(57)【要約】ＰＣ系除草剤或いはスルホニルウレア系除草剤に対して高度な抵抗性を示す。以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。（ａ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項５】
請求項１記載の遺伝子を有し、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有する植物。
【請求項６】
請求項５記載の植物を、ピリミジニルカルボキシ除草剤存在下で育成することを特徴とする植物育成方法。
【請求項７】
請求項１記載の遺伝子を選択マーカーとして使用し、該遺伝子を有する形質転換細胞を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、分岐鎖アミノ酸生合成経路における律速酵素であるアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子に関する。
背景技術
アセト乳酸シンターゼ（以下、「ＡＬＳ」という。）は、ロイシン、バリン及びイソロイシン等の分岐鎖アミノ酸生合成経路における律速酵素であり、植物の成長にとって必須な酵素として知られている。ＡＬＳは、高等植物全体に渡って広く存在していることが知られており、種々の微生物、例えば酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等においても見い出されている。
大腸菌及びネズミチフス菌には、ＡＬＳのイソ酵素が３種存在していることが知られている。これら各々のイソ酵素は、酵素の触媒活性を司る分子量の大きい触媒サブユニットと分岐鎖アミノ酸が結合することによりフィードバック阻害剤として機能する分子量の小さい制御サブユニットとからなるヘテロオリゴマーである（Ｃｈｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８５，４０１−４１９，１９９８）。触媒サブユニットは、それぞれＩｌｖ  ＩＨ、Ｉｌｖ  ＧＭ、Ｉｌｖ  ＢＮオペロンに位置している。一方、酵母菌の場合、ＡＬＳは、単一な酵素であるが、細菌と同様に触媒サブユニットと制御サブユニットとからなり（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，５２２２−５２３１，１９９９）、触媒蛋白質サブユニットはＩＬＶ２座位に位置している。
一方、植物におけるＡＬＳの場合も、上述した微生物と同じように触媒サブユニットと制御サブユニットとからなることが知られている（Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．４０，７９５−８０６，１９９９）。例えば、双子葉植物のタバコの場合、ＡＬＳの触媒サブユニットは、ＳｕＲＡ及びＳｕＲＢの２つの遺伝子座位によってコードされ（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８）、トウモロコシの場合、ＡＬＳの触媒サブユニットは、ａｌｓ  １及びａｌｓ  ２の２つの遺伝子座位にコードされている（Ｂｕｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，５５−６１，１９９１；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８，１１８５−１１８７，１９９２）。触媒サブユニットをコードする遺伝子に関しては、双子葉植物の場合、タバコだけでなくアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ナタネ、ワタ、オナモミ（Ｘａｎｔｈｉｕｍ）、アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）及びホウキギ（Ｋｏｃｈｉａ）について完全に塩基配列が決定されている（Ｃｈｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８５，４０１−４１９，１９９８及び再公表特許  ＷＯ９７／０８３２７参照）。単子葉植物で塩基配列が完全に決定されているのはトウモロコシとイネ（角ら，日本農薬学会第２６回大会講演要旨集，１０１頁，２００１）である。
一方、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤並びにピリミジニルカルボキシ系除草剤（以下、「ＰＣ系除草剤」という。）等の除草剤は、このＡＬＳを阻害することによって植物の成長を抑制することが知られている（Ｒａｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５，８２７−８３１，１９８４；Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６，５４５−５４６，１９８４；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，３１０−３１３，１９９１；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．１９，５９−６７，１９９４）。
これら除草剤に対して抵抗性を有する植物としては、表１及び表２に示すように、ＡＬＳをコードする遺伝子において、種を越えて保存されている保存領域中の１個又は２個のアミノ酸置換を引き起こす１個又は２個の塩基置換を有しているものが知られている。
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例えば、スルホニルウレア系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｋａｔｈｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８；Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１８８，４９１−４９７，１９９２；Ｇｕｔｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．４３，１７５−１７８，１９９５；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５及び特開昭６３−７１１８４号公報参照）、イミダゾリノン系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１８８，４９１−４９７，１９９２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２，３４１−３４５，１９９９及び特開平５−２２７９６４号公報参照）、スルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に対して抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｋａｔｈｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５；Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６，４１９−４２５，１９９５；Ａｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１，１３５３，１９９６；Ｒａｊａｓｅｋａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１９，１１５−１２４，１９９６、特開昭６３−７１１８４号公報、特開平４−３１１３９２号公報及びＢｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５６３３４３７，１９９７参照）、或いはＰＣ系除草剤に高度な抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（角ら，日本農薬学会第２６回大会講演要旨集，１０１頁，２００１）が挙げられる。スルホニルウレア系除草剤に特異的に抵抗性を示すＡＬＳを有する個体とイミダゾリノン系除草剤に特異的に抵抗性を示すＡＬＳを有する個体とを掛け合わせて、両方に抵抗性を示す植物体を作る試みもなされている（Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２４３，１７８−１８４，１９９４）。さらに、ＡＬＳをコードする遺伝子を人為的に除草剤抵抗性遺伝子へ変えることも行われており（Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３，３５９−３６８，１９９６、特開昭６３−７１１８４号公報、特開平５−２２７９６４号公報、特表平１１−５０４２１３号公報参照）、１個のアミノ酸の欠失がスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に抵抗性を示すことが明かにされている（特開平５−２２７９６４号公報参照）。
上述のように除草剤に対する抵抗性を有するＡＬＳ及びＡＬＳをコードする遺伝子について精力的に研究されてきた経緯があるが、ＰＣ系除草剤抵抗性を指標とし、ＰＣ系除草剤に対して特異的な抵抗性を有する変異ＡＬＳ遺伝子については報告例が少なく、また、ＰＣ系除草剤及びその他の除草剤に対する抵抗性の検討に関しても報告例は少なかった。
発明の開示
そこで、本発明は、ＰＣ系除草剤或いはスルホニルウレア系除草剤に対して高度な抵抗性を示すＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされるＡＬＳタンパク質、該遺伝子を有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該遺伝子を有する植物、該植物の育成方法及び、該遺伝子を選択マーカーとして使用する形質転換細胞を選択する方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、野生型ＡＬＳにおける所定のアミノ酸残基を、所定のアミノ酸で置換してなる変異ＡＬＳがＰＣ系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すことを見出し本発明を完成するに至った。
（１）すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（２）また、本発明は、（１）記載の遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質である。
（３）さらに、本発明は、（１）記載の遺伝子を有する組換えベクターである。
（４）さらにまた、本発明は、（３）記載の組換えベクターを有する形質転換体である。
（５）さらにまた、本発明は、（１）記載の遺伝子を有し、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有する植物である。
（６）さらにまた、本発明は、（５）記載の植物を、ピリミジニルカルボキシ除草剤存在下で育成することを特徴とする植物育成方法である。
（７）さらにまた、本発明は、（１）記載の遺伝子を選択マーカーとして使用し、該遺伝子を有する形質転換細胞を選択する方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアセト乳酸シンターゼ遺伝子をコードする遺伝子（以下、「変異型ＡＬＳ遺伝子」という）は、野生型アセト乳酸シンターゼタンパク質（以下、「野生型ＡＬＳタンパク質」という）と異なるアミノ酸配列を有するアセト乳酸シンターゼタンパク質（以下、「変異型ＡＬＳタンパク質」という）をコードするものである。変異型ＡＬＳタンパク質は、イネで発現している野生型ＡＬＳタンパク質における所定の部位を変異させることによって得ることができる。本発明の変異型ＡＬＳタンパク質は、配列番号２，４，６及び８のいずれかのアミノ酸配列を含んでいる。
配列番号２のアミノ酸配列では、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における１７１番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における１７２番目のアルギニンがセリンに置換されている。配列番号２のアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質を、「Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質」又は「Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型」と呼ぶ。
配列番号４のアミノ酸配列では、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における１７１番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における５４８番目のトリプトファンがロイシンに置換されている。配列番号４のアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質を、「Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質」又は「Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型」と呼ぶ。
配列番号６のアミノ酸配列では、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における１７１番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における６２７番目のセリンがイソロイシンに置換されている。配列番号６のアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質を、「Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質」又は「Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型」と呼ぶ。
配列番号８のアミノ酸配列では、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における１７１番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における５４８番目のトリプトファンがロイシン置換されるとともに、野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における６２７番目のセリンがイソロイシンに置換されている。配列番号８のアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質を、「Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質」又は「Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型」と呼ぶ。
図１Ａ及び図１Ｂにこれら４種類の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列と野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列とを比較した結果を示す。なお、図１Ａ及び図１Ｂにおいて、一列目のアミノ酸配列は野生型ＡＬＳタンパク質を示しており、二列目のアミノ酸配列はＰ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質を示しており、三列目のアミノ酸配列はＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質を示しており、四列目のアミノ酸配列はＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質を示しており、五列目のアミノ酸配列はＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質を示している。
これら変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と比較して、ＰＣ系除草剤に対する優れた抵抗性を有するばかりでなく、スルホニルウレア系除草剤及びイミダゾリノン系除草剤に対しても抵抗性を有する。このことは、例えば、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子をサブクローニングしたｐＧＥＸ  ２Ｔで形質転換した大腸菌等において、発現した変異型ＡＬＳタンパク質の除草剤感受性を調べることにより判断することができる。
ここで、ＰＣ系除草剤としては、化１に示すように、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃを例示することができる。
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スルホニルウレア系除草剤としては、化２に示すように、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎを例示することができる。
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イミダゾリノン系除草剤としては、化３に示すように、ｉｍａｚａｑｕｉｎを例示することができる。
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特に、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は、Ｐ１７１Ｈ或いはＲ１７２Ｓを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示すだけでなく、Ｐ１７１Ｈ或いはＲ１７２Ｓを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質それぞれの抵抗性から予測される抵抗性よりも優れた抵抗性を示す。なお、Ｒ１７２Ｓを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質は、いかなる除草剤に対しても抵抗性を示すものではなく、Ｒ１７２Ｓ変異はサイレント変異である。換言すれば、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は、単独ではサイレント変異であるＲ１７２Ｓ変異が、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質における抵抗性を向上させている。
また、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型タンパク質は、Ｐ１７１Ｈ或いはＷ５４８Ｌを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示すだけでなく、Ｐ１７１Ｈ或いはＷ５４８Ｌを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質それぞれの抵抗性から予測される抵抗性よりも優れた抵抗性を示す。換言すれば、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型タンパク質は、Ｐ１７１Ｈ変異型タンパク質及びＷ５４８Ｌ変異型タンパク質の両方の抵抗性から予測される相加効果の抵抗性を大幅に上回る抵抗性を示す。
さらに、特に、Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型タンパク質は、Ｐ１７１Ｈ或いはＳ６２７Ｉを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示すだけでなく、Ｐ１７１Ｈ或いはＳ６２７Ｉを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質それぞれの抵抗性から予測される抵抗性よりも優れた抵抗性を示す。換言すれば、Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型タンパク質は、Ｐ１７１Ｈ変異型タンパク質及びＳ６２７Ｉ変異型タンパク質の両方の抵抗性から予測される相加効果の抵抗性を大幅に上回る抵抗性を示す。
さらにまた、特に、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型タンパク質は、Ｐ１７１Ｈ、Ｗ５４８Ｌ或いはＳ６２７Ｉを単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示す。
