(57)【要約】本発明により、全体的脳虚血中の頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドのラット脳神経への導入が提供される。ポリメラーゼ連鎖反応は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全体的脳虚血後１時間で効果的に腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、および細胞内接着分子１メッセンジャーＲＮＡの発現を阻害することを示した。末端デオキリヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識染色および微小管結合タンパク質２免疫組織化学は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全体的脳虚血後７日で、有意に神経損傷を和らげることを示した。脳虚血中のＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドの治療的トランスフェクションは、神経損傷を和らげるために有効であり得、全体的虚血に対する大脳保護の戦略を示唆する。
2003082331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための薬学的組成物であって、
少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項２】
前記疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記薬学的に受容可能なキャリアがリポソームである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
頸動脈を介する投与経路に適切である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行うための組成物であって、
少なくとも１つのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項８】
前記脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記デコイは、ＮＦ−κＢである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記薬学的に受容可能なキャリアはリポソームである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための方法であって、
少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬学的に受容可能なキャリアがリポソームである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
頸動脈を介する投与経路に適切である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行う方法であって、
少なくとも１つのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを、脳への直接投与以外の経路に適切な形態で含む、組成物、を被検体に投与する工程、
を、包含する、方法。
【請求項１８】
前記脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記デコイは、ＮＦ−κＢである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬学的に受容可能なキャリアはリポソームである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、転写調節因子が結合する部位と特異的に結合する化合物（例えば、核酸およびその類似体）を含む組成物およびその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、脳虚血障害を処置するためのデコイ化合物（例えば、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）デコイ）を含む組成物およびその使用方法に関する。本発明はまた、脳以外の経路により投与することにより脳に遺伝子トランスフェクションを行う方法およびそのための組成物を提供する。
背景技術
喘息、癌、心臓病、動脈瘤、自己免疫疾患およびウイルス感染症などの種々の疾患は、それぞれ異なる症状を示すにもかかわらず、その大部分は、１種類または数種類のタンパク質が、異常発現（過剰発現または過少発現）したことに起因することが示唆されている。一般に、これらタンパク質の発現は、種々の転写活性因子および転写抑制遺伝子などの転写調節因子によって制御されている。
ＮＦ−κＢは、炎症および免疫などに重要である遺伝子産物をコードする遺伝子のそのような転写因子の１つである（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ．ら、ＡｎｎｕＲｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１２：１４１−７９）。ＮＦ−κＢは、種々の細胞外シグナルに応答して、細胞質から核に迅速にトランスローケートし、そしていくつかのサイトカインおよび接着分子遺伝子の調整されたトランス活性化で中心的な役割を演じる。Ｃｏｏｐｅｒらは、心臓同種異系移植物モデルにおける拒絶の３日前にピークとなるＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性の時間依存的増加を示した（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９８  Ｏｃｔ  １５；６６（７）：８３８−４４）。しかし、ＮＦ−κＢの強力なインヒビターであるＰＤＴＣの投与は、このモデルにおいてＮＦ−κＢ活性のピークを低減して移植物の生存を顕著に延長した。
ヒトＮＦ−κＢの通常の活性形態は、２つのＤＮＡ結合性サブユニット、５０ｋＤａサブユニット（ｐ５０）および６５ｋＤａサブユニット（ｒｅｌＡまたはｐ６５）からなるヘテロダイマーである（Ｌｅｎａｒｄｏ、Ｃｅｌｌ．１９８９  Ｊｕｌ  ２８；５８（２）：２２７−９；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｍａｙ；１０（５）：２３２７−３４；Ｓａｔｒｉａｎｏ  Ｊ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４  Ｏｃｔ；９４（４）：１６２９−３６；Ｎｅｉｓｈ  ＡＳら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９２  Ｄｅｃ  １；１７６（６）：１５８３−９３）。刺激を受けていない細胞では、ＮＦ−κＢは、ＩκＢとして知られる阻害分子に結合して細胞質内に隠れている。細胞刺激の後、ＩκＢは、リン酸化され、そして急速に分解される。次いでＮＦ−κＢは、ＩκＢから放出され、この転写因子の核へのトランスローケーションを可能にし、そこで、それは、種々のＤＮＡ認識部位に結合することにより遺伝子発現を調節する（Ｂａｅｕｒｅｒｌｅ、１９９４、前出）。この複合体からの転写因子ＮＦ−κＢの解離が、インターロイキン（ＩＬ）−１、−６、および−８；細胞内接着因子；血管細胞接着因子；および内皮細胞接着分子を含む遺伝子の調整されたトランス活性化を誘導することによって、炎症変化の調節で中心的役割を演じることが示唆されている（Ｌｅｎａｒｄｏ、１９８９  前出；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ、１９９０  前出；Ｓａｔｒｉａｎｏ  Ｊ、１９９４  前出；Ｎｅｉｓｈ、１９９２  前出）。従って、ＮＦ−κＢをブロックすることは、心筋における遺伝子仲介性の虚血再還流を減衰し得る。
ＮＦ−κＢは、腫瘍悪性度の進行の開始に関与し得る（Ｒａｙｅｔ  Ｂら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９９  Ｎｏｖ  ２２；１８（４９）６９３８−４７）；ＮＦ−κＢは、低酸素症ストレスに対する腫瘍細胞の応答に関与する（Ｒｏｙｄｓ  ＪＡら、Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８  Ａｐｒ；５１（２）：５５−６１）；ＮＦ−κＢは、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞におけるサイトカインおよび接着分子の発現を阻害する（Ｔｏｍｉｔａ  Ｔら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）２０００  Ｊｕｌ；３９（７）：７４９−５７）；ＮＦ−κＢを含む複数の転写因子間の協力作用の抑制は、種々の癌の悪性表現型を変える（Ｄｅｎｈａｒｄｔ  ＤＴ、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇ  １９９６；７（３−４）：２６１−９１）；緑茶ポリフェノールによるＮＦ−κＢ活性のダウンレギュレーションは、一酸化窒素合成酵素の誘導をブロックし、Ａ４３１ヒト類表皮癌細胞を抑制する（Ｌｉｎ  ＪＫら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９９  Ｓｅｐ  １５；５８（６）：９１１−５）；アルツハイマー病患者の脳で見られるアミロイドβペプチドは、神経芽腫細胞において、７５ｋＤ神経栄養因子レセプター（ｐ７５ＮＴＲ）に結合することにより、ＮＦ−κＢを時間依存性様式および用量依存性様式で活性化する（Ｋｕｐｅｒ  Ｐら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  １９９８  Ｄｅｃ  １５；５４（６）：７９８−８０４）；ＴＮＦαは、糸球体腎炎の発症に重要な役割を演じる（Ａｒｄａｉｌｌｏｕら、Ｂｕｌｌ  Ａｃａｄ  Ｎａｔｌ  Ｍｅｄ  １９９５  Ｊａｎ；１７９（１）１０３−１５）。
ＮＦ−κＢに対する転写因子デコイは、ＴＮＦαで誘導されるマウス腎炎においてサイトカインおよび接着分子の発現をインビボで阻害する（Ｔｏｍｌｔａ  Ｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００  Ａｕｇ；７（１５）１３２６−３２）；など。
ＮＦ−κＢは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のメンバー、ＭＭＰ１およびＭＭＰ９を転写レベルで抑制することが示唆された（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ  Ｗ、Ｈｕｗｉｌｅｒ  Ａ、Ｂｅｃｋ  ＫＦ、Ｗａｌｐｅｎ  Ｓ、Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ  Ｊ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｎｏｖ  １５、１６５（１０）、５７８８−９７；Ｍ、Ｂａｋｅｒ  ＡＨ、Ｎｅｗｂｙ  ＡＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｂｏｎｄ  １９９９  Ｏｃｔ  ２２、２６４（２）、５６１−７；Ｂｏｎｄ  Ｍ、Ｆａｂｕｎｍｉ  ＲＰ、Ｂａｋｅｒ  ＡＨ、Ｎｅｗｂｙ  ＡＣ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９８  Ｓｅｐ  １１、４３５（１）、２９−３４；およびＫｉｍ  Ｈ、Ｋｏｈ  Ｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００  Ｍａｒ  １６、２６９（２）、４０１−５）。ＭＭＰは、細胞外マトリックス成分の分解に関与する亜鉛依存性酵素の多遺伝子ファミリーである。
ＭＭＰは、細胞外マトリックスタンパク質の分解を仲介することにより癌細胞侵入において重要な役割を果たす。多くの癌研究によって、ＭＭＰおよびＭＭＰのインヒビター（ＴＩＭＰ）が、癌の進行に関与することが示唆されている：血清中のＴＩＭＰ１レベルは、結腸直腸の予後および診断マーカーとなり、そして転移性癌の選択的マーカーとして用い得る（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｌ  Ｐら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０００  Ｓｅｐ；４９（７）：３８８−９４）；ヒト膀胱癌細胞中のＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現および活性は、腫瘍壊死因子αとγインターフェロンの影響を受ける（Ｓｈｉｎ  ＫＹら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２０００  Ｏｃｔ  ３１；１５９（２）：１２７−１３４）；卵巣上皮腫瘍で、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＴ１−ＭＭＰ、およびそれらのインヒビターＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２が発現する（Ｓａｋａｔａ  Ｋら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２０００  Ｏｃｔ；１７（４）：６７３−６８１）；ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３およびＭＭＰ９の各々のレベルおよび総ＭＭＰ活性は、結腸直腸腫瘍でアップレギュレートし、ＭＭＰ１が結腸直腸癌進行に最も重要である（Ｂａｋｅｒ  ＥＡら、Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２０００  Ｓｅｐ；８７（９）：１２１５−１２２１）；活性化されたＭＭＰ２が、尿路上皮癌の浸潤に重要な役割を演じ、しかも活性化されたＭＭＰ２発現のレベルが有用な予後指標となる（Ｋａｎｅｄａ  Ｋら、ＢＪＵ  Ｉｎｔ  ２０００  Ｓｅｐ；８６（４）：５５３−５５７）；プロスタグランジン合成のインヒビターが、ヒト前立腺腫瘍細胞浸潤を阻害し、かつＭＭＰの放出を低減する（Ａｔｔｉｇａ  ＦＡら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００  Ａｕｇ  １５；６０（１６）：４６２９−３７）；血清真性グロブリン画分中のＭＭＰ活性が、乳癌および肺癌患者で増加し、これら癌の腫瘍マーカーとして用い得る（Ｆａｒｉａｓ  Ｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０００  Ｊｕｌ  ２０；８９（４）：３８９−９４）；ＭＭＰインヒビターは、腫瘍細胞におけるゼラチン分解活性を阻害する（Ｉｋｅｄａ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００  Ａｕｇ；６（８）：３２９０−６）；膜タンパク質ＬＭＰ１によるＭＭＰ９の誘導が、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の転移性に寄与する（Ｈｏｒｉｋａｗａ  Ｔら、Ｃａｎｅｒ  ２０００  Ａｕｇ  １５；８９（４）：７１５−２３）；ＭＭＰは、血管形成の初期に重要な役割を演じ、ＭＭＰインヒビターがヒト微小血管内皮細胞浸潤および形態形成を抑制する（Ｊｉａ  ＭＣら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２０００；４７６：１８１−９４）；浸潤性および再発性下垂体腺腫および下垂体癌においてＭＭＰ９が発現する（Ｔｕｒｎｅｒ  ＨＥら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０００  Ａｕｇ；８５（８）：２９３１−５）；など。
ＭＭＰはまた、大動脈瘤の進展に関与することが知られている：ＭＭＰは、脳動脈瘤形成および破壊に関与する（Ｇａｅｔａｎｉ  Ｐら、Ｎｅｕｒｏｌ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｊｕｎ；２１（４）：３８５−９０）；ＭＭＰ−９プロモーターは、脳動脈瘤のリスクファクターである（Ｐｅｔｅｒｓ  ＤＧは、Ｓｔｒｏｋｅ  １９９９  Ｄｅｃ；３０（１２）：２６１２−６）；ＭＭＰの阻害は、動脈瘤モデルにおいて、小動脈瘤の成長の阻害をもたらす（Ｔｒｅｈａｒｎｅ  ＧＤは、ＢｒＪ  Ｓｕｒｇ  １９９９  Ａｕｇ；８６（８）：１０５３−８）；など。ＭＭＰは、遊走血管平滑筋細胞、マクロファージなどから分泌され、血管壁に存在するコラーゲン、エラスチンなどを破壊し、これによって血管の緊張が失われ、血圧に抵抗しきれずに血管径は拡張する。事実、動脈瘤の血管では、顕著なエラスチンの破壊が認められる。
３５才から８０才までの成人男性の大動脈径を測定したデータによると、その平均は１．５ｃｍ〜２．０ｃｍであった。一般に、大動脈径が、平均値の１．５倍を超えると大動脈瘤と判断されるが、上記データによれば、直径３ｃｍ以上の瘤を有し、大動脈瘤と判断されるヒトは、４００人に１人の割合で存在していた。従って、大動脈破裂の危険度は別にして、３５才から８０才までの成人男性において大動脈瘤の有病率はかなり高く、６５才以上の高齢者においては有病率はさらに大きくなると考えらている。
ＭＭＰインヒビターは、ラット腹部大動脈瘤モデルにおいて、血管径の拡張を抑制することが報告されている。ＭＭＰインヒビターはまた、糸球体腎炎の治療に用いられ得る（Ｍａｒｔｉ  ＨＰ、Ｓｃｈｗｅｉｚ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ｍａｙ  ２７；１３０（２１）；７８４−８）。しかし、ＭＭＰインヒビターの全身投与は、重篤な副作用を生じ、上記種々の疾患の処置（治療および予防）するための臨床適用は困難である。
「デコイ化合物」ｃｉｓ−エレメントとしての合成ＯＤＮは、目的遺伝子のプロモーター領域への核因子の結合をブロックし、インビトロおよびインビボアッセイ系における遺伝子トランス活性化の阻害を生じる（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、ＪＶｉｒｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ；６５（１２）：６８１１−６；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ．ら、Ｃｏｎｔｒｉｂ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９６；１１８：２５４−６４）。このようなデコイ戦略は、ある種のヒト疾患の処置として提案されている。本発明者らは、先に、Ｅ２ＦのデコイＯＤＮのトランスフェクションが、再狭窄の遺伝子治療のモデルとして、バルーン損傷後の新内膜形成を阻害したことを報告した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ  Ａ．１９９５  Ｊｕｎ  ２０；９２（１３）：５８５５−９）。最近、本発明者らは、ラットにおいて、ＮＦ−κＢに対するデコイを用いて、虚血損傷からのインビボ心筋保護に成功した。
心臓手術の分野において、循環停止は、大動脈動脈瘤変化を有する患者または複合先天的異常を有する新生児における支持技術として一般的に使用される。しかし、循環停止に関する種々の合併症はまだ解決されず、そして循環停止の期間が長くなるにつれ、神経学的後遺症の発生数は高くなる（Ｊｏｎａｓ  ＲＡ．ＪＣａｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｖａｓｃ  Ａｎｅｓｔｈ．１９９６；１０：６６−７４を参照のこと）。循環停止中、脳を含む全身は、虚血症でそして長い虚血は、ニューロンの壊死を導く。さらに、脳ニューロン、特に海馬におけるニューロンは、数分の虚血でさえ、５日〜７日後に死に、この現象は、遅延神経死と呼ばれる（Ｋｉｒｉｎｏ  Ｔ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９８２；２３９：５７−６９を参照のこと）。超低体温のような技術が、虚血損傷に対して脳を保護するために使用された場合でさえ、４５分〜６０分が、循環停止を維持する肉体的な限界であり、そして超低体温は、種々の危険（出血の増加、輸血および免疫の低下を含む）と関連する（Ｋｉｒｋｌｉｎ  ＬＷ，Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ  ＢＧ．Ｋｉｒｋｌｉｎ  ＪＷ，Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ  ＢＧ、編  Ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ；１９９３．ｐ．６６−７３を参照のこと）。虚血障害由来の神経壊死および遅延神経死の両者に対する脳保護のより良い技術の開発は、大動脈疾患および先天的心臓疾患に対する手術の病的状態を改善することが所望される。
最近の研究により、大脳虚血後の神経損傷におけるＮＦ−κＢの活性化が明らかになってきており、重要な転写因子であることが判明してきた（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  Ｄ，Ｙｉｎ  Ｔ，Ｓｍａｌｓｔｉｇ  ＥＢ，Ｈｓｕ  ＭＡ，Ｐａｎｅｔｔａ  Ｊ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｌａｂ．２０００；２０：５９２−６０３；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ａ，Ｍａｒｔｉｎ−Ｖｉｌｌａｌｂａ  Ａ，Ｗｅｉｈ  Ｆ，Ｖｏｇｅｌ  Ｊ，Ｗｉｒｔｈ  Ｔ，Ｓｃｈｗａｎｉｎｇｅｒ  Ｍ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９；５：５５４−９；およびＣｌｅｍｅｎｓ  ＪＡ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ＤＴ，Ｄｉｘｏｎ  ＥＰ，Ｓｍａｌｓｔｉｇ  ＥＢ，Ｍｉｎｃｙ  ＲＥ，Ｒａｓｈ  ＫＳら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９７；４８：１８７−９６を参照のこと）。
ＮＦ−κＢは、その発現が虚血再灌流損傷に関係する多くの遺伝子の転写活性化剤（サイトカイン（腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン１β（ＩＬ−１β））（Ｃｈｒｉｓｉｍａｎｎ  ＪＷ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  ＬＨ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＴＳ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９８；２４：１１３１−８を参照のこと）ならびに接着分子（細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１））（Ｈｏｗａｒｄ  ＥＦ，Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｃｈｅｎｇ  Ｃ，Ｃａｒｒｏｌｌ  ＪＥ，Ｈｅｓｓ−Ｄ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．１９９８；２４８：１９９−２０３を参照のこと）など）である。さらに、アスピリンなどのＮＦ−κＢの阻害剤は、ニューロンにおいて虚血損傷をブロックするようである（Ｇｒｉｌｌｉ  Ｍ，Ｐｉｚｚｉ  Ｍ，Ｍｅｍｏ  Ｍ，Ｓｐａｎｏ  Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７４：１３８３−５を参照のこと）。デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のトランスフェクションは、サイトカインおよび接着分子の転写活性化をブロックすると報告され（Ｔｏｍｉｔａ  Ｎ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｓ，Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＧＨ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｍら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：１３２６−３２を参照のこと）、本発明者らは、以前、心臓における虚血再灌流損傷を防ぐためのＮＦ−κＢデコイＯＤＮをトランスフェクトする効力を報告した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｋｉｄａ  Ｉ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｎ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９７；３：８９４−９；およびＳａｗａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，Ｋａｇｉｓａｋｉ  Ｋ，Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｍａｅｄａ．Ｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９７；９６（Ｓｕｐｐｌ  ９）：ＩＩ−２８０−５を参照のこと）。
