(57)【要約】細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法であって、下記の工程：（１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；（２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び（３）工程（２）で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程を含む方法。細胞壁に対して阻害作用を有する薬剤の作用点を簡便かつ適切に判定することにより、特定の作用点に作用する細胞壁作用性薬剤を効率的にスクリーニングできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法であって、下記の工程：
（１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
（２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
（３）工程（２）で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程
を含む方法。
【請求項２】
細胞壁作用性薬剤のなかから特定の作用点を有する薬剤をスクリーニングするために用いる請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
レポータータンパク質由来物の糖鎖の分析がレポーター蛋白質由来物の分子量測定により行われる請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
【請求項４】
レポーター蛋白質がグリーン・フルオレッセント・プロテインである請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞壁作用性薬剤が抗真菌剤である請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記工程（１）に先立って、細胞壁作用性薬剤のスクリーニングを下記の工程：
（Ａ１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養する工程；
（Ａ２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する工程；及び
（Ａ３）レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しない場合に、該被検薬剤が細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると判定する工程；
により行ない、上記工程（Ａ３）により細胞壁に対して選択的な阻害作用を有すると判定された薬剤について上記（１）〜（３）の工程を行なう請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞壁作用性薬剤の作用点の推定方法であって、下記の工程：
（１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
（２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
（３）工程（２）で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、蛍光蛋白質などのレポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を利用した細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法に関するものである。
背景技術
深在性真菌症の発生頻度は易感染患者の増加とともに、ますます増加する傾向にあり、有効な治療薬が望まれている。現在、国内で上市されている深在性真菌症治療薬はわずか５剤のみであり、このうち３剤はアゾール系薬剤（ミコナゾール，フルコナゾール，イトラコナゾール）である。その代表であるフルコナゾールは作用が静菌的であることに加え、使用量の増加とともに耐性菌の出現も懸念されている。一方、殺菌効果の高いポリエン系抗生物質であるアムホテリシンＢは毒性も強く、必ずしも安全に使用できる薬剤ではない。これらの理由から、深在性真菌感染症での医療満足度は総じて低く、殺菌的かつ真菌選択的な新規薬剤への需要は依然として大きい。
真菌細胞に特徴的に存在する細胞壁は選択性の観点から魅力的な標的である。パン酵母を例にとると細胞壁を構成する主要な糖ポリマーは、（１，３）−β−グルカン、（１，６）−β−グルカン、キチン、マンナンである。これらの糖ポリマーの合成経路のうち、マンナン合成経路は動物および真菌細胞間での存在自体や生合成経路についての共通性が高いため、真菌に特異的な標的を見出すことは不可能ではないものの、一般的に困難であると考えられる。（１，３）−β−グルカン合成経路およびキチン合成経路には、ＦＫＳ遺伝子群およびＣＨＳ遺伝子群などのように、真菌に特異的かつ生育に必須な酵素の存在が明らかになっており、これらを標的とした抗真菌剤の探索や開発が進められている。そして、（１，３）−β−グルカン阻害作用を有するカンジン系抗真菌薬が実際に開発されている。これに対して、（１，６）−β−グルカン合成経路も真菌に特異的な経路であると考えられ、遺伝学的解析の結果から真菌の生育に必須であると考えられる酵素の存在が明らかとなっているが、酵素レベルでのアッセイ系が確立されていないため阻害物質の報告もなく、この合成経路を阻害する抗真菌剤は未だ知られていない。
一般に、真核細胞には広くＧＰＩアンカー蛋白質と総称される蛋白質が存在し、これらはＧＰＩアンカーにより細胞膜に固定化される（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，ｐｐ．２８５−３２０，１９８８）。ＧＰＩアンカー蛋白質はＮ末端及びＣ末端に疎水性の高いシグナルペプチド領域を持ち、翻訳後の修飾によりこれらのシグナルは切断されるとともにＣ末端にＧＰＩアンカーの付加を受け、ＥＲ（粗面小胞体）膜に固定される。その後、ＥＲ膜に固定化されたＧＰＩアンカー蛋白質は膜上を輸送され、細胞膜に固定化される（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，ｐｐ．２８５−３２０，１９８８；Ｌｕ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４，ｐｐ．４８２５−４８３３，１９９４）。
パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、細胞膜に固定化されたＧＰＩアンカー蛋白質の一部はさらにＧＰＩアンカーの一部が切断されて、新たに（１，６）−β−グルカンをアンカーとして細胞壁に固定化される（Ｌｕ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４，ｐｐ．４８２５−４８３３，１９９４；Ｋｏｌｌａｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐｐ．１７７６２−１７７７５，１９９７）。
すなわち、パン酵母では細胞膜あるいは細胞壁に固定化された２種類のＧＰＩアンカー蛋白質が存在し、この局在性の違いはＣ末端のシグナルペプチドの違いにより制御されることが予想されている（Ｈａｍａｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５８，ｐｐ．５３−５９，１９９８；Ｃａｒｏ，Ｌ．，Ｙｅａｓｔ，１３，ｐｐ．１４７７−１４８９，１９９７）。最近、このような蛋白質の細胞壁への局在化機構を利用して、外来の任意の蛋白質を細胞壁に固定化した酵母（アーミングイースト）の作出が報告された（Ｖａｒｒｔ，Ｊ．Ｍ．Ｖ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，ｐｐ．６１５−６２０，１９９７；Ｍｕｒａｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，ｐｐ．１３６２−１３６６，１９９７）。
上述したように、（１，６）−β−グルカンはＧＰＩアンカー蛋白質を細胞壁に固定化するためのアンカーとしての機能を有しており、これまでの解析結果では、遺伝子破壊によって（１，６）−β−グルカンの生合成を阻害すると、これらの蛋白質は細胞外へ流出する（Ｌｕ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４，ｐｐ．４８２５−４８３３，１９９４；Ｌｕ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２８，ｐｐ．３３３−３４０，１９９５）。
最近、土屋らによりブドウ球菌細胞壁ペプチドグリカン結合型レポーター蛋白質の発現系の構築が報告されている（日本薬学会第１２０年会、要旨集２、第１５３頁、演題番号３０［ＰＢ］１５−７１）。この系は、グラム陽性菌の細胞壁にレポーター蛋白質としてセファロスポリナーゼをアンカリングさせたものである。しかしながら、この系の用途については明らかにされておらず、細胞壁作用性薬剤のスクリーニングに使用できることを示唆ないし教示していない。
