(57)【要約】組織再生に要する期間には充分な力学的強度が保持でき、しかも組織再生後には速やかに分解消失させることができる適度な生体分解吸収性を兼ね備えた、生体組織再生用複合材料を提供することを課題とし、かかる課題を解決する手段として、本発明の生体組織再生用複合材料は、天然高分子と生体分解吸収性合成高分子とからなる複合材料であって、天然高分子からなるスポンジ中に生体分解吸収性合成高分子が繊維状の形態で存在しており、かつ、前記天然高分子が架橋されてなる。
2003028782.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然高分子と生体分解吸収性合成高分子とからなる複合材料であって、天然高分子からなるスポンジ中に生体分解吸収性合成高分子が繊維状の形態で存在しており、かつ、前記天然高分子が架橋されてなる、ことを特徴とする生体組織再生用複合材料。
【請求項２】
前記生体分解吸収性合成高分子の繊維は、その隣接する繊維間に結合点を有している、請求項１に記載の生体組織再生用複合材料。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、例えば、生体組織を再生するための細胞の足場材料として用いられる生体組織再生用複合材料に関する。
背景技術
生体組織を再生するために用いられる細胞の足場材料としては、１）細胞との親和性を有すること、２）組織再生に要する期間、充分な力学的強度が保持できること、３）生体分解吸収性を有し、組織再生の経過を妨げないようにその進行に応じて速やかに分解消失させうること、４）細胞が入り易くし、かつ入り込んだ細胞に対する酸素や栄養の供給を可能にするために、多孔質であること、が要求される。このような足場材料としては、従来から、天然高分子であるコラーゲンを用いたスポンジ状成形体が知られているが、力学的強度が低いという欠点があり、実際に生体内に埋入した場合あるいは細胞接種のため細胞混濁液に浸漬した場合、その形状が維持できないといった問題があった。力学的強度の問題を解決する生体組織再生用材料として、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、あるいはこれらの共重合体、もしくはこれらとε−カプロラクトンとの共重合体等の生体分解性の合成高分子を用いたスポンジ状成形体や不織布等が提案されているが、生体分解性合成高分子のみからなる材料では、コラーゲンに比べて細胞との親和性に劣ると同時に、その分解消失期間も組織再生の観点からは長すぎるといった問題があった。このように、コラーゲンもしくは生体分解性合成高分子を単独に用いた材料では、上記１）〜３）を同時に満足させることは難しかった。
そこで、両者の短所を補う１つの方法として、近年、コラーゲンと生体分解性合成高分子との複合材料の開発がなされている。例えば、特開平７−２３６６８８号公報では、コラーゲンからなるスポンジ材料の少なくとも一部を生体分解性プラスチックで被覆した複合材料が提案されている。しかし、該複合材料は、その表面に合成高分子が存在するため、力学的強度には優れるものの、生体適合性については依然として低く、改良の余地があるものであった。他方、「人工臓器」２９巻２号，４６３−４６７（２０００年）には、乳酸／グリコール酸共重合体から作製したスポンジをコラーゲン溶液に浸漬した後、凍結乾燥して得られる複合材料が報告されている。しかし、このようにして得られた複合材料は、コラーゲンに対する合成高分子の比率が高く、細胞との親和性という点ではやはり充分に満足のいく性能が得られるものでなく、しかも材料が体内で分解吸収されるのに要する期間も組織再生の観点からは長すぎるといった問題があった。
発明の開示
発明が解決しようとする課題
そこで、本発明は、細胞との親和性に優れ、組織再生に要する期間には充分な力学的強度が保持でき、しかも組織再生の経過を妨げないようにその進行に応じて速やかに分解消失させることができる適度な生体分解吸収性を兼ね備えた、生体組織再生用複合材料を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、前記課題に鑑み、コラーゲン等の天然高分子と生体分解吸収性合成高分子との複合材料において、合成高分子の含有率を低く抑ながら効果的に力学的強度を保持させるべく、鋭意検討を行なった。その結果、生体分解吸収性合成高分子を繊維状の形態で存在させるとともに、天然高分子を架橋させることにより、前記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の生体組織再生用複合材料は、天然高分子と生体分解吸収性合成高分子とからなる複合材料であって、天然高分子からなるスポンジ中に生体分解吸収性合成高分子が繊維状の形態で存在しており、かつ、前記天然高分子が架橋されてなる。
発明の実施の形態
本発明の生体組織再生用複合材料は、天然高分子の溶液中に繊維状の生体分解吸収性合成高分子を含浸させた状態で凍結乾燥を行い、その後架橋処理を施すことにより、得ることができる。
