(57)【要約】試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法および装置において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差（Ｂ−Ａ）を求めることとする。さらに前記とは異なる方法として、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めるか、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることことにより、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図る。
2003100086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記第一画像中の輝点を計数し、
前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第二画像中の輝点を計数し、
前記第一画像中の輝点数と第二画像中の輝点数との差を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。
【請求項２】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、
前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。
【請求項３】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、かつ前記第一画像中の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、
前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、
前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。
【請求項４】
前記第一画像取得の際の励起光量は、前記第二画像取得の際の励起光量より大とすることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項５】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、前記請求の範囲第３項に記載の第一画像に代えて、試料の実体画像を取得してこれを第一画像とし、かつ前記実体画像中の全ての粒子の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、
前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、
前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。
【請求項６】
前記「生細胞を蛍光試薬により標識すること」に代えて、「生細胞内の代謝により蛍光すること」とすることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項７】
前記生細胞は、細菌とすることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項８】
試料をろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、蛍光試薬をフィルタ上の試料に添加して生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項９】
生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、ろ過後も残留する蛍光試薬を洗い流すべく、洗浄液を前記フィルタ上の試料に添加して、この洗浄液をろ過することを特徴とする請求の範囲第８項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項１０】
前記洗浄液は、前記蛍光試薬の蛍光発現に適したｐＨを有する緩衝液とすることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項１１】
前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部を正に帯電させることにより、自然状態で負に帯電した試料中の生細胞を前記正帯電部に捕捉し、前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項１２】
前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部に、予め、捕捉すべき生細胞と特異的に結合する抗体を固定しておくことにより、試料中の生細胞を前記抗体との結合によって捕捉し、前記抗体に捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項１３】
前記試料を、ろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上の生細胞捕捉面を、ガラスまたはプラスチック等の透明板で被覆し、この透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬をフィルタの生細胞捕捉面と反対側から添加することにより、前記前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、前記透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。
