(57)【要約】ウイルスに対する新しい予防・治療剤を提供することを目的として、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有するウイルス感染予防・治療剤を提供する。また、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する、抗ウイルス因子活性増強剤及びプロテインキナーゼ誘導剤を提供する。さらに、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する医薬を患者に有効量投与することを含むウイルス感染の予防・治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有するウイルス感染予防・治療剤。
【請求項２】
前記ウイルスはインフルエンザウイルスである請求の範囲１記載のウイルス感染予防・治療剤。
【請求項３】
ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する医薬を患者に有効量投与することを含むウイルス感染の予防・治療方法。
【請求項４】
ウイルス感染予防・治療剤の製造のためのゲラニルゲラニルアセトンの使用。
【請求項５】
ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する抗ウイルス因子活性増強剤。
【請求項６】
前記抗ウイルス因子はＭｘＡ遺伝子である請求の範囲５記載の抗ウイルス因子活性増強剤。
【請求項７】
ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有するプロテインキナーゼ誘導剤。
【請求項８】
前記プロテインはインターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ活性化蛋白である請求の範囲７記載のプロテインキナーゼ誘導剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ゲラニルゲラニルアセトンの予防・治療剤としての新たな用途に係り、より詳細には、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有するウイルス感染予防・治療剤に関する。
背景技術
ウイルスは種々の疾患の原因となり、例えば、インフルエンザＡウイルス感染症は世界中で集団感染や大流行を引き起こし、小児、高齢者、心肺疾患や免疫不全患者にしばしば深刻な状況をもたらすウイルスの一つである（非特許文献１乃至３参照）。
近年、様々な治療法が進歩する中、いまだにウイルスに対する確実で有効な治療法は見出されていない。現在では、不活性ワクチン接種が最も有効な手段として用いられているものの、例えばインフルエンザＡウイルスはその表面抗原性を巧みに変化させ、ワクチンによる治療効果をしばしば低下させている。
最近、ノイラミニダーゼインヒビター（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）、オセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）といった新薬や（非特許文献４乃至７参照）、イオンチャンネルブロッカーであるアマンタジン（ａｍａｎｔａｚｉｎｅ）、リマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）といった薬物によるウイルス感染の化学療法効果に関して、インビボ若しくはインビトロで多くの報告がなされている（非特許文献８参照）。
しかし、それも発症早期での投薬のみでしか効果がなく、肺炎や二次感染は防げないとも報告されており（非特許文献９参照）、また耐性を持つウイルスも報告されている。
ところで、熱ショック蛋白質（以下、「ＨＳＰ」という。）は様々なストレス下で細胞内に誘導されるストレス蛋白の一群であり、その傾向は分子量７０ｋＤの熱ショック蛋白質（以下、「ＨＳＰ７０」という。）に最も顕著に認められる現象である。最近の研究により、生体及び細胞に対する熱ショック蛋白質の保護効果が数多く報告されており、注目を浴びている。
