(57)【要約】哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つ新規タンパク質およびその遺伝子を提供する。本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。（ａ）配列表の配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つタンパク質。（ｃ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質を持つタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載されるタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つタンパク質。
（ｃ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質を持つタンパク質。
【請求項２】
ｃＤＮＡである請求の範囲１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、１８３〜４１８７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求の範囲２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列のうち、１７５〜４１７９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求の範囲２記載の遺伝子。
【請求項５】
ゲノムＤＮＡである請求の範囲１記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号５〜３５に示される各塩基配列を有する請求の範囲５記載の遺伝子。
【請求項７】
配列番号３６〜４８に連続的に示される一連の塩基配列を有する請求の範囲５記載の遺伝子。
【請求項８】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項９】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質を持つタンパク質。
【請求項１１】
哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合し、当該タンパク質の酵素活性を高める性質を持つ請求の範囲８〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
真核細胞の翻訳開始因子結合タンパク質（ｅＩＦ−４ＥＢＰ）に結合する性質を持つ請求の範囲８〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
ｐ７０Ｓ６キナーゼに結合する性質を持つ請求の範囲８〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求の範囲８〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質と、（１）哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、（２）真核細胞の翻訳開始因子結合タンパク質（ｅＩＦ−４ＥＢＰ）、（３）ｐ７０Ｓ６キナーゼ、または（４）ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質との結合を阻害する結合阻害剤。
【請求項１５】
請求の範囲１４に記載の結合阻害剤をスクリーニングする方法であって、下記▲１▼〜▲４▼のいずれかの物質を用いることを特徴とするスクリーニング方法。
▲１▼  請求の範囲８〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質
▲２▼  上記▲１▼のタンパク質の部分タンパク質であって、その全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくとも１〜９０４番目の配列を含む部分タンパク質
▲３▼  上記▲１▼のタンパク質の部分タンパク質であって、その全長タンパク質のアミノ酸配列中、ｍＴＯＲまたは、ｅＩＦ−４ＥＢＰとの結合領域を含む部分タンパク質
▲４▼  上記▲１▼のタンパク質または上記▲２▼もしくは▲３▼の部分タンパク質の改変体
【請求項１６】
請求の範囲８〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質の変異体であって、下記の（イ）〜（ホ）のいずれかの性質に異常を持つ変異タンパク質。
（イ）哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質
（ロ）哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の酵素活性を高める性質
（ハ）真核細胞の翻訳開始因子結合タンパク質（ｅＩＦ−４ＥＢＰ）に結合する性質
（ニ）ｐ７０Ｓ６キナーゼに結合する性質
（ホ）ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質
【請求項１７】
請求の範囲１６記載の変異タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１８】
請求の範囲８〜１３、１６のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１９】
請求の範囲１〜７、１７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２０】
請求の範囲１〜７、１７のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項２１】
請求の範囲１〜７、１７のいずれか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ：以下、「ｍＴＯＲ」という）に結合する性質を持つ新規タンパク質およびその遺伝子に関するものである。
背景技術
哺乳動物において、免疫抑制剤として知られる有機化合物ラパマイシンの細胞内標的タンパク質ｍＴＯＲは、約２５００のアミノ酸からなる２９０ｋＤａ（分子量２９万）のセリン−スレオニン蛋白質リン酸化酵素であり、ＡＴＭキナーゼファミリーの一員として知られている。ｍＴＯＲは、ｍＲＮＡの転写や翻訳・細胞周期の調節・蛋白の分解などに関わっている多様な分子を制御しながら細胞の成長（細胞のサイズ）を調節していると考えられているが、未だその全貌は明らかでない。
近年、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系と、細胞増殖因子からのシグナル伝達系との関係が明らかにされつつある。これを図１を参照して簡単に説明すると、まず、細胞増殖因子の１つであるインスリンは、次のような経路によりタンパク質合成に関与していると考えられる。インスリンがインスリンレセプターに結合すると、ＰＩ−３キナーゼが活性化される。ＰＩ−３キナーゼが活性化されると、順にＰＤＫ１、ｐ７０Ｓ６キナーゼが活性化され、最終的にタンパク質合成が促進される。
一方、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系については、ラパマイシンの発見からこれまでの研究の経緯を含め、以下詳しく説明する。
１９７５年に、南太平洋に浮かぶイスター島の土壌から得られた細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓより新規の有機化合物が分離され、ラパマイシンと名付けられた。数年後、このラパマイシンに免疫抑制作用があることが発見され、その作用機序の研究が始まった。１９９０年代にはいって、その作用機序が徐々に明らかとなってきた。以下、その研究成果を列挙する。
１）  ラパマイシンは細胞内に存在する１２ｋＤａの小さな蛋白質ＦＫ−５０６結合蛋白−１２（ＦＫＢＰ−１２）と結合し、複合体を形成することが明らかとなった。
２）  出芽酵母を使った研究により、ラパマイシン／ＦＫＢＰ−１２複合体の細胞内標的蛋白質が、ＴＯＲ（Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）であることが明らかにされた。出芽酵母のＴＯＲは２つ存在し、ＴＯＲ１・ＴＯＲ２と命名された。どちらも、３００ｋＤａからなる巨大蛋白質であり、カルボキシル末端にキナーゼドメインを有していた。
３）  このキナーゼドメインは、小脳失調性毛細血管拡張症（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌｅａｇｅｌｅｔａｓｉａ）の原因遺伝子であるＡＴＭ遺伝子産物に相同性を有しており、ＴＯＲは、ＡＴＭ遺伝子産物ファミリーの一員に分類されている。このファミリー群は細胞周期チェックポイント制御にかかわるキナーゼと考えられている。
４）  続いて、ＴＯＲの哺乳動物ホモログの遺伝子がクローニングされ、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）と命名された。
５）  ｍＲＮＡの翻訳に関わる２つのシグナル伝達分子ｐ７０Ｓ６キナーゼおよびｅＩＦ−４ＥＢＰについて、細胞をラパマイシン処理することにより、ｐ７０Ｓ６キナーゼは完全に不活性化され、ｅＩＦ−４ＥＢＰは脱リン酸化される。ｍＴＯＲが、これらｐ７０Ｓ６キナーゼおよびｅＩＦ−４ＥＢＰの上流のシグナル制御分子であることが証明された（図１参照）。
６）  上記ｅＩＦ−４ＥＢＰとは、ｅＩＦ−４Ｅ結合タンパク質（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のことであり、以下、「ｅＩＦ４ＥＢＰ１」または単に「４ＥＢＰ１」という場合がある。ｅＩＦ−４ＥＢＰは、ｐ７０Ｓ６キナーゼと同様に、ｍＲＮＡの翻訳に関わる分子である。殆どの真核生物のｍＲＮＡは、７ＭｅＧＴＰグループすなわちＣａｐ構造を５’末端に持っている。そのＣａｐ構造に結合するタンパク質がｅＩＦ−４Ｅである。Ｃａｐ構造に結合したｅＩＦ−４Ｅには、スカフォールドタンパク質であるｅＩＦ−４Ｇが結合し、ｍＲＮＡの翻訳を促進する。上記ｅＩＦ−４ＥＢＰは、ｅＩＦ−４Ｇと競合的にｅＩＦ−４Ｅに結合することにより、ｅＩＦ−４ＧがＣａｐ構造へ結合するのを制御している。
上記ｅＩＦ−４ＥＢＰのｅＩＦ−４Ｅへの結合能力は、ｅＩＦ−４ＥＢＰの複数のリン酸化により抑制される。このリン酸化部位は、全てセリン−プロリンあるいは、スレオニン−プロリンのモチーフをもっている。この部位のリン酸化は、細胞成長因子の添加や細胞環境中のアミノ酸が豊富にあると促進される。このリン酸化は、細胞抽出液より免疫沈降されたｍＴＯＲによって促進される。よって、このリン酸化は、ｍＴＯＲそのもの、あるいは、ｍＴＯＲに結合した未同定の蛋白質リン酸化酵素によって行われていると考えられる。
このように、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系については、１）ｍＴＯＲが哺乳動物において細胞環境中のアミノ酸バランスのセンサーとして働くこと、２）ｍＲＮＡの翻訳に関わる上記ｐ７０Ｓ６キナーゼおよび上記ｅＩＦ−４ＥＢＰといった分子群の上流に存在し、そのリン酸化状態を調節することによって各分子の活性を制御していること、３）細胞増殖因子によるこれらｍＲＮＡの翻訳に関わる分子群の活性化にとって、ｍＴＯＲからのｉｎｐｕｔがプライミングシグナルとして必須であること、４）つまり、ｍＴＯＲはｐ７０Ｓ６キナーゼやｅＩＦ−４ＥＢＰのリン酸化状態を調節することによってタンパク質合成を制御し、細胞の成長（細胞のサイズ）を調節していること、などが分かってきた。
以上のように、ｍＴＯＲ、およびｍＴＯＲを介したシグナル伝達系は、タンパク質合成・ｍＲＮＡの転写や翻訳・細胞周期の調節・タンパク質の分解・細胞の成長（細胞のサイズ）の調節、といった多岐にわたる生理機能に関与し、ひいては、これらの生理機能に関わる種々の病気にも深く関与していると考えられている。したがって、もし上記ｍＴＯＲと結合するタンパク質の存在が明らかにされれば、このタンパク質は、上記ｍＴＯＲの働きを調節する候補タンパク質として、このような病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善など医療分野・産業分野に重要な貢献をもたらすものと期待される。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つ新規タンパク質およびその遺伝子、さらにその利用方法を提供することにある。
発明の開示
本願発明者は、上記の課題に鑑み、ｍＴＯＲに結合する分子の存在について鋭意検討した。その結果、ｍＴＯＲを免疫沈降する際、界面活性剤を含む緩衝液で洗浄すると、ｍＴＯＲ免疫沈降物によるｅＩＦ−４ＥＢＰのリン酸化は大きく抑制されることが分かった。このようなリン酸化抑制が起きるのは、ｍＴＯＲ免疫沈降物中に存在するｅＩＦ−４ＥＢＰをリン酸化するのに重要な因子を、界面活性剤が解離するからである、と本願発明者は考えた。
本願発明者は、質量分析法や５’−ＲＡＣＥ法等を用いて更に研究・解析を進めた結果、界面活性剤によってｍＴＯＲとの結合が阻害される約１５０ｋＤａの新規タンパク質を精製・同定するとともに、その全長遺伝子配列を決定し、さらに、この新規タンパク質が、ｍＴＯＲと結合し、ｍＴＯＲによるｅＩＦ−４ＥＢＰのリン酸化に極めて重要な役割を果たす分子であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
第一に、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つタンパク質。
（ｃ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質を持つタンパク質。
上記（ａ）のタンパク質は、後述のように、本願発明者が精製・同定し、その全長アミノ酸配列を明らかにした新規タンパク質ｒａｐｔｏｒであり、配列番号２にはヒト由来のアミノ酸配列を、配列番号４にはマウス由来のアミノ酸配列をそれぞれ示す。このｒａｐｔｏｒは、ｍＴＯＲと結合し、ｍＴＯＲの酵素活性（キナーゼ活性）を調節している分子であり、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系において極めて重要な役割を果たす分子と考えられる。それゆえ、本発明に係る遺伝子およびタンパク質は、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善などに広く有効利用できる可能性がある。
