(57)【要約】ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体を、生体内のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダードとして用いることにより、生体内のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を、より正確かつ厳密に測定することができ、更にこれを利用することにより新たな測定方法、検出方法、キットなどが得られる。
2004023141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」を成分とする、検体中の「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」を測定するためのスタンダード。
【請求項２】
「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうる酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」を成分とする、検体中の「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」を測定するためのスタンダード。
【請求項３】
「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうる酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」が、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有することを特徴とする、請求項２に記載のスタンダード。
（ａ）１００単位／ｍｌのヘパリンを共存させても、複合体を構成する酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
（ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２を共存させても、複合体を構成する酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
【請求項４】
検体が、生体由来の検体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスタンダード。
【請求項５】
生体由来の検体が、血液である、請求項４に記載のスタンダード。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のスタンダードを用いることを特徴とする、検体中の「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」の測定方法。
【請求項７】
検体中の「酸化ＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とを共有結合させるステップを少なくとも含む、請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
検体中の「酸化ＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とを、予めｐＨ３〜９の条件下でインキュベートするステップを少なくとも含む、請求項６に記載の測定方法。
【請求項９】
検体中の「『酸化ＬＤＬ』と『タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、アミノ糖又はアミノ脂質』とが静電的に結合した複合体」を解離させるステップを少なくとも含む、請求項６に記載の測定方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の測定方法を用いて検体中の「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」を測定し、測定された「検体中の当該複合体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法。
【請求項１１】
疾患が、抗リン脂質抗体症候群、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化及び糖尿病からなる群から選ばれるものである、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のスタンダードを構成成分として含むことを特徴する、検体中の「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」の測定キット。
【請求項１３】
さらに「『酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を構成成分として含むことを特徴とする、請求項１２に記載の測定キット。
【請求項１４】
疾患の検出に用いられることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の測定キット。
【請求項１５】
「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」を成分とする、検体中の「『酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を測定するための抗原。
【請求項１６】
「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうる酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」を成分とする、検体中の「『酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を測定するための抗原。
【請求項１７】
「酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうる酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体」が、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有することを特徴とする、請求項１６に記載の抗原。
（ａ）１００単位／ｍｌのヘパリンを共存させても、複合体を構成する酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
（ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２を共存させても、複合体を構成する酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の抗原を用いることを特徴とする、検体中の「『酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」の測定方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の測定方法を用いて検体中の「『酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を測定し、測定された「検体中の当該抗体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法。
【請求項２０】
疾患が、抗リン脂質抗体症候群、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化及び糖尿病からなる群から選ばれる、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の抗原が固着された固相。
【請求項２２】
請求項２１に記載の固相を構成成分として含むことを特徴する、検体中の「『酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」の測定キット。
【請求項２３】
さらに「『酸化ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」に結合する物質を構成成分として含むことを特徴とする、請求項２２に記載の測定キット。
【請求項２４】
疾患の検出に用いられることを特徴とする、請求項２３に記載の測定キット。
【請求項２５】
「β２−ＧＰＩを認識する抗体」及び／又は「ＬＤＬを認識する抗体」、並びに抗ＩｇＧ抗体を用いることを特徴とする、検体中の免疫複合体の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体内に存在する「酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）とβ２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）との複合体」（β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体）の測定に有用なスタンダード、及びこれを利用した生体内のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定方法等に関する。
【背景技術】  まず、本明細書において用いる略号を説明する。
ａＰＬ：抗リン脂質抗体
ａＣＬ：抗カルジオリピン抗体
ＡＰＳ：抗リン脂質抗体症候群
β２−ＧＰＩ：β２−グリコプロテインＩ
β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体：ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＬ：カルジオリピン
Ｃｕ２＋−ｏｘＬＤＬ：ＣｕＳＯ４で酸化したｏｘＬＤＬ
ＤＥＡＥ：ジエチルアミノエチル
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＨＲＰ：ホースラディッシュ（西洋ワサビ）のペルオキシダーゼ
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質
ＭＤＡ：マロンジアルデヒド
ＯＤ：吸光度
ｏｘＬＤＬ：酸化ＬＤＬ
ｏｘＬｉｇ−１：７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−９−ｃａｒｂｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ；９−ｏｘｏ−９−（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔ−５−ｅｎ−３β−ｙｌｏｘｙ）ｎｏｎａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＩＵＰＡＣ）
ｏｘＬｉｇ−２：７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−１２−ｃａｒｂｏｘｙ（ｋｅｔｏ）ｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ
ＰＡＰＳ：原発性抗リン脂質抗体症候群
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液
ＰＬ（ＰＬｓ）：リン脂質
ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス
ＴＢＡＲＳ：チオバルビツール酸反応性物質
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣ  ：  ７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−１３−ｃａｒｂｏｘｙｔｒｉｄｅｃａｎｏａｔｅ；１３−ｏｘｏ−１３−（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔ−５−ｅｎ−３β−ｙｌｏｘｙ）ｔｒｉｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ
β２−ＧＰＩは、ＡＰＳ患者に存在する「抗リン脂質抗体」が認識する主要な抗原であり、ｏｘＬＤＬに特異的に結合し、酸化されていない（ネイティブな）ＬＤＬには結合しないことが知られている。国際公開第９５／９３６３号パンフレットには、このようなβ２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬとの特異的結合能を利用したｏｘＬＤＬの測定方法や、これを応用した動脈硬化性疾患の診断用キット等が開示されている。またＪ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４２，ｐ６９７−７０９（２００１）［文献７］には、β２−ＧＰＩが、ｏｘＬＤＬ中のｏｘＬｉｇ−１構造部分を認識して結合することが開示されている。
ｏｘＬＤＬは生体内でβ２−ＧＰＩとの複合体（β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体）を形成しており、生体内に存在するこの複合体を測定することによって種々の疾患の検出を行うことができる。そして生体内に存在するこの複合体を測定する際のスタンダードとして、従来、Ｃｕ２＋−ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとをプレインキュベーションすることなく接触させたものが測定に用いられてきた。
生体内に存在する難解離性のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダードは、生体内に存在する複合体と同一又は可能な限り近似していることが望まれる。しかし、生体内に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体や、従来スタンダードとして用いられてきたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体におけるｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの結合様式等については知られていなかった。
【発明の開示】
本発明は、生体内に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定に有用なスタンダード、及びこれを利用した生体内のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定方法等に関する。
本発明者は、生体内に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体における。ｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの結合様式を検討した結果、驚くべきことにその大部分が共有結合、又は少なくとも静電的な結合力を上回る強い結合を形成していることを見出した。一方、従来スタンダードとして用いられてきた、プレインキュベーションすることなく接触させたｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを測定に供する場合、それらによる複合体における結合は、単なる静電的な結合であることを見出した。
