(57)【要約】フォルスコリンによるＣＲＥＢの活性化に対して抑制を示すクローンとしてＯＶＡＲＣ１０００４７３（配列番号：１）およびＮＴ２ＲＭ１０００３７７（配列番号：３）を同定し、該遺伝子、及び／または、該遺伝子によりコードされる蛋白質を用いた評価方法が提供された。更にこれらの蛋白質が、細胞障害の増強作用を有することが見出された。本発明の評価方法に基づいてスクリーニングすることができる化合物は、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害の増強に対する抑制剤、並びに記憶障害および／または神経変性疾患の予防剤や治療剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、被験化合物の、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出方法。
（１）ＣＲＥＢのリン酸化が可能な条件下で、またはリン酸化されたＣＲＥＢ若しくはそのリン酸化部位を含むペプチドの存在下で、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に被験化合物を接触させる工程、および
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）ＣＲＥＢまたはそのリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化のレベルを測定する工程
【請求項２】
ＣＲＥＢのリン酸化のレベルを、ＣＲＥＢにより制御される遺伝子の転写活性を指標として測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を有する化合物の評価方法。
（１）請求項１に記載の方法によって被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を検出する工程、および
（２）被験化合物不存在下でのＣＲＥＢのリン酸化レベルと比較して、リン酸化レベルが高い被験化合物を選択する工程
【請求項４】
以下の要素を含む、被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出用キット。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、および
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）ＣＲＥＢのリン酸化のレベルを測定するための手段
【請求項５】
請求項３に記載の方法によって選択される化合物を有効成分として含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
【請求項６】
請求項３に記載の方法によって選択される化合物を有効成分として含有する記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、ＣＲＥＢのリン酸化状態が調節されたモデル動物。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質とＣＲＥＢとを接触させる工程を含む、ＣＲＥＢの脱リン酸化方法。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を主成分として含むＣＲＥＢの脱リン酸化剤。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項１０】
配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質、または該蛋白質をコードする遺伝子を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
【請求項１１】
配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質、または該蛋白質をコードする遺伝子を含有する記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
【請求項１２】
配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列に対して相補的な配列を有し、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
【請求項１３】
配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列に対して相補的な配列を有し、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸を含有する記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に対する抗体を主成分として含むＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に対する抗体を主成分として含む記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質。
【請求項１６】
以下の工程を含む、被験化合物の、細胞障害作用の調節活性の検出方法。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に、細胞を障害する条件下で、被験化合物を接触させる工程、および
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）前記細胞の細胞障害のレベルを対照と比較する工程、および
（３）対照との細胞障害のレベルの差を、被験化合物の細胞障害作用の調節活性と関連付ける工程
【請求項１７】
細胞を障害する条件が、細胞障害作用を有する化合物の投与によって与えられる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞障害作用を有する化合物がアポトーシス誘導剤である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アポトーシス誘導剤が、小胞体カルシウムポンプ阻害剤である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対照と比較して細胞障害レベルが低い場合に、被験化合物の細胞障害作用の抑制活性が検出される請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
以下の工程を含む、細胞障害作用の調節活性を有する化合物の選択方法。
（１）請求項１６に記載の方法によって被験化合物の細胞障害作用の調節活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、細胞障害レベルに差がある被験化合物を選択する工程
【請求項２２】
対照と比較して細胞障害レベルが小さい被験化合物を選択する工程を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項３に記載の方法によって選択された化合物を被験化合物とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含有する、細胞障害作用の調節剤。
【請求項２５】
細胞が神経細胞である、請求項２４に記載の、細胞障害作用の調節剤。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含有する、細胞障害作用の抑制剤。
【請求項２７】
細胞が神経細胞である、請求項２６に記載の、細胞障害の抑制剤。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含有する、記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
【請求項２９】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分とする、細胞障害作用を有する成分の作用増強剤。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項３０】
細胞障害作用を有する成分がアポトーシス誘導剤である請求項２９に記載の作用増強剤。
【請求項３１】
アポトーシス誘導剤が抗腫瘍剤である請求項３０に記載の作用増強剤。
【請求項３２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む、細胞障害作用を有する成分の作用増強方法。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
【請求項３３】
次の成分を含む、細胞障害組成物。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、またはそれをコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）細胞障害作用を有する成分
【請求項３４】
細胞が腫瘍細胞である、請求項３３に記載の細胞障害組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答配列（ＣＲＥ）に結合する転写因子（ＣＲＥＢ；ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の転写活性を阻害するホスファターゼを用いたホスファターゼ阻害因子の評価方法に関する。該方法を用いて得られるホスファターゼ阻害因子は、ＣＲＥＢの転写活性を上昇させ、記憶障害や神経変性を改善すると考えられ、幅広い神経疾患に対する医薬となることが期待される。
背景技術
ＣＲＥＢは、ＣＲＥに結合する転写因子である。サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによって、ＣＲＥＢのＳｅｒ１３３がリン酸化され活性化する。ＣＲＥは、ｃＡＭＰにより発現の促進される遺伝子群（ソマトスタチン、ｃ−ｆｏｓ等）の転写制御部位の中でｃＡＭＰによる誘導に不可欠な部分である。
セリンがリン酸化されたＣＲＥＢは、ＣＲＥＢ結合蛋白質（ＣＢＰ；ＣＲＥＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を中心とした転写制御因子と結合し、結合活性が上昇する（Ｓｈａｙｗｉｔｚ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：８２１（１９９９年））。また、高濃度のＫ＋による脱分極（Ｂｅｉｔｍｅｒ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９８３４−１９８３９（１９９８年））、または、長期増強（ＬＴＰ；ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）によるシナプス刺激（Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １６：８９−１０１（１９９６年））によって、ＣＲＥＢの転写活性の上昇が観察される。さらに、神経細胞におけるグルタミン酸によるカルシウムシグナルが、シナプス活性によって誘導されるＣＲＥＢの転写活性を上昇させることも知られている（Ｈａｒｄｉｎｇｈａｍ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：２６１−２６７（２００１年））。そして、アメフラシやラットの行動記憶の実験結果より、ＣＲＥＢのリン酸化が記憶形成に重要であることが公知である（Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１２７（１９９８年））。また、アルツハイマー型痴呆では、脳内のリン酸化ＣＲＥＢの量が有意に減少している（Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８２４：３００−３０３（１９９９年））。以上のことより、ＣＲＥＢ活性の上昇が記憶形成と関連していることが示唆されている。
