(57)【要約】本発明は、核内受容体ＲＸＲαの新規なアイソフォームＲＸＲα２およびＲＸＲα３に関する。ＲＸＲα２およびＲＸＲαは、既知のアイソフォームであるＲＸＲα１とは異なり、ＳＲＣ−１によって転写活性化作用が上昇する。本発明は、これらＲＸＲαアイソフォームのコアクチベータによる転写活性化作用の増強作用を調節する機能を評価する方法と、この評価方法に基づくスクリーニング方法を提供した。各コアクチベータとの相互作用を調節することで、アイソフォーム特異的に転写調節活性を制御することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項６】
次の工程を含む、被験物質の、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体を発現し、かつ前記核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞に、前記核内受容体を活性化するコアクチベータ存在下で被験物質を接触させる工程、
（２）前記核内受容体を発現可能な条件下で前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程
【請求項７】
核内受容体として、付加的に次の（Ａ’）〜（Ｅ’）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対する被験物質の活性を検出する工程を含む、請求項６に記載の方法。
（Ａ’）配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ’）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ’）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ’）配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ’）配列番号：５に記載の塩基配列と６０％以上のホモロジーを有し、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
【請求項８】
次の工程を含む、被験物質の、核内受容体とそれを活性化するコアクチベータとの結合を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体、ＳＲＣ−１、および被験物質を、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、
ｉ）核内受容体と被験物質を接触後にＳＲＣ−１を接触させる、
ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とＳＲＣ−１を接触させる、または
ｉｉｉ）核内受容体とＳＲＣ−１を接触後に被験物質を接触させる
（２）核内受容体と結合したＳＲＣ−１または被験物質の量を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体に結合する活性を検出する工程
【請求項９】
次の工程を含む、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法。
（１）請求項６に記載の方法によって被験物質の核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記核内受容体の転写活性化作用を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
【請求項１０】
次の工程を含む、核内受容体の特定のアイソフォームの転写調節活性を調節する活性を有する被験物質の評価方法。
（１）請求項６に記載の方法によって、請求項６の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を含む複数種の核内受容体について、被験物質の転写調節活性を調節する活性を検出する工程、
（２）複数種の核内受容体のそれぞれに対する被験物質の転写調節活性を調節する活性を比較する工程、および
（３）アイソフォーム間で、転写調節活性に与える影響に差がある被験物質を選択する工程
【請求項１１】
次の工程を含む、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法。
（１）請求項８に記載の方法によって被験物質の核内受容体とそれを活性化するコアクチベータとの結合を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、コアクチベータの核内受容体への結合を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体の活性調節剤。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体アイソフォーム特異的な活性調節剤。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体の活性調節剤。
【請求項１５】
下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、核内受容体の活性調節剤。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
【請求項１６】
下記の成分（１）〜（４）のいずれかを有効成分として含有する、核内受容体の活性抑制剤。
（１）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（２）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体、および
（３）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質
（４）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の部分配列に対応するセンスＲＮＡおよびそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ
【請求項１７】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、核内受容体の活性が調節されたモデル動物。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
【請求項１８】
被検者から採取された生体試料における下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、対照と比較して発現レベルが低い場合には当該ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の機能低下を原因とする疾患を、逆に発現レベルが高い場合に機能亢進を原因とする疾患を、被検者が有すると判定する工程を含む、核内受容体の活性の異常に起因する疾患の診断方法。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規な核内受容体アイソフォーム、およびその用途に関する。
背景技術
核内受容体はリガンドに依存して活性が誘導される、一群の転写因子のスーパーファミリーを指す。核内受容体は、相互に高い相同性を示すＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン等の特徴的な構造を有する。
核内受容体は、その配列の高い相同性を利用して、新規な遺伝子が数多く発見されてきている。ヒトについては、現在までのところ４０数個の核内受容体遺伝子が報告されている。これらの中には、リガンドが未同定のもの、あるいは活性発現にリガンドを要しないものも含まれている。
核内受容体レチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＸＲ）αは、レチノイン酸受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＡＲ）αのＤＮＡ結合ドメインとの相同性を利用して発見された（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ−ＤＪ，Ｏｎｇ−ＥＳ，Ｄｙｃｋ−ＪＡ  ＆  Ｅｖａｎｓ−ＲＭ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｄｉｆｉｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４５（１９９０）２２４−２２９．）。その後、ＲＸＲαは単独でも転写調節活性を有するが、ＰＰＡＲ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＡＲ、ＴＲ（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＤＲ（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等の核内受容体とヘテロダイマーを形成して転写活性化作用を発現する共役受容体であることが明らかにされた。ＲＸＲαは、ホルモン等が関与する生理現象において重要な役割を担っていると考えられている（Ｙｕ−ＶＣ，Ｄｅｉｓｅｒｔ−Ｃ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ−Ｂ，Ｈｏｌｌｏｗａｙ−ＪＭ，Ｄｅｖａｒｙ−ＯＶ，Ｎａａｒ−ＡＭ，Ｋｉｍ−ＳＹ，Ｂｏｕｔｉｎ−ＪＭ，Ｇｌａｓｓ−ＣＫ  ＆  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ−ＭＧ．ＲＸＲ  ｂｅｔａ：ａ  ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｇｎａｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ  ６７（１９９１）１２５１−１２６６．）。
ＲＸＲαのリガンドとして、レチノイドの他にＲＸＲ特異的なリガンドとして９−ｃｉｓレチノイン酸が同定されている（Ｈｅｙｍａｎ−ＲＡ，Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ−ＤＪ，Ｄｙｃｋ−ＪＡ，Ｓｔｅｉｎ−ＲＢ，Ｅｉｃｈｅｌｅ−Ｇ，Ｅｖａｎｓ−ＲＭ  ＆  Ｔｈａｌｌｅｒ−Ｃ．９−ｃｉｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ６８（１９９２）３９７−４０６．）。更に、ＲＸＲ特異的なアゴニスト、アンタゴニストが現在開発中である。これらの拮抗剤は、抗腫瘍薬、糖尿病治療薬等の臨床応用が考えられている（Ｍｕｋｈｅｅｒｊｅｅ−Ｒ，Ｄａｖｉｅｓ−ＰＪ，Ｃｒｏｍｂｉｅ−ＤＬ，Ｂｉｓｃｈｏｆｆ−ＥＤ，Ｃｅｓａｒｉｏ−ＲＭ，Ｊｏｗ−Ｌ，Ｈａｍａｎｎ−ＬＧ，Ｂｏｅｈｍ−ＭＦ，Ｍｏｎｄｏｎ−ＣＥ，Ｎａｄｚａｎ−ＡＭ，Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ−ＪＲＪ  ＆  Ｈｅｙｍａｎ−ＲＡ．Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｅ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｙ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（１９９７）４０７−４１０．；Ｗｕ−Ｋ，Ｌａｍｐｈ−ＷＷ  ＆  Ｂｒｏｗｎ−ＰＨ．ＲＸＲ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＲＡＲ  ａｎｄ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．６９（２００１）３７１．）。
ＲＸＲにはα、β、およびγの３種類のサブタイプの存在が知られている（Ｐｅｍｒｉｃｋ−ＳＭ，Ｌｕｃａｓ−ＤＡ  ＆  Ｇｒｉｐｐｏ−ＪＦ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ８（１９９４）１７９７−１８０６．）。更にβについては３種類の、またγについては２種類のアイソフォームがそれぞれ報告されている（Ｐｅｍｒｉｃｋ−ＳＭ，Ｌｕｃａｓ−ＤＡ  ＆  Ｇｒｉｐｐｏ−ＪＦ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ８（１９９４）１７９７−１８０６．；Ｍａｈａｊｎａ−Ｊ，Ｓｈｉ−Ｂ，Ｂｒｕｓｋｉｎ−Ａ．Ａ  ｆｏｕｒ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈＲＸＲｂｅｔａ  ａｎｄ  ｒｅｎｄｅｒｓ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（１９９７）４６３−７６．）。
ＲＸＲαについては、マウスにおいて３種類のアイソフォームが同定されている（Ｂｒｏｃａａｒｄ−Ｊ，Ｋａｓｔｎｅｒ−Ｐ  ＆  Ｃｈａｍｂｏｎ−Ｐ．Ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ＲＸＲ  ａｌｐｈａ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ．ＢＢＲＣ  ２２９（１９９６）２１１−２１８．）。しかしヒトにおいては、マウスのアイソフォームの配列情報を利用してのクローニングも試みられたが成功していない（Ｌｉ−Ｇ，Ｗａｌｃｈ−Ｅ，Ｙａｎｇ−Ｘ，Ｌｉｐｍａｎ−ＳＭ  ＆  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ−ＪＬ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ．ＢＢＲＣ  ２６９（２０００）５４−５７．）。
ＲＸＲのアイソフォームは、一例（Ｍａｈａｊｎａ−Ｊ，Ｓｈｉ−Ｂ，Ｂｒｕｓｋｉｎ−Ａ．Ａ  ｆｏｕｒ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈＲＸＲｂｅｔａ  ａｎｄ  ｒｅｎｄｅｒｓ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（１９９７）４６３−７６．）を除いて、何れもＮ末端のＡ／Ｂドメインのサイズが変化した構造を有する。Ａ／Ｂドメインがリガンド非依存性の転写活性化機能を有し、かつ他の転写因子との相互作用に関わっていることを考慮すると、ＲＸＲアイソフォームは互いに異なる生理条件下で発現調節を受ける遺伝子群の転写調節を分担していることが推定される。
核内受容体はリガンドがリガンド結合ドメインに結合することにより、ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒから解離し、更にｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒをリクルートして複合体を形成し、この複合体がＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ複合体に作用して転写反応を誘導すると推定されている。ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ／ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒは近年数多く発見されており、組織特異的あるいは生理刺激特異的に発現調節を受けているものも存在する。核内受容体が多様な転写調節機能を発現することに、核内受容体とｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ／ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒとの間の相互作用が重要な因子として関わっていることが考えられている（Ｆｒｅｅｄｍａｎ−ＬＰ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  ９７（１９９９）５−８）。
発明の開示
本発明は、公知のＲＸＲαアイソフォームとは異なるコアクチベータによって転写活性化作用が上昇する新規なアイソフォームの提供を課題とする。また本発明は、新規なアイソフォームの機能に基づく、ＲＸＲαの転写調節活性を調節する作用の新規な評価方法の提供を課題とする。
