(57)【要約】導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してなることを特徴とする活性酸素種用電極が開示されている。この活性酸素種用電極は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のいずれの環境であっても、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、・ＯＨ等の活性酸素種や、他のラジカル活性種（ＮＯ、ＯＮＯＯ−等）の検出を行うことができ、各種疾病の特定や、食品内の活性酸素種の存在あるいは水道水、下水等の水中の活性酸素種の存在を調べることができる。
2003054536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してしてなることを特徴とする活性酸素種用電極。
【請求項２】
金属ポルフィリン錯体が下記（Ｉ）または（ＩＩ）
2003054536.tif 000010
（式中、Ｍは、鉄、マンガン、コバルト、クロム、イリジウムから選ばれる金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基から選ばれるいずれかの基であり、他のＲは、前記のいずれかの基またはアルキル基、アリール（ａｒｙｌ）基もしくは水素を示す）
2003054536.tif 000011
（式中、ＭおよびＲは上記した意味を有し、２つのＬのうち少なくとも１つは、イミダゾールおよびその誘導体、ピリジンおよびその誘導体、アニリンおよびその誘導体、ヒスチジンおよびその誘導体、トリメチルアミンおよびその誘導体等の窒素系軸配位子、チオフェノールおよびその誘導体、システインおよびその誘導体、メチオニンおよびその誘導体等の硫黄系軸配位子、安息香酸およびその誘導体、酢酸およびその誘導体、フェノールおよびその誘導体、脂肪族アルコールおよびその誘導体、水等の酸素系軸配位子であり、他のＬは、前記のいずれかのの軸配位子または配位子のないものを示す）
で表される請求項第１項記載の電極。
【請求項３】
金属ポルフィリン錯体を形成するポルフィリン化合物が、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（２−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（３−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（２−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（３−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（２−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（３−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（２−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリンおよび［５−モノ（３−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリンなる群から選ばれるものである請求項第１項または第２項記載の電極。
【請求項４】
導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してなる活性酸素種用電極、対極及び参照電極を含む活性酸素種濃度測定用センサー。
【請求項５】
金属ポルフィリン錯体が下記（Ｉ）または（ＩＩ）
2003054536.tif 000012
（式中、Ｍは、鉄、マンガン、コバルト、クロム、イリジウムから選ばれる金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基から選ばれるいずれかの基であり、他のＲは、前記のいずれかの基またはアルキル基、アリール（ａｒｙｌ）基もしくは水素を示す）
2003054536.tif 000013
（式中、ＭおよびＲは上記した意味を有し、２つのＬのうち少なくとも１つは、イミダゾールおよびその誘導体、ピリジンおよびその誘導体、アニリンおよびその誘導体、ヒスチジンおよびその誘導体、トリメチルアミンおよびその誘導体等の窒素系軸配位子、チオフェノールおよびその誘導体、システインおよびその誘導体、メチオニンおよびその誘導体等の硫黄系軸配位子、安息香酸およびその誘導体、酢酸およびその誘導体、フェノールおよびその誘導体、脂肪族アルコールおよびその誘導体、水等の酸素系軸配位子であり、他のＬは、前記のいずれかのの軸配位子または配位子のないものを示す）
で表される請求項第４項記載のセンサー。
【請求項６】
金属ポルフィリン錯体を構成する金属ポルフィリンが、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（２−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（３−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（２−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（３−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（２−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（３−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（２−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（３−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリンなる群から選ばれるものである請求項第４項または第５項記載のセンサー。
【請求項７】
金属ポルフィリン重合膜中の金属と活性酸素種との間の酸化還元反応で生じる電流を、請求項第４項ないし第６項のいずれかの項記載のセンサーで測定することを特徴とする試料中の活性酸素種の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体内のスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）等の活性酸素種用電極及びこの濃度測定用電極を用いる活性酸素種の濃度測定用センサーに関する。さらに詳細には、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも適用でき、かつ、多量の酵素を必要とせず、使用する酵素の失活の問題もない活性酸素種用電極及び活性酸素種の濃度測定用センサーに関する。
背景技術
活性酸素種であるスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）は、生体内ではキサンチン・キサンチン酸化酵素（ＸＯＤ）によるキサンチン並びにヒポキサンチンなどの尿酸への酸化及び酸素のヘモグロビンによる還元等により生成されるものであり、生体内で生理活性物質の合成、殺菌作用、老化現象などに関連して重要な役割を有している。その一方で、スーパーオキシドアニオンラジカルから派生する種々の活性酸素種はガンなどの各種疾患を引き起こすといわれており、従って生体内のスーパーオキシドアニオンラジカルを含む活性酸素種の濃度測定は、上記各種疾患を特定するためにも重要なものであると考えられる。
このスーパーオキシドアニオンラジカルは、基質の存在しない場合には、式（１）に示されるように不均化反応により過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と酸素分子（Ｏ２）になる。この不均化反応は、スーパーオキシドアニオンラジカルへのプロトン付加によるＨＯ２・の生成、ＨＯ２・と酸素分子の反応による過酸化水素と酸素分子の生成、及びＨＯ２・同士の衝突による過酸化水素と酸素分子の生成からなるものである（式（１）〜式（４））。
2003054536.tif 000003
