(57)【要約】本発明は、抗ＦＧＦ−８中和抗体を有効成分として含有する、関節炎の予防薬または治療薬、軟骨保護剤、関節破壊抑制剤、滑膜増殖抑制剤、および抗ＦＧＦ−８抗体を有効成分として含有する関節炎の診断薬ならびに該抗体を用いた関節炎の判定方法を提供する。
2003057251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節炎の予防薬または治療薬。
【請求項２】
ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１記載の医薬。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である請求項２記載の医薬。
【請求項４】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）である請求項３記載の医薬。
【請求項５】
ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体である請求項３記載の医薬。
【請求項６】
ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにヒト抗体の抗体重鎖定常領域（ＣＨ）および抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるヒト型キメラ抗体である請求項５記載の医薬。
【請求項７】
ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である請求項６記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
【請求項８】
ヒト型キメラ抗体が、形質転換体ＫＭ３０３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６）が生産するヒト型キメラ抗体である請求項７記載の医薬。
【請求項９】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項５記載の医薬。
【請求項１０】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項９記載の医薬。
【請求項１１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項９または１０記載の医薬。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項１２】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項９または１０記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項１３】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項９または１０記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項１４】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項１３記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項１５】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項９または１０記載の医薬。
（ａ）形質転換体ＫＭ８０３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）形質転換体ＫＭ８０３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）形質転換体ＫＭ８０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項１６】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項３記載の医薬。
【請求項１７】
ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する関節炎の診断薬。
【請求項１８】
ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１７記載の診断薬。
【請求項１９】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である請求項１８記載の診断薬。
【請求項２０】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）である請求項１９記載の診断薬。
【請求項２１】
ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項１９記載の診断薬。
【請求項２２】
ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型キメラ抗体である請求項２１記載の診断薬。
【請求項２３】
ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である請求項２２記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
【請求項２４】
ヒト型キメラ抗体が形質転換体ＫＭ３０３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６）が生産するヒト型キメラ抗体である請求項２３記載の診断薬。
【請求項２５】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項２１記載の診断薬。
【請求項２６】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項２５記載の診断薬。
【請求項２７】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項２５または２６記載の診断薬。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項２８】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項２５または２６記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項２９】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項２５または２６記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項３０】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項２９記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項３１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項２５または２６記載の診断薬。
（ａ）形質転換体ＫＭ８０３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）形質転換体ＫＭ８０３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）形質転換体ＫＭ８０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項３２】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化Ｖ領域断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１９記載の診断薬。
【請求項３３】
ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体を用いて試料中のＦＧＦ−８を検出および／または定量することを特徴とする関節炎の判定方法。
【請求項３４】
ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３３記載の判定方法。
【請求項３５】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である請求項３４記載の判定方法。
【請求項３６】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）である請求項３５記載の判定方法。
【請求項３７】
ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項３５記載の判定方法。
【請求項３８】
ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型キメラ抗体である請求項３７記載の判定方法。
【請求項３９】
ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である請求項３８記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
【請求項４０】
ヒト型キメラ抗体が形質転換体ＫＭ３０３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６）が生産するヒト型キメラ抗体である請求項３９記載の判定方法。
【請求項４１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項３７記載の判定方法。
【請求項４２】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項４１記載の判定方法。
【請求項４３】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項４１または４２記載の判定方法。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項４４】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項４１または４２記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項４５】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項４１または４２記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項４６】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項４５記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項４７】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項４１または４２記載の判定方法。
（ａ）形質転換体ＫＭ８０３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）形質転換体ＫＭ８０３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）形質転換体ＫＭ８０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
【請求項４８】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化Ｖ領域断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項３５記載の判定方法。
【請求項４９】
ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節破壊抑制剤。
【請求項５０】
ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する軟骨保護剤。
【請求項５１】
ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する滑膜増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗ＦＧＦ−８抗体を有効成分として含有する、関節炎の予防薬または治療薬、関節破壊抑制剤、軟骨保護剤、滑膜増殖抑制剤および関節炎の診断薬、ならびに該抗体を用いる関節炎の判定方法に関する。
背景技術
高齢者社会において関節症状を訴える人は確実に増加している。関節疾患の代表的な変形性関節症、あるいは関節リウマチといった疾患の早期診断やスクリーニング、あるいは患者の予後判定を的確に行うことは大変重要であり、その治療が多くの高齢者の生活の質を高めることになるが、未だに十分な診断や治療方法が確立していない。
関節軟骨は、関節の可動面を覆う少数の軟骨細胞と豊富な細胞外マトリックスに富んだ組織で、血管や神経は分布しておらず、主として関節内面を覆う滑膜から産生される滑液から栄養補給を受けている。また、無血管であるだけでなく、血管網に富む周囲組織からの血管の侵入に対して強い抵抗性を示す。軟骨細胞は、細胞外マトリックス合成、分解の両面を複雑に制御し、細胞外マトリックスの恒常性の維持に中心的役割を担っている。サイトカイン、成長因子などの化学的因子や荷重負荷などの力学的因子は軟骨細胞に作用し、細胞外マトリックス合成、分解の両者のバランスを変えることにより、細胞外マトリックス代謝に影響する。
変形性関節症は、加齢や機械的ストレスが原因となって、関節軟骨表面の崩壊と、これに伴う関節辺縁の新たな軟骨の増殖、関節の変形、適合性の破綻をきたし、さらに関節滑膜の炎症へと進行する。変形性関節炎は、関節の軟骨の遅行変性で、しばしば痛みと機能喪失とを特徴とする単関節炎疾患である（Ｍａｎｅｋ  Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｎ．Ｅ．，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，６１，１７９５−１８０４，２０００）
関節リウマチでは、免疫異常や感染症が原因となって、滑膜に炎症性細胞が浸潤し、さらに、血管新生に伴って滑膜線維芽細胞の増殖が亢進して、パンヌスと呼ばれる炎症性滑膜肉芽組織が形成される。パンヌスが形成されると、骨や軟骨の破壊が進み、関節に不可逆的な障害がもたらされる。骨や軟骨が破壊される過程では、多量に存在するコラーゲンやプロテオグリカンなどの種々の細胞外マトリックスが分解される。
変形性関節症あるいは関節リウマチなどの関節症において、滑膜炎症および細胞外マトリックスの破壊が関節軟骨の機能喪失へつながってゆく。
変形性関節症と関節リウマチは、病因論的に全く異なる疾患であるが、関節軟骨破壊機構において多くの共通点を有する。関節滑液および滑膜・軟骨などの関節局所で多種類のマトリックスメタロプロテアーゼが産生・分泌され、関節局所にマトリックスメタロプロテアーゼが過剰に検出される。マトリックスメタロプロテアーゼは多種類の細胞外マトリックスを分解するため、このことが関節破壊の一因となっている。これらの産生は、炎症滑膜、マクロファージ、好中球のみならず軟骨細胞からも産生されるが、その産生は同じ関節局所において産生分泌される種々のサイトカイン、活性酸素、一酸化窒素、プロスタグランジン、成長因子等により調節されている。これらは滑膜細胞、軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテアーゼの産生を誘導して、細胞外マトリックスの分解を促進することも報告されている。
これらの報告から、変形性関節症や関節リウマチのほか、自己抗体の出現と免疫複合体の組織沈着による炎症性組織傷害が認められる原因不明の疾患で、関節症状が高率に出現する全身性エリテマトーデス、強直性関節炎、乾癬症患者に合併する滑膜増殖を伴い骨破壊にまで至る乾癬性関節炎、椎間板の細胞外マトリックスの破壊が認められる椎間板疾患、急性結晶性滑膜炎（痛風、偽痛風）といった関節炎疾患（広畑和志ら編  リウマチ学  同文書院  １９８９年）において、滑膜の増殖や軟骨破壊を抑制することにより治療することが可能と考えられる。
従来、関節リウマチの薬物療法は、主に関節の疼痛および炎症を軽減するために、種々の非ステロイド性抗炎症薬、プレドニゾロン等のステロイド剤やメトトレキサートをはじめとする抗リウマチ薬が使われている（治療，７８，３５５３−３５５８，南山堂，１９９６）。変形性関節症においては、疼痛および炎症の除去のために、種々の非ステロイド性抗炎症薬や鎮痛剤や、関節注入剤ヒアルロン酸製剤等の投与が行われてきた。軟骨破壊を抑制するヒアルロン酸は軟骨保護剤として使われている（Ｃｒｅａｍｅｒ  Ｐ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．，２０，１４６１−１４６４，１９９３、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４３，１９０５−１９１５，２０００）。また、理学療法や、骨切り術、人工関節置換術等の手術療法も行われている。全身性エリテマトーデスでは非ステロイド性抗炎症薬やプレドニゾロン等のステロイド剤、強直性関節炎には非ステロイド性抗炎症薬や抗リウマチ薬であるスルファサラジン、乾癬症患者に合併する滑膜増殖を伴い骨破壊にまで至る乾癬性関節炎では非ステロイド性抗炎症薬、抗リウマチ薬やステロイドの関節内注入、椎間板の細胞外マトリックスの破壊が認められる椎間板疾患では非ステロイド性抗炎症薬や鎮痛薬、急性結晶性滑膜炎では非ステロイド性抗炎症薬やコルヒチン等が使われている（広畑和志ら編  リウマチ学  同文書院  １９８９年）が、このような薬物療法は対症療法で、関節破壊を十分に抑制することは困難であった。
現在、関節リウマチの治療では、関節の破壊を少しでも予防しようとする積極的な治療法の選択が受け入れられつつあり、なるべく早い段階で関節リウマチと診断して、メトトレキサートをはじめとする抗リウマチ薬を、いかに適切に選択していくかがポイントとなっているが、十分な診断法はまだない。
生体内に存在する様々な成長因子の一種である線維芽細胞増殖因子（以下、ＦＧＦと略す）は、血管内皮細胞に作用するヘパリン結合性増殖因子として知られている。また、ＦＧＦファミリーには１９種類以上あり、ＦＧＦ−２（ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ）やＦＧＦ−１（ａｃｉｄｉｃ  ＦＧＦ）等が古くから知られている。ＦＧＦ受容体は現在までに７種類見出されており、チロシンキナーゼを細胞内領域にコードしている。
ＦＧＦ−８は、アンドロジェン誘導増殖因子（ＡＩＧＦ）として、性ホルモン依存的増殖を示すマウス乳癌細胞株ＳＣ−３（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７，４５９−４６４，１９８７）の培養上清中より単離された因子で、アンドロジェン刺激により誘導産生され、オートクライン的にＳＣ−３細胞を増殖させる増殖因子である（Ｔａｎａｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，８９２８−８９３２，１９９２）。ＦＧＦ−８は、前立腺癌の細胞や繊維芽細胞の増殖を促進させることが報告されている（Ｔａｎａｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６３，２２６−２３０，１９９５）。ＦＧＦ−８はＦＧＦレセプター−２ＩＩＩｃ、ＦＧＦレセプター−３ＩＩＩｃ、ＦＧＦレセプター−４の３種のレセプターに結合することが報告されている（Ｏｒｎｉｔｚ  Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１５２９２−１５２９７，１９９６）。また、ＦＧＦの作用にはシンデカンなどの膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合が不可欠である。ヘパラン硫酸との結合はＦＧＦを安定的に局所に蓄積するためにも必要である。炎症などの組織改変の状況ではヘパラン硫酸が分解されることにより、細胞外マトリックスからＦＧＦが遊離して、その活性を発揮すると考えられている。軟骨中にはＦＧＦ−２のような強い血管新生因子が含有されている（Ｓａｔｏｈ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２３０７−１２３１５，１９９８）。また関節炎では滑膜細胞、軟骨細胞および侵入した炎症細胞が著しく高レベルのＦＧＦ−１やＦＧＦ−２を合成し（Ｓａｎｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１０，１４１７−１４２６，１９９０、Ｒｅｍｍｅｒｓ  Ｅ．Ｆ．，Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ，２，１７９−１８８，１９９０）、リウマチ患者の関節液中のＦＧＦ−２濃度は、関節症状と相関する（Ｍａｎａｂｅ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３８，７１４−７２０，１９９９）。ＦＧＦ−２は変形性関節症における骨棘形成に関与している（Ｕｃｈｉｎｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，３７７，１１９−１２５，２０００）。これらの報告はＦＧＦ−１やＦＧＦ−２が関節炎に関与することを示している。
ＦＧＦ−８ノックアウトマウスを用いた報告では、ＦＧＦ−８が関節の発生段階に発現している（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７，２４７１−２４７９，２０００；Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６，４６０−４６３，２０００）とされるが、ＦＧＦ−８の関節炎への関与は知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、関節炎の予防薬または治療薬、関節破壊抑制剤、軟骨保護剤、滑膜増殖抑制剤および関節炎の診断薬、ならびに関節炎の判定方法を提供することにある。
発明の開示
本発明は以下の（１）〜（５１）を提供する。
（１）ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節炎の予防薬または治療薬。
（２）ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする（１）記載の医薬。
（３）モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である（２）記載の医薬。
（４）ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）である（３）記載の医薬。
（５）ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体である（３）記載の医薬。
（６）ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにヒト抗体の抗体重鎖定常領域（ＣＨ）および抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるヒト型キメラ抗体である（５）記載の医薬。
（７）ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である（６）記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（８）ヒト型キメラ抗体が形質転換体ＫＭ３０３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６）が生産するヒト型キメラ抗体である（７）記載の医薬。
（９）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である（５）記載の医薬。
（１０）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型ＣＤＲ移植抗体である（９）記載の医薬。
（１１）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（９）または（１０）記載の医薬。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（１２）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（９）または（１０）記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（１３）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（９）または（１０）記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（１４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（１３）記載の医薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（１５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（９）または（１０）記載の医薬。
（ａ）形質転換体ＫＭ８０３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）形質転換体ＫＭ８０３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）形質転換体ＫＭ８０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（１６）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（３）記載の医薬。
（１７）ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する関節炎の診断薬。
（１８）ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする（１７）記載の診断薬。
（１９）モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である（１８）記載の診断薬。
（２０）ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）である（１９）記載の診断薬。
（２１）ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である（１９）記載の診断薬。
（２２）ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型キメラ抗体である（２１）記載の診断薬。
（２３）ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である（２２）記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（２４）ヒト型キメラ抗体が形質転換体ＫＭ３０３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６）が生産するヒト型キメラ抗体である（２３）記載の診断薬。
（２５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である（２１）記載の診断薬。
（２６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型ＣＤＲ移植抗体である（２５）記載の診断薬。
（２７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（２５）または（２６）記載の診断薬。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（２８）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（２５）または（２６）記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（２９）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（２５）または（２６）記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（３０）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（２９）記載の診断薬。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（３１）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（２５）または（２６）記載の診断薬。
（ａ）形質転換体ＫＭ８０３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）形質転換体ＫＭ８０３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）形質転換体ＫＭ８０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（３２）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体
（ｓｃＦｖ）、２量体化Ｖ領域断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１９）記載の診断薬。
（３３）ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体を用いて試料中のＦＧＦ−８を検出および／または定量することを特徴とする関節炎の判定方法。
（３４）ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする（３３）記載の判定方法。
（３５）モノクローナル抗体が、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である（３４）記載の判定方法。
（３６）ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）である（３５）記載の判定方法。
（３７）ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である（３５）記載の判定方法。
（３８）ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型キメラ抗体である（３７）記載の判定方法。
（３９）ヒト型キメラ抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型キメラ抗体である（３８）記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（４０）ヒト型キメラ抗体が形質転換体ＫＭ３０３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６）が生産するヒト型キメラ抗体である（３９）記載の判定方法。
（４１）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である（３７）記載の判定方法。
（４２）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型ＣＤＲ移植抗体である（４１）記載の判定方法。
（４３）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（４１）または（４２）記載の判定方法。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８および９で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（４４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（４１）または（４２）記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（４５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（４１）または（４２）記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（４６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（４５）記載の判定方法。