なお、本発明の変異型ＡＬＳタンパク質は、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、且つ、アセト乳酸シンターゼ活性を有するアミノ酸配列であれば、配列番号２、４、６及び８のいずれかのアミノ酸配列において、少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、「１以上のアミノ酸」とは、１〜３０個のアミノ酸であることが好ましく、１個〜２０個のアミノ酸であることがより好ましく、１〜１０個のアミノ酸であることが更に好ましい。
特に、配列番号２のアミノ酸配列においては、「少なくとも１以上のアミノ酸」として１７１番目及び１７２番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。配列番号４のアミノ酸配列においては、「少なくとも１以上のアミノ酸」として１７１番目及び５４８番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。配列番号６のアミノ酸配列においては、「少なくとも１以上のアミノ酸」として１７１番目及び６２７番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。配列番号８のアミノ酸配列においては、「少なくとも１以上のアミノ酸」として１７１番目、６２７番目及び５４８番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。
ところで、本発明の変異型ＡＬＳ遺伝子は、上述したような変異型ＡＬＳタンパク質をコードする塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号１、３、５及び７のいずれかの塩基配列を挙げることができる。配列番号１の塩基配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードし、配列番号３の塩基配列は配列番号４のアミノ酸配列をコードし、配列番号５の塩基配列は配列番号６のアミノ酸配列をコードし、配列番号７の塩基配列は配列番号８のアミノ酸配列をコードしている。変異型ＡＬＳ遺伝子は、配列番号１、３、５及び７のいずれかの塩基配列において、所定のアミノ酸をコードするコドンを縮重コドンにより置換した塩基配列であっても良い。
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄにこれら４種類の変異型ＡＬＳタンパク質をコードする塩基配列と野生型ＡＬＳタンパク質をコードする塩基配列とを比較した結果を示す。なお、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄにおいて、一列目の塩基配列は野生型ＡＬＳタンパク質を示しており、二列目の塩基配列はＰ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質を示しており、三列目の塩基配列はＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質を示しており、四列目の塩基配列はＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質を示しており、五列目の塩基配列はＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質を示している。
また、本発明の変異型ＡＬＳ遺伝子は、配列番号１、３、５及び７のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ、アセト乳酸シンターゼ活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるものであってもよい。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士（例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士）がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。具体的に、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
これら変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、日本型イネ品種である金南風のゲノムＤＮＡに存在する野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子に対して、上述したような変異を導入することによって得ることができる。変異を導入する手法としては、公知の手法を使用することができ、例えば、部位特異的変異導入法を用いることができる。部位特異的変異導入法は、市販のキット、例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造株式会社製）、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ（プロメガ社製）、ＥｘＳｉｔｅ（ストラタジーン社製）等を使用して行うことができる。
また、変異ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、ＰＣ系除草剤感受性の野生株培養細胞をＰＣ系除草剤の存在下で培養し、その後、出現したＰＣ系除草剤に対する抵抗性を示す変異株培養細胞から得ることができる。そして見い出された変異をもとにしてＰＣＲ法及びＳＰＲ（ｓｅｌｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、新たな変異の組み合わせを持つＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を、酵素を使って合成することができる。
具体的には、先ず、ＰＣ系除草剤抵抗性の変異型培養細胞からｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成後、λｇｔ１１ファージのｃＤＮＡライブラリーを作出する。これを、野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の一部を含んでいる核酸プローブを用いてスクリーニングし、得られる陽性クローンのインサートＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋にサブクローニングし塩基配列を決定する。変異が認められたｃＤＮＡインサートについては、インサートＤＮＡを保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋を鋳型として、野性型イネＡＬＳ遺伝子を元に設計したプライマーを使い、ＰＣＲ及とＳＰＲ法で変異を含む断片を合成する。一方、ＰＣ系除草剤抵抗性のイネ培養細胞からゲノムＤＮＡを調製すると伴にイネＡＬＳ遺伝子を元に各種プライマーを設計する。そしてプライマーウオーキングによって、調製したゲノムＤＮＡに存在するＡＬＳ遺伝子のシークエンスを決定して変異部位を見つけ出す。変異が見い出された場合に、その変異を含む断片をＰＣＲ法及びＳＰＲ法で合成する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋へクローニングした変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡから合成した変異を含む断片を含めて、これらの変異を含む断片をｐＧＥＸ  ２Ｔへサブクローニングし、このベクターで大腸菌を形質転換する。
その結果、配列番号２、４、６及び８に示すアミノ酸配列をコードするインサートＤＮＡを有するクローンを選択することによって、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。なお、上述のようにして得られた、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子をｐＧＥＸ  ２Ｔに組み込んだプラスミドはＲｉｃｅ  Ｍｕｔａｎｔ  ＡＬＳ  ｃＤＮＡ  １（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９４４）として、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子をｐＧＥＸ  ２Ｔに組み込んだプラスミドはＲｉｃｅ  Ｍｕｔａｎｔ  ＡＬＳ  ｃＤＮＡ  ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９４５）として、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子をｐＧＥＸ  ２Ｔに組み込んだプラスミドはＲｉｃｅ  Ｍｕｔａｎｔ  ＡＬＳ  ｃＤＮＡ  ３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９４６）として、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子をｐＧＥＸ  ２Ｔに組み込んだプラスミドはＲｉｃｅ  Ｍｕｔａｎｔ  ＡＬＳ  ｃＤＮＡ  ４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９４７）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、２００２年３月８日付けでブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
一方、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を、標的とする植物に形質転換することによって、当該植物に対してＰＣ系除草剤等の多種の除草剤に対して抵抗性を与えることができる。植物に形質転換する手法としては、公知の手法を使用することができる。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて外来遺伝子を標的植物細胞に導入する手法を例示することができる。
具体的には、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ配列を含んでいるバイナリーベクターに変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を挿入する。このＴｉプラスミドを大腸菌等に形質転換する。次に、大腸菌等で増殖させた変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を保持するバイナリーベクターを、ヘルパープラスミドを含んでいるアグロバクテリウム菌に形質転換する。そして、このアグロバクテリウム菌を、標的とする植物に感染させた後、形質転換植物を同定する。同定された形質転換植物が培養細胞の場合には、公知の手法により、その植物細胞を完全な植物に再生させることができる。
また、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を標的とする植物に形質転換する場合、公知の手法を用いて直接的に植物体に導入してもよい。さらに、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを形質転換する方法としては、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
一方、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、単子葉植物及び双子葉植物等のいかなる種類の植物に形質転換してもよい。変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を形質転換する対象の作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン及びタバコ等を挙げることができる。さらに、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、芝草や樹木等を形質転換してもよい。
いずれの場合であっても、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を植物に形質転換することによって、当該植物に対して、ＰＣ系除草剤、スルホニルウレア系除草剤及びイミダゾリノン系除草剤に対する抵抗性を付与することができる。
ところで、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、植物形質転換実験における選択性マーカーとしても使用することができる。例えば、目的遺伝子を用いて植物細胞を形質転換する場合、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを有するベクターを植物細胞内に導入した後、当該植物細胞をＰＣ系除草剤等の除草剤の存在下で培養する。その結果、除草剤の存在下で生存する植物細胞には、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子と共に目的遺伝子が導入されたことが判る。また、目的遺伝子及び変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子が植物細胞の染色体に組み込まれたかどうかは、その植物の表現型を観察した後、ゲノムサザーンハイブリダイゼーション或いはＰＣＲによって、これら遺伝子のゲノム上の存在を調べることで確認することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を、実施例を用いて更に詳細に説明する。ただし、本発明の技術範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  ＰＣ除草剤抵抗性のイネ（金南風）培養細胞の作出
イネの種子（品種；金南風、学名：Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｖａｒ．Ｋｉｎｍａｚｅ）の籾を除いた後、当該種子を７０％のエタノール中に５分間浸漬し、その後、約５％のアンチホルミン中に２０分間浸漬し、その後、滅菌蒸留水で数回洗浄した。次に、この種子を表３に示す組成の培地上で静置培養した。
2003083118.tif 000007
なお、上記培地組成中、２，４−Ｄは合成オーキシンである。培地を作製する際には、先ず、上記培地組成を１リッターのビーカーに入れ、蒸留水で１０００ｍｌにする。次に、これをｐＨ５．７に調製し、３ｇのゲルライトを添加する。次に、電子レンジを用いて加熱してゲルライトを解かした状態とし、分注機を用いて３０ｍｌずつ培養フラスコに分注する。次に、培養フラスコに３重のアルミ箔をかぶせ、オートクレーブ装置内で１２１℃、１５〜２０分間加熱滅菌する。その後、室温にまで冷却することによって、上記種子を静置培養するための培地を作製した。
続いて、この培地上で誘導されたカルスから胚乳の部分を除き継代培養を行った。そして、得られたカルスの一部を、ＰＣ系除草剤の１つあるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを１μＭ添加した液体培地（表３の培地組成と同様であり、ゲルライトを添加しないもの）中でおよそ２週間に１回継代しながら培養を行った。その結果、２週間〜６週間程度で培養細胞が枯死し始め、約２ヵ月後でほとんどが枯死して茶色に変色している培養細胞集団の中に、変色が無く細胞分裂を行っていると考えられる細胞塊が複数個得られた。これら細胞塊を単離し、培養を行った結果、２μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ存在下でも増殖する複数の細胞株を得ることができた。得られた細胞株をそれぞれＲｂ系統、Ｓｒ系統、Ｇａ系統及びＶｇ系統と命名した。
その後、得られた複数の細胞株をｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの添加濃度を順次上げて培養した結果、１００μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ共存下でも増殖できる細胞株が得られた。このｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性培養細胞（以下、抵抗性変異株）を１〜１０μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを添加したＭＳ−２，４−Ｄ固体培地で継代培養した。継代培養した抵抗性変異株の一部を採取し、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ無添加のＭＳ−２，４−Ｄ液体培地に添加して、８日〜１０日間のサイクルで懸濁培養した。
そして、この抵抗性変異株約１．５ｇ（湿重量）を、ＭＳ−２，４−Ｄ液体培地５０ｍｌと所定の濃度のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍとを入れておいた２００ｍｌの三角フラスコに移植し、約２７℃で所定期間培養した。経時的にカルスの湿重量を測定し、移植した抵抗性変異株の湿重量を基準にして相対的な増殖量を求めた。なお、試験は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度を変化させたものを３連で行い、標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ）を算出した。抵抗性変異株におけるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度変化と８或いは１２日目の相対重量との関係を図３〜６に示す。また対照として、金南風の野生株を用いて同様な実験を行い、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度と８日目の相対重量との関係を測定した結果を図７に示す。
図７から判るように、野生株では、１ｎＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ添加区で増殖阻害されなかったが、１０ｎＭ以上のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ添加区で増殖阻害されていることが判る。一方、図３〜６から判るように、抵抗性変異株（Ｒｂ系統、Ｓｒ系統、Ｇａ系統及びＶｇ系統）では、Ｖｇ系統以外は１０μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ添加区においてもほとんど増殖に影響を受けていないことが判る。Ｖｇ系統であっても、野生株と比較すると、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの増殖に対する影響が小さいことが判る。
一方、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに代えてｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎを用いた場合も、上述したように野生株及び抵抗性変異株の増殖率を測定した。野生株におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ濃度変化と９日目の相対重量との関係を図８に示す。また、抵抗性変異株、すなわち、Ｒｂ系統、Ｓｒ系統、Ｇａ系統及びＶｇ系統におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ濃度変化と８或いは１０日目の相対重量との関係を図９〜１２に示す。
図８から判るように、野性株では、１ｎＭのｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ添加で増殖阻害を受けており、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの場合よりも高い感受性を示した。一方、図９〜１２から判るように、Ｒｂ系統、Ｓｒ系統、Ｇａ系統及びＶｇ系統では、それぞれ感受性は異なるが、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ添加による増殖阻害の影響が小さく、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性を示した。なお、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ及びｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性は、野性株及び抵抗性変異株において、培養時間が長くても共に大きく変化することはなかった。また、増殖速度は、抵抗性変異株及び野性株において、ともにほぼ同じであった。
