(57)【要約】ポストゲノム研究の構造および機能解析研究をハイスループットに行うツールとして、蛋白質の合成を効率的に行える翻訳テンプレートを提供する。翻訳テンプレートは、コード部のみ、またはコード部とＰＥＧ部から構成され、そのコード部の３’末端に、アクセプター領域と、アクセプター領域の５’上流の、配列ＳＮＮＳを含む翻訳増強配列とを持つ場合は、そのＰＥＧ部は蛋白質とペプチジル転移反応により結合できないものであることが蛋白質の合成に用いるのに有利であり、そのコード部の３’末端にアクセプター領域を持つ場合は、そのＰＥＧ部は蛋白質とペプチジル転移反応により結合できるものであることが対応付けに用いるのに有利である。これらの翻訳テンプレートによって合成された蛋白質、Ｃ末端修飾蛋白質、および対応付け分子も提供し、これらＣ末端修飾蛋白質の修飾剤および対応付け分子のＰＥＧ部に機能性修飾を持たせることも可能である。
2003106675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質に翻訳される情報を持つＯＲＦ領域およびその３’末端領域を有し、３’末端領域は、アクセプター領域と、アクセプター領域の５’上流に、配列ＳＮＮＳを含む翻訳増強配列とを含むことを特徴とするコード分子。
【請求項２】
アクセプター領域が、長さ２〜１０塩基のポリＡ配列を含むことを特徴とする請求項１記載のコード分子。
【請求項３】
Ｘ配列がＳＮＮＳ配列であることを特徴とする請求項１または２記載のコード分子。
【請求項４】
Ｘ配列がＸｈｏＩ配列であることを特徴とする請求項１または２記載のコード分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載されたコード分子のライブラリー。
【請求項６】
蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結するためのドナー領域を持つＰＥＧスペーサー部を含み、コード部が請求項１〜４のいずれか１項に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
【請求項７】
スペーサー部が、コード部と連結するためのドナー領域、およびポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つことを特徴とするＰＥＧスペーサー分子に由来する請求項６記載の翻訳テンプレート。
【請求項８】
ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする請求項７記載の翻訳テンプレート。
【請求項９】
ＣＣＡ領域が、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする請求項７記載の翻訳テンプレート。
【請求項１０】
ＣＣＡ領域にピューロマイシンを有することを特徴とする請求項９記載の翻訳テンプレート。
【請求項１１】
ドナー領域に機能付与ユニットＦ１および／またはＣＣＡ領域に機能付与ユニットＦ２を含むことを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載の翻訳テンプレート。
【請求項１２】
機能付与ユニットＦ１および／またはＦ２が、該翻訳テンプレートを固定化および／または蛍光ラベル化するものであることを特徴とする請求項１１に記載の翻訳テンプレート。
【請求項１３】
機能付与ユニットＦ１および／またはＦ２がビオチンであることを特徴とする請求項１２記載の翻訳テンプレート。
【請求項１４】
機能付与ユニットＦ１および／またはＦ２が、フルオレセイン、Ｃｙ５、またはローダミングリーンであることを特徴とする請求項１２記載の翻訳テンプレート。
【請求項１５】
請求項６〜１４のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートのライブラリー。
【請求項１６】
請求項６〜１４のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートがリボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
【請求項１７】
請求項１５に記載された翻訳テンプレートのライブラリーがリボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
【請求項１８】
請求項６〜１４のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートが、修飾部と、ピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部と、それらを連結するヌクレオチドのリンカーとを含む、蛋白質のＣ末端を標識する修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
【請求項１９】
修飾部において、少なくとも１つの機能付与ユニットＦ３を含むことを特徴とする請求項１８に記載の蛋白質。
【請求項２０】
機能付与ユニットＦ３が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする請求項１９記載の蛋白質。
【請求項２１】
機能付与ユニットＦ３がビオチンであることを特徴とする請求項２０記載の蛋白質。
【請求項２２】
機能付与ユニットＦ３が、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーンであることを特徴とする請求項２０記載の蛋白質。
【請求項２３】
請求項１５に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、修飾部と、ピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部と、それらを連結するヌクレオチドのリンカーとを含む、蛋白質のＣ末端を標識する修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
【請求項２４】
修飾部において、少なくとも１つの機能付与ユニットＦ３を含むことを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質のライブラリー。
【請求項２５】
機能付与ユニットＦ３が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする請求項２４記載の蛋白質のライブラリー。
【請求項２６】
機能付与ユニットＦ３がビオチンであることを特徴とする請求項２５記載の蛋白質のライブラリー。
【請求項２７】
機能付与ユニットＦ３が、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーンであることを特徴とする請求項２５記載の蛋白質のライブラリー。
【請求項２８】
蛋白質に翻訳される情報を持つＯＲＦ領域およびその３’末端領域を有し、３’末端領域は、長さ２〜１０塩基のポリＡ配列を含むアクセプター領域を含むことを特徴とするコード分子。
【請求項２９】
請求項２８に記載されたコード分子のライブラリー。
【請求項３０】
蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結するためのドナー領域を持つＰＥＧスペーサー部を含み、コード部が請求項２８に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
【請求項３１】
スペーサー部が、コード部と連結するためのドナー領域、およびポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つことを特徴とするＰＥＧスペーサー分子に由来する請求項３０記載の翻訳テンプレート。
【請求項３２】
ＣＣＡ領域が、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とする請求項３１記載の翻訳テンプレート。
【請求項３３】
ＣＣＡ領域にピューロマイシンを有することを特徴とする請求項３２記載の翻訳テンプレート。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートのライブラリー。
【請求項３５】
請求項３０〜３３のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートが、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
【請求項３６】
請求項３４に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
【請求項３７】
コード部を持たないことを特徴とする請求項３５記載の蛋白質。
【請求項３８】
蛋白質がコード部を持たないことを特徴とする請求項３６記載の蛋白質のライブラリー。
【請求項３９】
請求項３７に記載された蛋白質または請求項３８記載のライブラリーにおけるコード部を、ＲＮａｓｅによって切断することを特徴とする蛋白質またはそのライブラリーの製造法。
【請求項４０】
請求項１６、１８〜２３、３５および３７のいずれか１項に記載の蛋白質、または、請求項１７、２３〜２７、３６および３８のいずれか１項に記載の蛋白質のライブラリーと物質を相互作用させて相互作用を解析することを含む、蛋白質と物質の相互作用解析方法。
【請求項４１】
相互作用の解析が、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、または、固相酵素免疫検定法により行われる、請求項４０記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
【請求項４２】
請求項３５に記載の蛋白質、または、請求項３６記載の蛋白質のライブラリーにおいて、該蛋白質のＣ末端に結合したコード部の塩基配列の増幅により蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
【請求項４３】
無細胞共翻訳法または無細胞共翻訳スクリーニング法を用いることを特徴とする請求項４２記載の蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
【請求項４４】
相互作用の解析において、翻訳テンプレートとそのライブラリーを蛍光ラベル化および／または固定化することを特徴とする、請求項４１記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
【請求項４５】
相互作用の解析において、蛋白質とそのライブラリーを蛍光ラベル化および／または固定化することを特徴とする、請求項４０記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
【請求項４６】
相互作用の解析において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質と物質の相互作用を解析する請求項４０載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
【請求項４７】
相互作用の解析において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで共翻訳法を利用することを特徴とする請求項４６記載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
【請求項４８】
請求項１〜４および２８のいずれか１項に記載されたコード分子もしくは請求項６〜１４および３０〜３３のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートまたはそのライブラリーをリボソーム上で翻訳することを含む蛋白質またはそのライブラリーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第２幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析（Ｓａｅｇｕｓａ  Ａ．Ｊａｐａｎ  ｂｏｏｓｔｓ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．．．Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，６７５１（１９９９），Ｄａｌｔｏｎ  Ｒ，Ａｂｂｏｔｔ  Ａ．Ｃａｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ  ｆｉｎｄ  ｒｅｃｉｐｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｐｓ？  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，６７６３（１９９９））、および蛋白質間、核酸−蛋白質間相互作用解析などが期待されている（宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１４５；宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７）。これらの構造および機能解析には、蛋白質の大量発現が重要となってくる。蛋白質の大量発現が可能な無細胞翻訳系とともに、蛋白質の大量発現が可能で安定な翻訳テンプレートの開発が所望されている（白水美香子、木川隆則、横山茂之（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１９７−２０５）。
ポストゲノム機能解析によって、重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創製など、医療、食料、エネルギー、環境など多くの分野の産業の基本ツールとして積極的に利用可能である。
背景技術
ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、蛋白質の合成工程であり、さまざまな生物種のゲノムやｃＤＮＡから一万種類以上の蛋白質を発現させねばならない。そのためには、ハイスループットで強力な無細胞翻訳系が開発されてきた。大腸菌内での発現方法と比較した利点は、（１）発現ベクターにクローニングすることなく、直線状ＤＮＡ断片や転写したｍＲＮＡから直接目的の蛋白質が発現可能、（２）短時間の反応で大量発現が可能、（３）凝集しやすい性質や毒性を持つような発現の難しい蛋白質も生産可能、などが挙げられる。
これまで、無細胞翻訳系として小麦胚芽の系（Ｍａｄｉｎ  Ｋ，Ｓａｗａｓａｋｉ  Ｔ，Ｏｇａｓａｗａｒａ  Ｔ，Ｅｎｄｏ  Ｙ．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ  ｅｍｂｒｙｏｓ：ｐｌａｎｔｓ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｃｏｎｔａｉｎ  ａ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｔ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０００  Ｊａｎ  １８；９７（２）：５５９−６４．）、および大腸菌の系（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｙ，Ｉｎｏｕｅ  Ａ，Ｔｏｍａｒｉ  Ｙ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，Ｙｏｋｏｇａｗａ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，Ｕｅｄａ  Ｔ．Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１  Ａｕｇ；１９（８）：７５１−５．）において、蛋白質の大量発現が研究されてきている。それに伴い、蛋白質の大量発現が可能な安定した翻訳テンプレートの開発として、ｍＲＮＡの安定性向上と翻訳効率向上のために、一般的には３’ＵＴＲが使われるが（Ｓａｃｈｓ  Ａ．Ｂ．，Ｓａｒｎｏｗ  Ｐ．，ａｎｄ  Ｈｅｎｔｚｗ  Ｍ．Ｗ．Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ，Ｍｉｄｄｌｅ，ａｎｄ  Ｅｎａ；Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，８３１−８３８）、ｍＲＮＡの化学構造の置換や修飾などの方法（Ｕｅｄａ  Ｔ，Ｔｏｈｄａ  Ｈ，Ｃｈｉｋａｚｕｍｉ  Ｎ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ．，Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．１９９１；（２５）：１５１−２．）を用いることなどが考案されている。
また、ポストゲノム機能解析研究のために開発されてきたいろいろな解析ツールにも無細胞翻訳系による蛋白質合成が重要な役割を占めている。その主なものを以下に挙げる。いずれも、蛋白質の大量発現が不可欠である。
