(57)【要約】ヒトグリオーマ等の癌の診断や治療に有用な癌抑制遺伝子あるいは癌遺伝子を同定し、ヒトグリオーマ等の癌の診断方法や診断薬、ヒトグリオーマ等の癌の治療方法や治療薬を提供するものである。ヒトグリオーマ又はヒトグリオーマ細胞株由来のジェノミックＤＮＡと、正常組織由来のジェノミックＤＮＡとにおけるＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化の程度を比較し、ＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子や、ＨＯＸＤ９遺伝子等の癌遺伝子をスクリーニングする。これら癌抑制遺伝子又は癌遺伝子を標的とすることで、ヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療を実施する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトグリオーマ又はヒトグリオーマ細胞株由来のジェノミックＤＮＡと、正常組織由来のジェノミックＤＮＡとにおけるＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化の程度を比較することを特徴とする癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２】
癌抑制遺伝子又は癌遺伝子が、ヒトグリオーマの癌抑制遺伝子又は癌遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項３】
ヒトグリオーマの癌抑制遺伝子が、ＲＦＸ１遺伝子又はＢＧＴ−１遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＲＦＸ１遺伝子として、ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンを用いることを特徴とする請求項３記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項５】
ヒトグリオーマの癌遺伝子が、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ９又はＨＯＸＣ９等のＨＯＸ遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子の、メチル化の程度、遺伝子変異の有無、遺伝子発現の程度、タンパク質発現の程度の少なくともいずれか１つを測定することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子の、メチル化の程度、遺伝子変異の有無、遺伝子発現の程度、タンパク質発現の程度の少なくともいずれか１つを測定することができる試薬を備えたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断薬。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子を癌細胞で発現させるか、あるいは、前記癌抑制遺伝子の発現産物、メチル基転移酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の少なくともいずれか１つを癌患者に投与することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子、前記癌抑制遺伝子の発現産物、メチル基転移酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の少なくともいずれか１つを含有することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療薬。
【請求項１０】
請求項１、２又は５記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌遺伝子の発現抑制剤又は該癌遺伝子の発現産物に特異的に結合するペプチド・タンパク質等の化合物を癌患者に投与することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療方法。
【請求項１１】
請求項１、２又は５記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌遺伝子の発現抑制剤又は該癌遺伝子の発現産物に特異的に結合するペプチド・タンパク質等の化合物を含有することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療薬。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療方法。
【請求項１３】
ＲＦＸ１遺伝子又はＨＯＸ遺伝子群を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療薬。
【請求項１５】
ＲＦＸ１遺伝子又はＨＯＸ遺伝子群を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトの悪性脳腫瘍であるグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法、ヒトグリオーマ等の癌の診断方法・診断薬、ヒトグリオーマ等の癌の治療方法・治療薬に関する。
背景技術
癌の発生と進展には癌遺伝子や癌抑制遺伝子の異常が深く関係している。とくにｐ５３などの癌抑制遺伝子が遺伝子の発現を調節するマスター遺伝子であることが明らかとなり、癌抑制遺伝子の異常は癌化において極めて重要な役割を果たしていると考えられている。最近、癌の発症にＤＮＡメチル化が関わることが報告されている（Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７２，１４１−１９６，１９９８）。また、癌抑制遺伝子の不活性化の機構として、ジェノミックＤＮＡの異常メチル化が注目されている。遺伝子の近傍５′部位のＣｐＧ配列に富む領域はＣｐＧアイランドと呼ばれ、通常ヒトゲノム中のＣｐＧ配列の多くはメチル化されているが、正常組織におけるＣｐＧアイランド中のＣｐＧ配列は、遺伝子の発現の有無にかかわらずメチル化を受けていない。しかし、癌においてはＣｐＧアイランドがメチル化され、様々な遺伝子の発現が抑制・消失している。メチル化されたＣｐＧアイランドにはＭｅＣＰ２（ｍｅｔｈｙｌ  ＣｐＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ２）と呼ばれるメチル化ＣｐＧ結合タンパク質が結合し、ヒストン脱アセチル化酵素やクロマチン再構築因子の複合体をメチル化領域にリクルートする。その結果、周辺のクロマチン構造が縮合型に変化し、ＲＮＡポリメラーゼや転写因子がプロモーター領域に入っていけなくなるため、転写発現が低下する（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２５，２１７−２２２，１９９９）。
近年、メチル化されているＣｐ（；アイランドを同定する手法として、メチル化感受性制限酵素Ｎｏｔ  Ｉを利用したＲＬＧＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｌａｎｄｍａｒｋ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）法が開発されている。