本発明における天然高分子としては、特に制限はないが、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、グルテン、フィブロイン等のタンパク質およびこれらの誘導体；ポリアミノ酸およびこれらの誘導体；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、デキストラン等の多糖およびこれらの誘導体；これらの２種以上からなる混合物および化学結合により作製された複合体；等が挙げられる。なお、天然高分子は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
本発明の好ましい形態においては、天然高分子はコラーゲンであることが好ましい。コラーゲンとしては、特に制限はなく、動物の骨や皮等を原料として得られる従来公知の酸可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、またはこれら可溶化コラーゲンの化学修飾コラーゲンや、可溶化コラーゲンからコラーゲン繊維を再生させた再生コラーゲン等のコラーゲン溶液を用いることができる。具体的には、例えば、豚皮由来Ｉ型コラーゲン、豚腱由来Ｉ型コラーゲン、牛鼻軟骨由来ＩＩ型コラーゲン、魚から抽出したＩ型コラーゲン等が挙げられる。
前記天然高分子としてコラーゲンを用いる場合、コラーゲン溶液の濃度としては、特に制限はないが、０．１〜４重量％とすることが好ましく、０．３〜２重量％とすることがより好ましい。
また、前記天然高分子としてコラーゲンを用いる場合、前記コラーゲン溶液には、効果的に発泡させて得られるコラーゲンスポンジのポアーサイズを最適な範囲にする目的で、水と混合しない性質をもつ有機溶媒を添加することもできる。このような有機溶媒としては、例えば、クロロホルム、四塩化炭素、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素；酢酸エチル、プロピオン酸エチル等のエステル類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；等が挙げられ、これらは１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。なお、これら有機溶媒を添加する場合、その効果を充分に発揮させるためには、添加した後の有機溶媒濃度が２重量％以上となるようにすることが好ましい。
さらに、前記天然高分子としてコラーゲンを用いる場合、前記コラーゲン溶液には、コラーゲンスポンジの製造において従来から用いられている各種添加剤を、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じて添加しておいてもよい。例えば、ムコ多糖類、細胞接着因子、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン等、あるいはこれらの物質の有する生理活性をもつタンパク質やペプチド等を添加しておくことにより、生体適合性をより向上させることができる。
本発明における生体分解吸収性合成高分子としては、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリ−β−リンゴ酸、ポリオルソエステル、ポリジアミノホスファゼン、およびこれらの共重合体等が挙げられる。これらの中でも特に、一般的な組織再生の期間に適した生体分解吸収性を有する点から、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、あるいはこれらの共重合体が好ましい。なお、生体分解吸収性合成高分子は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記生体分解吸収性合成高分子は、繊維状になっていることが重要である。生体分解吸収性合成高分子を繊維状の形態で存在させることにより、少ない含有量で充分な力学的強度を保持させることができるのである。詳しくは、該繊維は、長繊維であっても短繊維であってもよいが、例えば不織布をほぐした状態のように、充分に絡まりあっていることが好ましい。また、その繊維径も特に限定されるものではなく、例えば１〜１００μｍ径のものを好ましく用いることができる。
前記生体分解吸収性合成高分子の繊維は、その隣接する繊維間に結合点を有していることが好ましい。これにより、生体分解吸収性合成高分子繊維の強度を補強し、得られる複合材料により優れた力学的強度を付与することができる。また、これにより、より少ない量の生体分解吸収性合成高分子繊維で得られる複合材料に充分な力学的強度を付与することができることとなる。
