(57)【要約】第１のプロモーター、リコンビナーゼ認識配列を両端に有する遺伝子、胚性幹細胞から分化する目的細胞の選択マーカー遺伝子の順に５’側から配置され、第１のプロモーターが選択マーカー遺伝子を発現させる第１の組換えＤＮＡと、胚性幹細胞から分化する目的細胞に対して特異的に発現する第２のプロモーター、リコンビナーゼ発現遺伝子の順に５’側から配置された第２の組換えＤＮＡとを、各々胚性幹細胞に導入する胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。第１のＤＮＡを含む第１の遺伝子導入用ベクターと第２のＤＮＡを含む第２の遺伝子導入用ベクターとを備えた単離又は可視化用キット。
2003106673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のプロモーター、リコンビナーゼ認識配列を両端に有する遺伝子、胚性幹細胞から分化する目的細胞の選択マーカー遺伝子の順に５’側から配置され、第１のプロモーターが前記選択マーカー遺伝子を発現させる第１の組換えＤＮＡと、胚性幹細胞から分化する目的細胞に対して特異的に発現する第２のプロモーター、リコンビナーゼ発現遺伝子の順に５’側から配置された第２の組換えＤＮＡとを、各々胚性幹細胞に導入することを特徴とする胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項２】
リコンビナーゼ認識配列が、ｌｏｘＰである請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項３】
第１のプロモーターが、恒常的強発現プロモーターである請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項４】
恒常的強発現プロモーターが、ＣＭＶプロモーター又はＣＡプロモーターである請求の範囲第３項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項５】
選択マーカー遺伝子が、蛍光蛋白遺伝子である請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項６】
リコンビナーゼ発現遺伝子が、リコンビナーゼＣｒｅ発現遺伝子である請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項７】
第２のプロモーターが、Ｎｋｘ２．５遺伝子プロモーター又はαＭＨＣ遺伝子プロモーターである請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項８】
第１の組換えＤＮＡの胚性幹細胞への導入が、第１の遺伝子導入用ベクターを用いて行われることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項９】
第１の遺伝子導入用ベクターが、ウイルスベクターである請求の範囲第８項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項１０】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求の範囲第９項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項１１】
第２の組換えＤＮＡの胚性幹細胞への導入が、第２の遺伝子導入用ベクターを用いて行われることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項１２】
第２の遺伝子導入用ベクターが、ウイルスベクターである請求の範囲第１１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項１３】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求の範囲第１２項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載の第１の組換えＤＮＡが導入された胚性幹細胞。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載の第２の組換えＤＮＡが導入された胚性幹細胞。
【請求項１６】
請求の範囲第１項に記載の第１の組換えＤＮＡと第２の組換えＤＮＡとが各々導入された胚性幹細胞。
【請求項１７】
胚性幹細胞が、マウスに由来する請求の範囲項１４〜請求項１６のいずれかに記載の胚性幹細胞。
【請求項１８】
請求の範囲第８項に記載の第１の組換えＤＮＡを含む第１の遺伝子導入用ベクター。
【請求項１９】
ウイルスベクターである請求の範囲第１８項に記載の第１の遺伝子導入用ベクター。
【請求項２０】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求の範囲第１９項に記載の第１の遺伝子導入用ベクター。
【請求項２１】
請求の範囲第１１項に記載の第２の組換えＤＮＡを含む第２の遺伝子導入用ベクター。
【請求項２２】
ウイルスベクターである請求の範囲第２１項に記載の第２の遺伝子導入用ベクター。
【請求項２３】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求の範囲第２２項に記載の第２の遺伝子導入用ベクター。
【請求項２４】
請求の範囲第１８項に記載の第１の遺伝子導入用ベクターと、請求の範囲第２１項に記載の第２の遺伝子導入用ベクターとを備えた胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項２５】
第１の遺伝子導入用ベクターと第２の遺伝子導入用ベクターがウイルスベクターである請求の範囲第２４項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項２６】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求の範囲第２５項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項２７】
請求の範囲第１４項に記載の胚性幹細胞と、請求の範囲第２１項に記載の第２の遺伝子導入用ベクターとを備えた胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項２８】
第２の遺伝子導入用ベクターがウイルスベクターである請求の範囲第２７項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項２９】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求の範囲第２８項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項３０】
請求の範囲第１８項に記載の第１の遺伝子導入用ベクターと、請求の範囲第１５項に記載の胚性幹細胞とを備えた胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項３１】
第１の遺伝子導入用ベクターがウイルスベクターである請求の範囲第３０項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項３２】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求の範囲第３１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
【請求項３３】
請求の範囲第１項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法により得られる細胞。
【請求項３４】
細胞が、第２のプロモーターとしてＮｋｘ２．５遺伝子プロモーターを用いて得られる細胞である請求項３３記載の細胞。
【請求項３５】
細胞が、第２のプロモーターとしてαＭＨＣ遺伝子プロモーターを用いて得られる心筋細胞である請求の範囲第３３項に記載の細胞。
【請求項３６】
請求の範囲第３３項に記載の細胞を含む組織。
【請求項３７】
請求の範囲第３３項に記載の細胞及び／又請求の範囲第３６項に記載の組織を用いる疾患の治療法。
【請求項３８】
疾患が、心疾患である請求の範囲第３７項に記載の疾患の治療法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、胚性幹細胞から分化した目的細胞を効率良く確実に選別して単離又は可視化できる方法及びこれに用いる単離又は可視化用キットに関する。
背景技術
胚性幹（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ、ＥＳ）細胞（以下，ＥＳ細胞ともいう）は、初期胚から分離された細胞で、培養系を操作することにより血球系、心筋、骨格筋、神経などいかなる臓器、細胞にも分化し得る全能性を有するため、これを利用して発生学などの生物学、先端医学の分野などでの研究の進展が大いに期待されている。このような研究のためには、ＥＳ細胞から分化した目的細胞を効率良く、確実に選別し、単離する方法の確立が最も重要な課題の一つである。
ところで、従来、分化した目的細胞が特異的な膜蛋白を発現する場合は、その膜蛋白を指標にフローサイトメトリーで目的の細胞を単離することが行われている（守田陽平，リンパ球サブセットに対する多重染色解析：中内啓光監修，田中弥生編，フローサイトメトリー自由自在（細胞工学  別冊），秀潤社，ｐ６０−６６（１９９９）／Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ，Ｉｔｏｈ  Ｈ，Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｏｇａｗａ  Ｍ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ，Ｙｕｒｕｇｉ  Ｔ，Ｎａｉｔｏ  Ｍ，Ｎａｋａｏ  Ｋ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ．Ｆｌｋｌ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｒｖｅ  ａｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８（６８０８）：ｐ９２−６（２０００））。
しかし、この方法が適応できるのは、細胞特異的な分子が膜蛋白として細胞外に発現している場合に限られるため、血球系や血管系などの一部の細胞、臓器に応用が限定されるのが実情であった。
