(57)【要約】臓器由来の結合織あるいは支持組織に放射線照射してフィダーレイヤーを形成し、その後、上皮細胞を植えてこれを重層化することで、正常再生組織を形成し、また簡便、かつ確実に、ヒト由来正常組織をベースに三次元培養による再生組織を実現して、そしてこのことによって、各々の再生組織を各臓器のモデルとして医薬品等の化学物質の作用や、副作用の検定システム、あるいは感受性等の検定のためのシステムとする。
2003039611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臓器由来の結合織またはその構成細胞あるいは支持組織に放射線照射してフィダーレイヤーを形成し、その後、上皮細胞を植えてこれを重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法。
【請求項２】
結合織またはその構成細胞あるいは支持組織と上皮細胞が由来臓器の同所性を有していることを特徴とする請求項１の正常再生組織の形成方法。
【請求項３】
結合織またはその構成細胞あるいは支持組織は、臓器由来の線維芽細胞、内皮細胞およびそれらの構成組織の少くともいずれかであることを特徴とする請求項１または２の正常再生組織の形成方法。
【請求項４】
培地で、臓器由来の線維芽細胞の上に血管内皮細胞を植えた後に放射線照射してフィダーレイヤーを形成し、その後、上皮細胞を植えてこれを重層化することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかの正常再生組織の形成方法。
【請求項５】
上皮細胞を植えた後に、細胞外マトリックスの１種以上を添加して上皮細胞を重層化することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかの正常再生組織の形成方法。
【請求項６】
細胞外マトリックスは、細胞外基質の構造要素または接着性分子であることを特徴とする請求項５の正常再生組織の形成方法。
【請求項７】
細胞外マトリックスは、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、およびテネスチンのうちの１種以上であることを特徴とする請求項５または６の正常再生組織の形成方法。
【請求項８】
上皮細胞を植えた後にコラーゲンもしくはコラーゲンとフィブロネクチン並びにラミニンを添加して、上皮細胞を重層化することを特徴とする請求項７の正常再生組織の形成方法。
【請求項９】
結合織またはその構成細胞あるいは支持組織を、同所性を有する臓器由来の別種の構成細胞およびその培養上清の少くとも１種とともに共培養した後に放射線照射してフィダーレイヤーを形成することを特徴とする請求項１ないし８のいずれかの正常再生組織の形成方法。
【請求項１０】
同所性を有する臓器由来の別種の構成細胞、上皮細胞およびそれらの培養上清の少くとも１種とともに共培養して重層化することを特徴とする請求項１ないし９のいずれかの正常再生組織の形成方法。
【請求項１１】
放射線がＸ線またはγ線であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかの正常再生組織の形成方法。
【請求項１２】
炭酸ガス濃度を５〜１５％、大気濃度を８５〜９５％とし、２０〜４０℃の温度範囲で培養して上皮細胞を重層化することを特徴とする請求項１ないし１１のいずれかの正常再生組織の形成方法。
【請求項１３】
臓器由来の結合織または構成細胞あるいは支持組織からのフィダーレイヤーに重層化された上皮細胞層を有していることを特徴とする正常再生組織。
【請求項１４】
上皮細胞層は、神経、口腔粘膜、皮膚、気管支、乳腺、肝臓、または腎臓由来のものであることを特徴とする請求項１３の正常再生組織。
【請求項１５】
結合織またはその構成細胞あるいは支持組織と上皮細胞が由来臓器の同所性を有していることを特徴とする請求項１３または１４の正常再生組織。
【請求項１６】
結合織またはその構成細胞あるいは支持組織は、臓器由来の線維芽細胞、内皮細胞およびそれらの構成組織の少くともいずれかであることを特徴とする請求項１３ないし１５のいずれかの正常再生組織。
【請求項１７】
フィダーレイヤー層が臓器由来の線維芽細胞による下層と血管内皮細胞による上層とによって構成され、フィダーレイヤー層の上には、重層化された上皮細胞層が配置されていることを特徴とする正常再生組織。
【請求項１８】
上皮細胞が約４層以上重層化されていることを特徴とする請求項１３ないし１７のいずれかの正常再生組織。
【請求項１９】
請求項１３ないし１８のいずれかの正常再生組織が基板上に配置されていることを特徴とする正常再生組織。
【請求項２０】
培地または培養液が正常再生組織に接して流通するようにされていることを特徴とする請求項１３ないし１９のいずれかの正常再生組織。
【請求項２１】
請求項１９または２０の正常再生組織の複数のものが培地または培養液の流通路で通過されることを特徴とする正常再生組織。
【請求項２２】
請求項１３ないし２１の正常再生組織の再生臓器モデル体を構成していることを特徴とする正常再生組織。
【請求項２３】
請求項１３ないし２２のいずれかの正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重層化された上皮細胞層に癌細胞を植え、化学物質の添加や放射線照射により癌細胞の感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法。
【請求項２４】
低酸素化状況にて検定することを特徴とする請求項２３の感受性の検定方法。
【請求項２５】
癌細胞を植えた後にコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充し、もしくはコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充した後に癌細胞を植え、次いで感受性を検定することを特徴とする請求項２３または２４の感受性の検定方法。
【請求項２６】
請求項１３ないし２２のいずれかの正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重層化された上皮細胞層に癌細胞を植え、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充してその上に血管内皮細胞を植え、化学物質の添加にともなう癌細胞の血管新生能を検定することを特徴とする血管新生能の検定方法。
【請求項２７】
請求項１３ないし２２のいずれかの正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重複化された上皮細胞に癌細胞を植え、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を載せて、全体を上下逆転させることで、転移あるいは浸潤能を検定することを特徴とする転移あるいは浸潤能の検定方法。
【請求項２８】
請求項１３ないし２２のいずれかの正常再生組織に対し、化学物質の添加や放射線照射により正常再生組織の感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法。
【請求項２９】
請求項１３ないし２２のいずれかの正常再生組織において遺伝子導入の効率を検定することを特徴とする遺伝子導入の検定方法。
【請求項３０】
再生上皮細胞の増殖を抑制するために照射する放射線はＸ線であるいはγ線であることを特徴とする請求項２３ないし２９のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、正常再生組織の形成方法と正常再生組織並びに感受性等の検定方法に関するものである。
背景技術
脳死後臓器移植でさえ遅々としてなかなか軌道に乗らない我が国ではあるが、既に、再生医学医療に向けて、主に組織幹細胞（ＴＳ）の三次元培養が定着している。また胚性幹細胞（ＥＳ）さえもが、倫理的な側面で限られた形ではあるが応用されようとしている。しかし、これらの技術では、いわゆる機能を十分発揮できる再生臓器ができるというにはまだほど遠いのが現状である。また、一方で、製薬メーカー各社が期待するゲノム創薬と対峙する形で、ヒトの臓器組織バンクを創設し維持する動きが盛んである。このような状況において、従来よりは、簡便にかつ確実に、ヒト由来正常組織を重層化し、分化誘導することで、再生組織を形成することへの期待は大きく、これを実現することが重要な課題になっている。それぞれの再生組織を各臓器モデルとすることで、医薬品を中心とした化学物質の作用、副作用の検定システムあるいは感受性予知システムを構築することが可能となるからである。
現状の薬剤の作用や感受性予知のシステムについて概観すると、たとえば、コラーゲンゲルによるＨｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｓｓａｙ（ＨＤＲＡ）が比較的有効なものとして知られている。
