(57)【要約】臓器移植における新規かつ有効な戦略を提供する。移植臓器に対する急性拒絶反応を防ぎ予後を改善するための治療剤および方法を提供する。臓器移植における拒絶反応を抑制する治療剤であって、ＮＦ−κＢデコイ化合物を含む治療剤が提供される。代表的には、上記臓器移植は腎臓移植である。この治療剤は、超音波検査コントラスト剤をさらに含み得る。臓器移植における予後を改善する治療剤もまた提供される。この治療剤は、ドナー臓器に投与され、超音波処理によってこの臓器へのＮＦ−κＢデコイ化合物のトラクスフェクション効率を増加し得る。
2003043663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臓器移植における拒絶反応を抑制する治療剤であって、ＮＦ−κＢデコイ化合物を含む、治療剤。
【請求項２】
前記拒絶反応が同種異系応答である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記同種異系応答が急性である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
前記臓器移植が腎臓移植である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
超音波検査コントラスト剤をさらに含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項６】
前記超音波検査コントラスト剤が、ガラクトース、アルブミン、ガラクトースおよびパルミチン酸、リポソーム、高分子膜、脂肪酸、乳酸ポリマーからなる群から選択される基質を含む、請求項５に記載の治療剤。
【請求項７】
前記超音波検査コントラスト剤がＯｐｔｉｓｏｎ（登録商標）である、請求項５に記載の治療剤。
【請求項８】
臓器移植における予後を改善する治療剤であって、ＮＦ−κＢデコイ化合物を含む、治療剤。
【請求項９】
ドナー臓器に投与され、超音波処理によって該臓器へのＮＦ−κＢデコイ化合物のトラクスフェクション効率を増加する、請求項７に記載の治療剤。
【請求項１０】
臓器移植における拒絶反応を抑制する方法であって、
ドナー臓器に、デコイ化合物含む治療剤を投与する工程、および
デコイ化合物を含むドナー臓器を超音波処理する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
臓器移植における予後を改善する方法であって、
ドナー臓器に、デコイ化合物含む治療剤を投与する工程、および
デコイ化合物を含むドナー臓器を超音波処理する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドの生体組織へのトラクスフェクションを増強する方法であって、
目的のオリゴヌクレオチドを生体組織に導入する工程、および
該オリゴヌクレオチドを含む生体組織を超音波処理する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記超音波処理する工程が、超音波造影剤の存在下で行なわれる、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、転写調節因子が結合する染色体上の部位と特異的に結合する化合物（例えば、核酸およびその類似体）を含む組成物およびその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、デコイ化合物を含む組成物およびその使用方法に関する。
背景技術
急性同種異系拒絶はＴ細胞が仲介する免疫学的現象であって、多くの炎症メディエータおよび接着分子が関与する［Ｈａｎｃｏｃｋ、１９８３］。この複雑な事象の発症は、複数の転写因子の共力調整様式の活性化を必要とする［Ｓｈａｎｎｏｎ、１９９５］。
ＮＦ−κＢは、炎症および免疫に重要である遺伝子産物をコードする遺伝子のそのような転写因子の１つである［Ｂａｅｕｅｒｌｅ、１９９４］。ＮＦ−κＢは、種々の細胞外シグナルに応答して、細胞質から核に迅速にトランスローケートし、そしていくつかのサイトカインおよび接着分子遺伝子の調整されたトランス活性化で中心的な役割を演じる。Ｃｏｏｐｅｒらは、心臓同種異系移植モデルにおける拒絶の３日前にピークとなるＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性の時間依存的増加を示した［Ｃｏｏｐｅｒ、１９９８］。しかし、ＮＦ−κＢの強力なインヒビターであるＰＤＴＣの投与は、このモデルにおいてＮＦ−κＢ活性のピークを低減して移植後の生存を顕著に延長した。
新規な免疫抑制剤ＦＫ５０６およびＣｓＡは、カルシルニン（ＮＦ−κＢの活性化に関与し、鍵となるシグナル伝達性のホスファターゼである）を阻害することにより、遺伝子転写を実際に切り替えた［Ｍａｔｔｉｌａ、１９９０；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ、１９９４；Ｋａｎｎｏ、１９９５］。別の主要な免疫抑制剤であるグルココルチコイドの影響は、部分的に、ＮＦ−κＢ活性化の阻害による結果であると説明されている［Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ、１９９５；Ａｕｐｈａｎ、１９９５］。
ヒトＮＦ−κＢの通常の活性形態は、２つのＤＮＡ結合性サブユニット、５０ｋＤａサブユニット（ｐ５０）および６５ｋＤａサブユニット（ｒｅｌＡまたはｐ６５）からなるヘテロダイマーである［Ｌｅｎａｒｄｏ、１９８９；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ、１９９０；Ｓａｔｒｉａｎｏ  Ｊ、１９９４；Ｂｒｅｎｎａｎ、１９９０；Ｎｅｉｓｈ、１９９２］。刺激を受けていない細胞では、ＮＦ−κＢは、ＩκＢとして知られる阻害分子に結合して細胞質内に隠れている。細胞刺激の後、ＩκＢは、リン酸化され、そして急速に分解される。次いでＮＦ−κＢは、ＩκＢから放出され、この転写因子の核へのトランスローケーションを可能にし、そこで、それは、種々のＤＮＡ認識部位に結合することにより遺伝子発現を調節する［Ｂａｅｕｒｅｒｌｅ、１９９４］。この結合複合体からの転写因子ＮＦ−κＢの解離が、インターロイキン（ＩＬ）−１、−６、および−８；細胞内接着因子；血管細胞接着因子；および内皮細胞接着分子を含む遺伝子の調整されたトランス活性化を誘導することによって、炎症変化の調節で中心的役割を演じることが示唆されている［Ｌｅｎａｒｄｏ、１９８９；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ、１９９０；Ｓａｔｒｉａｎｏ  Ｊ、１９９４；Ｂｒｅｎｎａｎ、１９９０；Ｎｅｉｓｈ、１９９２；Ｙａｍａｚａｋｉ、１９９３］。従って、ＮＦ−κＢをブロックすることは、心筋における遺伝子仲介性の虚血再灌流を減衰し得る。
