(57)【要約】乾癬に関連する新規ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びそれをコードする核酸、ＰＬＡ２阻害剤や医薬の特徴付け、同定、選択を行うための方法、乾癬の診断や検査の新しい方法等を提供すること。配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その保存的置換変異体又は自然発生対立変異体等。前記ポリペプチドをコードする核酸又はその相補物等。前記ポリペプチドを用いる、ＰＬＡ２阻害剤や医薬の特徴付け、同定、選択方法。前記核酸からなる遺伝子の発現レベルの検定を特徴とする乾癬の検査方法等。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの保存的置換変異体又は自然発生対立変異体であるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列の全長と比較して７５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
（ｉｖ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物にコードされるポリペプチド、
からなる群より選択され、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドから選択されてなるポリペプチド。
【請求項２】
ヒトのポリペプチドである、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
組換えポリペプチドである、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
コードされたポリペプチドが、ヒトのポリペプチドである、請求項４記載の核酸。
【請求項６】
下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸
（ｂ）下記（Ｉ）又は（ＩＩ）：
（Ｉ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物、又は
（ＩＩ）配列番号：８で示される塩基配列における翻訳領域全長の配列と比較して７０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する核酸、
から選択され、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドをコードする核酸
から選択されてなる核酸。
【請求項７】
ヒトの核酸である、請求項６記載の核酸。
【請求項８】
下記（Ｉ）又は（ＩＩ）：
（Ｉ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物、又は
（ＩＩ）配列番号：８で示される塩基配列における翻訳領域全長の配列と比較して７０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する核酸、
から選択され、かつ下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）請求項４〜７のいずれか１項記載の核酸からなる遺伝子の発現若しくは存在の検出、又は
（Ｂ）請求項４〜７のいずれか１項記載の核酸からなる遺伝子の発現の変調のために使用される核酸。
【請求項９】
単離された核酸である、請求項４〜８のいずれか１項記載の核酸。
【請求項１０】
請求項４〜８のいずれか１項記載の核酸を含有してなる組換えベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項１０記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１３】
１）請求項１１記載の組換えベクターが導入された宿主細胞を培養して、培養物を得る工程；及び
２）前記工程１）で得られた培養物から、該組換えベクター上にコードされたホスホリパーゼＡ２のポリペプチドを回収する工程
を含む、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を被験物質と接触させ、該ホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定することを含む、炎症性皮膚疾患の治療薬を特徴付け、同定又は選択するための方法。
【請求項１６】
該ホスホリパーゼＡ２と、該ホスホリパーゼＡ２の基質と被験物質とを含む反応系内で酵素反応を行い、該ホスホリパーゼＡ２の酵素活性に対する阻害作用を検定することにより、被験物質の作用を検定するものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
基質がグリセロリン脂質であり、酵素活性がグリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解する活性である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定した被験物質を、炎症性皮膚疾患の患者であるヒト個体に投与することを含む、ヒトにおける該ホスホリパーゼＡ２の阻害方法。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定した被験物質もしくはこれを含む組成物を炎症性皮膚疾患治療薬として販売する方法。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定した被験物質を担体とともに混合することを含む、炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物の製造方法。
【請求項２１】
炎症性皮膚疾患治療薬の製造のための、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２の使用方法。
【請求項２２】
炎症性皮膚疾患が、慢性難治性皮膚疾患である、請求項１５〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
炎症性皮膚疾患が、乾癬である、請求項１５〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
被験物質が、ホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤であることが知られていなかった化合物である、請求項１５〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を阻害する化合物を有効成分として含有してなる、炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を阻害する化合物の有効量を患者に投与することを含む、炎症性皮膚疾患の治療方法。
【請求項２７】
ヒト又は非ヒト動物個体から採取した生体試料について、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検定することを特徴とする、乾癬の検査方法。
【請求項２８】
該発現レベルを、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物をプローブ又はプライマーとして用いて検定する、請求項２７記載の検査方法。
【請求項２９】
該プローブ又はプライマーが、配列番号：４で示される塩基配列を有する核酸又はその相補物である、請求項２８記載の検査方法。
【請求項３０】
該発現レベルを、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドを認識する抗体を用いて検定する、請求項２７記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、乾癬に関連する新規なホスホリパーゼＡ２、それをコードする核酸及びそれらの使用方法；該ホスホリパーゼＡ２の製造方法及びそれに用いる組換えベクター又は宿主細胞；該ホスホリパーゼＡ２を認識する抗体；該ホスホリパーゼＡ２の阻害剤や医薬の特徴付け、同定又は選択方法；該ホスホリパーゼＡ２の阻害方法；炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物及びその製造方法；炎症皮膚疾患の治療方法；並びに乾癬の検査方法に関する。
背景技術
乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）は、炎症性角化症候群の一つであり、鱗屑を特徴とする慢性難治性皮膚疾患である。前記乾癬は、多くの場合、軽快憎悪を繰り返す疾患であり、現在まで、該乾癬に対する決定的な治療方法はない。
乾癬は、その病態の特徴から、（１）尋常性乾癬、（２）乾癬性紅皮症、（３）関節症性乾癬、（４）滴状乾癬、（５）膿疱性乾癬の５型に大別される。このうち、尋常性乾癬は、患者数が最も多く、乾癬患者全体の約８割を占める疾患であり、膿疱性乾癬は、全身症状を伴い、時として死に到る疾患である。いずれの型においても、乾癬の病態には、表皮及び真皮内の免疫学的異常と、表皮角化細胞の増殖・分化異常の両者が伴う。
乾癬の発症原因には、遺伝的背景と外的因子の両方が関与しており、かかる乾癬は、ある種の遺伝学的背景を有する人に、何らかの外的又は内的因子が加わって発症する。
乾癬の発症に遺伝的因子が関係していることはよく知られている。欧米における家族内発症の割合は、約３分の１であり、一卵性双生児における乾癬の発症率は、７２％と高い一致率を示すが、二卵性双生児では２２％と低い。このように、乾癬においては、遺伝的因子が重要な発症要因であることは確かであるが、遺伝形式ははっきりしていない。また、単一の遺伝子によって発症する症例は少なく、多くの症例では、多遺伝子によって発症すると考えられている。
第６染色体のＨＬＡ抗原遺伝子領域に存在するＰＳＯＲ１（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）遺伝子は、腎移植時のＨＬＡのタイピングから偶然に発見された乾癬感受性遺伝子である。乾癬の発症に関与する遺伝子としては、このＰＳＯＲ１遺伝子のほか、第１染色体、第３染色体、第４染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１９染色体、第２０染色体に位置する数種類の遺伝子が現在までに報告されている。
しかし、乾癬の発症メカニズムは未だ不明な点が多く、治療方法の開発等は難しい状況にある。新たな診断方法及び治療方法の開発に繋げるため、乾癬の発症に関与する遺伝子（乾癬関連遺伝子）の探索と解析の進展が望まれている。
乾癬の病態等については、いくつかの総説にまとめられている（Ｂｏｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第２０巻、第４０−４６頁、１９９９年；Ｂａｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、第２６巻、第３２１−３２５頁、２００１年）。
一方、炎症性疾患に関与する酵素として、ホスホリパーゼＡ２が知られている。ホスホリパーゼＡ２は、グリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解して、等モル量の遊離脂肪酸とリゾリン脂質とを産する反応を触媒する酵素である。ホスホリパーゼＡ２の作用により、生体膜を構成するグリセロリン脂質から遊離したアラキドン酸は、リポキシゲナーゼ等によってロイコトリエン類に変換されるか、あるいはシクロオキシゲナーゼ等によってプロスタグランジン類に変換、若しくは、さらに該プロスタグランジン類に更にトロンボキサンシンターゼが作用してトロンボキサンＡ２等に変換される。これらのエイコサノイド（ロイコトリエン類、プロスタグランジン類、トロンボキサン類）は、種々の炎症、アレルギー反応、虚血性疾患等に密接に関与していることが明らかとなっており、ホスホリパーゼＡ２は、アラキドン酸以降の炎症性メディエーター産生につながる最初の反応を惹起する酵素として重要な役割を果たしている。
ホスホリパーゼＡ２には、少なくとも１７種類の分子種があることが知られており、それらは、構造及び性質の類似性から４つのサブクラス（分泌性ホスホリパーゼＡ２、細胞質ホスホリパーゼＡ２、Ｃａ２＋非依存的ホスホリパーゼＡ２、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）に分類されている。
このうち、細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）は、細胞質局在性の高分子量ホスホリパーゼＡ２であり、これまでに、３種の分子種〔ｃＰＬＡ２α（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｍ７２３９３；Ｃｌａｒｋら、Ｃｅｌｌ、第６５巻、第１０４３−１０５１頁、１９９１年）、ｃＰＬＡ２β（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０６５２１５；Ｐｉｃｋａｒｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７４巻、第８８２３−８８３１頁、１９９９年）、ｃＰＬＡ２γ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０５８９２１；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７３巻、第２１９２６−２１９３２頁、１９９８年）〕が同定されている。ｃＰＬＡ２γは、Ｃａ２＋濃度に非依存的に活性を発揮する。これに対し、ｃＰＬＡ２α及びｃＰＬＡ２βは、蛋白分子のＮ末端側にリン脂質結合領域を有し、Ｃａ２＋濃度依存的にリン脂質膜に結合して活性を発揮するが、活性の発現のためのＣａ２＋必要量は、μＭオーダーであるため、細胞質内でも活性を発揮すると考えられている。