【請求項１４】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
生細胞計数用の撮像手段を備え、かつ試料中の生細胞を捕捉するための正帯電部もしくは抗体固定部を備えたセル流路内に、前記試料を蛍光試薬と共に導入し、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識される前に、前記捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、その後、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識した後に、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。
【請求項１５】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、
前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数し、かつ前記第一画像と第二画像との間の輝点数の差を求める演算手段とを備えることを特徴とする生細胞の計数装置。
【請求項１６】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、
前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、前記第一画像と第二画像との間の差分画像を求め、この差分画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数する演算手段とを備えることを特徴とする生細胞の計数装置。
【請求項１７】
試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、
前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求め、予め設定した範囲の面積を有する輝点の位置を記録する画像処理手段と、記録した個々の輝点の位置に対して、予め設定した領域を各々の輝点に付随する不感領域として認識し、かつ、前記第二画像中の輝点のうち、その位置が第一画像で認識された不感領域に含まれないものを判別し計数する演算手段とを備えることを特徴とする生細胞の計数装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、微生物や組織細胞等の生細胞を、蛍光標識（蛍光試薬で染色）し、試薬を励起することで蛍光を発生させ、あるいは、微生物や組織細胞等の生細胞が元々有する蛍光性分子を励起することで蛍光を発生させ、その蛍光画像を利用して生細胞を計数する生細胞の計数方法および装置に関する。
背景技術
試料中の微生物や動植物等の組織細胞などの生細胞の検出は、例えば、滅菌状態の確認や、細胞の生存状態の異常等を検出する上で、産業上極めて重要な技術である。以下の説明においては、説明の便宜上、主に細菌を対象として述べる。
自然環境中には、生きているが通常の方法では培養が困難な状態にある細菌が高い割合で存在する。これらの細菌は、一般的な寒天平板培地上にコロニーを形成せず、また液体培地中でも増殖しないことが多い。このため、従来の培養を基本とする方法では検出できない恐れがある。
こうした問題を解決する方法として、前記生細胞を蛍光試薬により標識する方法以外に、例えばＤＮＡに結合するジアミジノ・フェニル・インドール（ＤＡＰＩ）やアクリジン・オレンジ（ＡＯ）を用いて遺伝子を標識することで細菌を検出する方法や、細菌内で代謝されて蛍光性となるフルオレセイン・ジアセテート（ＦＤＡ）、カルボキシ・フルオレセイン・ジアセテート（ＣＦＤＡ）、５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロライド（ＣＴＣ）などを用いて生理活性を維持している細菌を検出する計測方法が提案されている。
前記ＦＤＡやＣＦＤＡは、細菌などの生細胞内にある酵素（エステラーゼ）の働きで加水分解されて蛍光性となる。また、ＣＴＣは、生細胞の呼吸に伴って還元されると蛍光性となる。前記いずれの試薬も、溶液として測定対象となる試料中の生細胞に接触させ、生細胞内に取り込まれて反応することにより、蛍光を発する状態となり、この蛍光によって細菌等の生細胞を検出する。
しかしながら、蛍光によって細菌を検出する方法では、試料中に蛍光性の夾雑物が共存した場合、それを検出すべき細菌と誤認し、計数結果の誤差になるという問題があった。
後述する特許文献１は、この問題を解消すべく発明された細菌の検出方法として、以下の方法を開示している。即ち、「（ａ）蛍光性酵素基質で媒体を染色し、その蛍光画像を記録し、（ｂ）染色された媒体に光照射して光退色させた後、その蛍光画像を記録し、（ｃ）上記（ａ）で得られた蛍光画像と、上記（ｂ）で得られた蛍光画像との差画像を取ることを特徴とする生細胞の検出方法。」を開示している。
前記特許文献１に記載の発明においては、要するに、蛍光試薬によって標識した細菌が元々試料に含まれる蛍光性夾雑物よりも光退色しやすいという点に着目し、前記のような手順により蛍光性夾雑物の影響を除去するようにしている。
しかしながら、上記特許文献１に記載の発明においても、下記のような問題がある。
蛍光試薬によって標識した生細胞は、試料に含まれる蛍光性夾雑物よりも光退色しやすいものの、夾雑物の蛍光特性は制御し得ないため、必ずしも、染色された細菌だけが退色して、夾雑物の蛍光が全て退色しない状態を維持するとは限らない。
夾雑物の蛍光が蛍光標識した細菌と同様に退色した場合には、その分測定誤差となる。従って、常に、精度の高い生細胞の計数が可能というわけにはいかず、試料の性状が変わった場合には、計測値の精度確保が難しい問題がある。