さらに、本願発明者は、（１）上記ｒａｐｔｏｒは、ｅＩＦ−４ＥＢＰだけでなく、ｐ７０Ｓ６キナーゼとも結合すること、（２）これらｍＴＯＲの基質タンパク質であるｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼには、ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）といわれる５アミノ酸からなる保存された配列が存在しており、そのＴＯＳモチーフがｍＴＯＲのシグナル伝達に必須であること、（３）ｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼのｒａｐｔｏｒへの結合と、ｍＴＯＲによるこれら基質タンパク質のリン酸化とに、上記ＴＯＳモチーフが必須であること、を明らかにした。
すなわち、ｒａｐｔｏｒの機能は、ｍＴＯＲおよびその基質タンパク質であるｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼと結合し、リン酸化反応の場を提供するスカフォールドタンパク質であると考えられる。
ＴＯＳモチーフのＴＯＳは、ＴＯＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇの略である。つまり、ＴＯＳモチーフとは、ＴＯＲシグナリングモチーフのことであり、ｍＴＯＲから、下流のｐ７０Ｓ６キナーゼやｅＩＦ４ＥＢＰにシグナルが伝達するのに必須の配列（５アミノ酸からなる配列）である。そしてＴＯＳモチーフは、それら下流の分子上に同定された。すなわち、ＴＯＳモチーフは、ｐ７０Ｓ６キナーゼでは、アミノ末端近くに存在するＦＤＩＤＬ（ヒト）という配列である。また、ＴＯＳモチーフは、ｅＩＦ４ＥＢＰでは、カルボキシル末端に存在するＦＥＭＤＩ（ヒト）という配列である。
なお、上記「遺伝子」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを含む意味であり、本発明に係る遺伝子としては、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、１８３〜４１８７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するヒト由来のｃＤＮＡ、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、１７５〜４１７９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するマウス由来のｃＤＮＡ、▲３▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡ、▲４▼配列番号５〜３５に示される各塩基配列（各エキソン配列）を有するヒト由来のゲノムＤＮＡ、▲５▼配列番号３６〜４８に連続的に示される一連の塩基配列を有するヒト由来のゲノムＤＮＡ、が例として挙げられる。
また、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
第二に、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質、即ち、（ａ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つタンパク質、又は（ｃ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質を持つタンパク質、である。
ここで、上記「タンパク質」は、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨＡやＦＬＡＧ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
また、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意義する。このように、上記（ｂ）（ｃ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
本発明に係るタンパク質は、さらに、下記Ａ）〜Ｄ）の性質・特徴によって特定されるものであってもよい。
Ａ）哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合し、当該タンパク質の酵素活性を高める性質を持つ。
Ｂ）真核細胞の翻訳開始因子結合タンパク質（ｅＩＦ−４ＥＢＰ）に結合する性質を持つ。
Ｃ）ｐ７０Ｓ６キナーゼに結合する性質を持つ。
Ｄ）ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質を持つ。
また、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質の変異体であって、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質、当該タンパク質の酵素活性を高める性質、真核細胞の翻訳開始因子結合タンパク質（ｅＩＦ−４ＥＢＰ）に結合する性質、ｐ７０Ｓ６キナーゼに結合する性質、またはＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）を有するタンパク質に結合する性質、のいずれかに異常を持つ変異タンパク質であってもよい。このような変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、このような変異タンパク質をコードする遺伝子も含まれ、このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
第三に、本発明に係る結合阻害剤は、上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質と、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）との結合を阻害する結合阻害剤であり、このような結合阻害剤としては、後述のように、ＮＰ−４０やＣＨＡＰＳ等の界面活性剤のほか、本発明のスクリーニング方法により得られた結合阻害剤が例として挙げられる。このような結合阻害剤も、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善などに広く有効利用できる可能性がある。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明に係るタンパク質ｒａｐｔｏｒ、及びその遺伝子の配列、構造等
本願発明者は、前述のように、質量分析法や５’−ＲＡＣＥ法等を用いて、ｍＴＯＲに結合する約１５０ｋＤａの新規タンパク質のアミノ酸配列を決定するとともに、当該タンパク質をコードする遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を決定することに成功し、この新規タンパク質を当初「ｐ１５０ＴＯＲＡＰ」と命名した。ＴＯＲＡＰとは、ＴＯＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎの略である。さらに、この新規タンパク質（ｍＴＯＲ結合タンパク質）について機能解析を進めた結果、ｍＴＯＲの活性を調節する作用を有することから、最終的に、この新規タンパク質の名前を「ｒａｐｔｏｒ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ）」と命名した。以下では、説明の便宜上、本発明の新規タンパク質を、単に「ｐ１５０」または「ｒａｐｔｏｒ」と表記する。
機能解析の結果、上記タンパク質ｒａｐｔｏｒは、ｍＴＯＲとだけではなく、ｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼとも結合することが確認された。すなわち、ｒａｐｔｏｒの機能は、ｍＴＯＲおよびその基質タンパク質であるｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼと結合し、リン酸化反応の場を提供するスカフォールドタンパク質であると考えられる。
上記タンパク質ｒａｐｔｏｒのアミノ酸配列が、配列番号２および４に示される。配列番号２にはヒト由来のｒａｐｔｏｒのアミノ酸配列を、配列番号４にはマウス由来のｒａｐｔｏｒのアミノ酸配列をそれぞれ示す。
また、上記ｒａｐｔｏｒの全長ｃＤＮＡ配列の塩基配列が、配列番号１および３に示される。配列番号１にはヒト由来のｒａｐｔｏｒのｃＤＮＡ配列を、配列番号３にはマウス由来のｒａｐｔｏｒのｃＤＮＡ配列をそれぞれ示す。
なお、配列番号１の塩基配列中、１８３〜４１８７番目の塩基配列が、上記ヒト由来のタンパク質ｒａｐｔｏｒをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に相当する。また、配列番号３の塩基配列中、１７５〜４１７９番目の塩基配列が、上記マウス由来のタンパク質ｒａｐｔｏｒをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に相当する。配列番号１および３に示される各ｃＤＮＡ配列は、このＯＲＦ領域のほか５’側及び３’側にそれぞれ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むものであった。
上記ＯＲＦ領域は、ヒト由来のものもマウス由来のものも４００５塩基からなり、この遺伝子より推定されるアミノ酸配列は、１３３５残基であった。
上記の結果に基づいて、データベース検索をさらに行った。その結果、ショウジョウバエ、線虫、出芽酵母、分裂酵母、シロイヌナズナと、種を超えて上記ｒａｐｔｏｒのホモログが存在することが判明した。図２〜図９は、これらホモログ間の相同性を示すアライメントデータであり、図中、１はヒト、２はショウジョウバエ、３は線虫、４は出芽酵母、５は分裂酵母、６はシロイヌナズナの配列を示すものである。また図中、黒色の領域は、３つの種以上で保存されたアミノ酸を示しており、灰色の領域は、同じ性質を持つ（ｓｉｍｉｌａｒな）アミノ酸を示している。
上記各ホモログのアミノ酸配列を比較すると、特にアミノ酸残基４９番から６６７番までの領域はショウジョウバエ、線虫、酵母、シロイヌナズナと種を超えても非常によく配列が保存されていることが判明した。この結果は、アミノ酸残基４９番から６６７番までの領域が、種を超えてｒａｐｔｏｒの機能にとって重要であることを示唆する。
さらに、解析の結果、上記ｒａｐｔｏｒのアミノ酸配列の１０１５番目からＣ末端にかけて、ＷＤ−４０  ｒｅｐｅａｔという構造を７回くり返す領域が存在する、ということが判明した。ＷＤ−４０  ｒｅｐｅａｔ構造は、多様なシグナル伝達分子と相互作用するための足場を形成する構造であると考えられている。また、これまでの多くのシグナル伝達分子に、ＷＤ−４０  ｒｅｐｅａｔ構造を発見することができる。これらの事実からも、上記ｒａｐｔｏｒは、多彩なシグナルを伝達する、足場タンパクとしての機能を担っていると考えられる。
図１０〜図１２は、ヒト由来のｒａｐｔｏｒとマウス由来のｒａｐｔｏｒとのアミノ酸配列の相同性を調べた結果を示す。同図に示すように、ヒト・マウス間では、９６．５５％という高い相同性が認められた。
また、上記ヒト由来のｒａｐｔｏｒのｃＤＮＡ配列を用いて、ヒトゲノムドラフトシークエンスのデータベース検索を行った。その結果、ヒト由来のｒａｐｔｏｒの全ゲノム配列は、１７番染色体上に存在することが判明した。
上記検索により得られたデータを整理検討し解析した結果、予想されるエキソン数は３４と考えられる。しかし、エキソン１を同定することはできなかった。また、ゲノムの全長をつなげることは現時点ではできなかったが、総塩基数は少なくとも２９２２５８塩基と考えられた。
上記解析結果に基づき、図１３には、エキソン−イントロン構造の全体像を示す。図１４においては、エキソン２６からエキソン３４までの図を示した。図１３・１４では、イントロンが連続していない部分は、Ｘを挿入した。
配列番号５〜３５には、予想されるエキソン数３４のうち、エキソン２〜６、エキソン８〜１３、およびエキソン１５〜３４の各塩基配列（各エキソン配列）が示される。配列番号４９にはエキソン７の塩基配列を、配列番号５０にはエキソン１４の塩基配列を示す。また、配列番号３６〜４８に連続的に示される一連の塩基配列は、ヒト由来のｒａｐｔｏｒの全長ゲノムＤＮＡ配列である。図３３には、予想される各エキソンについて、対応するｃＤＮＡ配列と、塩基数と、対応する配列番号と、エキソンを含んでいる配列とを一覧に示した。
図３３の表における「エキソン」の項目には、エキソンの名前（エキソン１〜３４）を記載している。「ｃＤＮＡ配列」の項目には、「エキソン」の項目に示した各エキソンが、配列番号１に示すｃＤＮＡ配列の何番目に対応しているかを示している。例えば、エキソン２について「ｃＤＮＡ配列」の項目には「３４５−４４７」と記載されている。これは、エキソン２が、ｃＤＮＡ配列における３４５番目の塩基から４４７番目の塩基に対応していることを示している。
図３３の表における「塩基数（ｂｐ）」の項目には、各エキソンの塩基数を、「エキソンの配列番号」の項目には、各エキソンが示されている配列番号を示している。
図３３の表における「エキソンを含んでいる配列」の項目において「配列番号」の項目には、エキソンを含んでいる塩基配列（ヒトのゲノムＤＮＡ配列）の配列番号を示している。そして、その配列中、エキソンの開始位置は「エキソン開始位置」の項目に、エキソンの終了位置は「エキソン終了位置」の項目にそれぞれ示される。
例えば、エキソン２は、配列番号３６の配列に含まれ、その配列中、１２１４１番目の塩基から１２２４３番目の塩基に対応している。
なお、図３３において、エキソン７については、「エキソンを含んでいる配列」の項目の「エキソン開始位置」は９４１と、「エキソン終了位置」は１０００と記載されている。これら位置は、図４２に示す塩基配列を先頭から数えた場合におけるエキソンの位置を示している。図４２は、図１３において、エキソン７（図中「Ｅ７」）を２つのＸ印で挟んでいる領域を、塩基配列で示したものである。
