(57)【要約】糖供与体の二糖配糖体と、糖受容体の水酸基を有する化合物とからなる基質に、ジグリコシダーゼを作用させ、該酵素の糖転位反応を利用して合成することを特徴とするジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法に関する。この発明において、ジグリコシダーゼが、β−プリメベロシダーゼであるジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法に関する。本発明により、β−プリメベロシドからなる香気前駆体の製造は勿論のこと、食品、トイレタリー製品、あるいは医薬など様々な分野において有用性が期待される様々な配糖体を高収率で製造できる方法を提供できる。
2003072795.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖供与体の二糖配糖体と、糖受容体の水酸基を有する化合物とからなる基質に、ジグリコシダーゼを作用させ、該酵素の糖転移反応を利用して合成することを特徴とするジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項２】
ジグリコシダーゼが、β−プリメベロシダーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項３】
β−プリメベロシダーゼが、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）又はアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）が生産するものであることを特徴とする請求の範囲第２項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項４】
二糖配糖体が、β−プリメベロシドであることを特徴とする請求の範囲第１項〜請求の範囲第３項のいずれか１項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項５】
水酸基を有する化合物が、飽和脂肪族アルコールであることを特徴とする請求の範囲第１項〜請求の範囲第４項のいずれか１項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項６】
飽和脂肪族アルコールが、Ｃ２〜Ｃ１２のアルカノール、Ｃ４〜Ｃ１２のアルカンジオールの中から選ばれた一種であることを特徴とする請求の範囲第５項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項７】
水酸基を有する化合物が、不飽和脂肪族アルコールであることを特徴とする請求の範囲第１項〜請求の範囲第４項のいずれか１項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項８】
不飽和脂肪族アルコールが、１−ヘキセノール、３−ヘキセノール、リナロール、ゲラニオールの中から選ばれた一種であることを特徴とする請求の範囲第７項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項９】
水酸基を有する化合物が、芳香族アルコールであることを特徴とする請求の範囲第１項〜請求の範囲第４項のいずれか１項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【請求項１０】
芳香族アルコールが、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、サリチルアルコール、シンナミルアルコールの中から選ばれた一種であることを特徴とする請求の範囲第９項記載のジグリコシダーゼを用いた配糖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、配糖体の製造方法に関し、詳細には、ジグリコシダーゼの糖転移能を利用する配糖体の製造方法に関する。
背景技術
緑茶や紅茶などの茶葉香気は、香気成分が糖に結合した香気前駆体が植物中につくられ、該香気前駆体を酵素が分解して遊離する香気成分によることが知られている。香気前駆体の多くは、香気成分のリナロール、ゲラニオール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコールなどがβ−プリメベロース（Ｄ−キシロースがＤ−グルコピラノースのＣ−６位水酸基にβ結合でグリコシド結合した二糖）と結合したβ−プリメベロシド（６−Ｏ−β−Ｄ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）として存在し、該β−プリメベドシドは、植物中の内在性β−プリメベロシダーゼにより分解される。
従来、茶葉に含まれる茶香気成分生成酵素のβ−プリメベロシダーゼとその製造方法についての提案がある（特開平８−１４０６７５号公報参照）。そして、この公報には、該酵素が茶フレーバー前駆体からバランスのとれた茶フレーバーを効率よく生成でき、茶飲料等のフレーバーの改善に有効に活用できることが記載されている。しかし、茶フレーバー前駆体自体は茶葉に十分に含まれるものではない。また、香気成分は、一般的に揮発性で水に不溶かつ不安定であるが、香気成分を配糖化すればその溶解度を高めると共に安定性を付与することが可能となる。そのため、香気を増強させるには香気配糖体を予め茶に添加することがより望ましい。これにより、内在性のβ−プリメベロシダーゼの作用で十分量の香気成分を分解遊離させることが可能となり、ひいては香気に優れた食品、トイレタリー製品などへの応用が可能となる。
他方、従来より香気前駆体の他いくつかの配糖体が医薬など様々な分野で有用な化合物として用いられていることは周知のとおりである。
しかしながら、香気前駆体のように様々な配糖体を化学的に合成することは難しく、化学的に合成ができても高収率で量産し医薬などに利用することは更に困難であった。
