(57)【要約】本発明は、優れたネコブセンチュウ抵抗性遺伝子と、該遺伝子の利用方法に関する。すなわち、高温感受性がなく、幅広い種や系統のネコブセンチュウに対応可能な、量的抵抗性を有する新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子と、該遺伝子を導入したネコブセンチュウ抵抗性組換え植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ宿主にネコブセンチュウ抵抗性を付与するＤＮＡ。
【請求項２】
前記ネコブセンチュウ抵抗性が、遺伝子のコピー数に応じて抵抗性が増す量的抵抗性であることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の遺伝子。
【請求項３】
請求の範囲第１項記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求の範囲第１項記載の遺伝子を宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項５】
宿主が植物である、請求の範囲第４項記載の形質転換体。
【請求項６】
前記植物がナス科植物である、請求の範囲第５項記載の形質転換体。
【請求項７】
請求の範囲第１項記載の遺伝子を植物に導入することにより、ネコブセンチュウ抵抗性を有する組換え植物を作製する方法。
【請求項８】
請求の範囲第１項記載の遺伝子を含む、ネコブセンチュウ防除薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子に関する。より詳細には、高温感受性がなく、幅広い種や系統のネコブセンチュウに対応可能な、量的抵抗性を有する新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子と、該遺伝子の利用方法に関する。
背景技術
センチュウは大きな門を構成する動物体で、植物や動物に寄生する１種の害虫である。植物に寄生するネコブセンチュウは、一般に体長１ｍｍ以下であるが、植物細胞の原形質から栄養をとり、その被害は全世界で年間約１０億ドルにも達する。ネコブセンチュウのうち、メロイドジーネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属に属するもの（英名ルート・ノット・ネマトード：ｒｏｏｔ  ｋｎｏｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）は、現在約７０種が確認されている。これらは、全ての作物及び多くの雑草に寄生するため、２０００種を超える植物種に影響を与えると報告されており、その中にはサツマイモやトマト、ジャカイモも含まれる。
ネコブセンチュウに感染しても、地上部分では、感染初期に寄生の判別に有効なはっきりとした兆候は見られないが、地下ではコブ（ｇａｌｌ或いはｋｎｏｔ）が形成され始める。このコブの大きさは種や品種により異なり、多くの場合１−２ｍｍ程度であるため、肉眼では確認しにくい場合もあるが、コブの表面や根に産卵される卵の固まりは肉眼でも確認できる。最も顕著な兆候は、根や塊茎にあらわれる縦状の亀裂で、感染した根や塊茎中には様々な発達段階のセンチュウが寄生する。ネコブセンチュウの感染は収量を減少させるだけではなく、寄生した根や塊茎の市場価値を激減或いは喪失させる。また、根や塊茎の亀裂は、別の病原生物の攻撃を容易にし、複合感染の可能性を増大させる（Ｈｏｏｋｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｐ９７−９８，１９８１，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ；Ｊａｎｓｓｏｎ  ＆  Ｒａｍａｎ，Ｓｗｅｅｔ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ｐｐ１−１２，１９９１，Ｗｓｅｔｖｉｅｗ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｐｐ４９−５０，１９９１，ＡＰＳ  ＰＲＥＳＳ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）。
ジャガイモに寄生するメロイドジーネ属のセンチュウは、メロイドジーネ  アレナリア  チトウッド（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ａｒｅｎａｒｉａ  Ｃｈｉｔｗｏｏｄ）、メロイドジーネ  インコグニータ  チトウッド（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ  Ｃｈｉｔｗｏｏｄ）、メロイドジーネ  ハプラ  チトウッド（Ｍ．ｈａｐｌａ  Ｃｈｉｔｗｏｏｄ）、メロイドジーネ  ジャバニカ  チトウッド（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ  Ｃｈｉｔｗｏｏｄ）の４種である。このうち、メロイドジーネ・インコグニータは、世界中のジャガイモ圃場において、最も頻繁に発生するセンチュウである（Ｈｏｏｋｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｐ９７−９８，１９８１，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）。日本でも、暖かい九州のジャガイモ栽培地域で発症がみられ、作物の抵抗性付与や総合防除法の開発が望まれている。
ジャガイモにおけるネコブセンチュウの制御としては、古くから輪作による方法が行なわれてきた。この方法は、センチュウの集団密度を低下させるという点では有効な方法であるが、雑食性のネコブセンチュウでは輪作のサイクルに限界があるため、輪作のみでネコブセンチュウを制御することは難しい。一方、有機肥料を加えて、アンモニア系窒素の働きでネコブセンチュウの集団密度を押さえることもできる。この方法は、現在もアフリカ、アジア、中南米で実施されているが、ネコブセンチュウに対する決定的な防御法ではない。他方、速攻性という点では、ジクロロプロペン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｒｏｐｅｎｅ）や臭化メチル（ｍｅｔｈｙｌｂｒｏｍｉｄｅ）等による土壌燻蒸が最も優れているが、生態系あるいは作業者への悪影響という問題がある。