このため心筋細胞のように特異的な膜蛋白が知られていない多くの細胞に対する方策としては、目的の細胞に特異的に発現する分子（遺伝子）のプロモーター領域下にマーカー遺伝子をつないだ組換え遺伝子をＥＳ細胞に安定導入し、分化した細胞で特異的に発現するそのマーカーを指標に細胞を選別し、単離する方法が報告されている（Ａｎｄｒｅｓｓｅｎ  Ｃ，Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ｅ，Ｋｌｉｎｚ  ＦＪ，Ｌｅｎｋａ  Ｎ，Ｈｅｓｃｈｅｌｅｒ  Ｊ，Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ  Ｂ，Ａｒｎｈｏｌｄ  Ｓ，Ａｄｄｉｃｋｓ  Ｋ．Ｎｅｓｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １９（５）：４１９−２４（２００１））。この方法は、組織特異的に発現する遺伝子のプロモーターを使うことにより、薬剤耐性遺伝子を細胞特異的に発現させてその薬剤を用いて目的細胞のみを選別する方法、あるいは特異的な波長の励起光で発色する分子を細胞特異的に発現させることによりフローサイトメトリーで目的の細胞を選別して単離する方法である。
しかし、これらの方法は細胞特異的なプロモーターの活性（発現強度）に著しく左右されてしまうという大きな問題点があり、その応用と効用は非常に限定的であった。すなわち、細胞特異的なプロモーターは特異性はあっても活性が弱い場合、分化した目的細胞を選別、単離するのに十分な強度のマーカー遺伝子の発現が得られず目的細胞を選別できないため、この方法が適応できるものは非常に限定されるというのが実情であった。また、実験を計画をする段階で確実にこの方法が有用であるか否かを予想することは困難で、予想される結果が不確かであるにも拘わらず目的細胞に分化させて単離するためにＥＳ細胞株を目的毎に１つ１つ作成し、分化した目的細胞の１つ１つについて検証をしなければならず、多大な労力と時間を使いながら結果として目的細胞を単離できないことがあった。
本発明は、活性（発現強度）が低い組織特異的なプロモーターでもマーカー遺伝子を機能させるために十分な量の発現を可能とすることにより、各種動物のＥＳ細胞を用いた医学、生物学、バイオテクノロジー分野など様々な研究分野や再生医療において利用可能な分化した目的細胞を確実、簡便かつ迅速に選別単離する方法又は選別可視化する方法及びそれに用いる単離又は可視化用キットを提供する。
発明の開示
本発明は、第１のプロモーター、リコンビナーゼ認識配列を両端に有する遺伝子、胚性幹細胞から分化する目的細胞の選択マーカー遺伝子の順に５’側から配置され、第１のプロモーターが前記選択マーカー遺伝子を発現させる第１の組換えＤＮＡと、胚性幹細胞から分化する目的細胞に対して特異的に発現する第２のプロモーター、リコンビナーゼ発現遺伝子の順に５’側から配置された第２の組換えＤＮＡとを、各々胚性幹細胞に導入することを特徴とする胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法である。上記発明において、第１の組換えＤＮＡ又は第２の組換えＤＮＡの胚性幹細胞への導入を、遺伝子導入用ベクターを用いて行っても良い。この遺伝子導入用ベクターは、アデノウイルスベクターを用いることができる。
また、本発明は、上記発明の第１の組換えＤＮＡ及び／又は第２の組換えＤＮＡが導入された胚性幹細胞である。
また、本発明は、上記の第１の組換えＤＮＡを含む第１の遺伝子導入用ベクター又は上記の第２の組換えＤＮＡを含む第２の遺伝子導入用ベクターである。
また、本発明は、上記の第１の組換えＤＮＡを含む第１の遺伝子導入用ベクターと上記の第２の組換えＤＮＡを含む第２の遺伝子導入用ベクターとを備えた胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キットである。
また、本発明は、上記の第１の組換えＤＮＡが導入された胚性幹細胞と、上記の第２の組換えＤＮＡを含む第２の遺伝子導入用ベクターとを備えた胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キットである。
また、本発明は、上記の第１の組換えＤＮＡを含む第１の遺伝子導入用ベクターと、上記の第２の組換えＤＮＡが導入された胚性幹細胞とを備えた胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キットである。
また、本発明は、上記の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離方法により得られる細胞又はこの細胞を含む組織である。
また、本発明は、上記の細胞及び／又は組織を用いる疾患の治療法である。
本発明の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的分離又は可視化方法は、各種動物に由来するＥＳ細胞に適用ができ、例えばマウス、ラット、サル、ヒトなどすでに樹立されている種は勿論のこと、今後樹立されるであろう他の種のＥＳ細胞にも用いることが可能であり、ＥＳ細胞の動物種、種類により特に限定されない。
ＥＳ細胞の取扱いの標準的な方法は、Ｂｒｉｇｉｄ  Ｈｏｇａｎ他著、山内一也他訳、「マウス胚の操作マニュアル」、近代出版（１９９７）、あるいは相沢慎一著、「ジンターゲッティング：ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」、実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ８、羊土社（１９９５）などに記載されている。
本発明に用いる第１の組換えＤＮＡとは、第１のプロモーター、リコンビナーゼ認識配列を両端に有する遺伝子、胚性幹細胞から分化する目的細胞の選択マーカー遺伝子とが５’から順に配置されたものを遺伝子組換え技術により作成したものである。第１のプロモーターとは、選択マーカー遺伝子を十分に発現させられない第２のプロモーターより活性が高く、選択マーカー遺伝子を発現させるに足るプロモーターであれば特に限定されるものではなく、例えばＣＡ（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターのハイブリッドプロモーター）プロモーターやＣＭＶ（サイトメガロウイルス初期遺伝子エンハンサー・プロモーター）プロモーターなどの恒常的強発現プロモーターが好適である。なお、恒常的強発現プロモーターとは、該プロモーターに繋いだ目的遺伝子をＥＳ細胞を初めとするほとんどの細胞に導入した場合、目的の遺伝子を恒常的に強く発現させるプロモーターのことをいう。
リコンビナーゼ認識配列は、特異的なＤＮＡ組換え酵素であるリコンビナーゼにより認識される塩基配列であれば特に限定されず、リコンビナーゼにより二つのリコンビナーゼ認識配列で挟まれたＤＮＡ鎖の切断、置換、結合というＤＮＡの組換え反応を生じるｌｏｘＰやＦＲＴなどの特異的な塩基配列をいう。
リコンビナーゼ発現遺伝子は、リコンビナーゼを発現する遺伝子で、ｌｏｘＰを認識するバクテリオファージＰ１由来のリコンビナーゼＣｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．Ｖｏｌ．１５０，４６７−４８６（１９８１））、ＦＲＴを認識する酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のリコンビナーゼＦＬＰ（Ｂａｂｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６０，１２３１３−１２３１９（１９８５））、チゴサッカロマイセス・ルーイのｐＳＲ１プラスミド由来のＲ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８，９５５−９６２（１９８８）を発現する遺伝子などを代表例として挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
選択マーカー遺伝子は、第２の組換えＤＮＡがＥＳ細胞に導入された後、第１のプロモーターにより発現しＥＳ細胞から分化した目的細胞を特異的に選別するための指標として用いるもので、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの発光蛋白遺伝子や種々の薬剤耐性遺伝子を挙げることができるが、選択マーカーとして用い得ればこれらに限定されない。特に、発光蛋白遺伝子は、目的細胞を可視化でき、フローサイトメトリーなどを用いてその選別単離が容易になるのでより好ましい。また、発光蛋白遺伝子は、恒常的強発現プロモーターを用いた場合、分化した目的細胞から更に分化した細胞をも永続的、恒常的に標識して可視化できるので、分化系統、組織系統が培養皿上で観察、解析することが可能となるので、好ましい。
本発明に用いる第２の組換えＤＮＡとは、胚性幹細胞から分化する目的細胞に対して特異的に発現する第２のプロモーター、リコンビナーゼ発現遺伝子が５’から順に配置されたものを遺伝子組換え技術により作成したものである。第２のプロモーターとは、分化する目的細胞でのみ特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域のことである。その例としては、心筋細胞のＮｋｘ２．５，ＭＥＦ−２，ＧＡＴＡ−４，心筋型アクチン、心筋型αミオシン重鎖（α−ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ：以下、αＭＨＣという）蛋白、ミオシン軽鎖２ｖ（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ−２ｖ：ＭＬＣ２ｖ）蛋白、脳の神経細胞のネスチンｎｅｓｔｉｎ、脳のグリア細胞のｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）、より未分化な肝細胞のαフェトプロテインα−ｆｅｔｒｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、（成熟した）肝細胞のアルブミンａｌｂｕｍｉｎ、骨髄芽細胞のオステオカルシンｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、膵臓β細胞の膵・十二指腸ホメオボックス遺伝子１ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ  １（ＰＤＸ−１）、血管（内皮細胞）のｆｌｔ−１、表皮ケラチン細胞のケラチン１４ｋｅｒａｔｉｎ１４（Ｋ１４）、骨格筋細胞の筋クレアチンキナーゼｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅなどの遺伝子のプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターに繋がれたリコンビナーゼ発現遺伝子は、ＥＳ細胞がその目的細胞に分化したときに限定してリコンビナーゼを発現する。
ＥＳ細胞への第１の組換えＤＮＡあるいは第２の組換えＤＮＡの導入には、それぞれの組換えＤＮＡと共に薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドをエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポゾーム法、ＤＡＥデキストラン法などの分子生物学の一般的な方法で導入して、その後、薬剤添加培地で細胞を１−２週間培養することにより、染色体にこれらの組換えＤＮＡが組み込まれ安定かつ永続的に遺伝子を発現するＥＳ細胞のクローンを採取して、分化の実験に用いることができる。さらに有用な方法として、第１の組換えＤＮＡあるいは第２の組換えＤＮＡを含む遺伝子導入用ベクターをそれぞれ作成し、これにより簡便かつ非常に効率的にＥＳ細胞に組換えＤＮＡを導入することができる。遺伝子導入用ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノアソシエートベクター、センダイウイルスベクターなど、非ウイルスベクターとして、カチオニックリポゾーム、ＨＶＪリポゾームなどが挙げられるが、これらに限定されない。