分子間相互作用の検出方法として、これまで表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光偏光解消法、エバネッセント場イメージング法、蛍光相関分光法、蛍光イメージング法、固相酵素免疫検定法などが知られている。とりわけ、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）は、測定に必要な試料量が少なく（およそフェムトリットル）、測定時間が短く（およそ１０秒）、ＨＴＳのための自動化が容易である（実際にＥＶＯＴＥＣ社では１日で１０万検体以上のスクリーニングを行うウルトラＨＴＳを目指した装置の開発を行なっている）等の長所があり、検出系として優れている（金城政孝（１９９９）蛋白質核酸酵素４４：１４３１−１４３８）。さらに２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）では、１種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同程度の大きさをもつ分子間の相互作用も検出が可能であり、タンパク質相互作用のＨＴＳへの応用が期待されている。
一般に、タンパク質相互作用の検出系では、固相化のためのタグや蛍光色素等のプローブでタンパク質を修飾する必要がある。本発明者等は、ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中でタンパク質のＣ末端を修飾する方法を先に提案している（特開平１１−３２２７８１、特開２０００−１３９４６８）。この方法は、従来の化学修飾法や蛍光タンパク質融合法に比べて、タンパク質の機能を損ないにくい等の利点がある。
一方、進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」を応用して、ポストゲノム機能解析における蛋白質間相互作用を網羅的に解析する方法として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｉｖａ  Ｏｒｉｇｉｎｏ  ２５，３５（１９９７），Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ：Ｂｏｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７），ＷＯ９８／１６６３６）、ＳＴＡＢＬＥ法（Ｄｏｉ  Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ  Ｈ．ＳＴＡＢＬＥ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５７，２２７（１９９９））、ファージディスプレー法（Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８，１３１５（１９８５））、リボソーム・ディスプレイ法（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，９０２２−９０２６，Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．＆  Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９９５）ＷＯ９５／１１９２２））、ｍＲＮＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｕｓｉｏｎ（ｍＲＮＡ  ｄｉｓｐｌａｙ）法（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７）などである。
発明の開示
ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、蛋白質の合成工程であり、さまざまな生物種のゲノムやｃＤＮＡから一万種類以上の蛋白質を発現させねばならない。その目的で、ハイスループットで強力な無細胞翻訳系が開発されてきた。大腸菌内での発現方法と比較した利点は、（１）発現ベクターにクローニングすることなく、直線状ＤＮＡ断片や転写したｍＲＮＡから直接目的の蛋白質が発現可能、（２）短時間の反応で大量発現が可能、（３）凝集しやすい性質や毒性を持つような発現の難しい蛋白質も生産可能、などが挙げられる。ここで、ｍＲＮＡの安定性向上と翻訳効率向上のために一般的に３’ＵＴＲが使われるが（Ｓａｃｈｓ  Ａ．Ｂ．，Ｓａｒｎｏｗ  Ｐ．，ａｎｄ  Ｈｅｎｔｚｗ  Ｍ．Ｗ．Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ，Ｍｉｄｄｌｅ，ａｎｄ  Ｅｎａ；Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，８３１−８３８）、３’ＵＴＲは数百ベースと長いので、ＰＣＲで簡単にプライミングでつけることは出来ない。そこで、せっかく無細胞翻訳系を利用するのに３’ＵＴＲを持つベクターに組み込んで利用することになる（Ｍａｄｉｎ  Ｋ，Ｓａｗａｓａｋｉ  Ｔ，Ｏｇａｓａｗａｒａ  Ｔ，Ｅｎｄｏ  Ｙ．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ  ｅｍｂｒｙｏｓ：ｐｌａｎｔｓ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｃｏｎｔａｉｎ  ａ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｔ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０００  Ｊａｎ  １８；９７（２）：５５９−６４．）。しかしながら、最近の研究で３’ＵＴＲの機能は翻訳量の調節にあることがわかってきており（Ｂｏｕｃｈｅｒ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｆ  ｓｔａｇｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ３’ＵＴＲ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２  Ｍａｒ  ２３；［ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）、一概に翻訳を増加させるだけではなく抑制する場合も考えられるなどの問題点も抱えている。また、ｍＲＮＡの化学構造の置換や修飾などの方法（Ｕｅｄａ  Ｔ，Ｔｏｈｄａ  Ｈ，Ｃｈｉｋａｚｕｍｉ  Ｎ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ．，Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．１９９１；（２５）：１５１−２．）では、化学構造を置換した材料が高価であったり、安定性は得られるが、翻訳に支障を来す可能性があるなどの問題点が挙げられる。
本発明の目的は、以上の問題を解決するために、作成方法が簡単で安定でかつ高効率に蛋白合成を行える翻訳テンプレートを提供することである。この翻訳テンプレートによって、ポストゲノム構造および機能解析をハイスループットに行うことが出来る。また、この翻訳テンプレートの利用により、Ｃ末端ラベル化蛋白質（Ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ，ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｔｏ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ，２００１，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，２２８，９９４，Ｈ．Ｙａｎａｇａｗａ，Ｎ．Ｎｅｍｏｔｏ，Ｅ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ）による蛋白質の相互作用解析、および対応付け分子（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｉｚｅｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ，１９９８，ＰＣＴ／ＪＰ９７／０３７６６（ＷＯ９８／１６６３６）Ｈ．Ｙａｎａｇａｗａ，Ｎ．Ｎｅｍｏｔｏ，Ｅ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｆｕｓｉｍｉ）によるゲノム機能解析、進化分子工学への応用などの解析能力を従来よりもいっそう向上させることが出来る。
本発明の第一の発明は、蛋白質に翻訳される情報を含むコード部の３’末端にＰＥＧスペーサー部をライゲーションした翻訳効率の高い翻訳テンプレートとその合成方法であり、そのＰＥＧスペーサー部に機能性修飾物質を持たせることが可能な構成を特徴とし、およびそのテンプレートによって合成された蛋白質やそのライブラリーを提供するものである。また、第二の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートを用いて合成されたＣ末端ラベル化蛋白質とその合成方法であり、特に、翻訳テンプレートのコード部の３’末端に特別な配列（ＸＡ配列）を用いることが特徴であり、また、そのＣ末端修飾剤に機能性修飾物質を持たせることが可能な構成を特徴とし、およびそのテンプレートによって合成されたＣ末端修飾された蛋白質とそのライブラリーを提供するものである。第三の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートを用いて合成された翻訳テンプレートＣ末端修飾された蛋白質（対応付け分子）またはＰＥＧスペーサー部でＣ末端修飾された蛋白質、とそれらの合成方法であり、特に、翻訳テンプレートのコード部の３’末端に特別な配列（Ａ配列）を用いることが特徴であり、また、そのＰＥＧスペーサー部に機能性修飾物質を持たせることが可能な構成を特徴とし、およびそのテンプレートによって合成されたＣ末端修飾された蛋白質とそのライブラリーを提供するものである。
本発明の第一の発明は、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなることを特徴とする翻訳テンプレートに関するものである。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の３’末端領域にアクセプター領域（Ａ配列）を持つ、または、コード部の３’末端領域にアクセプター領域（Ａ配列）を持ち、かつＡ配列の５’上流に翻訳増強配列（Ｘ配列）を持つことを特徴とする。コード部のＡ配列として、短いポリＡ配列を含む。Ｘ配列として、Ｃ（またはＧ）ＮＮＣ（またはＧ）配列を有する配列、たとえば、ＸｈｏＩ配列を有することを特徴とする。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、コード部と連結するためのドナー領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つ。ＰＥＧスペーサー部は、ドナー領域のみ、ＣＣＡ領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域を含む構成をとる。ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とし得る。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量は、４００以上であることを特徴とし得る。また、ドナー領域および／またはＣＣＡ領域において、少なくとも１つの機能付与ユニット（Ｆ）を含むことを特徴とし得る。機能付与ユニット（Ｆ１および／またはＦ２）が、該翻訳テンプレートおよび／または該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これらのコード分子や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。翻訳テンプレートはコード部のみからなるもの（コード分子）であってもよい。
本発明の第二の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートにより翻訳され、修飾剤によってＣ末端ラベル化された蛋白質に関するものである。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧスペーサー部からなる。コード部は、Ａ配列とＸ配列を有し、Ａ配列として、短いポリＡ配列を含む。Ｘ配列として、Ｃ（またはＧ）ＮＮＣ（またはＧ）配列を有する配列、たとえば、ＸｈｏＩ配列を有することを特徴とする。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および／またはＣＣＡ領域において、少なくとも１つの機能付与ユニット（Ｆ）を含むことを特徴とし得る。ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とし得る。機能性修飾物質（Ｆ１および／またはＦ２）が、該翻訳テンプレートおよび／または該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。また、修飾剤は、蛋白質のＣ末端を標識する修飾部とピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部、およびそれらを連結するヌクレオチドのリンカー、からなる。また、修飾剤は、修飾部に、機能性修飾物質（Ｆ３）を含むことを特徴とし得る。該Ｆ３が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質および蛋白質のライブラリーに関するものである。
本発明の第三の発明は、翻訳テンプレートによってＣ末端修飾された蛋白質（＝対応付け分子）に関するものである。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなる。コード部の３’末端にＡ配列を有し、Ａ配列は、短いポリＡ配列を含む。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および／またはＣＣＡ領域において、少なくとも１つの修飾物質（Ｆ１および／またはＦ２）を含むことを特徴とし得る。また、ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはＣＣＡ領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質（Ｆ１および／またはＦ２）が、該翻訳テンプレートおよび／または該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝対応付け分子）および蛋白質（＝対応付け分子）のライブラリーに関するものである。
これら３つの発明を応用した発明として、コード分子および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーを用いて、無細胞翻訳系、および細胞での蛋白質の大量合成が可能であり、蛋白質の構造と機能解析が実現できる。また、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝蛋白質、Ｃ末端ラベル化蛋白質、対応付け分子）およびそのライブラリーのいろいろな組み合わせを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質と物質の相互作用解析が可能である。たとえば、対応付け分子は、分子進化工学的な機能物質の創製やゲノム機能解析に利用できる（図４）。蛋白質と物質の相互作用解析において、翻訳テンプレートとそのライブラリーおよび／または蛋白質とそのライブラリーを蛍光ラベル化および／または固定化することを特徴とする蛋白質と物質の相互作用解析も可能である（図５）。たとえば、各種のアフィニティー・スクリーニング、マイクロアレイやプロテインチップは、固定化の例であり、ＦＣＣＳ解析などは、蛍光ラベル化の例である（図５）。以上の解析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。
本発明は、より詳細には、以下のものを提供する。
１．  蛋白質に翻訳される情報を持つＯＲＦ領域およびその３’末端領域を有し、３’末端領域は、アクセプター領域と、アクセプター領域の５’上流に、配列ＳＮＮＳを含む翻訳増強配列とを含むことを特徴とするコード分子。
２．  アクセプター領域が、長さ２〜１０塩基のポリＡ配列を含むことを特徴とする１記載のコード分子。
３．  Ｘ配列がＳＮＮＳ配列であることを特徴とする１または２記載のコード分子。
４．  Ｘ配列がＸｈｏＩ配列であることを特徴とする１または２記載のコード分子。
５．  １〜４のいずれか１項に記載されたコード分子のライブラリー。
６．  蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結するためのドナー領域を持つＰＥＧスペーサー部を含み、コード部が１〜４のいずれか１項に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
