(57)【要約】コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有する酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、該酵素等の遺伝子工学的な生産、該酵素に基づくＧａｌＮＡｃ修飾ペプチドあるいはＧａｌＮＡｃ修飾タンパク質などの基質としての生産、該酵素に基づく未知Ｏ−結合型糖鎖の付加したタンパク質あるいは未知ペプチドのＯ−結合型糖鎖修飾位置の同定や、該遺伝子等に基づく疾患の診断を可能にすること。配列表の配列番号１−７に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、基質となるコアタンパク質あるいはペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をα１結合で転移する活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１−７に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、タンパク質あるいはペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をα１結合で転移する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は、配列番号１−７に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質は、配列番号１−７に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、配列番号１−７に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
配列番号８−１４に示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
配列表の配列番号８に示される塩基配列の１ｎｔ〜１６２９ｎｔ、配列番号９に示される塩基配列の１ｎｔ〜１６５９ｎｔ、配列番号１０に示される塩基配列の１ｎｔ〜１８１２ｎｔ、配列番号１１に示される塩基配列の１ｎｔ〜１７４６ｎｔ、配列番号１２に示される塩基配列の１ｎｔ〜１８２４ｎｔ、配列番号１３に示される塩基配列の１ｎｔ〜１７９７ｎｔおよび配列番号１４に示される塩基配列の１ｎｔ〜１９２０ｎｔまでの塩基配列を有する請求項６記載の核酸。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
【請求項１０】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
【請求項１１】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸、又は当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする測定用核酸。
【請求項１２】
請求項８記載の核酸中の部分領域と相補的な配列を有する請求項１１記載の測定用核酸。
【請求項１３】
プローブ又はプライマーである請求項１１又は１２記載の測定用核酸。
【請求項１４】
塩基数が１５塩基以上である請求項１３記載の測定用核酸。
【請求項１５】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の測定用核酸のうち少なくとも一つ含むマイクロアレイ。
【請求項１６】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の測定用核酸及び測定説明書を含む測定用キット。
【請求項１７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を含む糖鎖合成キット。
【請求項１８】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を用いて合成したＴｎ抗原（ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を持つ多抗原性の糖ペプチドを用いた免疫感作療法。
【請求項１９】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を用いた、未知Ｏ−結合型糖鎖の付加したタンパク質あるいは未知ペプチドのＯ−結合型糖鎖修飾位置の同定法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、コアタンパク質、ペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をα１結合で転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を測定するための核酸および測定用キットに関する。
背景技術
これまでに、コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有するヒトの酵素としては８種類が知られている［末尾の参考文献１−８を参照］。しかし、それぞれの遺伝子で発現組織や転移可能なアミノ酸配列や周囲のアミノ酸への糖修飾のパターンにより、使用される酵素は異なっている。即ち、全てのヒトのタンパク質にＮ−アセチルガラクトサミン修飾を施すには、あらゆる種類のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素が必要になると考えられる。さらに、コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有する酵素はＯ−結合型糖鎖の根元酵素であり、この酵素の変化による細胞表面やタンパク質上の糖鎖密度の変化や糖鎖構造の欠如により、多数の疾患が引き起こされることが知られている。具体的な例としては、癌細胞の糖鎖修飾は正常細胞と比較して異なることが多い。最も特徴的な癌細胞の糖鎖変化は、ムチン型（Ｏ−結合型）糖鎖において起こり、これらの変化は癌細胞の浸潤や転移に関連し、癌細胞の脱分化や成長速度の上昇を反映する。そのＯ−結合型糖鎖の根元にはＧａｌＮＡｃが存在する。細胞表面のＧａｌＮＡｃの密度あるいは露出度の変化はＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ特異的なＣａ２＋依存性レクチンをもつマクロファージの癌細胞の認識や接着度合と関連している［末尾の参考文献９を参照］。さらに、合成したＴｎ抗原を持つ多抗原性のＯ−結合型糖ペプチドは、免疫感作療法に使用され、腫瘍耐性マウスの生存率が増加するという報告もなされている［末尾の参考文献１０を参照］。このように、糖転移酵素の解析は、疾患の診断や治療においても重要であると考えられる。
発明の開示
コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有する酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、該酵素等の遺伝子工学的な生産、該酵素に基づくＧａｌＮＡｃ修飾ペプチドあるいはＧａｌＮＡｃ修飾タンパク質などの基質としての生産、該酵素に基づく未知Ｏ−結合型糖鎖の付加したタンパク質あるいは未知ペプチドのＯ−結合型糖鎖修飾位置の同定や、該遺伝子等に基づく疾患の診断が可能になる。しかしながら、従来のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素では受容体基質としないにもかかわらず、生体内に糖鎖構造が存在することから、未だ分離精製もされていない該酵素が存在し、かつ、該酵素の単離及び遺伝子の同定の手がかりはない。そのために、該酵素に対する抗体も作製されていない。
発明の詳細な説明
本発明は、配列表の配列番号１−７に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有しコアタンパク質、ペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸及び測定用キットを提供する。さらに、本発明は、ペプチドコア糖鎖構造を合成するため、他の糖転移酵素の基質及びその調製方法を提供する。本発明はまた、本発明のタンパク質を含む糖鎖合成キットを提供し、本発明キットは糖鎖合成装置及び糖鎖合成試薬とともに使用することができる。さらに、該酵素を用いて合成したＴｎ抗原（ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を持つ多抗原性の糖ペプチドの免疫感作療法及び試薬、キット類を提供する。さらに、該酵素を用いた、未知Ｏ−結合型糖鎖の付加したタンパク質あるいは未知ペプチドのＯ−結合型糖鎖修飾位置の同定法及び試薬、キット類を提供する。
発明を実施するための最良の形態
（１）タンパク質
下記実施例において詳述する方法によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列表の配列番号８−１４に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番号１−７には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。
下記実施例で得られた本発明のタンパク質は、次の性質を有する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記実施例において詳述されている。
作用：  コアタンパク質とポリペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する（ＥＣ  ２．４．１．４１、ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＧａｌＮＡｃ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。触媒する反応を反応式で記載すると、
ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ＋ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓ／Ｔ）＜＝＞
ＵＤＰ＋Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−１−Ｓ／Ｔ−ｐｅｐｔｉｄｅ）
基質特異性：  コアタンパク質のポリペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基。
なお、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１−７に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、コアタンパク質、ペプチド中のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。
ここで、「複数個」とは、好ましくは１−２００個、より好ましくは１−１００個、さらにより好ましくは１−５０個、最も好ましくは１−２０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保持される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１−１０個である。
このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１−７に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１−７に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有するものが特に好ましい。
本発明のタンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号１−７のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
本願明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｐ．２４４４−２４４８，１９８８）に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる修飾タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような修飾タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
本発明のタンパク質は、例えば、後述の実施例に従って、本発明の核酸による配列番号２に記載のＤＮＡ配列を大腸菌、酵母、昆虫、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
本発明によって、このタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、前記酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。
（２）核酸
本発明は、配列番号１−７で示されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２に示されている。配列２に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下（例えば、５  ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ，６  ｘ  ＳＳＣ，０．５％  ＳＤＳ又は０．１％  ＳＤＳといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反応を行なう）において、ハイブリダイズし、かつ、上記修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に入る。
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
本発明の核酸は、例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子の塩基配列をクエリーとして塩基配列の検索を行い、ＥＳＴ配列を得ることができた。さらに、この配列から見出したゲノム配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてｃＤＮＡライブラリーなどから本発明核酸（例えば本発明ＤＮＡ）を調製することができる。