本発明者らは、新規な核内受容体を見出すために、核内受容体に特徴的なＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）やリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する蛋白質をコードする遺伝子を探索した。そしてＲＸＲαの新規なアイソフォームの単離に成功した。更に本発明者らは、探索によって絞り込まれた遺伝子について、その機能を解析した。その結果、ある種のＲＸＲαアイソフォームは、既知のアイソフォームとは異なるコアクチベータによってその転写活性化作用を発現することを見出した。
次に本発明者らは、核内受容体を活性化するコアクチベータの存在下における各種のＲＸＲαアイソフォームの転写調節活性を評価するためのアッセイ系を確立した。更に本発明者らは、このアッセイ系を利用して、ＲＸＲαの転写調節活性に対する被験物質の影響を、各アイソフォームごとに評価しうることを確認し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に関する。また本発明は、核内受容体ＲＸＲαの各アイソフォームについて、コアクチベータの存在下における転写調節活性に与える被験物質の影響の評価方法に関する。更に本発明は、この評価方法に基づいて、ＲＸＲαアイソフォームの転写調節活性を調節する作用を有する被験物質の選択方法に関する。
〔１〕下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
〔２〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔３〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔４〕〔１〕に記載のポリヌクレオチド、または〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔５〕〔４〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔２〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔６〕次の工程を含む、被験物質の、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体を発現し、かつ前記核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞に、前記核内受容体を活性化するコアクチベータ存在下で被験物質を接触させる工程、
（２）前記核内受容体を発現可能な条件下で前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程
〔７〕核内受容体として、付加的に次の（Ａ’）〜（Ｅ’）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対する被験物質の活性を検出する工程を含む、〔６〕に記載の方法。
（Ａ’）配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ’）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ’）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ’）配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ’）配列番号：５に記載の塩基配列と６０％以上のホモロジーを有し、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
〔８〕次の工程を含む、被験物質の、核内受容体とそれを活性化するコアクチベータとの結合を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体、ＳＲＣ−１、および被験物質を、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、
ｉ）核内受容体と被験物質を接触後にＳＲＣ−１を接触させる、
ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とＳＲＣ−１を接触させる、または
ｉｉｉ）核内受容体とＳＲＣ−１を接触後に被験物質を接触させる
（２）核内受容体と結合したＳＲＣ−１または被験物質の量を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体に結合する活性を検出する工程
〔９〕次の工程を含む、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔６〕に記載の方法によって被験物質の核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記核内受容体の転写活性化作用を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
〔１０〕次の工程を含む、核内受容体の特定のアイソフォームの転写調節活性を調節する活性を有する被験物質の評価方法。
（１）〔６〕に記載の方法によって、〔６〕の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を含む複数種の核内受容体について、被験物質の転写調節活性を調節する活性を検出する工程、
（２）複数種の核内受容体のそれぞれに対する被験物質の転写調節活性を調節する活性を比較する工程、および
（３）アイソフォーム間で、転写調節活性に与える影響に差がある被験物質を選択する工程
〔１１〕次の工程を含む、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔８〕に記載の方法によって被験物質の核内受容体とそれを活性化するコアクチベータとの結合を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、コアクチベータの核内受容体への結合を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
〔１２〕〔９〕に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体の活性調節剤。
〔１３〕〔１０〕に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体アイソフォーム特異的な活性調節剤。
〔１４〕〔１１〕に記載の方法によって選択された物質を有効成分として含む、核内受容体の活性調節剤。
〔１５〕下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、核内受容体の活性調節剤。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
〔１６〕下記の成分（１）〜（４）のいずれかを有効成分として含有する、核内受容体の活性抑制剤。
（１）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（２）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体、および
（３）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質
（４）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の部分配列に対応するセンスＲＮＡおよびそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ
〔１７〕以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、核内受容体の活性が調節されたモデル動物。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
〔１８〕被検者から採取された生体試料における下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、対照と比較して発現レベルが低い場合には当該ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の機能低下を原因とする疾患を、逆に発現レベルが高い場合に機能亢進を原因とする疾患を、被検者が有すると判定する工程を含む、核内受容体の活性の異常に起因する疾患の診断方法。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
本発明者らは、新規な核内受容体を見出すために、全長ｃＤＮＡライブラリーを対象として核内受容体に特徴的なＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）やリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する蛋白質をコードする遺伝子を探索した。探索された遺伝子の中で、特にＲＸＲαとの高い相同性が確認された、Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９、およびＣ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７に着目した。
Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９は、２３９３塩基長のｃＤＮＡであり、４３５アミノ酸残基長に対応するコーディング配列（９２３−２２３０）を有する。既知のＲＸＲα１アイソフォームと比較して、Ｎ末端の２７アミノ酸残基が欠失していた。これらの構造的特徴から、Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９は新規なＲＸＲαアイソフォームと結論し、ヒトＲＸＲα２と命名した。
一方Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７は、２４２１塩基長のｃＤＮＡであり、３６５アミノ酸残基長に対応するコーディング配列（９２４−２０２１）を有する。既知のＲＸＲα１アイソフォームと比較して、Ｎ末端の９７アミノ酸残基が欠失していた。これらの構造的特徴から、Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７は新規なＲＸＲαアイソフォームと結論し、ヒトＲＸＲα３と命名した。
これらのアイソフォームの塩基配列を、ヒトゲノム塩基配列データベースに対してＢｌａｓｔ検索を行ったところ、ヒト第９染色体ｑ３４．３部位のクローン配列に一致し、それぞれ１０（ＲＸＲα２）あるいは９個（ＲＸＲα３）のエクソンから構成されていることが判明した。ＲＸＲα１についても同様に検索を行い、３者を比較したところ、ＲＸＲα２はＲＸＲα１のエクソン２以降を共有するが、５’末端は異なるエクソンを使用していた。またＲＸＲα３はＲＸＲα１のエクソン３以降を共有し、５’末端のエクソンは別のエクソンを使用していた（図２６）。
本発明はＲＸＲα２をコードする配列番号：１に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。また本発明は、ＲＸＲα３をコードする配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明には、配列番号：２または配列番号：４に示したアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。本発明において、対象となる蛋白質が次の性状（ａ）および（ｂ）を有するとき、その蛋白質は本発明の蛋白質であるＲＸＲα２またはＲＸＲα３と機能的に同等であると言うことができる。
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
たとえば、次のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質であって、前記性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。
（Ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
本発明において、ある蛋白質の転写活性化作用がリガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって上昇することは、次のようにして確認することができる。以下の説明では、機能的な同等性を確認すべき蛋白質を、被験蛋白質と記載する。たとえば、前記性状（ａ）を確認するための手法としてレポータジーンアッセイを利用することができる。具体的には、性状（ａ）を有することを確認すべき被験蛋白質を細胞内で発現させる。宿主となる細胞には、前記被験蛋白質の応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現するベクターを導入しておく。ＲＸＲの応答配列は公知である。
被験蛋白質が前記性状（ａ）を有していれば、この細胞をリガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストによって処理したときに、レポータ遺伝子の発現レベルが高まる。したがって、リガンドで細胞を処理する前後におけるレポータ遺伝子の発現レベルの比較結果に基づいて、被験蛋白質が性状（ａ）を有することを知ることができる。
一方、本発明における機能的同等性の指標とする、性状（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとすることも、性状（ａ）と同様にレポータジーンアッセイによって確認することができる。前記のように、被験蛋白質を細胞内で発現させる宿主となる細胞には、前記被験蛋白質の応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現するベクターを導入しておく。この細胞にＳＲＣ−１を与えたときに、リガンドに応答してレポータ遺伝子の発現レベルが上昇すれば、被験蛋白質がＳＲＣ−１をコアクチベータとする蛋白質であることが確認できる。
一般にコアクチベータとは、核内受容体の転写活性化作用の発現に必要とされる分子である。リガンド応答性の核内受容体は、コアクチベータの存在下で、リガンドに応答して転写活性化作用を発現する。このとき、核内受容体の転写活性化作用はリガンドの量に応答するが、コアクチベータの作用は定性的である。つまり、一定量のコアクチベータが存在すれば転写活性化作用がもたらされるが、その量的な変化が転写活性化作用に与える影響は小さい。
本発明において、核内受容体の転写調節活性とは、核内受容体が転写ユニットによる遺伝子の転写を開始する活性を言う。一般に核内受容体は、転写共役因子と呼ばれる複数の因子をリクルートメントすることにより、転写を開始するとされている。核内受容体の転写調節活性によってもたらされる転写の活性化を転写活性化作用と言う。
本発明の核内受容体ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の機能的に同等な蛋白質は、コアクチベータとしてＳＲＣ−１を要求する。更に望ましい態様においては、本発明における機能的に同等な蛋白質は、既知のアイソフォームであるＲＸＲα１と同様に、ＣＢＰの存在下でもリガンドに応答して転写活性化作用が増強される。すなわち、コアクチベータＣＢＰによっても転写活性化作用がもたらされる。
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法を利用して調製することができる。変異の導入方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５）等を示すことができる。また、このような蛋白質は自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列（配列番号：２または配列番号：４）において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加等により異なる蛋白質も含まれる。
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り特に制限されない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
