(57)【要約】免疫欠損動物であるスキッドマウスに、抗アシアロＧＭ１抗体を投与し、ナチュラルキラー細胞に依存する免疫応答能を欠損させた後、正常の肝臓組織、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎患者由来の肝臓組織、などのヒト由来の非癌部肝臓組織をスキッドマウスの腎臓皮下に移植することによって、ヒトの非癌部肝臓組織を保持した肝炎モデル動物を作製する。このモデル動物は、ヒトの肝臓組織を有しているため、従来よりもより一層ヒトに近い状態で動物実験を行うために有効に利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の組織に、ヒトの非癌部肝臓組織が移植されていることを特徴とするモデル動物。
【請求項２】
前記非癌部肝臓組織は、正常肝臓組織であることを特徴とする請求項１に記載のモデル動物。
【請求項３】
前記非癌部肝臓組織は、肝炎を発症した肝臓組織であることを特徴とする請求項１または２に記載のモデル動物。
【請求項４】
前記非癌部肝臓組織組織は、前記動物の腎臓に移植されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のモデル動物。
【請求項５】
前記動物は、免疫欠損動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のモデル動物。
【請求項６】
前記免疫欠損動物は、Ｔ細胞および／またはＢ細胞に依存する免疫応答能を欠損していることを特徴とする請求項５に記載のモデル動物。
【請求項７】
前記免疫欠損動物は、ヌード動物あるいはスキッド動物であることを特徴とする請求項６に記載のモデル動物。
【請求項８】
前記免疫欠損動物は、ナチュラルキラー細胞に依存する免疫応答能を欠損していることを特徴とする請求項５ないし７のいずれか１項に記載のモデル動物。
【請求項９】
抗アシアロＧＭ１抗体を投与することによりナチュラルキラー細胞に依存する免疫応答能を欠損させることを特徴とする請求項８に記載のモデル動物。
【請求項１０】
前記動物は、マウスであることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載のモデル動物。
【請求項１１】
動物の免疫応答能を欠損させた免疫欠損動物の組織に、非癌部肝臓組織を移植して前記非癌部肝臓組織を生着させることを特徴とするモデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトの非癌肝臓組織が移植されたモデル動物およびその作製方法に関し、特に、ヒトの正常肝臓組織が移植されたモデル動物、および、ヒトとチンパンジーとにしか感染せず慢性肝炎の原因となるＢ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスに感染したヒトの肝臓組織を保有する肝炎モデル動物、およびその作製方法に関するものである。
【背景技術】  新規医薬品などの各種物質は、まず健常動物によって、物質の体内動態や組織特異性を調べる動物実験が行われる。例えば、生体の物質代謝機能を担い生命を維持している肝臓組織での各種物質の代謝解析が行われる。
また、ヒト疾患の発症機構を解明し、その治療方法及び治療薬剤を開発する場合には、そのヒト疾患と酷似した病態を示すモデル動物を利用した動物実験が重要な役割を果たす。例えば、肝炎をはじめとする肝臓に関する医薬品開発を目的とする薬効スクリーニング試験などにおいては、健常動物での安全性試験が行われた後、より実際の臨床症状に近くなるように、一定の病態状態にある疾患モデル動物を用いて薬効評価試験が行われる必要がある。
しかしながら、従来、ウイルス性肝炎、特に慢性肝炎の原因となるＢ型肝炎およびＣ型肝炎に感染した肝炎モデル動物を調達することは極めて困難であった。その大きな原因として、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスは、ヒトおよびチンパンジーの肝臓にしか感染しないことが挙げられる。ヒト以外に唯一感染するチンパンジーは、極めて高価（１頭市価２０００万円以上）であり、しかもワシントン条約により殺すことができない。
また、たとえ、このような動物実験によって各種物質の体内動態、組織特異性、薬効評価を解析したとしても、それらの結果が必ずしもヒトの場合に一致するとは限らない。なぜなら、ヒトの場合には、種差により、動物実験によって得られた結果からは予期し得ない体内動態を示す場合も考えられるからである。