これらの結果から、抵抗性変異株は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して高い抵抗性を有するものであることが明らかとなった。また、抵抗性変異株は、野生株と比較してｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性が向上していることも明らかとなった。
〔実施例２〕抵抗性変異株から部分精製したＡＬＳタンパク質の薬剤感受性
本例では、実施例１で得られた抵抗性変異株（Ｇａ系統を除く、Ｒｂ系統、Ｓｒ系統及びＶｇ系統）から変異型ＡＬＳタンパク質を部分精製し、得られた変異型ＡＬＳタンパク質における薬剤感受性を検討した。変異型ＡＬＳタンパク質は以下のようにして部分精製した。
先ず、表３のうちゲルライトを除いた組成で液体培養法（ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ無添加）により抵抗性変異株を２００ｇ以上調製した。次に、これらの約１５０ｇを組織重量の３倍量の緩衝液−１（２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５ｍＭのチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、１０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、組織重量の１／１０量のポリビニルポリピロリドンを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５）でヒスコトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートをナイロンガーゼでろ過した後、１５０００×ｇで２０分間遠心した。遠心上澄に、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、氷中に約１時間放置した。これを再度、１５０００×ｇで２０分間遠心し、その沈澱画分を約３０ｍｌの緩衝液−２（２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５ｍＭのＴＰＰ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液緩衝液ｐＨ７．５）に溶解した。これを再度、１５０００×ｇで２０分間遠心し、その上澄画分をセファデックスＧ−２５（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライして素通り画分を約４０ｍｌ採取した。そして、採取した液を「粗酵素液」とした。
次に、粗酵素液のタンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙのマニュアルに従ってＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。その後、粗酵素液をワットマンフィルター（ワットマン社製）でろ過し、タンパク質量として適正な量の粗酵素液（１０〜１５ｍｌ）をＦＰＬＣ装置（アマシャム  バイオサイエンス社製）を使用して、３本連結したＨｉＴｒａｐＱ（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライした。ＨｉＴｒａｐ  Ｑを用いてタンパク質成分を吸着させた後、ベッドボリュームの３〜５倍量の緩衝液−２で非吸着画分を流し出した。その後、吸着したタンパク質成分を、ベッドボリュームの１０倍量（１５０ｍｌ）の溶出液を用いて溶出した。ここで、溶出液は、０〜０．４Ｍの直線濃度勾配で緩衝液−２にＫＣｌを溶解させたものである。タンパク質成分を溶出した溶出液は、複数の分取用試験管に５ｍｌずつ分取した。なお、溶出したタンパク質成分に含まれるＡＬＳタンパク質を安定化するために、２０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む緩衝液−２（０．５ｍｌ）を事前に分取用試験管の中へ添加しておいた。
次に、複数の分取用試験管に分取された溶出画分に含まれる変異型ＡＬＳタンパク質に由来するＡＬＳ活性を、以下のように測定した。測定反応に使用する反応溶液は、２０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＴＰＰ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＦＡＤ及び２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液に、測定対象の溶出画分を混合したものである。この反応溶液を１ｍｌ使用した。測定反応は、測定対象の溶出画分を添加した後、３０℃で４０分〜６０分間行った。また、測定反応は、０．１ｍｌの６Ｎ硫酸（あるいは０．２５Ｎの水酸化ナトリウム）を添加することにより停止させた。
次に、反応が終了した反応溶液を６０℃で１０分間インキュベートした。これにより、反応溶液中に含まれるアセト乳酸をアセトインに変化させた。
次に、反応溶液中に含まれるアセトインを定量するため、０．５％（ｗ／ｖ）のクレアチン１ｍｌと２．５Ｎの水酸化ナトリウムに溶かした５％（ｗ／ｖ）のα−ナフトール１ｍｌとを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、反応溶液における吸光度５２５ｎｍを比色することでアセトインを定量し、ＡＬＳ活性を評価した。なお、反応溶液中には、少量のピルビン酸ナトリウムが含まれるため、反応０時間をコントロールとした。
その結果、ＯＤ５２５ｎｍにおける吸光度が反応溶液０．２ｍｌ当たりで約７という高い値となった。しかしながら、上述した測定反応を水酸化ナトリウムで停止させ、ＡＬＳ活性以外によるアセトイン生成活性を調べた結果、この見掛け上のＡＬＳ活性の８０％近くが変異型ＡＬＳタンパク質以外の直接的なアセトイン生成活性であることが判った。そこで、変異型ＡＬＳタンパク質と変異型ＡＬＳタンパク質以外のアセトイン生成活性を、陰イオン交換樹脂を使用したＦＰＬＣで分離した。抵抗性変異株としてＳｒ系統を用いた場合の結果を図１３に示す。図１３に示すように、３つの活性ピークが検出された。
これら３つの活性ピークのうち、どちらに変異型ＡＬＳタンパク質が含まれているのを判定するために、各ピークのアセトイン生成活性を調べた。その結果、変異型ＡＬＳタンパク質は、初めに溶出したピークで示される画分に含まれていることがわかった。
そして、変異型ＡＬＳタンパク質を含む酵素溶液を用いて、当該変異型ＡＬＳタンパク質のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ及びｉｍａｚａｑｕｉｎに対する感受性を調べた。各除草剤に対する感受性は、酵素溶液を添加する前に除草剤を所定の濃度となるように反応液中に添加した以外は、上述した測定反応と同様にしてＡＬＳ活性を測定することによって評価した。また、比較のために、野生型ＡＬＳタンパク質を同様にして分離精製し（図１４）、実験に供した。なお、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍは水溶液とし、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ及びｉｍａｚａｑｕｉｎはアセトン溶液とした。アセトン溶液は最終濃度１％とした。
ＡＬＳ活性阻害率とｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度との関係を図１５に示す。ＡＬＳ活性阻害率とｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ濃度との関係を図１６に示す。ＡＬＳ活性阻害率とｉｍａｚａｑｕｉｎ濃度との関係を図１７に示す。なお、これら図１５〜図１７において、野生型ＡＬＳタンパク質を破線で示し、Ｓｒ系統の変異型ＡＬＳタンパク質は二点破線で示し、Ｒｂ系統の変異型ＡＬＳタンパク質は実線で示し、Ｖｇ系統の変異型ＡＬＳタンパク質は一点破線で示している。
また、上述した実験から、ＡＬＳ活性を５０％阻害する除草剤濃度（Ｉ５０値）をプロビット法に準じて算出し、変異ＡＬＳタンパク質におけるＩ５０値と野生型ＡＬＳタンパク質におけるＩ５０値との比を算出した。結果を表４に示す。
2003083118.tif 000008
さらに、表４の結果から、各除草剤について抵抗性変異株のＩ５０値を野生株のＩ５０値で除算し、ＲＳ値を算出した結果を表５に示す。
2003083118.tif 000009
これら図１５〜図１７、表４及び表５に示すように、変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と比較して除草剤存在下でも比較的高いＡＬＳ活性を示した。特に、Ｒｂ系統及びＳｒ系統由来の変異型ＡＬＳタンパク質では、それぞれｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性が他の除草剤に対する感受性と比較して顕著に優れていることが判った。すなわち、これらＲｂ系統及びＳｒ系統は、特にｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性に優れたものであることが判った。
〔実施例３〕野生型及び変異型ＡＬＳ遺伝子のクローニング
本例では、野生株から野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子（野生型ＡＬＳ遺伝子）をクローニングするとともに、抵抗性変異株から変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子（変異型ＡＬＳ遺伝子）をクローニングした。
野生型ＡＬＳ遺伝子及び変異型ＡＬＳ遺伝子をクローニングする際に使用するプローブを以下のようにして調製した。本例においてプローブとしては、トウモロコシのＡＬＳ遺伝子と高い相同性を示したイネ（日本晴）由来部分ｃＤＮＡを使用した。
（１）トウモロコシのＡＬＳ遺伝子と高い相同性を示したイネ（日本晴）由来部分ｃＤＮＡの塩基配列の決定
社団法人農林水産先端技術産業振興センター及び独立行政法人農業生物資源研究所が行っているイネゲノムプロジェクトの一環でイネ（日本晴）のｃＤＮＡの部分塩基配列の決定が行われており、ｃＤＮＡの部分塩基配列データベースが構築されている。このデータベースに含まれる約３５０ｂｐの塩基配列として既に知られているｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：Ｃ７２４１１）がトウモロコシにおけるＡＬＳ遺伝子と高い相同性を示した。なお、トウモロコシにおけるＡＬＳ遺伝子は完全に塩基配列が決定されている。
そして、このｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：Ｃ７２４１１）を農業生物資源研究所から入手し、以下のように塩基配列を決定した。なお、このｃＤＮＡクローンは、ＡＬＳホモログ遺伝子がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋中に挿入されており、大腸菌内で自律複製を行うことができる形であった。
先ず、このＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターを大腸菌（ＤＨ５α）へ形質転換した。プレートより得られた白色のコロニーを液体培養し、菌体より常法に従いプラスミドを抽出した。インサートＤＮＡはプラスミドベクター中のマルチクローニングサイトの制限酵素、Ｓａｌ  ＩとＮｏｔ  Ｉの間に挿入されていたのでこの２つの酵素でベクターを消化し、アガロース電気泳動でインサートの確認を行った。この後、得られたＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターをＲＮａｓｅＡ、ＰＥＧ、ＬｉＣｌ等を使用する常法に従って精製し、プライマー及びＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔを用いシークエンス反応を行った。ＰＣＲの条件はプロトコールに従った。またプライマーはＭ１３プライマー及び決定した塩基配列から設計した合成プライマーを用いた。得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿で精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０シークエンサーで塩基配列を決定した。
このＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターには、１．６ｋｂｐのインサートＤＮＡが入っているという情報であった。得られたＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターをＳａｌＩとＮｏｔＩの制限酵素で消化し、電気泳動を行ったところ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋に相当する約３ｋｂｐのバンドとインサートＤＮＡ断片に相当する１．６ｋｂｐのバンドが検出された（図示せず）。インサートＤＮＡ部分についての全塩基配列を決定し、トウモロコシの塩基配列の相同性検索を行った結果、図１８Ａ及び図１８Ｂに示すように、８４．７％の相同性を示した。したがって、このＡＬＳホモログは日本晴におけるＡＬＳ遺伝子の部分ｃＤＮＡであると判断されたので、Ｓａｌ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化して切り出したインサートＤＮＡをプローブとした。なお、図１８Ａ及び図１８Ｂにおいて、一列目は日本晴におけるＡＬＳ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列であり、二列目はトウモロコシにおけるＡＬＳ遺伝子の塩基配列である。
（２）抵抗性変異株及び野性株からのｍＲＮＡの調製
先ず、液体窒素で凍結した抵抗性変異株を、乳鉢と乳棒を用いて摩砕した後、ミキサーにより３０秒間細かく粉砕した。粉砕後の粉末を抽出緩衝液〔（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１重量％  ＳＤＳ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ）：（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）：（Ｔｒｉｓ飽和フェノール）＝１５：３：２０〕中に懸濁し，その後よく撹拌した。この溶液を１２０００×ｇで１５分間遠心し上澄を回収し、２００ｍｌのＰＣＩ〔（Ｔｒｉｓ飽和フェノール）：（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）：（ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ）＝２５：２４：１〕を加え、４℃で１０分間振とうした後、１２０００×ｇで１５分間遠心し上澄を回収した。この操作を２回繰り返した。得られた上澄に１／２０量の５ＭのＮａＣｌ、２．２倍量のエタノールを加え、−８０℃で３０分間静置した後、１２０００×ｇで５分間遠心することで沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させた後に１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール溶液に溶かし、この溶液を２７０００×ｇで１０分間遠心して不溶性画分を除いた後、１０ＭのＬｉＣｌを１／４量加えて氷上で１時間静置した。これをさらに２７０００×ｇで１０分間遠心して沈殿を回収し、４ｍｌのＨ２Ｏに溶かした後、２６０ｎｍの吸光度を測定してＲＮＡの濃度を求めた。これに１／２０量の５Ｍ  ＮａＣｌと２．２倍量のエタノールを加えて、−８０℃で３０分間静置した後、２７０００×ｇで１０分間遠心して沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄後乾燥させた。これを適量のＨ２Ｏに溶かしトータルＲＮＡ溶液とした。なお、遠心操作は４℃で行った。
このトータルＲＮＡから次の方法でｍＲＮＡの分離精製した。抽出したトータルＲＮＡ溶液の液量に対して等量の２×結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ）を加えた。０．１ｇのｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（アマシャム  バイオサイエンス社製）を詰めたカラムを１×結合バッファーで洗浄した後、このトータルＲＮＡ溶液をカラムにかけた。１×結合バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＥＤＴＡ）をアプライし、溶出液を０．５ｍｌずつ回収した。なお、カラムを素通りした画分については、別のｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（アマシャム  バイオサイエンス社製）カラムにかけ、同様の操作を行った。各画分の吸光度から溶出されたｍＲＮＡの濃度を計算した後、１／１０量の１０Ｍ  ＬｉＣｌと２．５倍量のエタノールを加えて−８０℃で３０分間静置した。これを遠心して沈澱画分を乾燥した後１００μｌのＨ２Ｏに溶かした。こうして得られたｍＲＮＡをショ糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。
分離精製したｍＲＮＡを、２５％ショ糖溶液及び５％ショ糖溶液を用いて密度勾配をつけた遠心管にアプライし、スウィングローターを用いて４℃、２７０００ｒｐｍで１５時間超遠心を行った。遠心後、密度勾配の順に各０．５ｍｌずつ分画回収した。それぞれの画分の吸光度を測定し、回収されたｍＲＮＡの濃度を計算するとともにＥＣＬキット（ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，アマシャム  バイオサイエンス社製）によるハイブリダイゼーションによりＡＬＳ  ｍＲＮＡの存在を確認した。ハイブリダイゼーションは、上記（１）で調製したプローブを用いて４２℃で１６時間行った。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、キット添付の１次洗浄バッファーを用いて４２℃で５分間を２回、その後、２×ＳＳＣ溶液を用いて４２℃で５分間を１回行った。洗浄後の膜は、透明のプラスティックフィルムで包みキット付属の発光試薬に浸し多状態を維持し、その後、Ｘ線フィルムに感光させた。
これらの操作により、抵抗性変異株としてＳｒ系統を用いた場合には、約３５ｍｇのトータルＲＮＡを抽出するとともに、約４ｍｇのｍＲＮＡを抽出することができた。また、ショ糖密度勾配遠心法では、予想される画分にハイブリダイゼーション陽性のスポットが認められた。
一方、野生株を用いたところ、約９５ｍｇのトータルＲＮＡを抽出するとともに、約７ｍｇのｍＲＮＡを抽出することができた。野生株からｍＲＮＡを抽出する際には、抵抗性変異株に代えて野生株を使用した以外は、上述した方法を適用した。
（３）抵抗性変異株及び野性株由来のｃＤＮＡライブラリの作製
上記（２）で精製したｍＲＮＡ２μｇ及びｃＤＮＡ合成キット（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いてｃＤＮＡの合成を行い、抵抗性変異株由来のｃＤＮＡライブラリの作製した。
先ず、逆転写反応にはキット添付のＲＴａｓｅを使用し、その後の相補鎖伸長反応にはキットに添付のＴ４  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。相補鎖伸長反応の際には、ｃＤＮＡ合成の収率を計算するために３２Ｐ−ｄＣＴＰを加えた。合成したｃＤＮＡは、アダプターを付加した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージング法によりλファージへ組み込んだ。
ｃＤＮＡに付加するアダプターとしては、宝酒造株式会社製のＥｃｏ  ＲＩ−Ｎｏｔ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩアダプターを使用した。ｃＤＮＡを含む溶液にｃＤＮＡに対してモル濃度で５０倍のアダプターを加え、この混合溶液にＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ファルマシア社製）を加えてライゲーション反応を４℃で一晩行った。この反応溶液をＡｓａｈｉＰａｋ  ＧＳ  ７１０カラム（旭化成工業株式会社製）を用いてＨＰＣＬにアプライし、溶出液を波長２６０ｎｍの紫外線でモニターした。溶出液を０．５ｍｌ程度ずつ２５本に分画し、各フラクションをＣｅｒｅｎｋｏｖカウンターで測定し、カウントの高いフラクションを３〜４本回収した。このフラクションをＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（宝酒造株式会社社製）を用いてアダプターの５’末端をリン酸化した後、λｇｔ  １１  Ｅｃｏ  ＲＩアームを加えてライゲーションした。ライゲーション反応は、溶液にＧｉｇａＰａｃｋ  Ｇｏｌｄ  ＩＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を加えて室温で２時間行った。反応終了後、２００μｌのＳＭバッファーと８μｌのクロロホルムを加えてファージ溶液とした。このファージ溶液を１０倍希釈し、これの１μｌを大腸菌（Ｙ−１０８８）に感染させた後、０．７％トップアガーを加え、ＬＢプレートに蒔き、４時間から８時間後にプレートに現れたプラークの数を数えることでタイターを測定した。
