(57)【要約】配列番号１〜２００７に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子の少なくとも１つを含む、腎疾患関連遺伝子群、並びに該腎疾患関連遺伝子群の利用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本発明は、腎疾患に関連する遺伝子群、並びに該遺伝子群に関する情報を用いて腎疾患の診断乃至治療を適切に行う手段を提供することを主な目的とする。
背  景  技  術
日本における末期腎不全透析患者は２０万人を超え、米国の２４万人について世界第２位である。しかも新規透析導入患者は年間約３万人を数え、急速に増加しつつある。更に、近年の生活環境の変化は、腎不全に至る大きな原因となる糖尿病を急増させており、今後も透析患者の著しい増加が予測されている。腎疾患に基づく透析導入は、高齢患者の晩年の生活の質を著しく低下せしめる。更に透析療法に費やす医療費は年間約１兆円を越え、８０億円／年の割合で増え続けている。
蛋白尿はこのような腎疾患の独立した危険因子である。大量の蛋白尿は腎障害を誘導する。また慢性腎疾患では、蛋白尿の量自体が、進行性腎障害の予後を規定する因子になっている。即ち、糸球体ろ過されたアルブミンは、腎臓近位尿細管で再吸収され、分解・処理されるが、この過程で近位尿細管が活性化されて、種々のサイトカインや成長因子が産生され、尿細管間質繊維化を促進し、進行性腎障害の悪化をもたらしている。
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、近位尿細管細胞が蛋白負荷を受けると、炎症に関わる遺伝子が発現してくることが報告されている。単球やＴリンパ球の遊走をもたらす因子であるＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）は近位尿細管細胞でＮＦ−ｋＢの活性化と共に増加すること、またＭＨＣクラスＩ、ＩＩやＢ７−１などの抗原提示に関わる分子が近位尿細管で発現することなどが報告されている。また蛋白尿による腎障害の実験モデル動物では、尿細管の活性化から、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球の腎臓への浸潤がもたらされ、その結果として、腎臓間質の炎症が惹起され、繊維芽細胞の増殖や細胞外基質の増生が生じる。
これらの事実は、尿細管細胞とＴリンパ球が直接相互作用する可能性を示しており、近位尿細管細胞がそれ自体抗原提示細胞として、腎障害を起こす中心的な役割を果たしていることを強く示唆している。
このように、腎疾患の原因として、近位尿細管の病態又は蛋白尿との関連が強く示唆されている。しかし、腎障害に関する診断乃至治療は進展していない。というのも、腎臓は、糸球体及び機能的・形態的に異なるセグメントからなるネフロンと呼ばれる最小単位が、ヒトでは約１００万個集合して機能するという複雑な構成を持っている。腎疾患研究において、その特異な構築を無視して検討を行うことは困難である。腎疾患研究において、ネフロン・セグメントにおける種々の遺伝子の発現部位や発現量の同定は、重要な意味を持つと考えられることから、従来から、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法や実体顕微鏡下マイクロダイセクション法を用いて、遺伝子発現に関する種々の検討が行われてきた。しかし、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は発現部位の同定に優れているが定量が困難であった。また、実体顕微鏡下マイクロダイセクション法は、技術的に熟練を要することや、ヒト・サンプルに応用することが難しいなどの問題があった。更に、疾患腎におけるＲＮＡは極めて脆弱であり、微細なサンプルを用いた場合、正確な発現定量は困難であるという問題があった。
近位尿細管での病態又は蛋白尿に関連する特定の因子が、腎疾患の中心的役割を果たすことは示唆されてきたが、上述したように、腎臓の構造やその機能は複雑で、その機能の解明や疾患関連因子の特定には困難を有し、疾患の診断乃至治療法の開発は遅々として進んでいなかった。そのため、特定因子の解明や、腎疾患の診断乃至治療のための有効な手段の確立が強く望まれていた。
発  明  の  開  示
本発明は、腎疾患の解明並びに腎疾患の診断乃至至治療のために有用な腎疾患関連遺伝子群を提供することを主な目的とする。また該遺伝子群に関する情報を利用して、腎疾患の診断乃至治療に有効な手段、具体的には、腎疾患の罹患、重症度又は予後の診断乃至治療に有効な手段を提供することを主な目的とする。
上述したように、腎障害において、近位尿細管の病態又は蛋白尿が重要な役割を果たしていることは明らかである。本発明者は、近位尿細管の病態の適切な観察を行うために、実体顕微鏡下マイクロダイセクション法により収集した近位尿細管を用いて、組織切片からの微細構築の単離とＰＣＲとを組み合わせる手法を開発した。そして、該手法を用いて顕微鏡下に尿細管あるいは糸球体のみを回収し、腎疾患モデルと正常モデルとの当該部位における遺伝子発現を定量的に比較検討して、腎疾患において特異的に発現している約２０００の遺伝子を同定することに成功した。そして、それらの遺伝子の配列を解析し、該約２０００の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群を特定し、更に特定の機能に関与する可能性の高い複数の遺伝子群にグループ化した。また、該遺伝子群の情報を利用して、腎機能に関する新たな知見を見出し、また新規遺伝子も明らかにした。
このようなネフロン特異的な遺伝子群は、他に報告されたことがなく、現時点では、使用可能な、世界で唯一のものである。また本発明の遺伝子群は、腎疾患との関連が強く示唆される遺伝子の多くが包含されている。本願発明で明らかとなった技術は、全く新しい腎障害機序の解明につながるものであり、腎疾患の診断乃至治療のための有用な手段を提供するものである。
即ち、本発明は次の事項に関する。
１．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは各配列番号に対応するＤＮＡを有する２００７個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは該２００７個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
２．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む免疫関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号９、２３、３２、４２、６９、７０、７３、１０５、１２９、１８５、２０２、２１９、２２５、２５６、２７３、２７９、３３７、４３５、４５６、５１８、５２５、５３３、５４４、５９２、５９６、６２４、６３０、６３６、６４５、６４７、６５１、８７３、８９４、８９６、９１６、９２９、９３１、９４８、９５２、９５６、９７５、９８８、１００１、１００３、１００４、１０３２、１０４７、１０５０、１０８０、１１５３、１１９５、１２３６、１２４０、１２７８、１２８０、１２９８、１４１６、１４２５、１４５３、１４７８、１５８１、１５９７、１６０２、１６０９、１６３８、１６４６、１６７２、１６９１、１７４１、１７８４、１８１６、１８４１、１８４７、１９０６又は１９１８のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する７５個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該７５個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
３．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号１７、１８、２４６、２７７、２７８、３０９、４１４、５２７、５４３、５６０、６１１、１０４２又は１７１５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する１３個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該１３個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
４．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号５０、５８、８６、９３、９７、１８９、１９１、２１１、３０４、３０８、３２４、３５３、４１３、４６０、４７１、４８４、４８６、５１１、５１２、５３４、５４８、５４９、５８７、６８９、９７０、１１４５、１１８２、１２１６、１５５８、１７２２又は１７６５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する３１個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該３１個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
５．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むリゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号１１１、１３２、５８１、７８９、１０４５、１２２８又は１５９９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する７個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該７個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
６．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号２９５又は１４７７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する２個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは該２個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
７．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号６、２２、２８、１１３、１７３、２０１、２６２、２６３、３１８、３６５、３７１、３９２、４０６、４４０、４５３、４７７、５１９、５４０、５５３、５６１、６７４、６９０、７０４、７０６、７１０、７６３、７７４、８３３、８８１、８８４、９１２、９１４、９６１、１０８８、１１１０、１１１８、１１２７、１１４１、１５７２、１６０７、１６４９又は１８４３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する４２個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該４２個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
８．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むＡＴＰアーゼ関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号１１８、１２４、２２４、５２８、５５８、６２８、６８２、７３８、８８８又は１１９１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する１０個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該１０個の遺伝子からなる関連腎疾患関連遺伝子群である。
９．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むチトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号４８、１４５、１５５、１６３、２１２、２８４、３２５、３４７、４０２、４７８、６９３、７３９、１２０２、１４０４又は１８７８のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する１５個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該１５個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１０．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号２４４、２５４、２８７、５１４、９９５、１１３５又は１７０８のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する７個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該７個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１１．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むＦｏｓ／Ｒａｓ／ＳＶ４０関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号２２３、２３４、３２２、８３１、１０６１、１０６３、１０６５、１０９５、１３０８、１６９２又は１７８７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する１１個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該１１個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１２．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むメタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号３５９、３６１又は１３４５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する３個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該３個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１３．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号１９２、２１７、８０６、１２３８、１７２５又は１８７３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する６個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該６個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１４．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号４４、１８８、２６１、６５１又は１８６９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する５個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該５個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１５．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むキナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号８５、１２３、１６０、１６２、２６０、２７０、４２４、４７６、５７８、９０１、１０８４、１１３３、１２１８、１３６２、１６２８、１６４５、１６８２又は１６９７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する１８個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該１８個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１６．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む神経関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号３、１２０、２４３、４５５、４７２、５８４、７９２、８２６、９９３、１１７１、１１９４、１２８８、１３３５、１４４８、１７７８、１７９２、１８１７又は２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する１８個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該１８個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１７．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むレセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号５７、６７、１３４、１８３、２００、２４７、３７７、４５４、４８２、４８７、５８０、６２９、６８３、７７０、８２０、８７４、１０１９、１０４４、１１０３、１２０８、１３２１、１３４８、１３７８、１４２８、１４９１、１５５６、１６３５、１８０７、１８０８、１８１８、１８３９又は１９１２のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する３２個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該３２個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１８．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む転写因子関連の腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号３７２、４００、４３０、４５７、５２６、５３１、１０７３、１２１１、１５８４又は１７１９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する１０個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該１０個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
１９．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群：
（ａ）配列番号６１、２６３、２７８、２９５、７６３、８９６、９１６又は２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
好ましくは、各配列番号に対応するＤＮＡを有する８個の遺伝子を含む腎疾患関連遺伝子群、更に好ましくは、該８個の遺伝子からなる腎疾患関連遺伝子群である。
２０．項１〜１９のいずれかに記載の遺伝子群の遺伝子配列を含む腎疾患関連遺伝子データベース。
２１．項１〜１９のいずれかに記載の遺伝子群の遺伝子配列を記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
２２．項１〜１９のいずれかに記載の遺伝子群の遺伝子配列を格納する手段と、遺伝子配列にアクセスする手段と、ターゲットとなる遺伝子配列を検索する手段を有する遺伝子配列データ処理装置。
２３．項１〜１９のいずれかに記載の遺伝子群の遺伝子配列を格納する手段と、遺伝子配列を修正、追加又は削除する手段を有する遺伝子データ処理装置。
２４．項１〜１９のいずれかに記載の遺伝子群の遺伝子配列を格納する手段と、遺伝子配列を編集、分類又はグループ化する手段を有する遺伝子データ処理装置。
２５．項１〜１９のいずれかに記載の遺伝子群の遺伝子配列を格納する手段と、遺伝子配列又は遺伝子配列から得られる情報を用いて演算処理を行う手段を有する遺伝子データ処理装置。
２６．項１〜１９のいずれかに記載の遺伝子群の遺伝子配列を格納する手段と、遺伝子配列、遺伝子配列から得られる情報又は遺伝子配列を電算処理した結果を表示する手段を有する遺伝子データ処理装置。
２７．（ａ）配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、若しくは（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する腎疾患関連遺伝子。
２８．（ａ）配列番号６１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）に記載のＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡ、若しくは（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する腎疾患関連遺伝子。
２９．項２８又は２９に記載の遺伝子によってコードされる腎疾患関連蛋白質。
３０．項２９に記載の腎疾患関連蛋白質又はその部分ペプチドを認識する抗体。
好ましくは、腎疾患検出用抗体、腎疾患解析用抗体、腎疾患診断用抗体である。
３１．項３０に記載の抗体を、検体試料と接触させて、抗体と結合する蛋白質の有無、部位又は量を測定する工程を有する腎疾患の診断乃至判定方法。
３２．項３０に記載の抗体を含有する腎疾患の検出乃至診断薬。
３３．項２８又は２９に記載の遺伝子を含有するベクター。
３４．項３３に記載のベクターを含む形質転換体。
３５．項３４に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が産生する蛋白質を取得する工程を有する腎疾患関連蛋白質の生産方法。
３６．項２８又は２９に記載の遺伝子が導入された腎疾患モデルトランスジェニック非ヒト動物。
３７．項２８又は２９に記載の遺伝子を導入する工程を有する腎疾患モデルトランスジェニック非ヒト動物の作成方法。
より詳しくは項２８又は２９に記載の遺伝子を導入する工程を有する蛋白尿発生トランスジェニック非ヒト動物の作成方法である。
３８．項３６又は３７に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物に対して被検物質が与える影響を測定する工程を含む腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法。
３９．項３６又は３７に記載のトランスジェニック非ヒト動物に、腎機能の回復又は障害を引き起こす操作を行い、次いで、被検物質を投与し、該動物に対して被検物質が与える影響を測定する工程を含む腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法。
４０．項２８又は２９に記載の遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物。
４１．項４０に記載のノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物に対して被検物質が与える影響を測定することを含む腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法。
４２．項４０に記載のノックアウト非ヒト動物に、腎機能の回復又は障害を引き起こす操作を行った後、被検物質を投与し、被検物質が該動物に対して与える影響を測定する工程を含む腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法。
４３．配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる腎疾患関連プローブ。
好ましくは、腎疾患関連遺伝子検出用プローブ、又は腎疾患解析乃至診断用プローブである。
