(57)【要約】本発明によれば、コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物、および該微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを構成するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ・ラージサブユニット（以下、ＩＳＯＭと略す）のアミノ酸配列おいて、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭのアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がグリシン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５】
グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸である請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
コリネ型細菌に属する微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸残基がグリシン残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項９】
グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸である請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１５】
グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンである請求項１４に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸をコードするコドンである請求項１４に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
コリネ型細菌に属する微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、またはマイコバクテリウム属に属する微生物である請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１９】
グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンである請求項１８に記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸をコードするコドンである請求項１８に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項２２記載の組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物。
【請求項２４】
染色体ＤＮＡ上に請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する微生物。
【請求項２５】
微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微生物である請求項２３または２４に記載の微生物。
【請求項２６】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである請求項２５に記載の微生物。
【請求項２７】
請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２８】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンおよびＬ−トリプトファンからなる群より選ばれるアミノ酸である請求項２７に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物、および該微生物を培地に培養することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法に関する。
背景技術
イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼは、ロイシン合成経路上の２−イソプロピルリンゴ酸を３−イソプロピルリンゴ酸に変換する反応を触媒する酵素である。
またイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ・ラージサブユニット（以下、ＩＳＯＭと称す）は、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ・スモールサブユニットと複合体を形成し、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを構成しているポリペプチドである。
近年、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等、種々の微生物で全ゲノム配列が解読され〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９（１９９７）〕、ＩＳＯＭをコードするＤＮＡの塩基配列も明らかになっている。
コリネバクテリウム属に属する微生物については、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、ゲノム配列情報からＩＳＯＭをコードする遺伝子が予測され、その塩基配列が報告されている（ＷＯ  ０１／００８４３、ＥＰ１１０８７９０）。
一方、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のリジン生産菌において、ＩＳＯＭを欠損したロイシン要求株が取得されている〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７，５６６（１９９２）〕。同文献において、このロイシン要求株は、ロイシンをある濃度で添加した培地で培養すると、生育レベルが適度に抑制されてリジン蓄積量が増加することが報告されている。
また、ロイシン合成経路上の別の酵素であるイソプロピルリンゴ酸シンターゼを欠損させたコリネバクテリウム・グルタミカムのリジン生産菌を用いて、ロイシン要求性とリジン生産との関連が調べられており、ロイシンの培地への添加量を制限して培養するとリジン蓄積量が増加するのは、生育レベルが抑制されるためである可能性が最も高いと報告されている〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０，１３３（１９９４）〕。
しかし、これまでに、ＩＳＯＭをコードするＤＮＡに変異を導入することによって、生産培地にロイシンを添加することなく、かつ生育レベルにも有意な変化をもたらさずに、Ｌ−リジンの生産性を向上させることができることは知られていない。さらに、ＩＳＯＭの変異によってＬ−リジンだけでなく他の多くのＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができること、およびＩＳＯＭをコードするＤＮＡにどのような変異を導入すれば前記効果が得られるかについて記載および示唆した報告もない。
発明の開示
本発明の目的は、微生物を用いた効率的なＬ−アミノ酸の製造法を提供することにある。
本発明者らは、本発明の変異型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを発現する微生物は、ロイシンを培地に添加しなくとも、野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを発現する微生物に比べ、有意に高いＬ−アミノ酸の生産性を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（２８）に関する。
（１）コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
（２）ポリペプチドが、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを構成するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ・ラージサブユニット（以下、ＩＳＯＭと略す）のアミノ酸配列おいて、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする上記（１）のポリペプチド。
（３）コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
（４）コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭのアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がグリシン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（５）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である上記（４）のポリペプチド。
（６）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸である上記（４）のポリペプチド。
（７）コリネ型細菌に属する微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載のポリペプチド。
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸残基がグリシン残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（９）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である上記（８）のポリペプチド。
（１０）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸である上記（８）のポリペプチド。
（１１）上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
（１２）上記（４）〜（１１）のいずれか１つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１４）コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡ。
（１５）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンである上記（１４）のＤＮＡ。
（１６）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸をコードするコドンである上記（１４）のＤＮＡ。
