(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を体液、培養液等の試料から、操作が簡単で精製も短時間で可となる遠心分離により、分離・精製するための抗体精製用チップを提供する。【解決手段】マイクロメーターサイズの連続細孔とナノメーターサイズのメソ孔を有する無機系多孔質連続体を円盤状に成型し、その表面にまずアミノ基を修飾しさらにこのアミノ基に抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質を結合することにより抗体精製用無機系多孔質連続体を作製する。抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質としては、各種公知のものを使用できる。常温以下で無機系多孔質連続体をチップに固定するため、無機系多孔質連続体１とチップ３との間に弾力性のあるゴム等の材料でスペーサ２を作製し、これを用いて固定することにより円盤状の抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質修飾無機系多孔質連続体を遠心チップ３に装着する。【選択図】図１
0003149787.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体を用いた抗体精製用カラムであって、前記無機系多孔質連続体を円盤状に成型し、円盤状の無機系多孔質連続体表面を抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質で修飾し、遠心チップ内に装着したことを特徴とする抗体精製用チップ。
【請求項２】
無機系多孔質連続体の厚さと外径との比が０．１から１．０の範囲であることを特徴とする抗体精製用チップ。
【請求項３】
円盤状の無機系多孔質連続体を弾性を有するスペーサを用いて遠心チップに固定することを特徴とする抗体精製用チップ
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、抗体を体液、培養液等の試料から分離・精製するための抗体精製用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体精製用のカラムは球状の多孔質担体の表面に抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質、例えば、Staphylococcus aureus由来プロテインAもしくはその配列を改変したタンパク質、を化学的に修飾した充填材をカラム内に均一に充填したカラムが用いられている（例えば、特許文献１）。多孔質担体としてはアガロースゲル、シリカゲルが用いられている。プロテインAを修飾した担体を均一に充填したカラムは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）装置と共に、あるいは注射器に装着して吸着、洗浄、脱着工程をおこない、抗体精製を行っている。
遠心分離により吸着、洗浄、脱着工程を行うことができれば、HPLC装置を用いたり注射器を用いる場合と比べて操作が簡単であり精製時間も短縮することができる。
【０００３】
【特許文献１】特表平９−５０７５７７号
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、粒子を充填したカラムでは粒子径が小さいほど分離能はよくなるが反面カラムに溶液を通すための負荷圧が大きくなる。遠心分離による精製では、通液を可能とするためには大きな粒子径の充填材を用いなければならず分離能が十分ではなく、遠心チップに装着し遠心分離により抗体を精製できる抗体精製用カラムはない。また、遠心チップ内に粒子を充填するには非常に手間がかかり、コストの面でも高コスト化が避けられない。
本考案は、遠心分離でも通液可能で分離能も高い遠心チップ型抗体精製カラムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本考案は、上記のような欠点を克服するものであり、これに対して、マイクロメーターサイズの連続細孔とナノメーターサイズのメソ孔を有する無機系多孔質連続体では粒子充填カラムよりも小さな負荷圧で高分離能のカラムの作製が可能であり、低負荷圧で高分離能の抗体精製カラムの作製が可能である。このような無機系多孔質連続体を用い、表面に抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質を修飾した抗体精製カラムを遠心チップに装着すれば、遠心分離でも抗体精製が遠心チップを得ることができる。
無機系多孔質連続体を円盤状に成型し、その表面にまずアミノ基を修飾しさらにこのアミノ基に抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質を結合することにより抗体精製用無機系多孔質連続体を作製する。
抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質としては、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡ(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)、Streptococus sp. Group C/G由来のプロテインＧ (欧州特許出願公開第0131142A2号明細書（1983）に記載)、Peptostreptococcus magnus由来のプロテインＬ（米国特許第5965390号明細書（1992）に記載）、group A Streptococcus由来のプロテインＨ（米国特許第5180810号明細書（1993）に記載）、Haemophilus influenzae由来のプロテインＤ（米国特許第6025484号明細書（1990）に記載）、Streptococcus AP4由来のプロテインArp (Protein Arp 4)（米国特許第5210183号明細書（1987）に記載）、group C Streptococcus 由来のStreptococcal FcRc（米国特許第4900660号明細書（1985）に記載）、group A streptococcus, Type II strain 由来のタンパク質（米国特許第5556944号明細書（1991）に記載）、Human Colonic Mucosal Epithelial Cell由来のタンパク質（米国特許第6271362号明細書（1994）に記載）、Staphylococcus aureu , strain 8325-4由来のタンパク質（米国特許第6548639号明細書（1997）に記載）、Pseudomonas maltophilia由来のタンパク質（米国特許第5245016号明細書（1991）に記載）等が知られているが、抗体結合を有するペプチドもしくはタンパク質の種類には依存しない。
円盤状に成型するには、切削加工、打ち抜き等の公知の方法により行うことができる。