具体的には、一般的に、新規医薬品などの各種物質は、消化管から吸収されて、血中に入り、標的組織に移行し、そこでの生化学反応を介して変化し、薬理効果を発揮する。しかし、多くの場合、生体内に入った薬物は、代謝物として尿や胆汁中に排泄される。その際、ほとんどの薬物は、化学構造が変化して薬理活性を失う。
しかしながら、一部の薬物では、代謝されてもまだ元の化合物と同等の活性を示す場合がある。場合によっては、元の化合物以上の活性を示す活性代謝物に変化する場合も知られている。
病態動物の生体内において薬物が薬効を示す場合、未変化体が薬効を示しているのか、または、活性代謝物が薬効を示しているのかを解析することは医薬品開発において特に重要である。なぜなら、未変化体ではなく、活性代謝物が薬効を示している場合、動物実験での評価において薬効が確認されたとしても、動物とヒトとでは代謝経路が一致するわけではないからである。それゆえ、ヒトの体内でその活性代謝物がほとんど生成せず、臨床効果が期待できない場合も考えられるのである。
このように、従来の実験動物を用いた動物実験では、種差が原因となり、各種物質の体内動態、組織に対する特異性、薬効評価などの試験を正確に行うことが困難であった。したがって、各種物質の体内動態、組織特異性、薬効評価などを動物実験で行う場合には、種差による問題をいかに解決するのかが課題となっている。
それゆえ、もし、ヒトの肝臓組織を実験動物に移植することができれば、前述のような種差による問題が解消され、従来よりも一層ヒトに近い体内動態を解析することができると考えられる。しかしながら、ヒトの正常肝組織が移植されたモデル動物は未だ開発されていないのが現状である。その大きな原因として、肝細胞が非常に虚血に弱いことが挙げられる。生体内で肝臓組織は、門脈、肝動脈から豊富な血流を得ることによって、虚血を免れている。このため、肝臓組織を動物に移植して生着させようとすると、血管を吻合しない限り、移植後すぐに肝臓組織が虚血により壊死してしまう。このように、肝臓組織を動物に移植して生着させることは極めて困難であり、ヒトの正常肝組織が移植されたモデル動物は未だ開発されていない。
また、ウイルス性肝炎、特に慢性肝炎は、肝硬変を経て肝臓癌を発症して、場合によっては死に至る危険性のある疾患である。それゆえ、ウイルス性肝炎、特に慢性肝炎の原因となる、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスに感染した動物を作製し、それを用いてウイルス性肝炎について、より詳細に研究し、その治療方法を開発することが望まれる。
しかしながら、前述のようにＢ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルスはヒトおよびチンパンジーにしか感染せず、チンパンジーは高価であり殺すこともできないため、肝炎モデル動物として利用できないのが現状である。それゆえ、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスを排除する新規治療法が開発されても、肝炎モデル動物を用いてその効果を確認することができないという問題を有している。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ヒトの非癌部肝臓組織を保持したモデル動物およびその作製方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者等は、上記の課題に鑑み、ヒトの非癌部肝臓組織を有するモデル動物およびその作製方法について鋭意検討した。その結果、免疫欠損マウス（スキッドマウス：ｓｃｉｄ  ｍｏｕｓｅ）を予め抗アシアロＧＭ１抗体投与処理することにより、ナチュラルキラー細胞依存性拒絶反応を効率的に抑制して移植組織の生着率を向上させること成功し、ヒトの正常肝臓組織、および、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型ウイルス感染患者由来の肝臓組織を上記免疫欠損マウスの腎臓皮膜下に移植して長期に維持できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明のモデル動物は、動物の組織に、ヒトの非癌部肝臓組織が移植されていることを特徴としている。
