【手続補正書】
【提出日】平成12年11月16日(2000.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】遺伝子転写パターンの同定方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】標識を得るための方法であって、
（ａ）二本鎖ｃＤＮＡを供給し、
（ｂ）前記二本鎖ｃＤＮＡを中断制限エンドヌクレアーゼにより切断することにより、ｃＤＮＡフラグメントを供給し、
（ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントに、前記ｃＤＮＡフラグメントにおける一定の部位でのＤＮＡ切断を可能にするタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための前記認識配列から離れて含んで成る５’側アダプターを連結し、これにより第１ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｄ）前記第１ｃＤＮＡ構造体を前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断することにより、第２ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｅ）前記第２ｃＤＮＡ構造体に３’側アダプターを連結し、それにより、前記第２ｃＤＮＡ構造体の３’側に隣接して位置する中断エンドヌクレアーゼのための認識配列を生成して、第３ｃＤＮＡを供給し、
（ｆ）前記３ｃＤＮＡ構造体を前記中断制限エンドヌクレアーゼにより消化することにより、ｃＤＮＡ配列を含んで成る標識を供給し、そして
（ｇ）前記標識のヌクレオチド配列を決定する；
段階を含んで成る方法。
【請求項２】前記中断制限エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩであり、そしてタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼがＢｓｇＩである請求項１記載の方法。
【請求項３】一連の標識を供給する、標識を連結する段階をさらに含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項４】前記一連の標識をベクター中に挿入する段階をさらに含んで成る請求項３記載の方法。
【請求項５】一連の標識を得るための方法であって、
（ａ）ビオチニル化されたオリゴｄＴプライマーを用いて、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを供給し、
（ｂ）前記二本鎖ｃＤＮＡ内を、中断制限エンドヌクレアーゼにより切断して、ｃＤＮＡフラグメント集団を供給し、
（ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントに、
ｉ） 前記中断制限エンドヌクレアーゼによる切断により生成される末端と適合できる一本鎖末端；
ｉｉ） 前記一本鎖末端の５’側に位置するタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列；
ｉｉｉ） 前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列の５’側に位置する５’−クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列；
を含んで成る５’側アダプターを連結し、これにより第１ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｄ）前記第１ｃＤＮＡ構造体を、固相ストレプタビジン上での親和性捕獲により単離し、
（ｅ）前記第１ｃＤＮＡ構造体を、前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断して、第２ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｆ）前記第２ｃＤＮＡ構造体に、
ｉ） 前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより生成される末端と適合できる変性一本鎖末端；
ｉｉ） 前記変性末端の３’側に位置する前記中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列；
ｉｉｉ） 前記中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列の３’側に位置する３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列；
を含んで成る３’側アダプターを連結し、これにより第３ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｇ）前記第３ｃＤＮＡ構造体を、前記５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼにより消化して、第４ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｈ）前記第４ｃＤＮＡ構造体を、前記５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼにより消化されたクローニングベクター中に挿入、
（ｉ）前記ベクターＤＮＡを適切な宿主株において複製し、
（ｊ）前記ベクターＤＮＡを単離し、
（ｋ）前記ベクターＤＮＡを前記中断制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｃＤＮＡ配列及びＧＣクランプを含んで成る標識を供給し、
（ｌ）前記標識を連結し、少なくとも１０個の標識及びＧＣに富んでいるクランプを含んで成る一連の標識を供給する；
段階を含んで成る方法。
【請求項６】前記中断制限エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩであり、そして前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼがＢｓｇＩである請求項５記載の方法。
【請求項７】前記５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼがＥｃｏＲＩであり、そして前記３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼがＮｏｔＩである請求項５記載の方法。
【請求項８】遺伝子転写のパターンの同定方法であって、興味ある源から、請求項１に従って１又は複数の標識を供給し、そして遺伝子転写のパターンを同定する段階を含んで成る方法。
【請求項９】１つよりも多くのサンプルにおいて、請求項８に従って遺伝子転写パターンを同定し、そして第１ｍＲＮＡ集団からの遺伝子転写のパターンと、もう１つのサンプルからの遺伝子転写のパターンとを比較することによって、複数のｍＲＮＡ集団間の遺伝子転写の差異を検出するための方法。
【請求項１０】ｍＲＮＡ集団における遺伝子転写の相対的頻度を決定するための方法であって、
（ａ）請求項５記載の一連の標識を供給し、
（ｂ）前記一連の標識を配列決定し、そして
（ｃ）標識の相対的頻度を決定する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１１】細胞に対するストレスについてスクリーンするための方法であって、
（ａ）ストレス、又は興味ある生理学的ストレスの存在下で遺伝子転写のパターンを同定し、
（ｂ）注目のストレスの存在下で遺伝子転写のパターンを同定し、
（ｃ）請求項８に従って、（ａ）及び（ｂ）からの遺伝子転写のパターンを比較する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１２】標的生物におけるストレスの存在の検出方法であって、
（ａ）正常な細胞又は組織において差別的に発現される遺伝子の標識配列を供給し、
（ｂ）前記標識により、第１細胞又は組織から得られるｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイズし、
（ｃ）前記標識により、第２細胞又は組織から得られるｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイズし、そして
（ｄ）前記第１及び第２細胞又は組織における前記遺伝子の転写レベルを比較する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１３】請求項１記載の標識を含んで成るプローブによりｃＤＮＡライブラリーをプローブし、そして遺伝子を単離することを含んで成る、遺伝子の単離方法。
【請求項１４】１つの標識又は一連の標識を得るためのキットであって、
（ａ）５’側アダプター、
（ｂ）３’側アダプター、
（ｃ）ベクター、及び
（ｄ）１又は複数の制限エンドヌクレアーゼを含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
発明は、細胞又は組織における遺伝子転写パターンを同定するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
発現された配列標識（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）（ＥＳＴ）プログラムは、ヒトゲノムにおける発現されたヒト遺伝子の実質的な割合についてのＤＮＡ配列情報を提供した（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｃ． など．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７： ３４５−３４６ （１９９４））。しかしながら、ＤＮＡ配列情報のみでは、遺伝子機能及び調節の完全な理解のためには不十分である。
【０００３】
十分な遺伝子能力範囲の一部のみがいずれかの所定の時間で細胞において発現されるので、遺伝子転写を定性的に、および定量的にモニターする手段が必要とされる。
従来の定性的且つ定量的技法、たとえばノザンブロット及びヌクレアーゼ保護アッセイは正確且つ定量的であるが、しかし全体的遺伝子発現プロフィールを生成するのに十分に速く情報を提供することができない。
【０００４】
より最近のアプローチは、ｃＤＮＡライブラリーからのランダム単離物の配列分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション−アレイに基づく方法を包含するが、しかしそれらの個々の方法は制限されている。
既知に遺伝子に対応するＲＮＡ又はｃＤＮＡの高密度マイクロアレイ  ハイブリダイゼーション（Ｒａｍｓａｙ， Ｇ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ４０−４４（１９９８））は、全体的な遺伝子発現の同時分析のための早い方法である。しかしながら、この方法は既知の遺伝子に対して制限され、そして単一のマイクロアレイにおける遺伝子の数も同様に制限される。
