(57)【要約】動脈硬化症の病巣において特異的に発現している遺伝子及びポリペプチド、更にそれらの利用を提供するものである。アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）欠失マウス（アポＥノックアウトマウス）の動脈硬化症の病巣細胞から、該細胞において特異的に発現している新規遺伝子をクローニングした。また、該遺伝子に相同の遺伝子を、正常組織から取得した。平滑筋細胞における該遺伝子の発現及び該遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を測定することにより、動脈硬化症の診断及び動脈硬化症の予防又は治療薬のスクリーニングが可能となる。また、動脈硬化平滑筋細胞における該遺伝子の発現を抑制することにより動脈硬化症の予防或いは治療を可能とする。更に、動脈硬化症で発現する本発明の遺伝子を、平滑筋細胞に導入することにより、血管細胞にアポトーシスを誘導して、動脈硬化形成抑制を行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチド
【請求項７】
配列表の配列番号５に示される、血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項９】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチド。
【請求項１０】
配列表の配列番号７に示される、血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するするポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項１２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈平滑筋細胞における該請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列からなる遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１７】
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチド。
【請求項１８】
配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１９】
配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドと類似構造を有するポリペプチド。
【請求項２０】
配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２１】
配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドと類似構造を有するポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２３】
抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２２記載の抗体。
【請求項２４】
抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項２２記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する動脈硬化症診断用プローブ。
【請求項２６】
請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が、請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項２５記載の動脈硬化症診断用プローブ。
【請求項２７】
請求項２５又は２６記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする動脈硬化症診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項２８】
請求項２２〜２４のいずれか記載の抗体及び／又は請求項２５又は２６記載の診断用プローブを含有することを特徴とする動脈硬化症診断薬。
【請求項２９】
請求項２２〜２４のいずれか記載の抗体及び／又は請求項項２５又は２６記載の診断用プローブを含有することを特徴とする動脈硬化症診断キット。
【請求項３０】
被検組織から試料を得、該試料における請求項請求項１、４、７、又は１０記載の遺伝子の発現を測定することを特徴とする動脈硬化症の診断方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の遺伝子の発現の測定が、定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とする動脈硬化症の診断方法。
【請求項３２】
ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）と配列表の配列番号１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマー、及び／又は配列表の配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ）と配列表の配列番号１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを用いることを特徴とする請求項３１記載の動脈硬化症の診断方法。
【請求項３３】
請求項３０〜３２のいずれか記載の遺伝子の発現の測定が、マイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロッティング法を用いて行われることを特徴とする動脈硬化症の診断方法。
【請求項３４】
被検組織から試料を取得、培養し、該試料における遺伝子の発現により生成される配列表の配列番号２、４、６及び８に記載されるポリペプチドの一つ以上を測定することを特徴とする動脈硬化症の診断方法。
【請求項３５】
請求項２２〜２４のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とする請求項３４記載の動脈硬化症の診断方法。
【請求項３６】
動脈硬化発症モデル動物に、被検物質を投与し、配列表の配列番号１、４、７及び１０に記載される塩基配列を有する遺伝子の一つ以上の遺伝子の発現、及び／又は配列表の配列番号２、４、６及び８に記載されるポリペプチドの一つ以上のポリペプチド又はその部分ポリペプチドの生成を測定することを特徴とする動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３７】
動脈硬化発症モデル動物が、ＡｐｏＥ欠損マウスであることを特徴とする請求項３６記載の動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３８】
動脈平滑筋細胞に、請求項１３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、動脈平滑筋細胞における該請求項１、４、７又は１０記載の塩基配列からなる遺伝子の発現を抑制することを特徴とする動脈硬化発症遺伝子の発現抑制方法。
【請求項３９】
請求項４〜１２のいずれか記載のＤＮＡ遺伝子を、動脈硬化症を発症している平滑筋細胞に導入し、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とする血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法。
【請求項４０】
請求項３９記載の血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法を用いて動脈硬化症を発症している平滑筋細胞の治療を行うことを特徴とする動脈硬化発症細胞の遺伝子治療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動脈硬化症の病巣において特異的に発現している遺伝子、ポリペプチド、及びその利用に関する。
背景技術
平滑筋細胞は、血管壁の形態形成及び薬理的反応に関与している重要な構成要素である。通常の場合、成人大動脈壁内側の平滑筋細胞は分裂せず、筋細胞の収縮に特化していると考えられている（収縮型）。しかし場合によっては、血管の平滑筋細胞がある程度の合成能力、細胞外基質の産出、及び細胞分裂を示すことがある。動脈硬化巣における平滑筋細胞は、増殖、遊走し細胞外基質を産生することが知られている（増殖型）。これらは平滑筋細胞が異常状態に転換したことによると考えられているが、このような転換は、アテローム性動脈硬化症の病因を研究する上で重要である（Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８０１−８０９，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ，７０，１７５３−１７５６，１９７３；Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．５８，４２７−４４４，１９８６）。
しかし平滑筋細胞が収縮型から増殖型に移行するメカニズムに関しては、現在も明らかでない。平滑筋細胞が増殖能力を有することがあることは多くの研究がすでに明らかにしており、ヒト、霊長類、ウサギ、又はラット動脈由来の平滑筋細胞を培養液中に分散すると、自然に合成能力を有するフェノタイプに転換することがすでに知られている（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９，１−６１，１９７９；Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．３３，１６−２７，１９７５；Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．１７７，５０３−５２２，１９７７）。最近の研究から、平滑筋細胞を単離してクローニングすると、培養液中で倍化を繰り返しても、分化型（収縮型）細胞又は未分化型（増殖型）細胞はそれぞれの遺伝子発現パターンを部分的に維持し続けることも知られている（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４４，１０６８−１０８１，１９９４；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１３，１４４９−１４５５，１９９３）。このことから、これら２種類のフェノタイプを有する細胞は、正常血管壁において安定的に共存でき、合成型フェノタイプを有する細胞は、病気の過程中において刺激に応答することで増殖することがわかる。
アテローム性動脈硬化症の動脈及び正常な動脈から得た細胞を比較すると、増殖率に関して差があることが知られている。例えば、ウサギのアテローム性動脈硬化症の動脈又はバルーン擦過法で肥厚したラットの動脈から得た細胞を、対照である正常動脈由来の細胞との比較をしたところ、活発な増殖活動がみられることがわかっている（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ３６，２４１−２４８，１９８０；Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．６２，２５５−２５９，１９８４；Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１１２，９８７−９９６，１９８８；Ａｒｔｅｒｙ  １４，２６６−２８２，１９８７）。一方、ヒト（ＡｍＪ  Ｐａｔｈｏｌ  ７８，１７５−１９０，１９７５）及びウサギ（Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ６０，２２１−２２５，１９８２）から、アテローム性動脈硬化性病変が進行した動脈の細胞及び正常な動脈の細胞を得て比較したところ、違いはみられないことも知られている。さらに、ヒトから得たアテローム性動脈硬化プラーク由来細胞を調べたところ、対照である血管由来の細胞と比べて細胞死（アポトーシス）が起こりやすいこともすでにわかっている（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８１，５９１−５９９，１９９７）。
動物個体中のアテローム性動脈硬化性病変が進行した部分及び正常動脈部分から得た平滑筋細胞を比較するような研究はこれまで行われていない。また、細胞増殖の促進及び抑制因子に対して応答する際の、プラーク（Ｐ）由来及びノンプラーク（ＮＰ）由来の平滑筋細胞を比較する研究もこれまで行われていない。さらに、進行したアテローム性動脈硬化症動脈プラーク中における平滑筋細胞が示す特徴に関してもこれまで研究が行われていなかった。
動脈硬化の発症においては、血管平滑筋細胞の増殖が中心的役割を果たしている。しかし、従来、これらの平滑筋細胞の活性化の原因となっている遺伝子は、明かにされていなかった。
近年、動脈硬化の原因遺伝子に焦点を当てたゲノム研究が進められた。１９９５年１２月には米国Ｄａｗｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社が、フランスＲＰＲ  Ｇｅｎｃｅｌｌ部門、フランスＧｅｎｅｔｈｏｎと手を組んで、家系分析とポジショナル・クローニングによる粥状（アテローム性）動脈硬化の病因遺伝子の探索に着手したことが伝えられている。また、１９９５年１０月には米国Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓと米国Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社が動脈硬化の原因遺伝子に基づいた治療薬のスクリーニングに乗り出していることが、伝えられている。
最近、血管傷害に応答して、血管平滑筋細胞によるＶＩＩＩ型コラーゲンの遺伝子が発現していることが報告されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８０，５３２−５４１，１９９７）。