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５）］，ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）；Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１）］、及び転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０）］、及びＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
後述する実施例に示すように、各種プライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物としてＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して本発明の核酸を得ることができる。
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７９）に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タンパク質」をも包含する。
（３）組換えベクターと形質転換体
本発明によれば、単離した本発明の核酸を含む組換えベクターが提供される。プラスミド等のベクターに本発明核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＴＢ１、ＬＥ３９２、ＸＬ−３９２、又はＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が例示されるが、これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明酵素を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明発現ベクターは上記の本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理及び連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いることもできる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物とドナーベクターとから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、哺乳類用発現ベクターとしてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎなどが好ましく、大腸菌用発現ベクターとしてｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡ０８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃｐ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
上記「本発明発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。本発明の形質転換体をえるための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）、サル（例えば、ＣＯＳ−１）由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
ところで、「本発明の核酸」は、ヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明酵素」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特に哺乳類細胞を選択することが好ましい。動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、入工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
本発明の発現ベクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
なお、組換えベクターの構築及びそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が下記実施例２に詳述されている。
（４）タンパク質の単離・精製
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させて、その培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
本発明のタンパク質は、上記の如く調整された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
本発明のタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
本発明のタンパク質を、セリン、スレオニン残基を有するコアタンパク質、ペプチド配列、糖タンパク質、オリゴ糖または多糖等に作用させることにより、Ｎ−アセチルガラクトサミンがα１結合で転移される。従って、本発明のタンパク質は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、このタンパク質を免疫原として動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該タンパク質を測定することが可能になる。従って、本発明のタンパク質およびこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
本発明のタンパク質はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号４１）であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ  ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
具体的には、後述される実施例２に記載されるように、本発明のタンパク質を発現する発現ベクターにＦＬＡＧのｃＤＮＡを挿入し、ＦＬＡＧ標識したタンパク質を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体によって、該タンパク質の発現を確認することができる。
（５）測定用核酸
本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする、前記本発明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明により提供された。ここで、「特異的」とは、検査対象となる細胞中に存在する他の核酸とハイブリダイズせず、上記本発明の核酸とのみハイブリダイズするという意味である。測定用核酸は、上記本発明の核酸に示される塩基配列を有する核酸中の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましいが、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えないことが多い。尚、「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
（ａ）プライマー
本発明測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、本発明測定用核酸は、オリゴヌクレオチドであって、
配列番号１−７に示すタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−５０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−７０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のプライマーは、本発明核酸の部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。
なお、本発明のプライマーの塩基数は１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、５０塩基以下である。
（ｂ）プローブ
本発明測定用核酸をプローブとして使用する場合、本発明測定用核酸は、配列番号８−１４に記載の塩基配列の全体又は部分領域と相同的な配列を有することが好ましい。本発明の測定用核酸が、ｃＤＮＡプローブの場合、塩基数は、１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上で、それぞれ遺伝子のコード領域の全長以下が好ましい。配列番号８−１４に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と２０％以下、好ましくは１０％以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。また、本発明の測定用核酸が、合成オリゴヌクレオチドの場合、塩基数は１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、長さによるが、配列番号８−１４に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と１または２塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たし得る。また、前述のプライマーも本発明のプローブとして使用し得る。
本発明のプローブには、該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。被検核酸またはその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。
（ｃ）マイクロアレイ
本発明測定用核酸は、マイクロアレイとして使用することができる。マイクロアレイは、ゲノム機能の大量で迅速な解析を可能にする手段である。具体的には、固相基盤、例えばガラス上に高密度に固定した多数の異なった核酸プローブに、標識した核酸をハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを検出し、得られたデータを解析するものである。本明細書において「マイクロアレイ」というときは、固相基盤、例えば、メンブラン、フィルター、チップ、ガラス上に、本発明測定用核酸を配列したものをいう。
（ｄ）被検核酸の測定
被検核酸の部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例３には、ヒト細胞中の本発明のタンパク質のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体的に詳述されている。また、被検核酸の測定には、前記マイクロアレイを使用することもできる。
ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行なうと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行なうことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。
本発明の酵素を、セリン、スレオニン残基を有するペプチト、コアタンパク質、糖タンパク質等に作用させることにより、Ｎ−アセチルガラクトサミンをα１結合させる。従って、本発明の酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明の酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１の塩基配列決定
既存のＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子（Ｘ８５０１８、Ｘ８５０１９、Ｘ９２６８９、Ｙ０８５６４、Ｙ０８５６５、ＡＪ００２７４４、ＡＢ０３２９５９、ＡＢ０４０６７２）と類似遺伝子の高い相同性を有するアミノ酸配列領域を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子における配列番号：Ｘ８５０１８、Ｘ８５０１９、Ｘ９２６８９、Ｙ０８５６４、Ｙ０８５６５、ＡＪ００２７４４、ＡＢ０３２９５９、ＡＢ０４０６７２である。また検索は、Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）］等のプログラムを利用した。
その結果、ＥＳＴ配列Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０３２９５６が見出された。ＡＢ０３２９５６の配列において、そのうちのヌクレオチド１１８−１７４５に新規遺伝子のＯＲＦが見出された。次に、表１で示すプライマー（配列番号１５−１７）を用いて、後述の実施例８で述べる方法で長さ１６２９塩基の遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。後述する実施例１１及び１２により、この新規遺伝子の翻訳産物がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性を示したことから、この新規ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子をＧａｌＮＡｃＴ−１１と命名した（配列番号８）。
実施例２
遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２の塩基配列決定
