(57)【要約】本発明は、ＤＡＰキナーゼ（Ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、以下、「ＤＡＰＫ」と称することがある）の結晶、該結晶のＸ線構造回折像より得られるＤＡＰＫの三次元構造座標、該三次元構造座標を含むコンピュータープログラム、該三次元構造を用いたＤＡＰＫをターゲットとする薬物のスクリーニング方法、該方法により得られるＤＡＰＫをターゲットとする薬物等に存する。さらに、本発明は、ＤＡＰＫを可溶化蛋白質として大量発現する方法に存する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＡＰキナーゼの結晶であって、三次元構造におけるＤＡＰキナーゼのＣ末端ドメインとＮ末端ドメインとの間の開き方が、そのクローズド状態の場合と比較して約７．５度開いている結晶。
【請求項２】
結晶が斜方晶系の空間群対象Ｐ２１２１２１に属する請求項１記載の結晶。
【請求項３】
結晶の単位格子が、ａ＝５０±１０Å、ｂ＝７９±１０Å、ｃ＝１１３±１０Åである請求項２記載の結晶。
【請求項４】
ＤＡＰキナーゼの結晶であって、結晶が斜方晶系の空間群対象Ｐ２１２１２１に属し、結晶の単位格子が、ａ＝４７±１０Å、ｂ＝６３±１０Å、ｃ＝９０±１０Åである結晶。
【請求項５】
ＤＡＰキナーゼの結晶であって、ＤＡＰキナーゼがＡＴＰ類似化合物との複合体である結晶。
【請求項６】
ＡＴＰ類似化合物が、ＡＤＰまたはＡＤＰＭｇである請求項５記載の結晶。
【請求項７】
ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項５または６のいずれかに記載の結晶。
【請求項８】
ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１３９，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項５または６のいずれかに記載の結晶。
【請求項９】
ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項５または６のいずれかに記載の結晶。
【請求項１０】
ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４，Ａｌａ１６５及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項５または６のいずれかに記載の結晶。
【請求項１１】
ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項５または６のいずれかに記載の結晶。
【請求項１２】
ＤＡＰキナーゼの結晶であって、ＤＡＰキナーゼがＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物との複合体である結晶。
【請求項１３】
ＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物が、下記式（１）または（２）で表わされる化合物である請求項１２記載の結晶。
2003083101.tif 000694
【請求項１４】
ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項１２または１３のいずれかに記載の結晶。
【請求項１５】
ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項１２または１３のいずれかに記載の結晶。
【請求項１６】
ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１０３，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項１２または１３のいずれかに記載の結晶。
【請求項１７】
ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ７９，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ａｓｐ１０３，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ａｒｇ１５０，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項１２または１３のいずれかに記載の結晶。
【請求項１８】
ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している請求項１２または１３のいずれかに記載の結晶。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の結晶のＸ線構造回折像より得られるＤＡＰキナーゼの三次元構造座標。
【請求項２０】
請求項１から３及び１２から１８のいずれかに記載の結晶のＸ線構造回折像より得られるＤＡＰキナーゼの三次元構造座標。
【請求項２１】
三次元構造座標が表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７または表８のいずれかで示される請求項１９記載の三次元構造座標。
【請求項２２】
三次元構造座標が表１、表５、表６、表７または表８のいずれかで示される請求項２０記載の三次元構造座標。
【請求項２３】
請求項１９から２２のいずれかに記載の三次元構造について、各原子の相対的な配置を変化させずに、三次元空間内で数学的な移動操作を行った結果として得られる三次元構造座標。
【請求項２４】
三次元構造座標が未知の蛋白質について、請求項１９から２３のいずれかに記載の三次元構造を元に、蛋白質の三次元構造構築方法により求めたものである蛋白質の三次元構造座標。
【請求項２５】
三次元構造構築方法が、分子置換法またはホモロジーモデリングである請求項２４記載の三次元構造座標。
【請求項２６】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標の全部または一部を含む座標が記載されたコンピュータープログラム。
【請求項２７】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標及びＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標を用いることにより、ＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物をスクリーニングする方法。
【請求項２８】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用に基づいてスクリーニングする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１３９，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４，Ａｌａ１６５及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１０３，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ７９，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ａｓｐ１０３，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ａｒｇ１５０，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１９から２５のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
ＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物が、ＤＡＰキナーゼの活性を阻害する薬物である請求項２７から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
請求項２７から３８のいずれかに記載の方法によりスクリーニングして得られるＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物。
【請求項４０】
薬物が、細胞死を伴う疾患の予防及び／または治療に用いる薬物である請求項３９記載の薬物。
【請求項４１】
細胞死を伴う疾患が、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン舞踏病から選ばれる請求項４０に記載の薬物。
【請求項４２】
請求項３９から４１のいずれかに記載の薬物を化学合成方法により製造する工程及び薬学的に許容され得る担体を配合する工程を含むＤＡＰキナーゼをターゲットとする医薬品組成物の製造方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法により得られるＤＡＰキナーゼをターゲットとする医薬品組成物。
【請求項４４】
ＤＡＰキナーゼのキナーゼドメインを含む部分領域を大腸菌で可溶性蛋白質として大量発現させる工程を含むＤＡＰキナーゼの製造方法。
【請求項４５】
キナーゼドメインがポリヒスチジンタグを付与していない請求項４４記載の製造方法。
【請求項４６】
ＤＡＰキナーゼのキナーゼドメインを含む部分領域を大腸菌で可溶性蛋白質として大量発現させる工程を含むＤＡＰキナーゼの結晶の製造方法。
【請求項４７】
キナーゼドメインがポリヒスチジンタグを付与していない請求項４６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＤＡＰキナーゼ（Ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、以下、「ＤＡＰＫ」と称することがある）の結晶、該結晶のＸ線構造回折像より得られるＤＡＰＫの三次元構造座標、該三次元構造座標を含むコンピュータープログラム、該三次元構造を用いたＤＡＰＫをターゲットとする薬物のスクリーニング方法、該方法により得られるＤＡＰＫをターゲットとする薬物等に存する。さらに、本発明は、ＤＡＰＫを可溶化蛋白質として大量発現する方法に存する。
背景技術
ＤＡＰＫは、アポトーシス、ガン抑制に関連するプロテインキナーゼとして知られている。Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８  ８９９−９０７（２００１）（非特許文献１）には、ＤＡＰＫのＸ線結晶構造が記載されているが、ここで記載されているＤＡＰＫの結晶は、アポ・フォーム（Ａｐｏ  Ｆｏｒｍ）でありながら、クローズド（Ｃｌｏｓｅｄ）状態である結晶であり、また、そのＸ線構造回折による三次元構造座標に関しては記載されていない。
近年、タンパク質を薬物のターゲットとして使用してスクリーニングする場合には、Ｘ線構造回折によりその酵素の三次元構造座標を求める手段がさかんに行われている。従って、ＤＡＰＫの場合も、それをターゲットとする薬物を得るために、その三次元構造座標を得ることが求められている。
一般に、Ｘ線構造解析のためのタンパク質結晶の取得には高純度の精製タンパク質標品が必要であり、その為に大腸菌などの発現系を用いて大量に目的のタンパク質を発現させ、それを出発材料にして目的タンパク質を精製する手段が取られている。
その場合、不溶性で発現させて高純度に精製した後、タンパク質のリフォールディングを行って可溶性タンパク質として再生する方法もあるが、この場合、リフォールディングの条件検討に多大の時間と労力が必要なほか、活性のある正しいコンフォメーションに再生できるか必ずしも保証されないという問題がある。そこで、酵素タンパク質などを発現させる場合には、活性の確認が容易な可溶性タンパク質の形で発現させるのが望ましいと考えられている。
