(57)【要約】本発明のタンパク質の分離方法は、粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を用いて分離することを特徴とする。本発明のタンパク質の分離方法によれば、目的とするタンパク質を工業的規模での大量処理をその機能を損なうことなく、例えば酵素活性低下なしに、簡便、安価で優れた効率で得ることが可能となり、タンパク質を濃縮・精製することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を用いて分離することを特徴とするタンパク質の分離方法。
【請求項２】
前記粘土鉱物組成物がベントナイト、モンモリナイト、カオリナイト、イライト、緑泥石、ハイドロタルサイト及びそれらの焼成物または変性物からなる群より選ばれる１種または２種以上を含むものである請求項１記載のタンパク質の分離方法。
【請求項３】
前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上の平均分子量が１０００未満である請求項１または２に記載のタンパク質の分離方法。
【請求項４】
前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上として、該脂肪酸エステルの全体量に対し、モノ脂肪酸エステルが５０質量％以上であるものを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質の分離方法。
【請求項５】
前記タンパク質が酵素タンパク質、生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質の分離方法。
【請求項６】
前記タンパク質が脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質の分離方法。
【請求項７】
水分存在下で行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質の分離方法。
【請求項８】
下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を有することを特徴とする濃縮・精製タンパク質の製造方法。
（Ｉ）タンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させる工程；及び
（ＩＩ）粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離する工程。
【請求項９】
さらに、前記工程（Ｉ）を経た後に、下記工程（Ｉ−Ａ）および／または（Ｉ−Ｂ）を実施することを特徴とする請求項８に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
（Ｉ−Ａ）該タンパク質を吸着させた粘土鉱物組成物を回収する工程、
（Ｉ−Ｂ）該タンパク質を吸着させた粘土鉱物組成物を精製処理する工程。
【請求項１０】
さらに、前記工程（ＩＩ）を経た後に、下記工程（ＩＩＩ）を実施することを特徴とする請求項８または９に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
（ＩＩＩ）タンパク質の分離に用いた脂肪酸エステルを除去する工程および／または分離したタンパクを回収する工程。
【請求項１１】
タンパク質を含有する溶液に粘土鉱物組成物を添加し、攪拌処理することでタンパク質を吸着させた後、遠心分離機および／または膜によりタンパク質を吸着した粘土鉱物組成物を回収し、該回収されたタンパク質を吸着した粘土鉱物組成物から脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を用いてタンパク質を分離することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
粘土鉱物組成物を固定した膜および／またはカラムに、タンパク質を含有する溶液を通液することで上記粘度鉱物組成物にタンパク質を吸着させ、その後脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上の含有液を上記膜および／またはカラムに通液することでタンパク質を分離することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
前記粘土鉱物組成物がベントナイト、モンモリナイト、カオリナイト、イライト、緑泥石、ハイドロタルサイト及びそれらの焼成物または変性物からなる群より選ばれる１種または２種以上を含むものである請求項８〜１２のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
前記吸着に使用する粘度鉱物組成物の平均粒子径が０．１〜１００μｍである請求項８〜１４のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１５】
脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上からなる脂肪酸エステルの平均分子量が１０００未満である請求項８〜１４のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上として、該脂肪酸エステルの全体量に対し、モノ脂肪酸エステルが５０質量％以上であるものを用いることを特徴とする請求項８〜１５のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が酵素タンパク質、生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項８〜１６のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項８〜１７のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
水分存在下で行うことを特徴とする請求項８〜１８のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項２０】
タンパク質の回収率が７０％以上である請求項８〜１９のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法
【請求項２１】
得られる濃縮・精製タンパク質の電気伝導度（ｍｓ／ｃｍ）が５以下となる請求項８〜２０のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項２２】
比活性が３倍以上に濃縮・精製される請求項８〜２１のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質の製造方法。
【請求項２３】
請求項８〜２２のいずれか１項に記載の方法により得られる濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項２４】
さらに、水溶性高分子化合物、２価の金属イオン、酸化防止剤、タンパク質の１種または２種以上を含有することを特徴とする請求項２３に記載の濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項２５】
水溶性高分子化合物が多水酸基性化合物である請求項２４に記載の濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項２６】
２価の金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、銅イオンからなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項２４に記載の濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項２７】
酸化防止剤が、アスコルビン酸、２−メルカプトエタノール、システイン、ジチオトレイトールからなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項２４に記載の濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項２８】
タンパク質が油糧種子由来のタンパク質およびその加水分解物からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項２３または２４に記載の濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項２９】
前記タンパク質が酵素タンパク質及び生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項３０】
前記タンパク質が脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質組成物。
【請求項３１】
請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の濃縮・精製タンパク質組成物を飲食物の製造処理において使用する方法。
【請求項３２】
前記飲食物が、油脂および／または油脂加工品である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離することで得られるタンパク質含有脂肪酸エステル組成物。
【請求項３４】
さらに、水溶性高分子化合物、２価の金属イオン、酸化防止剤、タンパク質の１種または２種以上を含有することを特徴とする請求項３３に記載のタンパク質含有脂肪酸エステル組成物。
【請求項３５】
