(57)【要約】シナプスに局在し細胞骨格に強く結合しているｐ１２０蛋白をコードするｍＲＮＡ及びｐ１２０蛋白の検出・定量が可能となった。更にｐ１２０が、ＲＩＭ１をシナプスに局在させるための足場として機能し、ａｃｔｉｖｃ  ｚｏｎｅ形成の分子基盤として寄与していることが明らかとなった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１に示す塩基配列を有する請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシナプスに局在する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列と相同性が９０％以上の塩基配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したシナプスに局在する蛋白質を培養物から採取することを含む、シナプスに局在する蛋白質の製造法。
【請求項１０】
請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質と反応する抗体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体を使用することを特徴とする、請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質を測定する方法。
【請求項１２】
配列番号１に示す塩基配列の少なくとも１５個の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、プライマーまたはプローブとして使用することを特徴とする、請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを測定する方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の抗体を用いて、請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質を検出する方法。
【請求項１４】
以下の工程、
（１）請求項９に記載の方法により製造した請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質、あるいは請求項８に記載の形質転換体と、被検物質を混合する工程、
（２）結合した、あるいは結合しなかった被検物質の量を測定する工程、
を含んで成る、請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質と反応性を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
以下の工程、
（１）請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質を発現している細胞に被検物質を添加し培養する工程、
（２）細胞に発現している請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質、あるいは該蛋白質をコードするｍＲＮＡを測定する工程、
を含んで成る、請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質の発現に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
以下の工程、
（１）請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質の発現を制御するプロモータ領域を同定する工程、
（２）被検物質がプロモータ活性に及ぼす影響を測定する工程、
を含んで成る、請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質の発現に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
以下の工程、
（１）請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質を発現している細胞に被検物質を添加し培養する工程、
（２）請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質の分布を測定する工程、
を含んで成る、請求項１あるいは請求項６に記載の蛋白質の分布に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、シナプス細胞骨格に結び付いている新規な蛋白質に関するものであり、医学の分野で利用される。
背景技術
神経シナプスのｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＰＳＤ）には、ＰＳＤ−９５などのｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅや神経伝達物質受容体が数多く存在し、ＰＳＤの形成と構造維持に重要な役割を果たしている。また、前シナプスのａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅを構成する細胞骨格（ＣＡＺ：Ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ  ａｔ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｚｏｎｅ）には、ＢａｓｓｏｏｎやＲＩＭなどの細胞骨格蛋白質が存在し、ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅの形成と構造維持に重要な役割を果たしている。神経シナプス間の効率よいシグナル伝達は学習や記憶の形成や維持に極めて重要であり、その破たんが各種精神疾患や神経変性疾患を引き起こすことは容易に想像できる。