この反応系においては、スーパーオキシドアニオンラジカルは電子受容体（酸化剤）、電子供与体（還元剤）及び水素イオンの受容体（塩基）としてはたらくが、このうちの前二者の性質を利用して、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定が試みられていた。例えば、フェリチトクロームｃ（３価）からフェロチトクロームｃ（２価）への変換反応や、ニトロブルーテラゾリウム（ＮＢＴ）からブルーホルマザンの生成反応及びテトラニトロメタン（ＴＮＭ）の還元反応を利用して、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定が試みられていたが、これらは全て体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での測定方法であった。
一方、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を定量的に検出する方法についての検討も行われていた。例えば、マックネイル（ＭｃＮｅｉｌ）ら、タリオフ（Ｔａｒｉｏｖ）ら、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）らは、金や白金電極の表面を酵素であるＮ−アセチルシステインで修飾し、その上にヘムといわれる鉄錯体を酸化還元中心とした金属蛋白質であるチトクロームｃなどの蛋白質をＳ−Ａｕ結合させて固定化させた酵素電極（チトクロームｃ固定化電極）を作製し、これによりスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を電気化学的に検出することができると報告している（文献名：Ｃ．Ｊ．ＭｃＮｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７，８９（１９８９）；Ｍ．Ｊ．Ｔａｒｉｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３，１８４７（１９９１）；Ｊ．Ｍ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｋ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３４７，２６７（１９９３））。
この検出方法の測定原理は以下のとおりである。すなわち、チトクロームｃ（３価）（ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ３＋））は、スーパーオキシドアニオンラジカルと式（５）のように反応して、チトクロームｃ（２価）（ｃｙｔ．ｃ（Ｆｅ２＋））に還元される。次に、式（６）のように、Ｏ２−により還元されたチトクロームｃ（２価）を電気化学的に再酸化し、その際の酸化電流を測定することにより、間接的にスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を定量的に検出するものである。
2003054536.tif 000004
しかしながら、チトクロームｃは、生体細胞内のミトコンドリアの膜上に存在する電子伝達蛋白質であるため、上記測定に十分な量のチトクロームｃを固定化させた電極を作製するには、１０５〜１０６個という多量の細胞が必要とされ、また、使用する酵素が数日間で失活してしまうという問題もあった。従って、多量の酵素を必要とせず、かつ使用する酵素の失活の問題もなくスーパーオキシドアニオンラジカル等の活性酸素種を検出することができる電極の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは上記の実情に鑑み、スーパーオキシドアニオンラジカル等の活性酸素種を、酸化・還元反応から検出可能な電極を得るべく鋭意検討した結果、ポルフィリン化合物の中心に金属原子を導入した金属ポルフィリン錯体の重合膜を導電性部材の表面上に形成した電極は、多量の酵素を要せず、また、失活の問題もなく、活性酸素種の存在や濃度の検出に利用できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してなることを特徴とする活性酸素種用電極を提供するものである。
また本発明は、導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してなる活性酸素種用電極、対極及び参照電極を含む活性酸素種濃度測定用センサーを提供するものである。
更に本発明は、金属ポルフィリン重合膜中の金属と活性酸素種の間で生じる電流を上記センサーで測定することを特徴とする試料中の活性酸素種の検出方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の活性酸素種用電極（以下、「電極」とする）は、導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してなるものである。
本発明の電極を構成する導電性部材としては、一般に電極用として使用される部材であれば特に制限なく使用でき、例えばグラッシーカーボン（Ｇｌａｓｓｙ  Ｃａｒｂｏｎ：ＧＣ）、グラファイト、パイロリティックグラファイト（ＰＧ）、ハイリーオリエンティッドパイロリティックグラファイト（ＨＯＰＧ）、活性炭等のカーボン類、又は白金、金、銀等の貴金属、又はＩｎ２Ｏ３／ＳｎＯ２（ＩＴＯ）等を使用することができるが、特に経済性、加工性、軽量性などを考慮して、グラッシーカーボンを用いることが好ましい。また、導電性部材の形状は、電極として使用できる形状であれば特には制限はなく、円柱状、角柱状、ニードル状、繊維（ファイバー）状等の各種形状とすることができるが、例えば、生体内での活性酸素種濃度を測定するためには、ニードル状の形状とすることが好ましい。
本発明では、上記の導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成するが、この金属ポルフィリン錯体の重合膜の形成に使用される金属ポルフィリン錯体の例としては、下記の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるものが挙げられる。
2003054536.tif 000005
（式中、Ｍは、鉄、マンガン、コバルト、クロム、イリジウムから選ばれる金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基から選ばれるいずれかの基であり、他のＲは、前記のいずれかの基またはアルキル基、アリール（ａｒｙｌ）基もしくは水素を示す）
2003054536.tif 000006
（式中、ＭおよびＲは上記した意味を有し、２つのＬのうち少なくとも１つは、イミダゾールおよびその誘導体、ピリジンおよびその誘導体、アニリンおよびその誘導体、ヒスチジンおよびその誘導体、トリメチルアミンおよびその誘導体等の窒素系軸配位子、チオフェノールおよびその誘導体、システインおよびその誘導体、メチオニンおよびその誘導体等の硫黄系軸配位子、安息香酸およびその誘導体、酢酸およびその誘導体、フェノールおよびその誘導体、脂肪族アルコールおよびその誘導体、水等の酸素系軸配位子であり、他のＬは、前記のいずれかのの軸配位子または配位子のないものを示す）
上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される金属ポルフィリン錯体は、ポルフィリン化合物に金属原子を配位させた錯体化合物である。また、このポルフィリン化合物は、４つのピロール環がα位置で４つのメチン基と交互に結合した環状化合物であり、４つの窒素原子が中心に向かい合って形成されている。この中心部に金属原子を挟み込むことで、錯体化合物（金属ポルフィリン錯体）を形成することができる。該錯体化合物を形成するには、通常使用される金属錯体の形成方法、例えばメタレーション（Ｍｅｔａｌａｔｉｏｎ）等の方法を用いて、金属原子をポルフィリンの中心に導入すればよい。本発明において、ポルフィリン化合物の中心に導入できる金属としては、鉄、マンガン、コバルト、クロム、イリジウム等の各種金属を用いることができる。
また、この金属原子は測定対象の活性酸素種の種類によって使い分けることもできる。例えば、スーパーオキシドアニオンラジカルを測定対象とするする場合は、鉄、マンガン、コバルト等を、分子状酸素を測定対象とする場合は、鉄、コバルト、マンガン、クロム、イリジウム等を、過酸化水素を測定対象とする場合は鉄、マンガン等を、さらに、・ＯＨ、ＮＯ、ＯＮＯＯ−等を測定対象とする場合は、鉄、マンガン等をそれぞれ用いることが好ましい。