昨今、ホストであるジャガイモ自身のセンチュウ抵抗性を高める方法が試みられ、種々の抵抗性を有する育種系統が作出されている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｊ．７１：５９９−６０４，１９９４；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４５：３４１−３４７，１９９５；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４６：３２９−３３６，１９９６；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４９：５３−６１，１９９９；Ｗａｔａｎａｂｅ  ＆  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１６，２０００）。しかし、センチュウのうち、メロイドジーネ・インコグニータに対して高い抵抗性を持つジャガイモは、未だ作出されていない。
ところで、ネコブセンチュウ抵抗性を有する２倍性野生近縁種から栽培ジャガイモへの抵抗性付与も試みられている。２倍性野性近縁種には、ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｒｍｉ）が存在し、この遺伝子は相加的効果のある量的抵抗性を有することが、表現型の遺伝解析や育種経験からわかっている（Ｉｗａｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｏｒｔ  Ｓｃｉ．，１１４（６）：１００８−１１１３（１９８９）；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉ．，４６：３２３−３６９（１９９６）；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉ．、４９：５３−６１（１９９９））。また、上記文献には、このＲｍｉ遺伝子によって誘導される抵抗性は、温度に対する感受性がなく高温でも有効であることも報告されている。しかしながら、このＲｍｉはいまだ単離されておらず、その配列もわかっていない。また、栽培ジャガイモは同質４倍体であるため遺伝様式が複雑で、有用な抵抗性品種の育種は実現していない。
ネコブセンチュウ属に対する抵抗性遺伝子群は、現在のところトマト及びジャガイモにおいてのみ、いくつかの遺伝地図上の位置が確認されている。例えば、トマトにおいては、メロイドジーネ  インコグニータ  チトウッド、メロイドジーネ  ジャバニカ  チトウッド、及びメロイドジーネ  アレナリア  チトウッドに対するＬｉｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来抵抗性遺伝子Ｍｉが、染色体６番上（Ｍｅｓｓｅｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８２：５２９−５３６，１９９１；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２：９７１−９８２，１９９２）に座上することが報告されている。また、メロイドジーネ  インコグニータ  チトウッド及びメロイドジーネ  ジャバニカ  チトウッドに対するＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来抵抗性遺伝子Ｍｉ３が染色体１２番上（Ｙａｇｈｏｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９１：４５７−４６４，１９９５）に座上することが報告されている。Ｍｉ遺伝子は、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎらのグループにより単離され、その構造も明らかにされている（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９５：９７５０−９７５４，１９９８；Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１０：１３０７−１３１９，１９９８）。しかし、Ｍｉ遺伝子は高温感受性であるため、感染初期の２４〜４８時間に高温露出されると、抵抗性が機能しなくなるという問題がある。
ジャガイモについては、メロイドジーネ  チトウディの、レース１に対するＲｍｃｌ遺伝子座がＳ．ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ（ソラナムバルボカスタナム）の染色体１１番に座上していることが報告されている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９２：５７２−５７６，１９９６）。また、メロイドジーネ・インコグニータ・チトウッドに対する抵抗性の伝達について、１）二つ以上の遺伝子が抵抗性に関与している可能性（Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｊ．，６０：３５３−３６０，１９８３）、及び２）細胞質が抵抗性の発現に関与している可能性（Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｊ．，６０：３５３−３６０，１９８３，Ｉｗａｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．，１１４：１１０８−１０１３．１９８９，）が指摘されている。さらに、メロイドジーネ  インコグニータ  チトウッドに対する抵抗性は５−６の抵抗性遺伝子に支配される相加的な量的抵抗性であることがわかってきている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．，９：５３−６１，１９９９；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）。
一般に、植物の病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）に対する強度の抵抗性は、非常に特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が高い場合が多い。フローが提唱した遺伝子対遺伝子説（ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｈｙｐｏｔｅｓｉｓ）（Ｆｌｏｗ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，９：２７５−２９６，１９７１）は、このような高い特異的抵抗性を、植物の抵抗性遺伝子（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）と病原体の非病原性遺伝子（ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ）の相互作用から説明する。そして、遺伝子対遺伝子の分子認識機構としては、リガンド  レセプターモデルが一般に仮定されている（Ｇａｂｒｉｅｌ  ＆  Ｒｏｌｆｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：３６５−３９１，１９９０）。
