(57)【要約】動脈硬化性疾患の発症しやすさや、進行しやすさ等を動脈硬化性疾患危険度として正確に判定でき、動脈硬化の予防および治療に利用できる動脈硬化性疾患危険度判定方法、該危険度の判定等に用いられる、遺伝子多型分析用キットおよび動脈硬化性疾患危険度判定装置等を提供することを課題とする。複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該遺伝子多型の遺伝子型から、遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程を含み、前記複数の遺伝子多型の組合せの少なくとも一つが、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該遺伝子多型の遺伝子型から、遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程を含み、
前記複数の遺伝子多型の組合せの少なくとも一つが、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項２】
複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度が、該組合せと頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有するか否かで設定される請求の範囲第１項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項３】
複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度が、該組合せと頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する頻度のオッズ比で設定される請求の範囲第１項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項４】
複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度が、頚動脈内膜中膜肥厚度増加量で設定される請求の範囲第１項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項５】
複数の遺伝子多型の、組合せが、下記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを含む請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
2003087360.tif 000022
2003087360.tif 000023
2003087360.tif 000024
2003087360.tif 000025
表１−１から表１−４中、「番号」は下記表２−１から表２−２中の同一番号の遺伝子多型を表し、「分類」の番号は遺伝子多型の遺伝子型のうち、組合せの対象となった遺伝子型を表し、１は表２−１から表２−２中の遺伝子多型名において左側に現される多型のホモを、２はヘテロを、３は、右側に現される多型のホモを現し、１  ２は前記１と２とをまとめた遺伝子型、２  ３は前記２と３とをまとめた遺伝子型を表す。
2003087360.tif 000026
2003087360.tif 000027
【請求項６】
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が１５％以下となるように、
複数の遺伝子多型の組合せが選択される請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項７】
動脈硬化疾患例集団および非動脈硬化疾患例集団が、いずれも糖尿病患者であって、心筋梗塞病歴がない集団である請求の範囲第６項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項８】
複数の遺伝子多型の組合せが、２から５個の少なくともいずれかの遺伝子多型の組合せである請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項９】
複数の遺伝子多型の組合せが、少なくとも３個の遺伝子多型からなる請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１０】
複数の遺伝子多型の組合せが、下記のａ）からｌ）のいずれかの群に属する少なくとも二つの遺伝子多型を含む請求の範囲第１項から第９項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
【請求項１１】
血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型と、レニン・アンギオテンシン系に関連する遺伝子多型群、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）に関連する遺伝子多型群、および、脂質に関連する遺伝子多型群の少なくともいずれかに属する遺伝子多型とを少なくとも含む請求の範囲第１０項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１２】
血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型が、ＰＡＩ−１遺伝子に関連する遺伝子多型である請求の範囲第１１項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１３】
レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型が、ＡＣＥ遺伝子に関連する遺伝子多型である請求の範囲第１１項および第１２項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１４】
脂質に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型が、ＨＵＭＰＯＭＡ遺伝子に関連する遺伝子多型である請求の範囲第１２項および第１３項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１５】
環境因子に固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該環境因子の情報から該環境因子による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程をさらに含む、請求の範囲第１項から第１４項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１６】
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該頚動脈内膜中膜複合体肥厚度から頚動脈内膜中膜複合体肥厚度による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程をさらに含む請求の範囲第１項から第１５項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１７】
動脈硬化性疾患危険度判定方法が、複数の危険度決定工程を有し、該危険度決定工程ごとに求められる動脈硬化危険度を総合して動脈硬化性疾患危険度を算出する動脈硬化性疾患危険度算出工程を含む請求の範囲第１項から第１６項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１８】
被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程を、顕在化工程前にさらに含む請求の範囲第１項から第１７項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項１９】
被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程と、複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度に基づき、前記検出工程で検出された被験対象の遺伝子多型の遺伝子型から、遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程とを含み、
前記複数の遺伝子多型の少なくとも一の組合せが、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度測定方法。
【請求項２０】
被験対象の遺伝子多型のうち、動脈硬化関連遺伝子多型セットにかかる複数の遺伝子多型の遺伝子型を選択的に明らかにすることにより、該被験対象の遺伝子多型における動脈硬化関連遺伝子多型セットを顕在化させる顕在化工程を含み、
該動脈硬化関連遺伝子多型セットが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せであり、動脈硬化性疾患関連因子であることを特徴とする動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２１】
顕在化工程が、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当するか否かにより表される請求の範囲第２０項に記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２２】
顕在化工程が、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当する場合に、動脈硬化関連遺伝子多型セットに固有の、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する頻度のオッズ比により表される請求の範囲第２０項に記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２３】
顕在化工程が、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当する場合に、動脈硬化関連遺伝子多型セットに固有の頚動脈内膜中膜肥厚度増加量により表される請求の範囲第２０項に記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２４】
動脈硬化関連遺伝子多型セットが、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを含む請求の範囲第２０項から第２３項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２５】
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを有する例が１５％以下となるように、
動脈硬化関連遺伝子多型セットが選択される請求の範囲第２０項から第２４項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２６】
動脈硬化疾患例集団および非動脈硬化疾患例集団が、いずれも糖尿病患者であって、心筋梗塞病歴がない集団である請求の範囲第２５項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法。
【請求項２７】
動脈硬化関連遺伝子多型セットが、２から５個の少なくともいずれかの遺伝子多型からなる請求の範囲第２０項から第２６項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２８】
動脈硬化関連遺伝子多型セットが、少なくとも３個の遺伝子多型からなる請求の範囲第２０項から第２７項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項２９】
動脈硬化関連遺伝子多型セットが、下記のａ）からｌ）のいずれかの群に属する少なくとも二つの遺伝子多型を含む請求の範囲第２０項から第２８項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
【請求項３０】
被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程を顕在化工程前にさらに含む請求の範囲第２０項から第２９項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法。
【請求項３１】
上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型について、被験対象の遺伝子型を検出する工程を含み、
検出結果が動脈硬化性疾患危険度判定のために用いられることを特徴とする遺伝子多型検出方法。
【請求項３２】
上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型を含む遺伝子マーカー。
【請求項３３】
上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対あるいは遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含み、少なくとも一の表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットを検出することを特徴とする遺伝子多型分析用キット。
【請求項３４】
動脈硬化関連遺伝子多型セットが少なくとも３個の遺伝子多型を含むものである請求の範囲第３３項に記載の遺伝子多型分析用キット。
【請求項３５】
表２−１から表２−２中に記載の遺伝子多型から選択された少なくとも２個の遺伝子多型の遺伝子多型検出用プライマーおよびプローブの少なくともいずれかを有し、
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも０．２ｍｍ以上厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、該選択された遺伝子多型で構成され得る上記表２−１から表２−２中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せを少なくとも一つ有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、１５％以下となる請求の範囲第３３項および第３４項のいずれかに記載の遺伝子多型分析用キット。
【請求項３６】
表２−１から表２−２中に記載の遺伝子多型から選択された少なくとも２個の遺伝子多型についての遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブを有し、
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも０．２ｍｍ以上厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、該選択された遺伝子多型で構成され得る上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せを有する例が５０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、１５％以下となる請求の範囲第３３項から第３５項のいずれかに記載の遺伝子多型分析用キット。
【請求項３７】
複数の遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブが下記のａ）からｌ）の互いに異なるいずれかの群に属する請求の範囲第３３項から第３６項のいずれかに記載の遺伝子多型分析用キット。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
【請求項３８】
上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型の、遺伝子多型検出用プローブを有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイ。
【請求項３９】
コンピューターを利用した動脈硬化性疾患危険度判定装置であって、複数の遺伝子多型の、組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の複数の遺伝子多型の組合せと、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける複数の遺伝子多型の組合せとを照合し、一致する遺伝子多型の組合せがある場合に、該遺伝子多型の組合せに対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とを有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４０】
複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として１単位を対応させたものである請求の範囲第３９項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４１】
複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比を対応させたものである請求の範囲第３９項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４２】
複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加を対応させたものである請求の範囲第３９項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４３】