これにより、これまで虚血に非常に弱いため血管吻合しなければ動物の組織に生着することができないと考えられていた肝臓組織を、血管吻合することなく、しかも他の動物の組織上で生着させることができる。このようにして得られるモデル動物は、ヒトの非癌部肝臓組織が移植された、これまで作製されたことのない新規モデル動物である。
ここで、「非癌部肝臓組織が生着」とは、移植された非癌部肝臓組織が壊死することなく、体内において機能し、且つ、肝臓組織が移植されたモデル動物が生存することを意味する。
上記非癌部肝臓組織としては、特に限定されるものではないが、正常の肝臓組織、肝炎（特にＢ型肝炎およびＣ型肝炎）を発症した肝臓組織であることが好ましい。
ヒトの正常の肝臓組織が移植されたモデル動物は、各種物質の体内動態の解析、肝臓組織に対する特異性の確認試験などの試験を、よりヒトに近い状態で正確に行うことができる。
また、肝炎を発症したヒトの肝臓組織が移植されたモデル動物（すなわち肝炎モデル動物）は、これまで新規治療薬が開発されても、その有効性を肝炎モデル動物で確認することができなかった治療薬の開発、特にＢ型肝炎またはＣ型肝炎といった慢性肝炎のような病気の病態解析やその治療薬の開発、治療法の改善に好適に利用することができる。したがって、慢性肝炎から肝硬変・肝臓癌への進展を防ぐことができ、これらの疾患の予防のために重要な役割を果たす。
本発明において、上記「肝炎」とは、主として、肝炎ウイルスによるウイルス性肝炎、特に慢性肝炎の原因となるＢ型肝炎またはＣ型肝炎ウイルスを意味するが、飲酒によるアルコール性肝炎、薬物による薬物性肝炎、および自己免疫機序による自己免疫性肝炎、その他のウイルスや細菌などによって発症するものであってもよい。
上記肝臓組織が移植される動物の組織は、特に限定されるものではないが、虚血によって肝臓組織が壊死しないように、血流の多い組織であることが好ましい。このような組織としては、例えば、腎臓、肝臓、脾臓、筋肉などが挙げられる。このうち、上記肝臓組織は、上記動物の腎臓、より詳細には腎臓皮膜下に移植することが特に好ましい。このように、腎臓に移植すれば、比較的短期間（１週間程度）で生着が得られる。また、移植される腎臓と、移植された組織との識別が容易である。さらに、同一個体の腎臓の左右、または、上部、中部、下部などに分けて移植することが可能である。それゆえ、同一条件での薬剤の効果などが比較できるなどの利点がある。
本発明において、上記動物は、免疫欠損動物であることが好ましい。
ここで、「免疫欠損」とは、免疫系を構成する細胞要素の一部あるいはいくつかの欠損または機能不全によって正常免疫機構に障害を生じた免疫不全の状態にあることを意味する。換言すれば、移植される肝臓組織が動物に生着するように、先天性免疫および／または後天性免疫が抑制されていることを意味する。また、上記免疫欠損動物は免疫不全動物ということもできる。
すなわち、上記免疫欠損動物は、免疫担当細胞や免疫応答に関与する因子の一部または全てを欠損していることが好ましい。
具体的には、上記免疫欠損動物は、Ｔ細胞および／またはＢ細胞に依存する免疫応答能を欠損していることが好ましく、さらに、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に依存する免疫応答能を欠損していることがより好ましい。免疫担当細胞や免疫応答に関与する因子の多くを欠損していれば、当該細胞や因子に依存する免疫応答を抑制し、肝臓組織を移植する時の拒絶反応を低減できると考えられる。
それゆえ、上記免疫欠損動物としては、例えば、胸腺を持たないためにＴ細胞に依存する免疫応答能を欠損しているヌード動物、ヌード動物における免疫応答能の欠損に加えてＢ細胞に依存する免疫応答能を欠損しているスキッド動物、スキッド動物における免疫応答能の欠損に加えてＮＫ細胞に依存する免疫応答能を欠損している動物を挙げることができる。
上記免疫欠損動物としてのＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞に依存する免疫応答能を欠損したマウスは、一般的に用いられるスキッドマウスに抗アシアロＧＭ１抗体を投与して作製することができる。アシアロＧＭ１はマウスのＮＫ細胞に特異的に表現されるタンパク質である。それゆえ、抗アシアロＧＭ１抗体をスキッドマウスに投与すれば、Ｔ細胞およびＢ細胞に依存する免疫応答能の欠損に加えて、ＮＫ細胞に依存する免疫応答能を欠損（または抑制）させることができる。なお、Ｘ線照射および免疫抑制剤の投与によっても上記免疫応答能を欠損させることができる。
