(57)【要約】本発明は、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する新規ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチドおよびその利用方法を提供する。  本発明は、以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチド：（１）作用：ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを補酵素として、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに作用し、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する、（２）作用至適ｐＨ：５．０から６．０、（３）作用至適温度：４０℃から５０℃、（４）分子量：ゲル濾過分析において約４００００、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約３００００である。また、本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドを高生産する形質転換体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチド：
（１）作用：ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを補酵素として、式（１）
2003093477.tif 000022
で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに作用し、式（２）
2003093477.tif 000023
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する、
（２）作用至適ｐＨ：５．０から６．０、
（３）作用至適温度：４０℃から５０℃、
（４）分子量：ゲル濾過分析において約４００００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約３００００。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列、または、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中に少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含み、かつ、式（１）
2003093477.tif 000024
で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して、式（２）
2003093477.tif 000025
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドがロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する微生物に由来する請求の範囲第１または２項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ロドトルーラ属に属する微生物が、ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株である請求の範囲第３項記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲第１から４項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチド：
（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｄ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、式（１）
2003093477.tif 000026
で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して、式（２）
2003093477.tif 000027
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲第５または６項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
プラスミドｐＮＴＲＧである請求の範囲第７項記載の発現ベクター。
【請求項９】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求の範囲第７項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素である、請求の範囲第９項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミドｐＮＴＲＧＧ１である請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求の範囲第７から１１項のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
【請求項１３】
前記宿主細胞が大腸菌である請求の範囲第１２項に記載の形質転換体。
【請求項１４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５７）である請求の範囲第１３項に記載の形質転換体。
【請求項１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５８）である請求の範囲第１３項に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求の範囲第１２から１５項のいずれかに記載の形質転換体の培養物またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１７】
前記カルボニル基を有する化合物が、一般式（３）
2003093477.tif 000028
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、ニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される光学活性１−フェニルエタノン誘導体であり、前記光学活性アルコールが、一般式（４）
2003093477.tif 000029
（式中、Ｒ１、Ｒ２、および、Ｒ３は前記と同じ）で表される光学活性１−フェニルエタノール誘導体である請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
前記カルボニル基を有する化合物が、式（１）
2003093477.tif 000030
で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンであり、前記光学活性アルコールが、式（２）
2003093477.tif 000031
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールである、請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記カルボニル基を有する化合物が、式（５）
2003093477.tif 000032
で表される１−（２’−フルオロフェニル）エタノンであり、前記光学活性アルコールが、式（６）
2003093477.tif 000033
で表される（Ｓ）−１−（２’−フルオロフェニル）エタノールである、請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記カルボニル基を有する化合物が、一般式（７）
2003093477.tif 000034
（式中、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アジド、ベンジロキシ基、置換基を有してもよいアルキル基を示し、Ｒ５はアルキル基、フェニル基を示す。）で表される３−オキソエステル誘導体であり、前記光学活性アルコールが一般式（８）
2003093477.tif 000035
（式中、Ｒ４およびＲ５は前記と同じ）で表される光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体である請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記カルボニル基を有する化合物が、式（９）
2003093477.tif 000036
で表される４−クロロアセト酢酸エチルであり、前記光学活性アルコールが、式（１０）
2003093477.tif 000037
で表される（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルである請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、式（１）
2003093477.tif 000002
で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して、式（２）
2003093477.tif 000003
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有する微生物より単離された、該活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明はまた、該形質転換体を用いた光学活性アルコール、とりわけ光学活性１−フェニルエタノール誘導体または光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体の製造法に関する。光学活性１−フェニルエタノール誘導体、および光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体は、医薬、農薬等の合成原料として有用な化合物である。
