(57)【要約】本発明は、糸球体線維化を伴う腎疾患を反映する疾患マーカー、該疾患マーカーを利用した糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法、該疾患の改善に有用な薬物のスクリーニング方法を提供する。本発明は、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴ）遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチド等を糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーとして利用し、また、被験物質とＣＧＴ遺伝子発現細胞とを接触させて、ＣＧＴ遺伝子発現の有無又は増加・抑制を調べることによって糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬をスクリーニングすることにより実施できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは２に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドであって、標識されていてもよい糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカー。
【請求項２】
糸球体線維化を伴う腎疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される請求項１に記載の疾患マーカー。
【請求項３】
配列番号３に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅのアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体を有する糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカー。
【請求項４】
糸球体線維化を伴う腎疾患の検出においてプローブとして使用される請求項３に記載の疾患マーカー。
【請求項５】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
【請求項６】
工程（ａ）及び（ｂ）に引き続いてさらに下記の工程（ｃ）を含む、請求項５に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
【請求項７】
工程（ｃ）における糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の判断が、工程（ｂ）において被験者について得られる測定結果を、正常者について同様に得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへのポリヌクレオチドの結合量の異同に基づいて行われるものである、請求項６に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
【請求項８】
下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ａ）被験者の腎組織抽出物と請求項３または４に記載の疾患マーカーとを接触させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した腎組織抽出物中のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
【請求項９】
工程（ａ）及び（ｂ）に引き続いてさらに下記の工程（ｃ）を含む、請求項８に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
【請求項１０】
工程（ｃ）における糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の判断が、工程（ｂ）において被験者について得られる測定結果を、正常者について同様に得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへのＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドの結合量の異同に基づいて行われるものである、請求項９に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）を含む糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｃ）被験者の腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量を測定する工程。
【請求項１２】
上記工程（ａ）に引き続いて下記の工程（ｂ）を含む、請求項１１に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｄ）上記（ａ）の結果を正常者の腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量と対比して、その異同に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
【請求項１３】
下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ａ）被験者の腎組織抽出物とＵＤＰ−グルコース及びセラミドとを接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に基づいて生じるグルコシルセラミドの生成量を測定する工程、
【請求項１４】
上記工程（ａ）および（ｂ）に引き続いてさらに下記の工程（ｃ）を含む、請求項１３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果を正常者のグルコシルセラミド生成量と対比して、その異同に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
【請求項１５】
少なくとも一方が標識化されていてもよいＵＤＰ−グルコースおよびセラミドを、同一の包装物中または別個の包装物として有する、糸球体線維化を伴う腎疾患の検査試薬。
【請求項１６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質とＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１７】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質とＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを産生可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生量を測定し、該産生量を被験物質を接触させない対照細胞の上記Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１８】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質をＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅに接触させる工程、
（ｂ）上記工程に起因して生じるＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない場合のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性の低下をもたらす被験物質を選択する工程。
【請求項１９】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質の存在下で、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ−グルコース、及びセラミドを反応させる工程、
（ｂ）上記反応の結果生じたグルコシルセラミドの生成量を測定し、該生成量を、被験物質の非存在下で上記（ａ）の反応を行って得られるグルコシルセラミドの生成量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、グルコシルセラミドの生成量の減少をもたらす被験物質を選択する工程。
【請求項２０】
糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項１６乃至１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２２】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質が請求項１６に記載のスクリーニング方法により得られるものである、請求項２１に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２３】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの生成、機能または活性を抑制する物質を有効成分とする糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２４】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの生成、機能または活性を抑制する物質が、請求項１７乃至１９のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるものである、請求項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２５】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000023
（式中、Ｒ１は炭素数５〜１５のアルキル基またはベンジルオキシ基、Ｒ２は―（ＣＨ２）４―基または―（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２―基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩である、請求項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２６】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの活性を抑制する物質が、Ｄ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−１−フェニル−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＢＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヘキサノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＨＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−オクタノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＯＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−デカノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＤＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−パルミトイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＰＰＰ）、及びこれらの薬学上許容される塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２７】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000024
（式中、Ｒ３は任意の官能基、またＲ４は環中の窒素原子とともに複素環を形成する任意の官能基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩を被験物質として、請求項１８または１９のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うことによって得られるものである、請求項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２８】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000025
（式中、Ｒ５は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、一般式：
2003057874.tif 000026
（式中、Ｒ６は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、またはこれらの薬学上許容される塩である、請求項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項２９】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの活性を抑制する物質が、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン、Ｎ−ノニル−デオキシノジリマイシン、Ｎ−デシル−デオキシノジリマイシン、Ｎ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシン、およびこれらの薬学上許容される塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項３０】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000027
（式中、Ｒ７は任意の官能基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩を被験物質として、請求項１８または１９のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うことによって得られるものである、請求項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
【請求項３１】
配列番号１若しくは２に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドの、糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーとしての使用。
【請求項３２】
配列番号３に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅのアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体の、糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーとしての使用。
【請求項３３】
疾患マーカーが糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして用いられるものである、請求項３１または３２記載の使用。
【請求項３４】
糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法における下記の工程（ａ）及び（ｂ）の使用：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
【請求項３５】
糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法における下記の工程（ａ）及び（ｂ）の使用：
（ａ）被験者の腎組織抽出物と請求項３または４に記載の疾患マーカーとを接触させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した腎組織抽出物中のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
【請求項３６】
糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法における下記の工程（ｉ）または工程（ｉｉ−ａ）および（ｉｉ−ｂ）の使用：
（ｉ）被験者の腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量を測定する工程、または
（ｉｉ−ａ）被験者の腎組織抽出物とＵＤＰ−グルコース及びセラミドとを接触させる工程、および
（ｉｉ−ｂ）上記（ｉｉ−ａ）の工程に基づいて生じるグルコシルセラミドの生成量を測定する工程。
【請求項３７】
標識化されていてもよいＵＤＰ−グルコースまたはセラミドの、糸球体線維化を伴う腎疾患の検査試薬としての使用。
【請求項３８】
糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤の有効成分を取得するための、請求項１６乃至１９のいずれかに記載するスクリーニング方法の使用。
【請求項３９】
糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤を製造するための、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質の使用。
【請求項４０】
糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤を製造するための、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの生成、機能または活性を抑制する物質の使用。
【請求項４１】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000028
（式中、Ｒ１は炭素数５〜１５のアルキル基またはベンジルオキシ基、Ｒ２は―（ＣＨ２）４―基または―（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２―基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩である請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000029
（式中、Ｒ５は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、一般式：
2003057874.tif 000030
（式中、Ｒ６は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、またはこれらの薬学上許容される塩である請求項４０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、慢性腎炎、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、腎不全または糸球体硬化症等といった糸球体の線維化を伴う腎疾患の診断に有用な疾患マーカーに関する。より詳細には、本発明は上記糸球体線維化を伴う腎疾患の診断において、プライマーまたは検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカーに関する。また本発明は、かかる疾患マーカーを利用した糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法（診断方法）に関する。
さらに本発明は、糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬の有効成分として有用な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法で調製される上記物質を有効成分とする糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬に関する。
背景技術
近年、ＩｇＡ腎症や遺伝性腎疾患等の慢性腎炎、または糖尿病性腎症等などの腎疾患が進行して末期腎疾患となり、透析療法が導入されるに至る患者は年々増加している。このため透析治療に費やされる医療費は莫大なものとなりつつある。
慢性腎炎や糖尿病性腎症などの糸球体腎炎を発症すると、病理学的所見としてメサンギウム拡大と糸球体線維化（または糸球体硬化）が認められ、さらにこれが進行すると糸球体硬化症に至ることが知られている。
このような糸球体硬化を伴う腎疾患の治療には、従来より血圧調整剤、ステロイド、または免疫抑制剤を用いた薬物療法が行われているが、今なお根本的な病態の改善は不可能であり、末期腎疾患に至るまでの時期遅延の効果しか得られていないのが現状である。
上記糸球体腎炎の病理学的所見として見られるメサンギウム拡大と糸球体線維化（または糸球体硬化）のいずれもメサンギウム領域を中心とした細胞外基質の産生亢進を主因とした腎組織における組織の線維化が原因であると考えられている。このため、組織の線維化に至る過程を阻害するか、もしくは線維化状態の組織を回復させることによって慢性腎炎等の腎疾患を有効に改善し治療することが可能であり、このような薬剤が切望されている。しかしながら、これまで上市されている慢性腎炎の治療剤にはこのようなメカニズムに依拠したものは存在していない。また従来より行われている腎機能診断は尿採取による尿中タンパク質検査などであり、糸球体線維化（腎組織の線維化）を伴う腎疾患の罹患の有無を簡単に判定する方法はない。
一方で、最近の医療現場では、腎疾患に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。高齢化社会でのＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）向上の必要性が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マーカーが有用であり、ゆえにその探索並びに開発を目指した研究が精力的に行われているのが現状である。
なお本発明が対象とするＣＧＴは、スフィンゴリピッド合成系の酵素であり、ＵＤＰ−グルコースとセラミドからグルコシルセラミドを生成する反応を触媒することが知られている（ＳＨＡＹＭＡＮ  ＪＡ，ＡＢＥ  Ａ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ  ２０００；３１１：４２−９  “ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ：ＡＳＳＡＹ  ＡＮＤ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ．及びＭＡＲＫＳ  ＤＬ，ＰＡＵＬ  Ｐ，ＫＡＭＩＳＡＫＡ  Ｙ，ＰＡＧＡＮＯ  ＲＥ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ．２０００；３１１：５０−９．”ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＴＵＤＹＩＮＧ  ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ”）。
発明の開示
本発明は、糸球体線維化を伴う腎疾患の診断に有用な疾患マーカーを提供することを目的とする。より詳細には、本発明は腎臓の組織線維化、具体的には糸球体線維化を伴う腎疾患を特異的に反映した疾患マーカーを提供することを目的とする。また本発明は、該疾患マーカーを利用した糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、上記疾患マーカーを利用して糸球体線維化を伴う疾患の改善または治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の改善または治療に有用な薬物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、スフィンゴリピッド合成系の律速酵素であるＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下、「ＣＧＴ」ともいう）の遺伝子（以下、「ＣＧＴ遺伝子」ともいう）が、糸球体の線維化が進行した糸球体硬化症患者の腎組織において正常者に比して特異的に高く発現していることを見いだした。本発明者らは、さらにこの知見に基づいて研究を重ねることにより、上記ＣＧＴの阻害剤によって糸球体硬化をもたらす原因となる細胞外基質の産生亢進が抑制されて腎組織の線維化が抑えられること（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、糸球体線維化を伴う腎疾患モデル動物（Ｔｈｙ−１モデル）の腎皮質においても同様に当該遺伝子の発現が亢進していること、並びに該モデル動物に上記ＣＧＴ阻害剤を投与することによって糸球体の線維化病態（病変）が改善すること（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を確認した。これらの種々の知見から、本発明者らは、ＣＧＴが糸球体線維化を伴う腎疾患の進展（腎組織の線維化、糸球体の硬化）に関与していること、ＣＧＴ遺伝子の発現量（又はＣＧＴ生成量）やＣＧＴの酵素活性が糸球体線維化を伴う腎疾患診断の指標（マーカー）となること、ＣＧＴの生成またはその作用（機能、活性）を阻害することにより当該腎疾患の進展が抑制されて、これにより糸球体硬化症への進行（発症）が予防できること、また糸球体線維化を伴う腎疾患が改善／治療できる可能性を確信した。本発明はかかる知見に基づいて開発されたものである。
すなわち本発明は下記に掲げるものである。
項１．  配列番号１若しくは２に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドであって、標識されていてもよい糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカー。
項２．  糸球体線維化を伴う腎疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される項１に記載の疾患マーカー。
項３．  配列番号３に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅのアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体を有する糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカー。
項４．  糸球体線維化を伴う腎疾患の検出においてプローブとして使用される項３に記載の疾患マーカー。
項５．  下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
項６．  工程（ａ）及び（ｂ）に引き続いてさらに下記の工程（ｃ）を含む、項５に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
項７．  工程（ｃ）における糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の判断が、工程（ｂ）において被験者について得られる測定結果を、正常者について同様に得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへのポリヌクレオチドの結合量の異同に基づいて行われるものである、項６に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
項８．  下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ａ）被験者の腎組織抽出物と項３または４に記載の疾患マーカーとを接触させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した腎組織抽出物中のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
項９．  工程（ａ）及び（ｂ）に引き続いてさらに下記の工程（ｃ）を含む、項８に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
項１０．  工程（ｃ）における糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の判断が、工程（ｂ）において被験者について得られる測定結果を、正常者について同様に得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへのＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドの結合量の異同に基づいて行われるものである、項９に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
項１１．  下記の工程（ａ）を含む糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ａ）被験者の腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量を測定する工程。
項１２．  上記工程（ａ）に引き続いて下記の工程（ｂ）を含む、項１１に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｂ）上記（ａ）の結果を正常者の腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量と対比して、その異同に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
項１３．  下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ａ）被験者の腎組織抽出物とＵＤＰ−グルコース及びセラミドとを接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に基づいて生じるグルコシルセラミドの生成量を測定する工程。
項１４．  上記工程（ａ）および（ｂ）に引き続いてさらに下記の工程（ｃ）を含む、項１３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法：
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果を正常者のグルコシルセラミド生成量と対比して、その異同に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
項１５．  少なくとも一方が標識化されていてもよいＵＤＰ−グルコースおよびセラミドを、同一の包装物中または別個の包装物として有する、糸球体線維化を伴う腎疾患の検査試薬。
項１６．  下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質とＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
項１７．  下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質とＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを産生可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生量を測定し、該産生量を被験物質を接触させない対照細胞の上記Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの産生量を減少させる被験物質を選択する工程。
項１８．  下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質をＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅに接触させる工程、
（ｂ）上記工程に起因して生じるＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない場合のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性の低下をもたらす被験物質を選択する工程。
項１９．  下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質の存在下で、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ−グルコース、及びセラミドを反応させる工程、
（ｂ）上記反応の結果生じたグルコシルセラミドの生成量を測定し、該生成量を、被験物質の非存在下で上記（ａ）の反応を行って得られるグルコシルセラミドの生成量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、グルコシルセラミドの生成量の減少をもたらす被験物質を選択する工程。
項２０．  糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項１６乃至１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項２１．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２２．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質が項１６に記載のスクリーニング方法により得られるものである、項２１に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２３．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの生成、機能または活性を抑制する物質を有効成分とする糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２４．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの生成、機能または活性を抑制する物質が、項１７乃至１９のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるものである、項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２５．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000002
