(57)【要約】フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分非存在下で、大量にかつ安全に未分化な胚性幹細胞を維持する培養基材ならびにこの培養基材を用いる培養方法を提供するものである。多孔質体からなる培養基材に、未分化な、多能性の胚性幹細胞の増殖増強効果を見出し、該培養基材を用いて胚性幹細胞を培養することにより、フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分の非存在下で、大量にかつ安全に未分化状態の胚性幹細胞を提供し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質体よりなる胚性幹細胞培養用基材。
【請求項２】
胚性幹細胞の未分化状態を維持することを特徴とする請求項１記載の胚性幹細胞培養用基材。
【請求項３】
フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分を含有しないことを特徴とする請求項１または２に記載の胚性幹細胞培養用基材。
【請求項４】
多孔質体が不織布である請求項１〜３のいずれかに記載の胚性幹細胞培養用基材。
【請求項５】
多孔質体が高分子物質によりコートされている請求項１〜４のいずれかに記載の胚性幹細胞培養用基材。
【請求項６】
多孔質体の平均孔径が０．１μｍから１５０μｍである、請求項１〜５のいずれかに記載の胚性幹細胞培養用基材。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の胚性幹細胞培養用基材を用いて、胚性幹細胞を培養し、その未分化状態を維持することを特徴とする胚性幹細胞の培養方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の胚性幹細胞培養用基材を用いて、胚性幹細胞を含有する細胞溶液から、胚性幹細胞を捕捉する方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の胚性幹細胞培養用基材からなり、胚性幹細胞を捕捉し得る細胞捕捉材。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞捕捉材を容器に充填してなる胚性幹細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、胚性幹細胞の培養用基材、それを用いる胚性幹細胞の培養方法および培養装置に関する。より詳細には、本発明は、フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分の非存在下の状態において未分化状態の胚性幹細胞を培養するための基材、培養する方法および培養装置を提供するものである。本発明は、細胞培養、組織移植、創薬、および遺伝子治療の分野で応用することができる。
従来の技術
外傷や病気、さらには加齢などによって傷害を受けた臓器・組織は再生を促進し、その機能を回復させる必要がある。特に、心臓・肝臓・腎臓・膵臓などの実質臓器は生命維持に必須であるためその機能低下・廃絶は死に直結することから、臓器移植により救命を図る移植医療が盛んに行われている。しかし、恒常的なドナー不足からその解決には新たなアプローチが必要になっている。Ｎｏｎ−ｈｅａｒｔ  ｂｅａｔｉｎｇ  ｄｏｎｏｒからの組織移植、異種移植などが解決策として提案されているが、前者では組織保存、後者には異種免疫や病原体移入など、大きな問題が存在する。そこで最近新しい選択肢として再生医療という概念がクローズアップされてきている。再生という言葉の概念は、既に２０世紀に本来個体が持っている再生力を増強させようとする考え方として、治療への応用が試みられていた。しかし、２１世紀を迎えた現在、さらに積極的に幹細胞などの利用による組織・器官の作製を行い、欠損組織の補填を行うことが目標となり、それにより臓器移植の欠点を凌駕する治療法を目指す新しい考え方へと発展しつつある。具体的には増殖能が機能細胞より高い幹細胞を増やした後、分化させ、細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築を行い、それを生体内へ移植したり人工臓器として利用したりすることなどが考えられている。実際に幹細胞を細胞移植治療や組織工学に利用できれば、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できると期待される。
近年、実験動物やヒトからこのような治療への応用が期待される幹細胞が、血管、神経、血液、軟骨、骨、肝臓、膵臓など数々の分野で同定されている。幹細胞の中でも、ほぼ全ての細胞型に分化する能力を有し、多能性細胞と呼ばれることもある胚性幹細胞は、上述の再生医療分野のほか、創薬、および遺伝子治療に用いるための細胞ならびに組織を容易に提供し得る細胞として特に注目されている。
胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下、ＥＳ細胞）は、各種個体形成組織への分化能を保持しながら未分化状態のまま試験管内で培養可能な株化細胞としてマウスで初めて樹立された（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，ｐ１５４，１９８１年）。正常な胚とキメラ胚を形成させることにより、成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有しながら培養維持が可能な細胞である。また、ＥＳ細胞はイン・ビトロの分化誘導条件によっても様々な細胞を生成させる能力をもっている。個体を構成する細胞は胚盤胞期の内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ，ＩＣＭ）あるいは外胚葉（ｅｐｉｂｌａｓｔ、エピブラスト）から派生した一次外胚葉に由来している。その意味ではＩＣＭおよびエピブラストは全能性を持った幹細胞群であるといえる。このＩＣＭから未分化状態を維持したまま培養分離されるのがＥＳ細胞である。
ＥＳ細胞の分化能は高く、イン・ビボでは初期胚とキメラ胚を形成させることにより、正常な胎仔発生に貢献し、成体のあらゆる臓器にＥＳ細胞由来の成熟細胞が検出されることから、全能性の幹細胞と見なされている。一方イン・ビトロでは培養系を操作することにより、ＥＳ細胞から血球系、心筋、骨格筋、神経など多数の細胞群へ分化させることが可能である。
最近になって、マウス以外でもＥＳ細胞株の樹立が報告され、マウスＥＳ細胞と同様多分化能を有していることが示されている（ウシＥＳ細胞：Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３１，ｐ１５−１７，１９８９年、豚ＥＳ細胞：Ｓｔｒｏｊｅｋら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３，ｐ９０１，１９９０年、羊ＥＳ細胞：Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ、Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６，ｐ１８５，１９８７年、ハムスターＥＳ細胞：Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７，ｐ２２４，１９８８年、アカゲザルＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２、ｐ７８４４，１９９５年、マーモセットＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，５５，ｐ２５４，１９９６年、ヒトＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８，ｐ３９９，２０００年）。
ＥＳ細胞の未分化状態を維持するには、通常胎仔由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いて共培養することが必要である。霊長類のＥＳ細胞株の未分化維持においても同様の方法が用いられている（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，ｐ７８４４，１９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８，ｐ３９９，２０００年）。
