(57)【要約】ヒスチジンを、好ましくは、システイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを有効成分として含む、臓器線維化抑制剤、特に肝線維化抑制剤を提供する。この併用により臓器線維化、特に肝線維化抑制作用を著しく示し、医薬品の形態や飲食品に使用した形態でこの両者を目的とする有効成分として使用することができる。前記有効成分それぞれ別形態で、或いはその有効成分の１種と２種混合物とをそれぞれ別々に製品化した組み合わせも臓器線維化抑制剤として提供する。この結果、線維化に起因する各種臓器疾患、例えば肝臓疾患用薬剤等医薬品のみならず、肝機能を改善、維持する保健機能食品、病者用食品等飲食品に使用した形態でも適用可能な肝線維化抑制剤等、臓器線維化抑制剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジンを有効成分として含有することを特徴とする臓器線維化抑制剤。
但し、ヒスチジンはＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、また塩の形態でもよい。
【請求項２】
更に、システイン及び／又はシスチンを有効成分として含有する請求の範囲１記載の臓器線維化抑制剤。
但し、システイン及びシスチンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、またそれぞれ塩の形態でもよい。
【請求項３】
腎線維化抑制剤、膵線維化抑制剤、肺線維化抑制剤、血管線維化抑制剤、皮膚線維化抑制剤、骨髄線維化抑制剤及び肝線維化抑制剤の何れかである請求の範囲１又は２記載の臓器線維化抑制剤。
【請求項４】
肝線維化抑制剤である請求の範囲１又は２記載の臓器線維化抑制剤。
【請求項５】
肝臓疾患用薬剤の形態にある請求の範囲４記載の臓器線維化抑制剤。
【請求項６】
当該肝臓疾患用薬剤が慢性肝炎、肝線維症、肝硬変、肝臓癌、及びＮＡＳＨの少なくとも１種用である請求の範囲５記載の臓器線維化抑制剤。
【請求項７】
飲食品に使用した形態にある請求の範囲１又は２記載の臓器線維化抑制剤。
【請求項８】
経口用又は非経口用である請求の範囲１又は２記載の臓器線維化抑制剤。
【請求項９】
システイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとの含有比率（モル比率）が遊離体換算でシステイン及び／又はシスチン：ヒスチジン＝１：０．１〜１０である請求の範囲２記載の臓器線維化抑制剤。
尚、シスチンについてはシステインのモル比に換算して算定する。
【請求項１０】
臓器線維化抑制剤に使用することを特徴とするシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとの組み合わせ。
但し、システイン、シスチン及びヒスチジンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、またそれぞれ塩の形態でもよい。
【請求項１１】
システイン又はシスチンと、ヒスチジンとがそれぞれ分離した形態にあり；又は、システイン、シスチン及びヒスチジンの３種それぞれが、若しくはその２種混合物と他の１種とが相互に分離した形態にある請求の範囲１０記載の組み合わせ。
【請求項１２】
ヒスチジンを生体内に投与することを特徴とする臓器線維化抑制方法。
但し、ヒスチジンはＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、また塩の形態でもよい。
【請求項１３】
システイン及び／又はシスチンを当該生体内に投与する請求の範囲１２記載の方法。
但し、システイン及びシスチンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、またそれぞれ塩の形態でもよい。
【請求項１４】
当該投与の形態が請求の範囲１〜９何れか記載の臓器線維化抑制剤の形態にある請求の範囲１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
ヒスチジンの臓器線維化抑制剤製造への使用。
但し、ヒスチジンはＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、また塩の形態でもよい。
【請求項１６】
システイン及び／又はシスチン、並びにヒスチジンの臓器線維化抑制剤製造への使用。
但し、システイン、シスチン及びヒスチジンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、またそれぞれ塩の形態でもよい。
システイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとをそれぞれ相互に分離した形態で使用してもよい。
【請求項１７】
当該臓器線維化抑制剤製造への使用形態が請求の範囲１〜９何れか記載の臓器線維化抑制剤の形態にある請求の範囲１５又は１６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規臓器線維化抑制剤（腎線維化抑制剤、膵線維化抑制剤、肺線維化抑制剤、血管線維化抑制剤、皮膚線維化抑制剤、骨髄線維化抑制剤、肝線維化抑制剤等）、より詳しくはヒスチジンを有効成分として、好ましくはシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを有効成分として、含有する臓器線維化抑制剤に関する。臓器の線維化を有効に抑制し、上記有効成分が全てアミノ酸の一成分であり経口投与又は経口摂取が可能であるところから、線維化に起因する各種臓器疾患用の薬剤、特に肝線維症、肝硬変等肝臓疾患用薬剤（医薬品）の形態で、また、保健機能食品、病者用食品等の飲食品に使用された形態で実施することができる。
更に、本発明は臓器線維化抑制方法（生体内の臓器線維化に起因する疾患の治療、改善、進展防止、予防等のための処置法等含む。）、前記有効成分の臓器線維化抑制剤（医薬品、飲食品等の形態を含む。）製造への使用、前記複数の有効成分を使用する場合それ等有効成分の臓器線維化抑制剤としての組み合わせ或いはそれ等の臓器線維化抑制方法への使用のための組み合わせ等に関する。
背景技術
臓器線維化抑制剤、特に肝線維症、肝硬変等肝臓疾患用薬剤として有効な薬剤（予防、改善及び／又は治療剤）は見当たらない。
例えば、肝硬変はウイルス性やアルコール性肝炎等の慢性肝疾患の終末像であるばかりでなく、高率に肝細胞癌に進行することから、合併症（腹水・浮腫、脳症、黄疸）に対する既存療法の他に、肝硬変の病因である肝線維化に対する直接的な治療法の開発が望まれている。
肝線維化はウイルスやアルコール等の外的要因若しくは自己免疫異常が関与する内的要因によって惹起される肝細胞壊死と、肝機能を維持するための肝再生とのバランスが崩れた場合に、肝臓組織を修復するためにコラーゲン等の細胞外マトリックスが過剰沈着した結果と考えられている。細胞レベルでは、肝実質細胞の障害、壊死がクッパー細胞や内皮細胞等を活性化し、活性化されたクッパー細胞や内皮細胞等からＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦが放出される。次に、それ等の因子が、肝線維化の主役とされている星細胞を活性化し、細胞増殖とコラーゲンの合成が惹起されるものと考えられている。
更に、肺、腎、膵、皮膚等の臓器においても、肝同様に、各々の臓器に存在する線維芽細胞や各臓器に特異的な間質系細胞（腎メザンギウム細胞、膵星細胞等）が各種サイトカインの刺激により、増殖、細胞外マトリックスの合成異常を呈することにより、臓器線維症が引き起こされるものと考えられている。
そこで、肝線維化に対する直接的で著効を示す薬剤の開発が求められている。更に、それ以外の各種の臓器線維化に有効な薬剤の開発が同様に求められている。
発明の開示
１．発明が解決しようとする課題
本発明が解決しようとする課題は、臓器線維化抑制作用、特に肝線維化抑制作用を著しく示す成分を開発し、これを使用し肝臓等各種臓器疾患用薬剤等の医薬品のみならず、保健機能食品、病者用食品等飲食品に使用した形態でも適用可能な薬剤を提供することにある。
２．課題を解決するための手段
本発明者等は上記課題を解決すべく、鋭意検討を進めた結果、ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、ＤＬ−ヒスチジン等）が前記臓器線維化抑制作用、特に肝線維化抑制作用を著しく示し、これを有効成分に使用すると肝臓疾患等の各種臓器疾患用薬剤等の医薬品のみならず、保健機能食品、病者用食品等飲食品に使用した形態でも適用できること、更に上記ヒスチジンに対し特にシステイン（Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ＤＬ−システイン等）及び／又はシスチン（Ｌ−シスチン、Ｄ−シスチン、ＤＬ−シスチン等）を有効成分として併用することにより、より強い線維化抑制作用を示すこと等を見出し、これ等の各種知見に基づいて本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は、一つの形態として、ヒスチジンを有効成分として、好ましくはシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを有効成分として含有することに特徴を有する腎線維化抑制剤、膵線維化抑制剤、肺線維化抑制剤、血管線維化抑制剤、皮膚線維化抑制剤、骨髄線維化抑制剤、肝線維化抑制剤等の臓器線維化抑制剤に存する。