(57)【要約】受容体との結合時と非結合時に蛍光偏光度に差が見られる、蛍光標識された低分子化合物について、蛍光偏光度の変化を測定することにより、結合活性を検出することが可能となった。この方法を利用することにより、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物のスクリーニング方法が提供される。
2003070697.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光体と低分子化合物とがリンカーを介して共有結合を形成している低分子化合物であって、該低分子化合物の受容体に対して結合活性を有し、かつ該低分子化合物の受容体に結合していない際の蛍光偏光度と該低分子化合物の受容体に結合した際の蛍光偏光度の差が検出可能である蛍光標識された低分子化合物。
【請求項２】
リンカーが、アルキル基、アルキルオキシ重合体、またはペプチドである、請求項１に記載の蛍光標識された低分子化合物。
【請求項３】
リンカーの長さが、Ｃ５〜Ｃ２５に相当する長さを有するリンカーである、請求項２に記載の蛍光標識された低分子化合物。
【請求項４】
蛍光体がフローレセインである請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光標識された低分子化合物。
【請求項５】
低分子化合物がビタミンＤ３誘導体であって、かつ該低分子化合物の受容体がビタミンＤ３受容体である請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光標識された低分子化合物。
【請求項６】
下記の化学式１で示される構造を有する蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体。
2003070697.tif 000012
Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す。
【請求項７】
下記の化学式２で示される構造を有する蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体。
2003070697.tif 000013
Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す。
【請求項８】
ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合の検出方法であって、
（ａ）請求項５〜７のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体とを接触させる工程、および
（ｂ）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法。
【請求項９】
試料中に含まれる、ビタミンＤ３受容体の検出方法であって、
（１）請求項５〜７のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に試料を接触させる工程、
（２）該ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法。
【請求項１０】
試料中に含まれる、ビタミンＤ３誘導体の検出方法であって、
（１）一定量のビタミンＤ３受容体を、試料、および請求項５〜７のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と接触させる工程、
（２）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法。
【請求項１１】
被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の測定方法であって、
（１）請求項５〜７のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体および被験化合物とを接触させる工程
（２）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と該ビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する化合物を選択する工程を含む、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載のスクリーニング方法によって選択された、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項１４】
請求項１３に記載のビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する骨関連疾患治療薬。
【請求項１５】
被験化合物のビタミンＤ３誘導体に対する結合活性の測定方法であって、
（１）被験化合物と、請求項５〜７のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とを接触させる工程
（２）該被験化合物と該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体との結合によって生じた蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によって、被験化合物のビタミンＤ３誘導体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３誘導体に対する結合活性を有する化合物を選択する工程を含む、ビタミンＤ３受容体のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項５〜７のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を含む、請求項８〜１２、１５、または１６のいずれかに記載の方法に使用するための測定キット。
【請求項１８】
（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール。
【請求項１９】
（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール。
【請求項２０】
（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール。
【請求項２１】
（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、蛍光偏光法を用いた低分子化合物の受容体への結合活性測定方法、および該方法を用いた低分子化合物と結合する化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
ビタミンＤ誘導体は骨形成作用等、種々の生理活性を有しており、医薬品として開発されている。ビタミンＤ誘導体は核内に存在するビタミンＤ受容体（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＤＲ）と結合して種々の生理活性を示すことが知られている。従って、新規ビタミンＤ３誘導体の合成や開発には、ビタミンＤ３誘導体とＶＤＲとの結合活性を測定することが極めて重要である。ビタミンＤ３誘導体とＶＤＲとの結合活性を測定する方法には、放射性同位体を使用する方法等、いくつか知られているが、近年、取扱いの容易さから蛍光ラベルによる測定方法が応用されてきている。例えば、３位ＢＯＤＩＰＹ標識体を用いた方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２９  ６８−７９（１９９５））では、予め蛍光標識したビタミンＤ３誘導体を用いた組織染色方法が記載されている。また、３位Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｍｉｄｅ標識体を用いた方法（米国特許ＵＳ６２９１６９３）では、蛍光標識したビタミンＤ３誘導体を用いたＥＬＩＳＡ法が記載されている。しかしながら、これらの方法はいずれも従来法の検出方法を蛍光に変更したものであり、これらの方法はビタミンＤ３誘導体とＶＤＲとの結合活性を感度よく、しかも簡便に測定する方法ではない。
一方、最近、蛍光標識した分子を用いる測定方法のひとつとして、蛍光偏光性を利用した結合活性測定系が開発されている。蛍光偏光法では、偏光フィルターを通して直線偏光した励起光を当て、蛍光分子が放射する直線偏光した蛍光を測定する。蛍光にはナノ秒程度の寿命があるが、この間に蛍光分子はブラウン運動などによって回転するので蛍光の偏光は次第に解消することになる。この時、回転ブラウン運動の速度は蛍光分子が大きければ遅く、小さければ速い。また、蛍光分子の自由度によっても回転ブラウン運動が制限されることから観測される蛍光の偏光性が異なり、蛍光分子の存在する環境、すなわち他分子との相互作用の有無を検出することができる。
蛍光偏光法は、蛍光標識体を用いて該蛍光標識体と他の分子が相互作用することにより生じる蛍光の偏光性の変化を測定するものであり、均一系で測定できることから、操作が単純かつ簡便であること、平衡状態を保ったまま測定が可能であること、洗浄工程等がないために微小化が可能であること等の利点がある。さらには、非放射性同位体を使用するため取扱いが容易であること、高感度であること、受容体や蛍光標識体の使用量が少量で済むこと等の利点を有している（日本分光学会  測定法シリーズ３  蛍光測定  生物科学への応用、木下一彦・御端廣眞編、学会出版センター；生物化学実験法１３  蛋白質の化学修飾（下）、大野素徳ら著、学会出版センター；Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ  Ｗ．Ｂ．ａｎｄ  Ｓａｕｓｓｕｒｅ  Ｖ．Ａ．（１９７０）”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，７９９−８２８；Ｍａｅｄａ  Ｈ．（１９７９）”Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２，２２２−２２７）。しかしながら、結合により分子量が十分に増加しない場合や蛍光体の運動拘束が弱い場合には蛍光偏光度の変化が十分ではなく、測定が困難であることから、蛍光偏光法は主にオリゴヌクレオチドやオリゴペプチドなどの分子を蛍光標識し、これとＤＮＡやタンパク質、抗体等の巨大分子との結合の測定に限られて用いられてきた。
