(57)【要約】式（Ｉ）で示される化合物、カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属する微生物を用いる式（Ｉ）中のＸが−Ｏ−を表わしＲが水酸基を表わす化合物（Ｆ−１４９０物質）の製造方法、Ｆ−１４９０物質を生産する能力を有するカニングハメラ・エスピー（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐ．）Ｆ−１４９０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８７）、及び式（Ｉ）で示される化合物を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤。2003076639.tif 000009（式中、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ２−を表わし、Ｒは、Ｘが−Ｏ−のときは水酸基を表わし、Ｘが−ＣＨ２のときは水素原子を表わす。）
2003076639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
2003076639.tif 000008
（式中、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ２−を表わし、Ｒは、Ｘが−Ｏ−のときは水酸基を表わし、Ｘが−ＣＨ２のときは水素原子を表わす。）で示される化合物またはその塩。
【請求項２】
式（Ｉ）中のＸが−Ｏ−を表わし、Ｒが水酸基を表わす請求の範囲１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
式（Ｉ）中のＸが−ＣＨ２−を表わし、Ｒが水素原子を表わす請求の範囲１に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属し、請求の範囲２記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養して、その培養物から請求の範囲２記載の化合物を採取することを特徴とする請求の範囲２記載の化合物の製造方法。
【請求項５】
請求の範囲２記載の化合物を生産する能力を有するカニングハメラ・エスピー（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐ．）Ｆ−１４９０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８７）。
【請求項６】
請求の範囲１記載の化合物またはその塩を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、式（Ｉ）
2003076639.tif 000003
（式中の記号は後記と同じ意味を表わす。）で示される化合物、カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属する微生物を用いる式（Ｉ）中のＸが−Ｏ−を表わしＲが水酸基を表わす化合物（Ｆ−１４９０物質）の製造方法、Ｆ−１４９０物質を生産する能力を有するカニングハメラ・エスピー（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐ．）Ｆ−１４９０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８７）、及び式（Ｉ）で示される化合物を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤に関する。
背景技術
破骨細胞は、骨髄細胞から分化して生成する細胞であり、乳がんなどのがん細胞の骨転移、リウマチ性関節炎あるいは骨粗鬆症など、数多くの疾患に関わっていることが知られている。従って、骨髄細胞から破骨細胞への分化を抑制することができれば、前述した疾患に対して、優れた治療効果を挙げることができると考えられる。そこで毒性が低くかつ骨髄細胞から破骨細胞への分化抑制作用が強い物質の開発が望まれているが、現在、微生物由来の低分子物質にはこのような性質をもつ物質の報告はない。
発明の開示
本発明の課題は、毒性が低く、かつ破骨細胞分化抑制作用を有する新規な化合物、それらの製造方法、その化合物を生産する能力を有する新規な微生物及びその化合物を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤を提供することにある。
なお、本明細書において、「破骨細胞分化抑制」の用語は骨髄細胞から破骨細胞への分化を抑制することを意味する。
本発明者らは、上記課題を解決するため、各地の土壌から微生物を分離し、それらが生産する代謝産物について研究を重ねた結果、新たに分離したカニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属する微生物が、破骨細胞分化抑制活性を示す物質を培養液中に生産していることを見出した。その培養液から有効物質を分離精製し、その物理化学的性質を調べたところ、得られた有効物質は、いかなる既知物質とも相違する後記の式（Ｉ）で示される新規化合物であり、かつ優れた破骨細胞分化抑制活性を有することを確認した。
また、本発明者らは、式（Ｉ）の化合物に構造類似の、式（ＩＩ）で示される新規類縁体化合物を合成して、その性質を調べたところ、同様に低濃度で破骨細胞分化抑制活性を有することを確認し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記の破骨細胞分化抑制活性を示す新規化合物またはその塩、それら化合物の製造方法、その化合物を生産する微生物、それら化合物を有効成分とする薬剤に関する。
１．式（Ｉ）
2003076639.tif 000004