ＨＳＰはリポポリサッカライドに対する抗炎症作用・炎症性サイトカインの抑制、虚血からの保護効果、細胞のアポトーシスの抑制などから敗血症性ショック、心臓や脳といった生命器官の虚血性疾患など様々な病態において、生体にとって侵襲防御の面から有益であることが示されている。
しかしながら、ＨＳＰの誘導法は熱ショック、亜ヒ酸ナトリウム塩、重金属などの環境ストレスや虚血などの病的ストレス等で、臨床応用には非現実的なものであり、生体で安全にＨＳＰを誘導する方法は、未だ確立されていない。
近年、抗潰瘍薬として市販されているゲラニルゲラニルアセトン（以下、「ＧＧＡ」という。（商品名「セルベックス（Ｓｅｌｂｅｘ）」エーザイ株式会社製）の作用機序がＨＳＰの誘導、発現を介していることが報告された（非特許文献１０参照）。そのため、ＧＧＡは臨床応用可能なＨＳＰ誘導剤として、特に、注目されている。
そこで、本発明は、ＧＧＡの強力なＨＳＰ誘導作用に着目し、ウイルスに対する感染予防・治療効果を検討し、ウイルスに対する新しい医薬を提供することを目的とする。
非特許文献１：Ｇｌｅｚｅｎ  ＷＰ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９８２；４：２５−４４；
非特許文献２：Ｃｏｕｃｈ  ＲＢ，Ｋａｓｅｌ  ＪＡ，Ｇｌｅｚｅｎ  ＷＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９８６；１５３：４３１−４０；
非特許文献３：ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９７；４６（ＲＲ−９）：１−２５；
非特許文献４：Ｗｏｏｄｓ  ＪＭ，Ｂｅｔｈｅｌｌ  ＲＣ，Ｃｏａｔｅｓ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９９３；３７：１４７３−９；
非特許文献５：Ｈａｙｄｅｎ  ＦＧ，Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ  ＡＤＭＥ，Ｔｒｅａｎｏｒ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９７；３３７：８７４−８０；
非特許文献６：Ｇｕｂａｒｅｖａ  ＬＶ，Ｋａｉｓｅｒ  Ｌ，Ｈａｙｄｅｎ  ＦＧ，Ｌａｎｃｅｔ  ２０００；３５５（９２０６）：８２７−３５；
非特許文献７：，Ｌｏｎｇ  ＪＫ，Ｍｏｓｓａｄ，Ｇｏｌｄｍａｎ  ＭＰ，Ｃｌｅｖｅ  ｃｌｉｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００；６７：９２−５；
非特許文献８：Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ  ＷＬ，Ｐｏｌｌａｃｋ  Ｄ，Ｇｒｕｎｅｒｔ  ＲＲ，Ｎ  Ｅｎｇｌｉ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９６９；２８１：５７９−８４；
非特許文献９：Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ  ＷＬ，Ｐｏｌｌａｃｋ  Ｄ，Ｇｒｕｎｅｒｔ  ＲＲ，Ｎ  Ｅｎｇｌｉ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９６９；２８１：５７９−８４；
非特許文献１０：Ｈｉｒａｋａｗａ  Ｔ，Ｒｏｋｕｔａｎ  Ｋ，Ｎｉｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｇｙ  １９９６；１１１：３４５−５７。
発明の開示
上記目的は、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有するウイルス感染予防・治療剤により達成される。
本発明の好ましい態様によれば、前記ウイルス感染予防・治療剤において、前記ウイルスがインフルエンザウイルスであることを特徴とする。
また、上記目的は、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する医薬を患者に有効量投与することを含むウイルス感染の予防・治療方法により達成される。