４４．検体から調整した遺伝子試料に、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる腎疾患関連プローブの少なくとも１つをハイブリダイゼーションさせる工程を有する腎疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析乃至診断方法。
４５．配列番号１〜２００７に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ
好ましくは、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる２００７個のプローブを支持体上に固定化した腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップである。
４６．配列番号９、２３、３２、４２、６９、７０、７３、１０５、１２９、１８５、２０２、２１９、２２５、２５６、２７３、２７９、３３７、４３５、４５６、５１８、５２５、５３３、５４４、５９２、５９６、６２４、６３０、６３６、６４５、６４７、６５１、８７３、８９４、８９６、９１６、９２９、９３１、９４８、９５２、９５６、９７５、９８８、１００１、１００３、１００４、１０３２、１０４７、１０５０、１０８０、１１５３、１１９５、１２３６、１２４０、１２７８、１２８０、１２９８、１４１６、１４２５、１４５３、１４７８、１５８１、１５９７、１６０２、１６０９、１６３８、１６４６、１６７２、１６９１、１７４１、１７８４、１８１６、１８４１、１８４７、１９０６又は１９１８のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した免疫関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる７５個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
４７．配列番号１７、１８、２４６、２７７、２７８、３０９、４１４、５２７、５４３、５６０、６１１、１０４２又は１７１５のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを支持体上に固定化したヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる１３個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
４８．配列番号５０、５８、８６、９３、９７、１８９、１９１、２１１、３０４、３０８、３２４、３５３、４１３、４６０、４７１、４８４、４８６、５１１、５１２、５３４、５４８、５４９、５８７、６８９、９７０、１１４５、１１８２、１２１６、１５５８、１７２２又は１７６５のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる３１個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
４９．配列番号１１１、１３２、５８１、７８９、１０４５、１２２８又は１５９９のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したリゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる７個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５０．配列番号２９５又は１４７７のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる２個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５１．配列番号６、２２、２８、１１３、１７３、２０１、２６２、２６３、３１８、３６５、３７１、３９２、４０６、４４０、４５３、４７７、５１９、５４０、５５３、５６１、６７４、６９０、７０４、７０６、７１０、７６３、７７４、８３３、８８１、８８４、９１２、９１４、９６１、１０８８、１１１０、１１１８、１１２７、１１４１、１５７２、１６０７、１６４９又は１８４３のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる４２個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５２．配列番号１１８、１２４、２２４、５２８、５５８、６２８、６８２、７３８、８８８又は１１９１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したＡＴＰアーゼ関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる１０個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５３．配列番号４８、１４５、１５５、１６３、２１２、２８４、３２５、３４７、４０２、４７８、６９３、７３９、１２０２、１４０４又は１８７８のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したチトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる１５個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５４．配列番号２４４、２５４、２８７、５１４、９９５、１１３５又は１７０８のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる７個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５５．配列番号２２３、２３４、３２２、８３１、１０６１、１０６３、１０６５、１０９５、１３０８、１６９２又は１７８７のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したＦｏｓ／Ｒａｓ／ＳＶ４０関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる１１個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５６．配列番号３５９、３６１及び１３４５のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したメタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる３個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５７．配列番号１９２、２１７、８０６、１２３８、１７２５又は１８７３のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる６個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５８．配列番号４４、１８８、２６１、６５１又は１８６９のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる５個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
５９．配列番号８５、１２３、１６０、１６２、２６０、２７０、４２４、４７６、５７８、９０１、１０８４、１１３３、１２１８、１３６２、１６２８、１６４５、１６８２又は１６９７のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したキナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる１８個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
６０．配列番号３、１２０、２４３、４５５、４７２、５８４、７９２、８２６、９９３、１１７１、１１９４、１２８８、１３３５、１４４８、１７７８、１７９２、１８１７又は２００７のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した神経関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる１８個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
６１．配列番号５７、６７、１３４、１８３、２００、２４７、３７７、４５４、４８２、４８７、５８０、６２９、６８３、７７０、８２０、８７４、１０１９、１０４４、１１０３、１２０８、１３２１、１３４８、１３７８、１４２８、１４９１、１５５６、１６３５、１８０７、１８０８、１８１８、１８３９又は１９１２のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化したレセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる３２個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
６２．配列番号３７２、４００、４３０、４５７、５２６、５３１、１０７３、１２１１、１５８４又は１７１９のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した転写因子関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる１０個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
６３．配列番号６１、２６３、２７８、２９５、７６３、８９６、９１６又は２００７のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップ。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる８個のプローブを支持体上に固定化したＤＮＡチップである。
６４．検体から調整した遺伝子試料を、項４５〜６３のいずれかに記載のＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせる工程を有する腎疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析乃至診断方法。
６５．配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有する腎疾患診断乃至治療用アンチセンスＤＮＡ。
６６．配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを含有する腎疾患診断乃至治療薬。
６７．配列番号１〜２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する腎疾患診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
６８．配列番号９、２３、３２、４２、６９、７０、７３、１０５、１２９、１８５、２０２、２１９、２２５、２５６、２７３、２７９、３３７、４３５、４５６、５１８、５２５、５３３、５４４、５９２、５９６、６２４、６３０、６３６、６４５、６４７、６５１、８７３、８９４、８９６、９１６、９２９、９３１、９４８、９５２、９５６、９７５、９８８、１００１、１００３、１００４、１０３２、１０４７、１０５０、１０８０、１１５３、１１９５、１２３６、１２４０、１２７８、１２８０、１２９８、１４１６、１４２５、１４５３、１４７８、１５８１、１５９７、１６０２、１６０９、１６３８、１６４６、１６７２、１６９１、１７４１、１７８４、１８１６、１８４１、１８４７、１９０６又は１９１８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する免疫関連腎疾患診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する７５個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
６９．配列番号１７、１８、２４６、２７７、２７８、３０９、４１４、５２７、５４３、５６０、６１１、１０４２又は１７１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連腎疾患診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する１３個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７０．配列番号５０、５８、８６、９３、９７、１８９、１９１、２１１、３０４、３０８、３２４、３５３、４１３、４６０、４７１、４８４、４８６、５１１、５１２、５３４、５４８、５４９、５８７、６８９、９７０、１１４５、１１８２、１２１６、１５５８、１７２２又は１７６５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する３１個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７１．配列番号１１１、１３２、５８１、７８９、１０４５、１２２８又は１５９９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するリゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する７個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７２．配列番号２９５又は１４７７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する２個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７３．配列番号６、２２、２８、１１３、１７３、２０１、２６２、２６３、３１８、３６５、３７１、３９２、４０６、４４０、４５３、４７７、５１９、５４０、５５３、５６１、６７４、６９０、７０４、７０６、７１０、７６３、７７４、８３３、８８１、８８４、９１２、９１４、９６１、１０８８、１１１０、１１１８、１１２７、１１４１、１５７２、１６０７、１６４９又は１８４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する４２個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７４．配列番号１１８、１２４、２２４、５２８、５５８、６２８、６８２、７３８、８８８又は１１９１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するＡＴＰアーゼ関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する１０個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７５．配列番号４８、１４５、１５５、１６３、２１２、２８４、３２５、３４７、４０２、４７８、６９３、７３９、１２０２、１４０４又は１８７８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するチトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する１５個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７６．配列番号２４４、２５４、２８７、５１４、９９５、１１３５又は１７０８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する７個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７７．配列番号２２３、２３４、３２２、８３１、１０６１、１０６３、１０６５、１０９５、１３０８、１６９２又は１７８７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するＦｏｓ／Ｒａｓ／ＳＶ４０関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する１１個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７８．配列番号３５９、３６１又は１３４５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するメタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する３個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
７９．配列番号１９２、２１７、８０６、１２３８、１７２５又は１８７３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する６個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
８０．配列番号４４、１８８、２６１、６５１又は１８６９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する５個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
８１．配列番号８５、１２３、１６０、１６２、２６０、２７０、４２４、４７６、５７８、９０１、１０８４、１１３３、１２１８、１３６２、１６２８、１６４５、１６８２又は１６９７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するキナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する１８個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
８２．配列番号３、１２０、２４３、４５５、４７２、５８４、７９２、８２６、９９３、１１７１、１１９４、１２８８、１３３５、１４４８、１７７８、１７９２、１８１７又は２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を非験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する神経関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する１８個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
８３．配列番号５７、６７、１３４、１８３、２００、２４７、３７７、４５４、４８２、４８７、５８０、６２９、６８３、７７０、８２０、８７４、１０１９、１０４４、１１０３、１２０８、１３２１、１３４８、１３７８、１４２８、１４９１、１５５６、１６３５、１８０７、１８０８、１８１８、１８３９又は１９１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較するレセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する３２個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
８４．配列番号３７２、４００、４３０、４５７、５２６、５３１、１０７３、１２１１、１５８４又は１７１９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する転写因子関連腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する１０個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
８５．配列番号６１、２６３、２７８、２９５、７６３、８９６、９１６又は２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を被験化合物の存在下及び非存在下において測定し、比較する腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する８個の遺伝子の発現量を測定するスクリーニング方法である。
８６．配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有し、かつ、ｐ３８ＭＡＰＫ活性化活性を有する蛋白質をコードする腎疾患関連遺伝子。
８７．配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有し、かつ、急性腎障害及び／又は糸球体硬化促進活性を有する蛋白質をコードする腎疾患関連遺伝子。
８８．配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物或いは配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物に、被検物質を投与し、該被検物質が（１）細胞内酸化ストレスの遷延化、（２）ｐ３８ＭＡＰＫ活性化、（３）Ｆ−ａｃｔｉｎの再構築及び／又は（４）細胞死に対する脆弱性に与える影響を測定する工程を有する腎疾患関連診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
８９．配列番号８９６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有し、かつ、近位尿細管障害活性を有する蛋白質をコードする腎疾患関連遺伝子。
９０．配列番号８９６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物或いは配列番号８９６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物に、被検物質を投与し、該被検物質が（１）リンパ球系の活性化、及び／又は（２）ＴＳＡ−１発現に与える影響を測定する工程を有する腎疾患関連診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
９１．蛋白負荷した近位尿細管細胞に、被検物質を投与し、該被検物質が、（１）免疫関連腎疾患関連遺伝子群の遺伝子発現、及び／又は（２）Ｊａｋ／Ｓｔａｔ系の活性の変化に与える影響を測定する工程を有する免疫関連腎疾患診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法。
９２．項３８〜３９、４１〜４２、６７〜８５、８８、９０又は９１のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られる化合物又はその誘導体を有効成分とする腎疾患の診断乃至治療薬。
以下、本発明を詳細に説明する。
腎疾患関連遺伝子群
本発明の腎疾患関連遺伝子群は、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該塩基配列に対応するＤＮＡを有する腎疾患関連遺伝子を含んで構成される。
腎疾患関連遺伝子とは、換言すると、腎疾患の発症又は進行或いはそれらの誘導又は調整に関与する遺伝子、具体的には、腎疾患の発症又は進行或いはそれらの誘導又は調整を行う蛋白質をコードする遺伝子である。
本発明において、腎疾患関連遺伝子群とは、腎疾患関連遺伝子の集合であり、具体的には、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の各塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる１又は複数の遺伝子の集合、もしくは、該遺伝子から選ばれる１又は複数の遺伝子と他の腎疾患関連遺伝子との集合である。
本発明における配列番号１〜２００７に記載の各塩基配列からなるＤＮＡを有する腎疾患関連遺伝子は、蛋白負荷した近位尿細管において特異的発現又は発現増加が認められたものである。
これらの遺伝子発現の増加は、実体顕微鏡下マイクロダイセクション法やレーザーマイクロダイセクション法により確認することができる。
ここで、レーザーマイクロダイセクション法とは、レーザー技術を応用し微細な組織構築を特異的に単離回収する方法である。
