(57)【要約】酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物またはそのプロドラッグを含む医薬品の薬理作用を評価するための検査薬、並びに酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法が提供される。上記の検査薬および方法に用いられる試薬は（ａ）試料中の酵素の基質となる化合物、（ｂ）（ａ）の酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物、（ｃ）試料中の酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物、（ｄ）（ｃ）の酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物、（ｅ）試料中の受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体のいずれの物質を含む。
2003071271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物またはそのプロドラッグを含む医薬品の薬理作用を評価するための検査薬であって、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の医薬品に含まれる受容体リガンド、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む前記検査薬。
【請求項２】
医薬品と、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の医薬品に含まれる受容体リガンド、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む検査薬を被験体に投与し、
前記被験体から生体試料を少なくとも１回採取し、
前記生体試料における前記物質自体またはその代謝物の量を測定し、
前記測定の数値に基づいて医薬品の薬理作用を評価することを含む、医薬品の薬理作用を評価する方法において使用される請求項１記載の検査薬。
【請求項３】
検査薬が（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の１３Ｃ−標識体を含み、被験体の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度を測定する請求項２記載の検査薬。
【請求項４】
酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法であって、
酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から評価対象の薬物またはプロドラッグを選択し、前記評価対象の薬物またはプロドラッグと、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の薬物である受容体リガンド、または評価対象のプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む試薬をヒト以外の被験体に投与し、
前記被験体から生体試料を少なくとも１回採取し、
前記生体試料における前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質自体またはその代謝物の量を測定し、
前記測定の数値に基づいて前記評価対象の薬物またはプロドラッグの薬理作用を評価することを含む、前記の方法。
【請求項５】
試薬が（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の１３Ｃ−標識体を含み、被験体の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度を測定する請求項４記載の方法。
【請求項６】
酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングするための試薬であって、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の薬物である受容体リガンド、または評価対象のプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む前記試薬。
【請求項７】
酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から評価対象の薬物またはプロドラッグを選択し、
前記評価対象の薬物またはプロドラッグと、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の薬物である受容体リガンド、または評価対象のプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む試薬をヒト以外の被験体に投与し、
前記被験体から生体試料を少なくとも１回採取し、
前記生体試料における前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質自体またはその代謝物の量を測定し、
前記測定の数値に基づいて前記評価対象の薬物またはプロドラッグの薬理作用を評価することを含む、酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法において使用される請求項６記載の試薬。
【請求項８】
試薬が（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の１３Ｃ−標識体を含み、被験体の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度を測定する請求項７記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬品の薬理作用を評価するための検査薬、並びに酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法および試薬に関する。
背景技術
医薬品の薬理作用は、臨床症状の変化（改善あるいは副作用の出現）により判定されている。
臨床症状からの判定は、ある期間、医薬品の投与を行った後でなくては不可能である。
また、医薬品由来の薬物の血中濃度が経験的に得られた治療域内あるいは安全域内であるかどうかを確認することで間接的に薬理作用を評価する血中濃度モニタリングも行われるが、薬理作用と血中濃度との間にある程度の良い相関があり、かつ治療域あるいは安全域が明らかであることが前提である（標準薬理学  第５版  海老原昭夫監修（１９９７）Ｐ．３１）上に、薬理作用を評価する方法としてはあくまでも間接的である。
本発明は、医薬品を投与したことによる医薬品のターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能の亢進度あるいは阻害度を短時間で正確に測定する検査薬を提供することで医薬品の薬理作用を評価することを目的とする。
ところで、医薬用化合物のスクリーニングでは医薬効果が高くかつ副作用ができる限り小さいものを選定する。医薬品の多くはターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を阻害あるいは亢進することで薬理作用を発現する。従って、薬理作用は医薬品のターゲットの機能の阻害度あるいは亢進度を知ることで評価できる。
現在、ターゲットの機能の阻害度あるいは亢進度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価されている。近年ではＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）と呼ばれる大処理量が可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ系が主流である。これは、９６穴、３８４穴，１５３６穴プレートといった高密度プレートを使用、オートメーション等の技術を最大限に利用し、数十万検体にもおよぶ多数の検体の薬理作用を高速に評価する方法である。
しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した結果は、必ずしも個体に投与した結果と一致しない。
個体に投与した結果は、臨床症状の変化（改善あるいは副作用の出現）を観察するしかない。
本発明は、従来法では不可能であった、ホールボディを用いたかつリアルタイムでのターゲット機能阻害度あるいは亢進度の評価により、薬物および／またはプロドラッグの中から投与効果の高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法および試薬を提供することを目的とする。
発明の開示
医薬品の多くはターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を阻害あるいは亢進することで薬理作用を発現する。例えば、酵素を含む医薬品は生体内酵素反応を亢進し、酵素阻害剤を含む医薬品は生体内酵素反応を阻害し、受容体リガンドを含む医薬品は受容体との結合によって受容体の機能を亢進あるいは阻害し、ひいては関連する生体内酵素反応を亢進あるいは阻害することで薬理作用を発現する。従って、医薬品の薬理作用は、医薬品を投与したことによる医薬品のターゲットの機能の亢進度あるいは阻害度を知ることで評価できる。
本発明は、酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物またはそのプロドラッグを含む医薬品の薬理作用を評価するための検査薬であって、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の医薬品に含まれる受容体リガンド、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む前記検査薬を提供する。
本発明の検査薬は、
医薬品と、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の医薬品に含まれる受容体リガンド、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む検査薬を被験体に投与し、
前記被験体から生体試料を少なくとも１回採取し、
前記生体試料における前記物質自体またはその代謝物の量を測定し、
前記測定の数値に基づいて医薬品の薬理作用を評価することを含む、医薬品の薬理作用を評価する方法において使用されるとよい。
医薬品は、本発明の検査薬の投与と同時または投与前に、１回以上被験体に投与しておくとよい。
上記の方法において、検査薬が（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の１３Ｃ−標識体を含む場合には、被験体の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度を測定するとよい。
本明細書において、「酵素を含む医薬品」とは、酵素を投与することによる生体内酵素反応の亢進により薬効をしめす製剤をいい、酵素を含む医薬品としては、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、リゾチーム、アミラーゼ、含糖ペプシン、ジアスターゼ、パンクレアチンなどを各々含む製剤を例示することができる。