（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体
（４７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヒト型ＣＤＲ移植抗体である（４１）または（４２）記載の判定方法。
（ａ）形質転換体ＫＭ８０３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｂ）形質転換体ＫＭ８０３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（ｃ）形質転換体ＫＭ８０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体
（４８）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体
（ｓｃＦｖ）、２量体化Ｖ領域断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（３５）記載の判定方法。
（４９）ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する関節破壊抑制剤。
（５０）ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する軟骨保護剤。
（５１）ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を有効成分として含有する滑膜増殖抑制剤。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬に用いられる抗体は、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、かつＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体（以下、抗ＦＧＦ−８中和抗体とも称する）であればいかなるものでもよく、例えば、ＦＧＦ−８に対して中和活性を有する抗体および該抗体断片などがあげられる。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬に用いられる抗ＦＧＦ−８中和抗体は、ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体（以下、抗ＦＧＦ−８抗体とも称する）の中から、ＦＧＦ−８の活性を阻害する能力を有する抗体を選択することにより得ることができる。ＦＧＦ−８の活性としては、ＦＧＦ−８が有する生物活性であればいかなるものであってもよいが、具体的には、マウス乳癌細胞株ＳＣ−３（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７，４５９−４６４，１９８７）、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６５８）、もしくはヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４０）の増殖を促進する活性、滑膜細胞の増殖を促進する活性、軟骨細胞の細胞外マトリックスの分解を促進する活性、軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生を促進する活性をあげることができる。
抗ＦＧＦ−８抗体は、公知の手段（Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８、以下、アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアルと記す）を用いて製造することができる。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用される抗ＦＧＦ−８中和抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、ヒト化抗体およびこれらの抗体の抗体断片をあげることができる。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用される、ハイブリドーマにより生産される抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体は、具体的には以下に述べる方法によって製造することができる。
すなわち、ＦＧＦ−８蛋白質を抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性をもつ形質細胞を誘導し、さらに、それと骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマを培養するか、あるいは該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水よりＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体を分離、精製する。得られた抗体の中から、ＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体を選択する。このような抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体として、特開平９−２７１３９１に記載されているマウスＩｇＧ１サブクラスに属するハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ１３３４があげられる。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト化抗体としては、上記の抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものがあげられる。該抗体においては、抗原性が低く、血中半減期の延長されたものが、予防薬または治療薬として好ましい。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト化抗体は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと略記する。）移植抗体を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下、可変領域をＶ領域、重鎖可変領域をＶＨと称す）および軽鎖Ｖ領域（以下、ＶＬと称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域をＣ領域、重鎖定常領域をＣＨと称す）およびヒト抗体の軽鎖Ｃ領域（以下、ＣＬと称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト型キメラ抗体は、抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより得られる該抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡから、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（ｈＩｇ）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、ｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ＦＧＦ−８に特異的に結合しＦＧＦ−８の活性を阻害するヒト型キメラ抗体（以下、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体とも称する）としては、ＦＧＦ−８に特異的に結合しＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＶＨおよびＣＬからなる抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体、好ましくはＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、ＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、およびＶＨが配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体があげられる。具体的には、抗体のＶＨが配列番号５記載のアミノ酸配列、ＣＨがヒトγ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のＶＬが配列番号６記載のアミノ酸配列、ＣＬがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４があげられる。
ヒト型キメラ抗体ＫＭ３０３４を生産する形質転換体ＫＭ３０３４は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成１３年１２月２６日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６として寄託されている。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト抗体に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＣＤＲ配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列で任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列をそれぞれ置換したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ＦＧＦ−８に特異的に結合しＦＧＦ−８の活性を阻害するヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体とも称する）としては、ＦＧＦ−８に特異的に結合しＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、ＦＧＦ−８に特異的に結合し、ＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと略す）、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなるヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。好ましくは、（ａ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｂ）ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられ、より好ましくは（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。さらに好ましくは（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｂ）ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。具体的には、（ａ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｂ）ＶＬが配列番号１９、２１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｃ）ＶＨが配列番号１８または２０で示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号１９、２１、、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０または５１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられ、好ましくは（ａ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが２１で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｂ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが４４で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、（ｃ）ＶＨが配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが５０で示されるアミノ酸配列配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。このようなヒト型ＣＤＲ移植抗体として、ＶＨが配列番号１８記載のアミノ酸配列、ＣＨがヒトγ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、ＶＬが配列番号２１記載のアミノ酸配列、ＣＬがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＶＨが配列番号１８記載のアミノ酸配列、ＣＨがヒトγ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、ＶＬが配列番号４４記載のアミノ酸配列、ＣＬがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＶＨが配列番号１８記載のアミノ酸配列、ＣＨがヒトγ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、ＶＬが配列番号５０記載のアミノ酸配列、ＣＬがヒトκクラスのアミノ酸配列からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯがあげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６を生産する形質転換体ＫＭ８０３７は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成１４年６月２０日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４として、ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ３−１を生産する形質転換体ＫＭ８０３６は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成１４年６月２０日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３として、ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３を生産する形質転換体ＫＭ８０３５は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）に平成１４年６月２０日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２として、それぞれ寄託されている。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用される抗ＦＧＦ−８中和抗体には抗体断片も含まれる。抗体断片は、ＦＧＦ−８に特異的に結合しＦＧＦ−８の活性を阻害する抗体断片であるＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇの略）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ；以下、ｓｃＦｖと称す）、２量体化Ｖ領域断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ；以下、ｄｓＦｖと称す）およびＣＤＲを含むペプチドを含有する。
Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドである。本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体であればいかなるものでもよい。
ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対するそれぞれ特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるｄｓＦｖに含まれるＶＨあるいはＶＬは、抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体であればいかなるものでもよい。
本発明の関節炎の予防薬または治療薬で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
以下に、本発明で使用される抗ＦＧＦ−８中和抗体の具体的な作製方法と活性評価方法、該抗体を含有する関節炎の予防薬または治療薬、抗ＦＧＦ−８抗体を含有する関節炎の診断薬、抗ＦＧＦ−８抗体を用いた関節炎の判定方法について説明する。
１．抗ＦＧＦ−８中和抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）の作製方法
（１）抗原の調製
抗ＦＧＦ−８中和抗体を作製するために必要な抗原としては、ＦＧＦ−８を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはＦＧＦ−８蛋白質、該蛋白質の部分断片、該蛋白質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドなどがあげられる。
ＦＧＦ−８蛋白質および該蛋白質の部分断片は、ＦＧＦ−８をコードする全長あるいはその部分断片ＤＮＡ（Ｔａｎａｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，８９２８−８９３２，１９９２、Ｔａｎａｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６３，２２６−２３０，１９９６）を適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組み換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより得られたＦＧＦ−８発現細胞を、適当な培地中で培養することにより細胞内あるいは培養上清中にそのままあるいは融合蛋白質として生産することができる。また、ＦＧＦ−８蛋白質の部分配列を有するペプチドは、ペプチド合成機を用いて調製することができる。
ＦＧＦ−８をコードする全長あるいはその部分断片ＤＮＡは、ＦＧＦ−８を発現しているＳＣ−３等の細胞から調製したｃＤＮＡを鋳型にした、ポリメラーゼ連鎖反応〔Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下ＰＣＲと記す；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００１（以下、「モレキュラー・クローニング  第３版」と記す）、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−２００１（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと記す）〕により調製することができる。
宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであれば、いずれでもよい。細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のエシェリヒア属、バチルス属等の細菌が例示される。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が例示される。動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞等が例示される。昆虫細胞としては、Ｓｆ９、Ｓｆ２１〔ファーミンジェン（Ｆａｒｍｉｎｇｅｎ）社製〕、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕等が例示される。
ＦＧＦ−８をコードする全長あるいはその部分断片ＤＮＡを導入するベクターとしては、該ＤＮＡを組み込むことができ、宿主細胞で発現できるものであればいかなるベクターでも用いることができる。
細菌、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＦＧＦ−８をコードする全長あるいはその部分断片ＤＮＡ、転写終結配列、場合によってはプロモーターの制御配列より構成されているのが好ましいが、例えば、市販のｐＧＥＸ−２Ｔ〔アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、ｐＥＴ１７ｂ〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕などが例示される。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０−２１１４，１９７２）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）等、いずれの方法も用いられる。
酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等が用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７，１９９１）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，１９２９−１９３３，１９７８）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８，１９８３）等、いずれの方法も用いられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ  Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）等が用いられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０あるいはメタロチオネインのプロモーター等があげられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）等、いずれの方法も用いられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。すなわち、以下に述べる組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得たのち、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質発現昆虫細胞を取得する。
遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３（共にファーミンジェン社製）、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インビトロジェン社製）等が用いられる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）などが用いられる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）等が用いられる。
また、ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットなどを用いて組み換えバキュロウィルスを作製したのち、前述したＳｆ９、Ｓｆ２１あるいはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ等の昆虫細胞に該組み換えウィルスを感染させることにより蛋白質を生産させることもできる（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７，１９８８）。
遺伝子の発現方法としては、ＦＧＦ−８蛋白質だけを細胞内に発現させる以外に、分泌生産、融合蛋白質発現等が開発されており、いずれの方法も用いることができる。例えば、モレキュラー・クローニング  第３版に記載されている方法に準じて行うことができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にＦＧＦ−８蛋白質を生成蓄積させ、該培養物からＦＧＦ−８蛋白質を採取することにより、ＦＧＦ−８蛋白質の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として製造することができる。
形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい（モレキュラー・クローニング  第３版）。培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下、１５〜４０℃で１６￣９６時間行う。培養期間中、ｐＨは３．０￣９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養中は必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ  １６４０培地、イーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ培地またはこれら培地にウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３５〜３７℃で３〜７日間行い、培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ９００ＩＩＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ４００、ＥＸ−ＣＥＬＬ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕等が用いられる。培養は、２５〜３０℃で１〜４日間行い、培養中は必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記において、動物細胞および昆虫細胞の培養において可能であれば、ＦＧＦ−８の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質の精製を容易にするため、血清無添加の培地を用いることが好ましい。
ＦＧＦ−８の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として宿主細胞内に蓄積された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離し、水系緩衝液にけん濁後、超音波法、フレンチプレス法などにより細胞を破砕し、その遠心分離上清に該蛋白質を回収する。
さらに、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体をタンパク質変性剤で可溶化後、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、タンパク質の立体構造を形成させることができる。
ＦＧＦ−８蛋白質の全長または部分断片、あるいはこれらの蛋白質の融合蛋白質が細胞外に分泌された場合には、培養上清中に発現蛋白質を回収することができる。
単離精製については、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈殿、塩析、透析、遠心分離、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができる。
ＦＧＦ−８のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）法、ｔＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）法等の化学合成法によって製造することができる。また、アドバンスド・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、プロテイン・テクノロジーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、島津製作所等のペプチド合成機を用いても製造することができる。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記で得られた該蛋白質を抗原として動物を免疫する。免疫する方法としては、動物の皮下、静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、抗原性の高いキャリアタンパク質を抗原に結合させて投与する、あるいは適当なアジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。
キャリアタンパク質としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン、ウシチログロブリン等があげられ、アジュバンドとしては、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。
免疫動物としては、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスターなどの非ヒト哺乳動物があげられる。
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間毎に３〜１０回行う。抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。各投与後、３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、該血清の抗原との特異的な結合性について、下記に示すような酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法  第３版  医学書院１９８７年、アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｃｈａｐｔｅｒ  １４）、Ｇｏｄｉｎｇ  Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、モノクローナル・アンチボディーズと略す）〕などで確認する。
酵素免疫測定法は以下のようにして行うことができる。
抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞などをプレートにコートし免疫動物より採取した血清を第一抗体として反応させる。第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。反応後、第二抗体を標識した物質に応じた検出反応を行い、抗体価を測定する。
第二抗体とは、第一抗体を認識できる抗体を、パーオキシダーゼ等の酵素やビオチン等で標識したものである。具体的には、免疫動物にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
そして、該血清が十分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物を、抗体産生細胞の供給源とする。
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫動物より公知の方法（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に準じてリンパ球を摘出し、リンパ球と骨髄腫細胞とを融合させる。
ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。該ポリクローナル抗体がＦＧＦ−８の活性を阻害する中和活性を有しているかどうかは下記の１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで調べることができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するが、動物に投与して該細胞を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗体産生細胞は、抗原投与された非ヒト哺乳動物脾細胞、リンパ節、末梢血などから採取する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｈｕｌｍａｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７６，２６９−２７０，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（Ｋｅａｒｎｅｙ  Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）など、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体の選択