システイン、シスチン及びヒスチジンはそれぞれ、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体何れも使用可能である。また、システイン、シスチン及びヒスチジンはそれぞれ、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができ、システイン、シスチン及びヒスチジンの医薬品又は飲食品として許容される塩を選択することが好ましい。システイン、シスチン及びヒスチジンに、それぞれ付加して医薬品又は飲食品として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸又はモノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。システイン、シスチン及びヒスチジンの医薬品又は飲食品として許容される塩基との塩の例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物或いは炭酸化物や、アンモニア等の無機の塩基との塩、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機の塩基との塩が挙げられる。
この臓器線維化抑制剤の使用に関しては線維化に起因する臓器の各種疾患用薬剤として使用することができる。例えば、肝臓疾患用薬剤（肝臓疾患の予防、改善及び／又は治療等に使用する薬剤。）、特に慢性肝炎、肝硬変及び肝臓癌等医薬品の形態で使用することができるし、保健機能食品、病者用食品等飲食品に使用した形態で使用することもできる。
前記ヒスチジンを少なくとも含み、各種臓器のために線維化を抑制する作用、例えば肝線維化抑制作用を発現する薬剤（飲食品に使用した形態を含む。）は本発明に該当し、従って本発明の目的や本発明で奏する作用
（効果）を阻害しない範囲で、前記システイン及び／又はシスチン等や、或いは各種必要なその他の成分等を随時配合、使用することもできる（例えば、後述の補助剤、担体等参照。）。
尚、真田等は、Ｌ−ヒスチジンを投与したラットにおいて、Ｄ−ガラクトサミン投与による肝障害が軽減されることを報告している（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６３，３１９−３２２，１９９９年参照。）。しかし、ヒスチジンに肝線維化等の臓器線維化抑制作用があることは示されておらず、示唆も無い。
更に、ヒスチジンについて、星細胞への直接作用による活性化抑制や、例えば肝線維化抑制作用等については検討されていない。
システイン及び／又はシスチンを併用する場合、システイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとの含有比率（モル比率）については、遊離体換算でシステイン及び／又はシスチン：ヒスチジン＝１：０．１〜１０、好ましくは１：０．２〜８、より好ましくは１：０．３〜６になるように各成分を配合することが望ましい。この場合、シスチンについてはシステインのモル比に換算して算定するとよい。
システイン及び／又はシスチンを併用する場合、臓器線維化抑制剤としてシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとをそれぞれ分離して別の形態、例えば２種製剤等にそれぞれを含めてセットで使用してもよい。従って、有効成分に使用する全てのアミノ酸を同一製剤或いは同一飲食品等の形態に含めて使用することもできるし、有効成分に使用するアミノ酸を二つ又はそれ以上の形態、例えば二つ又は三つの製剤及び／又は飲食品等の形態に分離して使用することもできる。例えば、一つのアミノ酸が医薬品で、他のアミノ酸が飲食品というような形態での使用も可能である。
本発明は、別の形態として、臓器線維化抑制剤に使用することに特徴を有するシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとの組み合わせにも存する。
組み合わせる複数の有効成分を、代表的には混合状態で一つの形態、例えば合剤として使用することができる。また、システイン又はシスチンと、ヒスチジンとを、それぞれ分離した形態、例えば別形態の製剤或いは飲食品の形態で；又は、システイン、シスチン及びヒスチジンの３種それぞれを、若しくはその何れか２種混合物と他の１種とを、相互に分離した形態、例えば別形態の製剤或いは飲食品の形態で使用することもできる。