「酵素阻害剤」とは、生体内酵素と結合し、反応速度を遅延あるいは停止させる物質をいい（薬物代謝辞典  山本郁男  編著（１９９６）ｐ２４１）、酵素阻害剤としては、糖尿病治療薬として使用されるアカルボース（α−グルコシダーゼ阻害剤）、高脂血症として使用されるシンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、降圧剤として使用されるマレイン酸エナラプリル、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸キナプリル、カプトプリル、シラザプリルなどのアンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗癌剤として使用されるメトトレキサート（葉酸還元酵素阻害剤）、塩酸ファドロゾール（アロマターゼ阻害剤）、ＡＩＤＳ治療薬として使用される、メシル酸サキナビルなどのＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ジドブシン（ウイルス逆転写酵素阻害剤）、ホスカルネット（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）、インフルエンザ治療薬として使用されるザナビル水和物などのノイラミニダーゼ阻害剤などを例示することができる。
「受容体リガンド」とは、細胞膜上あるいは細胞内に存在する受容体タンパク質に特異的に結合する物質をいい、受容体と受容体リガンドが結合することでその組み合わせに特異的な生物反応が生ずる。本来生体内に存在する受容体リガンドとしてはホルモン、神経伝達物質などが挙げられる。医薬品として投与される場合、本来生体内に存在する受容体リガンドが受容体と結合して生じる生物反応を、刺激薬・作動薬として促進させることを目的とする。あるいは、拮抗薬・遮断薬として阻害・遮断することを目的とする。具体的には、消化性潰瘍治療薬として用いられる塩酸ラニチジン、シメチジン、ファモチジン、ラフチジンなどを含むヒスタミンＨ２受容体遮断剤、エストラジオールおよびその誘導体、エストリオールおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、テストステロンおよびその誘導体などのホルモン剤、血管拡張薬として用いられるトラゾリン、イフェンプロジル、ニセルゴリンなどのα受容体抑制薬、狭心症治療薬として用いられる塩酸アルプレノロール、塩酸ブフェトロールをはじめとするβ受容体遮断薬などを例示することができる。
「プロドラッグ」とは、それ自体は薬理学的に不活性であるが、生体内で酵素反応あるいは非酵素的反応により薬理作用を現す物質に変換される物質をいい（薬物代謝辞典  山本郁男  編著（１９９６）ｐ３７７）、スリンダク（還元されて消炎・鎮痛効果を示すスルフィド体に変換される）、ロキソプロフェン（消炎・鎮痛効果を示すｔｒａｎｓ−ＯＨ体に変換される）、ナブメトン（消炎・鎮痛効果を示す６−メトキシ−２−ナフチル酢酸に変換される）、インドメタシンファルネシル（消炎・鎮痛効果を示すインドメタシンに変換される）などを例示することができる。
「医薬品の薬理作用」とは、ターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を亢進あるいは阻害することで発現する作用であり、投与効果および副作用がこれに含まれる。すなわち、投与効果とはターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を亢進あるいは阻害の持続により、病態が改善することであり、副作用とはその持続により出現する有害作用のことである。
従って、「医薬品の薬理作用を評価する」とは、病態が改善にいたるに十分な、医薬品のターゲットの機能の亢進あるいは阻害が得られているかを評価することあるいは副作用の出現の恐れがある医薬品のターゲットの機能の亢進あるいは阻害がもたらされていないかを評価することをいう。
「酵素の基質」とは、酵素と直接結合することで変化を受ける物質をいい、酵素とその基質としては、ジアスターゼとサイクロデキストリン、α−グルコシダーゼとマルトース、パンクレアチンとタンパク質、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素とＨＭＧ−ＣｏＡ、アロマターゼとアンドロゲンなどを例示することができる。
「酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素」とは、酵素と共役反応系を構成するあるいは酵素により活性化される別の酵素などをいう。
酵素、その酵素の効果とカップリングして活性が変化する酵素とその別の酵素の基質としては、以下の表に記載のものを例示することができる。
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「酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素」とは、酵素阻害剤に直接阻害される酵素と共役反応系を構成するために、その酵素自体は阻害されないが活性は変化する酵素などをいう。
酵素阻害剤、酵素阻害剤が直接阻害する酵素とその基質、酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素とその基質としては、以下の表に記載のものを例示することができる。
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リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素およびその基質としては、以下の表に記載のものを例示することができる。
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「標識体」とは、その化合物自体あるいはその代謝物が検出可能な性質を備えている状態をいい、標識の方法としては、安定同位体（例えば、１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１８Ｏなど）や放射性同位体（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉなど）などの同位体によるものと、発色性、蛍光性の置換基（例えば、フルオレセイン、メチルクマリルアミド、カルセイン、ローダミンなど）によるものなどを例示することができる。
「１３Ｃ−標識体」とは、化合物中の１３Ｃ濃度を天然存在比以上に高めた物質をいい、中でも特定位の１３Ｃ濃度が高まったものが望ましく、１３Ｃ−標識体としては、市販されている１３Ｃ標識ＮａＨＣＯ３、１３Ｃ標識ぎ酸、１３Ｃ標識酢酸、１３Ｃ標識プロピオン酸、１３Ｃ標識乳酸、１３Ｃ標識酪酸、１３Ｃ標識ピルビン酸、１３Ｃ標識安息香酸などの有機酸や、１３Ｃ標識アラニンをはじめとする１３Ｃ標識アミノ酸、１３Ｃ標識グルコースなどの１３Ｃ標識糖類、１３Ｃ標識エタノールをはじめとする１３Ｃ標識アルコール類などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
「被験体」とは、本発明の検査薬を投与する対象となる生体をいい、「生体」とは、生きている個体をいう。被験体としては、（１）ヒト、（２）イヌ、ネコをはじめとするペット動物、（３）ラット、マウス、モルモット、ウサギ、サルなどの実験動物あるいは（４）その他の哺乳動物を例示することができる。
被験体から採取する生体試料としては、呼気、血液、尿などを例示することができる。
「代謝物」とは、物質を生体に投与した後、その物質が代謝される過程で生成する物質をいい、上記の（ａ）〜（ｆ）の物質の代謝物としては、以下の表に記載のものを例示することができる。
2003071271.tif 000006
医薬品の多くはターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を亢進あるいは阻害することで薬理作用を発現する。例えば、酵素を含む医薬品は生体内酵素反応を亢進し、酵素阻害剤を含む医薬品は生体内酵素反応を阻害し、受容体リガンドを含む医薬品は受容体との結合によって受容体の機能を亢進あるいは阻害し、ひいては関連する生体内酵素反応を亢進あるいは阻害することで薬理作用を発現する。従って、医薬品の薬理作用は医薬品を投与したことによる医薬品のターゲットの機能の亢進度あるいは阻害度を知ることで評価できる。本発明の検査薬は、ターゲットの機能亢進度あるいは阻害度を評価することにより医薬品の薬理作用を評価するものである。
それらの原理を以下に示す。
１．ターゲットが酵素の場合（酵素、酵素阻害剤あるいはそれらのプロドラッグを含む医薬品の場合）
ターゲット自体の基質あるいはターゲットとの共役反応などターゲットの機能が亢進あるいは阻害されることで変化が生じる酵素反応に関与する第二の酵素の基質あるいはその標識体を検査薬として被験体に投与し、ターゲットの機能亢進または阻害による検査薬由来の代謝物あるいは検査薬自体の増減を測定することにより、医薬品のターゲットの機能亢進度あるいは阻害度を評価する。たとえば、酵素を含む医薬品の場合、ターゲットである生体内酵素の基質あるいはその標識体を検査薬として被験体に投与した際に、検査薬由来の代謝物が増加していれば、医薬品がターゲットの機能を亢進していると考えられるので、医薬品が十分に効果を上げていることが確認できる。また、たとえば、酵素阻害剤を含む医薬品の場合、ターゲットである酵素の基質あるいはその標識体を検査薬として被験体に投与した際に、検査薬由来の代謝物がほとんど検出されなければ、医薬品がターゲットの機能を十分に阻害していると考えられるので、医薬品が十分に投薬効果を上げていることが確認できる。
２．ターゲットが受容体の場合（受容体リガンドあるいはそのプロドラッグを含む医薬品の場合）
ターゲットに医薬品が結合することで変化が生じる酵素反応の基質あるいはその標識体を検査薬として被験体に投与し、酵素反応による検査薬由来の代謝物あるいは検査薬自体の増減を測定することにより、医薬品によるターゲット機能亢進度あるいは阻害度を評価する。たとえば、医薬品がターゲットに結合することで亢進される生体内酵素反応の基質あるいはその標識体を検査薬として被験体に投与した場合、検査薬由来の代謝物が増加していれば、医薬品がターゲットの機能を亢進していると考えられるので、医薬品が十分に効果を上げていることが確認できる。また、たとえば、医薬品がターゲットに結合することで阻害される生体内酵素反応の基質あるいはその標識体を検査薬として被験体に投与した場合、検査薬由来の代謝物がほとんど検出されなければ、医薬品がターゲットの機能を完全に阻害していると考えられるので、医薬品が十分に投薬効果を上げていることが確認できる。
本発明の検査薬は、下記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等）、注射剤に製剤化されたものであるとよい。
（ａ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の医薬品に含まれる酵素、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の医薬品に含まれる酵素阻害剤、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の医薬品に含まれる受容体リガンド、または評価対象の医薬品に含まれるプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
（ａ）〜（ｆ）いずれも薬剤学的に許容できる塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩；酢酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、マレイン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムなどのアルカリ土類金属との塩などを例示することができる。