本発明において、上記動物は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、などの哺乳動物が挙げられる。これらのうち、実験動物・病態モデル動物として用いるには、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯目動物がより好ましく、比較的短期間（１週間程度）で生着が得られ、安価に入手できることからマウスであることが特に好ましい。また、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っていることからも、マウスが好ましい。
以上のような本発明にかかるモデル動物は、動物の免疫応答能を欠損させた免疫欠損動物の組織、好ましくは腎皮膜下に、例えば、正常肝臓組織、肝炎を発症した肝臓組織などの非癌部肝臓組織を移植して前記非癌部肝臓組織を生着させることによって作製することができる。
これにより、上記モデル動物の体内にヒトの非癌部肝臓組織を高確率で生着させ、長期に渡って維持することができる。したがって、各種物質の体内動態、組織に対する特異性、薬効評価などの試験を、よりヒトに近い状態で正確に行うことができる。例えば、肝炎の治療法及び治療薬の開発に有用な肝炎モデル動物を、容易に作製することができる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例４の実験操作を示す概略図である。
図２は、実施例４にて生着したヒト肝臓組織とマウス腎臓とのＨＥ染色の結果を示す顕微鏡画像である。
図３は、図２のヒト肝臓とマウス腎臓との蛍光顕微鏡画像である。
図４は、実施例４における各組織の蛍光強度を示すグラフである。
なお、図中、４−ヒト肝臓、５−マウス腎臓である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の一形態について説明する。
（１）本発明のモデル動物およびその作製方法
本発明にかかるモデル動物は、ヒトの非癌部肝臓組織が動物の体内に移植され、上記非癌部肝臓組織を体内に生着させたものである。即ち、上記モデル動物とは、ヒトから摘出されたヒト由来の非癌部肝臓組織を、他の動物に移植し、動物の体内において上記ヒト非癌部肝臓組織を生着させてなるものである。
試料となる上記「非癌部肝臓組織」は、正常肝臓組織、肝炎を発症した肝臓組織といった、癌細胞以外の肝臓組織であれば特に限定されるものではなく、いずれの動物由来のものであってもよい。しかし、各種物質のヒトの肝臓での動態解析（特に代謝解析）や肝臓に対する組織特異性、ヒト肝炎の薬効スクリーニング試験などの解析を行うためにはヒト由来のものが好ましい。ヒト由来の上記「非癌部肝臓組織」は、一般的な病院においても肝細胞癌に対する治療として肝切除術を行っており、患者数も多いので容易に得ることができる。また、上記「非癌部肝臓組織」として正常の肝臓組織を移植する場合、後述する動物の組織に正常の肝臓組織を移植してモデル動物とした後、当該モデル動物に移植された正常の肝臓組織に肝炎などの疾患を発症させることもできる。
また、上記「非癌部肝臓組織」は、非癌部肝臓組織を取り出した組織片を移植してもよいし、当該組織片を同一個体または他の生物で生体内培養（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）して継代したものであってもよいし、ガラス器内培養（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）したものであってもよい。
なお、上記ヒト肝組織は、肝炎患者より摘出された後、氷冷された培養液（例えば細胞培養液、生理食塩水など）中に保存されることが好ましい。また、移植される肝組織は、移植先の個体の大きさによって異なるが、例えば、マウス及びラットに移植を行う場合は、２ｍｍ角程度の適当な大きさに切除されることが好ましい。
なお、上記試料は、動物から摘出されたものであって、後述のモデル動物への移植が可能であれば、肝臓組織以外の器官、組織、などから摘出したものであってもよい。
