(57)【要約】本発明は、多分化能幹細胞を骨髄、皮膚、骨格筋などの組織から末梢血中に動員する薬剤に関する。本発明はさらに、多分化能幹細胞を骨髄、皮膚、骨格筋などの組織から末梢血中に動員する薬剤を用いた心不全、肝不全、腎不全、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病）、心血管障害、脳血管障害、脊髄損傷、関節炎、骨粗鬆症、糖尿病などを治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球またはマクロファージを活性化するサイトカイン、活性化した単球またはマクロファージから分泌されるサイトカイン、およびＧ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞から分泌されるサイトカインからなる群より選ばれるサイトカインを有効成分として含有する多分化能幹細胞を組織から末梢血へ動員する薬剤。
【請求項２】
サイトカインが、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８からなる群から選ばれるサイトカインである、請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
単球またはマクロファージを活性化するサイトカインが、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＷ−ＣＳＦからなる群から選ばれる、請求項１記載の薬剤。
【請求項４】
Ｇ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞が、顆粒球または好中球である、請求項１記載の薬剤。
【請求項５】
好中球から分泌されるサイトカインが、ＩＬ−８である、請求項４記載の薬剤。
【請求項６】
サイトカインが、化学修飾された請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
化学修飾がポリアルキレングリコールにより修飾された請求項６記載の薬剤。
【請求項８】
サイトカインが、構成するアミノ酸配列のうち、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加され、かつ実質的に同等な活性を有するサイトカインである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項９】
組織が骨髄である請求項１記載の薬剤。
【請求項１０】
多分化能幹細胞が、ＣＤ４５陰性細胞、グリコホリンＡ陰性細胞およびｏｃｔ３／４陽性細胞からなる群より選ばれる多分化能幹細胞である請求項１記載の薬剤。
【請求項１１】
多分化能幹細胞が、ＣＤ４５陰性およびグリコホリンＡ陰性の細胞、ｏｃｔ３／４陽性およびＣＤ４５陰性の細胞、ｏｃｔ３／４陽性およびグリコホリンＡ陰性の細胞、ＣＤ４５陰性、グリコホリンＡ陰性およびｏｃｔ３／４陽性の細胞ならびにＣＤ４５陰性およびＣＤ３４陰性の細胞からなる群より選ばれる多分化能幹細胞である、請求項１記載の薬剤。
【請求項１２】
多分化能幹細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１１７陽性およびＣＤ１４０陽性の細胞、ＣＤ１０陽性およびＣＤ６６ｅ陽性の細胞、ＣＤ１３陽性およびＣＤ４９ｂ陽性の細胞、ならびにＣＤ４５陰性およびＣＤ３４陽性からなる群より選ばれる多分化能幹細胞である、請求項１記載の薬剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤を用いることを特徴とする、末梢血幹細胞に動員された多分化能幹細胞を回収する方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法により取得した多分化能幹細胞を、組織再生するために用いる方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤を用いて、末梢血幹細胞に動員された多分化能幹細胞を体性細胞へと分化誘導する方法。
【請求項１６】
体性細胞が赤血球、白血球、血小板、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、皮膚表皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、気管上皮細胞、肺胞細胞、消化管上皮細胞、口腔上皮、エナメル芽細胞、ゾウゲ芽細胞、肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞、腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、下垂体内分泌細胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、視細胞、色素上皮細胞、角膜細胞、涙腺細胞、および鼓膜細胞からなる群から選ばれる体細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
単球またはマクロファージを活性化するサイトカイン、活性化した単球またはマクロファージから分泌されるサイトカイン、およびＧ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞から分泌されるサイトカインからなる群より選ばれるサイトカインを有効成分として含有する組織再生治療剤。
【請求項１８】
サイトカインが、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８からなる群から選ばれるサイトカインである、請求項１７記載の治療剤。
【請求項１９】
単球またはマクロファージを活性化するサイトカインが、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選ばれる、請求項１７記載の治療剤。
【請求項２０】
Ｇ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞が顆粒球または好中球である、請求項１７記載の治療剤。
【請求項２１】
好中球から分泌されるサイトカインがＩＬ−８である、請求項２０記載の治療剤。
【請求項２２】
サイトカインが、化学修飾された請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２３】
化学修飾がポリアルキレングリコールにより修飾された請求項２２記載の治療剤。
【請求項２４】
サイトカインが、構成するアミノ酸配列のうち、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加され、かつ実質的に同等な活性を有するサイトカインである、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２５】
組織が神経系組織、皮膚組織、循環器系組織、呼吸器系組織、骨格系組織、結合組織、血液、免疫系組織、消化管組織、口腔内組織、肝組織、膵臓組織、泌尿器系組織、内分泌腺、感覚器系組織からなる群により選ばれる、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２６】
神経系組織が、中枢神経系および末梢神経系からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項２７】
皮膚組織が、皮膚表皮、皮膚真皮および皮下組織からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項２８】
循環器系組織が、心臓、動脈血管、静脈血管、毛細血管、およびリンパ管からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項２９】
呼吸器系組織が、鼻粘膜、気管および肺胞からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３０】
骨格系組織が、骨、軟骨、関節、靭帯、および腱からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３１】
結合系組織が、脂肪組織および繊維組織からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３２】
血液組織が、赤血球、白血球および血小板からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３３】
免疫系組織が、リンパ球、単球、顆粒球、胸腺、リンパ節および脾臓からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３４】
消化管系組織が、唾液腺、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および肛門からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３５】
口腔内組織が、口腔粘膜、歯および舌からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３６】
肝組織が、肝臓および胆嚢からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３７】
膵臓組織が、膵外分泌腺および膵内分泌腺からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３８】
泌尿器系組織が、腎臓ネフロン、腎臓尿細管、腎髄質、尿管、膀胱、および尿路からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項３９】
内分泌腺が、下垂体、甲状腺、および末梢神からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【請求項４０】
