(57)【要約】ヒトＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニット３Ａ（ＮＲ３Ａ）に関する新規な物質を見出すこと。ヒト脳由来の新規なｃＤＮＡを単離し、全塩基配列を解析した。そして、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳してホモロジー検索を行なったところ、ラットＮＲ３Ａと９３％の相同性を有していることを確認し、これがヒトＮＲ３Ａであることを見出した。さらに、精神分裂病患者の脳において、ＮＲ３Ａをコードする遺伝子が有意に増加していることを確認し、ＮＲ３Ａが精神分裂病の病態に関与する物質であることを見出して本発明を完成するに至った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選ばれるＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体に関連するポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有するタンパク質；
▲１▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲２▼前記▲１▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲３▼前記▲１▼のポリペプチドと少なくとも約５０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
▲４▼前記▲１▼〜▲３▼のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、少なくとも約８個の連続するアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項５】
請求の範囲第３項または第４項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求の範囲第２項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項７】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補的塩基配列の少なくとも約１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求の範囲第６項または第７項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求の範囲第３項〜第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求の範囲第９項に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求の範囲第１０項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求の範囲第１項または第２項に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチドの製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項または第２項に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１３】
少なくともＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニットを認識する、請求の範囲第１２項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害もしくは促進する作用を有する化合物、および／または請求の範囲第３項ないし第５項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、請求の範囲第１項または第２項に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチド、請求の範囲第３項ないし第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、請求の範囲第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、請求の範囲第１２項もしくは第１３項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする抗精神病薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害もしくは活性化する化合物、または請求の範囲第３項ないし第５項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、化合物とポリペプチドまたはタンパク質との間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチドまたはタンパク質とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作用はポリペプチドまたはタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第２の成分に関連したものである）、次いで、化合物とポリペプチドまたはタンパク質との相互作用により生じるシグナルの存在または不存在または変化を検出することにより、化合物がポリペプチドまたはタンパク質と相互作用して、その活性を活性化または阻害するかどうかを決定することを含む抗精神病薬のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１４項または第１５項に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法でスクリーニングされる化合物であって、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害または促進する化合物またはその塩。
【請求項１７】
請求の範囲第１４項または第１５項に記載の方法でスクリーニングされる化合物であって、請求の範囲第３項ないし第５項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物またはその塩。
【請求項１８】
請求の範囲第１項または第２項に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチド、請求の範囲第３項ないし第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、請求の範囲第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、請求の範囲第１２項もしくは第１３項に記載の抗体、または請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載の化合物のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする抗精神病薬からなる医薬組成物。
【請求項１９】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質の発現または活性に関連した疾病（精神分裂病）の診断方法であって、（ａ）該ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている核酸、および／または（ｂ）試料中の該ポリペプチドまたはタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１項または第２項に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチド、請求の範囲第３項ないし第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、または請求の範囲第１２項もしくは第１３項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる、（ａ）該ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている核酸、および／または（ｂ）試料中の該ポリペプチドまたはタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法に使用する精神分裂病診断用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニット３Ａポリペプチドまたはタンパク質、および該ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。さらに詳しくは、該ポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の全部もしくは一部を有するペプチド、該ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を使ったペプチドまたはポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリーニング方法、該スクリーニングされた化合物、該ポリペプチドもしくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物または活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、およびこれらに関係する疾病診断方法に関する。
背景技術
Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体は、発達脳の可塑性、記憶・学習、知覚系の神経伝達、呼吸および血圧の制御など、種々の生理機能に関与していると考えられている（Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ  Ｇ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂｌｉｓｓ  Ｔ．Ｖ．Ｐ．（１９８７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１０，２８８−２９３）。
