(57)【要約】式（Ｉ）で示される化合物、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し前記化合物を生産する能力を有する微生物を培養して、培養物からその化合物を採取する化合物の製造方法、その化合物を有効成分とする血管新生阻害剤、及びその化合物を生産する能力を有するアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−１４９１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８８）。2003076638.tif 000012（式中、Ｒはメチル基またはエチル基を表わし、Ｒ１は水素原子、塩素原子、水酸基またはメトキシ基を表わし、Ｒ２は水酸基を表わすか、あるいはＲ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する。）
2003076638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
2003076638.tif 000011
（式中、Ｒはメチル基またはエチル基を表わし、Ｒ１は水素原子、塩素原子、水酸基またはメトキシ基を表わし、Ｒ２は水酸基を表わすか、あるいはＲ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する。）で示される化合物。
【請求項２】
式（Ｉ）中、Ｒがエチル基であり、Ｒ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項４】
式（Ｉ）中、Ｒがエチル基であり、Ｒ１が塩素原子、Ｒ２が水酸基である請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項５】
式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１が塩素原子、Ｒ２が水酸基である請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項６】
式（Ｉ）中、Ｒがエチル基であり、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水酸基である請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項７】
式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水酸基である請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項８】
式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１がメトキシ基、Ｒ２が水酸基である請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項９】
式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１及びＲ２が水酸基である請求の範囲１に記載の化合物。
【請求項１０】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、請求の範囲１記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養して、その培養物から請求の範囲１記載の化合物を採取することを特徴とする請求の範囲１記載の化合物の製造方法。
【請求項１１】
請求の範囲１記載の化合物を生産する能力を有するアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−１４９１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８８）。
【請求項１２】
請求の範囲１記載の化合物を有効成分とする血管新生阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が生産し血管新生阻害活性を有する新規化合物、その化合物を生産する能力を有する微生物を培養して、培養物からその化合物を採取する化合物の製造方法、その化合物を有効成分とする血管新生阻害剤、及びその化合物を生産する能力を有するアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−１４９１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８８）に関する。
背景技術
血管新生とは、一般的に、プロテアーゼによる血管の基底膜の消化・破壊、血管内皮細胞の遊走・増殖・細胞外マトリックスへの接着及び血管内皮細胞の分化による管腔形成、そして血管の再構成を伴う現象である。血管新生は生理的には黄体形成や胎盤形成に際して出現するものであるが、固形がん、糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患などの病態においても出現する。例えば、網膜症においては、先ず既存の網膜血管周囲の基底膜及び硝子体までのあいだに介在する網膜組織が破壊され、次いで既存の血管を構成する血管内皮細胞が網膜組織の破壊部位の間隙から遊走し、遊走した血管内皮細胞の隙間を埋めるように血管内皮細胞が増殖した後、網膜硝子体へ遊走した血管内皮細胞が血管を再構成することにより血管新生が進展する。また、固形がんが増殖するには、血管新生によって栄養や酸素の供給と老廃物の除去の道を確保する事が必須である。さらに、現在のがん治療上の大きな問題である転移において、その道を確保するという意味で血管新生が重要なステップとなっている。