ハエや線虫などを用いた解析から、これまで、神経細胞の軸索誘導の分子機構（ｐａｔｈｆｉｎｄｉｎｇ）については、関与する分子群が数多く同定され一定の理解が進みつつある。しかし、その後のシナプス形成（ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）にいたっては、時間的にまた空間的にどのような分子が関与し、成熟したシナプス結合が形成されていくのかについては依然不明な点が多い。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題は、シナプスが形成される過程で重要な役割を果たすと考えられる、新規な細胞骨格に結び付いている蛋白質を探し出すことにある。
本発明者らは、シナプス結合に濃縮している蛋白質を同定する目的で、ラット大脳から粗膜（Ｐ２）分画およびＰＳＤ分画を調製し、尿素を含むバッファーで可溶化した。次いで、これら可溶化したサンプルを陰イオン交換カラムにかけて分離し、各溶出フラクションを電気泳動後染色して粗膜（Ｐ２）分画およびＰＳＤ分画のバンドパターンを比較した。バンドパターンからＰＳＤ分画により濃縮している蛋白質を同定し、質量分析によりデータベースにヒットしない２つの蛋白質（ｐ５００蛋白及びｐ１２０蛋白）を見出した。（以下、ｐ１２０蛋白という記載は本発明の蛋白質を示す。）
これらをアミノ酸解析にかけたところ、ｐ１２０蛋白由来の４つのペプチド配列はＫＩＡＡ０３７８蛋白質の内部配列に一致し、更なる研究の結果、ｐ１２０蛋白がシナプスのみに分布し細胞骨格に強く結合していることが明らかとなった。またｐ１２０が、シナプス可塑性において重要なはたらきをしているＲＩＭ１（Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４１５：３２７−３３０，２００２；、Ｓｃｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４１５：３２１−３２６，２００２）を、シナプスに局在させるための足場蛋白質として機能していることも明らかとなった。
すなわち本発明は、
１．下記（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質。
２．１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
３．配列番号１に示す塩基配列を有する２に記載のＤＮＡ。
４．下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシナプスに局在する蛋白質をコードするＤＮＡ。
５．下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列と相同性が９０％以上の塩基配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質をコードするＤＮＡ。
６．４〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
７．２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
８．２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
９．８記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したシナプスに局在する蛋白質を培養物から採取することを含む、シナプスに局在する蛋白質の製造法。
１０．１あるいは６に記載の蛋白質と反応する抗体。
１１．１０に記載の抗体を使用することを特徴とする、１あるいは６に記載の蛋白質を測定する方法。
１２．配列番号１に示す塩基配列の少なくとも１５個の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、プライマーまたはプローブとして使用することを特徴とする、１あるいは６に記載の蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを測定する方法。
１３．１０に記載の抗体を用いて、１あるいは６に記載の蛋白質を検出する方法。
１４．以下の工程、
（１）９に記載の方法により製造した１あるいは６に記載の蛋白質、あるいは８に記載の形質転換体と、被検物質を混合する工程、
（２）結合した、あるいは結合しなかった被検物質の量を測定する工程、
を含んで成る、１あるいは６に記載の蛋白質と反応性を有する物質をスクリーニングする方法。
１５．以下の工程、
（１）１あるいは６に記載の蛋白質を発現している細胞に被検物質を添加し培養する工程、
（２）細胞に発現している１あるいは６に記載の蛋白質、あるいは該蛋白質をコードするｍＲＮＡを測定する工程、
を含んで成る、１あるいは６に記載の蛋白質の発現に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
１６．以下の工程、
（１）１あるいは６に記載の蛋白質の発現を制御するプロモータ領域を同定する工程、
（２）被検物質がプロモータ活性に及ぼす影響を測定する工程、
を含んで成る、１あるいは６に記載の蛋白質の発現に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
