(57)【要約】接合菌由来のエンドグルカナーゼ、そのセルロース結合領域欠失タンパク質、又はこれらの改変タンパク質若しくは相同体と、還元剤とを含むセルラーゼ調製物を開示する。また、前記セルラーゼ調製物を、セルロース含有繊維に作用させ、前記繊維の性質を改善させる繊維の処理方法、前記セルラーゼ調製物を、脱インキ薬品と共に古紙に作用させる工程を含む古紙の脱インキ方法、及び前記セルラーゼ調製物を、紙パルプに作用させる工程を含む、紙パルプのろ水性の改善方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
接合菌由来のエンドグルカナーゼ、前記接合菌由来エンドグルカナーゼにおいてセルロース結合領域が欠失したタンパク質、又は前記接合菌由来エンドグルカナーゼ若しくは前記セルロース結合領域欠失タンパク質の改変タンパク質若しくは相同体と、還元剤とを含む、セルラーゼ調製物。
【請求項２】
接合菌がリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、又はファイコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である、請求項１に記載のセルラーゼ調製物。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも一つのタンパク質と還元剤とを含む、セルラーゼ調製物。
（ａ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列においてセルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と還元剤とを含む、セルラーゼ調製物。
（ａ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は前記アミノ酸配列においてセルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的であって、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項５】
還元剤をセルラーゼ調製物に０．０１〜５０重量％含有させてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のセルラーゼ調製物。
【請求項６】
還元剤がチオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又はチオ尿素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ調製物。
【請求項７】
飛散性のない顆粒状、又は安定化された液体状である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のセルラーゼ調製物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のセルラーゼ調製物を、セルロース含有繊維に作用させ、前記繊維の性質を改善させる、繊維の処理方法。
【請求項９】
繊維の性質の改善が、色の澄明化である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
繊維の性質の改善が、毛羽の除去である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
繊維の性質の改善が、ストーンウオッシュ様外観及び風合いの付与である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
繊維の性質の改善が、肌触り及び外観の改善である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
繊維の性質の改善が、柔軟化である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
繊維の浸漬又はすすぎ工程で行う、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のセルラーゼ調製物を、脱インキ薬品と共に古紙に作用させる工程を含む、古紙の脱インキ方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のセルラーゼ調製物を、紙パルプに作用させる工程を含む、紙パルプのろ水性の改善方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、還元剤を含有させることによってエンドグルカナーゼの効果を向上させたセルラーゼ調製物、及び前記セルラーゼ調製物を用いる繊維の処理方法に関する。
背景技術
セルラーゼには、セルロースの固い結晶領域を非還元末端からエキソ型に加水分解しセロビオースを生成するセロビオヒドロラーゼ活性、セルロースの非結晶領域をエンド型に加水分解しセルロース分子の低分子化と各種のセロオリゴ糖を生成するエンドグルカナーゼ活性、及びセロビオースやセロオリゴ糖をグルコースに分解するβ−グルコシダーゼ活性、の３種類の酵素活性が含まれている。これらのうち、エンドグルカナーゼが高活性を発揮するほど、繊維処理には有利であることが知られている。
従来から、セルロース含有繊維に所望の特性を与えるために、それをセルラーゼで処理することが行われている。例えば繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触り及び外観を改善するために、又は着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウオッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている（ヨーロッパ特許第３０７，５６４号明細書）。
かかる繊維加工においては、主に木材腐朽菌であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のセルラーゼが使用されている。従来、このようなセルラーゼは、セルロース分解能を有する微生物を培養した培養ろ液を加工し、複数のセルラーゼ成分を含む状態で利用されていた。最近では経済性を高めるために、これらセルラーゼ成分から繊維処理に高活性を有するエンドグルカナーゼのみを単離し、遺伝子工学的に活性を増強したエンドグルカナーゼ（高活性エンドグルカナーゼ）を含むセルラーゼ調製物が使用されている。