（１７）コリネ型細菌に属する微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、またはマイコバクテリウム属に属する微生物である上記（１４）〜（１６）のいずれか１つに記載のＤＮＡ。
（１８）配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡ。
（１９）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンである上記（１８）のＤＮＡ。
（２０）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸をコードするコドンである上記（１８）のＤＮＡ。
（２１）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするＤＮＡ。
（２２）上記（１３）〜（２１）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
（２３）上記（２２）の組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物。
（２４）染色体ＤＮＡ上に上記（１３）〜（２１）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含有する微生物。
（２５）微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微生物である上記（２３）または（２４）の微生物。
（２６）コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである上記（２５）の微生物。
（２７）上記（２３）〜（２６）のいずれか１つに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２８）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンおよびＬ−トリプトファンからなる群より選ばれるアミノ酸である上記（２７）の製造法。
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドとしては、例えば
（ｉ）コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド
（ｉｉ）ポリペプチドが、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを構成するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ・ラージサブユニット（以下、ＩＳＯＭと略す）のアミノ酸配列おいて、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする上記（ｉ）のポリペプチド
（ｉｉｉ）コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド
（ｉｖ）コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭのアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がグリシン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｖ）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である上記（ｉｖ）のポリペプチド
（ｖｉ）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸である上記（ｉｖ）のポリペプチド
（ｖｉｉ）コリネ型細菌に属する微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である上記（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれか１項に記載のポリペプチド
（ｖｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸残基がグリシン残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｉｘ）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基である上記（ｖｉｉｉ）のポリペプチド
（ｘ）グリシン残基以外のアミノ酸残基がＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸である上記（ｖｉｉｉ）のポリペプチド
（ｘｉ）上記（ｉｖ）〜（ｘ）のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド
（ｘｉｉ）上記（ｉｖ）〜（ｘｉ）のいずれか１つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするポリペプチド
をあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとしては、Ｂｅｒｇｅｙｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８，５９９（１９７４）に定義されているコリネ型細菌に属する微生物である、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをあげることができ、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ等の微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをあげることができる。
上記コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼは、配列番号３若しくは配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖、または該ＤＮＡの一部からなるＤＮＡの相補鎖をプローブとして用い、後述するハイブリダイゼーションにより、または、配列番号３若しくは配列番号４で表される塩基配列から設計できるプライマーＤＮＡを用い、上記コリネ型細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができるイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードするＤＮＡを用いて、常法により取得することができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとしては、例えばＥＰ１１０８７９０に記載されている、配列番号１および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドより構成されるイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのスモールサブユニットおよびイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのラージサブユニット（ＩＳＯＭ）のアミノ酸配列の両方、またはどちらか一方のサブユニットのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができるが、好ましくはＩＳＯＭのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのスモールサブユニットおよびＩＳＯＭのアミノ酸配列の両方またはどちらか一方のサブユニットのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するサブユニットは、該スモールサブユニットおよびＩＳＯＭをコードするＤＮＡの両方またはどちらか一方のＤＮＡ、例えば配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両方またはどちらか一方のＤＮＡに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加があることを意味し、欠失、置換若しくは付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わないが、天然型アミノ酸残基であることが好ましい。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
上記（１）の本発明のポリペプチドがイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとしての活性を有するためには、配列番号１および２で表されるアミノ酸配列との相同性が、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）〕を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プロダラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌は、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを生産するコリネ型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡと該野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードするＤＮＡとを相同組換え技術を用いて置換することにより取得できる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すとは、該コリネ型細菌を最少培地を用いて培養したとき、生育は認められるが、その生育速度は野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを生産する該コリネ型細菌を該最少培地で培養したときの生育速度より遅く、該生育速度はロイシンを適量添加することで回復することを意味する。
