(57)【要約】本発明は、活性化プロテインＣ（ａＰＣ）の不活性化を抑制する抗ａＰＣ抗体およびその利用を提供する。抗ａＰＣ抗体のスクリーニングにより、血中におけるａＰＣの不活性化を抑制する活性を持つ抗ａＰＣ抗体を単離することに成功した。本発明の抗体は、ａＰＣの不活性化を抑制することを通してａＰＣの活性を維持し、血液凝固系の活性化の抑制または抗炎症作用などのａＰＣの生理活性の効果を持続させるために使用することができる。また本発明は、血栓症および敗血症などのａＰＣによる治療における本発明の抗体の使用を提供する。ａＰＣ投与による治療において、本発明の抗体をａＰＣに結合させることにより、治療効果を持続させることができる。本発明の抗体は、血栓症および敗血症などの治療および予防において利用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＣもしくは活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に対する抗体であって、生体内において活性化プロテインＣの作用を増強する活性を有する抗体。
【請求項２】
プロテインＣもしくは活性化プロテインＣに対する抗体であって、生体内での活性化プロテインＣの不活性化を抑制する活性を有する抗体。
【請求項３】
プロテインＣもしくは活性化プロテインＣに対する抗体であって、（ａ）血液による活性化プロテインＣの不活性化、または（ｂ）活性化プロテインＣの生理的な阻害物質による活性化プロテインＣの不活性化、あるいはそれらの両方を抑制する活性を有する抗体。
【請求項４】
活性化プロテインＣの生理的な阻害物質がセリンプロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮｓ）である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
セリンプロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮｓ）がプロテインＣインヒビターまたはα１−アンチトリプシンである、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載の抗体であって、以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する抗体。
（ａ）配列番号：９、１０、および１１に記載のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号：２１、２２、および２３に記載のアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号：３１、３２、および３３に記載のアミノ酸配列。
（ｄ）配列番号：２４、２５、および３４に記載のアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号：１５、１６、および１７に記載のアミノ酸配列。
（ｆ）配列番号：２７、２８、および２９に記載のアミノ酸配列。
【請求項７】
抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体断片、一本鎖抗体、およびダイアボディーからなる群より選択される、請求項１から３のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項９】
さらにプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物である、請求項８または請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
疾患が血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患が、敗血症、播種性血管内凝固症候群、動脈血栓症、および静脈血栓症からなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から３のいずれかに記載の抗体をプロテインＣまたは活性化プロテインＣに接触させる工程を含む、不活性化が抑制されたプロテインＣまたは活性化プロテインＣの製造方法。
【請求項１４】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患を予防または治療する方法であって、（ａ）プロテインＣおよび／または活性化プロテインＣ、並びに（ｂ）請求項１から３のいずれかに記載の抗体、を投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）プロテインＣ、活性化プロテインＣ、および請求項１から３のいずれかに記載の抗体からなる群から選択される少なくとも一つ、および（ｂ）治療有効量のプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣと該抗体とを併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は活性化プロテインＣの非中和抗体に関する。
【背景技術】  下肢関節置換術、あるいは開腹手術後には高頻度で静脈血栓症が発症する。現在その治療は主として低分子ヘパリンおよびワーファリンにより予防的に行われている。しかし低分子ヘパリンは連日の皮下投与が必要であり、ワーファリンは経口投与であるがタンパク結合率が非常に高いため他薬との相互作用により併用には制限がある。またいずれの薬物も出血傾向を呈する。したがって、作用が長時間持続し出血傾向を呈さない抗血栓薬があれば、術直後および退院直前に投与する事により、血栓症を予防しかつ患者のＱＯＬを向上させることができる。その他の血栓症についても、特に作用持続の長い抗血栓薬の開発が望まれている。
血栓は血小板と血液凝固系が活性化することにより形成され、一般には動脈血栓には血小板が、静脈血栓には凝固系が主として働くと考えられている。血液凝固系が活性化され生成されたトロンビンは血栓網の主体となるフィブリンを生成するとともに、血管内皮上に存在するトロンボモデュリンと結合して性質が変化し、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ；ＰＣ）を活性化させる。活性化されたＰＣ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ；ａＰＣ）はプロテインＳ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ）を補酵素として、Ｆａｃｔｏｒ  ＶａおよびＶＩＩＩａを不活化し凝固系の回転を抑制する方向に働く。またａＰＣはＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）やＴＡＦＩ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などの線溶阻害物質抑制作用も有するため、線溶系を促進する。したがってＰＣおよびａＰＣは活性化した血液凝固系に対するネガテイブフィードバック機構として重要な働きをすると考えられており、実際、先天性ＰＣ欠乏症、あるいはＦａｃｔｏｒ  Ｖａ変異によるａＰＣ不応症は血栓症の発現因子の一つであることからもａＰＣは血栓症の治療および予防に有効であると考えられる。
一方、敗血症にはこれまで効果的な薬剤が存在しなかったが、最近になってリコンビナントａＰＣが敗血症の治療に有効であることが報告されている（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１，３４４：６９９−７０９）。また、ａＰＣが血管内皮に作用し抗炎症作用を有することが示唆されており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：１１１９９−１１２０３）、敗血症モデルにおいてトロンビンの産生抑制以外の作用で抗炎症作用を発揮することも報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７，７９：９１８−２５）。
しかしながらａＰＣは血中半減期が２０〜３０分と非常に短いために、静脈内持続投与や長期にわたる連続投与が必要である。半減期が短い理由は、ａＰＣが生体内の生理的な阻害物質、すなわちプロテインＣインヒビター（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＣＩ）やα１アンチトリプシン（α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ；ＡＡＴ）により非可逆的に不活化されることによる。また、もしａＰＣの前駆体であるＰＣを製剤化したとしても生体内半減期は６〜８時間と短く、持続あるいは頻回投与が必要となり医療経済学的に非効率である。
【発明の開示】
前述の通り、ａＰＣは血液凝固系のフィードバックとして機能するため、その生成と作用は凝固系が活性化されている局所に限定されている。したがってａＰＣを全身投与する場合には、必要とされる局所へ供給し、かつ不活化による消費を補うために大量持続投与せざるを得ない。局所で内因性に生成されるａＰＣの作用を増強する薬物があれば、作用は限定的で、しかも通常は薬物そのものは消費されないため、少量かつ一度の投与で作用が持続することになり効率的である。そこで本発明者らは、ａＰＣの不活化を抑制し半減期を延長することにより内因性ａＰＣの作用を増強することができる薬剤の開発を行った。
このために本発明者らは、ａＰＣに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングを行った。そしてハイブリドーマの大規模なスクリーニングにより、血中におけるａＰＣの不活性化を抑制する抗体をスクリーニングした結果、ａＰＣの不活性化を強く抑制する抗ａＰＣ抗体を単離することに成功した。これらの抗体は、ＰＣＩによるａＰＣの不活性化も抑制することが確認された。本発明の抗体は、ａＰＣの不活性化の抑制を通して血液凝固系の働きを抑制するため、血栓症の治療および予防のために極めて有用である。また本発明の抗体は、敗血症等の治療において、ａＰＣと併用して、あるいは単独で用いることにより、血中におけるａＰＣの不活化を抑制することによりａＰＣの作用を増強し、治療する薬剤として利用することができる。
すなわち本発明は、ａＰＣの不活性化を抑制する抗ａＰＣ抗体およびその利用に関し、より具体的には、
（１）プロテインＣもしくは活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に対する抗体であって、生体内において活性化プロテインＣの作用を増強する活性を有する抗体、
（２）プロテインＣもしくは活性化プロテインＣに対する抗体であって、生体内での活性化プロテインＣの不活性化を抑制する活性を有する抗体、