また、上記目的は、ウイルス感染予防・治療剤の製造のためのゲラニルゲラニルアセトンの使用により達成される。
また、上記目的は、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する抗ウイルス因子活性増強剤により達成される。
本発明の好ましい態様によれば、前記抗ウイルス因子活性増強剤において、抗ウイルス因子はＭｘＡ遺伝子であることを特徴とする。
さらに、上記目的は、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有するプロテインキナーゼ誘導剤により達成される。
本発明の好ましい態様によれば、前記プロテインキナーゼ誘導剤において、前記プロテインはインターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ活性化蛋白であることを特徴とする。
本発明によれば、ＧＧＡはウイルスに感染する前にあらかじめ投与されるとウイルス感染を予防する効果があり、感染後に投与されるとウイルス感染を治療する効果がある。
また、本発明によれば、ＧＧＡ投与は抗ウイルス遺伝子であるＭｘＡの発現を増加させ、抗ウイルス作用を有するインターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ活性化蛋白キナーゼのｍＲＮＡ発現も増加させる。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＧＧＡを投与することがインフルエンザウイルス感染予防・治療効果を有することを初めて見出してなされたものである。以下、本発明の好ましい実施態様を、本発明で行った実験を説明しながら、詳述する。
本発明で利用するＧＧＡは、一般名をテプレノンといい、胃潰瘍・胃炎治療薬として広く用いられおり、試薬、工業原料として入手することも可能であり、公知の合成法に従って合成することができる。ＧＧＡの化学名は、６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オンであり、その構造式は下記の通りである。
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ＧＧＡはその構造中に４カ所に二重結合を有しており、計８種類の幾何異性体が存在するが、本発明においては特に限定されず、いずれか１つの異性体でもよく、また２種以上の混合物であってもよい。これらの中でも好ましい化合物としては、（５Ｅ，９Ｅ，１３Ｅ）−６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オン及び（５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅ）−６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オンを挙げることができる。
本発明では、インビボの実験として、マウス感染モデルを用いてＧＧＡ投与による臨床的感染兆候等の改善傾向を検討する。具体的には、ＧＧＡ前処理の群と前処理のない群に分け、両群をインフルエンザウイルスに感染させた後、種々の挙動を詳細に評価する。
なお、本発明におけるウイルスは、インフルエンザウイルスを代表的なウイルスとして例示するが、これに限定されず、リノウイルス等のいわゆる感冒を引き起こすウイルスやヘルペスウイルス等の皮膚、粘膜に感染するウイルス等も含まれる。
インフルエンザウイルス感染後、マウスの体重、マウス肺内のウイルス複製、マウス肺内のウイルス核蛋白合成及びＨＳＰ７０発現の観点から、プラークアッセイ法、ウエスタンブロット法、ノーザンブロット法等の公知の手法を用いて、ＧＧＡ投与の効果を解析する。
前述の解析により、マウス体重減少の改善、マウス肺内のウイルス数の減少、マウス肺内のウイルス核蛋白の発現量の抑制、ＨＳＰ７０発現の増大は、前処理に利用したＧＧＡ濃度依存性を有する。つまり、本発明において、ＧＧＡを予め投与したマウス群では、ＧＧＡ投与量が多いほど、マウスの体重減少が改善され、肺内ウイルス増殖が認められず、その結果、事前にＧＧＡ投与することにより、ウイルス感染の予防が可能となる。