血管新生は上述したとおり種々の疾患の発症あるいは進行過程に深く関わっていることから、これらの疾患の予防または治療に向けて、血管新生を阻害する物質を模索すべく研究が活発に推進されている。例えば、血管新生阻害剤としては、血管内皮細胞の増殖阻害作用を有する微生物代謝産物フマギリン類縁体、コラゲナーゼ活性を阻害する作用を有するテトラサイクリン系抗生物質、ヘパリン結合性血管新生因子の受容体への結合抑制作用を有する微生物由来Ｄ−グルコ−ガラクタン硫酸等の薬剤が知られており、いくつかの物質の臨床上での有効性が検討されている。
しかしながら、現在、血管新生阻害剤として臨床的に未だ満足できる薬剤がないため、血管新生に係わる上記疾患には十分な治療方法がない。特に糖尿病性網膜症においては、外科的治療法を施行しない限り新生血管の退縮は見られず、その新生血管からの出血による視力障害が問題となっていることから、血管新生に対して優れた効果を示す薬剤の開発が大いに切望されている。
発明の開示
本発明の課題は、血管新生阻害活性を有する新規な化合物、それらの製造方法、それらの化合物を生産する能力を有する新規な微生物及びそれらの化合物を有効成分とする血管新生阻害剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため、各地の土壌から微生物を分離し、それらが生産する代謝産物について研究を重ねた結果、新たに分離したアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が、血管新生の阻害活性を示す物質を培養液中に生産していることを見出した。その培養液から有効物質を分離精製し、その物理化学的性質を調べたところ、得られた有効物質は、いかなる既知物質とも相違し、かつ優れた血管新生阻害活性を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、血管新生阻害活性を有する下記式（Ｉ）で示される新規化合物、前記化合物を生産する能力を有するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を培養して、その培養物から前記化合物を採取する化合物の製造方法、及びその化合物を生産する能力を有するアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−１４９１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８８）に関する。
１．式（Ｉ）
2003076638.tif 000003
（式中、Ｒはメチル基またはエチル基を表わし、Ｒ１は水素原子、塩素原子、水酸基またはメトキシ基を表わし、Ｒ２は水酸基を表わすか、あるいはＲ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する。）で示される化合物。
２．式（Ｉ）中、Ｒがエチル基であり、Ｒ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する前記１に記載の化合物。
３．式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する前記１に記載の化合物。
４．式（Ｉ）中、Ｒがエチル基であり、Ｒ１が塩素原子、Ｒ２が水酸基である前記１に記載の化合物。
５．式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１が塩素原子、Ｒ２が水酸基である前記１に記載の化合物。
６．式（Ｉ）中、Ｒがエチル基であり、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水酸基である前記１に記載の化合物。
７．式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水酸基である前記１に記載の化合物。
８．式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１がメトキシ基、Ｒ２が水酸基である前記１に記載の化合物。
９．式（Ｉ）中、Ｒがメチル基であり、Ｒ１及びＲ２が水酸基である前記１に記載の化合物。
１０．アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、前記１記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養して、その培養物から前記１記載の化合物を採取することを特徴とする前記１記載の化合物の製造方法。
１１．前記１記載の化合物を生産する能力を有するアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−１４９１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８８）。
１２．前記１記載の化合物を有効成分とする血管新生阻害剤。
詳細な説明
本発明者らは、一般式（Ｉ）で示される化合物の具体例を以下の通り命名した。
（１）Ｒがエチル基で、Ｒ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する化合物：Ｆ−１４９１Ａ、
（２）Ｒがメチル基で、Ｒ１とＲ２とが一緒になってエポキシ環構造を形成する化合物：Ｆ−１４９１Ｂ、
（３）Ｒがエチル基で、Ｒ１が塩素原子、Ｒ２が水酸基である化合物：Ｆ−１４９１Ｃ、
（４）Ｒがメチル基で、Ｒ１が塩素原子、Ｒ２が水酸基である化合物：Ｆ−１４９１Ｄ、
（５）Ｒがエチル基で、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水酸基である化合物：Ｆ−１４９１Ｅ、
（６）Ｒがメチル基で、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水酸基である化合物：Ｆ−１４９１Ｆ、
（７）Ｒがメチル基で、Ｒ１がメトキシ基、Ｒ２が水酸基である化合物：Ｆ−１４９１Ｇ、
（８）Ｒがメチル基で、Ｒ１及びＲ２が水酸基である化合物：Ｆ−１４９１Ｈ。
