(57)【要約】担子菌の宿主において、リグニン分解酵素を高生産させるためのプロモーター、該プロモーターを含む宿主・ベクター系、該系を利用したリグニン分解酵素の高生産方法、並びに該酵素を利用した木材チップ処理方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、
該リグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する工程とからなる、リグニン分解酵素の生産方法。
【請求項２】
担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、
該リグニン分解酵素高生産宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とからなる、木材チップの処理方法。
【請求項３】
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、又はβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター配列である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片である、請求項１、２又は３に記載の方法。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号１又は２において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
【請求項５】
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片である、請求項１、２又は３に記載の方法。
（ａ）配列番号１３、２５又は３７で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号１３、２５又は３７において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
【請求項６】
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片である、請求項１、２又は３に記載の方法。
（ａ）配列番号４９で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号４９において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
【請求項７】
リグニン分解酵素をコードする遺伝子が、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
担子菌がコリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞がコリオラス・ヒルスタスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって得られる木材チップ。
【請求項１１】
請求項１０に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって得られるパルプ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、担子菌、特にコリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）から得られたプロモーター活性を有する新規ＤＮＡ断片、それを含む組換えＤＮＡ、該ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該宿主細胞を利用したリグニン分解酵素の高生産方法、並びに該酵素を利用した木材チップ処理方法に関する。
背景技術
現在まで、組換えＤＮＡ技術を用いて多様なポリペプチドを産生する系は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を中心とする宿主系を用いて行われている。しかしながら、大腸菌は宿主として適さない場合が多い。例えば、大腸菌において、ヒトなど高等生物由来の有用なポリペプチドを生産させる場合、活性型酵素タンパク質として生産されないこと、また目的ポリペプチド以外にも多数の毒性物質を産生し、目的産物の精製が非常に困難となる等の問題点がある。これらの問題点を解決する手段として下等真核生物の酵母を宿主として生産する方法が盛んに研究されているが、生産性が低いという問題点が新たに生じている。そこで、ポリペプチド産生のため、より高等生物である真核生物としてアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属などの糸状菌、またファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属やコリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属などの担子菌を宿主とした形質転換系が開発され、酵素タンパク質生産が検討されている。
担子菌は真核生物に属するが、酵母よりも動物細胞に近縁であると考えられている（Ｔ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７０６３（１９８９））。リグニン分解力が強いコリオラス・ヒルスタスはコリオラス属に属する担子菌類であり、本発明者らにより宿主・ベクター系が開発され、組換えＤＮＡ技術を用いて、これまで困難とされていたリグニンペルオキシダーゼ生産に成功している（特開平６−０５４６９１号公報）。しかしながら、用いるプロモーター領域はアミノ酸合成系酵素遺伝子であるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子やリグニン分解に関与するフェノールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域であるため、リグニンペルオキシダーゼの生産性が低く、野生株ＩＦＯ  ４９１７株をリグニンペルオキシダーゼ生産用培地（低炭素・低窒素源）で生産した時と同程度であり、またリグニンペルオキシダーゼが二次代謝産物として得られるために遺伝子発現に時間を要するなどの問題点があった。さらに、他の生物種、例えば糸状菌などの遺伝子組換えによる酵素タンパク質生産系に供されているプロモーターは、担子菌では機能しないことが報告されている（Ａ．Ｌｏｒｎａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，３５（１９８９））。
そこで、担子菌類で機能する、より強力な転写活性を有するプロモーターに対する関心が高まっており、本出願人は先に、コリオラス・ヒルスタス由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列を含んでなるＤＮＡ断片とそれを用いた宿主・ベクター系（特開平９−４７２８９号公報）、また、コリオラス・ヒルスタス又はシイタケ由来のｒａｓ遺伝子プロモーター領域又はｐｒｉＡ遺伝子プロモーター領域を含んでなるＤＮＡ断片とそれを用いた宿主・ベクター系（特開２０００−３４２２７５）を見出している。
しかしながら、現在まで、セルロース分解系酵素のプロモータを用いて有用ポリペプチド、特にリグニン分解酵素を担子菌において効果的に大量に産出し得る、さらなるプロモーターＤＮＡ断片及び該断片を用いた宿主・ベクター系、該宿主・ベクター系を用いたリグニン分解酵素の高生産方法、並びに該酵素を利用した木材チップ処理方法の開発は未だ開示されていない。
発明の開示
本発明は、担子菌の宿主において有用ポリペプチド、特にリグニン分解酵素を高生産させるためのプロモーターを提供することを目的とする。また、本発明は、該プロモーターを含む宿主・ベクター系、該系を利用したリグニン分解酵素の高生産方法、並びに該酵素を利用した木材チップの処理方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、セルロース等の木質バイオマス成分の存在下で発現する担子菌、特にコリオラス・ヒルスタスのセルロース分解酵素遺伝子に着目し、コリオラス・ヒルスタスの染色体ＤＮＡ制限酵素断片から各種セルロース分解酵素遺伝子をコードするＤＮＡ断片をクローン化し、この遺伝子の上流に存在するプロモーター領域を配列決定し、このプロモーター領域が宿主・ベクター系において有用ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に有効であることを見出した。
さらに、該プロモーター領域の下流に、コリオラス・ヒルスタスからクローニングしたマンガンペルオキシダーゼ遺伝子、高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子（特開平５−２６０９７８号公報）またはラッカーゼ遺伝子のシグナルペプチドを含む構造遺伝子を連結し、宿主細胞であるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損コリオラス・ヒルスタス変異株に移入することにより、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ又はラッカーゼ高生産株を取得することに成功し、本発明を完成することに至った。
したがって、本発明は以下の（１）〜（１２）を提供する。
（１）  担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する工程とからなる、リグニン分解酵素の生産方法。
（２）  担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とからなる、木材チップの処理方法。
（３）  セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、又はβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター配列である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片である、（１）、（２）又は（３）に記載の方法。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号１又は２において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（５）  セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片である、（１）、（２）又は（３）に記載の方法。
（ａ）配列番号１３、２５又は３７で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号１３、２５又は３７において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（６）  セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片である、（１）、（２）又は（３）に記載の方法。
（ａ）配列番号４９で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号４９において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（７）  リグニン分解酵素をコードする遺伝子が、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子からなる群から選択される、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  担子菌がコリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  宿主細胞がコリオラス・ヒルスタスである、（１）〜（８）のいずれかに方法。
（１０）  （１）〜（９）のいずれかに記載の方法によって得られる木材チップ。
（１１）  （１０）に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
（１２）  （１１）に記載の方法によって得られるパルプ。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−０４８６７４号、２００２−２０６７６２号、２００２−２５１７２０号、２００２−２５１９２３号及び２００２−２５２０５５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号３は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。
配列番号４は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む２．３ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号５は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む２．３ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号６は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号７は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号８は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む１．７ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号９は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号１０は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号１１は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号１２は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号１６は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。なお、塩基“ｙ”はチミジンもしくはシチジンを示し、塩基“ｒ”はグアノシンもしくはアデノシンを示す。
配列番号１７は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１遺伝子プロモーター領域を含む２．３ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号１８は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１遺伝子プロモーター領域を含む２．３ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号１９は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号２０は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号２１は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号２２は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号２３は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号２４は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号２８は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。塩基“ｉ”はイノシンを示す。
配列番号２９は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ）遺伝子プロモーター領域を含む３．１ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号３０は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター領域を含む３．１ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号３１は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号３２は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号３３は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号３４は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号３５は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号３６は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号４０は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。塩基“ｙ”はチミジンもしくはシチジンを示し、塩基“ｒ”はグアノシンもしくはアデノシンを示す。