ホスホリパーゼＡ２は、炎症性疾患治療薬等の開発研究において重要な標的分子であり、その阻害剤の研究が精力的に進められている。既知医薬の中にホスホリパーゼＡ２阻害作用が見出されたものがあり、また、特異的なホスホリパーゼＡ２阻害剤が有用な治療薬となりうることが見出されている。
治療効果が高く、副作用の少ない優れた医薬を開発するためには、標的とする特定の型のホスホリパーゼＡ２に対して選択性の高い阻害剤を選択することが望まれている。
さらに、従来のものとは異なる分子種である新しい型のホスホリパーゼＡ２を見出すことが、炎症性疾患の発症メカニズムの研究のためにも、また、新たな治療薬の標的分子となる可能性からも、望まれている。
発明の開示
本発明の目的は、乾癬に関連する、新規な型のホスホリパーゼＡ２及びそれをコードする核酸を提供することにある。また、ホスホリパーゼＡ２阻害剤や医薬の特徴付け、同定又は選択を行うための新しい方法、及び乾癬の診断や検査の新しい方法を提供することにある。また、上記以外の目的については以下の記載により明らかである。
乾癬に関しては、従来、網羅的な遺伝子解析自体が行われていなかったが、本発明者らは、大久保らの開発したボディー・マップ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５巻、第１７−３３頁、１９９４年）を用いて、乾癬患者と正常人の表皮で発現している遺伝子を鋭意比較研究することにより、乾癬患者の表皮で特異的に発現が増大している乾癬関連遺伝子（ＧＳ２１０１５遺伝子）を見出した。さらに、当該遺伝子にコードされるポリペプチドが新規なホスホリパーゼＡ２であることを見出し、当該ホスホリパーゼＡ２を遺伝子組換え技術によって細胞中で発現させることに成功して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕  下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの保存的置換変異体又は自然発生対立変異体であるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列の全長と比較して７５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
（ｉｖ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物にコードされるポリペプチド、
からなる群より選択され、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドから選択されてなるポリペプチド、
〔２〕  ヒトのポリペプチドである、前記〔１〕記載のポリペプチド、
〔３〕  組換えポリペプチドである、前記〔１〕記載のポリペプチド、
〔４〕  前記〔１〕記載のポリペプチドをコードする核酸、
〔５〕  コードされたポリペプチドが、ヒトのポリペプチドである、前記〔４〕記載の核酸、
〔６〕  下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸
（ｂ）下記（Ｉ）又は（ＩＩ）：
（Ｉ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物、又は
（ＩＩ）配列番号：８で示される塩基配列における翻訳領域全長の配列と比較して７０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する核酸、
から選択され、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドをコードする核酸
から選択されてなる核酸、
〔７〕  ヒトの核酸である、前記〔６〕記載の核酸、
〔８〕  下記（Ｉ）又は（ＩＩ）：
（Ｉ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物、又は
（ＩＩ）配列番号：８で示される塩基配列における翻訳領域全長の配列と比較して７０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する核酸、
から選択され、かつ下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）前記〔４〕〜〔７〕のいずれか１項記載の核酸からなる遺伝子の発現若しくは存在の検出、又は
（Ｂ）前記〔４〕〜〔７〕のいずれか１項記載の核酸からなる遺伝子の発現の変調
のために使用される核酸、
〔９〕  単離された核酸である、前記〔４〕〜〔８〕のいずれか１項記載の核酸、
〔１０〕  前記〔４〕〜〔８〕のいずれか１項記載の核酸を含有してなる組換えベクター、
〔１１〕  発現ベクターである、前記〔１０〕記載の組換えベクター、
〔１２〕  前記〔１１〕記載の組換えベクターが導入された宿主細胞、
〔１３〕  １）前記〔１１〕記載の組換えベクターが導入された宿主細胞を培養して、培養物を得る工程；及び
２）前記工程１）で得られた培養物から、該組換えベクター上にコードされたホスホリパーゼＡ２のポリペプチドを回収する工程
を含む、組換えポリペプチドの製造方法、
〔１４〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドを認識する抗体、
〔１５〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を被験物質と接触させ、該ホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定することを含む、炎症性皮膚疾患の治療薬を特徴付け、同定又は選択するための方法、
〔１６〕  該ホスホリパーゼＡ２と、該ホスホリパーゼＡ２の基質と被験物質とを含む反応系内で酵素反応を行い、該ホスホリパーゼＡ２の酵素活性に対する阻害作用を検定することにより、被験物質の作用を検定するものである、前記〔１５〕記載の方法。
〔１７〕  基質がグリセロリン脂質であり、酵素活性がグリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解する活性である、前記〔１６〕記載の方法、
〔１８〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定した被験物質を、炎症性皮膚疾患の患者であるヒト個体に投与することを含む、
ヒトにおける該ホスホリパーゼＡ２の阻害方法、
〔１９〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定した被験物質もしくはこれを含む組成物を炎症性皮膚疾患治療薬として販売する方法、
〔２０〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定した被験物質を担体とともに混合することを含む、炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物の製造方法、
〔２１〕  炎症性皮膚疾患治療薬の製造のための、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２の使用方法、
〔２２〕  炎症性皮膚疾患が、慢性難治性皮膚疾患である、前記〔１５〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の方法、
〔２３〕  炎症性皮膚疾患が、乾癬である、前記〔１５〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の方法、
〔２４〕  被験物質が、ホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤であることが知られていなかった化合物である、前記〔１５〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の方法、
〔２５〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を阻害する化合物を有効成分として含有してなる、炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物、
〔２６〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を阻害する化合物の有効量を患者に投与することを含む、炎症性皮膚疾患の治療方法、
〔２７〕  ヒト又は非ヒト動物個体から採取した生体試料について、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検定することを特徴とする、乾癬の検査方法、
〔２８〕  該発現レベルを、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物をプローブ又はプライマーとして用いて検定する、前記〔２７〕記載の検査方法、
〔２９〕  該プローブ又はプライマーが、配列番号：４で示される塩基配列を有する核酸又はその相補物である、前記〔２８〕記載の検査方法、並びに
〔３０〕  該発現レベルを、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドを認識する抗体を用いて検定する、前記〔２７〕記載の検査方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、後記配列表の配列番号：８は、発明者らが見出した乾癬関連遺伝子（ＧＳ２１０１５遺伝子）の翻訳領域全長を含むヒトｃＤＮＡの塩基配列を表し、配列番号：９は、前記ｃＤＮＡにコードされるヒトのポリペプチド（ＧＳ２１０１５）のアミノ酸配列を表す。
本発明のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２及びそれをコードする核酸は、疾患治療薬（特に炎症性疾患治療薬）の研究開発における新たな標的分子として有用である。とりわけ、前記ホスホリパーゼＡ２及び核酸は、皮膚組織等に特異的に発現しており、かつ、正常組織と比較して乾癬組織において発現が増大しているため、乾癬等の炎症性皮膚疾患の治療薬の研究開発において有用である。また、炎症性疾患の発症メカニズムの研究のためにも有用である。
本発明において、ポリペプチドとしては、組換え型又は単離されたポリペプチドが挙げられる。また、本発明において、核酸としては、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子が挙げられ、組換え型又は単離された核酸が挙げられる。また、これら核酸としては、一本鎖核酸及び二本鎖核酸が含まれる。例えば、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸としては、該塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ、該塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡとその相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）とからなる二本鎖ＤＮＡ、それらに対応するＲＮＡ分子等が含まれる。ここで、本明細書において、前記二本鎖ＤＮＡの構成要素としての「相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」は、前記一本鎖ＤＮＡに対する完全な相補物をいう。
本発明のポリペプチドとしては、例えば、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。本発明には、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの、自然発生的な変異体、人為的に改変した変異体、異種生物に由来するホモログ及びオルソログ等が含まれる。
すなわち、本発明のポリペプチドとしては、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの他、これの保存的置換変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ）及び自然発生対立変異体（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）等のバリアントが挙げられる。
このようなポリペプチド（前記バリアント）は、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の生物学的活性〔すなわち、ホスホリパーゼＡ２活性（より詳細にはグリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解する活性）〕を有するものであればよい。このようなポリペプチド（前記バリアント）のアミノ酸配列は、例えば、配列番号：９で示されるアミノ酸配列の全長と比較して、通常約７５％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに一層好ましくは約９５％以上の配列相同性を有する。あるいはまた、このようなポリペプチド（前記バリアント）としては、配列番号：８で示される核酸配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物にコードされるポリペプチドが挙げられる。
