(57)【要約】最小培地で培養したとき、対数増殖期に乾燥菌体当たり１重量％以上のγ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリス、例えば細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が改変されたキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することにより、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品を製造する。
2003080832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最小培地で培養したとき、対数増殖期に乾燥菌体当たり１重量％以上のγ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリス。
【請求項２】
最小培地がＳＤ培地である請求項１記載のキャンディダ・ユティリス。
【請求項３】
グルタチオン合成酵素活性が０．００５μｍｏｌ  ＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下である請求項１又は２に記載のキャンディダ・ユティリス。
【請求項４】
細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が改変された請求項１〜３のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス。
【請求項５】
γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が上昇するように改変された請求項１〜４のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、もしくはγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理によってシステインが生成したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
【請求項７】
飲食品が発酵食品調味料である請求項６記載の飲食品。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【請求項１０】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１０に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号４２の塩基番号１１０〜２１０１の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４２の塩基番号１１０〜２１０１の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、γ−グルタミルシステインを産生するキャンディダ・ユティリス、及びそれを利用した食品に関するものである。γ−グルタミルシステイン、及びそれから製造されるシステインは、食品分野で有用である。
背景技術
システインは、食品の風味改善などを目的に用いられている。システインの製法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用いられている方法は蛋白分解法と半合成法である。システインを食品の風味改善に用いることを目的として、システイン含量の高い天然食品素材が求められているが、そのような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかった。一方、γ−グルタミルシステインを含む酵母エキスを加熱または酵素処理すれば、システインを高含有する食品素材を得ることが可能であると報告されている（ＷＯ  ００／３０４７４）。
γ−グルタミルシステインは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、γ−グルタミルシステイン合成酵素の働きによりシステインとグルタミン酸を基質にして合成される。また、グルタチオンはグルタチオン合成酵素の働きによりγ−グルタミルシステインとグリシンを基質にして合成される。γ−グルタミルシステインを高含有する酵母は、ＷＯ  ００／３０４７４；Ｏｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（１２），３１４５−３１５０，１９９０；クリスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．，８，１６９９−１７０７，１９９７；Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１３９５（１９９８）３１５−３２０）などで報告されている。しかし、これらの報告は全てサッカロマイセス・セレビシエを用いてなされた検討であり、キャンディダ・ユティリスを用いた報告例はない。
キャンディダ・ユティリスは、以前はピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、又はハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属に分類されていたこともあるが、現在はキャンディダ属として分類されている。このキャンディダ属とは、有性生殖を行なわないか、有性生殖を行なうことが見つけられない不完全菌酵母１５の属の１つで、系統分類の見地からみれば全く寄せ集めの属であり（酵母研究技法の新展開（ＩＳＢＮ番号：４−７６２２−４６７０−０）、ｐ１２４−１２５）、キャンディダ属に属する酵母は、サッカロマイセス・セレビシエと比較して特異な性質を有していることが多い。例えば、キャンディダ・ユティリスは、ピリジン塩基を生産するペントース燐酸経路でエネルギーの大部分を得るという特徴（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，ｖｏｌ．３（ＩＳＢＮ番号：３−５２７−２５７６５−９）ｐ３０，１９８３）や、カタボライト制御が弱いという特徴（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，ｖｏｌ．３  ｐ３０，１９８３）等を有している。また、研究用酵母としては、通常サッカロマイセス・セレビシエが用いられているため、キャンディダ・ユティリスに関する知見は数少ない。そのような状況から、キャンディダ・ユティリスがどの様にしてグルタチオンを生合成しているか報告例がなく、わずかに、亜鉛耐性等を利用して取得された特定のキャンディダ・ユティリスにおいて、グルタチオンを高生産する温度が通常の温度より５℃以上低いとの報告例（特公平０３−１８８７２）などがあるのみである。
このように、キャンディダ・ユティリスにおいては、グルタチオン合成酵素活性とγ−グルタミルシステインの蓄積との関係は知られておらず、グルタチオン合成酵素活性を低下させることによりγ−グルタミルシステインを蓄積させることができるか否かは不明であった。
発明の開示
キャンディダ・ユティリスは単位糖あたりの生育がサッカロマイセス・セレビシエよりよいと報告されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，ｖｏｌ．３  ｐ３０，１９８３）。また、厳格な好気条件下ではエタノールの副生が生じない為（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，ＤＥＣ．１９９５，ｐ７１７１−７１７７））、培養上エタノールの副生に注意する必要性が低い。そこで、本発明者は、γ−グルタミルシステインを高含有するキャンディダ・ユティリスを用いて製造した酵母エキスは、サッカロマイセス・セレビシエを用いて製造した酵母エキスよりも安価になり、工業生産には望ましいと考えた。
本発明は、上記観点からなされたものであり、γ−グルタミルシステインを高含有するキャンディダ・ユティリス、及びそれを用いた酵母エキス、並びにそれらを用いたγ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品及びその製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、他の生物との相同性から、キャンディダ・ユティリスからグルタチオン合成酵素をコードしていると予測される遺伝子断片を取得し、その断片を利用してグルタチオン合成酵素活性を低下させることにより、キャンディダ・ユティリスにγ−グルタミルシステインを生産させることに成功した。さらに、キャンディダ・ユティリスからγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードしていると予測される遺伝子断片を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）最小培地で培養したとき、対数増殖期に乾燥菌体当たり１重量％以上のγ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリス。
