(57)【要約】粒子形成能を有するＨＢＶプレコア蛋白およびその測定手段を提供する。ＨＢＶのウイルス（様）粒子を形成する新規なＨＢＶプレコア蛋白を同定した。本発明はこの新規なＨＢＶプレコア蛋白を提供する。さらにこのＨＢＶプレコア蛋白によって形成される、コア様粒子、ウイルス様粒子を提供する。このウイルス様粒子はワクチン、治療薬に利用できる。さらに本発明はＨＢＶプレコア蛋白の測定法および抗ＨＢＶプレコアタンパク抗体の測定法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＶのコア様粒子形成能を有する、シグナル配列の全部または一部を含むＨＢＶプレコア蛋白。
【請求項２】
ＨＢＶのコア様粒子形成能を有する、アミノ酸配列のＮ末端が−２８番目でありＣ末端が１５０番目から１５４番目のいずれかである、ＨＢＶプレコア蛋白。
【請求項３】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる請求項１に記載のＨＢＶプレコア蛋白。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢＶプレコア蛋白を含んでなるＨＢＶコア（様）粒子またはＨＢＶウイルス（様）粒子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢＶプレコア蛋白を含んでなるＨＢＶワクチン、または治療薬。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢＶプレコア蛋白を含んでなるＨＢＶ診断薬または診断キット。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢＶプレコア蛋白を測定する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢＶプレコア蛋白を露出させる工程、ＨＢＶプレコア蛋白を認識するプローブと結合する工程を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＢＶプレコア蛋白を露出させる工程が界面活性剤の処理または添加である請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記界面活性剤が陰イオン性界面活性剤、または陰イオン性界面活性剤および両イオン性界面活性剤、または陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれかである請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＢＶプレコア蛋白に結合するプローブがアミノ酸配列の−２８〜−１１に結合するプローブまたは請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢＶプレコア蛋白に特異的に結合し、ＨＢｅ抗原あるいはＨＢｃ抗原には結合しないプローブである請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＢＶプレコア蛋白に結合するプローブが抗体である請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がアミノ酸配列の１番目から１９番目を認識する抗体、２１番目から４０番目を認識する抗体、３１番目から４９番目を認識する抗体、１３０番目から１４０番目を認識する抗体、１播目から８１番目の構造領域を認識する抗体の中から選択される２つ以上の抗体の組み合わせである請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＨＢｓ抗体等のＨＢｓ抗原に結合するプローブにより（免疫）沈降し、沈降物中のＨＢＶプレコア／コアタンパクを測定することにより、粒子状ＨＢＶプレコア／コアタンパクを測定する方法。
【請求項１５】
請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法により測定したＨＢＶプレコア蛋白の測定値にＨＢｅ抗原の値が含まれている場合に、ＨＢｅ抗原の測定値を減算することにより算出する検体中の粒子状ＨＢＶプレコア／コア蛋白の値を測定する方法。
【請求項１６】
請求項７〜１５のいずれか１項に記載の方法により測定したＨＢＶプレコア／コア蛋白の測定値よりＨＢｃ抗原の測定値を減算することにより算出する検体中の粒子状ＨＢＶプレコア蛋白の値を測定する方法。
【請求項１７】
請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法で測定したＨＢＶプレコア蛋白の定量をＨＢＶ感染あるいはＢ型肝炎の病態マーカーとして利用する方法。
【請求項１８】
陰イオン性界面活性剤およびＨＢＶプレコア蛋白の−２８〜１５０番目のアミノ酸を認識する抗体を含む測定キットおよびＨＢｅ抗原を測定するキットを含む診断薬。
【請求項１９】
陰イオン性界面活性剤およびＨＢＶプレコア／コアタンパクの−２８〜１５０アミノ酸を認識する抗体、および粒子状ＨＢＶプレコア／コアタンパクとＨＢｅ抗原を分離する抗体を含む測定キットおよび診断薬。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢＶプレコアタンパクに対する抗体を検出する方法。
【請求項２１】
ＨＢＶプレコアタンパクを含む粒子状ＨＢＶプレコアタンパクに対する抗体を測定する測定キットおよび診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＨＢＶウイルスのコア様粒子形成が可能なＨＢＶプレコア蛋白に関する。
【背景技術】  ウイルス感染の診断は、主にウイルスやウイルス関連成分（蛋白や核酸）を検出する方法と、ウイルス感染により生体が産生する特異抗体を測定する方法とによって行われる。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染においては、ＨＢｓ抗原・抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原・抗体、ＨＢＶ−ＤＮＡなどの診断マーカーが臨床検査法として導入されている。
通常、ＨＢＶ感染の有無はＨＢｓ抗原やＨＢｃ抗体により知ることができる。また、ＨＢＶの感染性のみならず、ＨＢＶキァリアの病態や予後、治療の効果判定の指標としては、ＨＢｅ抗原・抗体、ＨＢＶ−ＤＮＡ量の測定が用いられる。中でもＨＢｅ抗原・抗体免疫測定法は操作が簡便で安価なため最も汎用されているが、ＨＢｅ抗原を産生・分泌できないプレコア変異株では、ＨＢｅ抗原が陰性であってもＨＢＶの増殖が旺盛で、感染性や免疫原性が強く病態も活動的な症例が存在する。一方、野生株や変異株にかかわらず、ＨＢＶの増殖・複製状態を反映するＨＢＶ−ＤＮＡ量の測定が重要となるが、前処理法や測定法が煩雑で、再現性や安定性に欠けるという問題点がある。