【０００５】
ＥＳＴを生成するためにｃＤＮＡライブラリーからのランダム単離物の配列決定は、定量的な結果を提供するが、しかし困難な仕事である（Ａｄａｍｓ， Ｍ．Ｄ．， など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： １６５１−１６５６ （１９９１）；Ａｄａｍｓ， Ｍ．Ｄ． など．， ＮａＴｕｒｅ ３５５： ６３２−６３４ （１９９２））。ｃＤＮＡライブラリー内において、ｃＤＮＡクローンの頻度は、ＲＮＡが由来する細胞又は組織のＲＮＡ集団におけるその転写体の定常状態量に比例すべきである（Ｏｋｕｂｏ Ｋ． など．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２： １７３−１７９ （１９９２）；Ｌｅｅ， Ｎ．Ｈ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： ８３０３−８３０７ （１９９５））。しかしながら、このアプローチは、ほとんどの実験室の能力を超えてＤＮＡ配列決定の努力を必要とする。
【０００６】
ＰＣＲに基づく方法は、発現プロフィールを形成するために、それらの分離及び同定を可能にする、サイズ及び配列を異なるｍＲＮＡプールからＤＮＡフラグメントを生成することができる。検出する異なった細胞又は組織集団からのプロフィールは、特異的に遺伝子を発現した。この方法は、ｍＲＮＡフラグメントのデータベースを確立するために使用されて来た（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ．Ｇ．Ｋ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８： ６５３１ （１９９０）；Ｗｅｌｓｈ， Ｊ．， など． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８： ７２１３ （１９９０）； Ｗｏｏｄｗａｒｄ， Ｓ． Ｒ．， Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ． ３： ７３ （１９９２）； Ｎａｄｅａｕ， Ｊ．Ｈ．， Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ ３： ５５ （１９９２））。
【０００７】
何人かは、複数のサンプルの間のｍＲＮＡ手段を比較するためにそれらの方法を適合せしめることを探究しており（Ｌｉａｎｇ， Ｐ． など． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７ （１９９２）； また， Ｊ． など．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２０： ４９６５ （１９９２）； Ｌｉａｎｇ， Ｐ．， など．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３２６９ （１９９３）及び１９９５年５月１８日に公開されたＷＯ９５／１３３６９号． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＡＦＬＰ） （Ｌｉａｎｇ Ｐ． ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， Ａ． Ｂ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６７−９７１ （１９９２））， （Ｖｏｓ． Ｐ． など．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３： ４４０７−４４１４ （１９９５） を参照のこと））、たとえば適切な速度及び規模で遺伝子発現情報を提供することができるが、しかしそれらの方法はＰＣＲ人工物を定量化するそれらの感受性のために精度及び再性能力を欠いている。
【０００８】
最近、ランダムｃＤＮＡ配列決定アプローチのためのＰＣＲの変法が、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ など． （Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ， Ｖ．Ｅ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： ４８４ （１９９５））により記載されている。Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＳＡＧＥ） と呼ばれるこの技法は、“二重標識（ｄｉ−ｔａｇｓ）”を形成するために、末端−末端形式でランダムに連結され、そしてＰＣＲにより増幅されるｃＤＮＡからの定義された短い配列を生成する。次に、それらの二重標識が、クローン化され、そしてＤＮＡ配列決定により分析されるアレイに連鎖される。個々の配列決定鋳型は多くの遺伝子に対応する同定できる標識を含むので、ＳＡＧＥの可能性ある処理量は従来のｃＤＮＡ配列決定を越え、多くの実験室における遺伝子転写の分布測定を可能にする。
【０００９】
しかしながら、いずれかの他のＰＣＲ工程のように、ＳＡＧＥについての結果は、出発鋳型発生量以外の要因により影響される。“増幅効率”における配列−特異的差異は、生成物収率における人工物差異を生ぜしめることが知られている。すなわち、ＰＣＲ生成物の量は、出発鋳型における真の差異の不在において異なることができる。たとえば、同じ鋳型調製物の増幅は、６倍ほども異なる生成物収量を生成する（Ｇｉｌｌｉａｎｄ など． ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ６０−６９ （１９９０））。従って、増幅により生成される生成物の量から出発鋳型発生量を推定することを試みる、いずれかのＰＣＲに基づく方法は、厳重な同時増幅制御を必要とする。
【００１０】
従って、遺伝子転写を検出し、そして定量化し、すなわちＰＣＲ及び他の人工物を有さず、未知の遺伝子を提供し、そしてさらに、サンプル間の敏速な検出及び比較を可能にするのに十分に早い、個々の細胞又は組織における遺伝子、及び遺伝子転写パターン及び頻度を同定するための単純且つ再生可能方法についての必要性がある。
当業界において見出される問題を回避するために、本発明者は、ＰＣＲ増幅人工物を回避するＴＡＬＥＳＴ（発現された配列標識のタンデム配列された連結）と呼ばれるｃＤＮＡ標識に基づく技法を開発した。この技法は、遺伝子発現プロフィールへのランダムｃＤＮＡ配列決定アプローチに対して、２５倍の処理量の増大をもたらす。
【００１１】
発明の要約
本発明は、所定のｍＲＮＡ集団内での遺伝子転写体の相対的発生量の検定を可能にする短いＤＮＡ“標識”配列を得るための改良された方法を提供する。
本発明は、一連の標識を得るための方法を提供する。
本発明は、遺伝子転写のパターンを同定するための方法を提供する。
本発明は、複数のｍＲＮＡ集団間の遺伝子転写の差異を検出する方法を提供する。
本発明は、ｍＲＮＡ集団における個々の遺伝子の頻度を決定する方法を提供する。
本発明は、細胞又は組織に対する薬物の効果についてスクリーニングするための方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ストレス、たとえば障害、疾病、成長又は分化の開始又は進行、外因性物質（化学物質、補因し、生物分子又は毒物）、条件（たとえば環境条件、たとえば心臓、浸透圧又は同様のもの）、受容体活性（受容体におけるリガンド又は他の点による）、異常細胞条件（たとえば、突然変異、異常コピー数又は同様のもの）の標的生物における存在を検出するための方法を提供する。
本発明は、遺伝子を単離するための方法を提供する。
本発明は、標識又は一連の標識を得るためのキットを提供する。
【００１３】
発明の特定の記載
本発明の当業者による理解を助けるために、当業界において通常使用される用語から逸脱する次の定義が提供される。
“遺伝子転写のパターン”とは、本明細書において使用される場合、ＲＮＡ分子を形成するために転写され又は発現される、特定組織又は細胞型内の遺伝子の組を意味する。遺伝子は特定細胞系又は組織において発現され、そして遺伝子が発現されるレベルは、要因、たとえば組織又は細胞型、細胞、組織又は標的生物の増殖の段階い依存し、そして細胞は正常又は形質転換された細胞、たとえば癌細胞である。
【００１４】
たとえば、遺伝子は特定標的生物の成長において、胚又は胎児段階で発現され、そして次に、標的生物が成熟するにつれて発現されなくなる。または、もう１つの例として、遺伝子は、肝臓組織においては発現されるが、しかしヒト成人の脳組織においては発現されない。もう１つの例においては、遺伝子は、正常な肺組織いおいては低レベルで発現されるが、しかし疾病の肺組織においては高いレベルで発現される。
【００１５】
“中断（ｐｕｎｃｔｕａｔｉｎｇ）制限エンドヌクレアーゼ”とは、本明細書において使用される場合、ｃＤＮＡの個々のコピー内の配列を認識する可能性（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）確率を有する制限エンドヌクレアーゼを意味する。好ましくは、中断エンドヌクレアーゼは、６個よりも少ない塩基から成る配列を認識する。より好ましくは、中断エンドヌクレアーゼは、４個の塩基から成る配列を認識する。最も好ましくは、中断エンドヌクレアーゼは、ＭｓｐＩ， ＨａｅＩＩＩ又はＳａｕ３ａＩ， 又はそれらのいずれかのアイソシゾマーである。
【００１６】
“タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ”とは、本明細書において使用される場合、制限エンドヌクレアーゼのための認識配列から離れてＤＮＡにおける部位でのＤＮＡ切断を可能にする制限エンドヌクレアーゼを意味する。好ましくは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは、４〜７個の塩基を認識し、そして認識配列の３’側から１０〜１８個の塩基、または好ましくは１０個以上の塩基だけはなれて、隣接するＤＮＡを切断する。従って、“離れて”とは、タイプＩＩ、又はタイプＩＩ−様制限エンドヌクレアーゼの範囲内を意味する。最も好ましくは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｇＩ， ＢｓｅＲＩ， ＦｏｋＩ， ＢｓｍＦＩである。
【００１７】
