(57)【要約】インフルエンザウイルスの宿主域の変異や抗原性の変異にも対応し、あらゆる人および動物由来のＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスの感染を阻止できる医薬品やウイルス除去用フィルター等の吸着剤として有用な物質として、次式（Ｉ）2003074570.tif 000018（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基およびアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルヘキソサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい。また、Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソースとの結合は、天然に存在するＯ−グリコシド結合であっても、Ｓ−グリコシド、Ｓｅ−グリコシド結合等の化学的に変換された結合であってもよい。）で表される新規分岐状シアロ糖分子を提供する。
2003074570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）
2003074570.tif 000015
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルヘキソサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）
で表されることを特徴とする新規分岐状シアロ糖分子。
【請求項２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソースは、天然のＯ−グリコシド結合により結合している請求項１の新規分岐状シアロ糖分子。
【請求項３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソースの結合は、化学的に変換された結合である請求項１の新規分子状シアロ糖分子。
【請求項４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソースの結合形態は、Ｓ−グリコシド結合またはＳｅ−グリコシド結合である請求項３の新規分子状シアロ糖分子。
【請求項５】
次式（ＩＩ）
2003074570.tif 000016
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）
で表されることを特徴とする新規分岐状シアロ糖分子。
【請求項６】
次式（ＩＩＩ）
2003074570.tif 000017
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）
で表されることを特徴とする新規分岐状シアロ糖分子。
【請求項７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸とガラクトースは、天然のＯ−グリコシド結合により結合している請求項５または６のいずれかの新規分岐状シアロ糖分子。
【請求項８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸とガラクトースの結合は、化学的に変換された結合である請求項５または６のいずれかの新規分子状シアロ糖分子。
【請求項９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸とガラクトースの結合形態は、Ｓ−グリコシド結合またはＳｅ−グリコシド結合である請求項８の新規分子状シアロ糖分子。
【請求項１０】
少なくとも請求項１ないし９のいずれかの新規分岐状シアロ糖分子を有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、新規分岐状シアロ糖分子に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、インフルエンザウイルスの宿主域の変異や抗原性の変異に対応でき、すべてのヒトおよび動物由来のＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスの感染、ならびにインフルエンザの流行を阻止できる医薬品やウイルス除去用フィルター等の吸着剤として有用な新規分岐状シアロ糖分子に関するものである。
背景技術
日本におけるインフルエンザ感染者は、毎年数１０万人〜１００万人を超える。１９１８年のスペイン風邪（遺伝子解析によりＨ１Ｎ１型インフルエンザウイルスによることが判明）は、世界で年間に少なくとも２０００万人、日本でも３８万人以上を死亡させ、人類史上最悪、最大の自然災害と位置付けられている。
また、近年では、インフルエンザが特に高齢者においては気管支炎や肺炎を併発して重症化させ、小児においては脳炎や脳症を引き起こすことなどが報告されており、冬季における疾患の制圧は世界的に急務となっている。
インフルエンザの病原体は、インフルエンザウイルスであり、インフルエンザウイルスには内部タンパク質の抗原性の違いによりＡ、Ｂ、Ｃ型の３種類が知られている。Ｂ、Ｃ型は主にヒトから分離されるが、Ａ型ウイルスは、ヒト以外にも野生水鳥、家禽類、ブタ、ウマ、アザラシ、クジラ、フェレットなど自然界の多くの動物種から分離され、最も病原性が高く、世界的流行を起こしている。
インフルエンザウイルスは、分節状の単鎖ＲＮＡをゲノムとする。一般に１本鎖ＲＮＡの配列を読み取るＲＮＡポリメラーゼによる複製は、通常の２本鎖ＤＮＡを読み取るＤＮＡポリメラーゼによる複製に比べ、格段に「間違い」を起こしやすいことが知られている（Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｊ．：Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１，４０９−４３３（１９８７）；Ｇｏｊｏｂｏｒｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｉｋｅｏ，Ｋ．，Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ｍ．：Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６９，４８１−４８８（１９９４））。そのため、ウイルスが宿主細胞内で増殖すると、同時に新たな変異ウイルスが生まれてしまう。このような変異によりウイルスタンパク質の抗原性が少しずつ変化するため、インフルエンザウイルスは通常の免疫監視機構には検知されない場合が多く、毎年流行するのである。
インフルエンザウイルスの変異には、前記の抗原性の連続変異（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｄｒｉｆｔ）以外に、宿主域の変異（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｓｈｉｆｔ）（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，４２９−４５７（１９９４））がある。インフルエンザウイルスの遺伝子は、一つにつながっておらず、分節状であるため、例えばヒトとカモのインフルエンザウイルスがブタに同時感染するとブタ体内で両者の遺伝子再集合体が生まれ、全く新しい型（抗原性）を有するウイルスが生まれることがある。そして、ヒトはこのようなウイルスに対する抗体を全く持たないために、ヒトが新しいウイルスに感染すると世界的に大流行する危険性がある。
インフルエンザウイルスの感染は、ウイルス糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）が宿主細胞表面に存在するシアル酸含有糖鎖に結合することにより起こることが知られている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，４２９−４５７（１９９４）；Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．：  Ｔｈｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｖｏｌ．２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ｐｐ．１３１−２１９（１９８５）；  Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｋｅｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．：  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６，３６５−３９４（１９８７））。そこで、従来、このシアル酸含有糖鎖が研究され、抗インフルエンザウイルス剤として各種のシアル酸含有糖鎖（シアロ糖鎖）化合物が報告されている（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ｏ．，Ａｏｙａｍａ，Ｙ．，Ｇｕｏ，Ｃ．Ｔ．，Ｈｉｄａｒｉ，Ｋ．Ｉ．Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒ，１２５９−１２６０（１９９９）；  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ｋｉｓｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．：Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．７，３４９−５４（１９９０））。しかし、これらの化合物は、いずれも、一つの型のウイルスに対してのみ抗インフルエンザウイルス性を示すものであり、複数の型のウイルスが同時に流行するという現状においては、その有効性に限界があったのが実情である。
また、インフルエンザウイルスの動物種間の伝播による宿主域の変異や宿主が持つインフルエンザウイルス抗体による抗原性の変異にも対応できる抗インフルエンザ剤は、これまでのところ開発されていない。
したがって、この出願の発明は、以上のとおりの問題点を解決し、インフルエンザウイルスの宿主域の変異や抗原性の変異にも対応し、あらゆるヒトおよび動物由来のＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスの感染ならびにインフルエンザの流行を阻止できる医薬品やウイルス除去用フィルター等の吸着剤として有用な物質を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、第１には、次式（Ｉ）
2003074570.tif 000003
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルヘキソサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）で表されることを特徴とする新規分岐状シアロ糖分子を提供する。
この出願の発明は、第２には、Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソースが天然のＯ−グリコシド結合により結合している前記の新規分岐状シアロ糖分子を、第３には、Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソースの結合が化学的に変換された結合である前記の新規分子状シアロ糖分子を、また、第４には、Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソースの結合形態がＳ−グリコシド結合またはＳｅ−グリコシド結合から選択される前記の新規分子状シアロ糖分子を提供する。
この出願の発明は、第５には、次式（ＩＩ）
2003074570.tif 000004
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）で表されることを特徴とする新規分岐状シアロ糖分子を提供する。
さらに、第６には、この出願の発明は、次式（ＩＩＩ）
2003074570.tif 000005
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）で表されることを特徴とする新規分岐状シアロ糖分子を提供する。
この出願の発明は、第７には、Ｎ−アセチルノイラミン酸とガラクトースが、天然のＯ−グリコシド結合により結合している前記いずれかの新規分岐状シアロ糖分子を、第８には、Ｎ−アセチルノイラミン酸とガラクトースの結合が、化学的に変換された結合である前記いずれかの新規分子状シアロ糖分子を、さらに、第９には、Ｎ−アセチルノイラミン酸とガラクトースの結合形態がＳ−グリコシド結合またはＳｅ−グリコシド結合である前記の新規分子状シアロ糖分子を提供する。