７．  スペーサー部が、コード部と連結するためのドナー領域、およびポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つことを特徴とするＰＥＧスペーサー分子に由来する６記載の翻訳テンプレート。
８．  ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする７記載の翻訳テンプレート。
９．  ＣＣＡ領域が、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする７記載の翻訳テンプレート。
１０．  ＣＣＡ領域にピューロマイシンを有することを特徴とする９記載の翻訳テンプレート。
１１．  ドナー領域に機能付与ユニットＦ１および／またはＣＣＡ領域に機能付与ユニットＦ２を含むことを特徴とする７〜１０のいずれか１項に記載の翻訳テンプレート。
１２．  機能付与ユニットＦ１および／またはＦ２が、該翻訳テンプレートを固定化および／または蛍光ラベル化するものであることを特徴とする１１に記載の翻訳テンプレート。
１３．  機能付与ユニットＦ１および／またはＦ２がビオチンであることを特徴とする１２記載の翻訳テンプレート。
１４．  機能付与ユニットＦ１および／またはＦ２が、フルオレセイン、Ｃｙ５、またはローダミングリーンであることを特徴とする１２記載の翻訳テンプレート。
１５．  ６〜１４のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートのライブラリー。
１６．  ６〜１４のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートがリボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
１７．  １５に記載された翻訳テンプレートのライブラリーがリボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
１８．  ６〜１４のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートが、修飾部と、ピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部と、それらを連結するヌクレオチドのリンカーとを含む、蛋白質のＣ末端を標識する修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
１９．  修飾部において、少なくとも１つの機能付与ユニットＦ３を含むことを特徴とする１８に記載の蛋白質。
２０．  機能付与ユニットＦ３が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする１９記載の蛋白質。
２１．  機能付与ユニットＦ３がビオチンであることを特徴とする２０記載の蛋白質。
２２．  機能付与ユニットＦ３が、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーンであることを特徴とする２０記載の蛋白質。
２３．  １５に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、修飾部と、ピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部と、それらを連結するヌクレオチドのリンカーとを含む、蛋白質のＣ末端を標識する修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
２４．  修飾部において、少なくとも１つの機能付与ユニットＦ３を含むことを特徴とする２３に記載の蛋白質のライブラリー。
２５．  機能付与ユニットＦ３が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする２４記載の蛋白質のライブラリー。
２６．  機能付与ユニットＦ３がビオチンであることを特徴とする２５記載の蛋白質のライブラリー。
２７．  機能付与ユニットＦ３が、フルオレセイン，Ｃｙ５，またはローダミングリーンであることを特徴とする２５記載の蛋白質のライブラリー。
２８．  蛋白質に翻訳される情報を持つＯＲＦ領域およびその３’末端領域を有し、３’末端領域は、長さ２〜１０塩基のポリＡ配列を含むアクセプター領域を含むことを特徴とするコード分子。
２９．  ２８に記載されたコード分子のライブラリー。
３０．  蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結するためのドナー領域を持つＰＥＧスペーサー部を含み、コード部が２８に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
３１．  スペーサー部が、コード部と連結するためのドナー領域、およびポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つことを特徴とするＰＥＧスペーサー分子に由来する３０記載の翻訳テンプレート。
３２．  ＣＣＡ領域が、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とする３１記載の翻訳テンプレート。
３３．  ＣＣＡ領域にピューロマイシンを有することを特徴とする３２記載の翻訳テンプレート。
３４．  ３０〜３３のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートのライブラリー。
３５．  ３０〜３３のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートが、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
３６．  ３４に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
３７．  コード部を持たないことを特徴とする３５記載の蛋白質。
３８．  蛋白質がコード部を持たないことを特徴とする３６記載の蛋白質のライブラリー。
３９．  ３７に記載された蛋白質または３８記載のライブラリーにおけるコード部を、ＲＮａｓｅによって切断することを特徴とする蛋白質またはそのライブラリーの製造法。
４０．  １６、１８〜２３、３５および３７のいずれか１項に記載の蛋白質、または、１７、２３〜２７、３６および３８のいずれか１項に記載の蛋白質のライブラリーと物質を相互作用させて相互作用を解析することを含む、蛋白質と物質の相互作用解析方法。
４１．  相互作用の解析が、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、または、固相酵素免疫検定法により行われる、４０記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
４２．  ３５に記載の蛋白質、または、３６記載の蛋白質のライブラリーにおいて、該蛋白質のＣ末端に結合したコード部の塩基配列の増幅により蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
４３．  無細胞共翻訳法または無細胞共翻訳スクリーニング法を用いることを特徴とする４２記載の蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
４４．  相互作用の解析において、翻訳テンプレートとそのライブラリーを蛍光ラベル化および／または固定化することを特徴とする、４１記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
４５．  相互作用の解析において、蛋白質とそのライブラリーを蛍光ラベル化および／または固定化することを特徴とする、４０記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
４６．  相互作用の解析において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質と物質の相互作用を解析する４０載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
４７．  相互作用の解析において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで共翻訳法を利用することを特徴とする４６記載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
４８．  １〜４および２８のいずれか１項に記載されたコード分子もしくは６〜１４および３０〜３３のいずれか１項に記載された翻訳テンプレートまたはそのライブラリーをリボソーム上で翻訳することを含む蛋白質またはそのライブラリーの製造方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明の翻訳テンプレートがリボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質のうち、翻訳テンプレートと結合している蛋白質（対応付け分子）、さらに修飾剤の存在下で同様に合成される蛋白質（Ｃ末端ラベル化蛋白質）に関して、まず、本発明を説明する。なお、本明細書において塩基を表す記号は、特記しない限り、ＷＩＰＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５の定義によるものである。
＜１＞対応付け分子
本明細書において、対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現型の発現に関与するタンパク質を含む表現型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を、その塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。
対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。
図１９に、対応付け分子、スペーサー分子およびコード分子の一例の大まかな構成を示す。この対応付け分子は、ピューロマイシンを含むスペーサー（スペーサー部と呼ぶ）と表現型のコードを反映する塩基配列（コード部と呼ぶ）からなる。この対応付け分子は、コード分子に何らかの方法によってピューロマイシンを含むスペーサー部を結合して遺伝子型分子とし、無細胞翻訳系において、リボソーム上で表現型分子と連結した構成をもつ。スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、少なくともピューロマイシンまたはピューロマイシンと１残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなるＣＣＡ領域、少なくとも１残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むドナー領域、さらに、少なくとも１残基のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニット（Ｘ）からなる。コード分子は、デコード部の一部の配列からなるＤＮＡおよび／またはＲＮＡのポリＡ配列を含む３’末端領域、および、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ５’ＵＴＲ、さらに、主として表現型分子の配列からなるＯＲＦ領域から構成される。以下、この例を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜１−１＞スペーサー分子
スペーサー分子は、核酸の３’末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域と、ＰＥＧ領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）または２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞ＵまたはＴ＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０ｂｐ以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０ｂｐ以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、または、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞ＵまたはＴ＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー分子は、ドナー領域とＰＥＧ領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも１残基のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、固定化や蛍光ラベル化のための物質が挙げられる。具体例としては、図２０に示した蛍光物質、ビオチン、またはＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
図２０に、スペーサー分子の一例の詳細な構成を示す。スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、ピューロマイシンまたはピューロマイシンと少なくとも１残基のＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなるＣＣＡ領域、少なくとも１残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むドナー領域、さらに、少なくとも１残基のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニット（Ｘ）からなる。ここでは、機能付与ユニット（Ｘ）として蛍光物質Ｔ（Ｆ１）とビオチンＴ（Ｂｉｏ）が用いられている。
＜１−２＞コード分子
コード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、アクセプター領域（通常にはポリＡ配列）および、必要によりその５’側に翻訳増強配列（例えば制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列）を含む３’末端領域を含む核酸である。
コード分子は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＲＮＡの場合、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
３’末端領域は、例えば、ＸｈｏＩ配列とその下流にポリＡ配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては３’末端領域のポリＡ配列が重要であり、ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／またはｒＡの混合または単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’ＵＴＲ、および、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮される。５’ＵＴＲの転写プロモーターはＴ７／Ｔ３またはＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列（Ｇａｌｌｉｅ  Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８）の一部（０２９）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが重要となる。また、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせも重要となる。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
ＯＲＦ領域については、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の５’ＵＴＲをＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’ＵＴＲで約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’ＵＴＲと３’末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
図２１に、コード分子の一例の詳細な構成を示す。コード分子は、３’末端領域と、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’ＵＴＲと、デコード部の配列情報からなる、すなわち表現型タンパク質をコードするＯＲＦ領域とからなる。ここでは、３’末端領域として、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる親和性タグ配列、ＸｈｏＩ配列、ポリＡ配列を含み、Ｆｌａｇ−ｔａｇ配列を用いている。５’ＵＴＲとして、転写プロモーターのＳＰ６、翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部である０２９を含む配列を用いている。