感覚器系組織が、味蕾、嗅上皮、網膜、角膜、水晶体、内耳および末梢神経系からなる群から選ばれる請求項２５記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は成体組織中にある赤血球、白血球、血小板、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、皮膚表皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、気管上皮細胞、肺胞細胞、消化管上皮細胞、口腔上皮、エナメル芽細胞、ゾウゲ芽細胞、肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞、腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、下垂体内分泌細胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、視細胞、色素上皮細胞、角膜細胞、涙腺細胞、鼓膜細胞などの様々な細胞に分化する能力を有する多分化能幹細胞を末梢血中に動員する薬剤、該薬剤を含有する組織再生治療剤、該薬剤を用いた多分化能幹細胞の回収方法、および該方法により取得した多分化能幹細胞の体細胞への分化誘導方法に関する。
背景技術
現在、心不全、肝不全、腎不全、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病）、心血管障害、脳血管障害、脊髄損傷、関節炎、骨粗鬆症、糖尿病等に対する根治療法としては脳死臓器移植が実施されている。しかしドナー不足から、移植医療の進んでいる米国においても臓器移植を望む患者の約５％にしか、臓器は行き渡らないのが実状である〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２６７，２３９−２４６（１９９２）〕。
また臓器移植には、免疫拒絶が伴うために免疫抑制剤を生涯にわたり服用し続けなければならないという問題点や、ドナー由来の感染症に罹る危険性などの課題が存在する。
臓器のドナー不足を解決するために異種移植に関する技術開発が進められている。
しかし、免疫拒絶の問題は解決しておらず同種移植と比較しても拒絶の度合いはより厳しい。また異種移植の有効な材料と考えられているブタから、移植を介してウイルスなどが感染する危険性も考えられる。実際マレイシアでは１００万頭近いブタがヘンドラ・ウイルスに感染し、その結果７０人以上の人に致死性の感染が引き起こされている〔Ｎａｔｕｒｅ，３９８，５４９（１９９９）〕。
上述した同種臓器移植や異種臓器移植の問題点を克服する目的で、幹細胞からヒト組織や細胞を分化誘導する技術が検討されている。
幹細胞とは自己複製能と様々な組織に分化できる多分化能とを併せ持つ細胞である。幹細胞は採取部位から胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎生幹細胞、成体幹細胞、臍帯血幹細胞、胎盤幹細胞の大きく５つに分類することができる。胞胚期の胚の内部細胞塊と呼ばれる部位から分離されるＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）や胎児の生殖腺から採取されるＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）は、成体のすべての細胞に分化できる全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有することから組織を再構築するための材料として注目されている〔今日の移植，１４，５４２−５４８（２００１）〕。また、胎児の組織からは神経幹細胞などの組織特異的な幹細胞が分離・培養されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４７２０−１４７２５（２０００）〕。しかし、このような胚や胎児由来の幹細胞を取得するには、胚や胎児を破壊することが必要なことから倫理的な問題を包含しており、また脳死臓器移植の場合と同様に患者自身の細胞でないことから免疫拒絶の問題を回避することも簡単ではない。さらに、胚の幹細胞や胎児の幹細胞は個体の発生のために機能する細胞であることから、成体の幹細胞とは性質が異なり、また成体組織に対する親和性も異なっている。実際、ＥＳ細胞を成体の組織に移植すると腫瘍を形成する。以上のことから、胚や胎児由来の細胞を成体に移植する治療法は長期間にわたる安全性を検証することが容易ではないことを示している。
成体組織由来の幹細胞の場合には患者自身の細胞を用いた治療が可能である。
幹細胞は、自己複製能を有することから細胞の大量製造が可能である。したがって、生体外で培養・製造した幹細胞が組織中の幹細胞と同質のものであることを証明することで、移植の際の安全性を担保することが可能である。皮膚や軟骨を再生するための商品がすでに販売されている〔蛋白質  核酸  酵素，４５，２３４２−２３４７（２０００）〕。
しかし、成体の組織中に存在する組織特異的な幹細胞は分裂能に限りがあることから、十分に細胞量を確保するのが困難という欠点がある。また、組織特異的な幹細胞を用いる限りは、その組織の治療にしか利用できず、汎用性がない。
しかし、最近成体組織中に成体のほとんどすべての細胞に分化する能力を持つ多分化能幹細胞が存在することが明らかになった（ＷＯ０１／１１０１１、ＷＯ０１／２１７６７、ＷＯ０１／４８１４９）。
当該細胞は無限に増殖する自己複製能を有することから大量に細胞を製造することも可能である。また本細胞は胚由来のＥＳ細胞とは異なり、成体組織に移植しても腫瘍を形成することはない。このような多分化能幹細胞は、出生後のヒト皮膚、骨格筋、骨髄から取得できることが示されている。
一方、様々な疾患の治療を目的として造血幹細胞の移植による造血系の再建が試みられている。造血幹細胞は骨髄から採取するが、採取の際の患者への負担がかかる。そこで、採取の容易さや移植時間の短縮などの理由から骨髄からの造血幹細胞の採取よりは造血幹細胞を末梢血中に動員させて採取することが試みられている。
造血幹細胞を末梢血中に動員する方法としては、造血系の増殖因子、ケモカイン、細胞障害薬などが知られている。
造血系の増殖因子としては、Ｇ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ｆｌｔ−３リガンド、ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、トロンボポエチンなどが知られている。ケモカインとしてはＩＬ−８、ＭＩＰ−２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）、ＢＢ−１００１０（ＭＩＰ−１α）などが知られている。細胞障害薬としてはシクロフォスファミドなどが知られている〔Ｂｌｏｏｄ，１０，３０２５−３０３１（２０００）〕。
またコロンビア大学の研究グループは、Ｇ−ＣＳＦによりヒト末梢血中に動員される細胞からＣＤ３４陽性細胞を分離し、心筋梗塞モデルに移植すると血管新生が起こり、心機能が改善することを見出した〔Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７，４３０−４３６（２００１）、ＷＯ２００１／９４４２０〕。
ニューヨーク州立大学の研究グループは、マウス骨髄中のＬｉｎ陰性およびｃ−ｋｉｔ陽性の造血幹細胞を心筋梗塞を引き起こしたマウスに移植すると心筋と血管が再生することを見出した〔Ｎａｔｕｒｅ，４１０，７０１−７０５（２００１）〕。また、同じ研究グループは心筋梗塞を起す前にマウスにＧ−ＣＳＦおよびＳＣＦを投与すると、梗塞部位で心筋と血管の再生が起こることを見出し、Ｇ−ＣＳＦにより造血幹細胞が末梢血中に流れ出て梗塞心筋を再生すると考察した［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，１０３４４−１０３４９（２００１）］。
発明の開示
多分化能幹細胞は、様々な組織を再生することが可能である。患者の皮膚、骨格筋、骨髄から多能性幹細胞を採取する際には、患者自身に強い痛みや組織破壊を導くなどの問題点がある。そこで、患者の末梢血から容易な採取を行うべく、多能性幹細胞を末梢血中に動員する薬剤が求められている。また患者からの細胞採取、生体外での細胞培養および患者への細胞移植という一連の細胞を用いた再生医療をさらに簡便化し、細胞移植を伴わずに組織破壊や変性をすることができる因子の発見が求められている。
上記課題を解決するために、様々な因子に関して鋭意検討した結果、従来免疫系の活性化に働くと考えられてきたサイトカインが、様々な組織修復に関与する多分化能幹細胞を末梢血中に動員する働きがあることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４０）に関する。
（１）  単球またはマクロファージを活性化するサイトカイン、活性化した単球またはマクロファージから分泌されるサイトカイン、およびＧ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞から分泌されるサイトカインからなる群より選ばれるサイトカインを有効成分として含有する多分化能幹細胞を組織から末梢血へ動員する薬剤。
（２）  サイトカインが、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８からなる群から選ばれるサイトカインである、上記（１）記載の薬剤。
（３）  単球またはマクロファージを活性化するサイトカインが、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選ばれる、上記（１）記載の薬剤。
（４）  Ｇ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞が、顆粒球または好中球である、上記（１記載の薬剤。