“５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼ”とは、本明細書において使用される場合、酵素による切断からＤＮＡを保護することができる、対応するメチラーゼ又は他の保護手段を有する制限エンドヌクレアーゼを意味する。好ましくは、５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼは、約４〜１０個の塩基の配列を認識する。この最も好ましい５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼの例は、ＥｃｏＲＩ， ＢａｍＨＩ， ＨｉｎｄＩＩＩである。
【００１８】
“３’側クローニング制限エンドヌクレアーゼ”とは、本明細書において使用される場合、ヒトゲノムにおいてまれに出現する認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼを意味する。好ましくは、３’側クローニング制限エンドヌクレアーゼは、６又はそれ以上の塩基、好ましくは６個以上の塩基から成る配列を認識する。より好ましくは、３’側制限エンドヌクレアーゼは、その内部にＣＧジヌクレオチドを含む、８個又はそれ以上の塩基から成る配列を認識する。より好ましくは、３’側制限エンドヌクレアーゼは、５’側クローニング制限酵素により生成される切断末端に容易に連結しない切断末端を提供する。最も好ましい例は、３’側制限エンドヌクレアーゼ、すなわちＮｏｔＩである。
【００１９】
“最３’側ｃＤＮＡフラグメント”とは、本明細書において使用される場合、最３’側中断制限エンドヌクレアーゼ部位とｃＤＮＡの３’末端との間の十分な長さのｃＤＮＡのその部分から成る、好ましくはビオチニル化されている、オリゴｄＴプライマーの興味あるｍＲＮＡ集団から転写された二本鎖ｃＤＮＡのフラグメントを意味する。その最３’側ｃＤＮＡフラグメントは、中断制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成される他のｃＤＮＡフラグメントからそのフラグメントの分離を容易にするために、ストレプタビジンを含む固相マトリックス上で単離され得る。
【００２０】
“第１ｃＤＮＡ構造体”とは、本明細書において使用される場合、５’側アダプターに連結される最３’側ｃＤＮＡフラグメントを含んで成るｃＤＮＡ構造体を意味する。５’側アダプターがｃＤＮＡフラグメントの５’末端に連結され、第１ｃＤＮＡ構造体が提供される。好ましくは、この５’側アダプターは、本明細書に使用されるよう構想されるエンドヌクレアーゼのための適切な認識部位を提供し、そしてそれはまた、好ましくは標識からの決定のための十分な分子量、もちろん酵素の選択と共にそれらの必要条件の変化、決定のための染色方法及び同様のものも提供する。その５’側アダプターは、ビオチニル化され、その単離を容易にするためにストレプタビジン含有固相マトリックス上への第１ｃＤＮＡ構造体の捕獲を可能にされ得る。
【００２１】
“第２ｃＤＮＡ構造体”とは、本明細書において使用される場合、５’側アダプター内の配列を認識するが、しかしｃＤＮＡフラグメント内のＤＮＡを切断するタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより第１ｃＤＮＡ構造体を切断することによって提供されるｃＤＮＡ構造体を意味する。
【００２２】
“第３ｃＤＮＡ構造体”とは、本明細書において使用される場合、第２ｃＤＮＡ構造体及び３’側アダプターを含んで成るｃＤＮＡ構造体を意味する。３’側アダプターが第２ｃＤＮＡ構造体の３’末端に連結され、第３ｃＤＮＡ構造体が供給される。好ましくは、第３ｃＤＮＡ構造体はビオチニル化され、そしてその単離を容易にするためにストレプタビジン含有固相マトリックス上に捕獲され得る。
“第４ｃＤＮＡ構造体”とは、本明細書において使用される場合、それぞれ５’側及び３’側アダプターに位置する部位を認識する、５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼ及び３’側制限エンドヌクレアーゼにより第３ｃＤＮＡ構造体を切断することによって提供されるｃＤＮＡ構造体を意味する。
【００２３】
“５’側アダプター”とは、本明細書において使用される場合、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含む二本鎖ポリデオキシリボヌクレオチドから成るアダプターを意味する。その５’側アダプターは、中断制限エンドヌクレアーゼによるｃＤＮＡの切断により生成されるｃＤＮＡフラグメントの５’末端に連結される。好ましくは、５’側アダプターはさらに、中断制限エンドヌクレアーゼによるｃＤＮＡフラグメントの切断により生成されるオーバーハング配列と適合できる一本鎖オーバーハング配列を含む。
【００２４】
（“オーバーハング”とは、本明細書において使用される場合、大きな二本鎖である場合、他の鎖上に補体が存在しない事実を除いて対合される、１又は両鎖上に１又は両末端で１又は複数の対になっていないか又は垂れ下がっている塩基を有する、二本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ鎖を有することの効果として定義される。好ましくは、それらは、１つの鎖が１つの末端上にオーバーハングを有し、そして他の二本鎖ＤＮＡの他の末端上にオーバーハングを有する場合に生じる。）
【００２５】
より好ましくは、５’側アダプターはさらに、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列の５’側に位置する５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含む。その５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、５’側のタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ切断配列の方に向かって、約４個、好ましくは約１０個以上、より好ましくは約２０個以上、最も好ましくは約３０個以上のヌクレオチド、及び好ましくは約９０個以下、より好ましくは約７０個以下、最も好ましくは約６０個以下のヌクレオチドの位置に存在する。ＣＤＮＡフラグメントへの連結により、５’側アダプターは、中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を再創造する。５’側アダプターのセンス鎖は好ましくは、配列番号１に示される配列を有し、そして５’側アダプターのアンチセンス鎖は好ましくは、配列番号２に示される配列を有する。
【００２６】
“３’側アダプター”とは、本明細書において使用される場合、第２ｃＤＮＡ構造体の３’末端への連結のための二本鎖ポリデオキシリボヌクレオチドから成るアダプターを意味し、ここで前記連結により、第３ｃＤＮＡ構造体が供給される。好ましくは、３’側アダプターは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成される第２ｃＤＮＡ構造体のすべての可能な末端と適合できる変性１本鎖末端を含んで成る。より好ましくは、３’アダプターはさらに、前記変性末端の３’側に位置する中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含む。
【００２７】
その３’側アダプターにおいては、中断制限エンドヌクレアーゼの認識配列は好ましくは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより生成される第２ｃＤＮＡ構造体の末端と適合できる変性一本鎖末端に隣接する。好ましくは、３’側アダプターはさらに、中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列の３’側に位置する３’側クローニング制限エンドヌクレアーのための認識配列を含んで成る。
【００２８】
好ましくは、３’側アダプターは、３’側クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列の３’側に位置する１又は複数のビオチン分子を含み、ここで前記３’側アダプターのセンス鎖は、配列番号３のすべてまたは一部を含んで成り、好ましくは配列番号３であり、そして３’側アダプターのアンチセンス鎖は配列番号４のすべて又は一部を含んで成り、そしてより好ましくは、配列番号４である。
【００２９】
“標識”とは、本明細書において使用される場合、
（１）好ましくは、ｃＤＮＡにおける最３’側中断制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接して位置するｃＤＮＡ配列に対応する二本鎖の１０〜１４個のデオキシリボヌクレオチド、
（２）制限エンドヌクレアーゼからの認識配列にそれ自体由来するｃＤＮＡ−由来の配列の両末端を有する二本鎖塩基対、及び任意には、
（３）自己適合性付着端を生成する制限エンドヌクレアーゼに由来する一本鎖オーバーハング配列から成るＤＮＡ配列を意味する。
【００３０】
増幅の前、１つの標識はｍＲＮＡの１つのコピーを表し、そして２つの同じ標識はｍＲＮＡの１つのコピーから創造されない。標識は、ｃＤＮＡ配列を含んで成る。好ましくは、標識はＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結される。標識端の処理により、オーバーハングを有するブラント末端化又は付着末端化され得る。このような理由のために、当業者は、オーバーハングが好ましいことを理解するであろう。より好ましくは、標識は、一緒に連結される場合、中断制限エンドヌクレアーゼのための標識配列を再生し、中断配列によるそれらの分離のために、別々のｃＤＮＡ−由来の配列の認識を可能にする。
【００３１】
“標識配列”は、本明細書において使用される場合、少なくとも１つの標識配列を含んで成るＤＮＡ配列を意味する。一連の標識は、１又は複数の配列を有する多くの標識を含む。標識配列は、線状オリゴヌクレオチド、ビクター又は同様のものに含まれ得る。
“ｃＤＮＡ標識ライブラリー”とは、本明細書において使用される場合、（１）５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼにより切断された５’側アダプターの連結されたフラグメント、（２）３’側クローニング制限エンドヌクレアーゼにより切断された３’側アダプターの連結されたフラグメント、及び（３）標識を含んで成るベクターにおいて調製されたｃＤＮＡライブラリーを意味する。ｃＤＮＡ標識ライブラリーがクローニングベクター中にクローン化され、そして宿主細胞において増幅され得る。
【００３２】
“一連の標識”とは、本明細書において使用される場合、二本鎖ＤＮＡ配列を形成するために、それらの付着端又はブラント末端により連結された標識を意味する。それらの一連の標識はまた、連鎖された標識を意味する“コンカテマー”として言及される。それらの一連の標識はベクターに含まれ得る。好ましくは、一連の標識は、中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列により散在されるｃＤＮＡ配列を含んで成る。
【００３３】