（３）プロテインＣもしくは活性化プロテインＣに対する抗体であって、（ａ）血液による活性化プロテインＣの不活性化、または（ｂ）活性化プロテインＣの生理的な阻害物質による活性化プロテインＣの不活性化、あるいはそれらの両方を抑制する活性を有する抗体、
（４）活性化プロテインＣの生理的な阻害物質がセリンプロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮｓ）である、（３）に記載の抗体、
（５）セリンプロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮｓ）がプロテインＣインヒビターまたはα１−アンチトリプシンである、（４）に記載の抗体、
（６）（１）から（３）のいずれかに記載の抗体であって、以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する抗体、
（ａ）配列番号：９、１０、および１１に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２１、２２、および２３に記載のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号：３１、３２、および３３に記載のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号：２４、２５、および３４に記載のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号：１５、１６、および１７に記載のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号：２７、２８、および２９に記載のアミノ酸配列、
（７）抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体断片、一本鎖抗体、およびダイアボディーからなる群より選択される、（１）から（３）のいずれかに記載の抗体、
（８）（１）から（３）のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物、
（９）さらにプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣを含む、（８）に記載の組成物、
（１０）活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物である、（８）または（９）に記載の組成物、
（１１）疾患が血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患である（１０）に記載の組成物、
（１２）血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患が、敗血症、播種性血管内凝固症候群、動脈血栓症、および静脈血栓症からなる群より選択される、（１１）に記載の組成物、
（１３）（１）から（３）のいずれかに記載の抗体をプロテインＣまたは活性化プロテインＣに接触させる工程を含む、不活性化が抑制されたプロテインＣまたは活性化プロテインＣの製造方法、
（１４）活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患を予防または治療する方法であって、（ａ）プロテインＣおよび／または活性化プロテインＣ、並びに（ｂ）（１）から（３）のいずれかに記載の抗体、を投与する工程を含む方法、
（１５）活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）プロテインＣ、活性化プロテインＣ、および（１）から（３）のいずれかに記載の抗体からなる群から選択される少なくとも一つ、および（ｂ）治療有効量のプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣと該抗体とを併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキット、に関する。
本発明は、ａＰＣの不活性化を抑制し、半減期を延長するａＰＣの非中和抗体を提供する。本発明者らは、ａＰＣの非中和抗体の中には、血中においてＰＣＩまたはＡＡＴによりａＰＣの抗血液凝固作用が不活性化されるのを防止することによりａＰＣの生体内での寿命を延長させて活性を増強することが可能な抗体が存在することを見出した。ここでａＰＣの不活性化とは、ａＰＣの生物学的活性の低下または喪失を言う。具体的には、ａＰＣの不活性化とは、血液あるいはＰＣＩまたはＡＡＴ等の生体内の生理的な阻害物質によりａＰＣが非可逆的に不活性化されることを言う。具体的には、例えばａＰＣの抗血液凝固作用が不活性化されることである。ａＰＣは、例えばａＰＣを血漿中でインキュベートすることにより不活性化される。また、ＰＣＩまたはＡＡＴ等の生体内の阻害物質と接触させることによっても不活性化される。本発明の抗体は、血漿および／またはａＰＣの生理的阻害物質（ＰＣＩなど）によるａＰＣの不活性化を抑制する抗体である。本発明の抗体を用いれば、生体内でのａＰＣの不活性化を抑制し、生体内における活性化プロテインＣの作用を、該抗体がない場合に比べて相対的に増強することが可能である。ａＰＣの不活性化の抗体による抑制は、実施例に記載されたような方法またはその他の方法により測定することができる。具体的には、例えば被検抗体とａＰＣとをインキュベートし、その後または同時に、該ａＰＣを血漿またはＰＣＩ等のａＰＣ阻害物質とインキュベートした後、ａＰＣの活性を測定する。該抗体とインキュベートしないａＰＣを血漿またはａＰＣ阻害物質とインキュベートした対照に比べ、ａＰＣの不活性化の程度を減少させる抗体は、ａＰＣの不活性化を抑制する活性を有すると判断される。ａＰＣの活性としては、抗血液凝固作用が挙げられ、例えば公知の方法によりＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を測定して定量することができる。あるいは発色基質ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（Ｓ−２３６６）などの低分子化合物を用いてａＰＣ活性をアッセイすることも可能である。
ａＰＣの生理的な阻害物質としては、例えばセリンプロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮｓ）が挙げられ、特にプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２５８：１６３−１６８；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ２０００，１４：１３３−１４５  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２：６１１−６１６；Ｚｅｃｈｍｅｉｓｔｅｒ−Ｍａｃｈｈａｒｔ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８６，６１−６６，１９９７；Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２９，２６３−２６８，１９９８；Ｙｕａｓａ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８３，２６２−２６７，２０００）およびα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ，Ｈｅｅｂ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，２６３：１１６１３−１１６１６）を例示することができる。
また本発明は、ａＰＣに対する抗体であって、
ｉ）ａＰＣに対する抗体を結合させたまたは結合させていないａＰＣの、血液による不活性化を測定する工程、
ｉｉ）該抗体を結合させていないａＰＣに比べ、該抗体を結合させたａＰＣの該不活性化が抑制されるような抗体を選択する工程、により得ることができる抗体を提供する。
また本発明は、ａＰＣに対する抗体であって、
ｉ）ａＰＣに対する抗体を結合させたまたは結合させていないａＰＣの、ａＰＣ不活性化因子による不活性化を測定する工程、
ｉｉ）該抗体を結合させていないａＰＣに比べ、該抗体を結合させたａＰＣの該不活性化が抑制されるような抗体を選択する工程、により得ることができる抗体を提供する。
血液としては、全血または血漿であってよい。またａＰＣ不活性化因子としては、ａＰＣの生理的な阻害物質が挙げられ、例えばＰＣＩおよびＡＡＴが例示できる。ａＰＣに対する抗体をａＰＣに結合させるには、両者を溶液中で共存させればよく、例えば両者を含む溶液を５分〜数時間、例えば１時間程度インキュベートすることができる。血液またはａＰＣ不活性化因子によるａＰＣの不活性化は、例えば血液またはａＰＣ阻害物質とａＰＣとを共存させることにより実施することができ、例えば両者を含む溶液を５分〜数時間、例えば１時間程度インキュベートすることにより実施することができる。
本発明の抗ａＰＣ抗体は、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、またはそれらの抗体の変異体であってもよい。均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む慣用なポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖（Ｈ鎖）及び／または軽鎖（Ｌ鎖）の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、抗体変異体、並びに抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。例えば、抗体の可変領域を、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変することができる。このような改変は、部位特異的変異（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８５）参照）、ＰＣＲ変異、カセット変異等の方法により行うことができる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップ導入した後、元となった抗体のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。
具体的には、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）のウェブサイトを参照；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。例えば以下の方法により作製することができる。
