(57)【要約】本発明は、摂食量のコントロールが良好な新規生活習慣病治療薬又は拒食症治療薬、並びにそのスクリーニング方法の提供を提供する。詳細には、視床下部で発現するＧＰＣＲ、ＧＰＲＣ５Ｄの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬、該受容体の発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬、ＧＰＲＣ５Ｄと各種Ｇ蛋白質の共発現系のシリーズからなるスクリーニング系、及び該スクリーニング系を用いることによる、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
2003055507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸：
（ａ）配列番号１又は３記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１又は３記載の塩基配列からなる核酸もしくは転写後プロセッシングにより該塩基配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の視床下部の生理的条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該配列番号１又は３記載の塩基配列にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸
を有効成分とする拒食症治療薬。
【請求項３】
配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的親和性を示し、該ポリペプチドの機能的発現を阻害する物質を有効成分とする拒食症治療薬。
【請求項４】
該物質が核酸である請求項３記載の拒食症治療薬。
【請求項５】
該物質が抗体である請求項３記載の拒食症治療薬。
【請求項６】
請求項２又は４記載の核酸をコードする発現ベクターを有効成分とする拒食症治療薬。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を有効成分とする拒食症治療薬。
【請求項８】
配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド
を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項１０】
請求項９記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【請求項１２】
摂食抑制剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤又は抗高脂血症剤である請求項８〜１１のいずれかに記載の生活習慣病治療薬。
【請求項１３】
拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリーニング系であって、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド
を含む脂質二重層膜、並びにあるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドを構成要素として含む系を１構成単位とし、該構成単位をＧ蛋白質αサブユニットの各ファミリーの受容体結合領域について有することを特徴とするスクリーニング系。
【請求項１４】
該構成単位が、該（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、あるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項１３記載のスクリーニング系。
【請求項１５】
該構成単位が、該（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドのＣ末端側に、あるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項１３記載のスクリーニング系。
【請求項１６】
各構成単位の、Ｇ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドが、同一の効果器相互作用領域をさらに含み、且つ該脂質二重層膜が該領域と相互作用する効果器をさらに含むものである、請求項１３〜１５のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項１７】
生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項１３〜１６のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項１８】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のスクリーニング系の各構成単位において、被験物質の存在下及び非存在下で、標識したＧＴＰアナログを添加し、グアニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を両条件下で比較することを特徴とする、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１６記載のスクリーニング系の各構成単位における効果器の活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のスクリーニング系の各構成単位において、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対するリガンドの存在下又は非存在下で、標識したＧＴＰアナログを添加し、グアニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を各構成単位間で比較することを特徴とする、該ポリペプチドと共役し得るＧ蛋白質αサブユニットの同定方法。
【請求項２１】
請求項１６記載のスクリーニング系の各構成単位における効果器の活性を、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対するリガンドの存在下又は非存在下で比較することを特徴とする、該ポリペプチドと共役し得るＧ蛋白質αサブユニットの同定方法。
【請求項２２】
請求項１８又は１９記載の方法を、請求項２０または２１記載の方法により同定されたＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域を含むポリペプチドを構成要素として含む系についてのみ実施することを特徴とする、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
該Ｇ蛋白質αサブユニットがＧｓファミリーに属するものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド
に対するリガンドのスクリーニング系であって、該ポリペプチドを含む脂質二重層膜、並びにＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドを構成要素として含むことを特徴とするスクリーニング系。
【請求項２５】
該（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、Ｇｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項２４記載のスクリーニング系。
【請求項２６】
該（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドのＣ末端側に、Ｇｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項２４記載のスクリーニング系。
【請求項２７】
Ｇｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットの受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドが、任意の効果器相互作用領域をさらに含み、且つ該脂質二重層膜が該領域と相互作用する効果器をさらに含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項２８】
該効果器がアデニル酸シクラーゼである請求項２７記載のスクリーニング系。
【請求項２９】
拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質を探索するための系である請求項２４〜２８のいずれかに記載のスクリーニング系。
【請求項３０】
生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項２９記載のスクリーニング系。
【請求項３１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド
に対するリガンドのスクリーニング方法であって、請求項２４〜２６のいずれかに記載のスクリーニング系において、被験物質の存在下及び非存在下で、標識したＧＴＰアナログを添加し、グアニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を両条件下で比較することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧｓファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニットと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド
に対するリガンドのスクリーニング方法であって、請求項２７記載のスクリーニング系における効果器の活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３３】
宿主真核細胞内のｃＡＭＰ量を被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、請求項３２記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質を探索するための系である請求項３１〜３３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項３５】
生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項１８、１９、２２、２３及び３４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
請求項１３〜１６、１８、１９、２２、２３、２９及び３４のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、拒食症に対する治療活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療剤。
【請求項３７】
請求項１３〜１６、１８、１９、２２、２３、２９及び３４のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、生活習慣病に対する治療活性を有する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、視床下部で発現するオーファンＧＰＣＲの発現又は機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬に関する。詳細には、本発明は、該ＧＰＣＲｍＲＮＡのアンチセンス核酸、該核酸を含む発現ベクターもしくは該発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を有効成分とする拒食症治療薬、あるいは該ＧＰＣＲに対してアンタゴニスト活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療薬に関する。さらに、本発明は、該ＧＰＣＲ及びＧ蛋白質の共発現系及びそれを用いた拒食症治療活性化合物のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、該ＧＰＣＲの発現又は機能を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬に関する。詳細には、本発明は、該ＧＰＣＲに対してアゴニスト活性を有する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬に関する。さらに、本発明は、該ＧＰＣＲ及びＧ蛋白質の共発現系及びそれを用いた生活習慣病治療活性化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満とそれに付随する生活習慣病、特にＩＩ型糖尿病患者の増加が著しい。本症例の治療には、はじめに運動療法や食事療法が行われるが、本療法によっても体重コントロールが不十分な場合には薬物療法が行われる。この際、摂食量と体重、血糖コントロールが良好で、かつ安全な治療薬が望まれている。
一方、現代のストレス社会は、安易なダイエットの流行とも相まって、思春期の女性を中心に拒食症のような心因性の摂食障害の急増をもたらしている。これらの病気を根本的に治療するには、心理的な問題を解決することが不可欠であるが、サポート的な治療として摂食行動を強制的にコントロールするための薬物療法が施されることもある。この場合の治療薬も、体重や血糖値をコントロールしながら摂食を促進し得るものであることが要求される。
摂食のコントロールは主に中枢神経系で行われており、特に視床下部には、食欲等の人間の本能的な行動を支配する神経系が多く存在している。実際に、ラットの視床下部腹内側核を破壊すると過食と肥満をもたらし、一方、視床下部外側核を破壊すると摂食行動を行わなくなる。また、これまでに、摂食調節にかかわるレプチン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）等の神経ペプチドの受容体が視床下部に局在することが示されており、このことからも視床下部が摂食行動に重要な器官であることは明白である。
視床下部をはじめとする中枢神経系における生理活性物質の受容体、特にＧ蛋白質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）が、摂食行動と相関することが明らかとなっている。例えば、セロトニン５−ＴＨＴ２Ｃレセプターのノックアウト（ＫＯ）マウスは慢性的な過食をきたすことが知られている。また、メラノコルチン４レセプターのアンタゴニストは摂食を増加させ、逆に、ＮＰＹ  Ｙ５レセプターのアンタゴニストは摂食を抑制する。
従って、視床下部の神経系を刺激することは摂食行動等に影響を及ぼすものと考えられ、視床下部で発現するＧＰＣＲを介したシグナル伝達を、低分子化合物を用いて代替的に操作することは、摂食量と体重、血糖値等をコントロールするという上記の目的にかなうものである。しかし、このような作用機序を持つ薬剤は現在のところ上市されておらず、このような薬剤の開発が大いに望まれるところである。
従って、本発明の目的は、外的因子、特に摂食行動に関わるＧＰＣＲの発現もしくは機能を抑制あるいは促進する因子を作用させることによって、摂食行動を調節し、もって過食、肥満症を主因とする生活習慣病、あるいは拒食症を治療する手段を提供することである。また、本発明の別の目的は、過食もしくは拒食といった摂食障害、肥満症等の調節作用を有する化合物、並びにそのような化合物のスクリーニング方法を提供することである。
発明の開示
