(57)【要約】ヘリコバクター・ピロリを認識する抗体、およびヘリコバクター・ピロリを検出する方法の提供。ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリ菌株の低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体ならびにこれらの抗体の少なくとも一つを用いるヘリコバクター・ピロリを検出する方法。
2002066631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６およびＣＡ４菌株の表面ＬＰＳを認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９４）の産生する請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９４）である、ハイブリドーマ。
【請求項６】
ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体。
【請求項７】
６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２菌株の表面ＬＰＳを認識する請求項６記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ２５−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９３）の産生する請求項６または７記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である請求項６〜８のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ２５−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９３）であるハイブリドーマ。
【請求項１１】
ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体。
【請求項１２】
６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２の総ての菌株の表面ＬＰＳを認識する請求項１１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９１）の産生する請求項１１または１２記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である請求項１１〜１３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９１）であるハイブリドーマ。
【請求項１６】
ヘリコバクター・ピロリ菌株の低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体。
【請求項１７】
胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを認識する、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、ＣＡ６、ＣＡ４およびＣＡ２菌株の表面ＬＰＳを認識する請求項１６または１７記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
ハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９２）の産生する請求項１６〜１８のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である請求項１６〜１９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
ハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９２）であるハイブリドーマ。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体および請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法。
【請求項２３】
さらに、請求項６〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いる請求項２２記載のヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法。
【請求項２４】
さらに、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いる請求項２３に記載のヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法。
【請求項２５】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを検出する方法。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体および請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリを検出する方法。
【請求項２７】
さらに、請求項６〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いる請求項２６記載のヘリコバクター・ピロリを検出する方法。
【請求項２８】
さらに、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いる請求項２７に記載のヘリコバクター・ピロリを検出する方法。
【請求項２９】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを検出することを含む低抗原性ヘリコバクター・ピロリの検出方法。
【請求項３０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項６〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体および請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも１種のモノクローナル抗体を含むヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット。
【請求項３１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体および請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む請求項３０記載のヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット。
【請求項３２】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む低抗原性ヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ（リポ多糖）のコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリの菌株が共通して有するＬＰＳ抗原（ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的ＬＰＳ）、すなわちヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的モノクローナル抗体）および該抗体を産生するハイブリドーマ、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、ならびに低抗原性ヘリコバクター・ピロリの低抗原性ＬＰＳ（ＬＰＳに存在する低抗原性エピトープ）を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマに関する。さらに本発明は、これらの抗体の１種または数種を含むヘリコバクター・ピロリの検出試薬およびキットならびにこれらの抗体の１種または数種を用いたヘリコバクター・ピロリの検出方法及びそのキットに関する。この試薬、キットおよび方法は胃疾患等の診断に有効に利用されるものである。
背景技術
近年の研究の結果、ヘリコバクター・ピロリが胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎の主な原因であることが明らかになりつつある。また、ヘリコバクター・ピロリと胃がんの関連性も注目されている。
ヘリコバクター属を構成する菌種は多く知られており、胃生検材料から分離された細菌がヘリコバクター・ピロリであるかを確認（鑑別）し、ヘリコバクター・ピロリを特異的に検出する必要がある。
そのためには顕微鏡による形態学的観察に加え、ウレアーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ等の酵素が陽性であること、ナリジクス酸耐性、セファロチン感受性であることの確認など多くの試験を行う必要がある。これらの試験を行うためには多くの時間と労力を必要とすることから、簡便にヘリコバクター・ピロリを検出する試薬の開発が望まれていた。
また、多くのヘリコバクター・ピロリ感染患者がヘリコバクター・ピロリの表面抗原であるＬＰＳに対する抗体を有していること、すなわちＬＰＳにヘリコバクター・ピロリの主要なエピトープがあることが知られていた。
しかし、従来ヘリコバクター・ピロリに対する抗体としてＬＰＳのルイス抗原部分に対する抗体が得られていたが、これらはルイス抗原の各型に特異的であった。従って、ヘリコバクター・ピロリを菌株に関係なく広く検出するためにはルイス抗原の各型（Ｌｅｘ、Ｌｅｙ、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｄ）に対する複数の抗体が必要とされた。
そこで、ヘリコバクター・ピロリの菌株に関係なくより少ない種類の抗体でヘリコバクター・ピロリを確実に検出する方法の開発、および該方法に用いる抗体の開発が望まれていた。
また、最近、ヘリコバクター・ピロリのリポ多糖（ＬＰＳ）と患者抗体との関係で、ヘリコバクター・ピロリはヒトに対して抗体価の上昇する多糖をもつ株（高抗原性ヘリコバクター・ピロリ株）と、上昇しない多糖をもつ株（低抗原性ヘリコバクター・ピロリ株）に分類され、それぞれ高抗原性ＬＰＳ、低抗原性ＬＰＳを有すること、低抗原性のヘリコバクターは癌患者由来の菌株に多いことが報告されている（横田伸一ら、：ヘリコバクター・ピロリのリポ多糖のヒトにおける抗原性、エンドトキシン研究１  〜基礎と臨床〜、近藤元治ほか編、ｐ．１１３〜１２１、菜根出版、東京、１９９８）。