ＤＥ  ８１ペーパーとＣｅｒｅｎｋｏｖカウンティングの結果からＳｒ系統由来のｃＤＮＡが約７４ｎｇ合成されたことが判った。アダプターを付加したベクターのライゲーション後のＣｅｒｅｎｋｏｖカウンティングの結果からＳｒ系統について約２２ｎｇのインサートが挿入されたλＤＮＡが得られた。このλＤＮＡをファージへパッケージングし、これを抵抗性変異株細胞由来のｃＤＮＡライブラリとした。このライブラリ溶液のタイターは、１６６００ｐｆｕ／μｌであった。
一方、野生株から抽出したｍＲＮＡを用いて、上述した方法に準じてｃＤＮＡライブラリを調製したところ、野生株由来のｃＤＮＡが約３８ｎｇ合成されたことが判った。また、野生株についてインサートが挿入されたλＤＮＡが約５ｎｇ得られた。さらに、野生株由来のｃＤＮＡライブラリ溶液のタイターは１８１６０ｐｆｕ／μｌであった。
（４）ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡのスクリーニング
プレートに２００００個程度のプラークが出るように、上記（３）で調製したライブラリ溶液を希釈した後、野性株由来及びＳｒ系統由来のファージをそれぞれ１０枚ずつ蒔いた。プラークをニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｎｅｌｌ社製，ＰＲＯＴＯＲＡＮ  ＢＡ８５，ポアサイズ０．４５μｍ）へ転写し、転写したニトロセルロースメンブレンを変性溶液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）、続いて中和溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に約２０秒浸した。濾紙を用いてニトロセルロースメンブレンから余分な水分を除去した後、ニトロセルロースメンブレンを８０℃で２時間ベーキングした。なお、ニトロセルロースメンブレンに代えてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャム  バイオテック社製）を用いた際には、ベーキング操作は省略し、０．４Ｍ  ＮａＯＨにて２０分間固定した。
上記（１）で調製したインサートＤＮＡを、ＲＩ及び非ＲＩの２種類の方法でラベル化しプローブＤＮＡとして使用した。ＲＩラベル化とハイブリダイゼーションは次の方法で行った。まず、約２００〜５００ｎｇのプローブＤＮＡを熱変性させた。ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いてラベルを行った。このラベル化反応に際して、キットに添付のバッファー、ランダムプライマー及び３２Ｐ−ｄＣＴＰを加えた。ＢｃａＢＥＳＴを加え、６５℃で３０分間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。ニトロセルロースメンブレン８枚程度にプローブがおよそ１００ｎｇ程度含まれる容量を加え、４２℃、一晩、微振とうでハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ溶液で３回洗浄し後、ＢＡＳ  ２０００イメージングアナライザー（富士フィルム株式会社製）のイメージングプレートに約１時間露光させた。露光後イメージングアナライザーを用いて陽性クローンを検出した。
一方、非ＲＩラベル化は次の方法で行った。約２００〜５００ｎｇのプローブＤＮＡを熱変性させた後、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャム  バイオサイエンス社製）添付のＤＮＡ標識試薬（ペルオキシダーゼ）及びグルタルアルデヒドを加えて３７℃でインキュベートした。この場合、ニトロセルロースメンブレン膜８枚程度におよそ１００ｎｇ程度のラベル化プローブＤＮＡが含まれるように添加した後、４２℃、一晩、微振とうでハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、ｐｒｉｍａｒｙ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを室温、１０分間、３回、その後２×ＳＳＣで室温、１０分間、１回で膜の洗浄を行った。膜をＥＣＬキット添付の発光液に浸し、３０分から３時間でＸ線フィルムに露光した。
ハイブリダイゼーション（１次スクリーニング）の結果得られた陽性ファージを滅菌した爪楊枝でトップアガーごと掻き取り、２００μｌのＳＭバッファーに懸濁し、ファージ溶液を得た。このファージ溶液を各クローンごと適宜希釈を行い、大腸菌Ｙ−１０８８株に感染させ、ＬＢプレートに蒔いた。この新たに作製したプレートを用いて、同様にハイブリダイゼーション（２次スクリーニング）を行い、陽性ファージを２００μｌのＳＭバッファーに懸濁し、シングルファージとした。なお、２次スクリーニングでシングルファージとして単離できなかった場合、もう一度希釈してＬＢプレートに蒔き、ハイブリダイゼーション（３次スクリーニング）を行ってシングルファージにした。
このシングルファージから次の方法でλＤＮＡを調製した。竹串又は爪楊枝を使って陽性クローンのプラークから集めたλファージを、新鮮な宿主大腸菌（Ｙ１０８８）懸濁液を５μｌ含む２００μｌの２ｘＹＴ培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２と０．２％マルトースを含む）にイノキュレートした。静置状態４２℃で一晩インキュベートした後、再度宿主大腸菌（Ｙ１０８８）懸濁液を２５μｌ含む１ｍｌの２ｘＹＴ培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２と０．２％マルトースを含む）にイノキュレートし一晩振とう培養した（以上が前培養）。前培養した溶液（１０〜５０μｌ）を１０ｍＭのＭｇＣｌ２と０．５ｍｌの大腸菌Ｙ１０８８懸濁液とを含む１２ｍｌの２ｘＹＴ培地にイノキュレートし、比較的強く振とうしながら溶菌後濁度が増すまで４２℃で一晩インキュベートした。培養終了後、５０μｌのクロロホルムと１．２ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌを加え、振とうしながら４２℃で１０分間インキュベートした。これを２７０００×ｇで１０分間遠心した後、新たに遠心管に移した上澄に５ｍｌの５０％  ＰＥＧを加え、氷上で１時間以上インキュベートした。これを２７０００×ｇで１０分間遠心し上澄を捨てた後、再度２７０００×ｇで遠心して液体部分を捨てた。沈澱画分を４μｇのＤＮａｓｅ  Ｉ、２０μｇのＲＮａｓｅ  Ａならびに１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む３０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５の３００μｌに懸濁させ、１．５ｍｌチューブへ移した。この懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした後、７．５μｌの２０％ＳＤＳ、３μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）、１２μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加え、さらに５５℃で１５分間インキュベートした。これに１５０μｌのフェノールを加えて激しく撹拌した後、トミーマイクロ遠心機ＭＲ−１５０（トミー精工社製）を用いて１５０００ｒｐｍで３分間遠心し、水層を回収した。集めた水層に８００μｌのエチルエーテル（蒸留水を加えて過酸化物を除いておく）を加え激しく撹拌した後、１５０００ｒｐｍで１０秒間遠心しエーテル層を捨てた。このエーテル抽出操作を繰り返した後、水層に残存するエーテルを窒素ガスで除去した。水層に３０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、８７５μｌのエタノールを加えることで沈澱してきたλＤＮＡを速やかに回収し、λＤＮＡを１ｍｌ程度の７０％エタノールでリンスした後、約１分間減圧下で乾燥させてエタノールを除いた。これを２０μｌ〜５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かしてλＤＮＡ溶液とした。
得られたλＤＮＡ中のインサートＤＮＡのサブクローニング及び塩基配列決定は次の方法で行った。得られたλＤＮＡ溶液（１μｌ）をＮｏｔ  Ｉで消化し、インサートＤＮＡを切り出した。切り出し反応の反応液組成は制限酵素添付の説明書に従い、３７℃で約２時間反応させた後、１％アガロースゲルを使用した電気泳動でインサートサイズの確認を行った。インサートＤＮＡを持つλＤＮＡ（１０μｌ〜２０μｌ）をＮｏｔ  Ｉで消化し、インサートＤＮＡを切り出した。これを分取用のアガロースゲルで分離した後、相当するバンドをゲルから切り出し、常法によりインサートＤＮＡを精製した。このインサートＤＮＡとＢＡＰ処理（エビのアルカリフォスファターゼを用いた脱リン酸化処理）したベクターとをモル比で１：１の割合で混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで１６℃、２時間以上ライゲーション反応を行った。なお、インサートＤＮＡはＮｏｔ  Ｉで切り出したものを材料としたので、ＢＡＰ処理についてもＮｏｔ  Ｉで切断したベクターについて行った。ライゲーション終了後、その溶液の一部をコンピテントセル（ＤＨ５α）と混合し、氷上に３０分間放置した。これを４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、さらに氷上に２分間放置した。続いてＳＯＣを添加し３７℃で１時間インキュベートした後、２×ＹＴ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン入り）の１００μ及び３％  Ｘ−Ｇａｌ  ３０μｌならびに１Ｍ  ＩＰＴＧ  ３μｌを混合したものを事前に均一になるようにまいておいたＬＢ培地上プレートにまき、３７℃で１０時間以上培養した。形質転換された白色コロニーをアンピシリン入りのＬＢ培地あるいは２ｘＹＴ培地の２ｍｌに１つのコロニーを接種した後３７℃で一晩培養した。この培養液から常法によりプラスミドを調製しＨ２Ｏに溶かしＤＮＡ濃度を定量した後シークエンス用ＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ反応及び塩基配列決定は上述した方法で行った。
以上の実験により、野性型及びＳｒ系統のそれぞれの培養細胞から約２．２ｋｂの不完全長のＡＬＳ  ｃＤＮＡが得られた。このＤＮＡの５’側から約２５０ｂｐの位置にＳｍａ  Ｉサイトが存在したので、さらに次の方法で新たなプローブを作製した。野生株由来の約２．２ｋｂｐの不完全長のＡＬＳ  ｃＤＮＡを保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋を宿主大腸菌のＪＭ１０９で増やした後、プラスミドを自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯ  ＰＩ−１００）で抽出した。このプラスミドを直接Ｓｍａ  Ｉで消化し、生成した約２５０ｂｐの断片を１％のアガロース電気泳動で分離精製し濃度を算出後プローブとした。このプローブを用いて上述のＲＩを使用した方法で再度ライブラリをスクリーニングした。その結果得られたシングファージからλＤＮＡを調製し、そのλＤＮＡ溶液（１μｌ）をＥｃｏ  ＲＩで消化し、電気泳動でサイズを確認した後、ニトロセルロースメンブランに固定した。電気泳動後のゲルを１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液中に浸し１５分間程度軽く振とうした。この後ゲルを水洗し、３ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に浸し１５分程度振とうしながらゲルを中和した。ステンレスバットに２０×ＳＳＣを張り、その中に工業用の厚手のろ紙を５枚程度重ねた台座を置いた。その上に中和後のゲル、メンブラン（所定の大きさに切断したニトロセルロースメンブランを蒸留水になじませた後、２０×ＳＳＣでさらに１０分間なじませた）、２枚重ねのろ紙を順番に乗せた後、さらにその上に３ｃｍ〜４ｃｍ厚のペーパータオルを重ねた。この上にガラス板を乗せ、その上に軽い重しを乗せた後、約５分間ブロッティングを行った。この後、ゲルとメンブランの間に気泡が入っていないことを確かめた上で１０分間程度ブロッティングを行った。ブロッティング終了後、メンブランをトランスイルミネーターでＵＶ処理し、１５分から３０分程度８０℃でベーキングした。ベーキング終了後、３２Ｐでラベルした上述の２５０ｂｐプローブＤＮＡによるハイブリダイゼーション（ハイブリダイゼーション緩衝液組成：５×ＳＳＰＥ，０．５％  ＳＤＳ，５×Ｄｅｎｈａｒｌｔｓ，ｓｏｌｕｍ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ，５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を行い、結合したバンドの放射能をイメージングプレートへ写し取り、ＢＡＳ−２０００でその結果を解析した。このハイブリダイゼーションで陽性を示したインサートの中で比較的大きなサイズを示したものを大量に調製し、上述した方法でＥｃｏ  ＲＩ消化後ＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ＋にサブクローニングした。これを大腸菌（ＪＭ１０５）に形質転換し、得られた形質転換体を液体培養後、常法によりプラスミドを調製し、上述の方法で塩基配列を決定した。
その結果、野性型及びＳｒ系統のそれぞれの培養細胞からＡＬＳ完全長ｃＤＮＡを取得することができた。これらの野生型と変異型ＡＬＳ遺伝子相同性を比較した結果を図１９Ａ、図１９Ｂ及び図１９Ｃに示した。図１９Ａ、図１９Ｂ及び図１９Ｃに示すように、Ｓｒ系統では、野性型と比較して、転写開始コドンＡＴＧの最初の塩基Ａを起点として１６４３番目及び１８８０番目の２点の変異が認められた。Ｓｒ系統では、野生型における１６４３番目のＧがＴに変異（Ｇ１６４３Ｔと表記する）し、野生型における１８８０番目のＧがＴに変異（Ｇ１８８０Ｔと表記する）していた。これらの変異はアミノ酸に変換すると、Ｓｒ系統の変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質における５４８番目のトリプトファンがロイシンへ変異（すなわち「Ｗ５４８Ｌ変異」）し、野生型ＡＬＳタンパク質における６２７番目のセリンがイソロシンへ変異（すなわち「Ｓ６２７Ｉ変異」）したアミノ酸配列を有することを意味していた。
（５）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋へクローニングした野性型ＡＬＳ  ｃＤＮＡのｐＧＥＸ  ２Ｔへのサブクローニング
上記（４）で得られた野性型ＡＬＳ完全長ｃＤＮＡを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋プラスミドをＥｃｏ  ＲＩで消化して、野性型ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡを切り出した後、大腸菌発現ベクターであるｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）のＥｃｏ  ＲＩサイトに組み込んだ。以下、ｐＧＥＸ−２ＴにおけるＥｃｏ  ＲＩサイトに野性型ＡＬＳ完全長ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、「ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）」と呼ぶ。ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）を大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、形質転換により得られたコロニーを液体培養してプラスミドを抽出し、シークエンスによりインサートＤＮＡの挿入方向を確認した。これによりｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）で形質転換した大腸菌（ＪＭ１０９）を作製した。
〔実施例４〕ＰＣ除草剤抵抗性イネ培養細胞ＡＬＳ遺伝子の変異部位の解明
（１）抵抗性変異株（Ｓｒ，Ｒｂ，Ｖｇ，Ｇａ系統株）からのゲノムＤＮＡの抽出
植物ＤＮＡ抽出キットＩＳＯＰＬＡＮＴ  ＩＩ（ニッポンジーン社）を用い、添付のプロトコルに従って、Ｓｒ、Ｒｂ、Ｖｇ及びＧａ系統のぞれぞれの培養細胞０．１ｇからゲノムＤＮＡを抽出した。上記キットでゲノムＤＮＡを抽出した後、ＲＮａｓｅ  ＡでＲＮＡを分解除去した。その後、アガロースゲルで電気泳動し、ゲノムＤＮＡを確認した。
（２）ゲノムＤＮＡを鋳型としたＡＬＳ遺伝子のＰＣＲ
それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記に示すプライマー「ＡＬＳ−Ｒｓｐ３」とプライマー「４−８３−３」を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、最終容量２５μｌで行った。反応条件としては、９４℃で５分間初期変性工程を行い、続いて、９４℃で３０秒間の変性工程、５５℃で１分間のアニーリング工程及び７２℃で２分間の伸長工程からなるサイクルを４０回行うものとし、最終サイクルの伸長工程を７２℃で９分間行うものとした。
次に、ＰＣＲ反応液を２％アガロースゲルで電気泳動（１００Ｖ，１  Ｘ  ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ）した後、ＰＣＲ生成物を含むゲルを切り出し、切り出したゲルを小さな断片に切断した。得られたゲル断片を滅菌イオン交換水で２、３度リンスした後、５００μｌの滅菌イオン交換水を入れ、凍結・溶解を３回繰り返した。これにより、ＰＣＲ生成物を水中に溶出することができた。
次に、このＰＣＲ生成物が溶存する溶出液を用いたＰＣＲを再度行った。すなわち、このＰＣＲでは、溶液中に含まれるＰＣＲ生成物を鋳型とし、同一のプライマーセットを用いるか、或いは内子のプライマー（ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）を用い、最終容量１００μｌで行った。反応終了後、反応液を分取用アガロースゲル（１％）で電気泳動した後、目的のバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＆  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。そして、最終的に７５μｌの滅菌脱イオン水でＰＣＲ生成物を溶出した。
（３）シークエンシング
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  ｖｅｒ．２（アプライドバイオシステム社製）を用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応に際しては、鋳型ＤＮＡを１１μｌ、プライマー（３．２ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ、ｐｒｅ−ｍｉｘを８μｌとし、総容量を２０μｌとした。シークエンス反応条件は、９６℃で５分間の初期変性工程、続いて、９６℃で５秒間の変性工程、５０℃で５秒間のアニーリング工程及び６０℃で４分間の伸長工程からなるサイクル４０回行い、最終サイクルの伸長工程を６０℃で９分間行うものとした。シークエンス反応後、ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム  バイオテック社製）を用い反応液中の蛍光塩基をゲル濾過により除去し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を読んだ。
（４）使用したプライマーの名称及び塩基配列
上記（２）で用いたプライマー及び、以下の実施例で使用したプライマーについて、名称及び塩基配列等を表６にまとめた。