このように、ＮＦ−κＢは、その転写制御下にある、多くの遺伝子の発現を介して、種々の疾患に関与することが示唆されている。しかし、脳虚血に関連する障害または疾患を有効に処置する方法、特に非侵襲的処置法は提供されていない。特に、脳虚血は、上記のように稀ではない疾患であり、高齢化社会にともなう動脈硬化性疾患の増加は、当然大動脈瘤疾患の増加をもたらす。患者の高齢化を考慮した場合、薬剤により大動脈瘤の増長を直接抑制できれば理想的であるが、現在のところその手段はなく、大動脈瘤の低侵襲的な治療および予防法の開発が切望されている。
また、大動脈瘤が破裂することなどにより脳が虚血状態に陥ると、脳神経障害を生じる。この障害は、種々の神経における機能不全をもたらし、知能障害、痴呆などをも引き起こし得る。近年になり、ＮＦ−κＢに対するシスエレメントデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、虚血損傷を媒介する遺伝子の活性化をブロックすることが報告された。しかし、従来は、これらの脳の虚血状態に起因する障害に対する処置または予防のために有効な低侵襲的な治療および予防法は実質的になかった。
従って、本発明は、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮをニューロンにトランスフェクトすることが、全脳虚血後の神経損傷を防ぎ、そしてＮＦ−κＢデコイＯＤＮが、新しい大脳保護治療を提供することを課題とする。本発明は、頸動脈を介してＮＦ−κＢデコイＯＤＮを脳にトランスフェクトすることが、ラットモデルにおいて全脳虚血後のニューロンへの損傷を和らげるかどうかを試験することをも課題とする。本発明者らの課題は、心血管手術における循環停止を含む全脳虚血中に使用するための新しい大脳保護薬剤を開発することである。心臓手術における循環停止中の脳保護を改良するために、本発明者らは、全脳虚血後の神経損傷を防ぐ点でＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの効力を評価することも課題とした。
別の局面では、本発明は、脳への直接投与以外の投与経路で、特に脳血液関門を通過する投与経路を介して、脳へ遺伝子トランスフェクションのための組成物を投与することにより、脳内での遺伝子トランスフェクションが行わせることを課題とした。このようなことは、従来不可能であった、技術であり、その技術的意義は深い。
発明の要旨
本発明により、全体的脳虚血中の頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドのラット脳神経への導入が提供される。ポリメラーゼ連鎖反応は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全体的脳虚血後１時間で効果的に腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、および細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）メッセンジャーＲＮＡの発現を阻害することを示した。末端デオキリヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識染色および微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）免疫組織化学は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全体的脳虚血後７日で、有意に神経損傷を和らげることを示した。脳虚血中のＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドの治療的トランスフェクションは、神経損傷を和らげるために有効であり得、全体的虚血に対する大脳保護の戦略を示唆する。
本発明は、脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための薬学的組成物であって、少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を提供する。本発明はまた、脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに上記疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための方法であって、少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を被検体に投与する工程、を包含する、方法を提供する。
１つの実施形態では、上記疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であり得る。上記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択され得る。上記薬学的に受容可能なキャリアがリポソームであり得る。上記ＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含み得る。本発明の組成物は、頸動脈を介する投与経路に適切であり得る。
別の局面において、本発明は、脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行うための組成物であって、少なくとも１つのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を提供する。本発明はまた、脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行う方法であって、少なくとも１つのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを、脳への直接投与以外の経路に適切な形態で含む、組成物、を被検体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
１つの実施形態において、上記脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入であり得る。別の実施形態において、上記デコイは、ＮＦ−κＢであり得る。別の実施形態において、上記薬学的に受容可能なキャリアはリポソームであり得る。
発明の実施の形態
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
本発明で用いられる用語「デコイ」または「デコイ化合物」は、ＮＦ−κＢなどの転写因子が結合する染色体上の部位、またはＮＦ−κＢなどの転写因子に制御される遺伝子の他の転写調節因子が結合する染色体上の部位（以下標的結合部位という）に結合し、ＮＦ−κＢまたはその他の転写因子と、これらの標的結合部位への結合について拮抗する化合物をいう。代表的には、デコイまたはデコイ化合物は、核酸およびその類似体である。
デコイが核内に存在する場合、転写調節因子の標的結合部位への結合について、デコイが転写調節因子と競合し、その結果、転写調節因子の標的結合部位への結合によってもたらされる生物学的機能が阻害される。デコイは、標的結合配列に結合し得る核酸配列を少なくとも１つ含む。標的結合配列への結合活性を有する限り、デコイは、本発明の薬学的組成物の調製に用いることができる。
デコイの例としては、ＮＦ−κＢについてＧＧＧＡＴＴＴＣを含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいデコイの例として、５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１）（ＮＦ−κＢデコイ）、５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号２）（ＳＴＡＴ−１のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号３）（ＧＡＴＡ−３のデコイ）、５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号４）（ＳＴＡＴ−６のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号５）（ＡＰ−１のデコイ）、および５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号６）（Ｅｔｓのデコイ）、５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’（ＣＲＥデコイ配列）またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、またはそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および／または擬核酸を含むものであってもよい。また、これらのオリゴヌクレオチド、その変異体、またはこれらを分子内に含む化合物は、１本鎖でも２本鎖であってもよく、線状であっても環状であっもよい。変異体とは上記配列の一部が、変異、置換、挿入、欠失しているもので、ＮＦ−κＢなどの転写因子またはＮＦ−κＢなどの転写因子に制御される遺伝子のその他の転写調節因子が結合する核酸結合部位と特異的に拮抗する核酸を示す。さらに好ましいＮＦ−κＢなどの転写因子またはＮＦ−κＢなどの転写因子に制御される遺伝子のその他の転写調節因子のデコイとしては、上記核酸配列を１つまたは複数含む２本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。上記核酸配列を１つまたは複数含む核酸は、含まれる核酸配列の数を示すために、含まれる核酸配列が２つの場合タブルデコイと称され、そし３つの場合トリプルデコイなどと称され得る。
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子で置換したチオリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、またはリン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチド等、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクリオチド等が含まれる。
本発明で用いられるデコイの製造方法としては、当該分野で公知の化学合成法または生化学的合成法を用いることができる。例えば、デコイ化合物として核酸を用いる場合、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることができ、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて目的のデコイ核酸を直接合成してもよいし、またはこれらの核酸、それを含む核酸またはその一部を合成した後、ＰＣＲ法またはクローニングベクター等を用いて増幅してもよい。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、ＤＮＡリガーゼ等を用いて結合等を行い、目的とする核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、核酸の塩基、糖、リン酸部分に、例えば、アルキル化、アシル化等の化学修飾を施してもよい。
本発明は、上記のデコイ化合物を単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。
本発明の薬学的組成物は、デコイが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
本発明の薬学的組成物は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリアー（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアーと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明の実施態様において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
本発明の薬学的組成物の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頸動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位である脳に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。本発明では、脳血液関門を越える必要がある頸部注入などでも有効であることが証明されたことから、従来技術では達成されなかった格別の効果を有する。従って、好ましい実施形態では、本発明は、脳血液関門を通過する必要がある経路（例えば、経口投与、頭部以外の非経口投与（例えば、頸部投与））で投与される。より好ましくは、投与経路は、頸部注入（例えば、頸動脈を介する）であり得る。従って、頸動脈を介した経路で、脳における遺伝子トランスフェクションを行うための新たな処置方法およびそのための組成物が本発明により提供される。
デコイ化合物に加えて、これらの薬学的組成物は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、デコイ化合物のプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最終版に記載されている。
経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
経口使用のための薬学的組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以下を含むが、それらに限定されない：ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量（すなわち用量）を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
経口で使用され得る薬学的製剤は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、デコイ化合物は、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
局所または鼻孔投与のために、浸透されるべき特定のバリアに対して適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は一般に当該分野で公知である。
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって）で製造され得る。
好ましくは、患部の細胞または目的とする組織の細胞内に局所投与または頸部注入のように非経口的投与をする場合、本発明の薬学的組成物は、キャリアとして合成または天然の親水性ポリマーを含み有る。このような親水性ポリマーの例として、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコールが挙げられる。本発明のデコイ化合物を、適切な溶媒中のこのような親水性ポリマーと混合し、溶媒を、風乾などの方法により除去して、所望の形態、例えば、シート状に成型した後、標的部位に付与し得る。このような親水性ポリマーを含む製剤は、水分含量が少ないので、保存性に優れ、使用の際には、水分を吸収してゲル状になるので、デコイ化合物の貯留性に優れる。
あるいは、デコイとして核酸またはその修飾体を用いる場合には、本発明の薬学的組成物は、一般に用いられている遺伝子導入法で用いられる形態、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を用いた膜融合リポソーム製剤や、エンドサイトーシスを利用するリポソーム製剤等のリポソーム製剤、リポフェクトアミン（Ｇｉｏｃｏ  ＢＲＬ）等のカチオン性脂質を含有する製剤、またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等を用いるウイルス製剤を用いるのが有利であり、特に、膜融合リポソーム製剤が好適である。
リポソーム製剤は、そのリポソーム構造体が、大きな１枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）のいずれであってもよい。その大きさも、ＬＵＶでは２００から１０００ｎｍ、ＭＬＶでは４００〜３５００ｎｍ、ＳＵＶでは２０〜５０ｎｍ程度の粒子系をとり得るが、ＨＶＪ等を用いる膜融合リポソーム製剤の場合は粒子系２００〜１０００ｎｍのＭＬＶを用いるのが好ましい。
リポソームの製造方法は、デコイが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ、Ｆら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．６０１  ５５９（１９８０））、エーテル注入法（Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．：Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８  ２５０（１９７８））、界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．４５５  ３２２（１９７６））等を用いて製造することができる。
リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般に、リン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを定法に従って水素添加したものの他、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質を用いることができる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内にもつものを用いることにより、電気的に陰性のデコイ核酸の結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。
このようにして得られるリポソームには、患部の細胞または目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えば、ＨＶＪ、不活化ＨＶＪ、センダウイルスから精製された膜融合促進タンパク質、ポリエチレングルコール等を添加することができる。
リポソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、例えば、前記したリポソーム形成物質を、コレステロールとともにテトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノール等の有機溶媒に溶解し、これを適切な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリポソーム形成物質の膜を形成する。これにデコイを含有する緩衝液を加えて攪拌し、得られたリポソームにさらに所望により前記の膜融合促進物質を添加した後、リポソームを単離する。このようにして得られるデコイを含有するリポソームは適当な溶媒中に懸濁させるか、または一旦凍結乾燥したものを、適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。膜融合促進物質はリポソーム単離後、使用までの間に添加してもよい。
本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
１つの実施形態において、本発明の組成物またはキットは、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
徐放性形態の場合、徐放性製剤（ミニペレット製剤など）を投与部位付近に埋め込むこともできる。または、徐放性製剤は、オスモチックポンプなどを用いて投与部位に連続的に徐々に投与することもできる。
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。リポソーム形態の場合には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤のようなリポソーム製剤に必要な試薬を加えることができる。リポソームは、非経口的に投与することが好ましい。従って、リポソームを投与する場合には、非侵襲的なカテーテルまたは非侵襲的な注射器などによる投与方法を用いることができる。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法としては、例えば、脳内に直接または頸動脈に本発明の組成物を注入することが挙げられる。
本発明の薬学的組成物は、デコイ化合物が意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するデコイ化合物の量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、デコイの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するデコイの種類等により適宜選択されるが、例えば、脳への投与では、一般に、１回あたり、１０〜１０，０００ｎｍｏｌｅを１日１回から数回投与することができる。また、頸動脈への投与では、一般に、１回あたり、１０〜１０，０００ｎｍｏｌｅを１日１回から数回投与することができる。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
この様にして得られたデコイを主成分として含有する医薬品は、疾患の種類、使用するデコイの種類等により各種の方法で投与することができ、例えば、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および癌の転移・浸潤、悪疫質においては血管内投与、疾患部位に塗布、疾患部位内に投与または疾患部位に血管内投与等することができる。さらに具体的な例としては、例えば、臓器梗塞等でＰＴＣＡを行う場合には、同時またはその前後に患部血管に投与することができ、また臓器移植等では移植する臓器を予め本願で用いられる製剤で処置して用いてもよい。また、例えば、慢性関節リウマチ等では、直接関節内に注入して用いることもできる。例えば、脳では、脳内に直接注入して用いることもできる。
本発明の化合物が対象とする障害または疾患は、脳内の血管が破裂したことなどにより、脳内の血液が不足していることに起因するものであり、本明細書において、脳の虚血状態を伴う疾患という。そのような障害または疾患としては、例えば、クモ膜下出血、一過性脳虚血、脳動脈硬化症のような脳卒中、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍における血管破裂、頭部外傷、慢性、急性の硬膜下血腫、脳血管閉塞、脳血栓、脳出血、もやもや病、脳血管性痴呆、アルツハイマー型痴呆、脳出血後遺症、脳梗塞後遺症などが挙げられる。本発明はまた、上記のような脳の虚血状態を伴う疾患に起因する障害または後遺症（例えば、神経障害など）を処置および予防するのに有効である。
「クモ膜下出血」とは、クモ膜下腔に出血した状態をいう。頭部外傷によるクモ膜下出血を除けば，脳動脈瘤破裂によるものが最大の原因である（６０？８０％）。その他の原因としては，脳動静脈奇形破裂（１０％），高血圧性脳内出血（１０％），その他の順となっている。高血圧性脳内出血の場合は，出血が脳室内に穿破し，これがクモ膜下腔に流出したと考えられる。クモ膜下腔閉塞による慢性的な髄液循環障害が約１０％に生じ，正常圧水頭症を引き起こし得る。従来は、その症状である歩行障害，尿失禁，知能障害が髄液シャント術によって回復していたが、約３０％の患者は、入院前に死亡する。他の従来の治療としては、動脈瘤をチタン製のクリップでつまんで、再び出血を防ぐ方法、および太股の動脈から細い管を入れて、チタン製のコイルで動脈瘤を内側からつめる方法などがある。このようにクモ膜下出血の処置は外科的処置が多く根本的な解決には至っていない。本発明は、これらすべてのクモ膜下出血の処置および予防に有効であり得る
高血圧性脳内出血とは、長期に持続する高血圧のために脳の細小動脈壁に類線維性壊死が起こり，壁が破綻し出血する状態をいう．脳血管障害の２０％を占める。高血圧性脳内出血はまた、微小脳動脈瘤が発生し，それが破綻して発生するともいわれている。高発生年齢は６０歳代であり、出血の発生部位は大脳基底核視床部６０％，大脳皮質下２０％，小脳１０％，中脳橋１０％となっている。従来は、保存的治療がなされ、出血の拡大防止、頭蓋内圧低下、全身合併症の防止、早期リハビリに向けられている。外科的治療の目的は主に救命である。長期治療成績は手術例と非手術例との間では違いがなかったという報告もあり、手術に代わる有効な処置および予防方法が期待されていた。本発明は、これらすべての高血圧性脳内出血の処置および予防に有効であり得る。
脳梗塞とは、完全に血管がつまってしまい、脳の一部分が死んでしまう状態をいう。脳虚血とは、血管が狭くなって十分な血液が脳に供給されない状態をいう。脳１００ｇあたり一分間に２０ｍｌ以上の血液が供給されなければ、脳の機能が障害されるといわれる。脳硬塞による症状は、半身の麻痺や感覚障害です。早朝に発生することが多く、心臓に不整脈などの障害がある場合に起りやすい。現在の最もよく行われる方法は、血管がつまってから、できるだけ早期（好ましくは、発症から３時間以内）に行う血栓溶解である。発症から３時間以上経過してしまうと、血栓溶解により出血が起ることがあるからである（この状態を出血性梗塞とよび、極めて危険な状態である）。最近では、ＭＲＩ、ＤＷＩによって早期に梗塞を発見することが行われている。しかし、脳虚血における根本的な治療はこれまでは実質的にはなかった。本発明は、これらすべての脳虚血および脳梗塞の処置および予防に有効であり得る。