本発明の課題は、ヒトグリオーマ等の癌の診断や治療に有用な癌抑制遺伝子あるいは癌遺伝子を同定し、ヒトグリオーマ等の癌の診断方法や診断薬、ヒトグリオーマ等の癌の治療方法や治療薬を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、メチル化感受性制限酵素を用いたＲＬＧＳ法により、グリオーマにおけるメチル化の異常を解析し、グリオーマにおけるＲＦＸ１およびＢＧＴ−１遺伝子の発現が減少あるいは消失することや、ＨＯＸＤ９遺伝子が異所性にグリオーマにおいて発現していることなどを見い出した。この結果、上記ＲＬＧＳ法で同定された遺伝子のグリオーマを含む癌の診断、治療薬としての有用性が明らかになり、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、ヒトグリオーマ又はヒトグリオーマ細胞株由来のジェノミックＤＮＡと、正常組織由来のジェノミックＤＮＡとにおけるＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化の程度を比較することを特徴とする癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法（請求項１）や、癌抑制遺伝子又は癌遺伝子が、ヒトグリオーマの癌抑制遺伝子又は癌遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法（請求項２）や、ヒトグリオーマの癌抑制遺伝子が、ＲＦＸ１遺伝子又はＢＧＴ−１遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法（請求項３）や、ＲＦＸ１遺伝子として、ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンを用いることを特徴とする請求項３記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法（請求項４）や、ヒトグリオーマの癌遺伝子が、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ９又はＨＯＸＣ９等のＨＯＸ遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法（請求項５）や、請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子の、メチル化の程度、遺伝子変異の有無、遺伝子発現の程度、タンパク質発現の程度の少なくともいずれか１つを測定することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断方法（請求項６）や、請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子の、メチル化の程度、遺伝子変異の有無、遺伝子発現の程度、タンパク質発現の程度の少なくともいずれか１つを測定することができる試薬を備えたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断薬（請求項７）や、請求項１〜４のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子を癌細胞で発現させるか、あるいは、前記癌抑制遺伝子の発現産物、メチル基転移酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の少なくともいずれか１つを癌患者に投与することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療方法（請求項８）や、請求項１〜４のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子、前記癌抑制遺伝子の発現産物、メチル基転移酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の少なくともいずれか１つを含有することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療薬（請求項９）や、請求項１、２又は５記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌遺伝子の発現抑制剤又は該癌遺伝子の発現産物に特異的に結合するペプチド・タンパク質等の化合物を癌患者に投与することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療方法（請求項１０）や、請求項１、２又は５記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌遺伝子の発現抑制剤又は該癌遺伝子の発現産物に特異的に結合するペプチド・タンパク質等の化合物を含有することを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の治療薬（請求項１１）や、請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療方法（請求項１２）や、ＲＦＸ１遺伝子又はＨＯＸ遺伝子群を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療方法（請求項１３）や、請求項１〜５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療薬（請求項１４）や、ＲＦＸ１遺伝子又はＨＯＸ遺伝子群を標的としたことを特徴とするヒトグリオーマ等の癌の診断又は治療薬（請求項１５）に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子のスクリーニング方法としては、ヒトグリオーマ又はヒトグリオーマ細胞株由来のジェノミックＤＮＡと、正常組織由来のジェノミックＤＮＡとにおけるＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化の程度を比較する方法であれば特に制限されるものではなく、上記スクリーニングの対象となる癌抑制遺伝子としては、ＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等のヒトグリオーマなどの癌抑制遺伝子を挙げることができ、癌遺伝子としては、ＨＯＸ（ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ９等）遺伝子等のヒトグリオーマなどの癌遺伝子を挙げることができる。また、上記ＲＦＸ１遺伝子として、ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンを特に有利に用いることができる。
ＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化の状態を調べる方法としては、メチル化感受性制限酵素を用いる方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，２２５５−２２６４，１９９８）、ヒドラジンや過マンガン酸や重亜硫酸ナトリウムによる化学修飾を用いる方法、メチル化ＤＮＡに特異的な抗体を用いた免疫学的方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，２２５５−２２６４，１９９８）、ＭｅＣＰ２などのＭＢＤ（ｍｅｔｈｙｌ−ＣｐＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を用いたアフィニティ・カラム法およびＤＧＧＥ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，２９１３−２９１８，１９９９）など、公知の方法を含め、ＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化の程度を調べる方法であれば特に制限されないが、メチル化感受性酵素Ｎｏｔ  Ｉを用いたＲＬＧＳ解析を好適に挙げることができる。