しかしながら、ＨＤＲＡには、依然として臨床的に約６０％未満のｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅしかないという欠点がある。ＨＤＲＡは、ｔｒｕｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒａｔｅが８０％以上あるとされていることから、米国でも、ＨＤＲＡは効果のない抗癌剤を判断するためにだけメディケアで採用されている。いわば、最も効果的な薬剤を選ぶべきオーダーメイド医療として認知されているとは言い難いのである。それでも、わが国では、高度先進医療として認められているが、約５０％の確率でしか有効な薬剤を選べない事実に多くの臨床医は満足していないのである。
そして、正常組織の副作用を同時に予測することもできない。
また、ＨＤＲＡ法以外の方法としてはＣＤ−ＤＳＴ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔ）が知られている。しかしこの方法においては、Ｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅは７０−８３％と著しく向上しているのですが、癌細胞の増殖不良（コントロールでも増殖しない）の率が２５％を超え、コンタミ率と合わせて３０％以上が失敗に終わるという重大な欠点がある。すなわち、この二つの率を掛け合わせると結局６０％未満の患者でしか、感受性が予測できない。また、卵巣癌でのデータからは組織型により予測が異なる可能性が示唆されている。またこの方法でも正常組織の副作用の強さは予測できない。
従って、従来の癌治療感受性試験では癌細胞、癌組織の治療に対する感受性を検討できても、正常組織の副作用を同時に検定できるものはなかった。効果が高く、副作用の軽いものを選択するというテーラーメイド癌治療の理想からは遠く隔たっている。
たとえば以上のような現状からも、医薬品の作用や感受性予知等について、従来では想定できなかった高レベルの検知、評価のためのシステムを再生組織によって実現することが焦眉の課題になっている
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の限界と課題を克服し、簡便、かつ確実に、ヒト由来正常組織をベースに三次元培養による再生組織を実現すること、そしてこのことによって、各々の再生組織を各臓器のモデルとして医薬品等の化学物質の作用や、副作用の検定システム、あるいは感受性等の検定のためのシステムを構築するための方策を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、臓器由来の結合織またはその構成細胞あるいは支持組織に放射線照射してフィダーレイヤーを形成し、その後、上皮細胞を植えてこれを重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法を提供し、第２には、結合織またはその構成細胞あるいは支持組織と、上皮細胞が由来臓器の同所性を有していることを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第３には、結合織またはその構成細胞あるいは支持組織は、臓器由来線維芽細胞、内皮細胞およびそれらの構成組織の少くともいずれかであることを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第４には培地で、臓器由来の線維芽細胞の上に血管内皮細胞を植えた後に放射線照射してフィダーレイヤーを形成し、その後、上皮細胞を植えてこれを重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法を提供する。
また、第５には、上皮細胞を植えた後に、細胞外マトリックスの１種以上を添加して上皮細胞を重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第６には細胞外マトリックスは、細胞外基質の構造要素または接着性分子であることを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第７には細胞外マトリックスは、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンおよびテネスチンのうちの１種以上であることを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第８には、上皮細胞を植えた後にコラーゲンもしくはコラーゲンとフィブロネクチン並びにラミニンを添加してゲル化し、上皮細胞を重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第９には、結合織またはその構成細胞あるいは支持組織を同所性を有する臓器由来の別種の構成細胞およびその培養上清の少くとも１種とともに共培養した後に放射線照射してフィダーレイヤーを形成することを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第１０には、同所性を有する臓器由来の別種の構成細胞、上皮細胞およびそれらの培養上清の少くとも１種とともに共培養して重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第１１には、放射線がＸ線またはγ線であることを特徴とする正常再生組織の形成方法を、第１２には、炭酸ガス濃度を５〜１５％、大気濃度を８５〜９５％とし、２０〜４０℃の温度範囲で培養して上皮細胞を重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法を提供する。
また、この出願の発明は、第１３には、臓器由来の結合織またはその構成細胞あるいは支持組織からのフィダーレイヤーに重層化された上皮細胞層を有していることを特徴とする正常再生組織を提供し、第１４には、上皮細胞層は、神経、口腔粘膜、皮膚、気管支、乳腺、肝臓，または腎臓由来のものであることを特徴とする正常再生組織を、第１５には、結合織またはその構成細胞あるいは支持組織と、上皮細胞が由来臓器の同所性を有していることを特徴とする正常再生組織を、第１６には結合織またはその構成細胞あるいは支持組織は、臓器由来線維芽細胞、内皮細胞およびそれらの構成組織の少くともいずれかであることを特徴とする正常再生組織を、第１７には、フィダーレイヤー層が臓器由来の線維芽細胞と血管内皮細胞とによって構成され、フィダーレイヤー層の上には、重層化された上皮細胞層が配置されていることを特徴とする正常再生組織を提供し、第１８には、上皮細胞が約４層以上重層化されていることを特徴とする正常再生組織を提供する。
第１９には、上記いずれかの正常再生組織が基板上に配置されていることを特徴とする正常再生組織を提供し、第２０には、培地または培養液が正常再生組織に接して流通するようにされていることを特徴とする正常再生組織を、第２１には、正常再生組織の複数のものが培地または培養液の流通路で通過されることを特徴とする正常再生組織を、第２２には、正常再生組織が再生臓器モデル体を構成していることを特徴とする正常再生組織を提供する。
そして、この出願の発明は、第２３には上記いずれかの正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重層化された上皮細胞層に癌細胞を植え、化学物質の添加や放射線照射により癌細胞の感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法を提供し、第２４には、低酸素化状態にて検定することを特徴とする感受性の検定方法を、第２５には、癌細胞を植えた後にコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充し、もしくはコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充した後にガン細胞を植え、次いで感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法を提供する。
第２６には、この出願の発明は、上記いずれかの正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重層化された上皮細胞層に癌細胞を植え、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充してその上に血管内皮細胞を植え、化学物質の添加にともなう癌細胞の血管新生能を検定することを特徴とする血管新生能の検定方法を提供する。