なお、本明細書において、アミノ酸配列に関する「配列同一性」は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて算出された値を適用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、オープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）５、エクステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）２及びワードレングス（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）１１の条件である。
また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して１若しくはそれ以上の保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を有するポリペプチドが挙げられる。
このようなポリペプチドは、配列番号：９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、生物学的活性〔すなわち、ホスホリパーゼＡ２活性（より詳細にはグリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解する活性）〕が失われない程度であればよく、通常１〜約２００個、好ましくは１〜約１６０個、より好ましくは１〜約１２０個、さらに好ましくは１〜約８０個、さらに一層好ましくは１〜約４０個である。
なお、前記「保存的置換変異体」とは、ポリペプチドの有する生理活性を維持し、かつ生体において、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷、ｐＫ等に関して同等の物理化学的性質を示しうるアミノ酸残基同士の置換を有する変異体をいう。「保存的置換」としては、例えば、配列番号：９に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基と、下記１群〜６群：
１群  グリシン、アラニン、
２群  バリン、イソロイシン、ロイシン、
３群  アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、
４群  セリン、スレオニン、
５群  リジン、アルギニン、
６群  フェニルアラニン、チロシン、
のいずれかのグループにおいて、同じグループに属する他のアミノ酸との置換が挙げられる。
ホスホリパーゼＡ２活性が失われないためには、当該活性を司る領域、すなわち触媒領域において、他の領域よりも、アミノ酸配列がより高度に保存されていることが望ましい。
触媒領域としては、例えば、配列番号：９で示されるアミノ酸配列における第２７５〜５２５番目（触媒領域Ａ）及び第６１３〜７９８番目（触媒領域Ｂ）のアミノ酸残基に相当する領域が挙げられる。各触媒領域におけるアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、それぞれ、通常１〜約２０個、好ましくは１〜約１０個、より好ましくは１〜約５個である。このようなポリペプチドの各触媒領域のアミノ酸配列は、配列番号：９で示されるアミノ酸配列中に存在する各触媒領域と比較して、それぞれ、通常約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の配列相同性を有する。一方、非触媒領域におけるアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、通常１〜約１６０個、好ましくは１〜約１４０個、より好ましくは１〜約１１０個、さらに好ましくは１〜約８０個、さらに一層好ましくは１〜約４０個である。
本発明の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）としては、例えば、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸が挙げられるが、これに限定されない。本発明には、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸の、自然発生的な変異体、人為的に改変した変異体、異種生物に由来するホモログ及びオルソログ等が含まれる。
すなわち、本発明の核酸としては、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸の他、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下（より好ましくはハイストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸又はその相補物（相補的配列を有する核酸）が挙げられる。
このような核酸の塩基配列は、配列番号：８で示される塩基配列における翻訳領域全長の配列と比較して、通常約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上の配列相同性を有する。
また、このような核酸は、ホスホリパーゼＡ２活性（より詳細にはグリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解する活性）を有するポリペプチドをコードするものであることが好ましい。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６５℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。具体的には、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ‘ｓ）溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行い、洗浄液（２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中、６５℃で５分間の洗浄を行った後、洗浄液（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中６５℃で３０分間の洗浄を２回行うことにより実施できる。
なお、本明細書において、塩基配列に関する配列同一性は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて算出された値である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、オープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）５、エクステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）２及びワードレングス（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）１１の条件である。
本発明のポリペプチド及び核酸は、哺乳動物の組織や細胞を源（ｓｏｕｒｃｅ）として用いて単離取得できる。かかる哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウス等の非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利用する上では、ヒト由来のものを用いることが望ましい。
本発明の核酸は、本明細書中に開示された配列情報（後記配列表の配列番号：８）を利用して取得することができる。例えば、開示された塩基配列の情報をもとにプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法を適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得できる。
例えば、哺乳動物の細胞や組織から調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、ＰＣＲ法により、本発明の核酸又はその一部に対応するｃＤＮＡ断片を得る。得られたｃＤＮＡをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法又はプラークハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、全長ｃＤＮＡを取得できる。また、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム遺伝子を単離することができる。また、他の哺乳動物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異種生物由来のホモログ又はオルソログを単離することができる。ここで、スクリーニングの際のＰＣＲ法及びハイブリダイゼーション法は、本明細書に記載の温度条件等を参照して行うことができる。
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子産物のポリペプチドをコードする翻訳領域を決定でき、このポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。
本発明のポリペプチドは、哺乳動物の組織や細胞の抽出液から単離精製して得ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、通常の遺伝子組換え技術により組換えポリペプチドとして過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させ生産することができる。また、他のポリペプチド（融合パートナー）との融合ポリペプチド（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）の形で発現させ生産することもできる。前記融合パートナーとしては、例えば、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
組換えポリペプチドは、例えば、本発明の核酸を含有した組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を培養し、その細胞の培養物（培養液の上清、培養細胞の細胞抽出液等）から、目的の組換えポリペプチドを回収することにより製造できる。本発明には、本発明の核酸を含有した組換え発現ベクターが導入された宿主細胞（以下、形質転換細胞ともいう）及び該宿主細胞を用いる組換えポリペプチドの製造方法も含まれる。
本発明の組換えポリペプチドの製造方法は、１）本発明の核酸を含有した組換えベクターが導入された宿主細胞を培養して、培養物を得る工程；及び
２）前記工程１）で得られた培養物から、該組換えベクター上にコードされたホスホリパーゼＡ２のポリペプチドを回収する工程
を含む方法である。
組換えポリペプチドを過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させるための組換え発現ベクター及び形質転換細胞は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、本発明のポリペプチドをコードする核酸を、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで、得られた発現ベクターを宿主細胞に導入する。
発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能がよく保存されたポリペプチドを得るためには、哺乳動物細胞（サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等）及び昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ＳＦ９、ＳＦ２１等）を宿主として用いることが好ましい。
ベクターとしては、用いる発現系に応じて適宜選択することができ、哺乳動物細胞の発現系の場合、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等、昆虫細胞の発現系の場合、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。
本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、用いる発現系に応じて適宜選択することができ、哺乳動物細胞の発現系の場合、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等、昆虫細胞の発現系の場合、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸としては、自然界に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（例えば、配列番号：８で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ）を用いることができるが、これに限定されない。目的とするポリペプチドのアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して、得られたＤＮＡを用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を有するＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したＰＣＲ法や部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２−５６６６頁、１９８４年）等によって実施できる。
