(57)【要約】Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体に結合する蛋白質Ａおよび該蛋白質Ａと相互作用する蛋白質Ｂを提供し、さらにこれら蛋白質がＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を著しく促進することに基づいて、これら蛋白質の発現および／または機能の調節剤（阻害剤または促進剤）、および調節方法を提供することにより、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達異常や記憶再生の異常に起因する疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病およびポリグルタミン病等の神経変性疾患の解明、並びにそれら疾患の防止、改善、または治療を可能にした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節剤。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の阻害剤。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の促進剤。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節方法。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の阻害方法。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の促進方法。
【請求項７】
下記の群から選ばれるポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有し、かつＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有し、かつＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド。
【請求項８】
下記の群から選ばれるポリペプチドであって、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項９】
下記の群から選ばれるポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド。
【請求項１０】
下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項１１】
下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下で、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達を増幅するポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項１２】
下記のポリペプチドであって、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合し、かつ配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用しないポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
または
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項１３】
配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド。
【請求項１４】
配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体と結合するペプチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するペプチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド。
【請求項１７】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するペプチド。
【請求項１８】
請求の範囲第７項から第１７項に記載のポリペプチドまたはペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなる請求の範囲第１項に記載の調節剤。
【請求項１９】
請求の範囲第１２項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなる請求の範囲第２項に記載の阻害剤。
【請求項２０】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなる請求の範囲第３項に記載の促進剤。
【請求項２１】
請求の範囲第７項から第１７項に記載のポリペプチドまたはペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の調節方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１２項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第５項に記載の阻害方法。
【請求項２３】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の促進方法。
【請求項２４】
請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドをコードする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列表の配列番号４または配列番号５に記載の塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求の範囲第２４項または第２５項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドをコードする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列表の配列番号６に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求の範囲第２７項または第２８項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求の範囲第２４項から第２６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項３１】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第３０項に記載の組換えベクター。
【請求項３２】
請求の範囲第２７項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項３３】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第３２項に記載の組換えベクター。
【請求項３４】
請求の範囲第３０項または第３１項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項３５】
請求の範囲第３２項または第３３項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項３６】
請求の範囲第３０項または第３１項に記載の組換えベクター、および請求の範囲第３２項または第３３項に記載の組換えベクターのいずれか１つの組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項３７】
請求の範囲第３１項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求の範囲第３０項もしくは第３１項に記載の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項３８】
請求の範囲第３３項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求の範囲第３２項もしくは第３３項に記載の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項３９】
請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項４０】
請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体であって、該ポリペプチドの機能を阻害する抗体。
【請求項４１】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項４２】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体であって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害する抗体。
【請求項４３】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。
【請求項４４】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、化合物と該ポリペプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ポリペプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、化合物が該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリペプチドの機能または該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法。
【請求項４５】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体と化合物とを接触させ、該ポリペプチドの発現または機能の有無を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ポリペプチドの発現または機能を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法。
【請求項４６】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第７項または第８項に記載のポリペプチド、請求の範囲第２４項から第２６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項または第３１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項または第４０項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。
【請求項４７】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。
【請求項４８】
請求の範囲第４３項から第４７項のいずれか１項に記載の同定方法で同定された化合物。
【請求項４９】
請求の範囲第７項または第８項に記載のポリペプチドと相互作用し、その機能を阻害または促進する化合物。
【請求項５０】
請求の範囲第２４項から第２６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。
【請求項５１】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用し、当該ポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害または促進する化合物。
【請求項５２】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用し、当該ポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の増幅を阻害または促進する化合物。
【請求項５３】
請求の範囲第２７項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。
【請求項５４】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項５５】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５６】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる記憶再生の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５７】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる神経変性疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５８】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなるアルツハイマー病の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５９】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とするＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６０】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とする記憶再生の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６１】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とする神経変性疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６２】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とするアルツハイマー病の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６３】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法。
【請求項６４】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＰＤＺドメインを保有しておりＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（以下、ＮＭＤＡと略称する）受容体と複合体を形成し得るポストシナプス  デンシティー蛋白質（以下、蛋白質Ａと略称する）および蛋白質Ａと相互作用する蛋白質（以下、蛋白質Ｂと称する）、並びに蛋白質ＡとＮＭＤＡ受容体との複合体形成の阻害または促進を特徴とするＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の調節剤（阻害剤または促進剤）、蛋白質Ａと蛋白質Ｂとの相互作用の阻害または促進特徴とするＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節剤、蛋白質ＡとＮＭＤＡ受容体との複合体形成の阻害または促進によるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節方法、および蛋白質Ａと蛋白質Ｂとの相互作用の阻害または促進によるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節方法に関する。さらに詳しくは、蛋白質Ａまたは蛋白質Ｂのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチドまたはペプチドをコードする塩基配列、またはその相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ポリペプチドまたはペプチドに対する抗体、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用する化合物、これらの１種以上を含む医薬組成物、該ポリペプチドまたはペプチドの製造方法、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用する化合物の同定方法、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの測定方法、並びに試薬キットに関する。
背景技術
ポストシナプス  デンシティー蛋白質（Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（以下、ＰＳＤと略称する）は、神経細胞間情報伝達においてシナプスの情報を受け取るシナプス後細胞に存在するポストシナプス  デンシティーを構成する蛋白質である。ＰＳＤは、シナプス後膜において受容体やイオンチャネル等の機能性膜蛋白質の局在化や集積または生体マルチソームの形成に関与していると考えられている。
一方、シナプスやタイトジャンクションのような複雑な細胞膜構造の形成と維持、膜蛋白質の集積、情報伝達、複合体の形成および細胞極性の維持等の生体機能に関与する蛋白質が、蛋白質間相互作用を担うモジュールとしてこれら機能に関与すると考えられるペプチド結合ドメインを保有することが報告された（非特許文献１）。このドメインはＰＤＺドメインと呼ばれ、９０乃至１００アミノ酸残基からなる。これら生体機能の中で、特定の蛋白質を細胞内の特定の部位に局在させる、あるいはＰＤＺドメイン自身が含まれる蛋白質と標的蛋白質との結合を促進するといった機能に、ＰＤＺドメインがより重要な役割を果たしていると考えられている。例えば、ＰＤＺドメインによるシグナル伝達蛋白質の細胞膜上の蛋白質複合体への局在化が適切なシグナル伝達に必要であると考えられる。
ＰＤＺドメインは、蛋白質間相互作用において標的蛋白質の最もＣ末端のアミノ酸配列を認識する。その標的蛋白質は膜貫通型の受容体やチャネルであることが多い。例えば、脊椎動物または無脊椎動物のシナプスに存在するＭＡＧＵＫ蛋白質（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーに属するＰＳＤ−９５、ＰＳＤ−９３（ｃｈａｐｓｙｎ１１０またはＫＡＰ−５）およびショウジョウバエｄｌｇ蛋白質のヒトにおけるホモログであるｈｄｌｇは、その第２番目および第３番目のＰＤＺドメインにより、ＮＭＤＡ受容体およびシェーカー型カリウムイオン  チャネルＫｉｒ１．４のＣ末端を認識することが報告されている（非特許文献２）。
ＰＤＺドメインを有する蛋白質のインビボでの局在と、インビトロの生化学的解析から同定された膜貫通型の標的蛋白質の局在との解析により、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ−９３およびｈｄｌｇが、全てＮＭＤＡ受容体またはカリウムイオン  チャネルと同じ局在を示すことが、各組織あるいは神経系の各細胞種において確認されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６）。
また、ＰＳＤ−９５とＮＭＤＡ受容体あるいはカリウムイオン  チャネルとを線維芽細胞に共発現させると、細胞表面上にこれら蛋白質のクラスター形成が見られるが、それぞれ単独で発現させたときは分散した局在しか示さない（非特許文献４）。一方、ＰＳＤ−９５が認識するＣ末端のアミノ酸モチーフ（Ｓ／ＴＸＶ）を欠失したスプライシングアイソフォームは分散した局在を示す（非特許文献７）。これらから、ＭＡＧＵＫ蛋白質がＰＤＺドメインを介した相互作用によって、細胞膜蛋白質の架橋と集積に直接関与していると考えられる。
さらに、Ｋｉｒを導入した線維芽細胞においてＰＫＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａ）を活性化するとアミノ酸配列第４４０番目のセリン（Ｓ４４０）がリン酸化され、ＫｉｒとＰＳＤ−９５が乖離し、カリウムイオン電導率が低下する。Ｓ４４０をアラニンに置換すると、ＰＫＡのこの効果は見られない。これらの結果は、ＫｉｒへのＰＳＤ−９５の結合がチャネルをクラスター化させるだけでなく、チャネル電導率にＰＫＡ感受性を付与することを示している。
ＰＳＤ−９５は、ポストシナプス  デンシティー蛋白質の１つであり、数々の機能、例えば胚の発生、神経の発生、神経伝達、情報伝達および蛋白質複合体の形成等への関与が知られている。また、トランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、アンカー蛋白質として膜蛋白質、例えば受容体やイオンチャネル等を細胞骨格に連結する作用、および細胞の集合や接合に関与するアドヘシン／アグルチニンとしての作用が報告されている（非特許文献４および非特許文献８）。これらから、ＰＳＤ−９５は、神経伝達物質放出の制御、あるいは細胞増殖やがんの抑制に関与していると考えられている（非特許文献９、非特許文献１０および非特許文献１１）。
ＰＳＤ−９５のアミノ酸配列中には、３つのＰＤＺドメイン、１つのＳＨ３ドメイン（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ３  ｄｏｍａｉｎ）、１つのＧＫドメイン（グアニレートキナーゼ  ドメイン）（ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）が存在する。
ＰＳＤ−９５は、そのＰＤＺドメインを介して、シナプス後膜に存在するＮＭＤＡ受容体の構成因子である２Ｂサブユニットと結合する（非特許文献２、非特許文献１２、非特許文献１３および非特許文献１４）。このことから、ＰＳＤ−９５は該受容体のシグナル伝達等に関与する細胞骨格蛋白質の１つであると考えられている。
また、ＰＳＤ９５がそのＧＫドメインを介して、ＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０関連蛋白質３（ＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３）（以下、ＳＡＰＡＰ−３と略す）と相互作用することが、ラットにおいて報告されている（非特許文献１５）。ラットＳＡＰＡＰ−３は神経細胞に特異的に発現しており、ポストシナプス  デンシティー画分に豊富に存在する。この報告では、ラットＳＡＰＡＰ−３は、ポストシナプス  デンシティーの構成要素、例えばＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０等、を膜領域に集合させることによりポストシナプス  デンシティーの構造維持に関与していると考えられている。
一方、ＮＭＤＡ受容体は、グルタミン酸受容体の１種であり、リガンド依存性イオンチャネルに共通する高次構造を有することから、細胞膜上においてイオンチャネルを形成していると考えられている。該イオンチャネルはカルシウムイオン透過性をもち、シナプス後膜内のカルシウム濃度を上昇させる生理的機能を有する。通常は、シナプス間隙中のマグネシウムイオンによって閉塞されており、単発のシナプス伝達には関与しないと考えられているが、頻回興奮等によって膜電位が脱分極状態にあるとマグネシウムイオンによる閉塞が解かれて活性化する。生体内でのリガンドとしてはグルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられる。ＮＭＤＡ受容体の阻害剤として知られているアミノホスホノ吉草酸やＭＫ−８０１等を哺乳動物脳に直接投与することにより記憶障害が起きることから、ＮＭＤＡ受容体の記憶成立への関与が示唆されている。
上記のように、ＰＤＺドメインの機能は、かなり広範囲の生命現象において利用されていると予想される。したがって、ＰＤＺドメインを有する蛋白質によって形成される複合体や、その複合体に関わる蛋白質の解明とその制御により、蛋白質相互作用、例えば細胞骨格構造の形成、膜蛋白質の集積、シグナル伝達、複合体の形成および細胞極性の維持等、の異常に起因する疾患の防止、治療および診断が可能になる。例えば、ＰＤＺドメインを有する新規なＰＳＤを見出すことにより、該ＰＳＤの異常が関与する疾患、例えば神経変性疾患の解明、並びにそれらの防止、治療および診断が可能になる。すなわち、蛋白質相互作用やＰＤＺドメインの認識機構の研究、並びに医薬品開発の分野において、ＰＤＺドメインを有する蛋白質および該蛋白質と相互作用する蛋白質、並びに両蛋白質の相互作用を制御する方法を見出すことが必要である。
以下に、本背景技術の説明に引用した文献を列記する。
非特許文献１：「細胞工学」、２００１年、第２０巻、ｐ．１３４５−１３４９。
非特許文献２：ニーサマー（Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ，Ｍ．）ら、「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス（Ｊｏｕｒａｎｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９６年、第１６巻、ｐ．２１５７−２１６３。
非特許文献３：コーナウ（Ｋｏｒｎａｕ，Ｈ．Ｃ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２６９巻、ｐ．１７３７−１７４０。
非特許文献４：キム（Ｋｉｍ，Ｅ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９５年、第３７８巻、ｐ．８５−８８。
非特許文献５：キム（Ｋｉｍ，Ｅ．）ら、「ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）」、１９９６年、第１７巻、ｐ．１０３−１１３。
非特許文献６：ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｍ．）ら、「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス（Ｊｏｕｒａｎｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第１５巻、ｐ．２３５４−２３６６。
非特許文献８：スタサキス（Ｓｔａｔｈａｋｉｓ，Ｄ．）ら、「ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、１９９７年、第４４巻、ｐ．７１−８２。
非特許文献９：ハナダ（Ｈａｎａｄａ，Ｔ．）ら、「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年、第２７５巻、ｐ．２８７７４−２８７８４。
非特許文献１０：ミゴード（Ｍｉｇａｕｄ，Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９８年、第３９６巻、ｐ．４３３−４３９。
非特許文献１１：サットラー（Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｒ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９９年、第２８４巻、ｐ．１８４５−１８４８。
非特許文献１２：モンヤー（Ｍｏｎｙｅｒ，Ｈ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９２年、第２５６巻、ｐ．１２１７−１２２１。