脳腫瘍とは、本明細書において、頭蓋内に発生する腫瘍をいう。脳実質のみならず，頭蓋内に存在する組織（例えば、骨、髄膜、血管、下垂体、脳神経、先天性遺残組織などを含む）から発生する原発性または転移性新生物をさす．寄生虫、結核などの肉芽腫も脳腫瘍に含まれ得る。脳腫瘍は、通常ＷＨＯの国際統一分類により分類されており、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。基本的には手術による腫瘍摘除により処置されている。また、腫瘍の局在部位により根治手術が困難な場合は，放射線療法，化学療法，免疫療法が用いられている。従って、本発明のデコイによる処置は、新たな局面による有効な治療および予防の方法を提供する。
頭部外傷とは、頭部に外力が作用したために生じたあらゆる損傷をいう．発生の時期により、急性期（外傷より３日以内）、亜急性期（外傷より４？２０日くらいまで）、慢性期（外傷より３週以降）の３期に分かれ、この区別は予後に関係する．頭部外傷は、交通事故、転落、転倒などにより頭部を打撲した場合などに発生する。頭部外傷には、全く異常が見られないものから脳挫傷・脳内血腫をともなうものまで種々存在する。頭部外傷の分類には種々あるが、一般的には開放性と閉鎖性に分けられ、さらに部位により頭皮、頭蓋骨、頭蓋内に分けられる。本発明は、これらすべての頭部外傷による脳の血管破裂の処置および予防に有効であり得る。
硬膜下血腫とは、硬膜と脳表との間に形成される被膜を有する流動性の血腫をいう。硬膜下血腫は、急性のものと慢性のものとに分類される。急性硬膜下血腫は、外傷によって生ずる脳と頭蓋骨とのずれによって伸展された橋静脈が断裂することによって起こる場合と，外傷によって生じた脳挫傷＊からの出血が硬膜下腔に広がってできる場合とがある。慢性硬膜下血腫とは、外傷によって生じた比較的少量の硬膜下血腫が数週間から数ヵ月の経過のうちに次第に増大し，意識低下や、精神症状、あるいは運動麻痺をきたす病態をいう。硬膜下血腫の周囲に，次第に生体反応としての線維性の被膜が形成され、この膜が半透膜の性質を有し、次第に周囲の髄液成分が引き込まれ増大する。半身麻痺、頭痛などの症状に始まり、痴呆、歩行障害、尿失禁などの典型的な症状が発生し得る。局所麻酔の手術によって、血液をく方法、および脳室と腹部をチューブによって連絡させる脳室−腹腔短絡術などにより処置されている。本発明は、これらすべての硬膜下血腫の処置および予防に有効であり得る。
従って、本明細書において、脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択され得る。
本発明が対象とする治療部位は、どのような種類の生物由来であり得る。本発明が対象とする生物としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）である。より好ましくは、本発明が対象とする生物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。
本発明の組成物およびキットは、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
別の局面において、本発明は、脳虚血障害を処置するためのキットを提供する。このキットは、本発明のデコイまたはデコイ化合物；ならびにこのデコイまたはデコイ化合物を投与する指針を与える指示書を備える。ここで、上記指示書は、デコイまたはデコイ化合物の適切な投与方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法において使用されるデコイまたはデコイ化合物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
別の実施形態では、本発明の処置方法は、さらに他の薬剤もまた投与する工程を包含し得る。そのような薬剤は、当該分野において公知の任意の医薬であり得、例えば、そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤（例えば、抗生物質など）であり得る。当然、そのような薬剤は、２種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方最新版、米国薬局方最新版、他の国の薬局方の最新版において掲載されているものなどが挙げられる。そのような薬剤は、好ましくは、脳虚血疾患に対して効果を有するもの（例えば、抗血小板剤、脳神経機能改善剤、脳代謝改善剤、血流改善剤など）であり得る。
好ましい実施形態において、本発明のデコイまたはデコイ化合物は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在し得る。より好ましくは、本発明のデコイまたはデコイ化合物は、１．０ｎｇ／ｍｌで存在し得る。別の好ましい実施形態では、本発明のデコイまたはデコイ化合物は、少なくとも２．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１０．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌを超えて存在し得る。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド（ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド）がある。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
また、ヒトゲノムプロジェクトのようなゲノムデータ、ＧｅｎＢａｎｋのような遺伝子情報データベースに対して、本発明のデコイの配列をもとにＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いて相同性検索を行って得られた配列もまた、本発明の範囲内にある。
本明細書では塩基配列の同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。
遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号１のＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。記載の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
「誘導体オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドをいう。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が転写因子である場合、転写活性を調節する活性を包含する。ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。本発明の１実施形態では、その生物学的活性は、転写因子の少なくとも１つへの結合活性を包含する。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。本明細書において、核酸分子の「ホモログ（種相同体）」とは、参照核酸分子のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ホモログは、代表的には、参照核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。本発明の核酸分子についていう場合、「ホモログ」とは、本発明のデコイの核酸配列と相同性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、その生物学的機能が本発明のプロモーターと同一または類似する核酸分子をいう。従って、「ホモログ」と「改変体」とは一部重複する概念である。従って、ホモログは、ある種の中で、ある配列とヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのようなホモログを取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。例えば、本発明のデコイのホモログは、同じ種の相同遺伝子または他の種の対応する遺伝子であり得る。従って、本発明のデコイには、すべてのデコイのホモログが包含され得る。
（発明の詳細な説明）
本発明は、第一の局面において、脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための薬学的組成物およびこの組成物を使用した脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防する方法を提供する。この組成物は、少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
１つの実施形態において、本発明が対象とする疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であり得る。別の実施形態において、前記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択され得る。
別の実施形態において、上記薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的に受容可能である任意のキャリアであり得るが、好ましくはリポソームであり得る。より好ましくは、本発明の薬学的組成物は、ＨＶＪ−リポソームの形態で提供され得る。
本発明において用いられるＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含む。より好ましくは、ＮＦ−κＢのデコイは、ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ（配列番号１）を含み得る。別の実施形態では、ＮＦ−κＢのデコイは、さらに改変された形態でもよい。
好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、頸動脈を介する投与経路で投与され得る。
別の局面において、本発明は、脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行う方法およびそのための組成物を提供する。この組成物は、少なくとも１つのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
好ましい実施形態において、脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入であり得る。脳への直接投与以外の経路での投与でのトランスフェクションに適切な遺伝子は任意の遺伝子であり得る。好ましくは、そのような遺伝子は、脳内での発現が効果を奏する遺伝子であり得る。そのような遺伝子としては、例えば、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、Ｅｔｓ、ＣＲＥのデコイが挙げられる。好ましいデコイの例として、５’−ＣＣＴ−ＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１）（ＮＦ−κＢデコイ）、５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号２）（ＳＴＡＴ−１のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号３）（ＧＡＴＡ−３のデコイ）、５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号４）（ＳＴＡＴ−６のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号５）（ＡＰ−１のデコイ）、および５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号６）（Ｅｔｓのデコイ）、５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’（ＣＲＥのデコイ）またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物が挙げられる。ここで、好ましい実施形態では、薬学的に受容可能なキャリアはリポソームであり得る。
本発明では、転写因子ＮＦ−κＢを結合するシスエレメントデコイのインビボトランスフェクションを使用して全脳虚血後の神経損傷を和らげる証拠が示された。
１つの実施形態では、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮは、頸動脈を介しておよび血液脳関門を横切ってそれらを注入することによって首尾良くニューロンの核に導入される。ＴＵＮＥＬ標識（ＤＮＡ切断）およびＭＡＰ２（神経マーカー）の免疫反応性での評価によれば、このトランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイＯＤＮは、海馬においてＮＦ−κＢシグナルに関する遺伝子発現を抑制し、全脳虚血に起因する神経損傷を和らげることが実証された。従って、本発明は、頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮを用いたニューロンのトランスフェクションは、全脳虚血中に虚血損傷から脳を保護するための新しい戦略を提供する。
従来の脳虚血の処置では、超低体温が用いられていた。超低体温は、大脳のエネルギー要求を減らす循環停止中に脳保護に対する基本的な戦略である。しかし、超低体温循環停止は、神経損傷の有害な危険を伴い、合併症（発作、大脳麻痺、運動性機能不全、および記憶欠損など）を併発していた（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  ＬＡ，Ｗｙｐｉｊ  Ｄ，Ｂｅｌｌｉｎｇｅｒ  ＤＣ，Ｈｅｌｍｅｒｓ  ＳＬ，Ｈｏｌｍｅｓ  ＧＬ，Ｂａｒｎｅｓ  ＰＤら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９８；９７：７７３−９；Ｂｅｌｌｉｎｇｅｒ  ＤＣ，Ｊｏｎａｓ  ＲＡ，Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  ＬＡ，Ｗｙｐｉｊ  Ｄ，Ｗｅｒｎｏｖｓｋｙ  Ｇ，Ｋｕｂａｎ  ＫＣら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９５；３３２：５４９−５５；およびＲｅｉｃｈ  ＤＬ，Ｕｙｓａｌ  Ｓ，Ｓｌｉｗｉｎｓｋｉ  Ｍ，Ｅｒｇｉｎ  ＭＡ，Ｋａｈｎ  ＲＡ，Ｋｏｎｓｔａｄｔ  ＳＮら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；１１７：１５６−６３を参照のこと）。神経損傷（壊死および遅延神経死を含む）は、これらの神経学的損傷の一つの原因である。本発明による処置では、神経学的事象は、ラットにおいて示されず、組織学的研究は、脳切片において梗塞形成領域を示さなかった。コントロール群における虚血後７日のラットは、全て生存しているにもかかわらず、ＮＦ−κＢデコイ群にラットと比較して、学習能力が低下していたことが結論づけられた。神経損傷を和らげることに関して、超低体温に加えて多くの方法が報告されている（Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｊｏｎａｓ  ＲＡ，Ｎｏｍｕｒａ  Ｆ，Ｓｔｒｏｍｓｋｉ  ＭＥ，Ｔｓｕｊｉ  ＭＫ，Ｈｉｃｋｅｙ  ＰＲら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１９９４；１０８：２９１−３０１を参照のこと）。しかし、これらの報告は、主にエネルギー要求および代謝の調節に集中し、そして一般的に臨床的な成功を証明することに失敗した。従って、他のメカニズムに基づく代替的方法（虚血再灌流損傷に関する遺伝子発現の調整など）が求められていた。本発明の方法はこのような課題をも解決した。
最近の報告では、アポトーシスが、循環停止後の遅延神経損傷において重要な役割を果たし得ることを示されている（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ，Ｄｅｓｈｕｍｕｋｈ  Ｍ，Ｄ’Ｃｏｓｔａ  Ｍ，Ｄｅｍａｒｏ  ＪＡ，Ｇｉｄｄａｙ  ＪＭ，Ｓｈａｈ  Ａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；１０１：１９９２−９；およびＫｕｒｔｈ  ＣＤ，Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ  Ｍ，Ｇｏｌｄｅｎ  Ｊ，ＭｃＣａｎｎ  Ｊ，Ｒａｇｈｕｐａｔｈｉ  Ｒ．，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；１１８：１０６８−７７を参照のこと）。多くの分子シグナル（炎症関連サイトカインおよび接着分子を含む）がアポトーシスに関連する。これらの炎症関連因子は、ＮＦ−κＢの転写活性化によって主にアップレギュレートされる。このＮＦ−κＢは、酸化ストレス反応性分子である。サイトカインｍＲＮＡ（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βなど）レベルの調節が、直接神経損傷をブロックするかどうかは明らかではない。しかし、最小で、これらの炎症サイトカインは、虚血関連神経損傷の一因となる。本発明は、ＮＦ−κＢが全脳虚血後の虚血再灌流損傷および神経損傷の減衰において重要な役割を果たし得ることを実証した。ＴＵＮＥＬ染色は、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡの修復を示し得る非特異的技術であり、そして壊死細胞においてでさえ陽性であり得る。従って、さらに他の検査を行った。本発明において、組織学的実験を行ったところ、全脳虚血後の２日でＴＵＮＥＬ陽性ニューロンが、総ニューロン中約１５％（全脳虚血後の７日のＴＵＮＥＬ陽性ニューロンより少ない）であることが実証された。神経損傷（壊死および遅延神経死の両方を含む）は、全脳虚血後の少なくとも２日と７日の間で生じる。
さらに、ＮＦ−κＢは、多くの経路を介して働くと推測され、そしてこれらの経路はまた、全脳虚血後の神経損傷と関連し得る。これらのメカニズムには、以下が包含される：（１）ＮＦ−κＢ活性化は、多くの組織（脳を含む）においてフリーラジカル損傷を部分的に媒介すること（Ｓｃｈｒｅｃｋ  Ｒ，Ｒｉｅｂｅｒ  Ｐ，Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９１；１０：２２４７−５８を参照のこと）；（２）ＮＦ−κＢ活性化は、グルタミン酸細胞毒性の原因となると思われること（Ｇｒｉｌｌｉ  Ｍら、１９９６、前出を参照のこと）；（３）ＮＦ−κＢは、誘導硝酸シンターゼおよびサイクロオキシゲナーゼ２のアップレギュレーションにおいて機能すること（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋ，Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｄ，Ｒｉｅｈｅｍａｎｎ  Ｋ，Ｗｅｓｓｅｌｂｏｒｇ  Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９７；１９８：３５−４９を参照のこと）；ならびに（４）ＮＦ−κＢは、遅延神経損傷を起こすＣＤ９５リガンドの活性化を媒介し得ること（Ｖｏｇｔ  Ｍ，Ｂａｕｅｒ  ＭＫ，Ｆｅｒａｒｒｉ  Ｄ，Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２９：６７−７２を参照のこと）。これらのメカニズムは、全てＮＦ−κＢデコイＯＤＮ方法の可能な標的である。従って、本発明は、上記の少なくとも１つのメカニズムに作用することによって神経損傷を処置および予防する組成物および方法を提供する。
さらに、ＮＦ−κＢに対する標的遺伝子は、アポトーシス関連遺伝子（ＴＰ５３（Ｗｕ  Ｈ，Ｌｏｚａｎｏ  Ｇ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９：２００６７−７４を参照のこと）およびｃ−ｍｙｃ（ＬａＲｏｓａ  ＦＡ，Ｐｉｅｒｃｅ  ＪＷ，Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ＧＥ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：１０３９−４４を参照のこと）を含む）を含む。従って、ＮＦ−κＢ結合部位に接するデコイＯＤＮを使用する本発明の遺伝子治療は、炎症応答に関する遺伝子発現および次いで神経損傷（アポトーシスを含む）を抑制することで虚血中の神経保護に対する新しい戦略を提供する。
多くの研究者は、脳保護のために遺伝子治療を使用することについての戦略を報告した（Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｙ，Ｓａｉｔｏｈ  Ｙ，Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｋｏｈｍｕｒａ  Ｅ，Ｙｏｓｈｉｍｉｎｅ  Ｔ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：７５９−６３；およびＯｎｏ  Ｓ，Ｄａｔｅ  Ｉ，Ｏｎｏｄａ  Ｋ，Ｓｈｉｏｔａ  Ｔ，Ｏｈｍｏｔｏ  Ｔ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ  Ｙら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；１０：３３５）を参照のこと）。これらの報告において、遺伝子は、クモ膜下の空間または脳室に注入された。しかし、研究は、頸動脈を介する注入による効果的な遺伝子トランスフェクションを示さなかった。これは、血液脳関門が、多くの外来物質および微生物の侵入を防ぐためである。しかし、全脳虚血中および後、血液脳関門を介する透過性が増大し；事実、血液脳関門の軽減が、虚血後６時間まで継続することが報告された（Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｅ，Ｆｏｓｔｅｒ  ＤＯ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９７：７６１：４−１０を参照のこと）。本発明者らは、ニューロンをデコイＯＤＮでトランスフェクションすることにおける本発明者らの成功は、脳組織におけるＨＶＪ−リポソーム複合体の累積のためであると考える。本発明者らの知識の及ぶ限りでは、これは、頸動脈を介するおよび血液脳関門を横切る遺伝子トランスフェクションの成功した最初の報告である。このような効果は、従来技術では達成できなかった、患者により安全でかつ快適な治療を提供するものである。
デコイ治療は、多くの利益（即時効果、低コスト、およびほとんどない合併症を含む）を有し、そして裸のＥ２Ｆデコイを用いる遺伝子治療は、静脈移植疾患を予防するために臨床的設定ですでに試みられている（Ｍａｎｎ  ＭＪ．Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ  ＡＤ，Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ＭＣ，Ｂｅｌｋｉｎ  Ｍ，Ｃｏｎｔｅ  ＭＳ，Ｐｏｌａｋ  ＪＦら、，Ｌａｎｃｅｔ．１９９９：３５４：１４９３−８を参照のこと）。しかし、本発明において、頸動脈を介する裸のＯＤＮのトランスフェクションは、脳においてその有効性に限定があることから、より安全なベクターが利用され得る。従って、頸動脈を介するＨＶＪ−リポソームまたは他のベクターを用いたＮＦ−κＢデコイ治療の臨床的適用は、循環停止中の虚血損傷からの脳保護に有用である。脈管を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮ治療は、脳保護のための臨床的使用において広い適用（大脳麻痺の逆行再灌流など）の可能性を有し得る。
要約すると、本発明の結果は、全脳虚血中のＮＦ−κＢデコイＯＤＮの投与が、ラットモデルにおいて海馬ＣＡ１領域における神経損傷を和らげることを示す。従って、頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮ投与は、全脳循環停止中のニューロンを保護し得、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮが、全体的虚血から脳を保護するための将来有望な治療的薬剤になり得る可能性を掲げる。本発明では、脳に対する遺伝子トランスフェクションのこの方法は、心臓外科の分野以外にも、神経外科・脳外科のような他の分野においても適用可能であることが実証されたことになる。このように、デコイの脳神経分野での応用が示されたことは顕著な効果であり、その有用性は筆舌に尽くしがたい。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
（実施例１：ＨＶＪウイルス−リポソーム複合体の調製）