上記の（ａ）〜（ｆ）の物質は、市販のものを使用してもよいし、市販の原料から公知の方法で製造してもよい。
例えば、１３Ｃ−標識ＤＯＰＡは後述の製造例１のようにして製造することができる。同様の方法により１４Ｃ−標識ＤＯＰＡの製造も可能である。
１３Ｃ−または１４Ｃ−標識ペプチドまたはその塩は、市販の１３Ｃ−または１４Ｃ−標識アミノ酸を利用して、公知の方法で合成することができる。例えば、実験化学講座２２  有機合成ＩＶ、日本化学会編、丸善刊（１９９２）に記載の方法により製造することができるが、その一例について、以下に説明する。
１３Ｃ標識アミノ酸を塩化水素／メタノールに溶解後還流し、得られたメチルエステルをジクロロメタンに懸濁後氷冷撹拌下トリエチルアミンを滴下する。さらに、Ｎ−ベンゾイル−アミノ酸、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ・Ｈ２Ｏ）及びジクロロメタンを添加する。次に、ＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ・ＨＣｌ）をジクロロメタンに溶解した溶液を加え、撹拌する。濃縮した後酢酸エチルで抽出し、１Ｎ−塩酸、５％ＮａＨＣＯ３、水で洗浄後硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮乾固することで、または、さらにけん化することで、１３Ｃ標識ペプチドが得られる。
１３Ｃ−または１４Ｃ−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩は、各々文献（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７６（１９８８），１０７−１１５、特開平３−９１４９６、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ４６４９１０８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３３６（１９８４），３６８−３７３、特開平８−２９１）に記載された方法で合成することができる。その際、例えば、市販の１３Ｃ−または１４Ｃ−標識マルトオリゴ糖、または公知の方法で得られる１３Ｃ−または１４Ｃ−標識マルトオリゴ糖を原料として用いることにより、１３Ｃ−または１４Ｃ−標識された上記の化合物を合成することができる。
例えば、非還元末端が修飾されたオリゴ糖の一つであるガラクトシルオリゴ糖は、オリゴ糖に、乳糖を加えてラクターゼを作用させ、反応混合物からカラムクロマトグラフィーにより分取することにより得ることができる（特開平４−２０９２７７公報，特開平８−１９６２８９公報，特開平１０−３１６６９７公報）。この際、例えば、１３Ｃ−または１４Ｃ−標識されたオリゴ糖を用いることにより、１３Ｃ−または１４Ｃ−標識ガラクトシルオリゴ糖を得ることができる。また、１３Ｃ−または１４Ｃ−ガラクトシル標識乳糖を使用すれば、ガラクトシル基が１３Ｃ−または１４Ｃ−標識されたガラクトシルオリゴ糖がえられる。
賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。注射剤の場合、一般に滅菌水、生理食塩水、各種緩衝液が望ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いたり、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解して投与することもできる。
上記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質（以下、「主成分」という）の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常１〜１００重量％、好ましくは５０〜１００重量％である。例えば注射剤の場合には、通常１〜４０重量％となるよう主成分を添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤の場合は、製剤中における主成分の含量は、約１０〜１００重量％、好ましくは５０〜１００重量％であり、残部は担体である。
本発明の検査薬の投与量は、被験体から採取した生体試料中の主成分の主成分自体またはその代謝物が確認できる量が必要であり、被験体の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば１回当たりの投与量は成人の場合、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度である。
本発明の検査薬を用いる検査では、医薬品の投与（例えば、経口投与）後または投与と同時に、被験体に本発明の検査薬を投与（例えば、経口投与）し、一定時間後の、主成分自体またはその代謝物の血中への移行量または体外への排出量（例えば、尿中・呼気中への排出量）、あるいは投与後一定時間までの血中への移行量または体外への排出量の積算または経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）の測定データから医薬品の薬理作用を評価することができる。
測定方法は、測定対象（血液、尿、呼気）および投与物質（主成分）に応じて選択され、比色定量法、蛍光定量法、質量分析法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法、ＨＰＬＣ法、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、光電音響分光法、ＧＭ計数管法、液体シンチレーション法、固体シンチレーション法、オートラジオグラフィー、電離箱法などで行うことができる。
具体的には、血中への移行量を測定する場合には、採血した血液をそのまま測定してもよいし、分離・前処理などの操作を施した血液を測定してもよい。例えば、蛍光性の基で標識した化合物を検査薬として投与し、一定時間後に採血をおこない、血清あるいは血漿を調製し、蛍光強度を比較することなどによりおこなう。あるいは、紫外部や可視部に吸収をもつ置換基で標識した化合物を検査薬として投与する場合には、一定時間後に採血をおこない血清あるいは血漿サンプルの紫外部や可視部の吸収を吸光光度計などで測定してもよいし、また、採血することなく皮膚上から血液の紫外部や可視部の吸収を測定してもよい。
また、尿を試料とする場合には、尿をそのまま測定してもよいし、分離・前処理などの操作を施した尿を測定してもよい。例えば、蛍光性の基で標識した化合物を検査薬として投与し、一定時間後に採尿をおこない、尿中の蛍光強度を比較することなどによりおこなう。あるいは、紫外部や可視部に吸収をもつ置換基で標識した化合物を検査薬として投与する場合には、一定時間後に採尿をおこない尿サンプルの紫外部や可視部の吸収を吸光光度計などで測定することによりおこなう。
呼気中への排出量を測定する場合で、たとえば１３Ｃ標識化合物を検査薬として用いる際には、その測定を１３ＣＯ２のガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法等で行うことができる。また１４Ｃ標識化合物を検査薬として用いる際には、呼気を直接あるいは溶媒等にＣＯ２をトラップした後、ＧＭ計数管、液体シンチレーションカウンター、固体シンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー、電離箱法などで測定を行うことができる。
ところで、前述のように、医薬品の多くはターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を亢進あるいは阻害することで薬理作用を発現する。例えば、酵素からなる薬物は生体内酵素反応を亢進し、酵素阻害剤からなる薬物およびそのプロドラッグは生体内酵素反応を阻害し、受容体リガンドからなる薬物およびそのプロドラッグは受容体とリガンドの結合によって受容体の機能を亢進あるいは阻害し、ひいては関連する生体内酵素反応を亢進あるいは阻害することで薬理作用を発現する。従って、医薬品の薬理作用は薬物またはプロドラッグを投与したことによる薬物またはプロドラッグのターゲット機能の亢進度あるいは阻害度を知ることで評価できる。この原理を応用すれば、薬物および／またはプロドラッグの中から投与効果の高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングすることができる。
本発明は、酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法であって、
酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から評価対象の薬物またはプロドラッグを選択し、前記評価対象の薬物またはプロドラッグと、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の薬物である受容体リガンド、または評価対象のプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む試薬をヒト以外の被験体に投与し、
前記被験体から生体試料を少なくとも１回採取し、
前記生体試料における前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質自体またはその代謝物の量を測定し、
前記測定の数値に基づいて前記評価対象の薬物またはプロドラッグの薬理作用を評価することを含む、前記の方法を提供する。この方法によりスクリーニングされる薬物および／またはプロドラッグは、投与効果ができる限り高いもの、副作用ができる限り小さいもの、投与効果ができる限り高くかつ副作用ができる限り小さいものであることが好ましい。
評価対象の薬物またはプロドラッグは、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質を含む試薬の投与と同時または投与前に、１回以上被験体に投与しておくとよい。
また、本発明は、酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングするための試薬であって、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の薬物である受容体リガンド、または評価対象のプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む前記試薬を提供する。
本発明の試薬は、酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から評価対象の薬物またはプロドラッグを選択し、
前記評価対象の薬物またはプロドラッグと、下記の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の薬物である受容体リガンド、または評価対象のプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
のいずれかの物質を含む試薬をヒト以外の被験体に投与し、
前記被験体から生体試料を少なくとも１回採取し、
前記生体試料における前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質自体またはその代謝物の量を測定し、