また、本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４）を用いて本発明の蛋白質をコードする塩基配列（配列番号：１または配列番号：３）またはその一部をもとにこれと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、このポリヌクレオチドから機能的に同等な蛋白質を得ることは、通常行い得ることである。本発明には、本発明の蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も含まれる。
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常は洗浄のための条件として「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ストリンジェンシーに影響を与えるその他の条件として、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間などを示すことができる。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離される蛋白質は、配列番号：２または配列番号：４に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列または該蛋白質をコードする塩基配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、９０％以上）の配列の同一性を指す。相同性の特定は、ＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，１９９７  Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．）を用いて決定することができる。
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
配列番号：５に記載の塩基配列は、既知のアイソフォームＲＸＲα１の塩基配列である。この塩基配列における１−１０２の塩基配列は、ＲＸＲα１のエクソンＡに相当する。本発明において、エクソンＡに相当する塩基配列を置換する塩基配列は任意である。置換する塩基配列は、たとえば非翻訳配列とすることができる。一方、エクソンＡに相当する塩基配列は開始コドン（７６−７８）を含んでいる。したがって、この領域を欠失、または置換するときには、１０３以降の塩基配列に相当する領域において新たな開始コドンを与える必要がある。
発明のポリヌクレオチドにおける開始コドンは、たとえば配列番号：５における１５７番目のａから始まるａｔｇとすることができる。この開始コドンは、後に述べる本発明における望ましい塩基配列である配列番号：１の塩基配列における開始コドンに相当する。配列番号：１の塩基配列における開始コドンは、エクソンＡに隣接するエクソンに相当する塩基配列に最初に見出されるａｔｇである。したがって、エクソンＡを欠失した場合の最初の開始コドンは、本発明のポリヌクレオチドの望ましい開始コドンのひとつとして示すことができる。
この他、本発明のポリヌクレオチドの開始コドンとして、配列番号：３の塩基配列における開始コドンを示すこともできる。配列番号：３における開始コドン（９２４）は、配列番号：５においては５’末端側からカウントして３番目のエクソンに見出される最初の開始コドン（３６７）である。結局、配列番号：５に記載の塩基配列中、エクソンＡ（１−１０２）の欠失、または置換の後に、積極的に開始コドンを与える必要は無く、隣接するエクソンに見出される最初の開始コドンから翻訳を開始できれば良いと言える。
置換された塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質が、前記性状（ａ）および（ｂ）を有することは、先に述べたような方法によって確認することができる。ある塩基配列を有するポリヌクレオチドの、特定の領域を欠失したり、あるいは他の塩基配列に置換するための方法は公知である。たとえば配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列は、本発明における望ましいポリヌクレオチドである。
図２６に示すように、配列番号：１に記載の塩基配列（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）は、配列番号：５（ＲＸＲα１）におけるエクソンＡに代えてエクソンＢを有する。また配列番号：３に記載の塩基配列（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）は、同様にエクソンＡおよびエクソンＣに代えてエクソンＤを有する。その結果、これらのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：６に記載のアミノ酸配列（ＲＸＲα１）に対して、そのＮ末端側のアミノ酸配列を２７アミノ酸残基（ＲＸＲα２）、あるいは９７アミノ酸残基（ＲＸＲα３）欠失した配列を有する。
また、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）を用いて、本実施例において同定された塩基配列（配列番号：１または配列番号：３）の一部をもとにプライマーを設計し、これら塩基配列またはその一部と相同性の高いＤＮＡ断片を単離して、これをもとに本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることも可能である。本発明の蛋白質、並びに本発明における機能的に同等な蛋白質は、後に述べるような、当該蛋白質の機能を修飾する化合物の評価方法に用いることができる。またこれらの蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、当該蛋白質の製造、発現状態を知るためのプライマーまたはプローブとして有用である。
あるいは本発明は、本発明の蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。ドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、その発現によって細胞がもともと備えている内在性の野生型蛋白質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する。例えば、本発明の蛋白質における、他の核内受容体との相互作用に必要な領域、リガンドドメイン等、該蛋白質の活性に影響すると考えられる配列に相当する部分のアミノ酸配列を改変すれば、核内受領体の活性化作用を持たない不活性体を得ることができると考えられる。このようなアミノ酸配列をコードする遺伝子を細胞内に発現させれば、本発明のＲＸＲα２またはＲＸＲα３の発現をドミナントネガティブ効果（不活性型の拮抗阻害）により抑制することができる。従って、ウイルスベクター等の遺伝子導入技術によって、不活性体遺伝子を細胞に導入発現させることで、核内受容体の活性を調節することができる。
また本発明は、前記ポリヌクレオチドのいずれかを含有する発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチド、あるいは前記いずれかの発現ベクターを保持する形質転換体、並びにその形質転換体を培養し、その培養物から本発明の蛋白質を単離することからなる、本発明の蛋白質、或いはその部分ペプチドの製造方法に関する。さらに本発明は、上記の方法で製造された蛋白質、或いはその部分ペプチドを提供する。
遺伝子組換え手法でポリペプチドを生産する場合、宿主細胞の種類により、目的ポリペプチドのグリコシル化の種類や程度の異なったものが得られることや、いわゆるポリペプチドの分泌生産法において、宿主細胞中で発現された前駆体ポリペプチドの末端（Ｎ−末端および／またはＣ−末端）アミノ酸配列がシグナル・ペプチダーゼ等によりプロセッシングを受け、種々の末端アミノ酸配列を持つポリペプチドが得られることは当業者に周知である。従って、そのようなポリペプチドも本発明の蛋白質の範囲に含まれることは、当業者ならば容易に理解し得ることである。
下記実施例には、発現ベクターとして哺乳類動物細胞内で機能するベクターの構築例が示されている。しかしながら、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが開示されている結果、これらに基づいて、酵母等の真菌類、並びに原核性細胞宿主に導入したとき、該宿主に本発明の蛋白質を発現、産生させ得る発現ベクターを構築することは当業者にとって容易である。従って、本発明は、本発明の核酸配列に基づき、当該技術分野既知の方法で構築される発現ベクターをも包含する。
本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現させるために用い得る微生物細胞には、例えば、原核性の細菌［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）］および真核性の酵母［例えばパン酵母菌（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］がある。また、哺乳類細胞には培養ヒト細胞および培養動物細胞が含まれる。さらには培養植物細胞も用い得る。
微生物の例としてはエシェリキア属に属する細菌やパン酵母がある。より具体的には、例えば次のような菌株を微生物宿主として挙げることができる。
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哺乳動物細胞の例としてはヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、マウスＬ９２９細胞およびチャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞等がある。
通常、原核生物である細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、終止コドンおよび自己複製可能ユニットから構成される。真核生物、即ち酵母や哺乳動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび終止コドンから構成されるのが好ましい。さらにエンハンサー配列、本発明の蛋白質の５’−および３’−非コード領域、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入することもできる。
上記の自己複製可能単位は、形質転換体の選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性）を含有していることが好ましい。細菌を宿主とする発現ベクターの場合、プロモーターという語句は、プロモーター、オペレーターおよびシャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列（例えばＡＡＧＧ等）からなるプロモーター・オペレーター領域を意味する。そのようなプロモーターの例としては、慣用のプロモーター・オペレーター領域が挙げられる。具体的には、ラクトースオペロン、ＰＬ−プロモーター、あるいはｔｒｐ−プロモーター等を示すことができる。酵母を宿主とする発現ベクターに用いられるプロモーターの例としてはｐｈｏ５プロモーターが挙げられる。更に、精製を容易に行うことを目的として、金属イオンキレートに対する親和性を持つ塩基性アミノ酸を、本発明の蛋白質におけるいずれかの末端に付加することができる。塩基性アミノ酸を付加する場合には、希望のアミノ酸をコードする塩基配列が連続した塩基配列を５’側に付加したプライマーを用いて、ＰＣＲを行えば、目的とする遺伝子の任意の末端に、オリゴペプチドを付加することができる。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、あるいはアルギニンなどを用いることができる。
哺乳動物細胞における発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、マウス・メタロチオネインＩ（ＭＭＴ）−プロモーター等が挙げられる。好ましい開始コドンの例としてメチオニンコドン（ＡＴＧ）が挙げられる。
終止コドンの例としては慣用されている終止コドン（例えばＴＡＧ、ＴＧＡ、等）が挙げられる。自己複製可能ユニットとは、それを含有する発現ベクターの全ＤＮＡを宿主細胞中で自己複製し得るＤＮＡ配列であって、天然のプラスミド、人工的に修飾したプラスミド、および合成プラスミドが挙げられる。人工的に修飾したプラスミドには、例えば天然プラスミドから調製したＤＮＡ断片等が含まれる。そのようなプラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプラスミドｐＢＲ３２２やその人工修飾体が挙げられる。人工修飾体とは、たとえばｐＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって得られたＤＮＡ断片等を示すことができる。また酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＪＤＢ２１９、ｐＪＤＢ２０７等が挙げられる。さらに、動物細胞用プラスミドとしては、例えばプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＭＭ３２４、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ  ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ  ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ  ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられる。
エンハンサー配列としては、例えばＳＶ４０のエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリアデニル化部位が挙げられる。
本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて、部分合成または全合成することによって得ることができる。或いは、ヒトｃＤＮＡライブラリーより、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列に基づいて設定したプローブやプライマーを用いて取得することができる。更に、ゲノムＤＮＡを常法通り処理することによって、本発明の蛋白質をコードするゲノムＤＮＡを調製することができる。ゲノムＤＮＡの処理方法としては、例えば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスファターゼによる脱燐酸化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる燐酸化、およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション等の工程を含む処理方法を示すことができる。更にこのようにして取得したゲノムＤＮＡを利用し、ゲノムにおける本発明の遺伝子の転写開始点を明らかにし、より上流に位置する発現制御領域を特定することができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターやエンハンサー等の制御領域は、本発明の蛋白質の発現異常を検出するための標的領域として有用である。或いは、これらの領域を標的とするデコイ核酸医薬などにより、発現制御を実現することができる。
本発明の実施に必要な、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からの蛋白質の回収等の操作は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５）他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）］に準じて行なうことができる。