単離された抵抗性遺伝子は、現在までに遺伝子産物の機能や構造の類似点から、５つのグループに整理されている（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：７２６，１９９７；Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：２２８１−２２８５，２００１；Ｄａｎｇｌ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：８２６−８３３，２００１）。このうち、クラスＩに分類される抵抗性遺伝子は、ヌクレオチド結合領域（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ：ＮＢＳ）及びロイシン反復領域（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ：ＬＲＲ）を有し、これらの領域が抵抗性発現のシグナル伝達に関与していることが予想されている。クラスＩに属する単離された遺伝子には、タバコのｔａｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓに対するＮ（Ｗｈｉｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７８：１１０１−１１０５，１９９４）、アマのＭｅｌａｍｐｓｏｒａ  ｌｉｎｉｎに対するＬ６（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７：１１９５−１２０６，１９９５）及びＭ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，９：６４１−６５１，１９９７）、シロイヌナズナのＰｅｒｓｏｍｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対するＲＰＰ５（Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，８：１７５７−１７７１，１９９６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅに対するＲＰＳ２（Ｂｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１８５６−１８６０，１９９３；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７８：１０８９−１０９９，１９９４）及び、ＲＰＭ１（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：８４３−８４６，１９９５）、トマトのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅに対するＰＲＦ（Ｓａｌｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８６：１２３−１３３，１９９６）及び、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍに対するＩ２Ｃ−１（Ｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，９：５２１−５３１，１９９７）等が含まれる。さらに、前述のトマトにおけるＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来のネコブセンチュウ抵抗性遺伝子Ｍｉも、ＮＢＳ及びＬＲＲを有する遺伝子であることが明らかにされている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１０：１３０７−１３１９，１９９８）。
クラスＩに属するタンパク質は、Ｃ末端側に不完全なＬＲＲをもち、Ｎ末端側にＮＢＳをもっている。ＮＢＳはＡＴＰａｓｅ及びＧＴＰａｓｅ等に見られるタイプで、Ｐループを含む３つのモチーフから構成されている（Ｔｒａｕｔ，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２９：９−１９，１９９４）。一般に、最初のキナーゼ１ａドメインは、リン酸結合ループを形成し、その下流にはキナーゼ２ドメインが存在する。このキナーゼ２ドメイン中の固定したアスパラギン酸は、リン酸の移行反応に必要な金属結合部位を調整していると予想されている。さらに下流に位置するキナーゼ３ａドメインは、ＡＴＰのプリンとしばしば相互作用するチロシン又はアルギニンを有する（Ｔｒａｕｔ，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２９：９−１９，１９９４）。これらのＮＢＳの存在は、抵抗性機能にキナーゼ活性或いはＧタンパク質が重要な役割をもつことを示唆している（Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ  ＆  Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｕｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｙ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．，４８：５７５−６０７，１９９７）。
一方、ＬＲＲドメインは様々なタンパク質に見られ、イースト、ショウジョウバエ、ヒト等の種においては、多くの場合タンパク質−タンパク質相互作用に関わるものと考えられている（Ｋｏｂｅ  ＆  Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：７５１−７５６，１９９３）。しかし、植物病害虫抵抗性においては、ＬＲＲドメインは、非病原性（Ａｖｒ）遺伝子により産出されたリガンド結合ドメインとして機能したり、抵抗性（Ｒ）遺伝子の産物と、防御シグナル伝達に関係する他のタンパク質との相互作用を容易にするものではないかと推測されている（Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，８：１７５７−１７７１，１９９６）。