さらに最近では、ＣＲＥＢ活性の上昇が神経細胞の抗アポトーシス活性と結びついていることが示されている。脳梗塞（Ｔａｎａｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８１８：５２０−５２６（１９９９年）等の病態モデルにおいて、梗塞近傍のペナンブラ（ｐｅｎｕｍｂｒａ）領域においてＣＲＥＢのリン酸化領域が観察される。ペナンブラ領域は、脳梗塞病変の周囲の、血流は低下しているが神経活動が継続している領域を指す用語である。一般に、ペナンブラ領域における血流が不充分な状態が４８時間以上継続すると、神経細胞死が観察されるようになる。この事実は、細胞レベルの実験系においても観察されており、神経培養細胞において低酸素（Ｂｅｉｔｍｅｒ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，上述）、および低グルコース刺激（Ｒｉｃｃｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：２３５８−２３６１（１９９９年））によるＣＲＥＢの転写活性の上昇が認められている。また、栄養因子除去による神経細胞死に対する、ＣＲＥＢの転写上昇による生存効果が認められている（Ｒｉｃｃｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，上述）。
一方ＣＢＰは、ＣＲＥＢのコアクチベーターとして作用する。ＣＢＰは、リン酸化ＣＲＥＢおよび基本転写因子Ｔ  Ｆ  ＩＩＢの両者に結合し、ＣＲＥＢによる転写活性を促進することが知られている（Ｓｈａｙｗｉｔｚ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，上述）。ハンチントン病の原因遺伝子であるＩＴ１５遺伝子の産物ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮病の原因遺伝子の産物であるａｔｒｏｐｈｉｎ−１はＣＢＰと活発に結合し、その機能を抑制する（Ｎｕｃｉｆｏｒａ  Ｊｒ．，Ｆ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：２４２３−２４２８（２００１年））。即ち、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎおよびａｔｒｏｐｈｉｎ−１により、ＣＢＰを介してのＣＲＥＢの転写活性が抑制され、ニューロンの生存に決定的であると知られている標的遺伝子の転写が防止されることにより神経細胞が障害を受けることが知られている。
一般に、種々の細胞内の事象がプロテインキナーゼおよびホスファターゼによるリン酸化（または脱リン酸化）を介して調節されていることが知られている。たとえば、収縮、膜輸送、グリコーゲン代謝、および細胞分裂等のリン酸化による調節機構が明らかにされている。ＣＢＰがリン酸化されたＣＲＥＢに結合して転写活性を促進することから、ＣＲＥＢによる転写活性にもホスファターゼ関連遺伝子が関与していることが考えられた。ホスファターゼ関連遺伝子がＣＲＥＢの脱リン酸化に働き、その転写活性が抑制されることが十分に考えられ、記憶および神経変性に対してＣＲＥＢの転写活性の上昇が改善効果を持つことが示唆される。
ところで、ｃＡＭＰ刺激によるＣＲＥＢ活性の主要なダウンレギュレーターとしては、典型的なＳｅｒ／ＴｈｒホスファターゼであるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１（ＰＰ−１）が知られている（Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７０：１０５−１１３（１９９２年））。ＰＰ−１の活性は、リン酸化されたＩｎｈｉｂｉｔｏｒ−１（Ｉ−１）により阻害されることが報告された（Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：４５３−５０８（１９８９年））。この報告により、細胞におけるｃＡＭＰ応答が、ＣＲＥＢの脱リン酸化の阻止によって増幅され得ることが示唆された。しかしｃＡＭＰ刺激によるＣＲＥＢ活性のダウンレギュレーターとして働くホスファターゼは、現在のところＰＰ−１の他には知られていない。
発明の開示
本発明の課題は、ＣＲＥＢによる転写活性を抑制するホスファターゼを同定し、該ホスファターゼの活性を調節する化合物の評価方法を提供することである。ＣＲＥＢによる転写活性を抑制するホスファターゼの活性を阻害する化合物は、ＣＲＥＢの転写活性の上昇を通じて、記憶障害あるいは神経変性を改善し、幅広い神経疾患に対する治療効果を期待できる。
また本発明は、細胞障害を増強する蛋白質を同定し、当該蛋白質の活性を調節する化合物の評価方法の提供を課題とする。細胞の障害を増強する活性の調節によって、各種の細胞障害に起因する様々な疾患の治療や予防を実現できる。
本発明者らは、ＣＲＥＢ転写活性を阻害するホスファターゼを同定するため、様々のｃＤＮＡライブラリーを探索し、バイオインフォーマティックスを使ってホスファターゼ関連遺伝子を選択した。更に選択された候補遺伝子について、フォルスコリンによるＣＲＥＢ転写活性の上昇を抑制する作用を確認した。その結果、ホスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする２つの遺伝子を同定した。そしてこれらの遺伝子によってコードされる蛋白質を用いて、ホスファターゼの活性を調節する化合物の評価が実現できることを見出し、本発明を完成した。更に本発明者らは、新たにフォスファターゼ活性を有することが見出された蛋白質が、細胞障害を増強することを明らかにした。そして当該蛋白質を用いて、細胞障害の増強作用を調節する活性を評価できることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の評価方法、あるいは本発明者らによって見出されたホスファターゼ活性あるいは細胞障害の増強活性の用途に関する。
〔１〕以下の工程を含む、被験化合物の、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出方法。
（１）ＣＲＥＢのリン酸化が可能な条件下で、またはリン酸化されたＣＲＥＢ若しくはそのリン酸化部位を含むペプチドの存在下で、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に被験化合物を接触させる工程、および
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）ＣＲＥＢまたはそのリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化のレベルを測定する工程
〔２〕ＣＲＥＢのリン酸化のレベルを、ＣＲＥＢにより制御される遺伝子の転写活性を指標として測定する〔１〕に記載の方法。
〔３〕以下の工程を含む、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を有する化合物の評価方法。
（１）〔１〕に記載の方法によって被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を検出する工程、および
（２）被験化合物不存在下でのＣＲＥＢのリン酸化レベルと比較して、リン酸化レベルが高い被験化合物を選択する工程
〔４〕以下の要素を含む、被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出用キット。
（１）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、および
（２）ＣＲＥＢのリン酸化のレベルを測定するための手段
〔５〕〔３〕に記載の方法によって選択される化合物を有効成分として含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
〔６〕〔３〕に記載の方法によって選択される化合物を有効成分として含有する記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
〔７〕前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、ＣＲＥＢのリン酸化状態が調節されたモデル動物。
〔８〕前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質とＣＲＥＢとを接触させる工程を含む、ＣＲＥＢの脱リン酸化方法。
〔９〕前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を主成分として含むＣＲＥＢの脱リン酸化剤。
〔１０〕配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質、または該蛋白質をコードする遺伝子を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
〔１１〕配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質、または該蛋白質をコードする遺伝子を含有する記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
〔１２〕配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列に対して相補的な配列を有し、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
〔１３〕配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列に対して相補的な配列を有し、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸を含有する記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
〔１４〕前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に対する抗体を主成分として含むＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤。
〔１５〕前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に対する抗体を主成分として含む記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
〔１６〕以下の工程を含む、被験化合物の、細胞障害作用の調節活性の検出方法。
（１）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に、細胞を障害する条件下で、被験化合物を接触させる工程、および
（２）前記細胞の細胞障害のレベルを対照と比較する工程、および
（３）対照との細胞障害のレベルの差を、被験化合物の細胞障害作用の調節活性と関連付ける工程
〔１７〕細胞を障害する条件が、細胞障害作用を有する化合物の投与によって与えられる〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕細胞障害作用を有する化合物がアポトーシス誘導剤である〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕アポトーシス誘導剤が、小胞体カルシウムポンプ阻害剤である〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕対照と比較して細胞障害レベルが低い場合に、被験化合物の細胞障害作用の抑制活性が検出される〔１６〕に記載の方法。
〔２１〕以下の工程を含む、細胞障害作用の調節活性を有する化合物の選択方法。
（１）〔１６〕に記載の方法によって被験化合物の細胞障害作用の調節活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、細胞障害レベルに差がある被験化合物を選択する工程
〔２２〕対照と比較して細胞障害レベルが小さい被験化合物を選択する工程を含む〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕〔３〕に記載の方法によって選択された化合物を被験化合物とする〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕〔２１〕に記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含有する、細胞障害作用の調節剤。
〔２５〕細胞が神経細胞である、〔２４〕に記載の、細胞障害の調節剤。
〔２６〕〔２２〕に記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含有する、細胞障害作用の抑制剤。
〔２７〕細胞が神経細胞である、〔２６〕に記載の、細胞障害の抑制剤。
〔２８〕〔２２〕に記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含有する、記憶障害および／または神経変性疾患治療剤。