背景技術
光学活性１−フェニルエタノール誘導体の製造方法としては、
１）２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノンに、アシビア属やオガタエア属等に属する微生物またはその処理物を作用させ、光学活性２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノールを得る方法（特開平４−２１８３８４号公報、特開平１１−２１５９９５号公報）、
２）１−（置換フェニル）エタノンにゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）の乾燥菌体を作用させ、光学活性１−（置換フェニル）エタノールを得る方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，８９５７（１９９８））、
が開示されている。
また、光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体の製造方法としては、
３）４−置換アセト酢酸エステルに、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）由来のアルデヒドレダクターゼの遺伝子を導入した遺伝子組換え大腸菌を作用させ、（Ｒ）−４−置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルを得る方法（特開平８−１０３２６９号公報）、が開示されている。
しかしながら、これらの方法はいずれも、その基質仕込み濃度または基質から生成物への転換率が低く、より効率の良い製造方法が望まれていた。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、光学活性１−フェニルエタノール誘導体または光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体の製造に有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。
また、本発明は、該形質転換体を用いて光学活性１−フェニルエタノール誘導体または光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体を効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有する微生物より、該活性を有するポリペプチドを単離し、該ポリペプチドを利用することにより（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールのみならず、（Ｓ）−１−（２’−フルオロフェニル）エタノール等の光学活性１−フェニルエタノール誘導体、および、（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに代表される光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体等の有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出した。また、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、さらには、発現ベクター並びに形質転換体を創製することにも成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成し得るポリペプチドである。
また、本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを高生産する形質転換体である。
さらに、本発明は、該形質転換体を用いた、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノール、（Ｓ）−１−（２’−フルオロフェニル）エタノール、および（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに代表される、光学活性１−フェニルエタノール誘導体または光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体の実用的な製造方法でもある。
発明の詳細な開示
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明のポリペプチドとしては、式（１）
2003093477.tif 000004
で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して、式（２）
2003093477.tif 000005
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有するポリペプチドであればいずれも用いることができる。
このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物から単離することができる。ポリペプチドの起源として用いられる微生物は、特に限定されないが、例えばロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株を挙げることができる。
本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらのポリペプチドを単離および／または精製してそのアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工程、およびこのポリヌクレオチドを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程を包含する方法により得られ得る。
本発明のポリペプチドを有する微生物からの該ポリペプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、超音波破砕機などで破砕し、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液から、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリペプチドが精製され得る。
該酵素活性の測定は、０．３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行い得る。
本発明のポリペプチドとしては、例えば、以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチドを挙げることができる。
（１）作用：ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを補酵素として、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに作用し、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する、
（２）作用至適ｐＨ：５．０から６．０、
（３）作用至適温度：４０℃から５０℃、
（４）分子量：ゲル濾過分析において約４００００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約３００００。
また、本発明のポリペプチドとして、例えば、（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列、または、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中に少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含み、かつ、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中に少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリペプチドに包含される。
本発明のポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができるが、例えば、（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、（ｄ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプロープとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。なお、ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のポリヌクレオチドをあげることができ、コードされるポリペプチドが２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリヌクレオチドに包含される。
ここで、「配列の同一性（％）」とは、対比される２つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＵｎｉｘベースのＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０  １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本発明のポリヌクレオチドは、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株を挙げることができる。
以下に、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有する微生物より、本発明のポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