ところで、ジャガイモは世界の主要作物であり、アメリカ合衆国や日本等の先進国における多投資型（ｈｉｇｈ  ｉｎｐｕｔ）から、アフリカ、アジア、ラテンアメリカの発展途上国における低投資型（ｌｏｗ  ｉｎｐｕｔ）農業までの幅広い生産体制に対応する優れた作物である。主食や野菜、スナックとしての食用のみでなく、飼料や工業用澱粉及び醗酵材料としても世界中で広く栽培されている（Ｈａｒｒｉｓ，Ｐ．Ｍ．Ｔｈｅ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｒｏｐ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９７８；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｉａｒ．ｏｒｇ．ｃｉｐ／２００１）。特に発展途上国においては、生産量及び熱量供給の両面から、最も重要な作物の一つである。爆発的な人口の増大が進行するこれらの国々において、貴重な食糧源として、今後ますますジャガイジャガイモの生産量及び生産性の向上が期待されている。
一方、ジャガイモの生産量の多くは病害虫により失われ、その中でもネコブセンチュウによる被害は、熱帯、亜熱帯から温帯に渡る広い地域に及ぶ深刻なものである（Ｈｏｏｋｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｐ９７−９８，１９８１，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）。
しかしながら、ネコブセンチュウによる被害に対する決定的な解決策はなく、抵抗性遺伝子の機能や構造についての解明が待ち望まれていた。
発明の開示
本発明は、様々なネコブセンチュウに幅広く対応できる、優れたネコブセンチュウ抵抗性遺伝子を見出し、深刻なネコブセンチュウ被害に対する解決策を提供することを課題とする。
本発明者らは、２倍性ジャガイモ系統を対象として、植物抵抗性遺伝子群に共通なＮＢＳやＬＲＲなどの配列情報を基に探索を行った結果、従来にない優れたネコブセンチュウ抵抗性を有する新規遺伝子の単離に成功した。そして、該遺伝子を利用することにより、優れたネコブセンチュウ抵抗性組換え植物の作出に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）に関する。
（１）  以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ宿主にネコブセンチュウ抵抗性を付与するＤＮＡ。
（２）  前記ネコブセンチュウ抵抗性が、遺伝子のコピー数に応じて抵抗性が増す量的抵抗性であることを特徴とする、上記（１）記載の遺伝子。
（３）  上記（１）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（４）  上記（１）記載の遺伝子を宿主に導入して得られる形質転換体。
（５）  宿主が植物である、上記（４）記載の形質転換体。
（６）  前記植物がナス科植物である、上記（５）記載の形質転換体。
（７）  上記（１）記載の遺伝子を植物に導入することにより、ネコブセンチュウ抵抗性を有する組換え植物を作製する方法。
（８）  上記（１）記載の遺伝子を含む、ネコブセンチュウ防除薬剤。
１．新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子
（１）本発明の遺伝子の特徴
本発明の遺伝子は、２倍性ジャガイモ系統より単離された、新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子である。該遺伝子は、従来知られているネコブセンチュウ抵抗性遺伝子とは異なり、以下のような特徴を有する。
▲１▼  トマトの抵抗性遺伝子（Ｍｉ遺伝子）にような優性ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ）とは異なり、遺伝子のコピー数に応じて抵抗性が増す「量的抵抗性」を持つ。
▲２▼  トマトの抵抗性遺伝子のような高温感受性による抵抗性のブレークダウンがない。
▲３▼  様々なネコブセンチュウの種や系統に幅広く対応できる。
（２）本発明の遺伝子の単離
本発明の遺伝子は、ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子を有することが知られている２倍性ジャガイモ系統８５．３７．３８（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｊ．７１：５９９−６０４，１９９４）のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから、植物抵抗性遺伝子群に共通なＮＢＳやＬＲＲなどの配列情報を基に検索することができる。例えば、Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ（１９９７  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：５７５−６０７）などの総論を参考に、既知の植物病虫害抵抗性遺伝子に保存的な領域、例えばＮＢＳやＬＲＲの配列に基づき、プライマーを設計する。そして、該プライマーを用いて、前記２倍性ジャガイモ系統のｃＤＮＡライブラリーから、目的とする遺伝子を増幅、単離すればよい。
（３）塩基配列の決定
得られた遺伝子は、常法にしたがい塩基配列の決定をすることができる。塩基配列の決定は、マキサム−ギルバートの化学修飾法、Ｍ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法、又は自動塩基配列解析装置（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を用いた方法等、公知の方法を利用すればよい。
配列番号１は、こうして特定された、本発明のネコブセンチュウ抵抗性遺伝子の塩基配列を示す。しかし、本発明にかかるネコブセンチュウ抵抗性遺伝子は、上記配列に限定されず、配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる遺伝子も、（１）に記載した本発明の遺伝子に特徴的なネコブセンチュウ抵抗性を宿主に付与することができる限り、本発明の遺伝子に含まれるものとする。なお、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭ、温度が２５℃〜７０℃、好ましくはナトリウム濃度が５０ｍＭ〜１００ｍＭ、温度が４２℃〜５５℃の条件をいう。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは核塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、さらに本発明の遺伝子を得ることができる。
２．ベクター