水溶性高分子化合物が多水酸基性化合物である請求項３３または３４に記載のタンパク質含有脂肪酸エステル組成物。
【請求項３６】
２価の金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、銅イオンからなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項３４に記載のタンパク質含有脂肪酸エステル組成物。
【請求項３７】
酸化防止剤が、アスコルビン酸、２−メルカプトエタノール、システイン、ジチオトレイトールからなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項３４に記載のタンパク質含有脂肪酸エステル組成物。
【請求項３８】
タンパク質が油糧種子由来のタンパク質およびその加水分解物からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項３３または３４に記載のタンパク質含有脂肪酸エステル組成物。
【請求項３９】
前記タンパク質が酵素タンパク質及び生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のタンパク質含有脂肪酸エステル組成物
【請求項４０】
前記タンパク質が脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である請求項３３〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質含有脂肪酸エステル組成物
【請求項４１】
下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を有することを特徴とするタンパク質の回収方法。
（Ｉ）タンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させる工程；及び
（ＩＩ）粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離させる工程。
【請求項４２】
蛋白質の反応処理中および／または処理後に、該蛋白質を回収することを特徴とする請求項４１に記載の回収方法。
【請求項４３】
廃液から酵素タンパク質を回収することを特徴とする請求項４１または４２に記載の回収方法。
【請求項４４】
脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を含有することを特徴とする粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を分離するための蛋白質分離剤。
【請求項４５】
前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上の平均分子量が１０００未満である請求項４４に記載のタンパク質分離剤。
【請求項４６】
前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上として、該脂肪酸エステルの全体量に対し、モノ脂肪酸エステルが５０質量％以上であるものを含有することを特徴とする請求項４４または４５に記載のタンパク質分離剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は酵素タンパク質、生理活性タンパク質等の濃縮・精製タンパク質の製造方法、回収方法等に関する。
背景技術
従来、タンパク質水溶液を分離・濃縮・精製するためには、両性電解質であるタンパク質をイオン交換法、分子篩効果を用いたゲルろ過法、タンパク質の等電点を利用した等電点電気泳動法が一般的に利用されている。しかしながら、これらの従来の手法によって粗タンパク質の分離・濃縮・精製を行うためには、予めタンパク質溶液の脱塩処理、濃縮処理などの予備処理を必要とするため、工業的規模では、工程が複雑になり、コスト上の問題など多くの技術的課題があり、安価に効率的に分離・濃縮・精製できる方法が望まれてきた。
従来、タンパク質の中には粘土鉱物質に特異的に吸着されるタンパク質があることは、古くから知られている。しかしながら、粘土鉱物質に一旦吸着されたタンパク質は一般的に溶出がきわめて困難であり、ほとんどの場合、不可逆的吸着であった。更に、一旦吸着されたタンパク質を、溶出させるためには、ｐＨやイオン強度を変えて行うが、このような処理によってタンパク質の高次構造に変化を生じる可能性があり、いまだに安価且つ入手容易な溶出溶媒で、簡単に且つ効率よく溶出処理して分離・濃縮・精製できない技術的課題があった。
このような、粘土鉱物を利用した酵素タンパク質の処理に関して従来、いくつかの提案が知られている。
たとえば、特開昭５１−７０８７４号公報には、α−１，６−グルコシダーゼを粘土またはケイソウ土に吸着させることを特徴とするα−１，６−グルコシダーゼの回収および不溶化法が記載されている。該公報には、吸着されたα−１，６−グルコシダーゼは５〜１０％濃度の食塩水に懸濁し、ｐＨ７〜９に調整することにより溶出できることが記載されているだけである。
また、特開昭５１−７０８７３号公報には、β−アミラーゼ（α−１，４−グルカンマルトヒドロラーゼ）およびα−１，６−グルコシダーゼを生産するバチルス属細菌のβ−アミラーゼを５０℃〜６５℃の温度で加熱処理された澱粉に吸着させることを特徴とするバチルス属β−アミラーゼの吸着方法、更に、該バチルス属細菌のβ−アミラーゼとα−１，６−グルコシダーゼを５０℃〜６５℃の温度に加熱処理された澱粉とケイソウ土の混合物に吸着させることを特徴とするバチルス属β−アミラーゼとα−１，６−グルコシダーゼの吸着方法が開示されている。該公報は、前者の態様で該澱粉からβ−アミラーゼを溶出するには、１〜１０％、通常５〜１０％のマルトース溶液又は水あめのようなデキストリン溶液などのでんぷんの部分分解物の溶液で溶出でき、また、後者の態様では、両酵素の溶出は食塩５〜１０％を含むマルトースなど澱粉部分分解物溶液（糖濃度１〜１０％、通常５〜１０％）で行なわれることが記載されている。
最近の提案として、特開昭６３−１３２８９８号には、酵素タンパク質、生理活性タンパク質を粘土鉱物と接触させて該タンパク質を高分子化合物の水溶液を溶出溶媒として溶出処理する方法が記載されているが、この方法においては、接触させた高分子化合物の分離が困難であるという問題があった。
本発明は、粘土鉱物組成物に可吸着性タンパク質を、その機能性に関与する高次構造を損なうことなく、温和な条件で且つ容易な操作で高純度・高回収率での分離、濃縮・精製、回収を行うことを課題とし、また、従来大量濃縮・精製の容易でない医薬、酵素、食品、その他の多くの分野におけるタンパク質の濃縮・精製を工業的規模で行うことを課題とする。
発明の開示
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意研究した結果、粘土鉱物組成物に吸着した酵素タンパク質、生理活性タンパク等のタンパク質を、低分子量である脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを用いることにより、容易に分離することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を用いて分離することを特徴とするタンパク質の分離方法に関する。好ましくは、前記粘土鉱物組成物がベントナイト、モンモリナイト、カオリナイト、イライト、緑泥石、ハイドロタルサイト及びそれらの焼成物または変性物からなる群より選ばれる１種または２種以上を含むものであり、好ましくは前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上の平均分子量が１０００未満であり、また、該脂肪酸エステルの全体量に対し、モノ脂肪酸エステルが５０質量％以上であるものを用いることが好ましい。好ましくは、前記タンパク質が酵素タンパク質、生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上であり、さらに脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上であることが好ましい。また、好ましくは水分存在下でタンパク質の分離を行うことが好ましく、水溶液中で行うことが好ましい。
本発明は、タンパク質の濃縮・精製法に関し、下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を有することを特徴とする濃縮・精製タンパク質の製造方法に関する。
（Ｉ）タンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させる工程；
（ＩＩ）粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離する工程。
好ましくは、さらに、前記工程（Ｉ）を経た後に、下記工程（Ｉ−Ａ）および／または（Ｉ−Ｂ）を実施することを特徴とする濃縮・精製タンパク質の製造方法に関し、
（Ｉ−Ａ）該タンパク質を吸着させた粘土鉱物組成物を回収する工程、
（Ｉ−Ｂ）該タンパク質を吸着させた粘土鉱物組成物を精製処理する工程。
好ましくは、さらに、前記工程（ＩＩ）を経た後に、下記工程（ＩＩＩ）を有することを特徴とする濃縮・精製タンパク質の製造方法に関する。
（ＩＩＩ）タンパク質の分離に用いた脂肪酸エステルを除去する処理および／または分離したタンパクを回収する処理。