そして、この出願の発明は、第１０には、少なくとも前記いずれかの新規分岐状シアロ糖分子を有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤をも提供する。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明者らは、インフルエンザウイルスの遺伝子解析、および宿主への感染に必須なウイルス受容体となるシアロ糖鎖の調査を進め、インフルエンザウイルスがヒトから他の動物へ伝播する仕組みを明らかにしてきた（Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｔａｋａｄａ，Ａ．，Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｏｔｓｕｋｉ，Ｋ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｈ．，Ｙａｍａｄａ，Ｍ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｋｉｄａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋａｗａｏｋａ，Ｙ．：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１，３３５７−３３６２（１９９７）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈｏｒｉｉｋｅ，Ｇ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｙ．，Ｋａｗａｂｅ，Ｋ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｈ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．Ｉ．，Ｙａｍａｇａｔａ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｋｉｄａ，Ｈ．，Ｋａｗａｏｋａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０４，１９２−１９６（１９９７）；  Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｍｉｔｎａｕｌ，Ｌ．，Ｖｉｎｅｓ，Ａ．，Ｋｉｄａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋａｗａｏｋａ，Ｙ．：  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２７，４９３−４９９（１９９７）；  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．：  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＩＩＩ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｈａｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｗ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｄｉｔｏｒｓ），４４４３−４４４６（１９９６））。そして、ヒト、ブタ、トリ、ウマから分離されるインフルエンザＡ型ウイルスおよびヒトインフルエンザＢ型ウイルスは、いずれも共通してシアル酸（Ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ，ＳＡ）を含む糖鎖を特異的に認識結合すること、特に、シアリルラクト系Ｉ型およびＩＩ型糖鎖（Ｉ型糖鎖：ＳＡα２−６（３）Ｇａｌ  β１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−；ＩＩ型糖鎖：ＳＡα２−６（３）Ｇａｌ  β１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−）と強く結合することを明らかにした。（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｎａｋａｏ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｔｏｄａ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｇ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｙａｍａｄａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８９，１２１−１３１（１９９２）；鈴木康夫：生化学、６２，２３１−２６０（１９９０））
さらに、発明者らは、活性のあるシアロ糖鎖でも遊離オリゴ糖として存在する場合にはインフルエンザウイルスへの結合力は弱いが、シアロ糖脂質、シアロ糖タンパク質などとして、脂質あるいはタンパク質に結合した糖鎖として存在する場合、さらに化学合成ポリマー上に上記シアロ糖鎖をクラスター形成して発現させた場合には、飛躍的に高い結合性を表すことを見出した。
（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ｏ．，Ａｏｙａｍａ，Ｙ．，Ｇｕｏ，Ｃ．Ｔ．，Ｈｉｄａｒｉ，Ｋ．Ｉ．Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒ，１２５９−１２６０（１９９９）；Ａｋｉｋｏ  Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋａｚｕｋｉｙｏ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎｏｒｉｔａｋａ  Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｔｓｕｋａｓａ  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔａｋａｓｈｉ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙａｓｕｏ  Ｓｕｚｕｋｉ：Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，１５，１０４７−１０５４（１９９８））
さらにまた、Ａ型、Ｂ型のインフルエンザウイルスヘマグルチニンの分子進化は、受容体シアロ糖鎖末端のシアル酸結合様式（ＳＡ−２−３Ｇａｌ，ＳＡ２−６Ｇａｌ）とシアル酸分子種（Ｎｅｕ５Ａｃ，Ｎｅｕ５Ｇｃ）の認識の変化として現れることをも見出した。（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｋａｔｏ，Ｈ．，Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３，４２９８−４３０２（１９８９）；  Ｘｕ，Ｇ．，Ｈｏｒｉｉｋｅ，Ｇ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｄ．，Ｋｕｍｉｈａｓｈｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．：  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２２４，８１５−８１８（１９９６））例えば、ヒトからＭＤＣＫ細胞を用いて分離されたＡ型（Ｈ１，Ｈ３亜型）およびＢ型ウイルスは、ＳＡ２−６Ｇａｌ結合（以下２−６と記述）を認識するのに対して、カモおよびウマから分離されるウイルスはいずれもＳＡ２−３Ｇａｌ結合（以下２−３と記述）に強い親和性を示し、２−６への結合は弱い。一方、ブタから分離されるウイルスは２−６への強い親和性を示すが、２−３にも結合できる。
そこで、インフルエンザウイルスの受容組織（ヒト、ブタ、ウマは上気道粘膜細胞、カモは腸管粘膜細胞）におけるシアル酸の結合様式および分子種を調査したところ、ブタの上気道細胞にはヒト、カモウイルス両者に対する受容体シアロ糖鎖（２，６−、２，３−の両者）が存在することが明らかになった。すなわち、ブタは自然界においてカモおよびヒトインフルエンザウイルスの中間宿主となり得ることが分子レベルで明らかになったのである。
しかし、実際に宿主細胞の表面で発現されているシアロ糖鎖（すなわち、特定のレセプター分子）の存在や構造はこれまで明らかにされていなかった。そこで、この出願の発明者らは、鋭意研究により、インフルエンザウイルス感染組織から各種のシアロ糖鎖を抽出し、それぞれのインフルエンザウイルスに対する結合性を調べ、本願発明にいたったものである。
すなわち、この出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子は、次の化学式（Ｉ）
2003074570.tif 000006
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルヘキソサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）で表されるものである。この出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子は、すなわち、α２，６−結合したＮｅｕＡｃとＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃとα２，３−結合したＮｅｕＡｃとＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃを両方有することを特徴とするものである。
このような化合物において、ＨｅｘおよびＨｅｘＮＡｃの種類はとくに限定されない。好ましくは、Ｈｅｘはガラクトース（Ｇａｌ）、ＨｅｘＮＡｃはガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）である。また、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基がハロゲン基（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アルキル基（Ｃ２−Ｃ２０）およびアシル基（Ｃ２−Ｃ２０）で化学的に修飾されていてもよい。
さらに、この出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子において、Ｎ−アセチルノイラミン酸とヘキソース（またはガラクトース）との結合は、天然に存在するＯ−グリコシド結合のみではなく、Ｓ−グリコシド、Ｓｅ−グリコシド結合等化学的に変換されていてもよい。
また、この出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子は、Ｒが水素原子や置換基を有していてもよい炭化水素基である遊離オリゴ糖やその誘導体であってもよいし、Ｒが糖鎖、脂質、タンパク質あるいは合成高分子等であってもよい。前記のとおり、Ｒとして脂質、タンパク質、合成高分子等を有し、新規分岐状シアロ糖脂質、新規分岐状シアロ糖タンパク、高分子固定化新規分岐状シアロ糖などを形成している場合には、インフルエンザウイルスに対する結合性が高くなり、好ましい。また、Ｒの構造は、この発明の新規分岐状シアロ糖分子の用途に応じて適宜変更してもよい。
この出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子は、公知の多糖類の合成方法によって合成されるものであってもよいし、天然由来のものであってもよい。とくに孵化鶏卵しょう尿膜由来のものを単離して得られるものが例示される。
この出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子は、その分子中にすべての型（Ａ型、Ｂ型、およびＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン亜型）のウイルスが宿主細胞受容体に結合する上で必要な複数のシアロ糖鎖、とくにα２，６−およびα２，３−結合を同時に有するため、Ａ型のインフルエンザウイルスおよびＢ型のインフルエンザウイルスのいずれに対しても有効に結合する。