まず、精製した前記ポリペプチド、および該ポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼで消化することにより得られるペプチド断片の部分アミノ酸配列を、エドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチドプライマーを合成する。次に、本発明のポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。
この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部を増幅する。ここで増幅されたポリヌクレオチドの塩基配列は、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネイション法などにより決定することができる。例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行われ得る。
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，８１８６（１９８８））によりその全体の塩基配列を決定することができる。また、染色体ＤＮＡ上の該ポリヌクレオチドがイントロンを含むものであった場合は、例えば、以下の方法によりイントロンを含まない成熟型のポリヌクレオチドの塩基配列を決定する事ができる。即ち、まず、該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のヌクレオチド単離法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の方法により、該微生物のｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型とし、先に判明している該ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端付近の配列を有するヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，８９９８（１９８８））により成熟型のポリヌクレオチドを増幅し、その塩基配列を先と同様に決定する。
本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主微生物内で該ポリヌクレオチド中の遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターから選ばれるものが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。
本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター、および、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、該ポリヌクレオチド中の遺伝子が発現するように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入することができる。
本発明のポリペプチドを用いて２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生産する場合、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ等の補酵素が必要となる。しかし、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに反応系に添加することにより、つまり補酵素再生系を本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。
補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
上記の補酵素再生能を有する酵素を、不斉還元反応系に別途添加することによっても当該反応が行われ得るが、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換せしめられた形質転換体を触媒として用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。
このような形質転換体は、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
なお、上述のように、本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むものである。好ましくはプラスミドｐＮＴＲＧである発現ベクターが挙げられる。
また、当該発現ベクターは、上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むものも挙げられる。なお、上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素であることが好ましい。より好ましくは、プラスミドｐＮＴＲＧＧ１である発現ベクターが挙げられる。
本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られたものである。宿主細胞としては、大腸菌が好ましい。
また、本発明の形質転換体として、
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５７の受託番号で、平成１４年１月２２日付で、
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５８の受託番号で、平成１４年１月２２日付で、
それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。
形質転換体中の補酵素再生能を有する酵素の活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭおよび酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行い得る。
本発明の形質転換体を用いた光学活性１−フェニルエタノール誘導体または３−ヒドロキシエステル誘導体等の光学活性アルコールの生産は、以下のように実施され得る。つまり、上記形質転換体の培養物またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることにより光学活性アルコールを製造する。
具体的には、まず、適当な溶媒中に、基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＰ等の補酵素、および、該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
形質転換体の培養は、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて行い得る。また、培養温度は好ましくは４〜５０℃である。
ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物等を意味する。さらにそれらは、ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。
また、本反応を行う際、形質転換体として、本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有する酵素（例えば、グルコース脱水素酵素）の両者を生産するものを用いる場合、反応系に補酵素再生のための基質（例えば、グルコース）を添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。
基質となるカルボニル基を有する化合物としては、例えば、式（３）
2003093477.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、ニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される１−フェニルエタノン誘導体、または、一般式（７）
2003093477.tif 000007
（式中、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アジド、ベンジロキシ基、置換基を有してもよいアルキル基を示し、Ｒ５はアルキル基、フェニル基を示す。）で表される３−オキソエステル誘導体を挙げることができ、より詳しくは、例えば、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、１−（２’−フルオロフェニル）エタノン、または、４−クロロアセト酢酸エチル等を挙げることができる。
また、上記方法により得られる光学活性アルコールとしては、例えば式（４）
2003093477.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、および、Ｒ３は前記と同じ）で表される光学活性１−フェニルエタノール誘導体、または、式（８）
2003093477.tif 000009
（式中、Ｒ４およびＲ５は前記と同じ）で表される光学活性３−ヒドロキシエステル誘導体を挙げることができ、より詳しくは、例えば、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノール、（Ｓ）−１−（２’−フルオロフェニル）エタノール、または、（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル等を挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２におけるアルコキシ基としては、炭素数１〜３のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられる。好ましくはメトキシ基である。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５におけるアルキル基としては、炭素数１〜８のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。好ましくは炭素数１〜２のアルキル基である。