2003083118.tif 000010
なお、表６中、対応ＡＬＳ部位は、転写開始コドン（ＡＴＧ）を起点とした場合の対応する塩基の番号である。また、ＡＬＳ−Ｒｓｐ１の塩基配列は配列番号９に示し、ＡＬＳ−Ｒｓｐ２の塩基配列は配列番号１０に示し、ＡＬＳ−Ｒｓｐ３の塩基配列は配列番号１１に示し、ＡＬＳ−Ｒｓｐ４の塩基配列は配列番号１２に示し、ＡＬＳ−Ｒｓｐ６の塩基配列は配列番号１３に示し、ＡＬＳ−Ｒｓｐ７の塩基配列は配列番号１４に示し、ＡＬＳ−ＲｓｐＡの塩基配列は配列番号１５に示し、ＡＬＳ−ＲｓｐＢの塩基配列は配列番号１６に示し、ＡＬＳ−ＲｓｐＣの塩基配列は配列番号１７に示し、ＡＬＳ−ＲｓｐＤの塩基配列は配列番号１８に示し、ＡＬＳ−ＲｓｐＦの塩基配列は配列番号１９に示し、ＡＬＳ−ＲｓｐＥの塩基配列は配列番号２０に示し、３−１−１の塩基配列は配列番号２１に示し、３−１−２の塩基配列は配列番号２２に示し、３−１−３の塩基配列は配列番号２３に示し、３−１−４の塩基配列は配列番号２４に示し、４−８３−１の塩基配列は配列番号２５に示し、４−８３−３の塩基配列は配列番号２６に示し、４−８３−１０の塩基配列は配列番号２７に示し、４−８３−１５の塩基配列は配列番号２８に示し、ＡＬＳ−ＤＧ７の塩基配列は配列番号２９に示した。
（５）シークエンスの結果明らかになった各系統における変異
上記（３）で決定した塩基配列解析の結果、Ｒｂ系統、Ｖｇ系統、Ｇａ系統及びＳｒ系統の変異が明らかとなった。各系統の変異点を表７にまとめる。
2003083118.tif 000011
表７に示すように、Ｒｂ系統株では塩基配列における５１２番目のＣがＡにホモに、１６４３番目のＧがＴにヘテロに変異していた。これはアミノ酸レベルでは１７１番目のプロリンと５４８番目のトリプトファン（Ｗ）がそれぞれヒスチジン（Ｈ）とロイシン（Ｌ）に変異していることを意味している。Ｖｇ系統株では塩基配列における１６４３番目のＧがＴにヘテロに変異しており、これはアミノ酸レベルでは５４８番目のトリプトファン（Ｗ）がロイシン（Ｌ）に変異していることになる。Ｇａ系統株では塩基配列における５１２番目と５１４番目のＣがＡにホモかヘテロ（得られたＰＣＲ生成物により異なっていた）に、１６４３番目のＧがＴにヘテロに変異していた。これはアミノ酸レベルでは１７１番目のプロリン（Ｐ）と１７２番目のアルギニン（Ｒ）及び５４８番目のトリプトファン（Ｗ）がそれぞれヒスチジン（Ｈ）、セリン（Ｓ）及びロイシン（Ｌ）に変異していることを意味している。またＳｒ系統株では塩基配列における１６４３番目と１８８０番目の双方のＧがＴにヘテロに変異していた。
上述した方法でＳｒ系統株のｃＤＮＡライブラリーからＡＬＳ遺伝子をスクリーニングして単離した際、２点変異型遺伝子だけではなく野性型の遺伝子の遺伝子も単離されたことからゲノムＤＮＡレベルではヘテロに変異していると推定していたが、ゲノムＰＣＲによる結果もそれを裏付ける結果となった。
以上のように全ての抵抗性変異株で５４８番目のトリプトファン（Ｗ）はヘテロにロイシン（Ｌ）に変異しており、Ｖｇ系統がこの変異のみを有していた。上述したようにｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性はＶｇ系統株では１０μＭまで、Ｓｒ、Ｒｂ、Ｇａ系統株では１００μＭまで抵抗性を示していた。このことから抵抗性の獲得はその淘汰圧の強度が強くなると共にＶｇ系統を起点にその他の系統に分岐し変異していったと推察された。
〔実施例５〕Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）及びＧ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）のそれぞれの変異を単独で持つＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
先ず、Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）及びＧ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）のそれぞれの変異を単独で持つＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製について、図２０を用いて説明する。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＡＬＳ−２  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｎｔ）或いはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）の１μｌ（各々５８５ｎｇ／μｌ及び５５４ｎｇ／μｌ）を鋳型として、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）の１μｌを用い、最終反応量１００μｌでＰＣＲを行った。反応条件は９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で２分間からなるサイクルを２５回繰り返した。なおｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＡＬＳ−２  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｎｔ）は、Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）及びＧ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）の２点変異型のＡＬＳ遺伝子を含んでいる。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）は、変異を持たない野生型のＡＬＳ遺伝子を含んでいる。ＰＣＲに際して、プライマーはＡＬＳ−Ｒｓｐ６とＡＬＳ−ＲｓｐＦの組み合わせ及びＡＬＳ−ＲｓｐＥとＭ１３Ｒの組み合わせを用いた。鋳型となるＡＬＳ遺伝子と所定の組合せのプライマーとにより増幅される断片の名称を表８にまとめた。なお、プライマーＭ１３Ｒは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＴ３プロモーター近傍のアンチセンスプライマーである。また、Ｍ１３Ｒの塩基配列は、５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号３０）である。
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ＰＣＲによって得られたＰＣＲ−１、ＰＣＲ−２、ＰＣＲ−３及びＰＣＲ−４をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離した後、アガロースゲルから前述と同様に回収し、５０μｌ滅菌水で溶出した。
次に、ＰＣＲ−１及びＰＣＲ−４のセットと、ＰＣＲ−２及びＰＣＲ−３のセットとを用いてＳＰＲ（ｓｅｌｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に供した。ＳＰＲは、ＰＣＲ−１及びＰＣＲ−４のセット或いはＰＣＲ−２及びＰＣＲ−３のセット２３．５μｌとＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μｌとを加え、最終容量７５μｌとし、９５℃で１分間の変性工程、５５℃で３０秒間のアニーリング工程及び７２℃で２分間の伸長工程からなるサイクルを２５回行うものとした。ＰＣＲ−１及びＰＣＲ−４のセットを用いたＳＰＲで得られたＤＮＡ断片をＳＰＲ−１とし、ＰＣＲ−２及びＰＣＲ−３のセットを用いたＳＰＲで得られたＤＮＡ断片をＳＰＲ−２とした。
なお、本例では、十分量のＳＰＲ−１とＳＰＲ−２と確保するため、精製されたＳＰＲ−１或いはＳＰＲ−２を鋳型とし、ＡＬＳ−Ｒｓｐ６及びＭ１３Ｒを用いて再度ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより最終反応量１００μｌでＰＣＲをそれぞれ行った。このときのＰＣＲは、９５℃で３０秒間の変性工程、５５℃で３０秒間のアニーリング工程及び７２℃で２分間の伸長工程からなるサイクルを２５回繰り返した。このＰＣＲの後、反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのシングルバンド（ＰＣＲ産物）をアガロースゲルから回収し、１００μｌ滅菌水で溶出した。
次に、ＰＣＲによって増幅したＳＰＲ−１とＳＰＲ−２をＡｃｃ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩによりそれぞれ消化し、ＳＰＲ−１（Ａｃｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ消化断片）とＳＰＲ−２（Ａｃｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ消化断片）を得た。すなわち、ＰＣＲ産物が溶存する１００μｌの滅菌水のうち５０μｌを、１０  ｘ  Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）存在下、Ａｃｃ  Ｉ  １μｌ（１２ｕ／μｌ）及びＥｃｏ  ＲＩ  １μｌ（１２ｕ／μｌ）と混合し、最終容量６０μｌで３７℃、１時間インキュベートした。その後、反応溶液全量をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の１．５ｋｂｐの断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで回収した。回収した１．５ｋｂｐの断片を５０μｌの滅菌水で溶出することによって、ＳＰＲ−１（Ａｃｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ消化断片）を含む溶液とＳＰＲ−２（Ａｃｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ消化断片）を含む溶液とを調製した。
一方、野性型ＡＬＳ遺伝子が組み込まれたタンパク質発現ベクター、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）プラスミド（濃度約５０ｎｇ／μｌ）の１５０μｌを、１０  Ｘ  Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ存在下でＡｃｃ  Ｉ  １μｌ（１２ｕ／μｌ，Ｔａｋａｒａ社製）と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動により直鎖状になった７．２ｋｂｐのバンドを確認した。ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのプロトコルに従いこのアガロースゲルから、７．２ｋｂｐのバンドに相当するＤＮＡを回収後、１８０μｌの滅菌水で溶出した。その内８９μｌを、１０μｌの１０  ｘ  Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）及び１μｌのＥｃｏ  ＲＩ（１２ｕ／μｌ）と混合し、３７℃で１分間反応することによって、回収したＤＮＡをＥｃｏ  ＲＩで部分消化した。反応終了後、１０  ｘ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、４．９ｋｂｐ、５．７ｋｂｐ、６．５ｋｂｐ及び全く切断されない７．２ｋｂｐのバンドに分かれ、目的の５．７ｋｂｐのバンドをゲルから切り出した。切り出したゲルに含まれる約５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより回収し、その後、５０μｌの滅菌水で溶出した。
そして、このようにして得られたｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）のＡｃｃ  Ｉ消化及びＥｃｏ  ＲＩ部分消化断片の３μｌとＳＰＲ−１（Ａｃｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ消化断片）或いはＳＰＲ−２（Ａｃｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ消化断片）の３μｌとを、それぞれＴａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ｖｅｒ．２，Ｉ液）６μｌと１６℃で１晩反応させた。
次に、反応液を大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０９株、Ｔａｋａｒａ社製）に添付のプロトコルに従ってそれぞれ形質転換し、アンピシリン５０ｐｐｍを含むＬＢ培地に播き、３７℃で１晩インキュベートした。この結果、現れたコロニーの中から数点を選び、表６に記載したＡＬＳ−ＲｓｐＥ及びＰＧＥＸ−３（５’−ＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ−３’：配列番号３１）のセットと、ＰＧＥＸ−５（５’−ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’：配列番号３２）及びＰＧＥＸ−３のセットと、ＰＧＥＸ−５及び表６に記載したＡＬＳ−ＲｓｐＡのセットとを用いてコロニーを鋳型にしてダイレクトにＰＣＲを行った。なお、ＰＧＥＸ−３は、ベクターとして使用したｐＧＥＸ−２Ｔの３’側に位置するアンチセンス鎖の一部と同じ配列である。ＰＧＥＸ−５は、ベクターとして使用したｐＧＥＸ−２Ｔの５’側に位置するセンス鎖の一部と同じ配列である。反応条件としては、ＡＬＳ−ＲｓｐＥ／ＰＧＥＸ−３セットのときには、総量２５μｌ中、各々のプライマーを１μＭとＰＣＲ  ｂｅａｄ１個を溶解し、９５℃で３０秒間の変性工程、５５℃で１分間のアニーリング工程及び７２℃で２分間の伸長工程からなるサイクルを４０回繰り返した。またＰＧＥＸ−５／ＰＧＥＸ−３セット及びＰＧＥＸ−５／ＡＬＳ−ＲｓｐＡセットの場合には、上流部分にＧＣコンテントが７５％程度の領域があるので、上記の溶液に更に最終濃度が５％のＤＭＳＯを加えた。このＰＣＲの結果、所望のインサートが挿入されていることを確認した。
所望のインサートの挿入が確認されたコロニー１点を取り、アンピシリン５０ｐｐｍを含有するＬＢ液体培地（３ｍｌ  １０本）にて、３７℃で１２時間振とう培養した。培養後、プラスミド抽出装置（ＴＯＭＹ社製ＤＰ−４８０）で培地からプラスミドを抽出（４００〜５００μｌ程度）した後、遠心濃縮により２００μｌ程度まで濃縮した。その後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製及び脱塩し、最後に１３０μｌ程度の滅菌水で溶出した。
これらのプラスミドをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  ｖｅｒ．２を用いてシークエンス反応を行い、プラスミドに含まれるインサートの塩基配列を解析した。シークエンス反応に際して、反応溶液は、１１μｌの鋳型ＤＮＡと、１μｌのプライマー（３．２ｐｍｏｌ／μｌ）と、８μｌのｐｒｅ−ｍｉｘとを混合して調製し、総容量を２０μｌとした。シークエンス反応条件としては、９６℃で５分間の初期変性工程の後、９６℃で５秒間の変性工程、５０℃で５秒間のアニーリング工程及び６０℃で４分間の伸長工程からなるサイクルを４０回繰り返し、最終サイクルの伸長工程は６０℃で９分間行うものとした。シークエンス反応終了後、ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０  ｃｏｌｕｍｎを用い反応液中の蛍光塩基をゲル濾過により除去し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
なお、シークエンス反応に際しては、表６に記載したプライマーのうち、センスプライマーとしてＰＧＥＸ−５、ＡＬＳ−ＲｓｐＣ、ＡＬＳ−Ｒｓｐ３、ＡＬＳ−Ｒｓｐ１、３−１−４及びＡＬＳ−ＲｓｐＢを用い、アンチセンスプライマーとして４−８３−３、ＰＧＥＸ−３、ＡＬＳ−Ｒｓｐ２、４−８３−１０及びＡＬＳ−Ｒｓｐ７を用いた。
解析の結果、Ｗ５４８Ｌ変異を有する変異ＡＬＳ遺伝子を有するｐＧＥＸ  ２Ｔベクター（図２０において、「ｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）」と記載）及びＳ６２７Ｉ変異を有する変異型ＡＬＳ遺伝子を有するｐＧＥＸ  ２Ｔベクター（図２０において、「ｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）」と記載）が得られたことを確認した。次いで、これらｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）及びｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）で大腸菌を形質転換した。
〔実施例６〕Ｒｂ系統のゲノムＰＣＲにより見い出されたＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異及びＧａ系統のゲノムＰＣＲにより見い出されたＣ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異をそれぞれ単独で持つＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製ならびにこのベクターによる大腸菌の形質転換
先ず、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）及びＣ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）のそれぞれの変異を単独で持つＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製について、図２１及び２２を用いて説明する。
Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異ＤＮＡ断片を得るため、Ｒｂ系統のゲノムＤＮＡを鋳型として、表６に記載したＡＬＳ−Ｒｓｐ６及びＡＬＳ−Ｒｓｐ４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＲｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓを用い、鋳型のゲノムＤＮＡを５μｌ、各々のプライマー（２５ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ加え、最終容量２５μｌで行った。反応条件としては、９５℃で５分間の初期変性工程の後、９５℃で３０秒間の変性工程、５５℃で１分間のアニーリング工程及び７２℃で２分間の伸長工程からなるサイクルを４０回繰り返し、最終サイクルの伸長工程を７２℃で９分間行うものとした。
ＰＣＲ反応終了後、反応溶液を２％アガロースゲルで電気泳動に供し、アガロースゲルからＰＣＲ生成物（図２１において「ＰＣＲ−５」と記載）のバンドを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＆  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製した。次に、精製したＰＣＲ−５をＰＣＲ産物クローニング用ベクター（ＴＡクローニングベクター）であるｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだ。すなわち、精製したＰＣＲ生成物１μｌを、１μｌのｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（５０ｎｇ／μｌ）、３μｌの滅菌脱イオン水及び５μｌのｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ｖｅｒ．２，Ｉ液，宝酒造社製）と混合し、１６℃で１晩反応させた。
反応終了後、反応液全量を大腸菌（ＪＭ１０９株）へ定法に従い形質転換した。アンピシリン５０ｐｐｍを含むＬＢ固体培地上で培養後、実施例５と同様にして、出現したシングルコロニーから目的のシークエンスを有するもの選別した。選別したシングルコロニーを、アンピシリン５０ｐｐｍを含むＬＢ液体培養液（３ｍｌ  １０本）で、３７℃で１２時間振とう培養した。培養後、プラスミド抽出装置（ＴＯＭＹ社製ＤＰ−４８０）でプラスミドを抽出（４００〜５００μｌ）した。これを遠心濃縮により２００μｌ程度まで濃縮して、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製及び脱塩し、８０μｌ程度の滅菌水で溶出した。