次に、本発明によるインビトロの実験として、ヒト肺胞上皮細胞を用いて、ＧＧＡ投与による抗ウイルス活性の有無を検討する。
前述のヒト肺胞上皮細胞としてはＡ５４９細胞を利用し、ＧＧＡ処理によるＨＳＰ誘導効果と、インフルエンザウイルス感染後の核蛋白等やＨＳＰの合成能、並びに抗ウイルス遺伝子の発現を評価する。
本発明によるＧＧＡ処理を行うと、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡの発現がＧＧＡ濃度に依存して誘導され、蛋白質レベルでもその合成能が上昇する。
インフルエンザウイルス感染後でも、ＧＧＡ処理によりＨＳＰ蛋白が強く発現されているため、インフルエンザ血球凝集素蛋白やマトリックス蛋白、非構造蛋白等の各種のウイルス蛋白合成能が抑制される。
さらに、本発明では、ＧＧＡ処理後のインフルエンザウイルス感染時の抗ウイルス遺伝子の発現への影響の検討から、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現の増強とともに、ＧＧＡ処理Ａ５４９細胞では抗ウイルス遺伝子であるＭｘＡの発現と、抗ウイルス作用を有するインターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ活性化蛋白キナーゼを活性化させる。そのため、本発明では、宿主細胞におけるウイルス感染に対する生体防御機能を増強している可能性を示唆され、ウイルス感染後にＧＧＡを投与すると、ウイルス感染を治療する効果が予想される。
ここで、ＧＧＡの投与量は、感染ウイルスの種類、症状、年齢、体重等により適宜選択することができるが、通常は成人１日あたり１５０ｍｇから３ｇであり、好ましくは２００ｍｇから２ｇ、さらに好ましくは２５０ｍｇから１．５ｇである。
ＧＧＡの投与方法は、特に限定されず、経口投与または非経口投与を適宜選択できるが、特に経口投与が好ましい。
経口投与のための剤型は、固体又は液体の剤型、具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が好ましい。ＧＧＡはすでに医薬品として広く用いられ、毒性が低く、重篤な副作用は知られておらずきわめて安全性の高い化合物であるため、そのまま粉末剤として経口投与してもよい。あるいは、製剤分野において常用される賦型剤（例えば、乳頭、白糖、デンプン、マンニトール等）、希釈剤等を含有した適当な剤型の医薬として投与してもよい。
さらに、必要に応じて、前記医薬は、ＧＧＡのほかに、酸化防止剤、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等）、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００等）、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含有した医薬として投与してもよい。
非経口投与のための剤型は、注射用製剤、点滴剤、外用剤、坐剤が好ましい。
［実施例］
以下、実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実験動物の取り扱いに関する実験手順は、大分医科大学の動物実験倫理規定委員会の承認を得て行われた。
ウイルス感染症、特に罹患率・死亡率ともに顕著なインフルエンザウイルス感染症に対するＧＧＡ作用を、インビボ及びインビトロによる実験で解析を行った。
ウイルスはインフルエンザＡウイルスであるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株（以下、「ＰＲ８」と称す。）を、マウスはＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）ＢＡＬＢ／ｃＮ、メスの６週齢（チャールズリバージャパン（株）製）を、細胞はヒト肺上皮由来のＡ５４９細胞を、使用した。
まず、前記マウスは４匹ずつ清潔な状態のもと、滅菌した食餌と水を自由摂取できる状態でケージにて飼育した。