連結された一連の標識は、およそ少なくとも１０個の標識、好ましくは少なくとも３０個の標識、より好ましくは少なくとも４０個の標識、及び７０個以下の標識、より好ましくは６０個以下の標識、最も好ましくは約５１個以下の標識を含んで成る。より好ましくは、一連の標識は中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列により開始し、そしてそれにより終結する。最も好ましくは、中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列は、個々の標識間に位置する。
【００３４】
“中断配列”とは、本明細書において使用される場合、ＤＮＡヌクレオチド配列を中断する一連の標識の配列において検出されるような中断制限エンドヌクレアーゼにより消化された２つの末端を連結することによって形成される配列を意味する。
【００３５】
“クランプ”とは、本明細書において使用される場合、標識が中断制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成される場合、ｃＤＮＡ由来の配列に結合されたまま存続する中断制限エンドヌクレアーゼからの認識配列に由来する塩基対を意味する。クランプの基本組成は好ましくは、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）から成り、そしてＧ及びＣから成るクランプを意味する“ＧＣ−クランプ”として言及される。ＧＣ−クランプの機能は、中断制限エンドヌクレアーゼによる消化の後、標識の逆平行鎖を一緒に保持する水素結合の数を高めることによって標識の熱安定性を増強することである。
【００３６】
“ＧＣに富んでいる”とは、本明細書において使用される場合、Ｇ又はＣである塩基の百分率が４０％以上、好ましくは５０％以上である配列を意味する。
“対応する”とは、本明細書において使用される場合、１つの核酸分子の一部が第２の核酸分子に対して相補的であるか又は同一であることを意味する。従って、ｃＤＮＡ分子はｍＲＮＡ分子に対応することができ、ここで前記ｍＲＮＡ分子はｃＤＮＡ分子を生成するために逆転写のための鋳型として使用される。同様に、遺伝子のゲノム配列はｃＤＮＡ配列に対応することができ、ここでゲノム配列の一部は前記ｃＤＮＡ配列に相補的であるか又は同一である。
【００３７】
“ハイブリダイズする”とは、本明細書において使用される場合、ヌクレオチドポリマー間の塩基−対合された相互作用の形成を意味する。塩基対合の存在は、２種のヌクレオチド配列の個々におけるヌクレオチドの部分（たとえば、ヌクレオチドにおける隣接する塩基グループの少なくとも８０％）が通常許容される塩基対合規則に従って他のヌクレオチドに対して相補的であることを包含する。安定したハイブリダイゼーションを得るために相補的であるべきであるヌクレオチドの正確な部分は、多くの要因、たとえばヌクレオチド配列、溶液の塩濃度、温度及びｐＨにより変化するのであろう。
【００３８】
“緊縮条件”とは、本明細書において使用される場合、相補的オリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションが維持されるが、しかしミスマッチが存在しない条件を意味する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８９）， たとえば１１．４６； ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ａｎｄ ９．５１， ＲＮＡ： ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ）。好ましくは、緊縮条件は、１−６×ＳＳＣにおける２５−６５℃でのインキュベーションを意味する。より好ましくは、緊縮条件は、４−６×ＳＳＣにおける４２−６５℃でのインキュベーションを意味する。
【００３９】
“プローブ”とは、本明細書において使用される場合、ＲＮＡ又はＤＮＡのプールにハイブリダイズし、そして当業者に知られている種々の方法のいずれかにより興味ある核酸を検出するために使用される、標識又は標識−由来（すなわち、標識のすべて又は一部に由来する）の配列を含むオリゴヌクレオチド又はベクターを意味する。
【００４０】
“ベクター”とは、本明細書において使用される場合、本発明のＤＮＡが、適切な宿主細胞における挿入体及び剤の両者の複製を可能にするその剤のＤＮＡ中への連結により挿入され得る剤を意味する。ベクターの種類の例は、プラスミド、コスミド及びウィルス（たとえば、バクテリオファージ）であり得る。クローニングベクターは、ｃｄＮＡ標識ライブラリーを形成するために標識配列を含んで成るＤＮＡ配列をクローニングするために使用される。より好ましくは、クローニングベクターとして、ｐＵＣ１９が使用される。好ましくは、クローニングベクター内の中断制限エンドヌクレアーゼのための内因性認識部位は、特定部位の突然変異誘発により破壊されている。配列決定ベクターは、ＤＮＡ配列分析のための調製において標識又は一連の標識をクローン化するために使用される。配列決定ベクターとして、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９が好ましい。
【００４１】
本発明は、
（ａ）二本鎖ｃＤＮＡを供給し、
（ｂ）中断制限エンドヌクレアーゼにより二本鎖ｃＤＮＡを切断し、ｃＤＮＡフラグメントを供給し、
【００４２】
（ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントに、ブラント末端であるか、又は好ましくは中断制限エンドヌクレアーゼと適合できる一本鎖オーバーハングを含む５’側アダプターを連結し；ここでそのような連結は、中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列が再生される第１ｃＤＮＡ構造体を生成し；前記５’側アダプターはまた、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列から離れてｃＤＮＡフラグメントにおける部位でのＤＮＡ切断を可能にするタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含み、
【００４３】
（ｄ）前記第１ｃＤＮＡ構造体をタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断し、第２ｃＤＮＡ構造体を供給し；好ましくは、前記構造体は、ｃＤＮＡ由来の配列の１０−１４個の塩基対を有し、そしてその３’末端で、ランダム一本鎖オーバーハングを、及びその５’末端で、中断酵素の認識配列及び５’側アダプターに由来する追加の配列を有し、
【００４４】
（ｅ）前記第２ｃＤＮＡ構造体に３’側アダプターを連結し、ここで前記アダプターはオーバーハングを有し、それは第１ｃＤＮＡ構造体に存在するすべての可能なオーバーハングと適合できる変性一本鎖オーバーハングを含み、前記３’側アダプターはまた、使用される場合、変性一本鎖末端に隣接して位置する中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含み、従って、前記第１ｃＤＮＡ構造体への前記３’側アダプターの連結がｃＤＮＡ構造体を生成し、ここで１０−１４個の塩基のｃＤＮＡ由来の配列が、両端で、中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列、及びいずれかの端に位置する追加の配列を有し、第３ｃＤＮＡ構造体を供給し、
【００４５】
（ｆ）５’及び３’側クローニング制限エンドヌクレアーゼにより前記第３ｃＤＮＡ構造体を消化し、同様の消化されたクローニングベクター中に連結され（“同様の消化された”とは、ベクター又は構造体の他の末端に連結され得る末端を供給するために消化されることを意味する）、そして標識ライブラリーを形成するために適切な宿主における増殖により増幅される第４ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｇ）任意には、前記標識ライブラリーからベクターＤＮＡを単離し、そして前記ベクターから標識を開放するために、中断制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡを消化し、そして
【００４６】
（ｈ）前記標識のヌクレオチド配列を決定する；
段階を含んで成る、標識を得るための方法を提供する。
好ましくは、本発明は、
（ａ）ビオチニル化されたオリゴｄＴプライマーを用いて、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを供給し、
（ｂ）前記二本鎖ｃＤＮＡ内を、ｃＤＮＡ内を切断する中断制限エンドヌクレアーゼにより切断し、ｃＤＮＡフラグメント集団を供給し、
【００４７】
（ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントに、
ｉ） 前記中断制限エンドヌクレアーゼによる切断により生成される末端と適合できる一本鎖末端；
ｉｉ） 前記一本鎖末端の５’側に位置するタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列；
ｉｉｉ） 前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列の５’側に位置すつ５’−クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含んで成る５’−クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含んで成る５’側アダプターを連結し、第１ｃＤＮＡ構造体を供給し、
【００４８】
（ｄ）前記第１ｃＤＮＡ構造体を、固相ストレプタビジン上での親和性捕獲（たとえば、クロマトグラフィー、粗いビーズ、磁気媒体又は同様のもの）により単離し、
（ｅ）前記第１ｃＤＮＡ構造体を、固相及び／又はストレプタビジンからの前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断し、第２ｃＤＮＡ構造体を供給し、
【００４９】
（ｆ）前記第２ｃＤＮＡ構造体に、
ｉ） 前記タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより生成されるいずれかの末端と適合できる変性一本鎖末端；
ｉｉ） 前記変性末端の３’側に位置する前記中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列；
ｉｉｉ） 前記中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列の３’側に位置する３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含んで成る３’側アダプターを連結し、第３ｃＤＮＡ構造体を供給し、
【００５０】