しかしながら、一般に、大腸菌でヒトなどの哺乳類由来のタンパク質を発現させる場合、必ずしも発現量が多くなく、しかも可溶性タンパク質として発現できないという問題点がある。この問題点の原因の一つとして、目的タンパク質のコード配列内に大腸菌では使用頻度が低いアミノ酸のコドンが使用されているために、発現量が制限される場合が報告されている（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２、２５０４−２５１０、１９９０（非特許文献２））。この場合、使用頻度が低いアミノ酸のコドンを使用頻度が高い別のコドンになるようにコード領域内の配列を変換するか、または低使用頻度のアミノ酸コドンに対応するｔＲＮＡの遺伝子を大腸菌に追加導入する方法が知られていた（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８、５０３１−５０３６（非特許文献３）が、必ずしも一般化された技術ではなかった。
一方で、完全長のタンパク質ではなくその一部を発現させる場合に、発現させる領域を種々検討しないと可溶性タンパク質として発現しないという問題点があった。
【非特許文献１】  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８  ８９９−９０７（２００１）
【非特許文献２】  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２、２５０４−２５１０、１９９０
【非特許文献３】  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８、５０３１−５０３６
本発明は、ＤＡＰＫを大腸菌で可溶性タンパク質として大量に発現させ、高純度に精製し、得られた可溶性タンパク質標品を用いて効率良くＸ線結晶構造解析に使用可能なＤＡＰＫ結晶を製造し、さらには、ＤＡＰＫのＸ線結晶回折像を取得し、最終的には、ＤＡＰＫの三次元構造を取得してそれを用いてＤＡＰＫをターゲットとする薬物を得ようとすることを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ＤＡＰＫのうち、キナーゼドメインを含む部分領域を大腸菌で可溶性タンパク質として大量に発現させ、高純度に精製することを可能とした。さらには、得られた可溶性タンパク質標品を用いて効率良くＸ線結晶構造解析の目的に使用可能なタンパク質の結晶を得ることができ、それを用いてＸ線結晶構造解折像を取得し、最終的にＤＡＰＫタンパク質のキナーゼドメインの３次元座標を取得するに至り、本発明を完成させた。
なお、上記で挙げたＮａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８  ８９９−９０７（２００１）は、本発明を完成させた後で発行されたと考えられるが、本文献には、ＤＡＰＫのＸ線構造回折による三次元構造座標に関しては記載されていない。また、本文献で発現させているＤＡＰＫのキナーゼドメインはＮ末から２８６アミノ酸残基の領域のＣ末側に精製のためのポリヒスチジンタグを付与したものである。これに対して本発明のＤＡＰＫタンパク質の発現領域はＮ末から２８０アミノ酸残基を、余分なタグ配列を付与しない形で、しかも可溶性タンパク質として大量調製するものである。
即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）．ＤＡＰキナーゼの結晶であって、三次元構造におけるＤＡＰキナーゼのＣ末端ドメインとＮ末端ドメインとの間の開き方が、そのクローズド状態の場合と比較して約７．５度開いている結晶。
（２）．結晶が斜方晶系の空間群対象Ｐ２１２１２１に属する（１）記載の結晶。
（３）．結晶の単位格子が、ａ＝５０±１０Å、ｂ＝７９±１０Å、ｃ＝１１３±１０Åである（２）記載の結晶。
（４）．ＤＡＰキナーゼの結晶であって、結晶が斜方晶系の空間群対象Ｐ２１２１２１に属し、結晶の単位格子が、ａ＝４７±１０Å、ｂ＝６３±１０Å、ｃ＝９０±１０Åである結晶。
（５）．ＤＡＰキナーゼの結晶であって、ＤＡＰキナーゼがＡＴＰ類似化合物との複合体である結晶。
（６）．ＡＴＰ類似化合物が、ＡＤＰまたはＡＤＰＭｇである（５）記載の結晶。
（７）．ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（５）または（６）のいずれかに記載の結晶。
（８）．ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１３９，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（５）または（６）のいずれかに記載の結晶。
（９）．ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（５）または（６）のいずれかに記載の結晶。
（１０）．ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４，Ａｌａ１６５及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（５）または（６）のいずれかに記載の結晶。
（１１）．ＤＡＰキナーゼとＡＴＰ類似化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（５）または（６）のいずれかに記載の結晶。
（１２）  ＤＡＰキナーゼの結晶であって、ＤＡＰキナーゼがＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物との複合体である結晶。
（１３）  ＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物が、下記式（１）または（２）で表わされる化合物である（１２）記載の結晶。
2003083101.tif 000002
（１４）．ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（１２）または（１３）のいずれかに記載の結晶。
（１５）．ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（１２）または（１３）のいずれかに記載の結晶。
（１６）  ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１０３，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（１２）または（１３）のいずれかに記載の結晶。
（１７）．ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ７９，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ａｓｐ１０３，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ａｒｇ１５０，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（１２）または（１３）のいずれかに記載の結晶。
（１８）．ＤＡＰキナーゼとＤＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物とが、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列においてＬｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基と相互作用して複合体を形成している（１２）または（１３）のいずれかに記載の結晶。
（１９）．（１）から（１８）のいずれかに記載の結晶のＸ線構造回折像より得られるＤＡＰキナーゼの三次元構造座標。
（２０）．（１）から（３）及び（１２）から（１８）のいずれかに記載の結晶のＸ線構造回折像より得られるＤＡＰキナーゼの三次元構造座標。
（２１）．三次元構造座標が表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７または表８のいずれかで示される（１９）記載の三次元構造座標。
（２２）  三次元構造座標が表１、表５、表６、表７または表８のいずれかで示される（２０）の三次元構造座標。
（２３）  （１９）から（２２）のいずれかに記載の三次元構造について、各原子の相対的な配置を変化させずに、三次元空間内で数学的な移動操作を行った結果として得られる三次元構造座標。
（２４）．三次元構造座標が未知の蛋白質について、（１９）から（２３）のいずれかに記載の三次元構造を元に、蛋白質の三次元構造構築方法により求めたものである蛋白質の三次元構造座標。
（２５）．三次元構造構築方法が、分子置換法またはホモロジーモデリングである（２４）記載の三次元構造座標。
（２６）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標の全部または一部を含む座標が記載されたコンピュータープログラム。
（２７）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標及びＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標を用いることにより、ＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物をスクリーニングする方法。
（２８）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用に基づいてスクリーニングする（２７）に記載の方法。
（２９）  （１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３０）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１３９，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３１）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３２）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４，Ａｌａ１６５及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３３）  （１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３４）  （１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３５）  （１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１０３，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３６）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ７９，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ａｓｐ１０３，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ａｒｇ１５０，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３７）．（１９）から（２５）のいずれかに記載の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用が、配列表の配列番号１０、１１または１２のいずれかに記載のＤＡＰキナーゼのアミノ酸配列において、Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１及びその近傍のアミノ酸残基のすべてまたは一部のアミノ酸残基の三次元構造座標とＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物の候補となる分子の三次元構造座標との相互作用である（２８）に記載の方法。
（３８）．ＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物が、ＤＡＰキナーゼの活性を阻害する薬物である（２７）から（３７）のいずれかに記載の方法。
