(57)【要約】所望の核酸を効率的に細胞に導入するための手段を提供する。コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体を使用することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含有する、標的細胞への核酸導入促進剤。
【請求項２】
コラーゲンまたはコラーゲン誘導体が所望の核酸と複合体を形成して含有されている、請求項１記載の標的細胞への核酸導入促進剤。
【請求項３】
該複合体が粒子である、請求項２記載の核酸導入促進剤。
【請求項４】
該複合体粒子の長径が３００ｎｍ〜３００μｍである、請求項２記載の核酸導入促進剤。
【請求項５】
所望の核酸がプラスミドＤＮＡである請求項２から４までのいずれか記載の核酸導入促進剤。
【請求項６】
該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とプラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数の比が１：２０〜１：プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数である、請求項５記載の核酸導入促進剤。
【請求項７】
所望の核酸がオリゴヌクレオチドである請求項２から４までのいずれか記載の核酸導入促進剤。
【請求項８】
該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とオリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマー数の比が１：１〜１：２００である、請求項７記載の核酸導入促進剤。
【請求項９】
コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体粒子。
【請求項１０】
長径が３００ｎｍ〜３００μｍである、請求項９記載の複合体粒子。
【請求項１１】
所望の核酸がプラスミドＤＮＡである請求項９または１０記載の複合体粒子。
【請求項１２】
該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とプラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数の比が１：２０〜１：プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数である、請求項１１記載の複合体粒子。
【請求項１３】
所望の核酸がオリゴヌクレオチドである請求項９または１０記載の複合体粒子。
【請求項１４】
該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とオリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマー数の比が１：１〜１：２００である、請求項１３記載の複合体粒子。
【請求項１５】
コラーゲンの会合体形成を抑制する物質を含有する溶液中にて、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを混合することを特徴とする、請求項９から１４までのいずれか記載の複合体粒子を調製する方法。
【請求項１６】
請求項９から１４までのいずれか記載の複合体粒子が表面に塗布されている医療用具。
【請求項１７】
請求項９から１４までのいずれか記載の複合体粒子が細胞培養面に塗布されている細胞培養器具。
【請求項１８】
請求項９から１４までのいずれか記載の複合体粒子を使用することを特徴とする、所望の核酸を標的細胞に導入するための方法。
【請求項１９】
請求項９から１４までのいずれか記載の複合体粒子を使用することを特徴とする、所望の核酸の標的細胞における発現効率を向上させるための方法。
【請求項２０】
標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法であって、該遺伝子もしくは該タンパク質をコードする核酸または該遺伝子もしくは該タンパク質の発現を細胞内で阻害する核酸を含む請求項９から１４までのいずれか記載の複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上で該標的細胞を培養し、該標的細胞における該核酸の発現レベルまたは該遺伝子もしくは該タンパク質の発現レベル、または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする方法。
【請求項２１】
ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸の候補核酸を含む請求項９から１４までのいずれか記載の複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上にて該疾患状態にある細胞を培養し、各候補核酸によって阻害される該遺伝子の発現レベル、または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする、該疾患を処置できる核酸をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医療分野、特に遺伝子治療および遺伝子関連の基礎研究の分野に属する。詳細には、本発明は、所望の核酸の標的細胞への導入を促進する製剤およびそのための方法に関する。
背景技術
近年、遺伝子治療に関する研究が盛んに試みられており、実際に種々の癌や遺伝子疾患に臨床応用されている。遺伝子治療とは、正常な遺伝子を細胞に補ったり、遺伝子の欠陥を修復、修正することで病気を治療する手法であり、目的の酵素、サイトカイン等の遺伝子を患者の細胞内に導入し、その遺伝子により体内に目的とする物質を産生させて疾患の治療を行うものである。遺伝子治療は生命活動の根幹を制御する治療法であり、癌や遺伝子疾患だけでなく、ＡＩＤＳ、慢性関節リウマチ、生活習慣病など様々な病気の治療への可能性がある。
遺伝子治療において、遺伝子の標的細胞への導入効率は治療の有効性を高めるうえで重要な因子である。癌に対する遺伝子治療方法としてアデノウイルス等による方法（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８，４４５（１９９４）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６，８０８（１９９２）；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０６，１０７６（１９９４）；ＴＩＢＴＥＣＨ，１１，１８２（１９９３）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６６，３３６１（１９９１）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１，５８３（１９９５）およびこれらの引用文献）およびリポソーム製剤を用いる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１０９７，１（１９９１）；Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，３，３９９（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１１２７７（１９９２））がある。ウイルスベクターを用いる方法はリポソーム製剤を用いる方法に比べて遺伝子の導入効率が一般に高い。しかし、ウイルスに由来する免疫反応のために複数回の投与が困難という問題がある（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１３６９５（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，３６９（１９９４））。
他方、ヒトの全遺伝情報（ヒトゲノム）の解読がほぼ完了したことから、今後そのヒトゲノム情報をどうのように医療や産業に生かしていくかというポストゲノムに研究の比重が置かれるようになった。即ち、解明された遺伝情報に基づいて、ヒト遺伝子の解明や、それによってコードされるタンパク質の構造、機能の解析の重要性が強調されている。そのようなポストゲノム研究では、遺伝情報を解明するにタンパク質を発現させ生産する必要があり、そのためには目的遺伝子を細胞に導入することが必須である。一方、導入した遺伝子が宿主細胞のゲノムに取りこまれないアデノウイルスベクターやリポソームベクター、プラスミドＤＮＡベクターでは、導入した遺伝子の発現が一過性であり、定常的に遺伝子を発現させることができないが、この定常的な遺伝子発現は遺伝子治療や遺伝子機能の解析に重要である。
発明の開示
このように、遺伝子を構成し得る核酸を所望の細胞に効率的に導入し、かつ宿主細胞の染色体に遺伝子を組み込むことなく遺伝子を長期間発現する手法には大きな有用性が期待できる。
本発明者らは、コラーゲンの意外な作用を見出し、核酸を所望の細胞に効率的に導入する手法を発見した。詳細には、コラーゲンとプラスミドＤＮＡなどの核酸とを組合わせると、意外にもそれらが複合体を形成し、それが核酸の細胞への導入を促進し、かつ遺伝子を長期間発現することを見出した。なお、遺伝子をコラーゲン等の生体親和性材料からなる担体に担持させた遺伝子製剤が開示されているが（特開平９−７１５４２）、その遺伝子製剤は遺伝子を生体内において徐放化させる徐放性製剤として記載されている。
このように、本発明はコラーゲンまたはコラーゲン誘導体の新規な用途を基礎とするものである。
即ち、本発明は、（１）コラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含有する、標的細胞への核酸導入促進剤；
（２）コラーゲンまたはコラーゲン誘導体が所望の核酸と複合体を形成して含有されている核酸導入促進剤、好ましくは該複合体が粒子である核酸導入促進剤、より好ましくは該複合体粒子の長径が３００ｎｍ〜３００μｍ、より好ましくは３００ｎｍ〜１００μｍ、さらに好ましくは３００ｎｍ〜５０μｍ、さらに好ましく３００ｎｍ〜３０μｍの複合体を含有する核酸導入促進剤；具体的には核酸がプラスミドＤＮＡである場合、該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とプラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数の比が１：２０〜１：プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数、好ましくは１：５０〜１：プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数、より好ましくは１：５０〜１：４０００、さらに好ましくは１：５０〜１：２０００、より好ましくは１：５０〜１：１０００である、または核酸がオリゴヌクレオチドである場合、該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とオリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマー数の比が１：１〜１：２００、好ましくは１：３〜１：１５０、より好ましくは１：２０〜１：１２０、さらに好ましくは１：５０〜１：１２０である、核酸導入促進剤；
（３）コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体粒子；
（４）コラーゲンの会合体形成を抑制する物質を含有する溶液中にて、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを混合することを特徴とする、本発明の複合体粒子を調製する方法；
（５）上記（３）の複合体粒子が表面に塗布されている医療用具、または該複合体粒子が細胞培養面に塗布されている細胞培養器具；
（６）上記（３）の複合体粒子を使用することを特徴とする、所望の核酸を標的細胞に導入するための、または所望の核酸の標的細胞における発現効率を向上させるための方法；
（７）標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法であって、該遺伝子もしくは該タンパク質をコードする核酸または該遺伝子もしくは該タンパク質の発現を細胞内で阻害する核酸を含む上記（３）の複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上で該標的細胞を培養し、該標的細胞における該核酸の発現レベルまたは該遺伝子もしくは該タンパク質の発現レベル、または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする方法；
（８）ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸の候補核酸を含む上記（３）の複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上にて該疾患状態にある細胞を培養し、各候補核酸によって阻害される該遺伝子の発現レベル、または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする、該疾患を処置できる核酸をスクリーニングする方法；に関する。
以下の実施例にて詳細に説明しているように、本発明の核酸導入促進剤は、プラスミドＤＮＡ単独では遺伝子発現が見られないｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養系において核酸の発現が認められたことから、核酸の細胞への導入効率を向上することが示された。さらに核酸の発現がリポソーム製剤と比較して長期間持続することから、本発明の核酸導入促進剤は核酸の細胞内での安定性を向上することが示された。
