(57)【要約】アダム分子、特にアダム１２のプロテアーゼ活性に対する阻害剤（例えばヒドロキサム酸化合物）は、心肥大に伴う心機能不全の治療薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アダム分子のプロテアーゼ活性に対する阻害剤を有効成分とする、心肥大に伴う心機能不全の治療薬。
【請求項２】
アダム分子のプロテアーゼ活性に対する阻害剤がマトリクスメタロプロテアーゼ阻害活性を有するヒドロキサム酸化合物である、請求項１の治療薬。
【請求項３】
アダム分子がアダム１２である請求項１又は２の治療薬。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
アダム（ＡＤＡＭ；Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）とは、その名の通りシステイン残基を多く含むディスインテグリン様ドメインと金属プロテアーゼ様ドメインを含む分子であり、プロテアーゼ活性のみならず接着分子活性をも発揮し得る機能性タンパク質として注目を集めている。
本願発明は、このアダム分子、より詳しくは、アダム１２のプロテアーゼ活性を阻害することにより、ヘパリン結合性ＥＧＦ（上皮増殖因子）様増殖因子（以下、ＨＢ−ＥＧＦと略記する）の可溶化を抑制する作用を有する化合物を有効成分とする、心肥大に伴う心機能不全治療薬に関する。
（背景技術）
現在までにアダムファミリーに属する２０種以上の分子が報告されている〔例えば、アダム１７／Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７２９（１９９７），ｉｂｉｄ．，３８５，７３３（１９９７）；アダム９／Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３２，７１７（１９９６）；アダム１０／Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１７，４５（１９９６），；アダム１２／Ｎａｔｕｒｅ，３７７，６５２（１９９５）；アダム１５／Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，４５９３（１９９６）；アダム２０／Ｇｅｎｅ，２０６，２７３（１９９８）等〕。
これらの多くは膜貫通型ドメインを有して細胞膜に局在し、細胞表面における分子制御に極めて重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。例えば、アダム１７は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の転換酵素（可溶化酵素）として知られている。また、アダム１０はノッチシグナル（Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌ）の制御に関与し、神経形成に重要な役割を果たしている他、膜タンパクのプロセシング、更には細胞外マトリックス成分の分解への関与も示唆されている。アダム１２がプロテアーゼ活性を有することは既に知られているが、その生理的意義は不明である。
これらアダム分子によるプロセシングの標的分子のひとつに成長因子がある。今日までに種々の成長因子ファミリーが知られているが、例えば、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）リガンドの成長因子ファミリー（ＥＧＦの他、ＨＢ−ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子−α、アンフィレギュリン、エピレギュリン等）は、いずれも膜結合型として生体内で合成された後、プロセシングを受けて可溶化されることが知られている。成長因子の可溶化酵素について、イズミ（ｉｚｕｍｉ）等は、ＨＢ−ＥＧＦの可溶化プロセスにアダム９が関与することを述べている〔ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７，７２６０−７２７２（１９９８）〕。
最近、成長因子が心肥大を引き起こす因子のひとつとして注目されている。心肥大は、本来、種々の負荷に対する心臓の適応反応であるが、長期にわたる心肥大は慢性的な心機能障害や突然死にも関連するのでそのメカニズム解明は重要である。
フェニレフリン、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン−１のような血管収縮性薬物が心肥大を引き起こすことが既に知られている。これらの薬物はいずれもＧ−タンパク連結受容体（ＧＰＣＲ）に結合した後、一連のシグナル伝達を介してタンパク合成を刺激し心肥大を引き起こすことが知られている。
このＧＰＣＲにより開始される一連のシグナル伝達系にＥＧＦＲの活性化が関与している例が種々の細胞で報告されている。例えば、エグチ（Ｅｇｕｃｈｉ）等は、ラットの血管平滑筋細胞を用いた実験からアンジオテンシンＩＩがＧＰＣＲに結合した後、ＥＧＦＲのリン酸化を生じさせることを示した〔Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７３，８８９０−８８９６（１９９８）〕。また、プレンツェル（Ｐｒｅｎｚｅｌ）等は、ＧＰＣＲの活性化によりＨＢ−ＥＧＦにおける前駆体からの可溶化プロセスが促進され、生じた活性化ＨＢ−ＥＧＦがＥＧＦＲと結合してこれを活性化するスキームを提出し、ＨＢ−ＥＧＦの可溶化プロセスをブロックすることによりＧＰＣＲを介して誘起されるＥＧＦＲ活性化を阻害できることを示した〔Ｎａｔｕｒｅ，４０２，８８４（１９９９）〕。
（発明の開示）
本願発明の目的は、心肥大に伴う、心機能不全の新たな治療薬を提供することにある。