前記生体分解吸収性合成高分子の繊維の隣接する繊維間に結合点を形成する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記繊維状の生体分解吸収性合成高分子に、例えば、ポリ乳酸、乳酸とグリコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸とε−カプロラクトンとの共重合体など、前記繊維状の生体分解吸収性合成高分子として用いる高分子よりも融点が低い生体分解吸収性合成高分子（以下、低融点高分子と称す。）をコーティングした後、該コーティングされた低融点高分子のみが融解するような条件で熱処理するようにすればよい。繊維状の生体分解吸収性合成高分子にこのような処理を施すことにより、繊維にコーティングされた低融点高分子のみが融解し、この融解した低融点高分子が繊維の交点にて凝固し、隣接する繊維間に結合点が形成されることとなる。具体的には、前記低融点高分子をコーティングするには、例えば、該低融点高分子を、例えばクロロホルム、酢酸エチル、ジオキサン等の溶媒に溶解させた溶液とし、該溶液を噴霧器等を用いて繊維の表面にスプレーした後、凍結乾燥するなどして前記溶媒を除去するようにすればよい。なお、このとき、前記低融点高分子のコーティング量は、繊維状の生体分解吸収性合成高分子に対して０．１〜５０重量％の範囲とすることが好ましい。また、熱処理する際の条件は、例えば、前記低融点高分子のみが融解するような条件であれば、特に制限はされないが、例えば、０．１〜０．５トール未満の真空下、１６０〜２５０℃で５〜６０分間とすればよい。
生体分解吸収性合成高分子の含有量は、生体分解吸収性合成高分子／天然高分子（重量比）＝０．２〜１０．０となるようにすることが好ましい。本発明においては生体分解吸収性合成高分子が繊維状の形態を呈しているので、前記範囲のように生体分解吸収性合成高分子の含有量が少なくても充分な力学的強度を保持させることができる。そして、生体分解吸収性合成高分子の含有量が少ないことにより、優れた細胞との親和性を発現すると同時に、組織再生後に速やかに分解消失させることができる。前記天然高分子としてコラーゲンを用いる場合、実際には、生体分解吸収性合成高分子は、前記コラーゲン溶液（前記有機溶媒や各種添加剤を添加する前の状態）に対して０．０１〜１０重量％とすることが好ましく、０．４〜１重量％とすることがより好ましい。
凍結乾燥は、例えば、前記繊維状の生体分解吸収性合成高分子を入れた容器内に前記天然高分子の溶液を加え、生体分解吸収性合成高分子繊維を含浸させた状態にして行なえばよい。このとき、容器に加える天然高分子の溶液は、通常のホモジナイザー等を用いて充分には発泡させておくことが好ましい。
凍結乾燥の方法については、常法に従って行なえばよく、例えば、凍結の際の温度は−４〜−１９６℃とすればよい。
凍結乾燥により得られたスポンジには、続いて架橋処理を施すことが重要である。該架橋処理でコラーゲン等の天然高分子を架橋することにより、生体分解吸収性合成高分子の含有量が少なくても充分な力学的強度を保持させることができるのである。
架橋処理の方法については、特に制限はなく、例えば、従来公知の化学架橋法、真空下での熱脱水架橋法、紫外線照射による架橋法等を採用すればよい。具体的には、化学架橋を行なう場合には、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いればよく、真空下で熱脱水架橋させる場合には、１００〜１５０℃で２〜１２０時間程度の条件で行なえばよく、紫外線照射による場合には、例えば２５４ｎｍの紫外線を１分〜２４時間程度照射すればよい。
このようにして得られる本発明の生体組織再生用複合材料は、天然高分子からなる架橋されたミクロポーラスなスポンジの中に、繊維状の生体分解吸収性合成高分子がランダムに埋入された構造を有している。
本発明の生体組織再生用複合材料は、細胞との親和性に優れ、組織再生に要する期間には充分な力学的強度が保持でき、しかも組織再生後には速やかに分解消失させることができる適度な生体分解吸収性を兼ね備えたものであるので、例えば、皮膚、筋肉および脂肪等の軟組織、神経組織、軟骨組織、骨組織、肝臓や腎臓等の実質組織、食道や胃腸等の消化管、気管、膀胱、尿管および尿道等の泌尿器器官、歯周組織、腱、じん帯等の欠損部を再生させるため、細胞の増殖・分化を行なう際の足場材料として有用である。また、本発明の生体組織再生用複合材料は、幹細胞など種々の細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける増殖・分化のための培養足場材料としても利用可能である。
実施例
＜実施例１＞
ポリグリコール酸からなる不織布３ｍｇ分を切り出し、ピンセットで均一にほぐして繊維状にし、シリコン（「シグマコート」ＳＩＧＭＡ社製）でコーティングしたアルミキャップ（２０ｍｍφ、３４ｍｍＨ）の中に入れた。次に、０．３重量％の豚皮由来Ｉ型コラーゲン溶液１．５ｇに、クロロホルムをクロロホルム濃度が約５重量％となるように添加し、ジェネレーターシャフト付ホモジナイザーを用いて１２０００ｒｐｍで３分間攪拌した後、該溶液を前記アルミキャップに添加した。次いで、該アルミキャップの内容物を−８０℃で１２時間凍結した後、０．１トール未満の真空下で２４時間凍結乾燥を行った。その後、１４０℃、０．１トール未満の真空下で１２時間熱脱水架橋を行い、ポリグリコール酸／コラーゲン＝０．６７（重量比）である本発明の複合材料を得た。
＜実施例２〜４＞
ポリグリコール酸からなる不織布の重量を、実施例２においては６ｍｇ、実施例３においては１２ｍｇ、実施例４においては２４ｍｇとしたこと以外は、実施例１と同様にして、本発明の複合材料を得た。