（５）  好中球から分泌されるサイトカインが、ＩＬ−８である、上記（４）記載の薬剤。
（６）  サイトカインが、化学修飾された上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の薬剤。
（７）  化学修飾がポリアルキレングリコールにより修飾された上記（６）記載の薬剤。
（８）  サイトカインが、構成するアミノ酸配列のうち、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加され、かつ実質的に同等な活性を有するサイトカインである、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の薬剤。
（９）  組織が骨髄である上記（１）記載の薬剤。
（１０）  多分化能幹細胞が、ＣＤ４５陰性細胞、グリコホリンＡ陰性細胞およびｏｃｔ３／４陽性細胞からなる群より選ばれる多分化能幹細胞である上記（１）記載の薬剤。
（１１）  多分化能幹細胞が、ＣＤ４５陰性およびグリコホリンＡ陰性の細胞、ｏｃｔ３／４陽性およびＣＤ４５陰性の細胞、ｏｃｔ３／４陽性およびグリコホリンＡ陰性の細胞、ＣＤ４５陰性、グリコホリンＡ陰性およびｏｃｔ３／４陽性の細胞ならびにＣＤ４５陰性およびＣＤ３４陰性の細胞からなる群より選ばれる多分化能幹細胞である、上記（１）記載の薬剤。
（１２）  多分化能幹細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１１７陽性およびＣＤ１４０陽性の細胞、ＣＤ１０陽性およびＣＤ６６ｅ陽性の細胞、ＣＤ１３陽性およびＣＤ４９ｂ陽性の細胞、ならびにＣＤ４５陰性およびＣＤ３４陽性からなる群より選ばれる多分化能幹細胞である、上記（１）記載の薬剤。
（１３）  上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の薬剤を用いることを特徴とする、末梢血幹細胞に動員された多分化能幹細胞を回収する方法。
（１４）  上記（１３）記載の方法により取得した多分化能幹細胞を、組織再生するために用いる方法。
（１５）  上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の薬剤を用いて、末梢血幹細胞に動員された多分化能幹細胞を体性細胞へと分化誘導する方法。
（１６）  体性細胞が赤血球、白血球、血小板、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、皮膚表皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、気管上皮細胞、肺胞細胞、消化管上皮細胞、口腔上皮、エナメル芽細胞、ゾウゲ芽細胞、肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞、腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、下垂体内分泌細胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、視細胞、色素上皮細胞、角膜細胞、涙腺細胞、および鼓膜細胞からなる群から選ばれる体細胞である、上記（１５）記載の方法。
（１７）  単球またはマクロファージを活性化するサイトカイン、活性化した単球またはマクロファージから分泌されるサイトカイン、およびＧ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞から分泌されるサイトカインからなる群より選ばれるサイトカインを有効成分として含有する組織再生治療剤。
（１８）  サイトカインが、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８からなる群から選ばれるサイトカインである、上記（１７）記載の治療剤。
（１９）  単球またはマクロファージを活性化するサイトカインが、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選ばれる、上記（１７）記載の治療剤。
（２０）  Ｇ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞が顆粒球または好中球である、上記（１７）記載の治療剤。
（２１）  好中球から分泌されるサイトカインがＩＬ−８である、上記（２０）記載の治療剤。
（２２）  サイトカインが、化学修飾された上記（１７）〜（２１）のいずれか１項に記載の治療剤。
（２３）  化学修飾がポリアルキレングリコールにより修飾された上記（２２）記載の治療剤。
（２４）  サイトカインが、構成するアミノ酸配列のうち、１または数個のアミノ酸が欠失、置換挿入もしくは付加され、かつ実質的に同等な活性を有するサイトカインである、上記（１７）〜（２３）のいずれか１項に記載の治療剤。
（２５）  組織が神経系組織、皮膚組織、循環器系組織、呼吸器系組織、骨格系組織、結合組織、血液、免疫系組織、消化管組織、口腔内組織、肝組織、膵臓組織、泌尿器系組織、内分泌腺、感覚器系組織からなる群により選ばれる、上記（１７）〜（２４）のいずれか１項に記載の治療剤。
（２６）  神経系組織が、中枢神経系および末梢神経系からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（２７）  皮膚組織が、皮膚表皮、皮膚真皮および皮下組織からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（２８）  循環器系組織が、心臓、動脈血管、静脈血管、毛細血管、およびリンパ管からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（２９）  呼吸器系組織が、鼻粘膜、気管および肺胞からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３０）  骨格系組織が、骨、軟骨、関節、靭帯、および腱からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３１）  結合系組織が、脂肪組織および繊維組織からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３２）  血液組織が、赤血球、白血球および血小板からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３３）  免疫系組織が、リンパ球、単球、顆粒球、胸腺、リンパ節および脾臓からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３４）  消化管系組織が、唾液腺、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および肛門からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３５）  口腔内組織が、口腔粘膜、歯および舌からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３６）  肝組織が、肝臓および胆嚢からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３７）  膵臓組織が、膵外分泌腺および膵内分泌腺からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３８）  泌尿器系組織が、腎臓ネフロン、腎臓尿細管、腎髄質、尿管、膀胱、および尿路からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（３９）  内分泌腺が、下垂体、甲状腺、および末梢神からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
（４０）  感覚器系組織が、味蕾、嗅上皮、網膜、角膜、水晶体、内耳および末梢神経系からなる群から選ばれる上記（２５）記載の治療剤。
以下に本発明を詳細に説明する。
１．  多分化能幹細胞を組織から末梢血へ動員する薬剤
本発明は、顆粒球、単球またはマクロファージを活性化するサイトカイン、活性化した単球またはマクロファージから分泌されるサイトカイン、あるいはＧ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞から分泌されるサイトカイン等のサイトカインを有効成分として含有する多分化能幹細胞を組織から末梢血へ動員する薬剤に関する。
上記性質を有するサイトカインであればいずれも本発明の薬剤として用いることができる。
例えば、顆粒球、単球およびマクロファージを活性化するサイトカインとして、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど、活性化したマクロファージから分泌されるサイトカインとしては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど、好中球から分泌されるサイトカインとして、ＩＬ−８などをあげることができる。
Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  Ｂ（以下、ＭＭＰ−９と略記する）はサイトカインではないが、好中球から分泌されるサイトカインと同等の活性を有するため、本発明においては上記サイトカインと同等のものとして扱う。