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体はグルタミン酸受容体の一種でラット、マウスでは３つのサブユニット（ＮＲ１、ＮＲ２、ＮＲ３Ａ）が報告されている。ＮＲ１サブユニットとＮＲ２サブユニットが４ないし５量体となりリガンド依存性イオンチャンネルを形成する。通常はシナプス間隙中のＭｇ２＋によって閉塞されており、頻回興奮などによって膜電位が脱分極状態にあるとＭｇ２＋閉塞が解かれて活性化する。イオンチャンネルはＮａ＋およびＣａ２＋透過性をもち、シナプス後細胞内のＣａ２＋濃度を上昇させることが生理的役割とされる。生体内でのリガンドはグルタミン酸およびアスパラギン酸であるが、ＮＭＤＡによって強く活性化される。
アフリカツメガエルの卵母細胞にラットＮＲ１サブユニットとＮＲ２サブユニットを共発現させると、イオンチャンネルを形成し、電流応答が記録される。また、ラットＮＲ１サブユニット、ＮＲ２サブユニットおよびＮＲ３Ａサブユニットを共発現させると電流量が減少した。したがって、ＮＲ３Ａは抑制性サブユニットと考えられる（Ｄａｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９３，３７７−３８１）。
海馬ＣＡ１でのみＮＲ１を欠損したマウスでは長期増強（ＬＴＰ）、空間記憶、時間記憶がともに傷害されていた（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｅ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０，１１７０−４）。ＮＲ２Ｄを過剰発現させたマウスではＬＴＰ、長期抑制（ＬＴＤ）が減少した（Ｏｋａｂｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８，４１７７−８８）。一方ＮＲ２Ｂ過剰発現マウスではＬＴＤは変化がなかったが、ＬＴＰは５倍に増加し、学習能が増加していた（Ｔａｎｇ  Ｙ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，４０１，６３−９）。ＮＲ３Ａを欠損したマウスはＮＭＤＡに対する感受性が増大し、樹状突起のスパインが増加していた（Ｄａｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９３，３７７−３８１）。したがって、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体はシナプス形成、シナプスの可塑性、記憶形成に必要であると考えられる。
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体と精神分裂病
解離性麻酔薬であるフェンサイクリジン（ＰＣＰ）はエンジェルダストの通称で１９７０年頃から密かに流通し、アメリカではコカインと並ぶ代表的な乱用薬物となっている。ＰＣＰの連用によって精神分裂病類似の症状が発現するが、これは幻覚・妄想などいわゆる陽性症状のみならず、感情鈍麻、疎通性低下などの陰性症状も引き起こし、精神分裂病モデルとして関心を呼んだ。ところがこのＰＣＰがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして作用することがわかり、グルタミン酸受容体と分裂病とのつながりを示すものとして注目を集めている（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ  Ｊ．Ｔ．ａｎｄ  Ｄａｎｙｓｚ  Ｗ．（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２９，４４１−４７４）。また、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストはラットの帯状回などに対して神経毒性を持ち、その毒性が抗精神病薬で拮抗されることなどの報告がある（Ｆｉｘ  Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２３，２０４−２１５）。
一方で、ＮＲ１の発現を正常の５％程度に減らした変異マウスが作製され、その行動を観察したところ、移所運動、常同行動の増加および社会行動・性行動の回避といった精神分裂病様の行動様式を示した。さらに、これらの症状は抗精神病薬であるハロペリドール、クロザピンで改善され、クロザピンがより有効であった（Ｍｏｈｎ  Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８，４２７−３６）。
ＮＲ３Ａサブユニットと精神分裂病
ＰＣＰの乱用による精神分裂病症状やＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体アンタゴニストを投与した動物の解析、さらにＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニットの発現変動動物の作製により、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の機能不全が精神分裂病と密接に関連していることが考えられる。また、ＮＲ３ＡサブユニットはＮＲ１／ＮＲ２ヘテロ重合体に結合し、チャンネルとしての機能を阻害する。
しかしながら、ヒトにおいてはＮＲ３Ａサブユニットはまだ見出されておらず、また精神分裂病との関連性も証明されていなかった。
（発明が解決しようとする課題）
本発明が解決しようとする課題の一つは、上記のようにヒトＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニット３Ａ（ＮＲ３Ａ）に関する新規な物質を見出すことである。また、本発明のもう一つの課題は、ヒトＮＲ３Ａの生体内における生理的役割および機能を明確にし、ヒトＮＲ３Ａが関与する疾患の診断方法、有用な治療薬・治療方法、治療薬のスクリーニング方法等を提供することである。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト脳由来の新規なｃＤＮＡ（管理コード：ＰＦ００１５４）を単離し、全塩基配列を解析することに成功した。そして、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳してホモロジー検索を行なったところ、ラットＮＲ３Ａと９３％の相同性を有していることを確認し、これがヒトＮＲ３Ａであることを見出した。さらに、本発明者らは、精神分裂病患者と非精神分裂病患者の死後脳におけるＮＲ３Ａ遺伝子の発現量を比較することにより、精神分裂病患者の脳において、ＮＲ３Ａをコードする遺伝子が有意に増加していることを確認し、ＮＲ３Ａが精神分裂病の病態に関与する物質であることを見出して本発明を完成するに至った。
発明の開示
すなわち、本発明は、
１．下記の群より選ばれるヒトＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体に関連するポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質；
▲１▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲２▼前記▲１▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲３▼前記▲１▼のポリペプチドと少なくとも約５０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
▲４▼前記▲１▼〜▲３▼のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
２．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、少なくとも約８個の連続するアミノ酸配列を有するペプチド。
３．前項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
４．配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
５．前項３または４に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
６．前項２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
７．配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補的塩基配列の少なくとも約１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
８．前項６または７に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
９．前項３〜８に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。
１０．前項９に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
１１．前項１０に記載の形質転換体を培養する工程を含む、前項１または２に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチドの製造方法。
１２．前項１または２に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチドを免疫学的に認識する抗体。
１３．少なくとも  ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体サブユニットを認識する、前項１２に記載の抗体。
１４．前項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害もしくは促進する作用を有する化合物、および／または前項３ないし５に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、前項１または２に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチド、前項３ないし８に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、前項９に記載のベクター、前項１０に記載の形質転換体、前項１２もしくは１３に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする抗精神病薬のスクリーニング方法。
