(57)【要約】ヒトの治療等の臨床使用が可能な新規な血管新生剤が開示されている。本発明の血管新生剤は、所定のアミノ酸配列を有し、血管新生作用を有するペプチドを有効成分として含むものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該配列において、１個〜３個のアミノ酸が置換し、若しくは一方若しくは両方の端部に位置する１個若しくは２個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを有効成分として含む血管新生剤。
【請求項２】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が置換し（ただし、４番目のチロシン残基はチロシン残基又は側鎖に芳香環を有するアミノ酸である）、若しくは一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む請求項１記載の血管新生剤。
【請求項３】
前記側鎖に芳香環を有するアミノ酸が、フェニルアラニン又はそのベンゼン環に１又は複数の置換基を有する化学修飾フェニルアラニンである請求項２記載の血管新生剤。
【請求項４】
配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該配列において、一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む請求項１記載の血管新生剤。
【請求項５】
配列表の配列番号１ないし７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はこれらのアミノ酸配列のいずれかの一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む請求項２記載の血管新生剤。
【請求項６】
配列表の配列番号９ないし１１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はこれらのアミノ酸配列のいずれかの一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む請求項２記載の血管新生剤。
【請求項７】
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はこれらのアミノ酸配列のいずれかの一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む請求項６記載の血管新生剤。
【請求項８】
前記ペプチドの総アミノ酸残基数が４〜３５０である請求項１ないし７のずれか１項に記載の血管新生剤。
【請求項９】
前記ペプチドの総アミノ酸残基数が４〜５０である請求項８記載の血管新生剤。
【請求項１０】
前記ペプチドの総アミノ酸残基数が５〜２０である請求項９記載の血管新生剤。
【請求項１１】
前記ペプチドは、配列表の配列番号１ないし７のいずれかで示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部にそれぞれ１０個以下のアミノ酸が付加されたペプチドである請求項５記載の血管新生剤。
【請求項１２】
前記ペプチドは、配列表の配列番号１ないし７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する請求項１１記載の血管新生剤。
【請求項１３】
前記ペプチドは、配列表の配列番号９ないし１１のいずれかで示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部にそれぞれ１０個以下のアミノ酸が付加されたペプチドである請求項１２記載の血管新生剤。
【請求項１４】
前記ペプチドは、配列表の配列番号９ないし１１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する請求項１３記載の血管新生剤。
【請求項１５】
キャリアに結合された形態にある請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の血管新生剤。
【請求項１６】
前記キャリアがタンパク質である請求項１５記載の血管新生剤。
【請求項１７】
前記キャリアタンパク質が、細胞接着性タンパク質である請求項１６記載の血管新生剤。
【請求項１８】
前記細胞接着性タンパク質がコラーゲン又はその部分加水分解物である請求項１７記載の血管新生剤。
【請求項１９】
血管新生が所望される患者の部位に請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の血管新生剤を投与することを含む、血管の新生方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載のペプチド又はキャリアに結合されたペプチドの血管新生剤製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血管を新生させる作用を有する血管新生剤に関する。本発明の血管新生剤は虚血性疾患の治療のみならず人工骨等の生体代用材料を用いた臓器の再生・修復にも有用である。
