(57)【要約】グルコアミラーゼを表層に提示し、かつα−アミラーゼを分泌するように構築したプラスミドを酵母に組込み、この酵母をデンプンを基質として生育させることにより、デンプンから直接かつ効率よくアルコール発酵できる。この酵母は、グルコアミラーゼとα−アミラーゼとをそれぞれ細胞表層に提示する酵母、α−アミラーゼを細胞表層に提示しグルコアミラーゼを分泌する酵母、およびグルコアミラーゼを細胞表層に提示する酵母に比べて、デンプンからのアルコール発酵能に優れ、さらに、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを用いると無蒸煮デンプンから直接的にエタノールを生産できる。また、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを糖鎖結合タンパク質の凝集機能ドメインとの融合タンパク質として細胞表層に提示する酵母を用いることもできる。
2003016525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコアミラーゼを細胞表層に提示し、かつα−アミラーゼを分泌する酵母。
【請求項２】
前記グルコアミラーゼが、ＧＰＩアンカーを介して提示されている、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記グルコアミラーゼが、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を有さない糖鎖結合タンパク質ドメインとの融合タンパク質として提示されている、請求項１に記載の酵母。
【請求項４】
グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を有さない糖鎖結合タンパク質ドメインとの融合タンパク質として細胞表層に提示する酵母であって、該ドメインの一端に該グルコアミラーゼが融合され、そして他端に該α−アミラーゼが融合されている、酵母。
【請求項５】
前記糖鎖結合タンパク質ドメインが、少なくともＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインを含む部分である、請求項３または４に記載の酵母。
【請求項６】
前記ＧＰＩアンカータンパク質が、凝集タンパク質である、請求項５に記載の細胞表層結合性タンパク質。
【請求項７】
前記凝集タンパク質が、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、およびＦＬＯ１１からなる群より選択されるタンパク質である、請求項６に記載の細胞表層結合性タンパク質。
【請求項８】
前記α−アミラーゼがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来である、請求項１から７のいずれかに記載の酵母。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の酵母を、デンプンを含む培地で培養する工程を含む、アルコールの製造方法。
【請求項１０】
前記デンプンが無蒸煮である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、デンプンからのエタノールの製造方法に関する。詳しくは、グルコアミラーゼを細胞表面に提示し、かつα−アミラーゼを分泌する酵母を用いる、エタノールの製造方法に関する。あるいは、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを融合タンパク質として細胞表層に提示する酵母を用いる、エタノールの製造方法に関する。さらに詳しくは、上記のような酵母を用いて無蒸煮デンプンからエタノールを製造する方法に関する。
背景技術
新しいエネルギー資源としてのバイオマスの利用が、近年注目されている。植物起源のセルロースおよびデンプン性物質は、最も豊富に存在する利用可能なバイオマス資源である。特に、デンプン資源から生産されるエタノールは、再生可能な環境調和型エネルギー資源として注目され、今後その需要が増加すると予想されている。
現在の発酵法によるデンプンからのエタノール生産は、デンプンの蒸煮後、アミラーゼを分泌する麹菌などでの処理によるデンプン質の糖化、および酵母によって発酵するという２段階の工程で行われている。これは、酵母はアミラーゼ類を有しないため、デンプンを分解して糖化することができないからである。
酵母に糖化型のアミラーゼ（グルコアミラーゼ）をコードする遺伝子を導入して糖化型のアミラーゼを分泌させるようにし、この酵母をデンプンを唯一の炭素源として生育させ、アルコール発酵を試みた例がある（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５３：２１−２５（１９９７））。しかし、酵母の生育が良好ではなく、エタノール生産量も低く、実用的ではなかった。さらに、グルコアミラーゼを酵母の細胞表層に固定化し、この酵母をデンプンを唯一の炭素源として生育させ、エタノールを生産する試みがなされ、エタノールの生産量を増加させること成功している（植田ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：１３６２−１３６６（１９９７））が、未だ実用化されるに至っていない。
発明の開示
そこで、本発明は、デンプンから直接的に、より高い効率でエタノールを生産できる酵母の構築およびそれを利用してエタノールを製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、デンプンからの効率的なエタノールの生産について種々検討した結果、グルコアミラーゼを細胞表面に提示し、かつα−アミラーゼを分泌または細胞表層に提示するように酵母を形質転換することによって、エタノール生産性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明は、グルコアミラーゼを細胞表層に提示し、かつα−アミラーゼを分泌する酵母を提供する。
好適な実施態様では、上記グルコアミラーゼは、ＧＰＩアンカーを介して提示されている。
好適な実施態様では、上記グルコアミラーゼは、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を有さない糖鎖結合タンパク質ドメインとの融合タンパク質として提示されている。
本発明はまた、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼ融合タンパク質を、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を有さない糖鎖結合タンパク質ドメインとの融合タンパク質として細胞表層に提示する酵母であって、該ドメインの一端に該グルコアミラーゼが融合され、そして他端に該α−アミラーゼが融合されている、酵母を提供する。
好適な実施態様では、上記糖鎖結合タンパク質ドメインは、少なくともＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインを含む部分である。
より好適な実施態様では、上記ＧＰＩアンカータンパク質は、凝集タンパク質である。
さらに好適な実施態様では、上記凝集タンパク質は、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、およびＦＬＯ１１からなる群より選択されるタンパク質である。
他の好適な実施態様では、上記α−アミラーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ  １４８由来である。
本発明はまた、上記酵母を、デンプンを含む培地で培養する工程を含む、アルコールの製造方法を提供する。
好適な実施態様では、上記デンプンは無蒸煮である。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、グルコアミラーゼとは、デンプンの非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素をいう。このような活性を有していれば、その起源は限定されず、例えばＲｈｉｚｏｐｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどのカビ由来のグルコアミラーゼが用いられる。例えば、植田ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１３６２−１３６６（１９９７））に記載のように、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼが好適に用いられる。