但し、システイン、シスチン及びヒスチジンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、また塩の形態でもよい。
一つの有効成分について非経口製剤で、他の有効成分について経口製剤であるような組み合わせや、一つが医薬製剤で、他が飲食品の形態であるような組み合わせや、一つが非経口製剤、もう一つが経口製剤、三つ目の有効成分については飲食品であるような３種成分の組み合わせも可能である。
この発明は前記本発明の臓器線維化抑制剤を含むので、本明細書中前記本発明についての説明は全てこの発明の説明に適用される。この発明は有効成分単位で別々に医薬品として或いは飲食品として製品化されたものをも含み、それぞれ同時に摂取又は投与する前記本発明に対し、この発明においては本発明で使用する有効成分の１種又は２種をそれぞれ別々の摂取又は投与形態で、また時と所を異にして摂取又は投与できるようにしたものであり、前記本発明に対する明細書の説明を参考に、同様にこの発明を実施することができる。
尚、このようなシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとの併用による臓器線維化抑制作用についてはこれまでに報告されておらず、また示唆も無い。
本発明は、別の形態として、ヒスチジンを、好ましくはシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを生体内に投与することに特徴を有する臓器線維化抑制方法（臓器線維化に起因する疾患の治療、改善、進展防止、予防等のための処置法等含む。）に存する。有効成分として上記複数のアミノ酸を生体内に投与する場合、これ等複数のアミノ酸の相対的な投与時期には特に制限は無い。例えば、これ等アミノ酸を全て同時に投与することもできるし、その中の１種のみ別個に投与したり、又は３種を使用する場合３種に分離して別々に時間をおいて生体内に投与することもできる。
但し、ヒスチジンはＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、また塩の形態でもよい。システイン及びシスチンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、またそれぞれ塩の形態でもよい。
当該投与の形態としては、前記本発明の臓器線維化抑制剤の中から選択することができる。
本発明は、更に別の形態として、ヒスチジン、好ましくはシステイン及び／又はシスチン、並びにヒスチジンの臓器線維化抑制剤製造への使用に存する。
但し、システイン、シスチン及びヒスチジンは、それぞれＬ−体、Ｄ−体及びＤＬ−体何れでもよく、またそれぞれ塩の形態でもよい。
併用する場合複数の有効成分を、代表的には混合状態で一つの形態、例えば合剤として使用することができる。また、併用するシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとをそれぞれ分離し、又は別の形態、例えば複数の医薬品製剤及び／又は飲食品等の別形態で使用してもよい。上記有効成分として使用するアミノ酸の当該臓器線維化抑制剤製造への使用形態としては、前記本発明の臓器線維化抑制剤の中から選択することができる。
発明の実施の形態
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（臓器線維化抑制剤）
本発明の薬剤においては，各種臓器の線維化を抑制する作用、好ましくは肝線維化抑制作用を付与するために有効成分に、ヒスチジンを使用し、好ましくはシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを使用し、医薬品の形態や飲食品に使用した形態で実施することができる。
適用の対象としては、肝臓に関しては、肝線維化抑制作用を利用してウイルス性、アルコール性等の慢性肝炎、その他の肝炎（非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等）、肝線維症、肝硬変、及び肝臓癌等、肝臓疾患を予防、改善及び／又は治療する動物、特にヒト（肝臓疾患患者等）であり、またその作用を利用して飲食品、飼料等を通じて肝臓の働きを強化、維持することを期待する健常者、家畜等である。
腎臓に関しては、その線維化抑制作用を利用して、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、腎硬化症等、腎線維化を示す腎疾患を予防、改善及び／又は治療する動物、特にヒト（腎疾患患者等）であり、またその作用を利用して、飲食品、飼料等を通じて腎臓の働きを強化、維持することを期待する健常者、家畜等である。