同様に、図３３において、エキソン１４については、「エキソン開始位置」は８０６と、「エキソン終了位置」は８８０と記載されている。これら位置は、図４３に示す塩基配列を先頭から数えた場合におけるエキソンの位置を示している。図４３は、図１３において、エキソン１４（図中  「Ｅ１４」）を２つのＸ印で挟んでいる領域を、塩基配列で示したものである。
（２）本発明に係るタンパク質ｒａｐｔｏｒ、及びその遺伝子の有用性
上記ｍＴＯＲは、細胞環境中の栄養状態、特にアミノ酸バランスを感知する分子であり、種々の細胞機能を制御しているが、最終的に細胞の成長、言い換えれば、細胞のサイズを調節する中心分子として注目を集めている。かつ、ｍＴＯＲが多様な疾患と関連がある証拠が徐々に蓄積されつつある。その例を挙げれば、以下のとおりである。
ａ）糖尿病との関連：  ｍＴＯＲの下流分子であるｐ７０Ｓ６キナーゼのホモノックアウトにより耐糖能異常が発生する。発展途上国でみられる低栄養性の糖尿病にアミノ酸−ｍＴＯＲ−ｐ７０Ｓ６キナーゼのシグナル伝達系が関与している可能性が考えられる。
ｂ）脂肪細胞との関連：  ｍＴＯＲの下流分子である４ＥＢＰ１のノックアウトにより、白色脂肪細胞の分化が抑制され、褐色脂肪細胞の分化が促進し、エネルギー代謝が亢進していることが明らかになっている。これは、ｍＴＯＲ−ｒａｐｔｏｒと“肥満あるいはやせ”との関係を示唆する実験結果である。
ｃ）狭心症との関連：  狭心症は、心臓の栄養血管である冠動脈に狭窄が生じ、心臓が虚血状態に陥り、悪化すると心筋梗塞を引き起こす疾患である。この狭心症の治療にａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙという狭窄化した冠動脈を物理的に押し広げる治療法がある。さらに押し広げた部分にステントという金属性の細い管をいれ、再狭窄を遅らせるという治療法が開発されている。しかしながら、このステントを使った治療においても再狭窄率は依然として高く、この分野の大きな問題になっている。しかし、最近このステントにラパマイシンを染み込ませておくと、再狭窄率が大きく低下するという報告がある。
ｄ）ラパマイシンそのものあるいはその誘導体に抗癌作用があると報告されており、ラパマイシンの骨格を利用した抗癌剤の開発と臨床試験が進みつつある。
ｅ）最近、ランダムにゲノムにｍｕｔａｔｉｏｎを導入し、興味あるｐｈｅｎｏｔｙｐｅが出現した動物を解析し、その原因遺伝子を探るという研究手法がある。この方法により、「ｆｌａｔ  ｔｏｐ」と呼ばれる脳の前半が欠失したマウスが生まれ、この原因遺伝子がｍＴＯＲであることが判明した。また、妊娠初期のマウスにラパマイシンを投与しつづけると、同じようなｐｈｅｎｏｔｙｐｅを持った子供が生まれるという。このことから、ｍＴＯＲが脳の形成に関わっている可能性が指摘されている。
以上の状況から、ｍＴＯＲの結合分子であり、４ＥＢＰ１のリン酸化に重要な役割を果たすタンパク質ｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）、およびその遺伝子の有用性としては、以下の有用性が挙げられる。
イ）ｍＴＯＲとｒａｐｔｏｒとの結合、あるいはｒａｐｔｏｒと４ＥＢＰ１との結合を阻害する化合物（阻害剤）のスクリーニング等に利用できる。このような阻害剤が開発されれば、
▲１▼  肥満の治療薬となる可能性があり、肥満によって引き起こされる糖尿病・高血圧・抗脂血症・心臓病などの治療につながる可能性をもっている。
▲２▼  狭心症のａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙによる治療後の再狭窄の治療薬になる可能性がある。
▲３▼  抗癌剤としての臨床応用の可能性がある。
ロ）ｒａｐｔｏｒのゲノム配列上に存在する可能性のあるｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）を活用すれば、下記診断への応用が期待できる。
▲１▼  肥満ややせについての各個人の遺伝学的診断への応用
▲２▼  肥満ややせに対する薬物の感受性の臨床診断への応用
▲３▼  狭心症のａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙによる治療後の再狭窄の治療薬に対する感受性の臨床診断への応用
▲４▼  抗癌剤に対する感受性の臨床診断への応用
ハ）ｒａｐｔｏｒのｍＲＮＡの発現量の検討によって、上記ロ）で述べたのと同様に、各診断への応用が期待できる。
ニ）ｒａｐｔｏｒの遺伝子を用いた遺伝子治療により、上記イ）で述べた各疾患の治療に利用できる可能性がある。
また、後述の実施例において詳述するように、上記ｒａｐｔｏｒは、ｍＴＯＲと結合し、ｍＴＯＲの酵素活性（キナーゼ活性）を調節している分子であり、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系において極めて重要な役割を果たす分子と考えられる。それゆえ、本発明に係る遺伝子およびタンパク質は、上記ｍＴＯＲを介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善などに広く有効利用できる可能性がある。
本発明の新規タンパク質（ｒａｐｔｏｒ）は、ｍＴＯＲとだけではなく、その基質タンパク質であるｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼと結合し、リン酸化反応の場を提供するスカフォールドタンパク質であると考えられる（後述の実施例参照）。
ｍＴＯＲの基質タンパク質であるｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼには、ＴＯＳモチーフ（ｍＴＯＲシグナリングモチーフ）といわれる５アミノ酸からなる保存された配列が存在していることと、そのＴＯＳモチーフは、ｍＴＯＲのシグナル伝達に必須であることが知られていた。
本願発明者は、ｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼのｒａｐｔｏｒへの結合と、ｍＴＯＲによるこれら基質タンパク質のリン酸化とに、上記ＴＯＳモチーフが必須であることを明らかにした。この知見は、ＴＯＳモチーフをもつ他のタンパク質は、ｒａｐｔｏｒと結合し、ｍＴＯＲの基質になる可能性があることを示している。さらに、ｒａｐｔｏｒとＴＯＳモチーフの結合を阻害する物質の探索が、ｍＴＯＲシグナルを抑制し、免疫抑制効果・抗癌作用・虚血性心疾患における冠動脈の再狭窄の抑制剤などの新薬の開発につながる可能性を示している。
尚、前記イ）の項で述べたように、本発明のタンパク質ｒａｐｔｏｒとｍＴＯＲ（または、ｅＩＦ−４ＥＢＰやｐ７０Ｓ６キナーゼ等のＴＯＳモチーフを有するタンパク質）との結合を阻害する物質は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）となり、医学上および産業上有用である。本発明は、このような物質のスクリーニング方法を含むものである。
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、上記ｒａｐｔｏｒは、そのアミノ末端側の領域（１〜９０４番目のアミノ酸残基）を介してｐ７０Ｓ６キナーゼに結合し、この結合がｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化に不可欠である（後の実施例参照）ことから、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ）において、下記▲１▼〜▲４▼のいずれかの物質を発現させ、当該物資とｍＴＯＲ（または、ｅＩＦ−４ＥＢＰやｐ７０Ｓ６キナーゼ等のＴＯＳモチーフを有するタンパク質）との結合を阻害する物質を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法などが挙げられる。
▲１▼  上記ｒａｐｔｏｒなどの本発明のタンパク質
▲２▼  上記▲１▼のタンパク質の部分タンパク質であって、その全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくとも１〜９０４番目の配列（ｐ７０Ｓ６キナーゼとの結合領域）を含む部分タンパク質
▲３▼  上記▲１▼のタンパク質の部分タンパク質であって、その全長タンパク質のアミノ酸配列中、ｍＴＯＲ（または、ｅＩＦ−４ＥＢＰ）との結合領域を含む部分タンパク質
▲４▼  上記▲１▼のタンパク質または上記▲２▼▲３▼の部分タンパク質の改変体
上記ｒａｐｔｏｒは、そのアミノ末端側の領域（１〜９０４番目のアミノ酸残基）を介してｐ７０Ｓ６キナーゼに結合することから、同じくＴＯＳモチーフを有するｅＩＦ−４ＥＢＰについても、上記アミノ末端側の領域を介してｒａｐｔｏｒと結合する可能性が高い。
上記「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、当該タンパク質がＨｉｓやＭｙｃ等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
上記スクリーニング方法に用いるｍＴＯＲ（または、ｅＩＦ−４ＥＢＰやｐ７０Ｓ６キナーゼ等のＴＯＳモチーフを有するタンパク質）についても、全長タンパク質に限らず、ｒａｐｔｏｒとの結合領域を含む部分タンパク質を使用してもよいし、全長または部分タンパク質の改変体を使用してもよい。
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍでのスクリーニングではなく、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。
そのほか、（１）ｍＴＯＲ（または、ｅＩＦ−４ＥＢＰやｐ７０Ｓ６キナーゼ等のＴＯＳモチーフを有するタンパク質）のｒａｐｔｏｒとの結合領域をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降―免疫ブロット法を用いてｒａｐｔｏｒとｍＴＯＲ等との結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
さらに、本発明のスクリーニング方法においては、ヒト以外のタンパク質、例えば、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いてスクリーニングを行ってもよい。
（３）本発明の組換え発現ベクター等
本発明の組換え発現ベクターは、前記（ａ）〜（ｃ）の何れかのタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものであり、例えば、配列番号１又は３に示される何れかの塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明の形質転換体は、前記（ａ）〜（ｃ）の何れかのタンパク質をコードする本発明の遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、ノックアウトマウス等は、上記タンパク質ｒａｐｔｏｒやそのホモログの更なる機能解析、これらのタンパク質が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
本発明の遺伝子検出器具は、本発明の上記遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いている。遺伝子検出器具は、種々の条件下での本発明の遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用できる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
本発明の抗体は、前記（ａ）〜（ｃ）の何れかののタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の検出・測定などに利用でき、その他、診断用・治療用などに利用できる可能性がある。
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
〔４−１：遺伝子の取得方法〕
以上、本発明に係るタンパク質であるｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）およびその遺伝子の配列、構造、機能、有用性などの諸特徴について説明したが、以下では、本発明に係るタンパク質および遺伝子の取得方法について説明する。
上記タンパク質ｒａｐｔｏｒをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記ｒａｐｔｏｒをコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトまたはマウスのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ｒａｐｔｏｒをコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、上記ｒａｐｔｏｒの機能上重要と考えられる領域（例えば、アミノ酸配列の上記４９番から６６７番までの領域）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ｒａｐｔｏｒと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ｒａｐｔｏｒのｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
〔４−２：タンパク質の取得方法〕
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記ｒａｐｔｏｒ又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れ、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記タンパク質ｒａｐｔｏｒ等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等により比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