しかしながら、低分子化合物の蛍光標識体を用いる場合には、蛍光標識による結合活性の低下が起こらず、かつ、蛍光標識体の自由度が蛍光偏光度に反映されるような蛍光標識された低分子化合物をデザインすることが困難であり、一般的な蛍光標識方法は確立されていない。これまでに、低分子化合物の蛍光標識体を用いた蛍光偏光法の測定例としては、蛍光標識したエストロジェンを用いたエストロジェン受容体結合活性の測定が報告されているが、該文献に記載された方法ではエストロジェン分子内に発色団を有する蛍光誘導体が使用されており、低分子化合物一般に応用できる方法ではない（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６０，６３６−６４５（１９９５））。
従って、適度な蛍光偏光特性と受容体結合活性を有する低分子化合物をデザインし、作製する方法が望まれている。特に、ビタミンＤ３受容体とビタミンＤ３との結合活性について、蛍光偏光法に利用可能な蛍光標識されたビタミンＤ誘導体が望まれていた。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と、該化合物の受容体との結合活性測定方法、および該方法に利用できる蛍光標識された低分子化合物の提供を目的とする。より詳しくは、蛍光偏光法を用いたビタミンＤ３受容体の結合活性測定方法、および、該方法を利用したビタミンＤ３受容体と結合する化合物のスクリーニング方法、並びに、該方法に利用できる蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、リンカーを介してリガンドである低分子化合物と蛍光体を結合させることで、蛍光偏光特性と受容体結合性の両立が可能であることを見出した。また、リンカーを使用する方法は、適度にリンカーの長さを調節することが可能であり、容易に蛍光偏光法に使用できる蛍光標識体を作製できることを見出した。すなわち、蛍光体と結合した低分子化合物が、この低分子化合物の受容体と非結合時、および受容体結合時において蛍光偏光度が変化することを見出した。従って、蛍光偏光度を測定することにより、低分子化合物と該化合物の受容体との結合活性を測定することが可能となった。
本発明者らは上記の如く、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と、該化合物の受容体との結合活性を測定する新規な方法を開発し、本発明を完成させた。
また、低分子化合物がビタミンＤ３誘導体の場合、ビタミンＤ３骨格の２位、または２５位にＣ１０のアルキル基を介して蛍光体を結合させたビタミンＤ３誘導体は、リガンドと蛍光体が、リガンドの受容体への結合を妨げない程度、十分に距離的に離れている一方で、リガンドの運動拘束が蛍光体の偏光特性に影響するに足る程度に近い距離にあることを見出した。従って、このような化合物は、ＶＤＲのリガンド結合部位に結合し、競合阻害によりその他のビタミンＤ３誘導体の結合活性を測定する際にも有用である。
さらに上記方法を利用することにより、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物のスクリーニングを行うことが可能である。
即ち本発明は、蛍光偏光法を用いた低分子化合物の受容体への結合活性測定方法、および該方法に利用できる蛍光標識された低分子化合物に関し、より具体的には、
〔１〕  蛍光体と低分子化合物とがリンカーを介して共有結合を形成している化合物であって、該低分子化合物の受容体に対して結合活性を有し、かつ該低分子化合物の受容体に結合していない際の蛍光偏光度と該低分子化合物の受容体に結合した際の蛍光偏光度の差が検出可能である蛍光標識された低分子化合物、
〔２〕  リンカーが、アルキル基、アルキルオキシ重合体、またはペプチドである、〔１〕に記載の蛍光標識された低分子化合物、
〔３〕  リンカーの長さが、Ｃ５〜Ｃ２５に相当する長さを有するリンカーである、〔２〕に記載の蛍光標識された低分子化合物、
〔４〕  蛍光体がフローレセインである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の蛍光標識された低分子化合物、
〔５〕  低分子化合物がビタミンＤ３誘導体であって、かつ該低分子化合物の受容体がビタミンＤ３受容体である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の蛍光標識された低分子化合物、
〔６〕  下記の化学式１で示される構造を有する蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体、
2003070697.tif 000003
Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す、
〔７〕  下記の化学式２で示される構造を有する蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体、
2003070697.tif 000004
Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す、
〔８〕  ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合の検出方法であって、
（ａ）〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体とを接触させる工程、および
（ｂ）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔９〕  試料中に含まれる、ビタミンＤ３受容体の検出方法であって、
（１）〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に試料を接触させる工程、
（２）該ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１０〕  試料中に含まれる、ビタミンＤ３誘導体の検出方法であって、
（１）一定量のビタミンＤ３受容体を、試料、および〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と接触させる工程、
（２）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１１〕  被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の測定方法であって、
（１）〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体および被験化合物とを接触させる工程
（２）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と該ビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１２〕  〔１１〕に記載の方法によって、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する化合物を選択する工程を含む、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔１３〕  〔１２〕に記載のスクリーニング方法によって選択された、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、
〔１４〕  〔１３〕に記載のビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する骨関連疾患治療薬、
〔１５〕  被験化合物のビタミンＤ３誘導体に対する結合活性の測定方法であって、
（１）被験化合物と、〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とを接触させる工程
（２）該被験化合物と該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１６〕  〔１５〕に記載の方法によって、被験化合物のビタミンＤ３誘導体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３誘導体に対する結合活性を有する化合物を選択する工程を含む、ビタミンＤ３受容体のスクリーニング方法、
〔１７〕  〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を含む、〔８〕〜〔１２〕、〔１５〕、または〔１６〕のいずれかに記載の方法に使用するための測定キット、
〔１８〕  （１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、
〔１９〕  （１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、
〔２０〕  （１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、
〔２１〕  （１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、を提供するものである。
本発明は、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と、該化合物の受容体との結合活性測定方法、および該方法に利用できる蛍光標識された低分子化合物に関する。本発明はまず、該方法に利用できる蛍光標識された低分子化合物を提供する。本発明の好ましい態様においては、本発明は、蛍光体と低分子化合物とがリンカーを介して共有結合を形成している化合物であって、該低分子化合物の受容体に対して結合活性を有し、かつ該低分子化合物の受容体に結合していない際の蛍光偏光度と該低分子化合物の受容体に結合した際の蛍光偏光度の差が検出可能である蛍光標識された低分子化合物を提供する。