＜１−３＞遺伝子型分子およびその製造方法
遺伝子型分子（翻訳テンプレート）は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸であるコード分子の３’末端と、スペーサー分子のドナー領域とが結合してなる。
遺伝子型分子を構成するコード分子は、コード分子について説明したとおりである。しかしながら、必要により発現増強配列を有することが好ましい。
遺伝子型分子は、上記コード分子の３’末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、ＰＥＧ領域を含むスペーサー分子のＰＥＧ領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、１５℃で０．５〜４時間に短縮することも可能である。
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の３’末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡのポリＡ配列があること、さらに、５’ＵＴＲの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列（０２９；図２１）が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）または２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。このことによって、ＲＮＡリガーゼを用いることでＤＮＡリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を６０〜８０％に保つことができる。
遺伝子型分子がＲＮＡである場合には、（ａ）転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含むコード分子の３’末端と、（ｂ）上記のスペーサー分子のドナー領域であってＲＮＡからなるものとを、スペーサー分子内のＰＥＧ領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、ＲＮＡリガーゼにより結合させることが好ましい。
ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域を含むスペーサー部のＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が８０〜９０％以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
＜１−４＞対応付け分子およびその製造方法
対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のＯＲＦ領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結してなるものである。
対応付け分子は、遺伝子型分子を、リボゾーム上で翻訳（例えば無細胞翻訳系で翻訳）することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のＯＲＦ領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結することにより。
無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、２５〜３７℃で１５〜２４０分の条件が挙げられる。
無細胞翻訳系については、これまで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系で対応付け分子の形成が検討され、ウサギ網状赤血球の系でのみ対応付け分子が確認されていたが（Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７）、この態様によれば、ＰＥＧ領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子として、小麦胚芽の系でも対応付け分子の形成を行うことができる。また、これまでウサギ網状赤血球の系では遺伝子型分子の安定性を欠くために実用性に乏しく、短い鎖長の遺伝子型分子にのみ適用されてきたが（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５）、ＰＥＧ領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子は、小麦胚芽の系ではより安定であり長い鎖長を取り扱える実用的な系である。
＜２＞Ｃ末端ラベル化蛋白質
Ｃ末端ラベル化蛋白質は、Ｃ末端が修飾された蛋白質であり、図２２のＡに示すように、ラベル化剤が蛋白質のＣ末端に結合した構成をもっている。すなわち、Ｃ末端ラベル化蛋白質は、蛋白質とラベル化剤とにより構成される。
Ｃ末端ラベル化蛋白質を構成する「蛋白質」とは、その機能が既知または未知である相互作用の解析対象として用いる蛋白質を意味する。本発明のＣ末端ラベル化蛋白質は、この蛋白質と後述する標的分子との相互作用の有無の測定に使用できる。
この蛋白質は、天然蛋白質またはその変異体、および人工蛋白質またはその変異体の何れでもよい。天然蛋白質は、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写および翻訳される、多様性を有する蛋白質のライブラリーをも含むものである。人工蛋白質は、天然蛋白質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、またはランダムなアミノ酸配列を含むものである。
Ｃ末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は、全長蛋白質であることが好ましい。本明細書において「全長蛋白質」とは、Ｃ末端が完全に翻訳されている蛋白質、すなわち、その蛋白質をコードする塩基配列の終止コドンの一つ前までのコドンが翻訳されて得られた蛋白質を意味する。全長蛋白質のＮ末端は、シグナルペプチドの切断等何らかのプロセシングを受けていてもよい。
また、Ｃ末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は親和性タグと融合した蛋白質であってもよい。親和性タグの例としては、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合蛋白質、カルモジュリン結合ペプチド等が挙げられる。
Ｃ末端ラベル化蛋白質は、ラベル化剤存在下で、翻訳テンプレートを翻訳系で発現させて蛋白質合成を行わせ、合成された蛋白質を精製することにより製造することができる。以下、ラベル化剤、翻訳テンプレートおよび製造の例について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜２−１＞ラベル化剤
ラベル化剤は、図２２のＢに示すように、蛋白質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基（残基を含む）をもつペプチドアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。このラベル化剤の存在下で蛋白質合成を行い、得られるＣ末端ラベル化蛋白質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、蛋白質相互作用の検出が可能となる。
修飾部に含まれる修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光性蛋白質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。
Ｃ末端ラベル化剤においては、修飾部が蛍光基、蛋白質と結合する基（例えばビオチニル基やイミノビオチニル基）、または、その両方をもつことが好ましい。特に、ビオチニル基やイミノビオチニル基を有することは、本発明Ｃ末端ラベル化剤による修飾の効率が上昇するため、好ましい。
ペプチドアクセプター部は、蛋白質の翻訳系で、ペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシンまたはその誘導体の残基をもつ。
ピューロマイシンはアミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、蛋白質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度では蛋白質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、蛋白質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。
修飾部とペプチドアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）またはデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とペプチドアクセプター部との間に挿入することによって修飾蛋白質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。
ラベル化剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシシチジル酸、リボシチジル酸、または、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。
ラベル化剤は、上記修飾部とペプチドアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記ペプチドアクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機等を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したヌクレオチドホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類、または結合の種類によっては液相合成法で結合させるかまたは両者を併用することもできる。また、修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。
＜２−２＞翻訳テンプレート
翻訳テンプレートは、本発明修飾蛋白質を製造する際に利用できる翻訳テンプレートであり、図２２のＣに示すように、ポリＡ配列を含む３’末端領域、転写プロモーターを含んだ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および、蛋白質のコードされたＯＲＦ領域から構成される。翻訳テンプレートはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
さらに詳細には、翻訳テンプレートは、蛋白質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の５’側に位置する、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ５’ＵＴＲと、ＯＲＦ領域の３’側に位置する、ポリＡ配列（ｐｏｌｙＡ）を含んだ３’末端領域から構成される。
さらに好ましい翻訳テンプレートは、５’ＵＴＲの転写プロモーターとしてＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含み、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガ配列の一部（０２９）を含む。また、ＯＲＦ領域がその下流部分に親和性タグ配列を含むことが好ましい。親和性タグ配列は、上述の親和性タグをコードする配列であり、好ましくはＨｉｓ−ｔａｇ（ポリヒスチジンタグ）配列を含む。本発明翻訳テンプレートを用いて製造された本発明修飾蛋白質をポリヒスチジンタグを用いて製造する場合には、ポリヒスチジンタグは長い方が、ニッケルキレート樹脂による回収率が向上するため、好ましい。ポリヒスチジンタグの好ましい長さの範囲は、修飾される蛋白質の種類や標識の種類により変化し得るが、通常には、８〜１２残基である。
なお、本明細書において「上流」および「下流」とは、転写または翻訳の方向におけるものを意味する。
翻訳テンプレートは、ＤＮＡである場合、上記の領域を適当なＤＮＡベクターまたはプラスミドに導入することにより得られたＤＮＡベクターまたはプラスミドであってもよい。また、翻訳テンプレートは、ＲＮＡである場合、５’末端にＣａｐ構造があってもなくてもよい
＜２−３＞Ｃ末端ラベル化蛋白質の製造
Ｃ末端ラベル化蛋白質の製造に用いられる翻訳系としては、無細胞蛋白質合成系や細胞発現系が挙げられる。無細胞蛋白質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液等が挙げられる。これらの無細胞蛋白質合成系の中に、上記翻訳テンプレートを加え、同時に１〜１００μＭの修飾剤を加え、２５〜３７℃で１〜数時間保温することによってＣ末端修飾蛋白質が合成される。合成された修飾蛋白質は、そのまま次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。一方、細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等の細胞に至るまで、遺伝子導入が可能な細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞の中に、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、同時に１〜１００μＭの本発明修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾蛋白質が合成される。合成された修飾蛋白質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。翻訳テンプレートは、用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。
Ｃ末端ラベル化蛋白質を精製する方法としては、アフィニティー、ゲルろ過、イオン交換等のクロマトグラフィーや、電気泳動、沈澱、透析等、一般に蛋白質の精製に用いられるあらゆる方法が利用可能である。好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィー、電気泳動、沈殿、透析、および、それらの任意の組合せが挙げられる。特に好ましい例として、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合蛋白質、カルモジュリン結合ペプチド等の親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で精製し、さらに未反応の修飾剤を完全に除去するためにゲルろ過カラムに数回かける方法がある。
また、上記の親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で予め精製した後、修飾部のビオチニル基またはイミノビオチニル基とアビジンまたはストレプトアビジンの親和性を利用して、未修飾蛋白質を完全に除き、１００％修飾された蛋白質を得る方法もある。
＜３＞本発明のより具体的な態様の説明
第一の発明の翻訳テンプレート（図１のＡ）は、コード分子（図１のＢ）に由来するコード部とＰＥＧスペーサー分子（図１のＣ）に由来するＰＥＧスペーサー部からなる。本発明は、基本的にはコード部の配列によらず、コード部にＰＥＧスペーサー部を連結（ライゲーション）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。しかしながら、さらにコード部の構成やＰＥＧスペーサー部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。以下にその詳細を記載する。