またそれを利用した試薬が、特許（公開番号：特開平１０−２１８９００号公報）として公開されている。これによると、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリの菌株のＬＰＳでは欠失しているが、慢性胃炎患者、胃潰瘍患者または十二指腸潰瘍患者由来のヘリコバクターの菌株には存在する、ヒトに対する抗原決定基を認識する抗体を用いて、悪性度を検定するものである。すなわち、本血清に反応しないヘリコバクターは悪性度が高いとするものである。
しかし、この方法は分離されたヘリコバクター・ピロリ菌株から熱フェノール抽出法又はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下でプロテイナーゼＫ処理を行ってＬＰＳを調製しなければならない。さらに、調製したＬＰＳをポリアクリルアミド電気泳動に供するか、又は酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に供するためにマイクロプレートに固相しなければならない。さらにこれらの調製ＬＰＳに抗体を反応させ、陰性であれば悪性度が高いと判定するものである。これらの試験には多くの時間と労力を必要とすると共に陽性ではなく陰性を重要視している。これらのことから、逆に低抗原性の菌株に特異的な抗原、すなわち低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ（低抗原性ＬＰＳ）に特異的に存在する低抗原性エピトープを認識する抗体を用いる簡便な試薬の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明は、ヘリコバクター・ピロリを特異的に、簡便に、短時間に検出するためのモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、ヘリコバクター・ピロリを特異的に、簡便に、短時間に検出する方法、ヘリコバクター・ピロリを特異的に、簡便に、短時間に検出するためのキットを提供することを目的とする。
具体的には、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリの菌株が共通して有するＬＰＳ抗原（ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的ＬＰＳ）、すなわちヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的モノクローナル抗体）および該抗体を産生するハイブリドーマ、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ、ならびにヘリコバクター・ピロリの低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマに関する。さらに本発明は、これらの抗体の１種または数種を含むヘリコバクター・ピロリの検出試薬ならびにこれらの抗体の１種または数種を用いたヘリコバクター・ピロリの検出方法及びその検出キットの提供を目的とする。
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリの血清学的分類の検討（特許公開２０００−２６２２９１号公報）を進める中で、ヘリコバクター・ピロリ２２０−Ｂ株を抗原として免疫化したマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞（ミエローマ）株と融合させて多数のハイブリドーマを作製した。その中から多くのヘリコバクター・ピロリに反応するモノクローナル抗体を該ヘリコバクター・ピロリから抽出した内毒素（ＬＰＳ）を抗原としてスクリーニングした結果、ヘリコバクター・ピロリ菌株と広く反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができた。ヘリコバクター・ピロリには図１に示すように、Ｏ−抗原多糖を有するスムース型（Ｓ型）ＬＰＳを有するスムース（Ｓ）型と称する正常型菌株とＯ−抗原多糖を有しないラフ型（Ｒ型）ＬＰＳを有するラフ型（Ｒ型）菌株が存在していることが知られていた。ほとんどのヘリコバクター・ピロリ菌株は、スムース型であり、Ｏ−抗原多糖は、末端の抗ルイス抗体と反応するルイス血液型抗原と共通する抗原部分と繰り返し部分で構成される。ほとんどのヘリコバクター・ピロリ菌株は、スムース型であるので、スムース型のヘリコバクター・ピロリは正常なヘリコバクター・ピロリであるということができる。従って、正常なヘリコバクター・ピロリの集団を対象とした場合、本発明のヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原を認識するモノクローナル抗体であり、また、ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体である。
本発明者らは、ヒト抗ヘリコバクター・ピロリ血清中のルイス抗原に対する抗体価は高くなく、ヒト血清中の抗体はＯ−抗原多糖のルイス抗原とは異なったエピトープを認識していることを確認した。そこで、このエピトープに対するモノクローナル抗体の作製を行ったところ、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、スムース型のヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、ならびにこれらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。モノクローナル抗体の反応性の検討の結果、該ＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体とヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体とを組み合せて使用することによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出できることを見出し、また該２種類の抗体の組み合わせにさらにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を組み合わせて使用することにより総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができることを見出し本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株であって、慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを有する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を抗原として、マウスを免疫し、マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（ミエローマ）とを融合し、得られたハイブリドーマから低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ、すなわち低抗原性ＬＰＳを特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは、低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体が胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのＯ−抗原多糖部分に多く存在するが、慢性胃炎患者、胃潰瘍患者および十二指腸潰瘍患者由来のヘリコバクター・ピロリのＬＰＳには存在しないＬＰＳ部分の低抗原性エピトープを認識することを見出した。
本発明者等は、さらに、上述のモノクローナル抗体を組み合わせることにより総てのヘリコバクター・ピロリを検出し得、さらに胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株を検出し得る試薬、キットおよび方法を見出したのである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体、
（２）  ６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６およびＣＡ４菌株の表面ＬＰＳを認識する（１）のモノクローナル抗体、
（３）  ハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９４で、２００１年８月１５日付（原寄託）で独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（１）または（２）のモノクローナル抗体、
（４）  Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である（１）〜（３）のいずれかのモノクローナル抗体、
（５）  ハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９４）である、ハイブリドーマ、
（６）  ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、
（７）  ６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２菌株の表面ＬＰＳを認識する（６）のモノクローナル抗体、
（８）  ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ２５−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９３で、２００１年８月１５日付（原寄託）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（６）または（７）のモノクローナル抗体、
（９）  Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である（６）〜（８）のいずれかのモノクローナル抗体。
（１０）  ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ２５−３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９３）であるハイブリドーマ、