背景技術
現在日本人の死因として、心筋梗塞、脳梗塞など血管の閉塞に起因する虚血のためにおこる疾患がかなり多数を占めている。また、死因とならないまでも閉塞性大動脈硬化症のように下肢の切断を余儀なくされ、ＱＯＬ（生活の質）の損なわれる疾患も見られる。これらの虚血性疾患に対しては、新たに血管を形成することによる血管新生療法に大きな期待が寄せられている。血流が乏しいことによる虚血性疾患の治療に加えて、血管新生は生体材料の生着にも重要な役割を果たしている。従来より、骨補填材またインプラント材として、アパタイトやチタン等が用いられている。これらの従来の生体材料は、周囲の軟・硬組織との親和性が良くないために本来の機能が十分発揮できない場合が多い。
周囲の軟・硬組織との親和性を良好にするために、生体接着機能性分子ペプチドを用いることが提案されている。例えば、生体硬組織の組成・結晶性に類似した炭酸アパタイトと、生体接着機能性分子ペプチドの１つであるコラーゲンとを混合した複合体を代用骨として用いることが提案されている（Ｋ．Ｎｏｋｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｏｓａｋａ，３７３−３７６，２００１．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｍ．Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ，３７，９５−１００，２００１，Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ＣＯ３  ａｐａｔｉｔｅ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｔｉｆ  ａｓ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．）。この複合体は生体親和性が良好であり、バイオミメティックな代用骨として有望である。
もし、このような生体材料表面，内面に血管が新生されれば、移植生体材料の表面，内面の細胞へ術後早期に豊富な血液により栄養、酸素が十分に供給され、細胞の機能を発揮するのに最適の環境が形成され、その結果、生体と良好な生着性が得られるため好都合である。
一方、副作用を含む安全性、代謝性等で大きな利点を有するペプチドはデザインが容易であり高効率な合成法や検定法が確立されている。加えてアミノ酸誘導体はコンビナトリアルケミカルライブラリー構築の都合よいビルディングユニットであり、固相合成法によって短時間で構造の最適化が可能である。従って、もし、血管新生作用を有する比較的分子量の小さいペプチドが存在すれば、これを合成し、単独投与あるいは生体材料に結合することにより、生体材料が接する周囲の軟・硬組織との相互作用をより良好にすることができ有利である。しかしながら、顕著な血管新生作用を有する低分子のペプチド、あるいはペプチドミメティックな有機化合物はほとんど知られていない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、血管新生作用を有するペプチドを見出し、それを有効成分として含む、ヒトの治療等の臨床使用が可能な新規な血管新生剤を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、血管新生作用を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該配列において、１個〜３個のアミノ酸が置換し、若しくは一方若しくは両方の端部に位置する１個若しくは２個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む血管新生剤を提供する。
本発明により、強い血管新生作用を有するペプチドが見出され、それを有効成分として含む新規な血管新生剤が初めて提供された。本発明の血管新生剤は、人工骨等の生体代用材料を用いた臓器の再生・修復や、生活習慣病として大きな部分を占める心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性大動脈硬化症などの虚血性疾患の治療にも有用である。
発明の実施の形態
下記実施例で具体的に示されるように、本願発明者らは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヘプタペプチドが血管新生作用を有することを見出した。従って、本発明の血管新生剤の好ましい一例では、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヘプタペプチドを有効成分として含む。