上記ｒａｐｔｏｒの変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ストラタジーン社製）を利用してもよい。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られており、一方、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。例えば、上記タンパク質ｒａｐｔｏｒの変異タンパク質を作製する場合、ｍＴＯＲとの結合領域、あるいは、ｅＩＦ−４ＥＢＰとの結合領域に変異を生じさせることにより、ｍＴＯＲと結合する性質、ｍＴＯＲの酵素活性を高める性質、または、ｅＩＦ−４ＥＢＰと結合する性質、のいずれかに異常を持つ変異タンパク質を作製できる可能性が高い。同様に、ｒａｐｔｏｒの機能上重要と考えられる領域（例えば、アミノ酸配列の上記４９番から６６７番までの領域や上記ＷＤ−４０  ｒｅｐｅａｔ領城）に変異を生じさせることにより、ｍＴＯＲと結合する性質、ｍＴＯＲの酵素活性を高める性質、または、ｅＩＦ−４ＥＢＰと結合する性質、のいずれかに異常を持つ変異タンパク質を作製できる可能性がある。
〔４−３：遺伝子検出器具〕
遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子における一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いたものである。例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができ、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ  ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）などを挙げることができる。
尚、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
〔４−４：組換え発現ベクター及び形質転換体〕
組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
〔４−５：抗体〕
抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」」に記載の方法が挙げられる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
（実施例）
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。  （実施例１：新規ｍＴＯＲ結合タンパク質の存在を示唆する実験データ）
ｍＴＯＲに対するモノクローナル抗体を用いて、ＨＥＫ２９３細胞よりｍＴＯＲを免疫沈降し、ｍＴＯＲとともに共精製されるｅＩＦ４ＥＢＰ１に対するリン酸化活性を解析した。具体的には、ＧＳＴ−ｔａｇをつけたｅＩＦ４ＥＢＰ１（ＧＳＴ−４ＥＢＰ１）を基質として、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ存在下にｍＴＯＲのリン酸化アッセイを行い、反応後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、オートラジオグラフィーで解析した。
また、上記免疫沈降後に洗浄する際、洗浄の条件が異なるものを４つ準備した。条件を大きく分けると、洗浄用に塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む緩衝液を用いたものと、ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）を含む緩衝液を用いたものとに分けられる。塩化ナトリウムを含む緩衝液には、０．５Ｍ、１Ｍ、および１．５Ｍの濃度のものをそれぞれ用意した。一方、ＣＨＡＰＳは、濃度１％のものを使用した。なお、ＣＨＡＰＳとは、商品名（製造元：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であって、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナートが主成分の界面活性剤である。
さらに、上記と異なる実験条件のものをもう１つ用意した。これは、免疫沈降前に３０％硫酸アンモニウムによって塩析後、再度緩衝液に可溶化させた後にｍＴＯＲを免疫沈降し、上記と同様にｍＴＯＲのリン酸化活性を解析したものである。
上記実験結果を図１５に示す。図中、レーン１〜３は、それぞれＮａＣｌの濃度０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍの緩衝液で洗浄したもの、レーン４は、免疫沈降前に３０％硫酸アンモニウムで塩析したもの、レーン５は、ＣＨＡＰＳを含む緩衝液で洗浄したものの結果である。また図中、「←ｍＴＯＲ−Ｐ」は、リン酸化されたｍＴＯＲのバンド位置を示し、「←ＧＳＴ−４ＥＢＰ１−Ｐ」は、リン酸化されたＧＳＴ−４ＥＢＰ１のバンド位置を示す。
図１５に示すように、レーン１〜３では、リン酸化されたＧＳＴ−４ＥＢＰ１のバンドが認められた。つまり、ＮａＣｌを含む緩衝液を用いてｍＴＯＲ免疫沈降物を洗浄しても、ｍＴＯＲのｅＩＦ４ＥＢＰ１に対するリン酸化活性（キナーゼ活性）は正常に保たれる。さらに、１．５Ｍの塩化ナトリウムという比較的高濃度の塩を含む緩衝液による洗浄に対しても、リン酸化活性が非常に安定であることが判明した（レーン３）。
レーン４も、ＧＳＴ−４ＥＢＰ１−Ｐのバンドが認められた。つまり、この場合も、ｍＴＯＲのｅＩＦ４ＥＢＰ１に対するリン酸化活性は正常に保たれ、塩に対してリン酸化活性が非常に安定であることが判明した。
一方、レーン５では、ＧＳＴ−４ＥＢＰ１−Ｐのバンドが殆ど認められない。つまり、ｍＴＯＲの上記リン酸化活性は、ＮＰ−４０やＣＨＡＰＳなどの界面活性剤による洗浄に対しては非常に弱く、これらの界面活性剤を含む緩衝液で洗浄するとｍＴＯＲのキナーゼ活性はほぼ完全に失われることが判明した。
上記実験結果は、ｍＴＯＲと結合し、ｍＴＯＲのｅＩＦ４ＥＢＰ１に対するリン酸化活性に必須の分子が存在し、当該分子とｍＴＯＲとの結合が上記界面活性剤により阻害されることを示唆するものであった。
（実施例２：新規ｍＴＯＲ結合タンパク質ｒａｐｔｏｒの精製）
以下のように、新規ｍＴＯＲ結合タンパク質ｒａｐｔｏｒを精製した。
まず、凍結保存した５×１０９個のＨｅＬａ細胞を１４０ｍｌの緩衝液Ａに浮遊させた。緩衝液Ａの組成は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、２０μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ＰＭＳＦである。次に、超音波にて細胞を破砕した。７００×ｇで２０分間の遠心分離後、上清を回収し、更に１００，０００×ｇで１時間の遠心分離を行い、その上清を回収した。この細胞質分画の上清に対し、硫酸アンモニウムを最終濃度３０％になるように加えた後、氷上で１０分間静置後、２０，０００×ｇで遠心分離を行い、沈殿を回収した。
次に、上記沈殿を５０ｍｌの緩衝液Ａで再懸濁し、０．４５μｍのフィルターでろ過後、Ｈｉｌｏａｄ１６／１０  ＳＰカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社製）にかけた。カラム結合タンパク質を２０ｍＭから５００ｍＭまでのＮａＣｌの濃度勾配によって溶出し、ｍＴＯＲを含む分画を抗ｍＴＯＲモノクローナル抗体を用いたドットブロット法により検出した。ｍＴＯＲを含むピークフラクション、及び、コントロールとしてｍＴＯＲを少量しか含まないフラクションを回収し、免疫沈降を行った。免疫沈降には、抗ｍＴＯＲモノクローナル抗体、または、ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎを固相化したプロテインＧセファロースビーズを用いた。反応後、タンパク質が結合したプロテインＧセファロースビーズを０．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄した。
上記洗浄後、結合タンパク質を溶出した。その溶出の条件は、グリシン（ｐＨ＝２．８）だけで溶出したもの、１％ＮＰ−４０（界面活性剤）で溶出したもの、および、１％ＮＰ−４０での第１段階の溶出に続いて２段階目の溶出をグリシンで行ったものである。
上記の条件により溶出したサンプルを、それぞれ１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。その後、ネガティブ染色法によりタンパク質を染色し、タンパク質を検出した。その結果を図１６に示す。
図中、「ｍＴＯＲ  ｉｐ」とは、抗ｍＴＯＲモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行ったものを、「ＮＭＧ  ｉｐ」とは、ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎを用いて免疫沈降を行ったものを表し、「ｆｒ．７」とは、ｍＴＯＲを含むピークフラクションを、「ｆｒ．１３」とは、コントロールとしてｍＴＯＲを少量しか含まないフラクションを表す。
また、図中、左側の１レーンは、グリシン（ｐＨ＝２．８）だけで溶出したもの、また、右側の６レーンのうち、下段に「１％ＮＰ−４０」と記載した３つのレーンは、１％ＮＰ−４０（界面活性剤）で溶出したもの、下段に「Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ，２．８）」と記載した３つのレーンは、１％ＮＰ−４０での第１段階の溶出に続いて第２段階目の溶出をグリシンで行ったものである。
さらに、同図左端には、ｍＴＯＲ、ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）、ｐ３９およびＩｇＧの位置をそれぞれ矢印で示し、同図右端には、分子量マーカーの位置を示す。
図１６に示すように、左から３つ目のレーン、即ち、「ｍＴＯＲ  ｉｐ」「ｆｒ．７」かつ「１％ＮＰ−４０」の場合に、分子量約１５０ｋＤａのバンド（２００ｋＤａと１２０ｋＤａとの間のバンド）が認められた。このバンドをゲルから切り出し、下記実施例に示すようにタンパク質の同定および機能解析を行った結果、ｍＴＯＲに結合する新規タンパク質（ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ））であることが判明した。
（実施例３：質量分析法によるｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）の同定）
上記実施例２にて切り出したゲルに含まれるタンパク質（ｐ１５０）を、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬製）によってゲル内消化した。次に、消化物を抽出し、Ｚｉｐ−Ｔｉｐ（ミリポア社製）を用いて脱塩処理を行った。Ｚｉｐ−Ｔｉｐからのペプチド断片の溶出液として、３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸、および５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸を各４μｌ用いて溶出した。それぞれの溶出液を、Ｑ−Ｔｏｆ２（マイクロマス社製）を用いたＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳによって解析した。
上記解析によって得たスペクトル（図１７および図１８）から、主要なイオンを示す４種のスペクトルを選択し、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ解析）を行った。さらに、そのＭＳ／ＭＳ解析に基づいて、Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳイオンサーチ（Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎｓ  Ｓｅａｒｃｈ）によるタンパク質同定を行った。
ＭＳ／ＭＳ解析したイオンは、下記（１）〜（４）の４種類である。
（１）３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液で観測された、ｍ／ｚ＝７５９．８９（２＋）（図１７）
（２）３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液で観測された、ｍ／ｚ＝８１３．７８（３＋）（図１７）
（３）５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液で観測された、ｍ／ｚ＝１１３２．５８（３＋）（図１８）
（４）５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液で観測された、ｍ／ｚ＝８２１．９７（２＋）（図１８）
それぞれのＭＳ／ＭＳ解析で得たプロダクトイオンの情報と各親イオンの質量数の情報とに基づき、Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎｓ  Ｓｅａｒｃｈを行った。その結果、３０１の高いスコアをもって、解析したタンパク質（ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ））は、ＫＩＡＡ１３０３のｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質（ＫＩＡＡ１３０３  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］）であると同定された。