したがって、この出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子は、インフルエンザウイルス感染、ならびにインフルエンザの流行を防止する各種の手段に適用できる。例えば、医薬品（抗ウイルス剤）の有効成分、マスクや空気清浄機等のフィルターにおけるウイルス吸着剤等の用途が挙げられる。例えば抗ウイルス剤として用いる場合には、どのような形態としてもよく、液剤、錠剤、粉末等の経口投与されるものや、点鼻薬、口腔スプレーなどのエアロゾル等として鼻腔や咽頭に直接適用するもの、経皮投与するもの等が例示される。また、フィルター等に充填する場合には、空気中からウイルスを除去し、拡散を防ぐことが可能となる。さらに、カーテン、壁紙などの家庭用品にこの出願の発明の新規分岐状シアロ糖分子を混合あるいは塗布すれば、ウイルスの除去、拡散防止効果を付与することができる。
この発明の新規分岐状シアロ糖分子は、インフルエンザウイルスに対して従来の直鎖状の糖鎖群と同等かそれ以上の結合性を有し、高い感染防止効果を発揮する。また、前記のとおり、あらゆるインフルエンザウイルスに対して高い結合性を有するために、複数種のインフルエンザが同時に流行したり、新たなインフルエンザウイルスの変異体が発生したりしても、十分な結合性を維持でき、抗ウイルス剤やウイルス吸着剤としての性能を発揮できる点で、従来の直鎖状の糖鎖群よりも有用性が高いといえる。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明する。もちろん、この出願の発明は、以下の実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
実  施  例
実施例１  インフルエンザウイルスレセプター候補分子の探索
インフルエンザウイルスのレセプターとなる分子を探索、同定するために、ウイルスの増殖に用いられる孵化鶏卵のしょう尿膜およびウイルスの分離や感染実験に用いられる犬の腎尿細管細胞（ＭＤＣＫ細胞）からＡ型およびＢ型のインフルエンザウイルスと反応する脂質性分子を単離することを試みた。
Ｉ．実験方法
（１）材料
インフルエンザウイルス株は、表１に示すものを使用した。
2003074570.tif 000007
なお、表中、Ｎ−アセチルノイラミン酸への結合特性は、ＩＩＩに後述するＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙにより標準糖脂質（シアリルパラグロボシド）との反応性を調べた結果に基づく値である。また、ＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙは、発明者らにより確立された方法である。（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｎａｋａｏ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｔｏｄａ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｇ．Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｙａｍａｄａ，Ａ．，Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｋｉｔａｍｅ，Ｆ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｄｅｙａ，Ｅ．，Ｋｉｓｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９，１２１−１３１；  Ｇｕｏ，Ｃ．−Ｔ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，Ｋａｊｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｍｉｕｒａ，Ｔ．，Ｉｄａ，Ｙ．，Ｊｕｎｅｊａ，Ｌ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｊ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｈ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１５，１０９９−１１０８）
抗インフルエンザウイルス抗体としては、次の表２に示すものを使用した。
2003074570.tif 000008
（２）インフルエンザウイルスの精製
ＰＢＳで希釈（Ａ型インフルエンザウイルス：２−３〜４；Ｂ型インフルエンザウイルス：２−１〜０）したウイルス懸濁液を１１日齢発育鶏卵のしょう尿腔に０．２ｍｌ植種し、３４℃で４８時間培養した。
しょう尿液を回収した後、４℃、４０００ｒｐｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＳＣＩ  ２０Ｂ，ＲＰＲ９ローター）で１０分間遠心し、夾雑物を除去した。上清をさらに４℃、８０００ｒｐｍで３時間遠心し、ペレットをＰＢＳで懸濁して粗ウイルス液とした。次に５０％グリセロール（ＷＡＫＯ）−ＰＢＳに粗ウイルス重層し、４℃、３８０００ｒｐｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＣＰ６５β，Ｐ４０ＳＴローター）で２時間遠心した。再び得られたペレットをＰＢＳで懸濁し、１０−４０％（ｗ／ｖ）ショ糖連続密度勾配遠心を４℃、２００００ｒｐｍで９０分（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＣＰ６５β，Ｐ２８Ｓローター）行った。
ウイルスのバンドを回収し、４℃、８０００ｒｐｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＳＣＲ  ２０Ｂ，ＲＰＲ１８ローター）で３時間遠心することにより精製ウイルスを得た。得られたウイルスはＰＢＳで懸濁し、−８０℃で保存した。
（３）赤血球凝集活性（ＨＡＵ）の測定
２１０倍希釈した精製インフルエンザウイルス５０μｌをマイクロプレート（９６Ｕ−ｂｏｔｔｏｍ  ｗｅｌｌｓ，Ｆａｌｃｏｎ）上にて０．０１％ゼラチン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）−ＰＢＳ  ５０μｌで倍々希釈した。０．５％（ｖ／ｖ）モルモット赤血球−ＰＢＳを５０μｌ加え、４℃で２時間静置した後、赤血球の凝集を観察した。ＨＡＵはモルモット赤血球が凝集するために必要なウイルスの最高希釈倍数で示した。
（４）しょう尿膜からの反応性脂質の探索
１１日齢発育鶏卵４０個のしょう尿膜を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、凍結乾燥（ＥＹＥＬＡ  ＦＤＵ−８３０）した。乾燥重量１．８１ｇのしょう尿膜にＭｉｌｌｉＱ水１５ｍｌを加え、ホモジナイズした。さらにＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ  ６０ｍｌを加え、１時間抽出した後、抽出液をろ過し、エバポレーターで溶媒を留去した。ＭｅＯＨ  ６０ｍｌを加え、バス式ソニケーター（ＳＩＬＥＮＴＳＯＮＩＣ，ＳＨＡＲＰ）にて超音波処理した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨにより３７℃で一晩加水分解を行った。溶媒を留去した後、ＭｉｌｌｉＱ水２０ｍｌを加え、超音波処理し、透析（透析膜：ＶＩＳＫＡＳＥ  ＳＡＬＥＳ  ＣＯＲＰ）を行った。
透析後、凍結乾燥したサンプルをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）２０ｍｌに溶解させ、超音波処理し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィーのサンプルとした。
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）はＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．８Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）で予め活性化した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）で平衡化したものを用いた。Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  １０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５にサンプルを導入し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１００ｍｌで中性脂質画分を溶出させた後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．８Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１００ｍｌで酸性脂質画分を溶出させた。これらの画分から溶媒を除去し、ＭｉｌｌｉＱ水１０ｍｌを加え、超音波処理した後、透析を行った。
透析後、さらに凍結乾燥したサンプルのうち酸性脂質画分の半量をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）０．７５ｍｌに溶解し、予めＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）で平衡化し、Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ３ｍｌ）（Ｉａｔｒｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に導入した。
まず、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）１５ｍｌを流しながら、１ｍｌずつ画分を集めた。その後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１５ｍｌ、ＭｅＯＨ  １５ｍｌを流した。これらの画分のうち目的糖脂質を含む画分を集め、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｖ／ｖ）１ｍｌに溶解し、後述のＩＩ（ａ）およびＩＩＩのＴＬＣプレートの二次元展開により分析を行った。
予めＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）で平衡化したＩａｔｒｏｂｅａｄｓ（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ２５ｍｌ）にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）で溶解したサンプル２．５ｍｌを投与した。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）で１２５ｍｌからＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１２５ｍｌへ勾配をかけた溶媒で溶出し、２．５ｍｌずつフラクションコレクター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ，ＳＦ−３１２０）で分取した。これらのフラクションについて、Ａ型（ヒト、トリ）およびＢ型ウイルスとの反応性を後述のＩＩ（ｂ）およびＩＩＩの分析方法で調べた。
結果が認められたフラクションについて、さらに精製するために、全量をＨＰＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ，ＨＰＴＬＣ−Ｆｅｒｔｉｇｐｌａｔｔｅｎ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０）プレートに投与し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（５０／４０／７／３，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）にて展開し、得られた４つのバンドをメス（ＫＥＩＳＥＩＭＥＤＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＣＯ．，ＬＴＤ）で掻き取った。掻き取ったバンドは、それぞれＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）１ｍｌを加えて５分間超音波処理した後、パスツールで綿栓ろ過した。さらに綿栓にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）２ｍｌを流して先のろ液と合わせた。この溶媒を留去した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／（１／１，ｖ／ｖ）１００μｌを加え、後述のＩＩ（ｃ）およびＩＩＩの方法によりＴＬＣプレートにて分析を行った。