（１１）  ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、
（１２）  ６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２の総ての菌株の表面ＬＰＳを認識する（１１）のモノクローナル抗体、
（１３）  ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９１で、２００１年２月１９日付（原寄託）で独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（１１）または（１２）のモノクローナル抗体、
（１４）  Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である（１１）〜（１３）のいずれかのモノクローナル抗体、
（１５）  ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９１）であるハイブリドーマ、
（１６）  ヘリコバクター・ピロリ菌株の低抗原性ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体、
（１７）  胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを認識する、（１６）のモノクローナル抗体、
（１８）  ６株のヘリコバクター・ピロリ菌株、２６６９５、ＣＡ９、ＣＡ６、ＣＡ４、ＣＡ２およびＧＵ２のうち、ＣＡ６、ＣＡ４およびＣＡ２菌株の表面ＬＰＳを認識する（１６）または（１７）のモノクローナル抗体、
（１９）  ハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９２で、２００１年２月１９日付（原寄託）で独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（２００２年２月１４日付で原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求受領））の産生する（１６）〜（１８）のいずれかのモノクローナル抗体、
（２０）  Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である（１６）〜（１９）のいずれかのモノクローナル抗体、
（２１）  ハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９２）であるハイブリドーマ、
（２２）  （１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法、
（２３）  さらに、（６）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２２）のヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法、
（２４）  さらに、（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２３）のヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを検出する方法、
（２５）  （１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを検出する方法、
（２６）  （１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリを検出する方法、
（２７）  さらに、（６）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２６）のヘリコバクター・ピロリを検出する方法、
（２８）  さらに、（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いる（２７）に記載のヘリコバクター・ピロリを検出する方法、
（２９）  （１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリ菌株に多く存在し、慢性胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清とは反応しない低抗原性ＬＰＳを検出することを含む低抗原性ヘリコバクター・ピロリの検出方法、
（３０）  （１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体、（６）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体、（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも１種のモノクローナル抗体を含むヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット、
（３１）  （１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体および（１１）〜（１４）のいずれかのモノクローナル抗体を含む（３０）のヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット、および
（３２）  （１６）〜（２０）のいずれかのモノクローナル抗体を含む低抗原性ヘリコバクター・ピロリを検出するためのキット。
以下、本発明を詳細に説明する。
モノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルステインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）等の公知の方法により作製し得る。
ホルマリン処理等により不活性化したヘリコバクター・ピロリ菌株を免疫原として用いることができる。不活性化した菌株を、ＰＢＳ等の緩衝液に、０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度で浮遊させて免疫原を調製することができる。免疫原は、市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＢＣＧ、水酸化アルミニウムゲル、百日咳ワクチン等の適当なアジュバントと共に投与するのが望ましい。また、被免疫動物は、マウス、ラット、モルモット等が利用可能であるが、通常はマウスが汎用される。マウスの場合、３〜１０週齢、好ましくは４週齢のマウスを用いる。調製した免疫原は、動物の皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等いずれのルートを通しても投与することができる。免疫の間隔は特に限定されないが、例えば１〜２週間隔で、２〜５回免疫するのが望ましい。また、１回当たりの投与量も限定されないが、例えば上述のように調製した免疫原を適当なアジュバントと混合し、数十μｌ〜数百μｌの量を投与すればよい。
最終免疫後、３〜１０日後に、被免疫動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞が挙げられるが、脾臓細胞を用いるのが一般的である。被免疫動物から脾臓、リンパ節、胸腺、末梢血等を摘出または採取し、これらの組織を破砕する。さらにこの破砕物をＰＢＳ等の緩衝液またはＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｅ−ＲＤＦ等の培地に懸濁した後に、２００〜２５０μｍのステンレスメッシュ等を用いてろ過し、遠心分離することにより目的とする抗体産生細胞を調製することができる。
このようにして調製した抗体産生細胞を骨髄腫細胞と細胞融合させる。骨髄腫細胞としては、当業者が入手可能な株化細胞を用いることができる。骨髄腫細胞は、一般に被免疫動物と同種の動物より得られたものを用いるが、異種間でも可能な場合がある。使用する細胞株は、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態ではヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地中で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態のみで生存できる性質を有するものが好ましい。一般的には、８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損し（ＨＧＰＲＴ−）、ＨＡＴ培地に生育できない。骨髄腫細胞として、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１；Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２７１（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８［ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−９；Ｎａｔｕｒｅ、２６５、４９５−４９７（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３  Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８１、１−７（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３［ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６，５１１−５１９（１９７６）］、Ｐ２／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１；Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９−２７０（１９７８）］等のマウス骨髄腫細胞株が挙げられる。
細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｅ−ＲＤＦ等の動物細胞培養用培地中で１０７〜１０８細胞／ｍｌの骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で、例えば１：５の割合で、融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜３分間細胞同士を接触させることにより効率的に行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等を用いることができる。また、センダイウイルス等の融合ウイルスを用いて細胞融合を行うこともできる。さらに、エレクトロポーレーション等の電気刺激を利用した方法によっても細胞融合を行うことができる。エレクトロポーレーションを利用した細胞融合装置は市販のものが利用可能である。