レーザーマイクロダイセクション法には、２種類の手法、即ち、Ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＣＭ）法と、Ｌａｓｅｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＭＭ）法がある。
このうち、ＬＣＭ法は、組織標本上に薄い特殊なフィルムを乗せ、上方より直径２５〜５０μｍのレーザービームを照射することにより、フィルムを溶かし、目的とする組織を粘着テープではがすように回収する方法である。レーザービーム径が比較的大きく、ビーム径を複数の段階に設定できるが、連続的には変更できない。この方法は腎組織における糸球体の単離に好適である。ＬＣＭ法を利用して糸球体あるいは尿細管各部位を収集し、更にＲＴ−ＰＣＲ法あるいはサザンブロット法と組み合わせることにより、腎組織、特に、糸球体、近位尿細管とヘンレ上行脚での特異的な遺伝子発現の確認が可能となる。
一方、ＬＭＭ法は、ビーム径１μｍ以下の強力なレーザーによりメスのように組織標本を切断し、回収する方法である。この方法では、レーザー発生装置と顕微鏡を用いる。組織標本を、コンピューターマウスでの操作が可能なマニュピレーター上に置き、顕微鏡下にトレースする。切断された組織片はレーザーにより吹き飛ばされ、上方に置いたチューブに回収される。ＬＭＭ法により、糸球体を特異的に回収し、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法等により半定量して、同部位に特異的な遺伝子発現を確認する。レーザーマイクロダイセクション法により得られる細胞数は限られるため、細胞から抽出したＲＮＡを増幅させるためには、更にＰＣＲ法を組み合わせて用いることが好適である。このレーザーマイクロダイセクション法は、従来のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に比べて、定量性にすぐれ、また、実体顕微鏡下マイクロダイセクション法より簡便であるという利点を有している。
このように、蛋白負荷した近位尿細管において特異的発現又は発現増加が認められる腎疾患関連遺伝子群は、腎疾患の発症又は進行或いはそれらの誘導又は調整との関連が強く示唆される。
従って、本願発明における腎疾患関連遺伝子群は、腎疾患解析用、腎疾患診断用、腎疾患検出用、腎疾患判定用、腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。
本願発明の遺伝子群は、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する２００７個の遺伝子から選ばれる１又は複数個の遺伝子で構成される。例えば、本発明の腎疾患関連遺伝子群としては、２００７個の遺伝子から選ばれる１０個の遺伝子からなる遺伝子群や、２００７個の遺伝子から選ばれる１００個の遺伝子からなる遺伝子群が含まれる。
本願発明の腎疾患関連遺伝子群には、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる遺伝子のみからなる遺伝子群で構成されるものでもよく、また、該２００７個の遺伝子以外の他の公知の遺伝子を含んで構成されるものでもよい。
例えば、腎疾患関連遺伝子との関係が強く示唆される配列番号６１、２６３、２７８、２９５、７６３、８９６、９１６又は２００７に記載のＤＮＡ配列をそれぞれ有する８個の遺伝子のみからなる腎疾患関連遺伝子群が挙げられる。又は、該８個の遺伝子に、更に、公知の遺伝子を少なくとも１つ含めた遺伝子群が挙げられる。
本発明の腎疾患関連遺伝子群は、機能により、更に特定のグループ群に分類される。該特定のグループ群を利用すれば、各種疾患と遺伝子発現との関係や、各種腎疾患の原因などを効率よく解析することが可能になる。さらに、創薬のターゲットの絞り込みも適切に行うことができる。
例えば、次のような遺伝子群が挙げられる。
（ａ）免疫関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号９、２３、３２、４２、６９、７０、７３、１０５、１２９、１８５、２０２、２１９、２２５、２５６、２７３、２７９、３３７、４３５、４５６、５１８、５２５、５３３，５４４、５９２、５９６、６２４、６３０、６３６、６４５、６４７、６５１、８７３、８９４、８９６、９１６、９２９、９３１、９４８、９５２、９５６、９７５、９８８、１００１、１００３、１００４、１０３２，１０４７、１０５０、１０８０、１１５３、１１９５、１２３６、１２４０、１２７８、１２８０、１２９８、１４１６、１４２５、１４５３、１４７８、１５８１、１５９７、１６０２、１６０９、１６３８、１６４６、１６７２、１６９１、１７４１、１７８４、１８１６、１８４１、１８４７、１９０６又は１９１８のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ配列を有する遺伝子は、特に免疫機能と関連している。これらは、近位尿細管細胞が抗原提示細胞として深く炎症に関わることを示唆する免疫関連遺伝子である。例えば、配列番号８９６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、インターフェロンγの誘導遺伝子の一つで、Ｔ細胞の活性化のみならず、細胞増殖に関わるとされるＴＳＡ−１（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｈａｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）をコードする遺伝子である（Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８  Ｍａｙ  １５；２７３（２０）：１２３０１−６）。配列番号９７５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、免疫反応において、キーとなる分子の一つであるセマフォリン４Ｄ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｄ）をコードする遺伝子である（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  Ｏｃｔ  １５；１６７（８）：４３２１−８）。配列番号９８８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ系誘導遺伝子の一つであって、免疫反応を引き起こす上でキーとなる遺伝子で、インターフェロン制御因子１（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｅｒ  １（ＩＲＦ−１））をコードする遺伝子である（Ｙｕ−Ｌｅｅ，Ｌｕｐｕｓ  ２００１；１０（１０）：６９１−９）。配列番号１２８０に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、インターフェロンγの誘導遺伝子の一つであって、免疫反応を引き起こす上でキーとなる遺伝子で、ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）をコードする遺伝子である（Ｚｏｊａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９９  Ｓｅｐ−Ｄｅｃ；７（５−６）：４２０−８）。
また、蛋白尿により近位尿細管細胞においてＳｔａｔ１およびＳｔａｔ５の活性化が生じる事が示された。Ｓｔａｔ１／５は遺伝子の転写を起こす蛋白であり、活性化により免疫関連の遺伝子群の発現増加が起こる。例えばＳｔａｔ１はインターフェロンγの主なシグナル伝達経路である。従って、インターフェロンγにより誘導される一群の免疫関連遺伝子具体的にはＴＳＡ−１を含む上記遺伝子群は、一つのグループを構成する。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する７５個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、免疫関連の腎疾患解析用、免疫関連腎疾患診断用、免疫関連腎疾患検出用、免疫関連腎疾患判定用、免疫関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、リンパ球や免疫系の機能に与える影響を測定して、腎疾患の診断又は治療に有効な薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｂ）ヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号１７、１８、２４６、２７７、２７８、３０９、４１４、５２７、５４３、５６０、６１１、１０４２又は１７１５のいずれかに記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子は、特にヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ））及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）に関連する機能を有している。これらは、近位尿細管細胞が蛋白負荷をストレスとして認識していることを示唆するＨｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ関連遺伝子である。例えば、配列番号２７８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子はＨＳＰ６０をコードする遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する１３個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、ヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連の腎疾患解析用、ヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連腎疾患診断用、ヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連腎疾患検出用、ヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連腎疾患判定用、ヒートショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、ヒートショック蛋白質及び／又はシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）関連機能に与える影響を測定して、腎疾患の診断又は治療に有効な薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号５０、５８、８６、９３、９７、１８９、１９１、２１１、３０４、３０８、３２４、３５３、４１３、４６０、４７１、４８４、４８６、５１１、５１２、５３４、５４８、５４９、５８７、６８９、９７０、１１４５、１１８２、１２１６、１５５８、１７２２又は１７６５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特にユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）に関連している。これらは、近位尿細管細胞が積極的に蛋白分解するとともに、蛋白をストレスとして認識していることを示唆するＵｂｉｑｕｉｔｉｎ／Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する３１個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連の腎疾患解析用、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連腎疾患診断用、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連腎疾患検出用、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連腎疾患判定用、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及び／又はプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）関連機能に与える影響を測定して、腎疾患の診断又は治療に有効な薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｄ）リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号１１１、１３２、５８１、７８９、１０４５、１２２８又は１５９９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に関連している。これらは、近位尿細管細胞が積極的に蛋白分解に寄与していることを示唆するＬｙｓｏｚｙｍｅ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する７個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連の腎疾患解析用、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連腎疾患診断用、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連腎疾患検出用、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連腎疾患判定用、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）関連機能に与える影響を測定して、腎疾患の診断又は治療に有効な薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析、予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｅ）薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連の腎疾患関連遺伝子  配列番号２９５又は１４７７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に関連している。これらは、近位尿細管細胞が蛋白負荷で薬剤耐性を有することを示唆するＤｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ関連遺伝子である。例えば、配列番号２９５に記載の遺伝子は、ＭＡＰ１７遺伝子である。また、配列番号１４７７に記載の遺伝子は、ＰＤＺＫ１をコードする遺伝子である（Ｋｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９９  Ｓｅｐ；７９（９）：１１６１−７０）。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する２個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患解析用、薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患診断用、薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患検出用、薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患判定用、薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、薬剤耐性の変化や細胞機能の変化を測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｆ）結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号６、２２、２８、１１３、１７３、２０１、２６２、２６３、３１８、３６５、３７１、３９２、４０６、４４０、４５３、４７７、５１９、５４０、５５３、５６１、６７４、６９０、７０４、７０６、７１０、７６３、７７４、８３３、８８１、８８４、９１２、９１４、９６１、１０８８、１１１０、１１１８、１１２７、１１４１、１５７２、１６０７、１６４９又は１８４３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）に関連している。これらは、蛋白負荷による近位尿細管細胞内物質のｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅを示唆するＢｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ関連遺伝子である。例えば、配列番号７６３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、Ｅｚｒｉｎをコードする遺伝子である。また、配列番号２６３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子はｃｏｆｉｌｉｎをコードする遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する４２個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連腎疾患解析用、結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連腎疾患診断用、結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連腎疾患検出用、結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連腎疾患判定用、結合蛋白（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、近位尿細管細胞内物質の構造変化や細胞内情報伝達系の変化などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｇ）ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号１１８、１２４、２２４、５２８、５５８、６２８、６８２、７３８、８８８又は１１９１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）に関連している。これらは、近位尿細管細胞が活性化していることを示唆するＡＴＰａｓｅ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する１０個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）関連腎疾患解析用、ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）関連腎疾患診断用、ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）関連腎疾患検出用、ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）関連腎疾患判定用、ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、ＡＴＰアーゼ活性や細胞活性の変化などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｈ）チトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号４８、１４５、１５５、１６３、２１２、２８４、３２５、３４７、４０２、４７８、６９３、７３９、１２０２、１４０４又は１８７８のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、チトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）に関連している。これらは、近位尿細管細胞内でアポトーシスが進行していることを示唆するＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ関連遺伝子の遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する１５個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、チトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連腎疾患解析用、チトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連腎疾患診断用、チトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連腎疾患検出用、チトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連腎疾患判定用、チトクローム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、チトクローム関連機能や、活動エネルギーの変化、アポトーシスの進行の変化などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｉ）サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号２４４、２５４、２８７、５１４、９９５、１１３５又は１７０８のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）に関連している。これらは、蛋白尿が近位尿細管細胞の増殖と関わることを示唆するＣｙｃｌｉｎ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する７個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連の腎疾患解析用、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連腎疾患診断用、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連腎疾患検出用、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連腎疾患判定用、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、サイクリン関連機能や細胞増殖などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析、及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｊ）Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０関連の腎疾患関連遺伝子群  配列番号２２３、２３４、３２２、８３１、１０６１、１０６３、１０６５、１０９５、１３０８、１６９２又は１７８７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０に関連している。これら蛋白尿が近位尿細管細胞の形質転換と関わることを示唆するＦｏｓ／Ｒａｓ／ＳＶ４０関連遺伝子の遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する１１個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０関連の腎疾患解析用、Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０関連腎疾患診断用、Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０関連腎疾患検出用、Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０関連腎疾患判定用、Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、Ｆｏｓ及び／又はＲａｓ及び／又はＳＶ４０関連機能に与える影響などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｋ）メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号３５９、３６１又は１３４５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）に関連している。