非特許文献１３：イシイ（Ｉｓｈｉｉ，Ｔ．）ら、「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９３年、第２６８巻、ｐ．２８３６−２８４３。
非特許文献１４：シェン（Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９４年、第３６８巻、ｐ．１４４−１４７。
非特許文献１５：タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．）ら、「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２７２巻、ｐ．１１９４３−１１９５１。
発明の開示
本発明は、蛋白質間相互作用を担うモジュールとして作用するＰＤＺドメインを保有しＮＭＤＡ受容体と複合体を形成し得る特定のアミノ酸配列からなる蛋白質Ａおよび該蛋白質Ａと相互作用する蛋白質Ｂ、並びにこれらをそれぞれコードする遺伝子を見出し、これらを利用することにより達成したものである。
すなわち、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮＭＤＡ受容体との結合を阻害または促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節剤である。
また、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮＭＤＡ受容体との結合を阻害し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の阻害剤である。
さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮＭＤＡ受容体との結合を促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進剤である。
さらにまた、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮＭＤＡ受容体との結合を阻害または促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節方法である。
またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮＭＤＡ受容体との結合を阻害し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の阻害方法である。
また、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮＭＤＡ受容体との結合を促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進方法である。
さらに、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドである；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有し、かつＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有し、かつＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド。
さらにまた、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドであって、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチドである；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
またさらに、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドである；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド。
また、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチドである；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
さらに、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下で、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を増幅するポリペプチドである；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
さらにまた、本発明の一態様は、下記のポリペプチドであって、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合し、かつ配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用しないポリペプチドである；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
または
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドである。
また、本発明の一態様は、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、ＮＭＤＡ受容体と結合するペプチドである。
さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するペプチドである。
さらにまた、本発明の一態様は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドである。
またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するペプチド。
また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節剤である。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の阻害剤である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進剤である。
またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節方法である。
また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の阻害方法である。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドのいずれかをコードする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドである。
またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号４または配列番号５に記載の塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
また、本発明の一態様は、配列表の配列番号６に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターである。
またさらに、本発明の一態様は、組換えベクターが発現組換えベクターである上記組換えベクターである。
また、本発明の一態様は、上記組換えベクターを導入されてなる形質転換体である。
さらに、本発明の一態様は、上記組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または上記組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドの製造方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
またさらに、本発明の一態様は、上記抗体であって、上記ポリペプチドの機能を阻害する抗体である。
また、本発明の一態様は、上記抗体であって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害する抗体である。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記ポリペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、および上記抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、化合物と該ポリペプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ポリペプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、化合物が該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリペプチドの機能または該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法である。
またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記形質転換体と化合物とを接触させ、該ポリペプチドの発現または機能の有無を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ポリペプチドの発現または機能を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法である。
また、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記ポリペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、および上記抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法である。
さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記ポリペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、および上記抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記いずれかの同定方法で同定された化合物である。
またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用し、その機能を阻害または促進する化合物である。
また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用し、当該ポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害または促進する化合物である。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用し、当該ポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の増幅を阻害または促進する化合物である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物である。
またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる医薬組成物である。
また、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤である。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる記憶再生の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる神経変性疾患の防止剤、治療剤、または改善剤である。
またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなるアルツハイマー病の防止剤、治療剤、または改善剤である。
また、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とするＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法である。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とする記憶再生の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とする神経変性疾患の防止方法、治療方法、または改善方法である。
またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とするアルツハイマー病の防止方法、治療方法、または改善方法である。
また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドまたは上記ポリヌクレオチドを、定量的あるいは定性的に測定する方法である。
さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キットである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００１−３５４６７８号、同第２００２−４６７８６号および同第２００２−２２９８６３号からの優先権を請求するものである。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者（当業者）により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料はそれらを引用することにより本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものとして導入される。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
（新規ＰＳＤおよび該ＰＳＤと相互作用する蛋白質）
本発明においては、新規なヒトＰＳＤおよび該ＰＳＤと相互作用する蛋白質、並びにこれらをそれぞれコードする遺伝子を提供する。
新規ヒトＰＳＤは、ヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーから、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメインおよびＧＫドメインを有する遺伝子として選出したクローンｈｊ０２５３７がコードする蛋白質である。当該蛋白質は、ｈｊ０２５３７遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを導入した大腸菌で発現させて得た。
以下、本発明に係るヒトＰＳＤをＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ、当該ＰＳＤをコードする遺伝子をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子と呼ぶ。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子は４９４１塩基（配列表の配列番号４）からなり、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長は１７３１塩基、該遺伝子の遺伝子産物は５７６アミノ酸残基（配列表の配列番号１）からなる。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘは既知ＰＳＤと同様に、そのアミノ酸配列中の第１３９番目イソロイシン（Ｉｌｅ）から第２１９番目グリシン（Ｇｌｙ）にＰＤＺドメインを、第２３１番目メチオニン（Ｍｅｔ）から第２９６番目アルギニン（Ａｒｇ）にＳＨ３ドメインを、および第４０４番目トレオニン（Ｔｈｒ）から第５００番目アスパラギン（Ａｓｎ）にＧＫドメインを保有している。このことから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸはＰＳＤ−９５が含まれるＤＬＧ様ＰＤＺ蛋白質のホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）であると推定した（第１図を参照）。したがって、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘは、ＰＳＤ−９５と同様の作用を持つと考えられ、膜受容体・イオンチャネル近傍に存在して器官（ａｐｐａｒａｔｕｓ）を形成し、細胞間での情報伝達や神経伝達物質放出の制御に係わると想定される。
実際、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘは、ＰＳＤ−９５と同様にＰＤＺドメインでＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合し、さらにＮＭＤＡ受容体のリガンド刺激によるシグナルに対してＰＳＤ−９５よりも強い増幅作用を示した。すなわち、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸはＮＭＤＡ受容体と複合体を形成し、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を促進すると考えられる。しかし、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＳＤ−９５は保有するＰＤＺドメイン数が異なり、ＰＳＤ−９５には３つ存在するのに対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘにおいては１つである。このことから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸはＰＳＤ−９５と異なる受容体シグナルを担う可能性がある。あるいは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘは、ＰＳＤ−９５様のシグナル伝達の補足や、ＰＤＺドメイン数による他の受容体等への結合選択性を現すことが考えられる
また、本発明においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸのＮ末端側８５アミノ酸残基が欠失したポリペプチド（配列表の配列番号２）を提供する。該ポリペプチドは、ヒト脳海馬由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーから得られた遺伝子クローンｐｊ０２６７７がコードするものである。ｐｊ０２６７７は４３７０塩基からなるポリヌクレオチド（配列表の配列番号５）であり、４９１アミノ酸からなるポリペプチド（配列表の配列番号２）をコードする。ｐｊ０２６７７がコードするポリプチドのアミノ酸配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと比較して、Ｎ末端側８５アミノ酸残基が欠失している他は同一である。したがって、そのアミノ酸配列中にＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、およびＧＫドメインをそれぞれ１つ保有しており、このことからＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと同様にＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合し、同様の生理活性を示すものと推定される。ｐｊ０２６７７は、脳、例えば小脳等、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、脊髄等、各種臓器で広範に発現していることを確認した。ｐｊ０２６７７は上記ｈｊ０２５３７の５’末端側塩基配列が欠失したものと考えられることから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子も同様にこれらの臓器で発現していると考えられる。
一方、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと相互作用する蛋白質は、かずさＤＮＡ研究所のヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベースから、ラットＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０−アソシエーティッド  プロテイン−３（ＳＡＰＡＰ−３）（ＧｅｎＢａｎｋ：アクセッション番号：Ｕ６７１３９）と９６％の相同性を有する遺伝子として抽出したクローンＰＪ０１０８７がコードする蛋白質である。当該蛋白質は、ＰＪ０１０８７遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを導入した大腸菌で発現させて得た。以下、この蛋白質をＰＪ０１０８７蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子をＰＪ０１０８７遺伝子と呼ぶ。また、ＰＪ０１０８７蛋白質をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｙと称することもある。ＰＪ０１０８７遺伝子は３７０５塩基（配列表の配列番号６）からなり、そのＯＲＦ全長は２９４０塩基、該遺伝子の遺伝子産物は９７９アミノ酸残基（配列表の配列番号３）からなる。また、ＰＪ０１０８７蛋白質は脳に特異的に発現していることが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）により判明した。
ＰＪ０１０８７蛋白質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘの共存下でＮＭＤＡ受容体からのシグナルを著しく増幅した。ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとによる該シグナルの増幅は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ単独による増幅よりも格段に大きかった。一方、ＰＳＤ−９５の共存下ではＰＪ０１０８７蛋白質による上記シグナルの増幅は認められなかった。これらから、ＰＪ０１０８７蛋白質がＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと相互作用すること、および該相互作用によりＮＭＤＡ受容体リガンド刺激によるシグナル伝達が著しく増幅されることが判明した。
本明細書中で、ＰＪ０１０８７蛋白質がＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと相互作用するとは、両蛋白質がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、それぞれの蛋白質の機能が促進されることを意味する。それぞれの蛋白質の機能としては、例えば膜受容体・イオンチャネルの生理機能の促進、具体的には当該膜受容体の安定化や当該受容体のシグナル伝達の促進等が挙げられる。かかる膜受容体・イオンチャネルとしては、例えばＮＭＤＡ受容体が例示できる。相互作用する様式としては、結合、一過性の結合、あるいは他の物質を介した複合体の形成等が例示されるが、これらに限定されない。ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの結合が免疫沈降法による分析では認められなかったことから、両蛋白質の相互作用は結合による様式ではなく、何らかの別様式によるものと考えている。
これらから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘの過剰発現により、あるいはその生理活性、例えば他の蛋白質との相互作用やグアニレートキナーゼ活性の促進により、膜受容体、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナルの増幅が可能になると考えられる。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘの発現阻害により、あるいはその生理活性、例えば他の蛋白質との相互作用やグアニレートキナーゼ活性の阻害により、膜受容体、例えばＮＭＤＡ受容体の異常シグナルを正常化できると考えられる。同様に、ＰＪ０１０８７蛋白質の過剰発現により、あるいはその生理活性の促進により、膜受容体シグナルの増幅が可能になる。また、ＰＪ０１０８７蛋白質の発現阻害により、あるいはその生理活性の阻害により、膜受容体の異常シグナルを正常化できる。すなわち、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと膜受容体または当該受容体のシグナル伝達に関与する蛋白質等との相互作用の阻害または促進により、膜受容体のシグナル伝達等を調節することが可能である。ここで、「調節」とは、「阻害」または「促進」を意味する。また「促進」には、「増強」および「増幅」という意味も含まれる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体との相互作用の阻害または促進、あるいはＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質との相互作用の阻害または促進により、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達等を調節できる。したがって、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ自体、ＰＪ０１０８７蛋白質自体、並びにそれらの発現あるいは生理活性の阻害剤および促進剤は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘの異常、ＰＪ０１０８７蛋白質の異常、両蛋白質の異常、または両蛋白質の相互作用の異常に起因する疾患の防止、改善、または治療に適用できる。すなわち、これら疾患の防止剤、改善剤、または治療剤、および防止方法、改善方法、または治療方法に使用できる。かかる疾患として、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質が係わる膜受容体のシグナル伝達等の異常に基づく疾患が挙げられる。具体的には、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病およびポリグルタミン病等を例示できるが、これらに限定されない。
（ポリペプチドまたはペプチド）
本明細書において、ポリペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち、蛋白質等の長鎖ペプチドを意味し、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを単にペプチドという。本明細書においてはアミノ酸を３文字表記することもある。