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子多型の組合せであることが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比が一定以上であること、および、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の平均値に有意差があることの少なくともいずれかにより定義される請求の範囲第３９項から第４２項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４４】
環境因子の有無または数値と、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の環境因子の有無または数値と、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける環境因子の有無または数値とを照合し、該環境因子の有無または数値に対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とをさらに有する請求の範囲第３９項から第４３項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４５】
動脈硬化性疾患危険度判定装置が複数の検出手段を有し、前記複数の検出手段から検出された複数の頚動脈危険度の加算値に基づき動脈硬化性疾患危険度を判定する判定手段をさらに有する請求の範囲第３９項から第４４項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４６】
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度と、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度と、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度とを照合し、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とをさらに有する請求の範囲第３９項から第４５項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４７】
前記検出手段から検出された頚動脈危険度および複数の前記抽出手段から抽出された頚動脈危険度の加算値のいずれかと、入力された、被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との加算値に基づき動脈硬化性疾患危険度を判定する判定手段をさらに有する請求の範囲第３９項から第４６項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４８】
被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度を測定して、前記頚動脈内膜中膜複合体肥厚度を前記コンピューターに供給する血管膜圧測定手段を含む請求の範囲第３９項から第４７項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置。
【請求項４９】
複数の遺伝子多型の、組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルをコンピューターに記憶させ、
該コンピューターを、入力された、被験対象の複数の遺伝子多型の組合せと、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける複数の遺伝子多型の組合せとを照合し、一致する遺伝子多型の組合せがある場合に、該遺伝子多型の組合せに対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段として機能させることを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定プログラム。
【請求項５０】
複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として１単位を対応させたものである請求の範囲第４９項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラム。
【請求項５１】
複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比を対応させたものである請求の範囲第４９項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラム。
【請求項５２】
複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加を対応させたものである請求の範囲第４９項に記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラム。
【請求項５３】
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せであることが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比が一定以上であること、および、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の平均値に有意差があることの少なくともいずれかにより定義される請求の範囲第４９項から第５２項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラム。
【請求項５４】
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、動脈硬化危険度を少なくとも１単位有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、動脈硬化危険度を少なくとも１単位有する例が１５％以下となる、
請求の範囲第４９項から第５３項のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動脈硬化性疾患危険度の判定に関し、より詳しくは動脈硬化の予防、治療および診断に利用できる動脈硬化性疾患危険度判定方法、動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法、動脈硬化性疾患危険度測定方法、遺伝子多型検出方法、遺伝子マーカー、遺伝子多型分析用キット、動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイ、動脈硬化性疾患危険度判定装置および動脈硬化性疾患危険度判定プログラムに関する。
背景技術
動脈硬化性疾患（虚血性心疾患）の発症には、高血圧、糖尿病、高脂血症、肥満、喫煙などの環境要件が、危険因子として関係することが知られているが、家族歴もまた、危険因子の一つであり、近年の分子生物学的手法の発展により、動脈硬化に関係する遺伝子上に存在する種々の遺伝子多型が明らかになっており、疾病への関与が研究されている。
このような疾病に関与する遺伝子多型を危険因子として、被験対象の遺伝子多型の遺伝子型等の情報から、疾病になりやすさや、進行しやすさ等のいわゆる動脈硬化性疾患危険度が判定できれば、危険度の高い被験対象は早期に日常から疾病の予防に心がけることができるし、発症後の進行度なども予測することができ、よりきめ細かい診断および治療に役立てることができる。
しかし、動脈硬化疾患においてこれまで報告されてきたＳＮＰを含む遺伝子多型の臨床関連研究においては、単一の遺伝子多型を調べて、該遺伝子多型について一の遺伝子型の集団と、他の遺伝子型の集団とにおいてそれぞれ、心筋梗塞患者と健常者との割合を調べることにより、心筋梗塞になりやすさのオッズ比を算出している。このような調査方法では、ほとんどの多型は有意差がなく、遺伝子多型から疾病のなりやすさや、進行しやすさ等の危険度を予測することはできなかった。
（非特許文献）  Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｉｚａｗａ  Ｈ，Ｉｃｈｉｈａｒａ  Ｓ，Ｔａｋａｔｓｕ  Ｆ，Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｈ，Ｈｉｒａｙａｍａ  Ｈ，Ｓｏｎｅ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ｍ，Ｙｏｋｏｔａ  Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅｓ．
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００２；３４７（２４）：１９１６−２３
発明の開示
本発明は、従来における動脈硬化性疾患の危険度の判定に関する問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。すなわち、動脈硬化性疾患の発症しやすさや、進行しやすさ等を動脈硬化性疾患危険度として正確に判定でき、動脈硬化の予防および治療に利用できる動脈硬化性疾患危険度判定方法、該危険度の判定等に用いられる動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法、動脈硬化性疾患危険度測定方法、遺伝子多型検出方法、遺伝子マーカー、遺伝子多型分析用キット、動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイ、動脈硬化性疾患危険度判定装置および動脈硬化性疾患危険度判定プログラムを提供することを目的とする。
本発明者らは、多数の遺伝子多型について、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との関係を定量的に解析し、さらに、複数の該遺伝子多型が組み合わさった場合に、前記頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に相加的または相乗的に有意な影響を与えるとの知見を得た。
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
＜１＞  複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該遺伝子多型の遺伝子型から、遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程を含み、
前記複数の遺伝子多型の組合せの少なくとも一つが、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜２＞  複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度が、該組合せと頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有するか否かで設定される前記＜１＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜３＞  複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度が、該組合せと頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する頻度のオッズ比で設定される前記＜１＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜４＞  複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度が、頚動脈内膜中膜肥厚度増加量で設定される前記＜１＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜５＞  複数の遺伝子多型の、組合せが、下記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを含む前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
2003087360.tif 000002
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表１−１から表１−４中、「番号」は下記表２−１から表２−２中の同一番号の遺伝子多型を表し、「分類」の番号は遺伝子多型の遺伝子型のうち、組合せの対象となった遺伝子型を表し、１は表２−１から表２−２中の遺伝子多型名において左側に表される多型のホモを、２はヘテロを、３は、右側に表される多型のホモを表し、１  ２は前記１と２とをまとめた遺伝子型、２  ３は前記２と３とをまとめた遺伝子型を表す。
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＜６＞  頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が１５％以下となるように、
複数の遺伝子多型の組合せが選択される前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜７＞  動脈硬化疾患例集団および非動脈硬化疾患例集団が、いずれも糖尿病患者であって、心筋梗塞病歴がない集団である前記＜６＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜８＞  複数の遺伝子多型の組合せが、２から５個の少なくともいずれかの遺伝子多型の組合せである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜９＞  複数の遺伝子多型の組合せが、少なくとも３個の遺伝子多型からなる前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１０＞  複数の遺伝子多型の組合せが、下記のａ）からｌ）のいずれかの群に属する少なくとも二つの遺伝子多型を含む前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
＜１１＞  血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型と、レニン・アンギオテンシン系に関連する遺伝子多型群、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）に関連する遺伝子多型群、および、脂質に関連する遺伝子多型群の少なくともいずれかに属する遺伝子多型とを少なくとも含む前記＜１０＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１２＞  血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型が、ＰＡＩ−１遺伝子に関連する遺伝子多型である前記＜１１＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１３＞  レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型が、ＡＣＥ遺伝子に関連する遺伝子多型である前記＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１４＞  脂質に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型が、ＨＵＭＰＯＭＡ遺伝子に関連する遺伝子多型である前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１５＞  環境因子に固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該環境因子の情報から該環境因子による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程をさらに含む、前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１６＞  頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該頚動脈内膜中膜複合体肥厚度から頚動脈内膜中膜複合体肥厚度による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程をさらに含む前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１７＞  動脈硬化性疾患危険度判定方法が、複数の危険度決定工程を有し、該危険度決定工程ごとに求められる動脈硬化危険度を総合して動脈硬化性疾患危険度を算出する動脈硬化性疾患危険度算出工程を含む前記＜１＞から＜１６＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１８＞  被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程を、顕在化工程前にさらに含む前記＜１＞から＜１７＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜１９＞  被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程と、