マウスは、ランダムに以下の４つの処置群に分割し試験に共した；▲１▼ｃｏｎｔｒｏｌ群；ＰＲ８ウイルスを２ｘ１０５ＰＦＵ、経鼻的に感染、▲２▼１５０Ｇ−ＰＲ８群；１５０ｍｇ／ｋｇ  ＧＧＡ投与後ｃｏｎｔｒｏｌ群と同様に、同量のＰＲ８感染、▲３▼７５Ｇ−ＰＲ８群；７５ｍｇ／ｋｇ  ＧＧＡ投与後同様に、同量のＰＲ８感染、▲４▼１５Ｇ−ＰＲ８群；１５ｍｇ／ｋｇ  ＧＧＡ投与後同様に、同量のＰＲ８感染させた。前記▲１▼は対照群、▲２▼〜▲４▼は感染前のＧＧＡ投与群と称する。ＧＧＡ投与群においてはＧＧＡを経口的に１２時間おきに３週間投与した。
図１は、ＰＲ８感染による体重減少に及ぼすＧＧＡ効果の結果を示す図である。マウスＰＲ８感染モデルにおいて、ＧＧＡ投与による臨床的感染徴候の改善が、次にように認められた。
ｃｏｎｔｒｏｌ群では、感染後、３０％に達する体重減少が観測された。一方、７５Ｇ−ＰＲ８群以外のＧＧＡ投与群では、感染による体重減少はほとんど認められなかった。
図２は、本発明によるインフルエンザ感染後の各群のマウス肺内ウイルス複製に及ぼすＧＧＡ効果を示す図である。ここで、肺内ウイルスの定量は、ＭＤＣＫを用いたプラークアッセイ法にて行った。図２から分かるように、ｃｏｎｔｒｏｌ群では肺内のＰＲ８ウイルス量は初回感染ウイルス量の約１０３倍まで増殖した。一方、ＧＧＡ投与群では肺内ウイルス増殖はＧＧＡの投与量依存的に抑制され、１５０Ｇ−ＰＲ８群においては３日後、７５Ｇ−ＰＲ８群においては４日後にウイルスは完全に消失した。
図３は、本発明によるインフルエンザウイルス感染後の各群のマウス肺内のウイルス核蛋白（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ＮＰ」という）の合成に及ぼすＧＧＡ効果の結果を示す図である。各群のマウスの肺内におけるウイルスのＮＰ発現量は、ウエスタンブロット法により分析し、対照群であるｃｏｎｔｒｏｌ群に比較して、ＧＧＡ投与群では濃度依存性に抑制されることが判明した。なお、図３中に記載されたｐ．ｉ．ｄａｙｓとは、ＰＲ８感染後の日数を指す。
図４は、本発明による感染後の各群のマウス肺内のウイルスＮＰ合成に及ぼすＧＧＡの効果を、さらにＥＩＡ法にて詳細に定量した結果を示す図である。図４から明らかなように、ＧＧＡ未投与群である対照群と比較して、ＧＧＡ投与群ではＰＲ８感染後にウイルスＮＰ合成能が顕著に低下していることが分かる。
次に、ＧＧＡがマウス肺にＨＳＰ７０  ｍＲＮＡの発現を誘導させるか否かを確認した。
図５は、ＧＧＡ投与によるマウス肺におけるＨＳＰ７０発現の結果を示す図である。図５から明らかなように、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３週間ＧＧＡを投与すると（図５のＧＧＡ１５０とは、ＧＧＡを、３週間１２時間おきに１５０ｍｇ／ｋｇを投与したことを示す。）、肺にＨＳＰ７０の発現が投与量に依存して誘導されることが、ノーザンブロットにより同定された。つまり、ＨＳＰ７０の発現量は、ＧＧＡ処理により、ＧＧＡ処理なし（図５中の−に相当する）よりは顕著に多く、ＧＧＡ投与量が多いほどその発現量は増大する傾向にある。
図６は、感染後のマウス肺におけるＨＳＰ７０  ｍＲＮＡ発現の動態に及ぼすＧＧＡの影響をノーザンブロットにて検討した結果を示す図である。図６から、図５の示す結果と同様に、ＨＳＰ７０の発現量はＧＧＡ投与量に依存していることが分かる。なお、図６中のｐ．ｉ．ｄａｙとは、ＰＲ８による感染後の日数を意味する。
なお、図５及び図６は、グルタールアルデヒド二リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコントロールに使用し、ＧＧＡ投与によるマウス肺におけるＨＳＰ７０の発現の結果を示す図である。図５では、ビヒクルは各投与量と同量のα−トコフェロールを含む希釈剤を投与した。
図５及び図６の結果から、ＧＧＡ投与単独で、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡが濃度依存的に肺組織内で発現しており、感染後のｃｏｎｔｒｏｌ群に比較してＧＧＡ投与群は肺内ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡの発現が、図１及び図２に示す体重減少・ウイルス増殖の時期に一致して増加しており、症状改善時に一致した発現の増強が認められた。これは、ＨＳＰ７０の発現とインフルエンザ感染症状の抑制に強い相関関係があることを示唆するものである。