（２）最小培地がＳＤ培地である（１）のキャンディダ・ユティリス。
（３）グルタチオン合成酵素活性が０．００５μｍｏｌ  ＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下である（１）又は（２）のキャンディダ・ユティリス。
（４）細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が改変された（１）〜（３）のいずれかのキャンディダ・ユティリス。
（５）γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が上昇するように改変された（１）〜（４）のいずれかのキャンディダ・ユティリス。
（６）（１）〜（５）のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、もしくはγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物又は熱処理によってシステインが生成したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
（７）飲食品が発酵食品調味料である（６）の飲食品。
（８）（１）〜（５）のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
（９）（１）〜（５）のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
（１０）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
（１１）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１０）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号４２の塩基番号１１０〜２１０１の記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４２の塩基番号１１０〜２１０１の記載の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のキャンディダ・ユティリス
本発明のキャンディダ・ユティリスは、最小培地で培養したとき、対数増殖期に乾燥酵母菌体当たり１重量％以上、好ましくは１．５重量％以上、より好ましくは２．０重量％以上のγ−グルタミルシステインを含有する。
前記最小培地としては、下記組成を有するＳＤ培地が挙げられる。
〔ＳＤ培地組成〕
グルコース      ２％
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  １倍濃度
（１０倍濃度Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅは、１．７ｇのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社）と５ｇの硫酸アンモニウムを混合したものを１００ｍｌの滅菌水に溶解し、ｐＨを５．２程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの）
「対数増殖期」とは、培養中における細胞数が培養時間に対して対数的に増加する時期をいう。培養は、振盪培養でも静置培養でもよいが、振とう培養が好ましい。
γ−グルタミルシステインの含有量は、乾燥酵母菌体すなわち菌体の固形成分、例えば、１０５℃で４時間加熱した後の菌体重量に対するγ−グルタミルシステインの含有量（％）をいう。
尚、上記のγ−グルタミルシステインの含有量は、対数増殖期のすべてにわたって維持される必要はなく、少なくとも対数増殖期の任意の時点において、好ましくは、対数増殖期の次に述べる状態で、上記の値を示せばよい。即ち、前記状態とは、対数増殖期から定常状態になったときの培養液の吸光度の１／２以上の吸光度を有する対数増殖期である。
本発明のキャンディダ・ユティリスは、グルタチオン合成酵素活性が０．００５μｍｏｌ  ＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下であることが好ましく、０．００１μｍｏｌ  ＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下であることがより好ましい（「ＧＳＨ」はグルタチオンを示す）。更には、グルタチオン合成酵素活性が検出限界以下であることが好ましい。グルタチオン合成酵素性は、Ｇｕｓｈｉｍａらの方法（Ｇｕｓｈｉｍａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５，２１０（１９８３））によって測定することができる。
本発明のキャンディダ・ユティリスは、キャンディダ・ユティリスの適当な菌株、例えば野生株を、突然変異処理又は遺伝子組換え技術（例えば、以下の文献等に開示されている技術が利用できる。ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ１６５（１９９８）３３５−３４０、ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｄｅｃ．１９９５，ｐ７１７１−７１７７、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９８６；１０（８）：５７３−５７８、ＷＯ  ９８／１４６００）により、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下するように改変することにより、取得することができる。グルタチオン合成酵素活性が低下するとは、グルタチオン合成酵素活性が消失することを含む。また、細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変することによっても、γ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリスを育種することができる。γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、Ｊａｃｋｓｏｎの方法（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１１１，３０９（１９６９））によって測定することができる。
突然変異処理としては、紫外線照射、または、ＭＮＮＧ、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、遺伝子組換え技術を利用してグルタチオン合成酵素活性を低下させるには、グルタチオン合成酵素活性が低下するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を改変する方法が挙げられる。キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９株のグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子の一部の塩基配列を、配列番号１７に示す。従来、キャンディダ属酵母のグルタチオン合成酵素遺伝子は知られていなかったが、本発明者は、各種生物のグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列から、保存性の高い領域を検索し、配列番号１〜８の領域を見出した。そして、それらのうち、配列番号６〜８に示すアミノ酸配列に対応するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡから、グルタチオン合成酵素をコードすると予想される遺伝子断片を増幅することに成功した。同遺伝子断片を取得するためのプライマーとしては、配列番号１５及び１６に示すプライマーが挙げられる。また、キャンディダ・ユティリスの菌株としては特に制限されないが、例えばＡＴＣＣ１５２３９株が挙げられる。同菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、住所１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）から入手することができる。
グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を改変してグルタチオン合成酵素活性を低下させるには、例えば、グルタチオン合成酵素の発現量が低下するように前記遺伝子の発現調節配列を改変するか、または、活性を有するグルタチオン合成酵素が発現しないように、コード領域を改変する方法が挙げられる。具体的には例えば、５’末端部及び３’末端部を欠失した変異型グルタチオン合成酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊することができる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