最近、ＨＢＶコア関連抗体（ＨＢｃ抗体およびＨＢｅ抗体）の存在下や変異株の出現にかかわらず、ＨＢＶの増殖・複製状態を反映すると考えられるＨＢＶコア関連抗原を測定する方法が開発された。Ｋｉｍｕｒａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４０，４３９−４４５，２００２）は、ＨＢＶコア関連抗原（ＨＢｃ抗原及びＨＢｅ抗原を含むＨＢＶプレコア／コア遺伝子産物）に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、簡便な前処理法により血清中のＨＢｃ抗原とＨＢｅ抗原を同時に検出する免疫測定方法を開発し、ウイルスゲノムを検出するＮＡＴ検査法と相関を持つことを示した。
これまでの文献報告では、ＨＢＶプレコア／コア遺伝子は全長２１２アミノ酸残基（アミノ酸番号：−２９〜１８３（ＨＢｃ抗原の一番目のアミノ酸を１とした場合。以下同様））からなるタンパクをコードし、そのＮ末端には１９残基のシグナルペプチドを有する。シグナルペプチドとは疎水性のアミノ酸残基からなり、分泌蛋白が膜に結合するためのシグナル配列として機能する。ここでは−２９〜−１１番目のアミノ酸からなる配列を指す。
プレコア蛋白は翻訳されると小胞体膜を通過し１９残基のシグナルペプチド切断後、Ｃ末端核酸結合ドメインが切断されＨＢｅ抗原（アミノ酸番号：−１０〜１４９）となり血中に分泌される。従来このＨＢｅ抗原は血中ではアルブミンやγ−グロブリンなどの血清蛋白と結合して存在すると考えられ、ＨＢＶ粒子を形成しているとの報告はなかった。またＨＢｅ抗原は、免疫寛容の維持、ウイルス複製の抑制などにかかわっているとの報告も見られるが、ＨＢＶの複製には不可欠ではなく、その生物学的役割については不明な点が多い。
また、ＨＢＶプレコア／コア遺伝子は２番目の転写開始シグナルを持ち、この開始シグナルから転写翻訳された産物はＨＢｃ抗原（アミノ酸番号：１〜１８３）となり、ＨＢＶ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｅ  ＲＮＡを取り込みながらウイルスキャプシドを形成し、ＨＢｓ抗原からなる外皮（エンベロープ）をまとった後、細胞外に完全ウイルス粒子（Ｄａｎｅ粒子）として放出される。このＨＢｃ抗原のうち、１−１４４番目のアミノ酸が存在すれば、コア粒子の形成が起こることが報告されているが、感染性のウイルスのコア粒子を形成している分子は１−１８３番目のアミノ酸配列の蛋白から構成されていると考えられている。
上記のようにＨＢｃ抗原とＨＢｅ抗原は、大部分共通の配列を持つ蛋白でありながら大きく異なる性質を持っている。この性質の違いに重要な働きをしているのはＨＢｅ抗原のアミノ酸−７番目にあるシステイン残基である。このシステインは同じ分子内のアミノ酸６１番目のシステイン残基とジスルフィド結合を形成し、ｅ抗原性を獲得する（Ｍ．Ｎａｓｓａｌ  ａｎｄ  Ａ．Ｒｉｅｇｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７；４３０７−４３１５，１９９３）。−７番目のシステインを他のアミノ酸に変異させるなどしてこのジスルフィド結合を形成できないようにすると、ＨＢｅ抗原のコンフォメーションはとらないことからもこのジスルフィド結合の重要性が示されている。
一方ＨＢｃ抗原は１番目のアミノ酸部位から転写翻訳されるためアミノ酸−７番目にあるシステイン残基を持たず、ＨＢｃコンフォメーションをとり、２分子のＨＢｃ蛋白がアミノ酸６１番目のシステイン残基どうしのジスルフィド結合形成によりホモ２量体となり、ウイルスキャプシド（コア粒子）を形成する。
ＨＢＶ患者血清中に存在するＨＢＶコア関連抗原は、主に感染性を有するＤａｎｅ粒子を構成するＨＢｃ抗原（アミノ酸番号：１〜１８３）、および、ＨＢｃ抗原とアミノ酸配列上はほとんど同様であるがＨＢｃ抗原とは抗原性が異なる分泌性のＨＢｅ抗原（アミノ酸番号：−１０〜１４９）に大別される。しかしながら、この他に血中のマイナー分子としてＨＢｅ抗原性を示すプレＨＢｅ抗原（アミノ酸番号：−２９〜１４９）の存在がＴＡＫＡＨＡＳＨＩら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４７，３１５６−３１６０，１９９１）により明らかにされている。
彼らはプールした血清を超遠心で分離し、上清より抗ＨＢｅモノクローナル抗体のアフィニティーカラムでＨＢｅ抗原性を持つ蛋白を精製し、その配列を決定した。ＨＢｅ抗原蛋白質は前述したように、ウイルス粒子を形成せず血中に存在すると考えられる。彼らもＨＢＶの外皮蛋白であるＨＢｓ抗原を剥離（破壊）する処理あるいはウイルス粒子、コア粒子を破壊するような処理を行わずに精製したＨＢｅ抗原配列を決定しており、彼らが証明したシグナル配列を持つＨＢｅ抗原（アミノ酸番号：−２９〜１４９）は血清中に遊離して存在すると考えられる。
また一方で、Ｄａｎｅ粒子の中には、ＨＢＶ−ＤＮＡを含まない空粒子（ＳＡＫＡＭＯＴＯ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，４８，６７８−６８２，１９８３）やスプライシングを受けた通常より短いＨＢＶ−ＤＮＡを含む複製不可能な欠損粒子が存在すること（ＴＥＲＲＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５，５５３９−５５４３，１９９１）が報告されているが、その粒子を形成しているＨＢＶタンパクの詳細な解析は行われていない。
このように、これらの文献で解析されている血中でのＨＢＶコア関連抗原の生化学的分析は十分とはいえず、ＨＢＶの増殖・複製状態を反映すると考えられるＨＢＶコア関連抗原のウイルスマーカーとしての血中における存在様式は未解明のままである。
【発明の開示】
臨床的有用性の高いＨＢＶのＮＡＴ検査には、現在ＰＣＲ法及びＴＭＡ法があるが、検査コストが高く付く上に操作が煩雑であることが問題点として挙げられる。また、遺伝子増幅法を用いているため、増幅用プライマーが標的ＤＮＡと一致しないと偽陰性を引き起こす。一方、免疫測定法は操作が簡便で安価に測定できるが、増殖マーカーとしての現行のＨＢｅ抗原測定法では、ＨＢｅ抗体の存在下では免疫複合体として存在するＨＢｅ抗原を測定できないし、ＨＢｅ抗原を産生・分泌できないプレコア変異株、コアプロモーター変異株では、ＨＢｅ抗原が陰性となる。また、ＨＢｃ抗原測定法は、ＨＢＶ−ＤＮＡ量と相関はあるものの、前処理が繁雑で感度不足のため臨床応用されていない。
従って本発明の目的は、Ｂ型肝炎のスクリーニングやＢ型慢性肝炎患者の治療におけるモニタリングなどに臨床応用されると考えられるＨＢＶコア関連抗原を生化学的に分析し、ＨＢＶの増殖・複製状態を反映する血中のＨＢＶコア関連抗原の分子種を同定することである。
こうした解析により、ＨＢＶ感染患者の診断等に有用な分子種を発見し、新たな診断薬を開発することができる。
また、ＨＢＶコア関連抗原の存在様式およびその役割を解析することで、新たなＨＢＶワクチン、治療薬の開発につなげることができる。