また、本発明の宿主細胞には、本発明のＲＸＲα２またはＲＸＲα３の機能解析やこの蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤の評価方法のために用いる目的の細胞も含まれる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法等の方法で行うことが可能である。形質転換体からの本発明の蛋白質の調製は、当業者に公知の蛋白質の分離・精製法を利用して行なうことができる。本発明は、こうして精製された実質的に純粋な蛋白質に関する。本発明において、実質的に純粋とは、ヒトに由来するその他の蛋白質を含まないことを言う。あるいは本発明における実質的に純粋な蛋白質は、たとえば８０％以上、通常９０％以上、または９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の純度を有する蛋白質を言う。
本発明はまた、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（Ａ：Ｕ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡやＲＮＡを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
特に、配列番号：１または配列番号：３に示す塩基配列のうち、既知のアイソフォームであるＲＸＲα１とエクソンを共有していないエクソンを含む領域は、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列を含むＤＮＡの検出において有用である。この領域を構成する塩基配列、またはその相補配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３を特異的に検出するためのプローブ、あるいはプライマーとして有用である。
たとえば、エクソンを共有しない領域にアニールするプライマーからなるプライマーセットは、これらのアイソフォームの特異的な増幅に有用である。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質の異常を検査・診断するために利用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをプローブやプライマーとして用いたノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにより、発現異常を検査することができる。また本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ゲノムＤＮＡ−ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲを実施することができる。更に、本発明の蛋白質をコードする遺伝子やその発現制御領域を増幅し、ＲＦＬＰ解析、ＳＳＣＰ、シークエンシング等の方法により、配列の異常を検査・診断したりすることができる。
また、本発明のＲＸＲαアイソフォームは、まずリガンドであるレチノイン酸の刺激によって転写活性化作用が上昇する。あるいは本発明のＲＸＲαアイソフォームは、ＳＲＣ−１をコアクチベータとする。したがって、該因子をコードするポリヌクレオチドを、該因子が関連する疾患の遺伝子治療に用いることも可能である。即ち、宿主の疾患部位において適切に発現されるよう該ポリヌクレオチドを導入することにより、本発明のＲＸＲα２またはＲＸＲα３を発現させ、該因子が関連する疾患を治療・予防することが可能である。本発明において「発現」とは、転写および／または翻訳が含まれる。本発明のポリヌクレオチドを用いた発現の解析により、遺伝子の転写レベルでの発現を検査・診断することができる。また、本発明の蛋白質に対する抗体を用いれば、遺伝子の翻訳レベルでの発現を検査・診断することができる。
ＲＸＲαには、１種のアイソフォームＲＸＲα１の存在しか知られていなかった。本発明によって、コアクチベータの要求性を異にする新たなアイソフォームの存在が明らかにされた。ＲＸＲαの機能不全によってもたらされる疾患は、厳密には様々なアイソフォームの機能低下を原因となっている。したがって、ＲＸＲα１の活性増強によって症状が改善されない患者においては、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の機能不全が病態を構成している可能性が考えられる。ＲＸＲα１は、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３とは異なるコアクチベータを要求する。したがって、ＲＸＲα１を用いてスクリーニングされたアゴニストは、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３には作用しない可能性がある。本発明によって得ることができるアゴニストは、既知アイソフォームであるＲＸＲα１に対するアゴニストでは治療効果を達成できない疾患に対する、有効な治療薬となる可能性がある。
また、「配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド」には、本発明の蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。一方、本発明におけるアンチセンスとは、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現を抑制するポリヌクレオチドを意味する。
また、「配列番号：１または配列番号：３に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の部分配列に対応するセンスＲＮＡおよびそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ」には、本発明の蛋白質の発現を抑制する為のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が含まれる。本発明における２本鎖ＲＮＡは、２つのストランドからなる２本鎖ＲＮＡに加え、センス配列とアンチセンス配列を含むヘアピンループ構造を構成する１本鎖のＲＮＡを含む。
アンチセンス、またはｓｉＲＮＡは、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の発現を抑制し、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の活性調節剤として用いることができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡでもアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスＤＮＡは、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ、さらに好ましくは５００ｂｐ以上の鎖長を有し、通常、３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内の鎖長を有する。該アンチセンスＤＮＡを単独あるいは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等の適当なベクターにアンチセンス方向に挿入して用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ｂｐ以上、通常１００ｂｐ以内、好ましくは２０ｂｐ以上、５０ｂｐ以内の鎖長を有する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオエート法（Ｓｔｅｉｎ”Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９−３２２１（１９８８））等により調製することが可能である。
またｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを投与することにより、生体に導入することができる。ｓｉＲＮＡ発現用ベクターは公知である。
このようなアンチセンス、またはｓｉＲＮＡには、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の異常に起因する疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。本発明の蛋白質の異常には、蛋白質の機能異常や発現異常などが含まれる。遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター等を利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法等により患者へ投与することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクターなどを利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法などにより患者へ投与することができる。
本発明はまた、次の工程を含む、被験物質の、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法に関する。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（Ｃ）に記載の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体を発現し、かつ前記核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞に、前記核内受容体を活性化するコアクチベータ存在下で被験物質を接触させる工程、
（２）前記核内受容体を発現可能な条件下で前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程
前記検出方法において、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質とは、前記性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質を言う。配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列を有する蛋白質は、本発明者らによって新たに見出された蛋白質ＲＸＲαのアイソフォームである。一般に、サブタイプとは構造的に類似する一群の分子を含む用語である。一方アイソフォームとは、構造的な共通性を有するのみならず、エクソンを共有する場合に特にアイソフォームと呼ばれる。ヒトＲＸＲαには、アイソフォームの存在は知られていなかったが、本発明者らによりはじめて２つのアイソフォームの存在が明らかにされた。
ある蛋白質が、レチノイン酸またはそのアゴニストをリガントすることを確認するための方法は既に述べたとおりである。またある蛋白質の転写活性化作用がコアクチベータであるＳＲＣ−１によってもたらされることを確認するための方法も既に述べた。このような手法によって、本発明における機能的に同等な蛋白質であることは確認できる。
本発明において、核内受容体を発現し、かつ前記核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞は、たとえば次のようにして得ることができる。
まず、前記核内受容体を発現させるためには、目的とする核内受容体をコードするＤＮＡを細胞に導入する。本発明の方法に用いる核内受容体をコードするＤＮＡとしては、たとえば、配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡを示すことができる。本発明においては、これらの塩基配列に加え、配列番号：２、または配列番号：４のアミノ酸配列を有する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを利用することもできる。配列番号：２、または配列番号：４のアミノ酸配列からなる蛋白質が、レチノイン酸をリガンドとし、更にコアクチベータであるＳＲＣ−１によって転写活性化作用がもたらされることは実施例に示したとおりである。
これらのＤＮＡは、それぞれの塩基配列情報に基づいて、ヒト、あるいは他の動物、線虫、および酵母などの生物に由来するｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲやハイブリダイズを利用したスクリーニング方法によって得ることができる。あるいはまた、これらの塩基配列情報に基づいて、必要な塩基配列を有するＤＮＡを合成することもできる。
これらのＤＮＡは、発現ベクターにクローニングし、細胞へ導入する。発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＭＭ３２４、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ  ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ  ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ  ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられる。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、哺乳動物細胞において外来遺伝子の高度な発現を可能とするベクターである。
本発明において、これらの核内受容体をコードするＤＮＡを導入する細胞としては、これらのＤＮＡを蛋白質に翻訳し、かつその細胞に導入される前記核内受容体の応答配列の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットを有する細胞が用いられる。本発明において、核内受容体の転写調節活性によって、その応答配列の制御下にレポータ遺伝子が転写されるように配置された、応答配列とレポータ遺伝子の組み合せを発現カセットと言う。発現カセットは、プラスミドとして細胞に導入することもできるし、細胞のゲノムにインテグレートしておくこともできる。
応答配列とは、核内受容体のＤＢＤと結合し、転写ユニットによるｍＲＮＡへの転写の開始に必要な塩基配列である。ＲＸＲαの応答配列は公知である（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ−ＤＪ，Ｕｍｅｓｏｎｏ−Ｋ，Ｋｌｉｅｗｅｒ−ＳＡ，Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ−Ｕ，Ｏｎｇ−ＥＳ  ＆  Ｅｖａｎｓ−ＲＭ．Ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＸＲ  ａｎｄ  ＲＡＲ．Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１）５５５−５６１．）。たとえば実施例に用いたレチノイン酸応答配列ＲＲＥは、配列番号：１７の塩基配列からなる。
応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現させるためには、その応答配列の制御下に発現している遺伝子をレポータ遺伝子に組み換えれば良い。応答配列の下流にレポータ遺伝子を配置した発現カセットを有するプラスミドを、レポータプラスミドと呼ぶ。
レポータプラスミドは、レポータベクターを用いれば容易に構築することができる。レポータベクターは、レポータ遺伝子と、その上流に任意の応答配列を挿入するためのクローニングサイトを有するベクターである。たとえば、レポータ遺伝子としてルシフェラーゼを有するレポータベクターＰＧＶＰ２が市販されている。レポータベクターのクローニングサイトに、前記応答配列を挿入することによって、本発明に用いるレポータプラスミドとすることができる。応答配列は、タンデムに、複数個を挿入することによって、対応する核内受容体の応答性を高めることができる。その結果、転写活性に対するより高い検出感度を期待できる。挿入すべき応答配列は、化学的に合成することができる。
本発明において、レポータ遺伝子としては、容易にシグナルを測定することができる任意のレポータ遺伝子を利用することができる。遺伝子の発現調節機構を解析するためのレポータ遺伝子は公知である。具体的には、例えばルシフェラーゼ、カタラーゼ、βガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の遺伝子がレポータ遺伝子として一般に用いられる。ベクターを導入する細胞には、例えば当該遺伝子を欠失させた動物細胞を用いることができる。
上記各種の遺伝子を導入する細胞には、動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞などを用いることができる。たとえば実施例において用いたサル腎由来の細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）は、本発明における望ましい細胞の一つである。