また、グルタチオン合成酵素遺伝子の内部の配列を欠失し、正常に機能するグルタチオン合成酵素を産生しないように改変した変異型遺伝子を含む組換えＤＮＡをキャンディダ・ユティリスに導入し、変異型遺伝子と染色体上の正常な遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊することができる。
上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するグルタチオン合成酵素遺伝子配列との組換えを起こし、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子と変異型グルタチオン合成酵素遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が機能する。
次に、染色体ＤＮＡ上に変異型グルタチオン合成酵素遺伝子のみを残すために、２個のグルタチオン合成酵素遺伝子の組換えにより１コピーのグルタチオン合成酵素遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、変異型グルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合と、反対に変異型グルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカー遺伝子が脱落するので、２回目の組換えが生じたことは、マーカー遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子置換株は、ＰＣＲによりグルタチオン合成酵素遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。
遺伝子破壊に用いるグルタチオン合成酵素遺伝子又はその断片としては、配列番号１７に示す塩基配列を有するＤＮＡの他に、同塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、又は配列番号１７に示す塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
尚、サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子の破壊については、ＷＯ  ００／３０４７４に開示されている。キャンディダ・ユティリスに組換えＤＮＡを導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｌｕｉｓら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ  ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６５（１９９８）３３５−３４０）が挙げられる。
グルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、メチルグリオキサールに対する感受性を指標として選択することができる（Ｏｈｔａｋｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（１２），３１４５−３１５０，１９９０）。グルタチオンを一定量生合成できる菌株（グルタチオン合成酵素活性及びγ−ＧＣ合成酵素活性を有する菌株）は、メチルグリオキサールに耐性を示す。また、グルタチオンを含有しない培地での生育を調べることによっても、グルタチオン合成酵素活性が低下していることを確認することができる。更に、グルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、ＭＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）濃度勾配プレートを利用することにより効率的に取得することができる。
グルタチオン合成酵素活性の低下は、例えば以下の例と同様にして確認することができる。ＹＰＤ寒天プレートの中央にフィルターを置き、１ｍｇのＭＮＮＧを３０μｌのＤＭＳＯに溶解させた溶液を全量、そのフィルターに染み込ませ、ＭＮＮＧ濃度が中心点から遠ざかるにつれて薄くなるＭＮＮＧ濃度勾配寒天培地を作製した。この寒天培地に、ＹＰＤ培地で培養したサッカロマイセス・セレビシエ１倍体Ｎα１株及びＮα３株をスプレッドした。３０℃で７０時間培養後、寒天培地の中心点から酵母がコロニーを形成するまでの距離を測定した。その結果、Ｎα１株は２．３ｃｍ、Ｎα３株は１．８ｃｍであった。Ｎα３株はＮα１株を親株にしてグルタチオン合成酵素の３７０位のアルギニン残基以降を欠失させるように改変して取得した株である。その為、グルタチオン合成酵素が弱化しており、グルタチオンを微量しか含有していないという特徴を有している。
本発明のキャンディダ・ユティリスは、グルタチオン合成酵素活性が低下することに加えて、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されていてもよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子、発現可能な形態でキャンディダ・ユティリスに導入することによって、増強することができる。γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子や、後述するキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子が挙げられる。
キャンディダ・ユティリスへのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の導入する方法としては、例えば、同遺伝子と、キャンディダ・ユティリス染色体上に存在するＤＮＡ配列とを含む組換えＤＮＡで、キャンディダ・ユティリスを形質転換し、染色体中に組換えＤＮＡを組み込む方法がある（Ｋｏｎｄｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，７１７１−７１７７（１９９５））。具体的には、前記遺伝子置換と同様にして行うことができる。
また、キャンディダ・ユティリスへの目的遺伝子の導入は、染色体ＤＮＡ中に存在する自律複製配列（ＡＲＳ）を含むプラスミドを用いて行うこともできる。キャンディダ・ユティリスのＡＲＳ、及び、それを用いた形質転換は、国際公開ＷＯ９５／３２２８９号パンフレットに記載されている。
キャンディダ・ユティリスの形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（Ｈ．Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．，１５３−１６３（１９８３））、ＫＵＲ法（発酵と工業  ｖｏｌ．４３，ｐ．６３０−６３７（１９８５））、エレクトロポレーション法等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物  実験ライン３１  酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
また、キャンディダ・ユティリス細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増強する方法として、染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーターで置換する方法（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５０巻第１０号、第９８９〜９９４頁、１９９２年）が挙げられる。
＜２＞キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子
本発明のＤＮＡは、下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列番号４３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
γ−グルタミルシステイン合成酵素活性とは、システインとグルタミン酸からγ−グルタミルシステインを生成する反応を触媒する活性をいう。
本発明のＤＮＡがコードするγ−グルタミルシステイン合成酵素は、同酵素活性が損なわれない限り、配列番号４３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含んでもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、２〜１５個、好ましくは、２〜８個、より好ましくは２〜５個である。
