【手続補正書】
【提出日】平成13年10月23日(2001.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】抗−脈管形成性腸ペプチド、ｚｄｉｎｔ５
【特許請求の範囲】
【請求項１】ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；
ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及び
ｃ）配列番号８に示されアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；
から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項２】配列番号１１に示されるアミノ酸配列をさらに含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】前記ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第２ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結されている請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】第１ポリペプチドセグメント及び第２ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記第１ポリペプチドセグメントが配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んで成り、そして前記第２ポリヌクレオチドセグメントが１又は複数のＴＳＰ１−様ドメインをコードする第２ポリペプチドをコードし、そして前記第１ポリペプチドセグメントが前記第２ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置することを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】第１ポリペプチドセグメント及び第２ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記第１ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第２ポリペプチドセグメントが、
（ａ）配列番号５の残基１〜４８を含んで成るポリペプチド；及び
（ｂ）配列番号８の残基１〜５９を含んで成るポリペプチド；
から成る群から選択された１又は複数のポリペプチドを含んで成り；
ここで前記第１ポリペプチドセグメントが前記第２ポリペプチドセグメントのアミノ末端側に位置することを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】次の作用可能に連結された要素：
ａ）転写プロモーター；
ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、ここで前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、
ｉ）請求項１記載のアミノ酸配列；
ｉｉ） 配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列；
から成る群から選択される；及び
ｃ）転写ターミネーター；
を含んで成る発現ベクター。
【請求項７】請求項６記載の発現ベクターが導入されている、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項８】ＤＮＡセグメントによりコードされたポリペプチドを発現する、請求項７記載の細胞を培養し；そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法。
【請求項９】請求項８記載の方法により製造されるポリペプチド。
【請求項１０】配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列から成るポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
細胞外マトリックス形成及び分解に関連するタンパク質、特にタンパク質分解タンパク質は、種々の疾病、例えば癌、関節炎、アルツハイマー及び種々の炎症状態において、成長の間の確立する組織構成及び組織分解において決定的である。ＡＤＡＭ（ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ＭＤＣ（メタロプロテアーゼ−ディスインテグリン−システインに富んでいるタンパク質）及びＳＶＭＰ（ヘビ毒メタロプロテアーゼタンパク質）において同定されている亜鉛メタロプロテアーゼが、特に細胞外タンパク質に適切である。それらのタンパク質の分解活性は、マトリックス分子及び非マトリックス分子、例えば腫瘍壊死因子αについてのタンパク質分解を包含する。Ｈｕｒｓｋａｉｎｅｎ， Ｔ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ２５５５５−２５５６３， １９９９を参照のこと。
【０００２】
トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ１）は、インビボでの脈管形成を阻害する能力を有する細胞外マトリックス結合されたタンパク質である。ＴＳＰ１は、インビトロで、細管−様管形成及び内皮細胞増殖を阻止する。ＴＳＰ１の抗−脈管形成活性は、３種のタイプ１反復体を含む領域にマッピングされている。それらの反復体の組換え及びタンパク質分解フラグメントは、ウサギ角膜嚢及び漿尿膜アッセイにおいて血管−阻害活性を示した。ＴＳＰ１の第２及び第３タイプ１に由来するペプチドは、内皮細胞を阻害し、そして全身性注射される場合、腫瘍増殖を抑制する。Ｖａｚｑｕｅｚ， Ｆ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ２３３４９−２３３５７， １９９９を参照のこと。
【０００３】
ＡＤＡＭ−ＴＳ（メタロプロテアーゼ、及びトロンボスポンジン−１反復体を有するディスインテグリン）及びＭＥＴＨ （メタロプロテアーゼ、及びトロンボスポンジン−１反復タンパク質）は、ＡＤＡＭに関連する。ＡＤＡＭＴＳ−１は、トロンボスポンジン型を有するディスインテグリン及びメタロプロテアーゼとして特徴づけられ、そして悪液質腫瘍選択遺伝子としても同定されている炎症関連遺伝子である（Ｋｕｎｏ， Ｋ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ５５６−５６２， １９９７）。
【０００４】
ＭＥＴＨ−１は、メタロプロテアーゼ及びトロンボスポンジンドメインの組み合わせであり、そして脈管形成を阻害する（Ｖａｓｑｕｅｚ， 前記）。ＡＤＡＭＴＳタンパク質ファミリーの追加の再考に関しては、Ｔａｎｇ， Ｂ． Ｌ．， など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ４４５： ２２３−２２５， １９９９を参照のこと。追加のＡＤＡＭＴＳファミリーメンバー、すなわちＡＤＡＭＴＳ−２は、軟膏“アグレカナーゼ（凝集酵素）”として包含され；Ｆｌａｎｎｅｒｙ， Ｃ．Ｒ．， など．， Ｂｉｏｃ． ａｎｄ Ｂｉｏｐｈ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２６０： ３１８−３２２， １９９９を参照のこと。
【０００５】
治療的に有用であることが示されているタンパク質のＡＤＡＭｓ／ＡＤＡＭＳ−ＴＳ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓ／ＭＥＴＨファミリーのメンバーは、急性冠状動脈血栓症候群のための抗−凝集材として有用であるｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ （ＣＯＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 及びＫｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． により製造されるＩｎｔｅｇｒｉｌｉｎ（商標））， 及びβ２インテグリン−介在性ヒト転移性メラノーマ細胞付着を阻害し、そして実験転移を阻止し（Ｔｒｉｋｈａ， Ｍ． など．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４： ４９９３−４９９８， １９９４）、そして血小板凝集を阻害する（Ｃｌａｒｋ， Ｅ．Ａ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ （３５）： ２１９４０−２１９４３， １９９４）ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｉｎを包含する。
【０００６】
本発明は、ＡＤＡＭｓ／ＡＤＡＭＳ−ＴＳ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓ／ＭＥＴＨファミリーの新規メンバー、及びそのしようが本明細書における教授から当業者に明らかであろう関連する組成物を提供する。
【０００７】
発明の要約：
１つの観点において、本発明は、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。
【０００８】
１つの観点において、本発明は、配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。
【０００９】
１つの観点において、本発明は、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。
【００１０】
１つの観点において、本発明は、配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。
【００１１】
１つの観点において、本発明は、ａ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ｂ）配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ｃ）配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及びｄ）配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドを提供し；ここで前記ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第２ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結される。
【００１２】
１つの観点において、第１ポリペプチドセグメント及び第２ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが供給され、ここで前記第１ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第２ポリペプチドセグメントが配列番号５の残基１〜４８を含んで成るポリペプチド；及び配列番号８の残基１〜５９を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドを含んで成り；ここで前記第１ポリペプチドセグメントが前記第２ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【００１３】
もう１つの観点において、本発明は、第１ポリペプチドセグメント及び第２ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを供給し、ここで前記第１ポリペプチドセグメントが配列番号２の残基１〜２０３を含んで成り、そして前記第２ポリヌクレオチドセグメントがＴＳＰ１−様ドメインである第２ポリペプチドをコードし、そして前記第１ポリペプチドセグメントが前記第２ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【００１４】
もう１つの観点において、本発明は、次の作用可能に連結された要素：ａ）転写プロモーター；ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、ここで前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２に示されるようなのアミノ酸配列；配列番号５に示されるようなのアミノ酸配列；配列番号８に示されるようなのアミノ酸配列；及び配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る；及びｃ）転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。
【００１５】
１つの観点においては、発現ベクターが導入されている、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞が供給される。もう１つの観点において、本発明は、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養し；そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法を提供する。さらなる態様においては、前記方法により製造されるポリペプチドが提供される。
【００１６】
もう１つの態様においては、ポリペプチドと細胞とを組合すことによって細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドが、ａ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ｂ）配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ｃ）配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及びｄ）配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択される。細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法においては、細胞は、ａ）結腸からの組織；ｂ）小腸からの組織；ｃ）精巣からの組織；及びｄ）肺からの組織から成る群から選択された組織に由来する。
【００１７】
もう１つの観点においては、本発明は、ポリペプチドが、抗体を生成するために動物における免疫応答を誘発するよう、前記ポリペプチドにより動物を接種し；そして前記動物から抗体を単離する段階を含んで成る、請求項３１記載の方法により製造されるポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供する。１つの態様においては、前記抗体は、ａ）配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ｂ）配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ｃ）配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及びｄ）配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドに対して特異的に結合する。
【００１８】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号１１の少なくとも１１個の連続したアミノ酸残基を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは、配列番号１１の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含んで成る。もう１つの態様においては、単離されたポリペプチドは、配列番号１１の少なくとも３０個の連続したアミノ酸を含んで成る。もう１つの態様においては、前記１１個のアミノ酸残基は、（ａ）配列番号２；（ｂ）配列番号５；及び（ｃ）配列番号８から成る群からである。
【００１９】
もう１つの態様においては、単離されたポリペプチドは、４８〜１１２０個の長さのアミノ酸である。もう１つの態様においては、前記連続したアミノ酸残基の少なくとも９個が、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第２ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結される。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号１１の少なくとも１１個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記１１個のアミノ酸の連続した配列は、ａ）配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ｂ）配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及びｃ）配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択される。もう１つの態様においては、前記ポリペプチド分子は、４８〜１１２０個の長さのアミノ酸である。
【００２１】
１つの観点においては、本発明は、第１ポリペプチドセグメント及び第２ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが供給され、ここで前記第１ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第２ポリペプチドセグメントが（ａ）配列番号５の残基１〜４８を含んで成るポリペプチド；及び（ｂ）配列番号８の残基１〜５９を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチド分子を含んで成り；ここで前記第１ポリペプチドセグメントが前記第２ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【００２２】
もう１つの観点においては、本発明は、第１ポリペプチドセグメント及び第２ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを供給し、ここで前記第１ポリペプチドセグメントが配列番号２の残基１〜２０３を含んで成り、そして前記第２ポリヌクレオチドセグメントがＴＳＰ１−様ドメインである第２ポリペプチドをコードし、そして前記第１ポリペプチドセグメントが前記第２ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【００２３】
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：ａ）転写プロモーター；ｂ）配列番号１１の少なくとも１１個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及びｃ）転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。１つの態様においては、前記ＤＮＡセグメントはさらに、親和性標識をコードする。
【００２４】
１つの観点においては、発現ベクターが導入されている、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞が供給される。もう１つの観点において、本発明は、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養し；そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法を提供する。さらなる態様においては、前記方法により製造されるポリペプチドが提供される。
【００２５】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号１１の少なくとも１１個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドと細胞を、インビボ又はインビトロで組合すことによって、細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法を提供する。もう１つの態様においては、細胞は、ａ）結腸からの組織；ｂ）小腸からの組織；ｃ）精巣からの組織；及びｄ）肺からの組織から成る群から選択された組織に由来する。もう１つの観点においては、本発明は、ポリペプチドが、抗体を生成するために動物における免疫応答を誘発するよう、請求項１５記載のポリペプチドにより動物を接種し；そして前記動物から抗体を単離する段階を含んで成る、ポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供する。
【００２６】
もう１つの態様においては、（ａ）配列番号２；（ｂ）配列番号５；（ｃ）配列番号８；及び（ｄ）配列番号１１から成る群から選択されたポリペプチドを含んで成るタンパク質に結合する、前記方法により生成される抗体が供給される。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の発明の特定の記載に基づいて明らかになるであろう。
【００２７】
発明の特定の記載：
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる：
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【００２８】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）（配列番号７）、 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎ など．， Ｇｅｎｅ６７：３１， １９８８）、セルロース結合タンパク質、チオレドキシン、ユビキチン、Ｔ７ポリメラーゼ又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。ＤＮＡコード親和性標識及び他の試薬は、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈｅｖｅｎ， ＣＴ）から入手できる。
【００２９】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００３０】
用語“ポリヌクレオチド分子の補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に対して相補的である。
用語“〜に対応する”とは、配列におけるアミノ酸残基の位置に適用される場合、配列が最適に整列される場合の多くの配列における対応する位置を意味する。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００３１】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに操作可能的に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状ＤＮＡ分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００３２】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノム  クローンを含む分子である。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する５’及び３’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６： ７７４―７８， １９８５を参照のこと）。
【００３３】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００３４】