なお、Ｒ３、Ｒ４におけるアルキル基は、置換基を有してもよく、置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。
反応には、溶媒として、水系溶媒を用いてもよいし、水系溶媒と有機系溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、ヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル等が挙げられる。
反応温度は、１０℃〜７０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間は、１〜１００時間、好ましくは１０〜５０時間である。また、反応中、反応液のｐＨは、例えば水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液等を用いて、４〜１０、好ましくは５〜８に維持する。
さらに、反応は、バッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。
反応で生じた光学活性アルコールは常法により精製し得る。例えば、反応で生じた光学活性アルコールが（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノール、（Ｓ）−１−（２’−フルオロフェニル）エタノール、または（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルである場合、必要に応じて遠心分離、濾過などの処理を施して反応物から菌体等の懸濁物を除去した後、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに蒸留またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量および２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
１−（２’−フルオロフェニル）エタノンおよび１−（２’−フルオロフェニル）エタノールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
また、１−（２’−フルオロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
４−クロロアセト酢酸エチルおよび４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ジーエルサイエンス株式会社製ＰＥＧ−２０Ｍ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ  ＤＭＣＳ  １０％  ８０／１００ｍｅｓｈ（ＩＤ３ｍｍ×１ｍ）、カラム温度：１５０℃、検出：ＦＩＤ）で行い得る。
また、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１５ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、種々の有用な光学活性アルコールの優れた製造法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
実施例１  酵素の精製
以下の方法に従って、ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株より２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有する酵素を単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。
（ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株の培養）
３０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に下記の組成からなる液体培地１８Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。
培地組成（％は（ｗ／ｖ）で表示）：
グルコース                            ４．０％
イーストエキス                        ０．３％
ＫＨ２ＰＯ４                          ０．７％
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４                  １．３％
ＮａＣｌ                              ０．１％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ０．０８％
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ０．００６％
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ０．００９％
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                  ０．０００５％
ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ              ０．００１％
アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．０１％
水道水                                ｐＨ７．０
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株の培養液を１８０ｍｌずつ接種し、攪拌回転数２５０ｒｐｍ、通気量５．０ＮＬ／ｍｉｎ、３０℃で、３０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の滴下により下限ｐＨを５．５に調整しながら培養した。培養開始から１８時間後、２２時間後、２６時間後に５５％（ｗ／ｗ）グルコース水溶液６５５ｇを添加し、３０時間培養を行った。
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養液５６００ｍｌから遠心分離により菌体を集め、１０００ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．２）にて菌体を洗浄した。このようにして，該菌株の湿菌体１５９９ｇを得た。この湿菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２０００ｍｌの菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をダイノミル（Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）で破砕した後、破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液１４７０ｍｌを得た。
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た無細胞抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除去した（この際、無細胞抽出液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．５に維持しながら行った）。先と同様ｐＨ７．５を維持しながら、この遠心上清に６０％飽和となるようさらに硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、同一緩衝液で１夜透析した。
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（２５０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．３Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１夜透析を行った。
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液に終濃度１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し（この際粗酵素液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．５に維持しながら行った）、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（１００ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１夜透析を行った。
（Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＢｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（２０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。以後、この酵素をＲＲＧと呼ぶことにする。
実施例２  酵素の性質の測定
得られた酵素の酵素学的性質について検討した。
酵素活性の測定は、基本的には、０．３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で１分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。
（１）作用：