動物の免疫に用いるａＰＣとしては、組換えＤＮＡ法又は化学合成により調製したａＰＣのアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチドなどが挙げられる。ヒトおよびその他の哺乳動物のａＰＣのアミノ酸配列は公知である（Ｍａｔｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６８２２−６８３１（１９９６）；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４６７３−４６７７（１９８５））。例えば、市販のａＰＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ（ヒト血漿由来），ＳＩＧＭＡ，＃Ｐ２２００）を抗原として用いることができる。抗原としてはａＰＣまたはその部分ペプチド自体を用いることもできるし、キャリアー蛋白質に結合させて免疫することもできる。キャリアー蛋白質を用いる場合は、例えば抗原であるａＰＣをキャリアー蛋白質（例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全なアジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。抗原蛋白質の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１０〜１００μｇ（例えば２０〜４０μｇ）を用いることができるが、これに制限されない。
初回免疫前および２回目以降の免疫から３〜７日後に動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。また、免疫応答を増幅するため、ミョウバン等の凝集剤が好ましくは用いられる。選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、及び競合分析（例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。
ポリクローナル抗体のスクリーニング法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｙ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅｅｄｉｔ．（１９８８））に記載されるような慣用の交差結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５））を行ってもよい。ポリペプチドまたは抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量化を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて抗体の１若しくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。
モノクローナル抗体の調製におけるハイブリドーマの作製は、例えば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，７３，３−４６．）等に準じて行うことができる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えばＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）、Ｐ３Ｕ１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７９；１５０：５８０；Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７８；８１：１）等が好適に使用される。また、ヒトミエローマ、及び、マウス−ヒトｈｅｔｅｒｏｍｙｃｌｏｍａセルラインも、ヒトモノクローナ抗体の産生に用いることができる（Ｋｏｚｂａｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。抗体産生細胞は、例えば最終の免疫日から２〜３日後に犠牲死させた動物から採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。具体的には、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出又は採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地又は緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：２０で融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００（Ｄａ）のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１））、及びＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））は、各々、ファージライブラリーを用いたマウス及びヒト抗体の単離について記載している。また、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））、そして、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染、及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））などが知られている。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。
本発明の非中和抗ａＰＣ抗体は、例えば以下のスクリーニングにより選択することができる。
・１次スクリーニング
抗体の結合特異性を、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）、ＨＴＲＦ（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、または蛍光免疫法等（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）により測定し、ａＰＣへ結合するものを選択する。
・２次スクリーニング
ヒト血漿を用いてＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を測定し、ａＰＣの抗血液凝固作用を増強する抗体を選択する。または、ａＰＣにＡＡＴまたはＰＣＩを添加しａＰＣの不活化を測定し、ＡＡＴおよび／またはＰＣＩによるａＰＣ不活化を阻害する抗体を選択する。例えば、ハイブリドーマなどの抗体産生細胞から得られた抗体を用いてアッセイしているならば、目的の活性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を同定し、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により生育させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。培養培地としては、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＩＭ−１６４０培地を用いることができる。スクリーニングを繰り返して、より強いａＰＣ不活化抑制抗体を産生する抗体産生細胞（ハイブリドーマなど）を選択することにより、抗体産生細胞のクローニングを行うことが可能である。
本発明の抗体は、血液またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を抑制する抗体である。このような抑制レベルは不活性化抑制率（％）と定義され、血液またはａＰＣ阻害物質により不活性化した場合のａＰＣの活性と同レベルのａＰＣ活性を０％、しない場合のａＰＣ活性と同レベルのａＰＣ活性を１００％とした相対値で表される。
不活性化抑制率は適宜抗体の用量を変えながら至適条件で測定すればよく、具体的には、以下の手順で決定することができる。１０μｇ／ｍＬのａＰＣ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ−２２００など）溶液１０μＬと４０μＬの抗体溶液（ハイブリドーマのスクリーニングであれば、例えばハイブリドーマ培養上清）あるいはコントロールとして抗体を含まない溶液（例えばミエローマ細胞の培養上清またはＨＡＴ培地など）を混合し、室温で一定時間（例えば６０分）インキュベートする。この混合液に血漿（例えばヒト標準血漿）を５０μＬ添加し、さらに室温で一定時間（例えば６０分）インキュベートする。ＡＰＴＴ試薬（例えばＤＡＤＥ  ＢＥＨＲＩＮＧ、ＧＡＡ−２００Ａ）５０μＬを添加する。血漿とインキュベーションを行わないａＰＣの血液凝固時間は、ＡＰＴＴ試薬添加直前に血漿に加えて測定する。例えば３７℃で３分間インキュベートした後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２（例えばＤＡＤＥ  ＢＥＨＲＩＮＧ、ＧＭＺ−３１０）５０μＬを添加し、凝固までの時間を測定する。血液凝固時間は、血液凝固自動測定装置（例えばＡｍｅｌｕｎｇ、ＫＣ−１０Ａ）などにより測定することができる。
血漿とインキュベートしなかったａＰＣを加えた場合の凝固時間（ａ）を１００％、コントロールとして抗体を含まない溶液（例えば上記のようにミエローマ細胞の培養上清など）とインキュベート後に血漿とインキュベートしたａＰＣを加えた場合の凝固時間（ｂ）を０％とし、ハイブリドーマ培養上清などの抗体溶液とインキュベート後に血漿とインキュベートしたａＰＣを加えた場合の凝固時間（ｃ）から、ハイブリドーマ培養上清などの抗体溶液の凝固時間延長に対する作用を求める（不活性化抑制率（％）＝｛（ｃ−ｂ）／（ａ−ｂ）｝×１００）。この値が大きいほど、ａＰＣ不活性化に対する抑制作用が強いと判断される。Ｓ−２３６６等の基質化合物を用いてａＰＣ活性を測定する場合でも、上記と同様に抗体とインキュベートせずに血漿で不活性化させたａＰＣ、および血漿とインキュベートしないａＰＣを比較に用いてａＰＣ活性を測定し、不活性化抑制率（％）を算出することができる。本発明の抗体は、この不活化抑制率（％）が、好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上、より好ましくは１８以上、より好ましくは２０以上、より好ましくは２５以上、より好ましくは３０以上、より好ましくは３５以上、より好ましくは４０以上、より好ましくは４５以上、より好ましくは５０以上である。