以後、本明細書においてこれらの化合物を上記名称を用いて説明するか、これら物質を一括してＦ−１４９１物質と呼ぶことがある。
なお、Ｆ−１４９１物質は、弱い抗真菌活性を有するとして報告されているＦｕｓａｒｉｅｌｉｎ類と構造上の類似性を有している（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４８（１），４５〜５２（１９９５））。しかしながら、本発明のＦ−１４９１物質は、その分子式、物理化学的性質、構造及び生物学的作用の特徴によって既知のＦｕｓａｒｉｅｌｉｎ類とは明確に区別される新規物質である。
さらに本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、血管新生阻害活性を示す式（Ｉ）で示される化合物を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から該化合物を採取する該化合物の製造方法、該化合物を生産する能力をもつアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物並びに該化合物を有効成分とする血管新生阻害剤をも提供するものである。
本発明に使用される微生物は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、本発明のＦ−１４９１物質を生産する能力を有する菌株であれば、どのようなものでも使用できる。そのような微生物の探索は、例えば以下のようにして行なうことができる。血管内皮細胞が増殖したマイクロプレート上に、種々の微生物培養液の抽出液を加え、増殖の指標である放射性同位体で標識されたチミジン等の細胞内への取り込みを測定する。この取り込み量の減少、すなわち血管内皮細胞の増殖が阻害された微生物の培養液から活性物質を単離、確認することにより、目的のＦ−１４９１物質を生産する能力をもつ微生物を得ることができる。
そのようにして見出された微生物として、例えば、本発明者らが土壌から分離したアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するＦ−１４９１株を挙げることができるが、この菌株に限らず、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、本発明のＦ−１４９１物質を生産する能力を有する菌株であれば、それらの変異株、例えば、紫外線、エックス線、放射線、薬品等の変異処理により取得できる人工変異株ならびに自然変異株も含めて、すべて本発明に使用することができる。
以下、Ｆ−１４９１株の菌学的性状を説明する。
本菌株をツァペック・イーストエキス・アガー（Ｃｚａｐｅｋ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ：以下ＣＹＡと記す。）、モルトエキス・アガー（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ：以下ＭＥＡと記す。）、２０％シュクロース含有ツァペック・イーストエキス・アガー（Ｃｚａｐｅｋ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ  ｗｉｔｈ  ２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ：以下ＣＹ２０Ｓと記す。）に接種し、２５℃で７日間培養した結果、全ての寒天プレート上において平坦からやや隆起した生育を示し、菌糸は密生した綿毛状からフェルト状で白色（ｗｈｉｔｅ）〜赤灰色（ｒｅｄｄｉｓｈ  ｇｒａｙ）（８Ａ−Ｂ１−２）を呈する。裏面は表面とほぼ同様の色調を呈する。分生子形成による表面色調の変化はＭＢＡ及びＣＹ２０Ｓプレートにおいて灰緑色（ｇｒａｙｉｓｈ  ｇｒｅｅｎ）（２５Ｃ−Ｄ５−６）の呈色が認められる。生育速度は培地により異なり、２５℃、１週間の培養条件下でＣＹＡプレートでは直径５６〜５８ｍｍ、ＭＥＡプレートでは２４〜２６ｍｍ、ＣＹ２０Ｓプレートでは２８〜２９ｍｍに達する。ＣＹＡプレートでは、３７℃で１２〜１４ｍｍの生育を示す。長期間培養後のＣＹＡプレートにおいては若干透明な滲出液（ｅｘｕｄａｔｅ）の産生が認められる。全てのプレートにおいて可溶性色素の産生は認められなかった。なお、色調に関する記述は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー（Ｍｅｔｈｕｅｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｕｒ（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ  ＆  Ｗａｎｓｃｈｅｒ，１９７８））」に従った。
形態的特徴として、光学顕微鏡による観察でアスペルジラム（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｍ）様の分生子形成構造が確認され、単列性（ｕｎｉｓｅｒｉａｔｅ）の構造を成す。分生子形成細胞はフィアロ型、アンプル形で短い首を有する。柄（ｓｔｉｐｅ）は隔壁を持たず無色で平滑（ｓｍｏｏｔｈ）で、極端に短く４０〜８０μｍ×２．５〜３．０μｍのものが数多く観察される。柄と栄養菌糸との結合部では柄足細胞（ｆｏｏｔ  ｃｅｌｌ）の存在も確認される。柄の先端より頂嚢（ｖｅｓｉｃｌｅ）を生じ、亜球形からフラスコ形で幅は１０〜１５μｍのものが大半であった。メトレは全く観察されない。フィアライドは頂嚢の先端から半分までのところより生じ、上方へ向かって生育し、アンプル形で平滑である。大きさは６．０〜７．５μｍ×１．８〜２．５μｍである。分生子は１細胞性でほぼ全てのものが球形を示し、表面は平滑である。大きさは２．５〜３．５μｍで、分生子同士は形成時において鎖状に連なるが、明瞭な接続部は認められない。培養開始後４週間以上経過した検体からも閉子嚢殻（ｃｌｅｉｓｔｏｔｈｅｃｉｕｍ）等の有性生殖器官の形成は確認されなかった。