本発明のヒトグリオーマ等の癌の診断方法としては、上記のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子を標的とした癌の診断方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＲＦＸ１遺伝子等の上記癌抑制遺伝子、又はＨＯＸ遺伝子群等の癌遺伝子の、メチル化の程度、遺伝子発現の有無、遺伝子発現の程度、タンパク質発現の程度の少なくともいずれか１つを測定する方法を挙げることができる。特に、ＲＦＸ１遺伝子、好ましくはＲＦＸ１遺伝子第７イントロンは、ヒトグリオーマの診断方法において有用である。上記メチル化の程度を測定する方法としては、前記ＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化の状態を調べる方法を例示することができ、遺伝子発現の有無を調べる方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法やＤＮＡシーケンスを比較する方法を例示することができ、遺伝子発現の程度を測定する方法としては、前記癌抑制遺伝子又は癌遺伝子に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ法等を例示することができ、タンパク質発現の程度を測定する方法としては、前記癌抑制遺伝子又は癌遺伝子の発現産物に対するモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロット法等を例示することができる。かかる診断方法に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるジェノミックＤＮＡや、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はタンパク質を具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
本発明のヒトグリオーマ等の癌の診断薬としては、上記のスクリーニング方法により得られるヒトグリオーマ等の癌抑制遺伝子又は癌遺伝子を標的とした癌の診断薬であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＲＦＸ１遺伝子等の上記癌抑制遺伝子、又はＨＯＸ遺伝子群等の癌遺伝子の、メチル化の程度、遺伝子発現の有無、遺伝子発現の程度、タンパク質発現の程度の少なくともいずれか１つを測定することができる試薬を備えたものを挙げることができる。特に、ＲＦＸ１遺伝子、好ましくはＲＦＸ１遺伝子第７イントロンは、ヒトグリオーマの診断薬において有用である。上記メチル化の程度を測定することができる試薬としては、例えばメチル化感受性酵素とＲＬＧＳ解析用試薬を例示することができ、遺伝子発現の有無を測定することができる試薬としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析用試薬を例示することができ、遺伝子発現の程度を測定することができる試薬としては、前記癌抑制遺伝子又は癌遺伝子に特異的なプライマーとＲＴ−ＰＣＲ用試薬等を例示することができ、タンパク質発現の程度を測定することができる試薬としては、前記癌抑制遺伝子又は癌遺伝子の発現産物に対するモノクローナル抗体と標識化２次抗体等のウエスタンブロット用試薬などを例示することができる。
本発明のヒトグリオーマ等の癌の治療方法としては、上記のスクリーニング方法により得られるＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の治療方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のヒトグリオーマ等の癌の治療薬としては、上記のスクリーニング方法により得られるＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の治療方法であれば特に制限されるものではないが、上記ＲＦＸ１遺伝子は、ヒトグリオーマの治療方法や治療薬において特に有用である。上記ＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の治療方法としては、例えば、ＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子を癌細胞で発現させるか、あるいは、前記癌抑制遺伝子の発現産物、メチル基転移酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の少なくともいずれか１つを癌患者に投与する方法を挙げることができる。また、上記ＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の治療薬としては、例えば、ＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子、好ましくは癌抑制遺伝子を含む発現ベクター、あるいは、前記癌抑制遺伝子の発現産物、メチル基転移酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の少なくともいずれか１つを含有するものであれば特に制限されるものではない。
遺伝子治療として、上記ＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子を含む発現ベクターを局所投与する場合、前記癌抑制遺伝子の発現産物を有効成分とする治療薬を局所投与する場合に比べて、癌抑制遺伝子の安定した発現により、癌抑制遺伝子の発現産物を局所に安定的に供給することが可能になる。例えば、発現ベクターを用いて、ヒトグリオーマ細胞へ癌抑制遺伝子を導入することにより、所定の期間の安定した発現を得ることができる。このようなベクターとしては、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター等のウイルスベクターを好適に挙げることができるが、これらウイルスベクターの中でもＨＳＶベクターやＣＭＶベクターが好ましい。特に、ＨＳＶベクターは、ＨＳＶが細胞のジェノミックＤＮＡに組み込まれないため安全であり、また、導入遺伝子の発現期間を調節することが可能である。また、これら癌抑制遺伝子を含む発現ベクターは、常法により調製することができる。
ヒトグリオーマの治療薬としてのメチル基転移酵素阻害剤としては、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシトジン、Ｓ−アデノシルホモシステイン等の化合物を挙げることができ、また、ヒトグリオーマの治療薬としてのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、酪酸、微生物代謝産物のトリコスタチンＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７１７４−１７１７９，１９９０）やトラポキシン（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２２４２９−２２４３５，１９９３）、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，３３５６−３３６１，１９９８）、フェニル酪酸（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９０（２１），１６２１−１６２５，１９９８）、ＦＲ−９０１２２８（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４１，１２６−１３３，１９９８）、ＭＳ−２７−２７５（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，４５９２−４５９７，１９９９）、ベンズアミド誘導体（特開平１１−３３５３７５号広報）、ジチオール誘導体（特開２００１−３５４６９４号広報）などの化合物を挙げることができる。