具体的には、例えば、タンパク質を含有する溶液に粘土鉱物組成物を添加し、攪拌処理することでタンパク質を吸着させた後、遠心分離機および／または膜によりタンパク質を吸着した粘土鉱物組成物を回収し、該回収されたタンパク質を吸着した粘土鉱物組成物から脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を用いてタンパク質を分離することによりタンパク質の濃縮・精製することができる。また、膜および／またはカラムによって固定された粘土鉱物組成物に、タンパク質を含有する溶液を通液することでタンパク質を吸着させ、その後、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上の含有液を通液することでタンパク質を分離し、タンパク質を濃縮・精製することができる。
また、前記粘土鉱物組成物がベントナイト、モンモリナイト、カオリナイト、イライト、緑泥石、ハイドロタルサイト及びそれらの焼成物または変性物からなる群より選ばれる１種または２種以上を含むものを用いることが好ましく、前記吸着に使用する粘度鉱物組成物の平均粒子径は０．１〜１００μｍであることが好ましい。好ましくは、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上からなる脂肪酸エステルの平均分子量が１０００未満であり、また、該脂肪酸エステルの全体量に対し、モノ脂肪酸エステルが５０質量％以上であるものを用いることが好ましい。また、好ましくは前記タンパク質が酵素タンパク質、生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上であり、好ましくは前記タンパク質が脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上であることが好ましい。また、水分存在下でタンパク質の分離を行うことが好ましく、水溶液中で行うことが更に好ましい。
本発明により、タンパク質は濃縮・精製されるが、例えば、タンパク質の回収率は７０％以上であり、非常に収率が良く、工業的、コスト的にも好ましい。また、得られる濃縮・精製タンパク質の電気伝導度（ｍｓ／ｃｍ）は５以下となるため、活性に悪影響をあたえる不純物が少なく、活性からの純度が高いといえ、その後の安定性や機能性に優れ、製品的にも好ましい。また、比活性を指標とした濃縮倍率が３倍以上となるように濃縮・精製することができるため好ましい。本発明においては、前記濃縮・精製方法により、濃縮・精製されたタンパク質組成物を得ることができる。さらに、水溶性高分子化合物、２価の金属イオン、酸化防止剤などを加えて、保存安定性を向上させることができる。たとえば、水溶性高分子化合物としては、特に多水酸基性化合物が好ましく、例えばグルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコールがあげられる。また、２価の金属イオンとしては、例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン、銅イオン等があげられる。また、酸化防止剤としては、例えばアスコルビン酸、２−メルカプトエタノール、システイン、ジチオトレイトール等などがあげられる。また、タンパク質としては、例えば大豆、なたね、ゴマ（ｓｅｓａｍｅ）など油糧種子タンパク質やその加水分解物等があげられる。
前述の通り、タンパク質が酵素タンパク質及び生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である場合が好ましく、また、脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上であることが好ましい。これらは、処理前に比べて大幅に濃縮され、不純物が除去されて精製されているため、そのこと自体で、また、有する機能が向上しており、各種飲食物、医薬品、化粧品等に配合することを含め様々な用途に使用することができるが、例えば飲食物の製造工程において使用することができ、また、油脂および／または油脂加工品の製造工程において使用することができる。
本発明は、粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離することで得られるタンパク質含有脂肪酸エステル組成物に関する。例えば、前記濃縮・精製処理において、粘土鉱物組成物からタンパク質を分離した際に、該タンパク質含有脂肪酸エステル組成物を得ることができる。タンパク質を使用するに際し、該脂肪酸エステルを除去する必要がない場合には、タンパク質含有脂肪酸エステル組成物をそのまま使用することができる。好ましくは、さらに、水溶性高分子化合物、２価の金属イオン、酸化防止剤などを加えて、保存安定性を向上させることができる。たとえば、水溶性高分子化合物としては、特に多水酸基性化合物が好ましく、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコールがあげられる。また、２価の金属イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、銅イオン等があげられる。また、酸化防止剤としては、アスコルビン酸、２−メルカプトエタノール、システイン、ジチオトレイトール等などがあげられる。また、タンパク質としては、大豆、なたね、など油糧種子タンパク質やその加水分解物等があげられる。これらからなる群より選ばれる１種または２種以上を含有し、好ましくは、前記タンパク質が酵素タンパク質及び生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上であり、また、脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上であることが好ましい。
本発明は、下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を有することを特徴とするタンパク質の回収方法に関する。
（Ｉ）タンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させる工程；及び
（ＩＩ）粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離させる工程。
特に、酵素反応処理中および／または処理後や、廃液から酵素タンパク質を回収することにより、特にコスト面において好適であり、工業的に好適である。
本発明は、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を含有することを特徴とする粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質の分離剤に関する。好ましくは、前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上の平均分子量が１０００未満であり、また、該脂肪酸エステルの全体量に対し、モノ脂肪酸エステルが５０質量％以上であるものを含有することが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを用いて分離する方法と、この分離方法を応用することで、タンパク質を濃縮・精製する方法、回収する方法等を完成させている。
粘土鉱物にタンパク質を吸着させることは公知であり、その分離方法として、従来は、粘土鉱物に吸着されたタンパク質をｐＨ変化やイオン強度変化により分離する手法が存在していたが、このような手法は、タンパク質の機能性に関与する高次構造に変化を引き起こす恐れのあるような急激なｐＨ変化やイオン強度の変化を伴っている。さらに、後処理として、溶出タンパク質の脱イオン処理を行なうため、透析処理などを行なう必要があり、工業的規模での大量処理が複雑で高価なものになるという問題があった。また、高分子化合物を添加する手法等が存在し、高分子化合物を溶出剤として使用することによって、脱イオン状態の濃縮・精製タンパク質を回収できるとしているが、比較的高濃度の高分子化合物水溶液を添加して、３０分間以上攪拌しておかなければ該タンパク質は溶出しないという問題があった。また、高分子化合物を添加した溶出タンパク質水溶液は少なからず粘性を持つことで、粉末化などの後処理で活性の低下などの悪影響を及ぼすという問題があり、また、高分子化合物は分子量が大きく、タンパク質の分子量と類似しており、一般的濃縮・精製法である限外ろ過法やゲルろ過での分別は困難であり、イオン交換法などの吸着処理を行う必要があった。このイオン交換法では、イオン強度を高くして該タンパク質を溶出させるため、その後、透析などによる脱イオン処理を行なわなければならず、工業的規模での大量処理が複雑で高価なものになる。これだけの工業的・作業的・コスト的問題をクリアーして該高分子化合物を溶出剤として用いた場合でも、溶出タンパク質の回収率は５０％以下にとどまっているというのが現状であった。
ここで、本発明においては、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを用いることで、該吸着したタンパク質を容易に分離することができ、高濃度のタンパク質を得ることができることを見出している。例えば、該脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを添加することにより、攪拌・放置することなく、容易に吸着された該タンパク質を分離することができ、例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上という高い回収率で回収することができる。
また、本発明の分離方法によれば、工業的規模での大量処理をも簡単かつ安価に行うことができ、工業的・コスト的にも優れている。
本発明においてタンパク質を吸着させる粘土鉱物組成物とは、粘土鉱物を含有する組成物を意味するものとし、各種変性処理したものであってもよい。また、粘土鉱物とは、粘土に塑性を与えている一群の含水ケイ酸塩を含有するものである。粘土鉱物組成物としては、特に粘土鉱物のみからなる場合が好ましい。