「デコイ化合物」ｃｉｓ−エレメントとしての合成オリゴヌクレオチド（以下ＯＤＮと記載する）は、目的遺伝子のプロモーター領域への核因子の結合をブロックし、インビトロおよびインビボアッセイ系における遺伝子トランス活性化の阻害を生じる［Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、１９９０；Ｂｉｅｎｌｉｎｓｋａ、１９９０；Ｙａｍａｄａ、１９９５；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ、１９９６］。このようなデコイ戦略は、ある種のヒト疾患の処置として提案されている。本発明者らは、先に、Ｅ２ＦのデコイＯＤＮのトランスフェクションが、再狭窄の遺伝子治療のモデルとして、バルーン損傷後の新内膜形成を阻害したことを報告した［Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ、１９９５］。最近、本発明者らは、ラットにおいて、ＮＦ−κＢに対するデコイを用いて、虚血損傷からのインビボ心筋保護に成功した。
発明の開示
本発明は、臓器移植における急性拒絶を防ぎ、予後を改善することを目的とする。
本発明者らは、デコイ化合物ｃｉｓ−エレメントとしてインビボで導入された、ＮＦ−κＢに高い親和性を有する合成２本鎖ＤＮＡが、転写因子に結合し、そして急性の同種異系応答を仲介する遺伝子の活性化をブロックし、腎臓急性拒絶に対する有効な治療を提供すると考えた。
本発明者らは、ＮＦ−κＢ  ｃｉｓ−エレメントを含む、十分な量のデコイＯＤＮのドナー腎臓の内皮細胞中へのトランスフェクションが、ＮＦ−κＢを効果的に結合し、それが必須サイトカインおよび接着分子タンパク質の遺伝子発現をトランス活性化することを防ぎ、そしてそれによって急性拒絶現象の確立または進行を防ぐことを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、本発明者らは、灌流溶液中の、超音波心臓検査コントラスト剤Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標名：米国モレキュラー・バイオシステムズ・インク社製）の使用をともなう超音波処理を適用することにより、ラットにおける同種異系移植腎臓中へのＮＦ−κＢ  ｃｉｓ−エレメントを含むデコイＯＤＮの十分量をトランスフェクトすることに成功し、本発明を完成するに至った。
本発明は、臓器移植における拒絶反応を抑制する治療剤に関し、この治療剤は、ＮＦ−κＢデコイ化合物を含む。対象となる臓器は、腎臓、心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、胆嚢、胃、小腸、大腸、膀胱などを含むがこれらに制限されるわけではない。
好ましくは、上記拒絶反応は同種異系応答である。
好ましくは、上記同種異系応答は急性である。
好ましくは、上記臓器移植は腎臓移植である。
好ましくは、上記治療剤は超音波検査コントラスト剤をさらに含む。
好ましくは、上記超音波検査コントラスト剤は、ガラクトース、アルブミン、ガラクトースおよびパルミチン酸、リポソーム、高分子膜、脂肪酸、乳酸ポリマーからなる群から選択される基質を含む。このような、超音波検査コントラスト剤として、Ｅｃｈｏｖｉｓｔ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社）、Ａｌｕｂｕｎｅｘ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、Ｌｅｖｏｖｉｓｔ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社）、ＤＭＰ１１５（Ｉｍａｇｅｎｔ）（Ｄｕｐｏｎ  Ｍｅｒｋ社）、ＥｃｈｏＧｅｎ（登録商標）（Ｓｏｎｕｓ社）、Ｓｏｎｏｖｉｓｔ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社）、Ｓｏｎｏ  Ｖｕｅ（登録商標）（Ｂｒａｃｃｏ社）、ＢＹ９６３（登録商標）（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ社）、ＮＣ１００１００（Ｎｙｃｏｍｅｄ社）、ＰＥＳＤＡ、Ｑｕａｎｔｉｓｏｎ（登録商標）（Ａｎｄａｒｉｓ社）、Ｑｕａｎｔｉｓｏｎ  Ｄｅｐｏ（登録商標）（Ａｎｄａｒｉｓ社）、ＱＵＣ８２７５５などが挙げられる。
好ましくは、上記超音波検査コントラスト剤はＯｐｔｉｓｏｎ（登録商標）である。Ｏｐｔｉｓｏｎは、不活性ガスであるパーフルオロカーボンを含有するアルブミン由来の微小気泡含有小球体である。
本発明はまた、臓器移植における予後を改善する治療剤に関し、この治療剤はＮＦ−κＢデコイ化合物を含む。
この治療剤は、ドナー臓器に投与され、超音波処理によって該臓器へのＮＦ−κＢデコイ化合物のトラクスフェクション効率を増加し得る。
本発明はまた、臓器移植における拒絶反応を抑制する方法に関し、この方法は、ドナー臓器に、デコイ化合物を含む治療剤を投与する工程、およびデコイ化合物を含むドナー臓器を超音波処理する工程を包含する。
本発明はまた、臓器移植における予後を改善する方法に関し、この方法は、ドナー臓器に、デコイ化合物含む治療剤を投与する工程、およびデコイ化合物を含むドナー臓器を超音波処理する工程を包含する。
本発明はまた、オリゴヌクレオチドの生体組織へのトラクスフェクションを増強する方法に関し、この方法は、目的のオリゴヌクレオチドを生体組織に導入する工程、およびこのオリゴヌクレオチドを含む生体組織を超音波処理する工程を包含する。