本発明の他の態様のヒトグリオーマ等の癌の治療方法としては、上記のスクリーニング方法により得られるＨＯＸ遺伝子等の癌遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の治療方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の他の態様のヒトグリオーマ等の癌の治療薬としては、上記のスクリーニング方法により得られるＨＯＸ遺伝子等の癌遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の治療薬であれば特に制限されるものではない。上記ＨＯＸ遺伝子等の癌遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の治療方法としては、上記癌遺伝子の発現抑制剤や上記癌遺伝子の発現産物に特異的に結合するペプチド・タンパク質等の化合物を癌患者に投与する方法を挙げることができ、また、本発明の他の態様のヒトグリオーマ等の癌の治療薬としては、上記癌遺伝子の発現抑制剤や上記癌遺伝子の発現産物に特異的に結合するペプチド・タンパク質等の化合物を含有するものであれば特に制限されるものではない。
上記癌遺伝子の発現抑制剤としては、例えば癌遺伝子ＤＮＡ又はそのｍＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を挙げることができるが、２０ｂｐ以上からなるＤＮＡ又はＲＮＡが好ましい。かかるアンチセンス鎖の局所への投与は、前記のようにウイルスベクターを用いることができるが、ヒトグリオーマ等の癌細胞に対するモノクローナル抗体を用いることにより、選択的にグリオーマ等にアンチセンス鎖を導入させることもできる。また、上記癌遺伝子の発現産物に特異的に結合するペプチド・タンパク質等の化合物としては、癌遺伝子の発現産物に対するモノクローナル抗体等の抗体やその可変領域などを挙げることができる。
上記本発明の癌の治療薬には、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を適宜添加することができる。またかかる治療薬は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口に局所に投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。本発明のこれら治療薬の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度およびその他の条件により適宜選択されるが、通常有効成分化合物の量としては、体重１ｋｇ当り、１日約０．０００１〜１００ｍｇ程度とするのがよい。また投与単位形態の製剤中には有効成分化合物が約０．００１〜１，０００ｍｇの範囲で含有されることが望ましい。
以上、本発明の癌の診断・治療方法、診断・治療薬における癌がヒト悪性脳腫瘍であるヒトグリオーマについて主として述べてきたが、本発明の対象となる癌はグリオーマに限定されるものでなく、ヒトのグリオーマの他、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌などを例示することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［材料と方法］
実施例１Ａ（細胞株、腫瘍）
ヒトグリオーマ細胞株であるＴ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、Ａ１７２はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から、Ｕ２５１、ＧＩ−１は理研ジーンバンクから購入したものを用いた。これらのグリオーマ細胞株は牛胎児血清を１０％添加したＤＭＥＭ培地を用いて培養した。ヒトグリオーマ組織（ＧＢ４、ＧＢ１３、ＧＢ１６、ＧＢ１７、ＧＢ２６、ＧＢ３０）は同意を得られた患者の手術時に摘出された病変の一部を用いた。ヒトグリオーマ組織（ＧＢ２６及びＧＢ３０）、同患者の血液、また同意を得た健常人の血液から高分子量のジェノミックＤＮＡを調製した。
実施例１Ｂ（メチル化感受性酵素Ｎｏｔ  Ｉを用いたＲＬＧＳ解析）
基本的にＲＬＧＳは林崎らの方法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１６，１９９５）に従って行った。腫瘍組織および血液から抽出されたジェノミックＤＮＡをメチル化感受性酵素Ｎｏｔ  Ｉで切断した後、末端を３２Ｐにて標識した。さらに制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩで切断した後、アガロースゲルを用いて一次元目の電気泳動を行った。続いて、アガロースゲルを制限酵素Ｐｓｔ  Ｉを含む溶液中で酵素処理を行った後、ポリアクリルアミドゲルを用いて二次元目の電気泳動を行った。泳動後、ポリアクリルアミドゲルを乾燥させて、オートラジオグラフィーを行い、標識されたＤＮＡ断片を可視化した。
実施例１Ｃ（ＤＮＡ断片の単離とジェノミック・シークエンシング）
ヒトグリオーマ由来ＤＮＡと同じ患者の血液由来ＤＮＡとのＲＬＧＳプロファイルを比較して、グリオーマ２例で共通して発現が減少あるいは消失していたスポットを、ヒト胎盤由来ＤＮＡのＲＬＧＳゲルから単離した。切り出したＤＮＡ断片をゲルから溶出後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによりＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡをＮｏｔ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉアダプターと結合させて、アダプターに特異的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。シークエンス反応はＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。ＤＮＡが微量で直接シークエンスができなかった場合、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にサブクローニングした後、シークエンシングを行った。得られた配列をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースを利用して、塩基配列の相同性を解析した。
実施例１Ｄ（ＲＮＡ調製とＲＴ−ＰＣＲ）
ヒトグリオーマ組織（ＧＢ４、ＧＢ１３、ＧＢ１６、ＧＢ１７）とヒトグリオーマ細胞株由来の全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（ギブコ社製）を用いて抽出し、正常組織の全ＲＮＡはクローンテック社より購入した。ｃＤＮＡの合成は１０μｇの全ＲＮＡより、逆転写酵素ＸＬ（ＡＭＶ）（宝酒造社製）を用いて行い、最終量は１００μｌとした。１μｌのｃＤＮＡ鋳型を用いてＴａｋａｒａ  ＴａｑＴＭ（宝酒造社製）を用いて総量２５μｌの系でＰＣＲを行った。反応液には２．５μｌの１０×ＰＣＲ−Ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］と２μｌのｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）と、０．１μＭのプライマーを添加した。