今回、コラーゲンが核酸と静電的におよび／または物理的に相互作用し複合体を形成していることを見出した。よって、実施例にて認められた核酸発現の持続は複合体形成による核酸の細胞内での安定性向上によってもたらされると考えられる。これは、コラーゲンのマトリックス中に封入された遺伝子等が生分解作用によるコラーゲンの分解により徐々に遺伝子が放出されると考えられていた、従来のコラーゲンによる遺伝子等の徐放メカニズムと大きく相違する。
発明を実施するための最良の形態
１）核酸導入促進剤
第１の態様における本発明は、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含有する標的細胞への核酸導入促進剤である。本態様は、標的細胞への核酸導入を促進させるというコラーゲンまたはコラーゲン誘導体における、今回初めて見出された作用を利用するものである。即ち、本態様では、標的細胞への核酸導入を促進するための、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体の新規な用途を提供する。
本発明において、「コラーゲンまたはコラーゲン誘導体」とは、通常、医療分野、化粧品分野、工業分野および食品分野で用いられているあらゆる「コラーゲンまたはコラーゲン誘導体」を意味する。コラーゲンは、可溶性あるいは可溶化コラーゲンを用いることが好ましい。可溶性コラーゲンとは、酸性あるいは中性の水や塩溶液に可溶であり、可溶化コラーゲンとは、酵素により可溶化される酵素可溶化コラーゲン、アルカリにより可溶化されるアルカリ可溶化コラーゲンがあり、いずれも孔サイズが１マイクロメートルのメンブレンフィルターを通過できることが好ましい。コラーゲンの可溶性はコラーゲンの架橋度に依存し、架橋度が高いほど不溶化することから、本発明に使用するコラーゲンの架橋度は、例えば、３量体以下であることが好ましく、より好ましくは２量体以下である。コラーゲンの分子量は例えば、約３０万から約９０万が好ましく、約３０万から約６０万がより好ましい。コラーゲンはいかなる動物種から抽出されたものでも用いることが出来るが、好ましくは脊椎動物から抽出されたもの、さらに好ましくは哺乳類、鳥類、魚類から抽出されたもの、より好ましくは変性温度が高い哺乳類、鳥類から抽出されたコラーゲンが望ましい。コラーゲンのタイプもいかなるタイプのコラーゲンでも良いが、動物体内の存在量からＩ〜Ｖ型が好ましい。具体的には例えば、哺乳動物の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲンが挙げられ、より好ましくは例えば、仔牛の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲン、遺伝子工学的に生産されるＩ型コラーゲンなどが挙げられる。同じＩ型コラーゲンでも腱由来のコラーゲンは架橋度が高く不溶性であるため適さない。また、安全性の面から抗原性の高いテロペプチドを酵素的に除去したアテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産されるアテロコラーゲンが望ましく、１０００残基あたりチロシン残基が３以下であるアテロコラーゲンがより好ましい。また、必要に応じて側鎖を修飾したコラーゲン、架橋したコラーゲン等を用いることができる。側鎖を修飾したコラーゲンとしては、例えばサクシニル化またはメチル化したコラーゲン等が挙げられ、架橋したコラーゲンとしては、例えばグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソアナートまたはポリエポキシ化合物等で処理したコラーゲン等を挙げることができる（フレグランス・ジャーナル１９８９−１２，１０４−１０９、特公平７−５９５２２号公報）。好ましいコラーゲン誘導体はゼラチンまたはゼラチンの架橋体、またはコラーゲンとの架橋体である。
なお、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体には他の生体親和性材料を混合することもできる。生体親和性材料としては、例えばゼラチン、フィブリン、アルブミン、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、ペクチン、アガロース、ハイドロキシアパタイト、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、またはグリコール酸、乳酸もしくはアミノ酸の重合体もしくはこれらの共重合体、またはこれらの生体親和性材料の２種類以上の混合物等が挙げられる。
２）複合体を含有する核酸導入促進剤
第２の態様における本発明は、所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体、好ましくは複合体粒子を必須成分として含有する、標的細胞への核酸導入促進剤である。
核酸は単独ではインビトロの細胞に血清存在下に投与してもほとんど細胞に導入できない。コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体を形成することにより、初めて効率的に核酸を細胞に導入することができる。
本発明において、「核酸」はポリヌクレオチドであってもオリゴヌクレオチドであってもよく、またＤＮＡでもＲＮＡ分子でもあり得る。ＤＮＡ分子の場合、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであってもよい。またＤＮＡおよびＲＮＡはいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得る。１本鎖の場合、コード鎖あるいは非コード鎖であり得る。「核酸」にはＤＮＡ誘導体またはＲＮＡ誘導体が含まれ、該誘導体とはホスホロチオエート結合を有する核酸、または酵素による分解を避ける為にインターヌクレオチドのリン酸部位、糖部分、塩基部分に化学修飾を施した核酸を意味する。また、「核酸」にはアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスも含まれる。
好ましくは、「核酸」はオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであり、好ましくは５量体以上１００量体以下、より好ましくは５量体以上３０量体以下のオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。疾患症状の治療あるいは改善効果のある生理活性を有するタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡ、または疾患症状の予防、治療あるいは改善効果のある免疫反応を誘導するタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡがより好ましい。
核酸がプラスミドＤＮＡまたはウイルス等の遺伝子治療に用いられるベクターである場合、細胞内に導入されたとき、コードした遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましく、プロモーター等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する、あるいは染色体への組み込みを可能とする要素を含有するベクター等である。本発明の核酸としてのプラスミドＤＮＡのサイズには特に制限はなく、遺伝子工学的手法で効率的に生産でき、細胞に導入された場合、効率的にコードした遺伝情報を細胞内で発現できるサイズの中から適当に選択することができる。
本発明の核酸導入促進剤中には、別個の所望の核酸を組み込んだ数種類のベクターが同時に存在してもよい。また、一つのベクターには複数の遺伝情報がコードされていてもよい。導入促進剤中に含有されるベクターの量に特に制限はない。
遺伝子治療時に発現が要求されるタンパク質をコードする核酸には遺伝病の処置に用いられ得る遺伝子、例えばアデノシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ等の酵素類、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２等のサイトカイン類、または繊維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）をコードする遺伝子が挙げられるがこれに限られるものではない。また、遺伝子治療時に発現が要求される別のタンパク質をコードする核酸として、発現されるタンパク質あるいはペプチドが抗原として免疫を誘導し、感染症もしくは腫瘍の予防または治療を行うことを目的とする遺伝子、即ち上記の抗原となり得るタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子、例えばインフルエンザウイルスの表面タンパク質であるＨＡやＮＡまたは核タンパク質であるＮＰの各タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２やＮＳ１タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質であるＶＰ１やＶＰ３、あるいはカプシド様タンパク質、デングウイルスのＥｇｐタンパク質、ＲＳウイルスのＦあるいはＧタンパク質、狂犬病ウイルスの構造タンパク質であるＧやＮタンパク質、ヘルペスウイルスのｇＤタンパク質、日本脳炎ウイルスのＥ１あるいはｐｒｅ−Ｍタンパク質、ロタウイルスの外殻糖タンパク質ＶＰ７や外殻タンパク質ＶＰ４、ヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０やｇｐ１６０タンパク質、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒの主要表面抗原タンパク質、マラリアのスポロゾイドの主要表面抗原（ｃｉｒｃｕｍ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、トキソプラズマの５４−ｋｄやＣＳタンパク質、虫歯の原因となるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの菌体表層タンパク質ＰＡｃをコードする遺伝子；また、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３またはＢＡＧＥなどの癌退縮抗原や、チロシナーゼ、Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５などの組織特異抗原、ｐ１５、Ｍｕｃｌ、ＣＥＡ、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＨＰＲ２／ｎｅｕなどをコードする遺伝子、および「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ」：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７６巻，１９９４年，１４５−１５２頁に記載されている遺伝子を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
核酸がオリゴヌクレオチドの場合、例えば、少なくともその一部が生体の恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードした遺伝子、病原性のウイルス、細菌等に特異的な遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と生理的な条件下で相補的に結合する塩基配列等であり、より具体的には、病原性ウイルス、細菌等に特異的な遺伝子および恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質等をコードした遺伝子のメッセンジャーＲＮＡと相補的に結合する塩基配列である。