また、従来、細胞壁作用性の薬剤の作用点を簡便かつ的確に推定する方法は（１，３）−β−グルカンやキチンなどの細胞壁関連薬剤のスクリーニング方法以外に知られておらず、特定の作用点に作用する薬剤をスクリーニングする方法もその作用点以外のスクリーニングには利用できなかった。
発明の開示
本発明の課題は、細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法であって、細胞壁に対して阻害作用を有する薬剤の作用点を簡便かつ適切に判定することにより、特定の作用点に作用する薬剤を効率的にスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明者らは、先に、検出の容易な蛋白質（レポーター蛋白質）を細胞膜又は細胞壁に固定した２種類の酵母（各々、膜型アーミングイースト又は壁型アーミングイーストと称する。）を作出し、実質的に壁型アーミングイーストでのみレポーター蛋白質が流出することを指標とすることで、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤、例えば細胞壁を構成する（１，６）−β−グルカン生合成酵素に対して選択的な阻害作用を有する薬剤をスクリーニングし得ることを見出した（ＰＣＴ／ＪＰ０１／３６３０）。
本発明者らは上記の課題を解決すべくさらに研究を続けた結果、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤の作用点に応じて、遊離するレポータータンパク質に付加している細胞壁を構成する上記糖鎖の分子量がそれぞれ異なり、遊離したレポータータンパク質の分子量を測定することによって薬剤の作用点を推定できることを見出した。すなわち、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤の作用点に応じて遊離するレポーター蛋白質の糖鎖が異なるとの現象を発見したのである。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法であって、下記の工程：
（１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
（２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
（３）工程（２）で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程
を含む方法を提供するものである。この方法は、好ましくは、細胞壁作用性薬剤のなかから、所望の作用点を有する薬剤をスクリーニングするために用いられる。
上記の発明の好ましい態様によれば、レポータータンパク質由来物の糖鎖の分析が、レポーター蛋白質由来物の分子量測定により行われる上記方法；レポーター蛋白質を細胞壁の（１，６）−β−グルカンに固定した微生物を用いる上記の方法；微生物が酵母である上記の方法；レポーター蛋白質が蛍光蛋白質である上記の方法；蛍光蛋白質がグリーン・フルオレッセント・プロテインである上記の方法；並びに細胞壁に対する阻害作用が細胞壁の構築過程および／または糖鎖の生合成酵素（糖鎖の伸長に関する酵素）に対する阻害作用である上記の方法が提供される。細胞壁作用性薬剤は好ましくは抗真菌剤である。
本発明のさらに好ましい態様では、上記方法の前に、細胞壁作用性薬剤をスクリーニングする工程を含む。この態様では、まず細胞壁作用性薬剤のスクリーニングを下記の工程：
（Ａ１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養する工程；
（Ａ２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する工程；及び
（Ａ３）レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しない場合に、該被検薬剤が細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると判定する工程；
に従って行ない、この工程（Ａ３）により細胞壁に対して選択的な阻害作用を有すると判定された薬剤について、上記（１）〜（３）の工程を行って、該薬剤のなかから所望の作用点を有する薬剤をスクリーニングすることができる。
別の観点からは、細胞壁作用性薬剤の作用点の推定方法であって、下記の工程：
（１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
（２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
（３）工程（２）で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報（特に、分子量あるいは分子量パターン等）に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程
を含む方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明のスクリーニング方法は、細胞壁作用性薬剤のなかから特定の作用点を有する薬剤をスクリーニングするために好適に用いることができる。一般的には、細胞壁作用性薬剤、好ましくは細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤を多数の化合物を含むライブラリーなどから１次スクリーニングにより選抜した後、その薬剤の作用点を確認するため、あるいは特定の作用点を有する薬剤をさらにスクリーニングするなどの目的で用いることができる。もっとも、本発明の方法の使用態様は上記のものに限定されることはなく、薬剤が細胞壁作用性であることがすでに分かっている場合、あるいは予測可能な場合には、上記の１次スクリーニングを省略して、その薬剤の作用点を確認する目的で被験薬剤に本発明の方法を直接適用してもよい。本発明の範囲にこのような態様が包含されることは言うまでもない。
本明細書において「細胞壁作用性」という用語は、例えば、以下の酵素の一種又は二種以上に作用して、その酵素の働きを干渉することを意味している。
（ａ）微生物の細胞壁を構成する成分（糖ポリマー）の合成酵素；
（ｂ）微生物の細胞壁を構成する成分（糖ポリマー）の合成酵素の働きを補助する酵素；
（ｃ）微生物の細胞壁を構成する成分（糖ポリマー）の合成酵素の働きを抑制する酵素；
（ｄ）上記（ｂ）と（ｃ）に属する酵素が上記（ａ）の合成酵素の働きを補助又は抑制するために必要な過程やこれに関わる酵素；
（ｅ）異なる糖ポリマー同士の架橋に働く過程やこれに関わる酵素；
（ｆ）糖ポリマーに限らず、細胞壁を構成する成分（例えば、細胞壁に存在するＧＰＩ蛋白質）の細胞壁へのアンカリング過程や、この過程に関わる酵素；
（ｇ）糖ポリマーが細胞壁内で正常に構築される過程やこれに関わる酵素；
（ｈ）細胞壁の合成を調節する過程や経路、およびこれに関わる酵素；
（ｉ）微生物細胞の分裂過程に働く過程やこれに関わる酵素；
（ｊ）微生物細胞の形態を変化させる過程やこれに関わる酵素；
（ｋ）構築された微生物細胞の細胞壁を消化する過程やこれに関わる酵素；
（ｌ）微生物が外界の環境変化に対応して、その細胞壁組成を大きく変化させる過程やこれに関わる酵素；及び
（ｍ）その他、上記の例にのみ限定されることはなく、微生物細胞壁の構築や合成、細胞壁の構造を変化させる過程やそれに関わる酵素。
また、本明細書において「細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する」とは、細胞壁の合成や分解などを含めて、上記の（ａ）から（ｍ）に記載の事象に関して特異的な阻害作用を有することを意味している。本明細書において、「薬剤」とは、低分子化合物又は高分子化合物のほか、天然物、蛋白質又はその一部、あるいはポリペプチド、そしてオリゴヌクレオチドなどの核酸などを含めて、生物学的な作用を有する物質を全て包含する概念として用いる。いかなる意味においても「薬剤」の語を限定的に解釈してはならなず、最も広義に解釈しなければならない。
本発明の方法を行うに先立って、細胞壁作用性の薬剤を化合物ライブラリーからスクリーニングすることが好ましい（本明細書において上記目的で行われるスクリーニングを「１次スクリーニング」と呼ぶ場合がある）。この方法は、通常、ＰＣＴ／ＪＰ０１／３６３０号明細書に記載された方法に従って行うことができる。より具体的には、細胞壁作用性薬剤は、下記の工程：
（Ａ１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養する工程；
（Ａ２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する工程；及び
（Ａ３）レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しない場合に、該被検薬剤が細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると判定する工程；
を含むスクリーニング方法にて選抜可能である。
上記の１次スクリーニングでは、レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養した後、培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する。培地や温度、培養時間などの条件は微生物の種類に応じて適宜選択すればよい。微生物として酵母を用いる場合の培養の具体的方法については、ＰＣＴ／ＪＰ０１／３６３０号明細書に具体的に説明されている。なお、本明細書において用いられる「ＧＰＩアンカー蛋白質」という用語は、特定の蛋白質を意味するものではなく、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