以上の菌学的性質から、本発明者らは本菌株をアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属すると判断し、本菌株をアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−１４９１と命名し平成１３年１０月２日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４９の受託番号で寄託し、平成１５年１月３１日付で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８８番号の国際寄託に移管した。
本発明のＦ−１４９１物質は上記菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造される。Ｆ−１４９１物質の生産菌としては、アスペルギルス属に属し、Ｆ−１４９１物質を生産する能力を有するものであれば、上記菌株に限らず全て本発明に利用できる。
上記微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養に用いられる培地としては、アスペルギルス属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成として、炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜等を単独または組み合わせて用いることができる。窒素源としてはファーマメディア、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源を単独または組み合わせて用いることができる。その他、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属塩、ビタミンＢ及びビオチン等のビタミン類も必要に応じ、添加使用することができる。
なお、培養中発泡が著しい場合には、各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。消泡剤の添加にあたっては、目的物質の生産に悪影響を与えない濃度とする必要がある。培地のｐＨは５〜９程度、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜２７℃に保つのがよい。培養日数は２〜１４日程度で、通常３〜５日である。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。培養液中に蓄積された本発明のＦ−１４９１物質はろ過、遠心分離等の既知の通常の固液分離手段によって菌体を分離し、その上清及び菌体から各々抽出することにより回収可能である。
Ｆ−１４９１物質の分離、精製は、公知の種々の方法を選択、組み合わせて行なうことができる。例えば、酢酸エチル、メタノール、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出や、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）等のポリスチレン系吸着樹脂、シリカゲル、アルミナ、活性炭などの担体を用いるカラムクロマトグラフィーによる方法を用いることができる。これらの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いることができる。さらにセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等によるゲルろ過、シリカゲル、アルミナ等による薄層クロマトグラフィー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を用いることができ、これらの方法を単独または適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、分離、精製することができる。
以上のようにして得られるＦ−１４９１Ａ〜Ｆ−１４９１Ｈ物質は以下に示す物理化学的性質を有する。
１．Ｆ−１４９１Ａ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２４Ｈ３４Ｏ３、
（高分解能ＦＡＢマススペクトロメトリーによるＣ２４Ｈ３５Ｏ３の計算値ｍ／ｚ：３７１．２５８６（Ｍ＋Ｈ）＋  実測値ｍ／ｚ：３７１．２５８０）、
（３）比旋光度：［α］Ｄ２６−１９４°（ｃ０．１、メタノール）、
（４）融点：５５〜５８℃、
（５）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果は、図１のとおりであり、特徴的な吸収は次のとおりである。
ＩＲ  νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：２９７０、２９１５、１６６０、１６３０、１４４０、１３７５、１２６０、８３５、
（６）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（７）溶解性：メタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶、水に難溶、
（８）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（９）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。
２．Ｆ−１４９１Ｂ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２３Ｈ３２Ｏ３、
（高分解能ＦＡＢマススペクトロメトリーによるＣ２３Ｈ３３Ｏ３の計算値ｍ／ｚ：３５７．２４３０（Ｍ＋Ｈ）＋  実測値ｍ／ｚ：３５７．２４６３）、
（３）比旋光度：［α］Ｄ２６−２２２°（ｃ０．１、メタノール）、
（４）融点：５３〜５６℃、