“作用可能に連結された”とは、複数の実物体が、それらがそれらの意図された目的のために機能するよう一緒に連結されることを意味する。ＤＮＡセグメントを言及する場合、その用語は、コード配列が正しい読み取り柄を整合して連結され、そして転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行することを示す。ポリペプチドを言及する場合、“作用可能に連結された”とは、配列の所望する機能が保持される、共有（例えば、ジスルフィド結合）及び非共有（例えば，水素結合、疎水性相互作用、又は塩−架橋相互作用）結合された配列を包含する。
【００３５】
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”又は“種相同体”（ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇ）とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
【００３６】
“ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略語“ｂｐ”）、ヌクレオチド（“ｎｔ”）、又はキロ塩基（“ｋｂ”）として表される。
【００３７】
ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのような対になっていない末端は、長さ２０ｎｔを超えない。
【００３８】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡ ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【００３９】
用語“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００４０】
用語“受容体”は、生物活性分子（すなわち“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づけられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。
【００４１】
受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、ＡＭＰ生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体）、又はマルチマー（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ―ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポイエチン受容体及びＩＬ―６受容体）であり得る。
【００４２】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
“セグメント”とは、特定された特性を有する大きな分子（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）の一部である。例えば、特定されたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５‘から３’の方向に読み取られる場合、その特定されたポリペプチドのアミノ酸をコードする、長いＤＮＡ分子の一部、例えばプラスミド又はプラスミドフラグメントである。
【００４３】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される
【００４４】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
ＡＤＡＭ−ＴＳ及びＭＥＴＨファミリーメンバーのいくつかのメンバーのドメイン構造の議論は、本発明をより詳細に例示することを助けるであろう。分泌ペプチドが上記に記載されて来た。
【００４５】
プロペプチドドメインは通常、メタロプロテアーゼのアミノ−末端側であり、そしてメタロプロテアーゼドメインが一定の環境下で活性化されるよう、メタロプロテアーゼドメインのためのインビトロとして作用することができる（たぶん、システイン−スイッチ機構を通して）。この阻害は、メタロプロテアーゼドメインの活性部位を阻止することによることができる。
【００４６】
プロテアーゼドメインは、活性又は不活性であり得る。ディスインテグリンファミリーのいくつかのメンバーは、システインに富んでいるドメインにおいて“システイン−スイッチ”により調節され得る“活性”亜鉛触媒部位を有する“活性”プロテアーゼドメインを有するファミリーメンバーの例は、細胞外マトリックスにおけるタンパク質のプロセッシングを通して炎症工程に関与すると思われるＡＤＡＭ−ＴＳ１である。そのような触媒部位を有さないこのファミリーのメンバーは、例えば腫瘍抑制に関与するＡＤＡＭ１１を包含する。不活性プロテアーゼドメインを有することが知られている他のタンパク質ファミリーは、セリンプロテアーゼである。
【００４７】
付着（ディスインテグリン）ドメインは、ディスインテグリンの特異性に依存して、多数の細胞の表面上に位置することができるインテグリン又は細胞表面受容体を結合する。このディスインテグリンドメイン内の予測される結合部位はしばしば、１３又は１４個のアミノ酸を含んで成るアミノ酸ループである。Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， 前記を参照のこと。折りたたみに基づくこの配列のコンホメーションは、その先端でアミノ酸配列を表すヘアピンループをもたらす。この配列はしばしば、“ＲＧＤ”であるが、しかし種々の他のアミノ酸残基により置換され得る（Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， 前記；及びＪｉａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １３０９４−１３１０２， １９９７）。
【００４８】
特定種類のディスインテグリンドメインのための受容体は、多くのディスインテグリン結合ループ配列を認識することができる。ディスインテグリンドメインは、細胞−細胞相互作用、例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ （フィブロネクチン受容体）及び／又はＧＰＩａ／ＩＩａ（コラーゲン受容体）を結合することによって血小板凝集の阻害を担当することが示されている。ＭＥＴＨタンパク質は、２種のディスインテグリンドメインを有する。
【００４９】
多くのディスインテグリンファミリーメンバーは、融合ドメイン、すなわち約２３個のアミノ酸の比較的疎水性のドメインを有する。このドメインは、ＡＤＡＭファミリーメンバーのいくつかのメンバー内に存在し、そして細胞−細胞融合及び特に、精子／卵融合及び筋肉融合に関与することが示されている。
システインに富んでいるドメインは、ＡＤＡＭｓ／ＡＤＡＭＳ−ＴＳ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓ／ＭＥＴＨ−様ファミリーメンバーにおいて変化し、そしてインテグリンにインテグリン−結合領域を構造的に提供することに関与すると思われる。このファミリーのディスインテグリン−様メンバーに関しては、システインに富んでいるドメインはまた、ポリペプチドの二次構造コンホメーション、特にディスインテグリンドメインとシステインドメインとの間のジスルフィド結合のためにも必要である。
【００５０】
多くのＡＤＡＭｓ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓファミリーメンバーは、細胞膜にポリペプチドを固定するために作用するトランスメンブランドメインを有する。ＭＥＴＨタンパク質の場合、ポリペプチドは、細胞外マトリックスへのＳＰ１−様ドメインの結合を通して固定されると思われる。従って、ＭＥＴＨ−１及びＭＥＴＨ−２タンパク質は、脈管形成の効果的インヒビターであることが示されている。膜固定されたＡＤＡＭｓ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓファミリーメンバーは、メタロプロテアーゼドメインがもう１つのタンパク質の細胞外ドメインを分解する“タンパク質エクトドメインシェディング（ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）”と呼ばれる工程に関与している。
【００５１】
それらの場合、メタロプロテアーゼは、フェルチリン（ＡＤＡＭｓ１及び２）又はＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）の場合のように、細胞表面自体に対して活性的であり、又はメタロプトテアーゼは、ＫＵＺ及びＡＤＡＭ１０について記載されるように、分泌経路において細胞内作用することができる（Ｂｌｏｂｅｌ， Ｃ． Ｐ．， 前記；及びＬａｍｍｉｃｈ， Ｓ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： ３９２２−３９２７， １９９９）。
【００５２】
それらのメンバー−固定されたメタロプロテアーゼは、それらの遺伝子が転写される組織においてたぶん、活性的であり、この場合、それらは、同じ細胞表面に結合される他のタンパク質に対してシスで作用し、他の細胞表面に結合されるタンパク質、又は膜結合されない他のタンパク質に対してトランス作用することができる。さらに、膜アンカー自体は、分解され、身体における他の部位で活性的であり得るメタロプロテアーゼ／ディスインテグリンの可溶性形がもたらされる。
【００５３】
ＡＤＡＭｓ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓファミリーメンバーの細胞質又はシグナル化ドメインは、リン酸化のための長さ及び部位において保存される傾向がある。しかしながら、他に、それらはアミノ酸組成においてユニークである傾向がある。いくつかのディスインテグリンファミリーメンバーは、Ａｂ１， Ｓｒｃ， 及び／又はＳｒｃ−関連ＳＨ３ドメインのＳＨ３ドメインに結合することによってシグナルを出すことができる。
【００５４】
トロンボスポンジ−様（ＴＳＰ−様）ドメインは、タンパク質のカルボキシル末端側に位置する。複数のＴＳＰ−様ドメインが存在することができる。例えばＭＥＴＨ−１は、３種のＴＳＰ−様ドメインを有し、そしてもう１つのＭＥＴＨ相同体ＭＥＴＨ−２（Ｖａｓｑｕｅｚ， 前記）は、２種のＴＳＰ−様ドメインを有する。トロンボスポンジン−１は、細胞外マトリックスに関連し、そして脈管形成をインビボで阻害する能力を有するモデュラータンパク質である。培養条件下で、トロンポスポンジン−１は、細管−様形成及び内皮細胞増殖を阻止する。ＭＥＴＨ−１及びＭＥＴＨ−２の両者はまた、角膜嚢及びＣＡＭアッセイにおける脈管形成を阻害することが示されている（Ｖａｓｑｕｅｚ， など）。
【００５５】
本発明は、ｚｄｉｎｔ５と称するタンパク質のＭＥＴＨサブファミリーのメンバーの新規ドメインの発現に基づかれている。ｚｄｉｎｔ５のドメインは、メタロプロテアーゼドメイン及び２種のＴＳＰ１−様ドメインを包含する。メタロプロテアーゼドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号１及び２で示される。メタロプロテアーゼドメイン内に、配列番号２の残基１５１〜１６１の亜鉛結合型が存在する。第１のＴＳＰ１−様ドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号４及び５で示される。第２のＴＳＰ１−様ドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号７及び８で示される。
【００５６】
メタロプロテアーゼのための縮重ポリヌクレオチド、及び第１及び第２のＴＳＰ１−様ドメインは、それぞれ、配列番号３、６及び９で示される。それらのドメインがタンパク質においていかに組合され得るのか実例は、配列番号１０（ポリヌクレオチド）、配列番号１１（ポリペプチド）及び配列番号に（縮重ポリヌクレオチド）に示される。配列番号２に示されるようなアミノ酸残基６９及び配列番号１１に示されるようなもの１７２；配列番号２に示されるような７３及び配列番号１１に示されるような１７６；及び配列番号１１に示されるような４８５， ５３３， ５６０， ５９５及び６３５は、可能性あるＮ−結合されたグリコシル化部位である。
【００５７】
ｚｄｉｎｔ５の組織分布の分析は、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｄｏｔ Ｂｌｏｔｓを用いて、ノザンブロット技法により行われ得る。そのようなブロット市販されており（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、そして当業者に知らされている方法によりプローブされ得る。例えば、Ｗｕ Ｗ． など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ， １９９７を参照のこと。さらに、本発明のポリヌクレオチドの部分は、配列データベースに質問し、そして配列が由来する組織を同定することによって同定され得る。本発明のポリヌクレオチドの部分は、結腸腺癌ｃＤＮＡライブラリー、小腸ｃＤＮＡライブラリー、及び胎児肺、組織及びＢ−細胞から製造されたｃＤＮＡライブラリーにおいて同定されている。
【００５８】
ＡＤＡＭｓファミリーのいくつかのメンバーは、スプライシングされたイソフォームを有する。スプライシングの例は、メルトリンαとしても知られているＡＤＡＭ１２である。プロペプチド及びメタロプロテアーゼドメインを欠いている、この分子の切断された形は、インビボで異所性筋肉形成に関連するが、しかしインビトロではそうではなく、このことは、この遺伝子を発現する細胞が隣接する前駆体細胞に対して作用する成長因子を生成することを示唆する。
【００５９】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３は、配列番号２のｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。配列番号６は、配列番号５のｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。配列番号９は、配列番号８のｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。配列番号１２は、配列番号１１のｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。
【００６０】
当業者はまた、配列番号３、６、９及び１２の縮重配列がＵとＴとを置換することによって、配列番号２、５、８及び１１をコードするすべてのＲＮＡ配列も供給する。従って、配列番号３のヌクレオチド１−６０９；及び配列番号１２のヌクレオチド１−２３７９を含んで成るｚｄｉｎｔ５ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド及びそれらのＲＮＡ相当物は、本発明により包含される。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３、６、９及び１２内に使用される１文字コードを示す。“決定”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードＹはＣ又はＴのいずれかを示し、そしてその相補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、そしてＧはＣに対して相補的である。
【００６１】
【表１】
2004500087.tif 000001
与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号３、６、９及び１２に使用される縮重コドンが表２に示される。
【００６２】
【表２】
2004500087.tif 000002
【００６３】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（ＡＧＲ）をコードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（ＡＧＹ）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２、５、８及び１１のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【００６４】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３、６、９及び１２に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【００６５】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、３、４、６、７、９、１０及び１２の類似するサイズの領域、又はそれに対して相補的配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、当業界において良く知られており、そして多くの用途のために広く使用される；例えばＳａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ など．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， １９８７； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， ｅｄｓ．， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １５２， １９８７ 及びＷｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６： ２２７−５９， １９９０、参照のこと。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、二重鎖ハイブリッドを形成する一本鎖相補的配列の能力を開発する。そのようなハイブリッドは、ＤＮＡ−ＤＮＡ， ＲＮＡ−ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡを包含する。
【００６６】
例示されるように、変異体、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１， ３， ４， ６， ７， ９， １０及び１２のヌクレオチド配列を有する核酸分子（又はそれら補体）により、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び１５ｍＭのクレン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液：２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ ４００， ２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン及び２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）、１０％硫酸デキストリン及び２０μｇ／ｍｌの変性され、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液において、４２℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【００６７】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動を操作することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高温で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液（例えば、Ｅｘｐｒｅｓｓ ＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を、その製造業者の説明書に従って利用できる。
【００６８】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１、３、４、６、９、１０及び１２のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５５〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液、例えば５５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるＳＳＣをＳＳＰＥにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【００６９】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得る変異体ｚｄｉｎｔ５核酸分子を企画する：上記記載のような、配列番号２、５、８及び１１のアミノ酸配列（下記に記載されるような）のコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなｚｄｉｎｔ５変異体は、（１）５５〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１、３、４、６、７、９、１０及び１２のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２、５、８又は１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【００７０】
他方では、ｚｄｉｎｔ５変異体は、（１）５０〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１又は３のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２、５、８又は１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【００７１】
ｚｄｉｎｔ５のディスインテグリンドメインにおける高度に保存されるアミノ酸は、新規ファミリーメンバーを同定するための手段として使用され得る。例えば、逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、種々の組織源又は細胞系から得られたＲＮＡからの保存されたディスインテグリンメインをコードする配列を増幅するために使用され得る。特に、ｚｄｉｎｔ５配列から企画された高い縮重プライマーが、この目的のために有用である。
【００７２】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、ＲＮＡは、多量のｚｄｉｎｔ５  ＲＮＡを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５２０１， １９８０）により同定され、そして結腸、小腸、胎児肺、精巣及びＢ−細胞を包含する。
【００７３】
前記活性、又はＲＮＡ生成細胞又は組織が同定されると、全ＲＮＡは、グアニジウム  ＨＣｌ抽出、続くＣｓＣｌグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２−９４， １９７９）。ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡは、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９： １４０８−１４１２， １９７２ ）の方法を用いて全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いて、ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡから調製される。他方では、ゲノムＤＮＡが単離され得る。次に、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
【００７４】
ｚｄｉｎｔ５をコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようｃＤＮＡクローンを修飾することが好ましい。ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、ｚｄｉｎｔ５に対する抗体、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
【００７５】