好ましくは、上記超音波処理する工程は、超音波造影剤の存在下で行なわれる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも本発明の例示であり、本発明は、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。
本発明で用いられる用語「デコイ」または「デコイ化合物」は、ＮＦ−κＢが結合する染色体上の部位、あるいはＮＦ−κＢに制御される遺伝子の他の転写調節因子が結合する染色体上の部位（以下標的結合部位という）に結合し、ＮＦ−κＢまたはその他の転写因子と、これらの標的結合部位への結合について拮抗する化合物をいう。代表的には、デコイまたはデコイ化合物は、核酸およびその類似体である。
デコイが核内に存在する場合、転写調節因子の標的結合部位への結合について、デコイが転写調節因子と競合し、その結果、転写調節因子の標的結合部位への結合によってもたらされる生物学的機能が阻害される。デコイは、標的結合配列に結合し得る核酸配列を少なくとも１つ含む。標的結合配列への結合活性を有する限り、デコイは、本発明の治療剤の調製に用いることができる。
好ましいデコイの例として、５’−ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＣＣ−３’（配列番号１）（ＮＦ−κＢデコイ）、またはこの相補配列を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、またはそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および／または擬核酸を含むものであってもよい。また、これらのオリゴヌクレオチド、その変異体、またはこれらを分子内に含む化合物は、１本鎖でも２本鎖であってもよく、線状であっても環状であっもよい。変異体とは上記配列の一部が、変異、置換、挿入、欠失しているもので、ＮＦ−κＢまたはＮＦ−κＢに制御される遺伝子のその他の転写調節因子が結合する核酸結合部位と特異的に拮抗する能力を有する核酸を意味する。
さらに好ましいデコイとしては、上記核酸配列を１つまたは複数含む２本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。上記核酸配列を１つまたは複数含む核酸は、含まれる核酸配列の数を示すために、含まれる核酸配列が２つの場合キメラ（タブル）デコイと称され、そして３つの場合トリプルデコイなどと称され得る。
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドには、リン酸ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子で置換したチオリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、またはリン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチドなど、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクリオチドなどが含まれる。
本発明で用いられるデコイの製造方法としては、当該分野で公知の化学合成法または生化学的合成法を用いることができる。例えば、デコイ化合物として核酸を用いる場合、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることができ、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて目的のデコイ核酸を直接合成してもよいし、またはこれらの核酸、それを含む核酸またはその一部を合成した後、ＰＣＲ法またはクローニングベクターなどを用いて増幅してもよい。さらに、これらの方法によって得られた核酸を、制限酵素などを用いて切断し、ＤＮＡリガーゼなどを用いて結合などを行い、目的とする核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、核酸の塩基、糖、リン酸部分に、例えば、アルキル化、アシル化などの化学修飾を行ってもよい。
本発明の治療剤は、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。薬学的に受容可能なキャリアの例として、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水などが挙げられる。一般に、薬学的に受容可能なキャリアは薬学的に不活性である。
本発明の治療剤はまた、デコイ化合物、賦形剤、アジュバント、および薬学的に受容可能なキャリアを含み得、さらには、デコイ化合物に加えて他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。
本発明の治療剤は、経口的または非経口的に投与される。非経口的投与は、局所、皮膚塗布、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内投与を含む。好ましくは、本発明の組成物は、静脈注射および動脈注射により投与される。処方および投与のための技術は、例えば、当業者に周知の教科書「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載されるように当業者に周知である。
本発明の治療剤は、デコイ化合物を、意図される目的を達成するために有効な量で含む。代表的には、本発明の治療剤は、デコイ化合物を約５〜１５μＭの濃度で含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であって、意図される薬学的結果を得るために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。治療有効量は、目的となる疾患の回復の程度を測定することによってアッセイされ得る。治療有効量は、処置が適用される個体の状態に依存し得、目的の効果が有意な副作用なくして達成されるように最適化され得る。当業者は、当該分野で慣用的である手法に従って治療有効量を決定し得る。例えば、治療的有効量は、細胞培養アッセイ、適切な動物モデルなどを用いて推定され得る。次いで、得られた情報を用い、ヒトへの投与に有効な量および経路を決定し得る。