しかし、これらフィーダー細胞を用いたＥＳ細胞培養法は、ＥＳ細胞株細胞培養のプロセスを複雑かつ遅延させる。さらに、最近になって異種動物間での内在性ウィルスの感染例が報告されており（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４０７，ｐ９０，２０００年）、医療用途でのヒトＥＳ細胞の利用を目的とした培養方法においては異種動物細胞間での接触をでき得る限り回避した培養方法の開発が望まれている。
フィーダー細胞を用いないＥＳ細胞の未分化維持培養方法として、ゼラチンをコートした培養皿を用いる培養方法が既に知られているが、この場合には、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）の培地への添加が必須であり（Ｓｍｉｔｈら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２１，ｐ１，１９８７年）、高コスト、品質管理の困難さなどから大量培養には適していない。加えて、ＬＩＦの効果は特定のマウス系統（１２９／ｓｖ系やＣ５７ＢＬ／６系）に限定的であり、他のマウスの系統や他種動物において顕著な効果は見られない。
また、霊長類のＥＳ細胞株の培養においてもフィーダー細胞を直接用いない培養方法が報告されている（特開２００１−１７１６３号公報）が、この場合においてもマウス胎仔由来線維芽細胞の分泌成分の培地への添加が不可欠であり、上述の内在性ウィルスの問題などは解決されていない。
一方、多孔質担体を含む培養基材を用いた細胞培養方法はこれまでにも知られていた（特開２００１−１２０２６７号公報、特開２０００−４８７０号公報、特開２０００−１５７２６１号公報）がこれらは特定の分化した細胞のみに有効な培養基材あるいは培養方法であり、胚性幹細胞の全能性を維持したまま培養可能な培養基材およびそれを用いた培養方法はこれまで知られていなかった。
発明の開示
本発明の目的は、大量にかつ安全に未分化状態の胚性幹細胞を維持する培養基材、胚性幹細胞を未分化の状態で維持する培養方法および培養装置を提供することにある。
マウス胚線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた場合の、未分化な、多能性の胚性幹細胞増殖の増強は、部分的にはマウス胚線維芽細胞によって産生される成分の培地への追加によってなされると考えられるが、その一方で、線維芽細胞のフィーダー細胞層が胚性幹細胞の付着に適した形状および形質を保持した表面を形成し、胚性幹細胞がそのフィーダー細胞表面と接触することにより未分化状態を維持したままの増殖が刺激されることが示唆される。本発明者らは以上の予測に基づき、種々の材料による、未分化な、多能性の胚性幹細胞の未分化維持効果について鋭意研究を行った結果、フィーダー細胞表面と同様の状態を作成し、胚性幹細胞を接触させることによって、フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分の非存在下で未分化状態を保ったまま胚性幹細胞を培養できることを見出し本発明を完成した。
本発明は、フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分の非存在下で胚性幹細胞の未分化状態を維持することのできる培養基材を提供するものである。即ち本発明は、多孔質体であり、フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分の非存在下で胚性幹細胞の未分化状態を維持することのできる培養基材を提供する。
また本発明は、フィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分の非存在下で胚性幹細胞の未分化状態を維持する培養方法を提供するものである。即ち本発明は、上記培養基材を用いるフィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分非存在下で胚性幹細胞の未分化状態を維持する培養方法を提供する。
さらに、本発明は、このような胚性幹細胞培養用基材を用いて、胚性幹細胞を含有する細胞溶液から、胚性幹細胞を捕捉する方法と、このような胚性幹細胞培養用基材からなり、胚性幹細胞を捕捉し得る細胞捕捉材を提供する。また、そのような細胞捕捉材を容器に充填してなる胚性幹細胞の培養装置を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、未分化状態にある胚性幹細胞をそのままの状態で維持することのできる培養基材、それを用いる培養方法および培養装置に関する。本発明によって提供される培養基材、培養方法および培養装置は、それによって得られる胚性幹細胞を利用することにより得られる多くの恩恵に加え、さらに一つもしくは多数の遺伝的な改変を有する胚性幹細胞を産生するために適用することができる。このような適用の例としては、疾患についての細胞ベースのモデルの開発ならびに遺伝病を処置するために移植について特異化された組織の開発を含むが、これらに限定されるものではない。
以下の用語は他で述べない限り、ここで提供されるように定義される。本明細書で使用される他の全ての用語は、他に述べない限り、その用語に関する特定の分野でのその語法に従って定義される。
幹細胞：幹細胞とは、特に、特異化された機能を有する他の細胞型、即ち最終的に分化した細胞、もしくは、より狭い範囲の細胞型に分化可能な他の幹細胞型に分化し得る細胞を指す。
胚性幹細胞：胚性幹細胞とは、前着床段階の胚の、桑実胚または胚盤胞段階から得られた全能性の幹細胞であり、ＥＳ細胞とも呼ばれる。また、胚性幹細胞は、精子あるいは卵子になると決まっている、胚または胎児（胎仔）の始原生殖細胞に由来する多能性の幹細胞のことをいう場合もあり、これらの細胞はＥＧ細胞とも呼ばれる。本発明で用いる胚性幹細胞の由来は、ヒトを含む霊長類、哺乳類、鳥類のいずれであっても良い。
全能性：全能性とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る細胞のことを言う。
多能性：多能性とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの一つへと分化し得る細胞をいう。多能性細胞の一つの例は、骨髄幹細胞であり、この細胞は神経細胞以外の、リンパ球および赤血球のような種々の血液細胞型へと分化し得る。従って、全ての全能性細胞は多能性であるのに対して、全ての多能性細胞が全能性であるわけではないことが認識される。
未分化：未分化とは、任意の細胞が、一つまたは複数の、さらに分化が進んだ状態の細胞に分化し得る能力を有する状態であることをいう。
細胞培地：細胞培地とは、培養において胚性幹細胞の増殖を支持するために有効な、塩および栄養素の溶液をいう。
フィーダー細胞：フィーダー細胞とは、胚性幹細胞がその上にプレートされる非胚性幹細胞をいい、非胚性幹細胞は、プレートされた胚性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供する。
フィーダー細胞由来成分：フィーダー細胞から分泌される成分、細胞膜成分を含むフィーダー細胞破砕成分をいう。フィーダー細胞から分泌される成分には白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）が挙げられる。また、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸などからなる複合体である細胞外マトリックスもこれに含まれる。
非必須アミノ酸：非必須アミノ酸とは、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、およびＬ−セリンのアミノ酸をいう。
本発明は、胚性幹細胞を未分化の状態で、増殖および維持するための培養基材、培養方法および培養装置を提供する。本発明で提供する培養基材、それを用いる培養方法および培養装置は、従来より簡便に、安全に、未分化状態の胚性幹細胞を増殖しそして維持する。また、本発明の培養基材を用いる胚性幹細胞の培養方法は、特定の分化誘導因子、および分化誘導因子の有用な組み合わせについてスクリーニングするために使用され得る。本発明の培養基材、および培養方法を使用して、未分化の状態の全能性胚性幹細胞を増殖させる能力は、重要な治療適用を有する胚性幹細胞系を産生する能力を含む重要な利益を提供する。
本発明は、未分化の状態での胚性幹細胞を、増殖および維持するための培養基材を提供する。具体的には、本発明の培養基材には多孔質体を使用することがでる。
