(57)【要約】イミダゾキノリン系化合物等の免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識するＴＬＲ７をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、合成化合物不応答性モデル非ヒト動物を提供するものである。マウス遺伝子ライブラリーから得られたＴＬＲ７遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、ＴＬＲ７遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによってＴＬＲ７ノックアウトマウスを作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識するＴＬＲ７をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項２】
非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項３】
齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項２記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項４】
マウスが、マウス遺伝子ライブラリーからマウスＥＳＴクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られたＴＬＲ７遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、ＴＬＲ７遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるＴＬＲ７ノックアウトマウスであることを特徴とする請求項３記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項５】
免疫賦活化作用を有する合成化合物が、イミダゾキノリン系化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項６】
イミダゾキノリン系化合物が、Ｒ−８４８であることを特徴とする請求項５記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項７】
請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、免疫賦活化作用を有する合成化合物とを用いて、前記免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、免疫賦活化作用を有する合成化合物とを用いて、前記非ヒト動物における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価するに際し、対照としての野生型非ヒト動物との比較・評価を行うことを特徴とする請求項７又は８記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ウイルス感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ＴＬＲ７に対するアゴニスト又はアンタゴニストであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
免疫賦活化作用を有する合成化合物が、イミダゾキノリン系化合物であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
イミダゾキノリン系化合物が、Ｒ−８４８であることを特徴とする請求項１２記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質。
【請求項１５】
免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ウイルス感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項１４記載の合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質。
【請求項１６】
免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ＴＬＲ７に対するアゴニスト又はアンタゴニストであることを特徴とする請求項１４記載の合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質。
【請求項１７】
請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、対照としての野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・比較評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と、対照としての野生型非ヒト動物と、被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物と野生型非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・比較評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法。
【請求項２１】
イミキモド又はＲ−８４８をリード化合物とすることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法。
【請求項２２】
イミキモド又はＲ−８４８をリード化合物とする請求項２１記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、イミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８等の合成化合物を特異的に認識するＴＬＲ７をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、イミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８等の合成化合物不応答性モデル非ヒト動物や、またこれらモデル非ヒト動物を用いたイミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８等の合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法等に関する。
背景技術
トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（Ｃｅｌｌ５２，２６９−２７９，１９８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２，３９３−４１６，１９９６）、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であることが知られている（Ｃｅｌｌ８６，９７３−９８３，１９９６）。かかるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（Ｎａｔｕｒｅ３５１，３５５−３５６，１９９１、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２，３９３−４１６，１９９６、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６３，６５０−６５７，１９９８）。
近年、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）と呼ばれるＴｏｌｌの哺乳類のホモログが同定され、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０など現在までに１０個のファミリーが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ３８８，３９４−３９７，１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，５８８−５９３，１９９８、Ｂｌｏｏｄ９１，４０２０−４０２７，１９９８、Ｇｅｎｅ２３１，５９−６５，１９９９）。このＴＬＲファミリーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）をリクルートし、続いて下流のマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ及び核因子であるＮＦ−κＢを活性化することが知られている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，２０９７−２１０１，１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ２，２５３−２５８，１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１１，１１５−１２２，１９９９）。また、哺乳類におけるＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として、先天的な免疫認識に関わっているとも考えられている（Ｃｅｌｌ９１，２９５−２９８，１９９７）。