複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度に基づき、前記検出工程で検出された被験対象の遺伝子多型の遺伝子型から、遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程とを含み、
前記複数の遺伝子多型の少なくとも一の組合せが、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度測定方法である。
＜２０＞  被験対象の遺伝子多型のうち、動脈硬化関連遺伝子多型セットにかかる複数の遺伝子多型の遺伝子型を選択的に明らかにすることにより、該被験対象の遺伝子多型における動脈硬化関連遺伝子多型セットを顕在化させる顕在化工程を含み、
該動脈硬化関連遺伝子多型セットが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せであり、動脈硬化性疾患関連因子であることを特徴とする動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２１＞  顕在化工程が、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当するか否かにより表される前記＜２０＞に記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２２＞  顕在化工程が、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当する場合に、動脈硬化関連遺伝子多型セットに固有の、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する頻度のオッズ比により表される前記＜２０＞に記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２３＞  顕在化工程が、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当する場合に、動脈硬化関連遺伝子多型セットに固有の頚動脈内膜中膜肥厚度増加量により表される前記＜２０＞に記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２４＞  動脈硬化関連遺伝子多型セットが、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを含む前記＜２０＞から＜２３＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２５＞  頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを有する例が１５％以下となるように、
動脈硬化関連遺伝子多型セットが選択される前記＜２０＞から＜２４＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２７＞  動脈硬化疾患例集団および非動脈硬化疾患例集団が、いずれも糖尿病患者であって、心筋梗塞病歴がない集団である前記＜２５＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定方法である。
＜２７＞  動脈硬化関連遺伝子多型セットが、２から５個の少なくともいずれかの遺伝子多型からなる前記＜２０＞から＜２６＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２８＞  動脈硬化関連遺伝子多型セットが、少なくとも３個の遺伝子多型からなる前記＜２０＞から＜２７＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜２９＞  動脈硬化関連遺伝子多型セットが、下記のａ）からｌ）のいずれかの群に属する少なくとも二つの遺伝子多型を含む前記＜２０＞から＜２８＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
＜３０＞  被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程を顕在化工程前にさらに含む前記＜２０＞から＜２９＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法である。
＜３１＞  上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型について、被験対象の遺伝子型を検出する工程を含み、
検出結果が動脈硬化性疾患危険度判定のために用いられることを特徴とする遺伝子多型検出方法である。
＜３２＞  上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型を含む遺伝子マーカーである。
＜３３＞  上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対あるいは遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含み、
少なくとも一の表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットを検出することを特徴とする遺伝子多型分析用キットである。
＜３４＞  動脈硬化関連遺伝子多型セットが少なくとも３個の遺伝子多型を含むものである前記＜３３＞に記載の遺伝子多型分析用キットである。
＜３５＞  表２−１から表２−２中に記載の遺伝子多型から選択された少なくとも２個の遺伝子多型の遺伝子多型検出用プライマーおよびプローブの少なくともいずれかを有し、
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも０．２ｍｍ以上厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、該選択された遺伝子多型で構成され得る上記表２−１から表２−２中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せを少なくとも一つ有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、１５％以下となる前記＜３３＞から＜３４＞のいずれかに記載の遺伝子多型分析用キットである。
＜３６＞  表２−１から表２−２中に記載の遺伝子多型から選択された少なくとも２個の遺伝子多型についての遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブを有し、
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも０．２ｍｍ以上厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、該選択された遺伝子多型で構成され得る上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せを有する例が５０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、１５％以下となる前記＜３３＞から＜３５＞のいずれかに記載の遺伝子多型分析用キットである。
＜３７＞  複数の遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブが下記のａ）からｌ）の互いに異なるいずれかの群に属する前記＜３３＞から＜３６＞のいずれかに記載の遺伝子多型分析用キットである。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
＜３８＞  上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型の、遺伝子多型検出用プローブを有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイである。
＜３９＞  コンピューターを利用した動脈硬化性疾患危険度判定装置であって、複数の遺伝子多型の、組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の複数の遺伝子多型の組合せと、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける複数の遺伝子多型の組合せとを照合し、一致する遺伝子多型の組合せがある場合に、該遺伝子多型の組合せに対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とを有することを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４０＞  複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として１単位を対応させたものである前記＜３９＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４１＞  複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比を対応させたものである前記＜３９＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４２＞  複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加を対応させたものである前記＜３９＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４３＞  頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子多型の組合せであることが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比が一定以上であること、および、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の平均値に有意差があることの少なくともいずれかにより定義される前記＜３９＞から＜４２＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４４＞  環境因子の有無または数値と、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の環境因子の有無または数値と、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける環境因子の有無または数値とを照合し、該環境因子の有無または数値に対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とをさらに有する前記＜３９＞から＜４３＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４５＞  動脈硬化性疾患危険度判定装置が複数の検出手段を有し、前記複数の検出手段から検出された複数の頚動脈危険度の加算値に基づき動脈硬化性疾患危険度を判定する判定手段をさらに有する前記＜３９＞から＜４４＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４６＞  頚動脈内膜中膜複合体肥厚度と、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度と、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度とを照合し、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とをさらに有する前記＜３９＞から＜４５＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４７＞  前記検出手段から検出された頚動脈危険度および複数の前記抽出手段から抽出された頚動脈危険度の加算値のいずれかと、入力された、被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との加算値に基づき動脈硬化性疾患危険度を判定する判定手段をさらに有する前記＜３９＞から＜４６＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４８＞  被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度を測定して、前記頚動脈内膜中膜複合体肥厚度を前記コンピューターに供給する血管膜圧測定手段を含む前記＜３９＞から＜４７＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定装置である。
＜４９＞  複数の遺伝子多型の、組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルをコンピューターに記憶させ、
該コンピューターを、入力された、被験対象の複数の遺伝子多型の組合せと、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける複数の遺伝子多型の組合せとを照合し、一致する遺伝子多型の組合せがある場合に、該遺伝子多型の組合せに対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段として機能させることを特徴とする動脈硬化性疾患危険度判定プログラムである。
＜５０＞  複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として１単位を対応させたものである前記＜４９＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラムである。
＜５１＞  複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比を対応させたものである前記＜４９＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラムである。
＜５２＞  複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加を対応させたものである前記＜４９＞に記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラムである。
＜５３＞  頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せであることが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比が一定以上であること、および、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の平均値に有意差があることの少なくともいずれかにより定義される前記＜４９＞から＜５２＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラムである。
＜５４＞  頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、
少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、動脈硬化危険度を少なくとも１単位有する例が３０％以上となり、
少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、動脈硬化危険度を少なくとも１単位有する例が１５％以下となる、
前記＜４９＞から＜５３＞のいずれかに記載の動脈硬化性疾患危険度判定プログラムである。
発明を実施するための最良の形態
（動脈硬化性疾患危険度判定方法）
本発明の動脈硬化性疾患危険度判定方法は、複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該遺伝子多型の遺伝子型から、遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程を含み、前記複数の遺伝子多型の組合せの少なくとも一つが、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有することを特徴とし、この工程を含む限り、他のいかなる工程を含むものであってもよい。
前記動脈硬化性疾患とは、虚血性疾患をいい、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、末梢動脈閉塞症が含まれる。また、前記動脈硬化性疾患危険度は、前記動脈硬化性疾患の発症しやすさや、進行しやすさを表す指標である。
前記遺伝子多型とは、一つの遺伝子座に複数の対立遺伝子（アレル）が存在する多様性を意味する。しかし、ここでいう遺伝子はＲＮＡとして転写される領域に限定されるものではなく、プロモーター、エンハンサー等の制御領域などを含むヒトゲノム上で特定しうるすべてのＤＮＡを含むものである。
ヒトゲノムＤＮＡの９９．９％は各個人間で共通しており、残る０．１％がこのような多様性の原因となり、特定の疾患に対する感受性、薬物や環境因子に対する反応性の個人差として関与し得る。遺伝子多型があっても表現型に差が出るとは限らない。ＳＮＰ（一塩基多型）も該遺伝子多型の一種であるが、本発明の遺伝子多型はこれに限られない。
本発明に用いられる遺伝子多型としては、動脈硬化性疾患に関与することが推定される公知の遺伝子多型のなかから、下記の複数の遺伝子多型の要件を満たすように適宜選択することができる。