第２７には、上記いずれかの正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重複化された上皮細胞に癌細胞を植え、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を載せて、全体を上下逆転させることで、転移あるいは浸潤阻害剤の作用評価等のための、転移あるいは浸潤能を検定することを特徴とする転移あるいは浸潤能の検定方法を提供する。
第２８には、上記いずれかの正常再生組織に対し、化学物質の添加や放射線照射により正常再生組織の感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法を提供する。
第２９には、上記いずれかの正常再生組織において遺伝子導入の効率を検定することを特徴とする遺伝子導入の検定方法を提供する。
第３０には、再生上皮細胞の増殖を抑制するために照射する放射線はＸ線あるいはγ線であることを特徴とする上記いずれかの方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下に、その実施の形態について説明する。
まず、この出願の発明の背景について若干説明すると、１９７０年代以降、特に癌の転移研究などを通じて、ＭＤアンダーソン癌センターのＪフイドラー教授らによって、いわゆる同所性移植の意義が説かれ、世界を席巻してきた。すなわち、肺には肺特有の増殖因子、サイトカインなど液性因子による恒常性維持と細胞相互の接着によって生まれる環境がある。従って、「肺由来の例えば線維芽細胞など各々の細胞は、そのような環境下で最もその本来の形質を示すことができる。」ということが示唆されてきた。最近では、彼のグループは各臓器由来の線維芽細胞は各々特有の突然変異を起こしており、相異なるとの報告まで行っている。さすがにこれは広く受け入れられるまでに至っていない。しかし、最近では、継代により、皮膚の線維芽細胞ではｐ１６の誘導がみられないが、肺の線維芽細胞ではｐ１６の誘導がみられるとの報告がある。
このような背景についても考慮しつつ、この出願の発明では、従来の三次元培養が内在性ウイルスの存在するマウス由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をフィダーレイヤー（ＦＬ）として用いたり、普遍的細胞外マトリックスであるコラーゲンゲルのみを用いた方法に比べて、はるかに効率的な新規三次元培養法が提供される。その特徴としては、上記の同所性移植の特性を活かしつつ、生体内では癌細胞だけが正常組織なしで存在することはあり得ないという事実や、照射を受けた細胞、ＦＬからの遺伝子発現プロファイルへのノイズはほとんどないこと、癌細胞はさておき、正常（上皮）組織は通常ゲル上では重層化しての増殖をしにくいこと、照射を受けた細胞、ＦＬのＭＴＴアッセイ上のノイズも無視できることなどの特徴を活かしている。
すなわち、この出願の発明では、臓器由来の結合織またはその構成細胞あるいは支持組織に放射線を照射してフィダーレイヤーを形成し、その後、上皮細胞を植えてこれを重層化することを特徴としており、この場合の結合織あるいは支持組織は、当然にも、増殖因子、サイトカイニン等を産生する母地である。
結合織またはその構成細胞あるいは支持組織の役割を果たすための代表的なものとしては、臓器由来の線維芽細胞、内皮細胞およびそれらの構成組織のいずれかのものが例示される。なかでも、この発明では線維芽細胞と血管内皮細胞とを例示することができる。その他としては、各種のものが考慮されるが、たとえば、神経膠細胞、平滑筋細胞や心筋などの筋肉等を例示することができる。
そして、特に、この出願の発明においては、結合織またはその構成細胞あるいは支持組織と上皮細胞とは、由来する臓器が、皮膚、腎臓、気管支、神経等の同じ臓器であるという同所性を有していることが一つの重要な形態である。この同所性によって、上皮細胞の重層化は極めて効率的に実現されることになる。
また、その出願の発明では、より具体的にも、培地で、臓器由来の線維芽細胞の上に血管内皮細胞を殖えた後に放射線を照射してフィダーレイヤーを形成し、その後、上皮細胞を植えてこれを重層化することを特徴とする正常再生組織の形成方法を提供する。
この出願の発明の方法においては、上皮細胞を植えた後に、細胞外マトリックスの１種以上を添加して上皮細胞を重層化することや、たとえば細胞外マトリックスとしては、細胞外基質の構成要素または接着性分子を用い、より具体的に例示すると、たとえば細胞外マトリックスは、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フイブロネクチン、ラミニンおよびテネスチンのうちの１種以上を用いることを特徴とすることができる。さらには、各臓器由来の増殖因子を添加することによってさらに重層化効率が向上する。
また、上皮細胞を増えた後にコラーゲンもしくはコラーゲンとフィブロネクチン並びにラミニンを添加して上皮細胞を重層化することや、放射線がＸ線またはγ線であることを好ましい形態としてもいる。さらにまた、結合織またはその構成細胞あるいは支持組織を同所性を有する臓器由来の別種の構造細胞およびその培養上清の少くとも１種とともに共培養した後に放射線照射してフィーダーテイヤーを形成することや、同所性を有する臓器由来の別種の構造細胞、上皮細胞およびそれらの培養上清の少くとも１種とともに共培養して重層化すること、そして上皮細胞の重層化は、炭酸ガス濃度５〜１５％、大気濃度８５〜９５％とし、２０〜４０℃の温度範囲で行うことも好ましい。
以上のとおりのこの出願の発明の方法によれば、臓器由来の結合織またはその構成細胞あるいは支持組織からのフィダーレイヤーに重層化された上皮細胞層を有している正常再生組織が得られることになる。
この場合の上皮細胞層は各種のものであってよく、たとえば、神経、口腔粘膜、皮膚、気管支、乳腺、肝臓、または腎臓等の各種の臓器由来のものが例示される。
重層化は、この出願の発明によれば３層、４層、そして５層以上のつまり、約４層以上のものが入手容易とされる。そして、得られた正常再生組織は基板上に配置してもよいし、培地または培養液がこれに接して流通することや、再生臓器モデル体とすること等ができる。
そして、この出願の発明によれば、正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重層化された上皮細胞層に癌細胞を植え、化学物質の添加や放射線照射により癌細胞の感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法や、これを具体化した、低酸素化状況にて検定することを特徴とする感受性の検定方法、癌細胞を植えた後にコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充し、もしくはコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充した後に癌細胞を植え、次いで感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法が実現される。
また、正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重層化された上皮細胞層に癌細胞を植え、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を補充してその上に血管内皮細胞を植え、化学物質の添加にともなう癌細胞の血管新生能を検定することを特徴とする血管新生能の検定方法や、正常再生組織に放射線を照射して再生上皮細胞の増殖を抑制した後に重複化された上皮細胞に癌細胞を植え、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックスのうちの１種以上を載せて、全体を上下逆転させることで、転移あるいは浸潤能を検定することを特徴とする転移あるいは浸潤能の検定方法、正常再生組織に対し、化学物質の添加や放射線照射により正常再生組織の感受性を検定することを特徴とする感受性の検定方法、正常再生組織において遺伝子導入の効率を検定する方法等が実現されることになる。
以下に、添付した概要図面をも参照しつつ、発明の実施の形態について例示説明する。
＜実施の形態１＞
たとえば、感受性検定のためのシステムに関しては、６穴、１２穴、２４穴ディッシュなど多孔ディッシュを用いることができる。まず、目的とする臓器由来の線維芽細胞及び血管内皮細胞を手術の摘出組織から、細胞１個１個にまでばらばらにしない程度のマイルドなコラゲナーゼ、トリプシン処理後、モノクローナル抗体、セルソーターなどを用いて同定分離する。そして、図１に例示したように、たとえば１５％牛胎児血清添加維持培地（１）で、たとえば約０．５×１０５個／ｃｍ２の線維芽細胞（比率１０）（２）の上に血管内皮細胞（比率１の割合で）（３）を植え、たとえば、その後約６−２４時間以内に線維芽細胞の増殖を抑制しながら、約２週間以上足場としての組織構築を維持するためのプレコンディショニング線量（２０Ｇｙ以下）のＸ−線（４）を照射しＦＬ（５）を作成する。