本明細書において、野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとは、最少培地で培養したときにロイシン要求性を示さないコリネ型細菌に属する微生物が有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのことをいい、好ましくはロイシン要求性を示さない野生型株が有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのことをいう。野生型株とは、自然集団中で、その微生物が属する種において、最も高頻度に見られる型の微生物のことをいい、コリネ型細菌に属する微生物の野生型株としては、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ  ＡＴＣＣ１５９９１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０６０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８２６（旧属種  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、あるいは  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ  ＡＴＣＣ１３８６８、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ  ＡＴＣＣ１５９９０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ９２４４、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ  ＡＴＣＣ１３８２５、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ  ＡＴＣＣ１９２４０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４などをあげることができる。
本明細書において、最少培地とは、コリネ型細菌に属する微生物が栄養要求性を示す菌株である場合には、該栄養要求性物質を添加した培地を含むものである。ただし、該栄養要求性物質にはロイシンは含まれない。
上記した部分的ロイシン要求性を示すとは、具体的には、上記の方法で得られるコリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、コリネバクテリウム  グルタミカムの野生型株ＡＴＣＣ１３０３２を形質転換し、相同組換え技術によって該ＤＮＡと野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードするＤＮＡとを置換したときに得られる変異株が以下のような性質を示すことを意味する。
すなわち、最少寒天培地〔１％グルコース、０．４％塩化アンモニウム、０．２％尿素、０．１％リン酸二水素カリウム、０．３％リン酸水素二カリウム、０．０４％硫酸マグネシウム、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄、１ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン、５ｍｇ／Ｌニコチン酸、１００μｇ／Ｌビオチン、５ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩、１．６％バクトアガー（Ｄｉｆｃｏ）、ｐＨ７．２〕上に、該変異株および野生株ＡＴＣＣ１３０３２を、各々１〜１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように塗布して３０℃で２〜３日間培養したとき、該変異株は、そのコロニーの直径がＡＴＣＣ１３０３２の９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは５０％以下であり、かつ目視で充分に認識できるコロニー（コロニーの直径が０．１ｍｍ以上）を形成する。該変異株を、５０ｍｇ／Ｌのロイシンを含む最少培地に塗布して同様に３０℃で２〜３日間培養したときには、野生型株ＡＴＣＣ１３０３２と同等の大きさのコロニーを形成する。
上記性質を有する上記（ｉ）の本発明のポリペプチドを、唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌は、アミノ酸発酵に用いる通常の生産培地において、ロイシンを添加しなくても、野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを生産するコリネ型細菌と同等の生育を示す。該生産培地の組成は生産するアミノ酸により異なるが、一般に、アミノ酸発酵では菌の生育を促進するために、ビタミン類等の栄養源や窒素源としてコーンスティープリカーや大豆加水分解物などの安価な天然物を最少培地に加えた培地が用いられる。該天然物にはロイシンが微量含まれているので、上記（ｉ）の本発明のポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産するコリネ型細菌が呈する部分的ロイシン要求性は相補される。
上記（ｉｉ）の本発明のポリペプチドは、上記（ｉ）の本発明のポリペプチドのうち、ＩＳＯＭに変異を有するポリペプチドであるので、上記と同様の方法により取得することができる。
上記（ｉｉｉ）の本発明のポリペプチドは、上記（ｉ）と同様の方法により取得することができる。
すなわち、コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡに、上記した部位特異的変位導入法により変異を導入することにより、コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを取得することができる。
上記方法によって得られるポリペプチドが上記（ｉｉｉ）の本発明のポリペプチドであることは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換させることにより得られるコリネ型細菌が、最少培地において上記した部分的ロイシン要求性を示すことにより確認することができる。
上記（ｉｖ）の本発明のポリペプチドについて、コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基とは、コリネ型細菌由来のＩＳＯＭが有するアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性を上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡなどの相同性解析プログラムを用いて計算し、両アミノ酸配列の相同性が最も高くなるように該アミノ酸配列同士を重ね合わせたとき、該コリネ型細菌由来のＩＳＯＭが有するアミノ酸配列上で、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基をいう。
グリシン残基以外のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基から選ばれるアミノ酸残基であり、より好ましくはＬ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基、さらに好ましくはＬ−アスパラギン酸残基をあげることができる。
上記（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）のポリペプチドは、コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のグリシン残基に相応するアミノ酸残基をコードするコドンを、上記した部位特異的変異導入法を用いてグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに変えたＤＮＡを用いて取得することができる。
該変異ＤＮＡが、上記（ｉｖ）の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであることは、該変異ＤＮＡを用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該変異ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換することにより得られる形質転換体が、上記した部分的ロイシン要求性を呈することをもって確認することができる。
上記（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）の本発明のポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、Ｎ末端から４５６番目のグリシン残基をコードするコドンを、上記の部位特異的変異導入法によりグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに変えることにより取得することができる。
グリシン残基以外のアミノ酸とは、好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基から選ばれるアミノ酸残基であり、より好ましくはＬ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基、さらに好ましくはＬ−アスパラギン酸残基をあげることができる。
上記（ｘ）のポリペプチドは、上記（ｉｖ）〜（ｉｘ）のいずれかに記載の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに対して、上記部位特異的変異導入法を用いることにより取得することができる。導入する部位特異的変異は、上記（ｉｖ）〜（ｉｘ）のいずれかに記載の本発明のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目に相応するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基について、欠失若しくは置換するのであれば、どのような変異でもよい。
また、上記（ｉｖ）〜（ｉｘ）のいずれかに記載の本発明のポリペプチドを取得する際に同時に、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目に相応するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を、上記部位特異的変異導入法を用いて欠失若しくは置換させることによっても上記（ｘ）のポリペプチドを取得することができる。
欠失若しくは置換されるアミノ酸は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であれば特に限定されない。
上記で取得されるポリペプチドが上記（ｘ）の本発明のポリペプチドであることは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的ロイシン要求性を呈することをもって確認することができる。
上記（ｘｉ）のポリペプチドは、上記（ｉｖ）〜（ｘ）のいずれかに記載の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに上記部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
また上記（ｉｖ）〜（ｘ）のいずれかに記載の本発明のポリペプチドを取得する際に同時に、配列番号１で表されるアミノ酸配列に、上記部位特異的変異導入法を用いてアミノ酸残基を付加することによっても取得することができる。
上記で取得されるポリペプチドが上記（ｘｉ）の本発明のポリペプチドであることは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的ロイシン要求性を呈することをもって確認することができる。
欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加があることを意味し、欠失、置換若しくは付加が同時に生じてもよく、置換若しくは付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない点、および置換可能なアミノ酸については、上記と同様である。
上記（ｘ）または（ｘｉ）のポリペプチドがＩＳＯＭとしての活性を有するためには、配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が、上記ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記パラメーターに基づいて計算したときに、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
［２］本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、例えば、
（ｉ）上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｉｉ）コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡ
（ｉｉｉ）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンである上記（ｉｉ）のＤＮＡ
（ｉｖ）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸をコードするコドンである上記（ｉｉ）のＤＮＡ。
（ｖ）コリネ型細菌に属する微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、またはマイコバクテリウム属に属する微生物である上記（ｉｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに記載のＤＮＡ
（ｖｉ）配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡ
（ｖｉｉ）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸から選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンである上記（ｖｉ）のＤＮＡ
（ｖｉｉｉ）グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸をコードするコドンである上記（ｖｉ）のＤＮＡ
（ｉｘ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを唯一のＩＳＯＭとして生産するコリネ型細菌が、最少培地において部分的ロイシン要求性を示すことを特徴とするＤＮＡをあげることができる。
上記（ｉｉ）の本発明のＤＮＡにおいて、コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡとしては、上記［１］のコリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのＩＳＯＭをコードするＤＮＡをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡは、上記［１］のコリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのＩＳＯＭをコードするＤＮＡであれば、いずれのＤＮＡでもよい。
該ＤＮＡは、上記［１］の方法により取得することができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡとしては、例えばＥＰ１１０８７９０に記載されている、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域とは、コリネ型細菌由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡが有する塩基配列と配列番号３で表される塩基配列との相同性を上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡなどの相同性解析プログラムを用いて計算し、両塩基配列の相同性が最も高くなるように該塩基配列同士を重ね合わせたとき、該コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡが有する塩基配列上で配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に対応する領域をいう。
配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡは、コリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡに上記の部位特異的変異導入法を用いて塩基置換を導入することによって取得することができる。
グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンとしては、グリシン以外のアミノ酸残基をコードするコドンであればいずれでもよく、好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基から選ばれるアミノ酸残基であり、より好ましくはＬ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基、さらに好ましくはＬ−アスパラギン酸残基をあげることができる。
上記で得られるＤＮＡが上記（ｉｉ）の本発明のＤＮＡであることは、該ＤＮＡを用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的ロイシン要求性を呈することをもって確認することができる。
上記（ｖｉ）〜（ｖｉｉｉ）のＤＮＡは、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡに対して、上記した部位特異的変異導入法を用いることにより、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列をグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換することにより取得できる。
グリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンとしては、グリシン以外のアミノ酸残基をコードするコドンであればいずれでもよく、好ましくはＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基から選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンであり、より好ましくはＬ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸残基をコードするコドン、さらに好ましくはＬ−アスパラギン酸残基をコードするコドンあげることができる。
配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列をアスパラギン酸残基をコードするコドンに置換したＤＮＡとしては、配列番号３で表される塩基配列において、該塩基配列の５’末端から１３６７番目のグアニンをアデニンに置換したＤＮＡをあげることができる。
上記で得られるＤＮＡが上記（ｖｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかに記載の本発明のＤＮＡであることは、該ＤＮＡを用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的ロイシン要求性を呈することをもって確認することができる。
上記（ｉｘ）のＤＮＡにおいて、配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖の一部分または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメーターに基づき計算したときに、配列番号３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記方法で得られるＤＮＡが、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡである場合は、該ＤＮＡを用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的ロイシン要求性を呈することをもって上記方法で得られるＤＮＡが、上記（ｉｘ）の本発明のＤＮＡであることを確認することができる。
上記方法で得られるＤＮＡが、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡである場合は、上記方法で得られるＤＮＡに対して、上記（ｉｉ）の本発明のＤＮＡを取得する方法に従い部位特異的変異を導入することで上記（ｉｘ）のＤＮＡを取得することができる。
該ＤＮＡが、上記（ｉｘ）の本発明のＤＮＡであることは、該ＤＮＡを用いて、野生型ＩＳＯＭを生産するコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡと該野生型ＩＳＯＭをコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換することにより得られるコリネ型細菌が、上記した部分的ロイシン要求性を示すことにより確認することができる。
［３］本発明のＤＮＡの調製
（ｉ）コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭをコードするＤＮＡの取得
コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭをコードするＤＮＡを取得する方法としては、コリネ型細菌に属する微生物から斎藤らの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）〕に従い調製することができる染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３および４で表される塩基配列、または配列番号３で表される塩基配列に基づき設計、合成することができるプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ等により取得する方法等をあげることができる。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１０３２株から染色体ＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号３および４で表されるそれぞれの塩基配列の５’末端および３’末端領域の配列を有するＤＮＡを化学合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲによりイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードするＤＮＡを取得できる。また、配列番号３で表される塩基配列の５’末端および３’末端領域の配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲによりＩＳＯＭをコードするＤＮＡを取得することができる。上記方法により取得できる具体的なＤＮＡとしては、配列番号３および配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