（３９）．（２７）から（３８）のいずれかに記載の方法によりスクリーニングして得られるＤＡＰキナーゼをターゲットとする薬物。
（４０）．薬物が、細胞死を伴う疾患の予防及び／または治療に用いる薬物である（３９）記載の薬物。
（４１）．細胞死を伴う疾患が、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン舞踏病から選ばれる（４０）に記載の薬物。
（４２）．（３９）から（４１）のいずれかに記載の薬物を化学合成方法により製造する工程及び薬学的に許容され得る担体を配合する工程を含むＤＡＰキナーゼをターゲットとする医薬品組成物の製造方法。
（４３）．（４２）に記載の方法により得られるＤＡＰキナーゼをターゲットとする医薬品組成物。
（４４）．ＤＡＰキナーゼのキナーゼドメインを含む部分領域を大腸菌で可溶性蛋白質として大量発現させる工程を含むＤＡＰキナーゼの製造方法。
（４５）．キナーゼドメインがポリヒスチジンタグを付与していない（４４）記載の製造方法。
（４６）．ＤＡＰキナーゼのキナーゼドメインを含む部分領域を大腸菌で可溶性蛋白質として大量発現させる工程を含むＤＡＰキナーゼの結晶の製造方法。
（４７）．キナーゼドメインがポリヒスチジンタグを付与していない（４６）記載の製造方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳細に説明する。
以下の実施例に示すように、本発明のＤＡＰＫタンパク質の発現領域はＮ末から２８０アミノ酸残基を、余分なタグ配列を付与しない形で、しかも可溶性タンパク質として大量調製する点に特徴を有する。大腸菌における発現は、以下の実施例に示した方法のほか、公知の方法を種々組み合わせることにより可能である。また、このようにして発現させたＤＡＰＫタンパク質は、以下の実施例で示すような種々の方法を組み合わせることにより精製可能である。
ＤＡＰＫ結晶化並びにＤＡＰＫと、ＡＴＰ類似化合物及びＤＡＰＫ阻害活性を有する化合物との複合体の結晶化は、バッチ法、透析法、蒸気拡散法などの結晶化方法を用いることができる。また、蛋白質濃度、塩濃度、水素イオン濃度、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子の決定が必要である。
なお、本発明において、ＡＴＰ類似化合物とは、ＡＴＰと共通した化学構造上の特徴を有し、その特徴的化学構造を用いてＤＡＰＫのＡＴＰ結合部位と相互作用する化合物を意味する。更に詳述すれば、ＡＴＰのγリン酸構造を除く大半の部分構造、例えば、塩基、糖、α及びβリン酸等が、ＡＤＰ及びＡＤＰＭｇ等にも共通して存在している。さらに、後述する結晶構造解析から、ＡＤＰまたはＡＤＰＭｇの共通部分構造は、ＤＡＰＫの同一部分に同様の相互作用によって結合していることが確認されている。従って、ＡＤＰ及びＡＤＰＭｇ等は、すべてＡＴＰ類似化合物に含まれるものとする。
また、本発明において、ＤＡＰＫ阻害活性を有する化合物とは、例えば、後述の実施例に示すような方法で、基質にＭｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎをもとに作製した人工基質Ｔｒｘ−２ＭＬＣを用いた実験を行なうことによってその阻害活性を有することを確認した化合物である。その具体例としては、前述の式（１）及び式（２）で表わされるような化合物が挙げられる。
上記のようにして得られたＤＡＰＫの結晶並びにＤＡＰＫと、ＡＴＰ類似化合物及びＤＡＰＫ阻害活性を有する化合物との複合体の結晶の構造を、Ｘ線結晶構造回折により解析することにより、それぞれの三次元構造座標を得ることが可能である。
本発明においては、ＤＡＰＫの結晶のアポ・フォーム（Ａｐｏ  ｆｏｒｍ）として、以下の２種類の結晶が得られる。
結晶形Ｉ
・三次元構造におけるＤＡＰＫのＣ末端ドメインとＮ末端ドメインとの間の開き方が、そのクローズド（ｃｌｏｓｅｄ）状態の場合と比較して約７．５度開いている。
・結晶が斜方晶系の空間群対象Ｐ２１２１２１に属し、結晶の単位格子が、ａ＝５０±１０Å、ｂ＝７９±１０Å、ｃ＝１１３±１０Åである。
結晶形ＩＩ
・アポ・フォームでありながら、クローズド状態である。結晶が斜方晶系の空間群対象Ｐ２１２１２１に属し、結晶の単位格子が、ａ＝４７±１０Å、ｂ＝６３±１０Å、ｃ＝９０±１０Åである。
なお、本発明において好ましいのは結晶形Ｉである。
また、ＤＡＰＫの結晶の三次元構造座標を後述の表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７及び表８に示す。表１、表５、表６、表７及び表８は、結晶形Ｉの三次元構造座標を示し、表２、表３及び表４は、結晶形ＩＩの三次元構造座標を示す。
なお、各表は、一般的に使用されている蛋白質の三次元構造座標の表記方法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って記述したものである。各表の１行目以降、最終行を除いて、各原子の三次元座標を記述している。１列目のＡＴＯＭはこの行が原子座標の行であることを示し、２列目はその原子の順番を、３列目はアミノ酸残基における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基を、５列目は分子の種類を（同一の種類は一本のポリペプチド鎖であることを示す）、６列目は配列表の配列番号７、８及び９に対応したアミノ酸の番号を、７、８、９列目はその原子の座標（ａ軸、ｂ軸、ｃ軸方向の順番でÅ単位）を、１０列目は、その原子の占有率を（但し、１．００のときは＊で示す）、１１列目はその原子の温度因子を示している。最終行は、この表の終わりの行であることを示している。
ここで、蛋白質の三次元構造座標とは、蛋白質を構成する各原子の空間的な位置関係を示す値であって、三次元空間上で立体構造を記述するものである。各原子の座標とは、空間上のある点を原点とする互いに垂直な二方向の相対的な距離であり、蛋白質中に存在する水素原子を除く原子一つあたりに３個の数字からなるベクトル量である。
上記した本発明の結晶構造座標と実質的に一致するものは本発明の範囲である。ここで、「実質的に一致する」とは、該構造の主要部分、具体的にはαヘリックスやβシート構造といった二次構造を形成している部分や、温度因子が他の部分に比べ低い値となっている部分において、対応する部分の主鎖またはＣα炭素の部分の２乗平均平方根誤差がおよそ２Å以下である構造を指す。また、各配列の開始部位及び終了部位も必ずしも厳密に規定されたものでなく、Ｎ末端及び／またはＣ末端部分に別の蛋白質が結合しているもの、Ｎ末端及び／またはＣ末端に１個または複数個のアミノ酸残基が付加したものなど、ＤＡＰＫの活性について実質的な変化をもたらさないものについても本発明の範囲に含まれる。
上記で得られた三次元構造座標より、ＤＡＰＫと、ＡＴＰ類似化合物及びＤＡＰＫ阻害活性を有する化合物との相互作用領域、すなわち、ＤＡＰＫのリガンド認識部位を明らかとすることができる。リガンドとして、以下の実施例で用いたＡＤＰ、ＡＤＰＭｇ、上記式（１）で表わされる化合物及び上記式（２）で表わされる化合物を考慮し、リガンドからの距離としては、好ましくは５Å、さらに好ましくは８Å程度が適当である。
ＡＤＰより５Å以内にある残基：
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１
ＡＤＰより８Å以内にある残基：
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１３９，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４
ＡＤＰＭｇより５Å以内にある残基：
Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４
ＡＤＰＭｇより８Å以内にある残基：
Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４，Ａｌａ１６５
式（１）で表わされる化合物より５Å以内にある残基：
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１
式（１）で表わされる化合物より８Å以内にある残基：
Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１０３，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３
式（２）で表わされる化合物より５Å以内にある残基：
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１
式（２）で表わされる化合物より８Å以内にある残基：
Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ７９，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ａｓｐ１０３，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ａｒｇ１５０，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２
なお、上記をもとに、いずれの化合物もが共通に利用しているＤＡＰＫリガンド認識部位を明らかにすることができ、以下の１３残基がそれにあたる。
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１
これらは、各化合物の平面構造的特長部分及び水素結合の観点（後述の実施例に記載の水素結合）から、ＡＤＰ（Ｍｇ）のアデニン環部分から５Å以内にある残基群であって、かつ、上記式（１）で表される化合物からも、上記式（２）で表される化合物からも５Å以内にある残基群を示している。
また、上記で得られた三次元構造座標より、ＤＡＰＫと、ＡＴＰ類似化合物及びＤＡＰＫ阻害作用を有する化合物との分子間相互作用に関与する原子群を明らかにすることができる。後述の実施例に示すように、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用に関与する原子群や、水素結合を明らかにすることができる。
なお、後述の表１から表８に示す構造座標は、結晶内における単位格子の原点を三次元空間における原点として表記している。本発明の構造座標をコンピューターによる計算に用いる場合などにおいて、各原子の相対的な配置を変化させずに、三次元空間内で並進、回転、対称などの数学的な移動操作を施した結果として得られる新たな構造座標も本発明の三次元構造座標の範囲である。
本発明のＤＡＰＫと、ＡＴＰ類似化合物及びＤＡＰＫ阻害活性を有する化合物との複合体の三次元構造座標は、ＤＡＰＫと有意な相同性を有するアミノ酸配列を持つ他の蛋白質から得られた結晶等のＸ線結晶構造解析に用いることができる。すなわち、Ｘ線構造解析の手法のひとつとして一般的に使用されている分子置換法（例えば、Ｊ．ドレント著、竹中ら訳、蛋白質のＸ線結晶解析法、シュプリンガー・フェアラーク東京、２０４−２２４（１９９８））において、本発明のＤＡＰＫとＡＴＰ類似化合物との複合体の三次元構造座標のすべてまたはその一部を使用することで、構造座標が未知の上記蛋白質の結晶においても、その構造座標を決定する際に、重原子同型置換法を用いることなく、はるかに迅速にその結晶のＸ線回折像より得られる構造因子からその構造座標を決定することが可能である。
また、本発明のＤＡＰＫの三次元構造座標を用いて、異種のＤＡＰＫまたはアミノ酸配列が有意に相同である他の蛋白質の三次元構造座標をホモロジーモデリング（中村春木、中井謙太、バイオテクノロジーのためのコンピューター入門、コロナ社、１８６−２０４（１９９５））により推定することができる。ホモロジーモデリングを行う際には、ホモロジーモデリングに用いるプログラムが動作するように調整されているコンピューターを用いる。該プログラムは、例えば、ＨＯＭＯＬＯＧＹ、ＭＯＤＥＬＥＲ（モレキュラーシミュレーション社）、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２４，２７４−２７９（１９９６））などが挙げられるが、その他のプログラムを用いることができる。