上記のようなγ−グルタミルシステイン合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）もしくはＥＭＳ等の通常に変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のようなアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、γ−グルタミルシステイン合成酵素を保持するキャンディダ・ユティリスの菌株の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｔｉｏｎまたはｖａｒｉａｔｉｏｎ）も含まれる。
上記のような変異を有するＤＮＡを、サッカロマイセス・セレビシエ等の適当な細胞で発現させ、その細胞のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を調べることにより、γ−グルタミルシステイン合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号４２の塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質質をコードするＤＮＡを単離することによっても、γ−グルタミルシステイン合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
プローブとして、配列番号４２の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号４２の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号４２の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、発現産物の酵素活性をを調べることによって選択することができる。
配列番号４２に示す塩基配列を有するＤＮＡは、後記実施例に示すように、γ−グルタミルシステイン合成酵素が弱化したサッカロマイセス・セレビシエに導入したところ、グルタチオン合成が促進されたことから、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードしていることが確認された。
配列番号４２のアミノ酸配列を、データベースで相同性検索したところ、サッカロマイセス・セレビシエ、及びシゾサッカロマイセス・ポンベのγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列と、各々５０．９３％及び４２．８８％の相同性が認められた。
＜３＞本発明の酵母エキス、飲食品及びその製造法
上記のようにして得られるγ−グルタミルシステインを産生する酵母を好適な条件で培養して得られた培養物又はその分画物は、γ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であってもよい。菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
上記γ−グルタミルシステインを含む培養物又はその分画物を加熱することにより、γ−グルタミルシステインがシステインとピロリドンカルボン酸に分解するため、システインを遊離させることができる。具体的には、培養物又はその分画物を、水の存在下で、酸性から中性、具体的にはｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に３〜３００時間保持することにより、システインを生成させることができる。
また、γ−グルタミルシステインを含む培養物又はその分画物をｐＨ３〜９に調整した後、γ−グルタミルペプチド分解酵素（γ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ、グルタミナーゼ等）を加え、１５〜７０℃で１〜３００分作用させることによっても、システインを生成させることができる。
培養に用いる培地は、本発明の酵母が良好に生育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく産生するものであれば特に制限されない。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
培養条件及び酵母エキス等の調製は、通常の酵母の培養、及び酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものでもよいし、酵母菌体を消化したものでもよい。また、本発明の酵母エキスは、熱処理又は酵素処理によりシステインを生成させたものであってもよいし、他の飲食品原料とともに飲食品に加工する際、又は加工後に熱処理されるものであってもよい。
具体的には、酵母エキスの熱処理は次のようにして行うことができる。酵母エキス粉末に水を加え、塩酸でｐＨを５に調整し、濃度２％の水溶液を作製し、これを９８℃で１８０分間加熱する。
上記γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物は、飲食品の製造に用いることができる。飲食品としては、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料が挙げられる。熱処理によるγ−グルタミルシステインからシステインの生成は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。また、飲食品の製造に先立って、酵母の培養物又はその分画物を熱処理してもよい。
上記飲食品は、γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することによって製造される。本発明の飲食品は、前記培養物又は分画物を使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。また、酵母エキスもしくはその濃縮物、またはそれらを乾燥したものは、それ自体で発酵食品調味料として用いることができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  γ−グルタミルシステインを産生するキャンディダ・ユティリスの構築
＜１＞キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードすると予測される遺伝子断片の取得
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９株をＹＰＤ試験管培地で３０℃で振とう培養し、Ｇｅｎとるくん酵母用（宝酒造（株）、Ｃｏｄｅ９０８４）を用いて、菌体から染色体を回収した。
〔ＹＰＤ培地組成〕
グルコース    ２％
ペプトン      ２％
酵母エキス    １％
（ｐＨ５．０）
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、及びラットのグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列（以上、クリスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．，８，１６９９−１７０７，１９９７）から、以下の相同性が高い配列を選定した。
2003080832.tif 000003
各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、▲１▼と▲２▼、▲１▼と▲３▼、▲１▼と▲４▼、▲１▼と▲５▼、▲２▼と▲３▼、▲２▼と▲４▼、▲２▼と▲５▼、▲３▼と▲４▼、▲３▼と▲５▼、及び▲４▼と▲５▼の各々の組み合わせに対応する宿重プライマーを用いて、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、予想される大きさの領域を切り出し、ＤＮＡを回収した。さらに、この回収ＤＮＡを鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行なったが、目的の断片を取得することはできなかった。
次に、以下のアミノ酸配列に対応するプライマーを、キャンディダ・ユティリスのコドン使用頻度を参考に設定した。
2003080832.tif 000004
上記▲６▼のアミノ酸配列に対応するプライマー（ＧＧＴ  ＴＣＹ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＹ  ＣＡＲ  ＣＡ（配列番号９））と、▲７▼のアミノ酸配列に対応するプライマー（ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＹ  ＴＣＴ  ＣＴＹ  ＴＧＴ  ＧＧ（配列番号１０））を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社  コードＬＤＰ−１０１）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。９４℃２分→９４℃１分、５５℃（１サイクル毎に０．５℃づつ温度減少）１分、７４℃４０秒を２２サイクル→９４℃１分、５０℃１分、７４℃４０秒を１５サイクル。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル（Ｎｕｓｉｅｖｅ３：１アガロース３％、１×ＴＡＥ溶液（宝酒造（株）、ＣｏｄｅＦ５１８０Ａ））にて電気泳動を行なった。ゲルをエチジウムブロマイド溶液で染色後、１００ｂｐ〜３００ｂｐに相当する領域を切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ社、ＣｏｄｅＮＰＫ−６０１）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。