本発明者は、平滑筋細胞の活性化の原因となっている遺伝子の発現を解明すべく研究を進め、それらの遺伝子の一つとして、α１ＶＩＩＩ型コラーゲンの遺伝子があることをつきとめ、これを公表した（Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３７，１５８−１６９，２０００）。
本発明の課題は、動脈硬化症の病巣において特異的に発現している遺伝子及びポリペプチド、及び、正常な血管平滑筋細胞において発現している該遺伝子及びポリペプチドに相同の遺伝子及びポリペプチド、更には、それらの利用を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）欠損マウス（アポＥノックアウトマウス）の動脈硬化症の病巣細胞から、該細胞において特異的に発現している遺伝子をクローニングし、更に、正常な血管平滑筋細胞において発現している該遺伝子に相同の遺伝子をクローニングして本発明を完成するに至った。
即ち、今回本発明者は、正常および動脈硬化巣よりそれぞれ培養平滑筋細胞を作製し比較検討を行った。実験材料として、動脈硬化の自然発症モデルであるＡｐｏＥのノックアウトマウスから胸部大動脈を摘出し、動脈硬化プラークおよび正常部分より移植片培養により培養平滑筋細胞を作製した。増殖速度は［３Ｈ］−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取込みで測定し、遺伝子発現の比較にはディファレンシャル・ディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）法を用いた。その結果、正常血管及び動脈硬化巣の培養平滑筋細胞は形態学的な差異を示さなかった。増殖速度は培養細胞株によって違いは認められるものの正常血管および動脈硬化巣間での有意な差は認められなかった。増殖促進因子および抑制因子に対する反応性においても有意な差はみられなかった。
一方ディファレンシャル・ディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）法によって遺伝子発現を比較した結果、数種類の遺伝子において発現の差がみられた。遺伝子配列を調べた結果それらの一つはＶＩＩＩ型コラーゲンであり、動脈硬化平滑筋細胞において発現が亢進していた。ＶＩＩＩ型コラーゲンの発現亢進はｉｎ  ｖｉｖｏにおいても確認された。
そして、発現が亢進している遺伝子について同定を行った結果、発現が亢進している遺伝子の中に、今まで知られていない未知の遺伝子が存在することが確認された。これらの新規遺伝子をクローニングして、その構造を決定し、一つは「Ｆ２２７」（配列表の配列番号１）と、及び他の一つは「Ｈ２Ａ」（配列表の配列番号３）と命名した。更に、正常な組織からは、該組織において発現している上記遺伝子に相同の遺伝子の「ＡＫ００２８７３」（配列表の配列番号５）と「ＮＭ＿００３２３７４」（配列表の配列番号７をクローニングしてその構造を決定した。
本発明において取得、同定した遺伝子の発現及び該遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を動脈硬化症診断用の遺伝子マーカー、ペプチドマーカーとして検出することで測定することにより、動脈硬化症の診断を行うことが可能であり、更に該遺伝子の発現及びタンパク質の生成の測定を行うことにより、動脈硬化症の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことができる。更には、動脈平滑筋細胞における該遺伝子の発現を抑制することにより、或いは、該遺伝子の導入によりアポトーシスを誘導して、動脈硬化症の予防或いは治療を可能とする。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項１）や、請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項２）や、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチド（請求項３）や、配列表の配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項４）や、請求項４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項５）や、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチド（請求項６）からなる。
また、本発明は、配列表の配列番号５に示される、血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項７）や、請求項７記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子（請求項８）や、以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードする遺伝子。（ｃ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｄ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチド（請求項９）や、配列表の配列番号７に示される、血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項１０）や、請求項１０記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するするポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子（請求項１１）や、以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードする遺伝子。（ｃ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｄ）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチド（請求項１２）からなる。
また本発明は、請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈平滑筋細胞における該請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列からなる遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（請求項１３）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１４）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチド（請求項１５）や、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項１６）や、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチド（請求項１７）や、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするポリペプチド（請求項１８）や、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドと類似構造を有するポリペプチド（請求項１９）や、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするポリペプチド（請求項２０）や、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドと類似構造を有するポリペプチド（請求項２１）や、請求項１４〜２１のいずれか記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体（請求項２２）や、抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２２記載の抗体（請求項２３）や、抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項２２記載の抗体（請求項２４）からなる。
また本発明は、請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する動脈硬化症診断用プローブ（請求項２５）や、請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が、請求項１、４、７、又は１０記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項２５記載の動脈硬化症診断用プローブ（請求項２６）や、請求項２５又は２６記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする動脈硬化症診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ（請求項２７）や、請求項２２〜２４のいずれか記載の抗体及び／又は請求項２５又は２６記載の診断用プローブを含有することを特徴とする動脈硬化症診断薬（請求項２８）や、請求項２２〜２４のいずれか記載の抗体及び／又は請求項項２５又は２６記載の診断用プローブを含有することを特徴とする動脈硬化症診断キット（請求項２９）からなる。
さらに本発明は、被検組織から試料を得、該試料における請求項請求項１、４、７、又は１０記載の遺伝子の発現を測定することを特徴とする動脈硬化症の診断方法（請求項３０）や、請求項３０記載の遺伝子の発現の測定が、定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とする動脈硬化症の診断方法（請求項３１）や、ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）と配列表の配列番号１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマー、及び／又は配列表の配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ）と配列表の配列番号１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを用いることを特徴とする請求項３１記載の動脈硬化症の診断方法（請求項３２）や、請求項３０〜３２のいずれか記載の遺伝子の発現の測定が、マイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロッティング法を用いて行われることを特徴とする動脈硬化症の診断方法（請求項３３）や、被検組織から試料を取得、培養し、該試料における遺伝子の発現により生成される配列表の配列番号２、４、６及び８に記載されるポリペプチドの一つ以上を測定することを特徴とする動脈硬化症の診断方法（請求項３４）や、請求項２２〜２４のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とする請求項３４記載の動脈硬化症の診断方法（請求項３５）や、動脈硬化発症モデル動物に、被検物質を投与し、配列表の配列番号１、４、７及び１０に記載される塩基配列を有する遺伝子の一つ以上の遺伝子の発現、及び／又は配列表の配列番号２、４、６及び８に記載されるポリペプチドの一つ以上のポリペプチド又はその部分ポリペプチドの生成を測定することを特徴とする動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニング方法（請求項３６）や、動脈硬化発症モデル動物が、ＡｐｏＥ欠損マウスであることを特徴とする請求項３６記載の動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニング方法（請求項３７）や、動脈平滑筋細胞に、請求項１３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、動脈平滑筋細胞における該請求項１、４、７又は１０記載の塩基配列からなる遺伝子の発現を制御することを特徴とする動脈硬化発症遺伝子の発現抑制方法（請求項３８）や、請求項４〜１２のいずれか記載のＤＮＡ遺伝子を、動脈硬化症を発症している平滑筋細胞に導入し、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とする血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法（請求項３９）や、請求項３９記載の血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法を用いて動脈硬化症を発症している平滑筋細胞の治療を行うことを特徴とする動脈硬化発症細胞の遺伝子治療方法（請求項４０）からなる。
発明を実施するための最良の形態
（遺伝子のクローニング、同定）
本邦死因の２、３位を占める脳卒中、心臓病は動脈硬化が原因となって発症する疾患である。従って、動脈硬化の発症、進展を予防することは臨床上最も重要な課題の１つとなっている。動脈硬化の発症、進展の機構を解明するには、動脈硬化症の病巣で発現している遺伝子を取得し、クローニングすることが重要となる。今回、本発明者は動脈硬化の自然発症モデルであるＡｐｏＥノックアウトマウスからの動脈硬化巣と正常血管からそれぞれ平滑筋細胞を単離・培養し、ディファレンシャル・ディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）を用いて遺伝子発現を比較した。その結果動脈硬化巣で発現の亢進している３種類の遺伝子を取得し、うち１つはＶＩＩＩ型コラーゲンであった。他の２つについては新規の遺伝子であったため今回全配列を明らかにした。また、別途、ヒト及びマウスの心臓遺伝子ライブラリーから、上記遺伝子と相同の遺伝子を取得し、全配列を決定した。
前記動脈硬化巣で発現する２種類の新規遺伝子のうち１つはデータベースに全く未登録のものであった。この遺伝子は動脈以外でも多くの組織で発現しており組織の維持や再生などの基本的な病態に関係していると推測された。他の１つは登録されている機能不明の遺伝子からａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇによって生じた産物であると考えられる。２つの遺伝子は、動脈硬化巣において発現し、病態に関係していることが確認された。