（式中、Ｒ１は炭素数５〜１５のアルキル基またはベンジルオキシ基、Ｒ２は―（ＣＨ２）４―基または―（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２―基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩である、項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２６．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの活性を抑制する物質が、Ｄ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−１−フェニル−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＢＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヘキサノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＨＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−オクタノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＯＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−デカノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＤＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−パルミトイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＰＰＰ）、及びこれらの薬学上許容される塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２７．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000003
（式中、Ｒ３は任意の官能基、またＲ４は環中の窒素原子とともに複素環を形成する任意の官能基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩を被験物質として、項１８または１９のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うことによって得られるものである、項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２８．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000004
（式中、Ｒ５は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、一般式：
2003057874.tif 000005
（式中、Ｒ６は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、またはこれらの薬学上許容される塩である、項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項２９．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの活性を抑制する物質が、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン、Ｎ−ノニル−デオキシノジリマイシン、Ｎ−デシル−デオキシノジリマイシン、Ｎ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシン、およびこれらの薬学上許容される塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項３０．  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000006
（式中、Ｒ７は任意の官能基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩を被験物質として、項１８または１９のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うことによって得られるものである、項２３に記載の糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤。
項３１．  配列番号１若しくは２に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドの、糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーとしての使用。
項３２．  配列番号３に記載のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅのアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体の、糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーとしての使用。
項３３．  疾患マーカーが糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして用いられるものである、項３１または３２記載の使用。
項３４．  糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法における下記の工程（ａ）及び（ｂ）の使用：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
項３５．  糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法における下記の工程（ａ）及び（ｂ）の使用：
（ａ）被験者の腎組織抽出物と項３または４に記載の疾患マーカーとを接触させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した腎組織抽出物中のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
項３６．  糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法における下記の工程（ｉ）または工程（ｉｉ−ａ）および（ｉｉ−ｂ）の使用：
（ｉ）被験者の腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量を測定する工程、または
（ｉｉ−ａ）被験者の腎組織抽出物とＵＤＰ−グルコース及びセラミドとを接触させる工程、および
（ｉｉ−ｂ）上記（ｉｉ−ａ）の工程に基づいて生じるグルコシルセラミドの生成量を測定する工程。
項３７．標識化されていてもよいＵＤＰ−グルコースまたはセラミドの、糸球体線維化を伴う腎疾患の検査試薬としての使用。
項３８．糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤の有効成分を取得するための、項１６乃至１９のいずれかに記載するスクリーニング方法の使用。
項３９．糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤を製造するための、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の発現を抑制する物質の使用。
項４０．糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤を製造するための、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの生成、機能または活性を抑制する物質の使用。
項４１．Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000007
（式中、Ｒ１は炭素数５〜１５のアルキル基またはベンジルオキシ基、Ｒ２は―（ＣＨ２）４―基または―（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２―基を意味する。）
で示される化合物またはその薬学上許容される塩である項４０記載の使用。
項４２．Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質が、一般式：
2003057874.tif 000008
（式中、Ｒ５は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、一般式：
2003057874.tif 000009
（式中、Ｒ６は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示される化合物、またはこれらの薬学上許容される塩である項４０記載の使用。
発明を実施するための最良の形態
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定の塩基配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログ）、誘導体、および変異体が包含される。なお、上記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、腎疾患、特に糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の有無若しくは罹患の程度を診断するために、直接または間接的に利用されるものである。具体的には、糸球体線維化を伴う腎疾患患者の腎組織において特異的に発現上昇しているＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴ）遺伝子またはその発現産物（タンパク質、ＣＧＴ）を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内で発現した上記遺伝子（ＣＧＴ遺伝子）及びタンパク質（ＣＧＴ）を検出し、定量するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子（ＣＧＴ遺伝子）を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
また本明細書において、「正常者」とは、腎疾患、具体的には糸球体の線維化を伴う腎疾患に罹患していない者を意味する。より具体的には、血清クレアチニン値検査、または尿中タンパク質や糸球体濾過率等の測定の結果から、腎疾患に罹患していないと診断された者を意味する。また本明細書において、「正常な腎組織」とは、当該正常者の腎組織を意味するものである。
本発明は、前述するように、ＣＧＴ遺伝子の発現が糸球体線維化を伴う腎疾患患者の腎組織で特異的に増大しており、且つｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＧＴの阻害剤の投与によって糸球体硬化をもたらす糸球体の線維化が抑制もしくは改善されるという知見に基づくものである。従って、当該ＣＧＴ遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド〕は、腎疾患、特に糸球体線維化を伴う腎疾患の解明、並びに診断に有効に利用することができる。そして、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。また、これらＣＧＴ遺伝子及びその発現産物（ＣＧＴ）並びにそれらからの派生物（例えば、ＣＧＴに対する抗体など）は、上記腎疾患の治療、並びに該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用することができる。さらに、個体または腎組織における、上記ＣＧＴ遺伝子の発現またはその発現産物（ＣＧＴ）の有無またはその程度の測定（定性、定量）、または該遺伝子の変異またはその発現不全の検出は、糸球体線維化を伴う腎疾患の解明や診断に有効に利用することができる。
本発明でいう腎疾患には、具体的には糸球体線維化を伴う慢性腎炎、糸球体線維化を伴う糖尿病性腎症、糸球体線維化を伴うＩｇＡ腎症、糸球体線維化を伴う遺伝性腎疾患、糸球体線維化を伴う腎不全、及び糸球体線維化を伴う糸球体硬化症などが包含される。なお、本明細書において「糸球体線維化を伴う腎疾患」は、単に「糸球体の線維化」と言い換えることができる。
以下、ＣＧＴ遺伝子、並びに当該遺伝子の発現産物（ＣＧＴ）やそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
（１）糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカー及びその応用
（１−１）ポリヌクレオチド
本発明の配列番号１および２の塩基配列で示すポリヌクレオチドは、それぞれヒト由来のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴ）の遺伝子としていずれも公知の遺伝子である（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＸＭ＿００５５５５とＤ５０８４０）。なお、これらの遺伝子は２１位と６３８位の２カ所の塩基配列を異にするものの、ともに同一のアミノ酸配列を有するＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴ）をコードする遺伝子である。
本発明は、前述するように、ＣＧＴ遺伝子の発現上昇の有無やその程度を検出（定性・定量的測定）することによって糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の有無や罹患の程度（進行度・進展度）を特異的に検出することができ、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。すなわち、本発明は、被験者における上記遺伝子の発現上昇の有無またはその程度を測定することによって、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の有無またはその程度を診断することのできるツールとして有用な疾患マーカーを提供するものである。
かかる本発明の疾患マーカーは、配列番号１または２に記載のＣＧＴ遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号１または２に示される塩基配列（ＣＧＴ遺伝子の全長配列）、または該塩基配列において連続した少なくとも１５塩基長の塩基配列を有する配列（部分配列）（ここでは便宜上、これら全長配列及び部分配列を「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列に対して完全な相補配列である場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイス状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号１または２に記載の塩基配列（全長配列）またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
本発明の糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーは、具体的にはＣＧＴ遺伝子の塩基配列に関する配列番号１または２に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号１または２で示されるＣＧＴ遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の各々部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法を用いる場合には、ＣＧＴ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合にはＣＧＴ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、これらに限定されることなく、当業者が上記ノーザンブロット法における検出物または上記ＲＴ−ＰＣＲ法における生成物が、ＣＧＴ遺伝子またはこれに由来するポリヌクレオチドに由来すると判断できるものであればよい。
そのような本発明の疾患マーカーは、配列番号１または２で示されるＣＧＴ遺伝子の塩基配列をもとに、例えばｐｒｉｍｅｒ  ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することができる。
具体的にはＣＧＴ遺伝子の塩基配列をｐｒｉｍｅｒ３またはベクターＮＴＩのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
本発明で用いる疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
本発明において糸球体線維化を伴う腎疾患の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に腎組織におけるＣＧＴ遺伝子の発現上昇の有無またはそのレベル（発現上昇程度）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の疾患マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
上記疾患マーカーを、糸球体線維化を伴う腎疾患の検出においてプライマーとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜全配列の塩基数、好ましくは１５ｂｐ〜１ｋｂ、より好ましくは１００ｂｐ〜１ｋｂの塩基長を有するものが例示できる。