本発明においては、被験物質の存在下、前記核内受容体を発現可能な条件下でコアクチベータとともに前記細胞を培養し、前記細胞におけるレポータ遺伝子の発現レベルが測定される。前記検出方法において、前記核内受容体が発現可能な条件下とは、導入されたベクターが有する核内受容体遺伝子が宿主細胞において発現される条件を言う。たとえば、ベクターに誘導性のプロモーターが利用されている場合には、発現の誘導に必要な条件下で培養する。
このとき、前記核内受容体が、リガンド依存性である場合には、細胞にリガンドを供給するのが望ましい。他方リガンド非依存的に転写活性化作用を発現する核内受容体においては、リガンドを与えない状態で上記方法を実施することができる。一方コアクチベータであるＳＲＣ−１は、コアクチベータ遺伝子を発現ベクターに組み込んだ発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、細胞内にコアクチベータを発現させることにより供給される。トランスフェクションに用いるＤＮＡ量は、たとえばＲＸＲα発現プラスミドと等量とすることができる。
本発明の検出方法において、被験物質は、培養物に添加することにより、前記細胞に接触させることができる。あるいは、被験物質が蛋白質であれば、それをコードする遺伝子を同じ細胞に導入することで、核内受容体に接触させることができる。更に、被験物質を発現する細胞を、前記核内受容体を発現する細胞とともに共培養することによって、接触させることもできる。
核内受容体が発現すれば、コアクチベータＳＲＣ−１に依存してレポータ遺伝子が転写され蛋白質が発現する。レポータ遺伝子の発現レベルは、この蛋白質に由来するシグナルの大きさに基づいて測定することができる。たとえばレポータ遺伝子としてルシフェラーゼを用いた場合は、ルシフェラーゼ活性を発光強度として測定することができる。あるいはレポータ遺伝子がＧＦＰであれば、ＧＦＰの蛍光強度を測定することができる。
このとき、共存する被験物質が転写調節活性を調節する作用を有していれば、レポータ遺伝子の転写レベルは変化する。この変化の程度に基づいて、被験物質が転写を阻害する場合には、レポータ遺伝子の転写は抑制され、レポータ遺伝子のシグナルが低下する。逆に転写活性化作用を増強する作用を有する被験物質は、レポータ遺伝子のシグナルを上昇させる。したがって、レポータ遺伝子の転写レベルを指標として、被験物質の転写調節活性に及ぼす影響を評価することができる。
あらかじめ転写調節活性に与える影響がわかっている物質を利用して、転写調節活性に与える影響の大きさとレポータ遺伝子のシグナル強度の関係を明らかにしておけば、転写調節活性に与える影響が未知の物質について、その作用をシグナルの強度から定量的に評価することもできる。
本発明の検出方法においては、更に付加的に、ＲＸＲαの他のアイソフォームに対する、被験物質の転写調節活性を調節する活性を検出する工程を組み合せることもできる。ＲＸＲαの他のアイソフォームには、たとえば次の（Ａ’）〜（Ｅ’）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を示すことができる。
（Ａ’）配列番号：５に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ’）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ’）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｄ’）配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ’）配列番号：５に記載の塩基配列と６０％以上のホモロジーを有し、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ａ’）〜（Ｅ’）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、ヒトＲＸＲα１またはその機能的に同等な蛋白質である。本発明において、ヒトＲＸＲα１と機能的に同等な蛋白質とは、次の性状（ａ’）および（ｂ’）を有する蛋白質を言う。
（ａ’）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ’）ＣＢＰをコアクチベータとする
ＲＸＲα１は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２９５７として登録されている既知の蛋白質である。本発明のＲＸＲαアイソフォームのみならず、他のアイソフォームについても同様の手法によって、被験物質の転写調節活性を調節する活性を評価すれば、当該被験物質の、各アイソフォームに対する特異性の違いを知ることができる。各アイソフォームは、たとえばコアクチベータの種類によって活性化のレベルが異なるといった相違がある。たとえば、本発明によって新たに見出されたアイソフォームであるＲＸＲα２およびＲＸＲα３がＣＢＰあるいはＳＲＣ−１をコアクチベータとするのに対して、既知アイソフォームであるＲＸＲα１はＳＲＣ−１をコアクチベータとしない。これらの相違が、生体内において各アイソフォームの機能的な違いの原因となっているものと考えられる。したがって、各アイソフォームに対する被験物質の特異性は、これらの核内受容体の特異的な制御を実現するために重要な情報となる。
たとえば本発明の評価方法により選択されるアイソフォーム選択的薬物は、アイソフォームが特異的に発現する組織（臓器）に特異的、あるいはアイソフォームが反応する生理条件に特異的に作用することが期待される。このような薬物には、アイソフォーム非選択的な従来の薬物と比較して副作用の低減が期待される。
なお本発明において、他のアイソフォームについて、転写調節活性を調節する作用の検出を行う場合には、各アイソフォームを活性化し得るコアクチベータの存在下で、上記方法を実施する。たとえば、上記（Ａ’）〜（Ｅ’）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質であれば、コアクチベータとしてＣＢＰを利用するのが望ましい。
本発明の検出方法によって、ＳＲＣ−１によって活性化される核内受容体の転写調節活性を調節する活性を評価することができる。本発明の転写調節活性を調節する活性の検出方法は、転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、転写調節活性を調節する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記方法によって被験物質の核内受容体の転写調節活性を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記核内受容体の転写活性化作用を抑制または増強する活性を有する被験物質を選択する工程
上記の核内受容体を発現するベクターを導入した細胞は、核内受容体の発現に伴って、レポータ遺伝子によるシグナルを生成する。得られた細胞を９６ウエルマルチプレートに播種し、細胞に導入した遺伝子の発現を誘導する条件下で培養を開始する。このとき評価すべき被験物質を各ウエルに加えることにより、核内受容体複合体の転写活性化作用に作用して、該作用を抑制する、あるいは促進する作用をレポータ遺伝子の発現レベルを指標として容易に検出することができる。
例えば、レポータ遺伝子としてＧＦＰを用いた場合、被験物質を加えた状態および加えない場合でのＧＦＰの発光量の比較を行うことにより、発現制御領域に対する影響を評価することができる。比較にあたっては、たとえば２倍以上若しくは１／２以下、好ましくは５倍若しくは１／５以下、より好ましくは１０倍以上若しくは１／１０以下の発光量比を示す場合に、有意な差があると判定することができる。本方法は動物細胞ばかりでなく、導入された核内受容体の転写活性化作用を再現できる宿主であれば、真核生物・原核生物を問わず応用することができる。このとき、細胞はレポータ遺伝子が発現可能な条件下で培養される。
本発明の評価方法に用いる被験物質は特に制限されない。具体的には、たとえば細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物等が挙げられる。あるいは、前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体も、スクリーニングに用いる候補物質として有用である。
一方、本発明の評価方法における対照には、転写調節活性に与える影響がわかっている化合物を用いることができる。より具体的には、たとえば転写調節活性に影響を与えないことが明らかな物質を対照とすることができる。被験物質をなんら与えない場合の測定結果を、転写調節活性に影響を与えない場合の対照とすることもできる。
あるいは予め目的とする作用を有することがわかっている物質を対照として、その物質よりもシグナルの変化が大きい物質を探索することによって、より大きな作用を有する物質を選択することもできる。
本発明の評価方法は、目的とする活性を有する化合物のスクリーニング方法や、化合物のキャラクタリゼーション等に利用することができる。たとえば、幅広い物質に対して本発明に基づく評価方法を実施し、目的とする活性に優れる化合物の選択を繰り返すことにより、スクリーニングを実施することができる。あるいは、前記検出方法を利用して、特定の化合物の特性を解析することもできる。
更に本発明は、次の工程を含む、被験物質の、核内受容体とそれを活性化するコアクチベータとの結合を調節する活性を検出する方法であって、核内受容体が次の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法に関する。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（Ｃ）に記載の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（１）核内受容体、ＳＲＣ−１、および被験物質を、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、
ｉ）核内受容体と被験物質を接触後にＳＲＣ−１を接触させる、
ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とＳＲＣ−１を接触させる、または
ｉｉｉ）核内受容体とＳＲＣ−１を接触後に被験物質を接触させる
（２）核内受容体と結合したＳＲＣ−１または被験物質の量を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、被験物質の前記核内受容体に結合する活性を検出する工程
先に述べた転写調節活性におよぼす影響の検出方法が細胞内における挙動を指標としているのに対して、この方法では物質間の相互作用に基づいて核内受容体に結合する活性を見出している。本発明による被験物質の核内受容体に対する結合活性を検出する方法において、核内受容体とは、本発明において見出されたＲＸＲα２またはＲＸＲα３、若しくはこれらのアイソフォームとと機能的に同等な蛋白質が用いられる。これらの核内受容体に対する結合活性は、コアクチベータとの競合を観察することにより検出される。
本発明において、前記核内受容体のコアクチベータしては、たとえばＳＲＣ−１およびＣＢＰを示すことができる。ＳＲＣ−１は、本発明のアイソフォームＲＸＲα２およびＲＸＲα３に対して、リガンドの容量に依存してその転写活性化作用を増強する。またＣＢＰは、ＲＸＲα２およびＲＸＲα３に加えて、既知のアイソフォームであるＲＸＲα１に対してもコアクチベータとして作用する。
本発明において、核内受容体、そのコアクチベータ、および被験物質は、次のｉ）−ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させられる。まずｉ）核内受容体と被験物質を接触後にコアクチベータを接触させることにより、コアクチベータの核内受容体への結合を阻害する作用を評価することができる。次に、ｉｉ）被験物質の存在下で核内受容体とコアクチベータを接触させることによって、核内受容体に対して被験物質がコアクチベータと競合する作用を評価することができる。更に、ｉｉｉ）核内受容体とコアクチベータを接触後に被験物質を接触させることによって、被験物質の核内状態に結合したコアクチベータを置換する作用を評価することができる。これらの方法によって見出される作用を有する化合物は、いずれもＲＸＲα２またはＲＸＲα３のアゴニスト、あるいはアンタゴニストの候補化合物として有用である。
更に本発明の検出方法は、核内受容体と結合したコアクチベータまたは被験物質の量を測定する工程を含む。核内受容体への、コアクチベータまたは被験物質の結合量は、これらの物質を標識しておくことにより測定することができる。コアクチベータまたは被験物質は、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、酵素活性物質、あるいはタグによって標識することができる。核内受容体に結合したコアクチベータまたは被験物質を測定するには、核内受容体を反応液から分離し、分離された画分に含まれる標識を測定すれば良い。核内受容体を予め固相に結合させておくと、核内受容体を容易に反応液から分離することができる。固相には、磁性粒子や反応容器の内壁などが一般に用いられる。
本発明の検出方法では、核内受容体に結合したコアクチベータ（または被験物質）の量が、被験物質の前記核内受容体に結合する活性と関連付けられる。本発明において、核内受容体に結合したコアクチベータの量が、被験物質を添加しない場合に比べて低下するとき、被験物質は核内受容体への結合活性を有していると判定される。あるいは、核内受容体に結合する被験物質の量を測定する場合には、コアクチベータの存在しない状態における被験物質の結合量に比べて、コアクチベータ存在下での結合量が低下する場合に、当該被験物質がコアクチベータとの結合阻害作用を有すると判断される。
本発明の結合活性の検出方法に基づいて、前記核内受容体に対する結合活性を有する化合物の評価方法が提供される。すなわち前記検出方法の結果、核内受容体への結合活性を測定し、対照と比較して結合活性が大きい物質を選択することにより、核内受容体に対する結合活性を有する物質をスクリーニングすることができる。本発明の評価方法によって得られる物質は、前記核内受容体に対する結合作用を有することから、前記核内受容体のアゴニスト、あるいはアンタゴニストとして作用する可能性が大きい。このような物質は、本発明の核内受容体ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の活性調節剤として有用である。
本発明の評価方法において、被験物質としては、前記転写調節活性を調節する作用の評価方法と同様の物質を用いることができる。また本発明の評価方法においては、被験物質を接触させない場合を対照とすることができる。あるいは、本発明の核内受容体への結合作用を有することが明らかな物質を対照として用いることにより、当該化合物よりも結合作用の大きい物質を探索することもできる。
本発明の評価方法により単離される化合物は、核内受容体の転写調節活性を調節する化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）の候補となる。また、生体内において、核内受容体間、核内受容体とその応答配列間、核内受容体とコファクター間等の相互作用を調節する化合物の候補となる。本発明において、転写調節活性や相互作用の調節とは、転写活性化作用の阻害あるいは活性化が含まれる。これら化合物は、核内受容体が関連する疾患の予防や治療のための医薬品として応用が考えられる。
更に、既知のＲＸＲαアイソフォームも含めた複数種のアイソフォームの間で、被験物質の作用を比較することによって、被験物質の各アイソフォームの転写調節活性に与える影響を比較することができる。その結果、アイソフォーム間で、転写調節活性に与える影響に差が見出された被験物質を選択することによって、特定のアイソフォームに特異的に作用する被験物質を選択することもできる。すなわち本発明は、ＲＸＲαのアイソフォーム特異的な活性調節作用を見出す方法を提供する。あるいは本発明は、この方法によって見出された、ＲＸＲαのアイソフォーム特異的な転写調節活性調節剤に関する。加えて本発明は、この方法によって見出された化合物を投与する工程を含むＲＸＲαのアイソフォーム特異的な転写調節活性調節方法に関する。あるいは本発明は、この方法によって見出された化合物の、ＲＸＲαのアイソフォーム特異的な転写調節活性調節剤の製造における使用に関する。
