(57)【要約】食品として日常的に摂取できる安全性の高い素材からなる抗炎症剤、アレルギー性疾患予防又は改善剤及びこれらの作用を有する機能性食品を提供する。抗炎症剤は、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有する。アレルギー性疾患予防又は改善剤は、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有する。機能性食品は、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有する。これらのα−結合ガラクトオリゴ糖は、ガラクトース又はガラクトースを含む物質を基質としてα−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応を利用して合成されたものを用いることができる。
2003101464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項２】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトース又はガラクトースを含む物質を基質としてα−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応を利用して合成されたものである請求の範囲第１項に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトースを基質として合成され、α−（Ｇａｌ）ｎ（Ｇａｌ：ガラクトース、ｎは通常２〜１０の整数）で示されるものである請求の範囲第２項に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトースを含む物質としてガラクトース以外にグルコース含む物質を基質として合成され、α−（Ｇａｌ）ｎＧｌｃ（Ｇｌｃ：グルコース、ｎは通常１〜９の整数）で示されるものである請求の範囲第２項に記載の抗炎症剤。
【請求項５】
α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有するアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項６】
アレルギー性疾患の予防又は改善が、タイプ１ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）の免疫応答を亢進し、かつタイプ２ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の免疫応答を抑制する請求の範囲第５項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項７】
アレルギー性疾患の予防又は改善が、ＩｇＥ抗体の産生の抑制及び好酸球の浸潤の抑制による請求の範囲第５項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項８】
アレルギー性疾患が、アレルギー性気管支喘息である請求の範囲第７項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項９】
アレルギー性疾患の予防又は改善が、経口免疫寛容の誘導の促進による請求の範囲第５項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項１０】
アレルギー性疾患が、食品アレルギーである請求の範囲第９項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項１１】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトース又はガラクトースを含む物質を基質としてα−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応を利用して合成されたものである請求の範囲第５項〜請求の範囲第１０項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項１２】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトースを基質として合成され、α−（Ｇａｌ）ｎ（ｎは通常２〜１０の整数）で示されるものである請求の範囲第１１項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項１３】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトースを含む物質としてガラクトース以外にグルコース含む物質を基質として合成され、α−（Ｇａｌ）ｎＧｌｃ（ｎは通常１〜９の整数）で示されるものである請求の範囲第１１項に記載のアレルギー性疾患予防又は改善剤。