ＨＶＪ−リポソーム複合体を、文献に記載のように調製した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｋｉｄａ  Ｉ，ＴｏｍｉｔａＮ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａら、，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９７；３：８９４−９）。概略をいうと、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を、１：４：８：２の重量比で混合した。この脂質混合物（１０ｍｇ）を、ロータリーエバポレーターで溶媒（テトラヒドロフラン）を除去することでフラスコの側面に沈殿させた。乾燥した脂質を、２００μｇのＯＤＮを有する２００μＬの生理的食塩水で水和した。リポソームを、振とうおよび音波破壊で調整した。リポソーム懸濁液（１０ｍｇの脂質を含有する０．５ｍＬ）を、総容量４ｍＬの生理的食塩水中で不活化したＨＶＪ（１００００血球凝集ユニット）と混合した。混合物を、４℃、５分でインキュベートし、次いで穏やかな振とうで３０℃で３０分インキュベートした。自由ＨＶＪを、密度勾配遠心分離によってＨＶＪ−リポソームから除去した。スクロース勾配の最上層を、使用するために収集した。ホスホロチオエートＯＤＮの配列は、以下：ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ、５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１）、および３’−ＧＧＡＡＣＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧ−５’（配列番号７）；スクランブルデコイ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｄｅｃｏｙ）ＯＤＮ、５’−ＴＴＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＣ−３’（配列番号８）、および３’−ＡＡＣＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＧＧ−５’（配列番号９）である。
（実施例２：全脳虚血モデルの作製およびモデル作製の評価）
本発明者らは、鎖骨下頸動脈の閉塞技術の改変技術を使用して、ラット全脳虚血−再灌流モデルを樹立した（Ｔｏｒｒｅ  ＪＣ，Ｆｏｒｔｉｎ  Ｔ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．１９９１；２６：３６５−７２．）。３００ｇ〜５００ｇ体重の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。全ての動物は、大阪大学医学部動物施設（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）が作成した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」に従って世話をした。各ラットに、５０ｍｇ／ｋｇペントバルビタール腹腔内投与で麻酔をかけ、そして口に挿管した。齧歯類用換気機を３５ｍｍＨｇのＰＣＯ２を維持するように１０ｍＬ／ｋｇ容量および５０〜６０ストローク／分で取りつけた。実験中、ラットは、脳以外の部分を加熱ブランケットで３６℃に保温した。開胸後、胸腺の左葉を除去した。その大動脈弓を同定し、そして無名動脈、左総頸動脈、および左鎖骨下動脈を、５０ナイロン縫合糸で縫合した。右総頸動脈を、首の中で曝露しそしてポリエチレンチューブ（ＰＥ１０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）のカニューレを挿入した。全脳虚血を、全ての３縫合動脈を２０分間クランプすることで誘導した。
（実施例３：脳虚血中のＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドのトランスフェクション）
動脈をクランプした後直ぐに、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ（ＮＦデコイ群）またはスクランブルデコイＯＤＮ（Ｓデコイ群）のいずれかを含むＨＶＪ−リポソーム複合体を、脳組織に行き渡らせるために右頸動脈に注入した。これらの薬物を、４℃で保管し、そして１動物当たり２ｍＬを注入した。この手法において咽頭温度は、３５．２℃±０．２℃から３３．１℃±０．５℃へ低下した。神経学的事象は、外科的手法後のいずれの動物においても観察されなかった。
全体的虚血−再灌流脳を、３つの方法で評価した。初めに、３匹のラットを再灌流後１時間で屠殺し、そして脳切片を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したＯＤＮ送達のトランスフェクションを蛍光顕微鏡で観察することにより検査した。次に、各群から５匹のラットを、再灌流後１時間で屠殺し、そしてＣＡ１領域を含む海馬を収集して、ＮＦ−κＢによって活性化されることが知られるメッセンジャーＲＮＡの発現に対するトランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイＯＤＮの効果を試験した。血管を剥ぎ取った後、サンプルは２０ｍｇ〜２５ｍｇの重量であった。第３に、各群から１０匹のラットを、全脳虚血後７日で屠殺し、神経損傷を調査するため末端デオキリヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色または微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）による免疫組織化学による組織学検査を行った。
（インビボでの全脳虚血中の頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクション）
本発明者らの予備的な研究において、本発明者らは、全脳虚血中に、いずれのベクターも使用せず裸のＦＩＴＣ−標識ＮＦ−κＢ  ＯＤＮを頸動脈に注入した。しかし、この方法を使用することによって、蛍光は、脳組織中に検出されなかった（データは示さない）。次に本発明者らは、脳組織中にＮＦ−κＢデコイＯＤＮをトランスフェクトするためのＨＶＪ−リポソーム方法を使用することを試みた。再灌流後１時間で、試験された全てのラットにおいて、本発明者らは、ＦＩＴＣ標識ＯＤＮを有する細胞のトランスフェクションを、内膜動脈においでだけでなく、ニューロン（特に皮質および海馬のニューロン）においてもまた観察した（図１）。蛍光は、主に細胞核に対して局在された。従って、本発明者らのモデルにおいて、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮを、全脳虚血中に血液脳関門を介して脳組織へトランスフェクトし得た。
（結果）
全脳虚血中の頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドのラット脳神経への導入は、明らかに成功した。ポリメラーゼ連鎖反応は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全脳虚血後１時間で効果的に腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、および細胞内接着分子１  メッセンジャーＲＮＡの発現を阻害することを示した。末端デオキリヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識染色および微小管結合タンパク質２免疫組織化学は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全脳虚血後７日で、有意に神経損傷を和らげることを示した。
（海馬におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡの定量）
次に、本実施例では海馬におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡの定量を行った。
本発明者らは、実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを使用して、再灌流後１時間でＮＦ−κＢのシグナルに応答することが知られる遺伝子の発現に対する、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ対ＳデコイコントロールＯＤＮのインビボでのトランスフェクションの効果を調査した。この技術をもちいることにより、相補ＤＮＡ増幅の定量を行った。蛍光ベースの実時間ＰＣＲ次いでＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を用いた増幅の測定を含む。
概略すると、総ＲＮＡを、メーカーの指示（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して各２０ｍｇ〜２５ｍｇ海馬サンプルから精製した。そのＲＮＡサンプルを、液体窒素で凍結し、そして使用まで−８０℃で保管した。遺伝子転写に対する試験をするため、２μｇのＲＮＡを、メーカーによって推奨される総容量４０μＬで、ＲＮａｓｅ−Ｈ−陰性  モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ２、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡの１／８０を、各ＰＣＲ反応のため使用し、そして各転写の測定を、３倍で実施した。実時間ＰＣＲの技術は、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エンドヌクレアーゼ活性による各増幅サイクルで特異的蛍光プローブの加水分解に基づく。この技術は、いくらかの改変を有するが、Ｄｅｐｒｅら（Ｄｅｐｒｅ  Ｃ，Ｓｈｉｐｌｅｙ  ＧＬ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｈａｎ  Ｑ，Ｄｏｅｎｓｔ  Ｔ，Ｍｏｏｒｅ  Ｍら、，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８；４：１２６９−７５を参照のこと）によって記載されたように実施される。フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
2003082331.tif 000003
2003082331.tif 000004
ここでアッセイされた各分子に対して、プライマー対、または少なくとも１つのプライマーもしくはプローブを、１つ以上のイントロンをまたぐように設計し、それによってｍＲＮＡのみを測定した。事実、ゲノムＤＮＡを標的として使用する場合、いずれの分子に対してもシグナルは検出されなかった。プライマーおよびプローブを、各ＰＣＲ反応において２００ｍｍｏｌ／Ｌで使用し、そしてＰＣＲを、９５℃での１５秒変性工程および６０℃での１分アニーリング工程の５０サイクルで実施した。各測定において生じる標準曲線の相関係数は、いつも０．９７またはそれよりも良く、そして３倍のサンプルにおける変動係数は、通常１０％以下であった。分光測定法を用いたＲＮＡ濃度の測定において精度の相対的に不足していたことから、細胞性酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）による転写のレベルを、各サンプルにおいて内部コントロールとして量的に測定した。ＧＡＰＤＨプライマーおよびプローブ配列は、以下のとおりであった：
2003082331.tif 000005
2003082331.tif 000006
ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ値を、各サンプルに対して計算し、次いで正常のラットｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨレベルと比較した誘導値を算出した。
（結果）
（海馬におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡ発現）
ＮＦデコイ群において、再灌流後１時間でのＴＮＦ−αをコードする遺伝子の発現の誘導率の倍率は、正常細胞における速度と比較して２．８±１．１であり、ところがＳデコイ群において誘導率の倍率は、１２．５±２．２であった。再灌流後１時間でのＩＬ−１βおよびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡ発現の誘導率の倍率は、それぞれ、ＮＦデコイ群においては４．７±１．７および３．５±０．５、ならびにＳデコイ群においては１４．０±７．５および２５．７±１２．０であった（図２）。これらの３遺伝子の発現は、ＮＦ−κＢによって活性化され、そして頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクションによって効果的に抑制される（それぞれ、Ｐ＝０．０１、Ｐ＝０．０１、およびＰ＝０．１）。これらのデータは、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイＯＤＮが、海馬中の虚血再灌流損傷におけるＮＦ−κＢに関する遺伝子発現を効果的にブロックすることを実証した。
（実施例４：海馬ＣＡ１領域におけるＮＦ−κＢデコイＯＤＮによる神経損傷の遮断）
次に、本実施例において、海馬ＣＡ１領域におけるＮＦ−κＢデコイＯＤＮによる神経損傷の遮断を組織化学的に評価した。
（ＴＵＮＥＬ染色および免疫組織化学）
全脳虚血後１週間で正常なマウスにおいて、特に海馬のＣＡ１領域において虚血損傷が検出され得、そしてＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンの数が増加することが分かっている（Ｊｏｎａｓ  ＲＡ．Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ，ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ａｒｒｅｓｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒａｉｎ．ＪＣａｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｖａｓｃ  Ａｎｅｓｔｈ．１９９６；１０：６６−７４）。ＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンの存在は、直接アポトーシスの発生を示さないが、ＤＮＡ損傷を示す。ＭＡＰ２の発現レベル（細胞骨格性タンパク質は、虚血損傷のマーカーで、そしてその発現において減少する）を、全脳虚血後に観察した（Ｖａｎｉｃｋｅｙ  Ｉ，Ｂａｉｃｈｅｎ  Ｔ，Ｄｉｅｍｅｒ  ＮＨ，，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．１９９５；７：１６１−４）。神経虚血損傷に対して、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクトの効果を評価するために、脳を、速やかに液体窒素で凍結し、そして海馬の吻側尾側の（ｒｏｓｔｒｏｃａｕｄａｌ）伸長を介して環状に切断する。ＴＵＮＥＬ染色に対して、５μｍ切片を、１％パラホルムアルデヒド中に固定する。ＴＵＮＥＬ染色を、メーカーにより推奨されるようにＡｐｏｐＴａｇ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）を用いて実施した。反応産物を、３、３’−ジアミノベンジジンおよびＨ２Ｏ２を用いた展開によって視覚化した。ＴＵＮＥＬ染色した脳切片を、またヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。次いで、各ラットにつき３切片についてＣＡ１領域（５００μｍ長）においてＴＵＮＥＬ陽性であるニューロンの総数のパーセンテージを算出した。
免疫組織化学を、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼシステム（ＡＢＣ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ）を使用することで脳切片に対して実施した。５μｍ切片を、２％パラホルムアルデヒド中に固定し、そしてモノクローナルＭＡＰ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）と共に一晩４℃でインキュベートした。切片を、メーカーの推奨に従ってＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼシステムを使用して染色した。反応産物を、３、３’−ジアミノベンジジンおよびＨ２Ｏ２を用いた展開によって視覚化し、これらの切片をまたヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。ＭＡＰ２−陽性ニューロンの数を、各ラットにつき３切片についてＣＡ１領域（５００μｍ長）において計数した。
（統計解析）
データを、平均±標準偏差として示した。２群間の統計学的有意差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテストで計算した。
（結果）
（海馬ＣＡ１領域におけるＮＦ−κＢデコイＯＤＮによる神経損傷の遮断）
次に、全脳虚血後７日で組織学的に評価して、脳組織を、神経損傷に対するＮＦ−κＢデコイＯＤＮの保護効果を測定した。ＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンを、両半球において検出し、右半球において神経損傷を評価した。
ＮＦデコイ群において、全脳虚血後７日で、Ｓデコイ群と比較してＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンはより少なくなった（ＮＦデコイ群において、１１．３％±１３．１％、Ｓデコイ群において、４０．３％±１８．０％、Ｐ＝０．００３；図３）。ＭＡＰ２−陽性ニューロンの数は、Ｓデコイ群においてよりもＮＦデコイ群において高くなった（ＮＦデコイ群において、９６．４±３３．０細胞／５００μｍ長、Ｓデコイ群において、５０．６±２３．８細胞／５００μｍ長、Ｐ＝０．００５；図４）。これらのデータは、頸動脈を介してＮＦ−κＢをニューロンにトランスフェクトすることが、全脳虚血後の神経損傷を和らげたことを示す。
（結論）
脳虚血中のＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドの治療的トランスフェクションは、神経損傷を和らげるために有効であり、脳虚血に対する大脳および神経の保護に有効であることが示された。
（実施例５：他のデコイの頸動脈への投与による脳内遺伝子トランスフェクション）
次に、他の遺伝子でも脳血液関門を通過した後に脳内で遺伝子トランスフェクションが行われることを実証するために、例として、ＳＴＡＴ−１のデコイ（５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号２））、ＧＡＴＡ−３のデコイ（５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号３））、ＳＴＡＴ−６のデコイ（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号４））、ＡＰ−１のデコイ（５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号５））およびＥｔｓのデコイ（５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号６））を用いた。
上記デコイについて、実施例１の記載に従って、ＨＶＪウイルス−リポソーム複合体を調製した。
本発明者らは、全脳虚血中に、いずれのベクターも使用せず裸のＦＩＴＣ−標識した上記各デコイＯＤＮを頸動脈に注入した。しかし、この方法を使用しても、蛍光は、脳組織中に検出されなかった（データは示さない）。次に本発明者らは、脳組織中に上記各デコイＯＤＮをトランスフェクトするためのＨＶＪ−リポソーム方法を使用することを試みた。再灌流後１時間で、試験された全てのラットにおいて、本発明者らは、ＦＩＴＣ標識ＯＤＮを有する細胞のトランスフェクションを、内膜動脈においでだけでなく、ニューロン（特に皮質および海馬のニューロン）においてもまた観察した（データは示さない）。蛍光は、主に細胞核に対して局在された。従って、本発明者らのモデルにおいて、ＮＦ−κＢ以外の上記各デコイＯＤＮでも、全脳虚血中に血液脳関門を介して脳組織へトランスフェクトし得ることが明らかになった。
本実施例は、どのようなデコイでも、血液脳関門を介した脳内トランスフェクションが可能であることを実証した。
産業上の利用可能性
デコイを用いて脳における虚血に起因する疾患または障害を処置または予防する薬学的組成物が提供される。本発明の薬学的組成物の脳以外での投与によって脳での遺伝子トランスフェクションを達成したことは、非侵襲的であって、繰り返し可能な脳の治療および予防の方法を提供し得る。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、再灌流後１時間でのＦＩＴＣで標識したＮＦ−κＢデコイＯＤＮでトランスフェクトしたラット組織の顕微鏡写真を示す。ＦＩＴＣ蛍光が全体に観察され、そして脳全体のニューロン中の核内で観察することができた。Ａはラット皮質切片、Ｂは海馬を表す。Ａ−１およびＢ−１は、４０倍での写真を示し、Ａ−２およびＢ−２は、１００倍での写真を示す。
図２は、再灌流後１時間でのラット海馬でのｍＲＮＡの誘導率を示すグラフである。これらのｍＲＮＡのレベルは、各々のサンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して正規化した。誘導率は、正常ラット海馬でのレベルと本発明での処置されたもののレベルを比較することによって算出した。ＡはＴＮＦ−αｍＲＮＡを示し、ＢはＩＬ−１β  ｍＲＮＡを示し、ＣはＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡを示す。すべての値は、ＮＦ−κＢデコイ群において、Ｓデコイ群よりも有意に抑制されていた。
図３Ａは、全脳虚血後７日でのＴＵＮＥＬ染色を伴うラット海馬ＣＡ１領域を貫く切片を示す写真である。ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ治療（Ａ−１）は、Ｓデコイ群（Ａ−２）と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性ニューロン（茶色に染まる）の出現を抑制した。倍率は、Ａ−１およびＡ−２とも１００倍である。図３Ｂは、海馬ＣＡ１領域でのＴＵＮＥＬ陽性ニューロンの割合を示すグラフである（５００μｍ長）。ＴＵＮＥＬ陽性ニューロンの割合は、Ｓデコイ群（ｐ〈０．０１）よりも、ＮＦ−κＢデコイ群において、有意に減少していた。
図４Ａは、全脳虚血後７日でのＭＡＰ２免疫染色を伴うラット海馬ＣＡ１領域を貫く切片を示す写真である。ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ治療（Ａ−１）は、Ｓデコイ群（Ａ−２）と比較して、ＭＡＰ２陽性ニューロン（細胞質ゾルにおける免疫反応なし）の出現を抑制した。倍率は、Ａ−１およびＡ−２とも１００倍である。図４Ｂは、海馬ＣＡ１領域でのＭＡＰ２陽性ニューロンの割合を示すグラフである（５００μｍ長）。ＭＡＰ２陽性ニューロンの割合は、Ｓデコイ群（ｐ〈０．０１）よりも、ＮＦ−κＢデコイ群において、有意に維持されていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月11日(2005.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【特許請求の範囲】  
【請求項１】
脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための薬学的組成物であって、
少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項２】
前記疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記薬学的に受容可能なキャリアがリポソームである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
頸動脈を介する投与経路に適切である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行うための組成物であって、
少なくとも１つのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項８】
前記脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記デコイは、ＮＦ−κＢのデコイである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記薬学的に受容可能なキャリアはリポソームである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための方法であって、
少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬学的に受容可能なキャリアがリポソームである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
頸動脈を介する投与経路に適切である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行う方法であって、
少なくとも１つのデコイ、および
薬学的に受容可能なキャリアを、脳への直接投与以外の経路に適切な形態で含む、組成物、を被検体に投与する工程、
を、包含する、方法。
【請求項１８】
前記脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記デコイは、ＮＦ−κＢである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬学的に受容可能なキャリアはリポソームである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、転写調節因子が結合する部位と特異的に結合する化合物（例えば、核酸およびその類似体）を含む組成物およびその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、脳虚血障害を処置するためのデコイ化合物（例えば、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）デコイ）を含む組成物およびその使用方法に関する。本発明はまた、脳以外の経路により投与することにより脳に遺伝子トランスフェクションを行う方法およびそのための組成物を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