レポーター蛋白質はその性質が明らかになっている蛋白質であれば限定されず、蛍光測定などの分光学的手段、高速液体クロマトグラフィー、マススペクトル、又は酵素反応などの生化学的手段などの通常の手段によって検出可能な蛋白質であればその種類は特に限定されないが、例えば、蛍光性蛋白質などを好適に用いることができる。例えば、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）又はその変異体（ＥＧＦＰ：Ｄｏｒｍａｃｋ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１７３，ｐｐ．３３−３８など）を用いることが好ましい。本明細書において「グリーン・フルオレッセント・プロテイン」という用語はＧＦＰ及びその変異体を含めた概念として用いる。微生物としてはＧＰＩアンカー蛋白質を有する真核細胞微生物であればその種類は特に限定されないが、例えばパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を用いることが好ましい。
酵母においては、細胞膜に固定化されたＧＰＩアンカー蛋白質の一部が（１，６）−β−グルカンをアンカーとして細胞壁に固定化されることが知られている（Ｌｕ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４，ｐｐ．４８２５−４８３３，１９９４；Ｋｏｌｌａｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐｐ．１７７６２−１７７７５，１９９７）。また、融合蛋白質の製造によって酵素を微生物の細胞壁に固定化する方法が知られている（クリスら、特表平７−５０８６５２号公報）。こうした知見を利用して、外来の蛋白質を酵母の細胞壁に固定化する方法が開発されている（Ｖａｒｒｔ，Ｊ．Ｍ．Ｖ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，ｐｐ．６１５−６２０，１９９７；Ｍｕｒａｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，ｐｐ．１３６２−１３６６，１９９７）。ＧＰＩアンカー蛋白質はＧＰＩアンカー型蛋白質ともよばれ、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型蛋白質、ホスファチジルイノシトールアンカー型蛋白質、ＰＩアンカー型蛋白質などとも呼ばれる場合がある。
従って、微生物として酵母を用いることが好ましいが、酵母を用いる場合には、上記の刊行物に記載された方法に従って、レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁又は細胞膜に固定した酵母を作出することができる。ＰＣＴ／ＪＰ０１／３６３０号明細書の実施例にはその具体的方法が示されており、当業者は上記刊行物に記載された方法に従って、所望の微生物を生産することが可能である。
本明細書のスクリーニング法において、レポーター蛋白質由来物とは、薬剤の作用により細胞壁から遊離し、かつレポーター蛋白質の全部又はその主要な部分を含む単一の蛋白質又は複数の蛋白質の集合体である（本明細書において、レポーター蛋白質由来物の用語は、特に言及しない場合には単一物質又は複数の物質の混合物のいずれの意味でも用いる）。後述するように、レポーター蛋白質が細胞壁に固定されている場合には、細胞壁作用性薬剤の作用点の違いに応じて、各々特有の糖鎖を有するレポーター蛋白質由来物が生成する。
上記の１次スクリーニングの培養工程において（この１次スクリーニングの場合、レポーター蛋白質由来物には、細胞壁から遊離するものだけでなく、細胞膜から遊離するところの、細胞壁のレポーター蛋白質由来物に対応した蛋白（類）も含まれる）、培養液中にレポーター蛋白質由来物の流出が認められる場合には、その微生物の細胞壁又は細胞膜が被検薬剤の作用により損傷を受けたと解釈でき、レポーター蛋白質由来物が流出するものと考えられる（Ｌｕ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４，ｐｐ．４８２５−４８３３，１９９４；Ｌｕ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２８，ｐｐ．３３３−３４０，１９９５）。例えば、真菌に対して選択毒性を有する薬剤として細胞壁を選択的に損傷させる薬剤をスクリーニングする場合には、レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しないことを判定基準として、その条件を満足する薬剤を選択すればよい。この判定基準により陽性と判断される薬剤は、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると推定できる。
１次スクリーニングにおいて、レポーター蛋白質由来物の測定は、レポーター蛋白質の種類や性質に応じて適宜の方法を選択すればよい。例えば、レポーター蛋白質としてグリーン・フルオレッセント・プロテインを用いる場合には、培養液の蛍光スペクトルを測定することによりレポーター蛋白質由来物の流出を検出することが可能である。
本発明の方法は、好ましくは上記の１次スクリーニングにより選抜された細胞壁作用性薬剤から特定の作用点を有する薬剤をスクリーニングするために用いられ、下記の工程：
（１）レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
（２）上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
（３）工程（２）で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程；
を含むことを特徴としている。
本発明の方法において用いられる微生物は、上記の１次スクリーニングについての説明で言及した微生物のうち、ＧＰＩアンカー蛋白質としてレポーター蛋白質が細胞壁に固定した微生物であり、好ましい態様では、レポーター蛋白質を細胞壁の（１，６）−β−グルカンに固定した微生物などを用いることができる。また、１次スクリーニングの説明で言及したとおり、微生物としては酵母を用いることが好ましい。本発明の方法において用いられる微生物において、レポーター蛋白質としては蛍光蛋白質を用いることが好ましく、グリーン・フルオレッセント・プロテインを用いることが特に好ましい。
本発明の方法では、細胞壁作用性薬剤の作用点の違いによってレポーター蛋白質由来物に結合する糖鎖が変化することを利用し、その糖鎖を分析することにより、好ましくはレポーター蛋白質由来物の分子量（特に、分子量変化や分子量パターン）を測定することにより、被験薬剤の作用点を推定することを特徴としている。
ＧＰＩアンカー蛋白質として細胞壁に固定されたレポーター蛋白質には、通常、アンカリングに関与する（１，６）−β−グルカン及び／又は（１，３）−β−グルカンのほか、Ｎ−グリコシル鎖及びＯ−グリコシル鎖などの複数の種類の糖鎖が結合している。細胞壁作用性薬剤、例えば、（１，６）−β−グルカンの合成阻害薬、（１，３）−β−グルカンの合成阻害薬、マンナンの合成阻害薬（Ｎ型糖鎖またはＯ型糖鎖）、ヘテロ糖鎖のクロスリンクの阻害剤、糖鎖合成の調節を阻害する薬剤、及びＧＰＩアンカーの合成阻害剤などは、上記微生物に作用してそれぞれレポーター蛋白質由来物を流出させる能力を有するが、これらの薬剤は上記の各糖鎖に対して異なる作用点で作用することから、レポーター蛋白質に結合した上記糖鎖はこれらの薬剤の作用点に応じて特徴的に変化する。この結果、薬剤の作用により遊離したレポーター蛋白質由来物は、これらの薬剤の作用点に応じた異なる糖鎖断片を有する（あるいは特定の糖鎖を欠落する）ことになる。
本発明の方法において、レポーター蛋白質由来物の糖鎖の分析方法は特に限定されない。本明細書において用いられる「糖鎖の分析」という用語は、糖鎖部分の分子量の測定や構造決定のほか、レポーター蛋白質由来物全体についての分子量測定などを含めて、最も広義に解釈する必要がある。糖鎖の違いを証明できる手段であればいかなる方法を採用してもよい。最も簡便には、ポリアクリルアミドゲルなどを用いた電気泳動によりレポーター蛋白質由来物全体の分子量を測定することによって糖鎖を分析することができ、ウエスタンブロッティングなど当業者に周知かつ汎用の手法により、糖鎖の違いを反映したレポーター蛋白質由来物の分子量分布を可視的に確認することが可能である。本明細書において用いられる「分子量の測定」という用語は、分子量の比較を行うのに十分な情報を与えるものであればよく、その用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