試料が移植される上記動物の組織は、上記試料が生着できれば特に限定されるものではないが、虚血によって移植した肝臓組織が壊死しないように、血流の多い組織であることが好ましい。このような組織としては、例えば、腎臓、肝臓、脾臓、筋肉、などが挙げられる。これらのうち、上記肝臓組織は、上記動物の腎臓、より詳細には腎臓皮膜下に移植することが特に好ましい。この「腎臓皮膜下に移植」とは、移植先の腎臓の皮膜が切開され、その切開部へ肝臓組織が挿入されることを言う。
また、上記動物の組織は、例えば、眼球結膜のように、上記試料と拒絶反応が起こりにくい組織であってもよい。
このように、試料を拒絶反応が起こりにくい動物の組織に移植する他にも、上記動物の免疫応答機能を欠損させた免疫欠損動物を用いることによっても、試料と動物の組織との拒絶反応を抑制することができる。
上記免疫欠損動物は、例えば、免疫担当細胞の異常、免疫応答遺伝子などの遺伝子の異常、免疫抑制剤などの薬剤の投与またはＸ線照射などの物理化学的因子、などによって免疫不全の状態にある動物を意味する。このような、免疫欠損動物は、突然変異または人為的に作製することによって得ることができる。
人為的に免疫抑制動物を作製する方法としては、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的手法または薬剤の投与などによって免疫担当細胞や免疫応答に関与する因子、具体的には、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなどの食細胞、補体などのうち、１つ以上の細胞または因子の一部または全てに異常を生じさせることにより作製できる。異常を生じさせる免疫担当細胞または免疫応答因子が多ければ、それらに依存する免疫応答能を欠損させることができ、肝臓組織を動物に移植するときの拒絶反応を一層低減することができる。それゆえ、ヒト由来の肝臓組織であっても、上記免疫欠損動物に効率よく生着させることができる。
上記免疫欠損動物としては、例えば、Ｔ細胞に依存する免疫応答能を欠損したヌード動物、Ｔ細胞およびＢ細胞に依存する免疫応答能を欠損したスキッド動物、後述の実施例のようにスキッド動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与することによりさらにＮＫ細胞に依存する免疫応答能を欠損した動物などが挙げられる。
なお、上記抗アシアロＧＭ１抗体は、マウスのＮＫ細胞に特異的に表現されるアシアロＧＭ１タンパク質を抗原とする抗体であり、当該タンパク質と特異的に結合することによってＮＫ細胞に依存する免疫応答能を抑制している。
また、マウス以外の動物においてＮＫ細胞が関与する免疫応答能を欠損させるためには、放射線照射もしくは免疫抑制剤を大量に投与すればよい。
なお、試料の移植は、移植する動物およびその組織によって異なるが、一般的な方法で移植することができる。例えば、後述の実施例のようにマウスの腎臓皮膜下に移植する場合、マウスを麻酔して開腹した後、腎臓を露出させて、腎臓皮膜下に試料の肝臓組織を挿入し、筋層および皮膚を一層にて縫合して移植を行えばよい。
なお、上記モデル動物において、移植された肝臓組織が生着したか否かの判定は、例えば、以下のようにして実施することができる。すなわち、移植した肝組織をＨＥ染色することによって実施することができる。ＨＥ染色によって生きていることが確認されれば、移植されたヒト肝組織は生着していると判断することができる。一方、生着が得られなかった組織については細胞構造が全く壊れてしまうことから、容易に判定することができる。また、上記以外の判定方法として、ヒト肝細胞で合成されるヒトアルブミン、ヒトプレアルブミン、ＰｒｏｔｅｉｎＣなどのタンパク質をＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などで測定する方法、血液中のＢ型肝炎ウイルス由来抗原（Ｅ抗原、Ｃ抗原、Ｓ抗原）、Ｃ型肝炎由来抗原（Ｃ抗原、Ｓ抗原、ＮＳ１抗原、ＮＳ２抗原、ＮＳ３抗原、ＮＳ４抗原、ＮＳ５抗原）をＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などで測定する方法などがある。
以上のようにして、ヒト由来の非癌肝臓組織を移植したモデル動物、例えば、ヒト由来の正常肝臓組織が移植されたモデル動物、ヒト肝炎の病態を示した肝炎モデル動物などを作製することができる。