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させる。細胞の洗浄にはＭＥＭ培地またはＰＢＳ（１．８３ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２１ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４、７．６５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）などを用いる。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地〔正常培地（１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１０ｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％  ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ  １６４０培地）に１００μｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１５μｍｏｌ／Ｌチミジンおよび０．４μｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地〕を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、下記の酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをＦＧＦ−８と特異的に結合するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
酵素免疫測定法は１．（２）に記載したのと同様に行うが、第一抗体として、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の方法で得られる精製抗体を用いる。
モノクローナル抗体とＦＧＦ−８との特異的な結合は表面プラズモン共鳴（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９−２４０，１９９１）によっても評価できる。
抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体の具体例としては、特開平９−２７１３９１に記載されているマウスＩｇＧ１サブクラスに属するハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ１３３４があげられる。
上記で選択されたハイブリドーマが生産する抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体がＦＧＦ−８の活性を阻害できるか否かを、ターゲット細胞にマウス乳癌細胞株ＳＣ−３（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７，４５９−４６４，１９８７）、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６５８）、もしくはヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７４０）を用いた増殖阻害アッセイにて調べる。方法としては、ターゲット細胞をＦＧＦ−８（１〜１００ｎｇ／ｍＬ）あるいはテストステロンを含む培地にて培養する際、培養上清もしくは下記２．（５）にしたがって精製した抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体の最終濃度が０．００１〜１００μｇ／ｍＬになるように段階希釈して培地中に添加する。２４〜７２時間培養後、ＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチル−２−チアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド〕溶液、セルカウンティングキットもしくはＷＳＴ−１キットなどを用いて生細胞数を測定する。抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体を添加しない場合に比べて抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体の濃度依存的に生細胞数が減少する場合に、該抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体はＦＧＦ−８の活性を阻害する抗ＦＧＦ−８中和抗体であることが確認できる。
また、ボルトン−ハンター法（Ｂｏｌｔｏｎ  Ａ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｗ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１３３，５２９−５３９，１９７３）などで１２５Ｉ標識したＦＧＦ−８の上記の細胞株への結合測定系を用いて、抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体のＦＧＦ−８の細胞表面上の受容体への結合阻害活性を測定することができる。
上記のモノクローナル抗体ＫＭ１３３４は、ＦＧＦ−８の活性を阻害する活性を有する抗ＦＧＦ−８中和抗体であり、関節炎の予防薬または治療薬として好ましい。
（５）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を腹腔内投与して腹水癌化させた腹水から、分離、精製することにより調製できる。
モノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて行う方法があげられる。この方法により、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体を取得することができる。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、モノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられるが、特にマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ１タイプは、補体依存性細胞傷害活性および抗体依存性細胞傷害活性を有し、治療への応用上、有用である。
２．抗ＦＧＦ−８中和ヒト化抗体の作製方法
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用ベクターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣ領域であるＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体γ１サブクラスのＣＨ、γ４サブクラスのＣＨ、およびκクラスのＣＬ等があげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはエキソンとイントロンより成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を組込み、発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
例えば、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ  Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２７，２２３−２３２，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７８，１５２７−１５３１，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３−１８０，１９９０）等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ  Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０−９６８，１９８７）、および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ  Ｊ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１，４７９−４８７，１９８５）とエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ  Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３，７１７−７２８，１９８３）等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｂｅｎｔｌｅｙ  Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７，１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体、例えば、マウス抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡは以下のようにして取得する。
マウス抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体を産生する細胞、例えば、マウスＦＧＦ−８中和抗体産生ハイブリドーマ等よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、ファージあるいはプラスミドなどのベクターに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。
組換えファージあるいは組換えプラスミド上のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３−２８，１９８７）、また、全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング  第３版）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、ファストトラック（ＦａｓｔＴｒａｃｋ）ｍＲＮＡ単離キット（インビトロジェン社製）、クイックプレップ（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ）ｍＲＮＡ精製キット（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング  第３版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）、あるいは市販のキット、例えば、ｃＤＮＡ合成用スーパースクリプト・チョイス・システム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、インビトロジェン社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット〔ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕、タイムセーバー（ＴｉｍｅＳａｖｅｒ）ｃＤＮＡ合成キット（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、λＺＡＰ  ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０（ストラタジーン社製）、λｇｔ１１（ストラタジーン社製）、ＬａｍｂｄａＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐｃＤ２（Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ  Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０−２８９，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（ストラタジーン社製）、Ｃ６００（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ  Ｒ．Ｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０−４５２，１９５４）、Ｙ１０８８（Ｙｏｕｎｇ  Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８−７８２，１９８３）、Ｙ１０９０（Ｙｏｕｎｇ  Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８−７８２，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｇｏｕｇｈ  Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ  Ｎ．Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１−１９，１９８３）、Ｋ８０２（Ｗｏｏｄ  Ｗ．Ｂ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８−１３３，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング  第３版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲによりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡの塩基配列は、適当なベクターにクローニングされた該ｃＤＮＡを用いてジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４，５４６３−５４６７，１９７７）に基く反応を行い、ＡＢＩ３７７（アプライドバイオシステムズ社製）等のＤＮＡシークエンサーを用いて解析することで決定することができる。（３）ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の解析とＣＤＲのアミノ酸配列の同定
２．（２）で取得し、決定したｃＤＮＡの塩基配列から該ｃＤＮＡがコードするＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１、以下、「シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト」と記す。）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。
さらに、任意のデータベース、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ等に対して、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）など相同性検索プログラムを用いて、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
抗体の抗原結合部位を形成するＶＨ及びＶＬは、配列の比較的保存された４個のＦＲとそれらを連結する配列の変化に富んだ３個のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）から成っている（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。そしてＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列は、既知の抗体のＶ領域のアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより同定することができる
（４）抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターの構築
２．（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを挿入し、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを有するプラスミドを鋳型として、抗体のＶＨおよびＶＬを、適当な制限酵素の認識配列とＶ領域をコードする塩基配列よりなる５’末端側と３’末端側のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、それぞれの増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、２．（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。得られたプラスミドより、抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを単離し、２．（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングし、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするＤＮＡの構築
抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）などがあげられるが、それらの中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、ヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性、好ましくは６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮して塩基配列に変換し、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００〜１５０塩基の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも４本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、２．（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、２．（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望の抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
（６）抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに、移植しただけでは、その抗原結合活性はもとのヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている（Ｔｅｍｐｅｓｔ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７１，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（Ｔｅｍｐｅｓｔ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７１，１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｆ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５−５４２，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｔｅｍｐｅｓｔ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１−１５０７，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について２．（２）に記載の方法により、その塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認して、目的の変異が導入されたＤＮＡを含むベクター（以下、アミノ酸配列改変ベクターと称す）を取得する。
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、２０〜３５塩基からなる変異導入プライマーを用いたＰＣＲ変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を含む２０〜３５塩基からなるセンス変異プライマー及びアンチセンス変異プライマーを合成し、改変すべきＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として２段階のＰＣＲを行う。最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたＤＮＡを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
（７）抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
２．（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流に、２．（５）および（６）で構築した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを挿入し、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、２．（５）および（６）で抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、２．（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングすることができる。
（８）ヒト化抗体の一過性発現および活性評価
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、２．（４）記載の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクター、２．（７）に記載の抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６５１）が一般に用いられる（Ｗａｒｒ  Ｇ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９０）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｗａｒｒ  Ｇ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９０）、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、第一抗体として培養上清を、第二抗体として標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いた１．（２）に記載の酵素免疫測定法などにより測定できる。また、ＦＧＦ−８の活性を阻害する中和活性を保持しているかどうかを１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで確認することができる。
（９）ヒト化抗体の安定発現および活性評価
２．（４）記載の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターまたは２．（７）に記載の抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（特開平２−２５７８９１；Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）等があげられる。
抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターまたは抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す）遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ  Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０  １９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と称す）等があげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換体は、Ｇ４１８（Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ；シグマ−アルドリッチ社製）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ  １６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、ハイブリドーマーＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換体を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は前記１．（４）に記載のＥＬＩＳＡなどにより測定できる。また、形質転換体は、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。
ヒト化抗体は、形質転換体の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル，ｃｈａｐｔｅｒ  ８；モノクローナル・アンチボディーズ）。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウエスタンブロッティング法（アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル，ｃｈａｐｔｅｒ  １２；モノクローナル・アンチボディーズ）等で測定する。
精製したヒト化抗体の抗原結合活性は、第一抗体として精製ヒト化抗体を、第二抗体として標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いた前記１．（２）に記載の酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９−２４０，１９９１）などにより測定できる。また、ＦＧＦ−８の活性を阻害する中和活性を保持しているかどうかを１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで確認することができる。
３．抗体断片の作製
抗体断片は、１．および２．に記載の抗ＦＧＦ−８中和モノクローナル抗体、抗ＦＧＦ−８中和ヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、抗ＦＧＦ−８中和抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（モノクローナル・アンチボディーズ）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（モノクローナル・アンチボディーズ）。また、Ｆａｂは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｂｅｔｔｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ｂｏｒｒｅｂｅｃｋ  Ｋ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）。
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、抗ＦＧＦ−８中和抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（モノクローナル・アンチボディーズ）。また、３．（３）に記載のＦａｂ’をＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドやビスマレイミドヘキサン等のようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、５、５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）で処理し、ジスルフィド結合させる方法によっても作製することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、３．（２）に記載のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトール等の還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６３−１６７，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラム等を用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、１２残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡを介して連結し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製する。ポリペプチドリンカーは、その付加がＶＨ、ＶＬの抗原への結合に対して妨害しないように最適化することが重要で、例えばＰａｎｔｏｌｉａｎｏらにより示されたもの（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  Ｈ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０１１７−１０１２５，１９９１）あるいはそれを改変したものを用いることができる。
作製したＤＮＡをｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、Ｐｈｆａ（Ｌａｈ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８−５６，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。
（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは、上記のｓｃＦｖを作製する際のポリペプチドリンカーを３〜１０残基程度にすることで、作製することができる。１種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合には、２価のｄｉａｂｏｄｙを、２種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合は、２特異性を有するｄｉａｂｏｄｙを作製することができる（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４５３，１６４−１６８，１９９９、Ｃｏｕｒａｇｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，７６３−７６８３  １９９８）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。まず、２．（２）、（５）および（６）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。アミノ酸残基のシステイン残基への改変は２．（６）のＰＣＲを用いた変異導入法により行うことができる。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７，６９７−７０４，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＶＨおよびＶＬを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、ジスルフィド結合を形成させ、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、さらに精製することができる（Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７，６９７−７０４，１９９４）。
