(57)【要約】本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉＲＮＡ発現システムは細胞内でｓｉ（短鎖干渉）ＲＮＡを発現させるシステムであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡより前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡを発現させる一つ以上のプロモータとが備えられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でｓｉ（短鎖干渉）ＲＮＡを発現させるシステムであって、
標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、
前記標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、
前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡより前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡを発現させる一つ以上のプロモータとを備えた、ｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項２】
発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至４９塩基対である、請求項１記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項３】
発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３５塩基対である、請求項１記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項４】
発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３０塩基対である、請求項１記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中にミスマッチまたはバルジを含む、請求項１記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項６】
ミスマッチの一方の塩基がグアニンであり、他方がウラシルである、請求項５記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項７】
１乃至７個のミスマッチを含む、請求項５記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項８】
１乃至７個のバルジを含む、請求項５記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項９】
１乃至７個のバルジおよびミスマッチの両方を含む、請求項９記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１０】
プロモータがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩＩＩ系プロモータである、請求項１乃至９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１１】
ｐｏｌＩＩＩプロモータがＵ６プロモータである、請求項１乃至１０のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１２】
プロモータが誘導可能なものである、請求項１乃至１１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１３】
プロモータがアンチセンスコードＤＮＡと、センスコードＤＮＡの上流にそれぞれ備えられている請求項１乃至１２のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのようにｌｏｘＰ配列が備えられた、発現制御可能な請求項１乃至１３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
（ａ）プロモータ内のＤＳＥとＰＳＥとを距離をあけて備え、その間、ＤＳＥの近傍とＰＳＥの近傍とにそれぞれｌｏｘＰ配列を備える
（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたＤＳＥとＰＳＥとの間にｌｏｘＰを備え、ＤＳＥの上流またはＰＳＥの下流にもう一つのｌｏｘＰを備える（ｃ）アンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡを挟むように二つのｌｏｘＰを備える
【請求項１５】
アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとが同一のベクター分子上にまたは別のベクターＤＮＡ分子にそれぞれ保持された、請求項１乃至１４のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１６】
プロモータが、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡがリンカーを挟んで逆向きに連結されたユニットの片側に備えられている請求項１乃至１３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのようにｌｏｘＰ配列が備えられた、発現制御可能な請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
（ａ）プロモータ内のＤＳＥとＰＳＥとを距離をあけて備え、その間、ＤＳＥの近傍とＰＳＥの近傍とにそれぞれｌｏｘＰ配列を備える
（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたＤＳＥとＰＳＥとの間にｌｏｘＰを備え、ＤＳＥの上流またはＰＳＥの下流にもう一つのｌｏｘＰを備える
（ｃ）アンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡを挟むように二つのｌｏｘＰを備える
（ｄ）リンカーにストップ配列を備え、該配列を挟むように二つのｌｏｘＰを備える
【請求項１８】
アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとがベクター分子上に保持された、請求項１６または１７に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項１９】
ベクターがプラスミドベクターである、請求項１５または１８に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項２０】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１５または１８に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項２１】
ベクターがダンベル型ＤＮＡベクターである、請求項１５または１８に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを保持した細胞。
【請求項２３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項２２記載の細胞。
【請求項２４】
請求項１乃至２１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを保持した生物個体。
【請求項２５】
請求項１乃至２１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを含む組成物。
【請求項２６】
医薬組成物である、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、
請求項１乃至２１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを細胞に導入する工程、および前記ｓｉＲＮＡ発現システムが導入された細胞を選択する工程、を含む、生産方法。
【請求項２８】
細胞内でｓｉＲＮＡライブラリーを発現させるシステムであって、
ｓｉＲＮＡの鎖長分の任意配列からなる二本鎖のｓｉＲＮＡコードＤＮＡと、
前記ｓｉＲＮＡコードＤＮＡを挟むように対向して、前記二本鎖のそれぞれの鎖から互いに相補するＲＮＡを発現させ得る二つのプロモータと、が備えられた、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項２９】
細胞内でｓｉＲＮＡライブラリーを発現させるシステムであって、
アンチセンスコードＤＮＡと該アンチセンスコードＤＮＡと相補的なセンスコードＤＮＡとをリンカーを挟んで逆向きに接続したステム型ｓｉＲＮＡ生成ユニットと、前記ステム型ｓｉＲＮＡ生成ユニットの片側に、ステム型ｓｉＲＮＡを発現させ得るプロモータと、が備えられた、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３０】
発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至４９塩基対である、請求項２８または２９記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３１】
発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３５塩基対である、請求項２８または２９記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３２】
発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３０塩基対である、請求項２８または２９記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３３】
ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中にミスマッチまたはバルジを含む、請求項２８乃至３２のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３４】
プロモータがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩＩＩ系プロモータである、請求項２８乃至３３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３５】
プロモータが誘導可能なものである、請求項２８乃至３３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３６】
発現されるｓｉＲＮＡが、ランダムなＲＮＡ鎖から構成される、請求項２８乃至３３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３７】
コーディング領域及び／またはノンコーディング領域を含む個々の遺伝子配列に対する、個々のｓｉＲＮＡ発現ベクターを個々に作成し、それらをすべて集めることによって構成される、請求項２８乃至３３に記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３８】
発現されるｓｉＲＮＡが、任意のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのｓｉＲＮＡ鎖長分の部分断片ＤＮＡによってコードされるＲＮＡ鎖から構成される、請求項２８乃至３３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
【請求項３９】
請求項２８乃至３８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの集合体であって、
集合内のそれぞれのシステムより異なるｓｉＲＮＡが発現される、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム集合体。
【請求項４０】
請求項２８乃至３８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは請求項３９記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、
前記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞を選択する工程、
選択された細胞の表現型を解析する工程、を含む機能遺伝子探索方法。
【請求項４１】
表現型解析により表現型が変化していた細胞中のｓｉＲＮＡコードＤＮＡの配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項４０記載の機能遺伝子探索方法。
【請求項４２】
請求項２８乃至３８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは請求項３９記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、
前記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞において特定の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程、を含む高活性ｓｉＲＮＡ選択方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、標的遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ発現システムおよび、これを用いたノックダウン細胞の生産方法等に関する。
従来の技術
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列からなるセンスＲＮＡとこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡとからなる二重鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用として注目を集めている。上記ＲＮＡｉは、当初、線虫において発見されたが（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１，（１９９８））、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Ｆｉｒｅ，Ａ．ＲＮＡ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５，３５８−３６３（１９９９）、Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ２００１．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，４８５−４９０（２００１）、Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，Ｃａｕｄｙ，Ａ．Ａ．＆  Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２，１１０−１１１９（２００１）、Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｏｕｎｄ  ｏｆ  ｓｉｌｅｎｃｅ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．８，７４６−７５０（２００１））。これら生物では、実際に外来よりｄｓＲＮＡを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としも利用されつつある。
一方、哺乳動物細胞では、他の生物と同様にｄｓＲＮＡを細胞外から導入することによりＲＮＡｉの誘導が試みられたが、導入されたｄｓＲＮＡにより宿主が有するウイルス感染などに対する防御機構が作動してタンパク質合成が阻害され、ＲＮＡｉを観察することができなかった。
しかし、最近Ｔｕｓｃｈｌらにより、他の生物で用いられているような長い二重鎖ＲＮＡに代えて、２もしく３ヌクレオチドの一本鎖の３’末端の突出（オーバーハング）を有する全長２１もしくは２２ヌクレオチドの短いｄｓＲＮＡを哺乳動物細胞に導入することにより、哺乳動物細胞でもＲＮＡｉを誘導し得ることが報告された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８（２００１）、Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，９７４２−９７４７（２００１））。
上記の通り、哺乳動物細胞でも短鎖の干渉用ＲＮＡ二重鎖（以下、「ｓｉＲＮＡ」と略称する）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導することに成功したが、このＲＮＡｉを利用して遺伝子発現抑制による機能解析や遺伝子治療を行うためには、細胞内へのｓｉＲＮＡの効率的な導入や、細胞内でのｓｉＲＮＡの安定的な保持が必要になる。
しかしながら、ｓｉＲＮＡを外来から導入する際の効率も細胞により様々であり、細胞によっては１％〜１０％という低い場合がある。また、哺乳動物細胞内において、外来より導入されたｓｉＲＮＡは導入数日経過後に消失してしまい、遺伝子の機能を解析するための十分な安定性は有していない。また遺伝子治療では、ｓｉＲＮＡを定期的に投与する必要が生じるため、患者の身体的な負担が大きくなることが予想される。
また、外来からｓｉＲＮＡを導入する方法では、特定の組織のみでＲＮＡｉを誘導することや、発生・分化の特定の過程などでＲＮＡｉを誘導することは極めて困難である。また、ｓｉＲＮＡは短いとは言え、ＲＮＡの合成はＤＮＡ合成に比べ格段に費用がかかり、ｓｉＲＮＡを直接用いてＲＮＡｉを誘導することは経済性に欠ける。
他方、遺伝子の一次配列がほぼ明らかにされた現在、遺伝子の機能を迅速に解明するために、系統的かつ効率的な機能遺伝子探索方法の開発が進められている。ＲＮＡｉを利用して任意の遺伝子の発現を抑制し、その細胞あるいは個体の表現型の変化から系統的に機能遺伝子の探索を行うことができれば、新規な機能遺伝子の解明をより一層加速させることができる。
発明の開示
そこで、本発明は、細胞内でより効率よく、安定かつ低廉にＲＮＡｉを産生し得る細胞内ｓｉＲＮＡ発現システム、および、このｓｉＲＮＡ発現システムを用いたノックダウン細胞等の生産方法、さらには、ｓｉＲＮＡ発現システムを用いて機能遺伝子の探索方法を提供することを目的とする。
本願発明者らは、上記課題に鑑みて、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉＲＮＡ発現システムを研究し、その開発に成功した。すなわち、本発明は、具体的には、
〔１〕  細胞内でｓｉ（短鎖干渉）ＲＮＡを発現させるシステムであって、
標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、
前記標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、
前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡより前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡを発現させる一つ以上のプロモータとを備えた、ｓｉＲＮＡ発現システム、
〔２〕  発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至４９塩基対である、〔１〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔３〕  発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３５塩基対である、〔１〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔４〕  発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３０塩基対である、〔１〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔５〕  ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中にミスマッチまたはバルジを含む、〔１〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔６〕  ミスマッチの一方の塩基がグアニンであり、他方がウラシルである、
〔５〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔７〕  １乃至７個のミスマッチを含む、〔５〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔８〕  １乃至７個のバルジを含む、〔５〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔９〕  １乃至７個のバルジおよびミスマッチの両方を含む、〔５〕記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１０〕  プロモータがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩＩＩ系プロモータである、〔１〕乃至〔９〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１１〕  ｐｏｌＩＩＩプロモータがＵ６プロモータである、〔１〕乃至〔１０〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１２〕  プロモータが誘導可能なものである、〔１〕乃至〔１１〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１３〕  プロモータがアンチセンスコードＤＮＡと、センスコードＤＮＡの上流にそれぞれ備えられている〔１〕乃至〔１２〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのようにｌｏｘＰ配列が備えられた、発現制御可能な〔１〕乃至〔１３〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
（ａ）プロモータ内のＤＳＥとＰＳＥとを距離をあけて備え、その間、ＤＳＥの近傍とＰＳＥの近傍とにそれぞれｌｏｘＰ配列を備える
（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたＤＳＥとＰＳＥとの間にｌｏｘＰを備え、ＤＳＥの上流またはＰＳＥの下流にもう一つのｌｏｘＰを備える
（ｃ）アンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡを挟むように二つのｌｏｘＰを備える
〔１５〕  アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとが同一のベクター分子上にまたは別のベクターＤＮＡ分子にそれぞれ保持された、〔１〕乃至〔１４〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１６〕  プロモータが、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡがリンカーを挟んで逆向きに連結されたユニットの片側に備えられている〔１〕乃至〔１３〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１７〕  以下の４（ａ）〜（ｄ）のいずれかのようにｌｏｘＰ配列が備えられた、発現制御可能な〔１６〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
（ａ）プロモータ内のＤＳＥとＰＳＥとを距離をあけて備え、その間、ＤＳＥの近傍とＰＳＥの近傍とにそれぞれｌｏｘＰ配列を備える
（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたＤＳＥとＰＳＥとの間にｌｏｘＰを備え、ＤＳＥの上流またはＰＳＥの下流にもう一つのｌｏｘＰを備える
（ｃ）アンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡを挟むように二つのｌｏｘＰを備える
（ｄ）リンカーにストップ配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）を備え、該配列を挟むように二つのｌｏｘＰを備える
〔１８〕  アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとがベクター分子上に保持された、〔１６〕または〔１７〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔１９〕  ベクターがプラスミドベクターである、〔１５〕または〔１８〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔２０〕  ベクターがウイルスベクターである、〔１５〕または〔１８〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔２１〕  ベクターがダンベル型ＤＮＡベクターである、〔１５〕または〔１８〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔２２〕  〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを保持した細胞、
〔２３〕  細胞が哺乳動物細胞である、〔２２〕記載の細胞、
〔２４〕  〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを保持した生物個体、
〔２５〕  〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを含む組成物、
〔２６〕  医薬組成物である、〔２５〕記載の組成物、
〔２７〕  標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、
〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システムを細胞に導入する工程、および前記ｓｉＲＮＡ発現システムが導入された細胞を選択する工程、を含む、生産方法、
〔２８〕  細胞内でｓｉＲＮＡライブラリーを発現させるシステムであって、
ｓｉＲＮＡの鎖長分の任意配列からなる二本鎖のｓｉＲＮＡコードＤＮＡと、
前記ｓｉＲＮＡコードＤＮＡを挟むように対向して、前記二本鎖のそれぞれの鎖から互いに相補するＲＮＡを発現させ得る二つのプロモータと、が備えられた、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔２９〕  細胞内でｓｉＲＮＡライブラリーを発現させるシステムであって、
アンチセンスコードＤＮＡと該アンチセンスコードＤＮＡと相補的なセンスコードＤＮＡとをリンカーを挟んで逆向きに接続したステム型ｓｉＲＮＡ生成ユニットと、
前記ステム型ｓｉＲＮＡ生成ユニットの片側に、ステム型ｓｉＲＮＡを発現させ得るプロモータと、が備えられた、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３０〕  発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至４９塩基対である、〔２８〕または〔２９〕記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３１〕  発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３５塩基対である、〔２８〕または〔２９〕記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３２〕  発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的に１５乃至３０塩基対である、〔２８〕または〔２９〕記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３３〕  ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中にミスマッチまたはバルジを含む、〔２８〕乃至〔３２〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３４〕  プロモータがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩＩＩ系プロモータである、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３５〕  プロモータが誘導可能なものである、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３６〕  発現されるｓｉＲＮＡが、ランダムなＲＮＡ鎖から構成される、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３７〕  コーディング領域及び／またはノンコーディング領域を含む個々の遺伝子配列に対する、個々のｓｉＲＮＡ発現ベクターを個々に作成し、それらをすべて集めることによって構成される、〔２８〕乃至〔３３〕に記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム。
〔３８〕  発現されるｓｉＲＮＡが、任意のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのｓｉＲＮＡ鎖長分の部分断片ＤＮＡによってコードされるＲＮＡ鎖から構成される、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、
〔３９〕  〔２８〕乃至〔３８〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの集合体であって、
集合内のそれぞれのシステムより異なるｓｉＲＮＡが発現される、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム集合体、
〔４０〕  〔２８〕乃至〔３８〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは〔３９〕記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、
前記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞を選択する工程、
選択された細胞の表現型を解析する工程、を含む機能遺伝子探索方法、
〔４１〕  表現型解析により表現型が変化していた細胞中のｓｉＲＮＡコードＤＮＡの配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、〔４０〕記載の機能遺伝子探索方法、
〔４２〕  〔２８〕乃至〔３８〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは〔３９〕記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、
前記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞において特定の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程、を含む高活性ｓｉＲＮＡ選択方法、
を、提供するものである。
本発明の第一の側面は細胞内でｓｉＲＮＡを発現させるシステムに関する。このｓｉＲＮＡ発現システムには、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡより前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡを発現させる一つ以上のプロモータとが備えられている。
「ｓｉＲＮＡ」は、哺乳動物細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、Ｔｕｓｃｈｌら（前掲）により報告された全長２１〜２３塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。あるいは、発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的な二重鎖ＲＮＡ部分の長さが、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。不対合部分はｓｉＲＮＡ形成に支障がない範囲で設けることができる。本発明における上記「バルジ」は、好ましくは１乃至２塩基の不対合塩基からなり、ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、好ましくは１乃至７個、より好ましくは１乃至５個含まれる。また、本発明における上記「ミスマッチ」は、ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、好ましくは１乃至７個、より好ましくは１乃至５個含まれる。好ましくは、一方の塩基がグアニンであり、他方がウラシルであるようなミスマッチを挙げることができる。好適には、センスＲＮＡをコードするＤＮＡにおいて、ＣからＴへの変異、またはＧからＡへの変異、もしくはこれらの変異が混在した変異であるが、特にこれらの変異に制限されない。さらに本発明においては、ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよく、ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチを、好ましくは、合わせて１乃至７個、より好ましくは合わせて１乃至５個含まれる。
また、このように不対合部分（ミスマッチまたはバルジ等）を設けることにより、後述するアンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの間での組換えを抑制でき、後述するｓｉＲＮＡ発現システムの安定化を図ることもできる。さらに、ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に不対合部分を含まないステムループ形ＤＮＡでは塩基配列の決定が困難であるが、上述のようにミスマッチまたはバルジを導入することによって、塩基配列の決定が可能となる。また、対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、ミスマッチまたはバルジを含むｓｉＲＮＡは、大腸菌の中、あるいは動物細胞内で安定となる利点を有する。
ｓｉＲＮＡの末端構造は、標的遺伝子の発現をｉＲＮＡ効果により抑制し得るものであれば、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、Ｔｕｓｃｈｌら（前掲）により報告されたような３’末端側が突出している構造だけでなく、上記ＲＮＡｉ効果を誘導し得る限り５’末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、すでに報告がある２，３塩基に限定されず、ＲＮＡｉ効果を誘導し得る塩基数とすることができる。例えば、この塩基数としては、１〜８塩基、好適には、２〜４塩基とすることができる。なお、本明細書において、粘着末端構造を有するｓｉＲＮＡの全長表示は、現実に対になっている中央の二本鎖部分の長さに、両端に突出している一本鎖同士を対にした長さを加算したものとする。例えば、中央が１９塩基対で両端に４塩基の突出がある場合には、全長は２３塩基対と表示することとする。また、この突出している配列部分は、標的遺伝子との特異性が低いため、標的遺伝子の配列と相補的（アンチセンス）配列あるいは同じ（センス）配列である必要は必ずしもない。また、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を保持し得る範囲で、例えば一端の突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子であってもよく、また人工的なＲＮＡ分子）を備えてもよい。