これら高活性エンドグルカナーゼの例としては、綿生地に強く作用するフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のＥＧＶ（特表平５−５０９２２３号公報）及びＮＣＥ４（国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号パンフレット）、またリヨセル生地に強く作用するリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、及びＲＣＥＩＩＩ、ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）由来のＭＣＥＩ及びＭＣＥＩＩ、並びにファイコマイセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）由来のＰＣＥＩが知られている（国際公開第ＷＯ００／２４８７９号パンフレット）。
一方、セルラーゼの有する効果を向上させるため、添加剤を併用することも今までに行われている。添加剤として、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及びポリアクリルアマイド等の水溶性高分子を併用すると、フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼの有する効果を増強し、着色生地の毛羽除去活性を向上させることが知られている（特表平５−５０７６１５号公報）。また、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の培養液のＣＭＣアーゼ活性は、Ｔｗｅｅｎ２０の添加によって向上することが知られている（Ｏｏｓｈｉｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２８：１７２７−１７３４，１９８６）。また、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＲＣＥＩの毛羽除去活性は、ノニオン系界面活性剤の存在下で向上することが示されている（国際公開第ＷＯ０２／３８７５４号パンフレット）。
発明の開示
本発明者らは、前記用途に使用されるセルラーゼは、いずれもコストがまだ高いため、工業的実用化レベルに見合うには、そのエンドグルカナーゼ活性をさらに向上させ、セルラーゼの有する前記効果をさらに効率的に発揮できるようにすることが必要であると考えた。さらに、添加剤との併用でエンドグルカナーゼ活性向上効果を得ようと試みる場合は、高価な添加物の使用は繊維加工処理におけるコストの増加になるため、添加剤の選択においては、低濃度の添加で活性向上効果を発揮し、入手が容易で安価であることが求められると考えた。
従って、本発明は、エンドグルカナーゼ活性を向上させ、毛羽立ち除去等のセルロース含有繊維改善を目的とした繊維処理を効率よくかつ安価に行うために好適に使用されうるセルラーゼ調製物を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、還元剤（例えば、チオ硫酸ナトリウム等）が、接合菌由来のエンドグルカナーゼであるＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、及びＰＣＥＩ等の効果を、トリコデルマ及びフミコーラ由来の既存のエンドグルカナーゼよりもはるかに高い割合で向上させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
（１）接合菌由来のエンドグルカナーゼ、前記接合菌由来エンドグルカナーゼにおいてセルロース結合領域が欠失したタンパク質、又は前記接合菌由来エンドグルカナーゼ若しくは前記セルロース結合領域欠失タンパク質の改変タンパク質若しくは相同体と、還元剤とを含む、セルラーゼ調製物。
（２）接合菌がリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、又はファイコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である、（１）に記載のセルラーゼ調製物。
（３）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも一つのタンパク質と還元剤とを含む、セルラーゼ調製物。
（ａ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列においてセルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質
（４）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と還元剤とを含む、セルラーゼ調製物。
（ａ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、セルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）  配列番号１〜６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は前記アミノ酸配列においてセルロース結合領域が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的であって、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（５）還元剤をセルラーゼ調製物に０．０１〜５０重量％含有させてなる、（１）〜（４）のいずれか一つに記載のセルラーゼ調製物。
（６）還元剤がチオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又はチオ尿素である、（１）〜（５）のいずれか一つに記載のセルラーゼ調製物。
（７）飛散性のない顆粒状、又は安定化された液体状である、（１）〜（６）のいずれか一つに記載のセルラーゼ調製物。
（８）（１）〜（７）のいずれか一つに記載のセルラーゼ調製物を、セルロース含有繊維に作用させ、前記繊維の性質を改善させる、繊維の処理方法。
（９）繊維の性質の改善が、色の澄明化である、（８）に記載の方法。
（１０）繊維の性質の改善が、毛羽の除去である、（８）に記載の方法。
（１１）繊維の性質の改善が、ストーンウオッシュ様外観及び風合いの付与である、（８）に記載の方法。
（１２）繊維の性質の改善が、肌触り及び外観の改善である、（８）に記載の方法。
（１３）繊維の性質の改善が、柔軟化である、（８）に記載の方法。
（１４）繊維の浸漬又はすすぎ工程で行う、（８）〜（１３）のいずれか一つに記載の方法。
（１５）（１）〜（７）のいずれか一つに記載のセルラーゼ調製物を、脱インキ薬品と共に古紙に作用させる工程を含む、古紙の脱インキ方法。