１７．以下の工程、
（１）１あるいは６に記載の蛋白質を発現している細胞に被検物質を添加し培養する工程、
（２）１あるいは６に記載の蛋白質の分布を測定する工程、
を含んで成る、１あるいは６に記載の蛋白質の分布に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の蛋白質のうち、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質は、後述の実施例に記載したように、シナプスに局在する蛋白質として特定された蛋白質である。一方、神経科学の分野では、例えばある蛋白質がシナプスに存在することを証明する場合、シナプスに存在することがすでに判明している蛋白質をシナプスのマーカーとして利用することが一般的である。また、シナプスの構造変化と疾患との関連性が知られている（Ｐｕｒｐｕｒａ，Ｄ．Ｐ．（１９７４）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅ”ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ”ａｎｄ  ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８６，１１２６−１２８；、Ｇｅｉｎｉｓｍａｎ，Ｙ．，ｄｅ  Ｔｏｌｅｄｏ−Ｍｏｒｒｅｌｌ，Ｆ．，Ｐｅｒｓｉｎａ，Ｉ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｍ．（１９９２）．Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ａｘｏｓｐｉｏｕｓ  ｓｔｎａｐｓｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ａｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ２，４３７−４４４）。従って、本発明の蛋白質や該蛋白質をコードするＤＮＡは、シナプスのマーカーとして、研究または診断分野において利用できると考えられる。
蛋白質には同一の機能を有する変異体の存在が予測され、また、蛋白質のアミノ酸配列を適宜改変することによって、同一の機能を有する変異体を得ることができる。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質も本発明の蛋白質に包含される。
蛋白質のアミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法などの周知の手段により蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を改変し、塩基配列が改変されたＤＮＡを発現させることによって行うことができる。シナプスに局在することは、当業者であれば蛍光抗体法により容易に確認できる。
本発明の蛋白質は、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグ、ＧＦＰと融合させることにより融合蛋白質とされてもよく、融合蛋白を用いて局在を確認することもできる。
本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡとしては、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。このＤＮＡは後述の実施例において、塩基配列が決定されたＤＮＡである。遺伝子には、同一の産物をコードするが塩基配列の異なる遺伝子や、同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子の存在が予測され、また、塩基配列の改変により、同一の産物や同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子を得ることができる。従って、本発明のＤＮＡには、配列番号１に示す塩基配列に類似する塩基配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質をコードするＤＮＡも包含される。このようなＤＮＡが由来する生物としては、ヒト、ラット、マウス、線虫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に線虫は、神経系の研究に関して、極めて有用なモデル生物である。本蛋白質が線虫に存在していることはすでに明らかになっている（Ｏｈｔｓｕｋａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２  ５；１５８（３）：５７７−９０参照）。
類似の塩基配列を有するＤＮＡとしては、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または、配列番号１または配列番号３に示す塩基配列と相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃４ｘＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション、次いで６５℃で１時間０．１ｘＳＳＣ中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド中４２℃４ｘＳＳＣである。また、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ）溶液中６５℃２．５時間ハイブリダイゼーション、次いで１）．２ｘＳＳＣ，０．０５％ＳＤＳ溶液：２５℃５分、２）．２ｘＳＳＣ，０．０５％ＳＤＳ溶液：２５℃１５分、３）．０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液５０℃２０分の洗浄といった条件も許される。