上記で得られたＤＡＰＫの三次元構造座標は、コンピューターが利用可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することによりＤＡＰＫの三次元構造座標データベースまたは記録媒体が構築できる。本発明において、データベースとは、上記構造座標を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピュータシステムをも意味する。
また、本発明においては、上記で得られた構造座標のすべてまたは一部を使用して、薬物分子設計を行うことができる適当なプログラム（例えば、モレキュラーシミュレーション社のＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ等）が動作するコンピューターにより、ＤＡＰＫに作用する薬物分子を同定、検索、評価または設計する等のＤＡＰＫをターゲットとする薬物候補分子のスクリーニングを行うことが可能である。ＤＡＰＫに作用する薬物候補分子の同定、検索、評価または設計は、本発明のＤＡＰＫの三次元構造座標と薬物分子の三次元構造座標との相互作用の有無やその程度に基いて行われる。
なお、本発明の結晶形Ｉについては，多少かさ高い阻害剤デザインに有効と考えられる。実際，スタウロスポリン（上記式（１）で表わされる化合物）が結合することで、ＤＡＰＫのＣ末端ドメインとＮ末端ドメインとの間の開き方が、アポ・フォームの方がＡＴＰ結合型より開くと報告がされている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，７９６−８０１（１９９７））。さらに、後述の実施例において実際にＤＡＰＫ阻害活性を有する化合物が結晶形Ｉに結合していたことが証明されたため、結晶形Ｉの構造がＤＡＰＫ阻害剤の設計、デザインに有効であることが明らかとなった。この知見は本発明において初めて得られたことである。また、この知見により、ＤＡＰＫ阻害剤とＤＡＰＫとが相互作用しているアミノ酸残基も明らかとなった。すなわち、ＤＡＰＫ阻害剤の設計、デザインに有効な情報は本発明において初めて明らかにされた点である。
また、一連の結晶構造解析により複数の構造水が観測されているが，アポ・フォーム（後述の実施例で示すｄｋ０３，ｄｋ０４；結晶形ＩＩ）の構造とＡＴＰ結合型の構造を重ね合わせる（ｂｅｓｔｆｉｔ）ことにより，ＡＴＰ結合部位内における保存された水分子の存在を明らかにすることができる（２分子ある）。このような水分子はアポ・フォーム、ＡＴＰ結合型のいずれのフォームにおいても見られることから、ＤＡＰＫの構造維持，機能発現において特に重要な水分子と考えられ、これら２水分子結合領域の相互作用を利用した，薬物候補分子のデザインが考えられる（水分子除去による結合エネルギー強化）。
本発明でいうＤＡＰＫをターゲットとする薬物とは、ＤＡＰＫに作用して何らかの薬理活性を生じるものをいう。すなわち、ＤＡＰＫアンタゴニスト、ＤＡＰＫアゴニスト等をいう。本発明においてより好ましいのは、ＤＡＰＫアンタゴニストである。
ＤＡＰＫアンタゴニストの場合、対象とする疾患は、細胞死を伴う疾患であり、例えば、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病が挙げられ、これらの予防／治療のために用いられる。
本発明でいう薬物候補分子とは、合成化合物、天然化合物のいずれでも良く、また、高分子化合物、低分子化合物のいずれでも良い。
上記のようにしてスクリーニングされた薬物候補分子は、一旦構造が決定された後は、各々適した方法により化学合成することが可能である。その後、薬学的に許容される担体を配合することによって、ＤＡＰＫをターゲットとする医薬品組成物を得ることが可能である。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１  ＤＡＰＫの調製
（１）．ＰＣＲ法によるＤＡＰＫ遺伝子の部分ＤＮＡ断片の取得
鋳型となるＤＡＰＫ遺伝子は動物細胞用の発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３に完全長のｃＤＮＡが挿入されたＤＡＰＫ／ｐｃＤＮＡ３（ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，９９８−１００８，１９９７）を用いた。
ＰＣＲはＭＪリサーチ社のＭＪ１００を使用して、使用説明書に基づき、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を使って行った。すなわち、基質ＤＮＡ  ０．５μｌ（１０ｎｇ相当量）、１０培濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］７．５μｌ、２．５ｍＭ  ４ｄＮＴＰ  ６μｌ、４０μＭプライマー各０．４μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．４μｌを加えて７５μｌの系とした。＋鎖ＤＮＡプライマーとして配列表の配列番号１のプライマーを用い、これと組み合わせる−鎖ＤＮＡプライマーとしては、配列表の配列番号２の配列、配列表の配列番号３の配列、配列表の配列番号４の配列の３種類をそれぞれ用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの反応は９５℃、１分間の前処理後、９５℃３０秒間（変性ステップ）、５６℃１分間（アニーリングステップ）、７２℃２分間（伸長ステップ）のインキュベーションを１８サイクル行った。最後に７２℃で７分間のインキュベーションを行い反応を終了した。
このようにして得られた３種類の反応液のうち、それぞれ１６μｌずつを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、特異的に増幅されたそれぞれ約８５０ｂｐ、約９９０ｂｐ、約１０１０ｂｐのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラグメントを回収し、エタノール沈澱を行った。ＤＮＡ沈澱を２５μｌ滅菌脱イオン水に溶解し、うち０．２μｌを用いて精製ＤＮＡ断片を宝酒造社のｐＴ７−Ｂｌｕｅベクターを用いてＴＡクローニング法によりクローン化した。
得られたクローンからプラスミドＤＮＡを常法により調製し、アプライドバイオシステムズ製蛍光シークエンサー３７７を用いて配列を決定した。シークエンスプライマーとして配列表の配列番号３及び配列表の配列番号４の２種の合成プライマーを使用し、該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。この結果、それぞれ配列表の配列番号７、８、９、１０、１１、１２に示すＰＣＲフラグメントの塩基配列を含むプラスミドクローン、ｐＴＤＫ１、ｐＴＤＫ２、およびｐＴＤＫ３を得た。
（２）．ＤＡＰＫのキナーゼドメインのタンパク質発現プラスミドの構築と形質転換体の取得
上記（１）で調製したそれぞれ約８５０ｂｐ、約９９０ｂｐ、約１０１０ｂｐのＰＣＲ断片を含むプラスミド、ｐＴＤＫ１、ｐＴＤＫ２、ｐＴＤＫ３のＤＮＡ標品各２μｌ（０．５μｇ相当量）に１０倍濃度制限酵素緩衝液［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ］２μｌ、滅菌脱イオン水１５μｌ、制限酵素ＮｄｅＩ（東洋紡績社製）０．５μｌ（８ユニット）、ＳａｌＩ（東洋紡績社製）０．５μｌ（８ユニット）を加え３７℃で３時間反応させた後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、それぞれ約８５０ｂｐ、約９９０ｂｐ、約１０１０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラグメントを回収し、エタノール沈澱を行った。
ＤＮＡ沈澱を２５μｌ滅菌脱イオン水に溶解し、うち０．２μｌを用いて、ｐＥＴ３１プラスミドベクター、およびｐＥＴ２８プラスミドベクター（いずれもＮｏｖａｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイト内にあるＮｄｅＩ−ＳａｌＩサイトに組み込んだ。（この時ライゲーションに用いたベクターＤＮＡは、次の様に用意されたものを１０ｎｇ使用した。即ち、ｐＥＴ３１のＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ（東洋紡績社製）およびＳａｌＩ（東洋紡績社製）で切断し、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈澱させた後、さらにアルカリフォスタファーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）で５′末端を脱リン酸化して［モレキュラークローニング、コールドスプリングハーバーラボラトリー、１９８２年］、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈澱させた。）このようにしてＤＡＰＫのキナーゼドメインのうち、ＤＡＰＫのＮ末から２８０アミノ酸残基を含むタンパク質（以下ＤＫ１タンパク質と略す）の発現ベクター、ｐＥＤＫ１３１およびｐＥＤＫ１２８、ＤＡＰＫのＮ末から３１０アミノ酸残基を含むタンパク質（以下ＤＫ２タンパク質と略す）の発現ベクター、ｐＥＤＫ２３１およびｐＥＤＫ２２８、ＤＡＰＫのＮ末から３３３アミノ酸残基を含むタンパク質（以下ＤＫ３タンパク質と略す）の発現ベクター、ｐＥＤＫ３３１およびｐＥＤＫ３２８をそれぞれ得た。
発現ベクターを有する形質転換体からプラスミドＤＮＡを常法に従い調製し、このプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９、１１３−１３０（１９８６））を形質転換し、形質転換体を得た。さらにこの形質転換体に大腸菌のアルギニンのｔＲＮＡ遺伝子、ａｒｇＵの発現ベクター、ｐＡＡｒｇＵ３を導入し、アルギニンのｔＲＮＡを共発現する形質転換体を得た。
（３）．形質転換体を用いた大腸菌でのＤＫ１、ＤＫ２、ＤＫ３タンパク質の生産
（２）で得られたｐＥＤＫ１３１、ｐＥＤＫ１２８、ｐＥＤＫ２３１、ｐＥＤＫ２２８、ｐＥＤＫ３３１、ｐＥＤＫ３２８をそれぞれ含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換体を３ｍｌのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン含有）培地に接種し３０℃で一昼夜培養した後、５０ｍｌのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン含有）培地に植え継いだ後、３０℃で１時間培養し、プロモーターの転写誘導剤であるＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、さらに３０℃で６時間培養した。
培養液から遠心分離（５００ｒｐｍ、５分）により菌体を集め、ＰＢＳで１回洗浄した後に５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷冷したのちに氷上でソニケーターで破砕（３００Ｗ、２分間、パルス等間隔）後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分）により沈殿画分（不溶性タンパク質画分）と上清画分（可溶性タンパク質画分）に分け、破砕前の全細胞サンプルと共に、定法に従って１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルドゲル電気泳動に供した。
その結果、それぞれのコード領域から推定される分子量に相当する位置にそれぞれのタンパク質のバンドが観察された。これらの形質転換体のうち、ｐＡＡｒｇＵ３を導入たものはｐＡＡｒｇＵ３を導入していないものに比べ大幅に発現量が上昇した。