（ｇ）前記第３ｃＤＮＡ構造体を、前記５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼにより消化し、第４ｃＤＮＡ構造体を供給し、
（ｈ）前記第４ｃＤＮＡ構造体を、前記５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼにより消化されたクローニングベクター中に挿入し、
（ｉ）前記ベクターＤＮＡを適切な宿主株において複製し、
（ｊ）前記ベクターＤＮＡを単離し、
（ｋ）前記ベクターＤＮＡを、前記中断制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｃＤＮＡ配列及びＧＣクランプを含んで成る標識を供給し、
【００５１】
（ｌ）前記標識を連結し、少なくとも１０個の標識及びＧＣに富んでいるクランプを含んで成る一連の標識を供給し、
（ｍ）任意には、前記一連の標識を配列決定ベクター中に挿入し、
（ｎ）任意には、前記一連の標識のヌクレオチド配列を決定する；
段階を含んで成る、一連の標識を得るための方法を提供する。
【００５２】
二本鎖ｃＤＮＡは、オリゴ−ｄＴプライマーを用いて標準の方法により標的ｍＲＮＡプールから調製される。前記オリゴ−ｄＴプライマーは好ましくは、ビオチニル化される。好ましくは、二本鎖ｃＤＮＡは、いずれかの内部エンドヌクレアーゼ認識部位を保護するために、メチラーゼ又は５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼ及び／又は３’側クローニング制限エンドヌクレアーゼのための他の保護手段により処理される。
二本鎖ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡフラグメントを提供するいずれかの既知条件下で、中断制限エンドヌクレアーゼにより切断される。その中断制限エンドヌクレアーゼは、ｃＤＮＡフラグメント内を切断する。
【００５３】
中断制限エンドヌクレアーゼと適合できる一本鎖オーバーハングを有する合成二本鎖アダプター分子が、ｃＤＮＡフラグメントに連結される。次に、最３’側ｃＤＮＡフラグメントが、親和性保護により、好ましくは、遊離５’側アダプターを除去するために集中的に洗浄される固相上のビオチン及びストレプタビジンにより単離され、第１ｃＤＮＡ構造体が供給される。５’側アダプターは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはＢｓｇＩのための認識配列を、連結されたｃＤＮＡフラグメントの５’側に直接的に導入する。好ましくは、５’側アダプターは、後でのクローニングを促進するために、その５’末端で、５’側クローニング制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含む。
【００５４】
タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼによるアダプター連結された、好ましくは固相結合されたｃＤＮＡフラグメントの切断は、アダプター自体、及び中断配列によりアダプターから分離される未知のｃＤＮＡ配列の追加のヌクレオチドから成る線状ＤＮＡフラグメントを溶液相中に開放し、第２ｃＤＮＡ構造体を供給する。
【００５５】
次に、第２ｃＤＮＡ構造体が、オーバーハング、たとえば２つの塩基のオーバーハングが使用される場合、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより開放されるすべての可能なｃＤＮＡオーバーハング配列とそれとの適合を可能にする３’側アダプターの５’末端で１６倍の変性オーバーハングを有する３’側アダプター分子に連結され、第３ｃＤＮＡ構造体が供給される。好ましくは、前記３’側アダプターは、３’側制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含む。このアダプターは、第２ｃＤＮＡ構造体の３’末端に、中断制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を導入し、その結果、前記構造体は、５’及び３’側アダプターにより生成される中断配列を両端で有するｃＤＮＡ−由来の“標識”配列を含む。
【００５６】
第３ｃＤＮＡ構造体が当業者に知られている条件下で、中断エンドヌクレオチドにより消化され、従って標識が供給される。その中断エンドヌクレアーゼによる消化は、その末端で中断エンドヌクレアーゼのための認識配列と共にｃＤＮＡ配列を含んで成る標識を供給する。その得られる標識はたとえば、微生物において増幅するためのクローニングベクター中に挿入され得る。増幅の後、その標識配列は、いずれかの既知の方法により決定される。
【００５７】
他方では、中断制限エンドヌクレアーゼによる第３ｃＤＮＡ構造体の消化の代わりに、その得られる第３ｃＤＮＡ構造体が５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼにより消化され、第４ｃＤＮＡ構造体が供給される。第３ｃＤＮＡ構造体はまず、５’又は３’側制限エンドヌクレアーゼのいずれかにより消化され、又は両制限エンドヌクレアーゼにより同時に消化され得る。
【００５８】
この場合、第４ｃＤＮＡ構造体がいずれかの既知の方法、たとえばゲル電気泳動又は同様の方法により単離され、連結反応においてまた形成されるアダプターのダイマーから分離される。それらの操作は、中断配列を両端で有するｃＤＮＡ標識を含む、５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼ−末端ＤＮＡフラグメントをもたらす。得られる第４ｃＤＮＡ構造体が、既知の方法、たとえばゲルから溶出し、そしてエタノール沈殿により回収することにより、単離手段又は分解手段から単離される。
【００５９】
第４ｃＤＮＡ構造体をクローニングベクター（５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼにより消化された）中に挿入する前、好ましくは、前記ベクターにおけるいずれかの内因性中断エンドヌクレアーゼ制限部位が特定部位の突然変異誘発により除去されている。クローニングベクターとして、好ましくはｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９が使用される。クローニングベクターが５’及び３’−クローニング制限エンドヌクレアーゼにより消化され、そして第４ｃＤＮＡ構造体がクローニングベクター中に挿入される。
【００６０】
クローニングベクターが、当業界において知られているいずれかの方法を用いて複製される。好ましくは、ｃＤＮＡ構造体を含んで成るクローニングベクターが、宿主細胞、たとえばＥ．コリ（但し、それだけには限定されない）において、まず、ｃＤＮＡ構造体を含んで成るベクターによりＥ． コリを形質転換し、その形質転換された細胞を増殖し、そして細胞培養物からクローニングベクターを単離することによって増幅される。
好ましくは、培養された宿主細胞は遠心分離により集められ、そして次に、プラスミドＤＮＡが、ベクターＤＮＡを単離するためにいずれか既知の方法を用いて沈殿物から調製される。
【００６１】
プラスミドＤＮＡが、標識を開放するために、中断制限エンドヌクレアーゼにより消化される。個々の標識は、ｃＤＮＡに由来する１０−１４個の塩基対配列から成るＤＮＡフラグメントである。得られる標識は、好ましくは、中断エンドヌクレアーゼのための認識配列に由来する、適合性一本鎖オーバーハングを、両端で有する。中断エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩである場合、標識は、ＧＣ一本鎖３’側オーバーハング及びＣＧ一本鎖５’側オーバーハングを有する。ＧＣクランプは、周囲温度での標識の溶融、及びＡＴに富んでいる配列に対する付随する偏向を妨げる。標識フラグメントは、アクリルアミド電気泳動によりプラスミド主鎖から単離され、ゲルから溶出され、そしてエタノール沈殿により回収される。
【００６２】
標識は、一連の標識を形成するために、それらの適合できる末端を通して一緒に連結される。前記一連の標識は、アガロースゲル電気泳動により単離される。  一連の標識が、ＤＮＡ配列分析のために調製における配列決定ベクター中に挿入される。配列決定ベクターとしては、いずれのベクターでも有用である。好ましくは、ｐＧＥＭ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）， ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｌｏｌｌａ， ＣＡ）， ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９が好ましい。より好ましくは、ｐＵＣ１９が使用され得る。個々の一連の標識は好ましくは、お互い分離され、そして定義される４−塩基中断配列によりプラスミド主鎖から分離された１０−１４塩基対の標識配列から成る。
【００６３】
いずれかの既知方法が、標識又は一連の標識のヌクレオチド配列を決定するための配列決定分析のために使用される。
この方法は、所定の細胞集団における多くのコピー数を有するｍＲＮＡの検出を可能にする。細胞間での遺伝子転写プロフィールを比較することによって、この方法は、転写が病理学的表現型と関係している個々の遺伝子を同定するために使用され得る。
【００６４】
高処理量ＤＮＡ配列決定を用いれば、本発明の方法はまた、全体的な遺伝子転写プロフィールの生成も可能にする。従って、本発明は、全体的な遺伝子転写プロフィールを得、そして興味ある遺伝子を同定するために、当業者に知られている情報システムに使用する十分なデータを得るための単純且つ急速な方法を提供する。
従って、本発明は、複数の細胞又は組織間での異なった遺伝子転写パターンを同定するために使用され得る。従って、本発明の方法を使用すれば、いずれかの所定の細胞型、組織又は標的生物において転写される遺伝子を、他の細胞型、組織又は標的生物におけるレベルとは異なったレベルで同定することができる。
【００６５】
本発明の方法は、異なった遺伝子転写パターンを、同じ細胞型又は組織型における異なった発生段階で同定し、そして疾病又は異常細胞における遺伝子転写パターンの変化を同定するために使用さえ得る。さらに、本発明は、環境条件の変化又は薬物による処理のために遺伝子転写パターンの変化を検出するためにも使用され得る。そのようにするためには、遺伝子転写のパターンが、興味ある異なったｍＲＮＡ集団から得られる二本鎖ｃＤＮＡを用いて比較される。
【００６６】
この方法はまた、
（ａ）本発明に従って、興味ある源から標識を供給し、そして
（ｂ）遺伝子転写のパターンを同定する；
段階を含んで成る、遺伝子転写のパターンを同定する方法も提供する。
標識は本発明に従って興味あるｍＲＮＡ集団から調製され、そしてそれらの配列が従来の方法を用いて決定される。
【００６７】
得られる標識の配列が、遺伝子転写のパターンを同定するために既知配列データベースに比較される。
本発明はまた、