本発明において低分子化合物とは、分子量が１０００以下の有機化合物であり、好ましくは分子量が５０〜８００、さらに好ましくは１００〜７００、最も好ましくは２００〜５００である。本発明における低分子化合物の受容体（本明細書においては単に「受容体」とも記載する）とは通常、生体内に天然に存在するタンパク質であって、天然に存在するリガンドと結合する活性を有するタンパク質である。また、天然に存在するリガンドと結合する限り、該タンパク質の一部が人為的あるいは自然に改変されたタンパク質も受容体である。受容体は血液中に存在している受容体であってもよいし、細胞内に存在する受容体であってもよい。細胞内に存在する場合としては、膜受容体、核内受容体、細胞質内受容体が含まれる。なお、本発明のビタミンＤ３受容体には、所謂ビタミンＤ３受容体様化合物も含まれる。
天然に存在するリガンド（受容体と結合活性を有する分子）としては、タンパク質であっても低分子化合物であってもよいが、天然に存在し、生理活性を有することが好ましい。従って、本発明の低分子化合物は、天然に存在し、受容体に結合して生理活性を発揮する化合物である。例えば、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、ビタミンＤ３、女性ホルモン、男性ホルモン、甲状腺ホルモン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ビタミンＡ等が含まれる。より具体的には、ビタミンＤ３、１−ヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、アンドロジェン（テストステロン、ジヒドロテストステロン）、エストロジェン（エストラジオール、エストロン、エストリオール）、アドレナリン、ノルアドレナリン、ヒスタミン、ドーパミン、セロトニン、プロゲステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、チロキシン、レチノール、レチノイン酸、プロスタグランジンＥ２、ロイコトリエンＢ４等あるいはこれらの化合物の誘導体を挙げることができる。
本発明における特に好ましい態様においては、低分子化合物としてビタミンＤ３誘導体を挙げることができる。ビタミンＤ３誘導体とは、９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン構造を有する化合物を指す。好ましくは、（５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン構造を有する化合物である。さらに好ましくは（１α，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１−オール構造を有する化合物、より好ましくは（１α，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，２５−ジオール構造を有する化合物、さらに好ましくは（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３−ジオール構造を有する化合物、最も好ましくは（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール構造を有する化合物である。本発明のビタミンＤ３誘導体は、上記の構造を有するものであれば特に限定されず、従って、上記の化合物に対して種々の置換基を有する化合物も本発明のビタミンＤ３誘導体に含まれる。また、本発明のビタミンＤ３誘導体には、上記の化合物に対する活性類似体、および構造類似体も含まれる。活性類似体とは、上記生理活性を有する化合物と同様の生物学的活性を有する化合物を指す。活性類似体の当該活性の強弱に関わらず、同様の生物学的活性を有する化合物は、活性類似体に含まれる。また本発明における構造類似体とは、化合物の固有の構造に様々な修飾を施した化合物を言う。構造類似体は人為的に合成することもできるし、天然に存在する化合物であってもよい。
本発明における蛍光体としては特に制限はなく、蛍光を発する分子である限り使用することができる。例えば、フローレセインやテトラメチルローダミン、テキサスレッドを好適に使用することができる。入手が容易であること、蛍光寿命が適当であること、市販の測定機器で測定可能であること等から、フローレセインが好ましい。フローレセインを蛍光体として使用する場合には、フローレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とアミノ基等を反応させればよい。蛍光体と低分子化合物をリンカーを介して共有結合させるには、例えば、後述の実施例に記載の方法に従って行うことができる。
本発明において「リンカー」とは、低分子化合物および蛍光体と共有結合を形成している構造部、または該構造部を形成させるために必要な化合物を指す。リンカーはどのような化学構造を有していても良いが、低分子化合物と該化合物の受容体との結合に実質的に関与しないものが好ましく、種々の溶媒に対して化学的に安定であることが望ましい。たとえば、炭素鎖であってもよいし、ペプチド鎖、糖鎖であってもよい。炭素鎖の場合には、置換されていてもよいアルキル基や無置換のアルキル基であってもよい。また、酸素原子、窒素原子、硫黄原子を炭素鎖中に有していてもよい。例えば、エチル基やプロピル基が酸素原子を介して複数回の繰り返し構造を有していてもよい。置換基としては特に制限はなく、例えば、アルキル基、ハロゲン、水酸基、アミノ基、カルボキシル基等が挙げられるが、蛍光偏光の測定に影響を与えない点で、好ましくは、無置換のアルキル基である。リンカーの末端は、蛍光体および低分子化合物と共有結合を形成できるように、適当な置換基を有することが好ましい。例えば、アミノ基、水酸基、チオール基等が挙げられる。どのような置換基を使用するかは、結合される低分子化合物および蛍光体の官能基との組み合わせで決定すればよいが、好ましくはアミノ基または水酸基である。これらの適切なリンカーの選択や製造は当業者には公知の技術である。
リンカーと共有結合を形成する低分子化合物の部位は、リンカーと結合した低分子化合物が該化合物の受容体と結合する限り、特に制限はない。つまり、低分子化合物がリンカーと共有結合を形成する部位は、該低分子化合物の構造において、受容体あるいは酵素との結合に関与しない部分であればよい。リンカーを結合させる部位もしくは官能基の選定は、例えば受容体あるいは酵素との相互作用の様式を解析すれば決定することができる。受容体や酵素の立体構造をコンピューターで解析し、所望の低分子化合物との結合様式を解析し、結合に関与しない部位を決定すればよい。具体的には、低分子化合物がビタミンＤ３誘導体である場合、好ましくは、１位および／または３位以外の位置である。好ましくはビタミンＤ３骨格の２位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位の炭素原子であり、より好ましくは２位、２５位または２６位の炭素原子である。
リンカーの長さは、低分子化合物と蛍光体との間に、該低分子化合物と該低分子化合物の受容体との結合を妨げず、かつ、該低分子化合物と該低分子化合物の受容体との結合により蛍光体の蛍光偏光度に影響を及ぼすことができる適度な距離を与えるものであることが好ましい。低分子化合物と蛍光体との間の適度な距離とは、炭素鎖に換算して、５以上２５以下、好ましくは５以上２０以下、さらに好ましくは８以上１５以下、最も好ましくは８以上１２以下である。また、必要に応じて、低分子化合物との結合様式をコンピューターにより解析し、リンカーの最適な長さを決定することもできる。
本発明においては、蛍光体と低分子化合物とは、適当な長さのリンカーを介して共有結合を形成していることが好ましい。
本発明の好ましい態様においては、本発明の低分子化合物は、該低分子化合物の受容体に対して結合している場合の蛍光偏光度と、受容体に結合していない場合の蛍光偏光度に有意な差が見られる化合物である。蛍光偏光の測定には、市販の測定機器を使用することができる。例えば、ＰａｎＶｅｒａ社によるＢＥＡＣＯＮ（商品名）を使用すればよい。
本発明の低分子化合物として、好ましくは下記の構造を有する蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を挙げることができる。
2003070697.tif 000005
Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す。
2003070697.tif 000006
Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す。
本発明の蛍光標識された低分子化合物と受容体との結合活性を測定するためには、受容体は精製されていることが好ましい。従って、精製が容易な点で遺伝子組換えタンパク質は、本発明における好ましい受容体である。遺伝子組換えタンパク質を作成する方法は既に公知であり、適当なベクターと宿主を組み合わせて製造することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，１９８６）。また、遺伝子組換えタンパク質や天然に存在するタンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離方法、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、フィルター、塩析、免疫沈降、電気泳動法等を組み合わせて使用することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。
また本発明は、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と該化合物受容体との結合の検出方法に関する。本発明の好ましい態様においては、蛍光偏光法を用いた本発明の上記ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合の検出方法を提供する。
本発明の上記方法においては、まず、蛍光標識された本発明のビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体とを接触させ（工程（ａ））、次いで、該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する（工程（ｂ））。