【請求項１４】
α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有し、抗炎症作用又はアレルギー性疾患の予防若しくは改善作用を有する機能性食品。
【請求項１５】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトース又はガラクトースを含む物質を基質としてα−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応を利用して合成されたものである請求の範囲第１４項に記載の機能性食品。
【請求項１６】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトースを基質として合成され、α−（Ｇａｌ）ｎ（ｎは通常２〜１０の整数）で示されるものである請求の範囲第１５項に記載の機能性食品。
【請求項１７】
α−結合ガラクトオリゴ糖が、ガラクトースを含む物質としてガラクトース以外にグルコース含む物質を基質として合成され、α−（Ｇａｌ）ｎＧｌｃ（ｎは通常１〜９の整数）で示されるものである請求の範囲第１５項に記載の機能性食品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分とする抗炎症剤、アレルギー性疾患予防又は改善剤及びα−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分とする抗炎症性作用又はアレルギー性疾患の予防若しくは改善作用を有する機能性食品に関する。
背景技術
炎症は、あらゆる内外からの刺激に対して生体が示す一連の反応で、細菌、ウイルス、寄生虫等の感染による炎症、熱、冷却、機械的外傷、紫外線等による炎症、体内で産生された免疫複合体の細胞、組織への沈着によるアレルギー性炎症、体内に生じた異常代謝産物による炎症等があり、炎症により発熱、発赤、腫脹、疼痛、機能障害などを招く。このような炎症の治療には、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、消炎酵素剤、抗ヒスタミン剤等が用いられている。
また、今日、花粉症、食品アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー、アレルギー性気管支喘息などアレルギー性疾患の罹患者数が増加傾向にある。アレルギーは、免疫応答の結果、生体に障害をもたらす反応で、上記のアレルギー性疾患はＢ細胞が産生するＩｇＥ抗体が関与するＩ型アレルギーに分類される。Ｉ型アレルギーは、微生物や食物などの抗原の刺激により産生されたＩｇＥ抗体が肥満細胞（マスト細胞）に結合し、ここに再度同じ抗原が結合することによりヒスタミン、ロイコトリエン、セロトニン、プロスタグランジンなど様々なケミカルメディエーターが分泌され、血管透過性の亢進、気管支収縮、組織障害などをもたらすものである（即時相）。またアレルギー性気管支喘息などでは、気道粘膜の組織障害などが好酸球の著しい浸潤によってももたらされることが明らかになってきている（遅発相）。
一方、上記で説明した免疫機構によれば、摂取され生体内に取り込まれた食物成分の内、タンパク質等は免疫応答を引き起こすいわゆる抗原となり、摂取することにより過敏な免疫応答が惹起されてしまうことになる。
ところが、生体は、経口免疫寛容と呼ばれる食品抗原に対してアレルギーなどの過剰な免疫応答が引き起こされるのを防ぐ調節機構を備えている。この経口免疫寛容は、食品抗原に対する特異的Ｔ細胞を不応答状態（アナジー）にしたりアポトーシス（細胞死）を起こして消失させることにより誘導されるが、何らかの原因により、経口免疫寛容の機構が損なわれると摂取されたある種の食品に対してＩｇＥ抗体が産生され食品アレルギーが惹起されることがある。
上記のＩ型アレルギーを招くＩｇＥ抗体は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）が分化する２つの異なるサブセット（タイプ１ヘルパーＴ細胞（インターロイキン１２（ＩＬ−１２）等が分化・誘導、以下、Ｔｈ１という）とタイプ２ヘルパーＴ細胞（インターロイキン４（ＩＬ−４）等が分化・誘導、以下、Ｔｈ２という））の内、分化・誘導されたＴｈ２の分泌するＩＬ−４等がＢ細胞を活性化することにより産生される。Ｔｈ１とＴｈ２は、サイトカインを介して互いの増殖を抑制する関係にあり、免疫応答は本来、両者が調節し合ってバランスをとる機構の下に存在する。そのため、Ｉ型アレルギーは、何らかの原因でＴｈ２型の方へバランスが偏ってしまった結果であると考えられ、この偏りの是正、換言すればＴｈ１型を優位にすることによりアレルギー性疾患の予防、改善が可能と考えられる。アレルギー性疾患の罹患者数の増加は、遺伝因子のみならず環境因子（衛生状態の改善による体内への微生物の侵入機会の減少、化学物質への曝露機会の増加、ストレスの増加等）によりＴｈ２型が優位になったことに起因するとの考えもあり、アレルギー性疾患の予防、改善は今日的な重大な課題である。