以上の説明は、インビボでの実験による解析であるが、以下は、インビトロにおいて検討を行った結果を説明する。
図７は、本発明にて行ったインビトロによる実験において、Ａ５４９細胞をＧＧＡ処理した結果を示す図である。即ち、図７に示す結果から、ＧＧＡは、ヒト肺胞上皮由来Ａ５４９細胞において、ＨＳＰ誘導効果を有することが判明した。なお、ＨＳＰ誘導の定量はノーザンブロット法により行った。
図７に示すように、インビボと同様にＧＡＰＤＨをコントロールとした場合、ＨＳＰ７０  ｍＲＮＡの発現が濃度及び時間に依存して誘導された。なお、図７中のαはα−トコフェロールを示す。
図８は、３５Ｓ−メチオニンを用いたパルスラベル法にて細胞内蛋白を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開した結果を示す図である。その結果から、ＧＧＡは約７０ｋＤの蛋白の発現を２４時間にわたり強く誘導し、蛋白レベルでも顕著に合成能を上昇させた（図８左を参照）。また、同サンプルをＨＳＰ７０抗体によるウエスタンブロットで解析すると、その蛋白はＨＳＰ７０と同定され（図８右を参照）、ＧＧＡ投与６時間後を発現のピークとして、ＨＳＰ７０の発現が観測された。
図９は、ＰＲ８感染時のＧＧＡによるＮＰ及びＨＳＰ７０の合成能への影響を調べた結果を示す図である。パルスラベル法により、ＧＧＡ処理なし（−）、ＧＧＡ処理有り（＋）のＡ５４９細胞でのＮＰ、ＨＳＰ７０の蛋白合成能を解析した。ＧＧＡ処理（−）では、ＮＰの合成が感染後２４時間にわたり著しく増強し、一方、ＧＧＡ処理（＋）では、ＨＳＰ７０合成能の増強が感染早期に認められ、その減衰に一致したＮＰの合成が１２時間後に開始した。しかしながら、その合成能はＧＧＡ処理（−）に比して抑制されていることが分かった。
また、図９から、対照に対してＰＲ８のＨＡ（インフルエンザ血球凝集素蛋白）、ＮＰ、Ｍ１（マトリックス蛋白）、ＮＳ１（非構造蛋白）などのウイルス蛋白の合成能が顕著に抑制されていることが明らかである。その抑制効果は、ＨＳＰ７０の発現時期と強く相関していた。
図１０は、図９にて用いたサンプルの蛋白量を、感染３、６、１２、２４時間後にてデンシトメトリーにより解析した結果を示す図である。図１０の結果から、ＰＲ８感染１２時間後まではＨＳＰ７０の発現が認められた。
図１１は、本発明によるＰＲ８感染１２時間後の細胞におけるＨＳＰ７０とＮＰの蛋白の蓄積をウエスタンブロットにより解析した結果を示す図である。その結果から、ウイルス未感染のｍｏｃｋではＮＰ合成が認められず、ＧＧＡ処理がＨＳＰ７０を誘導し、ＮＰの発現を感染１２時間後の阻害していることが確認され、ウイルス蛋白合成は、ＨＳＰ７０の合成により著明に抑制された。
次いで、ＧＧＡ処理によるＰＲ８感染時の抗ウイルス遺伝子の発現への影響を検討し、その結果を図１２及び図１３に示す。図１２から、ノーザンブロット法によりＡ５４９細胞に対するＧＧＡ処理はＰＲ８感染時にＨＳＰ  ｍＲＮＡ発現を増強し、それに伴い、図１２から抗ウイルス遺伝子（特にオルソミクソウイルス）であるＭｘＡ遺伝子の発現も増強することが確認された。なお、図１２中のＧＡＰＤＨは、前出の図５と同様に、コントロールとして使用したものである。
図１３は、抗ウイルス作用を持つインターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ活性化蛋白キナーゼ（以下、「ＰＫＲ」という。）のｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法にて定量した結果を示す。その結果から、ＧＧＡ処理によりＡ５４９細胞内のＰＫＲの発現が増加し、そのｍＲＮＡもアップレギュレートされたことが分かった。なお、本図中のβ−アクチンはコントロールとして使用したものである。
一般に、ウイルスが感染すると生体内において種々の遺伝子、抗ウイルス因子や酵素の発現が増強され又は抑制されるが、この中でＧＧＡがＭｘＡ遺伝子及びＰＫＲに作用していることは、ウイルス感染特にインフルエンザウイルス感染の予防治療に有効であることを、作用メカニズムの点から強く指示するものであり、同時にＧＧＡが抗ウイルス因子活性増強剤又は蛋白キナーゼ誘導剤であることを示すものである。