配列番号４１は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩ２６）遺伝子プロモーター領域を含む１．１ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号４２は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩ２６）遺伝子プロモーター領域を含む１．１ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号４３は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号４４は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号４５は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号４６は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号４７は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号４８は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号５２は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。塩基“ｉ”はイノシンを示す。
配列番号５３は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター領域を含む３．１ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号５４は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター領域を含む３．１ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号５５は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号５６は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号５７は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号５８は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む２．４ｋｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号５９は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号６０は、コリオラス・ヒルスタスＩＦＯ  ４９１７株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む２．２ｋｂｐ  ＮｃｏＩ断片をＰＣＲで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
発明を実施するための形態
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、第１の態様において、担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する工程とからなる、リグニン分解酵素の生産方法を提供する。
該方法の第１の工程として、担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する。
本発明において、セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列とは、セルロースを分解し得る酵素のプロモーター配列であれば特に限定されないが、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、又はβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター配列が好ましい。
担子菌はセルロース分解能を有する属種であればいかなる菌も利用可能であるが、特に、和名をアラゲカワラタケと称するコリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）が好適である。
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片は、例えば、以下の１．〜３．に示すようなＤＮＡ断片を使用することができる。
１．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号１又は２において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
２．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号１３、２５又は３７で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号１３、２５又は３７において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
３．  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号４９で表される塩基配列。
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
（ｃ）配列番号４９において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
上記１．に記載のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片は以下のような手順で得ることができる。
コリオラス・ヒルスタスから染色体ＤＮＡを調製するには、Ｙｅｌｔｏｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１４７０（１９８４）］等、通常の染色体ＤＮＡの抽出法を用いることができる。次に、得られた染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ等の適当な制限酵素で処理し、部分分解を行った後ショ糖密度勾配超遠心法で分画して１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐの断片を得る。同じ付着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージＤＮＡに、上記で得られたＤＮＡ断片を連結する。当該ファージＤＮＡとしては、例えば、ＥＭＢＬ３［Ａ−Ｍ，Ｆｒｉｓｈａｕｆら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０，８２７（１９８３）］λファージＤＮＡが用いられる。得られたＤＮＡ断片連結ファージについてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングを行い、染色体ＤＮＡライブラリーとする。またサブクローニングには常用のクローニングベクター、好ましくは大腸菌クローニングベクター、例えばｐＵＣ系ベクターであるｐＵＣ１８［Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等を用いることができる。クローニングベクターは上記例示のものに制限されず、市販されるか、文献記載の公知のものが使用できる。
上記で得られた染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離にあたっては、精製後のコリオラス・ヒルスタスのセロビオースデヒドロゲナーゼをリジルエンドペプチダーゼを用いて完全消化し、アミノ酸シークエンスを行い、このアミノ酸配列から推定される塩基配列に基づいて作製した合成ＤＮＡプローブを用い、プラークハイブリダイゼーションによりセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含むクローンを選択する。選択したクローンからセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を単離し、制限酵素地図の作成および配列決定を行う。配列決定は、上記のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む断片を適当なクローニングベクター（例えばｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター）に挿入し、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））によって行うことができる。
上記の手順により、配列番号１又は２で表されるコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列が決定された。
セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含むＤＮＡ断片は、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む断片からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。ＰＣＲのためのプライマーとしては、配列番号１で表される塩基配列およびその相補配列に基づく約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号４に示すセンスプライマー、配列番号５に示すアンチセンスプライマーを使用することができる。（実施例３参照）。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
本発明におけるプロモーター配列又はプロモーター領域は、構造遺伝子の転写を調節する機能を有するものであり、真核生物のプロモーター内で実質的に保存されている機能的塩基配列をモティーフ（ＴＡＴＡ，ＣＣＡＡ，ＧＣボックスなど）を少なくとも含む。従って、配列番号１で表される塩基配列はそのようなプロモーター配列の１つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列に相補的な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列も本発明の範囲内である。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜１５０ｍＭであり、温度が３７〜８０℃、好ましくは５０〜６５℃での条件をいう。
なお、遺伝子に変異または改変を行うには、配列番号１又は２で表される塩基配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的変異技術（例えば、Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施可能である。
なお、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含むゲノムＤＮＡ断片を保有する大腸菌形質転換株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＣＤＨ１及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＣＤＨ２は、２００２年２月８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７９が付与されている。これらの寄託株に含まれる配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡも、本発明に包含される。
また、上記２．に記載のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離された３種類のＤＮＡ断片は以下のような手順で得ることができる。
１）セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離された第１のＤＮＡ断片
前記と同様にして、コリオラス・ヒルスタスから染色体遺伝子ライブラリーを調製した。次いで、得られた染色体遺伝子ライブラリーから、他生物種（例えばファネロケエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）等）から単離されているセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子の塩基配列に基づいて作製した合成ＤＮＡプローブを用いるプラークハイブリダイゼーションによってセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子とプロモーター領域をともに含むクローンを選択する。選択したクローンから目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、配列決定を行う。配列決定は、上記のセロビオヒドロラーゼＩ染色体遺伝子を含む断片を適当なクローニングベクター（例えばｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター）に挿入し、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））によって行うことができる。
上記の手順により、配列番号１４に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス属由来のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子およびその上流にセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含む４６２４塩基対からなるゲノム遺伝子（配列番号１４）である。配列中、プロモーター領域は塩基番号１〜２２９３（配列番号１３）に存在し、塩基番号２２０２〜２２０７にＴＡＴＡＡＡが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼＩ構造遺伝子は、塩基番号２２９４〜３７７５に存在し、３個のエキソンと２個のイントロン（介在配列）によって構成されている。具体的には、イントロン１は２５８６〜２６３７、イントロン２は２９６５〜３０２２にそれぞれ存在している。さらに塩基番号３７７６〜４６２４はターミネーターを含む３’非翻訳領域である。配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、４５７アミノ酸残基からなる配列番号１５に示すアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含むＤＮＡ断片は、上記のセロビオヒドロラーゼＩ染色体遺伝子を含む断片からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。ＰＣＲのためのプライマーとしては、配列番号１３に示される塩基配列およびその相補的配列に基づく約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号１７に示すセンスプライマー、配列番号１８に示すアンチセンスプライマーを使用することができる（実施例１５参照）。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号１３に示す塩基配列はそのようなプロモーター配列の１つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列において１個または複数の塩基の欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列も本発明の範囲内である。このような変異または改変は、配列番号１３に示す塩基配列を基にオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的突然変異技術（例えばＳｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施可能である。
２）セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離された第２のＤＮＡ断片