本発明に係るポリペプチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子の遺伝子産物であり、該遺伝子を大腸菌等の細胞で発現させて得られたポリペプチドである。また当該ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、化学合成して得られるポリペプチドや、細胞またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するポリペプチドであってもよい。当該ポリペプチドは、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一、または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、少なくともＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合し得るポリペプチドである限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するポリペプチドであり得る。あるいは、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のポリペプチドと、アミノ酸配列上で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有し、かつＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合し得るものであってもよい。さらに、グアニレートキナーゼ活性を有するものがより好ましい。加えて、ＰＤＺドメインを１つ保有するものがさらに好ましい。ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合は、例えば後述する実施例に示したように、オーバーレイ法等の公知の方法により測定できる。また、グアニレートキナーゼ活性は自体公知の方法で測定できる。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、ｃＤＮＡの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。さらに、このように特定されたポリペプチドを基にして、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合および／またはグアニレートキナーゼ活性を指標にすることにより、１個以上、例えば１個乃至１００個、好ましくは１個乃至３０個、より好ましくは１個乃至２０個、さらに好ましくは１個乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、および／または挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供できる。これらポリペプチドも、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドに含まれる。このようなポリペプチドとして、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。上記変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。さらにまた、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用しないポリペプチドも、本発明の範囲に包含される。かかるポリペプチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと競合することにより、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質との相互作用を阻害すると推定できる。このため、かかるポリペプチドは、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を阻害できると考えられる。
本発明に係る別のポリペプチドは、ＰＪ０１０８７遺伝子の遺伝子産物であり、該遺伝子を大腸菌等の細胞で発現させて得られたポリペプチドである。また当該ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、化学合成して得られるポリペプチドや、細胞またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するポリペプチドであってもよい。当該ポリペプチドは、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一、または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、少なくとも配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチドである限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するポリペプチドであり得る。あるいは、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、アミノ酸配列上で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するものであってもよい。また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下でＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を増幅するものであってもよい。このとき、ＳＡＰＡＰ−３のアミノ酸配列は本発明の範囲に含まれない。また、相互作用するペプチドは、蛋白質の立体構造から決まる構造単位で、しばしば機能単位としても働くモジュールの概念から考えると、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸配列を有するものも利用できる。モジュールのアミノ酸残基数は平均１５として知られているが、抗原となり得る機能等を考えるとアミノ酸残基５個でも充分機能単位となり得ると考えている。配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用は、例えば当該ポリペプチド、被検対象であるポリペプチド、およびＮＭＤＡ受容体を細胞に共発現させ、ＮＭＤＡ受容体のリガンド刺激による細胞内シグナル伝達を公知の方法を利用して測定することにより検定可能である（実施例４参照）。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、ｃＤＮＡの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。このように特定されたポリペプチドを基にして、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用、具体的には例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進、または配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下におけるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の増幅を指標にすることにより、１個以上、例えば１個乃至１００個、好ましくは１個乃至３０個、より好ましくは１個乃至２０個、さらに好ましくは１個乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、および／または挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。これらポリペプチドも、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドに含まれる。このとき、上記ＳＡＰＡＰ−３のアミノ酸配列は本発明の範囲に含まれない。上記変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。
欠失、置換、付加、および／または挿入といった変異の導入方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独でまたは適宜組み合わせて、サムブルックら編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９年、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８年、エールリッヒ，ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−〕を利用することができる。このような変異の導入において、ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これらポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、その機能や作用がより促進されたものあるいは低下したものであり得る。例えば、ＮＭＤＡ受容体との複合体形成能、グアニレートキナーゼ活性、および／または配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用の程度が異なるものであり得る。より具体的には例えば、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を促進する機能の強度が異なるもの、例えば機能がより促進されたもの、あるいは機能が低下したものであり得る。
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、その機能や作用がより促進されたものあるいは低下したものであり得る。例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用の程度が異なるもの、例えば相互作用がより促進されたもの、あるいは相互作用が低下したものであり得る。より具体的には、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を促進する機能の強度が異なるもの、例えば機能がより促進されたもの、あるいは機能が低下したものであり得る。
本発明の範囲には、上記ポリペプチドに別種の蛋白質または物質、例えばキャリア等を結合したものも包含される。例えば、本発明に係るポリペプチド等の検出または精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、そのＮ末端側やＣ末端側に別種の蛋白質またはペプチド、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）等の免疫グロブリンＦｃ断片、ヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）またはフラッグ−タグ（ＦＬＡＧ−ｔａｇ）等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等の公知方法を用いて付加することもできる。
また、本発明は、配列表の配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドを包含する。当該部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、その最小単位として５個以上のアミノ酸、好ましくは８個以上のアミノ酸、より好ましくは１２個以上、さらに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸からなるものである。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７蛋白質の機能に関わる最小活性単位（領域またはドメイン）からなるポリペプチドまたはペプチドも本発明において提供される。上記部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の機能を阻害するために使用できる。具体的には例えば、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合し得る上記ペプチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合を阻害できる。また、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７蛋白質の部分ペプチドであって、両蛋白質の相互作用に関与する領域を含むペプチドは、当該相互作用を阻害できる。あるいは、ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘの共存下におけるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の増幅を阻害できる。したがって、かかるペプチドは、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進を阻害することができる。また、上記部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと同様の生理活性、例えばＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合、グアニレートキナーゼ活性、および／またはＰＪ０１０８７蛋白質との相互作用を有する上記ポリペプチドの生理活性を調節する物質の同定等に使用する試薬として有用である。さらに、ＰＪ０１０８７蛋白質またはＰＪ０１０８７蛋白質と同様の生理活性、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの相互作用を有する上記ポリペプチドの生理活性を調節する物質の同定等に使用する試薬として有用である。免疫学的に認識され得るペプチド、例えばエピトープペプチドであれば、後述するように、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７蛋白質に特異的な抗体を作成するための抗原として単独でまたはキャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたは卵白アルブミン）と結合して使用できる。
（ポリヌクレオチド）
一つの態様において、本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドをそれぞれコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含むポリヌクレオチドを意味する。例えば、配列表の配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドであり得る。好ましくは、配列表の配列番号４、配列番号５または配列番号６に記載の塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。本発明において、相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを相補鎖と称することもある。
別の態様において本発明は、上記ポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号４、配列番号５または配列番号６に記載の塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９年等に従うことができる。これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号４、配列番号５または配列番号６に記載の塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ハイブリダイゼーションするものであれば必ずしも相補的配列でなくともよい。例えば、配列表の配列番号４、配列番号５または配列番号６に記載の塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する相同性において、少なくとも約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上のものであればよい。このとき、ＳＡＰＡＰ−３遺伝子の塩基配列は本発明の範囲には含まれない。また本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの指定された塩基配列領域に対応する連続する１０個以上のヌクレオチド、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを包含する。
これらポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチド等の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬または標準品としても利用できる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７蛋白質をコードする核酸、例えばその遺伝子またはｍＲＮＡの検出のためのプローブまたはプライマーとして、または遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として利用できる。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。ここで、上記本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの選別は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の確認を行い、その生理活性を指標にして実施できる。指標にする生理活性は、例えばＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合、グアニレートキナーゼ活性、あるいは配列表の配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用等が挙げられる。相互作用は、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を促進させる機能の測定により評価できる。具体的には、配列表の配列番号１および配列番号３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなる２種のポリペプチドの共存下で、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を増幅する機能を指標にして測定可能である。公知の蛋白質発現系としては、例えば、胚芽または家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用した無細胞蛋白質発現系〔「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９５７年、第１７９巻、ｐ．１６０−１６１〕を例示できる。
（組換えベクター）
本発明に係るポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組込むことにより、組換えベクターが得られる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等が挙げられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製する。前記ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
（形質転換体）
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターＤＮＡを、自体公知の宿主に自体公知の方法で導入することにより形質転換体が得られる。宿主に導入するベクターＤＮＡは、１種のベクターＤＮＡであってもよく、２種以上のベクターＤＮＡを導入してもよい。例えば、配列表の配列番号４に記載のポリヌクレオチドを含むベクターＤＮＡと配列番号６に記載のポリヌクレオチドを含むベクターＤＮＡの、一方を導入してもよいし、両方を導入することもできる。宿主としては、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞または動物細胞等が例示できる。遺伝子の導入を行う場合、より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、サムブルックら編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル］コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９年等に記載されている標準的な方法により実施できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。
宿主に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で培養する。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの機能、例えばＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合、グアニレートキナーゼ活性、あるいは配列表の配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された該ポリペプチドまたはペプチド量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
（ポリペプチドおよびペプチドの回収および／または精製）
上記形質転換体を培養した培地からの本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの回収および／または精製は、当該ポリペプチドまたはペプチドの機能、例えばＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合、グアニレートキナーゼ活性、あるいは配列表の配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を指標にして実施できる。回収および／または精製の方法としては、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段、ゲルろ過、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられ、これらを単独でまたは組み合わせて使用する。好ましくは、回収および／または精製しようとするペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法を使用する。
（抗体）
抗体は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は上記ポリペプチドまたは上記ペプチド、あるいはそれらの断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドに特異的な抗体を作成するためには、該ポリペプチドまたは該ペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも上記ポリペプチドまたは上記ペプチドに記載のものと相同または同一である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に、上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定できる。
抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、上記抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等が例示される。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせが例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法により得られる。
モノクローナル抗体は、上記免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られた上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドを認識して結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、上記ポリペプチドまたはペプチドの精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。
上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドを認識して結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のうち、例えば、直接Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘに結合してその生理活性、例えばＮＭＤＡ受容体等の他の蛋白質との結合活性、グアニレートキナーゼ活性、および／またはＰＪ０１０８７蛋白質との相互作用を阻害する抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはその機能の異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善、または治療のために有用である。また、例えば、直接ＰＪ０１０８７蛋白質に結合して、その機能、例えば少なくともＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの相互作用を阻害するものは、ＰＪ０１０８７蛋白質および／またはその機能の異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善、または治療に有用である。かかる抗体として例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用による、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進を阻害する抗体が例示できる。より具体的には例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の共存下における、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の増幅を阻害する抗体が挙げられる。