＜比較例１＞
０．３重量％の豚皮由来Ｉ型コラーゲン溶液１．５ｇに、クロロホルムをクロロホルム濃度が約５重量％となるように添加し、ジェネレーターシャフト付ホモジナイザーを用いて１２０００ｒｐｍで３分間攪拌した後、該溶液を、シリコン（「シグマコート」ＳＩＧＭＡ社製）でコーティングしたアルミキャップ（２０ｍｍφ、３４ｍｍＨ）に入れた。次いで、該アルミキャップの内容物を−８０℃で１２時間凍結した後、０．１トール未満の真空下で２４時間凍結乾燥を行った。その後、１４０℃、０．１トール未満の真空下で１２時間熱脱水架橋を行い、比較用のコラーゲン単独材料を得た。
＜比較例２＞
熱脱水架橋を施さないこと以外は、実施例２と同様にして、比較用の複合材料を得た。
＜比較例３＞
熱脱水架橋を施さないこと以外は、比較例１と同様にして、比較用のコラーゲン単独材料を得た。
（走査型電子顕微鏡による観察）
実施例１および比較例１で得られた材料の断面を走査型電子顕微鏡を用いて観察した。実施例１の断面を図１に、比較例１の断面を図２に、それぞれ示す。
図１と図２から、本発明の複合材料には、繊維状の生体分解吸収性合成高分子が認められ、しかも、生体分解吸収性合成高分子繊維の有無に関わらずポアサイズに差はないことが判る。
（圧縮試験）
実施例４および比較例１で得られた材料を用いて、以下の圧縮試験を行なった。
得られた材料を、直径１８ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱形に切り出し、圧縮試験機（「オートグラフＡＧＳ−１０ｋＮＤ」島津製作所製）を用いて、１ｍｍ／分で高さの５０％を圧縮したときの応力−ひずみ曲線を得、該曲線から圧縮弾性率を求めた。
上記の結果、実施例４の材料では圧縮弾性率は３９．４ＭＰａであるのに対して、比較例１の材料では圧縮弾性率は６．６ＭＰａであった。このことから、生体分解吸収性合成高分子繊維を含有させた本発明の複合材料は、インプラントした際にも、コラーゲン単独材料に比べ、より高い圧縮に対して抵抗性を発揮しうることが示唆された。
（ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける収縮試験）
実施例１〜３および比較例１で得られた材料を、直径１５ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱形の試験片とし、これを７０％エタノール中に３分間浸漬した後、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ含む）に３回浸漬した。培地を除去した後、試験片をプレートに入れ、その中に、Ｌ９２９線維芽細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を含むＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ含む）１ｍｌを加え、３７℃でインキュベートした。そして、６時間後の試験片の直径を測定し、浸漬前の試験片直径に対する浸漬後の試験片直径の割合を求めた。結果を図３に示す。なお、結果は、各材料について３回ずつ行なったときの平均値で表わした。
他方、Ｌ９２９線維芽細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を含むＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ含む）の代わりに、Ｌ９２９線維芽細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を含まないＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ含む）を用いたこと以外は上記と同様にして、６時間後の試験片の直径を測定し、浸漬前の試験片直径に対する浸漬後の試験片直径の割合を求めた。結果を図４に示す。なお、結果は、各材料について３回ずつ行なったときの平均値で表わした。
図３および図４の結果から、培地中の細胞の有無に関わらず、コラーゲン単独材料は、培地に浸漬することにより大きく収縮するが、生体分解吸収性合成高分子繊維を含有させた本発明の複合材料では、収縮を小さく抑えられることが明らかであった。これは、生体分解吸収性合成高分子繊維が材料スポンジ内で骨格の役割をなしているためであると推測される。また、生体分解吸収性合成高分子繊維の含有量が同じ場合、培地中の細胞の有無によって、収縮の差は認められなかった。
（ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける生体親和性試験）
実施例２および比較例１で得られた材料を、直径１５ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱形の試験片とし、これを７０％エタノール中に３分間浸漬した後、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ含む）に３回浸漬した。培地を除去した後、試験片をプレートに入れ、その中に、Ｌ９２９線維芽細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を含むＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ含む）０．５ｍｌを加え、３７℃でインキュベートした。そして、６時間後の接着細胞数を、細胞のＤＮＡを定量することにより測定した。