正常肝臓組織が移植されたモデル動物は、各種物質の体内動態、肝臓に対する組織特異性などの動物試験を、よりヒトに近い状態で行うことができる。
また、各種物質の薬理作用、特に医薬品開発を目的とする薬効スクリーニング試験などにおいては、健常動物ではなく一定の病態状態にある疾患モデル動物を用いた試験法がより実際の臨床症状に近いため、薬効評価上も好ましい。それゆえ、本発明のモデル動物は、肝臓に関わるヒト疾患の原因解明、診断、および予防、並びに治療技術の開発にあたっては、疾患モデル動物を用いての実験が重要な役割を果たす。
また、毒性との関連でもモデル動物は重要である。薬物が代謝により変化して、反応性の高い活性代謝物になり、その活性代謝物が生体高分子（タンパク質、核酸、脂質など）と共有結合すれば、変異原性、ガン原生、抗原性、細胞毒性などを示す可能性がある。毒性試験は長期にわたって実施されるほど重要で、毒性を示す代謝的変化を予測することは、医薬品候補化合物の安全性を確認する上で必要不可欠となる。それゆえ、本発明のモデル動物は、上記のような毒性試験にも好適に用いることができ、よりヒトに近い状態で試験することができる。
以下、疾患モデル動物としての肝炎モデル動物について簡単に説明する。
ウイルス性肝炎は、肝炎ウイルスの感染による肝臓の炎症で、急性肝炎と慢性肝炎とがある。現在、ウイルス性肝炎の起因ウイルスとして、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型が確認されている。これらすべての型の肝炎ウイルスが急性肝炎を起こし、Ｂ型、Ｃ型は慢性肝炎患者に持続感染している。また、Ｄ型は常にＢ型と共存している。Ａ型肝炎ウイルスによる急性肝炎では慢性化することはないが、Ｂ型肝炎ウイルスによる急性肝炎による急性肝炎では頻度は低いものの慢性化する可能性があり、Ｃ型肝炎ウイルスによる急性肝炎では遷延化ないし慢性化する頻度が高い。
一方、慢性肝炎は、主にＢ型、Ｃ型肝炎ウイルスによるもので、臨床的には６ヵ月以上、肝機能異常や自覚症状のあるものである。また、慢性肝炎に感染した感染者のうち約１５〜２０％が肝硬変を起こし、肝硬変患者では、年率約１〜４％の割合で、原発性肝細胞癌を発症する。
このように、ウイルス性肝炎、特に慢性肝炎は、肝硬変を経て肝臓癌を発症して、場合によっては死に至る危険性のある疾患であるが、慢性肝炎の原因となる、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は、ヒト以外にはチンパンジーにしか感染しない。そのため、肝炎のモデル動物としてはチンパンジーが利用可能であるが、チンパンジーは高価であり殺すこともできないため、肝炎モデル動物として利用できない。しかしながら、本発明によれば、ヒト以外の唯一の実験動物である高価なチンパンジーを使用することなく、ヒトの肝炎に感染した肝炎モデル動物も作製することができる。
（２）本発明の肝炎モデル動物の有用性
上記（１）で説明した作製方法により得られるモデル動物は以下のような有用性がある。
▲１▼虚血に極めて弱い肝臓組織を、血管吻合することなく、しかも他の動物の組織上で生着させることができる。
▲２▼スタンフォード大学医学部など（Ｋ，Ｍａｒｉｏｎ  ＰＬ，Ｎａｋａｉ  Ｈ，Ｍｅｕｓｅ  Ｌ，Ｃｕｌｌｅｎ  ＪＭ，Ｂｏｒｄｉｅｒ  ＢＢ，Ｓｃｈｗａｌｌ  Ｒ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＨＢ，Ｇｌｅｎｎ  ＪＳ，Ｋａｙ  ＭＡ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０００  Ｍａｒ；６（３）：３２７−３３１．）の肝細胞をマウスの尻尾から注射する従来の方法では、マウス肝臓内にモザイク状にヒト肝臓細胞が埋め込まれているため、組織としてヒト肝臓組織を保持することは不可能である。一方、本発明は上記の従来法とは異なり、ヒト肝臓組織を移植しているため、薬物や種々の物質を肝細胞で検討するよりも生体により近く、臨床的にみても意義のあるモデル動物を提供できる。
▲３▼比較的短期間（１週間程度）で非癌部肝臓組織の生着したモデル動物を作製することが可能である。
▲４▼本発明のモデル動物の腎臓に、患者由来の肝臓組織を移植すれば、
ａ）モデル動物の腎臓と移植された肝臓組織との識別が容易である。
ｂ）同一個体の腎臓の左右、または、上部、中部、下部などに分けて移植することが可能である。それゆえ、同一条件での薬剤の効果等が比較できる。