プライマーの塩基配列としては、ＲＦＸ１遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  Ｃ−３’（配列番号１）］とアンチセンスプライマー［５’−ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＴＣＣ−３’（配列番号２）］を用い、ＨＯＸＡ９遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＡＡ−３’（配列番号３）］とアンチセンスプライマー［５’−ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  Ｃ−３’（配列番号４）］を用い、ＨＯＸＢ９遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＧＧ−３’（配列番号５）］とアンチセンスプライマー［５’−ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  Ｇ−３’（配列番号６）］を用い、ＨＯＸＣ９遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡ−３’（配列番号７）］とアンチセンスプライマー［５’−ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＴＡＧ  ＧＡＣ−３’（配列番号８）］を用い、ＨＯＸＤ９遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＣＣＣ−３’（配列番号９）］とアンチセンスプライマー［５’−ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  Ｃ−３’（配列番号１０）］を用い、ＨＯＸＤ８遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号１１）］とアンチセンスプライマー［５’−ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号１２）］を用い、ＢＧＴ−１遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＧＡＧ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  Ｃ−３’（配列番号１３）］とアンチセンスプライマー［５’−ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  Ｃ−３’（配列番号１４）］を用い、ＧＡＰＤＨについてはセンスプライマー［５’−ＴＧＡ  ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  Ｇ−３’（配列番号１５）］とアンチセンスプライマー［５’−ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＡ−３’（配列番号１６）］を用い、β−ａｃｔｉｎについてはセンスプライマー［５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＴＧＣ−３’（配列番号１７）］とアンチセンスプライマー［５’−ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  Ｇ−３’（配列番号１８）］を用いた。
また、ＰＣＲは以下の反応条件で行った。
▲１▼ＲＦＸ１については、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、５７℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反応させるというサイクルを３０回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。
▲２▼ＨＯＸＡ９、Ｂ９及びＣ９については、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、６２℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反応させるというサイクルを３５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。
▲３▼ＨＯＸＤ９については、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、５７℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反応させるというサイクルを３５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。
▲４▼ＨＯＸＤ８については、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、５８℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間伸長反応させるというサイクルを３５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。
▲５▼ＢＧＴ１については、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、６５℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間伸長反応させるというサイクルを３５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。
▲６▼ＧＡＰＤＨについては、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、５８℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反応させるというサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。
▲７▼β−ａｃｔｉｎについては、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、６８℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間伸長反応させるというサイクルを２０回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。
得られた各ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して解析した。
さらにＨＯＸＤ群遺伝子のグリオーマにおける発現を網羅的に解析した。プライマーの塩基配列としては、ＨＯＸＤ１遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＣＴＣ−３’（配列番号２３）］とアンチセンスプライマー［５’−ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＴＧ−３’（配列番号２４）］を用い、ＨＯＸＤ３遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ−３’（配列番号２５）］とアンチセンスプライマー［５’−ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  Ｔ−３’（配列番号２６）］を用い、ＨＯＸＤ４遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＧ−３’（配列番号２７）］とアンチセンスプライマー［５’−ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＣＡ−３’（配列番号２８）］を用い、ＨＯＸＤ９遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＣＣＣ−３’（配列番号９）］とアンチセンスプライマー［５’−ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  Ｃ−３’（配列番号１０）］を用い、ＨＯＸＤ１０遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＣＧＡ  ＡＧＡ−３’（配列番号２９）］とアンチセンスプライマー［５’−ＴＣＧ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  Ｃ−３’（配列番号３０）］を用い、ＨＯＸＤ１３遺伝子についてはセンスプライマー［５’−ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号３１）］とアンチセンスプライマー［５’−ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＡＧ−３’（配列番号３２）］を用いた。また、ＰＣＲ反応条件は次の通りである：９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、各ＴＭ値で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反応させるというサイクルを３５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。各ＴＭ値は、ＨＯＸＤ１及びＤ３が６０℃、ＨＯＸＤ４が６６℃、ＨＯＸＤ９が５７℃、ＨＯＸＤ１０が６７℃、ＨＯＸＤ１３が７０℃である。