あるいは、本発明の抗体は、好ましくはＰＣＩまたはＡＡＴなどのａＰＣ阻害物質のａＰＣ不活化に対する阻害作用を有している。この作用は、低分子基質を用いたｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙにより測定することができる。一例を挙げれば、精製抗体溶液４０μＬと１０μｇ／ｍＬのａＰＣ溶液１０μＬとを室温で６０分間反応させる。ａＰＣと抗体の混合液５０μＬをヘパリン１０Ｕを含むｂｕｆｆｅｒ（最終濃度：７０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２，０．１％  ＢＳＡ）に加え１８０μＬとする。組み換えＰＣＩ（Ｆｌａｇタグ付き）１００μｇ／ｍＬを２０μＬ添加し、３７℃で３０分間反応させる。低分子基質Ｓ−２３６６（２ｍｍｏｌ／Ｌ）５０μＬを添加し、６０分後の吸光度（４０５ｎｍ）を測定する。
ＰＣＩ未添加ａＰＣを用いた場合の吸光度に比べ、ＰＣＩを添加すると吸光度は低下する。ＰＣＩの添加によるａＰＣ活性を０％、ＰＣＩ未添加のａＰＣ活性を１００％として、抗体の相対活性を吸光度の平均値を基にもとめる。本発明の抗体は、この相対値が好ましくは１以上、より好ましくは２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは５以上、より好ましくは７以上、より好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上である。
本発明の抗体は、例えば、上記の血漿を用いたＡＰＴＴ測定による抗血液凝固作用または上記のＰＣＩのａＰＣ不活化に対する阻害作用のどちらかを有しているものであってよいが、より好ましくは、これらの両方の活性を有している。すなわち本発明の抗体は、好ましくは血液およびａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を抑制する抗体である。
本発明の抗体は、例えばａＰＣの生理的阻害物質と相互作用するａＰＣ部位に結合する抗体であってよい。そのようなａＰＣのアミノ酸としては、例えばＥ２１５、Ｓ２１６、またはＳ３３６が同定されている（Ｓｈｅｎ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：２８５３−２８６０（２０００））。本発明の抗体は、ａＰＣ中のこれらのいずれかのアミノ酸あるいはその近傍（例えば１０アミノ酸以内の部位）に結合する抗体であってよい。このような抗体を作製するには、目的のａＰＣ部分を含むオリゴペプチドを合成し、それを抗原として動物に免疫して抗体を産生させればよい。なお、ａＰＣ活性部位として、Ｈ２１１、Ｄ２５７、およびＳ３６０が知られている（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４６７３−４６７７（１９８５））。これらのアミノ酸を含む領域に結合する抗体は、ａＰＣの活性を阻害する可能性があることから好ましくないと考えられる。
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水又は血清を採取する。腹水形成を促進するために、例えばプリスタン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）などを予め腹腔内投与することができる。
本発明で使用される抗体は、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、硫黄塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
また、本発明では、上記の方法にしたがって得られた抗体の遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。本発明は、本発明の抗体をコードする核酸および該核酸を有するベクターを提供する。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。本発明は、本発明の抗体を発現する細胞を提供する。本発明の抗体を発現する細胞としては、このような抗体遺伝子で形質転換された細胞、およびハイブリドーマが含まれる。
本発明の抗体としては、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体（表１）とエピトープが重複する（または同一の）抗体が特に好ましい。このような抗体を、本発明においては実質的に同じ部位に結合する抗体と呼ぶ。例えば、実施例に記載のモノクローナル抗体のエピトープを、ａＰＣの部分ペプチドなどを用いた公知のエピトープマッピング法により解析し、同定されたエピトープを含むペプチドを抗原に用いて、これに結合する抗体を調製することにより、上記モノクローナル抗体のａＰＣ結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体を得ることができる。このような抗体は、ａＰＣ活性の低下に対して実施例で単離した抗体と同様の抑制作用を発揮することが期待される。２つの抗体が抗原蛋白質と実質的に同じ部位に結合するかどうかは、例えば競合実験により決定することができる。具体的には、第一の抗ａＰＣ抗体とａＰＣとの結合が、第二の抗ａＰＣ抗体によって競合阻害を受けるとき、第一の抗体と第二の抗体は実質的に同じ抗原部位に結合していると判断される。このように、実施例で単離した抗体のａＰＣ結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体は本発明に含まれる。
また本発明の抗体には、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体（表１）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を含む抗体が含まれる。機能的に同等とは、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体のＣＤＲｓのアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を有し、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有することを言う。ＣＤＲとは抗体の可変領域（Ｖ領域とも言う）に存在する抗原への結合の特異性を決定している領域であり、Ｈ鎖とＬ鎖にそれぞれ３箇所ずつ存在し、それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と命名されている。ＣＤＲを挟むようにフレームワークと呼ばれるアミノ酸配列の保存性の高い４つの領域が介在する。ＣＤＲは他の抗体に移植することが可能であり、所望の抗体のフレームワークと組み合わせることにより組み換え抗体を作製することができる。また抗原に対する結合性を維持しながら１または数個のＣＤＲのアミノ酸を改変することが可能である。例えば、ＣＤＲ中の１または数個のアミノ酸を、置換、欠失、および／または付加することができる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ａｍｐ；Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、各ＣＤＲのアミノ酸の４０％以内であり、好ましくは３５％以内であり、さらに好ましくは３０％以内（例えば、２５％以内）である。アミノ酸配列の同一性は本明細書に記載したようにして決定すればよい。
本発明に含まれる抗体には、実施例に記載した＃７９、＃１２３、＃２８１、または＃２８５のＣＤＲｓと機能的に同等の相補性決定領域を含む抗体が含まれる。このような抗体としては、例えばＤＳＹＭＮ（配列番号：９）、ＥＶＹＰＥＴＧＮＳＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：１０）、およびＧＧＴＧＦＤＹ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを有する抗体が挙げられる。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。これらのＣＤＲを、所望のＨ鎖可変領域のフレームワークの間のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する位置に挿入すれば、本発明の抗体を作製することができる。上記の各ＣＤＲのアミノ酸は、適宜置換などにより改変してもよい。例えば、各ＣＤＲのアミノ酸を保存的に置換された抗体は本発明の抗体に含まれる。これらの抗体は、クローン＃７９と同等の活性を有することが期待される。
上記のＨ鎖ＣＤＲを含む抗体には、適宜抗体Ｌ鎖の可変領域を組み合わせて用いることができる。Ｌ鎖ＣＤＲとしては、例えばＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号：２１）、ＳＴＳＮＬＡＳＧＡＰＴ（配列番号：２２）、およびＹＨＲＳＰＦＴ（配列番号：２３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。また、これらのＬ鎖ＣＤＲｓは、上記のＨ鎖とは独立に用いてもよい。これらのＣＤＲは、所望のＬ鎖可変領域のフレームワークの間のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する位置に挿入される。上記の各ＣＤＲのアミノ酸は、適宜置換などにより改変してもよい。例えば、各ＣＤＲのアミノ酸を保存的に置換された抗体は本発明の抗体に含まれる。
具体的には、本発明の抗体には、以下のＨ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：９、１０、および１１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：９、１０、および１１の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：９の２個以内、配列番号：１０の８個以内、および配列番号：１１の３個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：９、１０、および１１とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
ここで（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：９のうち１個である。また好ましくは配列番号：１０の７個以内、さらに好ましくは６個以内、さらに好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２または１個である。また好ましくは配列番号：１１の２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