本発明で用いるデコイ化合物の治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するデコイ化合物の量をいう。デコイ化合物の治療効果および毒性は、例えば、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。このような用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存して変動し得る。一般に、デコイ化合物は５〜１５μＭの濃度で用いられる。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
実施例
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。なお、以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限するものではない。
１．材料および方法
１．１．ＯＤＮの合成および配列標的の選択
用いたホスホロチオネートＯＤＮの配列は以下の通りである；ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ：５’−ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＣＣ−３’（配列番号１）、３’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−５’；スクランブルデコイＯＤＮ：５’−ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＴＡＧ  ＣＣ−３’（配列番号２）、３’−ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＣ  ＧＧ−５’およびＰＲＥ（プロゲステロン結合配列）：５’−ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ−３’（配列番号３）、３’−ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＴＧＴ−５’。
これらのＯＤＮは、定法に従って合成した。合成ＯＤＮを、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、そして殺菌Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１ｍｍｏｌ／Ｌ  エチレンジアミン四酢酸）中に溶解した。上清液をＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、Ｓｗｅｄｅｎ）で精製し、そして比色法で定量した。ＮＦ−κＢおよびスクランブルデコイＯＤＮは、エンドラベリングキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｉｎｃ  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  Ｃａｌｉｆ）を用い、３’および５’末端でＦＩＴＣ標識した。
１．２．腎臓移植における急性拒絶モデル
近交系の２００〜２５０ｇの雄Ｌｅｗｉｓラット（ＬＥＷ、ＲＴ１ｌ）を移植物レシピエントとして用い、そして雄のＷＦ（ＲＴ１ｕ）ラットをドナーとして供した。腎臓動脈を通じて氷冷したヘパリン添加生理食塩水（５０Ｕ／ｍｌ）で灌流した後、ＷＦラットから左の腎臓を摘出した。この腎臓を、両方の腎臓を摘出したＬｅｗｉｓレシピエントに、ミクロ手術技法を用いて、左腎臓血管および左尿管の端と端とを吻合すること（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ  ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ）により同所的に移植した。この技法は良く確立されており、そして虚血時間は安定している。この手順の間、ドナー腎臓は、３０分間の冷虚血損傷を受けた。すべての実験プロトコールは、本発明者らの属する研究所の動物倫理委員会の方針に従って行った。このモデルでは、代表的には、動物は、急性拒絶を受け、貧無尿になり、そして１０日以内に尿毒症により死ぬ（ＣＴＬＡ−９）。腎臓同種異系移植後の生存時間は、移植から死亡の時間までの時間として規定される。移植後の最初の２４時間以内の手術技法の失敗により死亡した動物は、分析から除いた。
１．３．灌流溶液中の超音波コントラスト剤  Ｏｐｔｉｓｏｎの使用をともなう超音波処理（以下ＵＳＥと記載する）を適用することによるドナー腎臓中へのＮＦ−κＢデコイのトランスフェクション
まず、ドナー腎臓において最大のトランスフェクションが生じる条件を決定するために以下の実験を行った。腎臓静脈と尿管とを、灌流の後、血管クリップを用いてクランプした。５０μｇのルシフェラーゼレポーター遺伝子、またはＦＩＴＣで標識した１００μｇのＮＦ−κＢデコイＯＤＮを、Ｏｐｔｉｓｏｎを３種の異なる濃度（０、１０、または２５％）で含む、０．５ｍｌの生理食塩水中に溶解し、そして腎臓動脈を通じて腎臓中に注入した。腎臓を摘出し、そして水浴中、２ＭＨｚキャリア周波数で超音波処理した。信号強度は４ｂａｒ、そして照射時間は、３０秒〜８分間の間で変化させた。次いで腎臓をＬｅｗｉｓレシピエントに移植した。この同種異系移植臓器を、１、２、および４日目にそれぞれ摘出し、そしてルシフェラーゼレポーター遺伝子およびＮＦ−κＢデコイＯＤＮの発現を、それぞれ、ルシフェラーゼアッセイおよび蛍光顕微鏡により評価した。
（実験デザイン）
以下の表１に列挙したように、１群が１０匹のラットからなる６つの実験群を作り、Ｏｐｔｉｓｏｎの使用をともなう超音波処理の効き目を調べ、そしてＮＦ−κＢデコイＯＤＮを用いる腎臓同種異系移植臓器の処置のための新たな手順を確立した。
【表１】