本発明において、α−アミラーゼとは、デンプンのα１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型の酵素をいう。この活性を有していればその起源は限定されず、例えば、動物（唾液、膵臓など）、植物（麦芽など）、および微生物由来のα−アミラーゼが用いられる。本発明においては、微生物由来のαアミラーゼが好適に用いられ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓなどに由来するものが挙げられる。後述するように、特に、無蒸煮デンプンを炭素源とする場合には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼが好ましい。
本発明の第一の酵母は、グルコアミラーゼを細胞表層に提示し、かつα−アミラーゼを分泌するように形質転換された酵母である。このような酵母は、グルコアミラーゼを細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡと、α−アミラーゼを分泌するように組換えられたＤＮＡとを酵母に導入することにより、得られる。
また、本発明の第二の酵母は、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを、糖鎖結合タンパク質ドメインとの融合タンパク質として細胞表層に提示するように形質転換された酵母である。このような酵母は、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、および糖鎖結合タンパク質ドメインを１つの融合タンパク質として細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡを酵母に導入することによって得られる。
まず、細胞表層に酵素を提示する一般的な方法について説明する。細胞表層に酵素を提示する方法には、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して酵素を細胞表層に提示する方法、および（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して酵素を細胞表層に提示する方法がある。１種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ａ）および（ｂ）のいずれの方法を用いてもよい。なお、２種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ｂ）の方法によって融合タンパク質と発現することが好ましい。
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、およびＦＬＯ１１）、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。
（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法
ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元部が切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
従って、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とする酵素の構造遺伝子の配列で置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素を細胞表層に提示する組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素遺伝子を導入することが好ましい。
この目的とする酵素の構造遺伝子として、グルコアミラーゼ遺伝子を用いると、ＧＰＩアンカーを介して細胞表層にグルコアミラーゼを提示する組換えＤＮＡが得られる。
（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法
細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
この細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）と目的の酵素とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。
従って、例えば、
（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子、
（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素の構造遺伝子、
（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする他の酵素の構造遺伝子、などのＤＮＡ配列を作成することにより、細胞表層に目的の酵素を提示する組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。
この目的とする酵素の構造遺伝子として、グルコアミラーゼ遺伝子を用いると、糖鎖結合タンパク質ドメインを利用して、細胞表層にグルコアミラーゼを提示する組換えＤＮＡが得られる。あるいは、糖鎖結合タンパク質ドメインのＮ末端およびＣ末端に、それぞれグルコアミラーゼ構造遺伝子とα−アミラーゼ構造遺伝子とを有する組換えＤＮＡが得られ、融合タンパク質として両酵素を細胞表層に発現することもできる。
上記組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列を用いてもよいし、発現した酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列を用いてもよい。例えば、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列が好適に用いられる。酵素活性に影響を及ぼさないのであれば、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
次に、酵母にアミラーゼ類（グルコアミラーゼ、α−アミラーゼなど）を分泌させる方法は、当業者には周知である。上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼなどの目的の酵素の構造遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作成し、酵母に導入すればよい。
上記の各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列とグルコアミラーゼあるいはα−アミラーゼの構造遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断および活性なグルコアミラーゼあるいはα−アミラーゼの発現が可能である。
上記の目的とする配列（組換えＤＮＡ）は、好ましくは、ベクターに組み込まれる。ＤＮＡの取得を容易にする点からは、大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましく、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製起点とを有し、さらに酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、ＴＲＰ、ＬＥＵ２など）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することがさらに好ましい。
グルコアミラーゼあるいはα−アミラーゼ構造遺伝子を発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列を含んでいることが望ましい。例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターとを含むプラスミドｐＹＧＡ２２７０またはｐＹＥ２２ｍ、あるいはＵＰＲ−ＩＣＬ（イソクエン酸リアーゼ上流領域）配列とＴｅｒｍ−ＩＣＬ（イソクエン酸リアーゼのターミネーター領域）配列とを含むプラスミドｐＷＩ３が挙げられる。
酵母の細胞表層に酵素を提示する場合、最も好適には、プラスミドｐＹＧＡ２２７０またはｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨプロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターの配列の間に、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡと、グルコアミラーゼまたはα−アミラーゼの構造遺伝子配列を有する配列と、α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸をコードする配列とを結合した配列を挿入すれば、酵母に導入するためのベクターが製造される。
