(57)【要約】発色基質Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの誤発色を防止する方法を提供し、これによって前記発色基質を用いた酸化還元反応を利用した測定の測定精度の向上を図る。界面活性剤の存在下で、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよび前記発色基質を試料に添加し、前記試料中の測定対象物由来の酸化物質と酸化により発色する前記発色基質とを酸化還元酵素により反応させ、前記発色量を測定することによって前記酸化物質の量を測定する。なお、前記反応溶液において、前記発色基質１μｍｏｌに対して、テトラゾリウム化合物を０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムを０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および界面活性剤を０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲とし、ｐＨを６〜９に設定する。
2003097865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む水性溶媒中におけるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの誤発色を防止する方法であって、界面活性剤を前記水性溶媒に共存させた状態で、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよびＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを前記水性溶媒中で混合し、かつ、前記Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリム  １μｍｏｌに対するテトラゾリウム化合物の割合を０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムの割合を０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および前記界面活性剤の割合を０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲とし、前記テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウム、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムおよび界面活性剤を混合した水性溶媒のｐＨを６〜９とする方法。
【請求項２】
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム１μｍｏｌに対するテトラゾリウム化合物の割合を０．０２〜０．８ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムの割合を０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および前記界面活性剤の割合を０．０１〜０．４ｍｍｏｌの範囲とする請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求の範囲１記載の方法。
【請求項４】
前記水性溶媒に界面活性剤を添加した後に、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよびＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを添加する請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】
前記水性溶媒に、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した後に、界面活性剤の存在下、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを添加する請求の範囲１記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含むＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム試薬溶液であって、さらに界面活性剤を含み、かつ、前記Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム  １μｍｏｌに対し、テトラゾリウム化合物が０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムが０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および界面活性剤が０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲で含まれており、ｐＨが６〜９の範囲である試薬溶液。
【請求項７】
テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求の範囲６記載の試薬溶液。
【請求項８】
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下、試料中の測定対象物由来の酸化物質と発色基質であるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムとを酸化還元酵素により反応させ、前記発色基質の発色量を測定することにより、前記酸化物質の量を測定する方法であって、界面活性剤の存在下、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよび発色基質を水性溶媒中で混合し、かつ、前記発色基質Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム１μｍｏｌに対するテトラゾリウム化合物の割合を０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムの割合を０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および界面活性剤の割合を０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲とし、前記混合液のｐＨを６〜９とする測定方法。
【請求項９】
前記水性溶媒が、測定対象物を含む試料溶液である請求項８記載の測定方法。
【請求項１０】
前記試料溶液に、テトラゾリウム化およびアジ化ナトリウムを添加した後、界面活性剤の存在下、さらにＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムおよび酸化還元酵素を添加して、前記酸化還元酵素による反応を行う請求の範囲９記載の測定方法
【請求項１１】
前記酸化還元酵素による反応に先立って、前記測定対象物をプロテアーゼ処理する請求の範囲１０記載の測定方法。
【請求項１２】
前記測定対象物のプロテアーゼ分解物に、前記酸化還元酵素を作用させる請求の範囲１１記載の測定方法。
【請求項１３】
前記酸化還元酵素が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求の範囲８記載の測定方法。
【請求項１４】
測定対象物由来の酸化物質が過酸化水素である請求の範囲８記載の測定方法。
【請求項１５】
測定対象物が糖化タンパク質である請求の範囲８記載の測定方法。
【請求項１６】
測定対象物が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲１５記載の測定方法。
【請求項１７】
テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求の範囲８記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの誤発色を防止する方法および前記方法を用いた試薬溶液ならびに酸化還元反応を利用した測定方法に関する。
背景技術