次に、本発明の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法の原理を典型的な例を用いて第１図を参照しながら説明する。
第１の組換えＤＮＡは、第１のプロモーター（図中、ＣＡプロモーター）、リコンビナーゼ認識配列としてｌｏｘＰ配列、ＥＳ細胞から分化した目的細胞の選択マーカーとしてＥＧＦＰ遺伝子が５’側から順に配置され、２つのｌｏｘＰ配列間には、マーカーのＮｅｏ遺伝子とポリＡシグナルが配置され、ＥＧＦＰ遺伝子の下流には、ポリＡシグナルが配置されている。なお、リコンビナーゼ認識配列間に配置されるマーカーは、Ｎｅｏ遺伝子に限定されるものではなく、様々なマーカー遺伝子を用いることができる。また、ポリＡシグナルも特に限定されず、牛成長ホルモンのポリＡシグナル、ラビットβ−グロビンポリＡシグナルなど様々なポリＡシグナルを用いることができる。
また、第２の組換えＤＮＡは、第２のプロモーター（図中、Ｎｋｘ２．５遺伝子プロモター又はαＭＨＣ遺伝子プロモーター）、リコンビナーゼＣｒｅの順で５’側から配置されている。リコンビナーゼＣｒｅの下流には、ポリＡシグナルが配置されている。
第１の組換えＤＮＡと第２の組換えＤＮＡが導入されたＥＳ細胞が、目的の細胞に分化誘導されることにより第２のプロモータが発現し、リコンビナーゼＣｒｅが作用してｌｏｘＰ配列で囲まれた部分が切り出されると、第１のプロモーターによりＥＧＦＰ遺伝子が強く発現し、蛍光を指標にして目的細胞の心筋細胞を可視化でき、フローサイトメトリーなどにより簡便かつ容易に選別単離することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、比較例、実施例のプラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う遺伝子工学技術ならびに細胞培養技術などは、特に断らない限り、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９９４），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．」並びに「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、第２版（１９８７），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ」に記載の方法に準じて行った。また特に断りがない限り、ＥＳ細胞の培養、取り扱いに関しては前述のＢｒｉｇｉｄ  Ｈｏｇａｎ他著、山内一也他訳、「マウス胚の操作マニュアル」、近代出版（１９９７）、あるいは相沢慎一著、「ジンターゲッティング：ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」、実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ８、羊土社（１９９５）に記載の方法、アデノウイルスの一般的な取り扱いに関しては特に断りがない限り、Ｆｒａｎｋ  Ｌ．Ｇｒａｈａｍ著、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｈａｐａｔｅｒ  １１．ｐ１０９−ｐ１２８、；Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９１）、アデノウイルスの作成については、Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９５）９２，２４７７−２５８１．、あるいはＭｉｚｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９，２５７７−２５８３，（１９９８）に記載の方法に準じて行った。
〔比較例〕
以下、従来の胚性幹細胞の単離方法を比較例として記載する。
Ｎｋｘ２．５遺伝子プロモーターは、Ｙｕｔｚｅｙ氏より供与を受けたものを使用した。Ｙｕｔｚｅｙらは、Ｎｋｘ２．５遺伝子の５’上流のゲノム解析により、Ｎｋｘ２．５遺伝子の心筋特異的な発現調節を可能とするプロモーター領域について詳しい検討を行っている（詳細は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｖｏｌ．１２５，４４６１−４４７０（１９９８）に記載）。これによると転写開始点より５’上流の−３０５９ｂｐまで含む領域が、Ｎｋｘ２．５遺伝子の心筋特異的に十分な発現レベルで発現するための最適なプロモーター領域として働くことが確認されている。
ちなみに、これより短い領域、つまり転写開始点より５’上流−９５９ｂｐまで、あるいは逆にこれより長い領域、つまり転写開始点より５’上流−９０００ｂｐでも、心筋特異的に十分な発現レベルでこの下流の遺伝子を発現させることはできないことが上記の論文で示されている。このＮｋｘ２．５遺伝子の転写開始点より５’上流の−３０５９ｂｐの領域、マーカー遺伝子の大腸菌のｌａｃＺ遺伝子、ＳＶ４０  ｓｍａｌｌ  ｔ−ｉｎｔｒｏｎとｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌがプラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫに挿入されたｐＮｋｘ２．５−ＩＡ−ＬａｃＺプラスミドをＹｕｔｚｅｙ氏より供与を受けた（詳細は上記Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｖｏｌ．１２５，４４６１−４４７０（１９９８）に記載）。ｐＮｋｘ２．５−ＩＡ−ＬａｃＺ（論文での記載名は−３０５９Ｎｋｘ２．５ｌａｃＺ）は心筋細胞特異的にＬａｃＺ遺伝子を発現することが確認されている。
次いで、プラスミドのｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社、カタログ番号６０８４−１）から制限酵素のＮｈｅＩとＢｃｌＩ処理によりＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を切り出し、切り出したＥＧＦＰ遺伝子の両末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＩにより平滑化した。ｐＮｋｘ２．５−ＩＡ−ＬａｃＺを制限酵素のＳａｌＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで末端を平滑化し、自己ライゲーションを防ぐためＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ）酵素で末端脱リン酸化処理した後、切り出したＥＧＦＰ遺伝子とＴ４  ＤＮＡリガーゼで反応させライゲーション反応を行い、プラスミドｐＢＳ−Ｎｋｘ２．５−ＥＧＦＰを作成した。
一方、プラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏは、プラスミドｐＢＳ２４６（旧ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１０３４８−０１９）のリコンビナーゼ認識配列のｌｏｘＰ配列２個の間のマルチクローニングサイト中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ間に、５’側よりｐＧＫプロモーター、Ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８薬剤耐性遺伝子）、ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅのｐｏｌｙ  Ａ  ｓｉｇｎａｌの順で連結された遺伝子を挿入することにより作成した。このプラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏを制限酵素のＮｏｔＩで切断しＣＩＰ処理を行い精製したものと、ｐＢＳ−Ｎｋｘ２．５−ＥＧＦＰをＮｏｔＩで切り出した遺伝子断片（転写開始点から−３０５９までのＮｋｘ２．５プロモーター、ＥＧＦＰ遺伝子、ＳＶ４０  ｓｍａｌｌ  ｔ−ｉｎｔｒｏｎとｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌが連結された遺伝子）とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで反応させ、ｐＮｋｘ２．５−ＥＧＦＰ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏを作成した。ｐＮｋｘ２．５−ＥＧＦＰ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのバックボーンを持ち、５’側よりＮｋｘ２．５遺伝子プロモーター（転写開始点から−３０５９まで）、ＥＧＦＰ遺伝子、ＳＶ４０  ｓｍａｌｌ  ｔ−ｉｎｔｒｏｎとｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌ、ｌｏｘＰ配列、ｐＧＫプロモーター、Ｎｅｏ遺伝子、ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅのｐｏｌｙ  Ａ  ｓｉｇｎａｌ，ｌｏｘＰ配列が順に挿入されたプラスミドである。
このプラスミドｐＮｋｘ２．５−ＥＧＦＰ−ｌｏｘＰ−ＮｅｏをマウスＥＳ細胞株のＲ１細胞にエレクトロポレーション法（バイオラド社のＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩで、０，２ｍｍのｃｕｖｅｔｔｅで１５０ｍＶ、９５０μＦで通電）により遺伝子導入して、翌日より薬剤選択のための抗生剤のＧ４１８を１５０μｇ／ｍｌの濃度でＬＩＦ（マウスｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒの組換え蛋白：旧ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、商品名ＥＳＧＲＯ）添加のＥＳ細胞用培地に加え、１−２週間後にコロニーが十分に分離できたところで、この薬剤耐性のＥＳ細胞株クローンをとった。３回の実験によりＧ４１８耐性のクローンを７８個採取した。