１５．前項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害もしくは活性化する化合物、または前項３ないし５に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、化合物とポリペプチドまたはタンパク質との間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチドまたはタンパク質とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作用はポリペプチドまたはタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第２の成分に関連したものである）、次いで、化合物とポリペプチドまたはタンパク質との相互作用により生じるシグナルの存在または不存在または変化を検出することにより、化合物がポリペプチドまたはタンパク質と相互作用して、その活性を活性化または阻害するかどうかを決定することを含む抗精神病薬のスクリーニング方法。
１６．前項１４または１５に記載の抗精神病薬のスクリーニング方法でスクリーニングされる化合物であって、前項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害または促進する化合物またはその塩。
１７．前項１４または１５に記載の方法でスクリーニングされる化合物であって、前項３ないし５に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物またはその塩。
１８．前項１または２に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチド、前項３ないし８に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、前項９に記載のベクター、前項１０に記載の形質転換体、前項１２もしくは１３に記載の抗体、または前項１６もしくは１７に記載の化合物のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする抗精神病薬からなる医薬組成物。
１９．前項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを有するタンパク質の発現または活性に関連した疾病（精神分裂病）の診断方法であって、（ａ）該ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている核酸、および／または（ｂ）試料中の該ポリペプチドまたはタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法。
２０．前項１または２に記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを有するタンパク質またはペプチド、前項３ないし８に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、または前項１２もしくは１３に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる、（ａ）該ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている核酸、および／または（ｂ）試料中の該ポリペプチドまたはタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法に使用する精神分裂病診断用試薬キット。
に関するものである。
発明を実施するための最良の形態
（新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質）
本発明において提供される新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質は、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体に関連するものであり、ヒト脳細胞中のｍＲＮＡからクローニングされたもので、新規なアミノ酸配列を有する物質としてそのｃＤＮＡが取得されたものである。当該ｃＤＮＡクローンにコードされるアミノ酸配列は配列表の配列番号１に記載した。そして本発明からなる新規なＮＲ３ＡのｃＤＮＡは、脳で発現が高く、次いで脊髄、卵巣、肝臓、心臓、精巣、腎臓、脾臓で発現量が高かった。また、脳においては、扁桃体において最も発現が高く、次いで視床下核、海馬、視床、黒質などでの発現が高かった。特に、精神分裂病患者の脳内において、本発明タンパク質をコードする遺伝子の高い発現が確認された。
本発明に係る新規なＮＲ３Ａタンパク質は１１１５個のアミノ酸残基からなる。そして、その遺伝子は３３４８塩基対のオープンリーディングフレームを有し、推定アミノ酸配列全体に渡ってラットＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ＮＭＤＡＲ−Ｌ（ＥＭＢＬ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：Ｔ３１０６８）と９３％の相同性がある。また、膜蛋白予想プログラムにより、膜貫通ドメインの予想を行ったところ、８番目から２９番目、６７４番目から６９５番目、７１２番目から７３４番目、７４４番目から７６６番目および９２９番目から９５１番目の５箇所において膜貫通ドメインが予想される。
（タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド）
本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一、または実質的に同一なアミノ酸配列を含有するタンパク質である。当該新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質は、ヒトの細胞に存在するあらゆる組織に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、少なくともＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体に関連を維持し、また実施例３および７にみられる発現特性を保持する限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
また、配列表の配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、さらに、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の機能特性を有するタンパク質等が例示される。実質的に同質の活性として、少なくともＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体に関連を維持することが挙げることができる。
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、ｃＤＮＡの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。
本発明に係る新規なＮＲ３Ａポリペプチドを含むタンパク質は「成熟」タンパクの形態であってもよく、あるいは融合タンパクのごとき大型のタンパクの一部であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、または組換え生産を行っている間の安定性のためのさらなる配列を含むものであってもよい。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドを包含し、これらは例えば試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては８個以上のアミノ酸、好ましくは１０個以上のアミノ酸、より好ましくは１２個以上、さらに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定し得るポリペプチドまたはペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、試薬もしくは標準物質、または後述するように本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質に特異的な抗体を作製するための抗原として単独またはキャリア（例えば、キーホールリンペイトヘモシアニンまたは卵白アルブミン）と結合して使用できるが、これらのように別種のタンパク質または物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。部分配列は、「独立して存在するもの（ｆｒｅｅ  ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であるか、あるいはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、その中で部分配列は一部分もしくはある領域を形成していてもよい。最も好ましくは、単一の連続した領域としてより大きなポリペプチドに含まれる。
さらに、このように特定されたポリペプチドまたはペプチドを基にして、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体との関連を指標とすることにより、１以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個で特に好ましくは１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはペプチドも提供される。欠失、置換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。例えば、Ｎ末端を含む一連の残基が欠失、またはＣ末端を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がＮ末端でもう一方がＣ末端を含む２種の一連の残基が欠失していること以外は上記新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質のアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを包含する。
また、構造的または機能的属性により特徴づけられる部分配列、例えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、５回の膜貫通ドメインおよび高抗原性指標領域を含む部分配列等も好ましい。また、生物学的に活性な領域も好ましく、類似の活性もしくは改善された活性のある、または望ましくない活性を減じた部分配列等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的な部分配列もまた含まれる。