従来から、試料中の測定対象物の量を酸化還元反応を利用して測定する方法が、広く実施されており、例えば、以下のように行われている。まず、酸化物質である測定対象物や、測定対象物から発生した酸化物質に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記酸化物質と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。前記還元剤として、酸化されることによって発色する還元剤を用いれば、その発色量と前記酸化物質量とは相関関係にあるため、前記発色量の測定により前記酸化物質量を決定できる。このような酸化により発色する還元剤として、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムが使用されている。
しかしながら、このような測定方法は、測定感度が十分ではないために、測定精度が向上しない場合があった。
発明の開示
そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で前記酸化還元反応を行えば、測定感度を向上できることを見出し、別途出願している。しかし、この方法によると、前述のように測定感度は向上するが、新たな問題として、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムとテトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムとの３成分が溶液中で共存することによって、前記酸化還元反応前に、発色基質であるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムが誤発色を起すことがわかった。このように誤発色が生じると、例えば、前述のように発色量を測定する場合に、バックグラウンドが高くなるという問題があり、また、十分量添加したはずの発色基質が、酸化還元反応において不足する場合もある。
そこで、本発明の目的は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの誤発色を防止する方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の誤発色防止方法は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む水性溶媒中におけるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（以下、「ＤＡ−６４」ともいう）の誤発色を防止する方法であって、界面活性剤を前記水性溶媒に共存させ、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよびＤＡ−６４を前記水性溶媒中で混合し、かつ、前記ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対するテトラゾリウム化合物の割合を０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムの割合を０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および前記界面活性剤の割合を０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲とし、ＤＡ−６４、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよび界面活性剤を含む前記水性溶媒のｐＨを６〜９とすることを特徴とする。
このように、界面活性剤の存在下で前記３つの成分を混合し、かつ、各成分の濃度および混合液のｐＨを前記範囲に設定すれば、「ＤＡ−６４、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウム」が水性溶媒中で共存しても、前述のようなＤＡ−６４の誤発色を抑制できる。したがって、このような誤発色防止方法を利用して、後述するような酸化還元反応を用いた測定を行えば、吸光度測定におけるバックグラウンドの上昇が抑制でき、測定対象物を高精度で測定できる。なお、これらの各成分の添加順序は、特に制限されず、ＤＡ−６４、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの全てを水性溶媒中で混合する際に、前記界面活性剤が共存していればよい。このため、例えば、予め水性溶媒に界面活性剤を添加してから、他の３成分をそれぞれ添加してもよいし、水性溶媒にテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した後に、界面活性剤の存在下、ＤＡ−６４を添加してもよく、これらの添加順序には制限されない。
つぎに、本発明の試薬溶液は、ＤＡ−６４、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含むＤＡ−６４試薬溶液であって、さらに界面活性剤を含み、かつ、前記ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対して、テトラゾリウム化合物が０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムが０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および界面活性剤が０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲であり、そのｐＨが６〜９の範囲である。
このような組成の試薬溶液も、前述の誤発色防止方法と同様に、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下であっても、ＤＡ−６４の誤発色を防止できる。このため、溶液状態で、安定に保存することが可能となり、例えば、以下の測定方法等に有用である。
つぎに、本発明の測定方法は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下、試料中の測定対象物由来の酸化物質と発色基質であるＤＡ−６４とを酸化還元酵素により反応させ、前記発色基質の発色量を測定することにより、前記酸化物質の量を測定する方法であって、界面活性剤の存在下、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよび発色基質を水性溶媒中で混合し、かつ、前記発色基質ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対するテトラゾリウム化合物の割合を０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムの割合を０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および界面活性剤の割合を０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲とし、前記混合液のｐＨを６〜９とすることを特徴とする。
このような測定方法は、測定感度に優れるだけでなく、ＤＡ−６４の誤発色によるバックグラウンドの上昇も抑制できるため、測定精度にも優れる。なお、本発明において、「測定対象物由来の酸化物質」とは、測定対象物そのもの、もしくは、その中の酸化物質、または測定対象物から酸化還元酵素等を用いて発生した酸化物質の双方を意味する。
本発明の測定方法において、前記水性溶媒は、測定対象物を含む試料溶液であることが好ましく、例えば、前記試料溶液に、テトラゾリウム化およびアジ化ナトリウムを添加した後、界面活性剤の存在下、さらにＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムおよび酸化還元酵素を添加して、前記酸化還元酵素による反応を行うことが好ましい。
本発明の測定方法において、前記測定試料の種類は、特に制限されず、例えば、全血、血漿、血清、血球等の血液試料の他に、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
本発明の測定方法において、測定対象物としては、前記酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されない。例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。また、具体的な測定対象物としては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等もあげられ、より好ましくは糖化タンパク質であり、特に好ましくは糖化ヘモグロビンである。糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映するため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。本発明によれば、その量を高精度に測定できるため、糖化ヘモグロビンの指標としての信頼性が向上し、臨床医療の分野においても有益だからである。