ベクターは、マルチコピー型および染色体組込み型がある。どの型のベクターにどの遺伝子を組込むかは、当業者が適宜決定すればよい。細胞表層に提示される酵素と分泌される酵素とは、同一のベクターに組込まれてもよく、それぞれ異なるベクターに組込まれてもよい。
宿主の酵母としては、糖を資化してアルコール発酵能を有する酵母であれば、どのような酵母でもよい。非凝集性および凝集性の酵母が用いられる。凝集性の酵母が、反応後の分離が簡単である点で、あるいは簡単に固定できるため連続反応を行い得る点で好ましい。
非凝集性の酵母としては、特に制限はないが、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ８−１などが挙げられる。
凝集性の酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ６０７１５、同ＡＴＣＣ６０７１２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＦＯ１９５３、同ＣＧ１９４５、同ＨＦ７Ｃなどが挙げられる。また、新たな凝集性酵母を構築してもよい。例えば、後述の実施例の「実験材料の調製」に示すように、Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９０，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）の方法に従って、凝集性酵母ＡＴＣＣ６０７１２と非凝集性酵母Ｗ３０３−１Ｂとの接合による二倍体から、凝集性酵母ＹＦ２０７およびこれと同等の性質を有する酵母を得ることができる。本発明者らが取得した凝集性酵母ＹＦ２０７株は、プラスミドの保持安定性に優れ、さらに発酵能が非常に高い。従って、グルコアミラーゼを細胞表層に提示しかつα−アミラーゼを分泌するように組換えられた凝集性酵母ＹＦ２０７株を用いた場合は、エタノールの生産性は非常に高くなる。
本発明のグルコアミラーゼを細胞表層に提示しかつα−アミラーゼを分泌する酵母、あるいはグルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを融合タンパク質として細胞表層に提示する酵母（以下、これらをまとめて本発明の酵母という）は、上記それぞれの酵素をコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡ（ベクター）を、酵母に同時にまたは別々に導入することにより得られる。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。
組換えＤＮＡ（ベクター）が導入された酵母は、選択マーカー（例えばＴＲＰ、ＵＲＡ）で選択される。グルコアミラーゼまたはα−アミラーゼが細胞表層に提示されていることは、細胞を洗浄した後に、例えば抗グルコアミラーゼ抗体または抗α−アミラーゼ抗体とＦＩＴＣ標識抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。また、α−アミラーゼが分泌されていることも、細胞を除去した培養液について、例えば抗α−アミラーゼ抗体を用いる免疫抗体法によって確認し得る。
本発明の酵母は、担体に固定化されていてもよい。固定されていると、繰り返し回分発酵または連続発酵における使用に便利である。酵母の固定化は、当業者が通常酵母に対して用いる方法が、適用される。固定化された酵母は、担体に付着した状態で、浮遊状態で培養されるか、カラムなどに充填されて、いわゆるバイオリアクターとして用いることもできる。連続的にあるいは回分（バッチ）で繰り返し培養および発酵させた場合でも、活性が低下したあるいは死滅した酵母が脱離していくので、酵母としての活性が低下することはなく、有効に利用することができる。
以下、本発明の酵母をデンプン存在下で発酵させて、エタノールを製造する方法を説明する。
本発明の酵母を、まず、好気的条件下で培養して、その数を増加させる。培地は、選択培地であっても非選択培地であってもよい。この酵母は、デンプンを炭素源として生育可能であり、培養時の培地中のデンプン濃度は、可溶性デンプンを用いる場合、好ましくは約１〜約１０ｇ／ｌ、より好ましくは約２〜約６ｇ／ｌ、最も好ましくは約４ｇ／ｌである。また、無蒸煮デンプンを用いる場合、培地中のデンプン濃度は、約１〜約５０ｇ／ｌ、好ましくは約２〜約４０ｇ／ｌ、さらに好ましくは約１０〜約２０ｇ／ｌである。培養時の培地のｐＨは、好ましくは約４．０〜約６．０、最も好ましくは約５．０である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約０．５〜約６ｐｐｍ、より好ましくは約１〜約４ｐｐｍ、最も好ましくは約２．０ｐｐｍである。また、培養時の温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約３５℃、最も好ましくは約３０℃である。培養は、菌体濃度が１０ｇ／ｌ以上になるまで培養することが好ましい。
次いで、本発明の酵母を、嫌気的条件下で発酵させて、エタノールを生産させる。この発酵工程の形式としては、回分（バッチ）工程、流加回分工程、繰り返し回分工程、連続工程などが挙げられるが、これらのいずれであってもよい。
回分発酵工程とは、予め発酵槽内に入れられた培地に酵母を接種することによって行われる閉鎖的発酵法である。流加回分工程とは、上記回分工程に対し、栄養培地を供給しながら発酵させるが、目的生産物はある時期に至るまで抜き取らない方法である。繰り返し回分工程とは、上記回分工程を、繰り返して行う工程である。具体的には、１回目の回分工程後、培地と酵母とを分離して、培地を抜き出し、その後新鮮培地を新たに添加して発酵工程を行う、という操作が繰り返して行われる。連続発酵工程とは、発酵槽に新鮮な培地を連続的に供給しながら、同時に生産物（すなわち、エタノール）を含む培地を発酵槽から抜き取っていく工程である。
回分式（回分、流加回分、繰り返し回分）工程の場合、培地中のデンプン濃度は、好ましくは約４０〜約１５０ｇ／ｌである。特に、デンプン濃度は、より好ましくは約５０〜約１２０ｇ／ｌ、最も好ましくは約６０ｇ／ｌである。また、連続工程の場合、添加デンプン濃度は、好ましくは約４０〜約３００ｇ／ｌ、より好ましくは約６０〜約２５０ｇ／ｌ、最も好ましくは約２００ｇ／ｌで維持される。また、無蒸煮デンプンを用いる場合、培地中の仕込みデンプン濃度は、約５０〜約５００ｇ／ｌ、好ましくは約５０〜約４００ｇ／ｌ、さらに好ましくは約１５０〜約２５０ｇ／ｌである。発酵時の培地のｐＨは、好ましくは約４．０〜約６．０、最も好ましくは約５．０である。
嫌気的発酵時の培地中の溶存酸素濃度は、宿主となる酵母により異なるが、好ましくは約１．０ｐｐｍ以下、より好ましくは約０．１ｐｐｍ以下、最も好ましくは約０．０５ｐｐｍ以下である。また、発酵時の温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約３５℃、最も好ましくは約３０℃である。
嫌気的発酵時の培地中の初期細胞濃度（仕込み濃度）は、酵母の種類、培地中のデンプン濃度などにより異なるが、好ましくは初期ＯＤ６００は、１０〜３００、より好ましくは３０〜１００である。
発酵の進行とともに上記の発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフィ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
発酵工程中または終了後、エタノールを含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例
参考例  実験材料の調製
（参考例１  宿主酵母の育種）
凝集性酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ６０７１２（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３，１１２  ｈｉｓ２  ｌｙｓ２  ｓｔａ１  ＦＬＯ８）および非凝集性酵母であるＷ３０３−１Ｂ（ＭＡＴα  ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１Δ２  ｌｅｕ２−３，１１２  ｈｉｓ３−１１  ａｄｅ２−１  ｃａｎ１−１００）を用い、Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅら（前出）の方法に従って、トリプトファン栄養要求性の新たな凝集性の菌株ＹＦ２０７（ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１Δ２  ｈｉｓ  ａｄｅ２−１  ｃａｎ１−１００  ｓｔａ１  ＦＬＯ８）を得た。