そのＦＬ（５）上に、たとえば同じく摘出組織からマイルドなディスパーゼ処理により分離した上皮細胞層（約１．０×１０５個／ｃｍ２）（６）を植える。上皮細胞（６）は、三次元に重層化して再生上皮（７）となる。ドナーが高齢や、高度喫煙歴など上皮の増殖能が低い可能性がある場合などは、その上から、滅菌した後、氷温近くまで下げた液状の状態〔比較的低い濃度の各種増殖因子を添加した培地（メンテナンス培地よりも増殖因子は約１／２以下で低濃度とする）で希釈し作成する〕で、コラーゲン（８）を載せた後、温度をたとえば３７℃に上昇させゲル化する。再生組織を維持する場合、やや通常よりも炭酸ガス濃度を上げ、たとえば１０％とし、大気を９０％とし３７．０℃で培養する。炭酸ガスの濃度は５〜１５％、大気は８５〜９５％程度が、また温度は２０〜４０℃が考慮される。この間、たとえば週３回培地交換を行う。約２週間以内に約４層以上、つまり４層もしくは３層以上という形で重層化した段階で正常組織への主作用、副作用あるいは毒性を、各濃度の種々の組み合わせの薬物処理後、あるいは放射線照射後約数−２４時間以内に、ＭＴＴアッセイや遺伝子発現プロフィイル、プロテインプロファイルなどを用いて検討する。
表１は、重層化の前段階での使用が考慮されるＮＨＢＥ（たとえば乳腺上皮や気管支上皮用の）と高ｆａｃｔｏｒ  ＮＨＢＥ（気管支上皮等の特別な増殖促進用）、並びに重層化の際に使用が考慮されるＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ培地の組成について例示したものである。
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そして、この出願の発明では、特徴のある三次元培養により構築される正常再生組織パネルあるいはチップ、再生臓器モデル体も提供される。
硬質ガラス、石英等の基板上に、上記の再生組織を形成し、さらにはその培養液を流通させるようにする。複数種の正常再生組織を培養液の流路として連通してもよい。なお、パネルあるいはチップの場合には、あらかじめ基板表面に、ラミニン、フィブロノネクチンなどの基質をコートしておくことも考慮される。
実際に、発明者によって、表２のような種類の臓器由来の正常再生組織や、神経、皮膚、乳腺、肝臓、腎臓等由来の正常再生組織の構築が可能であることが確認されている。
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それぞれのパネルまたはチップを組織あるいは臓器モデルとし、薬剤など化学物質、あるいはホルモンなど抽出物質も含めて主作用、副作用を検出するための手段として確立できる。現在までに、商業的に入手した気管支、乳腺、前立腺、肝臓、神経、や同意に基づいて入手した細胞としての症例由来皮膚、頭頚部粘膜などの三次元培養を試み種々の臓器由来の組織総ての再生組織の確立に成功している。更に心臓、肝臓、なども含めて薬剤などの標的臓器すべてを網羅し、薬剤の主作用、副作用としての検定するパネルとして応用することが可能となる。もちろん、制癌剤の感受性試験のための手段としても応用可能である。
各々のパネルまたはチップ用の培地を混ぜることにより、内分泌ホルモン系やオートクラインやパラクライン増殖因子は言うに及ばず、近い将来神経をも含めて、ヒトに優しい化学物質の検定システムとして役立つものとなる。
たとえば抗癌剤や各種の分割法による放射線治療などとの組み合わせの感受性を調べる場合では、図１にも例示したように、上記の重層化した再生上皮（７）に、その増殖を抑制するため２０Ｇｙ以下のＸ−線あるいはγ線（９）を照射し新たにＦＬとした後、手術組織から分離し、１−３ｍｍ角に細切し、上記ＦＬのコンデション培地で作成したコラーゲンゲル中にて維持していた癌細胞（約１０００個／ｃｍ２の濃度）（１０）あるいは正常線維組織や血管など腫瘍間質を含む組織を植える。そして培地を増殖因子を可能な限り低濃度にした培地に置き換え、たとえば約１２−２４時間後に上記の各種の処理を行った後、約４８−９６時間でＭＴＴアッセイや約６−４８時間後に遺伝子発現プロファイル、プロティンプロファイルなどを用いて検討する。ガン細胞（１０）を植えた場合には、必要に応じてコラーゲンゲルを補充して、化学物質の添加や放射線の照射（１１）によって、ガン細胞の感受性を検定することができる。更にコラーゲンゲル上で三次元的に癌組織が３−５ｍｍ角以上に増殖したことを確認できた段階で、その上から更にコラーゲンゲルを載せ、低酸素状態に近い環境を作成し血管内皮細胞をコラーゲンゲルの外側に植え、血管新生阻害剤の検定をする目的で、個別の癌腫の血管新生能の検討に応用することができる。なお、培養系で低酸素状態を形成する方法としては、旋回培養などで、癌細胞群が「まりも」のように球状に増殖するスフェロイドの場合が知られている。この場合、約２００〜４００ミクロン以上の直径になると、中心部に低酸素状態ができる。このような知見から、この出願の発明でも同様にゲルに包まれた癌組織が三次元的に増殖し、中心部に低酸素状態を形成することができる。また、ＩＶ型コラーゲン等で作成したゲルを載せて、上下をひっくり返せば、転移あるいは浸潤阻害剤の検定のための浸潤能を検討するシステムとして応用することができる。
癌細胞の感受性の検定とは別に、たとえば図２に示したように、重層化した上皮細胞層にコラーゲンゲル（１２）を補充し、その上に癌組織（１３）をのせて、次いで、化学物質や放射線等に対しての癌組織の感受性を検定することもできる。
一方、図に示した重層化した上皮細胞（７）層を有する正常再生組織に対しては、必要に応じてコラーゲンゲル（１２）を補充し、化学物質や放射線等に対しての正常組織の感受性を検定することが可能となる。
そして、この出願の発明による医薬品の主作用と副作用の検定に関しては、健常人由来の正常再生組織とともに、むしろ、生活習慣病などの病態のある正常再生組織（癌がないという意味で）を用いることに意義があることが考慮される。実際、糖尿病などの症例に対する主作用・副作用の検定系として好ましい。
たとえば以上例示したような、この出願の発明の方法では、従来のコラーゲンゲルによりＨｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｓｓａｙ（ＨＤＲＡ）やＣＤ−ＤＳＴが依然臨床的には約６０％未満のｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅしかないという欠点を十分補いｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅを向上させることができる。最も効果的な薬剤を選ぶべきオーダーメイト医療として認知されているとは言い難く、約５０％の確率でしか有効な薬剤を選べずに多くの臨床医は満足していないＨＤＲＡやＣＤ−ＤＳＴに対し、この出願の発明によれば外来性の培地中の増殖因子を低濃度に抑え、個々の症例からの正常組織を用い、正常組織への副作用と、正常組織と共存する癌組織の感受性を同時に検出可能であり、いわゆるオーダーメイド癌治療を実現するものとなる。また、この方法は再生組織あるいは臓器を、ＴＳ以外の幹細胞から作成する場合に、分化誘導を薬剤や外来の生物学的因子を過剰に添加しなくても作成する方法としても応用できる。
また、この出願の発明は、遺伝子治療のインビトロ検定系としても有用である。遺伝子導入の効率などは、従来、二次元培養系で検定されていたが、これには大きな制約がある。実際の臓器のモデルとしてのこの出願発明の再生組織は、三次元性を有するものとして意義のあるものである。
なお、正常組織の三次元培養には、粘膜下層に多い線維芽細胞の増殖が圧倒的に早いため、この組織レベルでの排除を考慮する必要があり、たとえば、以下の操作が前提として考慮される。
１．手術時、あるいは生検時、採取した組織粘膜などを、抗生物質液（ペニシリンＧ１００ユニット／ｍｌ、カナマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、ファンギゾン０．２５マイクロｇ／ｍｌを含む）を含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｃａイオン、Ｍｇイオン不含）で良く洗浄する。
２．ディスパーゼ（１００ユニット／ｍｌ）を含むＤＭＥ（ＦＣＳ含有）で４．０℃下で約２４時間処理する。
３．その後、上皮層と粘膜下層を物理的に分離する。
４．上皮層のみトリプシン（０．２５％及び０．０５％ＥＤＴＡ含有（トリプシンの効きが悪い場合のみ））溶液中で３０分間処理する。
５．マグネチックスターラーを用いて攪拌し、上皮細胞を分離する。