本発明においては、公知の粘土鉱物が利用でき、例えばベントナイト、モンモリナイト、カオリナイト、イライト、緑泥石、ハイドロタルサイト及びそれらの焼成物または変性物からなる群があげられる。これらは、単独でも使用できるが、複数を組み合わせて併用することも可能である。また、特に制限されないが、ベントナイト、モンモリナイト、カオリナイト及びそれらの焼成物または変性物からなる群より選ばれる１種または２種以上である場合が好ましく、さらにはベントナイトおよび、その焼成物または変性物が好ましく用いられる。
粘土鉱物組成物の形状および使用量は適宜に選択変更できる。たとえば、粉状、粒状、顆粒状、ペレット状、塊状などの形状を例示できる。また、使用量としては、吸着固定されたタンパク質の質量の０．１〜５０倍、好ましくは０．５〜２０倍、さらに好ましくは１〜５倍のであればよい。
また、接触性、水分散性、沈降性等の機能の付加、保形性、を目的として他の成分を配合することができる。
配合例としては、けい藻土、けい砂、セルロース繊維、などがあげられるが、これに限定されるものではない。
また、上記変性処理として、例えば有機変性処理が挙げられる。具体的には、４級アンモニウム、アニオン系ポリマーなどを用いた層表面修飾されたベントナイトやアルキルトリアルコシシランを用いた端面修飾やカルボキシビニルポリマー、プロピレンカーボネートを用いた複合修飾や４級アンモニウム＋アルキルトリアルコキシシランを用いた層表面、端面修飾ベントナイトなどがあげられる。４級アンモニウムやアルキルトリアルコシシランなどによる修飾により、疎水性が付与でき、有機溶剤やプラスチックなどでの利用が可能になる。アニオン系ポリマーによる修飾では高分散性、低粘性、カルボキシビニルポリマーやプロピレンカーボネートによる修飾では高粘性を付与することができる。
タンパク質の吸着とは、表面がマイナスに荷電しており、プラスに荷電している物質を電気的に吸着することができる。蛋白質は、独自の等電点を持っており、蛋白質溶解液のｐＨが等電点より高ければプラスに荷電するため、ベントナイトに電気的に吸着する。また、ベントナイトの主成分であるモンモリナイトの構成成分であるシリカ（Ｓｉ）と蛋白質中の疎水性アミノ酸とが疎水結合していると考えられる。
本発明における粘土鉱物組成物に可吸着性のタンパク質の具体例としては、アミノ酸のみから構成されているタンパク質である単純タンパク質、アミノ酸以外の構成成分も含む複合タンパク質などが挙げられる。単純タンパク質としては、アルブミン、グロブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、硬タンパク質などが挙げられるが、これに限定されるものではない。複合タンパク質としては核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、色素タンパク質、金属タンパク質などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、生理活性タンパク質、酵素タンパク質、などの機能を持ったタンパク質が挙げられる。
生理活性タンパク質の具体例としては、たとえば、大豆グロブリン、小麦グロブリン、ゴマグロブリン（ｓｅｓａｍｅ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、小麦アルブミンなどの大豆、小麦、ゴマなどのタンパク質、血清アルブミン、ヘモグロビンなどの血液タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトグロブリンなどの乳タンパク質、卵グロブリンなどの卵タンパク質などがあげられる。本発明の分離条件においては、高次構造を維持することができるため、生理活性タンパク質の有する機能を維持したまま分離することができるため好ましい。
酵素タンパク質としては、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ（転移酵素）、加水分解酵素、リアーゼ（脱離酵素）、イソメラーゼ（異性化酵素）、リガーゼ（合成酵素）、などがあげられる。具体的には、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、イソメラーゼ、オキシゲナーゼ、リゾチーム、ウロキナーゼ、アスパラギナーゼなどの酵素タンパク質等があげられる。
本発明の分離条件においては、酵素タンパクが失活せずに、その機能を維持したままで分離することができるため好ましい。
また、さらに好ましくは、タンパク質が脂質関連酵素タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上である。
脂質関連酵素タンパク質としては、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼなどがあげられる。好ましくは、トリアシルグリセロールリパーゼ、ジアシルグリセロールリパーゼ、モノアシルグリセロールリパーゼ、フォスフォリパーゼＡ１，Ａ２，Ｂ，Ｃ，Ｄなどがあげられる。
同様に本発明の分離条件においては、脂質関連酵素タンパクが失活せずに、その機能を維持したままで分離することができるため好ましい。
本発明においては、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種を利用して粘土鉱物組成物からタンパク質を分離する。が、該脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルとしては、モノ脂肪酸エステル、ジ脂肪酸エステル、トリ脂肪酸エステルやポリ脂肪酸エステルが挙げられるが、いずれも好適に使用することができる。
ここで、粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を分離する場合において、該タンパク質が吸着した粘土鉱物組成物が油中に存在する場合においては、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルはＨＬＢ０〜５、好ましくは０〜４、さら好ましくは２〜３であり、逆に水溶液中ではＨＬＢが５以上、好ましくは１０〜２０、さらに好ましくは１５〜１８である脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを使用することで好適に分離することができる。
これら脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルのＨＬＢや後述の分子量条件は、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステル１種でも可能であるが、２種組み合わせることで好適なＨＬＢ値に調整することもできる。
前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルとしては、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン、酵素分解レシチン等があげられる。
具体的には、ソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタントリオレエート（ＨＬＢ１．８）、ソルビタントリステアレート（ＨＬＢ２．１）、ソルビタンジステアレート（ＨＬＢ４．４）、ソルビタンモノステアレート（ＨＬＢ４．７）、ソルビタンモノパルミテート（ＨＬＢ６．７）、ソルビタンモノオレエート（ＨＬＢ４．３）、ソルビタンモノラウレート（ＨＬＢ８．６）などがあげられる。
ショ糖脂肪酸エステルとしては、たとえば、ショ糖ステアリン酸モノエステル（ＨＬＢ１６）、ショ糖オレイン酸トリエステル（ＨＬＢ１）、ショ糖ミリスチン酸ジエステル（ＨＬＢ１１）、ショ糖ベヘニン酸ジエステル（ＨＬＢ３）ショ糖オレイン酸モノエステル（ＨＬＢ１５）、ショ糖エルカ酸トリエステル（ＨＬＢ２）などがあげられる。
グリセリン脂肪酸エステルとしては、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノオレエートなどがあげられる。ポリグリセリン脂肪酸エステルとしては、デカグリセリンラウリン酸エステル、デカグリセリンステアリン酸エステル、デカグリセリンパルミチン酸エステルなどがあげられる。
また、レシチン、酵素分解レシチンとしては、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸、そのリゾ体、または、その混合物などがあげられる。
油溶液中で蛋白質を分離する場合、以下に限定されないが、例えばショ糖脂肪酸エステル、グリセリンモノ脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタンポリ脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルを使用することが好ましい。  また、水溶液での分離の場合、同様に限定されないが、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルを用いることが好ましい。
脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルの１種または２種以上としては、その平均分子量が、１０００未満であることが好ましく、９００未満であることが更に好ましく、８００未満であることが更に好ましく、７００未満であることが更に好ましく、６００未満であることが更に好ましく、さらには５５０未満であることが更に好ましく、５３０未満であることが最も好ましいが、これに限定されない、分子量が小さいほど、濃縮・精製されたタンパク質を分離することが容易であり、該脂肪酸エステルを除去することが容易であるため好ましい。