本発明のポリペプチドの単離精製は、発現ベクターを導入した細胞の培養物等から、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法等）を適宜組合せることによって、実施できる。
また、本発明のポリペプチド、又はこれと免疫学的同等性を有するペプチド（ポリペプチドの断片又は部分配列を有する合成ペプチド等）を抗原として用いて、本発明のポリペプチドを認識する抗体を取得することができる。ここで、免疫学的同等性を有するとは、例えば本発明のポリペプチドに対する抗体と交差反応を生じるということを意味する。
ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラット、ウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができる。モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法等の技術により製造できる。また、モノクローナル抗体の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体等を作製できる。
上記抗体を用いて、通常の免疫化学的方法（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ法等）により、細胞中又は組織中等における本発明のポリペプチドの発現を検出することができる。あるいは、抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドの精製を実施することができる。また、中和抗体を用いて、本発明のポリペプチドの機能又は活性を変調させる（例えば、抑制する）ことができる。
本発明の核酸と比較して高い配列相同性を有する核酸、及び、本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド）又はその相補物は、（Ａ）本発明の核酸からなる遺伝子の発現又は存在を検出するために、本技術分野における通常の技術を適用して、プローブ又はプライマーとして使用できる。あるいは、（Ｂ）本発明の核酸からなる遺伝子の発現を変調（例えば抑制）させるために、本技術分野における通常の技術を適用して、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドや、リボザイム、デコイとして使用することもできる。このような核酸又はその相補物としては、例えば、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸（センス鎖又はアンチセンス鎖）の、連続する１４ヌクレオチド以上の部分配列又はその相補的な配列を有するヌクレオチド等が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドを過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させることにより、細胞における該ポリペプチドの機能又は活性を高める（増強させる）ことができる。
本発明のポリペプチドが、ホスホリパーゼＡ２活性を有することは、例えば、既知のホスホリパーゼＡ２活性の測定方法（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７３巻、第２１９２６−２１９３２頁、１９９８年等）によって確認することができる。
酵素反応の基質としては、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ホスファチジルコリン等のグリセロリン脂質を用いることができる。
また、本発明のポリペプチドは、これを用いることにより、本発明のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を調べることができ、阻害剤の特徴付け、同定又は選択のために使用することができる。
例えば、本発明のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を被験物質と接触させ、該ホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定することができる。
被験物質の作用の検定は、例えば、
−  本発明のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２と、該ホスホリパーゼＡ２の基質（グリセロリン脂質）と被験物質とを含む反応系内で酵素反応を行い、該ホスホリパーゼＡ２の酵素活性（グリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解する活性）に対する被験物質の阻害作用を検定すること（態様Ｉという）、又は
−  該ホスホリパーゼＡ２と被験物質とを含む反応系内で結合反応を行い、該ホスホリパーゼＡ２と被験物質との結合能を検定すること（態様ＩＩという）、
によって、実施することができる。
本発明のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対して結合能力を有する被験物質（リガンド）は、阻害剤となる可能性が高い。
前記態様Ｉにおいては、阻害作用は、被験物質非存在下の反応での酵素活性Ａ０と、被験物質存在下の反応での酵素活性Ａ１とを比較することにより検定することができ、Ａ０＞Ａ１である場合が、該被験物質が阻害作用を有することの指標となる。
また、前記態様ＩＩにおいては、結合能は、表面プラズモン解析等により検定することができる。例えば、表面プラズモン解析で解析する場合、本発明のホスホリパーゼＡ２を固定化したセンサーチップに、被験物質を含有した溶液を一定の流速で送液し、適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度等）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ等）〕により、光学的変動又は質量の変動として結合の有無、結合速度等を検出することにより、該結合を検定することができる。ここで、ホスホリパーゼＡ２と被験物質との複合体の形成を示すセンサーグラム、例えば、光学的センサーグラム又は質量センサーグラムが、送液による被験物質の導入により変動した場合が、ホスホリパーゼＡ２と被験物質とが結合したことの指標となる。また、複合体の形成が、早いほど、被験物質が、ホスホリパーゼＡ２に対し、高い結合親和性を有することの指標となる。
さらに、被験物質（好ましくは低分子化合物等）について、本発明のポリペプチド（ホスホリパーゼＡ２）に対する阻害作用（又は結合能）を調べ、他の型のホスホリパーゼＡ２に対する阻害作用（又は結合能）と比較することによって、阻害作用（又は結合能）の選択性を判定することができる。これにより、特定の型のホスホリパーゼＡ２に対して相対的に高い作用を有する阻害剤（選択的な阻害剤）を選択することができる。また、阻害剤を同定し、特徴付けることができる。
前記「他の型のホスホリパーゼＡ２」としては、例えば、ｃＰＬＡ２α（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｍ７２３９３；Ｃｌａｒｋら、Ｃｅｌｌ、第６５巻、第１０４３−１０５１頁、１９９１年）、ｃＰＬＡ２β（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０６５２１５；Ｐｉｃｋａｒｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７４巻、第８８２３−８８３１頁、１９９９年）、ｃＰＬＡ２γ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０５８９２１；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７３巻、第２１９２６−２１９３２頁、１９９８年）等が挙げられる。前記ｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β、ｃＰＬＡ２γ等は、それぞれの酵素に応じ、前述のＣｌａｒｋらの文献、Ｐｉｃｋａｒｄらの文献、Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄらの文献の記載の反応条件に従い用いればよい。
本発明のポリペプチドは、乾癬患者の表皮で発現が増大しているホスホリパーゼＡ２であり、上述したようにホスホリパーゼＡ２は、炎症性メディエータの産生において重要な役割を担う酵素である。従って、本発明のホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤（該ホスホリパーゼを阻害する化合物）は、炎症性皮膚疾患（特に、乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）等の治療において、医薬（治療薬等）の有効成分としての効果が期待される。
従って、本発明のポリペプチドは、炎症性皮膚疾患の治療薬の特徴付け、同定又は選択のために使用することができる。すなわち、本発明のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害（望ましくは、選択的に阻害）することを決定することにより、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）の治療薬の特徴付け、同定又は選択を行うことができる。
また、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害（望ましくは、選択的に阻害）することを決定した被験物質は、担体とともに混合することにより、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）の治療のための医薬組成物を製造することができる。
また、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害（望ましくは、選択的に阻害）することを決定した被験物質もしくはこれを含む組成物は、有用な医薬、特に、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）の治療薬として販売することができる。
また、本発明のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害（望ましくは、選択的に阻害）することを決定した被験物質を、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）の患者であるヒト個体に投与することにより、ヒトにおける該ホスホリパーゼＡ２を阻害することができる。
ここで、被験物質として、ホスホリパーゼＡ２を阻害することが知られていなかった化合物を用いることにより、新規な医薬、具体的には、炎症性皮膚疾患治療薬等や治療方法の創製につながる。
当該ホスホリパーゼＡ２を阻害（望ましくは、選択的に阻害）する化合物の有効量を患者に投与することにより、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）を治療することができ、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害（望ましくは、選択的に阻害）する化合物を有効成分として含有してなる、医薬組成物は、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）の治療のため有用である。
本発明のホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤（本発明のホスホリパーゼＡ２を阻害する化合物）としては、後記実施例と同様にして測定した場合のＩＣ５０値が、通常３０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下である化合物が挙げられる。
また、医薬として用いる場合に副作用を低減させるという観点から、有効成分とする化合物は、本発明のホスホリパーゼＡ２に対する選択的な阻害剤（本発明のホスホリパーゼＡ２を選択的に阻害する化合物）を用いることが望ましい。すなわち、本発明のホスホリパーゼＡ２を阻害する化合物のうち、他の型のホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β、ｃＰＬＡ２γ等）に対する阻害作用と比較して、本発明のホスホリパーゼＡ２に対する阻害作用が、３倍以上、好ましくは１０倍以上強い化合物を用いることが望ましい。
本発明のホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤が有する抗炎症作用は、既知の抗炎症作用のアッセイ方法もしくはそれらと同等の方法により評価確認できる。