本発明コード部（図１のＢ）は、５’末端領域、ＯＲＦ領域、３’末端領域からなり、５’末端にＣａｐ構造があってもなくてもよい。また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクターやプラスミドに組み込まれた遺伝子やランダム配列などの利用が考えられる。また、コード部の３’末端領域には、Ａ配列としてポリＡｘ８配列、またはＸ配列としてＸｈｏＩ配列や４塩基以上で（ＣまたはＧ）ＮＮ（ＣまたはＧ）の配列を持つもの（すなわち、ＸｈｏＩ配列およびその他の４塩基以上でＳＮＮＳの配列を持つもの）、およびＡ配列とＸ配列の組み合わせとしてのＸＡ配列がある。Ａ配列、Ｘ配列、またはＸＡ配列の上流に親和性タグ配列としてＦｌａｇ−ｔａｇ配列、からなる構成が考えられる。ここで、親和性タグ配列としてはＨＡ−ｔａｇやＩｇＧのｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ｚドメイン）などの抗原抗体反応を利用したものやＨｉｓ−ｔａｇなど、蛋白質を検出または精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、ＸＡ配列の組み合わせが重要であり、Ｘ配列のなかで、最初の４塩基が重要であり、ＳＮＮＳの配列を持つものが好ましい。Ｘ配列の長さの上限は、翻訳増強の効果が得られる限り特に限定されないが、通常には、１５塩基以下、好ましくは６塩基以下である。また、５’末端領域は、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはＴ７／Ｔ３またはＳＰ６などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモーターとしては、ＳＰ６を用いることが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部（０２９）は、ＴＭＶのオメガ配列（Ｇａｌｌｉｅ  Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８）の一部を含んだものである。コード部のＯＲＦ領域については、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。
本発明ＰＥＧスペーサー部（図１のＣ）は、ＣＣＡ領域、ＰＥＧ領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずＰＥＧスペーサー部を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、４００〜３０，０００で、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜６，０００である。また、ＣＣＡ領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたＣＣＡ領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。ＣＣＡ領域（ＣＣＡ）の５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞ＵまたはＴ＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ  Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３，３７４−３７７）が適当である。第一の発明では、これらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。
本発明ＰＥＧスペーサー部は修飾物質（Ｆ１および／またはＦ２）を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、または固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも１残基のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。また、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計可能な長さである。これによって新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本発明の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、３’ＵＴＲの代わりとしてＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本発明ＰＥＧスペーサー部とコード部のライゲーションは、その方法については、一般的なＤＮＡリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。ＲＮＡリガーゼを用いるライゲーションでは、コード部でライゲーション効率に影響を与える範囲としては３’末端領域のＡ配列が重要であり、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／またはｒＡの混合または単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６から８残基以上のポリＡ連続鎖である。ＰＥＧスペーサー部のドナー領域の５’末端のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とＰＥＧスペーサー部を、ＲＮＡリガーゼでライゲーションするためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）または２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞ＵまたはＴ＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。さらに、ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。
第二の発明は、修飾剤の存在下で、第一の発明の翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、修飾剤でＣ末端修飾された蛋白質（図２のＡ）であり、翻訳テンプレート（図２のＢ）と、修飾剤（図２のＣ）からなる。ここでの特徴は、特に翻訳テンプレートのコード部の構成にある。以下詳細に記述する。
本発明翻訳テンプレート（図２のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結出来ないことを特徴とし、第一の発明と同様である。また、コード部も第一の発明と同様であるが、特に、Ｃ末端ラベル化に適した構成としては、３’末端領域が、ＸＡ配列であることが重要であり、Ｘ配列のなかで、最初の４塩基が重要で、ＳＮＮＳの配列を持つものが好ましい。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本発明の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に３’ＵＴＲの代わりとしてＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、Ｃ末端ラベル化に適した翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本発明修飾剤（図２のＣ）は、タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基（残基を含む）をもつペプチドアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、得られるＣ末端修飾タンパク質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、タンパク質相互作用の検出が可能となる。修飾部には、第一の発明のＰＥＧスペーサー部と同様に修飾物質（Ｆ３）が含まれる。修飾物質として、非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性タンパク質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。本発明修飾剤においては、修飾部が蛍光基、タンパク質と結合する基、または、その両方をもつことが好ましい。ペプチドアクセプター部は、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシンまたはその誘導体の残基をもつ。ピューロマイシンはアミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、タンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度ではタンパク質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｃｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、タンパク質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。修飾部とアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）またはデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とアクセプター部との間に挿入することによって修飾タンパク質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシチジル酸、リボシチジル酸、または、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。
本発明の修飾剤は、上記修飾部とアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、機能性修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類、または結合の種類によっては液相合成法で結合させるかまたは両者を併用することもできる。また、機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。
第三の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（図３のＡ；対応付け分子）と翻訳テンプレート（図３のＢ）を除去した、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図３のＣ）の構成を持つ。以下詳細に記述する。
翻訳テンプレート（図３のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は第一の発明と同様である。また、コード部も第一の発明と同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、３’末端領域をＡ配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減することが確認された。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本発明の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、ＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。また、本発明のＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図３Ｃ）は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅ  Ａなどで意図的に切断することが好ましい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。
対応付け分子は、進化分子工学として、ダーウイン進化機構を利用して、「変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、「選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」、「増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」の３つの単位操作を繰り返すことで、ランダムライブラリーなどから、漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することで工学的に応用することが可能である（図４）。また、ゲノム機能解析への応用として、ｃＤＮＡライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である（図４）。さらに、図４のスクリーニングを一次スクリーニング後に、二次スクリーニングとして、図５に示したように物質や蛋白質と相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどにより解析することが可能である。以上の解析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。また、一次スクリーニングで対応付け分子を利用するときはＡ配列のコード部を利用し、二次スクリーニングでは、対応付け分子を利用するときはＡ配列のコード部、Ｃ末端ラベル化蛋白質を利用するときはＸＡ配列のコード部をプライミングによって変更して使用することで、それぞれの効果を使い分けることが出来る。
無細胞タンパク質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系の中に、上記翻訳テンプレートを加え、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に１〜１００μＭの修飾剤を加え、２５〜３７℃で１〜数時間保温することによってＣ末端修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、上記翻訳テンプレートを加えて、２５〜３７℃で１〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、そのまま次の精製プロセスまたは検出プロセス、または直接細胞への導入に供することができる。細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。これらの細胞の中に、上記Ｃ末端ラベル化または対応付けされた両修飾タンパク質を直接導入することもできるし、または、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に１〜１００μＭの本発明修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。翻訳テンプレートは、用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。
本発明は、本発明翻訳テンプレートから合成されたＣ末端修飾タンパク質（修飾剤でＣ末端修飾された蛋白質（図２のＡ）、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（図３のＡ；対応付け分子）、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図３Ｃ））を利用したタンパク質と標的分子との間の相互作用の解析方法、すなわち、タンパク質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該タンパク質を含む本発明修飾タンパク質を用いることを特徴とする方法を提供する（図５）。
＜４＞解析方法
本発明の解析方法においては、通常には、上記で得られた本発明修飾タンパク質と標的分子を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該本発明修飾タンパク質または該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析する。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、または、固相酵素免疫検定法により行われる。以下これらの方法の詳細については記述する。
「標的分子」とは、本発明修飾タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。タンパク質としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、またはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、またはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、ＤＮＡまたはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列または機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、および塩基配列が既知のものか、またはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。糖鎖としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列または機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列または機能が既知の糖鎖が用いられる。低分子化合物としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はない。機能が未知のものでも、またはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