一般に、生理活性を有するペプチドにおいて、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個〜３個のアミノ酸が置換し、若しくは一方若しくは両方の端部に位置する１個若しくは２個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチド（以下、便宜的に「修飾ペプチド」と呼ぶことがある）であって血管新生作用を有するペプチドも本発明の範囲に含まれる。なお、ここで、「修飾ペプチド」に含まれるアミノ酸は、天然のタンパク質を構成するアミノ酸に限定されるものではなく、天然のアミノ酸を化学修飾（例えば、アミノ酸の側鎖にニトロ基やハロゲンを導入する等）して得られるアミノ酸も包含される。また、Ｄ型アミノ酸であってもよい。下記実施例で具体的に確認されたように、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端の１アミノ酸を欠失したアミノ酸配列を有するペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドと何ら遜色のない血管新生効果を発揮するものであり、本発明の好ましい形態である。下記実施例で具体的に記載するように、配列番号１の４番目のチロシンをアラニンに置換したペプチド（配列番号８）では血管新生作用が失われたので、４番目のチロシン残基は重要であると考えられ、その側鎖の化学構造が大幅に変更されるような置換はしない方が好ましい。もっとも、天然のＬ型のＴｙｒでなくてもＤ型あるいはチロシンの側鎖のフェノールリングにハロゲンやニトロ基を入れたものなどが通常Ｔｙｒの置換体としてメディシナルケミストリーで分子設計され、より強い効果や同等の効果を発揮する場合がしばしばあることが知られている。また、側鎖に芳香環を有する他のアミノ酸（例えばフェニルアラニンなど）でも同等の効果を発揮するであろうと考えられ、下記実施例に具体的に記載するように、４番目のチロシンをフェニルアラニンで置換したペプチドは、より優れた効果を発揮することが確認された。従って、修飾ペプチドのうち、好ましいものとして、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が置換し、若しくは一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、４番目のアミノ酸残基がチロシン残基又は側鎖に芳香環を有するアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンである血管新生作用を有するペプチドを挙げることができる。なお、ここで、「側鎖に芳香環を有するアミノ酸」は必ずしも天然のタンパク質を構成するアミノ酸に限定されるものではなく、上記のようにチロシン又はフェニルアラニンの芳香環にニトロ基、ハロゲン、炭素数１〜５のアルキル基及び炭素数１〜５のアシル基から成る群より選ばれる少なくとも１種の置換基を結合させたチロシン又はフェニルアラニン誘導体も包含される。置換基が存在する場合、芳香環、好ましくはベンゼン環上に置換する置換基の数は、１〜５個であり、１〜３個が好ましい。また、「芳香環」は好ましくはベンゼン環又はベンゼン環を含むナフタレン環のような縮合環（複素環でもよい）であり、特に好ましくはベンゼン環である。
下記実施例に具体的に記載されるように、本願発明者らは、配列番号１の第４番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドよりもさらに優れた血管新生効果を有することを見出した。なお、フェニルアラニンは、側鎖に芳香環（ベンゼン環）を有するアミノ酸である。したがって、本発明の好ましい形態として、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該配列において、一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む血管新生剤を挙げることができる。
血管新生作用を有する領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列中に含まれるので、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくはその端部領域が欠失した、血管新生作用を有する修飾ペプチドの一端又は両端に他の任意のアミノ酸配列が付加されていてもそのペプチドは血管新生作用を発揮し得る。このことは、フィブロネクチンやラミニン等の細胞接着性ペプチドの細胞接着作用がＲＧＤという僅か３つのアミノ酸から成る領域や、ＹＩＧＳＲという僅か５つのアミノ酸から成る領域等により発揮されるものであることからも類推できる。従って、血管新生活性を有する領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列中に含まれるので、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくはその端部領域が欠失した、血管新生作用を有する修飾ペプチドの一端又は両端に、長いアミノ酸配列が付加されている場合であっても、上記ペプチド又は修飾ペプチド領域が相互作用のために露出している限りは血管新生作用を発揮するものと考えられる。なお、現在では、人工ペプチドの立体構造は、その一次配列から、市販のコンピューターソフトを用いて容易に予測することができるので、サイズの大きなペプチドであっても、上記ペプチド又は修飾ペプチド領域が露出するペプチドは容易にデザインできる。