喘息、癌、心臓病、動脈瘤、自己免疫疾患およびウイルス感染症などの種々の疾患は、それぞれ異なる症状を示すにもかかわらず、その大部分は、１種類または数種類のタンパク質が、異常発現（過剰発現または過少発現）したことに起因することが示唆されている。一般に、これらタンパク質の発現は、種々の転写活性因子および転写抑制遺伝子などの転写調節因子によって制御されている。
【０００３】
ＮＦ−κＢは、炎症および免疫などに重要である遺伝子産物をコードする遺伝子のそのような転写因子の１つである（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ．ら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１２：１４１−７９）。ＮＦ−κＢは、種々の細胞外シグナルに応答して、細胞質から核に迅速にトランスローケートし、そしていくつかのサイトカインおよび接着分子遺伝子の調整されたトランス活性化で中心的な役割を演じる。Ｃｏｏｐｅｒらは、心臓同種異系移植物モデルにおける拒絶の３日前にピークとなるＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性の時間依存的増加を示した（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  １９９８  Ｏｃｔ  １５；６６（７）：８３８−４４）。しかし、ＮＦ−κＢの強力なインヒビターであるＰＤＴＣの投与は、このモデルにおいてＮＦ−κＢ活性のピークを低減して移植物の生存を顕著に延長した。
【０００４】
ヒトＮＦ−κＢの通常の活性形態は、２つのＤＮＡ結合性サブユニット、５０ｋＤａサブユニット（ｐ５０）および６５ｋＤａサブユニット（ｒｅｌＡまたはｐ６５）からなるヘテロダイマーである（Ｌｅｎａｒｄｏ、Ｃｅｌｌ．  １９８９  Ｊｕｌ  ２８；５８（２）：２２７−９；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９０  Ｍａｙ；１０（５）：２３２７−３４；Ｓａｔｒｉａｎｏ  Ｊ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９４  Ｏｃｔ；９４（４）：１６２９−３６；Ｎｅｉｓｈ  ＡＳら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９２  Ｄｅｃ  １；１７６（６）：１５８３−９３）。刺激を受けていない細胞では、ＮＦ−κＢは、ＩκＢとして知られる阻害分子に結合して細胞質内に隠れている。細胞刺激の後、ＩκＢは、リン酸化され、そして急速に分解される。次いでＮＦ−κＢは、ＩκＢから放出され、この転写因子の核へのトランスローケーションを可能にし、そこで、それは、種々のＤＮＡ認識部位に結合することにより遺伝子発現を調節する（Ｂａｅｕｒｅｒｌｅ、１９９４、前出）。この複合体からの転写因子ＮＦ−κＢの解離が、インターロイキン（ＩＬ）−１、−６、および−８；細胞内接着因子；血管細胞接着因子；および内皮細胞接着分子を含む遺伝子の調整されたトランス活性化を誘導することによって、炎症変化の調節で中心的役割を演じることが示唆されている（Ｌｅｎａｒｄｏ、１９８９  前出；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ、１９９０  前出；Ｓａｔｒｉａｎｏ  Ｊ、１９９４  前出；Ｎｅｉｓｈ、１９９２  前出）。従って、ＮＦ−κＢをブロックすることは、心筋における遺伝子仲介性の虚血再還流を減衰し得る。
【０００５】
ＮＦ−κＢは、腫瘍悪性度の進行の開始に関与し得る（Ｒａｙｅｔ  Ｂら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９９  Ｎｏｖ  ２２；１８（４９）６９３８−４７）；ＮＦ−κＢは、低酸素症ストレスに対する腫瘍細胞の応答に関与する（Ｒｏｙｄｓ  ＪＡら、Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８  Ａｐｒ；５１（２）：５５−６１）；ＮＦ−κＢは、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞におけるサイトカインおよび接着分子の発現を阻害する（Ｔｏｍｉｔａ  Ｔら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）  ２０００  Ｊｕｌ；３９（７）：７４９−５７）；ＮＦ−κＢを含む複数の転写因子間の協力作用の抑制は、種々の癌の悪性表現型を変える（Ｄｅｎｈａｒｄｔ  ＤＴ、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇ  １９９６；７（３−４）：２６１−９１）；緑茶ポリフェノールによるＮＦ−κＢ活性のダウンレギュレーションは、一酸化窒素合成酵素の誘導をブロックし、Ａ４３１ヒト類表皮癌細胞を抑制する（Ｌｉｎ  ＪＫら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９９  Ｓｅｐ  １５；５８（６）：９１１−５）；アルツハイマー病患者の脳で見られるアミロイドβペプチドは、神経芽腫細胞において、７５ｋＤ神経栄養因子レセプター（ｐ７５ＮＴＲ）に結合することにより、ＮＦ−κＢを時間依存性様式および用量依存性様式で活性化する（Ｋｕｐｅｒ  Ｐら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  １９９８  Ｄｅｃ  １５；５４（６）：７９８−８０４）；ＴＮＦαは、糸球体腎炎の発症に重要な役割を演じる（Ａｒｄａｉｌｌｏｕら、Ｂｕｌｌ  Ａｃａｄ  Ｎａｔｌ  Ｍｅｄ  １９９５  Ｊａｎ；１７９（１）１０３−１５）。
【０００６】
ＮＦ−κＢに対する転写因子デコイは、ＴＮＦαで誘導されるマウス腎炎においてサイトカインおよび接着分子の発現をインビボで阻害する（Ｔｏｍｌｔａ  Ｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００  Ａｕｇ；７（１５）１３２６−３２）；など。
【０００７】
ＮＦ−κＢは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のメンバー、ＭＭＰ１およびＭＭＰ９を転写レベルで抑制することが示唆された（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ  Ｗ、  Ｈｕｗｉｌｅｒ  Ａ、  Ｂｅｃｋ  ＫＦ、  Ｗａｌｐｅｎ  Ｓ、  Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ  Ｊ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｎｏｖ  １５、１６５（１０）、５７８８−９７; Ｍ、Ｂａｋｅｒ  ＡＨ、  Ｎｅｗｂｙ  ＡＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｂｏｎｄ  １９９９  Ｏｃｔ  ２２、２６４（２）、５６１−７；Ｂｏｎｄ  Ｍ、  Ｆａｂｕｎｍｉ  ＲＰ、  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ、  Ｎｅｗｂｙ  ＡＣ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９８  Ｓｅｐ  １１、４３５（１）、２９−３４；およびＫｉｍ  Ｈ、Ｋｏｈ  Ｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０００  Ｍａｒ  １６、２６９（２）、４０１−５）。ＭＭＰは、細胞外マトリックス成分の分解に関与する亜鉛依存性酵素の多遺伝子ファミリーである。
【０００８】
ＭＭＰは、細胞外マトリックスタンパク質の分解を仲介することにより癌細胞侵入において重要な役割を果たす。多くの癌研究によって、ＭＭＰおよびＭＭＰのインヒビター（ＴＩＭＰ）が、癌の進行に関与することが示唆されている：血清中のＴＩＭＰ１レベルは、結腸直腸の予後および診断マーカーとなり、そして転移性癌の選択的マーカーとして用い得る（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｌ  Ｐら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０００  Ｓｅｐ；４９（７）：３８８−９４）；ヒト膀胱癌細胞中のＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現および活性は、腫瘍壊死因子αとγインターフェロンの影響を受ける（Ｓｈｉｎ  ＫＹら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２０００  Ｏｃｔ  ３１；１５９（２）：１２７−１３４）；卵巣上皮腫瘍で、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＴ１−ＭＭＰ、およびそれらのインヒビターＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２が発現する（ＳａｋａｔａＫら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２０００  Ｏｃｔ；１７（４）：６７３−６８１）；ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３およびＭＭＰ９の各々のレベルおよび総ＭＭＰ活性は、結腸直腸腫瘍でアップレギュレートし、ＭＭＰ１が結腸直腸癌進行に最も重要である（Ｂａｋｅｒ  ＥＡら、Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２０００  Ｓｅｐ；８７（９）：１２１５−１２２１）；活性化されたＭＭＰ２が、尿路上皮癌の浸潤に重要な役割を演じ、しかも活性化されたＭＭＰ２発現のレベルが有用な予後指標となる（Ｋａｎｅｄａ  Ｋら、ＢＪＵ  Ｉｎｔ  ２０００  Ｓｅｐ；８６（４）：５５３−５５７）；プロスタグランジン合成のインヒビターが、ヒト前立腺腫瘍細胞浸潤を阻害し、かつＭＭＰの放出を低減する（Ａｔｔｉｇａ  ＦＡら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００  Ａｕｇ  １５；６０（１６）：４６２９−３７）；血清真性グロブリン画分中のＭＭＰ活性が、乳癌および肺癌患者で増加し、これら癌の腫瘍マーカーとして用い得る（Ｆａｒｉａｓ  Ｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０００  Ｊｕｌ  ２０；８９（４）：３８９−９４）；ＭＭＰインヒビターは、腫瘍細胞におけるゼラチン分解活性を阻害する（Ｉｋｅｄａ  Ｍら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００  Ａｕｇ；６（８）：３２９０−６）；膜タンパク質ＬＭＰ１によるＭＭＰ９の誘導が、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の転移性に寄与する（Ｈｏｒｉｋａｗａ  Ｔら、Ｃａｎｅｒ  ２０００  Ａｕｇ  １５；８９（４）：７１５−２３）；ＭＭＰは、血管形成の初期に重要な役割を演じ、ＭＭＰインヒビターがヒト微小血管内皮細胞浸潤および形態形成を抑制する（Ｊｉａ  ＭＣら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２０００；４７６：１８１−９４）；浸潤性および再発性下垂体腺腫および下垂体癌においてＭＭＰ９が発現する（Ｔｕｒｎｅｒ  ＨＥら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０００  Ａｕｇ；８５（８）：２９３１−５）；など。
【０００９】
ＭＭＰはまた、大動脈瘤の進展に関与することが知られている：ＭＭＰは、脳動脈瘤形成および破壊に関与する（Ｇａｅｔａｎｉ  Ｐら、Ｎｅｕｒｏｌ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｊｕｎ；２１（４）：３８５−９０）；ＭＭＰ−９プロモーターは、脳動脈瘤のリスクファクターである（Ｐｅｔｅｒｓ  ＤＧは、Ｓｔｒｏｋｅ  １９９９  Ｄｅｃ；３０（１２）：２６１２−６）；ＭＭＰの阻害は、動脈瘤モデルにおいて、小動脈瘤の成長の阻害をもたらす（Ｔｒｅｈａｒｎｅ  ＧＤは、Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  １９９９  Ａｕｇ；８６（８）：１０５３−８）；など。  ＭＭＰは、遊走血管平滑筋細胞、マクロファージなどから分泌され、血管壁に存在するコラーゲン、エラスチンなどを破壊し、これによって血管の緊張が失われ、血圧に抵抗しきれずに血管径は拡張する。事実、動脈瘤の血管では、顕著なエラスチンの破壊が認められる。
【００１０】
３５才から８０才までの成人男性の大動脈径を測定したデータによると、その平均は１．５ｃｍ〜２．０ｃｍであった。一般に、大動脈径が、平均値の１．５倍を超えると大動脈瘤と判断されるが、上記データによれば、直径３ｃｍ以上の瘤を有し、大動脈瘤と判断されるヒトは、４００人に１人の割合で存在していた。従って、大動脈破裂の危険度は別にして、３５才から８０才までの成人男性において大動脈瘤の有病率はかなり高く、６５才以上の高齢者においては有病率はさらに大きくなると考えらている。
【００１１】
ＭＭＰインヒビターは、ラット腹部大動脈瘤モデルにおいて、血管径の拡張を抑制することが報告されている。ＭＭＰインヒビターはまた、糸球体腎炎の治療に用いられ得る（Ｍａｒｔｉ  ＨＰ、Ｓｃｈｗｅｉｚ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ｍａｙ  ２７；１３０（２１）；７８４−８）。しかし、ＭＭＰインヒビターの全身投与は、重篤な副作用を生じ、上記種々の疾患の処置（治療および予防）するための臨床適用は困難である。
【００１２】
「デコイ化合物」ｃｉｓ−エレメントとしての合成ＯＤＮは、目的遺伝子のプロモーター領域への核因子の結合をブロックし、インビトロおよびインビボアッセイ系における遺伝子トランス活性化の阻害を生じる（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９１  Ｄｅｃ；６５（１２）：６８１１−６；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ．ら、Ｃｏｎｔｒｉｂ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １９９６；１１８：２５４−６４）。このようなデコイ戦略は、ある種のヒト疾患の処置として提案されている。本発明者らは、先に、Ｅ２ＦのデコイＯＤＮのトランスフェクションが、再狭窄の遺伝子治療のモデルとして、バルーン損傷後の新内膜形成を阻害したことを報告した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９５  Ｊｕｎ  ２０；９２（１３）：５８５５−９）。最近、本発明者らは、ラットにおいて、ＮＦ−κＢに対するデコイを用いて、虚血損傷からのインビボ心筋保護に成功した。
【００１３】
心臓手術の分野において、循環停止は、大動脈動脈瘤変化を有する患者または複合先天的異常を有する新生児における支持技術として一般的に使用される。しかし、循環停止に関する種々の合併症はまだ解決されず、そして循環停止の期間が長くなるにつれ、神経学的後遺症の発生数は高くなる（Ｊｏｎａｓ  ＲＡ．Ｊ  Ｃａｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｖａｓｃ  Ａｎｅｓｔｈ．１９９６；１０：６６−７４を参照のこと）。循環停止中、脳を含む全身は、虚血症でそして長い虚血は、ニューロンの壊死を導く。さらに、脳ニューロン、特に海馬におけるニューロンは、数分の虚血でさえ、５日〜７日後に死に、この現象は、遅延神経死と呼ばれる（Ｋｉｒｉｎｏ  Ｔ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９８２；２３９：５７−６９を参照のこと）。超低体温のような技術が、虚血損傷に対して脳を保護するために使用された場合でさえ、４５分〜６０分が、循環停止を維持する肉体的な限界であり、そして超低体温は、種々の危険（出血の増加、輸血および免疫の低下を含む）と関連する（Ｋｉｒｋｌｉｎ  ＬＷ，Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ  ＢＧ．Ｋｉｒｋｌｉｎ  ＪＷ，Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ  ＢＧ、編  Ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ；１９９３．ｐ．６６−７３を参照のこと）。虚血障害由来の神経壊死および遅延神経死の両者に対する脳保護のより良い技術の開発は、大動脈疾患および先天的心臓疾患に対する手術の病的状態を改善することが所望される。
【００１４】
最近の研究により、大脳虚血後の神経損傷におけるＮＦ−κＢの活性化が明らかになってきており、重要な転写因子であることが判明してきた（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  Ｄ，Ｙｉｎ  Ｔ，Ｓｍａｌｓｔｉｇ  ＥＢ，Ｈｓｕ  ＭＡ，Ｐａｎｅｔｔａ  Ｊ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｌａｂ．２０００；２０：５９２−６０３；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ａ，Ｍａｒｔｉｎ−Ｖｉｌｌａｌｂａ  Ａ，Ｗｅｉｈ  Ｆ，Ｖｏｇｅｌ  Ｊ，Ｗｉｒｔｈ  Ｔ，Ｓｃｈｗａｎｉｎｇｅｒ  Ｍ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９；５：５５４−９；およびＣｌｅｍｅｎｓ  ＪＡ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ＤＴ，Ｄｉｘｏｎ  ＥＰ，Ｓｍａｌｓｔｉｇ  ＥＢ，Ｍｉｎｃｙ  ＲＥ，Ｒａｓｈ  ＫＳら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９７；４８：１８７−９６を参照のこと）。
【００１５】
ＮＦ−κＢは、その発現が虚血再灌流損傷に関係する多くの遺伝子の転写活性化剤（サイトカイン（腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン１β（ＩＬ−１β））（Ｃｈｒｉｓｉｍａｎｎ  ＪＷ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  ＬＨ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＴＳ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９８；２４：ｌ１３１−８を参照のこと）ならびに接着分子（細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１））（Ｈｏｗａｒｄ  ＥＦ，Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｃｈｅｎｇ  Ｃ，Ｃａｒｒｏｌｌ  ＪＥ，Ｈｅｓｓ−Ｄ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．  １９９８；２４８：１９９−２０３を参照のこと）など）である。さらに、アスピリンなどのＮＦ−κＢの阻害剤は、ニューロンにおいて虚血損傷をブロックするようである（Ｇｒｉｌｌｉ  Ｍ，Ｐｉｚｚｉ  Ｍ，Ｍｅｍｏ  Ｍ，Ｓｐａｎｏ  Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７４：１３８３−５を参照のこと）。デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のトランスフェクションは、サイトカインおよび接着分子の転写活性化をブロックすると報告され（Ｔｏｍｉｔａ  Ｎ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｓ，Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＧＨ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｍら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：１３２６−３２を参照のこと）、本発明者らは、以前、心臓における虚血再灌流損傷を防ぐためのＮＦ−κＢデコイＯＤＮをトランスフェクトする効力を報告した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｋｉｄａ  Ｉ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｎ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９７；３：８９４−９；およびＳａｗａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，Ｋａｇｉｓａｋｉ  Ｋ，Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｍａｅｄａ．Ｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９７；９６（Ｓｕｐｐｌ  ９）：ＩＩ−２８０−５を参照のこと）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ＮＦ−κＢは、その転写制御下にある、多くの遺伝子の発現を介して、種々の疾患に関与することが示唆されている。しかし、脳虚血に関連する障害または疾患を有効に処置する方法、特に非侵襲的処置法は提供されていない。特に、脳虚血は、上記のように稀ではない疾患であり、高齢化社会にともなう動脈硬化性疾患の増加は、当然大動脈瘤疾患の増加をもたらす。患者の高齢化を考慮した場合、薬剤により大動脈瘤の増長を直接抑制できれば理想的であるが、現在のところその手段はなく、大動脈瘤の低侵襲的な治療および予防法の開発が切望されている。
【００１７】
また、大動脈瘤が破裂することなどにより脳が虚血状態に陥ると、脳神経障害を生じる。この障害は、種々の神経における機能不全をもたらし、知能障害、痴呆などをも引き起こし得る。近年になり、ＮＦ−κＢに対するシスエレメントデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、虚血損傷を媒介する遺伝子の活性化をブロックすることが報告された。しかし、従来は、これらの脳の虚血状態に起因する障害に対する処置または予防のために有効な低侵襲的な治療および予防法は実質的になかった。
【００１８】
従って、本発明は、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮをニューロンにトランスフェクトすることが、全脳虚血後の神経損傷を防ぎ、そしてＮＦ−κＢデコイＯＤＮが、新しい大脳保護治療を提供することを課題とする。本発明は、頸動脈を介してＮＦ−κＢデコイＯＤＮを脳にトランスフェクトすることが、ラットモデルにおいて全脳虚血後のニューロンへの損傷を和らげるかどうかを試験することをも課題とする。本発明者らの課題は、心血管手術における循環停止を含む全脳虚血中に使用するための新しい大脳保護薬剤を開発することである。心臓手術における循環停止中の脳保護を改良するために、本発明者らは、全脳虚血後の神経損傷を防ぐ点でＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの効力を評価することも課題とした。
【００１９】
別の局面では、本発明は、脳への直接投与以外の投与経路で、特に脳血液関門を通過する投与経路を介して、脳へ遺伝子トランスフェクションのための組成物を投与することにより、脳内での遺伝子トランスフェクションが行わせることを課題とした。このようなことは、従来不可能であった、技術であり、その技術的意義は深い。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
発明の要旨
本発明により、全体的脳虚血中の頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドのラット脳神経への導入が提供される。ポリメラーゼ連鎖反応は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全体的脳虚血後１時間で効果的に腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、および細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）  メッセンジャーＲＮＡの発現を阻害することを示した。末端デオキリヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識染色および微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）免疫組織化学は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全体的脳虚血後７日で、有意に神経損傷を和らげることを示した。脳虚血中のＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドの治療的トランスフェクションは、神経損傷を和らげるために有効であり得、全体的虚血に対する大脳保護の戦略を示唆する。