しかしながら、従来、炎症の治療剤やアレルギー性疾患の治療剤は医薬が大半であり、慢性炎症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支喘息等のように長期に亘り治療が必要な場合、連用により何らかの副作用を伴うことがあり、連用しても安全性の高い治療が望まれていた。また、近年、様々な食物に対する食品アレルギーの罹患者数も増加傾向にあり、安全性の高い治療が望まれていた。更に、アレルギー性疾患の治療に用いられる医薬は、抗ヒスタミン剤のように対症療法的に用いられるものが大半であり、原因療法が望まれていた。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、食品として日常的に摂取され安全性の高い素材からなる抗炎症剤、アレルギー性疾患の発症のメカニズムに依拠したアレルギー性疾患予防又は改善剤及びこれらの作用を有する機能性食品を提供するものである。
発明の開示
本発明は、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有する抗炎症剤である。
本発明は、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有するアレルギー性疾患予防又は改善剤である。このアレルギー性疾患予防又は改善剤において、アレルギー性疾患の予防又は改善は、Ｔｈ１の免疫応答を亢進し、かつＴｈ２の免疫応答を抑制するものである。α−結合ガラクトオリゴ糖は、Ｔｈ１型を亢進しＴｈ２型を抑制し、両者のバランスの調整をするので、ＩｇＥ抗体の産生を抑制できる。また、このアレルギー性疾患予防又は改善剤において、アレルギー性疾患の予防又は改善は、ＩｇＥ抗体の産生及び好酸球の浸潤を抑制するものである。α−結合ガラクトオリゴ糖は、特に、好酸球の浸潤を強く抑制するので、遅発相でアレルギー反応が惹起されるアレルギー性気管支喘息などに有用である。また、α−結合ガラクトオリゴ糖は、経口免疫寛容の誘導を促進するので食品アレルギーに有用である。
本発明は、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分として含有し、抗炎症作用又はアレルギー性疾患の予防若しくは改善作用を有する機能性食品である。
α−結合ガラクトオリゴ糖は、α−ガラクトシル基を有するオリゴ糖であり、メリビオース、マンニノトリオース、ラフィノース、スタキオースなどが含まれ、これらはビートや大豆オリゴ糖などから製造することができる。また、これらのα−結合ガラクトオリゴ糖は、市販されているものを用いることもできる。
また、α−結合ガラクトオリゴ糖は、酵素により合成したものを用いることができる。酵素による合成は、α−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応を利用してガラクトースあるいはガラクトースを含む物質を基質として行うことができる。ガラクトースを基質として合成することにより、一般的にα−（Ｇａｌ）ｎ（ｎは通常２〜１０の整数）で示されるα−ガラクトビオース、α−ガラクトトリオース、α−ガラクトテトラオース以上のオリゴ糖が混在したα−結合ガラクトオリゴ糖が得られる。
また、ガラクトースとグルコースを基質として合成することにより、一般的にα−（Ｇａｌ）ｎＧｌｃ（ｎは通常１〜９の整数）で示されるα−ガラクトシルグルコースとα−ガラクトビオースなどガラクトースのみからなるオリゴ糖が混在したα−結合ガラクトオリゴ糖が得られる。なお、ガラクトースを含む物質には、ガラクトースを含む物質の加水分解物、例えば、乳糖にβ−ガラクトシダーゼや酸を作用させて得られるガラクトースとグルコースの混合物などを含む。また、ガラクトースに別途グルコースを混合して基質とする場合をも包含する（ＷＯ  ０２／１８６１４参照）。これらα−結合ガラクトオリゴ糖は、安全性が確認されており日常的に使用し得るものである。