上記ＰＲＲにより認識される病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰ：ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）の一つは、グラム陰性菌の外膜の主成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）であって（Ｃｅｌｌ９１，２９５−２９８，１９９７）、かかるＬＰＳが宿主細胞を刺激して宿主細胞にＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６等の各種炎症性サイトカインを産生させること（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，２９３−４５０，１９７９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３，４３７−４５７，１９９５）や、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ：ＬＰＳ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）により捕獲されたＬＰＳが細胞表面上のＣＤ１４に引き渡されることが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９，１４３１−１４３３，１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，４３７−４５７，１９９５）。本発明者らは、ＴＬＲ４のノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ４ノックアウトウスが上記グラム陰性菌の外膜の主成分であるＬＰＳに不応答性であること（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，３７４９−３７５２，１９９９）や、ＴＬＲ２ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージがグラム陽性菌細胞壁やその構成成分であるペプチドグリカンに対する反応性が低下すること（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１，４４３−４５１，１９９９）や、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８シグナル伝達経路を介して生体反応を引き起こしていること（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５５４−５５７，２０００）を報告している。
また、本発明者らは、ＴＬＲ６ノックアウトマウスと野生型マウスとＴＬＲ２ノックアウトマウスとを比較・解析することにより、ＴＬＲ６がマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識する受容体タンパク質であることや、ＴＬＲ９について完全長ｃＤＮＡを見い出し（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５７０４）、ＴＬＲ９が非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質であることを明らかにしている。その他、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の新たな２つのメンバーがＧｅｎＢａｎｋに登録されている（登録番号ＡＦ２４０４６７及びＡＦ２４６９７１）。
他方、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）は、抗ヘルペスウィルス活性をスクリーニングする際に見い出された免疫応答修飾剤であり、モデル動物における抗ウィルス活性及び抗腫瘍活性を示す。種々の細胞タイプにおけるＩＦＮ−γの二次誘導によるのと同様に、この薬剤は、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２のようなサイトカインを誘導することにより抗ウィルス活性、抗増殖活性を示すこと（Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５８，３６５−３７２，１９９５、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ，１９８９，Ｓ２１１５、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８，２０５９−２０６４，１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１０２，７６８−７７４，１９９４）や、イミキモドがＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼを刺激することも明らかにされている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，５５５２−５５５７，２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２２０７−２２１８，１９９５）。また、イミキモド及びその関連化合物は、タイプ２ヘルペスシンプレックスウィルス及びサイトメガロウィルスの複製を阻害することが知られている（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８３，８４４−８４９，２００１、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３２，６７８−８３，１９８８）。そして、実際の治療において、イミキモドがヒトパピローマウィルスにより生じた外陰部疣贅（尖圭コンジローマ）の治療に対して有効であるとの報告（Ｓｅｘ．Ｔｒａｎｓｍ．Ｉｎｆｅｃ．７６，１６２−８，２０００）や、イミキモドの誘導体であるＲ−８４８と略称されるレジキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ））が生殖器ヘルペスの治療にも有効であるとの報告（ＪＡＭＡ２８５，２１８２−２１８３，２００１）がなされている。これらイミダゾキノリン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）系化合物であるイミキモドとＲ−８４８の構造式を以下に示す。
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ＴＬＲファミリーは、病原体の構成成分の認識に関わる受容体として知られており、上記のように、種々の細菌、真菌由来の構成成分がＴＬＲファミリーによって認識されることが本発明者らにより明らかにされている。すなわち、本発明者らは既に、ＴＬＲ２，ＴＬＲ４，ＴＬＲ６及びＴＬＲ９欠損マウスを作製し、ＴＬＲ４はリポ多糖（ＬＰＳ）に対して応答し、ＴＬＲ２はグラム陽性菌由来のペプチドグリカン及びリポタンパク質に応答し、ＴＬＲ２と同様に、ＴＬＲ６はマイコプラズマのポリペプチドに応答し、ＴＬＲ９は非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに応答する受容体であることを明らかにした。しかしながら、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ１０等のその他のＴＬＲファミリーメンバーが、いかなる物質を認識するかは未だ知られていない。加えて、免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識しうるタンパク質は知られていなかった。
本発明の課題は、インビボにおける免疫賦活化作用を有する合成化合物刺激によるシグナル伝達に対するＴＬＲファミリー各メンバーの関係、特にＴＬＲ７のインビボにおける役割を明らかにする上で有用な、免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識するＴＬＲ７をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、合成化合物不応答性モデル非ヒト動物、特にＴＬＲ７遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、これらを用いた免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法などを提供することにある。
本発明者らはＭｙＤ８８欠損マウスを作製し、ＭｙＤ８８欠損マウスに由来するマクロファージがサイトカインを産出する際に、全てのＴＬＲリガンドに応答しないことを既に報告している。ＭｙＤ８８欠損マウスでは細胞における応答を確認することができないので、ＴＬＲを介して細胞を活性化していると思われる各種化合物について調べてみた。数多くの化合物についてスクリーニングを行い、単核白血球細胞又はマクロファージからサイトカインを誘導する過程を経て、体液性免疫及び細胞性免疫を誘導すると思われるイミダゾキノリン系化合物、すなわち種々の細胞に作用しＩＦＮ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２などの炎症性サイトカインの産生を誘導する免疫賦活剤として知られているイミキモドやＲ−８４８等のイミダゾキノリン系化合物を標的化合物とすることとした。一方、ＴＬＲ７はタンパク質の一次構造が、微生物ＤＮＡを認識するＴＬＲ９に極めて類似している。しかし、ＴＬＲ７欠損マウスは、ＴＬＲ９欠損マウスのように微生物ＤＮＡに対する反応性の欠如は認められない。そこで、ＴＬＲファミリーのＴＬＲ７欠損マウスを作製し、ＴＬＲ７を標的としてそれが認識する物質についてもスクリーニングを重ねていた。