前記測定の数値に基づいて前記評価対象の薬物またはプロドラッグの薬理作用を評価することを含む、酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法において使用されるとよい。この方法によりスクリーニングされる薬物および／またはプロドラッグは、投与効果ができる限り高いもの、副作用ができる限り小さいもの、投与効果ができる限り高くかつ副作用ができる限り小さいものであることが好ましい。
評価対象の薬物またはプロドラッグは、本発明の試薬の投与と同時または投与前に、１回以上被験体に投与しておくとよい。
本発明のスクリーニング方法および試薬において、試薬が（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の１３Ｃ−標識体を含む場合には、被験体の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度を測定するとよい。
本明細書において、「酵素からなる薬物」とは、酵素を投与することによる生体内酵素反応の亢進により薬効をしめす製剤をいい、酵素からなる薬物としては、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、リゾチーム、アミラーゼ、含糖ペプシン、ジアスターゼ、パンクレアチンなどを各々含む製剤を例示することができる。
「酵素阻害剤」とは、前述の通りである。
「受容体リガンド」とは、前述の通りである。
「プロドラッグ」とは、前述の通りである。
「薬物またはプロドラッグの薬理作用」とは、ターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を亢進あるいは阻害することで発現する作用であり、投与効果および副作用がこれに含まれる。すなわち、投与効果とはターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を亢進あるいは阻害の持続により病態が改善することであり、副作用とはその持続により出現する有害作用のことである。
従って、「薬物またはプロドラッグの薬理作用を評価する」とは、病態が改善にいたるに十分な、薬物またはプロドラッグのターゲットの機能の亢進あるいは阻害が得られているかを、あるいは副作用の出現の恐れがある医薬品のターゲットの機能の亢進あるいは阻害がもたらされていないかを評価することをいう。
「酵素の基質」とは、前述の通りである。
「酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素」とは、前述の通りである。
酵素、その酵素の効果とカップリングして活性が変化する酵素とその別の酵素の基質としては、前記の表１に記載のものを例示することができる。
「酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素」とは、前述の通りである。
酵素阻害剤、酵素阻害剤が直接阻害する酵素とその基質、酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素とその基質としては、前記の表２に記載のものを例示することができる。
リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素およびその基質としては、前記の表３に記載のものを例示することができる。
「標識体」とは、前述の通りである。
「１３Ｃ−標識体」とは、前述の通りである。
「被験体」とは、前述の通りである。
「代謝物」とは、物質を生体に投与した後、その物質が代謝される過程で生成する物質をいい、上記の（ａ）〜（ｆ）の物質の代謝物としては、以下の表５に記載のものを例示することができる。
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薬物およびそのプロドラッグの多くはターゲット（生体内酵素あるいは受容体）の機能を亢進あるいは阻害することで薬理作用を発現する。例えば、酵素からなる薬物は生体内酵素反応を亢進し、酵素阻害剤からなる薬物またはプロドラッグから生じる酵素阻害剤は生体内酵素反応を阻害し、受容体リガンドからなる薬物またはプロドラッグから生じる受容体リガンドは受容体との結合によって受容体の機能を亢進あるいは阻害し、ひいては関連する生体内酵素反応を亢進あるいは阻害することで薬理作用を発現する。従って、薬物の薬理作用は薬物またはプロドラッグを投与したことによる薬物またはプロドラッグのターゲットの機能亢進度あるいは阻害度を知ることで評価できる。本発明のスクリーニング方法および試薬は、ターゲット機能亢進度あるいは阻害度を評価することによって医薬品の薬理作用を評価することにより、薬物および／またはプロドラッグの中から投与効果の高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法および試薬である。
それらの原理を以下に示す。
１．ターゲットが酵素の場合（酵素、酵素阻害剤あるいはそれらのプロドラッグを評価対象とする場合）
ターゲット自体の基質あるいはターゲットとの共役反応などターゲットの機能が亢進あるいは阻害されることで変化が生じる酵素反応に関与する第二の酵素の基質またはその標識体をスクリーニング試薬として被験体に投与し、ターゲットの機能亢進または阻害によるスクリーニング試薬由来の代謝物あるいはスクリーニング試薬自体の増減を測定することにより、酵素、酵素阻害剤あるいはそれらのプロドラッグのターゲット機能亢進度あるいは阻害度を評価する。たとえば、評価対象が酵素である場合、ターゲットである生体内酵素の基質あるいはその標識体をスクリーニング試薬として被験体に投与した際に、スクリーニング試薬由来の代謝物が増加していれば、酵素の機能が亢進していると考えられるので、評価対象の酵素が十分に投薬効果を上げていることが確認できる。また、たとえば、評価対象が酵素阻害剤である場合、ターゲットである酵素の基質あるいはその標識体をスクリーニング試薬として被験体に投与した際に、スクリーニング試薬由来の代謝物がほとんど検出されなければ、酵素阻害剤がターゲットの機能を十分に阻害していると考えられるので、酵素阻害剤が十分に投薬効果を上げていることが確認できる。
２．ターゲットが受容体の場合（受容体リガンドあるいはそのプロドラッグを評価対象とする場合）
ターゲットに受容体リガンドあるいはそのプロドラッグが結合することで変化が生じる酵素反応の基質またはその標識体をスクリーニング試薬として被験体に投与し、酵素反応によるスクリーニング試薬由来の代謝物あるいはスクリーニング試薬自体の増減を測定することにより、受容体リガンドあるいはそのプロドラッグによるターゲット機能亢進度あるいは阻害度を評価する。たとえば、受容体リガンドあるいはそのプロドラッグがターゲットに結合することで亢進される生体内酵素反応の基質またはその標識体をスクリーニング試薬として被験体に投与した場合、スクリーニング試薬由来の代謝物が増加していれば、受容体リガンドあるいはそのプロドラッグがターゲットの機能を亢進していると考えられるので、受容体リガンドあるいはそのプロドラッグが十分に効果を上げていることが確認できる。また、たとえば、受容体リガンドあるいはそのプロドラッグがターゲットに結合することで阻害される生体内酵素反応の基質またはその標識体をスクリーニング試薬として被験体に投与した場合、スクリーニング試薬由来の代謝物がほとんど検出されなければ、受容体リガンドあるいはそのプロドラッグがターゲットの機能を完全に阻害していると考えられるので、受容体リガンドあるいはそのプロドラッグが十分に投薬効果を上げていることが確認できる。
本発明のスクリーニングのための試薬は、下記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等）、注射剤に製剤化されたものであるとよい。
（ａ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｂ）評価対象の薬物である酵素、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素の効果とカップリングして活性が変化する別の酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｃ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤が直接阻害する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｄ）評価対象の薬物である酵素阻害剤、または評価対象のプロドラッグから生じる酵素阻害剤の効果とカップリングして活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
（ｅ）評価対象の薬物である受容体リガンド、または評価対象のプロドラッグから生じる受容体リガンドが受容体に結合することにより活性が変化する酵素の基質となる化合物若しくは薬剤学的に許容できるその塩、
または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの物質の標識体
（ａ）〜（ｆ）いずれも薬剤学的に許容できる塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩；酢酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、マレイン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムなどのアルカリ土類金属との塩などを例示することができる。
上記の（ａ）〜（ｆ）の物質は、市販のものを使用してもよいし、市販の原料から公知の方法で製造してもよい。その製法は、前述の通りである。
賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。注射剤の場合、一般に滅菌水、生理食塩水、各種緩衝液が望ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いたり、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解して投与することもできる。
上記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの物質（以下、「主成分」という）の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常１〜１００重量％、好ましくは５０〜１００重量％である。例えば注射剤の場合には、通常１〜４０重量％となるよう主成分を添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤の場合は、製剤中における主成分の含量は、約１０〜１００重量％、好ましくは５０〜１００重量％であり、残部は担体である。
本発明のスクリーニングのための試薬の投与量は、被験体から採取した生体試料中の主成分自体またはその代謝物が確認できる量が必要であり、被験体の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば１回当たりの投与量は成人の場合、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度である。
本発明の試薬を用いるスクリーニングでは、評価対象の薬物またはプロドラッグの投与（例えば、経口投与）後または投与と同時に、被験体に本発明の試薬を投与（例えば、経口投与）し、一定時間後の、主成分自体またはその代謝物の血中への移行量または体外への排出量（例えば、尿中・呼気中への排出量）、あるいは投与後一定時間までの血中への移行量または体外への排出量の積算または経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）の測定データから評価対象の薬物またはプロドラッグの薬理作用を評価することができる。