（１６）（１）〜（７）のいずれか一つに記載のセルラーゼ調製物を、紙パルプに作用させる工程を含む、紙パルプのろ水性の改善方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］セルラーゼ調製物
本発明のセルラーゼ調製物は、
（１ａ）接合菌由来のエンドグルカナーゼ、
（１ｂ）前記接合菌由来エンドグルカナーゼ（１ａ）においてセルロース結合領域が欠失したタンパク質（以下、「セルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼ」と称することがある）、
（１ｃ）前記接合菌由来エンドグルカナーゼ（１ａ）若しくは前記セルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼ（１ｂ）の改変タンパク質（以下、単に、「改変タンパク質」と称することがある）、又は
（１ｄ）前記接合菌由来エンドグルカナーゼ（１ａ）若しくは前記セルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼ（１ｂ）の相同体（以下、単に、「相同体」と称することがある）
の少なくともいずれか１つと、
還元剤と
を含んでなる。
本発明において、エンドグルカナーゼとは、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）を意味し、β−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する作用を有する。
本発明における「エンドグルカナーゼ活性」とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。ここで「ＣＭＣアーゼ活性」とは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）を加水分解する活性を意味し、被験タンパク質とＣＭＣ溶液を一定時間インキュベーションした後に遊離してくる還元糖量を測定して、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
エンドグルカナーゼ活性は、例えば次のような手順により測定することができる。まず、被験タンパク質を含む溶液０．５ｍＬを、２％のＣＭＣを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍＬに添加し、５０℃で３０分間インキュベーションする。次いで、得られる反応液の生成還元糖濃度を、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で定量する。すなわち、反応３０分後の反応液１．０ｍＬ中にＤＮＳ試薬３．０ｍＬを添加し、沸騰水浴中で５分間インキュベーションした後、蒸留水８．０ｍＬで希釈し、５４０ｎｍの吸光度を測定する。段階的に希釈したグルコース溶液を用いて検量線を作成し、酵素反応液中の生成還元糖量をグルコース換算で決定する。１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位として活性を算出する。
ＤＮＳ試薬は文献等（例えば、「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、第１９〜２０頁、福井作蔵著、学会出版センター）の記載に従って調製することもできるが、例えば次のような手順で調製することができる。まず、４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍＬに、１％３，５−ジニトロサリチル酸溶液８８０ｍＬ及びロッセル塩２５５ｇを添加する（溶液Ａ）。別に、１０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍＬに結晶フェノール１０ｇを加え、さらに水を加えて溶解して１００ｍＬとする（溶液Ｂ）。溶液Ｂ６９ｍＬに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを加えて溶解させ、溶液Ａを注いでロッセル塩が充分に溶解するまで攪拌混合し、２日間放置した後に濾過する。
本発明において、接合菌由来のエンドグルカナーゼとしては、例えば、リゾプス属、ファイコマイセス属、及びムコール属由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。その具体例としては、例えば、ＲＣＥＩ（配列番号１）、ＲＣＥＩＩ（配列番号２）、ＲＣＥＩＩＩ（配列番号３）、ＭＣＥＩ（配列番号４）、ＭＣＥＩＩ（配列番号５）、及びＰＣＥＩ（配列番号６）（国際公開第ＷＯ００／２４８７９号パンフレット）を用いることができる。また、セルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼとしては、これらのエンドグルカナーゼにおいてセルロース結合領域が欠失したタンパク質、例えば、国際公開第ＷＯ０２／４２４７４号パンフレットに記載のセルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼを用いることができる。セルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼは、セルロース結合領域が欠失しているが、エンドグルカナーゼ活性を有する。
前記ＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、及びＲＣＥＩＩＩの由来であるリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＣＰ９６００１株は、１９９７年（平成９年）４月２１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９９年（平成１１年）年９月２４日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８９［ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２０１］である。
前記ＭＣＥＩ及びＭＣＥＩＩの由来であるムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＣＰ９９００１株は、１９９９年（平成１１年）７月２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９９年（平成１１年）年９月２４日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９０［ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４４６］である。