尚、ＥＳ細胞用培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ条件，Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１１０ｍｇ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅが含有：シグマ社）に、ＮａＨＣＯ３、１２５μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ナカライ社）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、核酸、２０％胎児牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ストレプトマイシン、ペニシリンを加えたものである。なお、ＥＳ細胞の未分化能を維持する際はこのＥＳ細胞用培地に１０３Ｕ／ｍＬでＬＩＦを加えて培養し、ＥＳ細胞の分化誘導の際はこのＥＳ細胞用培地単独でＬＩＦは添加しないで培養する。
これらのクローンＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、ゲノミックＰＣＲを行い、ＥＧＦＰを増幅するために設計したプライマーで２５クローン陽性、連結されたＮｋｘ２．５遺伝子プロモーターとＥＧＦＰを含む領域を増幅するために設計したプライマーで１６クローン陽性、さらにこの両者のプライマーセットでいずれも陽性だったものが１３クローンであった。少なくともこの１３クローンは正しく目的の遺伝子が導入されていると考えられるため、以降の実験にはダブルポジティブのこの１３クローンを用いた。
上記の１３クローンのＥＳ細胞を２つの分化誘導系にのせた。一つの系はＥＳ細胞を細胞非接着の皿でＬＩＦ非添加のＥＳ細胞用培地で浮遊させて培養することにより、ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙと呼ばれる初期胚と似た細胞塊が形成された。このｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙを３日目（ＬＩＦを除いた分化誘導開始から３日後）から接着の培養皿に移しＬＩＦ非添加のＥＳ細胞用培地で接着状態で培養すると、７日目（ＬＩＦを除いた分化誘導開始から７日後）位から１４日目位にかけて、生体の心筋細胞のように自己拍動する細胞塊が出現してきた。
もう一つの系はＳＴ２細胞というマウス間質細胞の上にＥＳ細胞をのせてＬＩＦ非添加のＥＳ細胞用培地で共培養する分化誘導系である。これもＬＩＦを除いてこのＳＴ２細胞の上にＥＳ細胞をのせて７〜９日後位より、生体の心筋のように自動収縮する細胞塊がところどころに出現してきた。
この２つの分化系に載せて７日後から１４日後までの各日の細胞塊からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を行うと、心筋特異的な遺伝子（Ｎｋｘ２．５、αＭＨＣ、ＭＬＣ２ｖなど）の発現誘導が確認された。また同時期の細胞塊の免疫染色により筋特異的や心筋特異的な蛋白質（αアクチニン、トロポミオシン、Ｎｋｘ２．５、ＭＬＣ２ｖ）などの発現も確認でき、これらの自動収縮する細胞塊が心筋細胞に分化していることが証明された。
一方、この４日後から１４日後の心筋に分化した細胞塊から抽出したＲＮＡからＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で増幅しても、いずれにおいても陽性の所見はみられなかった。そしてこれらのＥＳ細胞から分化した心筋細胞塊は、いずれのＥＳ細胞クローンから誘導されたものも、蛍光顕微鏡で可視化することも、またセルソーターで単離可能なレベルの明らかなＥＧＦＰの発現もみられなかった。前述のように、このＮｋｘ２．５遺伝子プロモーター（−３０５９）は、Ｙｕｔｚｅｙらが、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｖｏｌ．１２５，４４６１−４４７０（１９９８）で報告しているものと同様のものであり、このプロモーターに繋いだ遺伝子は、マウスの発生において早期より心臓の予定領域に発現し、心筋細胞に比較的特異的に発現することが確認されたものである。
Ｙｕｔｚｅｙらが用いたＬａｃＺ遺伝子の発現を組織のｘ−ｇａｌ染色で検出する方法は酵素反応であるため検出感度は比較的高く、検出に必要なＬａｃＺ遺伝子の発現レベルは非常に微量で良いものの、細胞を生きたままで可視化、単離するためにはＬａｃＺ遺伝子をマーカー遺伝子として用いることができない。そのため、このような目的にはＥＧＦＰ遺伝子をマーカー遺伝子として用いるのが一般的であるが、一方ＥＧＦＰを蛍光顕微鏡で可視化させたりセルソーターで分離するためにはある程度のＥＧＦＰ遺伝子の発現量が必要である。つまりこの遺伝子が正しく組み込まれて、またＥＳ細胞が心筋に分化したにも関わらずＥＧＦＰの発現がみられないのは、このＮｋｘ２．５遺伝子プロモーターに繋がれた遺伝子は心筋特異的な発現は生じても、ＥＧＦＰを可視化できるレベルの発現活性を持たないためである。このように、従来法では目的の細胞に分化した心筋細胞をＮｋｘ２．５遺伝プロモーターからＥＧＦＰ遺伝子を発現させることで可視化し、また、セルソーターで単離するという試みはいずれも不可能であった。
〔実施例１〕
５’側より、ＣＭＶプロモーター（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）あるいはＣＡプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒ＋ｃｈｉｃｋｅｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、その下流に２つのｌｏｘＰ配列で囲まれたＮｅｏ遺伝子、さらにその下流のマーカー遺伝子にＥＧＦＰ遺伝子を配置した第１の組換えＤＮＡを含むプラスミドｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰならびにｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを作成したが、その作成過程を以下に記載する。
まずｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素のＢｃｌＩとＢｓｍＩで処理してＮｅｏ遺伝子を切り出し、その断端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＩ処理により平滑末端化する（インサート）。ｐＢＳ２４６プラスミド（旧ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断しＣＩＰ処理する（ベクター）。このインサートとベクターの両者をＴ４  ＤＮＡリガーゼで反応させライゲーションすることで、ｐＢＳ２４６のｌｏｘＰ配列の間にｎｅｏ遺伝子が挿入されたプラスミドのｐＢＳ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏを得た。
次に、このｐＢＳ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏを制限酵素ＮｏｔＩで切り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩ処理し、２つのｌｏｘＰ配列とそれに囲まれたＮｅｏ遺伝子の遺伝子断片を回収した（インサート）。一方、ＣＭＶプロモーターが導入されているプラスミドｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（クロンテック社、カタログ番号＃６０６４−７）を制限酵素ＣｌａＩとＢａｍＨＩで処理し、ＭＣＳ（マルチクローニングサイト）、ＩＶＳ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｎ）、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を除いたベクター部分を回収し、これをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで末端平滑化した（ベクター）。このインサートとベクターの両者をＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることにより、目的の一つのプラスミドｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを得た。
さらにプラスミドｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰをＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで処理しＣＭＶプロモーター部を除き、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで断端を平滑末端化、ＣＩＰ処理をした（ベクター）。一方、コスミドｐＡｄｅｘ１Ｃａｗｔ（タカラ社、コード番号６１５０）をＰｍｅＩとＳｗａＩで処理して、ＣＡプロモーター部を切り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで断端を平滑末端化した（インサート）。このインサートと前記ベクターの両者をＴ４  ＤＮＡリガーゼで反応させライゲーションを行い、もう一つの目的プラスミドｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを得た。
プラスミドｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰあるいはｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを別々にＥＳ細胞（Ｄ３細胞）にエレクトロポレーション法にて遺伝子導入し、１５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８と１０３Ｕ／Ｌ  ＬＩＦ添加したＥＳ細胞用培地にて１−２週間培養することにより、ＥＳ細胞クローンを単離した。これらの手技は比較例の項で詳細に記載した通りである。ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを遺伝子導入したクローンを７０個、ｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを５９個採取した。
また、５’側より、Ｎｋｘ２．５プロモーター（−３０５９）、リコンビナーゼのＣｒｅ遺伝子、ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｏｌｙ  Ａ  ｓｉｇｎａｌを配置した第２の組換えＤＮＡを作成し、さらにその遺伝子を含むアデノウイルスベクターＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを下記のように作成した。