多孔質体とは、微細な孔を多数有する基材のことをいい、微細な孔は人為的に製作してもよく、その材質、厚さ、形状、寸法などは特に限定はない。多孔質体の材質は、有機材料、無機材料および有機材料と無機材料からなる複合材料であっても良い。
その中でも有機材料とりわけ、有機高分子は、切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。有機高分子としては、例えば、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリスルホン、セルロース、セルロースアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエーテル−ポリアミドブロツクコポリマー、エチレン−ビニルアルコールコポリマー等が挙げられるが、本発明の多孔質体は上記例示に限定されるものではない。
尚、無機材料としては、ガラス、シリコンウェハー等のようなシリカ系材料、アルミナ、ジルコニア等のようなセラミックス類、金、銀、銅、鉄、ニッケル、アルミニウム、チタン等の様な金属類、ハイドロキシアパタイト、セメント硬化体等が挙げられる。また、有機材料と無機材料からなる複合体としてはシリカと有機分子がナノサイズに分散したシリカ主体または有機分子主体の材料（Ｎｏｖａｋ，Ｍ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．５，４２２（１９９３）、Ｃｈｕｊｏ，Ｙ．，Ｅｎｃｙｃｌｐ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，６，４７９３（１９９６））等が挙げられる。
多孔質体の形状は細胞を支持できる細孔を有するものであれば特に限定はなく、平板状、球状、棒状、繊維状、中空状のいずれの形態であっても良く、例えば、フィルム、シート、膜、板、不織布、ろ紙、スポンジ、織物、編物、塊、糸、中空糸、粒子等が挙げられる。細胞を培養するにあたって、３次元的に培養できるように細胞を支持する孔の大きさを簡単に制御できることや、基材作製の容易さおよびコストなどを考慮するとフィルム、シート、膜、板、不織布、スポンジ、中空糸、粒子が好ましく、さらに好ましくは、粒子、不織布がより好ましい。多孔質体の孔の大きさについては、特に限定はないが、細胞を３次元的に支持できるようにすることを考慮すると、平均孔径が、０．１μｍ以上１５０μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上５０μｍ以下がさらに好ましい。さらに好ましくは、５μｍ以上３０μｍ以下である。
本発明における多孔質体の平均孔径とは、水銀ポロシメーターで測定しうる値、又は、光学顕微鏡やＳＥＭなどで観察測定しうる値である。水銀ポロシメーターで測定する場合は、細孔径分布曲線における最大のピークを示す細孔径（直径）が本発明でいう平均孔径である。また、光学顕微鏡やＳＥＭなどで観察測定する場合は、観察して得られた映像から、表面開孔部の輪郭を透明フィルムにトレースし、イメージスキャナーで開孔部のエッジ画像を作成後、画像解析装置を用いて、開孔部の円相当径を測定することができる。その１０個以上の開孔部の円相当径（直径）の平均を取ったものが本発明でいう平均孔径である。従って、多孔質体の平均孔径よりも大きい直径を有する粒子は入り難いという径を表わすものであって、これ以上の直径の粒子は絶対に入らないというものではない。尚、本明細書において不織布の平均孔径は水銀ポロシメーターで測定した値であり、マイクロキャリアの平均孔径は観察した画像を解析して求めた値である。
上記の多孔質体は、細胞の接着性や分化維持機能、増殖能を向上させるために、多孔質体の孔を塞がない程度に、高分子物質により表面コーティング処理を施されていても良い。
高分子物質とは、１種以上の繰り返し構成単位の単量体が１次元、２次元、３次元的に連なった分子量数百以上の物質のことをいう。高分子物質は、大きく天然高分子物質、半合成高分子物質、合成高分子物質の３つに分類することができ、本発明においていずれの高分子物質も使用することができる。例えば、天然高分子物質としては、マイカ（雲母）、アスベスト（石綿）、グラファイト（石墨）、ダイアモンド、でんぷん、セルロース、アルギン酸等に代表される糖類およびゼラチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン等に代表されるタンパク質やペプチド等が挙げられる。半合成高分子物質としては、ガラス、硝酸セルロース、酢酸セルロース、塩酸ゴム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリホスホニトリルクロライド、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリレートおよびヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体に代表されるような２種類以上の合成単量体からなる共重合体等が挙げられる。
コーティング処理のし易さを考慮すると、有機高分子物質が好ましく、タンパク質やペプチド並びに有機合成高分子物質がさらに好ましい。
また、多孔質体にＬＩＦなどの生理活性物質の固定化や、グラフトおよび電子線や放射線照射等による、何らかの表面処理を施されていても良い。
本発明の多孔質体からなる培養基材を細胞捕捉材として用いることにより、複数の異なる細胞からなる集団から、胚性幹細胞を分離し、さらに、捕捉した胚性幹細胞を未分化な状態で培養する方法および装置が提供され得る。
即ち、胚性幹細胞と、除去対象細胞を含む細胞含有液を本発明の培養基材からなる細胞捕捉材が充填されている容器に導入し、細胞捕捉材に胚性幹細胞を捕捉させ、除去対象細胞を容器外に導出した後に容器ごと培養することを特徴とする胚性幹細胞培養方法であり、また本発明の培養基材からなる細胞捕捉材を容器に充填した細胞培養装置であって、前記細胞捕捉材は細胞培養用担体として使用し得るものであり、前記容器は細胞培養に使用し得るものであることを特徴とする細胞培養装置である。除去対象細胞とは、胚性幹細胞以外の全ての細胞をいう。また、胚性幹細胞から分化して、多分化能を失った細胞もこれに含まれる。細胞捕捉材に導入する細胞含有液としては、胚性幹細胞を含有する細胞液であればいかなるものでもよく、一例として、血液、骨髄、砕片組織液、或いは、幹細胞、胚性幹細胞の培養液などがあげられる。分離、培養された胚性幹細胞は、そのままで、或いは適当な処理を施された後、細胞移植、或いは組織工学など再生医療分野をはじめとした様々な分野で利用され得る。
本発明の培養基材は、以下に述べる細胞培地とともに用いて胚性幹細胞培養装置として使用することができる。さらに、栄養血清または血清代替物を加えて使用することもできる。胚性幹細胞の培地としては、任意の細胞培養基本培地が使用される。細胞基本培地の例としてはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ノックアウトＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ（以上ＧＩＢＣＯＢＲＬ（米国）より入手可能）などが挙げられるがこれらに限定されない。さらにこれらの基礎培地に血清または血清代替物、或いは各種増殖因子を添加して用いることもできる。血清は、胚性幹細胞の増殖および生存性の維持に効果的である栄養素を供給する任意の血清、または、血清ベースの溶液であり得る。このような血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ血清（ＣＳ）、馬血清（ＨＳ）などがある。また、血清代替物としてはノックアウト血清リプレースメント：ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製、米国）などが含まれるがこれらに限定されない。一つの実施態様において、血清はウシ胎仔血清であり、血清代替物はＫＳＲである。より特定の実施態様において、ウシ胎仔血清またはＫＳＲは約２５％と約１％との間の濃度で使用される。さらにより特定の実施態様において、細胞培地でのウシ胎仔血清またはＫＳＲの濃度は１５％である。本発明の培養基材を用いて、血清代替物を含有する培地にて培養されるヒト胚性幹細胞は、異種細胞、または異種細胞由来成分との接触がないことから従来法で培養される胚性幹細胞に比べて極めて安全であり、細胞移植、組織工学等の臨床用途で利用され得る胚性幹細胞が提供される。