本発明の疾患マーカーをプライマーとして用いる場合、好ましいプライマーとしては、センス鎖については、ＣＧＴ遺伝子の塩基配列７８０−７９９位に位置する配列を有するセンス鎖（２０ｂｐ）：５’−ＡＡＡＧＴＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号４）、アンチセンス鎖については、ＣＧＴ遺伝子の塩基配列（配列番号１）の１６０８−１６２７位に位置する配列（２０ｂｐ）に対するアンチセンス鎖（２０ｂｐ）：５’−ＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＡ−３’（配列番号５）を例示することができる。
また本発明の疾患マーカーをプローブとして用いる場合、好ましいプローブとしては、上記プライマーを用いて増幅される配列、すなわちＣＧＴ遺伝子の塩基配列７８０−１６２７位に位置する配列（配列番号６）またはその相補配列を例示することができる。なお、本発明の疾患マーカー（ＲＮＡに対しては相補鎖）は、放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）、蛍光物質、化学発光物質、または酵素などで標識されていてもよく、かかる標識疾患マーカーはプローブ（検出マーカー）として好適に利用することができる。
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に認識し、また検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができ、これによって糸球体線維化を伴う腎疾患に関連するＣＧＴ遺伝子の発現上昇の有無またはそのレベル（発現上昇程度）を評価することができる。なお、測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の腎組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。なお、採取する腎組織は、腎皮質及び腎髄質の別を問わないが、好ましくは腎皮質である。
また、生体組織におけるＣＧＴ遺伝子の遺伝子発現レベルは、ＤＮＡチップを利用して検出あるいは定量することもできる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該ＤＮＡチップのプローブとして使用することができる。かかるＤＮＡチップを、生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡまたは標識ＲＮＡとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズによって形成された上記プローブ（疾患マーカー）と標識ＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体を該標識ＤＮＡまたはＲＮＡの標識を指標として検出することにより生体組織中でのＣＧＴ遺伝子の発現量が測定でき、これによって該遺伝子の発現上昇の有無またはそのレベル（発現上昇程度）を評価することができる。
本発明の疾患マーカーは、糸球体線維化を伴う腎疾患の検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。当該検出は被験者の腎組織におけるＣＧＴ遺伝子の発現量を上記疾患マーカーを用いて測定することにより実施することができる。具体的には、糸球体線維化を伴う腎疾患でＣＧＴ遺伝子が特異的に発現誘導されていることから（発現上昇を示す）、当該検出は被験者の腎組織におけるＣＧＴ遺伝子の遺伝子発現量を上記疾患マーカーを用いて測定し、被験者における該遺伝子発現量の上昇の有無を、正常者の腎組織におけるＣＧＴ遺伝子の遺伝子発現量との対比から判定することによって行うことができる。この場合、被験者の腎組織での該遺伝子の発現量が正常者の腎組織の発現量と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上多ければ、当該被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患が疑われる。
（１−２）抗体
また本発明は、糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーとしてＣＧＴ遺伝子の発現産物（タンパク質、ＣＧＴ）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
ＣＧＴとしては配列番号１または２に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げることができる。なお、配列番号１または２に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができる。
なお、ここで配列番号３に示すタンパク質は、スフィンゴリピッド合成系の律速酵素であるヒト由来のＣＧＴ（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）として公知のタンパク質であり、その酵素学的性質や取得方法についてもＳＨＡＹＭＡＮ  ＪＡ，ＡＢＥ  Ａ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ  ２０００；３１１：４２−９“ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ：ＡＳＳＡＹ  ＡＮＤ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ”及びＭＡＲＫＳ  ＤＬ，ＰＡＵＬ  Ｐ，ＫＡＭＩＳＡＫＡ  Ｙ，ＰＡＧＡＮＯ  ＲＥ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ．２０００；３１１：５０−９．“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＴＵＤＹＩＮＧ  ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ”に記載されるように公知である。ただし、当該ＣＧＴ酵素が糸球体線維化を伴う腎疾患に何らかの形で関与していることの認識は、本発明で初めて見いだされたものである。
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、ＣＧＴを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには当該ＣＧＴのアミノ酸配列のうち、連続する少なくとも８アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＣＧＴを用いて、あるいは常法に従って当該ＣＧＴの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＣＧＴ、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１）。
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１または２）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））などに準じて行うことができる。具体的にはＣＧＴをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらＣＧＴは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号３）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
なお、本発明のＣＧＴには、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の公知の機能と同等の生物学的機能を有するか、及び／または免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
なお、ここで配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の公知の機能と同等の生物学的機能を有するタンパク質としてはＣＧＴと生化学的または薬理学的機能において同等の機能を有するタンパク質を挙げることができる。また、上記タンパク質と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつＣＧＴに対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ  Ｓｔａｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸のうち１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸のうち５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸のうち１％以内である。また置換されるアミノ酸は、当該アミノ酸で置換した後に得られるタンパク質がＣＧＴの生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されない。好ましくは、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸である。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらのアミノ酸の性質を指標として同群に属するアミノ酸の中からを適宜選択することができる。
また本発明の抗体は、ＣＧＴの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、ＣＧＴと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる免疫原特性を有し、ＣＧＴのアミノ酸配列において連続する少なくとも８つのアミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント；水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル；並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質；ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
本発明の抗体はＣＧＴに特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の腎組織内に発現した上記タンパク質（ＣＧＴ）を特異的に検出し、また定量することができる。すなわち、当該抗体は被験者の腎組織内におけるＣＧＴ生成の有無を検出するためのプローブとして有用である。
具体的には、患者の腎組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って上記のタンパク質（ＣＧＴ）を含む腎組織抽出物（タンパク質（ＣＧＴ）含有画分）を調製して、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、上記腎組織抽出物中（すなわち腎組織）に存在するＣＧＴを検出することができる。
前述するように、糸球体線維化を伴う腎疾患患者の腎組織ではＣＧＴ遺伝子が発現上昇を示していることから、被験者の腎組織におけるＣＧＴの量が正常な腎組織におけるＣＧＴの量に比して上昇しているか否かを判定することによって、糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患の有無を診断することができる。この場合、被験者の腎組織におけるＣＧＴ遺伝子の発現産物（ＣＧＴ）の量が正常な腎組織における発現産物量と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上多いことが判定されれば、当該被験者において糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患が疑われる。
（２）糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法
本発明は、糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法を提供する。
（２−１）当該検出方法としては、第１に前述する本発明の糸球体線維化を伴う腎疾患の疾患マーカーを利用する方法を挙げることができる。
具体的には、当該検出方法は、被験者の腎組織の一部をバイオプシなどで採取し、そこに含まれるＣＧＴ遺伝子の遺伝子発現レベルまたはこれらの遺伝子に由来するタンパク質（ＣＧＴ）を検出し、または定量する工程を有する。ここで得られた結果に基づいて該被験者が糸球体線維化を伴う腎疾患に罹患しているか否か、または罹患している場合にはその程度を判断することができる。
本発明の腎疾患の検出方法は次の（ａ）および（ｂ）の工程を含むものである：
（ａ）被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
（ｂ）生体試料中のＣＧＴ遺伝子の発現レベル、またはその遺伝子産物（タンパク質、ＣＧＴ）の量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
さらに、本発明の腎疾患の検出方法は上記工程（ａ）および（ｂ）に加えて、さらに下記の工程（ｃ）を含むことができる：
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
当該（ｃ）工程は、例えば、工程（ｂ）において被験者について得られる測定結果を、正常者について同様にして得られる測定結果と対比して、得られる疾患マーカーへのポリヌクレオチドの結合量の異同に基づいて行うことができる。
ここで用いられる生体試料は、被験者の腎組織から調製されるＲＮＡ若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチド、被験者の腎組織から調製されるタンパク質、またはタンパク質含有画分を含む被験者の腎組織抽出物、または腎組織などである。かかるＲＮＡ、ポリヌクレオチド、タンパク質または腎組織抽出物（タンパク質含有画分）は、被験者の腎組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製することができる。
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
（ｉ）  測定対象の生体試料としてＲＮＡまたはそれから調製されるポリヌクレオチドを利用する場合
この場合、上記工程（ａ）および（ｂ）として下記の工程を用いることができる。
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
検出に用いる生体試料としてＲＮＡまたはそれから調製されるポリペプチド（以下、ＲＮＡ等という）を利用する場合は、本発明の腎疾患の検出方法は該ＲＮＡ等中のＣＧＴ遺伝子の発現を検出し、またその程度を測定することによって実施される。具体的には、前述する本発明のポリヌクレオチドからなる疾患マーカー（ＣＧＴ遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、上記ＲＮＡ等を対象にしてノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ等中のＣＧＴ遺伝子の発現の有無やその発現の程度を検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（ＲＮＡに対しては相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡ等とハイブリダイズさせた後、形成された疾患マーカー（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ等との二重鎖を、疾患マーカーの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質等）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器等で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒａｍｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（ポリヌクレオチド）を標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡ等とハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカー（ポリヌクレオチド）をプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ等中のＣＧＴ遺伝子の発現の有無やその程度を検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のＣＧＴ遺伝子領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー〔上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する本発明の疾患マーカー（正鎖）、上記ｃＤＮＡの逆鎖（＋鎖）に結合する本発明の疾患マーカー（相補鎖）〕をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＭＥ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチド）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製されたｃＲＮＡとハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖に、別途ＲＩや蛍光物質等で標識してなる本発明の疾患マーカー（ポリヌクレオチド）を標識プローブとして結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記ＤＮＡチップとして、ＣＧＴ遺伝子の発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを挙げることができる。かかるＤＮＡチップを用いた、被験者ＲＮＡ中のＣＧＴ遺伝子の発現レベルの検出、測定については、実施例において詳細に説明する。