本発明に係るタンパク質、ポリペプチドおよびそれらの部分配列ペプチドのアミノ酸配列は保存的アミノ酸置換により変化したものも含まれている。かかる典型的な置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；ならびに塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ間におけるものである。数個、５ないし１０個、１ないし５個、または１ないし２個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されているものが特に好ましい。
上記のような変異の導入において、当該タンパク質の基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。
なお、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質はペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドを意味する。また、本明細書において、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖をポリペプチド、また、長鎖のものをタンパク質ということもある。
本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質は、２０種の遺伝子によりコードされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することもできる。「タンパク質」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびＮ末端側またはＣ末端側等のポリペプチドの任意の部位で行われ得る。同一の型の修飾は該ポリペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度で存在し得る。また、タンパク質は多くの型の修飾をも含み得る。タンパク質は、ユビキチネーションの結果として分枝状であってもよく、分枝を伴うまたは伴わない環状のものであってもよい。環状、分枝状および分枝状かつ環状のタンパク質は翻訳後の天然プロセッシングにより生じるものであってもよく、あるいは合成法により製造されるものであってもよい。
修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、およびセレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介のタンパクへのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーション等がある。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９９３年およびＰｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８３年のＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１−１２頁；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）６６３：４８−６２参照。
さらに、本発明に係るポリペプチド等の検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、Ｎ末端側やＣ末端側に別のタンパク質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片またはＦＬＡＧ−ｔａｇ等のペプチドを直接またはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することは当業者には容易であり、これらの別の物質を結合したポリペプチド等も本発明の範囲に包含される。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。
（ポリヌクレオチド）
一つの態様において、本発明に係るポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、本発明に係るポリペプチド等、例えば配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。これらは例えば上記新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。好ましいポリヌクレオチドの塩基配列は、配列表の配列番号２のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列に記載した。
別の態様において本発明は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号２の塩基配列のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものであるが、その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ・精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ中での洗浄といった条件であってもよい。
これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号２の塩基配列のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列番号２の塩基配列のうちコーデイング領域の６０２〜３９４９の配列またはその相補的配列に対する相同性において、少なくとも約４０％、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上である。また本発明に係るポリヌクレオチドは、指定された塩基配列の領域に対応する連続する１０個以上の、好ましくは１５個以上の、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよびこれらの相補鎖を包含する。ここで、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質またはこれと同様の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現タンパク質の確認を行い、その生理活性特にＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に関連を維持することを指標にして選別することにより行なうことができる。無細胞タンパク質発現系を利用する場合は、例えばコムギ胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒｅ（１９５７）１７９：１６０−１６１）。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチド等の製造において、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質をコードする核酸、例えば、その遺伝子、もしくはｍＲＮＡの検出のためのプローブもしくはプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として、または遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。例えば、アンチセンスによって本発明に係る新規なＮＲ３Ａ含有タンパク質の発現を特異的に阻害するためには、当該ＮＲ３Ａタンパク質に固有な領域の塩基配列を用いることが想定される。一方、保存配列を用いることにより当該ＮＲ３Ａタンパク質を含むタンパク質の発現を同時に抑制することも可能と考えられる。
本発明に係るポリヌクレオチドは、一般的には、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。「ＲＮＡもしくはＤＮＡ」は、安定性またはその他の理由により、修飾された塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのごとき通常的でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡについて行われており、典型的に天然において見い出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ＲＮＡもしくはＤＮＡ」は、しばしば「オリゴヌクレオチド」と称する短いポリヌクレオチドを包含する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、対象のＲＮＡ、ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を変化させるものであってもよく、対象配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠損、融合および末端切断を招く場合があるが、本発明はこれらのものも包含する。これらの変化は１またはそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が変化し得るものであり、これらの変化は、突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知のその他の組換え技術により製造できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は、本発明に係るＲＮＡ、ＤＮＡまたは本発明に係るタンパク質の同一性の尺度である。一般的には、最大限に合致するような配列を並置する。同一性はそれ自体当該分野において認識された意味を有し、公表された方法を用いて算出できる。
例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，パートＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、アカデミック・プレス、１９８７年；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、エム・ストックトン・プレス、ニューヨーク、１９９４年に記載の方法が利用できる。二つの配列の同一性を測定する方法は多くあるが、用語「同一性」は当業者によく知られている（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、アカデミック・プレス、１９８７年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、１９９１年；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３）。