〔特許文献１〕
特開平１０−２１５８９４号公報
本発明は上記のような点に鑑みなされたもので、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図った生細胞の計数方法および装置を提供することを目的とする。
発明の開示
上記のような課題を解決するため、請求の範囲第１項の発明では、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記第一画像中の輝点を計数し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第二画像中の輝点を計数し、前記第一画像中の輝点数と第二画像中の輝点数との差を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする。上記計数方法によれば、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除でき、精度よく生細胞を計数することができる。
同様の目的を達成するために、下記請求の範囲第２項ないし第３項の発明の方法とすることもできる。即ち、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定する（請求の範囲第２項の発明）。
また、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、かつ前記第一画像中の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定する（請求の範囲第３項の発明）。
上記不感領域設定は、計測状況や試料の状態によって異なるが、例えば「第一画像で得られた輝点の存在位置に対して半径１０μｍの領域」あるいは「画像として縦横とも±５ピクセルの領域」といった設定ができる。この不感領域を適切に設定することによって、細菌数を適正に計測することが可能となる。
さらに、蛍光性夾雑物の影響の排除をより確実にして、生細胞の計数精度をより向上する観点から、下記請求の範囲第４項ないし第５項の発明が好ましい。即ち、前記請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記第一画像取得の際の励起光量を、前記第二画像取得の際の励起光量より大とする（請求の範囲第４項の発明）。
また、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、前記請求の範囲第３項に記載の第一画像に代えて、試料の実体画像を取得してこれを第一画像とし、かつ前記実体画像中の全ての粒子の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定する（請求の範囲第５項の発明）。
さらに、請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記「生細胞を蛍光試薬により標識すること」に代えて、「生細胞内の代謝により蛍光すること」とすることもできる（請求の範囲第６項の発明）。生細胞内の代謝により蛍光性となる試薬としては、前述のＦＤＡ，ＣＦＤＡ，ＣＴＣ等が使用できる。
また、適用メリットの観点から、前記請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記生細胞は、細菌とすること（請求の範囲第７項の発明）が好適である。
さらにまた、請求の範囲第１項ないし第５項の発明の実施態様としては、測定精度向上の観点から、下記請求の範囲第８項ないし第１０項の発明が好ましい。即ち、試料をろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、蛍光試薬をフィルタ上の試料に添加して生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得する（請求の範囲第８項の発明）。
また、請求の範囲第８項に記載の生細胞の計数方法において、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、ろ過後も残留する蛍光試薬を洗い流すべく、洗浄液を前記フィルタ上の試料に添加して、この洗浄液をろ過する（請求の範囲第９項の発明）。
さらに、請求の範囲第９項に記載の生細胞の計数方法において、前記洗浄液は、前記蛍光試薬の蛍光発現に適したｐＨを有する緩衝液とする（請求の範囲第１０項の発明）。
また、前記第一画像および第二画像を取得する際の、前記請求の範囲第８項の発明とは異なる方法に関する発明としては、下記請求の範囲第１１項ないし第１４項の発明が、それぞれニーズに応じて好適に採用できる。
まず、請求の範囲第１１項の発明は、生細胞の捕捉に静電力を利用する方法であって、即ち、前記請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部を正に帯電させることにより、自然状態で負に帯電した試料中の生細胞を前記正帯電部に捕捉し、前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする。
次に、請求の範囲第１２項の発明は、生細胞の捕捉に抗原抗体反応を利用する方法であって、即ち、前記請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部に、予め、捕捉すべき生細胞と特異的に結合する抗体を固定しておくことにより、試料中の生細胞を前記抗体との結合によって捕捉し、前記抗体に捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする。