また、上記「ｓｉＲＮＡ」の末端構造は上述したように両側が断端構造を有している必要はなく、二重鎖ＲＮＡの一方の端部がリンカーＲＮＡにより接続されたステムループ型構造であってもよい。この二重鎖ＲＮＡ部分（ステム部分）の長さは上述したように、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。あるいは、発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的な二重鎖ＲＮＡ部分の長さが、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。また、リンカーの長さはステム部分の対合に支障のない長さであれば特に限定はない。例えば、ステムの対合の安定化およびステム部分をコードしているＤＮＡ間での組換えを抑制するために、リンカー部分にクロバーリーフｔＲＮＡ構造を用いてもよい。また、リンカーの長さがステムの対合に支障を与える長さであっても、例えば、リンカー部分にイントロンを包含させ、前駆ＲＮＡから成熟ＲＮＡにプロセッシングされる際にイントロンが切り出されて、ステム部分が対合するような構成をとってもよい。また、ステムループ型のｓｉＲＮＡの場合には、ループを備えていないＲＮＡのいずれかの末端（頭部または尾部）に低分子ＲＮＡを備えてもよい。この低分子ＲＮＡは、上述したように、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子であってもよく、また人工的なＲＮＡ分子であってもよい。
「標的遺伝子」は、その遺伝子の発現が本システムより発現されるｓｉＲＮＡより抑制される遺伝子であり、任意に選択することができる。この標的遺伝子は、例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを好適に選択することができる。標的遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列の一部、すなわちｓｉＲＮＡの一方の鎖（アンチセンスＲＮＡ鎖）と結合し得る長さである少なくとも１５塩基以上が判明しているものであれば、ゲノム配列まで判明していない遺伝子であっても選択することができる。したがって、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）などのｍＲＮＡの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子なども「標的遺伝子」として選択することができる。
「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補する配列からなる鎖であり、このアンチセンスＲＮＡが標的遺伝子のｍＲＮＡと結合してＲＮＡｉを誘導すると考えられている。「センスＲＮＡ」は、上記アンチセンスＲＮＡと相補する配列を備え、相補的なアンチセンスＲＮＡとアニーリングしてｓｉＲＮＡを生成する。これらアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとは、従来では、ＲＮＡ合成機により合成されたが、本発明では、これらＲＮＡはそれぞれ、ｓｉＲＮＡ発現システム中のアンチセンスＲＮＡをコードしたＤＮＡ（アンチセンスコードＤＮＡ）、センスＲＮＡをコードしたＤＮＡ（センスコードＤＮＡ）より細胞内で発現される。
上記アンチセンスコードＤＮＡ、センスコードＤＮＡよりアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させるために、本発明のｓｉＲＮＡ発現システムには、「プロモータ」が備えられている。このプロモータは、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを発現し得るものであれば、その種類、数、位置などは任意に定めることができる。簡易な構成としては、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡの上流にプロモータをそれぞれ備えたタンデム型発現システムとすることができる。このタンデム型発現システムでは上述した両側断端構造を有するｓｉＲＮＡを生成し得る。また、ステムループ型ｓｉＲＮＡを発現するシステム（ステム型発現システム）は、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを逆向きに配置し、さらにこれらＤＮＡをリンカーＤＮＡにより接続したユニットを構築する。そして、このユニットの片側にプロモータを連結することにより、ステム型ｓｉＲＮＡ発現システムを構築することができる。なお、リンカーＤＮＡの長さ、配列には特に限定はないが、ｓｉＲＮＡの生成を阻害するようなターミネーション配列などでなく、および上述したように成熟ＲＮＡまで生成された際にステム部分の対合に支障のないリンカーの長さ、配列であればよい。一例としては、上述したｔＲＮＡをコードしたＤＮＡなどをリンカーＤＮＡなどに用いることができる。
また、タンデム型、ステム型発現システムのいずれの場合にも、５’端にプロモータからの転写を促進し得る配列を備えてもよい。具体的にはタンデム型の場合には、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの５’端それぞれに、また、ステム型の場合には上記ユニットの５’端に、プロモータからの転写を促進し得る配列を備えることにより、ｓｉＲＮＡの生成を効率化してもよい。なお、こうした配列からの転写物は、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制に支障がない場合には、ｓｉＲＮＡに付加された状態で用いてもよいが、発現抑制に影響を与える場合には、トリミング手段（例えば、後述するリボザイムなど）を用いてトリミングを行うことが好ましい。
上述したタンデム型、ステム型のいずれのシステムの場合でもプロモータは、上記各ＤＮＡより対応するＲＮＡを産生し得るものであれば、ｐｏｌＩＩ系、ｐｏｌＩＩＩ系のいずれでもよいが、好ましくはｓｉＲＮＡのような短いＲＮＡの発現に適したｐｏｌＩＩＩ系を用いることができる。このｐｏｌＩＩＩ系のプロモータとしては、例えば、Ｕ６プロモータ、ｔＲＮＡプロモータ、レトロウイルス性ＬＴＲプロモータ、アデノウイルスＶＡ１プロモータ、５Ｓ  ｒＲＮＡプロモータ、７ＳＫ  ＲＮＡプロモータ、７ＳＬ  ＲＮＡプロモータ、Ｈ１  ＲＮＡプロモータなどを挙げることができる。なお、上記Ｕ６プロモータはＲＮＡの３‘末端に４塩基のウリジン塩基を付加するが、この３’末端の突出はアンチセンスコードＤＮＡおよびセンスコードＤＮＡの先頭配列としてＡを０、１、２、３または４塩基備えることにより、最終的に生成されるｓｉＲＮＡ３’末端の突出を自在に４、３、２、１，０塩基にすることができる。なお、他のプロモータを用いた場合にも、同様に末端の突出塩基数を自在に変更することは可能である。  また、ｐｏｌＩＩＩ系のプロモータを用いた場合には、短いＲＮＡのみを発現させ適切に転写を終結させるために、さらにセンスコードＤＮＡ、アンチセンスコードＤＮＡの３’末端にターミネーターを備えることが好ましい。ターミネーターは、プロモータの転写を終結し得る配列であれば、特に限定はなく、例えば、Ａ（アデニン）塩基が４つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列などを用いることができる。
一方、ｐｏｌＩＩ系プロモータとしては、サイトメガロウイルスプロモータ、Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ＲＳＶプロモータ、ＥＦ−１αプロモータ、β−アクチンプロモータ、γ−グロブリンプロモータ、ＳＲαプロモータなどを挙げることができる。ただし、ｐｏｌＩＩ系を用いた場合には、ｐｏｌＩＩＩ系のような短いＲＮＡではなく、ある程度の長さのＲＮＡとして合成される。そのため、ｐｏｌＩＩ系のプロモータを用いた場合には、このある程度の長さとして合成されるＲＮＡより、例えばリボザイムなどのＲＮＡをセルフプロセッシングにより切断し得る手段を用いて、アンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡを生成させることもできる。ｐｏｌＩＩ系プロモータの直後にステムループ配列を挿入し、その後ろにｐｏｌｙＡ付加シグナルをいれて、ステムループＲＮＡを生成させることもできる。このようなリボザイムを用いてアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡを生成するためのユニットとして、次のような構成を例示することができる。すなわち、図２Ａに示すように、このユニットには、上記アンチセンスコードＤＮＡあるいはセンスコードＤＮＡを有し、その５’端、３’端にリボザイムが認識するＲＮＡ配列をコードした領域（認識配列コード領域）がそれぞれ備えられ、さらに、この認識配列コード領域の外側にはそれぞれ隣接するように認識配列を切断する５’端、３’端切断用リボザイムがコードされた領域がそれぞれ備えられる。このようなアンチセンスＲＮＡ生成ユニットあるいはセンスＲＮＡ生成ユニットは、同一のｐｏｌＩＩ系プロモータの下流にタンデムに並べて作動可能に連結させてもよく（図２Ｂ）、また、別のプロモータの下流に作動可能にそれぞれ連結させてもよい（図２Ｃ）。なお、図２Ｂには両ユニットを連結させてタンデムに並べた例を示しているが、必要に応じて、アンチセンスＲＮＡ生成ユニットとセンスＲＮＡ生成ユニットとの間に任意のスペーサー配列を備えて、それぞれのユニットから発現されるＲＮＡの間隔をリボザイムが作用しやすいように調節することもできる。
上記アンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡの５’端切断用リボザイム、３’端切断用リボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイムなどを挙げることができる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ  ｎ．，Ｖｏｌ．１８６，ｐｐ．１２７１−１２７９（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０．ｐｐ．１１３０２−１１３０６（１９９３））。但し、セルフプロセッシングできるリボザイムである限り、他のどのような配列でもよい（ＢＩＯ  ｍｅｄｉｃａ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．８９−９４（１９９２））。リボザイム自身もハンマーヘッド型リボザイムに限定するものではなく、セルフプロセッシングを行うことができるものであれば、例えば、ヘアピン型リボザイム、ＨＤＶリボザイム、テトラヒメナ由来のリボザイムなどを用いてもよい（Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐｐ．８５−９０（１９９２））。また、リボザイム認識配列としては、５’端、３’端切断用リボザイムに対応した認識配列を用いる。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムはＮＵＨ（ＮはＡ，Ｇ，Ｃ，Ｕであり、ＨはＡ，Ｃ，Ｕである。いずれの組み合わせでもよいが、好適には最も効率良く切断される「ＧＵＣ」がよい）配列の３’側でそのリン酸ジエステル結合を切断する。そのため、ハンマーヘッド型リボザイムを用いる場合には、認識配列としてＮＵＨ、好ましくはＧＵＣを用いることができる。一例として、このハンマーヘッド型リボザイムと認識配列ＧＵＣとの組み合わせを、アンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡの５’端、３’端に付加し、アンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを生成させるためのｍＲＮＡ構成を図２Ｄに示す。図２Ｄでは、２塩基の突出を形成させるために、アンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡの５’末端を「Ｃ」としたが、３塩基のオーバーハングとする場合には、５’末端は「Ｃ」に限定されない。なお、図２Ｄに示す構成では、少なくともＧＵＣ配列が３’端側に付加される。
また、上記プロモータとして、誘導可能なプロモータを用いることにより、所望のタイミングでｓｉＲＮＡを発現させることも可能となる。このような誘導可能なプロモータとしては、テトラサイクリンで誘導可能なＵ６プロモータ（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，５７７−５８５（２０００）、図１２）等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモータ、あるいはＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムのようなＤＮＡ組み換えのシステムを用いて、組織特異的にｓｉＲＮＡの発現を誘導してもよい。
また、上記のように薬剤等による誘導可能なプロモータを用いなくとも、例えば、組換え酵素を用いてｓｉＲＮＡの生成を制御してもよい。組換え酵素としてＣＲＥ−ｌｏｘＰの系を用いた場合を一例として説明する（図１７）。プロモータ内のＤｉｓｔａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＤＳＥ）とＰｒｏｘｉ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＰＳＥ）とを距離をあけて備え、その間、ＤＳＥの近傍とＰＳＥの近傍とにそれぞれｌｏｘＰ配列を備える。通常は、ＤＳＥとＰＳＥとが離れているために、プロモータ活性はオフ状態でｓｉＲＮＡの発現は抑制される。しかし、この発現系にＣＲＥタンパク質を作用させることによりＤＳＥの近傍とＰＳＥの近傍とに備えられたｌｏｘＰ配列間で組換えが起こり、ｌｏｘＰ配列間のＤＮＡが切り出される。これによって、ＤＳＥとＰＳＥとが接近しプロモータ活性がオン状態となって、ｓｉＲＮＡを発現させる。この例は、ＣＲＥを作用させることにより、プロモータ活性をオンにしてｓｉＲＮＡを生成するシステムであるが、逆に、ＣＲＥを作用させることにより、ｓｉＲＮＡの発現を抑制するシステムを構築することもできる（図示せず）。例えば、プロモータ活性を保持し得るように配置されたＤＳＥとＰＳＥとの間にｌｏｘＰを備え、ＤＳＥの上流またはＰＳＥの下流にもう一つのｌｏｘＰを備える。Ｃｒｅタンパク質が供給されていない場合には、プロモータ活性がオン状態であるが、Ｃｒｅタンパク質が供給されるとｌｏｘＰ間の組換えによりＤＳＥあるいはＰＳＥが切り出されてプロモータ活性がオフ状態になりｓｉＲＮＡの生成が抑制される。また、これはプロモータ領域にｌｏｘＰを配置した例であるが、アンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡを挟むように二つのｌｏｘＰを設け、ＣＲＥタンパク質の供給によりｓｉＲＮＡの生成を抑制することもできる。
また、ステム型ｓｉＲＮＡ発現システムの場合には、リンカー部分にストップ配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）を挟むように二つのｌｏｘＰを備えることができる。ＣＲＥタンパク質が供給されていない場合には、プロモータからの転写がリンカー部分のストップ配列で終結するため、ｓｉＲＮＡの生成が抑制される。ＣＲＥタンパク質の供給によりｌｏｘＰ間の組換えが起こりストップ配列が切り出されると、アンチセンスコードＤＮＡおよびセンスコードＤＮＡが転写され、ステム型ｓｉＲＮＡが生成される（図２８参照）。
上記「プロモータ」、「アンチセンスコードＤＮＡ」および「センスコードＤＮＡ」を備えたｓｉＲＮＡ発現システムは、そのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内でアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させｓｉＲＮＡを形成させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記ｓｉＲＮＡ発現システムをベクターに保持させることが好ましい。ここで用いることができる「ベクター」は、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Ｙ．Ｎｉｉｔｓｕら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５：１３８５−１３９５（１９９８））、これらに限定されるものではない。また、ウイルスベクターではなく、ダンベル型ＤＮＡ（Ｚａｎｔａ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｃａｒｒｙ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９  Ｊａｎ  ５；９６（１）：９１−６）、ヌクレアーゼ耐性を持つような修飾ＤＮＡ、またはｎａｋｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄもまた好適に用いることができる（Ｌｉｕ  Ｆ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ  ｉｔｓ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００１  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３（６）：５６９−７６）。本発明者らは、後述の実施例で示すように、本発明のｓｉＲＮＡ発現システムをダンベル型ＤＮＡに保持させることにより、標的遺伝子の発現を効率的に抑制できることを見出した。従って、本発明の好ましい態様においては、ｓｉＲＮＡ発現システムがダンベル型ＤＮＡ分子上へ保持された発現システムを好適に用いることができる。また、ダンベル型の場合には細胞への導入をしやすくすることを目的として、抗体、ペプチド等と結合してもよい。
また、ベクターにｓｉＲＮＡ発現システムを保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させる必要はなく、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現し得るように構成することができる。例えば、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードＤＮＡおよびセンスコードＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌＩＩＩ系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセット、センスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。このうち同方向にカセットを挿入した構成例を図１Ａに示す。また、図１Ｂのような異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３’末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。なお、これら発現システムでは図１Ａに示すように、両側に断端構造を備えたｓｉＲＮＡが生成される。
また、別の構成、上述したステム型ｓｉＲＮＡを発現し得るシステムとして、アンチセンスＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを同一ＤＮＡ鎖上に逆向きに配置し、これらＤＮＡ間にリンカーを挟んで連結させたユニットを一つのプロモータの下流に接続させることもできる。その際、発現する順番は、必ずしも「アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ→リンカー→センスＲＮＡをコードするＤＮＡ」の順に限定されず、「センスＲＮＡをコードするＤＮＡ→リンカー→アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ」の順であってもよい。この構成を有する発現システムより生成されるＲＮＡはリンカー部分をループとし、その両側のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが対合（ステム構造）となったステムループ型構造を有する。そして、細胞内の酵素によりこのパリンドロームのループ部分が切断され、ｓｉＲＮＡを生成させることができる。なお、この場合のステム部分の長さ、リンカーの長さ、種類などは上述した通り構成することができる。
また、図２のようなリボザイムを用いる系では、図２Ｂに示すシステムをベクターに挿入してもよく、また、図２Ｃに示す二つのカセットを同一のベクターに同方向あるいは逆方向に挿入してもよい。また、一つベクターには、複数のｓｉＲＮＡ（異なる標的遺伝子ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、同一の標的遺伝子ｍＲＮＡの異なる部位に対するｓｉＲＮＡ、または同一標的遺伝子ｍＲＮＡの同一部位に対するｓｉＲＮＡ）を発現し得るシステムを担持させることもできる。
また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードＤＮＡおよびセンスコードＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌＩＩＩ系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセット、センスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。また、リボザイムを用いる系では、図２Ｃに示すような二つのカセットを異なるベクターに別々に保持させることにより構成することができる。
また、ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、ＧＦＰなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、ＥＧＦレセプター、Ｂ７−２、またはＣＤ４などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなども用いてもよいこのように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、ｓｉＲＮＡ発現システムが導入された細胞のみを選択することが可能となる。そのため、従来のようにｓｉＲＮＡ断片を外来から導入する際の導入効率の低さを解消し、ｓｉＲＮＡが発現してい名細胞のみを濃縮することも可能となる。また、ベクターを用いることにより、細胞内での保持時間を高め、またベクターによってはレトロウイルスベクターなどのように染色体へのインテグレーションを誘導するため、ｓｉＲＮＡ発現システムからのｓｉＲＮＡの細胞内での安定的な供給を行うことが可能となる。
本発明は、上記ｓｉＲＮＡ発現システムを保持した細胞に関する。このｓｉＲＮＡ発現システムを導入する細胞は、ｓｉＲＮＡは従来ＲＮＡｉの誘導が困難であった哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを誘導し得るものであることから、哺乳動物細胞であることが好ましい。また、植物細胞などの長鎖のｄｓＲＮＡでは、長期の安定な発現保持が難しい細胞も、本ｓｉＲＮＡ発現システムを導入される細胞として好適である。しかし本発明の上記細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞に特に限定されず、例えば、哺乳動物以外の動物細胞、酵母、菌類等であってもよい。
また、上記細胞への上記ｓｉＲＮＡ発現システムの導入方法は、細胞の種類により任意に選択することができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．４５６（１９７３））、エレクトロポーレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１３１１（１９８７））、リポフェクション法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．１７５（１９８９））、ウィルスにより感染導入方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，ｐ．３４，Ｍａｒｃｈ（１９９４））、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１９，ｐ．７９１（１９８６））、ポリエチレングリコール法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．３，ｐ．２７１７（１９８４））、パーティクルガン法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐ．８５０２（１９８８））、アグロバクテリュウムを介した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１２，ｐ．８７１１（１９８４））等により行うことができる。
上記ｓｉＲＮＡ発現システムが導入された細胞を選択する方法としては、ｓｉＲＮＡ発現システムに特異的なＤＮＡ配列をプローブあるいはプライマーとしてハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどの公知の手法により選択することもできるが、選択マーカーを備えたベクターにｓｉＲＮＡ発現システムが保持されている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる。
上記の通り、ｓｉＲＮＡ発現システムが導入された細胞は、標的遺伝子の発現が抑制されたノックダウン細胞となる。ここで「ノックダウン細胞」には、標的遺伝子の発現が完全に抑制された細胞と、標的遺伝子の発現が完全には抑制されていないが低減されている細胞とが含まれる。従来、このような細胞は、標的遺伝子をあるいはその制御領域を欠損・改変させることにより創生されていたが、本ｓｉＲＮＡ発現システムを用いることにより、染色体上の標的遺伝子を改変することなく、単にｓｉＲＮＡ発現システムを導入し、導入された細胞を選択するという簡易な方法により標的遺伝子の発現が抑制された細胞を作ることができる。このように創生されたノックダウン細胞は、標的遺伝子の機能解析のための研究材料として、また疾患原因遺伝子を標的遺伝子として発現が抑制されている細胞では疾患モデル細胞などとして利用することが可能となる。また、生殖細胞に上記ｓｉＲＮＡ発現システムを導入し、この本システムを保持した生殖細胞より生物個体を発生させることにより、標的遺伝子ノックダウン動物、疾患モデル動物などを創生することも可能となる。
上記ｓｉＲＮＡ発現システムを用いた標的遺伝子ノックダウン動物の作製方法は特に限定はなく、既知のいずれの方法を用いてもよい。一例を示せば、ｓｉＲＮＡ発現ベクターをＦ１のメス（例えば、ＣＢＡ／Ｊ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）とオス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）とを交配して得られた受精卵に注入する。受精卵から発生させたマウスの尾部から末梢血ＤＮＡを得て、発現ベクターの一部をプローブに用いてゲノミックサザンブロットを行い、染色体にｓｉＲＮＡ発現ベクターが組み込まれた陽性の創始動物を同定する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＦ１（ＣＢＡ／Ｊ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）ハイブリッドマウスのいずれかとの戻し交配を繰り返して後代マウスを得る。そして、ゲノミックサザンブロット解析およびＰＣＲ解析により、遺伝子組換え陽性の子孫を同定する。
また、上記では主に哺乳動物にｓｉＲＮＡ発現システムを用いる場合を説明したが、本発明のｓｉＲＮＡ発現システムは植物に用いてもよい。特に、従来の二重鎖ＲＮＡを直接植物細胞に導入してＲＮＡｉを誘導していたが、細胞を継代している過程でｄｓＲＮＡが欠落しＲＮＡｉの効果を維持することが困難であった。そのため、本発明のＲＮＡ発現システムを用いて、植物細胞中の染色体にインテグレーションさせることにより、ＲＮＡｉの効果を維持することが可能となる。また、こうした細胞よりトランスジェニック植物を創生することにより、ＲＮＡｉ効果を安定的に保持した植物を創生することもできる。なお、植物の創生は、当業者においては、周知の方法により実施することが可能である。
また、本発明は上記ｓｉＲＮＡ発現システムを含む組成物に関する。本ｓｉＲＮＡ発現システムは、ｓｉＲＮＡにより所望の標的遺伝子の発現を抑制し得るため、このシステムにより疾患の原因となる遺伝子発現を抑制し得ることもできる。このようなｓｉＲＮＡを発現するシステムは、適切な賦形剤を添加した医薬組成物などとして用いることもできる。
本発明の他の態様は、細胞内でｓｉＲＮＡライブラリーを発現させるシステムに関する。本発明における「ｓｉＲＮＡライブラリー」によって発現されるｓｉＲＮＡは、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシルをｓｉＲＮＡ鎖長分だけ順列に並べ得る配列からなるＲＮＡ鎖から構成される、もしくは任意のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのｓｉＲＮＡ鎖長分の（ランダムな）部分断片ＤＮＡによってコードされるＲＮＡ鎖から構成される。このような上記ｓｉＲＮＡを本明細書においては、「ランダム（な）ｓｉＲＮＡ」とも記載する。即ち、本発明において「ランダムｓｉＲＮＡ」とは、配列が任意の配列、あるいは、特定のｃＤＮＡ配列もしくは特定のｃＤＮＡライブラリーに含まれる配列およびゲノム配列から選ばれる任意の配列から構成される。上述までのｓｉＲＮＡ発現システムは特定の標的遺伝子の発現を抑制し得るものであるが、本発明では、ｓｉＲＮＡライブラリーを発現して、任意の遺伝子、例えば機能未知の遺伝子や配列未知の遺伝子を抑制し、新規な機能遺伝子を探索するために用いることができる。一例とすれば、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムは、図１Ｂに示すような構成を取ることができる。中央にランダムなアンチセンスＲＮＡをコードしたＤＮＡとこのＤＮＡと相補的なセンスＲＮＡをコードしたＤＮＡとが対合した二本鎖のｓｉＲＮＡコードＤＮＡ（以下「ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ」という）を備え、このｓｉＲＮＡコードＤＮＡを挟むように対向して、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをそれぞれ発現させ得る二つのプロモータが備えられる。
上記「ランダムなｓｉＲＮＡ」は、配列が任意の配列、あるいは特定のｃＤＮＡ配列、特定のｃＤＮＡライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列であることを除いて、上述のｓｉＲＮＡ発現システムと同様であり、哺乳動物細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡから構成される。短鎖とは、Ｔｕｓｃｈｌら（前掲）により報告された全長２１〜２３塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には、１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。また、上記ランダムｓｉＲＮＡの末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により抑制し得るものであれば、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、３’末端側が突出している構造だけでなく、上記ＲＮＡｉ効果を誘導し得る限り５’末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、２，３塩基に限定されず、ＲＮＡｉ効果を誘導し得る塩基数とすることができる。例えば、この塩基数としては、１〜８塩基、好適には、２〜４塩基とすることができる。また、上述したように一端の突出部分に低分子ＲＮＡを備えた構成としてもよい。また、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムによって発現されるｓｉＲＮＡは、上述のように、ＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中にミスマッチもしくはバルジ、あるいはその両方を含んでいてもよい。
また、ｓｉＲＮＡライブラリーを発現させるシステムは、上述したような構成（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡを挟むように対向して二つのプロモータを備えた構成）に限られず、ステム型のｓｉＲＮＡを発現させ得るような構成をとることもできる。すなわち、一方のアンチセンスＲＮＡ（例えば、ランダムな任意配列、あるいは特定のｃＤＮＡ配列、特定のｃＤＮＡライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列）をコードしたＤＮＡとそれと相補するセンスＲＮＡをコードしたＤＮＡとを逆向きにし、これらをリンカーＤＮＡにより接続したユニット（以下、「ステム型ｓｉＲＮＡライブラリー生成ユニット」という）の上流にプロモータを連結した構成をも本発明に含まれる。上記ステム型ｓｉＲＮＡライブラリー生成ユニットの作製方法の一例を図１８に示す。すなわち、ＤＮＡ合成機等により中央部にランダムな配列からなるアンチセンスＲＮＡをコードしたＤＮＡ（アンチセンスコードＤＮＡ）配列と３’末端側に任意のパリンドローム構造を形成し得る配列とを備えた一本鎖ＤＮＡを合成する。次いで、この一本鎖ＤＮＡの５’側に相補的なプライマーを準備し、このプライマーをアニーリングさせるとともに、一本鎖ＤＮＡ上の３’側にパリンドローム構造を形成させる。この状態で、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼを作用させ、アンチセンスコードＤＮＡと相補し得るセンスコードＤＮＡ鎖が合成されるとともにステム部分が延長したパリンドローム構造が形成される。このパリンドローム構造を変性処理により一本鎖とし、アンチセンスコードＤＮＡおよびセンスコードＤＮＡを挟む両側配列と相補するプライマーを用いたＰＣＲにより、ステム型ｓｉＲＮＡライブラリー生成ユニットを含む二本鎖ＤＮＡが生成される。この二本鎖ＤＮＡのステム型ｓｉＲＮＡライブラリー生成ユニットの側鎖を必要に応じて、制限酵素などによりトリミングした後、適当なプロモータの下流に接続して、ステム型ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムが生成される。
なお、上記ステム型ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムからはステムループ型のｓｉＲＮＡが生成される。このステムループ型のｓｉＲＮＡにおいても、上述の通り、生成される二重鎖ＲＮＡ部分（ステム部分）の長さは、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。また、リンカーの長さおよび配列は、ステム部分の対合に支障のない長さおよび配列であれば特に限定はなく、例えば、クロバーリーフｔＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを設けてもよい。
上記「ランダムなアンチセンスコードＤＮＡ」は、任意の配列から構成され、例えば、４塩基「Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ」を鎖長分だけ順列により並べ得る配列の集合の中から任意に選択することができる。あるいは、特定のｃＤＮＡ配列もしくは特定のｃＤＮＡライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列から構成される。また、ここで用いることができるプロモータはｐｏｌＩＩ系、ｐｏｌＩＩＩ系のいずれでもよいが、好ましくはｓｉＲＮＡのような短いＲＮＡの発現に適したｐｏｌＩＩＩ系を用いることが好ましい。また、対向するプロモータ同士は、同一の種類、異なる種類のいずれであってもよいが、発現効率の点から好ましくは異なる種類とすることがよい。なお、これらｐｏｌＩＩＩ系、ｐｏｌＩＩ系のプロモータとして用い得る例は上述と同様である。