〔２９〕前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分とする、細胞障害作用を有する成分の作用増強剤。
〔３０〕細胞障害作用を有する成分がアポトーシス誘導剤である〔２９〕に記載の作用増強剤。
〔３１〕アポトーシス誘導剤が抗腫瘍剤である〔３０〕に記載の作用増強剤。
〔３２〕前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む、細胞障害作用を有する成分の作用増強方法。
〔３３〕次の成分を含む、細胞障害組成物。
（１）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、またはそれをコードするポリヌクレオチド、および
（２）細胞障害作用を有する成分
〔３４〕細胞が腫瘍細胞である、〔３３〕に記載の細胞障害組成物。
本発明は、次の２つの遺伝子によってコードされるホスファターゼまたはこれらのホスファターゼと機能的に同等な蛋白質の活性を阻害する活性の検出方法、およびそれを利用した評価方法である。あるいは本発明は、次の２つの遺伝子によってコードされる蛋白質あるいはその機能的に同等な蛋白質が有する細胞障害の増強作用を調節する活性の検出方法、およびそれを利用したスクリーニング方法である。
2003038118.tif 000002
上記２つの遺伝子は、いずれもヘリックス研究所の全長ｃＤＮＡデータベース（ＥＰ１０７４６１７）より見出された。これらの遺伝子は全長ｃＤＮＡとしてその構造は公知であるが、ＣＲＥＢに対するホスファターゼ活性を有することは知られていない。
ＯＶＡＲＣ１０００４７３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＢＣ００４１７６）は卵巣より単離された遺伝子である。この遺伝子によってコードされる２１８の全アミノ酸残基中、Ｃ末端のアミノ酸（１２２−２１８）が二特異性プロテインホスファターゼ（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；Ｓｗｉｓｓｐｌｏｔ  Ｑ１６６９０）と３４％の相同性を有し、１５９−１７６のアミノ酸配列にホスファターゼの触媒部位（Ｋｅｙｓｅ  ＳＭ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９５  Ｍａｒ  １６）１２６５（２−３）：１５２−６０）が認められた（図１上）。
また、ＮＴ２ＲＭ１０００３７７（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＡＫ０２２５１３）はヒト神経芽細胞ＮＴ２細胞より単離された遺伝子である。この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列（１４０アミノ酸残基）は、二特異性プロテインホスファターゼＭＫＰ−５（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０２６４３６）のＣ末側３４３−４８２アミノ酸残基と一致し、６７−７８のアミノ酸配列にホスファターゼの触媒部位を有していた（図１下）。更にそのアミノ酸配列には、Ｃｄｃ２５とアミノ酸１次配列で高いホモロジーを示す領域が見られた。当該領域をＣｄｃ２５様ドメインとして図１（下）に示した。ＣＤＣ２５Ａ（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ２５Ａ，Ｍ−ｐｈａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １）は、細胞周期の進行に必須な機能を担っているｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの一種で、ＣＤＣ２蛋白を脱リン酸化して、そのキナーゼ活性を上昇させることが知られている。ＭＫＰ−５の塩基配列を配列番号：５に、またこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：６に示した。これらの遺伝子はｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １０（ＤＵＳＰ１０）としてもデータベースに登録されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿１４４７２９，ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿１４４７２８）。
これらの遺伝子は、次のようにして同定された。まずヘリックス研究所のｃＤＮＡデータベースからＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、ホスファターゼ関連遺伝子を選び出した。次に、選ばれた遺伝子候補遺伝子をＣＲＥレポーター遺伝子と共にＰＣ１２細胞に導入した。この細胞にフォルスコリンを作用させ、ＣＲＥＢの転写活性を誘導した。その結果、フォルスコリンによるＣＲＥＢの転写活性の増加を抑制する作用を持つ遺伝子として、前記２つのクローンを同定した。
そして当該蛋白質を標的分子として用いることにより、ＣＲＥＢの脱リン酸化を抑制する活性を評価できることが見出された。すなわち本発明は、以下の工程を含む、被験化合物の、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出方法に関する。
（１）ＣＲＥＢのリン酸化が可能な条件下で、またはリン酸化されたＣＲＥＢ若しくはそのリン酸化部位を含むペプチドの存在下で、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に被験化合物を接触させる工程、および
（２）ＣＲＥＢまたはそのリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化のレベルを測定する工程
本発明によるＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出方法は、上述の蛋白質または前記蛋白質と機能的に同等な蛋白質を用いて次のようにして行われる。すなわち、ＣＲＥＢのリン酸化が可能な条件下で、またはリン酸化されたＣＲＥＢ若しくはそのリン酸化部位を含むペプチドの存在下で、前記蛋白質または前記蛋白質と機能的に同等な蛋白質、および被験化合物を接触させ、ＣＲＥＢおよび／またはリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化のレベルを測定する。このような測定は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて行うことができる。
本発明に用いるＣＲＥＢによる転写活性を抑制するホスファターゼは、配列番号：２、または配列番号：４で示される配列の全部またはその一部の配列を有する蛋白質、あるいは該蛋白質と機能的に同等な蛋白質である。
ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質がフォルスコリンにより誘導されたＣＲＥＢの転写活性の増加を抑制する活性、または、ＣＲＥＢを脱リン酸化する活性を持つことを意味する。即ち、本発明の「機能的に同等な蛋白質」には、脱リン酸化反応を触媒するような断片も含まれる。このような活性はＣＲＥＢのリン酸化が可能な条件下で、当該蛋白質をＣＲＥＢと接触させ、ＣＲＥＢのリン酸化レベルの減少を指標として確認することができる。
例えば、ＣＲＥＢおよびｃＡＭＰ存在下で該蛋白質がＣＲＥレポーター遺伝子の発現を抑制すれば、その蛋白質は機能的に同等な蛋白質と言うことができる。具体的には、以下のような方法によって目的蛋白質のＣＲＥＢの転写活性化を抑制する活性を決定することができる。
１）目的蛋白質をコードする遺伝子を発現するベクターを調製する、
２）発現ベクターをＣＲＥレポーター遺伝子と共に細胞内へ導入する、
３）フォルスコリンを添加する、そして
４）ＣＲＥレポーター遺伝子の発現を確認する。
更に本発明においてフォスファターゼ活性が見出された上記蛋白質は、フォスファターゼ活性のみならず、細胞障害を増強する活性を有することが明らかにされた。そして当該蛋白質を標的分子として用いることにより、細胞障害作用の増強を調節する活性を評価できることが見出された。すなわち本発明は、次の工程を含む細胞障害作用の増強を調節する活性の検出方法を提供する。
（１）上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に、細胞を障害する条件下で、被験化合物を接触させる工程、および
（２）前記細胞の細胞障害のレベルを対照と比較する工程、および
（３）対照との細胞障害のレベルの差を、被験化合物の細胞障害作用の調節活性と関連付ける工程
本発明によって明らかにされたフォスファターゼ関連遺伝子であるＮＴ２ＲＭ１０００３７７は、細胞障害作用を増強する活性を有する。したがって、上記のような方法によって、その活性を調節する作用を見出すことができる。より具体的には、対照と比較して細胞障害レベルが低い場合に、細胞障害作用の増強作用を抑制する活性が検出される。逆に、対照と比較して細胞の障害レベルが高い場合には、細胞障害作用の増強を刺激する活性が検出される。
本発明において、細胞を障害する条件とは、細胞の増殖や生存を妨げる条件を言う。このような条件は、たとえば細胞のアポトーシスを誘導することによって与えることができる。具体的には、細胞障害作用を有する化合物の投与、細胞のアポトーシスを誘導する培養条件の変化などを、細胞を障害する条件として利用することができる。細胞を障害する作用を有する化合物には、アポトーシス誘導剤を用いることができる。細胞にアポトーシスを誘導する様々な化合物が知られている。具体的には、ｆａｓリガンドや小胞体カルシウムポンプ阻害剤は、細胞にアポトーシスを誘導する作用を有する。細胞を障害する化合物を細胞に投与するタイミングは任意である。すなわち、被験化合物を細胞に接触させる前、同時、または後に細胞を障害する化合物を投与することができる。
この他、血清などの培地成分を要求する細胞に対して、血清を枯渇させることにより、アポトーシスを誘導できることも公知である。培養条件の変化によるアポトーシスの誘導のタイミングも、任意である。すなわち被験化合物の投与の前、同時、あるいは後に、アポトーシスを誘導するための培養条件の変化を与えることができる。被験化合物を与える前にアポトーシスを誘導した場合には、たとえば被験化合物の細胞障害増強に対する治療効果を評価することができる。逆に、被験化合物を与えた後にアポトーシスを誘導すると、主として被験化合物の細胞障害増強に対する予防的効果を知ることができる。
本発明の方法において用いることができる細胞として、神経細胞様の形質を示す細胞を示すことができる。本発明において標的分子として用いられる蛋白質は、いずれもＣＲＥＢの脱リン酸化に関与している。ＣＲＥＢが記憶形成や神経細胞の障害と強く関連していることは既に述べた。したがって、その作用に与える影響を評価するためには、神経細胞様の形質を示す細胞を用いるのが望ましい。神経細胞様の形質を示す細胞として、ＰＣ１２を示すことができる。ＰＣ１２は、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）の副腎褐色細胞腫（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ；ａｄｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ）から樹立された細胞株で、レチノイン酸やＮＧＦ等の刺激によって、ニューロン様の細胞に分化させることができる。ＰＣ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）はセルバンクから入手することができる。
本発明の方法において、対照としては被験化合物を投与しない細胞を用いることができる。また、被験化合物の活性をより正確に評価するために、細胞を障害する条件を与えない実験も合わせて実施することができる。このような実験を組み合せることにより、被験化合物そのものが細胞に与える影響を合わせて評価することができる。すなわち、細胞を障害する条件の有無に関わらず細胞の障害が観察されるときには、被験化合物そのものが細胞障害作用を有していると考えられる。
細胞の障害レベルを測定する方法は公知である。具体的には、細胞の増殖レベル、アポトーシスを起こした細胞のレベル、あるいは破壊された細胞のレベルなどを指標として、細胞の障害レベルを知ることができる。