膵臓に関しては、その線維化抑制作用を利用して．膵線維症等、膵疾患を予防、改善及び／又は治療する動物、特にヒト（膵疾患患者等）であり、またその作用を利用して、飲食品、飼料等を通じて膵臓の働きを強化、維持することを期待する健常者、家畜等である。
肺に関しては、その線維化抑制作用を利用して、肺線維症等、肺疾患を予防、改善及び／又は治療する動物、特にヒト（肺疾患患者等）であり、またその作用を利用して、飲食品、飼料等を通じて肺臓の働きを強化、維持することを期待する健常者、家畜等である。
血管に関しては、その線維化抑制作用を利用して．動脈硬化症、ＰＴＣＡ施行やシャント挿入等、血管再開処置後の再挟窄等の線維性血管変性疾患を予防、改善及び／又は治療する動物、特にヒト（血管変性疾患患者等）であり、またその作用を利用して、飲食品、飼料等を通じて血管の働きを強化、維持することを期待する健常者、家畜等である。
皮膚、骨髄又はその他の臓器に対しては、その線維化抑制作用を利用して、例えば、強皮症、ケロイド、骨髄線維症、全身性硬化症等の疾患を予防、改善及び／又は治療する動物、特にヒト（線維性臓器変性疾患患者等）であり、またその作用を利用して、飲食品、飼料等を通じて該当する臓器の働きを強化、維持することを期待する健常者、家畜等である。
システイン、シスチン及びヒスチジンを使用する場合の入手経路について、調製する場合その調製法は特に困難は無く、何れも従来技術に基づいて容易に行うことができるし、それ等のＬ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体については市販品が存在するので、これ等を購入使用するのが簡便である。
システイン、シスチン及びヒスチジンを塩の形態で使用する場合には、従来から知られている造塩工程を利用して遊離体から目的とする塩（医薬品又は飲食品として許容される塩）を容易に調製することができる。前記の通り各種の塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ナトリウム塩、ジエタノールアミン塩等を挙げることができる。
本発明で使用する前記有効成分を各種の薬剤、例えば肝臓疾患用薬剤として使用する場合、製剤の形態には特に制限は無く、経口剤でも非経口剤（注射剤）でもよい。飲食品に使用する場合、通常は経口摂取となるが、経口ではない特別（経管等）の摂取手段も考えられる。本発明で使用する全有効成分を同時に含む製剤の形態でも、また前述の如く有効成分のそれぞれを別々の製剤に調製することもできる。
有効成分の使用量については、例えば肝臓疾患用薬剤（医薬品製剤）に使用する場合、例えば患者の症状やその程度、剤形の種類等により適宜選択すればよい。ヒスチジンを投与するとき、経口投与の場合で通常、ヒスチジンの遊離体換算で１日当たり好ましくは１０ｍｇ〜５０ｇ程度、より好ましくは１００ｍｇ〜２０ｇ程度、更に好ましくは１〜１０ｇ程度使用することができる。また、静脈等への注射剤として使用する場合、前記経口投与用製剤に使用する場合の前記有効成分使用量の二十分の一〜二分の一程度の使用量で十分である。一方、システイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを併用投与するとき、経口投与の場合で通常、システインとヒスチジンとの１：０．１〜１０（モル比、遊離体換算）の混合組成の場合、遊離体換算で１日当たり好ましくは１０ｍｇ〜５０ｇ程度、より好ましくは１００ｍｇ〜２０ｇ程度、更に好ましくは１〜１０ｇ程度使用することができる。また、静脈等への注射剤として使用する場合、前記経口投与用製剤に使用する場合の前記有効成分使用量の二十分の一〜二分の一程度の使用量で十分である。尚、シスチンをシステインに代えて、又はシステインと共に使用する場合、前記システインの使用量を参考に対応する使用量を容易に選択することができる。当然のことながら、ヒスチジン単独投与の場合に比較して、ヒスチジンとシステイン等との併用投与の場合にはより効果が高いので、より少ない投与量で前者の場合と同一の効果を上げることができる。
上記有効成分の使用量に関し、勿論、重篤な場合には更に増量することもできる。投与の回数、時期については、数日に１回でも、また１日１回でも可能であるが、通常は１日当たり数回、例えば２〜４回に分けて、好ましくは食後に投与される。
一方、飲食品に使用する場合、上記経口投与量を基準にその有効成分の飲食品中への配合量を決めることができる。