また、上述のサイトカインが化学修飾されているサイトカインも本発明の薬剤として用いることができる。化学修飾の方法としては、ポリアルキレングリコールによる修飾（ＷＯ９８／５５５００）、アルブミン、セルロース誘導体、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ポリサッカライド、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリアミノ酸による修飾（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３，３４９−３６２，１９９２）、レシチンなどの脂質による修飾（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２７１，１６７２−１６７７，１９９４）、スチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）による修飾（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６，３３２−３５１，１９９５）などがあげられるが、好ましくはポリアルキレングリコールによる修飾があげられる。
ポリアルキレングリコールにより修飾されたサイトカインの具体例としては、ポリエチレングリコールにより修飾されたＧ−ＣＳＦならびにＧ−ＣＳＦ誘導体ＮＤ２８［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１５：８１４−８１９（１９９４）］などがあげられる。
さらに、上述のサイトカインを構成するアミノ酸配列のうち、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加され、かつ実質的に同等な活性を有するサイトカインも本発明の薬剤として用いることができる。欠失、置換、挿入もしくは付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加があることを意味し、欠失、置換、挿入もしくは付加が同時に生じてもよく、欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に属するアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン  Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸  Ｃ群：アスパラギン、グルタミン  Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン  Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン  Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン具体的には、Ｇ−ＣＳＦの変異体としては、ＮＤ２８（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  １５９：１０３−１１１，１９８９）があげられる。ＮＤ２８は野生型Ｇ−ＣＳＦの１番目のＴｈｒ，３番目のＬｅｕ、４番目のＧｌｙ、５番目のＰｒｏおよび１７番目のＣｙｓをそれぞれ、Ａｌａ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ａｒｇ，Ｓｅｒに置換したものである。
Ｇ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞としては、ミエロイド系前駆細胞、リンパ球、血管内皮細胞、マクロファージ、好中球などがあげられるが、好ましくはマクロファージ、好中球があげられる。
本発明の薬剤に用いるサイトカインは、単独で用いてもよいし、組み合わせて用いることもできる。
上記組織としては、主に骨髄があげられる。
上記多分化能幹細胞としては、ＣＤ４５陰性の細胞、グリコホリンＡ陰性の細胞、ｏｃｔ３／４陽性の細胞等の細胞をあげることができ、好ましい多分化能幹細胞としては、ＣＤ４５陰性およびグリコホリンＡ陰性の細胞、ｏｃｔ３／４陽性およびＣＤ４５陰性の細胞、ｏｃｔ３／４陽性およびグリコホリンＡ陰性の細胞、ＣＤ１０陽性およびＣＤ６６ｅ陽性の細胞、ＣＤ１３陽性およびＣＤ４９ｂ陽性の細胞等の細胞を、さらに好ましい多分化能幹細胞としては、ＣＤ４５陰性、グリコホリンＡ陰性およびｏｃｔ３／４陽性の細胞、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１１７陽性およびＣＤ１４０陽性の細胞、ＣＤ４５陰性およびＣＤ３４陰性の細胞、ＣＤ４５陰性およびＣＤ３４陽性の細胞等をあげることができる。
具体的な例としては、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１、ＴＧＦ−Ｒ２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａ，およびＰＤＧＦ−Ｒ１ｂが陽性で、かつＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩならびに２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎ陰性である多分化能幹細胞、ＣＤ１０およびＣＤ６６ｅが陽性で、かつＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＡ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１６６、ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＤＲＩＩ、Ｃｌａｓｓ−Ｉ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＬＩＮ陰性である多分化能幹細胞、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０，およびＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ−Ｉ陽性である多分化能幹細胞、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０およびＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ−Ｉ陽性で、かつＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＡ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１６６、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＤＲ−ＩＩ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＬＩＮ陰性である多分化能幹細胞、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１４４、ＣＤ１４０、ＣＤ２９およびＣＤ４４陽性で、かつＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、Ｆｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ１０２およびＣＤ１０６陰性である多分化能幹細胞があげられる。
本発明の薬剤は、上述の顆粒球、単球およびマクロファージを活性化する因子、活性化した単球あるいはマクロファージから分泌される因子、またはＧ−ＣＳＦ受容体を発現している造血系細胞から分泌される因子、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８およびＭＭＰ−９からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有するものであれば限定されないが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
医薬製剤の具体例として、遺伝子組換えＧ−ＣＳＦ製剤ノイアップ（協和発酵工業株式会社製）、遺伝子組換えＧ−ＣＳＦ製剤ノイトロジン（中外製薬）、遺伝子組換えＧ−ＣＳＦ製剤グラン（キリンビール）、Ｍ−ＣＳＦ製剤ロイコプロール（協和発酵工業株式会社製）などがあげられる。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、好ましくは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、好ましくは皮下または静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ上記因子を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。上記因子および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、例えばＧ−ＣＳＦ製剤ノイアップであれば０．１〜１０００μｇ／ｋｇ／日投与する。Ｍ−ＣＳＦ製剤ロイコプロールであれば１０万〜１０００万単位／日投与する。投与は、１日１回の単回投与または連日投与する。
本発明の薬剤を投与することにより、末梢血中に多能性幹細胞を動員することができる。
２．末梢血幹細胞に動員された多分化能幹細胞を回収する方法
また本発明は、本発明の薬剤を用いることを特徴とする、末梢血幹細胞に動員された多分化能幹細胞を回収する方法に関する。
本発明の薬剤によりヒト末梢血中に動員された多分化能幹細胞を回収する方法としては、末梢血中の単核球を白血球搬出法（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ法）により選別し、細胞マーカーの識別により所望の細胞を回収する方法などがあげられる。
白血球搬出法としては、ヘモネティクス社のＣＣＳ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）などの機器を用いて行うことができる。