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第１群、１０％のＯｐｔｉｓｏｎ（Ｏｐｔ）を含む０．５ｍｌの生理食塩水０．５ｍｌに溶解した１００μｇのＮＦ−κＢデコイＯＤＮ（ＮＦ）をドナー腎臓中に注入した。遺伝子トランスフェクションは、超音波処理（ＵＳＥ）を１分間適用することにより実施した；第２群、ドナー腎臓を、同量のＮＦ−κＢデコイで処理し、ＵＳＥ処理を行った。ｏｐｔｉｓｏｎは用いなかった；第３群、腎臓を、同量のＯｐｔｉｓｏｎおよびＮＦ−κＢデコイで処理した。ＵＳＥ処理は行わなかった；第４群、腎臓を、同量のＮＦ−κＢのみで処理した。ＯｐｔｉｓｏｎおよびＵＳＥ処理は行わなかった；第５群、腎臓を、Ｏｐｔｉｓｏｎを含むＮＦ−κＢと同量のスクランブルデコイで処理し、ＵＳＥ処理した；第６群、ドナー腎臓になんらの処理も行わなかった。
１０％濃度のＯｐｔｉｓｏｎを含む０．５ｍｌの生理食塩水中に溶解した１００μｇのＮＦ−κＢデコイ（第１群：Ｇｐ１）、およびＯｐｔｉｓｏｎを含まない０．５ｍｌの生理食塩水中に溶解した１００μｇのＮＦ−κＢデコイ（第２群：Ｇｐ２）をドナー腎臓に注入した。これらの腎臓を、水浴中で１分間、２ＭＨｚキャリア周波数でＵＳＥ処理し、そしてＬｅｗｉｓレシピエント中に同所的に移植した。Ｏｐｔｉｓｏｎ（１０％）あり（第３群：Ｇｐ３）、またはなし（第４群：Ｇｐ４）の同量のＮＦ−κＢデコイで処理したドナー腎臓をＵＳＥ処理なしでレシピエント中に移植した。コントロール群として、ドナー腎臓を、Ｏｐｔｉｓｏｎを含む同量のスクランブルデコイで処理し、ＵＳＥ処理したドナー腎臓を、第５群（Ｇｐ５）のレシピエント中に移植した。これらの処理を施さなかった腎臓移植レシピエントを別のコントロール群（第６群：Ｇｐ６）として供した。各群からの動物をランダムに選択し、そして移植臓器生存の評価を行った。腎臓移植後の生存時間は、移植から死亡の時間までの時間として規定される。移植後、最初の２４時間以内の手術技法の失敗により死亡した動物は、分析から除いた。各群からのランダムに選択した５匹動物のドナー腎臓を、４日目に摘出し、そしてＯＤＮトランスフェクション、組織学的分析、および免疫組織学的評価のために調製した。
（移植臓器の機能）
移植後、１日おきに２４時間の尿を集め尿容量を連続して測定し、そして尿の特徴を尿沈渣を調べることにより検査した。次いで、本発明者らは、第１群〜第５群までのレシピエント中の連続的な血清クレアチニンレベルの測定により、移植臓器の機能をより定量的に評価した。血清は、１日おきに尾静脈から採取し、そして血清クレアチニン（Ｓ−Ｃｒ）は、Ｊａｆｆｅ反応法により測定した。
（移植臓器の形態）
腎臓組織を、リン酸緩衝化生理食塩水中４％パラホルムアルデヒドで固定した。パラフィン切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）、ならびに過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色し、次いで光学顕微鏡により評価した。組織学的評価をＢａｎｆｕの評価基準を基礎に実施した。
ＥＤ１、ＣＤ４、またはＣＤ８陽性細胞の染色は、ＤＡＫＯ  ＡＰＡＡＰ  ＫＩＴ（ＤＡＫＯ  Ｊａｐａｎ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用い、製造業者の指示書に従って、アルカリホスファターゼおよび抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）法により実施した。ＥＤ１、ＣＤ４、またはＣＤ８に対するモノクローナル抗体は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ（Ｐａｒｃｄ’ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ６、単球化学誘因タンパク質（ＭＣＰ−１）、ＴＮＦ−α、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）およびＶＣＡＭ−１を含むサイトカインおよび接着分子の染色は、免疫ペルオキシダーゼ法により実施した。ＩＬ１、ＩＬ２、ＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、およびＭＣＰ−１（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）に対する抗ラットウサギポリクローナル抗体を一次抗体として用い、ビオチン化抗ウサギヤギＩｇ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を２次抗体として適用した。反応は、３、３’ジアミノベンジジンで可視化した。
マーカー陽性細胞の数を、視野あたりの細胞の平均±標準偏差（Ｍ±ＳＤ）（ｃ／ＦＶ）して表し、各切片／標本について、４００倍の倍率で、２０視野以上を評価した。接着分子、サイトカインおよび細胞外マトリックスの発現は、０〜４＋スケール（４＋＝密）で定量化した。
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ）
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ＫｉｔｓＲ（ＱＵＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造業者の指示書に従って、組織から抽出した。ＲＮＡの量は、ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動上で確認し、そしてｃＤＮＡを、先に記載のように調製した［Ａｚｕｍａ、２００１］。ＰＣＲは、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、およびβ−アクチンに対するプライマーを用い、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００  ＰＣＲシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）により実施した。