本明細書に開示されるｚｄｉｎｔ５ポリヌクレオチド配列はまた、ｚｄｉｎｔ５遺伝子の５’非コード領域をクローン化するためにプローブ又はプライマーとしても使用され得る。この遺伝子領域は、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びＢ−細胞における特異的発現を提供することが予測される。従ってｚｄｉｎｔ５遺伝子からのプロモーター要素は、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子療法により処理された動物における異種遺伝子の組織−特異的発現を方向づけるために使用され得る。５’側フランキング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第５，６４１，６７０号に開示されるように、“遺伝子活性化”によるｚｄｉｎｔ５タンパク質の生成を促進する。
【００７６】
手短に言及すれば、細胞における内因性ｚａｌｐｈａ１１リガンド遺伝子の発現が、ｚｄｉｎｔ５遺伝子中に、少なくとも１つの標的化配列、調節配列、エキソン、及びスプライスドナー部位を含んで成るＤＮＡ構造体を導入することによって変更される。前記標的化配列は、内因性ｚｄｉｎｔ５遺伝子座による前記構造体の相同組換えを可能にし、それにより、前記構造体内の配列が内因性ｚｄｉｎｔ５コード配列と操作可能的に連結されるようになる、ｚｄｉｎｔ５  ５’非コード配列である。この場合、内因性ｚｄｉｎｔ５プロモーターが、増強された組織−特異的又は他方では、調節された発現を提供するために、他の調節配列により置換され得るか又はそれにより補充され得る。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ合成機を用いても合成され得る。現在、選択の方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖ＤＮＡが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相補的鎖が別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０ｂｐ）の生成は技術的に直接的であり、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され得る。しかしながら、より長い遺伝子（３００ｂｐ以上）の生成に関しては、化学的にＤＮＡ合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに１００％ではないので、特定の方法が所望される。
【００７８】
この問題を克服するためには、合成遺伝子（二本鎖）が、２０〜１００個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でアセンブルされる。遺伝子合成方法は、当業界において良く知られている。たとえば、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． １９９４）； Ｉｔａｋｕｒａ など．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３： ３２３−５６， １９８４及びＣｌｉｍｉｅ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓａ． ＵＳＡ ８７： ６３３−７， １９９０を参照のこと。
【００７９】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのｚｄｉｎｔ５ポリペプチドである。ヒトｚｄｉｎｔ５ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃＤＮＡは、ｚｄｉｎｔ５を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。
【００８０】
そのような組織は、例えば、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びＢ−細胞を包含する。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。次に、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドコードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。
【００８１】
ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なヒトｚｄｉｎｔ５ポリヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ， アメリカ特許第４，６８３，２０２号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム  クローンの単離に適用され得る。
【００８２】
当業者は、配列番号１、３、４、６、７、９、１０及び１２に開示される配列がヒトｚｄｉｎｔ５の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号１、３、４、６、７、９、１０及び１２に示されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２、５、８及び１１の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
【００８３】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００８４】
本発明はまた、配列番号２、５、８及び１１ポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実質的に同一である単離されたｚｄｉｎｔ５ポリペプチドも提供する。そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２、５、８及び１１又はそのオルト体に対して、少なくとも  ９０％、及び最も好ましくは９５％又はそれ以上同一であろう。％配列同一性は、従来の方法により決定される。
【００８５】
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ｂｌｏｓｕｍ ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【００８６】
【数１】
2004500087.tif 000003
【００８７】
【表３】
2004500087.tif 000004
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
【００８８】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体ｚｄｉｎｔ５のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【００８９】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２、５、８及び１１）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【００９０】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。
【００９１】
ＦＡＳＴＡ 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは４〜６であり得る。
【００９２】
本発明は、配列番号２、５、８及び１１のアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。
【００９３】
本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
【００９４】
ｚｄｉｎｔ５ 遺伝子における保存性アミノ酸置換は、配列番号１， ３， ４， ６， ７， ９， １０及び１２に列挙されるヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発、リンカー−走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いて突然変異誘発により得れる（Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５）， ｐ． ８−１０〜８−２２； 及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ． Ｐｒｅｓｓ １９９１））。細胞−細胞相互作用を促進するそのような変異体の能力は、標準方法、例えば本明細書に記載されるアッセイを用いて決定され得る。他方では、変異体ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、抗−ｚｄｉｎｔ５抗体を特異的に結合する能力により同定され得る。
【００９５】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−５７０８， １９９６を参照のこと。
【００９６】
ディスインテグリン−インテグリン、プロテアーゼ、又は細胞外マトリックス相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ など．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２， １９９２； Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４， １９９２； Ｗｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４， １９９２を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連するメタロプロテアーゼ／ディスインテグリン／トロンボスポンジン−１様分子による相同体の分析からも推定され得る。
【００９７】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【００９８】
開示されるｚｄｉｎｔ５  ＤＮＡ及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡが、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。
【００９９】
この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１００】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチド（例えば、プロテアーゼ活性、又は脈管形成阻害）をコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１０１】
変異体ｚｄｉｎｔ５遺伝子の特定のヌクレオチド配列にかかわらず、前記遺伝子は、プロテアーゼ活性、又は脈管形成阻害により、又は抗−ｚｄｉｎｔ５抗体に対して特異的に結合する能力により特徴づけられるポリペプチドをコードする。より特定には、変異体ｚｄｉｎｔ５遺伝子は、本明細書に記載されるヒトｚｄｉｎｔ５遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の少なくとも５０％、及び好ましくは７０％、８０％又は９０％以上を示すポリペプチドをコードする。
【０１０２】
変異体ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド及び実質的に相同のｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【０１０３】
従って、本発明は、配列番号２、５、８又は１１のその対応する領域に対して、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、及びより好ましくは９５％又はそれ以上の同一性を有する配列を含んでなる、１８〜２０００個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Ｘａ因子分解部位を含む。
【０１０４】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のｚｄｉｎｔ５変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号１， ２， ３，４，５，６，７，８，９，  １０，  １１及び１４の少なくとも１つの配列を提供するデータ構造体によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【０１０５】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライイブ、ランダムアクセス記憶（ＲＡＭ）チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアーテープ（ＤＬＴ）、ディスクカーシ及びＺＩＰディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、ＣＤ−読み取りのみ記憶（ＲＯＭ）、ＣＤ−再書き込みできる（ＲＷ）及びＣＤ−再記録できる）、及びデジタル可転性／ビデオディスク（ＤＶＤ）（例えば、ＤＶＤ−ＲＯＭ， ＤＶＤ−ＲＡＭ及びＤＶＤ＋ＲＷ）により例示される。
【０１０６】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド、及び１又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えばＴＳＰ１−様ポリペプチドドメインのメタロプロテアーゼは、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示されるように、ニ量体化タンパク質に融合体として調製され得る。
【０１０７】
これに関する好ましいニ量体化タンパク質は、他のディスインテグリンポリペプチドドメイン、ＴＳＰ１−様ドメイン、ディスインテグリンポロペプチドドメインフラグメント、又はタンパク質のディスインテグリンプロテアーゼファミリーの他のメンバー、例えばＭＤＣｓ， ＳＢＭＰｓ， ＭＥＴＨｓ及びＡＤＡＭｓのメンバーを含んで成るポリペプチドを包含する。それらのディスインテグリンポリペプチドドメイン融合体、ディスインテグリンポリペプチドドメインフラグメント融合体、又は他のディスインテグリンプロテアーゼとの融合体は、種々のマルチマーディスインテグリン−様類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。
【０１０８】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべてが、本発明のｚｄｉｎｔ５と、もう１つのファミリーメンバー、例えばＡＤＡＭ、ＭＤＣ、ＳＶＭＰ、ＡＤＡＭ−ＴＳ及びＭＥＴＨからのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。
【０１０９】
そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：保存されたモチーフ、例えば分泌シグナル配列、プロペプチド、プロテアーゼ、ディスインテグリン及びディスインテグリンループドメイン、例えば“ＲＧＤ−様及びシグナル化ドメイン。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知のディスインテグリン−様ファミリータンパク質（例えば、ＡＤＡＭｓ、ＭＤＣｓ、ＳＶＭＰｓ、ＡＤＡＭ−ＴＳ及びＭＥＴＨ）と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【０１１０】
さらに、当業界において記載される方法を用いて、ポリペプチド融合体又はハイブリッドｚｄｉｎｔ５タンパク質が、他のディスインテグリン及びディスインテグリン−様分子（例えば、ＡＤＡＭ、ＭＤＣ、及びＳＶＭＰ）、又は異種タンパク質と組合して、本発明のｚｄｉｎｔ５の領域又はドメインを用いて構成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， 前記；Ａｌｔｓｃｈｕｌ など．， 前記；Ｐｉｃａｒｄ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ５１１−５， １９９４及びそれらにおける引例）。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在性を変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【０１１１】
補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子（例えば、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びＢ−細胞）に対してそれらを標的化するためにｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに融合され得る。例えば、プロテアーゼポリペプチドドメイン、又はプロテアーゼポリペプチドフラグメント又はタンパク質が、標的細胞の表面上のインテグリンポリペプチド又はインテグリン−様ポリペプチドに特異的に結合するディスインテグリンポリペプチドドメイン又はフラグメントにｚｄｉｎｔ５ポリペプチドを融合せしめることによって、予定された細胞型に標的化され得る。そのようなディスインテグリン又はプロテアーゼポリペプチドドメイン又はフラグメントは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化−ディスインテグリンドメインに融合され得る。
【０１１２】
同様に、プロテアーゼポリペプチドドメイン、又はプロテアーゼポリペプチドフラグメント又はタンパク質は、細胞外マトリックスに特異的に結合するＴＳＰ１−様ポリペプチドドメイン又はフラグメントにそれを融合せしめることによって細胞外マトリックスに標的化され得る。この場合、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント及びタンパク質は、治療又は診断目的のために標的化され得る。ポリペプチド融合体はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： １−９， １９９６を参照のこと。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは一般に約２，０００以下のアミノ酸残基、好ましくは約１，７００以下のアミノ酸残基、より好ましくは約１，５００以下のアミノ酸残基を含有し、そして多くの場合においてかなり小さいであろう。例えば、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの残基を大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（１，０２１残基；Ｃａｓａｄａｂａｎ他、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １４３：９７１−９８０、１９８０参照）、１０残基のスペーサー、および４残基の因子Ｘａ切断部位に融合することができる。第２例において、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの残基をマルトース結合性タンパク質（ほぼ３７０残基）、４残基の切断部位、および６残基のポリヒスチジンタグに融合することができる。
【０１１４】
宿主細胞からのｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの輸出（ｅｘｐｏｒｔ）を指令するために、分泌ペプチド、例えば、ｔ−ＰＡ分泌ペプチドまたはｚｄｉｎｔ５分泌ペプチドをコードする第２ＤＮＡセグメントにｚｄｉｎｔ５ＤＮＡを結合する。分泌されたポリペプチドの精製を促進するために、Ｃ末端のエクステンション、例えば、ポリヒスチジンタグ、サブスタンスＰ、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４−１２１０、１９８８；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、コネチカット州ニューヘブン、から入手可能である）、マルトース結合性タンパク質、または他の特定の結合因子が利用可能である、他のポリペプチドまたはタンパク質をｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに融合することができる。
【０１１５】
本発明は、また、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの「機能的フラグメント」およびこのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために、核酸分子の日常的欠失分析を実行することができる。例示として、配列番号１、３、４、６、７、９、１０または１２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子をＢａｌ３１ヌクレアーゼで消化して、１系列のネステッド欠失を得る。
【０１１６】
次いでフラグメントを発現ベクターの中に適切なリーディングフレームで挿入し、発現されたポリペプチドを単離し、プロテアーゼ活性、または血管形成阻害について、または抗ｚｄｉｎｔ５抗体に結合する能力について試験する。エクソヌクレアーゼ消化に対する１つの別法は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して欠失または停止コドンを導入して、所望のフラグメントの産生を特定することである。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ｚｄｉｎｔ５遺伝子の特定のフラグメントを合成することができる。
【０１１７】
機能的ドメインを同定する標準的方法は当業者によく知られている。例えば、インターフェロンのいずれかまたは両方の末端におけるトランケーションについての研究は、ＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒおよびＤｉ  Ｍａｒｃｏ、Ｐｈａｒｍａｃ．  Ｔｈｅｒ．  ６６：５０７（１９９５）に要約されている。そのうえ、タンパク質の機能的分析の標準的技術は、例えば、下記の文献に記載されている：
【０１１８】
Ｔｒｅｕｔｅｒ他、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４０：１１３（１９９３）、Ｃｏｎｔｅｎｔ他、″Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４２  ｋＤａ  ２−５Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ″、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＩＳＩＲ−ＴＮＯ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｎｔｅｌｌ（編者）、ｐｐ．  ６５−７２（Ｎｉｊｉｈｏｆｆ  １９８７）、Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ、″Ｔｈｅ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ″、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．  １、Ｂｏｙｎｔｏｎ他（編者）ｐｐ．  １６９−１９９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、Ｃｏｕｍａｉｌｌｅａｕ他、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：２９２７０（１９９５）；Ｆｕｋｕｎａｇａ他、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：２５２９１（１９９５）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５０：１２９５（１９９５）、およびＭｅｉｓｅｌ他、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ３０：１（１９９６）。