また、配列番号３および配列番号４で表される塩基配列、または該列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法によって、コリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭをコードするＤＮＡを取得することができる。
さらに、コリネ型細菌に属する微生物のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭをコードするＤＮＡは、配列番号３および配列番号４で表される塩基配列、または配列番号３で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することにより取得できる。
（ｉｉ）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、上記（ｉ）で得られるコリネ型細菌に属する微生物由来のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭをコードするＤＮＡに、モレキュラー・クローニング第３版またはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に従い、部位特異変異を導入することにより取得することができる。
上記（ｉ）で得られるＤＮＡが、配列番号３で表される塩基配列において５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン以外のアミノ酸残基をコードするコドンを有する場合は、該ＤＮＡは本発明のＤＮＡである。
また本発明のＤＮＡは、上記（１）で得られるコリネ型細菌に属する微生物由来のＩＳＯＭをコードするＤＮＡにおいて、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６〜１３６８番目の塩基配列に相応する領域がグリシン以外のアミノ酸残基をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡを、公知の方法で化学合成することにより取得できる。
このようにして得られる本発明のＤＮＡとして、例えば、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１３６６番目の塩基がグアニンからアデニンに置換された塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
該ＤＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のアミノ酸残基がグリシン残基からＬ−アスパラギン酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡである。
［４］本発明のポリペプチドの製造
上記［１］の本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第３版やカレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記［２］の本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて製造することができる。
即ち、上記で取得されたＤＮＡを基にして、必要に応じて該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を作製することができる。
また該ＤＮＡ断片の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製することにより、本発明のポリペプチドを効率的に製造することもできる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる細菌、または酵母であればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｙｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
とくに、コリネ型細菌に属する微生物、例えば  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ等を使用することが好ましい。
より具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ  ＡＴＣＣ１５９９１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０６０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８２６（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ  ＡＴＣＣ１３８６８、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ  ＡＴＣＣ１５９９０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ９２４４、ＡＴＣＣ９２４５、ＡＴＣＣ９２４６およびＡＴＣＣ９２７７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ  ＡＴＣＣ１３８２５、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ  ＡＴＣＣ１９２４０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４を使用することが好ましい。
宿主細胞が、上記のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物であるときは、本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製するために用いられるベクターとして、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）〕等を用いることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭５７−１８６４９２、特開昭５７−１８６４９）、電気穿孔法〔例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５，４０９６（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１（１９９９）〕、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する微生物、例えば、サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
酵母により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドの生産形態としては、そのままの構造で生産する以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質として生産することもできる。
本発明のポリペプチドは、上記方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成、蓄積させ、該培養物より本発明のポリペプチドを採取することで得ることができる。
該形質転換体の培養は、通常の培養法によって実施することができる。
培地としては、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機または有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、および肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０℃〜４２℃が好適である。とくに３０℃〜４０℃が好ましい。培地中のｐＨは、５〜９に維持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養期間は通常１〜６日間である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、上記［１］のポリペプチドをあげることができ、より具体的には配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換したポリペプチドをあげることができる。
［５］本発明のＬ−アミノ酸の製造法
（ｉ）本発明の微生物
本発明の微生物としては、本発明の蛋白質を唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼとして生産する微生物、または本発明の蛋白質を唯一のＩＳＯＭとして生産する微生物をあげることができる。
上記微生物としては、本発明のポリペプチドを唯一のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭとして生産する微生物であれば、いずれの微生物でもよいが、好ましくはコリネ型細菌に属する微生物、より好ましくはコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微生物、さらに好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムなどをあげることができる。
本発明の微生物は、本発明のＤＮＡを用いて、宿主細胞を常法に準じて形質転換することにより取得することができる。
形質転換において、自律複製型プラスミドに本発明のＤＮＡ連結したプラスミドを用いる場合は、宿主細胞としてイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭを生産しない微生物を用いることができる。
イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭを生産しない微生物は、例えばＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７，５６６（１９９２）に記載の方法に準じて取得することができる。