配列間の同一性または類似性を測定するために通常用いられる方法はＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．（１９９８）４８：１０７３等に開示されているが、これらに限定するものではない。同一性および類似性を決定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）等があるが、これらに限定するものではない。
（形質転換体）
本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によっても、または本発明に係るＤＮＡ由来のＲＮＡを用いた無細胞タンパク質合成法により、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドは提供可能である。
形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー、マーカー配列、転写配列、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡを安定化する配列のごとき非コーディング５′および３′配列等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。なお、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社製）中に提供されるようなヘキサーヒスチジンペプチド（Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に記載される）またはＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８４）３７：７６７）が好適に例示される。
ＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８６年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年のごとき多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行なうことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等がある。
適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えば連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）細胞；動物細胞例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞；ならびに植物細胞等がある。
ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等がある。
発現系の構築物には発現を制御および引き起こす調節領域を含有させることができる。通常、宿主中にＤＮＡを保持、伸長または発現するためには、タンパク質を発現するのに適した任意の系またはベクターを選択することが必要となる。これらは周知の技術により適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入することができ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年に記載されている。また、翻訳タンパクを、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナルを発現するタンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルはタンパク質に本来的なものであってもよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、発現産生される本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの特異配列をマーカーにして行なってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養によって行ってもよい。
目的とするタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが上記形質転換体の培養培地中に分泌される場合は、該培地を回収し、該培地から精製することによりそれらを得ることができる。さらに、それらが上記形質転換体の細胞内に生成される場合は、まず細胞を溶解し、次いで、タンパク質を回収することによって目的のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを得ることができる。また、目的とするタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをスクリーニングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細胞表面にタンパク質を生産させるのが好ましい。この場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集めてもよい。
（新規ＮＲ３Ａドメイン含有タンパク質及びその由来物の精製・回収）
本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドは、ヒトやその他哺乳動物の細胞、組織、培養された該細胞もしくはその培養培地（細胞培養物）、または上記形質転換体の細胞培養物から周知の精製方法により得ることができる。その方法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー等がある。これらの方法は適宜組み合わせて行ってもよい。好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。また、高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。簡便には、ヘパリンを利用した親和性クロマトグラフィーが利用できる。さらに、精製過程において、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に関連を維持することを指標にして、精製の確認を行うこともできる。タンパク質が単離および／または精製中に変性した場合、再び活性な立体配座にするために、タンパク再生のための周知の技法を用いることができる。
（抗体）
抗体は、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、あるいはそれらの抗原決定基を含むペプチドを選別し、これらを抗原として用いて作製する。抗原は当該ＮＲ３Ａタンパク質またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。当該ＮＲ３Ａタンパク質に免疫特異的な抗体を作製するためには、新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質に固有な配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１と相同である必要はなく、タンパク質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位がアミノ酸の一次配列上で不連続部位であったとしても当該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。「免疫特異的」とは、先行技術の他の関連タンパク質に対する親和性よりも、当該ＮＲ３Ａタンパク質に対する親和性が実質的に大きいことを意味する。
抗体の生産は、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質、その由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行なうことによって行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン（血漿由来または遺伝子組換え技術により生産されるものを含む）等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
モノクローナル抗体の生産は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、上記抗体産生細胞と永久増殖性細胞とから作成されたハイブリドーマをクローン化し、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質を特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。実例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）；トリオーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８５）：７７−９６）に記載されるような種々の技法がある。
一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）は、本発明に係るタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を包含する他の生物を用いて、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法によりヒト化抗体を発現させてもよい。
上記抗体は、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質を発現するクローンの単離または同定、あるいは親和性クロマトグラフィーによる該タンパク質の精製に使用することができる。
また、上記抗体を用いて、とりわけ、精神分裂病関連疾患を治療してもよい。
（スクリーニングおよびスクリーニングされた化合物）