また相同性は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ法により計算される相同性である。
本発明のＤＮＡは、その一部をプライマーまたはプローブとして用いることにより、ｐ１２０蛋白遺伝子解析や遺伝子の発現の解析に利用することができる。さらに、本発明のＤＮＡは、その一部をプライマーまたはプローブとして用いることにより、シナプスの検出に使用できる。すなわち、本発明のＤＮＡは、シナプスを検出するための研究用もしくは診断用の試薬またはキットとして利用できる。本発明のキットには、本発明のＤＮＡの他に、ｐ１２０のペプチド断片をコードするＤＮＡが含まれてもよい。該ｐ１２０のペプチド断片としては、ｐ１２０とＲＩＭ１の結合を阻害可能な断片、例えばｐ１２０とＲＩＭ１との結合に必要な３つのアミノ酸ＩＷＡを含むｐ１２０のＣ末１０アミノ酸程度を有する断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明において、「一部」とは、プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドが本発明のＤＮＡ配列をもとに少なくとも１０個の対応する塩基配列を含むものからなり、好ましくは少なくとも１５個の塩基配列、さらに好ましくは少なくとも約２０〜３０個の塩基配列を含むものからなる対応するポリヌクレオチドを意味する。またプローブとしては、さらに高分子のもの、全ＤＮＡも使用することができる。
本発明のＤＮＡは、明らかにされた塩基配列に基づき常法により得ることができる。例えば、化学合成法により合成してもよいし、適宜設定されたプライマーを用いて、神経細胞や脳組織から調整されたｍＲＮＡかＲＴ−ＰＣＲ法により得ても良い。
遺伝子操作法は成書（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載されている方法に従って行うことができる。
本発明のベクターとしては、挿入したＤＮＡを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などが好ましい。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内で蛋白質を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればｐＢＥＳＴベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればｐＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、培養細胞であればｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）、生物個体であればｐＭＥ１８Ｓベクター（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２（１９８８））などが好ましい。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１）。
本発明の形質転換体は、本発明のＤＮＡにより宿主を形質転換して得られる形質転換体であり、本発明の蛋白質を発現する。本発明のベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主が用いられる。蛋白質を発現させるための宿主としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳＦ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
本発明の製造法は、本発明のシナプスに局在する蛋白質の製造法であり、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したシナプスに局在する蛋白質を培養物から採取することを含む。
培養は、形質転換体が本発明の蛋白質を発現する条件で行えばよく、培養物からの本発明の蛋白質の採取は、蛋白質の精製に通常に用いられる、種々のクロマトグラフィー、電気泳動、ゲルろ過などの方法を適宜組み合わせて行えばよい。本発明の蛋白質をＧＳＴやＨｉｓタグとの融合蛋白質として発現させる場合には、それぞれグルタチオンセファロースカラムやニッケルセファロースカラムを用いて精製することが可能である。精製された蛋白質は、例えば、抗体の製造に利用できる。
本発明のｐ１２０蛋白の全部または一部をエピトープとして用いることで、抗体を製造できる。製造された抗体を用いることで、当業者に周知の方法、例えば実施例４に記載の方法により、シナプスを検出することが可能である。すなわち、本発明の抗体は、シナプスを検出するための研究用もしくは診断用の試薬またはキットとして利用できる。本発明のキットには、本発明の抗体の他に、ｐ１２０のペプチド断片が含まれてもよい。