従来のスタンダードも、生体内に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定に使用しうるものではある。しかし、より正確かつ厳密な測定を行うためには、前記の通り、生体内に存在する複合体に可能な限り近似していることが望ましい。
そこで本発明者は、前記の新規な知見に基づき、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するための新規なスタンダード、これを利用したβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定方法、この測定方法を利用した疾患の検出方法、前記スタンダードを利用した、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定キット等を提供するに至り、本発明を完成した。
また本発明者は、生体内に存在する「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」（自己抗体）の測定に用いる抗原も、生体内に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体に可能な限り近似していることが望ましいことにも着目し、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定するための新規な抗原、これを利用した「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定方法、この測定方法を利用した疾患の検出方法、前記抗原が固着された固相、この固相を利用した、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定キット等を提供するに至り、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体を成分とする、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダード（以下、本発明スタンダード１という）を提供する。
また本発明は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」を成分とする、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダード（以下、本発明スタンダード２という）を提供する。本発明スタンダード２における「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」は、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するものが好ましい。
（ａ）１００単位／ｍｌのヘパリンを共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
（ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２を共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
また本発明スタンダードを用いた測定に付される「検体」は、生体由来の検体であることが好ましい。また、この「生体由来の検体」は血液であることが好ましい。
以下、本発明スタンダード１及び２を併せて、単に「本発明スタンダード」という。
また本発明は、本発明スタンダードを用いることを特徴とする、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定方法（以下、本発明測定方法１という）を提供する。本発明測定方法１は、検体中の「ｏｘＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とを共有結合させるステップを少なくとも含むものが好ましい。また、検体中の「ｏｘＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とを、予めｐＨ３〜９の条件下でインキュベートするステップを少なくとも含むものも好ましい。また、検体中の「『ｏｘＬＤＬ』と『タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、アミノ糖又はアミノ脂質』とが静電的に結合した複合体」を解離させるステップを少なくとも含むものも好ましい。
また本発明は、本発明測定方法１を用いて検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定し、測定された「検体中の当該複合体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法（以下、本発明検出方法１という）を提供する。本発明検出方法１によって検出される疾患は、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい。
また本発明は、本発明スタンダードを構成成分として含むことを特徴する、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定キット（以下、本発明キット１という）を提供する。本発明キット１は、さらに「『ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体』を認識する抗体」を構成成分として含むことが好ましい。また本発明キット１は、疾患の検出に用いられるものが好ましい。
また本発明は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」を成分とする、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定するための抗原（以下、本発明抗原１という）を提供する。
また本発明は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」を成分とする、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定するための抗原（以下、本発明抗原２という）を提供する。本発明抗原２における「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」は、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するものが好ましい。
（ａ）１００単位／ｍｌのヘパリンを共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
（ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２を共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
以下、本発明抗原１及び２を併せて、単に「本発明抗原」という。
また本発明は、本発明抗原を用いることを特徴とする、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定方法（以下、本発明測定方法２という）を提供する。
また本発明は、本発明測定方法２を用いて検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定し、測定された「検体中の当該抗体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法（以下、本発明検出方法２という）を提供する。本発明検出方法２によって検出される疾患は、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい。
また本発明は、本発明抗原が固着された固相（以下、本発明固相という）を提供する。
また本発明は、本発明固相を構成成分として含むことを特徴する、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定キット（以下、本発明キット２という）を提供する。本発明キット２は、さらに「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」に結合する物質を構成成分として含むことが好ましい。また本発明キット２は、疾患の検出に用いられるものが好ましい。
また本発明は、「β２−ＧＰＩを認識する抗体」及び／又は「ＬＤＬを認識する抗体」、並びに抗ＩｇＧ抗体を用いることを特徴とする、検体中の免疫複合体の測定方法（以下、本発明測定方法３という）を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、オキシステロールエステルの２つのω−カルボキシル変異体（ｏｘＬｉｇ−１及び９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣ）のリガンドブロット分析を示す図である。ＴＬＣプレート上で展開したリガンドをＩ２の噴霧（Ｉ２ｖａｐｏｒ）で染色し（Ａ）、リガンドブロットは抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２２（Ｂ）及びＥＹ２Ｃ９（Ｃ））を用いて行った。
図２は、Ｃｕ２＋で酸化したｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体形成プロファイルを示す図である。
（Ａ）：ｏｘＬＤＬ１２ｈ（ａｐｏＢ相当で、０（白三角印）、０．１６（白四角印）又は２．５μｇ／ｍｌ（白丸印）を、ウエル中で種々の濃度のβ２−ＧＰＩとインキュベートし、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を検出するためのＥＬＩＳＡを行った。
（Ｂ）：図中に示した濃度のｏｘＬＤＬ１２ｈ（ＬＤＬを５μＭ  ＣｕＳＯ４によって３７℃で１２時間処理したもの；丸印）又はネイティブなＬＤＬ（四角印）を、β２−ＧＰＩの非存在下（白色）又は存在下（２５μｇ／ｍｌ；黒色）でインキュベートし、ＥＬＩＳＡを行った。
（Ｃ）：図中に示した濃度のｏｘＬＤＬ１２ｈ及びβ２−ＧＰＩ（２５μｇ／ｍｌ）をウエル中でインキュベートし、非存在下（白丸印）、ヘパリン（１００単位／ｍｌ）の存在下（黒四角印）又はＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下（黒菱形印）でＥＬＩＳＡを行った。
（Ｄ）：ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体は、ｏｘＬＤＬ１２ｈ（１００μｇ／ｍｌ）をβ２−ＧＰＩ（１００μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で１６時間インキュベートすることによって調製した。ＥＬＩＳＡは、この複合体（ａｐｏＢ相当で２．５μｇ／ｍｌ）を用いて、非存在下（白丸印）、ヘパリン（１００単位／ｍｌ）の存在下（黒四角印）又はＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下（黒菱形印）で行った。データは、３つのサンプルの平均値＋／−ＳＤで示した。
図３は、Ｃｕ２＋で酸化したｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの複合体形成の経時変化を示す図である。
（Ａ）：ＬＤＬ（図中に示した時間、５μＭ  ＣｕＳＯ４で処理したもの）中のＴＢＡＲＳを測定した。
（Ｂ）：Ｃｕ２＋−ｏｘＬＤＬ（ａｐｏＢ相当で２．５μｇ／ｍｌ）をβ２−ＧＰＩ（０μｇ／ｍｌ（白丸印）、２５μｇ／ｍｌ（黒丸印））とともにウエル中でインキュベーションすることによってβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を生成させ、ＥＬＩＳＡを行った。２５μｇ／ｍｌのβ２−ＧＰＩを共存させたＥＬＩＳＡは、ヘパリン（１００単位／ｍｌ；黒四角印）又はＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；黒菱形印）の存在下においても行った。
（Ｃ）：ｏｘＬＤＬ１２ｈ（１００μｇ／ｍｌ）をβ２−ＧＰＩ（１００μｇ／ｍｌ）とともに４℃（点線）又は３７℃（実線）条件下で図示した時間インキュベートすることにより生成したβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を、ＥＬＩＳＡで検出した。ＥＬＩＳＡは、ヘパリン及びＭｇＣｌ２の非存在下（白丸印）、又はヘパリン（１００単位／ｍｌ；黒四角印）若しくはＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；黒菱形印）の存在下においても行った。
（Ｄ）：β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）とβ２−ＧＰＩ（１００μｇ／ｍｌ）とを、３７℃におけるＣｕ２＋（５μＭ）酸化の過程で、同時にインキュベートすることによって形成され、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体（ａｐｏＢ相当で２．５μｇ／ｍｌ）はＥＬＩＳＡによって検出された。ＥＬＩＳＡは、ヘパリン（１００単位／ｍｌ；黒四角印）若しくはＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；黒菱形印）の存在下、又は非存在下（白丸印）でも行った。データは、３つのサンプルの平均値＋／−ＳＤで示した。
図４は、ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体の安定性と、種々のｐＨ条件におけるそのＮａＣＮＢＨ３−還元型を示す図である。
ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体（ａｐｏＢ相当で１００μｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中で、２００ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３を用い、ｐＨ７．４で１６時間処理することによって還元した。還元されていない、又は還元された複合体は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の非存在下又は存在下、図示したｐＨ条件下で、３７℃、１６時間インキュベートした。３００ｎｇ／ｍｌのＬＤＬ（ａｐｏＢ相当）を含有するこの調製物中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体をＥＬＩＳＡによって測定した。データは、３つのサンプルの平均値＋／−ＳＤで示した。