（式中、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ２−を表わし、Ｒは、Ｘが−Ｏ−のときは水酸基を表わし、Ｘが−ＣＨ２のときは水素原子を表わす。）で示される化合物またはその塩。
２．式（Ｉ）中のＸが−Ｏ−を表わし、Ｒが水酸基を表わす前項１に記載の化合物またはその塩。
３．式（Ｉ）中のＸが−ＣＨ２−を表わし、Ｒが水素原子を表わす前項１に記載の化合物またはその塩。
４．カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属し、前項２記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養して、その培養物から前項２記載の化合物を採取することを特徴とする前項２記載の化合物の製造方法。
５．前項２記載の化合物を生産する能力を有するカニングハメラ・エスピー（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐ．）Ｆ−１４９０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８７）。
６．  前項１記載の化合物またはその塩を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、式（Ｉ）で示される化合物のうちＸが−Ｏ−を表わし、Ｒが水酸基を表わす化合物を、Ｆ−１４９０物質と命名した。
Ｆ−１４９０物質は、その分子式、物理化学的性質及び構造上の特徴によって、既知の化合物と明確に区別される新規物質である。
なお、本発明のＦ−１４９０物質の塩としては、製薬上許容される塩基（無機塩基及び有機塩基）との塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン等）との塩などが例示される。
さらに本発明は、カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属し、破骨細胞の分化抑制活性を示すＦ−１４９０物質を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から該物質を採取する該物質の製造方法、Ｆ−１４９０物質を生産する能力をもつカニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属する微生物、並びにＦ−１４９０物質を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤を提供するものである。
本発明に使用される微生物は、カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属し、本発明のＦ−１４９０物質を生産する能力を有する菌株であれば、どのようなものでも使用できる。そのような微生物の探索は、例えば以下のようにして行なうことができる。骨髄細胞の培養液に種々の微生物培養液の抽出液を加え、破骨細胞への分化の指標である酒石酸耐性酸性フォスファターゼ陽性細胞数を測定する。この細胞数が減少する、すなわち破骨細胞への分化が抑制された微生物の培養液から活性物質を単離、確認することにより、目的のＦ−１４９０物質を生産する能力をもつ微生物を得ることができる。
そのようにして見出された微生物として、例えば、本発明者らが土壌から分離したカニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属するＦ−１４９０株を挙げることができるが、この菌株に限らず、カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属し、本発明のＦ−１４９０物質を生産する能力を有する菌株であれば、それらの変異株、例えば、紫外線、エックス線、放射線、薬品等の変異処理により取得できる人工変異株ならびに自然変異株も含めて、すべて本発明に使用することができる。
以下、Ｆ−１４９０株の菌学的性状を説明する。
本菌株をポテトデキストロースアガー（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ：以下ＰＤＡと記す）、モルトエキスアガー（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ：以下ＭＥＡを記す。）、オートミールアガー（Ｏａｔｍｅａｌ  Ａｇａｒ：以下ＯＡと記す。）に接種し、２５℃で培養した結果、全ての寒天プレート上において菌糸は羊毛状で当初白色（ｗｈｉｔｅ）（Ａ１）を呈し、後に黄白色（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｗｈｉｔｅ）（４Ａ２）を経てクリーム色（ｃｒｅａｍ）（４Ａ３）を呈する。
生育速度は極めて速く、３日間の培養条件下で全てのプレートにおいて直径８５ｍｍのシャーレ全面に達し、１週間後にはシャーレのふたを持ち上げるほどの旺盛な生育を示す。また、全てのプレートにおいて可溶性色素の産生は認められない。なお、色調に関する記述は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー［Ｍｅｔｈｕｅｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｕｒ（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ＆Ｗａｎｓｃｈｅｒ，１９７８）］に従った。
