の惹起にリンクする腎細胞のナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素の発現量に影響を与えるか否か調査した。
具体的にはイヌ腎上皮細胞ＭＤＣＫは、１０％牛胎児血清（シグマ社）を添加した最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を用いて２４穴培養プレートに１．５ｘ１０５細胞／穴で３７℃にて４８時間培養した。培養液に溶媒（ジメチルスルホキシド）のみ、あるいはピオグリタゾン（終濃度０．１−１０μＭ）または被験化合物ＸＦ（終濃度０．１−１０μＭ）を添加し、さらに６時間培養した。１ｍｌの測定用緩衝液（３ｍＭ  ＭｇＳＯ４，３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１０ｍＭ  トリス塩酸，２５０ｍＭ  ショ糖）で細胞を２回洗浄した後、３Ｈ−ウアバイン（７４Ｂｑ／μｌ、アマシャムバイオサイエンス社）および２μＭウアバインを含む測定用緩衝液２００μｌを加えて３７℃で２時間静置した。この条件で得られる結合放射活性を全結合量とした。また、非特異的結合量の測定には３Ｈ−ウアバイン（７４Ｂｑ／μｌ）および１ｍＭ  ウアバインを用いた。反応液を吸引除去後、１ｍｌの氷冷測定用緩衝液で３回細胞を洗浄し、０．５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（２５０μｌ）により細胞を溶解した。等量の０．５Ｎ  ＨＣｌ水溶液により中和後、５ｍｌ液体シンチレータを加え、液体シンチレーション測定器により放射活性を計測した。３Ｈ−ウアバインの特異的結合量は、全結合量から非特異的結合量を差し引いた値として求め、ナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素の発現量を測定した。
その結果図１２に示すとおり、ピオグリタゾンは溶媒のみを添加したコントロール細胞に比較して０．１μＭの添加で有意なナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素の発現量増大作用が見られた。それに対して化合物ＸＦは、上述の知見からＰＰＡＲγ転写活性化においてはピオグリタゾンとほぼ同様の効果を示す１０μＭの濃度を添加してもナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素の発現量を増大させなかった。すなわち、ＦＬＪ１３１１１選択的ＰＰＡＲγリガンドである化合物ＸＦは浮腫を惹起するナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素の酵素発現量の増大を引き起こさないことが明らかとなり、化合物ＸＦが浮腫の惹起に関与しないことが示された。
（実施例１８）ＦＬＪ１３１１１選択的ＰＰＡＲγリガンドによる脂肪細胞分化能の測定
次に化合物ＸＦの添加がインスリン抵抗性の低減にリンクする脂肪細胞の分化に影響を与えるか否かを前述の実施例１５と同様の方法により調査した。具体的にはマウス培養前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１（ＡＴＣＣ）細胞に、化合物ＸＦ（１．０−１０．０μＭ）を添加して７日目の細胞のトリグリセリド量を指標として脂肪細胞への分化の度合いを測定した。その結果、化合物ＸＦの添加は溶媒のみを添加した細胞に比較して約２０％程度のトリグリセリド量の増加が認められた。
脂肪細胞の分化促進は脂肪細胞が担う糖取込の総量を増加させ、インスリン抵抗性を改善する。したがって以上の結果から化合物ＸＦは浮腫の惹起を引き起こさずにインスリン抵抗性を改善する作用を持つことが示された。
以上の結果から、ＦＬＪ１３１１１を用いることにより、主作用を選択的にもたらして副作用を引き起こさない化合物、すなわちインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングできることは明らかである。
産業上の利用可能性
本発明の、リガンド存在下で行う酵母ツーハイブリッドスクリーニング方法により、副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングするのに有用なツールとなるリガンド依存的にＰＰＡＲと相互作用する蛋白質をスクリーニングすることができる。前記方法により得られた、主作用リガンド依存性ＰＰＡＲ結合分子ＥＣＨＬＰ、主作用リガンド選択的ＰＰＡＲγ作用因子ＦＬＪ１３１１１、および副作用リガンド依存性ＰＰＡＲ結合分子ＡＯＰ２を用いることにより、主作用を選択的にもたらして副作用を引き起こさない化合物を同定及びスクリーニングすることができる。該スクリーニング系により選択された物質は、インスリン抵抗性改善薬の候補物質として有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号９、１０、１１、１３、２４、２５、２７、２８の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、リガンド依存的なＰＰＡＲγ相互作用因子とＰＰＡＲγの結合におけるアゴニスト選択性を示す図である。
図２は、糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（ＫＫＡｙ）およびＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）と正常マウスにおけるＥｃｈ１発現量の比較を示す図である。
図３は、Ｅｃｈ１の組織別発現分布を示す図である。
図４は、ＥＣＨＬＰによるＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対する抑制作用を示す図である。
図５は、ＡＯＰ２によるＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対する促進作用を示す図である。
図６は、ＥＣＨＬＰ、ＡＯＰ２によるＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対する作用を利用した主作用特異的なＰＰＡＲγリガンドのスクリーニングを示す図である。
図７は、ＦＬＪ１３１１１によるＰＰＡＲγのリガンド依存的転写誘導能に対する促進作用を示す図である。
図８は、糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（ＫＫＡｙ）、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）および正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｃ５７ＢＬ）、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−＋ｍ／＋ｍ（ｍ＋／ｍ＋））におけるＦＬＪ１３１１１発現量の比較を示す図である。
図９は、ＦＬＪ１３１１１プロモーターの転写誘導活性及び該活性に及ぼすピオグリタゾン又はＦＬＪ１３１１１過剰発現の影響を示す図である。
図１０は、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるピオグリタゾンによるトリグリセリド含量の増加に対するＥＣＨＬＰ過剰発現の影響を示す図である。
図１１は、ＦＬＪ１３１１１存在あるいは非存在下におけるピオグリタゾン又は化合物ＸＦに依存したＰＰＡＲγの転写誘導能を示す図である。
図１２は、腎上皮細胞におけるナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素の発現量に対するピオグリタゾンあるいは化合物ＸＦの影響を示す図である。
【図１】
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【図１−１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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