本方法においては、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体とが接触している状態における蛍光偏光度を測定すれば、結合の有無を測定することができる。また、ビタミンＤ３受容体との接触の前後における蛍光偏光度の変化を測定してもよい。
工程（ｂ）における蛍光偏光度の測定は、当業者においては、前述の市販の測定機器を使用することにより行うことができる。
測定に使用する緩衝液の種類は、蛍光を適切に測定できるものであれば特に制限はなく、当業者においては、使用する蛍光体の種類によって適宜決定することができる。例えば、蛍光体としてフローレセインを使用する場合には、蛍光が安定する緩衝液として、ｐＨ７．５以上の緩衝液が好ましい。例えば、ｐＨ７．５〜１０．０であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ７．５〜９．０、最も好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５である。また、塩の種類や濃度についても当業者であれば適宜選択することが可能であるが、例えば、ＫＣｌを使用することができる。塩濃度は測定に応じて適宜決定することができるが、例えば、３００〜５００ｍＭの濃度を使用することができる。また、使用する受容体や酵素等のタンパク質の特性によっては、安定化剤を使用することが好ましく、ビタミンＤ３受容体の場合には、ＥＤＴＡを添加するとよい。
本発明の低分子化合物として難水溶性の化合物を使用する場合には、一旦有機溶媒に溶解した後に使用することが好ましい。例えば、有機溶媒としてＤＭＳＯを使用すればよい。例えば、最終濃度として５％以下、好ましくは２％以下、最も好ましくは１％以下のＤＭＳＯを使用することができる。
本発明においては、測定した蛍光偏光度に変化が見られた場合、ビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体とは結合（相互作用）するものと判定される。
本発明によれば、ビタミンＤ３受容体のみならず、試料中に含まれるビタミンＤ３誘導体を測定することもできる。本発明の上記方法においては、一定量のビタミンＤ３受容体を、試料と同時に、または試料との接触の後に、本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に接触させ、該ビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合によって生じた蛍光偏光度を測定する。ビタミンＤ３受容体、試料、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を接触させる順序はいずれであってもよく、試料と蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を接触させたのち、ビタミンＤ３受容体を添加してもよい。上記の「一定量」は、その上限または下限を特に制限されるものではないが、通常、１００ｐｇ〜１００ｎｇである。
上記方法では、一定量のビタミンＤ３受容体に対して、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、試料中に存在するビタミンＤ３誘導体とを競合させることにより、試料中に含まれるビタミンＤ３誘導体を測定することができる。競合反応を行うためには、一定量のビタミンＤ３受容体を、試料の存在下で蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に接触させるか、または試料との接触の後に、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と接触させる。その結果、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と結合するビタミンＤ３受容体は、試料中に含まれるビタミンＤ３誘導体の濃度と逆比例する。
本発明の別の態様においては、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の測定方法を提供する。本発明の方法においては、本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体および被験化合物とを接触させ、次いで、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する。
また本発明は、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の検出方法を利用した、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。該方法においては、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する化合物を選択する。
本発明のスクリーニング方法に供される被験化合物は、通常ビタミンＤ３誘導体であるが、これに特に限定されない。本発明の上記方法により選択されるビタミンＤ３受容体と結合する化合物は、該ビタミンＤ３受容体に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤、促進剤として有用である。またビタミンＤ３受容体と結合する化合物は、ビタミンＤ３受容体の検出や精製を可能とするリガンドとして有用である。本発明においては、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物の探索に用いられる該ビタミンＤ３受容体を特に標的分子と呼ぶ場合がある。すなわち、被験化合物を蛍光標識し、標的分子を反応させた後、標的分子と蛍光標識された被験化合物との反応によって生じる複合体の形成を蛍光偏光度の変化に基づいて測定する。
さらに、本発明の好ましい態様においては、ビタミンＤ３受容体と、該ビタミンＤ３受容体と結合することが予め判明しているビタミンＤ３誘導体との結合に干渉する、ビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する化合物の検出方法に関する。上記方法は、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の検出方法であって、以下の工程を含む。
（ｉ）本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体および被験化合物とを接触させる工程
（ｉｉ）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程
上記工程（ｉ）の「接触」は、より具体的には、例えば下記のようにして行うことができる。
（Ａ）被験化合物の存在下で、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体を接触させる。
（Ｂ）被験化合物とビタミンＤ３受容体を接触させた後に、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と接触させる。
（Ｃ）既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体を接触させた後に、候補化合物と接触させる。
上記（Ａ）は、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合反応に対する被験化合物の競合活性（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定するための方法である。被験化合物存在下でビタミンＤ３受容体と、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体との結合が観測されない場合には、該被験化合物はビタミンＤ３受容体に結合する活性を有しており、ビタミンＤ３受容体のアゴニストや促進剤、またはアンタゴニストや阻害剤であると同定することができる。
また、上記（Ｂ）は、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られているビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合反応に対する被験化合物の阻害活性（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定するための方法である。この方法においても、被験化合物がビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する場合には、ビタミンＤ３誘導体へのビタミンＤ３受容体の結合が阻害される。
そして上記（Ｃ）は、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られているビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合反応に対する被験化合物の置換活性（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定するための方法である。この方法においては、被験化合物がビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する場合には、先にビタミンＤ３誘導体に結合しているビタミンＤ３受容体の一部が、該被験化合物によって置換され、複合体の形成量が低下する。
本発明の上記方法によっても、ビタミンＤ３受容体に対する被験化合物の結合活性を検出することができる。またこの方法によって結合活性を見出された被験化合物を選択することにより、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物のスクリーニングを行うことができる。この方法によって選択された化合物は、ビタミンＤ３受容体のアゴニストや促進剤、またはアンタゴニストや阻害剤として有用である。