前記ＰＣＥＩの由来であるファイコマイセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）ＣＰ９９００２株は、１９９９年（平成１１年）７月２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９９年（平成１１年）年９月２４日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９１［ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４４７］である。
本発明のセルラーゼ調製物に用いることのできるタンパク質には、前記のＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、及びＰＣＥＩ、並びに前記セルロース結合領域欠失エンドグルカナーゼに加え、それらの改変タンパク質及び／又はそれらの相同体が包含される。
ここで、「改変タンパク質」とは、ＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、若しくはＰＣＥＩ、又はこれらのタンパク質においてセルロース結合領域が欠失したタンパク質のアミノ酸配列において、１又は複数個（例えば、１〜数十個、具体的には１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜９個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を保持するタンパク質をいう。
また、「相同体」とは、ＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、若しくはＰＣＥＩ、又はこれらのタンパク質においてセルロース結合領域が欠失したタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（塩基配列）と「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」ポリヌクレオチド（塩基配列）と相補的なポリヌクレオチド（塩基配列）によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつエンドグルカナーゼ活性を保持するタンパク質をいう。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、
（ａ）ＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、若しくはＰＣＥＩのアミノ酸配列、
（ｂ）前記タンパク質においてセルロース結合領域が欠失したタンパク質のアミノ酸配列、又は
（ｃ）それらの改変タンパク質のアミノ酸配列
の一部又は全部の配列をコードする塩基配列を含んでなるプローブと、相同体をコードするポリヌクレオチドとがハイブリダイズする一方で、このプローブが、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号パンフレットに記載のエンドグルカナーゼＮＣＥ４遺伝子（配列番号７）及び国際公開第ＷＯ９８／５４３２２号パンフレットに記載のエンドグルカナーゼＳＣＥ３遺伝子（配列番号８）とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する（なお、ここで、各遺伝子又はポリヌクレオチド量は、ＮＣＥ４遺伝子、ＳＣＥ３遺伝子、及び相同体をコードするポリヌクレオチドとも同量使用することとする）。
より具体的には、例えば、プローブとして標識化したＲＣＥＩのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の添付の操作方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、前記プローブを添加し、１５時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った後、０．４％ＳＤＳ及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素添加０．５倍濃度ＳＳＣ（１×ＳＳＣ；１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃にて２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温にて１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
なお、前記の「ＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、及びＰＣＥＩのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（塩基配列）」には、形質転換に使用する宿主細胞の種類に応じてコドン使用及び／又はイントロン認識配列を最適化したポリヌクレオチド（例えば、国際公開第ＷＯ００／２４８７９号パンフレットに記載のコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子；配列番号９）を含む。
このような改変タンパク質又は相同体としては、ＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、若しくはＰＣＥＩ、又はこれらのタンパク質においてセルロース結合領域が欠失したタンパク質のアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。なお、ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはＦＡＳＴＡ３［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍ１］においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
一方、本発明のセルラーゼ調製物に含有させる還元剤とは、相手方の分子の電子を奪い、自身が酸化されることで相手方の分子を還元するような作用を持った物質の総称である。このような還元剤には、水道水中の残存塩素等を還元除去する効果があることが知られている。本発明に用いられる還元剤としては無機性還元剤が好ましく、また、酵素の活性を低下させるものであってはならない。具体例としては、亜硫酸、二亜硫酸、チオ硫酸及びこれらの塩、並びにチオ尿素等が挙げられる。これらの還元剤は１種類のみだけでなく、複数を組み合わせて使用することもできる。