さらに、ｐＡＡｒｇＵ３をともに導入した形質転換体のうち、ｐＥＤＫ１３１を含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換体からは、発現したＤＫ１タンパク量のほぼ５０％程度のタンパク質が可溶性タンパク質として発現したが、それ以外は概ね発現ＤＡＰＫ部分タンパク質量の１０％以下しか可溶性タンパク質として発現していないと見積もられた。すなわち、おなじＤＫ１タンパクのコード領域を用いた場合でも、Ｎ末側にポリヒスチジンタグをつけた場合には可溶性ＤＫ１タンパク質の発現量が低いが、タグを付けずにアルギニンのｔＲＮＡ遺伝子と共発現させると可溶性ＤＫ１タンパク質が大量に得られることが明らかになった。
（４）．形質転換体を用いた大腸菌でのＤＫ１タンパク質の大量生産
（２）で得られたｐＥＤＫ１３１とｐＡＡｒｇＵ３を含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換体を５０ｍｌのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン含有）培地に接種し３０℃で一昼夜培養した後、１リットルのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン含有）培地に植え継いだ後、３０℃で１時間培養し、プロモーターの転写誘導剤であるＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、さらに３０℃で６時間培養した。菌体を遠心分離により集め、ＰＢＳで１回洗浄した後、−８０℃に保存した。
（５）．ＤＡＰＫの発現と精製
２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌに保存していた上記（４）で得られた酵素発現用大腸菌を、最終濃度５０ｕｇ／ｍｌ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（ＷＡＫＯ，ｃｏｄｅ＃０１６−１０３７３）と２５ｕｇ／ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ（ＷＡＫＯ，ｃｏｄｅ＃１１３−００３４３）を含むＬＢ培地２００ｍＬが入った４本のフラスコに植菌し３０℃にて一昼夜振とう培養した。翌日、培養液を最終濃度５０ｕｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（ＷＡＫＯ，ｃｏｄｅ＃０１６−１０３７３）と２５ｕｇ／ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ（ＷＡＫＯ，ｃｏｄｅ＃１１３−００３４３）を含むＬＢ培地２Ｌが入ったフラスコ４本に植菌し、３０℃にて６００ｎｍの吸光度が約０．５になるまで培養し、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ，ｃｏｄｅ＃Ｉ−５５０２）を最終濃度０．５ｕＭになるように添加した。添加後３０℃にて６時間振とう培養し、目的酵素を大腸菌内で誘導発現させた。その後大腸菌を遠心分離（７，７００ｇ、１０分）により回収し、ＰＢＳ緩衝液にて洗浄後、再び遠心分離（７，７００ｇ、１０分）し菌体を回収した。次に菌体をＰＢＳ緩衝液にて再懸濁し、最終濃度１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）を添加した後、超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ，Ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０）にて大腸菌を破砕し、遠心分離（３９，０００ｇ、２０分）によりその上清を回収した。上清は孔径０．４５ｕｍのシリンジフイルター（ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ，ｃｏｄｅ＃１６５５５）でろ過した。
ろ過した上清を２倍容量の緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にて希釈し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃｏｄｅ＃１７−０５１０−０１）を充填したカラム（φ２．６ｃｍ  ｘ  １８ｃｍ）にアプライし、開始緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にてカラムを洗浄した後、開始緩衝液と溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）でＮａＣｌのｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔをかけて溶出した。溶出した画分は、２８０ｎｍの吸光度とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３２ＫＤａの目的酵素を多く含む画分を回収した。
次に回収した画分を等容量の緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、３．２Ｍ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を加え１時間攪拌し遠心分離（１５，０００ｇ、４℃、２０分）して得られた上清を、ＴＳＫｇｅｌ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ（東ソー，ｃｏｄｅ＃０７４７７）を充填したカラム（φ２ｃｍ  ｘ  １０ｃｍ）にアプライし、開始緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１．６Ｍ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で洗浄した後、開始緩衝液と溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で、ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅのｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔをかけて溶出し、最後は溶出緩衝液のみで溶出した。溶出した画分は、２８０ｎｍの吸光度とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３２ＫＤａの目的酵素を多く含む画分を回収した。
次に回収した画分をＹＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ，ｃｏｄｅ＃１３６３２）を用い限外ろ過にて濃縮し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃｏｄｅ＃１７−１０１４−０１）を充填したカラム（φ２ｃｍ  ｘ  ８．５ｃｍ）にアプライし、開始緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にてカラムを洗浄した後、開始緩衝液と溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）でＮａＣｌのｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔをかけて溶出した。溶出した画分は、２８０ｎｍの吸光度とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３２ＫＤａの目的酵素がほぼ単一バンドとなる精製画分を得た。またわずかに不純物の見られた画分を集め約３倍容量の開始緩衝液で希釈後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを充填したカラム（φ２ｃｍ  ｘ  ８．５ｃｍ）に再びアプライし、同じ条件で溶出した。２８０ｎｍの吸光度とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により３２ＫＤａの目的酵素がほぼ単一バンドとなる精製画分を得て、前出の精製画分と混合した後、ＹＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ，ｃｏｄｅ＃１３６３２）を用い限外ろ過にて濃縮し、高純度精製酵素を得た。
（６）．Ｘ線構造解析用酵素の調製
クロマトグラフィーにより得られた高純度精製酵素をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，ｃｏｄｅ＃４２０６）にて濃縮後、４倍容量の緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に希釈し、再度Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０にて濃縮した。濃縮したサンプルを遠心分離し、上清を回収してＸ線構造解析用酵素を得た。
（７）．酵素活性の確認
高純度精製酵素を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝液にて希釈し、最終濃度０．４ｕｇ／ｍＬになるように酵素活性測定用反応液（最終濃度５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｂｏｖａｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ，ｃｏｄｅ＃Ａ−４５０３））に添加し、３０℃にて３０分間保温した。次に酵素を含む反応液に、あらかじめ３０℃にて３０分間保温した基質（最終濃度０．１２ｍｇ／ｍＬ  ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ（ＳＩＧＭＡ，ｃｏｄｅ＃Ｍ−７５１８））、０．０２ｍＭ  ＡＴＰ（ＡＭＲＥＳＣＯ，ｃｏｄｅ＃０２２０−２５Ｇ）、５ｕＣｉ  γ−３２Ｐ  ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃｏｄｅ＃ＰＢ１０２８）を添加し、３０℃にて３分、６０分間保温した。３分と６０分後、反応液を濃縮サンプルバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２０％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、８％ＳＤＳ、２０％ｓｕｃｒｏｓｅ、０．００８％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）の入ったマイクロチューブに移し、１００℃にて１０分間加熱後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルを乾燥しＢＡＳ２０００ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）にて解析した。その結果反応時間３分、６０分いずれの場合もＤＡＰ−ｋｉｎａｓｅの基質として報告（ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，９９８−１００８，１９９７）されているｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎの分子量付近に強いリン酸化が見られ、精製酵素はキナーゼ活性を有することが認められた。
（８）．Ｋｍの算出