また、非凝集性酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ８−１（ＭＡＴａ  ａｄｅ  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）（Ｔａｊｉｍａら、Ｙｅａｓｔ，１：６７−７７，１９８５）も、宿主酵母として用いた。
（参考例２  実施例および比較例に用いる各種プラスミドの調製）
［２−１］Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するために用いるプラスミドの調製
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを細胞表層に提示するマルチコピー型プラスミドｐＧＡ１１は、発明者である田中および植田らの文献（Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）６３：１３６２−１３６６）に記載のものを用いた。
［２−２］Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するために用いるプラスミドの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼを細胞表層に提示するプラスミドｐＡＡ１２は、プラスミドｐＩＡＡΔ１１を出発材料として調製した。図１にその構築の模式図を示す。プラスミドｐＩＡＡΔ１１をＸｈｏＩで処理し、長断片と短断片とに分離した。
長断片をセルフライゲーションして得られるプラスミドをＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで切断し、平滑化した後、約８６０ｂｐの断片を得た。この断片はＧＡＰＤＨプロモーター配列およびα−アグルチニンの３’側から３２０アミノ酸残基をコードする遺伝子配列を有する。他方、マルチコピー型プラスミドｐＭＴ３４（＋３）を、ＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、平滑化した後、上記約８６０ｂｐの断片を組込んで、プラスミドｐＵＧＰ１２を得た。
プラスミドｐＩＡＡΔ１１をＸｈｏＩで処理して得られた短断片は、約２０００ｂｐの酵母のα−ファクターの分泌シグナル配列およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼの成熟タンパク質配列をコードしている。この断片を、上記プラスミドｐＵＧＰ１２のＸｈｏＩ部位に導入して、α−アミラーゼを細胞表層に提示するために用いるプラスミドｐＡＡ１２を得た。
［２−３］Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼを分泌するために用いるプラスミドの調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼを分泌するプラスミドｐＳＡＡ１１は、発明者である田中および植田らの文献（Ｍｕｒａｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５１：６５−７０）に記載の染色体組込み型プラスミドｐＩＡＡ１１からα−アミラーゼ遺伝子を単離し、これをマルチコピープラスミドｐＵＧＰ３（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）５５：４５４−４６２）に組込むことにより調製した。図２にその構築の模式図を示す。ｐＩＡＡ１１をテンプレートとし、５’−ＡＴＧＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１）および５’−ＡＴＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＧＴＴＣＧＧ−３’（配列番号２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行い、ＳａｃＩで切断して約２０００ｂｐの長さの断片を得た。この断片は、酵母のα−ファクターの分泌シグナル配列およびα−アミラーゼの成熟タンパク質配列をコードしていた。得られた配列を、予めＳａｃＩ処理したｐＵＧＰ３に連結し、プラスミドｐＳＡＡ１１を得た。
［２−４］Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを分泌するために用いるプラスミドの調製
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを分泌するプラスミドｐＳＧＡ１１は、図３に示す方法で作成した。ｐＧＡ１１をテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＴＴ−３’（配列番号３）、および５’−ＡＴＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＧＣＧＴＡ−３’（配列番号４）を用いてＰＣＲ増幅を行い、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断して、約１８００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を得た。この断片は、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列およびグルコアミラーゼの成熟タンパク質配列をコードしている。他方、マルチコピー型プラスミドｐＵＧＰ３（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、同上）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、そこに上記約１８００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を連結して、グルコアミラーゼを分泌するために用いるプラスミドｐＳＧＡ１１を作成した。
［２−５］Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するために用いるプラスミドの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ  １４８由来のα−アミラーゼを細胞表層に提示するプラスミドｐＢＡＡ１は、上記［ａ−２］で得られたプラスミドｐＡＡ１２を出発材料として調製した。図４にプラスミドｐＢＡＡ１の模式図を示す。プラスミドｐＡＡ１２をＸｈｏＩで処理し、長断片（６．９ｋｂ）と短断片（１．７ｋｂ）とに分離した。
長断片をセルフライゲーションして得られるプラスミドをＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで切断し、平滑化した後、約８６０ｂｐの断片を得た。この断片はＧＡＰＤＨプロモーター配列およびα−アグルチニンの３’側から３２０アミノ酸残基をコードする遺伝子配列を有する。他方、マルチコピー型プラスミドｐＭＴ３４（＋３）を、ＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、平滑化した後、上記約８６０ｂｐの断片を組込んで、プラスミドｐＵＧＰ１２を得た。
プラスミドｐＱＥ３１（キアゲン社）にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ  ４１８由来のα−アミラーゼ遺伝子（Ｅ．Ｓａｔｏｈら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５９３−４５９６（１９９７））が挿入されたプラスミドｐＱＥ３１：：ａｍｙＡを作成した。これをＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断して、Ｓ．ｂｏｖｉｓ  ４１８由来のα−アミラーゼ遺伝子を含む断片を得た。次いで、プラスミドｐＣＡＳ１（Ｓ．Ｓｈｉｂａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５５：４７１−４７５（２００１））をＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、そこにＳ．ｂｏｖｉｓ  ４１８由来のα−アミラーゼ遺伝子断片を挿入して、プラスミドｐＣＡＳ１：：ａｍｙＡを得た。このプラスミドｐＣＡＳ１：：ａｍｙＡをテンプレートとして、５’−ＡＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＴ−３’（配列番号５）および５’−ＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＴＴＴＴＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号６）のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅し、ＸｈｏＩで処理し、グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ  １４８由来のα−アミラーゼ遺伝子を含む２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を、上記プラスミドｐＵＧＰ１２のＸｈｏＩ部位に導入して、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを細胞表層に提示するために用いるプラスミドｐＢＡＡ１を得た。