次に、溶出液のうち５０μｌを、１０μｌの１０  Ｘ  Ｔ  ｂｕｆｆｅｒ及び１０μｌの０．１％ＢＳＡ存在下で、１μｌのＡｃｃ  Ｉ（１２ｕ／μｌ）及び１μｌのＳｍａ  Ｉ（１０ｕ／μｌ）と混合し総量１００μｌとし、３７℃で２時間インキュベートした。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のバンドを切り出して回収し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのプロトコルに従ってＤＮＡ断片を回収した。これにより、末端にＳｍａ  ＩサイトとＡＣＣ  Ｉサイトを持つＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異ＤＮＡ断片を得た。
一方、Ｃ５１４Ａ変異及びＣ５１２Ａ変異が近接しているため、Ｇｂ系統から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは、Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異のみを有するＤＮＡ断片を得ることができない。したがって、図２１に示すように、予め変異点を導入した一対のプライマーを用いることで、Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異のみを有するＤＮＡ断片を調製した。即ち、変異点の入ったプライマーとしてＡＬＳ−Ｍ１（５’−ＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＴ−３’：配列番号３３、下線のＡが変異点）とＡＬＳ−Ｍ２（５’−ＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴ−３’：配列番号３４、下線のＴが変異点）を用い、野性型ＡＬＳ  ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋を鋳型とし、ＡＬＳ−Ｒｓｐ６及びＡＬＳ−Ｍ２のプライマーセットとＡＬＳ−Ｍ１及びＡＬＳ−Ｒｓｐ４のプライマーセットとを用いてそれぞれＰＣＲを行った。なお、ＡＬＳ−Ｍ１における１〜２３番目の塩基配列とＡＬＳ−Ｍ２における１〜２３番目の塩基配列とが相補的な部分である。ＡＬＳ−Ｒｓｐ６及びＡＬＳ−Ｍ２のプライマーセットを用いた場合には図２１中「ＰＣＲ−６」と記載したＤＮＡ断片が増幅され、ＡＬＳ−Ｍ１及びＡＬＳ−Ｒｓｐ４のプライマーセットを用いた場合には図２１中「ＰＣＲ−７」と記載したＤＮＡ断片が増幅される。
ＰＣＲに際して、反応溶液は、１μｌのＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ、ＴＡＫＡＲＡ社製）、１０μｌの１０  Ｘ  ＬＡ  ｂｕｆｆｅｒ、１０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６μｌのｄＮＴＰｓ（それぞれ２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰからなる）、１μｌの鋳型ＤＮＡ、それぞれ４μｌのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（それぞれ２５ｐｍｏｌ／μｌ）を総量１００μｌに溶解したものを調製した。反応条件としては、９５℃で５分間の初期変性工程の後、９５℃で３０秒間の変性工程、５５℃で１分間のアニーリング工程及び７２℃で２分間の伸長工程からなるサイクルを２５回繰り返し、最終サイクルの伸長工程を７２℃で９分間行うものとした。
反応終了後、反応液を分取用１．５％アガロースゲルで電気泳動に供し、目的の２１３ｂｐ（ＰＣＲ−６）と３７７ｂｐ（ＰＣＲ−７）のバンドを切り取り、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＆  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製した後、生成したＤＮＡ断片をそれぞれ１００μｌの滅菌脱イオン水で溶出した。
次に、得られたＰＣＲ−６及びＰＣＲ−７を用いてＳＰＲを行った。ＳＰＲに際して、反応液は、得られた溶出液のうち３０μｌを、１μｌのＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）、１０μｌの１０  Ｘ  ＬＡ  ｂｕｆｆｅｒ、１０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６μｌのｄＮＴＰｓ（それぞれ２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰからなる）と混合して総量１００μｌに調製した。ＳＰＲ条件としては、９５℃で５分間の初期変性工程の後、９５℃で３０秒間の変性工程、５５℃で１分間のアニーリング工程及び７２℃で２分間の伸長工程からなるサイクルを４０回繰り返し、最終サイクルの伸長工程を７２℃で９分間行うものとした。
反応終了後、反応液を分取用アガロースゲル（１．５％）電気泳動に供し、目的の５６０ｂｐのバンド（図２１において「ＳＰＲ−３」と記載）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＆  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製し、生成したＤＮＡ断片（ＳＰＲ−３）を１００μｌの滅菌脱イオン水で溶出した。これを先に述べた方法と同様に、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒに組み込み、大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換した。この大腸菌を培養し、抽出されたプラスミドをＡｃｃ  ＩとＳｍａ  Ｉで消化して、末端にＳｍａ  ＩサイトとＡＣＣ  Ｉサイトを持つＣ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異ＤＮＡ断片を得た。
他方、野性型ＡＬＳ遺伝子が組み込まれたプラスミド、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）で形質転換された大腸菌（ＪＭ１０９株）を、アンピシリン５０ｐｐｍを含むＬＢ液体培地（２ｍｌ  ｘ  １５本）にて３７℃で１晩振とう培養した。プラスミド抽出装置（ＤＰ−４８０）でプラスミドを抽出後、抽出液（約７５０μｌ）を減圧遠心濃縮器で２００μｌ程まで濃縮した。その後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＆  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより脱塩し、最終的にプラスミドを２００μｌの滅菌脱イオン水で溶出した。
次に、得られたプラスミド、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）をＡｃｃ  Ｉで消化した。すなわち、溶出液のうち７５μｌを、９μｌの１０  Ｘ  Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ、３μｌのＡｃｃ  Ｉ（１２ｕ／μｌ）及び３μｌの滅菌脱イオン水と混合し、３７℃で３時間反応した。反応終了後、反応液を１．５％分取用アガロースゲル電気泳動に供し、目的のバンドを切り出して回収した後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＆  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製し、最終的に１００μｌの滅菌脱イオン水でＤＮＡ断片を溶出した。
次に、Ａｃｃ  Ｉで消化されたｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）を、Ｓｍａ  Ｉで部分消化した。すなわち、溶出液のうち７９μｌを、１０μｌの１０  Ｘ  Ｔ  ｂｕｆｆｅｒ、１０μｌの０．１％  ＢＳＡ、１μｌのＳｍａ  Ｉ（１０ｕ／μｌ）と混合して総量１００μｌとし、３０℃で１分間インキュベートした。なお、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）には、３箇所のＳｍａ  Ｉ認識配列（ｐＧＥＸ−２ＴのＴｈｒｏｍｂｉｎ切断サイトに隣接するマルチクローニングサイト上、ＡＬＳ遺伝子２７６番目及び４３０番目）があるため、短時間で部分消化した。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＡＬＳ遺伝子４３０番目のＳｍａ  Ｉ認識配列のみを消化したプラスミドに相当するバンドを切り出して回収し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＆  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて酵素・タンパク質を除去して精製した。そして、最終的に滅菌脱イオン水５０μｌで溶出した。このＡｃｃ  Ｉ消化／Ｓｍａ  Ｉ部分消化処理したｐＧＥＸ−２Ｔ−野性型ＡＬＳ  ｃＤＮＡ断片と、上述の方法で得られた末端にＳｍａ  ＩサイトとＡＣＣ  Ｉサイトを有するＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異ＤＮＡ断片並びにＣ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異ＤＮＡ断片を定法によりライゲーションした。なお、図２２において、この方法により得られたＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異のみを単独で有する変異ＡＬＳ遺伝子を含むプラスミドを「ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｐ１７１Ｈ  ｍｕｔａｎｔ）」と記載し、Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異のみを単独で有する変異ＡＬＳ遺伝子を含むプラスミドを「ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｒ１７２Ｓ  ｍｕｔａｎｔ）」と記載する。
その後、反応液の全量を用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ培地上で出現したシングルコロニーを、上述した方法と同様に、ＰＣＲによりスクリーニングし、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｐ１７１Ｈ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌及びｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｒ１７２Ｓ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌を選抜した。
〔実施例７〕Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）の２点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ−２Ｔの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）の２点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ−２Ｔの作製について、図２３を用いて説明する。
Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）の２点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成は、上述の実施例６に記載した方法に準じ、Ｇａ系統から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで行った。すなわち、Ｇａ系統から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡＬＳ−Ｒｓｐ６及びＡＬＳ−Ｒｓｐ４をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、図２３中「ＰＣＲ−８」と記載したＤＮＡ断片を増幅した。そして、増幅したＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒにライゲーションした後、これをＡｃｃ  Ｉ及びＳｍａ  Ｉで消化することによって、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異ＤＮＡ断片を得た。次に、図２２に示したように、Ａｃｃ  Ｉ消化／Ｓｍａ  Ｉ部分消化処理したｐＧＥＸ−２Ｔ−野性型ＡＬＳ  ｃＤＮＡ断片と、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異ＤＮＡとを定法によりライゲーションした。これにより、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｐ１７１Ｈ，Ｒ１７２Ｓ  ｍｕｔａｎｔ）を作製した。また、実施例６と同様にして、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｐ１７１Ｈ，Ｒ１７２Ｓ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌を作製した。
〔実施例８〕Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）及びＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）の２点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ−２Ｔの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）及びＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）の２点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ−２Ｔの作製について、図２４を用いて説明する。
先ず、実施例５で得たｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）を、実施例６の方法に準じて、Ａｃｃ  Ｉで消化した後にＳｍａ  Ｉで部分消化することによって、ＡＬＳ遺伝子における４３０番目のＳｍａ  Ｉ認識配列からＡｃｃ  Ｉ認識配列までを欠失させる。次に、これと実施例６で作製したＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異断片とをライゲーションすることによって、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）２点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡを含むプラスミド（図２４中、「ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）」と記載）を作製した。
一方、ｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）の代わりに、実施例５で得たｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）を用いることによって、同様にして、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）２点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡを含むプラスミド（図２４中、「ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）」と記載）を作製した。
さらに、これらｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）及びｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）を用いて、実施例６の方法と同様にして、大腸菌を形質転換した。
〔実施例９〕Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）／Ｇ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）の３点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ−２Ｔの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）／Ｇ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）の３点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ−２Ｔの作製について、図２５を用いて説明する。
先ず、実施例５で得たｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）をＸｈｏ  Ｉで消化した後、定法に従ってＢＡＰ処理を行う。次に、上述した方法に準じて、目的の遺伝子断片（ベクター側）をアガロースゲルから分離・精製した。また、実施例５で得たｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）をＸｈｏ  Ｉで消化し、上述した方法に準じて、当該変異を含む断片をアガロースゲルから分離・精製した。
次に、Ｇ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）とＧ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）の２点変異を併せ持つ「ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）」を作製する目的で、得られたＤＮＡ断片それぞれをライゲーション反応に供した。反応終了後、反応液全量を用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ培地上で出現したシングルコロニーを、上述した方法に準じてＰＣＲによりスクリーニングし、目的のプラスミド（ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ））を持つ大腸菌を選抜した。
選抜した大腸菌を培養後、上述した方法に準じて、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）を調製した。ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）をＡｃｃ  Ｉ消化した後、Ｓｍａ  Ｉによる部分消化を行い、ＡＬＳ遺伝子における４３０番目のＳｍａ  Ｉ認識配列からＡｃｃ  Ｉ認識配列までを欠失させたｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）を作製した。次に、これと実施例６で作製したＣ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異断片とをライゲーションすることによって、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）／Ｇ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）３点変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡを含むプラスミド（図２５中、「ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）と記載」）を作製した。
さらに、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）を用いて、実施例６の方法と同様にして、大腸菌を形質転換した。
〔実施例１０〕変異型ＡＬＳタンパク質の発現