本発明は、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを提供する。該ベクターは、本発明の遺伝子をそのまま、又は適当な制限酵素で消化し、あるいは、適当なリンカーを連結して、プラスミド等の適当なベクターに導入することにより作製される。該ベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系ベクター、ｐＢＨＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２等のバイナリーベクターを挙げることができる。特に、アグロバクテリウムのバイナリーベクターを用いる場合は、該バイナリーベクターの境界配列間に外来遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌内で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、これを形質転換体用ベクターとして用いる。
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、該遺伝子の前後に、それぞれプロモーターとターミネーターを配置させる必要がある。前記プロモーターとターミネーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。植物を宿主とする場合であれば、例えば、プロモーター配列としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ転写物［Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１−３９０７（１９８７）、トウモロコシのユビキチン［Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９（１９９２）］、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成遺伝子のプロモーターが挙げられる。またターミネーター配列としては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等が挙げられる。
さらに効率的に目的の形質転換体を選抜するために、有効な選択マーカー遺伝子を導入することが好ましい。該選択マーカーとしては、カナマイシン耐性を付与する遺伝子、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子及びビアラフォスに対する抵抗性を植物に付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等を挙げることができる。こうした選択マーカー遺伝子と本発明の遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれを別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
３．形質転換体
本発明はまた、本発明の遺伝子を導入した形質転換体を提供する。該形質転換体は、前述の本発明のベクターを用いて、宿主を形質転換することにより作製される。該宿主は、本発明の遺伝子が機能しうるものであれば特に限定されないが、植物であることが好ましく、例えば、ナス科植物、サツマイモ等のヒルガオ科植物、大根等の根菜類を含むアブラナ科植物等、２０００種以上の植物において有効に機能しうると考えられる。なかでも、ジャガイモ、タバコ、トマト等のナス科植物が好適である。なお、本発明において「植物」という言葉には、植物培養細胞、栽培植物個体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、又は植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のすべてを含むものとする。例えば、植物培養細胞、植物体、植物器官、又は植物組織を宿主とする場合、採取した植物切片に本発明の遺伝子を、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルガン法、又はポリエチレングリコール法等を用いて導入することにより、目的とする形質転換体を得ることができる。あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で遺伝子を導入して形質転換体を作製してもよい。
本発明の遺伝子が導入された形質転換体は、選択マーカーによるスクリーニング、又はネコブセンチュウ抵抗性という本発明の遺伝子が有する機能発現解析により、選抜することができる。得られた形質転換体、特に組換え植物は、土壌又はバーミキュライトを詰めたポットで栽培し、株分けすることによって増殖させることが可能である。こうして増殖させた組換え植物、及びその子孫もすべて、本発明の遺伝子を有する限り、本発明の形質転換体の範囲に含まれる。
４．ネコブセンチュウ抵抗性を有する組換え植物
本発明のネコブセンチュウ抵抗性遺伝子を導入された組換え植物は、幅広い種のネコブセンチュウに対して強い抵抗性を有する。しかも、本発明の遺伝子によって付与される抵抗性は、遺伝子導入数に応じて抵抗性が増す「量的抵抗性」である。ちなみに、従来知られているネコブセンチュウ抵抗性遺伝子は量的抵抗性を持たない。したがって、導入する遺伝子数を増加させることにより、本発明の遺伝子はより強力なネコブセンチュウ抵抗性組換え植物を作出することができる。
一方、これまで同定されているネコブセンチュウ抵抗性遺伝子は温度感受性であり、一定の温度以上に達すると抵抗性を失ってしまうものであった（Ｍｉは通常２８℃で失活する）。しかし、本発明の組換え植物は、３３〜３５℃という高い温度条件下で栽培してもネコブセンチュウに対する抵抗性維持することができる。したがって、本発明の遺伝子を導入した組換え植物は、温帯や熱帯など比較的気温が高い地域においても、ネコブセンチュウ抵抗性を維持し続ける組換え植物を作出することができる。
かくして、本発明は、従来にないネコブセンチュウ抵抗性を有する組換え植物とその作製方法を提供することができる。
５．その他
本発明の遺伝子は、宿主、特にジャガイモ、タバコ、トマト等のナス科植物に優れたネコブセンチュウ抵抗性を付与する。したがって、該遺伝子や該遺伝子を含む組成物は、ネコブセンチュウ防除薬剤として使用しうる。本発明の遺伝子や、該遺伝子を導入された組換え植物、該遺伝子を含むネコブセンチュウ防除薬剤は、ネコブセンチュウの被害が深刻な地域において、その被害を抑え、作物の生産性を向上させる重要な効果を有する。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００２−０８９６２２号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  遺伝子領域の単離
抵抗性遺伝子を有することが知られている２倍性ジャガイモ系統８５．３７．３８（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｊ．７１：５９９−６０４，１９９４）のゲノムＤＮＡから、以下のプライマー設計し、ＰＣＲにより遺伝子を単離した。なお、プライマーは、既知の植物病虫害抵抗性遺伝子に保存的な領域、例えばＮＢＳやＬＲＲの配列に基づいて設計した。