上記の第１のＤＮＡ断片の場合と同様にして、第２のＤＮＡ断片の配列決定を行った。その結果、配列番号２６に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス属由来のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子およびその上流にセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含む４１７０塩基対からなるゲノム遺伝子である。配列中、プロモーター領域は塩基番号１〜２１８２（配列番号２５）に存在し、塩基番号２０９９〜２１０４にＴＡＴＡＡＡが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子は、塩基番号２１８３〜３６６７に存在し、３個のエキソンと２個のイントロン（介在配列）によって構成されている。具体的には、イントロン１は２４７５〜２５３５、イントロン２は２８６２〜２９１７にそれぞれ存在している。さらに塩基番号３６６８〜４１７０はターミネーターを含む３’非翻訳領域である。配列の解析から推定されるアミノ酸配列は４５７アミノ酸残基からなる配列番号２７に示されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含む第２のＤＮＡ断片は、上記のセロビオヒドロラーゼＩ染色体遺伝子を含む断片からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。ＰＣＲのためのプライマーとしては、配列番号２５に示される塩基配列およびその相補的配列に基づく約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号２９に示すセンスプライマー、配列番号３０に示すアンチセンスプライマーを使用することができる（実施例２５参照）。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号２５に示す塩基配列はそのようなプロモーター配列の１つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列において１個または複数のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列も本発明の範囲内である。このような変異または改変は、配列番号１に示す塩基配列を基にオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的突然変異技術（例えばＳｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施可能である。
３）セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離された第３のＤＮＡ断片
上記の第１のＤＮＡ断片の場合と同様にして、第３のＤＮＡ断片の配列決定を行った。その結果、配列番号３８に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス属由来のセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子およびその上流にセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含む３９１６塩基対からなるゲノム遺伝子である。配列中、プロモーター領域は塩基番号１〜１０８６（配列番号３７）に存在し、塩基番号１００１〜１００６にＴＡＴＡＡＡが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼＩ構造遺伝子は、塩基番号１０８７〜２５７９に存在し、３個のエキソンと２個のイントロン（介在配列）によって構成されている。具体的には、イントロン１は１３７９〜１４４４、イントロン２は１７７１〜１８２９にそれぞれ存在している。さらに塩基番号２５８０〜３９１６はターミネーターを含む３’非翻訳領域である。配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、４５６アミノ酸残基からなる配列番号３９に示されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含む第３のＤＮＡ断片は、上記のセロビオヒドロラーゼＩ染色体遺伝子を含む断片からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。ＰＣＲのためのプライマーとしては、配列番号３７に示される塩基配列およびその相補的配列に基づく約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号４１に示すセンスプライマー、配列番号４２に示すアンチセンスプライマーを使用することができる（実施例２５参照）。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号３７に示す塩基配列はそのようなプロモーター配列の１つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列において１個または複数の塩基の欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列も本発明の範囲内である。このような変異または改変は、配列番号３７に示す塩基配列を基にオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的突然変異技術（例えばＳｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施可能である。
上記３．に記載のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ断片は以下のような手順で得ることができる。
上記１．に記載の方法と同様にして、染色体ＤＮＡライブラリーを得た。次いで、得られた染色体ＤＮＡライブラリーから、他生物種（例えば、ファネロケエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）等）から単離されているセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子の塩基配列に基づいて作製した合成ＤＮＡプローブを用い、プラークハイブリダイゼーションを行うことによって、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むクローンを選択する。選択したクローンからセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、配列決定を行う。
配列決定は、上記のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター（例えばｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター）に挿入し、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））によって行うことができる。
上記の手順により、配列番号５０に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子の構造遺伝子、その上流のプロモーター領域およびターミネーターを含む３’非翻訳領域を含む４９３３塩基対からなるゲノム遺伝子である。
配列中、プロモーター領域は塩基番号１〜３１２１（配列番号４９）に存在し、塩基番号３０５９〜３０６４にＴＡＴＡＡＡが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼＩＩの構造遺伝子は、塩基番号３１２２〜４８２２に存在し、７個のエキソンと６個のイントロン（介在配列）によって構成されている。具体的には、エキソン１は３１２２〜３２２１、エキソン２は３２８０〜３３４６、エキソン３は３４０２〜３５４９、エキソン４は３６０５〜４２２０、エキソン５は４２７５〜４３６３、エキソン６は４４２５〜４６７６、エキソン７は４７３６〜４８２２にそれぞれ存在している。また、イントロン１は３２２２〜３２７９、イントロン２は３３４７〜３４０１、イントロン３は３５５０〜３６０４、イントロン４は４２２１〜４２７４、イントロン５は４３６４〜４４２４そしてイントロン６は４６７７〜４７３５にそれぞれ存在している。さらに、塩基番号４８２３〜４９３３はターミネーターを含む３’非翻訳領域である。また、配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、４５３アミノ酸残基からなる配列番号５１に示されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を含むＤＮＡ断片は、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子を含む断片からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。ＰＣＲのためのプライマーとしては、配列番号４９で表される塩基配列およびその相補配列に基づく約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３０塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば、配列番号５３に示すセンスプライマー、配列番号５５に示すアンチセンスプライマーを使用することができる（実施例３参照）。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号４９で表される塩基配列はそのようなプロモーター配列の１つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列に相補的な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列も本発明の範囲内である。ここでストリンジェントな条件とは、配列番号４９に示す塩基配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に９５％以上である、配列番号４９で表す配列において１個または２個以上の塩基の欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列とハイブリダイゼーション可能である条件を意味し、例えば、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜１５０ｍＭであり、温度が３７〜８０℃、好ましくは５０〜６５℃での条件をいう。
なお、遺伝子に変異または改変を行うには、配列番号４９で表される塩基配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的変異技術（例えば、Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施可能である。
リグニン分解酵素をコードする遺伝子とは、リグニンを分解し得る酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子、ラッカーゼ遺伝子などがあげられる。これらの遺伝子は、ジーンバンクに登録されている配列、文献記載の配列等に基づいて周知のゲノムクローニングまたはｃＤＮＡクローニング法やＰＣＲ法を行うことによっても取得可能である。あるいは、寄託されている遺伝子については、分譲請求により入手可能なものを利用することができる。
また、本方法の第１の工程において、転写可能とは、宿主内でプロモーターの作用下でリグニン分解酵素をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が起こることを意味する。リグニン分解酵素をコードする遺伝子は、セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を有するＤＮＡ断片の下流に結合され、プロモーターの作動によりｍＲＮＡに転写される。
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片とリグニン分解酵素をコードする遺伝子は、必要に応じて制限部位の導入、平滑末端化または付着末端化後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて連結することができる。クローニング、連結反応、ＰＣＲ等を含む組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９やＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されるものを利用することができる。
ベクターの種類は特に限定されないが、このベクターによって形質転換される宿主の種類に応じて選択される。ベクターとしては、原核または真核生物宿主細胞において自律複製可能または染色体中に相同組替え可能なベクターを使用することができる。プラスミド、ファージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクターは、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリリンカー、エンハンサー、リボゾーム結合部位などを適宜含むことができる。細菌、真菌、酵母、動物、植物などの原核および真核生物用の種々のベクターが市販されているか、あるいは、文献等に記載されており、これらを利用して本発明のＤＮＡ断片または組換えＤＮＡをベクターに導入することができる。ＤＮＡ導入は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載される技術を使用して実施することができる。
本方法の第２の工程において、上記に規定するベクターによって形質転換されたリグニン分解酵素高生産宿主細胞を作製する。
ここで宿主細胞は、担子菌、真菌類、酵母類を含む菌類だけではなく、他の真核細胞（動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、藻類など）や原核細胞（細菌、藍藻など）であっても、リグニン分解酵素をコードする遺伝子の発現においてプロモーター活性を発揮できるならば、いずれの宿主細胞も使用可能である。このうち、好ましい宿主細胞は担子菌であり、特に好ましくはコリオラス・ヒルスタスである。例えば、具体的には、後述の実施例に記載されている、コリオラス・ヒルスタスのオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性を欠損している栄養要求性変異株ＯＪＩ−１０７８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を宿主として使用できる。更に選抜マーカー遺伝子としてはコリオラス・ヒルスタスから単離したオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を含む大腸菌組換え株ＪＭ１０９／ｐＵＣＲ１（特開平６−０５４６９１号公報；ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２０１）を用いることができる。
形質転換法としては、塩化カルシウム／ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポーレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法などを例示できるが、これらに限定されない。
本方法の第３の工程においては、上記の形質転換されたリグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する。
リグニン分解酵素は、シグナルペプチドとの融合形態で発現・翻訳されるときには分泌形態で産生され、この場合には培地から直接単離することができるが、一方、ポリペプチドが非分泌形態で産生されるときには細胞を分離して、超音波処理、ホモゲナイジング等の処理により細胞を破壊して抽出液を得、この抽出液からポリペプチドを単離することができる。単離・精製は、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈殿、限外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの方法を単独にまたは組み合わせて行うことができる。
例えば、本発明のプロモーター領域の下流にマンガンペルオキシダーゼ遺伝子部分又はリグニンペルオキシダーゼ遺伝子部分又はラッカーゼ遺伝子部分を連結した組換えベクターで形質転換した宿主細胞を培養することにより、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ又はラッカーゼを大量に生産することができる。前記各遺伝子は、特に限定されず、配列が公知の各種遺伝子を用いることができるが、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているマンガンペルオキシダーゼｃＤＮＡ遺伝子を含む大腸菌組換え株ＪＭ１０９／ｐＢＳＭＰＯＣ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３２）、マンガンペルオキシダーゼ染色体遺伝子を含む大腸菌組換え株ＪＭ１０９／ｐＢＳＭＰＯＧ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３）、高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１ｂｌｕｅ／ｐＢＳＬＰＯＧ７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３）、また、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９３（染色体遺伝子）、ＦＥＲＭ  Ｐ−１００５５（ｃＤＮＡ）およびＦＥＲＭ  Ｐ−１００６１（ｃＤＮＡ）として寄託されているラッカーゼ（別称：フェノールオキシダーゼ）遺伝子を含む大腸菌組換え株（特公平７−４６９９５号公報；特公平６−８５７１７号公報）を用いることによって得ることができる。