高純度精製酵素を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝液にて希釈し、最終濃度１ｕｇ／ｍＬになるように酵素活性測定用反応液（最終濃度５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍＬ  ｂｏｖａｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、１０ｕｇ／ｍＬ  ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ，ｃｏｄｅ＃Ｍ−４３５７）、２％ＤＭＳＯ）に添加し、３０℃にて３０分間保温した。次に酵素を含む反応液に、あらかじめ３０℃にて３０分間保温したγ−３２Ｐ  ＡＴＰを、最終濃度１００ｕＭ（０．１ｕＣｉ／ｕＬ）、５０ｕＭ（０．０５ｕＣｉ／ｕＬ）、１０ｕＭ（０．０１ｕＣｉ／ｕＬ）、５ｕＭ（０．００５ｕＣｉ／ｕＬ）、１ｕＭ（０．００１ｕＣｉ／ｕＬ）、０．５ｕＭ（０．０００５ｕＣｉ／ｕＬ）になるように添加し、３０℃にて３分間保温した。なお対照として酵素の入っていない反応液に各稀釈γ−３２Ｐ  ＡＴＰを加え同様に反応させた。３分後反応液の５分の２をホスホセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎｎ，ｃｏｄｅ＃３６９８−９１５）に染込ませ、風乾させた。風乾後、１％（Ｖ／Ｖ）Ｈ３ＰＯ４にて２５℃、３分間振とうして、同じ操作を３回繰返した。次に超純水にて２５℃、３分間振とうして、同じ操作を２回繰返したのち風乾させた。風乾させた紙片を液体シンチレーターの入ったボトルに移し、液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  １４０９）にて放射カウントを測定した。測定後、横軸にＡＴＰ濃度の逆数、縦軸に対照を差し引いた放射カウントの逆数をプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット）して、最小自乗法によりＸ軸切片（＝−１／Ｋｍ）を算出し、Ｋｍを求めたところ、０．７５ｕＭであった。
（９）．全長ＤＡＰキナーゼの取得
全長ＤＡＰキナーゼをコードする遺伝子（ＧＥＮＥ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ７６１０４）とＨＡ−ｔａｇが導入されたバキュロウィルス（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｉｔｕｔｅ，Ｄｒ．Ｋｉｍｃｈｉより供与）をＭＯＩ＝５でＳｆ−９昆虫細胞に６０時間感染させ、感染昆虫細胞を遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分）により回収し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄後、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分）により細胞を得た。次に回収した細胞を、２５０ＫＵ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００ｕＭ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１００ｕＭ  ａｎｔｉｐａｉｎ，１００ｕＭ  ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、１００ｕＭ  ＮａＶＯ３、１００ｕＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦの入ったＰＬＢ緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＨＰＯ４  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）にて懸濁した後、テフロンホモジナーザー（ＥＹＥＬＡ  ＭＡＺＥＬＡＺ）にて細胞を破砕した。破砕した溶液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分）して得られた上清に、抗ＨＡ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｃｏｄｅ＃１８６７４２３）を加え４℃で一昼夜免疫沈降させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ｃｏｄｅ＃１７−０６１８−０２）を添加し４℃で４時間反応させ、ＰＬＢ緩衝液で３回洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０にて３回洗浄し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇに結合した形で全長ＤＡＰＫを取得した。
（１０）．全長ＤＡＰキナーゼ酵素との薬理学的プロファイルの比較
総タンパク質量約１５０ｕｇの昆虫細胞破砕上清から抗ＨＡ抗体との免疫沈降により得られた全長ＤＡＰキナーゼあるいは精製酵素（最終濃度２ｕｇ／ｍＬ）を、酵素活性測定用反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｂｏｖａｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｕＭ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（ＳＩＧＭＡ，ｃｏｄｅ＃Ｐ−２２７７））に添加し、さらにＤＭＳＯ（最終濃度２％）あるいはｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ（上記式（１）で表わされる化合物）（最終濃度２、２０、２００ｎＭ）を添加し３０℃にて３０分間保温した。次に酵素を含む反応液に、あらかじめ３０℃にて３０分間保温した基質（最終濃度０．１２ｍｇ／ｍＬ  ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ（ＳＩＧＭＡ，ｃｏｄｅ＃Ｍ−７５１８））、０．０２ｍＭ  ＡＴＰ、５ｕＣｉ  γ−３２Ｐ  ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃｏｄｅ＃ＰＢ１０２８）を添加し、３０℃にて５分間保温した。５分後、反応液の３０％を濃縮サンプルバッファーの入ったマイクロチューブに移し１００℃にて１０分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルを乾燥しＢＡＳ２０００ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）にてＭＬＣのリン酸化を解析した。その結果、全長ＤＡＰキナーゼ、精製酵素ともにｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎによる濃度依存的な活性阻害が見られ、キナーゼ活性を５０％阻害するｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ濃度（ＩＣ５０）は、全長ＤＡＰキナーゼ、精製酵素それぞれ５６、５０ｎＭであった。以上より精製酵素の薬理学的プロファイルにおいては、全長酵素とほぼ同じであることが推測された。
実施例２  ＤＡＰＫの結晶化及び構造決定（１）
結晶化に際しての液滴は１０ｍｇ／ｍｌ、３μｌの上記実施例１で得られた蛋白質溶液を等量のｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液と混ぜ、ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐとした。Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液は、０．７ｍｌ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ６．８，７．２，７．６）、０．２ｍｌ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ試薬ＣＳ−４１、添加剤（６０ｍＭ  ＮＸＴ、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、試みの半分においては更に、１０％ＭＥＧＡ−８）を混ぜて作成した。ここで、ＮＸＴは、ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（ｄｉまたはｔｒｉ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮはＡまたはＧ、ＸはＤまたはＴ）を表す。有効なｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、ＡＴＰとＧＴＰであった。沈殿剤は、１０％２−ｐｒｏｐａｎｏｌと２０％ＰＥＧ４０００をｐＨ７．５で用いた（ＣＳ−４１）。ＭＥＧＡ−８は、蛋白質の溶解度を下げ、速い結晶化のために大きな効果があった。
ここで得られた結晶は、ｂｉｐｙｒａｍｉｄあるいは  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｂｉｐｙｒａｍｉｄと言える形状をしており、ＭＥＧＡ−８を含む結晶化系で早く現れたが、大きさとしては中程度のものであった。ＧＴＰ／ＭＥＧＡ−８（ｐＨ７．２）からは２０μｘ８００μ、ＡＴＰ／ＭＥＧＡ−８（ｐＨ７．２，７．６）からは  ４０μｘ８００−９００μの結晶が得られた。
更に、低温室の利用、ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ法の試みをも含めて、実験条件を振り、強い複屈折が観測される、大きさ３５０ｘ２５０ｘ１５０μのｂｉｐｙｒａｍｉｄ型の良質結晶を得た。用いた結晶条件は、３ｍｇ／ｍｌ  ＤＫ１、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、１１０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．０を始めとする領域で、ＡＴＰＭｇ（ＡＤＰＭｇ）を入れても結晶は得られた。
更に結晶化を進め、ｂｒｉｃｋ様の大きな結晶（２８０μｘ３６０μ）、また、いくつかの中程度の大きさの結晶（８０−１００μｘ２００−３００μ）が得られた。このときの結晶化条件は、３ｍｇ／ｍｌ（＝０．１ｍＭ）ＤＡＰＫ蛋白質、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６％ＰＥＧ４０００等を用いた。得られた結晶は以下のとおりである。
Ｘ線測定と構造決定
2003083101.tif 000003
2003083101.tif 000004
構造決定の段階は，以下のとおりである。
実験装置：ＤＫ０１  Ｒｉｇａｋｕ  Ｘ線回折計  ＲＡＸＩＳ  ＩＩｃ
ＤＫ０２−０５  Ｓｐｒｉｎｇ−８  ｂｅａｍ  ｌｉｎｅ  ＢＬ２４ＸＵまたはＢＬ４０Ｂ２
実験条件：１００Ｋ窒素気流下
構造決定用ソフトウェア：分子置換法として、ＡＭｏＲｅ／ＣＣＰ４を使用、精密化にはＸＰＬＯＲ（剛体近似精密化及び二面角分子動力学によって位相を求める）と、ＲｅｆＭａｃ／ＣＣＰ４（分子力学的制約のもと位相を改良する）を使用した。
実施例３  ＤＡＰＫの結晶化及び構造決定（２）
以下で用いたＤＫ−１はいずれも上記実施例１で得られたものである。
（１）ＤＫ−１アポフォーム
結晶化に際しての液滴は６．８７ｍｇ／ｍｌの上記ＤＫ−１のサンプル２μｌを等量のｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液と混ぜ、ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐとした。Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液は、ハンプトンリサーチ社のスクリーニングキットＣｒｙｏのＮｏ．１８を１００μｌ使用した。結晶化は、１０度の恒温庫で行った。ここで得られた結晶は、大きさとしては中程度（０．０２ｍｍ×〜０．０５ｍｍ）のものが得られた。更に、実験条件を振り、良質な結晶（０．０４ｍｍ×０．０８〜０．１ｍｍ）を得ることができた。結晶化に際しての液滴は５μｌの結晶化のサンプルを等量のｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液と混ぜ、ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐとした。Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液としてＣｒｙｏ．Ｎｏ１８（１６％ＰＥＧ８０００，０．０８Ｍ  Ｎａ  Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ  ｐＨ６．５，０．１６Ｍ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を２００μｌとＤ．Ｗ４００μｌを混合した溶液６００μｌを使用した。結晶の外形はｂｉｐｙｒａｍｉｄのような形であった。