（本発明の遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチド及びその抗体）
本発明において、ＡｐｏＥノックアウトマウスの動脈硬化巣からクローニングした新規遺伝子「Ｆ２２７」、「Ｈ２Ａ」、「ＡＫ００２８７３」及び「ＮＭ＿００３２３７４」の構造を、それぞれ配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７に示した。該遺伝子がコードするポリペプチド（タンパク質）を、配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８に示した。なお、「ＡＫ００２８７３」及び「ＮＭ＿００３２３７４」は、ＮＣＢＩのデータベースで検索することができる。本発明は、該配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７に示される塩基配列（遺伝子）若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列、更には、該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むものである。
更に、次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ａ）配列表の配列番号２及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号２及び配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチド、及び、次の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）配列表の配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列表の配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチド、を含むものである。
また、本発明は、配列表の配列番号１、３、５又は７の塩基配列の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈平滑筋細胞における該遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むものである。
本発明において、種々のＤＮＡ配列の変異は、周知の遺伝子工学的遺伝子変異手段によって、行うことができる。
なお、上記本発明の塩基配列において、「塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
更に、本発明は、配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、該配列表の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチドを含むものである。本発明のポリペプチドを取得するには、本発明の遺伝子を適宜の発現ベクター−宿主細胞発現系に導入し、発現することによって取得することができる。
更に、本発明は、本発明のポリペプチドによって誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクロナール抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドとの抗原抗体反応により、本発明遺伝子の平滑筋細胞における発現の有無の検出に利用することができ、動脈硬化症の診断に利用することができる。
（本発明の遺伝子及び該遺伝子によってコードされるポリペプチドの利用）
本発明において、動脈硬化巣からクローニングした新規遺伝子「Ｆ２２７」（配列表の配列番号１）及び「Ｈ２Ａ」（配列表の配列番号３）、及び正常の平滑筋細胞からクローニングした「ＡＫ００２８７３」及び「ＮＭ＿００３２３７４」は、該塩基配列のアンチセンス鎖等を用いることにより診断用プローブとして、動脈硬化症の診断に用いることができる。該診断用プローブや前記本発明ポリペプチドに特異的に結合する抗体を装備して、動脈硬化症診断キットとして利用することができる。
また、本発明のＤＮＡを少なくとも１つ以上デバイス上に固定して、動脈硬化症診断用マイクロアレイとして利用することができる。該マイクロアレイには、ＶＩＩＩ型コラーゲンのような動脈硬化症の病巣で発現している遺伝子を合わせて固定することができる。マイクロアレイの調製は、常法により行うことができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，４６７−４７０，１９９５、細胞工学別冊  ゲノムサイエンスシリーズ▲１▼「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」株式会社秀潤社（２０００年３月１６日））。
本発明における動脈硬化症の診断方法は、被検組織として、平滑筋細胞における本発明の遺伝子やタンパク質（ポリペプチド）の発現を測定することよりなる。
遺伝子の検出には、汎用されているマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法又はノーザンブロッティング法等を便利に用いることができる。また、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ（ａｄａｐｔｏｒ−ｔａｇｇｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ）、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙａｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）等の公知の遺伝子の検出方法等も適宜使用することができる。ポリペプチドの検出には、本発明の抗体を用いた免疫学的測定法、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などの免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等公知の免疫学的測定法を用いることができる。
本発明における動脈硬化症の診断は、本発明において取得した遺伝子の発現に基づく遺伝子産物（本発明のポリペプチド）の血中濃度を測定することにより行うこともできる。これらの診断法は、動脈硬化の定量的診断に適用可能である。
本発明における動脈硬化症の診断方法に用いる、平滑筋細胞における本発明の遺伝子やタンパク質（ポリペプチド）の発現の測定方法は、動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニングに用いることができる。動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニングを行うには、動脈硬化発症モデル動物に、被検物質を投与し、本発明の遺伝子の発現、及び／又は本発明のポリペプチドの生成を測定することにより行う。本発明において、動脈硬化症の診断における遺伝子の発現の診断には、定量的ＰＣＲを使用することができる。該ＰＣＲの実施に際しては、プライマーとして、「Ｈ２Ａ」遺伝子に対しては配列表の配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）及び配列番号１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）、「ＡＫ００２８７３」に対しては、配列表の配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ）及び配列番号１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を用いることができる。該動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニングに用いる、動脈硬化発症モデル動物としては、動脈硬化の自然発症モデルであるＡｐｏＥ欠損マウスが有利に利用することができる。ＡｐｏＥ欠損（ａｐｏＥ−／−）マウスは、動脈（大動脈）においてアテローム性動脈硬化性病変を自然発生的に発症し、これらの病変はヒトのアテローム性動脈硬化性病変に似た特徴を示す（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  １４，１４１−１４７，１９９４）。
本発明においては、本発明の遺伝子である、配列表の配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなる遺伝子を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを動脈平滑筋細胞に導入して、該動脈硬化発症遺伝子の発現抑制を行い、動脈硬化症の予防又は治療を行うことができる。
該動脈硬化発症遺伝子の発現抑制を行うについて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製を行うには、配列表の配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなる遺伝子にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該遺伝子の発現の抑制作用を有する塩基配列を調製する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの大きさについては、遺伝子の発現を抑制できるものであれば特に制限はされないが、生体への投与及び安定性等を考慮すれば、１２〜４０塩基対、特に１５〜２５塩基対程度のものが好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの動脈平滑筋細胞への導入は、この分野で通常用いられる方法を用いることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動脈平滑筋細胞へ直接投与することができる。また、必要に応じて薬学的に許容される細胞内導入試薬、例えば、リポフェクチン試薬、リポフェクトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、Ｔｆｘ試薬、リポソーム及び高分子担体等と共に投与することができる。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それ単独、或いは、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、稀釈剤、ｐＨ緩衝剤、可溶化剤、溶解補助剤等の調剤用配合成分を添加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するには、注射剤のような形で投与することができる。この場合には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、水や生理食塩水又はブドウ糖溶液等に溶解させて調製し、必要に応じて緩衝剤、保存剤或いは安定化剤等を含有させて投与することができる。
また、細胞への取りこみの促進や標的とする細胞への指向性を高める目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるようにデザインされたプラスミドやウイルスベクターを遺伝子治療用のベクターとして用いることができる。該ベクターとしては、例えば、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウィルスベクター等のウイルスベクター等を挙げることができる。
また、本発明の配列表の配列番号３、５又は７に示される遺伝子及びその変異遺伝子を、動脈硬化症を発症している平滑筋細胞に導入し、活性化された平滑筋細胞や血管内皮等の血管細胞にアポトーシスを誘導することにより血管平滑筋細胞の動脈硬化形成を抑制することができる。該遺伝子の平滑筋細胞への導入は、真核細胞への公知の遺伝子導入方法を用いることができ、例えば、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿法（リン酸カルシウム法）或いはリポフェクタミン等の市販試薬とＤＮＡを混合して細胞を処理する方法（リポフェクション）、更には、レトロウイルス法、電気穿孔法等のトランスフェクション法を用いることができる。
この血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法を用いて、動脈硬化症を発症している平滑筋細胞の治療を行うことにより、動脈硬化発症細胞の遺伝子治療を行うことができる。
また、本発明の配列表の配列番号３、５又は７の遺伝子は、活性化された細胞に、アポトーシスを誘導するので、該遺伝子を癌細胞に導入し、アポトーシスを誘導することにより、癌細胞や組織の死滅・除去を目的とした遺伝子治療に用いることができる。
実施例１．Ｆ２７７（配列表の配列番号１）及びＨ２Ａ（配列表の配列番号３）遺伝子のクローニング及び同定
Ａ．大動脈のプラーク（Ｐ）及びノンプラーク（ＮＰ）部分から得た平滑筋細胞の培養
エクスプラント法で平滑筋細胞（ＳＭＣ）組織を樹立した。４．５ｇ／ｌのグルコース、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）及び抗生物質（１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、及び２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）を用いて細胞を培養した。
Ｂ．培養細胞からのＲＮＡの調製
トリ・リージェント（ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ）（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、上記培養細胞から以下の方法によりＲＮＡの精製を行った。