糸球体線維化に伴う腎疾患の診断は、好適には、上記の如くして測定される本発明の疾患マーカーに対するポリヌクレオチドの結合量に反映される、被験者の腎組織ＲＮＡ等中におけるＣＧＴ遺伝子の発現量を、同様にして測定される正常者の腎組織ＲＮＡ等中におけるＣＧＴ遺伝子の発現量と対比して、両者の違いに基づいて行うことができる。具体的には、被験者の当該発現量が正常者の発現量よりも多い場合には、該被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を疑うことができる、この場合、被験者のＣＧＴ遺伝子の発現量が正常者のそれよりも２倍以上、好ましくは３倍以上高ければ、より高い信頼性をもって、該被験者について腎疾患の罹患を認定することができる。
（ｉｉ）  測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の検出方法は生体試料中のＣＧＴを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、被験者の腎組織抽出物（タンパク質含有画分）を、抗体に関する本発明の疾患マーカー（配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体）と接触させて、該疾患マーカーに結合したＣＧＴ又はその部分ペプチドを、ウエスタンブロット法などの方法で、本発明の疾患マーカーを指標として検出し、また定量する方法を挙げることができる。
この場合、前述する工程（ａ）および（ｂ）として下記の工程を用いることができる。
（ａ）被験者の腎組織抽出物と請求項３または４に記載の疾患マーカーとを接触させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した腎組織抽出物中のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程。
ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、二次抗体として上記一次抗体に結合性を有する１２５Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質で標識してなる抗体を用いて、ＣＧＴ又はその部分ペプチドと疾患マーカー（一次抗体）との複合体を標識し、次いで該放射性同位元素若しくは蛍光物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で測定することもできる。
糸球体線維化を伴う腎疾患の検出は、好適には上記の如くして測定される本発明の疾患マーカーに対するＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはその部分ペプチドの結合量に反映される、被験者の腎組織におけるＣＧＴ遺伝子の発現産物（ＣＧＴ）の量を、同様にして測定される正常な腎組織における当該ＣＧＴの量と比較し、両者の違いに基づいて行うことができる。具体的には、被験者の腎組織中のＣＧＴ量が正常者のＣＧＴ量よりも多い場合には、該被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を疑うことができる、この場合、被験者の腎組織中のＣＧＴ量が正常者のそれよりも２倍以上、好ましくは３倍以上高ければ、より高い信頼性をもって、該被験者について腎疾患の罹患を認定することができる。
なお、被験者の腎組織と正常な腎組織とのＣＧＴ遺伝子の発現の程度またはＣＧＴ量の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行なわない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な腎組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたＣＧＴ遺伝子の発現の程度、若しくはその遺伝子発現産物であるＣＧＴの量の平均値または統計的中間値を、正常者のＣＧＴ遺伝子発現レベル若しくはＣＧＴ量として、比較に用いることができる。
ところで、ＣＧＴは前述するようにスフィンゴリピッド合成系の酵素であり、ＵＤＰ−グルコースとセラミドからグルコシルセラミドを生成する反応を触媒することが知られている（ＳＨＡＹＭＡＮ  ＪＡ，ＡＢＥ  Ａ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ  ２０００；３１１：４２−９“ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ：ＡＳＳＡＹ  ＡＮＤ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ．及びＭＡＲＫＳ  ＤＬ，ＰＡＵＬ  Ｐ，ＫＡＭＩＳＡＫＡ  Ｙ，ＰＡＧＡＮＯ  ＲＥ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ．２０００；３１１：５０−９．”ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＴＵＤＹＩＮＧ  ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ”）。従って、腎組織中のＣＧＴ量は、該腎組織中の当該ＣＧＴ酵素活性を測定することによっても、評価することができる。
（２−２）従って、本発明は糸球体線維化を伴う腎疾患の検出方法として、第２に、被験者の腎組織中のＣＧＴ酵素活性に基づいて該疾患の罹患の有無を検出する方法を提供する。
具体的には、本発明の検出方法は、（ａ）被験者の腎組織中のＣＧＴ酵素活性を測定する工程を実施することで行うことができる。
この場合、具体的には腎組織中のＣＧＴ酵素活性は、例えば、（ｉ）腎組織中に内在するグルコシルセラミド（内因性グルコシルセラミド）の量を測定するか、または（ｉｉ）腎組織抽出物にＵＤＰ−グルコースとセラミドを配合して、当該外来的に添加したＵＤＰ−グルコースとセラミドに基づいて生成するグルコシルセラミド（外因性グルコシルセラミド）の量を測定することによって、測定し評価することができる。当該（ｉ）の方法は、腎組織中に本来的に存在するＵＤＰ−グルコースとセラミドに対して腎組織中のＣＧＴの作用によって生成する内在性のグルコシルセラミドの量に基づいてＣＧＴ活性を評価する方法である。また（ｉｉ）の方法は腎組織抽出物に外来的に配合したＵＤＰ−グルコースとセラミドに対して腎組織中のＣＧＴの作用によって生成する外来性のグルコシルセラミドの量に基づいてＣＧＴ活性を評価する方法である。当該（ｉｉ）の方法は、具体的には上記（ａ）の工程として下記工程を実施することによって行うことができる：
（ａ−１）被験者の腎組織抽出物とＵＤＰ−グルコース及びセラミドとを接触させる工程、
（ａ−２）上記（ａ）の工程に基づいて生じるグルコシルセラミドの生成量を測定する工程。
腎組織抽出物は、腎組織中に存在するＣＧＴの量や活性、ＵＤＰ−グルコース、セラミド及びグルコシルセラミドの量を低減させない方法を用いて調製することが好ましい。かかる方法としてＳＨＡＹＭＡＮ  ＪＡ，ＡＢＥ  Ａ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ  ２０００；３１１：４２−９“ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ：ＡＳＳＡＹ  ＡＮＤ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ”、またはＭＡＲＫＳ  ＤＬ，ＰＡＵＬ  Ｐ，ＫＡＭＩＳＡＫＡ  Ｙ，ＰＡＧＡＮＯ  ＲＥ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ．２０００；３１１：５０−９．“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＴＵＤＹＩＮＧ  ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ”に記載される方法を挙げることができる。
（ｉ）の方法において、腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量は、具体的には上記方法に従って得られる腎組織抽出物から脂質画分を抽出し、これをＨＰＣＬに供することによって測定することができる。
（ｉｉ）の方法は、具体的には上記の腎組織抽出物０．１μｇ〜０．１ｇあたりに、ＵＤＰ−グルコース及びセラミドをそれぞれ０．１ｐｇ〜０．１ｍｇ程度の割合で加え、得られる混合物を３７℃で１時間程度反応させて、イソプロパノールと硫酸ナトリウムの混合物等の反応停止剤を添加後、得られた反応物について、上記方法に従ってグルコシルセラミドの量を測定することによって実施することができる。この時に、コントロールとしてＵＤＰ−グルコース及びセラミドを添加しない腎組織抽出物についても同様に実験を行い、得られるグルコシルセラミドの内在量（内因性グルコシルセラミドの量）を差し引くことによって、外因性グルコシルセラミドの量を評価することができる。
上記において用いられるセラミドとは、ＣＧＴの基質となるものであれば、天然由来／非天然由来のいずれであってもよく、セラミドの誘導体も本発明でいうセラミドの範疇に含まれる。セラミドの誘導体としては、具体的にはＮ−アシルスフィンゴシンを挙げることができる。ここでアシルとは、炭素数２〜２０程度のアシル基を指し、好ましくは炭素数８のアシル基を有するオクタノイルスフィンゴシン（Ｏｃｔａｎｏｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を挙げることができる。
また、上記（ｉｉ）の方法において腎組織抽出物と反応させるＵＤＰ−グルコース及びセラミドのいずれか少なくとも１方を、放射性同位体、蛍光試薬、化学発光試薬または酵素試薬などで標識したものを使用することによって、外因性グルコシルセラミドの量を選択的に測定し評価することができる。具体的には、一例として、腎組織抽出物とセラミド及びＵＤＰ−３Ｈ−グルコースを混合して、３７℃で１時間程度反応させた後、イソプロパノールと硫酸ナトリウムの混合物等の反応停止剤を添加して反応を停止し、得られた反応溶液からｔ−ブチルメチルエーテルで３Ｈ−グルコシルセラミドを抽出して、該標識グルコシルセラミドの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する方法を例示することができる。
このように本発明の糸球体線維化を伴う腎疾患の診断は、いずれか少なくとも１方が標識化されていてもよいＵＤＰ−グルコース及びセラミドを検査試薬として用いて実施することができる。よって本発明は、いずれか少なくとも１方が標識化されていてもよいＵＤＰ−グルコース及びセラミドの糸球体線維化を伴う腎疾患の検査試薬としての使用（用途）をも提供するものである。当該検査試薬は、少なくともＵＤＰ−グルコースとセラミドとが予め混合された状態で包装されてなるものであってもよいし、また用時に混合できるように、別個に包装されてなるものであってもよい。なお、ＵＤＰ−グルコース及び／またはセラミドを標識する場合、使用される標識剤としては特に制限されず、従来公知のアッセイ系で使用される標識剤、例えば放射性同位体、蛍光試薬、化学発光試薬または酵素試薬などを用いることができる。また、本発明の検査試薬の中には、同一包装物中または別個の包装物として、他の成分（例えば、反応緩衝液、反応停止剤、酵素反応基質、ｐＨ調整剤）を含めることもできる。
本発明の糸球体線維化を伴う腎疾患の検出は、好適にはさらに前述する方法によって得られる被験者の腎組織に内在するグルコシルセラミドまたは外来的に生じるグルコシルセラミドの量を、正常者のそれらと対比して、両者の異同に基づいて行うことができる。
具体的には、（ｉ）の場合、上記（ａ）の工程に加えてさらに下記の工程を行うことが好ましい：
（ｂ）上記（ａ）の結果を正常者の腎組織中に内在するグルコシルセラミドの量と対比して、その異同に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
（ｉｉ）の場合は、上記（ａ−１）および（ａ−２）の工程に加えてさらに下記の工程を行うことが好ましい：
（ｂ）上記（ａ−２）の測定結果を、同様にして得られる正常者のグルコシルセラミド生成量と対比して、その異同に基づいて、被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患の罹患を判断する工程。
上記（ｂ）の工程において、被験者に内在するグルコシルセラミドの量または外来的に生じるグルコシルセラミドの量が正常者のそれよりも多い場合には、該被験者について糸球体線維化を伴う腎疾患を疑うことができる。この場合、被験者についてグルコシルセラミドの量が正常者のそれよりも２倍以上、好ましくは３倍以上高ければ、より高い信頼性をもって、該被験者について腎疾患の罹患を認定することができる。
（３）候補薬のスクリーニング方法
（３−１）遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号１または２に記載の塩基配列を有するＣＧＴ遺伝子の発現を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とＣＧＴ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞のＣＧＴ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、および（ｃ）上記の比較結果に基づいて、ＣＧＴ遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられる細胞としてはＣＧＴ遺伝子を発現する細胞であって、かつ腎臓由来の細胞を挙げることができる。腎臓由来の細胞としては、具体的には、抗Ｔｈｙ−１抗体を投与したＷｉｓｔａｒラット（チャールズリバー社製）、もしくは６分の５腎臓摘出Ｗｉｓｔａｒラット（チャールズリバー社製）から単離・調製した初代腎臓培養細胞などを挙げることができる。またＮＲＫ−４９Ｆ細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｒａｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｃｅｌｌ：ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１５７０）のような株化細胞も用いることができる。その際、糸球体線維化を伴う腎炎またはこれに近い状態の細胞を用いることもでき、かかる細胞は、上記ＣＧＴ遺伝子を発現する腎臓由来の細胞をＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）あるいはＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等の線維化原因因子で処理することにより調製することができる。さらに本発明のスクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
実施例に示すように、糸球体線維化を伴う腎疾患（糸球体硬化症）に罹患した患者の腎組織には、特異的にＣＧＴ遺伝子が高く発現している。また既存のＣＧＴ阻害剤の投与実験により、糸球体線維化抑制効果が認められた。これらの知見から、ＣＧＴ遺伝子の発現の増加（発現誘導）が糸球体線維化を伴う腎疾患の原因になっていると考えられる。本発明の上記スクリーニング方法は、当該知見に基づいて、糸球体線維化を伴う腎疾患の緩和／抑制作用を有する（糸球体線維化を伴う腎疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質（以下、「候補物質」ともいう）を、上記ＣＧＴ遺伝子の発現レベルの減少、あるいは発現誘導の抑制を指標として探索しようとするものである。
ここで候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（ＣＧＴ遺伝子のアンチセンス分子を含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明のスクリーニング方法は、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を上記細胞と接触させることにより行うことができる。また細胞との接触は、かかる被験物質を含む試料（被験試料）を用いて行うこともでき、かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、または合成低分子化合物、合成ペプチド、若しくは天然化合物などを含む試料を例示することができる。
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法によれば、ＣＧＴ遺伝子の発現を抑制する物質を探索することによって、糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を取得することができる。この意味で、本発明のスクリーニング方法は被験物質の中から糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬の有効成分を探索し、選別し、取得する方法として位置づけることができる。