本発明の測定方法において、測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質の糖化部分をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で酸化分解することにより過酸化水素を生成させることが好ましい。また、前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸も、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。このようにして生成した過酸化水素は、前述の測定対象物由来の酸化物質に相当する。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ２−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ２        …（１）
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４                    …（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ                …（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ５−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７        …（４）
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ３−ＮＨ）ｎ−Ｈ                  …（５）
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ                …（６）
前記ＦＡＯＤとしては、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸に特異的に作用する市販の商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、α−アミノ基およびリジン等のε−アミノ基等が糖化された糖化アミノ酸に特異的に作用する商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、商品名ＫＡＯ（ジェンザイム社製）等があげられる。
発明を実施するための最良の形態
本発明によるＤＡ−６４の誤発色の防止は、例えば、以下に示すように行うことができる。
水性溶媒に界面活性剤を溶解し、この溶液にテトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよびＤＡ−６４を混合する。この際、ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対して、テトラゾリウム化合物を０．０１〜１ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウムを０．００３〜０．５ｍｍｏｌの範囲および前記界面活性剤を０．００６〜０．４ｍｍｏｌの範囲に設定し、前記混合液のｐＨを６〜９に調整すればよい。
各成分の割合は、好ましくは、ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対して、テトラゾリウム化合物０．０２〜０．８ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウム０．０１〜０．３ｍｍｏｌの範囲および前記界面活性剤０．０１〜０．４ｍｍｏｌの範囲であり、特に好ましくはＤＡ−６４  １μｍｏｌに対して、テトラゾリウム化合物０．０３〜０．６ｍｍｏｌの範囲、アジ化ナトリウム０．０１〜０．２ｍｍｏｌの範囲および前記界面活性剤０．０４〜０．３ｍｍｏｌの範囲である。また、前記混合液のｐＨは、好ましくは６〜９であり、より好ましくは６．５〜８である。
各成分の添加順序は、前述のように特に制限されず、テトラゾリウム化合物、アジ化ナトリウムおよびＤＡ−６４の３成分を混合する際に、前記界面活性剤が前記範囲で共存していればよい。
前記水性溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、各種緩衝液等があげられる。前記緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸ナトリウム、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ等が使用でき、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸ナトリウムである。また、前記緩衝液の濃度は、例えば、１０〜３００ｍＭの範囲であり、好ましくは５０〜３００ｍＭである。
前記界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテルや、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルや、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０等のポリオキシエチレンソルビタンエーテル等があげられる。
前記テトラゾリウム化合物としては、例えば、テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する構造であることが好ましく、より好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が３箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
また、テトラゾリウム化合物は、少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。前記ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾイル基等である。
また、前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の少なくとも３箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
また、少なくとも１つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。
前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他にも、例えば、ヒドロペルオキシ基、オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｐ−トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フェニル基（Ｃ６Ｈ５−）、スチリル基（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ｏｒｔｈｏ−、ｍｅｔａ−、ｐｒａ−）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム塩および２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム塩、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル  カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩および３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。なお、このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。また、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