そして、偶々ＴＬＲ７欠損マウスをＲ−８４８で刺激したところ、マクロファージからの炎症性サイトカインの産生誘導や、Ｂ細胞の増殖誘導や、樹状細胞の成熟誘導が全く認められないことを見い出した。また、ＴＬＲ７欠損マウス由来のマクロファージでは、Ｒ−８４８刺激によるＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫなどの細胞内シグナルの活性化が全く認められなかった。このことは、ＴＬＲ７が病原体構成成分だけでなく、合成化合物の認識にも関与していることを示している。ＴＬＲファミリーシグナル伝達経路に必須の役割を果たすアダプター分子ＭｙＤ８８の欠損マウスでも、Ｒ−８４８に対する反応性は完全に欠如していたことを加味すると、ＴＬＲ７がイミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８の認識に必須の受容体であることや、イミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８がＴＬＲ７−ＭｙＤ８８を介したシグナル伝達経路により、免疫賦活化作用を発揮していると考えられた。イミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８は、強力な抗ウイルス作用や免疫細胞の賦活化作用を有しており、実際パピローマウイルスによるヒトの外陰部疣贅の治療に使用されていることから、ＴＬＲ７欠損マウスが、イミダゾキノリン系化合物の作用機序の解明に非常に有用なモデルマウスとなるばかりでなく、ＴＬＲ７を標的としてウイルス感染症の治療薬等の合成化合薬剤の臨床応用に向けての非常に有用なモデルマウスとなると考えられた。本発明は、上記の知見に基づいて完成するに至ったものである。
発明の開示
すなわち本発明は、免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識するＴＬＲ７をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物（請求項１）や、非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物（請求項２）や、齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項２記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物（請求項３）や、マウスが、マウス遺伝子ライブラリーからマウスＥＳＴクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られたＴＬＲ７遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、ＴＬＲ７遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるＴＬＲ７ノックアウトマウスであることを特徴とする請求項３記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物（請求項４）や、免疫賦活化作用を有する合成化合物が、イミダゾキノリン系化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物（請求項５）や、イミダゾキノリン系化合物が、Ｒ−８４８であることを特徴とする請求項５記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物（請求項６）に関する。
また本発明は、請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、免疫賦活化作用を有する合成化合物とを用いて、前記免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項７）や、請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、免疫賦活化作用を有する合成化合物とを用いて、前記非ヒト動物における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項８）や、免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価するに際し、対照としての野生型非ヒト動物との比較・評価を行うことを特徴とする請求項７又は８記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項９）や、免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ウイルス感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ＴＬＲ７に対するアゴニスト又はアンタゴニストであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項１１）や、免疫賦活化作用を有する合成化合物が、イミダゾキノリン系化合物であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、イミダゾキノリン系化合物が、Ｒ−８４８であることを特徴とする請求項１２記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法（請求項１３）に関する。
さらに本発明は、請求項７〜１３のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質（請求項１４）や、免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ウイルス感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする請求項１４記載の合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質（請求項１５）や、免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質が、ＴＬＲ７に対するアゴニスト又はアンタゴニストであることを特徴とする請求項１４記載の合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質（請求項１６）に関する。
また本発明は、請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法（請求項１７）や、請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法（請求項１８）や、請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、対照としての野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・比較評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法（請求項１９）や、請求項１〜６記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と、対照としての野生型非ヒト動物と、被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物と野生型非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・比較評価することを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法（請求項２０）や、イミキモド又はＲ−８４８をリード化合物とすることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか記載の免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法（請求項２１）や、イミキモド又はＲ−８４８をリード化合物とする請求項２１記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする免疫賦活化作用を有する合成化合物（請求項２２）に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物としては、免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識するＴＬＲ７をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、また、免疫賦活化作用を有する合成化合物としては、ＴＬＲ７が認識することができる免疫賦活化作用を有する合成化合物であればどのような合成化合物でもよく、例えばイミダゾキノリン系化合物、より具体的には前述のイミキモドとＲ−８４８等を挙げることができる。
したがって、本発明における合成化合物不応答性モデル非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べて免疫賦活化作用を有する合成化合物による刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が特異的に低下しているか、あるいは失われている非ヒト動物、例えば、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡによる刺激に対しては、正常に生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官において反応性を有するが、イミダゾキノリン系化合物等の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対しては、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいは失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいい、具体的には、ＴＬＲ７ノックアウトマウス等のＴＬＲ７遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を具体的に挙げることができる。また、上記免疫賦活化作用を有する合成化合物による刺激としては、免疫賦活化作用を有する合成化合物を生体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された細胞に免疫賦活化作用を有する合成化合物を接触させるインビトロでの刺激等を挙げることができる。