（７）ＣＤＲを含むペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（インビトロジェン社製）、ｐＡＸ４ａ＋〔モビテック（ＭＯＢｉＴｅｃ）社製〕などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズム層にＣＤＲを含むペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズム層からＣＤＲを含むペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる（Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７，６９７−７０４，１９９４）。
（８）活性の評価
上記の抗体断片の抗原結合活性は抗体断片を第一抗体として用いた前記１．（２）に記載の酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９−２４０，１９９１）などにより測定できる。また、ＦＧＦ−８の活性を阻害する中和活性を保持しているかどうかを１．（４）に記載の細胞増殖阻害アッセイで確認することができる。
４．本発明の予防薬および治療薬
抗ＦＧＦ−８中和抗体は、滑膜や軟骨の細胞および組織上のＦＧＦ−８と結合し、ＦＧＦ−８により誘導される軟骨の細胞外マトリックスの分解を抑制し、軟骨の破壊を抑制する能力を有するため、軟骨保護剤となる。また、該抗体はＦＧＦ−８により誘導される滑膜細胞の増殖を抑制する能力を有するため、滑膜細胞の増殖抑制剤となる。関節の破壊は、軟骨の破壊や滑膜細胞の増殖を伴うので、該抗体は滑膜細胞の増殖および軟骨の破壊を抑制することにより関節の破壊の抑制剤となる。関節炎は関節の破壊を伴う疾患であるので、該抗体は関節の破壊を抑制することにより関節炎の治療薬および予防薬となる。関節炎としては変形性関節症や関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強直性関節炎、乾癬性関節炎、椎間板疾患、急性結晶性滑膜炎（痛風、偽痛風を含む）などがあげられる。
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体と比較して、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において高い効果を示し、かつ免疫原性が低く、その効果が長期に渡り持続することが期待されるので、予防薬および治療薬として好ましい。
抗ＦＧＦ−８中和抗体を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、関節内、および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは関節内および静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体またはペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体またはペプチドを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体またはペプチドおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
抗ＦＧＦ−８中和抗体が軟骨の細胞外マトリックスの分解を抑制すること、および滑膜細胞の増殖を抑制することは、以下（１）および（２）に示すイン・ビトロでのアッセイ系を用いて確認できる。また、関節炎の治療薬および予防薬になることは、以下（３）に示す関節炎病態モデル動物に該抗体を投与し、その関節炎症状を軽減できるかどうかによっても評価できる。
（１）ＦＧＦ−８による軟骨破壊に対する阻害活性
軟骨の破壊は、軟骨細胞や軟骨器官を用いた軟骨の細胞外マトリックスの分解、軟骨細胞および滑膜細胞からの破壊因子の産生の増加を指標としたアッセイにより、軟骨破壊の進展による軟骨下骨の破壊は、骨吸収量を指標としたアッセイによりそれぞれ評価できる。
（ａ）軟骨の細胞外マトリックスの分解
軟骨破壊作用は、初代培養したウサギ関節軟骨細胞を、ＦＧＦ−８存在下で抗ＦＧＦ−８中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、培養後にプレートに残存する細胞外マトリックスの量を測定することにより評価できる。細胞外マトリックスの量はパパイン処理により遊離してきたグリコサミノグリカンの量として測定する。ＦＧＦ−８により誘導される細胞外マトリックスの減少が、抗ＦＧＦ−８中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。
軟骨破壊作用は、Ｐｒｉｃｅらの方法（Ｐｒｉｃｅ  Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４２，１３７−１４７，１９９９）に従って初代培養したウシ鼻中隔軟骨器官を、ＦＧＦ−８存在下で抗ＦＧＦ−８中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、培養し、培養後の軟骨器官中の細胞外マトリックスの量を測定することによっても評価できる。ＦＧＦ−８により誘導される細胞外マトリックスの減少が、抗ＦＧＦ−８中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。細胞外マトリックスの量は、培養後の器官をパパイン処理し、遊離してきたグリコサミノグリカンの量を、ジメチルメチレンブルー法（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１  １０３−１０８，１９８７）にて測定するかまたは、コラーゲンの量を東京衛生年報，３６，２７７，１９８５に従いヒドロキシプロリン濃度として測定することにより測定できる。
（ｂ）軟骨破壊に関与する因子の産生
軟骨破壊に関与する因子としては、プロスタグランジンＥ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３、一酸化窒素をあげることができる。ウサギ関節軟骨細胞またはウサギ滑膜細胞をＦＧＦ−８存在下で抗ＦＧＦ−８中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、これらの因子の該細胞からの産生量として、培養上清のプロスタグランジンＥ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３あるいは一酸化窒素を測定する。ＦＧＦ−８により促進されるプロスタグランジンＥ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３あるいは一酸化窒素の産生が、抗ＦＧＦ−８中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。
プロスタグランジンＥ２は、プロスタグランジンＥ２  ＥＩＡシステム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）により、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３は、ウサギマトリックスメタロプロテイナーゼ−３ＥＬＩＳＡシステム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）により、一酸化窒素はＧｒｉｅｓｓ試薬を用いる方法（Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６，１３１−１３８  １９８２）により測定することができる。
（ｃ）骨吸収
骨吸収は、Ｋｕｓａｎｏらの方法（Ｋｕｓａｎｏ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９，１３３８−１３４５，１９９８）に従って、マウス頭蓋冠をＦＧＦ−８存在下で抗ＦＧＦ−８中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、培養上清中のカルシウム濃度あるいはヒドロキシプロリン濃度を測定することにより評価できる。ＦＧＦ−８により促進される骨吸収が、抗ＦＧＦ−８中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は軟骨破壊の抑制作用を有すると考えられる。培養上清中のカルシウム濃度は、カルシウムＣ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定できる。また培養上清中のヒドロキシプロリン濃度は、東京衛生年報，３６，２７７，１９８５に従い測定できる。
（２）滑膜細胞の増殖抑制作用
滑膜細胞の増殖は、ヒトやウサギの滑膜細胞をＦＧＦ−８存在下で抗ＦＧＦ−８中和抗体を添加した場合と添加しない場合で培養し、［３Ｈ］チミジン取り込み量の測定により評価できる。ＦＧＦ−８により促進される［３Ｈ］チミジン取り込み量が、抗ＦＧＦ−８中和抗体の添加により阻害される場合、該抗体は滑膜細胞の増殖抑制作用を有すると考えられる。
（３）関節炎病態モデル動物を用いたイン・ビボでの評価
下記の関節炎病態モデル動物を用いて、ＦＧＦ−８あるいは抗ＦＧＦ−８中和抗体の関節破壊に対する効果を評価できる。関節炎病態モデル動物に抗ＦＧＦ−８中和抗体を投与し、該モデル動物の関節炎の症状が軽減する場合に関節炎の治療薬や予防薬として用いることができると考えられる。
関節リウマチに類似した病態を示すモデル動物として、主として足関節に関節炎が自然発症するＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（Ｈａｎｇ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５５，１６９０−１７０１，１９８２、日本チャールス・リバーより購入可能）、結核死菌を免疫して誘導されるラット・アジュバント関節炎モデル（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＣＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．，５，６５４−６５８，１９６２、Ｔａｕｒｏｇ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７５，２７１−２８２，１９８３、Ｂｅｎｄｅｌｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２６，１２２５−１２２９，１９９９）、関節に多いＩＩ型コラーゲンをアジュバントとともに免疫して発症させるマウス・コラーゲン関節炎モデル（Ｓｔｕａｒｔ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，１９９−２１８，１９８４、Ｋａｍａｄａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７０，１６９−１７５，１９９６）などをあげることができる。これらのモデル動物は関節リウマチと類似した病態を示し、関節炎治療薬の評価に広く用いられている。
ラット・アジュバント関節炎モデルを用いる場合は、アジュバント処置足（急性炎症に続いて慢性炎症が起こる二相性の炎症反応が起こる）およびアジュバント非処置足（感作１週間頃から慢性炎症が起こる）それぞれについて、経時的に後肢足蹠浮腫容積を測定する。また左右後肢の軟Ｘ線撮影を行い、骨破壊および関節の変形について評価する。また、尿中のグリコサミノグリカン量を測定することにより、全身における軟骨破壊について、尿中のデオキシピリジノリン量またはヒドロキシプロリン量を測定することにより、全身における骨破壊について、それぞれ評価する。尿中のグリコサミノグリカン量は、ジメチルメチレンブルー法（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１  １０３−１０８，１９８７）により、尿中のデオキシピリジノリン量は、オステオリンクス「ＤＰＤ」（住友製薬社製）を用いて、尿中のヒドロキシプロリン量は池田らの方法（池田眞悟ら，東京衛研年報．３６  ２７７−２８２，１９８５）に従って、それぞれ測定できる。さらに、全身の炎症反応の指標として血清中ムコ蛋白濃度をアスプローＧＰ（大塚製薬）を用いて、血清中の一酸化窒素濃度をＴｒａｃｅｙらの方法（Ｔｒａｃｅｙ  Ｗ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７２，１０１１−１０１５，１９９５）に従いそれぞれ測定する。
マウス・コラーゲン関節炎モデルを用いる場合は体重と全肢の関節炎スコアの経時変化、血清中抗コラーゲン抗体価を測定する。さらに解剖後、関節部の病理組織学的検討を行う。関節炎スコアは一肢０から４点、全肢最高１６点のスコアリングによって評価する。スコアの基準は、０：正常、１：弱い紅斑を認める、２：弱い腫脹と紅斑を認める、３：強い腫脹と紅斑を認め、触知により温感を認める、４：手指の変形を伴う著明な腫脹を認めるとする。
変形性関節症モデルとして、イヌ、ウサギなどの大動物を用い膝半月の切除や靭帯の切離によって関節に動揺性を生ぜしめ、慢性的な関節の変性を発生させるモデル（以下、実験的変形性関節症モデルと称する）が多く用いられている（伊藤隆太，新薬開発のための動物モデル利用集成，変形性関節症，Ｒ＆Ｄプランニング，１９８５年、Ｇｕｉｎｇａｍｐ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４０，１６７０−１６７９，１９９７、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒａａｎ  Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３５，１００１−１０１４，１９８９）。また、ラットの膝関節内にモノヨード酢酸を注入することにより、関節軟骨の細胞外マトリックスであるグリコサミノグリカンの遊離を促進し、関節破壊を惹起するラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルも変形性関節症モデルとしてあげられる。
ウサギ膝関節半月板部分切除による実験的変形性関節症モデルは、Ｃｏｌｏｍｂｏらの方法（Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，２６，８７５−８８６，１９８３）および菊地らの方法（菊地寿幸ら，関節外科，１５，９２−９８，１９６６）により作製できる。
ラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルは、Ｇｕｉｎｇａｍｐらの方法（Ｇｕｉｎｇａｍｐ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４０，１６７０−１６７９，１９９７）に基き、ラットの膝関節内にモノヨード酢酸を注入して作製できる。
これらの変形性関節症モデル動物は一定期間後に膝関節膝蓋骨を摘出し、パパイン処理し、グリコサミノグリカンの量をジメチルメチレンブルー法（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１，１０３−１０８３  １９８７）にて測定することにより関節破壊（細胞外マトリックスの分解）を評価する。また、膝関節の病理組織学的検討を行う。
抗ＦＧＦ−８中和抗体をモデル動物に投与する際の剤型および投与経路としては、対象となるモデル動物の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。例えば、それらをそのまま、または他の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤等と共に、モデル動物に対して、経口的または非経口的（腹腔内、静脈内、関節内、筋肉内、皮下投与など）に投与することができる。
抗ＦＧＦ−８中和抗体の配合量並びに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、モデル動物の具体的症状、モデル動物の体重などに応じて個別に決定され、特に限定されないが、投与量として、１日当たり概ね１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を、投与間隔として１日１回程度でも可能であり、１日２〜４回、またはそれ以上の回数に分けて投与することもできる。また、例えば点滴などにより連続的に投与することも可能である。関節などの局所に投与する場合には、１個所に概ね１ｐｇから１００ｍｇを投与する。
５．本発明の診断薬
ＦＧＦ−８は関節における滑膜細胞の増殖、軟骨の細胞外マトリックスの破壊を誘導する。上述した抗ＦＧＦ−８抗体は、ＦＧＦ−８と特異的に結合し、ＦＧＦ−８を検出および定量できるので、関節炎の診断薬として用いることができる。診断できる関節炎としては、上記４．に記載した疾患があげられる。ＦＧＦ−８の検出および定量は、下記６．に示す方法により行うことができる。
本発明の診断薬に使用される抗ＦＧＦ−８抗体としては、ＦＧＦ−８に特異的に結合する抗体であればいかなるものでもよく、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、ヒト化抗体およびこれらの抗体の抗体断片をあげることができる。
本発明の診断薬で使用される、抗ＦＧＦ−８抗体は、上記の抗ＦＧＦ−８中和抗体の製造法と同様にして製造することができるが、ＦＧＦ−８の活性を阻害することを要しない。抗ＦＧＦ−８中和抗体を、本発明の診断薬として使用される抗ＦＧＦ−８抗体として用いることもできる。本発明の診断薬に用いられる抗ＦＧＦ−８抗体の具体例としては、ハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ１３３４、形質転換体ＫＭ３０３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６）が生産するヒト型キメラ抗体ＫＭ３０３４、形質転換体ＫＭ３３３４が生産するヒト型キメラ抗体ＫＭ３３３４、形質転換体ＫＭ８０３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６、形質転換体ＫＭ８０３４が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、形質転換体ＫＭ８０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯおよび形質転換体ＫＭ８０３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯがあげられる。
抗ＦＧＦ−８抗体を含有する診断薬は、下記６．に示すような判定方法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩等が挙げられる。検出用試薬としては、抗ＦＧＦ−８抗体を認識する標識された二次抗体、標識に対応した基質等の通常の免疫学的検出法に用いられる試薬があげられる。
６．本発明の関節炎の判定方法
本発明の判定方法で判定される関節炎としては、上記４．に記載した疾患があげられる。これらの疾患の患者の関節では、健常者と比較して、滑膜細胞の増殖、軟骨の細胞外マトリックスの破壊を誘導する活性をもつＦＧＦ−８の量が増加していると考えられる。
本発明の関節炎の判定方法としては、例えば、バイオプシー等で被験者より採取した関節の滑膜や軟骨の細胞または組織切片、および該細胞または組織より調製した細胞抽出液、滑液等を用いて、細胞あるいは組織に存在するＦＧＦ−８を下記に述べるように、免疫学的に検出および／または定量する方法があげられる。
ＦＧＦ−８に対する抗体を用いて関節に発現したＦＧＦ−８を免疫学的に検出および／または定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（富山朔二および安東民衛，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック，１９８７年、日本生化学会，続生化学実験講座５，免疫生化学研究法，東京化学同人，１９８６年）などを用いることができる。
蛍光抗体法は、文献（モノクローナル・アンチボディーズ、富山朔二および安東民衛，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック，１９８７年）等に記載された方法を用いて行うことができる。具体的には、分離した関節の細胞あるいは組織などに、抗ＦＧＦ−８抗体を反応させ、さらにフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）あるいはフィコエリスリンなどの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、分離した関節の細胞あるいは組織、滑液などに、抗ＦＧＦ−８抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、酵素反応により発色する基質を加えて反応させ、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）は、分離した分離した関節の細胞あるいは組織、滑液などに、抗ＦＧＦ−８抗体を反応させ、さらに放射性同位体標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで放射能を測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法は、分離した関節の細胞あるいは組織などに、抗ＦＧＦ−８抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素等で標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させ、酵素標識の場合は酵素反応により発色する基質を加えて反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法であり、文献（モノクローナル・アンチボディーズ、富山朔二および安東民衛，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック，１９８７年）等に記載された方法を用いて行うことができる。
ウェスタンブロッティングは、分離した関節の細胞あるいは組織、それらの破砕液、滑液などをＳＤＳを含むサンプル用緩衝液に溶解させてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なったのち、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、抗ＦＧＦ−８抗体を反応させ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、酵素反応により発色あるいは化学発光する基質を加えて反応させ、バンドとして検出する方法である。
免疫沈降法は、分離した関節の細胞あるいは組織の破砕液、滑液とビーズ等に固定化した抗ＦＧＦ−８抗体を反応させ、遠心等によりビーズを単離した後、ビーズをＳＤＳを含むサンプル用緩衝液で処理して、溶解させたＦＧＦ−８をウェスタンブロッティング等により検出する方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡはエピトープがそれぞれ異なる２種類の抗ＦＧＦ−８抗体を用いた酵素免疫測定法の一種である。一方の抗ＦＧＦ−８抗体をプレート上に固定し、分離した関節の細胞あるいは組織、それらの破砕液、滑液を反応させた後、プレート上の抗ＦＧＦ−８抗体に結合したＦＧＦ−８にさらにもう一方の抗ＦＧＦ−８抗体を反応させる。ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体を反応させた後、酵素反応により発色する基質を加えて反応させ、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の実施例および参考例を示す。
実施例１  ウサギ軟骨細胞のＦＧＦ−８による細胞外マトリックスの分解と抗体による阻害
ウサギ関節軟骨細胞は、３週齢の雌性ニュージーランドホワイト種ウサギの両膝および肩より田村らの方法（Ｔａｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４１９，２６９−２７４，２００１）に従って分離培養した。すなわち両膝関節および両肩関節を摘出し、骨端軟骨を採取した。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、軟骨を細切し、０．４ｗ／ｖ％アクチナーゼＥを含む１０ｖｏｌ％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（以下、ＦＢＳを含むＤＭＥＭをＦＢＳ／ＤＭＥＭと記す）中で３７℃で１時間、さらに０．０２５ｗ／ｖ％コラゲナーゼＰを含む１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で３７℃、５〜６時間処理することにより軟骨細胞を軟骨組織から分離し、採取した。採取した軟骨細胞を１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、１００，０００個／ｍＬになるように調製した。この軟骨細胞を含む培養液を２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬずつ播種して５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ気相下、３７℃にて培養した。軟骨細胞がコンフルエントに達した後、培養液を０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに置換し２４時間培養した。培養液を除去し、０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（無刺激群）、またはＦＧＦ−８〔１、１０または１００ｎｇ／ｍＬ；ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）社製〕を含む０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを１ｍＬ添加して４８時間培養した。抗ＦＧＦ−８中和抗体の作用を検討する際は、ＦＧＦ−８（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（０群）、またはＦＧＦ−８（１００ｎｇ／ｍＬ）と抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４（１、３または１０μｇ／ｍＬ）とを含む０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを１ｍＬ添加して４８時間培養した。培養液を除去し、プレートに残った細胞外マトリックス中のグリコサミノグリカンの量をジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）法（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１  １０３−１０８，１９８７）にて測定した。すなわち、５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−システイン塩酸塩一水和物を加えて活性化した保存用パパイン緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８）に最終濃度が２０μｇ／ｍＬになるようにパパイン（シグマ−アルドリッチ社製）を加え、この液を上記の軟骨細胞を培養したプレートの各ウェルに１ｍＬずつ添加し、６０℃で一晩消化した。この消化液７５μＬに塩酸グアニジン緩衝液（２．８８ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジン、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８）２５μＬとＤＭＭＢ溶液２００μＬを添加し、５３０／５９０ｎｍの吸光度を測定した。スタンダードとして使用したコンドロイチン硫酸（クジラ軟骨由来、生化学工業社製）の吸光度から各サンプルのグリコサミノグリカンの濃度を算出した。実験は各条件とも３例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
その結果を第１図および第２図に示す。ＦＧＦ−８は１００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞外マトリックス中のグリコサミノグリカン残存量を有意に低下させた（第１図）。
このことは、ＦＧＦ−８が軟骨の細胞外マトリックスの分解を促進する作用を有することを示している。また、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４はＦＧＦ−８による軟骨の細胞外マトリックスの分解促進を３μｇ／ｍＬ以上の抗体濃度で有意に抑制した（第２図）。したがって、抗ＦＧＦ−８中和抗体の投与により、関節炎における細胞外マトリックスの分解を抑制することができる。
実施例２  ＦＧＦ−８によるウサギ軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生の促進と抗体による阻害
ウサギ関節軟骨細胞は、実施例１に記載の方法に従って分離培養した。軟骨細胞がコンフルエントに達した後、培養液を０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに置換し２４時間培養した。培養液を除去し、０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（無刺激群）、ＦＧＦ−８（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（０群）または、ＦＧＦ−８（１００ｎｇ／ｍＬ）と抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４（１、３または１０μｇ／ｍＬ）とを含む０．５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを１ｍＬ添加して４８時間培養した。４８時間後、培養液を回収し、培養液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−３濃度をウサギマトリックスメタロプロテイナーゼ−３  ＥＬＩＳＡシステム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いて測定した。実験は各条件とも３例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
その結果を第３図に示す。ＦＧＦ−８は１００ｎｇ／ｍＬの濃度で軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生を有意に増加させた（無刺激群対０群、Ｐ＝０．００７９）。このことは、ＦＧＦ−８が軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生誘導を介して細胞外マトリックスの分解を促進する作用を有することを示している。また、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４は、ＦＧＦ−８による軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生を１μｇ／ｍＬ以上の抗体濃度から有意に抑制した。抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の１、３または１０μｇ／ｍＬでの抑制率は、それぞれ７２、７４、１００％であった。したがって、抗ＦＧＦ−８中和抗体の投与により、軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の産生が抑制され、関節炎における細胞外マトリックスの分解を抑制することができる。
実施例３  ウサギ滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進と抗体による阻害