形態的特徴として、光学顕微鏡により特徴的な胞子嚢柄（ｓｐｏｒａｎｇｉｏｐｈｏｒｅ）のみが観察され、胞子嚢果（ｓｐｏｒｏｃａｒｐ）は確認されない。気中菌糸に隔壁は極めて少なく、ほふく枝（ｓｔｏｌｏｎ）を有し、仮根（ｒｈｉｚｏｉｄ）の形成も確認される。胞子嚢柄はほふく枝などの気中菌糸より単生する。柄（ｓｔｉｐｅ）は平滑で、直線的な生育をする。先端に頂嚢（ｖｅｓｉｃｌｅ）を有し、その下方に不規則ないしは輪生した分枝（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）が観察される。分枝の先端にも小型の頂嚢を有する。頂嚢は亜球形から卵円形で幅は先端部のもので３０μｍ、分枝したもので最大が２０μｍとなる。胞子嚢（ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）及び分節胞子嚢（ｍｅｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）を有さず、頂嚢表面より一胞子性の小胞子嚢（ｓｐｏｒａｎｇｉｏｌｕｍ）のみを生じる。小胞子嚢は球形（ｇｌｏｂｅｓｅ）ないしは楕円形（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌ）で、大きさは６〜９μｍとなる。褐色を呈し、表面は短い針状（ｓｈｏｒｔ−ｅｃｈｉｎｕｌａｔｅ）となり、条線（ｓｔｒｉａ）は観察されない。
以上の菌学的性質から本発明者らは本菌株をカニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属に属すると判断し、本菌株をカニングハメラ・エスピー（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐ．）Ｆ−１４９０と命名し、平成１３年１０月２日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４８の受託番号で寄託し、平成１５年１月３１日付で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８７番号の国際寄託に移管した。
本発明のＦ−１４９０物質は上記菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造される。Ｆ−１４９０物質の生産菌としては、カニングハメラ属に属し、Ｆ−１４９０物質を生産する能力を有するものであれば、上記菌株に限らず全て本発明に利用できる。
上記微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による震盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養に用いられる培地としては、カニングハメラ属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成として、炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜等を単独または組み合わせて用いることができる。窒素源としてはファーマメディア、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源を単独または組み合わせて用いることができる。その他、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属塩、ビタミンＢ及びビオチン等のビタミン類も必要に応じ、添加使用することができる。
なお、培養中発泡が著しい場合には、各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。消泡剤の添加にあたっては、目的物質の生産に悪影響を与えない濃度とする必要がある。培地のｐＨは５〜９程度、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜２７℃に保つのがよい。培養日数は２〜１４日程度で、通常３〜５日である。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。培養液中に蓄積された本発明のＦ−１４９０物質はろ過、遠心分離等の既知の通常の固液分離手段によって菌体を分離し、そのろ液からの抽出により回収可能である。
Ｆ−１４９０物質の分離、精製は、公知の種々の方法を選択、組み合わせて行なうことができる。例えば、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出や、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）等のポリスチレン系吸着樹脂、シリカゲル、アルミナ、活性炭などの担体を用いるカラムクロマトグラフィーによる方法を用いることができる。これらの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いることができる。さらにセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等によるゲルろ過、シリカゲル、アルミナ等による薄層クロマトグラフィー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を用いることができる。これらの方法を単独または適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、分離、精製することができる。
以上のようにして得られるＦ−１４９０物質は以下に示す物理化学的性質を有する。
（１）形状：白色粉状、
（２）分子式：Ｃ１２Ｈ１３ＮＯ６、
（高分解能ＦＡＢマススペクトロメトリーによるＣ１２Ｈ１４ＮＯ６の計算値  ｍ／ｚ：２６８．０８２１（Ｍ＋Ｈ）＋  実測値  ｍ／ｚ：２６８．０８６１）、
（３）比旋光度：［α］Ｄ２２−５７．５°（ｃ  ０．４，メタノール）、
（４）融点：１２５〜１３１℃（ｄｅｃ．）、
（５）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果は、図１のとおりである。また特徴的な吸収は次のとおりである。
ＩＲ  νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３３８０，１６８０，１６２０，１５００，１４４０，１３７５，１２６０，１０９０，１０３５。