これら標的分子が本発明修飾タンパク質と行う「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合および解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、または糖鎖とタンパク質との間の結合および解離が挙げられる。
用いられる標的分子は、態様に応じて修飾物質により修飾して用いることができる。修飾物質は、通常、蛍光性物質などの非放射性修飾物質から選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など）を持ち、タンパク質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいかなるものであってもよい。その他、色素など修飾可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさは問わない。
これらの修飾物質は、標的分子と本発明修飾タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定または解析方法に適したものが適宜用いられる。
上記修飾物質の標的分子への結合は、それ自体既知の適当な方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、標的分子がタンパク質の場合、上記に記載したＣ末端を修飾する方法等を用いることができる。また標的分子が核酸の場合は、予め修飾物質を共有結合などで結合させたオリゴＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲを行う方法などによって簡便に修飾することができる。
また、本発明修飾タンパク質または本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、固相に結合させる場合があるが、固相に結合させる方法としては、修飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。
修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド（以下、「アダプタータンパク質」と称することがある）を結合させる。アダプタータンパク質には、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体なども含まれる。
アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、またはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タンパク質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
アダプタータンパク質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、またはホスホアミダイドに変換可能な水酸基またはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常タンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、またはホスホアミダイドに変換可能な水酸基またはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。用いられる測定法としては、例えば、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、蛍光イメージングアナライズ法、表面プラズモン共鳴法、固相酵素免疫検定法など、分子間相互作用を検出できるあらゆる系が利用可能である。
蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、または拡散率、容積収縮等を測定する方法であり、本発明においては、本発明修飾タンパク質（Ｃ末端修飾タンパク質）と標的分子間の相互作用により元の修飾分子１分子の並進ブラウン運動の変化を測定することにより、相互作用する分子を測定することができる。具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメータは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。このＦＣＳを行う為の装置もカールツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質または標的分子のいずれも溶液として供することが必要である（液相法）。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
しかし、２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、１種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同じくらいの分子量をもつタンパク質間の相互作用も検出できる。２種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法が知られているが、ＦＲＥＴが生じるためには２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があり、タンパク質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性がある。ＦＣＣＳ法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。一方、他の検出系である蛍光偏向解消法と比較すると、ＦＣＣＳ法は必要なサンプル量が少なく、検出時間が短く、ＨＴＳのための自動化が容易等の長所がある。さらにＦＣＣＳ法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的な情報が得られるので、表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。両者の違いは、表面プラズモン共鳴法ではタンパク質が固定化された状態で相互作用を検出するのに対して、ＦＣＣＳ法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点にある。ＦＣＣＳ法では、タンパク質の固定化が必要ないかわりに、タンパク質を蛍光色素で標識する必要があるが、本発明により、この課題を克服することが可能となった。
本方法においてＣ末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販のＦＣＳ用装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記ＦＣＳ用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、または特定のＣ末端修飾タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
蛍光イメージングアナライズ法は、固相化された分子に、修飾分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固相化された分子上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定または解析する方法である。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質または標的分子のいずれか一方は上記した方法により固相化されていることが必要である。標的分子は固相化して用いる場合には修飾されているものと、されていないもののどちらも利用可能である。また、固相化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。Ｃ末端修飾タンパク質は、修飾部を介して固定化されているものも、修飾部以外の部分で固定化されているものも用いることができる。
Ｃ末端修飾タンパク質、または標的分子を固相化するための基板としては、通常タンパク質や核酸等を固定化するのに用いられるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、またはプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。
本方法において修飾標的分子またはＣ末端修飾タンパク質を固相化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子またはＣ末端修飾タンパク質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に接触させる方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する修飾標的分子またはＣ末端修飾タンパク質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標的分子またはＣ末端修飾タンパク質の修飾物質から発せられる蛍光信号、または固相化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定または解析することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＣ末端修飾タンパク質または修飾もしくは非修飾標的分子を番地付けして固相化する方法、または１種類のＣ末端修飾タンパク質または修飾もしくは非修飾標的分子に固相化されていない複数種のＣ末端修飾タンパク質または修飾標的分子を接触させる方法等が用いられる。複数種のＣ末端修飾タンパク質または修飾標的分子を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法は、２種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法としてよく知られている。ＦＲＥＴとは、２種類の蛍光色素の一方（エネルギー供与体）の蛍光スペクトルと、もう一方（エネルギー受容体）の吸収スペクトルに重なりがあるとき、２つの蛍光色素間の距離が十分小さいと、供与体からの発光が起こらないうちに、その励起エネルギーが受容体を励起してしまう確率が高くなる現象をいう。したがって、相互作用を検出したい２つのタンパク質を、それぞれ供与体および受容体となる蛍光色素で標識しておき、供与体を励起すれば、２つのタンパク質が相互作用しない場合は、蛍光色素間の距離が大きいためＦＲＥＴは起こらず、供与体の蛍光スペクトルが観察されるが、２つのタンパク質が相互作用して蛍光色素間の距離が小さくなると、ＦＲＥＴにより受容体の蛍光スペクトルが観察されるので、蛍光スペクトルの波長の違いからタンパク質間相互作用の有無を判別することができる。蛍光色素としては、供与体がフルオレセイン、受容体がローダミンという組み合わせがよく用いられている。また最近では、蛍光緑色タンパク質（ＧＦＰ）の波長の異なる変異体の組み合わせにより、細胞の中でＦＲＥＴを観察し相互作用を検出する試みがなされている。この方法の欠点としては、ＦＲＥＴが生じるために２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があるため、タンパク質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性があるという点が挙げられる。
エバネッセント場分子イメージング法とは、Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）等に記載されている方法で、ガラス等の透明体に固相化した分子に溶液として第２の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定または解析する方法である。これらの操作は、それ自体既知のエバネッセント場蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質または標的分子のいずれか一方は上記した方法により固相化されていることが必要である。標的分子は固相化する場合は修飾の必要はないが、固相化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。
Ｃ末端修飾タンパク質、または標的分子を固相化するための基板としては、ガラス等の材質の基板が用いられ、好ましくは石英ガラスが用いられる。また、レーザー光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。
本方法において固相化していないＣ末端修飾タンパク質または修飾標的分子を固相化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは固相化していないＣ末端修飾タンパク質または修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に滴下する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、エバネッセント場照明により励起された蛍光をＣＣＤカメラ等の検出器を用いて測定することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基板に、複数のＣ末端修飾タンパク質または修飾標的分子を番地付けして固相化する方法等が用いられる。
蛍光偏光法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））は、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する方法である。分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合には、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光を保ったままになっているのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏光が解消される。そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合からこの分子の運動性およびその存在状態に関する情報が得られるものである。この方法によれば、夾雑物があってもこれに影響されることなく、蛍光修飾された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。これは蛍光修飾された分子と標的分子が相互作用するときにのみ、偏光度の変化として測定されるからである。
この方法を行うための装置としては例えばＢＥＣＯＮ（Ｐａｎｙｅｒａ社製）等が市販されており、本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質または標的分子のいずれも溶液として供する必要である。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
本方法においてＣ末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
本方法において測定するＣ末端修飾タンパク質および標的分子との間の相互作用は、必ずしも抗原抗体方法ほど特異性は高くないことが考えられるため、最適の組み合わせを検出するためには、相互作用の程度を数値化することが有効である。相互作用の程度を示す指標としては、例えば一定濃度のＣ末端修飾タンパク質に対して、極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記蛍光偏光解消法測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、または特定のＣ末端修飾タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
表面プラズモン共鳴法とは、金属／液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する方法である（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））。この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質は上記した方法により固相化されていることが必要であるが、標的分子の修飾は必要ない。
Ｃ末端修飾タンパク質を固相化するための基板としては、ガラスの等の透明基板上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。透明基板としては、通常表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるものであってもよく、レーザー光に対して透明な材料からなるものとして一般的にはガラス等からなるものであり、その厚さは０．１〜５ｍｍ程度のものが用いられる。また金属薄膜の膜厚は１００〜２０００Å程度が適当である。このような表面プラズモン共鳴装置用固基板として市販されているものも用いることができる。Ｃ末端修飾タンパク質の上記基板への固相化は前述した方法により行うことができる。