細胞培地は、抗酸化剤（還元剤、例えば、β−メルカプトエタノール）も含んでもよい。ある好適な実施態様において、β−メルカプトエタノールは、約０．１ｍＭの濃度を有する。他の抗酸化剤（例えば、モノチオグリセロール、もしくは、ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）の単独もしくは組み合わせ）が同様の効果のために利用され得る。さらに他の等価な物質は、細胞培養の分野の当業者に周知である。
本発明は未分化の胚性幹細胞を増殖するための培養基材、およびこの培養基材を含む培地においてこのような細胞を培養する方法を提供する。
培養されるべき胚性幹細胞は、以下に示す、公知の方法および材料を使用して入手し得る。マウス胚性幹細胞：Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，ｐ１５４，１９８１年、ウシＥＳ細胞：Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３１，ｐ１５−１７，１９８９年、豚ＥＳ細胞：Ｓｔｒｏｊｅｋら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３，ｐ９０１，１９９０年、羊ＥＳ細胞：Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ、Ｒｏｕｘ’ｓＡｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６，ｐ１８５，１９８７年、ハムスターＥＳ細胞：Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７，ｐ２２４，１９８８年、サルＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，ｐ７８４４，１９９５年、ヒトＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８，ｐ３９９，２０００年。また、マウス胚性幹細胞（１２９ＳＶおよびＣ５７／ＢＬ６）は、大日本製薬より購入できる。
また、最近の報告によれば、マウスやヒトの骨髄、筋肉、脳に、胚性幹細胞特異的なマーカーであるＯｃｔ−３／４遺伝子やＲｅｘ−１遺伝子が発現する胚性幹細胞様細胞が存在することが示されている（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２０  Ｊｕｎｅ，２００２年（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ００８７０）、Ｊｉａｎｇら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３０，ｐ８９６，２００２）。これらの報告は、成体にも胚性幹細胞と同等の全能性の細胞が存在し得ることを示唆する。本発明の培養基材の特徴の一つとして、胚性幹細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現を維持して未分化を維持することが挙げられる。即ち、Ｏｃｔ−３／４遺伝子を発現する成人由来胚性幹細胞様細胞は、本発明の培養基材を用いて、未分化を維持して培養され得る。
一旦単離されると、胚性幹細胞は、任意の種々の技法を用いて、上記の細胞培地ならびに培養基材を使用して培養される。例えば、胚性幹細胞を滅菌した多孔質体の上に播種し、上述の細胞培地を加えて培養する。このような多孔質体として不織布が例示される。次いで、胚性幹細胞の増殖はモニターされ、培養胚性幹細胞の分化した程度が決定される。
胚性幹細胞の未分化程度は実施例５に記載されるように、Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。Ｏｃｔ−３／４遺伝子はＰＯＵファミリーに属する転写因子で、胚性幹細胞、胚性癌細胞（ＥＣ細胞）で、未分化状態で特異的に発現し（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ，６０，ｐ４６１，１９９０年）、胚発生においても未分化細胞系譜においてのみ発現し（Ｓｃｈｏｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ，７，ｐ３２３，１９９１年）、分化にともなって発現が低下することが知られている。さらに、Ｏｃｔ−３／４遺伝子破壊マウスのホモ個体は胚盤胞期で発生を停止することから未分化状態維持に重要な機能を有していることが明らかにされている（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ，９５，ｐ３７９，１９９８年）。従って、Ｏｃｔ−３／４遺伝子発現量に維持、或いは、減少を抑制する効果は、即ち胚性幹細胞の未分化状態の維持、或いは、分化の抑制に働く作用と同等であることが示唆される。
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現量を測定する一つの手段としては定量的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることができる。さらに、リアルタイムＰＣＲ法が用いられ、幅広いダイナミックレンジをもち、簡便で信頼性のある定量測定が可能である。リアルタイムＰＣＲ技術には、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＴａｑＭａｎプローブを用いる方法や、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ロシュ・ダイアグノスティック）を用いる方法がある。特に後者の場合はＰＣＲの温度サイクルが数十分で終了する高速反応サイクルのもとで、サイクルごとに合成されるＤＮＡの増幅量変化をリアルタイムに検出できる。リアルタイムＰＣＲ法のＤＮＡ検出法としては、ＤＮＡ結合色素（インターカレーター）、ハイブリダイゼーション・プローブ（キッシングプローブ）、ＴａｑＭａｎプローブおよびＳｕｎｒｉｓｅユニプライマー（モレキュラー・ビーコン）を利用する４種類の方法がある。またＤＮＡ結合色素、例えばＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩを利用してＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を解析することができる。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩはＤＮＡの二本鎖特異的に結合色素であり、二本鎖に結合することで本来の蛍光強度が増強される。ＰＣＲ反応時にＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩを加え、伸張反応の各サイクルの終わりに蛍光強度を測定すれば、ＰＣＲ産物の増加が検出できる。Ｏｃｔ−３／４遺伝子を検出するには通常のＰＣＲと同様にＯｃｔ−３／４遺伝子の配列をもとに、市販の遺伝子解析ソフトウェアなどを用いてプライマーを設計する。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩは非特異的産物も検出してしまうため最適なプライマーの設定が必要となる。設計基準としては、オリゴマーの長さ、配列の塩基組成、ＧＣ含量、およびＴｍ値などに留意が必要である。Ｏｃｔ−３／４遺伝子の増幅には、センスプライマーＯＣＴ３ｕｐ：５’−ｇｇｃｇｔｔｃｔｃｔ  ｔｔｇｇａａａｇｇｔ  ｇｔｔｃ−３’（配列表配列番号１）、およびアンチセンスプライマーＯｃｔ３  ｄｏｗｎ：５’−ｃｔｃｇａａｃｃａｃ  ａｔｃｃｔｔｃｔｃｔ−３’（配列表配列番号２）を用いることができる。オリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて合成可能であるが、また、当該業者に任意の配列のオリゴマーの合成を依頼することもできる。
多くの場合、定量ＰＣＲにおいて明らかにすることを目的とするのは、サンプル一定量当たりの目的ＤＮＡ量である。このためには最初に反応系に加えたサンプル量の評価が必要である。この場合サンプル量を反映するような内部標準となる別のＤＮＡを目的ＤＮＡとは別に測定し、最初に反応系に加えたサンプル量を補正することができる。サンプル量を補正する目的で用いる内部標準には、通常、組織によって発現量に差がないと考えられているハウスキーピング遺伝子を用いることができる。例えば、解糖系の主要酵素であるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、細胞骨格の構成成分であるβアクチンまたはγアクチン、リボゾームの構成蛋白質であるＳ２６などの遺伝子が挙げられる。