また、香気前駆体を含む各種の配糖体について酵素を利用して製造する方法における収率は高々１０〜２０％程度に過ぎず、高い収率で各種配糖体を製造する方法は提供されていない。
したがって、本発明は、β−プリメベロシドからなる香気前駆体の製造は勿論のこと、食品、トイレタリー製品、あるいは医薬など様々な分野において有用性が期待される様々な配糖体を高収率で製造できる方法を提供することを目的とするものである。
発明の開示
本発明の配糖体の製造方法は、糖供与体の二糖配糖体と、糖受容体の水酸基を有する化合物とからなる基質に、ジグリコシダーゼを作用させ、該酵素の糖転移反応を触媒することを利用して合成するものである。
ジグリコシダーゼとは、本来、糖を二糖単位で切断する酵素である。
ジグリコシダーゼは、糖供与体の二糖配糖体と、糖受容体の水酸基を有する化合物とを基質として、糖転位反応を触媒して配糖体を製造できるものであれば特に限定されないが、ジグリコシダーゼの一種であるβ−プリメベロシダーゼは、二糖配糖体と水酸基を有する化合物を基質として酵素反応させれば糖転移反応を特異的に触媒し、様々な配糖体を高収率で製造できるので好ましい。また、上記の反応特異性を有するβ−プリメベロシダーゼは、微生物に由来するものを用いることができる。
上記の各反応において、β−プリメベロシダーゼは、糖受容体の水酸基を有する広範な化合物に特異性を有するので、様々な水酸基を有する化合物を用いて合成を行うことにより、様々な配糖体の製造が可能となる。
二糖配糖体を糖供与体とし、水酸基を有する化合物を糖受容体とするジグリコシダーゼの糖転移反応を利用して二糖配糖体を合成する反応を例示すれば、以下のようになる。
Ｘｙｌ−Ｇｌｃβ−ＯＸ＋Ｙ−ＯＨ→Ｘｙｌ−Ｇｌｃβ−ＯＹ＋Ｘ−ＯＨ
（Ｘｙｌ：キシロース、Ｇｌｃ：グルコース、Ｘｙｌ−Ｇｌｃβ−ＯＸ：配糖体、Ｙ−ＯＨ：水酸基を有する化合物）
本発明の配糖体の製造方法に用いるβ−プリメベロシダーゼは、糖転移反応を触媒し、上記の反応において配糖体を合成できれば起源など特に限定されないが、微生物が生産するものが好ましく、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）又はアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）が生産するものがより好ましい。また、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）又はアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）が生産するβ−プリメベロシダーゼは、油層と水層の２層でも糖転移反応を触媒するので、高収率で配糖体が製造できるばかりか、酵素反応において界面活性剤が不要であるため有機溶媒も不要となり、更には界面活性剤を除くための精製も不要となる。
本発明の配糖体の製造方法に用いる二糖配糖体は、β−プリメベロシダーゼ（ジグリコシダーゼ）が糖転移反応を触媒する際に糖供与体として働き、配糖体を合成できるものであれば特に限定されないが、β−プリメベロシドが好ましい。また、ここでいう二糖配糖体には、例えばｐ−ニトロフェニルβ−プリメベロシドのような合成基質をも包含するものである。
本発明の配糖体の製造方法に用いる水酸基を有する化合物は、β−プリメベロシダーゼ（ジグリコシダーゼ）が糖転移反応を触媒する際に糖受容体として働き、配糖体を合成できるものであれば特に限定されないが、飽和脂肪族アルコール、不飽和脂肪族アルコールあるいは芳香族アルコールが好ましい。
飽和脂肪族アルコールは、Ｃ２〜Ｃ１２のアルカノール又はＣ４〜Ｃ１２のアルカンジオールが好ましく、これらの中でも第一アルコールがより好ましい。Ｃ２〜Ｃ１２のアルカノールとしては、例えば、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、３−オクタノール、４−オクタノール、１−ノナノール、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノール、５−ノナノール、１−デカノール、２−デカノール、３−デカノール、４−デカノール、５−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、３−ウンデカノール、４−ウンデカノール、４−ウンデカノール、５−ウンデカノール、６−ウンデカノール、１−ドデカノール、２−ドデカノール、３−ドデカノール、４−ドデカノール、５−ドデカノール、６−ドデカノールなどを挙げることができる。
Ｃ４〜Ｃ１２のアルカンジオールとしては、例えば、１，２−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，３−ペンタンジオール、１，４−ペンタンジオール、２，３−ペンタンジオール、２，４−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，３−ヘキサンジオール、１，４−ヘキサンジオール、１，５−ヘプタンジオール、２，３−ヘプタンジオール、２，４−ヘプタンジオール、２，５−ヘプンタンジオール、３，４−ヘプタンジオール、１，２−オクタンジオール、１，３−オクタンジオール、１，４−オクタンジオール、１，５−オクタンジオール、１，６−オクタンジオール、２，３−オクタンジオール、２，４−オクタンジオール、２，５−オクタンジオール、２，６−オクタンジオール、３，４−オクタンジオール、３，５−オクタンジオールなどを挙げることができる。
不飽和脂肪族アルコールとしては、例えば、１−ヘキセノール、３−ヘキセノール、リナロールあるいはゲラニオールなどを挙げることができる。
芳香族アルコールとしては、例えば、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、サリチルアルコールあるいはシンナミルアルコールなどを挙げることができる。
発明を実施するための最良の形態
〔β−プリメベロシダーゼの分離・精製〕