本発明の第２の態様として、担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とを含む、木材チップの処理方法を提供する。
担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該ＤＮＡ断片に結合されている組換えＤＮＡ、を含むベクターを作製する工程、及び該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程については、上記の第１の態様において定義したとおりである。
リグニン分解酵素高生産宿主細胞は、木材チップに接種して処理することにより、パルプ製造工程において叩解エネルギー削減や蒸解時間短縮による省エネルギー化を図ることができる。
処理は、例えば以下のようにして行うことができる。
得られたリグニン分解酵素高生産宿主細胞をポテトデキストロース寒天培地上で培養した後、低温（４℃）で保存し、このプレートから打ち抜いた切片を、グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、１００ｒｐｍで１週間振盪培養する。培養後、宿主細胞をろ別し、滅菌水で洗浄し、残存していた培地を除去する。
次いで、得られたリグニン分解酵素高生産宿主細胞を滅菌水と共に、ワーリングブレンダーで１５ｓｅｃ粉砕し、絶乾重量１ｋｇのユーカリ材の木材チップに対し、宿主細胞の乾燥重量が１ｇになるように植菌する。植菌後は宿主細胞が全体に行き渡るようによく撹拌する。培養は２８℃で通気をしながら１週間静置培養を行う。また、木材チップ含水率が４０〜６５％になるように随時飽和水蒸気を通気させる。通気する際の通気量は対チップ当り、０．０１ｖｖｍになるように行う。
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
１．セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
［実施例１］  染色体遺伝子ライブラリーの作製
コリオラス・ヒルスタス（ＩＦＯ  ４９１７株）の平板寒天培養から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）２００ｍｌに植菌し、２８℃で７日間回転振盪培養を行った。菌体を集菌後、１Ｌの滅菌水で菌体を洗浄し、液体窒素で凍結した。
この凍結菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕した。粉砕した菌体を遠心管に移し、溶菌緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、さらにプロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌとなるように添加）１０ｍｌを加え、５５℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、フェノール処理、クロロホルム処理を行い、水層部分にエタノールを徐々に添加しＤＮＡが析出したところで染色体ＤＮＡを巻取り、ＴＥ溶液に懸濁した。
得られた染色体ＤＮＡ１００μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、５〜２０％ショ糖密度勾配超遠心分離（３０，０００ｒｐｍ，１８時間）により分画し、２０〜４０ｋｂｐ断片区分を集めた。この断片区分を東洋紡社製ファージλＥＭＢＬ３−ＢａｍアームにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、得られたファージＤＮＡをＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ギガパックゴールドを用いてパッケージング後、大腸菌Ｐ２３９２株（前記ギガパックゴールドに含まれている）に感染せしめ染色体ＤＮＡライブラリーとした。
［実施例２］  染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片の単離
上記染色体ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含むクローンの選抜を行った。この一連の操作は常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））によった。プラークハイブリダイショーンに用いたプローブは次の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
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その結果、約４０，０００個のプラークの中から４個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＸｈｏＩで消化して得られた断片中に７．２ｋｂｐ及び５．３ｋｂｐのＤＮＡバンドとしてプローブにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片７．２ｋｂｐ及び５．３ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（東洋紡社製）のＸｈｏＩサイトにサブクローニング化し、プラスミドｐＣＨＣＤＨ１及びｐＣＨＣＤＨ２を得た。これらのプラスミドをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換した。なお、得られたコリオラス・ヒルスタス由来セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含む大腸菌形質転換株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＣＤＨ１及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＣＤＨ２は、２００２年２月８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７９が付与されている。次いで、サブクローニング化したＤＮＡを大量に調製し、超遠心操作（５０，０００ｒｐｍ，１６ｈ，１５℃）で精製し、塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製のシーケンシングキットを用いて行った。セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１又は２に示す。
［実施例３］  セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例２で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドｐＣＨＣＤＨ１から下記の配列番号４及び５に示す２つのプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、セロビオースデヒドロゲナーゼプロモーター領域のＢａｍＨＩ〜ブラントエンドを有する２．２ｋｂｐ断片（断片１）を増幅した。
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次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＭＰＯＧ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３）を以下の配列番号６及び７に示す２つのプロモーターを用いてＰＣＲ法を行うことにより、マンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分ブラントエンド〜ＥｃｏＲＩ約２．２ｋｂｐ（断片２）を増幅した。
大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨＩ〜ＥｃｏＲＩで切断し、上記の断片１及び２のＤＮＡ断片を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から断片１及び断片２のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＣＤＨＰＭＮと命名した。
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［実施例４］  マンガンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
以下の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。
ａ．一核菌糸体培養
直径６ｍｍ前後のガラスビーズを約３０個入れた５００ｍｌ容三角フラスコにＳＭＹ培地（シュークロース１％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）１００ｍｌを分注して滅菌後、コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株の平板寒天培地から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜きＳＭＹ培地に植菌し、２８℃で７日間静置培養した（前培養）。ただし、菌糸を細分化するために、１日に１〜２回振り混ぜた。次に、１Ｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地２００ｍｌを分注し、さらに回転子を入れ、滅菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、全量を植菌し、２８℃で培養した。なお、スターラーで１日２時間程度撹拌することにより菌糸を細分化した。この培養を４日間行った。
ｂ．プロトプラストの調製
上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、浸透圧調節溶液（０．５Ｍ  ＭｇＳＯ４、５０ｍｌマレイン酸バッファー（ｐＨ５．６））で洗浄した。次に、湿菌体１００ｍｇあたり１ｍｌの細胞壁分解酵素液に懸濁し、緩やかに震盪しながら２８℃で３時間インキュベートしてプロトプラストを遊離させた。細胞壁溶解酵素として、次の市販酵素製剤を組み合わせて使用した。即ち、セルラーゼ・オノズカ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＯＮＯＺＵＫＡ  ＲＳ）ヤクルト社製５ｍｇ、ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ）（宝酒造社製）１０ｍｇを上記浸透圧調節溶液１ｍｇに溶解して酵素液として用いた。
ｃ．プロトプラストの精製
上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高めるため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロトプラストを上記浸透圧調節溶液で１回洗浄した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠心分離（１，０００ｋ×ｇ、５分間）し、上静を除去し、４ｍｌの１Ｍシュークロース（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ６．３）で再懸濁後、遠心操作を繰り返し、上記１Ｍシュークロース溶液で２回洗浄した。沈殿物に１Ｍソルビトール溶液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．４）に４０ｍＭ塩化カルシウムを加えた溶液５００μｌに懸濁し、プロトプラスト溶液とした。この溶液を４℃で保存した。
プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて、直接検鏡により求めた。すべての遠心操作はスウィングローターで１，０００×ｇ、５分間、室温下で行った。
ｄ．形質転換
約１０６個／１００μｌのプロトプラスト溶液に対し実施例３で作製したプラスミド２μｇを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに捲いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ遺伝子発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例５］  形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
酸素漂白後広葉樹パルプ（ＬＯＫＰ）・ペプトン培地（ＬＯＫＰ１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに、上記実施例４で得られた形質転換株５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃、１００ｒｐｍで回転振盪培養した。６日後、得られた培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は０．５Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０μｌ、酵素液３４５μｌ、１０ｍＭ過酸化水素５μｌ、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４１００μｌを十分混合し、反応の結果生じるＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体の２７０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体を酵素活性が、培養開始６日目で６μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎで認められた。ここで酵素活性単位は１分間にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認められなかった。
［実施例６］  セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの下流にリグニンペルオキシダーゼ染色体遺伝子（特開平５−２６０９７８号；ｐＢＳＬＰＯＧ７；ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３）の構造遺伝子領域を連結し、発現プラスミドとした。
具体的には、実施例２で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドｐＣＨＣＤＨ１から実施例３において配列番号４及び５に示す２つのプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、プロモーター領域のＢａｍＨＩ〜ブラントエンドを有する２．２ｋｂｐ断片（断片３）を増幅した。また、リグニンペルオキシダーゼの構造遺伝子部分の取り出しはプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７をテンプレートにして以下の配列番号８に示すプライマーを用いてプライマー伸長法によりＤＮＡ断片を作製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分からなる１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片（断片４）を得た。
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さらに、大腸菌ベクターをｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記断片５及び６の２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から上記断片３及び４のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＣＤＨＰＬＰと命名した。
［実施例７］  リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例４に記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約１０６個／１００μｌのプロトプラスト溶液に対し実施例６で作製したプラスミド２μｇを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに捲いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ遺伝子発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例８］  形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
酸素漂白後広葉樹パルプ（ＬＯＫＰ）・ペプトン培地（ＬＯＫＰ１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに、上記実施例７で得られた形質転換株５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃、１００ｒｐｍで回転振盪培養した。６日後、得られた培養液を遠心分離し、その上清を得た。
