(57)【要約】高価な自動分析装置や電子顕微鏡を必要とせず、蛍光顕微鏡による観察のみで、凝集反応を正確に測定することができ、特に、臨床検査等への応用の広い免疫凝集反応の測定方法を提供する。すなわち、測定対象物質である抗体（またはウィルス）に対応したウィルス（または抗体）に蛍光標識を施し、溶液中において、それらの凝集を観察することを特徴とする免疫凝集反応などの測定方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質である凝集反応しうる物質に蛍光標識を施し、溶液中において、それらの凝集を観察することを特徴とする凝集反応の測定方法。
【請求項２】
測定対象物質である抗体（またはウィルス）に対応したウィルス（または抗体）に蛍光標識を施し、溶液中において、それらの凝集を観察する免疫凝集反応を測定する請求項１に記載した方法。
【請求項３】
凝集反応が一次または二次以上の多次であり、免疫反応、多価結合分子反応またはその組み合わせである請求項１に記載した方法。
【請求項４】
測定対象物質が多価結合能を有する分子である請求項１に記載した方法。
【請求項５】
測定対象物質は凝集反応を惹起または誘発しうる物質または凝集反応を起こす物資である請求項１または３に記載した方法。
【請求項６】
測定対象物質である凝集反応しうる物質に蛍光標識を施してなる凝集反応する物質の検出試薬。
【請求項７】
測定対象物質である抗体（またはウィルス）に対応したウィルス（または抗体）に蛍光標識を施してなる、抗体またはウィルスを検出する請求項４に記載した試薬。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野：
本発明は、抗体とウィルスとの免疫凝集反応などの凝集反応を測定する方法に関する。
従来の技術：
臨床検査の分野では、生体試料（血液、尿など）を用いて種々の疾患の診断を行っているが、これらを診断する方法として、種々の測定法が開発され利用されている。これらの測定法の代表的方法として、酵素反応を利用する生化学測定法や抗原抗体反応を利用する免疫測定法が挙げられる。近年においては、生体試料中の成分を精度よく測定することが望まれ、特異性の高い抗原抗体反応を利用した免疫測定法が盛んに用いられている。
免疫測定法としては、免疫比濁法（ＴＩＡ法）、ラテックス比濁法（ＬＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）などが挙げられ、目的に応じて使い分けされている。
近年、生体試料中の微量成分の測定においては、癌などの早期発見やエイズウイルスなどの感染初期を診断するため、超微量でも測定できる方法が要望されている。超微量測定が可能な手法としては、特にＥＩＡ法が重用されている。また、その測定法自体の精度を上げるため、あるいは測定の簡素化を図るための各種応用法が研究されており、例えば、ＥＩＡ法の抗原または抗体を標識する物質として酵素の代わりに発光物質を利用する方法（特開平５−３４３４６号公報）や強磁性粒子に抗体を固定化し蛍光標識を行い、凝集を生じさせたのち、蛍光濃度測定を行う方法（特開平５−９９９２６号公報）、測定対象物質をキャリアータンパク質に複合化させた後、該キャリアータンパク質を不溶性担体に担持させることにより、Ｂ／Ｆ分離と呼ばれる操作（Ｂは免疫反応等により結合した成分、Ｆは未反応の成分）を不要とした方法（特開２０００−３３８１０８号公報）が提案されている。
しかしながら、上記方法は、それ以前の従来手法に比べれば測定時間等の点で簡素化されているものの、汎用自動分析装置や専用自動分析装置、或いは電子顕微鏡による観察を必要とし、簡易検査もしくは予備的検査の手法としては十分満足できるものではなかった。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、高価な自動分析装置や電子顕微鏡を必要とせず、蛍光顕微鏡による観察のみで、免疫凝集反応などを正確に測定することができ、臨床検査等への応用の広い免疫凝集反応の測定方法の提供を目的のひとつとする。
即ち、本発明は、測定対象物質である凝集反応しうる物質に蛍光標識を施し、溶液中において、それらの凝集を観察することを特徴とする凝集反応の測定方法である。
例えば、測定対象物質である抗体（またはウィルス）に対応したウィルス（または抗体）に蛍光標識を施し、溶液中において、それらの凝集を観察する免疫凝集反応を測定する方法である。
凝集反応が一次または二次以上の多次であり、免疫反応、多価結合分子反応、またはその組み合わせであることが好ましい。
測定対象物質が多価結合能を有する分子である場合も含む。
測定対象物質は凝集反応を惹起または誘発しうる物質または凝集反応を起こす物資を含む。
また、本発明は、測定対象物質である凝集反応しうる物質に蛍光標識を施してなる凝集反応する物質の検出試薬を提供する。測定対象物質である抗体（またはウィルス）に対応したウィルス（または抗体）に蛍光標識を施してなる、抗体またはウィルスを検出する試薬も含む。
これらの凝集を蛍光顕微鏡により観察することで免疫凝集反応などの凝集反応を正確に測定できる。
発明の詳細な説明：
以下に本発明を詳しく説明する。ウィルスに対応する抗ウィルス抗体を反応させるとウィルスの凝集体が形成されることは公知であるが、その観察には電子顕微鏡が必要になる。本発明では、測定対象物質である抗体（またはウィルス）と、蛍光標識を施したウィルス（または抗体）を含む溶液とを混ぜ合わせ、該蛍光標識が取り込まれたウィルスの凝集体を形成させ、それを蛍光顕微鏡により観察するという簡単な操作により免疫凝集反応を測定可能としたため、簡易検査もしくは予備的検査として非常に有用である。