本発明において、エピトープとは、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に少なくとも６個のアミノ酸で構成され、６個のアミノ酸で構成されるポリペプチドが抗体と結合することは公知である（公表特許公報６０−５００６８４号）。本蛋白質の抗原ペプチドは、本発明のアミノ酸配列に基づいて、連続してなる少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは連続してなる少なくとも８個のアミノ酸、より好ましくは連続してなる少なくとも約１５個のアミノ酸、さらに好ましくは連続してなる少なくとも約２０個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。
本発明の抗体は、本発明の製造法により得られる本発明の蛋白質を免疫した動物から得ることができる。ポリクローナル抗体であれば上記免疫動物の血清より、モノクローナル抗体であれば上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、本発明の蛋白質に強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調製される。
免疫抗原としては、本発明の製造法により得られる本発明の蛋白質を用いることができる。また別法として、免疫抗原は、配列番号２に示すアミノ酸配列から適宜選択した部分構造を有するフラグメントあるいはペプチドであってもよい。抗原とキャリア蛋白の複合体の調製は種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
免疫される動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられるが、通常２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。たとえば、本発明の蛋白質をコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、本発明の蛋白質を含むサンプルを電気泳動後ニトロセルロース転写膜を用いるイムノブロット法などがあげられる。
このようなウェルから更に例えば限界希釈法によってクローニングを行いクローンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与したＳＣＩＤマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。
本発明によって得られたモノクローナル抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中の本発明の蛋白質の定性、定量を行うことができる。免疫学的方法としては、生体試料を必要に応じて適切に処理、たとえば細胞の分離、抽出操作などした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行い得る。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質はいずれも使用できる。
本発明のモノクローナル抗体はＦｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦａｂ’あるいはＦａｂ画分、あるいはその重合体を用いてもよい。またそのキメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。
本発明の蛋白質の発現に影響を与える薬剤のスクリーニングは以下のように実施できる。
本発明の蛋白質を発現する細胞株を、ノーザンブロッティング・ＲＴ−ＰＣＲ等により選択する。また、上に述べた方法により得られた抗体を用いて蛍光抗体法・酵素抗体法等により選択しても良い。
選択した細胞を被験薬剤の存在下に培養し、ｍＲＮＡ発現量をノーザンブロッティング・スロットブロットハイブリダイゼーション・ＲＴ−ＰＣＲ等により、あるいは発現量を蛍光抗体法・酵素抗体法等により定量し、被験薬剤の本発明の蛋白質の発現に対する影響を測定する。
また、より容易に大量の薬剤をスクリーニングできるように以下のような工夫をしても良い。ヒトＤＮＡライブラリーより、本発明の蛋白質のｃＤＮＡ５’領域とハイブリダイズするクローンを選び出し、適当なプロモータースクリーニングシステムに挿入してプロモーター活性を持ったクローンを選択する。場合によっては、ここでプロモーター活性に必須の領域を絞り込んでも良い。
ここで選択した本発明の蛋白質のプロモーター領域を持ったＤＮＡを、活性の測定が容易な酵素、例えばルシフェラーゼ・アルカリフォスファターゼなどをコードするＤＮＡの上流に挿入してレポーター遺伝子を構築する。このレポーター遺伝子をＮｅｏｒ，ｈｙｇｒなどの適当な耐性遺伝子と共に培養が可能な細胞、例えばＨｅＬａ細胞等に導入後、耐性遺伝子に対応した薬剤で選択し、本発明の蛋白質を発現させるプロモーターの活性を測定できる細胞株を確立する。この細胞株に薬剤を作用させて導入した酵素の活性を測定し、本発明の蛋白質の発現に影響を与える薬剤のスクリーニングを実施する。
別のスクリーニング系として、本発明の蛋白質の細胞内局在に影響を与える化合物の選択に利用することができる。スクリーニング法の一例として、本発明の蛋白質を発現する細胞株または本発明の形質転換体を、上に述べた方法により得られた抗体を用いて蛍光抗体法・酵素抗体法等により染色して、顕微鏡下に観察して、被験薬剤の本発明の蛋白質の細胞内局在に対する影響を測定する。たとえば、実施例３および６に記載した方法に準ずることができる。