上記の目的を達成するために、本発明者らはまず、視床下部に発現する受容体をコードする遺伝子につき検討した結果、あるオーファンＧＰＣＲ（以下、ＧＰＲＣ５Ｄという）の遺伝子が肥満モデルマウスの視床下部に発現していることを見出した。そこで、本発明者らは、当該受容体をコードするｍＲＮＡのアンチセンスオリゴＤＮＡを肥満モデルマウスに投与してその発現を阻害したところ、実際に摂餌量が増加し、また血糖値が上昇した。このことから、ＧＰＲＣ５Ｄは摂食行動を負に調節するシグナル伝達に関与する受容体であること、従って、この受容体の発現もしくは機能を阻害する物質は、拒食症のような摂食障害に対して治療効果を発揮することが明らかとなった。また反対に、この受容体の発現もしくは機能を増強する物質は、過食、肥満等に由来するＩＩ型糖尿病をはじめとする生活習慣病に治療効果を発揮するはずである。そこで、本発明者らは、ＧＰＲＣ５Ｄと各種Ｇ蛋白質の共発現系のシリーズを構築し、それを用いてＧＰＲＣ５Ｄのアゴニスト又はアンタゴニストを探索することにより、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する化合物をスクリーニングする方法を開発して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、視床下部で発現するＧＰＣＲ、ＧＰＲＣ５Ｄの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬を提供する。ＧＰＲＣ５Ｄの発現を特異的に抑制し得る物質としては、好ましくはＧＰＲＣ５ＤをコードするｍＲＮＡのアンチセンス核酸が挙げられる。この場合、アンチセンス核酸はそれ自体としてだけでなく、該核酸をコードする発現ベクターや、該発現ベクターを導入された宿主細胞の形態でも提供され得る。一方、ＧＰＲＣ５Ｄの機能を特異的に抑制し得る物質としては、当該受容体のアンタゴニストが挙げられる。
本発明はまた、ＧＰＲＣ５Ｄの発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。ＧＰＲＣ５Ｄの機能を特異的に増強し得る物質としては、当該受容体の生理的リガンドやアゴニストが挙げられる。
従って、別の本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄのアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングすることによる、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。当該方法は、ＧＰＲＣ５Ｄ又はその均等物を含む脂質二重層膜と、あるファミリーに属するＧ蛋白質αサブユニット（以下、Ｇαともいう）の受容体結合領域及び任意のＧ蛋白質αサブユニットのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドとを、必須の構成要素として少なくとも包含する系を１構成単位とし、該構成単位をＧαの各ファミリーの受容体結合領域について構築して得られる、一連の受容体−Ｇ蛋白質共発現系において、Ｇ蛋白質のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質が作用する効果器の活性を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする。
従って、本発明はまた、上記のような一連の受容体−Ｇ蛋白質共発現系からなる、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する物質のスクリーニング系を提供する。
本発明はさらに、上記スクリーニング系及びスクリーニング方法により得られる、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療薬又は生活習慣病治療薬を提供する。
本発明のさらなる特徴及び本発明の利点は、以下の「発明を実施するための最良の形態」の記載から明らかとなるであろう。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、視床下部で発現するＧＰＣＲ、ＧＰＲＣ５Ｄの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬を提供する。
「ＧＰＲＣ５Ｄ」は、代謝型グルタミン酸レセプター様ファミリー（ファミリーＣ）の第５群に分類される一連のヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列を用いたＥＳＴデータベースのホモロジー検索により新たに見出された、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるヒトＧＰＣＲ蛋白質の１つである（Ｂｒａｕｎｅｒ−Ｏｓｂｏｒｎｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５１８（３）：２３７−４８（２００１）；ＧｅｎｅＢａｎｋに受託番号：ＡＦ２０９９２３，ＸＭ００６８９６，ＮＭ０１８６５４として登録されている）。しかしながら、その生理機能や生理的リガンド、共役するＧ蛋白質（αサブユニット）のサブタイプ等については不明のままであった。本発明者らは、この受容体遺伝子が肥満モデルマウス視床下部で発現していることに着目して研究を進めた結果、上述のように、この蛋白質が摂食中枢の刺激に関与する膜受容体であることを見出した。
ヒトＧＰＲＣ５Ｄに対応するＧＰＣＲホモログが他の哺乳動物にも存在することが知られている。［例えば、マウスから、ヒトＧＰＲＣ５Ｄとアミノ酸レベルで約８２％の同一性を有するホモログｍＧｐｒｃ５ｄ（配列番号４）が見出されている（Ｂｒａｕｎｅｒ−Ｏｓｂｏｒｎｅら，上述；ＧｅｎｅＢａｎｋに受託番号：ＡＦ２１８８０９として登録されている）以下、単に「ＧＰＲＣ５Ｄ」と記載される場合は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄとそのマウスホモログとを包括的にいうものと理解されたい］。従って、本発明の拒食症治療薬は、ヒトのみならず他の哺乳動物における摂餌障害の治療への使用をも意図している。現代の社会環境は家畜やペット等の動物にとっても高ストレス環境であるといえ、したがって、本発明は獣医学の分野への適用においても有用である。
本発明の拒食症治療薬は、ＧＰＲＣ５Ｄの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分として含有する。ここで「発現」とは、受容体蛋白質が産生され且つ機能的な状態で細胞膜上に配置されることをいう。従って、「発現を抑制する物質」は、遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル、膜への輸送レベル及び蛋白質フォールディングのレベル等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。一方、「機能を抑制する物質」とは、いったん機能的な状態で細胞膜上に配置された受容体に作用して、その活性型と不活性型との平衡状態を、少なくともより活性側にシフトさせない物質をいう。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質としては、転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡ分解酵素、蛋白質合成阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤等が例示されるが、細胞内で発現する他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。従って、ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質の好ましい一態様は、ＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡ（配列番号１（ＯＲＦのみを示している）又は３記載の塩基配列からなる）もしくは初期転写産物のアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
本発明のアンチセンス核酸の長さは、ＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。アンチセンス核酸が約２５ｍｅｒのオリゴＤＮＡの場合、生理条件下でＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、通常、約８０％以上の同一性を有するものであればよい。
本発明のアンチセンス核酸の標的配列は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質もしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、ＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端まで（配列番号１記載の塩基配列中塩基番号１〜１０３５、又は配列番号３記載の塩基配列中塩基番号１〜１０４７で示される塩基配列）に位置することが望ましい。好ましくは５’末端からコード領域のＮ末端側の領域であり、最も好ましくは開始コドン（配列番号３記載の塩基配列においては塩基番号１４８〜１５０）近傍の塩基配列である。また、標的配列は、それに相補的なアンチセンス核酸がヘアピン構造等の二次構造を形成しないようなものを選択することが好ましい。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、ＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質の別の好ましい一態様は、ＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域（配列番号１記載の塩基配列中塩基番号１〜１０３５、又は配列番号３記載の塩基配列中塩基番号１４８〜１０４７で示される塩基配列）の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムである。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。ＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質のさらに別の一態様は、ＧＰＲＣ５ＤのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡである。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として注目されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、ＧＰＲＣ５ＤのｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有する二本鎖オリゴＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
ＧＰＲＣ５Ｄの機能的な発現を翻訳後レベルで抑制する物質の好ましい一態様は、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗体もしくはそのフラグメントである。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のフラグメントは、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるものであってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。
例えば、ポリクローナル抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１（２）：２２３−２２８（１９８５）］でも電圧パルス法［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７（６）：６２７−６３３（１９８８）］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ヒトと他の動物（例えば、マウス等）のキメラ抗体であることが好ましく、ヒト化抗体であることがさらに好ましい。ここで「キメラ抗体」とは免疫動物由来の可変部（Ｖ領域）とヒト由来の定常部（Ｃ領域）を有する抗体をいい、「ヒト化抗体」とはＣＤＲを除いて他の領域をすべてヒト抗体に置き換えた抗体をいう。キメラ抗体やヒト化抗体は、例えば、上記と同様の方法により作製したマウスモノクローナル抗体の遺伝子からＶ領域もしくはＣＤＲをコードする配列を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体のＣ領域をコードするＤＮＡと融合したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、これを適当な宿主細胞に導入して該キメラ遺伝子を発現させることにより取得することができる。
ＧＰＲＣ５Ｄの機能的な発現を翻訳後レベルで抑制する物質の別の好ましい態様は、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合してその機能的発現を阻害するオリゴヌクレオチド、即ちアプタマーである。ＧＰＲＣ５Ｄに対するアプタマーは、例えば、以下の手順により取得することができる。即ち、まず、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いてランダムにオリゴヌクレオチド（例えば、約６０塩基）を合成し、オリゴヌクレオチドのプールを作製する。次に、目的の蛋白質、即ちＧＰＲＣ５Ｄと結合するオリゴヌクレオチドをアフィニティーカラムで分離する。分離したオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅し、前述の選抜プロセスで再度選抜する。この過程を約５回以上繰り返すことによって、ＧＰＲＣ５Ｄに親和性の強いアプタマーを選抜することができる。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬は、標的組織（即ち、視床下部）の細胞内に取り込まれて初めてその治療活性を発揮し得るが、有効成分である核酸や蛋白質分子は細胞内に吸収されにくく、しかも体内で速やかに分解されやすい。また、通常これらの分子の取り込みはエンドサイトーシスにより行われるので、リソソーム酵素による分解を受けやすい。従って、ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質を、視床下部の細胞に安定な状態で送達し、細胞膜の透過性を向上させ、リソソーム／エンドソームからの薬剤の遊離を促進するようなドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の設計が重要である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のオリゴ核酸分子の場合、上述のようにリン酸結合や糖部分（２’位、３’位等）を修飾した核酸の他、リン酸と糖部分をペプチド結合に置き換えたＰＮＡ、リン酸骨格の代わりにモルフィン骨格を有するオリゴヌクレオチド等、化学修飾により、ヌクレアーゼに対する安定性、細胞内移行、リソソーム／エンドソームからの遊離を改善させることが可能であり、これらの修飾オリゴ核酸はＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて容易に調製することができる。
一方、ポリＬ−リジン、アビジン、コレステロール又はリン脂質成分等の付属基をオリゴヌクレオチドや抗体分子に結合させることによって、細胞膜透過性を向上させることもできる。