（６）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した結果は、図２のとおりである。また特徴的な吸収は次のとおりである。
ＵＶ  λｍａｘｎｍ：２１７，２４５（ｓｈ），３２８。
（７）溶解性：酢酸エチル、メタノール、ジメチルスルホキシド、水に易溶、ヘキサンに難溶。
（８）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジンに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した結果は図３のとおりである。また各シグナルの化学シフト、多重度、スピン結合定数は次のとおりである。
δ  ８．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，８Ｈｚ），７．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，８Ｈｚ），６．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｓ），４．６４（１Ｈ，ｍ），４．４０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２，５，１１Ｈｚ），３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１，１１Ｈｚ），３．３０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２，５，１３Ｈｚ），２．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１，１３Ｈｚ）。
（９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジンに溶解し、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した結果は図４のとおりである。また各シグナルの化学シフト、多重度は次のとおりである。
δ  １７１．７（ｓ），１４２．６（ｓ），１３５．６（ｓ），１２４．８（ｄ），１２１．１（ｄ），１１６．６（ｄ），１１４．１（ｓ），９２．３（ｓ），８１．２（ｄ），７２．０（ｔ），６４．１（ｄ），４５．９（ｔ）。
さらに、本発明者らは、Ｆ−１４９０物質に構造が類似する、式（Ｉ）においてＸが−ＣＨ２−を表わし、Ｒが水素原子を表わす新規類縁体化合物（以下、Ｆ−１４９０−Ａと呼ぶ。）を合成し（後述の実施例２参照）、Ｆ−１４９０物質と共にその生理活性を試験した。
本発明に係るＦ−１４９０物質及びＦ−１４９０−Ａ物質は、優れた破骨細胞分化抑制活性を有しており、しかも、細胞に対する毒性が低いので破骨細胞の活性亢進に随伴する疾患、例えばがん細胞の骨転移、リウマチ性関節炎、骨粗鬆症などの治療薬としての使用が期待される。
本発明に係る物質の破骨細胞分化抑制活性は、例えば、以下に述べる方法により測定することができる。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌性、６週令）から骨髄細胞を集め、２４穴マイクロプレートに１０％胎仔牛血清、１ｍＭピルビン酸、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ギブコ社）、５００μＭ  ２−メルカプトエタノール、２００ｎｇ／ｍｌ副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルビン酸を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１．５×１０６個／ウエルとなるように調製して１ｍｌずつ撒くと同時に試験試料を適当量添加する。培養後２及び４日目に培地の半量を試験試料を含む上記培地で交換する。培養７日目に培地を吸引除去し、アセトン：メタノール（１：１）液で細胞を固定後、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ陽性細胞を染色した。すなわち、染色液（０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＭＸ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（シグマ社）、０．６ｍｇ／ｍｌ  Ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ  ｓａｌ  （シグマ社）、２０ｍＭ酒石酸を含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２））を各ウエルに０．４ｍｌ加え、３７℃で１時間反応させる。発色後、破骨細胞への分化の指標である酒石酸耐性酸性フォスファターゼ陽性細胞数を顕微鏡下で測定する。
試験試料中に破骨細胞分化抑制に有効な物質が含まれる場合、酒石酸耐性フォスファターゼ陽性細胞の出現は抑制される。また試験試料の濃度に対する前記細胞数の変化により、この試験試料の有効な濃度域が求められる。
本発明のＦ−１４９０物質及びＦ−１４９０−Ａ物質は下記表１に示すとおり、低濃度で骨髄細胞の破骨細胞への分化を抑制した。
2003076639.tif 000005
また、本発明のＦ−１４９０物質及びＦ−１４９０−Ａ物質は下記表２に示すとおり各種培養細胞に対してほとんど毒性を示さない。
2003076639.tif 000006