実施例１と同様の検索法を用いて、ＥＳＴ配列Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ０２２７５３が見出された。ＡＫ０２２７５３の配列において、ヌクレオチド６２−１７３５に新規遺伝子のＯＲＦ領域が見出された。表１で示すプライマー（配列番号１８−２０）を用いて、後述の実施例８で述べる方法で遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定したところ、長さ１６５９塩基の遺伝子が得られた。この遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＫ０２２７５３と異なるＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆｏｒｍであることが判明した。後述する実施例１１及び１２により、この新規遺伝子の翻訳産物がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性を示したことから、この新規ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子をＧａｌＮＡｃＴ−１２と命名した（配列番号９）。
2003057887.tif 000002
2003057887.tif 000003
実施例３
遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の塩基配列決定
実施例１で述べた同様な検索法を用いて、ＥＳＴ配列Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＧ７７２１９５、ＢＦ３５９６７１，ＢＦ３５９６７７，ＢＦ３５９６８０，ＡＫ０２３７８２が見出された。これらのＥＳＴはＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いた塩基配列のアラインメント分析から同一遺伝子由来のＥＳＴであることが判明した。そのうちＢＧ７７２１９５のヌクレオチド１３９−１４１に開始コドン、ＡＫ０２３７８２のヌクレオチド１２７６−１２７８に終止コドンを発見した。そして、表１で示すプライマー（配列番号２１−２３）を用いて、後述の実施例８で述べる方法で遺伝子をクロニーグし、塩基配列を決定したところ、長さ１８１２塩基の遺伝子が得られた。後述する実施例１１及び１２により、この新規遺伝子の翻訳産物をＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性が示したことから、この新規ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子をＧａｌＮＡｃＴ−１３と命名した（配列番号１０）。
実施例４
遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の塩基配列決定
実施例１と同様の検索法を用いて、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＴ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ０２４８６５、ＢＥ６７７８１３，ＡＩ８００９２３，またはＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３６０８４が見出された。ＧＥＮＥＴＹＸを用いた塩基配列のアラインメント解析から、ＡＬ１３６０８４のヌクレオチド５２８６−５６５８の塩基配列、ＥＳＴの  ＡＫ０２４８６５、ＢＥ６７７８１３，ＡＩ８００９２３の塩基配列は同一遺伝子由来の配列であることが判明した。そのうち、ＡＬ１３６０８４のヌクレオチド５２８６−５２８８に開始コドンが存在し、ＡＫ０２４８６５のヌクレオチド１３１７−１３１９に終止コドンが存在していることを発見した。そして、表１で示すプライマー（配列番号２４−２６）を用いて、後述の実施例８で述べる方法で遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定したところ、長さ１７４６ｂｐｓの遺伝子が得られた。実施例１１及び１２により、この新規遺伝子の翻訳産物がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性を示したことから、この新規ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子をＧａｌＮＡｃＴ−１４と命名した（配列番号１１）。
実施例５
遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１５の塩基配列決定
実施例１と同様の検索法を用いて、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＴ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＧ４２０５２８、ＢＧ６７５５２７が見出された。以上のＥＳＴ配列はＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの脳由来のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０５０５１３とそれぞれの部分に相同性を示したので、同一のＨｕｍａｎ遺伝子由来の塩基配列であると考えられた。そのうちＢＧ４２０５２８においては、ヌクレオチド１９−２１に翻訳開始コドンが存在した。しかし、この遺伝子の翻訳終止コドンが不明のため、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社の肺のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡを用いて３’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）により情報を取得した。
具体的には、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｌｕｎｇ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｃａｔ．７４０８−１）付属のＡＰ１プライマーと（ＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、ＡＰ２のアダプターがついている）、見出したＢＧ６７５５２７配列のヌクレオチド７３１−７５５までの部分に設定したプライマーＧＰ１５１（ＣＣＧＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣ）（配列番号３６）でＰＣＲ（９４℃５秒、６８℃４分、を４０サイクル）を行った。常法により精製し、塩基配列を決定したところ終止コドンを発見した（配列番号１２）。
そして、表１で示すプライマー（配列番号２７−２９）を用いて、後述の実施例８で述べる方法で遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定したところ、長さ１８２４塩基の遺伝子が得られた。後述する実施例１１及び１２により、この新規遺伝子の翻訳産物がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性を示したことから、この新規ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素をＧａｌＮＡｃＴ−１５と命名した（配列番号１２）。
実施例６
遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６の塩基配列決定
実施例１と同様の検索法を用いて、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＴ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＦ５２７５６９、ＡＵ１２１２７９が見出された。さらに、ゲノム配列ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＴ−００７７９９．４が見出され、上記２つのＥＳＴが同一遺伝子であることを見出した。しかし、翻訳開始点は不明であったので、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社の胎児脳のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡを用いて５’ＲＡＣＥならびにクローニングを行った。
具体的には、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｆｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ１プライマーと（ＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、ＡＰ２のアダプターがついている）、見出した配列部分に設定したプライマーＧＰ１５７（５’−ＡＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＧＣＣ−３’）（配列番号３７）でＰＣＲ（９４℃５秒、６８℃４分、を４０サイクル）を行った。さらに、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ２プライマーと、配列部分に設定したプライマーＧＰ−１５８プライマー（５’−ＴＴＣＣＧＣＴＣＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＣＣＣＧＴＧ−３’）（配列番号３８）でｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（９４℃５秒、６８℃４分、を４０サイクル）を行った。目的とするフラグメントをゲルから切りだし、常法により精製し、塩基配列を決定した。
さらに、決定した配列の情報をもとに、再度５’ＲＡＣＥを行った。具体的にはＡＰ１プライマーとＧＰ−１５８プライマーでＰＣＲ（９４℃５秒、６８℃４分、を４０サイクル）を行った。その後、ＡＰ２プライマーとＯ６−Ｒ３プライマー（５’−ＧＧＴＣＴＣＣＧＧＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧ−３’）（配列番号３９）を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（９４℃５秒、６８℃４分、を４０サイクル）を行った。目的とするフラグメントをゲルから切りだし、常法により精製し、塩基配列を決定した。
最終的に、表１で示すプライマー（配列番号３０−３２）を用いて、後述の実施例８で述べる方法で遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定したところ、長さ１７９７塩基の遺伝子が得られた。後述する実施例１１及び１２により、この新規遺伝子の翻訳産物がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性を示したことから、この新規ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子をＧａｌＮＡｃＴ−１６と命名した（配列番号１３）。
実施例７
遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の塩基配列決定
実施例１と同様の検索法を用いて、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＴ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＧ６９９３４６，ＢＧ７１４１７８，ＢＧ７１５９７７が見出された。これらのＥＳＴ配列はヒトゲノム配列ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０９０９３５と相同性が見出され、Ｇｅｎｓｃａｎ  ＤＮＡ解析予測ソフトにより、ヌクレオチド５１１８５−５１３０４の領域に、翻訳開始コドンを含むエキソンとヌクレオチド１０３４４５−１０３５３３の領域に翻訳終止コドンを含むエキソンを見出した。この情報に従い、表１で示すプライマー（配列番号３３−３５）を用いて、後述の実施例８で述べる方法で遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定したところ、長さ１９２０塩基の遺伝子が得られた。後述する実施例１１及び１２により、この新規遺伝子の翻訳産物がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性を示したことから、この新規ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子をＧａｌＮＡｃＴ−１７と命名した（配列番号１４）。
実施例８
７種類のＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子の発現ベクターへの組込み
７種類のＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子の発現系を作成するため、まず７種類のＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子全長あるいは遺伝子の一部をインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＤＯＮＲ（商標）２０１およびｐＦａｓｔＢａｃ由来のデスティネーションベクターに組込み、さらにインビトロジェン社のＢａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄを作成した。以下に詳細を述べる。
（１）ＧａｔｅｗａｙシステムによるｐＦａｓｔＢａｃへの組込み
▲１▼エントリークローンの作成
上記の実施例１−７で得られた各遺伝子配列により、表１で示したプライマーセット及びＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４６  １７３）を用いて、９４℃１５秒、６８℃３分を３０サイクルの反応条件で各ＤＮＡ断片を増幅した。目的の断片をアガロースゲル電気泳動後のゲルから切りだし、精製後ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組込んだ。各遺伝子に対するプライマーＦ１とＲで増幅されたＤＮＡ断片は各遺伝子の全長ＯＲＦ、各遺伝子に対するプライマーＦ２とＲで増幅されたＤＮＡ断片は活性測定用トランケート型遺伝子としてｐＤＯＮＲ２０１へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１  １μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ｍｉｘ  ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして行った。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを１μｌ加えて３７℃で１０分おき反応を停止した。