また、本発明の微生物は、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等を用いて、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭを生産する微生物の染色体ＤＮＡ上の野生型イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入して取得することができる。部位特異的変異の導入は、モレキュラー・クローニング第３版、カレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に従って行うことができる。
組換えＤＮＡ技術を用いた本発明の微生物の作製方法としては、具体的には、上記［２］の方法で得られる本発明のＤＮＡを、宿主微生物中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）〕を有するプラスミドに組み込むことで得られる組換え体プラスミドを用いる方法をあげることができる。
該組換え体プラスミドは、上記［３］の方法に従い、該宿主微生物に導入することができる。
該組換え体プラスミドは該宿主微生物中で自律複製できないので、該組換え体プラスミド上に存在する抗生物質の耐性で選択することにより、該組換え体プラスミドがＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれた微生物を取得することができる。
つぎに、本発明のＤＮＡと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９２）〕を行うことによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡ上のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭをコードするＤＮＡが本発明のＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
以上の方法で、染色体ＤＮＡ上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
上記の染色体ＤＮＡ上に本発明のＤＮＡを有する形質転換体を作製する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができる。例えば、相田浩ら編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法をあげることができる。
（２）Ｌ−アミノ酸の製造
Ｌ−アミノ酸は、上記（１）で得られる微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物中より該Ｌ−アミノ酸を採取することにより、該Ｌ−アミノ酸を得ることができる。
該微生物を培養する方法は、上記［３］の形質転換体の培養法と同様である。
培養終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することによりＬ−アミノ酸を単離精製することができる。
本発明により製造することができるＬ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であれば特に限定されないが、好ましくはＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−メチオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−チロシン、Ｌ−オルニチン、より好ましくはＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−オルニチン、さらに好ましくはＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファンをあげることができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１．ＩＳＯＭ遺伝子置換用プラスミドｐＣｌｅｕＣ４５６の作製
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４５６番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換（Ｇｌｙ４５６Ａｓｐ）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＰＣＲを用いた部位特異的変異法（モレキュラー・クローニング第３版）により以下のようにして取得した。
まず、コリネバクテリウム・グルタミカムの野生型株ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）〕に従って調製した。
次いで、該染色体ＤＮＡを鋳型として、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、添付のバッファーおよび後述のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いたプライマーは、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＩＳＯＭ遺伝子の塩基配列情報（ＥＰ１１０８７９０）に基づき、該ＩＳＯＭ遺伝子中のＩＳＯＭをコードする領域（配列番号３で表される塩基配列）中で、該領域によりコードされるＩＳＯＭの有するアミノ酸配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列）のＮ末端から第４５６番目のグリシン残基をコードする領域（ｇｇｃ）を含む２１塩基からなる領域（配列番号３の第１３５９〜１３８０番目に相当）において、該グリシン残基をコードするコドンをアスパラギン酸残基をコードするコドン（ｇａｃ）に置換した塩基配列（配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ）からなるＤＮＡ断片、およびその相補配列である配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡを常法に従い合成した。
また、配列番号３で表される塩基配列の５’末端部分の２１塩基からなるＤＮＡ断片（配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ）、およびＩＳＯＭ遺伝子の３’末端下流に位置する遺伝子の塩基配列の相補配列である２１塩基からなるＤＮＡ断片（配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡと配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を各々プライマーセットとして用い、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた、約１．４ｋｂおよび約０．６ｋｂの増幅産物（配列番号３で表される塩基配列の第１〜１３８０番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片、および第１３６０番目からＩＳＯＭ遺伝子のＣ末下流の塩基配列に対応するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１社製）を用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、配列番号１で表されるＩＳＯＭの有するアミノ酸配列のＮ末端から第４５６番目のグリシン残基をコードするコドン（ｇｇｃ）がアスパラギン酸をコードするコドン（ｇａｃ）に置換された約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。得られた約２．０ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
次にｄＡＴＰ存在下、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）を７２℃、１０分間反応させることにより、該ＤＮＡ断片の３’末端にアデニンを付加した。得られた約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴＡクローニング法（モレキュラー・クローニング第３版）により、プラスミドｐＥＳＢ３０に挿入した。ｐＥＳＢ３０は、カナマイシン耐性遺伝子を有するベクターｐＨＳＧ２９９〔Ｇｅｎｅ，６１，６３（１９８７）〕のＰｓｔＩ切断部位に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６ｋｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）〕を連結したプラスミドである。
具体的には、ｐＥＳＢ３０をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断後、アガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｋｉｔを用いてｐＥＳＢ３０断片を抽出、精製した。得られたｐＥＳＢ３０断片の両末端をＤＮＡブランティングキット（ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従って、平滑化した。平滑化したｐＥＳＢ３０断片をフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、ｄＴＴＰ存在下、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を７０℃で２時間反応させ、３’末端にチミンを付加して、ｐＥＳＢ３０−Ｔ断片を調製した。
このｐＥＳＢ３０−Ｔ断片と、上記で得られたアデニンを付加した約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ１（宝酒造社製）を用い、連結反応を行った。得られた反応産物を用い、常法（モレキュラー・クローニング第３版）に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。
該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地〕上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、ｐＥＳＢ３０に上記で得られた約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドをｐＣｌｅｕＣ４５６と命名した。
実施例２．本発明のＤＮＡを有するＬ−リジン生産菌の造成
実施例１で作製したプラスミド、ｐＣｌｅｕＣ４５６を用い、遺伝子置換法によってＬ−リジン生産菌のＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を導入した。