このように、ＤＡ−６４の誤発色を防止するために調製された溶液は、ＤＡ−６４試薬溶液として使用できる。用途としては、特に制限されないが、例えば、後述する酸化還元反応における発色基質の試薬溶液として使用できる。
つぎに、本発明の酸化還元反応を用いた測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
まず、全血をそのまま溶血することによって、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血することによって、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリエチレンソルビタンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
つぎに、前記溶血試料に対し界面活性剤を添加する。なお、前述のような界面活性剤による溶血処理を行った場合、すでに下記添加割合となっていれば界面活性剤をさらに添加する必要はなく、また、下記添加割合に満たない場合は、不足分を添加すればよい。
界面活性剤は、後述する酸化還元反応溶液における終濃度が、０．００６〜８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるよう添加すればよく、好ましくは０．０５〜４０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、界面活性剤を添加した溶血試料における界面活性剤の濃度は、例えば、０．１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
続いて、前記界面活性剤を含む溶血試料に対し、さらにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加する。
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムは、前記酸化還元反応溶液における終濃度がそれぞれ、テトラゾリウム化合物０．０１〜４０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム０．０１５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加すればよく、好ましくはテトラゾリウム化合物０．１〜３２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム０．０５〜１２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、特に好ましくはテトラゾリウム化合物０．１５〜２４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、アジ化ナトリウム０．０５〜８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
また、前記テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）の添加割合（モル比Ａ：Ｂ）は、例えば、Ａ：Ｂ＝１０：１〜１：１の範囲であり、好ましくは６：１〜１．５：１の範囲、より好ましくは４：１〜２：１の範囲である。
具体的には、前記テトラゾリウム化合物は、例えば、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、濃度０．０２〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．４〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、アジ化ナトリウムは、例えば、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、濃度０．００６〜８００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０４〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
前記テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムは、そのまま前記溶血試料に添加してもよい。しかし、操作の簡便性等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液およびアジ化ナトリウム溶液として、または、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの両方を含有する溶液（テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液）として使用することが好ましい。
前記溶液の溶媒としては、例えば、ＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ等の緩衝液が使用できる。前記溶媒のｐＨは、例えば、５〜１２の範囲であり、好ましくは、６〜１０の範囲である。
また、より一層の感度向上が可能であることから、調製した前記テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液を、前記溶血試料に添加する前に、一定時間放置することによってエージングすることが好ましい。このエージング処理によって、感度が、エージングしない場合よりも、例えば、約１．２〜３倍に向上する。
前記エージングにおいて、例えば、処理温度は、４〜８０℃の範囲が好ましく、より好ましくは２５〜７５℃の範囲であり、特に好ましくは４０〜７０℃の範囲である。処理時間は、例えば、１０分〜２００時間の範囲であり、好ましくは１時間〜１８０時間の範囲であり、より好ましくは３時間〜１００時間の範囲である。
前記溶血試料に対して、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを直接または前記溶液として添加した後、通常、処理温度１０〜４０℃の範囲で、１〜１０分インキュベートし、前記試料の前処理を行う。このように試料をテトラゾリウム化合物で前処理することによって、前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に与える影響を除去でき、測定精度も向上できるからである。このようにテトラゾリウム化合物は、還元物質の影響除去による測定精度の向上にも寄与するが、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムとの共存によって測定感度も向上する。
続いて、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した前処理済み溶血試料について、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを測定対象物に作用し易くするためである。
前記プロテアーゼとしては、特に制限されないが、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロテナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等が好ましい。また、分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、前記プロテアーゼは、前記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロテイナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、特定のタンパク質の分解物を選択的に調製できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
前記緩衝液としては、例えば、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が使用できる。そのｐＨは、例えば、６〜１３の範囲であり、好ましくは７〜１０の範囲である。また、プロテアーゼ処理溶液における前記緩衝液の最終濃度は、例えば、１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてメタロプロテイナーゼを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のメタロプロテイナーゼ濃度２〜２０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。