測定方法は、測定対象（血液、尿、呼気）および投与物質（主成分）に応じて選択され、比色定量法、蛍光定量法、質量分析法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法、ＨＰＬＣ法、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、光電音響分光法、ＧＭ計数管法、液体シンチレーション法、固体シンチレーション法、オートラジオグラフィー、電離箱法などで行うことができる。
具体的には、血中への移行量を測定する場合には、採血した血液をそのまま測定してもよいし、分離・前処理などの操作を施した血液を測定してもよい。例えば、蛍光性の基で標識した化合物を試薬として投与し、一定時間後に採血をおこない、血清あるいは血漿を調製し、蛍光強度を比較することなどによりおこなう。あるいは、紫外部や可視部に吸収をもつ置換基で標識した化合物を試薬として投与する場合には、一定時間後に採血をおこない血清あるいは血漿サンプルの紫外部や可視部の吸収を吸光光度計などで測定してもよいし、また、採血することなく皮膚上から血液の紫外部や可視部の吸収を測定してもよい。
また、尿を試料とする場合には、尿をそのまま測定してもよいし、分離・前処理などの操作を施した尿を測定してもよい。例えば、蛍光性の基で標識した化合物を試薬として投与し、一定時間後に採尿をおこない、尿中の蛍光強度を比較することなどによりおこなう。あるいは、紫外部や可視部に吸収をもつ置換基で標識した化合物を試薬として投与する場合には、一定時間後に採尿をおこない尿サンプルの紫外部や可視部の吸収を吸光光度計などで測定することによりおこなう。
呼気中への排出量を測定する場合で、たとえば１３Ｃ標識化合物を試薬として用いる際には、その測定を１３ＣＯ２のガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法等で行うことができる。また１４Ｃ標識化合物を試薬として用いる際には、呼気を直接あるいは溶媒等にＣＯ２をトラップした後、ＧＭ計数管、液体シンチレーションカウンター、固体シンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー、電離箱法などで測定を行うことができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００２−４４５２６号及び特願２００２−４４７９１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。実験に使用したラット（Ｗｉｓｔａｒ雄  ７週令）は、日本チャールズリバーより購入した。
［製造例１］  Ｌ−［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡの製造
［１−１３Ｃ］Ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｍａｓｓ  Ｔｒａｃｅ社製、２．４４ｇ，３２ｍｍｏｌ）にＨ２Ｏ（１０ｍｌ）およびＡｃ２Ｏ（６．８８ｇ，６４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分間攪拌した。冷蔵庫に一夜放置し、析出した結晶をろ取、冷水（３ｍｌ）で洗浄した。ろ液を減圧濃縮した後、Ｈ２Ｏ（２．５ｍｌ）を加え、加熱還流し溶解した。これを冷蔵庫に一夜放置し、析出した結晶をろ取、冷水（１ｍｌ）で洗浄した後、１００℃で減圧乾燥し無色微細針状結晶としてＡｃＮＨＣＨ２１３ＣＯ２Ｈを得た。
３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ（１．５ｇ，１０．８ｍｍｏｌ），ＡｃＮＨＣＨ２１３ＣＯ２Ｈ（１．１８ｇ，１０ｍｍｏｌ）およびＡｃＯＮａ（２．４６ｇ，３０ｍｍｏｌ）をよく混和した後、ＡｃＯ２（１０ｍＬ）中に加え、１２０℃で５時間攪拌した後、室温で一夜放置した。反応液を氷水５００ｍＬ中に加え、析出した黄色粉末をろ取、水１００ｍＬ及び熱水２０ｍＬで洗浄した後、風乾した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｔ＝１：１）で精製し、黄色結晶として［ｃａｒｂｏｎｙｌ−１３Ｃ］２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−（３，４−ｄｉａｃｅｔｏｘｙｂｅｎｚａｌ）−５−ｏｘｚｏｌｏｎｅ（１．７６ｇ，５８％）を得た。
［ｃａｒｂｏｎｙｌ−１３Ｃ］２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−（３，４−ｄｉａｃｅｔｏｘｙｂｅｎｚａｌ）−５−ｏｘｚｏｌｏｎｅ（１．３１ｇ，４．３ｍｍｏｌ）およびＡｃＯＮａ（１．６ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１２ｍＬ）中に加え、５時間還流した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＝１０：１，ＡｃＯＥｔ−ＭｅＯＨ＝４０：１）で精製し、微黄色アモルファス（１．０２ｇ  ６４％）を得た。微黄色アモルファスをａｃｅｔｏｎｅ−ＣＨＣｌ３混液でパウダー化させた後に再結晶し［ｃａｒｂｏｎｙｌ−１３Ｃ］Ｍｅｔｈｙｌ  α−ａｃｅｔｏａｍｉｄｅ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍａｔｅを得た。
水素気流下においてＥｔＯＨ：ＰｈＨ＝４：１の混液１２ｍＬに［ｃａｒｂｏｎｙｌ−１３Ｃ］Ｍｅｔｈｙｌ  α−ａｃｅｔｏａｍｉｄｅ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍａｔｅ（０．６１８ｇ２．４５ｍｍｏｌ）を溶解した液に、窒素気流下、ｓ，ｓ−ＤＩＯＰ（２４９ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）および［ＲｈＣｌ（ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ）２］２（１２３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をＰｈＨ（２ｍＬ）に溶解し、１５分間室温攪拌した液を加えた。室温で２４時間攪拌し、溶媒を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製し、赤褐色アモルファスとして［ｃａｒｂｏｎｙｌ−１３Ｃ］Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（０．５ｇ，８０％）を得た。
［ｃａｒｂｏｎｙｌ−１３Ｃ］Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（０．４３５ｇ，１．７１ｍｍｏｌ）を１０％ＨＣｌ（４ｍＬ）中に加え、１２０℃で３時間攪拌した。１０％  ＨＣｌを減圧留去した後、残留物にＨ２Ｏ（５ｍＬ）を加え減圧乾固、さらにＨ２Ｏ（５ｍＬ）に加え減圧乾固するとアモルファス状となった。アモルファスにＥｔＯＨ（６ｍＬ）を加え、溶解し、氷冷下において２５％ＮＨ３水を滴下し、ｐＨ６．５に調整した。冷蔵庫中に一夜放置し、析出した結晶をろ取、ＥｔＯＨおよびＥｔ２Ｏで洗浄した後、減圧乾燥し、淡褐色粉末（３１６ｍｇ，９３％）を得た。得られた淡褐色粉末を活性炭および少量のＮａＨＳＯ３を含むＨ２Ｏ（７ｍＬ）を加え、加熱還流し、脱色した。ろ液を冷蔵庫中に３日間放置し、無色プリズム晶（２３８ｍｇ，７０％）を得た。
Ｌ−［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡの同定データ（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を図１（ａ）および図１（ｂ）に示す。
［製造例２］  Ｇｌｕｃｏｓｙｌ［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｕｃｏｓｅ（以下、Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃという）の製造
Ｄ−グルコース−Ｕ−１３Ｃ６（５．００ｇ，２６．８７ｍｍｏｌ、ＳＨＯＫＯ社製）にベンジルアルコール（６６．７ｍｌ，６４５ｍｍｏｌ）および４．５Ｎ−塩化水素−ジオキサン（９．６ｍｌ，４３．０ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で加熱撹拌した。５０分後に油浴からはずし、室温にまで放冷した後にエーテル（１．０１）を加え、氷冷した。生じた沈澱を濾取し、エーテルで洗浄後に減圧下で乾燥させた。（収量４．５２ｇ、収率６０．９％）
Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌ（４．４９ｇ，１６．２６ｍｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下で乾燥アセトニトリル（３５．０ｍｌ）および乾燥ＤＭＦ（７．０ｍｌ）を加えて溶解した。これにベンズアルデヒドジメチルアセタール（３．１７ｍｌ，２１．１４ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸一水和物（６１８ｍｇ，３．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。２．５時間後にベンズアルデヒドジメチルアセタール（２４５μｌ，１．６３ｍｍｏｌ）を追加した。４．５時間後に飽和炭酸水素ナトリウム水を加えて中和し、減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した。酢酸エチルを加えて抽出し、有機層を合わせて水および飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をピリジン（１００ｍｌ）に溶解し、氷冷した。これに無水酢酸（５０ｍｌ，５３０ｍｍｏｌ）を加え、３０分後に氷浴からはずして室温で撹拌した。１４時間後に減圧濃縮し、得られた残渣にトルエンを加えて共沸する操作を３回繰り返した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し４，６−Ｏ−Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−２，３−ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−Ｏｂｚｌを得た（収量３．３１ｇ、収率４５．４％）。
４，６−Ｏ−Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−２，３−ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌ（１．６５ｇ，３．６８ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル（３３．０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下でジメチルアミン−ボラン（１．０８ｇ，１８．４ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。反応混合物を−４０℃に冷却し、三フッ化ホウ素エーテラート（２．３３ｍｌ，１８．４ｍｍｏｌ）を加えた。６時間かけて徐々に−１５℃に昇温させた後に反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水に注ぎ、中和した。減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した後に酢酸エチルを加えて抽出し、有機層を合わせて水および飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し２，３−Ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−Ｏｂｚｌを得た（収量９７３ｍｇ、収率５８．７％）。