本発明に用いられる複数の遺伝子多型の、組合せとしては、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを含むものであることが好ましい。表１−１から表１−４中は、実施例４で詳述するが、糖尿病患者で、心筋梗塞病歴のない母集団において、早期動脈硬化を有する約４３７例について、早期動脈硬化を有さない約１９５例を対照にケースコントロールスタディーを行い、有意水準をオッズ比１０以上かつカイ二乗値６．６３５（Ｐ＜０．０１）以上として、頚動脈内膜中膜肥厚度との間に正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを抽出した結果である。一行が、それぞれ動脈硬化関連遺伝子多型セットである。本発明に用いられる複数の遺伝子多型は、上記表１−１から表１−４中の動脈硬化関連遺伝子多型セットを含んでさらに他の遺伝子多型と組み合わせたものであってもよい。
また、本発明に用いられる複数の遺伝子多型としては、表３に挙げられる遺伝子多型も用いることができる。なお、表３の遺伝子多型に関する文献を表４に記載する。表３および表４において同一番号は同一の遺伝子多型に付与されている。
2003087360.tif 000008
2003087360.tif 000009
前記複数の遺伝子多型とは、異なる遺伝子座を有する２種以上の遺伝子多型をいい、２種の遺伝子多型であれば、例えば、表３中に記載されている、ＳＥＲＰＩＮＥ１とＡＣＥとをいい、３種の遺伝子多型であれば、例えばＳＥＲＰＩＮＥ１と、ＡＰＯＡ１と、ＡＰＯＡ２とをいう。
前記遺伝子多型の組合せとは、前記複数の遺伝子多型の遺伝子型が組み合わさることをいう。例えば、表３中に記載されるＰＡＩ−１を関連因子とするプロモーター部位の多型であるＳＥＲＰＩＮＥ１多型には、Ｇのリピート数が異なる４Ｇ型と５Ｇ型の対立遺伝子が存在し、そのうち４Ｇ型が危険因子となる。このＳＥＲＰＩＮＥ１多型について被験対象の遺伝子型は、４Ｇ／４Ｇ、４Ｇ／５Ｇおよび５Ｇ／５Ｇのいずれかになる。同様に、表３中に記載されるＡＣＥを関連因子とする第１６イントロンの多型であるＡＣＥ多型には、挿入型（Ｉ型）と欠失型（Ｄ型）の対立遺伝子が存在し、このうちＤ型が危険因子となる。このＡＣＥ多型について被験対象の遺伝子型は、Ｄ／Ｄ、Ｄ／ＩおよびＩ／Ｉのいずれかになる。そこで、このＳＥＲＰＩＮＥ１多型と、ＡＣＥ多型を、複数の遺伝子多型として選択した場合、この両多型に関する遺伝子多型の組合せは、４Ｇ／４ＧとＤ／Ｄとを有する場合、４Ｇ／４ＧとＤ／Ｉとを有する場合等、全部で９通りできる。この９通りについて、すべて個々に危険度を設定することもできるが、例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ１多型について被験対象の遺伝子型を、危険対立遺伝子をホモで有する４Ｇ／４Ｇと、それ以外の、４Ｇと５Ｇとをヘテロで有するか５Ｇをホモで有する５Ｇ／？とに分類し、ＡＣＥ多型についても同様にＤ／Ｄと、Ｉ／？とに分類し、両多型の遺伝子型の組合せを４Ｇ／４ＧとＤ／Ｄとを有する場合、４Ｇ／４ＧとＩ／？とを有する場合、５Ｇ／？とＤ／Ｄとを有する場合、５Ｇ／？とＩ／？とを有する場合との４通りに統合して、遺伝子多型の組合せとすることもできる。さらに、危険因子をホモに有する遺伝子型同士の組合せと（４Ｇ／４ＧとＤ／Ｄとの組合せ）、それ以外の組合せとの２通りに統合して、危険度を設定することもできる。また、実施例４で詳述するように、一定の規則で組合せを統合して、危険度を設定することもでき、このような統合に特に制限はない。
前記複数の遺伝子多型の組合せの少なくとも一つは、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型であることを要する。
例えば、ＰＡＩ−１を関連因子とするＳＥＲＰＩＮＥ１多型、ＭＴＨＦＲを関連因子とするＭＴＨＦＲ多型、およびＡＣＥを関連因子とするＡＣＥ多型の４Ｇ／４ＧとＶａｌ／ＶａｌとＤ／Ｄとの組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間には、有意な正の関連性（頚動脈内膜中膜複合体肥厚度増加させる方向の関連性）を有すことから、この複数の遺伝子多型の組合せを含むものはこの要件を満たす。
ここで、有意な相関性を有するか否かを判断する場合の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の測定値には、高解像度超音波断層装置による測定値を用いる。頚動脈内膜中膜複合体肥厚度としては、測定された頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の一被測定者における平均値である平均肥厚度（ＩＭＴ）の値、および、測定された頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の一被測定者における最大値である最大肥厚度（ＰＩＭＴ）の値のいずれかを用いることとする。
また、有意な関連性を有するとは、統計学上一般的な仮説検定により、有意水準を０．０５として検定された結果により有意である場合、有意性の経験的な値である、重回帰分析における頚動脈内膜中膜複合体の平均肥厚度の増分（ΔＩＭＴ）が０．２ｍｍ以上の場合、および、同様に有意性の経験的な値である、重回帰分析における頚動脈内膜中膜複合体の最大肥厚度の増分（ΔＰＩＭＴ）が０．３ｍｍ以上の場合の少なくともいずれかに該当する場合をいう。
また、前記複数の遺伝子多型の組合せの選択およびセット数の選択に関しては、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上となり、少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が１５％以下となるように、複数の遺伝子多型の組合せが選択されることが好ましい。
また、同様の条件において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が３０％以上となり、少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せを有する例が１０％以下となるように、選択されることも好ましい。
また、複数の遺伝子多型の組合せはを構成する遺伝子多型の数は、２から５個程度が好ましい。遺伝子多型６個以上の組合せであっても、用いることはできるが、動脈硬化疾患例において、該組合せの総計がカバーできるパーセンテージがあまり増えない反面、対照例において該組合せを有しているパーセンテージが上昇してくる傾向にあるため、危険度の誤差が却って大きくなる可能性がある。また、組合せを構成する多型数が増えると、優位さを有する組合せは著しく増えるが、個々の組合せの頻度が著しく下がるため、解析が煩雑になる点で不利である。
複数の遺伝子多型の組合せが、少なくとも３個の遺伝子多型からなるものから選択することもできる。
前記複数の遺伝子多型は、下記のａ）からｌ）のいずれかの群に属する少なくとも二つの遺伝子多型を含むことが好ましく、三つ以上遺伝子多型を含むことがさらに好ましい。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ここで、或る遺伝子に関連する遺伝子多型群とは、該遺伝子のエクソン、イントロンに存在する多型に限られず、プロモータ領域、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域等に存在する多型も含まれる。一般にコーディング領域中の多型は、アミノ酸配列を変化させたり、ｍＲＮＡの発現量を変化させる場合があるし、調節領域中の多型であっても、ｍＲＮＡの発現量を変化させたり、スプライシングを変化させる場合があり、いずれも、タンパク質の発現量や、性質を変化させる可能性がる。
前記ａ）からｌ）のいずれかの群に属する遺伝子多型の具体例としては、例えば表１−１から表１−４中に記載の遺伝子多型が挙げられるが、これに限られない。
なお、前記ａ）からｌ）の群のうち、ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群、ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群、ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群、および、ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群は、インスリン抵抗性・血管内皮機能関連としてまとめて捉えることができ、ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群、ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群、および、ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群は、炎症反応関連としてまとめて捉えることができ、ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群は、交感神経血圧関連として捉えることができ、ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群、および、ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群は、凝固線溶系関連としてまとめて捉えることができ、ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群、および、ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群は、脂質関連としてまとめて捉えて、下記のように分類することもできる。
（Ａ）インスリン抵抗性・血管内皮機能関連
（Ｂ）炎症反応
（Ｃ）接着因子
（Ｄ）交感神経血圧
（Ｅ）凝固線溶系
（Ｆ）脂  質
レニン・アンジオテンシン系の各構成要素の遺伝子は、血管や心筋において確認されており、動脈硬化や心肥大、血管や心筋のリモデリングにおいて重要な働きをしていると報告されている。したがって、レニン・アンジオテンシン系の各構成要素の遺伝子に関連する多型は本発明に好適に用いられる。
内皮細胞下における血小板と血管障害部位との結合に関与する、血小板表面のＧＰ（グリコプロテイン）Ｉｂ、ＩＸレセプターやｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ）に関する遺伝子、血小板表面のフィブリノーゲンレセプターであるＧＰＩＩｂ、ＩＩＩａに関する遺伝子等に関連する多型は、血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する多型として本発明に好適に用いられる。
また、凝固因子としては凝固第ＶＩＩ因子や、血清フィブリノーゲン濃度と優位に関連するとの報告もあるフィブリノーゲンβ鎖の遺伝子に関する多型なども血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する多型として本発明に好適に用いられる。
一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群、ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群、ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群、ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群、筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群は、インスリン抵抗性に関与することが知られている。
また、ＭＴＨＦＲ（メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素）は、ホモシステインの代謝酵素であり、血中ホモシステイン濃度の上昇は心血管疾患の独立した危険因子であるとの報告がある。
前記複数の遺伝子多型が、互いに前記ａ）〜ｌ）の異なる群に属する少なくとも二つの遺伝子多型を含むことが、危険度に対する組合せによる相加効果または相乗効果を生じさせやすく、危険度に対する寄与が大きい点で特に好ましい。さらに、複数の遺伝子多型が、互いに前記ａ）〜ｌ）の異なる群に属する少なくとも三つの遺伝子多型を含むことも特に好ましい。
前記複数の遺伝子多型としては、血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型と、レニン・アンギオテンシン系に関連する遺伝子多型群、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）に関連する遺伝子多型群、および、脂質に関連する遺伝子多型群の少なくともいずれかに属する遺伝子多型とを少なくとも含む場合が危険度に対する寄与が大きい点で特に好ましい。また、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）に関連する遺伝子多型群と、脂質に関連する遺伝子多型群とを少なくとも含む場合も好ましい。
前記血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型としては、ＰＡＩ−１遺伝子に関連する遺伝子多型が好適に用いられる。また、前記レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型としては、ＡＣＥ遺伝子に関連する遺伝子多型が好適に用いられる。また、前記脂質に関連する遺伝子多型群に属する遺伝子多型としては、ＨＵＭＰＯＮＡ遺伝子に関連する遺伝子多型が好適に用いられる。
複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度は、集団において測定された動脈硬化危険度と、該複数の遺伝子多型の、組合せとの関係を解析することにより求めることができ、求められた数値により、あらかじめ、その組合せに固有の動脈硬化危険度を設定しておくことができる。
前記動脈硬化危険度は、頚動脈の肥厚度等を計測することにより求められる頸動脈硬化の種々の公知の指標の中から、目的により適宜選択して用いることができる。前記頚動脈の肥厚度の計測法としては、特に制限はないが、超音波的に到達可能な頸動脈の肥厚度を計測する無侵襲なかつ定量的計測法である超音波断層装置による頚動脈内膜中膜複合体肥厚度（ＩＭＴ）の測定が一般的である。前述した頚動脈内膜中膜複合体肥厚度（ＩＭＴ）の測定法はその一例であるが、前記動脈硬化危険度を定めるための測定法としては、これに限られない。
前記超音波断層装置は、７．５ＭＨｚ以上の中心周波数のリニア型パルスエコープローブを有するものを使用することが望ましい。頭蓋外頚動脈は皮下浅層に存在すため、７．５ＭＨｚ以上の周波数のものが使用可能で、高解像度（距離分解能０．１ｍｍ）を得ることができる。
血管壁は、血管内腔側の１層の低エコー輝度部分と、その外の高エコー輝度層の２層構造としてエコー像上解析される。著者らは１０４例の健常例の観察より、ＩＭＴが１０歳代より７０歳代まで加齢とともにほぼ直線的に増加し、その肥厚度は１．１ｍｍを越えないことを確認している。健常人のＩＭＴを年齢より次式の如く求めている。
ＩＭＴ＝０．０８ｘＡｇｅ＋０．３（３＜Ａｇｅ＜８０ｙｒ）  ［１］
前記動脈硬化危険度を表すことができる頸動脈の動脈硬化の種々の公知の指標としては、ＩＭＴの最大値を表す最大ＩＭＴ（Ｍａｘ−ＩＭＴ）、ＩＭＴの平均値を表す平均ＩＭＴ（ＡｖｇＩＭＴ）、プラークスコア（ＰＳ）、頸動脈スティッフネス等が有り、未だ一定の指標が決定されていない。さらに、それぞれの指標について、種々の計測方法がある。
前斜位、側面、後斜位の各縦断像で最大の内膜中膜肥厚度をＭａｘＩＭＴとし、該ＭａｘＩＭＴを示す部位を中心として中枢側１ｃｍおよび遠位側１ｃｍの計３ポイントの平均をＡｖｇＩＭＴとする研究者や、左右の総頸動脈（ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｏｔｉｄ：ＣＣ）から頸動脈分岐部、内頸動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ：ＩＣ）の３縦断面の皮膚に対する近位壁（ｎｅａｒ  ｗａｌｌ）および遠位壁（ｆａｒ  ｗａｌｌ）の合計１２の肥厚度の中、最大値をＡｖｇＩＭＴとする研究者、また、左右の肥厚度の平均をＡｖｇＩＭＴとする研究者もいる。さらに、ｆａｒ  ｗａｌｌの一定区画の平均肥厚度をｍｅａｎ  ＩＭＴとすることもある。また、一側の頸動脈の分岐部より中枢側１０ｍｍのｆａｒ  ｗａｌｌの肥厚度を指標とすることもある。
プラークスコア（ＰＳ）は、分岐部を基準として１５ｍｍずつ頸動脈を４区画に区分し、各々の部位での１．１ｍｍ以上のプラーク厚の左右頸動脈両方での総和をいう。また、上述の３〜４区画の各部位でのプラーク（ＩＭＴ１．１ｃｍ以上）の数の総和をプラークナンバー（ＰＮ）と呼んで指標とすることもある。
頸動脈スティッフネスは、収縮期および拡張期の頸動脈の径から計測される数値である。