本発明は、血中のＨＢＶ粒子及びＨＢＶ関連蛋白をショ糖密度勾配遠心法やＥＬＩＳＡ、電気泳動法等を用いることで、ＨＢＶコア関連抗原を分離精製し、従来報告されているＨＢｅ抗原及びＨＢｃ抗原とは異なる抗原を単離し、質量分析法により新規なコア様粒子を形成する分子を同定した。本発明の１つの態様はウイルス様粒子形成能のあるシグナル配列の全部または一部を含むＨＢＶプレコア蛋白を提供することである。
ここで一部とは１９残基のシグナル配列のうちＮ末側からの１残基以上の配列である。またこのＨＢＶプレコア蛋白のＣ末端はアミノ酸番号で１５０番目以降のＲＲＲＧＲのいずれかの部位で切断されたものである。さらにシグナル配列あるいはＨＢｅ配列部分（アミノ酸番号：−１０〜１４９）に変異を含んでも良く、許容される変異はコア様粒子を形成できる範囲ならば構わない。このＨＢＶプレコア蛋白は、最も好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
さらに本発明は上記のＨＢＶプレコア蛋白を含んでなるＨＢＶコア様粒子またはＨＢＶウイルス様粒子を提供する。
またこのＨＢＶプレコア蛋白、あるいはこの蛋白から構成されたＨＢＶコア様粒子、ＨＢＶウイルス様粒子を含むＨＢＶ診断薬あるいはキットを提供する。
さらにこのＨＢＶプレコア蛋白を測定する方法、あるいは診断薬、診断キットを提供する。
このＨＢＶプレコア蛋白の測定法はＨＢＶプレコア蛋白を露出させる工程、ＨＢＶプレコア蛋白を認識するプローブと結合させる工程を含んでもよい。またＨＢＶプレコア蛋白を露出させる工程が界面活性剤の処理または添加であっても良い。この界面活性剤は限定されず非イオン性界面活性剤も有効であるが、特に陰イオン性界面活性剤が適している。また陰イオン性界面活性剤に両イオン性界面活性剤を加えたもの、さらに非イオン性界面活性剤を加えたものも効果がある。
さらに前記ＨＢＶプレコア蛋白に結合するプローブがアミノ酸番号の−２８〜−１１の配列に結合するプローブであっても構わない。このプローブが抗体であっても良い。
また、抗ＨＢｓ抗体により免疫沈降を行い、沈降物中のＨＢＶプレコア／コアタンパクを測定することにより、遊離のＨＢｅ抗原を除いた粒子状ＨＢＶプレコア／コアタンパクのみを特異的に測定することも可能である。この免疫沈降はＨＢｓ抗原に結合するプローブを用いた分離法によって置き換えることもできる。
上記の測定法により測定したＨＢＶプレコア蛋白の測定値にＨＢｅ抗原の値が含まれている場合に、ＨＢｅ抗原の測定値を減算することにより検体中の粒子状ＨＢＶプレコア蛋白の値を算出し、測定することも可能である。さらにその値よりＨＢｃ抗原の測定値を減算することにより検体中の粒子状ＨＢＶプレコア蛋白の正確な値を測定することも可能である。この測定した粒子状ＨＢＶプレコア蛋白の定量値はＨＢＶ感染の病態マーカーとして利用できる。
さらに本発明は陰イオン性界面活性剤およびＨＢＶプレコア蛋白の−２８〜１５０番目のアミノ酸を認識する抗体を含む測定キットおよびＨＢｅ抗原を測定するキットを含む診断薬を提供する。
本発明の別の形態としてＨＢＶプレコア蛋白を含んでなるＨＢＶワクチン、および治療薬を提供する。
これらに加え、本発明は粒子状ＨＢＶプレコアタンパクに対する抗体を測定する方法、あるいは診断薬、診断キットを提供する。
これらには上記のＨＢＶプレコアタンパク粒子を抗原として用いることができる。この粒子は血清中などから密度勾配遠心、免疫沈降などで精製することで得られ、界面活性剤等でエンベロープを除去することで、ＨＢＶプレコアタンパク抗原を露出させることができる。また、リコンビナントタンパクにより、粒子状ＨＢＶプレコアタンパクを製造することも可能である。
この抗原を用いることにより、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体とは異なる粒子状ＨＢＶプレコアタンパクに対する抗体を測定することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＨＢＶプレコア蛋白、ＨＢｅ抗原、シグナル配列を持つＨＢｅ抗原、およびＨＢｃ抗原のアミノ酸の領域と各抗原の血液中での様態を示す図である。
図２は、ショ糖密度勾配遠心法にて分離したＨＢｅ抗原陽性血清のＨＢＶ抗原、ＨＢＶ  ＤＮＡの挙動を示す図である。各分画中のＨＢＶコア関連抗原（黒正方形）、ＨＢｃ抗原（●）、ＨＢｓ抗原（◇）、ＨＢｅ抗原  （□）、およびＨＢＶ  ＤＮＡ（○）をそれぞれ示し、分画の密度を破線で示す。
図３は、ショ糖密度勾配遠心法にて分離したＨＢＶコア関連抗原ピーク画分を再びショ糖密度勾配遠心法にて分離したときのＨＢＶ抗原、ＨＢＶ  ＤＮＡの挙動を示す図である。各分画中のＨＢＶコア関連抗原（黒正方形）、ＨＢｃ抗原（●）、ＨＢｓ抗原（◇）、およびＨＢＶ  ＤＮＡ（○）をそれぞれ示し、分画の密度を破線で示す。
図４は、ＨＢＶ抗原のゲルろ過での挙動を示す図である。上図、ショ糖密度勾配遠心法にて分離したＨＢＶコア関連抗原ピーク画分を、未処理のままゲルろ過した場合。下図、同じサンプルを３％ＮＰ−４０処理後ゲルろ過した場合。各分画中のＨＢＶコア関連抗原（黒正方形）、ＨＢｃ抗原（●）量を示す。分子量マーカーの溶出位置を上部に示す。
図５は、ＨＢｅ抗原陽性血清およびその密度勾配遠心分画をウエスタンブロット解析した結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。密度勾配遠心分画１〜２０がショ糖濃度１０〜６０％に相当する。ＨＢ５０はＨＢｃ抗原にのみ反応し、ＨＢ９１はＨＢｃ抗原ＨＢｅ抗原両方に反応するモノクローナル抗体である。
図６は、それぞれの症例での粒子状プレコアタンパクの全プレコア／コアタンパクに対する比率を示す図である。ＨＢｅ抗原陽性例を（●）で、ＨＢｅ抗体陽性例を（○）で示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で新規に同定したＨＢＶプレコア蛋白とは、シグナル配列を含み且つＨＢＶのウイルス様粒子を形成することのできる蛋白質である。血液中の本発明の蛋白質の主な分子は分子量２２０００ダルトンからなるｐ２２抗原である。ｐ２２抗原の代表的なアミノ酸配列は配列番号１に記載される１７８アミノ酸からなるＨＢＶのプレコア抗原に類似の抗原である。この抗原を特異的に認識する抗体を取得し、検体前処理法と組み合わせて測定系を構築することにより、抗体存在下でもＨＢＶコア関連抗原を測定することが可能となる。
一般的にＨＢＶプレコア／コア蛋白と呼ばれ得るものにはＨＢｅ抗原（ＨＢＶ  ｅ蛋白）、ＨＢｃ抗原（ＨＢＶコア蛋白）および他のＨＢＶプレコア／コア遺伝子産物がある。本発明において「ＨＢＶプレコア蛋白」と呼ぶ場合には、特に断らない限りシグナル配列を含み粒子形成能を有するＨＢＶプレコア／コア遺伝子産物である蛋白を示す。この代表的なものは配列表１に示す蛋白である。また、「ＨＢＶコア関連抗原」はＨＢｃ抗原（ＨＢＶコア蛋白）、ＨＢｅ抗原（ＨＢＶ  ｅ蛋白）を含むＨＢＶプレコア／コア遺伝子産物を示す。