従って、本発明に用いられるペプチドのサイズの上限は何ら限定されるものではないが、あまりに大きいと製造が困難となり、取り扱いが不便であり、また、単位重量当たりの血管新生活性が減少すると考えられるので、ペプチドの総アミノ酸数は、通常、４〜３５０、好ましくは４〜５０、さらに好ましくは５〜２０、さらに好ましくは５〜１０であり、さらに好ましくは６〜１０である。また、配列番号１〜７及び９〜１１のいずれかに示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部にそれぞれ１０個以下のアミノ酸が付加されたペプチドも好ましい。例えば、配列番号１２及び１３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列のいずれか一端に他のアミノ酸配列を付加したペプチドであるが、いずれも優れた血管新生活性を有することが確認されている。なお、配列番号１のみならず、配列番号２〜７及び９〜１１に記載したアミノ酸配列を有するペプチドが血管新生作用を有することは下記実施例において具体的に確認されているので、これらはいずれも好ましい例である。
なお、ペプチドが血管新生作用を有するか否かは、下記実施例に具体的に示すように、ペプチド溶液を充填したマイクロセルをマウスの背部に埋め込み、埋め込んだ周囲の組織内の毛細血管の形成状況を観察することにより調べることができる。
上記ペプチドは、手動あるいは市販のペプチド合成機を用いる常法により容易に合成することができる。また、サイズの大きなペプチドは、常法により、遺伝子工学的に製造することができる。
上記ペプチドは、単独で、又は生理緩衝液中に溶解した注射液等の形態で、血管新生が望まれる組織に局所投与することができる。手術や外傷により生じた創傷等の近傍に本発明の血管新生剤を、注射や塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、血管新生が促進され、創傷の治癒が促進される。ここで、注射又は塗布若しくは噴霧等に用いるペプチド溶液中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１〜１０μｇ（マイクログラム）／ｍＬ程度である。また、投与量は、傷などの大きさや深さにより適宜選択できるが、傷全体がペプチド溶液で被覆される程度でよい。また、傷が治癒するまで、１日〜数日毎に１回〜数回投与することができる。また、注射液には、他の消毒剤や消炎鎮痛剤など、通常、傷の治療薬に含まれる種々の成分を含んでいてもよい。
また、ペプチドをキャリアに結合し、ペプチドが結合されたキャリアを生体に埋め込むことにより血管新生を促進することもできる。これはキャリアに固定化している為に必要な部位に選択的に作用させることができ、新たなＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）としての可能性に富んでいる。生体材料移植部に本発明の血管新生剤を、塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、血管新生が促進され、術後の治癒が促進される。ここで、キャリアとしては、特に限定されるものではなく、代用骨や代用歯、人工臓器等に用いられる樹脂や、タンパク質等の生体高分子を挙げることができる。樹脂に上記ペプチドを結合することにより、該樹脂を生体に埋め込んだ際に、樹脂と接する周辺組織中での血管新生が促進され、樹脂の生体との親和性がより向上する。また、より好ましい態様として、タンパク質（本明細書において、特に断りがない限り「タンパク質」という語は、糖タンパク質やリンタンパク質等のタンパク質含有複合体を包含する）をキャリアとして用いるができる。
ここで、キャリアとして用いるタンパク質は、生体適合性を有するいずれのタンパク質であってもよく、とりわけ、生体組織との接合を良好にするために、細胞接着性タンパク質であることが好ましい。細胞接着性タンパク質の好ましい例として、コラーゲン（ゼラチン）、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニン等並びにこれらの部分加水分解物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。なお、これらのタンパク質は、アレルゲンを除去した精製タンパク質であることが、アレルギー反応の防止の観点から好ましい。例えば、コラーゲンとしては、動物由来のコラーゲンが種々市販されているが、これらは純度が低く、アレルゲンが含まれており、品質の再現性も劣るので臨床用途に適用することは好ましくない。動物由来のコラーゲンを部分加水分解し、アレルゲンを除去したゼラチンが臨床用途のために市販されているので、このような精製されたコラーゲン又はその部分加水分解物を用いることが好ましい。