次に、請求の範囲第１３項の発明は、生細胞の捕捉にフィルタを利用し、塵埃付着防止やハンドリングの容易化のために生細胞捕捉面を透明板で保持する方法であって、即ち、前記請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記試料を、ろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上の生細胞捕捉面を、ガラスまたはプラスチック等の透明板で被覆し、この透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬をフィルタの生細胞捕捉面と反対側から添加することにより、前記前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、前記透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする。なお、前記透明板としては、厚さの薄いフィルム状のものが好ましい。
次に、請求の範囲第１４項の発明は、生細胞の捕捉に、静電力または抗原抗体反応を利用し、かつ蛍光試薬の反応時間を第一画像および第二画像の取得タイミングに利用する方法であって、即ち、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、生細胞計数用の撮像手段を備え、かつ試料中の生細胞を捕捉するための正帯電部もしくは抗体固定部を備えたセル流路内に、前記試料を蛍光試薬と共に導入し、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識される前に、前記捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、その後、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識した後に、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする。
前記請求の範囲第１４項の発明の場合には、計数手順が簡略化するメリットがあるが、必要に応じて、蛍光試薬の濃度を下げて反応時間を遅くする、もしくは、反応時の温度を下げて反応時間を遅くすることにより、第一画像および第二画像の取得タイミングの間隔を大とすることができる。
また、前記計数方法を実施するための装置としては、下記請求の範囲第１５項ないし第１７項の発明が好適である。即ち、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数し、かつ前記第一画像と第二画像との間の輝点数の差を求める演算手段とを備える（請求の範囲第１５項の発明）。
また、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、前記第一画像と第二画像との間の差分画像を求め、この差分画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数する演算手段とを備える（請求の範囲第１６項の発明）。
さらに、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求め、予め設定した範囲の面積を有する輝点の位置を記録する画像処理手段と、記録した個々の輝点の位置に対して、予め設定した領域を各々の輝点に付随する不感領域として認識し、かつ、前記第二画像中の輝点のうち、その位置が第一画像で認識された不感領域に含まれないものを判別し計数する演算手段とを備える（請求の範囲第１７項の発明）。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例について、図１ないし図６に基づき詳細に説明する。
（実施例１：輝点数の差による方法）
図１に基づき、第一画像と第二画像との間の輝点数の差を求めることを利用する細菌数の計測方法の実施例について以下に述べる。以下の説明では液状試料に含まれる細菌の計数を想定している。ただし、固形試料に付着している細菌はふき取りやストマッキングによって滅菌水に展開し、それ以降、液状試料と同様に取り扱うことができる。
まず、試料１に含まれる細菌を、ろ過によってフィルタ２上に捕捉する。フィルタとしては、ポアサイズの均一性が高いメンブレンフィルタが好ましい。用いるメンブレンフィルタのポアサイズは、計測しようとする細菌のサイズによって選択が必要である。細菌を計数する場合は、通常０．２〜０．６μｍ程度が適当である。
次に、蛍光画像取得手段３を用いて、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光画像（第一画像）を取得する。取得した画像を画像・演算処理部４で画像処理し、画像中に存在する蛍光輝点数Ａを求める。蛍光標識前に既に存在する輝点は夾雑物である。
画像処理としては、具体的に次のような処理を行う。
▲１▼同一視野で複数画面を取込み、それらを平均化してランダムノイズを低減
▲２▼シェーディング（濃淡）補正
▲３▼エッジ検出により輝点を抽出
▲４▼ラベリングにより、どこまでがひとつながりの個別の輝点かを認識
▲５▼面積が予め設定した範囲に該当する輝点を選別
▲６▼▲５▼で選別された輝点を計数
前記▲５▼で予め設定する面積は、計数すべき細菌のサイズと検出に用いる装置の特性とから決まる数値である。事前に実験検討を行うことにより、例えば「直径０．２〜１０μｍ相当の面積」といった設定が可能である。