さらに、オリゴヌクレオチドや抗体分子をカチオン性リポソームに被包して製剤化することもできる。リポソーム中に被包することにより、有効成分はヌクレアーゼやプロテアーゼによる分解から保護され、且つリポソーム膜のカチオン性表面は細胞表面の陰性荷電分子と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。カチオン性リポソームは、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ等のカチオン性脂質と、膜融合能を持つ中性脂質ＤＯＰＥを混合して調製することができる。核酸や蛋白質はポリアニオン性であるので、カチオン性リポソームと混合することにより容易に複合体を形成する。また、リポソーム膜に視床下部の細胞で特異的に発現する細胞表面分子に対する抗体もしくはリガンドを組み込むことにより、細胞特異的なターゲッティングを行うこともできる。例えば抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体自体をリポソーム膜に組み込むこともできる。
また、エンドサイトーシスにより取り込まれたリポソームをリソソーム酵素による分解から保護するために、ｐＨ感受性リポソーム（酸性ｐＨで膜が不安定化し、リソソームと融合する前にエンドソーム小胞から細胞質に内容物が遊離される）や、紫外線照射等によりウイルスＲＮＡを完全に断片化したセンダイウイルスとの融合リポソーム（センダイウイルスの膜融合能を用いてエンドサイトーシス経路を回避する）を使用することも好ましい。
上記のような剤形に設計された本発明の拒食症治療薬は、適当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、経口的又は非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは視床下部付近への局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、側脳室内への局所投与が挙げられる。
本発明の拒食症治療薬の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００８〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約０．０２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを１回もしくは数回に分けて投与することができる。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質が、アンチセンス核酸、リボザイム又はアプタマーのような核酸分子（以下、有効核酸分子ともいう）である場合、本発明の拒食症治療薬は、該有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の有効核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の視床下部細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されているか、あるいは投与された動物の視床下部細胞内で、一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の視床下部細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。「一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置される」とは、例えば、以下でさらに詳述するように、プロモーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドが、該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有し、該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼの存在下に該スペーサー配列が切り出されて、有効核酸分子をコードするポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されるように配置されることをいう。
本発明の発現ベクターは、好ましくは有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。発現ベクターが上述のようにリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスペーサー配列を有する場合、該選択マーカー遺伝子は当該スペーサー配列内に配置することもできる。
本発明の発現ベクターに使用されるベクターは特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
アンチセンス核酸やリボザイム等の有効核酸分子は本来異物であり、これらの構成的且つ過剰な発現は、当該遺伝子を導入された宿主動物にとって毒性が強く、副作用を引き起こす場合も考えられる。従って、本発明の好ましい態様においては、発現ベクターは、不要な時期及び／又は不要な部位での有効核酸分子の過剰発現による悪影響を防ぐために、有効核酸分子を時期特異的及び／又は視床下部細胞特異的に発現させることができる。このようなベクターの第一の実施態様としては、投与対象となる動物の視床下部細胞において特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。例えば、ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子のネイティヴなプロモーター等が挙げられる。
本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターの第二の実施態様として、外因性の物質によってトランスに発現が制御される誘導プロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。誘導プロモーターとして、例えば、メタロチオネイン−１遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に視床下部に局所投与することにより、任意の時期に視床下部特異的に有効核酸分子の発現を誘導することができる。
本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターの別の好ましい態様は、プロモーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドとが、該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される２つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有するベクターである。該ベクターが視床下部の細胞内に導入されただけではプロモーターは有効核酸分子の転写を指示することができない。しかしながら、所望の時期に視床下部に該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼを局所投与するか、あるいは該リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを局所投与して該リコンビナーゼを視床下部の細胞内で発現させると、該認識配列間で該リコンビナーゼを介した相同組換えが起こり、その結果、該スペーサー配列が切り出され、有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されて、所望の時期に視床下部特異的に有効核酸分子が発現される。
上記ベクターに使用されるリコンビナーゼ認識配列は、投与対象に内在のリコンビナーゼによる組換えを防ぐために、内在のリコンビナーゼによっては認識されない異種リコンビナーゼ認識配列であることが望ましい。したがって、該ベクターにトランスに作用するリコンビナーゼもまた異種リコンビナーゼであることが望ましい。このような異種リコンビナーゼと該リコンビナーゼ認識配列の組み合わせとしては、大腸菌のバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘＰ配列、あるいは酵母由来のＦｌｐリコンビナーゼとｆｒｔ配列が好ましく例示されるが、それらに限定されるものではない。
Ｃｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージで発見されたが、特異的なＤＮＡ組換え反応は、原核細胞だけでなく真核細胞である動物細胞や動物ウイルスでも機能することが知られている。同一ＤＮＡ分子上に同方向の２つのｌｏｘＰ配列が存在する場合は、Ｃｒｅリコンビナーゼはその間に挟まれたＤＮＡ配列を切り出して環状分子を形成させる（切り出し反応）。一方、異なるＤＮＡ分子上に２つのｌｏｘＰ配列が存在し、その一方が環状ＤＮＡである場合は、ｌｏｘＰ配列を介して環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ分子上に挿入される（挿入反応）［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６（１９８１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：１５０９−１５１４（１９８４）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１０２６−１０２９（１９８４）］。切り出し反応の例は、動物培養細胞［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：１４７−１６１（１９８９）；Ｇｅｎｅ，１８１：２０７−２１２（１９９６）］、動物ウイルス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５１６６−５１７０（１９８８）；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：４６００−４６０６（１９９５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ−Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：３８１６−３８２１（１９９５）］、トランスジェニックマウス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６２３２−６２３６（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６８６１−６８６５（１９９２）；Ｃｅｌｌ，７３：１１５５−１１６４（１９９３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１０３−１０６（１９９４）］等で報告されている。
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用した本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターのプロモーターとしては、所望の時期及び部位での発現を確実にするために、好ましくはウイルス由来プロモーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターが使用される。
有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とする本発明の拒食症治療薬の投与は、治療対象動物自身の神経細胞を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うｉｎ  ｖｉｖｏ法のいずれかで行われる。ｅｘ  ｖｉｖｏ法の場合、標的細胞へのベクターの導入は、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等により行うことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法の場合、ウイルスベクターは、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等に投与される。あるいは、静脈内注射などによりベクターを投与すると、ウイルスベクターに対する中和抗体の産生が問題となるが、標的細胞の存在する視床下部付近、例えば側脳室内に局所的にベクターを注入すれば（ｉｎ  ｓｉｔｕ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。
また、有効核酸分子をコードする発現ベクターとして非ウイルスベクターを使用する場合、該発現ベクターの導入は、有効核酸分子自体を有効成分とする治療薬の剤形について上記したように、ポリＬ−リジン−核酸複合体などの高分子キャリアーを用いるか、リポソームに被包して行うことができる。あるいは、パーティクルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用したベクターの使用において、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ自体を局所投与する場合、例えば、リコンビナーゼを適当な無菌のビヒクル（例えば、人工の脳髄液等）に溶解または懸濁して視床下部に注入すればよい。一方、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ発現ベクターを視床下部に局所投与する場合、該リコンビナーゼ発現ベクターは、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドが、投与対象の視床下部細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結した発現カセットを有するものであれば特に制限されない。使用されるプロモーターが構成プロモーターである場合、不要な時期におけるリコンビナーゼの発現を防ぐために、視床下部に投与されるベクターは、例えばアデノウイルスのように、宿主細胞の染色体への組込みが稀なものであることが望ましい。しかしながら、アデノウイルスベクターを使用した場合、リコンビナーゼの一過的発現はせいぜい４週間程度しか持続しないので、治療が長期に及ぶ場合には第二、第三の投与が必要になる。リコンビナーゼを所望の時期に発現させる別のアプローチとして、メタロチオネイン遺伝子プロモーターのような誘導プロモーターの使用が挙げられる。この場合、レトロウイルス等のインテグレーション効率の高いウイルスベクターの使用が可能となる。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を抑制する物質が、アンチセンス核酸、リボザイム又はアプタマーのような核酸分子である場合、本発明の拒食症治療薬は、上記のような有効核酸分子をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を有効成分とすることもできる。使用される宿主細胞としては、上記のような発現ベクターのｅｘ  ｖｉｖｏ導入法において、投与対象から標的細胞として取り出される自己細胞、または同種異系（例えば、ヒトの場合、死産の胎児や脳死患者等）もしくは異種（ヒトの場合、ブタやサル等の他の哺乳動物）の個体から取り出した神経細胞、あるいはそれらの神経幹細胞やＥＳ細胞を培養・分化させて得られる神経細胞などが例示される。中枢神経系は拒絶反応の最も起こりにくい器官・組織であるので、少量の免疫抑制剤の併用により異種細胞であっても生着させることが可能である。