プライマー配列、アニーリング温度およびサイクル数は以下の通りである：ＭＣＰ−１、５’ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＧ（配列番号４）および３’ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＡＣＴ（５５℃、３３サイクル）；ＴＧＦ−β１、５’ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  Ｃおよび３’ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  Ｃ（配列番号５）（６４℃、２８サイクル）；ＴＮＦ−α、５’ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＧＧＧ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  Ｃ（配列番号６）および３’ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＣＣ（６０℃、３４サイクル）；ＩＬ−１、５’ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  Ｃ（配列番号７）および３’ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＴＴ（５５℃，３５サイクル）；ＩＬ−６、５’ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  Ｃ（配列番号８）および３’ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  Ｃ（３０サイクル）；ｉＮＯＳ、５’ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＧＧ（配列番号９）および３’ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ（３５サイクル）；ＩＣＡＭ−１、５’ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＡＡ（配列番号１０）および３’ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＧＧＴ  Ｇ（６０℃、２８サイクル）；ＶＣＡＭ−１、５’ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＣＧ（配列番号１１）および３’ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＣＴ（６０℃、２６サイクル）；β−アクチン、５’ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＴＧＧ（配列番号１２）および３’ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＡＧＧ（６０℃，２３サイクル）。ＤＮＡアンプリコンを、１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてエチジウムブロマイド染色し（０．０５ｍｇ／ｍｌ、１０分間）、紫外線下のバンドとして可視化した。競合的模倣物および標的ｃＤＮＡの密度を、Ａｄｏｂｅ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を備えたＳＣＡＮＪＥＴ  ４ｃ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋｅｒａｄ、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯＲ）を用いる走査デンシトメトリーにより測定した。個々のバンドの密度の比をプロットし、テンプレートの連続希釈に亘る直線関係を確立した。ｍＲＮＡの発現は、サンプルおよび模倣アンプリコンの密度を基に算出した：各々結果は、β−アクチ��に対するサンプルの比として表した。ゲノムＤＮＡによる汚染を排除するために、ＲＮＡはまた直接増幅した。各サンプルについて上記操作を２回繰り返し、そして算出値は、平均±標準偏差で表した。
（統計学的分析）
尿容量および血清クレアチニンについて得た値に関し、分散の片側分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。移植臓器生存は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒテストにより評価した。不対ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を、免疫組織化学における細胞浸潤に対して用いた。組織学的分析、ならびに接着分子、サイトカインおよび免疫組織化学における細胞外マトリックスの発現からのデータに対しては、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕテストを実施した。ＲＴ−ＰＣＲからの結果は、複製なしにＡＮＯＶＡに供した。ＡＮＯＶＡが有意である場合、個々の比較は、ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により行った。０．０５より小さいＰ値を統計学的に有意であると考えた。
２．結果
２．１．顕著な副作用を引き起こすことなく最大の遺伝子トランスフェクションが生じる条件
本発明者らは、まず、ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびＦＩＴＣ標識ＮＦ−κＢデコイＯＤＮを用い、ドナー腎臓中への遺伝子トランスフェクションに対するＵＳＥの効目を調べた。図１Ａおよび図１Ｂにその結果を示す。図１Ａの左のグラフに示すように、１分間まで、ＵＳＥ処理の時間に比例してルシフェラーゼレポーター遺伝子のトランスフェクションを顕著に増大した。ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ発現からの結果は、その効き目を立証した（図１Ｂ）。
図１Ｂは、ＦＩＴＣ標識ＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクションを、蛍光顕微鏡により評価した結果を示す腎臓切片の写真である。図１Ｂに示されるように、ＮＦ−κＢデコイＯＤＮ発現からの結果はその効き目を立証し、同種異系移植臓器中の尿細管細胞における顕著なＦＩＴＣ染色を示した。すなわち、図１Ｂに示されるように、糸球体におけるＦＩＴＣ染色の発現はほとんどなく（ａ）、そしてＯｐｔｉｓｏｎなしの３０秒間のＵＳＥ処理でわずかな染色が細管で観察された（ｂ）。この発現は、１分間のＵＳＥ処理で糸球体（ｃ）および細管（ｄ）の両方で増加し、そしてこれは、Ｏｐｔｉｓｏｎの使用によりさらに増加し、同種異系移植臓器の糸球体（ｅ）および細管（ｆ）において顕著なＦＩＴＣ染色を示した。