また本発明の抗体には、以下のＬ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：２１、２２、および２３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：２１、２２、および２３の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：２１の５個以内、配列番号：２２の５個以内、および配列番号：２３の３個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：２１、２２、および２３とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
ここで（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：２１の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：２２の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：２３の２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。特に、これらのＨ鎖相補性決定領域とＬ鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。
また本発明の抗体としては、（Ｓ／Ｒ）ＳＷＭＮ（配列番号：３１）、ＲＩＹＰＧＤＧＤ（Ｔ／Ｓ）（Ｎ／Ｉ）ＹＮＧＫＦ（Ｒ／Ｋ）Ｇ（配列番号：３２）、およびＷＧ（Ｉ／Ｓ）（Ｔ／Ｓ）（Ｔ／Ｇ）（Ａ／Ｓ）（Ａ／Ｓ）ＷＦＡＹ（配列番号：３３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを有する抗体が挙げられる。上記と同様に、それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する。このような抗体のＨ鎖ＣＤＲとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、ＣＤＲ１としてはＳＳＷＭＮ（配列番号：１２）またはＲＳＷＭＮ（配列番号：１８）、ＣＤＲ２としてはＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＲＧ（配列番号：１３）またはＲＩＹＰＧＤＧＤＳＩＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号：１９）、ＣＤＲ３としてはＷＧＩＴＴＡＡＷＦＡＹ（配列番号：１４）またはＷＧＳＳＧＳＳＷＦＡＹ（配列番号：２０）が挙げられる。具体的には、モノクローナル抗体＃１２３または＃２８５のＨ鎖のＣＤＲ１，２，および３の組み合わせを用いることができる。これらの抗体は、＃１２３または＃２８５と同等の活性を有することが期待される。この場合はＬ鎖ＣＤＲｓとして、例えばＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号：２４）、ＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳ（配列番号：２５）、およびＹＹＧ（Ｔ／Ｓ）Ｐ（Ｐ／Ｙ）Ｔ（配列番号：３４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。また、これらのＬ鎖ＣＤＲｓは、上記のＨ鎖とは独立に用いてもよい。Ｌ鎖ＣＤＲ３として好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、ＹＹＧＴＰＰＴ（配列番号：２６）またはＹＹＧＳＰＹＴ（配列番号：３０）が用いられるが、これらの配列には制限されない。
具体的には、本発明の抗体には、以下のＨ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：３１、３２、および３３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：３１、３２、および３３の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：３１の２個以内、配列番号：３２の８個以内、および配列番号：３３の５個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：３１、３２、および３３とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
ここで（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：３１の１個である。また好ましくは配列番号：３２の７個以内、さらに好ましくは６個以内、さらに好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２または１個である。また好ましくは配列番号：３３の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
また本発明の抗体には、以下のＬ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：２４、２５、および３４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：２４、２５、および３４の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：２４の５個以内、配列番号：２５の５個以内、および配列番号：３４の４個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：２４、２５、および３４とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
ここで（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：２４の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：２５の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：３４の３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。特に、これらのＨ鎖相補性決定領域とＬ鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。
また本発明の抗体としては、ＤＹＳＬＨ（配列番号：１５）、ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＴＹＡＤＤＬＫＧ（配列番号：１６）、およびＧＩＴＬＤＹ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを有する抗体が挙げられる。上記と同様に、それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する。これらの抗体は、＃２８１と同等の活性を有することが期待される。この場合はＬ鎖ＣＤＲとして、例えばＫＳＳＱＳＬＬＳＳＳＮＱＫＮＦＬＡ（配列番号：２７）、ＳＷＡＳＴＲＨＳＧＶＰＤ（配列番号：２８）、およびＹＹＲＹＰＬＴ（配列番号：２９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。
具体的には、本発明の抗体には、以下のＨ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：１５、１６、および１７に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：１５、１６、および１７の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：１５の２個以内、配列番号：１６の８個以内、および配列番号：１７の５個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：１５、１６、および１７とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：１５の１個である。また好ましくは配列番号：１６の７個以内、さらに好ましくは６個以内、さらに好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、さらに好ましくは３個以内である。また好ましくは配列番号：１７の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
また本発明の抗体には、以下のＬ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：２７、２８、および２９に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：２７、２８、および２９の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：２７の８個以内、配列番号：２８の５個以内、および配列番号：２９の３個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：２７、２８、および２９とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：２７の７個以内、さらに好ましくは６個以内、さらに好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：２８の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：２９の２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。特に、これらのＨ鎖相補性決定領域とＬ鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。
また本発明の抗体としては、配列番号：１、２、３、または４のアミノ酸配列からなる抗体Ｈ鎖可変領域またはこれらと機能的に同等の可変領域を有する抗体が挙げられる。この場合はＬ鎖として、それぞれ配列番号：５、６、７、または８のアミノ酸配列からなる可変領域またはこれらと機能的に同等の可変領域を持つＬ鎖を組み合わせることが好ましい。具体的には、本発明の抗体には、以下のＨ鎖可変領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：１、２、３、または４に記載のアミノ酸配列からなる可変領域。