（化合物の同定方法）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターが導入されてなる形質転換体、これらを用いる蛋白質合成系、または該ポリペプチドおよび／または該ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独でまたは複数を組み合わせることによって、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドの機能の阻害剤または促進剤、および／または上記ポリヌクレオチドの発現の阻害剤もしくは促進剤の同定に有効な方法を提供する。該方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。本発明に係る同定方法によれば、例えば上記ポリペプチドまたは上記ペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤または促進剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が可能である。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘに由来するポリペプチドまたはペプチドを用いて、被検化合物とこれらポリペプチドまたはペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下でこれらポリペプチドまたはペプチドと該化合物とを接触させて、その相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸおよびＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を促進する化合物または阻害する化合物を同定可能である。このとき、該ポリペプチドまたは該ペプチドと結合する他の蛋白質、例えばＮＭＤＡ受容体との相互作用を測定するアッセイ系を用い、ここに被検化合物を加えて当該相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと例えばＮＭＤＡ受容体との相互作用を促進する化合物または阻害する化合物を同定可能である。かかるアッセイ系は、自体公知のスクリーニングシステムを利用して構築可能であるが、例えば後述する実施例３に記載した方法が使用可能である。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘのグアニレートキナーゼ活性を指標にして、該グアニレートキナーゼ活性を促進する化合物または阻害する化合物が同定できる。グアニレートキナーゼ活性の測定は、自体公知の方法により行うことができる〔クック（Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｆ．）ら「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８２年、第２１巻、ｐ．５７９４−；ライト（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｅ．）ら、「プロシーディング  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、１９８１年、第７８巻、ｐ．６０４８−；コービン（Ｃｏｒｂｉｎ，Ｊ．Ｄ．）ら「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９７４年、第３８巻、ｐ．２８７−〕。
また、ＰＪ０１０８７蛋白質に由来するポリペプチドまたはペプチドを用いて、上記同様に、ＰＪ０１０８７蛋白質および同様の生理活性を有するポリペプチドの活性を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘに由来するポリペプチドまたはペプチドとＰＪ０１０８７蛋白質に由来するポリペプチドまたはペプチドとを用いて、それらの相互作用を測定するアッセイ系を用い、ここに被検化合物を加えて当該相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、当該相互作用を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。具体的には、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用によるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の促進を阻害する化合物またはさらに促進する化合物を同定可能である。あるいは、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の共存下におけるＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の増幅を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。かかるアッセイ系は、自体公知のスクリーニングシステムを利用して構築可能であるが、例えば後述する実施例６に記載した方法が使用可能である。
また、本発明に係るポリヌクレオチドと被検化合物との間の相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下でこれらポリヌクレオチドと該化合物とを接触させて、該ポリヌクレオチドの発現を検出できるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、これらポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。得られた化合物から、さらに形質転換体を用いた下記の方法により、これらポリヌクレオチド、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７遺伝子の発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。
さらに、本発明に係る形質転換体を用いて、被検化合物または上記同定された化合物と適当な条件下で接触させ、本発明に係るポリヌクレオチド、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現の有無または変化を検出することにより、該ポリヌクレオチド、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現の有無または変化の検出は、簡便には、発現される遺伝子産物の機能を測定することにより実施できる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子発現の有無または変化の検出は、グアニレートキナーゼ活性を指標として測定することにより実施できる。あるいは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現の有無または変化を検出するために、検出のためのシグナルまたはマーカーを使用する自体公知の系を導入し、このシグナルまたはマーカーの存在、不存在または変化を検出してもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的性質または化学的性質により直接検出されるものを指し、マーカーとはそのものの物理的性質または生物学的性質を指標として間接的に検出されるものをいう。シグナルとしてはルシフェラーゼやグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等、または検出用のタグ、例えばＨｉｓ−ｔａｇ等、公知のものが利用できる。これらのシグナルまたはマーカーを目的の遺伝子配列に付加した後にベクターに組込み、得られたベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作成すればよい。また、これらのシグナルまたはマーカーの利用方法および検出方法は、当業者には周知のものである。
具体的には、例えば後述する実施例に準じてＰｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７蛋白質とＨｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質を例えば大腸菌で発現させてＨｉｓ−ｔａｇを検出する実験系において、ここに被検化合物を加えることにより、ＰＪ０１０８７蛋白質またはＰＪ０１０８７蛋白質の発現または機能を阻害する化合物または促進する化合物を同定できる。
また別の具体例として、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子、ＰＪ０１０８７蛋白質遺伝子およびＮＭＤＡ受容体遺伝子を細胞に導入して共発現させ、被検化合物を加えて、ＮＭＤＡ受容体のリガンド刺激による細胞内シグナル伝達を公知の方法を利用して測定する方法が挙げられる。上記遺伝子を共発現させたかかる細胞を用いれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７蛋白質の機能を阻害する化合物または促進する化合物の他に、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＪ０１０８７蛋白質の発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。
上記例示した同定方法および実験系は、これらを具体的に説明するために例示したものであり、本発明に係る化合物の同定方法および該方法に用いる実験系はこれらに限定されない。
（ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの相互作用調節剤および医薬組成物）
本発明においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸがＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合してＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を増幅すること、並びにＰＪ０１０８７蛋白質がＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘの共存下で、膜受容体、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を著しく増幅することを見出した。このことから、ＰＪ０１０８７蛋白質は、膜受容体・イオンチャネル、例えばＮＭＤＡ受容体がそのリガンド等により刺激を受けると該受容体近傍に集積し、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの相互作用により、例えば当該受容体を安定化する、および／または、当該受容体のシグナル伝達を促進すると推察した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸおよびＰＪ０１０８７蛋白質は、これらが関わる膜受容体、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の結果引き起こされる生理機能、例えば神経伝達物質放出等に関わると考えられる。したがって、ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘの相互作用の阻害または促進により、ＰＪ０１０８７蛋白質およびＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘが関わる生理機能、例えば少なくともＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を調節することができる。また、ＮＭＤＡ受容体とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの結合の阻害または促進により、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を調節可能である。
かくして、本発明においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体との結合を阻害するまたは促進する手段、および／または、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用を阻害するまたは促進する手段を導入されたＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の調節剤および調節方法を提供する。ここで、調節剤とは阻害剤、拮抗剤または促進剤等を総称的にいうものである。また調節方法とは、阻害方法または促進方法等を意味する。Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体との結合の促進には、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ自体またはその遺伝子を用いることができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用の促進には、これら蛋白質自体またはそれらの遺伝子を用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質を過剰発現させることにより、あるいはそれらの機能を促進することにより、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体との結合またはＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用が促進されるため、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を促進することができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体との結合の阻害、またはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用の阻害は、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の発現を阻害することにより実現可能である。蛋白質発現の阻害、あるいはそれらの機能の阻害により受容体の異常シグナルを正常化できる。
Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体の結合、またはＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用を阻害または促進する手段としては、その他に、例えば上記方法により同定された化合物が挙げられる。当該化合物は、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体の結合の阻害剤または促進剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用の阻害剤または促進剤として用いることができ、さらにＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の阻害剤または促進剤として利用可能である。より具体的には、本発明に係るＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の共存下におけるＮＭＤＡ受容体シグナル伝達の増幅の阻害剤または促進剤として利用可能である。阻害剤として使用できる化合物としては、本発明に係る上記ポリペプチドの機能に関わる最小活性単位（領域またはドメイン）からなるポリペプチドまたはペプチドであって、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用を阻害できるものが例示できる。このようなポリペプチドまたはペプチドは、例えばＰＪ０１０８７蛋白質のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法によって合成し、上記同定方法で試験することにより同定可能である。また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用しないポリペプチドが阻害剤として利用できる。さらに、ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘの相互作用を阻害する抗体も上記化合物の１つとして例示できる。
上記選別された化合物、上記調節剤は、単独でまたは複数組み合わせて使用することにより、試薬として、あるいは医薬組成物の成分として使用できる。これらは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質、並びにそれらの遺伝子が関与する生体機能あるいは疾患の解明、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達機構の解明あるいはＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達異常に起因する疾患や神経変性疾患の解明に使用できる。
また、上記方法により同定された化合物は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと同様の生理活性を有するポリペプチドの活性、例えばＮＭＤＡ受容体等の他の蛋白質との結合活性やグアニレートキナーゼ活性の調節剤、例えば阻害剤、拮抗剤または促進剤の候補化合物として利用可能である。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと同様の生理活性を有するポリペプチドの遺伝子レベルでの発現に関する調節剤、例えば阻害剤、拮抗剤または促進剤の候補化合物としても利用可能である。あるいはＰＪ０１０８７蛋白質またはＰＪ０１０８７蛋白質と同様の生理活性を有するポリペプチドの活性、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの相互作用の調節剤、例えば阻害剤、拮抗剤または促進剤の候補化合物として利用可能である。また、ＰＪ０１０８７蛋白質またはＰＪ０１０８７蛋白質と同様の生理活性を有するポリペプチドの遺伝子レベルでの発現に関する調節剤、例えば阻害剤、拮抗剤または促進剤の候補化合物としても利用可能である。これらの発現を阻害する化合物としては、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが例示できる。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現系を用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現を特異的に阻害するものを選択することにより得られる。ここで「Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現を特異的に阻害する」とは、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子またはＰＪ０１０８７遺伝子の発現を強く阻害し、他の遺伝子の発現は阻害しないか、または弱く阻害することを意味する。
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することにより、医薬組成物として調製可能である。また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、並びに本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を本発明に係るポリペプチドの発現や機能の異常に起因する各種病的症状、例えば神経変性疾患の解明、診断、防止、改善、または治療に使用できる。すなわち本発明は、上記物質を単独でまたは複数組み合わせて使用することにより、これらのうち少なくとも１つを含有する医薬組成物を提供する。
発現の異常としては発現の過剰または低下が挙げられる。機能の異常としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体の結合の異常、あるいはＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用の異常等が挙げられる。これら異常の結果として、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の異常、具体的には例えばＮＭＤＡ受容体シグナル伝達の過剰、低下または欠失等が起きる。神経変性疾患としては、次に挙げる例に限定されるものではないが、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびポリグルタミン病等が挙げられる。
また、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘは、ＰＳＤ−９５が３つ有するＰＤＺドメインを１つ有する。この１つのＰＤＺドメインもＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合することが示されたことより、ＰＳＤ−９５様のシグナル伝達の補足や、ＰＤＺドメイン数による他の受容体等への結合選択性を現すことが考えられる。この想定される機能に由来するシグナルの強化や異常シグナルの正常化の工夫も利用できる。
本発明に係るＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の発現、および／またはその機能の低下または欠失等に関連する異常な症状の治療には、１つの方法としてＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質自体もしくはこれら蛋白質と同様の機能を有するポリペプチド、またはこれらをコードする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞内でＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質自体もしくはこれら蛋白質と同様の機能を有するポリペプチドを生成なさしめてもよい。遺伝子治療は、公知の方法が利用できるが、例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを組み入れた複製欠損レトロウイルスベクターを作成して遺伝子治療に利用すればよい。また、例えば、目的とする蛋白質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）において対象由来の細胞を処理し、次いで細胞を対象に導入することもできる。
Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の発現、および／またはその機能が過剰である場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与してこれら蛋白質の機能、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体の結合、および／またはＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の相互作用によるＮＭＤＡ受容体シグナル伝達の促進を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することもできる。さらに、発現ブロック法を用いて内在性の当該ポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成させた、あるいは別個に投与された当該遺伝子のアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドを使用して当該遺伝子の発現を阻害できる。これらオリゴヌクレオチドは、上記本発明に係るポリヌクレオチドを基にして設計し合成できる。当該オリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。
Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の発現、および／または機能の過剰、低下もしくは欠失等の機能障害は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質が関わる生理機能、例えば膜受容体のシグナル伝達の結果引き起こされる神経伝達物質放出等の制御の異常をきたし、病的症状を引き起こす。したがって、本発明は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の関与する生体機能の解明、例えば細胞内シグナル伝達や神経伝達物質放出の制御の解明に有用である。さらに、本発明は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の関与する細胞内シグナル伝達や神経伝達物質放出の制御の異常により引き起こされる疾患、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達異常に起因する疾患や神経変性疾患の、防止剤、改善剤、または治療剤および防止方法、改善方法、または治療方法、さらに該疾患の診断手段として用いる測定法に非常に有用なものである。
最近、ノックアウトマウスを用いた実験により、脳内の記憶再生メカニズムに関し知見が得られた。つまり、海馬のＣＡ３領域のＮＭＤＡ受容体が記憶再生に重要な役割を演じていた〔ナカザワ（Ｎａｋａｚａｗａ，Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００２年、第２９７巻、第５５７９号、ｐ．２１１−２１８〕。このＮＭＤＡ受容体の機能は、その機能を正常化したり、亢進すると、記憶再生に関わる疾患、例えばアルツハイマー病等の記憶力が低下する症状を防止、改善、または治療できる。このことから本発明は、記憶再生に関わる疾患、例えばアルツハイマー病等の防止、改善、または治療に用いられる薬剤の開発を可能にする。
本発明に係る医薬組成物、調節剤、防止剤、治療剤、または改善剤の処方は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量の本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、並びに本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、上記化合物、上記調節剤、上記防止剤、上記治療剤、上記改善剤、または上記医薬組成物、さらに医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるがこれらに限らない。処方は投与経路に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られている。これら医薬組成物、調節剤、防止剤、治療剤、または改善剤は、単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と一緒に使用してもよい。
本発明に係る医薬組成物、調節剤、防止剤、治療剤、または改善剤の投与形態は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様は、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜投与もしくは経皮投与を用いることもできる。局所的な投与においては、膏薬、パスタ、ゲル等の形態での投与であってもよい。
必要な用量範囲は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、並びに本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、上記化合物、上記調節剤、上記防止剤、上記改善剤、上記治療剤、または上記医薬組成物の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断による。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．１μｇ乃至１００μｇの範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。