２，３−Ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌ（１９１ｍｇ，０．４２４ｍｍｏｌ）および２，３，４，６−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｇｌｃ−ＯＣ（＝ＮＨ）−ＣＣｌ３（２９０ｍｇ，０．４２４ｍｍｏｌ）を乾燥クロロホルム（１０．０ｍｌ）に溶解しアルゴン雰囲気下でモレキュラーシーブ４Ａ（５００ｍｇ）を加えて室温で１５分間撹拌した。反応混合物を−６０℃に冷却し、三フッ化ホウ素エーテラート（１０７μｌ，０．８４８ｍｍｏｌ）を加え、３時間かけて徐々に−１０℃に昇温させた。反応混合物を酢酸エチルで希釈した後にモレキュラーシーブ４Ａを濾過した。酢酸エチルで洗浄し、濾液と洗液を合わせて飽和炭酸水素ナトリウム水、水および飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した（収量２５４ｍｇ、収率６１．５％）。これに準じた縮合反応をもう２回行い、計９６７ｍｇの２，３−Ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌから２’，３’，４’，６’−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｇｌｃ−（α  １−４）−２，３−ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌ  １．０１ｇを得た。
２’，３’，４’，６’−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｇｌｃ−（α１−４）−２，３−ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌ（２２９ｍｇ，０．２３５ｍｍｏｌ）を乾燥メタノール（１０．０ｍｌ）に溶解し、５．１８Ｍ−ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（９．１μｌ，４７．０μｍｏｌ）を加えて室温で撹拌した。４時間後に５．１８Ｍ−ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（４．６μｌ，２３．８μｍｏｌ）を追加し、さらに１時間室温で撹拌した。反応液にアンバーリスト１５を加えて中和し、濾過した。樹脂をメタノールで洗浄し、濾液と洗液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した（収量１８２ｍｇ、収率８７．２％）これに準じた脱アセチル化反応を再度行い、計１．０１ｇの  ２’，３’，４’，６’−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｇｌｃ−（α１−４）−２，３−ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌから２’，３’，４’，６’−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｇｌｃ−（α１−４）−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌ  ８５２ｍｇを得た。
２’，３’，４’，６’−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｇｌｃ−（α１−４）−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌ（１８０ｍｇ，０．２０２ｍｍｏｌ）をメタノール（３０．０ｍｌ）−水（６．０ｍｌ）に溶解し、パラジウムブラック（２０ｍｇ）を加えて水素を通じた。１時間後に３５℃に加熱し、水素を通じた。２時間後に水（４．０ｍｌ）を追加、４時間後に水（２０．０ｍｌ）を追加した。６時間後に濾過し、触媒を水で洗浄した。濾液と洗液を合わせ、減圧濃縮によりメタノールを除去した後に凍結乾燥した。得られた残渣を水（３０ｍｌ）に溶解し、パラジウムブラック（２０ｍｇ）を加えて３５℃に加熱して水素を通じた。６時間後に濾過し、触媒を水で洗浄した。濾液と洗液を合わせ、減圧濃縮により液量を減らした後に凍結乾燥した。得られた残渣をＨＰＬＣ（ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０）により精製した（収量６１．５ｍｇ、収率８７．６％）。これに準じた還元反応を再度行い計８５０ｍｇの２’，３’，４’，６’−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｇｌｃ−（α１−４）−６−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｕ−１３Ｃ−Ｇｌｃ−ＯＢｚｌからＧｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃ  ２９０ｍｇを得た。）Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃの同定データ（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、ＥＳＩ−ＭＳスペクトル）を図２（ａ）、図２（ｂ）、図２（ｃ）に示す。
［製造例３］  Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ−［１−１３Ｃ］Ａｌａｎｉｎｅ（以下、Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａという）の製造
［１−１３Ｃ］Ａｌａｎｉｎｅ（Ｍａｓｓｔｒａｃｅ，Ｉｎｃ．）（１０．０ｇ，０．１１１ｍｏｌ）を水酸化ナトリウム水溶液（１１１ｍｌ）に溶かし、Ｂｏｃ２Ｏ（２８．０ｍｌ，０．１２２ｍｏｌ）のアセトン溶液（１１０ｍｌ）、トリエチルアミン（７．７１ｍｌ，５５．５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で一晩攪拌した。減圧濃縮後、飽和食塩水を加えて液量を２００ｍｌにした。これにクエン酸を加えてｐＨ４に調整し、さらに食塩を飽和させてから、酢酸エチルで４回抽出した。有機層を飽和食塩水で２回洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧濃縮し、ジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に溶かし、シクロヘキシルアミン（１２．７ｍｌ，０．１１１ｍｏｌ）を加えて、室温で２時間静置した。析出した結晶を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄後、減圧乾燥し、Ｂｏｃ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＨ・ＣＨＡを得た。
Ｂｏｃ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＨ・ＣＨＡ（３２．０８ｇ，０．１１１ｍｏｌ）の酢酸エチル（４００ｍｌ）懸濁液に、１０％クエン酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で攪拌して溶液となってから食塩を飽和させ、有機層を分液した。酢酸エチルで２回抽出後、有機層を合わせて、飽和食塩水で２回洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮して無色抽出物を得た。これをエタノール−水（９：１）（２００ｍｌ）に溶かし、炭酸セシウム（１９．０ｇ，５８．３ｍｍｏｌ）を加えた。発泡が収まってから減圧濃縮して、残渣にトルエンを加えて共沸で水を除き、ゲル状物を得た。これをＤＭＦ（２００ｍｌ）に懸濁し、臭化ベンジル（１３．２ｍｌ，０．１１１ｍｏｌ）を加えて室温で１２時間攪拌した。減圧濃縮し、残渣に酢酸エチルを加えて、水、１０％クエン酸水溶液、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下に留去し、Ｂｏｃ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌを得た。
Ｂｏｃ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌ（３１．２７ｇ，０．１１１ｍｏｌ）に４．５Ｎ塩化水素／ジオキサン（２５０ｍｌ）を加えて、室温で３０分間放置した。減圧濃縮後、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）を加えて析出した結晶を濾取後、減圧下で乾燥し、ＨＣｌ・Ｈ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌ  ２２．４８ｇを得た。
ＨＣｌ・Ｈ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌ（７００ｍｇ，３．２３ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）．４／５ＡｃＯＥｔ．１／４Ｈ２Ｏ（１．６３ｇ，３．２３ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（４５９ｍｇ，３．３９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶かし、氷冷攪拌下、ＷＳＣＤ（６０２μｌ，３．３９ｍｍｏｌ）を滴下後、氷冷下３０分、室温で３時間攪拌した。酢酸エチルを加えて飽和重曹水、水、１０％クエン酸水溶液、水で順次洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下に留去し、得られた残さにジイソプロピルエーテル−ヘキサンを加えて、析出した固体をろ取し、減圧下に乾燥しＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌを得た（１．７８ｇ、９１％）。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌ（１．７８ｇ２，９４ｍｍｏｌ）に６Ｎ塩化水素／ジオキサン（３０ｍＬ）を加えて室温で１時間攪拌した。酢酸エチルを加えて、飽和重曹水、水、１０％クエン酸水溶液、水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下に留去し、残さにジエチルエーテル−ヘキサンを加えて、析出した固体をろ取し、減圧下に乾燥しＢｚ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌを得た（１．６３ｇ，９１％）。