また、ｐｏｌＩＩＩ系プロモータを用いた場合には、相補する短いＲＮＡを発現した後に適切に転写を終結させるため、図１Ｂに示すように二つのプロモータとｓｉＲＮＡコードＤＮＡとの境界にターネーターを備えることが好ましい。ターミネーターは図１Ｂに示すようなＡ（アデニン）塩基を４つ以上連続した配列を用いてもよく、また、当業者に公知のターミネーターなどを用いてもよい。
また、上記プロモータとして、誘導可能なプロモータを用いることにより、所望のタイミングでｓｉＲＮＡライブラリーを発現させることも可能となる。そのため、誘導可能なプロモータを用いることにより特定の発生・分化段階等で機能する遺伝子の解析を行うことが可能となる。また、転写活性が組織特異性のあるプロモータを利用した場合には、組織特異的にｓｉＲＮＡの発現を誘導することが可能となる。そのため、特定の組織での機能遺伝子の解析を行うことが可能となる。なお、ここで用いることができる誘導可能なプロモータ、組織特異的プロモータは上記と同様である。上記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムは、ＤＮＡ断片としてそのまま細胞内の染色体に導入してもよいが、効率的な細胞導入などを行うために、上記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムをベクターに保持させることが好ましい。ここで用いることができる「ベクター」は、上述したベクターと同様である。また、一つベクターには、複数の種類のｓｉＲＮＡを発現し得るｓｉＲＮＡライブラリー発現システムを保持させて、機能遺伝子のスクリーニングの効率化を図ることもできる。また、上記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムを保持したベクターには、必要に応じて、選択マーカーなどをさらに保持させることができる。ここで用いることができる選択マーカーは、上記と同様である。このように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムが導入された細胞のみを選択することが可能となり、機能遺伝子の探索の効率化を図ることができる。
また本発明のｓｉＲＮＡ発現システムの一つの態様としては、コーディング領域及び／またはノンコーディング領域を含む個々の遺伝子配列に対する、個々のｓｉＲＮＡ発現ベクターを個々に作成し、それらをすべて集めることによって構成されるｓｉＲＮＡライブラリー発現システムである。
また、それぞれ異なるｓｉＲＮＡを発現し得るｓｉＲＮＡライブラリー発現システムを集めて集合体を構築することもできる。例えば、この集合体より発現されるｓｉＲＮＡとして、４塩基「Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ」をｓｉＲＮＡ鎖長分だけ順列により並べ得る配列からなるＲＮＡ鎖を生成し得るようにｓｉＲＮＡコードＤＮＡ、ステム型ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムを構成してもよく、また、任意のｃＤＮＡ断片もしくは任意のｃＤＮＡライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列を用いてｓｉＲＮＡコードＤＮＡを構成してもよい。このようにｓｉＲＮＡライブラリー発現システムを複数集めた集合体を用いることにより、機能遺伝子の探索を一層効率的に行うことが可能となる。
上記ランダムｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは上記記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの集合体を用いて、機能遺伝子を探索する方法としては、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは上記記載のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの集合体を細胞に導入する工程、前記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞を選択する工程、選択された細胞の表現型を解析する工程、から構成することができる。
ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム等の細胞への導入は、上記と同様、細胞によって選択することができる。具体的には、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．４５６（１９７３））、エレクトロポーレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１３１１（１９８７））、リポフェクション法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．１７５（１９８９））、ウィルスにより感染導入方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，ｐ．３４，Ｍａｒｃｈ（１９９４））、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１９，ｐ．７９１（１９８６））、ポリエチレングリコール法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．３，ｐ．２７１７（１９８４））、パーティクルガン法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐ．８５０２（１９８８））、アグロバクテリュウムを介した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１２，ｐ．８７１１（１９８４））等により行うことができる。
ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム等が導入された細胞の選択は、選択マーカーを有するベクターを備えている場合には、その選択マーカーによる表現型により導入されている細胞を回収することにより選択することができる。また、選択マーカーを備えていない場合には、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムに共通し、これらに特有の配列をプローブまたはプライマーとして、公知のハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどにより導入細胞を検出することにより選択することができる。
上記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたはその集合体が導入された細胞が選択された後に、その細胞の表現型を解析する。この表現型の解析は、コントロールとしてｓｉＲＮＡライブラリー発現システム等が導入されていない細胞等の表現型と比較することにより行うことができる。この表現型は、細胞表面に生じるものだけではなく、例えば、細胞内の変化なども含まれる。
上記解析の結果、表現型が変化した細胞には、何らかの機能遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡライブラリー発現システムが含まれている可能性が高い。そのため、機能遺伝子をスクリーニングするために、この細胞に含まれるｓｉＲＮＡコードＤＮＡの配列に基づき、プローブ、プライマーを構築する。そして、このプローブ、プライマーを用いて、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲを行うことにより、機能遺伝子のクローニングを行うことができる。また、ｓｉＲＮＡコードＤＮＡの配列に基づいて、データベースから機能遺伝子を検索することもできる。
本発明のｓｉＲＮＡ発現システムの効果は、通常、標的となる遺伝子のターゲットサイトの場所により大きく異なる。例えば、ＨＩＶを標的とした場合、プライミングサイトを狙うことにより、ｓｉＲＮＡによる高い発現抑制効果が期待できる。好適なターゲットサイトが不明である場合にも、本発明のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムは有効である。即ち、本発明の上記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムは、ｍＲＮＡを壊すのに有効なｓｉＲＮＡの至適ターゲットサイトを検索するシステムとして非常に有用である。即ち本発明は、本発明のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは本発明のｓｉＲＮＡライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、前記ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞において特定の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程、を含む高活性ｓｉＲＮＡ選択方法を提供する。任意の遺伝子またはタンパク質の発現量の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーションまたはウエスタンブロットハイブリダイゼーション法等により、容易に実施することが可能である。
本発明のｓｉＲＮＡ発現システム、およびｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの利用は、哺乳動物に特に限定されず、その他の動物、植物、酵母、菌類等にも使用することができる。
本発明のｓｉＲＮＡ発現ライブラリーの使用法として、たとえば、ウイルス感染に関わる遺伝子を調べることが考えられる。その場合、ｓｉＲＮＡ発現ライブラリーを細胞に導入し、細胞にウイルスを感染させ、生き残る細胞を調べることにより、簡単にウイルス感染に関わる遺伝子が同定できる。このとき使用するライブラリーとしては、ヒト４万個のｃＤＮＡに対応するｓｉＲＮＡ発現ライブラリーを用いれば、すべて、関連する遺伝子を同定可能であり、また、ランダマイズ、あるいはゲノム断片のｓｉＲＮＡ発現ライブラリーを用いれば、ｃＤＮＡ以外の関連遺伝子の同定も可能となる。また、これら２つのライブラリーを混ぜて用いても良い。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］  ｓｉＲＮＡ発現ベクターによるＲＮＡｉの誘導
外来から導入したハイグロマイシン／ＥＧＦＰ融合タンパク質をコードした標的遺伝子の発現をｓｉＲＮＡ発現ベクターにより抑制し得るか否かを検討した。
ハイグロマイシン／ＥＧＦＰ発現ベクター（ｐＨｙｇＥＧＦＰ）とインターナルコントロールのＤｓＲｅｄを発現するベクター（ｐＤｓＲｅｄ２）を入手した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ヒトＵ６プロモーターを保持したプラスミドｐＵ６（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，５７７−５８５（２０００））を用いて構築した。ハイグロマイシン／ＥＧＦＰのセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの一部をコードしたＤＮＡを含む断片をＤＮＡ合成機により合成し、合成断片をｐＵ６のＵ６プロモータの直下にサブクローニングした。Ｕ６プロモータの直下にこれら増幅断片を挿入するために、サブクローニングに用いたベクターにはＵ６の下流にＢｓｐＭＩの認識部位と、さらにその下流に別のＢｓｐＭＩの認識部位を設け、Ｕ６プロモータの直下とさらに下流がＢｓｐＭＩにより切断されるように構成した。切断後は４塩基の粘着末端が形成されるため、これら粘着末端と相補する末端を備えた合成センスコードＤＮＡを挿入することによりセンスＲＮＡを発現し得るベクターを構築した。
同様にアンチセンスＲＮＡ（１９ヌクレオチド）をコードしたＤＮＡもＰＣＲにより増幅し、ｐＵ６のＵ６プロモータの直下にサブクローニングした。
このＵ６プロモータを備えたアンチセンＲＮＡ発現カセットをベクターから切り出し、センスＲＮＡ発現カセットを備えたｐＵ６ベクターに挿入して、ｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｐＵ６ｉＨｙｇ／ＥＦＧＰ）を構築した。ここで、Ｕ６プロモータを用いた場合、発現されるｍＲＮＡの３’末端には、４つのウリジン（Ｕ）が付加されることが報告されていることから、ｓｉＲＮＡ発現ベクターより発現され、細胞内で形成されるｓｉＲＮＡは、両３’末端が４ヌクレオチドの突出した構造を有する。すなわち、このｓｉＲＮＡ発現ベクターからは、中央に１９ヌクレオチドの二重鎖領域を有し、両３末端に４ヌクレオチドの突出を備えた、全長２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡが発現される（図１Ａ）。
上記ｐＨｙｇＥＧＦＰ（１μｇ）、ｐＤｓＲｅｄ２（０．５μｇ）、およびｐＵ６ｉＨｙｇ／ＥＦＧＰ（１μｇ）をヒトＨｅＬａＳ３細胞にリポフェクション法（リポフェクトアミン２０００）コトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後に３７℃で静置した後、共焦点顕微鏡で観察した。なお、コントロール実験として、ｓｉＲＮＡ発現ベクターに代えてｐＵ６を用いて同様の操作を行った。
図３において、上段はコントロールのｐＵ６を用いた結果を示し、下段はｐＵ６ｉＨｙｇ／ＥＦＧＰを導入した結果を示す。図３中央に示すように、赤色の蛍光を発するインターナルコントロールのｐＤｓＲｅｄが導入された細胞では、コントロール群とｐＵ６ｉＨｙｇ／ＥＦＧＰ導入群とで有意な差はなかった。そのため、両実験群でベクターの導入効率に差異はなく、またｓｉＲＮＡ発現ベクターによる非特異的な発現抑制がないことが示された。一方、図３左に示すように、ｐＨｙｇＥＧＦＰによる緑色の蛍光を発する細胞はコントロールに比べ、ｐＵ６ｉＨｙｇ／ＥＦＧＰ導入群で減少しており、また、緑色を発光している細胞でのその蛍光発光強度が低下していた。また、同様に、図３右に示すように、赤、緑、の蛍光を重ね合わせた場合でも、緑色を発する細胞および、赤と緑との混合による黄色を発する細胞は、コントロールに比べ、ｓｉＲＮＡ発現ベクター導入群では、減少していた。このことより、ｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入により、ＲＮＡｉが誘導され、標的遺伝子の発現抑制が示された。また、同様の解析をマウスＣＯＳ７細胞を用いて行った。その結果、ｐＤｓＲｅｄの発現には全く影響がないが、ｐＨｙｇＥＧＦＰの発現を特異的に抑制した（図示せず）。
［実施例２］  ｓｉＲＮＡ発現ベクター導入による発現抑制活性の定量
ＲＮＡｉの効果を定量化するために、他のレポーター遺伝子として、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼを用い、その発現の抑制活性を以下の通り解析した。
ＨｅＬａＳ３細胞とＣＯＳ７細胞を１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコウ変法イーグル培地で培養した。各培養細胞（３×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）を４８ウェルプレートの各ウェルに播いた。ルシフェラーゼレポーター解析を行うために、３０ｎｇのＲＳＶ−ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＲＬ−ＲＳＶ）１５、３０ｎｇのホタルルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）および様々な量のホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターを各ウェルにコトランスフェクションした。トランスフェクションはリポフェクトアミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いリポフェクション法により行った。
ＨｅＬａＳ３細胞でのルシフェラーゼ解析結果を図４に示す。図４Ａは、一定量（３００ｎｇ）のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した結果を示し、ｓｉＲＮＡを導入することにより対応する標的遺伝子の発現が抑制された。また、センスあるいはアンチセンスＲＮＡのいずれか一方のみを発現するプラスミドでもルシフェラーゼ活性を解析したが、両プラスミドともにホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現に全く影響を与えなかった。また、図４Ｂには、ｓｉＲＮＡの導入量を変えた際の結果を示す。ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ウミシイタケルシフェラーゼの活性に影響を与えることなく、ホタルルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下させた。一方、ウミシイタケルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクションした細胞では、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下させた。これらの結果よりＵ６プロモータを用いたｓｉＲＮＡ発現システムは、特異的にまた効果的に標的遺伝子の発現を抑制した。
［実施例３］  標的部位に依存した発現抑制
次に、同一転写産物中の異なる標的部位に対するｓｉＲＮＡを発現するベクターが、異なる発現抑制活性を有するか否かを検討した。なお、この解析では、ホタルルシフェラーゼ転写産物中の４つの異なる標的部位に対するｓｉＲＮＡ発現ベクターを、実施例２と同様の条件でホタルルシフェラーゼ発現ベクターおよびインターナルコントロールのウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターと共にＨｅＬａＳ３細胞にトランスフェクションを行った。なお、この４つの異なる標的部位に対するｓｉＲＮＡ発現ベクターのセンス、アンチセンスコードＤＮＡ配列を以下に示す。
2003046186.tif 000002
2003046186.tif 000003
図５Ａに示すように、標的部位の違いによりルシフェラーゼの抑制活性に差異が見られた。すなわち、部位Ｂに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターでは最も抑制活性が高く１４％まで低下させた。部位Ａ、部位Ｃおよび部位Ｄに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターではそれぞれ４４％，３８％および３６％まで低下させた。なお、部位０に対するｓｉＲＮＡ発現ベクターでは、二つのコントロール発現ベクター、Ｈｙｇ−Ｕ６ｓｉＲＮＡおよびｐＵ６と同様に抑制活性は０％であった。
上記標的部位による発現抑制活性の違いが、標的部位の違いのみに由来するのか、それとも各ｓｉＲＮＡの転写効率の違いによるかを検討した。この検討を行うために、上記センス、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。このｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
2003046186.tif 000004
2003046186.tif 000005
上記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、ＲＮＡ合成機Ｍｏｄｅｌ  ３９４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。合成ＲＮＡは、脱保護され、アクリルアミドゲルを変性させることにより精製した。ゲルからの溶出後、各ＲＮＡはＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、ＲＮＡ分解酵素を含まない水で溶出して脱塩化した。その後、真空下で乾燥させ、アニーリングバッファー（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．８，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に再懸濁した。次いでＲＮＡオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。アニーリングは１０μＭ濃度のＲＮＡを準備し、これれを９５℃、１分間インキュベーションし、その後、７０℃に冷却し、その後ゆっくり４℃まで２時間かけて冷却することにより、実施した。これらｓｉＲＮＡオリグヌクレオチドを上記と同様にＨｅＬａＳ３細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した（図５ｂ）。
各標的部位に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによるルシフェラーゼ発現の抑制プロファイルは、部位０に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが僅かな抑制活性を示した以外は、オリゴヌクレオチド導入濃度１ｎＭ、０．１ｎＭにおいて、ｓｉＲＮＡ発現ベクターによるルシフェラーゼ発現抑制プロファイルと同様のパターンを示した。この結果より、上記標的部位による発現抑制活性の差異は、各ｓｉＲＮＡの発現効率の違いによるものではなく、標的部位の違い、たとえば、標的部位の二次構造やＲＮＡ結合タンパク質の存在に依存することが示された。
［実施例４］ｓｉＲＮＡの３’末端の突出塩基の長さによる影響
Ｕ６プロモータにより生成されるｓｉＲＮＡは、３’末端に４つのウリジン塩基の突出を有する。一方、Ｅｌｂａｓｈｉｒらはショウジョウバエのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において、ｓｉＲＮＡにおける３’末端の突出は２，３塩基よりも長い場合には発現抑制効率が低下することを報告している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．＆  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ２１−ａｎｄ  ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００（２００１））。そこで、上記ｓｉＲＮＡの３’末端における４塩基の突出が、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉの誘導効率に影響を与えるかを検討した。上記ウミシイタケルシフェラーゼ転写産物上の同一標的部位に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいて、３’末端の突出のウリジン塩基の数を２塩基，３塩基あるいは４塩基としたものを上記実施例３と同様に合成・調製した。これらウミシイタケルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとインターナルコントロールのホタルルシフェラーゼ発現ベクターを様々な濃度でＨｅＬａＳ３細胞に上記リポフェクション法により導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した（図６ＡＣ）。
上記インターナルコントロールのみでは、ウミシイタケルシフェラーゼの発現は抑制されないが、上記オリゴヌクレオチドをコトランスフェクションした群では、導入濃度に依存して、ウミシイタケルシフェラーゼの発現が抑制された。また、この発現抑制活性は、オリゴヌクレオチドの３’末端における２〜４塩基の突出長さの違いにより、発現抑制活性に大きな差異は見られなかった。そのため、Ｕ６により生成される３’末端に４塩基の突出を有するｓｉＲＮＡでも、２塩基、３塩基突出のｓｉＲＮＡと同様に標的遺伝子の発現を効果的に抑制し得ることが示された。
［実施例５］  複数遺伝子の同時抑制
二つの異なる遺伝子を同時に発現させて異なる標的遺伝子の発現を同時に抑制し得るか否かを検討した。ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼに対する二つのｓｉＲＮＡ発現カセットを備えたプラスミドを構築し、コトランスフェクションした。
ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（３０ｎｇ）、ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター（３０ｎｇ）を両ルシフェラーゼ転写産物に対するｓｉＲＮＡを発現するベクター（３００ｎｇ）をインターナルコントロールであるβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（１００ｎｇ）とともにＨｅＬａＳ３細胞にコトランスフェクションした。なお、コントロールとして、ホタルルシフェラーゼ転写産物またはウミシイタケルシフェラーゼ転写産物のいずれか一方に対するｓｉＲＮＡを発現するベクターを用いて同様に行った。
図６Ｂに示す通り、両ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（Ｕ６ｉ−Ｆｉｒｅｆｌｙ／Ｒｅｎｉｌｌａ）のトランスフェクションにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現を同時に、いずれか一方のルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（Ｕ６ｉ−Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｕ６ｉ−Ｆｉｒｅｆｌｙ）をトランスフェクションした場合と同じレベルまで、それぞれのルシフェラーゼの発現活性を低下させた。
上記の通り、同一のプラスミド上に複数のｓｉＲＮＡ発現カセットを配置し、これら複数のｓｉＲＮＡを同時に発現させることにより、相互のプロモータ間で干渉を生じさせることなく、対応する標的遺伝子の発現を抑制し得ることが示された。
［実施例６］  内因性の遺伝子の発現抑制
上記実施例ではすべて外来から導入した遺伝子の発現を抑制したが、ｓｉＲＮＡ発現ベクターにより内因性遺伝子の発現を抑制し得るかを検討した。
本実施例においては、標的となる内因性遺伝子にβカテニンを選択した。このβカテニンは、裏打ちタンパク質であり、カドヘリンに起因した細胞間接着に関する因子として、また重要なガン遺伝子として知られている（Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．＆  Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ−ａ  ｌｏｏｋ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，１６０６−１６０９（２０００））。
βカテニンを発現しているＳＷ４８０細胞にβカテニンに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを備えたＥＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ／ｉｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）を導入した。コントロールとして、βカテニンに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを保持しないＥＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ）を同様の６０％コンフルエントの細胞に導入した。この細胞へのプラスミドの導入は、スライドガラスに細胞をのせ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の試薬を用いて導入した。導入４８時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで２０分間固定処理を行った。その後、０．１％トライトンＸ１００で浸透操作を行い、抗βカテニン抗体（ＵＢＩ社）およびＣｙ３ラベルした二次抗体を用いて染色した。染色後の細胞の蛍光を共焦点顕微鏡で解析した（図７）。
ｐＥＧＦＰ／ｉｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎを保持した緑色の蛍光を発する細胞では、プラスミド非導入細胞と比べて、βカテニンの発現レベルが実質的に低いことが示された。また、ｐＥＧＦＰを導入し、緑色の蛍光を発する細胞では、βカテニンの発現レベルは、プラスミド非導入細胞と比べて差異は見られなかった。
［実施例７］  タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびステム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおける発現抑制効果の比較解析
次に、センスおよびアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡがそれぞれタンデムに位置する構造を有するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｐＵ６ｔａｎｄｅｍ１９）、およびステムループ形のＲＮＡ分子を発現し得るｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｐＵ６ｓｔｅｍ１９）を用いて、それぞれのベクターにおける発現抑制効果を検討した。上記発現ベクターから発現されるｓｉＲＮＡを、それぞれタンデム型ｓｉＲＮＡ、ステム型ｓｉＲＮＡと記載する。ｐＵ６ｓｔｅｍ１９において転写されるステムの配列は５’−ＧＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＣｇｕｇｕｇｃｕｇｕｃｃＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：２１）である。発現抑制活性の定量は、上述の実施例に記載されたルシフェラーゼ解析によって行った。
解析結果を図８に示す。タンデム型ｓｉＲＮＡおよびステム型ｓｉＲＮＡのいずれにおいても、ルシフェラーゼの活性を濃度依存的に低下させた。この結果から、タンデム型ｓｉＲＮＡおよびステム型ｓｉＲＮＡの発現システムは、いずれも効果的に標的遺伝子の発現を抑制することが分った。
［実施例８］  種々のｓｉＲＮＡ発現ベクターにおける発現抑制効果
次に、各種プロモータを備えたｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いて、発現抑制効果の検討を行った。ｓｉＲＮＡ発現ベクターは以下のものを使用し、上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。
・タンデム型ｓｉＲＮＡをヒトＵ６プロモータによって発現させるベクター（ｐＵ６ｔａｎｄｅｍ１９）
・タンデム型ｓｉＲＮＡをヒト５Ｓ  ｒＲＮＡプロモータによって発現させるベクター（ｐ５Ｓｔａｎｄｅｍ１９）
・タンデム型ｓｉＲＮＡをヒトＨ１プロモータによって発現させるベクター（ｐＨ１ｔａｎｄｅｍ１９）
・ステム型ｓｉＲＮＡをヒトＨ１プロモーターによって発現させるベクター（ｐＨ１ｓｔｅｍ１９）
図９で示すように、使用した各種発現ベクターにおいて、ルシフェラーゼの抑制活性が見られた。すなわち、ｓｉＲＮＡ発現ベクターに使用可能なプロモータとしては、ある特定のプロモータに限定されず、ヒトＵ６プロモーター、ヒト５Ｓ  ｒＲＮＡプロモータ、ヒトＨ１プロモーター等の種々のプロモータを利用できることが示された。
［実施例９］  ＣＭＶプロモータまたはｔＲＮＡプロモータを備えたｓｉＲＮＡ発現ベクターにおける発現抑制効果
次にサイトメガロウイルス由来プロモータ（ＣＭＶプロモータ）もしくはｔＲＮＡプロモータとトリミングリボザイムを備えたｓｉＲＮＡ発現ベクター（それぞれｐＣＭＶ−ＴＲｚ、ｐｔＲＮＡ−ＴＲｚ）について、発現抑制効果の検討を行った。ｔＲＮＡプロモータからの転写物は、５’側にｔＲＮＡ分子が付加された構造を有する。なお、トリミングリボザイムの作用により、ｓｉＲＮＡの形成に必要ない３’側の余分なＲＮＡ分子は切除される。
図１０で示すように、ＣＭＶプロモータまたはｔＲＮＡプロモータを備えたｓｉＲＮＡ発現ベクターいずれにおいても、ルシフェラーゼ活性の低下が見られた。
よって本発明のｓｉＲＮＡ発現ベクターにおけるプロモータとして、ＣＭＶプロモータまたはｔＲＮＡプロモータを好適に使用することが可能であることが示された。また、発現ベクターの転写物の５’側にｔＲＮＡ等の分子が結合したものであっても、標的遺伝子の発現抑制効果を有することが明らかとなった。
［実施例１０］  ミスマッチまたはバルジを含むｓｉＲＮＡ二本鎖におけるＲＮＡｉの誘導
次に、ｓｉＲＮＡ二本鎖中の塩基対のミスマッチまたはバルジの存在が、ＲＮＡｉ効果に及ぼす影響について検討を行った。次のようなＲＮＡ配列を実験に使用し、上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。
2003046186.tif 000006
図１１で示すように、使用した各種発現ベクターにおいて、ルシフェラーゼの抑制活性が見られた。また、ｓｉＲＮＡ二本鎖中のミスマッチまたはバルジの有無によって、発現抑制活性には大きな差異は見られなかった。
さらに、ミスマッチまたはバルジを含む種々のｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡｉ効果を検討した。ｓｉＲＮＡの片鎖をコードするＤＮＡ配列、および該配列におけるＲＮＡｉ効果（ルシフェラーゼ活性）を図３２に示す。
以上のことから、ｓｉＲＮＡ二本鎖中にミスマッチまたはバルジを含むものであっても、標的遺伝子の発現を効果的に抑制し得ることが示された。つまり、ｓｉＲＮＡの二本鎖を構成するそれぞれの鎖は、互いに完全に相補的なものに限定されない。
［実施例１１］  テトラサイクリンで誘導可能なプロモータを有するｓｉＲＮＡ発現ベクターによるＲＮＡｉの誘導
テトラサイクリンによってＲＮＡプロモータからの転写活性を制御できるシステム（ＴｅｔＯＮ系）が知られている（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，５７７−５８５（２０００））。このシステムに用いられるヒトＵ６プロモータには、テトラサイクリン耐性トランスポゾンのテトラサイクリンオペレータ配列が挿入されている（図１２）。この配列にテトラサイクリンリプレッサータンパク質が結合すると、プロモータ活性が抑制される。このプロモータからの転写制御を受ける発現ベクターは、テトラサイクリンリプレッサータンパク質を発現する細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）中において、転写活性が抑制された状態にある。これは細胞中のテトラサイクリンリプレッサータンパク質が、ヒトＵ６プロモータへ結合し、転写活性を抑制するためと考えられる。この細胞へテトラサイクリン（またはテトラサイクリン誘導体）を添加すると、テトラサイクリンリプレッサータンパク質とテトラサイクリンが結合し、テトラサイクリンリプレッサータンパク質がＵ６プロモータから遊離するため、その結果、転写が活性化される。
本発明者らはテトラサイクリン耐性トランスポゾンのテトラサイクリンオペレータ配列が挿入されたヒトＵ６プロモータを有するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、ＴｅｔＯＮ系を利用して、ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおける遺伝子抑制効果について検討した。上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。