かくして調製された新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを用いるタンパク質合成系並びに当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによって、当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドに対する活性阻害剤または活性賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、タンパク質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等を、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。本発明のヒトＮＲ３Ａタンパク質は、精神分裂病疾患との関係が強く示唆される。したがって、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質を、その活性を阻害または促進する作用を有する化合物を見出すためのスクリーニングに用いることは有用である。
具体的には、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを用いて、スクリーニングの対象とされる化合物とこれらペプチドまたはポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカー（第２の成分）を使用する系を導入し、次いで、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在またはその変化（量的変化および／または質的変化を含む）を検出することにより、当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの活性を賦活または阻害する化合物をスクリーニング可能である。例えば、当該ＮＲ３Ａタンパク質を用いて、スクリーニングの対象とされる化合物中で小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドであってもよく、あるいは構造または機能を模倣したものであってもよい（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ５参照）。
さらにまた、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質のｃＤＮＡ、タンパク質および該タンパク質に対する抗体を用いて、細胞における当該ＮＲ３Ａタンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加化合物の影響を調べるためのスクリーニングアッセイを行ってもよい。例えば、当該分野で知られた一般的方法により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて、当該ＮＲ３Ａ含有タンパク質の分泌または細胞結合レベルを測定するための酵素免疫固相法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｖｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）を構築してもよく、また、これを用いて当該ＮＲ３Ａタンパク質の産生を阻害または促進し得る因子を適当に処理された細胞または組織から見いだすこともできる。スクリーニングアッセイを行うための一般的方法は当該分野においてよく知られたものである。
スクリーニングの対象とされる化合物としては、例えば細胞、無細胞から調製される物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物などが挙げられる。
このようにしてスクリーニングされた化合物は、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドについての活性阻害剤、活性拮抗剤、活性賦活剤の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物に対する発現阻害剤、発現拮抗剤、発現賦活剤の候補化合物としても利用可能である。それらは、ＮＲ３Ａタンパク質に由来する各種症状の予防・治療効果を期待できる。上記スクリーニング方法により選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性とのバランスを考慮してさらに選別することによって、医薬組成物として調製可能である。
（医薬組成物）
本発明において提供される新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター、当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体、ならびに上記スクリーニング方法により選別された化合物は、当該ＮＲ３Ａ含有タンパク質の活性阻害・拮抗・賦活等の機能を利用した治療薬等の医薬手段として使用可能である。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化方法を導入すればよい。
例えば、本発明は、抗体および／またはＴ細胞を産生させるに十分な上記新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質またはそのフラグメントを哺乳動物に接種して、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法による治療、精神分裂病に関連する疾患から該動物を防御することにも使用できる。
本発明はさらに、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質をインビボで発現させるための核酸ベクターを送達して、かかる免疫学的応答を誘導し、該動物を疾患から保護する抗体を生じさせることに使用することもできる。
さらに、本発明は、哺乳動物宿主中に導入された場合、上記新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質に対する哺乳動物の免疫学的応答を誘導させる免疫学的ワクチン処方（組成物）にも使用することができる。該組成物は当該新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいてもよい。当該ＮＲ３Ａタンパク質は胃で分解される可能性があるので、好ましくは非経口投与する。非経口投与としては、例えば皮下筋肉内、静脈、皮内、腹腔内等への注射による投与が挙げられる。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、バッファー、制細菌剤および処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性または非水性滅菌注射用溶液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を１回量または複数回量として容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、また使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系および当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。用量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験により容易に決定することができる。
本発明は、精神分裂病の関与する生体機能の解明、精神分裂病に関連する疾患の解明、予防、治療および診断を可能とする上で非常に有用なものになると期待される。
本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、当該ＮＲ３Ａタンパク質の活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することもできる。
さらに、発現ブロック法を用いて内在性の上記ＮＲ３Ａタンパク質をコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成した、あるいは別個に投与されたアンチセンス配列を、かかる知られた方法に使用する（例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）中、Ｏ’Ｃｏｃｃｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０参照）。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを用いてもよい（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０参照）。これらのオリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で発現させることもできる。
本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその活性の発現不足に関連する異常な症状の治療には、１つの方法として当該ＮＲ３Ａタンパク質自体あるいはこのタンパク質をコードする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物（促進剤）を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。別法として、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞による当該ＮＲ３Ａタンパク質の細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにしてもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質をコードしているＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導入して、今度はパッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成するようにしてもよい。インビボでの細胞の処理加工およびインビボでのタンパク質の発現のために、これらのプロデューサー細胞を対象に投与してもよい。遺伝子治療の概説としては、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ．Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９８６）中、第２０章、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその中の引用文献）参照。