また、本発明のセルラーゼ調製物には、従来からのセルラーゼ調製物に一般的に含まれている成分、例えば、賦形剤及び／又は防腐剤等を含有させることができる。また、セルラーゼ調製物の形態は、固形状であっても液状であってもよく、具体的には、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、又は液体製剤が挙げられる。
セルラーゼ調製物の一つである非粉塵化顆粒（好ましくは飛散性のない顆粒状）は、通常の乾式造粒法を用い製造することが可能である。すなわち、粉末状態のセルラーゼ酵素を、中性でエンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない無機塩（例えば、硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウム）、エンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない鉱物（例えば、ベントナイト又はモンモリナイト等）、中性の有機物（例えば、澱粉又は粒状セルロース等）、及び界面活性剤等から選ばれる１種又は複数に混合した後、前記のエンドグルカナーゼの効果を向上させる還元剤の一つ又は複数の粉末、あるいは微細に懸濁された懸濁液を加え、充分に混合又は混練する。
状況に応じ、固形物を結着させる合成高分子（例えば、ポリエチレングリコール）又は天然高分子（例えば、スターチ等）を適宜添加し、更に混練した後、ディスクペレッター等の押し出し成形造粒を行い、成形物をマルメライザーにより球状に成形後、乾燥させることで非粉塵化顆粒を製造することが可能である。もちろん、顆粒表面をポリマー等でコーティングし、酸素透過及び水分透過をコントロールすることも可能である。このとき、エンドグルカナーゼの効果を向上させる還元剤の一つ又は複数は、前記セルラーゼ調製物に０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜２０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％を添加することができる。
一方、液状製剤（好ましくは安定化された液体状）は、セルラーゼ酵素溶液にエンドグルカナーゼ酵素の安定化剤（例えば、合成高分子又は天然高分子等）を配合し、必要に応じて無機塩類及び／又は合成防腐剤を添加し調製することが可能である。このとき、エンドグルカナーゼの効果を還元剤の一つ又は複数を混合し用いることが可能である。非粉塵化顆粒同様に、エンドグルカナーゼの効果を向上させる還元剤の一つ又は複数は前記セルラーゼ調製物に０．０１〜５０重量％、好ましくは、０．１〜２０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％を添加することができる。
［２］繊維処理方法
本発明の繊維処理方法は、前記セルラーゼ調製物を、セルロース含有繊維に作用させることにより行う。
本処理方法により改善されうる、セルロース含有繊維の性質としては、以下のものが含まれる。
（１）着色セルロース含有繊維の色の澄明化
（２）毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、毛羽立ちの低減）
（３）着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊維、代表的にはジーンズへのストーンウオッシュ様の外観及び風合いの付与
（４）減量による繊維の肌触り及び外観の改善
（５）柔軟化（ごわつきの低減）
本発明の繊維処理方法は、具体的には、繊維が浸漬されているか又は浸漬されうる水に、本発明のセルラーゼ調製物を添加することにより行うことができ、例えば、繊維の浸漬工程又はすすぎ工程で行うことができる。
接触温度又はエンドグルカナーゼの量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか又は毛羽立ちを低減する場合、３０〜６０℃程度の温度で、０．２μｇ／ｍＬ以上の還元剤と０．００１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼ酵素を使用することにより処理することができる。還元剤は、０．２μｇ／ｍＬ以上であれば、酵素の活性を阻害しない限り経済的な効果を考慮して添加することができるが、好ましくは０．２〜５００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．３〜１５０μｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
更に、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす場合、４０〜６０℃程度の温度で、０．２μｇ／ｍＬ以上の還元剤及び０．０１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼを使用することにより処理することができる。還元剤は、０．２μｇ／ｍＬ以上であれば、酵素の活性を阻害しない限り経済的な効果を考慮して添加することができるが、好ましくは０．２〜５００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．３〜１５０μｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
また、セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的とした減量加工の場合、３０〜６０℃程度の温度で、０．２μｇ／ｍＬ以上の還元剤及び０．００１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼを使用することにより処理することができる。還元剤は０．２μｇ／ｍＬ以上であれば、酵素の活性を阻害しない限り経済的な効果を考慮して添加することができるが、好ましくは０．２〜５００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．３〜１５０μｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