一側の頸動脈の分岐部より中枢側１０ｍｍのｆａｒ  ｗａｌｌの肥厚度を指標とする方法は、測定が簡便であり、総頸動脈には病変が少ないことより測定誤差が少ないといわれる。ＩＭＴは、頸動脈の最大の病変を示す指標である。ＰＳは、動脈硬化の進展した頸動脈の全体像を示すことができるが、非進展例（肥厚度が１．１ｍｍ未満）では、０となる点で不利である等、測定する対象、疾患により好適な指標が異なる。糖尿病や高脂血症を伴う場合には、頸動脈壁は比較的に均一に肥厚することが多く、ＡｖｇＩＭＴやｍｅａｎ  ＩＭＴが重要な指標になるが、高血圧症を伴う場合は、プラークを認めることが多く、ＰＳ、ＰＮおよびＭａｘＩＭＴが有効な指標となる。
前記複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度は、前述のように頸動脈の動脈硬化の種々の公知の指標を用いて設定することができるが、例えば、該組合せと頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有するか否か（例えば１か０か）での設定や、該組合せと頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する頻度のオッズ比での設定等が好適に挙げられる。また、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加量で設定されることも、総合的な動脈硬化性疾患危険度を表すものとして好ましい。頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加量としては、平均ＩＭＴの増分（ΔＩＭＴ）および最大ＩＭＴの増分（ΔＰＩＭＴ）等を用いることができ、ΔＩＭＴは、総合的な動脈硬化性疾患危険度を表すものとして特に好ましい。頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加量と動脈硬化性疾患との関連性については、多くの報告がされており、特にΔＩＭＴについては、ΔＩＭＴが０．３３９ｍｍ増加するごとに心筋梗塞のオッズが４．９倍になることが知られており（Ｙａｍａｓａｋｉ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２０００（９））、ΔＩＭＴを動脈硬化危険度として用いた態様は、極めて有効に動脈硬化性疾患の危険度を判定しうるものである。前述のように頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加量は、そのまま動脈硬化危険度として用いて動脈硬化性疾患の危険度を表すものとなり得るし、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加量から、適宜関数を用いて動脈硬化危険度を算出するようにしてもよい。
前記頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加量（ΔＩＭＴおよびΔＰＩＭＴ等）は、集団より計測されたＩＭＴ値またはＰＩＭＴ値から重回帰分析の方法により計算される偏回帰係数により表すことができる。
前記遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程は、複数あってもよい。すなわち、複数のセットの前記複数の遺伝子多型からそれぞれ、動脈硬化危険度を決定してもよい。
前記危険度決定工程が単一の場合には、該工程により決定された動脈硬化危険度をそのまま動脈硬化性疾患危険度とすることができる。また、前記危険度決定工程が２つ以上の場合には、該工程により決定された動脈硬化危険度を総合して線形演算することにより、動脈硬化性疾患危険度とすることができる。
本発明の動脈硬化性疾患危険度判定方法は、環境因子に固有の動脈硬化危険度に基づき、被験対象の該環境因子の情報から該環境因子による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程をさらに含むことができる。
前記環境因子としては、年齢、性別、高血圧、糖尿病、高脂血症、肥満、喫煙、ヘモグロビンＡ１ｃ値等が報告されている。
また、Ｖｉｔｅｌｌｉらは、動脈硬化危険度調査（ＡＲＩＣ  Ｓｔｕｄｙ）において、２０８例の頸動脈肥厚を有する（平均ＩＭＴ、１．２１ｍｍ）非糖尿病者と２０８例の肥厚を有さない（平均ＩＭＴ、０．６３ｍｍ）非糖尿病者を比較し、ヘモグロビンＡ１ｃの１％の増加が動脈硬化のリスクを１．７７倍高めるとの推計結果を報告している［Ｖｉｔｅｌｌｉ  ＬＬ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １９９７；２０：１４５４−８］。
喫煙は動脈硬化の危険因子とされているが、住民を対象とした動脈硬化危険度調査（ＡＲＩＣ  Ｓｔｕｄｙ）で喫煙歴とＩＭＴの強い相関性が示され、糖尿病あるいは高血圧患者では喫煙がさらに強い促進因子となることを示された［Ｈｏｗａｒｄ  Ｇ，ＪＡＭＡ  １９９８；２７９：１１９−２４．］。
Ｓｕｔｔｏｎ−Ｔｙｒｒｅｌｌらは、同年代の閉経前と閉経後女性のＩＭＴとプラーク病変を検索し、閉経により平均ＩＭＴは０．６９→０．７７ｍｍ、プラークを認める女性は２５→５４％へと有意に増加することより、閉経が女性の動脈硬化を促進することを報告している［Ｓｕｔｔｏｎ−Ｔｙｒｒｅｌｌ  Ｋ，Ｓｔｒｏｋｅ  １９９８；２９：１１１６−２１］。
動脈硬化の原因として種々の感染症の関与が考えられている。Ｎｉｅｔｏらは、動脈硬化危険度調査（ＡＲＩＣ  Ｓｔｕｄｙ）でＩＭＴ進展群と非進展群を抽出し、サイトメガロウイルスの抗体価を検索したところ、抗体価が２０以上の症例の抗体価４未満群に対するオッズ比は５．３と有意に高く、動脈硬化の進展因子としてのサイトメガロウイルスの可能性を示唆している［Ｎｉｅｔｏ  ＦＪ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９６；９４：９２２−７］。
著者らは以前に、１型糖尿病、２型糖尿病、境界型症例のＩＭＴを従属変数として重回帰分析を行い、１型糖尿病者（３０才未満）では、年齢、糖尿病罹病期間、ヘモグロビンＡ１ｃ値が独立した危険因子であること、２型糖尿病患者（３０才以上）では、年齢、ヘモグロビンＡ１ｃ値、ｎｏｎＨＤＬコレステロール、収縮期血圧、喫煙歴が独立した危険因子であること、境界型糖尿病者では、加齢以外に収縮期血圧、喫煙が危険因子であることを報告した［Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｙ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９４；４３：６３４−６３９］。
前記環境因子の中でも特に年齢、性別、糖尿病罹病期間およびヘモグロビンＡ１ｃ値が重要である。これらの環境因子についても、これらの環境因子による前記頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増加量を、動脈硬化危険度として用いることができる。
前記環境因子による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程は、複数であってもよい。
本発明の動脈硬化性疾患危険度判定方法は、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に固有の動脈硬化危険度に基づき、実際に測定された被験対象の該頚動脈内膜中膜複合体肥厚度から頚動脈内膜中膜複合体肥厚度による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程をさらに含んでいてもよい。頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に固有の動脈硬化危険度は、例えば被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度×１として設定することもできる。被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が直接測定されていれば、それだけで、測定時における動脈硬化性疾患の発病の危険性または進行状況は求められるが、本発明のように遺伝子多型の組合せによる危険度をさらに組合せることにより、将来の発病の危険性および進行しやすさ等を含めた危険度を予測することができる点で優れている。特に、まだ測定時点においては肥厚が進んでいない若年齢の被験対象において、将来の危険度を予測できれば、危険度が高い場合には生活習慣の改善などの予防を行うことができ、動脈硬化性疾患の発病を防ぐことができる。
前記動脈硬化性疾患危険度判定方法が、環境因子による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程や、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程等を含む複数の危険度決定工程を有する場合には、該危険度決定工程ごとに求められる動脈硬化危険度を総合して線形演算することにより、動脈硬化性疾患危険度を算出する動脈硬化性疾患危険度算出工程を含むことができる。
本発明の動脈硬化性疾患危険度判定方法は、単一の遺伝子多型では、危険度に有意な影響を与えない場合でも、複数の遺伝子多型が組み合わさって存在することにより、危険度に相加的のみならず相乗的な影響をあたえるという発明者らの知見に基づき、遺伝子多型を組合せて前記動脈硬化性疾患危険度に影響を与える危険因子として捉えたことによるものであり、これにより精度の高い判定が可能となった。前記動脈硬化性疾患危険度判定方法は、遺伝子多型と、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度という健常者においても疾患を有する者においても同様に定量的に計測可能な指標との関係を精査することにより、実現可能となった判定方法である。
（動脈硬化性疾患危険度測定方法）
本発明の動脈硬化性疾患危険度測定方法は、被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程と、複数の遺伝子多型の、組合せに固有の動脈硬化危険度に基づき、前記検出工程で検出された被験対象の遺伝子多型の遺伝子型から、遺伝子多型による動脈硬化危険度を決定する危険度決定工程とを含み、前記複数の遺伝子多型の少なくとも一の組合せが、該複数の遺伝子多型の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な関連性を有すること以外は特に制限はない。
前記検出工程においては、対象者の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する方法であればいかなる方法も使用することができる。一般的な方法としては、対象者の血液、痰、皮膚、気管支肺胞洗浄液、その他の体液、あるいは組織等、ＤＮＡを含むものを検体として用いる。解析方法としては多くの方法が知られているが、以下に代表的なものを挙げる（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１１１４−１１２０，１９９７）。シークエンス法とは、遺伝子多型を含むＤＮＡ領域を直接にシークエンスする方法である。ＰＣＲ法においては、遺伝子多型に特異的なプライマーをもちいて、ある遺伝子多型のみを特異的に増幅する。ＰＣＲ法においては、もっとも３’側に遺伝子多型の核酸を配置するのが一般的であるが、Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＡＳＰ）−ＰＣＲ法のように、３’末端側から２番目に遺伝子多型を有するプライマーを配置する方法などのように、遺伝子多型をプライマーのどの領域に置くか、また、検出する遺伝子以外にどのような核酸配列を入れるかなどプライマーのデザインには、遺伝子多型を識別できる限りとくに制限はない。ＴａｑＭａｎ法において蛍光色素と消光物質により両端を標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するように設計したプライマーでＰＣＲ反応を行う。プライマーからのＰＣＲ反応がこのアレル特異的プローブがハイブリダイズした領域に達すると、Ｔａｑポリメラーゼの５プライムヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたプローブの５’末端に存在する蛍光色素が切断され、消光物質から離れることにより蛍光が生ずる。この手法により、アレル特異的プローブがどの程度ハイブリダイズしていたかがわかる。インベーダーアッセイ法においては、鋳型の遺伝子多型部位から５’側に特異的配列を持ち、３’側にフラップ配列を持つアレルプローブと、鋳型の遺伝子多型部位からの３’側の特異的配列を有するインベーダープローブ、さらに、フラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴプローブとの３種類のオリゴヌクレオチドを使い、ＴａｑＭａｎ法と同様の原理にてどのアレルプローブがハイブリズダイズし手かを特定できる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法においては、遺伝子多型部位に隣接するプライマーを作成してこの領域を増幅させた後、遺伝子多型部位の１塩基のみをｄｄＮＴＰを用いて増幅する。ついで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いて、付加したｄｄＮＴＰの種類を識別することにより遺伝子多型を同定する。Ｈｙｂｒｉｇｅｎｅ法などのＤＮＡチップ法と総称される方法においては、マイクロアレイ上に遺伝子多型を含むオリゴヌクレオチドプローブを配置し、ＰＣＲ増幅させたサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する。その他にも分子ビーコン法、ライゲーション法等が公知の方法として例示できる。
前記危険度決定工程については、前記動脈硬化性疾患危険度判定方法において述べた工程と同様の工程を用いることができる。
（動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法）
本発明の動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法は、被験対象の遺伝子多型のうち、動脈硬化関連遺伝子多型セットにかかる複数の遺伝子多型の遺伝子型を選択的に明らかにすることにより、該被験対象の遺伝子多型における動脈硬化関連遺伝子多型セットを顕在化させる顕在化工程を含み、
該動脈硬化関連遺伝子多型セットが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せであり、動脈硬化性疾患関連因子であること以外には特に制限はなく、顕在化工程を含む限りにおいて、他の付加的ないかなる工程を有していての本発明に含まれる。
ヒトゲノムには、極めて多くの遺伝子多型があり、そのうちのひとつだけでは、オッズ比が低く、また、頻度も限られているため、動脈硬化危険度を予測することは不可能である。したがって、それらの遺伝子多型をばらばらに見ていたのでは、個人が有する遺伝子多型のなかに組合せとして内在している動脈硬化と関連する因子を見つけることはできない。本発明において多数の母集団における解析により、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せが存在することが明らかになったことに基づき、それらの動脈硬化関連遺伝子多型セットを動脈硬化性疾患関連因子として位置づけ、被験試料の、これらの特定の組合せにかかる遺伝子多型を選択的に明らかにして、それらを一体と扱ったときに、はじめて、動脈硬化性疾患関連因子を顕在化させることができる。
顕在化された動脈硬化性疾患関連因子は、動脈硬化性疾患危険度判定の情報として、極めて価値が高いものである。
ここで、選択的に明らかにするとは、無数の遺伝子多型の組合せのうち特定のものを選択して明らかにすることである。
また、顕在化工程としては、単に、該複数の遺伝子多型の、組合せにかかる遺伝子型のセットを一体として明らかにすることのほか、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当するか否か（例えば０か１か）により、また、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当する場合に、動脈硬化関連遺伝子多型セットに固有の、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する頻度のオッズ比により、表わすことも含まれる。また、選択的に明らかにされた複数の遺伝子多型の遺伝子型が、動脈硬化関連遺伝子多型セットに該当する場合に、動脈硬化関連遺伝子多型セットに固有の頚動脈内膜中膜肥厚度増加量により表わすことも含まれ、該被験対象の遺伝子多型における動脈硬化関連遺伝子多型セットを顕在化できる方法であれば、特に制限は無い。
また、前記動脈硬化関連遺伝子多型セットとしては、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを含むものであることが好ましい。
また、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを有する例が３０％以上となり、少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを有する例が１５％以下となるように、動脈硬化関連遺伝子多型セットが選択されることが特に好ましい。
動脈硬化関連遺伝子多型セットは、２から５個の少なくともいずれかの遺伝子多型からなることが好ましく、動脈硬化関連遺伝子多型セットが、少なくとも３個の遺伝子多型からなるものであってもよい。