本発明によって明らかにされたフォスファターゼ関連遺伝子であるＮＴ２ＲＭ１０００３７７が、小胞体カルシウムポンプ阻害剤による細胞障害作用を増強することが確認された。細胞障害作用とは、細胞の生存妨げられることを言う。たとえば、アポトーシスの誘導は細胞障害に含まれる。また『細胞障害の増強』とは、上述の方法により各細胞の障害レベルを測定した場合に、ある単独の要因のみで観測される障害レベルに比較して、他の別の要因を加えることにより、障害レベルがさらに上昇して見られることを言う。
したがって本発明における機能的に同等な蛋白質には、細胞障害作用を増強する活性を備えた蛋白質が含まれる。このような活性は、例えば次のようにして確認することができる。すなわち、細胞を障害する条件下で、活性を確認すべき蛋白質とともに細胞に接触させ、当該細胞の障害のレベルを、該蛋白質を接触させない場合と比較することにより、上記活性を評価することができる。細胞に傷害を与える条件として、次のような条件を示すことができる。
たとえば、細胞障害作用を有する化合物を細胞に接触させることができる。
ある蛋白質を強制発現させた細胞に対して、このような条件を与えたときに、対照と比較して細胞障害作用が増強されていれば、当該蛋白質が上記活性を有することを確認することができる。
本発明に用いるホスファターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１または配列番号：３に記載の配列情報に基づき作製したプローブおよび／またはプライマーを用いてハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等により単離することができる。
これらポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドから発現される蛋白質が前記ホスファターゼと実質に同じ作用を有するものである限り、特に配列番号：１または配列番号：３に記載の配列を有するものに限定されない。すなわち、
１）前記配列番号に記載の配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
２）前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１、若しくは、複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド
が含まれる。このようなポリヌクレオチドは例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、ＰＣＲ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ６．１−６．４）、または、通常のハイブリダイゼーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）等により容易に得ることができる。
当業者であれば、配列番号：１または配列番号：３に記載の配列を有するポリヌクレオチド、または、その一部をプローブとして、あるいは、該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離することができる。
機能的に同等な蛋白質をコードするためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、洗浄のための条件として通常「１×ＳＳＣ、３７℃」程度であり、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドを単離し得る。但し、上記ハイブリダイゼーションの条件は例示的なものであり、当業者であれば使用する塩基配列、遺伝子プールの種類等の条件により、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間、反応温度、試薬濃度等を適宜選択し、目的に応じたストリンジェンシーを実現することが可能である。
上述のような方法により単離されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するホスファターゼと比較して、通常、そのアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より一層好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列相同性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性はＡｌｔｓｈｕｌらによるアルゴリズムＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラムが開発されている。ＢＬＡＳＴＮプログラムによって塩基配列データベースを対象として解析する場合には、パラメーターは例えばｅｘｃｅｐｔ＝１０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１１とすることができる。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列データベースを対象として解析する場合には、パラメーターは例えばｅｘｃｅｐｔ＝１０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とすることができる。また、各種のＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることもできる。これらの解析方法の具体的な手法は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）等で参照することができる。
配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列は、各々、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされている。このアミノ酸配列からなる蛋白質は、ＣＲＥＢの脱リン酸化を行う活性を有し、ＣＲＥＢの転写活性の増加を抑制する。本発明の方法には、これらの蛋白質と機能的に同等な活性を有する蛋白質を用いることができる。
機能的に同等な蛋白質には、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法、例えば、部位特異的突然変異誘発法等を利用して製造された蛋白質も含まれる。蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り特に制限されない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ．Ｌｅｕ．Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
また、ハイブリダイゼーション技術、ＰＣＲ法等により異なる組織、動物より機能的に同等な蛋白質をコードする遺伝子を取得し、由来の異なる蛋白質を得ることも可能である。機能的に同等な蛋白質を単離するための生物は特に限定されない。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ、ウシ等の哺乳動物を挙げることができる。
更に、対象となる蛋白質がそのままでは該活性を有さない場合であっても、なんらかの過程（切断、修飾等）を経ることによりＣＲＥＢの転写活性の増加を抑制する活性、あるいは細胞障害作用を増強する活性を持つ蛋白質を生成するような蛋白質も、本発明に用いることができる。また、通常、蛋白質の活性には必ずしも全構成アミノ酸が必要とされるものではないので、前記蛋白質の部分ペプチドを用いることもできる。即ち、前記蛋白質と機能的に同等な活性を示すのに必要とされる部分を保持した部分ペプチドは、本発明に用いることができる。部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、ペプチド合成法、あるいは、適当なペプチダーゼ等の酵素を用いた切断によって製造することができる。
本発明に必要な蛋白質は、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体から発現させることにより得ることができる。発現された蛋白質は、培養液または細胞画分より通常の方法により精製、単離することが可能である。
精製および単離の方法としては、例えば、以下のような方法を挙げることができる。まず、ろ過および遠心等の方法により細胞または上清を回収する。細胞内に蛋白質を発現させた場合には、細胞の細胞壁および／または細胞膜を超音波や磨砕等の物理的な手段、若しくは、ライソザイム等を用いて破砕することが必要となる。このようにして得られた、本発明の蛋白質を含む溶液を透析、カラムクロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティー等）、ゲルろ過等の慣用の手段を適宜、組み合わせて処理することにより、目的とする蛋白質を単離、精製することができる。
遺伝子工学的に蛋白質を製造する場合には、親和性を有するポリペプチドをコードする配列を目的蛋白質をコードする遺伝子の末端に付加して発現させることができる。付加したポリペプチドの親和性を、目的とする蛋白質の精製に利用することができる。金属イオンキレート、ビオチン、ストレプトアビジン、抗体等に対して親和性を有するポリペプチドが公知である。例えば、ヒスチジン、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸を目的蛋白質に付加すれば、金属イオンとの親和性を利用して容易に蛋白質を精製することができる。
精製された蛋白質は、ＣＲＥＢの脱リン酸化剤として使用することができる。ＣＲＥＢの脱リン酸化剤は、ＣＲＥＢの脱リン酸化を調節する化合物の評価に用いることができる。また、ＣＲＥＢの脱リン酸化剤を利用した評価方法によって見出すことができる、脱リン酸化を阻害する活性を有する化合物は、記憶障害および／または神経変性疾患に対して治療剤／予防剤として用いることができる。
あるいはこうして得られた蛋白質は、細胞の障害作用の増強剤として用いることができる。本発明の細胞障害作用の増強剤は、細胞障害の増強を調節する活性の評価に用いることができる。当該活性を有する化合物は、細胞障害の増強作用の調節に有用である。
更に本発明における細胞の障害作用の増強剤は、たとえば、抗腫瘍剤のような細胞障害作用を有する化合物の効果を増強するために有用である。細胞障害作用を有する化合物として、具体的には、アポトーシス誘導剤を示すことができる。アポトーシス誘導剤には、小胞体カルシウムポンプ阻害剤等が含まれる。たとえば、筋小胞体カルシウムポンプ阻害剤であるタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）は、癌の治療を目的とする研究が行われている代表的な細胞障害作用を有する化合物である。本発明の細胞障害作用の増強剤は、細胞障害作用を有する化合物とは別に投与することができる。あるいは、本発明の増強剤を予め細胞障害作用を有する化合物と配合し、その作用が増強された組成物とすることもできる。更に、本発明の細胞障害作用の増強剤には、前記蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。当該ポリヌクレオチドは、投与後に生体内において細胞障害作用を増強する蛋白質を発現し、目的とする作用を達成することができる。生体内に遺伝子を導入し、目的とする蛋白質を発現させるための技術が公知である。
また、本発明のＮＴ２ＲＭ１０００３７７は、解析により、二特異性プロテインホスファターゼＭＫＰ−５のスプライシングバリアントの一種であることが判明した。したがって、ＭＫＰ−５もＮＴ２ＲＭ１０００３７７と同様な作用を有し、脱リン酸化剤として使用できる。更に、ＮＴ２ＲＭ１０００３７７と同じようにＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する被験化合物の活性の検出方法、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を有する化合物の評価方法、およびＣＲＥＢの脱リン酸化方法においてもＭＫＰ−５を使用できる。ＭＫＰ−５を用いて見出されたＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を有する化合物は、記憶障害および／または神経変性疾患に対して治療剤／予防剤として用いることができる。ＭＫＰ−５が、ＣＲＥＢの脱リン酸化作用を有することは、本発明者らが見出した新規な知見である。