加えて、ペプチドマスフィンガープリンティング法によるタンパク質の同定を行った。ただし、上記ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ解析で得たスペクトルには、多価イオンが数多く検出された。また、当然ながら、それぞれのペプチド断片の分子イオンは、同位体のイオンを伴ったものであった。ゆえに、上記解析で得たデータをそのままの形で用いても、ペプチドマスフィンガープリンティング法によるタンパク質の同定はできない。そのため、データの変換を行った。具体的には、ＭａｘＥｎｔ３（マイクロマス社製）というソフトウェアを用いてデータの変換を行い、多価イオンを１価イオンに変換した。さらに、ＭａｘＥｎｔ３を用いて、同位体イオンを除いたスペクトルを作成した。ＭａｘＥｎｔ３処理後の３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液のスペクトルを図１９に、５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液のスペクトルを図２０にそれぞれ示す。
図１９・図２０より得られたペプチド断片の質量データのリストを用いて、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／）によるペプチドマスフィンガープリンティングを行い、タンパク質を同定した。その結果、２５１の高いスコアをもって、解析したタンパク質（ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ））は、ＫＩＡＡ１３０３のｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質（ＫＩＡＡ１３０３  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］）であると同定された。
Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎｓ  Ｓｅａｒｃｈを用いた同定と、Ｍａｓｃｏｔマスフィンガープリンティングを用いた同定とは、互いに依存していない、独立したタンパク質同定方法であり、２つの独立した方法で検索しても、解析したタンパク質（ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ））は同一のタンパク質と同定されたことになる。
しかしながら、ＫＩＡＡ１３０３  ｐｒｏｔｅｉｎとしてデータベース上に登録されている遺伝子の塩基配列は、開始コドンを欠いたものであり、かつ、ＫＩＡＡ１３０３  ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列は登録されていなかった。
（実施例４：質量分析法を用いた上記ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）のアミノ末端配列の解析）
データベース上に登録されている遺伝子の情報からは、上記ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）のアミノ末端（Ｎ末端）側の配列を決定することはできなかったので、質量分析によってできる限りの情報を得ることを試みた。
ペプチドマスフィンガープリンティング法による同定の際に帰属できなかった２種のイオンについて、ＭＳ／ＭＳ解析を行った。ＭＳ／ＭＳ解析したイオンは、次の２種（図２１の矢印）である。
（１）３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液で観測された、ｍ／ｚ＝５７９．３３（２＋）
（２）３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶出液で観測された、ｍ／ｚ＝６１５．８２（２＋）
上記ｍ／ｚ＝５７９．３３（２＋）のＭＳ／ＭＳ解析で得られたプロダクトイオンの情報に基づき、Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎ  Ｓｅａｒｃｈを行った。検索には、ｄｂＥＳＴを用いた。その結果、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＷ７５２８１０およびＡＡ５０８０３８のＥＳＴクローンに含まれるアミノ酸配列、ＡＬＥＴＩＧＡＮＬＱＫであると同定された（図２２）。
また、上記ｍ／ｚ＝６１５．８２（２＋）のＭＳ／ＭＳ解析で得られたプロダクトイオンの情報に基づき、Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎ  Ｓｅａｒｃｈを行った。その結果、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＷ７５２８１０、ＡＡ５０８０３８およびＡＡ５０８９０４のＥＳＴクローンに含まれるアミノ酸配列、ＱＳＬＤＰＴＶＤＥＶＫであると同定された（図２３）。
さらに、上記３種のＥＳＴクローン（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＷ７５２８１０、ＡＡ５０８０３８およびＡＡ５０８９０４）を用いて、ＴＨＣデータベースサーチを行った。その結果、３種のクローンは、ともにＴＨＣ５９７０５０に含まれていた。
上記ＴＨＣ５９７０５０の塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列のうち、Ｆｒａｍｅ  １の２７３残基目のバリン（Ｖａｌ）から３５５残基目のアルギニン（Ａｒｇ）までの８３残基にわたるアミノ酸配列は、データベース上に登録されているタンパク質（ＫＩＡＡ１３０３  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列の３残基目のＶａｌからの配列と完全に一致した。オーバーラップしたところからＮ末端方向に遡っていくと、終止コドンが現れるまでに７カ所の開始コドンが存在していた。
上記ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）のＮ末端を決定するために、ＴＨＣ５９７０５０におけるＦｒａｍｅ  １のアミノ酸配列を参考に、ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）のペプチドマスフィンガープリンティングを行ったときに帰属できなかったピークの帰属を試みた。その結果を、図２４および図２５に示す。上流の終止コドンに最も近い開始コドンがｐ１５０の開始コドンであるとした場合、ｐ１５０の前駆体タンパク質のＮ末端配列は、ＭＥＳＥＭＬ−となる。
真核細胞の細胞内タンパク質の６０〜８０％は、そのＮ末端がアセチル化されていると言われている。ペプチド鎖の合成開始シグナルである開始メチオニン（Ｍｅｔｉ）は、一般的に、側鎖の回転半径が１．４３×１０−１０ｍ（１．４３Å）よりも小さいアミノ酸（即ち、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）およびバリン（Ｖａｌ））が２残基目のアミノ酸残基として続く場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用によって脱離する。一方、側鎖の回転半径が１．４３Åよりも大きいその他１３種のアミノ酸残基が２番目の残基として存在する場合、Ｍｅｔｉはタンパク質のＮ末端アミノ酸として残存する。その後、Ｍｅｔｉに続くアミノ酸残基が、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）の場合、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）の作用によって、Ｍｅｔｉはアセチル化される。
上記の事項を考慮すると、ｒａｐｔｏｒのＮ末端アミノ酸配列がＭＥＳＥＭＬ−であった場合、Ｎ末端のメチオニンは脱離せずにアセチル化されている可能性が極めて高い。ｒａｐｔｏｒのＮ末端がこの配列を有し、さらにアセチル化されていた場合、理論的にはＭＨ＋＝３６６４．７１のイオンが観測されることが予想される。そして、マススペクトル上では３６６４．７０のイオンが観測されていた（図２４参照）。このフラグメントには、３残基のＭｅｔが含まれているが、その場合一部のメチオニンが酸化され、メチオニンスルフォキシドに変化することが予想される。マススペクトルをよく見ると、ＭＨ＋＝３６６４．７１のイオンの高質量側に、３６８０．７８のイオンも検出（図２６）され、これは１残基メチオニンスルフォキシドを含んだ断片のイオンであることが考えられ、このイオンの存在も、ＭＨ＋＝３６６４．７１がｒａｐｔｏｒのＮ末端断片由来のイオンであることを示す。以上の結果は、ｒａｐｔｏｒをエドマン分解した際に、有意なＰＴＨアミノ酸が得られなかったことと一致するものである。
以上の解析から、ｒａｐｔｏｒのＮ末端アミノ酸配列はＭＥＳＥＭＬ−であり、ｒａｐｔｏｒの全アミノ酸配列は、配列番号２に示すとおりであると決定した。なお、２１９番目からは、ＫＩＡＡ１３０３と重複する部分である。
（実施例５：ｒａｐｔｏｒの全長ｃＤＮＡの獲得とそのアミノ酸配列の特徴）
上記アミノ酸配列の決定とともに、同定された遺伝子ＫＩＡＡ１３０３の遺伝子配列をもとにプライマーを作成し、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、５’−ＲＡＣＥ法によって、ＫＩＡＡ１３０３遺伝子の５’側上流のｃＤＮＡを獲得した。得られた５’−ＲＡＣＥ産物とＫＩＡＡ１３０３の遺伝子配列とをオーバーラップさせることにより、オープンリーデイングフレーム４００５塩基からなるｒａｐｔｏｒの全長ｃＤＮＡ配列を決定した。この遺伝子より推定されるアミノ酸配列は、１３３５残基であった。
上記の結果に基づいて、データベース検索を行った。その結果、ショウジョウバエ、線虫、出芽酵母、分裂酵母、シロイヌナズナと種を超えても、ｒａｐｔｏｒのホモログが存在することが判明した。アミノ酸配列を比較すると、特にアミノ酸残基４９番から６６７番までの領域はショウジョウバエ、線虫、酵母、シロイヌナズナと種を超えても非常によく配列が保存されていることが判明した（図２〜図９参照）。この結果は、アミノ酸残基４９番から６６７番までの領域が、種を超えてｒａｐｔｏｒの機能にとって重要であることを示唆するものである。
さらに、アミノ酸配列の１０１５番目からＣ末端にかけて、ＷＤ−４０  ｒｅｐｅａｔという構造を７回くり返す領域が存在することが判明した。ＷＤ−４０  ｒｅｐｅａｔ構造は、多様なシグナル伝達分子と相互作用するための足場を形成する構造であると考えられている。また、これまで多くのシグナル伝達分子に、ＷＤ−４０  ｒｅｐｅａｔ構造を発見することができる。これらの事実を考慮すると、ｒａｐｔｏｒも同様に、多彩なシグナルを伝達する足場タンパクとしての機能を担っている可能性が高い。
（実施例６：ｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）とｍＴＯＲとの結合を調べた実験）
まず、ｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）のＮ末端側１７残基を抗原とする抗ｒａｐｔｏｒウサギポリクローナル抗体（抗ｐ１５０ウサギポリクローナル抗体）を作製した。次に、ＨＥＫ２９３細胞から調製した細胞上清を用いて、抗ｒａｐｔｏｒウサギポリクローナル抗体でｒａｐｔｏｒを免疫沈降し、免疫沈降物を抗ｍＴＯＲマウスモノクローナル抗体でウエスタンブロットを行ったところ、ｍＴＯＲがｒａｐｔｏｒとともに共免疫沈降されていることが確認できた（図２７のレーン２参照）。この結合は、１％ＮＰ−４０を含む洗浄用緩衝液による洗浄によって消失することも確認できた（同図レーン４参照）。逆に、抗ｍＴＯＲマウスモノクローナル抗体で免疫沈降し、免疫沈降物を抗ｒａｐｔｏｒウサギポリクローナル抗体でウエスタンブロットを行ったところ、ｒａｐｔｏｒがｍＴＯＲとともに共免疫沈降された（同図レーン６参照）。この場合も、この結合は１％ＮＰ−４０を含む洗浄用緩衝液による洗浄によって消失することが確認できた（同図レーン８参照）。
なお、図２７を参照して、内因性ｒａｐｔｏｒとｍＴＯＲとの結合を調べた上記実験について更に詳しく説明すると、ＨＥＫ２９３細胞から調製した細胞上清を、抗ｒａｐｔｏｒ抗体（抗ｐ１５０抗体）（同図レーン２・４）、免疫前ウサギ抗血清（同図レーン１・３）、抗ｍＴＯＲ抗体（同図レーン６・８）、またはコントロールマウスＩｇＧ（同図レーン５・７）で免疫沈降を行った。ＮＰ−４０を含む洗浄用緩衝液またはＮＰ−４０を含まない洗浄用緩衝液で洗浄後（ＮＰ−４０  ＋または―）、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、その後ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ＰＶＤＦ膜を上下２つに分け、上側を抗ｍＴＯＲ抗体（上段）を用い、下側を抗ｒａｐｔｏｒ抗体（下段）を用いてウエスタンブロットを行った。ｍＴＯＲとｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）とをそれぞれ矢印で示す。
（実施例７：ｒａｐｔｏｒとｍＴＯＲとｅＩＦ４ＥＢＰ１との結合）
ＨＡ−ｍＴＯＲをコードする発現プラスミド、ＦＬＡＧ−ｐ１５０をコードする発現プラスミドのいずれか１つまたは両方と、ＧＳＴ−４ＥＢＰをコードする発現プラスミド、ＧＳＴ−ｐ７０をコードする発現プラスミド、またはＧＳＴとを、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入（トランスフェクション）し、共発現させた。なお、ＨＡ−ｍＴＯＲとはＨＡ−ｔａｇをつけたｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０とはＦＬＡＧ−ｔａｇをつけたｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）、ＧＳＴ−４ＥＢＰとはＧＳＴ−ｔａｇをつけたｅＩＦ４ＥＢＰ１、ＧＳＴ−ｐ７０とはＧＳＴ−ｔａｇをつけたｐ７０Ｓ６キナーゼ、ＧＳＴとはＧＳＴ−ｔａｇのことである。
次に、界面活性剤を用いることなく細胞を抽出し、細胞を破砕した。さらに、細胞上清を３つに分けた。
１つ目の上清は、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した。次に、サンプルを洗浄した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。次に、ＰＶＤＦ膜を上下２つに切った。上側は、抗ＨＡ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体との混合物でブロットした。下側は、抗ＧＳＴ抗体でブロットした。その結果を図２８に示す。