細胞融合処理後の細胞から、ＨＡＴ培地等の選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法によりハイブリドーマを選別することができる。例えば、融合した細胞の懸濁液をＨＡＴサプリメント（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）及びインターロイキン−６（１ｕｎｉｔ／ｍＬ）を添加したイスコフ培地（ＩＭＤＭ）に１０３〜１０７細胞／ｍＬとなるよう希釈後、９６ウェルの細胞培養用マイクロプレートに１０２〜１０６細胞／ウェルの細胞密度でまき、各ウェルにＨＡＴ培地等の選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換しながら細胞培養を行い、ハイブリドーマを選別する。
骨髄腫細胞として、８−アザグアニン耐性株、選択培地としてＨＡＴ培地を用いた場合は、未融合の骨髄腫細胞は培養後約７〜１０日目に死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロでは長く生存できず、培養後約７〜１０日目に死滅する。その結果、培養６〜１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
増殖してきた細胞の培養上清について、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ抗原上のコアオリゴ糖部分に対する抗体の産生があるか否かを検定し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは通常の方法により行うことができる。例えば、ハイブリドーマが生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）等により目的とする抗体が含まれるか否か検定することができる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートに免疫原として使用したヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳおよび他のヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳコアオリゴ糖を各々吸着させた９６ウェルマイクロタイタープレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加して抗原と反応させる。
次いで、結合した特異的抗体に酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、各ウェルに酵素基質を添加して発色させ、培養上清中のモノクローナル抗体が固相化したＬＰＳと反応するかどうかを検定する。この際、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が用いられる。発色は、アッセイ系に応じた信号読取装置、例えばマイクロプレートリーダーを用いて測定することができる。ＬＰＳコアオリゴ糖と反応し結合するモノクローナル抗体を含む培養上清を選別することにより、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。
また、ＬＰＳコアオリゴ糖を精製せずに、ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別し、培養上清のＬＰＳとの反応性を確認することによりＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別することもできる。ＬＰＳとの反応性は、ヘリコバクター・ピロリ菌体を熱フェノール処理またはプロテイナーゼＫ処理して得たＬＰＳをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、これにモノクローナル抗体を反応させ、標識二次抗体による発色を見るイムノブロット法（ウエスタンブロット法）等により確認することができる。
このようにして、選別されたウェル中のハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することができる。
取得したヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体（抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体）産生ハイブリドーマから通常の細胞培養法、腹水形成法等を用いて抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体を採取することができる。
細胞培養法においては、抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０〜２０％仔ウシもしくはウシ胎児血清を含有させたＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭ、Ｅ−ＲＤＦまたは無血清培地等の動物細胞培養用培地中で、通常の培養条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。また腹水形成法においては、骨髄腫細胞由来の動物と同種の動物の腹腔内にあらかじめプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を投与し、その後１×１０７〜１×１０９細胞、好ましくは５×１０７〜１×１０８細胞の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。１〜４週間後、好ましくは２〜３週間後に腹水または血液を採集して抗体を取得することができる。
抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
このようにして、本願発明のモノクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は、完全抗体であっても、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等の抗原結合部位を有する断片であってもよい。
また、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖に対する特異的モノクローナル抗体として、例えばハイブリドーマ株ＨＰＣＡ／Ｄ４２−３の産生するものを用いることができる。
また、数種類のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳを用いて、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分を認識する抗体を得ることができる。この際、広くＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳと反応するものを選択すれば、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を得ることができる。さらに、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株のＬＰＳと反応するものを選択すれば、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を得ることができる。ここで、「一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリが有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体」とは、胃癌、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の胃疾患患者から分離した複数のＳ型ヘリコバクター・ピロリのうち、例えば、８０％以下のヘリコバクターと反応し認識する抗体をいい、好ましくは、７０％以下のヘリコバクターと反応し認識する抗体をいう。具体的には、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ１４株中、７株と反応する場合、「一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリが有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体」に該当する。前者の抗体として、ハイブリドーマ株ＨＰ２２０／２Ｄ１０−２を用いることもできる。また、後者の抗体としてハイブリドーマ株ＨＰ２２０／Ｂ−２５−３を用いることもできる。
ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖部分を認識するモノクローナル抗体の取得と同様に、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体またはヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体の取得においても、Ｓ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分を精製することなく、Ｓ型ＬＰＳを認識するモノクローナル抗体の中から、Ｓ型ＬＰＳおよびルイス抗原を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロットによる分析（ウエスタンブロット分析）により、Ｓ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分を認識するモノクローナル抗体を選別することができる。