これらは、蛋白尿が近位尿細管細胞の形質転換と関わることを示唆するｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する３個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連の腎疾患解析用、メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連腎疾患診断用、メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連腎疾患検出用、メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連腎疾患判定用、メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、メタプロテイナーゼの発現やメタプロテイナーゼ関連機能に与える影響などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｌ）成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号１９２、２１７、８０６、１２３８、１７２５又は１８７３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）に関連している。これらは、蛋白尿による影響にＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒが関わることを示唆するＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する６個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連の腎疾患解析用、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連腎疾患診断用、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連腎疾患検出用、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連腎疾患判定用、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、成長因子の増減や成長因子関連機能に与える影響などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｍ）インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号４４、１８８、２６１、６５１又は１８６９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）に関連している。これらは、蛋白尿による近位尿細管細胞への影響に細胞外マトリックスが関わることを示唆するＩｎｔｅｇｒｉｎ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する５個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連の腎疾患解析用、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連腎疾患診断用、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連腎疾患検出用、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連腎疾患判定用、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、インテグリン関連機能や細胞外マトリックスに与える影響などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｎ）キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号８５、１２３、１６０、１６２、２６０、２７０、４２４、４７６、５７８、９０１、１０８４、１１３３、１２１８、１３６２、１６２８、１６４５、１６８２又は１６９７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）に関連している。これらは、蛋白尿により近位尿細管細胞内において様々なシグナル伝達が関わることを示唆するＫｉｎａｓｅ関連遺伝子である。例えば、配列番号２６０に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、ＭＥＫ２（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ／Ｅｒｋ  ｋｉｎａｓｅ）をコードする遺伝子である。また、配列番号１６９７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子も、ＭＥＫキナーゼをコードする遺伝子である（Ｐａｇｅｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，１３７４−１３７７，１９９９）。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する１８個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連の腎疾患解析用、キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連腎疾患診断用、キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連腎疾患検出用、キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連腎疾患判定用、キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、キナーゼの活性変化やシグナル伝達などの細胞機能に与える影響などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｏ）神経関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号３、１２０、２４３、４５５、４７２、５８４、７９２、８２６、９９３、１１７１、１１９４、１２８８、１３３５、１４４８、１７７８、１７９２、１８１７又は２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、神経に関連している。これらは、蛋白尿により近位尿細管細胞が幼弱化していることを示唆する神経関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、１８個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、神経関連腎疾患解析用、神経関連腎疾患診断用、神経関連腎疾患検出用、神経関連腎疾患判定用、神経関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させたトランスジェニック非ヒト動物と発現させていない非ヒト動物の双方に被検物質を投与し、動態や神経系の発達の差異などの比較検討を行って、腎疾患の診断乃至治療に有効な薬物のスクリーニング、または腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｐ）レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号５７、６７、１３４、１８３、２００、２４７、３７７、４５４、４８２、４８７、５８０、６２９、６８３、７７０、８２０、８７４、１０１９、１０４４、１１０３、１２０８、１３２１、１３４８、１３７８、１４２８、１４９１、１５５６、１６３５、１８０７、１８０８、１８１８、１８３９又は１９１２のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）に関連している。これらは、蛋白尿により近位尿細管細胞機能が変化していることを示唆するＲｅｃｅｐｔｏｒ／Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する３２個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連腎疾患解析用、レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連腎疾患診断用、レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連腎疾患検出用、レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連腎疾患判定用、レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び／又はトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、レセプター及び／又はトランスポーター関連機能又は細胞機能に与える影響などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニングまたは腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
（ｑ）転写因子関連の腎疾患関連遺伝子群
配列番号３７２、４００、４３０、４５７、５２６、５３１、１０７３、１２１１、１５８４又は１７１９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、特に、転写因子に関連している。これらは、遺伝子発現の変化に様々な転写調節因子が関与していることを示唆する転写因子関連遺伝子である。
従って、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群、好ましくは、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する１０個の遺伝子の集合からなる遺伝子群は、転写因子関連腎疾患解析用、転写因子関連腎疾患診断用、転写因子関連腎疾患検出用、転写因子関連腎疾患判定用、転写因子関連腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして有用な遺伝子群である。例えば、これらの遺伝子を発現させた形質転換体やトランスジェニック動物に、被検物質を投与し、転写因子又は転写調節因子関連機能に与える影響などを測定して、腎疾患の診断又は治療に作用する薬物のスクリーニングまたは腎疾患の診断、解析及び予後の悪化の判定などに利用することができる。
これら本発明の腎疾患関連遺伝子群には、各群に記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子のみからなる遺伝子群であってもよく、また、各群に記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子以外の他の遺伝子を含んで構成されるものであってもよい。
また、本発明の遺伝子群は、各配列番号の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群として用いることができる。
また、該遺伝子群は、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群として用いることができる。また、上記記載の配列番号の塩基配列からなるＤＮＡに対応するヒト由来のＤＮＡを有する遺伝子と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する遺伝子を含んで構成される遺伝子群として用いることができる。
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件とは、通常、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、好ましくは「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、更に好ましくは、「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度である。配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡと通常高い相同性を有している。ここで、高い相同性とは、６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性を指す。
これらの遺伝子群は、該遺伝子群の関連する機能に応じて、所望の目的に応じて使用することができ、各種腎疾患解析用、各種腎疾患診断用、各種腎疾患検出用、各種腎疾患判定用、各種腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして用いられる。
また、本発明の遺伝子群と近位尿細管の機能等との関係を調べることによって、蛋白尿が腎臓のメカニズムに与える影響なども解析することができる。更に、該解析した結果に基づいて腎疾患の診断乃至治療に有効な成分の探索を効率よく進めることができる。
本発明の特定の遺伝子群を利用して得られる情報並びに知見は、疾患の予防、治療又は診断に有効な治療薬の開発、疾患の罹患、重症度、予後の判定などに有用に利用できるものである。
腎疾患関連遺伝子群の遺伝子配列を利用したデータベース、記録媒体及びデータ処理装置
本発明は、更に、上記腎疾患関連遺伝子群を利用したデータベース、記録媒体及びデータ処理装置を提供する。
データベースは、上記腎疾患関連遺伝子群の遺伝子の配列を含んで構成される。該データベースには、他の公知の遺伝子配列を含めることもできる。
本発明のデータベースに含まれる遺伝子は、必要に応じて、適宜修正、追加、削除することができる。そしてまた、それらを更新して用いることもできる。更に、編集、分類又はグループ化して用いることもできる。
本発明のデータベースにおいては、遺伝子配列に加えて、該遺伝子又は腎疾患に関する有用な情報を含めることができる。例えば、各遺伝子のコードする蛋白質や特定機能に関する情報、該遺伝子の由来する生物種名、腎疾患の種類や態様に関連する情報、検体に関する情報などを含めることができる。
本発明のデータベースは、腎疾患に関連する遺伝子の情報をはじめとして、腎疾患に関連する有用な情報を含むものであるから、各種腎疾患の解析用、診断用、検出用、判定用、腎疾患の予後の解析用又は腎機能解析用などとして、有用に用いることができる。
本発明のデータベースから得られる情報は全体的又は部分的に利用することができる。また変形して利用することもできる。
本発明の記録媒体は、上記腎疾患関連遺伝子群の遺伝子配列を記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。
ここで、記録媒体としては、遺伝子配列を記録して保存することができるものであれば特に限定されることはない。例えば、磁気テープ、光磁気ディスク、光ディスクなどが挙げられる。
本発明の該記録媒体には、遺伝子配列だけでなく、遺伝子配列に関する情報、例えば、遺伝子の由来や遺伝子がコードする蛋白質などの情報も記録することができる。また遺伝子配列の解析に有用なプログラム、例えば、演算処理プログラムや画像処理プログラム等を記録することもできる。
本発明の記録媒体は、該記録媒体に記録された遺伝子配列や遺伝子配列に関する情報を、該記録媒体を挿入したコンピュータで読み取ること、読み取った情報を利用して、表示すること、また演算等の各種処理を行うことなどにより利用することができる。
本発明の遺伝子データ処理装置は、上記腎疾患関連遺伝子群を構成する遺伝子の配列の解析手段、統計手段、検索手段など、本発明の遺伝子群を構成する遺伝子の配列又は関連情報を処理する機能を備えた装置である。
例えば、本発明の遺伝子データ処理装置には、遺伝子配列を格納する手段、該遺伝子配列にアクセスする手段、ターゲットとなる遺伝子配列を検索する手段、演算処理、画像処理又は編集処理等の電算処理結果を表示する手段、遺伝子配列又は遺伝子配列から得られる情報を利用して演算処理を行う手段、遺伝子の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳する手段、遺伝子配列を用いて相同性検索を行う手段、遺伝子を追加、削除及び／又は修正する手段、遺伝子配列の編集、分類、グループ化を行う手段、患者情報など各種情報との照合手段などの種々の機能を有する手段を設けることができる。
遺伝子データ処理装置においては、以上に記載したような各処理手段を、所望に応じて１又は２種以上組み合わせて用いることができる。
これらのデータベース、記録媒体又はデータ処理装置を用いることにより、本発明の腎疾患関連遺伝子群から得られる有用な情報の検討をより適切かつ迅速に行うことができる。また、これらを利用して、腎疾患の検出や診断、腎機能の解析、創薬ターゲットのスクリーニングなどを効率よく進めることもできる。
腎疾患関連遺伝子
次に、本発明の遺伝子群を構成する個々の遺伝子の機能について、例を挙げて、更に詳細に説明する。
・配列番号２００７に記載の配列を有する遺伝子（ＧＭＦ−Ｂ（Ｇｌｉａ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）遺伝子）
本発明の遺伝子のうち、配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子は、近位尿細管障害への関与が特に強く示唆される遺伝子である。相同性検索を行った結果、この遺伝子はＧＭＦ−Ｂ遺伝子と考えられる。
ＧＭＦ−Ｂ遺伝子は、分子量１７−ｋＤａの脳グリア細胞の分化を誘導する脳特異的なタンパク質として単離されており、神経グリア培養細胞（Ｃ６細胞）においては、ＧＭＦ遺伝子発現により転写因子ＮＦ−ｋＢを活性化し、神経成長因子産生や神軽成長因子の分泌を起こす事が知られている。ＧＭＦ−Ｂ遺伝子のアミノ酸配列は種を越えて、極めて良く保存されており、マウスとウシ間では１００％、ヒトとマウス間で９８％の相同性がある。この事は本遺伝子産物が生命現象に必須であることを示唆する。そのアミノ酸配列は核移行シグナルと細胞骨格蛋白であるアクチンと結合するコフィリン（ｃｏｆｉｌｉｎ）と類似の配列を有している。
従来、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子は、脳に特異的に発現し、神経細胞の成長・分化に関与することが知られていたが、他の臓器での機能は明らかにされていなかった。
本発明において、このＧＭＦ−Ｂ遺伝子が、障害を起こした腎細胞に特異的に発現していることが明らかとなった。
更に、腎近位尿細管病態モデルにおいて、このＧＭＦ−Ｂ遺伝子を強制発現させて解析したところ、（１）ｐ３８ＭＡＰＫの活性化が生じることが明らかとなった。
一般に、ｐ３８ＭＡＰＫは高血糖、酸化ストレス、虚血ストレス、紫外線照射など刺激により活性化され、細胞の増殖・分化、又はアポトーシスなどの細胞死を引き起こす、生体内でストレス応答に関わる主要なシグナル伝達分子である。活性化したｐ３８は、ＭＡＰＫＡＰ２、Ｅｌｋ−１などの細胞内シグナル伝達系・転写因子等をリン酸化することにより、それらの分子を活性化する。例えば、ｐ３８により活性化される転写因子Ｅｌｋ−１はＳＲＥと呼ばれる遺伝子配列に結合し、Ｅｇｒ−１遺伝子発現を誘導する。結果として、ケモカイン（ＭＣＰ１、ＩＬ１βなど）・細胞接着因子レセプター等の発現を促進する事が分っている。これらは、いずれも、腎障害に関与する分子群である。つまり、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化は、腎障害に関与する分子群が誘導される鍵になっていると考えられている。
従って、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子の近位尿細管での発現誘導によって、Ｐ３８ＭＡＰＫの活性化が生じるという事実は、本遺伝子又は遺伝子産物が近位尿細管障害に関わることを強く示唆するものである。
更に、腎近位尿細管病態モデルにおいてこのＧＭＦ−Ｂ遺伝子を強制発現させて解析した結果、（２）Ｆ−アクチンの再構築が起ること、及び（３）Ｆ−アクチン／活性型ｐ３８／ＧＭＦ−Ｂの細胞内での存在場所が同一であることも明らかになった。
細胞骨格蛋白であるＦ−アクチンは、種々の病態において再構築が起ることが知られている。腎臓では、虚血を起こすと、尿細管上皮細胞でＦ−アクチンの再構築がおこる。糸球体メサンギウム細胞では高血糖（糖尿病性腎障害モデル）や腎炎の一形態である膜性腎症や補体による実験腎炎モデルなどで、Ｆ−アクチンの再構築が報告されている。この様なことから、Ｆ−アクチンの再構築により細胞極性が無くなり、細胞−細胞間、細胞−細胞外基質間の接着が障害されると考えられている。
結果として、虚血では急性尿細管壊死と呼ばれる急性腎障害が起り、また、糸球体メサンギウム細胞機能が障害され、その結果、糸球体硬化（つまり腎障害の末期像）へと進展すると考えられている。
従って、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子の近位尿細管での発現誘導によって、Ｆ−アクチンの再構築をもたらすという事実は、本遺伝子が細胞−細胞間、細胞−細胞外基質間の接着を障害し、結果として、急性腎障害、糸球体硬化への進展を誘発していることを示唆するものである。
また、更に次のことが明らかとなった。
ＧＭＦ−Ｂを強制的に近位尿細管細胞で発現させた場合には、細胞死（アポトーシス）が起りやすくなる。また、細胞内の酸化ストレス刺激（例えばＨ２０２刺激のような酸化ストレス）によって、強制発現系でのみ細胞死が起る。
アンチセンスＧＭＦ−Ｂ導入細胞、遺伝子導入を行っていない細胞、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を加えた場合について、アポトーシス（細胞死）によるＤＮＡの断片化を調べると、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系でのみ細胞死の増強が認められる。一方ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）を加えたものは遺伝子導入を行っていない細胞と同レベルになる。
また、細胞死に関わる重要なｃａｓｐａｓｅ３活性をＧＭＦ−Ｂ強制発現系とｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（近位尿細管培養細胞系）、アンチセンスＧＭＦ−Ｂ発現系で測定すると、Ｈ２０２刺激によりｃａｓｐａｓｅ３活性はＧＭＦ−Ｂ発現細胞系でのみ顕著に誘導される。一方、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ｃａｓｐａｓｅ３阻害剤でそれらの誘導は抑制される。
更に、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の早期マーカーであるアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）の細胞膜への結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）を、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により同定すると、Ｈ２０２刺激により、アンチセンスＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞、ワイルドタイプ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）細胞、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞で細胞死が起こり、そのうち、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞では細胞死が著明に起こる。この結果、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系ではＨ２０２刺激により細胞死がおこりやすくなっていることを示すものである。猶、これらの変化はｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）により抑制される。