（精製方法）
１．平板培地の表面積１０ｃｍ２につき、１ｍｌのトリ・リージェントをとり、５分間室温で放置する。
２．１．５ｍｌ用マイクロ遠心分離管に溶解液を１ｍｌずつ分注する。
３．１ｍｌずつ分注した溶解液に、０．２ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間、はげしく混和した後、室温で２〜１５分間放置する。
４．４℃、１２０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。
５．溶解液の各チューブについて、無色の水溶液相（最上相）を新しいチューブに移す。
６．０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、混和した後、室温で５〜１０分間放置する。
７．４℃、１２０００×ｇで１０分間ＲＮＡをペレット化する。
８．７５％のエタノール１ｍｌでＲＮＡペレットを洗浄し、４℃、７５００×ｇで５分間、Ｖｏｒｔｅｘスターラーで回転する。
９．ＲＮＡペレットを乾燥し、次にＲＮａｓｅフリーの水又はバッファーに再懸濁する。
Ｃ．ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ法）を用いた、大動脈のプラーク（Ｐ）及びノンプラーク（ＮＰ）の遺伝子発現の比較、解析
ディファレンシャル・ディスプレイ法（ＳＣＩＥＮＣＥ  ２５７，９６７−９７１，１９９２；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，２６１−２６７，１９９８）を用いて、Ｐ及びＮＰの遺伝子発現を比較、解析した。用いた方法を、以下に示す。
１．以下の反応混合物を用いて、３７℃で３０秒間２０μｇのトータルＲＮＡをＤＮａｓｅで処理した。
１０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｎａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
１０ＵのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）
５０ｍＭのＫＣｌ
１．５ｍＭのＭｇＣｌ２
２０μｇのトータルＲＮＡ
ＤＥＰＣ処理水を加えて５０μｌにする。
３０℃，３０分間
２．フェノール／クロロホルムで抽出する。
３．１／１０Ｖｏｌの３ＭのＮａＡｃ  ｐＨ４．８及び２．５Ｖｏｌのエタノールを使用し、−７０℃で２０分間沈澱させる。
４．４℃で５分間回転する。
５．２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁する。
６．６５℃で５分間ＲＮＡを変性した後、氷冷する。
７．アンカーオリゴ−ｄＴ（Ｔ１２ＮＡ、Ｔ１２ＮＴ、Ｔ１２ＮＧ、Ｔ１２ＮＣ）プライマーを稀釈し、最終濃度を５０μＭとする。
８．（４つのチューブにおいて）逆転写する。
１０μｌのＤＥＰＣ処理水
１μｌのＤＮＡフリー・トータルＲＮＡ
４μｌの５×逆転写バッファー
２μｌの０．１ＭのＤＴＴ
１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰストック
１μｌの逆転写酵素
１μｌのＴ１２ＮＡ，Ｔ１２ＮＴ，Ｔ１２ＮＧ、又はＴ１２ＮＣ
（各々の反応に用いる）
３７℃、６０分間
９．ＰＣＲ反応ストックを作る（総量１００μｌ）
１５μｌ  ３２Ｐ−ｄＡＴＰ
５０μｌ  １０×ＰＣＲバッファー
５μｌ    ０．２ｍＭのｄＮＴＰ
１０μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）
２０μｌ  Ｈ２Ｏ
１０．それぞれのＲＮＡサンプルを、逆転写に用いたのと同じＴ１２ＮＡ、Ｔ１２ＮＴ、Ｔ１２ＮＧ、又はＴ１２ＮＣの四種類のアンカーオリゴ−ｄＴプライマー（各ＲＮＡサンプルに４チューブ）と混合する。
２μｌ    ＲＴ−ＰＣＲ生成物
１２μｌ  ＲＣＲ反応ストック
４５μｌ  Ｈ２Ｏ
３μｌ    各チューブ内のオリゴ−ｄＴプラス・プライマー
（Ｔ１２ＮＡ，Ｔ１２ＮＴ，Ｔ１２ＮＧ，又はＴ１２ＮＣ）
１１．各チューブに入っている前記溶液をエッペンドルフ小型チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）三つ（それぞれ１９μｌ）に分け、各チューブ（この場合では、三つの異なるランダム・プライマーを使用した）にそれぞれ１μｌのランダム・プライマーを加え、更に各チューブに鉱物油を一滴加える。
１２．ＰＣＲサイクル
９４℃、５分間、以下の３ステップ、４０サイクルにリンクする
９４℃、３０秒
４０℃、２分間
７２℃、３０秒
７２℃、５分間にリンク、４℃に維持
１３．６％シーケンシャル・ゲルを調製する。
３０ｇ    尿素
６ｍｌ    ５×ＴＢＥバッファー
９ｍｌ    ３８：２アクリルアミド
２３ｍｌ  水、穏やかに混和
１２０μｌの２０％ＡＳＰに６０μｌのＴＥＭＥＤを添加したもの
１４．各ＰＣＲ反応チューブに、ローディング・バッファー（シーケンシャル・ゲルで用いられるものと同じもの）を５μｌずつ加える。
１５．反応液を、９５℃で３分間変性させる。
１６．１×ＴＢＥバッファーを用いて、１３００Ｖの電圧で２０分間、ゲルをプレラン（Ｐｒｅｒｕｎ）する。
１７．相当するサンプル間でパラレルに、サンプルをのせる。
１８．勾配ゲル中で１１００Ｖの電圧で、１３００Ｖの電圧で４〜５時間ゲルを電気泳動する。
１９．ゲルドライヤーで１時間、ゲルを乾かす。
２０．一晩Ｘ線フィルムに露光する。
上記比較、解析において、３匹のＡｐｏＥ欠損マウス（＃１−３）に由来するプラーク（Ｐ）及びノンプラーク（ＮＰ）の培養平滑筋細胞の遺伝子発現を比較した結果のＸ線写真を第１図に示す。なお、図中のＪ２１２は、ＶＩＩＩ型コラーゲンを意味する。
Ｄ．特異的に発現するＤＮＡの単離、増幅
以下の方法を用いて、動脈硬化症の平滑筋細胞に特異的に発現する遺伝子のＤＮＡの単離、増幅を行った。
（ＤＮＡの単離、増幅法）
１．ゲルから発現変動するバンドを切りだし、３７℃で１時間５０μｌのＨ２Ｏに入れ、その後５分間煮沸する。
２．二次的ＰＣＲ
４０μｌ  水
１μｌ    ゲルから分離されたＤＮＡ画分
２μｌ    ２ｍＭ  ｄＮＴＰ
１μｌ    オリゴ−Ｔ１２ＮＸプライマー（一次反応に対応）
１μｌ    ランダム・プライマー（一次反応に対応）
５μｌ    １０×ＰＣＲバッファー
鉱物油一滴を添加する。
３．前記（＃１２）と同様、ＰＣＲサイクリングを行う。
４．ＴＢＥバッファーにて、２％アガロース・ゲルを用いてサンプルを電気泳動する。
Ｅ．特異的に発現するＤＮＡの精製
以下の方法を用いて、動脈硬化症の平滑筋細胞に特異的に発現する遺伝子のＤＮＡの精製を行った。
（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた精製法）
１．カミソリでアガロース・ゲルからＤＮＡバンドを切り取り、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に入れ、重量を計測する。
２．ゲル（１００ｍｇ〜１００μｌ）の３容量のバッファーＱＧを加える。
３．５０℃、１０分間インキュベートする（アガロースが完全に溶解するまで）。もし、溶液の色が紫になっていたら、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを加える。
４．１ゲル容量のイソプロパノールを加え、混合する。
５．収集チューブにカラムを設置し、サンプルをカラムに注入し、更に１分間高速で遠心分離する。
６．流下通過物を捨て、再度カラムを収集チューブに設置し、０．５ｍｌのＱＸ１を注入し、１分間回転する。
７．バッファーＰＥ０．７５ｍｌでカラムを洗浄する（１分間高速で）。
８．流下通過物を捨て、再度カラムを収集チューブに設置し、再度１分間回転する。
９．カラムを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに設置する。
１０．５０μｌの滅菌蒸留水でＤＮＡを溶離する（１分間放置し、１分間回転する。）。
１１．アガロース・ゲルでフラグメントを確認する。
Ｆ．ディファレンシャリーに発現したＤＮＡのｐＧＥＭ−Ｔベクターへのクローニング
以下の方法により、ディファレンシャリーに発現したＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングした。
（ｐＧＥＭ−Ｔベクターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））
１．以下のように、リゲーション反応の準備をする。
２×ラピッド・リゲーション・バッファー：５μｌ
ｐＧＥＭ−Ｔベクター：１μｌ
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ：１μｌ
ＰＣＲ生成物：３μｌ
２．混合し、４℃で一晩インキュベートする。
３．ＪＭ１０９コンピテントセルを用いて形質転換を行う。
Ｇ．シークエンシング
蛍光標識によるダイデオキシチェーンターミネーション法を用いて、ＤＮＡ配列の分析を行った。
本発明において取得した遺伝子のＤＮＡ配列の分析結果について、Ｆ２７７の塩基配列を配列表の配列番号１に、及びＨ２Ａの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。該遺伝子のコーディング領域におけるペプチド配列を、それぞれ配列表の配列番号２（Ｆ２７７）及び４（Ｈ２Ａ）に示す。
Ｈ．５′ＲＡＣＥ
ディファレンシャリーに発現したＤＮＡを、５′末端に伸長するために、５′ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）システム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて５′ＲＡＣＥを行った（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８）。
実験は、５′ＲＡＣＥプロトコル（５′ＲＡＣＥ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ）に従って行った。
Ｉ．ｃＤＮＡライブラリーＰＣＲ
（マウス腎臓ｃＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ社製））
ディファレンシャリーに発現した遺伝子の全ｃＤＮＡをクローニングするために、マウス腎臓のｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲを行った。
ライブラリーを構築するベクター及び関係する遺伝子の塩基配列から順方向及び逆方向のプライマーをそれぞれ設計した。
［Ｆ２７７（配列表の配列番号１）及びＨ２Ａ（配列表の配列番号３）遺伝子のホモロジー検索］
本発明において、取得し、同定した遺伝子について、ＢＬＡＳＴホモロジー検索を実施した。クローンＦ２７７について実施したホモロジー検索の結果を第２図に、及びクローンＨ２Ａについて実施した結果を第３図に示す。
ホモロジー検索の結果、クローンＦ２７７は、近似の遺伝子が報告されていない全く新規な遺伝子であることが確認された。また、クローンＨ２Ａは、「正常」マウス全遺伝子データーベース検索によりヒットした相同遺伝子とＣ末端側のアミノ酸３４個が全く相違している新規な遺伝子であることが確認された。
実施例２．「ＡＫ００２８７３」（配列表の配列番号５）及び「ＮＭ＿００３２３７４」（配列表の配列番号７）遺伝子のクローニング及び同定
正常なヒト及びマウスの心臓ｃＤＮＡライブラリーから、実施例１と同様にして、該細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している実施例１の遺伝子と相同な遺伝子をクローニングし、同定した。該遺伝子を、一つは「ＡＫ００２８７３」（配列表の配列番号５）と、及び他の一つは「ＮＭ＿００３２３７４」（配列表の配列番号７）と命名し、該遺伝子の構造を同配列表に示した。この実施例で取得したＡＫ００２８７３（健常マウス由来）及びＮＭ＿００３２３７４（健常ヒト由来）遺伝子と、実施例１で取得したＨ２Ａ（動脈硬化症発症マウス由来）遺伝子がコードするアミノ酸配列の対比を、第４図に示す。
第４図から明らかなように、動脈硬化症において発現している遺伝子（Ｈ２Ａ）と正常血管平滑筋細胞の遺伝子とは、Ｃ末から２１番目のＲ（Ａｒｇ）（枠内）より下流で顕著に相違している。したがって、これらの遺伝子をＰＣＲを用いて特異的に増幅するには、該Ｒ（Ａｒｇ）の上流及び下流のプライマー１対を用いることにより、行うことができる。
実施例３．動脈硬化症発現遺伝子の機能の解析
［動脈硬化症発現遺伝子（Ｈ２Ａ）発現ベクターの作製］
クローニングを容易に行うために、ＰＣＲ法を用いてｐｃＤＮＡ−Ｈ２Ａを作製した。オリゴヌクレオチドプライマーがＨ２Ａの配列に基づいた翻訳開始点と終止コドンを含むように設計した（Ｈ２Ａセンスプライマー：５’−ＡＴＧＧＣＧＧＣＴＴＴＧＣＧＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣ−３’、アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＣＧＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣ−３’）。特異的なＫｐｎＩ及びＸｈｏＩクローニング部位を作製するために、ＫｐｎＩ部位をセンスプライマーの５´末端で合成し、ＸｈｏＩ部位をアンチセンスプライマーの５´末端で合成した。０．５μＭのセンス及びアンチセンスプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、及び２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を含む１×ＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーＩＩ中でプラスミドＤＮＡを０．１ｎｇ増幅した。増幅反応はＤＮＡ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて行った。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製した後、ＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＫｐｎＩ部位とＸｈｏＩ部位内でクローニングし、ｐｃＤＮＡ−Ｈ２Ａを作製した。