被験化合物とビタミンＤ３受容体はあらかじめ混合した後に、本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体との結合を測定してもよいし、一旦ビタミンＤ３受容体と、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とを結合させた後、被験化合物を反応させ、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合が、被験化合物によって置き換わることによって生じるビタミンＤ３受容体の解離を蛍光偏光度の変化として検出してもよい。
本発明の方法では、蛍光標識したビタミンＤ３誘導体に直接結合するビタミンＤ３受容体以外に、共結合分子（ｃｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を単離、同定することができる。共結合分子とはコファクター（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）とも呼ばれ、生理活性分子の活性を調節する活性を有する。例えば、共結合分子が、ビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との複合体にさらに結合することで生理活性の増強がおこる。この場合当該共結合分子をコファクターと呼ぶ。逆に活性を低下される場合には、コリプレッサー（ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）と呼ばれることもある。共結合分子はビタミンＤ３受容体とビタミンＤ３誘導体との複合体に結合する場合もあるし、ビタミンＤ３受容体のみに結合する、あるいはビタミンＤ３誘導体のみに結合する場合もある。
本発明の方法によって回収（選択）されたビタミンＤ３受容体は、質量分析、アミノ酸分析等の分析手法により、分析、同定することが可能である（例えば米国特許５９５５７２９を参照）。該方法を用いれば、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に結合する活性を有する未知のビタミンＤ３受容体を同定することが可能である。本方法によって同定された新たなビタミンＤ３受容体は、薬剤のターゲット分子として有用である。
新たに同定されたビタミンＤ３受容体は、同定するために用いたビタミンＤ３誘導体と同様の活性を有する化合物をスクリーニングする為に用いることができる。すなわち、新たに同定されたビタミンＤ３受容体を用いて、被験化合物との結合を測定する、あるいは同定に用いたビタミンＤ３誘導体との競合反応を測定すればよい。これらのスクリーニング方法は、前述のように、蛍光偏光度の変化を測定することによって行うことができる。
スクリーニングに用いられる被験化合物や被験試料は、特に制限はなく、例えば、ペプチド、精製もしくは粗精製タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物発酵産物、海洋生物抽出液、植物出出液、細胞抽出液等を適宜用いることができる。これらの被験化合物は新規な化合物であってもよいし、既知の化合物であってもよい。
本発明の上記方法によって見出すことができる新たな化合物、例えば、ビタミンＤ３受容体アゴニストもしくはアンタゴニストは医薬品として有用である。特に、該化合物は、骨関連疾患治療薬となることが期待される。骨関連疾患としては、例えば、骨粗鬆症、癌の骨転移等を挙げることができる。本発明の方法によって取得されるビタミンＤ３受容体アゴニストおよびアンタゴニストも本発明に含まれる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物をヒトや他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬品として使用する場合、常用される手段に従って実施することができる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物を有効成分として含有する医薬組成物は、当業者に公知の方法により、薬学的に許容し得る賦形剤、安定剤等と共に製造することができる。
さらに本発明は、本発明の上記方法に使用するための測定キットを提供する。本発明のキットは、少なくとも、本発明の上記蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体が含まれる。該キットには、例えば、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体、ビタミンＤ３受容体、検体希釈液、測定用試験管またはマイクロプレート、標準品として１α−ヒドロキシビタミンＤ３あるいは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
また本発明は、後述の実施例において記載された下記（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物を提供する。
（ｉ）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
（ｉｉ）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
（ｉｉｉ）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
（ｉｖ）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
これらの化合物は標識されたビタミンＤ３誘導体、特に蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体の製造に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］アミノアルキルビタミンＤ３誘導体（（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（以下ＥＤ−５３３と称す））の合成（合成までのスキームを図５に示す）
（１）（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２０−ヨードメチル−プレグナ−５−エンの合成
（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）プレグナ−５−エン−２０−メタノール（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３９（１２），３２２１（１９９１），３４．１４ｇ）、トリフェニルホスフィン（１８．６２ｇ）、イミダゾール（５．２４ｇ）およびジクロロメタン（３５０ｍｌ）の混合物に、氷冷下、ヨウ素（１６．５２ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を、減圧下溶媒を留去し、得た残渣にヘキサンを加え、不溶物を濾別した。得られた濾液をチオ硫酸ナトリウム水溶液、０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアセトニトリルで洗浄し、（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２０−ヨードメチル−プレグナ−５−エン（３６．６３ｇ，９０％）を白色固体として得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．０３（３Ｈ，ｓ），０．０４（３Ｈ，ｓ），０．０５（３Ｈ，ｓ），０．０７（３Ｈ，ｓ），０．７２（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８９（９Ｈ，ｓ），０．９６（３Ｈ，ｓ），２．１３−２．３７（２Ｈ，ｍ），３．１１−３．２１（１Ｈ，ｍ），３．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），３．７７（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９１−４．０６（１Ｈ，ｍ），５．４１−５．４９（１Ｈ，ｍ）．
（２）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５−コレステン−２５−オンの合成
塩化ニッケル６水和物（９ｇ）、亜鉛末（１２．４ｇ）、メチルビニルケトン（１４．８ｇ）およびピリジン（２００ｍｌ）の混合物を６０℃で３０分間攪拌した後、室温に冷却した。室温で（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２０−ヨードメチル−プレグナ−５−エン（２０ｇ）、テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）およびピリジン（１００ｍｌ）の混合物を加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、セライトで濾過した。濾液を０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５−コレステン−２５−オン（１６．８ｇ，９１％）を白色固体として得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．０３（３Ｈ，ｓ），０．０４（３Ｈ，ｓ），０．０５（３Ｈ，ｓ），０．０７（３Ｈ，ｓ），０．６７（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），３．７７（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９１−４．０６（１Ｈ，ｍ），５．４１−５．４９（１Ｈ，ｍ）．
（３）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン  ４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体の合成