また、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１〜１０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよびＤＡ−６４を用いて酸化還元反応により測定する。
発色基質であるＤＡ−６４は、この酸化還元反応溶液における終濃度が、０．００１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加すればよく、好ましくは０．００５〜２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
また、ＤＡ−６４（Ｃ）と、すでに添加した界面活性剤（Ｄ）、テトラゾリウム化合物（Ｅ）およびアジ化ナトリウム（Ｆ）との添加割合（モル比Ｃ：Ｄ：Ｅ：Ｆ）は、１：６：１０：３〜１：２０００：１０００：５００の範囲であり、好ましくは１：１０：２０：１０〜１：１０００：８００：３００の範囲であり、より好ましくは１：４０：３０：１０〜１：５００：６００：２００の範囲である。
この酸化還元反応溶液のｐＨは、６〜９の範囲であり、好ましくは６〜８の範囲である。
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。具体的には、例えば、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ６〜８である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
前記ＤＡ−６４は、酸化還元反応により発色するため、この反応液について、例えば、検出波長６５０〜７６０ｎｍの範囲における吸光度（発色程度）を分光光度計で測定すれば、過酸化水素の量を測定できる。そして、測定した過酸化水素量と、予め準備した過酸化水素量と糖化タンパク質量との相関関係を示す検量線とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
このように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムだけでなく、さらに界面活性剤を添加し、その添加割合を前述の範囲に設定すれば、ＤＡ−６４の誤発色を防止できるため、バックグラウンドの上昇を抑制した、高い測定精度が実現できる。
また、前述のように、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、例えば、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。これらを測定する場合は、例えば、前述と同様にして測定対象物由来の酸化物質を生成して、その量を酸化還元反応によって測定すればよい。
前記測定対象物由来の酸化物質として、例えば、過酸化水素を発生させ、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行うことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
実施例
（処理液Ａ）
Ａ−１：ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル（ＰＥＧＬＥ）７ｇ／Ｌ（１２ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．５）
Ａ−２：ＰＥＧＬＥ  ５０ｇ／Ｌ（８５ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．５）
（処理液Ｂ）
２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学社製）５ｍｍｏｌ／Ｌとアジ化ナトリウム１．５ｍｍｏｌ／Ｌとを混合し、５０℃で２４時間インキュベートした。この混合溶液３ｍＬと、メタロプロテアーゼ（アークレイ社製、１０，０００ＫＵ／Ｌ）１ｍＬ、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ５．５）１ｍＬ、ＮａＣｌ溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）および精製水３ｍＬとを混合したものを処理液Ｂとした。
（処理液Ｃ）
Ｃ−１：ＤＡ−６４  ８０μｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＡＯＤ（アークレイ社製）３０ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ１００ＫＵ／Ｕ
Ｃ−２：ＤＡ−６４  １０００μｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＡＯＤ（アークレイ社製）３０ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ  １００ＫＵ／Ｕ
（方法）
血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ）して血球を回収した。この血球１０μＬと前記処理液Ａ（Ａ−１、Ａ−２）３００μＬを混合して、溶血試料を調製した。この溶血試料１０μＬに、前記処理液Ｂ１００μＬを添加して３７℃で５分間インキュベートし、さらに前記処理液Ｃ（Ｃ−１、Ｃ−２）２２μＬを加えて３７℃でインキュベートし、この反応液の吸光度（波長７５１ｎｍ）を自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子株式会社製）を用いて測定した。溶血試料と前記処理液Ｂとを混合した時点を０秒、処理液Ｃ添加時を３００秒とした。そして、ＦＡＯＤとＰＯＤとによる反応が終了した後に継続して生じる誤発色を測定するために、４８６秒〜６０３秒間の吸光度変化量を求めた。下記表１に、反応液における各成分の終濃度およびＤＡ−６４  １μｍｏｌに対する添加割合を示し、また、吸光度変化量の結果を図１および下記表２に示す。前記図１は、反応液における吸光度の経時変化を示すグラフである。
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2003097865.tif 000004
前記表１に示すように，比較例１は、ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対するＰＥＧＬＥが多く（＞０．４ｍｍｏｌ）、比較例２は、ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対するＰＥＧＬＥ（＜０．００６ｍｍｏｌ）、ＷＳＴ−３（＜０．０１ｍｍｏｌ）、ＮａＮ３（＜０．００３ｍｍｏｌ）がそれぞれ少なく、比較例３は、ＤＡ−６４  １μｍｏｌに対するＷＳＴ−３（＜０．０１ｍｍｏｌ）、ＮａＮ３（＜０．００３ｍｍｏｌ）がそれぞれ少ない。このため、比較例１〜３は、図１に示すように誤発色によって高い吸光度を示し、前記表２に示すように吸光度変化量が大きくなるが、実施例１によれば、誤発色が防止されることによって、図１に示すように吸光度が低くなり、前記表２に示すように吸光度変化量も抑制された。これらの結果から、本発明の方法によれば、ＤＡ−６４の誤発色を防止し、これによって測定精度を向上できることがわかる。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明によれば、発色基質であるＤＡ−６４の誤発色を防止できるため、この誤発色防止方法を、酸化還元反応を用いた測定に適用すれば、誤発色によるバックグラウンドの増加を抑制でき、測定精度が向上される。また、このような測定方法を、例えば、赤血球中のＨｂＡ１ｃの測定に適用すれば、従来よりも測定精度が高い測定を実現でき、この結果、ＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の測定方法の実施例における、吸光度の経時的変化を示したグラフである。
【図１】
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【国際調査報告】
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