また、別の態様においては、投与対象となる動物の鼻腔、咽頭、口腔、腸管等に常在する細菌等を宿主細胞として、常法によりこれを有効核酸分子をコードする発現ベクターで形質転換し、得られる形質転換体を宿主細胞が通常存在する投与対象内の部位に送達することもできる。最近、薬物を脳に移行させる際、血液脳関門以外の経路として鼻から脳脊髄液に直接移行させる経路が検討されており、鼻腔常在菌の使用はこの目的に適うものである。
有効核酸分子をコードする発現ベクター又は該発現ベクターを担持する宿主細胞を有効成分とする本発明の拒食症治療薬の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、プロモーター活性、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、有効核酸分子自体を有効成分とする治療薬を投与する場合の適切な投与量に相当する量の有効核酸分子を、ベクターもしくは宿主細胞を投与された動物の体内で発現させる程度であることが好ましく、例えば、成人１日あたりベクター量として約２〜約２０μｇ／ｋｇ、好ましくは約５〜約１０μｇ／ｋｇである。
ＧＰＲＣ５Ｄは、摂食量を負に調節するシグナル伝達を仲介する膜受容体蛋白質であることから、この受容体の発現を増強することにより、摂食行動を抑制することができる。従って、本発明はまた、ＧＰＲＣ５Ｄの発現を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。―般に、「生活習慣病」は、食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症・進行に関与する疾患群として規定されるが、本発明においては、特に「摂食量を抑制方向に調節することにより治療効果がもたらされ得る疾患群」をいい、例えば、糖尿病、肥満症、高脂血症、高尿酸血症等が代表的なものとして含まれる。患者はこれらの疾患の２つ以上を併発している場合が多い。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を増強する物質としては、例えば、ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子からのＲＮＡ転写を促進し得るトランス活性化因子、スプライシングやｍＲＮＡの細胞質移行を促進し得る因子、ｍＲＮＡの分解を抑制する因子、リボソームのｍＲＮＡへの結合を促進し得る因子、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質の分解を抑制する因子、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質の膜への輸送を促進する因子等が挙げられるが、より直接的且つ特異的な物質として、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質もしくはその均等物、ＧＰＲＣ５Ｄをコードする核酸を含む発現ベクター又は該発現ベクターを担持する宿主細胞が好ましく例示される。
ここで「ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質」は、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなる蛋白質であり、「その均等物」とは、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１もしくは２以上（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、いっそう好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧαと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド、あるいはこの定義の範囲外ではあるが、ヒト及びマウスのＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子と分子進化論上同一の起源を有する遺伝子によりコードされる他の哺乳動物由来の蛋白質、即ちオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）をいう。したがって、本発明の生活習慣病治療薬は、ヒト及びマウスのみならず、他の哺乳動物における糖尿病、肥満症、高脂血症、高尿酸血症等の治療への使用をも意図している。近年のペットブームにより、過剰な給餌と運動不足の結果、肥満症等の生活習慣病様の疾患を発症する動物が増加していることから、本発明の治療薬は獣医学の分野においても極めて有用である。
ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物は、例えばヒト又はマウス、あるいはウシ、ブタ、サル、ラット等の他の哺乳動物の視床下部組織由来の膜含有画分から、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該組織由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ＧＰＲＣ５ＤのｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、当該均等物は、ＧＰＲＣ５ＤのｃＤＮＡ配列（配列番号１記載の塩基配列中塩基番号１〜１０３５、又は配列番号３記載の塩基配列中塩基番号１４８〜１０４７で示される塩基配列）を基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はＧＰＲＣ５Ｄの受容体特性を変化させない範囲で、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質に適宜変異を導入することができる。しかしながら、リガンド結合ドメイン、好ましくはさらにインバースアゴニストが結合し得る細胞外ループ及びＮ末端鎖は高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。
ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物を有効成分とする生活習慣病治療薬は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を有効成分とする拒食症治療薬に関して上記したように、ポリＬ−リジン、アビジン、コレステロール又はリン脂質成分等の付属基を結合させることによって、細胞膜透過性を向上させることができる。あるいは、本治療薬は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をカチオン性リポソームに被包して製剤化することもできる。蛋白質はポリアニオン性であるので、カチオン性リポソームと混合することにより容易に複合体を形成する。また、リポソーム膜に視床下部の細胞で特異的に発現する細胞表面分子に対する抗体もしくはリガンドを組み込むことにより、細胞特異的なターゲッティングを行うこともできる。例えば、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（好ましくは、アンタゴニスト活性又はインバースアゴニスト活性を有しない抗体）をリポソーム膜に組み込むこともできる。
ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物を有効成分とする生活習慣病治療薬は、適当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、経口的又は非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは視床下部付近への局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、側脳室内への局所投与が挙げられる。
本生活習慣病治療薬の投与量は、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００８〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約０．０２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを１回もしくは数回に分けて投与することができる。
ＧＰＲＣ５Ｄの発現を増強する物質が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物である場合、本発明の生活習慣病治療薬は、それらのポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターであってもよいし、また、該発現ベクターを担持する宿主細胞であってもよい。ここで使用される発現ベクターや宿主細胞は、上記の拒食症治療薬の場合と同様のものであってよい。さらに、これらの生活習慣病治療薬の投与経路及び投与量についても、上記の拒食症治療薬のそれぞれに関して例示したものを、同様に好ましく使用することができる。
本発明はまた、視床下部細胞の細胞膜上に発現したＧＰＲＣ５Ｄの機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬、あるいは該機能を促進する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。これらの治療薬は、ＧＰＲＣ５Ｄに対してアゴニスト活性、アンタゴニスト活性又はインバースアゴニスト活性を有する物質をスクリーニングすることによって得ることができる。従って、本発明はまた、ＧＰＲＣ５Ｄの機能を抑制もしくは促進する物質のスクリーニング方法と、そのためのスクリーニング系を同時に提供する。
ここで「アゴニスト活性」とは、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体に特異的に結合し、ＧＰＲＣ５Ｄの活性型と不活性型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいう。従って、アゴニスト活性を有する物質には、いわゆるフルアゴニストや部分アゴニストの他、ＧＰＲＣ５Ｄの生理的リガンドも包含される。「アンタゴニスト活性」とは、ＧＰＲＣ５Ｄのリガンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない性質をいう。従って、アンタゴニスト活性を有する物質とは、いわゆるニュートラルアンタゴニストをいい、インバースアゴニストは含まないものとする。「インバースアゴニスト活性」とは、ＧＰＲＣ５Ｄの任意の部位に結合して、ＧＰＲＣ５Ｄの活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。尚、本明細書において、以下、単に「リガンド」という場合は、生理的リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストをすべて包含するものとする。
本発明のスクリーニング系は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜、並びにあるファミリーに属するＧαの受容体結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドを、必須の構成要素として含む系を１構成単位とし、該構成単位をＧαの各ファミリー（即ち、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ）の受容体結合領域について構築して得られる、一連の受容体−Ｇ蛋白質共発現系である。ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物は、上記の生活習慣病治療薬の有効成分として上記した通りのものである。ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物を保持する脂質二重層膜の由来は、該受容体蛋白質が該膜上で本来の立体構造をとることができる限り特に制限されないが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞膜画分が挙げられる。しかしながら、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞の細胞膜におけるそれに近い比率で混合した溶液から常法により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実施態様において好ましく使用され得る。
Ｇｓファミリーに属するＧα（Ｇαｓ）は、アデニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、Ｇαｓ−１〜Ｇαｓ−４、あるいはＧｏｌｆ等が挙げられる。Ｇｉファミリーに属するＧα（Ｇαｉ）は、アデニル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を抑制するものであり、例えば、Ｇαｉ−１〜Ｇαｉ−３、あるいはＧｚ等が挙げられる。Ｇｑファミリーに属するＧα（Ｇαｑ）は、ホスホリパーゼＣを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、ＧαｑあるいはＧ１６等が挙げられる。本スクリーニング系のＧαｓポリペプチド、Ｇαｉポリペプチド及びＧαｑポリペプチドはそれぞれ、自身のＧＰＣＲとの結合に関与する領域（ＲＢ領域）と任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域（ＧＢ領域）を有することが必要である。ＧαのＸ線結晶構造解析の結果から、ＧＰＣＲ結合領域はＣ末端近傍にあり、一方、ＧＢ領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ’ボックス、Ｇボックス、Ｇ”ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内のαＥヘリックスの先頭及びαＦヘリックスなど）であることが明らかになっている。ＧＰＲＣ５Ｄに対する生理的リガンド又はアゴニストが該受容体に結合すると、該受容体のＧα活性化ドメインと該受容体に共役するＧαのＲＢ領域とが相互作用してＧαのコンフォメーション変化を生じ、ＧＢ領域からＧＤＰが解離して速やかにＧＴＰを結合する。Ｇα−ＧＴＰは効果器に作用してその活性を促進又は抑制する。一方、インバースアゴニストが結合すると、受容体のコンフォメーション変化によりＧα活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型のＧα−ＧＴＰレベルが減少し、効果器への作用が阻害される。ここで、ＧＴＰの代わりに、例えば、３５Ｓ標識したＧＴＰγＳ等のＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加しておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価することができ、ＧＰＲＣ５Ｄに対するリガンド活性を有する物質をスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。一方、放射活性が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。
いったんＧＰＲＣ５Ｄに対するリガンドがスクリーニングされれば、該受容体と共役するＧαのファミリーが明らかになるので、以後のスクリーニングは、当該ファミリーに属するＧαポリプチペプチドを構成要素として含む系のみを用いて行うことができる。後述の受容体−Ｇα融合蛋白質発現系によるＧＰＲＣ５Ｄの恒常的活性化の結果から、ＧＰＲＣ５Ｄと共役し得るＧ蛋白質αサブユニットはＧαｓであることが強く示唆される。したがって、本発明はまた、ＧＰＲＣ５Ｄと共役し得るＧ蛋白質αサブユニット（好ましくは、Ｇαｓ）と該受容体との共発現系において、該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇαと相互作用する効果器の活性を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする、該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