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現レベルは、実施例に記載される方法を用いて、本発明の培養基材に曝露された細胞について決定する。培養基材に曝露されていない、即ち、胚性幹細胞から分化誘導されたコントロール細胞に対するＯｃｔ−３／４遺伝子発現量の増加と関連付けられる基材は、胚性幹細胞の未分化状態を維持する培養基材とみなされる。
最適化された胚性幹細胞の未分化維持培養基材を決定する他の方法として、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出する方法が挙げられる。未分化な胚性幹細胞ではＡＬＰの活性が維持され、分化すると減少することが知られている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６，ｐｐ６８４，１９８８年、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年）。ＡＬＰ活性は、ＡＬＰによって発色する不溶性基質を用いた細胞染色によって検出可能であり、また、水溶性の発色基質を用いたＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法によっても検出できる。一つの実施態様としては、アルカリホスファターゼ染色法を用いて細胞染色によってＡＬＰ活性を検出することができる。同方法を用いたＡＬＰ活性検出により、多孔質体を培養基材として用いて、細胞培地中で培養した胚性幹細胞は、ゼラチンをプラスチック製の細胞培養用ディッシュにコートして培養した胚性幹細胞に比べ、未分化細胞の割合が増加していることが確認された。
また、最適化された胚性幹細胞の未分化維持培養基材をスクリーニングするさらに他の方法として、ステージ特異的胚抗原（Ｓｔａｇｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ、以後ＳＳＥＡと記載）−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４などの未分化な細胞に特異的に発現する抗原を検出する方法が挙げられる（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６，ｐ６８８，１９８８年、Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，７５，ｐ５５６５，１９７８年、Ｋａｎｎａｇｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２，ｐ２３５５，１９８３年）。
一つの実施態様において、ＳＳＥＡ−１などの表面抗原は、同抗原を認識する特異的抗体（一次抗体）とインキュベートし、さらに蛍光標識のようなレポーターと結合した第二の抗体（二次抗体）とインキュベートすることにより、標識することができる。この操作により目的の抗原を発現する細胞が、蛍光性になる。次いで、標識された細胞を標準的な方法、例えばフローサイトメーターを用いて計数、さらには分取され得る。次いで、標識および非標識細胞の数は、目的とする培養基材の効果を決定するために比較され得る。あるいは、非標識細胞表面マーカー抗体に曝露された後、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）形式において、その細胞は、抗細胞表面抗原抗体（例えば抗ＳＳＥＡ−１抗体）に対して特異的な第二の抗体に曝露され得、そこから、所望の表面抗原を発現する細胞の数が、比色定量的に、または蛍光を測定することにより定量され得る。表面抗原を発現する細胞を定量するさらに他の方法も、細胞培養の当業者に周知である。
本発明によって提供される、未分化の胚性幹細胞の増殖に対する改善された培養基材および培養方法は、胚性幹細胞系が有用であるすべての技術に対して適用されることが予想される。
本発明の培養基材および培養方法を用いて産生される細胞は、分化させ、細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築に使用され、生体内へ移植したり人工臓器として利用されうる。幹細胞の細胞移植治療や組織工学への利用は、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できる。
本発明の培養基材および培養方法は、単一もしくは複数の遺伝的改変を有する胚性幹細胞を産生するために使用される。細胞の遺伝的変更は、遺伝子治療のための改変された細胞、および移植のための置換組織を提供する（例えば、宿主による細胞の拒絶を避けるため）というような、多くの理由のために望ましい。本発明によれば、胚性幹細胞は、上述した培養基材および培養方法を使用して増殖される。第一の遺伝子は、細胞培養物の少なくとも一つの細胞において、改変されるか、もしくはそれに導入され、そして、その得られる培養物から、改変された胚性幹細胞の最初のクローン集団が誘導される。第一のクローン集団は、本発明の培養基材で増殖され得、所望の遺伝的改変を有する細胞系が確立され得る。さらなる遺伝的改変が必要である場合、第二の遺伝子が、第一のクローン集団の少なくとも一つの細胞において改変されるか、またはそれに導入されて、第一および第二の遺伝的改変を有する第二のクローン集団を産生する。あるいは、第一および第二の遺伝的改変が、同じ胚性幹細胞に導入され、続いて同時に両方の改変についてスクリーニングし得る（すなわち、第一のクローン集団を単離する必要性を回避する）；しかし、好ましい手順は段階的手順である。
細胞に対して遺伝的改変を行うために用いられる方法は、遺伝的形質転換体を作製する分子生物学の技術分野において公知の任意のものであり得る。限定することなく、このような方法は、以下に記載するポジティブ−ネガティブ選択的ベクターの使用を含む；Ｃａｐｅｃｃｈｉらに対する米国特許第５，４６４，７６４号；同第５，４８７，９９２号；同第５，６２７，０５９号；および同第５，６３１，１５３号。
さらに、酵母人工染色体（ＹＡＣ）は以下に記載された遺伝的改変を実行するために使用し得る；米国特許第５，９８１，１７５号。なお他の方法は、調製した幹細胞の治療適用のため特定の遺伝子産物、シグナル伝達分子、細胞表面タンパク質などの発現を増大し得る幹細胞の調製について：Ｇｅｒｓｏｎらの、米国特許第５，５９１，６２５号に記載される方法を含む。これらの特許は、これらの全体がすべての目的のために、本明細書中で参考として援用される。
当業者に明白なように、遺伝子産物の改変された発現は、遺伝産物のコード配列の改変、もしくはコード配列の隣接領域の改変によって達成され得る。従って、本明細書中で使用される用語「遺伝的改変」は、遺伝子産物をコードしている配列に対する改変、および隣接領域、特にコード配列（プロモーターを含む）５’上流側の改変を含む。同様に、用語「遺伝子」はコード配列、およびそのコード配列に隣接して存在し得る調節配列、ならびにそのコード配列に隣接する他の配列を含む。加えて、当該分野で公知のように、遺伝的改変は、全遺伝子配列を必ずしも含まない核酸を細胞に導入することによって（例えば、組換えによってゲノムに挿入され得る核酸を導入することにより）達成され得る。
本発明によって提供される培養基材および培養方法を使用して培養および／または改変された細胞は、生物活性の物質についてスクリーニングをするために支持体表面に取り付けられる。外的刺激に応答しての細胞内の電気生理学的な変化が、例えば、生物活性物質についての高い処理量のスクリーニングとして使用されるために測定され得るように細胞が基板に結合される。その細胞は、細胞内の特定の遺伝子、もしくは遺伝子産物を標的化し、発現し、またはノックアウトするＤＮＡで形質転換されていてもよい。このようなチップに取り付けられた細胞を測定デバイス（例えばコンピューター）と組み合わせて提供することによって、多数の化合物が迅速かつ正確にスクリーニングされ得る。バイオセンサーはまた、大規模平行スクリーニングのために、配列されて、測定デバイスと組み合わせられ得る。
また、上述した方法を用いて、レポーター遺伝子が、特定の疾患状態と関連した遺伝子のコピーと機能的に組み合わせられた胚性幹細胞のＤＮＡに組み込まれる。レポーターは、転写事象および転写後事象の両方に感受性である。幹細胞は、分化した子孫が、それぞれ疾患遺伝子／レポーター構築物を、１コピーずつ含むように分化することが可能になる。次いで、この細胞は、推定の治療因子についてスクリーニングされる。これにより遺伝子発現、および潜在的な治療因子に対する応答性を、細胞の分化の状態と相関付けることが可能になる。レポーターの適切な選択によって、このようなスクリーニング戦略は、上記の高処理量バイオセンサーで実行され得る。やはり、本明細書に記載されたようなバイオセンサーの他の適用は、当業者に明らかである。
