(57)【要約】本発明は、タンパク質や有機物の結晶を、高品質で効率良く簡単に製造する方法に関する。タンパク質や有機物の溶液を調製し、これをゆっくりと冷却することによって低度の過飽和にする。この過飽和溶液に、フェムト秒レーザー１０を照射する。レーザーの焦点では、局所的な爆発現象が起きて結晶核が生成する。この結晶核を基に、時間をかけて結晶を成長させれば、高品質の結晶が得られる。フェムト秒レーザーとしては、波長８００ｎｍ、時間幅１２０ｆｓ、周波数１ｋＨｚ、出力４００ｍＷのチタンサファイアレーザーが使用できる。
2004018744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザーを照射することにより結晶核を生成させる結晶核の製造方法。
【請求項２】
パルスレーザーをレンズで溶液中に集光し、その集光位置で単発若しくは複数発の局所的な爆発現象を生じさせ、これによって結晶核を生成する請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
レーザー照射が一回の場合、パルスレーザーの光密度が、５×１０５（ｗａｔｔ）以上である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
レーザー照射が一回の場合、パルスレーザーのレーザー強度が、６０ｎＪ／ｐｕｌｓｅ以上である請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
レーザー照射が１秒間に１０００ｐｕｌｓｅ以上場合、パルスレーザーの光密度が、１×１０４（ｗａｔｔ）以上である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項６】
レーザー照射が１秒間に１０００ｐｕｌｓｅ以上、パルスレーザーのレーザー強度が、１．９５ｎＪ／ｐｕｌｓｅ以上である請求項１、２または５に記載の製造方法。
【請求項７】
パルスレーザーが、フェムト秒パルスレーザーである請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
パルスレーザーの照射回数が、単発から１０００万発である請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記溶液が、過飽和溶液である請求項１から８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法により溶液中に結晶核を生成させ、これを基に結晶を成長させる結晶の製造方法。
【請求項１１】
結晶化対象の溶質が、有機物である請求項１０記載の製造方法
【請求項１２】
結晶化対象の溶質が、タンパク質である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれかに記載の方法を実施するための結晶核製造装置であって、パルスレーザー照射手段を有する装置。
【請求項１４】
結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザーを照射する工程と、前記レーザー照射により結晶核が生成するか否かを判定する工程および前記レーザー照射により溶質が変化しているか否かを判定する工程の少なくとも一方とを含む結晶化条件のスクリーニング方法。
【請求項１５】
パルスレーザーをレンズで溶液中に集光し、その集光位置で単発若しくは複数発の局所的な爆発現象を生じさせ、これによって結晶核を生成若しくは溶質の変性を誘起する請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
レーザー照射が一回の場合、パルスレーザーの光密度が、５×１０５（ｗａｔｔ）以上である請求項１４または１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
レーザー照射が一回の場合、パルスレーザーのレーザー強度が、６０ｎＪ／ｐｕｌｓｅ以上である請求項１４から１６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
レーザー照射が１秒間に１０００ｐｕｌｓｅ以上場合、パルスレーザーの光密度が、１×１０４（ｗａｔｔ）以上である請求項１４または１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
レーザー照射が１秒間に１０００ｐｕｌｓｅ以上、パルスレーザーのレーザー強度が、１．９５ｎＪ／ｐｕｌｓｅ以上である請求項１４、１５または１８に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
パルスレーザーが、フェムト秒パルスレーザーである請求項１４から１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
パルスレーザーの照射回数が、単発から１０００万発である請求項１４から２０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記溶液が、過飽和溶液である請求項１４から２１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
結晶化対象の溶質が、有機物である請求項１４から２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
結晶化対象の溶質が、タンパク質である請求項１４から２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
請求項１４から２４のいずれかに記載のスクリーニング方法を実施するためのスクリーニング装置であって、パルスレーザー照射手段を有する装置。
【請求項２６】
前記溶液を入れた容器を運動させることにより前記溶液を攪拌しながら結晶を生成させ、育成する請求項１０記載の製造方法。
【請求項２７】
前記運動が、回転、振動および揺動のいずれかの運動若しくはこれらを２種類以上組み合わせた運動である請求項２６記載の製造方法。
【請求項２８】
前記容器が、複数のウエルを有するウエルプレートであり、前記各ウエルに前記溶液が入っている請求項２６または２７記載の製造方法。
【請求項２９】
前記溶液中の溶媒を蒸発させる、または温度変化させることなどにより過飽和状態にする請求項２６から２８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３０】
前記容器に、前記溶液よりも比重が重い液を入れ、前記比重が重い液と前記溶液との界面で結晶を成長させる請求項２６から２９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３１】
前記溶液の溶質以外の成分が前記溶液より高濃度で溶解したリザーバー溶液を入れた別の容器を準備し、この容器と前記溶質を入れた容器とにおいて、水蒸気が移動可能な状態で、前記溶質の結晶を発生・成長させる請求項２６から３０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３２】
前記溶液の溶質が、樹脂、タンパク質、糖類、脂質および核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項２６から３１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３３】
請求項１から１２のいずれかに記載の製造方法に使用する容器若しくは請求項１４から２４のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用する容器であって、結晶化対象物質の溶液を入れる第１の部屋と、前記結晶化対象物質の溶液における前記結晶化対象物質以外の成分のみが前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液を入れる第２の部屋と、前記第１の部屋および前記第２の部屋と連通し、気体が通過可能な通路とを有し、前記第１の部屋の一部若しくは全部が、前記結晶化対象物質の溶液にレーザー光線を照射可能なように透明若しくは半透明である容器。
【請求項３４】
前記結晶化対象物質が、樹脂、タンパク質、糖類、脂質および核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項３３記載の容器。
【請求項３５】
請求項１から１２のいずれかに記載の製造方法に使用するプレート若しくは請求項１４から２４のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用するプレートであって、請求項３３記載の容器が、複数形成されたプレート。
【請求項３６】
前記結晶化対象物質が、樹脂、タンパク質、糖類、脂質および核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項３５記載のプレート。
【請求項３７】
請求項１から１２のいずれかに記載の製造方法に使用する容器若しくは請求項１４から２４のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用する容器であって、結晶化対象物質の溶液を入れる第１の部屋と、前記結晶化対象物質の溶液における前記結晶化対象物質以外の成分のみが前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液を入れる第２の部屋と、前記第１の部屋および前記第２の部屋と連通し、気体が通過可能な通路とを有し、前記第１の部屋が複数あり、これが複数の前記通路により一つ以上の前記第２の部屋と連通しており、前記複数の通路において、それぞれ、通路径若しくは通路長の少なくとも一つが異なり、前記第１の部屋の一部若しくは全部が、前記結晶化対象物質の溶液にレーザー光線を照射可能なように透明若しくは半透明である容器。