続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬５を添加する。蛍光標識試薬５としては、遺伝子に親和性のあるＤＡＰＩやＡＯを用いれば全細菌を標識できる。死菌の標識にはＰＩが適している。酵素反応や呼吸など細菌の生理活性によって蛍光を発現するＣＦＤＡやＣＴＣを用いれば、生菌だけを選択的に標識できる。特定の細菌を標識する場合は、抗原抗体反応や特定の遺伝子配列を認識する手法を利用する。前者の場合、目的とする細菌の抗原に特異的に結合する抗体を予め蛍光標識しておき、この蛍光標識抗体を試料と反応させることで特定種の細菌だけを標識する。後者の場合、ＦＩＳＨ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲといった手法を用いて特定の遺伝子をターゲットとして目的の細菌を標識できる。
細菌と反応しなかった蛍光標識試薬が計測上のノイズとなる場合がある。この場合には、細菌に取り込まれなかった試薬をろ過により除去することが有効である。さらに除去の効果を上げるためには、細菌に取り込まれなかった試薬をろ過により除去した後、さらに、洗浄液によって試薬を洗い流すことが効果的である。
洗浄液としては、蛍光標識試薬の蛍光発現に適したｐＨを有する緩衝液が適している。例えば、蛍光標識試薬としてＡＯやＣＦＤＡはアルカリ性で蛍光発現効率が良好なため、洗浄液としてアルカリ性のｐＨ緩衝液を用いることで、よりコントラストの高い蛍光画像を得ることができる。
蛍光標識の後、再びメンブレンフィルタの蛍光画像（第二画像）を取得する。取得した第二画像に第一画像と同様の画像処理を行い、画像中に存在する蛍光輝点数Ｂを求める。そして、第一画像と第二画像との間で輝点数の差（Ｂ−Ａ）すなわち、蛍光標識によって現れた輝点数を求め、これを細菌数とする。
（実施例２：差分画像の利用による方法）
図２に基づき、第一画像と第二画像との間で差分画像を求めることを利用する細菌数の計測方法の実施例について、以下に述べる。
手順としては、まず、実施例１と同じく、試料液に含まれる細菌を、ろ過によってメンブレンフィルタ上に捕捉する。次に、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光画像（図２の中央部に示す第一画像６）を取得する。続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。その後、再びメンブレンフィルタの蛍光画像（図２の左側に示す第二画像７）を取得する。そして、前記第二画像７と第一画像６とにより、図２の右側に示す差分画像８を求める。
差分画像８中に存在する輝点が蛍光標識によって現れた輝点であり、これを細菌数として計数する。
実際に画像間で差分を行う際は、上述の処理で理想的な結果が得られないケースがある。具体的には、次のような場合、単純な差分画像では適正な輝点数を得るのが難しい。
▲１▼第一画像と第二画像とで画像取得位置がずれた場合
▲２▼蛍光標識操作の影響や、画像取得時の光学的な条件の違いから、第一画像と第二画像とで画像全体（背景）の輝度が異なった場合
▲３▼画像取得時のピントの合い方や、画像処理時の条件設定の違いによって、第一画像と第二画像とで、各々対応する輝点に由来する画像の形状やサイズが異なった場合
▲４▼第一画像と第二画像とで輝点自体が移動してしまった場合
前記▲１▼の場合は、パターンマッチングという画像処理で二つの画像の位置関係を認識し、対応する位置の差分画像を求めれば正しい結果を得ることができる。
前記▲２▼の場合は、二値化やエッジ検出という画像処理で輝点に由来する信号と背景に由来する信号との区別を明らかにする手法によって対応できる。▲３▼の場合は、本実施例での対応が難しいが、後述の実施例３によれば有効に対応が可能である。▲４▼の場合は、前述の実施例１で対応できる。
この他、本実施例および後述の実施例３では、蛍光標識や洗浄の際に細菌の位置が移動すると、第一画像と第二画像との間の輝点の解析に誤差が生じる。これを防ぐためには、吸引ろ過を行ったままで蛍光標識や洗浄を行うことが有効である。
（実施例３：位置情報の利用による方法）
図３に基づき、蛍光輝点の位置情報を利用する細菌数の計測方法の実施例について、以下に述べる。
手順としては、実施例１および実施例２と同様に、まず、試料液に含まれる細菌を、ろ過によってメンブレンフィルタ上に捕捉する。次に、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光画像（第一画像６）を取得する。画像取得の際、基準点９（図中、白抜きの矢印で示す）を利用し、これを基準にメンブレンフィルタの位置を把握して、第一画像中の輝点の位置情報１０を認識する。続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。その後、メンブレンフィルタの蛍光画像（第二画像７）を取得する。第一画像と同様に、画像取得の際、基準点９（図中矢印）を利用し、これを基準にメンブレンフィルタの位置を把握して、第二画像中の輝点の位置情報１１を認識する。
図３に示す第一画像６および第二画像７は、微小ではあるが、平行移動と回転が起きている例を示す。このように、画像取得位置がずれた場合でも、基準点からの相対位置として輝点の位置を正しく認識できる。そして、第二画像７と第一画像６とで輝点の位置情報を比較し、第二画像７になってから初めて現れた輝点情報１２を求める。輝点情報１２で求められた輝点数が、細菌数である。
実際には、面積を持たない点どうしの一致不一致を求めることは難しい。そこで、第一画像６で得られた輝点の存在位置に対して、予め設定した所定の領域を各々の輝点に付随する不感領域として認識させる。不感領域設定は、前述のように、例えば、「第一画像で得られた輝点の存在位置に対して半径１０μｍの領域」あるいは「画像として縦横とも±５ピクセルの領域」と設定する。この不感領域を適切に設定することによって、前述の実施例２で課題となっていた▲３▼の場合にも、細菌数を適正に計測することが可能となる。