ＧＰＲＣ５Ｄに対するリガンドの活性は、Ｇαポリペプチドの効果器への作用を指標として測定することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物に加えて、さらに効果器を含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要がある。また、Ｇαポリペプチドは該効果器と相互作用するための領域をさらに含む必要がある。各ファミリーに属するＧαは効果器の種類又は作用の方向が異なるので、それぞれが自身の効果器相互作用領域を有するよりも、共通の効果器相互作用領域をすべてのＧαポリペプチドが有することがより好ましい。従って、本スクリーニング系において、少なくとも２種のＧαポリペプチドは他のファミリーに属するＧαの効果器相互作用領域を含むキメラポリペプチドである。例えば、効果器としてホスホリパーゼＣを用いる場合、Ｇαｑポリペプチドはネイティブなものであってよいが、Ｇαｓポリペプチド及びＧαｉポリペプチドは効果器相互作用領域がＧαｑのもので置換されたキメラポリペプチドであることが必要である。別のファミリーに属するＧαの効果器相互作用領域を含むキメラポリペプチドの最も簡便な例としては、別のファミリーに属するＧαのＣ末端の約５アミノ酸程度（即ち、ＲＢ領域）を、自身のＣ末端配列で置換したものが挙げられる。
本スクリーニング系において、３種のＧαポリペプチドがＧαｓ又はＧαｉの効果器相互作用領域を含む場合、効果器としてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられる。一方、Ｇαポリペプチドが、Ｇαｑの効果器相互作用領域を含む場合は、効果器としてホスホリパーゼＣを含む脂質二重層膜を用いる必要がある。
効果器としてアデニル酸シクラーゼ（以下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系においては、Ｇαポリペプチドの効果器への作用は、ＡＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、ＡＣを含む膜画分にＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（例えば、１２５Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ＡＣを含む膜画分に［α−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成する［３２Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法等が挙げられるが、これに限定されない。ＧαポリペプチドがＧαｓの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対にＡＣ活性が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。一方、ＧαポリペプチドがＧαｉの効果器相互作用領域を含む場合は、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。反対にＡＣ活性が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、ＧαポリペプチドのＡＣへの作用は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定するか、あるいは細胞を［３Ｈ］アデニンで標識し、生成した［３Ｈ］ｃＡＭＰの放射活性を測定することによっても評価することができる。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。
別の態様として、ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＣＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内ｃＡＭＰ量を評価するというものである。
従って、ＧαポリペプチドがＧαｓの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対にｃＡＭＰ量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。一方、ＧαポリペプチドがＧαｉの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。反対にｃＡＭＰ量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。
一方、効果器としてホスホリパーゼＣ（以下、ＰＬＣともいう）を含むスクリーニング系（即ち、ＧαポリペプチドがＧαｑの効果器相互作用領域を含む場合）においては、Ｇαポリペプチドの効果器への作用は、ＰＬＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＰＬＣ活性は、例えば、３Ｈ標識したホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸をＰＬＣ含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下でＰＬＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＰＬＣ活性が増加すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対にＰＬＣ活性が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、ＧαポリペプチドのＰＬＣへの作用は、細胞に［３Ｈ］イノシトールを添加し、生成した［３Ｈ］イノシトールリン酸の放射活性を測定したり、細胞内のＣａ２＋量を測定することによっても評価することができる。細胞内Ｃａ２＋量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏｒ−３、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）システムが挙げられる。
別の態様として、Ｃａ２＋によりアップレギュレートされるＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、Ｃａ２＋量を評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＴＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ２＋量を評価するというものである。
従って、被験物質の存在下で細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対に細胞内Ｃａ２＋量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。
本発明のスクリーニング法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
本発明のスクリーニング系の１構成単位である、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜及びＧαポリペプチドを必須構成要素として含有する系の好ましい一実施態様は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、あるファミリーに属するＧαのＲＢ領域及び任意のＧαのＧＢ領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
「ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ」は、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは該アミノ酸配列において、１もしくは２以上（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、いっそう好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、ＧＰＲＣ５Ｄと同等のリガンド−受容体相互作用を示し、且つＧαと共役して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチド、あるいは配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのオルソログをコードするＤＮＡであれば特に制限はない。ＧＰＲＣ５Ｄ  ｃＤＮＡのコード領域（配列番号１記載の塩基配列中塩基番号１〜１０３５、又は配列番号３記載の塩基配列中塩基番号１４８〜１０４７で示される塩基配列）の他、ウシ、ブタ、サル、ラット等のヒト又はマウス以外の哺乳動物由来のＧＰＲＣ５Ｄに対応するＧＰＣＲをコードするＤＮＡ等が例示され、これらは、哺乳動物の視床下部を含む脳神経組織由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ＧＰＲＣ５ＤのｃＤＮＡをプローブとして単離され得る。また、当該均等物は、ＧＰＲＣ５ＤのｃＤＮＡを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。
３種のＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、少なくとも各ファミリーのＧαのＲＢ領域をコードする配列と、任意のＧαのＧＢ領域をコードする配列とを有することが必要である。各種Ｇα遺伝子の配列は公知であり、また、上述の通り、ＧαのＸ線結晶構造解析の結果から、ＲＢ領域及びＧＢ領域はよく知られている。従って、当業者は、所望によりＧαのコード配列の一部を欠失したフラグメントを容易に構築することができる。
Ｇαポリペプチドの効果器への作用を指標とするスクリーニング系においては、ＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、効果器相互作用領域をコードする核酸配列をさらに含む必要がある。上述のように、３種のＧαポリペプチドは共通の効果器相互作用領域を有するので、少なくとも２種のＧαポリペプチドは別のファミリーの効果器相互作用領域を有するキメラである。当該キメラポリペプチドをコードするＤＮＡの最も簡便な例としては、目的の効果器相互作用領域を有するＧαのｃＤＮＡのＣ末端の約５アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲ等の公知の手法を用いて、他のファミリーのＧαのＣ末端配列をコードするＤＮＡ配列に置換したものが挙げられる。
ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ、及びＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、宿主真核細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、真核細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の真核生物由来の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ましい。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有していてもよい。
本発明のスクリーニング系に使用されるベクターとしては、プラスミドベクターや、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、あるいは昆虫細胞での使用に好適なバキュロウイルスベクター等が挙げられる。
ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡと、ＧαポリペプチドをコードするＤＮＡは、２つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主細胞に共トランスフェクトされてもよいし、あるいは、１つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されてもよい。
宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞であれば特に制限はない。具体的には、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃｌ２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＴ２等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｒｏ等のサル由来細胞、およびＨｅＬａ、２９３等のヒト由来細胞及び、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ等の昆虫由来細胞などが例示される。
宿主細胞への遺伝子導入は、真核細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地等を用いて培養することができる。培地のｐＨは約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、通常約２７〜約４０℃である。
上記のようにして得られる、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ及びＧαポリペプチドをコードするＤＮＡを導入された真核細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例えば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収する）単離される膜画分の形態であってもよい。
例えば、ＧＴＰγＳ結合アッセイや、効果器の活性を直接測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはｃＡＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＣａ２＋応答性リポーターの発現量）を測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核細胞である。