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単離されたＲｍｉ遺伝子候補を（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＃９３）と命名し、その全配列（配列番号１）及び既知の遺伝子との相同性（表１）を調べた。
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該バイナリーベクターの境界配列間に外来遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌内で増幅した。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、これを植物の形質転換体作出用に用いた。
〔実施例２〕  ベクターの構築
（１）バイナリーベクターへの挿入
単離されたＲｍｉ遺伝子候補（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＃９３）は、ＢａｍＨＩで切断し、一度ｐＴａｒｇｅｔベクターにリゲーションしてから再度ＢａｍＨＩで切り出し、バイナリーベクター：ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔにリゲーションした。得られた組換えベクターは、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入して増幅し、アグロバクテリウム導入用ベクター（ＰｏｔａｔｏＲＫＮ：ｐＢＥ２１１３ＮｏｔＩ）を得た。
（２）エレクトロポレーション
バイナリーベクター（ＰｏｔａｔｏＲＫＮ：ｐＢＥ２１１３ＮｏｔＩ）をエレクトロポレーションによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢ４４０４株（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に導入した。すなわち、−８０℃で保存されているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢ４４０４株を氷上で解凍し、クリーンベンチ内で１．５ｍｌエッペンドルフチューブに２０μｌ程取り出す。そこに１００ｎｇ／μｌのＤＮＡを１μｌ加えて氷上で静置した後、キュペットに移しエレクトロポレーションを行った。
（３）遺伝子導入の確認
次いで、ＹＭ培地を５０μｌ加えて吸い上げ、１５ｍｌのファルコンチューブに移し、ＹＭ培地をさらに全量で１ｍｌまで加え、２２５ｒｐｍ、３時間、３０℃で振とう培養した。３時間後、カナマイシンを含むＹＭ寒天培地上に２００μｌスプレッドし、４８〜５６時間、３０℃で培養し、形成されたコロニーについてＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシングを行い、遺伝子導入を確認した。
（４）コロニーＰＣＲ
遺伝子導入が確認されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株のコロニーを取り出し、表２の組成でコロニーＰＣＲを行った。また、得られたＰＣＲ産物を１μｌ取り出し、少量のｂｌｕｅ  ｊｕｉｃｅと混合した後、０．５％ＴＡＥに２％量のアガロースを溶かしたゲルで泳動した。マーカーはλ  ＨｉｎｄＩＩＩ（ボーリンガーマンハイムのマーカーＩＩ）を用いる。その後、表２の割合で混合した溶液を８連チューブに入れ、ＰＣＲ機（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）にかけた。
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上記反応液を１．５ｍｌのＬｏｃｋｉｎｇ  Ｔｕｂｅに移し、７５％イソプロパノール８０μｌ加えて混合後、室温で１５分放置し、２０分遠心（室温・最大スピード）した。上澄みを除き、さらに７５％イソプロパノールを２５０μｌ加えて混合後、５分遠心（室温・最大スピード）し、上澄みを除いてドラフト内で乾燥させた。次に、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）を２５μｌずつ入れて混合し、スピンダウンして、ヒートブロックで９５℃、３分、熱ショックをかけた。これを氷上に放置し、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒ３１０専用のチューブに移し換え、ＤＮＡシークエンシングを行った。
遺伝子導入が確認されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢ４４０４株のコロニーを取り出し、カナマイシン１００ｍｇ／ｌ入れたＹＥＢ培地で３０℃、２２５ｒｐｍで一晩振とう培養する。この培養した菌液をクリオチューブに８５０μｌずつ氷上で分注し、グリセリン１５０μｌを加え、蓋をしてパラフィルムを巻いた後、ボルテックスを用いて混和した。これを−２０℃で冷やしておいた９９．５％エタノールにラップに包んでつけ、１０分程度−２０℃の冷凍庫で冷やす。その後−８０℃で冷やしておいた保存ケースに入れて保存した。
〔実施例３〕  組換え植物の作出
実施例２で作製したベクターを用いてネコブセンチュウ抵抗性遺伝子領域を導入した組換え植物を作出した。宿主植物としては、再分化や成長が早いネコブセンチュウ感受性の２倍体のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（ナス科植物）を用いた。これと平行してネコブセンチュウ感受性の４倍体ジャガイモ品種Ｄｅｓｉｒｅｅにも遺伝子導入を行った。
（１）植物体へのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの感染  実施例２で作製したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢ４４０４株を氷上で溶かしておく。クリーンベンチ内で５０ｍｌファルコンチューブにＹＥＢ培地４０ｍｌを移し、抗生物質を入れて転倒混和し、１チューブあたり１０ｍｌずつ分注した。そこにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株１０μｌを加えて、振とう培養機で一晩培養し（２８℃、２２５ｒｐｍ）、培養液の吸光度を波長６００ｎｍ分光光度計を用いて測定した。なお、このときの吸光度は約２程度あるのでＹＥＢ培地を用いて吸光度が０．６〜０．８になるように希釈した。