まずプラスミドｐＨＭＣＭＶ６（Ｍａｒｋ  Ｋａｙ氏より供与：プラスミドの詳細はＨ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｋａｙ：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ｖｏｌ．１０：２０１３−２０１（１９９９）に記載、現在、クロンテック社より販売）をＮｈｅＩとＭｕｎＩで処理してＣＭＶプロモーターを除いた後にＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションを行った。さらにこのプラスミドをＡｆｌＩＩで切断しＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで断端の平滑末端化を行い（ベクター）、この場所にプラスミドｐＢＳ１８５（旧ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）よりＸｈｏＩとＭｌｕＩでＣｒｅ遺伝子を切り出してＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端化したインサートを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーション反応をおこない挿入し、プラスミドｐＨＭΔｐ−Ｃｒｅを得た。つまりｐＨＭΔｐ−Ｃｒｅは、プロモーターを持たず、任意のプロモーターを簡単に挿入するためのマルチクローニングサイトを持ち、その下流にＣｒｅ遺伝子、ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｏｌｙ  Ａ  ｓｉｇｎａｌを持つプラスミドである。
比較例で記載したｐＮＸＫ２．５−ＩＡ−ＬａｃＺをＮｏｔＩとＸｂａＩで切り出しＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したＮｋｘ２．５遺伝子プロモーター部分（インサート）を、ｐＨＭΔｐ−ＣｒｅをＮｏｔＩで切断しＴ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端化しＣＩＰ処理したベクターに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、プラスミドｐＨＭ−Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを得た。
さらにｐＨＭ−Ｎｋｘ２．５−ＣｒｅをＩ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩで切断したインサート、ならびにアデノウイルスベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４（Ｍａｒｋ  Ｋａｙ氏より供与：プラスミドの詳細はＨ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｋａｙ：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ｖｏｌ．１０：２０１３−２０１（１９９９）に記載）をＩ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩで切断したベクターを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることにより、アデノウイルスベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４−Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを得た。ｐＡｄＨＭ４−Ｎｋｘ２．５−ＣｒｅをＰａｃＩで切断し精製したものを２９３細胞に遺伝子導入し、１０−１４日後に出現したアデノウイルスＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅのプラークを回収し、これを２９３細胞でウイルスの増幅を行い、ＣｓＣｌの密度勾配法による精製、カラムによる脱塩を行った（方法の詳細は最初に記載した引用文献、著書に記載）。
このＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅはヒト５型アデノウイルスベクターで、細胞に感染、遺伝子導入後はＮｋｘ２．５遺伝子プロモーターの制御下にＣｒｅ遺伝子を発現する。
また同様の方法でｐＨＭΔｐ−ＣｒｅにＣＡプロモーターを挿入して、同様の方法でアデノウイルスベクターＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを作成した。Ａｄ．ＣＡ−Ｃｒｅはヒト５型アデノウイルスベクターで、細胞に感染、遺伝子導入後はＣＡプロモーターの制御下にＣｒｅ遺伝子を発現する。ＣＡプロモーターはＥＳ細胞を含むほとんどの細胞で、下流の遺伝子を恒常的に強く発現させることができるため、Ａｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染させた細胞はその分化状態に関わらず細胞内で恒常的にＣｒｅ酵素を発現する。
次に、アデノウイルスベクターのＥＳ細胞に対する遺伝子導入効率を調べた。まずＣＭＶプロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子を発現するヒト５型アデノウイルスベクターＡｄ．ＣＭＶ−ｌａｃＺを前述の方法で作成した。Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺを各ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；感染可能なウイルス数／細胞数）で感染させ、ｘ−ｇａｌ染色で陽性細胞の割合を評価したところ、ＭＯＩを上げるに従い遺伝子導入効率は上昇した（第２図、第３図参照）。そして  Ｒ１、Ｄ３のいずれのＥＳ細胞でも、またフィーダー細胞有り、無しのいずれの状態でも、３０ＭＯＩで多くの細胞に遺伝子が導入でき、１００から３００ＭＯＩで１００％のＥＳ細胞に遺伝子を導入することができた。しかし、余りにも極端にＭＯＩを上げすぎると細胞障害がみられることもあるため、細胞障害がほとんどみられずに約６０−８０％の細胞に遺伝子導入ができる３０ＭＯＩで後述する実験を行った。同様に前述の分化誘導をかけたＥＳ細胞に十分量のＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺを感染させてｘ−ｇａｌ染色で評価すると、いずれの分化段階でも、分化誘導後１−１４日目のいずれの日でも、大差なく大部分の細胞に遺伝子を導入することができた（第２図ｃ参照）。このようにアデノウイルスベクターを使うことで、ＥＳ細胞に簡単に高率にいずれの分化段階でも遺伝子を導入することが確認できた。特に分化誘導中はエレクトロポレーション法などの従来の一般的な遺伝子導入法では遺伝子導入することが困難であるため、アデノウイルスベクターの使用は非常に有用であることが分かった。
第１の組換えＤＮＡが組み込まれたｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰが安定導入されたＥＳ細胞の７０クローンのうち、まず３４個をＥＧＦＰを増幅する比較例で設計したプライマーセットによるゲノミックＰＣＲを行ったところ、そのうちの３１個が陽性であった。またこの３１個のＥＳ細胞クローンにＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染させたところ、４クローンが蛍光顕微鏡による観察で十分な発現強度をもって可視化された（この４クローンはいずれもＥＧＦＰのゲノミックＰＣＲで陽性）。つまりゲノミックＰＣＲでＥＧＦＰ遺伝子の挿入を確認せずとも、直接Ａｄ．ＣＡ−Ｃｒｅ感染でスクリーニングする方が、より発現の強いクローンを迅速に選別できるため、以降は得られたＥＳ細胞クローンは直接Ａｄ．ＣＡ−Ｃｒｅ感染によるＥＧＦＰの発現強度により、目的のクローンを選別することにした。ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰが安定導入された残りの３４クローンをＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅ感染後の（蛍光顕微鏡での観察による）ＥＧＦＰ発現強度でスクリーニングしたところ、１１クローンがＥＧＦＰ強発現、４クローンがＥＧＦＰ弱発現であった。つまり、ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰが安定導入された合計７０クローンから１５クローン（弱い発現もいれると１９クローン）の目的のものを採取できた。
一方、ｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰが安定導入された５９クローンのＥＳ細胞を、Ａｄ．ＣＡ−Ｃｒｅ感染後のＥＧＦＰ発現で直接スクリーニングしたところ、１６クローンがＥＧＦＰ強発現する目的のものであった。
ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰとｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰがそれぞれ安定導入されたＥＳ細胞は、いずれもＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染しない場合、あるいはＣｒｅ遺伝子を発現しないコントロールのＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺの感染をした場合、ＥＧＦＰの可視レベルの発現はなく問題となるバックグラウンドはなかった。またＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染させた後のＰＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰとｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰがそれぞれ安定導入されたＥＳ細胞のＥＧＦＰの発現レベルは、いずれにおいてもｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰの方が強かった。これは多くの細胞株で報告されてきたのと同様に、ＥＳ細胞においてもＣＭＶプロモーターよりＣＡプロモーターの方が強発現を誘導できるという、それぞれのプロモーター活性の違いによると思われる。しかしｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰが導入されたＥＳ細胞でも可視レベルのＥＧＦＰの発現が得られ、さらに感度がいいセルソーターでの解析と単離を目的とした実験にはｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰでも本質的には問題ないと考えられる。本実験例での以下の分化誘導の実験には、より発現が強く蛍光顕微鏡下での観察がより明確に解析がより容易に行えるという点で、ｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを用いて行った。