α−ガラクトシダーゼは、ガラクトースあるいはガラクトースを含む物質を基質として脱水縮合反応でα−結合ガラクトオリゴ糖を合成できるものであれば起源などは特に限定されないが、収率などの観点からアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が生産するものが好ましく、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６８０）の生産するものがより好ましい（ＷＯ  ０２／１８６１４参照）。
本菌株は、本出願人によりブタペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（国内寄託から国際寄託に移管、原寄託日２０００年８月２９日、国内寄託の受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８００３）。
本菌株の菌学的性質を以下に記載する。
分生子頭：球状〜放射状、分生子（光学顕微鏡）：球形〜亜球形、滑面〜やや粗面、分生子（電子顕微鏡）：粗面（隆起物がある）、直径（３．５〜４．０μｍ程度）、浸出液：少し形成（透明〜褐色）、匂い：ほとんど無し、ステリグマタ：２段、集落の発育速度（麦芽エキス寒天培地、２５℃培養）：＞８５ｍｍ（７日培養）、＞８５ｍｍ（１２日培養）、集落の発育速度（ツァペックイースト寒天培地、２５℃培養）：６０〜６７ｍｍ（７日培養）、６５〜７３ｍｍ（１２日培養）、集落の色調（麦芽エキス寒天培地）：黒色（表面）、無色（裏面）、集落の色調（ツァペックイースト寒天培地）：黒色〜灰黒色（表面）、クリーム色〜灰黄色（裏面）
本発明の抗炎症剤あるいはアレルギー性疾患の予防又は改善剤の有効成分であるα−結合ガラクトオリゴ糖の有効量は、症状、年齢、体重、投与方法などにより適宜増減できるが、通常成人であれば４ｍｇ〜４０ｇ／日が好ましく、０．３ｇ〜３０ｇ／日がより好ましい。また、機能性食品として、α−結合ガラクトオリゴ糖を他の食品素材に含有させる場合には、０．３ｇ〜３０ｇ／日を摂取し得るようにすることが好ましいが、利用される食品の種類、形態、形状などに応じて適宜増減することができる。
また、α−結合ガラクトオリゴ糖は、液状あるいは粉末状のものを経口投与させるのが一般的であるが、これに限定されるものではない。すなわち、α−結合ガラクトオリゴ糖の剤型は適宜選択でき、薬理学的に許容される賦形剤、結合剤、崩壊剤など各種助剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、うがい薬、軟膏剤など様々な剤型に加工することができる。また、適当に希釈したα−結合ガラクトオリゴ糖水溶液を血中に注射することにより効果を得ることも可能である。
さらに、α−結合ガラクトオリゴ糖の有する作用効果を失わない限り、他の医薬などを配合して、医療用製剤として供することもできる。
また、α−結合ガラクトオリゴ糖を既存の適切な食品に配合し、これらの機能促進を目的とした機能性食品として供することもできる。例えば、α−結合ガラクトオリゴ糖を粉ミルクや液状ミルクに全体の糖質百分率を考慮して配合して摂取させることもできる。
発明を実施するための最良の形態
本発明をより詳細にするため、以下において実施例により説明する。
実施例に供したα−結合ガラクトオリゴ糖（以下、α−ＧＯＳ、又はＧＯＳという）は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６８０）が生産するα−ガラクトシダーゼをガラクトースに作用させ合成したもので、α−（Ｇａｌ）ｎ（ｎは通常２〜１０の整数）で示されるものである。
実施例１（アジュバント関節炎に対する発症予防効果）
１．実験材料および方法
（１）被験物質およびその調製方法
α−ＧＯＳを適当量秤量し、乳鉢で微粉末にした後、注射用蒸留水を加えて溶解し、６００ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。この溶液の一部を取り、注射用蒸留水で希釈し１００ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。被験物質の調製は、１週間毎に行った。なお、ラットに対する投与容量は０．６ｍＬ／１００ｇ体重とした。
（２）感作アジュバントの調製
加熱し死菌としたマイコバクテリウム  ツベリキュロシス
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ（和光純薬工業株式会社製）を適当量秤量し、メノウ乳鉢で微粉末にした後、流動パラフィン（和光純薬工業株式会社製）を少しずつ加えて懸濁し、６ｍｇ／ｍＬの懸濁液を調製した。
（３）実験動物