この円盤状の抗体精製用無機系多孔質連続体を遠心チップに装着する。この場合、抗体精製用無機系多孔質連続体の負荷圧は円盤の厚さにより決定される。無機系多孔質連続体の体積は抗体精製量を決める。円盤状無機系多孔質連続体の直径は遠心チップのサイズで決定されるので、無機系多孔質連続体の体積を大きくし精製量を大きくしようとすれば無機系多孔質連続体の厚さを大きくしなければならない。しかしながら無機系多孔質連続体の厚さを大きくすれば負荷圧が大きくなり遠心分離では通液ができなくなってしまう。よって、無機系多孔質連続体の厚さは直径に対して０．１から１．０の比の範囲が適当である。
【０００６】
円盤状の抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質修飾無機系多孔質連続体を遠心チップに装着するためには無機系多孔質連続体をチップに固定しなければならない。チップを融点以上に加熱し溶着により無機系多孔質連続体を固定することが考えられるが、抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質は、チップ融点以上の熱をかけると壊れてしまうので、無機系多孔質連続体をチップに溶着により固定することはできない。常温以下で無機系多孔質連続体をチップに固定するため、無機系多孔質連続体とチップとの間に弾力性のあるゴム等の材料でスペーサを作製し、これを用いて固定することにより円盤状の抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質修飾無機系多孔質連続体を遠心チップに装着することが可能となる。
【０００７】
無機系多孔質連続体は、相分離を利用したゾル―ゲル法によって調製することが好ましく、本発明における無機系多孔質連続体は、直径100nm〜10000nmのマクロ孔と骨格が共連続構造をした無機系多孔質連続体で、骨格には直径2nm〜200nmのメソ孔が存在する。
無機系多孔質連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル-ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
【０００８】
さらに具体的には、上記目的達成の手段は、水溶性高分子、熱分解する化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造することが好ましい。
【０００９】
ここで、水溶性高分子は、理論的には適当な濃度の水溶液と成し得る水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであれば良いが、具体的には高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン、あるいは中性高分子であって主鎖にエーテル結合を持つポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が好適である。また、有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、界面活性剤を用いてもよく、その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類が最適である。
【００１０】
加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド又はそのオリゴマーを用いることができ、これらのものは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。また、その金属としては、最終的に形成される酸化物の金属、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌが使用される。この金属としては1種又は2種以上であっても良い。一方オリゴマーとしてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には１０量体程度まで使用できる。
【００１１】
また、酸性水溶液としては、通常塩酸、硝酸等の鉱酸０．００１モル濃度以上のもの、あるいは酢酸、ギ酸等の有機酸０．０１モル濃度以上のものが好ましい。
【００１２】
相分離・ゲル化にあたっては、溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜５時間保存することにより達成できる。相分離・ゲル化は、当初透明な溶液が白濁してシリカ相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離・ゲル化で水溶性高分子は分散状態にありそれらの沈殿は実質的に生じない。
【００１３】
あらかじめ共存させる熱分解性の化合物の具体的な例としては、尿素あるいはヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の有機アミド類を利用できるが、加熱後の溶媒のｐＨ値が重要な条件であるので、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であれば特に制限はない。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃で、加熱後の溶媒のｐＨ値は、６．０〜１２．０が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
【００１４】
上記方法では、水溶性高分子を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行うと、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。生成物（ゲル）が固化した後、適当な熟成時間を経た後、湿潤状態のゲルを加熱することによって、反応溶液にあらかじめ溶解させておいたアミド系化合物が熱分解し、骨格相の内壁面に接触している溶媒のｐＨが上昇する。そして、溶媒がその内壁面を浸食し、内壁面の凹凸状態を変えることによって細孔径を徐々に拡大する。
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
【００１５】
巨大空孔を持たず３次元的に束縛された細孔のみを持つゲルでは、平衡条件としては溶解し得る部分でも、溶出物質が外部の溶液にまで拡散できないために、元の細孔構造が相当な割合で残る。これに対して巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゲルにおいては、２次元的にしか束縛されていない細孔が多く、外部の水溶液との物質のやり取りが十分頻繁に起こるため、大きい細孔の発達に並行して小さい細孔は消滅し、全体の細孔径分布は顕著に広がることがない。
【００１６】
なお、加熱過程においては、ゲルを密閉条件下に置き、熱分解生成物の蒸気圧が飽和して溶媒のｐＨが速やかに定常値をとるようにすることが有効である。
【００１７】
溶解・再析出反応が定常状態に達し、これに対応する細孔構造を得るために要する、加熱処理時間は、巨大空孔の大きさや試料の体積によって変化するので、それぞれの処理条件において実質的に細孔構造が変化しなくなる、最短処理時間を決定することが必要である。
【００１８】