まず、Ｂ型肝炎患者血清をショ糖密度勾配遠心法にて分画し、各分画のＨＢＶコア関連抗原を測定したところ、ＨＢｅ抗原と同様の密度１．０５付近に一つのピークを、密度１．１７付近のＨＢｃ抗原とＨＢＶ−ＤＮＡとほぼ同じ分画に、もう一つのピークを検出できる。さらに、密度１．１７付近のピークを低勾配のショ糖密度勾配遠心法にて再分画すると、ＨＢｃ抗原とＨＢＶ−ＤＮＡは同じ分画にピークを示すが、ＨＢＶコア関連抗原はこれよりわずかに低密度分画にピークを示し、その分画にはウイルスの外被蛋白であるＨＢｓ抗原が検出できる。
すなわち、Ｂ型肝炎患者血清中には、感染性を示すＤａｎｅ粒子のほかに、少し比重の軽いＨＢＶコア関連抗原からなるウイルス様粒子が存在すると考えられる。
また、そのＨＢＶコア関連抗原からなる粒子とＤａｎｅ粒子を含む画分をゲルろ過にかけると、ＨＢｃ抗原とＨＢＶコア関連抗原からなる粒子がそれぞれボイド画分に溶出する。また、同じ画分をノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０：ナカライテスク）処理し、外被蛋白のＨＢｓ抗原を剥がした後、ゲルろ過にかけると、ＨＢｃ抗原とＨＢＶコア関連抗原からなる粒子はやはりそれぞれボイド画分に溶出する。このことは、ＨＢｃ抗原とＨＢＶコア関連抗原からなる各々の粒子が、外被蛋白のＨＢｓ抗原を剥がされる界面活性剤処理によっても壊されない強固なキャプシド構造を形成していることを示している。
つぎに、ウエスタンブロット法を用いた解析から、そのＨＢＶコア関連抗原はＨＢｃ抗原とほぼ同じ２２０００ダルトンの分子量を示したが、ＨＢｃ抗原が有するＣ末端核酸結合領域に特異的なモノクローナル抗体（ＨＢ５０）には反応しない。つまり、このＨＢＶコア関連抗原は、その分子量からＣ末端核酸結合領域を含まず、シグナル配列の切断されていないプレコア遺伝子産物（ｐ２２抗原）と考えられる。
ｐ２２抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分離後、ポリアクリルアミドゲルより切出し、マトリックス支援型レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｔｓ，１９９７）によりアミノ酸配列を決定すると、ｐ２２抗原は配列番号１に記載の１７８アミノ酸からなるＨＢＶプレコア蛋白であることが明らかとなった。
このアミノ酸配列を決定したＨＢＶコア関連抗原を以下ＨＢＶプレコア蛋白と呼ぶが、本発明のＨＢＶプレコア蛋白は従来ＴＡＫＡＨＡＳＨＩら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４７，３１５６−３１６０，１９９１）によって報告されていたＨＢＶプレコア蛋白（プレＨＢｅ抗原）と比較するとＮ末（−２９番目）のメチオニンを欠いており、−２８番目のグルタミンがアセチル化されている。またＣ末側はＨＢｅ抗原のＣ末である１４９番目のバリンにアルギニンが結合しており、少なくとも１５０番目までが存在している。このＨＢＶプレコア蛋白はＨＢＶ核酸結合部位のうちＳＰＲＲＲを含む部位を認識するモノクローナル抗体ＨＢ５０では認識されないことから、１５４番目までのアミノ酸を含む可能性がある。
本発明のＨＢＶプレコア蛋白が不完全ウイルス粒子（ウイルス様粒子）を形成することから、このタンパクがキャプシド形成にあたりＨＢｃ抗原と競合してウイルス複製を阻害することが容易に推測される。したがって、本発明はＨＢＶプレコア蛋白を用いたＨＢＶ治療薬の可能性を提示する。
本発明のＨＢＶプレコア蛋白はＨＢＶ感染患者の体内で、ＨＢＶウイルス様粒子を形成している。また本発明は、このＨＢＶプレコア蛋白が完全ＨＢＶウイルス粒子中に存在することも示唆している。すなわち、ＨＢＶプレコア蛋白がＨＢｃ抗原と共にＨＢＶヌクレオキャプシドを形成していると考えられる。したがって、このＨＢＶプレコア蛋白を測定することはＨＢＶ感染の診断、肝炎や肝硬変あるいは肝癌の病態の診断、マーカーとして役立つと考えられる。
本発明のＨＢＶプレコア蛋白と既知のＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原はその機能やアミノ酸配列が異なる。しかしながら、機能的に似ている性質やアミノ酸配列の重複があるため、このＨＢＶプレコア蛋白を測定するためには、ＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原と区別して測定することが必要である。ただし、後述の実施例７に示すようにこのＨＢＶプレコア／コア蛋白とＨＢｃ抗原の量の比は１２：１〜１５８：１と最低でも１２倍以上の開きがある。
本発明のＨＢＶプレコア蛋白とＨＢｅ抗原あるいはＴａｋａｈａｓｈｉらの報告しているシグナルペプチドを持つＨＢｅ抗原との違いは、機能的に前者がＨＢＶのコア様粒子（ウイルス様粒子）を形成しているのに対し、後者が遊離の状態で血液中では血清蛋白と結合して存在している点である。このコア様粒子（ウイルス様粒子）を形成するという機能に関してはこのＨＢＶプレコア蛋白とＨＢｃ抗原は、ほぼ同じ機能を有している。このＨＢＶプレコア蛋白は粒子形成という性質を持つことから、ＨＢｅ抗原よりはＨＢｃ抗原に近い構造を有しているものと推測され、アミノ酸−７番目のシステインと６１番目のシステイン間のジスルフィド結合は形成されていないものと考えられる。
後述の実施例９に示すようにＨＢＶコア関連抗原測定系により検出されたＨＢＶコア関連抗原（ＨＢＶプレコア／コアタンパク）を従来のＨＢｃ抗原測定法やＨＢｅ抗原測定法で測定した場合、ＨＢｃ抗原やＨＢｅ抗原は検出されなかった。これは次のようなことを示していると考えられる。▲１▼ＨＢＶコア関連抗原は本願発明のＨＢＶプレコアタンパクを多く含んでいる。▲２▼従来取得されていたＨＢｃ抗原やＨＢｅ抗原に結合する抗体がＨＢＶプレコアタンパクに結合しないものがあり、ＨＢＶプレコア抗原の抗原性がＨＢｃ抗原やＨＢｅ抗原と異なる。
このことは本発明のＨＢＶプレコアタンパクは従来のＨＢｃ抗原測定法やＨＢｅ抗原測定法ではほとんど検出されていなかったことを示している。つまり木村らのＨＢＶコア関連抗原測定法により始めて測定可能となったと考えられる。ＨＢＶプレコアタンパクはＨＢＶコア関連抗原測定法によって検出できる。この測定系の特徴は界面活性剤でＨＢＶプレコアタンパクを含んだ検体を処理し、界面活性剤の存在下で抗体と反応させることである。そのため、ＨＢＶプレコアタンパク上の抗原エピトープは界面活性剤の存在下で安定であることが必要である。さらに抗体も界面活性剤の存在下で機能的に安定な抗体を使用する必要がある。