２つ目の上清は、グルタチオンセファロースビーズとインキュベートした。次に、サンプルを洗浄した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。次に、ＰＶＤＦ膜を上下２つに切った。上側は、抗ＨＡ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体との混合物でブロットした。下側は、抗ＧＳＴ抗体でブロットした。その結果を図２９に示す。
３つ目の上清は、そのままサンプル緩衝液と混ぜ、抗ＨＡ抗体でウエスタンブロットを行いＨＡ−ｍＴＯＲの発現を確認した。その結果を図３０に示す。
なお、図２８、図２９、図３０の表中に記す−はトランスフェクションしなかったことを、＋はトランスフェクションしたことを示す。また、図２８、図２９には、ＨＡ−ｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０、ＧＳＴ−４ＥＢＰまたはＧＳＴ−ｐ７０のバンド位置を、それぞれ矢印で示す。図３０には、ＨＡ−ｍＴＯＲのバンド位置を矢印で示す。
まず、図２８について説明する。レーン５の条件においては、ＨＡ−ｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０、およびＧＳＴ−４ＥＢＰのそれぞれのバンドを見つけることができる。つまり、ＦＬＡＧ−ｐ１５０を免疫沈降すると、ＨＡ−ｍＴＯＲとの結合が観察され、さらに、ＧＳＴ−４ＥＢＰが共沈降することが明らかとなった。
図２８のレーン３においては、ＦＬＡＧ−ｐ１５０とＧＳＴ−４ＥＢｐとの共沈が見られる。つまり、ｍＴＯＲと４ＥＢＰ１は、ｐ１５０を介して結合していると考えられた。
なお、図２８のレーン６からレーン１０において、コントロールとしてのＧＳＴ−ｐ７０を発現させた実験を示す。レーン９およびレーン１０において、ＨＡ−ｍＴＯＲとＦＬＡＧ−ｐ１５０との結合を示すバンドは確認できた。しかし、レーン７およびレーン９において、ｐ１５０（ｒａｐｔｏｒ）とＧＳＴ−ｐ７０との結合を示す有意なバンドを確認することができなかった。
次に、図２９について説明する。細胞上清を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した様子を図２８に示した。図２９に示す実施例においては、図２８における抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降する代わりに、グルタチオンセファロースビーズによるプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ）を行った。
図２９において、ＧＳＴ−ｐ７０の場合（レーン７および９）と比較して、ＧＳＴ−４ＥＢＰの場合（レーン３および５）は、有意にＦＬＡＧ−ｐ１５０かつｍＴＯＲの共沈が見られ、図２８で観察された現象が再確認された。
次に、図３０について説明する。図３０においては、細胞上清を抗ＨＡ抗体でウエスタンブロットを行うことにより、ＨＡ−ｍＴＯＲの発現を確認した。ＨＡ−ｍＴＯＲをコードする発現プラスミドをトランスフェクションした、レーン４、５、８、９、および１０において、ＨＡ−ｍＴＯＲの発現を確認できる。
また、データは示していないけれども、１％のＮＰ４０を含む洗浄用緩衝液による洗浄によって、ＦＬＡＧ−ｐ１５０とＧＳＴ−４ＥＢＰとの結合が消失することはなかった。つまり、ＦＬＡＧ−ｐ１５０とＧＳＴ−４ＥＢＰとの結合は、より強固な結合であると考えられた。
（実施例８：ｍＴＯＲがｅＩＦ４ＥＢＰ１をリン酸化する活性に与えるｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）の影響）
ＨＡ−ｍＴＯＲをコードする発現プラスミド、ＦＬＡＧ−ｐ１５０をコードする発現プラスミドのいずれか１つまたは両方をＨＥＫ２９３細胞に形質移入（トランスフェクション）した。なお、表中の、−はそれをトランスフェクションしなかったことを、＋はそれをトランスフェクションしたことを示す。
次に、細胞を破砕後、細胞上清を抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、ＮＰ４０を含む洗浄用緩衝液またはＮＰ４０を含まない洗浄用緩衝液で洗浄した。なお、表中には、ＮＰ４０を含む洗浄用緩衝液で洗浄したものは＋と、ＮＰ４０を含まない洗浄用緩衝液で洗浄したものは−と示す。
次に、ＧＳＴ−４ＥＢＰ１を基質として、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ存在下でリン酸化アッセイを行った。その後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。それを、オートラジオグラフィーで解析した（図３１上段）。その後、そのＰＶＤＦ膜を抗ＨＡ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体との混合物を用いて、ウエスタンブロットを行った（図３１中段）。細胞上清の一部は、そのまま抗ＦＬＡＧ抗体でウエスタンブロットを行い、ＦＬＡＧ−ｐ１５０の発現を確認した（図３１下段）。
なお、図中に、リン酸化されたＨＡ−ｍＴＯＲ（ＨＡ−ｍＴＯＲ−Ｐ）、リン酸化されたＦＬＡＧ−ｐ１５０（ＦＬＡＧ−ｐ１５０−ｐ）、リン酸化されたＧＳＴ−４ＥＢＰ１（ＧＳＴ−４ＥＢＰ１−Ｐ）、ＨＡ−ｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０のバンド位置を、それぞれ矢印で示す。
図３１上段および中段のレーン７および８は、ＨＥＫ２９３細胞にＨＡ−ｍＴＯＲをＦＬＡＧ−ｐ１５０と共発現させた細胞である。図３１上段および中段のレーン５および６は、ＨＡ−ｍＴＯＲのみを単独で発現させた細胞である。
まず、図３１上段の結果について説明する。図３１が示すのは、ＨＡ−ｍＴＯＲが行うｅＩＦ４ＥＢＰ１に対するリン酸化の酵素活性である。図３１上段によると、レーン５の酵素活性よりも、レーン７の酵素活性は５〜６倍高いことが分かった。つまり、ＦＬＡＧ−ｐ１５０が存在すると、ｅＩＦ４ＥＢＰ１に対するリン酸化の酵素活性が高まるということである。また、１％のＮＰ４０を含む洗浄用緩衝液による洗浄を行うと、このＦＬＡＧ−ｐ１５０によるｍＴＯＲの酵素活性の増強効果は消失する。このことは、レーン７と８との結果を比較すれば理解できる。これらの結果より、ＦＬＡＧ−ｐ１５０がｍＴＯＲによるｅＩＦ４ＥＢＰ１のリン酸化に必須の分子であることが明らかとなった。
（実施例９：ｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）と共免疫沈降される内因性ｍＴＯＲによるｅＩＦ４ＥＢＰ１を基質としたリン酸化活性）
まず、ＦＬＡＧ−ｐ１５０をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞とトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞を準備した。次に、細胞を破砕し、その後、細胞上清を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行った。沈降物を、ＮＰ４０を含む洗浄用緩衝液（図中、ＮＰ４０  ＋と示す）またはＮＰ４０を含まない洗浄用緩衝液（図中、ＮＰ４０  −と示す）で洗浄した。その後、ＧＳＴ−４ＥＢＰ１を基質にγ−３２Ｐ−ＡＴＰ存在下でリン酸化アッセイを行った。次に、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥした。その後、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、オートラジオグラフィーで解析した（上段）。その後、ＰＶＤＦ膜を抗  ＦＬＡＧ抗体（中段）と抗ｍＴＯＲ抗体（下段）を用いてウエスタンブロットを行った。
なお、図中に、リン酸化されたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−Ｐ）、リン酸化されたＦＬＡＧ−ｐ１５０（ＦＬＡＧ−ｐ１５０−ｐ）、リン酸化されたＧＳＴ−４ＥＢＰ１（ＧＳＴ−４ＥＢＰ１−Ｐ）、ＦＬＡＧ−ｐ１５０、およびｍＴＯＲのバンド位置を、それぞれ矢印で示す。
３分子の関係をさらに確かめるため、図３２においては、ＦＬＡＧ−ｐ１５０のみＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションを行い、内因性ｍＴＯＲとの関連を検討した。
レーン２および４はＮＰ４０を含む洗浄用緩衝液、レーン１および３はＮＰ４０を含まない洗浄用緩衝液で洗浄したものである。
図３２の中段および下段のウエスタンブロットによると、ＮＰ４０非存在下において、ＦＬＡＧ−ｐ１５０と内因性のｍＴＯＲとの結合を確認することができた。そして、上段のオートラジオグラフィーによって、ＦＬＡＧ−ｐ１５０は、ＮＰ４０非存在下で、ｍＴＯＲが結合しているときのみＧＳＴ−４ＥＢＰ１をリン酸化することが確認された。
また、上段のオートラジオグラフィーが示す、興味深い事実がある。それは、ＮＰ４０存在下でｍＴＯＲがＦＬＡＧ−ｐ１５０に結合していないときでも、ＦＬＡＧ−ｐ１５０がリン酸化されていることである（上段のレーン４）。この事実は、ｒａｐｔｏｒ（ｐ１５０）をリン酸化する酵素が、ｍＴＯＲ以外に存在していることを示唆している。
（実施例１０：ｐ７０Ｓ６キナーゼのＴＯＳモチーフは、ｒａｐｔｏｒとの結合に必要である）
ｐ７０Ｓ６キナーゼのＴＯＳモチーフがｒａｐｔｏｒとの結合に必要であるかどうかを調べるため、下記実験１および２を行った。実験１の結果を図３４に、実験２の結果を図３５に示す。
実施例１０−実験１：  ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ（レーン２，４〜６）と、ＧＳＴ融合ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ）（レーン３〜４）、２８番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋの変異体（ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａ）（レーン５）、ＧＳＴ融合ＰＤＫ１（ＧＳＴ−ＰＤＫ１）（レーン６）のいずれかとの共発現を行った。
次に、それらの細胞溶解液より、ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズを用いて精製した後、洗浄と溶出とを行った。次に、溶出したものを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離して、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンは切り分けて、上部は抗ＦＬＡＧ抗体、下部は抗ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。そのウェスタンブロッティングの結果を、図３４の「Ｅｌｕａｔｅｓ」の項目に示す。
なお、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒの発現を確認するため、まず、上記細胞溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離して、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。次に、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、免疫染色ウェスタンブロッティングを行った。その結果を、図３４の「Ｌｙｓａｔｅｓ」の項目に示す。
実施例１０−実験２：  ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ（レーン２，４〜６）と、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ（レーン３〜４）、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａ（レーン５）、カルボキシル末端欠失不活化ｐ７０Ｓ６キナーゼ変異体（ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−ＫＭ／ΔＣＴ）（レーン６）のいずれかとの共発現を行った。細胞溶解、ＧＳＴ融合タンパク質の精製、溶出は、上記（実施例１０−実験１）と同様に行った。その結果を、図３５に示す。
なお、図３４および図３５において、「＋」は当該分子を発現させているものを、「−」は発現させていないものを示している（以下、同じ）。
まず、実施例１０−実験１について説明する。図３４の「Ｅｌｕａｔｅｓ」の項目において、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングでは、４レーンのみ、つまり、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒとＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋとを共発現させたもののみ、バンドが確認できる。つまり、ｒａｐｔｏｒは、ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６キナーゼａｌｐｈａＩ）と結合することが示された。
さらに、ＴＯＳモチーフを破壊した変異体であるｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａ（２８番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したｐ７０Ｓ６キナーゼの変異体）では、バンドが見られない。つまり、ＴＯＳモチーフが破壊されたｐ７０Ｓ６キナーゼとｒａｐｔｏｒとは結合しないことが示された。