また、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系では、Ｈ２０２刺激により細胞内の酸化ストレス（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が遷延する。更に、細胞内に酸化ストレスを惹起する代表的な因子であるＴＮＦ−ａとアンギオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ）で刺激した場合も、やはり細胞内の酸化ストレスが遷延する。
これらのことは、ＧＭＦ−Ｂ発現が細胞内酸化ストレスの遷延化をもたらし、ｐ３８ＭＡＰＫ活性化、Ｆ−ａｃｔｉｎの再構築、細胞死に対する脆弱性を引き起こすことを示唆するものである。
これらのことから、ＧＭＦ−Ｂ発現細胞を用いることによって、候補物質が、１．細胞死に対する脆弱性、２：Ｆ−ａｃｔｉｎの再構築、３：酸化ストレスの遷延化の、どのパスウェイを抑制するかを確認することが可能である。
従って、細胞死、Ｆ−ａｃｔｉｎの再構築、酸化ストレスなどへの作用が考えられる物質を中心に候補物質を探索すること、または被検物質がＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現やＧＭＦ−Ｂ遺伝子発現により誘導される事象に与える影響を測定することによって、腎疾患の診断乃至治療薬の有効成分を効率よく探索することができる。
例えば、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子を発現させた形質転換体、トランスジェニック非ヒト動物或いはＧＭＦ−Ｂ遺伝子ノックアウト非ヒト動物に、被検物質を投与し、該被検物質が（１）細胞内酸化ストレスの遷延化、（２）ｐ３８ＭＡＰＫ活性化、（３）Ｆ−ａｃｔｉｎの再構築、又は（４）細胞死に対する脆弱性などに与える影響を測定することによって、腎疾患診断乃至治療薬の候補物質を探索（スクリーニング）することができる。
ＧＭＦ−Ｂの発現により、細胞骨格に関与するアクチン遺伝子ファミリーの発現あるいは蛋白構築が変化する。また、ｐ３８ＭＡＰＫを介し細胞内酸化ストレスの遷延をもたらす。従ってＧＭＦ−Ｂ発現によりアクチン遺伝子ファミリーおよびｋｉｎａｓｅ関連遺伝子が一群となって発現あるいは機能調節を来す。
このようなＧＭＦ−Ｂ発現誘導及びそれに続く事象は、腎臓に限定される現象ではなく、生体内の一般的な事象である。従って、上記のような方法は、腎疾患だけでなく、例えば、肝障害、呼吸器疾患、神経脳疾患、消化器疾患、自己免疫疾患など、慢性刺激による細胞機能変化が生ずる疾患の診断乃至治療薬の有効成分の探索にも応用することができる。
・配列番号８９６に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子（ＴＳＡ−１遺伝子）
本発明の遺伝子のうち、配列番号８９６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子は、近位尿細管障害への関与が特に強く示唆される遺伝子であった。この遺伝子を更に解析した結果、ＴＳＡ−１遺伝子であることが明らかとなった。
Ｔ細胞の活性化に関わる２つの遺伝子（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＰ）とｔｙｍｉｃ  ｓｈａｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＴＳＡ−１））の発現増加は、腎臓ｍＲＮＡを用いたノーザン解析により確認された。これらの遺伝子の、蛋白尿による遺伝子発現増加は、今まで報告されたことが無い。ＴＳＰはＴ細胞特異的なＧＴＰ結合蛋白で、Ｔ細胞の分化・活性化に重要な働きをする。ＴＳＡ−１はＬｙ−６ファミリーに属し、やはりＴ細胞の分化・活性化のマーカーとして有用であると考えられている。Ｌｙ−６ファミリー分子は１０−１８ｋＤａの糖蛋白でＧＰＩアンカーを介して細胞膜にリンクしている。ある研究では、インターフェロンγにより腎臓、特に近位尿細管の管腔則におけるＬｙ−６発現が著明に増加することが示されている。Ｌｙ−６ファミリーの機能はウロキナーゼ型プラスミノゲーゲンａｃｔｉｖａｔｏｒレセプターの様に、レセプターであると推定されている。Ｌｙ−６リガンドの存在が、リンパ球系細胞の表面に報告されている。Ｌｙ−６蛋白は、ちょうどＴ細胞の活性化や細胞接着に関与するＣＤ５９抗原の様に、細胞内情報伝達系や細胞接着の過程にある種の機能があると考えられている。これらの知見にもとづき、Ｌｙ−６ファミリー蛋白であるＴＳＡ−１をさらに検討した。ＴＳＡ−１は、未分化なＴ細胞や胸腺上皮細胞とともに、リンパ系以外の組織にも発現していることが報告されている。Ｌｙ−６ファミリーは多くの場合、近位尿細管細胞の管腔側に発現が報告されている。ＴＳＡ−１分子の腎臓内における発現を検討するために、モノクローナル抗体、ＰＲＳＴ１を用いた免疫組織学的解析を行った。ＴＳＡ−１の発現は、蛋白負荷３週後の近位尿細管において細胞の血管側に明らかに認められた。一方、コントロールにおいてその発現は認められなかった。
ＴＳＡ−１の血管側の発現が、ＭＨＣクラスＩやＩＩの発現パターンと同様であることは、興味深いことである。病態モデルにおけるＴＳＡ−１  ｍＲＮＡの発現増加は、レーザーマイクロダイセクション・ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により定量的に検討した。ほとんどコンタミネーションなしに近位尿細管のみを収集し、ｍＲＮＡ発現の定量を行った結果、近位尿細管におけるＴＳＡ−１  ｍＲＮＡ発現レベルは３週間の蛋白負荷によりコントロールの約３．８倍に増加していた。また、ＴＳＡ−１  ｍＲＮＡ発現増は、腎臓全体から抽出したｍＲＮＡを用いたノーザン解析から得られた結果とほぼ同じであった。
多くのＧＰＩアンカー型蛋白は、Ｔ細胞活性化の制御に関与している。小杉らは、ＴＳＡ−１の細胞外ドメインが、生理学的に、また機能的に、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の中心分子であるＣＤ３ｚｅｔａと関連することを示している。さらに、ＣｌａｓｓｏｎらはＴＳＡ−１の細胞外ドメインがある種のＴ細胞に結合することを報告しており、ＴＳＡ−１のリガンドがこれらの細胞にあると考えている。
これらのことから、ＴＳＡ−１は、Ｔ細胞の表面の標的分子と相互作用しうる細胞表面レセプターとして、近位尿細管とＴ細胞の直接の相互作用に関わっていることが示唆される。
また、ＴＳＡ−１遺伝子を強制的に発現させた細胞系を作成して細胞増殖について測定したところ、細胞増殖速度が増加すること、抗ＴＳＡ抗体によってその増加がコントロールレベルまで低下することが確認された。
このような事実から、ＴＳＡ−１を細胞血管側に発現した近位尿細管は、それ自体が抗原提示細胞として、間質に浸潤してくるＴ細胞やマクロファージを活性化し、近位尿細管の障害の進展に関与する責任分子の一つとして機能しているものと考えられる。
ＴＳＡ−１遺伝子を利用した具体的な医薬の有効成分の探索方法としては、例えば、ＴＳＡ−１遺伝子を発現させた形質転換体に、被検物質を投与し、該被検物質がＴＳＡ−１の発現誘導を抑制するかあるいは増加させるかを確認する方法、ＴＳＡ−１強制発現細胞系に被検物質を投与し、該被検物質の増殖を抑制するかどうかを調べる方法、ＴＳＡ−１遺伝子を発現させたトランスジェニック非ヒト動物或いはＴＳＡ−１遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与し、リンパ球系の活性化を抑制するかどうか、或いは、ＴＳＡ−１発現が制御されるかどうかを測定する方法が挙げられる。これにより、リンパ系或いは免疫系に作用する薬物の選択を効率よく行うことができる。また、抗ＴＳＡ−１抗体を用いて、腎生検における染色・尿中への漏出の検定系を行うこともできる。これにより、腎疾患、特に免疫関連腎疾患の診断や、免疫関連診断薬又は治療薬の作用評価などを有効に行うことができる。
・配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子（ＧＳ１８８遺伝子）
本発明の遺伝子群の中から、近位尿細管に特異的に発現し、かつ蛋白尿により発現が増加している、配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子を選択し、さらに検討を加えた。まずマウスｃＤＮＡを得るため、５’ＲＡＣＥ用のプライマーを準備した。マウスｃＤＮＡの５’部分がいくつか得られ、これからＤＮＡ配列を決定した。
該配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子は、従来機能が明らかにされていない、新規遺伝子である。
この遺伝子と腎疾患との強い関連性が以下のように明らかとなった。
マウスの配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子の全長は約１．１ｋｂで、７３２塩基の２４４アミノ酸をコードする部分を含んでいた。計算により、その分子量は約２６．６ｋＤａと推定された。翻訳開始領域はＫｏｚａｋ配列と類似していた。さらに、疎水性の解析から、該遺伝子がコードする蛋白は４つの強い疎水領域を持つことが明らかとなり、膜蛋白であることが示唆された。該蛋白質のアミノ酸配列についてＧｅｎＢａｎｋのデータを用い、ＦＡＳＴＡによる相同性検索を行った。その結果、ヒト肝細胞癌関連抗原、マウスＣｌａｓｔ１、マウスおよびヒトＬＲ８などに類似している事が明らかとなった。ＬＲ８の報告されているアミノ酸配列よりの疎水性解析結果は、配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子がコードする蛋白質のものとよく似ていた。マウスＬＲ８は２６３アミノ酸をコードする７８９ベースの蛋白コード領域を持っている。ＬＲ８ｍＲＮＡ発現は線維芽細胞に限局しており、線維芽細胞のマーカーとして有用であると報告されている。
該蛋白質発現の組織分布を見るため、ノーザン解析を行ったところ、該蛋白質は、マウス腎、肺、脾に主な発現が認められ、その大きさはおよそｃＤＮＡから得られたものと同様であった。該遺伝子ｍＲＮＡの腎臓における発現部位を同定するため、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。その発現は、蛋白尿に３週間さらされた近位尿細管に主に発現していた。病態モデルにおける遺伝子の発現をレーザーマイクロダイセクション法により定量した。この結果により、近位尿細管において３週間蛋白負荷した後、該遺伝子ｍＲＮＡは、正常コントロールの約５．９倍に増加していることが確認された。
更に、マウスとヒトのゲノムプロジェクトの結果を参照すると、マウスにおける配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子はマウス染色体６番に、ヒトの配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子はヒト染色体７ｑ３６にあることがわかった。ヒトにおいてもマウスにおいてもＬＲ８遺伝子は配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子の極めて近傍にあった。エクソン−イントロ解析を行ったところ、ヒトとマウスとの配列番号６１の配列を有する遺伝子の構造はほとんど同じであった。２つの遺伝子（ＬＲ８と配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子）は反対方向にあり、最初のイントロン内に５’非翻訳域を重なって持っている。これらの知見は配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子とＬＲ８遺伝子が極めて類似したものであることを示すものである。
このように配列番号６１に記載の配列を有する新規遺伝子（ＧＳ１８８遺伝子）は、腎疾患との関連が強く示唆される遺伝子である。
ＧＳ１８８遺伝子を利用した具体的な医薬の有効成分の探索方法としては、例えば、ＧＳ１８８遺伝子を発現させた形質転換体に、被検物質を投与し、該被検物質がＧＳ１８８の発現誘導を抑制するあるいは増加させるかを確認する方法、ＧＳ１８８強制発現細胞系に被検物質を投与し、該被検物質の増殖を抑制するかどうかを調べる方法、ＧＳ１８８遺伝子を発現させたトランスジェニック非ヒト動物或いはＧＳ１８８遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与し、被検物質が与える影響又はＧＳ１８８の発現が制御されるかどうかを測定する方法が挙げられる。また、抗ＧＳ１８８抗体を用いて、腎生検における染色・尿中への漏出の検定系を行うこともでき、これにより、腎疾患の診断や診断薬又は治療薬の作用評価などを有効に行うことができる。
蛋白質
本発明の蛋白質は、上述の腎疾患関連遺伝子によってコードされる腎疾患関連蛋白質である。具体的には、腎疾患の発症又は進行或いはそれらの誘導又は調整を行う蛋白質である。
本発明の蛋白質には、該蛋白質の塩や誘導体も含まれる。また、該蛋白質のアミノ酸配列の一部が欠失、置換、付加などによって改変されているが、実質的に本発明の蛋白質と同等の機能を有し得るものも含まれる。
本発明の蛋白質を取得する方法は特に限定されないが、例えば、以下のような方法で得ることができる。
配列番号１〜２００７のいずれかに記載のＤＮＡ配列又はその相補配列を有する遺伝子を、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作成する。ベクターとしては、例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター、バキュロウィルスベクターなどを用いることができる。宿主細胞としては、例えば、菌類、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞などを用いることができる。
作成した形質転換体を培養することによって、上記遺伝子がコードする蛋白質を産生することができる。産生された蛋白質は、公知の精製方法、例えば、無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法、免疫沈降法などの公知の精製技術を用いることによって、分離精製することができる。
本発明の蛋白質は、腎疾患の予防乃至治療薬の開発などに有用に利用することができる。
例えば、本発明の蛋白質は、腎疾患において特異的に発現していることから、生体から調整した試料における該蛋白質の発現量を調べることによって、腎疾患の罹患や重症度などを判定することができる。また、該蛋白質の機能又は作用を制御する化合物を、腎疾患又は他の疾患の予防乃至治療薬の有効成分として利用することもできる。また、本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを抗原として腎疾患を検出するための抗体等を作成することもできる。
相互作用蛋白の検索並びに該検索方法を用いた関連物質のスクリーニング方法
本発明の腎疾患関連蛋白質と相互作用する蛋白を検索することにより、当該蛋白質の細胞内での役割がより明らかになる。更に、生体分子間のネットワークの全体像や腎機能の解明等を明らかにすることなどができる。
本発明の腎疾患関連蛋白質と相互作用する蛋白を検索する方法としては、例えば、マーカーと融合させたｂａｉｔ（餌）となる蛋白質Ｘに、ｐｒｅｙ（獲物）となる蛋白質Ｙを作用させ、蛋白質Ｘと反応した蛋白質Ｙの複合体を精製し、蛋白質群を同定する方法などが挙げられる。
具体的には、次のように行うことができる。まず、本発明の遺伝子がコードしている蛋白質（ＧＭＦ−Ｂ、ＴＳＡ−１もしくはＧＳ１８８など）とＧＳＴと呼ばれるマーカーとの融合蛋白質Ｘ（ｂａｉｔ）を作成する。次に、細胞（近位尿細管細胞；正常細胞あるいは蛋白負荷又はＨ２０２処理後の細胞）抽出液と該融合蛋白質Ｘを反応させ、ｂａｉｔ蛋白質と反応した分子を含む複合体ごと取り出す。更に、ＧＳＴ−カラムにより粗精製する。ｂａｉｔ蛋白質Ｘと反応した蛋白質Ｙを含む複合体を、電気泳動により分離し、回収する。更に、染色（銀染色もしくはクマシンブルー染色）により、蛋白質Ｙをゲルより回収し、質量分析装置によって、蛋白質Ｙを同定する。
ＧＭＦ−Ｂ、ＴＳＡ−１もしくはＧＳ１８８等の種々の蛋白質と相互作用する蛋白質を同定することにより、遺伝子間のネットワーク像全体を知ることが出来、腎疾患の機能に関する様々な知見を得ることができる。また機能を推定できない遺伝子については、それと相互作用する既知蛋白質に関する情報を得ることにより、その遺伝子の機能も解明することができる。
抗体
本発明の抗体は、上記本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを認識し得るものであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れであってもよい。
モノクローナル抗体は、例えば、次のように製造される。本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを抗原として免疫された温血動物、例えばマウスから、抗体価の認められる個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する。該ハイブリドーマを培養して、抗体を産生し、適宜分離精製を行うことによって、モノクローナル抗体を得ることができる。
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）やその変法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３９，２８５，１９８０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８，４３７，１９８１、Ｎａｔｕｒｅ，２８５，４４６，１９８０）に従い、実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス等が用いられる。また、本発明のモノクローナル抗体をヒト化抗体として用いてもよい。
ポリクローナル抗体は、例えば、次のように作成できる。蛋白質抗原自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、モノクローナル抗体の製造方法と同様に温血動物に免疫を行う。該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより、得ることができる。
本発明の抗体は、検出試薬や診断薬など、腎疾患又は他の疾患の検出や診断などに有効に利用することができる。
例えば、検体から調整した尿などの試料に、本発明の抗体を接触させ、腎疾患において特異的に発現している蛋白質の有無を測定することによって、腎疾患の検出や、重症度、又は疾患の予後の解析などを有効に行うことができる。また、本発明の抗体を含有する診断薬や検出薬を調整し、腎疾患又は他の疾患の診断や解析などに利用することもできる。
例えば、ＧＭＦ−Ｂ、ＴＳＡ−１或いはＧＳ１８８に対する抗体等を用いて、腎生検における染色・尿中への漏出の検定を行うことができる。また該検出した結果に基づいて、腎疾患の診断や、腎疾患関連診断薬又は治療薬の作用を評価することなどができる。
トランスジェニック非ヒト動物
本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物とは、本発明の腎疾患関連遺伝子、具体的には配列番号１〜２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を導入させて、遺伝子組換えにより、作成された非ヒト動物のことをいう。非ヒト動物には、マウス、ウサギ、ラットなどのヒト以外の哺乳動物が含まれる。
トランスジェニック非ヒト動物を作成する方法としては、例えば、位相差顕微鏡下で前核期卵子の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵子に感染させる方法、または、精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法などが挙げられる。
本発明の遺伝子を対象動物に導入させるにあたっては、該遺伝子を、動物細胞で発現させ得るプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを形成し、該遺伝子コンストラクトを対象動物の受精卵、たとえばマウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって導入した遺伝子を強制発現させたトランスジェニック動物を作出できる。プロモーターとの遺伝子コンストラクトは、通常の遺伝子工学的手法によって作成できる。受精卵細胞段階における遺伝子の導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように行うとよい。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明腎疾患関連遺伝子が存在することは、作出動物の子孫が、全て、その胚芽細胞及び体細胞の全てに、該遺伝子を有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに該本発明の腎疾患関連遺伝子を有する。
上記のように作成したトランスジェニック非ヒト動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。さらに、目的遺伝子を保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つ雌雄の動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該外遺伝子を有するように繁殖継代することができる。
本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物は、腎疾患又は他の疾患の予防乃至治療に有効な医薬のスクリーニングなどに利用することができ、また腎疾患モデル動物として利用することもできる。
例えば、トランスジェニック非ヒト動物を腎疾患モデル動物として被検物質を投与し、被検物質が、該トランスジェニック動物に対して与える影響を測定することにより、腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニングを効率よく行うことができる。また、例えば、該トランスジェニック非ヒト動物に腎障害を引き起こす操作を加えた上で、候補物質を投与し評価することにより、該候補物質の有効性や薬理作用を調べることなどもできる。
また、本発明の腎疾患関連遺伝子を導入してトランスジェニック非ヒト動物を作成し、該動物をそのまま、又は蛋白尿又はストレスを与えて蛋白尿を発生させ、蛋白尿発生腎疾患モデル動物として利用することもできる。
ノックアウト非ヒト動物
本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明の腎疾患関連遺伝子、具体的には、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子が失われるように処理されたものである。非ヒト動物としては、マウス、ウサギ、ラットなどのヒト以外の哺乳動物などが含まれる。
ノックアウト非ヒト動物は、例えば、ＥＳ細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別し、ホモ接合体を得ることにより、作製することができる。
例えば、動物としてマウスを用いた場合には、以下のように作成することができる。受精卵の胚盤胞や桑実胚期に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。このキメラマウスと正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体マウスを作製することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスを作成する。