上記の結果、実施例２の材料では２２，１０９個であり、比較例１の材料では１９，９０８個であり、両者の間に有意な差は認められなかった。これらの結果は、生体分解吸収性合成高分子繊維を有無によってコラーゲンスポンジの細胞親和性は変わらないことを示している。
以上のｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける試験結果から、細胞懸濁液をスポンジに加えた段階でスポンジが収縮すれば、細胞の培養足場基材としての利用は難しいことが判る。これに比べて、本発明の材料ではこのような収縮は認められず、本来のコラーゲンと同じ細胞親和性をもち、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける細胞の培養足場としても優れていることが明らかであった。
（マウス背部皮下へのインプラント試験１）
実施例１〜４および比較例１で得られた材料をＥＯＧ殺菌した後、５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍの大きさの試験片を切り出した。マウス（ｄｄｙ、♀、清水実験材料）の背部の一部を切り、そこから前記試験片２個をマウスの背部皮下に埋入した後、縫合した。そして、３日後および７日後に試験片を取り出し、力学的強度および細胞との親和性を以下のようにして評価した。
１）力学的強度；取り出した試験片の体積を測定し、インプラント前の試験片体積に対するインプラント後の試験片体積の割合を求めた。結果を図５に示す。なお、結果は、各材料について３回ずつ行なったときの平均値で表わした。
図５の結果から、コラーゲン単独材料では、３日でインプラント前の１０％程度、７日後にはインプラント前の２％弱にまで体積が減少するのに比べ、生体分解吸収性合成高分子繊維を含有させた本発明の複合材料ではいずれも、体積の減少を有意的に抑制することができることが明らかであった。
２）細胞との親和性；７日後に取り出した試験片（実施例２を除く）を試験片中心部位で切断して、ヘマトキシリン・エオシンによる染色を行い、それらの断面に観察された細胞数を測定した。その結果、各材料について３回ずつ行なったときの平均値は、比較例１の材料では６９６．４個、実施例１の材料では７１６．２個、実施例３の材料では１６８０．９個、実施例４の材料では１７６８．１個であった。このとき使用した、比較例１の材料のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ・Ｅ）染色像を図６に、実施例１の材料のＨ・Ｅ染色像を図７に、実施例３の材料のＨ・Ｅ染色像を図８に、実施例４の材料のＨ・Ｅ染色像を図９に、それぞれ示す。
上記細胞数の結果から、材料内へ侵入した細胞数は、生体分解吸収性合成高分子繊維を含有させることによって増加し、その繊維含有量の増加に応じて増えていることが明らかであった。これは、生体分解吸収性合成高分子繊維を含有させることにより、材料の収縮が抑制され、コラーゲンスポンジの残存体積が大きくなることが起因していると考えられる。
（マウス背部皮下へのインプラント試験２）
実施例２および比較例２で得られた材料を用い、上記インプラント試験１と同様にして、試験片を作製しマウス背部皮下にインプラントした。そして、１４日後に試験片を取り出し、力学的強度および細胞との親和性を以下のようにして評価した。
１）力学的強度；取り出した試験片の１辺の長さを測定して、力学的強度を評価した。その結果、各材料について３回ずつ行なったときの平均値は、実施例２の材料では０．９３ｍｍ、架橋を施していない比較例２の材料では０．４０ｍｍであった。
２）細胞との親和性；取り出した試験片を試験片中心部位で切断して、ヘマトキシリン・エオシンによる染色を行い、それらの断面に観察された細胞数を測定し、単位面積当たりの細胞数を求めた。その結果、各材料について３回ずつ行なったときの平均値は、比較例２の材料では６０１．５個／ｍｍ２、実施例２の材料では８１７．０個／ｍｍ２であった。また、比較例２の材料のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ・Ｅ）染色像を図１０に、実施例２の材料のＨ・Ｅ染色像を図１１に、それぞれ示す。
図１０、図１１および上記細胞数の結果から、架橋を施していない比較例２の材料では、インプラント後１４日間で、Ｈ・Ｅ染色像による埋入コラーゲンの残存が認められず、コラーゲンは埋入部位から分解消失していた。このように速く分解してしまっては、コラーゲンスポンジは体内における細胞の増殖・分化のための足場になりえないと考えられる。これに対して、架橋を施した本発明の材料では、この時点でも埋入コラーゲンは残存しており、そのスポンジ内に細胞が侵入し、増殖していることが確認された。