すなわち本発明は、以下の工程を含む、被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出方法に関する。
（１）ＣＲＥＢのリン酸化が可能な条件下で、またはリン酸化されたＣＲＥＢ若しくはそのリン酸化部位を含むペプチドの存在下で、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に被験化合物を接触させる工程、および
（Ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（Ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（Ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（Ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（Ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（Ｄ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（Ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）ＣＲＥＢまたはそのリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化のレベルを測定する工程
また本発明は、以下の工程を含む、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を有する化合物の評価方法に関する。
（１）前記検出方法によって被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を検出する工程、および
（２）被験化合物不存在下でのＣＲＥＢのリン酸化レベルと比較して、リン酸化レベルが高い被験化合物を選択する工程
更に本発明は、これらの評価方法によって選択される化合物を有効成分として含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、あるいは、記憶障害および／または神経変性疾患治療剤に関する。また本発明は、この評価方法によって選択される化合物を投与する工程を含む記憶障害および／または神経変性疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、この評価方法によって選択される化合物の、記憶障害および／または神経変性疾患治療剤の製造における使用に関する。
また本発明は、以下の要素を含む、被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出用キットに関する。
（１）前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、および
（２）ＣＲＥＢのリン酸化のレベルを測定するための手段
あるいは本発明は、以下の要素を含む、被験化合物の細胞障害作用の増強を調節する活性の検出用キットに関する。
（１）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞、および
（２）前記細胞に対する障害作用を有する化合物
本発明のキットには、目的に応じて付加的な要素を組み合せることができる。たとえば、目的とする活性を有する（または有しない）ことが明らかな化合物を陰性対照や陽性対照として組み合せることができる。また細胞の培養を必要とするキットにおいては、細胞を培養するための培地や培養容器を組み合せることができる。更に、細胞の障害作用を評価することが必要なキットにおいては、細胞の障害レベルを評価するための要素を組み合せることができる。たとえば神経細胞ＰＣ１２の細胞障害レベルは、培養上清中のＬＤＨを指標として評価することができる。したがって、ＬＤＨの活性測定用の試薬をキットに組み合せることができる。
また本発明は、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、ＣＲＥＢのリン酸化状態が調節されたモデル動物に関する。
加えて本発明は、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質とＣＲＥＢとを接触させる工程を含む、ＣＲＥＢの脱リン酸化方法に関する。あるいは本発明は、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を主成分として含むＣＲＥＢの脱リン酸化剤に関する。また本発明は、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質の、ＣＲＥＢの脱リン酸化剤の製造における使用に関する。
更に本発明は、配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質、または該蛋白質をコードする遺伝子を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、あるいは記憶障害および／または神経変性疾患治療剤に関する。
また本発明は、配列番号：５に記載の塩基配列に対して相補的な配列を有し、配列番号：５に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、あるいは記憶障害および／または神経変性疾患治療剤に関する。加えて本発明は、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載の蛋白質に対する抗体を主成分として含むＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、あるいは記憶障害および／または神経変性疾患治療剤に関する。
本発明に用いる蛋白質を遺伝子工学的な手法により発現させる際には、使用する宿主細胞の種類に応じ適当な発現ベクターを選択することが必要である。本発明に用いる蛋白質を発現させるための宿主細胞は限定されない。具体的には、大腸菌および枯草菌等の原核生物、並びに、酵母、昆虫細胞、両生類等の動物細胞、および哺乳動物細胞等の真核細胞を宿主細胞として挙げることができる。
通常、原核生物を用いる場合には、プロモーター、開始コドン、目的蛋白質をコードする配列、終止コドンおよび自己複製ユニットを含む発現ベクターを用いる。真核細胞を宿主とする場合には、プロモーター、開始コドン、目的蛋白質をコードする配列および終止コドンから構成される発現ベクターを用いることが好ましい。必要に応じ、エンハンサー配列、目的蛋白質の５’および３’非コード領域、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入することもできる。
細菌を宿主とする場合のプロモーターという語句は、プロモーター、オペレーターおよびシャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列からなるプロモーター・オペレーター領域を意味する。適当なプロモーターの例として、ラクトースオペロン、ＰＬプロモーター、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。酵母を宿主とする場合のプロモーターの例としては、ｐｈｏ５プロモーターがある。哺乳動物細胞を用いた発現で使用し得るプロモーターの例としては、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、マウス・メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。本発明の実施に必要とされるＤＮＡのクローニング、プラスミドの構築、宿主の形質転換、その培養、および培養物からの蛋白質の回収等に必要とされる操作は、当業者であれば公知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）等）に従って行うことができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊｏｈｎ  ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法等の公知の方法に従って行うことができる。
本発明においてＣＲＥＢのリン酸化レベルは、例えば、ＣＲＥＢ、ｃＡＭＰ、および前記蛋白質の存在下におけるＣＲＥレポーター遺伝子の発現レベルを観察することによって評価することができる。例えば、前記蛋白質をコードする遺伝子を発現ベクター中に挿入し、ＣＲＥレポーター遺伝子と共に細胞内へ導入する。細胞のｃＡＭＰをフォルスコリン等の化合物を添加することにより誘導する際に被験化合物を存在させ、ＣＲＥレポーター遺伝子の発現を確認することによりＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を検出することができる。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて前記蛋白質をコードする遺伝子、およびＣＲＥレポーター遺伝子を発現させる場合には、後に述べるような発現ベクターを用いることができる。宿主細胞としては、ＣＲＥＢを発現するが、前記蛋白質をコードする遺伝子が発現されないか、該遺伝子が欠失された動物細胞を用いることができる。このような細胞としては、ＰＣ１２細胞、Ｊａｒｋａｔ細胞、初代培養神経細胞、ニューロプラストーマ（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，ＩＭＲ３２，Ｎｅｕｒｏ２ａ）を示すことができる。
ここでＣＲＥレポーター遺伝子とは、ＣＲＥ領域と、レポーター遺伝子とが結合されたものである。ＣＲＥ領域は、ｃＡＭＰにより発現の促進される遺伝子群の転写制御部位中のｃＡＭＰによる誘導に不可欠な部分である。ｃＡＭＰにより発現の促進される遺伝子群としては、ソマトスタチン、ｃ−ｆｏｓ等が知られている。その塩基配列は、ＴＧＡＣＧＴＴＣＡの８塩基、または、これに類似した構造のパリンドローム構造である。また、レポーター遺伝子としてはルシフェラーゼ、カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をコードする遺伝子を挙げることができる。
前記蛋白質による脱リン酸化を阻害する活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて測定することもできる。たとえば、前記蛋白質とリン酸化されたＣＲＥＢを被験化合物の存在下でインキュベート後、ＣＲＥＢのリン酸化のレベルの変化を測定することによって、前記活性を測定することができる。ＣＲＥＢのリン酸化レベルの変化は、たとえばＣＲＥＢのリン酸化レベルを識別することができる抗体を利用して測定することができる。
ＣＲＥＢのアミノ酸配列は公知（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｍ２７６９１）であり、該配列情報をもとにＣＲＥＢを公知の方法（例えば、本発明に用いる蛋白質の入手法で例示したようなハイブリダイゼーション技術、ＰＣＲ法、および遺伝子工学的な手法等）に従って入手することは当業者が容易になし得ることである。また、ＣＲＥＢのリン酸化は以下のような方法に従って行うことができる。細胞上清を除去し、ＰＢＳ等で洗浄した後、可溶化バッファー（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４，１％ｔｒｉｔｏｎＸ１００，１％ＳＤＳ，０．２ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｖａｎｄａｔｅ，１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，２μ  ｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，２μ  ｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｐｔｉｎｉｎ）で蛋白質を可溶化する。次に、サンプルを変性させずにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動し、分離する。電気泳動後、電気泳動したサンプルをＰＶＤＦフィルターにトランスファーし、抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体で同定する（Ｂｅｉｔｎｅｒ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８Ｊｕｌ．３１）２７３（３１）：１９８３４−９）。