さらに具体的には、本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡの開始コドンを含む領域あるいは前駆メッセンジャーＲＮＡがスプライシングを受ける部位に相補的な配列等である。本発明に用いられるオリゴヌクレオチドの例を示せば、がんの治療あるいは予防に用いるオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ｈｓｔ−１の発現を特異的に抑制する５’−ＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１）の配列を有したオリゴヌクレオチド、あるいはプロテインキナーゼＣαの発現を特異的に抑制して非小細胞性肺がんや結腸がんなどの進行性がんに有効で、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、大腸がん、小細胞肺がんへの適用が試みられているＩＳＩＳ３５２１、Ｃ−ｒａｆキナーゼの発現を特異的に抑制して前立腺がん、乳がん、卵巣がん、脳腫瘍、膵臓がん、大腸がん、小細胞肺がんへの適用が試みられているＩＳＩＳ５１３２／ＣＧＰ６９８４６Ａ、Ｈａ−ｒａｓの発現を特異的に阻害して大腸がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、肺小細胞がんへの適用が試みられているＩＳＩＳ２５０３、プロテインキナーゼＡタイプＩの発現を特異的に抑制するＧＥＭ２３１、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するＭＧ９８、ｃ−ｍｙｃの発現を抑制するＩＮＸＣ−６２９５、ｃ−ｍｙｂの発現を抑制し白血病への適用が検討されているＩＮＸ−３００１、ｂｃｌ−２の発現を抑制して非ホジキンリンパ腫、大腸がん、小細胞肺がん、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、乳がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、非細胞性肺癌、前立腺がんへの適用が検討されているＧ−３１３９（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）、ＭＤＭ２蛋白の発現を抑制するオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦの発現を抑制するオリゴヌクレオチドなどを挙げることができる。また、感染症の治療あるいは予防に用いるオリゴヌクレオチドとしては、ＨＩＶの増殖を抑制するＧＥＭ９２、ＧＰＩ−２Ａ、サイトメガロウイルスの増殖を抑制するＩＳＩＳ２９２２（ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ、ＩＳＩＳ１３３１２、ＧＥＭ１３２、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を抑制するＩＳＩＳ１４８０３などが挙げられ、炎症の治療に用いられるオリゴヌクレオチドとしては、ＩＣＡＭ−１の発現を特異的に抑制しクローン病、潰瘍性大腸炎、腎移植拒絶反応阻害、乾癬、喘息への適用が試みられているＩＳＩＳ２３０２、アデノシンＡ１レセプターの発現を抑制し、喘息への適用が試みられているＥＰＩ−２０１０、およびＴＮＦ−α、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）、ＶＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の発現を抑制するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。また、経皮経管冠動脈形成術後の再狭窄を防止するオリゴヌクレオチドとして、ｃ−ｍｙｃの発現を抑制するＲｅｓｔｅｎ−ＮＧなどが挙げられる。
恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードする遺伝子は具体的には、例えば、がん遺伝子とよばれる一群の遺伝子群が挙げられる。より具体的には、例えば増殖因子群、受容体型チロシンキナーゼ群、非受容体型チロシンキナーゼ群、ＧＴＰ結合タンパク質、セリン・スレオニンキナーゼ群、転写調節因子群などが挙げられる。さらに具体的には、例えば、ｈｓｔ−１あるいはオルニチン脱炭酸酵素等をコードする遺伝子等が挙げられる。
本発明の核酸導入促進剤は、本発明の複合体の他、必要に応じて医薬上許容される添加剤を含有することができる。医薬上許容される添加剤としては、複合体を注射剤として用いる場合の等張化剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤、あるいは固形剤として用いる場合の賦形剤、崩壊剤、コーティング剤が挙げられ、日本では医薬品添加物事典（日本医薬品添加剤協会編集）に記述されているものである。具体的にはｐＨを６〜８に保つため、あるいは細胞と等張に保つために用いられる塩類や糖類が挙げられる。
本発明の核酸導入促進剤の性状は固体状であっても溶液状であってもよい。本発明の促進剤が固体状である場合、核酸導入を促進させる際には、そのままの状態あるいは精製水、生理的食塩水、生体と等張な緩衝液等を用いて溶液状とし、所望の細胞に負荷する。このような溶液状の核酸導入促進剤も本発明の一部を構成する。
本発明の核酸導入促進剤を生体に投与する方法としては経口、注射、点眼、点鼻、経肺、皮膚を介した吸収のいずれでも良く、好ましくは経口または注射である。投与部位は疾患に応じて選択できるが、手術時に必要な部位に直接留置することもできる。
本態様では、詳細には次の発明が提供される。
（１）  所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体、好ましくは複合体粒子を必須成分として含有する、標的細胞への核酸導入促進剤（ここに、該複合体粒子の長径は好ましくはが３００ｎｍ〜３００μｍ、より好ましくは３００ｎｍ〜１００μｍ、さらに好ましくは３００ｎｍ〜５０μｍ、さらに好ましくは３００ｎｍ〜３０μｍである）、
（２）  標的細胞が動物細胞である前記（１）記載の核酸導入促進剤、
（３）  標的細胞が治療を必要とする臓器あるいは組織またはその付近の細胞である前記（２）記載の核酸導入促進剤、
（４）  コラーゲンがアテロコラーゲンである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸導入促進剤、
（５）  コラーゲンの分子量が約３０万〜約９０万である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸導入促進剤、
（６）  コラーゲン誘導体がゼラチンまたはゼラチンの架橋体である前記（１）〜（５）いずれかに記載の核酸導入促進剤、
（７）  コラーゲン誘導体がコラーゲンの架橋体である前記（１）〜（５）記載の核酸導入促進剤、
（８）  核酸がオリゴヌクレオチドである前記（１）〜（７）いずれかに記載の核酸導入促進剤、
（９）  オリゴヌクレオチドが５量体以上３０量体以下の前記（８）記載の核酸導入促進製剤、
（１０）  オリゴヌクレオチドがＤＮＡあるいはＤＮＡ誘導体である前記（８）または（９）記載の核酸導入促進剤、
（１１）  オリゴヌクレオチドがＲＮＡあるいはＲＮＡ誘導体である前記（８）または（９）記載の核酸導入促進剤、
（１２）  ＤＮＡ誘導体あるいはＲＮＡ誘導体が分子内に少なくとも１つ以上のホスホロチオエート結合を有する前記（１０）または（１１）記載の核酸導入促進剤、
（１３）  核酸がリボザイムまたはオリゴヌクレオチドである前記（１）〜（７）いずれかに記載の核酸導入促進剤、
（１４）  核酸がプラスミドＤＮＡである前記（１）〜（７）いずれかに記載の核酸導入促進剤、
（１５）  プラスミドＤＮＡが疾患症状の治療あるいは改善効果のある生理活性を有するタンパク質をコードしている前記（１３）記載の核酸導入促進剤、および
（１６）  プラスミドＤＮＡが疾患症状の予防、治療あるいは改善効果のある免疫反応を誘導するタンパク質をコードしている前記（１３）記載の核酸導入促進剤。
（１７）  核酸導入促進剤が溶液であり、複合体成分として核酸を１０ｍｇ／ｍｌ以下含有する前記（１）〜（１６）記載の核酸導入促進剤、
（１８）  複合体成分として核酸を１ｍｇ／ｍｌ以下含有する前記（１７）記載の核酸導入促進剤、
（１９）  複合体成分として核酸を５００μｇ／ｍｌ以下含有する前記（１８）記載の核酸導入促進剤、
（２０）  ｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８である前記（１）〜（１９）記載の核酸導入促進剤、
（２１）  リン酸を０．００１Ｍ以上０．１Ｍ以下含有する前記（１）〜（２０）記載の核酸導入促進剤、
（２２）  リン酸を０．０１Ｍ以上０．１Ｍ以下含有する前記（２１）記載の核酸導入促進剤、
（２３）  コラーゲンの会合体形成を抑制する物質、例えばシュクロースまたはアルギニンを含有する前記（１）〜（２２）記載の核酸導入促進剤、
（２４）  医薬上許容される添加剤を適量含有する前記（１）〜（２４）記載の核酸導入促進剤。
３）複合体
本発明の第３の態様は、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体である。この複合体には、静電的な力により結合して複合体を形成する静電的複合体と疎水結合等の物理的な力により複合体を形成する物理的複合体が含まれる。場合によっては、両方の結合様式が混在する場合があるが、そのような複合体も本発明における複合体に含まれる。
今回、コラーゲンが核酸と静電的に相互作用し複合体を形成し得ることが見出された。
本発明において「静電的複合体」とは、分子中に多数の荷電を有するコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸のポリイオン複合体、詳細には正電荷を帯びたコラーゲンまたはコラーゲン誘導体が負電荷を帯びた核酸と電気的に引き合った結合体を意味する。ポリイオン複合体は複合体形成時に分子内の荷電のカウンターイオンを多数フリーにすることから、非常に大きなエントロピーの増大が生じる。このような静電的複合体の形態から考えると、実施例にて認められた核酸発現の持続は複合体形成による細胞内での核酸の安定化によってもたらされると考えられる。
本発明の複合体の最少単位は一分子のコラーゲンと一分子の核酸が形成する複合体であるが、我々はコラーゲンは核酸と複合体を形成するのと並行して他のコラーゲンと会合し会合体を形成することを見出した。この会合体の形成は、長径約３００ｎｍ、直径約１．５ｎｍの円柱状のコラーゲン分子が主として分子の直軸方向と平行に会合するものであり、主として会合体は分子の長軸方向に伸長する。従って複合体は複数の会合体と複数の核酸分子が非共有結合で結合したものであり、会合体の伸長が大きく進展し長軸が１ｎｍを越える線維状複合体、細い会合体が核酸を介して結合した微線維状複合体、より微細な複合体が核酸と形成した粒子状複合体がある。
本発明の複合体は様々な形状をとることができる。
本発明の複合体は粒子であることが好ましい。本発明において、「粒子」とはコラーゲンまたはコラーゲン誘導体がとり得る形状であり、必ずしも球状を意味するものでない。本発明の複合体粒子のサイズは、一分子のコラーゲンが形成する複合体の長径３００ｎｍが最少であり、核酸導入効率を考慮し、その長径が３００ｎｍ〜１ｍｍであり、長径３００ｎｍ〜３００μｍである粒子が好ましく、より好ましくは長径３００ｎｍ〜１００μｍであり、さらに好ましくは長径３００ｎｍ〜５０μｍ、さらに好ましくは長径３００ｎｍ〜３０μｍである。
我々は複合体が様々な形状をとる原因が、複合体を構成するコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸との割合にあること、さらに複合体の形状が専ら核酸と複合体を形成することによって促進されるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体による会合体（線維）形成の進展に依存することを見出した。会合体の過形成は核酸導入には不適であるという本発明における知見に基づき、我々は、かかる複合体の形状が、混合するコラーゲンまたはコラーゲン誘導体および所望の核酸の濃度の他、コラーゲンの会合体形成に影響を与える環境因子である塩濃度、温度、ｐＨ、グルコース濃度を調整することにより制御できることを見出した。また、我々は複合体形成に伴うコラーゲンまたはコラーゲン誘導体の会合体形成が、核酸の鎖長に影響を受け、一般に１０００ｂｐを超えるプラスミドＤＮＡでは会合体形成が著しく促進されるのに対して、一般に１００ｂ以下のオリゴヌクレオチドでは会合体形成の促進効果が弱いことを見出し、それぞれに適したコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸の組成が存在することを見出した。
複合体の形状は核酸の細胞への導入効率に影響し得る。よって、コラーゲンが核酸と複合体を形成し、その形状が核酸の細胞への導入効率・発現効率に影響するという発見により、核酸導入効率を最適化し得るストラテジーが提供された。さらに、核酸の標的細胞への導入に実験室レベルで用いられているリポソームは、核酸と混合した後、直ちに凝集する性質があり、使用毎に核酸の導入効率にばらつきがある他、用時調製の必要があり、実際に汎用されるのは困難である。一方、本発明の複合体は冷所で保管することで形態が悪化することがない。遺伝子導入技術において最大の課題は汎用的な方法が少ないということである。本発明の複合体は形態が変化しない点からも現実性の高い技術である。
本態様では具体的には次の発明が提供される。
（１）所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体粒子、
（２）長径が３００ｎｍ〜３００μｍである、前記（１）記載の複合体粒子、
（３）長径が３００ｎｍ〜１００μｍである、前記（２）記載の複合体粒子、
（４）長径が３００ｎｍ〜５０μｍ、好ましくは３００ｎｍ〜３０μｍである、前記（３）記載の複合体粒子、
（５）核酸がプラスミドＤＮＡである前記（１）〜（４）記載の複合体粒子、
（６）コラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とプラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数の比が１：２０〜１：プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数、好ましくは１：５０〜１：プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数、より好ましくは１：５０〜１：４０００、さらに好ましくは１：５０〜１：２０００、より好ましくは１：５０〜１：１０００である、前記（５）記載の複合体粒子、
（７）１：９６〜１：プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数である前記（６）記載の複合体粒子、
（８）１：９６〜１：１１２２である前記（７）記載の複合体粒子、
（９）１：９６〜１：７０１である前記（８）記載の複合体粒子、
（１０）核酸がオリゴヌクレオチドである前記（１）〜（４）記載の複合体粒子、
（１１）該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とオリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマー数の比が１：１〜１：２００、好ましくは１：３〜１：１５０、より好ましくは１：３〜１：１２０である前記（１０）記載の複合体粒子、