本発明の方法は、細胞壁作用性薬剤のなかから、例えば、（１，６）−β−グルカンの生合成阻害作用を有する薬剤、又は（１，６）−β−グルカンの生合成に関与する１又は２以上の酵素に対して阻害作用を有する薬剤をスクリーニングするために特に好適に利用できる。さらに本発明の方法は（１，３）−β−グルカン阻害薬やその他の作用によって細胞壁の合成や構築が阻害される薬剤（これは作用点が未知であってもよい）をスクリーニングすることも可能である。そして、細胞壁作用性薬剤の具体例としては、例えば、抗真菌剤などを挙げることができるが、本発明の方法によりスクリーニング可能な薬剤は抗真菌剤に限定されることはない。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１（参考例）
（１）材料および方法
（Ａ）使用菌株および形質転換
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９，ＴＯＰ１０Ｆ’およびＤＨ５α株，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００株（ＭＡＴαａｄｅ２，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｌｙｓ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３），ＩＦＯ  ０５６５株，ＩＦＯ  １２２６株およびＫＲＥ６破壊株を用いた。形質転換法は公知の方法またはｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて指示書にしたがって実施した。
（Ｂ）使用薬剤
下記に示す薬剤を使用した。
2003035898.tif 000002
（Ｃ）オリゴヌクレオチド
以下に示すオリゴヌクレオチドを実験に供試した。Ｍ１３  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒおよびＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒはファルマシア社より購入し、それ以外は合成したものを用いた。これらは、レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として微生物の細胞壁又は細胞膜に固定するために用いる遺伝子として利用できる。
2003035898.tif 000003
（Ｄ）プラスミド
ｐＵＣ１９，ＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４（以上、Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，１９８５），ｐＹＰＲ２８３１（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，１７７１−１７７９，１９９０），ｐＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびｐＹＥＸ−Ｓ１（Ａｍｒａｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、以下のプラスミドを作製して用いた。これらには、レポーター蛋白質をＧＰＩアンカー蛋白質として微生物の細胞壁又は細胞膜に固定するために用いる遺伝子を含む組換えベクターが含まれる。ＰＣＲ産物のサブクローニングにはｐＧＥＭ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、変異の導入にはＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。アガロースからのＤＮＡ断片の回収、脱リン酸化、平滑化、ライゲーションおよび制限酵素消化は常法に従って行った。主なプラスミドの構造を第１図に示した。図中、ｏｒｉＢ：大腸菌の複製起点、ｏｒｉＹ：パン酵母の複製起点、Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子、ｄＬＥＵ２：ＬＥＵ２の部分欠損マーカー、Ｐｒｏ：フォスフォグリセレートキナーゼ・プロモーター、ＳＳ：分泌シグナル、Ｔｅｒ：フォスフォオグリセレートキナーゼ・ターミネーターを示す。
ｐＵＸＳ１：ＹＥｐ２４のＨｉｎｄＩＩＩ消化断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＸＳ２：ＹＥｐ１３のＸｈｏＩ，ＳａｌＩ消化断片をｐＵＣ１９のＳａｌＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ１：ＣＷＰ２（Ｖａｒｒｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，３１０４−３１１０，１９９５）の一部をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＣＷＰ２−ｓｅｎ１およびＣＷＰ２−ａｎｔｉ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＣ１ａ：ｐＵＡＣ１をＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ消化後、ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎさせた。
ｐＵＡＣ３：ＭＥＬ１（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．Ｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，ｐｐ．７２５７−７２６８，１９８５）の一部をＰＣＲで増幅（鋳型；ＩＦＯ  ０５６５株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＭＥＬ１−ｓｅｎ１およびＭＥＬ１−ａｎｔｉ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＣ５ａ：ｐＵＡＣ３のＳｃａＩ，ＢｇｌＩＩ消化断片をｐＵＡＣ１ａのＳｃａＩ，ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ８：ＭＥＬ１の一部をＰＣＲで増幅（鋳型；ＩＦＯ  １２２６株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＭＥＬ１−ｓｅｎ３およびＭＥＬ１−ａｎｔｉ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＣ１２：ＳＵＣ２（Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，ｐｐ．１９４３−１９５４，１９８３）の一部をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＨＰ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＳＵＣ２−ｓｅｎ１およびＳＵＣ２−ａｎｔｉ２）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＣ１３：ＭＥＬ１の一部をＰＣＲで増幅（鋳型；ＩＦＯ  ０５６５株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＭＥＬ１−ｓｅｎ３およびＭＥＬ１−ａｎｔｉ３）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＣ１４：ｐＧＦＰｕｖに変異を導入した（プライマー；ＧＦＰ−ＳＭ２，ＧＦＰ−ＳＭ３）。
ｐＵＡＣ１５：ｐＥＡＣ８ａをＳｔｕＩ消化後、ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎさせた。
ｐＵＡＣ１５ａ：ｐＵＡＣ１５に変異を導入した（プライマー；ＹＥＸ−ＳＭ４，ＹＥＸ−ＳＭ７）。
ｐＵＡＣ１６：ｐＵＡＣ１２のＮａｅＩ，ＳｐｅＩ消化断片をｐＵＡＣ１５ａのＳｐｅＩ，ＳｔｕＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ１９：ｐＵＸＳ１のＥｃｏＲＶ，ＰｖｕＩＩ消化断片をｐＥＡＣ１２のＥｃｏＲＶ  ｓｉｔｅに挿入した。
ＰＵＡＣ１９ａ：ｐＵＡＣ１９に変異を導入した（プライマー；ＧＦＰ−ＳＭ４，ＹＥＸ−ＳＭ８，ＹＥＸ−ＳＭ９）。
ｐＵＡＣ２０：ｐＵＸＳ２のＥｃｏＲＶ，ＰｖｕＩＩ消化断片をｐＥＡＣ１２のＥｃｏＲＶ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ２０ａ：ｐＵＡＣ２０に変異を導入した（プライマー；ＧＦＰ−ＳＭ４，ＹＥＸ−ＳＭ８，ＹＥＸ−ＳＭ９）。