その後上記ｍｉｘ全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクターを抽出・精製した。
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（ラムダファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデスティネーションベクターと混合することで、挿入部位がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
まずエントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＦを０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ｍｉｘ  ２μｌを２５℃で１時間反応させ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを１μｌ加えて３７℃１０分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔが生成される）。ｐＦＢＩＦは、ｐＦａｓｔＢａｃ１にＩｇκ（ＭＨＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ）（配列番号４０）とＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号４１）のシーケンスを加えたもので、ＯＴ３（５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ−３’）（配列番号４２）を鋳型に、プライマーＯＴ２０（５’−ＣＧＧＧＡ  ＴＣＣＡＴ  ＧＣＡＴＴ  ＴＴＣＡＡ  ＧＴＧＣＡ  Ｇ−３’）（配列番号４３）と、ＯＴ２１（５’−ＧＧＡＡＴ  ＴＣＴＴＧＴ  ＣＡＴＣＧ  ＴＣＧＴＣ  ＣＴＴＧ−３’）（配列番号４４）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍ  Ｈ１とＥｃｏ  Ｒ１で挿入して得られたものである。Ｉｇκは発現タンパク質を分泌型にするため、ＦＬＡＧタグは精製のため挿入した。
（２）Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄの作成
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＴとｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なＢａｃｍｉｄにＧａｌＮＡｃ−Ｔその他の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂａｃｍｉｄを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がＢａｃｍｉｄへとりこまれるというものである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
即ち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬＢプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。
実施例９
Ｂａｃｍｉｄの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたＢａｃｍｉｄに目的配列が挿入していることを確認した後、このＢａｃｍｉｄを昆虫細胞Ｓｆ２１に導入した。即ち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１  ｃｅｌｌ  ９ｘ１０５  ｃｅｌｌ／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ）を加え、２７℃で１時間培養して細胞を接着した。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ）精製したｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡ  ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ  １００μｌを加えた。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ）Ｃｅｌｌ  ＦＥＣＴＩＮ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ  １００μｌを加えた。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡおよびＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ  ２ｍｌを加えた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを混合して作製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩ  ８００μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を細胞に加え、２７℃で５時間インキュベートした。その後、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓを除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞  １ｘ１０７  ｃｅｌｌ／２０ｍｌ  Ｓｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。細胞が接着したら一次ウイルスを８００μｌ添加して、２７℃で４８時間培養した。４８時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞  １×１０７  ｃｅｌｌ／２０ｍｌ  Ｓｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら二次ウイルス液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。
加えて、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で１００ｍｌを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
一次から三次までのセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｘ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）細胞粗抽出液をＨ２Ｏで２０倍にし、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動についてウエスタンブロッテイングを行ない、それぞれ目的とする各ＧａｌＮＡｃ−Ｔタンパク質の発現を確認した。ＦＬＡＧ配列のついたＧａｌＮＡｃ−Ｔ（ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）に対する検出用抗体としては、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。各ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔはアミノ酸配列から計算した分子量とほぼ同じ位置にバンドが検出された。
実施例１０
各ＧａｌＮＡｃ−Ｔのレジン精製
上記三次感染のボトルからさらに四次感染をさせ、両ボトルからペレットと上清を回収し、遠心分離後（５０００ｒｐｍ１０分を２回）ペレットをソニケーションした（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｘ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）、ペレット粗抽出液と上清についてタンパク質定量（ＢＩＯ−ＲＡＤ社ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）し、タンパク量を調整の上ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッテイングでＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の発現を確認した。この結果から精製には、もっとも相対的発現量の多い、ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔの上清を使用することとした。
四次感染の各ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ上清２０ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ社）（１００μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（３０００ｒｐｍ  ５分４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ  ５分４℃）し、ペレットを２００μｌの１ｍＭ  ＣａＣｌ２・ＴＢＳに浮遊させ活性測定のサンプル（各ＧａｌＮＡｃ−Ｔ酵素液）とした。
実施例１１
ＧａｌＮＡｃ−Ｔの酵素活性の検出方法と受容体基質の調製
ＧａｌＮＡｃ−ＴによるＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素としての活性測定には、受容体基質として下記表２に記載したＦＩＴＣ（またはＦＡＭ）標識した合成ペプチド、および供与体基質（ｄｏｎｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを使用した。
反応液は、受容体基質（５０ｐｍｏｌ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（２５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（５ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２００ｎＭ）から成り、これにＧａｌＮＡｃ−Ｔ酵素液を２．５μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量を２０μｌとした（カッコ内は最終濃度）。
上記反応混合液を３７℃で６時間反応させ、反応終了後、Ｈ２Ｏを４０μｌ加え、軽く遠心後、上清を取得した。得られた上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を通して、２０μｌ−４０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣカラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３７８−６６）を用いた。展開バッファーＡは０．０５％ＴＦＡを含むイオン交換水、展開バッファーＢとしては受容体基質によって０．０５％ＴＦＡの２−プロパノール：アセトニトリル＝７：３と０．０５％ＴＦＡのアセトニトリルを用いた。分離にはバッファーＢの濃度勾配を用い、３０分で５０％まで上がるように勾配をかけた。検出条件は励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍとした。
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ここで、例えば、ＦＩＴＣ（またはＦＡＭ）標識した合成ペプチドである表２中のＥＡ２を受容体基質として用いた場合の既知のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０）の活性について検討した。上記の実験手法に従って得られた反応液をＨＰＬＣで分析し、転移酵素と反応させていない受容体基質ＥＡ２ピーク（保持時間２０．２７分）と、これとは０．７２分の差を示した転移酵素反応後の単一の産物ピーク（保持時間１９．５５分）を分取した。次いで、凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（ＢＲＵＫＥＲ社、機種：ＲＥＦＬＥＸＩＩＩ）で分析した。質量分析の結果、基質ＥＡ２（理論質量数：ｍ／ｚ  １６７５．３７；実測質量数：ｍ／ｚ  １６７６．９８）に対して（図１参照）、ＨＰＬＣ分析で保持時間１９．５５分ピークの産物の実測質量数は１８７９．８０ｍ／ｚであり、基質との差は２０２．８２ｍ／ｚであった。この質量数の差は、一つのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ、理論質量数：２０３）に相当し、従って、基質ＥＡ２に１ヶ所ＧａｌＮＡｃが付加されたことを示している（図２参照）。このようにＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０によって受容体基質であるＥＡ２にＧａｌＮＡｃが付加した産物をＥＡ２−Ｔ１０と命名した。
上記の具体的な実験手法に従えば、各種酵素と各種受容体基質との反応は、反応前後のＨＰＬＣ分取、および主要なピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦへの供することによって確認することができる。さらに、反応後のＧａｌＮＡｃ−Ｔが付加した受容体基質は、後述するような二次的ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性を測定するために使用することができる。
実施例１２
各ＧａｌＮＡｃ−ＴのＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性の確認