例えば、哺乳動物の炎症モデルに被験物質を投与して、被験物質が有する抗炎症作用をアッセイし評価することができる。炎症モデルとしては、既知のモデルを用いることができ、例えば、乾癬モデルとしては、免疫不全マウス（ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス）に乾癬患者の皮膚を移植して作製したモデル〔Ｆｒａｋｉ  Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、第８０巻、第３１ｓ−３５ｓ頁、１９８３年；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ  Ｂ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、第１４６巻、第５８０−５８８頁、１９９５年〕、同マウスにＴ細胞を注射して作製したモデル〔Ｓｃｈｏｎ  Ｍ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、第３巻、第１８３−１８８頁、１９９７年〕等を用いることができる。ここで、被験物質の投与により、炎症モデルにおける移植皮膚が、例えば、鱗屑や紅斑の消失・萎縮を呈した場合が、被験物質が、抗炎症作用を有することの指標となる。また、抗炎症作用の度合いは、例えば、移植皮膚におけるケラチノサイトの分化マーカー（Ｋ５、Ｋ１０）の発現が、乾癬病態型から正常型へ変動する度合いを指標として判断されうる。
本発明のホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤の投与方法は特に限定されず、一般的な経口もしくは非経口的な方法（経口、静脈内、筋肉内、皮下等）を適用すればよい。また、必要に応じて、投与方法に応じた不活性な担体と共に、慣用の医薬製剤（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、注射剤、吸入剤等）として製剤化して用いればよい。例えば、一般的な医薬において許容される結合剤、崩壊剤、増量剤、充填剤、滑沢剤等の賦活剤あるいは希釈剤と共に用いて、通常の方法により、製剤化して用いることができる。
投与量は、投与方法、患者の年令、体重、状態によっても異なるが、一般的な１日当たりの投与量は、例えば、０．０１〜３００ｍｇ／ｋｇの範囲で設定される。
本発明のホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤を有効成分として含有する、本発明の炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物は、本発明のホスホリパーゼＡ２に対する阻害作用に基づいて薬効（抗炎症作用）を発現するものである。従って、かかるホスホリパーゼＡ２阻害以外の他の主作用に基づいて薬効を発現する医薬は、本発明には含まれない。
また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子、すなわち本発明の核酸からなる遺伝子は、正常組織と比較して乾癬組織において発現が増大している遺伝子である。従って、生体試料中における当該遺伝子の発現レベルを検定することにより、乾癬の病態等を診断又は検査することができる。
従って、本発明により、乾癬の検査方法も提供される。
本発明の検査方法は、ヒト又は非ヒト動物個体から採取した生体試料について、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検定することを特徴とする方法である。
本発明の検査方法によれば、例えば、乾癬に罹患しているかどうかの判定、乾癬の病態の特徴の判定、乾癬の重症度の判定、乾癬の治療薬や治療方法の効果の判定等に利用でき、とりわけ、尋常性乾癬のために好適に適用される。また、ヒトの乾癬に対して適用される他、サル、イヌ、ラット、マウス等の哺乳動物の乾癬モデルに対しても適用される。さらに、本発明の乾癬の検査方法によれば、簡便、迅速に、良好な感度での乾癬の検査、乾癬組織の検出が可能になる。
従来、乾癬に関しては、主に医師が病理組織像から経験に基づいて診断を行っていた。しかしながら、本発明の検査方法によれば、本発明に係る遺伝子の発現レベルを指標として、客観的に診断を行うことが可能になる。
本発明の検査方法は、ヒト又は非ヒト動物の個体（乾癬に罹患している個体や乾癬への罹患が疑われる個体等）から、生体試料を採取・調製した後、この生体試料を用いて、当該遺伝子の発現レベルを検定することにより実施される。
具体的には、本発明の検査方法は、
−  前記発現レベルを、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物をプローブ又はプライマーとして用いて検定すること、又は
−  前記発現レベルを、本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いて、検定することにより実施される。
生体試料としては、動物（ヒト又は非ヒト）個体由来の細胞、組織等が挙げられる。組織としては、皮膚組織が挙げられ、特に、落屑等乾癬病変部位の皮膚組織等が好ましい。細胞としては、皮膚組織中等に存在する上皮細胞等が挙げられる。
生体試料中での当該遺伝子の発現レベルの検定は、例えば、生体試料からｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）中に存在する当該遺伝子由来のｍＲＮＡを検出・検定することにより実施できる。あるいは、当該遺伝子の遺伝子産物である本発明のポリペプチドを検出・検定してもよい。
当該遺伝子由来のｍＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）の検出・検定には、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｉｎｎｉｓ  ＭＡ，Ｇｅｌｆａｄ  ＤＨ，Ｓｎｉｎｓｋｙ  ＪＪ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ＴＪ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，１９９０年）、ＲＴ−ＰＣＲ法を応用したｉＡＦＬＰ法（Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第９巻、第１３０５−１３１２頁、１９９９年）、ＤＮＡマイクロアレイ法もしくはＤＮＡマイクロチップ法（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７０巻、第４６７−４７０頁、１９９５年；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５１巻、第７６７−７７３頁、１９９１年）、及び、通常のノーザンブロッティング法等を利用することができる。
これらのうち、ＲＴ−ＰＣＲ法は、感度や操作性の点で好適である。またＲＴ−ＰＣＲ法を応用したｉＡＦＬＰ法は、ＲＴ−ＰＣＲ法よりもさらに効率的でハイスループット化された方法であり、多数のサンプルの検定に好適である。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、当該遺伝子由来のｍＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）中の特異的な塩基配列を有する領域を含む断片を増幅するための適当なプライマーを設計、合成する。これらプライマーを用い、生体試料のｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲ産物を、必要に応じて電気泳動等により分離し、その断片を検出して存在量を検定すればよい。
ｍＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）の検出・検定においては、通常、当該遺伝子由来のｍＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）中の特異的な塩基配列を有する領域にハイブリダイズする核酸（オリゴヌクレオチド等）又はその相補物を設計・合成して、これをプローブ又はプライマーとして用いる。
特異的な塩基配列を有する領域は、特に限定されないが、ｍＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）の３’末端側の領域は、個々の遺伝子における配列特異性が高いので、この領域に対応するプローブ又はプライマーを採用することが、検出・検定において遺伝子発現量が適切に反映されるという点で好ましい。本発明の核酸からなる遺伝子におけるこのような３’末端側領域としては、例えば、ＧＳ２１０１５遺伝子のｍＲＮＡのポリＡから上流の最初に出現するＭｂｏＩ認識部位までの領域、すなわち、配列番号：４で示される塩基配列を有する領域が挙げられる。
遺伝子産物である本発明のポリペプチドを検出することによって、本発明の核酸からなる遺伝子の発現を検出・検定する場合には、例えば、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体を上記方法によって作製し、これを利用して通常の免疫化学的方法で検出する方法を用いることができる。
また、前記と同様の手法により、生体試料中の本発明の核酸又はポリペプチドの発現を調べることにより、乾癬組織を検出することもできる。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
実施例１  ボディー・マップ法による乾癬関連遺伝子の探索
大久保らの文献（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５巻、第１７−３３頁、１９９４年）記載の方法に従って、ボディー・マップ（Ｂｏｄｙ  Ｍａｐ）法により、以下のように、乾癬関連遺伝子のランダムスクリーニングを行った。
（１）ベクタープライマーの調製
ベクタープラスミドｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）を制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ及びターミナルトランスフェラーゼとともに反応させて末端にオリゴｄＴ（約３０〜３５個）を付加した。ベクタープラスミドｐＵＣ１１９は、ｄａｍ＋細菌（菌株名  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α；東洋紡績社製）を宿主として用いて複製し調製することにより、制限酵素ＭｂｏＩによる消化を受けないようにしたものを用いた。オリゴｄＴの付加状況は、取り込まれた〔３Ｈ〕ｄＴＴＰに由来する放射活性（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）によってモニターした。ついで、得られたベクターをＨｉｎｃＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルムによる抽出と数回のエタノール沈殿を行い、さらにオリゴ（ｄＡ）セルロースカラムを用いて、長い方のベクター断片を精製・取得した。このベクター断片をプライマー（ベクタープライマー）として用いた。
（２）３’−指向性ｃＤＮＡライブラリーの作製と各クローンの塩基配列の決定
乾癬患者から採取した皮膚組織（病変部の落屑性皮膚組織）１例及び正常人から採取した皮膚組織１例の各々を、クールミル（東洋紡績社製）中で物理的に破砕した後、これらサンプルから、ＲＮＡ調製用キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ）を用いてトータルＲＮＡを調製した。
かくして得られたトータルＲＮＡ（各約１μｇ）（乾癬患者又は正常人由来）を鋳型とし、前記（１）で調製したベクタープライマー（５０ｎｇ）をプライマーとして、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）のリバース・トランスクリプターゼ（商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ；ＢＲＬ社製）を用いて、鋳型の３’側から一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、ポリメラーゼ及びリガーゼ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。さらにガラスミルク（ＢＩＯ  １０１社製）（あるいはフェノール−クロロホルムによる抽出とエタノール沈殿）を用いてｃＤＮＡを精製・取得した。
得られた二本鎖ｃＤＮＡ（ベクターに付加されたもの）を制限酵素ＭｂｏＩ（ＧＡＴＣ配列を認識する）及びＢａｍＨＩで消化し、さらにＭｂｏＩアダプターを連結した後、ベクターを含む断片を環状化した。これを大腸菌（菌株名  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α；東洋紡績社製）に導入し形質転換株を得た。
得られた形質転換株のコロニー（正常人及び乾癬患者組織由来クローンについて各々約１万個ずつ）を自動釣菌装置を用いて９６穴プレートに拾った。９６穴プレート上で菌体を培養した後、オートクレーブにて加熱（９０℃、２０分）して溶菌させた。菌溶解液をミリポアフィルターで濾過して上清を得、これを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ベクタープラスミドの挿入断片を増幅した。ＰＣＲは、９３℃で３０秒と、５０℃で６０秒と、７２℃で２分とを１サイクルとする条件で２７サイクル行い、最終サイクルとして７２℃で５分間の条件で１サイクルを行って反応を終了した。また、ＰＣＲ用のプライマーは、挿入断片を囲むベクター部分の塩基配列をもとに設計し、センスプライマーとしては、後記配列表の配列番号：１記載の塩基配列のオリゴヌクレオチド（ＦＷ（−４０））を、アンチセンスプライマーとしては、配列番号：２記載の塩基配列のオリゴヌクレオチド（ＲＶ（−１４））を各々用いた。