製剤化にあたっては、例えばペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、または化合物等各対象の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、またはシクロデキストリン等の包接体等の製剤化方法が利用できる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロースおよびマンニトール等の賦形剤、澱粉およびアルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレートおよびタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトールおよびフラクトース等の糖類、ＰＥＧ等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油およびオリーブ油等の植物油並びにＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトールおよび果糖等）が例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
（診断のための測定方法および試薬）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、または当該ポリペプチドもしくはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用できる。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んであってもよい。本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または当該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの機能、例えばＮＭＤＡ受容体との結合、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの相互作用、またはＰＪ０１０８７蛋白質との相互作用、または該相互作用における例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達の増幅が阻害されなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質またはペプチド、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇまたはＦＬＡＧ−ｔａｇ等が、直接またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加されたものであってもよい。本発明に係るポリヌクレオチドはその機能、例えばコードするポリペプチドの発現や、発現されたポリペプチドの機能が阻害されなければ、５’末端側やＣ’末端側に、ルシフェラーゼやグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等のシグナル、あるいはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等のレポーター遺伝子が付加されたものでもよい。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットを提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチドまたはペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
これら試薬および試薬キットは、本発明に係る同定方法に使用できる。また、当該試薬および試薬キットは、本発明に係るポリペプチド、ペプチドまたはこれらのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの定量的および／または定性的な測定に使用できる。当該測定のための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。ポリペプチドまたはペプチドの測定に利用できる方法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等を例示できる。また、ポリヌクレオチドは、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて核酸レベル、例えばＲＮＡレベルで検出および定量が可能である。
上記試薬、試薬キットおよび測定方法は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、例えばＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘおよび／またはＰＪ０１０８７蛋白質の発現、およびそれらの機能の異常に起因する疾患の検出方法に適用できる。または、これらをコードするＤＮＡの変異等に起因する各種病的疾患の検出方法に使用できる。当該疾患としては、例えば神経変性疾患、より具体的には、アルツハイマー病、パーキンソン病およびポリグルタミン病が例示できる。
測定される試料は、個体由来の、例えば細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等が挙げられる。また、測定される核酸は上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出することができる。増幅ＤＮＡを、標識した本発明に係るポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。
すなわち、個体由来の試料について、例えば当該ポリペプチドまたは当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドとの相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定すること、並びに当該ポリペプチドまたはペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、当該ポリペプチドまたはペプチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することによって、上記疾患の診断が可能である。
さらに、本発明に係るポリペプチドもしくはペプチドまたはこれらのいずれか１つをコードする核酸を診断マーカーとして定性的にあるいは定量的に測定することにより、上記疾患の検査および診断が可能である。すなわち、上記検出方法を利用して、されに上記疾患の検査方法または診断方法が実施可能である。
実施例
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
（新規ＰＳＤ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子）の単離・同定）
本発明に係るＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子は、かずさＤＮＡ研究所のヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベースから、バイオインフォーマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）により、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメインおよびＧＫドメインを有する遺伝子として抽出したクローンｈｊ０２５３７に基づいて、ヒト脳由来ｍＲＮＡから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により作成したｃＤＮＡを鋳型としてクローニングを行うことにより、生体におけるその発現を確認した。
まず、ヒト脳由来ｍＲＮＡを用い、スーパースクリプトＩＩ（Ｓｕｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を使用して逆転写反応を行った。ヒト脳由来ｍＲＮＡ（１μｇ／μｌ）０．２μｌ、オリゴ（ｄＴ）プライマー（０．５μｇ／μｌ）１μｌ、Ｈ２Ｏ  １０．８μｌを混合し、７０℃で１０分間加熱し、氷冷後に５×  ファーストストランドバッファー（Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ）４μｌ、０．１Ｍ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）２μｌ、１０ｍＭ  デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）ミックス  １μｌを添加した。続いてスーパースクリプトＩＩ（２００Ｕ／μｌ）を１μｌ添加し、室温で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間反応させて、ｃＤＮＡを調製した。
つぎに、クローンｈｊ０２５３７の塩基配列に基づいて、下記プライマーを設計して合成した。プライマーの配列中、下線で示したＡＴＧは翻訳開始コドンである。
＜プライマー＞
2003044196.tif 000002
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はアドバンテージ２  ＰＣＲキット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｋｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて行った。１０×  アドバンテージ２  ＰＣＲバッファー２μｌ、上記Ｐｒ−ＨＪｆ（５３．０９ｐｍｏｌ／μｌ）０．２μｌ、上記Ｐｒ−ＨＪｒ（３８．５９ｐｍｏｌ／μｌ）０．３μｌ、上記調製したｃＤＮＡを１μｌ、１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１．６μｌ、５０×  ポリメラーゼミックス０．４μｌ、Ｈ２Ｏ  １４．５μｌを混合し（合計２０μｌ）、下記条件でＰＣＲ反応を行った。
＜ＰＣＲ運転条件＞
2003044196.tif 000003
得られたＰＣＲ産物を用いて、ゲイトウェイシステム（Ｇａｔｅ  ｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してクローニングを行った。ＰＣＲ産物１６μｌをＴＥバッファーで１００μｌとし、３０％  ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を５０μｌ添加して、室温で遠心（１５，０００ｒｐｍで１０分間）した後、ペレットを７０％エタノールで洗浄して乾燥し、ＴＥバッファー３０μｌに溶解した。その後、ＢＰクロナーゼ反応バッファー（ｃｌｏｎａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）１μｌ、ＰＣＲ産物１μｌ、エントリーベクター（ｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＤＯＮＲ２０１：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＴＥバッファー１．５μｌを氷上で混合し（合計４μｌ）、ＢＰクロナーゼ酵素ミックス（ｃｌｏｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ）を１μｌ添加後、２５℃で４．５時間反応させた。反応後、プロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）を０．５μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）ＪＭ１０９にトランスフォーメーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）し、ｐＤＯＮＲ２０１／ｈｊ０２５３７＃７およびｐＤＯＮＲ２０１／ｈｊ０２５３７＃９を得た。これらクローンの塩基配列から、脳における発現が確認された。
実施例２
（新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）の発現）
Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘを発現させるために、大腸菌発現ベクターおよび発現系をゲイトウェイシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて構築した。クローンｈｊ０２５３７を鋳型とし、アドバンテージ２  ＰＣＲキットを用いて蛋白質翻訳領域の増幅を行った。１０×  アドバンテージ２  ＰＣＲバッファー  ２μｌ、実施例１で作成したＰｒ−ＨＪｆ（５３．０９ｐｍｏｌ／μｌ）０．２μｌおよびＰｒ−ＨＪｒ（３８．５９ｐｍｏｌ／μｌ）０．３μｌ、クローンｈｊ０２５３７（１ｎｇ／μｌ）２μｌ、１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス  １．６μｌ、５０×  ポリメラーゼミックス  ０．４μｌ、Ｈ２Ｏ  １３．５μｌを混合し（合計２０μｌを２本調製した）、実施例１と同様にＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ産物３５μｌをＴＥバッファーで１００μｌとし、３０％  ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を５０μｌ添加し、室温で遠心（１５，０００ｒｐｍで１０分間）後、ペレットを７０％エタノールで洗浄して乾燥し、ＴＥバッファー５０μｌに溶解した。その後、ＢＰクロナーゼ反応バッファー１μｌ、ＰＣＲ産物１μｌ、エントリーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＴＥバッファー１．５μｌを氷上で混合し（合計４μｌ）、ＢＰクロナーゼ酵素ミックスを１μｌ添加後、２５℃で一晩反応させた。反応後にプロテイナーゼＫを０．５μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピテント細胞（ＪＭ１０９）にトランスフォーメーションし、ｐＤＯＮＲ２０１／ｈｊ０２５３７＃１を得た。
次にｐＤＯＮＲ２０１／ｈｊ０２５３７＃１を用い、６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質としてＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘを発現するベクターを構築した。ＬＲクロナーゼ反応バッファー１μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１／ｈｊ０２５３７＃１（５０ｎｇ／μｌ）１μｌ、６×Ｈｉｓ−ｔａｇ発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＴＥバッファー１．５μｌを氷上で混合し（合計４μｌ）、ＬＲクロナーゼ酵素ミックスを１μｌ添加後、２５℃で２時間反応させた。反応後にプロテイナーゼＫを０．５μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピテント細胞（ＢＬ２１−ＳＩ）にトランスフォーメーションし、３クローン（ｐＤＥＳＴ１７／ｈｊ０２５３７＃９、ｐＤＥＳＴ１７／ｈｊ０２５３７＃１０、ｐＤＥＳＴ１７／ｈｊ０２５３７＃１１）を得た。
上記３クローンについて、ＮａＣｌによる目的蛋白質の産生誘導の有無および可溶性蛋白質の調製について検討した。各大腸菌を、アンピシリンを含むＬＢ培地（以下、ＬＢ−Ａｍｐという）であってＮａＣｌ非添加（ＮａＣｌ−）のもの２ｍｌで３７℃にて一晩振とう培養した。この前培養液を３００μｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）合計３ｍｌで３７℃にて２時間振とう培養後、５Ｍ  ＮａＣｌを１８０μｌ添加し（終濃度０．３Ｍ）、さらに３７℃で２時間振とう培養した。コントロールとしてＮａＣｌの代わりにＨ２Ｏを１８０μｌ添加して同様に培養した。その後、培養液を１．２ｍｌずつサンプリングしたものを２本作製して遠心（４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）し、上清（以下、可溶性画分という）とペレットとに分けた。該ペレットは２％  ＳＤＳ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）または２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）２００μｌにけん濁後、超音波処理し、再度遠心（１０℃または４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）した。この遠心上清（以下、不溶性画分ということもある）を１０％  β−メルカプトエタノール（ＭＥ）を含む２×  サンプルバッファー〔２％  ＳＤＳ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）／３０％  グリセロール／０．０１％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）〕と等量ずつ混合し、２分間煮沸後、７．５％  ポリアクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により蛋白質を検出した。また、上記可溶性画分についても同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質の検出を行った。その結果、第２図に示すように、ヒトＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと、６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質と思われる約６５．８ｋＤａのバンドが検出された。当該融合蛋白質は、上記培養された大腸菌の可溶性画分には少なく（第３図）、不溶性画分に多量に存在すると考えられた。
Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質の可溶性画分での発現を検討するため、上記大腸菌の培養を２５℃で行った。各大腸菌をＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）２ｍｌで２５℃にて一晩振とう培養した。この前培養液を２００μｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）合計２．２ｍｌで２５℃にて４時間振とう培養後、５Ｍ  ＮａＣｌを１３２μｌ添加し（終濃度０．３Ｍ）、さらに２５℃で２時間振とう培養した。コントロールとして、ＮａＣｌの代わりにＨ２Ｏを１３２μｌ添加して同様に培養した。その後、培養液を１ｍｌずつサンプリングしたものを２本調製して遠心し（４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）、上清とペレットとに分けた。ペレットを２％  ＳＤＳ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）２００μｌにけん濁し、超音波処理後に再度遠心（１０℃または４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）した。遠心上清を１０％  β−ＭＥを含む２×  サンプルバッファーと等量ずつ混合し、２分間煮沸後、７．５％  ポリアクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記同様に融合蛋白質を検出した。第４図に示すように、２５℃における培養では、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質は可溶性画分にも発現された。
上記のようにクローンｈｊ０２５３７を基にして得られたヒトＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘは、配列表の配列番号１に記載したように５７６残基のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列の第１３９番目Ｉｌｅから第２１９番目ＧｌｙにＰＤＺドメイン、第２３１番目Ｍｅｔから第２９６番目ＡｒｇにＳＨ３ドメイン、第４０４番目Ｔｈｒから第５００番目ＡｓｎにＧＫドメインを有していた。
実施例３
（新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）のＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットへの結合）
Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸのＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットへの結合作用を、オーバーレイ（Ｏｖｅｒｌａｙ）法により検討した。
まず、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質を発現する大腸菌（ｐＤＥＳＴ１７／ｈｊ０２５３７＃１１）をＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）２ｍｌで２５℃にて一晩培養した。この前培養液を２００μｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）合計２．２ｍｌで２５℃にて４時間本培養後、５Ｍ  ＮａＣｌを１３２μｌ添加（終濃度０．３Ｍ）し、さらに２５℃で２時間培養して、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘの産生を誘導した。培養後に大腸菌を集菌して、抽出バッファ−〔１％  ＴｒｉｔｏｎＸ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）〕を２００μｌ添加し、超音波処理後に、氷上で２０分間インキュベーション後、遠心（４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）した。遠心上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘを含む試料として用いた。また、遠心上清の一部を用い、実施例２に記載したのと同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘの発現と発現量をウェスタンブロッティング法により確認し（第５図）、用いる試料の量を決定した。ウェスタンブロッティングは以下のように行った。まず、泳動後に、湿潤化（ｗｅｔｔｉｎｇ）処理したＰＶＤＦ転写膜（ｔｒａｎｆｅｒ  ｍｅｎｂｒａｎｅ）にセミドライ法で転写し（１００ｍＡで１時間）、５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで室温にて１時間ブロッキングした。その後、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで１０００倍希釈して添加し、室温にて１時間反応させた。反応後、該転写膜をＴＢＳ−Ｔを用いて室温で１０分間洗浄し、該洗浄を３回行った後に、二次抗体〔抗マウスＩｇＧ抗体−ホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）〕を５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで３０００倍希釈して添加し、室温にて１時間反応させ、その後ＴＢＳ−Ｔによる１０分間洗浄を室温で３回行った。その後、ＥＣＬキットおよびハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒ  ｆｉｌｍ）を用いてシグナルを検出した。
ネガティブコントロールとして用いるために、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合領域であるＰＤＺドメインを欠失させた変異体（ｍｕｔａｎｔ）を発現する大腸菌ｐＤＥＳＴ１７／ｈｊＰＤＺ（−）＃２を後述するように作製し、ＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）２ｍｌで３７℃にて一晩培養した。この前培養液を２００μｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）合計２．２ｍｌで３７℃にて４時間本培養後、Ｈ２Ｏを１３２μｌ添加し、さらに３７℃で２時間培養して、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体の産生を誘導した。培養後大腸菌を集菌して、上記同様に処理してＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体を含む試料を調製した。また、上記同様にその発現と発現量を確認した（第５図）。
ＧＳＴとＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの融合蛋白質（以下、ＧＳＴ−ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットということもある）を発現する大腸菌ｐＤＥＳＴ１５／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃５を後述するように作製し、ＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）２ｍｌで３７℃にて一晩培養した。この前培養液を３００μｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）合計３ｍｌで３７℃にて４時間本培養後、５Ｍ  ＮａＣｌを１８０μｌ添加し（終濃度０．３Ｍ）、さらに３７℃で２時間培養して、ＧＳＴとＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの融合蛋白質の産生を誘導した。コントロールとしてＮａＣｌの代わりにＨ２Ｏを添加して同様に培養した。培養後に大腸菌を集菌して、２％  ＳＤＳ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を２００μｌ添加して超音波処理した後に遠心（１０℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）した。遠心上清を回収し、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットを含む試料として用いた。また、目的とする蛋白質の発現と発現量を確認するために、遠心上清の一部を採り、２％  ＳＤＳ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で×１倍、×１／２倍希釈した。希釈した各遠心上清と１０％β−ＭＥを含む３×  サンプルバッファー（ＮＥＢ社）を２：１の割合で混合し、２分間煮沸後に５％−２０％のポリアクリルアミドゲルで泳動した。泳動後、湿潤化処理したＰＶＤＦ転写膜〔Ｐｏｌｙ  ｓｃｒｅｅｎ（ＮＥＮ社）〕に転写し（液槽、３００ｍＡで１．５時間）、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で室温にて１時間ブロッキングした。その後、ヤギ抗ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで１０００倍希釈して添加し、室温で１時間反応させた。反応後に、該転写膜をＴＢＳ−Ｔを用いて室温にて１０分間洗浄し、該洗浄を３回行った後に、二次抗体（抗ヤギＩｇＧ抗体−ＨＲＰ）（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで２０００倍希釈して添加し、室温にて１時間反応させ、その後ＴＢＳ−Ｔによる１０分間洗浄を室温で３回行った。その後ＥＣＬキットおよびハイパーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてシグナルを検出した（第６図）。