図５は、患者の血清中に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を示す図である。
（Ａ）：ネイティブなＬＤＬ（ｎＬＤＬ）−β２−ＧＰＩ１６ｈ（ネイティブなＬＤＬとβ２−ＧＰＩを３７℃で１６時間インキュベートした反応混合物；ネガティブコントロール）（ａｐｏＢ相当で３００ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ（３００ｎｇ／ｍｌ）又は１００倍希釈したβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体陽性の血清を、ヘパリン（１００単位／ｍｌ）若しくはＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下、又は非存在下でインキュベートした。
（Ｂ）：β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体陽性の血清を、ＭｇＣｌ２〔１０ｍＭ〕存在下、ｐＨ１０、３７℃で１６時間プレインキュベートし、ＥＬＩＳＡを行った。データは、２つのサンプルの平均値で示した。
図６は、ＥＬＩＳＡで検出されたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の血清レベルを示す図である。
健常人、原発性のＡＰＳ（ＰＡＰＳ）、ＳＬＥを伴うＡＰＳ（第２期のＡＰＳ）又はＡＰＳを伴わないＳＬＥの患者から採取した血清を１００倍希釈し、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を検出した。カットオフ値（１Ｕ／ｍｌ）は、５０人の健常人の平均値の標準偏差の３倍となるように調整した。図中の数字は、各群における平均値を示す。
図７は、３つの異なるＥＬＩＳＡ系で検出されたβ２−ＧＰＩ関連ＩｇＧ抗体の抗体価の相互関係を示す図である。
（Ａ）：「β２−ＧＰＩ依存性ＩｇＧ  ａ  ＣＬ（抗β２−ＧＰＩ−ＣＬ  ＩｇＧ抗体）」と「抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体」との関係。
（Ｂ）：「抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体（β２−ＧＰＩでコートしたポリ酸素化プレートを用いたＥＬＩＳＡで検出）」と「抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体」との関係。
図８は、ＩｇＧ抗体価とＩｇＧ免疫複合体レベルとの相互関係を示す図である。
（Ａ）：「抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体」と「β２−ＧＰＩとのＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ）」との関係。
（Ｂ）：「抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体」と「ＬＤＬとのＩｇＧ免疫複合体」との関係。
（Ｃ）：「β２−ＧＰＩとのＩｇＧ免疫複合体」と「ＬＤＬとのＩｇＧ免疫複合体」との関係。
図９は、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す図である。（Ａ）β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体の血清レベルを示す図。（Ｂ）「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」と「抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体」との関係。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、本発明の実施の形態を説明する。
本発明スタンダード
＜１＞−１  本発明スタンダード１
本発明スタンダード１は、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体を成分とする、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダードである。
本発明スタンダード１を構成する「ｏｘＬＤＬ」は、ＬＤＬを酸化させることによって調製することができる。酸化の方法は特に限定されないが、Ｃｕ２＋とともにインキュベートする方法が例示され、かつ好ましい。例えば、ＬＤＬを５μＭ程度のＣｕＳＯ４とともに３７℃程度の温度でインキュベートすることによって、ＬＤＬを酸化させることができる。この場合、酸化反応を停止させるためにはＥＤＴＡ等のキレート剤を添加すればよい。この方法の具体例は、後述の実施例を参照されたい。
また、本発明スタンダード１を構成する「β２−ＧＰＩ」は、哺乳動物の血清等から取得することもでき、遺伝子工学的手法によって生産させることもできる。「β２−ＧＰＩ」の由来は特に限定されないが、測定に付される「検体」が採取された動物種と同一の動物種由来のものが好ましい。例えば、測定に付される検体がヒトの血清である場合には、ヒト由来のβ２−ＧＰＩを用いることが好ましい。
本発明スタンダード１は、このような「ｏｘＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とが共有結合した複合体を成分とするものである。両者を共有結合させる方法は特に限定されず、公知の手法から適宜選択することができる。
このような方法で「ｏｘＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とを共有結合させることにより、これら両者が難解離性の複合体を形成する。本発明スタンダード１は、このような「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」を、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダードとしたものである。
本明細書における「測定」との用語は、ある物質を定量的に測定することのみならず、定性的に検出すること（ある物質の存否を検出すること）をも含む概念である。
本明細書における「スタンダード」との用語は、ある物質の測定の際に用いる「標準物質」を意味する。すなわち、ある物質Ａについて定量的又は定性的な測定を行う際には、基準となる当該物質Ａ（標準物質）が必要になる。例えば、検体中の物質ＡをＯＤによって定量的に測定する場合には、所定の濃度に調製した物質Ａ（標準物質）についてＯＤを測定し、この標準物質のＯＤ値と、検体のＯＤ値を比較することによって検体中の物質Ａの濃度を求めることができる。また例えば、検体中における物質Ａの存否を判定する場合（物質Ａを定性的に測定する場合）には、物質Ａ（標準物質）の物理化学的性質や生物学的性質（例えば抗原性等）を基準とし、これと同一の性質を示す物質の存否を指標として、検体中における物質Ａの存否を判定（物質Ａを定性的に測定）することができる。このような測定において用いる「標準物質」は、本明細書における「スタンダード」の典型例である。
本発明スタンダード１は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」を成分とする限りにおいて、さらに他の成分を含んでいてもよい。ここにいう「他の成分」は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」自体の物理化学的性質や生物学的性質（例えば抗原性等）に影響を与えず、かつ、当該複合体のスタンダードとしての機能の発揮を阻害しないものである限りにおいて特に限定されない。ここにいう「他の成分」としては、通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等が例示される。
また、本発明スタンダード１の形態も、スタンダードとして使用する際に所望の形態となしうる限りにおいて特に限定されず、例えば溶液、凍結物、凍結乾燥物等の形態を採用しうる。これを、アンプル、バイアル、シリンジ、ボトル等の適当な容器に充填し、そのまま流通させあるいは保存して、測定の際にスタンダードとして用いることができる。
＜１＞−２  本発明スタンダード２
本発明スタンダード２は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」を成分とする、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダードである。
本発明スタンダード２における「ｏｘＬＤＬ」及び「β２−ＧＰＩ」についての説明は、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。
本発明スタンダード２は、このようなｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を成分とするものである。「得られうる」としたのは、本発明スタンダード２の成分であるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって実際に得られた物」に限られるわけではなく、これと異なる方法によって得られた複合体であっても良いという趣旨である。したがって、異なる方法で得られたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体が、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって実際に得られたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」と物質的に同一と評価される場合には、当該異なる方法で得られたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体も、本発明スタンダード２の成分として採用することができる。
また、本発明スタンダード２の成分である「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」は、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するものが好ましい。
（ａ）１００単位／ｍｌのヘパリンを共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
（ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２を共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
上記（ａ）及び（ｂ）の性質を有するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、少なくとも、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得ることができる。しかし前記した通り、本発明スタンダード２の成分として用いることができるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、この方法によって実際に得られた物に限定されるわけではなく、これと異なる方法によって得られた複合体であっても良い。
本発明スタンダード２は、このようなβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定するためのスタンダードとしたものである。
本発明スタンダード２は、このようなβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を成分とする限りにおいてさらに他の成分を含んでいてもよい点、「他の成分」として用いることができるものについての説明や例示等は、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。
また、本発明スタンダード２の形態等に関する説明等も、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。
本発明スタンダードを用いた測定に付される検体は、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定が必要とされているものであれば特に限定されない。また検体は、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体について精製されていなくてもよい。検体としては生体由来のものが好ましく、生体由来の検体として具体的には、血液（本明細書では、血清及び血漿を含む概念として用いる）等が例示される。血液をそのまま用いてもよく、これを希釈したものや、サンプル中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体に影響を与えない限りにおいてこれを加工したものであってもよい。
＜２＞本発明測定方法１
本発明測定方法１は、本発明スタンダードを用いることを特徴とする、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定方法である。
ここにいう「本発明スタンダード」は、本発明スタンダード１であっても２であってもよい。これらの説明は前記の通りである。
本発明測定方法１は、本発明スタンダードを用いる限りにおいて、その具体的な方法は限定されない。具体的な方法の一例として、例えば抗体を用いた免疫学的な測定手法（ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法、競合法、阻害法等）、イムノブロッティング、凝集法等）が例示される。
生体内に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体におけるｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの結合の大部分は共有結合、又は少なくとも静電的な結合力を上回る強い結合を形成していること、及び静電的な結合をしているものも多少量存在していることが本発明者によって見出されている。そして共有結合している複合体と、静電的な結合をしている複合体とでは、物理化学的性質や生物学的性質（例えば抗原性等）が若干異なることが、本発明者により確認されている。
したがって、検体中に存在する「静電的な結合により形成されているβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」におけるｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、予め全て共有結合させておけば、検体中に存在する全ての複合体（共有結合したもの、及び静電的な結合をしたもの）を、より正確に測定することができる点で好ましい。すなわち本発明測定方法１は、検体中の「ｏｘＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とを共有結合させるステップを少なくとも含むことが好ましい。共有結合させる方法についての説明は、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。