本発明で使用されるポルフィリン化合物は、無置換体であるポルフィンに対して、ＩＵＰＡＣ命名法による位置番号の５、１０、１５、２０の４位置のうち少なくとも１位置を、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基等のいずれかの基で置換したものであり、さらに他の位置を、前記の置換基またはアルキル基、アリル基若しくは水素となったものを使用するのが好ましい。その具体例としては、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（２−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（３−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（２−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（３−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（２−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（３−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（２−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（３−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリン等が例示される。
なお、式（ＩＩ）で示された化合物のＬで表される配位子のうち、イミダゾールの誘導体の例としては、メチルイミダゾール、エチルイミダゾール、プロピルイミダゾール、ジメチルイミダゾール、ベンズイミダゾール等が、ピリジンの誘導体の例としては、メチルピリジン、メチルピリジルアセテート、ニコチンアミド、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン等が、アニリンの誘導体の例としては、アミノフェノール、ジアミノベンゼン等が、ヒスチジンの誘導体の例としては、ヒスチジンメチルエステル、ヒスタミン、ヒップリル−ヒスチジル−ロイシン等が、トリメチルアミンの誘導体の例としては、トリエチルアミン、トリプロピルアミン等が、チオフェノールの誘導体の例としては、チオクレゾール、メルカプトフェノール、メルカプト安息香酸、アミノチオフェノール、ベンゼンジチオール、メチルベンゼンジチオール等が、システインの誘導体の例としては、システインメチルエステル、システインエチルエステル等が、メチオニンの誘導体の例としては、メチオニンメチルエステル、メチオニンエチルエステル等が、安息香酸の誘導体の例としては、サリチル酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等が、酢酸の誘導体の例としては、トリフルオロ酢酸、メルカプト酢酸、プロピオン酸、酪酸等が、フェノールの誘導体の例としては、クレゾール、ジヒドロキシベンゼン等が、脂肪族アルコールの誘導体の例としては、エチルアルコール、プロピルアルコール等が挙げられる。
本発明において、導電性部材の表面に上記の金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成させるには、電解重合法、溶液重合法、不均一重合法等の各種重合法を用いることができる。このうち電解重合法を用いて重合膜を形成するのが好ましく、具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等の有機溶媒中、テトラブチルアンモニウムパークロレート（ＴＢＡＰ：Ｂｕ４ＮＣｌＯ４）、テトラプロピルアンモニウムパークロレート（ＴＰＡＰ：Ｐｒ４ＮＣｌＯ４）、テトラエチルアンモニウムパークロレート（ＴＥＡＰ：Ｅｔ４ＮＣｌＯ４）等適当な支持電解質を加え、導電性部材を作用極、白金（Ｐｔ）電極等の貴金属電極、チタン電極、カーボン類電極、ステンレス綱電極等の不溶性電極を対極、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）、銀−塩化銀電極等を参照極として、２電極（作用極−対極）式の電解、あるいは３電極（作用極−対極−参照極）式の定電位、定電流、可逆電位掃引、パルス式の電解等を行い、重合させることにより導電性部材の表面に金属ポルフィリン重合膜を形成させることができる。
この電解重合は、例えば、図１に示すような３電極式セルを用い、可逆電位掃引電解法等により行うことが好ましい。図１中、１はセル容器、２は導電性部材、３は対極、４は参照極、５は金属ポルフィリン錯体溶液、６はポテンシオスタット、７はＸ−Ｙレコーダーを示す。
また、金属ポルフィリン錯体溶液として高濃度のものを使用する場合は、例えば、図２に示すような２室型３電極式セルを用いても良い。図２において、１から７は図１と同じものを意味し、８は電解質溶液、９はサンプルバイアルを示す。
また、生体内測定、複合化測定、臨床での診断・治療などを考慮し、単純化した活性酸素種用電極（ニードル型の電極）を作製する場合は、例えば、図３（Ａ）および（Ｂ）に示すようなニードル型の電極１０および３電極式セルを用いても良い。図３において、１はセル容器、４は参照極、５は金属ポルフィリン錯体溶液、６はポテンショスタット、７はＸ−Ｙレコーダーを示し、８は電解質溶液、９はサンプルバイアル、１０はニードル型の電極、１１は対極部分、１２は導電部材端部（金属ポルフィリン重合膜形成部分）、１３は電気絶縁性材料、１４は対極用配線である。
この電極は、図３（Ｃ）に示すように電気絶縁性材料１３で調製された細管中に導電性部材を入れ、更にこの細管の外側を対極となる金属等の材料で被覆し、対極部分１１としたものである。そして、導電性部材端面１２上に金属ポルフィリン重合膜を形成させることにより、ニードル型電極として使用可能になる。
なお、金属ポルフィリン錯体の重合膜の厚さは、電極及び金属ポルフィリン錯体の種類及び測定する活性酸素の種類等により適宜決定されるが、電極活性、修飾安定性等という点で、１μｍ以下であることが好ましい。
更に，不必要な生体内電流、電流ノイズ等の除去、感度、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）等の向上を目指して図３の単純化した活性酸素種用電極（ニードル型の電極）を改良した単純化した活性酸素種用電極（改良／ニードル型の電極）を作製する場合は、例えば、図４（Ａ）に示すような改良／ニードル型の電極１５及び図３（Ａ）に示す３電極式セルを用いても良い。図４において、１１は対極部分、１２は導電部材端部（金属ポルフィリン重合膜形成部分）、１３は電気絶縁性材料、１４は対極用配線、１５は改良／ニードル型の電極、１６はアース部分、１７はアース用は配線である。
この電極は，図４（Ｂ）に示すように導電性部材を電気絶縁性材料１３中に入れ（２層構造）、それらを対極用材料１１中に入れ（３層構造）、更に、それらを電気絶縁性材料１３中に入れ（４層構造）、最終的にこの細管の外側をアースとなる金属等の材料で被覆（５層構造）し、アース部分１６としたものである。そして、導電性部材端面１２上に金属ポルフィリン重合膜を形成させることにより、改良した単純化した活性酸素種用電極（改良／ニードル型の電極）として使用可能になる。
なお、金属ポルフィリン錯体の重合膜の厚さは、電極及び金属ポルフィリン錯体の種類及び測定する活性酸素の種類等により適宜決定されるが、電極活性、修飾安定性等という点で１μｍ以下であることが好ましい。また，この改良／ニードル型の電極は複合化測定等にも用いるので、１０数層程度までの多層構造が可能である。なお，アースの構成材料としては、白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス鋼、鉄クロム合金等の耐食性合金、カーボン類等の材料を使用することができるが、アースは生体内に入ることが多いため、安全性の高い材料（例えば，白金，金，銀等の貴金属、チタン、ステンレス鋼、カーボン類等）等で構成することが好ましい。
本発明の電極を活性酸素種の測定、特にその濃度の測定に使用するには、この電極に、▲１▼対極と参照極（３電極式）または▲２▼対極（２電極式）を組み合わせることが好ましい。この対極の構成材料としては、白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス綱、鉄−クロム合金等の耐食性合金、カーボン類等の材料を使用することができるが、対極は生体内に入ることが多いため、安全性の高い材料（例えば白金、金、銀等の貴金属、チタン、ステンレス綱、カーボン類等）で構成することが好ましい。
また、参照電極としては、通常、銀／塩化銀電極、水銀／塩化第二水銀等の各種参照電極を用いることができ、また、固体の基準電極を用いることもできる。