ウサギ滑膜細胞はＨａｍｉｌｔｏｎらの方法（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｌｙｗｋａ  Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６，８５１−８５５，１９８１）に準じて採取した。分離した滑膜細胞を１０ｖｏｌ％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（以下、ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地をＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０と記す）中に懸濁し、１０，０００個ずつ９６ウェルの培養プレートに播種した。２４時間培養後、各ウェルの培養液を除去し、０．２ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０（無刺激群）、またはＦＧＦ−８（１、１０または１００ｎｇ／ｍＬ）を含む０．２ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０を２００μＬ添加した。抗ＦＧＦ−８中和抗体の作用を検討する際は、ＦＧＦ−８（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む０．２ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０（０群）、またはＦＧＦ−８（１００ｎｇ／ｍＬ）と抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４（０．１、０．３、１、３または１０μｇ／ｍＬ）とを含む０．２ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０を各ウェルに２００μＬ添加した。４８時間培養後、１ウェルあたり９．２５ｋＢｑの［３Ｈ］チミジンを添加した。さらに２４時間培養し、細胞内に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を液体シンチレーションカウンター（１２０５ベータープレート、パーキンエルマーライフサイエンスジャパン社製）を用いて測定した。実験は各条件とも６例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
その結果を第４図および第５図に示す。ＦＧＦ−８は１００ｎｇ／ｍＬの濃度でウサギ滑膜細胞への［３Ｈ］チミジンの取り込みを有意に促進した（第４図）。このことはＦＧＦ−８がウサギ滑膜細胞の増殖を促進する作用を有していることを示している。また、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４は、このＦＧＦ−８依存性の［３Ｈ］チミジンの取り込みの促進を０．３μｇ／ｍＬの抗体濃度から有意に抑制した（第５図）。したがって、抗ＦＧＦ−８中和抗体の投与により、関節炎における滑膜の増殖を抑制することができる。
実施例４  ヒト滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進と抗体による阻害
関節リウマチ患者由来のヒト滑膜細胞（東洋紡より購入）を用いて、実施例３と同様の実験を行った。ＦＧＦ−８の濃度は１０、１００または５００ｎｇ／ｍＬで行い、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４と共存させるＦＧＦ−８の濃度は５００ｎｇ／ｍＬにした。実験は各条件とも６例ずつ行い、平均値と標準誤差を求めた。
その結果を第６図および第７図に示す。ＦＧＦ−８は５００ｎｇ／ｍＬの濃度でヒト滑膜細胞への［３Ｈ］チミジンの取り込みを有意に促進した（第６図）。このことはＦＧＦ−８がヒト滑膜細胞の増殖を促進する作用を有していることを示している。また、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４はこのＦＧＦ−８依存性の［３Ｈ］チミジンの取り込みの促進を１μｇ／ｍＬの抗体濃度から有意に抑制した（第７図）。したがって、抗ＦＧＦ−８中和抗体の投与により、関節炎における滑膜の増殖を抑制することができる。
実施例５  抗ＦＧＦ−８抗体を使用した滑膜の染色
ヒト関節リウマチ患者より摘出した滑膜から、文献の方法（Ｔａｎａｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，２０５３−２０５６，１９９８）に従いパラフィン切片を作製し、抗ＦＧＦ−８抗体ＫＨ１３３４を用いて組織免疫染色を行った。その結果、ヒト関節リウマチ滑膜４例中３例の滑膜細胞でＦＧＦ−８が陽性であった。したがって、ＦＧＦ−８はヒト滑膜に存在することが確認された。また、抗ＦＧＦ−８抗体を用いてヒト関節リウマチの滑膜細胞を検出することにより、ヒト関節リウマチの判定が可能なことが示された。
実施例６  ＦＧＦ−８の関節内注入による関節炎の誘導
ＦＧＦ−８を用いて、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（雄性、７週齢、日本チャールス・リバー社）に、以下のようにして関節炎様症状を誘発した。最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩液（大塚製薬工場社製）を用いて調製したＦＧＦ−８を、ラット膝関節内に５０μＬ注入した。また、生理食塩液を膝関節内に５０μＬ注入した群を設けた。一群は３匹とした。ＦＧＦ−８または生理食塩液注入３日後に、Ｙａｍａｄａらの方法（Ｙａｍａｄａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．，４９，１４４−１４６，２０００）に従い、膝関節包内を０．３８ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム含有の生理食塩液３０μＬで洗浄し、洗浄液を回収した。この操作を１０回繰り返し、３００μＬの関節洗浄液を回収した。関節洗浄液中のグリコサミノグリカン量を実施例１に記載のＤＭＭＢ法にて測定した。また、膝関節の膝蓋骨を取り出し、実施例１に記載の方法で軟骨部分をパパインで消化し、硬骨の重量を測定した。
その結果を第８図および第９図に示す。第８図は関節洗浄液中のグリコサミノグリカンの濃度を示す。ＦＧＦ−８の注入により、関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度は、生理食塩液注入群の１．９倍に上昇した（Ｐ＝０．００３４）。このことは、ＦＧＦ−８の注入により関節軟骨の細胞外マトリックス分解が亢進することを示している。第９図はパパイン消化後の膝蓋骨重量を示す。ＦＧＦ−８の注入により、膝蓋骨の重量は、生理食塩液注入群の４０％に低下した（Ｐ＝０．０４５４）。このことは、ＦＧＦ−８の注入により、膝蓋骨の破壊が亢進することを示している。したがって、ＦＧＦ−８は、生体において関節破壊を誘導し、関節炎様の症状を引き起こすことが示された。
実施例７  マウス・コラーゲン関節炎モデルでの評価
マウス・コラーゲン関節炎モデルは、ＤＢＡ／１Ｊ系マウス（雄性、７週齢、日本チャールス・リバー社）を用いて、鎌田らの方法（Ｋａｍａｄａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７０，１６９−１７５，１９９６）に準じ、以下のようにして作製した。
ウシ軟骨由来ＩＩ型コラーゲン溶液（コラーゲン技術研修会社製）をフロイント完全アジュバント（ヤトロン社製）と氷冷下で混和してエマルジョンを形成させ、ＩＩ型コラーゲンの最終濃度が１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したものを、マウスの尾根部皮内に１００μＬ注射して感作し、さらに２１日後に同様の操作で追加免疫を行った。一群は１０匹とした。ＫＭ１３３４投与群には、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４を生理食塩液（大塚製薬工場社製）で最終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、上記マウス・コラーゲン関節炎モデルの初回感作から２１、２５、２８、３２、３５および３９日目に１日１回各個体に２００μＬ腹腔内投与した。また生理食塩液投与群には、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４溶液の代わりに生理食塩液のみを腹腔内投与した。また陽性コントロールとして、ジクロフェナック投与群には、非ステロイド性抗炎症薬であるジクロフェナックナトリウム（シグマ−アルドリッチ社製）を０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液に最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、上記マウス・コラーゲン関節炎モデルの初回感作２１日目から２５日目、２８日目から３２日目、および３５日目から３９日目に、１日１回、体重１００ｇあたり１ｍＬ経口投与した。また、溶媒投与群として０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液のみを同様に経口投与した。さらに未処置群をおき、これらにはコラーゲン感作および薬物投与を行なわなかった。コラーゲン関節炎における全肢浮腫の経時変化は、一肢０から４点、全肢合計最高１６点のスコアリングによって評価した。スコアの基準は、０：正常、１：弱い紅斑を認める、２：弱い腫脹と紅斑を認める、３：強い腫脹と紅斑を認め、触知により温感を認める、４：手指の変形を伴う著明な腫脹を認める、とした。
その結果を第１０図に示す。抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、４２日目で３４％（Ｐ＝０．０２０４）の有意な関節炎スコアの抑制が認められ、その抑制の程度は陽性コントロールのジクロフェナック投与群と同程度であった（第１０図）。このことは、抗ＦＧＦ−８中和抗体の投与により、関節炎を抑制することができることを示している。
実施例８  ラット・アジュバント関節炎モデルでの評価
ラット・アジュバント関節炎モデルは、Ｌｅｗｉｓ系ラット（雌性、８週齢、日本チャールス・リバー社）を用いて、Ｐｅａｒｓｏｎらの方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＣＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．，５，６５４−６５８，１９６２）に準じ、以下のようにして作製した。
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ディフコ社製）を、最終濃度が６ｍｇ／ｍＬとなるように流動パラフィン（和光純薬工業社製）に懸濁し、高圧蒸気滅菌したものを、ラットの右側足踵部皮内に１００μＬ注射して感作した。一群は８〜１０匹とした。ＫＭ１３３４投与群には、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４を生理食塩液で最終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、上記ラット・アジュバント関節炎モデルの感作日、ならびに感作から３、７、１０、１４、および１７日目に１日１回各個体に体重１００ｇあたり０．５ｍＬを腹腔内投与した。また生理食塩液投与群には、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４溶液の代わりに生理食塩液のみを腹腔内投与した。また陽性コントロールとして、ジクロフェナック投与群には、抗炎症薬のジクロフェナックナトリウムを０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液に最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、アジュバント感作日から４日目、７から１１、１４から１８日目に、１日１回、体重１００ｇあたり１ｍＬ経口投与した。メソトレキセート投与群には、代謝拮抗薬である注射用メソトレキセート商標登録５０ｍｇ（日本ワイスレダリー社製）を０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液に最終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、ジクロフェナック投与群と同様に投与した。プレドニゾロン投与群には、ステロイド薬であるプレドニゾロン（シグマ−アルドリッチ社製）を０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液に最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬとなるように懸濁し、ジクロフェナック投与群と同様に投与した。また溶媒投与群として０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液のみを同様に経口投与した。さらに未処置群をおき、これらにはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ感作および薬物投与を行わなかった。アジュバント処置足および非処置足の容積は、ラット後肢足浮腫測定装置（ＴＫ−１０１、ユニコム社製）を用いて経時的に測定した。
感作日より２１日目の測定結果を第１１図ならびに第１２図に示す。抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、アジュバント非処置足において、６９％（Ｐ＝０．００１０）の有意な足容積増加の抑制が見られた（第１１図）。ジクロフェナック投与群では４５％（Ｐ＜０．０００１）、メソトレキセート投与群では９０％（Ｐ＜０．０００１）、プレドニゾロン投与群では５１％（Ｐ＝０．００２９）の有意な足容積増加の抑制が見られた（第１２図）。すなわち、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４は、ジクロフェナックナトリウムやプレドニゾロンを上回る浮腫抑制作用を示した。
感作から２０日目より２１日目までの２４時間蓄尿を用いて、尿中のグリコサミノグリカン、デオキシピリジノリン、ヒドロキシプロリン、およびクレアチニン量を測定した。尿中のグリコサミノグリカン量は、実施例１に記載のＤＭＭＢ法にて測定した。尿中のヒドロキシプロリン量は、池田らの方法（池田眞悟ら，東京衛研年報．３６  ２７７−２８２，１９８５）に従って測定した。すなわち、尿０．８ｍＬにアミノ酸分析用塩酸（関東化学社製）０．８ｍＬ添加し、１１０℃で１５時間加水分解した。加水分解した試料０．５ｍＬに１．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を２ｍＬ添加して中和した。中和処理した試料０．５ｍＬにイソプロパノールを１ｍＬ添加し、Ｏｘｉｄａｎｔ溶液を１ｍＬ添加してよく攪拌し、５分間室温に静置した。Ｏｘｉｄａｎｔ溶液は、酢酸ナトリウム三水和物５．７ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物３．７５ｇ、クエン酸一水和物０．６０２ｇを蒸留水約５０ｍＬに溶解し、イソプロパノール３８．５ｍＬ加え、さらに蒸留水を加えて１００ｍＬとした酢酸クエン酸緩衝液と、蒸留水を用いて調製した７ｗ／ｖ％クロラミンＴ溶液（ｐ−トルエンスルホンクロロアミドナトリウム三水和物、和光純薬工業社製）を使用時に４：１の割合で良く混和したものである。その後Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬を１ｍＬ添加してよく攪拌し、恒温器にて６０℃、２０分間加温した。Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬は、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（和光純薬工業社製）１７．６ｇを過塩素酸（関東化学社製）２０．９ｍＬに溶解し、イソプロパノールを加えて１００ｍＬとしたものである。加温後、流水で冷却し、５６２ｎｍの吸光度を測定した。Ｌ−ヒドロキシプロリン（和光純薬工業社製）の吸光度から作成した検量線を用いて、各サンプルのヒドロキシプロリン濃度を算出した。尿中のデオキシピリジノリン量は、オステオリンクス「ＤＰＤ」（住友製薬社製）を用いて測定した。尿中クレアチニン量は、クレアチニン−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定した。個体間の尿濃度の差を補正するため、各個体毎にグリコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度、デオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度、あるいはヒドロキシプロリン濃度／クレアチニン濃度の比を算出し、それぞれの指標とした。
その結果を第１３図から第１７図に示す。尿中のグリコサミノグリカン量は、生理食塩液投与群において、未処置群の２．２倍に上昇した（Ｐ＜０．０００１）（第１３図）。このことは、関節炎の進展に伴い、軟骨破壊が亢進することを示している。抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、尿中グリコサミノグリカン量の上昇に対し、７３％（Ｐ＝０．００６４）の有意な抑制が見られた（第１３図）。メソトレキセート投与群では、７９％（Ｐ＝０．０４６５）の有意な尿中グリコサミノグリカン量上昇の抑制が見られた。有意ではないが、ジクロフェナック投与群では４０％、プレドニゾロン投与群では１８％の尿中グリコサミノグリカン量の低下が認められた（第１４図）。すなわち、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４は、メソトレキセートと同程度の軟骨破壊抑制作用を示した。
尿中のデオキシピリジノリン量は、生理食塩液投与群において、未処置群の１．８倍に上昇した（Ｐ＜０．０００１）（第１５図）。このことは、関節炎の進展に伴い、骨破壊が亢進することを示している。抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、尿中デオキシピリジノリン量の上昇に対し、４１％（Ｐ＝０．０１８５）の有意な抑制が見られた。ジクロフェナック投与群では、８８％（Ｐ＝０．００１６）の有意な尿中デオキシピリジノリン量上昇の抑制が見られた。有意ではないが、メソトレキセート投与群では３４％、プレドニゾロン投与群では３８％の尿中デオキシピリジノリン量の低下が認められた（第１６図）。すなわち、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４は、メソトレキセートやプレドニゾロンを上回る骨破壊抑制作用を示した。
尿中のヒドロキシプロリン量は、生理食塩液投与群において、未処置群の１．８倍に上昇した（Ｐ＝０．０００２）（第１７図）。このことは、関節炎の進展に伴い、骨破壊が亢進することを示している。抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、尿中ヒドロキシプロリン量の上昇に対し、有意ではないが４８％の低下が見られた。
感作から２１日目にアジュバント非処置足を脛骨骨幹部で切断して採取し、１０ｖｏｌ％リン酸緩衝ホルマリン溶液で固定した。その後、軟Ｘ線発生装置ＳＯＦＲＯＮＳＲＯ−Ｍ５０（ソフロン社製）を用いて、２９ｋＶ、４ｍＡ、２分間の条件下で軟Ｘ線写真を撮影した。実体顕微鏡を用いて写真を観察し、骨破壊をスコアリングした。スコアリングは、踵骨（一辺を１部位とし、合計５部位）の骨びらんの有無を観察し、びらんあり１点、なし０点として、一肢最高５点で行った。
その結果を第１表ならびに第２表に示す。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１（溶媒投与群対比、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を表す。
2003057251.tif 000003
2003057251.tif 000004
抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、有意ではないが、骨破壊スコアの２７％低下が見られたが、（第１表）。ジクロフェナック投与群では３３％（Ｐ＝０．０３６２）、メソトレキセート投与群では８０％（Ｐ＝０．０００６）、プレドニゾロン投与群では６１％（Ｐ＝０．００３２）骨破壊スコアの低下が認められた（第２表）。すなわち、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４は、ジクロフェナックナトリウムと同程度の骨破壊スコアの低下を示した。
ホルマリン固定したアジュバント非処置足のパラフィン切片を作製した。ヘマトキシリン／エオシン染色し、脛骨から中足骨にかけての骨、関節および関節周囲領域を組織病理学的に評価した。関節周囲組織あるいは関節腔への血漿漏出を、一肢０から４点のスコアリングにより評価した。スコアの基準は、０：変化なし、１：極軽度の変化を認める、２：軽度の変化を認める、３：中等度の変化を認める、４：重度の変化を認める、とした。
その結果を第３表に示す。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１（生理食塩液投与群対比、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を表す。
2003057251.tif 000005
抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、関節周囲組織への血漿漏出の４１％低下（Ｐ＝０．００２２）、ならびに関節腔への血球および血漿漏出の４１％低下（Ｐ＝０．０１５６）が見られた（第３表）。したがって、抗ＦＧＦ−８中和抗体の投与により、関節炎における浮腫形成と、軟骨ならびに骨破壊を抑制することができる。
実施例９  ラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルでの評価
ラット・モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（雄性、７週齢、日本チャールス・リバー社）を用いて、Ｇｕｉｎｇａｍｐらの方法（Ｇｕｉｎｇａｍｐ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４０，１６７０−１６７９，１９９７）に準じて、以下のようにして作製した。
最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩液を用いて調製したモノヨード酢酸（シグマ−アルドリッチ社製）を、ラットの右膝関節内に２５μＬ注入した。一群は１０匹とした。ＫＭ１３３４投与群には、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４を生理食塩液（大塚製薬工場社製）で最終濃度４ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、モノヨード酢酸注入時に１回、体重１００ｇあたり０．５ｍＬを腹腔内投与した。また生理食塩液群には、抗体溶液の代わりに生理食塩液のみを腹腔内投与した。さらに偽手術群をおき、これらには生理食塩液を膝関節内に注入し、薬物投与は行わなかった。モノヨード酢酸注入３日後に、実施例６に記載の方法に従い、関節洗浄液を回収した。関節洗浄液中のグリコサミノグリカン量を実施例１に記載のＤＭＭＢ法にて測定した。
その結果を第１７図に示す。モノヨード酢酸の注入により、関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度は、偽手術群の１．６倍に上昇した（Ｐ＝０．００１４）。このことは、モノヨード酢酸注入により、関節軟骨の細胞外マトリックス分解が亢進することを示している。このモノヨード酢酸注入による関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度の上昇に対し、抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４投与群では、４２％（Ｐ＝０．０１８８）の有意な抑制が見られた。したがって、抗ＦＧＦ−８中和抗体の投与により、関節炎における関節軟骨の破壊を抑制することができる。
参考例１  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の生産
１．マウスの抗ＦＧＦ−８中和抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離と解析
（１）マウスの抗ＦＧＦ−８中和抗体生産ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
マウスの抗ＦＧＦ−８中和抗体を生産するハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５１、特開平９−２７１３９１）の１×１０７細胞より、ｍＲＮＡの調製キットであるファストトラックｍＲＮＡ単離キット（インビトロジェン社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ｍＲＮＡを約８μｇ調製した。
（２）抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記（１）で取得したＫＭ１３３４のｍＲＮＡの５μｇから、タイムセーバーｃＤＮＡ合成キット（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。続いて、λＺＡＰＩＩクローニング・キット（ストラタジーン社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。まず、ｃＤＮＡ全量を２０μＬの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧクラスの抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１μｇ回収した。次に、各々の約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇと、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化したλＺＡＰＩＩベクター１μｇとを、添付の使用説明書に従い連結した。
連結後の各々の反応液のうち４μｌをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  Ｇｏｌｄ（ストラタジーン社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、適当量を大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）に感染させて、ＫＭ１３３４のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約８．１×１０４個と、５．５×１０４個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを常法（モレキュラー・クローニング  第３版）に従い、ナイロンメンブレン上に固定した。
（３）抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
上記（２）で作製したＫＭ１３３４のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンを、ＥＣＬ直接核酸標識検出システム（ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ〔Ｈ鎖はマウスＣγ１  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，２０１０−２０１６，１９９１）、Ｌ鎖はマウスＣκ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ｈｉｅｔｅｒ  Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２，１９７−２０７，１９８０）をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩクローニング・キット（ストラタジーン社製）の使用説明書に従い、イン・ビボ・エクシジョン（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２、アプライド・バイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１を得た。
（４）抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
配列番号１にプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１に含まれていたＶＨの全塩基配列、配列番号２に推定された全アミノ酸配列、配列番号３にプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１に含まれていたＶＬの全塩基配列、配列番号４に推定された全アミノ酸配列をそれぞれ示す。既知のマウス抗体の配列データ（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）との比較および精製した抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号２に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が、Ｌ鎖については配列番号４に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。なお、分泌シグナル配列を除いたＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号５および配列番号６にそれぞれ示した。
次に、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧパッケージ〔バージョン９．１、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）社製〕を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース〔ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｅｌｅａｓｅ  ５６．０）〕をＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０３  １９９０）により検索した。その結果、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに完全に一致する配列は認められず、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列であることが確認された。
また、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７、８および９に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０、１１および１２に示した。
２．抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のＶＨをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５の構築
参考例１の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１の５０ｎｇを鋳型とし、配列番号１３、１４に記載の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡ〔ジェンセット（ＧＥＮＳＥＴ）社製〕をプライマーとして終濃度０．３μｍｏｌ／Ｌｏｌ／Ｌとなるように加え、ＫＯＤプラス・ポリメラーゼ（東洋紡績社製）に添付の使用説明書に従い、全量５０μＬでまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５７℃３０秒間、６８℃１分間の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（５’末端側がＥｃｏＲＩ、３’末端側は平滑末端）を約０．３μｇ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたＶＨをコードするＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片０．１μｇとを全量１０μｌの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡績社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第１８図に示した抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のＶＨをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５を得た。