（ａ）本発明に従って、第１のｍＲＮＡ集団から遺伝子転写のパターンを同定し、
（ｂ）本発明に従って、第２のｍＲＮＡ集団から遺伝子転写のパターンを同定し、そして
（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）からの遺伝子転写のパターンを比較する段階を含んで成る、複数のｍＲＮＡ集団間での遺伝子転写の差異を検出する方法も提供する。
【００６８】
好ましくは、前記第１のｍＲＮＡ集団は、正常細胞又は組織から得られる。次に、第１のｍＲＮＡ集団からの遺伝子転写のパターンが同定される。好ましくは、第２のｍＲＮＡ集団及び／又はいずれか追加のｍＲＮＡ集団が、疾病又は障害を有する標的生物、異なった発生段階での細胞又は組織、同じ標的生物又は異なった標的生物の異なった組織又は器官から得られ、そして遺伝子転写のパターンが同定される。
第１及び第２のｍＲＮＡ集団から得られるパターンが比較され、そしてその差異が観察される。さらに、他のｍＲＮＡ集団からのパターンが、最初に誘導されたそれらのパターンに比較され得る。この方法はまた、進化、障害、薬物、ストレス、疾病又は同様のものにより変性される遺伝子の同定においても有用である。
【００６９】
本発明はまた、ｍＲＮＡ集団中に転写される他の遺伝子に比較される特定遺伝子の転写の相対的頻度を決定するための方法も提供し、ここで前記方法は、
（ａ）興味ある一連の標識を供給し、
（ｂ）前記一連の標識を配列決定し、そして
（ｃ）いずれかの又はすべての標識の相対的頻度を決定する；
段階を含んで成る。
一連の標識は、ｍＲＮＡ集団からのｃＤＮＡライブラリーから本発明に基づいて調製される。
【００７０】
前記一連の標識は、いずれかの既知方法、たとえばハイブリダイゼーション方法による配列決定により配列決定され得る（たとえば、アメリカ特許第５，２０２，２３１合を参照のこと；引用により本明細書中に組み込まれる）。
標識の配列決定が達成されると、標識の頻度の決定がいずれかの入手できる方法により行われる。たとえば、これは、手動的に、又は適切なアルゴリズム及び／又はコンピュター調査可能データベースを用いて行われ得る。
【００７１】
本発明はまた、上記で定義されたような疾病、障害又は同様のストレス、たとえば細胞又は組織に対する薬物の効果についてスクリーニングするための方法も提供し、ここで前記方法は、
（ａ）本発明に従って正常細胞における遺伝子転写のパターンを同定し、
（ｂ）本発明に従ってストレス又は同様のものの存在下で遺伝子転写のパターンを同定し、そして
（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）からの遺伝子転写のパターンを比較する；
段階を含んで成る。
【００７２】
たとえば、薬物と共に培養された細胞と薬物の不在下で培養された細胞との間の遺伝子転写のパターンの差異が、薬物が遺伝子転写プロフィールを変更するかどうかを決定するために比較される。この方法は、（１）上記に定義されたような疾病又は他のストレスの血液試験、又は同様のものによる診断において有用なマーカー、及び／又は（２）処理のための標的酵素又はタンパク質の決定、及び従って、薬物の企画又は開発への助力を提供することに対する情報を提供する。
【００７３】
本発明はまた、標的生物における上記で定義されたような疾病又は他のストレスの存在を検出するための方法も提供し、ここで前記方法は、
（ａ）本発明に従って正常な細胞又は組織において差別的に発現される（発現される、より豊富に高められた発現又は発現される、過度に低められた発現のいずれか、すなわち上記に定義されたような疾病又は他のストレスがある手段で発現を変性する）遺伝子の標識配列を供給し、
【００７４】
（ｂ）第１標的生物から得られたｃＤＮＡライブラリーを前記標識によりハイブリダイズし、
（ｃ）第２の正常な又は疾病の（又は上記に定義されたような他のストレスによりもたらされる）標的生物から得られたｃＤＮＡライブラリーを前記標識配列によりハイブリダイズし、そして
（ｄ）前記第１の標的生物における遺伝子の転写のレベルと第２の標的物における遺伝子の転写のレベルとを比較する；
段階を含んで成る。
【００７５】
いずれかの既知方法が、第１の標的生物における遺伝子の転写のレベルと、第２の標的生物における遺伝子の転写のレベルとを比較するために、前記第１の標的生物における上記で定義されるような疾病又は他のストレスの存在を検出するために使用される。
本発明はまた、
（ａ）本発明に従って興味ある標識配列を含んで成るプローブを供給し、
（ｂ）興味あるｃＤＮＡライブラリーをプローブし、そして
（ｃ）遺伝子を単離する段階を含んで成る、遺伝子を単離する方法も提供する。
【００７６】
興味あるいずれかの標識が、興味ある標識配列を含んで成るプローブを供給するために使用され得る。このプローブは、新規遺伝子を見出し、細胞中の遺伝子を検出し、又は突然変異を検出するために使用され得る。標識配列を含んで成るプローブは、合成オリゴヌクレオチド、又は標識配列を含んで成るベクターを用いて調製される。プローブは好ましくは、放射性同位体、蛍光及び同様のものによる検出のために、又はビオチン、ストレプタビジン又は同様のものにより単離のためにラベルされる。
【００７７】
標識のヌクレオチド配列が、単離する遺伝子を決定するために、既知のヌクレオチド配列と比較される。既知のヌクレオチド配列は、配列データベース、たとえばＧｅｎＢａｎｋ， などを用いて、いずれかの源から得られる。本発明はまた、
（ａ）５’側アダプター、
（ｂ）３’側アダプター、
（ｃ）適切なベクター、たとえばクローニング及び／又は配列決定ベクター、及び
（ｄ）本明細書に開示されるような適切な制限エンドヌクレアーゼを含んで成る、標識又は一連の標識を含むキットも提供する。
前記キットはさらに、反応緩衝液及び／又はｃＤＮＡライブラリー、及び他のそのような成分も含むことができる。
【００７８】
従って、本発明は、興味ある遺伝子転写プロフィールを定量的に分析し、そして興味ある宿主のための異なった源間でのプロフィールを比較する急速且つ正確な手段を提供する。
本発明はまた、本発明により生成される１０−１４ｂｐの標識配列は、機能がまだ知られていない興味ある標識された遺伝子の単離を促進するためにハイブリダイゼーションプローブとして作用することができるので、新規遺伝子発現を助ける。そのような標識を用いての遺伝子の単離は、当業者において十分に理解されている。
【００７９】
実施例
例
本発明の理解を助けるために、一連の実験の結果を記載する次の例が包含される。本発明に関する実験は、もちろん本発明を特別に限定するものではなく、そして当業者の範囲内にある、現在知られており又は後に開発される本発明のそのような変法は、本明細書に記載されるような本発明の範囲内であると思われる。  本明細書に使用される商標は単なる例であり、そして本発明と同様に使用される例示材料を表す。当業者は、多くの変法、製造方法及び同様のものが予測されることを認識するであろう。従って、使用される例及び商標は非制限的であり、そしてそれらは本発明を制限するものではなく、当業者が本発明の１又は複数の態様の実施をいかにして選択するのかの単なる例示である。
【００８０】
例１：ｃＤＮＡ標識ライブラリーの調製（１）
（ａ）ｃＤＮＡ合成
正常な成人ヒト肺からの１０μｇのポリＡ＋ＲＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を、５’ビオチニル化されたオリゴｄＴ（２５）によりプライムし、そしてｃＤＮＡ中にコピーした（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ からのＳｕｐｅｒｓｃｉｐｔＩＩ（商標） ｃＲＮＡ合成キット）。ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した。ペレットを、２００単位のＭｓｐＩ （ＮＥＢ）を含む、５０μｌの緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （ＮＥＢ）， Ｔｏｚｅｒ， ＭＡからの１×ＮＥＢ緩衝液＃２）に溶解し、そして３７℃で１時間、続いて６５℃で２０分間、消化し、酵素を不活性化した。
【００８１】
反応混合物を、磁気ビーズ結合緩衝液において８００μｌにし、６００μｌの前もって洗浄されたストレプタビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ｉｎｃ，． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ， ＮＹ）に添加し、そしてこれから、すべての洗浄緩衝液を除去した。この溶液の合計体積は８００μｌであった。この溶液を軽く回転しながら室温で一晩インキュベートした。ビーズを、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）による磁気捕獲装置を用いて５度、洗浄し、続いて最終的に、０．５×Ｔ４リガーゼ緩衝液（ＧＴＢＣＯ）により洗浄した。
【００８２】
（ｂ）アダプター連結及びライブラリー生成
オリゴヌクレオチド  アダプター（５’側アダプター）を、合成オリゴを混合し、それらを９５℃に加熱し、そして室温にゆっくりと冷却することによって創造した。このオリゴヌクレオチド  アダプターのセンス鎖は配列番号５の配列を有し、そしてこのオリゴヌクレオチド  アダプターのアンチセンス鎖は配列番号６の配列を有する。
【００８３】
７．６μｇのアダプターＤＮＡを、５０単位のＴ４リガーゼを含む０．５×Ｔ４リガーゼ緩衝液（ＧＩＢＣＯ）１００μｌ中、磁気ビーズ混合物に添加し、そして室温で２時間インキュベートした。次にビーズを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）１０ｍｌにより５度、洗浄した。ビーズを、それぞれ５００μｌの４つのアリコートに再懸濁し、そして６５℃で２０分間インキュベートした。次に、ビーズを、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７．６） １０ｍｌにより５度洗浄した。次に、ビーズを、８０μＭのＳＡＭ （５−アデノシルメチオニン） を含む、３６０μｌのＮＥＢ緩衝液４に再懸濁した。
【００８４】
ビーズを、それぞれ９０μｌの４つのアリコール中に分け、そして４０単位のＢｓｇＩ （ＮＥＢ）を個々のアリコートに添加した。次に、ビーズを３７℃で１．５時間インキュベートした。標識含有上清液をプールした。この溶液をフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてムラサキイガイ（ｍｕｓｓｅｌ）グリコーゲンキャリヤー２０μｇによりエタノール沈殿せしめた。
【００８５】
第２の１６倍−変性アダプター（３’側アダプター）分子を、合成オリゴをアニーリングすることによって調製した。この１６倍−変性アダプターのセンス鎖は配列番号７の配列を有し、そしてこの１６倍−変性アダプターのアンチセンス鎖は配列番号８の配列を有する。