【請求項３８】
結晶化対象物質が、樹脂、タンパク質、糖類、脂質および核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項３７記載の容器。
【請求項３９】
請求項１から１２のいずれかに記載の製造方法に使用するプレート若しくは請求項１４から２４のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用するプレートであって、請求項３７記載の容器が、複数形成されたプレート。
【請求項４０】
請求項１から１２のいずれかに記載の製造方法に使用する容器若しくは請求項１４から２４のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用する容器であって、結晶化対象物質の溶液およびこの溶液より比重が重たくかつ前記結晶化対象物質の溶液と混合しない非混合性高比重液を入れる第１の部屋と、前記結晶化対象物質の溶液における結晶化対象物質以外の成分のみが前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液を入れる第２の部屋とを有し、前記第２の部屋の中に前記第１の部屋が形成され、前記第１の部屋において、下部の大容積部と、これより容積が小さい上部の小容積部とを有し、この上部先端は開口して前記両部屋の間は気体が通過可能であり、少なくとも前記第１の部屋の上部もしくは先端開口部に結晶化対象物質の溶液を保持し、かつ前記結晶化対象物質の溶液にレーザー照射が可能なように、容器の一部若しくは全部が透明若しくは半透明である容器。
【請求項４１】
前記第１の部屋において、前記下部の大容積部の形状が逆円錐台若しくは逆角錐状台であり、前記上部の小容積部の形状が円筒若しくは角筒であり、前記両者が連結している請求項４０記載の容器。
【請求項４２】
前記第１の部屋において、前記上部の小容積部の先端開口の上に結晶化対象物質の溶液の液滴を形成し、この状態で、前記結晶化対象物質の溶液の溶媒を蒸発させる請求項４１記載の容器。
【請求項４３】
前記結晶化対象物質が、樹脂、タンパク質、糖類、脂質および核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項４０から４２のいずれかに記載の容器。
【請求項４４】
請求項１から１２のいずれかに記載の製造方法に使用するプレート若しくは請求項１４から２４のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用するプレートであって、請求項４０記載の容器が、複数形成されたプレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、結晶核の製造方法および結晶化条件のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  ポストゲノム研究の進展により、タンパク質の構造解析が急務になってきているが、そのためには、タンパク質を結晶化する必要がある。また、有機結晶は、次世代デバイス材料として有望視されており、その高品質結晶製造技術のニーズが高い。一般に、溶液から結晶を析出させるためには、溶媒蒸発や温度変化などにより過飽和度を大きくする必要がある。しかし、有機物やタンパク質等のように分子量が大きい物質は、過飽和度を極めて大きくしないと結晶化しない。また、このような極めて大きな過飽和度の溶液では、一度結晶化が起こると、結晶が急成長するため、得られる結晶の品質に問題があるおそれがある。また、このような高分子量物質の結晶化は、一般に困難であり、生産性が悪かった。通常、結晶化の条件は、実際に結晶化を試みて、試行錯誤の結果、決定されるが、これでは、タンパク質や有機物等のように、結晶化が必要不可欠な物質では、煩雑すぎて、実用的ではない。また、ナノ秒のＮｄ：ＹＡＧレーザーを用いて有機結晶を作成する試みがある（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７７（１９９６）ｐ３４７５、特開２００２−０６８８９９）。しかしながら、この方法では、結晶化は十分でなく、特にタンパク質の結晶化は困難である。
【発明の開示】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、高品質の結晶を簡単に効率よく製造できる技術を提供することを第１の目的とし、結晶化条件を簡単に決定できる技術を提供することを第２の目的とする。
前記第１の目的を達成するために、本発明の結晶核の製造方法は、結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザーを照射することにより結晶核を生成させる方法である。
このように、前記パルスレーザーを照射すれば、低過飽和溶液であっても結晶核が生成するので、これを基に、結晶をゆっくり成長させることができ、その結果、高品質の結晶が簡単に効率良く製造できる。本発明の方法は、タンパク質の結晶化および有機物の結晶化に最適であるが、その他の物質の結晶化にも使用できる。
また、前記第２の目的を達成するために、本発明の結晶化条件のスクリーニング方法は、結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザーを照射する工程と、前記レーザー照射により結晶核が生成するか否かを判定する工程および前記レーザー照射により溶質が変化しているか否かを判定する工程の少なくとも一方とを含む方法である。
このように、前記パルスレーザーを照射して結晶核の生成を観察し、結晶核が生成すれば、その溶液等の条件は、結晶化に適していると判断できる。また、前記パルスレーザーを照射して溶質の状態を観察し、溶質が変化していれば、その溶液等の条件は結晶化に適していると判断できる。前記溶質の変化は、タンパク質の場合、例えば、立体構造の変化（変性）である。
過飽和溶液に、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザーを照射すれば、結晶核が生成するが、そのメカニズムは不明である。これについて、本発明者等は、以下のように推測している。すなわち、前記パルスレーザーの焦点では、高密度の光子が集中するために、一つの溶質分子もしくは溶媒分子に光子が数個衝突し、それらが光を吸収する現象（多光子吸収）が高い確率で起こる。その結果として、パルスレーザーを集光した時、その焦点で急激な光吸収による爆発現象（レーザーアブレーション）が誘起される。結晶核生成は、これが摂動となり起こると考えられる。そして、その後のメカニズムにとしては、下記の３つが考えられる。
（１）パルスレーザーにより光熱変換が引き起こされ焦点付近の溶液が瞬間的に蒸発し、溶質の濃縮が起こった結果として結晶核が生成する。
（２）パルスレーザーが誘起するアブレーションにより衝撃波が発生し、それにより溶液が局所的に揺らされた結果として結晶核が生成する。
（３）レーザーの強度が強くなると溶液中で誘導散乱が引き起こされ、溶液中に濃度勾配が生成し、結晶核が生成する。
このように、本発明によれば、結晶化が困難なタンパク質や有機物であって、容易に効率良く結晶核を生成でき、これをゆっくり成長させれば高品質の結晶が得られる。また、本発明によれば、結晶化条件をスクリーニングでき、結晶化条件を迅速に決定できる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の一実施例に使用したレーザー照射装置の構成図である。
図２は、レーザー照射による衝撃波の大きさを測定する装置の一例を示す構成図である。
図３は、パルスレーザーの衝撃波と粒子の動きとの関係の一例を示す模式図である。
図４は、前記装置で測定した衝撃波による粒子の移動距離とレーザー集光点との関係を示すグラフである。
図５は、前記装置で測定した衝撃波の強度とレーザー強度との関係を示すグラフである。
図６は、本発明のその他の実施例に使用したレーザー照射装置の構成図である。
図７は、本発明のさらにその他の実施例に使用したレーザー照射装置の構成図である。
図８は、本発明の一実施例で生じたタンパク質結晶の写真である。
図９は、本発明のその他の実施例で生じたタンパク質結晶の写真である。
図１０は、木発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の写真である。
図１１は、本発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の写真である。
図１２は、本発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の写真である。
図１３は、本発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の写真である。
図１４は、参考例２に使用した攪拌装置の概略図である。
図１５Ａと図１５Ｂは、従来法で得られた結晶を示す写真であり、図１５Ｃと図１５Ｄは、前記参考例２で得られた結晶を示す写真である。
図１６は、本発明の容器の一例を示す断面図である。
図１７は、本発明のプレートの一例を示す斜視図である。