（５）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果は、図２のとおりであり、また特徴的な吸収は次のとおりである。
ＩＲ  νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：２９６５，２９２５，１６５５，１６３０，１４３５，１３７５，１２５５，８３５、
（６）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（７）溶解性：メタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶、水に難溶、
（８）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（９）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。
３．Ｆ−１４９１Ｃ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２４Ｈ３５Ｏ３Ｃｌ、
（高分解能ＥＳＩマススペクトロメトリーによるＣ２４Ｈ３５Ｏ３Ｃｌの計算値ｍ／ｚ：４２９．２１７２（Ｍ＋Ｎａ）＋  実測値ｍ／ｚ：４２９．２２０４）、
（３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（４）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（５）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。４．Ｆ−１４９１Ｄ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２３Ｈ３３Ｏ３Ｃｌ、
（高分解能ＥＳＩマススペクトロメトリーによるＣ２３Ｈ３３Ｏ３Ｃｌの計算値ｍ／ｚ：４１５．２０１６（Ｍ＋Ｎａ）＋  実測値ｍ／ｚ：４１５．２０３９）、
（３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（４）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重クロロホルムに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（５）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重クロロホルムに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。
５．Ｆ−１４９１Ｅ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２４Ｈ３６Ｏ３、
（高分解能ＥＳＩマススペクトロメトリーによるＣ２４Ｈ３６Ｏ３の計算値ｍ／ｚ：３９５．２５６２（Ｍ＋Ｎａ）＋  実測値ｍ／ｚ：３９５．２５６０）、
（３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（４）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（５）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。
６．Ｆ−１４９１Ｆ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２３Ｈ３４Ｏ３、
（高分解能ＥＳＩマススペクトロメトリーによるＣ２３Ｈ３４Ｏ３の計算値ｍ／ｚ：３８１．２４０６（Ｍ＋Ｎａ）＋  実測値ｍ／ｚ：３８１．２４０８）、
（３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（４）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（５）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。
７．Ｆ−１４９１Ｇ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２４Ｈ３６Ｏ４、
（高分解能ＥＳＩマススペクトロメトリーによるＣ２４Ｈ３６Ｏ４の計算値ｍ／ｚ：４１１．２５１１（Ｍ＋Ｎａ）＋  実測値ｍ／ｚ：４１１．２５３３）、
（３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（４）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（５）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重メタノールに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。
８．Ｆ−１４９１Ｈ物質の物理化学的性質
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ２３Ｈ３４Ｏ４、
（高分解能ＥＳＩマススペクトロメトリーによるＣ２３Ｈ３４Ｏ４の計算値ｍ／ｚ：３９７．２３５５（Ｍ＋Ｎａ）＋  実測値ｍ／ｚ：３９７．２３７６）、
（３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）：
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２８０、
（４）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重クロロホルムに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数を表１に示す。