この回収ＤＮＡを鋳型として、▲６▼の領域に対応するプライマー（配列番号９）と▲８▼の領域に対応するように設定したプライマー（ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＹＴＣ（配列番号１１））を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行なったところ、１００ｂｐ〜３００ｂｐに相当する領域に、３本のバンドが検出された。ＰＣＲは、前記と同様の条件で行った。これらの３本のバンドを各々切り出し、ゲルからＤＮＡを回収した。各々のバンドを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造（株））を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造（株）、Ｃｏｄｅ９０５２）を形質転換した。得られた形質転換体の一つからキャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードしていると予測される遺伝子断片を含んでいると予測される形質転換体を取得した。形質転換体が持つインサートの塩基配列を常法に従い、決定した。
上記のようにして決定した塩基配列をもとに３’ＲＡＣＥ（３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社、Ｃａｔ．Ｎｏ  １８３７３−０２７）を使用）を行なった。キャンディダ・ユティリスから、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０４）を用いて調製したｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ一次鎖を調製した後、３回のＰＣＲを行った。用いたプライマーは以下のとおりである。
2003080832.tif 000005
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社コードＬＤＰ−１０１）を使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行った。９４℃２分１サイクル→９４℃１分、５０℃３０秒、７４℃４０秒を３０サイクル。
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体が持つインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
以上の操作により判明した情報から、プライマーを設計し（ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＣＡ（配列番号１５）、ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  Ｇ（配列番号１６））、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９より回収した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、増幅産物の塩基配列を決定した。ＰＣＲは、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株）、Ｃｏｄｅ  Ｒ０００５Ａ）を使用して、製造者の指示にしたがい、次の条件で行った。９８℃２分→９８℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を４０サイクル。結果を配列番号１７に示す。この塩基配列によりコードされると予測されるグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。
＜２＞キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットの作製
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９より回収した染色体ＤＮＡを鋳型として、前記配列番号１５及び１６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株））を用いて、製造者の指示にしたがい、次の条件で行った。９８℃２分→９８℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を４０サイクル。
増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、Ｃａｔ．Ｎｏ  ２８１０６）を用い精製し、精製産物の末端にアデニンを付加した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに連結した。アデニンの付加は、ＡｍｐｌｉＴａｑ（ＡＢＩ社、Ｃｏｄｅ  Ｎ８０８−０１６１）を用い、ｄＮＴＰの代わりに２．５ｍＭのｄＡＴＰを使用し、７２℃で１０分間反応させることにより行った。続いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｃａｔａｌｏｇ＃２００５１８）を用いて、部位特異的組換えによりクローニング断片の２箇所の塩基配列を置換し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ切断部位を導入し、ＣＧＳＨ２Ｃｔｅｒｍｉ／ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターを得た。部位特異的組換えに使用したプライマーは以下のとおりである。
〔１度目の変異導入（ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の導入）〕
2003080832.tif 000006
〔２度目の変異導入（ＫｐｎＩ切断部位の導入）〕
2003080832.tif 000007
一方、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９より回収した染色体ＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＵＲＡ３遺伝子を含む断片を増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社コードＬＤＰ−１０１）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。９４℃２分→９４℃１分、５４℃３０秒、７４℃４０秒を３０サイクル。
2003080832.tif 000008
増幅産物をｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターに導入し、ＣＵＲＡ３／ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターを得た。ＣＧＳＨ２Ｃｔｅｒｍｉ／ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクター及びＣＵＲＡ３／ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターを、各々ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩにて切断した。ＣＧＳＨ２Ｃｔｅｒｍｉ／ｐＧＥＭＴ−ＥａｓｙベクターからはＣＧＳＨ２及びｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ本体を含む断片を回収し、ＣＵＲＡ３／ｐＧＥＭＴ−ＥａｓｙベクターからはＣＵＲＡ３を含む断片を回収した。これらの回収断片を連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。このようにして、ＣＵＲＡ３ΔＣＧＳＨ２／ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターを作製した。
ＣＵＲＡ３ΔＣＧＳＨ２／ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターを制限酵素ＮｏｔＩで切断したものを鋳型とし、配列番号１５及び１６に示すプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。こうして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを作製した（図１、２）。