（ｂ）配列番号：１、２、３、または４の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる可変領域。
（ｃ）配列番号：１、２、３、または４において１または複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる可変領域。
（ｄ）配列番号：１、２、３、または４とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる可変領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは３０個以内、さらに好ましくは２５個以内、さらに好ましくは２０個以内、さらに好ましくは１５個以内、さらに好ましくは１０個以内、さらに好ましくは５個以内である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
また本発明の抗体には、以下のＬ鎖可変領域を有する抗体であって、血液および／またはａＰＣ阻害物質によるａＰＣの不活性化を阻害する作用を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列からなる可変領域。
（ｂ）配列番号：５、６、７、または８の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる可変領域。
（ｃ）配列番号：５、６、７、または８において１または複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる可変領域。
（ｄ）配列番号：５、６、７、または８とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる可変領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは３０個以内、さらに好ましくは２５個以内、さらに好ましくは２０個以内、さらに好ましくは１５個以内、さらに好ましくは１０個以内、さらに好ましくは５個以内である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。特に、これらのＨ鎖可変領域とＬ鎖可変領城の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。
アミノ酸配列を改変するには、例えばアミノ酸配列を改変した可変領域をコードする複数のオリゴヌクレオチドを合成し、これらを基にＰＣＲにより可変領域をコードする核酸を生成させる。これを適当な発現ベクターに組み込んで発現させることにより、所望のＣＤＲを有する抗体を得ることができる。例えば、オリゴヌクレオチドの合成時に塩基を混合させて、ＣＤＲの特定の位置に様々なアミノ酸を有する抗体をコードするＤＮＡライブラリーを作製する。このライブラリーから、ａＰＣに結合しその活性抑制を阻害する抗体をコードするクローンを選択することによって、本発明の抗体を得ることができる。本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、該核酸を含むベクター、および該核酸または該ベクターを含む宿主細胞に関する。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター等の公知のベクターであってよい。宿主細胞は、バクテリア、酵母、昆虫、植物細胞、および哺乳動物細胞などが含まれる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体などが挙げられ、例えばヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体が挙げられる。このような抗体は、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体などの非ヒト抗体の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域に置き換えたものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照）。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入させたＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも含まれないアミノ酸残基を含んでいてもよい。通常、このようなアミノ酸残基の導入は、抗体の抗原認識・結合能力をより正確に至適化するために行われる。例えば必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の一部または全てのレパートリーを有するトランスジェニック（Ｔｇ）動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）；Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。このようなＴｇ動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物およびＴｇ動物の作製、およびこれらの動物同士の掛け合わせにより作り出す。免疫グロブリン重鎖遺伝子座の機能的な不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成でき、免疫グロブリン軽鎖（例えばκ鎖）の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は例えば所望の真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞である。
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考に実施することができる。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９，Ｓｆ２１，Ｔｎ５など、あるいはカイコなどの個体が挙げられる。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
本発明の抗体のアイソタイプとしては制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等が挙げられるが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭである。また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の断片又はその修飾物であってもよい。「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域を含む断片のことである。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または重鎖および軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などが挙げられる。従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきたが、現在では、遺伝子工学的に組み換え抗体として発現させること方法も公知である（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９１，９，１３２−１３７参照）。
「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含むものである。この領域は１つの重鎖および軽鎖の可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。即ち、重鎖と軽鎖をあわせて６つのＣＤＲが抗体の抗原結合部位として機能している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位を含む場合よりは低い親和性ではあるものの、抗原を認識し、結合する能力を有していることが知られている。従って、本発明における抗体断片はＦｖ断片が好ましいが、これに限定されるものではなく、重鎖または軽鎖のＣＤＲが保存され抗原を認識し、結合する能力を有する抗体の断片を含むポリペプチドであってよい。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常領域および重鎖の定常領域（ＣＨ１）を含む。例えば抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、１つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点でＦａｂ断片と異なるが、１つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片である点で構造的にＦａｂと同等である。本発明においては、プロテアーゼによる消化で生成した抗体断片と同一でなくても、パパイン消化により得られるものと同等な、１つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片をＦａｂ様抗体と称する。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常領城の１またはそれ以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を示すものである。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ部のシステインにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られている。抗体をペプシンで消化すると、２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。本発明において、ペプシン消化により得られるのも同等な、２つの抗原結合部位を有し抗原を交差結合し得る抗体断片をＦ（ａｂ’）２様抗体と称する。例えば、これらの抗体断片は組換技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片の形態に化学的結合させることもできる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。さらにまた別の方法としては、Ｆ（ａｂ’）２断片を直接、組換宿主培養物から単離することもできる。