具体的に、活性酸素種の測定用に用いることのできる測定装置の一例を示せば図５の通りである。図５中１、３、４、６および７は図１と同じものを意味し、１８は測定電極（作用極）、１９はマイクロシリンジ、２０は測定溶液、２１はマグネティックスターラー、２２は攪拌子をそれぞれ示す。
また、具体的に、活性酸素種の測定用に用いることのできる測定装置の別の一例を図６に示す。図６中の１、６、７、１９から２２は図４と同じものを意味し、１０はニードル型電極である。
本発明の活性酸素種用電極は、上記のような装置でスーパーオキシドアニオンラジカル等の活性酸素種を検出するための電極として用いることもできるが、▲１▼対極と参照極（３電極式）または▲２▼対極（２電極式）と共に用いることで、活性酸素種濃度測定用のセンサーとすることができる。上記の構成の活性酸素濃度測定用センサーを、例えば、スーパーオキシドアニオンラジカルが存在する測定系で使用すると、重合膜を形成する金属ポルフィリン錯体中の金属がスーパーオキシドアニオンラジカルにより還元される。例えば、該金属が鉄であれば、スーパーオキシドアニオンラジカルにより、Ｆｅ３＋からＦｅ２＋に還元される（式（７））。
そして、スーパーオキシドアニオンラジカルにより還元されたＦｅ２＋を、酸化されうる程度に濃度測定電極の電位（▲１▼の３電極式の場合）または電圧（▲２▼の２電極式の場合）を保持した状態で電気化学的に再酸化し（式（８））、この時に流れる電流（酸化電流）を測定すれば、その電流値は、スーパーオキシドアニオンラジカル濃度と対応するため、該酸化電流から試料溶液中に溶解しているスーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を定量的に検出することができる。すなわち、上記した式（５）及び式（６）と同様の原理により、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定が可能とされるものである。また、これと同様な原理により、過酸化水素、・ＯＨ等の活性酸素種やＮＯやＯＮＯＯ−等の他のラジカル活性種等についても同様に定量的に検出することができる。
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（式（７）及び式（８）中、「Ｐｏｒ」はポルフィリンを意味する）
本発明の活性酸素種用電極は、金属ポルフィリン錯体の重合膜を導電性部材の表面に形成してなるのであるため、従来のチトクロームｃを固定した電極に比べ、強度が格段に高く、電極の失活の問題もないものである。また、金属ポルフィリンの重合膜の形成も電解重合法等を用いて行われるため、従来の電極に比べ、その調製も極めて容易であり、特に生体内で使用しやすい形状、例えばニードル状とすることもできる。
このように、本発明の活性酸素種用電極は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）はもちろん、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の環境であっても、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、・ＯＨ等の活性酸素種や、他のラジカル活性種（ＮＯ、ＯＮＯＯ−等）の検出や、対極や参照電極と組み合わせることにより、これら活性酸素種等を定量測定できるので、各種分野で広く利用することができる。
すなわち、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）では、各種疾病は生体内の活性酵素種や他のラジカル活性種により特定することができるので、例えば血液中の活性酸素種の濃度を測定することにより、ガン等の疾患の特定を行うことが可能とされる。
一方、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でも、食品内の活性酸素種やその濃度を測定することにより、該食品の腐敗状態を観察することができる。また、水道水や下水等の水中のの活性酸素種やその濃度を測定することにより、水質汚染の状態を観察することができる。
さらに、スーパーオキシドアニオンラジカル及び該アニオンを消去するはたらきを持つ酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ：以下、「ＳＯＤ」とする）の濃度も、ＳＯＤを含む試料を加えたときのスーパーオキシドアニオンラジカルの消失程度を測定することにより、測定することが可能である。
実施例
以下に参考例、実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
参  考  例  １
５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフェニル）ポルフィリン（Ｈ２Ｔ３ＴｈＰ）の合成：
容量１００ｍｌの丸底フラスコ中にプロピオン酸５０ｍｌ、３−チオフェンカルバルデヒド２．０ｍｌ及びピロール１．４ｍｌを入れ、攪拌しながら１６０℃で１時間還流した。還流後、この反応物を室温まで放冷し、更に氷冷して、２００ｍｌの冷メタノール中に加えた。次に吸引濾過を行い、残留物をメタノールで洗浄後、さらにシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）により精製、乾固、再結晶、減圧乾燥し、Ｈ２Ｔ３ＴｈＰを黒色粉末結晶として得た（収量：０．６３ｇ  収率：１９％）。生成物はＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトル（ＵＶ−２１００：（株）島津製作所製）及び１Ｈ−ＮＭＲ測定により同定した。同定結果を表１及び表２に示す。
参  考  例  ２
５，１０，１５，２０−テトラキス（２−アミノフェニル）ポルフィリン（Ｈ２Ｔ２ＡｍＰ）の合成：
環流冷却器を備えた容量２Ｌの４つ口フラスコ中にプロピオン酸５００ｍｌを入れ、その中に２−ニトロベンズアルデヒド２５ｇを加え、攪拌しながら１１０℃で還流加熱し、さらにピロール１２ｍｌを加え、３０分間沸点還流した。その後、クロロホルム５０ｍｌを加え、氷冷、吸引濾過した。この濾過物にクロロホルム４００ｍｌを加え、洗浄して残留物を減圧乾燥（１００℃、６時間、０．１ｋＰａ）し、前駆体である５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ニトロフェニル）ポルフィリン（Ｈ２Ｔ２ＮＯ２Ｐ）を黒紫色結晶として得た（収量：５．０ｇ  収率：１４％）。
２Ｌの４つ口フラスコに１２ＮのＨＣｌを３００ｍｌ入れ、その中に上で合成した５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ニトロフェニル）ポルフィリン（Ｈ２Ｔ２ＮＯ２Ｐ）５．０ｇと塩化スズ（ＩＩ）二水和物２０．０ｇを加え、６５〜７０℃で３０分間加熱した。その後、アンモニア水を徐々に加え、吸引濾過、減圧乾燥した。この混合物を２Ｌビーカーに入れ、アセトン１０Ｌで抽出してエバポレーターにより蒸発乾固した。この乾固物をクロロホルム２Ｌに溶解させ、アンモニア水、イオン交換水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターにより蒸発乾固、再結晶、減圧乾燥して、紫色結晶のＨ２Ｔ２ＡｍＰを得た（収量：４．０ｇ、収率９０％）。この生成物を、参考例１と同様に、生成物をＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトル（ＵＶ−２１００：（株）島津製作所製）および１Ｈ−ＮＭＲ測定により同定した。同定結果を表１、表２に示す。また、図７（ａ）にＨ２Ｔ３ＴｈＰのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを、図８の（ａ）にＨ２Ｔ２ＡｍＰのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルをそれぞれ示す。
（同定結果）
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（同定結果）
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表１の同定結果より、Ｈ２Ｔ３ＴｈＰおよびＨ２Ｔ２ＡｍＰについて、それぞれのポルフィリン環を形成しているプロトンのピーク及びそれぞれについてのポルフィリン化合物特有のピークを確認した。また、Ｈ２Ｔ２ＡｍＰについては、アミノ基を形成するプロトンのピークであると考えられる４．０ｐｐｍにピークを確認した。さらに、表２、図７（ａ）及び図８（ａ）の同定結果より、Ｈ２Ｔ３ＴｈＰおよびＨ２Ｔ２ＡｍＰに基づくＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを確認した。以上より、参考例１及び２によりＨ２Ｔ３ＴｈＰ及びＨ２Ｔ２ＡｍＰが合成されていることを確認することができた。