６．ナイロンメッシュにて濾過し、上皮細胞を抽出する。
７．同様に粘膜下層から、血管内皮細胞、線維芽細胞をコラゲナーゼ溶液などを用いて分離する。
８．上記で得た細胞を、さらに、モノクローナル抗体標識によりソーティングし、各々の分画を単離する。
９．血清を含めて増殖因子など添加因子を１／１０に下げて、あるいは無血清培地中で３日間培養することで線維芽細胞の増殖を抑制する。
癌組織の三次元培養に持込みやすい組織レベルでの検討では上記のように、摘出癌組織から、腫瘍間質を含む１−３ｍｍ角の癌組織を作成し、多孔培養皿内でコラーゲンゲル上に載せ、正常組織の三次元的培養が４層以上に達するまで待つことが望ましい。
なお、ヒト臓器由来の細胞（組織）については、たとえば次の表３、表４のものが、市販品として入手可能である。
2003039611.tif 000005
2003039611.tif 000006
これらの細胞について、この出願の発明では試料としての使用が考慮されている。もちろん、以上例示のものに限定されることはない。
添付した図３、図４、図５および図６は、市販のヒト由来の正常組織について三次元の培養を検証した結果を例示した写真である。これらの写真は次のものを示している。
図３：正常肺線維芽細胞と血管内皮細胞の共培養でＸ線２０Ｇｙ照射前のもの
図４：上記照射後２４時間で気管上皮細胞を植えて２４時間後図５：１週間後
図６：部分的ではあるが、４層以上に重層化したもの
以上の例からは、この出願の発明の正常再生組織の形成が確認される。
また、図７、図８および図９は、以下のものを示し：
図７：この発明の方法による正常再生組織における再生気管支上皮細胞
図８：Ｘ線１０Ｇｙ照射３日後の再生気管支上皮細胞
図９：Ｘ線２０Ｇｙ照射３日後の再生気管支上皮細胞
これらの写真から明らかなように、Ｘ線にたいしての正常細胞組織の感受性を検定することが可能であることがわかる。
さらに、図１０、図１１、図１２および図１３は以下のものを示している。
図１０：この発明の方法により形成された再生気管支上皮細胞層にコラーゲンゲルを補充し、その上に、ヒト肺ガン由来ＡＯＩ細胞を移植した３日後の状態
図１１：図１０の場合と同様にして移植した３時間後に２０ＧｙＸ線を照射し、その直後の状態
図１２：図１１の場合において、照射３日後の状態
図１３：図１２の場合において、Ｘ線を１０Ｇｙで照射した時の状態
以上の図１０〜図１２によって、肺癌細胞のＸ線照射に対する感受性と、Ｘ線照射による抗癌作用についての検定が可能であることがわかる。制癌剤についても同様にして検定可能となる。
＜実施の形態２＞
上記と同様にして、さらに各種のヒト臓器由来の再生組織を形成し、これを癌治療感受性試験に供した。
１．粘膜シートの作成
１．１  ＳｕＳａ（Ｆｅｅｄｅｒ  Ｌａｙｅｒ）の調整
Ｆｅｅｄｅｒ  Ｌａｙｅｒとして、ＳｕＳａ（ヒト線維芽細胞）を用いた。培地には１０％Ｆｏｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．，以下ＦＣＳ）含有  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．，以下  ＤＥＭＥ）を使用した。２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり５×１０４／ｃｍ２となるように播種し、２４ｈｒ後にＸ線を２０Ｇｙ照射した。
１．２  上皮細胞の調整
上皮細胞は、腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、メザンギウム細胞（ＮＨＭＣ）、前立腺上皮細胞（ＰｒＥｃ）、神経前駆細胞（ＮＨＭＰ）、ヒト肝細胞（ＮＨｅｐｓ）、乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）（すべてクロネティクス社）を用いた。培地には、ＲＰＴＥＣは６．５１ｎｇ／ｍｌトリオードシロニン、０．５μｇ／ｍｌエビネフリン、１μｇ／ｍｌ  ＧＡ−１０００，１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチソン、０．０１μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ、０．５％  ＦＢＳ含有ＲＥＮＡＬ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＡＳＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ（クロネティクス社、ＲＥＢＭ）、ＮＨＭＣは、１μｇ／ｍｌＧＡ−１０００、５％  ＦＢＳ含有ＭＥＳＡＮＧＩＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＡＳＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ（クロネティクス社、ＭｓＢＭ）、ＰｒＥＣは１３μｇ／ｍｌ  ＢＰＥ、５μｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌ  ＧＡ−１０００、０．１ｎｇ／ｍｌレチン酸、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．５１ｎｇ／ｍｌトリオードシロニン、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、０．５μｇ／ｍｌエピネフリン、０．０１μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ含有ＰＲＯＳＴＡＴＥ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＡＳＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ（クロネティクス社，ＲｒＥＢＭ）、ＮＨＭＰは、０．０１μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ−８，０．０１μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ、０．８％  ＮＳＦ、１μｇ／ｍｌ  １ＧＡ−１０００含有ＮＥＵＲＡＬＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ  ＢＡＳＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ（クロネティクス社、ＮＰＢＭ）、ＮＨＥＰＳは、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、０．０１μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ、ＢＳＡ、アスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌ  ＧＡ−１０００含有ＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥ  ＢＡＳＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ（クロネティクス社、ＨＢＭ）、ＨＭＥＣは、５μｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌ  ＧＡ−１０００，０．０１μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ、１３μｇ／ｍｌ  ＢＰＥ、０．５μｇ／ｍｌヒトロコルチゾン含有ＭＡＭＡＰＹ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＢＡＳＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ（クロネティックス、ＭＥＢＭ）を使用した。コラーゲンディッシュ（ＩＷＡＫＩ）を用いて３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター培養し、８０％〜９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったのち１種類の細胞につき２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを６枚用意し、あらかじめに準備した前記のＦｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ上に１ｗｅｌｌあたり５×１０３／ｃｍ２となるように播種した。
１．３  再生シートの培養