動脈硬化関連遺伝子多型セットが、下記のａ）からｌ）のいずれかの群に属する少なくとも二つの遺伝子多型を含むことも好ましい。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
また、被験対象の複数の遺伝子多型の遺伝子型を検出する検出工程を顕在化工程前にさらに含んでいてもよい。
（遺伝子多型検出方法）
本発明の遺伝子多型検出方法は、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型について、被験対象の遺伝子型を検出する工程を含み、検出結果が動脈硬化性疾患危険度判定のために用いられるものであれば特に制限はない。
（遺伝子マーカー）
本発明の遺伝子マーカーは、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型を含むものであれば、特に制限はない。該遺伝子多型の組合せを動脈硬化性疾患の各種マーカーとして用いる態様である。
（遺伝子多型分析用キット）
本発明の遺伝子多型分析用キットは、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対あるいは遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含み、少なくとも一の表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットを検出するものであれば、どのようなものでもよい。
上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを検出するためには、該遺伝子多型セットにかかる遺伝子多型（表２−１から表２−２）に記載の遺伝子多型から選択された少なくとも２個の遺伝子多型の遺伝子多型検出用プライマーおよびプローブのいずれかを有することが必要である。一つの遺伝子多型について遺伝子多型検出用プライマーを含み、他の遺伝子多型について遺伝子多型検出用プローブを含むようなものであっても、前記複数の遺伝子多型を分析できる限り、本発明の遺伝子多型分析用キットに含まれる。表２−１から表２−２中に記載の各遺伝子多型の検出は上記遺伝子多型検出工程で記載したいずれの方法をも用いることができるが、ＰＣＲを用いるｈｙｂｒｉｇｅｎｅ法、ＴａｑＭａｎ法、インベーダー法や、遺伝子多型を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いるＡＳＰ−ＰＣＲ法などを好適に用いることができる。したがって、遺伝子多型分析用キットには、これらの遺伝子多系を検出する工程に用いるプライマーおよびプローブの少なくともいずれかが含まれる必要がある。遺伝子多型を検出するためのＰＣＲ法においては、もっとも３’側に遺伝子多型の核酸を配置するのが一般的であるが、Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＡＳＰ）−ＰＣＲ法のように、３’末端側から２番目に遺伝子多型を有するプライマーを配置する方法などのように、遺伝子多型をプライマーのどの領域に置くか、また、検出する遺伝子以外にどのような核酸配列を入れるかなどプライマーのデザインには、遺伝子多型を識別できる限りとくに制限はない。プローブのデザインにおいても同様に、遺伝子多型を識別できる限りその配列に制限なく用いることができる。
なお、遺伝子多型分析用キットにて検出される動脈硬化関連遺伝子多型セットは、上記表１−１から表１−４中に記載のものであればどれでもよいが、３つ以上の遺伝子多型を含むグループは、危険度検出の感度を高めるので好ましい。
さらに、表２−１から表２−２中に記載の遺伝子多型から選択された少なくとも２個の遺伝子多型の遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブを有し、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも０．２ｍｍ以上厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、該選択された遺伝子多型で構成され得る上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せを有する例が３０％以上となり、少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、１５％以下となるような動脈硬化関連遺伝子多型セットを検出するキットは、危険性予測において、好ましい。
また、表２−１から表２−２中に記載の遺伝子多型から選択された少なくとも２個の遺伝子多型についての遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブを有し、
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも０．２ｍｍ以上厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、該選択された遺伝子多型で構成され得る上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子型の組合せを少なくとも一つ有する例が５０％以上となり、少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、１５％以下となるような、分析キットは、危険性予測においてさらに好ましい。
また、前記分析用キットは、複数の遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブが下記のａ）からｌ）の互いに異なるいずれかの群に属するものであることも好ましい。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
（動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイ）
本発明の動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイは、上記表１−１から表１−４中に記載の動脈硬化関連遺伝子多型セットのうちから選択される少なくとも一の動脈硬化関連遺伝子多型セットを構成する遺伝子多型の、遺伝子多型検出用プローブを有すること以外は、本発明の効果を害さない限り、適宜公知の材料から選択して用いることができる。
前記動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイは、あらかじめ準備したプローブを基盤に固定する方法のほか、基板上で合成するＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社の方法等が知られており、どのような方法に用いられるものであってもよい。また、プローブを固定する基板に特に制限はないが、ガラスプレートやフィルター等公知のものを用いることができる。また、固定されるプローブの長さや用いる核酸の種類も、遺伝子多型を検出できる限りにおいて、特に制限はない。遺伝子多型を含む領域は、あらかじめＰＣＲで増幅しておくことが感度の上から望ましい。特に、標識したプライマーを用いて遺伝子多型を含む領域を増幅する方法は、感度、簡便さ等の点から好適に用いることができる。たとえば、Ｈｙｂｒｉｇｅｎｅ法においては、ビオチンにて標識したプライマーを用いて遺伝子多型を含む領域を増幅し、これをマイクロアレイに添加してハイブリダイズさせたのちに、ハイブリダイズしなかった核酸を洗浄して除く。ついで、ハイブリダイズしたプローブを、アビジン標識した蛍光色素にて検出する。この方法により遺伝子多型が感度よく検出できる。
前記動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイは、該遺伝子多型検出用プローブが下記のａ）からｌ）の互いに異なるいずれかの群に属する遺伝子多型検出用プローブであることも好ましい。
ａ）レニン・アンジオテンシン系に関連する遺伝子多型群
ｂ）血小板機能・凝固系に関連する遺伝子多型群
ｃ）脂質に関連する遺伝子多型群
ｄ）一酸化窒素合成酵素に関連する遺伝子多型群
ｅ）ＴＮＦ−α遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｆ）ＩＲＳ−１遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｇ）ＦＡＢＰ２遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｈ）筋グリコゲン合成酵素遺伝子に関連する遺伝子多型群
ｉ）ＮＡＤＰ・ＮＡＤＰＨ酸化酵素ｐ２２ｐｈｏｘに関連する遺伝子多型群
ｊ）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）に関連する遺伝子多型群
ｋ）熱ショックタンパク質７０−１に関連する遺伝子多型群
ｌ）ＴＧＦ−β１遺伝子に関連する遺伝子多型群
（動脈硬化性疾患危険度判定装置）
本発明の動脈硬化性疾患危険度判定装置は、コンピューターを利用した動脈硬化性疾患危険度判定装置であって、複数の遺伝子多型の、組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルを有し、かつ、入力された、被験対象の複数の遺伝子多型の組合せと、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける複数の遺伝子多型の組合せとを照合し、一致する遺伝子多型の組合せがある場合に、該遺伝子多型の組合せに対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段を有すること以外は特に制限は無い。検出された前記頚動脈危険度はそのまま動脈硬化性疾患危険度として用いることもできるし、適宜簡単な数値等に置き換えて動脈硬化性疾患危険度とすることもできる。
前記動脈硬化危険度データテーブルにおける複数の遺伝子多型が、該複数の遺伝子多型の少なくとも一の組合せと、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な関連性を有する複数の遺伝子多型であることが好ましい。
また、複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として１単位を対応させたものなども挙げられる。
さらに、複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する複数の遺伝子多型の組合せに、動脈硬化危険度として頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比を対応させたものであってもよい。
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度との間に有意な正の関連性を有する遺伝子多型の組合せであることが、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が正常範囲をこえる頻度のオッズ比が一定以上であること、および、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の平均値に有意差があること等により、好適に定義され得る。
また、本発明の動脈硬化性疾患危険度判定装置は、危険因子となる環境因子の情報を入力することによりさらに正確な動脈硬化性疾患危険度判定を行うため、環境因子の有無または数値と、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の環境因子の有無または数値と、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける環境因子の有無または数値とを照合し、該環境因子の有無または数値に対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とをさらに有することもできる。
動脈硬化性疾患危険度判定装置が複数の検出手段を有する場合には、前記複数の検出手段から検出された複数の頚動脈危険度の加算値に基づき動脈硬化性疾患危険度を判定することもできる。
また、本発明の動脈硬化性疾患危険度判定装置は、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度と、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルと、
入力された、被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度と、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける頚動脈内膜中膜複合体肥厚度とを照合し、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度に対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段とをさらに有することもできる。
また、本発明の動脈硬化性疾患危険度判定装置は、前記検出手段から検出された頚動脈危険度および複数の前記抽出手段から抽出された頚動脈危険度の加算値が、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増分として表されている場合には、入力された、被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度をそのまま使用して、それらの加算値に基づき動脈硬化性疾患危険度を判定することもできる。
また、本発明の動脈硬化性疾患危険度判定装置は、被験対象の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度を測定して前記頚動脈内膜中膜複合体肥厚度を前記コンピューターに供給する血管膜圧測定手段をさらに含むことができる。該血管膜圧測定手段としては、コンピューターとは別の血管膜圧測定装置や、血管膜圧測定装置と解析用コンピューターを組合せた装置などが用いられる。該血管膜圧測定装置は、公知の血管膜圧測定装置から目的にあわせて適宜選択することができ、前記血管膜圧測定手段にコンピューターが含まれる場合には、前記血管膜圧測定手段のコンピューターと、データテーブルの記憶および危険度検出のための前記コンピューターが一体となっていてもよい。
（動脈硬化性疾患危険度判定プログラム）
本発明の動脈硬化性疾患危険度判定プログラムは、複数の遺伝子多型の、組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルをコンピューターに記憶させ、かつ、該コンピューターを、入力された、被験対象の複数の遺伝子多型の組合せと、前記動脈硬化危険度データテーブルにおける複数の遺伝子多型の組合せとを照合し、一致する遺伝子多型の組合せがある場合に、該遺伝子多型の組合せに対応する該動脈硬化危険度を検出する検出手段として機能させることを特徴とするものである。
複数の遺伝子多型の組合せと、動脈硬化危険度とが対応して一覧化された動脈硬化危険度データテーブルについては、前記動脈硬化性疾患危険度判定装置とで述べたものと同様な機能を有するものが挙げられる。
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が、健常人の頚動脈内膜中膜複合体肥厚度平均よりも少なくとも０．２ｍｍ厚い場合を動脈硬化疾患例と定義し、それ以外を非動脈硬化疾患例と定義した場合に、少なくとも１５０例の動脈硬化疾患例集団において、動脈硬化危険度を少なくとも１単位有する例が３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０以上となり、少なくとも１５０例の非動脈硬化疾患例集団において、動脈硬化危険度を少なくとも１単位有する例が１５％以下となる、ような動脈硬化性疾患危険度判定プログラムは、危険度判定の観点から極めて有用である。
実施例
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
遺伝子多型とＩＭＴとの関係
２００例の健常者および２００例のＩＩ型糖尿病患者において頚動脈内膜中膜複合体肥厚度を測定し、それぞれの被測定者において平均ＩＭＴおよびピークＩＭＴ（ＰＩＭＴ）を得た。一方、該健常者および糖尿病患者から採取された血液からＤＮＡをフェノールクロロホルム法により抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、公知のＡＳＰ−ＰＣＲ法と遺伝子多型特異的プライマーとを用いて表３に表されるＡＣＥ、ＡＧＴ、ＳＥＲＩＮＥ１、ＡＰＯＥ、ＡＰＯＢ、ＰＯＮＴ、ＬＯＣ１１３６９０、ＭＴＨＦＲ、ＩＲＳ１、ＦＡＢＰ２の遺伝子多型を含むＤＮＡを増幅した。アガロース電気泳動にてＰＣＲ産物の有無を確認することにより、各遺伝子多型を判別した。
頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の測定は、高解像度超音波断層装置により２方向から肥厚度を連続的に３点以上測定し、一被測定者の測定値の平均値を平均ＩＭＴ、測定値の最大値をピークＩＭＰとした。このデータから、線形重回帰分析の手法により、該単一の遺伝子多型について危険因子をホモに有する遺伝子型に固有のΔＩＭＴおよびΔＰＩＭＴを算出した。ここで、ΔＩＭＴは、平均頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増分、ΔＰＩＭＴは最大頚動脈内膜中膜複合体肥厚度の増分を表す。結果を表５に表す。
2003087360.tif 000010