【００２１】
本発明は、脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための薬学的組成物であって、少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を提供する。本発明はまた、脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに上記疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための方法であって、少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を被検体に投与する工程、を包含する、方法を提供する。
【００２２】
１つの実施形態では、上記疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であり得る。上記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択され得る。上記薬学的に受容可能なキャリアがリポソームであり得る。上記ＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含み得る。本発明の組成物は、頸動脈を介する投与経路に適切であり得る。
【００２３】
別の局面において、本発明は、脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行うための組成物であって、少なくとも１つのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物を提供する。本発明はまた、脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行う方法であって、少なくとも１つのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを、脳への直接投与以外の経路に適切な形態で含む、組成物、を被検体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００２４】
１つの実施形態において、上記脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入であり得る。別の実施形態において、上記デコイは、ＮＦ−κＢのデコイであり得る。別の実施形態において、上記薬学的に受容可能なキャリアはリポソームであり得る。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２６】
本発明で用いられる用語「デコイ」または「デコイ化合物」は、ＮＦ−κＢなどの転写因子が結合する染色体上の部位、またはＮＦ−κＢなどの転写因子に制御される遺伝子の他の転写調節因子が結合する染色体上の部位（以下標的結合部位という）に結合し、ＮＦ−κＢまたはその他の転写因子と、これらの標的結合部位への結合について拮抗する化合物をいう。代表的には、デコイまたはデコイ化合物は、核酸およびその類似体である。
【００２７】
デコイが核内に存在する場合、転写調節因子の標的結合部位への結合について、デコイが転写調節因子と競合し、その結果、転写調節因子の標的結合部位への結合によってもたらされる生物学的機能が阻害される。デコイは、標的結合配列に結合し得る核酸配列を少なくとも１つ含む。標的結合配列への結合活性を有する限り、デコイは、本発明の薬学的組成物の調製に用いることができる。
【００２８】
デコイの例としては、ＮＦ−κＢについてＧＧＧＡＴＴＴＣを含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいデコイの例として、５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１）（ＮＦ−κＢデコイ）、５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号２）（ＳＴＡＴ−１のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号３）（ＧＡＴＡ−３のデコイ）、５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号４）（ＳＴＡＴ−６のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号５）（ＡＰ−１のデコイ）、および５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号６）（Ｅｔｓのデコイ）、５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’（ＣＲＥデコイ配列）またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、またはそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および／または擬核酸を含むものであってもよい。また、これらのオリゴヌクレオチド、その変異体、またはこれらを分子内に含む化合物は、１本鎖でも２本鎖であってもよく、線状であっても環状であっもよい。変異体とは上記配列の一部が、変異、置換、挿入、欠失しているもので、ＮＦ−κＢなどの転写因子またはＮＦ−κＢなどの転写因子に制御される遺伝子のその他の転写調節因子が結合する核酸結合部位と特異的に拮抗する核酸を示す。さらに好ましいＮＦ−κＢなどの転写因子またはＮＦ−κＢなどの転写因子に制御される遺伝子のその他の転写調節因子のデコイとしては、上記核酸配列を１つまたは複数含む２本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。上記核酸配列を１つまたは複数含む核酸は、含まれる核酸配列の数を示すために、含まれる核酸配列が２つの場合タブルデコイと称され、そし３つの場合トリプルデコイなどと称され得る。
【００２９】
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子で置換したチオリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、またはリン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチド等、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクリオチド等が含まれる。
【００３０】
本発明で用いられるデコイの製造方法としては、当該分野で公知の化学合成法または生化学的合成法を用いることができる。例えば、デコイ化合物として核酸を用いる場合、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることができ、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて目的のデコイ核酸を直接合成してもよいし、またはこれらの核酸、それを含む核酸またはその一部を合成した後、ＰＣＲ法またはクローニングベクター等を用いて増幅してもよい。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、ＤＮＡリガーゼ等を用いて結合等を行い、目的とする核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、核酸の塩基、糖、リン酸部分に、例えば、アルキル化、アシル化等の化学修飾を施してもよい。
【００３１】
本発明は、上記のデコイ化合物を単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。
【００３２】
本発明の薬学的組成物は、デコイが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
【００３３】
本発明の薬学的組成物は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリアー（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアーと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明の実施態様において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
【００３４】
本発明の薬学的組成物の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頚動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位である脳に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。本発明では、脳血液関門を越える必要がある頸部注入などでも有効であることが証明されたことから、従来技術では達成されなかった格別の効果を有する。従って、好ましい実施形態では、本発明は、脳血液関門を通過する必要がある経路（例えば、経口投与、頭部以外の非経口投与（例えば、頸部投与））で投与される。より好ましくは、投与経路は、頸部注入（例えば、頚動脈を介する）であり得る。従って、頸動脈を介した経路で、脳における遺伝子トランスフェクションを行うための新たな処置方法およびそのための組成物が本発明により提供される。
【００３５】
デコイ化合物に加えて、これらの薬学的組成物は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、デコイ化合物のプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」  （Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）の最終版に記載されている。
【００３６】
経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
【００３７】
経口使用のための薬学的組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以下を含むが、それらに限定されない：ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
【００３８】
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量（すなわち用量）を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
【００３９】
経口で使用され得る薬学的製剤は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、デコイ化合物は、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
【００４０】
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
【００４１】
局所または鼻孔投与のために、浸透されるべき特定のバリアに対して適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は一般に当該分野で公知である。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって）で製造され得る。
【００４３】
好ましくは、患部の細胞または目的とする組織の細胞内に局所投与または頸部注入のように非経口的投与をする場合、本発明の薬学的組成物は、キャリアとして合成または天然の親水性ポリマーを含み有る。このような親水性ポリマーの例として、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコールが挙げられる。本発明のデコイ化合物を、適切な溶媒中のこのような親水性ポリマーと混合し、溶媒を、風乾などの方法により除去して、所望の形態、例えば、シート状に成型した後、標的部位に付与し得る。このような親水性ポリマーを含む製剤は、水分含量が少ないので、保存性に優れ、使用の際には、水分を吸収してゲル状になるので、デコイ化合物の貯留性に優れる。
【００４４】
あるいは、デコイとして核酸またはその修飾体を用いる場合には、本発明の薬学的組成物は、一般に用いられている遺伝子導入法で用いられる形態、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を用いた膜融合リポソーム製剤や、エンドサイトーシスを利用するリポソーム製剤等のリポソーム製剤、リポフェクトアミン（Ｇｉｏｃｏ  ＢＲＬ）等のカチオン性脂質を含有する製剤、またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等を用いるウイルス製剤を用いるのが有利であり、特に、膜融合リポソーム製剤が好適である。
【００４５】
リポソーム製剤は、そのリポソーム構造体が、大きな１枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）のいずれであってもよい。その大きさも、ＬＵＶでは２００から１０００ｎｍ、ＭＬＶでは４００〜３５００ｎｍ、ＳＵＶでは２０〜５０ｎｍ程度の粒子系をとり得るが、ＨＶＪ等を用いる膜融合リポソーム製剤の場合は粒子系２００〜１０００ｎｍのＭＬＶを用いるのが好ましい。
【００４６】
リポソームの製造方法は、デコイが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ、Ｆら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．６０１  ５５９（１９８０））、エーテル注入法（Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．：Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８  ２５０（１９７８））、界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．４５５  ３２２（１９７６））等を用いて製造することができる。
【００４７】
リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般に、リン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを定法に従って水素添加したものの他、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質を用いることができる。
【００４８】
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内にもつものを用いることにより、電気的に陰性のデコイ核酸の結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。
【００４９】
このようにして得られるリポソームには、患部の細胞または目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えば、ＨＶＪ、不活化ＨＶＪ、センダウイルスから精製された膜融合促進タンパク質、ポリエチレングルコール等を添加することができる。
【００５０】
リポソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、例えば、前記したリポソーム形成物質を、コレステロールとともにテトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノール等の有機溶媒に溶解し、これを適切な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリポソーム形成物質の膜を形成する。これにデコイを含有する緩衝液を加えて攪拌し、得られたリポソームにさらに所望により前記の膜融合促進物質を添加した後、リポソームを単離する。このようにして得られるデコイを含有するリポソームは適当な溶媒中に懸濁させるか、または一旦凍結乾燥したものを、適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。膜融合促進物質はリポソーム単離後、使用までの間に添加してもよい。
【００５１】
本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明の組成物またはキットは、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
【００５３】
徐放性形態の場合、徐放性製剤（ミニペレット製剤など）を投与部位付近に埋め込むこともできる。または、徐放性製剤は、オスモチックポンプなどを用いて投与部位に連続的に徐々に投与することもできる。
【００５４】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。リポソーム形態の場合には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤のようなリポソーム製剤に必要な試薬を加えることができる。リポソームは、非経口的に投与することが好ましい。従って、リポソームを投与する場合には、非侵襲的なカテーテルまたは非侵襲的な注射器などによる投与方法を用いることができる。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法としては、例えば、脳内に直接または頸動脈に本発明の組成物を注入することが挙げられる。
【００５５】
本発明の薬学的組成物は、デコイ化合物が意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
【００５６】
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
【００５７】
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するデコイ化合物の量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ED50、集団の50％において治療的に有効な用量；およびLD50、集団の50％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ED50／LD50として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないED50を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、デコイの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するデコイの種類等により適宜選択されるが、例えば、脳への投与では、一般に、１回あたり、１０〜１０，０００ｎｍｏｌｅを１日１回から数回投与することができる。また、頸動脈への投与では、一般に、１回あたり、１０〜１０，０００ｎｍｏｌｅを１日１回から数回投与することができる。
【００５８】
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
【００５９】
この様にして得られたデコイを主成分として含有する医薬品は、疾患の種類、使用するデコイの種類等により各種の方法で投与することができ、例えば、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および癌の転移・浸潤、悪疫質においては血管内投与、疾患部位に塗布、疾患部位内に投与または疾患部位に血管内投与等することができる。さらに具体的な例としては、例えば、臓器梗塞等でＰＴＣＡを行う場合には、同時またはその前後に患部血管に投与することができ、また臓器移植等では移植する臓器を予め本願で用いられる製剤で処置して用いてもよい。また、例えば、慢性関節リウマチ等では、直接関節内に注入して用いることもできる。例えば、脳では、脳内に直接注入して用いることもできる。
【００６０】
本発明の化合物が対象とする障害または疾患は、脳内の血管が破裂したことなどにより、脳内の血液が不足していることに起因するものであり、本明細書において、脳の虚血状態を伴う疾患という。そのような障害または疾患としては、例えば、クモ膜下出血、一過性脳虚血、脳動脈硬化症のような脳卒中、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍における血管破裂、頭部外傷、慢性、急性の硬膜下血腫、脳血管閉塞、脳血栓、脳出血、もやもや病、脳血管性痴呆、アルツハイマー型痴呆、脳出血後遺症、脳梗塞後遺症などが挙げられる。本発明はまた、上記のような脳の虚血状態を伴う疾患に起因する障害または後遺症（例えば、神経障害など）を処置および予防するのに有効である。
【００６１】
「クモ膜下出血」とは、クモ膜下腔に出血した状態をいう。頭部外傷によるクモ膜下出血を除けば，脳動脈瘤破裂によるものが最大の原因である（60〜80％）。その他の原因としては，脳動静脈奇形破裂（10％），高血圧性脳内出血（10％），その他の順となっている。高血圧性脳内出血の場合は，出血が脳室内に穿破し，これがクモ膜下腔に流出したと考えられる。クモ膜下腔閉塞による慢性的な髄液循環障害が約10％に生じ，正常圧水頭症を引き起こし得る。従来は、その症状である歩行障害，尿失禁，知能障害が髄液シャント術によって回復していたが、約30％の患者は、入院前に死亡する。他の従来の治療としては、動脈瘤をチタン製のクリップでつまんで、再び出血を防ぐ方法、および太股の動脈から細い管を入れて、チタン製のコイルで動脈瘤を内側からつめる方法などがある。このようにクモ膜下出血の処置は外科的処置が多く根本的な解決には至っていない。本発明は、これらすべてのクモ膜下出血の処置および予防に有効であり得る
高血圧性脳内出血とは、長期に持続する高血圧のために脳の細小動脈壁に類線維性壊死が起こり，壁が破綻し出血する状態をいう．脳血管障害の20％を占める。高血圧性脳内出血はまた、微小脳動脈瘤が発生し，それが破綻して発生するともいわれている。高発生年齢は60歳代であり、出血の発生部位は大脳基底核視床部60％，大脳皮質下20％，小脳10％，中脳橋10％となっている。従来は、保存的治療がなされ、出血の拡大防止、頭蓋内圧低下、全身合併症の防止、早期リハビリに向けられている。外科的治療の目的は主に救命である。長期治療成績は手術例と非手術例との間では違いがなかったという報告もあり、手術に代わる有効な処置および予防方法が期待されていた。本発明は、これらすべての高血圧性脳内出血の処置および予防に有効であり得る。
【００６２】
脳梗塞とは、完全に血管がつまってしまい、脳の一部分が死んでしまう状態をいう。脳虚血とは、血管が狭くなって十分な血液が脳に供給されない状態をいう。脳１００ｇあたり一分間に２０ml以上の血液が供給されなければ、脳の機能が障害されるといわれる。脳硬塞による症状は、半身の麻痺や感覚障害です。早朝に発生することが多く、心臓に不整脈などの障害がある場合に起りやすい。現在の最もよく行われる方法は、血管がつまってから、できるだけ早期（好ましくは、発症から３時間以内）に行う血栓溶解である。発症から３時間以上経過してしまうと、血栓溶解により出血が起ることがあるからである（この状態を出血性梗塞とよび、極めて危険な状態である）。最近では、MRI、DWIによって早期に梗塞を発見することが行われている。しかし、脳虚血における根本的な治療はこれまでは実質的にはなかった。本発明は、これらすべての脳虚血および脳梗塞の処置および予防に有効であり得る。
【００６３】
脳腫瘍とは、本明細書において、頭蓋内に発生する腫瘍をいう。脳実質のみならず，頭蓋内に存在する組織（例えば、骨、髄膜、血管、下垂体、脳神経、先天性遺残組織などを含む）から発生する原発性または転移性新生物をさす．寄生虫、結核などの肉芽腫も脳腫瘍に含まれ得る。脳腫瘍は、通常WHOの国際統一分類により分類されており、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。基本的には手術による腫瘍摘除により処置されている。また、腫瘍の局在部位により根治手術が困難な場合は，放射線療法，化学療法，免疫療法が用いられている。従って、本発明のデコイによる処置は、新たな局面による有効な治療および予防の方法を提供する。
【００６４】
頭部外傷とは、頭部に外力が作用したために生じたあらゆる損傷をいう．発生の時期により、急性期（外傷より3日以内）、亜急性期（外傷より4〜20日くらいまで）、慢性期（外傷より3週以降）の3期に分かれ、この区別は予後に関係する．頭部外傷は、交通事故、転落、転倒などにより頭部を打撲した場合などに発生する。頭部外傷には、全く異常が見られないものから脳挫傷・脳内血腫をともなうものまで種々存在する。頭部外傷の分類には種々あるが、一般的には開放性と閉鎖性に分けられ、さらに部位により頭皮、頭蓋骨、頭蓋内に分けられる。本発明は、これらすべての頭部外傷による脳の血管破裂の処置および予防に有効であり得る。
【００６５】
硬膜下血腫とは、硬膜と脳表との間に形成される被膜を有する流動性の血腫をいう。硬膜下血腫は、急性のものと慢性のものとに分類される。急性硬膜下血腫は、外傷によって生ずる脳と頭蓋骨とのずれによって伸展された橋静脈が断裂することによって起こる場合と，外傷によって生じた脳挫傷からの出血が硬膜下腔に広がってできる場合とがある。慢性硬膜下血腫とは、外傷によって生じた比較的少量の硬膜下血腫が数週間から数ヵ月の経過のうちに次第に増大し，意識低下や、精神症状、あるいは運動麻痺をきたす病態をいう。硬膜下血腫の周囲に，次第に生体反応としての線維性の被膜が形成され、この膜が半透膜の性質を有し、次第に周囲の髄液成分が引き込まれ増大する。半身麻痺、頭痛などの症状に始まり、痴呆、歩行障害、尿失禁などの典型的な症状が発生し得る。局所麻酔の手術によって、血液をく方法、および脳室と腹部をチュ−ブによって連絡させる脳室−腹腔短絡術などにより処置されている。本発明は、これらすべての硬膜下血腫の処置および予防に有効であり得る。