さらに、本発明で使用される抗体は多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）であり得る。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。具体的には、結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ；Ｄｂ）は、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の抗体断片を指す（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号等）。一般にダイアボディは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）が、互いに結合できない位に短い、例えば、５残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため単鎖Ｖ領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは２つの抗原結合部位を有することとなる。このとき２つの異なる抗原（ａ、ｂ）に対するＶＬとＶＨをＶＬａ−ＶＨｂとＶＬｂ−ＶＨａの組合わせで５残基程度のリンカーで結んだものを同時に発現させると二種特異性Ｄｂとして分泌される。本発明の抗体としては、このようなＤｂであってもよい。
一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）は、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））参照。一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８８，８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖または重鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および軽鎖または軽鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
本発明は、本発明の抗体を含む、ＰＣまたはａＰＣの不活性化の抑制剤を提供する。また本発明は、本発明の抗体の、ＰＣまたはａＰＣの不活性化の抑制のための使用に関する。本発明の抗体をＰＣまたはａＰＣと接触させることにより、ＰＣＩまたはＡＡＴ等のａＰＣ阻害物質の存在下におけるＰＣまたはａＰＣの不活性化、または血中におけるＰＣまたはａＰＣの不活性化を抑制することができる。本発明は、本発明のａＰＣ抗体をＰＣまたはａＰＣと接触させる工程を含む、該ＰＣまたはａＰＣの不活性化を抑制する方法に関する。本発明の抗体を投与する場合、抗体は単独で投与することも可能であり、また、ＰＣおよび／またはａＰＣと併用することも可能である。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の抗体で処理したＰＣまたはａＰＣを投与することも可能である。また本発明は、本発明の抗体をＰＣまたはａＰＣに結合させる工程を含む、不活性化が抑制されたＰＣまたはａＰＣの製造方法、および該方法により製造された、不活性化が抑制されたＰＣおよびａＰＣを提供する。
ａＰＣは血液凝固および炎症を抑制する作用が知られており、本発明のａＰＣ非中和抗体を投与する工程により、血液凝固または炎症を抑制するａＰＣの効果を高めることが可能となる。本発明は、本発明の抗体を投与する工程を含む、血液凝固または炎症を抑制する方法に関する。該方法においては、さらにＰＣおよび／またはａＰＣを投与する工程を含んでもよい。この場合、ＰＣおよび／またはａＰＣに予め本発明の抗体を結合させておき、それを投与することが好ましい。本発明の抗体を有効成分として含有するａＰＣ不活性化の抑制剤を用いることにより、ａＰＣによる処置（例えば血栓症および敗血症等の予防および治療）におけるａＰＣの効果をより高めることが可能となる。なお本発明の抗体を「有効成分として含有する」とは、本発明の抗体を活性成分の少なくとも１つとして含むという意味であり、本発明の抗体の含有率を制限するものではない。本発明の抗体は、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に有用であり、その中でも血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患の予防および／または治療に特に有効である。そのような疾患としては、具体的には例えば動脈血栓症、静脈血栓症、播種性血管内凝固（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ＤＩＣ）症候群、敗血症等が挙げられる。
また本発明は、（ａ）本発明の抗体、および（ｂ）ＰＣおよび／またはａＰＣを含むキットを提供する。このキットは、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用することができる。さらに本発明は、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）ＰＣ、ａＰＣ、および本発明の抗体からなる群から選択される少なくとも一つ、および（ｂ）治療有効量のＰＣおよび／またはａＰＣと該抗体とを併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキットを提供する。このような疾患としては、上記のように血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患が挙げられ、具体的には動脈血栓症、静脈血栓症、ＤＩＣ、敗血症等が含まれる。本キットは、内因的ａＰＣあるいは生体外から投与したＰＣまたはａＰＣの体内における活性を相対的に上昇させるために有用であり、これにより上記疾患の予防および治療を行うことができる。記録媒体としては、紙およびプラスチックなどの印刷媒体、フレキシブルディスク（ＦＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、半導体メモリ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体など所望の記録媒体が挙げられる。典型的には、キットに添付される指示書などが挙げられ、そこに治療有効量のＰＣおよび／またはａＰＣと該抗体とを併用することが記載されているものであってよい。リンクとは、直接には治療有効量のＰＣおよび／またはａＰＣと該抗体とを併用することは記載されていないが、印などによって該記載と関連付けられていることを言い、その印を通して該記載にたどり着ける場合である。例えば指示書には別紙またはＵＲＬなどを参照するように指示または示唆する記載があり、別紙またはＵＲＬに該記載がある場合などが含まれる。
本発明の抗体は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗体はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の抗体は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体および／または添加物を供に含むものであってもよい。本発明は、本発明の抗体、ならびに医薬的に許容される担体および／または添加物を含む組成物（試薬および医薬を含む）に関する。例えば界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｏｓｌｏ  Ｅｄ．（１９８０）等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３）；ＥＰ第１３３，９８８号）。
また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングするか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターとして形成するか（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（ＷＯ９３／１７７０６等）して投与することができる。しかしながら、生体内において抗体が発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。
【図面の簡単な説明】  図１は、ａＰＣ不活化を抑制する抗ａＰＣ抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す図である。図中のアミノ酸配列は、ａＰＣ＃７９、ａＰＣ＃１２３、ａＰＣ＃２８１、およびａＰＣ＃２８５、のＶＨ領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１〜４、ａＰＣ＃７９、ａＰＣ＃１２３、ａＰＣ＃２８１、およびａＰＣ＃２８５、のＶＬ領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：５〜８とした。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  抗ヒトａＰＣモノクローナル抗体の作製
ａＰＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−２２００）を抗原としてＢＡＬＢ／ｃマウスに腹部への皮下投与にて免疫を行った。血清抗体価が上昇したことを確認した後、最終免疫として抗原を２０μｇ／ｍｏｕｓｅで尾静脈投与した。最終免疫の３日後に脾臓を摘出し脾臓細胞を調整した後Ｐ３Ｕ１細胞とｆｕｓｉｏｎを行い、２６４８ウェルの融合細胞を得た。
ｆｕｓｉｏｎ当日をＤａｙ０としてＤａｙ１，２，３，５にＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０，１０％  ＦＣＳ，０．１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，２％  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１，およびＨＡＴを含む）への培地交換を行い、ＨＡＴ培地によるハイブリドーマの選別を行った。Ｄａｙ８に培養上清を回収しＥＬＩＳＡによる１次スクリーニングを行った。
［実施例２］  １次スクリーニング