図１８は、本発明の容器のその他の例を示す図であり、Ａは平面図、Ｂは断面図である。
図１９は、本発明の容器のさらにその他の例を示す図であり、Ａは平面図、Ｂは断面図である。
図２０は、本発明の容器のさらにその他の例を示す断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】  つぎに、本発明をさらに詳しく説明する。
前述のように、本発明では、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザーをレンズで溶液中に集光し、その集光位置で単発若しくは複数発の局所的な爆発現象を生じさせ、これによって結晶核を生成することが好ましく、また前記爆発現象により、溶質を変化させることも好ましい。
本発明において、パルスレーザーの光密度（光子流量：ｐｈｏｔｏｎ  ｆｌｕｘ）は、例えば、５×１０５（ｗａｔｔ）以上であり、好ましくは２×１０９（ｗａｔｔ）以上である。パルスレーザーの光密度の上限は、特に制限されないが、例えば、１０１８（ｗａｔｔ）以下であり、好ましくは１０１５（ｗａｔｔ）以下であり、より好ましくは１０１２（ｗａｔｔ）以下である。
後述するように、レーザー光強度（Ｗ）および時間幅（Δｔ）の積が、光密度（Ｉ）であるから、レーザーの条件は、時間幅によって、例えば、以下のように設定することができる。なお、パルスレーザーは、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーがあり、このなかで、フェムト秒レーザーが特に好ましい。
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パルスレーザーは、単発で照射してもよいし、複数発繰り返して照射してもよい。パルスレーザーの照射回数は、特に制限されないが、例えば、１発（単発）から１０００万発の範囲である。また、繰り返し複数発照射する場合のレーザー繰り返し周波数は、例えば、１／１０００００００Ｈｚ〜１ｋＨｚの範囲である。照射時間も特に制限されず、例えば、１秒から１時間の範囲である。
パルスレーザーの具体例としては、例えば、フェムト秒チタンサファイアレーザー、フェムト秒ファイバーレーザー、ナノ秒・ピコ秒Ｎｄ３＋：ＹＡＧレーザー、ナノ秒・ピコ秒Ｎｄ３＋：ＶＹＯ４レーザー、エキシマレーザーおよびアレクサンドライトレーザー等がある。
本発明において、結晶化対象の溶質が溶解している溶液は、過飽和溶液であることが好ましく、より好ましくは低過飽和溶液である。タンパク質溶液の濃度は、例えば、２００〜５００％であり、好ましくは１００〜３００％であり、より好ましくは５０〜２００％である。有機物溶液の濃度は、例えば、２０〜５０％であり、好ましくは１０〜３０％であり、より好ましくは５〜２０％である。また、本発明の対象となるタンパク質としては、例えば、リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、キシナラーゼ、ミオグロビン、カタラーゼ、トリプシン、ヒトリゾチーム、フォトアクティブイエロープロテイン、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、リボヌクレアーゼ、プロスタグランジンＦ２α合成酵素、アデノシンデアミナーゼ、主要異物排出トランスポーター等がある。有機物としては、例えば、４−ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏ−Ｎ−ｍｅｔｙｌ−４’−Ｎ−ｓｔｉｌｂａｚｏｌｉｕｍ  ｔｏｓｙｌａｔｅ（ＤＡＳＴ）、メチルニトロアニリン（ＭＮＡ）、リン酸エルアルギニン（ＬＡＰ）等がある。なお、後述の実施例に示すように、本発明の方法によれば、従来、結晶化が困難であった膜タンパク質が、結晶化できる。
つぎに、本発明の方法を実施するための装置の一例を図１に示す。図示のように、この装置は、フェトム秒レーザー照射手段１、機械シャッター２、半波長板３、偏光子４、集光レンズ５、恒温水槽８を有する。恒温水槽８の中には、水９が入っており、その中に、結晶化対象の溶質が溶解した溶液７が入った試料容器６が配置される。恒温水槽８では、温度を徐々に低下させることで、溶液７の溶解度を低下させて過飽和状態にする。この時、過度の過飽和にすると結晶成長が速くなるので、低度の過飽和にする。そして、レーザー照射手段１よりレーザー光１０を照射すると、レーザー光１０は、機械シャッター２、半波長板３、偏光子４および集光レンズ５を通過し、溶液７内で集光し、ここで急激な光吸収による爆発現象がおき、これが結晶核生成を誘引する。結晶を成長させる場合は、この結晶核を基に、時間をかけてゆっくりと成長させれば、高品質の単結晶が得られる。また、結晶化条件をスクリーニングする場合、溶液の濃度、溶質の構成比率、温度条件を少しずつ変えた溶液を複数準備し、それらにレーザー光を照射後、溶液を観察する。そして、結晶核の生成や溶質の変化が確認できた場合、その溶液は結晶化条件に適していると判断し、そうでない場合は、結晶化条件不適と判断する。本発明のスクリーニング方法は、結晶化条件決定の一次スクリーニングとして使用することが好ましい。
本発明において、結晶化対象の溶質を溶解させた溶液は、それを入れた容器を運動させることにより前記溶液を攪拌しながら前記結晶を発生させ、これを成長させることが好ましい。
このように、溶液自身を直接攪拌するのではなく、それが入った容器を回転、振動、揺動等の運動をさせることにより、間接的に、前記溶液を攪拌すれば、簡単に穏やかな攪拌を実現でき、また、前記溶液の対流を自在に制御できるため結晶生成に適した攪拌を選択できる。この結果、従来は結晶化が難しかったタンパク質のような高分子であっても、結晶化が可能となる。
前記運動は、特に制限されず、回転、振動および揺動等があり、これらを２種類以上組み合わせた運動であってもよい。前記運動の程度も特に制限されず、高分子溶液の種類等に応じて適宜決定される。円運動の場合、例えば、１０〜１０００ｒｐｍ、好ましくは３０〜２００ｒｐｍ、より好ましくは５０〜１００ｒｐｍである。
前記容器は、特に制限されず、例えば、ビーカ、シャーレ、複数のウエルを有するウエルプレート等が使用できる。
結晶の発生・成長は、例えば、前記溶液を過飽和状態にすることにより、実施できる。過飽和状態は、例えば、前記溶液中の溶媒を蒸発させればよい。蒸発は、特に制限されず、自然蒸発、加熱による蒸発、減圧乾燥による蒸発、凍結乾燥による凍結等がある。この他に、前記溶質以外の成分が前記溶液より高濃度で溶解したリザーバー溶液を入れた別の容器を準備し、この容器と前記結晶化対象の溶液を入れた容器とにおいて、水蒸気が移動可能な状態にすると、前記結晶化対象の溶液の蒸発が穏やかな条件で促進でき、特に、変性しやすいタンパク質等の生体高分子にとっては、好ましい。このような方法を、通常、蒸気拡散法という。
本発明において、結晶の成長の場は特に制限されない。通常、成長した結晶は、溶液より比重が重いため沈降し、容器底に移動する。このような方法を、通常、Ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ法という。しかし、容器底で結晶が成長すると、ここに貼りついて回収に支障をきたす場合もある。そこで、前記容器に、前記結晶化対象の溶液よりも比重が重い液を入れ、前記比重が重い液と前記溶液との界面で結晶を成長させることが好ましい。このような方法は、通常、Ｆｌｏａｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ法という。
容器を運動させて溶液を攪拌する方法において、結晶化対象の物質は特に制限されず、例えば、樹脂、タンパク質、糖類、脂質および核酸等がある。この方法は、結晶化が特に困難なタンパク質等の生体高分子に適用することが好ましい。タンパク質としては、例えば、ニワトリ卵白リゾチーム、ヒトリゾチーム、グルコースイソメラーゼ、キシナラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、リボヌクレアーゼ、プロスタグランジンＦ２α合成酵素、アデノシンデアミナーゼ、主要異物排出トランスポーターなどが挙げられる。
つぎに、本発明の容器は、本発明の製造方法若しくはスクリーニングに使用する容器である。本発明の容器は、つぎの３つの種類の容器である。
本発明の第１の容器は、本発明の結晶核若しくは結晶の製造方法に使用する容器若しくは本発明の結晶条件のスクリーニングに使用する容器であって、結晶化対象物質の溶液を入れる第１の部屋と、前記結晶化対象物資の溶液における結晶化対象物質以外の成分のみが前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液を入れる第２の部屋と、前記第１の部屋および前記第２の部屋と連通し、気体が通過可能な通路とを有し、前記第１の部屋の一部若しくは全部が、前記結晶化対象物質の溶液にレーザー光線を照射可能なように透明若しくは半透明である容器である。
この容器は、いわゆる蒸気拡散法により結晶化対象物質の溶液の溶媒の蒸発を促進し、結晶化対象物質の結晶の生成を促進するものであるが、結晶化対象物質の溶液が入っている第１の部屋にレーザー光を照射することにより、強制的に結晶核を生成させたり、結晶化条件をスクリーニングしたりするものである。
また、前記第１の容器を１つのプレート内に複数形成してもよい。