日本エスエルシー株式会社より７週齢で購入した雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（ＳＰＦ）を１１日間予備飼育して実験に供した。ラットは予備飼育期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のＳＰＦバリア飼育室（照明時間８時〜１８時、換気回数１８回／時）で飼育した。
ラットは２〜３匹／ケージとし、固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業株式会社製）と滅菌蒸留水をそれぞれ自由に与えた。ラットの個体識別にはピクリン酸を被毛に用いた。
（４）関節炎の誘発
ラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、作製したアジュバントの０．１ｍＬを右後肢のｆｏｏｔｐａｄの皮内に注射し関節炎を誘発した。なお、誘発日をｄａｙ０とした。
（５）投与方法および群構成
投与方法：ラット経口用ゾンデを用いて強制経口投与した（１日１回投与）
投与期間：ｄａｙ０〜２１（但し、ｄａｙ６、１３、２０を除いた）
動物群：５匹／群
群構成：表１に示す通りである。
2003101464.tif 000003
（６）観察および検査項目
一般状態：毎日１回症状を観察した。
関節炎スコア：感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢および左後肢の発赤、腫脹および強直の程度を肉眼的に観察し、以下に示す基準に従った０〜４点のスコアを付け、最高１２点の合計で評価した。測定日はｄａｙ０、４、９、１４、１８および２２とした。
０：症状なし
１：４肢の指などの小関節が１本のみ発赤、腫脹
２：小関節の２本以上、あるいは手首や足首など比較的大きな関節が発赤、腫脹
３：１本の手や足全体が発赤、腫脹
４：さらに１本の手や足の全体的な腫脹が最大限に達していると判断した時（関節の強直を含む）
足容積：右後肢および左後肢の容積を足容積測定装置（ＴＫ−１０５、室町機械）を使用して測定した。測定日は、関節炎スコア評価日と同一にした。
（７）統計処理
得られた関節炎スコアおよび足容積は群毎の平均値±標準誤差で示した。陰性対照群に対する各群の統計的有意を検定するため、解析ソフト（Ｓｔａｔ  Ｖｉｅｗ，Ａｂａｃｕｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い、等分散であることを確認した後、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ法である多重比較検定を行い、群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意であるとした。
２．実験結果
（１）関節炎スコア
実験結果を図１に示した。
α−ＧＯＳ（０．６ｇ／ｋｇ）投与群は関節炎スコアに影響を示さなかった。
しかし、α−ＧＯＳ（３ｇ／ｋｇ）投与群は１４日後以降のスコア上昇を顕著に抑制した。特に、１４日後では対照群のスコアが３．８±０．８を示したのに対し、α−ＧＯＳ（３ｇ／ｋｇ）投与群のスコアは１．２±０．８であった（ｐ＜０．０５）。また１８日後では対照群のスコアが７．２±０．４を示したのに対し、α−ＧＯＳ（３ｇ／ｋｇ）投与群のスコアは３．０±１．３であった（ｐ＜０．０５）。
（２）足容積（右感作後肢）
実験結果を図２に示した。
関節炎スコアの場合と同様に、α−ＧＯＳ（０．６ｇ／ｋｇ）投与群は、右足容積に影響を示さなかった。
しかし、α−ＧＯＳ（３ｇ／ｋｇ）投与群は１４日後以降の右足容積増加を顕著に抑制した。特に、２２日後では対照群の容積が３．１３±０．１０ｍＬを示したのに対し、α−ＧＯＳ（３ｇ／ｋｇ）投与群のスコアは２．４４±０．２４ｍＬであった（ｐ＜０．０５）。
（３）足容積（左後肢）
実験結果を図３に示した。
関節炎スコアの場合と同様に、α−ＧＯＳ（０．６ｇ／ｋｇ）投与群は、左足容積に影響を示さなかった。
α−ＧＯＳ（３ｇ／ｋｇ）投与群は有意差を示さなかったものの、１４日後以降の容積増加を抑制する傾向を示した。
３．考察
α−ＧＯＳ（３ｇ／ｋｇ）は強制経口投与により、ラットのアジュバント関節炎に対して顕著な抑制効果を示すことが示唆され、特に慢性炎症に対する抗炎症効果が期待される。
実施例２（アレルギー性気管支喘息の予防効果）
１．実験材料および方法