尚、リガンド活性の評価を、ｃＡＭＰ応答性リポーター（効果器がアデニル酸シクラーゼの場合）もしくはＣａ２＋応答性リポーター（効果器がホスホリパーゼＣの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿主真核細胞は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）またはＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター領域の下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが機能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入されたものである必要がある。ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＧＴＣＡを含む配列が挙げられるが、ｃＡＭＰ応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。一方、ＴＲＥはＣａ２＋の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＴＣＡを含む配列が挙げられるが、Ｃａ２＋応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。ＣＲＥ又はＴＲＥを含むプロモーター配列としては、上記のようなウイルスプロモーターや真核生物由来の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列の下流にＣＲＥまたはＴＲＥ配列を挿入することができる。ＣＲＥ又はＴＲＥの制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列が配置されることがより好ましい。このようなＣＲＥ（又はＴＲＥ）−リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用することができる。
本発明のスクリーニング系の１構成単位である、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜及びＧαポリペプチドを必須構成要素として含有する系の別の好ましい実施態様は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物のＣ末端側に、あるファミリーに属するＧαのＲＢ領域及び任意のＧαのＧＢ領域を少なくとも含むポリペプチドが連結した融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡ、並びに各ファミリーのＧαのＲＢ結合領域及び任意のＧαのＧＢ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、上述のようにして取得することができる。当業者は、これらのＤＮＡ配列をもとにして、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、ＧＰＲＣ５ＤとＧαポリペプチドとの融合蛋白質をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。例えば、ＰＣＲ等を用いてＧＰＲＣ５ＤをコードするＤＮＡの終始コドンを除去したものに、ＧαポリペプチドをコードするＤＮＡを読み枠が合うように、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする等の方法が挙げられる。この際、ＧＰＲＣ５ＤのＣ末端の一部を欠失させたり、ＧＰＲＣ５ＤとＧαとの間にＨｉｓ−ｔａｇ等のリンカー配列を挿入したりすることもできる。
得られた融合蛋白質をコードするＤＮＡは、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主真核細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。得られた真核細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現すると、ＧＰＲＣ５ＤとＧαが相互作用し得る場合には、受容体の細胞内第３ループ上のＧα活性化ドメインとＧαのＲＢ領域とは、該受容体に対する生理的リガンドの非存在下に相互作用して、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進し得る。即ち、Ｇαは恒常的に活性化された状態となる。一方、ＧＰＲＣ５Ｄと相互作用しないＧαとの融合蛋白質ではＧＰＲＣ５Ｄは活性化されず、Ｇα−ＧＴＰレベルは増大しない。ここで、ＧＴＰの代わりに、例えば、３５Ｓ標識したＧＴＰγＳ等のＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加しておけば、３種の融合蛋白質をそれぞれ含む膜系において、膜に結合した放射活性を測定し、相互に比較することによって、ＧＰＲＣ５Ｄの活性化の有無を評価することができ、該受容体と相互作用し得るＧαを同定することができる。
いったんＧＰＲＣ５Ｄと相互作用し得るＧαが同定されれば、以後のスクリーニングは、ＧＰＲＣ５Ｄと当該Ｇαとを含む膜系、好ましくはＧＰＲＣ５Ｄと当該Ｇαとの融合蛋白質を含む膜系のみを用いて行うことができる。すなわち、上記の共役Ｇαの同定に用いたのと同様に、ＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加し、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価することができ、ＧＰＣＲに対するリガンド活性を有する物質をスクリーニングすることができる。被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するアゴニスト活性を有し、放射活性が減少すれば、該被験物質はＧＰＲＣ５Ｄに対するインバースアゴニスト活性を有する。融合蛋白質による受容体の活性化は部分的であるので、ＧＰＲＣ５Ｄに対する生理的リガンド又はアゴニストが結合すると、該受容体の活性型−不活性型の平衡状態はさらに活性状態側にシフトし、Ｇα−ＧＴＰレベルはさらに増大するので、本スクリーニング系はアゴニストのスクリーニングも可能である。
後記実施例に示される通り、ＧＰＲＣ５ＤはＧαｓとの融合蛋白質として発現させた場合にのみ恒常的に活性化されることから、該受容体と共役するＧαはＧαｓであることが強く示唆される。したがって、本発明はまた、Ｇαｓと該受容体との融合蛋白質発現系において、ＧαｓのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする、該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
融合蛋白質におけるＧＰＲＣ５Ｄの活性化は、Ｇαの効果器への作用を指標として評価することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、各融合蛋白質に加えて、各Ｇαが相互作用する効果器をさらに含む脂質二重層を包含する膜系である必要がある。すなわち、Ｇαｑとの融合蛋白質を含む膜系はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）をさらに含有し、ＧαｉおよびＧαｓとの融合蛋白質を含む膜系はアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）をさらに含有する。この場合、ＧＰＲＣ５Ｄの活性化の有無は、各Ｇαについて、ＧＰＲＣ５ＤとＧαとを別個に（即ち、融合蛋白質としてではなく）含有する膜系を調製し、それぞれについて効果器の活性を測定・比較することにより評価することもできる（即ち、ＧＰＲＣ５Ｄと相互作用し得るＧαとの融合蛋白質を含む膜系では、両者を非融合蛋白質として含む膜系よりも効果器の活性が有意に高く（Ｇαｉの場合は低い）、相互作用しないものでは両系間で効果器の活性に有意差はない）。
いったんＧＰＲＣ５Ｄと相互作用し得るＧαが同定されれば、以後のスクリーニングは、該Ｇαとの融合蛋白質を含む膜系のみを用いて、該Ｇαが相互作用し得る効果器の活性を、被験物質の存在下および非存在下で直接的もしくは間接的に測定し、比較することにより行うことができる。したがって、本発明はまた、上記ＧＰＲＣ５Ｄに対する共役Ｇαの同定方法により同定される該受容体と共役し得るＧαと該受容体との融合蛋白質及び該Ｇαが相互作用し得る効果器を含む膜系において、該効果器の活性を被験物質の存在下および非存在下で測定・比較することを特徴とする、ＧＰＲＣ５Ｄに対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
上述のように、ＧＰＲＣ５ＤはＧαｓとの融合蛋白質として発現させた場合にのみ恒常的に活性化されることから、該受容体と共役するＧαはＧαｓであることが強く示唆される。したがって、ＧＰＲＣ５ＤとＧαｓとの融合蛋白質およびＡＣを含有する膜系におけるＡＣ活性を、被験物質の存在下および非存在下で測定・比較する。ＡＣ活性の測定は上記と同様にして行うことができる。
あるいは、ＧαをコードするＤＮＡの特定の部分に公知の手法により変異を導入して、そのアミノ酸配列を改変することによっても、Ｇαが恒常的に活性化された状態となることが知られている。従って、この系もリガンドのスクリーニングに同様に用いることができる。このような技術は、例えば、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，８９０−８９８（２０００）やＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，８２５３−８２６１（１９９８）に記載される方法に準じた内容で実施することができる。
このような融合蛋白質（もしくは変異Ｇα）発現細胞についても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択して用いることができる。
本発明のさらに別の態様においては、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜、及びＧαポリペプチドを構成要素として含有するスクリーニング系として、精製したＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物とＧαポリペプチド、あるいは精製した該受容体とＧαとの融合蛋白質を、人工脂質二重層膜中に再構成させたものを使用することができる。ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物は、ヒトもしくはマウス、又は他の哺乳動物の視床下部を含む脳神経組織等から得られる膜画分より、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。あるいは、該受容体は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質又はその均等物をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することもできる。同様に、該受容体とＧαとの融合蛋白質も、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
人工脂質二重層膜を構成する脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。
例えば、受容体とＧα、又は受容体−Ｇα融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオリポソーム）は、以下の方法により調製することができる。即ち、まず、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝１２：１２：１の混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製した受容体とＧα、又は受容体−Ｇα融合蛋白質を適量添加し、氷中で時々攪拌しながら２０〜３０分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液に対して透析する。約１００，０００×ｇで３０〜６０分間遠心して沈渣を回収することにより、所望のプロテオリポソームを得ることができる。
上記のようなスクリーニング系及びスクリーニング方法により選ばれた、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質は、任意の医薬上許容される担体を配合することにより拒食症又は生活習慣病の治療薬とすることができる。従って、本発明は、本発明のスクリーニング法により選抜されたＧＰＲＣ５Ｄに対するアンタゴニスト又はインバースアゴニストを有効成分とする拒食症治療薬を提供する。本発明はまた、本発明のスクリーニング法により選抜されたＧＰＲＣ５Ｄに対する生理的リガンド又はアゴニストを有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。投与方法が視床下部付近への局所注入の場合、有効成分であるリガンドを人工脳髄液に溶解もしくは懸濁させた注射液剤が好ましい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。プルーロニックゲルは体温でゲル化し、それ以下の低温では液体であることから、リガンドをプルーロニックゲルとともに局所注入して標的組織周辺でゲル化させることにより、長期持続性とすることができる。当該リガンド製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、リガンドおよび医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明のリガンド製剤の投与量は、リガンド活性（フルアゴニストか部分アゴニストか、あるいはアンタゴニストかインバースアゴニストか）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたりリガンド量として約０．０００８〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約０．０２５／ｋｇである。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、特に明記しない限り、以下の実施例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年発行、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．等に記載の方法で行なった。
参考例１：ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子の発現分布解析
ｄｂ／ｄｂマウス（雄、ＳＰＦグレード、購入時７週齢、臓器採取時１０週齢、日本クレア）視床下部をＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）中にホモジナイズし、全ＲＮＡを採取した。全ＲＮＡ  １μｇを鋳型に、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ２．１．（Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。この視床下部ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のマウスＧＰＲＣ５Ｄ（ｍＧｐｒｃ５ｄ）特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。尚、Ｔａｑポリメラーゼはパーキンエルマー社のものを用いた。
2003055507.tif 000003
その結果、ｄｂ／ｄｂマウスの視床下部においてＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子が発現していることが明らかとなった。
参考例２：ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子の発現分布解析
マウス（ＣＤ−１（ＩＣＲ））から、１０％中性緩衝ホルマリンによる還流固定後に脳を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンによる固定後パラフィン包埋してブロックを作製した。このパラフィンブロックを冠状断（Ｉｎｔｅｒａｕｒａｌ  ２．３４ｍｍ、Ｂｒｅｇｍａ−１．４６ｍｍ付近）７μｍの厚さで薄切し、ＩＳＨ染色用の切片とした。