（１２）１：２０〜１：１２０である前記（１１）記載の複合体粒子、
（１３）１：５０〜１：１２０である前記（１２）記載の複合体粒子、
（１４）ｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８である溶液中に存在する、前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子、
（１５）１０℃以下に冷却した溶液中でコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子を調製する方法、
（１６）リン酸を０．００１Ｍ以上０．１Ｍ以下含有する溶液中でコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子を調製する方法、
（１７）リン酸を０．０１Ｍ以上０．１Ｍ以下含有する溶液中でコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子を調製する方法、
（１８）コラーゲンの会合体形成を抑制する物質、例えばシュクロースあるいはアルギニンを含有する溶液中でコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子を調製する方法、
（１９）医薬上許容される添加剤を適量含有する溶液中でコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子を調製する方法（ここに、医薬上許容される添加剤とは上記記載のもの）、
（２０）前記（１４）〜（１９）記載の方法を２以上組み合わせて前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子を調製する方法、
（２１）１００μｍ以下の孔径のフィルターを通過させて整粒する工程をさらに含む、前記（１）〜（１３）記載の複合体粒子を調製する方法、
（２２）１０μｍ以下の孔径のフィルターを通過させて整粒する前記（２１）記載の方法、
（２３）１０，０００回転以上の速さで遠心することで複合体を濃縮、単離する工程をさらに含む、前記（１）〜（１３）記載の複合体を調製する方法、
（２４）５０，０００回転以上の速さで遠心する前記（２３）記載の方法。
本発明において、「ヌクレオチドモノマー数」とは所望の核酸を構成するヌクレオチドモノマー単位の数を意味する。「コラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とヌクレオチドモノマー数の比」とは、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体１分子に対し、静電的または物理的に結合して複合体を構成する所望の核酸におけるヌクレオチドモノマーの数を意味する。ヌクレオチドモノマー数は、「所望の核酸の負電荷」と略同一である。本発明において「所望の核酸の負電荷」とは、核酸を構成するヌクレオチド間に存在するリン酸基の数を意味する。核酸の負電荷の数値は、核酸のリン酸基、核酸のヌクレオチド間リン酸基、核酸のヌクレオチド間リン含有基（リン酸基、ホスホロチオエイト基）の数に等しい。
「コラーゲンの会合体形成を抑制する物質」とは、コラーゲンの会合体形成が主としてコラーゲン分子中の塩基性アミノ酸や酸性アミノ酸の荷電によって生じることを考慮し、これらの静電的相互作用を抑制する物質およびコラーゲン分子を規則正しく会合させない物質が挙げられる。前者としては塩類、アミノ酸類、尿素であり、後者としてはシュクロース等の糖類およびアルギニンが挙げられる。
本発明の複合体粒子は、本発明の核酸導入促進剤に含有させることができる。
４）医療用具または細胞培養器具
本発明の第４の態様は、本発明の複合体粒子が表面に塗布されている医療用具または細胞培養器具である。
本発明の複合体粒子を固相表面に塗布し、そこへ標的細胞を接触させると、標的細胞の上から本発明複合体粒子を滴加するよりも、核酸の導入効率が向上する、即ち複合体粒子の固相塗布法が滴加法よりも導入効率の点で優れていることが見出された（以下の実施例６参照）。
本態様における医療用具には人工臓器、より具体的には人工血管、血管を補強する医療用具ステントまたは人工心臓が含まれる。人工血管の場合、血管内側での血栓の成長を阻害および補体の活性化を抑制するには血管内皮細胞が人工血管の内側で増殖し、被覆する必要がある。そのために、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの細胞増殖因子をコードする核酸をコラーゲンに結合させた本発明の複合体粒子を人工血管に塗布しておけば、その血管内皮細胞が容易かつ迅速に増殖することが期待される。
所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体粒子が細胞培養面に塗布されている細胞培養器具としては、細胞培養実験に通常用いられているシャーレ、フラスコ、９６穴マイクロプレート等が挙げられる。本発明の複合体粒子を固相表面に塗布する場合、単位面積あたりに塗布する複合体粒子の量は細胞への核酸の導入量に大きく影響することが以下の実施例６にて示されている。従って単位面積あたりに塗布する複合体粒子の量も本発明の重要な要件である。
本様態では具体的には次の発明が提供される。
（１）所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体粒子が塗布された医療用具または細胞培養器具、
（２）１平方センチメートルあたり０．１μｇ以上５０μｇ以下の核酸を含有する複合体粒子が塗布された前記（１）記載の医療用具または細胞培養器具、
（３）１平方センチメートルあたり０．５μｇ以上５０μｇ以下の核酸を含有する複合体粒子が塗布された前記（２）記載の医療用具または細胞培養器具、
（４）１平方センチメートルあたり１μｇ以上１０μｇ以下の核酸を含有する複合体粒子が塗布された前記（３）記載の医療用具または細胞培養器具、
（５）生体と等張の溶液に暴露した場合、長径が３００ｎｍ〜３００μｍである複合体粒子が固相表面より遊離する前記（１）記載の医療用具または細胞培養器具、および
（６）生体と等張の溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である前記（５）記載の医療用具または細胞培養器具。
本態様を実施するに際して本発明の流通性は重要である。先に述べた通り、リポソームは用時調製が必要であり、流通性が極めて低い。一般にアデノウイルスも本態様のように固相表面に塗布された状態で長期間室温で流通することは困難と考えられている。しかし意外にも本願発明のようにアデノウイルスをコラーゲンと混合して固相表面に塗布、乾燥した場合、室温下７日後でも高い感染性を維持した。このことは本発明の医療用具または細胞培養器具が高い流通性を有していることを示している。
５）所望の核酸を標的細胞に導入し、またはその発現効率を向上させる方法
上記のように、本発明の複合体粒子を使用すれば、所望の核酸の標的細胞への導入を促進させることができる。よって、本発明は第５の態様として、本発明の複合体粒子を使用することを特徴とする、所望の核酸を標的細胞に導入するための、または所望の核酸の標的細胞における発現効率を向上させるための方法を提供する。本発明において、「発現効率を向上させる」とは、所望の核酸の発現量を増大させ、または発現期間を延長させることを意味する。
即ち、本態様では次の発明が提供される。
（１）  所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む上記の複合体粒子を使用することを特徴とする、所望の核酸を標的細胞に導入するための方法、
（２）  所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む上記の複合体粒子を使用することを特徴とする、所望の核酸の標的細胞における発現効率を向上させるための方法、
（３）  発現量を増大させる、または発現期間を延長させるための、前記（２）記載の方法、および
（４）  前記複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上にて標的細胞を培養することを特徴とする、前記（１）〜（３）までのいずれかに記載の方法。
６）標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法
核酸の細胞への導入が促進される本発明に従えば、遺伝子またはタンパク質の標的細胞内での機能を容易に調べることができる。例えば、ヒトゲノムプロジェクトによって非常に多くの遺伝子が同定され、その塩基配列が明らかになった。しかしこれらの情報を実際に医療あるいは食品産業で生かすには、同定された遺伝子の機能を解明する必要がある。しかしながら同定された遺伝子の数は膨大であり、従来のように一つ一つの遺伝子からタンパク質を産生かつ精製して機能を調べる方法では、時間がかかりすぎて現実的でないことが明らかになってきている。従って、細胞内に機能を調べたい遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡを導入して発現させることによってその遺伝子の機能を調べる方法、あるいは機能を調べたい遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入して遺伝子の発現を抑制することによってその遺伝子の機能を調べる方法が有用である。また、このように細胞の表現型によって遺伝子の機能を調べる場合、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡを細胞に導入する方法は、細胞に影響を極力与えない方法で行うことは必須である。従って細胞障害性の高いリポソームを用いることは、得られる情報にリポソームによる細胞障害の影響が加わることとなる。一方、本発明のコラーゲンは元来生体内に存在し、細胞と接触している物質であることから細胞への影響は極めて低く、遺伝子の機能をノイズなく測定することが可能である。具体的な測定方法としては、機能を解明したい遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡ、アデノウイルスベクターあるいは機能を解明したい遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドとコラーゲンを混合し、複合体粒子を形成した後、培養プレート固相上に塗布、整列配置する。ここで使用する固相プレートは９６穴のマルチウエルプレートや、さらにミクロなプレートなどである。塗布した複合体粒子を乾燥して固相上に固定した後、細胞を播種し、数日間プレート上で培養する。塗布された複合体粒子は塗布された部分に接着した細胞に効率的に導入され、機能を調べたい遺伝子を発現あるいはその発現を長期間抑制する。数日後、細胞の形態や細胞内での遺伝子発現の状態、あるいは細胞から産生されたタンパク質の種類や量を調べることによって標的とした遺伝子の機能を明らかにすることができる。本方法の特徴は固相上に塗布された複合体粒子が、塗布された部分に接着した細胞に選択的かつ効率的に取り込まれることも挙げられる。すなわち細胞をウェルで区切って培養する必要がなく、ミクロプレート上で多数の遺伝子の機能を一度に解析することが可能となる。
本態様では、次の発明が提供される。
（１）  標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法であって、該遺伝子もしくは該タンパク質をコードする核酸または該遺伝子もしくは該タンパク質の発現を細胞内で阻害する核酸を含む本発明の複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上で該標的細胞を培養し、該標的細胞における該核酸の発現レベルまたは該遺伝子もしくは該タンパク質の発現レベル、または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする方法、
（２）  該遺伝子または該タンパク質をコードする核酸がプラスミドＤＮＡであり、該核酸の発現レベルを調べる、前記（１）記載の方法、および
（３）  該遺伝子または該タンパク質の発現を細胞内で阻害する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであり、該遺伝子または該タンパク質の発現レベルを調べる、前記（１）記載の方法。
７）疾患を処置できる核酸をスクリーニングする方法
核酸の細胞への導入が促進される本発明に従えば、遺伝子疾患、癌、ＡＩＤＳ、慢性関節リウマチ、生活習慣病など、正常な遺伝子を補ったり、遺伝子の欠陥を修復、修正すること処置できる様々な疾患を処置し得る核酸をスクリーニングすることができる。例えば、６）で記述したのと同じ方法で固相上に疾患の治療効果を調べたい核酸をコラーゲンと複合体粒子を形成させて塗布、乾燥して固定化し、この上で病態を呈した細胞を培養することにより、核酸が病態を呈した細胞に効率的に導入される。核酸の効果は、細胞の表現型の変化、細胞死、細胞の増殖、細胞内での遺伝子発現のパターン、産生されるタンパク質の種類や量により解析することができる。また、この核酸導入においても、導入ベクターによる影響を最小限に抑制すべきことは自明であり、コラーゲンを用いる本発明はノイズなく病態に対する核酸の効果を調べることができる。機能を調べたい核酸は微小な面積の細胞培養固相担体上に多数整列固定化することができることから、一度に多数の核酸を評価できることも本発明の特徴である。
本態様では、次の発明が提供される。