（２）抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のＶＬをコードするＤＮＡを含むプラスミドの構築
参考例１の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１の５０ｎｇを鋳型とし、配列番号１５、１６に記載の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）をプライマーとして終濃度０．３μｍｏｌ／Ｌとなるように加え、ＫＯＤプラス・ポリメラーゼに添付の使用説明書に従い、全量５０μＬでまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５７℃３０秒間、６８℃１分間の条件で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（５’末端側がＥｃｏＲＩ、３’末端側は平滑末端）を約０．３μｇ回収した。
次に、上記で得られたＶＬをコードするＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第１９図に示した抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のＶＬをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４を得た。
（３）抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と参考例１の２．（１）および（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５およびｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４を用いて抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を以下の様にして構築した。
参考例１の２．（１）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５の３μｇに、１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ〔ニュー・イングランド・バイオラブイズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社製〕及び１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を添加して３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４８ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇに、１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＮｏｔＩを添加して３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．８ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第２０図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈを得た。
次に、参考例１の２．（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（ニュー・イングランド・バイオラブイズ社製）を添加して３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈの３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＢｓｉＷＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．３０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈ由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第２０図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を得た。
得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の４００ｎｇを用い、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２およびＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列の解析を行った。その結果、目的のＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（４）抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた安定発現
上記参考例１の２．（３）で得られた抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を用いて、ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ  Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）を宿主とした抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の１０μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、１０〜３０ｍＬのＩＭＤＭ−１×ＨＴサプルメント−ｄＦＢＳ（１０）〔透析ＦＢＳ（以下ｄＦＢＳと略す）を１０％と１×ＨＴサプルメント（インビトロジェン社製）とを含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）〕に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（旭テクノグラス社製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、培養液を培地ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）〔ＨＴサプルメントを含まずに１０％ｄＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地〕と交換してさらに１〜２週間培養した。耐性コロニーが出現しコンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の抗原結合活性を下記の参考例１の２．（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については２４ウェルプレートに播種し、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、ｄｈｆｒの阻害剤であるメソトレキセート（シグマ−アルドリッチ社製、以下ＭＴＸと略す）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）で２週間培養した。更にＭＴＸ濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌ、５００ｎｍｏｌ／Ｌと高くし、それぞれの段階で２週間ずつ培養を行い、５００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２．（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。最終的に、５００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンをＫＭ３０３４と命名した。なお、ＫＭ３０３４は平成１３年１２月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３６として寄託されている。
（５）抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のＹＢ２／０細胞を用いた安定発現
上記参考例１の２項（３）で得られた抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を用いて抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６６２）での発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の１０μｇを４×１０６細胞のＹＢ２／０細胞へエレクトロポレーション法により導入後、４０ｍＬのハイブリドーマ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）〔５％ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社製）を含むハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）〕に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２．（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８および５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸを含むハイブリドーマ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート〔グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）社製〕に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の抗原結合活性を参考例１の２．（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を上昇させ、終濃度が１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８、２００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸを含むハイブリドーマ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体を高発現する形質転換株５−Ｄを得た。得られた形質転換株について、限界希釈法によるクローン化を行い、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞株を得た。得られた形質転換細胞株をＫＭ３３３４と命名した。
（６）ＥＬＩＳＡによる、抗体のＦＧＦ−８部分ペプチドに対する結合活性の測定
抗ＦＧＦ−８抗体が反応し得るヒトＦＧＦ−８の部分ペプチドとして、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４（特開平９−２７１３９１）の抗原ペプチドと同じ配列である配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。配列番号１７は、ヒトＦＧＦ−８のアミノ酸配列の２３〜４６番目の配列のＣ末端に、コンジュゲート作製のためにシステイン残基を付加した配列である。以下、このペプチドを化合物１と呼ぶ。ＥＬＩＳＡに用いるため、以下の方法で牛血清アルブミン（ナカライテスク社製、以下、ＢＳＡと略す）とのコンジュゲート（以下、ＢＳＡ−化合物１と呼ぶ）を作製した。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ  ９００μＬに、１００μＬの２５ｍｇ／ｍＬ  ＳＭＣＣ〔４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッド  Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、シグマ−アルドリッチ社製〕のＤＭＳＯ溶液を攪拌しながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬのＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラム（ＮＡＰ−１０カラム）に反応液１ｍＬを載せ、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした。各画分のＢＳＡ濃度は２８０ｎｍの吸光度で測定した。次に、１．０ｍｇの化合物１に２００μＬ  ＤＭＳＯを加え、次いで８００μＬ  ＰＢＳを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算２．５ｍｇ）を攪拌下で添加して室温で３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加した後、孔径０．２２μｍフィルターでろ過した溶液をＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したＢＳＡ−化合物１溶液を０．５〜１．０μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと呼ぶ）を１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと呼ぶ）で洗浄後、形質転換株の培養上清あるいは精製抗体を５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００〜６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液〔アメリカン・クォーレックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）社製〕を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間反応させた。反応後の各ウェルを、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔０．５５ｇの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に３０％過酸化水素水を１μＬ／ｍＬの割合で添加した溶液〕を５０μＬ／ウェルずつ加えて発色反応させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルずつ加えて反応を停止した。その後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
３．抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の精製
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の発現細胞の培養及び抗体の精製
参考例１の２．（４）で得られた抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体を発現する形質転換細胞株ＫＭ３０３４を５００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（グライナー社製）に４０ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で５〜７日間培養し、コンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２０ｍＬのＰＢＳにて細胞を洗浄した。ＰＢＳを除去し、４０ｍＬのＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０１培地（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）を加え、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて７〜１４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりプロセップ−Ａ〔Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア社製〕カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体を精製した。得られた抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体はＫＭ３０３４と名付けた。
（２）ＹＢ２／０細胞由来の発現細胞の培養及び抗体の精製
参考例１の２．（５）で得られた抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体を発現する形質転換細胞株ＫＭ３３３４を、１７５ｃｍ２フラスコで、２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸおよび５％ダイゴＧＦ２１（和光純薬社製）を含むハイブリドーマ−ＳＦＭ培地を用いて、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。８〜１０日間培養して回収した培養上清より、プロセップ−Ａカラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体を精製した。得られた抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体はＫＭ３３３４と名付けた。
４．精製した抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の解析
参考例１の３．で得られた各種動物細胞で発現、精製した２種類の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４の各４μｇを公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０，１９７０）に従ってＳＤＳ−電気泳動にかけ、分子量及び精製度を解析した。精製した各抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、分子量約５０ＫｄのＨ鎖と約２５ＫｄのＬ鎖にそれぞれ分解されるという報告（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）と一致し、これにより抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
５．精製した抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体の中和活性評価
精製した抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体のＦＧＦ−８中和活性の評価は、以下に示すマウス乳癌細胞株ＳＣ−３のＦＧＦ−８依存性増殖の抑制効果（Ｔａｎａｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，８９２８−８９３２，１９９２）により測定した。即ち、活性炭処理をしたＦＢＳを２％の濃度で含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培地〔ＤＭＥＭ培地とＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（インビトロジェン社製）とを１：１の割合で混合した培地〕に、ＳＣ−３細胞を３．０×１０４細胞／ｍＬの濃度でに懸濁し、１５０μＬ（４．５×１０３細胞）／ウェルずつ９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１８時間培養後、１００μＬ／ウェルの試験培地を用いて培地交換した。試験培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８（Ｒ＆Ｄ社製）及び各希釈濃度の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体を、ＢＳＡを０．１％で含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培地に溶解することにより作製した。また、陰性対照の抗体としてＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトケモカインＣＣＲ４に対するキメラ抗体ＫＭ２７６０を用いた。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、４８時間培養後、新たに調製した試験培地と交換し、さらに４８時間培養した。ＷＳＴ−１試薬（ロシュ社製）を１０μＬ／ウェルずつ添加し、軽く攪拌して５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１時間培養後、吸光度（ＯＤ４５０／６５０）を測定した。第２１図において、横軸は添加した抗体濃度、縦軸は５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８のみの添加時の増殖に対する相対増殖（％）を示す。５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８のみの添加時の増殖に対する相対増殖（％）は下記の式により算出された。
（式）ＦＧＦ−８添加時の増殖に対する相対増殖（％）
＝｛（ＦＧＦ−８及び抗体添加時の吸光度−ＦＧＦ−８及び抗体未添加時の吸光度）／（ＦＧＦ−８のみ添加時の吸光度−ＦＧＦ−８及び抗体未添加時の吸光度）｝×１００
第２１図に示したように、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４は、いずれも同等のＳＣ−３細胞増殖阻害活性を示し、キメラ抗体化による中和活性の低下は認められなかった。
参考例２  抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の作製
１．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの構築
（１）抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
まず、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。参考例１の１項（４）で同定した抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計することとした。より活性の高い抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ１３３４のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第４表には、相同性の検索結果を示した。第４表に示した様に、ＫＭ１３３４のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。
2003057251.tif 000006
以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１８に記載の抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０を設計した。
次に、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。参考例１の１．（４）で同定した抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＶ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。そこでＶＨの場合と同様にして、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ１３３４のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。
第５表には、相同性の検索結果を示した。第５表に示した様に、ＫＭ１３３４のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩと最も高い相同性を有していた。
2003057251.tif 000007
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１９に記載の抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０を設計した。
上記で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。多くの場合、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、マウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまう。それを回避するため、ヒト抗体とマウス抗体とのＦＲアミノ酸配列を比較し、異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本参考例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定することを検討した。
まず、上記で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０よりなる抗体Ｖ領域（ＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ〔オックスフォード・モレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）社製〕を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（オックスフォード・モレキュラー社製）あるいはＲａｓＭｏｌ〔グラクソ（Ｇｌａｘｏ）社製〕を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列において、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４と異なっているアミノ酸残基について順次、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４の相当する位置に見られるアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列からなる改変体のＶ領域三次元構造モデルを同様にして構築し、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較した。その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の活性に影響を与えると考えられる残基として、ＨＶ．０において１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８７番目のＡｒｇ、９５番目のＴｙｒを、ＬＶ．０において２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒを選択し、アミノ酸を改変することとした。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上をマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを以下のように設計した。
具体的には、ＶＨとしては、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、９５番目のＴｙｒの６残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅに改変した配列番号２０に記載のアミノ酸配列ＨＶ．６を設計した。ＶＬとしては、２番目のＩｌｅ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの６残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した配列番号２１に記載のアミノ酸配列ＬＶ．６を設計した。
（２）抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨをコードするＤＮＡの構築
参考例２の１項（１）で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０をコードするＤＮＡをＰＣＲを用いて以下の様にして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＨ鎖の分泌シグナル配列（配列番号２の１〜１９番目のアミノ酸配列）を繋げた。次に、得られたアミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を設計した。この塩基配列の５’末端と３’末端にヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含む配列を付加し、さらに５’末端にＭ１３プライマーＲＶ（宝酒造社製）の配列、３’末端にＭ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）の配列と相補的な配列を付加した。設計した塩基配列（配列番号２２）を５’末端側から１４１塩基ずつ、末端の２０塩基が重複する様に４つに区切り、それぞれの配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、センス鎖、アンチセンス鎖に相当する、配列番号２３〜２６に示す配列からなる４本のＤＮＡを化学合成した（ジェンセット社製）。
ＫＯＤポリメラーゼに添付の使用説明書に従い、０．１μｍｏｌ／Ｌの各合成ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ＬのＭ１３プライマーＲＶ、０．５μｍｏｌ／ＬのＭ１３プライマーＭ４および２．５単位のＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いて全量５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃で５分間加熱した後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７４℃で６０秒間のサイクルを２５サイクル行い、さらに７４℃で５分間加熱した。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよび１０単位の制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）に、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよび１０単位の制限酵素ＳｐｅＩを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片を約２．９μｇ回収した。
次に、上記で得られた抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨをコードするＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株の１０個のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２およびＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有する第２２図に示したプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０を得た。
また、参考例２の１．（１）で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．６をコードするＤＮＡを、上記ＨＶ．０をコードするＤＮＡと同様にして設計し（配列番号２７）、配列番号２８〜３１に示す配列からなる４本の合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）を用いて、上記と同様にしてＰＣＲにより構築した。ｐＫＭ１３３４ＨＶ０と同様の過程をとり、ＨＶ．６をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ６を得た。
（３）抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬをコードするＤＮＡの構築