キャリアに結合されるペプチドの量は、特に限定されず、適宜選択することができるが、通常、キャリアとペプチドの重量比率（キャリア：ペプチド）が１００：１〜１：１程度であり、好ましくは２０：１〜５：１程度である。
キャリアとペプチドとの結合は、共有結合によることが好ましい。結合は、例えばペプチドのＮ末端のアミノ基と、キャリア中の任意のアミノ基をグルタルアルデヒド等の結合架橋剤を用いて結合することにより容易に行うことができ、下記実施例に詳細な結合方法の一例が記載されている。また、人工臓器等の樹脂に結合する場合には、この樹脂中に、アミノ基等の、ペプチドとの結合に用いることができる基を含むモノマーを共重合させておき、当該アミノ基等とペプチドのＮ末端のアミノ基を結合することができる。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくは欠失した、血管新生作用を有する修飾ペプチドの一端又は両端に、任意のアミノ酸配列を有する他のペプチドを結合したものを採用し、この任意のペプチドをキャリアとの結合に供することも好ましい。
ペプチドを結合したキャリアは、塗布又は噴霧する他にそのままで生体内に埋め込むことができる。キャリアとして、細胞接着性タンパク質を採用した場合には、ペプチド結合キャリアは、縫合糸、各種整形手術材料、傷口の癒着促進剤等として単独又は他の薬効成分とともに用いることができる。また、ペプチドを結合したキャリアタンパク質を、炭酸アパタイトや、本発明のペプチドを結合していない細胞接着性タンパク質等の他の材料と混合したものを代用骨等として用いることができる。この場合、代用骨等の最終の生体材料中に含まれるペプチドの量は、特に限定されないが、通常、生体材料１００ｇ当たり、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ程度である。
本発明に用いられるペプチドは、天然のタンパク質を構成するアミノ酸によって構成されているものであり、生体内ではペプチダーゼの作用を受けてやがてはアミノ酸に分解されるものであるので、安全性が高い。実際、下記実施例で行った、マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏの実験において、毒性は全く観察されなかった。このことは、薬効を発揮する使用量において、毒性が認められなかったことを示している。
実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
実施例１    ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ化学による高効率固相法（Ｋ．Ｎｏｋｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅ  ｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９２，ｅｄ．，Ｒ．Ｅｐｔｏｎ，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ，４４５−４４８，１９９２，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ；軒原清史、有機合成化学協会誌、５２，３４７−３５８，１９９４，高効率ペプチド合成：多種品目同時自動合成とペプチドライブラリー）に基づき、ペプチド自動合成機を用いて配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヘプタペプチド（ＡＧＰ（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅの略）と命名）を合成した。得られたペプチドを、液体クロマトグラフィー結合質量スペクトル（ＬＣＭＳ）システムで検定し、高純度であることを確認した（単一成分、質量理論値と一致）。
実施例２    三次元培養された血管内皮培養組織中での血管新生作用
実施例１で合成したＡＧＰの存在下でラットの血管内皮細胞を三次元培養した。この操作は具体的には次のようにして行った。細胞はｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｒａｔ  ｌｕｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ（ＴＲＬＥＣ細胞）を用いた。１０μｇ／ｍｌの濃度のペプチド溶液混和コラーゲンＩ層中にＴＲＬＥＣ細胞を播種し、１４日間の炭酸ガスインキュベーター中で培養した。コントロールは因子（−）と従来より血管新生因子として知られているタンパク質ＶＥＧＦ（＋）で行った。