次に、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物の作製方法を、ＴＬＲ７ノックアウトマウスを例にとって説明する。マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＴＬＲ７をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＴＬＲ７をコードする遺伝子を、ウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このＴＬＲ７をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＴＬＲ７ノックアウトマウスにおいてＴＬＲ７が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＴＬＲ７の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
また、作出されたＴＬＲ７ノックアウトマウスが免疫賦活化作用を有する合成化合物に対して不応答性であることは、例えば、免疫賦活化作用を有する合成化合物をＴＬＲ７ノックアウトマウスのマクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビボで接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等の産生量や、脾臓Ｂ細胞の増殖応答や、脾臓Ｂ細胞表面でのＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ等の抗原の発現量や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ７のシグナル伝達経路における分子の活性化を測定することにより確認することができる。そして、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウスは、免疫賦活化作用を有する合成化合物の作用機序の解明や、ウイルス感染に対する治療戦略を考案する上で有用なモデルとすることができる。
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識するＴＬＲ７欠損型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、好ましくは免疫賦活化作用を有する合成化合物を認識するＴＬＲ７をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、さらには同腹の動物を、例えば以下に記載する本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニングに際して併用することが好ましい。
本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物由来のマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞は、免疫賦活化作用を有する合成化合物の作用機序の解明の他、ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス、ヒトパピローマウィルス等の各種ウイルスの感染による各種ウイルス感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ７に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどの免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニング等に用いることができる。外陰部疣贅等のウイルス感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ７に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどの免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニング方法を、以下に例を挙げて説明する。
本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法としては、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来するマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞と、被検物質と、免疫賦活化作用を有する合成化合物とを用いて、かかる免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法や、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、免疫賦活化作用を有する合成化合物とを用いて、かかるモデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法等を挙げることができる。
上記免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞を用いたスクリーニング方法としては、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物から得られる免疫細胞と被検物質とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、かかる免疫細胞を免疫賦活化作用を有する合成化合物の存在下で培養し、該免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法や、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物から得られる免疫細胞と免疫賦活化作用を有する合成化合物とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
また、免疫賦活化作用方法を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を免疫賦活化作用を有する合成化合物の存在下で培養し、該免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法や、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物に免疫賦活化作用を有する合成化合物を投与し、該非ヒト動物から得られる免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
また、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ免疫賦活化作用を有する合成化合物を投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法や、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ免疫賦活化作用を有する合成化合物を投与した後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られる免疫細胞における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
他方、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、免疫賦活化作用を有する合成化合物とを用いて、かかるモデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法としては、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該モデル非ヒト動物に免疫賦活化作用を有する合成化合物を投与し、該モデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法や、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物をあらかじめ免疫賦活化作用を有する合成化合物により感染させた後、該モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
本発明において免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答の測定・評価とは、免疫賦活化作用を有する合成化合物と特異的に反応し、細胞内にシグナルを伝達する機能の測定・評価をいい、かかるシグナル伝達機能としては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等のサイトカインを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面においてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ等の抗原を発現する機能や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ７のシグナル伝達経路における分子を活性化させる機能などを具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。また前記したように、免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する応答を測定・評価するに際し、対照として野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。