３’側アダプター７．９μｇを、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む、合計体積３０μｌのリガーゼ緩衝液中、標識ＤＮＡペレットに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。リガーゼ混合物を、６５℃での２０分間のインキュベーションにより熱不活性化した。
【００８６】
反応混合物を、１５％ＴＡＥ（１×ＴＡＥ；４０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ）アクリルアミドゲル上に負荷し、アダプターのマルチマーからｃＤＮＡ標識を含む６８ｂｐのフラグメントを分割した。ｃＤＮＡ標識フラグメントを、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）−染色されたゲルから切除し、５００μｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ）において一晩、溶出し、そして２０μｇのムラサキイガイ  グリコーゲンキャリヤーによりエタノール沈殿せしめた。
【００８７】
標識ＤＮＡを分光計により定量化し、そしてｐＵＣ１９（Ｂａｙｏｕ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｈａｒａｈａｎ， ＬＡ）のベクターの脱リン酸化されたＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位中に、１６℃で一晩、連結し、ここで内因性ＭｓｐＩ部位は、３：１の比の挿入体：ベクターで、特定部位の突然変異誘発により破壊されている。連結混合物を用いて、コンピラント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡからのＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ（商標））を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｌのＬＢ培地において増殖した。
【００８８】
（ｃ）標識単離及びコンカテマー形成
形成転換された細菌を遠心分離により回収し、そしてプラスミドＤＮＡを単離した（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡからのＭｅｇａ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ）。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを、合計体積１ｍｌにおいて、２０℃で１時間、５０００単位のＭｓｐＩにより消化した。この反応を、１５％ＴＡＥアクリルアミドゲルの１２のレーン中に負荷した。標識フラグメントを、ＥｔＢｒ−染色されたゲルから切除し、約１ｍｌのＴＥにおいて一晩溶出し、そして２０μｇのムラサキイガイ  グリコーゲンキャリヤーによりエタノール沈殿せしめた。
【００８９】
精製された標識を、１０単位のＴ４リガーゼを含む２０μｌのリガーゼ緩衝液に再懸濁し、そして室温で１．５時間インキュベートした。これを、５単位のクレノウフラグメント及び２ｍＭのｄＮＴＰと共に、さらに２０分間インキュベートした。次に、この反応物を、ＥｔＢｒを含む１％ＴＡＥアガロースゲル上に負荷し、そして電気泳動した。
【００９０】
長さ６００−１２００ｂｐの核酸をゲルから単離し、エタノール沈殿せしめ、そして５０ｎｇのＳｍａＩ−切断された、アルカリホスファターゼ−処理されたｐＵＣ１９、及び５単位のＴ４リガーゼを含む連結緩衝液１０μｌに再懸濁し、そして１６℃で一晩インキュベートした。１μｌの連結混合物を用いて、１００μｌのコンピテント細胞（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（商標））を形質転換した。反応混合物を、ＩＰＴＧ−Ｘｇａｌと共にＬＢ−Ａｍｐプレート上にプレートし、そして個々の白色コロニーをＤＮＡ配列分析のために採取した。
【００９１】
（ｄ）ＤＮＡ配列決定
約６００ｂｐ又はそれ以上の配列を、アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてｐＵＣ１９中にクローン化した。約７００の独立したコロニーからの配列決定−グレードのプラスミド鋳型を、９６−ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００）において調製した。鋳型を、Ｍ１３逆方向プライマーによるサイクル配列決定（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡからのＰＥ−ＡＢＩ ＢｉｏＤＹｅ（商標） ターミネーター化学）にゆだねた。反応を自動配列決定機（ＡＢＩ３７７自動配列決定機）上で実施した。取り出されたデータを、ＳｙＢａｓｅデーターベースにうつし、そして自動ＤＮＡ配列分析（ＰＥ−ＡＢＯからのＢｉｏＬＩＭＳ（商標） Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｅｒ． ３．１．３システム）にゆだねた。
【００９２】
標識の度数分布を生成し、そして小さな転写プロフィールを生成するためにデータベースに調べた。そのプロフィールは、２５６０の独立した遺伝子を表す１４，４９６の明白な標識配列を含む。個々の配列における同定できる標識の数は、２〜６３の範囲であり、そして配列当たり平均３２の標識であった。
このプロフィールにおける同定できる遺伝子に対応する多数の標識のほとんどは、肺（Ｉｔｏｈ， Ｋ． など．， ＤＮＡ Ｒｅｓ． １： ２７９ （１９９４））又はほとんどのヒト組織（Ａｄａｍｓ， Ｍ．Ｄ．など．， Ｎａｔｕｒｅ ３７７： （Ｓｕｐｐｌ．） ３ （１９９５））のいずれかにおいて、高く発現されるものとしてこれまでに記載されている。
【００９３】
例２：ｃＤＮＡ標識ライブラリーの調製（２）
（ａ）ｃＤＮＡ合成
正常なヒト成人肺からの１０μｇのポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）を、５’側ビオチニル化されたオリゴｄＴ（２５）によりプライムし、そしてｃＤＮＡ中にコピーした（ＧＩＢＣＯからのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標）ｃＤＮＡ合成キット）。ｃＤＮＡをエタノール沈殿せしめた。ペレットを、８０μＭのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（ＮＥＢ）， 及び３２０単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ（ＮＥＢ）を含む８０μｌのＥｃｏＲＩメチル化緩衝液（ＮＥＢ）に溶解し、そして３７℃で１時間、続いて６５℃で１５分間インキュベートし、酵素を不活性化した。反応混合物を水により８００μｌにし、そして６０μｌが保持されるまで、回転フィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ５０， Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を通して回転せしめた。
【００９４】
ＭｓｐＩ消化を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び４００単位のＭｓｐＩ（ＮＥＢ）を含む８０μｌの緩衝液（１×ＮＥＢ緩衝液＃２）において行い、そして３７℃で２時間、続いて６５℃で２０分間、消化し、酵素を不活性化した。反応混合物を水により８８０μｌにし、そして約６０μｌが保持されるまで、回転フィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０， Ａｍｉｃｏｎ）を通して回転せしめた。
【００９５】
（ｂ）アダプター連結及びライブラリー生成
オリゴヌクレオチド  アダプター（５’側アダプター）を、合成オリゴを混合し、それらを９５℃に加熱し、そして室温にゆっくりと冷却することによって創造した。このオリゴヌクレオチドアダプターのセンス鎖は配列番号１の配列を有し、そしてこのオリゴヌクレオチドアダプターのアンチセンス鎖は配列番号２の配列を有する。
【００９６】
５４μｇの５’側アダプターＤＮＡを、３７．５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む１５０μｌの１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＧＩＢＣＯ）中、ＭｓｐＩ−消化されたｃＤＮＡに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ， １ＭのＮａＣｌの溶液１５０μｌを反応に添加し、続いて、６５℃で２０分間、酵素を不活性した。３００μｌの反応混合物を、前もって洗浄され、そしてすべての緩衝液を除去された、９００μｌのストレプタビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ｉｎｃ．）に添加した。この溶液を、軽く回転しながら、室温で一晩インキュベートした。
【００９７】
ビーズをそれぞれ１０ｍｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）により、磁気捕獲装置を用いて５度洗浄した。ビーズを、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）及び２５０ｍＭのＮａＣｌの溶液２ｍｌに懸濁し、そして６５℃で２０分間インキュベートし、酵素をさらに不活性化した。次に、ビーズを、それぞれ１０ｍｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）により５度洗浄した。次にビーズを、８０μＭのＳＡＭを含む１×ＮＥＢ緩衝液１ｍｌにより１度洗浄した。
【００９８】
ビーズを、８０μＭのＳＡＭ及び１００単位のＢｓｇＩ（ＮＥＢ）を含む２００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液４に懸濁した。ビーズを、軽く回転しながら、３７℃で２時間インキュベートした。標識含有上清液を保存し、そしてビーズを１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）２００μｌにより２度洗浄した。洗浄物及び上清液をプールし、そして５ＭのＮａＣｌ３０μｌを添加した。次に、プールされた上清液及び洗浄物を６５℃で２０分間インキュベートし、酵素を不活性化した。この溶液を、約３０μｌが保持されるまで、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１０ （Ａｍｉｃｏｎ） 回転フィルター上で回転せしめた。
【００９９】