【０１１９】
本発明は、また、配列番号２、５、８および１１のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸変化を有するｚｄｉｎｔ５遺伝子の機能的フラグメントを意図する。前述したように、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを決定することによって、構造に基づいて変異型ｚｄｉｎｔ５遺伝子を同定することができる。構造に基づいて変異型遺伝子を同定する別のアプローチは、前述したように、潜在的変異型ｚｄｉｎｔ５遺伝子をコードする核酸分子を配列番号１、２、４、６、７、９、１０および１２のヌクレオチド配列を有する核酸分子に加水分解できるかどうかを決定することである。
【０１２０】
当業者は前述の方法を使用して、配列番号２、５、８および１１の種々のポリペプチドフラグメントまたは変異型、あるいは野生型ｚｄｉｎｔ５タンパク質のメタロプロテアーゼ、ＴＳＰ１様、および／またはジスインテグリン活性を保持する種々のポリペプチドフラグメントまたは変異型を同定および／または調製することができる。このようなポリペプチドは、例えば、細胞内シグナリングに関係するアミノ酸を包含する、分泌ドメイン、ポリペプチドドメイン、プロテアーゼドメイン、ジスインテグリンドメイン、ＴＳＰ１様ドメイン、ジスインテグリンループ（天然または合成）、トランスメンブランおよび細胞内ドメインの部分またはすべて；融合ドメイン；アフィニティータグ；およびその他からの追加のアミノ酸を含むことができる。
【０１２１】
本発明は、また、本明細書に記載するｚｄｉｎｔ５ポリペプチドのエピトープを支持する部分を含んでなるポリペプチドフラグメントまたはペプチドを提供する。このようなフラグメントまたはペプチドは、免疫原として全体のタンパク質を使用するとき、抗体応答を誘発するタンパク質の部分である、「免疫原性エピトープ」を含んでなることができる。免疫原性エピトープを支持するペプチドは標準的方法により同定することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｇｅｙｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３９９８（１９８３））。
【０１２２】
対照的に、ポリペプチドフラグメントまたはペプチドは、抗体がそれに対して特異的に結合することができるタンパク質の領域である、「抗原エピトープ」を含んでなることができる。ある種のエピトープは、アミノ酸の線状または隣接ストレッチから成り、そしてこのようなエピトープの抗原性は変性因子により崩壊されない。
【０１２３】
タンパク質のエピトープを模擬することができる、比較的短い合成ペプチドを使用して、そのタンパク質に対する抗体の産生を刺激することができることはこの分野において知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０（１９８３））。したがって、本発明の抗原エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するポリペプチドに結合する抗体を発生させるために有効である。抗原エピトープを支持するペプチドは、例えば、配列番号１１の残基７２７〜７３２、配列番号１１の残基９９〜１０４、配列番号１１の残基７２６〜７３１、および配列番号１１の残基１２７〜１３２を含む。
【０１２４】
抗原エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２、５、８および１１の少なくとも４〜１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１０〜１５アミノ酸、より好ましくは１５〜３０アミノ酸を含有する。このようなエピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、前述したように、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをフラグメント化するか、あるいは化学的にペプチドを合成することによって製造することができる。そのうえ、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイにより、エピトープを選択することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：ＬａｎｅおよびＳｔｅｐｈｅｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：２６８（１９９３）およびＣｏｒｔｅｓｅ他、Ｃｕｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：６１６（１９９６））。
【０１２５】
エピトープを同定しそしてエピトープを含んでなる小さいペプチドから抗体を産生する標準的方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｍｏｌｅ、″Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ″、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．  １０、Ｍａｎｓｏｎ（編者）、ｐｐ．  １０５−１１６（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２）、Ｐｒｉｃｅ、″Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ″、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＲｉｔｔｅｒおよびＬａｄｙｍａｎ（編者）、ｐｐ．  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ．  ９．３．１−９．３．５およびｐｐ．  ９．４．１−９．４．１１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９７）。
【０１２６】
例示として、ｚｄｉｎｔ５中の潜在的抗原部位（配列番号２、５、８および１１）は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥのＰＲＯＴＥＡＮプログラム（バージョン３．１４）（ＤＮＡＳＴＡＲ；ウイスコンシン州マディソン）により実行される、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ法、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１８１（１９８８）に従い同定された。この解析においてデフォルトパラメーターを使用した。
【０１２７】
ｚｄｉｎｔ５の適当な抗原は下記のものを包含する：配列番号２中に示すアミノ酸残基２３〜２９；配列番号２中に示す残基４０〜４９；配列番号２中に示す残基６２〜７０；配列番号２中に示す残基８７〜９８；配列番号２中に示す残基１０８〜１２０；配列番号２中に示す残基１３７〜１４４；配列番号２中に示す残基１５７〜１７２；配列番号２中に示す残基１７７〜１８３；配列番号２中に示す残基１９０〜１９７；配列番号２中に示す残基２３〜４９；配列番号２中に示す残基４０〜７０；配列番号２中に示す残基６２〜９８；配列番号２中に示す残基８７〜１２０；配列番号２中に示す残基１０８〜１４４；配列番号２中に示す残基１３７〜１７２；配列番号２中に示す残基１５７〜１８３；
【０１２８】
配列番号２中に示す残基１７７〜１９７；配列番号５中に示す残基３〜２４；配列番号５中に示す残基３９〜４５；配列番号５中に示す残基３〜４５；配列番号８中に示す残基１１〜１８；配列番号８中に示す残基２６〜３７；配列番号８中に示す残基３９〜５９；配列番号８中に示す残基１１〜３７；配列番号８中に示す残基２６〜５９；配列番号１１中に示す残基１２〜２０；配列番号１１中に示す残基３１〜４２；配列番号１１中に示す残基６０〜６７；配列番号１１中に示す残基８１〜１０８；配列番号１１中に示す残基１２６〜１３２；配列番号１１中に示す残基１４３〜１５２；配列番号１１中に示す残基１６５〜１７３；配列番号１１中に示す残基１９０〜２０３；
【０１２９】
配列番号１１中に示す残基２１１〜２２３；配列番号１１中に示す残基２４０〜２４７；配列番号１１中に示す残基２６０〜２７５；配列番号１１中に示す残基２８０〜２８７；配列番号１１中に示す残基２９３〜３００；配列番号１１中に示す残基３１０〜３２７；配列番号１１中に示す残基３５１〜３５９；配列番号１１中に示す残基３６６〜３７５；配列番号１１中に示す残基３８１〜４１９；配列番号１１中に示す残基４３４〜４６３；配列番号１１中に示す残基４５６〜４６３；配列番号１１中に示す残基４６９〜４９９；配列番号１１中に示す残基５０５〜５２７；配列番号１１中に示す残基５２９〜５５１；配列番号１１中に示す残基５９１〜５９８；配列番号１１中に示す残基６０１〜６２１；
【０１３０】
配列番号１１中に示す残基６３３〜６３９；配列番号１１中に示す残基６４１〜６５７；配列番号１１中に示す残基６７１〜６９０；配列番号１１中に示す残基７０９〜７１５；配列番号１１中に示す残基７２４〜７３５；配列番号１１中に示す残基７３８〜７６１；配列番号１１中に示す残基７７５〜７８１；配列番号１１中に示す残基７８５〜７９３；配列番号１１中に示す残基１２〜４２；配列番号２中に示す残基３１〜６７；配列番号２中に示す残基６０〜１０８；配列番号２中に示す残基８１〜１３２；配列番号２中に示す残基１２６〜１５２；配列番号２中に示す残基１４３〜１７３；配列番号２中に示す残基１６５〜２０３；配列番号２中に示す残基１９０〜２２３；
【０１３１】
配列番号２中に示す残基２１１〜２４７；配列番号２中に示す残基２４０〜２７５；配列番号２中に示す残基２６０〜２８７；配列番号２中に示す残基２８０〜３００；配列番号２中に示す残基２９３〜３２７；配列番号２中に示す残基３１０〜３５９；配列番号２中に示す残基３５１〜３７５；配列番号２中に示す残基３６６〜４１９；配列番号２中に示す残基３８１〜４６３；配列番号２中に示す残基４５６〜５２７；配列番号２中に示す残基５０５〜５５１；配列番号２中に示す残基５２９〜６２１；配列番号２中に示す残基６０１〜６３９；配列番号２中に示す残基６３３〜６５７；配列番号２中に示す残基６４１〜６９０；配列番号２中に示す残基６７１〜７１５；配列番号２中に示す残基７０９〜７３５；配列番号２中に示す残基７２４〜７６１；配列番号２中に示す残基７３８〜７８１；配列番号２中に示す残基７７５〜７９３は抗原ペプチドである。
【０１３２】
また、ｚｄｉｎｔ５のエピトープ、ペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するために、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドを使用することができる。ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドまたはそのフラグメントは、動物に接種し、免疫応答を誘発するための抗原（免疫原）として働く。当業者は認識するように、抗原エピトープを支持するペプチドは、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド（例えば、配列番号２、５、８および１１）の少なくとも６、好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１５〜約３０の隣接アミノ酸残基の配列を含有する。
【０１３３】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドのより大きい部分、すなわち、３０〜１０残基からアミノ酸配列の全長までを含んでなるポリペプチドが包含される。抗原または免疫原性エピトープは、また、本明細書において記載するように、結合したタグ、アジュバントおよび担体を含むことができる。適当な抗原は、配列番号２、５、８および１１のアミノ酸番号１〜アミノ酸番号１１２０またはそれらの隣接９〜１１７０アミノ酸フラグメントによりコードされるｚｄｉｎｔ５ポリペプチドを包含する。抗原として使用するために好ましいペプチドは、親水性ペプチド、例えば、疎水性プロットから当業者が予測するペプチドである。
【０１３４】
ｚｄｉｎｔ５親水性ペプチドは、下記のものから成る群から選択されるアミノ酸置換を含んでなるペプチドを包含する：配列番号２のアミノ酸残基２０〜３２；配列番号２の残基６４〜６９；配列番号２の残基８６〜９８；配列番号２の残基１１０〜１２１；配列番号２の残基１５４〜１７１；配列番号２の残基１９０〜１９９；配列番号２の残基２０〜６９；配列番号２の残基６４〜９８；配列番号２の残基８６〜１２１；配列番号２の残基１１０〜１７１；配列番号２の残基１５４〜１９９；配列番号５の残基１〜１３；配列番号５の残基１５〜３１；配列番号５の残基１〜３１；配列番号８の残基２５〜３６；配列番号８の残基４１〜５４；配列番号８の残基２５〜５４；配列番号８の残基１３〜１９；配列番号１１の残基３０〜４０；配列番号１１の残基６０〜６６；
【０１３５】
配列番号１１の残基８５〜１０７；配列番号１１の残基１２３〜１３５；配列番号１１の残基１６７〜１７２；配列番号１１の残基１８９〜２０１；配列番号１１の残基２１３〜２２５；配列番号１１の残基２５７〜２７４；配列番号１１の残基２９３〜３０２；配列番号１１の残基３０９〜３２７；配列番号１１の残基３３４〜３４２；配列番号１１の残基３４８〜３５８；配列番号１１の残基３６６〜３７４；配列番号１１の残基３８６〜４０８；配列番号１１の残基４１０〜４２５；配列番号１１の残基４７２〜４９９；配列番号１１の残基５０９〜５２５；配列番号１１の残基５２７〜５５１；配列番号１１の残基５９１〜６１９；配列番号１１の残基６２１〜６２６；配列番号１１の残基６３５〜６４９；配列番号１１の残基６８２〜６９０；配列番号１１の残基６９５〜７０２；
【０１３６】
配列番号１１の残基７２３〜７３４；配列番号１１の残基７３９〜７５２；配列番号１１の残基７５５〜７６３；配列番号１１の残基７８６〜７９３。さらに、折りたたまれたタンパク質の表面上に存在すると思われる、ポリペプチドの部分に対する抗原を発生させることができる。これらの抗原は下記のものを包含する：配列番号２のアミノ酸残基２２〜３１；配列番号２の残基８７〜９７；配列番号２の残基１１３〜１１８；配列番号８の残基２６〜３２；配列番号８の残基４４〜５０；配列番号１１の残基３１〜３９；配列番号１１の残基８６〜１０４；配列番号１１の残基１２５〜１３４；配列番号１１の残基１９０〜２００；配列番号１１の残基２１６〜２２１；配列番号１１の残基４９２〜４９８；
【０１３７】
配列番号１１の残基５１６〜５２２；配列番号１１の残基５４６〜５５１；配列番号１１の残基５９３〜５９８；配列番号１１の残基７２４〜７３０；配列番号１１の残基７４２〜７４８；配列番号１１の残基７８７〜７９３；配列番号１１の残基１３〜４０；配列番号１１の残基３０〜６６；配列番号１１の残基６０〜１０７；配列番号１１の残基８５〜１３５；配列番号１１の残基１２３〜１７２；配列番号１１の残基１６７〜２０１；配列番号１１の残基１８９〜２２５；配列番号１１の残基２１３〜２７４；配列番号１１の残基２５７〜３０２；配列番号１１の残基２９３〜３２７；配列番号１１の残基３０９〜３４２；配列番号１１の残基３３４〜３５８；配列番号１１の残基２４８〜３７６；配列番号１１の残基３６６〜４０８；配列番号１１の残基３８６〜４２５；配列番号１１の残基４１０〜４９９；
【０１３８】
配列番号１１の残基４７２〜５２５；配列番号１１の残基５０９〜５５１；配列番号１１の残基５２７〜６１９；配列番号１１の残基６２１〜６４９；配列番号１１の残基６３５〜６９０；配列番号１１の残基６８２〜７０２；配列番号１１の残基６９５〜７３４；配列番号１１の残基７２３〜７５２；配列番号１１の残基７３９〜７６３；および配列番号１１の残基７５５〜７９３。これらの抗原を動物に接種することによって発生した免疫応答からの抗体を、本明細書において記載するように、単離し、精製することができる。
【０１３９】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造し、単離する方法はこの分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｏｌｉｇａｎ他（編者）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＨｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．  Ｇ．  Ｒ．編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９８２。
【０１４０】
当業者にとって明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットにｚｄｉｎｔ５ポリペプチドまたはそのフラグメントを接種することによって、ポリクローナル抗体を発生させることができる。アジュバント、例えば、明礬（水酸化アルミニウム）またはフロインド完全アジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用することによって、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの免疫原性を増加させることができる。
【０１４１】
免疫化に有効なポリペプチドは、また、融合ポリペプチド、例えば、ｚｄｉｎｔ５またはその部分と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチドは全長の分子またはその部分であることができる。ポリペプチドの部分が「ハプテン様」である場合、このような部分は免疫化のために高分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド）好都合に接合または結合することができる。
【０１４２】
本明細書において使用するとき、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合性フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂタンパク質分解的フラグメントを包含する。遺伝子操作された無傷抗体またはフラグメント、例えば、キメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体およびその他、ならびに合成抗原結合性ペプチドおよびポリペプチドをまた包含される。
【０１４３】
非ヒトＣＤＲをヒトフレームワークおよび定常領域上にグラフトするか、あるいは全体の非ヒト可変ドメインを組込む（必要に応じて暴露された残基の置換によりそれらをヒト様表面で「クローキング」する、ここで結果は「ベニヤ化抗体」である）ことによって、非ヒト抗体をヒト化することができる。ある場合において、ヒト化抗体は可変領域フレームワーク内の非ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強することができる。抗体をヒト化することによって、生物学的半減期を増加させることができ、そして投与時の悪い免疫反応の可能性を減少させる。
【０１４４】
ここにおいて有効な抗体を発生させまたは選択する別の技術は、ｚｄｉｎｔ５タンパク質またはタンパク質に対するリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ暴露、およびファージまたは同様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーを包含する（例えば、固定化または標識化されたｚｄｉｎｔ５タンパク質またはペプチドを使用する）。ファージ上にまたは細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）上にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、潜在的ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド結合性ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。
【０１４５】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダム突然変異誘発およびランダムペプチド合成により得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを使用して、既知のターゲットと相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。既知のターゲットは、タンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物学的または合成高分子、または有機または無機の物質であることができる。
【０１４６】
このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーをつくり、スクリーニングする技術はこの分野において知られおり（Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第５，４０３，４８４号およびＬａｄｎｅｒ他、米国特許第５，５７１，６９８号）そしてランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（マサチュセッツ州ベバーリイ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ニュージャージイ州ピスカタウェイ）から商業的に入手可能である。
【０１４７】
本明細書に開示するｚｄｉｎｔ５を使用してランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、ｚｄｉｎｔ５に結合するタンパク質を同定することができる。ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合性タンパク質」は、細胞をタグ化するために；アフィニティー精製によりホモローグポリペプチドを単離するために使用することができる；それらを薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に直接的または間接的に結合させることができる。また、これらの結合性タンパク質は分析法、例えば、発現ライブラリーをスクリーニングする方法および活性を中和する方法において使用することができる。
【０１４８】
結合性タンパク質は、また、ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイ；根元的病理または疾患のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出または定量する診断アッセイにおいて使用することができる。また、これらの結合性タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるｚｄｉｎｔ５の結合およびシグナルトランスダクションをブロックするｚｄｉｎｔ５「アンタゴニスト」として作用することができる。これらの抗ｚｄｉｎｔ５結合性タンパク質は、一般に、例えば、プロテアーゼ活性、または血管形成阻害をモジュレートするために使用されるであろう。
【０１４９】
抗体が対照（非ｚｄｉｎｔ５）ポリペプチドに対する結合アフィニティーよりも少なくとも１０倍大きい結合活性（ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに対する）の限界レベルを示す場合、抗体は特異的に結合性であると決定される。抗体の結合アフィニティーは、当業者により、例えば、スキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ｇ．、Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０−６７２、１９４９）により、容易に測定することができる。
【０１５０】