参考例２の１．（１）で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０をコードするＤＮＡをＨＶ．０をコードするＤＮＡと同様にして設計した（配列番号３２）。ただし、合成ＤＮＡの設計の際、分泌シグナル配列としては、抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４のＬ鎖の分泌シグナル配列（配列番号４の１〜１９番目のアミノ酸配列）を用いた。ＨＶ．０をコードするＤＮＡと同様にして、それぞれ配列番号３３から３６の配列からなる４本の合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）を用いたＰＣＲにより、ＬＶ．０をコードするＤＮＡを構築した。ｐＫＭ１３３４ＨＶ０と同様の過程をとり、ＬＶ．０をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０を得た。
また、参考例２の１．（１）で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．６をコードするＤＮＡをＬＶ．０をコードするＤＮＡと同様にして設計し（配列番号３７）、それぞれ配列番号３８から４１の配列からなる４本の合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）を用いて上記と同様にしてＰＣＲにより構築した。ｐＫＭ１３３４ＨＶ０と同様の過程をとり、ＬＶ．６をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６を得た。
２．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と参考例２の１．（２）および（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０およびｐＫＭ１３３４ＬＶ０とを用いて抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を以下の様にして構築した。
参考例２の１．（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素ＡｐａＩ及び１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇに、１０単位の制限酵素ＡｐａＩ及び１０単位の制限酵素ＮｏｔＩを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．８ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたｐＫＭ１３３４ＨＶ０由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第２３図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０を得た。
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び制限酵素ＢｓｉＷＩを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．３０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたｐＫＭ１３３４ＬＶ０由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第２３図に示した発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を得た。
得られたプラスミドの４００ｎｇに対して、ビッグ・ダイ・ターミネーター・キット・バージョン２およびＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
また、参考例２の１．（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０および参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６を用いて上記と同様の方法により、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６を構築した。
また、参考例２の１．（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ６および参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６を用いて上記と同様の方法により、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ６ＬＶ６を構築した。
３．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＹＢ２／０細胞を用いた安定発現
参考例２の２．で得られた抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ６ＬＶ６をそれぞれ用いて各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＹＢ２／０細胞での安定発現を上記参考例１の２．（５）に記載の方法に従い、行った。
４．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の精製
参考例２の３．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体を発現するＹＢ２／０細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の精製を上記参考例１の３．（２）に記載の方法に従い、行った。ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ６、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ６ＬＶ６を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ６ＬＶ６とそれぞれ名付けた。
５．精製した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の解析
参考例２の４．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記参考例１の４．に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
６．ＥＬＩＳＡによる、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定
参考例２の４．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性は、上記参考例１の２．（６）に記載のＥＬＩＳＡにより測定した。陽性対照として、参考例１の３．（２）で得られたＹＢ２／０細胞由来の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３３３４を用いた。その結果を第２４図に示した。第２４図に示したように、いずれの抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体も、ＫＭ３３３４と同等のＦＧＦ−８結合活性を示し、ＣＤＲ移植化による明らかな結合活性の低下は認められなかった。
７．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定
参考例２の４．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性をより詳細に検討するため、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００〔ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）社製〕を用いて各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性を以下のようにして測定、比較した。陽性対照として、参考例１の３．（２）で得られたＹＢ２／０細胞由来の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３３３４を用いた。
以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰ（ビアコア社製）を使用した。まず、センサーチップＣＭ５（ビアコア社製）をセットし、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて３１．２５μｇ／ｍＬに溶解したＦＧＦ−８（Ｒ  ＆  Ｄ社製）をアミンカップリング法によりセンサーチップ表面に固定化した。共鳴シグナル（ＲＵ）を指標とした固定化量は４４９８ＲＵであった。
ＦＧＦ−８固定化フローセルに２０μＬ／分の流速で、各種抗体溶液を６０μＬ添加し、その後、３分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、２０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−塩酸溶液（ｐＨ１．５）を２回連続してフローセルに添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種濃度（５０−０．０６８μｇ／ｍＬ）の抗体溶液について行い、各種濃度におけるセンサーグラムを得た。各々の抗体のセンサーグラムは、陰性対照としてＧＤ３に対するキメラ抗体ＫＭ８７１（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３−３８０，１９９３）を用いて得られたセンサーグラムを差し引くことにより特異的な反応のセンサーグラムとした。第２５図に５０μｇ／ｍＬの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合〔共鳴シグナル（ＲＵ）〕の高さを比較することにより、行った。その結果、第２５図に示したように、キメラ抗体ＫＭ３３３４が最も高い結合反応を示し、ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６は、ＫＭ３３３４と同等の高い結合反応を示した。一方、ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０およびＨＶ６ＬＶ６は、ＫＭ３３３４およびＨＶ０ＬＶ６と比較して若干低い結合反応を示した。以上の結果は、ＥＬＩＳＡでは認められなかった抗体間の結合活性の比較がＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００を用いることにより可能であること、そして、ＶＬのＦＲの６アミノ酸残基の改変により、ＣＤＲ移植抗体の結合活性がキメラ抗体と同等レベルに回復することを示している。また、ＶＨのＦＲの６アミノ酸残基については、結合活性の回復に対する効果は認められなかった。
キメラ抗体ＫＭ３３３４と同等の高い結合反応を示したＹＢ２／０細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６をＫＭ８０３７と命名し、また、ＫＭ８０３７を高発現するＹＢ２／０細胞由来の形質転換細胞株も同様にＫＭ８０３７と命名した。なお、形質転換細胞株ＫＭ８０３７は平成１４年６月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８４として寄託されている。
参考例３  より免疫原性の低い抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の作製（１）
参考例２の結果より、ＶＬのＦＲにマウス抗体ＫＭ１３３４由来の６アミノ酸残基の改変を有する抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６は、キメラ抗体と同等の結合活性を示すことが明らかとなった。そこで、さらにこれら６残基の活性回復に対する効果を検討し、充分な活性を有し、かつマウス抗体由来のアミノ酸残基の少ない、より免疫原性の低下が期待される抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の作製を以下のようにして行った。
１．ＶＬのアミノ酸配列の設計
上記の６アミノ酸残基について、以下のような改変を有する６種類のＶＬのアミノ酸配列を設計した。いずれもＬＶ．０のアミノ酸残基からの改変を示した。
ＬＶ．４−１では、２番目のＩｌｅ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの４残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．４−２では、２番目のＩｌｅ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、９２番目のＴｙｒの４残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．３−１では、２番目のＩｌｅ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの３残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．３−２では、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、９２番目のＴｙｒの３残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．２−１では、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの２残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．２−２では、２番目のＩｌｅ、９２番目のＴｙｒの２残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．４−１、ＬＶ．４−２、ＬＶ．３−１、ＬＶ．３−２、ＬＶ．２−１、ＬＶ．２−２のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４２〜４７に示した。
２．ＶＬをコードするＤＮＡの構築
参考例３の１．で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の各種ＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは以下のようにして構築した。
（１）ＬＶ．４−１をコードするＤＮＡの構築
ＬＶ．４−１をコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号３８、３４、４０、４１の配列からなる４本の合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）を用いて参考例２の１．（３）に記載の方法に従い、構築した。その結果、ＬＶ．４−１をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１を得た。
（２）ＬＶ．３−１をコードするＤＮＡの構築
参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６の５０ｎｇを鋳型とし、Ｍ１３プライマーＲＶおよび配列番号４８の塩基配列からなる合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）をプライマーとして終濃度０．３μｍｏｌ／Ｌｏｌ／Ｌとなるように加え、ＫＯＤポリメラーゼに添付の使用説明書に従い、全量５０μＬでまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で１分間の条件のサイクルで３５サイクルのＰＣＲを行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＳｐｅＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．２２ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、参考例３の２．（１）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１の３μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．２１ｋｂのＫｐｎＩ断片を約０．２μｇ回収した。
さらに、３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）に、１０単位の制限酵素ＫｐｎＩおよび１０単位の制限酵素ＳｐｅＩを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片を約２μｇ回収した。
上記で得られたＶＬ  ＤＮＡのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇ、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１由来のＫｐｎＩ断片０．１μｇ、およびプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第２６図に示したＬＶ．３−１をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−１を得た。
（３）ＬＶ．２−１をコードするＤＮＡの構築
プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１の代わりに参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０を用いる以外は、参考例３の２．（１）に記載の方法と同様の方法で、ＬＶ．２−１をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−１を得た。
（４）ＬＶ．２−２をコードするＤＮＡの構築
プライマーとして配列番号４８に記載の合成ＤＮＡの代わりに配列番号４９に記載の合成ＤＮＡを用いる以外は、参考例３の２．（１）に記載の方法と同様の方法で、ＬＶ．２−２をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２を得た。
（５）ＬＶ．４−２をコードするＤＮＡの構築
参考例３の２．（４）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２の３μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．１６ｋｂＫｐｎＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６の３μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．２１ｋｂのＫｐｎＩ断片を約０．２μｇ回収した。
上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２由来のＫｐｎＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６由来のＫｐｎＩ断片０．１μｇとを全量１０μｌの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第２７図に示したＬＶ．４−２をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２を得た。
（６）ＬＶ．３−２をコードするＤＮＡの構築
参考例３の２．（５）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２の３μｇに、１０単位の制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉ（宝酒造社製）およびＸｍｎＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．２４ｋｂのＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素Ｔｔｈ１１１ＩおよびＸｍｎＩを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１．１１ｋｂのＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片を約１μｇ回収した。
上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２由来のＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０由来のＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片０．１μｇとを全量１０μｌの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第２８図に示したＬＶ．３−２をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−２を得た。
３．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
参考例２の２．で得られた発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６のＶＬをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を参考例３の２．で構築した各種ＶＬをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片で置換することにより、各種ＶＬをコードするＤＮＡを有する抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築した。具体的には、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−１、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−２、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−１、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−２、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−１、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−２の６種類を構築した。
４．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた安定発現
参考例２の２．で得られた抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０およびｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６、参考例３の３．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを用いて各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞での安定発現を上記参考例１の２．（４）に記載の方法に従い、行った。
５．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の精製
参考例３の４項で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体を発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の精製を上記参考例１の３．（１）に記載の方法に従い、行った。ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ０／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−１を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−２を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ４−２／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−１を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−２を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ３−２／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−１を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−２を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ２−２／ＣＨＯと名付けた。
６．精製した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の解析
参考例３の５．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記参考例１の４．に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
７．ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーによる、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定
参考例３の５．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性をより詳細に検討するため、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００を用いて各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性を、ＦＧＦ−８の部分ペプチドである化合物１のＣ末端をビオチン標識したものを用いて、以下のようにして測定、比較した。陽性対照として、参考例１の３．（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４を用いた。
以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰを使用した。まず、センサーチップＳＡ（ビアコア社製）をセットし、５μＬ／ｍｉｎの流速で０．０５μｇ／ｍＬに調製したＣ末端ビオチン標識化合物１を５μＬ添加した。その後、５μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−塩酸溶液（ｐＨ１．５）を２回連続して添加し、チップ表面を洗浄した。ＦＧＦ−８ペプチドの固定化量は３５ＲＵであった。
ＦＧＦ−８ペプチド固定化フローセルに２０μＬ／分の流速で、各種抗体溶液を６０μＬ添加し、その後、３分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、２０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−塩酸溶液（ｐＨ１．５）を２回連続して添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種濃度（５０−１．８５μｇ／ｍＬ）の抗体溶液について行い、各種濃度におけるセンサーグラムを得た。各々の抗体のセンサーグラムは、陰性対照としてＧＤ３に対するキメラ抗体ＫＭ８７１を用いて得られたセンサーグラムを差し引くことにより特異的な反応のセンサーグラムとした。
第２９図に１６．７μｇ／ｍＬの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合〔共鳴シグナル（ＲＵ）〕の高さを比較することにより、行った。
その結果、第２９図に示したように、キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯが最も高い結合反応を示し、次いで、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯが高い結合反応を示した。一方、ＨＶ０ＬＶ３−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−２は、低い結合反応を示し、ＨＶ０ＬＶ０／ＣＨＯは、最も低い結合反応を示した。これらの結果は、参考例２の７．に記載のＹＢ２／０細胞由来の抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体を用いた結果と一致していた。
８．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する中和活性の測定
参考例３の７項においてＦＧＦ−８に対する高い結合反応が確認された４種類の抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯのＦＧＦ−８中和活性の評価を参考例２の５項に記載の方法に従って、行った。陽性対照として、参考例１の３項（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４を、陰性対照として、ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトケモカインＣＣＲ４に対するキメラ抗体ＫＭ２７６０を用いた。その結果を第３０図に示した。第３０図に示したように、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯは、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等のＦＧＦ−８中和活性を示し、次いで、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯが高いＦＧＦ−８中和活性を示した。ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯは、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯに比べて若干低いＦＧＦ−８中和活性を示し、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯの中和活性が最も低かった。ＦＧＦ−８中和活性の強さと、ＢＩＡｃｏｒｅによる結合反応の強さとの間には相関が認められた。
参考例４  より免疫原性の低い抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の作製（２）
参考例３の結果より、ＬＶ６の６アミノ酸残基の改変のうち、５１番目の改変は活性回復に必須であることが明らかとなった。また、２番目の改変は、単独の改変では、活性回復に対する効果は小さいが５１番目の改変との組合せにより、協調的に活性回復に寄与することが示唆された。１４番目、１５番目の改変についても、５１番目の改変との組合せにより、協調的に活性回復に寄与することが示唆された。一方、５０番目の改変の効果は小さいことが示唆された。そこで、２番目の改変と１４番目、１５番目の改変のどちらがより活性回復に対する効果が高いかを検討するため、また、９２番目の改変の効果を検討するため、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の作製を再検討した。
１．ＶＬのアミノ酸配列の再設計
以下のような改変を有する２種類のＶＬのアミノ酸配列を設計した。いずれもＬＶ．０のアミノ酸残基からの改変を示した。
ＬＶ．４−３では、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの４残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．３−３では、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５１番目のＬｅｕの３残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌに改変した。
ＬＶ．４−３のアミノ酸配列を配列番号５０に、ＬＶ．３−３のアミノ酸配列を配列番号５１にそれぞれ示した。
２．ＶＬをコードするＤＮＡの構築