ＮＡＤＰＨを補酵素として、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに作用し、光学純度９９．９％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成した。ＮＡＤＨを補酵素として上記方法に準じて酵素活性を測定した場合、ＮＡＤＰＨを補酵素とした場合の約７％の活性を示した。
（２）作用至適ｐＨ：
緩衝液として、ジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液、および１００ｍＭ酢酸緩衝液を用いて、ｐＨを４．０〜８．０の範囲とした以外は、上記酵素活性の測定方法と同様にして、酵素活性を測定した。その結果、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに作用する至適ｐＨは５．０〜６．０であった。
（３）作用至適温度：
２０℃〜６０℃の温度とした以外は、上記酵素活性の測定方法と同様にして、酵素活性を測定した。その結果、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに作用する至適温度は４０℃〜５０℃であった。
（４）分子量：
溶離液として１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）による精製酵素のゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子量は約４００００であった。また、酵素のサブユニットの分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、標準タンパク質との相対移動度から算出した。本酵素のサブユニットの分子量は約３００００であった。
実施例３  ＲＲＧ遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ＲＲＧを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、ＤＮＡプライマー２種（プライマー１、配列番号３；プライマー２、配列番号４）を常法に従って合成した。
（ＰＣＲによるＲＲＧ遺伝子の増幅）
ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株の培養菌体からＶｉｓｓｅｒ等の方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，４１５（２０００））に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマーを用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、ＲＲＧ遺伝子の一部と考えられる約６００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された（ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を確認した。
（ｉ−ＰＣＲ法によるＲＲＧ遺伝子の全長配列の決定）
ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、前項で判明したＲＲＧ遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，８１８６（１９８８））により、染色体ＤＮＡ上のＲＲＧ遺伝子の全塩基配列を決定した（ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、塩基配列の決定は先と同様に行った。）。その塩基配列を、配列表の配列番号９および図１に示した。なお、図１において、塩基配列中でＲＲＧ遺伝子をコードしているのは下線を付した部分と考えられ、それ以外の部分はイントロンと考えられた。下線を付した塩基配列がコードするアミノ酸配列を塩基配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製ＲＲＧのリジルエンドペプチダーゼ消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製ＲＲＧの部分アミノ酸配列は全て、このアミノ酸配列中に存在した。図１中のアミノ酸配列において、精製ＲＲＧの部分アミノ酸配列と一致した部分には下線を付した。
実施例４  イントロンを含まないＲＲＧ遺伝子の取得
実施例３で決定された塩基配列を基に、ＲＲＧ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したＮ末端ＤＮＡプライマー（プライマー３、配列番号５）、および同遺伝子の３’末端の直後に終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマー（プライマー４、配列番号６）を合成した。次に、ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株の培養菌体から、同菌株の総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出、精製した。このＲＮＡを鋳型として、先に調製した２種のＤＮＡをプライマーとして用い、ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８（１９８８））により、開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し３’末端の直後に終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ切断点を付加したイントロンを含まない成熟型のＲＲＧ遺伝子を増幅した（ＲＴ−ＰＣＲはＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。
実施例５  ＲＲＧ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製
実施例４で得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＲＧを得た。
実施例６  ＲＲＧ遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を含む組換えプラスミドの作製
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと称する）の遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＳａｃＩ切断点を、また、終止コドンの直後にＢａｍＨＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方法により取得した。ＧＤＨ遺伝子の塩基配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点を付加したＮ末端ＤＮＡプライマー（プライマー５、配列番号７）と、ＧＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマー（プライマー６、配列番号８）を常法に従って合成した。これら２つのＤＮＡプライマーを用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、実施例５において構築したｐＮＴＲＧのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位（ＲＲＧ遺伝子の下流に存在する）に挿入した組換えプラスミドｐＮＴＲＧＧ１を得た。ｐＮＴＲＧＧ１の作製方法および構造を図２に示す。
実施例７  組換え大腸菌の作製
実施例５および６で得た組換えプラスミドｐＮＴＲＧおよびｐＮＴＲＧＧ１を用いて、大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）を得た。こうして得られた形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５７およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５８として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、平成１４年１月２２日付で寄託した。
実施例８  組換え大腸菌におけるＲＲＧの発現
実施例７で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）を１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＲＲＧ活性を以下のように測定した。ＲＲＧ活性の測定は、０．３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中のＲＲＧ活性を比活性として表し、ベクタープラスミドを保持する形質転換体と比較した。また、実施例１と同様の方法で調製したロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株の無細胞抽出液中のＲＲＧ活性についても同様に比較した。それらの結果を表１に示す。大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して明らかなＲＲＧ活性の増加が見られ、ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ０４１５株と比較して、比活性は約１５０倍に達した。
2003093477.tif 000010
実施例９  組換え大腸菌におけるＲＲＧおよびＧＤＨの同時発現