実施例３（５）で作製したｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−ｗｉｌｄ）で形質転換した大腸菌、実施例５で作製したｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換した大腸菌、実施例５で作製したｐＧＥＸ  ２Ｔ（ＡＬＳ−Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換した大腸菌、実施例６で作製したｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｐ１７１Ｈ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌、実施例６で作製したｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｒ１７２Ｓ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌、実施例７で作製したｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ  Ｐ１７１Ｈ，Ｒ１７２Ｓ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌、実施例８で作製したｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｗ５４８Ｌ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌、実施例８で作製したｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌及び実施例９で作製したｐＧＥＸ−２Ｔ（ＡＬＳ−Ｐ１７１Ｈ，Ｗ５４８Ｌ，Ｓ６２７Ｉ  ｍｕｔａｎｔ）で形質転換された大腸菌を、２ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて２７℃でそれぞれ振とう培養（前培養）した。この前培養液１ｍｌを用いて２５０ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で、それぞれ本培養を行った。一晩培養後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えてさらに３時間〜４時間培養することによって、ＧＳＴ融合タンパク質の発現誘導を行った。なお、菌体は洗浄後−８０℃で保存した。
大腸菌からのＡＬＳの調製と精製は次の方法で行った。先ず、−８０℃に保存しておいた大腸菌のペレットを、ＡＬＳ抽出緩衝液（３０％グリセロールと０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５）に懸濁した（培養液５０ｍｌから得られたペレットに対して２．５ｍｌのＡＬＳ抽出緩衝液を添加）。この懸濁液を超音波処理（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社製、Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  Ｗ−２２５Ｒ、マイクロチップ、アウトプットコントロール８、約１秒インターバル、４０秒２回）した後、４℃、１５０００×ｇで２０分間遠心し、その上澄を粗酵素溶液とした。
これにより、ＧＳＴ融合野生型ＡＬＳタンパク質、ＧＳＴ融合Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質、ＧＳＴ融合Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質、ＧＳＴ融合Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質、ＧＳＴ融合Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質、ＧＳＴ融合Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質、ＧＳＴ融合Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質、ＧＳＴ融合Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質及びＧＳＴ融合Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質のいずれかを含む９種類の粗酵素溶液を調製した。
〔実施例１１〕変異型ＡＬＳタンパク質の薬剤感受性
実施例１０で得た９種類の粗酵素溶液を用いて、野生型ＡＬＳタンパク質及び変異型ＡＬＳタンパク質の薬剤感受性を調べた。薬剤感受性試験は、実施例２とほぼ同様な手順に従って行った。ただし、本例においては、反応温度を３７℃、反応時間を３０分間とし、また大腸菌由来のＡＬＳ活性を阻害するために、反応液には１０ｍＭのバリンを添加した。また、薬剤には、ＰＣ除草剤としてｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ及びｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃの３種類を使用し、スルホニルウレア系除草剤としてｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎを使用し、イミダゾリノン系除草剤としてｉｍａｚａｑｕｉｎを使用した。これら薬剤は、変異型ＡＬＳタンパク質を添加する前に、これらの薬剤の所定の濃度の溶液（ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍとｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍは水溶液、その他はアセトン溶液）を反応液中に添加した。アセトンの最終濃度は１％とした。
９種類の粗酵素溶液について、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍによる阻害活性を図２６及び２７並びに表９に示し、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍによる阻害活性を表１０に示し、ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃによる阻害活性を表１１に示し、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎによる阻害活性を表１２に示し、ｉｍａｚａｑｕｉｎよる阻害活性を表１３に示した。
表９〜１３中、薬剤による阻害活性は、供試濃度において５０％阻害が得られる場合には、その５０％阻害を与える濃度（Ｉ５０値）で表し、５０％阻害が得られない場合には供試濃度の最高濃度における阻害％で表した。また、表９〜１３中、予想ＲＳ比とは、複数の変異を有する変異型ＡＬＳタンパク質について、単独で変異を有する変異型ＡＬＳタンパク質のＲＳ比から通常予測されるＲＳ比を意味する。すなわち、予想ＲＳ比は、単独で変異を有する変異型ＡＬＳタンパク質のＲＳ比から通常予測される相加効果を意味する。具体的には、複数の変異を有する変異型ＡＬＳタンパク質に関する予想ＲＳ比は、当該複数の変異のうちいずれか１つの変異のみ有する変異型ＡＬＳタンパク質のＲＳ比を当該複数の変異全てについて選択し、選択したＲＳ比を乗じることで算出した。複数の変異を有する変異型ＡＬＳタンパク質について実際のＲＳ比が予想ＲＳ比を上回る場合、当該複数の変異を有する変異型ＡＬＳタンパク質は、変異を単独で有する変異型ＡＬＳタンパク質の組み合わせから予想される相加効果の抵抗性を超える抵抗性を有するものである。
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以上の表９〜１３のデータを順に説明する。
まず、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍによる阻害活性データ（表９）からは次のことが明らかとなった。１点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して最も高い抵抗性を示した（ＲＳ比が５２０）。Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質又はＰ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質も高い抵抗性を示した（それぞれ、ＲＳ比が４１及び８．７）が、Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比が０．９８）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異、Ｗ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＲ１７２Ｓ変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
一方、２点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質の中では、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して最も強い抵抗性を示した（１００μＭで５．５％の阻害、ＲＳ比は＞１５０００）。Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質もｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して強い抵抗性を示した（ＲＳ比が３７００）。Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いは、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質とほぼ同じであった。また、３点変異型遺伝子によりコードされるＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質もｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して強い抵抗性を与えた（１００μＭで１．１％の阻害、ＲＳ比は＞１５０００）。なお、これらの結果の元になった実際の薬剤用量応答結果は図２６及び２７に示した。
２点変異及び３点変異について、予想ＲＳ比と実際のＲＳ比とを比較したところ、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質におけるＲＳ比は、予想ＲＳ比を有意に上回っていた（ＲＳ比と予想ＲＳ比の比が１よりも明瞭に大きくなる）。このことから、これらの２つの２点変異型遺伝子（Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子）は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性をＡＬＳタンパク質に与えることが判明した。
次に、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍによる阻害活性（表１０）からは次のことが明らかになった。１点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して最も強い抵抗性を示した（１００μＭで４１％、ＲＳ比は＞９１００）。Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も抵抗性を示した（ＲＳ比が２００）が、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いは低く（ＲＳ比が３．４）、Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比が０．８５）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異、Ｗ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異は、Ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＲ１７２Ｓ変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
一方、２点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのは、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質であり（１００μＭで２０％の阻害、ＲＳ比は＞９１００）、続いてＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質であった（ＲＳ比が８５０）。表９に示したｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍによる阻害活性データとは異なり、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの場合、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質よりも高い度合いで抵抗性を示しており（ＲＳ比１３）、単独ではサイレント変異であるＲ１７２Ｓ変異がＰ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いを高めることが判明した。
また、２点変異型ＡＬＳタンパク質について、１点変異型ＡＬＳタンパク質のＲＳ比から予想される予想ＲＳ比と実際のＲＳ比と比較したところ、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質のＲＳ比は予想ＲＳ比よりも有意に大きくなっていた（実際のＲＳ比と予想ＲＳ比の比が１よも明確に大きくなる）。このことから、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
次に、ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃによる阻害活性（表１１）からは次のことが明らかになった。１点変異型遺伝子（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）がコードする変異型ＡＬＳタンパク質の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃに対して最も強い抵抗性を示した（ＲＳ比４５００）。Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も強い抵抗性を与えたが（ＲＳ比２８００）、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いは低く（ＲＳ比５）、Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比１．２）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異、Ｗ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異は、ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＲ１７２Ｓ変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
２点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのは、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質であり（１００μＭで１１％の阻害、ＲＳ比は＞１３０００）、続いてＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質であった（１００μＭで２１％の阻害、ＲＳ比は＞１３０００）。これらＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質について、予想ＲＳ比と実際のＲＳ比とを比較した結果、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すかどうかを明確にすることはできなかった。
次に、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎによる阻害活性（表１２）からは次のことが明らかになった。１点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｃｈｌｏｒｓｕｒｆｕｒｏｎに対して最も強い抵抗性を示した（ＲＳ比５２０）。Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質も比較的強い抵抗性を示した（ＲＳ比８５）が、Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いは低く（ＲＳ比２．４）、Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比０．８５）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異及びＷ５４８Ｌ変異は、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＲ１７２Ｓ変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
２点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのはＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質であり（１００μＭで１６％の阻害、ＲＳ比は＞７７００）、続いてＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質であった（ＲＳ比７６０）。表９に示したｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍによる阻害活性データとは異なり、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎの場合、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合い（ＲＳ比４２０）はＰ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質よりも高い度合いで抵抗性を示しており、単独ではサイレント変異であるＲ１７２Ｓ変異がＰ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いを高めることが判明した。また、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も強い抵抗性を与えた（５００μＭで３０％の阻害、ＲＳ比は＞３８００）。
Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質について、予想ＲＳ比と実際のＲＳ比と比較したところ、ともに実際のＲＳ比は予想ＲＳ比よりも有意に大きくなっていた。このことから、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質は、ｃｈｌｏｒｓｕｒｆｕｒｏｎに対して、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
次に、Ｉｍｚａｑｕｉｎによる阻害活性データ（表１３）からは次のことが明らかとなった。１点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｉｍａｚａｑｕｉｎに対して最も強い抵抗性を示した（１００μＭで１４％、ＲＳ比は＞４５）。Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も抵抗性を示した（ＲＳ比４１）が、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質はほとんど抵抗性を示さなかった（ＲＳ比１．５）。Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比０．９８）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＷ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異は、ｉｍａｚａｑｕｉｎに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異及びＲ１７２Ｓ変異は、ｉｍａｚａｑｕｉｎに対してサイレント変異であることが明らかとなった。