候補物質の探索（選別）は、具体的には被験物質と接触させる細胞としてＣＧＴ遺伝子を発現する細胞を用いる場合は、被験物質を添加した細胞におけるＣＧＴ遺伝子の発現レベルが被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなることをもって行うことができる。
より具体的には、例えば、上記細胞として抗Ｔｈｙ−１抗体を投与したＷｉｓｔａｒラットや６分の５腎臓摘出Ｗｉｓｔａｒラットから単離・調製した初代腎臓培養細胞を用いる場合、被験物質を加えた初代腎臓培養細胞のＣＧＴ遺伝子の発現量を、被験物質を加えず溶媒のみを加えた初代腎臓培養細胞（対照細胞）のＣＧＴ遺伝子の発現量と比較し、添加によりその発現量の低下をもたらす被験物質を候補物質として選別することができる。
このようなＣＧＴ遺伝子の発現の検出や定量は、前記細胞から調製したＲＮＡ又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の方法の他、ＤＮＡチップなどを利用して実施できる。これら公知の方法については、前記本発明の腎疾患の検出方法に関する（２−１）の項を参照されたい。指標とするＣＧＴ遺伝子発現の低下（減少）の程度は、被験物質を添加した細胞におけるＣＧＴ遺伝子の発現量が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して１０％以上、好ましくは３０％以上、特に好ましくは５０％以上の低下（減少）を例示することができる。
またＣＧＴ遺伝子発現の検出及び定量は、ＣＧＴ遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実施することもできる。本発明のＣＧＴ遺伝子の発現抑制物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。この意味において請求項１６に記載する「Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子」の概念には、ＣＧＴ遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や抵触反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子もまた使用することができる。ここでＣＧＴ遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
以上のスクリーニング方法により、被験物質から選別される物質はＣＧＴ遺伝子の発現抑制剤として位置づけることができる。これらの物質は、ＣＧＴ遺伝子の発現を抑制することによって、糸球体線維化を伴う腎疾患の発症や進展、ならびに該疾患の進展による糸球体硬化症への移行を抑制し得ると考えられる。よって、これらの物質は、糸球体線維化を伴う腎疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物または糸球体硬化症への進展及び発症を予防する薬物の有力な候補物質となる。
（３−２）ＣＧＴ産生量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＣＧＴの産生を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とＣＧＴを産生可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＧＴの産生量を測定し、該産生量を被験物質を接触させない対照細胞の上記ＣＧＴの産生量と比較する工程、および
（ｃ）上記の比較結果に基づいて、ＣＧＴの産生量を減少させる被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、ＣＧＴ遺伝子を発現し、ＣＧＴを産生する細胞を挙げることができる。具体的には、抗Ｔｈｙ−１抗体を投与したＷｉｓｔａｒラット（チャールズリバー社製）、もしくは６分の５腎臓摘出Ｗｉｓｔａｒラット（チャールズリバー社製）から単離・調製した初代腎臓培養細胞、ＮＲＫ−４９Ｆ細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｒａｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｃｅｌｌ：ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１５７０）などの株化細胞を挙げることができる。また前述するように当該スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
実施例に示すように、糸球体線維化を伴う腎疾患（糸球体硬化症）に罹患した患者の腎組織には、特異的にＣＧＴ遺伝子が高く発現している。また既存のＣＧＴ阻害剤の投与実験により、糸球体線維化抑制効果が認められた。これらの知見から、ＣＧＴ遺伝子の発現の増加（発現誘導）が糸球体線維化を伴う腎疾患の原因になっていると考えられる。本発明のスクリーニング方法は、ＣＧＴ遺伝子の発現に対応して増減するＣＧＴの産生量を指標として（具体的にはＣＧＴの産生量の減少を指標として）、糸球体線維化を伴う腎疾患の緩和／抑制作用を有する（糸球体線維化を伴う腎疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質（候補物質）を探索しようとするものである。
ここで候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（ＣＧＴ遺伝子のアンチセンス分子を含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明のスクリーニング方法は、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を上記細胞と接触させることにより行うことができる。また細胞との接触は、かかる被験物質を含む試料（被験試料）を用いて行うこともでき、かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、または合成低分子化合物、合成ペプチド、若しくは天然化合物などを含む試料を例示することができる。
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法によれば、ＣＧＴの産生を抑制する物質を探索することによって、糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を取得することができる。この意味で、本発明のスクリーニング方法は被験物質の中から糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬の有効成分を探索し、選別し、取得する方法として位置づけることができる。
候補物質の探索（選別）は、具体的には被験物質を添加した細胞におけるＣＧＴの産生量が被験物質を添加しない細胞のＣＧＴ産生量に比して低くなることをもって行うことができる。
より具体的には、例えば、上記細胞として抗Ｔｈｙ−１抗体を投与したＷｉｓｔａｒラットや６分の５腎臓摘出Ｗｉｓｔａｒラットから単離・調製した初代腎臓培養細胞を用いる場合、被験物質を加えた初代腎臓培養細胞のＣＧＴの産生量を、被験物質を加えず溶媒のみを加えた初代腎臓培養細胞（対照細胞）のＣＧＴの産生量と比較し、添加によりその産生量の低下をもたらす被験物質を候補物質として選別することができる。
このようなＣＧＴ産生量は、抗体に関する本発明の疾患マーカー（配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体）を利用したウエスタンブロット法などの方法に従って測定することができる。これらの方法については、前記本発明の腎疾患の検出方法に関する（２−２）の項を参照されたい。指標とするＣＧＴ産生量の低下（減少）の程度は、被験物質を添加した細胞におけるＣＧＴの産生量が被験物質を添加しない対照細胞での産生量と比較して１０％以上、好ましくは３０％以上、特に好ましくは５０％以上の低下（減少）を例示することができる。
以上のスクリーニング方法により、被験物質から選別される物質はＣＧＴの産生抑制剤として位置づけることができる。これらの物質は、ＣＧＴの産生を抑制することによって、糸球体線維化を伴う腎疾患の発症や進展、ならびに該疾患の進展による糸球体硬化症への移行を抑制し得ると考えられる。よって、これらの物質は、糸球体線維化を伴う腎疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物または糸球体硬化症への進展及び発症を予防する薬物の有力な候補物質となる。
ＣＧＴは前述するように生体内に存在するスフィンゴリピッド合成系の酵素であり（ＳＨＡＹＭＡＮ  ＪＡ，ＡＢＥ  Ａ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ  ２０００；３１１：４２−９“ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ：ＡＳＳＡＹ  ＡＮＤ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ．及びＭＡＲＫＳ  ＤＬ，ＰＡＵＬ  Ｐ，ＫＡＭＩＳＡＫＡ  Ｙ，ＰＡＧＡＮＯ  ＲＥ．ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ．２０００；３１１：５０−９．”ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＴＵＤＹＩＮＧ  ＧＬＵＣＯＳＹＬＣＥＲＡＭＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＡＳＥ”）、それ自体が特定の機能や活性を有している。前述する本発明のスクリーニング方法は、ＣＧＴ遺伝子の発現量またはＣＧＴ産生量を指標とするものであるが、上記ＣＧＴの機能（活性）はこれらのＣＧＴ遺伝子発現量およびＣＧＴ産生量に応じて変動しえるものである。よって、同様のスクリーニングは、ＣＧＴの機能（活性）を指標として行うこともできる。
（３−３）ＣＧＴ（タンパク質）の機能または活性を指標とするスクリーニング方法
本発明は、ＣＧＴの機能または活性を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質をＣＧＴに接触させる工程、
（ｂ）上記工程に起因して生じるＣＧＴの機能または活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない場合のＣＧＴの機能または活性と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＧＴの機能または活性の低下をもたらす被験物質を選択する工程。
実施例に示すように、糸球体線維化を伴う腎疾患（糸球体硬化症）に罹患した患者の腎組織には、特異的にＣＧＴ遺伝子の発現が増大している。また既存のＣＧＴ阻害剤の投与実験により、糸球体線維化抑制効果が認められた。これらの知見から、ＣＧＴ遺伝子でコードされるタンパク質（ＣＧＴ）の機能または活性の増大が糸球体線維化を伴う腎疾患の原因となっていると考えられる。本発明のスクリーニング方法は、かかる知見に基づいて、当該腎疾患の緩和／抑制作用を有する（糸球体線維化を伴う腎疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質（候補物質）を、ＣＧＴの機能または活性の低下もしくは抑制を指標として探索しようとするものである。
すなわち、本発明のスクリーニング方法によれば、ＣＧＴの機能または活性を抑制する物質を探索することによって、糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を取得することができる。その意味で本発明のスクリーニング方法は、被験物質の中から糸球体線維化を伴う腎疾患の改善薬または治療薬の有効成分を探索し、選別し、また取得するための方法として位置づけることができる。
具体的には、当該スクリーニング方法は、ＵＤＰ−グルコースとセラミドとの反応を触媒してグルコシドセラミドを生成するというＣＧＴの酵素学的作用を利用して下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に従って実施することができる。
（ａ）被験物質の存在下で、ＣＧＴ、ＵＤＰ−グルコース、及びセラミドを反応させる工程、
（ｂ）上記反応の結果生じたグルコシルセラミドの生成量を測定し、該生成量を、被験物質の非存在下で上記（ａ）の反応を行って生じるグルコシルセラミドの生成量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、グルコシルセラミドの生成量の減少をもたらす被験物質を選択する工程。
ここで用いられるセラミドとは、ＣＧＴの基質となるものであれば、天然由来／非天然由来のいずれであってもよく、セラミドの誘導体も本発明でいうセラミドの範疇に含まれる。セラミドの誘導体として、具体的にはＮ−アシルスフィンゴシンを挙げることができる。ここでアシルとは、炭素数２〜２０程度のアシル基を指し、好ましくは炭素数８のアシル基を有するオクタノイルスフィンゴシン（Ｏｃｔａｎｏｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を挙げることができる。
また被験物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質（ＣＧＴに対する抗体を含む）、有機化合物または無機化合物などの任意のものを用いることができる。ＣＧＴの取得の由来も特に制限されず、天然由来のＣＧＴ酵素であっても、また遺伝子組み換え技術によって、例えば非細胞系もしくは各種細胞系（バクテリア、酵母、昆虫細胞、動物細胞）にて生産、精製して取得されるヒト組み換え型ＣＧＴ酵素であってもよい。また、当該ＣＧＴ、並びにＵＤＰ−グルコース及びセラミドは商業的に入手可能であり、簡便には市販のものを使用することができる。なお、ＵＤＰ−グルコースまたはセラミドは、少なくともいずれか１方が放射性同位体、蛍光試薬、化学発光試薬などの任意のラベルで標識されていてもよく、こうすることで反応によって生じるグルコシルセラミドを選択的に検出し、定量することができる。この場合、反応系に配合する各成分の割合は特に制限されないが、ＣＧＴ、並びにＵＤＰ−グルコース及びセラミド等のＣＧＴの基質の配合量として、それぞれ０．１ｐｇ〜０．１ｍｇ程度の割合を例示することができる。
具体的なスクリーニング方法としては、一例としてＣＧＴをセラミド、ＵＤＰ−３Ｈ−グルコース、及び被験物質と混合し、ｔ−ブチルメチルエーテルで３Ｈ−グルコシルセラミドを抽出して該標識グルコシドセラミドの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定することにより、生成したグルコシドセラミドを定量する方法を挙げることができる。当該方法は、具体的には、下記の操作によって行うことができる；
▲１▼上記混合物を３７℃にて１時間インキュベートし、１ｍｌのｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ、０．８ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ硫酸ナトリウムを添加し反応を止める。
▲２▼混合後６ｍｌのｔ−ｂｕｔｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒを添加しさらに混合する。
▲３▼１５００ｘｇで１０分間遠心分離した後、上清６ｍｌを４５℃のドライブロックヒーターで乾燥させ、０．５ｍｌの蒸留水に溶解して、５ｍｌのＡＣＳＩＩを添加して、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定する。
斯くして選抜取得される被験物質は、糸球体線維化を伴う腎疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
上記本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに糸球体線維化を伴う腎疾患モデル動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに糸球体線維化を伴う腎疾患患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な腎疾患改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
（４）腎疾患の改善・治療剤
本発明は、糸球体線維化を伴う腎疾患の改善・治療剤を提供するものである。
本発明はＣＧＴ遺伝子の発現が糸球体線維化を伴う腎疾患と関連しており、またＣＧＴに対する既存の阻害剤が糸球体の繊維化抑制効果を有しているという新たな知見からＣＧＴ遺伝子の発現を抑制する物質、ＣＧＴの産生を抑制する物質、あるいはＣＧＴの機能または活性を抑制する物質が、上記疾患の改善または治療に有効であるという考えに基づくものである。すなわち、本発明の腎疾患の改善・治療剤はＣＧＴ遺伝子の発現を抑制する物質、ＣＧＴの産生を抑制する物質、あるいはＣＧＴの機能又は活性を抑制する物質を有効成分とするものである。
本発明で用いる有効成分、すなわちＣＧＴ遺伝子の発現抑制物質、ＣＧＴの産生抑制物質、あるいはＣＧＴの機能または活性抑制物質には、それぞれＣＧＴ遺伝子の発現抑制作用、ＣＧＴの産生抑制作用、あるいはＣＧＴの機能または活性抑制作用を有するものであればよく、従来公知のもののほか、従来公知でないものも含まれる。従来公知でないものは、被験物質の中から上記のスクリーニング方法を利用して選別し、取得することができる。また、有効物質は上記スクリーニング方法を利用して選別された物質に関する情報に基づいてさらに常法に従って製造されたものであってもよい。