さらに、別のスクリーニング系として、本発明の蛋白質と結合する化合物の選択に利用することができる。結合する化合物は本発明の蛋白質の機能に影響を与える可能性を有し、また実施例に示されるように本発明の蛋白質の分布に外分泌腺特異性が見られることから、本発明の蛋白質に対する結合能に特異性を有する化合物であれば、臓器特異的な作用を発現する可能性がある。さらに、本発明の蛋白質と結合する化合物は、シナプスの検出に利用できる。例えば、被検体に標識化した該化合物を接触または投与することによって、シナプスを検出することができる。このように本発明は、シナプスを検出するための研究用または診断用試薬をスクリーニングする方法もまた提供する。スクリーニング法の一例として、本発明の形質転換体またはその細胞骨格あるいは単離された本発明の蛋白質またはその部分ペプチドなどが使用される。適切な条件下で、本発明の蛋白質と試験化合物とを反応させ両者の結合の有無を測定すればよい。測定手法は例えば標識物質を適宜利用することにより測定することができる。
なお、本発明が構造解析したｐ１２０蛋白はラット由来であるが、本発明のｐ１２０蛋白遺伝子解析方法およびスクリーニング方法はヒト由来のｐ１２０蛋白を使用した場合も本発明の範囲に含まれるものである。
発明を実施するための最良の形態
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
［実施例１］ｐ１２０蛋白をコードするＤＮＡのクローニング
シナプス結合に濃縮している蛋白質を同定する目的で、ラット大脳から粗膜（Ｐ２）分画およびＰＳＤ分画をショ糖密度勾配遠心法（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７４：１８１−２０３  １９７７）によって調製し、各分画を尿素を含むバッファーで可溶化した。次に、これら可溶化したサンプルをそれぞれＭｏｎｏ  Ｑ陰イオン交換カラム（ファルマシア社製）にかけて分離した。Ｐ２およびＰＳＤ分画の各溶出フラクションを電気泳動後染色し、バンドのパターンを比較し、ＰＳＤ分画により濃縮してる蛋白質を２０個同定した。これらのいくつかを図１に示す。
質量分析により、２０個の蛋白質のうちほとんどはシナプスに局在することがすでに報告されているものであったが、うち２つが質量分析のデータベースにヒットしなかった（ｐ５００蛋白およびｐ１２０蛋白：図１参照）。
次に、これらをアミノ酸解析にかけたところ、ｐ５００蛋白由来の２つのペプチド配列がＣＡＺ蛋白質であるｐｉｃｃｏｌｏの内部配列に一致した。また、ｐ１２０由来の４つのペプチド配列はＫＩＡＡ０３７８蛋白質の内部配列に一致した。ＫＩＡＡ０３７８についてはその部分シークエンスが登録されているものの、機能も未知の蛋白であることから、ｐ１２０についてさらに解析を進めた。
登録してあるＫＩＡＡ０３７８のｃＤＮＡをかずさＤＮＡ研究所の長瀬博士より分与していただき、これをもとに配列番号３及び４に記載のプライマーを設計し、ＰＣＲにてプローブを作製した。本プローブを用いて、ラット海馬のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、１０個以上のクローンを得た。これらのうち、最も長い配列を含む２つのクローンをつなげて全長とした。その塩基配列を配列番号１に、予測されるアミノ酸配列を配列番号２に記載した。
ｃＤＮＡにコードされている蛋白質は９５７アミノ酸からなり、いくつかのｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインを有していた（図２Ａ）。特に知られているドメイン構造は有していなかったが、Ｃ末端領域にヒスチジンの繰り返し配列が存在した。クローニングしたｃＤＮＡが本来精製してきたｐ１２０蛋白の全長のアミノ酸をコードしていることを確かめるために、ｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、ｍＲＮＡを抽出してウサギの網状赤血球抽出液を用いて発現させた（プロメガ社製）。実施例２で作製した抗体は内在性のｐ１２０蛋白とも反応し、ｃＤＮＡがコードする蛋白質は内在性のｐ１２０蛋白と電気泳動上ほぼ同じ移動度を示した（図２Ｂ）。以上の結果より、本ｃＤＮＡがｐ１２０蛋白の全長のアミノ酸をコードしていると結論した。
［実施例２］ｐ１２０蛋白に対する抗体の作製
ｐ１２０蛋白に対するウサギポリクローナル抗体を作製した。抗体は配列番号２の１８３〜３８０のアミノ酸をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆａｒａｓｅ（ＧＳＴ）に融合させた融合蛋白をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、大腸菌（ＪＭ１０９）に導入し、発現させた融合蛋白質をグルタチオンセファロースカラムで精製後、ウサギに免疫してｐ１２０蛋白に対する抗体を作製した。
［実施例３］ｐ１２０蛋白の分布の生化学的検討
最初にｐ１２０蛋白の各臓器での分布を検討した。プロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳ溶液でラットを還流し、各種臓器を取り出した。テフロンホモジナイザーもしくはポリトロンホモジナイザーで各臓器を破砕し、ホモジネートを調製した。蛋白質定量の後、それぞれ２０μｇのホモジネートを電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に転写後、上記抗ｐ１２０抗体を用いてウエスタンブロットを行った。脳のホモジネートに約１２０ｋＤａのバンドが検出された（図３Ａ）。心臓、脾臓、肺、骨格筋、腎臓および精巣にはバンドは検出されず、ｐ１２０は脳に特異的に発現していることが示唆された。