前述のように、ｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰが安定導入されＣｒｅ酵素の発現後にｌｏｘＰで挟まれたＮｅｏ遺伝子が切り出されてＥＧＦＰの強発現が保証された１５クローンのＥＳ細胞のうち、３個のクローンを用いてＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを用いた分化誘導の実験を行った。前述のＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを用いた予備実験で、Ａｄ．ＣＡ−Ｃｒｅ感染１日後より十分に可視化されるレベルのＥＧＦＰの発現がみられ、感染２日後で最大の発現レベルに達し、それ以降同レベルのＥＧＦＰの持続発現が得られることが確認された。
比較例で既に述べた、ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙを介した分化誘導系にこの３クローンのＥＳ細胞を使用してみた。まず、この分化誘導系でのＮｋｘ２．５  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで毎日調べたところ、分化誘導５日目よりＮｋｘ２．５の発現が明らかにみられた。このため分化誘導後４日目に分化中のＥＳ細胞にＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを３０ＭＯＩで感染させた。つまり、１日にＬＩＦ非添加のＥＳ細胞用培地で培養し非接着状態でｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙの作成を初め、分化誘導開始後３日目に培養皿に接着させ、４日目にＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを３０ＭＯＩで感染させた。分化誘導開始後５日目より蛍光顕微鏡下で所々にＥＧＦＰが可視化できる細胞が出現し、分化誘導開始後６日目より蛍光顕微鏡下で非常に強い発現レベルのＥＧＦＰ発現が観察され、このＥＧＦＰの発現は以降もずっと見られた（第４図Ｃ参照）。６日目、あるいは８日目でトリプシンにより細胞塊をばらばらにし、一個ずつの細胞に十分分離した後、セルソーターにてＥＧＦＰを発現する目的細胞を単離した。このフローサイトメトリーの解析では、Ａｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを感染させた群の陽性率、つまりＮｋｘ２．５発現細胞は約２％であった（第５図参照）。一方これに対し、陽性コントロールとしてＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅの代わりにＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染させた群での陽性率は（則ちこれはアデノウイルスが感染しＣｒｅ遺伝子を導入した細胞の割合を表すものである）、約６０％であった（第５図参照）。また一方陰性コントロールとしてＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅの代わりにＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺを感染させた群、あるいはアデノウイルスベクターを全く感染させなかった群での陽性率は（則ちこれはｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰの遺伝子が安定導入されているＥＳ細胞での、Ｃｒｅ酵素によるｌｏｘＰが切りだされていない状態でのＥＧＦＰ発現の漏れ、バックグラウンド）０−０．２％であった（第４図ａ、第５図参照）。
すなわちこの実験系では、非常に高率に約６０％の細胞に正しく目的の遺伝子が導入されており、またバックグラウンドがなく、正しく目的のＮｋｘ２．５発現細胞を可視化し、さらに単離できるということで、従来不可能だったこれらの技術を解決した非常にすぐれた実験系であることが分かった。
次いで、単離された細胞はすぐに培養皿に蒔いて培養し、翌日、あるいは数日後にその細胞の性格、形質について解析を行った。まず単離された細胞のＥＧＦＰ遺伝子の発現は、翌日から数日後も、大部分の細胞において蛍光顕微鏡ではっきりと確認できるくらいの強いＥＧＦＰの発現を示していた。これにより、この方法で単離された細胞が非常に高純度で目的の細胞であることが分かった。次に細胞の性格、形質の解析のため、この細胞からＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ法により、Ｎｋｘ２．５遺伝子の発現、心筋特異的な分子、並びにその他関連の遺伝子の発現を調べた。あるいは、これらの単離細胞の免疫細胞染色を行い、これらの分子の発現を調べた。
まずＮｋｘ２．５遺伝子、αＭＨＣ、ＭＥＦ２ｃ（心筋特異的転写因子）、ＧＡＴＡ４（心筋に頻度が高く発現する転写因子）は、８０％の細胞で明らかな発現がみられた。この結果よりこの細胞の多くは心筋細胞であることが分かった。
一方、２０−３０％の細胞に、心筋以外のマーカーの平滑筋型アクチン（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ：ＳＭＡ）、トロポミオシン（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ：ＴＭ）の発現もみられた（第６図ａ参照）。ＥＳ細胞からＮｋｘ２．５を発現する細胞のみを確実に（しかも蛍光顕微鏡でも可視化できるレベルで確実に）単離できた報告はこれまでになく、Ｎｋｘ２．５は現在まで分かっている心筋特異的遺伝子の中で心筋の発生過程で最も早期に発現する転写因子であることを考えると、本細胞の一部が心筋以外のマーカーを発現するという結果は、本細胞が今までにＥＳ細胞から単離されたことのない、成熟心筋細胞以前の分化段階の心筋細胞、さらには心筋芽細胞とでもいうべき心筋への分化が運命付けられているより未分化な細胞の可能性もある。そのため、この単離された細胞自身が、特に未だ十分に解明されていない初期の心臓の発生や、分化、再生に関する今後の基礎研究、ＥＳ細胞を使った心疾患への再生医療法開発にいて非常に有用なものと考えられる。
また、心筋の各分化段階で発現する様々な心筋特異的遺伝子はＭＥＦ２ＣやＧＡＴＡ４など幾つか報告されており、今後本方法を用いることでこのような遺伝子の発現を指標に心筋の各分化段階の細胞を自由に単離することが可能であり、本法の発明の意義は大きい。さらに本法の有用性は心筋に限定されるものではなく、組織特異的、あるいは性格が同定された種々遺伝子のプロモーターを用いれば、ＥＳ細胞から分化するいかなる特異的な分化段階の各組織も、ある遺伝子の発現に特化したいかなる目的の細胞も可視化でき、単離することが可能である。この点から、本発明は、ＥＳ細胞を用いた再生医学、発生学において極めて重要な意義を持つものである。
〔実施例２〕
本発明に用いる第２のプロモーターは、Ｎｋｘ２．５遺伝子プロモーターに限られるものではなく、その他の心筋特異的遺伝子を指標にしたＥＳ細胞由来の心筋細胞、あるいはＥＳ細胞由来の他の細胞や組織を蛍光顕微鏡下で可視化し、さらに単離する目的で一般化することに広く用いることが可能である。つまり第２のプロモーターさえ目的のものに置換する事で、いかなるＥＳ細胞由来の目的細胞をも可視化し単離できる。このような本発明の広い一般的な有用性をさらに確認するために、第２のプロモーターにマウスのαＭＨＣ遺伝子プロモーターを用いたアデノウイルスベクターＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅ、つまりこれはαＭＨＣが発現する心筋細胞に特異的にＣｒｅ酵素を発現するような組換え遺伝子を導入するアデノウイルスベクターであるが、これを実施例１と同様の方法で作成して同様の実験を行った。
Ａｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅは以下のようにして作成した。まずシンシナチー医科大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＪｅｆｆｒｅｙ  Ｒｏｂｂｉｎｓ氏より供与された、αＭＨＣプロモーターが挿入されているプラスミド（プラスミドの詳細は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６６，ｐ９１８０−９１８５（１９９１）に記載）から、ＢａｍＨＩとＳａｌＩでαＭＨＣ遺伝子プロモーターを含む約５．５ｋｂのＤＮＡを切り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで末端を平滑化し、精製、抽出した。これはＲｏｂｂｉｎｓ氏らが上記文献で報告しているように、心臓型βミオシン重鎖遺伝子の３’側の最後のエクソンの一部、αＭＨＣの３’領域ならびに蛋白をコードしない最初の三つのエクソンを含むＤＮＡであり、この領域が心臓特異的な発現をもたらすプロモーターとして働くことが同論文で示されている。一方実施例１で作成したベクターのｐＨＭΔｐ−ＣｒｅをＮｏｔＩ酵素で切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで末端を平滑化し、ＣＩＰ酵素で末端脱リン酸化処理して精製した。これを前述のαＭＨＣ遺伝子プロモーターの５．５ｋｂのＤＮＡ断片とともに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ酵素で反応させライゲーション反応を行い、αＭＨＣ遺伝子プロモーターの下流にＣｒｅ遺伝子が繋がれたプラスミッドｐＨＭ−αＭＨＣ−Ｃｒｅを作成した。このｐＨＭ−αＭＨＣ−ＣｒｅとアデノウイルスベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４を実施例１で記載したように、制限酵素のＩ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩで切断した後、両プラスミドをＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることにより、ｐＡｄＨＭ４−αＭＨＣ−Ｃｒｅを得た。ｐＡｄＨＭ４−αＭＨＣ−ＣｒｅをＰａｃＩで切断し精製したものを２９３細胞に遺伝子導入し、１０−１４日後に出現したアデノウイルスＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅのプラークを回収し、実施例１に記載したものと同様にウイルス増幅、精製、脱塩をおこなった。このように作成されたＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅは、細胞に感染、遺伝子導入後は、αＭＨＣ遺伝子プロモーターの制御下にＣｒｅ遺伝子を発現するものである。