また、前記の「本発明スタンダード２」で説明した通り、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとをｐＨ７．４のようなｐＨ３〜９の条件下でインキュベートすることによって、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの間に、下記（ａ）及び（ｂ）の性質を有する結合を形成させることができる。
（ａ）１００単位／ｍｌのヘパリンを共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
（ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２を共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
したがって、検体中に存在する「静電的な結合により形成されているβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」を、予め全て上記（ａ）及び（ｂ）の性質を有する結合にさせておけば、検体中に存在する全ての複合体（上記（ａ）及び（ｂ）の性質を有する結合をしたもの、及び静電的な結合をしたもの）を、より正確に測定することができる点で好ましい。すなわち本発明測定方法１は、検体中の「ｏｘＬＤＬ」と「β２−ＧＰＩ」とを、予めｐＨ３〜９の条件下でインキュベートするステップを少なくとも含むことが好ましい。具体的には、ｐＨ７．４程度を例示することができる。
なお、上記（ａ）及び（ｂ）の性質を有する結合は、Ｓｃｈｉｆｆ（シッフ）塩基の形成によるものと考えられ、この反応は酸触媒で進行する。従って、インキュベート時のｐＨは中性〜酸性であることが好ましい。ただし、強酸性条件下ではタンパク質の変性が起こることから好ましくない。
インキュベート時の温度は、ｏｘＬＤＬやβ２−ＧＰＩの機能を喪失しない程度である限りにおいて特に限定されないが、例えば３７℃程度が例示される。また、インキュベートの時間も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。一般にインキュベート時間が長いほど、前記の結合をより完全に形成させることができる。
また、検体中に存在する「静電的な結合により形成されているβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」におけるｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、予め全て解離させておけば、検体中に存在する、共有結合又は前記（ａ）及び（ｂ）の性質を有する結合をした複合体のみを、より正確に測定することができる点で好ましい。すなわち本発明測定方法１は、検体中の「『ｏｘＬＤＬ』と『タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、アミノ糖又はアミノ脂質』とが静電的に結合した複合体」を解離させるステップを少なくとも含むことが好ましい。解離させる方法・条件等については、静電的に結合した複合体のみを解離し、共有結合又は前記（ａ）及び（ｂ）の性質を有する結合をした複合体を解離しないものである限りにおいて特に限定されないが、ヘパリンや、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２等の塩の存在下で複合体をインキュベートする方法が例示される。これらの物質の濃度、インキュベート時の温度、インキュベートの時間等は、静電的に結合した複合体のみを解離し、共有結合又は前記（ａ）及び（ｂ）の性質を有する結合をした複合体を解離しない範囲において、当業者が適宜設定することができる。例えば、インキュベートの温度としては３７℃程度が例示される。またインキュベートの時間は、一般に長いほど前記の複合体の成分をより完全に解離することができる。
なお、「検体」の意義については、「本発明スタンダード」における説明と同様である。
＜３＞本発明検出方法１
本発明検出方法１は、本発明測定方法１を用いて検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定し、測定された「検体中の当該複合体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法である。
本発明検出方法１においては、まず本発明測定方法１によって検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を測定する。本発明測定方法１についての説明は前記の通りである。ここで用いる「検体」は、疾患の検出対象となる動物の生体由来のものである限りにおいて特に限定されず、具体的には、血液等が例示される。「検体」に関するその他の説明は、前記の「本発明スタンダード」における説明と同様である。
本発明検出方法１においては、次いで、本発明測定方法１を用いて測定された「検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」と疾患とを関連づけることにより疾患を検出する。
前記の通り、本明細書における「測定」との用語は、定量的な測定のみならず、定性的な検出（存否の検出）をも含む概念である。したがって、ここにいう「測定された『検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体』」は、検体中の当該複合体の「量」（定量的な測定結果）であっても「存否」（定性的な測定結果）であってもよい。また「量」については、濃度既知の本発明スタンダードを用いて作成した検量線や関係式等から求めた量（実測値）であっても良く、健常動物（疾患に罹患していない動物）に対する比（相対値）であっても良い。
そして、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の量はある種の疾患によって増加することから、検体中の当該複合体量が健常人のそれに比して多い場合には、「疾患に罹患している」もしくは「疾患に罹患している可能性が高い」と関連づけることができる。検体中の当該複合体量が健常人のそれと同等であれば、「疾患に罹患していない」もしくは「疾患に罹患している可能性は低い」と関連づけることができる。
また本発明検出方法１は、疾患への罹患の有無のみでなく、罹患の程度の検出も含まれる。例えば、ある個人の検体中の当該複合体量を定期的に測定し、当該複合体量が増加傾向にある場合には「疾患が進行している」もしくは「疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、測定された当該複合体量が減少傾向にある場合には、「疾患が改善方向にある」もしくは「疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また測定された当該複合体量に変化がない場合には、「疾患の程度（または健常性）に変化がない」もしくは「疾患の程度（または健常性）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。
本発明検出方法１によって検出される「疾患」は、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい。
＜４＞本発明キット１
本発明キット１は、本発明スタンダードを構成成分として含むことを特徴する、検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定キットである。ここにいう「本発明スタンダード」は、本発明スタンダード１であっても２であってもよい。これらの説明は前記の通りである。
また本発明キット１は、本発明スタンダードを構成成分として含んでいる限りにおいて、さらに他の構成成分を含んでいてもよい。なかでも「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」をさらに構成成分として含むものが好ましい。
「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」も特に限定されないが、例えば抗β２−ＧＰＩ自己抗体であるＷＢ−ＣＡＬ−１（ＩｇＧ２ａ，κ）や、マウスモノクローナル抗ヒトａｐｏＢ１００抗体である１Ｄ２（ＩｇＧ）等が例示される。
「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」は、標識物質で標識されていることが、検出が容易となることから好ましい。
また、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」自体が標識されていなくても、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」に結合する物質が標識されていてもよい。
このような標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）、化学発光物質（ルミノールなど）、ビオチン、アビジン（ストレプトアビジンを含む）等が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等〔「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、１９８７年発行参照〕等から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐ５７−６３，ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯＭＰＡＮＹ，１９９４年発行参照）、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭６３−１７８４３号公報記載の方法等から適宜選択できる。
また標識物質の検出は、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを使用した場合には、当該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン、Ｏ−フェニレンジアミン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定することにより検出を行うことができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
本発明キット１に加えうる他の構成成分としては、標識物質の検出試薬、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を標識する試薬等を例示することができる。これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等を含んでいてもよい。
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明測定方法１に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
本発明キット１を用いたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の測定は、本発明測定方法１に従って行うことができる。
また本発明キット１は、疾患の検出に用いられるものが好ましい。本発明キット１を用いて検出される「疾患」は、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい。本発明キット１を用いた疾患の検出は、本発明検出方法１に従って行うことができる。
ここで用いる「検体」は、疾患の検出対象となる動物の生体由来のものである限りにおいて特に限定されず、具体的には、血液等が例示される。「検体」に関するその他の説明は、前記の「本発明スタンダード」における説明と同様である。
＜５＞本発明抗原
＜５＞−１  本発明抗原１
本発明抗原１は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」を成分とする、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定するための抗原である。
本発明抗原１の成分である「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが共有結合した複合体」についての説明は、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。また、本発明抗原１はこのようなβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を成分とする限りにおいてさらに他の成分を含んでいてもよい点、「他の成分」として用いることができるものについての説明や例示等も、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。
また、本発明抗原１の形態等に関する説明等も、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。また「検体」の意義についても、「本発明スタンダード」における説明と同様である。
＜５＞−２  本発明抗原２
本発明抗原２は、「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」を成分とする、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定するための抗原である。
本発明抗原２の成分である「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」についての説明は、前記の「本発明スタンダード２」における説明と同様である。したがって、本発明抗原２における「ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを、３７℃、ｐＨ７．４の条件下で１６時間インキュベートすることによって得られうるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体」は、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するものが好ましい。
（ａ）１００単位／ｍｌのヘパリンを共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
（ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ２を共存させても、複合体を構成するｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとが実質的に解離しない。
上記（ａ）及び（ｂ）の性質を有するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の製造方法についても、前記の「本発明スタンダード２」における説明と同様である。
また、本発明抗原２はこのようなβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を成分とする限りにおいてさらに他の成分を含んでいてもよい点、「他の成分」として用いることができるものについての説明や例示等は、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。
また、本発明抗原２の形態等に関する説明等も、前記の「本発明スタンダード１」における説明と同様である。また「検体」の意義についても、「本発明スタンダード」における説明と同様である。
本発明抗原を用いた測定の対象となる「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」は特に限定されないが、自己抗体や、本発明キット１で説明した抗体等が例示される。
本発明抗原は、いずれも「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」と結合することから、この特性を利用して「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定に用いることができる。
＜６＞本発明測定方法２
本発明測定方法２は、本発明抗原を用いることを特徴とする、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定方法である。
ここにいう「本発明抗原」は、本発明抗原１であっても２であってもよい。これらの説明は前記の通りである。
本発明測定方法２は、本発明抗原を用いる限りにおいて、その具体的な方法は限定されない。具体的な方法の例については、前記の「本発明測定方法１」における例と同様である。ただし本発明測定方法２においては、本発明抗原を固相に固着させて用いることが好ましい。すなわち本発明測定方法２は、後述の「本発明固相」を用いた方法であることが好ましい。
「検体」の意義についは、「本発明スタンダード」における説明と同様である。また「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」については、前記の「本発明抗原」における説明と同様である。
＜７＞本発明検出方法２
本発明検出方法２は、本発明測定方法２を用いて検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定し、測定された「検体中の当該抗体」と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の検出方法である。
本発明検出方法２においては、まず本発明測定方法２によって検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を測定する。本発明測定方法２についての説明は前記の通りである。ここで用いる「検体」は、疾患の検出対象となる動物の生体由来のものである限りにおいて特に限定されず、具体的には、血液等が例示される。「検体」に関するその他の説明は、前記の「本発明スタンダード」における説明と同様である。
本発明検出方法２においては、次いで、本発明測定方法２を用いて測定された「検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」と疾患とを関連づけることにより疾患を検出する。
ここにいう「測定された『検体中のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体』」とは、前記の「本発明検出方法１」における説明と同様に、検体中の当該抗体の「量」（定量的な測定結果）であっても「存否」（定性的な測定結果）であってもよい。
また「量」が、実測値であっても相対値であっても良い点についても、前記の「本発明検出方法１」における説明と同様である。
「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の量はある種の疾患によって増加することから、検体中の当該抗体量が健常人のそれに比して多い場合には、「疾患に罹患している」もしくは「疾患に罹患している可能性が高い」と関連づけることができる。検体中の当該抗体量が健常人のそれと同等であれば、「疾患に罹患していない」もしくは「疾患に罹患している可能性は低い」と関連づけることができる。
本発明検出方法２が、疾患への罹患の有無のみでなく、罹患の程度の検出も含まれる点、及び、本発明検出方法２によって検出される「疾患」が、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい点についても、本発明検出方法１と同様である。
＜８＞本発明固相
本発明固相は、本発明抗原が固着された固相である。
ここにいう「本発明抗原」は、本発明抗原１であっても２であってもよい。これらの説明は前記の通りである。
本発明抗原を固着するために用いる固相は、本発明抗原を固着させることができ、かつ、水、検体または測定反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。
これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
これらの固相に本発明抗原を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法等、タンパク質や脂質の一般的な固着方法を利用することができる。
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
物理的吸着法として具体的には、例えば本発明抗原を緩衝液等に溶解し、この溶液を固相（例えばマイクロプレート）に接触させることによって、本発明抗原を固相に吸着させる方法を挙げることができる。
また、本発明抗原を固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」や他の分子種が固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して本発明抗原が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
ブロッキングの方法として具体的には、例えばブロッキング物質（血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等）を添加して、３７℃程度で３０分〜２時間保存するか、常温（１５〜２５℃）で１〜２時間保存する方法を挙げることができる。
＜９＞本発明キット２
本発明キット２は、本発明固相を構成成分として含むことを特徴する、検体中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定キットである。
また本発明キット２は、本発明固相を構成成分として含んでいる限りにおいて、さらに他の構成成分を含んでいてもよい。なかでも「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」に結合する物質をさらに構成成分として含むものが好ましい。
「『β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体』に結合する物質」は、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」に結合するものである限りにおいて特に限定されないが、「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」（免疫グロブリン）が由来する動物又はクラス等に応じた、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」がマウス由来のＩｇＧ１である場合には、「『β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体』に結合する物質」として抗マウスＩｇＧ１抗体を用いることができる。
このような「『β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体』に結合する物質」は、標識物質で標識されていることが、検出が容易となることから好ましい。
また、「『β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体』に結合する物質」自体が標識されていなくても、「『β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体』に結合する物質」に結合する物質が標識されていてもよい。
このような標識に使用される標識物質の説明、及び標識物質の検出についての説明は、前記の「本発明キット１」における説明と同様である。
本発明キット２に加えうる他の構成成分としては、標識物質の検出試薬、「『β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体』に結合する物質」を標識する試薬等を例示することができる。これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等を含んでいてもよい。
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明測定方法２に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
また本発明キット２を用いた「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の測定は、本発明測定方法２に従って行うことができる。
また本発明キット２は、疾患の検出に用いられるものが好ましい。本発明キット２を用いて検出される「疾患」が、ＡＰＳ、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣流産、腎疾患、動脈硬化（脳梗塞、心筋梗塞など）及び糖尿病からなる群から選ばれるものが好ましい点については、前記の「本発明キット１」と同様である。
また本発明キット２を用いた疾患の検出は、本発明検出方法２に従って行うことができる。
ここで用いる「検体」は、疾患の検出対象となる動物の生体由来のものである限りにおいて特に限定されず、具体的には、血液等が例示される。「検体」に関するその他の説明は、前記の「本発明スタンダード」における説明と同様である。
＜１０＞本発明測定方法３
本発明測定方法３は、「β２−ＧＰＩを認識する抗体」及び／又は「ＬＤＬを認識する抗体」、並びに抗ＩｇＧ抗体を用いることを特徴とする、検体中の免疫複合体の測定方法である。
本発明測定方法３により、β２−ＧＰＩ又はＬＤＬと共に形成されたＩｇＧ免疫複合体を検出することができる。
「β２−ＧＰＩを認識する抗体」は特に限定されないが、Ｃｏｆ−２３が好ましい。また「ＬＤＬを認識する抗体」も特に限定されないが、抗ａｐｏＢ１００抗体（１Ｄ２）が好ましい。また「抗ＩｇＧ抗体」も特に限定されず、免疫複合体を構成するＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）が由来する動物又はクラス等に応じた、そのＩｇＧに特異的に結合する抗体が例示される。例えば免疫複合体を構成するＩｇＧがヒト由来である場合には、抗ＩｇＧ抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。
これらの抗体は、固相に固着されたものが好ましい。ここで用いることができる固相は、前記の「本発明固相」と同様である。また「検体」の意義については、「本発明スタンダード」における説明と同様である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。なお、本実施例中の［］内の数字は、後述の引用文献の番号を示す。
まず、本実施例で用いた材料や方法等を説明する。
（１）モノクローナル抗体
Ｃｏｆ−２２（ＩｇＧ１，κ）及びＣｏｆ−２３（ＩｇＧ１，κ）：抗ヒトβ２−ＧＰＩ抗体である。ヒトβ２−ＧＰＩで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから確立された抗体である［文献２］。いずれも溶液中でモノメリックなβ２−ＧＰＩに結合する。
ＷＢ−ＣＡＬ−１（ＩｇＧ２ａ，κ）：抗β２−ＧＰＩ自己抗体である。ＷＢ  Ｆ１マウス由来の抗体である［文献８］。
ＥＹ２Ｃ９（ＩｇＭ）：抗β２−ＧＰＩ自己抗体である。ＡＰＳ患者の末梢血リンパ球から確立された抗体である［文献９］。
ＷＢ−ＣＡＬ−１及びＥＹ２Ｃ９は、いずれも「陰性に荷電したＰＬｓと複合体を形成したβ２−ＧＰＩ」又は「ｏｘＬＤＬと複合体を形成したβ２−ＧＰＩ」にのみ結合し、溶液中でモノメリックなβ２−ＧＰＩには結合しない。
１Ｄ２（ＩｇＧ）：マウスモノクローナル抗ヒトａｐｏＢ１００抗体である。ｏｘＬＤＬとネイティブなＬＤＬのいずれにも結合する。ヤマサ醤油株式会社より入手した。
（２）ヒトβ２−ＧＰＩの調製
β２−ＧＰＩは、健常人の血漿から［文献１０］に記載の方法に準じて精製した。プールした健常人の血漿は、ヘパリン−セファロースカラム、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、及び抗β２−ＧＰＩアフィニティーカラムを用いて精製した。種々のＩｇＧによるコンタミネーションを除去するために、β２−ＧＰＩリッチな画分をさらにプロテインＡ−セファロースカラムに通した。最終的なβ２−ＧＰＩ画分は、ｎ−ブタノールで十分に洗浄することによって脱脂した。
（３）ＬＤＬの単離及び酸化
ＬＤＬ（ｄ＝１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍｌ）は、［文献１１］に記載の方法に従って、新鮮な健常人血漿を超遠心することによって単離した。単離したＬＤＬを１００μｇ／ｍｌに調整し、５μＭ  ＣｕＳＯ４（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｈｅｐｅｓ緩衝液））とともに３７℃で種々の時間インキュベートすることによって酸化した。ＥＤＴＡ（終濃度１ｍＭ）を添加することによって酸化を停止させ、このＬＤＬを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＨｅｐｅｓ緩衝液に対して透析した。酸化の程度はチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）値［文献１２］によって評価した。
（４）９−カルボキシノナノエートのオキシステロール誘導体の合成