参  考  例  ３
金属ポルフィリン錯体の合成（１）（メタレーションによるＨ２Ｔ３ＴｈＰへの中心金属（Ｆｅ）の導入）：
容量５０ｍｌの３つ口フラスコに４８％臭化水素酸１０ｍｌを入れ、３０分間窒素ガスを吹き込み、さらに還元鉄１００ｍｇを加え、１００℃で還元鉄が溶解するまで攪拌した。攪拌後、溶液を減圧下で乾固させ、白色粉末の臭化鉄無水和物を得た。
この生成物中に参考例１で調製したポルフィリン（Ｈ２Ｔ３ＴｈＰ）２５０ｍｇと、あらかじめ窒素ガスを３０分間吹き込んだジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００ｍｌを加えて、窒素下で４時間反応させた。反応終了後、反応物にクロロホルム２００ｍｌを加え、さらにイオン交換水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水、濾過、エバポレータにより蒸発乾固した。乾固後、アルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製した。溶出液に４８％臭化水素酸を加え、無水硫酸ナトリウムで脱水、濾過、エバポレーターにより蒸発乾固し、再結晶後、減圧乾燥して金属ポルフィリン（中心にＦｅを含むＨ２Ｔ３ＴｈＰ；以下、「ＦｅＴ３ＴｈＰ」という）の黒色結晶を得た（収量：２３０ｍｇ  収率：８４％）。
参  考  例  ４
金属ポルフィリン錯体の合成（２）（メタレーションによるＨ２Ｔ２ＡｍＰへの中心金属（Ｆｅ）の導入）：
ポルフィリン化合物としてＨ２Ｔ２ＡｍＰ（参考例２で得たもの）２５０ｍｇを用いる以外は、参考例３と同様の方法を用いて、Ｈ２Ｔ２ＡｍＰの中心にＦｅを含む金属ポルフィリン錯体（以下「ＦｅＴ２ＡｍＰ」という）の黒色結晶を得た（収量：２２４ｍｇ  収率：８３％）。参考例３及び４の生成物について、ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルにより同定した。結果を図７、図８及び表２に示す。
図７の（ａ）にＨ２Ｔ３ＴｈＰのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを、図７の（ｂ）にＦｅＴ３ＴｈＰのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルをそれぞれ示す。また、図８の（ａ）にＨ２Ｔ２ＡｍＰのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを、図７の（ｂ）にＦｅＴ２ＡｍＰのＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを示す。さらに表３にＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトル測定結果を示す。
中心に金属が配位していないポルフィリン化合物（Ｈ２Ｔ３ＴｈＰ及びＨ２Ｔ２ＡｍＰ）では、４００ｎｍ付近に共役環に基づくピークが現れ、その分子吸光係数は３．６〜６．０×１０５Ｍ−１ｃｍ−１となり、これはＳｏｒｅｔ帯と呼ばれているものである。
また、可視部に分子吸光係数が１０４Ｍ−１ｃｍ−１のＱ帯と呼ばれる４つのピークを有する。金属導入の確認には、Ｑ帯のスペクトル変化が汎用されるが、図７及び表２の（ａ）および（ｂ）を比較すると、（ａ）ではＱ帯のピークが４つ存在するのに対し、（ｂ）では１つに減少している。これは、ポルフィリンが金属錯体化を形成したときの一般的な挙動に一致しており、これよりポルフィリンが鉄錯体化され、金属ポルフィリン錯体が合成されていることが確認できた。
参  考  例  ５
金属ポルフィリン錯体の合成（３）（メタレーションによるＨ２Ｔ３ＴｈＰへの中心金属（Ｍｎ）の導入）：
上部にアルゴンバルーンを取り付けた環流冷却器を備え、油浴およびマグネチックスターラーによる攪拌を可能とした容量３００ｍｌの４つ口フラスコ中に、酢酸マンガン０．５ｇおよび参考例１で得たＨ２Ｔ３ＴｈＰ０．５ｇを含む１００ｍｌのＤＭＦを加えた後、アルゴンで飽和し、１４０℃で１時間環流した。
得られた溶液を分液ロートに移し、クロロホルムとイオン交換水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムを入れ、１時間脱水した後、濾過し、濾液をエバポレーターにより乾固した。
この乾固物をカラムクロマトグラフィー［充填剤：塩基性アルミナ、溶離液：クロロホルム／メタノール（２０：１）］により分離精製した。濾過後、濾液をエバポレーションにより乾固した後、減圧乾燥（０．１ｋＰａ、１００℃）し、黒紫色結晶のＭｎＴ３ＴｈＰを得た（収量：０．３６ｇ）。
金属導入の確認として紫外・可視吸収スペクトル測定をおこなった。ＭｎＴ３ＴｈＰの吸収ピークは３８０、４０５、４８０、５３３、５８３、６２３ｎｍに生じ、前記のＨ２Ｔ３ＴｈＰとは異なる吸収ピークとなり、金属導入を確認した。
参  考  例  ６
軸配位子を有する金属ポルフィリン錯体の合成（１）（１−メチルイミダゾールが配位したＦｅＴ３ＴｈＰの合成）：
参考例３で得たＦｅＴ３ＴｈＰ（０．０１８ｇ）と１−メチルイミダゾール（２〜１００μｌ、ＦｅＴ３ＴｈＰ：１−メチルイミダゾール＝１〜５０（モル比））をジクロロメタン０．５ｍｌに加え、超音浴（１５Ｗ）照射下で撹拌（５分）または超音波非照射下で撹拌（６時間以上）した。
配位子付与の確認として紫外・可視吸収スペクトル測定をおこなった。ＦｅＴ３ＴｈＰに１−メチルイミダゾールが配位した錯体の吸収ピークは４２１ｎｍに生じ、前記のＦｅＴ３ＴｈＰとは異なる吸収ピークとなり、配位子付与を確認した。
これをエバポレーターで乾固して保存、または、活性酸素種用電極の作製に供した。
実  施  例  １
活性酸素種用電極の作製（１）：
グラッシーカーボン（ＧＣ）電極（直径１．０ｍｍ）（ビーエーエス（株）製）をアルミナ研磨剤（０．０５μｍ）で研磨し、このものを水で洗浄後、さらにメタノールで洗浄した。この電極の表面に対して、下記の電解溶液及び操作手順を用いて、電解重合法により表面にＦｅＴ３ＴｈＰの重合膜が形成されたグラッシーカーボン電極（本発明品１）及び表面にＦｅＴ２ＡｍＰの重合膜が形成されたグラッシーカーボン電極（本発明品２）を作製した。
（試料溶液）
金属ポルフィリン錯体としては、参考例３または４で合成したＦｅＴ３ＴｈＰまたはＦｅＴ２ＡｍＰを、０．０５Ｍの濃度として用いた。溶媒は支持電解質として０．１Ｍの過塩素酸テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ４ＮＣｌＯ４／ＴＢＡＰ）を含むジクロロメタン（無水）を用いた。なお、溶媒中の溶存酸素はアルゴンガスにより除去した。
（操作手順）
電解重合は図１に示す構成の３電極式セル（作用電極：ＧＣ、対極：Ｐｔ線、参照電極：ＳＣＥ）により可逆電位掃引電解法で行なった。掃引範囲はＦｅＴ３ＴｈＰを用いた活性酸素種用電極を調製する場合は、ＳＣＥに対し、０〜２．０Ｖであり、ＦｅＴ２ＡｍＰを用いた活性酸素種用電極を調製する場合は、ＳＣＥに対し、−０．２〜１．４Ｖであった。また、掃引速度は、何れも０．０５Ｖ／ｓで、掃引回数はＦｅＴ３ＴｈＰの場合は１回掃引、ＦｅＴ２ＡｍＰの場合は３回掃引とした。なお、この電解操作において得られたサイクリックボルタモグラム（ＣＶ曲線）は、Ｘ−Ｙレコーダー（理研電子製）にて記録した。結果を図９及び図１０に示す。
図９に、金属ポルフィリン錯体としてＦｅＴ３ＴｈＰを用いて電極を作製した際の電解重合時のＣＶ曲線を示す。この曲線から、＋１．７４Ｖ（対ＳＣＥ）でチオフェンのカチオンラジカルが生成していると考えられる。さらに電位スイープを反転させると、カチオンラジカルの還元によるカソード電流はほとんど流れないことから、生成したカチオンラジカルが溶液中で直ちに重合していると考えられる。また、０．６Ｖ（対ＳＣＥ）付近に還元ピークがみられるが、これはポリマーのレドックス応答であると考えられる。この結果により、ＧＣ電極の表面に金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ３ＴｈＰ）の重合膜が形成されていることが確認できた。