即ち、本発明は、通常では光学顕微鏡レベルでは目視しえないウィルスという微生物を（目視しえない）蛍光標識した抗体で凝集させることにより非常に鮮明な凝集体として目視しうるものとした点に特徴を有する。即ち、２つ以上の固相化していない物質で、本来、溶液中で均一に分布するものが、ある特性（ここでは抗原抗体反応）を通じて極性を持つ分布（＝凝集）に変化すること、かつ、蛍光色素は均一分布である場合区別できませんが、分布に極性をもたらすことによって蛍光強度の勾配をもたらし、光学レベルで目視しうるものなりうるということ（名付けるなら「非固相系蛍光体再分布可視化特性」）を利用した方法である。
本発明の免疫凝集反応の測定方法は、測定対象物質である抗体（またはウィルス）に対応したウィルス（または抗体）に蛍光標識を施しておき、抗体またはウィルスの検出試薬、即ち従来法にはない迅速かつ簡便な検査キットとして応用することができる。ここで、蛍光標識は、ウィルスに対してでも抗体に対してでも、どちらでもよく、必要に応じ選択すればよい。また、蛍光標識を施したウィルス（または抗体）は、適当な緩衝液（リン酸緩衝液、トリス緩衝液）などにより希釈して用いられる。
ここで、本発明に係る免疫凝集反応より測定される測定対象物質としては、生体試料中のウィルスまたは抗体が挙げられ、例えば、肝炎（Ｂ型もしくはＣ型など）由来ウィルスまたは抗体、ＨＩＶウィルスまたは抗体、インフルエンザ由来ウィルスまたは抗体、大腸菌その他に感染するウィルスであるバクリオファージ等を例示することができるが、特にこれらに限定されるものではない。即ち、上記の如き、天然由来のウィルスや抗体に限らず、アプタマー、遺伝子組み換えによるリコンビナント抗体等、人工的な物質であっても、凝集反応を惹起するものであれば、本発明の対象となり得る。
上記免疫反応の他に、一分子あるいは一複合体で多価結合能を持つ物質、例えばアビジンなどの凝集反応を同様に検出できる。
また、本発明では、反応が一つの抗体により起こる一段階の凝集反応に限らず、一つの抗体（一次抗体）で凝集が不充分であれば、１次抗体に結合する抗体（二次抗体）を用いたものなど多段階の反応による凝集も対象となりうる。即ち、本発明は一次または二次以上の多次である免疫凝集反応に適用できる。
また、本発明で用いられる蛍光標識、並びに蛍光標識の付与手法には特に制限はなく、従来技術が適用でき、必要量の蛍光色素を対象物質に付与すればよい。蛍光顕微鏡観察の場合、その色素に応じたフィルターが必要となるため、この点から蛍光色素として最も一般的なフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の使用が便利である。
ほかに、蛋白性の蛍光色素など、他の蛍光色素も使用できる。例えば、ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎなどの蛍光蛋白である。また、蛍光色素含有シリカ球のような大きな蛍光体の表面に抗原をつけ抗体を反応させ凝集体を観察できる。
実施例
実施例１
大腸菌に感染するウィルスであるバクテリオファージに対して、蛍光標識を行った抗Ｍ１３抗体を反応させて観察を行った。
＜材料＞
・線維状ファージＭ１３ＫＯ７  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）
・抗Ｍ１３抗体（抗Ｍ１３ＫＯ７  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅに結合するモノクローナル抗体）（アマシャムバイオテク社製）
・蛍光標識（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）（５（６）−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムなどを含む）。
＜抗体の標識＞
抗Ｍ１３抗体（１ｍｇ／ｍｌ）２００μｌにリン酸緩衝食塩水を３００μｌ加え、５００μｌとしＤｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅに溶解した５（６）−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（２０ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加え、緩やかな攪拌を行いながら２時間、室温にて反応させた。反応後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて標識した抗体と未反応の５（６）−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒを分離した。
＜ファージの検出＞
ファージ溶液（１０１〜１０７ｃｆｕ；ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ／μｌ）１μｌに標識抗体（１．５ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加え攪拌後、すぐに２μｌの反応液をスライドガラス上にのせ、カバーガラスをかけて蛍光顕微鏡にて観察した。図１はその観察写真である。
（結果）
反応直後から明瞭な蛍光を発する凝集体を１０４〜１０７／μｌの濃度のファージ反応溶液で検出することができた。
一方、対照実験として、抗Ｍ１３抗体の代わりに蛍光標識した抗マウス抗体、抗ウサギ抗体を使用したところ、凝集体は検出できなかった。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の実施例における凝集反応の観察を示す顕微鏡写真である。
【図１】
2003060519.tif 000002
【国際調査報告】
2003060519.tif 000003
2003060519.tif 000004