図１３で示すように、テトラサイクリン耐性トランスポゾンのテトラサイクリンオペレータ配列が挿入されたヒトＵ６プロモータを備えたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、テトラサイクリンの添加により、ルシフェラーゼ活性を低下させた。一方、テトラサイクリンオペレータ配列を含まないｓｉＲＮＡ発現ベクターは、テトラサイクリンの添加の有無にかかわらず、ルシフェラーゼ活性を低下させた。このことから、ｓｉＲＮＡの発現を誘導させるプロモータとして、テトラサイクリンで誘導可能な上記のＵ６プロモータが好適に利用できることが示された。
［実施例１２］  ＲＮＡセルフプロセッシングによるｓｉＲＮＡの生成
ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおいて、ｐｏｌＩＩ系のプロモータを用いた場合、ある程度の長さを有するＲＮＡが転写される。そのため、ｐｏｌＩＩ系のプロモータを用いた場合には、例えば、このＲＮＡをセルフプロセッシングにより切断し、アンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡを生成させる必要がある。そこで、アンチセンスコードＤＮＡあるいはセンスコードＤＮＡを有し、その５’端、３’端にリボザイムが認識するＲＮＡ配列をコードした領域（認識配列コード領域）がそれぞれ備えられ、さらに、この認識配列コード領域の外側にはそれぞれ隣接するように認識配列を切断する５’端、３’端切断用リボザイムがコードされた領域がそれぞれ備えられたＲＮＡ生成ユニット（図２）を用いて、実際にＲＮＡのセルフプロセッシングが起こるかどうかを検討した。図１４、１５にＲＮＡセルフプロセッシングの様式を模式的に示す。上記のユニットからの転写物をゲル電気泳動に供することにより解析を行った。
ゲル電気泳動の結果を図１６に示す。図１６の泳動バンドの横に、各バンドに対応する、想定されるＲＮＡ分子の構造を示した。ＲＮＡセルフプロセッシングによって生成されたものと考えられる、種々の長さのＲＮＡに対応したバンドが観察された。また、２１ｎｔの長さのｓｉＲＮＡのバンドが見られた。このことから、図２で示されるようなＲＮＡ生成ユニットを用いれば、ＲＮＡのセルフプロセッシングによる切断効果によって、ｓｉＲＮＡを効率的に生成させることが可能であることが示された。
［実施例１３］  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの作製
ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのランダムな部位を標的としたｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの作製を行った。作製概要を図１９〜図２３に示す。
（ａ）約２０−２５ｂｐ  ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片の調製
図１９−▲１▼で示したｓｉＲＮＡ発現ライブラリー作製の出発材料となる「脱リン酸化平滑化末端をもつランダムな約２０−２５ｂｐのＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片」を以下のように調製した。図２４にその概要を示した。
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１からＥＧＦＰをコードする部分をＰＣＲ増幅し、この増幅産物をＤＮａｓｅＩ処理することでランダムな約２０−２５ｂｐのＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片を得た。この断片を大量調製するため、得られた断片をＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑末端化し、サブクローニングした。サブクローニングに用いたベクターｐＳｗａＩはｐＵＣ１８を改変することで構築した。このベクターは、クローニング部位（ＳｗａＩ認識部位）の前後に制限酵素ＢｓｅＲＩの認識部位を設け、ＢｓｅＲＩによりインサートＤＮＡを切り出せるように構成されている。
サブクローニングされた約２０−２５ｂｐのＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片をＢｓｅＲＩで切り出した。ＢｓｅＲＩ切断後は２塩基余分な粘着末端が形成されるため、これをＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより平滑化した。ＣＩＡＰ処理により末端の脱リン酸化を行った。以上の操作によって脱リン酸化平滑化末端をもつランダムな約２０−２５ｂｐのＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片を大量に得た。
（ｂ）ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡのセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡをもつＤＮＡ断片の合成
（ａ）で調製した「脱リン酸化平滑化末端をもつ約２０−２５ｂｐのＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片」の両端に５’−リン酸化ヘアピン型ＤＮＡリンカー１をライゲーションした（図１９−▲２▼）。このヘアピン型リンカーには、ＩＩｓ型制限酵素ＢｓｐＭＩとＢｓｇＩの認識部位が設けられており、連結部位またはその近傍で切断することが可能なように構成されている。つぎに、この約２０−２５ｂｐ  ｃＤＮＡ断片とヘアピン型リンカーの連結産物の連結部位に存在するｎｉｃｋ部位にＢｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを作用させ、鎖置換反応を行った。これにより約２０−２５ｂｐのＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片とヘアピン型リンカーが１対１で連結したＤＮＡ産物を合成した（図２０−▲３▼）。つぎにこの産物の平滑末端側（ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片側）に新たな５’端リン酸化ＤＮＡリンカー２をライゲーションした（図２０−▲４▼）。このＤＮＡリンカーの片端はｐｏｌＩＩＩ型プロモータからの転写の終結となるＡＡＡＡＡ／ＴＴＴＴＴ配列が存在する。もう片端には制限酵素ＡｓｃＩの認識部位が存在する。ＡＡＡＡＡ／ＴＴＴＴＴ側のみが５’リン酸化されている。
このＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ、リンカー１、リンカー２の連結産物に再びＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを作用させ、連結部位に存在するｎｉｃｋ部位から鎖置換反応を行った（図２１−▲５▼）。これによりＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡのセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡが直列に存在するＤＮＡ断片を合成した。センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡの間にはＩＩｓ型制限酵素ＢｓｐＭＩとＢｓｇＩの認識部位が存在する。
（ｃ）ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡのセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡをもつＤＮＡ断片のクローニング
（ｂ）で合成したＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡのセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡをもつＤＮＡ断片をＡｓｃＩ切断し、粘着末端、平滑末端をもつＤＮＡ断片に調製した（図２１−▲６▼）。つぎにこの断片をクローニングするためのヒトＵ６プロモーターを保持したクローニングベクターを構築した（図２５）。プロモータの下流には、制限酵素ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＡｓｃＩの認識部位が存在し、ＢｓｐＭＩでプロモータの直下を切断、Ｋｌｅｎｏｗで切断部位を平滑化後、ＡｓｃＩで切断し、粘着末端、平滑末端をもったクローニングベクターを調製した。このベクターにＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡのセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡをもつ平滑末端、粘着末端のＤＮＡ断片を連結し、クローニングした（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ  Ｕ６型  ｓｉＲＮＡ発現プレ・ライブラリー）（図２２−▲７▼）。
またヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモータを保持したクローニングベクターも構築した（図２５）。ヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモータの下流にも同様に制限酵素ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＡｓｃＩの認識部位が存在する。クローニングベクター調製はＢｓｐＭＩの代わりにＢｓｅＲＩ切断でも可能であり、このベクターの場合はＢｓｅＲＩでプロモータの直下を切断し、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで切断部位を平滑化後、ＡｓｃＩで切断、同様にクローニングを行った（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ  ｔＲＮＡ型  ｓｉＲＮＡ発現プレ・ライブラリー）。
ｓｉＲＮＡ発現プレ・ライブラリープラスミドＤＮＡをｓｉＲＮＡのセンスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡの間のＢｓｐＭＩで切断し（図２２−▲８▼）、Ｋｌｅｎｏｗで切断断片を平滑化し自己連結させることで、プロモータ、アンチセンスＤＮＡ、センスＤＮＡ、ＴＴＴＴＴが一列につながったＡｎｔｉ−ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ発現ライブラリーを構築した（図２２−▲９▼）。シークエンス解析の結果、目的の産物ができていることを確認した。表１にＡｎｔｉ−ＥＧＦＰ  Ｕ６型ｓｉＲＮＡ発現ライブラリーのｓｉＲＮＡコードＤＮＡのシークエンス例を示す。
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表１中、アンチセンスコード、センスコードはＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのそれと逆転する場合があるが、ＲＮＡｉ誘導には問題はない。
また、プレ・ライブラリープラスミドＤＮＡを先にＢｓｇＩ切断、その後ＢｓｐＭＩ切断し（図２３−▲８▼−２）、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで切断部位を平滑化後自己連結を行うことで、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡの間にｓｉＲＮＡのＬｏｏｐ配列となるＴＴＣＧが存在するｓｉＲＮＡ発現ライブラリーを構築した。ヘアピン型ＤＮＡリンカー１の配列、制限酵素の種類、位置を変更することで、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡの間のＬｏｏｐ配列を自由に変更したり、プロモータや選択マーカー等の断片を加えたりすることが可能である。
［実施例１４］  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの評価
上記Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ  Ｕ６型  ｓｉＲＮＡ発現ライブラリー（１μｇ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（０．０１μｇ）をヒトＨｅＬａＳ３細胞にリポフェクション法（リポフェクトアミン２０００）コトランスフェクションした。３７℃で４８時間静置した後、共焦点顕微鏡で観察した。なお、コントロール実験として、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムに代えてｐＵＣ１８（１μｇ）を用いて同様の操作を行った。
結果、図２６に示すようにｐＥＧＦＰ−Ｎ１による緑色の蛍光を発する細胞は、コントロール（ｐＵＣ１８導入群）に比べ、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ  Ｕ６型  ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム導入群で減少しており、ＦＡＣＳ解析の結果細胞の蛍光発光強度の低下もみられた（図２７）。このことより、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ  Ｕ６型  ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの導入により、ＲＮＡｉが誘導され、標的遺伝子の発現抑制が示された。
Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ  Ｕ６型  ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの中にＲＮＡｉを誘導するクローンが存在し、それらにより標的遺伝子の発現抑制されたと期待される。
また、Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ  ｔＲＮＡ型ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムにおいても同様の結果が示された（図２６、図２７）。
［実施例１５］  ｓｉＲＮＡ発現アデノウイルスベクターおよびＨＩＶベクターによる発現抑制効果
評価用マーカー遺伝子としては、ルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ：プロメガ社）を用いた。ＳｉＲＮＡは、ヒトＵ６プロモータによりタンデム型で発現させた。標的とした配列はｓｉｔｅＢ：５’−ＧＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＣ−３’（配列番号：４３）とした。アデノウイルスベクターは水口らの方法（日本臨床，５８，１５４４−１５５３（２０００））に従い調製を行った。
１）ＲＮＡｉ発現カセットのシャトルプラスミドへの組み込み
クロンテック社から公開されているＰＳｈｕｔｔｌｅのシークエンスでは、ＨｉｎｃＩＩ  ｓｉｔｅが３箇所有るが、シークエンスの結果、実際には、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ内の１箇所のみしか存在しないことを確認した。
発現プラスミド（ｐＵ６ｉ−ＦＧＬＢ）をＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理で末端を平滑化した。次にＥｃｏＲＩで切断して、発現カセット（約６００ｂｐ）をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩ処理したシャトルベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）に組み込み、ｐＵ６ｉ−ＦＧＬＢ／Ｓｈｕｔｔｌｅを構築した。
２）発現カセットのＰＳｕｔｔｌｅからのＡｄベクタープラスミドへの組み込み、およびＡｄベクターの作製
ＲＧＤファイバーを持つＡｄベクタープラスミド（ｐＡｄＨＭ１５−ＲＧＤ）にＲＮＡｉ発現カセットを水口らの方法に従って、組み込み、ｐＵ６−ＦＧＬＢ／ＲＧＤを構築した。
コントロールとして、インサートを持たないｐＡｄＨＭ１５−ＲＧＤとｐＵ６−ＦＧＬＢ／ＲＧＤをＰａｃＩ消化後、ＴｒａｎｓＩＴ２９３（ＴａＫａＲａ社製）を用いてリポフェクションした。ＣＰＥの出た細胞から、水口らの方法に従って、Ａｄベクターを調製した。
塩化セシウム超遠心法で調製した、Ａｄベクターを１％ＢＳＡ入りのＰＢＳ（−）で１晩透析してＡｄベクターを精製した。精製したＡｄベクターのタイターはＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、測定した。測定した各Ａｄベクターのタイターは以下の通りだった。ＲＧＤ／Ａｄ（コントロール）：６．７６×１０＾１０  ｉｆｕ／ｍｌ
Ｕ６−ＦＧＬＢ／Ａｄ        ：５．２７×１０＾１０  ｉｆｕ／ｍｌ
３）ＨｅＬａ−Ｓ３細胞の調製
ＨｅＬａ−Ｓ３細胞を５×１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播いた。次に、各種Ａｄ  ｖｅｃｔｏｒをＭｏｉ  １，１０，２０，５０，１００となるように各ｗｅｌｌに添加した。２４時間後のリポフェクション前に培地を１．５ｍｌ加えた。
４）ルシフェラーゼプラスミドのリポフェクション
Ａｄをトランスダクションして２４時間後に、１ウェル当たり以下の組成でルシフェラーゼ発現プラスミドをリポフェクションした。
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを２５０ｕｌ入れたＴｕｂｅＡにｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌを０．０２ｕｇ、ｐＲＬ−Ｔｋを０．１ｕｇ、ｐＵＣ１９を１．０ｕｇ加えた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを２５０ｕｌ入れたＴｕｂｅＢにＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を５ｕｌ加え、室温で５分間静置した後、全量をＴｕｂｅＡに加えてよく混ぜ合わせた。室温で２０分間静置した後、全量を各ウェルに加え、３７℃で４８時間培養した。
５）ルシフェラーゼアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）
ルシフェラーゼアッセイはプロメガ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。
リポフェクション後４８時間培養したプレートの各ウェルを５００ｕｌのＰＢＳ（−）で１回洗浄した。ＰＢＳ（−）を除去した後、１×ＰＬＢを各ウェル５００ｕｌずつ加え、室温で１５分間、時々プレートを震盪しながら細胞を溶解した。細胞溶解液を１．５ｍｌ  ｔｕｂｅに移し、１４０００ｒｐｍで１分間遠心した後、上清を新しい１．５ｍｌ  ｔｕｂｅに移した（ＰＬＢ  Ｌｙｓａｔｅ）。
ルシフェラーゼ活性の測定はベルトールド社製のＡｕｔｏＬｕｍａｔＰＬＵＳ  ＬＢ９５３を用いて測定した。１０ｕｌのＰＬＢ  Ｌｙｓａｔｅを用いて、ＦｉｒｅＦｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ホタルルシフェラーゼ）とＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ウミシイタケルシフェラーゼ）を各１０秒間測光した。ホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケルシフェラーゼのＲＬＵ値の比をもとに、コントロールのＲＧＤ／Ａｄを導入した細胞の値を１００％として、それぞれのＲＮＡｉ発現Ａｄのルシフェラーゼ抑制効果を表した（図２９）。
同様にして、ＨＩＶベクターについても発現抑制効果を検討した結果、図３０で示すように、ＲＮＡｉ発現ＨＩＶのルシフェラーゼ抑制効果が見られた。
ｓｉＲＮＡ発現ＨＩＶベクターの作製はｓｉＲＮＡ発現アデノウイルスベクターとほぼ同様に、ＨＩＶシャトルベクターにＦｉｒｅＦｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに対するｓｉＲＮＡ発現カセットを挿入することにより、作製した。標的とした配列はｓｉｔｅＢ：５’−ＧＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＣ−３’（配列番号：４３）であり、プロモータはＵ６を用い、発現されるＲＮＡは５’−ＧＵＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣｇｕｇｕｇｃｕｇｕｃｃＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：２２）、５’−ＧＵＧＣＧＣＵＧｕＵＧＧＵＧｕＣＡＡＣＣＣｇｕｇｕｇｃｕｇｕｃｃＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：２３）、５’−ＧＵＧＣＧｕＵＧｕＵＧＧＵＧｕｕＡＡｕＣＣｇｕｇｕｇｃｕｇｕｃｃＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：５７）のステムループタイプである。ｓｉＲＮＡ発現シャトルプラスミドを２９３Ｔ細胞に導入し、ウイルスパーティクルを常法により回収、濃縮し、２９３細胞に５〜８ＭＯＩでトランスフェクションした。その後アデノウイルスの場合と同様にルシフェラーゼ活性によりＲＮＡｉ効果を調べた。
［実施例１６］  ｓｉＲＮＡ発現ダンベル型ベクターにおける発現抑制効果
次に、ｓｉＲＮＡ発現ダンベル型ベクターを用いて、発現抑制効果の検討を行った。ｓｉＲＮＡ発現ベクターは以下のものを使用し、上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。
・ステム型ｓｉＲＮＡをヒトＵ６プロモータによって発現させるベクター（ｐＵ６ｓｔｅｍ）
・ｓｉＲＮＡを発現させるダンベル型のベクター（Ｄｕｍｂｂｅｌｌ）
図３１で示すように、ｓｉＲＮＡ発現ダンベル型ベクターにおいて、ルシフェラーゼの抑制活性が見られた。すなわち、ｓｉＲＮＡ発現システムをダンベル型ベクターへ保持させることにより、効率的な発現抑制効果が見られることが示された。
産業上の利用の可能性
上記の通り、細胞内ｓｉＲＮＡ発現システムを用いることにより、標的遺伝子の発現を抑制することができた。また、一つのベクターに複数の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ発現システムを保持させ、細胞に導入した結果、複数の標的遺伝子の発現を抑制することもできた。このような細胞内ｓｉＲＮＡ発現システムを用いることにより、ｓｉＲＮＡが細胞内で供給されるため、安定的かつ長期にわたるｓｉＲＮＡの発現、すなわち、標的遺伝子の抑制を行うことも可能となる。また、ウイルスベクターなどを用いることにより細胞内への導入効率も向上させることができるため、より確実に哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを誘導させることが可能となる。よって、本システムは、ＲＮＡｉを利用した遺伝子治療、ノックダウン動物の創生に寄与し得る。
また、本システムを機能遺伝子の探索方法に活用し得るように、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム、および該システムの集合体が提供された。これらシステム等を用いることにより、機能遺伝子の探索を簡易かつ効率的なものとすることができる。そのため、本ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム等は、機能遺伝子の加速的な解明に寄与し得る。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｕ６プロモータを用いたｓｉＲＮＡ発現システムおよび、これをこれを用いてｓｉＲＮＡを生成するための方法を示す図である。（Ａ）二つのＵ６プロモータは、センスとアンチセンスとの短鎖ＲＮＡを生成し、この生成の際にＲＮＡの３’末端には４つのＵを付加する。そして、発現されたセンスおよびアンチセンスＲＮＡはアニールして、３’末端に４塩基の突出を備えたｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。（Ｂ）パリンドロームタイプの発現システムを示す。中央に、センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡとが二重鎖になったｓｉＲＮＡコードＤＮＡを備え、その両端にプロモータが備えられ、これらプロモータからセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡが発現される。
図２は、リボザイムを用いてｓｉＲＮＡを生成されるための構成例を示す図である。
図３は、ハイグロマイシン／ＥＧＦＰを発現している細胞にＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ発現システムを導入し、ＥＧＦＰの発現抑制効果を示す写真である。左のパネル（Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｊ）は、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ／ＥＧＦＰの発現を示す。中央のパネル（Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｋ）は、ＤｓＲｅｄの発現を示す写真である。右のパネル（Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ）は、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ／ＥＧＦＰとＤｓＲｅｄの発現を重ね合わせた結果を示す。
図４は、ルシフェラーゼ活性を有するＨｅＬａＳ３細胞にウミシイタケまたはホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを発現するシステムを導入した際の効果を示す図である。Ａに示す値は、ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを導入した群は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を基に標準化し、ウミシイタケルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを導入した群は、ホタルルシフェラーゼ活性を基に標準化した。Ｂはホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを発現するシステムを濃度依存的に導入した際の各ルシフェラーゼの抑制効果を示した。
図５は、同一標的遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）の異なる標的部位に対するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現システムのシリーズを用いて、発現抑制活性を解析した結果を示す図である。Ａは種々の標的部位に対するｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した際の発現抑制活性を解析した結果を示し、Ｂは標的部位の異なるｓｉＲＮＡを濃度を変えて外来より直接導入した際の結果を示す。
図６は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の長さによる発現抑制への影響を調べた結果（Ａ）、二つの標的遺伝子または二つの標的部位に対するｓｉＲＮＡ発現システムにより発現抑制効果（Ｂ）を示す図である。Ｂにおいて、ルシフェラーゼ活性値はインターナルコントロールとして導入したβ−ガラクトシダーゼ活性により標準化した。
図７は、内因性のβカテニン遺伝子の発現をｓｉＲＮＡ発現システムにより抑制し得るかを解析した結果を示す写真である。図において、パネルＡ、Ｂ、Ｃはβカテニンに対するｓｉＲＮＡを発現するベクター（ｐＨｙｇＥＧＦＰ／ｉβ−ｃａｔｅｎｉｎ）を導入した群であり、Ｄ，Ｅ，Ｆは空のベクターを（ｐＨｙｇＥＧＦＰ）を導入した群であり、これら群は全て抗βカテニン抗体により染色した。また、左側のパネル（Ａ，Ｄ）はＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ／ＥＧＦＰの発現を、中央のパネル（Ｂ，Ｅ）はβカテニンの発現を、そして右側のパネル（Ｃ，Ｆ）は、これらを重ねあわせたイメージを示す。
図８は、タンデム型ｓｉＲＮＡとステム型ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果を比較解析した結果を示す図である。ｐＵ６ｔａｎｄｅｍ１９はタンデム型、ｐＵ６ｓｔｅｍ１９はステム型のｓｉＲＮＡ発現ベクターである。Ｃｏｎｔ．は対照（空のベクター）を表す。
図９は、種々のｓｉＲＮＡ発現ベクターにおける発現抑制効果を解析した結果を示す図である。
図１０は、サイトメガロウイルス由来プロモータ（ＣＭＶプロモータ）、およびｔＲＮＡプロモータを備えたｓｉＲＮＡ発現ベクターにおける発現抑制効果を解析した結果を示す図である。
図１１は、ミスマッチまたはバルジを含むｓｉＲＮＡ二本鎖のＲＮＡｉ誘導効果を解析した結果を示す図である。
図１２は、Ｔｅｔ−ＯＮシステムの原理を模式的に示す図である。テトラサイクリン非存在下においては、テトラサイクリンリプレッサータンパク質がＵ６プロモータへ結合するため転写が抑制される。一方、テトラサイクリンが存在すると、テトラサイクリンがテトラサイクリンリプレッサータンパク質と結合し、Ｕ６プロモータから遊離するため、転写がオンになる。
図１３は、テトラサイクリンで誘導可能なプロモータを有するｓｉＲＮＡ発現ベクターによるＲＮＡｉの誘導効果を示す図である。Ｕ６Ｔｅｔｉはテトラサイクリンオペレータ配列をＵ６プロモータ中に含むｓｉＲＮＡ発現ベクターを、Ｕ６ｉは該配列を含まないｓｉＲＮＡ発現ベクターを表す。
図１４は、トリミングリボザイムを含むＲＮＡ転写物におけるオートマチック切断の様式を模式的に示す図である。
図１５は、トリミングリボザイムのセルフプロセッシングによるｓｉＲＮＡの生成の様式を示す図である。黒三角で示す場所で塩基の切断が起こり、ｓｉＲＮＡが生成される。
図１６は、ＲＮＡセルフプロセッシングによるｓｉＲＮＡの生成を示すゲル電気泳動の写真である。２１ｎｔのｓｉＲＮＡに相当するバンドを矢印で示す。
図１７は、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを用いてｓｉＲＮＡの発現を制御する構成の一例を示す図である。
図１８は、ステム型のｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの作製方法の一例を模式的に示す図である。
図１９は、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの作製方法の一例を示す図である。
▲１▼は、１９ｂｐ〜２９ｂｐの脱リン酸化平滑末端をもつランダムなＤＮＡ断片を示す。
▲２▼は、▲１▼の両端に５’リン酸化ヘアピン型ＤＮＡリンカー１をライゲーションさせた図である。
図２０は、図１９の続きの図である。
▲３▼は、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＮｉｃｋ部位からの鎖置換反応図である。
▲４▼は、ＤＮＡリンカー２をライゲーションした図である。
図２１は、図２０の続きの図である。
▲５▼は、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＮｉｃｋ部位からの鎖置換反応図である。
▲６▼は、▲５▼に対するＡｓｃＩによる切断図である。
図２２は、図２１の続きの図である。
▲７▼は、ｓｉＲＮＡライブラリー発現プレ・ライブラリーの図である。
▲８▼は、ｓｉＲＮＡライブラリー発現プレ・ライブラリーのＢｓｐＭＩ切断図である。センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡの間にＬｏｏｐ配列ＴＴＣＧを入れる場合は、ステップ▲８▼−２へ進む。
▲９▼は、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔによる平滑化、ＤＮＡリンカー１除去、自己連結の結果の、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システム完成図である。
図２３は、図２２の続きの図である。
▲８▼−２は、上記▲８▼において、センスコードＤＮＡとアンチセンスコードＤＮＡの間にＬｏｏｐ配列ＴＴＣＧを入れる場合の図である。ｓｉＲＮＡライブラリー発現プレ・ライブラリーをＢｓｇＩで切断する。
▲８▼−３は、ＢｓｐＭＩによる切断図である。ＢｓｇＩで切断された側はＢｓｐＭＩ切断ができない。
▲９▼−２は、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる平滑化、ＤＮＡ１リンカー除去、自己連結の結果の、ｓｉＲＮＡライブラリー発現システムの完成図である。
図２４は、約２０ｂｐ〜２５ｂｐ  ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片の調製を模式的に表わした図である。最終産物である、脱リン酸化平滑化末端をもつランダムな約２０−２５ｂｐのＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片は、図１９▲１▼における材料となる。
図２５は、クローニングベクターの調製を模式的に表わした図である。使用したプロモータは、ヒトＵ６プロモータ、あるいは、ヒトｔＲＮＡプロモータである。Ｕ６プロモータ保持クローニングベクターは、ＢｓｐＭＩ、Ｋｌｅｎｏｗで調製、ｔＲＮＡプロモータ保持クローニングベクターは、ＢｓｅＲＩ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで調製した。
図２６は、ＥＧＦＰ蛍光強度を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
図２７は、ｐＵＣ１８，Ｕ６  ＧＦＰ２５  ｓｉＲＮＡ  ｌｉｂ−ｌｏｏｐ−、Ｕ６  ＧＦＰ２５  ｓｉＲＮＡ  ｌｉｂ  ＴＴＣＧ、ｔＲＮＡ  ＧＦＰ２５  ｓｉＲＮＡ  ｌｉｂ  ｌｏｏｐ−、ｔＲＮＡ  ＧＦＰ２５  ｓｉＲＮＡ  ｌｉｂ  ＴＴＣＧの各サンプルにおけるＥＧＦＰの蛍光強度を、トランスフェクションの２４時間および４８時間後に計測し相対的に比較した図である。
図２８は、リンカー部分にストップ配列を挟むように二つのｌｏｘＰを備えた、ステム型ｓｉＲＮＡ発現システムを模式的に示す図である。
図２９は、ｓｉＲＮＡ発現アデノウイルスベクターによる発現抑制効果を示す図である。
図３０は、ｓｉＲＮＡ発現ＨＩＶベクターによる発現抑制効果を示す図である。
図３１は、ｓｉＲＮＡ発現ダンベル型ベクターによる発現抑制効果を示す図である。
図３２は、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中にミスマッチまたはバルジを含むｓｉＲＮＡ発現システムにおける発現抑制効果を示す図である。各配列先頭の括弧内は、配列番号を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2003046186.tif 000066
【図２６】
2003046186.tif 000067
【図２７】
2003046186.tif 000068
【図２８】
2003046186.tif 000069
【図２９】
2003046186.tif 000070
【図３０】
2003046186.tif 000071
【図３１】
2003046186.tif 000072
【図３２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月12日(2004.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  哺乳動物細胞内で標的遺伝子の発現を抑制し得るsi(短鎖干渉)RNAを発現させるシステムであって、
標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、