また、ネガティブコントロールとして用いるため、ＧＳＴのみを発現する大腸菌ＤＨ５α（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社のｐＧＥＸ−４Ｔ−３由来）をＬＢ−Ａｍｐ  ８ｍｌで３７℃にて一晩培養した。この前培養液を２ｍｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ合計２２ｍｌで、ＯＤ６００が１．０前後となるまで３７℃にて１．５時間本培養した後に、５００ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を４２μｌ添加（終濃度１ｍＭ）し、さらに３７℃で２時間培養した。培養後１．５ｍｌずつサンプリングして集菌した。この大腸菌に上記同様の処理を行い、得られた遠心上清を試料として用いた。また、目的とする蛋白質の発現と発現量を確認するために、遠心上清の一部を採り、２％  ＳＤＳ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で×１／４０、×１／８０、×１／１６０、×１／３２０、×１／６４０、×１／１２８０倍に希釈した。希釈した各遠心上清を用いて、上記同様にＧＳＴの発現を確認した（第７図）。
次に、オーバーレイ法によりＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合について検討した。上記調製したＧＳＴ−ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニット（ＮａＣｌにより誘導したものと未誘導のもの）またはＧＳＴを含む試料は、発現量を上記のようにウェスタンブロッティングで確認した結果（第６図および第７図）に基づいて、ＧＳＴ−ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニット（誘導、未誘導）を含む試料は原液を、ＧＳＴを含む試料は２％  ＳＤＳ／２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で６４０倍希釈したものを用いた。各試料と１０％  β−ＭＥを含む上記３×  サンプルバッファー（ＮＥＢ製）を２：１の割合で混合して２分間煮沸後、５％−２０％のポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。泳動後、湿潤化処理したＰＶＤＦ転写膜に転写（液槽、３００ｍＡで１．５時間）し、５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで室温にて２時間ブロッキングした。
次いで、上記調製したＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘを含む試料２０μｌと抽出バッファー４０μｌ、または上記調製したＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体を含む試料６０μｌにそれぞれ１ｍＭ  ＰＭＳＦ／ＴＢＳ−Ｔを３ｍｌ添加して混合した。コントロールとして、抽出バッファー６０μｌに１ｍＭ  ＰＭＳＦ／ＴＢＳ−Ｔを３ｍｌ添加して混合したものを用いた。各混合物を用いて、上記各転写膜に４℃で２時間反応させて結合させた。その後、ＴＢＳ−Ｔによる５分間の洗浄を室温にて３回行い、再度５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキング後、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで１０００倍希釈して添加し、室温にて１時間反応させた。反応後に、転写膜をＴＢＳ−Ｔを用いて室温にて１０分間洗浄し、該洗浄を３回行った後、二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰ）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を５％  スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで３０００倍希釈して添加し、室温にて１時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔによる１０分間の洗浄を室温で３回行った。その後ＥＣＬキットおよびハイパーフィルムを用いてシグナルを検出した。
その結果、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘを結合させた転写膜において、全長ＧＳＴ−ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットのバンドの位置（１８９．２ｋＤａ）にシグナルが検出されたことから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合が認められた。コントロールおよびＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体を用いたときにはシグナルは検出されず、すなわち結合は確認されなかった（第８図）。またＧＳＴに対する結合を検討した転写膜ではいずれもバンドは検出されず、ＧＳＴに対する結合は確認されなかった（第９図）。これらのことから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸはそのＰＤＺドメインでＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合していることが示唆された。また、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットは分解しやすい蛋白質であることが第６図から示唆されたが、上記実験の結果から全長ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットのバンドの位置でのみシグナルが検出されたこと（第８図）、並びにＧＳＴがＮ末に位置しているということから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの結合領域はＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットのＣ末端であることが予想され、これは文献情報と一致していた〔ナガノ（Ｎａｇａｎｏ，Ｔ．）ら、「ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９８年、第１２４巻、ｐ．８６９−８７５〕。ＰＤＺドメインを持つ蛋白質は標的蛋白質のＣ末端３残基のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）あるいはトレオニン（Ｔｈｒ）、その次は他のアミノ酸、その次がバリン（Ｖａｌ）（ＳＸＶまたはＴＸＶ）の配列（ｔＳＸＶモチーフ）を認識する。本実施例で用いたＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットのＣ末端アミノ酸配列はＳＤＶであった。
（新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）変異体の調製）
Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸからＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットとの結合領域であるＰＤＺドメインを欠失させた変異体の調製は、下記のように行った。
まず、クローンｈｊ０２５３７の塩基配列に基づいて、下記プライマーを設計して合成した。
＜プライマー＞
2003044196.tif 000004
つぎに、クローンｈｊ０２５３７を鋳型としてアドバンテージ２  ＰＣＲキットを用いてＰＣＲを行った。１０×  アドバンテージ２  ＰＣＲバッファー  ２μｌ、Ｐｒ−Ｄｐｄｚ−Ｆ１（５８．６４ｐｍｏｌ／μｌ）０．２μｌ、Ｐｒ−ＨＪｒ（３８．５９ｐｍｏｌ／μｌ）０．３μｌ、クローンｈｊ０２５３７（１ｎｇ／μｌ）１μｌ、１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス  １．６μｌ、５０×  ポリメラーゼミックス  ０．４μｌ、Ｈ２Ｏ  １４．５μｌを混合し（合計２０μｌ）、実施例１に記載の条件でＰＣＲ反応を行った。
その後、ＰＣＲ産物１６μｌをＴＥバッファーで５０μｌとし、３０％  ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を２５μｌ添加して、室温で遠心（１５，０００ｒｐｍで１０分間）した後に、ペレットを７０％エタノールで洗浄して乾燥し、ＴＥバッファー３０μｌに溶解した。その後、ＢＰクロナーゼ反応バッファー１μｌ、ＰＣＲ産物１μｌ、エントリーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＴＥバッファー１．５μｌを氷上で混合（合計、４μｌ）し、ＢＰクロナーゼ酵素ミックスを１μｌ添加後、２５℃にて２．７時間反応させた。反応後、プロテイナーゼＫを０．５μｌ添加して３７℃にて１０分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピテント細胞（ＤＨ５α）にトランスフォーメーションし、ｐＤＯＮＲ２１０／ｈｊＰＤＺ（−）＃２を得た。
続いて、ｐＤＯＮＲ２１０／ｈｊＰＤＺ（−）＃２を用い、ＰＤＺドメインを欠失させたＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質を発現するベクターを構築した。ＬＲクロナーゼ反応バッファー１μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１／ｈｊＰＤＺ（−）＃２（５０ｎｇ／μｌ）１μｌ、６×Ｈｉｓ−ｔａｇ発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＴＥバッファー１．５μｌを氷上で混合し（合計４μｌ）、ＬＲクロナーゼ酵素ミックスを１μｌ添加後２５℃で０．５時間反応させた。反応後にプロテイナーゼＫを０．５μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピテント細胞（ＢＬ２１−ＳＩ）にトランスフォーメーションし、３クローン〔ｐＤＥＳＴ１７／ｈｊＰＤＺ（−）＃１、ｐＤＥＳＴ１７  ｈｊＰＤＺ（−）＃２、ｐＤＥＳＴ１７／ｈｊＰＤＺ（−）＃３〕を得た。
上記３クローンについて、ＮａＣｌによる目的蛋白質の産生誘導の有無および可溶性蛋白質の調製について検討した。各大腸菌をＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）２ｍｌで３７℃にて一晩振とう培養した。この前培養液を３００μｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）合計３．３ｍｌで３７℃にて２時間振とう培養した後、５Ｍ  ＮａＣｌを１８０μｌ添加（終濃度０．３Ｍ）し、さらに３７℃にて２時間振とう培養した。コントロールとしてＨ２Ｏを１８０μｌ添加して同様に培養した。その後、培養液を１．５ｍｌずつサンプリングしたものを２本調製して遠心（４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）し、ペレットを２％  ＳＤＳ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）１５０μｌにけん濁して、超音波処理後に再度遠心（１０℃または４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）した。遠心上清を１０％  β−ＭＥを含む２×  サンプルバッファーと等量ずつ混合し、２分間煮沸後に５％−２０％ポリアクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、実施例２と同様に目的蛋白質の検出を行った。その結果、第１０図に示すように、ヒトＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体蛋白質と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質と思われる約４１．７ｋＤａのバンドが検出された。当該融合蛋白質は、上記培養された大腸菌の可溶性画分にも不溶性画分にも認められた。さらに、培養を２５℃で行ったときにも可溶性画分にその発現が認められた（第１１図）。
（ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの調製）
ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの調製は、その一部を含むクローンｆｊ０７１０８（かずさＤＮＡ研究所）を用いて、下記のように行った。クローンｆｊ０７１０８はＮ末側３４７アミノ酸残基が欠けていたため、まずこの領域を、ヒト脳由来ｍＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲによりサブクローニングした。
ヒト脳由来ｍＲＮＡをスーパースクリプトＩＩでオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびランダムプライマーを用いて逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、開始コドン上流および組換えを勘案してクローンｆｊ０７１０８の第３５２番目のＡｆｌＩＩ部位下流の塩基配列に基づいてＰＣＲ用プライマー〔下記Ｐｒ−ＮＭＤＡＲ２Ｂｆ、Ｐｒ−ＮＭＤＡＲ２Ｂ（ＲＶ）〕を設計し、アドバンテージ２  ＰＣＲキットを使用して、実施例１と同様にＰＣＲを行った。その後、ＰＣＲ産物をＢＫＬキット（ＴａＫａＲａ社）を用いて平滑末端化およびリン酸化処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）（ＳｍａＩ消化）に導入後、ｐＢＳ（ＳＫ−）／ＮＭＤＡｒ−Ｎ＃１０、ｐＢＳ（ＳＫ−）／ＮＭＤＡｒ−Ｎ＃２５を得た。塩基配列の確認を行ったところ、ｐＢＳ（ＳＫ−）／ＮＭＤＡｒ−Ｎ＃１０はＰＣＲによる変異が２個所存在していたがアミノ酸置換には至らなかった。しかし、塩基配列中第１４４ｂｐ目のグアニン（Ｇ）が１ｂｐ欠失していたため、ｐＢＳ（ＳＫ−）／ＮＭＤＡｒ−Ｎ＃２５を用い、その領域の下流に存在するＳｍａＩ部位およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）のＢａｍＨＩ部位を利用して組み換えを行い、新たにｐＢＳ（ＳＫ−）／ＮＭＤＡｒ−Ｎ＃３を得た。その塩基配列を確認したところ、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニット（アクセッション番号：ＮＭ＿０００８４３）と一致した。
＜プライマー＞
2003044196.tif 000005
その後、クローンｆｊ０７１０８のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）をＸｈｏＩ消化後、ブランティングキット（Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ）（ＴａＫａＲａ社）を用いて平滑末端処理し、ＡｆｌＩＩ消化した。次に、ｐＢＳ（ＳＫ−）／ＮＭＤＡｒ−Ｎ＃３のＭＣＳをＸｂａＩ消化して平滑末端処理後にＡｆｌＩＩ消化した約１．５ｋｂｐ断片を、上記ＡｆｌＩＩ消化したクローンｆｊ０７１０８に導入してｐＢＳ／ＮＭＤＡｒ＃２を得た。ｐＢＳ／ＮＭＤＡｒ＃２は全長ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットを含有するベクターである。
上記ｐＢＳ／ＮＭＤＡｒ＃２を鋳型としてアドバンテージ  ＨＦ２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、目的遺伝子の蛋白質翻訳領域の増幅を行った。プライマーはＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの全長塩基配列から設計し、合成した。１０×  アドバンテージ  ＨＦ２  ＰＣＲバッファー  ２．５μｌ、Ｐｒ−２Ｂｆ（５２．９４ｐｍｏｌ／μｌ）０．４μｌ、Ｐｒ−２Ｂｒ（３７．４４ｐｍｏｌ／μｌ）０．６μｌ、ｐＢＳ／ＮＭＤＡｒ＃２（０．４８μｇ／μｌ）０．２μｌ、ｄＮＴＰミックス  ２．５μｌ、５０×  ポリメラーゼミックス  ０．５μｌ、Ｈ２Ｏ  １８．３μｌを混合（合計２５μｌ）し、ＰＣＲを行った。
＜プライマー＞
2003044196.tif 000006
＜ＰＣＲ運転条件＞
2003044196.tif 000007
次にＰＣＲ産物を電気泳動（１％  アガロースゲル）して目的遺伝子の約４．５ｋｂｐバンドを分離し、Ｇｅｎ  ｅｌｕｔｅ  ＥｔＢｒ  ｍｉｎｕｓ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＳＩＧＭＡ社）で抽出、精製、乾燥後、ＴＥバッファー１０μｌに溶解した。続いてＴＥバッファーで１００μｌとし、３０％  ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を５０μｌ添加し、室温で遠心（１５，０００ｒｐｍで１０分間）後、ペレットを７０％エタノールで洗浄して乾燥し、ＴＥバッファー２０μｌに溶解した。その後ＢＰクロナーゼ反応バッファー１μｌ、ＰＣＲ産物１μｌ、エントリーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＴＥバッファー１．５μｌを氷上で混合し（合計４μｌ）、ＢＰクロナーゼ酵素ミックスを１μｌ添加後、２５℃にて１．７時間反応させた。反応後、プロテイナーゼＫを０．５μｌ添加し、３７℃にて１０分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピテント細胞（ＤＨ５α）にトランスフォーメーションし、ｐＤＯＮＲ２０１／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃１を得た。
ｐＤＯＮＲ２１０／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃１の塩基配列を確認したところ、ＰＣＲによるエラーと思われる変異が数箇所存在しており、アミノ酸置換を伴う変異も存在していた。そこで、ｐＤＯＮＲ２１０／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃１をＭｆｅＩおよびＡａｔＩＩで消化して変異領域を除き、ｐＢＳ／ＮＭＤＡｒ＃２をＭｆｅＩおよびＡａｔＩＩ消化した約３．４ｋｂｐ断片を導入して、ｐＤＯＮＲ２１０／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃２を得た。クローンｆｊ０７１０８由来の蛋白質翻訳領域には、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿０００８４３として登録されているＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットのものと異なる塩基配列が２箇所〔開始コドンより第２６６４ｂｐ番目の塩基（Ｃ→Ｔ；Ｔｈｒ→Ｔｈｒ）および第３４９９ｂｐ目の塩基（Ａ→Ｇ；Ｉｌｅ→Ｖａｌ）〕存在していたため、ヒト脳由来ｍＲＮＡを用いて、下記のプライマーＰｒ−Ｒ２Ｂ−５とＰｒ−ＮＭＤＡｒ−Ｒ８、Ｐｒ−Ｒ２Ｂ−７とＰｒ−ＮＭＤＡｒ−Ｒ１２のプライマーの組み合わせを使用してＲＴ−ＰＣＲによりサブクローニングを行った後に、ｐＢＳ／ＮＭＤＡｒ＃２の塩基配列を確認した。その結果、ヒト脳由来ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲでサブクローニングして得られた塩基配列が、クローンｆｊ０７１０８と一致することが確認された。
＜プライマー＞
2003044196.tif 000008
次に、ＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットとＧＳＴとの融合蛋白質を発現するベクターを構築した。ＬＲクロナーゼ反応バッファー１μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃２（５０ｎｇ／μｌ）１μｌ、ＧＳＴ発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１５：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＴＥバッファー１．５μｌを氷上で混合し（合計４μｌ）、ＬＲクロナーゼ酵素ミックスを１μｌ添加後、２５℃で１時間反応させた。反応後、プロテイナーゼＫを０．５μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピテント細胞（ＢＬ２１−ＳＩ）にトランスフォーメーションし、３クローン（ｐＤＥＳＴ１５／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃４、ｐＤＥＳＴ１５／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃５、ｐＤＥＳＴ１５／ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ＃６）を得た。
上記３クローンについてＮａＣｌによる目的蛋白質の産生誘導について検討した。各大腸菌をＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）２ｍｌで３７℃にて一晩振とう培養した。この前培養液を３００μｌ添加したＬＢ−Ａｍｐ（ＮａＣｌ−）合計３ｍｌを３７℃で４時間振とう培養後、５Ｍ  ＮａＣｌを１８０μｌ添加（終濃度０．３Ｍ）し、さらに３７℃で２時間振とう培養した。コントロールとしてＨ２Ｏを１８０μｌ添加して同様に培養した。その後、培養液を遠心し（４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）、ペレットを２  ％ＳＤＳ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）２００μｌにけん濁して、超音波処理を行い、その後遠心（１０℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）した。遠心上清を１０％  β−ＭＥを含む２×サンプルバッファーと等量ずつ混合し、２分間煮沸後に５％−２０％ポリアクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＧＳＴ抗体を用いて上記同様に目的蛋白質の検出を行った。その結果、第１２図に示すように、ＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットとＧＳＴとの融合蛋白質と思われる約１８９．２ｋＤａのバンドが検出された。
実施例４
（新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）のＮＭＤＡ受容体における機能解析）
Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸをＮＭＤＡ受容体と共にアフリカツメガエル卵母細胞で共発現させ、ＮＭＤＡ受容体に対するリガンド刺激による電流応答を測定し、ＮＭＤＡ受容体シグナルへのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘの作用を検討した。
本検討に、下記プラスミドを用いた。
＜新規ＰＳＤ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ遺伝子）を含むプラスミドＤＮＡ＞
ヒト幼若化骨髄細胞株（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）ＫＧ−１から文献〔ノムラ（Ｎｏｍｕｒａ，Ｎ．）ら、「ディーエヌエー  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９４年、第１巻、ｐ．２７−３５〕に記載の方法で調製されたｃＤＮＡライブラリーより、実施例１で抽出したクローンｈｊ０２５３７に相当するものを選択して使用した（第１３図）。当該クローンの配列に関する情報は、これまで開示されていない。
＜ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニット遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ＞
実施例３で調製したｐＢＳ／ＮＭＤＡｒを用いた（第１４図）。
＜ＮＭＤＡ受容体Ｉ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ＞
ヒト脳由来ｍＲＮＡをスーパースクリプトＩＩでオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびランダムプライマーを用いて逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、ＮＭＤＡ受容体Ｉの塩基配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを設計して合成し、アドバンテージ２  ＰＣＲキットを使用して、実施例１と同様にＰＣＲを行った。その後、得られたＰＣＲ産物を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してＴＡクローニングを行い、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクターを得た（第１５図）。当該ベクターは、ＥｃｏＲＩの２ｂｐ（ＣＣ）下流からＳｐｅＩの２ｂｐ（ＧＧ）上流の間に、ＮＭＤＡ受容体Ｉの翻訳領域２６５８ｂｐを保持する。
＜ＰＳＤ−９５遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ＞
上記同様にヒト脳由来ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＳＤ−９５遺伝子の塩基配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを設計して合成し、アドバンテージ２  ＰＣＲキットを使用して、実施例１と同様にＰＣＲを行った。その後、得られたＰＣＲ産物を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してＴＡクローニングを行い、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターを得た（第１６図）。当該ベクターは、ＳｐｅＩの３ｂｐ（ＧＡＧ）下流からＥｃｏＲＩの４ｂｐ（ＴＴＣＣ）上流の間に、ＰＳＤ−９５の翻訳領域２６５７ｂｐを保持する。