ここで腎疾患の改善・治療剤の有効成分となり得るＣＧＴの機能または活性抑制物質としては、下記の一般式
2003057874.tif 000010
（式中、Ｒ１は炭素数５〜１５のアルキル基またはベンジルオキシ基を、Ｒ２は―（ＣＨ２）４―基または―（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２―基を意味する。）
で示される化合物（１）またはその薬学的に許容される塩を挙げることができる。
具体的には１−フェニル−２−アルカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール、あるいは１−フェニル−２−アルカノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノールおよびその構造的アナログを挙げることができる（ＷＯ００／６２７７９；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ（１９８０），２６（３），２６５−７８；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２７，４８５−４９１（２０００）等参照）。ここで、前者１−フェニル−２−アルカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノールの構造的アナログとして、特に好ましくはＤ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）を挙げることができる。また、後者１−フェニル−２−アルカノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノールの構造的アナログとして、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヘキサノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＨＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−オクタノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＯＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−デカノイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＤＰＰ）、（１Ｒ，２Ｒ）−２−パルミトイルアミノ−１−フェニル−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＰＰＰ）および（１Ｒ，２Ｒ）−１−フェニル−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール（ＰＢＰＰ）を挙げることができる。なお、これらの物質は、いずれも例えば前記文献等に基づいて製造することができる。
また、これらに近縁するＣＧＴの機能または活性抑制物質は、下記の一般式：
2003057874.tif 000011
（式中、Ｒ３は任意の官能基、またＲ４は環中の窒素原子とともに複素環を形成する任意の官能基を意味する。）
で示される化合物（２）またはその薬学上許容される塩を被験物質として、前述の（３−３）の項で詳述する本発明のスクリーニング方法を行うことにより、取得することができる。上記複素環としては、各々置換基を有していても良いピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、及びモルフォリンを例示することができる。なお、上記化合物には立体異性体をはじめとする各種の異性体が含まれる。
ゆえに、本発明には、上記化合物（２）またはその薬学上許容される塩を被験物質として下記１）の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を実施するか、または下記２）の工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を実施する、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法が含まれる：
１）（ａ）被験物質をＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅに接触させる工程、
（ｂ）上記工程に起因して生じるＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない場合のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性と比較する工程、および
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性の低下をもたらす被験物質を選択する工程；
２）（ｄ）被験物質の存在下で、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ−グルコース、及びセラミドを反応させる工程、
（ｅ）上記反応の結果生じたグルコシルセラミドの生成量を測定し、該生成量を、被験物質の非存在下で上記（ａ）の反応を行って得られるグルコシルセラミドの生成量と比較する工程、および
（ｆ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、グルコシルセラミドの生成量の減少をもたらす被験物質を選択する工程。
また本発明には、上記スクリーニング方法で被験物質の中から選別され取得される候補物質を有効成分とする、糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤が含まれる。
さらにＣＧＴの機能または活性抑制物質の別の具体例として、一般式（３）：
2003057874.tif 000012
（式中、Ｒ５は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示されるＮ−アルキル−デオキシノジリマイシン（ＮＡ−ＤＮＪ）、一般式（４）：
2003057874.tif 000013
（式中、Ｒ６は炭素数１〜２０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味する。）
で示されるＮ−アルキル−デオキシガラクトノジリマイシン（ＮＡ−ＧＮＪ）、またはこれらの構造的アナログを挙げることができる（ＷＯ００／６２７７９、ＷＯ００／６２７８０、特許第２８３１０６８号公報、ＷＯ００／３３８４３、ＷＯ０１／０７０７８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５６，ｐｐ．４２１−４３０（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５９，ｐｐ．８２１−８２９（２０００）等参照）。なお、当該化合物は薬学的に許容される塩の態様を有していてもよい。
ここでＲ３で示されるアルキル基としては、炭素数１〜２０の直鎖又は分枝のアルキル基を挙げることができるが、好ましくは炭素数１〜１０のアルキル基であり、より炭素数４のブチル基である。Ｎ−アルキル−デオキシノジリマイシンとして具体的には、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）、Ｎ−ノニル−デオキシノジリマイシン、およびＮ−デシル−デオキシノジリマイシンが、またＮ−アルキル−デオキシガラクトノジリマイシンとして具体的にはＮ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）などを挙げることができる。中でも特に好ましくはＮ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）である。これらの物質は、例えば前記文献やＵＳ４１８２７６７、ＵＳ４６３９４３６、ＥＰ００１２２７８、ＥＰ０６２４６５２、ＵＳ４２６６０２５，ＵＳ４４０５７１４，ＵＳ５１５１５１９等に基づいて製造することができる。
また、これらＮＡ−ＤＮＪおよびＮＡ−ＧＮＪに近縁するＣＧＴの機能または活性抑制物質は、下記の一般式：
2003057874.tif 000014
（式中、Ｒ７は任意の官能基を意味する。）
で示される化合物（５）またはその薬学上許容される塩を被験物質として、前述の（３−３）の項で詳述する本発明のスクリーニング方法を行うことにより、取得することができる。なお、上記化合物には立体異性体をはじめとする各種の異性体が含まれる。
ゆえに、本発明には、上記化合物（５）またはその薬学上許容される塩を被験物質として下記１）の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を実施するか、または下記２）の工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を実施する、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法が含まれる：
１）（ａ）被験物質をＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅに接触させる工程、
（ｂ）上記工程に起因して生じるＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない場合のＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性と比較する工程、および
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの機能または活性の低下をもたらす被験物質を選択する工程；
２）（ｄ）被験物質の存在下で、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ−グルコース、及びセラミドを反応させる工程、
（ｅ）上記反応の結果生じたグルコシルセラミドの生成量を測定し、該生成量を、被験物質の非存在下で上記（ａ）の反応を行って得られるグルコシルセラミドの生成量と比較する工程、および
（ｆ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、グルコシルセラミドの生成量の減少をもたらす被験物質を選択する工程。
また本発明には、上記スクリーニング方法で被験物質の中から選別され取得される候補物質を有効成分とする、糸球体線維化を伴う腎疾患の改善または治療剤が含まれる。
以上詳述するＣＧＴの機能または活性抑制物質、ならびにＣＧＴ遺伝子の発現抑制物質、またはＣＧＴの産生抑制物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として、特に腎疾患の改善または治療を目的とした医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数百ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
なお、上記の物質がＤＮＡによりコードされるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。さらに、上記の物質がＣＧＴ遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドの場合は、そのまま、若しくは遺伝子治療用ベクターにこれを組み込むことにより遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
実施例
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
実施例１：  正常および糸球体硬化（線維化）状態の腎臓での遺伝子発現の変動解析
ヒト糸球体硬化症患者の腎臓組織６サンプルとヒトの正常な腎臓組織５５サンプルからそれぞれ調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＤＮＡチップ解析を行った。ＤＮＡチップ解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを用いて行った。具体的には、解析は、（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製、（２）該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５）プローブアレイの染色、（６）プローブアレイのスキャン、及び（７）遺伝子発現解析、の手順で行った。
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
ヒト糸球体硬化症患者の腎臓組織６サンプル、ヒトの正常な腎臓組織５５サンプルから常法に従って調製した各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０μｇ、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃、１０分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μＬ、該キットに含まれる１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ  ２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）９１μＬ、該キットに含まれる５×Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３０μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３μＬ、該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ４μＬ（４０Ｕ）、該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  １μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、室温下１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、１４５μＬの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬ、エタノール３６２．５μＬを加え混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むＤＮＡペレットを得た。その後、該ペレットに８０容量％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度上記と同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させて、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）１２μＬに溶解した。
以上の操作によって、ヒト糸球体硬化症患者の腎臓組織６サンプル、ヒトの正常な腎臓組織５５サンプルからそれぞれ調製したｔｏｔａｌＲＮＡからｃＤＮＡを取得した。
（２）ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
（１）で得られた各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＤＴＴ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ  ４μＬ、該キットに含まれる２０×Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベルｃＲＤＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加え、次いでＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
（２）で調製した各ラベル化ｃＲＮＡ  ２０μｇを含む溶液に、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  トリス−酢酸  ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）、１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加えて調製した反応液４０μＬを９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、各ラベル化ｃＲＮＡをフラグメント化した。
（４）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
（３）で得られた各フラグメント化ｃＲＮＡ  ４０μＬに、５ｎＭ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μＬ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ４μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ［Ｎａ＋］、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．５〜６．７：Ｐｉｅｒｃｅ社製）２００μＬ、ＤＥＰＣ処理水１４４μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