［培養平滑筋細胞へのトランスフエクション］
説明書記載の方法で、陽イオン脂質リポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用いてマウス血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）へのトランスフェクションを行った。顕微鏡による解析のために、２ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチェンバーカバーグラス（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社製）１枚あたり、１×１０４個の細胞を、１μｇのプラスミドＤＮＡと４μＬのリポフェクトアミンを各チェンバー毎に使用して２４時間後にトランスフェクトした。
［アポトーシスを起こした細胞の形態的解析と核染色］
核の形態的な解析を行うため、ＶＳＭＣを組織培養チェンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社製）を用いて培養した。断片化したアポトーシスを起こした核を解析するために、ＶＳＭＣをメタノール／酢酸＝３：１（ｖ／ｖ）で固定し、蛍光染料（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８，１０μｍｏｌ／Ｌ）で染色した。写真はニコンＥＦＤ２蛍光顕微鏡で撮影した（第５図）。
トランスフェクトした細胞培養物の形態的解析により、コントロールにおいては細胞の生存に変化はなかったが（第５図Ａ）、ｐｃＤＮＡ−Ｈ２Ａをトランスフェクトした培養細胞では細胞死が起こることが明らかになった（第５図Ｂ）。コントロールにおいては染色体の染色は見られなかったが（第５図Ｃ、Ｅ）、（ｐｃＤＮＡ−Ｈ２Ａをトランスフェクトした細胞では、）染色体が均一に染色されたアポトーシスを起こしている核中に広がっていたことから、通常の核構造とアポトーシスの特性が失われていることが示唆された（第５図Ｄ、Ｆ）。以上の結果からＨ２Ａの発現は血管平滑筋細胞にアポトーシスを起こさせていることが明らかになった。血管平滑筋細胞は動脈硬化の発症に際して活性化され、増殖、遊走と細胞外基質の産生を開始するが、Ｈ２Ａは、血管平滑筋細胞にアポトーシスを誘導して動脈硬化形成を抑制しているものと考えられる。Ｈ２Ａを動脈硬化血管で遺伝子治療により発現させれば動脈硬化の進展を抑制することができる。
産業上の利用可能性
本邦死因の２、３位を占める脳卒中、心臓病は、動脈硬化が原因となって発症する疾患である。従って、動脈硬化の発症、進展を予防することは臨床上最も重要な課題の１つとなっている。本発明においては、動脈硬化症の病巣と正常血管からそれぞれの平滑筋細胞を培養し、ディファレンシャル・ディスプレイを用いて遺伝子発現を比較し、その結果動脈硬化症の病巣で発現の亢進している２種類の新規遺伝子と、該遺伝子と相同の、正常の平滑筋細胞で発現している遺伝子を取得した。本遺伝子の取得、同定により、この遺伝子の発現の測定を行うことが可能となり、動脈硬化症の診断や該測定法を用いた動脈硬化症の予防及び治療薬のスクリーニングが可能となった。更に、本発明により、動脈硬化症の病巣において発現し、病態に関係する、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、動脈硬化の予防及び治療を可能とする。また、本発明においては、動脈硬化症において発現している本発明の遺伝子が、血管細胞にアポトーシスを誘導することを確認しており、該遺伝子を動脈硬化症を発症している平滑筋細胞に導入して、動脈硬化形成を抑制することができる。したがって、該方法により、遺伝子治療を行うことができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、３匹のＡｐｏＥ欠損マウス（＃１−３）から、プラーク（Ｐ）とノンプラーク（ＮＰ）の平滑筋細胞を培養して遺伝子発現を比較した結果のＸ線写真を示す図である。
第２図は、取得したクローンＦ２７７について、ＢＬＡＳＴホモロジー検索を実施した結果を示す図である。
第３図は、取得したクローンＨ２Ａについて、ＢＬＡＳＴホモロジー検索を実施した結果を示す図である。
第４図は、本発明の実施例において取得した遺伝子、Ｈ２Ａ、ＡＫ００２８７３、ＮＭ＿０３２３７４がコードするアミノ酸配列を対比した結果を示す図である。
第５図は、本発明の動脈硬化症で発現している遺伝子の導入により、アポトーシスを起こした細胞の形態的解析のために、蛍光染料で染色した核を蛍光顕微鏡で撮影した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月8日(2004.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】    明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化症の病巣において特異的に発現している遺伝子、ポリペプチド、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
平滑筋細胞は、血管壁の形態形成及び薬理的反応に関与している重要な構成要素である。通常の場合、成人大動脈壁内側の平滑筋細胞は分裂せず、筋細胞の収縮に特化していると考えられている（収縮型）。しかし場合によっては、血管の平滑筋細胞がある程度の合成能力、細胞外基質の産出、及び細胞分裂を示すことがある。動脈硬化巣における平滑筋細胞は、増殖、遊走し細胞外基質を産生することが知られている（増殖型）。これらは平滑筋細胞が異常状態に転換したことによると考えられているが、このような転換は、アテローム性動脈硬化症の病因を研究する上で重要である（Nature 362, 801-809, 1990；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 1753-1756, 1973；Circ. Res. 58, 427-444, 1986）。
【０００３】
しかし平滑筋細胞が収縮型から増殖型に移行するメカニズムに関しては、現在も明らかでない。平滑筋細胞が増殖能力を有することがあることは多くの研究がすでに明らかにしており、ヒト、霊長類、ウサギ、又はラット動脈由来の平滑筋細胞を培養液中に分散すると、自然に合成能力を有するフェノタイプに転換することがすでに知られている（Physiol. Rev. 59, 1-61, 1979；Lab. Invest. 33, 16-27, 1975；Cell Tiss. Res. 177, 503-522, 1977）。最近の研究から、平滑筋細胞を単離してクローニングすると、培養液中で倍化を繰り返しても、分化型（収縮型）細胞又は未分化型（増殖型）細胞はそれぞれの遺伝子発現パターンを部分的に維持し続けることも知られている（Am. J. Pathol. 144, 1068-1081, 1994；Arterioscler. Thromb. 13, 1449-1455, 1993）。このことから、これら２種類のフェノタイプを有する細胞は、正常血管壁において安定的に共存でき、合成型フェノタイプを有する細胞は、病気の過程中において刺激に応答することで増殖することがわかる。
【０００４】
アテローム性動脈硬化症の動脈及び正常な動脈から得た細胞を比較すると、増殖率に関して差があることが知られている。例えば、ウサギのアテローム性動脈硬化症の動脈又はバルーン擦過法で肥厚したラットの動脈から得た細胞を、対照である正常動脈由来の細胞との比較をしたところ、活発な増殖活動がみられることがわかっている（Atherosclerosis 36, 241-248, 1980；Med. Biol. 62, 255-259, 1984；Arch. Pathol. Lab. Med. 112, 987-996, 1988；Artery 14, 266-282, 1987）。一方、ヒト（Am J Pathol 78, 175-190,1975）及びウサギ（Med Biol 60, 221-225,1982）から、アテローム性動脈硬化性病変が進行した動脈の細胞及び正常な動脈の細胞を得て比較したところ、違いはみられないことも知られている。さらに、ヒトから得たアテローム性動脈硬化プラーク由来細胞を調べたところ、対照である血管由来の細胞と比べて細胞死（アポトーシス）が起こりやすいこともすでにわかっている（Circ Res 81,591-599,1997）。
【０００５】
動物個体中のアテローム性動脈硬化性病変が進行した部分及び正常動脈部分から得た平滑筋細胞を比較するような研究はこれまで行われていない。また、細胞増殖の促進及び抑制因子に対して応答する際の、プラーク（Ｐ）由来及びノンプラーク（ＮＰ）由来の平滑筋細胞を比較する研究もこれまで行われていない。さらに、進行したアテローム性動脈硬化症動脈プラーク中における平滑筋細胞が示す特徴に関してもこれまで研究が行われていなかった。
【０００６】
動脈硬化の発症においては、血管平滑筋細胞の増殖が中心的役割を果たしている。しかし、従来、これらの平滑筋細胞の活性化の原因となっている遺伝子は、明かにされていなかった。
【０００７】
近年、動脈硬化の原因遺伝子に焦点を当てたゲノム研究が進められた。１９９５年１２月には米国Dawin Molecular社が、フランスRPR Gencell部門、フランスGenethonと手を組んで、家系分析とポジショナル・クローニングによる粥状（アテローム性）動脈硬化の病因遺伝子の探索に着手したことが伝えられている。また、１９９５年１０月には米国Millenium Pharmaceuticalsと米国Eli Lilly社が動脈硬化の原因遺伝子に基づいた治療薬のスクリーニングに乗り出していることが、伝えられている。
【０００８】
最近、血管傷害に応答して、血管平滑筋細胞によるVIII型コラーゲンの遺伝子が発現していることが報告されている（Circulation Research,80, 532-541,1997）。
【０００９】
本発明者は、平滑筋細胞の活性化の原因となっている遺伝子の発現を解明すべく研究を進め、それらの遺伝子の一つとして、α１VIII型コラーゲンの遺伝子があることをつきとめ、これを公表した（J. Vasc. Res. 37, 158-169,2000）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとしている課題】    
【００１０】
本発明の課題は、動脈硬化症の病巣において特異的に発現している遺伝子及びポリペプチド、及び、正常な血管平滑筋細胞において発現している該遺伝子及びポリペプチドに相同の遺伝子及びポリペプチド、更には、それらの利用を提供することにある。
【問題を解決するための手段】    
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）欠損マウス（アポＥノックアウトマウス）の動脈硬化症の病巣細胞から、該細胞において特異的に発現している遺伝子をクローニングし、更に、マウス及びヒトの正常な血管平滑筋細胞において発現している該遺伝子に相同の遺伝子をクローニングして本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、今回本発明者は、正常および動脈硬化巣よりそれぞれ培養平滑筋細胞を作製し比較検討を行った。実験材料として、動脈硬化の自然発症モデルであるＡｐｏＥのノックアウトマウスから胸部大動脈を摘出し、動脈硬化プラークおよび正常部分より移植片培養により培養平滑筋細胞を作製した。増殖速度は［３Ｈ］-Thymidineの取込みで測定し、遺伝子発現の比較にはディファレンシャル・ディスプレイ（Differential Display）法を用いた。その結果、正常血管及び動脈硬化巣の培養平滑筋細胞は形態学的な差異を示さなかった。増殖速度は培養細胞株によって違いは認められるものの正常血管および動脈硬化巣間での有意な差は認められなかった。増殖促進因子および抑制因子に対する反応性においても有意な差はみられなかった。
【００１３】
一方ディファレンシャル・ディスプレイ（Differential Display）法によって遺伝子発現を比較した結果、数種類の遺伝子において発現の差がみられた。遺伝子配列を調べた結果それらの一つはVIII型コラーゲンであり、動脈硬化平滑筋細胞において発現が亢進していた。VIII型コラーゲンの発現亢進はｉｎ ｖｉｖｏにおいても確認された。
【００１４】
そして、発現が亢進している遺伝子について同定を行った結果、発現が亢進している遺伝子の中に、今まで知られていない未知の遺伝子が存在することが確認された。これらの新規遺伝子をクローニングして、その構造を決定し、一つは「Ｆ２２７」（配列表の配列番号１）と、及び他の一つは「Ｈ２Ａ」（配列表の配列番号３）と命名した。更に、マウス及びヒトの正常な組織からは、該組織において発現している上記遺伝子に相同の遺伝子の「ＡＫ００２８７３」（配列表の配列番号５）と「ＮＭ＿００３２３７４」（配列表の配列番号７をクローニングしてその構造を決定した。
【００１５】
本発明において取得、同定した遺伝子の発現及び該遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を動脈硬化症診断用の遺伝子マーカー、ペプチドマーカーとして検出することで測定することにより、動脈硬化症の診断を行うことが可能であり、更に該遺伝子の発現及びタンパク質の生成の測定を行うことにより、動脈硬化症の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことができる。更には、動脈平滑筋細胞における該遺伝子の発現を抑制することにより、或いは、該遺伝子の導入によりアポトーシスを誘導して、動脈硬化症の予防或いは治療を可能とする。
【００１６】