［２−６］Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌するために用いるプラスミドの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ  １４８由来のα−アミラーゼを分泌するプラスミドｐＳＢＡＡ２の模式図を、図５に示す。プラスミドｐＣＡＳ１：：ａｍｙＡをテンプレートとして、プライマーとして、５’−ＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＴ−３’（配列番号７）および５’−ＴＧＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＴＣ−３’（配列番号８）のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅し、制限酵素ＳａｃＩおよびＫｐｎＩで切断し、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列およびグルコアミラーゼの成熟タンパク質配列をコードする２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。他方、マルチコピー型プラスミドｐＵＧＰ３（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、同上）を制限酵素ＳａｃＩおよびＫｐｎＩで切断し、そこに上記ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片を連結して、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌するために用いるプラスミドｐＳＢＡＡ２を作成した。
［２−７］Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを凝集機能ドメインとの融合タンパク質として細胞表層に提示するために用いるプラスミドの調製
［２−７−１］ｐｒｅｐｒｏ  α−ｆａｃｔｏｒシグナル配列遺伝子の取得
次のようにしてｐｒｅｐｒｏ  α−ｆａｃｔｏｒシグナル配列遺伝子を取得した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ｂの染色体ＤＮＡを抽出した。これをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＡＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号９）および５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅物を、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩで消化して、約２５０ｂｐの長さのｐｒｅｐｒｏ  α−ｆａｃｔｏｒシグナル配列のＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片を得た。
［２−７−２］ＦＬＯ１の５’領域（凝集機能ドメイン）の遺伝子の取得
ＦＬＯ１の５’領域（凝集機能ドメイン）の遺伝子を、次のようにして取得した。まず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＴＣＣ６０７１５から染色体ＤＮＡを抽出した。次いで、これをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＧＴＧＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡ−３’（配列番号１１）および５’−ＧＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡ−３’（配列番号１２）を用いてＰＣＲ増幅し、増幅物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、約３３００ｂｐの長さのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を得た。この断片は、ＦＬＯ１の５’側の分泌シグナル配列を除くＦＬＯ１凝集機能ドメインをコードしており、Ｗａｔａｒｉらの報告（Ｙｅａｓｔ  １０（２）：２１１−２５（１９９４））に記載の配列と一致するものであった。
［２−７−３］Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ遺伝子の取得
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ遺伝子を以下のようにして取得した。簡単に述べると、まず、グルコアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＧＡ１１をテンプレートとし、プライマーとして５’−ＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１３）および５’−ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＧＣＧＴＡ−３’（配列番号１４）を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＢａｍＨＩで消化して約１８００ｂｐのグルコアミラーゼ遺伝子ＢａｍＨＩ断片を得た。この断片は、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列を除く成熟タンパク質配列をコードしていた。
［２−７−４］Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓのα−アミラーゼ遺伝子の取得
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓのα−アミラーゼ遺伝子を以下のようにして取得した。簡単に述べると、まず、α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＱＥ３１：：ａｍｙＡをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＣＧＴＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣＧ−３’（配列番号１５）および５’−ＡＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号１６）を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化して、約２０００ｂｐのα−アミラーゼ遺伝子ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片は、α−アミラーゼの分泌シグナル配列を除く成熟タンパク質配列をコードしていた。
［２−７−５］酵母表層提示用プラスミドの調製
まず、クローニングプラスミドｐＵＣ１１９をＳａｃＩおよびＫｐｎＩで消化後、上記［２−７−１］で得られたｐｒｅｐｒｏ  α−ｆａｃｔｏｒシグナル配列のＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片を挿入して、プラスミドｐＵＣ１１９αを得た。このプラスミドｐＵＣ１１９αを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、上記［２−７−２］で得られたＦＬＯ１遺伝子のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を挿入して、ｐＵＣ１１９αＦＳを得た。このプラスミドｐＵＣ１１９αＦＳをＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化後、得られた約３５００ｂｐのαＦＳ遺伝子ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片を、ＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化した酵母構成的発現用プラスミドｐＷＧＰ３に挿入し、酵母表層提示用プラスミドｐＷＧαＦＳを得た。