ｐＵＡＣ２１：ｐＹＰＲ２８３１のＰｓｔＩ消化断片を平滑化し、ｐＥＡＣ１２のＥｃｏＲＶ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ２１ａ：ｐＵＡＣ１９ａのＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ消化断片をｐＵＡＣ２１のＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ２８：ＧＡＳ１（Ｖａｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１２２４２−１２２４８，１９９０）の一部をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＧＡＳ１−ｓｅｎ１およびＧＡＳ１−ａｎｔｉ３）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＣ２９ｂ：ｐＵＡＣ２８のＢｇｌＩＩ，ＳａｃＩＩ消化断片をｐＵＡＣ２０ａのＢｇｌＩＩ，ＳａｃＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ３０ｂ：ｐＵＡＣ２９ｂのＢｇｌＩＩ，ＢａｍＨＩ消化断片をｐＵＡＣ１９ａのＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＣ３１ｂ：ｐＵＡＣ２９ｂのＢｇｌＩＩ，ＢａｍＨＩ消化断片をｐＵＡＣ２１ａのＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＥＡＣ３：ｐＵＡＣ５ａのＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ消化断片をｐＹＰＲ２８３１のＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＥＡＣ６：ｐＥＡＣ３の一部をＰＣＲで増幅（鋳型；ｐＥＡＣ３，プライマー；ＭＥＬ１−ｓｅｎ３およびＭＥＬ１−ａｎｔｉ２）させ、ｐＧＥＭ−ＴにサブクローニングしたプラスミドのＳａｃＩ消化断片をｐＹＥＸ−Ｓ１のＳａｃＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＥＡＣ６ａ：ｐＥＡＣ６に変異を導入した（プライマー；ＹＥＸ−ＳＭ２，ＹＥＸ−ＳＭ３）。
ｐＥＡＣ７：ｐＵＡＣ８のＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ消化断片をｐＥＡＣ６ａのＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＥＡＣ７ａ：ｐＥＡＣ７に変異を導入した（プライマー；ＹＥＸ−ＳＭ４，ＹＥＸ−ＳＭ５）。
ｐＥＡＣ８：ｐＵＡＣ１３のＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ消化断片をｐＥＡＣ６ａのＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＥＡＣ８ａ：ｐＥＡＣ８に変異を導入した（プライマー；ＹＥＸ−ＳＭ６）。
ｐＥＡＣ９：ｐＵＡＣ１４のＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ消化断片をｐＥＡＣ６ａのＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＥＡＣ１１：ｐＥＡＣ７ａのＳａｃＩ，ＮｄｅＩ消化断片をｐＵＡＣ１６のＳａｃＩ，ＮｄｅＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＥＡＣ１２：ｐＥＡＣ９のＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ消化断片をｐＥＡＣ１１のＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
第１図において、ｐＥＡＣ６ａ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝α−ガラクトシダーゼ、ｐＥＡＣ８ａ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＧＦＰｕｖ、ｐＵＡＣ１９：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＥＧＦＰ，Ｍａｒｋｅｒ＝ＵＲＡ３，ＡＳ＝ＣＷＰ２アンカリングシグナル、ｐＵＡＣ１９ａ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＥＧＦＰ，Ｍａｒｋｅｒ＝ＵＲＡ３，ＡＳ＝ＣＷＰ２アンカリングシグナル、ｐＵＡＣ２０ａ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＥＧＦＰ，Ｍａｒｋｅｒ＝ＬＥＵ２，ＡＳ＝ＣＷＰ２アンカリングシグナル、ｐＵＡＣ２１ａ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＥＧＦＰ，Ｍａｒｋｅｒ＝ＴＲＰ１，ＡＳ＝ＣＷＰ２アンカリングシグナル、ｐＵＡＣ２９ｂ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＥＧＦＰ，Ｍａｒｋｅｒ＝ＬＥＵ２，ＡＳ＝ＧＡＳ１アンカリングシグナル、ｐＵＡＣ３０ｂ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＥＧＦＰ，Ｍａｒｋｅｒ＝ＵＲＡ３，ＡＳ＝ＧＡＳ１アンカリングシグナル、ｐＵＡＣ３１ｂ：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ＝ＥＧＦＰｕｖ，Ｍａｒｋｅｒ＝ＴＲＰ１，ＡＳ＝ＧＡＳ１アンカリングシグナルである。
（Ｅ）アーミングイーストの作出
レポーター蛋白質としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−ガラクトシダーゼ（Ｔｕｒａｋａｉｎｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，２６２２−２６３０，１９９３；ＭＥＬ１）またはグリーン・フルオレセント・プロテイン（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）を選択した。ＧＦＰはＧＦＰｕｖおよびＥＧＦＰｕｖ（Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１７３，３３−３８，１９９６；ＧＦＰｕｖにＰｈｅ６４→ＬｅｕおよびＳｅｒ６５→Ｔｈｒになるように変異を導入したもの）を用いた。次いで、これらの蛋白質のＮ末端側にＳＵＣ２の分泌シグナル、Ｃ末端側にＣＷＰ２のＧＰＩアンカリングシグナルをそれぞれ付加した融合蛋白質をコードする遺伝子を設計してホスホグリセレートキナーゼのプロモーターとターミネターの間に挿入し、発現カセットとした。この発現カセットをＹＥｐ型ベクターに挿入したプラスミド（ｐＥＡＣ６ａ，ｐＥＡＣ８ａおよびｐＥＡＣ９）をそれぞれ形質転換（ＡＹＥ１，ＡＹＥ２およびＡＹＥ３株）、またはＹＩｐ型ベクターに挿入したプラスミド（ｐＵＡＣ１９ａ，ｐＵＡＣ２０ａおよびｐＵＡＣ２１ａ）を線状化した後に、菌株の染色体ＤＮＡに組み込んで壁型アーミングイースト（ＡＹ−２，ＡＹ−５，ＡＹ−１６，ＡＹ−１４，ＡＹ−１７株）を作出した。膜型アーミングイースト（ＡＹ−１２，ＡＹ−１５株）はＧＰＩアンカリングシグナルをＧＡＳ１由来のものに置き換えて（ｐＵＡＣ２９ｂ，ｐＵＡＣ３０ｂおよびｐＵＡＣ３１ｂ）作出した。作出した菌株を表２に示した。
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（Ｆ）培地
ＹＰＡＵＤ（１％イーストエクストラクト，２％ペプトン，２％グルコース，４０μｇ／ｍｌアデニン，２０μｇ／ｍｌウラシル），ＲＰＭＩＢ［ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ），１Ｍソルビトール，１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ４．０〜７．０），２％グルコース，４０μｇ／ｍｌアデニン，２０μｇ／ｍｌウラシル］，ＹＮＢ［０．６７％ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ，（Ｄｉｆｃｏ），２％グルコース，添加栄養素（４０μｇ／ｍｌアデニン，２０μｇ／ｍｌヒスチジン，６０μｇ／ｍｌロイシン，３０μｇ／ｍｌリジン，４０μｇ／ｍｌトリプトファン，２０μｇ／ｍｌウラシル）］を適宜用いた。また、寒天培地は上記の液体培地に１．５〜２％アガロースを添加した。
（Ｇ）α−ガラクトシダーゼ活性の測定
Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒら（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，９，３９９−４０９，１９９３）の方法を用いた。すなわち、ＹＮＢで培養した対数増殖後期の培養液１６０μｌに１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）および０．１Ｍ  ｐ−ニトロフェニル−α−ガラクトピラノシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｈｅｉｍ）を各２０μｌ加え、３７℃で５分間反応させた。反応液に１ｍｌの２％炭酸ナトリウムを加えた後に、吸光度（ＯＤ４１０）を測定した。
（Ｈ）ＧＦＰ発現株の蛍光強度測定
ＲＰＭＩＢ（ｐＨ７．０）で培養した対数増殖期の菌を集め、水にＯＤ５９５＝１．０になるように浮遊させて測定した。蛍光強度および至適波長の測定は蛍光光度計（Ｆ−２０００，日立工機）を用いて行った。また、個々の細胞の蛍光の検出には蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ，Ｚｅｉｓｓ）を用いた。
（Ｉ）Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ作用によるＧＦＰ流出効果の測定