まず、ＮＭＤＡ受容体Ｉ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをＳａｌＩで、その他の遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩでそれぞれ処理して直線化し、フェノール／クロロホルム精製を行った。得られたＤＮＡを鋳型として用い、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用して製品指示書に従って、ＲＮＡ合成反応を行った。このとき、ＲＮＡポリメラーゼとして、ＰＳＤ−９５遺伝子についてはＳＰ６を、それ以外の遺伝子についてはＴ７を使用した。ＲＮＡ合成反応終了後、ＤＮＡａｓｅ処理によって鋳型ＤＮＡを除去した。ＲＮＡ合成反応産物を１％  アガロースゲル電気泳動にて確認後、フェノール／クロロホルム精製を行った。精製後の合成ＲＮＡは滅菌水に溶解し、全てのＲＮＡ濃度が１μｇ／μＬになるよう調製した。ＲＮＡ濃度は吸光度法により求めた。
アフリカツメガエルは志木家田化学株式会社から購入し、数週間の肥育後、卵母細胞を摘出した。卵母細胞はコラゲナーゼで処理した後に一晩培養し、上記調製したＮＭＤＡ受容体のＲＮＡを自体公知の方法でマクロインジェクションした。このとき、ＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットのＲＮＡとＮＭＤＡ受容体ＩのＲＮＡとを１：２の割合で混合して細胞当たり２０ｎｇとなるように調製したものを用いた。インジェクション後の卵母細胞は、培地中（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＢａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２）で２０℃にて４８時間インキュベーションした。
Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＳＤ−９５をＮＭＤＡ受容体と共発現させるときには、ＮＭＤＡ受容体のＲＮＡを上記同様にインジェクション後、２４時間目にＰｒｏｔｅｉｎ−ＸのＲＮＡまたはＰＳＤ−９５のＲＮＡを１細胞あたり１０ｎｇ再インジェクションした。その後、培地中で２０℃にて２４時間インキュベーションした。
卵母細胞で発現させたＮＭＤＡ受容体にリガンドを作用させ、その結果ＮＭＤＡ受容体イオンチャネルが開口して起きる陽イオン流入を、電気生理学的計測法により電流の変化として測定した。ここでは、二電極膜電位固定法により、参考論文（「フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ）」、１９９９年、第４５８巻、ｐ．２９５−２９８）に従って計測を実施した。計測用のバッファーにはＢＡバッファー（ＮａＣｌ  １１５ｍＭ，ＫＣｌ  ２．５ｍＭ，ＢａＣｌ２  １．８ｍＭ，およびＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ，ｐＨ７．２）を用い、膜電位は−７０ｍＶに固定した。
リガンドとしてＬ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグリシン（Ｇｌｙ）の混合液を用い、卵母細胞に直接滴下してＮＭＤＡ受容体に作用させた。なお、電流の大きさを定量化するときは、リガンド刺激後の内向き電流の最大値から刺激前のリーク電流の平均値を減算した値を用いた（以下、電流変化量という）。電流応答の測定は実験毎に５〜６個の細胞を用いて行った。同一実験において、各細胞間で電流応答の結果生じる波形のパターンに大きな差異は認められなかった。
まず、ＮＭＤＡ受容体ＲＮＡをインジェクションした卵母細胞に、リガンドを異なる濃度（１０μＭ  Ｇｌｕ＋１０μＭ  Ｇｌｙ、１００μＭ  Ｇｌｕ＋１０μＭ  Ｇｌｙ、または１０００μＭ  Ｇｌｕ＋１０μＭ  Ｇｌｙ）で作用させてリガンドの濃度依存性を確認し、構築した実験系がＮＭＤＡ受容体シグナルの測定に妥当であることを検証した。なお、本実験ではリガンド溶液を添加した後、洗浄による除去を行わなかったため、特に高濃度刺激の場合では波形パターンが参考文献（「フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ）」、１９９９年、第４５８巻、ｐ．２９５−２９８）とは異なり、内向き電流が一過性になりにくかった。これはリガンドと受容体が結合し続けているので、ＮＭＤＡ受容体チャネルが開口したままになり、その結果陽イオン流入が続いているためと考えられる。
次に、リガンドとして１０００μＭ  Ｇｌｕと１０μＭ  Ｇｌｙとの混合液を用い、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸのＲＮＡまたはＰＳＤ−９５のＲＮＡとＮＭＤＡ受容体のＲＮＡとを共にインジェクションした卵母細胞における電流応答を測定した。その結果を第１７図および表１に示す。Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸまたはＰＳＤ−９５をＮＭＤＡ受容体と共発現させることにより、ＮＭＤＡ受容体単独のときと比較して、リガンド刺激に対する電流応答が大きくなる傾向が認められた。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘを発現させたときには、ＰＳＤ−９５を発現させたときと比較して約１．５倍の電流応答が得られた。
2003044196.tif 000009
上記電気生理学的測定の結果から、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘが、ＮＭＤＡ受容体／２Ｂ受容体と結合して器官（ａｐｐａｒａｔｕｓ）を形成すること、およびＮＭＤＡ受容体刺激により発生するシグナル、例えば受容体イオンチャネルの開口とそれに伴う陽イオンの流入、およびその促進に関与していることが判明した。
実施例５
（ＰＪ０１０８７遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ遺伝子）の単離・同定）
本発明に係る遺伝子は、かずさＤＮＡ研究所のヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡ解析情報（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）により、ラットＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０−アソシエーティッド  プロテイン−３（ＳＡＰＡＰ−３）と９６％の相同性を有する遺伝子として抽出したクローンＰＪ０１０８７に基づいて、単離・同定した。
まず、クローンＰＪ０１０８７を保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋ベクターを、ＤＨαコンピテント細胞に遺伝子導入して増幅し、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ切断によるインサートの長さが約３．７ｋｂであることを確認した。これを鋳型とし、下記プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。プライマーは、上記情報データベースから得られたＰＪ０１０８７の塩基配列に基づいて設計し合成した。ＰＣＲはアドバンテージ２  ＰＣＲキット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｋｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、使用説明書に準じて実施した。
＜プライマー＞
2003044196.tif 000010
その結果、ＰＪ０１０８７クローンのＯＲＦ全長を含む約２．９ｋｂのＰＣＲ産物が得られた。このＰＣＲ産物を用い、ゲイトウェイシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、エントリーベクターｐＤＯＮＲＴＭ２０１へのクローニングを行った。クローニングは、同システムの使用説明書に準じて実施した。
（ＰＪ０１０８７遺伝子の発現）
得られたベクター中のインサート部分の全長（約２．９ｋｂ）の塩基配列に間違いがないことを確認した。その後、大腸菌においてＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇを付加した蛋白質として発現可能な発現ベクターｐＤＥＳＴＴＭ１７、およびＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質として発現可能な発現ベクターｐＤＥＳＴＴＭ１５への組み換えを行った。組み換えは、ゲイトウェイシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、使用説明書に準じて実施した。
ＰＪ０１０８７を組み込んだｐＤＥＳＴＴＭ１７またはｐＤＥＳＴＴＭ１５を保持する大腸菌から、ＰＪ０１０８７クローン蛋白質の発現誘導を行った。アンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃にて、ＯＤ６００が０．５〜１．０になるまで振とうしながら前培養した。この前培養液３００μｌに、ＮａＣｌを終濃度０．３Ｍになるよう添加し〔ＮａＣｌ（＋）〕、３７℃で４時間振とう培養して蛋白質発現を誘導した。コントロールとしてＮａＣｌの代わりにＨ２Ｏを添加して同様に培養した〔ＮａＣｌ（−）〕。その後、各培養液を遠心処理して菌体を回収した。この菌体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、１０秒間の超音波処理を３回行い、再度遠心処理（１０℃または４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間）して、上清（以下、可溶性画分という）とペレットに分けた。ペレットはＰＢＳに再懸濁した（不溶性画分とよぶ）。
各画分について、Ｈｉｓ−ｔａｇおよびＧＳＴ−ｔａｇに対する抗体を用いたウェスタンブロッティング法で蛋白質の検出を行った。その結果、Ｈｉｓ−ｔａｇおよびＧＳＴ−ｔａｇのいずれを用いた検討においても、ＮａＣｌで発現誘導した大腸菌の不溶性画分に、約１１５ｋＤａの目的蛋白質と、その他にその分解産物と思われる蛋白質の発現誘導が観察された（第１８図ＡおよびＢ）。無細胞蛋白質発現系の一つとして、大腸菌の蛋白質発現システムを応用したラピッド  トランスレーション  システム（Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）ＲＴＳ５０００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて蛋白質発現の検討を行ったが、目的蛋白質はやはり不溶性画分に見出された。
かくして得られたヒト蛋白質は、配列表の配列番号３に記載したように９７９残基のアミノ酸からなる。また、該蛋白質をコードする遺伝子は、配列表の配列番号６に記載したように３７０５塩基からなる。
実施例６
（ＰＪ０１０８７遺伝子産物（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ遺伝子産物）のＮＭＤＡ受容体における機能解析）
ＰＪ０１０８７遺伝子はＳＡＰＡＰ−３と９６％の相同性を有する。ＳＡＰＡＰ−３がラットＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０関連蛋白質であることから、ＰＪ０１０８７遺伝子産物が、ヒトＰＳＤ−９５と複合体を形成すること、およびポストシナプス・デンシティーの構成に関与していることを予想した。ＰＳＤ−９５はＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達に関与することが報告されているため、ＰＪ０１０８７遺伝子とＰＳＤ−９５遺伝子をＮＭＤＡ受容体遺伝子と共にアフリカツメガエル卵母細胞で共発現させ、ＮＭＤＡ受容体に対するリガンド刺激による電流応答を測定し、ＮＭＤＡ受容体シグナルへのＰＪ０１０８７蛋白質の作用を検討した。このとき、ＰＳＤ−９５と同様にＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、およびＧＫドメインを有し、ＮＭＤＡ受容体に結合してシグナル伝達に関わると推定される新規ＰＳＤ蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）（配列表の配列番号１）をコードする遺伝子（配列表の配列番号４）を、ＰＳＤ−９５の代わりに用いて、同様に検討した。検討に用いた方法は、実施例４に記載の方法と全く同様の方法を用いた。
本検討には、下記プラスミドを使用した。
＜ＰＪ０１０８７遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ＞
ヒト幼若化骨髄細胞株ＫＧ−１から、文献〔ノムラ（Ｎｏｍｕｒａ，Ｎ．）ら、「ディーエヌエー  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９４年、第１巻、ｐ．２７−３５〕に記載の方法で調製されたｃＤＮＡライブラリーより、実施例５で抽出したクローンＰＪ０１０８７に相当するものを選択して使用した（第１９図）。
＜Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘを含むプラスミドＤＮＡ＞
実施例４に記載のプラスミドＤＮＡを用いた（第１３図）。
＜ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニット遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ＞
実施例３で調製したプラスミドｐＢＳ／ＮＭＤＡｒ（第１４図）を用いた。
＜ＮＭＤＡ受容体Ｉ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ＞
実施例４で調製したプラスミドＤＮＡを用いた（第１５図）。
＜ＰＳＤ−９５遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ＞
実施例４で調製したプラスミドＤＮＡを用いた（第１６図）
ＮＭＤＡ受容体シグナルに対するＰｒｏｔｅｉｎ−ＸおよびＰＪ０１０８７蛋白質の作用は、実施例４と同様の方法で試験した。
ＰＪ０１０８７、ＰＳＤ−９５、および／またはｐｒｏｔｅｉｎ−ＸをＮＭＤＡ受容体と共発現させるときには、ＮＭＤＡ受容体のＲＮＡを実施例４と同様にアフリカツメガエル欄母細胞にインジェクション後、２４時間目にＰＪ０１０８７、ＰＳＤ−９５、および／またはｐｒｏｔｅｉｎ−ＸのＲＮＡを１細胞あたり１０ｎｇ再インジェクションした。その後、培地中で２０℃にて２４時間インキュベーションした。
卵母細胞で発現させたＮＭＤＡ受容体にリガンドを作用させ、その結果ＮＭＤＡ受容体イオンチャネルが開口して起きる陽イオン流入を、実施例４に記載の方法と同様の方法で測定した。その結果を第２０図および第２１図に示す。実施例４で示したように、ＰＳＤ−９５またはＰｒｏｔｅｉｎ−ＸをＮＭＤＡ受容体と共発現させることにより、ＮＭＤＡ受容体単独のときと比較して、リガンド刺激に対する電流応答が大きくなることが認められた。また、ＰＪ０１０８７（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）とＰＳＤ−９５とをＮＭＤＡ受容体と共発現させても、ＰＳＤ−９５を発現させたときに観察された電流応答と比べて変化はなかった。一方、ＰＪ０１０８７（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘと共発現させたときには、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘを発現させたときの約７倍〜約８倍の電流応答が得られた。
上記電気生理学的測定の結果から、ＰＪ０１０８７はＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘの共存下で、ＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達を著しく増幅することが分かった。このことから、ＰＪ０１０８７は、ＰＤＺドメインを有しておりＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合するＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの相互作用により、ＮＭＤＡ受容体刺激によって発生する細胞内シグナルを増幅すること、ひいてはＮＭＤＡ受容体イオンチャネルの開口とそれに伴う陽イオンの流入の促進に関与していることが判明した。
実施例７
（ＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの結合の有無）
ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘとの結合を免疫沈降法で検討するために、下記蛋白質を調製した。
＜ＰＪ０１０８７蛋白質＞
Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質として発現させた大腸菌の２ｍｌ培養分のペレット（実施例５参照）に、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）２００μｌを添加して超音波処理、１５、０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、その上清を試料とした（Ｈｉｓ−ｐｊ０１０８７）。
＜Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ＞
実施例１に記載したクローンｈｊ０２５３７を用い、実施例５と同様の方法でＰｒｏｔｅｉｎ−ＸとＧＳＴとの融合蛋白質を発現させた大腸菌の２ｍｌ培養分のペレットに、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）２００μｌを添加して超音波処理、１５、０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、その上清を試料とした（ＧＳＴ−ｈｊ０２５３７）。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘのグアニレート  キナーゼ  ドメインを欠失させた変異体をＧＳＴとの融合蛋白質をして発現させた大腸菌を用い、当該変異体蛋白質を同様に調製した〔ＧＳＴ−ｈｊ（ＧＫ−）〕。
＜ＧＳＴ＞
コントロールとしてＧＳＴのみを発現させ同様に試料調製した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３由来）。
＜各蛋白質試料の処理＞
上記各上清に１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で平衡化したプロテインＧ−セファロース（ｐｒｏｔｅｉｎＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）３０μｌを添加し、４℃で１時間撹拌した。撹拌後に遠心処理し、その上清を結合試験に用いた。
＜結合試験＞
上記各上清を▲１▼〜▲４▼のように分注し、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で２００μｌとして４℃で一晩撹拌した。
▲１▼Ｈｉｓ−ｐｊ０１０８７  ２５μｌ＋ＧＳＴ−ｈｊ０２５３７  １６μｌ
▲２▼Ｈｉｓ−ｐｊ０１０８７  ２５μｌ＋ＧＳＴ−ｈｊ（ＧＫ−）１００μｌ
▲３▼Ｈｉｓ−ｐｊ０１０８７  ２５μｌ＋ＧＳＴ  ４μｌ
▲４▼Ｈｉｓ−ｐｊ０１０８７  ２５μｌ
ＧＳＴ抗体（ＳＩＧＭＡ社）１μｌを添加して４℃で１時間撹拌した後、さらにｐｒｏｔｅｉｎＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ３０μｌを添加し、４℃で６時間撹拌した。その後、遠心処理して上清を除き、ｐｒｏｔｅｉｎＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）５００μｌで３回洗浄した。洗浄後にｐｒｏｔｅｉｎＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅに２−メルカプトエタノールを含む２×  サンプルバッファー（２％  ＳＤＳ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）／３０％  グリセロール／０．０１％  ブロムフェノールブルー）３０μｌを加えて混合し、２分間煮沸後、５％−２０％  ポリアクリルアミドゲルにて泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＧＳＴ抗体および抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体でウエスタンブロッティングを行った。
その結果、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ（ＧＳＴ−ｈｊ０２５３７）およびＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体〔ＧＳＴ−ｈｊ（ＧＫ−）〕のｐｒｏｔｅｉｎＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの吸着は認められた（第２２図のレーン５および６）。しかし、ＰＪ０１０８７蛋白質（Ｈｉｓ−ｐｊ０１０８７）とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ（ＧＳＴ−ｈｊ０２５３７）またはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘ変異体〔ＧＳＴ−ｈｊ（ＧＫ−）〕とを反応させて抗ＧＳＴ抗体で免疫沈降した後に抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体で検出したときに、ＰＪ０１０８７蛋白質のバンドは検出されず、ＰＪ０１０８７蛋白質とＰｒｏｔｅｉｎ−Ｘの結合があるとの結果は得られなかった（第２３図のレーン５または６）。
産業上の利用可能性
かずさＤＮＡ研究所のヒト長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベースから、バイオインフォーマティクスにより、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメインおよびＧＫドメインを有する新規遺伝子としてｈｊ０２５３７を抽出し、この遺伝子（配列番号４）の遺伝子産物（配列番号１）がＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合する新規蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）であることを見出した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘは、そのアミノ酸配列の特徴から、ＰＳＤ−９５と同様に、細胞膜関連蛋白質であるグアニレートキナーゼファミリーの１つであると考えられる。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘが、ＮＭＤＡ受容体刺激により発生するシグナルに関与し、その促進作用を有することを見出した。
また同様に、ラットＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０−アソシエーティッド  プロテイン−３（ＳＡＰＡＰ−３）と９６％の相同性を有する遺伝子としてクローンＰＪ０１０８７を抽出した。そしてこの遺伝子（配列番号６）の遺伝子産物（配列番号３）が、ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ（配列番号１）との相互作用により、ＮＭＤＡ受容体から伝達されたシグナルを著しく増幅する作用を有することを見出した。ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ単独のときよりも、ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸとＰＪ０１０８７蛋白質の共存下のほうが、より強く増幅された。
これらから、本発明は、ｐｒｏｔｅｉｎ−ＸおよびＰＪ０１０８７蛋白質、並びにそれらの遺伝子が関与する生体機能あるいは疾患の解明、例えばＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達機構の解明、記憶再生機構の解明、さらにはＮＭＤＡ受容体のシグナル伝達異常や記憶再生の異常に起因する疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病およびポリグルタミン病等の神経変性疾患の解明、並びにそれら疾患の防止、治療、または改善を可能にするために非常に有用なものである。
配列表フリーテキスト
配列表の配列番号７：配列番号４に記載の配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号８：配列番号４に記載の配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号９：配列番号４に記載の配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１０：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの部分塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１１：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの部分塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１２：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１３：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１４：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１５：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１６：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１７：ＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１８：配列番号６に記載の配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
配列表の配列番号１９：配列番号６に記載の配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド
【配列表】
2003044196.tif 000011
2003044196.tif 000012
2003044196.tif 000013