さらに、以下のようにして低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を得ることができる。増殖してきた細胞の培養上清について、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識する抗体の産生があるか否かを検定し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは通常の方法により行うことができる。例えば、ハイブリドーマが生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）等により目的とする抗体が含まれるか否か検定することができる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートに複数の胃癌患者由来の低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳ及び複数の慢性胃炎患者、胃潰瘍患者または十二指腸潰瘍患者由来の高抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳを各々吸着させた９６ウェルマイクロタイタープレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加して抗原と反応させる。次いで、結合した特異的抗体に酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、各ウェルに酵素基質を添加して発色させ、培養上清中のモノクローナル抗体が固相したＬＰＳと反応するかどうかを検定する。この際、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が用いられる。発色は、アッセイ系に応じた信号読取装置、例えばマイクロプレートリーダーを用いて測定することができる。低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株由来のＬＰＳと反応するモノクローナル抗体を含む培養上清を選別することにより、低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株に共通するＬＰＳ抗原を認識して結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。
このようにして、選別されたウェル中のハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的に目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することができる。
取得した低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから通常の細胞培養法、腹水形成法等を用いて低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を採取することができる。
細胞培養法においては、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０〜２０％仔ウシ若しくはウシ胎児血清を含有させたＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭ、Ｅ−ＲＤＦまたは無血清培地等の動物細胞培養用培地中で、通常の培養条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。また腹水形成法においては、骨髄腫細胞由来の動物と同種の動物の腹腔内にあらかじめプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を投与し、その後１×１０７〜１×１０９細胞、好ましくは５×１０７〜１×１０８細胞の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。１〜４週間後、好ましくは２〜３週間後に腹水または血液を採集して抗体を取得することができる。
抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
このようにして、本願発明の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳに対する特異的モノクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は、完全抗体であっても、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等の抗原結合部位を有する断片であってもよい。
また、モノクローナル抗体として、例えばハイブリドーマ株ＨＰ２１７／Ｂ１５−４の産生するものを用いることができる。
本願発明のモノクローナル抗体のＬＰＳとの反応性は、ヘリコバクター・ピロリ菌体を熱フェノール処理またはプロテイナーゼＫ処理して得たＬＰＳをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、これにモノクローナル抗体を反応させ、標識二次抗体による発色を見るイムノブロット法等により確認することができる。
患者胃生検材料から分離されたヘリコバクター・ピロリが低抗原性であるかどうかの確認は、被検ヘリコバクター・ピロリ菌株から調製したＬＰＳをマイクロタイタープレートに固相し、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者の血清を反応させるＥＩＡ法により行うことができる。すなわち、胃潰瘍または十二指腸潰瘍患者血清が反応しないＬＰＳを持つヘリコバクター・ピロリ菌株が低抗原性ヘリコバクター・ピロリとされる。
ヘリコバクター・ピロリの検出
このようにして得られたヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖特異的モノクローナル抗体を用いてＲ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株、およびＳ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株の一部を検出することが可能である。
また、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を用いてほとんどのＳ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能である。さらに、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識する抗体を用いて一部のＳ型ＬＰＳを有するヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能である。また、本発明のモノクローナル抗体を用いて被験体の胃内にヘリコバクター・ピロリが存在するかどうかを検出することにより、被験体の胃疾患罹患の危険性を評価することもできる。本発明のモノクローナル抗体により被験体の胃内にヘリコバクター・ピロリが検出された場合、概被験体の胃内の洗浄または抗生物質の投与等によりヘリコバクター・ピロリを除去し、胃疾患の罹患危険性を低減または消滅させることが可能である。本発明のモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリの除去効果の判定にも用いることができる。
また、上述のようにして得られた低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を用いて胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリを検出することが可能である。また、被験体の胃内に本発明の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体が認識するヘリコバクター・ピロリが存在するかどうかを検出することにより、被験体の胃癌罹患の危険性を評価することもできる。本発明のモノクローナル抗体により被験体の胃内に低抗原性ヘリコバクター・ピロリが検出された場合、概被験体の胃内の洗浄または抗生物質の投与等により低抗原性ヘリコバクター・ピロリを除去し、胃癌の罹患危険性を低減または消滅させることが可能である。本発明のモノクローナル抗体は、低抗原性ヘリコバクター・ピロリの除去効果の判定にも用いることができる。
該抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を組み合せて使用することによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。ここで、「ほぼ総てを検出する」とは、胃癌、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の胃疾患患者から分離した複数のヘリコバクター・ピロリの好ましくは９５％以上を検出できることをいい、さらに好ましくは９８％以上を検出できることをいう。例えば、１８１の分離ヘリコバクター・ピロリのうち１７９を検出できた場合、「ほぼ総てを検出する」に該当する。さらに、これら２種類のモノクローナル抗体に、さらに上述のヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を組み合せて使用することにより総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。ここで、「総て検出する」とは、好ましくは、胃疾患患者から分離した複数のヘリコバクター・ピロリの９９％以上を検出できることをいい、さらに好ましくは、ヘリコバクター・ピロリの１００％を検出できることをいう。例えば、１８１の分離ヘリコバクター・ピロリ中１８１総てを検出できる場合である。但し、ヘリコバクター・ピロリには、正常なＬＰＳ抗原構造を有さず、上述の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体のいずれもが認識し得ない株もきわめて少数ながら存在し得、このような異常な株は、検出率の計算からは除くべきである。
上述の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体および低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体の総てを用いることにより、総てのヘリコバクター・ピロリを検出することができるとともに、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができる。
ヘリコバクター・ピロリの検出はイムノブロット法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、凝集反応を利用した方法、イムノクロマトグラフィー法等の当業者に知られた方法により行うことができる。この際、試料として、例えば胃潰瘍等の胃疾患患者の胃生検材料等から分離培養された細菌を用いることができるが、これに限定されるものではない。