液体培地で培養した対数増殖期の酵母を集め、適当なバッファーに浮遊させた。これにＺｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔ（生化学工業）を添加（４００〜６．２５μｇ／ｍｌ）し、３０℃で３０分間振盪した。反応後、フィルターでろ過して酵母とバッファーを分離し、バッファー中の蛍光強度を蛍光光度計で測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝４８７ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５１３ｎｍ）。
（Ｊ）ＧＦＰの局在比較
液体培地で培養した対数増殖期の菌（ＡＹ−２株）をガラスビーズを用いて物理的に粉砕したのち、細胞壁、細胞膜および可溶性蛋白質を分画し、適当なバッファーに懸濁した。それぞれの画分の蛍光強度を測定し（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝４８７ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５１３ｎｍ）、各画分の蛍光強度を菌全体の総蛍光強度に対する比率で表した。
（Ｋ）ＫＲＥ６破壊株のＧＦＰ流出効果の測定
ＫＲＥ６破壊株（ＡＹ−１６株）を３０℃で振盪培養し、３および６時間後にフィルターで培養液をろ過して培地中の蛍光強度を測定した。
（Ｌ）既存抗真菌試薬によるＧＦＰ流出効果の測定
培養した対数増殖期の菌（ＡＹ−２株およびＡＹ−１２株）を集め、各種の薬剤を作用させた。培養上清の蛍光強度はＣｙｔｏｆｌｕｏｒ２３００蛍光測定装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝４８０ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５３０ｎｍ）。各種薬剤作用時の蛍光強度は薬剤無添加対照の蛍光強度との差で示した。
（２）結果
（Ａ）各種壁型アーミングイーストの性状解析
レポーター蛋白質としてα−ｇａｌａｃｔｏｃｉｄａｓｅ、ＧＦＰｕｖ、及びＥＧＦＰｕｖの３種類を、発現方法として高コピーベクターを用いる方法と染色体へ挿入する方法を用いて種々の壁型アーミングイーストを作出し、これらの菌株のα−ガラクトシダーゼ活性および蛍光強度を比較した。その結果、α−ガラクトシダーゼ発現株（ＡＹＥ−１株およびＡＹＥ−２株）には、いずれも微弱な活性が認められるのみであった。また、ＧＦＰｕｖを高コピーベクターを用いて発現させた菌株（ＡＹＥ−３株）を蛍光顕微鏡で観察した結果、個々の細胞間での蛍光強度に大きなバラツキが認められたことから、プラスミドの安定性に問題があると考えられた。一方、ＥＧＦＰｕｖおよびＧＦＰｕｖ発現カセットを染色体へ挿入した菌株（ＡＹ−５株およびＡＹ−１７株）の蛍光強度を比較した結果（表３）、ＥＧＦＰｕｖの蛍光強度はＧＦＰｕｖのそれより３倍以上強かった。以上の結果から、レポーター蛋白質として蛍光蛋白質を用いることが適当であり、ＥＧＦＰｕｖをレポーター蛋白質として染色体に組込んだ株が特に好適であると結論できた。本菌株の至適波長を測定した結果、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｍａｘ＝４８７ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｍａｘ＝５１３ｎｍであった。
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対数増殖期の菌株を水に懸濁し、蛍光強度を測定した。
（Ｂ）Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ作用によるＧＦＰ流出効果の測定
ＡＹ−２株を試験管内で増殖させ、菌体を集めてＺｙｍｏｌｙａｓｅを作用させた。作用後の培養上清中の蛍光強度を測定した。浸透圧保護下でＡＹ−２株にＺｙｍｏｌｙａｓｅを作用させた結果、添加したＺｙｍｏｌｙａｓｅの濃度に依存してバッファー中の蛍光強度が上昇した（表４）。この結果から、大量のＧＦＰが細胞壁に固定化されていることが示唆された。
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（Ｃ）ＫＲＥ６破壊株のＧＦＰ流出効果の測定
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）における（１，６）−β−グルカンの生合成には少なくとも６種類の酵素が関与していることが推定されている。これらの酵素のうち、ゴルジ体に存在するＫＲＥ６−遺伝子がコードする産物（蛋白質）およびそのホモログであるＳＫＮ１遺伝子がコードする産物（蛋白質）の少なくとも１つは生育に必須であることが明らかとなっている（Ｇａｕｇｈｒａｎ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６，ｐｐ．５８５７−５８６０，１９９４）。また、ＫＲＥ６ホモログはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（代表的な病原性真菌）などの真菌にも広く存在すると推定されている。以上の知見から、Ｋｒｅ６ｐ（ＫＲＥ６遺伝子の産物）は新規な抗真菌剤を開発するために好ましい標的であると推測される。
ＫＲＥ６の破壊によるＧＦＰ流出効果を確認する目的で、ＡＹ−５株およびＡＹ−１６（ＫＲＥ６破壊）株を試験管内で培養し、経時的にＧＦＰの流出を測定した（第２図）。その結果、両株の培養液（菌＋培地）にはいずれの培養時間においても同等の蛍光強度が検出されたのに対し、培養上清の比較では、ＡＹ−１６株の方がＡＹ−５株よりも明らかに高かった。さらに、これら２株の酵母を試験管内で培養し、対数増殖期にある菌を蛍光顕微鏡下（×４００）で観察したところ、ＡＹ−１６株では蛍光強度が減弱していた。これらの結果は、ＫＲＥ６の破壊がＧＦＰの流出を促進することを示しており、作出した微生物（アーミングイースト）を用いてＫＲＥ６−遺伝子の産物を阻害する薬剤をスクリーニングし得る実験成績であった。
（Ｄ）ＧＦＰの局在性の比較
ＡＹ−２株（壁型アーミングイースト）およびＡＹ−１２株（膜型アーミングイースト）におけるＧＦＰの局在を比較した。各々の菌を試験管内で増殖させ、菌体を集めて細胞壁、細胞膜および可溶性蛋白質に分画した。得られた画分の蛍光強度を測定し、総蛍光強度に対する比率を算出した（単位：％）。結果を表５に示す。壁型アーミングイーストでは細胞壁に、膜型アーミングイーストでは細胞膜にそれぞれ大量のＧＦＰが固定化されていることが明らかとなった。
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（Ｅ）既存抗真菌試薬によるＧＦＰ流出効果の測定
上記方法がＫｒｅ６ｐ以外の作用点を有する薬剤のスクリーニングに利用できるか否かを確認する目的で、既存抗真菌試薬作用時のＡＹ−２株（壁型アーミングイースト）およびＡＹ−１２株（膜型アーミングイースト）におけるＧＦＰ流出効果を比較した。まず、試験管内で培養したＡＹ−２株およびＡＹ−１２株を浸透圧を保護した培地（ＲＰＭＩＢ）に浮遊させ、薬剤を作用させた。培養後、上清の蛍光強度を測定し、薬剤無添加対照との差を算出した。その結果を第３図に示す。
細胞壁を作用点とするアクレアシンＡ（Ａｃｕｌｅａｃｉｎ  Ａ：（１，３）−β−グルカン合成阻害剤）、ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ：マンナン合成阻害剤）ではＡＹ−２株において顕著なＧＦＰ流出効果が認められたが、ＡＹ−１２株においては流出効果はほとんど認められなかった。細胞膜を作用点とするアムホテリシンＢ（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ）、フルコナゾール（Ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、およびサリノマイシン（Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）はどちらの菌株においても若干の流出効果が認められた。上記以外の試薬では、壁型アーミングイースト（ＡＹ−２株）に対してのみ明瞭なＧＦＰ流出効果を示すものは認められなかった。以上の結果から、上記スクリーニング方法によって、種々の種類の細胞壁作用性薬剤をスクリーニングできることが明らかとなった。
以下の配列表に微生物ＡＹ−１５株及びＡＹ−１４株に保持させた遺伝子を示す。
配列番号１は膜型アーミングイーストであるＡＹ−１５株がゲノム組み込み型として保持する遺伝子であり、ＳＳ（分泌シグナル）−ＥＧＦＰｕｖ−膜アンカリングシグナル（ＡＳ）の塩基配列に相当しており、市販のＧＦＰｕｖに変異を加えてある（３１２番目をｇに、３１５番目をａ、３１６番目をａに置換した。オリジナルのＧＦＰｕｖではそれぞれｔ、ｃ，ｔである。）。
配列番号２は壁型アーミングイーストであるＡＹ−１４株がゲノム組み込み型として保持する遺伝子であり、ＳＳ（分泌シグナル）−ＥＧＦＰｕｖ−壁アンカリングシグナル（ＡＳ）の塩基配列に相当しており、市販のＧＦＰｕｖに変異を加えてある（３１２番目をｇに、３１５番目をａ、３１６番目をａに置換した。オリジナルのＧＦＰｕｖではそれぞれｔ、ｃ，ｔである。）。
例２（本発明）
（１）試験材料および方法
（Ａ）菌株、細胞、形質転換法、及び培地