継代後２〜３週齢の植物体は、滅菌済み濾紙上でメスを用いて傷つけ、根、茎、葉に切り分けて、乾燥しないように滅菌水につけた。傷をつけた植物断片は吸光度０．６〜０．８に調整したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ溶液に７分間浸し、滅菌済み濾紙上に取り出して十分に水分を切り、共存培地で３日間培養した。なお、共存培地は、ベンジルアデニン（ＢＡ）１ｍｇ／ｌ、Ｔｒａｎｓ  Ｚｅａｔｉｎ  Ｒｉｂｏｓｉｄｅ  ３５ｍｇ／ｌ、インドール酢酸０．１ｍｇ／ｌを加えたものを用いた。
（２）共存培地への継代
前項同様共存培地を作製し、これをシャーレに２０ｍｌずつ分注し、滅菌した円形濾紙を載せ、感染させた植物体を移して３日間培養した。
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（３）カルス形成用培地への継代
表３の改変ＭＳ培地にベンジルアデニン１ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ  ０．１ｍｇ／ｌ、カナマイシン１５０ｍｇ／ｌ、カルベニシリン２００ｍｇ／ｌを加えてカルス形成用培地とし、これをシャーレに２０ｍｌずつ分注する。このカルス形成用培地に、共存培地で３日間培養した植物体断片を順次継代した。
（４）シュート育成用培地への継代
表３の改変ＭＳ培地にカナマイシン１５０ｍｇ／ｌ、カルベニシリン２００ｍｇ／ｌを加えてシュート育成用培地とし、シャーレに２０ｍｌずつ分注する。このシュート育成用培地に、カルス形成用培地で２週間程度培養してカルスが形成された植物体断片を順次継代し、一日中、光（蛍光灯光）のあたる部屋で培養した。
（５）ＭＳ試験管培地への継代
表３の改変ＭＳ培地を１本の試験管に５ｍｌずつ分注し、オートクレーブで滅菌処理する。これに、シュート育成用培地で再分化させた個体を、完全に独立した個体を１系統として継代した。
（６）発根（Ｒｏｏｔｉｎｇ）用培地への継代
表３の改変ＭＳ培地にカナマイシン７５ｍｇ／ｌ、カルベニシリン１００ｍｇ／ｌを加えて培養瓶に４０ｍｌずつ分注し、発根用培地とする。ＭＳ試験管培地で１〜２週間培養し植物体の大きさが２〜３ｃｍに達した固体を、順次この発根用培地へ１瓶３個体程度継代した。
（７）順化
プランターに市販の野菜用の土を入れ、発根用培地で３週間程度培養し、しっかりと根が伸長した個体を移植して育てた。
〔実施例４〕  サザン・ハイブリダイゼーションによる遺伝子導入の確認
再生個体を選択培地であるカナマイシンを含む培地で育て、発根を主体とした成長の可否を指標として、成長の良好な系統を暫定的に組換え体候補として選抜した。この組換え体候補についてサザン・ハイブリダイゼーションにより遺伝子導入を確認した。
（１）試験方法
この暫定的組換え体候補系統群について、ＤＮＡを抽出し、実施例１で使用したプライマー（配列番号２及び３）を用いてＰＣＲを行い、ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子領域を増幅した。
ＰＣＲにより、遺伝子領域が導入されていると認められた系統について、実施例１で決定されたＲｍｉの配列（配列番号１）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、導入された遺伝子の数を推定した。ハイブリダイゼーションの条件を表４に示す。
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（２）結果
図１の結果をみると、ＣｏｎｔｒｏｌにもＰｏｓｉｔｉｖｅな反応が出ている。これは、非組換え体の植物にもＨｙｂｒｉｄｉｚｅする相同な領域を持っているためにＰｏｓｉｔｉｖｅな反応が出たものと思われた。そこでＣｏｎｔｒｏｌとバンドの形態が異なり、かつＣｏｎｔｒｏｌよりもバンド数の多い個体を、遺伝子導入された固体と判断した。
〔実施例５〕  ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子導入の確認
（１）試験方法
１）ｃＤＮＡの合成
乳鉢で液体窒素を用いて植物体を粉末状になるまで磨り潰し、常法に従いｍＲＮＡを抽出した。このｍＲＮＡをもとに、ＴＡＫＡＲＡ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラ社製）に添付されたＲａｎｄｏｍ  ９ｍｅｒとＭ１３ＰｒｉｍｅｒＭ４にｄＴを付加したプライマーを用いて、表５に示す反応組成で逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。なお、用いたプライマーと反応条件は以下のとおりである。
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＜Ｒａｎｄｏｍ  ９ｍｅｒｓ  Ｐｒｉｍｅｒを用いた反応＞
Ｒａｎｄｏｍ  ９ｍｅｒ：ｄｐ（５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’）
反応条件：３０℃  １０ｍｉｎプレインキュベート
４２℃  ３０分、９９℃  ５分、５５℃  ５分、１サイクル
＜Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒを用いた反応＞
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にｏｌｉｇｏ−ｄＴを付加したもの。
反応条件：４２℃  ３０分、９９℃  ５分、５５℃  ５分、１サイクル
２）ＰＣＲ反応
次に、得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、以下に示すプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ：ＲＫＮとＰｒｉｍｅｒ：Ｓｔａｒｔ２×２、Ｐｒｉｍｅｒ：ＰｏｔａＬＲＲ）および反応条件で行った。
＜Ｐｒｉｍｅｒ：ＲＫＮを用いたＰＣＲ反応＞
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反応条件：９５℃  １０分、９５℃  １分、５５℃  ２分、７２℃  ３分  ３０サイクル
最終伸張７２℃１０分
＜Ｐｒｉｍｅｒ：Ｓｔａｒｔ２×２、ＰｏｔａＬＲＲを用いた反応＞
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反応条件：９５℃  １０分、９５℃  １分、５５℃  ２分、７２℃  ３分  ３０サイクル
最終伸張７２℃１０分
３）電気泳動
上記で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、そのバンドの違いを比較することによって遺伝子導入の有無を判断した。
（２）結果