蛋白質のリン酸化レベルを識別し得る抗体の調製方法は公知である。例えば、ＣＲＥＢは、その１３３位のセリンがリン酸化される。したがって、リン酸化したセリンを用いて、１３３位のセリンを含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを合成し、免疫原とすることでＣＲＥＢのリン酸化レベルを識別する抗体を得ることができる。また、リン酸化ＣＲＥＢに対する抗体は市販されている。例えば＃９１９１Ｓは、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢ  Ｉｎｃ．が販売するリン酸化ＣＲＥＢに対する抗体である。
前記蛋白質による脱リン酸化を阻害する活性の検出方法に必要な要素は、予め組み合わせたキットとすることができる。すなわち本発明は、次の要素からなる被験化合物の、前記蛋白質によるＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性の検出用キットに関する。
（１）前記（ａ）〜（ｄ）に記載の蛋白質、および
（２）ＣＲＥＢのリン酸化のレベルを測定するための手段
本発明のキットには、更にＣＲＥＢ、および／またはＣＲＥＢのリン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるペプチドを組み合わせることができる。本発明のキットを構成するＣＲＥＢおよび／またはＣＲＥＢのリン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるペプチドは、前記検出方法において、予めリン酸化されるか、あるいはそのリン酸化が可能な条件下で用いられる。リン酸化が可能な条件を与えるために必要な要素をキットに付加することもできる。
具体的には、ＣＲＥＢを細胞に発現させる場合には、細胞にｃＡＭＰを作用させることによってＣＲＥＢのリン酸化が達成される。したがって、ＣＲＥＢ産生細胞、この細胞を培養するための培地、そしてｃＡＭＰをキットの構成要素とすることができる。あるいは、リン酸化されたＣＲＥＢやＣＲＥＢのリン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるペプチドを構成要素とすることもできる。
本発明のキットにおいて、ＣＲＥＢのリン酸化のレベルを測定するための手段とは、たとえば前記のＣＲＥレポーター遺伝子発現系やＣＲＥＢのリン酸化レベルを識別することができる抗体を示すことができる。
本発明のキットには、陽性や陰性の結果を与える対照試料や取り扱い指示書を組み合わせることもできる。本発明のキットは、以下に述べる評価方法に有用である。本発明のキットによって以下の評価方法を実施する場合には、評価のための被験化合物を組み合わせることもできる。
本発明は、前記検出方法を応用した評価方法に関する。本発明の評価方法は以下の工程を含む。
（１）前記検出方法によって被験化合物のＣＲＥＢの脱リン酸化反応を阻害する活性を検出する工程、および
（２）被験化合物不存在下でのＣＲＥＢのリン酸化レベルと比較して、リン酸化レベルが高い被験化合物を選択する工程
一方本発明の評価に用いる被験化合物としては、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物、公知のコンビナトリアルケミストリーの技術により製造された合成化合物等が挙げられる。該被験化合物にはさらにドミナントネガティブ体、アンチセンス核酸、抗体等の高分子化合物も含まれる。これらの被験化合物は単なる例示であり、これに限定されるものではない。
更に本発明による、細胞障害作用の増強に対する調節活性の検出方法を利用して、当該活性を有する化合物を選択することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む、細胞障害作用の調節活性を有する化合物の選択方法に関する。
（１）前記方法によって被験化合物の細胞障害作用の調節活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、細胞障害レベルに差がある被験化合物を選択する工程
本発明によって選択される化合物は、細胞障害作用の増強を調節する作用を有する。細胞障害作用の増強を調節する活性には、増強の抑制と刺激が含まれる。細胞障害作用の増強を抑制する活性を有する化合物は、ＯＶＡＲＣ１０００４７３（配列番号：１）およびＮＴ２ＲＭ１０００３７７（配列番号：３）によってコードされる蛋白質の、細胞障害作用の増強を抑制する。
本発明の方法において、被験化合物には先に述べたフォスファターゼ活性の調節活性の評価方法において例示されたような化合物を用いることができる。更に、上記の方法によって脱リン酸化反応の阻害作用を有することが見出された化合物を被験化合物として、更に本発明に基づく細胞障害の増強を調節する活性の評価方法を実施することもできる。こうして選択された化合物は、脱リン酸化を阻害する作用とともに、細胞障害の増強を抑制する作用をも併せ持つ化合物である。このような化合物は、神経細胞の障害をはじめとする様々な細胞の障害に起因する疾患の治療に有用である。
細胞障害作用の増強は、神経細胞の障害をはじめとする様々な細胞の障害に起因する疾患の病態を構成している。したがって、細胞障害作用の増強を抑制することができる化合物は、これらの疾患の治療や予防に有用である。
本発明により、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に、ＣＲＥＢの脱リン酸化作用、並びに細胞障害の増強作用が見出された。したがって、この蛋白質の活性や発現を抑制することにより、生体内におけるＣＲＥＢの脱リン酸化反応、あるいは細胞障害の増強を制御することができる。蛋白質の活性や発現を制御するには、たとえばドミナントネガティブ体やアンチセンス核酸を利用することができる。
すなわち本発明は、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質、または該蛋白質をコードする遺伝子を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、あるいは記憶障害および／または神経変性疾患治療剤に関する。
また本発明は、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列に対して相補的な配列を有し、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸を含有するＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、あるいは記憶障害および／または神経変性疾患治療剤に関する。
ここで、ドミナントネガティブ体とは、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質を指す。このようなドミナントネガティブ体は、細胞がもともと備えている内在性の野生型蛋白質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する。例えば、配列番号：２、または配列番号：４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、該配列によりコードされる蛋白質の活性に影響すると考えられる配列に相当するアミノ酸配列を改変することによって、ＣＲＥＢの脱リン酸化活性および／または細胞障害の増強活性が低い、あるいは活性が無い不活性体を得ることができる。
このようなドミナントネガティブ体を細胞へ投与するか、または該ドミナントネガティブ体をコードする遺伝子を細胞内で発現させることにより、ＣＲＥＢの脱リン酸化および／または細胞障害の増強をドミナントネガティブ効果（不活性型の拮抗阻害）により抑制することができる。従って、本発明のドミナントネガティブ体、または該ドミナントネガティブ体をコードする遺伝子は、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、または、記憶障害および／または神経変性疾患の治療若しくは予防剤として用いることができる。
また、本発明におけるアンチセンス核酸とは、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現を抑制するポリヌクレオチドを意味する。即ち、このような活性を有するアンチセンス核酸は、ＣＲＥＢの脱リン酸化および／または細胞障害の増強を抑制し、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、または、記憶障害および／または神経変性疾患の治療若しくは予防剤として用いることができる。
アンチセンス核酸は、アンチセンスＤＮＡでもアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスＤＮＡは、好ましくは数十ｂｐ以上の鎖長を有する。該アンチセンスＤＮＡを単独あるいは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等の適当なベクターにアンチセンス方向に挿入して用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ｂｐ以上、通常１００ｂｐ以内、好ましくは２０ｂｐ以上、５０ｂｐ以内の鎖長を有する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオエート法（Ｓｔｅｉｎ“Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９−３２２１（１９８８））等により調製することができる。
このようなアンチセンス核酸には、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に起因する疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター等を利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法等により患者へ投与することができる。
また、本発明に用いるホスファターゼに結合する抗体は、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、並びに、該ホスファターゼの関連する疾患、例えば記憶障害および／または神経変性疾患の予防および治療等に利用することもできる。本発明のＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、細胞障害作用の増強に対する抑制剤、または、記憶障害および／または神経変性疾患の予防剤若しくは治療剤として用い得る抗体とは、以下の（ａ）〜（ｂ）のいずれかに記載の蛋白質に対する抗体である。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（ｄ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質。
本発明に用いる抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体、または抗原結合性を有するそれらの断片も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、ヒト化抗体等の特殊抗体も含まれる。
ポリクローナル抗体は、前述の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、またはそれらの部分ペプチドを免疫動物に免疫することにより得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２〜１１．１３）。
一方、モノクローナル抗体は、該蛋白質または部分ペプチドを用いて免疫動物を免疫し、その抗体産生細胞と骨髄腫細胞等を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
抗体を患者の予防・治療目的で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｏｃｉ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組換えによって調製することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：９９−１２１（１９９１））。