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９およびＤＨ５α株，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株およびＹＰＨ５００株を用いた。形質転換法としては上記例１に記載された方法、またはｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて指示書に従って実施した。今回用いた菌株を表６に示す。培地は例１に記載した培地を適宜使用した。
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（Ｂ）オリゴヌクレオチド
以下に示す２４個のオリゴヌクレオチドを合成し、適宜実験に供試した。
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（Ｃ）プラスミド
上記例１に記載したｐＡＵＣ１９ａ，ｐＵＡＣ２９ｂ，ｐＵＡＣ２０ａ，ｐＵＡＣ３０ｂ，ｐＵＡＣ２１ａ，ｐＵＡＣ３１ｂ（以上、第８図），ｐＵＣ１９およびＹＥｐ２４を用いて以下のプラスミドを作成した。ＰＣＲ産物のサブクローニングにはｐＧＥＭ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、アガロースからのＤＮＡ断片の回収、ｌｉｇａｔｉｏｎおよび制限酵素消化は例１の方法により行った。
ｐＵＸＳ１：ＹＥｐ２４のＨｉｎｄＩＩＩ消化断片（Ｕｒａ３）をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＯ１：ＫＲＥ６をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＫＲＥ６−ｓｅｎ３およびＫＲＥ６−ａｎｔ３）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ１：ＳＫＮ１をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＳＫＮ１−ｓｅｎ１およびＳＫＮ１−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ３：ＧＡＳ１をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＧＡＳ１−ｓｅｎ１およびＧＡＳ１−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ４：ＧＰＩ１をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＧＰＩ１−ｓｅｎ１およびＧＰＩ１−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ５：ＫＥＸ２をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＫＥＸ２−ｓｅｎ１およびＫＥＸ２−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ６：ＹＥｐ２４のＣｌａＩ，ＳｍａＩ消化断片をｐＵＡＢ３のＣｌａＩ，ＭｓｃＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ７：ＹＥｐ２４のＣｌａＩ，ＳｍａＩ消化断片をｐＵＡＢ４のＣｌａＩ，ＨｐａＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ８：ＹＥｐ２４のＣｌａＩ，ＮｈｅＩ消化断片をｐＵＡＢ５のＣｌａＩ，ＸｂａＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ９：ＹＥｐ２４のＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ消化断片をｐＵＡＯ１のＢｇｌＩＩ，ＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ１０：ｐＵＸＳ１のＫｐｎＩ，ＰｖｕＩＩ消化断片をｐＵＡＢ１のＣｌａＩ，ＸｂａＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ１１：ＢＣＫ１をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＢＣＫ１−ｓｅｎ１およびＢＣＫ１−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ１２：ＰＭＴ１をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＰＭＴ１−ｓｅｎ１およびＰＭＴ１−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ１３：ＰＭＴ２をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＰＭＴ２−ｓｅｎ１およびＰＭＴ２−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ１４：ＰＭＴ４をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＰＭＴ４−ｓｅｎ１およびＰＭＴ４−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢＩ５：ＫＲＥ２をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＫＲＥ２−ｓｅｎ１およびＫＲＥ２−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ１６：ＦＫＳ１をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ５プライマー；ＦＫＳ１−ｓｅｎ１およびＦＫＳ１−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ１７：ＭＮＮ９をＰＣＲで増幅（鋳型；ＹＰＨ５００株染色体ＤＮＡ，プライマー；ＭＮＮ９−ｓｅｎ１およびＭＮＮ９−ａｎｔ１）させ、ｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
ｐＵＡＢ１８：ＹＥｐ２４のＥｃｏＲＩ，ＮｈｅＩ消化断片をｐＵＡＢ１１のＥｃｏＲＩ，ＮｈｅＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ１９：ＹＥｐ２４のＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ消化断片をｐＵＡＢ１２のＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＶ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ２０：ＹＥｐ２４のＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ消化断片をｐＵＡＢ１３のＸｈｏＩ，ＭｕｎＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ２１：ＹＥｐ２４のＣｌａＩ，ＳｍａＩ消化断片をｐＵＡＢ１４のＣｌａＩ，ＨｐａＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ２２：ＹＥｐ２４のＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ消化断片をｐＵＡＢ１５のＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＶ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ２３：ＹＥｐ２４のＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ消化断片をｐＵＡＢ１６のＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＶ  ｓｉｔｅに挿入した。
ｐＵＡＢ２４：ＹＥｐ２４のＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ消化断片をｐＵＡＢ１７のＥｃｏＲＩ，ＨｐａＩ  ｓｉｔｅに挿入した。
（Ｄ）アーミングイーストおよび遺伝子破壊株の作出
遺伝子破壊操作は常法に従った。作出した遺伝子操作株を使用したプラスミドとともに上記表６に示した。ＡＹ−１０ｋ株，ＡＹ−１０１株，ＡＹ−１２ｋ株およびＡＹ−１２１株は以下の方法で作出した。ＹＰＨ４９９株にＹＥｐ２４を形質転換し、生じた形質転換体をＡＹ−１０株またはＡＹ−１２株と接合させた。生じた二倍体からプラスミドを除き、それぞれＡＹ−１７株およびＡＹ−１８株とした。ＡＹ−１７株およびＡＹ−１８株にｐＵＡＢ７のＳｐｈＩ消化物またはｐＵＡＢ９のＥｃｏ５２Ｉ消化物を形質転換し、得られた形質転換体から半数体を分離した。得られた半数体およびＡＹ−１０ｕ株をＲＰＭＩＢ培地にそれぞれ接種し、３０℃で振盪培養した。得られた培養液の蛍光強度を比較し、ＡＹ−１０ｕ株と同程度の蛍光強度を有するコロニーを選択して、ＡＹ−１０ｋ株，ＡＹ−１０１株，ＡＹ−１２ｋ株およびＡＹ−１２１株とした。
（Ｅ）遺伝子破壊株のＧＦＰ流出と流出ＧＦＰ分子量の比較