細胞マーカーの識別により所望の細胞を回収する方法としては、細胞マーカーを認識する抗体を用いる方法、マイクロビーズおよび磁石を用いる方法などがあげられる。
所望の細胞としては、ＣＤ４５陰性および／またはグリコホリン−Ａ陰性の性質を有する細胞があげられる。
細胞マーカーを認識する抗体を用いる方法としては、上述した方法により取得した末梢血の単核球細胞から、リンパ球の共通の抗原であるＣＤ４５、赤芽球系の共通抗原であるグリコホリン−Ａなどを認識する抗体を用いてＣＤ４５陽性細胞、グリコホリン−Ａ陽性細胞を除去する方法があげられる。
マイクロビーズおよび磁石を用いる方法としては、ＣＤ４５およびグリコホリン−Ａのマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を末梢血より取得した単核細胞と１５分間室温でインキュベーションした後、磁石であるＳｕｐｅｒＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いることによりＣＤ４５陽性細胞、グリコホリン−Ａ陽性細胞を除去する方法があげられる。本処理により得られた細胞の約９９．５％がＣＤ４５陰性、グリコホリン−Ａ陰性であり、本細胞中に多能性幹細胞が含まれている。
３．末梢血中に動員された多能性幹細胞を分離・培養する方法
上記２で得られたＣＤ４５陰性、グリコホリン−Ａ陰性細胞画分より多分化能幹細胞を分離・培養する方法としては以下の二つの方法があげられる。
第一の方法としては、末梢血単核細胞より取得したＣＤ４５陰性、グリコホリン−Ａ陰性細胞をＬｏｗ−ＧＬＵＣＯＳＥ  ＤＭＥＭ，ＭＣＤＢ−２０１を基本培地として１０μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、５．５μｇ／ｍｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，５ｎｇ／ｍｌ  Ｓｌｅｎｉｕｍ，０．５μｇ／ｍｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，０．０１μＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，０．１ｍＭ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２％Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ，１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ，１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ，１０００ＩＵ  ＬＩＦを含む培地（培地−Ａ）中で５ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコートした培養皿の上で２週間〜３週間培養すると、小さな接着性を持った細胞がコロニーを形成する。このようにして得られた細胞の特性は、細胞表面マーカーを認識する抗体で細胞を染色した後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｉｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ）を持いて解析することができる。
該方法により取得された多分化能幹細胞はＦＡＣＳ解析により、細胞マーカーを同定することができる。
多分化能幹細胞の細胞マーカーとしては、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１、ＴＧＦ−Ｒ２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩ、２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎ等を利用することができる。
上記方法で取得される多分化能幹細胞の一例として、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１、ＴＧＦ−Ｒ２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａおよびＰＤＧＦ−Ｒ１ｂが陽性で、かつＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩおよび２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎ陰性を示す細胞をあげることができる。
多分化能幹細胞を取得する第二の方法としては、末梢血単核細胞より取得したＣＤ４５陰性、グリコホリン−Ａ陰性細胞を１０％の馬血清を含むＥＭＥＭ培地（培地−Ｂ）中で培養を行い、細胞がコンフルエントになるまで増殖させた後、０．０５％トリプシン，０．０７４４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液を用いて細胞を回収後、７．５％ＤＭＳＯを含む培地−Ｂ中で−８０℃まで冷却凍結する。凍結細胞は３７℃で融解後、遠心操作により細胞を回収して培地−Ｂ中で、再び培養を行う。このような凍結・融解の操作を繰り返すことで、多能性幹細胞が濃縮されてくる。
該方法により取得された多能性幹細胞はフローサイトメーターを用いた解析により、細胞マーカーを同定することができる。
上記方法で取得される多分化能幹細胞として、（１）ＣＤ１０およびＣＤ６６ｅ陽性で、かつＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＡ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１６６、ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＤＲＩＩ、Ｃｌａｓｓ−Ｉ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＬＩＮ陰性、（２）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０、およびＭＨＣＣｌａｓｓ−Ｉ陽性で、かつＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＡ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１６６、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＤＲ−ＩＩ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＬＩＮ陰性、（３）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１、ＴＧＦ−Ｒ２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａおよびＰＤＧＦ−Ｒ１ｂ陽性で、かつＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩおよび２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎ陰性、ならびに（４）ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１４４、ＣＤ１４０、ＣＤ２９およびＣＤ４４陽性で、かつＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、Ｆｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ１０２およびＣＤ１０６陰性などの細胞があげられる。
これらの細胞は、成体に存在する生殖腺以外のすべての組織に分化する多能性を有する。また、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０およびＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ−Ｉ陽性で、かつＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＡ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１６６、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＤＲ−ＩＩ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＬＩＮ陰性の細胞は間葉系系列に対する多能性を有している。
間葉系系列とは骨格筋、平滑筋、心筋、骨、軟骨、脂肪、繊維芽細胞、血管、血液などの中胚葉由来の細胞を包含する。
ＦＡＣＳのソーテイングの方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などがあげられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ１４−２３、秀潤社、１９９９年）。どちらの方法も、細胞の表面に発現している分子に結合した抗体から発せられる蛍光強度を電気信号に変換することにより抗原の発現量を定量することができる。また、使用する蛍光の種類を組み合わせることで、複数の表面抗原を利用して分離することも可能である。蛍光としては、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＴＲ（ＴｅｘａｓＲｅｄ）、Ｃｙ３、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、Ｒｅｄ６１３、Ｒｅｄ６７０、ＰｅｒＣＰ、ＴＲＩ−Ｃｏｌｏｒ、ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄなどがあげられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ３−１３、秀潤社、１９９９年）。