なお実施例５に記載された、胚性幹細胞分化についてのマーカーとしてのＯｃｔ−３／４遺伝子発現レベルの決定は、本発明の培養基材、および培養方法を用いて培養された胚性幹細胞の未分化度を決定するために使用される。本発明の培養基材および培養方法を用いて培養された胚性幹細胞は、分化を誘導され、細胞移植或いは人工的な組織構築に使用されうる。この細胞は、遺伝的に改変されていないか、または上述に記載される方法を使用して遺伝的に改変されているものであり得る。Ｏｃｔ−３／４遺伝子を高発現するとして同定された多能性の細胞は、特異的に単離され得、そして、上記のように細胞移植またはさらなる培養および／もしくは改変のために使用され得る。
さらに、非改変および改変された胚性幹細胞の培養物を提供するために、本発明の培養基材および細胞方法を使用することが、胚性幹細胞のモニタリングまたは幹細胞収集を改良する物質についてスクリーニングするために使用される。例えば、推定の胚性幹細胞増幅物質は、上記の方法を用いて増殖した細胞培養物へ添加され得る。推定の胚性幹細胞増幅因子を欠損した対照細胞培養物と比較して、Ｏｃｔ−３／４遺伝子発現を一定のレベルまで増大させる物質は、胚性幹細胞増幅因子として同定される。
実施例
次に実施例を示す。これらの実施例は本発明の実施の一例を示すものであって、これにより本発明の範囲は何も制限されるものではない。
（実施例１）
ＥＳ細胞培地の作製
ＥＳ細胞を増殖させる目的で、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１１  ９９５）に、以下に示す最終濃度で因子を添加したＥＳ細胞培地を調製した：１５％ウシ胎仔血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社製）、１×非必須アミノ酸ストック（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４０−０５０）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム塩（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３６０−０７０）、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０−０８１）、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．社製（商品番号  ＥＳＧ１１０７）：マウスＬＩＦを活性成分として含有する）。ＥＳ細胞分化抑制アッセイ用の培地として、上記のＥＳ細胞培地からＥＳＧＲＯを除いたＥＳ細胞アッセイ培地を作製した。
（実施例２）
胚性幹細胞の培養
直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に０．１％の濃度でＧｅｌａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製  ＴｙｐｅＡ：ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ＳＫＩＮ、Ｇ２５００）を溶解し、滅菌した０．１％ゼラチン水溶液５ｍｌを添加し、室温で１０分以上静置する。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンＣ（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（ライフテックオリエンタル社Ｃａｔ．Ｎｏ．ＹＥ９２８４４００）２×１０６個を播種し、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ  ５ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養した。マウス胚性幹細胞株Ｄ３ＥＳ細胞（Ｒｏｌｆ  Ｋｅｍｌｅｒ、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｉｍｍｕｎｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｓｔｕｈｅｗｅｇ  ５１、Ｄ−７９１０８  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、より入手可能）を、直径６ｃｍの前記マウス胚性初代培養細胞（繊維芽細胞）フィーダー層上に播種し、５ｍｌのＥＳ細胞培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２日間培養して増殖させた。
（実施例３）
ＥＳ細胞分化抑制アッセイ
実施例２で培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製１５０９０−０４６）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させる。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を５ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁した。６穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０４６）の底に不織布を敷き、その上に１×１０４個の細胞を播種し、３ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地で７日間培養した。ＥＳ細胞培養用の不織布は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）を基材とした繊度０．０１４ｄ、平均孔径１０μｍ（又は繊度０．０３ｄ、平均孔径１３μｍ）の不織布にＨＭ−３（２−ヒドロキシエチル）メタアクリレート（以下、ＨＥＭＡと略称する）とＮ，Ｎ−ジメチルメタアクリレート（以下、ＤＭと略称する）からなる共重合体（ＨＥＭＡ：ＤＭ＝９７：３）の１２％エタノール溶液でコートしたものを用いた。また、未コートの不織布も用いた。
（実施例４）
アルカリホスファターゼ染色
ＥＳ細胞をアルカリホスファターゼキット（ＳＩＧＭＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．８６−Ｒ）を用いて染色した。実施例３に記載の方法で培養したＥＳ細胞の各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を２ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、２ｍｌの細胞固定液（２５ｍｌクエン酸溶液（ＳＩＧＭＡ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．９１−５）、６５ｍｌアセトン、８ｍｌ  ３７％ホルムアルデヒド）を各穴に加え、室温で３０秒静置した。固定液を吸引除去し、２ｍｌの脱イオン水を各穴に加えて４５秒室温で静置した。脱イオン水を吸引除去し、次いでアルカリホスファターゼ染色液（１ｍｌ亜硝酸ナトリウム溶液、１ｍｌファーストレッドバイオレットＬＢソルト溶液、１ｍｌナフトールＡＳ−ＢＩアルカリ溶液、４５ｍｌ蒸留水）を１ウェルあたり２ｍｌ加え１５分間室温で静置後、染色液を吸引除去し、脱イオン水、２ｍｌで洗浄した。各ウェルの染色像を図１に示した。対照となるゼラチンコートのウェル（Ａ）に比べて不織布を敷いたウェル（Ｂ〜Ｄ）のアルカリホスファターゼ活性は有意に高かった。即ち、不織布は、未分化状態のＥＳ細胞の維持に効果が認められた。
（実施例５）
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現量の定量
ＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を、ライトサイクラー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。実施例３に示す方法で培養したＥＳ細胞から、ＳＶトータルＲＮＡアイソレーションシステム（プロメガ社製）を用い、添付の方法に従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡの１００ｎｇを鋳型に、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製１８４１８−０１２）、オムニスクリプトリバーストランスクリプターゼ（キアゲン社製）を用い添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ  ２０μｌのうち２μｌを鋳型として、ライトサイクラーファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩキット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い添付のプロトコールに従ってＰＣＲを行った。Ｏｃｔ−３／４遺伝子、並びに対照としてグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を測定した。Ｏｃｔ−３／４遺伝子の増幅には、センスプライマーＯＣＴ３  ｕｐ：５’−ｇｇｃｇｔｔｃｔｃｔ  ｔｔｇｇａａａｇｇｔ  ｇｔｔｃ−３’（配列表配列番号１）、およびアンチセンスプライマーＯｃｔ３  ｄｏｗｎ：５’−ｃｔｃｇａａｃｃａｃ  ａｔｃｃｔｔｃｔｃｔ−３’（配列表配列番号２）を用い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、センスプライマーＧＡＰＤＨ  ｕｐ：５’−ｇｇｔｇａａｇｇｔｃ  ｇｇｔｇｔｇａａｃｇ  ｇａ−３’（配列表配列番号３）、およびアンチセンスプライマーＧＡＰＤＨ  ｄｏｗｎ：５’−ｔｇｔｔａｇｔｇｇｇ  ｇｔｃｔｃｇｃｔｃｃ  ｔｇ−３’（配列表配列番号４）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成を表１に、また反応条件を表２にそれぞれ示した。
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不織布上で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現は、ゼラチン上で培養したＥＳ細胞に比べ有意に亢進しており、特に繊度が０．０３デニールより小さい不織布で高い効果が認められた（図２）。またＨＭ３ポリマーによってコーティングされた不織布においても同様のＯｃｔ−３／４発現亢進作用が認められた（図３）。また、ＨＭ３コートされた不織布の表面をさらに０．１％ゼラチン水溶液で予め浸した不織布ではＯｃｔ−３／４の発現が飛躍的に亢進した（図４）。以上の結果から、不織布がＥＳ細胞の未分化状態を維持することがＯｃｔ−３／４の発現量からも示された。
（実施例６）
ＥＳ細胞分化抑制アッセイ２
実施例２で培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製１５０９０−０４６）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させる。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を５ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、再度、０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁した。１２穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０４３）の底に直径２０ｍｍの円形に切った不織布を敷き、ＥＳアッセイ培地を１ｍｌ添加した。その上に５×１０３個／ｍｌとなるようにＥＳアッセイ培地に調製した細胞溶液を１ｍｌ播種し、７日間培養した。１２穴細胞培養用ディッシュに敷いた不織布は、予めＰＢＳに１０分間、次いでＥＳアッセイ培地に１０分間以上浸したものを用いた。不織布にゼラチンコートする場合はＰＢＳに１０分間浸した後、０．１％ゼラチン水溶液に１０分間浸し、その後ＥＳアッセイ培地に１０分間以上浸したものを用いた。
ＥＳ細胞培養用の不織布は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）を基材とした、平均孔径８．６μｍ（繊維径１．１５μｍ）、１２．０μｍ（繊維径１．２μｍ）、１３．４μｍ（繊維径１．７μｍ）の不織布（何れも旭化成社製、日本）を用いた。また、セルロースを素材とした不織布として、ベンリーゼ（登録商標）品番ＰＳ１４０（平均孔径４７μｍ）、ベンリーゼ（登録商標）品番ＴＳ３２７（平均孔怪１１３．８μｍ）、ベンリーゼ（登録商標）品番ＳＦ１８４（平均孔径１１４．１μｍ）の３種類（何れも旭化成社製、日本）を用いた。
（実施例７）
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現量の定量２
ＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を、ライトサイクラー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。実施例６に示す方法で培養したＥＳ細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン、日本）を用い、添付の方法に従ってトータルＲＮＡを抽出した。即ち、培養後のディッシュから培地を除去し、ＰＢＳ２ｍｌで洗浄した後、ＩＳＯＧＥＮを１ｍｌずつ各ウェルに加えた。室温で５分間静置した後、ＩＳＯＧＥＮを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに回収した。クロロホルム（和光純薬）を０．２ｍｌ加え、１５秒間振とうさせ、２〜３分間室温で静置した。微量遠心機（トミー精工）にて、４℃、１４０００回転で１５分間遠心した。上清４００μｌを新しいエッペンドルフチューブに移し、５００μｌのイソプロパノール（和光純薬）を加え、室温で１０分間静置後、微量遠心機にて、４℃、１４０００回転で１０分間遠心した。上清を除去後、７０％エタノールを１ｍｌ加え、振とうした後、微量遠心機にて４℃、１００００回転、５分間遠心した。上澄みを除去して沈殿を乾燥させた後、３０μｌの蒸留水に溶解させ、トータルＲＮＡ溶液を得た。このようにして得られたトータルＲＮＡの１μｇを鋳型に、ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ、インビトロジェン社）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製１８４１８−０１２）、オムニスクリプトリバーストランスクリプターゼ（キアゲン社製）を用い添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。即ち、トータルＲＮＡ１μｇに１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ（以上インビトロジェン社）と蒸留水を加えて１０μｌとなるようにした反応液を作製し、室温で１５分間インキュベートした。２５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を１μｌ加えて、６５℃で１０分間加熱した。室温に戻した後、２μｌの１０×Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＴ、２μｌの５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、２μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー、０．２５μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７７７−０１９）、１μｌのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを加え、Ｒｎａｓｅフリー精製水で全量２０μｌに合わせ、３７℃で６０分間インキュベートして、ｃＤＮＡ溶液を得た。このようにして得た合成ｃＤＮＡの一部を蒸留水で５倍に希釈し、その２μｌを鋳型として、ライトサイクラーファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩキット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い添付のプロトコールに従ってＰＣＲを行った。Ｏｃｔ−３／４遺伝子、並びに内部標準としてグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を測定した。Ｏｃｔ−３／４遺伝子の増幅には、センスプライマーＯＣＴ３  ｕｐ（配列表配列番号１）、およびアンチセンスプライマーＯｃｔ３  ｄｏｗｎ（配列表配列番号２）を用い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、センスプライマーＧＡＰＤＨ  ｕｐ（配列表配列番号３）、およびアンチセンスプライマーＧＡＰＤＨ  ｄｏｗｎ（配列表配列番号４）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成を表３に、また反応��件を表４にそれぞれ示した。