実施例１Ｅ（５−アザシチジン及びトリコスタチンＡ処理）
ヒトグリオーマ細胞株を低密度で培養し、２４時間後に５−アザシチジン（メチル基転移酵素阻害剤）（シグマ社製）を５００ｎＭになるように加えた。５−アザシチジン入りの培養液は２４時間ごとに取り替え、３日間培養し、最後の２４時間にトリコスタチンＡ（ヒストン脱アセチル化阻害剤）（和光社製）を５０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。その後Ｔｒｉｚｏｌを用いて全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲを行い、各薬剤による遺伝子発現の変化を解析した。
実施例１Ｆ（バイサルファイト・ジェノミック・シークエンシング）
１μｇのジェノミックＤＮＡから、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）を用いて、バイサルファイト変換を行った。この過程で非メチル化シトシンはウラシルに変化し、メチル化シトシンは変化しない。処理したＤＮＡは５０μｌの蒸留水に溶解させ、これを鋳型として、ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンに特異的なプライマーを用いてまず１回目のＰＣＲを行った。ここで用いたプライマー配列は以下の通りである。ＲＦＸ１−第７イントロンセンスプライマー１：５’−ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＴＴＴ−３’（配列番号１９）、ＲＦＸ１−第７イントロンアンチセンスプライマー１：５’−ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＡＡ−３’（配列番号２０）。ＰＣＲ反応条件は次の通りである：９８℃で５分間変性させた後、９８℃で１分間変性させ、５０℃で２分間アニーリングし、７２℃で２分間伸長反応させるというサイクルを４５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。さらに１回目のＰＣＲ産物を用いて、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。鋳型としては１回目のＰＣＲ産物を２５倍希釈したものを１μｌ用いた。プライマー配列は次の通りである。ＲＦＸ１−第７イントロンセンスプライマー２：５’−ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ−３’（配列番号２１）、ＲＦＸ１−第７イントロンアンチセンスプライマー２：５’−ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＡＣＡ−３’（配列番号２２）。また、ＰＣＲの条件は次の通りである：９８℃で５分間変性させた後、９８℃で１分間変性させ、５０℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反応させるというサイクルを４５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。このＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にサブクローニングした後、Ｔ７プライマーを用い、シークエンシングを行った。
以上のバイサルファイト・ジェノミック・シークエンシングを用いて、ヒトグリオーマ細胞株（Ｕ２５１、ＧＩ−１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ）、ヒトグリオーマ組織（４例）、正常ヒト脳組織（２例）及び正常ヒトリンパ球（３例）の各ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのＣｐＧのメチル化の解析を行った。図８ａ，ｂに第７イントロンのＣｐＧを示す。１回目のＰＣＲ条件を、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、４８℃で２分間アニーリングし、７２℃で２分間伸長反応させるというサイクルを４５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行うこと、及び２回目のＰＣＲ条件を、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分間変性させ、５０℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反応させるというサイクルを４５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行うこと以外は、上記バイサルファイト・ジェノミック・シークエンシングと同様に実施した。
実施例１Ｇ（ルシフェラーゼアッセイ）
ＲＦＸ１の第７イントロンをＰＣＲにより単離し、ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）に組み込んだ。ここでのＰＣＲにおけるプライマー配列として、センスプライマー：５’−ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  Ｇ−３’（配列番号３３）、アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  Ｇ−３’（配列番号３４）を用いた。また、ＰＣＲ反応条件は次の通りである：９８℃で５分間変性させた後、９８℃で１分間変性させ、６８℃で２分間アニーリングし、７２℃で２分間伸長反応させるというサイクルを４０回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長反応を行った。得られたプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳＴＭＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、Ｕ２５１グリオーマ細胞に遺伝子導入し、遺伝子導入から４８時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイにはＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いた。ルシフェラーゼによって生じる生物発光はＷａｌｌａｃ  ＡＲＶＯＴＭＳＸ  １４２０  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて検出した。
実施例１Ｈ（グリオーマ細胞の増殖抑制試験）