（１）  ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸の候補核酸を含む本発明の複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上にて該疾患状態にある細胞を培養し、各候補核酸によって阻害される該遺伝子の発現レベル、または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする、該疾患を処置できる核酸をスクリーニングする方法、
（２）  ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害すると期待される核酸を含む本発明の複合体粒子を固相表面に塗布し、その固相表面上にて該疾患状態にある細胞を培養し、該遺伝子の発現レベル、または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする、該核酸の該疾患に対する治療効果を調べる方法、
（３）  該核酸が疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸、または疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する機能を有する核酸である前記（１）または（２）記載の方法、および
（４）  疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸が該遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ、あるいは疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する機能を有する核酸がオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである前記（３）記載の方法。
８）他の態様
この態様では、以下の発明が提供できる。
（１）所望の核酸をコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と共に細胞培養面に固定化した細胞培養器具；好ましくは核酸がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体粒子を形成している該細胞培養器具；
（２）所望の核酸を含有するコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含むフィルムを細胞培養面に敷いた細胞培養器具；好ましくは所望の核酸がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体粒子を形成している該細胞培養器具；
（３）コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体粒子を含有するフィルムを細胞培養面に敷いた細胞培養器具；
（４）核酸がライブラリ化されている前記（１）乃至（３）記載の細胞培養器具；
（５）核酸がライブラリ化されているｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドである前記４記載の細胞培養器具；
（６）ライブラリ化された核酸がそれぞれ隔てられた位置毎に分画されている前記（４）または（５）記載の細胞培養器具；
（７）コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含有するフィルムであって、ライブラリ化された核酸がそれぞれ隔てられた位置毎に分画されているフィルム；好ましくは核酸がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体粒子を形成している該フィルム；
（８）核酸がｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドである前記（７）記載のフィルム；
（９）前記（７）または（８）記載のフィルムを細胞培養表面に敷いた前記（２）または（３）に記載の細胞培養器具；
（１０）タンパク質発現用の前記（９）記載の細胞培養器具；
（１１）遺伝子発現抑制用の前記（９）記載の細胞培養器具；
（１２）細胞における任意の遺伝子の機能を調べる方法であって、該遺伝子のｃＤＮＡを含有した核酸を固定化した前記（１）乃至（６）記載の細胞培養器具上で細胞を培養し、細胞の増殖率、表現型、特定のタンパク質の産生量を調べることを特徴とする方法；
（１３）細胞における任意の遺伝子の機能を調べる方法であって、該遺伝子の伝令ＲＮＡと相補な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを固定化した前記（１）乃至（６）記載の細胞培養器具上で細胞を培養し、細胞の増殖率、表現型、特定のタンパク質の産生量を調べることを特徴とする方法；および
（１４）核酸を固定化した部分以外の細胞培養表面が、細胞が接着できない高い親水性あるいは疎水性表面である前記（１）乃至（６）記載の細胞培養器具。
核酸を固相上で標的の細胞に導入する方法としては、上述のように核酸をコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と共にあるいは、核酸がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と形成した複合体粒子として直接固定した細胞培養表面上で標的細胞を培養する方法がある。またこれら以外に、核酸を含有するコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含むフィルムあるいは複合体粒子を含有するフィルムを固相表面上に敷いてその上で標的細胞を培養する方法、および核酸を含有するコラーゲンまたはコラーゲン誘導体またはそれらの複合体粒子を含むアガロースやアルブミンから形成されるフィルムを用いる方法がある。
本発明は多種類の核酸をコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体化して固相上に独立して整列配置（ライブラリ化）することにより、同時に同じ条件で細胞内での遺伝子の機能を調べることを可能にする。また、既にライブラリ化されたｃＤＮＡを含む核酸あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドを固相上に整列配置することで細胞レベルで遺伝子の機能を解析できる遺伝子発現ライブラリあるいは遺伝子発現抑制ライブラリを提供する。ライブラリ化されたｃＤＮＡを含む核酸はどのようなものでも良いが、例えばＧｅｎｅ  Ｓｔｏｒｍ  ｐｃＤＮＡ３．１  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。
核酸を含む複合体を固相上に整列配置し、その上で細胞を培養して導入された遺伝子の機能を解析する場合、独立して配置した核酸がそれぞれ導入された細胞が互いに交じり合うことを避ける必要がある。これを防ぐ方法として、各核酸の配置部分をウェルで仕切る方法があり、１プレートあたり６ウェルから３８４ウェルまで仕切ることが可能である。また、これとは別にウェル以外に細胞が接着できない高い親水性あるいは高い疎水性を有する表面で細胞の核酸配置部分間の移動を妨げることができる。ここでいう高い親水性を有する表面とは、水との接触角が４０度以下の表面であり、高い疎水性を有する表面とは、水との接触角が１１０度以上の表面である。また、核酸配置部分間の距離は播種する細胞が最も伸展した場合の長さ以上に保つ必要がある。このように核酸を固定化あるいは核酸を含むフィルムを配置する部分以外の細胞培養表面を高い親水性あるいは高い疎水性表面とすることで、細胞をウェルで仕切って培養する必要がなく、ミクロプレート上で多数の遺伝子の機能を一度に解析することが可能となる。
実施例
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
プラスミドＤＮＡとコラーゲンとの複合体の形成
繊維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）の遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２９８０−２９８４（１９８７））を組み込んだプラスミドＤＮＡ（ｐＣＡＨＳＴ−１：７．９Ｋｂｐ）を１０μｇ／ｍｌ含む水溶液と２００，６０，２０，６，２，０．６，０μｇのアテロコラーゲン（（株）高研）を含む中性水溶液とを等量混合し、アガロースゲル電気泳動で分析した。アガロースゲル電気泳動は水平型電気泳動ユニット（Ｍｕｐｉｄ、（株）アドバンス）にて、ＴＡＥ（トリス・酢酸）緩衝液中０．８％アガロースゲルを用いて行った。電気泳動後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、トランスイルミネーター上で撮影を行った。結果を図１に示す。ｐＣＡＨＳＴ−１は１０μｇ／ｍｌ以上の濃度のコラーゲン存在下では泳動されずウェルに残留した。この結果は５μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１が１０μｇ／ｍｌのコラーゲンと複合体を形成することを示している。
同様に１０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１と１００μｇ／ｍｌのコラーゲンを等量、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、１．０Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合し、電気泳動で分析した結果を図２に示す。ｐＣＡＨＳＴ−１は１００μｇ／ｍｌのコラーゲン存在下でも１．０Ｍ塩化ナトリウムが共存すると泳動された。このことはｐＣＡＨＳＴ−１とコラーゲンが形成する複合体は静電的複合体であることを示している。
また、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、１０μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１とコラーゲンの複合体形成をヘパラン硫酸の有無で比較した。結果を図３に示す。ヘパラン硫酸が存在しない場合、５μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１は１００μｇ／ｍｌのコラーゲンによりすべて複合体を形成したが、ヘパラン硫酸存在下では３００μｇ／ｍｌのコラーゲン存在下でも複合体を形成していないｐＣＡＨＳＴ−１の存在が確認された。これはｐＣＡＨＳＴ−１と同様に負電荷を有するヘパラン硫酸が存在することによって、コラーゲンとの複合体形成にｐＣＡＨＳＴ−１とヘパラン硫酸の競争反応が生じたことを示しており、ｐＣＡＨＳＴ−１とコラーゲンが静電的複合体を形成することを示唆している。
実施例２
複合体の顕微鏡観察結果
２００μｇ／ｍｌのｐＣＡＨＳＴ−１水溶液と０，２０，２００，１０００μｇ／ｍｌのアテロコラーゲン水溶液を等量混合し、得られた混合液にＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加してｐＣＡＨＳＴ−１を染色して蛍光顕微鏡で観察した。得られた結果を図４に示す。混合後のコラーゲン濃度が５００μｇ／ｍｌ（図中、コラーゲン０．０５％）の場合、主として長径１ｍｍを超える線維状複合体が観察されたが、コラーゲン濃度が１００μｇ／ｍｌ（図中、コラーゲン０．０１％）の場合、主として１０〜１００μｍの粒子状複合体が、さらに１０μｇ／ｍｌ（図中、コラーゲン０．００１％）の場合には、主として１０μｍ以下の微粒子状複合体が観察された。この結果は、混合時のプラスミドＤＮＡとコラーゲンの濃度によって複合体の形状を制御できることを示している。また、この複合体は５℃に保管することで１週以上安定にその形状が保持された（図５）。この結果は、この複合体が長期間にわたって貯蔵することが可能であり、用時調製する必要がなく複合体の状態で流通できることを示している。
実施例３
複合体による発現期間の延長効果
蛍光を発するタンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１，クローンテック株式会社）２００μｇ／ｍｌを含有する水溶液と０．０２％（ｗ／ｗ）のアテロコラーゲン水溶液を等量混合することにより、ゲル状製剤を調製した。
直径６ｃｍの培養皿で培養したヒト胎児腎臓細胞株２９３細胞に無血清培地２ｍｌ存在下、調製したゲル状製剤を１００μｌ（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ１０μｇ含有）添加した。添加後、３７℃で一晩培養した後、細胞表面をＰＢＳで洗浄して無血清培地と製剤を除去し、１０％の子牛血清を含む培地中で培養した。経時的に細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＥＧＦＰの発現を観察した。対照として同量のｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを含有するＰＢＳ溶液およびカチオニックリポソーム製剤とｐＣＭＶ−ＥＧＦＰの複合体を２９３細胞にそれぞれ添加した。
得られた結果を図６に示す。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰのゲル状製剤の場合、ＥＧＦＰの発現が観察され、その発現は添加５２日後までの長期間確認された。これに対し、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを含有するＰＢＳ溶液の場合にはＥＧＦＰの発現が観察されず、またカチオニックリポソーム製剤では、ＥＧＦＰの発現は確認されたが、その発現は２日間という短期間であった。これらの結果は、プラスミドＤＮＡをコラーゲンにて製剤化することでプラスミドＤＮＡの発現効率を高めることができ、かつ発現を長期間持続させることができることを示している。