Ｌ−リジン生産菌としては、遺伝形質が明らかなコリネバクテリウムグルタミカムＡＨＰ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３８２）を用いた。コリネバクテリウム  グルタミカムＡＨＰ−３株は、コリネバクテリウム  グルタミカムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｏｍ）にアミノ酸置換変異Ｖａｌ５９Ａｌａ、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）にアミノ酸置換変異Ｔｈｒ３３１Ｉｌｅ、およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）にアミノ酸置換変異Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒを有する菌株である。
遺伝子置換法によるＬ−リジン生産菌ＡＨＰ−３株のＩＳＯＭ遺伝子への変異の導入は、次に示すような２回の組換え操作によって行った。まず、上記で作製したプラスミドｐＣｌｅｕＣ４５６が、コリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、以下の方法で、該プラスミドが相同組換えでコリネバクテリウム  グルタミクムＡＨＰ−３株の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた株を、それぞれ選択した。
具体的には、該プラスミドを用い、レストらの方法〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）〕に従って電気穿孔法にてＡＨＰ−３株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの１株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、プラスミドがＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型および変異型のＩＳＯＭ遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。
該形質転換株（１回組換え体）をＳＵＣ寒天培地〔ショ糖１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して、生育するコロニーを選択した。ｓａｃＢ遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するので、ＳＵＣ寒天培地では生育できない〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９１）〕。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型のＩＳＯＭ遺伝子間での２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この２回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、ｓａｃＢとともに欠失する。このとき野生型がｓａｃＢとともに欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）〕により調製し、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーセットとして、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体の染色体ＤＮＡ上に存在するＩＳＯＭ遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定し、ＩＳＯＭ遺伝子内部にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を有するＡＨＬ−４５６株が取得できたことを確認した。
実施例３．ＩＳＯＭ変異株によるＬ−リジン生産試験
取得したＡＨＬ−４５６株および親株であるＡＨＰ−３株を、ＢＹＧ寒天培地（グルコース１０ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス５ｇ、バクトアガー１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）を用いて３０℃で２４時間培養し、各菌株をそれぞれ２５０ｍｌの種培地（スクロース５０ｇ、コーンスティープリカー４０ｇ、硫酸アンモニウム８．３ｇ、尿素１ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８３ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸銅５水和物１ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、β−アラニン１０ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、ビオチン０．５ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地）が入った２Ｌバッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃で１２時間〜１６時間培養した。
得られた種培養液全量を、それぞれ１，４００ｍｌの本培養培地（グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー２０ｇ、塩化アンモニウム２５ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．７５ｇ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１３ｍｇ、塩化カルシウム２水和物５０ｍｇ、硫酸銅５水和物６．３ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１．３ｍｇ、塩化ニッケル６水和物５ｍｇ、塩化コバルト６水和物１．３ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１．３ｍｇ、ニコチン酸１４ｍｇ、β−アラニン２３ｍｇ、チアミン塩酸塩７ｍｇ、ビオチン０．４２ｍｇを水１Ｌに含む培地）が入った５Ｌジャーファーメンターに植菌し、３４℃、１ｖｖｍ、８００ｒｐｍ条件下で、アンモニア水でｐＨ７．０に調整しながら培養した。
培地中のグルコースが消費された時点でグルコース・フィード液（グルコース４００ｇ、塩化アンモニウム４５ｇを水１Ｌに含む培地）を連続的に添加した。該フィード液の添加は、流加速度が２菌株間で同じになるように調整しながら行い、培養時間が３０時間に達したところで培養を終了した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第１表に示す。
2003078620.tif 000002
第１表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＡＨＬ−４５６株では、生育レベルは変わらないが、Ｌ−リジンの生産効率は親株ＡＨＰ−３に比べ向上していた。
実施例４．本発明のＤＮＡを有するＬ−スレオニン生産菌の造成
実施例１で造成したｐＣｌｅｕＣ４５６を用い、実施例２と同様な遺伝子置換法によってＬ−スレオニン生産菌のＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を導入した。
Ｌ−スレオニン生産菌としては、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１６６０を用いた。ＡＴＣＣ２１６６０株は、コリネバクテリウム  グルタミカムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２から、メチオニン要求性変異、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）耐性変異、およびＳ−（２−アミノエチル）−システイン（ＡＥＣ）耐性変異を誘導することにより取得された変異株である〔Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６１１（１９７２）〕。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーセットとして、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を有するＴＨＣ−１５株が取得できたことを確認した。
実施例５．ＩＳＯＭ変異株によるＬ−スレオニン生産試験
ＴＨＣ−１５株および親株であるＡＴＣＣ２１６６０株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃で２４時間培養し、１０ｍｌの種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地）が入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。次に、１ｍｌの種培養液を１０ｍｌの本培養培地（グルコース１００ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、ビオチン０．１ｍｇ、Ｌ−メチオニン０．１ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整後、２０ｇの炭酸カルシウムを加えた培地）が入った太型試験管に植菌し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−スレオニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第２表に示す。
2003078620.tif 000003
第２表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＴＨＣ−１５株では、生育レベルは変わらないが、Ｌ−スレオニンの生産効率は親株ＡＴＣＣ２１６６０に比べ向上していた。
実施例６．本発明のＤＮＡを有するＬ−グルタミン生産菌の造成
実施例１で造成したｐＣｌｅｕＣ４５６を用い、実施例２と同様な遺伝子置換法によってＬ−グルタミン生産菌のＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を導入した。
Ｌ−グルタミン生産菌としては、コリネバクテリウムグルタミクムの野生型菌株であるＡＴＣＣ１４７５２（特公昭６２−５１１１２）を用いた。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を有するＡＳＬ−７株が取得できたことを確認した。
実施例７．ＩＳＯＭ変異株によるＬ−グルタミン生産試験