本明細書ではＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性を以下の定義に従い２つに分類した。
ＧａｌＮＡｃが結合してないペプチドを受容体基質として反応し、いくつかのＧａｌＮＡｃがペプチドと結合させる触媒活性を「一次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性」と定義する。一方、すでに一ヶ所あるいは複数箇所にＧａｌＮＡｃが結合しているペプチドを受容体基質として、さらに新しいＧａｌＮＡｃを結合させる触媒活性を「二次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性」と定義する。
上記の実施例のＨＰＬＣ分析により、受容体基質ピークとは異なり、各ＧａｌＮＡｃ−Ｔとの反応後は新たな反応産物由来のピークが検出された。その具体的なピークの保持時間、受容体基質ピークの保持時間との差、さらに反応産物の生産量を表すピーク面積の比（パーセンテージ）を表３にまとめた。この結果により、受容体基質ＭＵＣ１ａ’を用いた実験において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７が一次ＧａｌＮＡｃＴ活性を有することが明らかになった。受容体基質ＭＵＣ２−Ｆを用いることにより、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４が一次ＧａｌＮＡｃＴ活性を有することが明らかになった。受容体基質ＭＵＣ７、ＭＵＣ５ＡＣ、ＥＡ２を用いることにより、すべでのＧａｌＮＡｃ−Ｔが一次ＧａｌＮＡｃＴ活性を有することが明らかになった。受容体基質ＨＰＫ−Ｆにおいて、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２が一次ＧａｌＮＡｃＴ活性を有することが明らかになった。受容体基質ＳＤＣ２８４において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７が一次ＧａｌＮＡｃＴ活性を有することが明らかになった。
さらに、例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ６と反応させて得られた、ＧａｌＮＡｃが一ヵ所付加されたＥＡ２−Ｔ６受容体基質を用いると、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７との反応後は受容体基質ピークとは異なる保持時間に新たな反応産物由来のピークが検出された。その具体的なピークの保持時間、受容体基質ピークの保持時間との差、さらに反応産物の生産量を表すピーク面積の比（パーセンテージ）を表３にまとめた。この結果により、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７には二次ＧａｌＮＡｃＴ活性があることが認められた。
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実施例１３
ＧａｌＮＡｃ−ＴのＦＡＭ（５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ：５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）ラベルした受容体基質の調製
Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ７、およびＥＡ２由来のオリゴペプチドにＦＡＭラベルしたものを株式会社サワディ（東京、日本）から入手し、受容体基質として用いた。一つのＧａｌＮＡｃ基が付加したＭｕｃ１ａ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ７、およびＥＡ２は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２［末尾の参考文献１１を参照］、−Ｔ６［末尾の参考文献１２を参照］、または−Ｔ１０によるＧａｌＮＡｃの付加後、ＨＰＬＣにより精製して、ＧａｌＮＡｃ−ＴアッセイのＧａｌＮＡｃ−糖ペプチド受容体基質とした。調製した基質を表４に示す。
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実施例１４
ＧａｌＮＡｃ−ＴのＦＡＭラベルした受容体基質への活性の検出法
ＧａｌＮＡｃ−Ｔアッセイは、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ）、適当な５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＦＡＭ）−ラベルした受容体基質、および精製した酵素を含む２０μｌの混合物中で３７℃で行った。図３および図４では５０ｐｍｏｌの受容体基質および１２５ｎｇの酵素を経時反応に用い、図５および図６ではその１／１０の基質および酵素を一次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性および二次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性を検出する反応に用いた。反応は３分間煮沸することで停止させ、そして以前に示したように［末尾の参考文献１３を参照］逆相Ｃ１８カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ、４．６ｘ２５０ｍｍ；ナカライテスク社）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で受容体基質および反応生成物のピークを検出・分析した。
実施例１５
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）マススペクトロメトリーによる糖ペプチド生成物のアミノ酸配列解析法
Ｇａｌ−Ｔ１４の反応の生成物のグリコシル化部位を決定するために、ＨＰＬＣにより単離した糖ペプチドは、ＲＥＦＬＥＸ（登録商標）ＩＶ（ブルカーダルトニクス）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分子量解析すると共に、プロテインシークエンサーＰＰＳＱ−２３Ａ（島津製作所）上でエドマン分解を行うことによりアミノ酸配列を解析した。マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびアミノ酸配列決定の方法は以前に示した［末尾の参考文献１３を参照］。
実施例１６
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性の確認
実施例１２と同様にＧａｌＮＡｃ−Ｔを二つに分類して定義した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の酵素活性の測定は実施例１４に示したように行い、基質には実施例１３に示したものを用いた。
Ｍｕｃ１ａペプチド誘導体（ＦＡＭ−ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲ）（配列番号５２）をＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４と共にインキュベートし、ＨＰＬＣにより解析した。図３に示したように、ＧａｌＮＡｃ−Ｔの反応のインキュベーション時間と共に基質のピーク（Ｓで示した）が徐々に消費されて他のピーク（Ｐで示した）が現れ、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４がＧａｌＮＡｃをＭｕｃ１ａペプチドに転移したことを示した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４とのインキュベーションによりＭｕｃ１ａペプチドにおいてはシフトしたピークが一つだけ現れた。これは一つのＳｅｒ／Ｔｈｒ部位のみがＧａｌＮＡｃ修飾されたことを示している。生成物をＨＰＬＣにより単離し、実施例１５に示したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーおよびプロテインシークエンシングにかけ、生成物は５番目のトレオニンにＧａｌＮＡｃを一つ有することを同定した。
一方、図４に示したように、Ｍｕｃ５ＡＣペプチド誘導体（ＦＡＭ−ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡ）（配列番号５４）に対する反応においては、生成物は複数ピークとして現れた。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４との短いインキュベーションの後には、ＨＰＬＣ上でＭｕｃ５ＡＣペプチドのシフトした高いピークが一つ現れたが、このピークは徐々に消費され、インキュベーション時間が増えるにつれて複数のピークが現れた。この結果は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４はＭｕｃ５ＡＣペプチドの複数の部位にＧａｌＮＡｃを転移したことを示すものである。
さらに、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４はＥＡ２ペプチドには酵素活性を示したが、Ｍｕｃ２およびＭｕｃ７についてはごくわずかな活性しか示さなかった（図５）。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４がＭｕｃ５Ａｃペプチドの複数の部位にＧａｌＮＡｃを転移したことは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４は二次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性を有することを示している。このことを確認するために、実施例１３に示したＧａｌＮＡｃが一つ転移したペプチドを基質として用いてＧａｌＮＡｃ−Ｔアッセイを行った。図６に示したように、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４とのインキュベーションにより、ＧａｌＮＡｃ−Ｍｕｃ５ＡＣペプチドを基質としたときのみシフトしたピークが生じ、その他のＧａｌＮＡｃが転移したＥＡ２、Ｍｕｃ１ａ、Ｍｕｃ２、およびＭｕｃ７を基質としたときにはシフトしたピークが現れないか、または現れてもごくわずかであった。
実施例１７
リアルタイムＰＣＲによるヒト組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４転写物の定量解析による分布の解析
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４転写物の定量解析には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社）を用い、定量リアルタイムＰＣＲを行った。種々のヒト組織のＭａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）ｃＤＮＡはクロンテックより購入した。ヒト組織ｃＤＮＡとしては、脳全体、大脳皮質、小脳、胎児脳、骨髄、甲状腺、胸腺、脾臓、白血球、心臓、骨格筋、肺、肝臓、食道、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、副腎、乳腺、子宮、胎盤、卵巣、精巣、および前立腺に由来するものを用いた。種々のガン細胞系列からのｃＤＮＡは以前に示した方法で調製した［末尾の参考文献１４を参照］。ガン細胞系列のｃＤＮＡとしては、ＧＯＴＯ（神経芽腫）、ＳＣＣＨ−２６（神経芽腫）、Ｔ９８Ｇ（膠芽腫）、Ｕ２５Ｉ（膠芽腫）、白血病プロミエロサイト、黒色腫、ＨＬ−６０（前黒色腫）、Ｋ５６２（白血病）、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ））、Ｎａｍａｌｗａ（Ｂ細胞白血病）、ＰＣ−１（肺扁平上皮細胞）、ＥＢＣ−１（肺扁平上皮細胞）、ＰＣ７（肺腺癌）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、ＭＫＮ４５（胃）、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ（胃）、ＨＳＣ４３（胃）、Ｃｏｌｏ２０５（大腸）、ＨＣＴ１５（大腸）、ＬＳＣ（大腸）、ＬＳＢ（大腸）、ＳＷ４８０（大腸）、およびＳＷ１１１６（大腸）に由来するものを用いた。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４のプライマーセットおよびプローブは以下のものである；フォーワードプライマー、５’−ＣＧＴＧＣＣＣＧＣＴＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号５７）、リバースプライマー、５’−ＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣＣＣＧＡＡＧ−３’（配列番号５８）、およびプローブ、マイナーグルーブバインダーを持つ５’−ＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴ−３’（配列番号５９）［末尾の参考文献１５を参照］。ＰＣＲ条件は、５０℃、２分間を１サイクル、９５℃、１０分間を１サイクル、９５℃、１５秒間、および６０℃１分間を５０サイクルで行った。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の転写物の相対量は、同じｃＤＮＡ中のＧＡＤＰＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）転写物の量により標準化した。
リアルタイムＰＣＲ法により、種々のヒト組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４転写物の発現レベルを決定した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４は、そのレベルは異なるものの、殆どの組織中（図７）、および種々の細胞系列中（図８）で発現した。かなり高いレベルの発現がみられた組織は、小腸、胃、膵臓、および大腸であった。中程度の発現が、精巣、甲状腺、および脾臓で観察された。試験したその他の組織の発現レベルは、非常に低い、または検出不可能であった。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４は試験した細胞系列においては比較的低いレベル、または検出不可能である程度に発現した。大腸癌および胃癌細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の発現レベル（図７）は、それぞれ大腸および胃のそれら（図８）と比較して低かった。