７−ケトコレステリル−９−カルボキシノナノエート（ｏｘＬｉｇ−１）は、［文献７］に記載の方法によって合成した。２２−ケトコレステリル−９−カルボキシノナノエート（９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣ）も同様に合成した。すなわち、２２−ケトコレステロール（２２−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）とアゼライン酸（ａｚｅｌａｉｃ  ａｃｉｄ；１４．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（１ｍｌ）に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；１９．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ；６．１ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温で２日間攪拌し、濃縮して、クロロホルムで抽出した。抽出物を２Ｍ塩酸で連続的に洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させた。残存物を、トルエン／酢酸エチル（３／１、ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライし９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣを得た（８．５ｍｇ、収率６１％）。１Ｈ  ＮＭＲで解析した結果は次の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ５．１Ｈｚ，Ｈ−６），４．５９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）
ｏｘＬｉｇ−１と同様に、９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｈ−３のシグナルがδ＝４．５９ｐｐｍの位置に多重として検出された。この結果は、この位置のヒドロキシル基がエステル化されていることを示唆している。スペクトルが、より低い磁気領域（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ）におけるＨ−６のオレフィンのプロトンのシグナルをも示すにもかかわらず、スピン−スピン・カップリングは隣接するメチレン基の間に観察された。９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣの分子量は、ｏｘＬｉｇ−１と同一であった。９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣはリーベルマン−ブルヒアルト反応；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ｂｕｒｃｈａｒｄ反応）に陽性であり、７位の結合ケトンが存在しないことが示された。
（５）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上でのリガンドブロット分析
ＴＬＣリガンドブロットを行うために、脂質をポリグラム・シリカゲルＧ  プレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  Ｇ  ｐｌａｔｅ；Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ社製）にスポットし、クロロホルム／メタノール（８／１，ｖ／ｖ）で展開した。リガンドブロット分析は、［文献７］に記載の方法によって行った。すなわち、プレートを乾燥させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳでブロッキングした後、そのプレートをβ２−ＧＰＩ及び抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２２及びＥＹ２Ｃ９）とともに１時間インキュベートした。次いで、そのプレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体で１時間インキュベートした。それぞれのステップの間で、プレートをＰＢＳで十分に洗浄した。発色はＨ２Ｏ２と４−メトキシ−１−ナフトール（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−１−ｎａｐｈｔｏｌ）を用いて行った。コントロールのＴＬＣプレートにおいては、分離したリガンドをＩ２の噴霧（Ｉ２ｖａｐｏｒ）で染色した。
（６）β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を検出するためのＥＬＩＳＡ
抗β２−ＧＰＩ抗体（ＷＢ−ＣＡＬ−１）は、その８μｇ／ｍｌ溶液（Ｈｅｐｅｓ緩衝液に溶解したもの；５０μｌ／ウエル）をマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に入れて４℃で一晩インキュベートすることによって吸着させた。このプレートを１％スキムミルクで１時間ブロッキングした。血清サンプル（１００倍希釈したもの）またはβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体若しくはｏｘＬＤＬを含有する溶液をウエルに添加し（１００μｌ／ウエル）、２時間インキュベートした。いくつかの実験については、このステップにおいて外来性のβ２−ＧＰＩを存在させた（２５μｇ／ｍｌ）。次いで、ウエルをビオチン標識した抗ａｐｏＢ１００抗体（１Ｄ２）と共に１時間インキュベートし、ＨＲＰ標識したアビジンで３０分間インキュベートした。発色は、ｏ−フェニレンジアミンおよびＨ２Ｏ２を用いて行った。発色反応を２Ｎの硫酸を添加することによって停止させ、４９０ｎｍのＯＤを測定した。これらのステップの間で、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＨｅｐｅｓ緩衝液で十分に洗浄した。個々のアッセイにおけるサンプルの吸光度（ＯＤ）をブランクのウエルにおける平均ＯＤで補正した。１．０ユニット／ｍｌを、５０人の健常人の血清サンプルの平均値の標準偏差の３倍となるように調整した結果、１．０ユニット／ｍｌのｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体は、ａｐｏＢで約４．５μｇ／ｍｌに相当した。反応性が１．０ユニット／ｍｌを上回ったサンプルを陽性とした。
（７）抗β２−ＧＰＩ−脂質ＩｇＧ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ
ＣＬ（ウシ心臓由来；シグマ社製）、ｏｘＬｉｇ−１又は９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣ（５０μｇ／ｍｌエタノール、５０μｌ／ウエル）をエバポレーションによってポリスチレンプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ；Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に吸着させ、このプレートを１％ＢＳＡでブロックした。ウエル中で、精製したモノクローナル自己抗体又は血清サンプル（１００倍希釈したもの）をβ２−ＧＰＩ（２５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で１時間インキュベートし、次いでＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ又は抗ヒトＩｇＧ若しくはＩｇＭを添加した。
その後のステップは「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を検出するためのＥＬＩＳＡ」に記載された方法で行った。個々のサンプルの吸光度（ＯＤ）をブランクのウエルにおける平均ＯＤで補正し、その抗体価を体内の陽性スタンダードで算出した。サンプル中の抗体価が、５０人の健常人の血漿サンプル中の平均値の標準偏差の３倍を上回る場合に陽性とした。
（８）抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ
抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡは、［文献１］に記載の方法によって行った。すなわち、β２−ＧＰＩをポリ酸素化したポリスチレンプレート（カルボキシル化、Ｓｕｍｉｌｏｎ  Ｃ、住友ベークライト社（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．））に１０μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウエル）入れて、４℃で一晩インキュベートすることによって吸着させ、このプレートを３％ゼラチンを用いてブロッキングした。血清サンプルを１００倍希釈し、ウエル中で１時間インキュベートした。次いでＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧをプレートに添加した。その後のステップは「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を検出するためのＥＬＩＳＡ」に記載された方法で行った。
（９）ＩｇＧ免疫複合体を検出するためのＥＬＩＳＡ
β２−ＧＰＩ又はＬＤＬと共に形成されたＩｇＧ免疫複合体を検出するために、抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２３）又は抗ａｐｏＢ１００抗体（１Ｄ２）を、ポリスチレンプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ）にそれぞれ５μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウエル）入れ、４℃で一晩インキュベートすることによって吸着させた。次いでプレートを１％ＢＳＡでブロックした。血清サンプル（１００倍希釈したもの）をウエル中で１時間インキュベートし、次いでＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧを添加した。その後のステップは「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を検出するためのＥＬＩＳＡ」に記載された方法で行った。
（１０）「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を検出するためのＥＬＩＳＡ
ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体（１０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ウエル）をポリスチレンプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  １Ｂ）のウエル中で４℃、一晩インキュベートした後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングした。次いで０．３％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１００倍希釈した血清サンプルをウエルに入れ、１時間反応させた後、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧで１時間反応させた。常法の通り、ｏ−フェニレンジアミンおよびＨ２Ｏ２を加えて発色させ、硫酸で反応を停止した後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
（１１）統計解析
統計解析は、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウエア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社）を用いて行った。自己抗体と臨床履歴を比較する場合には、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ検定を用いた。信頼率９５％の信頼区間（Ｃ．Ｉ．）は、Ｗｏｏｌｆの方法によって算出した。
（１２）血清サンプル
本実施例で用いた血清サンプルが由来する患者の構成を表１に示す。
2004023141.tif 000003
結果
（１）β２−ＧＰＩ結合リガンドとしての７−ケトンの役割
ケトンの位置が異なる２つのω−カルボキシルオキシステロールエステルの変異体（７−ケトコレステリル−９−カルボキシノナノエート（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−９−ｃａｒｂｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ；ｏｘＬｉｇ−１）及び２２−ケトコレステリル−９−カルボキシノナノエート（２２−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−９−ｃａｒｂｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ；９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣ）のβ２−ＧＰＩに対する結合を比較するため、抗β２−ＧＰＩ抗体をプローブとして用いたリガンドブロット及びＥＬＩＳＡを行った。Ｃｏｆ−２２抗体及びＥＹ２Ｃ９抗体を用いて検出したリガンドブロットにおいては、β２−ＧＰＩは７−ケト変異体（ｏｘＬｉｇ−１）に優先的に結合し、９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣには結合しなかった（図１）。リガンドをコートしたプレートを用いたＥＬＩＳＡにおいて、抗β２−ＧＰＩ抗体（Ｃｏｆ−２２、ＷＢ−ＣＡＬ−１又はＥＹ２Ｃ９）を用いて検出した結果、β２−ＧＰＩは、固相化された９−ＣＯＯＨ−２２ＫＣよりも、固相化されたｏｘＬｉｇ−１により強く結合した（表２）。これらのデータは、コレステロール骨格の７位のケトンが、β２−ＧＰＩとそのリガンドである「Ｃｕ２＋−ｏｘＬＤＬに由来するｏｘＬｉｇ−１」との間の高親和性の相互作用に必須の決定基であることを示している。
2004023141.tif 000004
（２）β２−ＧＰＩと「Ｃｕ２＋を介する酸化を受けたＬＤＬ」との相互作用
ＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）を、５μＭのＣｕＳＯ４とともに３７℃で１２時間インキュベートすることによって酸化し（これによって得られたｏｘＬＤＬを「ｏｘＬＤＬ１２ｈ」という）、ＥＤＴＡを添加することによって酸化を停止させた。β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を検出するＥＬＩＳＡによって調べた結果、ウエル中でｏｘＬＤＬ１２ｈを外来性のβ２−ＧＰＩとインキュベートした場合に限ってＯＤが増加した。複合体の形成は、β２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬの両方の濃度に依存した（図２Ａ、Ｂ）。有意な複合体形成は、ｏｘＬＤＬ１２ｈを用いた場合にのみ起こり、ネイティブなＬＤＬでは起こらなかった。ＰＨ７．４における複合体形成は、ヘパリン又はＭｇＣｌ２の存在下でほぼ完全にうち消された（図２Ｃ）。この阻害は、ＣａＣｌ２の存在下においても同様に観察された（データは示さない）。これらのデータから、β２−ＧＰＩは、ｏｘＬＤＬ１２ｈと、まず解離可能な非共有的な複合体を形成しうることが示された。これに対して、ｏｘＬＤＬ１２ｈをβ２−ＧＰＩとともにｐＨ７．４、３７℃で１６時間インキュベートすると、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの比較的安定な複合体が一致して観察された（ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ）。ヘパリン又はＭｇＣｌ２をｐＨ７．４の下で添加しても、ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈの複合体形成を崩壊させることはできなかった（図２Ｄ）。
このプロセスをさらに調べるために、種々の経時的な実験を行った。図３Ａは、ＣｕＳＯ４処理したＬＤＬにおける、ＴＢＡＲＳの時間に依存した生成を示す図である。３７℃でＣｕ２＋イオンに暴露したＬＤＬ調製物では速やかにＴＢＡＲＳが生成し、そのピークは４時間目で検出された。これに対し、β２−ＧＰＩとの結合を生じさせるＬＤＬの酸化は、少し遅延して進行し、約１２時間後に最高レベルに達した（図３Ｂ）。この複合体形成は、ヘパリン又はＭｇＣｌ２の添加によってほぼ完全に阻害された。これらのデータは、β２−ＧＰＩはＣｕ２＋−ｏｘＬＤＬに結合するが、「ＭＤＡで修飾されたＬＤＬ」には結合しないという従来の知見［文献６］とも一致する。
予め形成されたｏｘＬＤＬ１２ｈを、β２−ＧＰＩと共に４℃又は３７℃条件下で、種々の時間インキュベートした（それぞれの終濃度は１００μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ）（図３Ｃ）。β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の形成は、温度及び時間に依存的であった。この複合体は、ヘパリン又はＭｇＣｌ２を添加して、ｐＨ７．４の条件下でインキュベートしても解離しなかった。図３Ｄは、β２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬとの間の安定な相互作用が、たとえβ２−ＧＰＩの存在下であってもＣｕ２＋による酸化のプロセスの間に生成されることを示す図である。
（３）種々のｐＨにおける、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の安定性
安定な複合体が中性ｐＨにおいて出現し、これはおそらくβ２−ＧＰＩのリジン残基とε−アミンと、Ｃｕ２＋を介したｏｘＬＤＬ上で酸化的に生成したアルデヒドとの間に形成されたシッフ塩基付加物であると考えられる。これを確認するために、塩基性ｐＨ条件下で、非還元の、又はＮａＣＮＢＨ３還元した複合体の安定性を解析した。図４に示す通り、ＭｇＣｌ２の非存在下で、調べた範囲のｐＨ条件下においては、還元化したｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体の解離は観察されなかった。ＭｇＣｌ２の存在下では、ｐＨ１０において８２％の非還元の複合体が解離し、６９％の還元化した複合体が解離した。この現象は、その付加物がシッフ塩基ではないこと、又はシッフ塩基であったとしてもそれがＮａＣＮＢＨ３に接し得ない環境（例えば、疎水性ポケット）にあることを示している。
（４）患者の血清中に存在する、解離できないβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体
ＡＰＳ及び／又はＳＬＥ患者の血清サンプルを、高レベルのβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体が存在するか否かについてスクリーニングした。β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、まず２０個の血清サンプルから同定された。この群は、２．１〜１３．７ユニット／ｍｌ（平均濃度：４．４８ユニット／ｍｌ（カットオフ値：１．０ユニット／ｍｌ））という高濃度の血清複合体を示した。図５に示すように、ネイティブなＬＤＬは、β２−ＧＰＩとともに３７℃で１６時間インキュベートしても複合体を形成しなかった。これに対し、ｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体は、ｐＨ７．４の条件下で、ヘパリンやＭｇＣｌ２が存在しても安定である。ｐＨ７．４における５つの血清サンプルにおいて検出されたｏｘＬＤＬ−β２−ＧＰＩ複合体においても、典型的な結合パターンが見られた。２０の全てのサンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで形成された複合体は、中性ｐＨにおいて、ヘパリンやＭｇＣｌ２が存在していても安定であった（ヘパリン及びＭｇＣｌ２の存在下におけるＯＤは、コントロールの条件に対して、それぞれ１２１＋／−２５．１％及び１２８＋／−１３．６％であった）。血清サンプル中に存在する、前段階で形成した複合体は、ＭｇＣｌ２とともにｐＨ１０、３７℃で１６時間インキュベーション（この条件は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成した複合体を解離させることができる）した後にも一貫して見られた（１０４＋／−１０．９％）（図４）これらのことから、解離不能な、共有的な付加物が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてβ２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬとの間に形成されていると考えられる。また、今回の実験で見られたｉｎ  ｖｉｔｒｏ付加物は、解離不能な複合体形成の中間産物であると考えられる。
（５）β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体とその自己抗体の臨床的有意性
ＥＬＩＳＡにおいて、ａｐｏＢ相当で１０ｎｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌを範囲とするｏｘＬＤＬ１２ｈ−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体の見かけの検量線を作成した。このＥＬＩＳＡは、用いたＷＢ−ＣＡＬ−１抗体がｏｘＬＤＬと複合体を形成したβ２−ＧＰＩに高い特異性を有していることから、血清サンプル中に高濃度に存在する内在性の、かつ単量体のβ２−ＧＰＩによっては、影響を受けなかった。この実験では、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、原発性のＡＰＳ、ＳＬＥを伴うＡＰＳ（第２期のＡＰＳ）及びＡＰＳを伴わないＳＬＥにおいて、それぞれ５８．７％（２７／４６）、５４．１％（２０／３７）及び５６．８％（２５／４４）の患者で見られた（図６）。さらに、慢性腎炎（腎臓生検により診断された）では１８．６％（１６／８６）の患者においてこの複合体が陽性であった。
抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体は、原発性のＡＰＳ、ＳＬＥを伴うＡＰＳ（第２期のＡＰＳ）及びＡＰＳを伴わないＳＬＥにおいて、それぞれ７１．７％（３３／４６）、５９．５％（２２／３７）及び１１．４％（５／４４）の患者で見られた。
１２７人からなるこの群の患者における抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体の抗体価は、β２−ＧＰＩ依存性ＩｇＧ  ａ  ＣＬ及び抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体のいずれの抗体価とも強く相関していた（相関係数ｒ２は、それぞれ０．６９及び０．８１）（図７）。図８に示す通り、「抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体」と「β２−ＧＰＩを含有するＩｇＧ免疫複合体」との間（ｒ２＝０．５０）（図８Ａ）；「抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体」と「β２−ＧＰＩを含有するＩｇＧ免疫複合体」との間（ｒ２＝０．５０）（図８Ｂ）；及び「β２−ＧＰＩを含有するＩｇＧ免疫複合体」と「ＬＤＬを含有するＩｇＧ免疫複合体」との間（ｒ２＝０．４０）（図８Ｃ）において、良好な相関性が見られた。しかしながら、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体のレベルと、これらの抗体の抗体価との間に、良好な相関性は見られなかった（データは示していない）。
これらの患者（１２７人のＡＰＳ及び／又はＳＬＥ患者）における抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体は、血栓症（動脈及び／又は静脈血栓症、動脈血栓症、及び静脈血栓症）や習慣流産（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）の履歴と有意な関連性が見られたが、血小板減少（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｎｉｃａ）との間では見られなかった（表３）。動脈血栓症におけるアッセイのｐ値（期待値）、オッズ比、及び９５％ＣＩは、静脈血栓症、習慣流産及び血小板減少におけるものよりも良好であった。全ての患者を、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体陽性群と陰性群に分け、抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体を統計学的に解析した。その結果、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体陽性群においては、抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体と、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症及び習慣流産との間で、強い相関性が見られた。最も高い相関性は、動脈血栓症において見られた。
2004023141.tif 000005
（６）「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」の検出
血清中の「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」をＥＬＩＳＡにより検出した。また「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」と「抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体」との関係を調べた。結果を図９に示す。
考察
本発明者は、Ｃｕ２＋によって生成するｏｘＬＤＬへのβ２−ＧＰＩ結合に関与する主要な脂質リガンドが、７−ケトコレステリル−９−カルボキシノナノエート（ｏｘＬｉｇ−１）のようなω−カルボキシル化された７−ケトコレステロールエステルであることを報告し、ω−カルボキシル基がβ２−ＧＰＩの認識に必須であることを示した［文献７］。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのβ２−ＧＰＩとＣｕ２＋−ｏｘＬＤＬとの相互作用は、初期の段階ではＭｇ２＋処理によって可逆的であるが、次第に解離のためにＭｇ２＋と高いｐＨを必要とする、より安定な相互作用に発展する。これに対して、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの安定な、かつ解離できない複合体が、ＡＰＳ及び／又はＳＬＥ患者の血清サンプル中に見出された。さらに、これらの患者の血清から、ＬＤＬとβ２−ＧＰＩとを含有するＩｇＧ免疫複合体が検出され、また、血清のβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は動脈血栓症と関連することも示唆された。
泡沫細胞の形成は、初期のアテローム発生の特質とされており、ＬＤＬは泡沫細胞中に蓄積される脂質の主要なソースである。修飾されたＬＤＬの、マクロファージのスカベンジャー受容体への結合は、調節されないコレステロールの蓄積に至り、アテローム硬化型の傷害の発生を伴う泡沫細胞の形成に至る。最近、私はＣｕ２＋−ｏｘＬＤＬへのβ２−ＧＰＩ結合、及びマクロファージによる抗β２−ＧＰＩ抗体を介するファゴサイトーシスを与える２つの主要なリガンドの構造を、７−ケトコレステリル−９−カルボキシノナノエート（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−９−ｃａｒｂｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ；ｏｘＬｉｇ−１）及び７−ケトコレステリル−１２−カルボキシ（ケト）ドデカノエート（７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−１２−ｃａｒｂｏｘｙ（ｋｅｔｏ）ｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ；ｏｘＬｉｇ−２）と同定した［文献７］。
この研究では、リガンドのコレステロール骨格の７位に存在する結合ケトンがβ２−ＧＰＩへの高親和性結合に必須であり、２２位に存在するケトンでは代替することができないことが示された（図１及び表２）