ＲＦＸ１遺伝子をＵ２５１グリオーマ細胞に遺伝子導入するためのベクターとして、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｖｅｃｔｏｒ（シグマ社製）を用いた。ＲＦＸ１遺伝子は  Ｗ．Ｒｅｉｔｈ氏から提供を受けた。遺伝子導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳＴＭＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。グリオーマ細胞の増殖の解析は、細胞のチミジンの取り込み能により行った。具体的には、遺伝子導入から２４時間後、９６ウェルプレートの各ウェルに５０００個の細胞を加え、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養し、続いて１ウェルにつき１μＣｉの［３Ｈ］チミジンを加え、さらに２４時間後細胞を回収し、トップカウンターを用いて［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。
実施例２［結果］
実施例２Ａ（ＲＬＧＳプロファイル）
図１Ａに示すように、ＲＬＧＳプロファイル上には約２５００のスポットが観察されるが、今回は最も分解能が高い中心部の約４００スポットを２例のグリオーマ（ＧＢ２６およびＧＢ３０）と正常（それぞれ対応した患者血液）で比較解析した。この解析ではメチル化ＤＮＡを切断しないＮｏｔ  ＩをランドマークにＲＬＧＳを行ったため、正常と比較して異常にメチル化されたＤＮＡ領域に対応するスポットは消失あるいは信号が減弱する。本解析の結果、グリオーマ２例において共通して欠失および信号強度の減少した１２個のスポットを同定した（図１Ｂおよび表１）。
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実施例２Ｂ（グリオーマにおいてメチル化されたＤＮＡ断片の単離と同定）
グリオーマのＲＬＧＳプロファイルにおいて欠失していた１２個のスポットを胎盤のＲＬＧＳトラッパーゲルから単離し、シークエンシングを行った結果、解析可能であった全てのクローン（１１個）は、％ＧＣとＣｐＧ  ｒａｔｉｏ｛（ＣｐＧｓの数）／（グアニンの数）（シトシンの数）｝×（解析塩基数）の結果からＣｐＧアイランドに相当することが明らかになった（表１）。さらにこれら単離されたＣｐＧアイランド近傍の遺伝子を検索するためＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈを行ったところ、７つの遺伝子が同定された。例えばクローン１のＤＮＡ断片は、１９番染色体のＲＦＸ１遺伝子の第７イントロン内に存在することが明らかになった（図２）。
実施例２Ｃ（ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析）
同定された７つの遺伝子の正常組織、グリオーマ組織、およびグリオーマ細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果、以下の３つの遺伝子は興味深い発現パターンを呈していた。ＲＦＸ１遺伝子は正常組織では脳と精巣で発現が認められたが、グリオーマ組織（２／４）、グリオーマ細胞株（５／５）において発現の欠失あるいは減少が観察された（図３）。同様にＢＧＴ−１遺伝子は正常組織では脳、肝臓、腎臓、精巣で発現が認められたが、グリオーマ組織（３／４）、グリオーマ細胞株（５／５）において発現の欠失あるいは減少が観察された（図４）。一方、ＨＯＸＤ９遺伝子は正常では主に脾臓、腎臓、精巣で発現し、脳での発現が認められなかったが、グリオーマ組織（３／４）、グリオーマ細胞株（３／５）において発現が認められた（図５）。
実施例２Ｄ（５−アザシチジン、トリコスタチンＡ処理による遺伝子再発現）
グリオーマにおけるＲＦＸ１およびＢＧＴ−１遺伝子の発現の減少あるいは消失とＤＮＡのメチル化やヒストン脱アセチル化との関連性を調べるため、ヒトグリオーマ細胞株をメチル基転移酵素阻害剤である５−アザシチジンとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡでそれぞれ処理した後、あるいは両者で細胞を処理した後、それぞれの遺伝子の発現変化をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。その結果、コントロールと比較して、ヒトグリオーマＵ２５１細胞ではそれぞれの薬剤処理によりＲＦＸ１遺伝子の発現上昇が認められ、両者の薬剤処理によりさらに発現の増強が認められた（図６）。同様にＢＧＴ−１遺伝子に関しても、４種類のグリオーマ細胞株において、様々な程度であるが、薬剤処理によりコントロールと比較して発現の上昇が観察された（図７）。以上の結果から、グリオーマにおけるＲＦＸ１およびＢＧＴ−１の発現の減少がＤＮＡのメチル化に関係することが示された。
実施例２Ｅ（ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンのメチル化の解析）
さらにＲＦＸ１の第７イントロンのＣｐＧのメチル化の状態を詳しく調べるため、バイサルファイトシークエンスを行った。正常ヒト脳組織（２例）及び正常ヒトリンパ球（３例）の各ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのＣｐＧのメチル化の解析結果を図９に、ヒトグリオーマ細胞株（Ｕ２５１、ＧＩ−１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ）の各ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのＣｐＧのメチル化の解析結果を図１０に、ヒトグリオーマ組織（４例）の各ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのＣｐＧのメチル化の解析結果を図１１に、それぞれ示す。図９〜１１中において、●はメチル化を示し、○は非メチル化を示す。その結果、図９〜１１に示すように、正常脳組織やリンパ球と比較して、グリオーマ細胞株や組織ではＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのＣｐＧに高頻度のメチル化が認められた。これらの結果から、各ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのメチル化状態を解析することでグリオーマの診断が可能となることがわかった。
実施例２Ｆ（ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのエンハンサー活性の解析）
上記ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンのメチル化の解析結果から、ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのメチル化によりＲＦＸ１遺伝子の発現が調節されていることが示唆されたため、ＲＦＸ１第７イントロンのエンハンサー活性の解析をルシフェラーゼアッセイにより行った。結果を図１２に示す。図１２に示すデータは、それぞれをコントロールであるｐＧＬ３プロモーター（ＳＶ４０のプロモーターが組み込まれたベクター）の値で割ったもので表した。図１２中、ｐＧＬ３コントロールはＳＶ４０のプロモーターとＳＶ４０のエンハンサーが組み込まれたベクター、センスイントロンはＳＶ４０のプロモーターとセンス方向のＲＦＸ１遺伝子第７イントロンが組み込まれたベクター、アンチセンスイントロンはＳＶ４０のプロモーターとアンチセンス方向のＲＦＸ１遺伝子第７イントロンが組み込まれたベクター、ｐＧＬ３ベーシックはプロモーターもエンハンサーも組み込まれていないベクターを示す。図１２に示すように、ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンが組み込まれたベクターはセンス方向およびアンチセンス方向ともに、ＳＶ４０プロモーターが単独で組み込まれたベクターと比較して、高いルシフェラーゼの発光が認められたことから、ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンにはエンハンサー活性を有することが明らかになった。