上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質、すなわち、本発明に用いるホスファターゼに結合する抗体は、該ホスファターゼの精製に加え、これらのホスファターゼの発現異常や構造異常の検査・診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞等から蛋白質を抽出し、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等の方法による前記蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
本発明に基づいて単離される化合物は、生体内のＣＲＥＢの転写活性を促進する化合物の候補となる。これらの化合物は、前記蛋白質が関連する疾患の予防や治療のための医薬として有用である。即ち、本発明の評価方法により、ＣＲＥＢの転写活性が関与する幅広い記憶障害および／または神経変性を改善するための医薬、治療剤および予防剤として有用な化合物を評価することができる。
あるいは本発明に基づいて単離される化合物は、生体内の細胞障害の増強を調節する化合物の候補となる。これらの化合物は、前記蛋白質が関連する疾患の予防や治療のための医薬として有用である。即ち、本発明の評価方法により、細胞障害の増強活性が関与する幅広い細胞障害を改善するための医薬、治療剤および予防剤として有用な化合物を評価することができる。
本発明の評価方法は、目的とする活性を有する化合物のスクリーニング方法や、化合物のキャラクタリゼーション等に利用することができる。
上記評価方法に基づいてスクリーニングされた化合物は、ＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤、あるいは細胞障害作用の増強に対する抑制剤として有用である。ＣＲＥＢの脱リン酸化反応の阻害剤は、ＣＲＥＢの活性化によってもたらされる種々のアポトーシスを伴う疾患の治療や予防に用いることができる。また細胞障害作用の増強に対する抑制剤は、細胞障害作用の増強によってもたらされる様々な疾患の治療や予防に有用である。このような疾患としては、たとえば次のような疾患を示すことができる。
心筋梗塞、心筋炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、インスリン依存性糖尿病（膵臓ランゲルハンス島細胞の免疫反応性細胞死による）、脳梗塞
また上記評価方法に基づいてスクリーニングされた化合物は、記憶障害および／または神経変性を改善すると考えられ、幅広い神経疾患を予防、または、治療するための医薬として有用である。
本発明において記憶障害および／または神経変性疾患とは、ＣＲＥＢ活性の制御や神経細胞における細胞障害の増強の抑制によって改善される疾患を意味する。例えば、ＣＲＥＢ活性の上昇は神経細胞の抗アポトーシス活性と結びついていることから、本発明のスクリーニング方法により得られる脱リン酸化反応の阻害剤は、以下のような疾病の治療や予防に有用である。
脳血管障害性痴呆、多発性微小脳梗塞、脳血栓症、脳梗塞、脳出血、神経変性疾患（アルツハイマー等）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮病
上記疾患はいずれも細胞障害を伴うことから、本発明によって選択される細胞障害の増強を抑制する化合物も同様に、上記のような疾患の治療や予防に用いることができる。
本発明においてこれらを医薬品として用いる場合には、それ自体として医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、験濁剤等、製剤に用いられる公知のものと適宜組み合わせて製剤化することができる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重、年齢および病状、並びに、用いる投与方法等により変わるものであるが、当業者であれば適切な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がポリヌクレオチドによりコードされ得るものであれば、該化合物をコードするＤＮＡ等のポリヌクレオチドを遺伝子治療用のベクターに組込み、遺伝子治療において用いることも考えられる。
加えて本発明は、前記ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を触媒する蛋白質の発現レベルを調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、ＣＲＥＢのリン酸化状態が調節されたモデル動物に関する。本発明者らによって、前記蛋白質がＣＲＥＢの脱リン酸化反応を触媒していることが明らかにされた。この知見に基づいて、前記蛋白質の発現を調節することによって、ＣＲＥＢのリン酸化状態を調節することができる。
前記脱リン酸化反応を触媒する蛋白質をコードする遺伝子が導入された動物においては、生体内のＣＲＥＢのリン酸化状態が弱められる。その結果、ＣＲＥＢによる転写活性が減少し、記憶障害や神経変性等が起きると予想される。このような動物をモデルとして、その症状が緩和されるような化合物を評価することも可能である。
また、その動物における前記ＣＲＥＢの脱リン酸化反応を触媒する蛋白質の発現を弱めた動物では、ＣＲＥＢのリン酸化レベルが亢進する。その結果、ＣＲＥＢによる転写活性が増強された状態を作り出すことができる。このような動物は、記憶や神経細胞を維持するために必要な分子等を見出すためのモデルとして有用である。本発明において、発現を弱めた動物とは、当該蛋白質の発現を阻止した動物（ノックアウト）に加え、他の遺伝子に組み換えた動物（ノックイン）や蛋白質のアミノ酸配列に変異を与えてその活性を低下させた動物が含まれる。
あるいは本発明は、前記細胞障害作用を増強する蛋白質の発現レベルを調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、細胞障害作用が調節されたモデル動物に関する。本発明者らによって、前記蛋白質が細胞障害作用を増強することが明らかにされた。この知見に基づいて、前記蛋白質の発現を調節することによって、細胞障害作用を調節することができる。
前記細胞障害作用を増強する蛋白質をコードする遺伝子が導入された動物においては、生体内の細胞障害作用が増強される。その結果、細胞は障害されやすい状態に置かれ、記憶障害や神経変性等が起きると予想される。このような動物をモデルとして、その細胞の障害が緩和されるような化合物を評価することも可能である。
また、その動物における前記細胞障害を増強する蛋白質の発現を弱めた動物では、細胞障害の増強が抑制される。このような動物は、記憶や神経細胞を維持するために必要な分子等を見出すためのモデルとして有用である。
目的とする遺伝子の発現を調節したトランスジェニック動物を得る方法は公知である（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；日経サイエンスＶｏｌ．２５，Ｎｏ．６：４０−５０（１９９５）参照）。すなわち、細胞分化の初期段階で外来遺伝子を導入するか、目的遺伝子を相同組換え等の技術を利用して欠失させる。この胚から発生する個体は、遺伝子を操作した細胞を有するキメラ動物となる。キメラ動物の子孫が遺伝子の変異を持つ場合は、その個体は遺伝子の変異をヘテロに有するトランスジェニック動物である。ヘテロのトランスジェニック動物同士を交配することにより、ホモで変異を有するトランスジェニック動物を得ることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されない。
１．フォリスコリンによる転写活性の上昇に対するホスファターゼ関連遺伝子の作用
（１）ヘリックスクローン由来の発現ベクター及びレポーター発現ベクター
ヘリックス研究所等のｃＤＮＡライブラリーから、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって、ホスファターゼモチーフを有する６個のホスファターゼ関連遺伝子を選択した。得られた各遺伝子をＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ホスファターゼ関連遺伝子発現ベクターとした。
ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７は、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のＣＭＶ  ＩＥプロモーター下流にヘリックスクローンＮＴ２ＲＭ１０００３７７由来の遺伝子を連結させた発現ベクターである。ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−４７３は、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター下流にヘリックスクローンＯＶＡＲＣ１０００４７３由来の遺伝子を連結させた発現ベクターである。
ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、ＣＲＥエレメントを有するプロモータの下流に−ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子が連結されたレポーター発現ベクターである。ｐＲＬ３−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＳＶ４０ｅａｒｌｙプロモーター下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が連結されたレポーター発現ベクターである。
（２）ＰＣ１２細胞への遺伝子の導入
０．５ｍｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０μｇ  ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．２μｇ  ｐＲＬ３−ＳＶ４０、および１０μｇホスファターゼ関連遺伝子発現ベクターを加えて室温で５分間静置した。ここで、ヘリックスクローン関連遺伝子発現ベクターとしては、ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７、ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−４７３、またはコントロールとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いた。一方、０．５ｍｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と２０μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合して室温で３分間静置した。これらのベクター混合液とｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００希釈液とを混ぜ、さらに室温で２０分間インキュベーションを行なうことにより、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００とベクターとのコンジュゲートを作製した。あらかじめコラーゲンタイプＩでコートしたカルチャーフラスコ（２５ｃｍ２、コーニング社製）に１．０Ｘ１０６となるように播種し、３ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃一晩インキュベーションしたＰＣ１２細胞に、このコンジュゲートを滴下して加え、さらに３７℃で一晩培養した。
（３）ＣＲＥＢ転写活性の測定
上述の（２）の方法で得られた遺伝子導入細胞を、コラーゲンタイプＩ（日本ハム）でコートした９６ウエルプレートに各ウエルあたり５ｘ１０５個ずつ播種して、３７℃でさらに一晩培養した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を１０μＭの濃度に加えて、さらに８時間、３７℃で培養した後、以下に述べる方法でＣＲＥＢの活性測定を行なった。即ち、吸引により上清を除去し、２０μｌのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１２．５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４，１％  ＴｒｉｔｏｎＸ）で細胞を溶解した。これにＤｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のホタルルシフェラーゼ基質液（５０μｌ）及びウミシイタケルシフェラーゼ基質液（５０μｌ）を加え、化学発光量を測定した。測定機器としてＷａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の比をＣＲＥＢ転写活性とした。