本発明の第２の容器は、本発明の結晶核若しくは結晶の製造方法に使用する容器若しくは本発明の結晶条件のスクリーニングに使用する容器であって、結晶化対象物質の溶液を入れる第１の部屋と、結晶化対象物質の溶液における結晶化対象物質以外の成分のみが前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液を入れる第２の部屋と、前記第１の部屋および前記第２の部屋と連通し、気体が通過可能な通路とを有し、前記第１の部屋が複数あり、これが複数の前記通路により一つ以上の前記第２の部屋と連通しており、前記複数の通路において、それぞれ、通路径若しくは通路長の少なくとも一つが異なる容器であり、前記第１の部屋の一部若しくは全部は、前記結晶化対象物質の溶液にレーザー光線を照射可能なように透明若しくは半透明である容器である。
この容器は、いわゆる蒸気拡散法により結晶化対象物質の溶液の溶媒の蒸発を促進し、結晶化対象物質の結晶の生成を促進するものであるが、前記複数の通路において、通路径および通路長のいずれか若しくは双方がそれぞれ異なるため、複数の蒸気拡散条件を同時に設定することができ、結晶化の最適条件をスクリーニングしたり、その条件で結晶を生成させるものである。
前記第２の容器を、１つのプレート内に複数形成してもよい。
本発明の第３の容器は、本発明の結晶核若しくは結晶の製造方法に使用する容器若しくは本発明の結晶条件のスクリーニングに使用する容器であって、結晶化対象物質の溶液および前記結晶化対象物質の溶液より比重が重たくかつ前記結晶化対象物質の溶液と混合しない非混合性高比重液を入れる第１の部屋と、結晶化対象物質の溶液における結晶化対象物質以外の成分のみが前記高分子溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液を入れる第２の部屋とを有し、前記第２の部屋の中に前記第１の部屋が形成され、前記第１の部屋において、下部の大容積部と、これより容積が小さい上部の小容積部とを有し、その上部先端は開口して前記両部屋の間は気体が通過可能であり、少なくとも前記第１の部屋の上部もしくは先端開口部に結晶化対象物質の溶液を保持し、かつ前記結晶化対象物質の溶液にレーザーを照射可能なように容器の一部若しくは全部が透明若しくは半透明である容器である。
この容器は、いわゆる蒸気拡散法により結晶化対象物質の溶液の溶媒の蒸発を促進し、かつ結晶化対象物質の溶液と非混合性高比重液との界面で結晶化対象物質の結晶の生成を促進するものであるが、前記第１の部屋の前記小容積部もしくは先端開口部に結晶化対象物質の溶液を保持するため、結晶化対象物質の溶液は少量であってもよい。また、前記第１の部屋の前記大容積部に位置する非混合性高比重液を、例えば、マグネットスターラー等で攪拌すれば、間接的に結晶化対象物質の溶液を攪拌することができ、さらに結晶化を促進させることが可能である。
前記第３の容器の前記第１の部屋において、前記下部の大容積部の形状が逆円錐台若しくは逆角錐状台であり、前記上部の小容積部の形状が円筒若しくは角筒であり、前記両者が連結していることが好ましい。このような形状であれば、前記第１の部屋において、前記上部の小容積部の先端開口の上に結晶化対象物質の溶液の液滴を形成し、この状態で、前記結晶化対象物質の溶液の溶媒を蒸発させることが可能である。また、前記第３の容器を１つのプレート内に複数形成してもよい。
本発明において、前記結晶化対象物質は、特に制限されず、例えば、樹脂、タンパク質、糖類、脂質および核酸等があり、このなかで、タンパク質の結晶化について本発明の容器を適用することが好ましい。タンパク質としては、例えば、ニワトリ卵白リゾチーム、ヒトリゾチーム、グルコースイソメラーゼ、キシナラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、リボヌクレアーゼ、プロスタグランジンＦ２α合成酵素、アデノシンデアミナーゼ、主要異物排出トランスポーターなどが挙げられる。
【実施例】  つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。
（装置）
図１に示す装置を実施例１、２、比較例１および参考例に用いた。この装置は、高出力フェムト秒チタンサファイアレーザー１０を焦点距離１７０ｍｍのレンズ５により集光し、恒温水槽８中の試料溶液７に照射する装置である。恒温水槽８は、温度を±０．０５℃の精度で制御できる。レーザー１０の波長は８００ｎｍ、時間幅は１２０ｆｓである。レーザー発振の繰り返し周波数は１ｋＨｚから１Ｈｚまで調整できる。試料溶液７に単発のレーザーパルスを照射するときは、繰り返し周波数を２０Ｈｚに調節し、そのパルス列から機械シャッター２を５０ｍｓだけ開くことにより単発パルスを抜き出す。レーザー光強度は、半波長３と偏光子４により調整できる。この装置では、試料溶液７に対して強度２５０μＪ／ｐｕｌｓｅ（２×１０９ｗａｔｔ）のレーザーパルスを照射することができる。
【実施例１】  ＤＡＳＴ（４−ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏ−Ｎ−ｍｅｔｙｌ−４’−Ｎ−ｓｔｉｌｂａｚｏｌｉｕｍ  ｔｏｓｙｌａｔｅ）３．５ｇを、メタノール２００ｍｌおよび回転子と共に、容量２００ｍｌのテフロン容器６に入れ、初期温度２７．０℃の恒温水槽８内にて２時間で５５．０℃まで上昇させ、スターラ撹拌しながら溶解させた。約５時間後にＤＡＳＴが溶解しているのを確認して溶液７を３つに分け、育成溶液とした。この際、回転子は取り除いた。溶液準備１６時間後に、５５℃で１０時間加熱後、毎時間３℃ずつ下げて２３℃まで温度を降下させた。さらに、毎時間０．１℃で下げ２１．４℃まで温度を降下させた。この状態で、フェムト秒レーザーを光強度２５０μＪ／ｐｕｌｓｅ（２×１０９Ｗａｔｔ）、繰り返し周波数１ｋＨｚで２分間照射した。その後、１時間は結晶析出のないことを確認し、その１０時間後に肉眼で結晶が析出していることを確認した。前記温度を保持したまま、約６日観察を続けたところ、最初に発見した結晶は成長し、更に２、３個の結晶を確認した。再び強度２５０μＪ／ｐｕｌｓｅ（２×１０９ｗａｔｔ）、繰り返し周波数１ｋＨｚで１分間レーザーを照射し、その後３日間は結晶析出のないことを確認した。
【実施例２】  結晶核生成対象として、ニワトリ卵白リゾチームを使用した。その溶液は、蒸留水５０ｍｌに酢酸ナトリウム三水和物０．４６７ｇを加え、これに酢酸を加えてｐＨ４．５に調整した後、塩化ナトリウム１．２５ｇおよびニワトリ卵白リゾチーム１．２５ｇを加えて調製した。室温に調整した前記試料溶液７を、１００ｍｌのテフロン容器６に入れ、恒温水槽８にて４０℃で２４時間保持し、完全に溶解させた。その後、２５℃まで５時間で冷却し、メンブランフィルタにて不純物を除去した。その溶液２ｍｌとフロリナート３ｍｌを、１０本の直径１８ｍｍのネジ蓋付きガラス瓶６にそれぞれ注入した。これらのガラス瓶６を２５℃に保持した恒温水槽８内に静置させ、溶液温度を１５℃まで２０時間で降下させた。この試料溶液（リゾチーム溶液）７の飽和点は２３．８℃である。そして、結晶の析出がないことを確認して１４℃まで２４時間で降下させ、１４℃で２４時間保持し、再度、結晶の析出がないことを確認した。そして、光強度２５０μＪ／ｐｕｌｓｅ（２×１０９ｗａｔｔ）のフェムト秒パルスレーザーを溶液７内に１分間、順次照射して、変化を観察した。照射条件は、レーザーの繰り返し周波数を変化させ、５０Ｈｚ、１００Ｈｚで、それぞれ前記ガラス瓶２本ずつ照射し、コントロールとして４本の前記ガラス瓶にはレーザーを照射しなかった。レーザー照射１日後に、５０Ｈｚ、１００Ｈｚの溶液中に結晶が析出していることを肉眼で確認した。レーザーを照射していない溶液では結晶の析出は見られなかった。また、結晶の析出が見られなかった溶液に５００Ｈｚ、１０００Ｈｚのレーザーをそれぞれ照射したところ、溶液内に、リゾチームが凝集（変性）しているのが観察され、この溶液は結晶化の可能性ありと判定した。
（比較例１）
実施例２と同じ条件のタンパク質溶液を用いて、ＹＡＧレーザー（波長１０６４ｎｍ、５ｎｓ）を照射して結晶核の生成を試みた。前記タンパク質溶液は、蒸留水５０ｍｌに酢酸ナトリウム三水和物０．４６７ｇを加え、これに酢酸を加えてｐＨ４．５に調整した後、塩化ナトリウム１．２５ｇおよびニワトリ卵白リゾチーム１．２５ｇを加えて調製した。室温に調整した前記試料溶液７を、１００ｍｌのテフロン容器に入れ、恒温水槽にて４０℃で２４時間保持し、完全に溶解させた。その後、２５℃まで５時間で冷却し、メンブランフィルタにて不純物を除去した。その溶液２ｍｌとフロリナート３ｍｌを、１０本の直径１８ｍｍのネジ蓋付きガラス瓶にそれぞれ注入した。これらのガラス瓶を２５℃に保持した恒温水槽内に静置させ、溶液温度を１５℃まで２０時間で降下させた。この試料溶液（リゾチーム溶液）の飽和点は２３．８℃である。そして、結晶の析出がないことを確認して１４℃まで２４時間で降下させ、１４℃で２４時間保持し、再度、結晶の析出がないことを確認した。そして、ＹＡＧレーザーを溶液内に１分間、順次照射して、変化を観察した。照射条件は、レーザーの繰り返し周波数を変化させ、１０Ｈｚ、２０Ｈｚ、５０Ｈｚ、１００Ｈｚ、５００Ｈｚ、１０００Ｈｚをそれぞれ照射し、コントロールとして４本のガラス瓶にはレーザーを照射しなかった。レーザー強度は１．２ｍＪ／ｐｕｌｓｅであった。レーザー照射１日後、結晶の析出は確認できず、さらに過飽和度を大きくするため１６℃まで１０時間で降下させ、１２時間保持し、結晶の析出がないことを確認して、再度レーザーを照射した。照射条件は上記と同じである。この時も結晶の析出は確認できず、同様に、１５℃、１４℃でもレーザー照射したが、結局、結晶の析出および変性を確認できなかった。この例での光強度は、実施例で用いたフェムト秒パルスレーザーよりも１０倍大きいが、光密度（光子流量）は２．５×１０５（ｗａｔｔ）であり、実施例の一万分の一であり、これが原因で結晶核が生成しなかったと推察できる。