（５）ＭＤＣＫ細胞からの反応性脂質の探索
ＭＤＣＫ細胞（１０ｃｍ  ｄｉｓｈ２５枚）をｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養し、収集した。得られた細胞のペレットを凍結乾燥し（乾燥重量０．０６ｇ）、ＭｉｌｌｉＱ水６００μｌを加えた。さらに、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｖ／ｖ）６ｍｌを加え、１５００ｒｐｍ（ＴＯＭＹ，ＬＣ−１００）で５分間遠心し、得られた上清の溶媒を留去した。ＭｅＯＨ  ３ｍｌを加え、超音波処理した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで３７℃で一晩加水分解を行った。溶媒を留去した後、ＭｉｌｌｉＱ水２．５ｍｌを加え、超音波処理し、透析を行った。
透析後、凍結乾燥したサンプルをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）２０ｍｌに溶解させ、超音波処理し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィーのサンプルとした。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５は、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．８Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）で予め活性化した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）に置換したものを用いた。Ｂｅｄ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５にサンプルを投与し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１００ｍｌで中性脂質画分を溶出させた。
その後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．８Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１００ｍｌで酸性脂質画分を溶出させた。これらの画分の溶媒を留去し、ＭｉｌｌｉＱ水２．５ｍｌを加えて超音波処理した後、透析を行った。透析後、凍結乾燥した酸性脂質画分をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｖ／ｖ）１００μｌに溶解し、ＩＩ（ａ）およびＩＩＩのＴＬＣプレートの二次元展開により分析を行った。
ＩＩ．ＴＬＣの化学発色試薬による検出
（ａ）二次元展開：プラスチックＴＬＣプレート（ＭＥＲＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ，Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）はアセトンで展開した後、得られた酸性脂質画分と標準糖脂質（ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）を投与した。このＴＬＣプレートをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／８８％  ＨＣＯＯＨ（６５／２５／１０，ｖ／ｖ／ｖ）にて一次元で展開した後よく風乾し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／５Ｎ  ＮＨ４ＯＨで二次元展開を行った。プレートを風乾した後、ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬（１％（ｗ／ｖ）ｏｒｃｉｎｏｌ／２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を噴霧して１１０℃に加熱し、糖の検出を行った。
二次元展開の結果、ウイルスとの反応性が認められた画分については、さらに精製するために上記のＩａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーで得られた画分と酸性脂質画分の残りの半量を合わせて再度Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーを行った。
（ｂ）一次展開：プラスチックＴＬＣプレート上に得られた酸性脂質画分と標準糖脂質（ＧＳＣ−２７５、ＧＳＣ−２７３、ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）を投与した。このＴＬＣプレートをアセトンで展開した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）にて展開した。プレートを風乾した後、ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、糖の検出を行った。
なお、ＧＳＣ−２７５は、次の〔１〕に示す合成品のα２，６−ｓｉａｌｙｌｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅであり、ＧＳＣ−２７３は、〔２〕に示す合成品のα２，３−ｓｉａｌｙｌｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅである。
2003074570.tif 000009
（ｃ）一次展開：プラスチックＴＬＣプレート上に得られた糖脂質画分と標準糖脂質（前記ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬）を投与した。このＴＬＣプレートをアセトンで展開した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（５０／４０／７／３，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）にて展開した。プレートを風乾後、ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、糖の検出を行った。
ＩＩＩ．ＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ
ＩＩ（ａ）〜（ｃ）と同様に展開したＴＬＣプレートを１％ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，１％ｐｏｌｙｖｉｎｉｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ）（東京化成）−ＰＢＳ溶液（以下Ａ液とする）で室温にて１時間振盪した。ＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄した後、ＨＡＵ＝２７になるようにＰＢＳで希釈したインフルエンザウイルス懸濁液３ｍｌを加え、４℃にて一晩振盪した。なお、ｖｉｒｕｓ（−）にはウイルス懸濁液の代わりにＰＢＳを加えた。
これをＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄し、３％ＰＶＰ−ＰＢＳ溶液（以下Ｂ液とする）で希釈した一次抗体溶液３ｍｌを加えて、４℃で２時間振盪した。このプレートをＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄した後、Ｂ液で希釈した二次抗体溶液３ｍｌを加えて４℃で２時間振盪した。その後、ＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄し、発色基質溶液（０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０，５ｍｌ；０．１１ｍＭ  ４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ，１００μｌ；０．０６Ｍ  ＤＥＰＤＡ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ，１００μｌ；１００μｌ；３０％Ｈ２Ｏ２，５μｌ）を加えて室温で振盪した。発色後、精製水で洗浄、風乾した。
ＩＶ．結果
孵化鶏卵のしょう尿膜より脂質を抽出し、酸性脂質画分をＴＬＣで二次元展開後、糖の検出試薬であるｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬で発色させた（図１ｃ）。同様にして展開したプレートをＡ／ＰＲ／８／３４（図１ｄ）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図１ｅ）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０（図１ｆ）、Ｂ／Ｇｉｆｕ／２／７３（図１ｇ）と反応させたところ、ウイルスに共通して反応する箇所が確認された。（図中矢印で表示）
移動度から、この共通して反応した画分は、シアリルパラグロボシドとは異なる分子である、より長い糖鎖構造を有する物質であることが示唆された。
そこで、この画分をさらに精製するために、Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーを行った。図２ａに得られたパターンを示した。
１〜７のフラクションについて、Ａ型では、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（図２ｃ）、Ａ／ＰＲ／８／３４（図２ｄ）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図２ｅ）、Ａ／Ｄｕｃｋ／３１３／４（図２ｆ）、Ａ／Ｄｕｃｋ／９２／１／７６（図２ｇ）、Ｂ型では、Ｂ／Ｌｅｅ／４０（図２ｈ）を用いて反応性を検討した。
Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−６Ｇａｌ結合の糖鎖構造と強く反応するＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（図２ｃ）は、フラクション２〜６と反応しており、フラクション２の矢印で示したバンドは非常にシャープであった。Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−６Ｇａｌ結合の糖鎖構造と同程度に結合するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図２ｅ）もＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１と同様にフラクション２の矢印で示したバンドと強く反応していた。このバンドは、Ａ／Ｄｕｃｋ／３１３／４（図２ｆ）、Ａ／Ｄｕｃｋ／９２／１／７６（図２ｇ）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０（図２ｈ）にも反応しており、ヒトＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスに共通して反応するだけでなく、Ｈ５、Ｈ９のトリウイルスにも反応することが明らかになった。
そこで、この反応性脂質をさらに精製するために、フラクション２についてＨＰＴＬＣにて掻き取りを行ったところ、図３ａに示すようなパターンが得られた。このバンドは、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（図３ｂ）、Ａ／ＰＲ／８／３４（図３ｃ）と反応することが確認された。
一方、ＭＤＣＫ細胞からも同様にして脂質を抽出し、酸性脂質画分をＴＬＣで二次元展開した後、ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬で発色させたところ、図４ａのようなパターンが得られた。同様に展開したプレートをＡ／ＰＲ／８／３４（図４ｃ）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図４ｄ）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０（図４ｅ）、Ｂ／Ｇｉｆｕ／２／７３（図４ｆ）と反応させたところ、矢印で示した部分がすべてのウイルスに共通して反応することがわかった。