この結果はプラスミドＤＮＡとコラーゲンが形成した複合体が細胞内へのプラスミドＤＮＡの移入を高め、かつ細胞内外でのプラスミドＤＮＡの安定性を高め、細胞内で遺伝子の発現を長期化していることを示している。特定の理論にとらわれるものでないが、系中に複合体が存在しない状態においても発現が長期間持続されることは、複合体が洗浄にて除去されない程度に細胞と相互作用しているか、あるいは複合体として細胞内に取りこまれることが考えられる。
実施例４
複合体の組成におけるプラスミドＤＮＡ導入効率に対する効果
以下の表１に示す各種組成の複合体を、プラスミドＤＮＡとしてｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを用いて調製した。
2003000297.tif 000002
結果は、ＥＧＦＧ−３複合体＞ＥＧＦＧ−２複合体＞ＥＧＦＧ−４複合体＝ＥＧＦＧ−５複合体の順で導入効率が高かった。ＥＧＦＧ−１では導入は確認されなかった。この結果はプラスミドＤＮＡがアテロコラーゲンと複合体を形成することでプラスミドＤＮＡの発現効率が高まること、さらに等量のプラスミドＤＮＡを含有する複合体でもアテロコラーゲンの含有量によって発現効率が異なることを示している。
実施例５
プラスミドＤＮＡ導入効率に対するプラスミドＤＮＡ量の影響
実施例４にて最も導入効率が高かったＥＧＦＧ−３複合体（アテロコラーゲン０．０１％、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ１００μｇ／ｍｌ）０、１０、５０、１００、２５０および５００μｌを、６穴培養皿で培養した２９３細胞に無血清培地１ｍｌ存在下、滴加した。滴加後、３７℃で一晩培養した後、細胞表面をＰＢＳで洗浄して無血清培地と複合体を除去し、１０％ＦＢＳ（１０％牛胎児血清を含む）培地と培地交換した。６日間経時的に細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＥＧＦＰの発現を観察した。
プラスミドＤＮＡ量を増大させると導入効率も向上した。具体的データは次の通りである。表中、発現効率は、顕微鏡で観察できる決まった区画に存在する全細胞数を計数し、その中でＥＧＦＰを発現して蛍光を発する細胞数を計数して算出した。
2003000297.tif 000003
実施例６
複合体による発現期間の延長効果における複合体滴加法と固相塗布法の比較
まず、最も導入効率が高かったＥＧＦＧ−３複合体（アテロコラーゲン０．０１％、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ１００μｇ／ｍｌ）の組成に基づき、コラーゲンおよびプラスミドＤＮＡ組成の最適化を図りつつ、滴加法および固相塗布法による発現期間を比較した。
（１）以下の表３に示す各種アテロコラーゲン濃度組成の複合体を、プラスミドＤＮＡとしてｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを用いて調製した。
2003000297.tif 000004
６穴培養皿で培養した２９３細胞に無血清培地存在下、調製した複合体を滴加した。滴加後、３７℃で一晩培養した後、細胞表面をＰＢＳで洗浄して無血清培地と複合体を除去し、１０％ＦＢＳを含む培地と培地交換した。７日後に蛍光顕微鏡で観察してＥＧＦＰを発現している細胞数を計数した。結果を図７に示す。またＥＧＦＧ−３Ｂ、３Ｄ、３Ｅについては、発現したＥＧＦＰの蛍光強度を測定した（Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社）。各サンプルの相対的な蛍光強度を図８に示す。
６穴培養皿に調製した複合体２５０μｌ／ウェルを塗布し、３０分間風乾した。次いで、１０％ＦＢＳを含有する培地中、２９３細胞（４−５ｘ１０５細胞／ウェル）を加え、３７℃で一晩培養し、７目後に蛍光顕微鏡で観察してＥＧＦＰを発現している細胞数を計数した。結果を図９に示す。
滴加法による結果を示す図７および固相塗布法による結果を示す図９は、コラーゲン濃度が導入効率に影響を与えること、および固相塗布法が滴加法よりも導入効率の点で優れていることを示している。
（２）以下の表４に示す各種プラスミドＤＮＡ濃度組成の複合体を調製し、上記同様に滴加法と固相塗布法における導入効率を比較した。
2003000297.tif 000005
滴加法による結果を図１０に、固相塗布法による結果を図１１に示す。また、固相塗布法により得られた各サンプルでのＥＧＦＰの相対的な蛍光強度を図１２に示す。これらの結果は、プラスミドＤＮＡ濃度の比率が導入効率に影響を与え、特に固相塗布法ではＥＧＦＰの発現量とプラスミド、ＤＮＡの濃度の間に正の相関があること、およびここでも固相塗布法が滴加法よりも導入効率の点で優れていることを示している。
実施例７
固相塗布法のスクリーニングへの応用
線維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）の遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２８９０−２９８４（１９８７）に記載）の４１９６ｂから４２１６ｂまでの配列に相補的な配列を有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴ−３’，分子量：約６５００、配列番号２）（５）（サワデー株式会社）１０μＭと０．０５％アテロコラーゲン液を混合して複合体を形成した。得られた複合体を細胞培養用９６穴プレートの底部に塗布し風乾し、複合体が底部に塗布された細胞培養器具を得た。同様にＨＳＴ−１遺伝子と同じ配列を有するホスホロチオエート型センスオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＧＣＡＴＣＣＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡ−３’、配列番号３）（１）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列をスクランブルさせた配列（５’−ＡＧＴＣＧＣＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＡ−３’、配列番号４）（２）および３種のランダムな配列（５’−ＧＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＡＴＴＣＣＡＧＴ−３’、配列番号５）（３）、（５’−ＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＣ−３’配列番号６）（４）、（５’−ＧＴＴＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴ−３’、配列番号７）（６）を有するホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれコラーゲンと複合体を形成させてプレートの底部に塗布、乾燥させた。これらのオリゴヌクレオチドを塗布したプレートにＨＳＴ−１が過剰に発現することによって増殖が促進されているＮＥＣ８細胞とＨＳＴ−１以外の遺伝子で増殖が促進されているＨｅｐＧ２細胞を０．５Ｘ１０５個／ウェルの濃度で播種し、４日間培養した。培養後、細胞の増殖抑制をテトラカラーワン細胞増殖アッセイ試薬（生化学工業）を用いて測定した。具体的には着色したサンプル液を６５０ｎｍの吸光度を対照として４５０ｎｍの吸光度を測定した（図１３）。
結果、ＨＳＴ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコラーゲンと複合体を形成させて塗布した場合にのみ、ＮＥＣ８細胞で増殖阻害効果が認められた（図１３−５）。一方、ＨＳＴ−１に対するセンスオリゴヌクレオチドをコラーゲンと複合体を形成してプレート底部に塗布した場合には、阻害効果は認められなかった（図１３−１）。同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列をスクランブルさせた配列（図１３−２）およびランダムな配列（図１３−３、４、６）を有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドをコラーゲンと複合体を形成させて塗布した場合には、阻害効果は認められなかった。この結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをアテロコラーゲンと複合体を形成させて固相上に塗布し、その固相上で細胞を培養すれば、カチオニックリポソームやカチオン性脂質など通常生体内には存在しない遺伝子導入試薬を用いることなく細胞の増殖に関与する遺伝子をスクリーニング出来ることを示している。更にこの結果は、本方法によって遺伝子導入試薬が細胞に与える障害によるノイズなしに、かつ少量の細胞およびオリゴヌクレオチドで高感度に遺伝子機能を解析できることを示している。
実施例８
アテロコラーゲンによるアデノウイルスベクターの風乾保存
（固相塗布法による調製）
１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌアデノウイルスベクターＡｄＣＭＶＥＧＦＰ（Ｋ．Ａｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０００）１（６）：５５５−５６５）のＤＭＥＭ溶液中溶液１０μｌを、アテロコラーゲンのＰＢＳ（−）中２％溶液５μｌと混合した。この混合物５０μｌを２４ウェル培養プレート（非被覆）（コーニング社）に添加し、冷セットのドライヤーにより室温にて１５分間風乾し、固相塗布を行った。
（ウイルスの保存安定性試験）
得られた培養プレートを室温に放置しつつ、放置後１日、７日および１４日目にヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞を２ｘ１０５細胞／ウェルで加え、それぞれの２日後にＧＦＰの発現量を蛍光顕微鏡によって確認した。対照として、アデノウイルスベクターのみ、およびアテロコラーゲンのみを培養プレートに固相塗布し、同様に実験を行った。
得られた結果を表５に示す。
2003000297.tif 000006
実施例９
固相塗布法での遺伝子導入効果のアデノウイルス用量依存性
４Ｘ１０４，４Ｘ１０５，４Ｘ１０６，４Ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌのアデノウイルスベクターＡｄＣＭＶＥＧＦＰ（Ｋ．Ａｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０００）１（６）：５５５−５６５）のＤＭＥＭ溶液を１６０μｇ／ｍｌのアテロコラーゲン溶液と等量混合した。この混合物は４℃で長期間活性を低下することなく保存できた。混合物５０μｌを９６ウェル培養プレート（非被覆、コーニング社）に添加し、風乾し固相塗布を行った。このプレートは活性を低下させることなく、少なくとも２週間から４週間の間保存可能である。得られた培養プレートに胚幹細胞（ＥＳ細胞）を播種し、３日後にＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認すると共に、蛍光強度を測定した。結果、ＧＦＰの蛍光強度はアデノウイルスの投与量と正の相関があった（図１４）。この結果は、本発明がアデノウイルスを用いたＥＳ細胞のハイスループットスクリーニングに有用な技術であり、アデノウイルスとコラーゲンが形成した複合体を塗布したハイスループットスクリーニング用プレートが提供できることを示している。
実施例１０
プラスミドＤＮＡを含有する複合体の組成と平均長径との関係
１０℃以下に冷却した蛍光を発するタンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、４．７ｋｂｐ、クローンテック株式会社）２００μｇ／ｍｌを含有する水溶液、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）、塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）と、１０℃以下に冷却した０．００２〜０．２％（ｗ／ｗ）のアテロコラーゲン（（株）高研）を含有する水溶液、０．１Ｍリン酸緩衝液、塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液をそれぞれ１０℃以下で等量混合し、一晩１０℃以下で静置することによりゲル状製剤を調製した。得られたゲル状製剤を７０μｍ、あるいは１０μｍの孔径を有するフィルターを通過させ、整粒したゲル状製剤を調製した。
得られた製剤にＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加してｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを染色し蛍光顕微鏡で観察することにより、複合体の長径を測定した。同様にＨＳＴ−１の分泌シグナルペプチドとインターロイキン２をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２、６．２ｋｂｐ）とアテロコラーゲンを混合してゲル状製剤を得、複合体の長径を測定した。また、得られたゲル状製剤をアガロースゲル（トリス・酢酸緩衝液、０．８％アガロースゲル）で電気泳動することによって、複合体を形成したプラスミドＤＮＡと形成しなかったプラスミドＤＮＡを分離した。複合体を形成しなかったプラスミドＤＮＡのバンドをエチジウムブロマイドで染色し、蛍光強度をＦｌｕｏｒ−Ｓ−Ｍｕｌｔｉ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて測定した。濃度既知のプラスミドＤＮＡを電気泳動したバンドの蛍光強度から得られる検量線を基に、複合体を形成しなかったプラスミドＤＮＡ量を定量し、複合体に含まれるＤＮＡの負電荷量とコラーゲン分子量の比を算出した。結果を表６に示す。