以上の結果から、ＧＧＡはインビボにおいてインフルエンザウイルスに対する増殖抑制作用を示し、体重減少という臨床症状を顕著に改善させることが明らかであり、その効果にはＧＧＡによる肺でのＨＳＰ７０の合成促進が深く関与していることが示唆された。
また、インビトロでは、ＧＧＡがＨＳＰ７０の発現を強力に誘導しており、その誘導時期に一致してインフルエンザウイルスの複製を阻害していることが分かった。さらに、ＧＧＡはウイルス感染症における宿主側の抗ウイルス遺伝子ＭｘＡ、ＰＫＲを活性化させており、宿主のウイルス感染に対する生体防御能を増強していることが分かり、ＧＧＡを投与することは、インフルエンザウイルスに対する予防・治療に効果的であることが判明した。
産業上の利用可能性
以上の説明から、ゲラニルゲラニルアセトンの新たな用途として、ウイルス感染予防・治療剤へ利用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明によるマウスＰＲ８感染モデルにおいて、ＧＧＡ投与による臨床的感染兆候の改善傾向を示す図である。ここで、本発明で用いたＢＡＬＣ／ｃマウスは、以下の４つの群に無作為に抽出された。▲１▼ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝３０）；経鼻的にＡ／ＰＲ／８／３４、２ｘ１０５ＰＦＵを投与、ＧＧＡ前処理群は、３週間、１２時間毎にＧＧＡを経口的に投与され、ＧＧＡ投与量により、▲２▼１５０ｍｇ／ｋｇ（１５０Ｇ−ＰＲ８群；ｎ＝３０）、▲３▼７５ｍｇ／ｋｇ（７５Ｇ−ＰＲ８群；ｎ＝３０）、▲４▼１５ｍｇ／ｋｇ（１５Ｇ−ＰＲ８群；ｎ＝３０）とし、３週間後同様にＰＲ８に感染させた。感染後、各々のマウスの体重は１、２、３、４、７、１０日後に測定した。
図２は、本発明によるインフルエンザウイルス感染後の各群のマウス肺内ウイルス複製に及ぼすＧＧＡ効果を示す図である。
図３は、本発明によるインフルエンザウイルス感染後の各群のマウス肺内のウイルス核蛋白合成に及ぼすＧＧＡ効果を示す図である。なお、図３中の１５０ｍｇ／ｋｇＧＧＡ、７５ｍｇ／ｋｇＧＧＡ、１５ｍｇ／ｋｇＧＧＡは、１５０Ｇ−ＰＲ８群、７５Ｇ−ＰＲ８群、１５Ｇ−ＰＲ８群を、それぞれ示す。
図４は、本発明によるＰＲ８感染後の各群のマウス肺内のウイルス核蛋白合成に及ぼすＧＧＡ効果を、ＥＩＡ法にて定量した結果を示す図である。
図５は、本発明によるＧＧＡ投与によるマウス肺におけるＨＳＰ７０発現の結果を示す図である。
図６は、本発明によるＰＲ８感染後のマウス肺におけるＨＳＰ７０ｍＲＮＡ発現の動態に及ぼすＧＧＡの影響を、ノーザンブロット法により評価した結果を示す図である。なお、図６中の１５０ｍｇ／ｋｇＧＧＡ、７５ｍｇ／ｋｇＧＧＡ、１５ｍｇ／ｋｇＧＧＡは、１５０Ｇ−ＰＲ８群、７５Ｇ−ＰＲ８群、１５Ｇ−ＰＲ８群を、それぞれ示す。
図７は、本発明によるヒト肺上皮由来Ａ５４９細胞におけるＧＧＡのＨＳＰ誘導効果を示す図である。
図８は、本発明において、３５Ｓ−メチオニンを用いたパルスラベル法にて、細胞内蛋白を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開した結果を示す図である。
図９は、本発明によるＰＲ８感染時にて、ＧＧＡによるＨＰ及びＨＳＰ７０の合成能への影響を検討した結果を示す図である。
図１０は、図９にて検討したサンプルの蛋白量を、感染後の各時間にてデンシトメトリーにより解析した結果を示す図である。
図１１は、本発明によるＰＲ８感染１２時間後の細胞におけるＨＳＰ７０と核蛋白ＮＰの蓄積をウエスタンブロットにより解析した結果を示す図である。
図１２は、本発明によるＧＧＡ処理によりＰＲ８感染時の抗ウイルス遺伝子の発現への影響を示す図である。
図１３は、本発明によるＧＧＡ処理によりＰＲ８感染時の抗ウイルス遺伝子の発現への影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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