２点変異型遺伝子で最も強い抵抗性を与えたのはＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質であり（１００μＭで１３％の阻害、ＲＳ比は＞４５）、続いてＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質であった（ＲＳ比３２）。Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いはＰ１７１Ｈの１点変異遺伝子とほぼ同じであった。また、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も強い抵抗性を与えた（１００μＭで１５％の阻害、ＲＳ比は＞４５）。
これら２点変異型ＡＬＳタンパク質及び３点変異型ＡＬＳタンパク質について、予想ＲＳ比と実際のＲＳ比とを比較した結果、Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質のＲＳ比は予想ＲＳ比よりも有意に大きくなっていた（実際のＲＳ比と予想ＲＳ比の比が明瞭に１よりも大きくなる）。このことから、Ｐ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質は、ｉｍａｚａｑｕｉｎに対して、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、様々な除草剤に対して優れた抵抗性を示すアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質、該遺伝子を有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該遺伝子を有する植物、該植物の育成方法及び、該遺伝子を選択マーカーとして使用する形質転換細胞を選択する方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号９〜３４はプライマーである。
配列番号２９における第１５番目のｎはａ，ｃ，ｇ又はｔを表している。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１Ａは、変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列及び野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
図１Ｂは、図１Ａの続きであり、変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列及び野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
図２Ａは、変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列及び野生型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図２Ｂは、図２Ａの続きであり、変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列及び野生型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図２Ｃは、図２Ｂの続きであり、変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列及び野生型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図２Ｄは、図２Ｃの続きであり、変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列及び野生型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図３は、Ｒｂ系統のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図４は、Ｓｒ系統のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図５は、Ｇａ系統のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図６は、Ｖｇ系統のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図７は、野性株のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図８は、野性株のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図９は、Ｒｂ系統のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１０は、Ｓｒ系統のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１１は、Ｇａ系統のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１２は、Ｖｇ系統のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１３は、抵抗性変異株のＡＬＳタンパク質の分離を目的とした陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおけるフラクション番号とＯＤ  ５２５ｎｍの吸光度との関係を示す特性図である。
図１４は、野生株のＡＬＳタンパク質の分離を目的とした陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおけるフラクション番号とＯＤ  ５２５ｎｍの吸光度との関係を示す特性図である。
図１５は、野生型ＡＬＳタンパク質及び変異型ＡＬＳタンパク質におけるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図１６は、野生型ＡＬＳタンパク質及び変異型ＡＬＳタンパク質におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１７は、野生型ＡＬＳタンパク質及び変異型ＡＬＳタンパク質におけるｉｍａｚａｑｕｉｎに対する感受性を示す特性図である。
図１８Ａは、日本晴ＥＳＴの塩基配列とトウモロコシＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図１８Ｂは、図１８Ａの続きであり、日本晴ＥＳＴの塩基配列とトウモロコシＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図１９Ａは、Ｓｒ系統由来の完全長ｃＤＮＡの塩基配列と野性型ｃＤＮＡ  １の塩基配列を比較した図である。
図１９Ｂは、図１９Ａの続きであり、Ｓｒ系統由来の完全長ｃＤＮＡの塩基配列と野性型ｃＤＮＡ  １の塩基配列を比較した図である。
図１９Ｃは、図１９Ｂの続きであり、Ｓｒ系統由来の完全長ｃＤＮＡの塩基配列と野性型ｃＤＮＡ  １の塩基配列を比較した図である。
図２０は、Ｇ１６４３Ｔ（Ｗ５４８Ｌ）変異及びＧ１８８０Ｔ（Ｓ６２７Ｉ）変異をそれぞれ単独で有するＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製方法を示した図である。矢印はプライマー、アスタリスクは変異点を表す。
図２１は、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異ＤＮＡ断片及びＣ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異ＤＮＡ断片作製方法を示した図である。矢印はプライマー、アスタリスクは変異点を表す。
図２２は、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）変異及びＣ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）変異をそれぞれ単独で有するＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製方法を示した図である。アスタリスクは変異点を表す。
図２３は、Ｃ５１２Ａ（Ｐ１７１Ｈ）／Ｃ５１４Ａ（Ｒ１７２Ｓ）を有するＤＮＡ断片の作製方法を示した図である。矢印はプライマー、アスタリスクは変異点を表す。
図２４は、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡ及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製方法を示した図である。アスタリスクは変異点を表す。
図２５は、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳ  ｃＤＮＡの合成とこれを保持するｐＧＥＸ  ２Ｔの作製方法を示した図である。アスタリスクは変異点を表す。
図２６は、１点変異型ＡＬＳ遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を野性型ＡＬＳタンパク質と比較した図である。
図２７は、２点変異型及び３点変異型ＡＬＳ遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を野性型と比較した図である。
【図１Ａ】
2003083118.tif 000075
【図１Ｂ】
2003083118.tif 000076
【図２Ａ】
2003083118.tif 000077
【図２Ｂ】
2003083118.tif 000078
【図２Ｃ】
2003083118.tif 000079
【図２Ｄ】
2003083118.tif 000080
【図３】
2003083118.tif 000081
【図４】
2003083118.tif 000082
【図５】
2003083118.tif 000083
【図６】
2003083118.tif 000084
【図７】
2003083118.tif 000085
【図８】
2003083118.tif 000086
【図９】
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【図１０】
2003083118.tif 000088
【図１１】
2003083118.tif 000089
【図１２】
2003083118.tif 000090
【図１３】
2003083118.tif 000091
【図１４】
2003083118.tif 000092
【図１５】
2003083118.tif 000093
【図１６】
2003083118.tif 000094
【図１７】
2003083118.tif 000095
【図１８Ａ】
2003083118.tif 000096
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2003083118.tif 000099
【図１９Ｃ】
2003083118.tif 000100
【図２０】
2003083118.tif 000101
【図２１】
2003083118.tif 000102
【図２２】
2003083118.tif 000103
【図２３】
2003083118.tif 000104
【図２４】
2003083118.tif 000105
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月23日(2003.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２，４，６および８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項５】
請求項１記載の遺伝子を有し、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性に対する抵抗性を有する植物。
【請求項６】
請求項５記載の植物を、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤からなる群から選ばれる少なくとも１以上の除草剤の存在下で育成することを特徴とする植物育成方法。
【請求項７】
請求項１記載の遺伝子を選択マーカーとして使用し、該遺伝子を有する形質転換細胞を選択する方法。
【請求項８】
野生型イネ由来アセト乳酸シンターゼにおける６２７番目のセリンに相当するセリンをイソロイシンに変異させたアミノ酸配列を有し、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性を示すタンパク質をコードする遺伝子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
パク質のＲＳ比は予想ＲＳ比よりも有意に大きくなっていた（実際のＲＳ比と予想ＲＳ比の比が１よも明確に大きくなる）。このことから、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
次に、ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃによる阻害活性（表１１）からは次のことが明らかになった。１点変異型遺伝子（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）がコードする変異型ＡＬＳタンパク質の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃに対して最も強い抵抗性を示した（ＲＳ比４５００）。Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も強い抵抗性を与えたが（ＲＳ比２８００）、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いは低く（ＲＳ比５）、Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比１．２）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異、Ｗ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異は、ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＲ１７２Ｓ変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
２点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのは、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質であり（１００μＭで１１％の阻害、ＲＳ比は＞１３０００）、続いてＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質であった（１００μＭで２１％の阻害、ＲＳ比は＞１３０００）。これらＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質について、予想ＲＳ比と実際のＲＳ比とを比較した結果、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すかどうかを明確にすることはできなかった。
次に、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎによる阻害活性（表１２）からは次のことが明らかになった。１点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｃｈｌｏｒｓｕｒｆｕｒｏｎに対して最も強い抵抗性を示した（ＲＳ比７６０）。Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質も比較的強い抵抗性を示した（ＲＳ比８５）が、Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いは低く（ＲＳ比２．４）、Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比０．８５）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異及びＷ５４８Ｌ変異は、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であるこ


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
とが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＲ１７２Ｓ変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
２点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのはＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質であり（１００μＭで１６％の阻害、ＲＳ比は＞７７００）、続いてＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質であった（ＲＳ比７６０）。表９に示したｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍによる阻害活性データとは異なり、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎの場合、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合い（ＲＳ比４２０）はＰ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質よりも高い度合いで抵抗性を示しており、単独ではサイレント変異であるＲ１７２Ｓ変異がＰ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合いを高めることが判明した。また、Ｐ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も強い抵抗性を与えた（５００μＭで３０％の阻害、ＲＳ比は＞３８０００）。
Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質について、予想ＲＳ比と実際のＲＳ比と比較したところ、ともに実際のＲＳ比は予想ＲＳ比よりも有意に大きくなっていた。このことから、Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質及びＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質は、ｃｈｌｏｒｓｕｒｆｕｒｏｎに対して、１点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
次に、Ｉｍｚａｑｕｉｎによる阻害活性データ（表１３）からは次のことが明らかとなった。１点変異型遺伝子がコードする変異型ＡＬＳタンパク質（Ｐ１７１Ｈ、Ｒ１７２Ｓ、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）の中では、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質がｉｍａｚａｑｕｉｎに対して最も強い抵抗性を示した（１００μＭで１６％、ＲＳ比は＞４５）。Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質も抵抗性を示した（ＲＳ比６．８）が、Ｐ１７１Ｈ変異型ＡＬＳタンパク質はほとんど抵抗性を示さなかった（ＲＳ比１．５）。Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった（ＲＳ比１．０）。このことから、ＡＬＳタンパク質におけるＷ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異は、ｉｍａｚａｑｕｉｎに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ＡＬＳタンパク質におけるＰ１７１Ｈ変異及びＲ１７２Ｓ変異は、ｉｍａｚａｑｕｉｎに対してサイレント変異であることが明らかとなった。
２点変異型遺伝子で最も強い抵抗性を与えたのはＰ１７１Ｈ／Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳタンパク質であり（１００μＭで１３％の阻害、ＲＳ比は＞４５）、続いてＰ１７１Ｈ／Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳタンパク質であった（ＲＳ比３２）。Ｐ１７１Ｈ／Ｒ１７２Ｓ変異型ＡＬＳタンパク質の抵抗性の度合い




【国際調査報告】
2003083118.tif 000109
2003083118.tif 000110
2003083118.tif 000111
2003083118.tif 000112