４．本発明の組織再生治療剤
上記１の薬剤は、末梢血中に多分化能幹細胞を動員し、動員された多分化能幹細胞により障害組織を再生するすることができる。したがって、上記１の薬剤は組織再生治療剤となりうる。
本発明の組織再生治療剤を用いて疾患を治療する方法としては、患者に投与して障害部位を修復させる方法、上記１の薬剤で末梢血中に動員された多分化能幹細胞を上記２の方法により回収したのち、回収した多分化能幹細胞をそのまま、または生体外で目的の細胞あるいは組織に分化させた後、障害部位に移植する方法などいずれの方法を用いることができる。
本発明の組織再生治療剤は、末梢血中に多分化能幹細胞を動員させることができるので、多分化能幹細胞が障害部位に遊走または分化して組織障害を修復することができる。
このように、本発明の組織再生治療剤を患者に直接投与する方法は、組織障害が急激に惹起される疾患の治療に用いられることが好ましい。
組織障害が急激に惹起される疾患としては、心不全、肝不全、腎不全、心血管障害、脳血管障害、骨髄損傷、ガン化学療法やガン免疫療法などによる副作用などの器官や組織の不可逆的な障害などがあげられる。
また、本発明の組織再生治療剤を投与したのち、末梢血中に動員された多分化能幹細胞を上記２の方法により回収し、回収した多分化能幹細胞をそのまま、または生体外で目的の細胞あるいは組織に分化させた後、障害部位に移植することにより、疾患を治療することができる。
多分化能幹細胞、または分化させた細胞を治療に用いる場合、ヘモネティックス社のヘモライト２プラスなどを用いて生理食塩水により洗浄し、用いる機器は完全閉鎖系で培養細胞の濃縮、洗浄、回収処理が可能なものがあげられ、培養、分化に用いたサイトカインなどの物質を限りなく１００％除去できるものが好ましい。これにより回収された多分化能幹細胞または分化させた細胞は、通常の点適法で静脈中に注入するか、患部に直接注入することにより、治療に用いることができる。
このような方法は、慢性の組織障害や変性を伴う疾患の治療に用いられることが好ましい。
慢性の組織障害や変性を伴う疾患としては、神経変性疾患、関節炎、難治性炎症性腸障害、骨粗鬆症、動脈硬化、糖尿病などがあげられる。
さらに、本発明は顆粒球、単球およびマクロファージを活性化する因子のみならず、顆粒球と単球およびマクロファージを直接組織に移植することにより多分化能幹細胞を障害部位に動員することが可能である。
顆粒球と単球ならびにマクロファージは末梢血単核細胞よりｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ１４陽性細胞を集めることで取得できる。また、骨髄あるいは臍帯血より分離したＣＤ３４陽性、ＡＣ１３３陽性、あるいはＣＤ３４、ＡＣ１３３  ２重陽性の造血幹細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔｏ  Ｈ４４３４Ｖ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃ社）で培養することでも取得できる。
発明を実施するための最良の形態
実施例１．  Ｇ−ＣＳＦ単独あるいはＧ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦの併用投与による末梢血中の細胞の性質の変化
（１）末梢血中に動員される細胞数の変化
Ｇ−ＣＳＦあるいはＧ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦを投与することにより、末梢血中に動員される未分化幹細胞数の変化を調べた。
以下に示すように、３種類別々の薬剤を５日間連続で投与したマウスＡ群４匹、Ｂ群５匹、Ｃ群５匹を用意した。マウスＡ群は、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社）雄４匹に対し、５日間連続で毎日１匹あたり、Ｇ−ＣＳＦ（協和発酵工業社製：製品名ノイアップ）をそれぞれ１０μｇ皮下注射した。マウスＢ群は、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス雄５匹に対し、５日間連続で毎日１匹あたり、Ｇ−ＣＳＦ（協和発酵工業社製：製品名ノイアップ）を１０μｇとＭ−ＣＳＦ（協和発酵工業社製：製品名ロイコプロール）を１０５ｕｎｉｔｓ、それぞれ皮下注射した。マウスＣ群は、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス雄５匹に対し、５日間連続で毎日１匹あたり、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を２００μｌ皮下注射した。
最後に薬剤を投与した翌日、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群それぞれ別々にマウスをジエチルエーテルを用いて麻酔し、あらかじめヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）１００ｕｎｉｔｓを分注したチューブに、眼静脈より末梢血を約１．２ｍｌ採取した。その後、採取した血液と等量の０．９％ＮａＣｌを加えて希釈し、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７Ａｎｉｍａｌ（第一化学薬品社製）１．４ｍｌの上に重層し、室温で６００×ｇで３０分間遠心分離した。界面の単核球浮遊液の層を回収し、１ｍｌのＰＢＳを加えて混和し、室温で４００×ｇ、１５分間遠心分離した。上清を除き、沈殿している単核球をＭＡＣＳバッファー［０．５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を含有するＰＢＳ］２５０μｌに懸濁し、Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４５  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）７０μｌとＴｅｒ−１１９  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）３０μｌを加えて氷上で１５分間反応させた。この反応液に４ｍｌのＭＡＣＳバッファーを加え、３００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を除いたのち、沈殿を４００μｌのＭＡＣＳバッファーに懸濁した。懸濁した細胞を分離カラムＭＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）に通し、ＣＤ４５陽性Ｔｅｒ１１９陽性細胞の除去をおこない、末梢血中に含まれるＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性細胞を濃縮した。ＣＤ４５は白血球のマーカーであり、Ｔｅｒ１１９はマウス赤血球マーカーである。このように、末梢血中に含まれる白血球および赤血球などの成熟細胞を除いて得られたＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性の総細胞数は、マウスＡ群（Ｇ−ＣＳＦ投与）では、それぞれ、２．８８×１０４、２．３２×１０４、４．７２×１０４、２．０８×１０４個、マウスＢ群（Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ投与）ではそれぞれ２．７６×１０４、７．９３×１０３、３．８８×１０４、４．９４×１０４、３．０７×１０４個、マウスＣ群（ＰＢＳ投与）ではそれぞれ５．２８×１０３、５．１９×１０３、２．６０×１０３、２．６７×１０３、２．６７×１０３個であった。ＰＢＳ投与群に比べて、Ｇ−ＣＳＦ単独投与あるいはＧ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦの併用投与の方が末梢血中における細胞数が増加していた。
（２）末梢血中に動員された細胞の解析
次に、末梢血中に動員された細胞中の、各種細胞表面抗原が発現している細胞数をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いて解析した。解析には、多分化能幹細胞表面に発現するＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ１０、Ｓｃａ−１、ＣＤ１４０ａの５種類にそれぞれ反応する抗体を用いた。
まず上記方法で濃縮したＡ〜Ｃ群のＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性細胞をそれぞれ回収し、各群の細胞を３等分し、以下の解析に用いた（以下、分注された細胞と称する。）。
まず、各群の分注された細胞を、室温で４００×ｇ、１０分間遠心分離した後、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）２０μｌに懸濁し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ３４抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌ、ＰＥ標識抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌを加え、遮光して氷上で３０分間反応させた。ＤＭＥＭ培地で洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いてＦＩＴＣおよびＰＥの蛍光強度を調べ、抗原発現細胞の数を測定した。その結果、ＣＤ３４陽性細胞は、マウスＡ群では平均４６．７個、マウスＢ群では平均３５．３個、マウスＣ群では平均９．３個であった。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、マウスＡ群では平均３１．３個、マウスＢ群では平均１３．５個、マウスＣ群では平均１０．７個であった。