また、図１０に、金属ポルフィリン錯体としてＦｅＴ２ＡｍＰを用いて電極を作製した際の電解重合時のＣＶ曲線を示す。この曲線から、＋１．０２Ｖ（対ＳＣＥ）でアニリン（アミノベンゼン）のカチオンラジカルが生成していると考えられる。さらに電位スイープを反転させると、カチオンラジカルの還元によるカソード電流はほとんど流れないことから、生成したカチオンラジカルが溶液中で直ちに重合していると考えられる。また、０．１Ｖ（対ＳＣＥ）付近に還元ピークがみられるが、これはポリマーのレドックス応答であると考えられる。さらに第２回目の掃引において同様のピークがみられ、重合反応がさらに進行していることが確認できた。なお、０．２３Ｖ（対ＳＣＥ）付近にみられる酸化ピークは重合されたポリマーのレドックス応答であると考えられる。この結果により、ＧＣ電極の表面に金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ２ＡｍＰ）重合膜が形成されていることが確認できた。
実  施  例  ２
活性酸素種用電極の作製（２）：
周りをポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）で囲まれ、端部のみが露出したグラッシーカーボン（ＧＣ）電極（ＰＥＥＫは３ｍｍφ、ＧＣは１ｍｍφ、端部面積は０．００７９ｃｍ２／逆側端部は真ちゅう製）のＧＣ側端部を６μｍ研磨用ダイヤモンドおよび１μｍ研磨用ダイアモンドで順次研磨した後、アルミナ研磨パッド上でアルミナ研磨剤（０．０５μｍ）で仕上げ研磨し、イオン交換水ついでアセトンで洗浄した。
一方、参考例４で得たＦｅＴ２ＡｍＰ  ０．００３７ｇとＴＢＡＰ  ０．１７１ｇを５ｍｌ容メスフラスコに取り、アセトニトリルで５ｍｌにメスアップして試料溶液とした。
この試料溶液を、セルバイアルに入れ、ＧＣ電極を作用電極として図１に示す３電極式電気化学セルを組み立て、アルゴン置換した。
電位掃引範囲を、Ａｇ／Ａｇ＋に対し−０．３Ｖから＋１．０Ｖ、掃引速度２００ｍＶ／ｓｅｃで３回電位掃引を行った。掃引開始電位および終了電位は、Ａｇ／Ａｇ＋に対し０Ｖとし、卑方向への掃引から開始した。掃引終了後、アセトニトリル、イオン交換水で順次洗浄し、表面にＦｅＴ２ＡｍＰの重合膜が形成されたグラッシーカーボン電極（本発明品３）を作製した。
実  施  例  ３
活性酸素種用電極の作製（３）：
ＴＢＡＰ  ０．１７１ｇを５ｍｌ容メスフラスコに取り、ジクロロメタンで５ｍｌにメスアップして電解質溶液とした。
先端をバイコールガラスで封止したサンプルバイアルの先端部を上記電解質溶液に浸しながら、このサンプルバイアル中に参考例４で得たＦｅＴ２ＡｍＰ  ０．０１８２ｇ、ＴＢＡＰ  ０．０１７１ｇおよびジクロロメタン０．５ｍｌを加えた。
図２に示すように、このサンプルバイアルの中に、Ｐｔ対極と実施例２と同じＧＣ電極を入れ、サンプルバイアルの外側にＡｇ／Ａｇ＋電極を設置し、２室型３電極式電気化学セルを組み立てた。この２室は、いずれもアルゴン置換した。
電位掃引範囲を、Ａｇ／Ａｇ＋に対し−０．３Ｖから＋２．５Ｖ、掃引速度５０ｍＶ／ｓｅｃで３回電位掃引を行った。掃引開始電位は、Ａｇ／Ａｇ＋に対し０Ｖ、掃引終了電位は、Ａｇ／Ａｇ＋に対し−０．３Ｖとした。掃引は、卑方向への掃引から開始した。掃引終了後、ジクロロメタン、イオン交換水で順次洗浄し、表面にＦｅＴ２ＡｍＰの重合膜が形成されたグラッシーカーボン電極（本発明品４）を作製した。
実  施  例  ４
活性酸素種用電極の作製（４）
グラッシーカーボン（０．２８〜０．３０ｍｍφ）の線材をガラスキャピラリー（内径０．３ｍｍφ）中に導入し、さらにこれらをニードル（白金製、ステンレス鋼製等、寸法は例えば注射用ニードルで１８Ｇ程度）に導入した。これらの間をエポキシ系接着剤、アクリル系接着剤、マニュキュア等で接着、固定し、次に、グラッシーカーボンおよび外側のニードルを、各々、白金線、ステンレス線、銅線等で銀ペースト、カーボンペースト等の導電性接着剤を介して接合させ、さらに、先端をグラインダー等で研磨して図３に示すような３層構造のニードル型の電極を作製した（グラッシーカーボンは作用極用電極部、中側のガラスキャピラリーが作用極と対極の絶縁部、外側のニードルは対極用電極部となる）。
実施例３と同様に調製した電解質溶液（５ｍｌ）をセル容器に入れた。先端部をパイコールガラスで封止したサンプルバイアルの先端部を上記の電解質溶液に浸しながら、このサンプルバイアル中にＴＢＡＰ０．０１７１ｇを含む参考例６で得た１−メチルイミダゾールが配位したＦｅＴ３ＴｈＰのジクロロメタン溶液を加えた。
図３に示すように、このサンプルバイアル中に上記で作製したニードル型の電極（作用極および対極）を入れ、サンプルバイアルの外側にＡｇ／Ａｇ＋電極を設置し、２室型３電極式電気化学セルを組み立てた。
このセルを用い、可逆電位掃引法（電位掃引範囲：Ａｇ／Ａｇ＋に対し−０．１Ｖから＋２．０Ｖ、電位掃引速度１０から５００ｍＶ／ｓｅｃ）および定電位法（電位：Ａｇ／Ａｇ＋に対し＋２．０Ｖ）により電解重合を５分から１２０分間行った。電解重合終了後、ジクロロメタン、イオン交換水で順次洗浄し、表面に１−メチルイミダゾールが配位したＦｅＴ３ＴｈＰの重合膜が形成されたグラッシーカーボン電極を含む３層構造のニードル型の電極（グラッシーカーボン上に重合膜を修飾したものが作用極用電極部、中側のガラスキャピラリーが作用極と対極の絶縁部および外側のニードルは対極用電極部である；本発明品５）を作製した。
比  較  例  １
チトクロームｃ固定化金電極の作製：
本発明品の電極の比較品として、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定用電極であるチトクロームｃ固定化電極を下記の方法で作製した。
金電極（直径１．６ｍｍ）（ビーエーエス（株）製）をアルミナ研磨剤（０．０５μｍ）で研磨し、水で洗浄した。さらに１ＭのＨ２ＳＯ４中にて電気化学的処理を施し、水で洗浄した。次に１０ｍＭの３−メルカプトプロピオン酸（３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：以後ＭＰＡと略記する）（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（溶媒：１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０））に２４時間浸漬し、ＭＰＡ修飾金電極を作製した。これを水で洗浄し、０．４８ｍＭチトクロームｃ（ｔｙｐｅＩＶ  ｆｒｏｍ  Ｈｏｒｓｅ  Ｈｅａｒｔ：Ｓｉｇｍａ社製）（溶媒：１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．０））中にて３０分間電位掃引した（掃引範囲：−０．４〜０．４Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）、掃引速度：０．０５Ｖ／ｓ）。ここに、終濃度が０．５Ｍになるように１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ：ＥＤＣ）（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ社製）を加えて２時間浸漬し、最後にリン酸緩衝溶液で洗浄してチトクロームｃ固定化金電極（比較品１）を得た。なお、上記のリン酸緩衝溶液は、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムの混合溶液であり、試料溶液を調整する際に用いた水は１回蒸留したものである。
試  験  例  １
スーパーオキシドアニオンラジカル量の測定試験（１）：
本発明品１及び比較品１の電極を用い、スーパーオキシドアニオンラジカル量の測定を行った。
まず、本発明品１または比較品１の電極を作用極、Ｐｔ線を対極としてセル容器中に設置し、参照電極として銀／塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を用い、試験用３電極式セルを構成した。この試験用３電極式セルを中心に、図５に示すような装置を準備した。試験において、電位掃引範囲は、比較品１の電極で−０．２〜０．２５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）、本発明品１の電極で−０．５〜０．５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）に設定した。また、掃引速度は数種類で測定した。
一方、１４．４ｍＭキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む２ｍＭ水酸化カリウム水溶液および１０ｍＭ塩化カリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７．５）を調製し、前者を０．３６５ｍｌ、後者を１４．６３５ｍｌ分取し、これらを混合して、０．３５ｍＭキサンチン溶液を調製し、測定溶液とした。この測定溶液中の溶存酸素を高純度アルゴンガスで除去した。