この反応性脂質は、しょう尿膜で反応した画分（図１）と同様の移動度であることが明らかとなった。
実施例２
実施例１より、孵化鶏卵のしょう尿膜、ＭＤＣＫ細胞中に含まれる特定の脂質性分子がＡ型およびＢ型のインフルエンザウイルスと反応することが確認された。この脂質性分子の構造や結合特異性を調べるために、さらに大きなスケールで単離、精製を行った。最終的に単離された脂質性分子のインフルエンザウイルスとの結合特異性を既にウイルスとの結合性が報告されている標準糖脂質であるシアリルパラグロボシドと比較検討した。
Ｉ．実験方法
（１）材料
インフルエンザウイルス株は、表３に示すものを使用した。
2003074570.tif 000010
なお、表中Ｎ−アセチルノイラミン酸への結合特性は、実施例１に示したＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙにより標準糖脂質であるシアリルパラグロボシドとの反応性を調べた結果に基づく値である。
さらに、抗インフルエンザウイルス抗体としては、次の表４に示すものを使用した。
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（２）しょう尿膜から目的脂質の精製
１１日齢発育鶏卵１１５０個からしょう尿膜を採取し、ＰＢＳで洗浄した後凍結乾燥した。乾燥重量６７．７ｇのしょう尿膜にアセトン８００ｍｌを加え、１０分間超音波処理を行った。ホモジナイザーにて粉砕した後、室温で３時間攪拌した。抽出液をろ過し、乾燥させた残渣にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／５／１，ｖ／ｖ／ｖ）２７５０ｍｌを加え、１０分間超音波処理を行った。一晩攪拌した後、ろ過した残渣にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１２００ｍｌを加え、２時間攪拌した。
さらに、ろ液を先のろ液と合わせてエバポレーターで溶媒を留去した。ＭｅＯＨ  ３００ｍｌを加え、超音波処理した後、最終濃度０．１Ｎ  ＮａＯＨとなるように調製し、３７℃、３．５時間さらに室温で一晩加水分解を行った。最終濃度０．１Ｎとなるように調製したＡｃＯＨで中和した後、溶媒を留去した。ＭｉｌｌｉＱ水８０ｍｌを加え、超音波処理した後、透析を行った。透析後、凍結乾燥したサンプルをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１００ｍｌに溶解し超音波処理した後、ろ過した。残渣に再びＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）１００ｍｌを加え、同様の操作を２回行った。３回のろ液を合わせてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィーのサンプルとした。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５は、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．８Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）で予め活性化した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）で平衡化したものを用いた。
Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ４４０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５にサンプルを投与し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）２０ｌで中性脂質画分を溶出させた。その後ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）９ｌを流してモノシアロ酸性脂質画分とした（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｎａｋａｏ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｔｏｄａ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｇ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｙａｍａｄａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８９，１２１−１３１（１９９２））。
モノシアロ、ジシアロ以上の画分はＭｉｌｌｉＱ水１５０ｍｌを加えて透析を行った。透析後、凍結乾燥したジシアロ以上の画分をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）１０ｍｌに溶解した。ジシアロ以上の画分をさらに精製するため、Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーによりを行った。ＩａｔｒｏｂｅａｄｓはＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）で予め活性化したものを用いた。Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  １２０ｍｌのＩａｔｒｏｂｅａｄｓにサンプルを投与し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）２５０ｍｌを流した。その際、フラクションコレクターにて２．５ｍｌずつ１００本のフラクションをとり、ＨＰＴＬＣプレートで溶出画分の確認を行った。ＨＰＴＬＣプレートの展開溶媒はＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）にて展開、確認を行った。また、ウイルスとの反応性を前記実施例１と同様の方法により調べ、反応性を有する画分のみを集めた。
これらの画分をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）１ｍｌに溶解し、さらに精製するため再度Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーを行った。ＩａｔｒｏｂｅａｄｓはＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）で予め活性化したものを用いた。
Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ２５ｍｌのＩａｔｒｏｂｅａｄｓにサンプルを投与し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）７５ｍｌを流した。その際、フラクションコレクターにて０．２５ｍｌずつ３００本のフラクションをとった。これらのフラクションをＨＰＴＬＣプレートに投与し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）にて展開、マッピングを行った。
その結果、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）では目的の脂質性分子が溶出されなかったため、続いてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（４０／５０／９，ｖ／ｖ／ｖ）２５ｍｌを流し、０．２５ｍｌずつ１００本のフラクションをとった。
これらのフラクションを  ＨＰＴＬＣプレートに投与し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）にて２０ｃｍ展開、分かれた５つのバンドをメスで掻き取った。それぞれのバンドをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）４０ｍｌで抽出し、５分間超音波処理を行った。その後、シリカゲルを除くために綿栓ろ過し、溶媒を留去した。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｖ／ｖ）１ｍｌに溶解し、Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーを行なった。ＩａｔｒｏｂｅａｄｓはＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｖ／ｖ）で活性化し、Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  １ｍｌとした。サンプルを投与した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｖ／ｖ）１５ｍｌ、続いてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，  ｖ／ｖ／ｖ）２０ｍｌを流した。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０／６０／８，ｖ／ｖ／ｖ）により溶出された画分の溶媒を留去し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｖ／ｖ）２００μｌに溶解した。得られた画分をＨＰＴＬＣプレートに投与し、展開溶媒ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）にて展開、ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬で発色させた。
これらの画分をＡＭ１〜５と名付け、最終精製標品とした。ＡＭ１〜５について、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスとの結合特異性を標準糖脂質であるシアリルパラグロボシドと比較した。
ＩＩ．結果
ジシアロ以上の画分について１回目のＩａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーを行った結果を図５に示した。
溶出フラクションをＴＬＣプレートにて展開、糖の検出試薬であるｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬で発色させた。得られた１〜７のフラクションについて、ウイルスとの反応性を調べ、図６に結果を示した。
Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図６ｃ）はフラクション４および５と強く反応し、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（図６ｄ）はフラクション４、５、６と特に強く反応した。図５の矢印で示した部分がとくに強く反応することがわかったことから、この部分を多く含むフラクション４〜６をプールし、２回目のＩａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーを行った。
得られたパターンを図７に示した。矢印で示した部分がとくに目的糖脂質を多く含んでいたことからフラクション５と６を集め、さらに精製した。
なお、フラクション５および６は別々に精製し、以下フラクション６のみについてＨＰＴＬＣプレートを用いて２０ｃｍ展開した。その結果、ブロードに見えていたバンドが少なくとも５つの糖脂質の混合物であることが明らかになった。そこで、これら５つのバンドを掻き取り、シリカゲルを除いた後、糖の発色を調べた。図８に得られたパターンを示した。これら５つのフラクションをＡＭ１〜５と名付け、最終精製標品とし、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスとの結合特異性を標準糖脂質であるシアリルパラグロボシドと比較した。
ＡＭ１〜５について、Ａ型ではＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８、Ａ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１を用いて検討した。Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃ  α  ２−６Ｇａｌ結合の糖鎖構造と同程度に結合するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６はＡＭ１〜５のすべての脂質性分子に反応し、ＡＭ１の矢印の移動度に観察されるバンド、およびＡＭ３、４と強く反応した（図９ｃ）。