本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドあるいは化合物の処方および投与形態は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量のタンパク質、化合物または抗体、および医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべきであり、当業者によく知られている。さらに本発明は、上記本発明成分の１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットにも関する。
本発明に係るタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、化合物および抗体は単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、注射であり、とりわけ静脈注射である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与である。さらに、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらのタンパク質、化合物または抗体の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
必要な用量範囲は、有効成分としてのペプチド、化合物または抗体、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断による。しかしながら、適当な用量は対象の体重１ｋｇあたり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしながら、種々の使用タンパク質、化合物および抗体、種々の投与経路のさまざまな有効性を考慮すれば、必要な用量はさらに広範囲なものである。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量が必要である。当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行なうことができる。
遺伝子治療において、治療に使用するタンパク質を対象中において生成させることもできる。例えば、タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）において対象由来の細胞を処理加工し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。
（診断薬および診断方法）
また本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、ならびに当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。また、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
診断方法としては、例えば本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドをコードしている核酸との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸の存在量、および／または当該タンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドについて個体中の生体内分布、および／または個体由来の試料中の存在、および／または個体由来の試料中の存在量を、自体公知の方法を利用して測定し、それらの存在の有無および／または存在量の変化（増加または減少）により、本発明に係る当該ＮＲ３Ａタンパク質およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドの発現または活性に関連する疾患の有無および／またはその変化（増悪または軽減）を判定できる。詳しくは、当該ＮＲ３Ａタンパク質および／または核酸をマーカーとして検査するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、またはＰＣＲ反応系等を利用すればよい。
診断用の核酸は、個体由来の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出することができる。増幅ＤＮＡを標識した上記ＮＲ３Ａタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定することができる。ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、完全に対合した配列を誤対合二重らせんから区別することができる。ＤＮＡ配列の相違はまた、変性物質含有または不含のゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡ配列決定により検出できる（例えば、Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２参照）。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明らかにすることができる（例えば、Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１参照）。また、上記ＮＲ３Ａタンパク質をコードするＤＮＡまたはそのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ（ａｒｒａｙ）を構築して、例えば遺伝学的変異の効果的なスクリーニングを行なうことができる。アレイ法はよく知られており、広い適用範囲を有し、遺伝子発現、遺伝学的連関、および遺伝学的変異可能性を包含する分子遺伝学における種々の問題を調べるために用いられ得る（例えば、Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７４：６１０参照）。
また、本明細書記載の方法により上記ＮＲ３Ａタンパク質をコードするＤＮＡの変異・減少・増加を検出することにより、精神分裂病との関連がある疾患の診断方法も提供する。
さらに、対象由来の試料の異常に上昇または低下した上記ＮＲ３Ａタンパク質または当該ＮＲ３Ａタンパク質のｍＲＮＡレベルを調べることを特徴とする方法によって、精神分裂病との関連がある疾患の診断方法も提供する。
本発明に係る新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質をコードするＤＮＡの発現の増加または低下を、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方法の任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルで測定することができる。また、試料中の当該ＮＲ３Ａタンパク質レベルを決定するために用いることができるアッセイ法は当業者に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。
本発明に係るポリヌクレオチドの染色体の同定（染色体アッセイ）にも価値がある。該ポリヌクレオチドの配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標的とし、これにハイブリダイゼーションし得る。本発明による重要な配列の染色体へのマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第１工程である。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと関連づけることができる。かかるデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用できる）に見い出される。次いで、連関（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）の分析により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいくつかまたは全部において変異が観察されるが正常個体においては観察されない場合、その変異は疾病の原因である可能性がある。
（実施例）
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
（実施例１）
（ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築と遺伝子の分取）
ヒト脳海馬由来ｃＤＮＡのクローニング
ヒト脳海馬由来ｃＤＮＡライブラリーの構築は、Ｏｈａｒａら（Ｏｈａｒａ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．４，５３−５９）の方法に従った。即ち、Ｎｏｔ  Ｉ部位を有するオリゴヌクレオチド（配列番号３：ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をプライマーとして、ヒト脳海馬ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｓａｌ  Ｉ部位を有するアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をｃＤＮＡとライゲーションした後、Ｎｏｔ  Ｉ消化した。１％濃度の低融点アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。精製ｃＤＮＡ断片を、Ｓａｌ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）とライゲーションした。エレクトロポーレーション法により大腸菌、ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組換えプラスミドを導入した。こうして構築したｃＤＮＡライブラリーから、約６，０００個の組換え体を選択し、これらのクローンの両末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、両末端に新規配列をもつクローンの５’末端配列（約５００ｂｐ）をＧｅｎｅＭａｒｋ（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３５５４−３５６２）と呼ばれるプログラムにより解析した。タンパク質をコードする領域が予想された独立なクローンを約１６０個選別した。さらにこれらのクローンを鋳型にインビトロ転写／翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｃＤＮＡ上にコードされるタンパク質を産生させ、ＳＤＳ変性ゲル電気泳動にて分子量を測定した。分子量５０ｋＤａ以上のタンパク質を産生しうる約６０個のクローンについて全長配列解析を行った。配列決定には、ＤＮＡシーケンサー、ＡＢＩ３７７（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列をもとにしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