特に、ＲＸＲα１の活性増強によって症状が改善されない患者においては、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の機能不全が病態を構成している可能性が考えられる。ＲＸＲα１は、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３とは異なるコアクチベータを要求する。したがって、ＲＸＲα１を用いてスクリーニングされたアゴニストは、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３には作用しない可能性がある。本発明によって得ることができるアゴニストは、既知アイソフォームであるＲＸＲα１に対するアゴニストでは治療効果を達成できない疾患に対する、有効な治療薬となる可能性がある。
本発明による、核内受容体の転写調節活性を調節する活性を評価する方法に必要な要素は、キットとすることができる。本発明のキットは、たとえば、（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現し、かつこの細胞において、前記核内受容体の応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現しうる細胞と、当該核内受容体の活性維持に必要なコアクチベータを含む。
本発明のキットには更に細胞の培養のための培地、および培養容器をパッケージすることができる。培養容器は、ハイスループットスクリーニングに適用できる形状とするのが有利である。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアル、核内受容体の転写調節活性に対する影響の大きさが予め確認されている物質を対照として組み合せることもできる。
更に本発明は、本発明の評価方法によって得ることができる物質の医薬用途に関する。すなわち本発明は、本発明による評価方法によって選択される化合物の、核内受容体の転写調節活性制御における使用に関する。あるいは本発明は、これらの化合物を有効成分として含有することを特徴とする、核内受容体の異常に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。加えて本発明は、本発明による評価方法によって選択される化合物を投与する工程を含む、核内受容体の転写調節活性の制御方法に関する。あるいは本発明は、本発明による評価方法によって選択される化合物の核内受容体の活性調節剤の製造における使用に関する。
本発明において核内受容体の異常に特徴付けられる疾患とは、核内受容体の発現レベルや活性の異常によってもたらされる疾患を意味する。核内受容体の異常によってもたらされる疾患としては、たとえば各種の癌、高脂血症、動脈硬化、糖尿病、炎症性腸疾患等の各種炎症、乾癬などを示すことができる。癌には、前立腺癌、急性前骨髄性白血病、あるいは肝臓癌等が含まれる。これらの疾患は、いずれもＲＸＲの発現レベルや活性の低下を伴う疾患である。したがって、本発明の核内受容体の転写活性化作用を促進する化合物は、これらの疾患の治療や予防において有用である。
更に本発明は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、核内受容体の活性調節剤に関する。加えて本発明は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を投与する工程を含む、核内受容体の活性調節方法に関する。あるいは本発明は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の核内受容体の活性調節剤の製造における使用に関する。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（Ｃ）に記載の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
また本発明は、下記の成分（１）〜（４）のいずれかを有効成分として含有する、核内受容体の活性抑制剤に関する。加えて本発明は、下記の成分（１）〜（４）のいずれかを投与する工程を含む核内受容体の活性抑制方法に関する。あるいは本発明は、下記の（１）〜（４）のいずれかの成分の核内受容体の活性抑制剤の製造における使用に関する。
（１）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（２）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を認識する抗体、および
（３）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質
（４）上記（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の部分配列に対応するセンスＲＮＡおよびそのアンチセンスＲＮＡからなる２１−２３塩基対を含む２本鎖ＲＮＡ
本発明の蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体、ドミナントネガティブの形質を有する蛋白質、および上記評価方法により単離される物質は、核内受容体の転写調節活性を調節するために有用である。また、本発明においてこれらを医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等、当業者に公知の方法により行い得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することができる。また、該化合物がＤＮＡによりコードされ得るものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
投与量や投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動する。当業者であれば、必要に応じて投与量や投与方法を適宜選択することができる。
さらに本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、核内受容体の活性が調節されたモデル動物に関する。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（Ｃ）に記載の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
たとえば上記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかの蛋白質の発現や活性を低下させたトランスジェニック動物は、核内受容体の転写活性化作用が低下した疾患を誘導するモデル動物として有用である。より具体的には、たとえば各種の癌、高脂血症、動脈硬化、糖尿病、炎症性腸疾患等の各種炎症、あるいは乾癬などの治療薬の評価に用いることができる。癌には、前立腺癌、急性前骨髄性白血病、肝臓癌等が含まれる。
本発明におけるトランスジェニック動物には、上記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかの蛋白質の発現や活性を調節した動物が含まれる。たとえば、当該動物が有するヒトＲＸＲα２やＲＸＲα３のカウンターパートの遺伝子を取得し、その発現レベルや活性を調節することによって、前記蛋白質の活性や発現を調節することができる。当該遺伝子の開始コドンを他のコドンに変異させれば、遺伝子の発現を抑制することができる。また、遺伝子によってコードされる蛋白質において、活性の維持に必要な領域に変異や欠損を与えることによって、活性を奪うこともできる。このような遺伝子の改変方法は公知である。
更に本発明は、被検者から採取された生体試料における下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、対照と比較して発現レベルが低い場合には当該ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の機能低下を原因とする疾患を、逆に発現レベルが高い場合に機能亢進を原因とする疾患を、被検者が有すると判定する工程を含む、核内受容体の活性の異常に起因する疾患の診断方法に関する。
（Ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、次の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）リガンドであるレチノイン酸またはそのアゴニストとの結合によって転写活性化作用が上昇する、および
（ｂ）ＳＲＣ−１をコアクチベータとする
（Ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（Ｃ）に記載の性状（ａ）および（ｂ）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列中、１−１０２に相当する塩基配列が欠失または他の塩基配列に置換され、かつ配列番号：５に記載の塩基配列の１０３−１４６１の塩基配列に対して７０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
これらポリヌクレオチドの発現レベルは、ｍＲＮＡの定量、あるいは翻訳産物である蛋白質の定量、さらには蛋白質の活性などを指標として測定することができる。ｍＲＮＡや蛋白質の測定方法は公知である。たとえば被検者の疾患標的臓器よりバイオプシーにより細胞を採取し、通常の方法によりＲＮＡ画分を調製した後、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３特異的配列をプライマーに使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、疾患標的臓器におけるこれらのアイソフォームの発現レベルを測定することができる。
また上記ポリヌクレオチド（Ａ）〜（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、いずれもコアクチベータＳＲＣ−１の存在下でリガンドに依存して転写活性化作用を示す。したがって、この作用を指標として、これらの蛋白質の活性に基づいて、その発現レベルを知ることもできる。
得られた測定値を健常者と比較し、有意な差が見られた場合には、核内受容体による転写調節活性の異常が疑われる。
あるいは、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の遺伝子の変異や多型を指標として、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の活性の異常に起因する疾患の診断が可能である。たとえば、各種の癌、高脂血症、動脈硬化、糖尿病、炎症性腸疾患等の各種炎症、あるいは乾癬などはＲＸＲの機能低下が原因と考えられる。癌には、前立腺癌、急性前骨髄性白血病、肝臓癌等が含まれる。これらのＲＸＲの機能低下に起因する疾患は、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の活性低下につながる遺伝子変異を有する可能性がある。ＲＸＲα２またはＲＸＲα３に関するＳＮＰｓ等の遺伝子変異と上記の疾患感受性との相関が証明されれば、被検者の血液を採取し、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３遺伝子内の変異を測定する手法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等）により変異を同定し疾患発症の予測あるいは発症機序の解明に利用することができる。
たとえば、ＲＸＲの機能低下を伴う疾患の患者のうち、ＲＸＲα１の活性増強によって症状が改善されない患者においては、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の機能不全が病態を構成している可能性が考えられる。このような患者の疾患の原因を明らかにする方法として、本発明の診断方法は有用である。本発明の診断方法によって、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３の機能低下が予測された患者に対しては、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３のアゴニストの投与を治療方針として選択することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されない。また本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例１  ＜オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製＞
（１）ｍＲＮＡ抽出と購入
ヒト培養細胞（Ｈ４細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１４８））をカタログ記載の方法で培養後、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）記載の方法により全ＲＮＡとしてｍＲＮＡを抽出した。
さらに、ヒト扁桃組織（（Ｂｒａｉｎ，ａｍｙｇｄａｌａ），ＣＬＯＮＴＥＣＨ＃６５７４−１）よりポリＡ（＋）ＲＮＡとして抽出・精製されたｍＲＮＡを購入した。各組織由来のポリＡ（＋）ＲＮＡに、ポリＡ（−）ＲＮＡを混ぜたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。ポリＡ（−）ＲＮＡは、全脳（Ｂｒａｉｎ，ｗｈｏｌｅ），ＣＬＯＮＴＥＣＨ＃６４０２０−１の全ＲＮＡからポリＡ（＋）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースで除くことにより調製した。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
それぞれのＲＮＡよりオリゴキャプ法［Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１−１７４（１９９４）］を改良した方法（ＷＯ  ０１／０４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：７）およびＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：８）を用いて、ＷＯ  ０１／０４２８６に記載したようにＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’（配列番号：９）と３’（配列番号：１０）のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩ切断した。次いで、通常は２ｋｂ以上（場合によっては３ｋｂ以上）に分画したｃＤＮＡ断片をＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（図１）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
オリゴキャップ法を改良した方法で作製した高全長率ｃＤＮＡライブラリー（既知ｍＲＮＡのタンパク質コード領域を指標にして算出した各ｃＤＮＡライブラリーの５’端の全長率は平均９０％）は、真核細胞での発現が可能な発現ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を用いて作製した。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３にはクローニング部位の上流にＳＲαプロモーターとＳＶ４０ｓｍａｌｌ  ｔイントロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０ポリＡ付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩサイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化したｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞などに導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物である蛋白質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