本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞を用いると、免疫賦活化作用を有する合成化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法としては、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・評価する方法や、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではない。
上記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞を用いたスクリーニング方法としては、モデル非ヒト動物から得られるマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞と、被検合成化合物とをインビトロで接触せしめた後、かかる免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・評価する方法や、モデル非ヒト動物に被検合成化合物を投与した後、モデル非ヒト動物から得られる免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・評価する方法を挙げることができる。
上記モデル非ヒト動物を用いたスクリーニング方法としては、モデル非ヒト動物に被検合成化合物を投与した後、これらモデル非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・評価する方法を挙げることができる。
本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法における免疫賦活化作用の測定・評価とは、例えば、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞における、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等のサイトカインを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面においてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ等の抗原を発現する機能や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ７のシグナル伝達経路における分子を活性化させる機能などの程度を測定・評価することをいい、例えば、イミキモドやＲ−８４８をリード化合物とし、コンビナトリアルケミストリー等の手法を用いて、上記免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニングを行い、モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における挙動が、リード化合物を用いたときの挙動と類似する場合、かかる被検合成化合物は、免疫賦活化作用を有する合成化合物の候補物質となる可能性が大きい。そして、イミキモドやＲ−８４８をリード化合物とするスクリーニング方法により得られる免疫賦活化作用を有する合成化合物も本発明に含まれる。
また、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、対照としての野生型非ヒト動物や野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞を用いると、免疫賦活化作用を有する合成化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法としては、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、対照としての野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・比較評価する方法や、本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物と、対照としての野生型非ヒト動物と、被検合成化合物とを用いて、前記モデル非ヒト動物と野生型非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・比較評価する方法であれば特に制限されるものではない。
上記モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と対照としての野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞とを用いたスクリーニング方法としては、モデル非ヒト動物や野生型非ヒト動物から得られるマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞と、被検合成化合物とをインビトロでそれぞれ接触せしめた後、かかる免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・比較評価する方法や、モデル非ヒト動物や野生型非ヒト動物に被検合成化合物を投与した後、モデル非ヒト動物や野生型非ヒト動物からそれぞれ得られる免疫細胞における免疫賦活化作用を測定・比較評価する方法を挙げることができる。
上記モデル非ヒト動物と対照としての野生型非ヒト動物とを用いたスクリーニング方法としては、モデル非ヒト動物や野生型非ヒト動物に被検合成化合物をそれぞれ投与した後、これらモデル非ヒト動物や野生型非ヒト動物における免疫賦活化作用を測定・比較評価する方法を挙げることができる。
本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニング方法における免疫賦活化作用の測定・比較評価とは、例えば、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等のサイトカインを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面においてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ等の抗原を発現する機能や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ７のシグナル伝達経路における分子を活性化させる機能などの程度を、免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、対照としての野生型非ヒト動物や野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞とでそれぞれ測定し、その機能の程度を比較・評価することをいい、例えば、野生型非ヒト動物においてはサイトカイン産生を誘導するが、モデル非ヒト動物においてはサイトカイン産生を誘導しない被検合成化合物は、免疫賦活化作用を有する合成化合物の候補物質となる可能性が大きい。また、イミキモドやＲ−８４８をリード化合物とし、コンビナトリアルケミストリー等の手法を用いて、上記免疫賦活化作用を有する合成化合物のスクリーニングを行い、モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物由来の免疫細胞における挙動が、対照としての野生型非ヒト動物や野生型非ヒト動物に由来する免疫細胞における挙動と類似する場合、かかる被検合成化合物は、免疫賦活化作用を有する合成化合物の候補物質となる可能性が大きい。そして、イミキモドやＲ−８４８をリード化合物とするスクリーニング方法により得られる免疫賦活化作用を有する合成化合物も本発明に含まれる。
本発明の免疫賦活化作用を有する合成化合物に対する反応性を特異的に欠如したモデル非ヒト動物により、ＴＬＲ７が免疫賦活化作用を有する合成化合物の認識に関与していることが明らかとなったことから、これらのモデル非ヒト動物は、免疫賦活化作用を有する合成化合物の作用機序の解明の他、ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス、ヒトパピローマウィルス等の各種ウイルスの感染による各種ウイルス感染症に対する治療戦略を考案する上で、非常に有用なモデル動物となることが考えられる。またＴＬＲ７のアゴニストやアンタゴニストは、上記各種ウイルス感染症に対する抑制物質又は促進物質や、ＴＬＲ７活性の欠失又は異常に起因する疾病等の診断・治療に有用な物質となる可能性がある。
以下に、実施例・参考例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例等により限定されるものではない。また、実施例における試薬等は以下のものを用いた。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＤＮＡ及びミクロコッカス・ディクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡをＳｉｇｍａ社から購入し、更にフェノール／クロロホルム抽出物を用いて精製した。サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒｅ−５９５）由来のＬＰＳをＳｉｇｍａ社から購入した。マイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２は、Ｐｅｔｅｒ  Ｆ．Ｍｕｈｌｒａｄｔ博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐｈｉｌｉｐｐｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｅｒｍａｎｎｙ）に供与されたものを用いた。使用するＯＤＮ（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、全て北海道システム・サイエンスから購入した。また、ＣｐＧ  ＤＮＡの配列及びバックボーンは、以下の通りである。