他方、比較例１および比較例３で得られた材料を用い、上記インプラント試験１と同様にして、試験片を作製しマウス背部皮下にインプラントし、７日後のマウス背部皮下における材料の残存状態を観察した。比較例３の材料の残存状態を撮影したものを図１２のＡに、比較例１の材料の残存状態を撮影したものを図１２のＢに、それぞれ示す。その結果、図１２のＡに示されるように、架橋を施していない比較例３の材料では、インプラント７日後で完全に消失しているのに対して、架橋を施した比較例１の材料では、図１２のＢにおいて矢印で示す部分に、コラーゲンスポンジがその形状を維持して残存していることが確認できた。生体分解吸収性合成高分子繊維の含有がコラーゲンスポンジ自体の分解性に影響を与えるとは考えにくく、架橋を施していないコラーゲンスポンジは少なくとも７日以内に分解してしまうと考えられる。
上記マウス背部皮下へのインプラント試験２の結果から、生体組織の再生を目的とする場合、少なくとも７〜１４日間程度は分解吸収されずに体内に残存しなければ細胞の増殖・分化の足場材料としては不適切であると考えられる。この条件を達成するためには、コラーゲンスポンジを架橋処理することが不可欠であることが示された。
＜実施例５＞
ポリグリコール酸からなる不織布１．５ｍｇ分を切り出し、ピンセットで均一にほぐして繊維状にし、２４ウェルプレート（ｃｏａｓｔｅｒ  ３５２６，ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の中に入れた。次に、０．３重量％の豚皮由来Ｉ型コラーゲン溶液０．７５ｇを前記２４ウェルプレートに添加した。次いで、該２４ウェルプレートの内容物を−８０℃で１２時間凍結した後、０．１トール未満の真空下で２４時間凍結乾燥を行った。その後、１４０℃、０．１トール未満の真空下で１２時間熱脱水架橋を行い、ポリグリコール酸／コラーゲン＝０．６７（重量比）である本発明の複合材料を得た。
＜実施例６〜８＞
ポリグリコール酸からなる不織布の重量を、実施例６においては３ｍｇ、実施例７においては６ｍｇ、実施例８においては１２ｍｇとしたこと以外は、実施例５と同様にして、本発明の複合材料を得た。
＜比較例４＞
０．３重量％の豚皮由来Ｉ型コラーゲン溶液０．７５ｇを、２４ウェルプレート（ｃｏａｓｔｅｒ  ３５２６，ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に入れた。次いで、該２４ウェルプレートの内容物を−８０℃で１２時間凍結した後、０．１トール未満の真空下で２４時間凍結乾燥を行った。その後、１４０℃、０．１トール未満の真空下で１２時間熱脱水架橋を行い、比較用のコラーゲン単独材料を得た。
（マウス背部皮下へのインプラント試験３）
実施例５〜８および比較例４で得られた材料を用い、上記インプラント試験１と同様にして、試験片を作製しマウス背部皮下にインプラントした。そして、２４時間後に試験片を取り出し、細胞との親和性を判断する指標として、材料に侵入した全細胞数および侵入した細胞の材料表面からの距離を以下のようにして評価した。
１）材料に侵入した全細胞数；２４時間後に取り出した試験片をＰＢＳ（リン酸緩衝液）で洗浄した後、ＤＮＡアッセイを行い、材料中の全細胞数を測定した。細胞数は、Ｌ９２９線維芽細胞にて算出した標準曲線から計算により求めた。
上記の結果、実施例５の材料では２，０８４，９３８個であり、実施例６の材料では２，０００，９６０個であり、実施例７の材料では３，７７７，９１６個であり、実施例８の材料では５，８２５，９１６個であり、比較例４の材料では８４９，２２６個であった。これらの結果をグラフにして図１３に示す。これらの結果から、材料内へ侵入した細胞数は、生体分解吸収性合成高分子繊維を含有させることによって増加し、その繊維含有量の増加に応じて増えていることが明らかであった。
２）侵入した細胞の材料表面からの距離；２４時間後に取り出した試験片を４％ホルマリン溶液で固定し、ヘマトキシリン・エオシンによる染色を行った。そして、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ３．０１（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて、複数の異なる部位の組織切片を観察し、任意に選択した５００個の細胞について表面からの距離を測定した。結果を図１４に示す。
図１４の結果から、コラーゲン単独材料では、９９％の細胞が材料の表面から０．４ｍｍ以内に存在しており、細胞が材料内部まで侵入しにくいことが明らかであるのに比べ、生体分解吸収性合成高分子繊維を含有させた本発明の複合材料では、細胞が材料内部にまで侵入しており、しかもその繊維含有量の増加に応じて侵入距離が大きくなり、より材料内部にまで侵入することが明らかであった。
上記マウス背部皮下へのインプラント試験３の結果から、生体組織の再生を目的とする場合、本発明の材料は、コラーゲン単独材料に比べ、ｉｎ−ｖｉｖｏにおける細胞の侵入性に有意に優れていることが確認された。
＜実施例９＞