ｚｄｉｎｔ５タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために、当業者に知られている種々のアッセイを利用することができる。典型的なアッセイは下記の文献に詳細に記載されている：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編者）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８。このようなアッセイの代表例は下記のものを包含する：並流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。さらに、野生型ｖｓ突然変異体ｚｄｉｎｔ５タンパク質またはポリペプチドに対する結合について、抗体をスクリーニングすることができる。
【０１５１】
ｚｄｉｎｔ５を発現する細胞をタグ化するために；アフィニティー精製によりｚｄｉｎｔ５を単離するために；ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイのために；根元的病理または疾患のマーカーとして可溶性ｚｄｉｎｔ５を検出または定量するために；ＦＡＣＳを使用する分析法において；発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗イディオタイプ抗体を発生させるために；そして中和性抗体としてまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｚｄｉｎｔ５をブロックするアンタゴニストとして；ｚｄｉｎｔ５に対する抗体を使用することができる。
【０１５２】
適当な直接的タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する；ここにおける抗体は、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に対して直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの接合体をｉｎ  ｖｉｖｏ診断または療法的用途に使用することができる。そのうえ、アッセイ、例えば、ウェスタンブロットまたはこの分野において知られている他のアッセイにおいて、変性されたｚｄｉｎｔ５またはそのフラグメントを検出するために、ｚｄｉｎｔ５に対する抗体またはそのフラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて使用することができる。
【０１５３】
ここにおける抗体またはポリペプチドは、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に対して直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの接合体をｉｎ  ｖｉｖｏ診断または療法的用途に使用することができる。例えば、対応する抗相補的分子（例えば、それぞれ、インテグリンまたは抗原）を発現する組織または器官を同定または処置するために、本発明のポリペプチドまたは抗体を使用することができる。さらに詳しくは、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドまたは抗ｚｄｉｎｔ５抗体、またはそれらの生物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカップリングし、抗相補的分子を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【０１５４】
適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこれらの分子は放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する。適当な細胞障害性分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこれらの分子は細菌または植物トキシン（例えば、ジフテリアトキシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシン、リシン、アブリンおよびその他）、ならびに療法上の放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１、レニウム−１８８またはイットリウム−９０を包含する（ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合させるか、あるいは例えば、キレート化部分を通して間接的に結合させる）。
【０１５５】
また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシンに複合化することができる。検出可能なまたは細胞障害性分子を間接的に結合させるために、検出可能なまたは細胞障害性分子を相補的／抗相補的対の１メンバーと複合化することができ、ここで他方のメンバーをポリペプチドまたは抗体部分に結合させる。これらの目的のために、ビオチン／ストレプトアビジンは典型的な相補的／抗相補的対である。
【０１５６】
別実施態様では、ポリペプチド−毒素融合蛋白質又は抗体−毒素融合蛋白質は標的細胞又は組織を阻害し、又は除去するために使用することができる（例えば癌細胞又は組織の治療に）。あるいは、ＴＳＰ１−様ドメインのみを含む融合蛋白質は、検出可能分子、細胞傷害性分子又は相補性分子を所望する型の細胞又は組織（即ち細胞外マトリックス）に方向付けるのに好適であろう。同様に、ｚｄｉｎｔ５に対応する結合相手には検出可能又は細胞傷害性分子を結合させることができ、一般的な相補的−検出可能／細胞傷害性分子標識体に関する細胞／組織特異的運搬に適した一般的な標的ビークルを提供できる。
【０１５７】
別実施態様では、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド又は抗ｚｄｉｎｔ５抗体が以下器官由来の高増殖性組織を標的にするのであれば、ｚｄｉｎｔ５−サイトカイン融合蛋白質又は抗体−サイトカイン融合蛋白質はインビボでの標的組織（例えば結腸、小腸、胎児肺、清掃及びＢ−細胞）殺滅の促進に使用できる。（一般的にＨｏｒｎｉｃｋら、Ｂｌｏｏｄ ８９：４４３７−４７，１９９７参照）。
【０１５８】
かれらは作用が望まれる部位をサイトカインの標的とすることができ、それによりサイトカインの局所的濃度を高めることができる融合蛋白質を既述している。好適ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド又は抗−ｚｄｉｎｔ５抗体は望ましくない細胞又は組織（即ち腫瘍又は白血病）を標的とし、融合サイトカインはエフェクター細胞による高められた標的細胞融解を伝達する。本目的に好適なサイトカインには、例えばインターロイキン２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれる。
【０１５９】
ここに記載の生物活性型ポリペプチド又は抗体標識体は静脈内、動脈内又は腺管内に供給でき、あるいは作用を意図する部位に局所的に導入されるだろう。本発明のｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、完全長ポリペプチド、生物学的に活性な断片及び融合ポリペプチドを含め、通常の技術に従い遺伝子工学宿主細胞にて産生することができる。好適宿主細胞は外来性ＤＮＡによって形質転換できる、又はトランスフェクションでき、培養により増殖可能なタイプの細胞であり、細菌、真菌細胞及び培養高等真核細胞を含む。
【０１６０】
真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化ＤＮＡ分子を操作し、外来性ＤＮＡを各種宿主細胞内に導入するための技術はＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ． １９８９，及びＡｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， １９８７。
【０１６１】
一般にｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内にて発現に必要なその他遺伝的要素と動作可能に結合しており、一般には転写プロモーター及びターミネーターを含んでいる。更に当業者はあるシステム内では選択可能マーカーが別々のベクターに備えられても良く、そして外来性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム内への組み込みにより提供されることを認識するが、一般にはベクターは１又はそれ以上の選択可能なマーカー及び１又はそれ以上の複製介し起点を含んでいる。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクター及びその他要素の選択は、当分野通常技術水準内にある一般的事項である。多くのこの様な要素は文献に記載されており、商業的供給会社より入手できる。
【０１６２】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られている）が発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列はｚｄｉｎｔ５の分泌シグナル配列でよく、又はその他分泌型蛋白質（例えばｔ−ＰＡ）由来、又は新たに合成されたものでも良いだろう。分泌シグナル配列はｚｄｉｎｔ５ＤＮＡ配列に動作可能に結合され、即ち２配列は正確な読みとり枠内に結合し、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞分泌経路内に導かれる様に配置される。分泌シグナル配列は一般に対象ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置するが、一部分泌シグナル配列は対象ＤＮＡ配列内の別の部位に位置するだろう（Ｗｌｅｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号参照）。
【０１６３】
本発明のポリペプチドの未変性分泌シグナル配列は、その他ポリペプチドを分泌経路へ導くのに使用される。本発明はこの様な融合ポリペプチドを提供する。当業者既知でありここに開示されている方法を用いることで、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド由来分泌シグナル配列が他ポリペプチドに動作可能に結合されているシグナル融合ポリペプチドが作ることができる。本発明の融合ポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は追加ペプチドとアミノ末端側に好ましく融合し、追加ペプチドを分泌経路に導く。例えばこれら新規分泌シグナル配列融合構築体は、受容体の様な一般に非分泌型である蛋白質の活性成分を分泌させることができる。この様な融合体はペプチドを分泌経路させるためにインビボ又はインビトロにて使用できるだろう。
【０１６４】
あるいは、ｚｄｉｎｔ５のプロテアーゼドメインは異なるプロテアーゼドメインを提供する異種配列により置換することができる。この場合、融合産物は分泌でき、ｘｄｉｎｔ５のＴＳＰ１−様ドメインは置換型プロテアーゼドメインを上記特異的組織に誘導できる。この置換型プロテアーゼドメインＤＡＭｓ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓ／ＡＤＡＭ−ＴＳ／ＭＥＴＨ様ファミリー構成体により置き換えられたプロテアーゼドメイン、又はその他既知プロテアーゼ由来のドメインから選択できる。
【０１６５】
同様にｚｄｉｎｔ５蛋白質のＴＳＰ１−様ドメインは異なるＴＳＰ１−様ドメインを提供する異種配列により置換できる。この場合も、融合蛋白質は分泌でき、置換型ＴＳＰ１−様ドメインはｚｄｉｎｔ５のプロテアーゼドメインを特定組織に誘導できる。置換型ＴＳＰ１−様ドメインはＡＤＡＭｓ／ＭＤＣｓ／ＳＶＭＰｓ／ＭＥＴＨ−様ファミリー構成体のＴＳＰ１−様ドメインから選択できる。これら例では融合産物は、可溶性又は膜固定型蛋白質だろう。
【０１６６】
培養哺乳動物細胞は本発明の好適宿主である。哺乳動物宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入する方法には、リン酸カルシウム伝達トランスフェクション法（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４： ７２５， １９７８； ＣｏｒｓａｒｏとＰｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３， １９８１：ＧｒａｈａｍとＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６， １９７３）、エレクトロポレーション法（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ， １：８４１−５， １９８２）、ＤＥＡＥ−デキストラン伝達トランスフェクション法（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）、及びリポソーム伝達トランスフェクション法（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ １５：７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅら、Ｆｏｃｕｓ １５：８０， １９９３，及びウイルスベクター（ＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９０， １９８９； ＷａｎｇとＦｉｎｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２： ７１４−６， １９９６）。
【０１６７】
培養哺乳動物細胞での組換え体ポリペプチドの産生は例えばＬｅｖｉｎｓｏｎら、米国特許第３，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号；及びＲｉｎｇｏｌｄ、米国特許第４，６５６，１３４号により開示されている。好適培養哺乳動物細胞にはＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２， １９７７）及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株（例えばＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）が含まれる。
【０１６８】
その他好適細胞株が当分野既知であり、米国基準株コレクション（Ｍａｎａｓａｓ、ＶＡ）の様な好適寄託機構より入手できる。一般にＳＶ−４０又はサイトメガロウイルス由来プロモーターの様な強力な転写プロモーターが好ましい。例えば米国特許第４，９５６，２８８号を見よ。その他好適プロモーターには、メタロチオネイン遺伝子由来のもの（米国特許第４，５７９，８２１号及び第４，６０１，９７８号）及びアデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。
【０１６９】
一般には薬物選別が使用され、外来ＤＮＡが挿入された培養哺乳動物細胞が選択される。この様な細胞は一般には“トランスフェクタント”と称される。選択薬剤存在下に培養され、所望遺伝子をその子孫に伝えることができる細胞は“安定型トランスフェクタント”と呼ばれる。好ましい選別マーカーは抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選別はＧ−４１８等のネオマイシン型薬剤存在下に実施される。選別システムは“増幅”と呼ばれる工程である、所望遺伝子の発現レベルの向上にも利用できる。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選別薬剤存在下に培養し、続いて選別薬剤量を増加して高レベルの導入遺伝子産生を行う細胞を選別し、実施される。
【０１７０】
好適な増幅化能選別マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素であり、メトトレキセートに対する耐性を付与する。その他薬剤耐性遺伝子（例えば非グロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も利用できる。緑色蛍光蛋白質、又はＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩＭＨＣの様な細胞表面蛋白質、胎盤アルカリフォスファターゼの様なその他表現形を導入するその他マーカーは、ＦＡＣＳソーティング又は磁性ビーズ分離技術の様な手法による、非トランスフェクト細胞からのトランスフェクト細胞の選別に使用できるだろう。
【０１７１】
植物細胞、昆虫細胞及び鳥類細胞を含むその他高等真核生物細胞も宿主として利用できる。植物右細胞内の遺伝子発現に関するベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の使用はＳｉｎｋａｒら、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８， １９８７にレビューされている。昆虫細胞の形質転換及びその中での外来ポリペプチドの産生はＧｕａｒｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２２号及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号に開示されている。
【０１７２】
昆虫細胞は一般にはオートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｓｕｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ） 由来の組換え体バキュロウイルスで感染できる。Ｋｉｎｇ， Ｌ．Ａ及びＰｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．，バキュロウイルス発現系、ラボラトリーガイド（Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ）， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ．Ｒ．ら、バキュロウイルス発現ベクター；ラボラトリーマニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， １９９４； 及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， 編、バキュロウイルス発現プロトコール、分子生物学に於ける方法（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９５参照。
【０１７３】
組換え体ｚｄｉｎｔ５バキュロウイルスを作製する第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ（Ｌｕｃｋｏｗ、Ｖ．Ａ，ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７：４５６６−７９， １９９３）報告のトランスポゾンをベースとした系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系は、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）として市販されている。この系はトランスファーベクターであるＴｎ７トランスポゾンを含むｐＦａｓｔＢａｃ１ＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするＤＮＡを”Ｂａｃｍｉｄ”と呼ばれる大型プラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉ内に維持されたバキュロウイルスゲノム内に移動させる。ｐＦａｓｔＢａｃ１ＴＭトランスファーベクターはＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターを利用し所望遺伝子、本例ではｚｄｉｎｔ５の発現を誘導する。
【０１７４】
ポリヘドリンプロモーターは除去しバキュロウイルス感染初期に発現し、分泌蛋白質の発現に有利であることが示されているバキュロウイルス塩基性蛋白質プロモーター（Ｐｃｏｒ、ｐ６．９又はＭＰプロモーターとしても知られる）で置換することができる。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ及びＰｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ， ７１：９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４；及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．，及びＲａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７０： １５４３−９， １９９５参照。これらトランスファーベクターでは、短形及び長形の塩基性蛋白質プロモーターが使用できる。
【０１７５】
更に、未変性ｚｄｉｎｔ５分泌シグナル配列を昆虫蛋白質由来の分泌シグナル配列に置換したトランスファーベクターを構築できる。例えば、エクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、又はバキュロウイスルｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）由来の分泌シグナル配列を構築体内に利用し、未変性ｚｄｉｎｔ５分泌シグナル配列を置換することができる。更に、トランスファーベクターは発現されたｚｄｉｎｔ５ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端にエピトープタグ、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕエピトープタグ（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．８２： ７９５２−４， １９８５）をコードするＤＮＡを持つ読みとり枠内融合体を含むことができる。
【０１７６】
当分野既知の技術を利用し、ｚｄｉｎｔ５を含むトランスファーベクターはＥ．ｃｏｌｉ内に形質導入され、組換え体バキュロウイルスを示す中断型ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄｓに関しスクリーニングされる。組換え体バキュロウイルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄＤＮＡは通常技術により単離され、例えばＳｆ９細胞の様なスポドペトラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｅｔｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクトに利用される。引き続きｚｄｉｎｔ５を発現する組換え体ウイルスが産生される。組換え体ウイルス保存体は、当分野に通常使用さえる方法にて作成される。
【０１７７】
組換え体ウイルスは宿主細胞、典型的にはアワヨトウムシであるスポドフテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来細胞株の感染に使用される。一般的にはＧｌｉｃｋとＰａｓｔｅｒｎａｋ、分子バイオテクノロジー：組換え体ＤＮＡの原理と応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ．， １９９４参照。その他好適細胞株はトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（米国特許第５，３００，４３５号）由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＯＴＭ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） である。市販の無血清培地を使用し細胞を増殖、維持する。