なお、試験は、以下のとおり行なった。各種マウスがん細胞（Ｌ１２１０（白血病）、Ｃｏｌｏｎ２６（結腸がん）、Ｂ１６ＢＬ６（悪性黒色腫））を１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、それぞれ２×１０４個／ウエルとなるように調製し、９６穴マイクロプレートに０．１ｍｌずつ撒いた。同時に所定量のＦ−１４９０物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２を含む空気下で４８時間培養した。さらに０．５％のＭＴＴ（３−［４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］２，５−ｂｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を１０μｌ加え４時間培養した。培養後、０．１ｍｌの１０％ＳＤＳ−０．０１Ｎ塩酸を加え、５７０ｎｍの吸光度を測定し、５０％増殖阻害濃度を求めた。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の記載により限定されるものではない。
実施例１：Ｆ−１４９０物質生産菌の培養とＦ−１４９０物質の分離精製
カニングハメラ・エスピー（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐ．）Ｆ−１４９０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８７）株の斜面培地（ポテトデキストロースアガー）から１白金耳を５０ｍｌの種母培地（ポテト澱粉２％、グルコース１％、大豆粉（エスサンミート：味の素社製）２％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ無調整）を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２５℃で２日間ロータリーシェーカー上で培養して種培養液を得た。生産培地として水飴４％、ペプトン（極東製薬社製）２％、酵母エキス１％、硫酸マグネシウム０．５％、リン酸二水素カリウム０．９％からなる培地を用い、５００ｍｌ容の三角フラスコにそれぞれ６０ｍｌを入れて殺菌後、種培地を１％ずつ接種した。２５℃で４日間ロータリーシェーカー上で培養した後、得られた培養液２０Ｌを遠心分離器にかけ、培養ろ液及び菌体に分離した。
得られた培養ろ液を６Ｎ塩酸でｐＨ２に調整後、水で平衡化した５Ｌの吸着樹脂ダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）ＨＰ−２０（三菱化学社製）カラムに通過させた。活性成分が吸着されたＨＰ−２０カラムを２０％メタノール水１０Ｌで洗浄した後、メタノール１０Ｌで活性成分を溶出した。溶出液よりエバポレーターでメタノールを留去し、酢酸エチル２Ｌを加え撹拌した。この酢酸エチル層をとり、水２Ｌ加えて撹拌しながら、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整した。静置し、二層に分離した後、水層を分取し、１Ｎ塩酸でｐＨ２に調整した。さらに酢酸エチル２Ｌを加えて抽出した後、酢酸エチル層を減圧濃縮して褐色油状物質６．１ｇを得た。
この褐色油状物質を少量のメタノールに溶解してシリカゲルにまぶし、クロロホルムで充填した４００ｍｌ容のシリカゲルカラムに供した。クロロホルム−メタノール混合液（１５：１）１Ｌで洗浄後、クロホルム−メタノール混合液（１０：１）１Ｌで溶出した。このようにして得られた活性画分を減圧濃縮して黄色油状物質０．３９ｇを得た。さらにこれを少量のメタノールに溶解してシリカゲルにまぶし、トルエンで充填したシリカゲルカラム（５０ｍｌ）に供した。トルエン−アセトン混合液（３：１）１５０ｍｌで洗浄後、トルエン−アセトン混合液（２：１）１５０ｍｌで溶出した。活性物質を含む画分を集めて減圧濃縮し、黄色粉状物質１０６ｍｇを得た。
このようにして得た黄色粉状物質を少量のメタノールに溶解し、２００ｍｌのセファデックスＬＨ−２０カラム（ファルマシア社製）に供し、メタノールで溶出した。活性画分を集めて減圧濃縮し、Ｆ−１４９０物質２０ｍｇを得た。
実施例２：Ｆ−１４９０−Ａ物質の合成
３−ヒドロキシアントラニル酸１００ｍｇ及び１，２−シクロヘキサンジオン４００ｍｇのメタノール２０ｍｌ懸濁液に氷冷下、撹拌しながら水素化ホウ素ナトリウム１ｇを少量づつ３０分間で加えた。添加終了後、１時間室温で撹拌した後再び氷冷し、１Ｎ塩酸を加えｐＨ７に調整し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をプレパラティブＴＬＣ（ヘキサン−酢酸エチル１：１）によって、Ｒｆ値０．６にリンモリブデン硫酸で加熱下で呈色する単一バンドを精製し、９０ｍｇの目的物Ｆ−１４９０−Ａを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルからＦ−１４９０−Ａ物質は以下に示す構造を有することが明らかとなった。
2003076639.tif 000007
産業上の利用可能性
Ｆ−１４９０物質及びＦ−１４９０−Ａ物質は、優れた破骨細胞分化抑制活性を有し、また培養細胞に対する毒性が低いので、破骨細胞の活性亢進に随伴する疾患への治療薬としての利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｆ−１４９０物質のＫＢｒ法での赤外部吸収スペクトルである。
図２は、Ｆ−１４９０物質のメタノール溶液での紫外部吸収スペクトルである。
図３は、Ｆ−１４９０物質の重ピリジン溶液での１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルである。
図４は、Ｆ−１４９０物質の重ピリジン溶液での１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルである。
図５は、Ｆ−１４９０−Ａ物質の重メタノール溶液での１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルである。
図６は、Ｆ−１４９０−Ａ物質の重メタノール溶液での１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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