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に示す。１３より、Ｐｒｉｍｅｒ：ＲＫＮとＰｒｉｍｅｒ：Ｓｔａｒｔ２×２、ＰｏｔａＬＲＲにおいて、Ｃｏｎｔｒｏｌにはバンドは検出されず、組換え体候補（個体８及び９）にはバンドが検出された。これより、組換え体における遺伝子導入と転写が確認された。
〔実施例６〕  組換え植物の抵抗性評価
（１）試験方法
遺伝子導入が確認されたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ組換え体（Ｎｏ．１，Ｎｏ．８，Ｎｏ．１４，Ｎｏ．１８など）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの非組換え体、及びネコブセンチュウ感受性であるトマト系統ＴＡ２０９にネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）を感染させた。そして、その後の植物体地上部や根の様子を肉眼、及び顕微鏡で観察した。
また、遺伝子導入が確認されたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ組換え体（Ｎｏ．１，Ｎｏ．８，Ｎｏ．１４，Ｎｏ．１８など）、非組換え体、及びＴＡ２０９を、ネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）感染土壌で栽培して、抵抗性を評価した。同様に栽培して評価した。評価は、常法（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８）に従い、Ｅｒｉｏｇｌａｕｃｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてネコブセンチュウの卵を染色し、卵の有無や数を測定し、これにより抵抗性を評価した。また、この際に、根中の成虫の存在についても確認を行った。こうして、遺伝子導入数とセンチュウ抵抗性の関係を調べた。
（２）結果
組換え体の地上部の状態は、非組換え体及びＴＡ２０９の地上部の状態と比べて黄化の程度が進んでおらず、根瘤数も少なかった。さらに根を顕微鏡で観察したところ、組換え体では根に瘤状の変形は見られなかったが、非組換え及びＴＡ２０９では根に瘤状の変形が見られ、その中にセンチュウの卵と思われる影を観察することができた。以上より、本発明の遺伝子を導入した組換え植物は、高いネコブセンチュウ抵抗性を有することが確認された（図３および図４）。
さらに、本発明の組換え植物は、３３〜３５℃という高い温度条件下で培養・栽培してもネコブセンチュウに対する抵抗性維持し続けることができた。したがって、本発明の遺伝子はＭｉ遺伝子のような高温感受性（２８℃で失活）がないことが確認された。
〔実施例７〕  タバコ野生種におけるネコブセンチュウ抵抗性評価
（１）試験方法
実施例２で作製したベクターを用いて、実施例３の方法にしたがい、タバコ野生種にネコブセンチュウ抵抗性遺伝子を導入した。遺伝子導入したそれぞれの系統について、サザンハイブリダイゼーション及びＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子導入を確認した。さらに、組換え植物をネコブセンチュウ（Ｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）感染土壌に植え、温室内において、昼間（１６時間）は３０−３５℃、夜間（８時間）は２５−３０℃で６週間育成し、抵抗性を評価した。抵抗性は、まず根の根瘤を観察し、根瘤のないものについてさらに顕微鏡観察を行って評価した。結果を表８に示す。
（２）結果
表８より明らかなように、本発明のネコブセンチュウ抵抗性遺伝子はトマトのｍｉ遺伝子等の従来のネコブセンチュウ抵抗性遺伝子にはない、量的抵抗性を有することが確認された。
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〔実施例８〕  ジャガイモ栽培種におけるネコブセンチュウ抵抗性評価
（１）試験方法
実施例２で作製したベクターを用いて、実施例３の方法にしたがい、ジャガイモ栽培種（Ｄｅｓｉｒｅｅ）にネコブセンチュウ抵抗性遺伝子を導入した。遺伝子導入したそれぞれの系統について、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、及びＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子導入を確認した。さらに、組換え植物をネコブセンチュウ（Ｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）感染土壌に植え、温室内において、昼間（１６時間）は３０−３５℃で、夜間（８時間）は２５−３０℃で６週間育成し、抵抗性を実施例７と同様の方法で評価した。なお、ｃｏｎｔｒｏｌとして未処理のＤｅｓｉｒｅｅ、およびネコブセンチュウ感受性のＡｔｚｉｍｂａ（ジャガイモ）、ＴＡ２０９、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａも同様に育成し、評価した。結果を表９に示す。
（２）結果
表９より明らかなように、本発明のネコブセンチュウ抵抗性遺伝子はジャガイモ栽培種においても、量的抵抗性を示すことが確認された。
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本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、高温感受性がなく、様々なネコブセンチュウの種や系統に幅広く対応できる、量的抵抗性を有する新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子が提供される。該遺伝子を利用すれば、ジャガイモ、トマト、タバコ等の重要な作物に、高いネコブセンチュウ抵抗性を付与することができる。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、サザン・ハイブリダイゼーションによる遺伝子導入の確認結果を示す。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子導入の結果を示す。
２Ａ：Ｐｒｉｍｅｒ：ＲＮＫ  ２Ｂ：Ｐｒｉｍｅｒ：Ｓｔａｒｔ２ｘ２，ＰｏｔａｌＲＲ
図３は、ネコブセンチュウ感染４２日後の根の状態を示す写真である。
３Ａ：組換え体  ３Ｂ：ｃｏｎｔｒｏｌ  ３Ｃ：ＴＡ２０９
図４は、ネコブセンチュウ感染４２日後の根の顕微鏡写真（×４０）である。
４Ａ：組換え体  ４Ｂ：ｃｏｎｔｒｏｌ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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