活性測定法は８ｍＭベラトリルアルコール２５μｌ、０．５Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）５０μｌ、酵素液４００μｌ、２．７ｍＭ過酸化水素２５μｌを十分混合し、反応の結果生じるベラトルムアルデヒドの３１０ｎｍの吸光度を経時的に行い、上記培養上清中にベラトリルアルコールをベラトルムアルデヒドへと変換する酵素活性が静置培養開始５日目で３００〜５００ユニット／ｍｌの範囲で認められた。ここで酵素活性単位は１分間にベラトルムアルデヒド１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認められなかった。
［実施例９］  セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例２で得られたプラスミドｐＣＨＣＤＨ１をテンプレートにして以下の配列番号９及び１０に示す２つのプライマーを用いたＰＣＲを実施し、ＢａｍＨＩ処理を行うことによりＢａｍＨＩ〜ブラントエンドを有するＤＮＡ断片（断片７）を得た。
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一方、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドＯＪ−ＰＯＧ−Ｅ１（寄託番号ＢＰ−２７９３）を以下の配列番号１１及び１２に示す２つのプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。
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得られたＰＣＲ断片を上記のＴＡ−Ｃｌｏｎｏｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬＡＣを得た。プラスミドｐＴＡＬＡＣを制限酵素ＸｈｏＩで消化後、修飾酵素Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化し、その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分（断片６）を得た。
大腸菌ベクターｐＵＣ１８をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化したのち、上記断片７及び８のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から上記２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＣＤＨＰＬＡＣと命名した。
［実施例１０］  ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例４に記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約１０６個／１００μｌのプロトプラスト溶液に対し実施例９で作製したプラスミド２μｇを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに捲いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例１１］  形質転換体によるラッカーゼの生産
酸素漂白後広葉樹パルプ（ＬＯＫＰ）・ペプトン培地（ＬＯＫＰ１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに、上記実施例１０で得られた形質転換株を５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃、１００ｒｐｍで回転振盪培養した。６日後、得られた培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌ、５ｍＭ  ２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｉｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＡＢＴＳ）５０μｌ、酵素液４００μｌを加え、反応の結果生じるＡＢＴＳの酸化物を４２０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で４０ユニット／ｍＬで認められた。ここで、酵素活性単位は１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清にはわずか５ユニット／ｍｌしか認められなかった。
２．セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子のプロモーター配列を含む第１のＤＮＡ断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
［実施例１２］  染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター配列を含むＤＮＡ断片の単離
実施例１と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーを得た。得られた該ライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子を含むクローンの選抜を行った。この一連の操作は常法［Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ／２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）］によった。
プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは下記配列番号１６の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
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ただし、配列番号１６で塩基Ｙは塩基ＴまたはＣを示し、塩基Ｒは塩基ＧまたはＡを示す。
その結果、約４０，０００個のプラークの中から４個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩならびにＢａｍＨＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして４．６ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片４．６ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＥｃＯＲＩ−ＢａｍＨＩサイトにサブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１を得た。サブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡシークエンサーＰＲＩＳＭ  ３１０を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。
塩基配列を配列番号１４に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子は２つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
［実施例１３］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１を制限酵素ＮｃｏＩで消化した後、修飾酵素Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化を行い、自己連結を行い、ＮｃｏＩサイトを消失させる。得られたＮｃｏＩサイト消失プラスミドから以下に示す２つのプライマー（１，２）を用いてＰＣＲ法により、プロモーター領域２．３ｋｂｐとして増幅し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトへＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１Ｐを得た。
2003070939.tif 000009
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＭＰＯＧ１（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３）を以下に示す２つのプライマー（３，４）を用いてＰＣＲ法によりマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分ＮｃｏＩ約２．２ｋｂ断片を増幅する。
2003070939.tif 000010
得られたＰＣＲ断片をＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いて挿入し、ｐＴＡＭＰとした。次に、得られたｐＴＡＭＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、約２．２ｋｂを切り出し、上記ｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰのＮｃｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＭＰを得た（図１）。
［実施例１４］  マンガンペルオキシダーゼを高生産する形質転換体の作製
実施例４と同様にして、プロトプラストを調製・精製した。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００μｌに対し、実施例１３で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＭＰ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。つぎに、液量に対し等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。つぎに、０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例１５］  形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
上記実施例１４で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ４８ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は０．５Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０μｌ、酵素液３４５μｌ、１０ｍＭ過酸化水素５μｌ、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４１００μｌを充分に混合し、反応の結果生じるＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体の２７０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体を酵素活性が培養開始６日目で３．５μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎで認められた。ここで酵素活性単位は１分間にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認められなかった。
［実施例１６］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１Ｐを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化後、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドＯＪ−ＰＯＧ−Ｅ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９３）を以下に示す２つのプライマー（５，６）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
2003070939.tif 000011
得られたＰＣＲ断片を上記のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬＡＣを得た。
プラスミドｐＴＡＬＡＣを制限酵素ＸｈｏＩで消化後、修飾酵素ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化する。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ３１Ｐへ導入した。
得られたプラスミドをｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬＡＣと命名した（図２）。
［実施例１７］  ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例１６で得たｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬＡＣを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のＯＣＴ遺伝子保持するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に導入すること（ＰＥＧ法もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し実施例１６で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬＡＣ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例１８］  形質転換体によるラッカーゼの生産
上記実施例１７で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ１００ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌ、５ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｉｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）５０μｌ、酵素液４００μｌを加え、反応の結果生じるＡＢＴＳの酸化物を４２０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で３５ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位は１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清にはわずか５ユニット／ｍｌしか認められなかった。
［実施例１９］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例１３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１Ｐを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３）を以下に示す２つのプライマー（７，８）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
2003070939.tif 000012
得られたＰＣＲ断片を上記のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬｉＰを得た。
プラスミドｐＴＡＬｉＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ３１Ｐへ導入した。
得られたプラスミドをｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬｉＰと命名した（図３）。
［実施例２０］  リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例１９で得たｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬｉＰを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を同時に導入すること（ＰＥＧ法もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し実施例９で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬｉＰ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例２１］  形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