投与した抗原に対する抗体の応答がヒトに近いことが報告されているＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（ＢＮラット）を用いて、卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）をモデル抗原としたアレルギー性気管支喘息モデルを作成し、食餌に添加したα−ＧＯＳが及ぼす影響を解析した。実験開始まで基本飼料としてＡＩＮ−９３Ｇ（α−コーンスターチ、５２９．５ｇ／ｋｇ；カゼイン、２００ｇ／ｋｇ；スクロース、１００ｇ／ｋｇ；大豆油、７０ｇ／ｋｇ；セルロース、５０ｇ／ｋｇ；ミネラル混合、３５ｇ／ｋｇ；ビタミン混合、１０ｇ／ｋｇ；Ｌ−シスチン、３ｇ／ｋｇ；重酒石酸コリン、２．５ｇ／ｋｇ）を自由摂取させた。１週間の予備飼育後、ＯＶＡ（１ｍｇ／ｍＬ）とａｌｕｍの混合液を１ｍＬずつ頸背部に皮下投与した。同時にアジュバントとして不活性化百日咳菌（６×１０９ＣＦＵ／ｒａｔ）を腹腔内投与した。免疫から１週間後に、基本飼料群、基本飼料の５％（ｗ／ｗ）をα−ＧＯＳと置換した飼料を与えるα−ＧＯＳ添加飼料群に分け、２週間各試験飼料を自由摂取させた。この間に、α−ＧＯＳ添加飼料群の半数の個体にはＯＶＡ（１ｍｇ／ｒａｔ）の経口投与を４回行った。免疫から３週間後に、超音波ネブライザーを用いてＯＶＡ（１％（ｗ／ｖ））のエアロゾルを１０分間吸入させた。惹起翌日にネンブタール麻酔下で開腹し、腹大動脈より採血して失血死させた後、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を得た。ＢＡＬＦよりサイトスピン標本を作成し、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色を施して細胞プロファイルを解析した。また、血中のＯＶＡ特異的抗体レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。
２．実験結果
アレルギー性気管支喘息の病態は、抗原特異的なＩｇＥによる肥満細胞の脱顆粒が関与する即時相と、その後の好酸球性炎症が主体をなす遅発相よりなることが明らかになってきているので、本実施例においても、血中のＯＶＡ特異的抗体レベル及び抗原惹起後の気道における好酸球浸潤の程度を指標とした。
血中の抗原特異的ＩｇＥレベルに関しては、α−ＧＯＳ添加群において対照群である基本飼料群より低い傾向にあった（図４）。一方、ＢＡＬＦ中の好酸球数ならびに好中球数に関しては、α−ＧＯＳ添加群において基本飼料群より低い傾向にあり、更にＯＶＡを経口投与した場合には約半数であった（図５）。
以上の結果から、アレルギー性喘息モデルにおいて、α−ＧＯＳはアレルギー性喘息の予防効果を有することが明らかとなった。
また、免疫後にＯＶＡを経口投与すると、経口投与しない場合に比べ更に低値を示した。このことは、食餌α−ＧＯＳがＯＶＡによる経口免疫寛容の誘導を促進することによって症状を抑制する作用を発揮したと考えられる。以上の結果から、α−ＧＯＳは経口免疫寛容の誘導を促進し、食品アレルギーの予防、低減にも有効であることが明らかとなった。
実施例３（リンパ球増殖効果）
１．実験材料および方法
（１）動物
５週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃ１メスマウスは日本クレア株式会社より購入した。試験に用いるまで市販飼料（ＣＥ−２、日本クレア株式会社製）と水道水を自由摂取させ、温度２４±１℃、湿度５０±１０％、明暗１２時間サイクル（明期８：００−２０：００、暗期２０：００−８：００）の環境下で飼育した。試験に用いた時点では６週齢（体重１８．６ｇ、２０．３ｇ）であった。
（２）マイトジェン
Ｔ細胞マイトジェンとしてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ  ｔｙｐｅＩＶ、シグマ社製）を使用した。
（３）細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにネンブタールで麻酔（４０ｍｇ／ｋｇ）し、無菌的に脾臓を取りだした。Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの入った１枚目のシャーレで脾臓を洗浄して脂肪などを除去し、同溶液の入った２枚目のシャーレ内で茶漉しとガラス棒で脾臓をすりつぶし、浮遊細胞を調製した。１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離後、上澄みを除去して細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（日本製薬株式会社製）にＨｅｐｅｓ、Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ペニシリンＧ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）及び１０％Ｎｕｓｅｒｕｍ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂ．）を加えた培地に浮遊させ１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離後再び上澄みを除去した。細胞を少量の同培地に浮遊させ、２．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように希釈した。糖類の添加濃度は０〜１０００μｇ／ｍＬ、ＣｏｎＡは２μｇ／ｍＬとし、調製後９６ｗｅｌｌプレートに２００μＬずつまき、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２；５．０％）で培養を開始した。