β２−ＧＰＩのドメインＶ中の、正に荷電した１４個のアミノ酸残基からなるパッチ及び可動性のループは、ＣＬ、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、及びホスファチジルグリセロールのような両親媒性化合物と相互作用するために重要であることが報告されている［文献３−５］。β２−ＧＰＩのこの結合領域が、ｏｘＬＤＬとの相互作用にも関係していることも報告されている［文献１３］。リガンドの結合ケトンは、ω−カルボキシル基とともに親水性のスペースに配向し、β２−ＧＰＩに特異的に結合するものと考えられる。一般に、結合ケトンはω−アルデヒドに比してシッフ塩基付加化合物の形成活性は低い。ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの相互作用はＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及びヘパリンのいずれによっても阻害されることから、β２−ＧＰＩリガンドは、中性ｐＨ条件下において、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの間の非共有結合性の静電的な相互作用に関与していると考えられる。
今日、ＡＰＳ患者の血清中に見出される抗β２−ＧＰＩ抗体が、ＰＬをコートしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡにおいて、β２−ＧＰＩと、ＣＬ、ホスファチジルセリン及びホスファチジン酸のような負に荷電したＰＬｓとの複合体に結合することがよく知られている［文献１０］。また最近、ＡＰＳ患者に存在するａＣＬが、酸化されたＣＬとβ２−ＧＰＩとの間に形成されたシッフ塩基付加化合物と反応することが示されている。しかしながら、このような負に荷電したＰＬｓは、ＬＤＬの非常にマイナーな構成成分である。ＬＤＬ中のＣｕ２＋を介した酸化産物には、９−／又は１３−ヒドロペルオキシ（又はヒドロキシ）−オクタデカジエノエート（ｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏａｔｅ）、９−オキソノナノエート（９−ｏｘｏｎｏｎａｎｏａｔｅ）、又は９−カルボキシノナノエート（９−ｃａｒｂｏｘｙｎｏｎａｎｏａｔｅ）でエステル化されたコレステロール／又はオキシステロールが含まれ、これらのいくつかは動脈硬化性のプラークにも存在している［文献１４−１６］。既に報告されている通り［文献７］、酸化されたＰＬｓではなくｏｘＬｉｇ−１及びｏｘＬｉｇ−２のようなω−カルボキシル−オキシステリルエステル（ω−ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｏｘｙｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ）が、Ｃｕ２＋−ｏｘＬＤＬ中において主要なβ２−ＧＰＩリガンドとして検出された。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ付加化合物の性質は化学的に明らかにされていない。しかし、いくつかのコレステリルエステルの酸化修飾体とβ２−ＧＰＩとのコンジュゲートである可能性が高い。この研究では、過剰量のＮａＣＮＢＨ３（２００ｍＭ）によるｏｘＬＤＬ１２−β２−ＧＰＩ１６ｈ複合体の処理は、シッフ塩基付加物中のイミンの還元には有効ではなかった。この結果から、ｏｘＬＤＬとβ２−ＧＰＩとの、安定でかつ解離しない複合体はミカエル反応、又はポリ不飽和脂肪酸のアルコキシルラジカルによるリジン残基の直接的な酸化のような他のメカニズムによって生成する可能性を示している。
この研究では、ＡＰＳ及び／又はＳＬＥの患者（５４．１〜５８．７％）において、ｏｘＬＤＬは、β２−ＧＰＩとの安定な、かつ解離しない複合体として循環していることが示された。ｏｘＬＤＬは、スカベンジャー受容体を介してマクロファージに優先的に取り込まれ、泡沫細胞の形成とアテローム硬化型の傷害の発生に至ることが多く報告されている。しかしながら、動脈硬化症の患者の血流中を循環するｏｘＬＤＬに関しては不完全な形成が存在する。この実験では患者の血清中の遊離型のｏｘＬＤＬを測定していないが、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成されたｏｘＬＤＬは内在性のβ２−ＧＰＩと複合体を形成していると考えられる（血漿中のβ２−ＧＰＩの濃度は約２００μｇ／ｍｌである）。図３Ｄに示した通り、ｉｎ  ｖｉｒｔｏで酸化を受けたＬＤＬは、β２−ＧＰＩの存在下、中性ｐＨ条件において、インキュベーション時間の増加に伴って安定な付加物を形成する。さらに、β２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬとの間の安定な相互作用が、緩衝液のみ、１％ＢＳＡを含有する緩衝液、５０％ヒト血清のような種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下において観察される（データは示さない）。こうして、ｏｘＬｉｇ−１及びｏｘＬｉｇ−２に関連するβ２−ＧＰＩリガンドは、過剰量の種々の血漿／血清タンパク質の存在下において、β２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬとの間で特異的な相互作用を引き起こし、安定な複合体を形成する。
ａＰＬの、動脈／静脈血栓症、習慣流産、及び血小板減少のような重大な臨床合併症との関連は、ＡＰＳの患者において確立されている。ａＣＬは、当初、ＣＬのような酸性ＰＬｓに結合すると考えられていたが、現在はβ２−ＧＰＩがａＣＬの真の抗原であると広く受け入れられている。１９９８年に、抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体がＳＬＥ患者の動脈血栓症の血清マーカーとなりうることが示され、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ  ＩｇＧ抗体は動脈血栓症とは関係しないことが示された。本研究では、抗β２−ＧＰＩ−ＣＬ  ＩｇＧ抗体、抗β２−ＧＰＩ  ＩｇＧ抗体、及び抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体の抗体価との間の良好な関連性が示された（図７）。抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体の出現は、静脈血栓症や習慣流産に比して、動脈血栓症の履歴と最も高い相関性を示した（表３）。これに対し、これらの抗体の有意な関連性は、血小板減少においては見られなかった。これらの知見は、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１（β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ）複合体は、ａＣＬの真のターゲット抗原であることを示唆している。抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１  ＩｇＧ抗体は、自己免疫疾患に基づくアテローム性血栓症／アテローム性動脈硬化症の誘発因子として有力な候補である。
しかしながら、調査したＡＰＳ／ＳＬＥ患者の全ては、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体陽性と陰性の２つの群に分けられ、陽性群においては、陰性群に比して抗β２−ＧＰＩ−ｏｘＬｉｇ−１抗体とこれらの臨床症状の発症との間により強い関連性が見られた。自己抗体陽性ＡＰＳ患者においては、β２−ＧＰＩとＬＤＬを伴うＩｇＧ免疫複合体も観察された。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬＤＬの酸化メカニズムは未解明であるが、その結果物であるβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、ＡＰＳにおいて、血栓症、特に動脈血栓症の発症を誘発する自己抗原として、病原性の役割を果たしていると考えられる。
Ｇｅｏｒｇｅらは、通常の飼料を与え、β２−ＧＰＩで免疫したＬＤＬ受容体欠損マウスは、アテローム性動脈硬化症が加速することを報告している［文献１７］。β２−ＧＰＩは、内皮下領域及びヒトのアテローム硬化型プラークのｉｎｔｉｍａｌ−ｍｅｄｉａｌｂｏｒｄｅｒに豊富に存在し、単球及びＣＤ４陽性のリンパ球と共存している［文献１８］。よって、ＡＰＳのアテローム発生におけるβ２−ＧＰＩとｏｘＬＤＬが関与する自己免疫メカニズムの情況証拠がさらに高まった。
これは、安定な、かつ、解離不能なβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体が患者の血清中に見出され、この複合体はＡＰＳの動脈血栓症についての定量可能な危険因子であろうということの最初の報告である。しかしながら、β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体は、ＡＰＳのみならず、抗体陰性かつ非血栓性のＳＬＥ及び慢性腎炎においても見られる。このことは、血清の複合体レベルのみではＡＰＳにおける臨床症状を予期できないことを示している。脂質及びリポタンパク質代謝の異常は、種々の腎臓疾患及び高脂血症に共通しており、腎疾患患者のアテローム硬化性心血管性障害の高率発生や高い死亡率に関与するＬＤＬのような血漿リポタンパク質を増加させると理解されている。これらの知見は、冠動脈疾患患者の血流中で循環するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体の臨床的意義についての重要な、かつ新たな問題を提起するものでもある。
本発明キットの作成
（１）下記の構成からなる本発明キット１を作成した。
ｏｘＬＤＬ１２ｈをβ２−ＧＰＩとともにｐＨ７．４、３７℃で１６時間インキュベートすることによって得られたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体（１ｍｇ）（スタンダード）
２．９６ウェルのイムノプレート  １枚
抗β２−ＧＰＩ抗体（ＷＢ−ＣＡＬ−１）  １本
３．ビオチン標識した抗ａｐｏＢ１００抗体（１Ｄ２）
４．ＨＲＰ標識したアビジン
５．ｏ−フェニレンジアミン溶液  １本
６．過酸化水素水  １本
７．反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）  １本
（２）下記の構成からなる本発明キット２を作成した。
１．ｏｘＬＤＬ１２ｈをβ２−ＧＰＩとともにｐＨ７．４、３７℃で１６時間インキュベートすることによって得られたβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体が固着された９６ウェルのイムノプレート１枚
２．ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体
３．ｏ−フェニレンジアミン溶液  １本
４．過酸化水素水  １本
引用文献
１．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９，ｐ４５７−４６２（１９９４）
２．Ｂｌｏｏｄ，８７，ｐ３２６２−３２７０（１９９６）
３．ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，ｐ５１６６−５１７４（１９９９）
４．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０４，ｐ９２７−９３９（２０００）
５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，ｐ８０９２−８１００（２０００）
６．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７，ｐ５６９−５７３（１９９７）
７．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４２，ｐ６９７−７０９（２００１）
８．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９，ｐ１０６３−１０６８（１９９２）
９．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，３７，ｐ１４５３−１４６１（１９９４）
１０．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，ｐ３８８５−３８９１（１９９２）
１１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４３，ｐ１３４５−１３５３（１９５５）
１２．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，ｐ３５１−３５８（１９７９）
１３．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，ｐ１１８３−１１９２（２０００）
１４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１３，ｐ７９−８９（１９９３）
１５．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，，３６，ｐ１８７６−１８８６（１９９５）
１６．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３８，ｐ１３４７−１３６０（１９９７）
１７．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８，ｐ１１０８−１１１５（１９９８）
１８．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９９，ｐ２２２７−２２３０（１９９９）
【産業上の利用の可能性】
本発明スタンダードを用いると、特に生体内に存在するβ２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を、より正確かつ厳密に測定することができ、さらにこれによって本発明測定方法１、本発明検出方法１、及び本発明キット１が提供されることから極めて有用である。
また本発明抗原を用いると、特に生体内に存在する「β２−ＧＰＩ−ｏｘＬＤＬ複合体を認識する抗体」を、より正確かつ厳密に測定することができ、さらにこれによって本発明測定方法２、本発明検出方法２、本発明固相、及び本発明キット２が提供されることから極めて有用である。また、本発明測定方法３によれば、β２−ＧＰＩ又はＬＤＬと共に形成されたＩｇＧ免疫複合体を、簡便かつ迅速に検出することができることから極めて有用である。
【図１】
2004023141.tif 000006
【図２】
2004023141.tif 000007
【図３】
2004023141.tif 000008
【図４】
2004023141.tif 000009
【図５】
2004023141.tif 000010
【図６】
2004023141.tif 000011
【図７】
2004023141.tif 000012
【図８】
2004023141.tif 000013
【図９】
2004023141.tif 000014
【国際調査報告】
2004023141.tif 000015
2004023141.tif 000016
2004023141.tif 000017
2004023141.tif 000018