前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上として、該脂肪酸エステルの全体量に対し、モノ脂肪酸エステルが５０質量％以上であるものを用いる場合、上述の分子量が小さくなるため好ましい。分子量が小さくなる程、タンパク質の分離も、脂肪酸エステルの除去も容易になることから、特に、モノ脂肪酸エステルを用いることが好適であり、該モノ脂肪酸エステルを５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、さらに好ましくは７０質量％以上、特に好ましくは８０質量％以上であることが好ましい。
同様の理由により、脂肪酸エステルを構成する脂肪酸の炭素数も少ないことが好ましく、脂肪酸残基の炭素数は３０以下であり、脂肪酸残基の炭素数は２４以下であることが好ましく、脂肪酸残基の炭素数が１８以下であることが更に好ましく、脂肪酸残基の炭素数が１４以下であることが最も好ましい。
タンパク質の分離に使用するに際し、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルの含量は特に制限されないが、使用する際の濃度は高いほど分離性に優れる。以下に限定されないが、取り扱い性等の理由から含量は０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜５．０質量％、さらに好ましくは０．０５〜１．０質量％である。
タンパク質が吸着した粘度鉱物組成物を、脂肪酸エステル溶液に分散させることにより吸着タンパク質を溶出させる。
また、タンパク質に対して１：０．００１〜２０、好ましくは１：０．０１〜１０、さらに好ましくは１：０．０５〜２となるよう調整することで分離性・使用性ともに好適な条件とすることができる。
上記分離の態様として、例えば、水溶液中で分離する場合、ＨＬＢが好ましくは５〜２０、更に好ましくは１０〜２０、最も好ましくは１５〜１８の脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを、タンパク質の質量に対し、１：０．００１〜２０、好ましくは１：０．０１〜１０、さらに好ましくは１：０．０５〜２添加し（脂肪酸エステルを酵素液質量当たり１倍量％以下の低濃度添加）攪拌放置することなしに吸着された該タンパク質を簡単に９５％以上という高い濃度に濃縮することができる。また、攪拌器により好ましくは５〜５００ｒｐｍ、更に好ましくは１０〜３００ｒｐｍ、最も好ましくは５０〜２００ｒｐｍで攪拌処理（超音波でもよい）しても良い。その他、温度、圧力も特に制限されないが、好ましくは、温度は０〜１０℃であり、圧力は常圧である。その後、該粘土鉱物組成物を除去することで濃縮・精製されたタンパク質を得ることができ、また、分離のため添加した炭素数３０以下の脂肪酸エステルや、余分な溶液を除去することにより極めて高濃度のタンパク質を分離し、得ることができる。分離において、水系、油系のいずれも良いが、作業性やタンパクの性質、また、酵素等培養等を考慮すると、特に水系での処理が好ましい。
粘土鉱物組成物の分離方法としては、静置分離（デカンテーション）、遠心分離などがあげられるが、これに限定されるものではない。遠心分離としては、デカンター型遠心分離、バケット式遠心分離、分離板形遠心分離などがあがられるがこれに限定されるものではない。
脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルの除去方法に特に制限はないが、粘土鉱物との分子量の差異が大きいことを利用し、ゲルろ過法、限外ろ過膜法により容易に分別することができる。
具体的な方法としては、吸着後の粘土鉱物組成物は沈殿法、ろ過法、遠心法により分離し、必要に応じて水、または緩衝液で洗浄を数回繰り返し残存の非吸着物を除去した後、前記脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルの水性溶液等によって吸着タンパク質を分離することができる。脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルは、水又はイオン交換水に対して、０．１〜１０質量％、好ましくは０．１〜３質量％添加し、室温または、３０〜５０℃に加温して溶解、冷却して水溶液を作成する。この水溶液に、該タンパク質が吸着している粘土鉱物組成物質を添加、分散するのみでタンパク質を分離させることができる。その後、遠心分離、ろ過、デカンテーションにより粘土鉱物組成物質を容易に除去する。分離されたタンパク質からと脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを除去する場合、その分子量の差を利用して、ゲルろ過、限外ろ過などにより、容易に除去可能である。また、タンパク質の分離処理は、室温で行なうことができ、特に冷却もしくは加熱の必要はないが、例えば約０〜約６０℃の処理温度を例示することができる。
また、これらの作業・条件は、後述の濃縮・精製方法等においても援用することができる。
粘土鉱物組成物の回収を膜で行う場合には、回収された状態、つまり粘土鉱物組成物が膜に固定されている状態で洗浄等を行い、その状態で炭素数３０以下の脂肪酸エステルを通液させることで、タンパク質を容易に分離することができ、濃縮・精製されたタンパク質を得ることができる。
固形の粘土鉱物組成物を使用する場合には、固形の粘土鉱物に原料液を接触さるせることでタンパク質を吸着させ、その状態で洗浄処理等を行い、炭素数３０以下の脂肪酸エステルを接触・通液させることで容易に分離することができるため、工程中に固定するだけでよいため、上記とともに工業的生産に活用することができる。
従来は、粘度鉱物組成物に吸着したタンパク質は、高分子化合物や塩類により溶出させる方法を取っている。たとえば、ポリビニールアルコール溶液にタンパク質吸着粘度鉱物組成物を添加、分散することによりタンパク質を溶出させる。次に、ポリビニルアルコールを除去する処理として、イオン交換樹脂による分離が行われる。酵素溶液のｐＨを中性域にし、イオン交換樹脂にタンパク質を吸着させ、ポリビニルアルコールだけを溶出させる。イオン交換樹脂に吸着したタンパク質は、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に浸すことで、溶出させる。次いで、タンパク質水溶液に含有している塩を除去するため、限外ろ過膜による脱塩、または、ゲルろ過カラムによる塩の除去処理を行う必要がある。限外ろ過膜による方法としては、分画分子量６，０００又は１３，０００程度の材質（ポリアクリロニトリル）の中空糸膜を用いて、入口圧力０．０５Ｍｐａ、出口圧力０．１２ＭＰａになるようにし、流速を２０Ｌ／ｍ２，ｈｒに保つことで、約１／１０倍の液量まで濃縮を行い、濃縮液の２０倍の水を添加し、さらに同量まで濃縮することで、脱塩を行う。また、ゲルろ過の場合、セファデックスＧ−２００カラムに詰めて、上からタンパク質溶液を添加し、流量は、カラム体積１ｍＬ当たり、０．３ｍｌ／ｈｒ．／ｍｌで、水をタンパク質液量の５倍以上流すことで、タンパク質画分だけを分取する。
このように、粘度鉱物組成物に吸着したタンパク質を精製した後、高分子化合物の除去処理、脱塩処理を行う必要であり、非常に複雑で、コストがかかり、現実的でなかったが、本発明の方法によれば、下記の分離剤等を使用することで極めて簡易にタンパク質を分離することができ、上述のような複雑な後処理を必要としない。
また、本発明は、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを含有することを特徴とする粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質の分離剤に関する。
本発明の分離剤を用いることにより、粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を好適に分離することができ、本発明のタンパク質の分離方法、濃縮・精製方法、回収方法を実施することができる。脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルについては上述の通りであり、水溶液、油溶液に対応したＨＬＢの脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを用いる。また、上記分離、濃縮・精製、回収の目的に応じ、その濃度を調整することができ、また、その他成分を配合することができる。
分離剤としては、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルが用いられ、その含量は特に制限されないが、使用する際の濃度は高いほど分離性に優れる。以下に限定されないが、取り扱い性等の理由から０．０１〜５０質量％、好ましくは、０．５〜３０質量％、さらに好ましくは０．１〜５質量％、特に好ましくは０．１〜２．０質量％、最も好ましくは０．５〜２．０質量％である。
また、使用量との調整となるがタンパク質に対して１：０．００１〜２０、好ましくは１：０．０１〜１０、さらに好ましくは１：０．０５〜２となるよう調整することで分離性・使用性ともに好適な条件とすることができる。