１次スクリーニングはａＰＣ（ＳＩＧＭＡ  Ｐ−２２００）を抗原としたＥＬＩＳＡにより行った。ａＰＣはｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．６，０．０２ｗ／ｖ％  ＮａＮ３）で０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、ＥＬＩＳＡ用９６ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に１００μＬ／ｗｅｌｌづつ分注し固相化した。プレートをｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｗａｓｈｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｏｄｅｌ  １５５０）を用いてｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ（−），０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ（１ｗ／ｖ％  ＢＳＡ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．１，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２ｗ／ｖ％  ＮａＮ３）を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で１時間放置した。Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒを除いた後、ハイブリドーマ培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で１時間反応させた。プレートをｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ  ６２−６５２２）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で１時間放置した。プレートをｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．８，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）で１ｍｇ／ｍＬに調製した基質（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ）（Ｓｉｇｍａ１０４）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１時間後にｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０）でＯＤ４０５／６５５ｎｍを測定した。
陽性対照としてａＰＣへの結合を示す市販の抗ａＰＣ抗体（ＳＩＧＭＡ  Ｐ７０５８）を用いた。陽性対照濃度が１１１ｎｇ／ｍＬで示した吸光度よりも高値を示した培養上清を陽性とした。２６４８ｗｅｌｌのハイブリドーマ培養上清を検討した結果、３０８ｗｅｌｌを陽性として選択した。
［実施例３］  ２次スクリーニング
ａＰＣは抗凝固作用により血漿凝固時間を延長させる作用を持つが、ａＰＣは血漿中で経時的に不活化されるため、血漿とインキュベートされる時間が長いほどこの作用は減弱する。抗体にこのａＰＣ不活化を抑制する作用があれば、血漿とインキュベートする前にａＰＣに加えることでａＰＣの抗凝固作用は保持される。逆に抗体がａＰＣ中和作用を持っていれば、ａＰＣの抗凝固作用は失われる。ここでは凝固時間の指標としてＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を用い、ハイブリドーマ培養上清によるａＰＣ不活化抑制作用を検討した。
１０μｇ／ｍＬのａＰＣ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ−２２００）溶液１０μＬと、４０μＬのハイブリドーマ培養上清（３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養）またはＰ３Ｕ１の培養上清とを混合し、室温で６０分インキュベートした。この混合液にヒト標準血漿（ＤＡＤＥ  ＢＥＨＲＩＮＧ、ＧＣＨ−１００Ａ）５０μＬを添加し、さらに室温で６０分間インキュベートした。血液凝固自動測定装置（Ａｍｅｌｕｎｇ、ＫＣ−１０Ａ）にセットし、ＡＰＴＴ試薬（ＤＡＤＥ  ＢＥＨＲＩＮＧ、ＧＡＡ−２００Ａ）５０μＬを添加した。血漿とインキュベーションを行わないａＰＣはＡＰＴＴ試薬添加直前に血漿に加えた。３７℃で３分間インキュベートした後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２（ＤＡＤＥ  ＢＥＨＲＩＮＧ、ＧＭＺ−３１０）５０μＬを添加し、凝固までの時間を測定した。
上記の血漿とインキュベートしなかったａＰＣを加えた場合の凝固時間（Ａ）を１００％、Ｐ３Ｕ１培養上清とインキュベートした後に血漿とインキュベートしたａＰＣを加えた場合の凝固時間（Ｂ）を０％とし、ハイブリドーマ培養上清とインキュベート後に血漿とインキュベートしたａＰＣを加えた場合の凝固時間（Ｃ）からハイブリドーマ培養上清の凝固時間延長に対する作用を求めた（不活化抑制率（％）＝｛（Ｃ−Ｂ）／（Ａ−Ｂ）｝ｘ１００）
実験は２回行い（実験１および２）、２０％以上の凝固時間回復が２回とも認められた場合を陽性とした。１９株のハイブリドーマ培養上清が陽性とみなされた。
2004009641.tif 000002
［実施例４］  抗体精製及びＰＣＩによるａＰＣ不活化に対する作用検討
ウェル番号１９，４１，６４，７９，２８１，２９８のハイブリドーマを１０％  ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ含有ＨＡＴ培地で培養した培養上清よりＩｇＧ画分をｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎにより精製し、ＰＣＩのａＰＣ不活化に対する作用を低分子基質を用いて測定した。
具体的には、１０％  ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ含有ＨＡＴ培地５０ｍＬで培養したハイブリドーマの培養上清を回収した。培養上清はｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎ）に吸着させた。Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．０）１０ｍＬで洗浄した後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ２．７）で溶出した。回収したＩｇＧ画分はＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＹＭ−３０）を用いて濃縮した後、ＴＢＳにｂｕｆｆｅｒを置換した。得られたＩｇＧ画分４０μＬと１０μｇ／ｍＬのａＰＣ溶液１０μＬを室温で６０分間反応させた。ａＰＣと抗体の混合液５０μＬをヘパリン１０Ｕを含むｂｕｆｆｅｒ（最終濃度：７０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２，０．１％  ＢＳＡ）に加え１８０μＬとした。組み換えＰＣＩ（Ｆｌａｇタグ付き）１００μｇ／ｍＬを２０μＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。低分子基質Ｓ−２３６６（２ｍｍｏｌ／Ｌ）５０μＬを添加し、６０分後の吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。
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ＰＣＩ未添加ａＰＣ（表中の″−ＰＣＩ″）では吸光度が０．７０７となるところがＰＣＩの添加により０．２６２まで減少した（表中の″対照″）。ＰＣＩの添加によるａＰＣ活性を０％、ＰＣＩ未添加のａＰＣ活性を１００％として各ハイブリドーマ由来の抗体の相対活性を吸光度の平均値を基にもとめたところ、ウェル番号７９で２１％、２８１で１７％、４１で１２％とＰＣＩによるａＰＣ不活化を抑制した。ａＰＣ不活化を全く抑制しなかった２９８は培養上清のアイソタイピングによりＩｇＭである可能性が示唆された。そのため、ＩｇＧ精製では活性画分が得られなかった可能性がある。以上の精製抗体と低分子基質を用いたｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙにより、血漿凝固時間延長作用を有するａＰＣ不活化抑制抗体は、ＰＣＩによる不活化も抑制することが明らかとなった。
［実施例５］  抗ａＰＣ不活化抑制抗体のＨ鎖及びＬ鎖の解析
各抗体を産生するハイブリドーマ約１×１０７個の細胞よりＲｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７４９０４）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋｌ８１１−１）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡの合成を行った。＃２８１、＃２８５はＩｇＧ１の定常領域特異的なｐｒｉｍｅｒ、また＃７９、＃１２３はＩｇＧ２ｂの定常領域特異的なｐｒｉｍｅｒを用いてＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔにて５’−ＲＡＣＥによるＰＣＲを行い、Ｈ鎖及びＬ鎖の増幅を行った。増幅されたＨ鎖及びＬ鎖のＤＮＡ断片はｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）を用いてクローニングし、塩基配列の決定を行った。
得られた塩基配列を解析した結果、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ図１に示したようになった。＃１２３と＃２８５は類似した配列を有しておりこれら２クローンはお互いのエピトープが近傍にあることが予測された。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、ａＰＣの不活性化を抑制する非中和抗ａＰＣ抗体が提供された。本発明の抗体は、ａＰＣの不活性化を抑制することを通してａＰＣの活性を維持し、血液凝固系の活性化の抑制または抗炎症作用などのａＰＣの生理活性の効果を持続させる働きを有する。本発明の抗体は、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患または傷害の予防または治療に用いることができ、特に血栓症および敗血症などのａＰＣによる予防および治療において有用である。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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