ポリグリコール酸からなる不織布３．０ｍｇ分を切り出し、ピンセットで均一にほぐして繊維状にし、円柱状（半径約８ｍｍ、高さ約３ｍｍ）に成形したポリグリコール酸繊維（Ａ）とした。ポリ乳酸（分子量２万、ＷＡＫＯ）をクロロホルムに溶解させた５重量％ポリ乳酸溶液を噴霧器（ＹＴ−０３、ＴＯＲＩＣＯＮ）に入れ、１５ｃｍの距離から前記繊維体の表面に数秒間スプレーし、その後、凍結乾燥してクロロホルムを除去して、ポリグリコール酸に対して２０重量％のポリ乳酸をコーティングしたポリグリコール酸繊維（Ｂ）を得た。次いで、該ポリグリコール酸繊維（Ｂ）を０．１トール未満の真空下、１９５℃で３０分間熱処理して、ポリ乳酸をコーティングした後熱処理したポリグリコール酸繊維（Ｃ）を得た。
このポリグリコール酸繊維（Ｃ）を２４ウェルプレート（ｃｏａｓｔｅｒ  ３５２６，ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の中に入れ、次に、０．３重量％の豚皮由来Ｉ型コラーゲン溶液０．７５ｇを前記２４ウェルプレートに添加した。次いで、該２４ウェルプレートの内容物を−８０℃で１２時間凍結した後、０．１トール未満の真空下で２４時間凍結乾燥を行った。その後、１４０℃、０．１トール未満の真空下で１２時間熱脱水架橋を行い、ポリグリコール酸／コラーゲン＝１．３３（重量比）である本発明の複合材料を得た。
なお、上記ポリグリコール酸繊維（Ａ）、ポリ乳酸をコーティングしたポリグリコール酸繊維（Ｂ）、およびポリ乳酸をコーティングした後熱処理したポリグリコール酸繊維（Ｃ）の各断面を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。結果を図１５に示す。図１５において、Ａがポリグリコール酸繊維（Ａ）であり、Ｂがポリグリコール酸繊維（Ｂ）であり、Ｃがポリグリコール酸繊維（Ｃ）である。図１５の結果から、ポリグリコール酸繊維（Ｃ）には隣接繊維間に結合点が形成されていることが明らかであり、ポリ乳酸をコーティングした後熱処理することにより、コーティングされたポリ乳酸のみが融解・凝固し、隣接繊維間に結合点を形成できることが示された。
（マウス背部皮下へのインプラント試験４）
実施例９および実施例６（ポリグリコール酸繊維にポリ乳酸をコーティングした後熱処理する操作を行わないこと以外は、実施例９と同様）で得られた材料を用い、上記インプラント試験１と同様にして、試験片を作製しマウス背部皮下にインプラントした。そして、３日後および７日後に試験片を取り出し、マウス背部皮下へのインプラント試験１と同様の方法で力学的強度を評価した。結果を図１６に示す。
図１６の結果から、隣接繊維間に結合点を有するポリグリコール酸繊維を用いた材料は、隣接繊維間に結合点を有さないポリグリコール酸繊維を用いた材料に比べ、インプラント後に残存する体積が大きいことが明らかであった。これは、隣接繊維間に結合点を有するポリグリコール酸繊維を用いた材料は、隣接繊維間に結合点を有さないポリグリコール酸繊維を用いた材料に比べ、より力学的強度が高いことを示している。
（マウス背部皮下における脂肪再生試験）
足場材料として、実施例６で得られた材料とコラーゲン単独材料（コラーゲンスポンジ「ペルナック」グンゼ（株）製）とを用い、それぞれ１０ｍｍ×１０ｍｍ×３ｍｍに切り出して、各足場材料にそれぞれ、ヒト由来脂肪前駆細胞と、塩基性線維芽細胞増殖因子を含浸したゼラチン粒子とを組み合わせて、マウス背部皮下にて脂肪を再生させた。
まず、ヒト由来脂肪前駆細胞は、京都大学にてインフォームドコンセントを得た患者の乳癌切除時に採取した脂肪組織から、次のようにして単離して得た。すなわち、前記脂肪組織をＰＢＳ（リン酸緩衝液）で洗浄し、コラゲナーゼ（新田セラチン社製）を用いて３７℃で２０分間処理した。その後、１０重量％のウシ胎仔血清を含む培地（Ｍｅｄｉｕｍ１９９）を加え、遠心分離（２００ｇ当たり５分間）を行い、上澄みを除去し、さらに、ウシ胎仔血清を含む培地を加え遠心分離する同様の操作を２回繰り返した。次いで、０．１μｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地を加え、細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２、ＣＯＲＮＩＮＧ４３０７２，１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）にて５％ＣＯ２存在下、３７℃で７日間培養して得た。
一方、塩基性線維芽細胞増殖因子を含浸したゼラチン粒子は、エマルジョン状態のゼラチン溶液にグルタルアルデヒド架橋を施して調製したゼラチン粒子２ｍｇに対して、１μｇの塩基性線維芽細胞増殖因子（５０μｌ）を添加した後、１時間室温で放置することにより、ゼラチン粒子と塩基性線維芽細胞増殖因子とを結合させて得た。
次に、上記で得られた塩基性線維芽細胞増殖因子を含浸したゼラチン粒子に対して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／培地（５０μｌ）の細胞密度のヒト由来脂肪前駆細胞を混合して懸濁液とし、該懸濁液を足場材料に加えて、３時間インキュベートした。