分離剤として、さらに、水溶性高分子化合物、２価の金属イオン、酸化防止剤などを加えて、保存安定性を向上させることができる。たとえば、水溶性高分子化合物としては、特に多水酸基性化合物が好ましく、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコールがあげられる。また、２価の金属イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、銅イオン等があげられる。また、酸化防止剤としては、アスコルビン酸、２−メルカプトエタノール、システイン、ジチオトレイトール等などがあげられる。また、タンパク質としては、大豆、なたね、など油糧種子タンパク質やその加水分解物等の成分を配合することもできる。
常温で液状の添加剤は、そのまま、油に添加し、スターラーまたは、スリーワンモーターに攪拌羽根をつけて、好ましくは５０〜５００ｒｐｍ、更に好ましくは、更に１００〜３００ｒｐｍ、最も好ましくは、１００〜２００ｒｐｍで攪拌して溶解させる。また、常温で粉末、固形物、液状でも解けにくい添加剤の場合は、油を４０〜５０℃に加温した後、添加して溶解させる。
常温で液状の添加剤は、水に添加し、スターラーまたは、スリーワンモーターに攪拌羽根をつけて、好ましくは５０〜５００ｒｐｍ、更に好ましくは、１００〜３００ｒｐｍ、最も好ましくは、１００〜２００ｒｐｍで攪拌して溶解させる。また、常温で粉末、固形物、液状でも溶解し難い添加剤の場合は、水を４０〜５０℃に加温した後、添加して溶解させることが好ましい。
本発明の分離剤は、炭素数３０以下の脂肪酸エステルが液状で粘度も低いことから扱いやすい点においても好適である。
本発明は上述の分離方法を利用し、タンパク質を濃縮・精製する方法を提供する。下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）、
（Ｉ）タンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させる工程：及び
（ＩＩ）粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離する工程を経ることを中心とする濃縮・精製タンパクの製造方法である。溶液等に含有されているタンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させ、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを用いて分離することで、濃縮・精製されたタンパク質を得ることができる。
ここで、本発明における処理は、各目的を達成することができればその方法、場所、その他条件は特に制限されない。本発明の製造方法等は処理手順を示すものであり、いわゆる製造工程という意味も当然含むがそれに限定されず、特に各処理工程が別々の場所にあることを必要せず、各処理工程が別々の機器で行われることを必要とせず、また、各処理ごとの期間も制限されず連続でも、一定期間後に処理されても良い。つまり、場所的、設備的、期間的な制限を受けるものではない。
さらに、前記工程（Ｉ）を経た後に、下記工程（Ｉ−Ａ）および／または（Ｉ−Ｂ）を経ることで、より高度に濃縮され、より高度に不純物等が除去され精製されたタンパク質を得ることができる。
（Ｉ−Ａ）該タンパク質を吸着させた粘土鉱物組成物を回収する工程
（Ｉ−Ｂ）該タンパク質を吸着させた粘土鉱物組成物を精製処理する工程
ここで、（Ｉ−Ａ）（Ｉ−Ｂ）の順序は制限されない。
さらに、前記工程（ＩＩ）を経た後に、下記工程（ＩＩＩ）を経ることで、現実に濃縮・精製されたタンパク質を得ることができる。
（ＩＩＩ）タンパク質の分離に用いた脂肪酸エステルを除去する工程および／または分離したタンパクを回収する工程。
得られた濃縮・精製されたタンパク質は、さらに一般的な方法により不純物の除去等の処理を行うことができる。
前記濃縮・精製方法として、タンパク質を含有する溶液に粘土鉱物組成物を添加し、攪拌処理することでタンパク質を吸着させた後、遠心分離機および／または膜によりタンパク質を吸着した粘土鉱物組成物回収し、該回収されたタンパク質を吸着した粘土鉱物組成物から脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上を用いてタンパク質を分離する方法を例示することができる。
粘土鉱物組成物を固定した膜および／またはカラムに、タンパク質を含有する溶液を通液することで上記粘度鉱物組成物にタンパク質を吸着させ、その後脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上の含有液を上記膜および／またはカラムに通液することでタンパク質を分離することを特徴とする方法を例示することができる。具体例としては、珪藻土や繊維状セルロールと同時または別々に粘土鉱物組成物を添加し、フィルタープレスをプレコートした後、圧力０．１ＭＰａでタンパク質溶液を通液する。珪藻土、繊維状セルロールはタンパク質の質量に対して好ましくは０．５〜５０倍量、更に好ましくは０．５〜１０．０倍量、最も好ましくは１〜４倍量使用する。タンパク質を吸着させた後、好ましくは圧力０．０１Ｍｐａ〜０．２ＭＰａでタンパク質溶液の１〜１０倍量の水で洗浄することで、非吸着物質を洗い流す。その後、圧力０．０１Ｍｐａ〜０．５ＭＰａで分離剤である０．０１〜１０．０％脂肪酸エステル溶液をタンパク質溶液の３倍量流すことにより、目的タンパク質を分離させ、回収をすることができる。他の方法や処理条件については、分離方法での説明や後述の各諸条件によって行うことができる。
ここで、濃縮・精製する対象であるタンパク質を含む原料としてはタンパク質溶液が挙げられる。該タンパク質溶液としては、タンパク質の製造により製造されるタンパク質溶液や、他の食品製造等に利用された酵素タンパク質を含有する溶液等に加え、動物の細胞や体液、植物の細胞や種子、微生物による発酵生産物のタンパク質を含有する溶液を例示することができる。
前記タンパク質溶液等の原料からタンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させる方法としては、タンパク質溶液に粘土鉱物組成物を添加し、スターラー攪拌、プロペラ、ホモジナイザー、超音波等で攪拌することがあげられる。この場合の条件として、例えば、スターラーまたは、スリーワンモーターに攪拌羽根をつけて撹拌を行うが、回転数は好ましくは５０〜５００ｒｐｍ、更に好ましくは１００〜３００ｒｐｍ、最も好ましくは１００〜２００ｒｐｍであり、攪拌時間は、好ましくは１分間〜５時間、更に好ましくは１分間〜１時間、最も好ましくは１分間〜３０分間である。また、ホモジナイザーを用いる場合、回転数は好ましくは１０〜６０００ｒｐｍ、更に好ましくは５０〜５００ｒｐｍ、最も好ましくは５０〜３００ｒｐｍであり、処理時間は好ましくは１分間〜１時間、更に好ましくは１分間〜３０分間、最も好ましくは、１分間〜１５分間である。
また、あらかじめ膜や、カラムに粘土鉱物組成物を固定しておき、タンパク質溶液を通液させることでタンパク質を吸着させることもできる。
タンパク質が吸着した粘土鉱物組成物の回収法としては、上述の通り、遠心分離による方法、沈降法、膜によるろ過や、クロマトでの捕集による方法があげられる。
また、タンパク質を分離した後の粘土鉱物組成物の分離・除去方法としては、静置分離（デカンテーション）、遠心分離、膜による分離などがあげられるが、これに限定されるものではない。静置分離法としては、粘土鉱物組成物を３０分間以上静置することにより、上澄みをサイフォンなどでデカンテーションを行い、粘度鉱物を濃縮・分離していく。遠心分離としては、デカンター型遠心分離、バケット式遠心分離、分離板形遠心分離などがあげられるが、これに限定されるものではない。遠心分離はの条件は、回転数が好ましくは３００〜１０，０００ｒｐｍ、更に好ましくは３００〜３，０００ｒｐｍ、最も好ましくは６００〜２，０００ｒｐｍであり、遠心時間は、好ましくは１分間〜１時間、更に好ましくは１分間〜３０分間、最も好ましくは５分間〜１５分間である。また、膜による分離法としては、フィルタープレスや素焼きのろ過装置などが使用でき、珪藻土、繊維状セルロースなどでプレコートして使用する。珪藻土の粒子径は好ましくは０．０１〜１００μｍ、更に好ましくは０．０５〜５０μｍ、最も好ましくは０．１〜１０μｍである。このような分離法は、タンパク質との接触性も良く、タンパク質を好適に吸着することができるため好ましい。
粘土鉱物組成物からタンパク質を分離する方法についての条件その他は上述した通りである。
本発明は、分離、濃縮・精製方法、回収方法により得られるタンパク質を含有する脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステル組成物に関する。粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルで分離することが一連の発明の肝であるが、この分離後、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルはタンパク質を高含有で含む組成物の状態である。該組成物は、飲食物、医薬品等にそのまま原料として使用することができ、また、各種製造工程に利用することができる。
脂肪酸エステルを含むタンパク質組成物は、そのまま、油脂や飲食物、医薬品等に使用することができるが、さらに、油脂、好ましくはタンパク質の質量に対し好ましくは１〜２０倍量、更に好ましくは１〜１０倍量、最も好ましくは２〜５倍量の中鎖脂肪酸トリグリセリドに分散し、ろ過で回収することで、脂肪酸エステルを分離し、使用することもできる。ろ過は、ろ紙でのブフナーによる吸引ろ過、珪藻土でプレコートしたブフナー、フィルタープレスなどによるろ過が可能である。
好ましくは、前記組成物が分離された酵素タンパク質及び生理活性タンパク質からなる群より選ばれる１種または２種以上、また、脂質関連酵素タンパク質の１種または２種以上である場合であって、この状態で直接使用、配合することができる場合は好ましい態様といえる。