＜３＞ウラシル要求性キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９ｕｒａ−株の取得
常法（Ｌｕｉｓらの手法、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６５（１９９８）３３５−３４０）に従い、ＡＴＣＣ１５２３９由来のウラシル要求性株ＡＴＣＣ１５２３９ｕｒａ−株を取得した。ＡＴＣＣ１５２３９ｕｒａ−株は、後述するようにＵＲＡ３遺伝子によって相補されたことから、ｕｒａ３変異株であると推定される。
＜４＞キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン産生酵母（ＡＴＣＣ１５２３９Δｇｓｈ２株）の取得
まず、ＡＴＣＣ１５２３９ｕｒａ−株をＹＰＤ試験管培地で一晩３０℃で培養した。培養産物をＹＰＤフラスコ培地（坂口フラスコ５００ｍｌ容、５０ｍｌ張り込み）に植菌し、３０℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、４℃に冷やした１Ｍソルビトール溶液で、菌体を３回洗浄した。洗浄菌体を冷やした１Ｍソルビトール溶液に懸濁した。懸濁液に、５０μｌ（２μｇ）のグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを加え、０．２ｃｍキュベット中でよく混合し、エレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ社）を使用、インピーダンス２００Ω、キャパシタンス１２５μＦ、設定電圧１．５ｋＶに設定）を行なった。キュベットに、１ｍｌの冷やした１Ｍソルビトールを注ぎ、キュベットを１０分間氷上で冷却した。菌体懸濁液をＳＤプレートにスプレッドし、３０℃で静地培養した。
プレートに生育してきた株を、ＳＤプレート及び１０ｍＭのメチルグリオキサールを含むＳＤプレートにレプリカし、３０℃で静地培養した。メチルグリオキサールに感受性を示す株を７株選択した。これら７株を各々ＹＰＤ試験管培地で３０℃で一晩振とう培養した。培養液をＳＤ培地（坂口フラスコ５００ｍｌ容、５０ｍｌ張り込み）に２％植菌し、３０℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、滅菌水で２回菌体を洗浄した。洗浄菌体を７０℃１０分の熱水抽出を行い、酵母菌体内のγ−グルタミルシステインを抽出し、ＨＰＬＣにより分離定量した。一方、酵母の乾燥菌体量は、一定培地中に含まれる洗浄酵母菌体を濾紙上に取り、１０５℃で４時間加熱後に残った菌体重量として測定した。このようにして、乾燥酵母菌体あたり１％以上のγ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリス菌株として、ＡＴＣＣ１５２３９Δｇｓｈ２株を取得した。
ＡＴＣＣ１５２３９Δｇｓｈ２株をＳＤ培地に植菌し、３０℃で２日振とう培養した。培養物をＳＤ培地に２％植菌し、３０℃で振とう培養した。７時間後、及び９時間後のγ−グルタミルシステイン含有量を測定したところ、それぞれ１．０８％、及び１．１２％であった。グルタチオンは検出限界以下であった。
＜５＞ＡＴＣＣ１５２３９Δｇｓｈ２株のグルタチオン合成酵素活性の測定
ＡＴＣＣ１５２３９Δｇｓｈ２株をＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で振とう培養した。培養物をＳＤ培地（２Ｌ容フィン付三角フラスコに４００ｍｌ張り込み）に２％植菌し、３０℃で振とう培養した。対数増殖期に菌体を集菌し、４℃に冷やした１Ｍソルビトールで菌体を２回洗浄した。洗浄菌体を０．１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）０．５ｍｌに懸濁した。懸濁液にガラスビーズ（ＧＬＡＳＳ  ＢＥＡＤＳ  ４２５−６００ｍｉｃｒｏｎｓ  Ａｃｉｄ−ｗａｓｈｅｄ（ＳＩＧＭＡ社、コードＧ−８７７２））を加え、ＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ（和研薬株式会社）を用いて細胞を破砕した。細胞の破砕は顕微鏡で確認した。その後、１ｍｌの前記バッファーを加え、遠心操作により、ガラスビーズ及び細胞デブリを取り除いた。このようにして、細胞粗抽出液を得た。細胞粗抽出液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−１５  Ｂｉｏｍａｘ１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｃａｔ．Ｎｏ  ＵＦＶ２ＢＧＣ４０）を用いて精製し、酵素液を得た。酵素液の蛋白量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。発色はプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライ社、Ｃｏｄｅ２９４４９−１５）を用いて行い、５９５ｎｍの吸収を測定した。標準曲線はＡｌｂｕｍｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（ＰＩＥＲＣＥ社、Ｎｏ．２３２１０）を用いて作成した。
このようにして得た、酵素液中のグルタチオン合成酵素活性を、Ｇｕｓｈｉｍａらの方法（Ｇｕｓｈｉｍａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５，２１０（１９８３））にしたがって、以下のようにして測定した。
〔反応液〕
１００ｍＭ  γ−グルタミルシステイン  １００μｌ
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２                １００μｌ
５０ｍＭ  ＡＴＰ                      １００μｌ
１００ｍＭ  Ｇｌｙ                    １００μｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）    ８５．５μｌ
１６０ｍＭ  ＰＥＰ                      １２．５μｌ
１ｍｇ／ｍｌ  ＰＫ                        ２μｌ
酵素液（１〜１０ｍｇ蛋白）
精製水
合計                  ２ｍｌ
ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸（ＳＩＧＭＡ社、Ｃｏｄｅ  Ｐ−７１２７）
ＰＫ  ：ピルビン酸キナーゼ（ＳＩＧＭＡ社、Ｃｏｄｅ  Ｐ−１９０３）
上記組成の反応液を、酵素量１〜１０ｍｇ蛋白の範囲で３０℃で０〜２時間反応させた。メタクリル酸を１／５当量加えて反応を停止させた後、反応液のｐＨを８．０に調整し、生成したＧＳＨ量を定量した。この時の酵素活性は検出限界以下であり、検出されなかった。
次に、ＡＴＣＣ１５２３９Δｇｓｈ２株の親株であるＡＴＣＣ１５２３９株のグルタチオン合成酵素活性を同様にして測定した。その結果、ＡＴＣＣ１５２３９株のグルタチオン合成酵素活性は０．３８３μｍｏｌ−ＧＳＨ／ｍｇ蛋白／時間であった。
実施例２  γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の取得
＜１＞γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログの取得
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベのγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列（Ｏｈｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｙｅａｓｔ  １９９１  Ｄｅｃ；７（９）：９５３−９６１）、Ｍｕｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１９９５  Ｆｅｂ；１１７（２）：２８３−２８８）から、以下の相同性が高い配列を選定した。
2003080832.tif 000009
各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲを行なった。▲１▼の領域に相当するプライマーとして、プライマーＦ１（ＡＴＧ  ＧＧＮ  ＴＴＹ  ＧＧＮ  ＡＴＧ  ＧＧ）（配列番号２７）を、▲２▼の領域に相当するプライマーとしてプライマーＲ１（ＲＡＡ  ＹＴＣ  ＮＡＣ  ＮＣＫ  ＣＣＡ）（配列番号２８）を設計した。ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ  ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて製造者の指示に従ってＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は９４℃３分を１サイクル→９４℃１分，５２℃１分，７４℃１分を３０サイクルで行なった。
ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、予想される大きさの約７００ｂｐに相当する領域を切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ社、ＣｏｄｅＮＰＫ−６０１）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。
さらに、この回収ＤＮＡを鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは前述と同様にして行った。増幅産物をアガロースゲルにて電気泳動後エチジウムブロマイド溶液で染色し、約７００ｂｐに相当する領域を切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒを用いてゲルからＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造（株））を用いてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体の一つから、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードすると予想される遺伝子断片を含んでいると推測される形質転換体を取得した。形質転換体が持つインサートの塩基配列を常法に従い、決定した。
上記のようにして決定した塩基配列をもとに３’ＲＡＣＥ（３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社））を行なった。キャンディダ・ユティリスから、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して調製したｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ一次鎖を合成した後、３回のＰＣＲを行なった。
用いたプライマーは以下の通りである。
2003080832.tif 000010
2003080832.tif 000011
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ｄａｓｈを使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。９４℃２分１サイクル→９４℃１分、５０℃３０秒、７４℃４０秒を３０サイクル。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
次に、これまでに判明している塩基配列を元に、５’ＲＡＣＥを行った。キットは５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）を用いた。
ｃＤＮＡ一次鎖調製のためのＲＴ（逆転写）に用いたプライマーは以下の通りである。ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  Ｃ（配列番号３２）
製造者の指示に従って作製したｃＤＮＡライブラリーより、以下のプライマーを用いて３回のＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ｄａｓｈを使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。９４℃２分１サイクル→９４℃１分、５０℃３０秒、７４℃４０秒を３０サイクル。
用いたプライマーは以下の通りである。
2003080832.tif 000012
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。他の生物の相同性より全長をクローニングしていないと考え、更に５’ＲＡＣＥを行なった。
ｃＤＮＡ一次鎖調製のためのＲＴに用いたプライマーは以下の通りである。
ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＧＴＴ（配列番号３６）
製造者の指示に従って作製したｃＤＮＡライブラリーより、以下のプライマーを用いて３回のＰＣＲを行なった。
用いたプライマーは以下の通りである。
2003080832.tif 000013
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
以上のようにして判明した情報から、プライマーを設計し、ＰＣＲを行い、増幅産物の塩基配列を決定した。ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。９８℃２分→９８℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を４０サイクル。
用いたプライマーは以下のとおりである。
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このようにして増幅したＰＣＲ産物の塩基配列を常法に従って決定した。結果を配列番号４２に示す。また、この塩基配列によりコードされると予測されるγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号４３に示す。このようにして、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログを取得した。
実施例３  サッカロマイセス・セレビシエにおけるγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現
＜１＞グルタチオン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエ
グルタチオン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエとして、国際公開ＷＯ  ２００１／０９０３１０号パンフレットに記載のサッカロマイセス・セレビシエＮα３株を用いた。
Ｎα３株は、サッカロマイセス・セレビシエのウラシル要求性酵母一倍体であるＮα１株（国際公開ＷＯ  ２００１／０９０３１０号パンフレットに記載）を親株として、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換株として構築された菌株である。
＜２＞γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエの取得
（１）ＧＳＨ１遺伝子置換カセットの作製
まず、前記Ｎα１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（配列番号４４）の中流領域から末端領域までをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ  ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。下記に示す組成の反応液を用いて、９４℃１分の後、９４℃３０秒、６０℃４０秒、７４℃１分を３０サイクル繰り返すことにより行った。プライマーはＧＦ１（ｇｔｇ  ｇａｃ  ｇａｃ  ｃｇｔ  ａｃｔ  ｃｃｇ  ａａｇ）（配列番号４６）及びＧＲ１（ａｃｃ  ｃａａ  ａｔｃ  ｇａｔ  ａａｔ  ｇｔｃ  ａａｃ）（配列番号４７）を用いた。
上記のようにして増幅したＧＳＨ１遺伝子断片を、製造者の指示に従ってプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に連結し、ＧＳＨ１ｄａｓｈ／ｐＧＥＭを得た。
次に、部位特異的変異法により、ＧＳＨ１ｄａｓｈ／ｐＧＥＭに含まれるγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（配列番号４４）の、同遺伝子がコードするγ−グルタミルシステイン合成酵素（配列番号４５）の３７２番目、３７３番目に対応するアミノ酸セリン及びリジンに対応するコドンを終止コドンに置換した。この操作は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーはＱＣＦ１（ｃｔｔ  ｔｔｃ  ｔｔｇ  ｇｇｔ  ｇｇｇ  ｔａｇ  ｔａａ  ｔｔｔ  ｔｔｃ  ａａｔ  ａｇｇ  ａｃｔ）（配列番号４８）、ＱＣＲ１（ａｇｔ  ｃｃｔ  ａｔｔ  ｇａａ  ａａａ  ｔｔａ  ｃｔａ  ｃｃｃ  ａｃｃ  ｃａａ  ｇａａ  ａａｇ）（配列番号４９）を用いた。このようにしてプラスミドＧＳＨ１Ｍｄａｓｈ／ｐＧＥＭを作製した。
上記のようにして変異が導入されたγ−グルタミルシステイン合成酵素（弱化型グルタチオン合成酵素）は、微弱な酵素活性を保持している（国際公開ＷＯ  ２００１／０９０３１０号パンフレット）。