実施例２  ＜ｃＤＮＡクローン末端配列解析と全長塩基配列解析クローンの選択＞
各ｃＤＮＡライブラリーより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析した。得られたデータについてはデータベース化を行った。
解析されたｃＤＮＡクローンの５’末端配列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓの表記があるデータを対象にしたＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、ヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させた。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択し、選択されたクローンについては必要に応じ３’末端配列を５’末端配列と同様の方法で解析取得した。取得された末端配列のデータを解析し、５’末端と３’末端の配列でコンティグを作るクローンは除いた。更に再度前記と同様にＢＬＡＳＴによる相同性検索によりヒトのｍＲＮＡ配列（特許化または特許出願された配列を含む）に同一なものは除いた。こうして選択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローンを得た。
実施例３  ＜全長塩基配列解析＞
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて各々全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は、主にカスタム合成ＤＮＡプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成ＤＮＡプライマーを用い、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のＤＮＡシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を解析した。一部のクローンについては、Ｌｉｃｏｒ社製ＤＮＡシーケンサーも利用した。
また、一部のクローンについてはカスタムプライマーを用いずｃＤＮＡが含まれるプラスミドをランダムに切断するショットガン法を用いて同様にＤＮＡシーケンサーでＤＮＡ塩基配列を決定した。全長塩基配列は上記方法により決定された部分塩基配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。次に、決定された全長塩基配列から、蛋白質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。こうして決定された塩基配列のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索を行い、核内受容体ＲＸＲαと高い相同性を示すクローンＣ−ＢＮＧＨ４２００８６４９及びＣ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７を見出した。
実施例４＜ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）及びα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡの塩基配列の配列解析及びＲＸＲα既知ｉｓｏｆｏｒｍ  ｃＤＮＡ配列との比較＞
ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）ｃＤＮＡの２３９３塩基配列（図２−図５；配列番号：１）、及びα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡの２４２１塩基配列（図６−図９；配列番号：３）についてＤＮＡ配列解析ソフトｂｉｏＳＣＯＵＴ（Ｌｉｏｎ社）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ由来データベースに対して配列相同性検索及び機能モチーフ検索を行った。更に文献情報を基に既報告のＲＸＲαアイソフォームの配列と比較検討した（図１０−図２４）。
ＲＸＲα２は４３５アミノ酸残基の蛋白質をコードする１３０５塩基長（９２３−２２３０）の領域を有し、またＲＸＲα３は３６５アミノ酸残基の蛋白質をコードする１０９５塩基長（９２４−２０２１）の領域を有していた。両蛋白質には核内受容体ファミリーに共通するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）が存在した。本２種ｃＤＮＡと最も高い相同性を示したのがＲＸＲαの既知アイソフォームＲＸＲα１であった。夫々のコードする蛋白質のアミノ酸配列を比較したところ、Ｎ末配列に関してＲＸＲα１よりもＲＸＲα２及びＲＸＲα３は夫々２７及び９７アミノ酸残基長の欠失が認められた（図２５）。
実施例５  ＜ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）及びα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡのヒト染色体へのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏマッピング＞
ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）及びα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡ塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ及びＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅヒトゲノム配列データベース由来配列に対してＢＬＡＳＴ検索を行った。一部の配列が未ヒットであることを除いてｃＤＮＡ配列がヒト第９染色体ｑ３４．３部位のクローン配列と一致し、エクソン配列を同定することが出来た。但し、ゲノム配列データベースが現在のところドラフトレベルに留まっているため、ＲＸＲα１ゲノム構造の実験的解析結果を報告している文献（Ｌｉ−Ｇ，Ｗａｌｃｈ−Ｅ，Ｙａｎｇ−Ｘ，Ｌｉｐｍａｎ−ＳＭ  ＆  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ−ＪＬ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α  ｇｅｎｅ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ．ＢＢＲＣ  ２６９（２０００）５４−５７．）を参照して各アイソフォームのゲノム構造を推定した（図２６）。その結果ＲＸＲα２及びＲＸＲα３遺伝子は夫々少なくとも１０及び９個のエクソンから構成されていることを明らかにした。更に本エクソン配列で一義的に決まる各イントロン配列について境界配列がＧＴ−ＡＴルールを満足していることからＲＸＲα２及びＲＸＲα３  ｃＤＮＡの既知アイソフォームとの相違が人為的な結果でないことを明確に示すことができた。
実施例６  ＜ＲＸＲα２及びＲＸＲα３  ｃＤＮＡのヒト各種組織中発現の評価＞
ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の組織発現分布を、市販ヒト組織由来ｃＤＮＡを鋳型にし、各アイソフォーム特異的プライマーセットを使用してＰＣＲ法により測定した。ＰＣＲ反応液組成は２０μｌの容量中に鋳型としてヒト心臓、腎臓、肝臓、脾臓、脳あるいは骨格筋ｃＤＮＡ各１μｇ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １．６μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）１μｌ、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）１μｌ、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー１μｌ、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー１μｌ、滅菌水１１．４μｌとした。
使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
ＲＸＲα１の増幅用：
2003080668.tif 000003
ＲＸＲα２の増幅用：
2003080668.tif 000004
ＲＸＲα３の増幅用：
2003080668.tif 000005
ＰＣＲ増幅は９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分を１サイクルとし、３５回実施した。同時に、各組識について同一条件にて、ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅとして知られているｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）についてのＰＣＲを行い、発現の対照とした。ＲＸＲα１は腎臓、脾臓、肝臓、脂肪細胞及び前立腺における発現が認められたのに対し、ＲＸＲα３の発現は脳、脾臓及び前立腺で発現が認められた（図２７）。本実験の条件下ではＲＸＲα２については組織での発現は検出限界以下であった。
実施例７  ＜ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の転写調節活性評価のためのレポータジーンアッセイ系の構築＞
ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の転写調節活性評価のためのレポータジーンアッセイ系を構築するために、ＲＸＲＥ（ＲＸＲ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を組み込んだレポータプラスミド、ＲＸＲα２、ＲＸＲα３及びＲＸＲα１の発現プラスミドを以下の通り作製した。レポータジーンアッセイは、培養細胞にレポータプラスミド及び発現プラスミドをリポフェクション法により導入し一定時間培養後、細胞溶解液にて処理し、溶解液をデュアルルシフェラーゼ法によりルミノメーターを使用してレポータ活性を測定した。
ＲＸＲＥレポータプラスミドはルシフェラーゼを使用するレポータベクターＰＧＶＰ２のＢｇｌＩＩ部位にＲＸＲＥ配列に対応する合成ＤＮＡをタンデムに複数個挿入することにより作製した。ＲＸＲＥ（ＲＸＲ応答配列）に対応する２６ｍｅｒの互いに相補的な合成ＤＮＡ（５’−ＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡ−３’／配列番号：１７，５’−ＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡ−３’／配列番号：１８）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’端のリン酸化を行った後、各相補鎖を等量混合し、６５℃、１５分にて加熱変性後徐冷により、アニーリングを行い、挿入ＤＮＡ断片を調製した。本断片を制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩにより切断されたＰＧＶＰ２と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの形質転換に供した。市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピタント（東洋紡）を使用して定法により形質転換を行い、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。得られた形質転換体についてコロニーＰＣＲにより、組換えプラスミド中の挿入断片の有無、サイズを確認し、複数個が挿入されているクローンについて更に塩基配列の確認を行い、挿入応答配列の個数、正逆の向きを確認した。その中で応答配列が５個センス方向にタンデムに挿入されたクローンをレポータプラスミドとした。
ＲＸＲα１、ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の発現プラスミドは発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニング部位にコーディング領域を含む配列を挿入して作製した。挿入断片はＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）についてはｐＭＥ１８ＳＦＬ３−Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９を鋳型にして、ＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）についてはｐＭＥ１８ＳＦＬ３−Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７を鋳型にして、対照となるＲＸＲα１についてはヒト腎臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ増幅法により調製した。ＰＣＲに使用したプライマーは次のとおりである。
ＲＸＲα１用：
2003080668.tif 000006
2003080668.tif 000007
ＲＸＲα２用：
2003080668.tif 000008
ＲＸＲα３用：
2003080668.tif 000009
ＰＣＲ増幅条件は９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分の１サイクルを３５回実施した。得られた挿入断片及び発現ベクター夫々について制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩにより切断し、各切断断片をアガロース電気泳動にて分離精製後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。本反応液によりＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン耐性により形質転換体を取得した。得られた形質転換体についてコロニーＰＣＲにより組換えプラスミド中の挿入断片を確認し、更に塩基配列決定により配列に変異の無いことをを確認した。
上述の通り取得したレポータプラスミド及び発現プラスミドについて、各プラスミド保有株を大量培養して、市販のプラスミドＤＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりＤＮＡを調製し、レポータジーンアッセイに供した。
実施例８  ＜ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の転写調節活性＞
ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の転写調節活性をレポータジーンアッセイを使用して評価した。ＲＸＲα１を対照にしてＲＸＲα２及びＲＸＲα３の転写調節活性を比較検討し、また、夫々の転写調節活性についてＲＸＲαアゴニストＬＧ１００２６８に対する応答性も評価した（図２８）。
レポータジーンアッセイはＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）を宿主に使用し、ルシフェラーゼレポータプラスミドおよびＲＸＲα１，ＲＸＲα２あるいはＲＸＲα３の各発現プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行い、さらに細胞を各種濃度（０，１０−１０−１０−５Ｍ）のＬＧ１００２６８に２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより実施した。