なお、図３に示す実施例において、前記請求の範囲第４項の発明のように、第一画像取得の際の励起光量を、前記第二画像取得の際の励起光量より大とすることにより、蛍光性夾雑物の影響の排除をより確実にして、生細胞の計数精度をより向上することができる。
さらに、前記請求の範囲第５項の発明のように、第一画像を蛍光画像に代えて試料の実体画像とすることにより、計数精度の向上を図ることができる。この場合には、第一画像を取得する際、励起光を白色光に代えて試料に照射する。
（実施例４：装置の実施例）
図４に基づき、本発明に係る生細胞の計数装置の実施例について説明する。
光源１３から発した励起光は、ダイクロイックミラー１４で反射、対物レンズ１５で集光し、メンブレンフィルタ２上の試料１６に照射する。光源としては、発光ダイオード、半導体レーザ、水銀ランプなどが好適である。試料が発する蛍光は対物レンズで集光し、ダイクロイックミラーを透過して、撮像素子１７に結像する。撮像素子には、ＣＣＤ素子やＣＭＯＳ素子を用いることができる。撮像素子は蛍光を画像として捉え電気信号に変換する。撮像素子で得た画像は画像・演算処理部４に伝送し、既に述べたような各種の画像処理や演算処理を行う。
また、試料を載せたメンブレンフィルタ２は、図示しない駆動手段によって水平方向１８に順次走査し、複数画面を取得、解析することで視野面積を拡大することが好ましい。これは、例えば、細菌の分布に粗密がある場合に、計数結果の統計的なばらつきを低減するのに有効である。さらに、垂直方向１９の駆動は画像観察のためにオートフォーカスを行う場合に必要な機能である。駆動手段としては、例えば、精密な位置制御ができるステッピングモータが望ましい。
なお、第一画像を蛍光画像に代えて試料の実体画像とする場合には、第一画像を取得する際、励起光を白色光に代えて試料に照射するが、前記光源１３は、励起光と白色光との図示しない切り替え手段を備える。
（実施例５：静電力を利用する方法）
図５に基づき、生細胞の捕捉に静電力を利用する方法の実施例について、以下に述べる。
図５において、試料を、生細胞計数用の撮像手段２１と静電力発生用の電極２２とを備えたセル流路２０内に導入し、前記セル流路２０の一部を正に帯電させることにより、自然状態で負に帯電した試料中の生細胞３０を前記正帯電部に捕捉し、捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を撮像手段２１で取得し、その後、蛍光試薬をセル流路２０に導入して前記捕捉した生細胞３０を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を撮像手段２１により取得する。
なお、図５において、セル流路２０の少なくとも撮像手段２１が臨む面は、透明なガラスまたはプラスチックにより構成される。
（実施例６：抗原抗体反応を利用する方法）
図６に基づき、生細胞の捕捉に抗原抗体反応を利用する方法の実施例について、以下に述べる。
図６において、試料を、生細胞計数用の撮像手段２１を備えたセル流路２０内に導入し、前記セル流路２０の一部に、予め、捕捉すべき生細胞と特異的に結合する抗体２３を固定しておくことにより、試料中の生細胞３０を抗体２３との結合によって捕捉し、抗体２３に捕捉した生細胞３０を含む試料の第一画像を撮像手段２１により取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路２０に導入して前記捕捉した生細胞３０を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を撮像手段２１により取得する。
産業上の利用の可能性
この発明は、前述のように、微生物や組織細胞等の生細胞を、蛍光試薬で染色し、試薬を励起することで蛍光を発生させ、あるいは、微生物や組織細胞等の生細胞が元々有する蛍光性分子を励起することで蛍光を発生させ、その蛍光画像を利用して生細胞を計数する生細胞の計数方法および装置に利用できる。前記微生物としては、細菌，真菌，ウィルス，酵母，カビ類などがあり、本計数方法および装置の利用分野としては、医療，食品製造，上下水道などがある。
この発明によれば、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像もしくは実体画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差を求めるか、又は、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めるか、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることとしたので、
試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図った生細胞の計数方法および装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の実施例に関わる生細胞の計数方法の手順を示す図。
図２は、この発明の実施例に関わる差分画像を利用する方法の模式的説明図。
図３は、この発明の実施例に関わる輝点の位置情報を利用する方法の模式的説明図。
図４は、この発明の実施例に関わる生細胞の計数装置の模式的構成図。
図５は、この発明の静電力を利用する実施例の説明図。
図６は、この発明の抗原抗体反応を利用する実施例の説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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