［２−７−６］Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを凝集機能ドメインにより細胞表層に提示するために用いるプラスミドの調製
上記［２−７−５］で得られた酵母表層提示用プラスミドｐＷＧαＦＳを、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化後、上記［２−７−４］で得られたα−アミラーゼ遺伝子ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入して、α−アミラーゼ表層提示用プラスミドｐＷＧαＦＳＡを得た。なお、α−アミラーゼは、ＦＬＯ１凝集機能ドメインのＣ末端側に融合された融合タンパク質として発現する。
［２−７−７］Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを融合タンパク質として細胞表層に提示するために用いるプラスミドの調製
上記［２−７−６］で得られたプラスミドｐＷＧαＦＳＡをＢａｍＨＩで消化後、脱リン酸化を行い、上記［２−７−３］で得られたグルコアミラーゼ遺伝子ＢａｍＨＩ断片を挿入して、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを融合タンパク質として細胞表層に提示するためのプラスミドｐＷＧαＧＦＳＡプラスミドを得た。グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼは、ＦＬＯ１凝集機能ドメインのそれぞれＮ末端側およびＣ末端側に融合された融合タンパク質として発現する。
［２−８］Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを凝集機能ドメインにより細胞表層に提示するために用いるプラスミドの調製
上記［２−７−５］で得られた酵母表層提示用プラスミドｐＷＧαＦＳを、ＢａｍＨＩで消化後、脱リン酸化を行い、上記［２−７−３］で得られたグルコアミラーゼ遺伝子ＢａｍＨＩ断片を挿入して、グルコアミラーゼ表層提示用プラスミドｐＷＧαＧＦＳを得た。なお、グルコアミラーゼは、ＦＬＯ１凝集機能ドメインのＮ末端側に融合された融合タンパク質として発現する。
（実施例１：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示しかつＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼを分泌する凝集性酵母の作成）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するためのプラスミドｐＧＡ１１とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼを分泌するためのプラスミドｐＳＡＡ１１とを、Ｙｅａｓｔ  Ｍａｋｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた酢酸リチウム法によって、同時に酵母ＹＦ２０７に導入した。これを、選択培地として、Ｌ−トリプトファンおよびウラシルを含まない適切なアミノ酸および塩基を補充したＳＤ寒天培地（６．７ｇ／ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２％グルコース、０．０２ｇ／ｌ硫酸アデニン、０．０２ｇ／ｌ  Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ、０．０３ｇ／ｌ  Ｌ−ロイシン、０．０２ｇ／ｌ  Ｌ−リジン）を用いて、培養した。生育した酵母を選択し、ＹＦ２０７／ｐＧＡ１１＋ｐＳＡＡ１１と命名した。
（比較例１：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼをそれぞれＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示する凝集性酵母の作成）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するためのプラスミドｐＧＡ１１とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼを細胞表層に提示するためのプラスミドｐＡＡ１２とを、実施例１と同様に酵母ＹＦ２０７に同時に導入し、得られた酵母をＹＦ２０７／ｐＧＡ１１＋ｐＡＡ１２と命名した。
（比較例２：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを分泌しかつＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示する酵母の作成）
グルコアミラーゼを分泌するためのプラスミドｐＳＧＡ１１とα−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するためのプラスミドｐＡＡ１２とを、実施例１と同様に酵母ＹＦ２０７に同時に導入し、得られた酵母をＹＦ２０７／ｐＳＧＡ１１＋ｐＡＡ１２と命名した。
（比較例３：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示する凝集性酵母の作成）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを細胞表層に提示するためのプラスミドｐＧＡ１１を用い、選択培地にウラシル１０ｇ／ｌを加えた以外は実施例１と同様にして、プラスミドｐＧＡ１１を酵母ＹＦ２０７に導入し、得られた酵母をＹＦ２０７／ｐＧＡ１１と命名した。
（実施例２、比較例４〜６）
実施例１、比較例１〜３で得られた形質転換酵母各５ｍｌを、１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を含むＳＤ培地１００ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃にて４８時間振とうすることによって、種培養を行った。
次いで、各５０ｍｌの種培養物を、１Ｌの４％ＹＰＳ培地（１０ｇ／ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、４０ｇ／ｌデンプン（可溶性）（和光純薬（株）製）、５ｇ／ｌグルコース）を予め入れた２Ｌのジャーファーメンター（ＢＭＪ−０２ＰＩ、Ｂｉｏｔｔ  Ｃｏｒｐ．，東京）にそれぞれ入れ、３０℃にて好気的条件下で培養した。培地のｐＨを、硫酸および水酸化ナトリウムの添加によって５．０に維持し、そして溶存酸素濃度（ＤＯ）を、撹拌速度を調節することによって２．０ｐｐｍに維持した。乾燥菌体重量が約１５ｇ／ｌに達した後、培地を抜き取って、５０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって菌体を回収した。
なお、用いた酵母の宿主である酵母ＹＦ２０７株は、この培地では、ほとんど生育しなかった。
得られた酵母菌株を用いて、それぞれ回分発酵を行いエタノールを生産させた。すなわち、回収した各酵母ペレットを、ジャーファーメンター中の１Ｌの６％ＹＰＳ培地（すなわち、６０ｇ／ｌのデンプンを含む）に接種し、ｐＨ５．０、３０℃にて嫌気的条件下で緩やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら約３５時間発酵を行った。培養および発酵工程を通して、デンプン濃度、乾燥菌体重量、およびエタノール濃度を測定した。
デンプン濃度は、以下のように測定した。１．０ｍｌの試料から、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離によって菌体を分離し、上清を蒸留水で希釈して、デンプン濃度測定に使用した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコアミラーゼ溶液（６１００ユニット／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を蒸留水で１００倍希釈し、０．９ｍｌの希釈した試料に０．１ｍｌのグルコアミラーゼ溶液を加えて、３０℃にて３０分間インキュベートした。反応を１０分間の煮沸によって停止した後、溶液中のグルコース濃度を、グルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬（株）製）を用い、分光光度計（Ｕ−２００１、日立製）を使用して測定し、デンプン濃度に換算した。