ΔＰＩＭＴとΔＩＭＴの単位はミリメートル（ｍｍ）である。
表中、「＊」はΔＩＭＴとの有意な関連性（Ｐ値０．０５未満）を表す。また、「番号」は、表３および表４における同一番号の遺伝子多型を表すよう付与されている。
この結果、単一の遺伝子多型では、ＭＴＨＦＲおよびｐ２２ｐｈｏｘについて、ΔＩＭＴ増加に有意に関与することが認められた。
次に、ＰＯＮ１とＭＴＨＦＲとの、又は、ＰＯＮ１とＳＥＲＰＩＮＥ１との２つの遺伝子多型について危険因子をホモに有する遺伝子型同士の組合せに固有のΔＩＭＴを算出した。
ＰＯＮ１とＭＴＨＦＲとについて共に危険因子をホモに有する遺伝子型を有する場合のΔＩＭＴは、＊０．３０１ｍｍであった。また、ＰＯＮ１とＳＥＲＰＩＮＥ１とについて共に危険因子をホモに有する遺伝子型を有する場合のΔＩＭＴは、０．１６ｍｍであった。
この結果、ＰＯＮ１とＭＴＨＦＲとのような異なる機能に関与する複数の遺伝子多型が組合せて生じる場合には、単一の遺伝子多型の場合よりもさらにΔＩＭＴに大きく関与することが認められ、これに基づき、より正確な危険度を設定することができることが分かった。また、ＰＯＮ１とＳＥＲＰＩＮＥ１との組合せの場合も、単一遺伝子多型の場合よりもΔＩＭＴは大きくなったが、有意差を生じる程には増加しなかった。この組合せが、後述の実施例２の組合せ等と比較して、組合せによるΔＩＭＴの増加が少ないのは、該遺伝子多型は表３の異なる多型群に属してはいるが、ともに動脈硬化に密接に関連する多型であるため、大きくは同じ分類に属するためと考えられる。
（実施例２）
３つの遺伝子多型の組合せとＩＭＴとの関係、および、動脈硬化性疾患危険度判定方法
次に、２００例の健常者および２００例のＩＩ型糖尿病患者において、同様に、３つの遺伝子多型を検出すると共にＩＭＴを測定し、重回帰分析により３つの遺伝子型の組合せに固有のΔＩＭＴを求めた。
ＭＴＨＦＲを関連因子とするＭＴＨＦＲ遺伝子多型、ＡＣＥを関連因子とするＡＣＥ遺伝子多型、および、ＰＡＩ−１を関連因子とするＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子多型を複数の遺伝子多型の組合せとして選択し、それぞれの遺伝子多型について、危険因子をホモ型に含む遺伝子型（＋）とそれ以外の遺伝子型（−）に分類した。そして、３つの異なる遺伝子型多型におけるこの分類を組合せて遺伝子多型の組合せに固有のΔＩＭＴを算出し、動脈硬化危険度とした。結果を表６に表す。
2003087360.tif 000011
即ち、ＭＴＨＦＲ、ＡＣＥ、および、ＳＥＲＰＩＮＥ１のいずれの多型についても危険因子をホモ型に含む遺伝子型の組合せに固有の動脈硬化危険度を０．７７１と設定した。また、ＭＴＨＦＲとＡＣＥの両多型について危険因子をホモ型に含む遺伝子型であって、ＳＥＲＰＩＮＥ１については危険因子をホモ型に含まない遺伝子型の組合せに固有の動脈硬化危険度を０．４５１と設定した。同様に、ＭＴＨＦＲとＳＥＲＰＩＮＥ１との両多型について危険因子をホモ型に含む遺伝子型であって、ＡＣＥについては危険因子をホモ型に含まない遺伝子型の組合せに固有の動脈硬化危険度を０．３１８と設定した。同様に、ＡＣＥとＳＥＲＰＩＮＥ１との両多型について危険因子をホモ型に含む遺伝子型であって、ＭＴＨＦＲについては危険因子をホモ型に含まない遺伝子型の組合せに固有の動脈硬化危険度を０．１２７と設定した。さらに、ＭＴＨＦＲ、ＡＣＥおよびＳＥＲＰＩＮＥ１のいずれか一種のみ危険因子をホモ型に含む遺伝子型に固有の動脈硬化危険度をそれぞれ、０．０８９、−０．０１８および０．１４５と設定した。最後に３種の多型いずれもが危険因子をホモ型に含まない遺伝子型の組合せに固有の動脈硬化危険度を０と設定した。前記あらかじめ設定される動脈硬化危険度に、被験対象のＡＣＥ、ＳＥＲＰＩＮＥ１およびＭＴＨＦＲ多型の遺伝子型をあてはめて、被験対象の動脈硬化危険度を決定した。すなわち、もし被験対象の該三種多型がいずれも危険因子をホモ型に含む遺伝子型であれば、該被験対象の動脈硬化危険度は０．７７１と決定される。危険度決定工程が一つの場合には、この値をそのまま該被験対象の動脈硬化性疾患危険度とすることができる。
これらの結果から、本発明の動脈硬化性疾患危険度判定方法等において、これらのΔＩＭＴの値を、複数の遺伝子多型の組合せに固有の動脈硬化危険度として予め設定することができ、被験対象の該複数の遺伝子多型の遺伝子型から動脈硬化危険度を決定し、動脈硬化性疾患危険度を高精度に判定することができる。
（実施例３）
遺伝子多型以外の危険因子とＩＭＴとの関係
年齢、性別、糖尿病罹病期間、ヘモグロビンＡ１ｃ値について、それぞれ、２００例の健常者および２００例のＩＩ型糖尿病患者について、ΔＩＭＴとの関係を重回帰分析により解析した。求められた偏回帰係数を以下に表す。
環境因子                    偏回帰係数
年齢                        ＋０．０１５ｍｍ／ｙｒ
男性                        ＋０．１７８ｍｍ
糖尿病罹病期間              ＋０．００６ｍｍ／ｙｒ
ヘモグロビンＡ１ｃ値        ＋０．０２４ｍｍ／％
これらの環境因子は、それぞれ独立に危険因子となり、本発明の動脈硬化性疾患危険度判定方法は、これらの因子による危険度決定工程をさらに含むことができる。
例えば、環境因子のうち年齢および性別による危険度決定工程を含む場合は、判定被験対象が３０歳であれば、年齢に固有の動脈硬化危険度は年齢×０．０１５であるから該判定被験対象の年齢による頚動脈効果危険度は０．４５となる。該判定被験対象が男性であれば、環境因子のうち性別に固有の動脈硬化危険度は０．１７８である（女性の場合は０）。
該判定被験対象が前記実施例２の３つの遺伝子多型について、ＭＴＨＦＲとＳＥＲＰＩＮＥ１との両多型について危険因子をホモ型に含む遺伝子型であって、ＡＣＥについては危険因子をホモ型に含まない遺伝子型である場合は、この組合せに固有の動脈硬化危険度は０．３１８（表６）であるから、該判定被験対象の動脈硬化性疾患危険度は、下記式により求められる。
０．３１８＋０．４５＋０．１７８＝０．９４６
（実施例４）
次に、以上の結果に基づき、さらに大きな母集団で、動脈硬化などとの関連性が推測されている広範な既知の遺伝子多型の種々の組合せに関して検討し、動脈硬化関連遺伝子多型セットを決定し、疾患発症予測が可能かを検討した。
検索した遺伝子多型は、５７遺伝子多型で多型頻度が１％以下のものを除外し、最終的に４９遺伝子多型、表２−１から表２−２中に記載の４７遺伝子を検索した。
これら遺伝子多型を動脈硬化発症要因別に以下の（Ａ）から（Ｇ）のようにグループ化したところ表７−１から表７−２中のように分類でき、その数は以下のような内訳であった。
インスリン抵抗性・血管内皮機能関連  ５種  （Ａ）
炎症反応                            ９種  （Ｂ）
接着因子                            ４種  （Ｃ）
交感神経血圧                        ８種  （Ｄ）
凝固線溶系                          １１種（Ｅ）
脂  質                              ８種  （Ｆ）
その他                              ４種  （Ｇ）
2003087360.tif 000012
2003087360.tif 000013
但し、表２−１から表２−２および表７−１から表７−２中の文献番号に対応する文献名は以下のとおりである。
１．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｍ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ，Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｙ，Ｏｇａｗａ  Ｈ，Ｋｕｇｉｙａｍａ  Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｓ，Ｉｔｏ  Ｔ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｙ，Ｈａｒａｄａ  Ｅ，Ｙａｓｕｅ  Ｈ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｓａｉｔｏ  Ｙ，Ｎａｋａｏ  Ｋ．Ａ  Ｔ−７８６−＞Ｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｖａｓｏｍｏｔｉｌｉｔｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０００  ８５（６）：７１０−４．
２．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｈ，Ｓａｎｋｅ  Ｔ，Ｕｅｄａ  Ｋ，Ｈａｎａｂｕｓａ  Ｔ，Ｓａｋａｇａｓｈｉｒａ  Ｓ，Ｎａｎｊｏ  Ｋ．Ａｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ（Ｍ４１６Ｖ）ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４０（８）：９４７−５２．
３．Ｒｅｎｎｅｒ  Ｗ，Ｓｃｈａｌｌｍｏｓｅｒ  Ｋ，Ｇａｌｌｉｐｐｉ  Ｐ，Ｋｒａｕｓｓ  Ｃ，Ｔｏｐｌａｋ  Ｈ，Ｗａｓｃｈｅｒ  ＴＣ，Ｐｉｌｇｅｒ  Ｅ．Ｃ２４２Ｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ２２  ｐｈｏｘ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｎｏｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１５２（１）：１７５−９．
４．Ｒｏｓｍｏｎｄ  Ｒ，Ｃｈａｇｎｏｎ  Ｍ，Ｂｏｕｃｈａｒｄ  Ｃ，Ｂｊｏｒｎｔｏｒｐ  Ｐ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ｏｂｅｓｉｔｙ，Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔ２９Ｃ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ（１）Ｇｅｎｅ．Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ，５９（４）：１９１−４．
５．Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ  Ｓ，Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔ  ＨＪ，Ｐｏｉｒｉｅｒ  Ｏ，Ｂｉｃｋｅｌ  Ｃ，Ｓｍｉｅｊａ  Ｍ，Ｈａｆｎｅｒ  Ｇ，Ｍｅｙｅｒ  Ｊ，Ｃａｍｂｉｅｎ  Ｆ，Ｔｉｒｅｔ  Ｌ．Ｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ９  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０７（１２）：１５７９−８５．
６．Ｈｏｆｍａｎｎ  ＭＡ，Ｄｒｕｒｙ  Ｓ，Ｈｕｄｓｏｎ  ＢＩ，Ｇｌｅａｓｏｎ  ＭＲ，Ｑｕ  Ｗ，Ｌｕ  Ｙ，Ｌａｌｌａ  Ｅ，Ｃｈｉｔｎｉｓ  Ｓ，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  Ｊ，Ｓｔｉｃｋｌａｎｄ  ＭＨ，Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ  ＬＧ，Ｍｏｓｅｒ  Ｂ，Ｍｏｘｌｅｙ  Ｇ，Ｉｔｅｓｃｕ  Ｓ，Ｇｒａｎｔ  ＰＪ，Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ  ＰＫ，Ｓｔｅｒｎ  ＤＭ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＡＭ．ＲＡＧＥ  ａｎｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｔｈｅ  Ｇ８２Ｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．３（３）：１２３−３５．
７．Ｏｍｏｒｉ  Ｋ，Ｋａｚａｍａ  ＪＪ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｇｏｔｏ  Ｓ，Ｔａｋａｄａ  Ｔ，Ｓａｉｔｏ  Ｎ，Ｓａｋａｔｓｕｍｅ  Ｍ，Ｎａｒｉｔａ  Ｉ，Ｇｅｊｙｏ  Ｆ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＣＰ−１  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ａ−２５１８Ｇ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｐａｌ−ｔｕｎｎｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍｙｌｏｉｄ．９（３）：１７５−８２．
８．Ｃａｓｃｏｒｂｉ  Ｉ，Ｈｅｎｎｉｎｇ  Ｓ，Ｂｒｏｃｋｍｏｌｌｅｒ  Ｊ，Ｇｅｐｈａｒｔ  Ｊ，Ｍｅｉｓｅｌ  Ｃ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＪＭ，Ｌｏｄｄｅｎｋｅｍｐｅｒ  Ｒ，Ｒｏｏｔｓ  Ｉ．Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｎｔ−４６３Ａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（３）：６４４−９．
９．Ｒａｕｃｈｈａｕｓ  Ｍ，Ｇｒｏｓｓ  Ｍ，Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，Ｆｒａｎｃｉｓ  ＤＰ，Ｇｒｅｉｓｅｒ  Ｐ，Ｎｏｒｗｉｇ  Ａ，Ｗｅｉｄｈａｓｅ  Ｌ，Ｃｏａｔｓ  ＡＪ，Ｄｉｅｔｚ  Ｒ，Ａｎｋｅｒ  ＳＤ，Ｇｌａｓｅｒ  Ｃ．Ｔｈｅ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ＳＥＲ１２８ＡＲＧ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．８３（３）：２４９−５７．
１０．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｄ，Ｓｉｇｕｓｃｈ  ＨＨ，Ｖｏｇｔ  ＳＦ，Ｚｅｉｓｓ  Ｃ，Ｆａｒｋｅｒ  Ｋ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ａ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｓ．Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｇｅｒｍａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ．５５（１）：６９−７１．
１１．Ｋｒｏｌｌ  Ｈ，Ｇａｒｄｅｍａｎｎ  Ａ，Ｆｅｃｈｔｅｒ  Ａ，Ｈａｂｅｒｂｏｓｃｈ  Ｗ，Ｓａｎｔｏｓｏ  Ｓ．Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ１６４８Ｇ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．８３（３）：３９２−６．
１２．ｖｏｎ  Ｂｅｃｋｅｒａｔｈ  Ｎ，Ｋｏｃｈ  Ｗ，Ｍｅｈｉｌｌｉ  Ｊ，Ｂｏｔｔｉｇｅｒ  Ｃ，Ｓｃｈｏｍｉｇ  Ａ，Ｋａｓｔｒａｔｉ  Ａ．Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉａ  ｇｅｎｅ  Ｃ８０７Ｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｍａｊｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｅｖｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ３０  ｄａｙｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｔｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ．９５（１１）：３２９７−３０１．
１３．Ｐａｒｋ  ＨＹ，Ｎａｂｉｋａ  Ｔ，Ｊａｎｇ  Ｙ，Ｋｗｏｎ  ＨＭ，Ｃｈｏ  ＳＹ，Ｍａｓｕｄａ  Ｊ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−３３Ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａｎｓ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ．２５（３）：３８９−９４．
１４．Ｂｌａｋｅ  ＧＪ，Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｃ，Ｌｉｎｄｐａｉｎｔｎｅｒ  Ｋ，Ｒｉｄｋｅｒ  ＰＭ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｆｕｔｕｒｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｏｋｅ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．２２（２４）：２２６２−６．