（参考例１）
図２に示す装置を用いてパルスレーザーの爆発現象により生じるであろう衝撃波を調べた。この装置は、パルスレーザー照射装置を正立顕微鏡に組み込んだものである。図示のように、正立顕微鏡１１は、観察対象物を置くステージ２８と、コンデンサーレンズ２９と対物レンズ（１００倍、開口数１．２５）２６を備え、前記ステージ２８の上には、マイクロチップ２７が配置されている。また、正立顕微鏡１１下部のコンデンサーレンズ２９下には、光源ランプ１３が配置され、この光を検出するＣＣＤカメラ１２が顕微鏡１１上部に配置されている。また、正立顕微鏡１１外部にパルスレーザー照射装置２１が配置されており、レーザー２２は、１／２波長板２３および偏光子２４を通って正立顕微鏡１１内に照射され、ダイクロイックミラー２５によって光路が直角に曲げられてステージ２８上のマイクロチップ７内に照射されるようになっている。前記パルスレーザーとしては、チャープ増幅による高出力フェムト秒チタンサファイアレーザー（８００ｎｍ，１２０ｆｓ）を使用している。また、マイクロチップ２７内には、ポリスチレン微粒子（直径１μｍ）の分散液が入っている。この装置において、レーザー２２を照射すると、ステージ２８上に配置されたマイクロチップ２７内のポリスチレン微粒子分散液にレーザー２２が集光する。そして、マイクロチップ２７内の様子は、ＣＣＤカメラ１２で観察する。
つぎに、この装置を使い、ポリスチレン微粒子に対する衝撃波の影響を調べた。すなわち、前述の条件により、ポリスチレン微粒子分散液内に単発でフェムト秒チタンサファイアレーザーを照射した。レーザーの集光点で発生すると予想される衝撃波は３次元的に拡散し、微粒子はレーザー集光点から遠ざかる方向へ押される。この衝撃波によるポリスチレン微粒子の動きをＣＣＤカメラで観察し、レーザーの集光点から離れる距離を調べることにより、衝撃波の大きさを見積もった。図３は、パルスレーザー照射による衝撃波がポリスチレン微粒子に与える力の関係を模式的に表したものである。同図において、ｆは微粒子が受ける衝撃波の力を示し、Ｆ０は衝撃波により発生する力を示し、Ｒ０は微粒子の初期位置を示し、Ｒは衝撃波中心からの微粒子の位置を示し、ｒは微粒子の半径を示し、３２はレーザー光を示し、３３はポリスチレン微粒子を示し、３４はレーザーの集光点を示し、３７はポリスチレン微粒子分散液を示す。また、図４は、パルスレーザー照射と、その衝撃波による微粒子の移動距離の関係を示すグラフである。同図において、横軸は、時間を示し、縦軸は、衝撃波中心からの微粒子の位置（Ｒ）を示し、Ｒ０は微粒子の初期位置を示し、Ｌは微粒子の移動距離を示し、黒丸はパルスレーザーの照射時間を示す。このグラフに示すように、パルスレーザーが照射されると、微粒子が瞬間的に焦点から遠ざかることが解る。衝撃波がインパルス応答で３次元的に等方的に伝搬して、微粒子が水の粘性抵抗により停止すると仮定した場合、以下の式が成立し、微粒子の初期位置（Ｒ０）と移動距離（Ｌ）の関係から衝撃波により発生する力（Ｆ０）を見積もることができる。
微粒子の受ける衝撃波の力：
2004018744.tif 000004
微粒子の運動方程式：
2004018744.tif 000005
微粒子の変位量：
2004018744.tif 000006
このようにして、数百にのぼる微粒子の動きを観測し、フェムト秒チタンサファイアレーザーの光強度と衝撃波により発生する力の関係を求めた。その結果を、図５のグラフに示す。このグラフにおいて、縦軸は衝撃波の力（Ｆ０）を示し、横軸はレーザー光強度（Ｉ０）を示す。図示のように、この参考例では、６０ｎＪ／ｐｕｌｓｅ以上で衝撃波を確認できた。爆発現象の閾値は、多光子吸収の確率に依存するため、レーザーエネルギーの総量として定義されるレーザー強度ではなく、瞬間的に到達する光の密度（Ｉ）により関係づけられる。この参考例では、時間幅（Δｔ）１２０ｆｓのパルスレーザーのレーザー強度（Ｗ）が６０ｎＪ／ｐｕｌｓｅであったから、その光密度（Ｉ）は、以下のようになる。
Ｉ＝Ｗ／Δｔ＝５×１０５（Ｊ／ｓ・ｐｕｌｓｅ＝ｗａｔｔ）
したがって、この参考例では、時間幅（Δｔ）は、Δｔ＜Ｗ／５×１０５となる。この式とレーザー照射装置の能力とを考慮すると、ナノ秒以下の時間幅を持つパルスレーザーが好ましく、より好ましくはピコ秒以下、最適にはフェムト秒以下である。なお、この参考例によって、本発明は限定的に解釈されない。また、この参考例では、レーザー集光点で爆発現象が起きて衝撃波が発生すると仮定しているが、本発明は、これに限定されない。
なお、この参考例では衝撃波の可視化のためにポリスチレン微粒子を用いているが、ポリスチレン微粒子の重量は１．１ｘ１０−１２ｇであり、蛋白質の１億倍以上の重量である。つまり、蛋白質はポリスチレン微粒子よりも遙かに弱い衝撃波でも、その密度を変化させる可能性がある。ポリスチレン微粒子の可視化により定義されたパルスレーザーの光密度とレーザー強度は、本発明におけるその下限を限定するものではない。
【実施例３】  本実施例はニワトリ卵白リゾチーム（１４ｋＤａ）を結晶化した実施例である。タンパク質溶液の条件は、２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、２．５％の塩化ナトリウム、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５であり、室温で調製した。この溶液を、メンブランフィルタにて不純物を除去した。
結晶化は、図６に示すレーザー照射装置および結晶化プレートを用い、バッチ法にて行った。図示のように、このレーザー照射装置では、フェムト秒レーザー照射装置１０１から照射されたレーザーが、ミラー１０２、波長板１０３、偏光子１０４およびシャッター１０５を通過して対物レンズ（１０倍）１０８で集光され、結晶化プレート１０９の結晶育成容器部１０７に照射されるようになっている。前記結晶化プレート１０９は、蒸気拡散法を利用したものであり、タンパク質溶液を入れる結晶育成容器部１０７と、これと連通しているサーバー溶液部１０６とを有する。前記サーバー溶液は、タンパク質溶液において、タンパク質を除いた残りの成分と同じ成分が溶解している溶液であり、これによってタンパク質溶液の蒸発が促進される。同図において、１１０はシーリングテープであり、１１１は透明ガラスである。そして、前記結晶育成容器部１０７は、接眼レンズ１１２で肉眼で観察できるようになっており、またＣＣＤ１１３カメラおよびモニター１１４によっても観察可能となっている。
レーザーの照射は、温度・湿度管理したクリーンルーム内（温度２３℃±２℃、湿度６５％±５％）で行った。レーザーの波長は７８０ｎｍ、時間幅は２００フェムト秒（ｆｓ）、レーザー発振の繰り返し周波数は１ｋＨｚである。レーザー光強度は、波長板と偏光子により調節した。レーザー光の照射回数は、シャッターの開閉時間を変化させることにより調整した。
タンパク質溶液１０μｌを、結晶化プレート１１０のそれぞれの結晶育成容器部１０７に入れ、室温にて溶液中にレーザーを集光照射した。レーザーのパルス強度は１．９５ｎＪ／パルスであった。シャッターの開閉時間により、８パルス（１／１２５秒）、６２パルス（１／１６秒）、２４０００パルス（２４秒）、照射なし（０秒）とし、パルス数を変化させた。
レーザー照射後は１８℃に設定した恒温槽内に静置して、その後の結晶成長を観察した。レーザー照射２日後の写真を図８に示す。結晶の析出数が、レーザー照射回数とともに増加した。また、照射していないサンプルにおいて、小さな結晶が非常に多く析出した。これは、高過飽和溶液のために、結晶核が溶液中の至る所で自然発生したためであり、一度に大量の核発生につながった。これは、通常の結晶育成においても、よく観られることであり、結晶の高品質化、大型化の障壁となっている。一方、レーザーを照射したサンプルにおいては、室温の低過飽和溶液内で結晶核が生成し、その核が種結晶となり、成長した。そのため、パルス数が増加すると、結晶核の生成量が増加するため、結果として、結晶析出が増加している。
このように、結晶核の発生はレーザーパルスの照射回数に依存した現象であると考えられる。照射回数の増加により結晶数が増えることは、照射回数の増加により結晶が生成する確率が増加することと同義である。また、レーザーによる爆発現象が起こるためのレーザー強度が照射回数の増加により減少する現象（インキュベーション効果）が一般に知られている（例えば、Ｓ．Ｐｒｅｕｓｓ等（Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６２（２３），７  Ｊｕｎｅ  １９９３  ｐ３０４９−３０５１））。つまり、照射回数の増加により、結晶生成に必要なレーザーパルスの光密度、レーザー強度が減少することが考えられる。本実施例においても、複数発のレーザー照射によるレーザー強度が、ポリスチレン微粒子の動きによって定義したレーザー強度の下限を大きく下回るが、これは蛋白質分子がポリスチレン微粒子よりも遙かに小さいことと、パルスレーザーの複数発照射の効果であると考えられる。ただし、これらは、あくまでも本発明者等の推察であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例４】  本実施例は、リボヌクレアーゼＨ（１７ｋＤａ）の結晶化の実施例である。タンパク質溶液は、５ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＨを、０．０５Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に、室温で溶解することで調製した。その後、メンブランフィルタにて不純物を除去した。また、サーバー液（外液）として、０．２Ｍのトリス塩酸、ｐＨ９．０を作成した。レーザー照射による結晶化は、図６に示すレーザー照射装置および結晶化プレートを用いて、シッティングドロップ蒸気拡散法にて行った。