次いで、脳における細胞内の局在について検討した。Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ法（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７４：１８１−２０３  １９７７）により分離した膜分画を電気泳動後、抗ｐ１２０抗体でウエスタンブロットを行った。ｐ１２０蛋白はコントロールとしたＮＭＤＡレセプターと同様にＰＳＤ分画に濃縮していた（図３Ｂ）。
ｐ１２０蛋白を各種の界面活性剤を用いて可溶化する実験を行った。Ｐ２分画をＣＨＡＰＳ、ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＳＤＳもしくはＤＯＣにて室温で３０分処理した。各サンプルを超遠心（１００，０００ｘｇ）にかけ、上清と沈澱に分けた。等量の上清と沈澱を電気泳動にかけ、抗ｐ１２０抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
ｐ１２０蛋白は非イオン性の界面活性剤であるＣＨＡＰＳ、ＮＰ４０およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００では可溶化されず、沈澱に回収された（図３Ｃ）。しかし、イオン性の界面活性剤であるＳＤＳおよびＤＯＣで可溶化され上清に回収された。以上の結果より、ｐ１２０蛋白はシナプス結合に局在しその細胞骨格に強く結合していることが示唆された。
［実施例４］ｐ１２０蛋白の組織分布
上記の生化学的データはｐ１２０がシナプス蛋白質であることを示唆するものであったので、実際の組織においてもシナプスに局在するかどうかを検討した。
抗ｐ１２０抗体を用い、プレシナプスのシナプス小胞蛋白質ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  Ｉをコントロールとして、マウス海馬領域の免疫組織染色を行った。ｐ１２０のシグナルは海馬のＣＡ３と呼ばれる領域に最も強く見られた（図４Ａ）。この領域はｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍとよばれ、ｍｏｓｓｙ  ｆｉｂｅｒの神経終末と錐体細胞の樹状突起がシナプスを形成している領域であり、ｐ１２０がシナプスに局在することが示唆された。
ラット海馬初代培養神経細胞を用いて、ｐ１２０のシナプスへの局在を更に検討した。Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄａｙ  １９のラット大脳から海馬を取り出し、トリプシンで細胞を処理したあと、Ｂ−２７培地（ギブコ社製）で培養した。培養２１日目の細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理し、抗ｐ１２０抗体と抗ｂａｓｓｏｏｎ抗体または抗ＰＳ−９５抗体を同時に細胞とインキュベーションして、その後２次抗体でそれぞれの蛋白質の局在を検出した。ｐ１２０はｂａｓｓｏｏｎおよびＰＳ−９５と共に樹状突起にそってシナプスパターンの像を示し（図４Ｂ）、ｐ１２０はシナプスに局在することが強く示唆された。
更に免疫電子顕微鏡を用いた解析から、ｐ１２０は海馬ＣＡ３領域のプレシナプスのａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅに極めて近いところに局在することが明らかとなった（図４Ｃ）。
［実施例５］ｐ１２０の結合蛋白質の同定
ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅにおけるｐ１２０の機能を解析する目的で、ｐ１２０に結合する蛋白質の同定を試みた。
ｐ１２０の抗体を用いてＰ２分画の免疫沈降実験を行ったところ、ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ蛋白質であるＲＩＭ１およびｂａｓｓｏｏｎが共沈してきた（図５）。ｂａｓｓｏｏｎは分子量が４００万以上あり、生化学的解析が困難であるため、ＲＩＭ１との結合についてさらに解析を行った。
ＲＩＭ１は１９９７年に、低分子量Ｇ蛋白質Ｒａｂ３Ａの標的蛋白質として単離されたが、その機能については不明であった（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３８８：５９３−５９８，１９９７）。最近、ＲＩＭ１のノックアウトマウスが報告され、ＲＩＭ１がシナプス可塑性において極めて重要なはたらきをしていることが明らかとなったが、当初予想されていたようなａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ形成には関与していなかった（Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４１５：３２７−３３０，２００２；、Ｓｃｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４１５：３２１−３２６，２００２）。
それぞれのＧＳＴ融合蛋白質を作成し、お互いの結合ドメインの決定を行ったところ、ＲＩＭ１のＰＤＺドメインとＰ１２０のＣ末が直接結合することが明らかとなり（図６）、特に、最後のＩＷＡ（Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ）のアミノ酸が結合に必須であった。以上の結果から、ｐ１２０がａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅでのＲＩＭ１の足場蛋白質として機能していることが示唆された。