実施例１で作成したｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰが安定導入されたＥＳ細胞クローン株の中で、Ｃｒｅの発現後にＥＧＦＰが強く発現することが確認されたＥＳ細胞クローン株を用いて、Ａｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅの代わりにＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅを用いて実施例１と同様の実験を行った。基本的な実験プロトコール、手技は実施例１で記載したのものと同じであるが、ただ実施例１では、Ａｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを分化誘導後４日目に感染させて６日目に可視化された目的細胞をセルソーターで単離させていたところを、本実施例ではＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅを９日目に感染させて１３日目に可視化された目的細胞をセルソーターで単離することにした。これは分化誘導開始後のＥＳ細胞の内因性のαＭＨＣ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法や免疫組織化学で調べたところ、αＭＨＣの発現は約８日目から１４日目にかけて顕著にみられたためである。ＥＳ細胞の分化におけるこのαＭＨＣの発現時期の結果は、αＭＨＣは心筋特異的収縮蛋白の一つであるため成熟した心筋細胞で発現が強くみられるという生体内での事実と一致するものであり、また心筋様の拍動を示すＥＳ細胞のコロニーも分化誘導後９−１４日目に最も顕著にみられるということもこれと合致する所見である。このようにＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅの感染の時期以外の点では、実施例１と全く同じように以下の実験を行った。
Ａｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅ感染後１日目（分化誘導後９日目）より、一部の細胞にＥＧＦＰの発現が蛍光顕微鏡下で認められ、感染後２日目（分化誘導後１０日目）からはっきりとし、それ以降発現はやや増強し、感染後４日目（分化誘導後１３日目）にはＥＧＦＰの発現は最大となったため、この時にトリプシンで細胞をばらばらにし、セルソーターでＥＧＦＰ陽性細胞を単離した（第４図ｄ参照）。単離された細胞はほとんどＥＧＦＰを発現していた。さらにこれらの細胞の特性を確証するために、ＲＴ−ＰＣＲと免疫染色により、αＭＨＣ、アクチニンなどの心筋特異的分子のｍＲＮＡと蛋白の発現を調べたところ、単離されたほとんどの細胞でこれらの心筋特異的分子の発現は陽性であった（第６図ｂ参照）。さらに、電子顕微鏡の観察で横紋筋繊維構造などの心筋細胞に特有な細胞構造も確認できた。そして何といっても、培養皿に接着させて培養して翌日から数日間、細胞の心筋様の拍動が観察されたことは、単離された細胞が目的の成熟した心筋細胞であることを示している。これらの結果より、単離された細胞は成熟した心筋細胞であることが確証できた。このように本法により、Ｎｋｘ２．５は転写因子でαＭＨＣは収縮蛋白というように、二つの性格の異なる遺伝子のプロモーターを用いて、実施例１で比較的未熟な分化段階の心筋細胞を、そして実施例２で成熟した心筋細胞を、確実に単離できたことから、本発明が広く一般化して用いられ、有用であることが確証された。
〔実施例３〕
実施例１では第１の組換えＤＮＡが安定導入できたＥＳ細胞クローンを最初に取り、そのＥＳ細胞に分化誘導過程で第２の組換えＤＮＡをアデノウイルスベクターにより遺伝子導入するという方法を用いたが、実施例３ではＥＳ細胞クローンを取るといった作業をすることなしに、第１の組換えＤＮＡも第２の組換えＤＮＡも分化誘導過程のＥＳ細胞にアデノウイルスベクターを使って直接遺伝子導入した。
このためまず、第１の組換えＤＮＡを遺伝子導入できるアデノウイルスベクターを以下のように作製した。
まず実施例１で作成したｐＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰからＳａｌＩ酵素処理により、５’側よりＣＡプロモーター、リコンビナーゼ認識配列のｌｏｘＰ配列で囲まれたｎｅｏ遺伝子、ポリＡ配列、ＥＧＦＰ遺伝子、ポリＡ配列が繋がった目的のＤＮＡ断片を切り出した。一方、アデノウイルスを作成するシャトルベクターのｐＨＭ５プラスミド（Ｍａｒｋ  Ｋａｙ氏より供与：プラスミドの詳細はＨ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｋａｙ：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ｖｏｌ．１０：２０１３−２０１７（１９９９）に記載、マルチクローニングサイトの両端にそれぞれＩ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩの制限酵素認識配列を有する）は、マルチクローニングサイトのＳａｌＩ認識配列をＳａｌＩ酵素で切断し、ＣＩＰ酵素で末端脱リン酸化処理し、これと上記の切り出された目的のＤＮＡ断片とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ酵素でライゲーションすることにより、目的の第１の組換えＤＮＡが挿入されたシャトルベクタープラスミッドｐＨＭ−ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰ、ｐＨＭ−ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを各々得た。さらに、このｐＨＭ−ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰ、ｐＨＭ−ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰからＩ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ酵素で目的の遺伝子部分を切り出し、実施例１でも述べたように、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ酵素処理されたアデノウイルスベクタープラスミドのｐＡｄＨＭ４とともに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることで、目的の第１の組換えＤＮＡを持つアデノウイルスベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４−ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰ、ｐＡｄＨＭ４−ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを各々作成した。
アデノウイルスベクターの作成は実施例１で述べたように行った。つまり、ｐＡｄＨＭ４−ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰ、ｐＡｄＨＭ４−ｐＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰをＰａｃＩ酵素処理後に２９３細胞にトランスフェクションし、得られたウイルスプラークを増幅、精製、脱塩して、目的の第１の組換えＤＮＡを含むアデノウイルスベクターＡｄ．ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰ、Ａｄ．ＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを得た。
実施例１でも述べたように、本実施例の目的には、ＣＡプロモーターでもＣＭＶプロモーターでも本質的な差はないが、より発現が強いということで以下には、Ａｄ．ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを用いた実験結果を示す。但し、Ａｄ．ＣＭＶ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰでも同様の実験を行い、同様の結果が得られることは確認されている。
全く遺伝子が導入されていないＥＳ細胞（Ｄ３）を用い、実施例１と同様に、ＬＩＦを除いた培地でｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙを作成することで分化誘導を行った。
まずＮｋｘ２．５を指標とした、ＥＳ細胞由来のより未分化な心筋細胞の単離には、４日目にＡｄ．Ｎｋｘ２．５−ＣｒｅとＡｄ．ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰの２つのアデノウイルスベクターをそれぞれ３０ＭＯＩで感染させ、６日目にセルソーターで目的のＥＧＦＰ発現細胞を単離した。つまり本実施例が実施例１と異なるのは第１の組換えＤＮＡをアデノウイルスベクターを使って遺伝子導入したことのみである。この実験の結果、実施例１と同様の細胞が単離され、これらの細胞は実施例１と同様の遺伝子の発現パターンを示した。
次にαＭＨＣ遺伝子を発現するＥＳ細胞由来の成熟心筋細胞の単離には、実施例２と同様に分化誘導第９日目に、Ａｄ．αＭＨＣ−ＣｒｅとＡｄ．ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰの２つのアデノウイルスベクターをそれぞれ３０ＭＯＩで感染させ、第１３日目にセルソーターで目的のＥＧＦＰ発現細胞を単離した。この実験結果も、実験２と同様の細胞が単離され、これらの細胞は同様の心筋特徴的な遺伝子の発現パターンや心筋細胞様の収縮を示した。
この２つの実験結果より、第１の組換えＤＮＡも第２の組換えＤＮＡもアデノウイルスを使って遺伝子導入することで、従来の遺伝子導入安定発現細胞を取って行う方法と同様の結果が、より簡単に得られることが確認できた。
実施例１及び実施例２で示したように、従来の技術で第１の組換えＤＮＡを安定発現するＥＳ細胞を作成し、良好なクローンを選んでおいて、これに第２の組換えＤＮＡをアデノウイルスで遺伝子導入するという方法と、実施例３のように両方のＤＮＡをアデノウイルスを使って遺伝子導入する方法は、いずれも本発明における意義において本質的な差はない一方、それぞれの利点は目的によって使い分けが有用と考えられる。
二つのＤＮＡの遺伝子導入にアデノウイルスベクターを用いる利点をまとめると以下のようになる。
（１）第１、第２の組換えＤＮＡが安定導入され恒常発現するクローンを取る煩わしい作業の労力、時間を必要としない：つまり実施例１、２で示したように、従来の方法で第１の組換えＤＮＡを導入し安定的に恒常発現するクローンを選んで取るには、労力も時間も必要とする。さらに全くアデノウイルスベクターを使用せず従来の技術だけで遺伝子導入して、第１と第２の組換えＤＮＡの両方を安定的に恒常発現するクローンを選んで取るとすると、さらなる時間と労力を要することになる。この場合それに加え、２種類の異なる薬剤耐性遺伝子を必要とすることになり、これらの多重薬剤耐性遺伝子発現、またそのクローンを選択する煩雑な作業や長期の薬剤使用によるＥＳ細胞への影響、つまり細胞の性格の変化など、問題となる可能性があり、またこのような種々の影響で目的のクローンがとれない場合さえもある。
（２）アデノウイルスベクターは分化段階の任意な時期に高率に簡単に目的遺伝子を導入できる：これは従来の技術では不可能なことであったが、アデノウイルスを使えば簡単にできることを、本発明で示した。この利点として、（１）で記載したこととも関連するが、ＥＳ細胞に不要な遺伝子や薬剤の長期間の暴露などの、不要な影響を与えない。