このようにして測定されたＣＲＥＢ転写活性の結果を図２に示す。図２は３連実験の平均を示す。縦軸は、ｐＣＲＥ−Ｌｕｃを導入していない場合を０％とし、ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで形質転換し、フォルスコリンで刺激した場合を１００％とした相対的なＣＲＥＢ転写活性（％）を示している。ヘリックスクローンＯＶＡＲＣ１００４７３及びＮＴ２ＲＭ１０００３７７由来の各遺伝子を導入したＰＣ１２細胞においては、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ刺激によるＣＲＥＢ転写活性の増加が有意に抑制されることが見いだされた。この結果及び予想される蛋白質のアミノ酸配列の構造的特徴から、これら２つの遺伝子は、ＣＲＥＢの脱リン酸化を触媒するホスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と同定した。
２．ドラッグスクリーニング系の構築
１０μｇ  ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２μｇ  ｐＲＬ３−ＳＶ４０、および０μｇから１０μｇのｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７を、実施例１（２）と同様の方法で、ＰＣ１２細胞へ導入した。また、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒとしては、０μｇから１０μｇのｐＭＥ１８ＳＦＬ３を用い、ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７との合計量が１０μｇとなるようにした。これらの遺伝子導入細胞を、コラーゲンタイプＩ（日本ハム）でコートした９６ウエルプレートに各ウエルあたり５ｘ１０５個ずつ播種して、３７℃でさらに一晩培養した。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マウス２．５Ｓ  ＮＧＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度に加えて、さらに８時間、３７℃で培養した後、以下に述べる方法でＣＲＥＢの活性測定を行なった。即ち、吸引により上清を除去し、２０μｌのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１２．５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４，１％  ＴｒｉｔｏｎＸ）で細胞を溶解した。これにＤｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のホタルルシフェラーゼ基質液（５０μｌ）及びウミシイタケルシフェラーゼ基質液（５０μｌ）を加え、化学発光量を測定した。測定機器としてＷａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の比をＣＲＥＢ転写活性とした。
このようにして測定されたＣＲＥＢ転写活性の結果を図３に示す。図３は３連実験の平均を示す。縦軸は、相対的なＣＲＥＢ転写活性を示す。ｐＲＬ３−ＳＶ４０のみを導入しＮＧＦ未刺激の場合を０とし、ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７及びｐＭＥ１８ＳＦＬ３を全く導入しないでｐＣＲＥ−Ｌｕｃ及びｐＲＬ３−ＳＶ４０のみを導入しＮＧＦ未刺激の場合を１としている。ヘリックスクローンＮＴ２ＲＭ１０００３７７由来の遺伝子を導入したＰＣ１２細胞においては、遺伝子導入に用いた発現ベクターｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７の量に依存してＮＧＦ添加によるＣＲＥＢ転写活性の増加が有意に抑制されることが見いだされた。この事実は、ＮＴ２ＲＭ１０００３７７由来の遺伝子産物がＣＲＥＢ転写活性に対して抑制的に働いていることを示唆している。さらに、上述のアッセイ系において、ＮＧＦの添加と同時に、新規な化合物を加えた上で、その添加効果をＣＲＥＢ転写活性として測定することにより、ＣＲＥＢ転写活性抑制を回復する新しい薬剤のスクリーニング系が構築可能である。
３．細胞障害に対する増強効果
１０μｇ  ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２μｇ  ｐＲＬ３−ＳＶ４０、及び１０μｇ  ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７を、実施例１（２）と同様の方法で、ＰＣ１２細胞へ導入した。コントロールとしては、ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７の代わりに１０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いた。
これらの遺伝子導入細胞を、コラーゲン（日本ハム）コートした９６ウエルプレートに各ウエルあたり５ｘ１０５個ずつ播種して、３７℃でさらに一晩培養した。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マウス２．５Ｓ  ＮＧＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を０ｎｇ／ｍｌ，１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌの濃度に加えて、さらに８時間、３７℃で培養した。
細胞は一度培地で洗浄後、５％  Ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ及び５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）中に１０ｎＭタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ；Ｓｉｇｍａ）及び神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）を加え、１８時間インキュベーションした。
ＰＣ１２細胞はラット副腎褐色細胞腫由来の細胞株である。タプシガルギンは筋小胞体カルシウムポンプ（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ  ｐｕｍｐ）阻害剤である。タプシガルギンの投与は、ＰＣ１２細胞のアポトーシスを誘導する。またＰＣ１２は、ＮＧＦにより神経細胞様に分化する。この分化の過程において、ＣＲＥＢによる転写活性が刺激される。したがって、タプシガルギンとＮＧＦの存在下で、ｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７で形質転換したＰＣ１２細胞を培養することによって、ＮＴ２ＲＭ１０００３７７のアポトーシス誘導作用やＣＲＥＢの転写活性に与える影響を観察することができる。
細胞障害性は、細胞膜の損傷によって細胞外に遊離するＬＤＨ（Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性をＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＬＤＨ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。インキュベーション後の細胞上清７５μｌにＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを７５μｌ加え、室温で２０分間反応させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
このようにして測定されたＣＲＥＢ転写活性の結果を図４に示す。ヘリックスクローンＮＴ２ＲＭ１０００３７７由来の遺伝子を導入したＰＣ１２細胞においては、タプシガルギンによる細胞障害作用が増強されることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、フォルスコリンによるＣＲＥＢの活性化に対して抑制を示すクローンとしてＯＶＡＲＣ１０００４７３（配列番号：１）およびＮＴ２ＲＭ１０００３７７（配列番号：３）が同定された。そして、該遺伝子、および／または、該遺伝子によりコードされる蛋白質を用いた評価方法が提供された。本発明の評価方法によりＣＲＥＢのリン酸化を抑制する作用を阻害する化合物の評価が可能となる。本発明の評価方法によって選択される化合物は、ＣＲＥＢの転写活性を上昇させる作用を有する。このような化合物は、たとえば記憶障害や神経変性を改善し、幅広い神経疾患に対する医薬として有用である。上記遺伝子ＮＴ２ＲＭ１０００３７７によってコードされる蛋白質は、細胞障害の増強作用を有していることが確認された。当該蛋白質が、細胞障害を伴う疾患の治療や予防における重要な標的分子であることは明らかである。
更に本発明は、上記蛋白質の活性の調節を通じて、細胞障害作用を制御することができることを明らかにした。たとえばＮＴ２ＲＭ１０００３７７によってコードされる蛋白質の発現や活性の抑制によって、神経細胞の機能低下の進行を防ぐことができる。したがって、ＮＴ２ＲＭ１０００３７７の発現や活性を阻害する作用を有する化合物には、記憶障害や神経変性を改善し、幅広い神経疾患に対する医薬として有用である。
他方、ＮＴ２ＲＭ１０００３７７の発現や活性を刺激することにより、細胞障害作用を増強することができる。より具体的にはタプシガルギンの細胞障害作用をＮＴ２ＲＭ１０００３７７によってコードされる蛋白質の作用によって増強することができる。タプシガルギンは腫瘍治療への応用も試みられている化合物である。したがって、その作用を強化する作用を有する蛋白質は、腫瘍治療などに有用である。より具体的には、このような作用を有する蛋白質を神経細胞腫などの治療に用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＲＥＢによる転写活性の増加を抑制するクローンである、
ＯＶＡＲＣ１０００４７３（配列番号：１／上）およびＮＴ２ＲＭ１０００３７７（配列番号：３／下）によってコードされる蛋白質の構造を示す図である。ＯＶＡＲＣ１０００４７３のＮ末端側１２２−２１８のアミノ酸配列が二特異性プロテインフォスファターゼと相同性（３４％）を有する領域である。ＮＴ２ＲＭ１０００３７７は、その中央部分３０−１８２のアミノ酸酸配列が二特異性プロテインフォスファターゼＭＫＰ５と相同性（４０％）を有する領域である。この領域にフォスファターゼ触媒部位（６７−７８）およびＣｄｃ２５様ドメインを含む。
図２は、フォルスコリンによるＣＲＥＢの転写活性の上昇に対する、
ＯＶＡＲＣ１０００４７３（＃１）およびＮＴ２ＲＭ１０００３７７（＃２）の作用を示す図である。縦軸は、相対的なＣＲＥＢ転写活性（％）を示す。ｐＲＬ３−ＳＶ４０のみを導入しフォルスコリン未刺激の場合を０％とし、ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ、ｐＲＬ３−ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで形質転換し、フォルスコリンで刺激した場合を１００％としている。
図３は、ＮＧＦ刺激によるＣＲＥＢ転写活性の上昇が、ＰＣ１２細胞に導入されたＮＴ２ＲＭ１０００３７７の発現ベクターｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７の量に依存して有意に抑制されることを示す図である。縦軸は、相対的なＣＲＥＢ転写活性を示す。ｐＲＬ３−ＳＶ４０のみを導入しＮＧＦ未刺激の場合を０とし、ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ及びｐＲＬ３−ＳＶ４０のみを導入しＮＧＦ未刺激の場合を１としている。
図４は、ＮＴ２ＲＭ１０００３７７由来の遺伝子発現ベクターｐＭＥ１８ＤＦＬ３−３７７を導入したＰＣ１２細胞において、タプシガルギンによる細胞障害が増強されることを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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