各種エンドグルカナーゼのタンパク濃度は、例えば、ＴＳＫｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により算出することができる。前記ＨＰＬＣ分析では、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中のアセトニトリルを、濃度０％〜８０％のリニアグラジエントにより流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで流すことによってエンドグルカナーゼを溶出し、ＵＶ２８０ｎｍでのピーク面積から算出する。スタンダードとしては、例えば、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）によりあらかじめタンパク濃度を測定しておいた精製ＮＣＥ４を同様にＨＰＬＣ分析して用いることができる。精製ＮＣＥ４は、例えば、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号パンフレットに記載の方法に従って、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１株を培養し、培養物から精製したものを使用することができる。プロテインアッセイキットにおけるタンパク濃度測定のスタンダードは、例えば、Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いることができる。
［３］古紙の脱インキ方法
本発明の古紙の脱インキ方法は、前記セルラーゼ調製物を、脱インキ薬品と共に古紙に作用させることにより行う。
本方法は、具体的には、本発明のセルラーゼ調製物を、古紙から再生紙をつくる過程の脱インキ工程において脱インキ剤と共に古紙に作用させることにより行うことができる。本方法により古紙の脱インキが可能となり、古紙の白色度を向上させることができる。本方法の対象となる古紙は、一般に言われる古紙の全てが含まれ、例えば、機械パルプ及び化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙等の印刷古紙が含まれる。また、前記の脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品を意味し、例えば、塩化ナトリウム、アルカリ（例えば、炭酸ナトリウム等）、硅酸ソーダ、過酸化水素、リン酸塩、アニオン系若しくはノニオン系の界面活性剤、補集材（例えば、オレイン酸等）、又は助剤（例えば、ｐＨ安定剤、キレート剤、又は分散剤等）等が挙げられる。
［４］紙パルプのろ水性の改善方法
本発明の紙パルプのろ水性改善方法は、前記セルラーゼ調製物を、紙パルプに作用させることにより行う。
本方法は、具体的には、本発明のセルラーゼ調製物を、紙パルプに作用させることにより行うことができる。本方法の対象となる紙パルプの例としては、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、加工熱処理パルプ、又は他の高収率パルプ等が挙げられる。
実施例
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本明細書で引用した全ての刊行物及び特許出願をそのまま参考として取り入れるものである。
実施例１：還元剤による各種セルラーゼの毛羽除去活性向上率の比較
リゾプス・オリゼー、ムコール・サーシネロイデス、及びファイコマイセス・ニテンスの培養、並びに培養物からのＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、及びＰＣＥＩエンドグルカナーゼの精製は、国際公開第ＷＯ００／２４８７９号パンフレットに記載の方法に従って行った。
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１株の培養、及び培養物からのＮＣＥ４エンドグルカナーゼの精製は、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号パンフレットに記載の方法に従って行った。なお、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１株は、１９９６年（平成８年）７月１５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９７年（平成９年）年６月１３日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９７７［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７３６］である。
トリコデルマ・ビリデＭＣ３００−１株の培養は、国際公開第ＷＯ９８／５４３３２号パンフレットに記載の方法に従って行った。なお、トリコデルマ・ビリデＭＣ３００−１株は、１９９６年（平成８年）９月９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９７年（平成９年）年８月１１日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４７［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８４２］である。
得られた培養上清を用いて、大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（日東紡績株式会社製、綿スムースニットＮｏ．３９００を艶友染工株式会社にて茶色に反応染色した生地６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行った。
（試験条件）
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：トリコデルマ・ビリデ培養上清液のみ５８℃で、それ以外の酵素溶液は４０℃で反応
時間：１２０分
反応液量：１００ｍＬ
反応ｐＨ：トリコデルマ・ビリデ培養上清液のみｐＨ４．５（５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）、それ以外の酵素溶液は全てｐＨ７．０（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で反応させた。緩衝液は、いずれも水道水を用いて調製した。
還元剤の種類と添加量：チオ硫酸ナトリウム五水和物１．２μｇ／ｍＬ（和光純薬製）
処理液には、酵素溶液とともに約１６ｇゴムボールを４個加えた。
還元剤を添加した場合としない場合について、形成された毛羽が目視評価で約５０％除去されるために要する酵素液量をそれぞれ求めた。次に、還元剤を添加しない場合に毛羽が約５０％除去されるために要する酵素液量を、還元剤を添加した場合に毛羽が約５０％除去されるために要する酵素液量で割った値を、還元剤による毛羽除去活性向上率とした。結果を表１に示す。