（３）アデノウイルスベクターは、宿主細胞（この場合ＥＳ細胞）に導入遺伝子をｅｐｉｓｏｍａｌ（染色体に組み込まれることなく核内に存在）の形で安定して長期間発現させるため、安定した結果が得られる：従来の方法で、染色体に目的の遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞クローンを薬剤耐性遺伝子を利用して取って来る方法の場合、これらの導入遺伝子が染色体にランダムに組み込まれるため染色体上で組み込まれた場所の影響、クロマチン構造の影響などを受ける。このため必ずしも組み込まれた遺伝子が全て安定して発現するわけではないため、（１）に記載したように導入遺伝子を安定発現する良好なクローンを選択してくるのに時間と労力を要する。さらにＥＳ細胞では、他の癌細胞株や初代正常培養細胞などを用いた場合に比べ、染色体に組み込まれた導入遺伝子の発現が不安定になりやすいこと、例えば導入遺伝子の発現がシャットオフされる場合もあることが知られている。これに対しアデノウイルスベクターで遺伝子を導入した場合、ｅｐｉｓｏｍａｌであるため、このような染色体やクロマチンの影響をうけにくく、安定した発現が得られ、再現性のある安定した結果がいつも得られる。
（４）任意のＥＳ細胞株を用いることができる：ＥＳ細胞株の種類、またそのクローンやサブクローンによって分化能、性格が異なっている。この場合、ある細胞の単離には、よりその細胞へ分化しやすいことが同定されているＥＳ細胞株のクローンを特に指定して使用したい場合が考えられる。実施例３の第１と第２の組換えＤＮＡを遺伝子導入できるアデノウイルスベクターを用いれば、それぞのＥＳ細胞株やクローンについて安定細胞株を作成する必要がなく、自由に望みのＥＳ細胞を使用して行うことができる。
（５）ＥＳ細胞以外にも簡単に遺伝子導入できるため、作成した第１の組換えＤＮＡの特異性を他の細胞で直接的に確認することができる。また他の細胞での実験へも、この遺伝子構築したものが簡単に応用できる。
〔実施例４〕
前述したように、実施例で使用したＮｋｘ２．５遺伝子プロモーター及びαＭＨＣ遺伝子プロモーターの特異性は既に確認されており、また実際の実験結果でも心筋細胞を単離できることは明らかとなったが、さらに上記の（５）の観点から、実施例３の二つのアデノウイルスで導入したＤＮＡが正しく目的の心筋細胞を特異的に可視化できていることを直接的に証明する目的で、この二つのアデノウイルスをマウスの初代心筋培養細胞に感染させてみた。
出生１日目の新生児マウスより心筋を取り出し、これをコラゲナーゼで消化して心筋細胞を単一細胞に分離した後、培養皿に巻いて培養した。
この初代心筋細胞培養の手技は、Ｋｈａｌｉｄ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７２，ｐ７２５−７３６（１９９３）、ならびにＷａｎｇ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９，ｐ７９−８５（１９９６）に記載された方法に基本的に従って行った。このように培養して２日目の心筋細胞に、Ａｄ．Ｎｋｘ２．５−ＣｒｅとＡｄ．ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰをそれぞれ５ＭＯＩで感染させて、感染７２時間後に蛍光顕微鏡下で観察したところ、遺伝子が導入された心筋細胞がＥＧＦＰ陽性として可視された。同様のプロトコールで、Ａｄ．αＭＨＣ−ＣｒｅとＡｄ．ＣＡ−ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＥＧＦＰを同じように感染させても、遺伝子導入された心筋細胞はＥＧＦＰ陽性として可視された。これらの二つのアデノウイルスベクターを他の心筋以外の数種類の培養細胞（Ｈｅｌａヒト子宮頚癌細胞、ＭＫＮ２８ヒト胃癌細胞、ＬＬ２マウス肺癌細胞、ＬＭ８マウス骨肉腫細胞など）に感染させて、その特異性を検証したが、いずれの細胞でもこのようなＥＧＦＰの発現は蛍光顕微鏡でみられなかった。このように実施例１、２、３で用いた第１の組換えＤＮＡと第２の組換えＤＮＡは、遺伝子導入されると明らかに心筋細胞のみを標的化してＥＧＦＰで可視化できていることが直接的に証明された。
また、恒常的強発現プロモーターのＣＡプロモーター及び組織特異的遺伝子のＮｋｘ２．５プロモーターとαＭＨＣプロモーターのプロモーター活性を調べるための実験を行った。すなわち、以下のアデノウイルスベクターを感染効率（ＭＯＩ）３０か５００で感染させたマウス初代培養心筋細胞とＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株を用いてウエスタンブロット解析（Ｃｒｅ抗体）を行った（図７参照）。ＣＡはＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染させ５μｇの蛋白を泳動、ＣＡ’はＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染させ０．５μｇの蛋白を泳動、ＣＡ’’はＡｄ．ＣＡ−Ｃｒｅを感染させ０．１μｇの蛋白を泳動、ＮＣは陰性コントロールでｎｏ  Ａｄ，５μｇの蛋白を泳動、Ｎｋｘ２．５はＡｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを感染させ５μｇの蛋白を泳動、αＭＨＣはＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅを感染させ５μｇの蛋白を泳動、Ｔｕｂｌｉｎ（心筋細胞や線維芽細胞で分泌される蛋白）は内因性のコントロールとして、抗Ｔｕｂｌｉｎ抗体を用いて検出した。図７から、ＣＡプロモーターは５μｇの蛋白を用いる場合は勿論のこと、１０倍希釈したＣＡ’と５０倍希釈したＣＡ’’でもリコンビナーゼＣｒｅが検出されているが、Ｎｋｘ２．５プロモーターとαＭＨＣプロモーターはいずれも５μｇの蛋白でも非常に微量が検出されに過ぎなかった。これにより、組織特異的遺伝子のＮｋｘ２．５プロモーターとαＭＨＣプロモーターのプロモーター活性は非常に弱く、本発明によってのみ、ＥＧＦＰなどの選択マーカーを発現させられることが分かる。
産業上の利用分野
本発明の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法は、単離される各種の細胞、組織を用いて、発生学、再生医学、その他の分子生物学的研究に広く有用であるだけでなく、これらの目的細胞を用いた、心筋梗塞、脳硬塞を初めとする種々の難治性疾患への将来の再生医療の開発にも非常に有用である。また、永続的、恒常的に分化した目的細胞から更に分化した細胞をも標識して可視化できるので、分化系統、組織系統が培養皿上で観察、解析することが可能となる。胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的な単離又は可視化は、単離又は可視化用キットを用いることにより一層簡便に行うことができる。
本発明は、発明の実質的範囲に包含される限り、上記の実施例に制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法を模式的に示す説明図である。第２図は、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入効率を示す蛍光顕微鏡写真像である。（ａ）フイーダー細胞上で培養したマウスＥＳ細胞（Ｒ１細胞）の蛍光顕微鏡写真像（ｂ）フィーダー細胞無しで培養したマウスＥＳ細胞（Ｄ３細胞）の蛍光顕微鏡写真像（ｃ）分化誘導中のマウスＥＳ細胞（Ｄ３細胞）の蛍光顕微鏡写真像。なお、（ａ）〜（ｃ）は、ＭＯＩ１００でＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺを感染させ、ｘ−ｇａｌ染色したものであり、各蛍光顕微鏡写真像の右上はその位相差顕微鏡写真像を示す。第３図は、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入効率を示すグラフである。（ａ）各ＭＯＩでアデノウイルスベクターによるＥＳ細胞（Ｒ１細胞）の遺伝子導入効率を示すグラフである。（ｂ）各ＭＯＩでアデノウイルスベクターによるＥＳ細胞（Ｄ３細胞）の遺伝子導入効率を示すグラフである。第４図は、本発明の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法によりＥＧＦＰで可視化されたＥＳ細胞の蛍光顕微鏡写真像である。（ａ）陰性コントロールとして、Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺを感染させたもので、ＥＧＦＰの発現はない。（ｂ）陽性コントロールとして、Ａｄ．ＣＡ−ＬａｃＺを感染させたもので、遺伝子導入効率に一致して、６０〜７０％位の細胞がＥＧＦＰの発現により可視化されている。（ｃ）Ａｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅを第４日に感染させ、第６日に観察したもので、目的細胞と思われる細胞が散在して可視化されている。（ｄ）Ａｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅを第１３日に観察したもので、目的細胞と思われる細胞が可視化されている。第５図は、Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ、Ａｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅ及びＡｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅの発現を指標に単離された細胞のフローサイトメトリーのチャートである。第６図は、（ａ）Ａｄ．Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅ、（ｂ）Ａｄ．αＭＨＣ−Ｃｒｅの発現を指標に単離された細胞の免疫細胞染色の蛍光顕微鏡写真像である。（ａ）左の写真像がＥＧＦＰ、中央の写真像が目的の蛋白の発現を示しており、上段はＳＭＡ、下段はトロポミオシン（ＴＭ）で、それぞれに対する特異的な抗体により免疫蛍光染色したものである。また、右の写真像は左の写真像と中央の写真像を重ね合わせた写真像で、ＥＧＦＰと目的の蛋白が同じ細胞で発現していることを示している。（ｂ）左の写真像がＥＧＦＰ、中央の写真像が目的の蛋白の発現を示しており、上段はαＭＨＣ、下段はアクチニンで（いずれも心筋細胞特異的な分子）、それぞれに対する特異的な抗体により免疫蛍光染色したものである。また、右の写真像は左の写真像と中央の写真像を重ね合わせた写真像で、ＥＧＦＰと目的の蛋白が同じ細胞で発現していることを示している。第７図は、恒常的強発現プロモーターのＣＡプロモーター及び組織特異的遺伝子のＮｋｘ２．５プロモーターとαＭＨＣプロモーターにより発現したリコンビナーゼＣｒｅの電気泳動像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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