【０１７８】
好適培地はＳｆ９細胞に関してはＳｆ９００ＩＴＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＥＳＦ９２１ＴＭ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）である；そしてＴ．ｎｉ細胞に関してはＥｘ−ｃｅｌｌＯ０４０５ＴＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。細胞は培養密度約２−５×１０３細胞ないし密度１−２×１０６細胞まで増殖させ、その時点で組換え体ウイルス保存体を多重感染度（ＭＯＩ）０．１ないし１０、より一般的には約３で加える。使用方法は市販の研究用マニュアルに一般的に記載されている（Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ及びＰｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．，上記；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ．Ｒら、上記；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ．Ｄ．，上記）。続く上清からのｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの精製はここに記した方法を利用し達成できる。
【０１７９】
酵母細胞を含む真菌細胞も本発明に使用できる。この観点に於いて特に興味深い酵母の種はサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）， 及びピヒア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）である。サッカロミセス・セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を外来ＤＮＡにて形質転換する方法、及びそれより組換え体ポリペプチドを産生する方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ、米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号及びＭｕｒｒａｙら、米国特許第４，８４５，０７５号に開示されている。
【０１８０】
形質転換細胞は選別マーカー、一般には薬剤耐性又は特定栄養素（例えばロイシン）無しでの増殖能力により決定される表現形にて選別される。サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での使用に好適なベクター系はＫｗａｗａｋｉらにより開示されたＰＯＴ１ベクター系であり（米国特許第４，９３１，３７３号）、それにより形質転換細胞をグルコース含有培地中での増殖から選別することができる。酵母での使用に好適なプロモーター及びターミネーターには、糖分解性酵素遺伝子（例えばＫａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ、米国特許第４，９７７，０９２号）及びアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが含まれる。
【０１８１】
米国特許第４，９９０，４４６号；５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６号及び第４，６６１，４５４号も参照せよ。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）， シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）， クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）， クリイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）， ウルチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）， ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）， ピヒア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）， ピヒア・グイレルホンディー（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）及びキャンディダ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）を含むその他酵母に関する形質転換系は当分野既知である。例えばＧｌｅｅｓｏｎら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２：３４５９−６５， １９８６及びＣｒｅｇｇ、米国特許第４，８８２，２７９号を参照のこと。
【０１８２】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞はＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従い利用されるだろう。アクレロニウム・クリソゾナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換する方法はＳｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号に開示されている。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換する方法はＬａｍｂｏｗｉｔｚ、米国特許第４，４８６，５３３号に開示されている。組換え体蛋白質産生の宿主としてのピヒア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の使用は米国特許第５，７１６，８０８号、第５，７３６，３８３号、第５，８５４，０３９号及び第５，８８８，７６７号に開示されている。
【０１８３】
細菌大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びその他属を含む前核生物宿主細胞も本発明に於ける有用な宿主細胞である。これら宿主を形質転換し、その中にクローン化されている外来ＤＮＡ配列を発現する技術は当分野で良く知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照）。ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉの様な細菌内に発現させる場合、ポリペプチドは典型的には不溶性顆粒として細胞質に留まるか、又は細菌性分泌経路によりペリプラズム間隙内に運ばれるだろう。前者では、細胞は溶解され、顆粒は回収され、例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を使用し変性される。
【０１８４】
変性されたポリペプチドは次に、例えば尿素溶液及び還元型と酸化型グルタチオンの組合せ溶液に対し透析し、齟齬の緩衝化生理食塩水に対し透析する様にして変性剤を希釈することで、再度折りたたまれダイマー形成することができる。後者の場合には、細胞を破壊し（例えば超音波処理又は浸透圧ショック）ペリプラズム間隙より可溶性の機能型としてペリプラズム間隙内容物を放出させ、蛋白質を回収することで、変性及び再折りたたみの必要性を回避しポリペプチドを回収することができる。
【０１８５】
形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞は通常の方法に従い、栄養素及び選択された宿主細胞の増殖に必要とされるその他成分を含む培地内に培養される。限定培地及び複合培地を含む各種好適培地が当分や既知であり、一般には炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。培地は更に成長因子又は血清の様な成分も必要に応じ含むだろう。増殖培地は一般に、例えば発現ベクターに乗り運ばれるか又は宿主細胞内に共トランスフェクションされた選別マーカーにより補完される薬剤選別または必須栄養素の欠失により、外来性に添加されたＤＮＡを含む細胞を選別するだろう。
【０１８６】
ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞は炭素、窒素及び微量栄養素の適当な源を含む培地中、約２５℃ないし３５℃の温度にて培養される。液体培養体は小型フラスコの振とう、又はファーメンターのスパーリングの様な通常の方法により十分通気される。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）に関する好適培地はＹＥＰＤ（２％Ｄ−グルコース、２％ＢａｃｔｏＴＭペプトン（Ｄｉｆｏｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）、１％ＢａｃｔｏＴＭ酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．００４％アデニン及び０．００６％Ｌ−ロイシン）である。
【０１８７】
本発明の蛋白質は非天然に生ずるアミノ酸残基も含むことができる。非天然型に生ずるアミノ酸は、以下に限定されるものではないが、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコール酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔ−ロイシン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン及び４−フルオロフェニルアラニンを含む。
【０１８８】
非天然型アミノ酸残基を蛋白質に取り込ませるための幾つかの方法が当分野で既知である。例えばナンセンス変異を化学的にアミノアシル化した抑制型ｔＲＮＡを利用し抑制するインビトロ系が利用できる。アミノ酸を合成する方法及びｔＲＮＡをアミノアシル化する方法は当分野既知である。ナンセンス変異を含むプラスミド転写及び翻訳はＥ．ｃｏｌｉＳ３０抽出物及び市販の酵素ならびにその他試薬を含む無細胞系にて実施される。蛋白質はクロマトグラフィーにて精製される。例えばＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、 Ｊ． Ａｍ， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｉｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１， １９９１； Ｃｈｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９；８０６−９， １９９３；及びＣｈｕｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０１４５−９， １９９３）を見よ。
【０１８９】
第２の方法では、翻訳は変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化された抑制ｔＲＮＡのマイクロインジェクションにより、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵細胞内にて実施される（Ｔｕｒｃａｔｔｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９９９１−８， １９９６）。第３の方法では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は置換される天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）なしに、所望の非天然型アミノ酸（例えば２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下に培養される。
【０１９０】
非天然型アミノ酸はそれに対応する天然アミノ酸に代わって蛋白質内に取り込まれる。Ｋｏｉｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７４７０−６、１９９４参照。天然型アミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により非天然型に転換することができる。化学修飾は部位特異的突然変異誘導と組み合わせ、更に置換範囲を拡大することができる（Ｗｙｎｎ及びＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２：３９５−４０３， １９９３）。
Ｚｄｉｎｔ５アミノ酸残基に関しては、非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に生じないアミノ酸及び非天然型アミノ酸の限定数が置換されるだろう。
【０１９１】
本発明のポリペプチドを８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上精製することが好ましく、特に好ましくは医薬品として純粋な状態、即ち混入高分子、特にその他蛋白質及び拡散に関して９９．９％より高く純粋であり、感染性及び発熱性作用物質を含まないことが好ましい。好ましくは精製ポリペプチドはその他ポリペプチド、特に動物起源のその他ポリペプチドを実施含まないことが好ましい。
【０１９２】
発現組換え体ｚｄｉｎｔ５蛋白質（キメラポリペプチド及び多量体蛋白質を含む）は通常の蛋白質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組み合わせにより精製される。一般的にはＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８；及びＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４を見よ。
【０１９３】
ポリヒスチジンアフィニティータグ（典型的には約６ヒスチジン残基）を含む蛋白質は、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。例えばＨｏｕｃｈｕｌｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．６： １３２１−１３２５， １９８８を見よ。Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグを含む蛋白質は、通常の方法に従い免疫親和性クロマトグラフィーにより精製できる。たとえばＧｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら、上記を見よ。マルトース結合蛋白質融合体は、当分野既知の方法に従いアミロースカラムにより精製される。
【０１９４】
本発明のポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー、分子篩い及びアフィニティークロマトグラフィーを含む方法の組み合わせにより単離できる。例えば、固定金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーを利用し、ポリヒスチジンタグを含む蛋白質を含む富ヒスチジン蛋白質を精製できる。簡単に述べると、まずゲルに２価金属イオンを加えキレートを形成させる（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３：１−７， １９８５）。富ヒスチジン蛋白質は使用した金属イオンに依存し、各種親和性にてこのマトリックスに吸着され、そして競合的溶出体、ｐＨの低下、強力なキレート形成剤の使用により溶出されるだろう。
【０１９５】
その他精製法には、レシチンアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化蛋白質の精製が含まれる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ．１８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，（編集）、Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ｐｐ．５２９−３９）。発明の別の実施態様では精製を容易にするために、目的のポリペプチドとアフィニティータグ（例えばマルトース結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン）の融合体が構築されるだろう。
【０１９６】
Ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、排除固相合成法、部分固相法、断片濃縮又は古典的液層合成法を含む、当分野既知の方法による化学合成によっても調整できる。例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．８５：２１４９， １９６３； Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｍｅｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， １９８４； Ｂａｙｅｒ及びＲａｐｐ， Ｃｈｅｍ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． ３： ３， １９８６； 及びＡｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８９を見よ。
当分野既知の方法を利用し、ｚｄｉｎｔ５蛋白質はモノマー又は多量体として調整でき；グリコシル化又は非グリコシル化でき：ぺギル化又は非ペギル化でき；及び初期アミノ酸残基を含むことも、又は含まないこともできる。
【０１９７】
メタロプロテアーゼ（配列番号２）及びＴＳＰ１−様ドメイン（即ち配列番号５及び８）は結腸、小腸、小児肺、精巣及びＢ−細胞の疾患のアッセイ及び治療への利用に関し特に興味深い。メタロプロテアーゼドメインは感染に対する宿主防衛系の活性化に関係しているだろう。この様なメタロプロテアーゼの一つはマトリリジンである（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： １１３−１１７， １９９９）。マトリリジンは腸内の病原性細菌の宿主防御に関係していることが示されている。Ｗｉｌｓｏｎらは更にマトリリジンが上皮関連蛋白質として、小腸以外の組織に於ける防御活性化も特異的に制御している可能性を示唆している。
【０１９８】
同様に、ｚｄｉｎｔ５メタロプロテアーゼドメイン（配列番号２）は単独、又はその他ドメイン（即ちｚｄｉｎｔ５のＴＳＰ１−様ドメイン、配列番号５及び８、又は配列番号１１、又はＡＤＡＭ−ＴＳ及びＭＥＴＨ蛋白質ファミリー由来のその他ＴＳＰ１−様ドメイン）と共同し、例えば結腸、小腸及び肺の上皮を侵襲する病原性細菌に対する体反応に関係しているだろう。
あるいは、メタロプロテアーゼドメイン（配列番号２）はプロテアーゼとして工業応用での利用に関する酵素的界面活性剤としても利用できる。当業者はｚｄｉｎｔ５分子の蛋白質分解機能を測定するアッセイを容易に特定できるだろう。
【０１９９】
メタロプロテアーゼドメインの活性を測定するための代表的アッセイは、それの血漿蛋白質分解酵素阻害剤であるα２Ｍへの結合能力を測定することであろう。結合域の切断がα２Ｍサブユニット中に立体構造変化を誘導し、これがプロテアーゼのカプセル化及びα２Ｍ内部のチオエステルの活性化を招き、その結果活性型プロテアーゼの共有交差結合が生じる。Ｎａｇａｓｅ， Ｈら、Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７３２： ２９４−３０２， １９９４参照。
【０２００】
へパリン及びへパリン硫酸は分泌された成長因子及びその他蛋白質の細胞外マトリックスへの結合を促進する分子である。即ちヘパリン及びヘパリン硫酸に結合する分子はこれら成長因子の影響を変調するのに有用である。ヘパリン及びヘパリン結合モチーフは蛋白質のＭＥＴＨやＡＤＡＭ−ＴＳサブグループ中のトロンボスポンジン反復体中に認められている（Ｋｕｎｏ、１９９８、上記参照）。即ちＴＳＰ１−様ドメイン（配列番号５及び／又は８）はヘパリン及びヘパリン硫酸に結合することによって成長因子の影響を変調するのに有用であろう。
【０２０１】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの活性は、例えばプロテアーゼ活性、血管新生阻害剤；細胞外マトリックス形成又はリモデリング；転移、及びＡＤＡＭ／ＭＤＣ／ＳＶＭＰ／ＡＤＡＭ−ＴＳ／ＭＥＴＨファミリー構成体に関連する、あるいはアポトーシスの様なインテグリン／ディスインテグリン相互作用に関連したその他生物学的機能；又は分化を測定する各種アッセイを利用し、測定できる。特に興味深いものは、腫瘍抑制である。
【０２０２】
あるいはスプラシングされたペプチドを含む本発明の蛋白質は、結腸、小腸、胎児肺、清掃及びＢ−細胞での腫瘍抑制、生殖細胞成熟、免疫的認識、及び成長と分化に関し、単独又はその他分子（成長因子、サイトカイン等）と組合せての作用に有効である。ｚｄｉｎｔ５の別スプライシングは細胞型特異的であり、特異的組織に活性を付与するだろう。
【０２０３】
問題のアッセイは小腸、結腸、又は肺組織の増殖、分化、及び／又は発生の変化を測定し、又は検出する。更に、プロテアーゼ活性に対すｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの効果、又は上皮細胞、一般には腫瘍細胞の血管新生阻害に対する効果は、関心の測定対象である。更に別のアッセイは、プロテアーゼ活性及びアポトーシスの変化を検証する。
【０２０４】
精製は培養細胞を利用すること、又はクレームする発明の分子を適当な動物モデルに投与することで、インビボにて測定することができる。一般に、増殖効果は細胞数の増加として観察され、従ってアポトーシス及び有糸分裂誘発の阻害を含むだろう。培養細胞は、初代培養体からの結腸上皮癌細胞、精巣、胎児及び成人の肺、Ｂ細胞、メラノーマ及びヒト臍帯静脈上皮細胞を含む。細胞増殖を測定するアッセイは当分野既知である。
【０２０５】
例えば増殖を測定するアッセイは、色素であるニュートラルレッドに対する化学感受性（Ｃａｖａｎａｕｇｈら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ８： ３４７−３５４， １９９０）、放射線標識ヌクレオチドの取り込み（Ｃｏｏｋら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７９：１−７， １９８９）、増殖細胞のＤＮＡ中への５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み（Ｐｏｒｓｔｍａｎｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８２； １６９−１７９， １９８５）及びテトラゾリウム塩の利用（Ｍｏｓｍａｎｎ、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３， １９８３； Ａｌｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：５８９−６０１， １９８８； Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇ． ５： ６９−８４， １９９５；及びＳｃｕｄｉｅｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８： ４８２７−４８３３， １９８８）の様なアッセイを含む。更に、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは細胞接着を介して細胞増殖、移動及び血管新生に役割を果たしているだろう。
【０２０６】
Ｚｄｉｎｔ５がインビボで化学誘因物質であるかを決定するために、ｚｄｉｎｔ５は皮内又は腹膜内注射により投与できる。注射部位に蓄積した白血球の特徴は、系統特異的細胞表面マーカー及び蛍光免疫サイトメトリーを利用し、又は免疫組織化学により決定できる（Ｊｏｓｅ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：８８１−８７， １９９４）。骨髄から末梢血液への特異的白血球細胞集団の放出も、ｚｄｉｎｔ５注射後に測定するができる。