なお、図９では、実施例３に後述する方法で質量分析を行うことができた。ＡＭ１、３、４については、標準糖脂質であるα２−３シアリルパラグロボシド、α２−６シアリルパラグロボシドと同量を投与した。標準糖脂質と比較するとＡＭ１の矢印のバンドは、α２−３シアリルパラグロボシドより少し強く反応している。ＡＭ３、４は、α２−６シアリルパラグロボシドとほぼ同等の強さで結合している。
一方、Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３Ｇａｌ結合の糖鎖構造のみと結合するＡ／ＰＲ／８／３４（図９ｄ）はＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図９ｃ）と同様にＡＭ１の矢印のバンドと強く反応した。したがって、これは、α２−３シアリルパラグロボシドと比較して非常に強いインフルエンザウイルス結合性を持つことが示された。また、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図９ｃ）とは異なり、ＡＭ１から５の上の方の移動度に観察されるバンドとは反応しなかった。さらに、Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−６Ｇａｌ結合の糖鎖構造のみと結合するＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（図９ｅ）はＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（図９ｃ）と似たようなパターンを示した。
ＡＭ１はＡｉｃｈｉ／２／６８、Ａ／ＰＲ／８／３４と同じように反応し、その反応性は、α２−６シアリルパラグロボシドより少し弱かった。ＡＭ３、４は、α２−６シアリルパラグロボシドと同程度か、もしくはそれ以上に反応していた。これらの結果から、ＡＭ１の矢印バンドは３つのウイルスに共通して強く反応しており、その反応性は標準糖脂質と同程度かもしくはそれより強いことが分かった。
また、ＡＭ１〜５について、Ｂ型インフルエンザウイルスとの反応性を調べた結果を図１０に示した。Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃ  α  ２−６Ｇａｌ結合の糖鎖構造と同程度に結合するＢ／Ｇｉｆｕ／２／７３（図１０ｃ）は、１〜５のすべてのフラクションと反応した。Ａ型の３種類のウイルスと同様に、ＡＭ１の矢印のバンドとも反応することが明らかになった。ＡＭ１は標準糖脂質のα２−３およびα２−６シアリルパラグロボシドよりも強く反応していた。また、ＡＭ１〜３の上の方の移動度に観察されるバンドとは反応しなかった。
実施例３  質量分析法によるＡＭ１、３、４の構造解析
ＡＭ１〜５のうち、質量分析が可能であったＡＭ１、３、４の構造を解析するために、ＥＳＩ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−ＦＴＭＳ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）測定およびＳＩＭＳ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）−ＦＴＭＳ測定（いずれもＢｉｏＡＰＥＸ（Ｂｒｕｋｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を行った。
Ｉ．実験
（１）ＥＳＩ−ＦＴＭＳ
ＡＭ１，３，４の各サンプルをメタノールに溶解（３ｐｍｏｌ／μｌ）し、マイクロシリンジポンプを用いて１μｌ／ｍｉｎの流速にてスプレーを行った。ｃｙｌｉｎｄｅｒ、ｅｎｄｏｐｌａｔｅ、ｃａｐｉｌｌａｒｙ等のＥＳＩ  ｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒやスプレーノズルを調製した後、ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ｍｏｄｅにて測定を行った。
（２）ＳＩＭＳ−ＦＴＭＳ
サンプルをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２／１，ｖ／ｖ）に溶解し、そのうち一定量（３００ｐｍｏｌ）を取り出してマトリックス（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）と混合した後、ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｖｏｌｔａｇｅ  １０ｋＶ、ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ｍｏｄｅにて測定を行った。
ＩＩ．結果
分子量関連イオンピークと考えられるｍ／ｚ  ２１９５［Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ］−とそこからシアル酸［−ＮｅｕＡｃ−Ｎａ］１個がはずれたｍ／ｚ１８８２［Ｍ−ＮｅｕＡｃ−Ｈ］−が確認された。さらに、シアル酸関連ピークであるｍ／ｚ２９０［ＮｅｕＡｃ］−、ｍ／ｚ３０８［ＮｅｕＡｃ］−が低分子領域で認められた。また、２価イオン領域にｍ／ｚ１０８６［Ｍ−２Ｈ］２−が認められ、ここから計算される分子量が先に述べた分子量関連イオンピークの質量数と一致することから、シアル酸が二個含まれている可能性が示唆された。
この２個のシアル酸の結合に関して、ＧＤ１ａおよびＧＤ１ｂのスペクトルを参考に解析したところ、ＧＤ１ｂが有するＮｅｕＡｃ−ＮｅｕＡｃでは認められたｍ／ｚ５８１、ｍ／ｚ６０３がＡＭ１では認められないことから、これらのシアル酸はそれぞれ単独で中性糖に結合していると考えられる。また、分子量関連イオンピークｍ／ｚ２１９５はセラミド（ＬＣＢ１８：１−ＦＡ１６：０）、中性糖が６個（ヘキソースが４個、ヘキサミンが２個）、シアル酸が２個、Ｎａが１個付加した組み合わせであることが示された。
さらに、ＳＩＭＳ−ＦＴＭＳ測定からもセラミドに相当するｍ／ｚ５３６（ＬＣＢ１８：１−ＦＡ１６：０）が認められた。また、このセラミドにヘキソースが１個ずつ付加したピークに相当するｍ／ｚ６９８、ｍ／ｚ８６０、さらにヘキソサミンが付加したピークに相当するｍ／ｚ１０６３、ヘキソースが付加したピークに相当するｍ／ｚ１２２５が確認された。これよりＡＭ１はラクトサミン骨格を有していることが示された。
以上より、インフルエンザウイルスの宿主となる孵化鶏卵のしょう尿膜から、レセプター候補となる分子を単離することに成功した。また、構造解析よりこのレセプター分子は、次式（Ｉ）
2003074570.tif 000012
（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルヘキソサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）で表されることが確認された。
実施例４  各種インフルエンザウイルスに対する結合性の検討
Ｉ．実験方法
（１）材料
インフルエンザウイルス株は、表５に示したものを使用した。
2003074570.tif 000013
なお、ＮｅｕＡｃへの結合特異性は、本願の発明者らにより確立された前記のＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを利用して、標準糖脂質であるｓｉａｌｙｌｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅに対する各ウイルス株の反応性を調べた結果に基づいている。
また、標準糖脂質としては、以下のに示したものを用いた。
・ＧＭ３
Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３Ｇａｌ  β  １−４Ｇｌｃ  β  １−１’Ｃｅｒ・ＧＳＣ−２７３（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）
Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３Ｇａｌ  β  １−４ＧｌｃＮＡｃ  β  １−３Ｇａｌ  β  １−４Ｇｌｃ  β  １−ＯＣＨ（Ｃ１４Ｈ２９）２
・ＧＳＣ−２７５（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）
Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−６Ｇａｌ  β  １−４ＧｌｃＮＡｃ  β  １−３Ｇａｌ  β  １−４Ｇｌｃ  β  １−ＯＣＨ（Ｃ１４Ｈ２９）２
さらに、抗インフルエンザウイルス抗体としては、次の表６に示したものを用いた。
2003074570.tif 000014
（２）インフルエンザウイルスの精製
滅菌ＰＢＳで希釈したウイルス懸濁液（Ａ型インフルエンザウイルスは、赤血球凝集活性（ＨＡＵ）＝２−３〜−４、Ｂ型インフルエンザウイルスは、赤血球凝集活性（ＨＡＵ）＝２−１〜０となるように希釈した）を１１日齢発育鶏卵のしょう尿腔に０．２ｍｌ植種し、３４℃で４８時間培養した。
しょう尿液を回収した後、４℃、４０００ｒｐｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＳＣＲ  ２０Ｂ，ＲＰＲ９ローター）で１０分間遠心し、夾雑物を除去した。上清をさらに４℃、８０００ｒｐｍで３時間遠心し、ペレットをＰＢＳで懸濁して粗ウイルス液とした。次に５０％グリセロール−ＰＢＳ溶液に粗ウイルス液を重層し、４℃、３８０００ｒｐｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＣＰ６５β，Ｐ４０ＳＴローター）で２時間遠心した。
得られたペレットをＰＢＳで懸濁し、４℃、１５０００ｒｐｍで１時間遠心した。再び得られたペレットをＰＢＳで懸濁した後、１０〜４０％（ｗ／ｖ）ショ糖連続密度勾配遠心を４℃、２００００ｒｐｍで９０分（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＣＰ６５β，Ｐ２８Ｓローター）行なった。ウイルスのバンドを回収し、４℃、８０００ｒｐｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ  ＳＣＲ  ２０Ｂ，ＲＰＲ１８ローター）で３時間遠心することにより精製ウイルスを得た。
得られたウイルスはＰＢＳで懸濁し、−８０℃で保存した。
（３）ＨＡＵ測定
２１０倍希釈した精製インフルエンザウイルス５０μｌをマイクロプレート（９６Ｕ−ｂｏｔｔｏｍ  ｗｅｌｌｓ，Ｆａｌｃｏｎ）上にて０．０１％ゼラチン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）−ＰＢＳ  ５０μｌで倍々希釈した。０．５％（ｖ／ｖ）モルモット赤血球−ＰＢＳを５０μｌ加え、４℃で２時間静置した後、赤血球の凝集を観察した。ＨＡＵはモルモット赤血球が凝集するために必要なウイルスの最高希釈倍数で表した。
（４）孵化鶏卵しょう尿膜からのジシアロ糖脂質画分の調製
１１日齢孵化鶏卵１２０個からしょう尿膜を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、凍結乾燥した。乾燥しょう尿膜にａｃｅｔｏｎｅ  １００ｍｌを加え、１０分間ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを行った。ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒにて粉砕した後、室温で３時間撹拌し、得られた抽出液をろ過して残渣を乾燥させた後、この残渣にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（５：５：１，ｖ／ｖ／ｖ）６６０ｍｌを加え、１０分間ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを行った。
一晩撹拌した後ろ過し、残渣にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）３００ｍｌを加え２時間撹拌した。ろ液を先のろ液とあわせ、エバポレーターで溶媒を留去した。乾固物にＭｅＯＨ  ５０ｍｌを加えｓｏｎｉｃａｔｉｏｎしてよく懸濁後、最終濃度０．１ＮとなるようにＮａＯＨ溶液を加え、３７℃で３．５時間、さらに室温で一晩加水分解を行なった。最終濃度０．１ＮとなるようにＡｃＯＨを加えた後、溶媒を留去した。乾固物にＭｉｌｌｉＱ水２５ｍｌを加えｓｏｎｉｃａｔｉｏｎした後、透析を行なった。透析後、凍結乾燥したサンプルを５０ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）に溶解しｓｏｎｉｃａｔｉｏｎした後、ろ過した。