前記標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、
前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させる一つ以上のプロモータとを備え、
siRNAが転写され最終的に１9乃至４９塩基対である、siRNA発現システム。
【請求項２】  siRNAが転写され最終的に１９乃至３５塩基対である、請求項１記載のsiRNA発現システム。
【請求項３】  siRNAが転写され最終的に１９乃至３０塩基対である、請求項１記載のsiRNA発現システム。
【請求項４】  siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチまたはバルジを含む、請求項１記載のsiRNA発現システム。
【請求項５】  ミスマッチの一方の塩基がグアニンであり、他方がウラシルである、請求項４記載のsiRNA発現システム。
【請求項６】  １乃至７個のミスマッチを含む、請求項４記載のsiRNA発現システム。
【請求項７】  １乃至７個のバルジを含む、請求項４記載のsiRNA発現システム。
【請求項８】  １乃至７個のバルジおよびミスマッチの両方を含む、請求項４記載のsiRNA発現システム。
【請求項９】  プロモータがpolII系またはpolIII系プロモータである、請求項１乃至８のいずれかに記載のsiRNA発現システム。
【請求項１０】  polIIIプロモータがU6プロモータである、請求項1乃至９のいずれかに記載のsiRNA発現システム。
【請求項１１】  プロモータが誘導可能なものである、請求項１乃至１０のいずれかに記載のsiRNA発現システム。
【請求項１２】  プロモータがアンチセンスコードDNAと、センスコードDNAの上流にそれぞれ備えられている請求項１乃至１１のいずれかに記載のsiRNA発現システム。
【請求項１３】  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのようにloxP配列が備えられた、発現制御可能な請求項１乃至１２のいずれかに記載のsiRNA発現システム。
（ａ）プロモータ内のDSEとPSEとを距離をあけて備え、その間、DSEの近傍とPSEの近傍とにそれぞれloxP配列を備える
（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたDSEとPSEとの間にloxPを備え、DSEの上流またはPSEの下流にもう一つのloxPを備える
（ｃ）アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAを挟むように二つのloxPを備える
【請求項１４】  アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとが同一のベクター分子上にまたは別のベクターDNA分子にそれぞれ保持された、請求項１乃至１３のいずれかに記載のsiRNA発現システム。
【請求項１５】  プロモータが、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAがリンカーを挟んで逆向きに連結されたユニットの片側に備えられている請求項１乃至１３のいずれかに記載のsiRNA発現システム。
【請求項１６】  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのようにloxP配列が備えられた、発現制御可能な請求項１５に記載のsiRNA発現システム。
（ａ）プロモータ内のDSEとPSEとを距離をあけて備え、その間、DSEの近傍とPSEの近傍とにそれぞれloxP配列を備える
（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたDSEとPSEとの間にloxPを備え、DSEの上流またはPSEの下流にもう一つのloxPを備える
（ｃ）アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAを挟むように二つのloxPを備える
（ｄ）リンカーにストップ配列を備え、該配列を挟むように二つのloxPを備える
【請求項１７】  アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとがベクター分子上に保持された、請求項１５または１６に記載のsiRNA発現システム。
【請求項１８】  ベクターがプラスミドベクターである、請求項１４または１７に記載のsiRNA発現システム。
【請求項１９】  ベクターがウイルスベクターである、請求項１４または１７に記載のsiRNA発現システム。
【請求項２０】  ベクターがダンベル型DNAベクターである、請求項１４または１７に記載のsiRNA発現システム。
【請求項２１】  請求項１乃至２０のいずれかに記載のsiRNA発現システムを保持した細胞。
【請求項２２】  細胞が哺乳動物細胞である、請求項２１記載の細胞。
【請求項２３】  請求項１乃至２０のいずれかに記載のsiRNA発現システムを保持した、ヒトを除く生物個体。
【請求項２４】  請求項１乃至２０のいずれかに記載のsiRNA発現システムを含む、標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２５】  標的遺伝子の発現が抑制された哺乳動物細胞を生産する方法であって、
請求項１乃至２０のいずれかに記載のsiRNA発現システムを哺乳動物細胞に導入する工程、および前記siRNA発現システムが導入された哺乳動物細胞を選択する工程、を含む、生産方法。
【請求項２６】  哺乳動物細胞内でsiRNAライブラリーを発現させるシステムであって、
siRNAの鎖長分の任意配列からなる二本鎖のsiRNAコードDNAと、
前記siRNAコードDNAを挟むように対向して、前記二本鎖のそれぞれの鎖から互いに相補するRNAを発現させ得る二つのプロモータと、が備えられ、
siRNAの鎖長が１９乃至４９塩基対である、siRNAライブラリー発現システム。
【請求項２７】  哺乳動物細胞内でsiRNAライブラリーを発現させるシステムであって、
アンチセンスコードDNAと該アンチセンスコードDNAと相補的なセンスコードDNAとをリンカーを挟んで逆向きに接続したステム型siRNA生成ユニットと、
前記ステム型siRNA生成ユニットの片側に、ステム型siRNAを発現させ得るプロモータと、が備えられ、
siRNAの鎖長が１９乃至４９塩基対である、siRNAライブラリー発現システム。
【請求項２８】  siRNAが転写され最終的に１９乃至３５塩基対である、請求項２６または２７記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項２９】  siRNAが転写され最終的に１９乃至３０塩基対である、請求項２６または２７記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項３０】  siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチまたはバルジを含む、請求項２６乃至２９のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項３１】  プロモータがpolII系またはpolIII系プロモータである、請求項２６乃至３０のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項３２】  プロモータが誘導可能なものである、請求項２６乃至３１のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項３３】  siRNAが、ランダムなRNA鎖から構成される、請求項２６乃至３１のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項３４】  コーディング領域及び／またはノンコーディング領域を含む個々の遺伝子配列に対する、個々のsiRNA発現ベクターを個々に作成し、それらをすべて集めることによって構成される、請求項２６乃至３０に記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項３５】発現されるsiRNAが、任意のcDNAまたはゲノムDNAのsiRNA鎖長分の部分断片DNAによってコードされるRNA鎖から構成される、請求項２６乃至３０のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。
【請求項３６】  請求項２６乃至３５のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムの集合体であって、
集合内のそれぞれのシステムより異なるsiRNAが発現される、siRNAライブラリー発現システム集合体。
【請求項３７】  請求項２６乃至３５のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムまたは請求項３６記載のsiRNAライブラリー発現システム集合体を哺乳動物細胞に導入する工程、
前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された哺乳動物細胞を選択する工程、
選択された哺乳動物細胞の表現型を解析する工程、を含む機能遺伝子探索方法。
【請求項３８】  表現型解析により表現型が変化していた細胞中のsiRNAコードDNAの配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項３７記載の機能遺伝子探索方法。
【請求項３９】  請求項２６乃至３５のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムまたは請求項３６記載のsiRNAライブラリー発現システム集合体を哺乳動物細胞に導入する工程、
前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された哺乳動物細胞において特定の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程、を含む高活性siRNA選択方法。
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月1日(2004.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】【請求項１】  哺乳動物細胞内で標的遺伝子の発現を抑制し得るsi(短鎖干渉)RNAを発現させるシステムであって、  標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、  前記標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、  前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させる一つ以上のプロモータとを備え、 前記プロモータがpolII系またはpolIII系プロモータであり、該プロモータから発現されたアンチセンスRNAとセンスRNAとがアニーリングして生成されるsiRNAが最終的に１9乃至４９塩基対である、siRNA発現システム。【請求項２】  siRNAが最終的に１９乃至３５塩基対である、請求項１記載のsiRNA発現システム。【請求項３】  siRNAが最終的に１９乃至３０塩基対である、請求項１記載のsiRNA発現システム。【請求項４】  siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチまたはバルジを含む、請求項１記載のsiRNA発現システム。【請求項５】  ミスマッチの一方の塩基がグアニンであり、他方がウラシルである、請求項４記載のsiRNA発現システム。【請求項６】  １乃至７個のミスマッチを含む、請求項４記載のsiRNA発現システム。【請求項７】  １乃至７個のバルジを含む、請求項４記載のsiRNA発現システム。【請求項８】  １乃至７個のバルジおよびミスマッチの両方を含む、請求項４記載のsiRNA発現システム。【請求項９】  polIIIプロモータがU6プロモータである、請求項1乃至８のいずれかに記載のsiRNA発現システム。【請求項１０】  プロモータが誘導可能なものである、請求項１乃至９のいずれかに記載のsiRNA発現システム。【請求項１１】  プロモータがアンチセンスコードDNAと、センスコードDNAの上流にそれぞれ備えられている請求項１乃至１０のいずれかに記載のsiRNA発現システム。【請求項１２】  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのようにloxP配列が備えられた、発現制御可能な請求項１乃至１１のいずれかに記載のsiRNA発現システム。（ａ）プロモータ内のDSEとPSEとを距離をあけて備え、その間、DSEの近傍とPSEの近傍とにそれぞれloxP配列を備える（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたDSEとPSEとの間にloxPを備え、DSEの上流またはPSEの下流にもう一つのloxPを備える（ｃ）アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAを挟むように二つのloxPを備える【請求項１３】  アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとが同一のベクター分子上にまたは別のベクターDNA分子にそれぞれ保持された、請求項１乃至１２のいずれかに記載のsiRNA発現システム。【請求項１４】  プロモータが、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAがリンカーを挟んで逆向きに連結されたユニットの片側に備えられている請求項１乃至１２のいずれかに記載のsiRNA発現システム。【請求項１５】  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのようにloxP配列が備えられた、発現制御可能な請求項１４に記載のsiRNA発現システム。（ａ）プロモータ内のDSEとPSEとを距離をあけて備え、その間、DSEの近傍とPSEの近傍とにそれぞれloxP配列を備える（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたDSEとPSEとの間にloxPを備え、DSEの上流またはPSEの下流にもう一つのloxPを備える（ｃ）アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAを挟むように二つのloxPを備える（ｄ）リンカーにストップ配列を備え、該配列を挟むように二つのloxPを備える【請求項１６】  アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとがベクター分子上に保持された、請求項１４または１５に記載のsiRNA発現システム。【請求項１７】  ベクターがプラスミドベクターである、請求項１３または１６に記載のsiRNA発現システム。【請求項１８】  ベクターがウイルスベクターである、請求項１３または１６に記載のsiRNA発現システム。【請求項１９】  ベクターがダンベル型DNAベクターである、請求項１３または１６に記載のsiRNA発現システム。【請求項２０】  請求項１乃至１９のいずれかに記載のsiRNA発現システムを保持した細胞。【請求項２１】  細胞が哺乳動物細胞である、請求項２０記載の細胞。【請求項２２】  請求項１乃至１９のいずれかに記載のsiRNA発現システムを保持した、ヒトを除く生物個体。【請求項２３】  請求項１乃至１９のいずれかに記載のsiRNA発現システムを含む、標的遺伝子発現抑制用組成物。【請求項２４】  標的遺伝子の発現が抑制された哺乳動物細胞を生産する方法であって、  請求項１乃至１９のいずれかに記載のsiRNA発現システムを哺乳動物細胞に導入する工程、および前記siRNA発現システムが導入された哺乳動物細胞を選択する工程、を含む、生産方法。【請求項２５】  哺乳動物細胞内でsiRNAライブラリーを発現させるシステムであって、  siRNAの鎖長分の任意配列からなる二本鎖のsiRNAコードDNAと、  前記siRNAコードDNAを挟むように対向して、前記二本鎖のそれぞれの鎖から互いに相補するRNAを発現させ得る二つのプロモータと、が備えられ、 前記プロモータがpolII系またはpolIII系プロモータであり、各プロモータから発現されたRNAがアニーリングして生成されるsiRNAの鎖長が１９乃至４９塩基対である、siRNAライブラリー発現システム。【請求項２６】  哺乳動物細胞内でsiRNAライブラリーを発現させるシステムであって、  アンチセンスコードDNAと該アンチセンスコードDNAと相補的なセンスコードDNAとをリンカーを挟んで逆向きに接続したステム型siRNA生成ユニットと、前記ステム型siRNA生成ユニットの片側に、ステム型siRNAを発現させ得るプロモータと、が備えられ、 前記プロモータがpolII系またはpolIII系プロモータであり、前記プロモータから発現されたステム型siRNAの二重鎖RNA領域の長さが１９乃至４９塩基対である、siRNAライブラリー発現システム。【請求項２７】  siRNAまたは二重鎖RNA領域の長さが１９乃至３５塩基対である、請求項２５または２６記載のsiRNAライブラリー発現システム。【請求項２８】  siRNAまたは二重鎖RNA領域の長さが１９乃至３０塩基対である、請求項２５または２６記載のsiRNAライブラリー発現システム。【請求項２９】  siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチまたはバルジを含む、請求項２５乃至２８のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。【請求項３０】  プロモータが誘導可能なものである、請求項２５乃至２９のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。【請求項３１】  siRNAが、ランダムなRNA鎖から構成される、請求項２５乃至２９のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。【請求項３２】  コーディング領域及び／またはノンコーディング領域を含む���々の遺伝子配列に対する、個々のsiRNA発現ベクターを個々に作成し、それらをすべて集めることによって構成される、請求項２５乃至２９に記載のsiRNAライブラリー発現システム。【請求項３３】  発現されるsiRNAが、任意のcDNAまたはゲノムDNAのsiRNA鎖長分の部分断片DNAによってコードされるRNA鎖から構成される、請求項２５乃至２９のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム。【請求項３４】  請求項２５乃至３３のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムの集合体であって、  集合内のそれぞれのシステムより異なるsiRNAが発現される、siRNAライブラリー発現システム集合体。【請求項３５】  請求項２５乃至３３のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムまたは請求項３４記載のsiRNAライブラリー発現システム集合体を哺乳動物細胞に導入する工程、  前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された哺乳動物細胞を選択する工程、  選択された哺乳動物細胞の表現型を解析する工程、を含む機能遺伝子探索方法。【請求項３６】  表現型解析により表現型が変化していた細胞中のsiRNAコードDNAの配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項３５記載の機能遺伝子探索方法。【請求項３７】  請求項２５乃至３３のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムまたは請求項３４記載のsiRNAライブラリー発現システム集合体を哺乳動物細胞に導入する工程、  前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された哺乳動物細胞において特定の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程、を含む高活性siRNA選択方法。【発明の詳細な説明】技術分野  本発明は、標的遺伝子の発現を抑制し得るsiRNAのin vivo発現システムおよび、これを用いたノックダウン細胞の生産方法等に関する。従来の技術  RNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）は、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二重鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用として注目を集めている。上記RNAiは、当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)）。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としも利用されつつある。  一方、哺乳動物細胞では、他の生物と同様にdsRNAを細胞外から導入することによりRNAiの誘導が試みられたが、導入されたdsRNAにより宿主が有するウイルス感染などに対する防御機構が作動してタンパク質合成が阻害され、RNAiを観察することができなかった。  しかし、最近Tuschlらにより、他の生物で用いられているような長い二重鎖RNAに代えて、2もしく3ヌクレオチドの一本鎖の3'末端の突出（オーバーハング）を有する全長21もしくは22ヌクレオチドの短いdsRNAを哺乳動物細胞に導入することにより、哺乳動物細胞でもRNAiを誘導し得ることが報告された（Elbashir, S. M et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001)、Caplen, N. J. et al. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9742-9747 (2001)）。  上記の通り、哺乳動物細胞でも短鎖の干渉用RNA二重鎖（以下、「siRNA」と略称する）を用いることにより、RNAiを誘導することに成功したが、このRNAiを利用して遺伝子発現抑制による機能解析や遺伝子治療を行うためには、細胞内へのsiRNAの効率的な導入や、細胞内でのsiRNAの安定的な保持が必要になる。  しかしながら、siRNAを外来から導入する際の効率も細胞により様々であり、細胞によっては１％〜１０％という低い場合がある。また、哺乳動物細胞内において、外来より導入されたsiRNAは導入数日経過後に消失してしまい、遺伝子の機能を解析するための十分な安定性は有していない。また遺伝子治療では、siRNAを定期的に投与する必要が生じるため、患者の身体的な負担が大きくなることが予想される。  また、外来からsiRNAを導入する方法では、特定の組織のみでRNAiを誘導することや、発生・分化の特定の過程などでRNAiを誘導することは極めて困難である。また、siRNAは短いとは言え、RNAの合成はDNA合成に比べ格段に費用がかかり、siRNAを直接用いてRNAiを誘導することは経済性に欠ける。  他方、遺伝子の一次配列がほぼ明らかにされた現在、遺伝子の機能を迅速に解明するために、系統的かつ効率的な機能遺伝子探索方法の開発が進められている。RNAiを利用して任意の遺伝子の発現を抑制し、その細胞あるいは個体の表現型の変化から系統的に機能遺伝子の探索を行うことができれば、新規な機能遺伝子の解明をより一層加速させることができる。発明の開示  そこで、本発明は、細胞内でより効率よく、安定かつ低廉にRNAiを産生し得る細胞内siRNA発現システム、および、このsiRNA発現システムを用いたノックダウン細胞等の生産方法、さらには、siRNA発現システムを用いて機能遺伝子の探索方法を提供することを目的とする。  本願発明者らは、上記課題に鑑みて、in vivo siRNA発現システムを研究し、その開発に成功した。すなわち、本発明は、具体的には、〔１〕  細胞内でsi(短鎖干渉)RNAを発現させるシステムであって、  標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、  前記標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、  前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させる一つ以上のプロモータとを備えた、siRNA発現システム、〔２〕  発現されるsiRNAが転写され最終的に１５乃至４９塩基対である、〔１〕記載のsiRNA発現システム、〔３〕  発現されるsiRNAが転写され最終的に１５��至３５塩基対である、〔１〕記載のsiRNA発現システム、〔４〕  発現されるsiRNAが転写され最終的に１５乃至３０塩基対である、〔１〕記載のsiRNA発現システム、〔５〕  siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチまたはバルジを含む、〔１〕記載のsiRNA発現システム、〔６〕  ミスマッチの一方の塩基がグアニンであり、他方がウラシルである、〔５〕記載のsiRNA発現システム、〔７〕  １乃至７個のミスマッチを含む、〔５〕記載のsiRNA発現システム、〔８〕  １乃至７個のバルジを含む、〔５〕記載のsiRNA発現システム、〔９〕  １乃至７個のバルジおよびミスマッチの両方を含む、〔５〕記載のsiRNA発現システム、〔１０〕  プロモータがpolII系またはpolIII系プロモータである、〔１〕乃至〔９〕のいずれかに記載のsiRNA発現システム、〔１１〕  polIIIプロモータがU6プロモータである、〔１〕乃至〔１０〕のいずれかに記載のsiRNA発現システム、〔１２〕  プロモータが誘導可能なものである、〔１〕乃至〔１１〕のいずれかに記載のsiRNA発現システム、〔１３〕  プロモータがアンチセンスコードDNAと、センスコードDNAの上流にそれぞれ備えられている〔１〕乃至〔１２〕のいずれかに記載のsiRNA発現システム、〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのようにloxP配列が備えられた、発現制御可能な〔１〕乃至〔１３〕のいずれかに記載のsiRNA発現システム、（ａ）プロモータ内のDSEとPSEとを距離をあけて備え、その間、DSEの近傍とPSEの近傍とにそれぞれloxP配列を備える（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたDSEとPSEとの間にloxPを備え、DSEの上流またはPSEの下流にもう一つのloxPを備える（ｃ）アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAを挟むように二つのloxPを備える〔１５〕  アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとが同一のベクター分子上にまたは別のベクターDNA分子にそれぞれ保持された、〔１〕乃至〔１４〕のいずれかに記載のsiRNA発現システム、〔１６〕  プロモータが、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAがリンカーを挟んで逆向きに連結されたユニットの片側に備えられている〔１〕乃至〔１３〕のいずれかに記載のsiRNA発現システム、〔１７〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのようにloxP配列が備えられた、発現制御可能な〔１６〕に記載のsiRNA発現システム、（ａ）プロモータ内のDSEとPSEとを距離をあけて備え、その間、DSEの近傍とPSEの近傍とにそれぞれloxP配列を備える（ｂ）プロモータ活性を保持し得るように配置されたDSEとPSEとの間にloxPを備え、DSEの上流またはPSEの下流にもう一つのloxPを備える（ｃ）アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAを挟むように二つのloxPを備える（ｄ）リンカーにストップ配列（例えば、TTTTT）を備え、該配列を挟むように二つのloxPを備える〔１８〕  アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとがベクター分子上に保持された、〔１６〕または〔１７〕に記載のsiRNA発現システム、〔１９〕  ベクターがプラスミドベクターである、〔１５〕または〔１８〕に記載のsiRNA発現システム、〔２０〕  ベクターがウイルスベクターである、〔１５〕または〔１８〕に記載のsiRNA発現システム、〔２１〕  ベクターがダンベル型DNAベクターである、〔１５〕または〔１８〕に記載のsiRNA発現システム、〔２２〕  〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載���siRNA発現システムを保持した細胞、〔２３〕  細胞が哺乳動物細胞である、〔２２〕記載の細胞、〔２４〕  〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載のsiRNA発現システムを保持した生物個体、〔２５〕  〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載のsiRNA発現システムを含む組成物、〔２６〕  医薬組成物である、〔２５〕記載の組成物、〔２７〕  標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、  〔１〕乃至〔２１〕のいずれかに記載のsiRNA発現システムを細胞に導入する工程、および前記siRNA発現システムが導入された細胞を選択する工程、を含む、生産方法、〔２８〕  細胞内でsiRNAライブラリーを発現させるシステムであって、  siRNAの鎖長分の任意配列からなる二本鎖のsiRNAコードDNAと、  前記siRNAコードDNAを挟むように対向して、前記二本鎖のそれぞれの鎖から互いに相補するRNAを発現させ得る二つのプロモータと、が備えられた、siRNAライブラリー発現システム、〔２９〕  細胞内でsiRNAライブラリーを発現させるシステムであって、  アンチセンスコードDNAと該アンチセンスコードDNAと相補的なセンスコードDNAとをリンカーを挟んで逆向きに接続したステム型siRNA生成ユニットと、前記ステム型siRNA生成ユニットの片側に、ステム型siRNAを発現させ得るプロモータと、が備えられた、siRNAライブラリー発現システム、〔３０〕  発現されるsiRNAが転写され最終的に１５乃至４９塩基対である、〔２８〕または〔２９〕記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３１〕  発現されるsiRNAが転写され最終的に１５乃至３５塩基対である、〔２８〕または〔２９〕記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３２〕  発現されるsiRNAが転写され最終的に１５乃至３０塩基対である、〔２８〕または〔２９〕記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３３〕  siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチまたはバルジを含む、〔２８〕乃至〔３２〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３４〕  プロモータがpolII系またはpolIII系プロモータである、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３５〕  プロモータが誘導可能なものである、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３６〕  発現されるsiRNAが、ランダムなRNA鎖から構成される、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３７〕  コーディング領域及び／またはノンコーディング領域を含む個々の遺伝子配列に対する、個々のsiRNA発現ベクターを個々に作成し、それらをすべて集めることによって構成される、〔２８〕乃至〔３３〕に記載のsiRNAライブラリー発現システム。〔３８〕  発現されるsiRNAが、任意のcDNAまたはゲノムDNAのsiRNA鎖長分の部分断片DNAによってコードされるRNA鎖から構成される、〔２８〕乃至〔３３〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システム、〔３９〕  〔２８〕乃至〔３８〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムの集合体であって、  集合内のそれぞれのシステムより異なるsiRNAが発現される、siRNAライブラリー発現システム集合体、〔４０〕  〔２８〕乃至〔３８〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムまたは〔３９〕記載のsiRNAライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、  前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞を選択する工程、  選択された細胞の表現型を解析する工程、を含む機能遺伝子探索方法、〔４１〕  表現型解析により表現型が変化していた細胞中のsiRNAコードDNAの配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、〔４０〕記載の機能遺伝子探索方法、〔４２〕  〔２８〕乃至〔３８〕のいずれかに記載のsiRNAライブラリー発現システムまたは〔３９〕記載のsiRNAライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、  前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞において特定の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程、を含む高活性siRNA選択方法、を、提供するものである。  本発明の第一の側面は細胞内でsiRNAを発現させるシステムに関する。このsiRNA発現システムには、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAと、前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させる一つ以上のプロモータとが備えられている。  「siRNA」は、哺乳動物細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、Tuschlら（前掲）により報告された全長21〜23塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。siRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。不対合部分はsiRNA形成に支障がない範囲で設けることができる。本発明における上記「バルジ」は、好ましくは１乃至２塩基の不対合塩基からなり、siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、好ましくは１乃至７個、より好ましくは１乃至５個含まれる。また、本発明における上記「ミスマッチ」は、siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、好ましくは１乃至７個、より好ましくは１乃至５個含まれる。好ましくは、一方の塩基がグアニンであり、他方がウラシルであるようなミスマッチを挙げることができる。好適には、センスRNAをコードするDNAにおいて、CからTへの変異、またはGからAへの変異、もしくはこれらの変異が混在した変異であるが、特にこれらの変異に制限されない。