次に、前記で得られたＰＣＲ産物について、ダイデオキシ法によりシークエンス反応を行った後、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３７３Ａ）を用いて塩基配列を決定した。シークエンス反応用のプライマーとしては、ベクターに由来する配列番号：３記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ベクタープライマー）を用いた。
かくして、正常及び乾癬皮膚組織由来のｃＤＮＡクローン各１万個を塩基配列決定に供し、塩基配列が解読できなかったものやミトコンドリア由来のクローンを除いた結果、正常組織由来の約４３００クローン及び乾癬組織由来の約３７００クローンの塩基配列情報が得られた。ヒト皮膚組織（乾癬と正常）で発現する遺伝子の種類としては、計約３０００種類の遺伝子情報が得られた。
前記で得られた遺伝子情報のうち、クローンＧＳ２１０１５について得られたｃＤＮＡ配列情報（すなわち、ｃＤＮＡ３’末端のポリＡから最初に出現するＭｂｏＩサイトまでの塩基配列）は、後記配列表の配列番号：４に示した通りであった。
実施例２  ｉＡＦＬＰ法による発現プロファイル解析
前記実施例１で得られたクローンについて、川本らの文献（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第９巻、１３０５−１３１２頁、１９９９年）記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用したｉＡＦＬＰ（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法により、乾癬組織及び正常組織の間での発現プロファイルの相違を解析した。
まず、乾癬患者から採取した皮膚組織（病変部の落屑性皮膚組織）１０例（Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３・・・、Ｐ１０と称する）及び正常人から採取した皮膚組織７例（Ｎ０１、Ｎ０２、Ｎ０３・・・、Ｎ０７と称する）の各々からトータルＲＮＡを調製した。
得られたＲＮＡを鋳型とし、前記実施例１の（１）で調製したベクタープライマーをＰＣＲに用いて、前記実施例１の（２）と同様に処理することにより、３’側二本鎖ｃＤＮＡ（ベクターに付加されたもの）を取得した。かくして、得られた３’側二本鎖ｃＤＮＡ（ベクターに付加されたもの）を各組織に由来するｃＤＮＡプールとして以下に用いた。
前記で得た各ｃＤＮＡプール全量を制限酵素ＭｂｏＩ（ＧＡＴＣ配列を認識する）で消化した後、各々に増幅用アダプターを連結した。増幅用アダプターとしては、同時処理してもＰＣＲ産物を区別することができるように長さが３塩基長ずつ異なる５種類のアダプター（ＬＰ４０、ＬＰ４３、ＬＰ４６、ＬＰ４９、及びＬＰ５２）を以下のような組合せで用いた。
Ｐ０１、Ｐ０６、Ｎ０１、Ｎ０６  →  ＬＰ４０（４０塩基長）と連結
Ｐ０２、Ｐ０７、Ｎ０２、Ｎ０７  →  ＬＰ４３（４３塩基長）と連結
Ｐ０３、Ｐ０８、Ｎ０３  →  ＬＰ４６（４６塩基長）と連結
Ｐ０４、Ｐ０９、Ｎ０４  →  ＬＰ４９（４９塩基長）と連結
Ｐ０５、Ｐ１０、Ｎ０５  →  ＬＰ５２（５２塩基長）と連結
また、スタンダード（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として、各ｃＤＮＡプールに代えて、市販のヒト臓器由来ｃＤＮＡライブラリー３０種を混合したものを用い、これには６種類目の増幅アダプター（ＬＰ５５；５５塩基長）を連結した。
前記のようにして増幅用アダプターを連結したｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲのセンスプライマーとしては、６種類の増幅用アダプターに共通の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを蛍光標識したもの（Ｆ−Ｔ７（２５）プライマー、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）（２ｐｍｏｌｅ）を用いた。アンチセンスプライマーとしては、発現量を検出したい遺伝子（クローン）に特有の配列（すなわちｃＤＮＡの３’末端ポリＡから最初に出現するＭｂｏＩサイトまでの塩基配列中での特異的配列）をもとに設計し合成したオリゴヌクレオチド（２ｐｍｏｌｅ）を用いた。クローンＧＳ２１０１５の遺伝子発現を検出するためのアンチセンスプライマーとしては、具体的には、配列番号：５に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
ＰＣＲは、異なる種類の増幅用アダプターを連結した３〜５種類の鋳型及びスタンダード用鋳型を、一反応液（１０μｌ）中に、以下のように、等量ずつ混合して行った。
反応液１＝Ｎ０１、Ｎ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、及びスタンダード
反応液２＝Ｎ０３、Ｎ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０６、及びスタンダード
反応液３＝Ｎ０５、Ｎ０６、Ｐ０７、Ｐ０８、及びスタンダード
反応液４＝Ｎ０７、Ｐ０９、Ｐ１０、及びスタンダード
ＰＣＲの反応は、９４℃で３０秒と、５５℃で３０秒と、７２℃で３０秒とを１サイクルとする条件で３５サイクル行い、最終サイクルとして７２℃で３０秒の条件で１サイクルを行って反応終了した。
得られたＰＣＲ産物については、ＡＢＩの自動シークエンサー（ＡＢＩ社製）を用いて、電気泳動し蛍光を検出・定量した。
各組織サンプルのｃＤＮＡプールに由来する検出値について、スタンダードｃＤＮＡに由来する検出値に対する相対値を算出し、この値をもって、各組織サンプル中の遺伝子（転写産物）発現量の相対値とした。
前記のようにして、クローンＧＳ２１０１５の遺伝子発現プロファイルを解析した結果は、第１図に示した通りであった。
クローンＧＳ２１０１５に対応する遺伝子（ＧＳ２１０１５遺伝子）は、乾癬患者由来の皮膚組織中では正常人由来の皮膚組織中と比較して高い発現レベルを示していた。ＧＳ２１０１５遺伝子は、乾癬患者組織に特異的な発現プロファイルを示すことから、乾癬の病態の診断や検査のために使用できることがわかった。
実施例３  ＧＳ２１０１５遺伝子（全長ｃＤＮＡ）のクローニング
前記実施例２にて遺伝子発現プロファイルを確認したクローンＧＳ２１０１５について、以下のようにして、翻訳領域全長を含むｃＤＮＡを取得した。
実施例１で得られた配列情報（３’末端のポリＡから最初に出現するＭｂｏＩサイトまでのｃＤＮＡ塩基配列：配列番号：４）をもとに、ＢＬＡＳＴプログラムを用い、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）を検索した。検索の際の条件は、オープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）５、エクステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）２、ワードレングス（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）１１とした。
その結果、ゲノムドラフト配列にヒットした。このドラフト配列から、エクソン抽出ソフト（ＧｅｎｅＳｃａｎ）を用いてエクソンを抽出し、アミノ酸配列に置き換えてプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）を検索した結果、細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）の特定領域と高い相同性を示した。
この仮想エクソン情報を基に、ＰＣＲ用プライマー（配列番号：６記載の塩基配列を有するもの及び配列番号：７記載の塩基配列を有するもの）を設計し、これらを用いたＰＣＲを行って、乾癬組織由来のｃＤＮＡから、ＧＳ２１０１５遺伝子のｃＤＮＡの３’末端断片（１２４６ｂｐ）を取得した。
さらに、このｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、乾癬組織由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリーは、乾癬患者の皮膚組織（病変部の落屑性皮膚組織）から調製したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡをλＺａｐベクターに挿入して調製したものを用いた。スクリーニングの結果、ＧＳ２１０１５遺伝子の翻訳領域全長を含む全長ｃＤＮＡを取得した。
得られた全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定し解析した。全長ｃＤＮＡの塩基配列（３５８７ｂｐ）を配列番号：８に示し、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列（８１８アミノ酸残基）を配列番号：９に示した。アミノ酸配列から推定されるタンパク質の分子量は約９２ｋＤａであった。
また、配列番号：８に示した塩基配列について、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴプログラムを用い、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）に含まれる全ての配列に対してホモロジー検索を行った。さらに、配列番号：９に示したアミノ酸配列について、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴプログラムを用い、プロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に含まれる全ての配列に対してホモロジー検索を行った。なお、塩基配列についての検索の条件は、オープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）５、エクステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）２、ワードレングス（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）１１とした。また、アミノ酸配列についての検索の条件は、オープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）１１、エクステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）１、ワードレングス（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）３とした。
ホモロジー検索及び解析の結果、配列番号：９に示したアミノ酸配列は、細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）のアミノ酸配列と部分的に相同性を有していることが見出された。
配列番号：９に示したＧＳ２１０１５のアミノ酸配列と、ｃＰＬＡ２の分子種として従来から知られているｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β及びｃＰＬＡ２γのアミノ酸配列とを比較した結果を第２図に示した。
アミノ酸配列の類似性から、ＧＳ２１０１５の触媒領域は、第２７５〜５２５番目（触媒領域Ａ）及び第６１３〜７９８番目（触媒領域Ｂ）のアミノ酸残基に相当する領域であると推定された。また、ＧＳ２１０１５は、ｃＰＬＡ２α及びｃＰＬＡ２βと同様に、Ｎ末端側（第２４〜１４５番目のアミノ酸残基に相当する領域）にリン脂質結合領域を有し、Ｃａ２＋濃度依存的にリン脂質膜に結合すると推定された。
ＧＳ２１０１５のアミノ酸配列を、ｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β及びｃＰＬＡ２γのアミノ酸配列と比較すると、触媒領域Ａにおいては、ｃＰＬＡ２αと３１．３％、ｃＰＬＡ２βと６６．０％、ｃＰＬＡ２γと３１．７％の相同性を示し、触媒領域Ｂにおいては、ｃＰＬＡ２αと２８．９％、ｃＰＬＡ２βと５１．４％、ｃＰＬＡ２γと３６．４％の相同性を示した。リン脂質結合領域においては、ｃＰＬＡ２αと３１．３％、ｃＰＬＡ２βと４５．９％の相同性を示した。アミノ酸配列の全長においては、ｃＰＬＡ２αと２９．３％、ｃＰＬＡ２βと５０．３％、ｃＰＬＡ２γと２７．８％の相同性を示した。
これらアミノ酸配列の比較解析結果から、ＧＳ２１０１５は、ｃＰＬＡ２のファミリーであり、中でも、ｃＰＬＡ２βに最も近い分子種であると推定された。
また、ゲノムドラフト配列の情報から、ＧＳ２１０１５遺伝子は、ｃＰＬＡ２βと同じ第１５染色体上に位置することが判明した。
実施例４  ＧＳ２１０１５の過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記実施例３で取得したＧＳ２１０１５遺伝子（全長ｃＤＮＡ）をＰＣＲにより増幅した。この際、ＰＣＲプライマーとしては、ｃＤＮＡ断片の５’側及び３’側末端に、各々、ＥｃｏＲＩ認識部位が付加されるように設計したものを用いた。