一方、１×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで満たしたＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
（５）プローブアレイの染色
（４）で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイのそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（６×ＳＳＰＥＺ［２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈］、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０［Ｓｉｇｍａ社製］）を添加して、該溶液でプローブアレイを満たした。次にＮｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置にフラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後、染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って、１次染色液〔１０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＳＡＰＥ）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製］、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０〕、２次染色液〔１００μｇ／ｍＬ  Ｇｏａｔ  ＩｇＧ［Ｓｉｇｍａ社製］、３μｇ／ｍＬ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製］、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０〕により、プローブアレイを染色した。
（６）プローブアレイのスキャン、及び（７）遺伝子発現解析
（５）で染色した各プローブアレイをＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎおよび遺伝子発現の比較解析を行った。
以上のＤＮＡチップ解析による遺伝子発現の比較解析結果から、正常腎臓組織に比べて糸球体硬化症患者の腎臓組織で３倍以上の発現増を示したプローブを選抜した。
選抜したプローブの中から、さらに糸球体硬化症患者の腎組織で高頻度で発現上昇しているプローブを選抜した。具体的には、ＤＮＡチップ解析結果から得られるＡｂｓ  Ｃａｌｌを指標にして、糸球体硬化症患者の腎組織でのＡｂｓ  ＣａｌｌがＰｒｅｓｅｎｔである例数が４例以上であるプローブを選抜した。
その結果、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴ）遺伝子（プローブ名：６１３１５＿ａｔ）が選抜された。ＣＧＴ遺伝子は正常の腎臓と比較して糸球体硬化症の腎臓では３．１倍の発現上昇が観察された。
実施例２：  ＣＧＴ阻害剤による繊維芽細胞のプロテオグリカン合成阻害
ＣＧＴ遺伝子と糸球体硬化症または糸球体線維化を伴う腎疾患との関連性を確認するために、腎炎等の組織線維化の原因因子として知られるＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）［Ｎａｔｕｒｅ，３４６（６２８２），ｐｐ．３７１−３７４，１９９０，Ｊｕｌｙ  ２６］あるいはＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８（１５），ｐｐ．６５６０−６５６４，１９９１  Ａｕｇ．１；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，９２（６），ｐｐ．２５９７−２６０１，１９９３  Ｄｅｃ；Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１５４（１），ｐｐ．１６９−１７９，１９９９  Ｊａｎ．；Ｎｅｐｈｒｏｎ，８１（４），ｐｐ．４２８−４３３，１９９９；Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，５９（４），ｐｐ．１３２４−１３３２，２００１  Ａｐｒ．］に依存して産生されるプロテオグリカンの合成を、ＣＧＴの阻害剤が阻害するか否かを検討した。
株化細胞であるＮＲＫ−４９Ｆ細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｒａｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｃｅｌｌ：ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１５７０）を１．３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌの割合で９６穴プレートにまき込み、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。翌日、培養上清を吸引除去し、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地に交換し、ＣＧＴの既存の阻害剤、ＴＧＦ−β（終濃度３ｎｇ／ｍｌ）またはＰＤＧＦ（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、３５Ｓ−Ｎａ２ＳＯ４（終濃度１０μＣｉ／ｍｌ）を、計１００μｌ／ｗｅｌｌの割合で添加した。
なお、ここで組織線維化の原因因子としてＴＧＦ−βを配合した系（ＴＧＦ−β依存的プロテオグリカン産生系）にはＣＧＴの既存の阻害剤として、Ｄ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｌｙａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ：和光純薬工業）（終濃度３μＭ、３０μＭ）およびＮＢ−ＤＮＪ（Ｎ−Ｂｕｔｙｌｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ：和光純薬工業）（終濃度３μＭ、３０μＭ）の２種類を各々別個に、また組織線維化の原因因子としてＰＤＧＦを配合した系（ＰＤＧＦ依存的プロテオグリカン産生系）にはＣＧＴの既存の阻害剤として、Ｄ−ＰＤＭＰ（終濃度１μＭ、１０μＭ）を用いた。更に培養を約２４時間継続した後に培養上清を回収し、以下の条件にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
すなわち、前記培養上清２０μｌとサンプルバッファー（×５：６２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５０％グリセロール、５％ＳＤＳ、２５％  ２−メルカプトエタノール、０．０５％ブロムフェノールブルー）５μｌを混和し、１００℃で５分処理した後、１０μｌ／ｗｅｌｌの割合でゲル（４％ポリアクリルアミドゲル：テフコ社）にアプライし、１８ｍＡ／枚の定圧電流で３時間泳動を行った。ゲルをゲルドライヤーにて乾燥させた後、イメージングプレートに２４時間露光した。その後、電気泳動されたプロテオグリカンの放射活性をＢＡＳ２０００により定量し、以下の計算式によりＴＧＦ−β依存的プロテオグリカン産生阻害率、並びにＰＤＧＦ依存的プロテオグリカン産生阻害率を計算した。
2003057874.tif 000015
▲１▼ＴＧＦ−β（又はＰＤＧＦ）添加、ＣＧＴ阻害剤非添加時の放射活性
▲２▼ＴＧＦ−β（又はＰＤＧＦ）添加、ＣＧＴ阻害剤添加時の放射活性
▲３▼ＴＧＦ−β（又はＰＤＧＦ）非添加、ＣＧＴ阻害剤非添加時の放射活性
▲４▼ＴＧＦ−β（又はＰＤＧＦ）非添加、ＣＧＴ阻害剤添加時の放射活性
その結果得られたＴＧＦ−β依存的なプロテオグリカン産生阻害率を図１に、またＰＤＧＦ依存的なプロテオグリカン産生阻害率を図２に、それぞれ示す。この結果からわかるようにＣＧＴ阻害剤であるＤ−ＰＤＭＰおよびＮＢ−ＤＮＪのいずれもが組織線維化の原因因子であるＴＧＦ−βに依存するプロテオグリカン産生阻害活性を示し、またＰＤＭＰが同様に組織線維化の原因因子であるＰＤＧＦに依存するプロテオグリカン産生阻害活性を示したことから、ＣＧＴ阻害剤は、これら原因因子による細胞外基質（プロテオグリカン）の産生亢進を抑制すること、すなわち線維化抑制作用を有することが示された。
実施例３：  ノーザンブロット法によるＣＧＴの発現変化の評価
正常ラット（ウイスターラット：日本チャールズリバー（株））および、ウイスターラット（日本チャールズリバー（株））に抗Ｔｈｙ−１モノクローナル抗体（ＯＸ−７：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を投与して作成したＴｈｙ−１腎炎モデルラットから採取した腎皮質から、Ｔｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ  １０μｇを電気泳導した後にナイロンメンブレンに転写し、ＣＧＴに特異的なｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロット法を実施し、転写レベルをＢＡＳ−２０００（フジフィルム）を用いて定量的に解析することによって、正常ラットの腎皮質およびＴｈｙ−１腎炎モデルラットの腎皮質それぞれにおけるＣＧＴ遺伝子の発現量を調べた。その結果を、図３に、正常ラットの腎皮質中の発現量に対するＴｈｙ−１腎炎モデルラットの腎皮質中の発現量を「ＣＧＴ相対発現量」として示す。これからわかるように、正常ラットの腎皮質中のＣＧＴ遺伝子の発現量と比較して、Ｔｈｙ−１腎炎モデルラットの腎皮質中のＣＧＴ遺伝子の発現量が上昇しているのが観察された。
実施例４：  抗Ｔｈｙ−１腎炎モデルに対するＣＧＴ阻害剤の効果
ウイスターラット（日本チャールズリバー（株））（８匹）に生理食塩水（大塚製薬（株）製）で希釈した抗  Ｔｈｙ−１モノクローナル抗体（ＯＸ−７：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を０．４ｍｇ／ｋｇ（体重）の割合で尾静脈より投与した（ｄａｙ０）。その後、各ラットの体重を測定し、この測定結果に基づいて無作為に無処置群（４匹）、ＮＢ−ＤＮＪ投与群（４匹）に群分けを行った。また抗Ｔｈｙ−１モノクローナル抗体投与を行わない正常対照群（４匹）も設定した。
ＯＸ−７投与約６０分後よりＮＢ−ＤＮＪ投与群（４匹）に対してＮＢ−ＤＮＪの投与を開始し、ｄａｙ６まで１日１回５ｍｇ／ｈｅａｄ（約２０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与を行った。ｄａｙ７に当該ＮＢ−ＤＮＪ投与群（ＯＸ−７＋ＮＢ−ＤＮＪ投与群）、並びに無処置群（ＯＸ−７投与群）及び正常対照群のそれぞれのラットから腎臓を摘出し、各左腎を１０％中性緩衝ホルマリン溶液を用いて還流し、２μｍの組織切片を作成し、ＰＡＳ染色を施した。ＮＢ−ＤＮＪ投与群（ＯＸ−７＋ＮＢ−ＤＮＪ投与群）、無処置群（ＯＸ−７投与群）及び正常対照群のそれぞれラットの腎臓の糸球体組織（任意箇所）について、１００倍の視野倍率で撮影した像を図４に示す。図４の▲１▼と▲２▼との対比からわかるように、Ｔｈｙ−１腎炎モデルラットでは糸球体硬化の病態を示す糸球体基底膜の肥厚（線維化）が認められたが、ＮＢ−ＤＮＪ投与により当該糸球体の線維化の病態（病変）が改善することが確認された（▲３▼）。
このことから、ＣＧＴ阻害剤が糸球体線維化の予防または／および改善に有効であること、すなわちＣＧＴ阻害剤が糸球体線維化に伴う腎疾患の発症の予防、または／および当該腎疾患の改善または治療に有効であると考えられた。
実施例５：  ＣＧＴタンパクの生産、精製
全長ヒトＣＧＴをコードする遺伝子（配列番号１または２）を、ＳＵＰＥＲ  ＳＣＲＩＰＴＴＭｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）から常法によりクローニングし、これをｐＩＶＥＸ２．４ａ（Ｒｏｃｈｅ社）にサブクローニングしてＣＧＴ発現ベクターを調製する。当該ＣＧＴ発現ベクターを鋳型としてＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社）にてＣＧＴ（タンパク質）を合成する。次いで、得られたＣＧＴをベクターに付加されたヒスチジンタグを用いて、ニッケルカラム（アマシャムファルマシア）にて精製する。
実施例６：  ＣＧＴ阻害剤のスクリーニング
以下の反応混合液を調製する。
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まず上記ＣＧＴ以外の各成分を混合し、これにＣＧＴを加えて反応を開始し、３７℃にて１時間インキュベートする。コントロールとして、被験物質を含まないＤＭＳＯ溶液のみを含む反応混合物についても、同様の反応を行う。１ｍｌのｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ、０．８ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ硫酸ナトリウムを添加して反応を止め、さらに６ｍｌのｔ−ｂｕｔｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒを添加して混合する。１５００ｘｇで１０分遠心分離した後、上清６ｍｌを４５℃のドライブロックヒーターで乾燥させて、これを０．５ｍｌの蒸留水に溶解して、５ｍｌのＡＣＳＩＩを添加し液体シンチレーションカウンターで反応生成物（３Ｈ−標識Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄ）の放射活性を特定して３Ｈ−標識Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄの生成量を測定する。被験物質存在下での当該放射活性が、コントロールである被験物質非存在下の放射活性と比較して低下している場合に、その被験物質を、糸球体線維化を伴う腎疾患を緩和または抑制（改善、治療）する候補化合物として選択する。
産業上の利用可能性
本発明によって、糸球体線維化を伴う腎疾患、例えば慢性腎炎、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、遺伝性腎疾患などの腎疾患で発現が特異的に増大している遺伝子（ＣＧＴ遺伝子）が明らかとなり、当該遺伝子発現産物の生成またはその活性の増大が糸球体線維化を伴う腎疾患の発症並びに進行（進展）に関与していることが示唆された。従って。かかるＣＧＴ遺伝子は糸球体線維化を伴う腎疾患の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用である。かかるマーカー遺伝子によれば糸球体線維化を伴う腎疾患であるかどうか、その原因を明らかにすることができ（診断精度が向上）、これによってより適切な治療を施すことが可能となる。すなわち、糸球体線維化を伴う腎疾患の適切な治療のためのツールとして利用することができる。
また、本発明において、上記ＣＧＴを阻害することによって糸球体線維化の病態が改善し、またその進行を予防することが確認されたことから、該ＣＧＴの産生を抑制する化合物またはＣＧＴの機能または活性を抑制する化合物は、上記糸球体線維化を伴う腎疾患の治療薬または／および予防剤として有用であると思われる。従って、本発明のＣＧＴ遺伝子によれば、その発現の抑制若しくは減少を指標にすることによって、糸球体線維化を伴う腎疾患の治療薬または予防薬（糸球体線維化の進行抑制剤）の有効成分となり得る候補化合物をスクリーニング選別することが可能である。また本発明が提案するＣＧＴ活性の抑制作用を指標としたスクリーニング法によれば、糸球体線維化を伴う腎疾患の治療薬または予防薬（糸球体線維化の進行抑制剤）の有効成分となり得る候補化合物を簡便に、探索し取得することができる。すなわち、本発明は、糸球体線維化を伴う腎疾患の治療薬または予防薬（糸球体線維化の進行抑制剤）の開発に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例２において、既存のＣＧＴ阻害剤（Ｄ−ＰＤＭＰ［Ｄ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ］、ＮＢ−ＤＮＪ［Ｎ−ｂｕｔｙｌｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ］：各々３μＭ及び３０μＭ使用）について、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）依存的プロテオグリカン産生阻害率を調べた結果を示す図である。
図２は、実施例２において、既存のＣＧＴ阻害剤（Ｄ−ＰＤＭＰ：１μＭ及び１０μＭ）についてＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）依存的プロテオグリカン産生阻害率を調べた結果を示す図である。
図３は、実施例３において、正常ラットとＴｈｙ−１腎炎モデルラットについて腎皮質中でのＣＧＴ発現量を比較した結果を示す図である。
図４は、実施例４において、▲１▼正常対照群、▲２▼無処置群（ＯＸ−７投与群）及び▲３▼ＮＢ−ＤＮＪ投与群（ＯＸ−７＋ＮＢ−ＤＮＪ投与群）のそれぞれのラットの腎臓の糸球体組織切片についてＰＡＳ染色を行い、該組織の任意箇所を１００倍の視野倍率で撮影した像を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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