【００６６】
従って、本明細書において、脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択され得る。
【００６７】
本発明が対象とする治療部位は、どのような種類の生物由来であり得る。本発明が対象とする生物としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）である。より好ましくは、本発明が対象とする生物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。
【００６８】
本発明の組成物およびキットは、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
【００６９】
別の局面において、本発明は、脳虚血障害を処置するためのキットを提供する。このキットは、本発明のデコイまたはデコイ化合物；ならびにこのデコイまたはデコイ化合物を投与する指針を与える指示書を備える。ここで、上記指示書は、デコイまたはデコイ化合物の適切な投与方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００７０】
本発明の方法において使用されるデコイまたはデコイ化合物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
【００７１】
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の処置方法は、さらに他の薬剤もまた投与する工程を包含し得る。そのような薬剤は、当該分野において公知の任意の医薬であり得、例えば、そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤（例えば、抗生物質など）であり得る。当然、そのような薬剤は、２種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方最新版、米国薬局方最新版、他の国の薬局方の最新版において掲載されているものなどが挙げられる。そのような薬剤は、好ましくは、脳虚血疾患に対して効果を有するもの（例えば、抗血小板剤、脳神経機能改善剤、脳代謝改善剤、血流改善剤など）であり得る。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明のデコイまたはデコイ化合物は、少なくとも０．１  ｎｇ／ｍｌ存在し得る。より好ましくは、本発明のデコイまたはデコイ化合物は、１．０  ｎｇ  ／ｍｌで存在し得る。別の好ましい実施形態では、本発明のデコイまたはデコイ化合物は、少なくとも２．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも５．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも１０．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも２０．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも５０．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも１００．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも２００．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも５００．０  ｎｇ  ／ｍｌ、少なくとも１．０  μｇ  ／ｍｌ、少なくとも２．０  μｇ  ／ｍｌ、少なくとも５．０  μｇ  ／ｍｌ、少なくとも１０．０  μｇ  ／ｍｌ、少なくとも１００．０  μｇ  ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌを超えて存在し得る。
【００７４】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら  （１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【００７５】
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド（ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド）がある。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
【００７６】
また、ヒトゲノムプロジェクトのようなゲノムデータ、ＧｅｎＢａｎｋのような遺伝子情報データベースに対して、本発明のデコイの配列をもとにＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いて相同性検索を行って得られた配列もまた、本発明の範囲内にある。
【００７７】
本明細書では塩基配列の同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００７８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。
【００７９】
遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００８０】
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００８１】
「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号１のＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。記載の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
【００８２】
「誘導体オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドをいう。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。
【００８３】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が転写因子である場合、転写活性を調節する活性を包含する。ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。本発明の１実施形態では、その生物学的活性は、転写因子の少なくとも１つへの結合活性を包含する。
【００８４】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
【００８５】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。本明細書において、核酸分子の「ホモログ（種相同体）」とは、参照核酸分子のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ホモログは、代表的には、参照核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。本発明の核酸分子についていう場合、「ホモログ」とは、本発明のデコイの核酸配列と相同性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、その生物学的機能が本発明のプロモーターと同一または類似する核酸分子をいう。従って、「ホモログ」と「改変体」とは一部重複する概念である。従って、ホモログは、ある種の中で、ある配列とヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのようなホモログを取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。例えば、本発明のデコイのホモログは、同じ種の相同遺伝子または他の種の対応する遺伝子であり得る。従って、本発明のデコイには、すべてのデコイのホモログが包含され得る。
【００８６】 
（発明の詳細な説明）
本発明は、第一の局面において、脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防するための薬学的組成物およびこの組成物を使用した脳の虚血状態を伴う疾患および障害ならびに該疾患および障害に起因する障害を治療および予防する方法を提供する。この組成物は、少なくとも１つのＮＦ−κＢのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明が対象とする疾患は、クモ膜下出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳虚血、脳腫瘍、頭部外傷、慢性硬膜下血腫および急性硬膜下血腫からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であり得る。別の実施形態において、前記脳の虚血状態を伴う疾患および障害に起因する疾患および障害は、神経障害、運動障害、知能障害、痴呆、半身麻痺、頭痛および尿失禁からなる群より選択され得る。
【００８８】
別の実施形態において、上記薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的に受容可能である任意のキャリアであり得るが、好ましくはリポソームであり得る。より好ましくは、本発明の薬学的組成物は、ＨＶＪ−リポソームの形態で提供され得る。
【００８９】
本発明において用いられるＮＦ−κＢのデコイは、配列ＧＧＡＴＴＴＣＣＣを含む。より好ましくは、ＮＦ−κＢのデコイは、ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ（配列番号１）を含み得る。別の実施形態では、ＮＦ−κＢのデコイは、さらに改変された形態でもよい。
【００９０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、頸動脈を介する投与経路で投与され得る。
【００９１】
別の局面において、本発明は、脳への直接投与以外の経路により、脳での遺伝子トランスフェクションを行う方法およびそのための組成物を提供する。この組成物は、少なくとも１つのデコイ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００９２】
好ましい実施形態において、脳への直接投与以外の経路は、頸動脈注入であり得る。脳への直接投与以外の経路での投与でのトランスフェクションに適切な遺伝子は任意の遺伝子であり得る。好ましくは、そのような遺伝子は、脳内での発現が効果を奏する遺伝子であり得る。そのような遺伝子としては、例えば、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＧＡＰＤＨ、Ｅｔｓ、ＣＲＥのデコイが挙げられる。好ましいデコイの例として、５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１）（ＮＦ−κＢデコイ）、５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号２）（ＳＴＡＴ−１のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号３）（ＧＡＴＡ−３のデコイ）、５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号４）（ＳＴＡＴ−６のデコイ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号５）（ＡＰ−１のデコイ）、および５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号６）（Ｅｔｓのデコイ）、５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’（ＣＲＥのデコイ）またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物が挙げられる。ここで、好ましい実施形態では、薬学的に受容可能なキャリアはリポソームであり得る。
【００９３】
本発明では、転写因子ＮＦ−κＢを結合するシスエレメントデコイのインビボトランスフェクションを使用して全脳虚血後の神経損傷を和らげる証拠が示された。
【００９４】
１つの実施形態では、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮは、頸動脈を介しておよび血液脳関門を横切ってそれらを注入することによって首尾良くニューロンの核に導入される。ＴＵＮＥＬ標識（ＤＮＡ切断）およびＭＡＰ２（神経マーカー）の免疫反応性での評価によれば、このトランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイＯＤＮは、海馬においてＮＦ−κＢシグナルに関する遺伝子発現を抑制し、全脳虚血に起因する神経損傷を和らげることが実証された。従って、本発明は、頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮを用いたニューロンのトランスフェクションは、全脳虚血中に虚血損傷から脳を保護するための新しい戦略を提供する。
【００９５】
従来の脳虚血の処置では、超低体温が用いられていた。超低体温は、大脳のエネルギー要求を減らす循環停止中に脳保護に対する基本的な戦略である。しかし、超低体温循環停止は、神経損傷の有害な危険を伴い、合併症（発作、大脳麻痺、運動性機能不全、および記憶欠損など）を併発していた（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  ＬＡ，Ｗｙｐｉｊ  Ｄ，Ｂｅｌｌｉｎｇｅｒ  ＤＣ，Ｈｅｌｍｅｒｓ  ＳＬ，Ｈｏｌｍｅｓ  ＧＬ，Ｂａｒｎｅｓ  ＰＤら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９８；９７：７７３−９；Ｂｅｌｌｉｎｇｅｒ  ＤＣ，Ｊｏｎａｓ  ＲＡ，Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  ＬＡ，Ｗｙｐｉｊ  Ｄ，Ｗｅｒｎｏｖｓｋｙ  Ｇ，Ｋｕｂａｎ  ＫＣら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９５；３３２：５４９−５５；およびＲｅｉｃｈ  ＤＬ，Ｕｙｓａｌ  Ｓ，Ｓｌｉｗｉｎｓｋｉ  Ｍ，Ｅｒｇｉｎ  ＭＡ，Ｋａｈｎ  ＲＡ，Ｋｏｎｓｔａｄｔ  ＳＮら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；１１７：１５６−６３を参照のこと）。神経損傷（壊死および遅延神経死を含む）は、これらの神経学的損傷の一つの原因である。本発明による処置では、神経学的事象は、ラットにおいて示されず、組織学的研究は、脳切片において梗塞形成領域を示さなかった。コントロール群における虚血後７日のラットは、全て生存しているにもかかわらず、ＮＦ−κＢデコイ群にラットと比較して、学習能力が低下していたことが結論づけられた。神経損傷を和らげることに関して、超低体温に加えて多くの方法が報告されている（Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｊｏｎａｓ  ＲＡ，Ｎｏｍｕｒａ  Ｆ，Ｓｔｒｏｍｓｋｉ  ＭＥ，Ｔｓｕｊｉ  ＭＫ，Ｈｉｃｋｅｙ  ＰＲら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１９９４；１０８：２９１−３０１を参照のこと）。しかし、これらの報告は、主にエネルギー要求および代謝の調節に集中し、そして一般的に臨床的な成功を証明することに失敗した。従って、他のメカニズムに基づく代替的方法（虚血再灌流損傷に関する遺伝子発現の調整など）が求められていた。本発明の方法はこのような課題をも解決した。
【００９６】
最近の報告では、アポトーシスが、循環停止後の遅延神経損傷において重要な役割を果たし得ることを示されている（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ，Ｄｅｓｈｕｍｕｋｈ  Ｍ，Ｄ’Ｃｏｓｔａ  Ｍ，Ｄｅｍａｒｏ  ＪＡ，Ｇｉｄｄａｙ  ＪＭ，Ｓｈａｈ  Ａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；ｌ０１：１９９２−９；およびＫｕｒｔｈ  ＣＤ，Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ  Ｍ，Ｇｏｌｄｅｎ  Ｊ，ＭｃＣａｎｎ  Ｊ，Ｒａｇｈｕｐａｔｈｉ  Ｒ．，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；１１８：１０６８−７７を参照のこと）。多くの分子シグナル（炎症関連サイトカインおよび接着分子を含む）がアポトーシスに関連する。これらの炎症関連因子は、ＮＦ−κＢの転写活性化によって主にアップレギュレートされる。このＮＦ−κＢは、酸化ストレス反応性分子である。サイトカインｍＲＮＡ（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βなど）レベルの調節が、直接神経損傷をブロックするかどうかは明らかではない。しかし、最小で、これらの炎症サイトカインは、虚血関連神経損傷の一因となる。本発明は、ＮＦ−κＢが全脳虚血後の虚血再灌流損傷および神経損傷の減衰において重要な役割を果たし得ることを実証した。ＴＵＮＥＬ染色は、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡの修復を示し得る非特異的技術であり、そして壊死細胞においてでさえ陽性であり得る。従って、さらに他の検査を行った。本発明において、組織学的実験を行ったところ、全脳虚血後の２日でＴＵＮＥＬ陽性ニューロンが、総ニューロン中約１５％（全脳虚血後の７日のＴＵＮＥＬ陽性ニューロンより少ない）であることが実証された。神経損傷（壊死および遅延神経死の両方を含む）は、全脳虚血後の少なくとも２日と７日の間で生じる。
【００９７】
さらに、ＮＦ−κＢは、多くの経路を介して働くと推測され、そしてこれらの経路はまた、全脳虚血後の神経損傷と関連し得る。これらのメカニズムには、以下が包含される：（１）ＮＦ−κＢ活性化は、多くの組織（脳を含む）においてフリーラジカル損傷を部分的に媒介すること（Ｓｃｈｒｅｃｋ  Ｒ，Ｒｉｅｂｅｒ  Ｐ，Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９１；１０：２２４７−５８を参照のこと）；（２）ＮＦ−κＢ活性化は、グルタミン酸細胞毒性の原因となると思われること（Ｇｒｉｌｌｉ  Ｍら、１９９６、前出を参照のこと）；（３）ＮＦ−κＢは、誘導硝酸シンターゼおよびサイクロオキシゲナーゼ２のアップレギュレーションにおいて機能すること（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋ，Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｄ，Ｒｉｅｈｅｍａｎｎ  Ｋ，Ｗｅｓｓｅｌｂｏｒｇ  Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏ１ｏｇｙ．１９９７；１９８：３５−４９を参照のこと）；ならびに（４）ＮＦ−κＢは、遅延神経損傷を起こすＣＤ９５リガンドの活性化を媒介し得ること（Ｖｏｇｔ  Ｍ，Ｂａｕｅｒ  ＭＫ，Ｆｅｒａｒｒｉ  Ｄ，Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８；４２９：６７−７２を参照のこと）。これらのメカニズムは、全てＮＦ−κＢデコイＯＤＮ方法の可能な標的である。従って、本発明は、上記の少なくとも１つのメカニズムに作用することによって神経損傷を処置および予防する組成物および方法を提供する。
【００９８】
さらに、ＮＦ−κＢに対する標的遺伝子は、アポトーシス関連遺伝子（ＴＰ５３（Ｗｕ  Ｈ，Ｌｏｚａｎｏ  Ｇ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９：２００６７−７４を参照のこと）およびｃ−ｍｙｃ（ＬａＲｏｓａ  ＦＡ，Ｐｉｅｒｃｅ  ＪＷ，Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ＧＥ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：１０３９−４４を参照のこと）を含む）を含む。従って、ＮＦ−κＢ結合部位に接するデコイＯＤＮを使用する本発明の遺伝子治療は、炎症応答に関する遺伝子発現および次いで神経損傷（アポトーシスを含む）を抑制することで虚血中の神経保護に対する新しい戦略を提供する。
【００９９】
多くの研究者は、脳保護のために遺伝子治療を使用することについての戦略を報告した（Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｙ，Ｓａｉｔｏｈ  Ｙ，Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｋｏｈｍｕｒａ  Ｅ，Ｙｏｓｈｉｍｉｎｅ  Ｔ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：７５９−６３；およびＯｎｏ  Ｓ，Ｄａｔｅ  Ｉ，Ｏｎｏｄａ  Ｋ，Ｓｈｉｏｔａ  Ｔ，Ｏｈｍｏｔｏ  Ｔ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ  Ｙら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；ｌ０：３３５）を参照のこと）。これらの報告において、遺伝子は、クモ膜下の空間または脳室に注入された。しかし、研究は、頸動脈を介する注入による効果的な遺伝子トランスフェクションを示さなかった。これは、血液脳関門が、多くの外来物質および微生物の侵入を防ぐためである。しかし、全脳虚血中および後、血液脳関門を介する透過性が増大し；事実、血液脳関門の軽減が、虚血後６時間まで継続することが報告された（Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｅ，Ｆｏｓｔｅｒ  ＤＯ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９７：７６１：４−１０を参照のこと）。本発明者らは、ニューロンをデコイＯＤＮでトランスフェクションすることにおける本発明者らの成功は、脳組織におけるＨＶＪ−リポソーム複合体の累積のためであると考える。本発明者らの知識の及ぶ限りでは、これは、頸動脈を介するおよび血液脳関門を横切る遺伝子トランスフェクションの成功した最初の報告である。このような効果は、従来技術では達成できなかった、患者により安全でかつ快適な治療を提供するものである。
【０１００】
デコイ治療は、多くの利益（即時効果、低コスト、およびほとんどない合併症を含む）を有し、そして裸のＥ２Ｆデコイを用いる遺伝子治療は、静脈移植疾患を予防するために臨床的設定ですでに試みられている（Ｍａｎｎ  ＭＪ．Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ  ＡＤ，Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ＭＣ，Ｂｅｌｋｉｎ  Ｍ，Ｃｏｎｔｅ  ＭＳ，Ｐｏｌａｋ  ＪＦら、，Ｌａｎｃｅｔ．１９９９：３５４：１４９３−８を参照のこと）。しかし、本発明において、頸動脈を介する裸のＯＤＮのトランスフェクションは、脳においてその有効性に限定があることから、より安全なベクターが利用され得る。従って、頸動脈を介するＨＶＪ−リポソームまたは他のベクターを用いたＮＦ−κＢデコイ治療の臨床的適用は、循環停止中の虚血損傷からの脳保護に有用である。脈管を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮ治療は、脳保護のための臨床的使用において広い適用（大脳麻痺の逆行再灌流など）の可能性を有し得る。
【０１０１】
要約すると、本発明の結果は、全脳虚血中のＮＦ−κＢデコイＯＤＮの投与が、ラットモデルにおいて海馬ＣＡ１領域における神経損傷を和らげることを示す。従って、頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮ投与は、全脳循環停止中のニューロンを保護し得、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮが、全体的虚血から脳を保護するための将来有望な治療的薬剤になり得る可能性を掲げる。本発明では、脳に対する遺伝子トランスフェクションのこの方法は、心臓外科の分野以外にも、神経外科・脳外科のような他の分野においても適用可能であることが実証されたことになる。このように、デコイの脳神経分野での応用が示されたことは顕著な効果であり、その有用性は筆舌に尽くしがたい。
【０１０２】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１０３】
（実施例１：ＨＶＪウイルス−リポソーム複合体の調製）