加熱処理を終えたゲルは、溶媒を気化させることによって乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、適当な温度で熱処理を行い、有機物等を熱分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。なお、乾燥は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置して行い、熱処理は、２００〜８００℃程度で加熱する。
【考案を実施するための最良の形態】
【００１９】
抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質としては、アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質（製品名称を記載）をそのまま利用した。
実施例1
まず、無機系多孔質体を以下の方法で作製した。水溶性高分子であるポリエチレンオキシド（アルドリッチ製  商品番号85,645-2）0.90gおよび尿素0.90gを0.01規定酢酸水溶液10gに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン4mlをかくはん下で加えて、加水分解反応を行った。数分かくはんしたのち、得られた透明溶液を内径６ミリメートルのガラスチューブ内に注入し４０℃の恒温漕中に保持したところ約３０分後に固化した。
固化した試料をさらに数時間熟成させ、密閉条件下で１２０℃に１時間保った。この処理の後、ゲルを４０℃で３日間乾燥し、１００℃／ｈの昇温速度で８００℃まで加熱し、直径４．５ｍｍの棒状の無機系多孔質体を得た。
得られた多孔質体中には中心孔径２μｍ（＝２０００ｎｍ）程度の揃った貫通孔が３次元網目状に絡み合った構造で存在していることが確かめられた。そして、その貫通孔の内壁に直径２５ｎｍ程度の細孔が多数存在していることが、窒素吸着測定によって確かめられた。この棒状の無機系多孔質体を厚さ１．５ｍｍに切断することにより円盤状の無機系多孔質体を得た。
この円盤状の無機系多孔質体に以下の方法で「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質（製品名称：IBP“Amano”2）」を修飾した。まず、アミノプロピルトリエトキシシランをトルエン溶媒で２０％の濃度に希釈した溶液に円盤状の無機系多孔質体を浸漬し、６時間加熱還流して反応させることにより円盤状の無機系多孔質体の表面にアミノ基を導入した。次に、アミノ基修飾した円盤状の無機系多孔質体３０個を、プロテインＡ２０ｍｇを0.5Ｍ/Ｌのホウ酸バッファ５ｍｌに溶解した溶液に浸漬し、室温で２０時間反応させることにより円盤状の無機系多孔質体表面に「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質（製品名称：IBP“Amano”2）」を結合させた。
図１に示すようにこの円盤状の「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質（製品名称：IBP“Amano”2）」修飾抗体精製用無機系多孔質体１を容量５００μＬの遠心チップ３にシリコンゴム製のスペーサ２を用いて装着した。シリコンゴムスペーサのサイズは外径８ｍｍ、内径４．３ｍｍ、厚さ１．５ｍｍであった。無機系多孔質体の細孔径は連続細孔が約３μm、メソ細孔が６０ｎｍであった。
この遠心チップに、ヒトＩｇＧを加え卓上遠心分離機で３０秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。続いて、洗浄溶媒を加え卓上遠心分離機で３０秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。続いて、脱着溶媒を加え卓上遠心分離機で３０秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。ヒトＩｇＧの濃度は０．２、０．５、１．０、２．
０ｍｇ／ｍＬになるように吸着溶媒で希釈した。試料、洗浄溶媒、脱着溶媒の量はをそれぞれ５００μＬとした。脱着溶媒から回収した溶液に含まれる抗体の量を、UV吸収率より溶液の抗体濃度を測定することにより求めた。精製操作により回収できた回収率とともに表１に示した。「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質（製品名称：IBP“Amano”2）」修飾抗体精製用無機系多孔質体装着遠心チップを用い遠心分離という簡単な操作のみで抗体の精製が可能であった。
【表１】
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【００２０】
実施例２
実施例１と同様の方法で「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質（製品名称：IBP"Amano"2）」修飾抗体精製用無機系多孔質体を装着した遠心チップを作製し、この遠心チップに濃度が０．２ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを５００μＬ加え卓上遠心分離機で３０秒遠心する操作を１回、２回、３回繰り返す操作を行った後、洗浄溶媒を加え卓上遠心分離機で３０秒遠心し、続いて、脱着溶媒を加え卓上遠心分離機で３０秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。それぞれの脱着溶媒から回収した溶液に含まれる抗体の量を、UV吸収率より溶液の抗体濃度を測定することにより求めた。また、精製操作により回収できた回収率、カラム体積あたりの回収量を表２に示した。吸着回数が増えるとともに回収量も増えており、抗体の回収が可能であった。
【表２】
0003149787.tif 000004
【産業上の利用分野】
【００２１】
本考案は、抗体を体液、培養液等の試料から遠心分離により分離・精製するための抗体精製用遠心チップとして利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本考案の遠心チップ概略図
【符号の説明】
【００２３】
１：プロテインＡ修飾抗体精製用無機系多孔質体
２：スペーサ
３：遠心チップ
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月5日(2009.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体を用いた抗体精製用カラムであって、前記無機系多孔質連続体を円盤状に成型し、円盤状の無機系多孔質連続体表面を抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質で修飾し、遠心チップ内に装着したことを特徴とする抗体精製用チップ。
【請求項２】
前記無機系多孔質連続体の厚さと外径との比が０．１から１．０の範囲であることを特徴とする請求項１記載の抗体精製用チップ。
【請求項３】
円盤状の前記無機系多孔質連続体を弾性を有するスペーサを用いて前記遠心チップに固定することを特徴とする請求項1記載の抗体精製用チップ