さらに本発明においては、siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよく、siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチを、好ましくは、合わせて１乃至７個、より好ましくは合わせて１乃至５個含まれる。  また、このように不対合部分（ミスマッチまたはバルジ等）を設けることにより、後述するアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとの間での組換えを抑制でき、後述するsiRNA発現システムの安定化を図るこ���もできる。さらに、siRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に不対合部分を含まないステムループ形DNAでは塩基配列の決定が困難であるが、上述のようにミスマッチまたはバルジを導入することによって、塩基配列の決定が可能となる。また、対合する二重鎖RNA領域中に、ミスマッチまたはバルジを含むsiRNAは、大腸菌の中、あるいは動物細胞内で安定となる利点を有する。  siRNAの末端構造は、標的遺伝子の発現をiRNA効果により抑制し得るものであれば、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、Tuschlら（前掲）により報告されたような3'末端側が突出している構造だけでなく、上記RNAi効果を誘導し得る限り5'末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、すでに報告がある2，3塩基に限定されず、RNAi効果を誘導し得る塩基数とすることができる。例えば、この塩基数としては、１〜８塩基、好適には、２〜４塩基とすることができる。なお、本明細書において、粘着末端構造を有するsiRNAの全長表示は、現実に対になっている中央の二本鎖部分の長さに、両端に突出している一本鎖同士を対にした長さを加算したものとする。例えば、中央が19塩基対で両端に４塩基の突出がある場合には、全長は23塩基対と表示することとする。また、この突出している配列部分は、標的遺伝子との特異性が低いため、標的遺伝子の配列と相補的（アンチセンス）配列あるいは同じ（センス）配列である必要は必ずしもない。また、siRNAによる標的遺伝子の発現抑制効果を保持し得る範囲で、例えば一端の突出部分に低分子RNA（例えば、tRNA、rRNAまたはウイルスRNAのような天然のRNA分子であってもよく、また人工的なRNA分子）を備えてもよい。  また、上記「siRNA」の末端構造は上述したように両側が断端構造を有している必要はなく、二重鎖RNAの一方の端部がリンカーRNAにより接続されたステムループ型構造であってもよい。この二重鎖RNA部分（ステム部分）の長さは上述したように、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。また、リンカーの長さはステム部分の対合に支障のない長さであれば特に限定はない。例えば、ステムの対合の安定化およびステム部分をコードしているDNA間での組換えを抑制するために、リンカー部分にクロバーリーフtRNA構造を用いてもよい。また、リンカーの長さがステムの対合に支障を与える長さであっても、例えば、リンカー部分にイントロンを包含させ、前駆RNAから成熟RNAにプロセッシングされる際にイントロンが切り出されて、ステム部分が対合するような構成をとってもよい。また、ステムループ型のsiRNAの場合には、ループを備えていないRNAのいずれかの末端（頭部または尾部）に低分子RNAを備えてもよい。この低分子RNAは、上述したように、tRNA、rRNAまたはウイルスRNAのような天然のRNA分子であってもよく、また人工的なRNA分子であってもよい。  「標的遺伝子」は、その遺伝子の発現が本システムより発現されるsiRNAより抑制される遺伝子であり、任意に選択することができる。この標的遺伝子���、例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを好適に選択することができる。標的遺伝子は、そのmRNA配列の一部、すなわちsiRNAの一方の鎖（アンチセンスRNA鎖）と結合し得る長さである少なくとも１５塩基以上が判明しているものであれば、ゲノム配列まで判明していない遺伝子であっても選択することができる。したがって、EST（Expressed Sequence Tag）などのmRNAの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子なども「標的遺伝子」として選択することができる。  「アンチセンスRNA」は、標的遺伝子のmRNAと相補する配列からなる鎖であり、このアンチセンスRNAが標的遺伝子のmRNAと結合してRNAiを誘導すると考えられている。「センスRNA」は、上記アンチセンスRNAと相補する配列を備え、相補的なアンチセンスRNAとアニーリングしてsiRNAを生成する。これらアンチセンスRNAとセンスRNAとは、従来では、RNA合成機により合成されたが、本発明では、これらRNAはそれぞれ、siRNA発現システム中のアンチセンスRNAをコードしたDNA（アンチセンスコードDNA）、センスRNAをコードしたDNA（センスコードDNA）より細胞内で発現される。  上記アンチセンスコードDNA、センスコードDNAよりアンチセンスRNA、センスRNAを発現させるために、本発明のsiRNA発現システムには、「プロモータ」が備えられている。このプロモータは、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを発現し得るものであれば、その種類、数、位置などは任意に定めることができる。簡易な構成としては、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAの上流にプロモータをそれぞれ備えたタンデム型発現システムとすることができる。このタンデム型発現システムでは上述した両側断端構造を有するsiRNAを生成し得る。また、ステムループ型siRNAを発現するシステム（ステム型発現システム）は、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを逆向きに配置し、さらにこれらDNAをリンカーDNAにより接続したユニットを構築する。そして、このユニットの片側にプロモータを連結することにより、ステム型siRNA発現システムを構築することができる。なお、リンカーDNAの長さ、配列には特に限定はないが、siRNAの生成を阻害するようなターミネーション配列などでなく、および上述したように成熟RNAまで生成された際にステム部分の対合に支障のないリンカーの長さ、配列であればよい。一例としては、上述したtRNAをコードしたDNAなどをリンカーDNAなどに用いることができる。  また、タンデム型、ステム型発現システムのいずれの場合にも、5’端にプロモータからの転写を促進し得る配列を備えてもよい。具体的にはタンデム型の場合には、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとの5’端それぞれに、また、ステム型の場合には上記ユニットの5’端に、プロモータからの転写を促進し得る配列を備えることにより、siRNAの生成を効率化してもよい。なお、こうした配列からの転写物は、siRNAによる標的遺伝子の発現抑制に支障がない場合には、siRNAに付加された状態で用いてもよいが、発現抑制に影響を与える場合には、トリミング手段（例えば、後述するリボザイムなど）を用いてトリミングを行うことが好ましい。  上述したタンデム型、ステム型のいずれのシステムの場合でもプロモータは、上記各DNAより対応するRNAを産生し得るものであれば、polII系、polIII系のいずれでもよいが、好ましくはsiRNAのような短いRNAの発現に適したpolIII系を用いることができる。このpolIII系のプロモータとしては、例えば、U6プロモータ、ｔＲＮＡプロモータ、レトロウイルス性ＬＴＲプロモータ、アデノウイルスＶＡｌプロモータ、５Ｓ ｒＲＮＡプロモータ、７ＳＫ ＲＮＡプロモータ、７ＳＬ ＲＮＡプロモータ、Ｈ１ ＲＮＡプロモータなどを挙げることができる。なお、上記U6プロモータはRNAの３‘末端に４塩基のウリジン塩基を付加するが、この３'末端の突出はアンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの先頭配列としてAを０、１、２、３または４塩基備えることにより、最終的に生成されるsiRNA３'末端の突出を自在に４、３、２、１，０塩基にすることができる。なお、他のプロモータを用いた場合にも、同様に末端の突出塩基数を自在に変更することは可能である。  また、polIII系のプロモータを用いた場合には、短いRNAのみを発現させ適切に転写を終結させるために、さらにセンスコードDNA、アンチセンスコードDNAの３'末端にターミネーターを備えることが好ましい。ターミネーターは、プロモータの転写を終結し得る配列であれば、特に限定はなく、例えば、A(アデニン)塩基が４つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列などを用いることができる。  一方、polII系プロモータとしては、サイトメガロウイルスプロモータ、Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ＲＳＶプロモータ、ＥＦ−１αプロモータ、β―アクチンプロモータ、γ−グロブリンプロモータ、ＳＲαプロモータなどを挙げることができる。ただし、polII系を用いた場合には、polIII系のような短いRNAではなく、ある程度の長さのRNAとして合成される。そのため、polII系のプロモータを用いた場合には、このある程度の長さとして合成されるRNAより、例えばリボザイムなどのRNAをセルフプロセッシングにより切断し得る手段を用いて、アンチセンスRNAまたはセンスRNAを生成させることもできる。PolII系プロモータの直後にステムループ配列を挿入し、その後ろにpolyA付加シグナルをいれて、ステムループRNAを生成させることもできる。このようなリボザイムを用いてアンチセンスRNAまたはセンスRNAを生成するためのユニットとして、次のような構成を例示することができる。すなわち、図２Aに示すように、このユニットには、上記アンチセンスコードDNAあるいはセンスコードDNAを有し、その5'端、3'端にリボザイムが認識するRNA配列をコードした領域（認識配列コード領域）がそれぞれ備えられ、さらに、この認識配列コード領域の外側にはそれぞれ隣接するように認識配列を切断する5'端、3'端切断用リボザイムがコードされた領域がそれぞれ備えられる。このようなアンチセンスRNA生成ユニットあるいはセンスRNA生成ユニットは、同一のpolII系プロモータの下流にタンデムに並べて作動可能に連結させてもよく（図２B）、また、別のプロモータの下流に作動可能にそれぞれ連結させてもよい（図２C）。なお、図２Bには両ユニットを連結させてタンデムに並べた例を示しているが、必要に応じて、アンチセンスRNA生成ユニットとセンスRNA生成ユニットとの間に任意のスペーサー配列を備えて、それぞれのユニットから発現されるRNAの間隔をリボザイムが作用しやすいように調節することもできる。  上記アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAの5'端切断用リボザイム、3'端切断用リボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイムなどを挙げることができる（Biochem. Biophys. Res. Commu n., Vol.186, pp.1271-1279 (1992); Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, Vol.90, pp.11302-11306 (1993)）。但し、セルフプロセッシングできるリボザイムである限り、他のどのような配列でもよい（BIO medica, Vol.7, pp.89-94 (1992)）。リボザイム自身もハンマーヘッド型リボザイムに限定するものではなく、セルフプロセッシングを行うことができるものであれば、例えば、ヘアピン型リボザイム、ＨＤＶリボザイム、テトラヒメナ由来のリボザイムなどを用いてもよい（Gene, Vol.122, pp.85-90 (1992)）。また、リボザイム認識配列としては、5'端、3'端切断用リボザイムに対応した認識配列を用いる。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムはＮＵＨ（ＮはＡ，Ｇ，Ｃ，Ｕであり、ＨはＡ，Ｃ，Ｕである。いずれの組み合わせでもよいが、好適には最も効率良く切断される「ＧＵＣ」がよい）配列の３'側でそのリン酸ジエステル結合を切断する。そのため、ハンマーヘッド型リボザイムを用いる場合には、認識配列としてNUH、好ましくはGUCを用いることができる。一例として、このハンマーヘッド型リボザイムと認識配列GUCとの組み合わせを、アンチセンスRNAまたはセンスRNA の5'端、3'端に付加し、アンチセンスRNA、センスRNAを生成させるためのmRNA構成を図２Dに示す。図２Dでは、２塩基の突出を形成させるために、アンチセンスRNA、センスRNAの5'末端を「C」としたが、３塩基のオーバーハングとする場合には、5'末端は「C」に限定されない。なお、図２Dに示す構成では、少なくともGUC配列が3'端側に付加される。  また、上記プロモータとして、誘導可能なプロモータを用いることにより、所望のタイミングでsiRNAを発現させることも可能となる。このような誘導可能なプロモータとしては、テトラサイクリンで誘導可能なU6プロモータ（Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)、図１２）等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモータ、あるいはCre-LoxPシステムのようなDNA組み換えのシステムを用いて、組織特異的にsiRNAの発現を誘導してもよい。  また、上記のように薬剤等による誘導可能なプロモータを用いなくとも、例えば、組換え酵素を用いてsiRNAの生成を制御してもよい。組換え酵素としてCRE-loxPの系を用いた場合を一例として説明する（図１７）。プロモータ内のDistal Sequence Element(DSE)とProxi Sequence Element（PSE）とを距離をあけて備え、その間、DSEの近傍とPSEの近傍とにそれぞれloxP配列を備える。通常は、DSEとPSEとが離れているために、プロモータ活性はオフ状態でsiRNAの発現は抑制される。しかし、この発現系にCREタンパク質を作用させることによりDSEの近傍とPSEの近傍とに備えられたloxP配列間で組換えが起こり、loxP配列間のDNAが切り出される。これによって、DSEとPSEとが接近しプロモータ活性がオン状態となって、siRNAを発現させる。この例は、CREを作用させることにより、プロモータ活性をオンにしてsiRNAを生成するシステムであるが、逆に、CREを作用させることにより、siRNAの発現を抑制するシステムを構築す���こともできる（図示せず）。例えば、プロモータ活性を保持し得るように配置されたDSEとPSEとの間にloxPを備え、DSEの上流またはPSEの下流にもう一つのloxPを備える。Creタンパク質が供給されていない場合には、プロモータ活性がオン状態であるが、Creタンパク質が供給されるとloxP間の組換えによりDSEあるいはPSEが切り出されてプロモータ活性がオフ状態になりsiRNAの生成が抑制される。また、これはプロモータ領域にloxPを配置した例であるが、アンチセンスコードDNAまたはセンスコードDNAを挟むように二つのloxPを設け、CREタンパク質の供給によりsiRNAの生成を抑制することもできる。  また、ステム型siRNA発現システムの場合には、リンカー部分にストップ配列（例えば、TTTTT）を挟むように二つのloxPを備えることができる。CREタンパク質が供給されていない場合には、プロモータからの転写がリンカー部分のストップ配列で終結するため、siRNAの生成が抑制される。CREタンパク質の供給によりloxP間の組換えが起こりストップ配列が切り出されると、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAが転写され、ステム型siRNAが生成される（図２８参照）。  上記「プロモータ」、「アンチセンスコードDNA」および「センスコードDNA」を備えたsiRNA発現システムは、そのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内でアンチセンスRNA、センスRNAを発現させsiRNAを形成させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記siRNA発現システムをベクターに保持させることが好ましい。ここで用いることができる「ベクター」は、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドDNA複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Y. Niitsuら, Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)）、これらに限定されるものではない。また、ウイルスベクターではなく、ダンベル型DNA(Zanta M.A. et al., Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 5;96(1):91-6)、ヌクレアーゼ耐性を持つような修飾DNA、またはnaked plasmidもまた好適に用いることができる（Liu F, Huang L. Improving plasmid DNA-mediated liver gene transfer by prolonging its retention in the hepatic vasculature. J. Gene Med. 2001 Nov-Dec;3(6):569-76）。本発明者らは、後述の実施例で示すように、本発明のsiRNA発現システムをダンベル型DNAに保持させることにより、標的遺伝子の発現を効率的に抑制できることを見出した。従って、本発明の好ましい態様においては、siRNA発現システムがダンベル型DNA分子上へ保持された発現システムを好適に用いることができる。また、ダンベル型の場合には細胞への導入をしやすくすることを目的として、抗体、ペプチド等と結合してもよい。  また、ベクターにsiRNA発現システムを保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる必要はなく、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNA���発現し得るように構成することができる。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。このうち同方向にカセットを挿入した構成例を図１Aに示す。また、図１Bのような異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。なお、これら発現システムでは図１Aに示すように、両側に断端構造を備えたsiRNAが生成される。  また、別の構成、上述したステム型siRNAを発現し得るシステムとして、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを同一DNA鎖上に逆向きに配置し、これらDNA間にリンカーを挟んで連結させたユニットを一つのプロモータの下流に接続させることもできる。その際、発現する順番は、必ずしも「アンチセンスRNAをコードするDNA→リンカー→センスRNAをコードするDNA」の順に限定されず、「センスRNAをコードするDNA→リンカー→アンチセンスRNAをコードするDNA」の順であってもよい。この構成を有する発現システムより生成されるRNAはリンカー部分をループとし、その両側のセンスRNAとアンチセンスRNAとが対合（ステム構造）となったステムループ型構造を有する。そして、細胞内の酵素によりこのパリンドロームのループ部分が切断され、siRNAを生成させることができる。なお、この場合のステム部分の長さ、リンカーの長さ、種類などは上述した通り構成することができる。  また、図２のようなリボザイムを用いる系では、図２Bに示すシステムをベクターに挿入してもよく、また、図２Cに示す二つのカセットを同一のベクターに同方向あるいは逆方向に挿入してもよい。また、一つベクターには、複数のsiRNA（異なる標的遺伝子mRNAに対するsiRNA、同一の標的遺伝子mRNAの異なる部位に対するsiRNA、または同一標的遺伝子mRNAの同一部位に対するsiRNA）を発現し得るシステムを担持させることもできる。  また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保���させることにより構成することができる。また、リボザイムを用いる系では、図２Cに示すような二つのカセットを異なるベクターに別々に保持させることにより構成することができる。  また、ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、ＧＦＰなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、ＥＧＦレセプター、Ｂ７−２、またはＣＤ４などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなども用いてもよいこのように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、siRNA発現システムが導入された細胞のみを選択することが可能となる。そのため、従来のようにsiRNA断片を外来から導入する際の導入効率の低さを解消し、siRNAが発現している細胞のみを濃縮することも可能となる。また、ベクターを用いることにより、細胞内での保持時間を高め、またベクターによってはレトロウイルスベクターなどのように染色体へのインテグレーションを誘導するため、siRNA発現システムからのsiRNAの細胞内での安定的な供給を行うことが可能となる。  本発明は、上記siRNA発現システムを保持した細胞に関する。このsiRNA発現システムを導入する細胞は、siRNAは従来RNAiの誘導が困難であった哺乳動物細胞においてRNAiを誘導し得るものであることから、哺乳動物細胞であることが好ましい。また、植物細胞などの長鎖のdsRNAでは、長期の安定な発現保持が難しい細胞も、本siRNA発現システムを導入される細胞として好適である。しかし本発明の上記細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞に特に限定されず、例えば、哺乳動物以外の動物細胞、酵母、菌類等であってもよい。  また、上記細胞への上記siRNA発現システムの導入方法は、細胞の種類により任意に選択することができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法(Virology, Vol.52, p.456 (1973))、エレクトロポーレーション法(Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311 (1987)) 、リポフェクション法(J. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175 (1989))、ウィルスにより感染導入方法(Sci.Am., p.34, March (19 94)) 、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法(Nature, Vol.319, p.791 (1986)) 、ポリエチレングリコール法(EMBO J., Vol.3, p.2717 (1984)) 、パーティクルガン法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo l.85, p.8502 (1988)) 、アグロバクテリュウムを介した方法(Nucleic. Acids Res., Vol.12, p.8711 (1984)) 等により行うことができる。  上記siRNA発現システムが導入された細胞を選択する方法としては、siRNA発現システムに特異的なDNA配列をプローブあるいはプライマーとしてハイブリダイゼーション、PCRなどの公知の手法により選択することもできるが、選択マーカーを備えたベクターにsiRNA発現システムが保持されている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる。  上記の通り、siRNA発現システムが導入された細胞は、標的遺伝子の発現が抑制されたノックダウン細胞となる。ここで「ノックダウン細胞」には、標的遺伝子の発現が完全に抑制された細胞と、標的遺伝子の発現が完全には抑制されていないが低減されている細胞とが含まれる。従来、このような細胞は、標的遺伝子をあるいはその制御領域を欠損・改変させることにより創生されていたが、本siRNA発現システムを用いることにより、染色体上の標的遺伝子を改変することなく、単にsiRNA発現システムを導入し、導入された細胞を選択するという簡易な方法により標的遺伝子の発現が抑制された細胞を作ることができる。このように創生されたノックダウン細胞は、標的遺伝子の機能解析のための研究材料として、また疾患原因遺伝子を標的遺伝子として発現が抑制されている細胞では疾患モデル細胞などとして利用することが可能となる。また、生殖細胞に上記siRNA発現システムを導入し、この本システムを保持した生殖細胞より生物個体を発生させることにより、標的遺伝子ノックダウン動物、疾患モデル動物などを創生することも可能となる。  上記siRNA発現システムを用いた標的遺伝子ノックダウン動物の作製方法は特に限定はなく、既知のいずれの方法を用いてもよい。一例を示せば、siRNA発現ベクターをF1のメス（例えば、CBA/J×C57BL/6J）とオス（例えば、C57BL/6J）とを交配して得られた受精卵に注入する。受精卵から発生させたマウスの尾部から末梢血DNAを得て、発現ベクターの一部をプローブに用いてゲノミックサザンブロットを行い、染色体にsiRNA発現ベクターが組み込まれた陽性の創始動物を同定する。C57BL/6JまたはF1（CBA/J×C57BL/6J）ハイブリッドマウスのいずれかとの戻し交配を繰り返して後代マウスを得る。そして、ゲノミックサザンブロット解析およびPCR解析により、遺伝子組換え陽性の子孫を同定する。  また、上記では主に哺乳動物にsiRNA発現システムを用いる場合を説明したが、本発明のsiRNA発現システムは植物に用いてもよい。特に、従来の二重鎖RNAを直接植物細胞に導入してRNAiを誘導していたが、細胞を継代している過程でdsRNAが欠落しRNAiの効果を維持することが困難であった。そのため、本発明のRNA発現システムを用いて、植物細胞中の染色体にインテグレーションさせることにより、RNAiの効果を維持することが可能となる。また、こうした細胞よりトランスジェニック植物を創生することにより、RNAi効果を安定的に保持した植物を創生することもできる。なお、植物の創生は、当業者においては、周知の方法により実施することが可能である。  また、本発明は上記siRNA発現システムを含む組成物に関する。本siRNA発現システムは、siRNAにより所望の標的遺伝子の発現を抑制し得るため、このシステムにより疾患の原因となる遺伝子発現を抑制し得ることもできる。このようなsiRNAを発現するシステムは、適切な賦形剤を添加した医薬組成物などとして用いることもできる。  本発明の他の態様は、細胞内でsiRNAライブラリーを発現させるシステムに関する。本発明における「siRNAライブラリー」によって発現されるsiRNAは、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシルをsiRNA鎖長分だけ順列に並べ得る配列からなるRNA鎖から構成される、もしくは任意のcDNAまたはゲノムDNAのsiRNA鎖長分の（ランダムな）部分断片DNAによってコードされるRNA鎖から構成される。このような上記siRNAを本明細書においては、「ランダム（な）siRNA」とも記載する。即ち、本発明において��ランダムsiRNA」とは、配列が任意の配列、あるいは、特定のcDNA配列もしくは特定のcDNAライブラリーに含まれる配列およびゲノム配列から選ばれる任意の配列から構成される。上述までのsiRNA発現システムは特定の標的遺伝子の発現を抑制し得るものであるが、本発明では、siRNAライブラリーを発現して、任意の遺伝子、例えば機能未知の遺伝子や配列未知の遺伝子を抑制し、新規な機能遺伝子を探索するために用いることができる。一例とすれば、siRNAライブラリー発現システムは、図１Bに示すような構成を取ることができる。中央にランダムなアンチセンスRNAをコードしたDNAとこのDNAと相補的なセンスRNAをコードしたDNAとが対合した二本鎖のsiRNAコードDNA（以下「siRNAコードDNA」という）を備え、このsiRNAコードDNAを挟むように対向して、アンチセンスRNAとセンスRNAをそれぞれ発現させ得る二つのプロモータが備えられる。  上記「ランダムなsiRNA」は、配列が任意の配列、あるいは特定のcDNA配列、特定のcDNAライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列であることを除いて、上述のsiRNA発現システムと同様であり、哺乳動物細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAから構成される。短鎖とは、Tuschlら（前掲）により報告された全長21〜23塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば、例えば、15〜49塩基対と、好適には、15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。また、上記ランダムsiRNAの末端構造は、標的遺伝子の発現をRNAi効果により抑制し得るものであれば、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、3'末端側が突出している構造だけでなく、上記RNAi効果を誘導し得る限り5'末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、2，3塩基に限定されず、RNAi効果を誘導し得る塩基数とすることができる。例えば、この塩基数としては、１〜８塩基、好適には、２〜４塩基とすることができる。また、上述したように一端の突出部分に低分子RNAを備えた構成としてもよい。また、siRNAライブラリー発現システムによって発現されるsiRNAは、上述のように、RNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチもしくはバルジ、あるいはその両方を含んでいてもよい。  また、siRNAライブラリーを発現させるシステムは、上述したような構成（siRNAコードDNAを挟むように対向して二つのプロモータを備えた構成）に限られず、ステム型のsiRNAを発現させ得るような構成をとることもできる。すなわち、一方のアンチセンスRNA（例えば、ランダムな任意配列、あるいは特定のcDNA配列、特定のcDNAライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列）をコードしたDNAとそれと相補するセンスRNAをコードしたDNAとを逆向きにし、これらをリンカーDNAにより接続したユニット（以下、「ステム型siRNAライブラリー生成ユニット」という）の上流にプロモータを連結した構成をも本発明に含まれる。上記ステム型siRNAライブラリー生成ユニットの作製方法の一例を図１８に示す。すなわち、DNA合成機等により中央部にランダムな配列からなるアンチセンスRNAをコードしたDNA（アンチセンスコードDNA）配列と3’末端側に任意のパリンドローム構造を形成し得る配列とを備えた一本鎖DNAを合成する。次いで、この一本鎖DNAの5’側に相補的なプライマーを準備し、このプライマーをアニーリングさせるとともに、一本鎖DNA上の3’側にパリンドローム構造を形成させる。この状態で、DNAポリメラーゼとDNAリガーゼを作用させ、アンチセンスコードDNAと相補し得るセンスコードDNA鎖が合成されるとともにステム部分が延長したパリンドローム構造が形成される。このパリンドローム構造を変性処理により一本鎖とし、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAを挟む両側配列と相補するプライマーを用いたPCRにより、ステム型siRNAライブラリー生成ユニットを含む二本鎖DNAが生成される。この二本鎖DNAのステム型siRNAライブラリー生成ユニットの側鎖を必要に応じて、制限酵素などによりトリミングした後、適当なプロモータの下流に接続して、ステム型siRNAライブラリー発現システムが生成される。  なお、上記ステム型siRNAライブラリー発現システムからはステムループ型のsiRNAが生成される。このステムループ型のsiRNAにおいても、上述の通り、生成される二重鎖RNA部分（ステム部分）の長さは、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。また、リンカーの長さおよび配列は、ステム部分の対合に支障のない長さおよび配列であれば特に限定はなく、例えば、クロバーリーフtRNAなどの低分子RNAを設けてもよい。  上記「ランダムなアンチセンスコードDNA」は、任意の配列から構成され、例えば、４塩基「A,G,C,T」を鎖長分だけ順列により並べ得る配列の集合の中から任意に選択することができる。あるいは、特定のcDNA配列もしくは特定のcDNAライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列から構成される。また、ここで用いることができるプロモータはpolII系、polIII系のいずれでもよいが、好ましくはsiRNAのような短いRNAの発現に適したpolIII系を用いることが好ましい。また、対向するプロモータ同士は、同一の種類、異なる種類のいずれであってもよいが、発現効率の点から好ましくは異なる種類とすることがよい。なお、これらpolIII系、polII系のプロモータとして用い得る例は上述と同様である。  また、polIII系プロモータを用いた場合には、相補する短いRNAを発現した後に適切に転写を終結させるため、図１Bに示すように二つのプロモータとsiRNAコードDNAとの境界にターミネーターを備えることが好ましい。ターミネーターは図１Bに示すようなA（アデニン）塩基を４つ以上連続した配列を用いてもよく、また、当業者に公知のターミネーターなどを用いてもよい。  また、上記プロモータとして、誘導可能なプロモータを用いることにより、所望のタイミングでsiRNAライブラリーを発現させることも可能となる。そのため、誘導可能なプロモータを用いることにより特定の発生・分化段階等で機能する遺伝子の解析を行うことが可能となる。また、転写活性が組織特異性のあるプロモータを利用した場合には、組織特異的にsiRNAの発現を誘導することが可能となる。そのため、特定の組織での機能遺伝子の解析を行うことが可能となる。なお、ここで用いることができる誘導可能なプロモータ、組織特異的プロモータは上記と同様である。上記siRNAライブラリー発現システムは、DNA断片としてそのまま細胞内の染色体に導入してもよいが、��率的な細胞導入などを行うために、上記siRNAライブラリー発現システムをベクターに保持させることが好ましい。ここで用いることができる「ベクター」は、上述したベクターと同様である。また、一つベクターには、複数の種類のsiRNAを発現し得るsiRNAライブラリー発現システムを保持させて、機能遺伝子のスクリーニングの効率化を図ることもできる。また、上記siRNAライブラリー発現システムを保持したベクターには、必要に応じて、選択マーカーなどをさらに保持させることができる。ここで用いることができる選択マーカーは、上記と同様である。このように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、siRNAライブラリー発現システムが導入された細胞のみを選択することが可能となり、機能遺伝子の探索の効率化を図ることができる。  