ここで再び図１Ａを参照して、１分間までのＵＳＥ処理は、顕著な損傷はなかったが、２分間以上のＵＳＥ処理は、顕著な組織損傷を引き起こした。従って、本発明者らは、ＵＳＥ処理の時間を１分間と決定した。次いで、ＵＳＥの使用とともに、超音波検査コントラスト剤Ｏｐｔｉｓｏｎの効き目を調べた。図１Ａの右のグラフに示すように、Ｏｐｔｉｓｏｎの使用は、用量依存様式でルシフェラーゼレポーター遺伝子の遺伝子トランスフェクションを顕著に増大した。しかし、２５％の濃度で用いたとき、顕著な組織損傷を示した。１０％で用いたときは、顕著な損傷は観察されなかった。従って、本発明者らは、灌流溶液中のＯｐｔｉｓｏｎの濃度を１０％、そしてＵＳＥ処理の時間を１分間とした。
２．２．ドナー腎臓中へのＮＦ−κＢデコイのトランスフェクションは、動物生存を延長した
図２に、各試験群の動物の生存の結果を示した。なんらの処理を施さないこのモデルの生存時間は安定していた（平均±ＳＤ＝７．５±１．２、ｎ＝１０）；すべての動物は９日目までに死亡した。対照的に、ＵＳＥ処理によりＮＦ−κＢデコイＯＤＮで処理したドナー腎臓のレシピエント（第１群および第２群）は、他のすべての群と比較して延長された動物生存を示した。さらに、コントラスト剤Ｏｐｔｉｓｏｎの使用は、第１群における顕著に延長された動物生存によって証明されるように、遺伝子トランスフェクションに対するＵＳＥ処理の効き目を増大した；１０匹の動物のうち３匹がこの群で２０日間以上生存した。これらの結果は、ＵＳＥ処理によるドナー腎臓中へのＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクションが、移植臓器生存の延長に対して有利な効果をもたらし、そしてＯｐｔｉｓｏｎの使用がＵＳＥの効き目を増大することを示す。
２．３．移植臓器の機能
図３に、試験群の移植臓器の機能を測定した結果を示す。スクランブルデコイで処理した同種異系移植レシピエント（第５群）は、移植の後、２日目までに顕著な血尿を示した。このときまでに尿容量は、図３の上のグラフに示したように、第１群からのレシピエントのそれと比較して顕著に低下した（平均±ＳＤ＝２１．８１±６．８５ｍｌ／日に対して、平均±ＳＤ＝９．７７±３．６８ｍｌ／日、ｎ＝１０）。大部分の動物は、６日までに貧尿症（１．２９±１．１２ｍｌ／日、ｎ＝９）になった。その一方、ＮＦ−κＢデコイで処理した同種異系移植臓器を持つ大部分のレシピエント（第１群）は、６日目までに顕著な血尿を示すことなく、通常量の尿容量を維持した（１３．９３±６．４２ｍｌ／日、ｎ＝１０）。
図３の下のグラフに示したように、血清クレアチニンのレベルはこれらの結果を確証し、移植後２日までに、第５群からのレシピエントにおける血清クレアチニンのレベルは、第１群からのレシピエントの血清クレアチニンのレベルと比較して、顕著に増大した値を示した（０．９７±０．１６ｍｇ／日に対して、１．８４±０．２３ｍｇ／日、ｎ＝１０）。移植臓器機能のこのようなデータは、腎不全による動物の死亡、および移植臓器生存による延命を確認した。
２．４．ＮＦ−κＢ処理による顕著に良好に保存された移植臓器組織化学
図４に各試験群の移植臓器組織化学を示す。移植後２日目に回収されたコントロール動物からの同種異系移植臓器は、多数の広く拡散した単核細胞の浸潤を示した（ａ）。多くの糸球体は、多量の糸球体間質マトリックスをともなう顕著な単核細胞浸潤を示した。大部分の尿管は、顕著なタンパク質沈着と尿管内円柱（ｃａｓｔ）とともに構造的に変形した（ｃ）。４日目に、細胞の浸潤は、正常な腎臓構造の顕著な破壊および出血をともない，すべての領域でより鮮紅色になった（ｄ）。ある糸球体（ｅ）および尿管（ｆ）は、重篤な構造的変形および多数の単核細胞の浸潤をともなう壊死を示した。これらの変化は、６日目までに迅速かつ攻撃的に進行し、広く拡散した壊死組織とともに重篤な構造的変形を示した（ｇ）。大部分の糸球体（ｈ）および尿細管（ｉ）は、重篤な壊死によって置き換えられた。対照的に、ＮＦ−κＢデコイで処理した同種異系移植臓器は、２日目に単核細胞浸潤はほとんどなく良好に保存されていた（ｊ）。大部分の糸球体に顕著な変化はなかった（ｋ）。尿管構造は、移植臓器組織を通じて、見かけ上タンパク質沈着がなくほとんど正常のままであった（ｌ）。４日目までに、ほんのわずかな細胞浸潤が間隙領域で観察された（ｍ）、大部分の糸球体（ｎ）および細管（ｏ）は無傷のままであった。６日目に、組織中にかなりの数の細胞浸潤が出現したが（ｐ）、大部分の糸球体（ｑ）および細管（ｒ）の変化は小さかった。
２．４．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
図５にＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。図５の結果は、第２群（ＮＦ−κＢ投与、ＵＳＥ処理）と第５群（スクランブルデコイ投与、ＵＳＥ処理）のＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す電気泳動写真である。図５に見られるように、第２群のラットでは、ＩＬ−１、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−βの発現が、そして第５群のラットでは、ＴＧＦ−βの発現が抑制されている傾向が認められ、ドナー腎臓のＮＦ−κＢ処理により、移植腎臓においてサイトカイン産生および接着分子発現が抑制されていることが示された。
以上の結果を要約する。