次に、実施例１０−実験２について説明する。図３５の「Ｅｌｕａｔｅｓ」の項目において、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングでは、４レーンと６レーンとにおいて、バンドが確認できる。この６レーンは、ｐ７０Ｓ６キナーゼのカルボキシル末端の１０４アミノ酸を欠失し、キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位に変異を加え酵素活性を失わせたｐ７０Ｓ６ｋ−ＫＭ／ΔＣＴ変異体の結果を示している。つまり、そのｐ７０Ｓ６ｋ−ＫＭ／ΔＣＴ変異体はｒａｐｔｏｒと結合したことを示しており、ｒａｐｔｏｒとｐ７０Ｓ６キナーゼとの結合に、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化酵素活性あるいはｐ７０Ｓ６キナーゼのカルボキシル末端の１０４アミノ酸が必須でないことが示された。
（実施例１１：４Ｅ−ＢＰ１のＴＯＳモチーフは、ｒａｐｔｏｒとの結合に必要である）
次に、４Ｅ−ＢＰ１のＴＯＳモチーフがｒａｐｔｏｒとの結合に必要であるかどうかを調べるため、次の実験を行った。結果は図３６に示す。
まず、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ（レーン２，４〜６）と、ＧＳＴ融合４Ｅ−ＢＰ１（ＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１）（レーン３〜４）、１１４番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させたＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１の変異体（ＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１−Ｆ１１４Ａ）（レーン５）、ＧＳＴ融合ＰＤＫ１（ＧＳＴ−ＰＤＫ１）（レーン６）のいずれかとの共発現を行った。次に、それらの細胞溶解液より、ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズを用いて精製した後、洗浄と溶出とを行った。次に、溶出したものを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離して、ＰＶＤＦメンブレンに転写を行った。メンブレンは切り分けて、上部は抗ＦＬＡＧ抗体、下部は抗ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果を、図３６における「Ｅｌｕａｔｅｓ」の項目に示す。
また、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒの発現を確認するため、上記と同じ細胞溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写を行った後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果を、図３６における「Ｌｙｓａｔｅｓ」の項目に示す。
図３６の「Ｅｌｕａｔｅｓ」の項目において、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングでは、４レーンのみ、つまり、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒとＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１とが共発現したもののみに、バンドが認められる。これは、ｒａｐｔｏｒとｅＩＦ−４ＥＢＰとの結合を示している。一方、ＴＯＳモチーフを破壊した変異体であるｅＩＦ−４ＥＢＰ−Ｆ１１４Ａ（１１４番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したｅＩＦ−４ＥＢＰの変異体）、つまり５レーンでは、バンドは認められない。上記図３６の結果は、上記変異体はｒａｐｔｏｒと結合せず、ｒａｐｔｏｒとｅＩＦ−４ＥＢＰとの結合に、ＴＯＳモチーフが必要であることを示している。
（実施例１２：ｒａｐｔｏｒのアミノ末端側は、Ｐ７０Ｓ６キナーゼのＴＯＳモチーフとの結合に必要である）
ｒａｐｔｏｒのどの領域がｐ７０Ｓ６キナーゼのＴＯＳモチーフとの結合に必要であるかどうかを調べるため、ｒａｐｔｏｒの全長および種々の部分長変異体と、ｐ７０Ｓ６キナーゼとの結合を検討する下記の実験を行った。その結果を図３７に示す。
まず、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ（レーン４〜５）、ｒａｐｔｏｒのカルボキシル末端欠失変異体（ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−△ＣＴ）（レーン６〜７）、ｒａｐｔｏｒのアミノ末端欠失変異体（ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−△ＮＴ）（レーン８〜９）、ｒａｐｔｏｒのＷＤリピートドメイン（ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−ＷＤ）（レーン１０〜１１）のそれぞれと、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ（レーン２，４，６，８，１０）またはＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａ（レーン３，５，７，９，１１）との共発現を行った。それらの細胞溶解液より、ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズを用いて精製した後、洗浄と溶出とを行った。次に、溶出したものを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離して、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンは切り分けて、上部は抗ＦＬＡＧ抗体、下部は抗ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果を、図３７の「Ｅｌｕａｔｅｓ」の項目に示す。
また、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒの発現を確認するため、上記と同じ細胞溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写を行った後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果を、図３７の「Ｌｙｓａｔｅｓ」の項目に示す。
図３７の「Ｅｌｕａｔｅｓ」の項目において、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングでは、４レーン（図中「←ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ」で示す）および６レーン（図中「←ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−△ＣＴ」で示す）に、バンドが認められる。
図３７に示す結果は、ｐ７０Ｓ６キナーゼは、ｒａｐｔｏｒの全長およびカルボキシル末端欠失変異体（ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−△ＣＴ）に結合することと、ｐ７０Ｓ６キナーゼとｒａｐｔｏｒとの結合にｒａｐｔｏｒのアミノ端（アミノ酸１−９０４）が必要であることとを示している。
（実施例１３：ｍＴＯＲによる、試験管内での４Ｅ−ＢＰ１またはｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化に対するｒａｐｔｏｒ存在化、非存在下でのＴＯＳモチーフ変異の影響）
ｒａｐｔｏｒ存在化または非存在下で、４Ｅ−ＢＰ１またはｐ７０Ｓ６キナーゼのｍＴＯＲによるリン酸化に対して、ＴＯＳモチーフ変異が与える影響を、下記の実験１および２で調べた。実験１の結果は図３８および図３９に、実験２の結果は図４０および図４１に示す。
実施例１３−実験１：  まず、ＨＥＫ２９３細胞を、界面活性剤を含まない溶解バッファーで溶解した。次に、抗ｍＴＯＲ抗体（レーン２〜４，６〜７）もしくはノーマルマウスＩｇＧ（ＮＭＧ）（レーン１，５）を用いて、免疫沈降を行った。１％ＮＰ−４０を含んだ０．５Ｍ  ＮａＣｌ入りの溶解バッファー（レーン１〜２，５〜６）、もしくはＮＰ−４０を含まない０．５Ｍ  ＮａＣｌ入りの溶解バッファー（レーン３〜４，７）で、免疫沈降物を洗浄した後、ｍＴＯＲキナーゼアッセイを行った。
ｍＴＯＲキナーゼアッセイにおいて、基質は、ＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１−Ｆ１１４Ａ（レーン１〜３）またはＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１（レーン５〜７）を使用した。反応液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、オートラジオグラフィーを行った。その結果を、図３８における「Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ」の項目に示す。引き続き、そのメンブレンに対し、抗ｍＴＯＲ抗体、抗ｒａｐｔｏｒ抗体、および抗ＧＳＴ抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。その結果を図３８に示す。なお、抗ｍＴＯＲ抗体によるブロッティングの結果は「ａｎｔｉ−ｍＴＯＲ  ｂｌｏｔ」の項目に、抗ｒａｐｔｏｒ抗体によるブロッティングの結果は「ａｎｔｉ−ｒａｐｔｏｒ  ｂｌｏｔ」の項目に、抗ＧＳＴ抗体によるブロッティングの結果は「ａｎｔｉ−ＧＳＴ  ｂｌｏｔ」の項目に示している。
さらに、図３８に示したＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１にとりこまれた３２Ｐを、ＢＡＳ２５００を用いて測定し、グラフ化した。その結果を図３９に示す。
上記のように、ｅＩＦ−４ＥＢＰとｅＩＦ−４ＥＢＰ−Ｆ１１４Ａを基質に、ｒａｐｔｏｒ存在と非存在下のｍＴＯＲキナーゼ活性を測定した。その結果、ｍＴＯＲは、ｅＩＦ−４ＥＢＰを、ｒａｐｔｏｒ存在下でのみリン酸化した。このことは、特に、７レーンの「←３２Ｐ−ＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１」の位置におけるバンド（図３８）と、図３９のグラフにおける７レーンの値とによって、理解できる。一方、ｍＴＯＲは、ｒａｐｔｏｒの存在・非存在にかかわらず、ｅＩＦ−４ＥＢＰ−Ｆ１１４Ａをリン酸化できなかった。
上記結果により、ＴＯＳモチーフを介したｒａｐｔｏｒとｅＩＦ−４ＥＢＰとの結合が、ｍＴＯＲによるｅＩＦ−４ＥＢＰのリン酸化に必須であることが示された。
実施例１３−実験２：  ＨＥＫ２９３細胞を用いて、実施例１３−実験１と同様に、ｍＴＯＲキナーゼアッセイを行った。なお、基質は、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａ（レーン１〜３）、もしくはＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ（レーン５〜７）を使用した。反応液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、オートラジオグラフィーを行った。そのオートラジオグラフィーの結果を、図４０における「Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ」の項目に示す。
引き続き、上記メンブレンに対し、抗ｍＴＯＲ抗体（ａｎｔｉ−ｍＴＯＲ  ｂｌｏｔ）、抗ｒａｐｔｏｒ抗体（ａｎｔｉ−ｒａｐｔｏｒ  ｂｌｏｔ）、抗ＧＳＴ抗体（ａｎｔｉ−ＧＳＴ  ｂｌｏｔ）を用いて、ウエスタンブロットを行った。ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋとＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａの４１２番のトレオニンのリン酸化は、抗リン酸化４１２トレオニン抗体によるウエスタンブロットにより同定した。
これらウエスタンブロットの結果を、図４０に示す。なお、抗ｍＴＯＲ抗体によるウエスタンブロットの結果は「ａｎｔｉ−ｍＴＯＲ  ｂｌｏｔ」の項目に、抗ｒａｐｔｏｒ抗体によるウエスタンブロットの結果は「ａｎｔｉ−ｒａｐｔｏｒ  ｂｌｏｔ」の項目に、抗ＧＳＴ抗体によるウエスタンブロットの結果は「ａｎｔｉ−ＧＳＴ  ｂｌｏｔ」の項目に、抗リン酸化４１２トレオニン抗体によるウエスタンブロットの結果は「ａｎｔｉ−４１２−Ｐ  ｂｌｏｔ」に示す。
さらに、図４０に示したＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋにとりこまれた３２Ｐを、ＢＡＳ２５００を用いて測定し、グラフ化した。その結果を図４１に示す。
上記のように、ｐ７０Ｓ６キナーゼおよびｐ７０Ｓ６キナーゼ−Ｆ２８Ａを基質に、ｒａｐｔｏｒ存在または非存在下において、ｍＴＯＲキナーゼ活性を測定した。その結果、ｍＴＯＲは、ｐ７０Ｓ６キナーゼをｒａｐｔｏｒ存在下でリン酸化したが、ｒａｐｔｏｒ非存在下ではそのリン酸化の程度は約８０％減少した。このことは、図４１における６レーンの結果と７レーンの結果とを見れば、理解できる。
一方、ｍＴＯＲは、ｒａｐｔｏｒの存在・非存在にかかわらず、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａをリン酸化したが、その程度は、ｒａｐｔｏｒ非存在下でのｍＴＯＲによるｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化の程度と同等であった（図４１における、レーン２〜３、６の結果参照）。
この結果によって、ｐ７０Ｓ６キナーゼを基質とした場合、ｍＴＯＲキナーゼ活性の大部分がｒａｐｔｏｒとの結合に依存性であり、一部がｒａｐｔｏｒとの結合に非依存性であることが明らかとなった。
上記実施例１０〜実施例１３の結果は、下記（１）〜（５）を示している。
（１）  ｒａｐｔｏｒの機能が、ｍＴＯＲおよびその基質蛋白質であるｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼを結合しリン酸化反応の場を提供するｓｃａｆｆｏｌｄ蛋白質であることを支持している。
（２）  ｒａｐｔｏｒのｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼへの結合が、ｍＴＯＲを介したアミノ酸からのシグナル伝達に不可欠であることを示唆している。
（３）  ＴＯＳモチーフが、ｅＩＦ−４ＥＢＰおよびｐ７０Ｓ６キナーゼのｒａｐｔｏｒへの結合とｍＴＯＲによるこれら基質蛋白質のリン酸化に必須であることを示している。
（４）  ＴＯＳモチーフをもつ他の蛋白質が、ｒａｐｔｏｒに結合し、ｍＴＯＲの基質になる可能性を示唆する。
（５）  ｒａｐｔｏｒとＴＯＳモチーフの結合を阻害する物質の探索が、ｍＴＯＲシグナルを抑制し、免疫抑制効果・抗癌作用・虚血性心疾患における冠動脈の再狭窄の抑制剤などの新薬の開発に繋がる可能性を示している。
なお、上記「発明を実施するための最良の形態」においてなした、具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求事項の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用の可能性
本発明は、以上のように、哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）に結合する性質を持つ新規タンパク質およびその遺伝子に関するものであり、種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善などに広く有効利用できる、という効果を奏する。
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【図面の簡単な説明】
図１は、タンパク質合成に関与するシグナル伝達を説明する図である。
図２は、ヒト、ショウジョウバエ、線虫、出芽酵母、分裂酵母およびシロイヌナズナにおけるｒａｐｔｏｒおよびそのホモログのアミノ酸配列を示す図である。
図３は、図２に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図４は、図３に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図５は、図４に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図６は、図５に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図７は、図６に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図８は、図７に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図９は、図８に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図１０は、ヒトおよびマウスにおけるｒａｐｔｏｒのアミノ酸配列を示す図である。
図１１は、図１０に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図１２は、図１１に示すアミノ酸配列の続きを示す図である。
図１３は、ヒトのゲノム上に位置する、ｒａｐｔｏｒのエキソンとイントロンとを示す図である。
図１４は、図１３上の、エキソン２６からエキソン３４までの詳細を示す図である。
図１５は、ｍＴＯＲに対するモノクローナル抗体を用いてｍＴＯＲを免疫沈降し、ｅＩＦ４ＥＢＰ１に対するリン酸化活性を示す図である。
図１６は、新規ｍＴＯＲ結合タンパク質ｒａｐｔｏｒをｍＴＯＲとともに精製後、ｍＴＯＲを含む分画（ｆｒ．７）と含まない分画（ｆｒ．１３）とに分け、抗ｍＴＯＲモノクローナル抗体（ｍＴＯＲｉｐ）、または、ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＭＧｉｐ）を固相化したプロテインＧセファロースビーズによる免疫沈降を行い、タンパク質を１％ＮＰ４０またはグリシン（ｐＨ＝２．８）で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離後、銀染色を行った結果を示す図である。
図１７は、ｒａｐｔｏｒのペプチド断片を、３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸を用いてＺｉｐ−Ｔｉｐから溶出し、Ｑ−Ｔｏｆ２（マイクロマス社）を用いたＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳによって、その溶出液を解析した結果得られたスペクトルを示す図である。
図１８は、ｒａｐｔｏｒのペプチド断片を、５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸を用いてＺｉｐ−Ｔｉｐから溶出し、Ｑ−Ｔｏｆ２（マイクロマス社）を用いたＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳによって、その溶出液を解析した結果得られたスペクトルを示す図である。
図１９は、図１７から同位体イオンを除いたスペクトルを示す図である。
図２０は、図１８から同位体イオンを除いたスペクトルを示す図である。
図２１は、ペプチドマスフィンガープリンティング法による同定の際に帰属できなかった２種のイオンのスペクトルを示す図である。
図２２は、ｍ／ｚ＝５７９．３３（２＋）のＭＳ／ＭＳ解析で得られたプロダクトイオンの情報に基づき、得られたアミノ酸配列を示す図である。
図２３は、ｍ／ｚ＝６１５．８２（２＋）のＭＳ／ＭＳ解析で得られたプロダクトイオンの情報に基づき、得られたアミノ酸配列を示す図である。
図２４は、新規に解明されたｒａｐｔｏｒのＮ末端アミノ酸配列と、そのアミノ酸配列を示すスペクトルとを示す図である。
図２５は、図２４の示す、Ｎ末端アミノ酸配列とそのアミノ酸配列を示すスペクトルとの続きを示す図である。
図２６は、ＭＨ＋＝３６６４．７１のイオンの高質量側に位置し、３６８０．７８のイオンを示す図である。
図２７は、細胞上清を用いて免疫沈降し、界面活性剤（ＮＰ４０）の有無で条件分けを行い、抗ｍＴＯＲ抗体および抗ｐ１５０抗体（抗ｒａｐｔｏｒ抗体）を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
図２８は、ＨＡ−ｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０、ＧＳＴ−４ＥＢＰ、ＧＳＴ−ｐ７０、ＧＳＴを形質移入し、その細胞の上清をグルタチオンセファロースビーズとインキュベートし、抗ＨＡ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体との混合物、および抗ＧＳＴ抗体でブロットした結果を示す図である。
図２９は、ＨＡ−ｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０、ＧＳＴ−４ＥＢＰ、ＧＳＴ−ｐ７０、ＧＳＴを形質移入し、その細胞の上清を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、抗ＨＡ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体との混合物、および抗ＧＳＴ抗体でブロットした結果を示す図である。
図３０は、ＨＡ−ｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０、ＧＳＴ−４ＥＢＰ、ＧＳＴ−ｐ７０、ＧＳＴを形質移入し、その細胞の上清を抗ＨＡ抗体でウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
図３１は、ＨＡ−ｍＴＯＲ、ＦＬＡＧ−ｐ１５０を形質移入し、その細胞上清を抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、ＮＰ４０を含む洗浄用緩衝液またはＮＰ４０を含まない洗浄用緩衝液で洗浄し、ＧＳＴ−４ＥＢＰ１を基質として、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ存在下でリン酸化アッセイを行い、解析した結果を示す図である。
図３２は、ＦＬＡＧ−ｐ１５０をトランスフェクションし、その細胞上清を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、ＮＰ４０を含むまたは含まない洗浄用緩衝液で沈降物を洗浄し、ＧＳＴ−４ＥＢＰ１を基質にγ−３２Ｐ−ＡＴＰ存在下でリン酸化アッセイを行った後の解析結果を示す図である。
図３３は、予想される各エキソンについて、対応するｃＤＮＡ配列と、エキソンの塩基数と、エキソンの配列番号と、エキソンを含んでいる配列の配列番号と、エキソンを含んでいる配列におけるエキソン開始位置および終了位置とを一覧にした表である。
図３４は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ（ＦＬＡＧ−ｐ１５０）と、ＧＳＴ融合ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ）、２８番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋの変異体（ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａ）、ＧＳＴ融合ＰＤＫ１（ＧＳＴ−ＰＤＫ１）のいずれかとの共発現を行い、それらの細胞溶解液と抗体とを用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
図３５は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒと、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａ、カルボキシル末端欠失不活化ｐ７０Ｓ６キナーゼ変異体（ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−ＫＭ／ΔＣＴ）のいずれかとの共発現を行い、それらの細胞溶解液と抗体とを用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
図３６は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒと、ＧＳＴ融合４Ｅ−ＢＰ１（ＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１）、１１４番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させたＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１の変異体（ＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１−Ｆ１１４Ａ）、ＧＳＴ融合ＰＤＫ１（ＧＳＴ−ＰＤＫ１）のいずれかとの共発現を行い、それらの細胞溶解液と抗体とを用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
図３７は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ、ｒａｐｔｏｒのカルボキシル末端欠失変異体（ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−ΔＣＴ）、ｒａｐｔｏｒのアミノ末端欠失変異体（ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−ΔＮＴ）、ｒａｐｔｏｒのＷＤリピートドメイン（ＦＬＡＧ−ｒａｐｔｏｒ−ＷＤ）のそれぞれと、ＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋまたはＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８Ａとの共発現を行い、それらの細胞溶解液と抗体とを用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
図３８は、抗ｍＴＯＲ抗体またはノーマルマウスＩｇＧ（ＮＭＧ）とＨＥＫ２９３細胞とを用いて免疫沈降物を得て、基質としてＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１−Ｆ１１４ＡまたはＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１を用いたｍＴＯＲキナーゼアッセイを行い、さらに、反応液と抗体とを用いて、ウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
図３９は、上記図３８におけるＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１にとりこまれた３２Ｐを測定して、その測定結果を示すグラフである。
図４０は、抗ｍＴＯＲ抗体またはノーマルマウスＩｇＧ（ＮＭＧ）とＨＥＫ２９３細胞とを用いて免疫沈降物を得て、基質としてＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋ−Ｆ２８ＡまたはＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋを用いたｍＴＯＲキナーゼアッセイを行い、さらに、反応液と抗体とを用いて、ウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
図４１は、上記図４０におけるＧＳＴ−ｐ７０Ｓ６ｋにとりこまれた３２Ｐを測定して、その測定結果を示すグラフである。
図４２は、エキソン７の塩基配列（枠で囲った部分）と、そのエキソンの前後にある塩基配列とを示す図である。
図４３は、エキソン１４の塩基配列（枠で囲った部分）と、そのエキソンの前後にある塩基配列とを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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