ＨＶＪ−リポソーム複合体を、文献に記載のように調製した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｋｉｄａ  Ｉ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｎ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａら、，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９７；３：８９４−９）。概略をいうと、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を、１：４：８：２の重量比で混合した。この脂質混合物（１０ｍｇ）を、ロータリーエバポレーターで溶媒（テトラヒドロフラン）を除去することでフラスコの側面に沈殿させた。乾燥した脂質を、２００μｇのＯＤＮを有する２００μＬの生理的食塩水で水和した。リポソームを、振とうおよび音波破壊で調整した。リポソーム懸濁液（１０ｍｇの脂質を含有する０．５ｍＬ）を、総容量４ｍＬの生理的食塩水中で不活化したＨＶＪ（１００００血球凝集ユニット）と混合した。混合物を、４℃、５分でインキュベートし、次いで穏やかな振とうで３０℃で３０分インキュベートした。自由ＨＶＪを、密度勾配遠心分離によってＨＶＪ−リポソームから除去した。スクロース勾配の最上層を、使用するために収集した。ホスホロチオエートＯＤＮの配列は、以下：ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ、５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１）、および３’−ＧＧＡＡＣＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧ−５’（配列番号７）；スクランブルデコイ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｄｅｃｏｙ）ＯＤＮ、５’−ＴＴＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＣ−３’ （配列番号８）、および３’−ＡＡＣＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＧＧ−５’（配列番号９）である。
【０１０４】
（実施例２：全脳虚血モデルの作製およびモデル作製の評価）
本発明者らは、鎖骨下頸動脈の閉塞技術の改変技術を使用して、ラット全脳虚血−再灌流モデルを樹立した（Ｔｏｒｒｅ  ＪＣ，Ｆｏｒｔｉｎ  Ｔ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．１９９１；２６：３６５−７２．）。３００ｇ〜５００ｇ体重の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。全ての動物は、大阪大学医学部動物施設（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）が作成した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」に従って世話をした。各ラットに、５０ｍｇ／ｋｇペントバルビタール腹腔内投与で麻酔をかけ、そして口に挿管した。齧歯類用換気機を３５ｍｍＨｇのＰＣＯ２を維持するように１０ｍＬ／ｋｇ容量および５０〜６０ストローク／分で取りつけた。実験中、ラットは、脳以外の部分を加熱ブランケットで３６℃に保温した。開胸後、胸腺の左葉を除去した。その大動脈弓を同定し、そして無名動脈、左総頸動脈、および左鎖骨下動脈を、５０ナイロン縫合糸で縫合した。右総頸動脈を、首の中で曝露しそしてポリエチレンチューブ（ＰＥ１０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）のカニューレを挿入した。全脳虚血を、全ての３縫合動脈を２０分間クランプすることで誘導した。
【０１０５】
（実施例３：脳虚血中のＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドのトランスフェクション）
動脈をクランプした後直ぐに、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ（ＮＦデコイ群）またはスクランブルデコイＯＤＮ（Ｓデコイ群）のいずれかを含むＨＶＪ−リポソーム複合体を、脳組織に行き渡らせるために右頸動脈に注入した。これらの薬物を、４℃で保管し、そして１動物当たり２ｍＬを注入した。この手法において咽頭温度は、３５．２℃±０．２℃から３３．１℃±０．５℃へ低下した。神経学的事象は、外科的手法後のいずれの動物においても観察されなかった。
【０１０６】
全体的虚血−再灌流脳を、３つの方法で評価した。初めに、３匹のラットを再灌流後１時間で屠殺し、そして脳切片を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したＯＤＮ送達のトランスフェクションを蛍光顕微鏡で観察することにより検査した。次に、各群から５匹のラットを、再灌流後１時間で屠殺し、そしてＣＡ１領域を含む海馬を収集して、ＮＦ−κＢによって活性化されることが知られるメッセンジャーＲＮＡの発現に対するトランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイＯＤＮの効果を試験した。血管を剥ぎ取った後、サンプルは２０ｍｇ〜２５ｍｇの重量であった。第３に、各群から１０匹のラットを、全脳虚血後７日で屠殺し、神経損傷を調査するため末端デオキリヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色または微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）による免疫組織化学による組織学検査を行った。
【０１０７】
（インビボでの全脳虚血中の頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクション）
本発明者らの予備的な研究において、本発明者らは、全脳虚血中に、いずれのベクターも使用せず裸のＦＩＴＣ−標識ＮＦ−κＢ  ＯＤＮを頸動脈に注入した。しかし、この方法を使用することによって、蛍光は、脳組織中に検出されなかった（データは示さない）。次に本発明者らは、脳組織中にＮＦ−κＢデコイＯＤＮをトランスフェクトするためのＨＶＪ−リポソーム方法を使用することを試みた。再灌流後１時間で、試験された全てのラットにおいて、本発明者らは、ＦＩＴＣ標識ＯＤＮを有する細胞のトランスフェクションを、内膜動脈においでだけでなく、ニューロン（特に皮質および海馬のニューロン）においてもまた観察した（図１）。蛍光は、主に細胞核に対して局在された。従って、本発明者らのモデルにおいて、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮを、全脳虚血中に血液脳関門を介して脳組織へトランスフェクトし得た。
【０１０８】
（結果）
全脳虚血中の頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドのラット脳神経への導入は、明らかに成功した。ポリメラーゼ連鎖反応は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全脳虚血後１時間で効果的に腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、および細胞内接着分子１  メッセンジャーＲＮＡの発現を阻害することを示した。末端デオキリヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識染色および微小管結合タンパク質２免疫組織化学は、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドが、全脳虚血後７日で、有意に神経損傷を和らげることを示した。
【０１０９】
（海馬におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡの定量）
次に、本実施例では海馬におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡの定量を行った。
【０１１０】
本発明者らは、実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを使用して、再灌流後１時間でＮＦ−κＢのシグナルに応答することが知られる遺伝子の発現に対する、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ対ＳデコイコントロールＯＤＮのインビボでのトランスフェクションの効果を調査した。この技術をもちいることにより、相補ＤＮＡ増幅の定量を行った。蛍光ベースの実時間ＰＣＲ次いでＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を用いた増幅の測定を含む。
【０１１１】
概略すると、総ＲＮＡを、メーカーの指示（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して各２０ｍｇ〜２５ｍｇ海馬サンプルから精製した。そのＲＮＡサンプルを、液体窒素で凍結し、そして使用まで−８０℃で保管した。遺伝子転写に対する試験をするため、２μｇのＲＮＡを、メーカーによって推奨される総容量４０μＬで、ＲＮａｓｅ−Ｈ−陰性  モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ２、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡの１／８０を、各ＰＣＲ反応のため使用し、そして各転写の測定を、３倍で実施した。実時間ＰＣＲの技術は、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エンドヌクレアーゼ活性による各増幅サイクルで特異的蛍光プローブの加水分解に基づく。この技術は、いくらかの改変を有するが、Ｄｅｐｒｅら（Ｄｅｐｒｅ  Ｃ，Ｓｈｉｐｌｅｙ  ＧＬ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｈａｎ  Ｑ，Ｄｏｅｎｓｔ  Ｔ，Ｍｏｏｒｅ  Ｍら、，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８；４：１２６９−７５を参照のこと）によって記載されたように実施される。フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
ＴＮＦα順向きプライマー  ＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＣＴ（配列番号１０）、
逆向きプライマー  ＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴ（配列番号１１）、およびプローブ  ＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号１２）；
ＩＬ−１β：
順向きプライマー  ＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＡＧ（配列番号１３）、
逆向きプライマー  ＧＡＣＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号１４）、および
プローブ  ＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴＣＣＣ（配列番号１５）；
ＩＣＡＭ−１：
順向きプライマー  ＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＣＡＴＴＧＧ（配列番号１６）、
逆向きプライマー  ＴＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡ（配列番号１７）、および
プローブ  ＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＧＴＴＣＣ（配列番号１８）。
【０１１２】
ここでアッセイされた各分子に対して、プライマー対、または少なくとも１つのプライマーもしくはプローブを、１つ以上のイントロンをまたぐように設計し、それによってｍＲＮＡのみを測定した。事実、ゲノムＤＮＡを標的として使用する場合、いずれの分子に対してもシグナルは検出されなかった。プライマーおよびプローブを、各ＰＣＲ反応において２００ｍｍｏｌ／Ｌで使用し、そしてＰＣＲを、９５℃での１５秒変性工程および６０℃での１分アニーリング工程の５０サイクルで実施した。各測定において生じる標準曲線の相関係数は、いつも０．９７またはそれよりも良く、そして３倍のサンプルにおける変動係数は、通常１０％以下であった。分光測定法を用いたＲＮＡ濃度の測定において精度の相対的に不足していたことから、細胞性酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）による転写のレベルを、各サンプルにおいて内部コントロールとして量的に測定した。ＧＡＰＤＨプライマーおよびプローブ配列は、以下のとおりであった：
順向きプライマー、ＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣ（配列番号１９）；
逆向きプライマー、ＴＣＡＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡ（配列番号２０）；および
プローブ、ＣＧＴＧＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＡＴＣＣＧＴ（配列番号２１）。
【０１１３】
ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ値を、各サンプルに対して計算し、次いで正常のラットｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨレベルと比較した誘導値を算出した。
【０１１４】
（結果）
（海馬におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡ発現）
ＮＦデコイ群において、再灌流後１時間でのＴＮＦ−αをコードする遺伝子の発現の誘導率の倍率は、正常細胞における速度と比較して２．８±１．１であり、ところがＳデコイ群において誘導率の倍率は、１２．５±２．２であった。再灌流後１時間でのＩＬ−１βおよびＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡ発現の誘導率の倍率は、それぞれ、ＮＦデコイ群においては４．７±１．７および３．５±０．５、ならびにＳデコイ群においては１４．０±７．５および２５．７±１２．０であった（図２）。これらの３遺伝子の発現は、ＮＦ−κＢによって活性化され、そして頸動脈を介するＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクションによって効果的に抑制される（それぞれ、Ｐ＝０．０１、Ｐ＝０．０１、およびＰ＝０．１）。これらのデータは、トランスフェクトされたＮＦ−κＢデコイＯＤＮが、海馬中の虚血再灌流損傷におけるＮＦ−κＢに関する遺伝子発現を効果的にブロックすることを実証した。
【０１１５】
（実施例４：海馬ＣＡ１領域におけるＮＦ−κＢデコイＯＤＮによる神経損傷の遮断）
次に、本実施例において、海馬ＣＡ１領域におけるＮＦ−κＢデコイＯＤＮによる神経損傷の遮断を組織化学的に評価した。
【０１１６】
（ＴＵＮＥＬ染色および免疫組織化学）
全脳虚血後１週間で正常なマウスにおいて、特に海馬のＣＡ１領域において虚血損傷が検出され得、そしてＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンの数が増加することが分かっている（Ｊｏｎａｓ  ＲＡ．Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ，ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ａｒｒｅｓｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒａｉｎ．Ｊ  Ｃａｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｖａｓｃ  Ａｎｅｓｔｈ．１９９６；１０：６６−７４）。ＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンの存在は、直接アポトーシスの発生を示さないが、ＤＮＡ損傷を示す。ＭＡＰ２の発現レベル（細胞骨格性タンパク質は、虚血損傷のマーカーで、そしてその発現において減少する）を、全脳虚血後に観察した（Ｖａｎｉｃｋｅｙ  Ｉ，Ｂａｉｃｈｅｎ  Ｔ，Ｄｉｅｍｅｒ  ＮＨ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．１９９５；７：１６１−４）。神経虚血損傷に対して、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクトの効果を評価するために、脳を、速やかに液体窒素で凍結し、そして海馬の吻側尾側の（ｒｏｓｔｒｏｃａｕｄａｌ）伸長を介して環状に切断する。ＴＵＮＥＬ染色に対して、５μｍ切片を、１％パラホルムアルデヒド中に固定する。ＴＵＮＥＬ染色を、メーカーにより推奨されるようにＡｐｏｐＴａｇ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）を用いて実施した。反応産物を、３、３’−ジアミノベンジジンおよびＨ２Ｏ２を用いた展開によって視覚化した。ＴＵＮＥＬ染色した脳切片を、またヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。次いで、各ラットにつき３切片についてＣＡ１領域（５００μｍ長）においてＴＵＮＥＬ陽性であるニューロンの総数のパーセンテージを算出した。
【０１１７】
免疫組織化学を、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼシステム（ＡＢＣ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ）を使用することで脳切片に対して実施した。５μｍ切片を、２％パラホルムアルデヒド中に固定し、そしてモノクローナルＭＡＰ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）と共に一晩４℃でインキュベートした。切片を、メーカーの推奨に従ってＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼシステムを使用して染色した。反応産物を、３、３’−ジアミノベンジジンおよびＨ２Ｏ２を用いた展開によって視覚化し、これらの切片をまたヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。ＭＡＰ２−陽性ニューロンの数を、各ラットにつき３切片についてＣＡ１領域（５００μｍ長）において計数した。
【０１１８】
（統計解析）
データを、平均±標準偏差として示した。２群間の統計学的有意差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテストで計算した。
【０１１９】
（結果）
（海馬ＣＡ１領域におけるＮＦ−κＢデコイＯＤＮによる神経損傷の遮断）
次に、全脳虚血後７日で組織学的に評価して、脳組織を、神経損傷に対するＮＦ−κＢデコイＯＤＮの保護効果を測定した。ＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンを、両半球において検出し、右半球において神経損傷を評価した。
【０１２０】
ＮＦデコイ群において、全脳虚血後７日で、Ｓデコイ群と比較してＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンはより少なくなった（ＮＦデコイ群において、１１．３％±１３．１％、Ｓデコイ群において、４０．３％±１８．０％、Ｐ＝０．００３；図３）。ＭＡＰ２−陽性ニューロンの数は、Ｓデコイ群においてよりもＮＦデコイ群において高くなった（ＮＦデコイ群において、９６．４±３３．０細胞／５００μｍ長、Ｓデコイ群において、５０．６±２３．８細胞／５００μｍ長、Ｐ＝０．００５；図４）。これらのデータは、頸動脈を介してＮＦ−κＢをニューロンにトランスフェクトすることが、全脳虚血後の神経損傷を和らげたことを示す。
【０１２１】
（結論）
脳虚血中のＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチドの治療的トランスフェクションは、神経損傷を和らげるために有効であり、脳虚血に対する大脳および神経の保護に有効であることが示された。
【０１２２】
（実施例５：他のデコイの頚動脈への投与による脳内遺伝子トランスフェクション）
次に、他の遺伝子でも脳血液関門を通過した後に脳内で遺伝子トランスフェクションが行われることを実証するために、例として、ＳＴＡＴ−１のデコイ（５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号２））、ＧＡＴＡ−３のデコイ（５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号３））、ＳＴＡＴ−６のデコイ（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号４））、ＡＰ−１のデコイ（５’−ＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号５））およびＥｔｓのデコイ（５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号６））を用いた。
【０１２３】
上記デコイについて、実施例１の記載に従って、ＨＶＪウイルス−リポソーム複合体を調製した。
【０１２４】
本発明者らは、全脳虚血中に、いずれのベクターも使用せず裸のＦＩＴＣ−標識した上記各デコイＯＤＮを頸動脈に注入した。しかし、この方法を使用しても、蛍光は、脳組織中に検出されなかった（データは示さない）。次に本発明者らは、脳組織中に上記各デコイＯＤＮをトランスフェクトするためのＨＶＪ−リポソーム方法を使用することを試みた。再灌流後１時間で、試験された全てのラットにおいて、本発明者らは、ＦＩＴＣ標識ＯＤＮを有する細胞のトランスフェクションを、内膜動脈においでだけでなく、ニューロン（特に皮質および海馬のニューロン）においてもまた観察した（データは示さない）。蛍光は、主に細胞核に対して局在された。従って、本発明者らのモデルにおいて、ＮＦ−κＢ以外の上記各デコイＯＤＮでも、全脳虚血中に血液脳関門を介して脳組織へトランスフェクトし得ることが明らかになった。
【０１２５】
本実施例は、どのようなデコイでも、血液脳関門を介した脳内トランスフェクションが可能であることを実証した。
【０１２６】
産業上の利用可能性
デコイを用いて脳における虚血に起因する疾患または障害を処置または予防する薬学的組成物が提供される。本発明の薬学的組成物の脳以外での投与によって脳での遺伝子トランスフェクションを達成したことは、非侵襲的であって、繰り返し可能な脳の治療および予防の方法を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、再灌流後１時間でのＦＩＴＣで標識したＮＦ−κＢデコイＯＤＮでトランスフェクトしたラット組織の顕微鏡写真を示す。ＦＩＴＣ蛍光が全体に観察され、そして脳全体のニューロン中の核内で観察することができた。Ａはラット皮質切片、Ｂは海馬を表す。Ａ−１およびＢ−１は、４０倍での写真を示し、Ａ−２およびＢ−２は、１００倍での写真を示す。
【図２】
図２は、再灌流後１時間でのラット海馬でのｍＲＮＡの誘導率を示すグラフである。これらのｍＲＮＡのレベルは、各々のサンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して正規化した。誘導率は、正常ラット海馬でのレベルと本発明での処置されたもののレベルを比較することによって算出した。ＡはＴＮＦ−α  ｍＲＮＡを示し、ＢはＩＬ−１β  ｍＲＮＡを示し、ＣはＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡを示す。すべての値は、ＮＦ−κＢデコイ群において、Ｓデコイ群よりも有意に抑制されていた。
【図３】
図３Ａは、全脳虚血後７日でのＴＵＮＥＬ染色を伴うラット海馬ＣＡ１領域を貫く切片を示す写真である。ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ治療（Ａ−１）は、Ｓデコイ群（Ａ−２）と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性ニューロン（茶色に染まる）の出現を抑制した。倍率は、Ａ−１およびＡ−２とも１００倍である。図３Ｂは、海馬ＣＡ１領域でのＴＵＮＥＬ陽性ニューロンの割合を示すグラフである（５００μｍ長）。ＴＵＮＥＬ陽性ニューロンの割合は、Ｓデコイ群（ｐ<０．０１）よりも、ＮＦ−κＢデコイ群において、有意に減少していた。
【図４】
図４Ａは、全脳虚血後７日でのＭＡＰ２免疫染色を伴うラット海馬ＣＡ１領域を貫く切片を示す写真である。ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ治療（Ａ−１）は、Ｓデコイ群（Ａ−２）と比較して、ＭＡＰ２陽性ニューロン（細胞質ゾルにおける免疫反応なし）の出現を抑制した。倍率は、Ａ−１およびＡ−２とも１００倍である。図４Ｂは、海馬ＣＡ１領域でのＭＡＰ２陽性ニューロンの割合を示すグラフである（５００μｍ長）。ＭＡＰ２陽性ニューロンの割合は、Ｓデコイ群（ｐ<０．０１）よりも、ＮＦ−κＢデコイ群において、有意に維持されていた。
【国際調査報告】
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