このような抗体の認識するエピトープはＨＢＶコア蛋白のアミノ酸１−１９番目、２１−４０番目、３１−４９番目、１３１−１４０番目のリニアエピトープ、および１−８１番目の構造エピトープが適当である。これらのエピトープを認識する抗体を組み合わせることによってＨＢＶプレコアタンパクを測定することが可能となった。これらのエピトープを認識する抗体を２つ以上組み合わせることによってＨＢＶプレコアタンパクを検出することができるが、特に好適な組み合わせはアミノ酸２１−４０番目と３１−４９番目、１−１９番目と２１−４０番目、２１−４０番目と３１−４９番目のエピトープを認識する抗体の組み合わせであり、これらの組み合わせに他のエピトープを認識する抗体を加えることによって、検出感度が上昇する。
検出に用いる抗体は界面活性剤の存在下で上記のエピトープと結合することができる抗体でなければならない。ＨＢＶプレコアタンパク測定に用いる界面活性剤は陰イオン性界面活性剤が好適であるが、陰イオン性界面活性剤と両イオン性界面活性剤の組み合わせ、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を組み合わせることによりさらに感度が上昇する。陰イオン性界面活性剤の中ではＳＤＳがもっとも好適であったが、その他の陰イオン性界面活性剤も効果があり、ＳＤＳを他の構造の類似した陰イオン性界面活性剤に置き換えることにより、ＨＢＶプレコアタンパクの上記のエピトープを露出させ、抗体と結合できる状態にすることができる。
また本発明のＨＢＶプレコア蛋白と既知のＨＢｅ抗原、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの報告しているシグナルペプチドを持つＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原のアミノ酸配列に関する相違点は図１に示した。ＨＢＶプレコア／コア蛋白は本発明より−２８〜１５０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが代表的なものであると考えられる。これに対し、ＨＢｅ抗原は−１０〜１４９番目のアミノ酸配列、シグナルペプチドを持つＨＢｅ抗原は−２９〜１４９番目のアミノ酸配列、ＨＢｃ抗原は１−１８３番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドで構成されている。
上記のようなことから、本発明のＨＢＶプレコア蛋白とＨＢｅ抗原、シグナルペプチドを持つＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原を分離して測定するのは容易ではないが、そのウイルス（様）粒子を形成できるかできないかの機能と、アミノ酸配列の違いを利用して分離することが可能である。
まず本発明のＨＢＶプレコア蛋白とＨＢｅ抗原あるいはシグナルペプチドを持つＨＢｅ抗原を分離するためには、このＨＢＶプレコア蛋白はＨＢＶ様粒子を形成しており、ＨＢｅ抗原あるいはシグナルペプチドを持つＨＢｅ抗原は遊離の状態（本願では抗体と結合しているＨＢｅ抗原も遊離とする）で存在しているという特徴を利用する。実際には、
（１）ウイルス粒子を破壊する処理を行う前に測定した測定値とウイルス粒子を破壊する処理を行った後に測定した測定値を比較する方法がある。つまりウイルス粒子を破壊する処理を行った後に測定した測定値からウイルス粒子を破壊する処理を行う前に測定した測定値を引くことによって測定可能である。
（２）またウイルス（様）粒子を分離して、その中に含まれているＨＢＶプレコア蛋白を測定する方法もある。このウイルス（様）粒子を分離する方法には、例えば密度勾配遠心で遊離の抗原の分画とウイルス（様）粒子を形成している分画を分ける方法があり、ウイルス（様）粒子の含まれている分画のＨＢＶプレコア／コア蛋白を測定すればよい。この密度勾配遠心で遊離の抗原とウイルス（様）粒子を分離する方法以外にも、ウイルス（様）粒子を特異的に濃縮する方法や遊離の抗原を特異的に除く方法を用い、分離後にＨＢＶプレコア／コア蛋白の量を測定すればよい。
このような方法のひとつとして、例えば抗ＨＢｓ抗体による免疫沈降法があげられる。抗ＨＢｓ抗体により免疫沈降を行い、沈降物中のＨＢＶプレコア／コアタンパクを測定することによりＨＢｅ抗原を除いた粒子状ＨＢＶプレコア／コアタンパクのみを特異的に測定することも可能である。
またＨＢＶプレコア蛋白とＨＢｃ抗原はコア（様）粒子（ウイルス（様）粒子）の形成の機能で類似しているため、分離して測定するためには構成するアミノ酸配列が異なる部分に特異的に結合（認識）するプローブを使い分ける方法が考えられる。つまり、ＨＢＶプレコア蛋白を選択的に測定するためには、−２９〜−１０番目のアミノ酸に結合するプローブを使用すればよく、ＨＢｃ抗原を選択的に測定するためには１５１〜１８３番目に結合するプローブを使用すればよい。
また、両方に結合するプローブを使用し、ＨＢＶプレコア蛋白＋ＨＢｃ抗原の抗原量を測定し、その後いずれかの抗原（蛋白）を特異的に測定し、減算することによっても、それぞれの抗原（蛋白）の量を測定可能である。
実際上、検体中のＨＢＶプレコア蛋白の測定には、ウイルス様粒子の破壊を行い、ＨＢＶプレコア蛋白を露出させる工程が必須である。この工程ではウイルスの外皮蛋白質であるＨＢｓ抗原の剥離を行い、ＨＢＶプレコア蛋白を遊離させる処理剤を使用する。処理の方法としては、アルカリ処理があり、ＮａＯＨ等の処理により、ＨＢｓ抗原がはがれ、ＨＢＶの内部の抗原が遊離する。また他の処理剤としては界面活性剤が使用可能であり、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００やＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０のような非イオン性界面活性剤やＳＤＳやサルコシンン酸ナトリウムのような陰イオン性界面活性剤が適当である。さらに特許３１７１８２７号に出願されているような陰イオン性界面活性剤と他の界面活性剤の組み合わせも有効である。
このウイルス様粒子の破壊、ＨＢＶプレコア蛋白の露出の工程を行わずに、−２９〜１４９のアミノ酸を認識するプローブで測定を行うと遊離のＨＢｅ抗原あるいはシグナルペプチドを持つＨＢｅ抗原をも測定することとなる。そのため遊離の抗原とウイルス様粒子の分離を行わずに、検体中の抗原蛋白を測定した場合は、界面活性剤等による処理を行った測定値から界面活性剤などの処理を行わずに測定したＨＢｅ抗原の測定値を減算したものが、粒子状ＨＢＶプレコア／コア蛋白の測定値となると考えられる。
界面活性剤によるウイルス粒子の破壊、ＨＢＶプレコア蛋白の露出（露呈）の後、ＨＢＶプレコア蛋白を認識するプローブによる測定の工程がある。この工程ではアミノ酸配列の−２８〜１５０番目を認識するプローブを用いることにより、ＨＢＶプレコア蛋白の測定が可能である。プローブとしてはこのプレコア蛋白に結合するものであればよく、抗体、レセプター、アプタマー、リガンドなどが使用可能である。