またＴ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法によりジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを作製した。具体的にはＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、配列番号：３の２３４位−６２４位の領域に相当するアンチセンスＲＮＡプローブを作製した。
次に、前記で作製したマウス脳パラフィン切片とプローブとを用いて、常法によりＩＳＨ染色を実施した。抗体にはアルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体を、発色基質にはＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用し、染色後ケルネヒトロートにより核染色を行った。
ＧＰＲＣ５Ｄアンチセンスプローブを用いた染色の結果、室傍核、視床下部腹内側核において発現が認められた。この室傍核および視床下部腹内側核は、摂食中枢が存在する領域である。よってＧＰＲＣ５Ｄは、摂食中枢において摂食・エネルギー代謝に関与する因子であることが示唆された。
実施例１：肥満モデルマウスに対するＧＰＲＣ５ＤクローンアンチセンスＤＮＡの作用
（１）実験材料
試薬：ＧＰＲＣ５ＤクローンアンチセンスＤＮＡは、当該遺伝子開始コドン付近に対する２５ｍｅｒのチオール化アンチセンスＤＮＡを用いた。以下に該アンチセンスＤＮＡの塩基配列を示す。
2003055507.tif 000004
コントロールＤＮＡとしては、下記配列を有するチオール化オリゴＤＮＡを使用した。
2003055507.tif 000005
この配列は、ヘモグロビン異常症サラセミアにおける赤血球β−グロビンのプレｍＲＮＡ中、７０５位でのスプライシング異常を引き起こす変異により生じた配列に対して相補的である。このオリゴ鎖は、健常細胞では特異的標的部位や生物学的活性を有しておらず、サラセミアの赤血球細胞に作用させたときにのみ該スプライシング異常を訂正し、その結果、正常β−グロビンをコードするｍＲＮＡを生じさせるとされている。これらのオリゴＤＮＡの合成、チオール化及びＨＰＬＣ精製は、いずれも（株）日本バイオサービスに委託した。
その他試薬は市販の特級試薬を用いた。
実験動物：Ｃ５７ＢＬ  ｄｂ／ｄｂ（以下、肥満マウスという）（ＳＰＦ規格）を日本クレア社より購入、予備飼育の後、肥満マウスは１０週齢で実験に使用した。飼育環境：温度が２０℃以上２６℃以下、相対湿度が３０％以上７０％以下に制御され、照明が８：００〜２０：００点灯、２０：００〜８：００消灯のサイクルに設定された部屋で飼育した。飼育中は固形飼料（ＣＥ−２，日本クレア）および滅菌蒸留水を自由摂取させた。
（２）投与液の調製
アンチセンスＤＮＡ投与液、コントロールＤＮＡ投与液として、７．５μｇ／μｌのアンチセンスＤＮＡを含む人工脳髄液（０．１６６ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、７．０１４ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２９８ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．２０３ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２．１０ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３）を調製した。
（３）アンチセンスＤＮＡの脳室内投与
肥満マウスを２群に分け、一晩絶食の後、午前８：００に照明点灯と同時に、１群にアンチセンスＤＮＡ投与液を４μｌ／マウス（アンチセンスＤＮＡとして３０μｇ／マウス）を、もう一群にはコントロールＤＮＡ投与液４μｌ／マウスを側脳室内に投与した。
（４）アンチセンスＤＮＡ投与によるマウスの摂餌量、血糖値に対する影響
投与直後よりマウスへの給餌を再開し、投与後４８時間まで１２時間毎に摂餌量を算出した。肥満マウスの摂餌量に対するアンチセンスＤＮＡの作用を図１に示す。図１において、黒色のカラムはコントロールＤＮＡ投与群、白色のカラムはアンチセンスＤＮＡ投与群の、投与後１２時間毎の平均摂餌量（エラーバーは標準偏差、コントロールＤＮＡ投与群ｎ＝４、アンチセンスＤＮＡ投与群ｎ＝４）を示す。投与後１２時間では摂餌量に大きな変化は認められなかった。しかし、その後の経過と共にＧＰＲＣ５ＤクローンのアンチセンスＤＮＡ投与により、肥満マウスの摂餌量を上昇させる効果が見られた。
また、投与前および投与後４８時間まで２４時間毎に血糖値を測定した。肥満マウスの血糖値に対するアンチセンスＤＮＡの作用を図２に示す。図２において、黒色のカラムはコントロールＤＮＡ投与群、白色のカラムはアンチセンスＤＮＡ投与液群の、投与後２４時間毎の平均血糖値（エラーバーは標準偏差、コントロールＤＮＡ投与群ｎ＝４、アンチセンスＤＮＡ投与群ｎ＝４）を示す。投与後２４時間までは大きな変化は認められなかった。しかし、投与後４８時間でＧＰＲＣ５ＤクローンのアンチセンスＤＮＡ投与により、肥満マウスの血糖値を上昇させる効果が見られた。
上記の結果から、ＧＰＲＣ５Ｄクローンは摂食行動および糖代謝に関与する因子である可能性が示唆された。
実施例２：飽食・絶食状態での視床下部遺伝子発現変動の解析
ｄｂ／ｄｂマウス（雄、ＳＰＦグレード、購入時７週齢、臓器採取時１１週齢、日本クレア；以下、肥満マウスという）およびＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（雄、ＳＰＦグレード、購入時６週齢、臓器採取時１１週齢、日本チャールズ・リバー；以下、正常マウスという）の視床下部を飽食状態および２４時間絶食状態で採取し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）中にてホモジナイズし、全ＲＮＡを採取した。全ＲＮＡ  １μｇをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、逆転写反応を行った。続いて、逆転写反応済みの各サンプルとＧＰＲＣ５Ｄクローン特異的なプライマー（下記参照）を混合し、ＡＢＩ７７００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲ反応を実施し、ＧＰＲＣ５Ｄクローンの遺伝子発現変動を解析した。またＧＰＲＣ５Ｄクローンの発現は、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）にて補正を行い、相対値として解析した。
・ＧＰＲＣ５Ｄ
フォーワードプライマー：
2003055507.tif 000006
リバースプライマー：
2003055507.tif 000007
・ＧＡＰＤＨ
フォーワードプライマー：
2003055507.tif 000008
リバースプライマー：
2003055507.tif 000009
ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子の飽食／絶食状態での発現変動を図３に示す。図３において、黒色のカラムは飽食状態、白色のカラムは絶食状態のＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子の平均発現変動（エラーバーは標準偏差、各群ｎ＝３）を示す。正常マウスでは大きな変動は認められなかったが、肥満マウスでは、絶食によりＧＰＲＣ５Ｄの発現亢進が認められた。肥満マウスの絶食状態でＧＰＲＣ５Ｄクローン発現が亢進していること、並びにアンチセンス投与が摂食亢進、血糖上昇作用を示すことから、ＧＰＲＣ５Ｄクローンは摂食抑制作用を有する可能性が示唆された。以上のことより、ＧＰＲＣ５Ｄクローンは摂餌量および糖代謝の調節に関与しており、ＧＰＲＣ５Ｄクローンの作用を亢進することは、より効果的な生活習慣病治療効果が得られることが明らかになった。
実施例３：ＧＰＲＣ５Ｄクローン安定発現株の樹立
（１）導入遺伝子ベクターの構築
ＧＰＲＣ５Ｄクローンのコード領域をＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）にてＰＣＲ法で増幅する。増幅した遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターを構築する。
（２）細胞株の樹立
以下の３つのタイプのキメラＧ蛋白質（Ｇｑ、Ｇｑｉ５、Ｇｑｓ５）発現ＣＨＯ細胞株（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を１０ｃｍ２培養皿に播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。その後無血清培地に転換し、上記（１）で構築したＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターとＬｉｐｏｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ）と複合体を形成させ培地に添加する。５時間インキュベート後１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に転換後さらに８時間培養する。その後トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を培養皿から剥離させ、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８と１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、１０ｃｍ２培養皿に播種する。数日後に形成されたコロニーを単離し、ＧＰＲＣ５Ｄ安定発現株（￥ｑ、￥ｑｉ５、￥ｑＳ５）とする。
実施例４：レセプターアゴニストのスクリーニング
（１）細胞の調製
ＧＰＲＣ５Ｄ安定発現株（￥ｑ、￥ｑｉ５、￥ｑＳ５）を９６穴培養皿に播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。これを発現細胞として使用する。
（２）薬物添加
発現細胞の培地を使用前日に無血清のＤ−ＭＥＭ培地に交換する。評価日に各化合物（２．５ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液）をＤ−ＭＥＭ培地で目的の濃度になるように希釈する。培養皿の培地を除去し、希釈した被験化合物と４μＭのＦｌｕｏ３ＡＭ（Ｔｅｆｌａｂ．）及び２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを添加し、３７℃で６０分培養する。被験化合物を添加しない以外は同様に処理したサンプルを、比較のために用意する。
（３）ＦＬＩＰＲ法による細胞内カルシウム濃度測定
上記の処理を施した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、Ｔｈｙｒｏｄｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、１％ゼラチンを含む）に懸濁する。培養皿の４８８ｎＭ、５４０ｎＭでの吸収をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて定量する。
実施例５：ＧＰＲＣ５Ｄ−Ｇα融合蛋白質発現用プラスミドの構築
ＧＰＣＲのシグナリングをほぼ網羅できると考えられる代表格３種のαサブユニットとして、ＧｑファミリーからＧα１６、ＧｉファミリーからＧαｉ２、ＧｓファミリーからＧαＳ２を選択した。これらの全コーディング領域を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にＰＣＲクローニングした。さらに、ＰＣＲにより各Ｇαコーディング領域の直前に制限酵素ＥｃｏＲＶ切断部位と、６×Ｈｉｓタグを含む配列を付加し、各Ｇα蛋白質の５’側にＧＰＣＲの遺伝子を容易に融合することが出来るようなプラスミドｐｃＨＩＳＧα１６、ｐｃＨＩＳＧαｉ２、ｐｃＨＩＳＧαＳ２を作製した。
即ち、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ）を２０倍希釈し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。酵素は、ＫＯＤｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。ただし、Ｍｇ２＋濃度は１ｍＭとした。増幅反応は、２０μｌの反応液でＫＯＤｐｌｕｓに添付の反応バッファーを使用した。Ｇα１６  ｃＤＮＡを増幅するためにはプライマーＧＮＡ１５Ｆ１（配列番号１３）とＧＮＡ１５Ｒ１（配列番号１４）を、Ｇαｉ２  ｃＤＮＡを増幅するためにはプライマーＧＮＡｉ２Ｆ１（配列番号１５）とＧＮＡｉ２Ｒ１（配列番号１６）を、またＧαＳ２  ｃＤＮＡを増幅するためにはプライマーＧＳ２Ｆ１（配列番号１７）とＧＳ２Ｒ１（配列番号１８）をそれぞれ使用した。増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃、２分→（９４℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクルの条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。各ＰＣＲ産物の末端をリン酸化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分離精製後、制限酵素ＥｃｏＲＶで切断しＣＩＡＰ処理したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを確認し、得られた各Ｇ蛋白質発現プラスミドをそれぞれ、ｐｃＧα１６、ｐｃＧαｉ２およびｐｃＧαＳ２と命名した。
次に、各Ｇ蛋白質のＮ末側にＨＩＳタグを介してＧＰＲＣ５Ｄを融合することが出来るように、各Ｇ蛋白質の開始コドンＡＴＧの直前にＨＩＳタグ配列を連結し、さらに制限酵素ＥｃｏＲＶの認識部位を付加した。即ち、先ず、ｐｃＧα１６、ｐｃＧαｉ２およびｐｃＧαＳ２それぞれ１０ｎｇを鋳型として、プライマー（ＧＮＡ１５ＡＴＧ：配列番号１９、ＧＮＡｉ２ＡＴＧ：配列番号２０またはＧＳ２ＡＴＧ：配列番号２１）とベクター部分のプライマー（ｐｃＤＮＡＲＶ：配列番号２２）でＰＣＲを行った。増幅は、９４℃、２分→（９４℃、１５秒→５８℃、３０秒→６８℃、６０秒）×２０サイクルの条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。次に、ＨＩＳ２ｌｉｎｋｅｒ（配列番号２３）とＨＩＳ２ｌｉｎｋｅｒ（Ｒ）（配列番号２４）をアニーリングし、末端をリン酸化後、各ＰＣＲ産物とライゲーションした。これらを制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＸｈｏＩで切断後、目的ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離、精製した。回収したＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで切断した発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを確認し、得られたプラスミドをそれぞれｐｃＨＩＳＧα１６、ｐｃＨＩＳＧαｉ２およびｐｃＨＩＳＧαＳ２と命名した。
実施例６：ＧＰＲＣ５Ｄ−Ｇα融合蛋白質発現プラスミドの構築
（１）ＧＰＲＣ５Ｄのクローニング