また本発明のsiRNA発現システムの一つの態様としては、コーディング領域及び／またはノンコーディング領域を含む個々の遺伝子配列に対する、個々のsiRNA発現ベクターを個々に作成し、それらをすべて集めることによって構成されるsiRNAライブラリー発現システムである。  また、それぞれ異なるsiRNAを発現し得るsiRNAライブラリー発現システムを集めて集合体を構築することもできる。例えば、この集合体より発現されるsiRNAとして、４塩基「A,G,C,U」をsiRNA鎖長分だけ順列により並べ得る配列からなるRNA鎖を生成し得るようにsiRNAコードDNA、ステム型siRNAライブラリー発現システムを構成してもよく、また、任意のcDNA断片もしくは任意のcDNAライブラリーに含まれる配列またはゲノム配列から選ばれる任意の配列を用いてsiRNAコードDNAを構成してもよい。このようにsiRNAライブラリー発現システムを複数集めた集合体を用いることにより、機能遺伝子の探索を一層効率的に行うことが可能となる。  上記ランダムsiRNAライブラリー発現システムまたは上記記載のsiRNAライブラリー発現システムの集合体を用いて、機能遺伝子を探索する方法としては、siRNAライブラリー発現システムまたは上記記載のsiRNAライブラリー発現システムの集合体を細胞に導入する工程、前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞を選択する工程、選択された細胞の表現型を解析する工程、から構成することができる。  siRNAライブラリー発現システム等の細胞への導入は、上記と同様、細胞によって選択することができる。具体的には、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法(Virology, Vol.52, p.456 (1973))、エレクトロポーレーション法(Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311 (1987)) 、リポフェクション法(J. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175 (198 9))、ウィルスにより感染導入方法(Sci.Am., p.34, March (19 94)) 、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法(Nature, Vol.319, p.791 (1986)) 、ポリエチレングリコール法(EMBO J., Vol.3, p.2717 (1984)) 、パーティクルガン法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo l.85, p.8502 (1988)) 、アグロバクテリュウムを介した方法(Nucleic. Acids Res., Vol.12, p.8711 (1984)) 等により行うことができる。  siRNAライブラリー発現システム等が導入された細胞の選択は、選択マーカーを有するベクターを備えている場合には、その選択マーカーによる表現型により導入されている細胞を回収することにより選択することができる。また、選択マーカ��を備えていない場合には、siRNAライブラリー発現システムに共通し、これらに特有の配列をプローブまたはプライマーとして、公知のハイブリダイゼーションまたはPCRなどにより導入細胞を検出することにより選択することができる。  上記siRNAライブラリー発現システムまたはその集合体が導入された細胞が選択された後に、その細胞の表現型を解析する。この表現型の解析は、コントロールとしてsiRNAライブラリー発現システム等が導入されていない細胞等の表現型と比較することにより行うことができる。この表現型は、細胞表面に生じるものだけではなく、例えば、細胞内の変化なども含まれる。  上記解析の結果、表現型が変化した細胞には、何らかの機能遺伝子の発現を抑制し得るsiRNAライブラリー発現システムが含まれている可能性が高い。そのため、機能遺伝子をスクリーニングするために、この細胞に含まれるsiRNAコードDNAの配列に基づき、プローブ、プライマーを構築する。そして、このプローブ、プライマーを用いて、ハイブリダイゼーションまたはPCRを行うことにより、機能遺伝子のクローニングを行うことができる。また、siRNAコードDNAの配列に基づいて、データベースから機能遺伝子を検索することもできる。  本発明のsiRNA発現システムの効果は、通常、標的となる遺伝子のターゲットサイトの場所により大きく異なる。例えば、HIVを標的とした場合、プライミングサイトを狙うことにより、siRNAによる高い発現抑制効果が期待できる。好適なターゲットサイトが不明である場合にも、本発明のsiRNAライブラリー発現システムは有効である。即ち、本発明の上記siRNAライブラリー発現システムは、mRNAを壊すのに有効なsiRNAの至適ターゲットサイトを検索するシステムとして非常に有用である。即ち本発明は、本発明のsiRNAライブラリー発現システムまたは本発明のsiRNAライブラリー発現システム集合体を細胞に導入する工程、前記siRNAライブラリー発現システムまたは前記集合体が導入された細胞において特定の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程、を含む高活性siRNA選択方法を提供する。任意の遺伝子またはタンパク質の発現量の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーションまたはウエスタンブロットハイブリダイゼーション法等により、容易に実施することが可能である。  本発明のsiRNA発現システム、およびsiRNAライブラリー発現システムの利用は、哺乳動物に特に限定されず、その他の動物、植物、酵母、菌類等にも使用することができる。  本発明のsiRNA発現ライブラリーの使用法として、たとえば、ウイルス感染に関わる遺伝子を調べることが考えられる。その場合、siRNA発現ライブラリーを細胞に導入し、細胞にウイルスを感染させ、生き残る細胞を調べることにより、簡単にウイルス感染に関わる遺伝子が同定できる。このとき使用するライブラリーとしては、ヒト4万個のcDNAに対応するsiRNA発現ライブラリーを用いれば、すべて、関連する遺伝子を同定可能であり、また、ランダマイズ、あるいはゲノム断片のsiRNA発現ライブラリーを用いれば、cDNA以外の関連遺伝子の同定も可能となる。また、これら２つのライブラリーを混ぜて用いても良い。発明を実施するための最良の形態[実施例１]  siRNA発現ベクターによるRNAiの誘導  外来から導入したハイグロマイシン／EGFP融合タンパク質をコードした標的遺伝子の発現をsiRNA発現ベクターにより抑制し得るか否かを検討した。  ハイグロマイシン／EGFP発現ベクター（pHygEGFP） とインターナルコントロールのDsRedを発現するベクター（pDsRed2）を入手した（Clontech）。siRNA発現ベクターは、ヒトU6プロモーターを保持したプラスミドpU6（Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)）を用いて構築した。ハイグロマイシン／EGFPのセンスRNAおよびアンチセンスRNAの一部をコードしたDNAを含む断片をDNA合成機により合成し、合成断片をpU6のU6プロモータの直下にサブクローニングした。U6プロモータの直下にこれら増幅断片を挿入するために、サブクローニングに用いたベクターにはU6の下流にBspMIの認識部位と、さらにその下流に別のBspMIの認識部位を設け、U6プロモータの直下とさらに下流がBspMIにより切断されるように構成した。切断後は４塩基の粘着末端が形成されるため、これら粘着末端と相補する末端を備えた合成センスコードDNAを挿入することによりセンスRNAを発現し得るベクターを構築した。  同様にアンチセンスRNA（19ヌクレオチド）をコードしたDNAもPCRにより増幅し、pU6のU6プロモータの直下にサブクローニングした。  このU6プロモータを備えたアンチセンRNA発現カセットをベクターから切り出し、センスRNA発現カセットを備えたpU6 ベクター に挿入して、siRNA発現ベクター（pU6iHyg/EFGP）を構築した。ここで、U6プロモータを用いた場合、発現されるmRNAの3'末端には、４つのウリジン（U）が付加されることが報告されていることから、siRNA発現ベクターより発現され、細胞内で形成されるsiRNAは、両3'末端が４ヌクレオチドの突出した構造を有する。すなわち、このsiRNA発現ベクターからは、中央に19ヌクレオチドの二重鎖領域を有し、両3末端に４ヌクレオチドの突出を備えた、全長23ヌクレオチドのsiRNAが発現される（図１A）。  上記pHygEGFP（1μg）、pDsRed2（0.5μg）、およびpU6iHyg/EFGP（1μg）をヒトHeLaS3細胞にリポフェクション法（リポフェクトアミン2000）コトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後に37℃で静置した後、共焦点顕微鏡で観察した。なお、コントロール実験として、siRNA発現ベクターに代えてpU6を用いて同様の操作を行った。  図３において、上段はコントロールのpU6 を用いた結果を示し、下段はpU6iHyg/EFGPを導入した結果を示す。図３中央に示すように、赤色の蛍光を発するインターナルコントロールのpDsRedが導入された細胞では、コントロール群とpU6iHyg/EFGP導入群とで有意な差はなかった。そのため、両実験群でベクターの導入効率に差異はなく、またsiRNA発現ベクターによる非特異的な発現抑制がないことが示された。一方、図３左に示すように、pHygEGFPによる緑色の蛍光を発する細胞はコントロールに比べ、pU6iHyg/EFGP導入群で減少しており、また、緑色を発光している細胞でのその蛍光発光強度が低下していた。また、同様に、図３右に示すように、赤、緑、の蛍光を重ね合わせた場合でも、緑色を発する細胞および、赤と緑との混合による黄色を発する細胞は、コントロールに比べ、siRNA発現ベクター導入群では、減少していた。このことより、siRNA発現ベクターの導入により、RNAiが誘導され、標的遺伝子の発現抑制が示された。また、同様の解析をマウスCOS7細胞を用いて行った。その結果、pDsRedの発現には全く影響がないが、pHygEGFPの発現を特異的に抑制した（図示せず）。  [実施例２]  siRNA発現ベクター導入による発現抑制活性の定量  RNAiの効果を定量化するために、他のレポーター遺伝子として、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼを用い、その発現の抑制活性を以下の通り解析した。  HeLaS3 細胞とCOS7細胞を10％ウシ胎児血清含有ダルベッコウ変法イーグル培地で培養した。各培養細胞（３×１０４cells／ウェル）を48ウェルプレートの各ウェルに播いた。ルシフェラーゼレポーター解析を行うために、30 ng のRSV-ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター (pRL-RSV)15 、30 ng のホタルルシフェラーゼ発現ベクターpGL3 (Promega)および様々な量のホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼに対するsiRNA発現ベクターを各ウェルにコトランスフェクションした。トランスフェクションはリポフェクトアミン2000試薬(Life Technologies) を用いリポフェクション法により行った。  HeLaS3細胞でのルシフェラーゼ解析結果を図４に示す。図４Aは、一定量（300ng）のsiRNA発現ベクターを導入した結果を示し、siRNAを導入することにより対応する標的遺伝子の発現が抑制された。また、センスあるいはアンチセンスRNAのいずれか一方のみを発現するプラスミドでもルシフェラーゼ活性を解析したが、両プラスミドともにホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現に全く影響を与えなかった。また、図４Bには、siRNAの導入量を変えた際の結果を示す。ホタルルシフェラーゼに対するsiRNA発現ベクターは、ウミシイタケルシフェラーゼの活性に影響を与えることなく、ホタルルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下させた。一方、ウミシイタケルシフェラーゼに対するsiRNA発現ベクターをトランスフェクションした細胞では、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下させた。これらの結果よりU6プロモータを用いたsiRNA 発現システムは、特異的にまた効果的に標的遺伝子の発現を抑制した。  [実施例３]  標的部位に依存した発現抑制  次に、同一転写産物中の異なる標的部位に対するsiRNAを発現するベクターが、異なる発現抑制活性を有するか否かを検討した。なお、この解析では、ホタルルシフェラーゼ転写産物中の４つの異なる標的部位に対するsiRNA発現ベクターを、実施例２と同様の条件でホタルルシフェラーゼ発現ベクターおよびインターナルコントロールのウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターと共にHeLaS3細胞にトランスフェクションを行った。なお、この４つの異なる標的部位に対するsiRNA発現ベクターのセンス、アンチセンスコードDNA配列を以下に示す。  ホタルルシフェラーゼO部位センス鎖：5'-GCTATGAAACGATATGGGC-3'（配列番号：１）、O部位アンチセンス鎖：5'-GCCCATATCGTTTCATAGC-3' (配列番号：２)、 A部位センス鎖：5'-GTTCGTCACATCTCATCTAC-3' (配列番号：３)、A部位アンチセンス鎖：5'-GTAGATGAGATGTGACGAA-3' (配列番号：４)、B部位センス鎖：5'-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3' (配列番号：５)、B部位アンチセンス鎖：5'-GTTGGCACCAGCAGCGCAC-3' (配列番号：６)、C部位センス鎖：5'-ATGTACACGTTCGTCACAT-3' (配列番号：７)、C部位アンチセンス鎖5'-ATGTGACGAACGTGTACAT-3' (配列番号：８)、コントロールのウミシイタケルシフェラーゼ（センス鎖塩基突出）：5'-GTAGCGCGGTGTATTATAC-3' (配列番号：９)、（アンチセンス鎖塩基突出）5'-GTATAATACACCGCGCTAC-3' (配列番号：１０)。  図５Aに示すように、標的部位の違いによりルシフェラーゼの抑制活性に差異が見られた。すなわち、部位Bに対するsiRNA発現ベクターでは最も抑制活性が高く14%まで低下させた。部位A、部位Cおよび部位 Dに対するsiRNA発現ベクターではそれぞれ44%, 38% および36%まで低下させた。なお、部位Oに対するsiRNA発現ベクターでは、二つのコントロール発現ベクター、Hyg-U6siRNAおよびpU6と同様に抑制活性は0％であった。  上記標的部位による発現抑制活性の違いが、標的部位の違いのみに由来するのか、それとも各siRNAの転写効率の違いによるかを検討した。この検討を行うために、上記センス、アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。このsiRNAオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。  ホタルルシフェラーゼO部位センス鎖：5'-GCUAUGAAACGAUAUGGGCUU-3'（配列番号：１１）、O部位アンチセンス鎖：5'-GCCCAUAUCGUUUCAUAGCUU-3' (配列番号：１２)、 A部位センス鎖：5'-GUUCGUCACAUCUCAUCUACUU-3' (配列番号：１３)、A部位アンチセンス鎖：5'-GUAGAUGAGAUGUGACGAAUU-3' (配列番号：１４)、B部位センス鎖：5'-GUGCGCUGCUGGUGCCAACUU-3' (配列番号：１５)、B部位アンチセンス鎖：5'-GUUGGCACCAGCAGCGCACUU-3' (配列番号：１６)、C部位センス鎖：5'-AUGUACACGUUCGUCACAUUU-3' (配列番号：１７)、C部位アンチセンス鎖5'-AUGUGACGAACGUGUACAUUU-3' (配列番号：１８)、コントロールのウミシイタケルシフェラーゼ（センス鎖塩基突出）：5'-GUAGCGCGGUGUAUUAUACUU-3' (配列番号：１９)、（アンチセンス鎖塩基突出）5'-GUAUAAUACACCGCGCUACUU-3' (配列番号：２０)。  上記RNAオリゴヌクレオチドの合成は、RNA合成機Model 394 (Applied Biosystems)を用いた。合成RNAは、脱保護され、アクリルアミドゲルを変性させることにより精製した。ゲルからの溶出後、各RNAはNAP-10カラム(Pharmacia)を用い、RNA分解酵素を含まない水で溶出して脱塩化した。その後、真空下で乾燥させ、アニーリングバッファー(リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）pH 6.8, 2 mM MgCl2)中に再懸濁した。次いでRNAオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。アニーリングは10μM濃度のRNAを準備し、これれを95℃、１分間インキュベーションし、その後、70℃に冷却し、その後ゆっくり4℃まで２時間かけて冷却することにより、実施した。これらsiRNAオリグヌクレオチドを上記と同様にHeLaS3細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した（図５b）。  各標的部位に対するsiRNAオリゴヌクレオチドによるルシフェラーゼ発現の抑制プロファイルは、部位Oに対するsiRNAオリゴヌクレオチドが僅かな抑制活性を示した以外は、オリゴヌクレオチド導入濃度1 nM、0.1 nM において、siRNA発現ベクターによるルシフェラーゼ発現抑制プロファイルと同様のパターンを示した。この結果より、上記標的部位による発現抑制活性の差異は、各siRNAの発現効率の違いによるものではなく、標的部位の違い、たとえば、標的部位の二次構造やRNA結合タンパク質の存在に依存することが示された。  ［実施例４］siRNAの3'末端の突出塩基の長さによる影響  U6プロモータにより生成されるsiRNAは、3'末端に４つのウリジン塩基の突出を有する。一方、Elbashirらはショウジョウバエのin vitro実験において、siRNAにおける3'末端の突出は2，3塩基よりも長い場合には発現抑制効率が低下することを報告している��Elbashir, S. M., Lendeckel, W. & Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15, 188-200 (2001)）。そこで、上記siRNAの3'末端における４塩基の突出が、siRNAによるRNAiの誘導効率に影響を与えるかを検討した。上記ウミシイタケルシフェラーゼ転写産物上の同一標的部位に対するsiRNAオリゴヌクレオチドにおいて、3'末端の突出のウリジン塩基の数を2塩基, 3塩基あるいは4塩基としたものを上記実施例３と同様に合成・調製した。これらウミシイタケ ルシフェラーゼに対するsiRNAオリゴヌクレオチドとインターナルコントロールのホタルルシフェラーゼ発現ベクターを様々な濃度でHeLaS3細胞に上記リポフェクション法により導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した（図６AC）。  上記インターナルコントロールのみでは、ウミシイタケルシフェラーゼの発現は抑制されないが、上記オリゴヌクレオチドをコトランスフェクションした群では、導入濃度に依存して、ウミシイタケルシフェラーゼの発現が抑制された。また、この発現抑制活性は、オリゴヌクレオチドの3'末端における２〜４塩基の突出長さの違いにより、発現抑制活性に大きな差異は見られなかった。そのため、U6により生成される3'末端に４塩基の突出を有するsiRNAでも、2塩基、3塩基突出のsiRNAと同様に標的遺伝子の発現を効果的に抑制し得ることが示された。  ［実施例５］  複数遺伝子の同時抑制  二つの異なる遺伝子を同時に発現させて異なる標的遺伝子の発現を同時に抑制し得るか否かを検討した。ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼに対する二つのsiRNA発現カセットを備えたプラスミドを構築し、コトランスフェクションした。  ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（30 ng）、ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター（30 ng）を両ルシフェラーゼ転写産物に対するsiRNAを発現するベクター（300ng）をインターナルコントロールであるβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（100 ng）とともにHeLaS3細胞にコトランスフェクションした。なお、コントロールとして、ホタルルシフェラーゼ転写産物またはウミシイタケルシフェラーゼ転写産物のいずれか一方に対するsiRNAを発現するベクターを用いて同様に行った。  図６Bに示す通り、両ルシフェラーゼに対するsiRNA発現ベクター（U6i-Firefly/Renilla）のトランスフェクションにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現を同時に、いずれか一方のルシフェラーゼに対するsiRNA発現ベクター(U6i-Renilla、U6i-Firefly)をトランスフェクションした場合と同じレベルまで、それぞれのルシフェラーゼの発現活性を低下させた。  上記の通り、同一のプラスミド上に複数のsiRNA発現カセットを配置し、これら複数のsiRNAを同時に発現させることにより、相互のプロモータ間で干渉を生じさせることなく、対応する標的遺伝子の発現を抑制し得ることが示された。  ［実施例６]  内因性の遺伝子の発現抑制  上記実施例ではすべて外来から導入した遺伝子の発現を抑制したが、siRNA発現ベクターにより内因性遺伝子の発現を抑制し得るかを検討した。  本実施例においては、標的となる内因性遺伝子にβカテニンを選択した。このβカテニンは、裏打ちタンパク質であり、カドヘリンに起因した細胞間接着に関する因子として、また重要なガン遺伝子として知られている（Peifer, M. & Polakis, P. Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis--a look outside the nucleus. Science 287, 1606-1609 (2000)）。  βカテニンを発現しているSW480細胞にβカテニンに対するsiRNA発現カセットを備えたEGFP発現プラスミド(pEGFP/ibeta-catenin)を導入した。コントロールとして、βカテニンに対するsiRNA発現カセットを保持しないEGFP発現プラスミド(pEGFP)を同様の60％コンフルエントの細胞に導入した。この細胞へのプラスミドの導入は、スライドガラスに細胞をのせ、Effectene (Qiagen) またはFugene６ (Roche Molecular Biochemicals)の試薬を用いて導入した。導入48時間後に、細胞を4% パラホルムアルデヒド含有PBSで20分間固定処理を行った。その後、0.1％トライトンX100で浸透操作を行い、抗βカテニン抗体（UBI社）およびCy3ラベルした二次抗体を用いて染色した。染色後の細胞の蛍光を共焦点顕微鏡で解析した（図７）。  pEGFP/ibeta-cateninを保持した緑色の蛍光を発する細胞では、プラスミド非導入細胞と比べて、βカテニンの発現レベルが実質的に低いことが示された。また、pEGFPを導入し、緑色の蛍光を発する細胞では、βカテニンの発現レベルは、プラスミド非導入細胞と比べて差異は見られなかった。  ［実施例７］  タンデム型siRNA発現ベクターおよびステム型siRNA発現ベクターにおける発現抑制効果の比較解析  次に、センスおよびアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡがそれぞれタンデムに位置する構造を有するsiRNA発現ベクター(pU6tandem19)、およびステムループ形のＲＮＡ分子を発現し得るsiRNA発現ベクター(pU6stem19)を用いて、それぞれのベクターにおける発現抑制効果を検討した。上記発現ベクターから発現されるsiRNAを、それぞれタンデム型siRNA、ステム型siRNAと記載する。pU6stem19において転写されるステムの配列は5'-GTGCGCTGCTGGTGCCAACgugugcuguccGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3'（配列番号：２１）である。発現抑制活性の定量は、上述の実施例に記載されたルシフェラーゼ解析によって行った。  解析結果を図８に示す。タンデム型siRNAおよびステム型siRNAのいずれにおいても、ルシフェラーゼの活性を濃度依存的に低下させた。この結果から、タンデム型siRNAおよびステム型siRNAの発現システムは、いずれも効果的に標的遺伝子の発現を抑制することが分った。  ［実施例８］  種々のsiRNA発現ベクターにおける発現抑制効果  次に、各種プロモータを備えたsiRNA発現ベクターを用いて、発現抑制効果の検討を行った。siRNA発現ベクターは以下のものを使用し、上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。・タンデム型siRNAをヒトU6プロモータによって発現させるベクター(pU6tandem19)・タンデム型siRNAをヒト5S rRNAプロモータによって発現させるベクター(p5Standem19)・タンデム型siRNAをヒトH1プロモータによって発現させるベクター(pH1tandem19)・ステム型siRNAをヒトH1プロモーターによって発現させるベクター(pH1stem19)  図９で示すように、使用した各種発現ベクターにおいて、ルシフェラーゼの抑制活性が見られた。すなわち、siRNA発現ベクターに使用可能なプロモータとしては、ある特定のプロモータに限定されず、ヒトU6プロモーター、ヒト5S rRNAプロモータ、ヒトH1プロモーター等の種々のプロモータを利用できることが示された。  ［実施例９］  CMVプロモータまたはtRNAプロモータを備えたsiRNA発現ベクターにおける発現抑制効果  次にサイトメガロウイルス由来プロモータ(CMVプロモータ)もしくはtRNAプロモータとトリミングリボザイムを備えたsiRNA発現ベクター（それぞれpCMV-TRz、ptRNA-TRz）について、発現抑制効果の検討を行った。tRNAプロモータからの転写物は、5'側にtRNA分子が付加された構造を有する。なお、トリミングリボザイムの作用により、siRNAの形成に必要ない3'側の余分なRNA分子は切除される。  図１０で示すように、CMVプロモータまたはtRNAプロモータを備えたsiRNA発現ベクターいずれにおいても、ルシフェラーゼ活性の低下が見られた。  よって本発明のsiRNA発現ベクターにおけるプロモータとして、CMVプロモータまたはtRNAプロモータを好適に使用することが可能であることが示された。また、発現ベクターの転写物の5'側にtRNA等の分子が結合したものであっても、標的遺伝子の発現抑制効果を有することが明らかとなった。  ［実施例１０］  ミスマッチまたはバルジを含むsiRNA二本鎖におけるRNAiの誘導  次に、siRNA二本鎖中の塩基対のミスマッチまたはバルジの存在が、RNAi効果に及ぼす影響について検討を行った。次のようなRNA配列を実験に使用し、上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。・対照となるRNA配列：5'-GUGCGCUGCUGGUGCCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3'（配列番号：２２）・ミスマッチを含むRNA配列：5'-GUGCGCUGuUGGUGuCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3'（配列番号：２３）・バルジを含むRNA配列：5'-GUGCGCUGCUGGUGCuCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3'（配列番号：２４）  図１１で示すように、使用した各種発現ベクターにおいて、ルシフェラーゼの抑制活性が見られた。また、siRNA二本鎖中のミスマッチまたはバルジの有無によって、発現抑制活性には大きな差異は見られなかった。  さらに、ミスマッチまたはバルジを含む種々のsiRNAにおけるRNAi効果を検討した。siRNAの片鎖をコードするDNA配列、および該配列におけるRNAi効果（ルシフェラーゼ活性）を図３２に示す。  以上のことから、siRNA二本鎖中にミスマッチまたはバルジを含むものであっても、標的遺伝子の発現を効果的に抑制し得ることが示された。つまり、siRNAの二本鎖を構成するそれぞれの鎖は、互いに完全に相補的なものに限定されない。  ［実施例１１］  テトラサイクリンで誘導可能なプロモータを有するsiRNA発現ベクターによるRNAiの誘導  テトラサイクリンによってRNAプロモータからの転写活性を制御できるシステム（TetON系）が知られている(Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000))。このシステムに用いられるヒトU6プロモータには、テトラサイクリン耐性トランスポゾンのテトラサイクリンオペレータ配列が挿入されている（図１２）。この配列にテトラサイクリンリプレッサータンパク質が結合すると、プロモータ活性が抑制される。このプロモータからの転写制御を受ける発現ベクターは、テトラサイクリンリプレッサータンパク質を発現する細胞（例えば、HeLa細胞）中において、転写活性が抑制された状態にある。これは細胞中のテトラサイクリンリプレッサータンパク質が、ヒトU6プロモータへ結合し、転写活性を抑制するためと考えられる。この細胞へテトラサイクリン（またはテトラサイクリン誘導体）を添加すると、テトラサイクリンリプレッサータンパク質とテトラサイクリンが結合し、テトラサイクリンリプレッサータンパク質がU6プロモー��から遊離するため、その結果、転写が活性化される。  本発明者らはテトラサイクリン耐性トランスポゾンのテトラサイクリンオペレータ配列が挿入されたヒトU6プロモータを有するsiRNA発現ベクターを構築し、TetON系を利用して、siRNA発現ベクターにおける遺伝子抑制効果について検討した。上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。  図１３で示すように、テトラサイクリン耐性トランスポゾンのテトラサイクリンオペレータ配列が挿入されたヒトU6プロモータを備えたsiRNA発現ベクターは、テトラサイクリンの添加により、ルシフェラーゼ活性を低下させた。一方、テトラサイクリンオペレータ配列を含まないsiRNA発現ベクターは、テトラサイクリンの添加の有無にかかわらず、ルシフェラーゼ活性を低下させた。このことから、siRNAの発現を誘導させるプロモータとして、テトラサイクリンで誘導可能な上記のU6プロモータが好適に利用できることが示された。  ［実施例１２］  RNAセルフプロセッシングによるsiRNAの生成  siRNA発現ベクターにおいて、polII系のプロモータを用いた場合、ある程度の長さを有するRNAが転写される。そのため、polII系のプロモータを用いた場合には、例えば、このRNAをセルフプロセッシングにより切断し、アンチセンスRNAまたはセンスRNAを生成させる必要がある。そこで、アンチセンスコードDNAあるいはセンスコードDNAを有し、その5'端、3'端にリボザイムが認識するRNA配列をコードした領域（認識配列コード領域）がそれぞれ備えられ、さらに、この認識配列コード領域の外側にはそれぞれ隣接するように認識配列を切断する5'端、3'端切断用リボザイムがコードされた領域がそれぞれ備えられたRNA生成ユニット（図２）を用いて、実際にRNAのセルフプロセッシングが起こるかどうかを検討した。図１４、１５にRNAセルフプロセッシングの様式を模式的に示す。上記のユニットからの転写物をゲル電気泳動に供することにより解析を行った。  ゲル電気泳動の結果を図１６に示す。図１６の泳動バンドの横に、各バンドに対応する、想定されるRNA分子の構造を示した。RNAセルフプロセッシングによって生成されたものと考えられる、種々の長さのRNAに対応したバンドが観察された。また、21ntの長さのsiRNAのバンドが見られた。このことから、図２で示されるようなRNA生成ユニットを用いれば、RNAのセルフプロセッシングによる切断効果によって、siRNAを効率的に生成させることが可能であることが示された。  ［実施例１３］  EGFP mRNAを標的としたsiRNAライブラリー発現システムの作製  EGFP mRNAのランダムな部位を標的としたsiRNAライブラリー発現システムの作製を行った。作製概要を図１９〜図２３に示す。(a)  約20‐25bp EGFP cDNA断片の調製  図１９-（１）で示したsiRNA発現ライブラリー作製の出発材料となる「脱リン酸化平滑化末端をもつランダムな約20‐25bpのEGFP cDNA断片」を以下のように調製した。図２４にその概要を示した。  pEGFP-N1からEGFPをコードする部分をPCR増幅し、この増幅産物をDNaseI処理することでランダムな約20‐25bpのEGFP cDNA断片を得た。この断片を大量調製するため、得られた断片をKlenow Fragmentにより平滑末端化し、サブクローニングした。サブクローニングに用いたベクターpSwaIはpUC18を改変することで構築した。このベクターは、クローニング部位（SwaI認識部位）の前後���制限酵素BseRIの認識部位を設け、BseRIによりインサートDNAを切り出せるように構成されている。  サブクローニングされた約20‐25bpのEGFP cDNA断片をBseRIで切り出した。BseRI切断後は2塩基余分な粘着末端が形成されるため、これをT4 DNA Polymeraseにより平滑化した。CIAP処理により末端の脱リン酸化を行った。以上の操作によって脱リン酸化平滑化末端をもつランダムな約20‐25bpのEGFP cDNA断片を大量に得た。(b)  EGFP mRNAを標的としたsiRNAのセンスコードDNAとアンチセンスコードDNAをもつDNA断片の合成  (a)で調製した「脱リン酸化平滑化末端をもつ約20‐25bpのEGFP cDNA断片」の両端に5’-リン酸化ヘアピン型DNAリンカー１をライゲーションした（図１９-（２））。このヘアピン型リンカーには、II s型制限酵素BspMIとBsgIの認識部位が設けられており、連結部位またはその近傍で切断することが可能なように構成されている。つぎに、この約20‐25bp cDNA断片とヘアピン型リンカーの連結産物の連結部位に存在するnick部位にBstDNAPolymeraseを作用させ、鎖置換反応を行った。これにより約20‐25bpのEGFP cDNA断片とヘアピン型リンカーが１対１で連結したDNA産物を合成した（図２０-（３））。つぎにこの産物の平滑末端側（EGFP cDNA断片側）に新たな5’端リン酸化DNAリンカー２をライゲーションした（図２０-（４））。このDNAリンカーの片端はPolIII型プロモータからの転写の終結となるAAAAA/TTTTT配列が存在する。もう片端には制限酵素AscIの認識部位が存在する。AAAAA/TTTTT側のみが5’リン酸化されている。  このEGFP cDNA、リンカー１、リンカー2の連結産物に再びBst DNA Polymeraseを作用させ、連結部位に存在するnick部位から鎖置換反応を行った（図２１-（５））。これによりEGFP mRNAを標的としたsiRNAのセンスコードDNAとアンチセンスコードDNAが直列に存在するDNA断片を合成した。センスコードDNAとアンチセンスコードDNAの間にはII s型制限酵素BspMIとBsgIの認識部位が存在する。(c)  EGFP mRNAを標的としたsiRNAのセンスコードDNAとアンチセンスコードDNAをもつDNA断片のクローニング  (b)で合成したEGFP mRNAを標的としたsiRNAのセンスコードDNAとアンチセンスコードDNAをもつDNA断片をAscI切断し、粘着末端、平滑末端をもつDNA断片に調製した（図２１-（６））。つぎにこの断片をクローニングするためのヒトU6プロモーターを保持したクローニングベクターを構築した（図２５）。プロモータの下流には、制限酵素BspMI、BseRI、AscIの認識部位が存在し、BspMIでプロモータの直下を切断、Klenowで切断部位を平滑化後、AscIで切断し、粘着末端、平滑末端をもったクローニングベクターを調製した。このベクターにEGFP mRNAを標的としたsiRNAのセンスコードDNAとアンチセンスコードDNAをもつ平滑末端、粘着末端のDNA断片を連結し、クローニングした（Anti-EGFP U6型 siRNA発現プレ・ライブラリー）（図２２-（７））。  またヒトｔRNA-valプロモータを保持したクローニングベクターも構築した（図２５）。ヒトｔRNA-valプロモータの下流にも同様に制限酵素BspMI、BseRI、AscIの認識部位が存在する。クローニングベクター調製はBspMIの代わりにBseRI切断でも可能であり、このベクターの場合はBseRIでプロモータの直下を切断し、T4 DNA polymeraseで切断部位を平滑化後、AscIで切断、同様にクローニングを行った（Anti-EGFP tRNA型 siRNA発現プレ・ライブラリー）。  siRNA発現プレ・ライブラリープラスミドDNAをsiRNAのセンスコードDNAとアンチセンスコードDNAの間のBspMIで切断し（図２２-（８））、Klenowで切断断片を平滑化し自己連結させることで、プロモータ、アンチセンスDNA、センスDNA、TTTTTが一列につながったAnti-EGFP siRNA発現ライブラリーを構築した（図２２-（９））。シークエンス解析の結果、目的の産物ができていることを確認した。表１にAnti-EGFP U6型 siRNA発現ライブラリーのsiRNAコードDNAのシークエンス例を示す。2003046186.tif 000074