2003043588.tif 000003
下線部は、典型的なＣｐＧモチーフを示す。大文字及び小文字は、それぞれホスホジエステルバックボーン（天然バックボーン）及びホスホロチオエート修飾を示す。
参考例１（ＭｙＤ８８ノックアウトマウスの作製）
ＭｙＤ８８遺伝子を１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）からスクリーニングし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定した。標的ベクターは、ｐＭＣ１−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）からのネオマイシン抵抗遺伝子で、１．０ｋｂ遺伝子断片を置換することにより構築された。置換された遺伝子断片は、ＩＬ−１ＲａｃＰ（受容体補助タンパク）の細胞質ドメインに似ているドメインをコードする２つのエクソンを含んでいた。ネオマイシン抵抗遺伝子は、１．１ｋｂの５′遺伝子断片と５．２ｋｂの３′遺伝子断片をフランキング配列として有していた。次いで、ＨＳＶ−ｔｋカセットを遺伝子断片の３′端に導入した。線状化された標識ベクターでＥＳ細胞Ｅ１４．１にトランスフェクションし、Ｇ４１８及びガンシクロヴィアで選択した。突然変異ＭｙＤ８８対立遺伝子を含有していた標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションした。得られたキメラマウスを、ヘテロ接合体マウスを作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスと交尾させた。ヘテロ接合体マウスは、ホモ接合体マウスを得るためインタークロスし、ＭｙＤ８８欠損マウスを作製した。ＭｙＤ８８ノックアウトマウスは健康に育ち、２０週の年齢まで異常を示さなかった。
参考例２（ＴＬＲ９ノックアウトマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）からマウスＴＬＲ９遺伝子（登録番号ＡＦ２４５７０４）由来のプローブを用いて、ＴＬＲ９ゲノムＤＮＡを単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、ＬＲＲ（ロイシンリッチリピート）領域の一部分をコードする１．０ｋｂのフラグメントを、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｐＭＣ１−ｎｅｏ；ストラタジーン社製）に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した。このターゲッティングベクターを線状化し、胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションし、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示すクローンを選択した。突然変異ＴＬＲ９対立遺伝子を含有していた標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交配させ、ヘテロ接合体Ｆ１マウスを作製し、かかるヘテロ接合体Ｆ１マウスをインタークロスすることによってホモ接合体マウス（ＴＬＲ９ノックアウトマウス：ＴＬＲ９−／−）を得た。ＴＬＲ９ノックアウトマウスは健康に育ち、２０週の年齢まで異常を示さなかった。
実施例１（ＴＬＲ７ノックアウトマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）から、ヒトＴＬＲ７遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡ配列（登録番号ＡＣ００３０４６）由来のプローブ（配列番号５）を用いて、ＴＬＲ７のゲノムＤＮＡをスクリーニングし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、ロイシンリッチリピートの一部をコードしている１．８ｋｂのＴＬＲ７遺伝子フラグメントを、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｐＭＣ１−ｎｅｏ；ストラタジーン社製）に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した。マウスＴＬＲ７遺伝子座、ターゲッティングベクター及び変異導入による変異アレルを図１に示す。図１中の“■”は、コーディングエクソンを示す。使用した制限酵素は、ＳｃａＩ（Ｓｃ）及びＢａｍＨＩ（Ｂ）である。このターゲッティングベクターを線状化し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションし、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示す３４０個のクローンを選択し、ＰＣＲ法及びサザンブロット法により６個のクローンをスクリーニングした。
突然変異ＴＬＲ７対立遺伝子を含有していた３個の標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、変異対立遺伝子が生殖細胞系列を通じて伝達されたキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交配させて雌マウスが得られたが、得られた雌マウスは全てヘテロ接合マウスであった。これはＴＬＲ７がＸ染色体にマップされ、全ての生殖細胞系列が伝達されていたためである。ＴＬＲ７ノックアウトマウスを作製するために、得られたヘテロ接合雌マウスをヘテロ接合体（Ｆ１）とインタークロスすることによってホモ接合体マウス（ＴＬＲ７ノックアウトマウス：ＴＬＲ７−／−）を得た。なお、ホモ接合体マウスの確認は、マウスの尾から抽出した各ゲノムＤＮＡをＳｃａＩでダイジェストし、図１に示すプローブを用いるサザンブロット法により行った。図２に示される結果から、野生型雄マウス（＋／Ｙ）では６ｋｂのシングルバンド、ヘミ接合の雄マウス（−／Ｙ）では５ｋｂのバンド、ヘミ接合の雌マウス（＋／−）では両方のバンドを示した。本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７−／−）はメンデルの法則に従い作製することができ、２５週目までは顕著な異常を示さなかった。
実施例２（腹腔マクロファージの調製）
野生型マウス（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）、ＭｙＤ８８ノックアウトマウス（ＭｙＤ８８ＫＯ）及びＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９ＫＯ）のそれぞれの腹腔内に４％のチオグリコール酸培地（ＤＩＦＣＯ社製）を２ｍｌずつ注入し、３日後に各マウスの腹腔内から腹腔滲出細胞を単離し、これらの細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で３７℃にて２時間培養し、氷温のハンクス緩衝液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹腔マクロファージとして以下の実験に使用した。野生型マウス（＋／Ｙ）とＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）に由来するマクロファージから得られた全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動し、ナイロン膜に移し、ＴＬＲ７ｃＤＮＡの一部とハイブリダイズさせ、この膜をβアクチンプローブでもって再びハイブリダイズさせた。かかるノーザンブロット法で調べた。図３に示す結果から、ＴＬＲ７ノックアウトマウスではＴＬＲ７ｍＲＮＡの発現は見い出せなかった。
また、腹腔マクロファージから産出されたサイトカインの測定は、２×１０５／ウェル又は５×１０４／ウェルの腹腔マクロファージを、それぞれ９６ウェルプレート内で培養し、前述の試薬を用いて２４時間刺激した後、マニュアルに従い、ＥＬＩＳＡ法を用いてＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６及び／又はＩＦＮ−αの濃度を測定した。
実施例３（イミダゾキノリン系化合物による免疫細胞の活性化）