本方法において標的分子をＣ末端修飾タンパク質へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液に固相化されたＣ末端タンパク質を接触させる方法を用いることができる。
これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）によってもよい。両分子を接触せしめた後、それ自体既知の表面プラズモン共鳴装置を用いて、それぞれの反射光の相対強度の時間的変化を測定することにより、固相化されたＣ末端修飾タンパク質と標的分子の相互作用が解析できる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記表面プラズモン共鳴装置に用いられる基板に、複数のＣ末端修飾タンパク質を番地付けして固相化するか、または１種類の固相化されたＣ末端修飾タンパク質に複数種の標的分子を接触させる方法等が用いられる。
固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））は、固相上に固定化した抗原に対し、抗体を含む溶液を接触せしめ、両分子の相互作用（抗原抗体反応）により、固相化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する修飾分子（ＩｇＧ等）から発せられる蛍光、または修飾分子を基質とする色素から発せられる信号を、市販の検出器（ＥＬＩＳＡリーダー）を用いて測定または解析する方法である。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、抗原となるＣ末端修飾タンパク質を上記した方法により固相化されていることが必要である。また抗体となる標的分子は上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。
抗原となるＣ末端修飾タンパク質を固相化するための基板としては、通常ＥＬＩＳＡに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。
本方法において抗体となる修飾標的分子を固相分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これをマイクロプレートに注入する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する固相化分子に結合していない修飾分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販のＥＬＩＳＡリーダー等を用いて測定または解析することにより、固相化された抗原分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記マイクロプレートの各穴にそれぞれ異なる複数の修飾標的分子を固相化する方法が用いられる。
相互作用する分子の同定方法としては、上記のそれぞれの方法により測定されＣ末端修飾タンパク質との間に相互作用が認められた標的分子は、該分子の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法により、その一次構造を解析することができる。具体的には、相互作用を認められた標的分子がタンパク質の場合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、一次構造を特定することができる。また、標的分子が核酸の場合には、塩基配列決定方法により、オートＤＮＡシーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することができる。
Ｃ末端修飾タンパク質の固相化のための装置としては、上記に記載したＣ末端修飾タンパク質の修飾部を介した固相への固定化方法を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基板の保持、Ｃ末端修飾タンパク質溶液の添加、洗浄等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。これらの操作を組み合わせ、全自動または半自動の、Ｃ末端修飾タンパク質の固相化のための装置を構築することができる。
タンパク質−標的分子間相互作用測定のための装置としては、上記に記載したタンパク質−標的分子間相互作用測定を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基板の保持、標的分子の添加、洗浄、信号検出等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。これらの操作を組み合わせ、全自動または半自動の、タンパク質−標的分子間相互作用測定のための装置を構築することができる。
実施例
以下、具体的に本発明の翻訳テンプレート、Ｃ末端修飾蛋白質、翻訳テンプレートによるＣ末端ラベル化法および対応付け方法についての実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１    翻訳テンプレートの作成とその翻訳（Ｃ末端ラベル化）
コード分子は、マウス由来のｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓ（Ｇｅｎｔｚ  Ｒ，Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＦＪ  ３ｄ，Ａｂａｔｅ  Ｃ，Ｃｕｒｒａｎ  Ｔ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６９５−９；Ｎｅｕｂｅｒｇ  Ｍ，Ｓｃｈｕｅｒｍａｎｎ  Ｍ，Ｈｕｎｔｅｒ  ＪＢ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｒ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５８９−９０）の組み込まれているプラスミド（ｃ−ｊｕｎは、ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇ（配列番号１）；ｃ−ｆｏｓは、ｐＣＭＶＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号２））からＰＣＲで作成した。ＰＣＲのプライマーとしては、ｃ−ｊｕｎでは５’ＵＴＲ領域について１種類（プライマー；５’ＳＰ６−０２９（配列番号３））と３’末端領域については１３種類（プライマー；３’Ａ８＝Ａ（配列番号６）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）（配列番号７）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝ＸＡ（配列番号８）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＣＣ）Ａ８（配列番号９）、３’Ｘ（ＣＴＣＧ）Ａ８（配列番号１０）、３’Ｘ（ＣＴＣ）Ａ８（配列番号１１）、３’Ｘ（ＣＴＣＴ）Ａ８（配列番号１２）、３’Ｘ（ＴＴＣＧ）Ａ８（配列番号１３）、３’Ｘ（ＧＴＣＣ）Ａ８（配列番号１４）、３’Ｘ（ＣＡＴＧ）Ａ８（配列番号１５）、３’Ｘ（ＣＴＣＣ）Ａ８（配列番号１６）、３’Ｘ（ＧＴＣＧ）Ａ８（配列番号１７）、３’ｎｏｎｅ（配列番号５））、ｃ−ｆｏｓでは５’ＵＴＲ領域について１種類（プライマー；５’Ｔ７（０’）−ｂａｉｔ（配列番号４））と３’末端領域については２種類（プライマー；３’ｂａｉｔＦｏｓＤ（配列番号１８），３’ｂａｉｔＦｏｓＤＡ（配列番号１９））を用い、計１５種類のＤＮＡテンプレートを調製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これらのＤＮＡテンプレートを、ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をもちいて転写（３７℃，２ｈ）し、合成したｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、ｍＲＮＡテンプレート（コード分子）を得た。
まず、得られたｍＲＮＡテンプレートを翻訳テンプレートとして用いて、翻訳を行った。翻訳テンプレート２ｐｍｏｌを用いて、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１０μｌの系で翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）を行い、翻訳と同時に、修飾剤として２４０ｐｍｏｌのＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（フルオレセイン）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。その結果をまとめたグラフを図６に示す。
図６から、ポリＡ配列（Ａ配列）よりＳＮＮＳ配列（Ｘ配列）を有する場合に、さらにＳＮＮＳ−ポリＡ配列（ＸＡ配列）を有する場合に、翻訳量が増加することが示された。このことから、ＸＡ配列を持つ翻訳テンプレートは、一般的な翻訳やＣ末端ラベル化により好ましいといえる。また、Ｘ配列を変えたときの翻訳結果から、Ｘ配列がＡ配列と組み合わさって効果を現すには、最低４塩基からなることが必要であり、第一番目と第四番目の塩基はＣかＧであることが要求され、ＳＮＮＳ（ＳはＣまたはＧ）の構成が必要であることが示された。
さらに、ｍＲＮＡテンプレートの３’側にＰＥＧスペーサー分子（下記製造例１〜４参照）をライゲーションした翻訳テンプレートを作成した。ここでは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（宝酒造）をもちいて、ＰＥＧスペーサー部（（ｄＣ）２（Ｔ）２，ＰＥＧ４０００，ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃ）と、コード分子（Ｊｕｎ−Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝Ｊｕｎ−ＸＡ（プライマー３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝ＸＡを用いて得られたもの））またはコード分子（Ｆｏｓ−Ｄ（−Ａ）または３’ｂａｉｔＦｏｓ−ＤＡ（＋Ａ）（プライマー３’ｂａｉｔＦｏｓＤまたは３’ｂａｉｔＦｏｓＤＡを用いて得られたもの））とのライゲーション（１５℃，２０ｈ）を行い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、８Ｍ尿素４％ＰＡＧＥで電気泳動し、エチレンブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、バンドの蛍光（ＥｔＢｒとフルオレセイン）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。ライゲーションした２ｐｍｏｌの翻訳テンプレートを用いて、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）または、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて、１０μｌの系で翻訳（２６℃；１，３，６，２０ｈｒ）を行い、翻訳と同時に、修飾剤として２４０ｐｍｏｌのＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。ＲＮＡの安定性実験は、ＰＥＧスペーサー部の蛍光を用いて、ＲＮＡの残量をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。対照としてライゲーションしていない翻訳テンプレートを用いて同様の手順を行った。それらの結果をまとめたグラフを図７および図８に示す。
図７から、コード部の配列は基本的にはどのような配列でもＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで翻訳量が増加することが示された（図７のＡ）。また、ＸＡ配列を持つコード部をもつ翻訳テンプレート（ＸＡ）では、ＸＡ配列もＰＥＧスペーサー部も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ）に比べて、翻訳量が約３〜４倍増加していることが示された。また、ＸＡ配列を持つコード部では、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃの構成が最も翻訳量が増加することが示された（図７のＢ）。よって、一般的な翻訳やＣ末端ラベル化にはＰＥＧスペーサー部がライゲーションされたＸＡ配列を持つ翻訳テンプレートを用いることが適しているといえる。図８から、ＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ）、ＸＡ配列を持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ）は３時間で翻訳量は飽和に達したが、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃをもつ翻訳テンプレート（○；ＸＡ＋ＰＥＧ４００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃ）は、６時間でも翻訳の増加が見られた（図８のＡ）。また、その翻訳量は、６時間で比較すると、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃをもつ翻訳テンプレート（○）は、ＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ）の約２倍、ＸＡ配列を持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ）の約４倍であった（図８のＡ）。コード分子と、ＰＥＧスペーサー部をもつ翻訳テンプレートとの安定性を比較すると、コード分子（●；ＸＡ）は、そのｍＲＮＡが１時間で５０％減るのに対して、ＰＥＧスペーサー部をもつ翻訳テンプレート（○）は、１３時間でようやく５０％減ることから、ＰＥＧスペーサー部をもつコード分子（○）の安定性が非常によいことがわかる（図８のＢ）。以上から、翻訳テンプレート（○）の翻訳量が増加したのは、ライゲーションされたＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃによる安定性向上が原因と考えられる。
実施例２    翻訳テンプレートを用いた対応付け
コード分子（ｍＲＮＡテンプレート）にＰＥＧスペーサー分子（下記製造例１〜４参照）をライゲーションしたものを翻訳テンプレートとして用いた。ここでは、実施例１で得たコード分子のｍＲＮＡテンプレート（Ｊｕｎ−ＸＡ，Ｊｕｎ−Ａ）とＰＥＧスペーサー部（ＰＥＧ２０００Ｐｕｒｏ）を実施例１と同様の方法でライゲーションした。ライゲーションしたｍＲＮＡテンプレートを小麦胚芽の無細胞翻訳系としてＷｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をもちいて、実施例１と同様の方法で翻訳し、対応付け分子を８Ｍ尿素１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、蛍光（フルオレセイン）によってマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。また、フリー蛋白質の量は、翻訳と同時に、修飾剤としてＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、８Ｍ尿素１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（フルオレセイン）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定し、あわせて、Ｔ７−ｔａｇによる抗体を用いたウエスタンプロットで総蛋白量を決定した。それらの結果をまとめたグラフを図９に示す。
図９から、対応付け分子は、ＸＡ配列を持つコード部とＡ配列を持つコード部について比較すると、添加するＲＮＡ量を変化させたときの対応付け効率は両方とも７０％でほとんど変わらないことが示された（図９のＡ）。しかしながら、添加したＲＮＡテンプレートから合成された蛋白質総量（フリー蛋白質＋対応付け分子＝１００％）に対する対応付け効率については、添加するＲＮＡ量を変化させたとき、Ａ配列を持つコード部の場合は９０％（フリー蛋白質１０％）を超える高い効率を示すことが示された（図９のＢ）。一方、ＸＡ配列を持つコード部の場合は、フリー蛋白質の生成割合が高い（図９のＢ）。よって、対応付け分子にはＸＡ配列よりもＡ配列を持つコード部が適しているといえる。
製造例１    ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成