第２の１６倍−変性アダプター分子（３’側アダプター）を、合成オリゴをアニーリングすることによって調製した。１６倍−変性アダプターのセンス鎖は配列番号３の配列を有し、そして１６倍−変性アダプターのアンチセンス鎖は配列番号４の配列を有する。３’側アダプターは、オリゴ合成の間、オリゴの３’末端上に組み込まれる１又は複数のビオチニル化されたホスホアミジドを有する。
１０．８μｇの３’側アダプターを、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含むＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液４５μｌ中、標識ＤＮＡに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。そのリガーゼ混合物を、６５℃での２０分間のインキュベーションにより熱不活性化した。
【０１００】
標識ＤＮＡを、１×ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び６２５単位のＮｏｔＩ （Ｇｉｂｃｏ）を含む１×Ｒｅａｃｔ３緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）合計２５０μｌにより消化し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
ＮｏｔＩ消化反応物を、１２５０単位のＥｃｏＲＩを含む５００μｌの１×Ｒｅａｃｔ３緩衝液中、ＥｃｏＲＩにより消化し、そして３７℃で２時間インキュベートし、続いて０．５ＭのＥＤＴＡ５μｌ及び５ＭのＮａＣｌ９０μｌを添加した。反応を、６５℃での２０分間のインキュベーションにより、熱不活性化した。
【０１０１】
５００μｌの反応混合物を、前もって洗浄され、そしてこれから、すべての洗浄緩衝液が除去されている、３０μｌのストレプタビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ． Ｉｎｃ．）に添加した。この溶液を、軽く回転しながら、室温で一晩インキュベートした。
結合物からの上清液を集め、そして保持される体積が約３０μｌになるまで、回転フィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０， Ａｍｉｃｏｎ）上で回転せしめた。
【０１０２】
濃縮された反応混合物を、１０％ＴＡＥアクリルアミドゲル上に負荷し、アダプターのマルチマーからｃＤＮＡ標識を含む９３ｂｐのフラグメントを分解した。ｃＤＮＡ標識フラグメントをＥｔＢｒ−染色されたゲルから切除し、３００μｌのＴＥにおいて一晩溶出し、そして１５μｇのＧＬＹＣＯＢＬＵＥ （Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．， Ａｕｓｔｉｎ， Ｔｘ）キャリヤ−によりエタノール沈殿せしめた。標識 ＤＮＡを分光計により定量化し、そして内因性ＭｓｐＩ部位が１：４の比の挿入体：ベクターで特定部位の突然変異誘発により破壊されているｐＵＣ１９のベクターの脱リン酸化されたＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位中に、１６℃で一晩連結した。その連結混合物を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２Ｌにおいて増殖されたコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡからのＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ（商標））を形質転換した。
【０１０３】
（ｃ）標識単離及びコンカテマー形式
形質転換された細胞を遠心分離により、回収し、そしてプラスミドＤＮＡを単離した（Ｑｉａｇｅｎｅ， Ｉｎｃ． からのＭｅｇａＰｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ）。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを、合計体積１ｍｌ中、５０００単位のＭｓｐＩにより２０℃で１時間、消化した。その反応物を１５％ＴＡＥアクリルアミドゲルの１２本のレーン中に負荷した。標識フラグメントを、ＥｔＢｒ−染色されたゲルから切断し、約１ｍｌのＴＥにより一晩溶出し、そして１５μｇのＧＬＹＣＯＢＬＵＥ（Ａｍｂｉｏｎ）キャリヤーによりエタノール沈殿した。
【０１０４】
精製された標識を、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ緩衝液２０μｌに再懸濁した後、そして室温で１．５時間インキュベートした。これに続いて、５単位クレノウフラグメント及び２ｍＭのｄＮＴＰと共にさらに２０分間インキュベートした。次に反応物を、ＥｔＢｒを含む１％ＴＡＥアガロースゲル上に負荷し、そして電気泳動した。
【０１０５】
長さ６００−１２００ｂｐの核酸をゲルから単離し、エタノール沈殿せしめ、そして５０ｎｇ のＳｍａＩ−切断され、アルカリホスファターゼ処理されたｐＵＣ１９及び５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む１０ μｌの連結緩衝液に再懸濁し、そして１６℃で一晩インキュベートした。１μｌの連結混合物を用いて、１００μｌのコンピテント細胞（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（商標））を形質転換した。反応混合物を、イソプロピル−１−チオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に、ＬＢ−Ａｍｐプレート上にプレートし、そして個々の白色コロニーを、ＤＮＡ配列分析のために採取した。
【０１０６】
（ｄ）ＤＮＡ配列決定
約６００ｂｐ又はそれ以上の配列を、アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてｐＵＣ１９中にクローン化した。配列決定−グレードのプラスミド鋳型を、９６−ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００）において調製した。鋳型を、Ｍ１３逆方向プライマーによるサイクル配列決定（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡからのＰＥ−ＡＢＩ ＢｉｏＤＹｅ（商標）ターミネーター化学）にゆだねた。反応を自動配列決定機（ＡＢＩ３７７自動配列決定機）上で実施した。取り出されたデータを、ＳｙＢａｓｅデーターベースにうつし、そして自動ＤＮＡ配列分析（ＰＥ−ＡＢＯからのＢｉｏＬＩＭＳ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｅｒ． ３．１．３システム）にゆだねた。
【０１０７】
例３：標準のｃＤＮＡライブラリーに対するｃＤＮＡ標識ライブラリーの比較
遺伝子に対応するような標識を特徴づけるために、λ−ｇｔ１０において約１，０００，０００の一次プラークの標準オリゴｄＴ−プライムされたｃＤＮＡライブラリーを生成した（Ｈｕｙｎｈ， Ｔ．Ｖ． など．， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ， ＥＤ． （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ） （１９８４））。
【０１０８】
一連の同型ニトロセルロースフィルターリフトを、約１８，０００のプラークを含む大きなプレートから調製した。それらのフィルターを、同定された標識配列に対応する末端−ラベルされたオリゴヌクレオチドによりプローブした。プローブハイブリダイゼーションの頻度は、そのプロフィールにおける対応する標識頻度と十分に適合する。標識に対してハイブリダイズするクローンを単離し、そしてＤＮＡ配列分析にゆだねた。
この分析は、標識された遺伝子の同一性、及びｃＤＮＡライブラリーに比較してのその相対的な発現された多量性を確認した。
【０１０９】
例４：定量化に対してのＰＣＲ増幅に基づく方法の誤差の測定
合成アンプリコンに対応する２対の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、そしてアニーリングした。個々のアンプリコンは、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０： ４８４ （１９９５） に記載されるように、酵素配列（ＣＡＴＧ）及びＰＣＲプライミング部位を正確に固定することによって、それらを端に有する長さ１８個の塩基の単一の二重標識を含む。個々のアンプリコンにおける標識の１つは、同一の９−塩基の任意配列（ＣＴＧＴＴＡＧＴＡ）である。
【０１１０】
この通常の標識配列を、ＡＴに富んでいる非パリンドローム配列（アンプリコン１のためにはＴＡＴＡＡＴＡＡＡ）又はＧＣに富んでいるパリンドロ−ム配列（アンプリコン２のためにはＣＣＣＧＡＴＣＧＧ）のいずれかにより対合し、人口的な二重標識を形成した。完全な二本鎖合成アンプリコンは、クローニングを促進するために、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたベクターと適合する一本鎖末端で終結する。
【０１１１】
それらの人工アンプリコンをプラスミドベクター中に連結し、そして正確に等しい濃度のプラスミドＤＮＡを個々から調製した。このプラスミドＤＮＡを希釈し、そして６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）末端ラベルされたプライマーを用いての１５又は２０サイクルの増幅、及びＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０： ４８４ （１９９５） に記載される増幅条件にゆだねた。
【０１１２】
対応するＰＣＲ生成物に由来するバンドの強さは同一ではなかった。１５サイクルの増幅の後、アンプリコン２に由来する眼に見えるＰＣＲ生成物は存在せず、そしてアンプリコン１に由来するバンドは明白であった。サイクル数が２０に高められる場合、両ＰＣＲ生成物が眼に見えるが、しかしピーク領域分析（ＰＥ， Ｓａｎｔａ Ｆｅ， Ｎ．Ｍ． からのＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＧｅｎｅｓｃａｎＴＭ ソフトウェア）は、アンプリコン１に由来する生成物の量が、出発鋳型濃度又はＰＣＲプライマーにおける差異が存在しない事実にもかかわらず、アンプリコン２のその量の５倍以上であることを示した。増幅の後に生成されるＰＣＲ生成物の量は、その内部のいずれかの標識の配列により劇的に影響され得る明白な関係が存在する。
【０１１３】
本明細書に引用されるすべての文献は、それらが引例により組み込まれることを特別に言及しても、又はいなくても、それらが含む事項について十分に示しているかのように、引用により本明細書に組み込まれる。