実施例１８
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性の確認
実施例１２と同様にＧａｌＮＡｃ−Ｔを二つに分類して定義した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の酵素活性の測定は実施例１４に示したように行い、基質には実施例１３に示したものを用いた。
Ｍｕｃ１ａ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ７、およびＥＡ２由来のオリゴペプチドにＦＡＭラベルしたペプチド誘導体（実施例１３参照）をＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３と共にインキュベートし、ＨＰＬＣにより解析した。図９に示したように、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の反応前（上段）と反応後（下段）で、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ７、およびＥＡ２の基質ピーク（Ｓで示した）が消費されて他のピーク（Ｐで示した）が現れ、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がＧａｌＮＡｃを各ペプチドに有意に転移したことを示した。しかしながら、Ｍｕｃ２を基質とした場合には、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の転移活性はごくわずかであった。
さらに、一次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３活性を評価するために、Ｍｕｃ１をＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３と共に反応時間を変えてインキュベートし、反応混合物をＨＰＬＣにより解析した。図１０に示すように、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３はＭｕｃ１ａペプチドを効率的に利用し、インキュベーション時間が延長されるにつれてシフトした一本の生成物ピーク“Ｐ”が現れた。ＥＡ２ペプチドは、７個の可能な糖鎖修飾位置を含み、ラットの顎下腺ムチンリピート由来である。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３とＥＡ２ペプチドとの反応生成物は独特のパターンの複数ピークを示した（図１１）。生成物ピークＰ１及びＰ２は、基質ピークに近接し、反応時間を通して非常に低かった。これに対しピークＰ３、Ｐ４及びＰ５は逐次的に現れ、より多くの糖鎖修飾ペプチドであると推定でき、また、Ｐ１及びＰ２より高かった。
以上の結果は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がＥＡ２ペプチドに複数個のＧａｌＮＡｃを転移したことを示唆している。そこで、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３によるＥＡ２ペプチドに転移したＧａｌＮＡｃの数を決定する試みを行った。まず、生成物ピークをＨＰＬＣで精製し、画分を質量分析アッセイに供した。図１２パネルＢに示したように、ピークＰ３、Ｐ４およびＰ５（Ｔ１３で生じた）、並びにＰ１’およびＰ２’（Ｔ６で生じた）に対応する生成物について測定した分子量は、それぞれＦＡＭラベルしたＥＡ２ジ−、トリ−、テトラ−およびモノ−糖ペプチドと予想される分子量に合致していた。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３によって生じたＰ１及びＰ２の生成量は非常に小さく、質量分析用として回収することはできなかった。Ｐ２及びＰ１’の保持時間が同じであったので、以上の結果は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３によって生じたＰ１及びＰ２の両方とも一つのＧａｌＮＡｃ残基を異なった部位に結合したことを強く示唆している。同時に、この結果は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がＥＡ２ペプチドのＴｈｒ又はＳｅｒ部位に最初に一つのＧａｌＮＡｃを効率の悪い方法で転移し、その後、すぐに他の部位に別のＧａｌＮＡｃを転移することを示した。これは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がＥＡ２に対して強い二次的なＧａｌＮＡｃ糖ペプチド転移活性、及び相対的に弱い一次的なポリペプチドＧａｌＮＡｃ−転移活性を有することを示唆した。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の二次活性を確かめるために、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３アッセイ用に受容体基質としてＧａｌＮＡｃを転移したＥＡ２モノ−糖ペプチドを調製した。図１３パネルＢに示すように、基質ピーク（Ｓ”）は急速に消費され、さらにシフトしたピークＰ１”がＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３との短いインキュベーション後に現れた。その後、Ｐ１”は徐々に消費され、さらにシフトしたピークがインキュベーションの時間経過とともに現れた。
また、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の酵素反応８時間後に残存したＥＡ２基質の量は、たった１０分間の酵素反応におけるＧａｌＮＡｃ−ＥＡ２基質の残存量と殆ど同等であった（図１３）。この結果は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３がＥＡ２よりモノ−ＧａｌＮＡｃ−ＥＡ２に対してより選択的な活性を有することを示唆している。即ち、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３は、弱い一次活性と強い二次活性を併せ持つ糖転移酵素であることを示している。
これまでの研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＯ−結合型糖鎖修飾の速度論において、近接および遠隔のＯ−グリカンの、ネガティブ及びポジティブな相対的効果を示している［末尾の参考文献１６−１８を参照］。ＥＡ２へのＧａｌＮＡｃの付加は、ペプチド構造を変化させる可能性があり、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に対する特定の受容体部位に接近することに影響している。従来の刊行物では、遠隔部位と同様に糖鎖修飾部位に近いペプチド骨格構造に対するＯ−型糖鎖修飾の効果を同定している［末尾の参考文献１９−２１を参照］。他に可能な作用機序としては、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のレクチンドメインがＧａｌＮＡｃを付加したペプチドに結合し、ＥＡ２糖ペプチドの糖鎖修飾を触媒するようＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の能力に貢献するということが挙げられる。これは、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ４に見出される作用機序と同様である［末尾の参考文献２２を参照］。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３はまたＧａｌＮＡｃ−Ｍｕｃ５ＡＣに対しても強力にＧａｌＮＡｃ−糖ペプチド転移酵素活性を示した。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３は、ラットＧａｌＮＡｃ−Ｔ９［末尾の参考文献２３を参照］のオルソロガス異性体である。しかしながら、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３はラットＧａｌＮＡｃ−Ｔ９とは異なった基質特異性を示した。ラットＧａｌＮＡｃ−Ｔ９は、Ｍｕｃ１ａ、ＥＡ２、Ｍｕｃ２及びＭｕｃ５ＡＣを含む未修飾ペプチド基質に対しては、ＧａｌＮＡｃを転移しないことが報告されている［末尾の参考文献１６を参照］。ところが、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３は未修飾ポリペプチド基質に対して明らかな触媒活性を示した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３及びラット−Ｔ９の両方とも、ＥＡ２及びＭｕｃ５ＡＣ糖ペプチドに対して強力な二次活性を示した。以上の結果は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３およびラット−Ｔ９がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて異なった受容体基質特異性を有することを示している。
実施例１９
リアルタイムＰＣＲによるヒト組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３転写物の定量解析による分布の解析
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３転写物の定量解析は、実施例１７に記載の方法に準じて行った。ヒト組織ｃＤＮＡは、脳全体、小脳、大脳皮質、胎児脳、副腎、甲状腺、胸腺、肺、心臓、乳腺、肝臓、食道、胃、小腸、大腸、膵臓、脾臓、腎臓、子宮、胎盤、精巣、卵巣、骨格筋、および骨髄に由来するものを用いた。ガン細胞系列のｃＤＮＡとしては、ＳＣＣＨ−２６（神経芽腫）、ＧＯＴＯ（神経芽腫）、Ｔ９８Ｇ（膠芽腫）、Ｕ２５Ｉ（膠芽腫）、ＹＫＧ−１（膠芽腫）、Ｍ１１８−ＭＧ（膠芽腫）、Ａ１７２（膠芽腫）、ＰＣ−１（肺扁平上皮細胞）、ＥＢＣ−１（肺扁平上皮細胞）、ＰＣ７（肺腺癌）、ＨＳＣ４３（胃）、ＭＫＮ４５（胃）、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ（胃）、Ａ４３１（扁平上皮）、Ｃｏｌｏ２０５（大腸）、ＬＳＣ（大腸）、ＬＳＢ（大腸）、ＳＷ４８０（大腸）、ＳＷ１１６（大腸）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、Ｃａｐａｎ−２（膵臓）、ＫＨＭ−１Ｂ（ＩｇＡ骨髄腫）、Ｎａｍａｌｗａ（Ｂ細胞白血病）、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞  Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）、Ｋ５６２（白血病）、Ｕ２６６（骨髄腫）、ＨＬ−６０（前骨髄腫白血病）、および黒色腫に由来するものを用いた。また、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３のプライマーセットおよびプローブは以下のものである；フォーワードプライマー、５’−ＣＧＣＧＴＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡ−３’（配列番号６０）、リバースプライマー、５’−ＴＣＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＣＴ−３’（配列番号６１）、およびプローブ、５’−ＡＧＡＣＣＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＴＧＣＴＧＡ−３’（配列番号６２）。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３は試験した全ての組織中に発現していたが、発現レベルは組織に応じて異なっていた（図１４）。転写物の発現レベルが最も高い組織は小腸であり、中程度レベルのものは、胃、膵臓、卵巣、胸腺および脾臓であった。上記以外の組織では、微量ないしより低いレベルであった。ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ異性体、即ち、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、−Ｔ２、−Ｔ４、−Ｔ７および−Ｔ８はいたるところに発現している［末尾の参考文献５−８を参照］。複数のＧａｌＮＡｃ−Ｔが一つの組織に発現している理由はまだ明らかにされていない。酵素は基質特異性を有するので［末尾の参考文献２４−２６を参照］、細胞内では受容体基質全体の糖鎖修飾に対して、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ間で競争および協調があるのかもしれない。即ち、組織内で複数のＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現は、タンパク質の一連のプロセッシングに必要であり、または適切なタンパク質の糖鎖修飾を確実にするために過剰に提供しているのかもしれない。
また、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の発現レベルは、試験したほとんどの腫瘍細胞系列において低くく（図１５）、細胞系列間の特異的な発現パターンは見出すことができなかった。
実施例２０
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２転写物のＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ｉｓｏｆｏｒｍの同定