また、エタノール濃度は、水素炎イオン化検出器を装着したガスクロマトグラフ（Ｍｏｄｅｌ  ＧＣ−８；島津製作所製）を使用して測定した。測定条件は以下のとおりであった：カラム、３．０ｍｍ×３．１ｍのガラスに充填されたＵｎｉｓｏｌｅ  ３０００（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）；カラム温度、２１０℃；インジェクター／検出器の温度、２７０℃；キャリアガス、窒素（流速：２５ｍｌ／分）。
各種酵母の増殖および流加回分培養によるアルコール発酵の結果を表１に示す。なお、表１中、ｆｅｅｄ１、ｆｅｅｄ２とあるのは、それぞれ、３６時間目および７２時間目のデンプン濃度測定後に追加したデンプン量（ｇ）を意味し、それ以外の数字は、培地中のデンプン濃度（ｇ／ｌ）を意味する。
2003016525.tif 000003
実施例１の酵母、比較例１〜３の酵母ともに、デンプンを炭素源として生育し、アルコール発酵したことは、各表層に提示された酵素および分泌された酵素がデンプンを分解してグルコースを生成し、これが利用されたことを示している。
本発明の、グルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示し、α−アミラーゼを分泌する酵母は、増殖フェーズにおいては、他の酵母と大差はなかったものの、驚くべきことに、アルコール発酵の能力が、他の酵母に比べて優れていることが見出された（実施例２）。すなわち、他の酵母と比べて、デンプンの分解速度が早く、しかも残存するデンプン量が少なく、アルコール発酵の速度も大きいことが判明した。本発明の酵母のアルコール生産量は、約７７ｇ／ｌであり、添加したデンプンの約４０％がアルコールに変換されたことになる。この値は、グルコースを基質とした場合と遜色なく、実用性があることが立証された。なお、他の酵母のアルコール収率は、グルコアミラーゼとα−アミラーゼとをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示する酵母では３４％、α−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示し、グルコアミラーゼを分泌する酵母では３４％、グルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示する酵母では３１％であった。このことは、本発明の酵母がデンプンから直接アルコール発酵をするのに適しており、実用性が高いことを示している。
また、反応終了後、実施例３で用いた本発明の酵母をトリプトファンとウラシルを含まないＳＤ培地で希釈し、そしてＹＰＤプレートおよび、トリプトファンとウラシルを含まないＳＤプレートに播き、３０℃にて４８時間のインキュベーション後、両方のプレート上のコロニー数をカウントしたところ、８０％以上の酵母が、プラスミドを安定に保持していた。
（実施例３：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示しかつＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌する凝集性酵母の作成）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するためのプラスミドｐＧＡ１１とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌するためのプラスミドｐＳＢＡＡ２とを、実施例１と同様に酵母ＹＦ２０７に同時に導入し、得られた酵母をＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＳＢＡＡ２］と命名した。
（比較例７：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼをそれぞれＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示する凝集性酵母の作成）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するためのプラスミドｐＧＡ１１とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するためのプラスミドｐＢＡＡ１とを、実施例１と同様に酵母ＹＦ２０７に同時に導入し、得られた酵母をＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＢＡＡ１］と命名した。
（比較例８：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示する凝集性酵母の作成）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するためのプラスミドｐＢＡＡ１を、実施例１と同様に酵母ＹＦ２０７に導入し、得られた酵母をＹＦ２０７／ｐＢＡＡ１と命名した。
（比較例９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌する凝集性酵母の作成）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌するためのプラスミドｐＳＢＡＡ２を、実施例１と同様に酵母ＹＦ２０７に導入し、得られた酵母をＹＦ２０７／ｐＳＢＡＡ２と命名した。
なお、実施例３および比較例７〜９で得られた酵母について、プラスミドｐＧＡ１１によるグルコアミラーゼの細胞表層発現をフローサイトメトリー分析によって確認し、そしてプラスミドｐＢＡＡ１による細胞表層発現およびｐＳＢＡＡ２による分泌発現のα−アミラーゼ活性をブルースターチプレートによって確認した。
（実施例４、比較例１０〜１３）
実施例３、比較例３および７〜９で得られた形質転換酵母各２００μｌを、５ｇ／ｌ  Ｄ−グルコースを含む１００ｍｌのＹＳＰ培地（１０ｇ／ｌ酵母エキストラクト、２０ｇ／ｌポリペプトン、２０ｇ／ｌ蒸煮コーンスターチに接種し、そして酵母細胞を、３０℃にて好気的条件下で４８時間振とうしながら培養して、増殖させた。結果を、図６に示す。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼのみをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示または分泌するＹＦ２０７／ｐＢＡＡ１およびＹＦ２０７／ｐＳＢＡＡ２は両方とも、蒸煮コーンスターチを炭素源として増殖し得、そして４８時間後にＯＤ６００は１４に達した。一方、グルコアミラーゼ提示酵母ＹＦ２０７／ｐＧＡ１１は、わずかに増殖したにすぎなかった。
また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示しかつＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌するＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＳＢＡＡ２］は、蒸煮コーンスターチ培地で増殖し、そして４８時間後にＯＤ６００は２５に達した。グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを共提示するＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＢＡＡ１］も、蒸煮コーンスターチで良好に増殖していた。これらの２種の組換え酵母は、４８時間の培養で、培地中のデンプンの消費量も多かった。
次に、無蒸煮コーンスターチ培地を用いた場合のアルコール発酵について検討した。上記５種の組換え酵母細胞を、それぞれ３０℃にて好気的条件下で４８時間、ＳＤＣ培地（適切なアミノ酸およびヌクレオチドを追加した６．７ｇ／ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、１０ｇ／ｌカザミノ酸、２０ｇ／ｌグルコース）で増殖し、５０００×ｇでの１０分間の遠心分離によって回収した。得られた細胞ペレットを、５０ｍｌのＹＰＳ培地（１０ｇ／ｌ酵母エキストラクト、２０ｇ／ｌポリペプトン、５０ｇ／ｌ無蒸煮コーンスターチに、初期ＯＤ６００＝６０の酵母細胞濃度で接種した。次いで、３０℃にて嫌気的条件下で攪拌（１００ｒｐｍ）しながらアルコール発酵を行った。結果を図７に示す。
図７からわかるように、５０ｇ／ｌの無蒸煮コーンスターチを炭素源として用いた場合、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを提示しかつＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌するＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＳＢＡＡ２］のみが、デンプンを消費しそしてエタノールを生産し得た。一方、他の組換え酵母細胞では、エタノールの生産量は非常に少なく、ほとんど増殖していなかった。