上記実施例２０で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、５ｍＭベラトリルアルコール、リン酸でｐＨ４．５に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１００μｌ、８ｍＭベラトリルアルコール２５μｌ、酵素液３５０μｌ、５．４ｍＭ過酸化水素２５μｌを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを３１０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で０．８ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位は１分間に１μｍｏｌのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
３．セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子のプロモーター配列を含む第２のＤＮＡ断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
［実施例２２］  染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ遺伝子の単離
実施例１２と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーからクローンの選抜を行った。プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは下記配列番号２８の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
2003070939.tif 000013
ただし、配列番号２８で塩基Ｙは塩基ＴまたはＣを示し、塩基Ｒは塩基ＧまたはＡを示す。
その結果、約４０，０００個のプラークの中から４個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＳａｌＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして４．２ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片４．２ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳａｌＩサイトにサブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７を得た。サブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡシークエンサーＰＲＩＳＭ  ３１０を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。
塩基配列を配列番号２６に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子は２つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
［実施例２３］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７から以下に示す２つのプライマー（１，２）を用いてＰＣＲ法により、プロモーター領域２．１ｋｂｐとして増幅し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトへＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７Ｐを得た。
2003070939.tif 000014
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＭＰＯＧ１（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３）を以下に示す２つのプライマー（３，４）を用いてＰＣＲ法によりマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分ＮｃｏＩ約２．２ｋｂ断片を増幅する。
2003070939.tif 000015
得られたＰＣＲ断片をＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いて挿入し、ｐＴＡＭＰとした。次に、得られたｐＴＡＭＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、約２．２ｋｂを切り出し、上記ｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰのＮｃｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＭＰを得た（図４）。
［実施例２４］  形質転換体
実施例４と同様にして、プロトプラストを調製・精製した。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００μｌに対し、実施例２３で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＭＰ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。つぎに、液量に対し等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。つぎに、０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例２５］  形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
上記実施例２４で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ４８ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は０．５Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０μｌ、酵素液３４５μｌ、１０ｍＭ過酸化水素５μｌ、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４１００μｌを充分に混合し、反応の結果生じるＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体の２７０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体を酵素活性が培養開始６日目で８．５μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎで認められた。ここで酵素活性単位は１分間にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清には本活性は認められなかった。
［実施例２６］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例２３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７Ｐを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化後、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドＯＪ−ＰＯＧ−Ｅ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９３）を以下に示す２つのプライマー（５，６）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
2003070939.tif 000016
得られたＰＣＲ断片を上記のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬＡＣを得た。
プラスミドｐＴＡＬＡＣを制限酵素ＸｈｏＩで消化後、修飾酵素ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化する。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ２７Ｐへ導入した。
得られたプラスミドをｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬＡＣと命名した（図５）。
［実施例２７］  ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例２６で得たｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬＡＣを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のＯＣＴ遺伝子保持するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に導入すること（ＰＥＧ法もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し実施例２６で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬＡＣ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例２８］  形質転換体によるラッカーゼの生産
上記実施例２７で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ１００ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌ、５ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｉｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）５０μｌ、酵素液４００μｌを加え、反応の結果生じるＡＢＴＳの酸化物を４２０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で５７ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位は１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清にはわずか５ユニット／ｍｌしか認められなかった。
［実施例２９］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例２３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７Ｐを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３）を以下に示す２つのプライマー（７，８）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
2003070939.tif 000017
得られたＰＣＲ断片を上記のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬｉＰを得た。
プラスミドｐＴＡＬｉＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ２７Ｐへ導入した。
得られたプラスミドをｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬｉＰと命名した（図６）。
［実施例３０］  リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例２９で得たｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬｉＰを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を同時に導入すること（ＰＥＧ法もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し実施例２９で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬｉＰ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例３１］  形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
上記実施例３０で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、５ｍＭベラトリルアルコール、リン酸でｐＨ４．５に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１００μｌ、８ｍＭベラトリルアルコール２５μｌ、酵素液３５０μｌ、５．４ｍＭ過酸化水素２５μｌを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを３１０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で１．５ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位は１分間に１μｍｏｌのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
４．セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子のプロモーター配列を含む第３のＤＮＡ断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
［実施例３２］  染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドラーゼＩ遺伝子の単離
実施例１２と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーからクローンの選抜を行った。プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは下記配列番号４０の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
2003070939.tif 000018
ただし、配列番号４０で塩基Ｙは塩基ＴまたはＣを示し、塩基Ｒは塩基ＧまたはＡを示す。
その結果、約４０，０００個のプラークの中から４個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＰｓｔＩならびにＮｈｅＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして３．９ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片３．９ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓＩＩ  ＳＫ−のＰｓｔＩ−ＳｐｅＩサイトにサブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６を得た。サブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡシークエンサーＰＲＩＳＭ  ３１０を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。
塩基配列を配列番号３８に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子は２つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号３９に示す。
［実施例３３］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑末端とした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己連結を生じさせ、ＮｃｏＩサイトが消失したプラスミドｐＣＢＣＢＨＩ２６−ＮｃｏＩを得た。次に上記プラスミドを以下に示す２つのプライマー（１，２）を用いてＰＣＲ法により、プロモーター領域１．１ｋｂｐとして増幅し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトへＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６Ｐを得た。
2003070939.tif 000019
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＭＰＯＧ１（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３）を以下に示す２つのプライマー（３，４）を用いてＰＣＲ法によりマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分ＮｃｏＩ約２．２ｋｂ断片を増幅する。
2003070939.tif 000020