2003000297.tif 000007
塩を含有しない水を溶媒として複合体を調製した場合、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２共にコラーゲン濃度が０．０５％以上の場合、平均長径が１２２μｍ以上の複合体が得られた。またコラーゲン濃度が０．００５％〜０．０２％の時には平均長径６．１μｍ〜５３μｍの複合体が、コラーゲン濃度が０．００１％の時には平均長径１０μｍ以下の複合体が得られた。この結果は、塩を含有しない水を溶媒とした場合、混合時のプラスミドＤＮＡとコラーゲンの濃度の調節によって複合体の形状を制御できることを示している。特にコラーゲンの濃度を高くする、即ちコラーゲンの分子数を増加すると複合体の形状は大きくなる傾向があったが、これは複合体の長径の増大が専らコラーゲン分子による会合体形成に依存することを示している。
この結果は、実施例２においてｐＣＡＨＳＴ−１を用いて複合体を調製した結果と一致している。使用した各プラスミドＤＮＡのサイズはそれぞれ、ｐＣＡＨＳＴ−１：７．９ｋｂｐ、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ：４．７ｋｂｐ、ｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２：６．２ｋｂｐと相互に異なっている。このことも、プラスミドＤＮＡのサイズは、形成される複合体の形状に影響しないことを示している。
他方、０．１Ｍリン酸緩衝液および塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液を溶媒として複合体を調製した場合、コラーゲン濃度が０．００１％〜０．１％の時、複合体平均長径が３．４μｍ以下〜２９μｍの複合体が得られ、１００μｍを超えるサイズの複合体は得られなかった。これは塩の存在によってコラーゲンの会合体形成が抑制されるためと考えられ、コラーゲンの会合体形成を抑制する物質の存在下複合体を調製することで１００μｍ以下の平均長径を有する複合体をコラーゲンの濃度に依らず調製できることが示された。
また、一旦プラスミドＤＮＡとコラーゲンを混合して得られたゲル状製剤を７０μｍあるいは１０μｍの孔径を有するフィルターでろ過することによって、より平均長径の小さい複合体に整粒して得ることができた。
図１５にプラスミドＤＮＡ１分子に結合したコラーゲンの分子数と複合体の平均長径の関係を示した。塩を含有しない水を溶媒とした場合、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２共にプラスミドＤＮＡに結合するコラーゲン分子数が多くなるに従って複合体の平均長径が増大する傾向が見られた。一方、０．１Ｍリン酸緩衝液、塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液を溶媒として複合体を調製した場合には、そのような傾向は見られず、水を溶媒とした場合には平均長径が１００μｍを超えるコラーゲン分子がプラスミドＤＮＡと複合体を形成した場合でも平均長径は５０μｍを超えなかった。これは先に述べたように水を溶媒とした場合、プラスミドＤＮＡとコラーゲンが複合体を形成するのに伴ってコラーゲン会合体の形成が進展するが、この反応は専ら会合体の長軸を延伸する反応であるためと考えられる。一方、塩が存在する場合には、コラーゲン分子がプラスミドＤＮＡと結合して形成されたコラーゲン会合体が塩の存在によって充分に会合体の長軸方向に延伸できないため、微細な会合体がプラスミドＤＮＡに多数結合する構造をとるためと考えられる。他方、コラーゲンは適当な塩濃度において微細な会合体を形成することが知られていることから、一部のコラーゲンはプラスミドＤＮＡと混合する前に予め微細な会合体を形成し、プラスミドＤＮＡと微細なコラーゲン会合体が結合して複合体を生成したと考えられる。このことは、予めコラーゲンを微細会合体化してプラスミドＤＮＡと混合することで、平均長径５０μｍ以下の複合体を生成できることを示している。
今回得られた結果をプラスミドＤＮＡのサイズに依らず一般化して解析するため、複合体中のコラーゲン１分子あたりのプラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数を算出した。コラーゲン１分子あたりのプラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数と複合体の平均長径の関係を図１６に示した。コラーゲン１分子あたり、プラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数が少なくなるに従って複合体の平均長径が増大する傾向が見られた。
図１６と表６を総合すると次のことが導かれる。ヌクレオチドモノマー数が９５以下になった場合、平均長径が１２０μｍを超える複合体が得られた。このことは、コラーゲン１分子あたりのヌクレオチドモノマー数の減少が複合体中のプラスミドＤＮＡに対するコラーゲン分子数の増大を示し、よってコラーゲン１分子あたりのプラスミドＤＮＡのヌクレオチドモノマー数を９６以上に保つことによって平均長径が１２０μｍ以下の複合体を得ることができることを意味している。一方、複合体の最少単位はコラーゲン１分子とプラスミドＤＮＡ１分子が形成する複合体である。コラーゲン１分子と複数のプラスミドＤＮＡが複合体を形成することは、プラスミドＤＮＡ間の負電荷による反発と立体的な障害により困難である。従って、コラーゲン１分子あたりのヌクレオチドモノマー数が最大になるのは、コラーゲンとプラスミドＤＮＡが各々１分子で複合体を形成した場合であり、プラスミドＤＮＡが有するヌクレオチドモノマー数により規定される。
実施例１１
オリゴヌクレオチドを含有する複合体の組成と平均長径との関係
線維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）の遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２８９０−２９８４（１９８７）に記載）の４１９６ｂから４２１６ｂまでの配列に相補的な配列を有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴ−３’，分子量：約６５００、配列番号８）（エスペック株式会社）を２．０μＭ〜４０．０μＭの濃度で含有し、１０℃以下に冷却した水溶液、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）と、１０℃以下に冷却した０．０２〜３．０％（ｗ／ｗ）のアテロコラーゲン（（株）高研）を含有する水溶液、０．１Ｍリン酸緩衝液をそれぞれ１０℃以下で等量混合し、１０℃以下で一晩静置するとによりゲル状製剤を調製した。得られたゲル状製剤中でコラーゲンと複合体を形成したオリゴヌクレオチド量は、ゲル状製剤を５℃で１時間１５万回転で遠心して複合体を沈殿させ、上澄み液中の遊離したオリゴヌクレオチド量をＨＰＬＣ（カラム：Ｐｕｒｅｓｉｌ  Ｃ１８  ５（Ｗａｔｅｒｓ），移動相：１ｍＭのＥＤＴＡ，５ｍＭのテトラブチルアンモニウムを含有する０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）中のアセトニトリル含量を３５分間で２４．５％から３５％に変化，流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２６０ｎｍ）で定量して算出した。得られた製剤に単鎖核酸蛍光染色試薬ＹＯＹＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加してオリゴヌクレオチドを染色し蛍光顕微鏡で観察することにより、複合体の長径を測定した。結果を表７に示す。
2003000297.tif 000008
プラスミドＤＮＡを用いた実施例１０と同様に、オリゴヌクレオチドをコラーゲンと混合することでオリゴヌクレオチドとコラーゲンの複合体が得られた。プラスミドＤＮＡの場合と異なり、塩を含有しない水を溶媒とした場合、０．１Ｍリン酸緩衝液を溶媒とした場合共に、コラーゲンの濃度およびオリゴヌクレオチドの濃度によって複合体の平均長径に顕著な変化は見られなかった。これはオリゴヌクレオチドがプラスミドＤＮＡに比べて低分子であるため、コラーゲンの会合体形成を阻害するためと考えられる。
図１７に混合時のオリゴヌクレオチドとコラーゲンの分子数の比と複合体中でコラーゲン１分子に結合したオリゴヌクレオチドの分子数の関係を示した。水、リン酸緩衝液のいずれを溶媒として用いた場合でも、混合時のコラーゲン分子数に対するオリゴヌクレオチド分子数が高いほど、形成される複合体中でコラーゲン１分子に結合したオリゴヌクレオチド分子数が高くなる傾向があった。また、コラーゲン１分子に結合する最大のオリゴヌクレオチド分子数は溶媒によって異なり、水を溶媒とした場合６分子、リン酸緩衝液を溶媒とした場合には３分子であった。
コラーゲンの分子量（３０万）はオリゴヌクレオチドの分子量（約６，５００）に比べて非常に大きく、複合体の形状は専ら複合体を形成するコラーゲン分子数に依存することから、平均長径が同じ複合体中のコラーゲン分子数はほぼ同数である。従って平均長径が同じ複合体でもコラーゲン１分子に結合したオリゴヌクレオチド数に依存して、複合体に含有されるオリゴヌクレオチド分子数が異なる。細胞にオリゴヌクレオチドを導入する際、個々の複合体が細胞と接触してオリゴヌクレオチドを導入するため、オリゴヌクレオチド分子の含量が高い複合体の方が効率的に細胞にオリゴヌクレオチドを導入できる。従ってコラーゲン１分子あたりのオリゴヌクレオチド分子数が高い複合体がより望ましく、一般化すればコラーゲン１分子あたりに結合するヌクレオチドモノマー数が高いものがより望ましい。
実施例１２
オリゴヌクレオチドを含有する複合体を塗布した細胞培養器具
実施例１１で調製したゲル状製剤（１１−３、実施例７における製剤の組成）５０μｌを９６穴マイクロプレートの底部に滴下し、冷風を直接吹き付ける方法（室温、２時間）あるいはデシケーター中にシリカゲルと共に静置する方法（室温、２日間）で乾燥し、複合体を細胞培養表面に塗布した細胞培養器具を調製した。細胞培養器具のウェルに塩化ナトリウムにより生体と等張に調整した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１００μｌを添加し、直ちに軽くピペッティングして液を採取した。また、細胞培養器具のウェルに塩化ナトリウムにより生体と等張に調整した０．０１Ｍリン酸緩衝液１００μｌを添加し、３７℃で一晩静置した後、軽くピペティングして液を採取した。得られた液１０μｌに単鎖核酸蛍光染色試薬ＹＯＹＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）２μｌを添加してオリゴヌクレオチドを染色し、細胞培養器具表面から遊離した複合体を蛍光顕微鏡で観察した。得られた蛍光顕微鏡像を図１８に示した。採取したすべての液で、５０μｍ以下の長径を有する複合体が確認された。これはＰＢＳに暴露することで、細胞培養器具表面から複合体が遊離されることを示している。遊離した複合体の形状は、乾燥方法、ＰＢＳへの暴露の状態に関わらず、細胞培養器具表面に塗布する前と変化がなかった。この結果は、乾燥方法に依らず複合体が形状を保持した状態で細胞培養器具表面で保持されたことを示しており、更に一般に細胞培養に使用される３７℃という温度条件においても複合体の形状が変化しないことを示している。
実施例１３
プラスミドＤＮＡを含有する複合体を塗布した細胞培養器具
実施例１０で調製したゲル状製剤（１０−３；実施例６にて良好な導入効率が確認された組成）５０μｌを９６穴マイクロプレートの底部に滴下し、冷風を直接吹き付ける方法（室温、２時間）あるいはデシケーター中にシリカゲルと共に静置する方法（室温、２日間）で乾燥し、複合体を細胞培養表面に塗布した細胞培養器具を調製した。細胞培養器具のウェルに塩化ナトリウムにより生体と等張に調整した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１００μｌを添加し、直ちに軽くピペッティングして液を採取した。また、細胞培養器具のウェルに塩化ナトリウムにより生体と等張に調整した０．０１Ｍリン酸緩衝液１００μｌを添加し、３７℃で一晩静置した後、軽くピペティングして液を採取した。得られた液１０μｌにＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）２μｌを添加してプラスミドＤＮＡを染色し、細胞培養器具表面から遊離した複合体を蛍光顕微鏡で観察した。得られた蛍光顕微鏡像を図１９に示した。採取したすべての液で、１００μｍ以下の長径を有する複合体が確認された。これはＰＢＳに暴露することで、細胞培養器具表面から複合体が遊離されることを示している。遊離した複合体の形状は、乾燥方法、ＰＢＳへの暴露の状態に関わらず、細胞培養器具表面に塗布する前と変化がなかった。この結果は、乾燥方法に依らず複合体が形状を保持した状態で細胞培養器具表面で保持されたことを示しており、更に一般に細胞培養に使用される３７℃という温度条件においても複合体の形状が変化しないことを示している。
実施例１４
複合体を塗布した細胞培養器具による遺伝子導入