発明者等は、心筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの可溶化酵素阻害剤（ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ０１／７０２６９）がＥＧＦＲのリン酸化に及ぼす影響を調べたところ、フェニレフリン、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン−１によるＥＧＦＲのリン酸化は阻害を受けるが、リコンビナントＨＢ−ＥＧＦ（可溶化されたＨＢ−ＥＧＦ）によるリン酸化は影響されないことを見出した。フェニレフリン、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン−１によるＥＧＦＲのリン酸化は、ＨＢ−ＥＧＦの中和抗体によっても阻害を受けることから、可溶化されたＨＢ−ＥＧＦがＥＧＦＲの活性化に寄与していることが明らかとなった。
次いで、発明者等は、心筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの可溶化を担っている酵素の同定を行った。ＨＢ−ＥＧＦの可溶化がプロテインキナーゼＣのδフォーム（ＰＫＣδ）を介することが知られているので、ＰＫＣδとの結合能を指標としてヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、可溶化酵素がアダム１２であることを明らかにした。
次に、心肥大モデルマウスにおいて、可溶化酵素阻害剤が心肥大および心機能に及ぼす効果を確認した（後記試験例１〜３参照）。
以上の結果より、本願発明者らは、心肥大には可溶型のＨＢ−ＥＧＦが極めて重要な働きをしていることを見い出し、この産生を阻害すれば心肥大に基づく心機能不全の治療に有効であることを確認して本願発明を完成した。
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の心機能不全治療剤は、アダム分子のプロテアーゼ活性に対する阻害剤、特に、心筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの可溶化酵素であるアダム１２のプロテアーゼ活性を阻害する化合物を有効成分とする。その有効成分としては、ヒトにおいてアダム１２のプロテアーゼ活性を阻害する化合物であれば特に限定はされないが、例えば、ＰＣＴ国際公開公報（ＷＯ９７／３１１０９号）に開示されたメルトリン（アダム１２の別名；Ｍｅｌｔｒｉｎ  α）のアンタゴニストであってアダム１２のプロテアーゼ活性を阻害し得るものは本発明の心機能不全治療剤として用いることができる。その他、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤として知られている多くのヒドロキサム酸化合物がアダムのプロテアーゼ活性を阻害することが知られており（例えば、米国特許６１１０９６４号、同６１１４３６１号、同６１５６７９８号、同６１９７８１０等）、ＭＭＰ阻害作用を有するヒドロキサム酸化合物も本発明の心機能不全治療剤として用いることができる。また、以下の化合物も本発明の心機能不全治療剤として用いることができる。
１）４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（特開平７−１０１９２５号）
２）［４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１−ナフチル）アラニン−Ｎ−メチルアミド（ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９７／９０６６号）
３）［４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチルサクシニル］−Ｌ−３−（１−ナフチル）アラニン−Ｎ−メチルアミド〔Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，７６５−７７８（１９９７）〕
４）［４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリルメチル）サクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド〔Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，７６５−７７８（１９９７）〕
５）４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソプロピル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−メチルアミド〔Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１６，１１９−１３０（１９９９）〕
６）４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−メチルアミド（米国特許４７４３５８７号）
これらの化合物は、経口又は非経口で人間に投与することができる。
経口投与の剤型としては、錠剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、硬カプセル剤等の固形製剤の他、シロップ剤、軟カプセル剤等の液剤が含まれる。これらの製剤は常法によって製剤可能であり、錠剤、顆粒剤、散剤又は細粒剤は、上記化合物又はその薬学的に許容される塩と、例えば、乳糖、でんぷん、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、タルク等の通常用いられる医薬添加物とを混合して製造され、硬カプセル剤はこれら細粒剤又は散剤を適宜カプセルに充填することにより製造される。又、シロップ剤は白糖、カルボキシセルロース等を含む水溶液に上記化合物又はその薬学的に許容される塩を溶解又は懸濁して製造され、軟カプセル剤は、脂質賦形剤、例えば、植物油、油性エマルジョン、グリコール等に前記の化合物又はその薬学的に許容される塩を溶解または懸濁し、軟カプセルに充填して製造される。
非経口投与の剤形としては、注射剤の他、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤等の外用剤、坐薬、膣坐薬等の坐剤、噴霧剤等の経鼻投与剤等が例示される。これらの製剤は常法によって製造可能であり、例えば注射剤は、前記の化合物又はその薬学的に許容される塩を生理食塩液又は脂質賦形剤、例えば、植物油、油性エマルジョン、グリコール等に溶解又は乳化させ無菌的にアンプル又はバイヤルに封入することによって製造される。又、軟膏剤は、例えばワセリン、パラフィン、グリセリン等の基剤に前記の化合物又はその薬学的に許容される塩を加え、必要に応じて乳化剤、保存剤等を添加して常法により製造される。