得られたＰＣＲ断片をＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いて挿入し、ｐＴＡＭＰとした。次に、得られたｐＴＡＭＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、約２．２ｋｂを切り出し、上記ｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰのＮｃｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＭＰを得た（図７）。
［実施例３４］  コリオラス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）形質転換法
実施例４と同様にして、プロトプラストを調製・精製した。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００μｌに対し、実施例３３で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＭＰ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。つぎに、液量に対し等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。つぎに、０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例３５］  形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
上記実施例３４で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ４８ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は０．５Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０μｌ、酵素液３４５μｌ、１０ｍＭ過酸化水素５μｌ、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４１００μｌを充分に混合し、反応の結果生じるＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体の２７０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体を酵素活性が培養開始６日目で５．５μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎで認められた。ここで酵素活性単位は１分間にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清には本活性は認められなかった。
［実施例３６］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例３３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６Ｐを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化後、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドＯＪ−ＰＯＧ−Ｅ１（寄託番号ＢＰ−２７９３）を以下に示す２つのプライマー（５，６）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
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得られたＰＣＲ断片を上記のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬＡＣを得た。
プラスミドｐＴＡＬＡＣを制限酵素ＸｈｏＩで消化後、修飾酵素ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ２６Ｐへ導入した。
得られたプラスミドをｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬＡＣと命名した（図８）。
［実施例３７］  ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例３６で得たｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬＡＣを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のＯＣＴ遺伝子保持するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に導入すること（ＰＥＧ法もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し実施例３６で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬＡＣ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例３８］  形質転換体によるラッカーゼの生産
上記実施例３７で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ１００ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌ、５ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｉｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）５０μｌ、酵素液４００μｌを加え、反応の結果生じるＡＢＴＳの酸化物を４２０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で５２ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位は１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清にはわずか５ユニット／ｍｌしか認められなかった。
［実施例３９］  セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例３３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６Ｐを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３）を以下に示す２つのプライマー（７，８）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
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得られたＰＣＲ断片を上記のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬｉＰを得た。
プラスミドｐＴＡＬｉＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ２６Ｐへ導入した。
得られたプラスミドをｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬｉＰと命名した（図９）。
［実施例４０］  リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製；
実施例３９で得たｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬｉＰを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を同時に導入すること（ＰＥＧ法もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し実施例３９で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬｉＰ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例４１］  形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
上記実施例４０で得られた形質転換株を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、５ｍＭベラトリルアルコール、リン酸でｐＨ４．５に調整）に５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１００μｌ、８ｍＭベラトリルアルコール２５μｌ、酵素液３５０μｌ、５．４ｍＭ過酸化水素２５μｌを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを３１０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で１．０ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位は１分間に１μｍｏｌのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
５．セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
［実施例４２］  染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡ断片の単離
実施例１と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーを得た。得られた該ライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域を含むクローンの選抜を行った。この一連の操作は常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））によった。プラークハイブリダイショーンに用いたプローブは、ファネロケエテ・クリソスポリウムのセロビオヒドロラーゼＩＩの塩基配列に基づいて作製した、以下の配列番号５２に示す合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴＤＮＡ標識キットを用い３’末端をフルオレセインで標識したものである。
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その結果、約１００，０００個のプラークの中から８個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＶならびにＮｃｏＩで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして５．０ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記ＤＮＡ断片を回収するため、制限酵素ＮｃｏＩで消化後Ｋｌｅｎｏｗ断片により平滑化し、さらにＥｃｏＲＶで消化することにより得られる５．０ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトにサブクローン化し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩを得た。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換した。また、前記のサブクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡシークエンサーＰＲＩＳＭ  ３１０を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。その塩基配列を配列番号５０に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内において、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子は６つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５１に示した。
［実施例４３］  セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子のプロモーター配列を含む、実施例４２で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩから、以下の配列番号５３及び５４に示す２つのプライマーを用い、ＰＣＲ法により増幅し、プロモーター領域３．１ｋｂｐを得た。
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このＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を大腸菌クローニングベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトへＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰを得た。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＭＰＯＧ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３）を、以下の配列番号５５及び５６に示す２つのプライマーを用い、ＰＣＲ法により増幅し、マンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子ＮｃｏＩ切断部分約２．２ｋｂ断片を得た。
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このＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片をＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いてＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇベクターに挿入し、ｐＴＡＭＰとした。次に、得られたｐＴＡＭＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、約２．２ｋｂを切り出し、上記のプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰのＮｃｏＩサイトへ挿入し、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター配列とマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子を含むプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＭＰを得た（図１０）。
［実施例４４］  コリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例４と同様にしてプロトプラストの調製・精製を行った。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
１０６個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００μｌに対し、実施例３３で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＭＰ  ２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。次に、液量に対し等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。次に、０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。
さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＭＰが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例４５］  形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ４８ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に、上記実施例４４で得られた形質転換株の５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は０．５Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０μｌ、酵素液３４５μｌ、１０ｍＭ過酸化水素５μｌ、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４１００μｌを充分に混合し、反応の結果生じるＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体の２７０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行った。