【０２０７】
分化は漸進的および動的過程であり、多分化能性幹細胞で開始し、最終分化細胞で終結する。細胞系譜へのコミットメントを伴わずに再生し得る多分化能性幹細胞は、細胞系譜へのコミットメントがなされると失われる一組の分化マーカーを発現する。前駆細胞は、細胞が細胞系譜経路を進行して成熟に向かう場合に発現され続けることもある一組の分化マーカーを発現する。成熟細胞により専ら発現される分化マーカーは、通常は細胞生成物、細胞生成物を産生するための酵素、ならびに受容体および受容体様補体分子のような機能的特性を示す。
【０２０８】
細胞集団の分化の段階は、細胞集団中に存在するマーカーの同定によりモニタリングされる。例えば、筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および細網細胞は、共通の間充織幹細胞から生じると考えられる（Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｂａ Ｆｄｎ． Ｓｙｍｐ． １３６：４２−４６， １９８８）。間充織幹細胞のためのマーカーは十分に同定されておらず（Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ８７：７３１−７３８， １９８７）、そこで同定は普通は前駆細胞および成熟細胞段階でなされる。
【０２０９】
ある経路を通って最終分化または脱分化に向かう特定の種類の細胞を刺激する因子は、共通前駆体または幹細胞から生じる全細胞集団に影響を及ぼす、ということを示唆する証拠がある。したがって、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞の内分泌および外分泌細胞の抑制または増殖を刺激し得る。
分化を測定する検定としては、例えば組織の段階特異的発現に関連した細胞表面マーカーの測定、酵素活性、機能的活性または形態学的変化が挙げられる（Ｗａｔｔ， ＦＡＳＥＢ， ５：２８１−２８４， １９９１； Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５７：６３−７５， １９９４； Ｒａｅｓ， Ａｄｖ． Ａｎｉｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅ， １６１−１７１， １９８９）。
【０２１０】
本発明のｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞における増殖または分化を調べるために用いられ得る。本発明のこのような方法は一般に、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、モノクローナル抗体、そのアゴニストまたはアンタゴニストの存在下および非存在下でこれらの組織由来の細胞をインキュベートすること、ならびに細胞の増殖または分化の変化を観察することを包含する。これらの組織からの細胞株は、例えばアメリカ培養細胞コレクション（Ｍａｎａｓａｓ， ＶＡ）から市販されている。
【０２１１】
代替的にスプライスされたペプチドを含めた本発明のタンパク質および断片は、プロテアーゼ活性またはアンギオテンシン阻害を試験するのに有用である。ｚｄｉｎｔ５分子、変異体および断片は、分離して、あるいは結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞中のその他の分子（成長因子、サイトカイン等）と一緒に適用され得る。
【０２１２】
本発明のタンパク質は、治療薬の送達に有用であり、それらの例としては、プロテアーゼ放射性核種、化学療法薬および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの治療薬の作用は、培養細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、組織切片上でｅｘ ｖｉｖｏに、あるいは適切な動物モデルに特許請求した本発明の分子を投与することにより、測定され得る。本発明のタンパク質を検定するための代替的ｉｎ ｖｉｖｏアプローチは、ウイルス送達系を包含する。この目的のためのウイルスの例としては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＷ）が挙げられる。
【０２１３】
二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは近年、異種核酸の送達のためのもっともよく研究された遺伝子運搬ベクターである（再検討のためには、Ｔ．Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：１６１−８９， １９９４；およびＪ．Ｔ．Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：４４−５３， １９９７参照）。アデノウイルス系は、いくつかの利点を提供する：アデノウイルスは、（ｉ）相対的大型ＤＮＡ挿入物を収容し、（ｉｉ）高力価に増殖され、（ｉｉｉ）広範囲の哺乳類細胞型を感染させ、そして（ｉｖ）異なるプロモーターを含有する多数の利用可能なベクターとともに用いられる。さらに、アデノウイルスは血流中で安定であるため、それらは静注により投与され得る。
【０２１４】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失することにより、異種ＤＮＡの大型挿入物（７ ｋｂまで）が収容され得る。これらの挿入物は、直接結紮により、または同時トランスフェクト化プラスミドによる同種組換えにより、ウイルスＤＮＡ中に組み入れられ得る。模範的系では、必須いい１遺伝子がウイルスベクターから欠失されており、宿主細胞（ヒト２９３細胞株が適例である）によりＥ１遺伝子が提供されない限り、ウイルスは複製しない。
【０２１５】
無傷動物に静脈内投与した場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的にする。アデノウイルス送達系がＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウイルスは宿主中で複製し得ない。しかしながら、宿主の組織（例えば肝臓）は、異種タンパク質を発現し、加工処理（そして、分泌シグナル配列が存在する場合には、分泌）する。分泌タンパク質は高度血管新生化肝臓中の循環に入りそして感染動物に及ぼす影響が確定され得る。
【０２１６】
さらに、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含有するアデノウイルスベクターは、ベクターに対する免疫応答を低減または排除するための試みに用いられ得る。このようなアデノウイルスはＥ１欠失化され、さらにＥ２ＡまたはＥ４の欠失を含有する（Ｌｕｓｋｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２０２２−２０３２， １９９８； Ｒａｐｅｒ， Ｓ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：６７１−６７９， １９９８）。さらに、Ｅ２ｂの欠失は、免疫応答を低減することが報告されている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９２６−９３３， １９９８）。
【０２１７】
さらに、全アデノウイルスゲノムを欠失することにより、異種ＤＮＡの非常に大きい挿入物が収容され得る。全ウイルス遺伝子が欠失されたいわゆる「中身のない」アデノウイルスの生成は、異種ＤＮＡの大型挿入物の挿入のために特に有益である（再検討のためには、Ｙｅｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｍ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１：６１５−６２３， １９９７参照）。
【０２１８】
アデノウイルス系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質産生のためにも用いられ得る。細胞が迅速に分裂中でない条件下でアデノウイルス感染非２９３細胞を培養することにより、細胞は長期間タンパク質を産生し得る。例えば、ＢＨＫ細胞を細胞工場で集密まで成長させて、次に当該分泌タンパク質をコードするアデノウイルスベクターに曝露する。次に、有意の細胞分裂を伴わずに感染細胞を数週間生存させる無血清条件下で細胞を成長させる。あるいは、アデノウイルスベクター感染２９３Ｓ細胞は、相対的に高い細胞密度で懸濁培地中で成長して、有意量のタンパク質を産生し得る（参照Ｇａｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：１４５−５５， １９９４）。どちらかのプロトコールを用いて、発現、分泌異種タンパク質を細胞培養上清から反復的に単離し得る。感染２９３Ｓ細胞産生プロトコール内で、非分泌タンパク質も有効に得られ得る。
【０２１９】
可溶性または細胞表面タンパク質として、細胞表面タンパク質相互作用およびその後の生理学的細胞応答に関連した細胞外酸性化率または陽子排出を測定するケイ素ベースのバイオセンサーミクロフィジオメーターにより、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドまたはｚｄｉｎｔ５が結合するペプチドの活性を測定し得る。適例装置は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡにより製造されたサイトセンサーミクロフィジオメーターＣｙｔｏｓｅｎｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒである。
【０２２０】
種々の細胞応答、例えば細胞増殖、鉄輸送、エネルギー産生、炎症性応答、調節および受容体活性化等を、この方法により測定し得る（例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｈ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２， １９９２； Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２８：８４−１０８， １９９７； Ａｒｉｍｉｌｌｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２１２：４９−５９， １９９８； Ｖａｎ Ｌｉｅｆｄｅ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４６：８７−９５， １９９８参照）。ミクロフィジオメーターは、接着性または非接着性真核生物または原核生物細胞を検定するために用い得る。
【０２２１】
長時間、細胞培地中の細胞外酸性化変化を測定することにより、ミクロフィジオメーターは、ｚｄｉｎｔ５タンパク質、それらのアゴニストおよびアンタゴニストを含めた種々の刺激に対する細胞応答を直接測定する。好ましくは、ミクロフィジオメーターを用いて、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに応答しない対照真核生物細胞と比較した、ｚｄｉｎｔ５応答性真核生物細胞の応答を測定する。ｚｄｉｎｔ５応答性真核生物細胞は、ｚｄｉｎｔ５に対する結合相手に関するポリヌクレオチドがトランスフェクトされてｚｄｉｎｔ５に応答性の細胞を作製する細胞、あるいはｚｄｉｎｔ５に対して天然に応答性である細胞を包含する。
【０２２２】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに曝露された細胞の応答の変化により測定される分化は、ｚｄｉｎｔ５変調細胞応答の直接測定値である。さらに、種々の刺激したで、このようなｚｄｉｎｔ５変調応答を査定し得る。本発明は、ｚｄｉｎｔ５タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法であって、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに応答する細胞を提供し、被験化合物の非存在下で細胞の第一部分を培養し、被験化合物の存在下で細胞の第二部分を培養し、そして細胞の第一部分と比較した場合の細胞の第二部分の細胞外酸性化率の測定可能な変化を検出する方法を提供する。
【０２２３】
さらに、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの存在下および被験化合物の非存在下での細胞の第三部分の培養は、ｚｄｉｎｔ５応答性細胞に関する陽性対照ならびに被験化合物のアゴニスト活性をｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの場合と比較するための対照を提供する。ｚｄｉｎｔ５のアンタゴニストは、被験化合物の存在下および非存在下でｚｄｉｎｔ５タンパク質に細胞を曝露し、それによりｚｄｉｎｔ５変調性活性の低減が被験化合物中のアゴニスト活性を示すことにより同定され得る。
【０２２４】
さらに、ｚｄｉｎｔ５は、ｚｄｉｎｔ５変調性経路に応答する細胞、組織または細胞株を同定するために用いられ得る。前記のミクロフィジオメーターを用いて、本発明のｚｄｉｎｔ５に応答性の細胞のようなｚｄｉｎｔ５結合相手を発現する細胞を迅速に同定し得る。細胞は、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドの存在下または非存在下で培養され得る。ｚｄｉｎｔ５の存在下で細胞外酸性化の測定可能変化を引き出す細胞は、ｚｄｉｎｔ５に応答性である。このような細胞株は、前記のようなｚｄｉｎｔ５ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストを同定するために用いられ得る。同様の方法を用いて、ｚｄｉｎｔ５を発現する細胞は、ｚｄｉｎｔ５シグナリング経路を刺激する細胞を同定するために用いられ得る。
【０２２５】
ｚｄｉｎｔ５発現に関して観察される組織分布（結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞）の点から見て、アゴニスト（ネイティブプロテアーゼおよびＴＳＰ１様ドメインを含む）およびアンタゴニストは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ適用の両方において非常に大きい可能性を有する。ｚｄｉｎｔ５アゴニストおよびアンタゴニストとして同定された化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのプロテアーゼ活性、新脈管形成抑制、細胞外マトリックスタンパク質、虚血再還流および炎症の修復およびリモデリングを試験するために有用である。
【０２２６】
例えば、ｚｄｉｎｔ５およびアゴニスト化合物は、限定細胞培地の構成成分として有用であり、そして細胞培養に一般的に用いられる血清に取って代わるために、単独でまたは他のサイトカインおよびホルモンと組合せて用いられ得る。したがって、アゴニストは、培養中の骨髄系およびリンパ系細胞系譜の細胞の成長および／または発達を特異的に促進するのに有用である。さらに、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドおよびｚｄｉｎｔ５アゴニスト、例えば小分子は、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞の拡大、分化および／またはプロテアーゼ活性、あるいは新脈管形成抑制に関する研究試薬として有用である。ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、これらの細胞型に関する組織培地に付加される。
【０２２７】
アンタゴニストも、補体／抗補体対間の相互作用の部位、ならびにプロテアーゼ活性または新脈管形成抑制の部位を特性化するための研究試薬として有用である。ｚｄｉｎｔ５活性の阻害剤（ｚｄｉｎｔ５アンタゴニスト）としては、抗ｚｄｉｎｔ５抗体および可溶性ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド（例えば、配列番号２、５、８および１１における）、ならびにその他のペプチドおよび非ペプチド剤（リボザイムを含む）が挙げられる。
【０２２８】
ｚｄｉｎｔ５は、その活性の阻害剤（アンタゴニスト）を同定するためにも用いられ得る。被験物質が本明細書中に開示された検定に付加されて、ｚｄｉｎｔ５の活性を抑制する化合物を同定する。本明細書中に開示された検定の他に、試料は、ＴＳＰ１様ドメイン／細胞外マトリックス結合あるいはｚｄｉｎｔ５依存性細胞応答の刺激／抑制を測定するよう意図された種々の検定内でｚｄｉｎｔ５活性の抑制に関して試験され得る。例えば、ｚｄｉｎｔ５変調化細胞株は、ｚｄｉｎｔ５刺激性細胞経路に応答するレポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされ得る。
【０２２９】
この種類のレポーター遺伝子構築物は当業界で既知であり、一般的にルシフェラーゼのような検定可能タンパク質または環状ＡＭＰのような代謝物質をコードする遺伝子に操作可能的に連結されたＤＮＡ応答素子を含む。ＤＮＡ応答素子としては、環状ＡＭＰ応答素子（ＣＲＥ）、ホルモン応答素子（ＨＲＥ）、インスリン応答素子（ＩＲＥ）（Ｎａｓｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：５２７３−７， １９９０）および血清応答素子（ＳＲＥ）（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５６：５６３−７２， １９８９）が挙げられるが、これらに限定されない。環状ＡＭＰ応答素子は、Ｒｏｅｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３（１９）：９０６３−６； １９８８およびＨａｂｅｎｅｒ， Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ４（８）：１０８７−９４； １９９０で検討されている。
【０２３０】
ホルモン応答素子は、Ｂｅａｔｏ， Ｃｅｌｌ ５６：３３５−４４； １９８９で検討されている。候補化合物、溶液、混合物または抽出物は、レポーター遺伝子発現のｚｄｉｎｔ５刺激の低減により立証されるように、標的細胞におけるｚｄｉｎｔ５の活性を抑制する能力に関して試験される。この種類の検定は、細胞表面タンパク質、即ち細胞外マトリックスあるいは相補体／抗相補体対の抗相補体成員と結合するｚｄｉｎｔ５を直接遮断する化合物、ならびに相補体／抗相補体結合後の細胞経路における過程を遮断する化合物を検出する。
【０２３１】
代替的には、化合物またはその他の試料は、検出可能標識（例えば、１２５Ｉ、ビオチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣ等）でタグされたｚｄｉｎｔ５を用いて、ｚｄｉｎｔ５結合の直接遮断に関して試験され得る。この種類の検定内では、標識化ｚｄｉｎｔ５の結合を阻害する被験試料の能力は抑制活性を示し、これは二次検定により確証され得る。
【０２３２】
さらに、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニストは、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞組織における創傷治癒を促すために治療的に有用であり得る。本発明のｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストにおけるこの能力の存在を立証するために、当業界で既知の手法にしたがって、創傷治癒を促すそれらの能力に関して、このようなｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを評価する。所望により、この点におけるｚｄｉｎｔ５ポリペプチド性能を、増殖因子、例えばＥＧＦ、ＮＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等と比較し得る。さらに、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドあるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、共働的作用を同定するために、１つ又はそれ以上の増殖因子と組合せて評価され得る。
【０２３３】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、その結合相手（単数または複数）の精製のためにも用いられ得る。固体支持体、例えばアガロースのビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース系樹脂、シリカベースの樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下で安定である同様の物質上に固定される。固体支持体上にポリペプチドを連結するための方法は当業界で既知であり、その例としては、アミン化学作用、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化およびヒドラジド活性化が挙げられる。その結果生じる培地を、一般にカラムの形態で形造し、結合相手を含有する流体を１回またはそれ以上、カラムに通して、結合相手をｚｄｉｎｔ５ポリペプチドに結合させる。次に、塩濃度の変化、カオトロピック剤（グアニジンＨＣｌ）またはｐＨを用いて結合相手を溶離して、ｚｄｉｎｔ５／結合相手結合を中断する。
【０２３４】
リガンド結合受容体（または補体／抗相補体対の一成員である抗体またはその他の細胞表面結合タンパク質）またはその結合断片および市販のバイオセンサー計器（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用する検定系は、有益に用いられ得る。このような受容体、抗体、相補体／抗相補体対または断片は、受容体チップの表面に固定される。この計器の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：２２９−４０， １９９１およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４：５５４−６３， １９９３により開示されている。
【０２３５】
アミンまたはスルフヒドリル化学作用を用いて、受容体、抗体、成員、ディスインテグリンまたは断片を、フローセル内で金フィルムに付着されるデキストラン繊維と共有結合させる。被験試料をセルに通す。インテグリン、エピトープまたは補体／抗補体対の反対成員が試料中に存在する場合、それは固定化ディスインテグリン、抗体または成員とそれぞれ結合して、媒質の屈折率の変化を引き起こし、これは金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系は、結合親和性が算定され得るオン−およびオフ−速度の決定、およびその査定を可能にする。
【０２３６】
プロテアーゼまたはＴＳＰ１様ポリペプチドを結合するプロテアーゼ基質ポリペプチドおよびＴＳＰ１様結合ポリペプチドも、当業界で既知のその他の検定系内に用いられ得る。同様に、ｚｄｉｎｔ５のＴＳＰ１様ポリペプチドと結合する細胞外マトリックスポリペプチドも、他の検定系とともに用いられ得る。このような系としては、結合親和性の決定のためのスキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２， １９４９参照）および熱量検定（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｄｃｅ ２５３：５４５−４８， １９９１； Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：８２１−２５， １９９１）が挙げられる。
【０２３７】