１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５−コレステン−２５−オン（１６．８ｇ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（６．１４ｇ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（１．３ｇ）およびヘキサン（２００ｍｌ）の混合物を１５分間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、不溶物を濾過した後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣にトルエン（２００ｍｌ）およびγ−コリジン（１３．３ｍｌ）を室温で順次加え、２．５時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、不溶物を濾過した後、ヘキサンで希釈し、０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍｌ）および４−フェニル−１，２，４−トリアゾール−３，５−ジオン（４．７ｇ）を室温で順次加え、室温で４５分間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ジクロロメタン＝１０：１：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン  ４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（７．８ｇ，３６％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．０７（３Ｈ，ｓ），０．０８（３Ｈ，ｓ），０．１０（３Ｈ，ｓ），０．１３（３Ｈ，ｓ），０．８０（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８９（９Ｈ，ｓ），２．１４（３Ｈ，ｓ），３．１８−３．３０（１Ｈ，ｍ），３．８４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．６９−４．８５（１Ｈ，ｍ），６．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３４−７．４９（ｍ，５Ｈ）．
（４）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オンの合成
１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン  ４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（５．７ｇ）および１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（５７．１ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、１５０℃で攪拌した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝８：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン（３．３ｇ，７４％）を淡黄色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．０３−０．０８（９Ｈ，ｍ），０．１０（３Ｈ，ｓ），０．６１（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．６９−２．８２（１Ｈ，ｍ），３．６９（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９７−４．１１（１Ｈ，ｍ），５．２５−５．３４（１Ｈ，ｍ），５．５２−５．６１（１Ｈ，ｍ）．
（５）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オールの合成
マグネシウム末（３．３ｇ）、１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニルブロミド（４．８ｇ）およびテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、５０℃でエチレンブロミドを数滴加え、３０分間攪拌した。反応混合物に１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン（２．２ｇ）およびテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）の混合物を５０℃で加え、同温度で終夜攪拌した。反応混合物を室温に冷却後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、無色油状物（３．９７ｇ）を得た。得られた無色油状物（３．９７ｇ）およびテトラヒドロフラン（５０ｍｌ）の混合物に、テトラブチルアンモニウムフロリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液、１０ｍｌ）を室温で加え、同温度で１５分間攪拌した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オール（１．７４ｇ，６３％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．０３−０．０８（９Ｈ，ｍ），０．１１（３Ｈ，ｓ），０．６２（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８９（９Ｈ，ｓ），２．２８−２．４１（２Ｈ，ｍ），２．７１−２．８３（１Ｈ，ｍ），３．５７−３．７４（３Ｈ，ｍ），３．９６−４．１３（１Ｈ，ｍ），５．２６−５．３６（１Ｈ，ｍ），５．５４−５．６２（ｍ，１Ｈ）．
（６）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オール（０．５ｇ）およびテトラヒドロフラン（３５０ｍｌ）の混合物をアルゴン気流下、水冷で攪拌しながら、３時間ＵＶ光照射（ウシオ電機（株）製５００Ｗキセノン−水銀ランプ紫外線照射装置２９５ｎｍ干渉フィルター透過光）した。反応混合物にテトラヒドロフラン（１５０ｍｌ）を加えた後アルゴン雰囲気下２時間加熱還流した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−２５−オールを含む混合物４９３ｍｇを得た。得られた混合物（４９３ｍｇ）、テトラブチルアンモニウムフロリド（１．０Ｍテトラヒドロフラン溶液、１６ｍｌ）およびテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、４５℃で２時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈後、０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（１５９ｍｇ，４５％）を得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３３８，２９２７，２８５０，１７１１，１４６６，１３７７，１２６１，１０５７ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．５４（３Ｈ，ｓ），２．５４−２．６５（１Ｈ，ｍ），２．７６−２．９０（１Ｈ，ｍ），３．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４３（１Ｈ，ｂｒｓ），５．００（１Ｈ，ｓ），５．３３（１Ｈ，ｓ），６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ  ５４０（Ｍ＋−Ｈ２Ｏ）；ＵＶ（ｉｎ  ＥｔＯＨ）λｍａｘ２１２．５，２６４．５ｎｍ．
（７）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（１５９ｍｇ）、フタルイミド（６３ｍｇ）トリフェニルホスフィン（８９ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（２．８ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、室温でアゾジカルボン酸ジエチルエステル（０．０５ｍｌ）をゆっくり加え、室温で１．５時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）および薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−フタルイミドデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールを含む混合物（２４０ｍｇ）を得た。得られた混合物（２４０ｍｇ）およびメチルアミン（４０％メタノール溶液、８ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、室温で１時間攪拌した。反応混合物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（富士シリシア化学製ＮＨ  ＴＬＣプレート、ジクロロメタン：エタノール＝１０：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールを８．８ｍｇ（５．６％）（ＥＤ−５３３）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。また、ＥＤ−５３３の構造を化学式３に示す。
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３５６，２９２７，２８５２，１６４７，１４６６，１３７５，１０５７ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．５４（３Ｈ，ｓ），２．６６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．７７−２．８８（１Ｈ，ｍ），４．１５−４．２８（１Ｈ，ｍ），４．３５−４．４４（１Ｈ，ｍ），４．９８（１Ｈ，ｓ），５．３２（１Ｈ，ｓ），６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），６．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ  ５３９（Ｍ＋−Ｈ２Ｏ）；ＵＶ（ｉｎ  ＥｔＯＨ）λｍａｘ２１０．８，２６３．３ｎｍ．