残渣に再びＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）２０ｍｌを加え同様の操作を行なった。２回のろ液をあわせてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィー用のサンプルとした。
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５はＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．８Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）であらかじめ活性化した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）で平衡化したものを用いた。Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  １００ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５  ｃｏｌｕｍｎにサンプルをアプライし、次にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）３Ｌカラムに流して中性脂質画分を溶出した。
その後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）３．５Ｌをカラムに流し、モノシアロ酸性脂質画分を溶出した。さらにＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／０．８Ｍ  ＮａＯＡｃ（３０：６０：８，ｖ／ｖ／ｖ）２Ｌをカラムに流し、ジシアロ以上の酸性脂質画分を溶出した。モノシアロおよびジシアロ以上の画分はそれぞれエバポレーターで溶媒を留去した。モノシアロ画分にはＭｉｌｌｉＱ水２０ｍｌ、ジシアロ以上の画分にはＭｉｌｌｉＱ水２０ｍｌをそれぞれ加えて、透析を行なった。透析後、凍結乾燥したそれぞれの画分をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）１０００μｌに溶解した。両画分についてインフルエンザウイルスとの結合性をＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙにより検討した。
（５）ＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ
プラスチックＴＬＣプレート上に、孵化鶏卵のしょう尿膜からＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５５カラムクロマトグラフィーにより調製したモノシアロ、ジシアロ画分および標準糖脂質をアプライした後、このプレートをアセトンで展開、風乾し、同じ方向にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５：４：１，ｖ／ｖ／ｖ）で連続して展開、風乾した。
このプレートを１％ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，１％ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ）（東京化成）含有ＰＢＳ溶液（以下、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ）中で室温にて１時間振盪し、冷ＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄した。ここにＨＡＵ＝２７となるようにＰＢＳで希釈したインフルエンザウイルス懸濁液４ｍＬを添加し、４℃で一晩振盪した。なおｖｉｒｕｓ（−）にはウイルス懸濁液の代わりにＰＢＳを加えた。冷ＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄後、３％ＰＶＰ含有ＰＢＳ溶液（以下Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ）で希釈した一次抗体溶液４ｍＬを加えて４℃で２時間振盪し、冷ＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂで希釈した二次抗体溶液４ｍＬを加え４℃で２時間振盪した。反応後、冷ＰＢＳで４℃、５分間、３回洗浄し、発色基質溶液（０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０，５ｍＬ；０．１１Ｍ  ４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ，１００μＬ；０．０６Ｍ  ＤＥＰＤＡ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ，１００μＬ；３０％Ｈ２Ｏ２，５μＬ）を加え、室温で振盪した。発色後、プレートを精製水で洗浄、風乾した。
別の展開、風乾したプレートにｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、糖の検出を行った。同様にして、別のプレートにｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ−ＨＣｌ試薬を噴霧して加熱し、シアル酸の検出を行い、デンシトメーター（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）により各バンド成分の含有量を定量した。
ＩＩ．実験結果
孵化鶏卵のしょう尿膜より得られた酸性糖脂質画分（モノシアロおよびジシアロ画分）をＴＬＣにアプライして展開し、ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ−ＨＣｌ試薬で発色させ、それぞれの画分中に含まれる成分の存在量を測定した。図１１ａおよび図１１ｂに示すＴＬＣパターンが観察された。デンシトメーターによる定量により、それぞれの成分の存在比を算出した（図１１ｂのプレートの両側に示した）。同様にしてそれぞれの画分をスポット、展開したプレートをＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｈ３Ｎ２）のウイルス株とそれぞれ反応させた（図１１ｅ〜ｇ）。
その結果、図中矢印で示した部分に存在する極性の高い糖脂質が全てのウイルスに共通して反応することがわかった。
本願発明者らは既に、ジシアロ画分よりレセプター候補分子を単離しており、以上より、矢印で示した物質はその移動度が候補分子に極めて近いことから、レセプター候補分子そのものであることが示唆された。
さらに、ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ−ＨＣｌ試薬によるプレートのデンシトメーターによる定量から、今回調製したジシアロ画分中に含有されるレセプター候補分子は、１％以下（シアル酸量比）であることが明らかとなった。
実施例５  各種インフルエンザウイルスに対する感染阻害活性
Ｉ．実験方法  ＬＤＨ試験法によるインフルエンザウイルス感染阻害活性測定
９６ｗｅｌｌ培養用マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）にＭＤＣＫ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにまきこみ、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地１００μＬ中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２０〜２４時間培養した。
次に、孵化鶏卵のしょう尿膜より調製したジシアロ画分を、最終濃度が総シアル酸量として０．１、０．３、１、３、１０μＭとなるようにそれぞれ無血清ＭＥＭ培地で希釈して５０μＬとし、同じく無血清ＭＥＭ培地で希釈したインフルエンザウイルス液およびｃｏｎｔｒｏｌとしてウイルス液を含まない無血清ＭＥＭ培地５０μＬを加え、４℃で１時間ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。
細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒになっているのを確認した後、細胞を無血清ＭＥＭ培地１００μＬで３回洗浄し、ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎしておいたウイルス液および無血清ＭＥＭ培地１００μＬを加え、３４．５℃、５％ＣＯ２存在下で４時間静置してウイルスを感染させた。
感染後、上清を除去し、無血清ＭＥＭ培地１００μＬで１回洗浄してから５％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地１００μＬを加え、３４．５℃、５％ＣＯ２存在下で２０〜２４時間培養した。新しいマイクロプレート（９６Ｆｌａｔ−Ｂｏｔｔｏｍ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に（５×）ＰＢＳ  １０μＬを入れ、２０〜２４時間培養した細胞上清４０μＬを加えて混和し、３７℃で５分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした後、ＬＤＨ測定試薬（シノテスト社製）５０μＬを加えて混和して３７℃で１０分間反応させた。
０．５Ｎ  ＨＣｌ  １００μＬを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３２，ｃｏｒｏｎａ社）により測定波長５５０ｎｍ、対照波長４１５ｎｍにて各ｗｅｌｌの吸光度を測定した。ウイルス感染により細胞障害性が生じ、その結果、培養上清中に細胞内酵素であるＬＤＨが放出される。これを測定することにより、ウイルスの感染性を評価できる。
コントロールサンプル（テストサンプルを何も含まないウイルスのみ）の上清中のＬＤＨ活性を１００％とした時の各濃度のジシアロ画分含有サンプルの上清中のＬＤＨ活性の相対値を阻害活性の指標とした。
ＩＩ．実験結果
しょう尿膜より得られたジシアロ画分をウイルス液とｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎし、ＭＤＣＫ細胞に対するウイルス感染性への影響をＬＤＨ活性測定により調べた。ウイルス液のみを加えたときのＬＤＨ活性を１００％とし、各濃度のジシアロ画分を添加した時の相対活性を図１２に示した。
Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）に対するジシアロ画分のＴＣＩＤ５０（５０％  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ、５０％阻害濃度）が１μＭ（シアル酸濃度）であり、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０のそれは３μＭ（シアル酸濃度）であった。
ここで、前述したＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙの結果（図１１）と比較してみると、各ウイルスに共通して結合性がある糖脂質、すなわちレセプター物質が実際のジシアロ画分中の阻害活性物質と考えられ、その量はジシアロ画分中の総シアル酸量の１〜１０％以下であることが明らかとなっている。
以上より、分枝状シアロ糖鎖レセプター糖脂質は、実際には０．１〜０．３μＭ以下というわずかな量で、ウイルスのＭＤＣＫ細胞に対する感染を阻害する効果を発揮しうることが示唆された。
これまでに報告されているウイルス結合活性を有する化合物のインフルエンザウイルス感染阻害効果（ＴＣＩＤ５０）は１０μＭオーダーであり、それに比して、孵化鶏卵しょう尿膜ジシアロ画分に含まれる分枝状シアロ糖鎖レセプター糖脂質ははるかに高い抗インフルエンザウイルス活性を示すことが明らかとなった。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明により、新規な分岐状シアロ糖分子が提供される。この化合物は、すべてのヒトおよび動物由来のＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスに結合できることから、インフルエンザウイルスの宿主域の変異や抗原性の変異に対応でき、あらゆるインフルエンザウイルスの感染を阻止できる医薬品やウイルス除去用フィルター等の吸着剤として有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