１５．Ｊｅｎｇ  ＪＲ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＡＩ−１  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ４ｇ／５ｇ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ＰＡＩ−１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１６（４）：２９０−６．
１６．Ｃｅｎａｒｒｏ  Ａ，Ａｒｔｉｅｄａ  Ｍ，Ｃａｓｔｉｌｌｏ  Ｓ，Ｍｏｚａｓ  Ｐ，Ｒｅｙｅｓ  Ｇ，Ｔｅｊｅｄｏｒ  Ｄ，Ａｌｏｎｓｏ  Ｒ，Ｍａｔａ  Ｐ，Ｐｏｃｏｖｉ  Ｍ，Ｃｉｖｅｉｒａ  Ｆ．Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＡＢＣＡ１  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｏｗｅｒ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｅｍｉａ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．４０（３）：１６３−８．
１７．Ｊａｎｓｅｎ  Ｈ，Ｃｈｕ  Ｇ，Ｅｈｎｈｏｌｍ  Ｃ，Ｄａｌｌｏｎｇｅｖｉｌｌｅ  Ｊ，Ｎｉｃａｕｄ  Ｖ，Ｔａｌｍｕｄ  ＰＪ．Ｔｈｅ  Ｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖａｒｉａｎｔ  Ｃ−４８０Ｔ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ＨＤＬ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｅｐｒａｎｄｉａｌ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ＬｐＣＩＩＩ：Ｂ  ：  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＥＡＲＳ）ＩＩ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９（２）：３０３−８．
１８．Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ａｎｄｏ  Ｆ，Ｎｉｉｎｏ  Ｎ，Ｏｈｔａ  Ｓ，Ｓｈｉｍｏｋａｔａ  Ｈ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｍｏｒａｌ  ｎｅｃｋ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｏｍｅｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．８０（７）：４５２−６０．
１９．Ｂｊｏｒｋ  ＪＭ，Ｍｏｅｌｌｅｒ  ＦＧ，Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ＤＭ，Ｓｗａｎｎ  ＡＣ，Ｍａｃｈａｄｏ  ＭＡ，Ｈａｎｉｓ  ＣＬ．Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ２ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ１０２Ｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｍｐｕｌｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．１１４（３）：３３６−９．
２０．Ｊｏｒｍｓｊｏ  Ｓ，Ｗｈａｔｌｉｎｇ  Ｃ，Ｗａｌｔｅｒ  ＤＨ，Ｚｅｉｈｅｒ  ＡＭ，Ｈａｍｓｔｅｎ  Ａ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｐ．Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｌｕｍｉｎａｌ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２１（１１）：１８３４−９．
２１．Ｙｅｈ  ＨＩ，Ｃｈｏｕ  Ｙ，Ｌｉｕ  ＨＦ，Ｃｈａｎｇ  ＳＣ，Ｔｓａｉ  ＣＨ．Ｃｏｎｎｅｘｉｎ３７  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．８１（２−３）：２５１−５．
２２．Ｚｈｅｎｇ  Ｆ，Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ＪＡ，Ｚｈａｎｇ  ＬＱ，Ｖｉｒｇｉｌ  Ｄ，Ｙｅ  ＳＱ，Ｋｗｉｔｅｒｏｖｉｃｈ  ＰＯ．Ａｎ  ＨｐｈＩ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．５９（１）：５８−６４
２３．Ｗａｎｇ  ＡＹ，Ｃｈａｎ  ＪＣ，Ｗａｎｇ  Ｍ，Ｐｏｏｎ  Ｅ，Ｌｕｉ  ＳＦ，Ｌｉ  ＰＫ，Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＡＣＥ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ  ｇｅｎｅｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６３（５）：１８９９−９０７．
２４．Ｐｉｈｕｓｃｈ  Ｒ，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  Ｔ，Ｌｏｈｓｅ  Ｐ，Ｒｕｂｓａｍｅｎ  Ｈ，Ｒｏｇｅｎｈｏｆｅｒ  Ｎ，Ｈａｓｂａｒｇｅｎ  Ｕ，Ｈｉｌｌｅｒ  Ｅ，Ｔｈａｌｅｒ  ＣＪ．Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｏｒｔｉｏｎ：ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（２）：１２４−３１．
２５．Ｋｒｉｋｏｖｓｚｋｙ  Ｄ，Ｖａｓａｒｈｅｌｙｉ  Ｂ，Ｔｏｔｈ−Ｈｅｙｎ  Ｐ，Ｋｏｒｎｅｒ  Ａ，Ｔｕｌａｓｓａｙ  Ｔ，Ｍａｄａｃｓｙ  Ｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇ−３０８Ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ２４−ｈｏｕｒ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｖａｌｕｅｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．６２（６）：４７４−７．
２６．Ｃａｏ  Ｈ，Ｈｅｇｅｌｅ  ＲＡ．Ｈｕｍａｎ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）１０５９Ｇ／Ｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．４５（２）：１００−１．
２７．Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｉ  Ｈ，Ｏｇａｗａ  Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｒ，Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｋ，Ｉｍａｉ  Ｈ，Ｉｍａｍｕｒａ  Ａ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｔ，Ｔｓｕｚｕｋｉ  Ｍ，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｙ．Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ３−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．５２（３）：３５６−６１．
２８．Ｓｉｍｓｅｋ  Ｓ，Ｂｌｅｅｋｅｒ  ＰＭ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｏｏｔ  ＣＥ，ｖｏｎ  ｄｅｍ  Ｂｏｒｎｅ  ＡＥ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＶＮＴＲ）ｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＨＰＡ−２  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．７２（５）：７５７−６１．
２９．Ｃａｒｔｅｒ  ＡＭ，Ｃａｔｔｏ  ＡＪ，Ｋｏｈｌｅｒ  ＨＰ，Ａｒｉｅｎｓ  ＲＡ，Ｓｔｉｃｋｌａｎｄ  ＭＨ，Ｇｒａｎｔ  ＰＪ．ａｌｐｈａ−ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  Ｔｈｒ３１２Ａｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ．Ｂｌｏｏｄ．９６（３）：１１７７−９．
３０．Ｈｕｂｅｒ  Ｇ，Ｍａｒｚ  Ｗ，Ｍａｒｔｉｎ  ＪＲ，Ｍａｌｈｅｒｂｅ  Ｐ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＪＧ，Ｓｕｅｏｋａ  Ｎ，Ｏｈｍ  Ｔ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ＭＭ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ４（Ｃ１１２Ｒ）ａｎｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ４（Ｌ２８Ｐ；Ｃ１１２Ｒ）．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１０１（１）：２１１−８．
３１．Ｃｏｕｔｕｒｅ  Ｐ，Ｏｔｖｏｓ  ＪＤ，Ｃｕｐｐｌｅｓ  ＬＡ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＰＷ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ＥＪ，Ｏｒｄｏｖａｓ．ＪＭ．Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  Ｓｔｕｄｙ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１４８（２）：３３７−４３．
３２．Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｓ，Ｋｕｇｉｙａｍａ  Ｋ，Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｓ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓ，Ｋｏｉｄｅ  Ｓ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｈ，Ｈｏｎｄａ  Ｏ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｍ，Ｏｇａｗａ  Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｉｇａｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２５；１０５（２５）：２９６８−７３．
また、表２−１から表２−２および表７−１から表７−２中に記載の配列番号に対応する遺伝子配列は図１および２に表すとおりである。
糖尿病患者で、心筋梗塞病歴のない母集団において、早期動脈硬化を有する約４３７例について、早期動脈硬化を有さない約１９５例を対照にケースコントロールスタディーを行った。心筋梗塞病歴のない母集団について検索したのは、心筋梗塞病歴のある集団では、心筋梗塞と関連性がある心筋梗塞関連遺伝子が混じって検出されることにより、動脈硬化に特異的な遺伝子多型セットの感度が悪くなることを避けるためである。これにより、動脈硬化に特異的で、動脈硬化危険性を高く予測できる動脈硬化関連遺伝子多型セットが得られた。
実施例１と同様の測定法により測定したＩＭＴが、健常人の平均ＩＭＴより０．２ｍｍ以上厚い場合（ＳＤ＝０．１）について、早期動脈硬化を有する群として分類した。有意水準をオッズ比１０以上かつカイ二乗値６．６３５（Ｐ＜０．０１）以上として動脈硬化関連遺伝子多型セットを決定した（表８−１から表８−４）。
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ここで、オッズ比（Ｏｄｄ）とは、該当する事象が対照グループと比べどれだけ起こりやすいかの指標であり、オッズ比が２とはたとえば動脈硬化などが２倍起こりやすいことを示す。「オッズ比９９」のものは、対照グループにその事象が全く起こらないことを示している。カイ二乗値（Ｋａｉ）はその事象の起こる有意差をみる指標で、６．６３５以上はＰ＜０．０１に相当する。
１遺伝子多型のみの解析（４９ｘ４＝１９６遺伝子型）では、早期動脈硬化を説明しうる（Ｏｄｄ＞１０かつＫａｉ＞６．６３５）となる遺伝子多型は検索した４９種では存在しなかった。ここで、遺伝子多型の遺伝子型の分類の仕方として、例えばＭＰＯ（Ｇ４６３Ａ）のように記載されている場合、左側の多型のホモ（ＧＧ）を遺伝子型１とし、ヘテロ（ＧＡ）を遺伝子型２、右側の多型のホモ（ＡＡ）を遺伝子型３として、遺伝子型１、遺伝子型１と２、遺伝子型２と３、および、遺伝子型３という、４つの分類について解析し、他の遺伝子多型の遺伝子型と組合せたときに、最低限正の有意差がでる分類を採用した。例えば前記遺伝子型１でも遺伝子型１と２でも有意性がでる場合にはより有意の方を採用した。
２遺伝子多型の組合せを検索した（４９ｘ４８／２ｘ４ｘ４＝１７１８６遺伝子多型セット）とき、早期動脈硬化との関連性を説明しうるＯｄｄ＞１０かつＫａｉ＞６．６３５となる動脈硬化関連遺伝子多型セット１セットが抽出され、早期動脈硬化例４３７例中１４例がこの遺伝子多型セットで説明された。他方、非動脈硬化例１９５例中１例もこの遺伝子多型セットを認めなかった。また、グループの組合せは、ａｇであった。
３遺伝子多型の組合せを検索した（４９ｘ４８ｘ４７／６ｘ４ｘ４ｘ４＜５００，０００遺伝子多型セット）とき、早期動脈硬化との関連性を説明しうるＯｄｄ＞１０かつＫａｉ＞６．６３５となる動脈硬化関連遺伝子多型セットが７２セット抽出され、早期動脈硬化例４３７例中２３３例がこの遺伝子多型セットで説明された。他方、非早期動脈硬化例１９５例中１４例にのみこの遺伝子多型セットが認められた。なお、２遺伝子多型の組合せですでに抽出された遺伝子多型セットを含むものについては３遺伝子多型の組合せでは抽出しなかった。また、各グループの組合せでは、３４組合せ中２１組合せが前記（Ａ）から（Ｇ）の各グループ１遺伝子多型のみが組み込まれていた。
４遺伝子多型の組合せを検索した（４９ｘ４８ｘ４７ｘ４６／２４ｘ４ｘ４ｘ４ｘ４＜１５，０００，０００遺伝子多型セット）とき、早期動脈硬化を説明しうる（Ｏｄｄ＞１０かつＫａｉ＞６．６３５）となる動脈硬化関連遺伝子多型セット１０３セットが抽出され、早期動脈硬化例４３７例中２８３例が説明された。他方、非早期動脈硬化例１９５例中１９例にのみこの遺伝子多型セットが認められた。なお、２および３遺伝子多型の組合せですでに抽出された遺伝子多型セットを含むものについては４遺伝子多型の組合せでは抽出しなかった。また、各グループの組合せでは、７０６組合せ中２００組合せが前記（Ａ）から（Ｇ）の各グループ１遺伝子多型のみが組み込まれていた。
早期動脈硬化例中の、動脈硬化関連遺伝子多型セットにより説明できる割合と、非早期動脈硬化例中の動脈硬化関連遺伝子多型セットをもっていても症状を起こさない割合とを図３に示す。図３からみると、複合遺伝子多型数は、５セットまでで平衡に達する可能性がある。従って、必要な遺伝子多型の組合せ数は３〜５ぐらいで充分である。
本発明によると、動脈硬化性疾患の発症しやすさや、進行しやすさ等を動脈硬化性疾患危険度として正確に判定でき、動脈硬化の予防および治療に利用できる動脈硬化性疾患危険度判定方法、該危険度の判定等に用いられる動脈硬化性疾患関連因子顕在化方法、動脈硬化性疾患危険度測定方法、遺伝子多型検出方法、遺伝子マーカー、遺伝子多型分析用キット、動脈硬化性疾患危険度判定用マイクロアレイ、動脈硬化性疾患危険度判定装置および動脈硬化性疾患危険度判定プログラムを提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、表２−１から表２−２中に特定される遺伝子多型の配列を表した図である。
図２は、表２−１から表２−２中に特定される遺伝子多型の配列を表した図である。
図３は、実施例４における、組合せを構成する遺伝子多型の数による適合症例比率を表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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