2003070697.tif 000007
2003070697.tif 000008
［実施例２］（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（以下ＥＤ−５３２と称す）の合成（合成までのスキームを図６に示す）
（１）（１α，２β，３β）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−５，７−コレスタジエン−１，３，２５−トリオールの合成
マグネシウム末（１．５ｇ）、１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニルブロミド（５．０ｇ）およびテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、室温でエチレンブロミドを数滴加え、３０分間攪拌した。反応混合物に（１α，２α，３β）−１，２−エポキシ−コレスタ−５，７−ジエン−３，２５−ジオール（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４１（６），１１１１（１９９３），６２５ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）の混合物を室温で加え、１時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、（１α，２β，３β）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−５，７−コレスタジエン−１，３，２５−トリオール７１４ｍｇ（６７％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．５−０．７（９Ｈ，ｍ），０．９−１．１（１５Ｈ，ｍ），１．９１（１Ｈ，ｍ），２．０−２．２（２Ｈ，ｍ），２．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．７，４．６Ｈｚ），２．４９（１Ｈ，ｍ），２．６９（１Ｈ，ｍ），３．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．７８（１Ｈ，ｂｒｓ），４．２０（１Ｈ，ｍ），５．３７（１Ｈ，ｍ），５．６８（１Ｈ，ｍ）．
（２）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，２β，３β）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−５，７−コレスタジエン−１，３，２５−トリオール（５００ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（３５０ｍｌ）の混合物をアルゴン気流下、水冷で攪拌しながら、３時間ＵＶ光照射（ウシオ電機（株）製５００Ｗキセノン−水銀ランプ紫外線照射装置２９５ｎｍ干渉フィルター透過光）した。反応混合物にテトラヒドロフラン（１５０ｍｌ）を加えた後、アルゴン雰囲気下２時間加熱還流した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール１２３ｍｇ（２５％）を淡黄色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．５−０．７（９Ｈ，ｍ），０．８−１．０（１５Ｈ，ｍ），２．４５（２Ｈ，ｍ），２．８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．９−４．２（２Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６８７（Ｍ＋＋１）；ＵＶ（ｉｎ  ＥｔＯＨ）λｍａｘ２１４．１，２６４．５ｎｍ．
（３）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（１２３ｍｇ）、テトラブチルアンモニウムフロリド（１．０Ｍテトラヒドロフラン溶液、２ｍｌ）およびテトラヒドロフラン（２ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、室温で１５分間攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）で２回精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（８９ｍｇ，８７％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．５５（３Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），２．４６（２Ｈ，ｍ），２．８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．６４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．０３（１Ｈ，ｍ），４．１４（１Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５７３（Ｍ＋＋１）；ＵＶ（ｉｎ  ＥｔＯＨ）λｍａｘ２１３．７，２６４．１ｎｍ
（４）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（８９ｍｇ）、フタルイミド（３４ｍｇ）トリフェニルホスフィン（４９ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（１．５ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、室温でアゾジカルボン酸ジエチルエステル（０．０３ｍｌ）をゆっくり加え、室温で１．５時間攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）およびシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−フタルイミドデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールを含む混合物（７０ｍｇ）を得た。得られた混合物（７０ｍｇ）およびメチルアミン（４０％メタノール溶液、４ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（富士シリシア化学製ＮＨ  ＴＬＣプレート、ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（ＥＤ−５３２）を１７．８ｍｇ（２０％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。また、ＥＤ−５３２の構造を化学式４に示す。
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ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３６３，２９２５，２８５２，１７１６，１６４５，１５８５，１４６８，１４４１，１３７７，１２１５，１１４９，１０５９ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．５５（３Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），２．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．７６−２．８７（１Ｈ，ｍ），４．０１−４．０８（１Ｈ，ｍ），４．１１−４．１７（１Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），６．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ  ５７２（Ｍ＋）；ＵＶ（ｉｎ  ＥｔＯＨ）λｍａｘ２１３．３，２６４．７ｎｍ．
［実施例３］ＥＤ−５３２およびＥＤ−５３３のフローレセイン標識体の作製（合成までのスキームを図７に示す）
（１）ＥＤ−５３２ＦＬの合成
１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したＥＤ−５３２のエタノール溶液１２５μＬと０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．９）１２５μＬとを混合し、この液に１００ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したＦＩＴＣ  ｉｓｏｍｅｒＩ（モレキュラープローブス社）のジメチルホルムアミド溶液１０μＬを加え、室温暗所にて９０分間振とうした。この液に１０％（ｖ／ｖ）となるように希釈したエタノールアミンのエタノール溶液を１５μＬ加えたのち、以下の条件にてフローレセイン標識体をＨＰＬＣ精製した。
精製は、ＨＰＬＣカラムとして、関東化学Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８０ＤＳ（７５ｍｍ  ｘ  ４．６ｍｍ，粒子径３μｍ）を用い、移動相は１０％アセトニトリル（０〜０．５分）、１０〜１００％アセトニトリル直線グラジエント（０．５〜１１．５分）、１００％アセトニトリル（１１．５分〜）とし、流速１ｍＬ／分、注入量：２０μＬ／回で行い、保持時間１２分前後に認められる２６５ｎｍの紫外吸収ピーク部分を０．５ｍＬ取得した。
（２）ＥＤ−５３３ＦＬの合成