本発明のノックアウト非ヒト動物を用いることによって、遺伝子の生体機能又は腎疾患との関連をより適切に調べることができる。また、腎疾患又は他の疾患の診断乃至治療に有効な物質の開発やスクリーニングなどに有用に利用することができる。
例えば、ノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与し、被検物質が、該ノックアウト非ヒト動物に対して与える影響を測定することにより、腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング等を効率よく行うことができる。また、例えば、該ノックアウト非ヒト動物に腎障害を引き起こす操作を加えた上で、候補物質を投与し評価することにより、該候補物質の有効性や薬理作用を調べることなどもできる。
腎疾患関連プローブ
本発明のプローブは、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる腎疾患関連プローブである。
一部とは、上記塩基配列又はその相補配列の連続する少なくとも１５塩基からなるポリヌクレオチドである。該プローブは、適宜標識化して用いてもよい。
本発明の腎疾患関連プローブは、蛋白負荷した近位尿細管における特異的な発現又は発現の増加が見られる遺伝子を特異的に検出し得るものである。従って、本発明の腎疾患関連プローブは、腎疾患関連遺伝子検出用、又は腎疾患解析用、腎疾患診断用などとして有用に用いることができる。
例えば、検体から調整した遺伝子試料に、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる腎疾患関連プローブの少なくとも１つをハイブリダイゼーションさせて、腎疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏの解析乃至診断などを行うことができる。
具体的に、次のように行う。本発明の腎疾患関連遺伝子から選択した遺伝子の配列に基づき、全長４０〜１００塩基のプローブを作成し、標識化する。一方、検体試料から抽出したＲＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅後のＤＮＡを精製し、スライド上に固定して、ＤＮＡチップを作成する。該チップ上で、本発明の腎疾患関連遺伝子に基づき作成した標識プローブとのハイブリダイゼーションを行い、発現パターンを解析する。解析した結果を検討することにより、腎疾患の罹患の有無や、腎疾患の種類の特定などを判断することができ、腎疾患の検出や診断、予後の解析などを適切に行うことが可能となる。本発明のプローブは、上記各種腎疾患関連遺伝子群として記載したグループに応じて、特定の機能毎にグループ化して用いることもできる。
ＤＮＡチップ
本発明に係るＤＮＡチップは、本発明の腎疾患関連プローブ、具体的には、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを、高密度に整列させて、シリコンウェハーやガラススライド等の支持体上に固定化したものである。
本発明のＤＮＡチップには、蛋白負荷した近位尿細管に特異的に発現している遺伝子に係るプローブが固定化されており、腎疾患解析用乃至診断用として有用に用い得る。
本発明のＤＮＡチップには、所望に応じて、本発明の腎疾患関連プローブに加えて、他のプローブを適宜固定化してもよい。また、プローブは、適宜標識化して用いてもよい。
本発明のＤＮＡチップは、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブの少なくとも１つが固定されていればよい。例えば、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる２００７個全てのプローブを支持体上に固定化したものが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡチップは、特定の機能に応じて分類された各種腎疾患関連のプローブ毎に固定して、各種疾患の解析乃至診断用としてもよい。
例えば、配列番号９、２３、３２、４２、６９、７０、７３、１０５、１２９、１８５、２０２、２１９、２２５、２５６、２７３、２７９、３３７、４３５、４５６、５１８、５２５、５３３、５４４、５９２、５９６、６２４、６３０、６３６、６４５、６４７、６５１、８７３、８９４、８９６、９１６、９２９、９３１、９４８、９５２、９５６、９７５、９８８、１００１、１００３、１００４、１０３２、１０４７、１０５０、１０８０、１１５３、１１９５、１２３６、１２４０、１２７８、１２８０、１２９８、１４１６、１４２５、１４５３、１４７８、１５８１、１５９７、１６０２、１６０９、１６３８、１６４６、１６７２、１６９１、１７４１、１７８４、１８１６、１８４１、１８４７、１９０６又は１９１８のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなるプローブを少なくとも１つ支持体上に固定化した免疫関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップが挙げられる。
好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列又はその相補配列の全部又は一部からなる７５個全てのプローブを支持体上に固定化した免疫関連腎疾患解析乃至診断用ＤＮＡチップとするのがよい。
本発明のＤＮＡチップ上で、検体から調整した試料をハイブリダイゼーションさせることにより、各種腎疾患の適切な解析乃至診断を行うことが可能となる。
具体的には、以下のように行う。まず、本発明の腎疾患関連遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプローブを、蛍光色素にて標識化し、スライドガラス上に整列・固定化して、本発明のＤＮＡチップを作成する。一方、検体試料から、レーザーマイクロダイセクション法などにより細胞を採取し、該細胞から抽出したＲＮＡをＰＣＲ法等により増幅し、増幅したＲＮＡを前記蛍光色素とは異なる色の色素にて標識化する。例えば、腎疾患関連遺伝子プローブを赤色で標識し、検体試料から得られたＲＮＡは緑色で標識する。該標識化して調整した検体試料を、本発明のＤＮＡチップ上でコハイブリタイゼーションさせて色調の判定により発現量を比較検討する。該発現量の検討により、腎疾患の検出や診断、具体的には腎疾患の罹患の有無や腎疾患の種類の特定、又は予後の解析等を適切に行うことが可能となる。
この方法を用いると、数個から数万の遺伝子の発現量を同時に検討することが可能であり、また遺伝子発現という観点から腎機能や腎疾患の仕組みを包括的に解析することが可能である。上記機能毎に分類された本発明のＤＮＡチップを用いれば、各種疾患の種類や態様に応じたより適切な解析や診断が可能となる。
アンチセンスＤＮＡ
本発明の腎疾患関連アンチセンスＤＮＡは、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列のＤＮＡに相補的な又は実質的に相補的な塩基配列を有し、遺伝子の発現を抑制し得る作用を有するものである。本発明の腎疾患関連アンチセンスＤＮＡは、腎疾患診断用、腎疾患検出用、或いは腎疾患解析用などの用途に用いることができる。
実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明の遺伝子の塩基配列と、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列である。
本発明のアンチセンスＤＮＡは、薬学的に許容することができる担体と組み合わせて腎疾患診断乃至治療薬として用いることもできる。該アンチセンスＤＮＡを含有する医薬において、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡは１種含有させてもよく、また２種以上含有させてもよい。
本発明におけるアンチセンスＤＮＡは、上記腎疾患関連遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を有効に抑制することができるので、該腎疾患関連遺伝子の発現に基づく疾患の進行を効果的に抑制することができる。
具体的な適用方法としては、例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、そのまま、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与する方法などが挙げられる。さらに、該アンチセンスＤＮＡは、腎疾患診断用、腎疾患検出用、或いは腎疾患解析用オリゴヌクレオチドプローブとして、検体から取得した試料や実験細胞における本発明の遺伝子の存在や発現状況を調べるために使用することもできる。
スクリーニング方法
本発明の腎疾患関連遺伝子の発現を増加又は抑制する物質は、腎疾患の診断薬、予防薬乃至治療薬の有効成分の有力な候補化合物となり得る。
そのような化合物をスクリーニングするための方法としては、例えば、被験化合物の存在下及び非存在下において、配列番号１〜２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定し、該発現量を比較する方法等が挙げられる。
本発明の各腎疾患関連遺伝子群を利用して、各種腎疾患の種類に応じて、特定の疾患に効果的な診断乃至治療薬の有効成分を探索することができる。
例えば、被験化合物の存在下及び非存在下において、配列番号９、２３、３２、４２、６９、７０、７３、１０５、１２９、１８５、２０２、２１９、２２５、２５６、２７３、２７９、３３７、４３５、４５６、５１８、５２５、５３３、５４４、５９２、５９６、６２４、６３０、６３６、６４５、６４７、６５１、８７３、８９４、８９６、９１６、９２９、９３１、９４８、９５２、９５６、９７５、９８８、１００１、１００３、１００４、１０３２、１０４７、１０５０、１０８０、１１５３、１１９５、１２３６、１２４０、１２７８、１２８０、１２９８、１４１６、１４２５、１４５３、１４７８、１５８１、１５９７、１６０２、１６０９、１６３８、１６４６、１６７２、１６９１、１７４１、１７８４、１８１６、１８４１、１８４７、１９０６又は１９１８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子の発現量を測定し、測定した発現量を比較する免疫関連腎疾患診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法が挙げられる。好ましくは、上記配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する７５個の遺伝子の発現量を測定し、該発現量を比較する免疫関連腎疾患診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法である。
また、本発明のトランスジェニック動物又はノックアウト動物を用いてスクリーニングを行うこともできる。
例えば、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子が導入された腎疾患モデルトランスジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、被検物質が該動物に対して与える影響を測定する工程を含む腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法が挙げられる。
また、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子が導入された腎疾患モデルトランスジェニック非ヒト動物に、腎機能の回復又は障害を引き起こす操作を行い、次いで、被検物質を投与し、被検物質が該動物に対して与える影響を測定する工程を含む腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法が挙げられる。
また、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物に対して被検物質が与える影響を測定することを含む、腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法が挙げられる。
また、配列番号１〜２００７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物に、腎機能の回復又は障害を引き起こす操作を行った後、被検物質を投与し、被検物質が該動物に対して与える影響を測定する工程を含む、腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法が挙げられる。
上記トランスジェニック非ヒト動物又はノックアウト非ヒト動物を用いた方法は、各種腎疾患関連遺伝子群に分類したスクリーニングに対応させて行うことも可能である。
例えば、配列番号２９５又は１４７７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子が導入された腎疾患モデルトランスジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、被検物質が該動物に対して与える影響を測定する工程を含む薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法が挙げられる。
また、配列番号２９５又は１４７７に記載の塩基配列からなるからなるＤＮＡを有する遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与し、該動物に対して被検物質が与える影響を測定することを含む、薬剤耐性（Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）関連腎疾患の診断至治療に有効な物質のスクリーニング方法が挙げられる。
更に、特定の機能が解明された遺伝子については、機能に関連させたスクリーニング方法を適宜行うことができる。
例えば、配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物或いは配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物に、被検物質を投与し、該被検物質が（１）細胞内酸化ストレスの遷延化、（２）ｐ３８ＭＡＰＫ活性化、（３）Ｆ−ａｃｔｉｎの再構築及び／又は（４）細胞死に対する脆弱性に与える影響を測定する工程を有する腎疾患関連診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法が挙げられる。
また、配列番号８９６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物或いは配列番号８９６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物に、被検物質を投与し、該被検物質が（１）リンパ球系の活性化、及び／又は（２）ＴＳＡ−１発現に与える影響を測定する工程を有する、腎疾患関連診断乃至治療薬の有効成分のスクリーニング方法が挙げられる。
これらのスクリーニング方法において、遺伝子の発現を検出する方法としては、例えば、レポーターアッセイ法などを用いることができる。具体的には、遺伝子の転写調節領域とその下流に連結されたレポーター遺伝子からなるＤＮＡ構成を調製し、これを適当な動物細胞に導入する。この細胞を、被験物質の存在下及び非存在下に培養した後、細胞抽出液中のレポーター蛋白質の活性などを測定することにより、発現量を定量し比較すればよい。また、細胞や組織からＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、あるいはノーザンブロット解析法などを利用して、遺伝子の発現をｍＲＮＡレベルで検出してもよい。また、上述した抗体などを利用して、免疫化学的方法（ＥＬＩＳＡ法、免疫組織染色法など）などにより、遺伝子が発現する蛋白質を検出してもよい。
腎疾患関連医薬
本発明の医薬としては、例えば、本発明の遺伝子を含有する医薬、本発明の蛋白質又は抗体を含有する医薬、本発明のＤＮＡアンチセンスを含有する医薬などが挙げられる。また、本発明の医薬には、本発明の遺伝子の発現を制御する化合物を有効成分とする医薬、本発明の蛋白質の機能又は作用を制御する化合物を有効成分とする医薬が挙げられる。具体的には、上述のスクリーニング方法によって選定された化合物を有効成分とする医薬などが挙げられる。
本発明における配列番号１〜２００７に記載の各塩基配列からなるＤＮＡを有する腎疾患関連遺伝子は、蛋白負荷した近位尿細管において特異的発現又は発現増加が認められたものである。従って、上記のような本発明の医薬は腎疾患の予防薬、診断乃至治療薬などとして有用に用いることができる。
腎疾患の種類は特に限定されないが、例えば、慢性腎炎、慢性腎不全、急性腎障害、自己免疫疾患等による２次性腎疾患、糖尿病性腎障害、ネフローゼ症候群などが挙げられる。
そして、本発明の医薬は腎疾患だけでなく、他の疾患にも適用可能である。
例えば、ＧＭＦ−Ｂ発現誘導及びそれに続く事象は生体内の一般的な現象である。従って、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現誘導及びそれに続く事象を検討することによって、慢性刺激による細胞機能変化が生ずるほとんど全ての疾患、例えば、肝障害、呼吸器疾患、神経脳疾患、消化器疾患、自己免疫疾患などの慢性炎症による変化がもたらされる疾患、動脈硬化病変等等の診断乃至治療薬の候補物質を探索することができる。そして、探索した成分を各種疾患の診断乃至治療薬の有効成分とすることができる。
また、Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ５を用いた評価系は、シグナル伝達が関与するあらゆる疾患の診断乃至治療薬の開発に利用することもできる。
本発明の医薬は、化合物の物性や投与形態、適用箇所等に応じ、公知の技術を用いて、適宜製剤化して用いることができる。
また、本発明の腎疾患関連医薬は、ヒトの疾患に適用されるほか、マウス、ラット、ウサギなどの各種哺乳動物の疾患にも適用される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をより詳しく説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１：蛋白負荷したモデルの近位尿細管で高発現している遺伝子
（１）マウスタンパク負荷モデルの作成
蛋白負荷モデルは、５週齢のＣ５７Ｂ／６の雄と雌のマウス（約２０ｇ重）を生理食塩水に溶解した１０ｍｇ／ｇ体重のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，シグマ社、米国）を一週間のうち５日間腹腔内投与して作成した。最初の週は２．５ｍｇ／ｇ体重から徐々に投与量を増加させ、最終量にした。アルブミン負荷は３週間継続した。
一方、コントロールマウス（正常モデル）は、５週齢のＣ５７Ｂ／６の雄と雌のマウス（約２０ｇ重）に対し、アルブミンを含まない生理食塩水を用いる以外は、上記と同様の処理を行って作成した。
（２）マウス近位尿細管細胞のマイクロダイセクション
（１）で作成したマウスに、麻酔を行った後、腎近位尿細管を回収した。腎臓は５ｍｌのマイクロダイセクション用の溶液で灌流した（ａｔ  ４℃，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １３５ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，５ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，５．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，ａｎｄ  ５Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｐＨ７．４）。腎臓は、一部を切除しＲＮＡｌａｔｅｒ液（Ａｍｂｉｏｎ社、米国）につけ、４度に冷却したマイクロダイセクション用皿に移した。Ｓ１からＳ３細胞を含む近位尿細管を、実体顕微鏡下マイクロダイセクション法により腎臓から収集した。回収された近位尿細管全体の総計は約３０ｃｍと推定された。
（３）ＤＮＡ配列同定とデータ解析
ＲＮＡをマイクロダイセクションされた近位尿細管からＴＲＩｚｏｌ液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を用いて回収した。ｃＤＮＡはｐＵＣ１９を元にしたベクターのプライマーを用いて合成し、ＭｂｏＩ（ｄａｍメチラーゼに感受性な４ベースを認識する制限酵素）で切断後、環状にし、大腸菌に導入した。導入された大腸菌コロニーを約３０００個、無作為に選択し９６穴プレートで培養した。挿入したｃＤＮＡは近傍の配列を用い、ＤＮＡ配列を用いＰＣＲを行い、増幅後、サンガー法により、その配列を決定して遺伝子群を作成した。
正常近位尿細管に発現している遺伝子群と蛋白負荷蛋白尿モデル近位尿細管に発現している遺伝子群の遺伝子情報をコンピュータ上で比較し、発現量が増加もしくは減少した遺伝子群を選択し、お互いに相同性を調べた。相同性はＦＡＳＴＡ法で調べた。プログラムとしては、大久保らが開発したプログラム（Ｏｋｕｂｏ  Ｋ，Ｈｏｒｉ  Ｎ，Ｍａｔｏｂａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｂｙ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＤＮＡ  Ｓｅｑ  ２：１３７−１４４．，１９９１及びＯｋｕｂｏ  Ｋ，Ｈｏｒｉ  Ｎ，Ｍａｔｏｂａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．：Ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２：１７３−１７９．，１９９２）を用い、約９５％の相同性を持つものを同一の遺伝子としてグループ化した。そして、蛋白負荷モデルと正常モデルとの間で少なくとも１．５−２倍程度の発現量の差を認める遺伝子を、ノーザンブロット法やｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法やレーザーマイクロダイセクション・ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により解析し、有為に発現量の変化を確認できたものについての配列情報を集積してデータベース化した。
実施例２：配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ配列を有する遺伝子（ＧＭＦ−Ｂ遺伝子）を用いた評価系
（１）実施例１で得られた遺伝子データベースの中から、蛋白尿モデルの近位尿細管遺伝子情報上、特異的に発現し、かつ発現量の多いクローン（配列番号２００７のＤＮＡ配列を有するもの）について、相同性の検索を行った結果、配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子が、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子に該当するものであることが明らかになった。
（２）正常モデルにおけるＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現分布
正常モデルにおいて知られているＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現分布を図１に示す（Ａｓｇｅｒ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９３より改変）。図１において、縦軸はＧＭＦ−Ｂ遺伝子の相対的発現量を、横軸はどの組織でのデータであるかを示す。図１に示されるように、正常モデルにおいて、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子は、神経系に特異的に発現しており、他の臓器における発現はほとんどみられない。
（３）腎疾患モデルにおけるＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現分布
腎疾患モデルにおける、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現分布を解析するために、配列番号２００７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ配列を有する遺伝子をプローブとして、腎疾患モデルマウスより抽出したｍＲＮＡに対し、ノーザン解析を行った。その結果を図２に示す。