粘膜シートの培養には、ＤＭＥＭ（−）を使用した。培地には５μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２×１０−４Ｍトリヨードサイロニン、１×１０−９Ｍコレラトキシン、０．５μｇ／ｍｌハイドロコーチゾン、１０ｎｇ／ｍｌヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；宝酒造株式会社）、１０００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ（明治製菓株式会社）、１ｍｇ／ｍｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ，ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｋｌ  ａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）の濃度に調整された１％  Ａｎｔｉ−Ｂ、および１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ．，以下ＦＢＳ）を添加した。３７℃，１０％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、培地交換は２日毎に行った。１０日後に培地を除いた後、Ｇｅｌｌ  ｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ｇｅｌと１０×ＭＥＭ（ＮａＯＨ  ｆｒｅｅ）と２．２％ＮａＯＨおよび２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む０．０５Ｎ−ＮａＯＨ（新田ゼラチン株式会社）を８：１：１で混合したコラーゲンゲルを２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり０．５ｍｌのせた。２０日間培養したのち、ＭＴＴａｅｅａｙ用に２枚に分けて、ＲＰＴＥＣとＮＨＭＣはＡＣＨＮ−Ｌ４、ＰｒＥＣはＤＵ１４５，ＮＨＮＰはＡ７、ＮＨｅｐはＡｌｅｘ、ＨＭＥＣはＭＤＡ−ＭＢ−４５３を５×１０４／ｃｍ２となるように播種した。播種してから４ｈｒ後に１０μｇ／ｍｌ  ＣＤＤＰを添加し、２４ｈｒ後にそれぞれＸ線を０ＧＹ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、１０Ｇｙ照射した。照射７２ｈｒ後にＭＴＴａｓｓａｙのサンプリングを行った。
２．ＭＴＴａｓｓａｙ
ＣＤＤＰ投与後、７２ｈｒ後に培地を除いた後、コラーゲンゲルを約３ｍｍ角に切り、０．２％コラーゲナーゼを添加し、３７℃にて振とうさせて溶解したのち、１０００ｒｐｍ、５分間遠心して細胞を分離させて培地で再浮遊したあと２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに戻した。０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎ（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社．、以下Ｒｏｃｈｅ）を添加して４時間３７℃、１０％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、培地と等量のＳｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）を添加して２４時間３７℃、１０％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。その後各々のウェルから９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２００μｌずつ移しとり、マルチプレートリーダーにより波長６００ｎｍで吸光度を測定し３ウェルの平均値で表示した。
３．再生可能臓器由来組織の種類について
今回用いた腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ：図１４）、メザンギウム細胞（ＮＨＭＣ：図１５）、前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ：図１６）、神経前駆細胞（ＮＨＭＰ：図１７）、ヒト肝細胞（ＮＨｅｐｓ：図１８）、乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ：図１９）は、いずれも培養開始後、１０日以内に重層化した。また３週間以内にほとんど４層に達していた。また、たとえばメザンギウム細胞（ＮＨＭＣ）についてゲルを乗せる前の５日後に既に重層化が観察されたことから、コラーゲンゲルが再生に必須ではないことも確認された。
４．癌治療感受性試験の結果
ＭＴＴａｓｓａｙによる感受性試験の結果を図２０〜２３に示した。図中のｇｅｌ＋ｃａｎｃｅｒが従来のＨＤＲＡ法に相当する。この出願の発明の感受性試験は、上皮＋ｇｅｌ＋ｃａｎｃｅｒが代表し、上皮＋ｇｅｌが正常組織の感受性を示す。癌細胞だけの分離はしなかったため、上皮＋ｇｅｌ＋ｃａｎｃｅｒのＭＴＴａｓｓａｙは癌組織と２０Ｇｙ照射を受けｆｅｅｄｅｒ  Ｌａｙｅｒ化した正常組織の両方足した結果となっている。
癌細胞ではヌードマウス移植腫瘍及び臨床的に放射線化学療法に抵抗性の多型神経膠芽腫由来Ａ７細胞がＭＴＴａｓｓａｙではＨＤＲＡ法以上に抵抗性を示した（図２０）。肝細胞癌ＡｌｅｘはＭＴＴａｓｓａｙではＨＤＲＡ法との間に有意な差を認めなかったがシスプラチンとの併用効果で差が出た。前立腺癌細胞ＤＵ１４５は、ＭＴＴａｓｓａｙではＨＤＲＡ法で極端に放射線感受性が高いことを示したが、臨床的にヌードマウス移植腫瘍の実験でもそれほど高感受性ではないことが確認されており、この出願の発明の感受性の方の感受性がより近い結果となった。最後に臨床的にもヌードマウス移植腫瘍でも放射線抵抗性の腎癌ＡＧＨＮ−Ｌ４は支持組織がメザンギウス細胞ＮＨＭＣ由来か、腎臓近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣ由来かで全く放射線感受性が異なることが明らかとなった（図２２及び２３）。即ち支持組織の違いで同じ癌細胞の感受性に違いが出ることを示唆する非常に興味深い結果が得られた。またシスプラチン感受性からはこの出願の発明の感受性試験の方が、ヌードマウス移植腫瘍の結果に近いことが確認された。各癌細胞の感受性を新規感受性試験でＭＴＴａｓｓａｙで比較すると、シスプラチン高感受性のＡＣＨＮ−Ｌ４細胞の結果が合致した。
＜実施の形態３＞
癌治療感受性の試験を従来の二次元培養でのＭＴＴアッセイ系との比較として行った。
図２４〜図３４はその結果を示したものである。これらの図においては、癌細胞名のカラム（例：ＡＯＩ）が二次元培養の癌細胞の感受性に相当している。２番目のカラム（例：ＡＯＩ／（ＮＨＢＥ＋ＡＯＩ）は再生正常組織の上で三次元培養した癌組織に治療を行い癌組織のみを取り上げてＭＴＴアッセイを行った時の感受性に相当する。３番目（例ＮＨＢＥ／（ＮＨＢＥ＋ＡＯＩ）は、最初は正常組織のみで途中から癌組織と共培養し治療を行った後、癌組織を除いた後の三次元的再生正常組織のみの感受性に相当する。
また、これらの図においては、ＭＴＴａｓｓａｙの表示下の括弧の中は、左から用いた正常上皮細胞名（今回は気管支上皮（ＮＨＢＥ）または前立腺上皮（ＰｒＥＣ））、培地濃度（１／１０倍または１倍）、それからフィダーレイヤーに用いた線維芽細胞名（皮膚由来（ＳＵＳＡ）または肺由来（ＮＨＬＦ））を示している。Ｃｏｎｔｒｏｌは無処理群のＭＴＴアッセイの結果をＸ−ｒａｙは１０Ｇｙ一回照射後７２時間後のＭＴＴの結果を、また５ＦＵは５ＦＵを１０μｇ／ｍｌで７２時間の薬剤処理後のＭＴＴａｓｓａｙデータを、５ＦＵ＋Ｘ−ｒａｙは５ＦＵを１０μｇ／ｍｌで３時間処理後に１０Ｇｙ照射を併用し更に５ＦＵ添加後７２時間薬剤を併用処理後のＭＴＴａｓｓａｙデータを示している。さらにまた今回の３種類の薬剤処理はいずれも１０μｇ／ｍｌで７２時間の処理を行っている。
具体的には薬剤処理は、抗ガン剤３種類（ＣＤＤＰ、ＭＭＣ、５ＦＵ）の比較として行っている。
＜Ａ＞皮膚由来線維芽細胞（ＳＵＳＡ）をフィダーレイヤーとして用いた結果
１．結果として、例えば１／１０濃度培地では増殖因子の濃度が１／１０であるためか、癌組織と共存していた三次元的な正常組織は単独の正常組織よりも放射線やＭＭＣ単独やＭＭＣ＋Ｘ−ｒａｙに対して抵抗性であることがわかる。また二次元培養ＡＯＩ肺癌細胞よりも正常組織と共存していた三次元的ＡＯＩ癌組織の方がＭＭＣ単独やＭＭＣ＋Ｘ−ｒａｙに対して抵抗性であることもわかる。
２．１倍濃度の培地では増殖因子が過剰に存在するためか、むしろ三次元的に増殖している正常組織がマイトマイシンＭＭＣ単独やＭＭＣ＋Ｘ−ｒａｙに対して抵抗性になっている。また三次元的ＡＯＩ癌組織の方が、共培養して照射を更に１０Ｇｙ受けている正常気管支上皮からの増殖因子などのシグナルがあるためか二次元培養のＡＯＩ癌細胞よりも抵抗性になる。