測定法としては、ＨＢＶプレコア蛋白とプローブの結合を利用したものであれば良く、代表的なものとしては酵素抗体免疫法などがある。ＨＢＶプレコア蛋白とＨＢｃ抗原を分離して測定するためには、ＨＢＶプレコア蛋白は−２８〜−１１を認識するプローブを使用し、ＨＢｃ抗原は１５１−１８３を認識するプローブを使用すればよい。しかしながら、共通領域である１−１５０を認識するプローブでＨＢＶプレコア蛋白とＨＢｃ抗原の合計の量を測定し、それから１５１−１８３を認識するプローブを用い、ＨＢｃ抗原の量を測定し、合計の量から減算することによっても、ＨＢＶプレコア蛋白を定量することは可能である。
【実施例】  以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１．ＨＢＶコア関連抗原のショ糖密度勾配遠心法による分画
（Ａ）１０〜６０％ショ糖密度勾配遠心法による分画
ＴＮＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ］にショ糖をそれぞれ１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％と溶解させ、密度の重い６０％ショ糖液から順に１．７ｍｌづつ、１２ｍｌの超遠心チューブに注意深く重層させ、室温で６時間放置した。
ＨＢｅ抗原陽性血清１ｍｌを作製したショ糖密度勾配液の上に重層し、Ｓｗ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、３３．４Ｋｒｐｍ、４℃で１５時間の超遠心分離の後、上から３００μｌづつ４０分画した。それぞれの画分の密度を計算し、ＨＢＶコア関連抗原（ＰＣＴ出願：ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６９４７）、ＨＢｃ抗原（ＰＣＴ出願：ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６９４７）、ＨＢｓ抗原（ダイナボット）、ＨＢｅ抗原（ダイナボット）、ＨＢＶ−ＤＮＡ  ＰＣＲ（ロシュ・ダイアグノスティック）を測定したところ、ＨＢＶコア関連抗原の一部はＨＢｅ抗原と同様の密度にピークを示したが、大部分のＨＢＶコア関連抗原はＨＢＶ−ＤＮＡ  ＰＣＲのピーク付近に検出された（図２）。
（Ｂ）低勾配のショ糖密度勾配遠心法による再分画
３０％，４０％，５０％のショ糖液を、密度の重い５０％ショ糖液から順に３．４ｍｌづつ、１２ｍｌの超遠心チューブに注意深く重層させ、室温で６時間放置する。（Ａ）の２４番目と２５番目のピーク画分をＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ］で２倍に希釈後、作製したショ糖密度勾配液の上に重層し、Ｓｗ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、３３．４Ｋｒｐｍ、４℃で１５時間の超遠心分離の後、上から３００μｌづつ４０分画した。それぞれの画分の密度を計算し、ＨＢＶコア関連抗原（ＰＣＴ出願：ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６９４７、実施例５）、ＨＢｃ抗原（ＰＣＴ出願：ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６９４７、実施例６）、ＨＢｓ抗原、ＨＢＶ−ＤＮＡ  ＰＣＲを測定したところ、ＨＢＶコア関連抗原のピークはＨＢＶ−ＤＮＡ  ＰＣＲのピークよりも低密度分画に位置し、その分画にはＨＢｓ抗原が含まれていた（図３）。各々のピークを透析後、４℃で保存した。
実施例２．ＮＰ−４０処理によるゲルろ過
前記実施例１の（Ａ）により分画したピーク画分（２４−２５番）を０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてゲルろ過したところ、ＨＢＶコア関連抗原とＨＢｃ抗原の粒子がそれぞれボイド画分に溶出した（図４上図）。一方、前記実施例１の（Ａ）により分画したピーク画分（２４−２５番）にＮＰ−４０が最終濃度３％となるように加え、ＨＢｓ抗原を剥ぎ取るために３７℃にて１５分間処理した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてこれをゲルろ過したところ、ＨＢＶコア関連抗原とＨＢｃ抗原からなる裸の粒子がそれぞれボイド画分に溶出した（図４下図）。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲのボイド画分は分子量４０，０００，０００以上であり、これらの分子はウイルスキャプシド様粒子構造をとっているものと考えられる。
実施例３．ウエスタンブロット法による解析
ＨＢｅ抗原陽性血清を実施例１の（Ａ）に記載の方法と同様にしてショ糖密度勾配遠心を行い、上清から６００μｌづつ２０分画する。この分画およびＨＢｅ抗原陽性血清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜（イモビロン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した後、ＨＢｃ抗原とＨＢｅ抗原両方を認識するモノクローナル抗体ＨＢ９１とＨＢｃ抗原のＣ末端核酸結合領域に特異的なモノクローナル抗体ＨＢ５０を用いたウエスタンブロットにより、分子量約２２０００ダルトンのＨＢＶコア関連抗原を検出した（図５上図）。また、このＨＢＶコア関連抗原はＨＢ９１には反応するがＨＢ５０とは反応しないことが明らかになった（図５下図）。
ＨＢ５０抗体はエピトープ解析により、１６８−１７６番目のアミノ酸（ＳＱＳＰＲＲＲＲＳ）を認識することがわかっているが、この他に１４１−１５９番目のペプチド（ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲ）および１５０−１６７番目のペプチド（ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲ）にも反応することがわかっている。これらのペプチドの共通配列はＳＰＲＲＲであり、少なくともこの配列がＨＢ５０抗体との結合に必要である。つまり、このＳＰＲＲＲ配列は１５５番目以降に存在するため、本願発明のＨＢＶプレコア／コア蛋白は１５５番目以降の配列を欠いているものと考えられる。このことはＨＢ５０抗体を標識抗体として単独で用いているＨＢｃ抗原測定系でのピークがＨＢＶプレコア／コア蛋白のピークと重ならないことからも明らかである（図２、図３）。
実施例４．ＭＡＬＤＩ質量分析によるアミノ酸配列の解析
実施例１（Ａ）に記載の方法によって得られたＨＢＶコア関連抗原画分を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてゲルろ過したところ、ＨＢＶコア関連抗原とＨＢｃ抗原からなる粒子がボイド画分に溶出した。このボイド画分を１％ＮＰ−４０，２０％ショ糖を含むＴＮＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ］上に重層し、Ｓｗ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、３３．４Ｋｒｐｍ、４℃で１５時間の超遠心分離後、ＨＢＶコア関連抗原粒子を含むペレットを回収した。
このペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、２２ｋＤａのＨＢＶコア関連抗原のバンドを切り出し、トリプシン消化後、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。その結果、配列番号２、３、４、５および６の配列に相当する５つのペプチドを検出した。このうち配列番号２のペプチドはＮ末端アセチル化されていた。
実施例５．ＨＢＶコア関連抗原（プレコア／コアタンパク）の検出および測定法
抗ＨＢＶコア抗原モノクローナル抗体ＨＢ４４（認識部位３１−４９アミノ酸）、ＨＢ６１（認識部位１３１−１４０アミノ酸）およびＨＢ１１４（認識部位１−８１アミノ酸）を終濃度がそれぞれ２，１，１μｇ／ｍｌになるように０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、黒色９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）につき１００μｌ／ウェル分注し、４℃で一晩静置した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）０．４ｍｌで２回洗浄し、ブロッキング液（０．５％カゼインナトリウム，３％スクロース，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））０．４ｍｌを添加し、さらに室温で２時間静置した。ブロッキング液を除去後、真空乾燥した。
血清１００μｌに、処理液（１５％ＳＤＳ、２％Ｔｗｅｅｎ６０）を５０μｌ添加し、７０℃にて３０分間処理をおこない、その５０μｌを測定試料とした。
上記ウェルに反応緩衝液１００μｌと測定試料５０μｌを加え、室温で２時間反応させた。
洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４））０．４ｍｌで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識モノクローナル抗体ＨＢ９１（認識部位１−１９アミノ酸）およびＨＢ１１０（認識部位２１−４０アミノ酸）をそれぞれ０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェル添加し、室温１時間反応させた。洗浄液０．４ｍｌで６回洗浄後、発光基質としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（ＴＲＯＰＩＸ社）溶液１００μｌを加え室温２０分間反応させた後、発光を測定した。
実施例６．ＨＢｃ抗原の測定
（Ａ）抗体固相プレートの作製
ＨＢｃ抗原およびＨＢｅ抗原の両方に反応する３種のモノクローナル抗体ＨＢ４４（認識部位３１−４９アミノ酸）、ＨＢ６１（認識部位１３１−１４０アミノ酸）およびＨＢ１１４（認識部位１−８１アミノ酸）をマイクロタイタープレートウェルに感作し、固相化する。ＰＢＳで洗浄後、カゼインを含む溶液でブロッキングし、この溶液を除いた後、乾燥させる。
（Ｂ）検体の前処理
５０μｌの前処理液（１５％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、３％ＣＨＡＰＳ、１％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）を１００μｌの検体（血清、血漿など）と混合し、７０℃にて３０分処理する。
（Ｃ）１次反応
各抗体固相ウェルに１００μｌの反応緩衝液（ｐＨ８．０）および前処理した検体を５０μｌ加え、穏やかに撹拌しながら室温２時間反応させる。
（Ｄ）２次反応
ウェルを洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ＨＢ５０（認識部位１６８−１７６アミノ酸）モノクローナル抗体を含む溶液を１００μｌ加え、室温１時間反応させる。
（Ｅ）基質反応
ウェルを洗浄後、ＣＤＰ  Ｓｔａｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μｌ加え、室温２０分間反応後各ウェルの発光量をマイクロプレートルミノメーターで測定する。
実施例７．検体中のＨＢＶプレコア蛋白、ＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原の測定とその比率の計算
前記実施例１（Ａ）の方法に従って、血清７検体についてショ糖密度勾配遠心法により分画を行った。それぞれの検体において、低密度の遊離のＨＢｅ抗原を含んでいる分画（例えば図１では１−１９分画程度）と高密度のウイルス粒子を含んでいる分画（例えば図１では２０分画以上）に分けて、実施例５および実施例６の方法で各抗原の測定を行った。
低密度の画分を実施例５の方法で測定すると、この画分はウイルス粒子を含んでいない遊離のＨＢｅ抗原を測定している。また高密度の画分を実施例５の方法で測定すると、この測定方法はＨＢｃ抗原と粒子状プレコア蛋白をあわせて測定しているので、実施例５で測定した値から実施例６の値を減算することにより粒子状ＨＢＶプレコア蛋白の値が計測可能である。このようにして測定、計算したＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢＶプレコア蛋白のそれぞれの検体中の比を計算した（表１）。
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ＨＢＶプレコア蛋白：ＨＢｅ抗原は１３：１〜１：４０であり、検体によっていずれかの抗原、蛋白を多く含むものが異なっている。一方、ＨＢＶプレコア蛋白：ＨＢｃ抗原は１２：１〜１５８：１の範囲であり、すべての検体でＨＢＶプレコア蛋白を多く含んでいる。
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それぞれの分画のＨＢｃ抗原、ＨＢＶコア関連抗原測定値および、それから計算される粒子状プレコアタンパク濃度を表２に示す。定量可能であった全例でＨＢｃ抗原の９０％以上は高密度分画に存在した。低密度分画に存在するＨＢＶプレコア／コアタンパクはＨＢｅ抗原であり、高密度分画中ＨＢＶプレコア／コアタンパクはＨＢｃ抗原および粒子状ＨＢＶプレコアタンパクである。したがって、高密度ＨＢＶプレコア／コアタンパク濃度よりＨＢｃ抗原濃度を減じることにより、粒子状プレコアタンパク濃度を算出することができる。
実施例８．検体中の遊離および粒子状ＨＢＶプレコア／コアタンパク、およびＨＢｃ抗原の分別測定とその比率
ＨＢＶダイレクト−Ｍａｇキット（ＪＳＲ株式会社）の「反応バッファー」５０μｌ、「ＨＢＶ補足粒子」（抗ＨＢｓ抗体固相化磁気ビーズ）５０μｌ、および検体２００μｌを混合し室温３０分間振とうし、ＨＢｓ抗原を含むＨＢＶ関連粒子を結合させた。これを強力な磁石により磁気ビーズを分離し、上清を除いた。この上清には遊離ＨＢｅ抗原が含まれる。残った磁気ビーズに１５％ＳＤＳ溶液を６０μｌ加え、７０℃１０分加熱することにより、結合していた粒子状ＨＢＶプレコア／コアタンパクを溶出した。これを強力な磁石により磁気ビーズを分離し、抽出物を取り出した。