そこで、無蒸煮デンプンからエタノールを生産し得るＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＳＢＡＡ２］を使用して、アルコール発酵における仕込みデンプン濃度の影響を検討した。なお、初期ＯＤ６００は６０とした。図８に示すように、仕込みデンプン濃度が高くなるにつれて、生産されるエタノール濃度が高くなった。２５０ｇ／ｌの無蒸煮コーンスターチでは約８０時間で５０ｇ／ｌのエタノール濃度に達した。
さらに、２５０ｇ／ｌの無蒸煮コーンスターチ培地を用いる場合の仕込み時のＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＳＢＡＡ２］の細胞濃度について検討した。図９に示すように、初期ＯＤ６００が高くなるにつれて、初期エタノール生産速度は上昇するが、最終エタノール濃度は減少していた。一方、初期ＯＤ６００＝３０に酵母細胞濃度を低下させると、エタノール濃度は６０ｇ／ｌに達したが、５０ｇ／ｌエタノールに達するまでには、初期ＯＤ６００＝６０の場合よりも時間を要した。
（実施例５：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを凝集機能ドメインとの融合タンパク質として細胞表層に提示する非凝集性酵母の作成）
上記参考例２の［２−７−７］で得られたプラスミドｐＷＧαＧＦＳＡを、Ｙｅａｓｔ  Ｍａｋｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた酢酸リチウム法によって、非凝集性酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ８−１に導入した。これを、Ｌ−トリプトファンを含まない適切なアミノ酸および塩基を補充したＳＤ−Ｗ寒天選択培地（６．７％  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２％グルコース、２％寒天末）を用いて培養した。生育した酵母を選択し、得られた形質転換体をＭＴ８−１／ｐＷＧαＧＦＳＡ（グルコアミラーゼ＋α−アミラーゼ融合表層提示酵母）と命名した。
（比較例１４：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを凝集機能ドメインにより細胞表層に提示する非凝集性酵母の作成）
上記参考例２の［２−８］で得られたＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを細胞表層に提示するためのプラスミドｐＷＧαＧＦＳを、実施例５と同様に非凝集性酵母ＭＴ８−１に導入し、得られた酵母をＭＴ８−１／ｐＷＧαＧＦＳ（グルコアミラーゼ表層提示酵母）と命名した。
（比較例１５：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを凝集機能ドメインにより細胞表層に提示する凝集性酵母の作成）
上記参考例２の［２−７−６］で得られたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを細胞表層に提示するためのプラスミドｐＷＧαＦＳＡを、実施例５と同様に非凝集性酵母ＭＴ８−１に導入し、得られた酵母をＭＴ８−１／ｐＷＧαＦＳＡ（α−アミラーゼ表層提示酵母）と命名した。
（実施例６、比較例１６〜１７）
上記実施例５、比較例１４および１５で得られた形質転換酵母のそれぞれについて、グルコアミラーゼ活性についてのプレートアッセイを次のように行った。１％酵母エキス、２％ペプトン、３％可溶性デンプン、０．００３％ブロモクレゾールパープル、０．５％グルコース、および２％寒天末からなるプレート培地上に各形質転換体を画線した後、３０℃で４日間、次いで４℃で２日間保存した。コロニーの周囲に形成された透明なハロを観察することによって、グルコアミラーゼ活性を検出した。この結果を図１０に示す。グルコアミラーゼ表層提示酵母ＭＴ８−１／ｐＷＧαＧＦＳおよびグルコアミラーゼ＋α−アミラーゼ融合表層提示酵母ＭＴ８−１／ｐＷＧαＧＦＳＡの周囲にははっきりした透明なハロが観察されたことから、これらが十分なグルコアミラーゼ活性を有することがわかった。また、α−アミラーゼ表層提示酵母ＭＴ８−１／ｐＷＧαＦＳＡの周囲には、かすかにハロの形成が見られたことから、微弱ながらグルコアミラーゼ活性を有していた。
（実施例７、比較例１８〜１９）
上記実施例５、比較例１４および１５で得られた形質転換酵母のそれぞれについて、α−アミラーゼ活性のプレートアッセイを以下のように行った。１％酵母エキス、２％ペプトン、０．２５％レマゾールデンプン、２％グルコース、および２％寒天末からなるプレート培地上に各形質転換体を画線した後、３０℃で４日間培養した。コロニーの周囲に形成された透明なハロを観察することによって、α−アミラーゼ活性を検出した。この結果を図１１に示す。α−アミラーゼ表層提示酵母ＭＴ８−１／ｐＷＧαＦＳＡおよびグルコアミラーゼ＋α−アミラーゼ融合表層提示酵母ＭＴ８−１／ｐＷＧαＧＦＳＡの周囲には、はっきりした透明なハロが観察されたことから、これらが十分なα−アミラーゼ活性を有することがわかる。また、ハロの大きさからわかるように、グルコアミラーゼ＋α−アミラーゼ融合表層提示酵母は、α−アミラーゼ表層提示酵母よりも活性が高かった。これは、２種のアミラーゼを融合発現させることが有用であることを示す。
（実施例８）
実施例５で得られた形質転換酵母２００μｌを、５ｇ／ｌ  Ｄ−グルコースを含む１００ｍｌのＹＳＰ培地（１０ｇ／ｌ酵母エキストラクト、２０ｇ／ｌポリペプトン、２０ｇ／ｌ蒸煮コーンスターチに接種し、そして酵母細胞を、３０℃にて好気的条件下で４８時間振とうしながら培養して増殖させると、デンプンを消費しそしてエタノールを生産する。
産業上の利用可能性
本発明の、グルコアミラーゼを表層に提示し、かつα−アミラーゼを分泌する酵母は、デンプンを基質として生育する場合、グルコアミラーゼとα−アミラーゼをそれぞれ細胞表層に提示する酵母、α−アミラーゼを細胞表層に提示しグルコアミラーゼを分泌する酵母、およびグルコアミラーゼを細胞に提示する酵母と大差はないが、デンプンからのアルコール発酵の能力が、他の酵母に比べて優れている。そのアルコールの収率は４０％と、グルコースからのアルコール発酵と遜色ないため、デンプンから直接エタノールを生産するために有用である。特に、分泌させるα−アミラーゼとしてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ由来のものを用いると、無蒸煮デンプンを炭素源とした場合でも高収率でのアルコール生産が可能である。したがって、生デンプンを蒸煮することなく、より効率的にエタノールを生産できる。また、グルコアミラーゼ＋α−アミラーゼ融合表層提示酵母も、デンプンを効率よくアルコール発酵させる能力を有するため、デンプンからの直接的なエタノール生産に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、α−アミラーゼをＧＰＩアンカーにより細胞表層に提示するプラスミドｐＡＡ１２の構築を示す模式図である。
図２は、α−アミラーゼを分泌するプラスミドｐＳＡＡ１１の構築を示す模式図である。
図３は、グルコアミラーゼを分泌するプラスミドｐＳＧＡ１１の構築を示す模式図である。
図４は、プラスミドｐＢＡＡ１の模式図である。
図５は、プラスミドｐＳＢＡＡ２の模式図である。
図６は、各種組換え酵母細胞を好気的条件下で培養した場合の、デンプン濃度および細胞密度の経時変化を示すグラフである。
図７は、無蒸煮コーンスターチ培地を用いてアルコール発酵した場合の、培地中のデンプン濃度およびエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
図８は、種々の濃度の無蒸煮コーンスターチを用いた場合の、培地中のデンプン濃度およびエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
図９は、種々の濃度の酵母ＹＦ２０７／［ｐＧＡ１１，ｐＳＢＡＡ２］を用いた場合の、培地中のデンプン濃度およびエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
図１０は、グルコアミラーゼ活性についてのプレートアッセイの結果を示すプレートの写真である。
図１１は、α−アミラーゼ活性についてのプレートアッセイの結果を示すプレートの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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