次に、上記測定溶液を、それぞれ試験用３電極式セルに入れ、各電極の酸化還元電位より充分貴な電位である０．２Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加した。この測定溶液中に、終濃度が０〜１００ｍＵ／ｍｌになるようにキサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ：ＸＯＤ）（ＧｒａｄｅｌＩＩ  ｆｒｏｍ  ｂｕｔｔｅｒｍｉｌｋ：Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、その時の酸化電流の経時変化を記録した。本発明品１についての結果を図１２に、比較品１についての結果を図１１に示す。なお、ＸＯＤは使用前に１０ｍｌリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）にて透析した。また、測定はすべて室温下で行った。
キサンチンに対し、ＸＯＤを加えることにより、用量依存的にスーパーオキシドアニオンラジカルが発生するが、対象である比較品１のＸＯＤ添加時の酸化電流の経時変化を示す図１１では、酸化電流はＸＯＤを添加した直後に急激に増加し、その後ほぼ一定の値になることが示されている。一方、本発明品１について、ＸＯＤ添加時の酸化電流の経時変化を示す図１２も、図１１と同様、酸化電流はＸＯＤを添加した直後に急激に増加したが、その後一旦減少した後ほぼ一定の値になり、この電流値はＸＯＤの濃度つまりスーパーオキシドアニオンラジカルの量に依存することが示されていた。
また、図１３は、本発明品１及び比較品１の（ＸＯＤ活性度）１／２と、ＸＯＤを加えたときの電流増加量との関係を示すグラフである。このＸＯＤ活性度は、フリドビッチ（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ）ら、及びクーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）らの文献値（Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｂｏｉｌ．ｃｈｅｍ．，２４３，５７５３（１９６８）、Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｂｏｉｌ．ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）、Ｉ．Ｆｒｉｄｏｒｉｃｈ，Ｊ．Ｂｏｉｌ．ｃｈｅｍ．，２４５，４０５３（１９７０）及びＪ．Ｍ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｋ．Ｒ．ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ，ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３４７，２６７（１９９３））を参考にして定めた。
この結果から、本発明品１の電流増加量は、対照である比較品１と同様、（ＸＯＤ活性度）１／２に比例し、直線関係が得られた。これらのことから、本発明の活性酸素種用電極で、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度測定が可能であることが確認できた。
試  験  例  ２
スーパーオキシドアニオンラジカル量の測定試験（２）：
本発明品５の電極を用い、スーパーオキシドアニオンラジカル量の測定を行った。
本発明品５の電極、すなわち、３層構造のニードル型の電極（グラッシーカーボン上に重合膜を修飾したものが作用極用電極部、中側のガラスキャピラリーが作用極と対極の絶縁部および外側のニードルは対極用電極部、本発明品５）を用い、２電極式で測定した。測定溶液としては、０．１５ｍＭキサンチンを含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．５）を用い、０から１００ｍＵ／ｍｌとなる量のＸＯＤを添加した。また、印加電圧は０から１．０Ｖとした。
印加電圧＋０．５ＶでＸＯＤを１００ｍＵ／ｍｌとなるように添加した場合の電流の経時変化を図１４に、ピークの電流値を元に作成したスーパーオキシドアニオンラジカル量と電流量変化の関係のグラフを図１５に示す。
図１５から求めた、スーパーオキシドアニオンラジカル量と電流量変化の間の相関係数は、０．９９５であり、本発明電極はスーパーオキシドアニオンラジカル量の測定に有効に利用しうることが示された。
産業上の利用可能性
本発明の活性酸素種用電極は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のいずれの環境であっても、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、・ＯＨ等の活性酸素種や、他のラジカル活性種（ＮＯ、ＯＮＯＯ−等）の検出を行うことができる。また、対極や参照電極と組み合わせることにより、これら活性酸素種等を定量測定できるので、各種分野で広く利用することができるものである。
例えば、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での使用により、生体内の活性酵素種や他のラジカル活性種から各種疾病を特定することができる。
一方、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での使用により、例えば、食品内の活性酸素種やその濃度を測定することができ、該食品の腐敗状態を判断することが可能となる。また、水道水や下水等の水中の活性酸素種やその濃度を測定することにより、水質汚染の状態を観察することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明電極を製造するために用いる３電極式セルの一例を示す図面である。
図２は、本発明電極を製造するために用いる２室型３電極式セルの一例を示す図面である。
図３は、本発明電極を製造するために用いるニードル型の電極および２室型３電極式セルの一例を示す図面である。図中、（Ａ）は２室型３電極式セルを、（Ｂ）はニードル型の電極全体を、（ｃ）はニードル型電極の先端部分を示す。
図４は本発明電極を製造するために用いる改良／ニードル型の電極を示す図面である。本電極は図３のニードル型の電極を改良したものである。図中、（Ａ）は改良／ニードル型の電極全体を、（Ｂ）は改良／ニードル型の電極の先端部分を示す。
図５は、活性酸素種の測定用に用いる測定装置の一例を示す図面である。
図６は、活性酸素種の測定用に用いる測定装置の一例を示す図面である。
図７は、Ｈ２Ｔ３ＴｈＰ（図中の（ａ））及びＦｅＴ３ＴｈＰ（同（ｂ））のＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを示したグラフである。
図８は、Ｈ２Ｔ２ＡｍＰ（図中の（ａ））及びＦｅＴ２ＡｍＰ（同（ｂ））のＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペクトルを示したグラフである。
図９は、ＦｅＴ３ＴｈＰの電解重合時のＣＶ曲線を示すグラフである。
図１０は、ＦｅＴ２ＡｍＰの電極作製における電解重合時のＣＶ曲線を示すグラフである。
図１１は、比較品１のＸＯＤ添加時の酸化電流の経時変化を示すグラフである。
図１２は、本発明品１のＸＯＤ添加時の酸化電流の経時変化を示すグラフである。
図１３は、本発明品１及び比較品１の（ＸＯＤ活性度）１／２と電流増加量との関係を示すグラフである。
図１４は、本発明品４のＸＯＤを１００ｍＵ／ｍｌとなるように添加した場合の電流の経時変化を示す図面である。
図１５は、スーパーオキシドアニオンラジカル量と電流量変化の関係を示す図面である。
【図１】
2003054536.tif 000014
【図２】
2003054536.tif 000015
【図３】
2003054536.tif 000016
【図４】
2003054536.tif 000017
【図５】
2003054536.tif 000018
【図６】
2003054536.tif 000019
【図７】
2003054536.tif 000020
【図８】
2003054536.tif 000021
【図９】
2003054536.tif 000022
【図１０】
2003054536.tif 000023
【図１１】
2003054536.tif 000024
【図１２】
2003054536.tif 000025