▲５▼ヒト以外にＢ型肝炎およびＣ型肝炎に感染する唯一の実験動物である高価なチンパンジーを使用することなく、ヒト肝炎の病態を示した肝炎モデル動物が得られる。
▲６▼肝炎ウイルスに感染したヒト由来の肝臓組織を動物（特に実験動物として使いやすいマウス）で継代でき、ヒト肝炎の病態を示したモデル動物が得られる。
▲７▼肝炎の診断のための医薬品、肝炎の予防および／または治療のための医薬品のスクリーニング試験、遺伝子治療の効果判定などに好適に用いることができる。その結果、肝炎治療薬の開発が著しく容易になる。
▲８▼肝炎の治療薬の開発により、肝硬変・肝臓癌への進行を防ぐことができ、肝臓癌の早期発見・早期治療につながる。
▲９▼既存の肝炎ウイルスに限定されるものではなく、今後の研究によって、新たに起因ウイルスが発見された場合、その肝炎ウイルスによる肝炎にも適応し得る。
なお、上述の説明では、ヒトの非癌部肝臓組織を移植したモデル動物について説明したが、肝癌を発症したヒトの肝臓組織も同様に移植し、肝癌モデル動物を作製することも可能である。癌細胞は増殖が盛んであるため、ヌード動物の皮下でも充分に移植が可能である。
このように、本発明は、非癌部肝臓組織に限らず、肝癌を発症した肝臓組織を含んだすべてのヒトの肝臓組織が動物に移植され、動物体内においてヒト肝臓組織として維持することを可能にしたモデル動物およびその作製方法を提供するものである。
【実施例】  以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
〔実施例１〕（モデル動物の作製）
本実施例においては、Ｔ細胞、Ｂ細胞不全のスキッドマウス（ｓｃｉｄ  ｍｏｕｓｅ）を用いて、モデル動物の作製を行った。以下にその手順を示す。
上記スキッドマウスとして、本実施例ではＢＡＬＢ種のものを用いた。上記スキッドマウスには、前処理として抗アシアロＧＭ１抗体（Ｒａｎｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＡｓｉａｌｏＧＭ１  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製、型番ＣＬ８９５５）が投与された。抗アシアロＧＭ１抗体は、肝臓組織の移植３日前に２０μｇ、移植日の閉腹前（腹部の縫合前）に２０μｇ、移植後５日目に２０μｇ、および１０日目に２０μｇをそれぞれ腹腔内投与した。なお、比較のために、一部のスキッドマウスには、抗アシアロＧＭ１抗体の投与を行わなかった。
ヒトの非癌部肝臓組織として、▲１▼正常の肝臓組織、および、▲２▼Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎を起こした肝炎患者より摘出された肝臓組織を使用した。上記肝臓組織は、摘出した後数センチ角に切除され、氷冷した培養液の中に保存された。
上記スキッドマウスには、ネンブタール（萬有製薬製）を含む麻酔薬（生理食塩水１００ｃｃにネンブタール４ｃｃを加えたもの）が、注射器（２．５ｃｃ、針２７Ｇ）を用いて腹腔内に１ｃｃ投与され、麻酔がかけられた。２７Ｇの注射針を用いれば、マウスの腹壁に垂直に刺しても腸管が逃げるため、腸管を損傷させずに注射を行うことができる。麻酔がかけられたスキッドマウスは、手足をビニールテープで固定され、はさみにて腹部が正中切開された。このとき、腸管などを損傷しないように、皮膚、筋膜（ｆａｓｃｉａ）をそれぞれ別々に切開した。
続いて、スキッドマウスにマウス用の開創器をかけ、綿棒またはセッシを用いて腸管を分けていき、腎臓を露出させた。このとき、出血に対しては、綿棒にて圧迫することで対応する。その後、腎臓の背側に綿棒を挿入し、腎臓を脱転させた。そして、実体顕微鏡にて腎臓を観察しながら、腎被膜をマイクロセッシにて把持し、小切開を入れた。培養液中に保存されていた非癌部肝臓組織は、約２ｍｍ角の小片に切除され、セッシでスキッドマウスの腎皮膜を把持しつつ、肝臓組織の小片を切開した腎被膜下に挿入した。
このようにして、ヒトの非癌部肝臓組織の挿入が行われた後、腸管を腹腔内に戻し、腹部の切開部分は、縫合糸（３−０ｓｉｌｋ）を用いて縫合された。この縫合は、皮膚・筋膜の２層にてそれぞれ行われた。その後、上記スキッドマウスは、別のゲージに移され、約２時間程度で麻酔から覚醒した。
〔実施例２〕（移植された肝臓組織の生着の有無の判定）