製剤の調製については、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質（補助剤等として）を含むこともできる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を挙げることができる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、及び溶剤、例えば滅菌水及び一価又は多価アルコール、例えばグリセロールを挙げることができる。
本発明の薬剤は、前述の如く公知の又は将来開発される様々な医薬製剤の形態、例えば、経口投与、経腸投与、経皮的投与、吸入投与等各種の投与形態に調製することができる。本発明の薬剤をこれら様々な医薬製剤の形態に調製するためには公知の又は将来開発される方法を適宜採用することができる。
これ等様々な医薬製剤の形態として、例えば適当な固形又は液状の製剤形態、例えば顆粒、粉剤、被覆錠剤、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、乳濁液、滴下剤、注射用溶液、活性物質の放出を延長する製剤等を挙げることができる。
以上に例示した製剤形態にある本発明の薬剤には、薬効を奏するに有効な量の前記成分（Ｌ−ヒスチジン、並びに併用する場合Ｌ−システイン／Ｌ−シスチン及びＬ−ヒスチジン等）を含有すべきことは当然のことである。
それ以外の成分を使用する場合でも、これ等に基づき或いは知られている製剤技術を利用して、また各種の剤形に応じて必要な製剤を調製することができる。
一方、飲食品への用途についても前記経口用薬剤その他の説明を参考にして容易に実施することができる。
本発明の臓器線維化抑制剤で使用する有効成分をそれぞれ別々に製品化（医薬品製剤、飲食品等）する場合や有効成分の２種混合物と１種成分とで別々に製品化する場合（本発明の前記組み合わせ）にも、前記説明を基に同様に実施することができる。
（その他の発明）
前記の通り本発明は、それぞれ別の形態として、
（イ）臓器線維化抑制剤に使用することに特徴を有するシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとの組み合わせ、或いは臓器線維化抑制剤としてのシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとの組み合わせ；
（ロ）ヒスチジンを、好ましくはシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを生体内に投与することに特徴を有する臓器線維化抑制方法（臓器線維化に起因する疾患の治療、改善、進展防止、予防等のための処置法等含む。）；
（ハ）ヒスチジンの、好ましくはシステイン及び／又はシスチン、並びにヒスチジンの臓器線維化抑制剤製造への使用；等
にも存する。
これ等の発明については、何れも前記本発明の臓器線維化抑制剤についての説明や、後述の実施例等に基づいて、また必要により従来から知られている技術を参考にすることにより、容易に実施をすることができる。
好適な実施の形態
以下に、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれ等の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
９週齢ＳＤ系雄性ラットに１０ｍｇ／ｋｇのジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）を週３回腹腔内に３週間投与して肝線維化を惹起した。市販飼料又は、被験物としてＬ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）を、それぞれ０．２、０．５、１．０、及び２．０％添加した実験食を、ＤＭＮ投与開始日より供餌した。ＤＭＮ投与開始２１日目に肝臓を採取し、肝線維化の指標として肝臓中ハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）量をアミノ酸分析機を用いて測定した。この結果を図１に示した。この図１から明らかなように、ＤＭＮの投与によりおよそ６倍に増加した肝臓中のＨｙｐは、Ｈｉｓの経口投与により有意に減少した。
（実施例２）
ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系雄性ラット肝より、プロナーゼＥ、コラーゲナーゼ肝灌流法にて星細胞を単離・培養し、８−１４日目の星細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有培地で一晩培養後、０．１％ＦＣＳ含有培地に交換し更に４８時間培養した。その後、被検物質としてＬ−ヒスチジンを１〜３０ｍＭになるように添加し、更に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を終濃度２５ｎｇ／ｍｌとなるように加え、２４時間星細胞を培養した。培養終了６時間前にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を培養系に加え、培養終了後、細胞へのＢｒｄＵ取り込み量をＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ法）で測定した。コントロールとして培地中にＰＤＧＦ（終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）のみを添加した。コントロールのＢｒｄＵ取り込みを１００％としたときの各群の値を図２に示した。その結果、Ｌ−ヒスチジンはＰＤＧＦによる星細胞のＤＮＡ合成を用量依存的に強く抑制した。
（実施例３）
実施例２と同様の方法により、Ｌ−ヒスチジンとＤ−ヒスチジン（それぞれ、３０ｍＭ）の星細胞ＤＮＡ合成に対する効果を比較した。コントロール群のＢｒｄＵ取り込みを１００％としたときの各群の値を図３に示した。その結果、Ｌ−ヒスチジン及びＤ−ヒスチジン共にＰＤＧＦによる星細胞のＤＮＡ合成を強く抑制し、その抑制は同程度であった。
（実施例４）
ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系雄性ラット肝より、プロナーゼＥ、コラーゲナーゼ肝灌流法にて星細胞を単離・培養し、８−１４日目の星細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有培地で一晩培養後、０．１％ＦＣＳ含有培地に交換し更に４８時間培養した。その後、被検物質としてＬ−システイン、Ｌ−ヒスチジン或いはＬ−システインとＬ−ヒスチジンの組成物を添加し、更に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を終濃度２５ｎｇ／ｍｌとなるように加え、２４時間星細胞を培養した。培養終了６時間前にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を培養系に加え、培養終了後、細胞へのＢｒｄＵ取り込み量をＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ法）で測定した。コントロールとして培地中にＰＤＧＦ（終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）のみを添加した。コントロールのＢｒｄＵ取り込みを１００％としたときの各群の値を図４に示した。この結果から、Ｌ−システイン、或いはＬ−ヒスチジンそれぞれ単独の場合に比較して、Ｌ−システイン及びＬ−ヒスチジンの組成物はＰＤＧＦによる星細胞のＤＮＡ合成を強く抑制していることが理解される。
（実施例５）
ヒト正常肺線維芽細胞（ＨＬＦ−１細胞）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有培地で一晩培養後、０．１％ＦＣＳ含有培地に交換し更に２４時間培養した。その後、被検物質としてＬ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）を１０又は３０ｍＭになるように添加し、更に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を終濃度２５ｎｇ／ｍｌ或いはＦＣＳを終濃度５％となるように加え、２４時間ＨＬＦ−１細胞を培養した。培養終了６時間前にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を培養系に加え、培養終了後、細胞へのＢｒｄＵ取り込み量をＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ法）で測定した。コントロールとして培地中にＰＤＧＦ（終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）或いはＦＣＳ（終濃度５％）のみを添加した。コントロールのＢｒｄＵ取り込みを１００％としたときの各群の値を図５に示した。その結果から、Ｌ−ヒスチジンはＰＤＧＦ或いはＦＣＳによるヒト正常肺線維芽細胞のＤＮＡ合成を強く抑制することが分かった。
（実施例６）