例えば、凝集反応を利用した方法においては、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を感作した担体を用いてヘリコバクター・ピロリを検出することができる。さらに、検出率を上げるためにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を感作してもよい。さらに、胃癌患者由来株に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出するためには、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を感作すればよい。
これらのモノクローナル抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子を使用する場合には、特別な処理をしなくても容易に抗体を担体に感作できるとともに、対象菌株と担体の反応により生じる凝集像が明瞭となり、対象菌株の担体に対する反応性を容易かつ精度よく判別できる点でさらに有利である。
この際、上述の４種の抗体の２〜４種を同時に担体に結合させてもよいし、これらの抗体を別々に担体に結合させて、各抗体を結合させた４種の担体の２〜４種を混ぜて用いることも可能である。さらには、別々にそれぞれの抗体を結合させた担体を別々に各抗体が認識するヘリコバクター・ピロリの検出に用いても良い。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体は、他の３種とは別途に胃癌患者由来株に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができるので、他の３種とは別に担体に結合させるのが好ましい。
モノクローナル抗体を担体に感作する方法は、特に限定されない。例えば、モノクローナル抗体を担体に物理的に吸着させてもよいし、化学的に結合させてもよい。より具体的には、例えば、モノクローナル抗体と担体とを混和した後、３０〜３７℃で１〜２時間加温振盪することにより、抗体を担体に感作させることができる。担体に感作する抗体の量は、使用する担体の粒径に応じて適宜設定することができる。抗体を担体に感作した後、担体表面上の未感作部分をウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等でブロッキングするのが好ましい。モノクローナル抗体を感作した担体は、ヘリコバクター・ピロリに属する対象菌株と反応させる時まで媒体分散液として保持しておくのが好ましい。この際、媒体としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等を使用することができる。モノクローナル抗体に感作した担体の含有量は、通常、媒体分散液に対して０．２〜０．５重量％とすることができるが、０．２５〜０．３重量％とするのが好ましい。媒体中には、必要に応じてウシ血清アルブミン、ゼラチン、アラビアゴム等を添加してもよい。このようにして調製したモノクローナル抗体感作担体を対象菌株と反応させ、凝集の有無またはその程度により対象菌株とモノクローナル抗体との反応性を判別し、ヘリコバクター・ピロリを検出することができる。この際、ヘリコバクター・ピロリ菌株をあらかじめ適当な抽出試薬、例えば酵素または酢酸および亜硝酸ナトリウム等により処理しておいてもよい。
また、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）においては、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳ特異的モノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート、樹脂ビーズ、磁性化ビーズ等の担体に物理吸着や化学結合により固相化する。さらに、検出率を上げるためにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を固相化してもよい。さらに、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出するためには、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を固相化すればよい。
この際、これらの抗体の２〜４種類を混合して担体に固相化し、２〜４種類の抗体を固相化した担体を調製してヘリコバクター・ピロリの検出に用いてもよいし、別々にそれぞれの抗体を固相化した担体を調製し、別々に各抗体との反応性を測定してもよい。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体は、他の３種とは別途に胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができるので、他の３種とは別に担体に結合させるのが好ましい。
固相化量は、特に限定されないが担体がマイクロタイタープレートの場合、１ウェル当たり数ｎｇから数十μｇが望ましい。固相化は固相化すべき抗体を適切なバッファーに溶解し、担体と接触させて行うことができる。例えば、マイクロタイターウェルを用いる場合、抗体溶液をマイクロタイタープレートのウェルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。基質を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うのが好ましい。次いで、固相化担体と試料を反応させ、洗浄後、ヘリコバクター・ピロリを認識する標識したモノクローナル抗体を反応させる。標識は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼやグルコースオキシダーゼ等の酵素を用いて行うことができる。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）においては、多数のウェル（例えば、９６穴）を有するマイクロタイタープレートに基質を固相化させ、ウェル中で抗原抗体反応を行わせることにより一度に大量測定が可能になる。また、用いる抗体および試料菌体の使用量を非常に少なくすることも可能である。さらに、全自動ＥＩＡ測定装置などの自動測定機器を用いることも可能になる。
本発明は、ほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株の検出を可能にするキットの提供をも目的とするが、該キットは少なくともヘリコバクター・ピロリのＬＰＳコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を含む。また、本発明は、総てのヘリコバクター・ピロリ菌株の検出を可能にするキットの提供をも目的とし、該キットはさらにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を含む。さらに、本発明は、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株の検出を可能にするキットの提供をも目的とし、該キットはさらに低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を含む。該キットがＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該キットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
以上のように、本発明のヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いることによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリを検出でき、さらにヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体をも用いて総てのヘリコバクター・ピロリを検出でき、さらに低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体を用いて、胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することができることから、胃生検材料から分離された細菌を迅速にヘリコバクター・ピロリと鑑別し、ヘリコバクター・ピロリを検出することができ、生化学的性状を調べる時間と労力を大幅に省略することができる。
なお、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖を認識するモノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いてほぼ総てのヘリコバクター・ピロリを検出するか、またはさらにヘリコバクター・ビロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体をも用いて総てのヘリコバクター・ピロリを検出するか、あるいはさらに胃癌患者に由来する低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株を検出するかは、目的とする検出率、診断または検出しようとする疾患等に応じて選択することができ、また使用する抗体の数を減らすことにより調製にかかる費用、時間を減じることができるので、これらを考慮して適宜選択することができる。
また、本発明の４種類のモノクローナル抗体との反応性パターンにより、ヘリコバクター・ピロリを分類することができ、その分類を各種胃疾患と関連付けることもできる。さらに、本発明の４種類のモノクローナル抗体に加え、抗ルイス（Ｌｅｘ、Ｌｅｙ、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｄ）抗体との反応性パターンによりさらにヘリコバクター・ピロリを細分類することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１  ヘリコバクター・ピロリに対するモノクローナル抗体の作製
免疫抗原の調製
ヘリコバクター・ピロリ２２０−Ｂ株を血液寒天培地を用いて、微好気条件下で３〜４日間、３７℃で培養する。増殖した菌体をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に浮遊させ、ホルマリン処理にて不活化する。不活化した菌体をＰＢＳにて濃度を０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬに調製して免疫抗原とする。