１４日後に培養細胞を顕微鏡で観察したところ、コントロールはまったく管腔を形成しなかった。ＡＧＰとＶＥＧＦは管腔を形成し、この管腔を囲包する細胞同士が接着されていた。さらに、倍率７０００倍で電子顕微鏡で管腔部分を観察したところ、管腔の内壁にマイクロビライ（微細細胞突起）が複数個形成されていることが認められた。さらに、倍率１５０００倍で、管腔を取り囲む血管内皮細胞同士の接合部分を観察したところ、内皮細胞同士が堅固に結合されている領域、すなわち、タイトジャンクション（密着結合）が認められた。これらの所見は内皮細胞が極性を獲得して、管腔を形成したことを示す。なお、極性というのは細胞が頭と尻尾のような機能分担する部分をもつ性質で、内皮細胞を通常培養していても極性はなく、したがって管腔も作らないので、このペプチドで誘導されたことを示している。管腔形成長さは有意にＡＧＰの方がＶＥＧＦより優れていた。これらの結果から、ＡＧＰには血管内皮培養細胞から構成される組織中に、細胞同士を接着させてそれらの間に管腔を形成する作用（生体内では、この管腔が血管になる）があることが確認された。
実施例３、比較例１    ＤＡＳアッセイによるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生作用
細胞培養液として用いられるＤＭＥＭ（ダルベッコ修飾イーグル培地）中に１０μｇ／ｍｌの濃度のプチドを溶解した溶液を得た。直径０．４５ｍｍの円筒の上下をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（商品名）で塞いで構成されるマイクロセルをマウスの背部に埋め込んだ後、マイクロセル内に上記ＡＧＰ等のペプチド溶液やＶＥＧＦ溶液をインジェクションした。また、対照として、ペプチドを含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）単独もインジェクションした（比較例１）。５日後に、マイクロセル周辺の組織の様子を顕微鏡で観察した。
その結果、ＡＧＰ溶液をインジェクションしたマイクロセルに接していた組織では、枝分かれした毛細血管が多数形成されていた。一方、ＰＢＳのみを投与した比較例１（コントロール）では、このような毛細血管の生成は全く認められなかった。この結果をマグニチュードで示すとＡＧＰでは５（マグニチュード５を以下、「Ｍ５」のように表記する）、コントロールではＭ０、比較のために用いた既知の血管新生タンパク質ＶＥＧＦではＭ３であった。なお、マグニチュードは、スパイラル化した血管新生数であり、Ｍ０が０本、Ｍ１が１−１０本、Ｍ２が１１−２０本、Ｍ３が２１−３０本、Ｍ４が３１−４０本、Ｍ５が４１−５０本、Ｍ６が５１本以上であることを示す。従って、マグニチュードＭが大きいほど血管新生作用が大きい。上記結果から、ＡＧＰのｉｎ  ｖｉｖｏにおける強い（顕著な）血管新生作用が確認された。
実施例４〜９、比較例２
ＡＧＰを構成する７個のアミノ酸のうちの１個をアラニンに置換した、合計７種類のヘプタペプチド（配列番号２〜８）を実施例１と同様にして合成した。各ヘプタペプチドについて、実施例３に記載したＤＡＳアッセイによりマウス体内における血管新生作用を調べた。
その結果、配列番号１の４番目のチロシンをアラニンに置換したペプチド（配列番号８、比較例２）では、比較例１と同様、スパイラル化した血管新生作用が全く認められなかったが、他のペプチド（配列番号２〜７、実施例４〜９）では、ＡＧＰと同等又はそれ以上の新生血管が形成されており、明らかな血管新生作用が認められた。血管新生能をマグニチュードＭで表記すると、コントロール（ペプチドなし）（Ｍ０）、ＡＧＰ（Ｍ５）、ＡＧＰ１（Ｍ５）、ＡＧＰ２（Ｍ３）、ＡＧＰ３（Ｍ２）、ＡＧＰ４（Ｍ０）、ＡＧＰ５（Ｍ３）、ＡＧＰ６（Ｍ４）、ＡＧＰ７（Ｍ６）であった。なお、ここで、ＡＧＰ１は１位をＡｌａで置換したもの、以下同様でＡＧＰ７は７位をＡｌａ置換したものであり、括弧内は上記した血管新生マグニチュードを示す。上記結果から、ＡＧＰのうち、少なくともＮ末端とＣ末端は、血管新生作用にとって必要ではないことが明らかになった。従って、ＡＧＰのＮ末端又はＣ末端を、キャリアとの結合部位として利用しても血管新生作用が損なわれないことが明らかになった。
実施例１０    ペプチドのキャリアタンパク質への結合
キャリアタンパク質として、動物由来コラーゲンを部分加水分解し、アレルゲンの部分を除去したゼラチンであるＦｒｅＡｌａｇｉｎ  ＡＤタイプ（宮城化学工業株式会社製、分子量２０００〜２００００）を用いた。ＦｒｅＡｌａｇｉｎ  ＡＤタイプは、臨床での使用が認められているものである。
ＦｒｅＡｌａｇｉｎ  ＡＤ（キャリアタンパク質）１００ｍｇを２．５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。ＡＧＰ１．２０−１．３２ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに溶解し，キャリア蛋白質に氷冷下で加えた。グルタルアルデヒド（２５％溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈し、０．１５ｍＬを得られた混合物に滴下（４℃）、反応混合物を４℃で３〜４時間撹拌した。これにより、ＡＧＰのＮ末端のアミノ基と、キャリアタンパク質のアミノ基が共有結合された。