上述のように脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを含有したまま、食品、医薬品等の製造に使用すること、また、これらに直接配合することも可能であるが、高濃縮・精製品を得たい場合には、分離のために添加した脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを除去する必要があり、上述の方法により、脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを容易に分離することができる。この脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルの分離を考えると、分子量が小さい等の脂肪酸エステルも使用することが好ましい。
一般的に、蛋白質の濃縮は、限外ろ過膜法、塩析法、溶剤沈澱法などにより実施されるが、限外ろ過膜は高価でコスト高になり、硫安、塩安などによる沈澱法では、その後、脱塩処理を組み入れなければならなく、複雑である。また、アセトン、ヘキサンやアルコールなど溶剤による沈澱では、溶剤の回収に大掛かりな装置が必要である。
また、一般的に、蛋白質の精製は、カラムクロマトグラフィーで実施される。カラムクロマトグラフィーとしては、例えばイオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトなどがあげられる。イオン交換クロマトグラフィーでは、吸着した蛋白質は、ＮａＣＬなどの塩類により脱離されるため、次いで、脱塩処理を組み入れなければならない。アフィニティークロマトでは、担体が高価であり、また、吸着蛋白質を脱離させるためには、やはり、塩類の添加が必要である。ゲルろ過は分離剤は必要ないが、担体は高価である。
本発明のタンパク質の濃縮・精製方法によれば、担体にタンパク質を吸着脱離させて行うので、イオン交換樹脂などと比較して、安価な担体を用いて、遠心分離などの既存の設備で行うことができ、また、カラムなど複雑な設備が不要になるため、後処理での添加した分離剤の除去も分子量の差を利用して簡単に処理でき、簡易かつ短時間に濃縮・精製タンパク質を製造することができる。従来の方法では、脱離剤が高分子で分子量がタンパク質と近いため、タンパク質との分離が困難であり、イオン交換、脱塩など複雑な処理が必要になる。また、本発明の濃縮・精製方法では、１回処理するだけで３倍以上、条件によっては１０倍以上に濃縮・精製することができ、効率良くタンパク質の濃縮・精製することが可能となった。
本発明のタンパク質の濃縮・精製方法により、タンパク質を容易に、非常に高度に濃縮・精製することができる。例えばタンパク質の回収率は、通常の回収方法では高くても５０％未満であるが、本発明の方法によれば回収率は７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上であり、特に好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは９５％以上であり、非常に収率が良く、工業的、コスト的にも好ましい。
また、活性を指標とした純度である電気伝導度（ｍｓ／ｃｍ）を指標とすれば、得られる濃縮・精製タンパク質の電気伝導度（ｍｓ／ｃｍ）が５以下、好ましくは４以下、さらに好ましくは３以下、特に好ましくは２．５以下、最も好ましくは２以下となるため、活性に悪影響をあたえる不純物が少ないため、活性を視点とした純度が高いと言え、その後の安定性や機能性に優れ、製品的にも好ましい。
ここで、電気伝導とは電場の作用のもとに電荷が移動して電流が現れる現象を言う。電気伝導の機構は、物質中で電気を運ぶ担体がイオンである場合を指し、電気伝導度は電気抵抗の逆数を示す。金属塩では一般的に伝導度の数値が大きくなり、溶液中の金属塩残存量の指標となる。この金属塩が活性や安定性に悪影響を与えることから、活性面からの純度の指標と言え、また、安定性の指標でもあることから、電気抵抗が大きいと製品価値にも影響を与える。
さらに、比活性を指標とした場合、濃縮倍率は好ましくは３〜５０倍、さらに好ましくは５〜５０倍、さらに好ましくは７〜５０倍、特に好ましくは１０倍〜５０倍に濃縮することができる。
また、粘土鉱物組成物にタンパク質を吸着させた状態等において不純物を容易に除去することができるため、
例えば酵素タンパク質について、比活性を指標として濃縮・精製度を見てみると、通常販売されている酵素の機能と比べて数倍〜数十倍の値を示すことから、機能が向上していることが確認され、また、その比活性の比、すなわち、濃縮倍率が数倍〜数十倍に濃縮されたことが確認される。濃縮倍率は上述の通りである。
また、例えば、脂質関連酵素であるリパーゼ、フォスフォリパーゼ、コレステロールエステラーゼなどの場合、市販の状態での比活性が１００Ｕ／ｍｇ程度であるのに対し、本発明の濃縮・精製後の比活性は１０００Ｕ／ｍｇ以上であり、比活性が１０倍以上になっていることが確認される。実施例においても確認されている。
上記の通り、その機能が向上し、その機能の強さという点においても好ましく、その商品価値は向上している。濃縮・精製された酵素タンパク等は同量であれば数分の１の時間で反応が終了することを意味し、また、同機能を確保する場合には、量的に数分の１の量で必要な機能を担保できるということを意味する。飲食物等の製造工程において使用する場合、生産性・コスト性に優れているため、非常に好ましいものである。
また、該濃縮・精製タンパク質に、保存性や安定性を向上させること等を目的として、各種成分を配合することもできる。例えば、水溶性高分子化合物、２価の金属イオン、酸化防止剤、タンパク質等の１種または２種以上を含有することことによりタンパク質の安定性を向上できる。上記水溶性高分子化合物としては、特に多水酸基性化合物が好ましく、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコール等の１種または２種以上を含有することができる。
また、２価の金属イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、銅イオン等の１種または２種以上を含有することができる。また、酸化防止剤としては、アスコルビン酸、２−メルカプトエタノール、システイン、ジチオトレイトール等の１種または２種以上を含有することができる。また、タンパク質としては、大豆、なたね、など油糧種子タンパク質やその加水分解物等の１種または２種以上を含有することができる。
また、本発明は、上記濃縮・精製法により得られる濃縮・精製タンパク質、好ましくは濃縮・精製酵素タンパク質および／または濃縮・精製生理活性タンパク質に関し、また、濃縮・精製脂質関連酵素タンパクに関する。
また、これらを各分野において使用する方法に関し、特に、飲食物の製造工程において使用する方法に関する。
たとえば、澱粉乳（濃度３５〜５０％）に澱粉に対して０．１５％になるように市販細菌アミラーゼを加えて、均一に攪拌したものを８０−８８℃の熱水中に分散注入する。この工程で澱粉が糊化膨潤しはじめ、アミラーゼの作用を受けて液化する。この場合、上記精製アミラーゼを用いることで、耐熱性が向上でき、反応率が向上する。
実際の製造で、脂肪酸製造では、リパーゼを油脂に対して０．０２〜０．０３％添加して、水を油脂と等量程度添加して、３０〜４０℃で２０時間程度反応を行い、脂肪酸を製造する。熱によるタンパク質の変性が起こるが、本発明の濃縮・精製タンパク質の製造方法によって得られたリパーゼは熱安定性が高く、反応率が２０〜３０％高くなる。
また、カカオ代用脂では、リパーゼを用いて、パーム油となたね油とのエステル交換によって製造する場合、パーム油の融点が高いため、高温で反応させる必要がある。本発明の濃縮・精製タンパク質の製造方法によって得られたリパーゼは、熱安定性が高いので、エステル交換率が１０〜２０％高くなる。
本発明の方法においては、低濃度のタンパク溶液からのタンパク質の濃縮・精製も好適に行うことができる。特に、酵素タンパク質の培養液からの濃縮・精製等に好適であり、この場合、その濃縮効率が高いことがコスト面に大きく影響するため、重要である。
また、その機能を損なうことなく高度に濃縮・精製することができるため、酵素タンパク質や生理活性タンパク質の濃縮・精製方法として特に好ましい方法である。
本発明の濃縮・精製タンパク質の製造方法によって、目的とするタンパク質を一旦、粘度鉱物組成物質に吸着させ、該目的タンパク質を少量の溶出液を持って溶出することが可能であるため、溶出溶液はそのまま、必要に応じて、限外ろ過による濃縮・精製を加えて、効率良く、タンパク質の濃縮・精製・粉末化が出来るといった利益も達成することがわかった。
本発明は、下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を有することを特徴とするタンパク質の回収方法であり、特に、酵素反応処理中および／または処理後に、該酵素を回収することを特徴とする回収方法や、製造工程から生じる廃液から酵素タンパク質を回収することを特徴とする回収方法であり、主に工業的な面において有益な方法である。
（Ｉ）タンパク質を粘土鉱物組成物に吸着させる工程；及び
（ＩＩ）粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上により分離させる工程。