（４）細胞増殖測定
培養０、２４、４８、７２時間後にＭＴＴ法にて細胞増殖を測定した。０．５％ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液（ＲＰＭＩ−１６４０培地に溶解）を各ｗｅｌｌに１０μＬ添加してＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２；５．０％）で３時間反応させた。ＳＤＳ溶液（２０％ＳＤＳ  ｉｎ  ０．０３ＮＨＣｌ）を各ｗｅｌｌに８０μＬ添加して反応を停止した。約１０時間放置して色素を可溶化させた後に、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。細胞増殖は、培養液中の吸光度からブランクの吸光度を差し引いた吸光度差（ΔＯＤ）で評価した。
（５）サイトカインの測定
リンパ球増殖能評価試験のα−ＧＯＳ１２５および５００μｇ／ｍＬ添加条件のサンプルを用いてサイトカインの産生を測定した。培養開始７２時間後にプレートを凍結することにより培養を停止した。各培養液中のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１２）は、ＥＬＩＳＡキット（アマシャム・ファルマシア社製）にて測定した。
２．実験結果
（１）α−ＧＯＳのリンパ球増殖能評価試験
調製した浮遊細胞液は２．３×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ、生存率９６％であった。各糖濃度でのリンパ球増殖に伴う吸光度差（ΔＯＤ）の変化を図６と図７に示した。
培養開始後４８時間以降でα−ＧＯＳ添加群においてＣｏｎＡによる細胞増殖が見られた。
（２）α−ＧＯＳのサイトカイン産生測定
α−ＧＯＳ及びＣｏｎＡをプレートに添加した場合のＩＬ−４およびＩＬ−１２の産生を測定した結果を図８と図９に示した。
ＣｏｎＡ刺激時（７２時間後）のＩＬ−１２産生は、α−ＧＯＳ１２５および５００μｇ／ｍＬともに無添加区の２倍以上の値となった。一方でＩＬ−４産生は、α−ＧＯＳ１２５μｇ／ｍＬ添加では無添加区とほぼ同量であったが、５００μｇ／ｍＬ添加では無添加区よりも低値となった。
以上の結果から、マイトジェン（ＣｏｎＡ）添加により、α−ＧＯＳはＴ細胞を増殖させる活性をもつことが明らかとなった。この時、α−ＧＯＳはＩＬ−１２産生を促進し、ＩＬ−４産生を抑制した。すなわち、α−ＧＯＳはＴｈ１型の免疫応答を促進し、Ｔｈ２型の免疫応答を抑制する効果を有することが明らかとなった。
実施例４（オリゴ糖がアレルギー性気道好酸球性炎症に及ぼす影響）
１．実験方法
卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）をモデル抗原としたＢＡＬＢ／ｃマウスの経口感作モデルを作成し、食餌に添加した各種のオリゴ糖が血清抗体価に及ぼす影響を比較した。１２週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスに実験開始まで基本飼料としてＡＩＮ−９３Ｇ（α−コーンスターチ、５２９．５ｇ／ｋｇ；カゼイン、２００ｇ／ｋｇ；スクロース、１００ｇ／ｋｇ；大豆油、７０ｇ／ｋｇ；セルロース、５０ｇ／ｋｇ；ミネラル混合、３５ｇ／ｋｇ；ビタミン混合、１０ｇ／ｋｇ；Ｌ−シスチン、３ｇ／ｋｇ；重酒石酸コリン、２．５ｇ／ｋｇ）を自由摂取させた。１週間の予備飼育後、オリゴ糖無添加飼料（基本飼料）群、基本飼料の５％（Ｗ／Ｗ）をラフィノース（ＲＡＦ）、α−ＧＯＳ（以下、単にＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）の各々と置換した飼料を与える群の５群に分け、各試験飼料を８週間自由摂取させた。この間に、ＯＶＡ水溶液（１ｍｇ／０．２ｍＬ）を毎日強制経口投与した。ＯＶＡの投与開始後、１週間毎に眼窩静脈叢より採取し、遠心分離により血清を得た。１群（９頭／群）の血清をプールし、ＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体価の定量に供した。