すなわち、本発明は、（１）配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡや、（２）上記（１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡや、（３）以下の(ａ)又は(ｂ)のポリペプチドをコードするＤＮＡ。(ａ)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ｂ)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドや、（４）配列表の配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡや、（５）上記（４）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡや、（６）以下の(ａ)又は(ｂ)のポリペプチドをコードするＤＮＡ。(ａ)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ｂ)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドからなる。
【００１７】
また、本発明は、（７）配列表の配列番号５に示される、血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡや、（８）上記（７）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子や、（９）以下の(ｃ)又は(ｄ)のポリペプチドをコードする遺伝子。(ｃ)配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ｄ)配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドや、（１０）配列表の配列番号７に示される、血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡや、（１１）上記（１０）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するするポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子や、（１２）以下の(ｃ)又は(ｄ)のポリペプチドをコードする遺伝子。(ｃ)配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ｄ)配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドからなる。
【００１８】
また本発明は、（１３）上記（１）、（４）、（７）、又は（１０）記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈平滑筋細胞における該（１）、（４）、（７）、又は（１０）記載の塩基配列からなる遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドや、（１４）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドや、（１５）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチドや、（１６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドや、（１７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチドや、（１８）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするポリペプチドや、（１９）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドと類似構造を有するポリペプチドや、（２０）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするポリペプチドや、（２１）配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している配列表の配列番号２のポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチドと類似構造を有するポリペプチドや、（２２）上記（１４）〜（２１）のいずれか記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体や、（２３）抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする上記（２２）記載の抗体や、（２４）抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする上記（２２）記載の抗体からなる。
【００１９】
また本発明は、（２５）上記（１）、（４）、（７）、又は（１０）記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する動脈硬化症診断用プローブや、（２６）上記（１）、（４）、（７）、又は（１０）記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が、上記（１）、（４）、（７）、又は（１０）記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる上記（２５）記載の動脈硬化症診断用プローブや、（２７）上記（２５）又は（２６）記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする動脈硬化症診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップや、（２８）上記（２２）〜（２４）のいずれか記載の抗体及び／又は上記（２５）又は（２６）記載の診断用プローブを含有することを特徴とする動脈硬化症診断薬や、（２９）上記（２２）〜（２４）のいずれか記載の抗体及び／又は上記（２５）又は（２６）記載の診断用プローブを含有することを特徴とする動脈硬化症診断キットからなる。
【００２０】
さらに本発明は、（３０）被検組織から試料を得、該試料における上記（１）、（４）、（７）、又は（１０）記載の遺伝子の発現を測定することを特徴とする動脈硬化症の診断方法や、（３１）上記（３０）記載の遺伝子の発現の測定が、定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とする動脈硬化症の診断方法や、（３２）ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号９（Forward）と配列表の配列番号１０（Reverse）のプライマー、及び／又は配列表の配列番号１１（Forward）と配列表の配列番号１２（Reverse）のプライマーを用いることを特徴とする上記（３１）記載の動脈硬化症の診断方法や、（３３）上記（３０）〜（３２）のいずれか記載の遺伝子の発現の測定が、マイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロッティング法を用いて行われることを特徴とする動脈硬化症の診断方法や、（３４）被検組織から試料を取得、培養し、該試料における遺伝子の発現により生成される配列表の配列番号２、４、６及び８に記載されるポリペプチドの一つ以上を測定することを特徴とする動脈硬化症の診断方法や、（３５）上記（２２）〜（２４）のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とする上記（３４）記載の動脈硬化症の診断方法や、（３６）動脈硬化発症モデル動物に、被検物質を投与し、配列表の配列番号１、４、７及び１０に記載される塩基配列を有する遺伝子の一つ以上の遺伝子の発現、及び／又は配列表の配列番号２、４、６及び８に記載されるポリペプチドの一つ以上のポリペプチド又はその部分ポリペプチドの生成を測定することを特徴とする動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（３７）動脈硬化発症モデル動物が、ＡｐｏＥ欠損マウスであることを特徴とする上記（３６）記載の動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（３８）動脈平滑筋細胞に、上記（１３）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、動脈平滑筋細胞における該上記（１）、（４）、（７）又は（１０）記載の塩基配列からなる遺伝子の発現を抑制することを特徴とする動脈硬化発症遺伝子の発現抑制方法や、（３９）上記（４）〜（１２）のいずれか記載のＤＮＡ遺伝子を、動脈硬化症を発症している平滑筋細胞に導入し、血管細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とする血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法や、（４０）上記（３９）記載の血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法を用いて動脈硬化症を発症している平滑筋細胞の治療を行うことを特徴とする動脈硬化発症細胞の遺伝子治療方法からなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（遺伝子のクローニング、同定）
本邦死因の２、３位を占める脳卒中、心臓病は動脈硬化が原因となって発症する疾患である。従って、動脈硬化の発症、進展を予防することは臨床上最も重要な課題の１つとなっている。動脈硬化の発症、進展の機構を解明するには、動脈硬化症の病巣で発現している遺伝子を取得し、クローニングすることが重要となる。今回、本発明者は動脈硬化の自然発症モデルであるＡｐｏＥノックアウトマウスからの動脈硬化巣と正常血管からそれぞれ平滑筋細胞を単離・培養し、ディファレンシャル・ディスプレイ（Differential Display）を用いて遺伝子発現を比較した。その結果動脈硬化巣で発現の亢進している３種類の遺伝子を取得し、うち１つはVIII型コラーゲンであった。他の２つについては新規の遺伝子であったため今回全配列を明らかにした。また、別途、ヒト及びマウスの心臓遺伝子ライブラリーから、上記遺伝子と相同の遺伝子を取得し、全配列を決定した。
【００２２】
前記動脈硬化巣で発現する２種類の新規遺伝子のうち１つはデータベースに全く未登録のものであった。この遺伝子は動脈以外でも多くの組織で発現しており組織の維持や再生などの基本的な病態に関係していると推測された。他の１つは登録されている機能不明の遺伝子からalternative splicingによって生じた産物であると考えられる。２つの遺伝子は、動脈硬化巣において発現し、病態に関係していることが確認された。
【００２３】
（本発明の遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチド及びその抗体）
本発明において、クローニングした新規遺伝子「Ｆ２２７」、「Ｈ２Ａ」、「ＡＫ００２８７３」及び「ＮＭ＿００３２３７４」の構造を、それぞれ配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７に示した。該遺伝子がコードするポリペプチド（タンパク質）を、配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８に示した。なお、「ＡＫ００２８７３」及び「ＮＭ＿００３２３７４」は、ＮＣＢＩのデータベースで検索することができる。本発明は、該配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７に示される塩基配列（遺伝子）若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列、更には、該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むものである。
【００２４】
更に、次の(ａ)又は(ｂ)のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
(ａ)配列表の配列番号２及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ｂ)配列表の配列番号２及び配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチド、
及び、次の(ｃ)又は(ｄ)のポリペプチドをコードする遺伝子；
(ｃ)配列表の配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ｄ)配列表の配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、正常平滑筋細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現しているポリペプチドと相同性を有し、更に血管細胞にアポトーシスを誘導するポリペプチド、
を含むものである。
【００２５】
また、本発明は、配列表の配列番号１、３、５又は７の塩基配列の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動脈平滑筋細胞における該遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むものである。
【００２６】
本発明において、種々のＤＮＡ配列の変異は、周知の遺伝子工学的遺伝子変異手段によって、行うことができる。
【００２７】
なお、上記本発明の塩基配列において、「塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２８】
更に、本発明は、配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、該配列表の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、動脈硬化症において発現しているタンパク質の類似構造を有するポリペプチドを含むものである。本発明のポリペプチドを取得するには、本発明の遺伝子を適宜の発現ベクター−宿主細胞発現系に導入し、発現することによって取得することができる。