各発現組織または細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２転写物の多数のＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ｉｓｏｆｏｒｍを決定するために、２つのプライマー（ｓｉ−３：５’−ＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号６３）およびｓｉ−４：５’−ＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号６４））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲプログラムは、９５℃５分での最初の変性、続いて９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒の５０サイクル、および７２℃５分での最終のインキュベーションからなる。ＰＣＲ産物を４つの制限エンドヌクレアーゼ：Ｈａｅ  ＩＩ、Ｈｉｎｆ  Ｉ、Ｈａｅ  ＩＩＩおよびＮｃｉ  Ｉによって消化し、次いで、１０％  ＰＡＧＥで電気泳動によって解析し、エチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍｌ）によって染色した。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２のｃＤＮＡ配列とＧｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅに寄託されたゲノム配列との比較によって、２つの酵素、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２および−Ｔ２の染色体位置、並びにゲノム構造を決定した（図１６パネルＡ）。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２（受入れ番号ＮＴ００５１９４）のゲノム配列は染色体２に位置し、２２８ｋｂの長さであり、少なくとも１７個のエキソンを含み、各エキソンの長さはＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（受入れ番号ＮＴ０２１９７３）とほぼ同等であった。本発明者らが取得した新規配列（番号ＡＢ０７８１４４）は、登録された配列（Ｎｏ．ＡＫ０２２７５３）および図１６パネルＡ−Ｂとは異なっていたが、これらはＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２の２つのＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｉｓｏｆｏｒｍであることは明らかである。第一のｉｓｏｆｏｒｍ（Ｎｏ．ＡＢ０７８１４４）は１５個のエキソンを含み、第二のｉｓｏｆｏｒｍ（Ｎｏ．ＡＫ０２２７５３）は１６個のエキソンを含む（図１６パネルＢ）。
実施例２１
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性の確認
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２の酵素活性の測定は実施例１４に示したように行い、基質にはＭｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ２、およびＭｕｃ１３−５８由来のペプチド（表２を参照）を用いた。
上記ペプチドをＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ２とともに４８時間インキュベートし、反応生成物をそれぞれ異なる時間でＨＰＬＣによって解析した（図１７）。図１７パネルＡ、カラムＩに示したように、Ｍｕｃ５ＡＣの５０％が反応によって消化された場合、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２および−Ｔ２の両方とも３本のピーク（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２に対してはＰ１、Ｐ２およびＰ３（上段）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２に対してはＰ１’、Ｐ２’およびＰ３’（下段））を同じ保持時間（２０．３３分、２０．９２分および２０．６０分）が現れた。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２における主要な生成物ピーク（Ｐ２）、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ２における主要な生成物ピーク（Ｐ１’）は異なる保持時間で現れた。その後、はじめのＭｕｃ５ＡＣの８０％が反応によって消費された場合、保持時間が延長されるにつれて（図１７パネルＡ、カラムＩＩ）、それぞれの主要な生成物ピークが保持された。ここで、新規な糖ペプチド種をＨＰＬＣによって単離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。付加されたＧａｌＮＡｃ残基の数は、Ｐ１およびＰ１’は一つ、Ｐ２およびＰ２’もまた一つであったが、Ｐ３およびＰ３’は二つのＧａｌＮＡｃが付加していることが分かる。以上の結果より、Ｐ２およびＰ１’は異なる保持時間で現れたが、一つのＧａｌＮＡｃが付加されているので、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２および−Ｔ２はＭｕｃ５ＡＣの異なる位置に最初のＧａｌＮＡｃを主に付加したことを示している。また、図１７パネルＡ、カラムＩＩＩでは、全ての元々の基質がちょうどすっかり消失した場合、２つの酵素の反応生成物パターンは非常に異なり、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２は多種のＧａｌＮＡｃ−Ｔ付加産物を生成していることが分かる。
Ｍｕｃ２に対するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２および−Ｔ２の活性をＨＰＬＣで比較すると、生成物ピークＰ１（Ｔ１２について）とＰ１’（Ｔ２について）；Ｐ２（Ｔ１２）とＰ２’（Ｔ２）は、それぞれ同じ保持時間：２０．９９分と２０．５８分に現れていることが分かる（図１７パネルＢ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、Ｐ１とＰ１’はモノ−ＧａｌＮＡｃ糖ペプチドであり、Ｐ２とＰ２’はジ−ＧａｌＮＡｃ糖ペプチドであった。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２より速くＭｕｃ２に第二のＧａｌＮＡｃを付加する傾向にあることが図１７パネルＢから見出すことができる。従って、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２とは異なる保持時間を示し、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２とは異ったＧａｌＮＡｃ付加産物を生成するという特徴を有している。
これは、５０％および２０％の基質が消化された場合に、Ｐ２はまだ検出できないが、一方、Ｐ２’は現われ、そのピークが増大したことによる。全ての基質がちょうど消化された場合、Ｐ２は非常に小さいが、Ｐ２’は高レベルであり、そして保持時間がＰ２’より小さい、多くのピーク（三つのＧａｌＮＡｃが含まれることがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確かめられているが、データは示さず）がＧａｌＮＡｃ−Ｔ２について現れた。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２については、最初の基質が完全に消化された後に、反応生成物を試験した（データ示さず）。保持時間が延長されるにつれて、Ｐ１は減少し、その代りにＰ２が増大し、そして、意図時間がＰ２よりも短い、より多くのピーク（３個のＧａｌＮＡｃ残基を含むことがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確かめられているが、データは示さず）が現れた。また、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２は、Ｍｕｃ２により多くのＧａｌＮＡｃを付加させることができる。
Ｍｕｃ１３は、上皮細胞及び血液細胞に発現するヒト細胞表面ムチンである。本発明者が設計したペプチド基質であるＭｕｃ１３−５８はＴＳＰＡＰボックスを有し、これはムチンボックス（ＸＴＰＸＰ）に類似しているが少し異なる。Ｍｕｃ１３−５８に対するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２および−Ｔ２の活性は、ほぼ同等であった（図１７パネルＣ）。Ｐ１（Ｔ１２について）およびＰ１’（Ｔ２について）；Ｐ２（Ｔ１２）およびＰ２’（Ｔ２）は、それぞれ同じ保持時間：２２．９６分および２３．２９分で現れた。各生成物ピークの大きさは、消化される最初の基質量に応じて互いに均等であった。
実施例２２
リアルタイムＰＣＲによるヒト組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２転写物の定量解析による分布の解析
多種のヒト正常組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲを用いて調べた。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３転写物の定量解析は、実施例１７に記載の方法に準じて行った。ヒト組織ｃＤＮＡは、脳全体、大脳皮質、胸腺、肺、心臓、乳腺、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、脾臓、腎臓、膀胱、子宮、胎盤、精巣、卵巣、骨格筋、白血球、Ｂ細胞、骨髄、胎児脳、胎児胸腺、胎児肺、胎児肝臓、胎児小腸、胎児脾臓、胎児腎臓、胎児骨格筋、および胎児に由来するものを用いた。ガン細胞系列のｃＤＮＡとしては、ＮＡＧＡＩ、ＮＢ−９、ＳＣＣＨ−２６、ＩＭＲ３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＧＯＴＯ、ＮＴ２−Ｒ１０、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、Ａ１７２、ＫＧ−１−Ｃ、ＹＫＧ−１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５Ｉ、ＰＣ−１、ＥＢＣ−１、ＰＣ−７、ＳＢＣ−１、ＭＫＮ−４５、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ、ＨＳＣ４３、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ１５、ＬＳＣ、ＬＳＢ、ＳＷ４８０、ＳＷ１１１６、ＨｅｐＧ２、Ｃａｐａｎ−２、ＨＬ６０、Ｋ５６２、Ｎａｍａｌｗａ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ９３７、Ｒａｊｉ、およびＲａｍｏｓに由来するものを用いた。
また、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２のプライマーセットおよびプローブは以下のものである；フォーワードプライマー（エキソン５にコードされる）：５’−ＴＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧ−３’（配列番号６５）、リバースプライマー（エキソン５−６にコードされる）：５’−ＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＴＡＡＴＡＣＡＣＴＧＣＧ−３’（配列番号６６）、およびプローブ（エキソン５における）：５’−ＡＡＣＧＡＧＧＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号６７）。ＰＣＲは、９５℃３０秒、６０℃１５秒、７２℃３０秒を５０サイクルで行った。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２転写物は、試験した全てのヒト成人および胎児組織によって普遍的に発現している。特に、腎臓と胎児腎臓において発現が高かった（図１８パネルＡ）。しかしながら、試験した細胞系列における発現パターンは、組織よりも制限され、神経芽腫、ある種の腺癌（ＰＣ−７）、胃癌（ＭＫＮ４５）、白血病（ＨＬ６０、Ｎａｍａｌｗａ、Ｊｕｒｋａｔ）、およびバーキット病（Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ｄｕｄｉ）に限定される（図１８パネルＢ）。続いて、６種の組織（腎臓、胎児腎臓、脳、胎児脳、骨髄および胎児肝臓）、および６種の細胞系列（ＨＬ−６０、ＭＫＮ４５、ＧＯＴＯ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｄａｕｄｉ、ＳＣＣＨ−２６）においてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２転写物の２つのＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｉｓｏｆｏｒｍの存在を確認した。そこで、エキソン２、３または４を含んでいるはずの断片を増幅した。エキソン２、３および４は、それぞれＨａｅ  ＩＩ、Ｈｉｎｆ  Ｉ、またはＨａｅ  ＩＩＩとＮｃｉ  Ｉ部位を含むため、ｉｓｏｆｏｒｍを確認するために上記４つの制限エンドヌクレアーゼを用いて増幅した断片を消化した。図１６パネルＣに見られるように、増幅されたバンドは、Ｈａｅ  ＩＩＩおよびＮｃｉ  Ｉによってのみ消化されたが、しかしながら、Ｈａｅ  ＩＩまたはＨｉｎｆ  Ｉによって消化された断片は検出できなかった。上記の結果は、ｉｓｏｆｏｒｍ  １が主な転写物であり、一方、ｉｓｏｆｏｒｍ  ２が副産物であることを示している。
実施例２３
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性の確認
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１の酵素活性の測定は実施例１４に示したように行い、基質にはＭｕｃ１ａ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ７、Ｍｕｃ１３（５８）、ＳＤＣ２８４、およびＥＡ２由来のペプチドを用いた。