その結果、上記培養上清中には、マンガンペルオキシダーゼの酵素活性によって生成されるＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体が培養開始６日目で６μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎ認められた。ここで酵素活性単位は１分間にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認められなかった。
［実施例４６］  セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例４３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化後、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーター発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドＯＪ−ＰＯＧ−Ｅ１（ＢＰ−２７９３）を以下に示す配列番号５７及び５８のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。
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得られたＰＣＲによるＤＮＡ断片を実施例３と同様にＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬＡＣを得た。
プラスミドｐＴＡＬＡＣを制限酵素ＸｈｏＩで消化後、修飾酵素ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得た。
実施例４３で得られたセロビオヒドロラーゼＩＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩＩＰのＮｃｏＩサイトへラッカーゼ構造遺伝子部分を導入し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＬＡＣを得た（図１１）。
［実施例４７］  ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例４４記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約１０６個／１００μｌのプロトプラスト溶液に対し実施例４６で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＬＡＣ  ２μｇを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに捲いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＬＡＣが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例４８］  形質転換体によるラッカーゼの生産
５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ１００ｍｇ／ｌ、リン酸でｐＨ５．０に調整）に、上記実施例４７で得られた形質転換株の５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌ、５ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｉｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）５０μｌ、酵素液４００μｌを加え、反応の結果生じるＡＢＴＳの酸化物を４２０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行った。その結果、上記培養上清中に酵素活性が培養開始５日目で４０ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位（ユニット）は、１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳを酸化するのに必要とされる酵素量とした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には、酵素活性はわずか５ユニット／ｍｌしか認められなかった。
［実施例４９］  セロビオヒドロラーゼＩＩ遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例４３で得られたプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰを制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化し、セロビオヒドロラーゼＩＩ発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３）を以下に示す配列番号５９及び６０の２つのプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。
2003070939.tif 000027
得られたＰＣＲ断片を実施例４３と同様にＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇベクターへ導入し、プラスミドｐＴＡＬｉＰを得た。次いで、プラスミドｐＴＡＬｉＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得た。
実施例４３で得られたセロビオヒドロラーゼＩＩ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩＩＰのＮｃｏＩサイトへリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を導入し、プラスミドｐＣＨＣＢＨＨＰＬｉＰを得た（図１２）。
［実施例５０］  リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例４４に記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約１０６個／１００μｌのプロトプラスト溶液に対し実施例４９で作製したプラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＬｉＰ  ２μｇを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。
さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＬｉＰが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
［実施例５１］  形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのパルプ・ペプトン液体培地（晒パルプ３０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／ｌ、塩酸チアミン２ｍｇ／ｌ、５ｍＭベラトリルアルコール、リン酸でｐＨ４．５に調整）に上記実施例１０で得られた形質転換株の５０ｍｍ２の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は１Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１００μｌ、８ｍＭベラトリルアルコール２５μｌ、酵素液３５０μｌ、５．４ｍＭ過酸化水素２５μｌを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを３１０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行った。上記培養上清中に、酵素活性が培養開始５日目で１．２ユニット／ｍｌ認められた。ここで酵素活性単位（ユニット）は、１分間に１μｍｏｌのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量とした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないコリオラス・ヒルスタスＯＪＩ−１０７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２１０）の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
［実施例５２］  マンガンペルオキシダーゼを高分泌生産する形質転換体を用いたチップ処理
実施例４４により選抜したマンガンペルオキシダーゼ高分泌生産する形質転換株をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃にて培養した後、４℃で保存した。このプレートから直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた切片を５つずつ、グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４０．０５％、リン酸でｐＨ４．５に調製）を１００ｍｌずつ含む３００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、１００ｒｐｍで１週間震盪培養した。培養後、菌体をろ別し、菌体に残存した培地を滅菌水で洗浄した。菌体は滅菌水と共に、ワーリングブレンダーで１０ｓｅｃ粉砕し、絶乾重量１ｋｇのユーカリ材に対し、菌体の乾燥重量が１０ｍｇになるように植菌した。植菌後は菌が全体に行き渡るようによく撹拌した。培養は２８℃で通気をしながら１週間静置培養を行った。チップ含水率が４０〜６５％になるように随時飽和水蒸気を通気させた。通気する際の通気量は対チップ当り、０．０１ｖｖｍになるように行った。
［実施例５３］  マンガンペルオキシダーゼ高分泌生産する形質転換体による機械パルプの製造
ラジアータパイン材を用い実施例５２に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップをラボ用リファイナー（熊谷理機社製）を用いて叩解して、カナディアンスタンダードフリネスを２００ｍｌとした後、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製はＴａｐｐｉ試験法Ｔ２０５ｏｍ−８１に準拠して、パルプ手抄きシートの物理試験はＴａｐｐｉ法Ｔ２２０ｏｍ−８３に準拠して行った。使用電力量はワットメーター（Ｈｉｏｋｉｄｅｎｋｉ  ｍｏｄｅｌ３１３３）と積分計（ｍｏｄｅｌ３１４１）を用いた。チップ収率測定は水分を含んだ木材チップを容器に絶乾重量で１ｋｇ分取し、処理前後のチップ絶乾重量を測定し、以下の式を用いてチップ収率を算出した。
（処理後の絶乾重量）／（処理前の絶乾重量）×１００
表１に示すようにセロビオースデヒドロゲナーゼを抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
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［実施例５４］  マンガンペルオキシダーゼ高分泌生産する形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例５２に準じてユーカリ材のチップ処理を行った後、絶乾重量４００ｇのチップを測りとりオートクレーブ内で液比５、硫化度３０％、有効アルカリ１７％（Ｎａ２Ｏとして）となるように蒸解白液を加え、蒸解温度を１５０℃にてクラフト蒸解を行った。クラフト蒸解終了後、黒液を分離し、得られたチップを高濃度離解機によって解繊後、濾布で遠心脱水と水洗浄を３回繰り返した。次いでスクリーンにより、未蒸解物を除き、遠心脱水し蒸解未漂白パルプを得た。
上記のクラフト蒸解して得られたパルプに対して、ＮａＯＨを２．０質量％添加し、酸素ガスを注入し、１００℃、酸素ゲージ圧０．４９ＭＰａ（５ｋｇ／ｃｍ２）で６０分間処理を行った。
上記で得たパルプを下記に示すように、Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｄの４段漂白処理を行った。最初の二酸化塩素処理（Ｄ）は、パルプ濃度が１０質量％となるように調製し、二酸化塩素を０．４質量％添加し、７０℃、４０分間処理を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を１０質量％に調製し、苛性ソーダを１質量％添加し、７０℃、９０分間のアルカリ抽出処理（Ｅ）を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を１０質量％に調製し、過酸化水素０．５質量％、苛性ソーダ０．５質量％を順次添加し、７０℃、１２０分間の過酸化水素処理（Ｐ）を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を１０％に調製し、二酸化塩素０．２５質量％を添加し、７０℃、１８０分間二酸化塩素処理（Ｄ）を行った。最後にイオン交換水にて洗浄、脱水後、ＪＩＳ  Ｐ  ８１２３に準じた白色度８６．０％の漂白パルプを得た。
上記で得たパルプ濃度が４質量％のパルプスラリーをリファイナーによりフリーネスが４１０ｍｌ（ＣＳＦ）となるように叩解した。
［実施例５５］  Ｋａ価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
カッパー価の測定は、ＪＩＳ  Ｐ  ８２１１に準じて行った。パルプ物理用試験用手抄きシートの調製はＴａｐｐｉ試験法Ｔ２０５−ｏｍ８１に準拠して、パルプ手抄きシートの物理試験はＴａｐｐｉ法Ｔ２２０ｏｍ−８３に準拠して行った。表２に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のＫａ価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表３に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
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産業上の利用性
本発明は、宿主の担子菌、特にコリオラス・ヒルスタスで機能し、かつ該宿主においてリグニン分解酵素を大量に生産させるためのプロモーター配列を提供するものであり、遺伝子組換えによる酵素の大量生産が困難とされてきた、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼおよびラッカーゼ等のリグニン分解酵素の効率的な生産を可能とし、さらに該酵素を高生産する宿主細胞を用いて木材チップを処理することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１３に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＭＰの構造を示す図である。
図２は、実施例１６に記載されるラッカーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬＡＣの構造を示す図である。
図３は、実施例１９に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ３１ＰＬｉＰの構造を示す図である。
図４は、実施例２３に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＭＰの構造を示す図である。
図５は、実施例２６に記載されるラッカーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬＡＣの構造を示す図である。
図６は、実施例２９に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ２７ＰＬｉＰの構造を示す図である。
図７は、実施例３３に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＭＰの構造を示す図である。
図８は、実施例３６に記載されるラッカーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬＡＣの構造を示す図である。
図９は、実施例３９に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現ベクターｐＣＨＣＢＨＩ２６ＰＬｉＰの構造を示す図である。
図１０は、実施例４３に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＭＰの構造を示す図である。
図１１は、実施例４６に記載されるラッカーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＬＡＣの構造を示す図である。
図１２は、実施例４９に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドｐＣＨＣＢＨＩＩＰＬｉＰの構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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