本発明者らは、ＮＦ−κＢ結合部位に対する、蛍光色素イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したｃｉｓ−エレメントデコイ化合物（ＮＦ−κＢデコイ）を合成し、そして超音波処理（ＵＳＥ）によって、Ｗｉｓｔｅｒ  Ｆｉｒｔｈ（ＷＦ）の腎臓中にトランスフェクトした。さらに、超音波検査の媒体Ｏｐｔｉｓｏｎが、ＵＳＥの使用によるトランスフェクションを増強し、管状細胞および糸球体における顕著なＦＩＴＣ染色を示した。ＮＦ−κＢデコイでトランスフェクトしたドナー腎臓を、腎摘出したＬｅｗｉｓレシピエントの両方の腎臓に同所性移植した。ＮＦ−κＢデコイの代わりにスクランブルデコイ（ＳＤ）で処理したドナー腎臓を持つレシピエントをコントロールとして供した。
コントロール群では、４日目に、多くの単核細胞の浸潤をともなう腎臓組織の顕著な破壊が起こり、免疫組織学およびＲＴ−ＰＣＲは、移植腎臓における増加したサイトカイン産生および接着分子発現を示した。すべての動物は、１０日までに腎不全により死亡した。対照的に、ＮＦ−κＢデコイでトランスフェクトした同種異系移植片のレシピエントは、延長した生存を示した。特に、Ｏｐｔｉｓｏｎを併用するＵＳＥの適用では、コントロールの平均生存日数７．７±１．６（ｎ＝１０）に対して、１７．９±８．３（ｎ＝１０）の平均生存日数を示し、１０匹のうち３匹は、２０日以上生存した。移植腎臓の機能および組織学的観察は良好に維持され（４日目の血清クレアチニン値は、コントロールの２．４５±０．１２ｍｇ／ｄｌに対して、０．６９±０．１２ｍｇ／ｄｌ）、サイトカイン産生および接着分子発現もまた顕著に低減していた。
このように、この新規な手順、Ｏｐｔｉｓｏｎの使用をともなうＵＳＥの適用は、ＮＦ−κＢデコイ化合物ＯＤＮの腎臓移植臓器へのトランスフェクションを増大し、そしてサイトカイン産生および接着分子発現の阻害をともなって動物生存を改善した。この新規なアプローチは、腎臓同種異系移植臓器に対する新規かつ有効な戦略である。
上記の実施例は、本発明の種々の局面を例示して記載している。本発明の範囲を制限するものではない。
産業上の利用可能性
臓器移植における新規かつ有効な戦略が提供される。移植臓器に対する急性拒絶反応を防ぎ予後を改善するための治療剤および方法が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１Ａは、遺伝子トランスフェクションに対するＵＳＥおよびＯｐｔｉｓｏｎの効き目を示す図である。遺伝子トランスフェクションに対するＵＳＥの効き目をルシフェラーゼアッセイにより評価した。超音波処理（以下ＵＳＥという）の効き目は、２分間までの時間に比例し（図１Ａの左のグラフ）、そしてＯｐｔｉｓｏｎは用量依存様式で遺伝子トランスフェクションを有意に増大した（図１Ａの右のグラフ）。
図１Ｂは、ＦＩＴＣ標識ＮＦ−κＢデコイＯＤＮのトランスフェクションを、蛍光顕微鏡により評価した結果を示す腎臓切片の写真である。糸球体におけるＦＩＴＣ染色の発現はほとんどなく（ａ）、そしてＯｐｔｉｓｏｎなしの３０秒間のＵＳＥ処理でわずかな染色が細管で観察された（ｂ）。この発現は、１分間のＵＳＥ処理で糸球体（ｃ）および細管（ｄ）の両方で増加し、そしてこれは、Ｏｐｔｉｓｏｎの使用によりさらに増加し、同種異系移植物の糸球体（ｅ）および細管（ｆ）において顕著なＦＩＴＣ染色を示した。
図２は、試験における動物の生存を示すグラフである。動物の生存は、ＵＳＥ処理を用いたＮＦ−κＢデコイＯＤＮの遺伝子トランスフェクションにより（第１群および第２群）ドナー腎臓を処理することにより有意に延長された。さらに、Ｏｐｔｉｓｏｎの使用は、第１群の、他のすべての群と比較したとき、有意に延長された動物生存により示されるように、遺伝子トランスフェクションの効き目を増大した；この群では、１０匹の動物のうち３匹が２０日以上生存した。第１群からのレシピエントは、他のすべての群と比較して、有意に延長された生存を示した；１０匹の動物のうち３匹が２０日以上生存した。これらの結果は、遺伝子トランスフェクションに対するＵＳＥの効き目を示し、そしてＯｐｔｉｓｏｎの使用が、遺伝子トランスフェクションに対するＵＳＥの効き目を増大することを示す。第４群および第５群のレシピエントの生存時間の間に有意な差はなく、灌流溶液中へのＯｐｔｉｓｏｎの添加、およびＵＳＥ処理のみでは、動物生存に影響を与えないことを示す。
図３は、試験における移植腎臓の機能を示す図である。移植物の機能は、尿容量（ａ）血清クレアチニン（Ｓ−Ｃｒ）のレベル（ｂ）により評価した。第４群からのレシピエントにおいて、移植後２日目までに、尿容量は、第１群のレシピントに比較して有意に減少した。大部分の動物は６日目までに貧尿症になり、その一方、第１群からのレシピエントは、この時点までに通常の尿容量を維持した（ａ）。血清クレアチニンのレベルは、これらの結果を確証し、第１群からのレシピエント中におけるより第４群からのレシピエントにおいて有意に増加したレベルの血清クレアチニンを示した。
図４は、試験における腎臓の組織学を示す、腎臓切片の写真である。移植後２日目に回収したコントロール動物からの同種異系移植臓器は、多数の広く拡散した単核細胞浸潤を示した（ａ）。多くの糸球体は、多量の糸球体間質マトリックスをともなう顕著な単核細胞浸潤を示した（ｂ）。大部分の細管は、顕著なタンパク質沈着と細管内円柱とともに構造的に変形していた（ｃ）。４日目に、細胞浸潤は、正常な腎臓構造の顕著な破壊および出血をともなってすべての領域でより鮮紅色になった（ｄ）。ある糸球体（ｅ）および尿管（ｆ）は、重篤な構造的変形および多数の単核細胞の浸潤をともなう壊死を示した。これらの変化は、６日目までに迅速かつ攻撃的に進行し、広く拡散した壊死組織とともに重篤な構造的変形を示した（ｇ）。大部分の糸球体（ｈ）および尿細管（ｉ）は、重篤な壊死によって置き換えられた。対照的に、ＮＦ−κＢデコイで処理した同種異系移植臓器は、２日目に単核細胞浸潤はほとんどなく良好に保存されていた（ｊ）。大部分の糸球体に顕著な変化はなかった（ｋ）。尿管構造は、移植組織を通じて、見かけ上タンパク質沈着がなくほとんど正常のままであった（ｌ）。４日目までに、ほんのわずかな細胞浸潤が間隙領域で観察された（ｍ）、大部分の糸球体（ｎ）および細管（ｏ）は無傷のままであった。６日目に、組織中にかなりの数の細胞浸潤が出現したが（ｐ）、大部分の糸球体（ｑ）および細管（ｒ）の変化は小さかった。
図５は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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