６ウェルの細胞培養プレートに実施例１０で調製したｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを含有したゲル状製剤１０−１、１０−４、１０−７を３００μｌ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥してｐＣＭＶ−ＥＧＦを含有した複合体が塗布された細胞培養器具を調製した。対照群として１００μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを含有する水溶液３００μｌをプレート上に添加し、同様に乾燥させた。各ウェルに２９３細胞７．５Ｘ１０４個を播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加えて３７℃で培養した。培養開始後、４、５日おきに培地を新鮮な培地に交換した。細胞播種１１日後、蛍光顕微鏡で細胞を観察してＧＦＰを発現している細胞数を計測し、導入効率を算出した。
同様に６ウェルの細胞培養プレートに実施例１０で調製したｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２を含有したゲル状製剤１０−１３〜２２，２４を３００μｌあるいは５００μｌ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥してｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２を含有した複合体が塗布された細胞培養器具を調製した。対照群として１００μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２を含有する水溶液、ＰＢ液、ＰＢＳ液３００μｌあるいは５００μｌをプレート上に添加し、同様に乾燥させた。
１）２９３細胞へのプラスミドＤＮＡの導入
ゲル状製剤３００μｌを塗布した各ウェルに２９３細胞７．５Ｘ１０４個を播種し、１０−１３〜１９については１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加えて３７℃で培養した。細胞播種８日後に培地を交換し、１１日後培地を採取して培地中のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡで測定した（Ｑｕａｍｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））。１０−２０〜２２については、ＤＭＥＭ培地を加えて３７℃で培養一晩培養し、翌日培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換して３７℃で培養した。細胞播種８日後、１１日後に培地を交換し、１５日後培地を採取して培地中のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡで測定した。また、１０−２０，２１，２４については、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加えて３７℃で培養した。細胞播種８日後に培地を採取して培地中のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
２）ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのプラスミドＤＮＡの導入
１０−１４〜１７を５００μｌ塗布したウェルにＮＩＨ３Ｔ３細胞５Ｘ１０４個を播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加えて３７℃で培養した。細胞播種８日後に培地を採取して培地中のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
上記１）および２）にて得られた結果を表８と表９にまとめた。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２共にコラーゲンと複合体を形成して細胞培養器具に塗布することによって遺伝子を効率的に２９３細胞並びにＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入できた。この結果は、本発明の複合体による遺伝子導入促進効果がプラスミドＤＮＡの種類、細胞種および培養液中の血清の有無に依らないことを示している。また、プラスミドＤＮＡの場合、コラーゲン１分子あたりのヌクレオチドモノマー数が１１１２以下で複合体平均粒子径が１５１μｍ以下の複合体を塗布した場合、優れた導入効率および遺伝子発現が確認された。
2003000297.tif 000009
2003000297.tif 000010
実施例１５
複合体添加による細胞への遺伝子導入
６ウェルの細胞培養プレートに２９３細胞５Ｘ１０４個を播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地存在下３７℃で培養した。播種３日後実施例１０で調製したｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを含有したゲル状製剤１０−１、１０−４、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０と対照として１００μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを含有する水あるいはＰＢ溶液をそれぞれ３００μｌ添加し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地存在下３７℃で一晩培養した。翌日、新鮮な培地に交換して、１０−１、１０−４、１０−７については１３日間、１０−８、１０−９、１０−１０については５日間培養後、蛍光顕微鏡で細胞を観察してＧＦＰを発現している細胞数を計測した。
同様に６ウェルの細胞培養プレートに２９３細胞７．５Ｘ１０４個を播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地存在下３７℃で培養した。播種２日後実施例１０で調製したｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２を含有したゲル状製剤１０−２０、１０−２１と対照として１００μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２を含有するＰＢ溶液をそれぞれ３００μｌ添加し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地存在下３７℃で一晩培養した。翌日、新鮮な培地に交換して５日間培養後、培地を採取して培地中のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡで測定した（Ｑｕａｍｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））。
得られた結果を表１０、１１、１２にまとめた。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ＨＳＴ−１−ＩＬ−２共にコラーゲンと複合体を形成して細胞に添加することによって遺伝子を効率的に細胞に導入できた。本実施例のように複合体の平均長径が５３μｍ以下の場合、コラーゲン１分子あたりのヌクレオチドモノマー数が２４０６以下、更には７０１以下の複合体を細胞に添加した場合、優れた導入効率及び遺伝子発現が確認された。
2003000297.tif 000011
2003000297.tif 000012
2003000297.tif 000013
産業上の利用の可能性
本発明の複合体は、所望の核酸をコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体化して保護、安定化し、２）体内に投与することによって所望の核酸を効率よく細胞に導入でき、３）特別の遺伝子導入試薬を使わずとも、核酸の発現および抑制が可能である。また、１）ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ウイルスベクターを保護、安定化し、２）プレート上に塗布し、乾燥した状態で長期間保存が可能であり、３）その上に細胞を播くことで特別な遺伝子導入試薬を使わずとも、遺伝子の発現が可能であり、４）その対象となる核酸の種類および固定化される形態を選ばず、また、５）プラスミドＤＮＡを用いた場合、発現期間が非常に延長されるという特性から、種々の応用が可能である。
本発明によれば、細胞の増殖、細胞の形態またはサイトカインやレセプターの発現量などを測定することでアンチセンスオリゴヌクレオチドにより発現が抑制された遺伝子またはタンパク質の機能を容易に解明することができる。加えて、コラーゲンと複合体を形成させてプレート上に塗布できるのはアンチセンスオリゴヌクレオチドに限られず、リボザイムの場合にはアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様のスクリーニングが可能であり、さらにプラスミドＤＮＡあるいはアデノウイルスの場合は特定の遺伝子の発現による細胞の変化を測定して遺伝子またはタンパク質の機能を解析することが可能となる。特に本複合体を構成しているコラーゲンあるいはコラーゲン誘導体は、細胞に障害を与えないことが知られていることから、本発明の複合体を用いたスクリーニングでは、一般の遺伝子導入剤を用いた時に生じる非特異的な細胞への影響を極力排した遺伝子機能の解析を行うことが可能である。
【配列表】
2003000297.tif 000014
2003000297.tif 000015
【図面の簡単な説明】
図１は、一定濃度のプラスミドＤＮＡと種々の濃度のアテロコラーゲンとの静電的相互作用を示すアガロースゲル電気泳動結果の、図面に代わる写真である。
図２は、プラスミドＤＮＡとアテロコラーゲンとの静電的相互作用に対する塩化ナトリウムの影響を示すアガロースゲル電気泳動結果の、図面に代わる写真である。
図３は、プラスミドＤＮＡとアテロコラーゲンとの静電的相互作用に対するヘパラン硫酸の影響を示すアガロースゲル電気泳動結果の、図面に代わる写真である。左写真はヘパラン硫酸不存在下、右写真はヘパラン硫酸存在下での結果である。
図４は、各種濃度のアテロコラーゲンとのプラスミドＤＮＡの複合体の形状を表す顕微鏡写真である。
図５は、各種濃度のアテロコラーゲンとのプラスミドＤＮＡの複合体における１週間保存後の形状を表す顕微鏡写真である。
図６は、アテロコラーゲンのゲル状製剤、カチオニックリポソーム製剤およびＰＢＳ溶液におけるプラスミドＤＮＡの遺伝子発現期間の比較を示すグラフである。
図７は、コラーゲン濃度の異なる複合体と滴加法によるトランスフェクション７日後におけるプラスミドＤＮＡ導入効率との関係を示すグラフである。
図８は、コラーゲン濃度の異なる複合体における７日後におけるプラスミドＤＮＡ導入効率を蛍光強度にて示すグラフである。
図９は、コラーゲン濃度の異なる複合体と固相塗布法によるトランスフェクション７日後におけるプラスミドＤＮＡ導入効率との関係を示すグラフである。
図１０は、プラスミドＤＮＡ濃度の異なる複合体と滴加法によるトランスフェクション７日後におけるプラスミドＤＮＡ導入効率との関係を示すグラフである。
図１１は、プラスミドＤＮＡ濃度の異なる複合体と固相塗布法によるトランスフェクション７日後におけるプラスミドＤＮＡ導入効率との関係を示すグラフである。
図１２は、固相塗布法によるトランスフェクション７日後におけるプラスミドＤＮＡ導入効率を蛍光強度にて示すグラフおよびその蛍光を示す顕微鏡写真である。
図１３は、本発明方法における細胞増殖抑制を示すグラフである。
図１４は、固相塗布法にてアデノウイルスが用量依存的に導入されていることを示すグラフおよびその蛍光を示す顕微鏡写真である。
図１５は、プラスミドＤＮＡ１分子に結合したコラーゲンの分子数と複合体の平均長径の関係を示すグラフである。
図１６は、コラーゲン１分子あたりの所望の核酸のヌクレオチドモノマー数と複合体の平均長径の関係を示すグラフである。
図１７は、混合時におけるオリゴヌクレオチドとコラーゲンの分子数の比と複合体におけるコラーゲン１分子に結合したオリゴヌクレオチドの分子数との関係を示すグラフである。
図１８は、本発明の細胞培養器具の表面から遊離したオリゴヌクレオチドを含む複合体を蛍光顕微鏡で観察して得られた蛍光顕微鏡写真である。
図１９は、本発明の細胞培養器具の表面から遊離したプラスミドＤＮＡを含む複合体を蛍光顕微鏡で観察して得られた蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
2003000297.tif 000016
【図２】
2003000297.tif 000017
【図３】
2003000297.tif 000018
【図４】
2003000297.tif 000019
【図５】
2003000297.tif 000020
【図６】
2003000297.tif 000021
【図７】
2003000297.tif 000022
【図８】
2003000297.tif 000023
【図９】
2003000297.tif 000024
【図１０】
2003000297.tif 000025
【図１１】
2003000297.tif 000026
【図１２】
2003000297.tif 000027
【図１３】
2003000297.tif 000028
【図１４】
2003000297.tif 000029
【図１５】
2003000297.tif 000030
【図１６】
2003000297.tif 000031
【図１７】
2003000297.tif 000032
【図１８】
2003000297.tif 000033
【図１９】
2003000297.tif 000034
【国際調査報告】
2003000297.tif 000035
2003000297.tif 000036
2003000297.tif 000037
2003000297.tif 000038
2003000297.tif 000039
2003000297.tif 000040