特に、製造工程で使用された酵素タンパク質等、また、通常の方法では回収することができないタンパク質等を好適に回収することができる。製造工程で使用される酵素タンパク質等は、非常に高価であるため、これを好適に回収することができるか否かは、コストに大きな影響を与える。また、通常の方法では好適に回収することができなかったタンパク質を回収することができるため、歩留まりがあがり、同様にコスト面でも好適な効果が得られる。特に、生理活性タンパク質等を回収する場合には、その効果はさらに向上する。上述の通りコスト的、工業的に好ましい方法である。
ここで、本発明の濃縮・精製方法、回収等により得られるタンパク質は、さらに、タンパク質の一般的な濃縮・精製処理をすることができる。濃縮・精製されたタンパク質を限外ろ過膜やエバポレーターなどにより濃縮することができる。限外ろ過膜は、分画分子量６，０００〜１００，０００までの膜が使用でき、材質はポリスルフォン系、アセトニトリル系の両方が使用可能である。圧力や流速は、該目的タンパク質によって、臨機応変に変えることができるが、好ましくは、入口圧が０．０１〜０．２Ｍｐａであり、出口圧が０．０２〜０．３Ｍｐａである。さらに好ましくは、入口圧が０．０５〜０．１２Ｍｐａであり、出口圧が０．０８〜０．１３Ｍｐａである。スプレードライ、凍結乾燥、溶剤沈澱などにより粉末化する。スプレードライの条件は、該タンパク質や濃度により、臨機応変に変えることができるが、好ましくは、入口温度が５０〜１５０℃であり、出口温度が５０〜１２０℃であり、さらに好ましくは、入口温度が９０〜１４０℃であり、出口温度６０〜９０℃である。凍結乾燥は、凍結させたサンプルを用い、減圧が０．５Ｔｏｌｌ以下になるように調整し、加温は１０℃〜６０℃、好ましくは１５℃〜５０℃、さらに好ましくは、２５℃〜４５℃が良好である。溶剤沈澱において使用される溶剤としては、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノールなどアルコール類、ヘキサンなどが挙げられ、濃縮タンパク質溶液に対して、１倍量〜１０倍量程度添加、好ましくは、１倍量〜５倍量、さらに好ましくは、２倍量〜３倍量程度することで、沈澱させ、沈澱物をろ過により回収し、真空乾燥などで粉末化する。真空乾燥は、常温で、好ましくは１．０Ｔｏｌｌ以下、更に好ましくは０．５Ｔｏｌｌ、最も好ましくは０．１Ｔｏｌｌ以下であり、濃縮タンパク質溶液を加温しても良い。
実施例
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
粘土鉱物組成物質に吸着固定させた酵素タンパク質の溶出方法と溶出率について検討した。タンパク質としては、市販のリパーゼであるリパーゼＡＰ（天野製薬（株）製）をイオン交換水に１％濃度溶解して、得られた素溶液を用いた。
この酵素溶液１０ｍＬ当たり、後述の第１表、第２表に示した、平均粒子径が０．１〜１０μに調整された粘土鉱物組成物質を０．２ｇ加え３０分間攪拌後、８，０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離を行なって粘土鉱物組成物質を９５％以上回収した。粘土鉱物組成物質を更に１０倍量の水で洗浄後、同様な条件で遠心分離を行い、粘土鉱物組成物質を回収した。次に後述の第１表に示した各溶出液１０ｍＬを加え、分散後、すぐに同様な条件で遠心分離を行い、上清液を得た。比較例として第２表に示した溶出剤は、１．０％の高分子化合物溶液１０ｍＬを加え、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離回収した。この上清液のリパーゼ加水分解活性とタンパク質量をローリー法で測定し、溶出率と比活性を測定して、その結果を第１表に、また、比較例を第２表に示した。リパーゼの酵素単位は、基質オリーブ油から１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。リパーゼ加水分解活性測定法は、オリーブ油乳液５ｍＬと０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍＬとを正確にとり、よく混合し３７℃の恒温水槽を用いて１０分間予熱し、これに試料溶液１ｍＬを攪拌しながら加え、２０分間反応後、アセトン・エタノール混液２０ｍＬを加え、フェノールフタレイン試薬５滴を加え、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で滴定する。
2003042236.tif 000002
2003042236.tif 000003
第１表に示すように、溶出剤として、本発明の脂肪酸残基の炭素数が３０以下の脂肪酸エステルを用いることで、各種粘土鉱物組成物質より非常に効率よく酵素タンパク質が溶出され、濃縮・精製度も向上し、比活性も１０倍以上に向上することがわかった。
また、比較例としての第２表の溶出剤では、高濃度水溶液を用いて、溶出するための時間が掛かるわりに、回収率が低く、また比活性の向上も少ない。
実施例２
市販のリパーゼ粉末リパーゼ（生化学工業社製）を水に１％濃度になるように溶解し、１Ｌのリパーゼ酵素溶液を作成した。これに、和光純薬（株）製ベントナイト４０ｇを添加、２００ｒｐｍで１０分間攪拌・分散後、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、ベントナイトを回収した。回収したベントナイトを１Ｌの水に分散し、同様に遠心分離回収を行い、ベントナイトを洗浄した。洗浄したベントナイトを１Ｌの０．２％グリセリン脂肪酸エステル（商品名：レオドールＭＳ−１６５：花王（株）製）に分散後、同様な条件で遠心分離を行い、上澄み液を得た。上澄み液のリパーゼ活性とタンパク質を測定した。測定結果を第３表に示した。
2003042236.tif 000004
第３表に示すようにベントナイト吸分離溶出処理により、酵素タンパク質当たりの比活性は処理前の７．４倍に濃縮・精製された。
実施例３
市販のリパーゼ粉末リパーゼＱＬ（名糖産業製）を用いて、水に１％濃度になるように溶解し、１Ｌのリパーゼ酵素溶液を作成した。これに、ホージュン製ベントナイト４０ｇを添加、２００ｒｐｍで１０分間攪拌・分散後、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、回収したベントナイトを１Ｌの水に分散し、同様に遠心分離し、洗浄した。洗浄したベントナイトを１Ｌの０．４％のショ糖オレイン酸エステル（商品名：リョートーシュガーエステルＳ１６７０：三菱化学社製）に分散後、同様な条件で遠心分離を行い、上澄み液を得た。その上澄み液をＵＦ膜により濃縮脱塩を行い、リパーゼ活性とタンパク質量、電気伝導度を測定した。測定結果を第４表に示した。
2003042236.tif 000005
第４表に示すようにベントナイト吸着分離溶出処理により、酵素タンパク質当たりの比活性は処理前の約１３倍に濃縮・精製された。また、ＵＦ膜濃縮脱塩により、濃縮液の電気伝導度は２．７ｍｓ／ｃｍまで低下し、リパーゼの安定性が向上した。
対照例１
粗製パンクレアチン（和光純薬（株）製すい臓リパーゼ）１ｇを１００ｍＬの水に溶解し、遠心後、その上清に５ｇのベントナイトを加え３０ｍｉｎ．攪拌した。次に１０００ｇ×１０分間遠心分離して回収したベントナイトに水１００ｍＬを加えて懸濁し再び遠心分離し回収した。これにタンパク溶出剤として５０ｍＬの１％ＰＥＧ２０００を加えて３０ｍｉｎ．攪拌した後、遠心分離してその上清を得た。さらに、上清液のｐＨを０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液で７．５に調整し、イオン交換樹脂ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）５０ｇを充填したカラムに添加して、目的タンパク質を吸着し、２００ｍＬの０．５Ｍ  ｐｈｏｓｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５で非吸着部分を溶出させる。さらに、１．０Ｍ  ＮａＣＬの０．５Ｎ  ｐｈｏｓｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５  １００ｍＬで溶出させる。溶出液を分画分子量１３，０００のポリアクリロニトリル製ＡＩＶ−３０１０を用いて、入口圧０．０５Ｍｐａ、出口圧０．１ＭＰａで流速１５Ｌ／ｍ２，ｈｒで液量が１／１０になるまで濃縮を行った。さらに、２００ｍＬの水を添加し、液量が１００ｍＬになるまで濃縮を行った。このリパーゼ液のリパーゼ活性とタンパク質量、電気伝導度を測定しその結果を表−５に示した。
2003042236.tif 000006
ベントナイト処理後の濃縮液から高分子化合物である脱離剤をイオン交換樹脂により除去した。しかし、脱離に金属塩を使用するため、濃縮液の電気伝導度は４８となり、リパーゼの安定性が低下する。そこで、使用した金属塩をＵＦ膜により濃縮・脱塩することにより、濃縮液の電気伝導度を２．４ｍｓ／ｃｍまで低下させることが可能であった。しかし、多段階な除去方法により、回収率が３１．８％まで低下した。
本発明により、目的とするタンパク質を工業的規模での大量処理をその機能を損なうことなく、例えば酵素活性低下なしに、簡便、安価で優れた効率で得ることが可能となり、タンパク質を濃縮・精製することが可能となる。本発明により、粘土鉱物組成物に吸着したタンパク質を少量の分離剤により簡易に分離することができるため、目的とするタンパク質を非常に高い収率であることができ、活性面での純度が高く、蛋白質の比活性を約３倍以上とすることができる。本発明の方法によりタンパク質の濃縮・精製工程を簡略化できるとともに、得られた高濃度・高機能なタンパク質は食品、医薬品や、各種製造工程に利用することができる。
【国際調査報告】
2003042236.tif 000007
2003042236.tif 000008
2003042236.tif 000009
2003042236.tif 000010