（５）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重クロロホルムに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。各シグナルの化学シフト、多重度を表２に示す。
2003076638.tif 000004
2003076638.tif 000005
2003076638.tif 000006
各種スペクトル解析の結果、Ｆ−１４９１Ａ、Ｆ−１４９１Ｂ、Ｆ−１４９１Ｃ、Ｆ−１４９１Ｄ、Ｆ−１４９１Ｅ、Ｆ−１４９１Ｆ、Ｆ−１４９１Ｇ及びＦ−１４９１Ｈ物質の構造を下記に示すとおり決定した。
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本発明のＦ−１４９１物質（Ｆ−１４９１Ａ〜Ｆ−１４９１Ｈ物質）は、優れた血管新生阻害活性を有しており、しかも、細胞に対する毒性が低いので血管新生の亢進に随伴する疾患、例えば固形がん細胞の増殖、糖尿病性網膜症、乾癬などの治療薬としての使用が期待される。
本発明の化合物の血管新生阻害活性は、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖抑制という指標で以下に述べる方法により測定することができる。コラーゲンコートした９６穴マイクロプレート（住友ベークライト社）に１０μｇ／ｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子及び１０％子牛血清を含むＭＣＤＢ１３１培地（クロレラ工業社）で２×１０３個／ウエルに調製したヒト臍帯静脈内皮細胞（セルシステムズ社）０．１ｍｌを撒くと同時に試験試料を適当量添加する。３７℃、５％ＣＯ２を含む空気下で４８時間培養し、さらに１μＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンを加えて８時間培養する。次いで細胞をセルハーベスターを用いて集め、細胞に取り込まれた放射活性をシンチレーションカウンターを用いて測定する。
試験試料中に血管内皮細胞の増殖抑制に有効な物質が含まれる場合、細胞内に取り込まれる放射活性は抑制される。また試験試料の濃度に対する前記細胞の放射活性の変化により、この試験試料の有効な濃度域が求められる。
本発明のＦ−１４９１Ａ〜Ｆ−１４９１Ｈ物質は下記表３に示すとおり、低濃度でヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を抑制した。
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また、本発明のＦ−１４９１Ａ〜Ｆ−１４９１Ｈ物質は下記表４に示すとおり各種培養細胞に対してほとんど毒性を示さない。
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なお、試験は、以下のとおり行なった。各種ヒトがん細胞（Ｋ５６２（白血病）、Ｈ２２６（肺がん）、ＤＬＤ−１（前立腺がん）、ＨＴ１０８０（線維肉腫））を１０％子牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地を用いて、それぞれ５×１０３個／ウエルとなるように調製し、９６穴マイクロプレートに０．１ｍｌ撒いた。同時に適当量のＦ−１４９１物質（Ｆ−１４９１Ａ〜Ｆ−１４９１Ｈ物質）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２を含む空気下で７２時間培養した。さらに０．５％のＭＴＴ（３−［４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］２，５−ｂｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を１０μｌ加え４時間培養した。培養後、０．１ｍｌの１０％ＳＤＳ−０．０１Ｎ塩酸を加え、５７０ｎｍの吸光度を測定し、５０％増殖阻害濃度を求めた。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げ本発明を説明するが、本発明は下記の記載により限定されるものではない。
実施例１：Ｆ−１４９１Ａ及びＦ−１４９１Ｂ物質の単離
アスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−１４９１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８８）株の斜面培地（ポテトデキストロースアガー）から１白金耳を５０ｍｌの種母培地（ポテト澱粉２％、グルコース１％、大豆粉（エスサンミート：味の素社製）２％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ無調整）を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２５℃で２日間ロータリーシェーカー上で培養して種培養液を得た。生産培地としてグリセリン２％、ペプトン（極東製薬社製）１％、酵母エキス０．５％、乾燥酵母（エビオス：アサヒビール薬品社製）０．５％からなる培地を用い、５００ｍｌ容の三角フラスコにそれぞれ６０ｍｌを入れて殺菌後、種培地を１％づつ接種した。２５℃で４日間ロータリーシェーカー上で培養した後、得られた培養液１０Ｌを遠心分離器にかけ、培養ろ液及び菌体に分離した。
得られた培養ろ液を、水で平衡化した２Ｌの吸着樹脂ダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）ＨＰ−２０（三菱化学社製）カラムに通過させた。活性成分が吸着されたＨＰ−２０カラムを５０％メタノール水５Ｌで洗浄した後、メタノール３Ｌで活性成分を溶出した。溶出液より減圧下でメタノールを留去した。