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）０．２％、ペプトン（ＤＩＦＣＯ社製）０．５％、グルコース（片山化学社製）２．０％、リン酸２水素１カリウム（関東化学社製）０．１％、硫酸マグネシウム７水和物（片山化学社製）０．０５％からなる組成を精製水に溶解し、１Ｍ塩酸、１Ｍ水酸化ナトリウムにて、ｐＨ５．７に調整した。この培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌し、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）ＩＡＭ７１５３（入手先：東京大学分子細胞生物学研究所  東京都文京区弥生１−１−１）を１エーゼ接種後、３０℃で１日以上前培養を行った。ソーヤフラワーＡ（日清社製）２．０％、塩化ナトリウム（関東化学社製）０．３％、リン酸１水素２カリウム（関東化学社製）０．１％、硫酸マグネシウム７水和物（片山化学社製）０．０５％、可溶性デンプン（和光純薬社製）３．０％、ゲントース＃８０（日本食品加工社製）０．５％からなる組成を精製水に溶解し、１Ｍ塩酸、１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ５．６に調整した。この培地１００ｍｌを坂口フラスコに分注後、１２１℃、２０分間、１気圧で滅菌し、前培養ブロスより１ｍｌを接種後、３０℃で５日間本培養を行った。
濾紙ろ過により上記本培養液から菌体を除き、ろ液を限外ろ過膜（ＡＩＰ−１０１０、旭化成社製）で濃縮した。濃縮液を遠心分離後、上清に硫酸アンモニウム（５０％飽和）を加え、４℃で一晩撹拌した。その後、遠心分離を行い、得られた沈殿物を２０％飽和硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、遠心分離し上清を回収した。この上清を２０％飽和硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したフェニルセファロースカラム（１６×１００ｍｍ、ファルマシア社製）に供し、２０％から０％の硫酸アンモニウム直線濃度勾配により吸着した蛋白質を遊離させた。活性ピークを回収し、２５ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）で平衡化した陰イオン交換カラム（５×２００ｍｍ、ファルマシア社製）に供し、ポリバッファー（ｐＨ５．０、ファルマシア社製）で溶出し、ｐＨ８．３から５．０の直線濃度勾配により吸着させた蛋白質を遊離させ、β−プリメベロシダーゼの精製酵素標品を得た。なお、この酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単一バンドとして精製されていることが確認された。
上記で得られた酵素サンプル３０μｌと二糖配糖体としてｐ−ニトロフェニルβ−プリメベロシドを２ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解せしめたもの２００μｌと混合し、４０℃、サイクルタイム２２．５秒で９．７５分間反応させた後、炭酸ナトリウム２５０μｌを加え、４１２ｎｍの吸光度を測定した。サンプル由来のブランクの測定は、基質溶液の代わりに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて同様に測定した。この条件下で吸光度を１上昇させる酵素量を１単位とした。
〔実施例１〕（転移反応によるベンジルβ−プリメベロシドの合成）
糖供与体ｐ−ニトロフェニルβ−プリメベロシド（０．２１ｇ）と糖受容体ベンジルアルコール（２．６０ｇ）とをモル比１：５０とし、水２．３２ｍｌを加えた。この基質溶液に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１．２０ｍｌに溶解した上記で得られたペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）由来の粗酵素０．３Ｕ／ｍｌを添加した。
４０℃で４８時間振とうしながら反応後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止した。この反応液を予め２０％メタノールで平衡化させたトヨパールＨＷ−４０Ｓクロマトグラフィー（φ２．４×８１ｃｍ）に供した。
図１に示すように、中性糖に由来する４８５ｎｍと、ベンゼン環に由来する２１０ｎｍの吸収が一致するＦ−１（フラクションＮｏ．６−９、Ｆｒ．Ｎｏ．６−９）を濃縮した。
本画分は構造解析の結果、目的のベンジルβ−プリメベロシドであり、収量は０．１０ｇ、供与体あたりの収率は５１．２％であった。
なお、図２及び図３に各々１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。また、ｐ−ニトロフェニルβ−プリメベロシドは、ｐ−ニトロフェニル−グルコシド（メルク社製）とキシロオリゴ糖（和光純薬社製）を酵素キシロシダーゼ（シグマ社製）を用いて反応させ、ｐ−ニトロフェニル−グルコシドにキシロースをβ−１，６結合で１残基転移させることにより合成した。以下の各実施例においても同様である。
〔実施例２〕（転移反応によるフェネチルβ−プリメベロシドの合成）
糖供与体ｐ−ニトロフェニルβ−プリメベロシド（０．２１ｇ）と糖受容体フェネチルアルコール（２．９３ｇ）とをモル比１：５０とし、水２．１２ｍｌを加えた。この基質溶液に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１．００ｍｌに溶解した上記で得られたペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）由来の精製酵素０．１Ｕ／ｍｌを添加した。
４０℃で８時間振とうしながら反応後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止した。この反応液を予め２０％メタノールで平衡化させたトヨパールＨＷ−４０Ｓクロマトグラフィー（φ２．４×８１ｃｍ）に供した。