本発明の薬剤の投与量は、剤型、患者の年齢、性別若しくは体重又は症状によっても異なるが、一般には、有効成分として０．１〜６００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日が適量であり、これを１日１回または２〜４回に分けて投与する。
本発明の薬剤は、心肥大モデルマウスにおいて心肥大を有意に抑制し、また心機能の回復効果を示した（試験例１〜３）。組織学的検査によっても線維症または筋原線維の分解等は認められない。よって、本発明の薬剤は心肥大に伴う心機能不全の治療薬として有用である。
試験例１  心肥大抑制効果（左心室壁の厚さの変化）
１．供試化合物
化合物ａ：４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（特開平７−１０１９２５号）
２．試験方法
胸部大動脈狭窄マウス（ＴＡＣマウス）を用いて、左右頸動脈間に収縮期圧でおよそ４５ｍｍＨｇの血圧傾斜を作製し、圧負荷により形成される、後部左心室壁の肥厚に及ぼす供試化合物の影響を観察した。
ＴＡＣマウスは、８週齢、体重２０−２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを用い、左右頸動脈間の大動脈に隣接する部位において２７−ゲージ針と縫合糸を用いて横行大動脈の縮窄をすることにより作製した。
化合物ａは、０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁して、ＴＡＣマウスに対して１日あたり１００ｍｇ／ｋｇを４週間腹腔内投与し、心エコー図測定により左心室壁の厚さを測定した。
３．試験結果
測定結果を表１に示す。
2003045433.tif 000002
偽処置群に対する化合物非投与群、及び化合物非投与群に対する化合物投与群の測定値の有意差検定を実施して、結果をそれぞれ＊及び†で表した。
＊  Ｐ＜０．０５
†  Ｐ＜０．０５
供試化合物は、明らかに左心室壁の肥厚を抑制する効果を示した。
試験例２  心肥大抑制効果（心臓重量の変化）
１．供試化合物
化合物ａ：４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（特開平７−１０１９２５号）
２．試験方法
試験例１のＴＡＣマウスにおいて、４週後に体重および心臓重量を測定した。
３．試験結果
測定結果を表２に示す。
【表２】
2003045433.tif 000003
偽処置群に対する処置群、及び化合物非投与群に対する化合物投与群の測定値の有意差検定を実施して、結果をそれぞれ＊及び†で表した。
＊  Ｐ＜０．０５
†  Ｐ＜０．０５
供試化合物は、明らかに心臓重量の増加を抑制する効果を示した。
試験例３  心機能の保護効果
１．供試化合物
化合物ａ：４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（特開平７−１０１９２５号）
２．試験方法
試験例１に同じ。
２週間経過後および４週間経過後に、心エコー図測定により心筋収縮率を測定した。
３．試験結果
測定結果を表３に示す。
【表３】
2003045433.tif 000004
偽処置群に対する処置群、及び化合物非投与群に対する化合物投与群の測定値の有意差検定を実施して、結果をそれぞれ＊及び†で表した。
＊  Ｐ＜０．０５
†  Ｐ＜０．０５
供試化合物は、明らかに心筋収縮率の低下を抑制する効果を示した。
以下に参考例及び実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
錠剤の製造
以下の通り、１錠中に４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（化合物ａ）１００ｍｇを含有する錠剤を得る。
［処方］
2003045433.tif 000005
［操作］
主薬、コーンスターチ及び微結晶セルロースを混合し、これに水５０重量部に溶解したヒドロキシプロピルセルロースを加えて充分練合する。この練合物を篩に通して顆粒上に造粒して乾燥した後、得られた顆粒にステアリン酸マグネシウムを混合し１錠２５０ｍｇに打錠する。
実施例２
顆粒剤の製造
以下の通り、４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（化合物ａ）を含有する顆粒剤を得る。
［処方］
2003045433.tif 000006
［操作］
主薬、乳糖及びコーンスターチを混合し、これに水１２０重量部に溶解したヒドロキシプロピルセルロースを加えて充分練合する。この練合物を２０メッシュの篩に通して造粒し、乾燥して整粒を行い、５００ｍｇ中に主薬２００ｍｇを含有する顆粒剤を得る。
実施例３
カプセル剤の製造
以下の通り、１カプセル中に４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（化合物ａ）１００ｍｇを含有するカプセル剤を得る。
［処方］
2003045433.tif 000007
［操作］
上記の各成分を充分混合して、この混合末の２００ｍｇ宛をカプセルに充填してカプセル剤を得る。
実施例４
注射剤の製造
４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２（Ｒ）−イソブチル−３−メチルサクシニル］−Ｌ−フェニルグリシン−Ｎ−メチルアミド（化合物ａ）０．５重量部およびソルビット５重量部の混合物に注射用蒸留水を加えて溶解し、１００重量部とし、この水溶液をメンブランフィルターで濾過する。濾液を窒素置換したアンプルに５ｇずつ充填し、溶閉後、１２０℃で１５分間滅菌処理して１アンプル中に化合物ａ２５ｍｇを含有する注射剤を得る。
【国際調査報告】
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