このようにして得られたヒト由来脂肪前駆細胞および塩基性線維芽細胞増殖因子を含浸したゼラチン粒子に各足場材料（実施例６の材料およびコラーゲン単独材料）を組み合わせたものを試料とし、この両試料を、それぞれ別のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ，６ｗ，♀）の背部の一部を切り、そこからマウスの背部皮下に埋入した後、縫合した。そして、４２日後に犠牲死させたのち、背部を切り開いて、試料を観察した。
コラーゲン単独材料を用いた試料をデジタルカメラで撮影したものを図１７のＡに、実施例６の材料を用いた試料をデジタルカメラで撮影したものを図１７のＢに、それぞれ示す。図１７の結果から、どちらの試料とも、試料内に血管が侵入し、脂肪様の組織が形成されていることが確認できた。
また、両試料の残存体積を測定したところ、実施例６の材料を用いた試料の残存体積は３６．９ｍｍ３であるのに対し、コラーゲン単独材料を用いた試料の残存体積は２６．８ｍｍ３であった。これらの結果をグラフにして図１８に示す。この結果から、実施例６の材料を用いた試料は、コラーゲン単独材料を用いた試料に比べ、その残存体積が有意に大きいことが明らかであった。これは、ポリグリコール酸繊維を含有させることによって、コラーゲンスポンジの低い力学強度を改善して、優れた力学特性を付与しうることを示している。
上記マウス背部皮下における脂肪再生試験の結果から、ポリグリコール酸繊維は、コラーゲンの細胞親和性を損なうことなく材料強度を向上させ、しかも、繊維の残存は、その使用量が少ないため、脂肪組織の再生を妨げないことが明らかであった。その結果、本発明の材料は、より体積の大きな組織再生の足場として働き、再生された脂肪組織の体積を有意に増加させることが示された。なお、コラーゲン自体の生体分解吸収性は、ポリグリコール酸繊維の有無に関わらず同じであることも判っている。
産業上の利用可能性
本発明によれば、細胞との親和性に優れ、組織再生に要する期間には充分な力学的強度が保持でき、しかも組織再生後には速やかに分解消失させることができる適度な生体分解吸収性を兼ね備えた、生体組織再生用複合材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１で得られた複合材料の断面を走査型電子顕微鏡で撮影して得た図であり、第２図は、比較例１で得られた材料の断面を走査型電子顕微鏡で撮影して得た図であり、第３図は、収縮試験（培地中に細胞を含む場合）の結果を示すグラフであり、第４図は、収縮試験（培地中に細胞を含まない場合）の結果を示すグラフであり、第５図は、マウス背部皮下へのインプラント試験１における力学的強度の結果を示すグラフであり、第６図は、マウス背部皮下へのインプラント試験１において比較例１の材料の細胞との親和性をみたときのＨ・Ｅ染色像を示す図であり、第７図は、マウス背部皮下へのインプラント試験１において実施例１の材料の細胞との親和性をみたときのＨ・Ｅ染色像を示す図であり、第８図は、マウス背部皮下へのインプラント試験１において実施例３の材料の細胞との親和性をみたときのＨ・Ｅ染色像を示す図であり、第９図は、マウス背部皮下へのインプラント試験１において実施例４の材料の細胞との親和性をみたときのＨ・Ｅ染色像を示す図であり、第１０図は、マウス背部皮下へのインプラント試験２において比較例２の材料の細胞との親和性をみたときのＨ・Ｅ染色像を示す図であり、第１１図は、マウス背部皮下へのインプラント試験２において実施例２の材料の細胞との親和性をみたときのＨ・Ｅ染色像を示す図であり、第１２図は、マウス背部皮下へのインプラント試験２においてインプラント時の材料の残存状態を撮影して得た図であり、第１２図のＡは比較例３の材料の残存状態を、第１２図のＢは比較例１の材料の残存状態をそれぞれ示し、第１３図は、マウス背部皮下へのインプラント試験３における材料に侵入した全細胞数の結果を示すグラフであり、第１４図は、マウス背部皮下へのインプラント試験３における侵入した細胞の材料表面からの距離の結果を示すグラフであり、第１５図は、実施例９における、ポリグリコール酸繊維（Ａ）、ポリ乳酸をコーティングしたポリグリコール酸繊維（Ｂ）、およびポリ乳酸をコーティングした後１９５℃で３０分間熱処理したポリグリコール酸繊維（Ｃ）の各断面を走査型電子顕微鏡で撮影して得た図であり、第１５図のＡはポリグリコール酸繊維（Ａ）を、第１５図のＢはポリグリコール酸繊維（Ｂ）を、第１５図のＣはポリグリコール酸繊維（Ｃ）をそれぞれ示し、第１６図は、マウス背部皮下へのインプラント試験４における力学的強度の結果を示すグラフであり、第１７図は、マウス背部皮下における脂肪再生試験において試料の外観をデジタルカメラで撮影して得た図であり、第１７図のＡはコラーゲン単独材料を用いた試料の外観を、第１７図のＢは実施例６の材料を用いた試料の外観を、それぞれ示し、第１８図は、取り出した試料の残存体積の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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