表１中、アンチセンスコード、センスコードはEGFP mRNAのそれと逆転する場合があるが、RNAi誘導には問題はない。  また、プレ・ライブラリープラスミドDNAを先にBsgI切断、その後BspMI切断し（図２３-（８）-2）、T4 DNA polymeraseで切断部位を平滑化後自己連結を行うことで、アンチセンスDNAとセンスDNAの間にsiRNAのLoop配列となるTTCGが存在するsiRNA発現ライブラリーを構築した。ヘアピン型DNAリンカー１の配列、制限酵素の種類、位置を変更することで、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAの間のLoop配列を自由に変更したり、プロモータや選択マーカー等の断片を加えたりすることが可能である。  ［実施例１４］  EGFP mRNAを標的としたsiRNAライブラリー発現システムの評価  上記Anti-EGFP U6型 siRNA発現ライブラリー（1μg）、pEGFP-N1（0.01μg）をヒトHeLaS3細胞にリポフェクション法（リポフェクトアミン2000）コトランスフェクションした。37℃で48時間静置した後、共焦点顕微鏡で観察した。なお、コントロール実験として、siRNAライブラリー発現システムに代えてpUC18（1μg）を用いて同様の操作を行った。  結果、図２６に示すようにpEGFP-N1による緑色の蛍光を発する細胞は、コントロール（pUC18導入群）に比べ、Anti-EGFP U6型 siRNAライブラリー発現システム導入群で減少しており、FACS解析の結果細胞の蛍光発光強度の低下もみられた（図２７）。このことより、Anti-EGFP U6型 siRNAライブラリー発現システムの導入により、RNAiが誘導され、標的遺伝子の発現抑制が示された。  Anti-EGFP U6型 siRNAライブラリー発現システムの中にRNAiを誘導するクローンが存在し、それらにより標的遺伝子の発現抑制されたと期待される。  また、Anti-EGFP tRNA型siRNAライブラリー発現システムにおいても同様の結果が示された（図２６、図２７）。  ［実施例１５］  siRNA発現アデノウイルスベクターおよびHIVベクターによる発現抑制効果  評価用マーカー遺伝子としては、ルシフェラーゼ (pGL3-Control：プロメガ社)を用いた。SiRNAは、ヒトU6プロモータによりタンデム型で発現させた。標的とした配列はsiteB： 5'-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3’（配列番号：４３）とした。アデノウイルスベクターは水口らの方法（日本臨床，５８，１５４４−１５５３（２０００））に従い調製を行った。１）RNAi発現カセットのシャトルプラスミドへの組み込み  クロンテック社から公開されているPShuttleのシークエンスでは、HincII siteが3箇所有るが、シークエンスの結果、実際には、I-CeuI、PI-SceI内の1箇所のみしか存在しないことを確認した。  発現プラスミド（pU6i-FGLB）をHindIIIで切断後、Klenow処理で末端を平滑化した。次にEcoRIで切断して、発現カセット（約600bp）をEcoRI、HincII処理したシャトルベクター（pShuttle）に組み込み、pU6i-FGLB/Shuttleを構築した。２）発現カセットのPSuttleからのAdベクタープラスミドへの組み込み、およびAdベクターの作製  RGDファイバーを持つAdベクタープラスミド（pAdHM15-RGD）にRNAi発現カセットを水口らの方法に従って、組み込み、pU6-FGLB/RGDを構築した。  コントロールとして、インサートを持たないpAdHM15-RGDとpU6-FGLB/RGDをPacI消化後、TransIT293（TaKaRa社製）を用いてリポフェクションした。CPEの出た細胞から、水口らの方法に従って、Adベクターを調製した。  塩化セシウム超遠心法で調製した、Adベクターを1%BSA入りのPBS(-)で1晩透析してAdベクターを精製した。精製したAdベクターのタイターはAdeno-X Rapid Titer Kit (Clontech社製)を用いて、測定した。測定した各Adベクターのタイターは以下の通りだった。RGD/Ad（コントロール） : 6.76×10^10 ifu/mlU6-FGLB/Ad    : 5.27×10^10 ifu/ml３）HeLa-S3細胞の調製  HeLa-S3細胞を5×10^5 cells/mlとなるように調製し、1ml/wellずつ6well plateに播いた。次に、各種Ad vectorをMoi 1,10,20,50,100となるように各wellに添加した。24時間後のリポフェクション前に培地を1.5ml加えた。４）ルシフェラーゼプラスミドのリポフェクション  Adをトランスダクションして24時間後に、1ウェル当たり以下の組成でルシフェラーゼ発現プラスミドをリポフェクションした。  Opti-MEMを250ul入れたTubeAにpGL3-Controlを0.02ug、pRL-Tkを0.1ug、pUC19を1.0ug加えた。Opti-MEMを250ul入れたTubeBにLipofectAmine2000 (Invitrogen社製)を5ul加え、室温で5分間静置した後、全量をTubeAに加えてよく混ぜ合わせた。室温で20分間静置した後、全量を各ウェルに加え、37℃で48時間培養した。５）ルシフェラーゼアッセイ(Luciferase assay)  ルシフェラーゼアッセイはプロメガ社のDual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて測定した。  リポフェクション後48時間培養したプレートの各ウェルを500ulのPBS(-)で1回洗浄した。PBS(-)を除去した後、1×PLBを各ウェル500ul ずつ加え、室温で15分間、時々プレートを震盪しながら細胞を溶解した。細胞溶解液を1.5ml tubeに移し、14000rpmで1分間遠心した後、上清を新しい1.5ml tubeに移した(PLB Lysate)。  ルシフェラーゼ活性の測定はベルトールド社製のAutoLumatPLUS LB953を用いて測定した。10ulのPLB Lysateを用いて、FireFly Luciferase（ホタルルシフェラーゼ）とRenilla Luciferase（ウミシイタケルシフェラーゼ）を各10秒間測光した。ホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケルシフェラーゼのRLU値の比をもとに、コントロールのRGD/Adを導入した細胞の値を100%として、それぞれのRNAi発現Adのルシフェラーゼ抑制効果を表した（図２９）。  同様にして、HIVベクターについても発現抑制効果を検討した結果、図３０で示すように、RNAi発現HIVのルシフェラーゼ抑制効果が見られた。  siRNA発現HIVベクターの作製はsiRNA発現アデノウイルスベクターとほぼ同様に、HIVシャトルベクターにFireFly luciferaseに対するsiRNA発現カセットを挿入することにより、作製した。標的とした配列はsiteB： 5'-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3’（配列番号：４３）であり、プロモータはU6を用い、発現されるRNAは5'-GUGCGCUGCUGGUGCCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3'（配列番号：２２）、5'-GUGCGCUGuUGGUGuCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3'（配列番号：２３）、5'-GUGCGuUGuUGGUGuuAAuCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3'（配列番号：５７）のステムループタイプである。siRNA発現シャトルプラスミドを293T細胞に導入し、ウイルスパーティクルを常法により回収、濃縮し、293細胞に５〜８MOIでトランスフェクションした。その後アデノウイルスの場合と同様にルシフェラーゼ活性によりRNAi効果を調べた。  ［実施例１６］  siRNA発現ダンベル型ベクターにおける発現抑制効果  次に、siRNA発現ダンベル型ベクターを用いて、発現抑制効果の検討を行った。siRNA発現ベクターは以下のものを使用し、上述の実施例と同様の条件でルシフェラーゼ解析を行った。・ステム型siRNAをヒトU6プロモータによって発現させるベクター(pU6stem)・siRNAを発現させるダンベル型のベクター(Dumbbell)  図３１で示すように、siRNA発現ダンベル型ベクターにおいて、ルシフェラーゼの抑制���性が見られた。すなわち、siRNA発現システムをダンベル型ベクターへ保持させることにより、効率的な発現抑制効果が見られることが示された。産業上の利用の可能性  上記の通り、細胞内siRNA発現システムを用いることにより、標的遺伝子の発現を抑制することができた。また、一つのベクターに複数の標的遺伝子に対するsiRNA発現システムを保持させ、細胞に導入した結果、複数の標的遺伝子の発現を抑制することもできた。このような細胞内siRNA発現システムを用いることにより、siRNAが細胞内で供給されるため、安定的かつ長期にわたるsiRNAの発現、すなわち、標的遺伝子の抑制を行うことも可能となる。また、ウイルスベクターなどを用いることにより細胞内への導入効率も向上させることができるため、より確実に哺乳動物細胞においてRNAiを誘導させることが可能となる。よって、本システムは、RNAiを利用した遺伝子治療、ノックダウン動物の創生に寄与し得る。  また、本システムを機能遺伝子の探索方法に活用し得るように、siRNAライブラリー発現システム、および該システムの集合体が提供された。これらシステム等を用いることにより、機能遺伝子の探索を簡易かつ効率的なものとすることができる。そのため、本siRNAライブラリー発現システム等は、機能遺伝子の加速的な解明に寄与し得る。【図面の簡単な説明】  図１は、U6プロモータを用いたsiRNA発現システムおよび、これを用いてsiRNAを生成するための方法を示す図である。（A）二つのU6 プロモータは、センスとアンチセンスとの短鎖RNAを生成し、この生成の際にRNAの3'末端には４つのUを付加する。そして、発現されたセンスおよびアンチセンスRNAはアニールして、3'末端に４塩基の突出を備えたsiRNA 二重鎖を形成する。（B）パリンドロームタイプの発現システムを示す。中央に、センスコードDNAとアンチセンスコードDNAとが二重鎖になったsiRNAコードDNAを備え、その両端にプロモータが備えられ、これらプロモータからセンスRNA、アンチセンスRNAが発現される。  図２は、リボザイムを用いてsiRNAを生成させるための構成例を示す図である。  図３は、ハイグロマイシン/EGFPを発現している細胞にEGFPに対するsiRNA発現システムを導入し、EGFPの発現抑制効果を示す写真である。左のパネル (A, D, G, J)は、Hygromycin/EGFPの発現を示す。中央のパネル(B, E, H, K)は、 DsRedの発現を示す写真である。右のパネル(C, F, I, L)は、Hygromycin/EGFP とDsRedの発現を重ね合わせた結果を示す。  図４は、ルシフェラーゼ活性を有するHeLaS3細胞に ウミシイタケまたはホタルルシフェラーゼに対するsiRNAを発現するシステムを導入した際の効果を示す図である。Aに示す値は、ホタルルシフェラーゼに対するsiRNAを導入した群は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を基に標準化し、ウミシイタケルシフェラーゼに対するsiRNAを導入した群は、ホタルルシフェラーゼ活性を基に標準化した。Bはホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼに対するsiRNAを発現するシステムを濃度依存的に導入した際の各ルシフェラーゼの抑制効果を示した。  図５は、同一標的遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）の異なる標的部位に対するsiRNAまたはsiRNA発現システムのシリーズを用いて、発現抑制活性を解析した結果を示す図である。Aは種々の標的部位に対するsiRNA発現ベクターを導入した際の発現抑制活性を解析した結��を示し、Bは標的部位の異なるsiRNAを濃度を変えて外来より直接導入した際の結果を示す。  図６は、siRNAオリゴヌクレオチドの3'末端の長さによる発現抑制への影響を調べた結果（A）、二つの標的遺伝子または二つの標的部位に対するsiRNA発現システムにより発現抑制効果（B）を示す図である。Bにおいて、ルシフェラーゼ活性値はインターナルコントロールとして導入したβ−ガラクトシダーゼ活性により標準化した。  図７は、内因性のβカテニン遺伝子の発現をsiRNA発現システムにより抑制し得るかを解析した結果を示す写真である。図において、パネルA、B、Cはβカテニンに対するsiRNAを発現するベクター(pHygEGFP/iβ-catenin)を導入した群であり、D, E, F は空のベクターを (pHygEGFP)を導入した群であり、これら群は全て抗βカテニン抗体により染色した。また、左側のパネル（A, D）はHygromycin/EGFPの発現を、中央のパネル (B, E)はβカテニンの発現を、そして右側のパネル (C, F)は、これらを重ねあわせたイメージを示す。  図８は、タンデム型siRNAとステム型siRNAのRNAi効果を比較解析した結果を示す図である。pU6tandem19はタンデム型、pU6stem19はステム型のsiRNA発現ベクターである。Cont.は対照（空のベクター）を表す。  図９は、種々のsiRNA発現ベクターにおける発現抑制効果を解析した結果を示す図である。  図１０は、サイトメガロウイルス由来プロモータ(CMVプロモータ)、およびtRNAプロモータを備えたsiRNA発現ベクターにおける発現抑制効果を解析した結果を示す図である。  図１１は、ミスマッチまたはバルジを含むsiRNA二本鎖のRNAi誘導効果を解析した結果を示す図である。  図１２は、Tet-ONシステムの原理を模式的に示す図である。テトラサイクリン非存在下においては、テトラサイクリンリプレッサータンパク質がU6プロモータへ結合するため転写が抑制される。一方、テトラサイクリンが存在すると、テトラサイクリンがテトラサイクリンリプレッサータンパク質と結合し、U6プロモータから遊離するため、転写がオンになる。  図１３は、テトラサイクリンで誘導可能なプロモータを有するsiRNA発現ベクターによるRNAiの誘導効果を示す図である。U6Tetiはテトラサイクリンオペレータ配列をU6プロモータ中に含むsiRNA発現ベクターを、U6iは該配列を含まないsiRNA発現ベクターを表す。  図１４は、トリミングリボザイムを含むRNA転写物におけるオートマチック切断の様式を模式的に示す図である。  図１５は、トリミングリボザイムのセルフプロセッシングによるsiRNAの生成の様式を示す図である。黒三角で示す場所で塩基の切断が起こり、siRNAが生成される。  図１６は、RNAセルフプロセッシングによるsiRNAの生成を示すゲル電気泳動の写真である。21ntのsiRNAに相当するバンドを矢印で示す。  図１７は、Cre-loxシステムを用いてsiRNAの発現を制御する構成の一例を示す図である。  図１８は、ステム型のsiRNAライブラリー発現システムの作製方法の一例を模式的に示す図である。  図１９は、siRNAライブラリー発現システムの作製方法の一例を示す図である。（１）は、19bp〜29bpの脱リン酸化平滑末端をもつランダムなDNA断片を示す。（２）は、（１）の両端に5'リン酸化ヘアピン型DNAリンカー1をライゲーションさせた図である。  図２０は、図１９の続きの図である。（３）は、Bst DNA PolymeraseによるNick部位からの鎖置換反応図である。（４）��、DNAリンカー２をライゲーションした図である。  図２１は、図２０の続きの図である。（５）は、Bst DNA PolymeraseによるNick部位からの鎖置換反応図である。（６）は、（５）に対するAscIによる切断図である。  図２２は、図２１の続きの図である。（７）は、siRNAライブラリー発現プレ・ライブラリーの図である。（８）は、siRNAライブラリー発現プレ・ライブラリーのBspMI切断図である。センスコードDNAとアンチセンスコードDNAの間にLoop配列TTCGを入れる場合は、ステップ（８）-2へ進む。（９）は、Klenow Fragmentによる平滑化、DNAリンカー1除去、自己連結の結果の、siRNAライブラリー発現システム完成図である。  図２３は、図２２の続きの図である。（８）-2は、上記（８）において、センスコードDNAとアンチセンスコードDNAの間にLoop配列TTCGを入れる場合の図である。siRNAライブラリー発現プレ・ライブラリーをBsgIで切断する。（８）-3は、BspMIによる切断図である。BsgIで切断された側はBspMI切断ができない。（９）-2は、T4 DNA Polymeraseによる平滑化、DNA1リンカー除去、自己連結の結果の、siRNAライブラリー発現システムの完成図である。  図２４は、約20bp〜25bp EGFP cDNA断片の調製を模式的に表わした図である。最終産物である、脱リン酸化平滑化末端をもつランダムな約20-25bpのEGFP cDNA断片は、図１９（１）における材料となる。  図２５は、クローニングベクターの調製を模式的に表わした図である。使用したプロモータは、ヒトU6プロモータ、あるいは、ヒトtRNAプロモータである。U6プロモータ保持クローニングベクターは、BspMI、Klenowで調製、tRNAプロモータ保持クローニングベクターは、BseRI、T4 DNA Polymeraseで調製した。  図２６は、EGFP蛍光強度を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。  図２７は、pUC18,U6 GFP25 siRNA lib-loop-、U6 GFP25 siRNA lib TTCG、tRNA GFP25 siRNA lib loop-、tRNA GFP25 siRNA lib TTCGの各サンプルにおけるEGFPの蛍光強度を、トランスフェクションの24時間および48時間後に計測し相対的に比較した図である。  図２８は、リンカー部分にストップ配列を挟むように二つのloxPを備えた、ステム型siRNA発現システムを模式的に示す図である。  図２９は、siRNA発現アデノウイルスベクターによる発現抑制効果を示す図である。  図３０は、siRNA発現HIVベクターによる発現抑制効果を示す図である。  図３１は、siRNA発現ダンベル型ベクターによる発現抑制効果を示す図である。  図３２は、siRNAのRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中にミスマッチまたはバルジを含むsiRNA発現システムにおける発現抑制効果を示す図である。各配列先頭の括弧内は、配列番号を示す。【配列表】                               SEQUENCE LISTING<110> CENTER FOR ADVANCED SCIENCE AND TECHNOLOGY INCUBATION, LTD.<120> siRNA expression systems and methods for generating      cells with disrupting gene functions using the systems.<130> SEN-A0124P2<140><141><150> JP 2001-363385<151> 2001-11-28<150> PCT/JP02/11293<151> 2002-10-30<160> 57<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 1gctatgaaac gatatgggc                                              19    <210> 2<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 2gcccatatcg tttcatagc                                              19    <210> 3<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 3gttcgtcaca tctcatctac                                             20    <210> 4<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 4gtagatgaga tgtgacgaa                                              19    <210> 5<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      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ccgctcttcg cgccaaaaan nnnnnnnnnn nnnnnnnntt 60    cggcaggtcc ggtcgaccct gcacgcggcc aaggccgaaa aggccgcggc cgcaagcagg 120   ctcgaccgga cctgccgaan nnnnnnnnnn nnnnnnnntt tttggcgcga agagcggcgc 180   gccaagcttc tcgag                                                  195   <210> 31<211> 152<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (39)..(55)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<220> <221> misc_feature<222> (137)..(152)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 31ggctcgagaa gcttggcgcg ccgctcttcg cgccaaaaan nnnnnnnnnn nnnnnttcgg 60    caggtccggt cgaccctgct tgcggccgcg gccttttcgg ccttggccgc gtgcagggtc 120   gaccggacct gccgaannnn nnnnnnnnnn nn                               152   <210> 32<211> 152<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (1)..(16)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<220> <221> misc_feature<222> (98)..(113)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 32nnnnnnnnnn nnnnnnttcg gcaggtccgg tcgaccctgc acgcggccaa ggccgaaaag 60    gccgcggccg caagcagggt cgaccggacc tgccgaannn nnnnnnnnnn nnntttttgg 120   cgcgaagagc ggcgcgccaa gcttctcgag cc                               152   <210> 33<211> 142<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (24)..(42)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<220> <221> misc_feature<222> (124)..(142)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 33cgcgccgctc ttcgcgccaa aaannnnnnn nnnnnnnnnn nnttcggcag gtccggtcga 60    ccctgcttgc ggccgcggcc ttttcggcct tggccgcgtg cagggtcgac cggacctgcc 120   gaannnnnnn nnnnnnnnnn nn                                          142   <210> 34<211> 138<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (1)..(19)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<220> <221> misc_feature<222> (101)..(119)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 34nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tcggcaggtc cggtcgaccc tgcacgcggc caaggccgaa 60    aaggccgcgg ccgcaagcag ggtcgaccgg acctgccgaa nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt 120   ttttggcgcg aagagcgg                                               138   <210> 35<211> 43<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (6)..(43)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 35aaaaannnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn                   43    <210> 36<211> 43<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (1)..(38)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 36nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt ttt                   43    <210> 37<211> 47<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (6)..(24)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<220> <221> misc_feature<222> (29)..(47)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 37aaaaannnnn nnnnnnnnnn nnnncgaann nnnnnnnnnn nnnnnnn               47    <210> 38<211> 47<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<220> <221> misc_feature<222> (1)..(19)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<220> <221> misc_feature<222> (24)..(42)<223> "n" = any one base of a, t, g, or c.<400> 38nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnttttt               47    <210> 39<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 39cccgtgccct ggcccaccct cgtg                                        24    <210> 40<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 40cacgagggtg ggccagggca cggg                                        24    <210> 41<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 41accaggatgg gcaccacccc ggtg                                        24    <210> 42<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 42caccggggtg gtgcccatcc tggt                                        24    <210> 43<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 43gtgcgctgct ggtgccaac                                              19    <210> 44<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 44gtgcgctgct ggtgccaacc c                                           21    <210> 45<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 45gtgcgttgtt ggtgttaatc c                                           21    <210> 46<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 46gtgcgctgct ggtgtcaacc c                                           21    <210> 47<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 47gtgcggtggt ggtgggaagc c                                           21    <210> 48<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 48gtgcgttggt ggtggcaacc c                                           21    <210> 49<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 49gtgcgctcat ggtaccaacc c                                           21    <210> 50<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 50gtgcgctgct ggtgtcaacc c                                           21    <210> 51<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 51gtgcgctgtt ggtgtcaacc c                                           21    <210> 52<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 52gtgtgttgtt ggtgtcaatc c                                           21    <210> 53<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 53gtgtgttgtt ggtgttaatt c                                           21    <210> 54<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 54gtgcgttgtt ggtgtttaat cc                                          22    <210> 55<211> 23<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 55gtgcgctgtc tggtgctcaa ccc                                         23    <210> 56<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 56gtgtcgctgt ctggtgctca actcc                                       25    <210> 57<211> 53<212> RNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially      Synthesized Sequence<400> 57gugcguuguu gguguuaauc cgugugcugu ccggguuggc accagcagcg cac        53
【国際調査報告】
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