次に、各群の分注された細胞を、ＰＥ標識抗マウスＳｃａ−１抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌ、ウサギ抗ＣＤ１０抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１０μｌと氷上で３０分間反応させＤＭＥＭ培地で洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌと反応させ、ＣＤ１０陽性細胞とＳｃａ１陽性細胞の数をそれぞれＦＩＴＣとＰＥの強度をＦＡＣＳで測定することにより、解析した。その結果、ＣＤ１０陽性細胞は、マウスＡ群では平均１８．７個、マウスＢ群では平均９．８個、マウスＣ群では平均１．７個であった。
Ｓｃａ−１陽性細胞は、マウスＡ群では平均１８．７個、マウスＢ群では平均１１．８個、マウスＣ群では平均１．７個であった。
更に、各群の分注された細胞を、ラット抗ＣＤ１４０ａ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌを加えて氷上３０分間反応させＤＭＥＭ培地で洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌと反応させ、ＣＤ１４０ａ陽性細胞の数をＦＩＴＣの強度をＦＡＣＳで測定することにより解析した。その結果、ＣＤ１４０ａ陽性細胞の数は、マウスＡ群では平均１９．３個、マウスＢ群では平均６．３個、マウスＣ群では平均４．７個であった。
以上の結果は、Ｇ−ＣＳＦが末梢血中へ、造血幹細胞、単球・マクロファージだけでなく多能性幹細胞も動員することができることを示している。
実施例２．  Ｇ−ＣＳＦ投与により末梢血中に動員されたＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性ＣＤ１３陽性細胞数の変化
実施例１と同様に、２種類別々の薬剤を５日間連続で投与したマウスＤ群５匹、Ｅ群５匹を用意した。マウスＤ群は、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社）雄５匹に対し、５日間連続で毎日１匹あたり、Ｇ−ＣＳＦ（協和発酵工業社製：製品名ノイアップ）をそれぞれ１０μｇ皮下注射した。マウスＥ群は、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウ雄５匹に対し、５日間連続で毎日１匹あたり、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を２００μｌ皮下注射した。
最後に薬剤を投与した翌日、Ｄ群、Ｅ群それぞれ別々にマウスをジエチルエーテルを用いて麻酔し、あらかじめヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製：製品名ノイアップ）１００ｕｎｉｔｓを分注したチューブに、眼静脈より末梢血を約１．２ｍｌずつ採取した。その後、採取した血液と等量の０．９％ＮａＣｌを加えて希釈し、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７Ａｎｉｍａｌ（第一化学薬品社製）１．４ｍｌの上に重層し、室温で６００×ｇで３０分間遠心分離した。界面の単核球浮遊液の層を回収し、１ｍｌのＰＢＳを加えて混和し、室温で４００×ｇ、１５分間遠心分離した。上清を除き、沈殿している単核球をＭＡＣＳバッファー［０．５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を含有するＰＢＳ］２５０μｌに懸濁し、Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４５  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）７０μｌとＴｅｒ−１１９ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）３０μｌを加えて氷上で１５分間反応させた。この反応液に４ｍｌのＭＡＣＳバッファーを加え、３００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を除いたのち、沈殿を４００μｌのＭＡＣＳバッファーに懸濁した。懸濁した細胞を分離カラムＭＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）に通し、ＣＤ４５陽性Ｔｅｒ１１９陽性細胞の除去をおこない、末梢血中に含まれるＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性細胞を濃縮した。
次に、多分化能幹細胞表面で発現が確認されているＣＤ１３を指標として、濃縮したＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性細胞中のＣＤ１３発現細胞の数をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いて解析した。まず上記方法で濃縮したＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性細胞をそれぞれ、室温で４００×ｇ、１０分間遠心分離した後、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）２０μｌに懸濁し、ＰＥ標識抗マウスＣＤ１３抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌ、ＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１０μｌを加え、遮光して氷上で３０分間反応させた。ＤＭＥＭ培地で洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いて蛍光強度を調べ、抗原発現細胞の数を測定した。その結果、ＣＤ４５陰性Ｔｅｒ１１９陰性ＣＤ１３陽性の単核球細胞数は、マウスＤ群では平均２９．５個、マウスＥ群では平均１１．９個であった。この結果は、Ｇ−ＣＳＦが末梢血中へ、造血幹細胞、単球・マクロファージだけでなく多能性幹細胞も動員することができることを示している。
実施例３．  Ｇ−ＣＳＦ投与により末梢血中に動員された細胞の性質
（１）Ｇ−ＣＳＦ投与により動員された末梢血中に動員される細胞のＸ線照射マウスへの移植
Ｇ−ＣＳＦを投与することにより末梢血中に動員される細胞を、マウス個体に移植することにより、その性質を明らかにした。
全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれＧＦＰ蛋白質が発現しているマウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統のＦ４）の１０週齢の個体をＦ群３匹、Ｇ群１匹に分け、それぞれ別々に以下の薬剤を投与した。Ｆ群に対しては５日間連続で毎日１匹あたり、Ｇ−ＣＳＦ（協和発酵工業社製：製品名ノイアップ）を１０μｇ皮下注射した。Ｇ群に対しては、５日間連続で毎日１匹あたり、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を２００μｌ皮下注射した。
最後に薬剤を投与した翌日、Ｆ群、Ｇ群それぞれ別々にマウスをジエチルエーテルを用いて麻酔し、眼静脈より末梢血を採取し、予めヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）を分注したチューブに回収し、１００μｍセル・ストレイナー（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を通過させておいた。また、Ｇ群に関しては大腿骨を摘出し、大腿骨に付着している筋肉をはさみで切除して大腿骨全体を露出させた後、両端をはさみで切断し、テルモ製２７Ｇの針を装着しＰＢＳを含有した注射針の先端を大腿骨の膝関節側に断端に差し込み、試験管の中にＰＢＳを吹き出すことにより骨髄細胞を採取し、その後１００μｍセル・ストレイナー（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を通過させておいた。
このように採取した末梢血あるいは骨髄細胞を以下のようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より注入して移植をおこなった。
まず移植を受けるＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア社）は８週齢のものを用意し、尾静脈注射を受ける前日に、あらかじめＸ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて１２Ｇｙの線量のＸ線を照射しておいた。これらのマウスをＨ群、Ｉ群、Ｊ群、Ｋ群に分け、Ｈ群にはＦ群由来のマウス末梢血を１匹あたり３００μｌ尾静脈より移植し、Ｉ群にはＧ群由来のマウス末梢血を１匹あたり３００μｌ尾静脈より移植し、Ｊ群にはＧ群由来の骨髄細胞を１匹あたり３．０×１０６を尾静脈より移植し、Ｋ群は移植の処置を施さなかった。
その結果、Ｉ群およびＫ群では移植後７日から１０日以内にすべてが死亡した。一方、Ｈ群およびＪ群では移植後８週齢経過しても生存していた。しかしながら、骨髄移植を施したＪ群のマウスの中には、毛が抜け皮膚がただれたり、頭を傾けて歩行し歩き方がぎこちないという外見上および行動上の異常が見られた。Ｇ−ＣＳＦを投与したマウス末梢血を移植したＨ群では、外見上および行動上の異常はみられなかった。