次に、国際公開ＷＯ２００１／０９０３１０号パンフレットに記載のプラスミドｐＹＥＳ２ｄａｓｈ（プラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から２μｏｒｉを除去したプラスミド）、及び前記ＧＳＨ１Ｍｄａｓｈ／ｐＧＥＭを、いずれも制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩで切断し、ｐＹＥＳ２ｄａｓｈからはＵＲＡ３遺伝子を含む断片を、ＧＳＨ１Ｍｄａｓｈ／ｐＧＥＭからはγ−グルタミルシステイン合成酵素の部分遺伝子配列を含む領域を切り出し、これらを連結した。このようにしてプラスミドＧＳＨ１Ｍｄａｓｈ／ｐＹＥＳ２ｄａｓｈを作製した。ＧＳＨ１Ｍｄａｓｈ／ｐＹＥＳ２ｄａｓｈを制限酵素ＢｂｅＩで切断し、遺伝子置換カセットを得た（図３）。
（２）γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子置換株の構築
上記のようにして作製した遺伝子置換カセットを用いて、Ｎα１株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。Ｎα１株を前培養した後に、培養物を５０ｍｌのＹＰＤ培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を１Ｍソルビトールに懸濁し、遺伝子置換カセットを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤプレートで培養し、生育する株を選択した。遺伝子置換カセットが染色体上の目的の位置に組み込まれたことをＰＣＲによって確認し、得られた株をＮα４中間体とした。次に、変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のみを染色体上に残す為、以下の操作を行った。Ｎα４中間体を１ｍＭのグルタチオンを添加したＹＰＤ培地で培養し、培養産物を１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤＦＯＡプレートに蒔いた。プレート上に生育してきた株のグルタチオン合成酵素遺伝子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換されていることを確認し、Ｎα４株を得た（図４）。
（３）Ｎα４株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性弱化の確認
次に、上記のように取得したＮα４株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が弱化しているか否か調べた。大竹らは、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株より変異処理により取得したＹＨ１株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を測定しており（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ５４（１２）３１４５−３１５０，１９９０）、その方法に準じて活性を測定した。その結果、Ｎα４株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性は検出限界以下であった。次に、Ｎα４株をＳＤ培地で培養し、対数増殖期の細胞内のγ−グルタミルシステイン及びグルタチオン含有量を測定したが、γ−グルタミルシステインは検出されず、グルタチオンは０．０１％であった。また、Ｎα４株は２ｍＭのメチルグリオキサールに感受性を示したことから、ＹＨ１株と同様にγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子が置換されていることが確認された。
＜２＞キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログのＯＲＦ領域を増幅した。ＰＣＲは、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造）を用いて製造者の指示に従って次の条件で行った。９８℃２分→９８℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を４０サイクル。Ｎ末端側には制限酵素ＫｐｎＩ切断部位を付加したプライマーＣＧＳＨ１Ｆ１（ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＡＣ）（配列番号５０）を、Ｃ末端側にはＸｂａＩ切断部位ＣＧＳＨ１Ｒ１（ＣＣＣ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  Ｃ）（配列番号５１）をそれぞれ用いて前記の条件でＰＣＲを行い、増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物及びｐＡＵＲ１２３ベクター（宝酒造）を、各々制限酵素ＫｐｎＩ、ＸｂａＩで切断した後連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換した。このようにしてＣＧＳＨ１／ｐＡＵＲ１２３ベクターを作製した。次に、ＣＧＳＨ１／ｐＡＵＲ１２３ベクター及びｐＹＥＳ２ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。ＣＧＳＨ１／ｐＡＵＲ１２３ベクターからはＣＧＳＨ１のＯＲＦとｐＡＵＲ１２３ベクター由来のプロモーターを含む領域を回収し、切断末端を脱リン酸化したｐＹＥＳ２ベクターと連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換した。このようにして、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターＣＧＳＨ１／ｐＹＥＳ２ベクターを作製した（図５）。
＜３＞相補実験
次に、ＣＧＳＨ１／ｐＹＥＳ２ベクターをＮα３株及びＮα４株に導入した形質転換体を取得した。Ｎα３株又はＮα４株を前培養した後に、培養物を５０ｍｌの液体培地（１ｍＭのグルタチオンを含有するＹＰＤ培地）に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を１Ｍソルビトールに懸濁し、ＣＧＳＨ１／ｐＹＥＳ２ベクターを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換株を１ｍＭのグルタチオンを含むＳＤプレートで培養し、生育する株を選択した。Ｎα３株及びＮα４株はウラシル要求性を示し、ＣＧＳＨ１／ｐＹＥＳ２ベクターを含有する場合のみＳＤ培地で生育することができる。得られた形質転換体がＣＧＳＨ１／ｐＹＥＳ２ベクターを含有することを常法により確認した。
このようにして、形質転換体Ｎα３／ＣＧＳＨ１及びＮα４／ＣＧＳＨ１株を取得した。Ｎα３／ＣＧＳＨ１は２ｍＭのメチルグリオキサールに感受性を示したが、Ｎα４／ＣＧＳＨ１株は２ｍＭのメチルグリオキサールに感受性を示さなかった。また、ＳＤ培地で培養したとき、その対数増殖期にＮα３／ＣＧＳＨ１株はグルタチオンをほとんど含有しなかったが、Ｎα４／ＣＧＳＨ１株はグルタチオンを０．４％含有していた。Ｎα３株はサッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素に変異が生じグルタチオン合成力が低下しているが、Ｎα４株はサッカロマイセス・セレビシエのγ−グルタミルシステイン合成酵素に変異が生じグルタチオン合成力が低下していることから、ＣＧＳＨ１はサッカロマイセス・セレビシエのγ−グルタミルシステイン合成酵素を相補することが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、γ−グルタミルシステインを高含有するキャンディダ・ユティリスが提供される。本発明のキャンディダ・ユティリスを用いることにより、食品の風味改善等の用いることのできる酵母エキスを、安価に製造することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットの構築（前半）を示す図である。
図２は、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットの構築（後半）を示す図である。
図３は、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子置換カセットの構築を示す図である。
図４は、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子置換株の構築を示す図である。
図５は、キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターの構築を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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