実施例１において作製されたモデル動物の実施例１において作製されたモデル動物の生存率は１００％であった。即ち、麻酔から覚めた全てのマウスが生存した。
また、移植後２週間経過後に、上記マウスの腎被膜においてヒト肝組織の生着の有無が確認された。この確認実験は、実施の形態に説明するＨＥ染色法に基づいて行われた。その結果、生着率は、▲１▼正常の肝臓組織が移植されたモデル動物が５８％（１２例中７例）、▲２▼肝炎組織が移植された肝炎モデル動物が７０％（３０例中２１例）であった。
〔実施例３〕（抗アシアロＧＭ１抗体投与の有無による生着率の比較）
実施例１において作製されたモデル動物の抗アシアロＧＭ１抗体投与の有無による生着率の差について調査した結果を以下に示す。
▲１▼正常の肝臓組織が移植されたモデル動物
抗アシアロＧＭ１抗体を投与しなかった場合は、上記モデル動物１９匹中５匹において、ヒト肝組織の生着が確認された。抗アシアロＧＭ１抗体を投与した場合は、上記モデル動物１２匹中７匹において、ヒト肝組織の生着が確認された。この結果より、抗アシアロＧＭ１抗体を投与することによって、ヒト肝組織の生着率を高めることができることが確認された。これは、抗アシアロＧＭ１抗体の投与によって、モデル動物内のナチュラルキラー細胞が関与する免疫応答能を欠損させ、上記ナチュラルキラー細胞に依存する拒絶反応を抑制することができたためであると考えられる。
▲２▼肝炎組織が移植された肝炎モデル動物
抗アシアロＧＭ１抗体を投与しなかった場合は、上記肝炎モデル動物２０匹中８匹（生着率４０％）において、ヒト肝臓組織の生着が確認された。抗アシアロＧＭ１抗体を投与した場合は、上記モデル動物３０匹中２１匹（生着率７０％）において、ヒト肝臓組織の生着が確認された。
上記の結果によって、肝炎を発症したヒト肝組織の移植の場合にも、抗アシアロＧＭ１抗体の投与によって、生着率を高めることができると推測される。
〔実施例４〕（移植したヒトの肝臓組織のマウス体内での機能確認）
本実施例では、前述の実施例と同様の方法でマウス腎臓に、正常肝組織および肝細胞癌組織を移植し、移植部分の顕微鏡観察を行った。また、ヒト肝細胞を標的とするＬ粒子（特開２００１−３１６２９８（公開日２００１年１１月１３日）に記載のＨＢｓＡｇ粒子）に蛍光物質カルセインを取り込ませて投与し、移植部分の蛍光顕微鏡観察を行った。
抗アシアロＧＭ１抗体は、移植３日前、移植日の閉腹前（腹部の縫合前）、移植後３および６日後に、２０μｇをそれぞれ腹腔内投与した。
実施例１と同様にして、ヒト患者由来肝臓組織およびヒト肝細胞癌を摘出後、なるべく速やかにマウス腎臓の被膜下に移植した。なお、移植は、同一腎の上部（上極）および下部（下極）にそれぞれ行った。移植１０日後に、蛍光物質カルセインを取り込ませたＬ粒子２０μｇを、マウスの尾部静脈より注射で投与した。Ｌ粒子投与４日後（移植１４日後）、マウスを開腹して腎臓を摘出し、ＨＥ染色した後、移植部分の蛍光顕微鏡観察を行った（図１〜図３）。
その結果、図２のＨＥ染色の顕微鏡画像にも示すように、ヒト肝臓４およびマウス腎臓５共に、細胞が生きていることが確認された。図２中ヒト肝臓４とマウス腎臓５との境界を白線で示した。また、図３に示すように、蛍光顕微鏡観察では、移植部分のうち、ヒト肝臓４が顕著に蛍光強度が強いことが確認された。なお、図４に示すように、マウス腎臓以外の組織についても、蛍光顕微鏡により蛍光強度の平均値を測定した結果、Ｌ粒子は有意にヒト肝臓組織にのみ蛍光強度が高く、Ｌ粒子のヒト肝臓組織への高い特異性を示した。
以上の結果から、本発明のモデルマウスがヒト肝臓を保持したモデル動物として充分実用可能なことが証明された。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明によれば、これまで作製されていなかった、正常の肝臓組織、肝炎を発症した肝臓組織などのヒト由来の非癌部肝臓組織を動物で継代した新たなモデル動物を提供することができるので、各種物質の体内動態解析、肝臓に対する組織特異性の確認試験、肝炎の診断のための医薬品、肝炎の予防および／または治療のための医薬品のスクリーニング試験などに好適に用いることができ、よりヒトに近い状態で正確に動物試験を行うことが著しく容易になると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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