【図１３】
2003054536.tif 000026
【図１４】
2003054536.tif 000027
【図１５】
2003054536.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月3日(2004.2.3)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】（削除）
【請求項２】導電性部材の表面に下記（Ｉ）または（ＩＩ）
2003054536.tif 000029
（式中、Ｍは、鉄、マンガン、コバルト、クロム、イリジウムから選ばれる金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基またはアミノフェニル基から選ばれるいずれかの基であり、他のＲは、前記のいずれかの基またはアルキル基、アリール（ａｒｙｌ）基もしくは水素を示す）
2003054536.tif 000030
（式中、ＭおよびＲは上記した意味を有し、２つのＬのうち少なくとも１つは、イミダゾールおよびその誘導体、ピリジンおよびその誘導体、アニリンおよびその誘導体、ヒスチジンおよびその誘導体、トリメチルアミンおよびその誘導体等の窒素系軸配位子、チオフェノールおよびその誘導体、システインおよびその誘導体、メチオニンおよびその誘導体等の硫黄系軸配位子、安息香酸およびその誘導体、酢酸およびその誘導体、フェノールおよびその誘導体、脂肪族アルコールおよびその誘導体、水等の酸素系軸配位子であり、他のＬは、前記のいずれかの軸配位子または配位子のないものを示す）
で表される金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してなることを特徴とする活性酸素種用電極。
【請求項３】金属ポルフィリン錯体を形成するポルフィリン化合物が、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（２−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（３−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（２−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（３−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（２−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（３−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（２−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリンおよび［５−モノ（３−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリンなる群から選ばれるものである請求項第２項記載の活性酸素種用電極。
【請求項４】（削除）
【請求項５】（削除）
【請求項６】（削除）
【請求項７】（削除）
【請求項８】電気絶縁性材料で調製された細管中に導電性部材を入れ、更にこの細管の外側を対極となる金属等の材料で被覆して対極部分とし、導電性部材端面上に金属ポルフィリン重合膜を形成させてなり、ニードルの形状である請求項第２項または第３項記載の活性酸素種用電極。
【請求項９】導電性部材を電気絶縁性材料中に入れ、それらを対極用材料中に入れ、更に、それらを電気絶縁材料中に入れ、この外側をアースとなる材料で被覆し、導電性部材端面上に金属ポルフィリン重合膜を形成させてなり、ニードル状である請求項第２項または第３項記載の活性酸素種用電極。
【請求項１０】スーパーオキシドアニオンラジカル測定用のものである請求項第２項、第３項、第８項または第９項の何れかの項記載の活性酸素種用電極。
【請求項１１】導電性部材の表面に、下記（Ｉ）または（ＩＩ）
2003054536.tif 000031
（式中、Ｍは、鉄、マンガン、コバルト、クロム、イリジウムから選ばれる金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基またはアミノフェニル基から選ばれるいずれかの基であり、他のＲは、前記のいずれかの基またはアルキル基、アリール（ａｒｙｌ）基もしくは水素を示す）
2003054536.tif 000032
（式中、ＭおよびＲは上記した意味を有し、２つのＬのうち少なくとも１つは、イミダゾールおよびその誘導体、ピリジンおよびその誘導体、アニリンおよびその誘導体、ヒスチジンおよびその誘導体、トリメチルアミンおよびその誘導体等の窒素系軸配位子、チオフェノールおよびその誘導体、システィンおよびその誘導体、メチオニンおよびその誘導体等の硫黄系軸配位子、安息香酸およびその誘導体、酢酸およびその誘導体、フェノールおよびその誘導体、脂肪族アルコールおよびその誘導体、水等の酸素系軸配位子であり、他のＬは、前記のいずれかの軸配位子または配位子のないものを示す）
で表される金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成してなる活性酸素種用電極、対極及び参照電極を含む活性酸素種濃度測定用センサー。
【請求項１２】金属ポルフィリン錯体を構成する金属ポルフィリンが、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ピロリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−フリル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メルカプトフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−アミノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（２−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０，１５−トリス（３−チオフリル）−２０−モノ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（２−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１０−ビス（３−チオフリル）−１５，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（２−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５，１５−ビス（３−チオフリル）−１０，２０−ジ（フェニル）］ポルフィリン、［５−モノ（２−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリンおよび［５−モノ（３−チオフリル）−１０，１５，２０−トリ（フェニル）］ポルフィリンなる群から選ばれるものである請求項第１１項記載の活性酸素種濃度測定用センサー。
【請求項１３】電極として、電気絶縁性材料で調製された細管中に導電性部材を入れ、更にこの細管の外側を対極となる金属等の材料で被覆して対極部分とし、導電性部材端面上に金属ポルフィリン重合膜を形成させてなり、ニードルの形状である電極を使用する請求項第１１項または第１２項記載の活性酸素種濃度測定用センサー。
【請求項１４】電極として、導電性部材を電気絶縁性材料中に入れ、それらを対極用材料中に入れ、更に、それらを電気絶縁材料中に入れ、この外側をアースとなる材料で被覆し、導電性部材端面上に金属ポルフィリン重合膜を形成させてなり、ニードル状である電極を使用する請求項第１１項または第１２項記載の活性酸素種濃度測定用センサー。
【請求項１５】スーパーオキシドアニオンラジカル測定用のものである請求項第１１項ないし第１４項の何れかの項記載の活性酸素種濃度測定用センサー。
【請求項１６】金属ポルフィリン重合膜中の金属と活性酸素種との間の酸化還元反応で生じる電流を、請求項第１１項ないし第１５項記載のセンサーで測定することを特徴とする試料中の活性酸素種の検出方法。
【請求項１７】検出する活性酸素種がスーパーオキシドアニオンラジカルである請求項第１６項記載の試料中の活性酸素種の検出方法。




【国際調査報告】
2003054536.tif 000033
2003054536.tif 000034
2003054536.tif 000035
2003054536.tif 000036