図２において、縦軸は、腎臓におけるＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現量を、横軸は左から正常腎臓・蛋白尿モデルマウスの１週（１ｗｋ）、２週（２ｗｋ）、３週（３ｗｋ）、４週目（４ｗｋ）を示す。この結果、蛋白尿モデル腎臓（腎疾患モデル腎臓）において、該ＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現が増加することが確認された。
（４）ＧＭＦ−Ｂ強制発現における活性型ｐ３８の増加
ＧＭＦ−Ｂ強制発現におけるｐ３８と活性型ｐ３８の蛋白質発現量をウエスタンブロット法により解析した。その結果を図３に示す。ＷＴはコントロールの近位尿細管細胞である。ｐ３８の発現量は、コントロール細胞とＧＭＦ−Ｂ発現系でほとんど差がないが、活性型ｐ３８の発現量は、ＧＭＦ−Ｂ発現系において増加していることが確認された。
（５）ＧＭＦ−Ｂ強制発現近位尿細管細胞におけるＧＭＦ−Ｂと活性型ｐ３８の存在場所
ＧＭＦ−Ｂ強制発現近位尿細管細胞において、ＧＭＦ−Ｂと活性型ｐ３８の存在場所を解析した結果を図４に示す。強制発現したＧＭＦ−Ｂにｆｌａｇと呼ばれるマーカーをつけてＧＭＦ−Ｂを緑色に染色した（図４ａ）。また活性型ｐ３８に対する抗体で赤色に染色した。ＧＭＦ−Ｂ遺伝子産物を強制発現する細胞では通常の近位尿細管培養細胞では認めない活性型ｐ３８の存在を認められた（図４ｂ）。両図を重ね合わせたところ、ＧＭＦ−Ｂと活性型ｐ３８が同じ部分に存在する事が確認された（図４ｃ）。
（６）正常細胞における、Ｆ−アクチンと非活性型ｐ３８の細胞内局在
正常細胞における、Ｆ−アクチンと非活性型ｐ３８の細胞内局在を解析した結果を図５に示す。ロダミンを用いてＦ−アクチンを染色したところ、Ｆ−アクチンは、正常細胞に通常認められるファイバー形成をしていた（図５ａ）。非活性型ｐ３８（非活性型）を抗ｐ３８抗体により染色して調べたところ、通常のように、核内に存在していた（図５ｂ）。両図をかさねると、これら非活性型ｐ３８とＦ−アクチンの細胞内における存在場所は、全く異なっていることが確認された（図５ｃ）。
（７）正常細胞における、Ｆ−アクチンと活性型ｐ３８（ｐ−ｐ３８）の細胞内局在
正常細胞における、Ｆ−アクチンと活性型ｐ３８（ｐ−ｐ３８）の細胞内局在を解析した結果を図６に示す。Ｆ−アクチンをＦＩＴＣラベル抗Ｆ−アクチン抗体により染色して調べたところ、図５と同じパターンの発現が確認された（図６ａ）。活性型ｐ３８（ｐ−ｐ３８）は、通常の近位尿細管培養細胞には認められず、抗ｐ−Ｐ３８抗体により同定しえなかった（図６ｂ）。また、両図をかさねると、Ｆ−アクチンのみが確認された（図６ｃ）。
（８）Ｆ−アクチンの再構築
Ｆ−アクチンの再構築を測定した結果を図７に示す。コントロールとして、正常細胞における、近位尿細管細胞のＦ−アクチンを染色して調べた（図７ａ）。一方、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子を強制発現した同じ細胞系のＦ−アクチンを赤色で染色して調べた（図７ｂ）。その結果、両図の比較で示されるように、ＧＭＦ−Ｂの発現によって、Ｆ−アクチン構造の細胞内構築が変化している（再構築が起っている）ことが確認できた。
（９）ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０の影響
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０の影響を図８に示す。ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞系にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ２０３５８０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ−ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ社、１０３９４  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｏｕｒｔ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２１２１  ＵＳＡ）を加えた。その結果、Ｆ−アクチンの再構築が消失する事が明らかとなった。これによって、Ｆ−アクチンの再構築が、ＧＭＦ−Ｂにより生じた活性型ｐ３８ＭＡＰＫの作用と関係する事が推測された。
（１０）Ｆ−アクチン／活性型ｐ３８／ＧＭＦ−Ｂの細胞内での存在場所の確認
Ｆ−アクチン／活性型ｐ３８／ＧＭＦ−Ｂの細胞内での存在場所を調べた結果を図９に示す。図９に示されるように、ＧＭＦ−Ｂと活性型ｐ３８ＭＡＰＫの細胞内での位置は同じであることが確認された。また、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞におけるＧＭＦ−ＢとＦ−アクチンの細胞内分布を確認するために、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞系において、Ｆ−アクチンを染色し（図９ａ）、ＧＭＦ−Ｂを染色して（図９ｂ）それぞれの位置を調べ、両図を重ね合わせたところ、同じ場所に発現している事が確認された（図９ｃ）。
このことから、ＧＭＦ−Ｂを中心に、これら一連の現象が生じていることが明らかとなった。この事実から、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子の腎障害への関与が示唆された。
（１１）ＧＭＦ−Ｂ遺伝子強制発現細胞系の細胞死の変化
ＧＭＦ−Ｂ遺伝子を強制的に近位尿細管細胞で発現させて（以下、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞系という。）、細胞死（アポトーシス）の変化を調べた。また、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子強制発現系の細胞内の酸化ストレス刺激（例えばＨ２０２刺激のような酸化ストレス刺激）に対する強制発現系の細胞死の変化を調べた（図１０）。左よりアンチセンスＧＭＦ−Ｂ導入細胞、何も遺伝子を導入していない細胞、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を加えた場合のアポトーシス（細胞死）によるＤＮＡの断片化の結果を示す。この結果、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系の細胞死の増強が確認された。また、この細胞死の増強は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）で正常レベルに復帰することがわかった。
次に、細胞死に関わる重要なｃａｓｐａｓｅ３活性を、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系とｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（近位尿細管培養細胞系）、アンチセンスＧＭＦ−Ｂ発現系で測定した。図１１に示されるように、Ｈ２０２刺激によりｃａｓｐａｓｅ３活性はＧＭＦ−Ｂ発現細胞系において著名に誘導された。また、この誘導は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ｃａｓｐａｓｅ３阻害剤によって抑制された。
また、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の早期マーカーである、アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）の細胞膜への結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により同定した（図１２）。この結果、アンチセンスＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞、Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ細胞では、Ｈ２０２刺激により細胞死が増加したが（ピンクのシグナルが少し右に寄る）、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系では細胞死が特に著明におこり、細胞刺激により細胞死がおこりやすくなっていることがわかった。なお、これらの変化はｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）により抑制された（グリーンのライン）。
（１２）ＧＭＦ−Ｂ発現系に対する細胞内の酸化ストレスの影響
また、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系について、Ｈ２０２刺激による細胞内の酸化ストレス（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の時間的変化を調べた。図１３において、縦軸は酸化ストレスをフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により測定した値を、横軸にＨ２０２負荷後の時間を示す。その結果、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系では細胞内の酸化ストレスが遷延することが明らかとなった（黄色のライン）。
また、同様に、細胞内に酸化ストレスを惹起する代表的な因子であるＴＮＦ−ａとアンギオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ）で刺激による酸化ストレスの時間的変化を調べた。結果を図１４に示す。その結果、やはり細胞内の酸化ストレスが遷延することが明らかとなった。これらの結果から、ＧＭＦ−Ｂ発現が、細胞内酸化ストレスの遷延化をもたらすことが示唆された。
実施例３：配列番号８９６に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子（ＴＳＡ−１遺伝子）の機能解析
（１）上記で得られた遺伝子データベースの中から、蛋白尿モデルの近位尿細管遺伝子情報上、特異的に発現し、かつ発現量の多いクローン（配列番号８９６のＤＮＡ配列を有するもの）について、相同性の検索を行った結果、配列番号８９６のＤＮＡ配列を有する遺伝子が、ＴＳＡ−１遺伝子に該当するものであることが明らかになった。
（２）ｃＤＮＡのクローニング
配列番号８９６のＤＮＡ配列を有する遺伝子は蛋白負荷により遺伝子情報上発現量の増加している遺伝子である（図１５Ａ）。最初に、マウスＥＳＴ情報を用いてＤＮＡ配列をできる限り再構築した。次いで、得られたマウスｃＤＮＡ配列を、５’−ＲＡＣＥ法によりタンパク負荷腎臓から構築したｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ全長を得るためのプライマーを作成するために用いた。クローニングするために用いたプライマーは５’−ＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’であった。ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（クローンテック社、米国）は説明どおり使用した。得られたＰＣＲ産物はｐＳＴＢｌｕｅ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、米国）にクローニングされ、ＤＮＡ配列はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、米国）を用いて決定した。ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの為のプローブを準備するためにＳａｂａｔｈらが報告した方法にもとづいてＰＣＲを行った。ＤＮＡ配列はマウス腎臓ｍＲＮＡを基質として作成したｃＤＮＡ配列の５’端と３’端からのプライマーを用いてリバーストランスクリプテーション・ＰＣＲ法によって直接増幅することにより得た。
（３）組織の準備
腎臓はＰＢＳ液で灌流後、ノーザン解析用のｍＲＮＡ回収に使用された。組織学的検討にはＰＢＳついで４％パラフォルムアルデハイド（ＰＦＡ）で灌流後、腎臓を摘出した。サンプルはＰＦＡ固定後、パラフィン包埋法により準備し、免疫染色およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に用いた。
（４）ノーザン解析
マウス腎臓のＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ溶液を用いて回収した。それぞれ１０μｇのＲＮＡはフォルマリン・アガロース・ゲルで分離し、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に移した。膜は６５度で１時間、プレハイブリダイゼーションを行った後、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡラベルキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて３２Ｐ−でラベルしたプローブと一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜は０．１ＸＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ溶液で、６０度１５分で２回洗い、次いで−８０度で一日、増感紙と共にＸ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社、米国）で感光させた。ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡキットで得たｃＤＮＡプローブは、配列を確認した後、使用した。
（５）免疫組織染色
免疫染色はＴＳＡ−１用にモノクローナル抗体ＰＲＳＴ１を用いて行った。切片は室温でＰＲＳＴ１と３０分間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄し、再び、ビオチン化した２次抗体と３０分間反応させた。ＰＢＳでさらに洗浄後、切片は３０分間室温でＶＥＣＴＡＳＴＡＴＩＮ  ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒラボ、米国）を用いて反応させペルオキシダーセ液と４０秒間反応させた。近位尿細管であることは、連続切片をＰＡＳ染色し、刷子縁を確認することで行った。
（６）レーザーマイクロダイセクションによる組織のサンプリング
レーザーマイクロダイセクション用に、腎臓をＰＢＳ、次いで、９９．５％エタノールで灌流し、摘出した。その後、３０％ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳ液で一晩、脱水し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ社、米国）で冷凍し、クリオスタットを用いて、サンプルとした。サンプルはガラススライド上の１．３５μｍの薄いポリエチレン膜（ＰＡＬＭ社、ドイツ）上にマウントした。０．１％ポリ  Ｌ  リジン液を用い、組織が膜に強固につくようにした。膜上にマウントしたサンプルはＨＥ染色液で１０秒、素早く染色し、ＤＥＰＣ処理水で１０秒間洗浄し、９９．５％エタノールで脱水後、ＬＭ２００  Ｉｍａｇｅ  Ａｒｃｈｉｖｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＡＲＣＴＵＲＵＳ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、米国）によるレーザーマイクロダイセクションに供した。切片は、トランスファー用フィルムで覆い、近位尿細管はレーザービームによりフィルムに付し回収した。
（７）ＲＮＡ回収、逆転写反応とｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
ＲＮＡはトランスファー用フィルムについたサンプルからＴＲＩｚｏｌ液を用いて回収された。抽出したＲＮＡは１０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、一本鎖ＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素とランダムプライマーから作成した。産生物はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００機によるｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ用のテンプレートとして使用された。ＴＳＡ−１発現の定量はｒＲＮＡを標準としてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いて行った。ＴａｑＭａｎ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡコントロール試薬はｍＲＮＡ発現の内部コントロールとして用いた。
2003091427.tif 000002
（８）Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＰ）とｔｈｙｍｉｃ  ｓｈａｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＴＳＡ−１）の蛋白尿モデル近位尿細管における発現増加
Ｔ細胞の活性化に関わる２つの遺伝子（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＰ）とｔｈｙｍｉｃ  ｓｈａｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＴＳＡ−１））の発現増加は腎臓ｍＲＮＡを用いたノーザン解析により確認された。このような蛋白尿による遺伝子発現増は、報告されたことが無いものである。ＴＳＰはＴ細胞特異的なＧＴＰ結合蛋白で、Ｔ細胞の分化・活性化に重要な働きをする。ＴＳＡ−１はＬｙ−６ファミリーに属し、やはりＴ細胞の分化・活性化のマーカーとして有用であると考えられている。Ｌｙ−６ファミリー分子は、１０−１８ｋＤａの糖蛋白でＧＰＩアンカーを介して細胞膜にリンクしている。ある研究では、インターフェロンγにより腎臓、特に近位尿細管の管腔則におけるＬｙ−６発現が著明に増加することが示されている。Ｌｙ−６ファミリーの機能はウロキナーゼ型プラスミノゲーゲンａｃｔｉｖａｔｏｒレセプターの様に、レセプターであると推定されている。Ｌｙ−６リガンドの存在が、リンパ球系細胞の表面に報告されている。Ｌｙ−６蛋白は細胞内情報伝達系や細胞接着の過程にある種の機能があると考えられている。ちょうどＴ細胞の活性化や細胞接着に関与するＣＤ５９抗原の様である。これらの知見にもとづき、Ｌｙ−６ファミリー蛋白であるＴＳＡ−１をさらに検討した。ＴＳＡ−１は未分化なＴ細胞や胸腺上皮細胞とともに、リンパ系以外の組織にも発現していることが報告されている。Ｌｙ−６ファミリーは多くの場合、近位尿細管細胞の管腔側に発現が報告されている。ＴＳＡ−１分子の腎臓内における発現を検討するために、モノクローナル抗体、ＰＲＳＴ１を用いた免疫組織学的解析を行った。ＴＳＡ−１の発現は、明らかに蛋白負荷３週後の近位尿細管において細胞の血管側に認められた。一方、コントロールマウスにおいてはその発現は認めなかった。結果を図１６に示す。
ＴＳＡ−１の血管側の発現はＭＨＣクラスＩやＩＩの発現パターンと同様であることは、興味深い。病態モデルにおけるＴＳＡ−１  ｍＲＮＡの発現増加はレーザーマイクロダイセクション・ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により定量的に検討した。ほとんどコンタミネーションなしに近位尿細管のみを収集し、ｍＲＮＡ発現の定量を行う技術で行っている。近位尿細管におけるＴＳＡ−１  ｍＲＮＡ発現レベルは３週間の蛋白負荷によりコントロールにおける約３．８倍に増加していた。ＴＳＡ−１  ｍＲＮＡ発現増はまた、腎臓全体から抽出したｍＲＮＡを用いたノーザン解析から得られた結果とほぼ同じである。
多くのＧＰＩアンカー型蛋白はＴ細胞活性化の制御に関与している。小杉らはＴＳＡ−１の細胞外ドメインが、生理学的にまた、機能的にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の中心分子であるＣＤ３ｚｅｔａと関連することを示している。さらに、ＣｌａｓｓｏｎらはＴＳＡ−１の細胞外ドメインがある種のＴ細胞に結合することを報告しており、ＴＳＡ−１のリガンドがこれらの細胞にあると考えている。これらの報告よりＴＳＡ−１は、Ｔ細胞表面の標的分子と相互作用しうる細胞表面レセプターと推定される。それゆえ、病態モデル近位尿細管におけるＴＳＡ−１の血管側での発現増加は近位尿細管とＴ細胞の直接の相互作用に関わっていることが示唆される。
実施例４：配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子（ＧＳ１８８遺伝子）の機能解析
（１）上記で得られた遺伝子データベースの中から、蛋白尿モデルの近位尿細管遺伝子情報上、特異的に発現し、かつ発現量の多いクローン（配列番号６１のＤＮＡ配列を有するもの）について、相同性の検索を行った結果、配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子が、機能が未知の新規遺伝子であることが明らかになった。
（２）ｃＤＮＡのクローニング
配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子は、蛋白負荷により遺伝子情報上発現量が増加している（図１５Ｂ）。最初にＤＮＡ配列を、マウスＥＳＴ情報を用いて、できる限り再構築した。次いで、得られたマウスｃＤＮＡ配列を、５’−ＲＡＣＥ法により、タンパク負荷腎臓から構築したｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ全長を得るためのプライマーを作成するのに用いた。
クローニングするのに用いた配列は５’−ＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧＡＧ−３’である。増幅キットとしては、ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（クローンテック社、米国）を使用した。得られたＰＣＲ産物はｐＳＴＢｌｕｅ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、米国）にクローニングされ、ＤＮＡ配列はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、米国）を用いて決定した。ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの為のプローブを準備するためにＳａｂａｔｈらが報告した方法にもとづいてＰＣＲを行った。ＤＮＡ配列はマウス賢臓ｍＲＮＡを基質として作成したｃＤＮＡ配列の５’端と３’端からのプライマーを用いてリバーストランスクリプテーション・ＰＣＲ法によって直接増幅することにより得た。
（３）組織の準備
腎臓はＰＢＳ液で灌流後、ノーザン解析用のｍＲＮＡ回収に使用された。組織学的検討にはＰＢＳついで４％パラフォルムアルデハイド（ＰＦＡ）で灌流後、腎臓を摘出した。サンプルはＰＦＡ固定後、パラフィン包埋法により準備し、免疫染色およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイセーション法に用いた。
（４）ノーザン解析
マウス腎臓のＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ溶液をもちいて回収した。それぞれ１０μｇのＲＮＡはフォルマリン・アガロース・ゲルで分離され、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に移された。膜は６５度で１時間、プレハイブリダイゼーションを行った後、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡラベルキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて３２Ｐ−でラベルしたプローブと一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜は０．１ＸＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ溶液で６０度１５分で２回洗い、次いで−８０度で一日、増感紙と共にＸ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社、米国）で感光させた。ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡキットで得たｃＤＮＡプローブは、配列を確認した後使用した。