実施例７で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）を、実施例８と同様に処理して得られる無細胞抽出液のＧＤＨ活性を、以下のように測定した。ＧＤＨ活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭおよび酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、ＲＲＧ活性についても実施例８と同様に測定した。このように測定した無細胞抽出液中のＲＲＧおよびＧＤＨ活性を比活性として表し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）およびベクタープラスミドのみの形質転換体ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較した結果を表２に示す。大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかなＲＲＧおよびＧＤＨ活性の増加が見られた。
2003093477.tif 000011
実施例１０  ＲＲＧ遺伝子を導入した組換え大腸菌による２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンからの（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）の培養液を、ＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕液２０ｍｌにグルコース脱水素酵素（天野製薬株式会社製）２０００Ｕ、グルコース３ｇ、ＮＡＤＰ２ｍｇ、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン２ｇを添加した。この反応液を、５Ｍの水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で１８時間攪拌した。反応終了後、この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物の分析を行ったところ、収率９６％で２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールが得られた。この際、生成した２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量、および２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１１  ＲＲＧおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌による２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンからの（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの合成
実施例９で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）の培養液を、ＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕液２０ｍｌにグルコース３ｇ、ＮＡＤＰ２ｍｇ、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン２ｇを添加した。この反応液を、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物の分析を実施例１０と同様に行ったところ、収率９３％で２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールが得られた。この際、生成した２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
実施例１２  ＲＲＧおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌による４−クロロアセト酢酸エチルからの（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
実施例９で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）の培養液を、ＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕液２０ｍｌにグルコース４ｇ、ＮＡＤＰ３ｍｇを添加した。この反応液を３０℃で攪拌し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、４−クロロアセト酢酸エチル合計２ｇを１時間に０．２ｇの割合で連続的に添加した。そして、添加終了後さらに１２時間反応を継続した。反応終了後、この反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を分析したところ、収率９８％で４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが得られた。この際、生成した４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルは光学純度９９％ｅｅ以上のＲ体であった。
４−クロロアセト酢酸エチルおよび４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ジーエルサイエンス株式会社製ＰＥＧ−２０Ｍ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ  ＤＭＣＳ  １０％  ８０／１００ｍｅｓｈ（ＩＤ３ｍｍ×１ｍ）、カラム温度：１５０℃、検出：ＦＩＤ）で行った。また、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１５ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１３  ＲＲＧおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌による１−（２’−フルオロフェニル）エタノンからの（Ｓ）−１−（２’−フルオロフェニル）エタノールの合成
実施例９で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）の培養液を、ＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕液１００ｍｌにグルコース１５ｇ、１−（２’−フルオロフェニル）エタノン５ｇ、ＮＡＤＰ１５ｍｇを添加した。この反応液を、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、この反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を蒸留（５４℃／１ｍｍＨｇ）し、無色オイル状の１−（２’−フルオロフェニル）エタノール４．１ｇを得た。その比旋光度は［α］（２５、Ｄ）−４５．３（ｃ＝０．７９４，メタノール）を示し、光学純度９９．９％ｅｅのＳ体であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  １．５２（ｄ，３Ｈ），１．９７（ｂｒ，１Ｈ），５．２０（ｑ，１Ｈ），６．９９〜７．５１（ｍ，４Ｈ）
１−（２’−フルオロフェニル）エタノンおよび１−（２’−フルオロフェニル）エタノールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。また、１−（２’−フルオロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１４  ＲＲＧの基質特異性
ＲＲＧの種々のカルボニル化合物に対する還元活性を調べた。実施例２のＲＲＧ活性測定の基本反応条件において、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンのかわりに、表３に示す各種カルボニル化合物を基質として活性測定を行った。測定結果は、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを基質としたときの還元活性を１００％とした時の相対値で表し、表３に示した。
2003093477.tif 000012
産業上の利用可能性
２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを不斉的に還元して（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを生成する活性を有するポリペプチド遺伝子のクローニング、およびそのヌクレオチド配列の解析により、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になった。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、種々のカルボニル化合物から光学活性アルコールを効率良く合成することが可能となった。
【配列表】
2003093477.tif 000013
2003093477.tif 000014
2003093477.tif 000015
2003093477.tif 000016
2003093477.tif 000017
2003093477.tif 000018
2003093477.tif 000019
2003093477.tif 000020
2003093477.tif 000021
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
図２は、組換えプラスミドｐＮＴＲＧＧ１の作製方法および構造を示す図である。
【図１】
2003093477.tif 000038
【図２】
2003093477.tif 000039
【国際調査報告】
2003093477.tif 000040
2003093477.tif 000041
2003093477.tif 000042
2003093477.tif 000043