構造決定は以下の条件で行なった。
データ測定
装置：Ｓｐｒｉｎｇ−８  ｂｅａｍ  ｌｉｎｅ  ＢＬ−４０Ｂ２  Ｘ線波長：０．９Å
実験条件：１００Ｋ窒素気流下
構造決定用ソフトウェア：
ＤＰＳ／ＭＯＳＦＬＭ：Ｘ線回折データの処理
ＣＣＰ４：
ＣＮＳ：精密化
Ｘｔａｌｖｉｅｗ：分子モデルの構築
（２）ＤＫ−１とスタウロスポリン（上記式（１）で表わされる化合物）との複合体
６．８７ｍｇ／ｍｌ  ＤＫ−１（ｉｎ  Ｈ２Ｏ）          ３００μＬ
７．１４ｍｇ／ｍｌスタウロスポリン（ｉｎ  ＤＭＳＯ）  ９μＬ
上記の２溶液を混合後、４℃で１時間静置した後、１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心して結晶化の試料とした（混合後の濃度、ＤＫ１：０．２ｍＭ，スタウロスポリン：０．４５ｍＭ）。結晶化に際しての液滴は２μＬの上記の方法により調製した結晶化の試料を等量のｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液と混ぜ、ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐとした。Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液は、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ社のスクリーニングキットＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｃｒｙｏ  ＩのＮｏ．４５を１００μＬ使用した。結晶化は、１０度の恒温庫において、スタウロスポリンの光分解を避けるため遮光状態で行った。ここでは中程度の大きさの結晶が得られた（形状：柱状、大きさ：０．０５ｍｍ  Ｘ  ０．０２ｍｍ  Ｘ  ０．０２ｍｍ）。更に実験条件を検討し、以下のような条件において、良質な結晶を得ることができた。結晶化に際しての液滴は５μＬの結晶化の試料を等量のｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液と混ぜ、ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐとした。Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液には、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に、１５％ＰＥＧ４００，５％ＰＥＧ８０００，１５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを混合したものを、６００μＬ使用した。結晶化は、１０℃の恒温庫において、スタウロスポリンの光分解を避けるため遮光状態で行った。ここでは回折実験に適した結晶が得られた（形状：柱状、大きさ：０．１ｍｍ  Ｘ  ０．０５ｍｍ  Ｘ  ０．０５ｍｍ）。
構造決定の段階は以下のとおりである。
データ測定
Ｘ線源：ＳＰｒｉｎｇ−８  ｂｅａｍ  ｌｉｎｅ  ＢＬ−４０Ｂ２  Ｘ線波長  ０．７０Å
回折計：ＣＣＤ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｑｕａｎｔｕｍ  ４Ｒ（Ａｒｅａ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
実験条件：１００Ｋの窒素気流下
回折データの測定は遮光状態で行った。
構造解析
構造決定用ソフトウェア：
ＤＰＳ／ＭＯＳＦＬＭ：Ｘ線回折データの指数付け
ＣＣＰ４：ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ２，ＲＥＩＮＤＥＸ，ＳＣＡＬＥ，ＳＣＡＬＥでデータ処理
ＣＮＳ：精密化
Ｘｔａｌｖｉｅｗ：分子モデルの構築
ＣＣＰ４：ＰＲＯＣＨＥＣＫで構造チェック
（３）ＤＫ−１と上記式（２）で表わされる化合物との複合体
６．８７ｍｇ／ｍｌ  ＤＫ１（ｉｎ  Ｈ２Ｏ）          １００μＬ
１０．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＤ−４０２（ｉｎ  ＤＭＳＯ）  ２μＬ
上記の２溶液を混合後、４℃で１時間静置した後、１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心して結晶化の試料とした（混合後の濃度、ＤＫ１：０．２ｍＭ，ＢＤ−４０２：０．６ｍＭ）。結晶化に際しての液滴は５μＬの上記の方法により調製した結晶化の試料を等量のｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液と混ぜ、ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐとした。Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ溶液には、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に、２０％ＰＥＧ４００、５％ＰＥＧ８０００、１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌとなるように混合し調製したものを、６００μＬ使用した。結晶化は、１０℃の恒温庫において行った。ここでは回折実験に適した結晶が得られた（形状：ｂｉｐｙｒａｍｉｄ、大きさ：０．１４ｍｍ  Ｘ  ０．１４ｍｍ  Ｘ  ０．２ｍｍ）。
構造決定の段階は、以下のとおりである。
データ測定
Ｘ線源：ＳＰｒｉｎｇ−８  ｂｅａｍ  ｌｉｎｅ  ＢＬ−４０Ｂ２  Ｘ線波長  ０．７１Å
回折計：ＣＣＤ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｑｕａｎｔｕｍ  ４Ｒ（Ａｒｅａ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
実験条件：１００Ｋの窒素気流下
構造決定用ソフトウェア：
ＤＰＳ／ＭＯＳＦＬＭ：Ｘ線回折データの指数付け
ＣＣＰ４：ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ２，ＲＥＩＮＤＥＸ，ＳＣＡＬＥ，ＳＣＡＬＥでデータ処理
ＣＮＳ：精密化
Ｘｔａｌｖｉｅｗ：分子モデルの構築
ＣＣＰ４：ＰＲＯＣＨＥＣＫで構造チェック
上記で得られた結晶のＸ線測定と構造決定は以下のとおりである。
2003083101.tif 000005
2003083101.tif 000006
実施例４  立体構造データの解析、活性部位の同定及びＡＤＰ−ＤＡＰＫ相互作用
後述の表１から表５に示すように、ｄｋ０１はＶａｌ９からＴｈｒ２７９について、ｄｋ０２はＴｈｒ２からＬｙｓ２７６について、ｄｋ０３はＴｈｒ２からＬｙｓ２７６について、ｄｋ０４はＴｈｒ２からＬｙｓ２７６について、ｄｋ０５はＴｈｒ２からＡｌａ１０６、Ｌｅｕ１１１からＶａｌ１５２、Ｐｒｏ１５５からＬｙｓ２７６について、三次元構造座標を決定した。
活性部位に関しては、上記で得られた三次元構造座標に基づき、以下のように決定した。
ＡＤＰより５Å以内にある残基（２１残基）
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１
ＡＤＰより８Å以内にある残基（５２残基）
Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４
ＡＤＰＭｇより５Å以内にある残基（２４残基）
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１３９，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４
ＡＤＰＭｇより８Å以内にある残基（５３残基）
Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ｐｈｅ２４，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｖａｌ５６，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ｐｈｅ１０２，Ａｓｐ１０３，Ｈｉｓ１３７，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３，Ｌｅｕ１６４，Ａｌａ１６５
ＡＤＰ結合型（ｄｋ０２）の構造解析の結果，ＡＤＰとの分子間相互作用に関与するＤＫ１の原子（群）が明らかとなった．ＡＤＰとＤＡＰＫとの相互作用のうち，ファンデルワールス相互作用，静電相互作用に関与する原子群を以下に示す。また，水素結合については結合原子ペアを示す。
水素結合
１．ＡＤＰＭｇとＤＡＰＫ蛋白質（及び水分子，水分子を介して含む）との水素結合
2003083101.tif 000007
2003083101.tif 000008
２．水分子を介しての水素結合
2003083101.tif 000009
ファンデルワールス相互作用（ＡＤＰＭｇより４Å以内にある原子群）
2003083101.tif 000010
2003083101.tif 000011
静電相互作用（ＡＤＰＭｇより５Å以内にある原子群）
2003083101.tif 000012
2003083101.tif 000013
2003083101.tif 000014
上記の一部または全部を使用して、薬物候補分子の設計等を行うことが可能である。
また、一連の結晶構造解析により複数の構造水が観測されているが，アポ・フォーム（後述の実施例で示すｄｋ０３，ｄｋ０４；結晶形ＩＩ）の構造とＡＴＰ結合型の構造を重ね合わせる（ｂｅｓｔｆｉｔ）ことにより，ＡＴＰ結合部位内における保存された水分子の存在を以下のように明らかにすることができる（２分子ある）。
後述の三次元構造座標中のアミノ酸（水分子）番号（２分子）
2003083101.tif 000015
このような水分子はアポ・フォーム、ＡＴＰ結合型のいずれのフォームにおいても見られることから、ＤＡＰＫの構造維持、機能発現において特に重要な水分子と考えられ、これら２水分子結合領域の相互作用を利用した、生物活性化合物デザインが考えられる（水分子除去による結合エネルギー強化）。
実施例５  立体構造データの解析、活性部位の同定及び式（１）または式（２）で表わされる化合物とＤＡＰＫとの相互作用
後述の表６から表８に示すように、ｄｋ０６はＴｈｒ２からＬｙｓ２７６について、ｄｋ０７はＰｈｅ４からＬｙｓ２７６について、ｄｋ０８はＴｈｒ２からＬｙｓ２７６について、三次元構造座標を決定した。
活性部位に関しては、上記で得られた三次元構造座標に基づき、以下のように決定した。
式（１）で表わされる化合物より５Å以内にある残基：
１８残基
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１
式（１）で表わされる化合物より８Å以内にある残基：
４８残基
Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ｇｌｎ２３，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｉｌｅ４４，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ａｓｐ１０３，Ａｓｐ１３９，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２，Ｇｌｙ１６３
式（２）で表わされる化合物より５Å以内にある残基：
１９残基
Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｖａｌ２７，Ａｌａ４０，Ｌｙｓ４２，Ｉｌｅ７７，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｍｅｔ１４６，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１
式（２）で表わされる化合物より８Å以内にある残基：
４６残基
Ｇｌｕ１７，Ｇｌｕ１８，Ｌｅｕ１９，Ｇｌｙ２０，Ｓｅｒ２１，Ｇｌｙ２２，Ａｌａ２５，Ｖａｌ２６，Ｖａｌ２７，Ｌｙｓ２８，Ｌｙｓ２９，Ｔｙｒ３９，Ａｌａ４０，Ａｌａ４１，Ｌｙｓ４２，Ｇｌｕ６４，Ｌｅｕ６８，Ｉｌｅ７７，Ｔｈｒ７８，Ｌｅｕ７９，Ｌｅｕ９１，Ｉｌｅ９２，Ｌｅｕ９３，Ｇｌｕ９４，Ｌｅｕ９５，Ｖａｌ９６，Ａｌａ９７，Ｇｌｙ９８，Ｇｌｙ９９，Ｇｌｕ１００，Ｌｅｕ１０１，Ａｓｐ１０３，Ｌｙｓ１４１，Ｐｒｏ１４２，Ｇｌｕ１４３，Ａｓｎ１４４，Ｉｌｅ１４５，Ｍｅｔ１４６，Ｌｅｕ１４７，Ｌｅｕ１４８，Ａｒｇ１５０，Ｌｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｉｌｅ１６０，Ａｓｐ１６１，Ｐｈｅ１６２
式（１）および式（２）で表わされる化合物結合型（ｄｋ０７及びｄｋ０８）の構造解析の結果，それぞれの化合物との分子間相互作用に関与するＤＫ１の原子（群）が明らかとなった。それぞれの化合物とＤＡＰＫとの相互作用のうち，ファンデルワールス相互作用，静電相互作用に関与する原子群を以下に示す。また，水素結合については結合原子ペアを示す。
水素結合
１．式（１）で表わされる化合物とＤＡＰＫ蛋白質（及び水分子，水分子を介して含む）との水素結合
2003083101.tif 000016
２．式（２）で表わされる化合物とＤＡＰＫ蛋白質（及び水分子）との水素結合
2003083101.tif 000017
ファンデルワールス相互作用（それぞれの化合物から４Å以内にある原子群）
式（１）で表わされる化合物
2003083101.tif 000018
式（２）で表わされる化合物
2003083101.tif 000019
静電相互作用（それぞれの化合物から５Å以内にある原子群）
式（１）で表わされる化合物
2003083101.tif 000020
2003083101.tif 000021
式（２）で表わされる化合物
2003083101.tif 000022
2003083101.tif 000023
上記に示したそれぞれの結晶から得られた三次元構造を以下に示す。
2003083101.tif 000024
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合成例  式（２）で表わされる化合物の合成例
以下の参考例１から５に記載の方法に準じて、式（２）で表わされる化合物を合成した。
融点：２９０℃
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３５０７，３４０１，３２６０，２９２６，１７６５，１６９７，１５２６．
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，δ）：２．０８（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７，８６（ｄｕｌｌｓ，３Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），１１．０８（ｓ，１Ｈ）．
参考例１：ジメチル１，２−ジヒドロカルバゾール−３，４−ジカルボキシレートの製造
特開平４−１７８３８７号公報などと同様の方法で得られる２−アリルインドール２．２８ｇを１００ｍｌのトルエンに溶解し、２．５ｇのアセチレンジカルボン酸ジメチルエステルを加え、２４時間加熱還流した。反応液を０℃まで冷却した後、ヘキサンを加えて濾過し、目的物２．５０ｇを得た。
収率：５５％
融点：２２０−２２２℃
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ）：２．８３−２．８８（ｍ，４Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），４．０３（ｓ，３Ｈ），７．０９−７．４７（ｍ，４Ｈ），８．４９（ｂｒ，１Ｈ）．
参考例２：ジメチルカルバゾール−３，４−ジカルボキシレートの製造
参考例１で得られたジメチル１，２−ジヒドロカルバゾール−３，４−ジカルボキシレート１．７８ｇにブチルベンゼン１０ｍｌを加え、１６０℃にて溶解させ、１０％ＰｄＣｌ２／Ｃ  １．７８ｇを加え１時間攪拌した。反応液をグラスフィルターにて濾過、ＴＨＦにて洗浄後、減圧濃縮した。得られた残渣を、クロロホルム／酢酸エチル＝１５／１にてカラム精製し、目的物１．６６ｇを得た。
収率９４％
融点：２１４−２１６℃
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ）：３．９５（ｓ，３Ｈ），４．１６（ｓ，３Ｈ），７．２４−７．４９（ｍ，４Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．４４（ｂｒ，１Ｈ）．
参考例３：ジメチル９−（３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシプロピル）カルバゾール−３，４−ジカルボキシレートの製造
参考例２で得られたジメチルカルバゾール−３，４−ジカルボキシレート１．５５ｇを２３ｍｌのＤＭＦに溶解し、室温で０．３３ｇの水素化ナトリウムを加え、５０℃にて３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ−１−ブロモプロパンを加え、２時間攪拌した。反応液を水に注加し、酢酸エチルにて抽出し、水、飽和食塩水にて洗浄し、芒硝乾燥した後、減圧濃縮した。得られた残渣を、ヘキサン／酢酸エチル＝４／１にてカラム精製し、目的物１．４９ｇを得た。
収率５９％
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ）：０．７３（ｓ，６Ｈ），０．９７（ｓ，９Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），４．１６（ｓ，３Ｈ），４．８６（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５０−７．５６（ｍ，３Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例４：９−（３−ヒドロキシプロピル）カルバゾール−３，４−ジカルボン酸の製造
参考例３で得られたジメチル９−（３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシプロピル）カルバゾール−３，４−ジカルボキシレート１．１３ｇを３０ｍｌのエタノールに溶解し、１０Ｎ−水酸化カリウム水溶液２．４８ｍｌを加え、１０時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮した。得られた残渣にメタノールを加え、２Ｎ−塩酸水で中和後、濾過し、目的物０．６３ｇを得た。
収率：８２％
融点：１８１−１８３℃
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，δ）：１．９２（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６９（ｂｒ，１Ｈ），７．２７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７０−８．０７（ｍ，４Ｈ）．
参考例５：９−（３−アセトキシプロピル）カルバゾール−３，４−ジカルボン酸無水物の製造
参考例４で得られた９−（３−ヒドロキシプロピル）カルバゾール−３，４−ジカルボン酸０．５３ｇを無水酢酸２．５ｍｌに溶解し、１１０℃にて攪拌した。反応液を室温まで冷却した後、減圧濃縮し、残渣として目的物を得た。
参考例６：９−（３−アセトキシプロピル）カルバゾール−３，４−ジカルボキシイミドの製造
参考例５で残渣として得られた９−（３−アセトキシプロピル）カルバゾール−３，４−ジカルボン酸無水物を１０ｍｌのＤＭＦに溶解し、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン０．８１ｇと、メタノール０．０８ｇを加え、室温にて１０時間攪拌した。反応液を水に注加し、酢酸エチルにて抽出し、水、飽和食塩水にて洗浄し、芒硝乾燥した後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチルで懸洗し、目的物０．３６ｇを得た。
収率６８％
融点：２４８−２４９℃
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：１６９９，１７１８，１７５１，３０６７，３１８１．
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，δ）：１．９１（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｍ，２Ｈ），３．９６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．８８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），１１．２０（ｓ，１Ｈ）．
試験例：  ＤＡＰＫ阻害作用
式（１）及び式（２）で表わされる化合物のＤＡＰＫ阻害作用を上記実施例１で得られたＤＫ１のミオシン軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ；以下、ＭＣＬと略す）リン酸化の阻害作用によって確認した。
基質としてチオレドキシン−２ＭＣＬを９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに固相化し、ＰＢＳ緩衝液にて洗浄後、０．１％ｇｅｌａｔｉｎ水溶液にてブロッキングを行った。ＰＢＳ緩衝液にて２回、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて１回洗浄した。そこへ反応溶液（最終濃度５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、０．０１μｇ／ｍＬ  ＤＫ１）を加えた。さらにＤＭＳＯ（最終濃度０．５％）あるいは化合物を加えた。（被検化合物は１０％ＤＭＳＯにて調製して添加したため、最終の反応系には０．５％ＤＭＳＯを含む。）
ＡＴＰ溶液（最終濃度８μＭ  ＡＴＰ、４μＣｉ／ｍＬ  γ−３２Ｐ  ＡＴＰ）添加によりリン酸化反応を開始し、２５℃で２０分反応させ、２０％リン酸水溶液を添加して反応を停止した。アスピレーターで反応液を抜き取り、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液にて洗浄した。洗浄液を十分に取り除き、液体シンチレーターを加えてマイクロプレートシンチレーションカウンターにてチオレドキシン−２ＭＬＣのリン酸化を解析した。
上記の結果、式（１）で表わされる化合物の５０％阻害濃度は０．０２６μＭ、式（２）で表わされる化合物の５０％阻害濃度は０．０５８μＭであった。
産業上の利用分野
本発明によれば、ＤＡＰＫを大腸菌で可溶性タンパク質として大量に発現させ、高純度に精製し、得られた可溶性タンパク質標品を用いて効率良くＸ線結晶構造解析に使用可能なＤＡＰＫ結晶を製造することが可能である。さらには、ＤＡＰＫのＸ線結晶回折像を取得し、最終的には、ＤＡＰＫの三次元構造を取得してそれを用いてＤＡＰＫをターゲットとする薬物を得ることが可能である。
なお、本出願は、日本特許出願特願２００２−９７３５４号及び特願２００３−５１６７０号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2003083101.tif 000698
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