すなわち、タンパク質溶液１０μｌを結晶育成容器部１０７に入れ、サーバー溶液部１０６に１００μｌの外液を分注した。そして、室温にてタンパク質溶液中にレーザーを集光照射した。レーザーの照射は、温度・湿度管理したクリーンルーム内（温度２３℃±２℃、湿度６５％±５％）で行った。レーザーの波長は７８０ｎｍ、時間幅は２００フェムト秒（ｆｓ）、レーザー発振の繰り返し周波数は１ｋＨｚである。レーザー光強度は、波長板と偏光子により調節した。レーザー光の照射回数は、シャッターの開閉時間を変化させることにより調整した。レーザーのパルス強度は１．９５ｎＪ／パルスであった。シャッターの開閉時間により、８パルス（１／１２５秒）、６２パルス（１／１６秒）、４０００パルス（４秒）、８０００パルス（８秒）、照射なし（０秒）とし、パルス数を変化させた。
レーザー照射後は１４℃に設定した恒温槽内に静置して、その後の結晶成長を観察した。レーザー照射１日後の写真を図９に示す。照射していないサンプルにおいては、結晶の析出が２週間以上経っても見られなかった。しかしながら、レーザーの照射条件により析出状態に違いが見られた。８パルスでは、結晶核が生成しなかったのに対して、６２パルスと４０００パルスを照射した溶液からは、結晶の析出が観測できた。また、８０００パルスを照射した溶液内には、変性したリボヌクレアーゼＨが見られた。
【実施例５】  本実施例は、グルコースイソメラーゼ（１７３ｋＤａ）の結晶化の実施例である。タンパク質溶液は、２０ｍｇ／ｍｌのグルコースイソメラーゼを、０．２Ｍの硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．０）に室温で溶解して調製した。その後、メンブランフィルタにて不純物を除去した。また、サーバー液（外液）として、０．２Ｍの硫酸アンモニウム、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を溶解した溶液（ｐＨ７．０）を調製した。レーザー照射による結晶化は、図６に示すレーザー照射装置および結晶化プレートを用いて、シッティングドロップ蒸気拡散法にて行った。
すなわち、タンパク質溶液１０μｌを結晶育成容器部１０７に入れ、サーバー溶液部１０６に１００μｌの外液を分注した。その後、サーバー溶液部１０６から５μｌをピペットにて吸い上げ、結晶育成容器部１０７に注入し、タンパク質溶液とサーバー溶液を十分混ぜた。そして、室温にてタンパク質溶液中にレーザーを集光照射した。レーザーの照射は、温度・湿度管理したクリーンルーム内（温度２３℃±２℃、湿度６５％±５％）で行った。レーザーの波長は７８０ｎｍ、時間幅は２００フェムト秒（ｆｓ）、レーザー発振の繰り返し周波数は１ｋＨｚである。レーザー光強度は、波長板と偏光子により調節した。レーザー光の照射回数は、シャッターの開閉時間を変化させることにより調整した。レーザーのパルス強度は１．９５ｎＪ／パルスであった。シャッターの開閉時間により、８パルス（１／１２５秒）、４０００パルス（４秒）、照射なし（０秒）とし、パルス数を変化させた。
レーザー照射後は１８℃に設定した恒温槽内に静置して、その後の結晶成長を観察した。レーザー照射１日後の写真を図１０に示す。レーザーを照射した溶液からは結晶の析出が観察できたが、照射していないサンプルにおいては、結晶の析出が１ヶ月以上経っても見られなかった。本実施例では、分子量が約２０万の巨大タンパク質であるグルコースイソメラーゼを結晶化できた。このことにより、レーザー照射を利用する本発明の方法は、このような巨大タンパク質の結晶化にも有効だといえる。
【実施例６】  本実施例は、トリパノソーマ由来プロスタグランジンＦ２α合成酵素（３１ｋＤａ）の結晶化の実施例である。タンパク質溶液は、２０ｍｇ／ｍｌの前記合成酵素を、０．００５Ｍのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）と共に、０．０４Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に室温で十分溶解させて、調製した。その後、メンブランフィルタにて不純物を除去した。また、サーバー溶液（外液）として、０．０１Ｍのヘペス水酸化ナトリウム緩衝液（ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ）、２％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００、１．２Ｍの硫酸アンモニウムの溶液（ｐＨ７．５）を調製した。
レーザー照射による結晶化は、図７に示すレーザー照射装置および結晶化容器を用い、ハンギングドロップ蒸気拡散法にて行った。図示のように、このレーザー照射装置では、フェムト秒レーザー照射装置１０１から照射されたレーザーが、ミラー１０２、波長板１０３、偏光子１０４およびシャッター１０５を通過して対物レンズ（１０倍）１０８で集光され、結晶化容器１１８の結晶溶液１１７に照射されるようになっている。そして、前記結晶溶液１１７は、接眼レンズ１１２で肉眼で観察できるようになっており、またＣＣＤ１１３カメラおよびモニター１１４によっても観察可能となっている。同図において、１１６は外液であり、１１５はガラス板であり、１１９はグリースである。
図示のように、タンパク質溶液２μｌと外液２μｌを混合した結晶化溶液の液滴をガラス板１１５上に形成した。結晶化容器１１８に外液１１６を５００μｌ入れ、前記結晶化溶液の液滴１１７を吊り下げるようにしてガラスで蓋をした。このとき、グリース１１９を用いて密封させた。外液１１６が落下しないように注意しながら、結晶化容器１１８を逆さにし、結晶化溶液の液滴１１７中にレーザーを集光照射した。レーザーの照射は、温度・湿度管理したクリーンルーム内（温度２３℃±２℃、湿度６５％±５％）で行った。レーザーの波長は７８０ｎｍ、時間幅は２００フェムト秒（ｆｓ）、レーザー発振の繰り返し周波数は１ｋＨｚである。レーザー光強度は、波長板と偏光子により調節した。レーザー光の照射回数は、シャッターの開閉時間を変化させることにより調整した。レーザーのパルス強度は１．９５ｎＪ／パルスであった。シャッターの開閉により６２パルス（１／１６秒）を照射した。対象実験として、レーザー照射なしサンプルを育成した。
レーザー照射後は、２０℃に設定した恒温槽内に静置して、その後の結晶成長を観察した。レーザー照射７日後の写真を図１１に示す。レーザーを照射した溶液からは結晶の析出が観察できたが、照射していないサンプルにおいては、結晶の析出が３ヶ月以上経っても見られなかった。本実施例では、レーザー照射により短期間で結晶が生じた。
【実施例７】  本実施例は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）ネイティブの結晶化の実施例である。タンパク質溶液は、２０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡネイティブ、を０．００２５Ｍのヘペス緩衝液（ｐＨ７．５）に室温で溶解することにより調製した。その後、メンブランフィルタにて不純物を除去した。また、サーバー溶液（外液）として、▲１▼０．２Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムおよび３０％イソプロパノールの溶液（ｐＨ６．５）と▲２▼０．２Ｍの酢酸アンモニウム、０．１Ｍのクエン酸ナトリウムおよび３０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００の溶液（ｐＨ５．６）を調製した。
レーザー照射による結晶化は、図６に示すレーザー照射用および結晶化プレートを使用し、シッティングドロップ蒸気拡散法にて行った。タンパク質溶液２μｌを結晶育成容器部１０７に入れ、サーバー溶液部１０６に１００μｌの外液▲１▼と▲２▼をそれぞれ分注した。その後、サーバー溶液部１０６から２μｌをピペットにて吸い上げ、結晶育成容器部１０７に注入した。タンパク質溶液と外液が十分に混ざった後、室温にてタンパク質溶液中にレーザーを集光照射した。レーザーのパルス強度は１．９５ｎＪ／パルスであった。シャッターの開閉により、１０００パルス（１秒）を照射した。対象実験として、照射なしサンプルを育成した。
レーザー照射後は２０℃に設定した恒温槽内に静置して、その後の結晶成長を観察した。レーザー照射７日後の写真を図１２に示す。レーザーを照射した溶液からは結晶の析出が観察できたが、照射していないサンプルにおいては、結晶の析出が１ヶ月以上経っても見られなかった。本タンパク質に関して、これまでに結晶が得られたことはなく、本実施例において、初めて結晶化が実現できた。
【実施例８】  本実施例は、大腸菌主要異物排出トランスポーター（ＡｃｒＢ）を結晶化した例である。ＡｃｒＢはポリトピック型膜タンパク質であり、１０４９アミノ酸残基からなる単量体が、３個絡み合った３量体タンパク質である。