図４に示すように、Ｆ−１（フラクションＮｏ．６−１３、Ｆｒ．Ｎｏ．６−１３）、Ｆ−２（フラクションＮｏ．２８−４２）、Ｆ−３（フラクションＮｏ．４３−６４）が溶出した。Ｆ−１はフェネチルβ−プリメベロシド、Ｆ−２はフェネチルアルコール、更にＦ−３は中性糖であった。目的画分Ｆ−１を濃縮し、濃縮液を再び先と同じ条件で、２５％メタノールで平衡化させたトヨパールＨＷ−４０Ｓクロマトグラフィー（φ２．４×８１ｃｍ）に供した。その結果、図５に示すように、両吸収の一致するＦ−４（フラクションＮｏ．１８−２９）が溶出し、これを濃縮した。
本画分は構造解析の結果、目的のフェネチルβ−プリメベロシドであり、収量は０．１４ｇ、供与体あたりの収率は６９．６％であった。
なお、図６及び図７に各々１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。
〔実施例３〕（転移反応による３−ヘキセニルβ−プリメベロシドの合成）
糖供与体ｐ−ニトロフェニルβ−プリメベロシド（４．１６ｇ）と糖受容体３−ヘキセノール（５．１９ｇ）とをモル比１：５０とし、水４．６３ｍｌを加えた。この基質溶液に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２．４０ｍｌに溶解した上記で得られたペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）由来の粗酵素０．９Ｕ／ｍｌを添加した。
４０℃で８時間３０分振とうしながら反応後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止した。この反応液を予め２５％メタノールで平衡化させたトヨパールＨＷ−４０Ｓクロマトグラフィー（φ２．４×８１ｃｍ）に供した。
図８に示すように、Ｆ−１（フラクションＮｏ．１３−１９）、Ｆ−２（フラクションＮｏ．２１−３２）、Ｆ−３（フラクションＮｏ．３７−４５）が溶出した。Ｆ−１は３−ヘキセニルβ−プリメベロシド、Ｆ−２はｐ−ニトロフェニル−プリメベロシド、Ｆ−３は中性糖であった。目的画分Ｆ−１を濃縮したところ、本画分は構造解析の結果、目的の３−ヘキセニルβ−プリメベロシドであり、収量は０．２４ｇ、供与体あたりの収率は６２．２％であった。
なお、図９及び図１０に各々１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。
〔実施例４〕（転移反応によるゲラニルβ−プリメベロシドの合成）
糖供与体ｐ−ニトロフェニルβ−プリメベロシド（０．１６ｇ）と糖受容体ゲラニオール（１．８５ｇ）とをモル比０．０９：３とし、水１．８２ｍｌを加えた。この基質溶液に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）０．１０ｍｌに溶解した上記で得られたペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）由来の精製酵素０．３Ｕ／ｍｌを添加した。
４０℃で５時間振とう反応後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止した。この反応液を凍結させ、水層とゲラニオール層に分けた。この水層を酢酸エチルとの分配を行い、水層からゲラニルβ−プリメベロシドを取り出した。これをゲラニオール層と共に、シリカゲルカラム（φ２×５０ｃｍ）にクロロホルム／メタノール／水＝８．５／２／０．２で供した。目的の画分を濃縮し、先と同じ条件で、カラムにクロロホルム／メタノール／水＝８．５／２／０．２で供した。
本画分は構造解析の結果、目的のゲラニルβ−プリメベロシドであり、収量は１４．８ｍｇ、供与体あたりの収率は９．２％であった。
なお、図１１及び図１２に各々１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。
産業上の利用性
本発明の配糖体の製造方法は、二糖配糖体を糖供与体とし、水酸基を有する広範な化合物を糖受容体として様々な配糖体を高収率で製造できるので、茶葉などの香気増強に資することができることは勿論のこと、医薬、化粧品、化粧品基材、リポソーム基材など様々な分野での応用が期待される様々な配糖体の製造に資することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１のクロマトグラムにおける各フラクションを示す。
図２は、実施例１の１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す。図３は、実施例１の１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。図４は、実施例２のクロマトグラムにおける各フラクションを示す。図５は、実施例２のクロマトグラムにおける各フラクションを示す。図６は、実施例２の１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す。図７は、実施例２の１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。図８は、実施例３のクロマトグラムにおける各フラクションを示す。図９は、実施例３の１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す。図１０は、実施例３の１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。図１１は、実施例４の１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す。図１２は、実施例４の１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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