次いで、得られたＰＣＲ産物（ＧＳ２１０１５の翻訳領域全長を含むｃＤＮＡ断片）を、ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ４  ＨｉｓＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することにより、ＧＳ２１０１５の発現用ベクタープラスミドを構築した。この発現用ベクタープラスミドは、ＧＳ２１０１５のＮ末端に、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを付加したタンパク質を発現させるよう構成されている。
ＣＯＳ−７細胞（理研ＲＣＢ０５３９）を、２×１０６細胞／１０ｃｍディッシュの濃度で播き、一晩培養した。前記で構築した発現用ベクタープラスミド（又は対照としてベクタープラスミドｐｃＤＮＡ４  ＨｉｓＭａｘ）の１０μｇを、リポフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ社製、商品名：ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）とともに用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした後、さらに４８時間培養した。
培養後の細胞を用い、以下のように、ウエスタンブロッテイング法により、過剰発現させたＧＳ２１０１５（Ｎ末端、Ｈｉｓタグを付加したもの）を検出した。すなわち、培養後の細胞を回収し、緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３４Ｍショ糖、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１Ｍ  ＤＴＴ）５００μｌを加えて細胞溶解した。この細胞溶解液を遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を分取した後、その１０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
次いで、セミドライ法により、泳動タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転写した後、膜をブロッキング試薬（ブロックエース、大日本製薬社製）を含む溶液中に４℃で一夜浸漬してブロッキングした。さらに、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）（１０００倍希釈）と室温で２時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（商品名）〔０．１％Ｔｗｅｅｎ（商品名）を含むリン酸緩衝化生理食塩水〕で洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）と室温で２時間反応させた後洗浄し、さらに発色試薬（商品名：ＥＣＬシステム、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、抗Ｈｉｓタグ抗体と結合した膜中のタンパク質バンドを検出した。
その結果、タグ付加されたＧＳ２１０１５に相当する分子量約９７ｋＤ付近に、主たる陽性バンドが認められた。
実施例５  ＧＳ２１０１５の酵素的性質の解析及び酵素アッセイ
（１）ＧＳ２１０１５のホスホリパーゼＡ２活性の測定
以下のようにして、ＧＳ２１０１５のホスホリパーゼＡ２活性を測定した。
前記実施例４と同様にして、ＧＳ２１０１５を過剰発現させた細胞（ＧＳ２１０１５発現用ベクタープラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞）から細胞溶解液の上清を得て、これを酵素溶液として用いた。また、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ホスファチジルコリンを基質として用いて、これを加水分解する活性（２位のエステル結合を加水分解してアラキドン酸を遊離する活性）を測定した。また、活性の測定は、文献（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７３巻、第２１９２６−２１９３２頁、１９９８年）記載の方法と同様に、以下のように実施した。
まず、窒素ガス下で乾燥させた１−パルミトイル−２−［１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチジルコリン（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を、２μＭになるように反応用緩衝液〔１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２ｍＭ塩化カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３０％グリセロール、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（脂肪酸非含有）〕に加えて攪拌し、浴槽型超音波洗浄機に３０分浸した後、再び攪拌した。この基質溶液２５０μｌに、酵素溶液（ＧＳ２１０１５発現用ベクタープラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解液の上清。但し、対照としては、ベクターのみをトランスフェクトした同細胞の細胞溶解液の上清。）を１０μｌ添加して、反応を開始した。３７℃で、０、３０、又は６０分間保温して反応を行った後に、ドール試薬（２−プロパノール：ヘプタン：１Ｎ硫酸＝２０：５：１）１．２５ｍｌを加えて反応を停止させた。さらに、カラムクロマトグラフィー用シリカゲル（富士シリシア化学社製）０．１ｇを加えて攪拌し、ヘプタン０．７５ｍｌ及びイオン置換水０．７５ｍｌを加えて１０秒以上攪拌した。その上層（ヘプタン層）を０．５ｍｌ取り、シンチレーション液５ｍｌと混合後、シンチレーションカウンターでラジオ活性を測定した。
また、上記反応用緩衝液において、カルシウムイオンのマスキング剤として、５ｍＭエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸〔ＥＧＴＡ〕を添加し、それ以外は上記と同様にして、ＧＳ２１０１５及び対照についてホスホリパーゼＡ２活性を測定した。
その結果（反応時間と活性との相関）は第３図の通りであり、ＧＳ２１０１５がＣａ２＋濃度依存的なＰＬＡ２活性を有することが明らかとなった。
（２）ＧＳ２１０１５のホスホリパーゼＡ２活性に対する各種化合物の阻害作用のアッセイ
各種被験物質の存在下（又は非存在下）でＧＳ２１０１５のホスホリパーゼＡ２活性を測定し、各種被験物質の阻害作用を調べた。
ＧＳ２１０１５のホスホリパーゼＡ２活性の測定は、上記（１）と同様にして行った。但し、反応液中に、ＥＧＴＡは添加せず、また、各種被験物質（０〜４５μＭ）を添加した。
また、他の型のホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２α）に対する阻害作用も、上記と同様にして調べた。ｃＰＬＡ２α（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｍ７２３９３；Ｃｌａｒｋら、Ｃｅｌｌ、第６５巻、第１０４３−１０５１頁、１９９１年）の酵素溶液としては、前記実施例４と同様にして、ｃＰＬＡ２α発現用ベクタープラスミドを作製し、これをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解液の上清を得て、これを用いた。
被験物質として、ａｒａｃｈｄｉｎｙｌ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）及びｍｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いた時の、ＧＳ２１０１５及びｃＰＬＡ２αのホスホリパーゼＡ２活性に対する阻害作用アッセイ係数を、表１に示した。
2003060132.tif 000002
ｃＰＬＡ２αの阻害剤であるａｒａｃｈｄｉｎｙｌ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ及びｍｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅのうち、後者は、ＧＳ２１０１５のホスホリパーゼＡ２活性に対しても阻害作用を有することが明らかとなった。
実施例６  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるＧＳ２１０１５の発現解析
ヒトの乾癬皮膚組織及び正常皮膚組織を用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うことにより、ヒトの皮膚組織におけるＧＳ２１０１５ｍＲＮＡの発現を解析した。
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおけるプローブとしては、前記実施例３で取得したＧＳ２１０１５遺伝子（全長ｃＤＮＡ）の断片（当該断片の塩基配列は、配列番号：８に示した塩基配列の第２５２２〜３２３６番目の塩基配列に相当する。）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込み、制限酵素ＸｂａＩ及びＡｃｃＩで処理した後に、これを鋳型としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ３  ＲＮＡポリメラーゼによる転写を行って得たｃＲＮＡプローブを用いた。また、皮膚組織切片の作製及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、文献（野村慎太郎ら、細胞工学  別冊（９）  脱アイソトープ実験プロトコール  （１）ＤＩＧハイブリダイゼーション、第７２−８２頁、１９９４年）記載の方法に準じて行った。
なお、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．６Ｍ塩化ナトリウム、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、１×デンハルト溶液、０．２５％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％デキストラン硫酸〕中５０℃で１６時間のインキュベーションであり、洗浄条件は、洗浄用緩衝液〔組成：５×ＳＳＣ〕により、５０℃で５分間の洗浄を１回、ついで、洗浄用緩衝液〔組成：０．２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド〕により、５０℃で３０分間の洗浄を１回の洗浄である。
その結果、ＧＳ２１０１５ｍＲＮＡは、乾癬皮膚組織の表皮上層で発現していることが認められた。また、正常皮膚組織においては発現がほとんど検出されなかった。従って、乾癬皮膚組織においては正常皮膚組織と比較してＧＳ２１０１５ｍＲＮＡの発現が増大していることが確認された。
実施例７  ノーザンブロッティング法によるＧＳ２１０１５の発現解析
各種のヒト組織由来ｍＲＮＡをブロットした市販膜〔東洋紡績社製、商品名：ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ（コード番号：ＭＲＢ−１１１、ＭＲＢ−１１２、ＭＲＢ−１１３、ＭＲＢ−１１４、ＭＲＢ−３１１、及びＭＲＢ−３１２）〕を用いてノーザンブロッティングを行うことにより、ヒトの各種組織におけるＧＳ２１０１５ｍＲＮＡの発現を解析した。
なお、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液〔組成：６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ〕中６５℃で１６時間のインキュベーションであり、洗浄条件は、洗浄用緩衝液〔組成：２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ〕により、６５℃で５分間の洗浄を１回、ついで、洗浄用緩衝液〔組成：０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ〕により、６５℃で３０分間の洗浄を２回である。
ノーザンブロッティングにおけるプローブとしては、前記実施例３で取得したＧＳ２１０１５遺伝子（全長ｃＤＮＡ）の断片（当該ｃＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号：８に示した塩基配列の第９９〜７７０番目の塩基配列に相当する。）を、３２Ｐで標識して用いた。
ノーザンブロッティングの結果、ＧＳ２１０１５ｍＲＮＡの強い発現が胎児皮膚組織及び成人子宮頚部組織において認められ、弱い発現が成人子宮組織及び成人前立腺組織において認められたが、その他の組織（胎児の脳、心臓、肺、肝臓、小腸、腎臓、及び筋肉、並びに、成人の脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胃、空腸、回腸、結腸、直腸、腎臓、膀胱、前立腺、精巣、卵巣、胎盤、及び筋肉の各組織）では発現は認められなかった。ｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β及びｃＰＬＡ２γは、ほぼすべての組織で発現することが知られている（Ｐｉｃｋａｒｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７４巻、第８８２３−８８３１頁、１９９９年）。この点でＧＳ２１０１５は既知のｃＰＬＡ２と大きく異なり、発現が非常に特異的であることが判明した。