最後に、ラット海馬初代培養神経細胞を用いて、ｐ１２０がＲＩＭ１の実際に神経細胞において、足場蛋白質として機能するか否かを検討した。ｐ１２０およびＲＩＭ１を神経細胞に共発現させたところ、シナプスのマーカー蛋白質であるｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎと共局在した（図７および図８）。ｐ１２０を単独で発現させた場合も、同様の結果が得られ、また、ＲＩＭ１と結合することができないＣ末のＩＷＡアミノ酸を欠失させたミュータントｐ１２０もシナプスに局在することができた。従って、ｐ１２０のシナプスへの局在にはＲＩＭ１を必要としないことが明らかとなった。
次にＲＩＭ１のシナプスへの局在にｐ１２０が必要か否かについて検討を行った。ＲＩＭ１単独を発現させた場合、ｂａｓｓｏｏｎと共局在した（図９）。しかし、ｐ１２０との結合に必要なＰＤＺドメインを欠失したミュータントはシナプスに局在することができず、一方で、ＰＤＺドメインはｐ１２０を共発現させると、両者はシナプスで、ｂａｓｓｏｏｎと共局在した。以上の結果から、ＲＩＭ１はそのＰＤＺドメインを介してｐ１２０のＩＷＡ配列と結合することにより、シナプスに局在することが明らかとなった。
本研究で、われわれはｐ１２０がＲＩＭ１の局在をきめる重要なａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ蛋白質であることを明らかにした。このようなａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ蛋白質間の相互作用に基づいた分子複合体の形成は、ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ形成の分子基盤に大きく寄与しているのではないかと考えられる。
産業上の利用の可能性
シナプスに局在し細胞骨格に強く結合しているｐ１２０蛋白をコードするｍＲＮＡ及びｐ１２０蛋白の検出・定量が可能となった。更にｐ１２０が、ＲＩＭ１をシナプスに局在させるための足場として機能し、ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ形成の分子基盤として寄与していることが明らかとなった。また、本発明によって、シナプスの検出に利用できるマーカー、プローブ、および抗体が提供できるようになった。さらに、本発明によって、シナプスの検出に利用できる化合物のスクリーニング方法が提供できるようになった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｐ２およびＰＳＤ分画のＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラム溶出フラクションの電気泳動後バンドパターンを示す写真である。ｐ１２０はＰＳＤ分画特異的に認められた。
図２は、Ａ：ｐ１２０アミノ酸配列中のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン，Ｂ：ｐ１２０  ｃＤＮＡよりウサギ網状赤血球抽出液で発現させたｐ１２０蛋白、及び内在性ｐ１２０蛋白と電気泳動を示す図および写真である。ｃＤＮＡより発現させたｐ１２０は内在性ｐ１２０と同じ移動度を示した。
図３は、Ａ：ｐ１２０蛋白の臓器分布、Ｂ：細胞各分画中のｐ１２０蛋白の分布、Ｃ：非イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤によるｐ１２０の可溶化を示す写真である。ｐ１２０はシナプスに分布し、細胞骨格に強く結合していると考えられた。
図４は、Ａ：抗ｐ１２０抗体及び抗ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  Ｉ抗体によるマウス海馬領域の免疫組織染色、Ｂ：抗ｐ１２０抗体、抗ｂａｓｓｏｏｎ抗体または抗ＰＳ−９５抗体によるラット海馬初代培養神経細胞の免疫組織染色、Ｃ：抗ｐ１２０抗体によるシナプスの免疫電顕像を示す写真である。
図５は、Ａ：抗ｐ１２０抗体により免疫沈降したｐ１２０，ｂａｓｓｏｏｎ，ＲＩＭ１、Ｂ：抗ｂａｓｓｏｏｎ抗体により免疫沈降したｐ１２０，ｂａｓｓｏｏｎ，ＲＩＭ１を示す写真である。ｐ１２０はｂａｓｓｏｏｎ，ＲＩＭ１と共に免疫沈降し、互いに結合活性を有すると考えられた。
図６は、Ａ：ｐ１２０の各ドメインと共に免疫沈降するＲＩＭ１、Ｂ：ＲＩＭ１の各ドメインと共に免疫沈降するｐ１２０を示す図および写真である。ｐ１２０は、そのＣ末端のドメインで、ＲＩＭ１のＰＤＺドメインと結合していると考えられた。
図７は、ｐ１２０全体とＲＩＭ１との結合活性の有無を示す図である。
図８は、ＲＩＭ１との結合活性を持たないｐ１２０（ｐ１２０−２）とＥＧＦＰの融合蛋白の分布を示す写真である。ｐ１２０はＲＩＭ１との結合活性とは無関係にシナプスａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅに分布した。
図９は、ＲＩＭ１全体（ＲＩＭ１）、ＰＤＺドメインを欠失したＲＩＭ１（ＲＩＭ１ΔＮ）、ＲＩＭ１のＰＤＺドメイン（ＲＩＭ１  ＰＤＺ）とＭｙｃの融合蛋白の分布を示す写真である。ＲＩＭ１がシナプスａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅに分布するためには、ＰＤＺドメインが必要であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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