2003044196.tif 000014
2003044196.tif 000015
2003044196.tif 000016
2003044196.tif 000017
2003044196.tif 000018
2003044196.tif 000019
2003044196.tif 000020
2003044196.tif 000021
2003044196.tif 000022
2003044196.tif 000023
2003044196.tif 000024
2003044196.tif 000025
2003044196.tif 000026
2003044196.tif 000027
2003044196.tif 000028
2003044196.tif 000029
2003044196.tif 000030
2003044196.tif 000031
2003044196.tif 000032
2003044196.tif 000033
2003044196.tif 000034
2003044196.tif 000035
2003044196.tif 000036
2003044196.tif 000037
【図面の簡単な説明】
第１図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘと称する）とＰＳＤ−９５について、アミノ酸配列の特徴を比較した模式図である。
第２図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質を大腸菌で３７℃培養にて発現させたときの電気泳動図である。
第３図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質の、３７℃にて培養した大腸菌の可溶性画分中の発現量が少ないことを確認した電気泳動図である。
第４図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質が、２５℃にて培養した大腸菌の可溶性画分に発現することを示した電気泳動図である。
第５図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）またはそのＰＤＺドメイン欠失変異体と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質の発現と発現量を確認したウェスタンブロッティングの結果を示す。
第６図は、ＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットとＧＳＴとの融合蛋白質の発現を確認したウェスタンブロッティングの結果を示す。
第７図は、ＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットとＧＳＴとの融合蛋白質およびＧＳＴの発現および発現量を確認したウェスタンブロッティングの結果を示す。
第８図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）がＮＭＤＡ受容体／２Ｂサブユニットと結合するが、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）のＰＤＺドメイン欠失変異体は結合しないことをオーバーレイ法で検討した結果を示す。
第９図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）およびそのＰＤＺドメイン欠失変異体が、ＧＳＴとは結合しないことを示す。
第１０図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）のＰＤＺドメイン欠失変異体と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質を大腸菌で３７℃培養にて発現させたときの電気泳動図である。
第１１図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）のＰＤＺドメイン欠失変異体と６×Ｈｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質が、３７℃にて培養した大腸菌の可溶性画分に発現することを示した電気泳動図である。
第１２図は、ＮＭＤＡ受容体／２ＢサブユニットとＧＳＴとの融合蛋白質の発現を確認した電気泳動図である。
第１３図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。
第１４図は、ＮＭＤＡ受容体２Ｂサブユニット遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。
第１５図は、ＮＭＤＡ受容体Ｉ遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。
第１６図は、ＰＳＤ−９５遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。
第１７図は、新規ＰＳＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）により、ＮＭＤＡ受容体刺激により発生した電気応答が増強されることを示す。
第１８図Ａは、Ｈｉｓ−ｔａｇを付加したヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙと称することもある）の大腸菌における発現誘導を、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。図中、矢印はヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）を示す。
第１８図Ｂは、ＧＳＴを付加したヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）の大腸菌における発現誘導を、抗ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。図中、矢印はヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）を示す。
第１９図は、ヒトＰＪ０１０８７遺伝子（配列表の配列番号６）を保持するベクターの制限酵素地図である。
第２０図は、ヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）が、ＮＭＤＡ受容体刺激により発生した電気応答に対する、新規ＰＳＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）による増強効果をさらに強化するが、ＰＳＤ−９５による増強効果は強化しないことを示す。
第２１図は、ヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）により、ＮＭＤＡ受容体刺激により発生した電流変化量の新規ＰＳＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）による増強がさらに強化されることを示す。
第２２図は、ヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）とＨｉｓ−ｔａｇとを融合させた蛋白質および新規ＰＳＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）（ｈｊ０２５３７）とＧＳＴとを融合させた蛋白質を混合して抗ＧＳＴ抗体で免疫沈降し、その後抗ＧＳＴ抗体で免疫沈降された蛋白質を検出した結果を示す。
第２３図は、ヒトＰＪ０１０８７蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｙ）とＨｉｓ−ｔａｇとを融合させた蛋白質および新規ＰＳＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｘ）（ｈｊ０２５３７）とＧＳＴとを融合させた蛋白質を混合して抗ＧＳＴ抗体で免疫沈降し、その後抗Ｈｉｓ−ｔａｇで免疫沈降された蛋白質を検出した結果を示す。
【図１】
2003044196.tif 000038
【図２】
2003044196.tif 000039
【図３】
2003044196.tif 000040
【図４】
2003044196.tif 000041
【図５】
2003044196.tif 000042
【図６】
2003044196.tif 000043
【図７】
2003044196.tif 000044
【図８】
2003044196.tif 000045
【図９】
2003044196.tif 000046
【図１０】
2003044196.tif 000047
【図１１】
2003044196.tif 000048
【図１２】
2003044196.tif 000049
【図１３】
2003044196.tif 000050
【図１４】
2003044196.tif 000051
【図１５】
2003044196.tif 000052
【図１６】
2003044196.tif 000053
【図１７】
2003044196.tif 000054
【図１８】
2003044196.tif 000055
【図１９】
2003044196.tif 000056
【図２０】
2003044196.tif 000057
【図２１】
2003044196.tif 000058
【図２２】
2003044196.tif 000059
【図２３】
2003044196.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月17日(2003.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記裁のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節剤。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の阻害剤。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の促進剤。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節方法。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の阻害方法。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を促進し、および／または、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の促進方法。
【請求項７】
下記の群から選ばれるポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有し、かつＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニッと結合するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有し、かつＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド。
【請求項８】
下記の群から選ばれるポリペプチドであって、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド：
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項９】
下記の群から選ばれるポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド。
【請求項１０】
下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド：
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項１１】
下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下で、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達を増幅するポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
および
ｉｖ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項１２】
下記のポリペプチドであって、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合し、かつ配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用しないポリペプチド；
ｉ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約７０％の相同性を有するポリペプチド、
または
ｉｉ）前記ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。
【請求項１３】
配列表の配列番号１または配列番号２に記栽のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド。
【請求項１４】
配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、Ｎ−メチルーＤ−アスパラギン酸受容体と結合するペプチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するペプチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド。
【請求項１７】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するペプチド。
【請求項１８】
請求の範囲第７項から第１７項に記載のポリペプチドまたはペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなる請求の範囲第１項に記載の調節剤。
【請求項１９】
請求の範囲第１２項に記載のポリペプチド勅よび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなる請求の範囲第２項に記載の阻害剤。
【請求項２０】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなる請求の範囲第３項に記載の促進剤。
【請求項２１】
請求の範囲第７項から第１７項に記載のポリペプチドまたはペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の鯛節方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１２項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第５項に記載の阻害方法。
【請求項２３】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも１種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の促進方法。
【請求項２４】
請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドをコードする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列表の配列番号４または配列番号５に記載の塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求の範囲第２４項または第２５項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドをコードする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列表の配列番号６に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求の範囲第２７項または第２８項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求の範囲第２４項から第２６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項３１】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第３０項に記載の組換えベクター。
【請求項３２】
請求の範囲第２７項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項３３】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第３２項に記載の組換えベクター。
【請求項３４】
請求の範囲第３０項または第３１項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項３５】
請求の範囲第３２項または第３３項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項３６】
請求の範囲第３０項または第３１項に記載の組換えベクター、および請求の範囲第３２項または第３３項に記載の組換えベクターのいずれか１つの組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項３７】
請求の範囲第３１項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求の範囲第３０項もしくは第３１項に記載の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項３８】
請求の範囲第３３項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求の範囲第３２項もしくは第３３項に記載の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項３９】
請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項４０】
請求の範囲第７項、第８項もしくは第１２項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体であって、該ポリペプチドの機能を阻害する抗体。
【請求項４１】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項４２】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または請求の範囲第１６項もしくは第１７項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体であって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害する抗体。
【請求項４３】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。
【請求項４４】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、化合物と該ポリペプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ポリペプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、化合物が該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリペプチドの機能または該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法。
【請求項４５】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および／または、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体と化合物とを接触させ、該ポリペプチドの発現または機能の有無を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ポリペプチドの発現または機能を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法。
【請求項４６】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第７項または第８項に記載のポリペプチド、請求の範囲第２４項から第２６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項または第３１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項または第４０項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。
【請求項４７】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号３に記栽のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。
【請求項４８】
請求の範囲第４３項から第４７項のいずれか１項に記載の同定方法で同定された化合物。
【請求項４９】
請求の範囲第７項または第８項に記載のポリペプチドと相互作用し、その機能を阻害または促進する化合物。
【請求項５０】
請求の範囲第２４項から第２６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。
【請求項５１】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用し、当該ポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害または促進する化合物。
【請求項５２】
請求の範囲第９項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチドと相互作用し、当該ポリペプチドと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の増幅を阻害または促進する化合物。
【請求項５３】
請求の範囲第２７項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。
【請求項５４】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項５５】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５６】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる記憶再生の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５７】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなる神経変性疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５８】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを有効量含んでなるアルツハイマー病の防止剤、治療剤、または改善剤。
【請求項５９】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とするＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６０】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とする記憶再生の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６１】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とする神経変性疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６２】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体、請求の範囲第４８項から第５３項のいずれか１項に記載の化合物、請求の範囲第１項または第１８項に記載の調節剤、請求の範囲第２項または第１９項に記載の阻害剤、および請求の範囲第３項または第２０項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか１つを適用することを特徴とするアルツハイマー病の防止方法、治療方法、または改善方法。
【請求項６３】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法。
【請求項６４】
請求の範囲第７項から第１１項のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか１項に記載のペプチド、請求の範囲第２４項から第２９項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第３０項から第３３項のいずれか１項に記載の組換えベクター、請求の範囲第３４項から第３６項のいずれか１項に記載の形質転換体、および請求の範囲第３９項から第４２項のいずれか１項に記載の抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キット。
【請求項６５】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相互作用を阻害するまたは促進することを特徴とする、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節方法。
【請求項６６】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体との結合を阻害するまたは促進することを特徴とする、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節方法。
【請求項６７】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６８】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体／２Ｂサブユニットと結合するポリペプチド。
【請求項６９】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有するポリペプチド。
【請求項７０】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有するポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用するポリペプチド。
【国際調査報告】
2003044196.tif 000061
2003044196.tif 000062
2003044196.tif 000063
2003044196.tif 000064
2003044196.tif 000065
2003044196.tif 000066
2003044196.tif 000067