（実施例２）（ホモロジー検索の方法と結果）
得られた全塩基配列から推定されるアミノ酸配列について、タンパク質間の相同性検索を既知配列データベース（ｎｒデータベース、ＮＣＢＩ）に対してＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８）を用いて行った。その結果、プラスミドＰＦ００１５４は７７７０塩基対のｃＤＮＡを含んでおり、１１１５個のアミノ酸残基からなる新規なタンパク質をコードする３３４８塩基対のオープンリーディングフレームを有していた。推定アミノ酸配列全体に渡ってラットのＮＲ３ＡであるＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ＮＭＤＡＲ−Ｌ（ＥＭＢＬ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：Ｔ３１０６８）と９３％の相同性があった。さらに予想されたアミノ酸配列を用いてＰｆａｍデータベースＲｅｌｅａｓｅ  ６．６（Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，２６３−２６）に対してドメイン検索を行った結果、６７４番目から９５２番目のアミノ酸残基においてＬｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌのドメインに類似する配列が存在した。また、膜蛋白予想プログラム、ＳＯＳＵＩ（Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４，３７８−３７９）により、膜貫通ドメインの予想を行ったところ、８番目から２９番目、６７４番目から６９５番目、７１２番目から７３４番目、７４４番目から７６６番目および９２９番目から９５１番目の５箇所において膜貫通ドメインが予想された。
（実施例３）（ＲＴ−ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ法によるヒト組織での発現解析）
ＰＦ００１５４に対する遺伝子のヒト組織および、脳の部位における発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４、ｐｐ．１４１−１５０（１９９７））を用いて行い、そのＰＣＲ産物の定量にはＥＬＩＳＡ法（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５、ｐｐ．２７７−２８６（１９９８））を適用した。具体的には以下の通りである。
クロンテック社より購入した１３種類のヒト組織由来のｍＲＮＡ（心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、精巣、卵巣、脊髄、胎児肝臓および胎児脳）と脳の８つの部分由来のｍＲＮＡ（扁桃体、脳梁、小脳、尾状核、海馬、黒質、視床下核および視床）を鋳型に逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とランダムプライマー（宝酒造社）で１本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、これらｃＤＮＡを鋳型としてＰＦ００１５４遺伝子特異的プライマー（配列番号４：５’−ＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＧ−３’および、配列番号５：５’−ＣＡＣＡＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＣ−３’）とジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識のｄＵＴＰを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の直接標識を行った。この時、後の遺伝子発現定量のコントロールになるように、０．０５ｆｇから５００ｆｇまでの１０倍ずつ段階希釈したＰＦ００１５４プラスミドＤＮＡを鋳型に同様のＰＣＲを行い、ＤＩＧ標識のコントロール用ＰＣＲ産物を調製した。一方、同プライマーセットとビオチン標識のｄＵＴＰを用いて、ＰＦ００１５４プラスミドＤＮＡを鋳型に大量のビオチン標識ＰＣＲ産物を調整した。次に、発現の定量を行うためにＤＩＧ標識のＰＣＲ産物と過剰のビオチン標識のＰＣＲ産物を用いてハイブリダイゼーションを行った後、ストレプトアビジンプレート（Ｒｏｃｈｅ社）にＤＩＧ／ビオチンーヘテロＰＣＲ産物を補足させ、余剰分を洗い流した。
補足されたＤＩＧ標識ＰＣＲ産物にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識の抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を反応させ、２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｒｏｃｈｅ社）を基質に発色させ、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｓｅ社）を用いて定量した。最終的に鋳型ＤＮＡ濃度の明らかなコントロールＰＣＲでの測定値をもとに作成した標準線を用いて、各組織などで得られた数値を換算し、遺伝子のＲＮＡ発現量を組織由来の特定量のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの中での相対的なｃＤＮＡ量として表した。
結果を次表に示す。
組織相対発現量
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（実施例４）（脳組織からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出）
精神分裂病患者および非精神分裂病患者（コントロール）の死後脳からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。すなわち、−８０℃に保存してあるヒト前頭皮質サンプルをドライアイス上で小断片（約４０ｍｇ）に切断し、１．５ｍｌの遠心チューブに移した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出はＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの一部を取り、ＯＤ２６０の値から濃度を求めた。また２５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを０．１ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後のゲルをＵＶ照射し、２８ＳリボソームＲＮＡ、１８ＳリボソームＲＮＡのバンドを確認した。
（実施例５）（逆転写酵素反応）
約０．５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を用い、ｃＤＮＡを合成した。また検量線を作成するための標準サンプルの鋳型としてはＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。
（実施例６）（リアルタイムＰＣＲ）
１／１００量のｃＤＮＡを鋳型として、ＮＲ３Ａの増幅にはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、内部標準としてのβ−ａｃｔｉｎの増幅にはＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
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５０℃で２分間、さらに９５℃で１０分間保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ装置はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
（実施例７）（ＮＲ３Ａ遺伝子の測定）
系列希釈した標準サンプルの値を基に検量線を作成し、この検量線から各サンプルのＮＲ３Ａおよびβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の初期量を算出した。さらに初期のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量を補正するためにＮＲ３Ａ量をβ−ａｃｔｉｎ量で割った。最終的にコントロール群の値を１とした時の精神分裂病群の値を算出した。
その結果、図１に示すように、精神分裂病患者の群では、コントロール群に比し、脳内ＮＲ３Ａ遺伝子が有意（ｐ＜０．０５）に増加していた。従って、ＮＲ３Ａは精神分裂病の病態に関連する遺伝子であることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明は精神分裂病の病態に関与する新規なヒトＮＲ３Ａタンパク質およびその遺伝子を提供するものであり、この特性を利用した新規医薬組成物、診断手段の提供はＮＲ３Ａが関与する疾患、特に精神分裂病の臨床、医用領域において有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、リアルタイムＰＣＲによりコントロール（ｎ＝１０）と精神分裂病患者（ｎ＝９）の脳内ＮＲ３Ａ遺伝子の発現を定量した結果（平均±ＳＥ）を示す図である。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）
【図１】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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