イミダゾキノリン系化合物であるイミキモド及びＲ−８４８に対するＴＬＲ７ノックアウトマウスの応答性を調べる前に、まず、所定濃度のイミキモド及びＲ−８４８をそれぞれＢＡＬＢ／ｃマウス（野生型）に経口投与し、２時間経過した時点での血清中におけるＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の濃度を測定した。結果を図４に示す。その結果、血清中のＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の濃度は、投与量依存的に上昇した。データは平均値＋／−統計誤差Ｓ．Ｄ．（Ｎ＝３）である。同様に、イミキモド及びＲ−８４８をそれぞれ用いて、これら化合物がＴＬＲを介して免疫細胞を活性化する能力を調べた。実施例２により調製した野生型マウス及びＭｙＤ８８ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージ（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、３０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下又は非存在下に、イミキモド又はＲ−８４８で刺激し、腹腔マクロファージから産出されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図５に示す。その結果、野生型マウス由来のマクロファージは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２等のサイトカインを多量に産出したが、ＭｙＤ８８ノックアウトマウス由来のマクロファージはサイトカンをほとんど産出しなかった。このことから、イミダゾキノリン系化合物に応答する腹腔マクロファージから産出されるサイトカインが、ＭｙＤ８８に完全に依存することがわかった。また、これらの結果から、イミキモド及びＲ−８４８はＴＬＲを介して免疫細胞を活性化することがわかった。データは平均値＋／−統計誤差Ｓ．Ｄ．（Ｎ＝３）で示されている。
実施例４（ＴＬＲ７ＫＯマウス由来マクロファージにおけるＯＤＮ刺激）
次に、ＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）、ＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９ＫＯ）及び野生型マウス由来の腹腔マクロファージ（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、３０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下（＋）又は非存在下（−）に、所定濃度のＣｐＧ  ＤＮＡ１６６８（ホスホロチオエート１６８８）、Ｄ１９、ＡＡＣ３０、天然１６６８（ホスホジエステル１６８８）、大腸菌由来のゲノムＤＮＡ又はミクロコッカス・ディクティカス由来のゲノムＤＮＡで刺激し、２４時間培養後の培養上清中に含まれる腹腔マクロファージ産出のＩＬ−１２ｐ４０濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図６に示す（図中＊印は検出限界以下を示す。）。図６からわかるように、ＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージは、各種ＯＤＮ刺激によりＩＬ−１２ｐ４０の産生が野生型マウスと同様に認められたのに対して、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージではＩＬ−１２ｐ４０の産生誘導は認められなかった。データは平均値＋／−統計誤差（Ｓ．Ｄ．）である。独立して行なわれた３回の実験でも、類似の結果が得られた。
実施例５（ＴＬＲ７ＫＯマウス由来マクロファージにおけるイミダゾキノリン系化合物刺激）
続いて、ＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）及び野生型マウス由来の腹腔マクロファージ（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、３０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下（＋）又は非存在下（−）に、所定濃度のイミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８、ＬＰＳ、ＯＤＮ１６８８（ホスホロチオエート１６８８）で刺激し、２４時間培養後の培養上清中に含まれる腹腔マクロファージ産出のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図７に示す（図中＊印は検出限界以下を示す。）。図７からわかるように、ＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージは、ＬＰＳやＯＤＮ１６８８刺激によりＴＮＦ−αの産生が正常マウスと同様に認められたのに対して、イミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８によるＴＮＦ−αの産生誘導は認められなかった。同様にして、２４時間培養後の培養上清中に含まれる腹腔マクロファージ産出のＩＬ−１２ｐ４０濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図８に示す（図中＊印は検出限界以下を示す。）。図８からわかるように、ＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージは、ＬＰＳやＯＤＮ１６８８刺激によりＩＬ−１２ｐ４０の産生が正常マウスと同様に認められたのに対して、イミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８によるＩＬ−１２ｐ４０の産生誘導は認められなかった。
実施例６（ＴＬＲ７ＫＯマウス由来マクロファージにおけるイミダゾキノリン系化合物刺激）
本発明者らが既に作製している、ＴＬＲ２ノックアウトマウス、ＴＬＲ４ノックアウトマウス、ＴＬＲ６ノックアウトマウス又はＴＬＲ９ノックアウトマウスは、イミダゾキノリン系化合物に対して応答性を示したことから、イミダゾキノリン系化合物を認識するのは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６及びＴＬＲ９以外のＴＬＲメンバーが関与していると考えられた。そこで、ＴＬＲ７がイミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８を特異的に認識するかどうかについて、ＴＬＲ７ノックアウトマウスのＲ−８４８に対する応答性について調べてみた。ＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）及び野生型マウス由来の腹腔マクロファージ（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、３０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下（＋）又は非存在下（−）に、所定濃度のＲ−８４８とＬＰＳで刺激し、２４時間培養後の培養上清中に含まれる腹腔マクロファージが産出するＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図９に示す（図中＊印は検出限界以下を示す。）。図９からわかるように、ＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージは、ＬＰＳ刺激によりＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生が野生型マウスと同様に認められたのに対して、Ｒ−８４８刺激ではＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生誘導は認められなかった。
実施例７（ＴＬＲ７ＫＯマウス由来脾細胞におけるイミダゾキノリン系化合物刺激）
イミダゾキノリン系化合物でＢリンパ球を刺激することにより、活性化したフェノタイプが増殖して発現することから、脾細胞の増殖性を調べた（Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３，５５−６２，２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，５５５２−５５５７，２０００）。ＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）及び野生型マウス由来の脾細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、所定濃度のＲ−８４８とＣｐＧ  ＤＮＡで刺激し、４８時間（最後の８時間は［３Ｈ］チミジンを加えて培養）培養し、βシンチレーションカウンターを用いて、［３Ｈ］チミジンの取込量を調べた。結果を図１０に示す。実験は３回行なったが、その中で代表的な実験で得られた平均値＋／−測定誤差（＋／−Ｓ．Ｄ．）を示す。図１０からわかるように、野生型マウス由来の脾細胞は、Ｒ−８４８刺激及びＣｐＧ  ＤＮＡ刺激により、濃度依存的に増殖を示したが、ＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の脾細胞は、ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激に対しては濃度依存的に増殖したが、Ｒ−８４８刺激に対しては増殖を示さなかった。
実施例８（ＴＬＲ７ＫＯマウス由来樹状細胞におけるイミダゾキノリン系化合物刺激）
ＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）及び野生型マウス由来の骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）におけるＲ−８４８に対する応答性を調べてみた。１０％のウシ胎仔血清及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（マウス顆粒白血球／マクロファージコロニー刺激因子）を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地中で、ＴＬＲ７ノックアウトマウス及び野生型マウスから得た骨髄細胞を６日間培養した。得られたマウス未分化樹状細胞を、Ｒ−８４８又はＣｐＧ  ＤＮＡを用いて２４時間刺激して、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６に対するビオチン化抗体を用いて細胞を染色し、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ストレプトアビジンを検出し、自動細胞解析装置（ファクスキャリバー）で分析した。かかるフローサイトメトリー法によるＣＤ４０，ＣＤ８０及びＣＤ８６分子が細胞表面に発現するようすを調べた結果を図１１に示す。ＣｐＧ  ＤＮＡを用いた場合と同様に、Ｒ−８４８を用いて野生型マウス由来のＢＭＤＣを刺激した場合には、ＣＤ４０，ＣＤ８０及びＣＤ８６発現のアップレギュレーションが誘導された。こに対して、ＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）由来のＢＭＤＣを、Ｒ−８４８を用いて刺激した場合には、これら細胞表面分子の発現が増強されなかった。
実施例９（イミダゾキノリン系化合物刺激によるＮＦ−κＢ複合体の誘導）
次に、抗ウィルス免疫応答修飾剤に対する細胞内シグナルカスケードの活性化について調べた。チオグリコールで刺激したＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）及び野生型マウス由来の腹腔マクロファージ（各２×１０６ｃｅｌｌｓ）を、所定の時間１００ｎＭのＲ−８４８又は１．０μＭのＣｐＧ  ＤＮＡ１６６８（ＣｐＧ）で刺激し、核タンパク質抽出し、ＮＦ−κＢ結合部位を含む特異的プローブと共に得られた抽出物をインキュベートし、電気泳動を行い、オートラジオグラフィーにより視覚化し、ＮＦ−κＢ活性をＤＮＡ結合タンパク質として電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）でもって調べた。結果を図１２に示す。図１２中、矢印は誘導されたＮＦ−κＢ複合体を示しており、矢頭はフリープローブを示している。図１２からわかるように、野生型マウス由来のマクロファージの場合、イミダゾキノリン系化合物Ｒ−８４８又はＣｐＧ  ＤＮＡを用いて刺激すると、増強されたＮＦ−κＢ転写のＤＮＡ結合活性、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化、及びＩＲＡＫのリン酸化が誘導された。これに対して、ＭｙＤ８８ノックアウトマウス由来のマクロファージと同様に、ＴＬＲ７ノックアウトマウス由来のマクロファージにおいても、これらすべてのシグナルイベントは完全に破壊されていた。
実施例１０（イミダゾキノリン系化合物刺激によるＮＦ−κＢレポーター遺伝子のトランス活性化）
Ｒ−８４８が誘導するＮＦ−κＢレポーター遺伝子のトランス活性化におけるＴＬＲ７の機能的役割を調べた。ＨＥＫ２９３細胞をヒト由来のＴＬＲ７発現プラスミドとトランジェントにコトランスフェクションし、Ｒ−８４８で刺激する前後でルシフェラーゼ活性を測定した。チオグリコールで刺激したＴＬＲ７ノックアウトマウス（ＴＬＲ７ＫＯ）及び野生型マウス由来の腹腔マクロファージを、１００ｎＭのＲ−８４８又は１．０μＭのホスホロチオエート修飾ＣｐＧ  ＤＮＡ１６６８（ＣｐＧ）で刺激し、全細胞溶解物を調製し、抗ＪＮＫ抗体で免疫沈降させ、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質を基質として使用したインビトロキナーゼアッセイ法により、ＪＮＫ活性を調べた。結果を図１３（上段）に示す。抗ＪＮＫ抗体を用いて同じ溶解物をブロットした。また、抗ＩＲＡＫを用いて溶解物を免疫沈降させ、インビトロキナーゼアッセイ法でＩＲＡＫのキナーゼ活性を調べた。結果を図１３（下段）に示す。抗ＩＲＡＫ抗体を用いて、同じ溶解物をブロットした。図１３からわかるように、ＴＬＲ７を用いてトランスフェクションしたことにより、Ｒ−８４８に対するＮＦ−κＢ依存プロモーター活性が増進した。ＴＬＲ７−ＭｙＤ８８依存シグナル経路を活性化することは、インビトロでのイミダゾキノリンの効果に対して重要である。
実施例１１（インビボにおけるＴＬＲ７の関与）
Ｒ−８４８に対する応答にＴＬＲ７が関与しているかどうかをインビボで調べてみた。野生型マウス、ＭｙＤ８８ノックアウトマウス又はＴＬＲ７ノックアウトマウスの腹腔内に５０ｎｍｏｌのＲ−８４８を注入し、所定時間後に血清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によって血清中のＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びＩＬ１２ｐ４０の濃度を調べた。結果を図１４に示す。野生型マウスの腹腔中にＲ−８４８を注入すると、血清中のＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の濃度が著しく上昇した。他方、ＴＬＲ７ノックアウトマウスにおいては、これらサイトカインの増加は見られなかった。同様にＭｙＤ８８ノックアウトマウスは、Ｒ−８４８に対して全く応答性を示さなかった。
産業上の利用可能性
本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス等の免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物は、免疫賦活化作用を有する合成化合物に対して不応答性であるため、イミダゾキノリン系化合物の作用機序の解明に非常に有用なモデルマウスとなるばかりでなく、ＴＬＲ７を標的としてウイルス感染症の治療薬等の合成化合薬剤の臨床応用に向けての非常に有用なモデルマウスとなる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、マウスＴＬＲ７遺伝子座、ターゲッティングベクター及び変異導入による変異アレルの遺伝子地図を示す図である。
第２図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウスのサザンブロット分析の結果を示す写真である。
第３図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウスにおけるノーザンブロット分析の結果を示す写真である。
第４図は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（野生型）におけるイミキモド及びＲ−８４８経口投与によるＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２産生の結果を示す図である。
第５図は、野生型マウス及びＭｙＤ８８ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージにおけるＩＦＮ−γの存在下又は非存在下でのイミキモド又はＲ−８４８刺激によるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２産生の結果を示す図である。
第６図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス及びＴＬＲ９ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージにおける各種ＯＤＮ刺激によるＩＬ−１２ｐ４０産生の結果を示す図である。
第７図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージにおけるＩＦＮ−γの存在下又は非存在下での化学合成物Ｒ−８４８、ＬＰＳ、ＯＤＮ１６８８刺激によるＴＮＦ−α産生の結果を示す図である。
第８図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージにおけるＩＦＮ−γの存在下又は非存在下での化学合成物Ｒ−８４８、ＬＰＳ、ＯＤＮ１６８８刺激によるＩＬ−１２ｐ４０産生の結果を示す図である。
第９図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージにおけるＩＦＮ−γの存在下又は非存在下でのＲ−８４８、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０産生の結果を示す図である。
第１０図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の骨髄由来の樹状細胞におけるＲ−８４８、ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激による［３Ｈ］チミジンの取込量の結果を示す図である。
第１１図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の樹状細胞におけるＲ−８４８、ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激によるＣＤ４０，ＣＤ８０及びＣＤ８６分子の細胞表面での発現の結果を示す図である。
第１２図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス由来のマクロファージにおけるＲ−８４８、ＣｐＧ  ＤＮＡ刺激によるＮＦ−κＢの活性化の結果を示す写真である。
第１３図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウス由来のマクロファージにおけるＲ−８４８が誘導するＮＦ−κＢレポーター遺伝子のトランス活性化の結果を示す写真である。
第１４図は、本発明のＴＬＲ７ノックアウトマウスにおけるＲ−８４８に対するインビボでの応答結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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