完全な結合の確認は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料消失にて行った。反応混合物は５％酢酸を溶出液としＧ１０カラム（ファルマシア社製）で脱塩した。主ピークを凍結乾燥しほぼ定量的に結合物を得た。
実施例１１    ＡＧＰ結合ゼラチンの三次元培養された血管内皮培養組織中での血管新生作用
実施例１０で合成したＡＧＰ結合ゼラチンの存在下でラットの血管内皮細胞を三次元培養した。この操作は具体的には次のようにして行った。細胞はｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｒａｔ  ｌｕｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ（ＴＲＬＥＣ細胞）を用いた。ペプチドＡＧＰ結合ゼラチン（コンジュゲート）とコラーゲンタイプＩを１：１０の割合で混和し、１０μｇ（マイクログラム）／ｍｌの濃度にしたコンジュゲート・コラーゲン混和溶液混和層中にＴＲＬＥＣ細胞を播種し、１４日間の炭酸ガスインキュベーター中で培養した。コントロールは因子（−）で他は従来より血管新生因子として知られているタンパク質ＶＥＧＦ（＋）を用いた。
１４日後に顕微鏡で観察したところ、コントロールはまったく管腔を形成しなかった。ＡＧＰコンジュゲートとＶＥＧＦとは管腔を形成し、この管腔を囲包する細胞同士が接着されていた。さらに、倍率７０００倍で電子顕微鏡で管腔部分を観察したところ、管腔の内壁にマイクロビライ（微細細胞突起）が複数個形成されていることが認められた。さらに、倍率１５０００倍で、管腔を取り囲む血管内皮細胞同士の接合部分を観察したところ、内皮細胞同士が堅固に結合されている領域、すなわち、タイトジャンクションが認められた。管腔形成長さは有意にＡＧＰコンジュゲートの方がＶＥＧＦより優れていた。これらの結果から、ＡＧＰコンジュゲートには血管内皮培養細胞から構成される組織中に、細胞同士を接着させてそれらの間に管腔を形成する作用（生体内では、この管腔が血管になる）があることが確認された。
実施例１１、比較例３    ＤＡＳアッセイによるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生作用
１００μｇ／ｍｌの濃度のＡＧＰコンジュゲート（実施例１０で作製）をコラーゲンＩに１：１０の割合で溶解し、１０μｇ／ｍｌの濃度のプチド結合ゼラチンコラーゲン混和溶液を得た。直径０．４５ｍｍの円筒の上下をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（商品名）で塞いで構成されるマイクロセルをマウスの背部に埋め込んだ後、マイクロセル内に上記ＡＧＰコンジュゲートとＶＥＧＦ溶液とをインジェクションした。また、対照として、ペプチドを含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）単独もインジェクションした（比較例３）。５日後に、マイクロセル周辺の組織の様子を顕微鏡で観察した。
その結果、ＡＧＰコンジュゲート・コラーゲン混和溶液をインジェクションしたマイクロセルに接していた組織では、スパイラル化した毛細血管が多数形成されていた。一方、ＰＢＳのみを投与した比較例３では、このようなスパイラル化した血管の形成は全く認められなかった。血管新生マグニチュードは、対照はＭ０、ＡＧＰはＭ５、ＶＥＧＦはＭ３であった。この結果から、ＡＧＰコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管新生作用が確認された。
実施例１２〜２１、比較例４〜７
配列番号９ないし２２に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、実施例３と同様にしてＤＡＳアッセイを行った。結果を下記表１に示す。
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以上の結果から、配列番号９〜１１で示すアミノ酸配列を有するペプチドが非常に優れた血管新生活性を有し、とりわけ、配列番号９で示すアミノ酸配列を有するペプチドが特に優れた血管新生活性を有することが明らかになった。また、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に他のアミノ酸配列を有するペプチドも優れた血管新生活性を有することが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明の血管新生剤は、強い血管新生作用を有し、人工骨等の生体代用材料や人工臓器の体内埋め込み及び臓器の修復に有用である。また、生活習慣病として大きな部分を占める心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性大動脈硬化症などの虚血性疾患の治療にも有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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