ヒト腎メザンギウム細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有培地で一晩培養後、０．１％ＦＣＳ含有培地に交換し更に２４時間培養した。その後、被検物質としてＬ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）を１０又は３０ｍＭになるように添加し、更に、ＦＣＳを終濃度５％となるように加え、２４時間メザンギウム細胞を培養した。培養終了６時間前にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を培養系に加え、培養終了後、細胞へのＢｒｄＵ取り込み量をＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ法）で測定した。コントロールとして培地中に５％ＦＣＳのみを添加した。コントロールのＢｒｄＵ取り込みを１００％としたときの各群の値を図６に示した。その結果から、Ｌ−ヒスチジンはＦＣＳによるヒト腎メザンギウム細胞のＤＮＡ合成を強く抑制することが分かった。
発明の効果
本発明においては、ヒスチジンを有効成分として、好ましくはシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとを有効成分として含有する優れた、臓器線維化抑制剤、特に肝線維化抑制剤を提供し、例えば慢性肝炎、肝線維症、肝硬変及び肝臓癌等肝臓疾患用の薬剤（医薬品）の形態で使用できる外に、食品の分野でも、特に有効成分のアミノ酸にＬ−体を使用する場合保健機能食品、病者用食品等飲食品に使用した形態でも適用することができる。
ヒスチジンは、特に好ましくはシステイン及び／又はシスチンとの併用により、臓器線維化、特に肝線維化抑制作用を著しく示し、故にヒスチジンを、また併用する場合両者を同時に又は別々に、医薬品の形態や飲食品に使用した形態で目的とする有効成分として使用することができる。
本発明によれば、有効成分を併用する場合更にシステイン及び／又はシスチンと、ヒスチジンとがそれぞれ分離した形態、例えば別形態の製剤或いは飲食品の形態で；又は、システイン、シスチン及びヒスチジンの３種それぞれが、若しくはその２種混合物と他の１種とが相互に分離した形態、例えば別形態の製剤或いは飲食品の形態でも提供することができる。
更に、本発明は、臓器線維化抑制方法（生体内の臓器線維化に起因する疾患の治療、改善、進展防止、予防等のための処置法等含む。）、前記有効成分の臓器線維化抑制剤（医薬品、飲食品等の形態を含む。）製造への使用、前記複数の有効成分を使用する場合それ等有効成分の臓器線維化抑制剤としての組み合わせ或いはそれ等の臓器線維化抑制方法への使用のための組み合わせ等をも提供する。
従って、本発明は医薬品、食品分野等において広く実施することができ、故に工業的に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
［図１］
図１は、実施例１において、肝ハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）量を測定した結果を示す。
ｎｏｒｍａｌ：無処置群；
平均値＋標準偏差ｎｏｒｍａｌ（Ｎ＝４）、Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｎ＝７）、Ｈｉｓ投与群（Ｎ＝８）；＊：ｐ＜０．０５  Ｄｕｎｎｅｔ多重検定。
［図２］
図２は、実施例２において、血小板由来増殖因子刺激による星細胞のＤＮＡ合成能を測定した結果を示す。
平均値±標準偏差（Ｎ＝３）；＊：ｐ＜０．０５  Ｔ検定。
［図３］
図３は、実施例３において、血小板由来増殖因子刺激による星細胞のＤＮＡ合成能を測定した結果を示す。
平均値＋標準偏差（Ｎ＝３）；＊：ｐ＜０．０５  Ｔ検定。
［図４］
図４は、実施例４において、血小板由来増殖因子刺激による星細胞のＤＮＡ合成能を測定した結果を示す（ラット肝星細胞ＰＤＧＦ刺激ＤＮＡ合成能に対するＣｙｓ及びＨｉｓの配合効果）。
平均値＋標準偏差（Ｎ＝３）；＊：ｐ＜０．０５  Ｔ検定。
［図５］
図５は、実施例５において、細胞へのＢｒｄＵ取り込み量の測定結果を示す。
図５ａ：ＰＤＧＦ添加；図５ｂ：ＦＣＳ添加。
平均値＋標準偏差（Ｎ＝３）；＊：ｐ＜０．０５  Ｔ検定。
［図６］
図６は、実施例６において、細胞へのＢｒｄＵ取り込み量の測定結果を示す（ＦＣＳ添加）。
平均値＋標準偏差（Ｎ＝３）；＊：ｐ＜０．０５  Ｔ検定。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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