モノクローナル抗体の調製
上記免疫抗原１００μＬをフロイント完全アジュバントと共に５週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、２週間後同抗原５０μＬをフロイント不完全アジュバントで追加免疫を行った。さらに２週間後、同抗原２５μＬを静脈に注射し、その３日後に脾臓細胞を摘出した。摘出された脾臓細胞はケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３）と融合し、炭酸ガスインキュベーター中で３７℃で培養した。得られたハイブリドーマの培養上清を検体として、ヘリコバクター・ピロリ菌株のＳ型ＬＰＳ（２１７，２２０，ＣＡ４株）を抗原として固相したＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマのスクリーニングを行った。総てのＳ型ＬＰＳと反応した培養上清のハイブリドーマを選択した。スクリーニングされたハイブリドーマを限界希釈法によって０．５細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに播き、ウェル中に単一コロニーとして発育したハイブリドーマのみクローンとし、この限界希釈法を２度繰り返すことによりクローニングを行った。以上により、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳのコアオリゴ糖に対するモノクローナル抗体産生細胞株、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体産生細胞株およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体産生細胞株を取得した。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から硫安塩析法によってＩｇＧを精製した。
実施例２  低抗原性ヘリコバクター・ピロリに対するモノクローナル抗体の作製
免疫抗原の調製
低抗原性ヘリコバクター・ピロリＣＡ２株を血液寒天培地を用いて、微好気条件下で３〜４日間、３７℃で培養する。増殖した菌体をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に浮遊させ、ホルマリン処理にて不活化する。不活化した菌体をＰＢＳにて濃度を０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬに調製して免疫抗原とする。
モノクローナル抗体の調製
上記免疫抗原１００μＬをフロイント完全アジュバントと共に５週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、２週間後同抗原５０μＬをフロイント不完全アジュバントで追加免疫を行った。さらに２週間後、同抗原２５μＬを静脈に注射し、その３日後に脾臓細胞を摘出した。摘出された脾臓細胞はケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３）と融合し、炭酸ガスインキュベーター中で３７℃で培養した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株３株と高抗原性ヘリコバクター・ピロリ菌株３株のＬＰＳを抗原としてＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマのスクリーニングを行った。すなわち、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳに反応し、高抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳに反応しないハイブリドーマを選択した。スクリーニングされたハイブリドーマを限界希釈法によって０．５細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに播き、ウェル中に単一コロニーとして発育したハイブリドーマのみクローンとし、この限界希釈法を２度繰り返すことによりクローニングを行った。
以上により、数種の低抗原性ヘリコバクター・ピロリＬＰＳに対するモノクローナル抗体産生細胞株を取得した。取得した細胞をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から硫安塩析法によってＩｇＧを精製し、これをモノクローナル抗体とした。
実施例３  モノクローナル抗体のＬＰＳとの反応性
ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳは２種類の方法にて得た。第一は熱フェノール水抽出法であり、精製ＬＰＳが得られる。培養したヘリコバクター・ピロリの１％フェノール処理乾燥菌体１ｇを８０ｍＬ蒸留水に懸濁し、９０％フェノール水等量と混ぜた。６８℃、１５分間攪拌し、その後室温に戻し、次に遠心（２５００ｒｐｍ、２０分間）し、水層（上清）を取り出した。残りのフェノール層に８０ｍＬ蒸留水を加え、再び６８℃、１５分間攪拌する。室温に下がった後、遠心（２５００ｒｐｍ、２０分間）し、水層を取り出し、先の水層と一緒にして透析（１日２回蒸留水を交換して３日間）した。
透析後、透析内液を凍結乾燥し、少量の蒸留水に溶かし、超遠心（１００，０００ｘｇ、３時間）でＬＰＳを沈殿させた。この沈殿物を２回洗浄超遠心（１００，０００ｘｇ、３時間）して、最後に凍結乾燥して精製ＬＰＳを得た。
第二にプロテイナーゼＫ処理によるＬＰＳは精製されていないが、イムノブロットなどの免疫反応には用いることができる。乾燥菌体溶液（２ｍｇ）をＬｙｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール、６％ＳＤＳ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるｕｐｐｅｒ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬに溶かし、１００℃、１０分間加熱した。室温まで冷却後、プロテイナーゼＫ  ２００μＬ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃、１４時間、さらに６５℃、２時間反応させた。得られた試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥなどに用いた。
ＬＰＳのモノクローナル抗体との反応性はＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロットによって調べた。泳動用のサンプルとして精製ＬＰＳは約０．８μｇ、プロテイナーゼＫ処理ＬＰＳは最初の菌体に換算して約１００μｇを１ウェルに加えて、１２．５％ゲル濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥを常法にて行う。泳動後、ゲルをＰＶＤＦメンブレンフィルターに転写し、一次抗体としてモノクローナル抗体（５００倍希釈）、二次抗体として抗マウスＩｇ抗体（５００倍希釈）で反応し、ジアミノベンゼンにて発色させた。結果を図２に示す。図２に示すように、本発明の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体（抗体Ｉ）は、低分子量のコアオリゴ糖と反応し、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩ）は、Ｓ型ＬＰＳとラダー状に反応した。さらに、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩＩ）も、Ｓ型ＬＰＳとラダー状に反応したが、各菌株に対する反応性パターンは、抗体ＩＩとは異なっていた。さらに、低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＶ）も、ＬＰＳとラダー状に反応したが、各菌株に対する反応性パターンは他のモノクローナル抗体を異なっていた。
実施例４  低抗原性ヘリコバクター・ピロリの確認
低抗原性ヘリコバクター・ピロリの確認は熱フェノール水抽出法或いはプロテイナーゼＫ処理ＬＰＳを用いたイムノブロット或いはＥＬＩＳＡによる検出法にて行った。
被検菌であるヘリコバクター・ピロリ菌株を血液寒天培地で微好気の条件下で４日間、３７℃で培養した。増殖した菌体を生理食塩液に浮遊し、等量の熱フェノールを加えＬＰＳの抽出を行った。次に遠心分離を行い水層部分を採取し、流水で透析を行いＬＰＳ標品とした。これを５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５０倍に希釈後、マイクロプレートに分注し、４℃一夜放置して固相した。その後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）にてブロッキングを行いＥＩＡ用プレートとした。これに胃潰瘍患者血清を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳＴ）で２００倍に希釈し、その１００μｌを各ウェルに滴下し、室温で、１時間反応させた。反応液を吸引除去し、各ウェルに２００μＬのＰＢＳＴを加えて、３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳＴで５００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の１００μＬを各ウェルに加え、室温に１時間静置した。その後、各ウェルにＰＢＳＴを２００μＬ加えて、４回洗浄した。洗浄後、基質液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、過酸化水素）を１００μＬ加えて室温で３０分間静置した。
次に反応停止液（０．６Ｎ硫酸）を１００μＬ加えて反応を停止し、オートリーダー（波長４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）で吸光度を測定した。
実施例５  ラテックススライド凝集法によるヘリコバクター・ピロリの鑑別
▲１▼モノクローナル抗体感作ラテックスの調製
支持体として直径０．３μｍのポリスチレン製球状粒子（ラテックス：市販品）を用いた。実施例１および２により得られたモノクローナル抗体とラテックス粒子を各々リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．０）に溶解し、抗体とラテックス粒子の重量比が１：１０となるように抗体を支持体に固定化した。これをリン酸緩衝生理食塩液で洗浄し、牛血清アルブミンでブロッキングを行ったものを抗体感作ラテックスとした。