３．以上の傾向は抗ガン剤のシスプラチンでも観察された。特に三次元培養のＡＯＩ癌組織が二次元培養のＡＯＩ癌細胞よりも抵抗性になる程度が培養液（増殖因子）の濃度により強く影響されることが判明した。１／１０倍培地での放射線照射や５ＦＵ投与では、むしろ共培養していたＡＯＩ癌組織を除いた後の再生正常気管支上皮組織の増殖を促進する傾向が示唆された。また正常組織単独でも副作用の出現の程度は軽いことが示唆された。１倍の培地では添加増殖因子のためか、照射あるいは５ＦＵ単独処理時には増殖がむしろ促進されたが、両者を併用した場合にはその促進効果は消えた。再生正常組織に対する副作用は、むしろ添加増殖因子の濃度が高い場合には強く出ることが示唆された。
４．また１／１０倍の培地下の再生前立腺組織中では１０Ｇｙ照射した前立腺癌由来ＤＵ−１４５癌細胞を除いた後の再生正常前立腺組織の増殖がむしろ促進していた。この癌細胞もヌードマウス移植時と同じく放射高感受性と判明した。むしろ二次元培養の癌細胞よりも高感受性であった。むしろこの癌細胞はＡＯＩ細胞と比較して、シスプラチンには抵抗性で、５ＦＵには感受性が高く、またマイトマイシンに対しては、ＡＯＩ細胞と同程度の感受性を示した。
＜Ｂ＞肺由来の線維芽細胞をフィーダーレイヤーとして用いた場合
１．１／１０倍の培地下での肺由来の線維芽細胞を用いた場合には、大きく様相が変わった。
すなわち、三次元培養のＡＯＩ癌組織では、シスプラチンにはむしろ抵抗性であった。すなわち、また５ＦＵにたいしては、どの組織も感受性を示さなかった。更にマイトマイシンに対しては、皮膚由来と肺由来の線維芽細胞を用いた場合ん大きな違いはなかった。
２．１倍の培地下での肺由来の線維芽細胞を用いた場合には、大きく様相が変わった。
すなわち、線維芽細胞の違いによるＡＯＩ癌組織のシスプラチンに対する感受性の違いは小さかったが、正常組織に対するシスプラチンの毒性が小さくなった。またＡＯＩ癌細胞組織及び正常組織の５ＦＵに対する感受性が三次元では低くなった。更に三次元におけるＡＯＩ癌組織の感受性が高くなっか。この結果は同じガン細胞をヌードマウスに移植した場合の結果ときれいに合致している。
＜Ｃ＞結果からの判断として
１．実際のヌードマウスに移植したＡＯＩ腫瘍はヌードマウスの体重が２／３近くに減少する毒性の強い１０ｍｇ／ｋｇ（培養系では１０μｇ／ｍｌ相当か）のシスプラチン投与でも増殖遅延がわずか数日しか起こらない程、抵抗性を示す。またＡＯＩ腫瘍はマイトマイシンに対してシスプラチンよりもむしろ感受性が高いと言える。
２．以上のことから、やはり三次元培養した正常組織を用いた感受性の比較ではフィダーレイヤーに用いる線維芽細胞が同じ臓器由来かどうかで感受性が大きく異なることが判明した。すなわち、同じ臓器由来の線維芽細胞を用いてフィダーレイヤーを作成した方が、正確な感受性を検出できる。
実際に臨床材料を用いる場合には同じ臓器由来の線維芽細胞の入手が容易なため、問題は起こらない。また添加増殖因子の影響が感受性にも大きく出る場合もあるが、今回１／１０倍濃度の培地でも感受性の検定がむしろ正確に出ることが判明したため、問題はない。
以上の実験結果から、異所性（肺癌に対して皮膚由来の線維芽細胞をフィダーレイヤーとして用いた場合）のフィダーレイヤーを用いると、明らかに反応（感受性）に大きなぶれが生じる場合がある。また、結果として全体としては肺由来線維芽細胞（結合織）と再生気管支上皮組織を、両方とも癌に対しては、フィダーとして用いることなったため、肺癌由来細胞が本来の感受性（反応）を示したものと考えられる。これも同所性の作用を裏付ける結果となる。
＜実施の形態４＞
実施の形態２において、この出願の発明の臓器由来組織の再生ではコラーゲンゲルが再生に必須でないことが確認されているが、このことはコラーゲン以外の細胞マトリックスの一例であるフィブロネクチンの使用によっても確認することができた。
図３５は、腎臓由来の細胞：ＰｒＥＣについてコラーゲンのみを添加した場合の結果を例示しているが、図３６は、コラーゲンを使用することなしに、フィブロネクチン１００μｇ／ｍｌのみを用いた結果を例示している。このことから、フィブロネクチンによっても重層化が実現されることがわかる。
＜実施の形態５＞
コラーゲンゲル以外の細胞外マトリックスの添加効果について、この出願の発明の重層化による臓器由来組織の再生を検証した。
すなわち、実施の形態１と同様にしてヒト皮膚由来線維芽細胞のフィダーレイヤーの上に、ＮＨＤＦ−Ａｄ：ヒト皮膚角化細胞を重層化させるに際し、コラーゲンゲルにフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）とラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）を添加した。
図３７および図３８は、その結果を例示したものである。
この結果より、コラーゲンゲルに２μｇ／ｍｌのフィブロネクチンと１μｇ／ｍｌのラミニンを添加した場合（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ：ｌａｍｉｎｉｎ＝２：１）（図３８）の再生効率が最も良く、ついで１：１、１：２の順（図３７）であって、コラーゲンゲルのみの場合（図３８）の再生効率はこれらよりも劣っていることが確認された。
＜実施の形態６＞
ヒト悪性黒色腫由来ＳＫ−Ｍｅ１２６細胞を０．１ｍｇ／ｍｌのマトリゲルを引敷いたボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃａｍｂｅｒ）の中に５×１０４個播き、この出願の発明の方法で形成したヒト皮膚由来線維芽細胞上で重層化したヒト角化表皮細胞ＮＨＤＦ−Ａｄとともに培養した。マトリゲルを食い破って裏側に出てきた細胞を観察することによって浸潤能検定試験を行った。この場合にコラーゲンゲル中に前記の実施の形態５と同様にフィブロネクチンとラミニンを添加する割合（Ｆ：Ｌ）を変化させた。その結果を図３９に例示した。ここでも前者２μｇ／ｍｌあるいは１μｇ／ｍｌと後者１μｇ／ｍｌの組み合わせを添加した場合に最も浸潤能が高くなることが確認された。
＜実施の形態７＞
前記の実施の形態４において、ヒト前立腺上皮由来ＰｒＥＣ細胞の３日目の培養条件を変化させた場合の状態を図４０〜図４２に写真として例示した。
奇数番号のコラーゲン５００μｌ当たりフィブロネクチン２．５μｌ及びラミニン２．５μｌを添加したもの（Ｆ：Ｌ＝１：１）、
偶数番号はコラーゲン５００μｌ当たりフィブロネクチン５μｌ及びラミニン２．５μｌを添加したもの（Ｆ：Ｌ＝２：１）
を示している。
また、１と２はタイプ１コラーゲンのみ２５０μｌ／ｗｅｌｌ、
３と４はタイプ１を２００μｌ／ｗｅｌｌとタイプ２を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加したもの、
５と６はタイプ１を２００μｌ／ｗｅｌｌとタイプ３を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加したもの、
７と８はタイプ１を２００μｌ／ｗｅｌｌとタイプ４を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加したもの、
９と１０はタイプ１を２００μｌ／ｗｅｌｌとタイプ５を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加したもの、
１１と１２はタイプ１を１５０μｌ／ｗｅｌｌとタイプ２を２５μｌ／ｗｅｌｌとタイプ３を２５μｌ／ｗｅｌｌ更にタイプ４を２５μｌ／ｗｅｌｌと最後にタイプ５を２５μｌ／ｗｅｌｌ計５種類添加したものを示している。
奇数番号のもの全体において重層化が進んでいることと、コラーゲンのタイプの違いは前立腺上皮では際立たないことが確認された。
＜実施の形態８＞
癌細胞としてヒト腎癌由来ＡＣＨＮ−Ｌ４を用い癌治療感受性試験を行った。その結果を図４３および図４４に例示した。ＡＣＨＮ−Ｌ４／ｐｉｌｅｌａｙｅｒではヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）およびメザンギウム細胞（ＮＨＭＣ）の各々を重層化させたもの（ｄａｙ  ９）の上に０．１ｍｇ／ｍｌのマトリゲルを引敷いたボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃａｍｂｅｒ）を載せて使用しました。チャンバーの中にＡＣＨＮ−Ｌ４を５×１０４個播き、２４時間後の照射や薬剤処理７２時間後にＭＴＴアッセイなど治療効果判定に供した。Ｍｏｎｏｌａｙｅｒでは単層の状態のＲＰＴＥＣ細胞またはＮＨＭＣ細胞の上に０．１ｍｇ／ｍｌのマトリゲルを引敷いたボイデンチャンバーを載せて使用しました。チャンバーの中にＡＣＨＮ−Ｌ４を５×１０４個播き、２４時間後の照射や薬剤処理７２時間後にＭＴＴなど治療効果判定などに供した。ｃａｎｃｅｒ（ＡＣＨＮ−Ｌ４）では下にフィダーレイヤーもＲＰＴＥＣ、そしてＮＨＭＣも植えずに同様の治療実験に供した。