本結果は、Ｇ−ＣＳＦ投与によりマウス末梢血中には皮膚などの組織に分化する能力を有する幹細胞が動員されることを示している。
（２）細胞移植を受けたマウスの解剖
（１）で得られたＨ群のマウスを解剖し、灌流固定をおこない各臓器を摘出した。
具体的には、まずネンブタール（大日本製薬社製）の腹腔内注射により麻酔し、７０％エタノールで全身をぬらし、太ももの皮膚をつまみあげ膝から大腿部の根元までハサミで切開して大腿動脈および静脈を露出させ、絹製縫合糸（夏目製作所社製）で結紮した後、結紮部位の末端側から太ももを切断した。そこから脛骨を摘出し、脛骨に付着している筋肉をはさみで切除して脛骨全体を露出させた後、両端をはさみで切断し、テルモ製２３Ｇの針を装着しＰＢＳを含有した注射針の先端を脛骨の膝関節側に断端に差し込み、試験管の中にＰＢＳを吹き出すことにより骨髄細胞を採取した。
一方、マウスの方は開腹開胸して心臓を露出させ、２５Ｇのテルモ製翼付静注針を左心室に挿入した後、右心耳を切りＰＢＳを２０ｍｌ流し、全身を灌流させた。この時、心臓から溢れ出る血液を取得し、あらかじめヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）１００ｕｎｉｔｓを分注したチューブに入れ末梢血として回収した。
ＰＢＳを全量流した後、同様の操作により固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］を２０ｍｌ流し、固定をおこなった。
その後、まず気管をつけたまま肺を摘出し、ＰＢＳで２倍希釈したＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）を含有したテルモ製サーフロー留置針（２０Ｇ）付属のカテーテルを装着した２０ｍｌシリンジを気管から挿入し、カテーテルの先と気管を絹製縫合糸（夏目製作所社製）で結合し、ＰＢＳで２倍希釈したＯＣＴ溶液１０ｍｌを気管を通し肺に注入した。注入後、数ｍｍ角くらいのブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
また、残りの臓器についても個体から摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、数ｍｍ角くらいのブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成した。
上記操作過程で取得した末梢血細胞は、等量の０．９％ＮａＣｌを加えて希釈し、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７Ａｎｉｍａｌ（第一化学薬品社製）１．４ｍｌの上に重層し、室温で６００×ｇ、３０分間遠心分離した。界面の単核球浮遊液の層を回収し、１ｍｌのＰＢＳを加えて混和し、室温で４００×ｇ、１５分間遠心分離し、上清を除き、沈殿している単核球をＰＢＳ０．５ｍｌで懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いてＧＦＰ陽性細胞数の割合を測定した。その結果、末梢血単核球中におけるＧＦＰ陽性細胞の割合は、９０．３％であった。
骨髄細胞についても、同様にＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いてＧＦＰ陽性細胞の割合を測定したところ、８７．３％がＧＦＰ陽性細胞で占められていた。
また、各臓器から摘出して作成した凍結切片をＺｅｉｓｓ製蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｐｈｏｔ２で観察した結果、肺、心臓、肝臓、脳、胃、皮膚、小腸、大腸、骨格筋、膵臓、脾臓、腎臓、気管など、ほぼすべての全身の臓器で、ＧＦＰ陽性細胞が多く存在することを確認した。特に、脳では、嗅球、脈絡叢などの部分でＧＦＰ陽性細胞が多く観察された。本結果は、Ｇ−ＣＳＦ投与によるマウス末梢血中に動員された幹細胞が全身の様々な組織の修復に働くことを示している。
（３）免疫染色によるＧＦＰ陽性細胞の性質の同定
（２）で作成した凍結切片については、以下のようにして種々の抗体で染色し、ＧＦＰ陽性細胞の性質を調べた。
まず、種々の臓器の組織片に対して、抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体による免疫染色をおこなった。Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎは上皮系細胞のマーカーである。
皮膚を摘出して作成した凍結切片の乗せたスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドガラスを洗った。その後、終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に１５分間浸した。ＰＢＳで１回洗った後、固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］と室温で１５分間反応させた。更にＰＢＳで２回洗った後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，Ｃｌｏｎｅｓ  ＡＥ１／ＡＥ３］（ＤＡＫＯ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで５０倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［Ｃｙ３−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）］（生化学工業社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、Ｚｅｉｓｓ製蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｐｈｏｔ２で観察した。ＧＦＰ陽性細胞でかつＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ陽性細胞が観察されたことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、皮膚に生着し上皮系細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体を用いて、大腸の凍結切片に対して同様の染色をおこない、蛍光顕微鏡下で観察したところ、ＧＦＰ陽性細胞でかつＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ陽性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、大腸に生着し上皮系細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体と血球系細胞のマーカーであるＣＤ４５に対する抗体とを用いて、小腸の凍結切片に対しても同様の染色をおこなった。蛍光顕微鏡下で観察したところ、ＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、小腸にも生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
次に、種々の臓器に対して、抗ＣＤ４５抗体による免疫染色をおこなった。
肺を摘出して作成した凍結切片をのせたスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行うことにより洗った後、ＤＡＫＯ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（１）液（ＤＡＫＯ社製）に室温１０分間浸し、ＰＢＳで２回洗った後、ＤＡＫＯ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（２）液（ＤＡＫＯ社製）に室温１０分間浸し、再度ＰＢＳで２回洗った。
その後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４５（ＬＣＡ、Ｌｙ５）］（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで１００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで終濃度５μｇ／ｍｌとなるように希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、肺に生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗ＣＤ４５抗体を用いて、肝臓の凍結切片に対して同様の染色をおこない、蛍光顕微鏡下で観察したところ、ＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、肝臓にも生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗ＣＤ４５抗体を用いて、心臓、脳、胃、皮膚、小腸、大腸、骨格筋、膵臓の凍結切片に対しても同様の染色をおこなった。蛍光顕微鏡下で観察したところ、それぞれの組織においてＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、心臓、脳、胃、皮膚、小腸、大腸、骨格筋、膵臓にも生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
産業上の利用可能性
本発明は、成体の様々な組織に分化する能力を有する多分化能幹細胞を末梢血中に動員する薬剤、該薬剤を含有する組織再生治療剤、該薬剤を用いた多分化能幹細胞の回収方法、および該方法により取得した多分化能幹細胞の体細胞への分化誘導方法に関する。
【国際調査報告】
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