実施例８  免疫染色法によるＧＳ２１０１５の発現解析
ＧＳ２１０１５を認識するポリクローナル抗体を作製し、これを用いてヒトの乾癬皮膚組織及び正常皮膚組織の免疫染色を行うことにより、ヒトの皮膚組織におけるＧＳ２１０１５ポリペプチドの発現を解析した。
（１）ＧＳ２１０１５を認識する抗体の作製
ポリクローナル抗体作製用の抗原ペプチドを取得するため、前記実施例３で取得したＧＳ２１０１５遺伝子（全長ｃＤＮＡ）の断片（当該断片の塩基配列は、配列番号：８に示した塩基配列の第１０１〜６７２番目の塩基配列に相当する。）を、制限酵素認識配列を付加したプライマー（配列番号：１０記載の塩基配列を有するもの及び配列番号：１１記載の塩基配列を有するもの）を用いてＰＣＲを実施することにより取得した。このｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで処理した後に、同じ制限酵素で処理したｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込んだ。このベクターを大腸菌ＪＭ１０９株にトランスフェクションして、目的のペプチド（当該ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：９に示したアミノ酸配列の第１〜２２４番目のアミノ酸配列に相当する。）を、Ｎ末端側にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのアミノ酸配列を付加した融合タンパク質として発現させた。この大腸菌溶解液の上清から、目的のペプチドを、グルタチオンセファロース４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて分離精製した。
この抗原ペプチド１ｍｇと完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）を等量混合したものを、背中への皮内注射及び太ももへの筋肉注射を行って、ウサギに接種した。初回接種後、２週間おきに、初回と同様にして、抗原ペプチド１ｍｇと完全フロイントアジュバントを等量混合したものをウサギに接種した。計５回の接種を終了したその１週間後に、ウサギの血液を回収して、免疫血清を調製した。
（２）抗体を用いた発現検出
前記（１）で作製した免疫血清を用いて、ヒトの乾癬皮膚組織及び正常皮膚組織の切片の免疫染色を行った。乾癬皮膚組織及び正常皮膚組織の切片は、前記実施例６と同様にして作製した。免疫染色は、ＡＢＣ−ＰＯ（ウサギＩＧＧ）キット（Ｖｅｃｔａｓｔｅｉｎ社製）のプロトコールに従って行った。
その結果、ＧＳ２１０１５ポリペプチドの発現は、前記実施例６で実施したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるＧＳ２１０１５ｍＲＮＡの発現解析の結果と同様に、乾癬皮膚組織の表皮上層で認められ、正常皮膚組織においてはほとんど検出されなかった。従って、乾癬皮膚組織においては正常皮膚組織と比較してＧＳ２１０１５ポリペプチドの発現が増大していることが確認された。
すなわち、ＧＳ２１０１５遺伝子又はポリペプチドの発現を指標として、乾癬患者の検査を行うことができ、また、乾癬組織を検出することができることがわかった。
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、人工的に合成されたプライマーの配列（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す。
配列番号：２は、人工的に合成されたプライマーの配列を示す。
配列番号：３は、人工的に合成されたプライマーの配列を示す。
配列番号：５は、人工的に合成されたプライマーの配列を示す。
配列番号：６は、人工的に合成されたプライマーの配列を示す。
配列番号：７は、人工的に合成されたプライマーの配列を示す。
配列番号：１０は、人工的に合成されたプライマーの配列を示す。
配列番号：１１は、人工的に合成されたプライマーの配列を示す。
産業上の利用の可能性
本発明のポリペプチド及び核酸によれば、疾患治療薬、特に、炎症性疾患治療薬、より具体的には、乾癬等の炎症性皮膚疾患の治療薬の研究開発、炎症性疾患の発症メカニズムの研究が可能になる。また、本発明の核酸によれば、生体試料等における本発明のポリペプチド及び核酸自体の発現又は存在を検出することができ、該発現の変調を行うことができる。さらに、本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤を特徴付け、同定又は選択する方法によれば、本発明のホスホリパーゼＡ２に対して選択性の高い医薬、具体的には、炎症性疾患治療薬、特に、炎症性皮膚疾患治療薬、とりわけ、乾癬治療薬を、特徴付け、同定又は選択することができる。本発明のホスホリパーゼＡ２を選択的に阻害する化合物は、炎症性皮膚疾患（特に乾癬等の慢性難治性皮膚疾患）に対する優れた治療効果が期待される。さらに、本発明の乾癬の検査方法によれば、簡便、迅速に、良好な感度での乾癬の検査、乾癬組織の検出を可能にする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、正常人及び乾癬患者に由来する皮膚組織サンプルにおけるＧＳ２１０１５遺伝子の発現レベルをｉＡＦＬＰ法により解析した結果を示した図である。図中、「Ｎ０１」、「Ｎ０２」、「Ｎ０３」、・・・及び「Ｎ０７」は、正常人の組織サンプルを表し、「Ｐ０１」、「Ｐ０２」、「Ｐ０３」、・・・及び「Ｐ１０」は乾癬患者の組織サンプルを表す。
第２図は、ＧＳ２１０１５のアミノ酸配列と、ｃＰＬＡ２の分子種として従来から知られているｃＰＬＡ２α、ｃＰＬＡ２β及びｃＰＬＡ２γのアミノ酸配列とを比較し、その相同性を示した図である。
第３図は、ＧＳ２１０１５のホスホリパーゼＡ２活性（１−パルミトイル−２−アラキドニル−ホスファチジルコリンの２位のエステル結合を加水分解してアラキドン酸を遊離する活性）に関し、反応系にＥＧＴＡ（Ｃａ２＋のマスキング剤）を加えなかった場合と加えた場合の各々について、ホスホリパーゼＡ２活性と反応時間との相関を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月13日(2004.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの保存的置換変異体又は自然発生対立変異体であるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列の全長と比較して７５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号：９で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
（ｉｖ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物にコードされるポリペプチド、
からなる群より選択され、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチド
から選択されてなるポリペプチド。
【請求項２】
ヒトのポリペプチドである、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
組換えポリペプチドである、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
コードされたポリペプチドが、ヒトのポリペプチドである、請求項４記載の核酸。
【請求項６】
下記（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸
（ｂ）下記（Ｉ）又は（ＩＩ）：
（Ｉ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物、又は
（ＩＩ）配列番号：８で示される塩基配列における翻訳領域全長の配列と比較して７０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する核酸、
から選択され、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドをコードする核酸
から選択されてなる核酸。
【請求項７】
ヒトの核酸である、請求項６記載の核酸。
【請求項８】
下記（Ｉ）又は（ＩＩ）： 
（Ｉ）配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸若しくはその相補物、又は
（ＩＩ）配列番号：８で示される塩基配列における翻訳領域全長の配列と比較して７０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する核酸、
から選択され、かつ下記（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）請求項４〜７のいずれか１項記載の核酸からなる遺伝子の発現若しくは存在の検出、又は
（Ｂ）請求項４〜７のいずれか１項記載の核酸からなる遺伝子の発現の変調
のために使用される核酸。
【請求項９】
単離された核酸である、請求項４〜８のいずれか１項記載の核酸。
【請求項１０】
請求項４〜８のいずれか１項記載の核酸を含有してなる組換えベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項１０記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１３】
１）請求項１１記載の組換えベクターが導入された宿主細胞を培養して、培養物を得る工程；及び
２）前記工程１）で得られた培養物から、該組換えベクター上にコードされたホスホリパーゼＡ２のポリペプチドを回収する工程
を含む、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を被験物質と接触させ、該ホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、該ホスホリパーゼＡ2を阻害することを決定することを含む、炎症性皮膚疾患の治療薬を特徴付け、同定又は選択するための方法。
【請求項１６】
該ホスホリパーゼＡ２と、該ホスホリパーゼＡ２の基質と被験物質とを含む反応系内で酵素反応を行い、該ホスホリパーゼＡ２の酵素活性に対する阻害作用を検定することにより、被験物質の作用を検定するものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
基質がグリセロリン脂質であり、酵素活性がグリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解する活性である、請求項１６記載の方法。 
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２に対する被験物質の作用を検定し、当該ホスホリパーゼＡ２を阻害することを決定した被験物質を担体とともに混合することを含む、炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物の製造方法。
【請求項１９】
炎症性皮膚疾患治療薬の製造のための、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２の使用方法。
【請求項２０】
炎症性皮膚疾患が、慢性難治性皮膚疾患である、請求項１５〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
炎症性皮膚疾患が、乾癬である、請求項１５〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
被験物質が、ホスホリパーゼＡ２に対する阻害剤であることが知られていなかった化合物である、請求項１５〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドからなるホスホリパーゼＡ２を阻害する化合物を有効成分として含有してなる、炎症性皮膚疾患の治療のための医薬組成物。 
【請求項２４】
ヒト又は非ヒト動物個体から採取した生体試料について、請求項1〜３のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検定することを特徴とする、乾癬の検査方法。
【請求項２５】
該発現レベルを、配列番号：８で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物をプローブ又はプライマーとして用いて検定する、請求項２４記載の検査方法。
【請求項２６】
該プローブ又はプライマーが、配列番号：４で示される塩基配列を有する核酸又はその相補物である、請求項２５記載の検査方法。
【請求項２７】
該発現レベルを、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドを認識する抗体を用いて検定する、請求項２４記載の検査方法。
【国際調査報告】
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