タンパク質溶液は、２８ｍｇ／ｍｌのヒスチジン標識を付けたＡｃｒＢに、０．０２Ｍの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．２）、１０％グリセロールおよび０．２％ドデシルマルトシドを添加して、調製した。サーバー液（外液）として、１４．１〜１４．６％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００、０．０８Ｍの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．２）と、０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム−塩酸（ｐＨ５．６）とを調製した。
レーザー照射による結晶化は、図６に示す結晶化容器と装置を使用し、シッティングドロップ蒸気拡散法にて行った。
タンパク質溶液２μｌを、結晶育成容器部１０７に入れ、サーバー溶液部１０６に５０μｌの前記外液を分注した。その後、サーバー溶液部１０６から２μｌをピペットにて吸い上げ、結晶育成容器部１０７に注入し、タンパク質溶液と外液を十分に混合した。本実施例では、ＰＥＧ４０００の濃度を１４．１％から１４．６％までの０．１％刻みで６条件の育成溶液を準備し、それぞれの育成溶液で結晶化を行った。その後、温度・湿度管理したクリーンルーム内（温度２３℃±２℃、湿度６５％±５％）にて高出力フェムト秒チタンサファイアレーザーを対物レンズ（倍率１０倍）により集光し、タンパク質溶液中に照射した。レーザーの波長は７８０ｎｍ、時間幅は２００フェムト秒（ｆｓ）、レーザー発振の繰り返し周波数は１ｋＨｚ、レーザーのパルス強度は８００ｎＪ／パルスであった。シャッターの開閉時間により、２５０パルス（１／４秒）を照射した。対象実験として、照射なしサンプルを育成した。
レーザー照射後は２５℃に設定した恒温槽内に静置して、その後の結晶成長を観察した。レーザー照射２日後の写真を図１３に示す。図示のように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００の濃度を変えて結晶育成溶液を調製したが、いずれの育成溶液においてもレーザーを照射した溶液からは結晶の析出が観察できたが（図１３において矢印で示す）、照射しないサンプルからは、１週間後においても結晶の析出が確認できなかった（図示せず）。
膜タンパク質は、結晶化が困難であるが、本実施例では、膜タンパク質の結晶化が実現できた。
（参考例２）
この参考例は、容器を運動させてタンパク質を結晶化した例である。
ニワトリ卵白リゾチームの結晶育成において、溶液攪拌を行った。タンパク質溶液は蒸留水５０ｍｌ、酢酸ナトリウム三水和物０．４６７ｇの中に酢酸を加えｐＨ４．５に調整した後、塩化ナトリウム１．２５ｇおよびニワトリ卵白リゾチーム１．２５ｇを追加したものを用いた。室温で調整した溶液を、１００ｍｌのテフロン容器に入れ、恒温水槽にて４０℃で２４時間保持し、完全に溶解させた。その後、２５℃まで５時間で冷却し、穴径０．２μｍのメンブランフィルタにて不純物を除去した。一方、リザーバー溶液は蒸留水５０ｍｌ、酢酸ナトリウム三水和物０．４６７ｇの中に酢酸を加えｐＨ４．５に調整した後、塩化ナトリウム３ｇを追加したものを用いた。
タンパク質溶液３μｌおよび１０μｌに対して、リザーバー溶液を３００μｌとし、溶液攪拌の有無による違いを調べた。結晶化手法は、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いた。また、フロリナート（前記タンパク質溶液も比重が重い液）を用いた２液界面での結晶育成であるフローティングドロップ蒸気拡散法についても同時に実験を行った。フロリナート溶液量は１０μｌである。結晶育成は２０℃一定温度で行った。
攪拌機構はロータリー振盪器（タイテック製ＢＲ−１５）を用いた。回転速度は、溶液が緩やかに攪拌される５０ｒｐｍに設定した。この攪拌装置の模式図を図１４に示す。図示のように、振盪器２０２に、ウエルプレート２０１を載せて回転運動させて攪拌した。また、ウエルプレート２０１の各ウエルは、２つの小ウエルと１つの大ウエルとから構成されている。Ｆｌｏａｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ法を適用する小ウエルには、前記タンパク質溶液およびフロリナート２１４が入れてあり、Ｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ法を適用する小ウエルでは、前記タンパク質溶液２１２が入れられている。また、大ウエルでには、リゾチウム以外の成分が高濃度で溶解しているリザーバー溶液２１３が入れられている。この方法では一度にたくさんの溶液を簡便に攪拌することができる。
結晶の育成結果を図１５に示す。溶液攪拌の有無で結晶析出数と結晶サイズに明らかな違いが生じた。図１５Ａ、Ｂに示すように、溶液を攪拌しない従来法においては、非常に小さい結晶（微結晶）が数多く析出した。一方、図１５Ｃ，Ｄに示すように、溶液攪拌した育成では、結晶の析出数が少なく大きな結晶が得られた。また、溶液攪拌シッティングドロップ法（図１５Ｃ参照）に比べて、溶液攪拌フローティングドロップ法（図１５Ｄ）の方が結晶の析出がより少なく、結晶サイズも大きかった。
つぎに、本発明の容器の実施例について、図に基づき説明する。
【実施例９】  図１６の断面図に、本発明の第１の容器の一例を示す。図示のように、この容器３０１は、第１の部屋３１１と第２の部屋３１３を有し、前記両部屋は、通路で連通している。この容器３０１の上部は、蓋体３１６で覆われて密閉状態となっており、また前記容器３０１の底部３１５は、レーザー光３１７が透過できるように、前記第１の部屋に該当する部分が透明若しくは半透明になっている。この底の部分の材質は、レーザー光を通せば、特に制限されず、例えば、アクリル樹脂等の透明樹脂、石英ガラス、ガラス等の透明部材が使用できる。また、その他の部分の部材は、特に制限されず、一般の樹脂やガラス等が使用できる。この容器全体の大きさは、特に制限されず、例えば、縦２０〜１８０ｍｍ×横１０〜１２０×高さ３〜５０ｍｍ、好ましくは、縦４０〜１５０ｍｍ×横２０〜１００×高さ５〜３０ｍｍ、より好ましくは縦５０〜１３０ｍｍ×横３０〜８０×高さ１０〜２０ｍｍである。第１の部屋３１１には、タンパク質溶液等の溶液３１２が入れられ、第２の部屋３１３には、リザーバー溶液３１４が入れられるため、第１の部屋３１１は、第２の部屋３１３の部屋より小さいほうがよい。この容器３０１は、例えば、つぎのようにして使用される。
まず、蓋体３１６を外して、第１の部屋３１１にタンパク質溶液等の高分子溶液３１２を入れ、第２の部屋３１３にリザーバー溶液３１４を入れ、蓋体３１６で蓋をして密閉する。すると、同図において矢印で示すように、高分子溶液３１２から発生した水蒸気が通路を通って第２の部屋３１３に移行し、これによって高分子溶液３１２の溶媒の蒸発が促進される。そして、高分子溶液３１２が過飽和状態になったら、結晶核を強制的に生成させるため、容器３０１の底部から、例えば、パルスレーザー光３１７を高分子溶液３１２に照射する。結晶核が生成すれば、そのまま、結晶を成長させればよいし、結晶核が生成しなければ、その条件は、結晶化に不適と判断して、別の条件で結晶化を試みればよい。
このように、パルスレーザーを照射して結晶核の生成を観察し、結晶核が生成すれば、その溶液等の条件は、結晶化に適していると判断できるし、そのまま育成すれば結晶が得られる。また、パルスレーザーを照射して溶質の状態を観察し、溶質が変化していれば、その溶液等の条件は結晶化に適していると判断できる。前記溶質の変化は、タンパク質の場合、例えば、立体構造の変化（変性）である。
本発明の容器において、レーザーの種類、照射条件等は、本発明の製造方法等で記載したとおりであり、これらのレーザーの条件などは、本発明の他の容器若しくはプレートでも共通である。
【実施例１０】  つぎに、一つのプレート内に前記第１の容器を複数形成した例を、図１７の斜視図に示す。
図示のように、このプレート３０２は、６個の第１の容器３２１が形成されており、これは、第１の部屋３２１ａと第２の部屋３２１ｂを有し、前記両部屋は通路で連通している。また、このプレート３０２は、前記第１の容器３２１が形成されたプレート本体３２２、底部３２３および蓋体３２４とから構成されている。底部３２３は、レーザー光３２５が照射可能なように透明若しくは半透明部材から形成されている。このプレート３０２の形成材料および容器３２１の大きさ等については、前述の第１の容器と同様である。また、このプレート３０２の大きさは、特に制限されず、例えば、縦２０〜１８０ｍｍ×横１０〜１２０×高さ３〜５０ｍｍ、好ましくは、縦４０〜１５０ｍｍ×横２０〜１００×高さ５〜４０ｍｍ、より好ましくは縦５０〜１３０ｍｍ×横３０〜８０×高さ１０〜３０ｍｍである。このプレート３０２において、容器３２１の個数は６個であるが、本発明はこれに限定されず、プレートあたり、容器数１〜１５３６個、好ましくは２〜３８４個、より好ましくは４〜９６個である。このプレート３０２は、例えば、つぎのようにして使用される。
すなわち、まず、容器３２１部分の第１の部屋３２１ａに高分子溶液を入れ、第２の部屋３２１ｂにリザーバー溶液を入れると、蒸気拡散により、高分子溶液の溶媒の蒸発が促進される。そして、高分子溶液が過飽和状態となったら、前述のように、パルスレーザー３２５を照射して、結晶核を強制的に生成させる。結晶核が生成したら、これを育成して目的とする高分子結晶を得ることができる。また、結晶核が生成しない場合は、結晶化条件が不適当と判断して、次の条件で結晶化を試みる。このプレートでは、複数の容器が形成されているから、高分子溶液の濃度を変えるなど容器毎に異なる結晶化条件を設定でき、また、容器毎に異なる条件でレーザーを照射できる。