この上清および沈殿抽出物中のＨＢＶプレコア／コアタンパクおよびＨＢｃＡｇをそれぞれ実施例５、実施例６の方法で測定し、検体中のＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原、粒子状ＨＢＶプレコアタンパクのそれぞれの濃度および比率を計算した。結果を表３に示す。
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定量可能であった全例でＨＢｃ抗原の９０％以上は沈殿に存在した。すなわち、ＨＢｓ抗原に覆われた粒子は、ほぼ全て免疫沈降される。上清中に存在するＨＢＶプレコア／コアタンパクはＨＢｅ抗原であり、沈殿中ＨＢＶプレコア／コアタンパクはＨＢｃ抗原および粒子状ＨＢＶプレコアタンパクである。したがって、沈殿中ＨＢＶプレコア／コアタンパク濃度よりＨＢｃ抗原濃度を減じることにより、粒子状プレコアタンパク濃度を算出することができる。この濃度および比率は実施例７に示した密度勾配遠心による分別測定結果と非常に似通った値となっており、双方の測定法で粒子状プレコアタンパクの分別測定ができることを示している。
実施例９．粒子状ＨＢＶプレコアタンパク比の病態による違い
実施例８と同様にしてＨＢＶキャリアおよびＢ型肝炎の様々な病態における血清検体計８１例について、遊離および粒子状ＨＢＶプレコア／コアタンパク、およびＨＢｃ抗原を分別測定し、粒子状ＨＢＶプレコアタンパクの全プレコア／コアタンパク（ＨＢｅ抗原＋ＨＢｃ抗原＋粒子状ＨＢＶプレコアタンパク）に対する比率を比較した。結果を図６に示す。
ＨＢｅ抗原陽性例では急性肝炎で高く無症候性キャリアや肝硬変では低い傾向が認められた。また、ＨＢｅ抗体陽性例では、慢性肝炎や肝癌例で高く、急性肝炎治癒後や肝硬変で低い傾向が認められた。これらの結果から、粒子状プレコアタンパクを測定することにより、Ｂ型肝炎の診断、治療に有用な知見を得ることができ、さらにＨＢＶやＢ型肝炎の病態の解明に役立てることができる。こうした知見を通して、Ｂ型肝炎の治療薬の開発にも有用な知見が得られる。
実施例１０．検体処理法の比較
種種の検体前処理液を作製し、実施例６と同様にして前処理液だけを変化させＨＢＶ陽性血清５検体の検体処理およびＨＢｃ抗原の測定を行い、各処理法の効果を比較した。
このうちＳＤＳ，Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎ−Ｎａ，Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｎａは陰イオン性界面活性剤であり、ｎ−Ｄｅｃｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ−Ｂｒは陽イオン性界面活性剤である。検体処理中の各界面活性剤の終濃度は前処理液中の１／３に、ＨＢｃ抗原測定系における１次反応中の終濃度は１／９となる。
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この結果から処理液としてＳＤＳ，Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎ−Ｎａ，Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｎａなどの陰イオン性界面活性剤が適していることが明らかとなった。このうち特にＳＤＳが適している。一方ｎ−Ｄｅｃｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ−Ｂｒなどの陽イオン性界面活性剤を単独で用いることは、陰性検体でのバックグラウンドも高く、この測定系には適さない（表４）。
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この結果から前処理液として１５％ＳＤＳに加え、両性界面活性剤であるＣＨＡＰＳあるいはさらに非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などを加えることにより、前処理の効果がさらに高くなることが明らかとなった（表５）。
実施例１１．粒子状ＨＢＶプレコアタンパクの抗原性
抗ＨＢｃモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＨＢｃ（β）２Ａ２２特殊免疫研究所）を１μｇ／ｍｌに０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ炭酸−Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウェルマイクロプレート（ＮＵＮＣ社）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃一晩静置した。ＰＢＳで洗浄後、カゼインを含む溶液でブロッキングし、この溶液を除いた後、検体溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温１時間反応させた。洗浄液で洗浄後、１μｇ／ｍｌのビオチン標識２Ａ２２モノクローナル抗体を１００μｌ／ウェル加え、室温１時間反応させた。洗浄液で洗浄後、１０，０００倍希釈のペルオキシダーゼ標識アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ社）を、１００μｌ／ウェル加え、室温１時間反応させた。洗浄液で洗浄後、ＯＰＤ（ＳＩＧＭＡ社）／過酸化水素溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温３０分間呈色反応させた。１Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル加え、反応を停止させた後、４２０ｎｍ吸光度を測定した。
この測定系では、約２ｎｇ／ｍｌのＨＢｃＡｇを検出可能であった。実施例１（Ａ）のＨＢＶコア関連抗原のピーク分画を１％ＮＰ−４０で処理してエンベロープを除去した後、１０倍希釈し（ＨＢＶコア関連抗原含量約１５０ｎｇ／ｍｌ）上記の測定を行ったが、ＨＢｃ抗原は検出されなかった。
また、同じ検体を臨床的に用いられているＨＢｅ抗原測定系（ダイナボット社）にて測定したが、やはりＨＢｅ抗原は検出されなかった。したがって、本発明の粒子状ＨＢＶプレコアタンパクは、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原とは異なる抗原性を有していると考えられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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