【００２９】
更に、本発明は、本発明のポリペプチドによって誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクロナール抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドとの抗原抗体反応により、本発明遺伝子の平滑筋細胞における発現の有無の検出に利用することができ、動脈硬化症の診断に利用することができる。
【００３０】
（本発明の遺伝子及び該遺伝子によってコードされるポリペプチドの利用）
本発明において、動脈硬化巣からクローニングした新規遺伝子「Ｆ２２７」（配列表の配列番号１）及び「Ｈ２Ａ」（配列表の配列番号３）、及び正常の平滑筋細胞からクローニングした「ＡＫ００２８７３」及び「ＮＭ＿００３２３７４」は、該塩基配列のアンチセンス鎖等を用いることにより診断用プローブとして、動脈硬化症の診断に用いることができる。該診断用プローブや前記本発明ポリペプチドに特異的に結合する抗体を装備して、動脈硬化症診断キットとして利用することができる。
【００３１】
また、本発明のＤＮＡを少なくとも１つ以上デバイス上に固定して、動脈硬化症診断用マイクロアレイとして利用することができる。該マイクロアレイには、VIII型コラーゲンのような動脈硬化症の病巣で発現している遺伝子を合わせて固定することができる。マイクロアレイの調製は、常法により行うことができる（Science 270, 467−470, 1995、細胞工学別冊  ゲノムサイエンスシリーズ(1)「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」株式会社秀潤社（２０００年３月１６日））。
【００３２】
本発明における動脈硬化症の診断方法は、被検組織として、平滑筋細胞における本発明の遺伝子やタンパク質（ポリペプチド）の発現を測定することよりなる。
【００３３】
遺伝子の検出には、汎用されているマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法又はノーザンブロッティング法等を便利に用いることができる。また、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ（adaptor-tagged competitive PCR）、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ、ＥＳＴ(expressed sequence tags)、ＳＡＧＥ（serial analyasis of gene expression）等の公知の遺伝子の検出方法等も適宜使用することができる。ポリペプチドの検出には、本発明の抗体を用いた免疫学的測定法、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などの免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等公知の免疫学的測定法を用いることができる。
【００３４】
本発明における動脈硬化症の診断は、本発明において取得した遺伝子の発現に基づく遺伝子産物（本発明のポリペプチド）の血中濃度を測定することにより行うこともできる。これらの診断法は、動脈硬化の定量的診断に適用可能である。
【００３５】
本発明における動脈硬化症の診断方法に用いる、平滑筋細胞における本発明の遺伝子やタンパク質（ポリペプチド）の発現の測定方法は、動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニングに用いることができる。動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニングを行うには、動脈硬化発症モデル動物に、被検物質を投与し、本発明の遺伝子の発現、及び／又は本発明のポリペプチドの生成を測定することにより行う。本発明において、動脈硬化症の診断における遺伝子の発現の診断には、定量的ＰＣＲを使用することができる。該ＰＣＲの実施に際しては、プライマーとして、「Ｈ２Ａ」遺伝子に対しては配列表の配列番号９（Forward）及び配列番号１０（Reverse）、「ＡＫ００２８７３」に対しては、配列表の配列番号１１（Forward）及び配列番号１２（Reverse）を用いることができる。該動脈硬化症予防又は治療薬のスクリーニングに用いる、動脈硬化発症モデル動物としては、動脈硬化の自然発症モデルであるＡｐｏＥ欠損マウスが有利に利用することができる。ＡｐｏＥ欠損（ａｐｏＥ−／−）マウスは、動脈（大動脈）においてアテローム性動脈硬化性病変を自然発生的に発症し、これらの病変はヒトのアテローム性動脈硬化性病変に似た特徴を示す（Arterioscler Thromb 14, 141-147, 1994）。
【００３６】
本発明においては、本発明の遺伝子である、配列表の配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなる遺伝子を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを動脈平滑筋細胞に導入して、該動脈硬化発症遺伝子の発現抑制を行い、動脈硬化症の予防又は治療を行うことができる。
【００３７】
該動脈硬化発症遺伝子の発現抑制を行うについて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製を行うには、配列表の配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなる遺伝子にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該遺伝子の発現の抑制作用を有する塩基配列を調製する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの大きさについては、遺伝子の発現を抑制できるものであれば特に制限はされないが、生体への投与及び安定性等を考慮すれば、１２〜４０塩基対、特に１５〜２５塩基対程度のものが好ましい。
【００３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの動脈平滑筋細胞への導入は、この分野で通常用いられる方法を用いることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動脈平滑筋細胞へ直接投与することができる。また、必要に応じて薬学的に許容される細胞内導入試薬、例えば、リポフェクチン試薬、リポフェクトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、Ｔｆｘ試薬、リポソーム及び高分子担体等と共に投与することができる。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それ単独、或いは、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、稀釈剤、ｐＨ緩衝剤、可溶化剤、溶解補助剤等の調剤用配合成分を添加することができる。
【００３９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するには、注射剤のような形で投与することができる。この場合には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、水や生理食塩水又はブドウ糖溶液等に溶解させて調製し、必要に応じて緩衝剤、保存剤或いは安定化剤等を含有させて投与することができる。
【００４０】
また、細胞への取りこみの促進や標的とする細胞への指向性を高める目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるようにデザインされたプラスミドやウイルスベクターを遺伝子治療用のベクターとして用いることができる。該ベクターとしては、例えば、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウィルスベクター等のウイルスベクター等を挙げることができる。
【００４１】
また、本発明の配列表の配列番号３、５又は７に示される遺伝子及びその変異遺伝子を、動脈硬化症を発症している平滑筋細胞に導入し、活性化された平滑筋細胞や血管内皮等の血管細胞にアポトーシスを誘導することにより血管平滑筋細胞の動脈硬化形成を抑制することができる。該遺伝子の平滑筋細胞への導入は、真核細胞への公知の遺伝子導入方法を用いることができ、例えば、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿法（リン酸カルシウム法）或いはリポフェクタミン等の市販試薬とＤＮＡを混合して細胞を処理する方法（リポフェクション）、更には、レトロウイルス法、電気穿孔法等のトランスフェクション法を用いることができる。
【００４２】
この血管平滑筋細胞の動脈硬化形成抑制方法を用いて、動脈硬化症を発症している平滑筋細胞の治療を行うことにより、動脈硬化発症細胞の遺伝子治療を行うことができる。
【００４３】
また、本発明の配列表の配列番号３、５又は７の遺伝子は、活性化された細胞に、アポトーシスを誘導するので、該遺伝子を癌細胞に導入し、アポトーシスを誘導することにより、癌細胞や組織の死滅・除去を目的とした遺伝子治療に用いることができる。
【００４４】
（実施例）
【００４５】
（実施例１）
[Ｆ２７７（配列表の配列番号１）及びＨ２Ａ（配列表の配列番号３）遺伝子のクローニング及び同定]
Ａ．大動脈のプラーク（Ｐ）及びノンプラーク（ＮＰ）部分から得た平滑筋細胞の培養
エクスプラント法で平滑筋細胞（ＳＭＣ）組織を樹立した。４．５ｇ／ｌのグルコース、１０％のウシ胎児血清（Gibco BRL社製）及び抗生物質（１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、及び２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ）を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium（Ｄ−ＭＥＭ）を用いて細胞を培養した。
【００４６】
Ｂ．培養細胞からのＲＮＡの調製
トリ・リージェント（TRI REAGENT）（Sigma社製）を用い、上記培養細胞から以下の方法によりＲＮＡの精製を行った。
（精製方法）
１．平板培地の表面積１０ｃｍ２につき、１ｍｌのトリ・リージェントをとり、５分間室温で放置する。
２．１．５ｍｌ用マイクロ遠心分離管に溶解液を１ｍｌずつ分注する。
３．１ｍｌずつ分注した溶解液に、０．２ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間、はげしく混和した後、室温で２〜１５分間放置する。
４．４℃、１２０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。
５．溶解液の各チューブについて、無色の水溶液相（最上相）を新しいチューブに移す。
６．０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、混和した後、室温で５〜１０分間放置する。
７．４℃、１２０００×ｇで１０分間ＲＮＡをペレット化する。
８．７５％のエタノール１ｍｌでＲＮＡペレットを洗浄し、４℃、７５００×ｇで５分間、Ｖｏｒｔｅｘスターラーで回転する。
９．ＲＮＡペレットを乾燥し、次にＲＮａｓｅフリーの水又はバッファーに再懸濁する。
【００４７】
Ｃ．ディファレンシャル・ディスプレイ法（Differential Display法）を用いた、大動脈のプラーク（Ｐ）及びノンプラーク（ＮＰ）の遺伝子発現の比較、解析
ディファレンシャル・ディスプレイ法（SCIENCE 257, 967-971, 1992; Molecular Biotechnology 10, 261-267, 1998）を用いて、Ｐ及びＮＰの遺伝子発現を比較、解析した。用いた方法を、以下に示す。
１．以下の反応混合物を用いて、３７℃で３０秒間２０μｇのトータルＲＮＡをＤＮａｓｅで処理した。
１０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（Rnasin、Promega社製）
１０ＵのＤＮａｓｅ Ｉ(Promega社製)
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）
５０ｍＭのＫＣｌ
１．５ｍＭのＭｇＣｌ２
２０μｇのトータルＲＮＡ
ＤＥＰＣ処理水を加えて５０μｌにする。
３０℃，３０分間
２．フェノール／クロロホルムで抽出する。
３．１／１０Ｖｏｌの３ＭのＮａＡｃ ｐＨ４．８及び２．５Ｖｏｌのエタノールを使用し、−７０℃で２０分間沈澱させる。
４．４℃で５分間回転する。
５．２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁する。
６．６５℃で５分間ＲＮＡを変性した後、氷冷する。
７．アンカーオリゴ−ｄＴ（Ｔ１２ＮＡ、Ｔ１２ＮＴ、Ｔ１２ＮＧ、Ｔ１２ＮＣ）プライマーを稀釈し、最終濃度を５０μＭとする。
８．（４つのチューブにおいて）逆転写する。
１０μｌのＤＥＰＣ処理水
１μｌのＤＮＡフリー・トータルＲＮＡ
４μｌの５×逆転写バッファー
２μｌの０．１ＭのＤＴＴ
１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰストック
１μｌの逆転写酵素
１μｌのＴ１２ＮＡ，Ｔ１２ＮＴ，Ｔ１２ＮＧ、又はＴ１２ＮＣ
（各々の反応に用いる）
３７℃、６０分間
９．ＰＣＲ反応ストックを作る（総量１００μｌ）
１５μｌ  ３２Ｐ−ｄＡＴＰ
５０μｌ  １０×ＰＣＲバッファー
５μｌ    ０．２ｍＭのｄＮＴＰ
１０μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）
２０μｌ  Ｈ２Ｏ
１０．それぞれのＲＮＡサンプルを、逆転写に用いたのと同じＴ１２ＮＡ、Ｔ１２ＮＴ、Ｔ１２ＮＧ、又はＴ１２ＮＣの四種類のアンカーオリゴ−ｄＴプライマー（各ＲＮＡサンプルに４チューブ）と混合する。
２μｌ    ＲＴ−ＰＣＲ生成物
１２μｌ  ＲＣＲ反応ストック
４５μｌ  Ｈ２Ｏ