「可溶性タンパク質」とは、細胞膜に結合されないタンパク質である。可溶性タンパク質は、膜貫通および細胞質ドメインを欠く最も一般的なリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性タンパク質は、付加的アミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供するかまたは基質へのポリペプチドの付着のための部位を提供する親和性タグ、あるいはイムノグロブリン定常部配列を包含し得る。多数の細胞表面タンパク質は、タンパク質分解により産生され得るかまたは代替的スプライス化ｍＲＮＡから翻訳される天然可溶性対応体を有する。タンパク質は、それぞれ膜固定またはシグナル伝達を提供するのに十分なこれらのセグメントの部分を欠く場合、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないといわれている。
【０２３８】
可溶性形態のｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、例えば配列番号２、５、８および１１のポリペプチドは、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用し、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞におけるｚｄｉｎｔ５の作用を変調するのに有用である。
本発明の分子は、プロテアーゼ活性に、あるいは新脈管形成抑制に関与する細胞外マトリックスタンパク質、あるいは相補体／抗相補体対の成員を同定および単離するために用いられ得る。
【０２３９】
例えば、本発明のタンパク質およびペプチドは、カラム上に固定され、膜調製物がカラム上を走行する（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９２，ｐｐ．１９５−２０２）。タンパク質およびペプチドは、放射能標識され得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ｖｏｌ． １８２，”Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， ｅｄ．， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ７２１−３７）か、光親和性標識され（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：４８３−５１４， １９９３およびＦｅｄａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３３：１１６７−８０， １９８４）、そして特異的細胞表面タンパク質が同定され得る。
【０２４０】
本発明のポリペプチド、核酸および／または抗体は、胃腸照射、化学療法または抗体使用後の回復に関連した障害の治療に用い得る。さらに、本発明の分子は、抗感染剤および／または細胞外マトリックス修復およびリモデリングとして有用であり得る。本発明の分子は、タンパク質分解、アポトーシス、新脈管形成、感染、細胞接着、細胞融合およびシグナリングを変調するために、あるいは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞のような多様な組織における病理学的症状の発症を治療または予防するために用い得る。
【０２４１】
特に、ある種の疾患は、このような診断、治療または予防を受け容れ得る。本発明の分子は、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞における内皮の抑制および増殖を変調するために用い得る。ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドによる診断、治療または予防を受け容れ得る疾患としては、例えば腫瘍形成、クローン病、炎症性腸疾患、食物中毒、黒色腫および変性疾患が挙げられる。
【０２４２】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｚｄｉｎｔ５活性を増大または抑制するのが望ましい遺伝子療法適用内で有用である。哺乳類が突然変異化ｚｄｉｎｔ５遺伝子を有するかまたはｚｄｉｎｔ５遺伝子を有さない場合、ｚｄｉｎｔ５遺伝子は哺乳類の細胞中に導入され得る。一実施態様では、ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドをコードする遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏでウイルスベクターに導入される。このようなベクターとしては、弱毒または欠陥ＤＮＡウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
ウイルス遺伝子を全部またはほぼ全部欠く欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞に導入後は感染性でない。欠陥ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染し得る懸念なしに、特定の局在化領域の細胞への投与を可能にする。特殊なベクターの例としては、欠陥単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２：３２０−３０， １９９１）および弱毒アデノウイルスベクター、例えばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：６２６−３０， １９９２により記載されているようなベクター、ならびに血管アデノ関連ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：３０９６−１０１， １９８７； Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−８， １９８９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４４】
別の実施態様では、ｚｄｉｎｔ５遺伝子は例えば米国特許第５，３９９，３４６号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等）；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３３：１５３， １９８３；米国特許第４，６５０，７６４号（Ｔｅｍｉｎ等）；米国特許第４，９８０，２８９号（Ｔｅｍｉｎ等）；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１１２０， １９８８；米国特許第５，１２４，２６３号（Ｔｅｍｉｎ等）；国際特許公告ＷＯ ９５／０７３５８（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ等、１９９５年３月１６日公開）；およびＫｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５， １９９３に記載されているように、レトロウイルスベクターに導入され得る。あるいは、ベクターは、リポソームを用いたｉｎ ｖｉｖｏでのリポフェクションにより導入され得る。
【０２４５】
合成陽イオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのためのリポソームを調製し得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７， １９８７；Ｍａｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０２７−３１， １９８８）。特定器官にｉｎ ｖｉｖｏで外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、いくつかの実際的利点を有する。
【０２４６】
特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは、有益な一分野を示す。特に、特定の細胞への直接トランスフェクションは、有益な一分野を表す。例えば、特定細胞型への直接トランスフェクションは、細胞不均一性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓および脳において特に有益である。脂質は、ターゲッティングの目的のために他の分子と化学的に結合され得る。標的化ペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）、タンパク質、例えば抗体、または非ペプチド分子は、リポソームと化学的に結合され得る。
【０２４７】
同様に、ｚｄｉｎｔ５ポリヌクレオチド（配列番号１、３、４、６、７、９、１０または１２）は、特定組織、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞を標的するために用いられ得る。身体から標的細胞を除去し、裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に身体に形質転換化細胞を再移植することができる。遺伝子療法のための裸ＤＮＡベクターは、当業界で既知の方法により、例えばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター運搬体の使用により、所望の宿主細胞中に導入され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９６３−７， １９９２； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１４６２１−４， １９８８参照）。
【０２４８】
アンチセンスおよびリボザイム法を含めた種々の技法を用いて、例えば細胞増殖をｉｎ ｖｉｖｏで抑制するために、ｚｄｉｎｔ５遺伝子転写および翻訳を抑制し得る。ｚｄｉｎｔ５コードポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、４、６、７、９、１０または１２で記述されるようなポリヌクレオチド）のセグメントと相補的であるポリヌクレオチドは、ｚｄｉｎｔ５コードｍＲＮＡと結合し、そしてこのようなｍＲＮＡの翻訳を抑制するよう意図される。このようなアンチセンスポリヌクレオチドを用いて、細胞培養中のまたは被験者におけるｚｄｉｎｔ５ポリペプチドコード遺伝子の発現を抑制する。
【０２４９】
「トランスジェニックマウス」と呼ばれるｚｄｉｎｔ５遺伝子を発現するよう工学処理されたマウス、および「ノックアウトマウス」と呼ばれるｚｄｉｎｔ５遺伝子機能の完全非存在を示すマウスも生成され得る（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１０８３， １９９２； Ｌｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７４０−４２， １９９３； Ｃａｐｅｅｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２， １９８９； Ｐａｌｍｉｔｅｒ， Ｒ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． ２０：４６５−４９９， １９８６）。例えば、遍在的に、あるいは組織特異的または組織制限プロモーター下でｚｄｉｎｔ５を過剰発現するトランスジェニックマウスを用いて、過剰発現が表現型を生じるか否かを問う。
【０２５０】
例えば、野生型ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、ポリペプチド断片またはその突然変異体の過剰発現は、正常細胞過程を変え、ｚｄｉｎｔ５発現が機能的に関連する組織を同定し、ｚｄｉｎｔ５、そのアゴニストまたはアンタゴニストに対する治療的標的を示し得る表現型を生じ得る。例えば、工学処理するためのトランスジェニックマウスは、可溶性ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド（配列番号１１の約アミノ酸１０４〜３０６）を過剰発現するものである。さらに、このような過剰発現は、ヒト疾患との類似性を示す表現型をもたらす。同様に、ノックアウトｚｄｉｎｔ５マウスを用いて、ｚｄｉｎｔ５がｉｎ ｖｉｖｏで絶対に必要とされる場合を確定し得る。
【０２５１】
ノックアウトマウスの表現型は、本明細書中に記載したもののようなｚｄｉｎｔ５アンタゴニストが有し得るｉｎ ｖｉｖｏ作用を予測する。ヒトｚｄｉｎｔ５ｃＤＮＡを用いて、ネズミｚｄｉｎｔ５ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを単離し得るが、これらはその後、ノックアウトマウスを生成するために用いられる。これらのマウスは、ｚｄｉｎｔ５遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために用いられ得るし、対応するヒト疾患のためのｉｎ ｖｉｖｏモデルとして用いられ得る。さらに、本明細書中に記載したｚｄｉｎｔ５に対して向けられるｚｄｉｎｔ５アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムのトランスジェニックマウス発現は、前記のトランスジェニックマウスと同様に用いられ得る。
【０２５２】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチド、その変異体および断片は、プロテアーゼ活性または新脈管形成抑制に関連した障害、例えば概して免疫、炎症、受精、配偶子成熟、免疫学、外傷および上皮性障害に関連した障害に対する置換療法として有用であり得る。
組織形態形成の低広範見積決定基は、細胞再配列の過程である。細胞運動性および細胞−細胞接着はともに、形態形成的細胞再配列において中心的役割を演じると思われる。細胞は、隣接細胞との接触を迅速に破壊し、おそらくは同時的に再作製し得る必要がある（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ， Ｂ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ ６９：３８５−３８７， １９９２参照）。結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞中の分泌タンパク質と同様に、ｚｄｉｎｔ５はこれらのおよびその他の組織中での細胞間再配列に一役を演じ得る。
【０２５３】
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞の組織中で発現される。したがって、本発明のポリペプチドは、細胞接着および転移におけるその役割を調べるのに有用であり、転移、特に結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞の腫瘍における転移を防止するのに有用であり得る。同様に、ｚｄｉｎｔ５のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、腫瘍または罹患組織中のそれらの欠陥対応体を置換し得る。したがって、本発明のｚｄｉｎｔ５ポリペプチド製剤組成物は、これらの組織の病理学的調節または拡大に関連した障害の予防または治療に有用であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、調節可能プロモーターとともに用いられ、したがって送達タンパク質の投与を調節し得る。
【０２５４】
さらに、腫瘍進行および転移に及ぼすｚｄｉｎｔ５の活性および作用は、ｉｎ ｖｉｖｏで測定され得る。いくつかの同質遺伝子マウスモデルは、腫瘍進行に及ぼすポリペプチド、化合物またはその他の治療の影響を試験するために開発された。これらのモデルでは、培養中で継代される腫瘍細胞は、腫瘍ドナーとして同一系統のマウスに移植される。細胞は、レシピエントマウス中で同様の特徴を有する主要に発達し、いくつかのモデルでは転移も起こる。腫瘍モデルとしては、中でもＬｅｗｉｓ肺癌（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１６４２）およびＢ１６黒色腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−６３２３）が挙げられる。
【０２５５】
これらはともに一般的に用いられる腫瘍株であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に培養および操作される、Ｃ５７ＢＬ６マウスと同質遺伝子性である。これらの細胞株のいずれかの移植に起因する腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおいては肺に転移し得る。Ｌｅｗｉｓ肺癌モデルは、新脈管形成の阻害剤を同定するために、近年マウス二重盲検散られている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８， １９９４）。組換えタンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストの毎日注射により、アルは組換え体アデノウイルスの１回注射により、実験的作用物質を用いてＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを処置する。
【０２５６】
この処置の３日後に、１０５〜１０６細胞を背中皮膚したに移植する。あるいは、全身的というよりむしろ腫瘍部位にまたは細胞内にタンパク質が合成されるように、移植前に、細胞それ自体を組換え体アデノウイルス、例えばｚｄｉｎｔ５を発現するものに感染させ得る。マウスは、５日以内に可視的腫瘍を正常に発症する。腫瘍は３週間までの期間増殖させられ、この期間中に、それらは、対照群では１５００〜１８００ ｍｍ３のサイズに達し得る。実験中通して、腫瘍サイズおよび体重を注意深くモニタリングする。
屠殺時点で、腫瘍を取り出して、肺および肝臓と一緒に計量する。肺重量は、転移腫瘍重量とよく相関する。付加的測定として、肺表面転移を計数する。当業界で既知のそして本明細書中に記載した方法を用いて、組織病理学的検査、免疫組織化学的検査およびｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に、切除腫瘍、肺および肝臓を調製する。したがって、血管構造を補充し、転移を経る腫瘍の能力に及ぼす発現当該ポリペプチド、例えばｚｄｉｎｔ５の影響を査定し得る。さらに、アデノウイルスの使用の他に、移植細胞は一過性にｚｄｉｎｔ５でトランスフェクトされ得る。
【０２５７】
さらに、精製ｚｄｉｎｔ５またはｚｄｉｎｔ５状態調節培地はこのマウスモデルに直接注入され、それゆえこの系で用いられ得る。安定ｚｄｉｎｔ５トランスフェクト体の使用ならびにｉｎ ｖｉｖｏでのｚｄｉｎｔ５発現を活性化するための誘導可能プロモーターの使用は当業界で既知であり、転移のｚｄｉｎｔ５誘導を査定するためにこの系に用いられ得る（全般的参照のためには、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８， １９９４；およびＲｕｓｃｉａｎｏ Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １４：３４９−３６１， １９９５参照）。
【０２５８】
ｚｄｉｎｔ５遺伝子は、欠陥ｚｄｉｎｔ５遺伝子を有するヒトを同定するためのプローブとして有用であり得る。結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞におけるｚｄｉｎｔ５の強い発現は、ｚｄｉｎｔ５ポリヌクレオチドまたはポリペプチドがこれらの組織中での異所的増殖の指標として測定される場合に用いられ得る、ということを示唆する。したがって、ｚｄｉｎｔ５のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらに対する突然変異は、これらの組織における癌の診断指標として用いられ得る。
【０２５９】
本発明のポリペプチドは、細胞接着および転移におけるその役割を調べるのに有用であり、転移、特に結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞の腫瘍における転移を防止するのに有用であり得る。同様に、ｚｄｉｎｔ５のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、腫瘍または悪性組織中のそれらの欠陥対応体に取って代わるために用いられ得る。
ｚｄｉｎｔ５ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞中で発現される。したがって、本発明のｚｄｉｎｔ５ポリペプチド製剤組成物は、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞の病理学的調節または拡大に関連した障害の予防または治療に有用であり得る。
【０２６０】
配列番号２、５、８および１１のｚｄｉｎｔ５ポリヌクレオチドは、染色体９ｑ３４にマッピングされている。したがって、本発明は、診断的適用に用途を見出す試薬も提供する。例えば、ｚｄｉｎｔ５遺伝子、ｚｄｉｎｔ５ＤＮＡまたはＲＮＡを含むプローブ、あるいはその亜配列を用いて、ｚｄｉｎｔ５遺伝子が染色体９ｑ３４上に存在するか否か、あるいは突然変異が起きているか否かを確定し得る。
【０２６１】
ｚｄｉｎｔ５遺伝子座での検出可能染色体異常としては、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化および再配列が挙げられるが、これらに限定されない。このような異常は、分子遺伝子技法、例えば制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、ＰＣＲ技法を用いる短タンデム反復（ＳＴＲ）分析、ならびに当業界で既知のその他の遺伝子連鎖分析技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、上記；Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５−６５， １９９５）を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出し得る。
【０２６２】
製薬的使用のためには、本発明のタンパク質は、経口的、非経口的（特に静脈内または皮下）、膀胱内、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして）、頬内、胎内に、あるいは肺または鼻腔吸入剤として投与し得る。静脈内投与は、１〜数時間の限局期間中のボーラス注射または注入による。概して、製剤処方物は、ｚｄｉｎｔ５タンパク質を、単独で、または二量体相手とともに、製薬上許容可能なビヒクル、例えば食塩水、緩衝化食塩水、水中の５％デキストロース等と組合せて含有する。処方物はさらに、１つ又はそれ以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、ウイルス表面のタンパク質損失を防止するためのアルブミン等を含み得る。
【０２６３】
処方方法は当業界で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示されている。治療用量は一般に、０．１〜１００μｇ／患者の体重１ｋｇ／日、好ましくは０．５〜２０ ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、的確な用量は、処置される症状の性質および重症度、患者の特性等を考慮して、許容された規準にしたがって臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。
【０２６４】
本タンパク質は、１週間またはそれ以下、しばしば１〜３日間の短期治療のために投与され得るし、あるいは数ヶ月または数年に亘る長期治療に用いられ得る。概して、ｚｄｉｎｔ５の治療的有効量とは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞における細胞外マトリックスリモデリング、瘢痕組織形成、腫瘍抑制、血小板凝集、アポトーシス、筋発生の臨床的に有意の変化を生じるのに十分な量である。同様に、ｚｄｉｎｔ５の治療的有効量とは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびＢ細胞に関連した障害における臨床的に有意の変化を生じるのに十分な量である。