一方、菌体はメタノール３Ｌで抽出後、減圧下でメタノールを留去した。両者を合わせ、酢酸エチル１Ｌで抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、褐色油状物質７．５ｇを得た。これを少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム（５００ｍｌ）に供した。クロロホルム１Ｌ及びクロロホルム−メタノール混液（５０：１）１Ｌで溶出した。Ｆ−１４９１Ａ物質及びＦ−１４９１Ｂ物質を含む画分を集め、減圧濃縮し、黄色油状物質１．２ｇを得た。
これを少量のトルエンに溶解し、トルエンで充填したシリカゲルカラム（２００ｍｌ）に供した。このカラムをトルエン−アセトン混液（２０：１）で洗浄後、トルエン−アセトン混液（１０：１）で展開した。Ｆ−１４９１Ａ物質及びＦ−１４９１Ｂ物質を含む画分を集め、減圧濃縮し、黄色粉状物質２００ｍｇを得た。
これを少量のメタノールに溶解し、分取用高速液体クロマトグラフ装置により分取した。分離カラムにはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍを使用し、アセトニトリル−水混液（７：３）を移動層として７ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出し、Ｆ−１４９１Ａ物質及びＦ−１４９１Ｂ物質を含む画分を集めた。それぞれの画分を減圧濃縮し、粗Ｆ−１４９１Ａ物質１５ｍｇ及び粗Ｆ−１４９１Ｂ物質１３ｍｇを得た。さらに、それぞれの画分を少量のメタノールに溶解し、２００ｍｌのセファデックスＬＨ−２０カラム（ファルマシア社製）に供し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、Ｆ−１４９１Ａ物質１０ｍｇ及びＦ−１４９１Ｂ物質７ｍｇを得た。
実施例２：Ｆ−１４９１Ｃ〜Ｆ−１４９１Ｈ物質の単離
実施例１と同様に培養した。培養ろ液（１３０Ｌ）を、水で平衡化した１５Ｌの吸着樹脂ダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）ＨＰ−２０（三菱化学社製）カラムに通過させた。活性成分が吸着されたＨＰ−２０カラムを５０％メタノール水３０Ｌで洗浄した後、メタノール１５Ｌで活性成分を溶出した。溶出液より減圧下でメタノールを留去した。
一方、菌体はメタノール１５Ｌで抽出後、減圧下でメタノールを留去した。両者を合わせ、酢酸エチル４Ｌで抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、褐色油状物質８０ｇを得た。これを少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム（１０００ｍｌ）に供した。クロロホルム２Ｌで洗浄後、クロロホルム−メタノール混液（２５：１）２Ｌで溶出し、Ｆ−１４９１Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ物質を含む画分を集めた。これを減圧濃縮し、黄色油状物質１２ｇを得た。さらにクロロホルム−メタノール混液（１５：１）２Ｌで溶出し、Ｆ−１４９１Ｈ物質を含む画分を集め、減圧濃縮し、黄色油状物質７ｇを得た。
それぞれを少量のトルエンに溶解し、トルエンで充填したシリカゲルカラム（４００ｍｌ）に供した。Ｆ−１４９１Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ物質を含む画分はトルエン−アセトン混液（２０：１）で洗浄後、トルエン−アセトン混液（１０：１）で展開した。Ｆ−１４９１Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ物質を含む画分を集め、減圧濃縮し、黄色粉状物質１．２ｇを得た。Ｆ−１４９１Ｈ物質を含む画分はトルエン−アセトン混液（１０：１）で洗浄後トルエン−アセトン混液（３：１）で展開し、Ｈ物質を含む画分を集め、減圧濃縮し、黄色粉状物質０．８ｇを得た。
これを少量のメタノールに溶解し、分取用高速液体クロマトグラフ装置により分取した。分離カラムにはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス社製）２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍを使用した。Ｆ−１４９１Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ物質を含む画分はアセトニトリル−水混液（７：３）を移動層として７ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出し、Ｆ−１４９１Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ物質をそれぞれ含む画分を集めた。それぞれの画分を減圧濃縮し、Ｆ−１４９１Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ物質をそれぞれ１０ｍｇを得た。さらに、Ｆ−１４９１Ｈ物質を含む画分はアセトニトリル−水混液（３５：６５）を移動層として７ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出し、Ｆ−１４９１Ｈ物質を含む画分を集めた。これを減圧濃縮し、Ｆ−１４９１Ｈ物質を１５ｍｇを得た。
産業上の利用可能性
Ｆ１４９１物質（Ｆ−１４９１Ａ〜Ｆ−１４９１Ｈ物質）は、優れた血管新生阻害活性を有し、また培養細胞に対する毒性が低いので、血管新生の亢進に随伴する疾患への治療薬としての利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｆ−１４９１Ａ物質のＫＢｒ法での赤外部吸収スペクトルである。
図２は、Ｆ−１４９１Ｂ物質のＫＢｒ法での赤外部吸収スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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