ＰＥＧスペーサー分子（１１）は、図１０に示す試薬を用い、図１１に示す方法で合成した。図１０中アミダイト試薬（１〜５）はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より購入した。平均分子量１０００、２０００、３０００のＰＥＧは日本油脂（東京都渋谷区）より購入した。平均分子量４０００のＰＥＧはフルカ社（スイス）より購入した。それらを原料にしてアミダイト試薬（６）を、Ｊａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３０１−３０４）を用い合成した。図１１中１０はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）で合成した。なお、図１０中ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を、図１１中Ｆｍｏｃは９−フルオレンメトキシカルボニル基を示す。
１０（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、以下のＡ〜Ｄの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
Ａ．３％トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液を１ｍＬ加え室温で３分間放置後、塩化メチレン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｂ．ヌクレオチドアミダイト３０μｍｏｌ、０．４５７Ｍテトラゾール−無水アセトニトリル溶液１００μＬ、および無水アセトニトリル１ｍＬを加え、室温で１５分間振盪する。アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｃ．５０ｍＭヨウ素溶液（テトラヒドロフラン−ピリジン−水＝７５：２０：５）１ｍＬを加え室温で３分間放置後、ピリジン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水ピリジン５ｍＬで５回洗浄する。
Ｄ．１０％無水酢酸−ピリジン溶液１ｍＬおよび触媒量の４，４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で２０分間放置後、ピリジン５ｍＬで５回、塩化メチレン５ｍＬで５回洗浄する。
上記の処理をし所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された１０に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣ  ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３４３−５，溶離液１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、ＰＥＧスペーサー分子（１１）を得た。得られたＰＥＧスペーサー分子（１１）の構造および収率を以下に示す。
2003106675.tif 000003
製造例２  ＰＥＧスペーサー分子（１４）の合成
ＰＥＧスペーサー分子（１４）は、図１０に示す試薬を用い、図１１および１２に示す方法で合成した。図１０中、ローダミングリーン（ＲｈｏｄＧ）活性エステル（７）はモレキュラプローブ社（アメリカ合衆国、オレゴン州）より、Ｃｙ５活性エステル（８）およびＣｙ３活性エステル（９）はアマシャムファルマシアバイオテク社（イギリス、バッキンガムシャー）より、購入した。図１２中、１２はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）を応用し合成した。なお、図１０中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示す。
１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成の場合と同様のＡ〜Ｄの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
上記の処理を行ない、所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された１２に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣ  ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、１３を得た。１３を３０％アセトニトリル−水０．１ｍＬに溶かし、７，８または９を１０μｍｏｌ、および１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）を１０μＬ加え室温で２時間放置した。反応液を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮した。残査を６０％トリフルオロ酢酸−水１ｍＬにて室温で３０分処理後、濃縮乾固した。残査を濃アンモニア水１ｍＬにて室温で１５分処理後、濃縮乾固した。残査を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮し、ＰＥＧスペーサー分子（１４）を得た。なお、図１３中、ＲｈｏｄＧは図１０中７の、Ｃｙ５は図１０中８の、Ｃｙ３は図１０中９の、蛍光色素残基部をそれぞれ示す。得られたＰＥＧスペーサー分子（１４）の構造および収率を以下に示す。
2003106675.tif 000004
製造例３    Ｂｏｃ保護ＰＥＧスペーサー分子（１５）の合成
図１４に示したように、１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）より、ＰＥＧスペーサー部（１１）と同じ方法を用いてＢｏｃ保護ＰＥＧスペーサー部（１５）を合成した。得られたＢｏｃ保護ＰＥＧスペーサー分子（１５）の構造と収率を以下に示す。
2003106675.tif 000005
製造例４    ピューロマイシン非含有ＰＥＧスペーサー分子（１６）の合成
Ｊａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３０１−３０４）に従い合成した。得られたピューロマイシン非含有ＰＥＧスペーサー分子（１６）の構造と収率を以下に示す。
2003106675.tif 000006
製造例５    修飾剤１〜７の合成
修飾剤１〜７は、図１５および図１６に示した試薬を用い、図１７および１８にその概略を示す方法を用いて合成した。図１５中、アミダイト試薬（１５〜１９）はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より、スクシンイミド試薬（２０〜２２）はピアス社（アメリカ合衆国、イリノイ州）より購入した。
１０または１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成に関して示したＡ〜Ｄの処理を所定数のアミダイト試薬が導入されるまで繰り返し行なった。その後、５０ｍＭ炭酸ナトリウム−水を２ｍＬまたは濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノールを０．５ｍＬ加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣ  ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥した。その後、修飾剤によっては、残査を３０％アセトニトリル−水１ｍＬに溶解させ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム−水（ｐＨ８．３）を０．１ｍＬ、およびスクシンイミド試薬（７，８または２０）０．１ｍｍｏｌをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた液を加え、室温で２時間放置した。その後、減圧濃縮し、残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣ  ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥した。その後、修飾剤によっては、残査を８０％酢酸−水２ｍＬに溶解させ、室温で４時間放置後、減圧濃縮した。残査を３０％アセトニトリル−水１ｍＬに溶解させ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム−水（ｐＨ８．３）を０．１ｍＬ、およびスクシンイミド試薬（２１または２２）０．１ｍｍｏｌをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた液を加え、室温で２時間放置した。その後、Ｐｏｌｙ−ＰａｋＩＩ（グレンリサーチ社）で脱塩し減圧濃縮した。その後、上記の残査に６０％トリフルオロ酢酸−水２ｍＬを加え、室温で３０分間放置後、減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣ  ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥した。得られた修飾剤１〜７の物性データを以下に示す。
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産業上の利用の可能性
本発明の一態様によれば、翻訳系における翻訳テンプレートの安定性が向上し、翻訳の絶対量が増加する。
また、本発明の別の態様によれば、翻訳系を用いる対応付け分子の製造において、翻訳により生じる総蛋白質に対する目的の対応付け分子の割合が向上し、効率的に対応付け分子を得ることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の翻訳テンプレート（Ａ）ならびにその構成要素であるコード分子（Ｂ）およびスペーサー分子（Ｃ）の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。Ｆ１およびＦ２は蛍光色素を  す。
図２は、Ｃ末端修飾された蛋白質（Ｃ末端ラベル化蛋白質）（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、および、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。
図３は、Ｃ末端修飾された蛋白質（対応付け分子）（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、および、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。
図４は、本発明の対応付け分子による物質や蛋白質の相互作用解析の一次スクリーニングの説明図を示す。対応付け分子は、進化分子工学として、ランダムライブラリーなどから、漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することに応用できる。また、ゲノム機能解析への応用として、ｃＤＮＡライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析できる。ここでは、無細胞共翻訳スクリーニング法を利用することもできる。
図５は、本発明の対応づけ分子やＣ末端ラベル化法による物質や蛋白質の相互作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの説明図を示す。本発明翻訳テンプレートから合成されたＣ末端修飾タンパク質（修飾剤でＣ末端修飾された蛋白質、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（対応付け分子）、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質を利用したタンパク質を、標的分子との間の相互作用の解析に利用可能である。図４のスクリーニングを一次スクリーニングとして物質や蛋白質と相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどによりさらに解析することが可能である。
図６は、コード分子の３’末端配列の違いによる翻訳量の比較を示す。ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有する、異なる１２種類の３’末端配列を持つコード分子（Ａ８＝Ａ配列）の翻訳量の比較。Ｘ配列のバリエーションと必要な条件を示した。詳細は、実施例１参照。
図７は、翻訳テンプレートがＰＥＧスペーサー部を持たない場合および異なるＰＥＧスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較を示す。
Ａ：ｃ−ｆｏｓの遺伝子配列を有するＡ配列もＸ配列も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ（ｍＲＮＡ））と，Ａ配列を持つコード分子（Ａ（ｍＲＮＡ））、およびｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（＋ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ，）の翻訳量の比較。詳細は、実施例１参照。
Ｂ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するＡ配列もＸ配列も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ（ｍＲＮＡ）），ＸＡ配列を持つコード分子（ＸＡ（ｍＲＮＡ））、およびコード分子（ＸＡ（ｍＲＮＡ））に（ｄＣ）２Ｔ（Ｆｌｕ）Ｔ（ＸＡ＋（ｄＣ）２Ｔ２），ｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＴＰＥＧ４０００（ＸＡ＋ＰＥＧ４０００），ｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ（ＸＡ＋ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ）をライゲーションした翻訳テンプレートの翻訳量の比較（電気泳動の結果（写真）も示す）。詳細は、実施例１参照。
図８は、翻訳テンプレートの翻訳量と安定性を示す。
Ａ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ配列）、Ａ配列もＸ配列も持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ配列）、およびコード分子（ＸＡ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（○）の翻訳量のタイムコース。詳細は、実施例１参照。
Ｂ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（●；ＸＡ配列）と、およびコード分子（ＸＡ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（○）の安定性のタイムコース。詳細は、実施例１参照。
図９は、本発明の翻訳テンプレートが異なるＰＥＧスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較（電気泳動の結果（写真）も示す）を示す。
Ａ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（ＸＡ配列，Ａ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによる対応付け分子の形成効率。ＩＶＶ；対応付け分子、Ｌｉｇａｔｅｄ  ｍＲＮＡ；コード部にＰＥＧスペーサー部がライゲーションされた翻訳テンプレート。レーン１〜６；ＲＮＡ添加量が１０，２５，５０，１００，２００，４００ｎＭ．詳細は、実施例２参照。
Ｂ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（ＸＡ配列，Ａ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによるフリー蛋白質（Ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の合成率（対応付け分子の形成量＋フリー蛋白質の合成量＝１００％）。レーン１〜６；ＲＮＡ添加量が１０，２５，５０，１００，２００，４００ｎＭ．詳細は、実施例２参照。
図１０〜１４は、本発明に使用されるＰＥＧスペーサー分子とその合成スキームを示す。
図１５〜１８は、本発明に使用される修飾剤とその合成スキームを示す。
図１９は、対応付け分子、スペーサー分子およびコード分子の構造の概略を示す。
図２０は、スペーサー分子の一例の詳細な構成を示す。Ｄ：ドナー領域、Ｘ２およびＸ１：機能付与ユニット、ＰＥＧ：ＰＥＧ領域、Ａ：ペプチドアクセプター領域。Ｂｉｏ：ビオチン、Ｆ１：蛍光色素。
図２１は、コード分子の一例の詳細な構成を示す。
図２２は、Ｃ末端修飾蛋白質（Ａ）、修飾剤（Ｂ）、および、翻訳テンプレート（Ｃ）の構成を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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