図１は、この出願の発明の実施例において、インフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスの孵化鶏卵しょう尿膜に由来する酸性糖脂質との結合性試験（二次元展開）の結果を示す写真である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｂ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色、ｃ：Ａ／ＰＲ／８／３４との結合性、ｄ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８との結合性、ｅ：Ｂ／Ｌｅｅ／４０との結合性、ｆ：Ｂ／Ｇｉｆｕ／２／７３との結合性；Ｓ：標準糖脂質＝ｂｏｖｉｎｅｂｒａｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ、Ｓ１：α２−６シアリルパラグロボシド、Ｓ２：α２−３シアリルパラグロボシド、１ｓｔ：一次展開（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／８８％ＨＣＯＯＨ（６５／２５／１０，ｖ／ｖ／ｖ））、２ｎｄ：二次展開（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／５Ｎ  ＮＨ４ＯＨ（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ））；矢印：インフルエンザウイルスに共通して反応した糖脂質）
図２は、この出願の発明の実施例において、ｌａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーにより精製した孵化鶏卵しょう尿膜に由来する酸性糖脂質とインフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスの結合性試験（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ））の結果を示す写真である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｂ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色、ｃ：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７との結合性１、ｄ：Ａ／ＰＲ／８／３４との結合性、ｅ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８との結合性、ｆ：Ａ／Ｄｕｃｋ／３１３／４との結合性、ｇ：Ａ／Ｄｕｃｋ／９２／１／７６との結合性、ｈ：Ｂ／Ｌｅｅ／４０との結合性；Ｓ：標準糖脂質＝ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ＋ＧＭ３、Ｓ１：α２−６シアリルパラグロボシド、Ｓ２：α２−３シアリルパラグロボシド；１〜７：フラクション；矢印：目的の糖脂質）
図３は、この出願の発明の実施例において、孵化鶏卵しょう尿膜に由来する酸性糖脂質とインフルエンザＡ型ウイルスの結合性試験（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（５０／４０／７／３，ｖ／ｖ／ｖ））の結果を示す写真である。（ａ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色、ｂ：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１との結合性、ｃ：Ａ／ＰＲ／８／３４との結合性；Ｓ１：α２−６シアリルパラグロボシド、Ｓ２：α２−３シアリルパラグロボシド、ＡＭ：孵化鶏卵しょう尿膜由来の精製糖脂質）
図４は、この出願の発明の実施例において、ＭＤＣＫ細胞由来の酸性糖脂質とインフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスの結合性試験（二次元展開）の結果を示す写真である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｂ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色、ｃ：Ａ／ＰＲ／８／３４との結合性、ｄ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８との結合性、ｅ：Ｂ／Ｌｅｅ／４０との結合性、ｆ：Ｂ／Ｇｉｆｕ／２／７３との結合性；Ｓ：標準糖脂質＝ｂｏｖｉｎｅｂｒａｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ、Ｓ１：α２−６シアリルパラグロボシド、Ｓ２：α２−３シアリルパラグロボシド、１ｓｔ：一次展開（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／８８％ＨＣＯＯＨ（６５／２５／１０，ｖ／ｖ／ｖ））、２ｎｄ：二次展開（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／５Ｎ  ＮＨ４ＯＨ（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ））；矢印：インフルエンザウイルスに共通して反応した糖脂質）
図５は、この出願の発明の実施例において、孵化鶏卵しょう尿膜に由来する酸性糖脂質のｌａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーの流出プロファイルを示す写真である。（展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）；ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色）（矢印：インフルエンザウイルスとの反応性を示した糖脂質；１〜７：フラクション）
図６は、この出願の発明の実施例において、ｌａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーにより精製した孵化鶏卵しょう尿膜に由来する酸性糖脂質とインフルエンザＡ型ウイルスの結合性試験（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ））の結果を示す写真である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｂ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色、ｃ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８との結合性、ｄ：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１との結合性；Ｓ１：α２−６シアリルパラグロボシド、Ｓ２：α２−３シアリルパラグロボシド；１〜７：フラクション）
図７は、この出願の発明の実施例において、プールされた糖脂質のｌａｔｒｏｂｅａｄｓカラムクロマトグラフィーの流出プロファイルを示す写真である。（展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）；ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色）（矢印：インフルエンザウイルスとの反応性を示した糖脂質）
図８は、この出願の発明の実施例において、調製用ＴＬＣにより精製した糖脂質のＴＬＣ結果を示す写真である。（展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５／４／１，ｖ／ｖ／ｖ）；ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色）（Ｓ：ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）
図９は、この出願の発明の実施例において、調製用ＴＬＣにより精製した孵化鶏卵しょう尿膜由来の糖脂質とインフルエンザＡ型ウイルスの結合性試験の結果を示す写真である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｂ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色、ｃ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８との結合性、ｄ：Ａ／ＰＲ／８／３４との結合性、ｅ：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１との結合性；Ｓ１：α２−６シアリルパラグロボシド、Ｓ２：α２−３シアリルパラグロボシド；１〜５：ＡＭ番号；矢印：いずれのインフルエンザウイルスとも特異的に反応した糖脂質）
図１０は、この出願の発明の実施例において、調製用ＴＬＣにより精製した孵化鶏卵しょう尿膜由来の糖脂質とＢ／Ｇｉｆｕ／２／７３の結合性試験の結果を示す写真である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｂ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬により発色、ｃ：Ｂ／Ｇｉｆｕ／２／７３との結合性；Ｓ１：α２−６シアリルパラグロボシド、Ｓ２：α２−３シアリルパラグロボシド；１〜５：ＡＭ番号；矢印：Ｂ／Ｇｉｆｕ／２／７３と特異的に反応した糖脂質）
図１１は、この出願の発明の実施例において、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムにより調製した孵化鶏卵しょう尿膜由来の糖脂質（モノシアロおよびジシアロ画分）と各インフルエンザウイルスの結合性試験の結果を示す写真である。（ａ：ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４試薬による発色、ｂ：ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ−ＨＣｌ試薬による発色、ｃ：ｖｉｒｕｓ（−）（１次抗体＝ａｎｔｉ−Ｐ−５０）、ｄ：ｖｉｒｕｓ（−）（１次抗体＝ＵＳＡ１）、ｅ：Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１との結合性）、ｆ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）との結合性、ｇ：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｈ３Ｎ２）との結合性；Ｓ１：ＧＳＣ２７３（α２−３ｓｉａｌｙｌ  ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）、Ｓ２：ＧＳＣ２７５（α２−６ｓｉａｌｙｌ  ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）：＃１：モノシアロ画分、＃２：ジシアロ画分）
図１２は、しょう尿膜ジシアロ画分による各種インフルエンザウイルスに対する感染阻害作用を示す図である。（ウイルス液のみを加えたときのＬＤＨ活性を１００％とし、各濃度のジシアロ画分を添加した時の相対活性を示した。）（ａ：Ａ／ＰＲ／８／３４との結合性、ｂ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８との結合性、ｃ：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１との結合性、ｄ：Ｂ／Ｌｅｅ／４０との結合性）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月19日(2004.1.19)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】次式（Ｉ）
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（ただし、ＮｅｕＡｃは、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよいＮ−アセチルノイラミン酸を表し、Ｈｅｘはヘキソース、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルヘキソサミンを表し、Ｒは水素原子、炭化水素鎖、糖鎖、脂質、タンパク質、合成高分子から選択される基質であり、Ｒは置換基を有していてもよい）
で表されることを特徴とする新規分岐状シアロ糖分子。




【国際調査報告】
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