実施例２Ｇ（ＲＦＸ１によるグリオーマ細胞の増殖抑制）
ＲＦＸ１と発現と腫瘍細胞増殖との関連性を検討するために、ＲＦＸ１遺伝子をＵ２５１グリオーマ細胞に遺伝子導入した。まず、ＲＦＸ１の発現を、抗ＲＦＸ１抗体（Ｓａｕｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いたウエスタンブロット法により確認した。図１３Ａに示すように、Ｕ２５１グリオーマ細胞に何も導入しないコントロール及びベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２のみを導入した細胞（エンプティベクター）ではＲＦＸ１遺伝子の発現は認められず、ＲＦＸ１遺伝子を導入した細胞（ＲＦＸ１ベクター）でのみＲＦＸ１の発現が観察された。［３Ｈ］チミジンの取り込み量を指標とした細胞増殖の解析結果を図１３Ｂに示す。その結果、Ｕ２５１グリオーマ細胞に何も導入しないコントロールやベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２のみを導入した場合と比較して、ＲＦＸ１遺伝子を導入した場合、明らかな腫瘍細胞の増殖抑制が認められた。以上のことから、ＲＦＸ１遺伝子はグリオーマにおいて癌抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。また、ＲＦＸ１は転写因子として、癌遺伝子の一つであるｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を抑制することが知られていることからも、ＲＦＸ１遺伝子が癌抑制遺伝子としてグリオーマの発生に関与していることが示唆される。以上のとおり、ＲＦＸ１遺伝子は、メチル化状態、遺伝子発現、タンパク質発現を解析することでグリオーマの診断薬として有用であると同様に、グリオーマで発現が消失あるいは減少しているＲＦＸ１遺伝子をグリオーマで発現させることにより、治療薬としても有用であると考えられる。
実施例２Ｈ（ＨＯＸ遺伝子の発現解析）
ＨＯＸ遺伝子群は動物の発生時に機能し、個体の前後軸における分化特異性を決定する遺伝子である。これらの遺伝子群はホメオボックスと呼ばれるＤＮＡ結合配列を有し、その発現は高度に調節されている。図５に示されるように、ＨＯＸＤ９遺伝子が異所性にグリオーマにおいて発現していることが明らかになった。さらに、本来、正常脳組織に発現していない他のＨＯＸ遺伝子（ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ９）に関しても、グリオーマにおいて異所性に発現しているかどうかをＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果、調べた上記のＨＯＸ遺伝子（ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ９）のいずれもが、正常人の脳では発現が認められなかったのに対して、グリオーマ細胞株において遺伝子の発現が観察された（図１４、図１５）。したがって、これらＨＯＸ遺伝子は、メチル化されることにより、結果的に癌遺伝子としてグリオーマ（癌）の発生に関与していることが示唆された。以上の結果から、異所性に発現するＨＯＸ遺伝子群は、グリオーマを含む癌の診断薬や治療薬として有用であると考えられる。
次に、ＨＯＸＤ群遺伝子のグリオーマにおける発現を網羅的に解析した結果を図１６に示す。その結果、本来脳に存在するＨＯＸＤ１のみならず、脳には存在しないその他のＨＯＸＤ群遺伝子（ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３）が脳腫瘍で高発現していることが明らかになった。したがって、これらＨＯＸＤ１を除くＨＯＸＤ群遺伝子は、メチル化されることにより、結果的に癌遺伝子としてグリオーマ（癌）の発生に関与していることが示唆された。以上の結果から、異所性に発現するＨＯＸＤ群遺伝子は、グリオーマを含む癌の診断薬や治療薬として特に有用であると考えられる。
産業上の利用可能性
本発明によると、ヒトグリオーマ等の癌の診断や治療に有用なＲＦＸ１遺伝子、ＢＧＴ−１遺伝子等の癌抑制遺伝子あるいはＨＯＸ遺伝子等の癌遺伝子を同定することができ、それら癌抑制遺伝子や癌遺伝子を標的としたヒトグリオーマ等の癌の診断方法や診断薬、ヒトグリオーマ等の癌の治療方法や治療薬を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図、ＡはＲＬＧＳプロファイルによるスポットを観察した結果を示す図であり、ＢはＲＬＧＳ解析の結果、信号強度の減少あるいは欠失したスポットを示す図である。
第２図は、ＲＬＧＳクローンをＢＬＡＳＴサーチ検索にかけた結果を示す図である。
第３図は、正常組織、グリオーマ組織及びグリオーマ細胞株におけるＲＦＸ１遺伝子の発現の有無をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
第４図は、正常組織、グリオーマ組織及びグリオーマ細胞株におけるＢＧＴ−１遺伝子の発現の有無をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
第５図は、正常組織、グリオーマ組織及びグリオーマ細胞株におけるＨＯＸＤ９遺伝子の発現の有無をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
第６図は、薬剤処理を行ったヒトグリオーマ細胞株（Ｕ２５１）におけるＲＦＸ１遺伝子の発現状態の変化をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した図である。
第７図は、４種類のグリオーマ細胞株におけるＢＧＴ−１遺伝子の５−アザシチジン及びトリコスタチンＡ処理による発現状態の相違をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
第８図は、ＲＦＸ１遺伝子の第７イントロンのＣｐＧを示す図である。
である。
第９図は、正常ヒト脳組織及び正常ヒトリンパ球のＲＦＸ１遺伝子第７イントロンのＣｐＧのメチル化を、バイサルファイト・ジェノミック・シークエンシングによって解析した図である。
第１０図は、ヒトグリオーマ細胞株のＲＦＸ１遺伝子第７イントロンのＣｐＧのメチル化を、バイサルファイト・ジェノミック・シークエンシングによって解析した図である。
第１１図は、ヒトグリオーマ組織のＲＦＸ１遺伝子第７イントロンのＣｐＧのメチル化を、バイサルファイト・ジェノミック・シークエンシングによって解析した図である。
第１２図は、ＲＦＸ１遺伝子第７イントロンのエンハンサー活性を、ルシフェラーゼアッセイによって解析した図である。
第１３図、ＡはＵ２５１グリオーマ細胞におけるＲＦＸ１の発現を、抗ＲＦＸ１抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した図であり、Ｂは［３Ｈ］チミジンの取り込み量を指標とした細胞増殖の解析結果を示す図である
第１４図は、正常脳組織及び種々のグリオーマ細胞株におけるＨＯＸＤ８遺伝子の発現状態をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
第１５図は、正常脳組織及び種々のグリオーマ細胞株におけるＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ９遺伝子の発現状態をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
第１６図は、正常脳組織並びに種々のグリオーマ細胞株及びグリオーマ組織におけるＨＯＸＤ群遺伝子の発現状態をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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