２．結果及び考察
ＯＶＡの経口免疫の開始から８週目までの血中の抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＥ濃度の推移を各々図１０及び図１１に示した。ＯＶＡの投与前（０週）においてはＩｇＧ及びＩｇＥともに検出されなかった。
ＩｇＧは、ＯＶＡ投与開始後１週間目より検出され、オリゴ糖無添加飼料群においては３週目でプラトーに達し、その後８週目まではほぼ同じレベルを維持した。ＧＯＳ飼料群が実験期間を通じてオリゴ糖無添加飼料群と同様に推移したのに対し、ＦＯＳ飼料群は３〜４週目において、更にＲＡＦ及びＸＯＳ飼料群は２〜５週目において、いずれもオリゴ糖無添加飼料群より低く推移した。しかしながら、６週目にはすべての群がほぼ同様のレベルに収束した。
一方、ＩｇＥはＩｇＧに比して全般的に上昇が遅かった。オリゴ糖無添加飼料群においては、２週目より上昇しはじめ、５週目の一時的な最高値から８週目まで高い値を示した。これに対し、ＦＯＳ飼料群は５週目に上昇がみれら、その後８週目まで上昇し続けた。ＲＡＦ及びＸＯＳ飼料群では、７週目までオリゴ糖無添加飼料群ならびにＦＯＳ飼料群よりも低く推移したが、８週目でＦＯＳ群と同様の高値を示した。ＧＯＳ飼料群では、７週目まではＲＡＦ及びＸＯＳ飼料群と同様に低く推移し、更に８週目においても他群のレベルまで上昇することはなかった。
以上の結果より、ＲＡＦ及びＸＯＳは、ＩｇＧ及びＩｇＥに対して上昇を遅延させる効果を有し、ＦＯＳの効果はこれらより弱いと考えられた。一方、ＧＯＳは、ＩｇＧの上昇遅延効果はみられなかったが、ＩｇＥの上昇はＲＡＦやＸＯＳと異なり強く抑制した。現在のところ、オリゴ糖が血清抗体価の上昇を抑制する機構は明らかでない。しかしながら、経口抗原による感作は、腸管から体内への抗原の透過を必要とするので、オリゴ糖、特にＧＯＳが腸管内において抗原の腸管透過を抑制することにより感作を遅延させている可能性が考えられる。
本発明は、発明の実質的範囲に包含される限り上記の実施例に制限されるものではない。
産業上の利用性
以上のように、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分とする抗炎症剤、アレルギー性疾患予防又は改善剤は、長期に亘り安全に使用でき、特に慢性炎症あるいはアレルギー性気管支喘息、食品アレルギーに有用である。
また、α−結合ガラクトオリゴ糖を有効成分とする抗炎症作用又はアレルギー性疾患の予防若しくは改善作用を有する機能性食品は、様々な食品に配合して長期に亘り安全に使用でき、特に慢性炎症あるいはアレルギー性気管支喘息、食品アレルギーに有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ラットの関節炎スコアの経日変化を示すグラフである。図２は、ラットの足（右後肢）容積の経日変化を示すグラフである。図３は、ラットの足（左後肢）容積の経日変化を示すグラフである。図４は、ラットの各種免疫抗体の相対値を示すグラフである。図５は、ラットの気管支肺胞洗浄液中の免疫担当細胞数を示すグラフである。図６は、マウスのリンパ球増殖に伴う吸光度の経時変化を示すグラフである。なお、グラフ中、α−ＧＯＳはＣｏｎＡ刺激＋α−ＧＯＳ投与を、ＣｏｎＡはＣｏｎＡ刺激＋α−ＧＯＳ投与無しを示す。以下、図７〜図９においても同様である。図７は、マウスのリンパ球増殖に伴う吸光度の経時変化を示すグラフである。図８は、マウスのＩＬ−１２の産生量を示すグラフである。図９は、マウスのＩＬ−４の産生量を示すグラフである。
図１０は、各種オリゴ糖が及ぼすＩｇＧ抗体価の週変化を示すグラフである。図１１は、各種オリゴ糖が及ぼすＩｇＥ抗体価の週変化を示すグラフである。
【図１】
2003101464.tif 000004
【図２】
2003101464.tif 000005
【図３】
2003101464.tif 000006
【図４】
2003101464.tif 000007
【図５】
2003101464.tif 000008
【図６】
2003101464.tif 000009
【図７】
2003101464.tif 000010
【図８】
2003101464.tif 000011
【図９】
2003101464.tif 000012
【図１０】
2003101464.tif 000013
【図１１】
2003101464.tif 000014
【国際調査報告】
2003101464.tif 000015
2003101464.tif 000016
2003101464.tif 000017
2003101464.tif 000018