Ｂｚ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−［１−１３Ｃ］Ａｌａ−ＯＢｚｌ（１．６３ｇ，２．７４ｍｍｏｌ）とアニソール（１．５ｍＬ，１３．９ｍｍｏｌ）の混合物にドライアイス−メタノール浴冷却攪拌下、無水フッ化水素（８．５ｍｌ）を導入後、氷冷下１時間攪拌した。フッ化水素を氷冷下留去したのち、水（２０ｍｌ）とジエチルエーテル（１０ｍｌ）を加えて攪拌後、水層を抜き取り、減圧濃縮した。残さを水（３０ｍｌ）に溶かして微量の不溶物をろ去した後、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ＰＡＫ  ＯＤＳ  １０μｍ，３０×２５０ｍｍ，１−６０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ含有）、８０分、２０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した。主分画を集めて凍結乾燥した後、水（３０ｍｌ）に溶かして、強イオン性陰イオン交換樹脂（Ｍｕｒｏｍａｃ  １×２，ＡｃＯ−ｆｏｒｍ，２０ｍｌ）で酢酸塩に交換し、凍結乾燥して無色粉末としてＢｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａを得た（７７４ｍｇ，８１％）。
Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａの同定データ（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、ＨＰＬＣ分析チャート）を図３（ａ）、図３（ｂ）、図３（ｃ）に示す。
［製造例４］  ［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの製造
［Ｕ−１３Ｃ］スターチ（クロレラ工業製、Ａｌｇａｌ  Ｓｔａｒｃｈ（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ），ＬｏｔＮｏ．８０３１，Ｓ，Ｕ−１３Ｃ：９８．６  ａｔｏｍ  ％，Ｓｔａｒｃｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ：９３．５％、４．６５ｇ）を０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．４に溶解し、これにシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（林原製）を１８６Ｕｎｉｔ加え４０℃で２時間２０分間反応させた後、９５℃で１５分間処理し酵素を失活させた。この操作を４回繰り返し、得られた反応溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５により［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを含む画分を分取した。凍結乾燥して得られた１．４ｇを６回に分けてＨＰＬＣ（ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０  ｃｏｌｕｍｎ）により精製した。［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ画分を凍結乾燥し、３９８ｍｇを得た。［Ｕ−１３Ｃ］−γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの同定データ（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、ＥＳＩ−ＭＳスペクトル）を図４（ａ）、図４（ｂ）、図４（ｃ）に示す。
［実施例１］  抗パーキンソン補助剤ベンセラジドの薬理作用検査薬（［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ）およびＤＯＰＡ脱炭酸酵素阻害度あるいは亢進度を評価するためのスクリーニング試薬：［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ（評価対象：抗パーキンソン補助剤ベンセラジド）
ベンセラジドの薬理作用はＤＯＰＡ脱炭酸酵素阻害である。ＤＯＰＡ脱炭酸酵素の基質である［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ（製造例１）を薬理作用検査薬およびスクリーニング試薬とする。［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ呼気テスト前日の朝夕および当日呼気テスト開始３０分前の３回それぞれ５０ｍｇ／ｋｇずつ塩酸ベンセラジド（シグマ社製）を腹腔内投与したラット（投与群）と全く投与しなかったラット（対照群）で［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ呼気テストを比較した。［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ呼気テストは麻酔下で行い、大腿静脈から［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ  ５０ｍｇ／ｋｇを投与、その後の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度の増加率（Δ１３Ｃ（‰））の経時変化を測定した。
一晩絶食した投与群、および対照群を、麻酔下で仰向けに固定した。ストロークポンプ［バリアブル・ストロークポンプＶＳ−５００、（株）柴田科学工業］を用いて呼気を約１００〜３００ｍｌ／ｍｉｎの速度で吸引し、そのまま１３ＣＯ２アナライザーＥＸ−１３０Ｓ［（株）日本分光］のフローセルに導入した。ラットホルダーとストロークポンプの間にはパーマピュアドライヤー（ＭＤ−０５０−１２Ｐ、Ｐｅｒｍａ  Ｐｕｒｅ  ＩＮＣ．）を設置して呼気中の水蒸気を除去した。炭酸ガス濃度が安定した状態で、大腿静脈から［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ  ５０ｍｇ／ｋｇを投与した。吸引呼気中の炭酸ガス濃度は３±０．５％に維持した。
１３ＣＯ２アナライザーから出力されるデータはＡＤ変換した後パーソナルコンピュータ（Ａｐｐｌｅ  Ｐｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ８５００）に取込み、データ処理ソフトウェアＬａｂ  ＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて５秒間隔で１００ｍｓｅｃ毎１０点のデータを積算平均し、１３Ｃａｔｏｍ％、Δ１３Ｃ（‰）、炭酸ガス濃度（％）に変換することで連続測定１３Ｃ−呼気テストを行った。変換したデータはリアルタイムで画面表示した後、ハードディスク中に保存した。
尚、Δ１３Ｃ（‰）は各時点の呼気ＣＯ２中の１３Ｃ濃度（１３Ｃｔｍｉｎ）とＣＯ２標準ガスの１３Ｃ濃度（１３Ｃｓｔｄ）から下式により算出した。
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［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ呼気テストの結果、対照群ではΔ１３Ｃが投与後急激に増加し２分後にピーク値１００‰に達しその後経時的に漸減したのに比べて、投与群ではΔ１３Ｃ（‰）がほとんど増加せず、２０分後においても５‰程度であった（図５）。上記の結果より、本実施例のベンセラジド投与条件でベンセラジドのターゲット酵素の機能がほぼ１００％阻害されていることが確認された。［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡを薬理作用検査薬とすることでベンセラジドの薬理作用を評価することが可能である。また、［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡをスクリーニング試薬とすることで、ＤＯＰＡ脱炭酸酵素をターゲットとする投与効果の高い薬物および／またはプロドラッグをスクリーニングする方法および試薬を提供することが可能である。
［実施例２］  糖尿病治療薬アカルボースの薬理作用検査薬（Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃ）およびα−グルコシダーゼ阻害度あるいは亢進度を評価するためのスクリーニング試薬：Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃ（評価対象：糖尿病治療薬アカルボース）
アカルボースの薬理作用はα−グルコシダーゼ阻害である。α−グルコシダーゼの基質であるＧｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃ（製造例２参照）を薬理作用検査薬およびスクリーニング試薬とする。Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃの経口投与（２５ｍｇ／ｋｇ）と同時にアカルボース（市販名：グルコバイ、バイエル薬品（株））を経口投与（２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇあるいは１０ｍｇ／ｋｇ）したラットとＧｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃのみを投与したラット（アカルボース０ｍｇ／ｋｇ群）について、Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃ投与後の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度の増加率（Δ１３Ｃ（‰））の経時変化を測定・比較した。
１晩絶食したラット（雄性Ｗｉｓｔａｒ、８週齢）を無麻酔のままマイクロ波照射装置用ラットホルダー内に固定した。ストロークポンプ［バリアブル・ストロークポンプ  ＶＳ−５００、（株）柴田科学工業］を用いて呼気を約１００〜３００ｍｌ／ｍｉｎの速度で吸引し、炭酸ガス濃度を約３％に保った。ラットホルダーとストロークポンプの間にはパーマピュアドライヤー（ＭＤ−０５０−１２Ｐ、Ｐｅｒｍａ  Ｐｕｒｅ  ＩＮＣ．）を設置して呼気中の水蒸気を除去した。炭酸ガス濃度が安定した状態でいったんラットホルダーからラットを出し、蒸留水に溶解したＧｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃを経口投与用ゾンデを用いて胃内に投与した（投与量：３５μｍｏｌ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ））。５分おきに２０分まで呼気をシリンジでサンプリングした。シリンジから真空バイアルびん（１０ｍｌ）に１５ｍｌを封入し、ＧＣ−ＭＳ（Ｂｒｅａｔｈ  ＭＡＴ）［Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ］による自動分析に供した。呼気サンプルの１３Ｃ値（標準物質ＰＤＢとの差）であるδ１３Ｃから下式よりΔ１３Ｃ（‰）を算出した。
Δ１３Ｃ（‰）＝（δ１３Ｃ）ｔｍｉｎ−（δ１３Ｃ）０ｍｉｎ
＜Ｂｒｅａｔｈ  ＭＡＴ測定条件＞
装置：  Ｂｒｅａｔｈ  ＭＡＴ  ｐｌｕｓ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ社）
キャリアガス：  Ｈｅ
測定イオン：  ｍ／ｚ＝４４，４５，４６
Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃ呼気テストの結果、いずれの群も直線的にΔ１３Ｃは増加したが０ｍｇ／ｋｇ群（ｎ＝２）が２０分で７２．６０±９．４７‰に達したのに対し、２ｍｇ／ｋｇ群（ｎ＝２）では３７．０６±０．１６‰、４ｍｇ／ｋｇ群（ｎ＝２）では２６．０１±０．３８‰、１０ｍｇ／ｋｇ群（ｎ＝２）では９．８６±０．６６‰と投与量が増えるほどΔ１３Ｃが減少した（図６）。上記の結果より、本実施例のアカルボース投与条件でアカルボースのターゲット酵素の機能が投与量依存的に阻害されていることが確認された。従って、Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃを薬理作用検査薬とすることでアカルボースの薬理作用を評価することが可能である。また、Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃをスクリーニング試薬とすることで、α−グルコシダーゼをターゲットとする投与効果の高い薬物および／またはプロドラッグをスクリーニングする方法および試薬を提供することが可能である。
［実施例３］  膵炎治療薬メシル酸カモスタットの薬理作用検査薬（Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ）および膵プロテアーゼ阻害度あるいは亢進度を評価するためのスクリーニング試薬：Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ（評価対象：膵炎治療薬メシル酸カモスタット）
メシル酸カモスタットの薬理作用は膵プロテアーゼ阻害である。膵プロテアーゼの基質であるＢｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ（製造例３参照）を薬理作用検査薬およびスクリーニング試薬とする。Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａの経口投与（１２．２ｍｇ／ｋｇ）と同時にメシル酸カモスタット（市販名：フォイパン、小野薬品工業（株））を経口投与（２０ｍｇ／ｋｇ）したラット（投与群）とＢｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａのみを投与したラット（対照群）について、Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ投与後の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度の増加率（Δ１３Ｃ（‰））の経時変化を実施例２と同様の方法で測定・比較した。Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ呼気テストの結果、両群とも投与後１５分までは直線的にΔ１３Ｃは増加した。投与後２０分では対照群（ｎ＝３）が４１．２９±７．４９‰に達したのに対し、投与群（ｎ＝３）では２７．６４±４．８６‰であり、投与群でΔ１３Ｃが減少した（図７）。上記の結果より、本実施例のメシル酸カモスタット投与条件でメシル酸カモスタットのターゲット酵素の機能が阻害されていることが確認された。従って、Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａを薬理作用検査薬とすることでメシル酸カモスタットの薬理作用を評価することが可能である。また、Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａをスクリーニング試薬とすることで膵プロテアーゼをターゲットとする投与効果の高い薬物および／またはプロドラッグをスクリーニングする方法および試薬を提供することが可能である。
［実施例４］  消化酵素剤タカヂアスターゼの薬理作用検査薬（［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）およびアミラーゼ阻害度あるいは亢進度を評価するためのスクリーニング試薬：［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（評価対象：消化酵素剤タカヂアスターゼ）
タカヂアスターゼはアミラーゼの１種であり、酵素からなる医薬品である。消化酵素剤としてターゲット酵素である生体内アミラーゼの機能を補うために用いられる。従ってタカヂアスターゼの薬理作用はアミラーゼ亢進である。タカヂアスターゼおよび生体内アミラーゼの基質である［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（製造例４参照）を薬理作用検査薬およびスクリーニング試薬とする。タカヂアスターゼ（市販名：タカヂアスターゼ、三共（株））の経口投与（６ｍｇ／ｋｇ）の５分後に［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを経口投与（４０ｍｇ／ｋｇ）したラット（投与群）と［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎのみを投与したラット（対照群）について、［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ投与後の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度の増加率（Δ１３Ｃ（‰））の経時変化を実施例２と同様の方法で測定・比較した。［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ呼気テストの結果、両群とも投与後３０分までは直線的にΔ１３Ｃは増加した。投与後２０分では対照群（ｎ＝２）が４５．４６±１５．５７‰に達したのに対し、投与群（ｎ＝２）では８３．６６±１３．８７‰であり、投与群でΔ１３Ｃが増加した（図８）。上記の結果より、本実施例のタカヂアスターゼ投与条件でタカヂアスターゼがターゲット酵素アミラーゼの機能を亢進していることが確認された。従って、［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを薬理作用検査薬とすることでタカヂアスターゼの薬理作用を評価することが可能である。また、［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎをスクリーニング試薬とすることでアミラーゼをターゲットとする投与効果の高い薬物および／またはプロドラッグをスクリーニングする方法および試薬を提供することが可能である。
［実施例５］  Ｈ１受容体拮抗薬の薬理作用検査薬（［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）およびＨ１受容体阻害度あるいは亢進度のスクリーニング試薬：［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（評価対象：マレイン酸クロルフェニラミン）
マレイン酸クロルフェニラミンの薬理作用はＨ１受容体阻害である。マレイン酸クロルフェニラミン（シグマ社製）を実験前日に一回、さらに実験当日に一回、腹腔内投与し（各４０ｍｇ／ｋｇ）、その１時間３０分後に［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅを大腿静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ）したラット（投与群）と、［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅのみを大腿静脈内投与したラット（対照群）について、［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ投与後の呼気中ＣＯ２の１３Ｃ濃度の増加率（Δ１３Ｃ（‰））の経時変化を実施例２と同様の方法で測定・比較した。［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ呼気テストの結果、対照群（ｎ＝２）では投与後５分まで急激にΔ１３Ｃは増加し、その後非常に緩やかな増加に転じ、投与後１０分では７３．１±０．４‰であった。投与群（ｎ＝２）では投与後５分まで急激にΔ１３Ｃは増加し、投与後１０分では８４．７±１．９‰であり、投与群でΔ１３Ｃが増加した（図９）。上記の結果より、本実施例の［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ投与条件でマレイン酸クロルフェニラミン投与の有無を判別することができた。従って、［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅを薬理作用検査薬とすることでマレイン酸クロルフェニラミンの薬理作用を評価することが可能である。また、［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅをスクリーニング試薬とすることでＨ１受容体をターゲットとする投与効果の高い薬物および／またはプロドラッグをスクリーニングする方法および試薬を提供することが可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
従来法では不可能であった、医薬品のターゲットへの薬理作用そのものをリアルタイムで個別に評価することができるようになった。
また、従来法では不可能であった、ホールボディかつリアルタイムでのターゲット阻害度の評価が可能となり、この評価結果を利用して、薬物および／またはプロドラッグの中から投与効果の高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングすることができるようになった。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｌ−［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡの１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析結果を示す。
図２は、Ｇｌｃ−［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｃの１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
図３は、Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａの１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよびＨＰＬＣ分析結果を示す。
図４は、［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
図５は、［１−１３Ｃ］ＤＯＰＡ呼気テストの経時変化を示す。
図６は、Ｇｌｕｃｏｓｙｌ［Ｕ−１３Ｃ］Ｇｌｕｃｏｓｅ呼気テスト・２０分値の比較を示す。
図７は、Ｂｚ−Ａｒｇ−［１−１３Ｃ］Ａｌａ呼気テスト・２０分値の比較を示す。
図８は、［Ｕ−１３Ｃ］γ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ呼気テスト・２０分値の比較を示す。
図９は、［１，２−１３Ｃ］ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ呼気テスト・１０分値の比較を示す。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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