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ＰＥＴ不織布上で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現は、プラスチックディッシュ上で培養したＥＳ細胞に比べ有意に亢進しており、平均孔径１２．０μｍの不織布ではＥＳＧＲＯ  １０００ユニット／ｍｌと同等のＯｃｔ−３／４遺伝子発現維持効果が認められた（図５）。プラスチックディッシュおよび不織布をゼラチンで浸した場合にも同様の効果が認められた（図６）。即ち、ＰＥＴ不織布はＥＳ細胞の未分化を維持することがＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量から確認され、さらに、１２．０μｍの平均孔径を有する不織布が最も効果が高いことが確認された。また、セルロース不織布を用いた場合も、ＰＥＴ不織布と同様にプラスチックディッシュに比べＯｃｔ−３／４発現量維持効果が高いことが確認された（図７）。以上の結果から、不織布がＥＳ細胞の未分化状態を維持することがＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量からも示された。
（実施例８）
ＥＳ細胞分化抑制アッセイ３
実施例２で培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製１５０９０−０４６、米国）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させる。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工、日本）で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を５ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、再度、０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁した。２４穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０４７、米国）に旭化成マイクロキャリア（平均孔径３０μｍ：旭化成社製、日本）を０．５ｍｌ予め添加した後、２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、または１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＥＳ細胞培地に調製したＥＳ細胞溶液を０．５ｍｌずつ各ウェルに播種し、７日間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＥＳＧＲＯを含有するサンプルは、最終濃度が１０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるようにＥＳＧＲＯを予め細胞溶液に加えた。マイクロキャリアは、ＰＢＳに懸濁し１２１℃で、２０分間加圧滅菌した後、ＥＳ細胞培地に置換し、ベッドボリュームの４倍量のＥＳ細胞培地に懸濁した。ゼラチンコートマイクロキャリアは、加圧滅菌後、０．１％ゼラチン水溶液に置換して３０分間室温で静置後、ベッドボリュームの４倍量のＥＳ細胞培地に懸濁して調製した。
（実施例９）
アルカリホスファターゼ定量
ＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性を、ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ（ＭＯＳＳ  Ｉｎｃ．社製、ＰＲＯＤＵＣＴ  ＮＯ．ＮＰＰＤ−１０００、米国、以下、ｐ−ＮＰＰ）を用いて定量した。実施例８に記載の方法で培養したＥＳ細胞の各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄後、ｐ−ＮＰＰ  ２００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間静置した。各ウェルに２５μｌの８Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。反応液１００μｌを９６穴マイクロテストプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．３０７２、米国）に移し、溶液の４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４０５）と６９０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．６９０）を吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、型式：ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０）により測定し、Ｏ．Ｄ．４０５−Ｏ．Ｄ．６９０で算出される値をアルカリホスファターゼ活性とした。定量結果をグラフしたものを図８に示した。マイクロキャリアを用いて培養したＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性は、マイクロキャリアを用いない場合に加えて有意に高かった。即ち、マイクロキャリアは未分化なＥＳ細胞の培養を支持した。
産業上の利用可能性
本発明によるとフィーダー細胞およびフィーダー細胞由来成分の非存在下の状態において未分化状態の胚性幹細胞を大量にかつ安全に培養することができる。得られる胚性幹細胞は、細胞培養、組織移植、創薬、遺伝子治療等の分野で有用に利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４の不織布上で培養したＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ染色像を示す。なお、図１において、Ａ〜Ｄはそれぞれ次のウェルを示す。
Ａ：プラスチックディッシュにゼラチンコート
Ｂ：０．０３デニール不織布にＨＭ３コート
Ｃ：０．０１４デニール不織布にＨＭ３コート
Ｄ：０．０１４デニール不織布に非コート
図２は、実施例５の非コート不織布上で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子発現量を示す。
図３は、実施例５のＨＭ３コート不織布で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子発現量を示す。
図４は、実施例５のＨＭ３およびゼラチンコート不織布で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子発現量を示す。
図５は、実施例７の平均孔径１２．０μｍのＰＥＴ不織布で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子発現量を示す。
図６は、実施例７のゼラチンでコートした平均孔径８．６μｍ、１２．０μｍ、１３．４μｍのＰＥＴ不織布で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を示す。
図７は、実施例７のゼラチンコートしたセルロース不織布で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子発現量を示す。
図８は、実施例９のマイクロキャリアで培養したＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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