【実施例１１】  つぎに、本発明の第２の容器の一例を図１８に示す。同図において、（Ａ）は、平面図であり、（Ｂ）は断面図である。
図示のように、この容器３０３は、円盤の底に円柱が結合した形状である。前記円盤の周辺部には、円中心から放射状に８個の第１の部屋３３１が形成され、前記円柱の中には、１つの第２の部屋３３２が形成されており、前記第１の部屋３３１のそれぞれから通路３３３が延びて、第２の部屋３３２と連通している。前記８個の通路３３３において、各通路３３３は、それぞれ通路径が異なっている。この容器３０３全体の大きさは、特に制限されず、第１の部屋の大きさと個数や、第２の部屋の大きさ等により適宜決定される。前記第１の部屋の大きさは、例えば、内径０．５〜１０ｍｍ、深さ１〜５０ｍｍ、好ましくは、内径１〜５ｍｍ、深さ３〜４０ｍｍ、より好ましくは内径１〜３ｍｍ、深さ３〜３０ｍｍ、であり、第１の部屋の個数は、例えば、１〜１５３６個、好ましくは２〜３８４個、より好ましくは４〜９６個である。前記第２の部屋の大きさは、例えば、内径１〜３０ｍｍ、深さ１〜５０ｍｍ、好ましくは、内径２〜２０ｍｍ、深さ２〜４０ｍｍ、より好ましくは内径３〜１５ｍｍ、深さ３〜３０ｍｍである。前記通路の長さも制限されず、例えば、０．５〜５０ｍｍ、好ましくは１〜３０ｍｍ、より好ましくは１〜２０ｍｍである。また、この通路は、その通路径がそれぞれ異なるが、例えば、０．３〜１０ｍｍ、好ましくは０．５〜５ｍｍ、より好ましくは０．５〜３ｍｍである。この容器３０３の材質も特に制限されず、例えば、樹脂やガラスなどで構成されるが、第１の部屋にレーザーを照射する場合は、その部分をレーザーが透過するように、前述の透明若しくは半透明部材で構成すればよい。この容器３０３は、例えば、つぎのようにして使用する。
すなわち、まず、複数の第１の部屋３３１に高分子溶液３３４を入れ、第２の部屋３３２にリザーバー溶液３３５を入れると、図中の矢印で示すように、高分子溶液３３４から発生した水蒸気が通路３３３を通り、第２の部屋３３２に移動するという蒸気拡散により、高分子溶液３３４の溶媒の蒸発が促進される。この蒸気拡散において、通路３３３の通路径がそれぞれ異なるため、第１の部屋３３３のそれぞれの蒸気拡散条件が異なることになる。したがって、複数の第１の部屋において、結晶核が生成したものは、そのまま育成を続けて目的とする高分子結晶を得ることができる。また、結晶核が生じない第１の部屋は、結晶化条件が不適と判断することができる。さらに、高分子溶液３３４が過飽和状態となったら、前述のように、パルスレーザーを照射して、結晶核を強制的に生成させてもよい。結晶核が生成したら、これを育成して目的とする高分子結晶を得ることができる。また、結晶核が生成しない場合は、結晶化条件が不適当と判断して、次の条件で結晶化を試みる。
【実施例１２】  つぎに、本発明の第２の容器のその他の例を図１９に示す。同図において、（Ａ）は、平面図であり、（Ｂ）は断面図である。
図示のように、この容器３０４は、円盤の底に円柱が結合した形状である。前記円盤の周辺部には、円中心から放射状に８個の第１の部屋３４１が形成され、前記円柱の中には、１つの第２の部屋３４２が形成されており、前記第１の部屋３４１のそれぞれから通路３４３が延びて、第２の部屋３４２と連通している。前記８個の通路３４３において、各通路３３３は、それぞれ通路長が異なっている。この容器３０４全体の大きさは、特に制限されず、第１の部屋の大きさと個数や、第２の部屋の大きさ等により適宜決定される。前記第１の部屋の大きさは、例えば、内径０．５〜１０ｍｍ、深さ１〜５０ｍｍ、好ましくは、内径１〜５ｍｍ、深さ３〜４０ｍｍ、より好ましくは内径１〜３ｍｍ、深さ３〜３０ｍｍ、であり、第１の部屋の個数は、例えば、１〜１５３６個、好ましくは２〜３８４個、より好ましくは４〜９６個である。前記第２の部屋の大きさは、例えば、内径１〜３０ｍｍ、深さ１〜５０ｍｍ、好ましくは、内径２〜２０ｍｍ、深さ２〜４０ｍｍ、より好ましくは内径３〜１５ｍｍ、深さ３〜３０ｍｍである。前記通路の長さも制限されず、例えば、０．５〜５０ｍｍ、好ましくは１〜３０ｍｍ、より好ましくは１〜２０ｍｍである。また、この通路は、その通路径がそれぞれ異なるが、例えば、０．３〜１０ｍｍ、好ましくは０．５〜５ｍｍ、より好ましくは０．５〜３ｍｍである。この容器４の材質も特に制限されず、例えば、樹脂やガラスなどで構成されるが、第１の部屋にレーザーを照射する場合は、その部分をレーザーが透過するように、前述の透明若しくは半透明部材で構成すればよい。この容器３０４は、例えば、つぎのようにして使用する。
すなわち、まず、複数の第１の部屋３４１に高分子溶液３４４を入れ、第２の部屋３４２にリザーバー溶液３４５を入れると、図中の矢印で示すように、高分子溶液３４４から発生した水蒸気が通路３４３を通り、第２の部屋３４２に移動するという蒸気拡散により、高分子溶液３４４の溶媒の蒸発が促進される。この蒸気拡散において、通路３４３の通路長がそれぞれ異なるため、第１の部屋３４３のそれぞれの蒸気拡散条件が異なることになる。したがって、複数の第１の部屋において、結晶核が生成したものは、そのまま育成を続けて目的とする高分子結晶を得ることができる。また、結晶核が生じない第１の部屋は、結晶化条件が不適と判断することができる。さらに、高分子溶液３４４が過飽和状態となったら、前述のように、パルスレーザーを照射して、結晶核を強制的に生成させてもよい。結晶核が生成したら、これを育成して目的とする高分子結晶を得ることができる。また、結晶核が生成しない場合は、結晶化条件が不適当と判断して、次の条件で結晶化を試みる。
なお、実施例１１では、通路径を変化させ、実施例１２では、通路長を変化させたが、これらを組み合わせてもよい。また、実施例１１の容器、実施例１２の容器およびこれらの組み合わせの容器の少なくとも一つを、１つのプレート内に複数形成してもよい。このプレートの大きさ等の条件は、例えば、実施例１０のプレートと同様である。
【実施例１３】  つぎに、本発明の第３の容器の一例を、図２０に示す。図示のように、この容器３０５は、大容器３５１の中に、小容器３５２が配置された構成となっている。大容器３５１は、円柱状であり、その上部は、蓋体で蓋がされている。前記小容器３５２は、逆円錐台形状本体部（大容積部）と、この本体部分の上部と連結する円筒部（小容積部）とからなり、前記円筒部の先端は開口している。大容器３５１の内壁と小容器３５２の外壁との間の空間が、リザーバー溶液３５４を入れる第２の部屋である。また、小容器５１の内部若しくはその円筒部先端口付近が、高分子溶液３５５を入れる若しくは保持する第１の部屋となる。この容器３０５の大きさは、特に制限されない。前記大容器３５１の大きさは、例えば、内径３〜３０ｍｍで深さ５〜１００ｍｍであり、好ましくは、内径５〜２５ｍｍで深さ１０〜５０ｍｍであり、より好ましくは、内径１０〜２０ｍｍで深さ１０〜３０ｍｍである。小容器３５２の大きさは、例えば、逆円錐台形状本体部（大容積部）において、最大内径３〜３０ｍｍ、最小内径０．３〜５ｍｍ、高さ４〜９０ｍｍ、前記円筒部（小容積部）において、内径０．３〜５ｍｍ、高さ０．１〜５ｍｍであり、好ましくは、逆円錐台形状本体部（大容積部）において、最大内径５〜２５ｍｍ、最小内径０．５〜３ｍｍ、高さ９〜４５ｍｍ、円筒部（小容積部）において、内径０．５〜３ｍｍ、高さ０．１〜３ｍｍであり、より好ましくは、逆円錐台形状本体部（大容積部）において、最大内径１０〜２０ｍｍ、最小内径１〜２ｍｍ、高さ９〜２５ｍｍ、円筒部（小容積部）において、内径１〜２ｍｍ、高さ０．１〜２ｍｍである。また、容器３０５の材質は、特に制限されず、例えば、樹脂、ガラス等が使用できる。この容器において、レーザー光を照射する場合は、レーザー光が通過する部分は透明若しくは半透明の部材で構成され、そのような部材としては、前述のものがあげられる。この容器３０５は、例えば、つぎのようにして使用する。
すなわち、まず、大容器３５１（第の部屋３５３）にリザーバー溶液３５４を入れ、小容器３５２は、非混合性高比重液３５６で満たす。また、小容器３５２の底部には、マグネット攪拌子３０７を配置する。そして、小容器３５２の円筒部先端に、高分子溶液３５５の液滴を配置する。この状態で、容器３０５をマグネットスターラー３０６の上に置き、前記攪拌子３０７を回転させる。このようにすれば、リザーバー溶液３５４の作用により、高分子溶液３５５からは水蒸気の発生が促進される。また、攪拌子３０７の回転により、非混合性高比重液３５６が攪拌され、その振動が高分子溶液３５５にも伝わり、間接的に高分子溶液３５５も攪拌され、その結果、結晶核の生成が促進される。そして、高分子溶液の結晶核が生成したら、そのまま育成を続け、目的とする結晶を得てもよいし、結晶核が生成しない場合は、その条件は、結晶化条件に不適と判断し、次の条件で結晶化を試みればよい。さらに、過飽和状態になったら、高分子溶液３５５に、レーザー光を照射してもよい。また、この実施例の容器を、１つのプレート内に複数形成してもよい。その条件は、例えば、実施例１０のプレートと同様である。
【産業上の利用可能性】  以上のように、本発明の方法は、タンパク質等の有機物の結晶の製造若しくはスクリーニングに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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