2003052105.tif 000002
表１の結果から、接合菌由来のエンドグルカナーゼであるＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、及びＰＣＥＩは、フミコーラ・インソレンス及びトリコデルマ・ビリデ由来の培養上清液（すなわち、セルラーゼ）に比べて、はるかに高いレベルで還元剤により毛羽除去活性が向上することが分かる。
実施例２：各種還元剤によるフミコーラ発現ＲＣＥＩの毛羽除去活性向上効果
ＲＣＥＩエンドグルカナーゼを国際公開第ＷＯ００／２４８７９号パンフレットの実施例Ｄ３〜Ｄ４に記載の方法に従って、フミコーラ・インソレンスにて発現させ、その培養上清液を用いて、大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（日東紡績株式会社製、綿スムースニットＮｏ．３９００を艶友染工株式会社にて茶色に反応染色した生地６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行った。
（試験条件）
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：４０℃
時間：１２０分
反応液量：１００ｍＬ
反応ｐＨ：ｐＨ７．０（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、水道水を用いて調製）
還元剤の添加量：１．２μｇ／ｍＬ
還元剤の種類：チオ硫酸ナトリウム五水和物（和光純薬社製）
亜硫酸ナトリウム（無水）（和光純薬社製）
チオ尿素（関東化学社製）
処理液には、酵素溶液とともに約１６ｇゴムボールを４個加えた。
各種還元剤を添加した場合としない場合について、形成された毛羽が目視評価で約５０％除去されるために要する酵素液量をそれぞれ求めた。次に、還元剤を添加しない場合に毛羽が約５０％除去されるために要する酵素液量を、各種還元剤を添加した場合に毛羽が約５０％除去されるために要する酵素液量で割った値を、各種還元剤による毛羽除去活性向上率とした。結果を表２に示す。
2003052105.tif 000003
表２の結果から、ＲＣＥＩをフミコーラ・インソレンスにて発現分泌させた培養上清液は、いずれの還元剤によっても、毛羽除去活性が向上することが分かる。
実施例３：各種濃度の還元剤によるフミコーラ発現ＲＣＥＩの毛羽除去活性向上効果
ＲＣＥＩエンドグルカナーゼを国際公開第ＷＯ００／２４８７９号パンフレットの実施例Ｄ３〜Ｄ４に記載の方法に従って、フミコーラ・インソレンスにて発現させ、その培養上清液を用いて、大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（日東紡績株式会社製、綿スムースニットＮｏ．３９００を艶友染工株式会社にて茶色に反応染色した生地６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行った。
（試験条件）
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−２０（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：４０℃
時間：１２０分
反応液量：１００ｍＬ
反応ｐＨ：ｐＨ７．０（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、水道水を用いて調製）
還元剤の種類：チオ硫酸ナトリウム五水和物（和光純薬製）
還元剤の添加量：０．１５〜１５０μｇ／ｍＬ
処理液には、酵素溶液とともに約１６ｇゴムボールを４個加えた。
各種濃度の還元剤を添加した場合に形成された毛羽が目視評価で約５０％除去されるために要する酵素液量を求めた。次に、還元剤を添加しない場合に毛羽が約５０％除去されるために要する酵素液量を、各種濃度の還元剤を添加した場合に毛羽が約５０％除去されるために要する酵素液量で割った値を、各種濃度の還元剤による毛羽除去活性向上率とした。結果を表３に示す。
2003052105.tif 000004
表３の結果から、ＲＣＥＩをフミコーラ・インソレンスにて発現分泌させた培養上清液は、還元剤が０．３μｇ／ｍＬ〜１５０μｇ／ｍＬ以上の広い濃度範囲において毛羽除去活性が向上することが分かる。
実施例４：還元剤を添加したＲＣＥＩセルラーゼ調製物の製造
表４に記載の原材料を配合割合で混合した後、適当量の水を添加し、混練した。混練物をディスクペレッターに送り成型加工し、得られた射出物をマルメライザー（不二パウダル社製）を用いて粒状とし、乾燥、篩かけし、造粒物を得た。
2003052105.tif 000005
ＲＣＥＩセルラーゼ粉末品は、国際公開第ＷＯ００／２４８７９号パンフレットの実施例Ｄ３〜Ｄ４に記載の方法に従って、フミコーラ・インソレンスにて発現させた培養上清液を限外ろ過濃縮し、スプレードライにより調製したものを用いた。
産業上の利用可能性
本発明は、還元剤を含有させることによって、接合菌由来のエンドグルカナーゼ活性を飛躍的に向上させたセルラーゼ調製物を提供する。前記セルラーゼ調製物を、セルロース含有繊維の毛羽立ちの低減、肌触り及び外観の改善、色の澄明化、色の局所的変化、柔軟化等の繊維加工処理、古紙の脱インキ、並びに紙パルプのろ水性の改善処理に用いることにより、より少ない酵素量で各処理の実施が可能になり、大幅にコストが低減化することができる。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号９の配列で表される塩基配列は、ＲＣＥＩタンパク質（配列番号１）に相当するコドン最適化配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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2003052105.tif 000009
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2003052105.tif 000019
2003052105.tif 000020
2003052105.tif 000021
【国際調査報告】
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2003052105.tif 000023
2003052105.tif 000024
2003052105.tif 000025