３μｌ    各チューブ内のオリゴ−ｄＴプラス・プライマー
（Ｔ１２ＮＡ，Ｔ１２ＮＴ，Ｔ１２ＮＧ，又はＴ１２ＮＣ）
１１．各チューブに入っている前記溶液をエッペンドルフ小型チューブ（Eppendorf社製）三つ（それぞれ１９μｌ）に分け、各チューブ（この場合では、三つの異なるランダム・プライマーを使用した）にそれぞれ１μｌのランダム・プライマーを加え、更に各チューブに鉱物油を一滴加える。
１２．ＰＣＲサイクル
９４℃、５分間、以下の３ステップ、４０サイクルにリンクする
９４℃、３０秒
４０℃、２分間
７２℃、３０秒
７２℃、５分間にリンク、４℃に維持
１３．６％シーケンシャル・ゲルを調製する。
３０ｇ    尿素
６ｍｌ    ５×ＴＢＥバッファー
９ｍｌ    ３８：２アクリルアミド
２３ｍｌ  水、穏やかに混和
１２０μｌの２０％ＡＳＰに６０μｌのＴＥＭＥＤを添加したもの
１４．各ＰＣＲ反応チュ−ブに、ローディング・バッファー（シーケンシャル・ゲルで用いられるものと同じもの）を５μｌずつ加える。
１５．反応液を、９５℃で３分間変性させる。
１６．１×ＴＢＥバッファーを用いて、１３００Ｖの電圧で２０分間、ゲルをプレラン（Prerun）する。
１７．相当するサンプル間でパラレルに、サンプルをのせる。
１８．勾配ゲル中で１１００Ｖの電圧で、１３００Ｖの電圧で４〜５時間ゲルを電気泳動する。
１９．ゲルドライヤーで１時間、ゲルを乾かす。
２０．一晩Ｘ線フィルムに露光する。
【００４８】
上記比較、解析において、３匹のＡｐｏＥ欠損マウス（＃１−３）に由来するプラーク（Ｐ）及びノンプラーク（ＮＰ）の培養平滑筋細胞の遺伝子発現を比較した結果のＸ線写真を図１に示す。なお、図中のＪ２１２は、ＶIII型コラーゲンを意味する。
【００４９】
Ｄ．特異的に発現するＤＮＡの単離、増幅
以下の方法を用いて、動脈硬化症の平滑筋細胞に特異的に発現する遺伝子のＤＮＡの単離、増幅を行った。
【００５０】
（ＤＮＡの単離、増幅法）
１．ゲルから発現変動するバンドを切りだし、３７℃で１時間５０μｌのＨ２Ｏに入れ、その後５分間煮沸する。
２．二次的ＰＣＲ
４０μｌ  水
１μｌ    ゲルから分離されたＤＮＡ画分
２μｌ    ２ｍＭ  ｄＮＴＰ
１μｌ    オリゴ−Ｔ１２ＮＸプライマー（一次反応に対応）
１μｌ    ランダム・プライマー（一次反応に対応）
５μｌ    １０×ＰＣＲバッファー
鉱物油一滴を添加する。
３．前記（＃１２）と同様、ＰＣＲサイクリングを行う。
４．ＴＢＥバッファーにて、２％アガロース・ゲルを用いてサンプルを電気泳動する。
【００５１】
Ｅ．特異的に発現するＤＮＡの精製
以下の方法を用いて、動脈硬化症の平滑筋細胞に特異的に発現する遺伝子のＤＮＡの精製を行った。
（ＱＩＡquickゲル抽出キット（QIAGEN社製）を用いた精製法）
１．カミソリでアガロース・ゲルからＤＮＡバンドを切り取り、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ（Eppendorf社製）に入れ、重量を計測する。
２．ゲル（１００ｍｇ〜１００μｌ）の３容量のバッファーＱＧを加える。
３．５０℃、１０分間インキュベートする（アガロースが完全に溶解するまで）。もし、溶液の色が紫になっていたら、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを加える。
４．１ゲル容量のイソプロパノ−ルを加え、混合する。
５．収集チューブにカラムを設置し、サンプルをカラムに注入し、更に１分間高速で遠心分離する。
６．流下通過物を捨て、再度カラムを収集チューブに設置し、０．５ｍｌのＱＸ１を注入し、１分間回転する。
７．バッファーＰＥ０．７５ｍｌでカラムを洗浄する（１分間高速で）。
８．流下通過物を捨て、再度カラムを収集チューブに設置し、再度１分間回転する。
９．カラムを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに設置する。
１０．５０μｌの滅菌蒸留水でＤＮＡを溶離する（１分間放置し、１分間回転する。）。
１１．アガロース・ゲルでフラグメントを確認する。
【００５２】
Ｆ．ディファレンシャリーに発現したＤＮＡのｐＧＥＭ−Ｔベクターへのクローニング
以下の方法により、ディファレンシャリーに発現したＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングした。
（ｐＧＥＭ−Ｔベクターシステム（Promega社製））
１．以下のように、リゲーション反応の準備をする。
２×ラピッド・リゲーション・バッファー：５μｌ
ｐＧＥＭ−Ｔベクター：１μｌ
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ：１μｌ
ＰＣＲ生成物：３μｌ
２．混合し、４℃で一晩インキュベートする。
３．ＪＭ１０９コンピテントセルを用いて形質転換を行う。
【００５３】
Ｇ．シークエンシング
蛍光標識によるダイデオキシチェーンターミネーション法を用いて、ＤＮＡ配列の分析を行った。
【００５４】
本発明において取得した遺伝子のＤＮＡ配列の分析結果について、Ｆ２７７の塩基配列を配列表の配列番号１に、及びＨ２Ａの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。該遺伝子のコーディング領域におけるペプチド配列を、それぞれ配列表の配列番号２（Ｆ２７７）及び４（Ｈ２Ａ）に示す。
【００５５】
Ｈ．５′ＲＡＣＥ
ディファレンシャリーに発現したＤＮＡを、５′末端に伸長するために、５′ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）システム（Gibco BRL社製）を用いて５′ＲＡＣＥを行った（Proc. Natl.Acad. Sci.USA,85,8998-9002,1988）。
【００５６】
実験は、５′ＲＡＣＥプロトコル（５′RACE Instruction Manual）に従って行った。
Ｉ．ｃＤＮＡライブラリーＰＣＲ
（マウス腎臓ｃＤＮＡ（Takara社製））
ディファレンシャリーに発現した遺伝子の全ｃＤＮＡをクローニングするために、マウス腎臓のｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲを行った。
【００５７】
ライブラリーを構築するベクター及び関係する遺伝子の塩基配列から順方向及び逆方向のプライマーをそれぞれ設計した。
【００５８】
［Ｆ２７７（配列表の配列番号１）及びＨ２Ａ（配列表の配列番号３）遺伝子のホモロジー検索］
本発明において、取得し、同定した遺伝子について、ＢＬＡＳＴホモロジー検索を実施した。クローンＦ２７７について実施したホモロジー検索の結果を図２に、及びクローンＨ２Ａについて実施した結果を図３に示す。
【００５９】
ホモロジー検索の結果、クローンＦ２７７は、近似の遺伝子が報告されていない全く新規な遺伝子であることが確認された。また、クローンＨ２Ａは、「正常」マウス全遺伝子データーベース検索によりヒットした相同遺伝子とＣ末端側のアミノ酸３４個が全く相違している新規な遺伝子であることが確認された。
【００５９】
（実施例２）
[「ＡＫ００２８７３」（配列表の配列番号５）及び「ＮＭ＿００３２３７４」（配列表の配列番号７）遺伝子のクローニング及び同定]
正常なヒト及びマウスの心臓ｃＤＮＡライブラリーから、実施例１と同様にして、該細胞において発現し、かつ動脈硬化症において発現している実施例１の遺伝子と相同な遺伝子をクローニングし、同定した。該遺伝子を、一つは「ＡＫ００２８７３」（配列表の配列番号５）と、及び他の一つは「ＮＭ＿００３２３７４」（配列表の配列番号７）と命名し、該遺伝子の構造を同配列表に示した。この実施例で取得したＡＫ００２８７３（健常マウス由来）及びＮＭ＿００３２３７４（健常ヒト由来）遺伝子と、実施例１で取得したＨ２Ａ（動脈硬化症発症マウス由来）遺伝子がコードするアミノ酸配列の対比を、図４に示す。
【００６０】
図４から明らかなように、動脈硬化症において発現している遺伝子（Ｈ２Ａ）と正常血管平滑筋細胞の遺伝子とは、Ｃ末から２１番目のＲ（Ａｒｇ）（枠内）より下流で顕著に相違している。したがって、これらの遺伝子をＰＣＲを用いて特異的に増幅するには、該Ｒ（Ａｒｇ）の上流及び下流のプライマー１対を用いることにより、行うことができる。
【００６１】
（実施例３）
動脈硬化症発現遺伝子の機能の解析
［動脈硬化症発現遺伝子（Ｈ２Ａ）発現ベクターの作製］
クローニングを容易に行うために、ＰＣＲ法を用いてpcDNA-H2Aを作製した。オリゴヌクレオチドプライマーがＨ２Ａの配列に基づいた翻訳開始点と終止コドンを含むように設計した（Ｈ２Ａセンスプライマー：5’- ATGGCGGCTTTGCGGCCCGGAAGC -3’、アンチセンスプライマー：5’- CACTTCCACATCGCACTGTTCATC -3’）。特異的なKpn I及びXho Iクローニング部位を作製するために、Kpn I部位をセンスプライマーの５´末端で合成し、Xho I部位をアンチセンスプライマーの５´末端で合成した。０．５μＭのセンス及びアンチセンスプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、及び２．５ＵのPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を含む１×Pyrobest バッファーII中でプラスミドＤＮＡを０．１ｎｇ増幅した。増幅反応はDNA thermocycler（Perkin-Elmer Cetus Instruments社製）を用いて行った。ＰＣＲ産物をKpn I及びXho Iで消化し、QIA quick Gel Extraction kit（Qiagen社製）で精製した後、ＤＮＡ断片をpcDNA3.1(+)（Invitrogen社製）のKpn I部位とXho I部位内でクローニングし、pcDNA-H2Aを作製した。
【００６２】
［培養平滑筋細胞へのトランスフェクション］
説明書記載の方法で、陽イオン脂質リポフェクトアミン（Gibco-BRL社製）を用いてマウス血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）へのトランスフェクションを行った。顕微鏡による解析のために、２ウェルLab-Tek チェンバーカバーグラス（Nalge Nunc社製）１枚あたり、１×１０４個の細胞を、１μｇのプラスミドＤＮＡと４μＬのリポフェクトアミンを各チェンバー毎に使用して２４時間後にトランスフェクトした。
【００６３】
［アポトーシスを起こした細胞の形態的解析と核染色］
核の形態的な解析を行うため、ＶＳＭＣを組織培養チェンバースライド（Nalge Nunc社製）を用いて培養した。断片化したアポト−シスを起こした核を解析するために、ＶＳＭＣをメタノール／酢酸＝３：１（ｖ／ｖ）で固定し、蛍光染料（Hoechst 33258, １０μｍｏｌ／Ｌ）で染色した。写真はニコンＥＦＤ２蛍光顕微鏡で撮影した（図５）。
【００６４】
トランスフェクトした細胞培養物の形態的解析により、コントロールにおいては細胞の生存に変化はなかったが（図５Ａ）、pcDNA-H2Aをトランスフェクトした培養細胞では細胞死が起こることが明らかになった（図５Ｂ）。コントロールにおいては染色体の染色は見られなかったが（図５Ｃ、Ｅ）、（pcDNA-H2Aをトランスフェクトした細胞では、）染色体が均一に染色されたアポトーシスを起こしている核中に広がっていたことから、通常の核構造とアポトーシスの特性が失われていることが示唆された（第５図Ｄ、Ｆ）。以上の結果からＨ２Ａの発現は血管平滑筋細胞にアポトーシスを起こさせていることが明らかになった。血管平滑筋細胞は動脈硬化の発症に際して活性化され、増殖、遊走と細胞外基質の産生を開始するが、Ｈ２Ａは、血管平滑筋細胞にアポトーシスを誘導して動脈硬化形成を抑制しているものと考えられる。Ｈ２Ａを動脈硬化血管で遺伝子治療により発現させれば動脈硬化の進展を抑制することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本邦死因の２、３位を占める脳卒中、心臓病は、動脈硬化が原因となって発症する疾患である。従って、動脈硬化の発症、進展を予防することは臨床上最も重要な課題の１つとなっている。本発明においては、動脈硬化症の病巣と正常血管からそれぞれの平滑筋細胞を培養し、ディファレンシャル・ディスプレイを用いて遺伝子発現を比較し、その結果動脈硬化症の病巣で発現の亢進している２種類の新規遺伝子と、該遺伝子と相同の、正常の平滑筋細胞で発現している遺伝子を取得した。本遺伝子の取得、同定により、この遺伝子の発現の測定を行うことが可能となり、動脈硬化症の診断や該測定法を用いた動脈硬化症の予防及び治療薬のスクリーニングが可能となった。更に、本発明により、動脈硬化症の病巣において発現し、病態に関係する、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、動脈硬化の予防及び治療を可能とする。また、本発明においては、動脈硬化症において発現している本発明の遺伝子が、血管細胞にアポトーシスを誘導することを確認しており、該遺伝子を動脈硬化症を発症している平滑筋細胞に導入して、動脈硬化形成を抑制することができる。したがって、該方法により、遺伝子治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】第１図は、３匹のＡｐｏＥ欠損マウス（＃１−３）から、プラーク（Ｐ）とノンプラーク（ＮＰ）の平滑筋細胞を培養して遺伝子発現を比較した結果のＸ線写真を示す図である。
【図２】第２図は、取得したクローンＦ２７７について、ＢＬＡＳＴホモロジー検索を実施した結果を示す図である。
【図３】第３図は、取得したクローンＨ２Ａについて、ＢＬＡＳＴホモロジー検索を実施した結果を示す図である。
【図４】第４図は、本発明の実施例において取得した遺伝子、Ｈ２Ａ、ＡＫ００２８７３、ＮＭ＿０３２３７４がコードするアミノ酸配列を対比した結果を示す図である。
【図５】第５図は、本発明の動脈硬化症で発現している遺伝子の導入により、アポトーシスを起こした細胞の形態的解析のために、蛍光染料で染色した核を蛍光顕微鏡で撮影した写真である。
【国際調査報告】
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