ＥＤ−５３２の代わりにＥＤ−５３３を用いて同様の方法により、２５位にリンカーを介してフローレセインが結合しているＥＤ−５３３ＦＬを合成した。尚、精製は、Ｖａｒｉａｎ社Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃ１８カラムを用い、プレ洗浄としてアセトニトリル２．４ｍＬ、水４ｍＬで順次処理した後、反応産物を水で１０倍容量に希釈した溶液１ｍＬをカラムヘアプライした。１０％アセトニトリル２．４ｍＬ、２０％アセトニトリル２．４ｍＬの条件で順次洗浄した後、３０％アセトニトリル２．４ｍＬにより溶出した。溶出液を遠心濃縮器にて乾固したものを、５００μＬのエタノールに溶解した液を以下の実験に使用した。
［実施例４］ＥＤ−５３２ＦＬによる１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線
実施例３（１）にて得られたフローレセイン標識されたＥＤ−５３２（ＥＤ−５３２ＦＬ）２８μＬに３００ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を７ｍＬ加えた。この液より１９８μＬをＢＥＡＣＯＮテストチューブ（Ｐ２２４４、パンベラ社）に移し、これに２μＬのジメチルスルホキシドを加えてビタミンＤ受容体なし対照試料とした。残りの液には１．７μＬのリコンビナントヒトビタミンＤ３レセプター（５４８−００８７１、和光純薬）を加え、この液１９８μＬをＢＥＡＣＯＮテストチューブに移し、これに所定の濃度となるようにジメチルスルホキシドにて溶解した１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を２μＬ加えて測定試料とした。ビタミンＤ受容体なし対照試料ならびに測定試料は調製後に室温暗所にて９０分間静置し、これらの試料の２５℃における蛍光偏光度をフルレンジＢＥＡＣＯＮ２０００（パンベラ社）を用いて測定することにより用量反応曲線を得た。
図１に測定結果を示す。この結果は同一実験内の３測定値の平均と標準偏差を示しており、左端の点（ＶＤ（−））は１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を添加しないときの測定値（ＥＤ−５３２ＦＬとビタミンＤ受容体のみが存在している状態）、右端の点（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。蛍光の偏光度はビタミンＤ受容体の添加により約１３０ミリ偏光度上昇し、終濃度として１０−９Ｍ以上の１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を添加することで用量依存的に偏光度が低下した。この結果はＥＤ−５３２ＦＬがビタミンＤ３受容体と結合する活性を有すること、しかも、ビタミンＤ３受容体の１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３結合部位に結合することを示すものであり、本法により１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を始めとする種々のビタミンＤ３誘導体の定量が可能であることを示している。
［実施例５］種々のビタミンＤ誘導体に対する用量反応曲線
実施例４と同様の方法にて所定の濃度となるようにジメチルスルホキシドにて溶解した各種ビタミンＤ３誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）を測定し、それぞれの用量反応曲線を比較した。ＥＤ−７１、ＯＣＴ、またはＥＤ−１３０の構造を、それぞれ化学式５、６または７に示す。
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図２に測定結果を示す。この結果は同一実験内の３測定値の平均を示しており、左端の点（ＶＤ（−））は各種ビタミンＤ３誘導体を添加しないときの測定値、右端の点（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０は１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３よりもやや高濃度の終濃度として１０−８Ｍ以上の添加により用量依存的な偏光度が低下を示した。この結果は我々が発明した方法が種々のビタミンＤ３誘導体の定量に利用可能であること、ならびに各種ビタミンＤ誘導体の受容体結合能を相互に比較可能であることを示している。
［実施例６］種々のビタミンＤ誘導体に対する反応
実施例４と同様の方法にて１０−７Ｍとなるようにジメチルスルホキシドにて溶解した１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３ならびにその誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）を測定した。
図３に測定結果を示す。この結果は実施日が異なる３回の実験値の平均と標準偏差を示しており、各実験値は同一実験内の３測定値の平均として求めている。なお、左端の棒（ＶＤ（−））は各種ビタミンＤ３誘導体を添加しないときの測定値、左端より２番目の棒（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０を終濃度として１０−７Ｍ添加したときの偏光度はビタミンＤ３誘導体を添加しないときと比べて有意に低下するものの同濃度の１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を添加した場合よりも低下の程度は顕著ではなかった。この結果は単一用量における偏光度の大小から各種ビタミンＤ誘導体の受容体結合能を相互に比較可能であることを示すものである。
［実施例７］ＥＤ−５３３ＦＬによる１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線
実施例３（２）にて得られたフローレセイン標識されたＥＤ−５３３（ＥＤ−５３３ＦＬ）３．３μＬに３００ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を１０．４ｍＬ加えた。この液を３本のＢＥＡＣＯＮテストチューブ（Ｐ２２４４、パンベラ社）に１９８μＬづつ移し、それぞれに２μＬのジメチルスルホキシドを加えてビタミンＤ受容体なし対照試料とした。残りの液に２．５μＬのビタミンＤ３レセプター、ヒト、リコンビナント（５４８−００８７１、和光純薬）を加え、この液１９８μＬをＢＥＡＣＯＮテストチューブに移し、これに所定の濃度となるようにジメチルスルホキシドにて溶解した１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を加えて測定試料とした。ビタミンＤ受容体なし対照試料ならびに測定試料は調製後に室温暗所にて９０分間静置し、これらの試料の２５℃における蛍光偏光度をフルレンジＢＥＡＣＯＮ２０００（パンベラ社）を用いて測定することにより用量反応曲線を得た。
図４に測定結果を示す。この結果は同一実験内の３測定値の平均と標準偏差を示しており、左端の点（ＶＤ（−））は１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を添加しないときの測定値、右端の点（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。蛍光の偏光度はビタミンＤ受容体の添加により１３６ミリ偏光度上昇し、終濃度として１０−８Ｍ以上の１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を添加することで用量依存的に偏光度が低下した。この結果はＥＤ−５３３ＦＬがビタミンＤ３受容体と結合する活性を有すること、しかも、ビタミンＤ３受容体の１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３結合部位に結合することを示すものであり、本法により１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３を始めとする種々のビタミンＤ３誘導体の定量が可能であることを示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と、該化合物の受容体との結合活性を簡便かつ精度高く検出できる新規な方法が提供された。本方法は短時間で測定を終了することが可能であり、放射性同位体元素を用いた結合活性測定試験に比べ被験化合物に用いるタンパク質の結合活性の失活が少なく、信頼性のある実験データを取得することが期待される。また、本方法を利用することにより、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物、または新規ビタミンＤ３受容体のスクリーニングが可能となった。本発明のスクリーニング方法によって取得される化合物は、骨関連疾患のための治療薬となるものと大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＤ−５３２ＦＬによる１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線を示す図である。縦軸は蛍光偏光度、横軸は被験化合物の濃度を示す。
図２は、各種ビタミンＤ３誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）に対する用量反応曲線を示す図である。縦軸は蛍光偏光度、横軸は被験化合物の濃度を示す。
図３は、各種ビタミンＤ３誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）を１ｘ１０−７Ｍ添加した際の偏光度を示す図である。縦軸は蛍光偏光度を示す。
図４は、ＥＤ−５３３ＦＬによる１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線を示す図である。縦軸は蛍光偏光度、横軸は被験化合物の濃度を示す。
図５は、ＥＤ−５３３合成までのスキームを示す図である。
図６は、ＥＤ−５３２合成までのスキームを示す図である。
図７は、ＥＤ−５３２ＦＬおよびＥＤ−５３３ＦＬ合成までのスキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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