（５）Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＰＣＲ反応はＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に、配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子のセンス或いはアンチセンスｃＲＮＡプローブを作成するのに用いた。ＰＣＲプライマーは５’−ＴＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡ−３’と５’−ＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＡＴＡＧＣＴ−３’である。ＰＣＲ産物はｐＳＴＢｌｕｅ−１にクローニング後、ＤＮＡ配列を確認した。クローニングしたサンプルをアンチセンス用にＸｈｏＩでセンス用にＢａｍＨＩで切断した。ＤＩＧ標識したアンチセンスｃＲＮＡプローブは１μｇのテンプレイトからＴ７かＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼをＤＩＧ  ＲＮＡラベルキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて作成した。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはＤＮＡ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ）を用いて行った。
（６）レーザーマイクロダイセクションによる組織のサンプリング
レーザーマイクロダイセクション用には、腎臓はＰＢＳと次いで、９９．５％エタノールで灌流し、摘出した。その後、３０％ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳ液で一晩脱水し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ社、米国）で冷凍し、クリオスタットを用いて、サンプルとした。サンプルはガラススライド上の１．３５μｍの薄いポリエチレン膜（ＰＡＬＭ社、ドイツ）上にマウントした。０．１％ポリ  Ｌ  リジン液を組織が膜に強固につくように用いた。膜上にマウントしたサンプルはＨＥ染色液で１０秒、素早く染色し、ＤＥＰＣ処理水で１０秒間洗浄し、９９．５％エタノールで脱水後、ＬＭ２００  Ｉｍａｇｅ  Ａｒｃｈｉｖｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＡＲＣＴＵＲＵＳ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、米国）によるレーザーマイクロダイセクションに供した。切片はトランスファー用フィルムで覆い、近位尿細管はレーザービームによりフィルムに付けて回収した。
（７）ＲＮＡ回収、逆転写反応とｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
ＲＮＡはトランスファー用フィルムについたサンプルからＴＲＩｚｏｌ液を用いて回収された。抽出したＲＮＡは１０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、一本鎖ＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素とランダムプライマーから作成した。産生物はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００機によるｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ用のテンプレートとして使用した。配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量はｒＲＮＡを標準としてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いて行った。ＴａｑＭａｎ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡコントロール試薬はｍＲＮＡ発現の内部コントロールとして用いた。
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（８）蛋白尿モデルにおける配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現増加
遺伝子情報より近位尿細管特異的な発現がありかつ蛋白尿により発現増加する遺伝子である、配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子を選択し、さらに検討を加えた。マウスｃＤＮＡを得るため、５’ＲＡＣＥ用のプライマーを準備した。マウスｃＤＮＡの５’部分がいくつか得られ、ＤＮＡ配列を決定した。マウスの配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子の全長は約１．１ｋｂで７３２塩基の２４４アミノ酸をコードする部分を含んでいる。計算より、その分子量は約２６．６ｋＤａと推定される。翻訳開始領域はＫｏｚａｋ配列類似している。さらに、疎水性の解析から、該遺伝子がコードする蛋白は４つの強い疎水領域を持つことが明らかとなり、膜蛋白であることが示唆された（図１７参照）。該蛋白質のアミノ酸配列を用いた類似性検索をＧｅｎＢａｎｋのデータを用いＦＡＳＴＡ解析により行った。結果、ヒト肝細胞癌関連抗原、マウスＣｌａｓｔ１、マウスおよびヒトＬＲ８などが類似している事が明らかとなった。ＬＲ８の報告されているアミノ酸配列よりの疎水性解析結果は配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子がコードする蛋白質のものと、よく似ていた。マウスＬＲ８は２６３アミノ酸をコードする７８９ベースの蛋白コード領域を持っている。ＬＲ８  ｍＲＮＡ発現は線維芽細胞に限局しており、線維芽細胞のマーカーとして有用であると報告されている。該蛋白質発現の組織分布を見るため、ノーザン解析を行った。該蛋白質は、マウス腎、肺、脾に主な発現が認められ、その大きさはおよそｃＤＮＡから得られたものと同様であった。肺と脾は我々の遺伝子解析情報データに無いが、心・脳・骨格筋では発現はほとんど確認されていない。該遺伝子ｍＲＮＡの腎臓における発現部位を同定するため、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。その発現は蛋白尿に３週間さらされることで、近位尿細管に主に発現していた。病態モデルにおける遺伝子の発現をレーザーマイクロダイセクション法により定量した。この結果により、該遺伝子ｍＲＮＡは近位尿細管において３週の蛋白負荷後、正常コントロールの約５．９倍に増加していることが示された。マウスとヒトのゲノムプロジェクトの結果から、マウスにおける配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子はマウス染色体６番に、ヒトの配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子はヒト染色体７ｑ３６にあることを見出した。ヒトにおいてもマウスにおいてもＬＲ８遺伝子は配列番号６１のＤＮＡ配列を有する遺伝子の極めて近傍にあった。エクソン−イントロ解析からヒトとマウス配列番号６１の配列を有する遺伝子の遺伝子構造はほとんど同じであった。２つの遺伝子（ＬＲ８と配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子）は反対方向にあり、最初のイントロン内に５’非翻訳域を重なって持っている。これらの知見は配列番号６１に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子とＬＲ８遺伝子が極めて類似したものであることを示すものである。
実施例５：Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ５発現系を用いた評価
（１）免疫関連腎疾患遺伝子群のｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
マウス由来の腎近位尿細管細胞ｍＰｒｏｘ２４を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２媒体で培養した。そして、ＩＦＮ−６γによるＳｔａｔ系の活性の変化と遺伝子発現を調べた。その結果、インターフェロンγにより誘導される遺伝子が免疫関連遺伝子群に多くみられることがわかった。また、インターフェロンγによるＳｔａｔ系の活性変化が確認された。この知見に基づいて、Ｓｔａｔ系のシグナル伝達がタンパク負荷で活性化するのではないかと考え、更に、以下の実験を行った。
（２）免疫沈降およびウェスタンブロット法
培養細胞を無血清培地で２４時間培養した後、アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を５分から１時間、加え刺激した。処理後、氷冷ＰＢＳ（１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４を加えた）で３回洗浄し溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ４０，０．２５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１ｍＭ  ＮａＦ）にて１時間回転溶解した。遠心後、上清を使用した。ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５それぞれの抗体と２時間氷上にて静置後、常法に従いプロティンＡアガロースを用いて免疫沈降物を回収した。
ＳＤＳゲル泳動後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（アマシャム社、英国）にトランスファーし、ウエスタンブロットを行い、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社、米国）によりシグナルを同定した。その結果を図１８に示す。図１８において、上段はＳＴＡＴ１、中段はＳＴＡＴ３、下段はＳＴＡＴ５を示す。また、Ｐ−ＳＴＡＴ１はリン酸化された活性型を、ＳＴＡＴ１は同蛋白の非活性型を含むバンドを示す。
図１８に示されるように、アルブミン添加１５分以内に腎近位尿細管細胞でＳＴＡＴ１とＳＡＴＡＴ５の早期活性化が確認された。またＳＴＡＴ３は１５分後に一度活性化が減少し再びコントロールレベルまで復する２相性の変化を示した。
また、酸化スカベンジャーであるＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）を添加する事によりアルブミン添加によるＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ５の活性化（リン酸化）は抑制されることが明らかとなった。その結果を図１９に示す。このことから、アルブミン添加によるＳＴＡＴ１／５の活性化は酸化ストレスが関与することがわかった。
（３）ゲルシフト法（ＥＭＳＡ）
核蛋白を抽出し、下記ダブルストランドオリゴＤＮＡを用いてＰａｎｏｍｉｃｓ’  ＥＭＳＡキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社、米国）によりｎｏｎ−ＲＩ法にて行った。コンペティションアッセイは１００倍濃度の標識をしていない同じ配列のダブルストランドオリゴＤＮＡを用いた。
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５μｇの核蛋白とビオチンラベルしたプローブと１μｇ／μｌのポリｄＩ−ｄＣとバァッファー（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５ｍＭ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ，５ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３０分混合した後、６％ポリアクリルアミド・ゲル（０．２５％グリセロール入り）を０．５Ｘ  Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＥ）にて３時間２００Ｖで泳動した。その後、ナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｂ；Ｐａｌｌ，ＮＹ，ＵＳＡ）に２時間２００ｍＡにてトランスファーした。
シグナルはＰｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて同定した。スーパーシフト・アッセイはあらかじめ抗体と上記反応液を混合した後、同様にシグナルを得た。
図２０にＥＭＳＡ（ゲルシフトアッセイ）の結果を示す。ＳＴＡＴは転写因子として機能しているため結合配列とのＥＭＳＡにより活性を調べた。これにより、アルブミン添加１５分以内のＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ５の活性化が確認され、ＮＡＣ添加により活性が失われる事がわかった。
（４）ＤＣＦＨ−ＤＡ法を用いたｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳ）解析
細胞内の酸化ストレスは細胞を３０μＭの２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）と無血清培地において１時間３７度で培養後、種々のストレスを加えた。細胞はトリプシンで処理・収集し、蛍光はｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）にて解析した。図２１にＦＡＣＳ（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ）による細胞内酸化ストレスを調べた結果を示す。アルブミン負荷はＨ２０２刺激と同様に細胞内の酸化ストレスを増加させ（グラフが右にシフトしている）、ＮＡＣを加えることによりその増加が抑制されることが確認された。このことから、アルブミン添加後のＳＴＡＴ系の活性化には、酸化ストレスが関与していることが示唆された。
以上のように、ウェスタンブロット法、ゲルシフト法を用いた実験により、蛋白負荷により、賢近位尿細管細胞のＳＴＡＴ１／５が早期に活性化することが確認された。また、この活性化は、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）によって阻害されることが確認された。
また、ＤＣＦＨ−ＤＡ法を用いたＦＡＣＳ解析より、蛋白負荷を受けた腎近位尿細管細胞は酸化ストレスを受けており、この酸化ストレスはＮＡＣにより阻害されることが確認された。
実施例６：腎疾患モデルトランスジェニックマウス
ＧＭＦ−Ｂ遺伝子の翻訳開始付近点からポリＡ尾部まで付着する部分の遺伝子を、制限酵素部位（ＥｃｏＲ１）を付加させたプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって増幅した。これをＰＣＲフラグメント挿入用の市販ベクターに挿入し、配列を確認した。（ＦＬＡＧ−ＧＭＦ−Ｂ）。ＦＬＡＧ−ＧＭＦ−Ｂを制限酵素を用いて切断し、チキンβ−アクチン（Ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）プロモーター領域が挿入されたベクターに組み込み、プロモーターの下流にＧＭＦ−Ｂ遺伝子を挿入したプラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＦＬＡＧ−ＧＭＦ−Ｂを作成した（図２２）。制限酵素部位で切断することでＣｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎプロモーターの下流にＧＭＦ−Ｂ遺伝子を配置したＤＮＡフラグメントを取り出した。ＤＮＡフラグメントはマイクロインジェクション法によりマウス（系統；Ｃ５７Ｂ／６）の前核期卵に導入した。胚が正常な形態を示したものを、仮腹マウスに移植し、マウスを誕生させた。誕生したマウスの尻尾からゲノムＤＮＡを抽出、ＰＣＲ法によって、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子がゲノム中に挿入されているかを確認した結果、数匹のトランスジェニックマウスが確認された。更に、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子を腎臓特異的に高発現しているトランスジェニックマウスが、正常マウスと同様な行動をとり、繁殖能力も備わっていることもわかった。
産業上の利用の可能性
本発明の腎疾患関連遺伝子群は、進行性腎障害において主な障害を担うと考えられる近位尿細管において、特異的に発現・変化している遺伝子群に絞って構築されたものである。従って、本発明の腎疾患関連遺伝子群並びに該遺伝子群から得られる情報を活用すれば、腎疾患診断乃至治療薬有効成分の候補物質を効率良く探索することができる。また腎疾患の解析を効率よくかつ的確に行うことが可能である。また腎疾患の診断や腎疾患の発症や進行の機序などをより正確に調べることができる。
また、本発明の腎疾患関連遺伝子群は、新規な遺伝子や腎疾患での発現が確認されていなかった種々の遺伝子を含んでおり、新規な医薬や、従来とは作用経路又は効能が異なる腎疾患関連医薬の開発に有効に利用し得るものである。
更に、本発明の腎疾患関連遺伝子群は、特定の機能を有する遺伝子群に分類されており、各種病態や疾患との関係をより特定して効率よく解析することが可能になる。
例えば、本発明の腎疾患関連遺伝子群に関する患者の遺伝子発現を適宜モニタニングすることなどにより、患者の疾患の種類や進行度をより正確に選定することが可能になる。また、治療が必要な患者に対しては、より適切な治療法を選定することが可能になり、治療の質も向上させる。
このように、本発明は、腎疾患の診断乃至治療に極めて有効な手段を提供するものである。
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【図面の簡単な説明】
図１は、正常モデルにおいて知られているＧＭＦ−Ｂ遺伝子の発現分布を示す図面である。図１において、縦軸はＧＭＦ−Ｂ遺伝子の相対的発現量を、横軸はどの組織でのデータであるかを示す。
図２は、腎疾患モデルマウス腎臓におけるＧＭＦ−Ｂ遺伝子発現の推移を示す図面である。
図３は、ＧＭＦ−Ｂ強制発現により活性型ｐ３８が増加することを示す図面である。ｐ３８と活性型ｐ３８の蛋白量をウエスタンブロットで示している。ＷＴはコントロールの近位尿細管細胞を示す。
図４は、ＧＭＦ−Ｂ強制発現近位尿細管細胞におけるＧＭＦ−Ｂと活性型ｐ３８の存在場所を示す図面である。
図５は、Ｆ−アクチンとｐ３８の細胞内局在を示す図面である。
図６は、Ｆ−アクチンと活性型ｐ３８（ｐ−ｐ３８）の細胞内局在を示す図面である。
図７は、Ｆ−アクチンの構築の変化を示す図面である。
図８は、Ｆ−アクチンの再構築がｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０を加える事により、消失することを示す図面である。
図９は、ＧＭＦ−Ｂ強制発現細胞におけるＧＭＦ−ＢとＦ−アクチンの細胞内分布を示す図面である。
図１０は、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子強制発現系の細胞内の酸化ストレス刺激に対する強制発現系の細胞死の変化を調べた図面である。ａｎｔｉ  ＧＭＦはアンチセンスＧＭＦ−Ｂを発現させた事を示す。ＷＴは通常の近位尿細管細胞（ｍＰｒｏｘ２４）を示す。ＧＭＦはＧＭＦ−Ｂを発現させた事を示す（ＧＭＦ−Ｂを強制的に発現させた細胞での結果を示す。）ＧＭＦ＋ＳＢ２０３５８０はＧＭＦ−Ｂ発現細胞にｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０を作用させたものを示す。ＧＭＦ＋Ｃａｓｐａｓｅ  ３  ＩｎｈｉｂｉｔｏｒはＧＭＦ−Ｂ発現細胞にｃａｓｐａｓｅ３阻害剤を作用させたものを示す。ＭＡＲＫＥＲはマーカーを示す。図１１も同様に示す。
図１１は、細胞死に関わる重要なｃａｓｐａｓｅ３活性を、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系とｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（近位尿細管培養細胞系）、アンチセンスＧＭＦ−Ｂ発現系で測定した結果を示す図面である。
図１２は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の早期マーカーであるアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）の細胞膜への結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により同定した結果を示す図面である。
図１３は、ＧＭＦ−Ｂ強制発現系について、Ｈ２０２刺激による細胞内の酸化ストレス（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の時間的変化を調べた結果を示す図面である。図１３において、縦軸は酸化ストレスをフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により測定した値を、横軸はＨ２０２負荷後の時間を示す。
図１４は、細胞内に酸化ストレスを惹起する代表的な因子であるＴＮＦ−ａとアンギオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ）で刺激による酸化ストレスの時間的変化を調べた結果を示す図面である。
図１５（Ａ）は、腎疾患モデルマウス腎臓における配列番号８９６に記載の遺伝子の発現の推移を示す図面である。図１５（Ｂ）は配列番号６１に記載の遺伝子の発現の推移を示す図面である。
図１６は、腎臓におけるＴＳＡ−１遺伝子の免疫組織化学的解析の結果を示す図面である。
図１７は、配列番号６１に記載の塩基配列を有する遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列（Ａ）と疎水性の解析結果（Ｂ）を示す図面である。
図１８は、蛋白負荷した腎近位尿細管細胞でのＳＴＡＴ１とＳＡＴＡＴ５の早期活性化を示す図面である。
図１９は、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）を添加する事によりアルブミン添加によるＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ５の活性化（リン酸化）が抑制された結果を示す図面である。
図２０は、ＥＭＳＡ（ゲルシフトアッセイ）の結果を示す図面である。図２０において、ＣｏｎはＣｏｎｔｒｏｌ（コントロール）、ＡｌｂはＡｌｂｕｍｉｎ（アルブミン）添加、ＣｏｍはＣｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ（コンペティション）、ＳＳはＳｕｐｅｒＳｉｆｔ（スーパーシフト）を示す。
図２１は、ＦＡＣＳ（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ）による細胞内酸化ストレスを調べた結果を示す図面である。
図２２は、ＧＭＦ−Ｂ遺伝子を用いて作成した腎疾患モデルトランスジェニックモデルマウスのコンストラクトを示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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