▲２▼検体処理法
血液寒天培地シャーレ１枚に培養した被検菌の全てを採取し、生理食塩液２５０μＬに懸濁する。これに抽出試薬１（酢酸）と抽出試薬２（亜硝酸ナトリウム）を各々２５０μＬ加え１０分間放置した。その後抽出液３（緩衝液）を２５０μＬ加え中和させ、検体とした。
▲３▼スライド凝集反応
紙製のスライド板のサークル内に▲２▼の方法で得た検体の２５μＬを滴下し、これに▲１▼で調製した抗体感作ラテックスの５０μＬを加え混和した。１分間攪拌後、肉眼的に凝集の有無を観察し、凝集の認められたものを陽性、認められないものを陰性とした。
実施例６  低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＶ）感作ラテックス試薬の特異性
各種胃疾患患者から分離されたヘリコバクター・ピロリ株を実施例４に示した方法で、低抗原性または高抗原性を確認してから実施例５のとおり試験を行った。
結果を表１に示した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリに属する菌株は全て本感作ラテックスで陽性を示した。一方高抗原性ヘリコバクター・ピロリは、本感作ラテックスには反応しなかった。
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実施例７  Ｓ型ヘリコバクター・ピロリの菌株が共通して有するＬＰＳ抗原（ヘリコバクター・ピロリ菌種特異的ＬＰＳ）、すなわちヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリが共通して有するＬＰＳ抗原部分を特異的に認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩ）感作ラテックス試薬の特異性
各種胃疾患患者から分離されたヘリコバクター・ピロリ株、ヘリコバクター属であるヘリコバクター・ピロリ以外の菌株およびカンピロバクターを用いて実施例５のとおり試験を行った。
結果を表２に示した。生化学的性状がヘリコバクター・ピロリに属する菌株は全て本感作ラテックスで陽性を示した。一方ヘリコバクター・ピロリ以外のヘリコバクター属に分類される菌株およびカンピロバクター属に分類される菌株は全て陰性と判定された。
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実施例８  ４種類の抗体（抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）感作ラテックス試薬を用いたヘリコバクター・ピロリ菌株１８１株の反応性パターン
各種胃疾患患者から分離されたヘリコバクター・ピロリ株１８１株および抗体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを用いて実施例５のとおり試験を行った。
結果を表３に示した。抗体Ｉ、ＩＩを用いることにより、１８１株中１７９株とほぼ総てが検出でき、抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩを用いることにより１８１株総てを検出することができる。
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Ｉ：  抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体
ＩＩ：  ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
ＩＩＩ：  ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
さらに、抗体ＩＶをも用いて、同様に１８１の菌株を用いて試験を行った。
結果を表４に示した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識する抗体により検出されるヘリコバクター菌株が１８１株中１７株存在した。
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ＩＶ：  低抗原性ヘリコバクターのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体
実施例９  ４種類の抗体（抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）およびヘリコバクター・ピロリ菌株１４株を用いての検出
実施例３に記載の方法により１４株のヘリコバクター・ピロリ菌株（日本細菌学雑誌、５６（２）：４２１−４３３，２００１等）からＬＰＳを精製し、市販の５種類の抗ルイス抗原抗体（Ｌｅｘ：生化学工業社製、Ｌｅａ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製；Ｌｅｙ、Ｌｅｂ、Ｌｅｄ：Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）および３種類の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳモノクローナル抗体（抗Ｈｐモノクローナル抗体）との反応性を実施例３に記載のイムノブロットにより確認した。
結果を表５に示した。電気泳動の結果より、１４株のヘリコバクター・ピロリ菌株のうちＣＧ１０株、ＤＵ８株およびＯ１株は、図１のＯ−抗原多糖を有しないＲ型ＬＰＳを有し、他の１１株がＯ−抗原多糖を有するＳ型ＬＰＳを有することがわかった。本発明の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体（抗体Ｉ）は、Ｒ型ＬＰＳである３菌株のうち２菌株と反応し、Ｓ型ＬＰＳである１１菌株のうち９菌株と反応した。また、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩＩ）は、Ｓ型ＬＰＳである１１菌株のうち７菌株と反応した。ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＩ）は、ラフ型菌株とは反応せず、総てのスムース型菌株と反応した。低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（抗体ＩＶ）は、１４株中４株と反応した。
なお、Ｏ１株のように、いずれの抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳモノクローナル抗体および抗ルイス抗体とも反応しないヘリコバクター・ピロリ菌株も存在した。
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Ｉ：  抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体
ＩＩ：  ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
ＩＩＩ：  ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体
ＩＶ：  低抗原性ヘリコバクターのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体
＊  ：ヘリコバクター・ピロリ各菌株から精製したＬＰＳ
＊＊：銀染色による電気泳動パターンの分析Ｓ：スムース型
Ｒ：ラフ型
産業上の利用可能性
実施例に示すように本発明の抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分を認識するモノクローナル抗体が認識しないヘリコバクター・ピロリ菌株を認識することができ、抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体およびヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原部分を除いた部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリの検出を行うことによりほぼ総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。さらに、本発明のヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター・ピロリの検出を行うことにより総てのヘリコバクター・ピロリ菌株を検出することが可能になる。さらに、本発明の低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識する抗体を用いると胃癌患者由来のヘリコバクター・ピロリを検出することが可能であり、胃癌の可能性を診断することもできる。従って、本発明のモノクローナル抗体を広く胃疾患等の診断に有効に利用することができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳの推定構造を示した図である。
図２は、抗体に抗ヘリコバクター・ピロリＬＰＳコアオリゴ糖モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ  Ｉ）、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳのＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた抗原部分であって、Ｓ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が共通して有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ  ＩＩ）、ヘリコバクター・ピロリのＳ型ＬＰＳ抗原上のＯ−抗原多糖部分のうちルイス抗原を除いた部分であって、一部のＳ型ヘリコバクター・ピロリ菌株が有するＬＰＳ抗原部分を認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ  ＩＩＩ）および低抗原性ヘリコバクター・ピロリのＬＰＳを認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡＢ  ＩＶ）を用い、抗原にヘリコバクター・ピロリＬＰＳを用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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