参考例４の１．で設計した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の各種ＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは以下のようにして構築した。
（１）ＬＶ．４−３をコードするＤＮＡの構築
参考例３の２．（５）に記載の方法に従い、構築した。ただし、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２の代わりに参考例３の２．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−１を用い、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６の代わりに参考例３の２．（６）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−２を用いた。その結果、ＬＶ．４−３をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−３を得た。
（２）ＬＶ．３−３をコードするＤＮＡの構築
参考例４の２．（１）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−３の３μｇを１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＳｐｅＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．２３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片を約２．５μｇ回収した。
次に、参考例２の１．（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０の３μｇを１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ及び１０単位の制限酵素ＳｐｅＩを用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．１３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片を約０．１５μｇ回収した。
上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−３由来のＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０由来のＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、ライゲーション・ハイを用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第３１図に示したＬＶ．３−３をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−３を得た。
３．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
参考例２の２．で得られた発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６のＶＬをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を参考例４の２．で構築した各種ＶＬをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片で置換することにより、各種ＶＬをコードするＤＮＡを有する抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築した。具体的には、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−３、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−３の２種類を構築した。
４．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた安定発現
参考例４の３．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを用いて各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞での安定発現を上記参考例１の２．（４）に記載の方法に従い、行った。
５．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の精製
参考例４の４．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体を発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の精製を上記参考例１の３．（１）に記載の方法に従い、行った。ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−３を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−３を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯと名付けた。
６．精製した抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体の解析
参考例４の５．で得られた各種抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記参考例１の４．に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
７．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定
参考例３の５．で得られた抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、参考例４の５．で得られた抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性を参考例３の７．に記載の方法に従い、測定した。陽性対照として、参考例１の３．（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４を用いた。
第３２図に１６．７μｇ／ｍＬの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合〔共鳴シグナル（ＲＵ）〕の高さを比較することにより、行った。その結果、第３２図に示したように、キメラ抗体ＫＭ３０３４が最も高い結合反応を示し、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯは、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯよりも高く、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯと同等の結合反応を示した。ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯの結合反応は、ＨＶ０ＬＶ３−１よりも低かった。以上の結果より、結合反応の高さに関しては、２番目の改変よりも、１４番目、１５番目の改変の方がより協調的に働くこと、また、９２番目の改変は、活性の回復に必須であることが示唆された。
８．抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する中和活性の測定
参考例３の５．で得られた抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、参考例４の５．で得られた抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのＦＧＦ−８中和活性の評価を参考例２の５．に記載の方法に従って、行った。陽性対照として、参考例１の３．（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４を、陰性対照として、ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトケモカインＣＣＲ４に対するキメラ抗体ＫＭ２７６０を用いた。その結果を第３３図に示した。第３３図に示したように、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯは、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等のＦＧＦ−８中和活性を示した。一方、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯは、同等の中和活性を示し、その活性はキメラ抗体ＫＭ３０３４に比べて１／２程度であった。ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯとＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯの中和活性は、ＢＩＡｃｏｒｅでの結合反応の高さと相関せず、２番目のアミノ酸残基と１４番目、１５番目のアミノ酸残基は、ＦＧＦ−８に対する結合活性と細胞に対するＦＧＦ−８中和活性において独立した影響を与えることが示唆された。
以上の各種評価結果より、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等の高い結合反応およびＦＧＦ−８中和活性を示したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯをＫＭ８０３４と命名し、また、ＫＭ８０３４を高発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換細胞クローンも同様にＫＭ８０３４と命名した。また、ＫＭ８０３４と同等の高い結合反応を示したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯをＫＭ８０３５と命名し、また、ＫＭ８０３５を高発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換細胞株も同様にＫＭ８０３５と命名した。ＫＭ８０３５のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．４−３を配列番号３８に示した。なお、形質転換細胞株ＫＭ８０３５は平成１４年６月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８２として寄託されている。また、ＫＭ８０３４と同等の高いＦＧＦ−８中和活性を示したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯをＫＭ８０３６と命名し、また、ＫＭ８０３６を高発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換細胞株も同様にＫＭ８０３６と命名した。ＫＭ８０３６のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．３−１を配列番号３９に示した。なお、形質転換細胞株ＫＭ８０３６は平成１４年６月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１−１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８３として寄託されている。
抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８０３４は、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等の高い結合反応およびＦＧＦ−８中和活性を示し、かつ、ヒトにおける免疫原性がキメラ抗体よりも低下することから、キメラ抗体よりも高い治療効果が期待される。抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８０３６およびＫＭ８０３５では、ＫＭ８０３４に比べて、結合活性およびＦＧＦ−８中和活性が若干低下する可能性があるが、それぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に由来するＶ領域ＦＲのアミノ酸残基が３残基および４残基となることから、ＫＭ８０３４よりもさらに免疫原性が低下することが期待される。
産業上の利用可能性
本発明により、抗ＦＧＦ−８中和抗体を有効成分として含有する、関節炎の予防薬または治療薬、軟骨保護剤、関節破壊抑制剤、滑膜増殖抑制剤、および抗ＦＧＦ−８抗体を有効成分として含有する関節炎の診断薬ならびに該抗体を用いた関節炎の判定方法が提供される。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１３−ＫＭ１３３４のＶＨの増幅のためのプライマー
配列番号１４−ＫＭ１３３４のＶＨの増幅のためのプライマー
配列番号１５−ＫＭ１３３４のＶＬの増幅のためのプライマー
配列番号１６−ＫＭ１３３４のＶＨの増幅のためのプライマー
配列番号１７−Ｃ末にシステイン残基を付加したヒトＦＧＦ−８のペプチド（２３〜４６番目のアミノ酸残基）
配列番号１８−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列、ＨＶ．０
配列番号１９−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．０
配列番号２０−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列、ＨＶ．６
配列番号２１−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．６
配列番号２２−ＨＶ．０をコードするＤＮＡ
配列番号２３−ＨＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号２４−ＨＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号２５−ＨＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号２６−ＨＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号２７−ＨＶ．６をコードするＤＮＡ
配列番号２８−ＨＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号２９−ＨＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３０−ＨＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３１−ＨＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３２−ＬＶ．０をコードするＤＮＡ
配列番号３３−ＬＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３４−ＬＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３５−ＬＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３６−ＬＶ．０をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３７−ＬＶ．６をコードするＤＮＡ
配列番号３８−ＬＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号３９−ＬＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号４０−ＬＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号４１−ＬＶ．６をコードするＤＮＡの構築のためのの合成ＤＮＡ
配列番号４２−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．４−１
配列番号４３−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．４−２
配列番号４４−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．３−１
配列番号４５−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．３−２
配列番号４６−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．２−１
配列番号４７−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．２−２
配列番号４８−ＬＶ．３−１をコードするＤＮＡの構築のためののプライマー
配列番号４９−ＬＶ．２−２をコードするＤＮＡの構築のためののプライマー
配列番号５０−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．４−３
配列番号５１−設計された抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列、ＬＶ．３−３
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  ウサギ軟骨細胞のＦＧＦ−８による細胞外マトリックスの分解作用を示す図である。縦軸は細胞外マトリックス中に残ったグリコサミノグリカンの量を、横軸はＦＧＦ−８の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第２図  ウサギ軟骨細胞のＦＧＦ−８による細胞外マトリックスの分解に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は細胞外マトリックス中に残ったグリコサミノグリカンの量を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１（０群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第３図  ウサギ軟骨細胞のＦＧＦ−８によるマトリックスメタロプロテイナーゼ−３産生の促進と抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４による阻害作用を示す図である。縦軸は培養液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の量（ｎｇ／ウェル）を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃はＰ＜０．０１（無刺激群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１（０群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第４図  ウサギ滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進作用を示す図である。縦軸はウサギ滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＦＧＦ−８の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５（無刺激群対比、Ｓｔｅｅｌ検定）を表す。
第５図  ウサギ滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はウサギ滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１（０群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第６図  ヒト滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進作用を示す図である。縦軸はヒト滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＦＧＦ−８の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）を表す。
第７図  ヒト滑膜細胞のＦＧＦ−８による増殖の促進に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はヒト滑膜細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの放射活性を、横軸はＫＭ１３３４の濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（無刺激群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（０群対比、Ｓｔｅｅｌ検定）を表す。
第８図  ＦＧＦ−８の注入による関節の細胞外マトリックスの分解を示す図である。縦軸は関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊＊はＰ＜０．０１（生理食塩液注入群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第９図  ＦＧＦ−８の注入による関節の膝蓋骨の破壊を示す図である。縦軸は膝蓋骨重量（ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液注入群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１０図  コラーゲン関節炎発症マウスにおける関節炎スコアの経時変化に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は関節炎スコアを、横軸はコラーゲン初回感作日からの経過日数を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液投与群対比、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を表し、＃はＰ＜０．０５（溶媒投与群対比、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を表す。
第１１図  アジュバント関節炎発症ラットにおけるアジュバント非処置足の足容積増加に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は足容積（ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１（生理食塩液投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１２図  アジュバント関節炎発症ラットにおけるアジュバント非処置足の足容積増加に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸は足容積（ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１（溶媒投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、††はＰ＜０．０１、†††はＰ＜０．００１（溶媒投与群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表す。
第１３図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のグルコサミノグリカン量上昇に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はグルコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度比（μｇ／ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１（生理食塩液投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１４図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のグルコサミノグリカン量上昇に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸はグルコサミノグリカン濃度／クレアチニン濃度比（μｇ／ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃はＰ＜０．０１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（溶媒投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１５図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のデオキシピリジノリン量上昇に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はデオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度比（ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１６図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のデオキシピリジノリン量上昇に対するジクロフェナックナトリウム、メソトレキセート、およびプレドニゾロンの阻害作用を示す図である。縦軸はデオキシピリジノリン濃度／クレアチニン濃度比（ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表し、＊＊はＰ＜０．０１（溶媒投与群対比、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１７図  アジュバント関節炎発症ラット尿中のヒドロキシプロリン量上昇に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸はヒドロキシプロリン濃度／クレアチニン濃度比（μｇ／ｍｇ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃＃はＰ＜０．００１（未処置群対比、ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を表す。
第１８図  モノヨード酢酸誘発変形性関節症モデルラットにおける関節軟骨破壊に対する抗ＦＧＦ−８中和抗体ＫＭ１３３４の阻害作用を示す図である。縦軸は関節洗浄液中のグリコサミノグリカン濃度（μｇ／ｍＬ）を示している。値は平均値±標準誤差を意味し、＃＃はＰ＜０．０１（偽手術群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表し、＊はＰ＜０．０５（生理食塩液投与群対比、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）を表す。
第１９図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５の造成工程を示した図である。
第２０図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４の造成工程を示した図である。
第２１図  プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の造成工程を示した図である。
第２２図  抗ＦＧＦ−８中和マウス抗体ＫＭ１３３４、抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４のマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ１３３４、□がＫＭ３０３４、△がＫＭ３３３４、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
第２３図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０の造成工程を示した図である。
第２４図  プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第２５図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３３３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ６のＦＧＦ−８に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）を示す。△がＫＭ３３３４、○がＨＶ０ＬＶ０、□がＨＶ０ＬＶ６、×がＨＶ６ＬＶ６の活性を示す。
第２６図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３３３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ６のＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第２７図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−１の造成工程を示した図である。
第２８図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２の造成工程を示した図である。
第２９図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−２の造成工程を示した図である。
第３０図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−２／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第３１図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯのマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ３０３４、●がＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、◇がＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、△がＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、□がＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
第３２図  プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−３の造成工程を示した図である。
第３３図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第３４図  抗ＦＧＦ−８中和キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８中和ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ３０３４、●がＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、△がＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、▲がＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、■がＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯ、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
【図１】
2003057251.tif 000055
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2003057251.tif 000069
【図１６】
2003057251.tif 000070
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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