図１９は、各受容体基質に対するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１の反応前（パネル上段）および反応後（パネル下段）のＨＰＬＣチャートを示している。酵素反応時間はそれぞれ６時間であるが、Ｍｕｃ５Ａｃについては４８時間反応させたものについても示した。
実施例２４
リアルタイムＰＣＲによるヒト組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１転写物の定量解析による分布の解析
多種のヒト正常組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲを用いて調べた。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３転写物の定量解析は、実施例１７に記載の方法に準じて行った。ヒト組織ｃＤＮＡは、脳全体、大脳皮質、小脳、胎児脳、骨髄、甲状腺、胸腺、脾臓、白血球、心臓、細胞骨格、肺、肝臓、食道、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、副腎、乳腺、子宮、胎盤、卵巣、精巣、および前立腺に由来するものを用いた（図２０参照）。
また、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１のプライマーセットおよびプローブは以下のものである；フォーワードプライマー：５’−ＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号６８）、リバースプライマー：５’−ＴＴＣＧＧＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号６９）、およびプローブ：５’−ＣＣＧＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣ−３’（配列番号７０）。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１とＧＡＰＤＨに対する標準曲線を各プラスミドＤＮＡの連続的な希釈によって作成した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１転写物の発現レベルは、同じｃＤＮＡで測定したＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルによって標準化した。発現レベルは、全ＲＮＡの１μｇにおける標的遺伝子のコピー数として表した（図２０）。なお、データは３回の実験から得たものであり、平均値±標準偏差として示した。
実施例２５
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素活性の確認
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の酵素活性の測定は実施例１４に示したように行い、基質にはＥＡ２、Ｍｕｃ１ａ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ１３（５８）、Ｍｕｃ５ＡＣ、ＳＤＣ２８４、およびＨＲＰ由来のペプチドを用いた。
図２１は、各受容体基質に対するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の反応前（パネル上段）および反応後（パネル下段）のＨＰＬＣチャートを示している。酵素反応時間はそれぞれ６時間である。
実施例２６
リアルタイムＰＣＲによるヒト組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７転写物の定量解析による分布の解析
多種のヒト正常組織および細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲを用いて調べた（図２２）。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３転写物の定量解析は、実施例１７に記載の方法に準じて行った。ヒト組織ｃＤＮＡは、実施例１７に記載した組織に由来するものを用いた（図２２パネルＡ参照）。ガン細胞系列のｃＤＮＡとしては、実施例１７に記載したほかに、Ｕ２６６（骨髄腫）、Ａ４３１（扁平上皮）、ＳＷ１１６（大腸）、およびＣａｐａｎ−２（膵臓）に由来するものを用いた（図２２パネルＢ参照）。
また、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１のプライマーセットおよびプローブは以下のものである；フォーワードプライマー：５’−ＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＡ−３’（配列番号７１）、リバースプライマー：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＣＴＣＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡ−３’（配列番号７２）、およびプローブ：５’−ＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号７３）。
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産業上の利用の可能性
本発明により、コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有する酵素が単離され、その遺伝子の構造が明らかにされた。したがって、該酵素等の遺伝子工学的な生産、該酵素に基づくＧａｌＮＡｃ修飾ペプチドあるいはＧａｌＮＡｃ修飾タンパク質などの基質としての生産、該酵素に基づく未知Ｏ−結合型糖鎖の付加したタンパク質あるいは未知ペプチドのＯ−結合型糖鎖修飾位置の同定や、該遺伝子らに基づく疾患の診断が可能になった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＦＩＴＣラベルしたＥＡ２サンプルをＨＰＬＣ分析で保持時間２０．２７分のピークとして分取し、凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分析した結果を示すチャートである。
図２は、ＥＡ２を受容体基質として、既知のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０）と反応させて得られた反応液をＨＰＬＣ分析し、受容体基質ＥＡ２ピーク（保持時間２０．２７分）と０．７２分差を示す単一の産物ピーク（保持時間１９．５５分）を分取し、凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分析した結果を示すチャートである。
図３は、ＦＡＭラベルされたＭｕｃｌａペプチドを基質としたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の反応の経時変化の追跡を示すＨＰＬＣチャートである。
図４は、ＦＡＭラベルされたＭｕｃ５ＡＣペプチドを基質としたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の反応の経時変化の追跡を示すＨＰＬＣチャートである。
図５は、種々のＦＡＭラベルされた受容体基質を用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の一次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性の測定における、反応前と反応後のＨＰＬＣチャートである：Ｓは反応前の基質ピークを表し、Ｐは生成物ピークを示す。
図６は、一箇所ＧａｌＮＡｃ化を受けた種々のＦＡＭラベルされた受容体基質を用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４の二次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性の測定における、反応前と反応後のＨＰＬＣチャートである：Ｓは反応前の基質ピークを表し、Ｐは生成物ピークを示す。
図７は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト組織におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４転写物の定量解析の結果を示すグラフである。
図８は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト細胞系列におけるＧＡｌＮＡｃ−Ｔ１４転写物の定量解析の結果を示すグラフである。
図９は、種々のＦＡＭラベルされた受容体基質を用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の反応前と反応後のＨＰＬＣチャートである：Ｓは反応前の基質ピークを表し、Ｐは生成物ピークを示す。
図１０は、ＦＡＭラベルされたＭｕｃｌａペプチドを基質としたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３（パネルＡ）及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ６（パネルＢ）の反応の経時変化の追跡を示すＨＰＬＣチャートである。
図１１は、ＦＡＭラベルされたＭｕｃｌａペプチドを基質としたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３（パネルＡ）及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ６（パネルＢ）の反応の経時変化の追跡を示すＨＰＬＣチャートである。
図１２は、ＥＡ２ペプチド（Ｓ）及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３（Ｐ１ないしＰ５）及び−Ｔ６（Ｐ１’ないしＰ２’）によって生じた反応生成物のＨＰＬＣチャート（パネルＡ）、及び単離した各ピークに対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル（パネルＢ）を示す：ジ、ジ−糖ペプチド；トリ、トリ−糖ペプチド；テトラ、テトラ−糖ペプチド。
図１３は、ＥＡ２糖ペプチド基質及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３によって生じた反応生成物のＨＰＬＣチャートである。Ｓ”は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３の二次活性アッセイ用の糖ペプチド基質として使用されるモノＧａｌＮＡｃ−ＥＡ２に対応する。Ｐ１”、Ｐ２”及びＰ３”は、ＧａｌＮＡｃ−ＥＡ２を用いてＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３によって生じた生成物に対応する。
図１４は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト組織におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３転写物の定量解析の結果を示すグラフである。
図１５は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト細胞系列におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３転写物の定量解析の結果を示すグラフである。
図１６は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２転写物のＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ｉｓｏｆｏｒｍの同定について示す。
図１７は、ＦＡＭラベルされた受容体基質（Ｍｕｃ５ＡＣ（パネルＡ）、Ｍｕｃ２（パネルＢ）およびＭｕｃ１３−５８（パネルＣ））を用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２の一次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性の測定における、反応前と反応後のＨＰＬＣチャートである。各基質の残存量が、Ｉ：５０％、ＩＩ：２０％、およびＩＩＩ：０％である場合のＨＰＬＣチャートを示す。
図１８は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト組織（パネルＡ）および細胞系列（パネルＢ）におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２転写物の定量解析を示すグラフである。
図１９は、種々のＦＡＭラベルされた受容体基質を用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１の一次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性の測定における、反応前と反応後のＨＰＬＣチャートである。
図２０は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト組織におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１転写物の定量解析を示すグラフである。
図２１は、種々のＦＡＭラベルされた受容体基質を用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の一次ＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性の測定における、反応前と反応後のＨＰＬＣチャートである。
図２２は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト組織（パネルＡ）および細胞系列（パネルＢ）におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７転写物の定量解析を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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