液体培地に接種後、３０℃で培養した対数増殖期の菌を集め、同じ新鮮培地に浮遊させて接種菌液を作製した。これを３０℃で培養した。培養上清の蛍光強度をＡＲＶＯ  ｓｘ（Ｗａｌｌａｃ，東京）を用いて測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝４８０ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５３０ｎｍ）。遺伝子破壊株のＧＦＰ流出効果は、非遺伝子破壊株（ＡＹ−１０ｕ株またはＡＹ−１２ｕ株）のそれとの差で表した。蛍光測定後、培養上清は限外濾過して濃縮した。これを常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したのちにＰＶＤＦ膜にブロッティングし、市販の抗ＧＦＰ抗体（ウサギＩｇＧ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＧＦＰを検出し、分子量を比較した（ウエスタンブロッティング）。
（Ｆ）薬剤によるＧＦＰ分子量の変化
酵母の細胞壁合成に対して阻害作用の確認されている薬剤として、ツニカマイシンｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ（ＴＭ；フナコシ，東京），アクレアシンＡ  ａｃｕｌｅａｃｉｎ  Ａ（ＡＣ；和光純薬，大阪）およびスタウロスポリンｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＰ；ベーリンガーマンハイム，東京）を使用した。菌株はＡＹ−１４株を用いた。
（２）結果
（Ａ）遺伝子破壊によるＧＦＰの流出促進
細胞壁糖鎖の合成や正常な細胞壁構築に阻害が見られた際にＧＦＰが細胞壁から培地中に流出する（例１）。第９図に示したように、細胞壁合成に関わる遺伝子（表７参照）を破壊した場合、ＡＹ−１２株（膜型アーミングイースト）を親株とした遺伝子破壊株では、いずれの株においても有意な流出は観察されなかったが、ＡＹ−１０株（壁型アーミングイースト）を親株とした遺伝子破壊株では、特に△ＧＡＳ１株（△はＧＡＳ１遺伝子を破壊したことを示す。以下同様である。）、△ＧＰＩ１株，△ＫＲＥ６株，および△ＰＭＴ２株から明らかなＧＦＰ流出が観察された。これらの結果は、この方法により（１，６）−β−グルカンの生合成経路（ＫＲＥ６），ＧＰＩ−アンカーの生合成（ＧＰＩ１），Ｏ型糖鎖の合成経路（ＰＭＴ２）およびヘテロ糖鎖の架橋反応（ＧＡＳ１）を阻害する薬剤をスクリーニングできることを示唆している。
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細胞壁ポリマーの合成を阻害する薬剤を用いた実験において、ＳＰ（ＰＫＣ１プロテインカイネースＣの阻害薬），ＡＣ（（１，３）−β−グルカン合成阻害薬）およびＴＭ（Ｎ型糖鎖合成阻害薬）をそれぞれ単独でＡＹ−１４株に作用させたところ、ＧＦＰの流出が認められた（ＡＣ及びＴＭによる流出効果は例１に示したとおりである）。（１，３）−β−グルカンの合成経路，Ｎ型糖鎖の合成経路、糖鎖（グルカン）合成の調節経路などに対する阻害薬などもスクリーニングできることが明らかである。
この方法により選択される薬剤の阻害経路（作用点）のうち、真菌に特異的な酵素が存在し、かつ真菌にのみ存在する経路として示唆されているのは、（１，３）−β−グルカンの合成経路、（１，６）−β−グルカンの合成経路、Ｏ型糖鎖の合成経路、およびヘテロ糖鎖同士の重合（または架橋）反応である（表７）。従って、上記のスクリーニングにより選抜される薬剤から、さらに真菌に特異的な経路または生化学反応を阻害する薬剤をその作用点ごとに選別する作業が必要である。
（Ｂ）遺伝子破壊株から流出するＧＦＰの分子量の観察
第１０図には、遺伝子破壊株から流出したＧＦＰの分子量をウエスタンブロッティングで解析した結果を示した。この結果から分かるように、遺伝子破壊株から流出したＧＦＰの分子量は様々に変化していた。
（Ｃ）細胞壁合成を阻害する薬剤による流出ＧＦＰ分子量の観察
第１１図には、ＳＰ（ＰＫＣ１プロテインカイネースＣの阻害薬），ＡＣ（（１，３）−β−グルカン合成阻害薬）およびＴＭ（Ｎ型糖鎖合成阻害薬）をそれぞれ単独でＡＹ−１４株に作用させ、流出したＧＦＰの分子量を比較した結果を示した。薬剤無作用時に比べ、ＴＭの作用によってＧＦＰは大幅に低分子化した。また、流出ＧＦＰの分子量には、ＡＣの作用によって約１０ｋＤａ以内の高分子化が認められ、ＳＰの作用による場合には約１０ｋＤａ以内の低分子化が認められた。
すでに述べたように、真菌に特異的な酵素の存在が示唆されているのは、（１，３）−β−グルカン合成経路、（１，６）−β−グルカン合成経路、Ｏ型糖鎖合成経路、およびヘテロ糖鎖同士の重合（または架橋）反応である。これらの合成経路または生化学反応を阻害する薬剤を作用させた場合のＧＦＰの分子量変化は、いずれも１０ｋＤａ以内の小さな変化であった。このような分子量変化を与える薬剤をスクリーニングすることにより、真菌に選択的な、とりわけ真菌細胞壁に選択的な活性を示す薬剤を選択できる。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤の作用点を簡便かつ適確に判定することができ、細胞壁作用性薬剤のなかから所望の作用点を有する薬剤を効率的にスクリーニングすることが可能である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例で用いた主なプラスミド（ｐＥＡＣ及びｐＵＡＣ）の構造を示す。
第２図は、ＡＹ−５株およびＡＹ−１６株を試験管内で培養し、経時的に培養液および培養上清の蛍光強度によりＧＦＰ流出を測定した結果を示す。
第３図は、既存抗真菌試薬によるＧＦＰ流出効果を示す。カッコ内は主に障害される高分子を示し、上段の図はＡＹ−２株の結果、下段の図はＡＹ−１２株の結果をそれぞれ示し、薬剤は左よりＡＣ：Ａｃｕｌｅａｃｉｎ  Ａ，ＴＭ：Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ，ＮＭ：Ｎｉｋｋｏｍｙｃｉｎ，ＣＷ：Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ，ＣＲ：Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ，ＡＭＰＨ：Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ，ＳＭ：Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ，ＦＣＺ：Ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ，ＡＢ：Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ，ＣＥ：Ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ，５−ＦＣ：５−Ｆｌｕｃｙｔｏｃｉｎｅ，ＺＥ：Ｚｅｏｃｉｎ，ＮＥ：Ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ，ＣＨ：Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ，ＡＳ：Ａｚａｓｅｒｉｎｅ，ＢＣ：Ｂｒｏｍｏｃｏｎｄｕｒｉｔｏｌ，ＣＡ：Ｃａｆｆｅｉｎを示す。
第４図は、ＡＹ−１５株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数１１１６）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号６００番までを示す。
第５図は、ＡＹ−１５株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数１１１６）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号６０１番〜１１１６番までを示す。
第６図は、ＡＹ−１４株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数１２３６）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号６６０番までを示す。
第７図は、ＡＹ−１４株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数１２３６）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号６６１番〜１２３６番までを示す。
第８図は、実施例で用いたプラスミドｐＡＵＣ１９ａ，ｐＵＡＣ２９ｂ，ｐＵＡＣ２０ａ，ｐＵＡＣ３０ｂ，ｐＵＡＣ２１ａ，及びｐＵＡＣ３１ｂの構造を示す。
第９図は、細胞壁合成に関わる遺伝子を破壊した場合にＡＹ−１２株（膜型アーミングイースト）を親株とした遺伝子破壊株又はＡＹ−１０株（壁型アーミングイースト）を親株とした遺伝子破壊株から流出するＧＦＰの量を示す。
第１０図は、遺伝子破壊株から流出したＧＦＰの分子量をウエスタンブロッティングで解析した結果を示す。
第１１図は、ＳＰ（ＰＫＣ１プロテインカイネースＣの阻害薬），ＡＣ（（１，３）−β−グルカン合成阻害薬）およびＴＭ（Ｎ型糖鎖合成阻害薬）をそれぞれ単独でＡＹ−１４株に作用させ、流出したＧＦＰの分子量を比較した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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