ＡＳＬ−７株および親株であるＡＴＣＣ１４７５２株を、ＢＹＧ寒天培地上で２８℃で２４時間培養した。この培養菌体１白金を、２０ｍｌの生産培地（グルコース１５０ｇ、塩化アンモニウム５０ｇ、リン酸一水素カリウム０．７ｇ、リン酸二水素カリウム０．７ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２０ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、ビオチン６μｇ、チアミン塩酸塩１ｍｇ、肉エキス５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを５０ｇ加えた培地）が入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、２８℃で９６時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第３表に示す。
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第３表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＡＳＬ−７株では、生育レベルにほとんど差異はみられないが、Ｌ−グルタミンの生産効率は親株ＡＴＣＣ１４７５２に比べ向上していた。
実施例８．本発明のＤＮＡを有するＬ−アルギニン生産菌の造成
実施例１で造成したｐＣｌｅｕＣ４５６を用い、実施例２と同様な遺伝子置換法によってＬ−アルギニン生産菌のＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を導入することを試みた。
Ｌ−アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカムＦＥＲＭ  Ｐ−３６１６株を用いた。ＦＥＲＭ  Ｐ−３６１６株は、コリネバクテリウム  グルタミカムの野生株から、Ｄ−セリン感受性変異、Ｄ−アルギニン耐性変異、アルギニンハイドロキサメート耐性変異、および６−アザウラシル耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開平１−２５７４８６）。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーセットとして、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を有するＡＵＬ−６株が取得できたことを確認した。
実施例９．ＩＳＯＭ変異株によるＬ−アルギニン生産試験
ＡＵＬ−６株および親株であるＦＥＲＭ  Ｐ−３６１６株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、６ｍｌの種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）が入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。次に２ｍｌの種培養液を２０ｍｌの本培養培地〔廃糖蜜（グルコース換算）１５０ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、尿素３ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム２水和物０．２５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕が入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第４表に示す。
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第４表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＡＵＬ−６株では、生育レベルにほとんど差異はみられないが、Ｌ−アルギニンの生産効率は親株ＦＥＲＭ  Ｐ−３６１６に比べ向上していた。
実施例１０．本発明のＤＮＡを有するＬ−プロリン生産菌の造成
実施例１で造成したｐＣｌｅｕＣ４５６を用い、実施例２と同様な遺伝子置換法によってＬ−プロリン生産菌のＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を導入した。
Ｌ−プロリン生産菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカムＮＲＲＬ  Ｂ−１５５１１株を用いた。ＮＲＲＬ  Ｂ−１５５１１株は、コリネバクテリウム  グルタミカムの野生株から、６−メルカプトグアノシン耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特公平４−７１９６）。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーセットとして、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を有するＭＧＬ−５株が取得できたことを確認した。
実施例１１．ＩＳＯＭ変異株によるＬ−プロリン生産試験
ＭＧＬ−５株および親株であるＮＲＲＬ  Ｂ−１５５１１株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、６ｍｌの種培地（グルコース１０ｇ、肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス３ｇ、塩化ナトリウム３ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）が入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。次に２ｍｌの種培養液を２０ｍｌの本培養培地（グルコース１００ｇ、コーンスティープリカー２０ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、ニコチン酸１０ｍｇ、チアミン塩酸塩０．１ｇ、ビオチン０．１ｇ、Ｌ−グルタミン酸ソーダ２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地）が入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３２℃で９６時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−プロリンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第５表に示す。
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第５表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＭＧＬ−５株では、生育レベルは変わらないが、Ｌ−プロリンの生産効率は親株ＮＲＲＬ  Ｂ−１５５１１に比べ向上していた。
実施例１２．本発明のＤＮＡを有するＬ−トリプトファン生産菌の造成
実施例１で造成したｐＣｌｅｕＣ４５６を用い、実施例２と同様な遺伝子置換法によってＬ−トリプトファン生産菌のＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を導入した。
Ｌ−トリプトファン生産菌としては、コリネバクテリウムグルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１７７７株を用いた。ＦＥＲＭ  ＢＰ−１７７７株は、コリネバクテリウムグルタミカムの野生株から、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンの要求性変異、種々の芳香族アミノ酸アナログに対する耐性変異、および３−ブロモピルビン酸の感受性変異を誘導することにより取得された変異株である（日本特許第２５７８４８８号）。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーセットとして、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＩＳＯＭ遺伝子にＧｌｙ４５６Ａｓｐ変異を有するＢＰＬ−３１株が取得できたことを確認した。
実施例１３．ＩＳＯＭ変異株によるＬ−トリプトファン生産試験
ＢＰＬ−３１株および親株であるＦＥＲＭ  ＢＰ−１７７７株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、６ｍｌの種培地（グルコース２０ｇ、ポリペプトン１５ｇ、酵母エキス１５ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、尿素１ｇ、Ｌ−フェニルアラニン２００ｍｇ、Ｌ−チロシン２００ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）が入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。次に２ｍｌの種培養液を２０ｍｌの本培養培地（グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー１０ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２５ｇ、硫酸マンガン７水和物１０ｍｇ、ビオチン０．０３ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを２０ｇ加えた培地）が入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−トリプトファンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第６表に示す。
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第６表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＢＰＬ−３１株では、生育レベルは変わらないが、Ｌ−トリプトファンの生産効率は親株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１７７７に比べ向上していた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、改変されたイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼまたはＩＳＯＭおよびそれらをコードするＤＮＡが得られ、該ＤＮＡを有する微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率的に生産することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【国際調査報告】
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