今回Ｘ線の線量は１０Ｇｙを、ＣＤＤＰは１０μｇ／ｍｌ、ＭＭＣは１００μｇ／ｍｌでいずれもボイデンチャンバーの上下に処理した。
生存率は波長５５０ｎｍと６９０ｎｍで測定した時の値の差（Ｘ５５０−Ｙ６９０）から計算した。
また、図４５は、ヒト腎臓近位尿細管上皮由来重層化ＲＰＴＥＣ細胞について、５：０、４：１、３：２、などの割合で、重層化した皮膚角化細胞由来ＮＨＤＦ−Ａｄ細胞（異所性臓器由来）の培養上清（２日間培養後の）を新鮮メンテナンス培地に添加した、混合培地中での感受性の変化を例示している。
図４６は、この場合の状態を例示した写真である。
以上の実験においては、まず、ＭＴＴアッセイはボイデンチャンバーを用いることで、癌細胞と正常細胞の分離が容易となり、定量性が向上することが確認された。
また、結果として得られたＭＴＴアッセイの結果からは、従来の癌細胞単独と比較しても、２次元培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）と３次元培養（ｐｉｌｅｌａｙｃｒ）の正常組織共存下での癌細胞の治療への感受性が大きく異なることが証明できた。さらにまた正常組織の毒性の出方も２次元培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）と３次元培養（ｐｉｌｅｌａｙｃｒ）とで異なることも改めて証明できた。また共存させるにしても、同じヒト腎臓由来の正常組織の種類によっても癌細胞の反応が異なることも証明できた。
そして、異なる臓器由来の重層化した組織の培養上清が混ざると、癌細胞の感受性が変化することも定量的に観察できた。まさに毒性試験などの場合に臓器間の循環が重要な意味を持つことが確認された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、従来技術の限界と課題を克服し、簡便、かつ確実に、ヒト由来正常組織をベースに三次元培養による再生組織を実現すること、そしてこのことによって、各々の再生組織を各臓器のモデルとして医療品等の化学物質の作用や、副作用の検定システム、あるいは感受性等の検定のためのシステムを構築するための方策を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、この出願の発明の方法を例示した概要図である。
図２は、図２のプロセスに付加される方法を例示した概要図である。
図３は、実施の形態１において、正常肺線維芽細胞と血管内皮細胞の共培養でＸ線２０Ｇｙ照射前の状態を示した顕微鏡写真図である。
図４は、上記照射後２４時間で気管上皮細胞を増えて２４時間後の状態を示した顕微鏡写真図である。
図５は、１週間後の状態を示した顕微鏡写真図である。
図６は、部分的ではあるが、４層以上に重層化した状態を示した顕微鏡写真図である。
図７は、この発明の方法による正常再生組織における再生気管支上皮細胞を示した顕微鏡写真図である。
図８は、Ｘ線１０Ｇｙ照射３日後の再生気管支上皮細胞を示した顕微鏡写真図である。
図９は、Ｘ線２０Ｇｙ照射３日後の再生気管支上皮細胞を示した顕微鏡写真図である。
図１０は、この発明の方法により形成された再生気管支上皮細胞層にコラーゲンゲルを補充し、その上に、ヒト肺ガン由来ＡＯＩ細胞を移植した３日後の状態を示した顕微鏡写真図である。
図１１は、図１０の場合と同様にして移植した３時間後に２０ＧｙＸ線を照射し、その直後の状態を示した顕微鏡写真図である。
図１２は、図１１の場合において、照射３日後の状態を示した顕微鏡写真図である。
図１３は、図１２の場合において、Ｘ線を１０Ｇｙで照射した時の状態を示した顕微鏡写真図である。
図１４は、実施の形態２において、重層化された腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）の場合の顕微鏡写真図である。
図１５は、重層化されたメザンギウム細胞（ＮＨＭＣ）の場合の顕微鏡写真図である。
図１６は、重層化された前立腺上皮細胞（ＰｒＥｃ）の場合の顕微鏡写真図である。
図１７は、重層化された神経前駆細胞（ＮＨＭＰ）の場合の顕微鏡写真図である。
図１８は、重層化されたヒト肝細胞（ＮＨｅｐｓ）の場合の顕微鏡写真図である。
図１９は、重層化された乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の場合の顕微鏡写真図である。
図２０、図２１、図２２および図２３は、各々、ＭＴＴａｓｓａｙによる癌治療感受性試験の結果を、前記の重層化されたＮＨＭＰ、ＰｒＥＣ、ＮＨＭＣ、ＰＲＴＥＣの場合について例示した図である。
図２４、図２５、図２６、図２７、図２８および図２９は、実施の形態３で、重層化されたＮＨＢＥにおいて、フィダーレイヤーがＳｕＳａ（皮膚由来）の場合、癌治療感受性ＭＴＴａｓｓａｙの結果を例示した図である。
図３０、および図３１は、重層化されたＮＨＢＥにおいて、フィダーレイヤーがＮＨＬＦ（肺由来）の場合の、癌治療感受性ＭＴＴａｓｓａｙの結果を例示した図である。
図３２、図３３および図３４は、重層化されたＰｒＥｃにおいて、フィダーレイヤーがＳｕＳａ（皮膚由来）の場合の、癌治療感受性ＭＴＴａｓｓａｙの結果を例示した図である。
図３５は、実施の形態４において、ＰｒＥＣについてコラーゲンのみを添加して重層化再生させた場合の顕微鏡写真図である。一方、図３６は、コラーゲンを使用することなしに、フィブロネクチンのみを用いた場合の顕微鏡写真図である。
図３７は、実施の形態５において、ヒト皮膚由来線維芽細胞のフィダーレイヤーの上に、ＮＨＤＦ−Ａｄ：ヒト皮膚角化細胞を重層化再生させるに際し、コラーゲンに、フィブロネクチンとラミニンを１：１および１：２の割合で添加した場合の顕微鏡写真である。
図３８は、コラーゲンゲルのみの場合と、フィブロネクチン：ラミニンを２：１の割合で添加した場合の結果を例示した顕微鏡写真である。
図３９は、実施の形態６として、重層化再生したＮＨＤＦ−Ａｄにおいて、ヒト悪性黒色腫由来ＳＫ−Ｍｅ１２６細胞の浸潤能試験を、コラーゲンとともに、フィブロネクチンとラミニンとを添加して行った場合の結果を例示した顕微鏡写真である。
図４０、４１および図４２は、実施の形態７で、ＰｒＥＣ培養重層化において、コラーゲンへのフィブロネクチンとラミニンとの添加効果を、ケース１〜１２として例示した顕微鏡写真である。
図４３および図４４は、実施の形態８として、重層化再生させたヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）およびメザンギウム細胞（ＮＨＭＣ）の各々について、ヒト腎癌由来ＡＣＨＮ−Ｌ４細胞による感受性試験の結果を図示したものである。
図４５は、重層化ＲＰＴＥＣについて、皮膚角化細胞由来ＮＨＤＦ−Ａｄ細胞の培養上清の添加効果を例示した図である。
図４６は、この場合の感受性の変化を例示した顕微鏡写真図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３７−１】
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【図３８】
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【図３８−１】
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【図３９】
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【図３９−１】
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【図４０】
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【図４０−１】
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【図４１】
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【図４１−１】
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【図４２】
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【図４２−１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【国際調査報告】
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