ヒトＴｅｓｔｉｓ由来ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）を用いて以下のプライマーを用いてＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子のＰＣＲクローニングを行った。
2003055507.tif 000010
得られた断片をｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン社）にＴＡ−クローニングした。得られたクローンからプラスミドを調製し、塩基配列の解析を行った。その結果、既報の文献と一致する配列のＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子が得られた。得られたプラスミドをｐＴ７ＧＰＲＣ５Ｄと命名した。
（２）ＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターの構築
発現ベクターの構築は、基本的にインビトロジェン社のＧＡＴＥＷＡＹシステムを利用し、メーカーの取扱説明書に従って実施した。まず、発現ベクターのデスティネーション・ベクター化を行った。実施例５で作製したｐｃＨＩＳＧαＳ２、ｐｃＨＩＳＧαｉ２、ｐｃＨＩＳＧα１６それぞれをＥｃｏＲＶ消化後、ＧＡＴＥＷＡＹ  ｆｒａｍｅ  Ｂ（インビトロジェン社）を挿入し、ＤＢ３．１コンピテントセル（インビトロジェン社）を形質転換後クロラムフェニコールにて選抜し、得られたクローンをさらに制限酵素消化にて選択することにより、ＧＡＴＥＷＡＹ  ｆｒａｍｅ  Ｂが正しい方向に挿入された目的とするクローンを得た。これらをそれぞれｐｃＨｉｓＧαＳ２−ＤＥＳＴ、ｐｃＨｉｓＧαｉ２−ＤＥＳＴ、ｐｃＨｉｓＧα１６−ＤＥＳＴと名づけた。また、対照として非融合遺伝子発現用ベクターとしては同じＣＭＶプロモーターとｂＧＨターミネーターを持つデスティネーション・ベクターを利用した。すなわち、ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃＨｉｓＡをＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで消化後平滑化し、ＧＡＴＥＷＡＹ  ｆｒａｍｅ  Ｃ．１（インビトロジェン社）を挿入後、ＤＢ３．１コンピテントセルを形質転換後クロラムフェニコールにて選抜し、得られたクローンをさらに制限酵素消化にて選択することによりＧＡＴＥＷＡＹ  ｆｒａｍｅ  Ｃ．１が正しい方向に挿入されたクローンを得、これをｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴと命名した。
次に、ｐＴ７ＧＰＲＣ５Ｄをテンプレートとして、以下に示すプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりインタクトな終始コドンまでを持つＯＲＦ（Ｒ型）およびインタクトな終始コドンのみを除いたＯＲＦ（Ｆ型）を増幅し、これらを電気泳動してゲル切り出しにより精製した後、ＢＰクロナーゼ（インビトロジェン社）の反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェン社）に乗せ換えた。
ａｔＧＰＲＣ５ＤＭ（フォワード・プライマー）：
2003055507.tif 000011
ａｔＧＰＲＣ５ＤＲ（Ｒ型用リバース・プライマー）：
2003055507.tif 000012
ａｔＧＰＲＣ５ＤＦ（Ｆ型用リバース・プライマー）：
2003055507.tif 000013
得られたクローンについて塩基配列の解析を行い、それぞれ目的とするクローンが取得できたことを確認した。得られたクローンはそれぞれｐＥＮＴＲ／ＧＰＲＣ５Ｄ／Ｒ（Ｒ型エントリー・クローン）、ｐＥＮＴＲ／ＧＰＲＣ５Ｄ／Ｆ（Ｆ型エントリー・クローン）と命名した。
これらについてＬＲクロナーゼ反応によりｐＥＮＴＲ／ＧＰＲＣ５Ｄ／Ｆは３種のＧα融合デスティネーション・ベクター（ｐｃＨｉｓＧαＳ２−ＤＥＳＴ、ｐｃＨｉｓＧαｉ２−ＤＥＳＴ、ｐｃＨｉｓＧα１６−ＤＥＳＴ）へ、ｐＥＮＴＲ／ＧＰＲＣ５Ｄ／ＲはｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴへ載せ換えた。得られたクローンについて、小スケールにてプラスミド調製し、制限酵素処理によって目的のクローンを選択した。このようにして得られたプラスミドをそれぞれ、ｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／ＧαＳ２、ｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／Ｇαｉ２、ｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／Ｇα１６およびｐｃＣ５Ｄと命名した。さらに、細胞株への導入を目的として、１００ｍｌ培養液からキアゲン・マキシ・キット（キアゲン社）を用いてプラスミドの大量調製、精製を行った。
実施例７：ＧＰＲＣ５Ｄ−Ｇα融合蛋白質発現による恒常的活性化の確認
ＧＰＲＣ５ＤのＣ末端にＧα蛋白質を融合させた蛋白質を細胞に発現させることにより、恒常的活性化するかどうか検討するために、以下の実験を行った。
実施例６で構築した４種類のプラスミドベクター（ｐｃＣ５Ｄ、ｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／ＧαＳ２、ｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／Ｇαｉ２、ｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／Ｇα１６）及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０−２０）のＤＮＡ１μｇを１２５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地（インビトロジェン社：Ｃａｔ．Ｎｏ．３１９８５−０６２）で希釈した（Ａ液）。トランスフェクション試薬のリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１６６８−０２７）２．５μｌを１２５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で希釈して５分間静置した（Ｂ液）。Ａ液とＢ液を混合し２０分間静置した後、前日に９６ウエルプレートに３×１０４細胞／ウエルで植込んだチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）に５０μｌ／ウエルで添加した（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）。３７℃、５％ＣＯ２条件下で４時間培養した後、１０％ＦＣＳを含むＦ１２培地（インビトロジェン社：Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７６５−０５４）１００μｌ／ウエルで培地交換し、更に約１２時間培養した。これらの細胞を、ｃＡＭＰ測定キットのＨｉｔＨｕｎｔｅｒＴＭＥＦＣ  Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＲＸ−００２７）を用いて添付プロトコールに従い、細胞内ｃＡＭＰ量を測定した（図４）。その結果、ＧＰＲＣ５ＤとＧαＳ２との融合で特異的にｃＡＭＰ量の増加が認められたので、ＧＰＲＣ５ＤはＧαＳ２との融合により恒常的活性化ができることが示された。従って、ＧＰＲＣ５Ｄは、Ｇαｓと共役するＧＰＣＲであることが強く示唆された。
配列表フリーテキスト
配列番号５：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ＧＰＲＣ５Ｄの発現を阻害するアンチセンスＤＮＡとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：サラセミアにおけるβ−グロビン  プレｍＲＮＡの７０５位でのスプライシング異常を引き起こす変異により生じた配列に対するアンチセンスＤＮＡとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇα１６  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇα１６  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαｉ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１６：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαｉ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１７：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαＳ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１８：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαＳ２  ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号１９：ヒトＧ蛋白質Ｇα１６  ｃＤＮＡフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２０：ヒトＧ蛋白質Ｇαｉ２  ｃＤＮＡフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２１：ヒトＧ蛋白質ＧαＳ２  ｃＤＮＡフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２２：プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニング部位を増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２３：６ｘＨｉｓタグペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインされたセンス鎖オリゴヌクレオチド。
配列番号２４：６ｘＨｉｓタグペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインされたアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド。
配列番号２５：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｃＤＮＡを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２６：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｃＤＮＡを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２７：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｃＤＮＡのＯＲＦを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２８：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｃＤＮＡのＯＲＦ（Ｒ型）を増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
配列番号２９：ＧＰＲＣ５Ｄ  ｃＤＮＡのＯＲＦ（Ｆ型）を増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。
産業上の利用可能性
ＧＰＲＣ５Ｄは摂食行動に関与するＧＰＣＲであることから、ＧＰＲＣ５Ｄの発現もしくは機能を増強もしくは抑制する物質を有効成分とする本発明の医薬組成物は、摂食量を所望の値に調節することが可能であり、それによって糖尿病、肥満症、高脂血症等の過食に起因する生活習慣病、あるいは拒食症の治療に効果を発揮することが期待される。また、本発明のスクリーニング系及びスクリーニング方法によれば、ＧＰＲＣ５Ｄのリガンドを容易に且つ迅速にスクリーニングすることができ、ＧＰＲＣ５Ｄをターゲットとした新薬の開発、さらには疾患マーカーの探索や、当該疾患マーカーを用いた診断方法の確立に有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願２００１−３９７５２３を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【配列表】
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2003055507.tif 000015
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【図面の簡単な説明】
図１は、肥満マウスの摂餌量に及ぼすＧＰＲＣ５ＤのアンチセンスＤＮＡ投与の効果（投与直後〜４８時間後）を示す。黒色のカラムはコントロールＤＮＡ投与群、白色のカラムはアンチセンスＤＮＡ投与群における摂餌量（平均±標準偏差、コントロールＤＮＡ投与群ｎ＝４、アンチセンスＤＮＡ投与群ｎ＝４）をそれぞれ示している。図中の＊は両群間に有意な差があることを示している（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
図２は、肥満マウスの血糖値に及ぼすＧＰＲＣ５ＤのアンチセンスＤＮＡ投与の効果（投与直後〜４８時間後）を示す。黒色のカラムはコントロールＤＮＡ投与群、白色のカラムはアンチセンスＤＮＡ投与群における血糖値（平均±標準偏差、コントロールＤＮＡ投与群ｎ＝４、アンチセンスＤＮＡ投与群ｎ＝４）をそれぞれ示している。図中の＊は両群間に有意な差があることを示している（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
図３は、正常マウスおよび肥満マウスにおけるＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子の飽食および絶食状態での発現変動を示す。黒色のカラムは飽食時、白色のカラムは絶食時におけるＧＰＲＣ５Ｄ／ＧＡＰＤＨ比（平均±標準偏差、各群ｎ＝３）をそれぞれ示している。
図４は、ＧＰＲＣ５Ｄを単独で、あるいは各種Ｇα蛋白質と融合して一過的に発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞の抽出液中のｃＡＭＰ濃度を示す。ｍｏｃｋは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）で、ＧＰＲＣ５ＤはｐｃＣ５Ｄで、ＧＰＲＣ５Ｄ−ＧｓはｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／ＧαＳ２で、ＧＰＲＣ５Ｄ−ＧｉはｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／Ｇαｉ２で、ＧＰＲＣ５Ｄ−ＧｑはｐｃＣ５Ｄ／Ｈｉｓ／Ｇα１６でそれぞれトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を示している。
【図１】
2003055507.tif 000038
【図２】
2003055507.tif 000039
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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