形質転換は下記の通り行った。ＣＶ−１細胞を１０％牛胎児血清、２０００Ｕ／ｌペニシリンＧ、１００ｍｇ／ｌストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／２．５ｍｌの濃度になるように懸濁し、２．５ｍｌ  ６ウェルプレートにまき、ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で１８〜２４時間培養を行った。転写因子発現プラスミド、ルシフェラーゼレポータプラスミドおよび測定値補正用ルシフェラーゼレポータプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）各１μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）で全量１５０μｌになるように溶解し、細胞形質転換用試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）７μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  １４３μｌに希釈した液に対し、混合液を攪拌しながら滴下し、２０分放置した。
ＰＢＳ（−）１ｍｌで２回洗浄した細胞に本ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ−ＤＮＡ混合液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  １．５ｍｌに希釈した後、添加し４時間培養した。形質転換液を除き、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ  ２００μｌを添加し、３７℃で５分保温した。ＤＭＥＭ培地１ｍｌを加え、細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、１０００ｒｐｍ、３分間遠心した。遠心後、１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度になるように再度ＤＭＥＭ培地に懸濁し、１００μｌを９６ウェルプレートにまいた。薬剤を評価する場合、予め終濃度の１０００倍希釈濃度薬剤ＤＭＳＯ溶解液を培地で希釈して２倍濃度薬液とし、薬液５０μｌに１．６×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μｌの細胞を懸濁液５０μｌを添加した。ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）で２４時間培養を行った。
ルシフェラーゼ活性測定試薬としてＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。９６ウェルプレート各ウェルの上清を除き、ＰＢＳ（−）１００μｌで１回洗浄し、×１  ＰＬＢ（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）２０μｌ加え、１５分間室温放置後、測定時まで−２０℃のフリーザーに保存した。ルミノメーターとしてＡＲＶＯＴＭＨＴＳ１４２０マルチラベルカウンタ（Ｗａｌｌａｃ社）を使用した。測定プロトコールは１ウェルにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩ  ５０μｌ添加、０．３秒振とう、１秒測定、Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ５０μｌ添加、０．３秒振とう、１秒測定である。得られたｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼの測定値は内部対照としてのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの測定値で除することにより補正した。例数３で平均値および標準誤差を算出した。
新規アイソフォームＲＸＲα２及びＲＸＲα３はいずれも転写活性化作用を有していることが確認されたが、ＲＸＲα１、ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の間でＬＧ１００２６８に対する転写活性化作用の応答性に有意な差異は認められなかった。
実施例９  ＜ＲＸＲα２及びＲＸＲα３のＰＰＡＲγに対する転写共役活性＞
ＲＸＲα２及びＲＸＲα３のＰＰＡＲγに対する共役転写調節活性をＲＸＲα１のそれとレポータジーンアッセイを使用して比較検討した（図２９）。レポータジーンアッセイの詳細は、▲１▼ＲＸＲＥレポータプラスミドに代えてＰＰＡＲＥレポータプラスミドを使用すること、及び▲２▼ＰＰＡＲγ発現プラスミドを各ＲＸＲα発現プラスミドと共に同時に宿主細胞を形質転換する以外は実施例８と同様である。
ＲＸＲα１、ＲＸＲα２及びＲＸＲα３の間でＰＰＡＲγに対する共役転写調節活性及びＬＧ１００２６８に対する共役転写調節活性の応答性に有意な差異は認められなかった。
実施例１０  ＜ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ存在下におけるＲＸＲα２及びＲＸＲα３のＰＰＡＲγに対する転写共役活性＞
ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ存在下におけるＲＸＲα２及びＲＸＲα３のＰＰＡＲγに対する共役転写調節活性をＲＸＲα１のそれとレポータジーンアッセイを使用して比較検討した（図３０）。レポータジーンアッセイの詳細は、各ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ発現プラスミドをＰＰＡＲγ発現プラスミド及び各ＲＸＲα発現プラスミドと共に同時に宿主細胞を形質転換する以外は実施例９と同様である。
コアクチベータＣＢＰ−１存在下では、ＲＸＲα各アイソフォーム間でＬＧ１００２６８応答性に有意な差異は認められなかったが、ＰＣＧ−１存在下では、ＲＸＲα２及びＲＸＲα３はＬＧ１００２６８に対して応答を示さなかったのに対し、ＲＸＲα１は、活性は強くはないがＬＧ１００２６８濃度依存的に活性を増加させた。また逆に、ＳＲＣ−１存在下では、ＲＸＲα１はＬＧ１００２６８に対して応答を示さなかったのに対し、ＲＸＲα２及びＲＸＲα３はＬＧ１００２６８濃度依存的に活性が増加した。ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒの発現は組織及び生理条件依存的であり、組織発現分布の差異を併せて考慮すると、本結果はＲＸＲα新規アイソフォームがＲＸＲα１とは異なる生理的役割を担っていることを強く示唆するものである。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規な核内受容体ＲＸＲα２およびＲＸＲα３が提供された。これらのＲＸＲαアイソフォームは、レチノイン酸をリガンドとし、ＳＲＣ−１をコアクチベータとする核内受容体である。更に本発明のアイソフォームＲＸＲα２およびＲＸＲα３は、既知蛋白質であるＲＸＲα１と同様に、ＣＢＰもコアクチベータとすることが明らかにされた。
ＳＲＣ−１コアクチベーターは、様々な核内受容体との相互作用を通じて、生体内で多様な機能を担っていると推測される。例えば、Ｅ．Ｎｉｓｈｉｈａｒａ等は、ＳＲＣ−１コアクチベーターについて、遺伝子ターゲッティングの手法によりＳＲＣ−１  ｎｕｌｌ（ＳＲＣ−１−／−）ｍｉｃｅを作製し、機能解析を行なった（Ｅｉｊｕｎ  Ｎｉｓｈｉｈａｒａ，Ｈｉｒｏｍｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ−Ｋｏｍｉｙａ，Ｃｈｉ−Ｓｈｉｎｇ  Ｃｈａｎ，Ｌａｎ  Ｌｉａｏ，ｒｏｎａｌｄ  Ｌ．Ｄａｖｉｓ，Ｂｅｒｔ  Ｗ．Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，ａｎｄ  Ｊｉａｎｍｉｎｇ  Ｘｕ．ＳＲＣ−１  Ｎｕｌｌ  Ｍｉｃｅ  Ｅｘｈｉｂｉｔ  Ｍｏｄｅｒａｔｅ  Ｍｏｔｏｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  Ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３（２００３）２１３−２２２．）。その結果、これらのノックアウトマウスにおいては、子宮、前立腺、精巣、乳腺などの発達不全が見られ、またＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞の成長阻害が早い段階から見られ、成長後の軽い運動障害につながっていることが見出されている。本発明によって見出されたＲＸＲα２及びＲＸＲα３が、ＳＲＣ−１をコアクチベーターとすることは、このような臓器の発達不全や運動障害との関連において注目される。
本発明によって見出された、ＲＸＲαアイソフォームの構造と、コアクチベータに対する特異性は新規である。核内受容体の転写調節活性の制御は、シグナル伝達を通じて細胞の活動を制御することにつながる。このような考えかたに基づいて、これまでにも様々な核内受容体について機能解析が行われてきた。そして明らかにされた機能の制御によって、細胞の活動を制御する試みが続けられている。しかしこれらの試みの多くは、特定の核内受容体とリガンドの関係を標的として進められてきた。コアクチベータによる核内受容体の転写調節活性の調節作用は知られていた。しかし、たとえばアイソフォームのような近縁の分子間でも、コアクチベータに対する特異性に違いがあることには、着目されていなかった。しかし本発明者らの研究によって、核内受容体の活性がリガンドのみならず、コアクチベータに対する特異性によっても細かくコントロールされていることが明らかとなった。言いかえれば、核内受容体を標的として、シグナル伝達経路の制御を行うためには、特定のリガンドに対する作用のみならず、核内受容体の転写調節活性に与えるコアクチベータとの相互作用についても考慮する必要があることが明らかとなった。
本発明は、ＲＸＲαのアイソフォームについて、その転写調節活性を制御しているコアクチベータの作用を調節する活性の評価方法を提供した。更に本発明は、コアクチベータによる転写活性化作用の増強作用に与える被験物質の影響を評価する方法を提供した。本発明の評価方法に基づいて、ＲＸＲαを構成する各アイソフォームのコアクチベータによる転写活性化作用の増強作用を調節する活性について、被験物質を評価することが可能となった。その結果、本発明に基づいて、前記転写活性化作用の増強作用を調節する作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物は、ＲＸＲαのアイソフォームに対する転写活性化作用の増強作用を調節する化合物である。ＲＸＲαアイソフォームは、アイソフォームごとにコアクチベータに対する特異性が異なっているので、本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物によって、アイソフォームに特異的な活性の制御が実現する。このような化合物は、細胞活動の制御において、新規な標的に作用する薬剤として有用である。
またＲＸＲα２またはＲＸＲα３そのもの、あるいはこれらの蛋白質の活性や発現を調節することができる化合物も、核内受容体の転写調節活性の異常に起因する疾患において、有用な治療剤となる。
ＲＸＲα２またはＲＸＲα３蛋白質は、核内受容体の発現や活性の低下によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。より具体的には、各種の癌、高脂血症、動脈硬化、糖尿病、炎症性腸疾患等の各種炎症、あるいは乾癬などはＲＸＲの機能低下が原因と考えられる。癌には、前立腺癌、急性前骨髄性白血病、肝臓癌等が含まれる。
更に本発明は、ＲＸＲα２またはＲＸＲα３をコードするポリヌクレオチドのアンチセンス、２本鎖ＲＮＡ、あるいはこれらの蛋白質を提供する。アンチセンスやドミナントネガティブの形質を有する蛋白質は、これらの核内受容体の転写調節活性の異常によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のベクターのマップ
図２は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）を示す。
図３は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。（図２の続き）
図４は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列を示す。（図３の続き）
図５は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列を示す。（図４の続き）
図６は、ＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：３）を示す。
図７は、ＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列（配列番号：４）を示す。（図６の続き）
図８は、ＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列を示す。（図７の続き）
図９は、ＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）ｃＤＮＡの塩基配列と翻訳アミノ酸配列を示す。（図８の続き）
図１０は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９；配列番号：１）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７；配列番号：３）とＲＸＲα１（配列番号：５）の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。上から順に、ＲＸＲα１、ＲＸＲα２、およびＲＸＲα３の塩基配列を示す。塩基の欠失を「−」で、また３つのアイソフォーム間の塩基の一致を「＊」で示した。「．」は、３つのうちの任意の２つのアイソフォーム間の塩基の一致を示す。
図１１は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１０の続き）
図１２は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１１の続き）
図１３は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１２の続き）
図１４は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１３の続き）
図１５は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１４の続き）
図１６は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１５の続き）
図１７は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１６の続き）
図１８は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１７の続き）
図１９は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１８の続き）
図２０は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図１９の続き）
図２１は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図２０の続き）
図２２は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図２１の続き）
図２３は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図２２の続き）
図２４は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果を示す。（図２３の続き）
図２５は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ｃＤＮＡによってコードされるのアミノ酸配列を比較した結果を示す。上から順に、ＲＸＲα１（４６２ａａ；配列番号：６）、ＲＸＲα２（４３５ａａ；配列番号：２）、およびＲＸＲα３（３６５ａａ；配列番号：４）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基の欠失を「−」で、また３つのアイソフォーム間のアミノ酸の一致を「＊」で示した。「．」は、３つのうちの任意の２つのアイソフォーム間のアミノ酸の一致を示す。
図２６は、ＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）とＲＸＲα１の、ゲノム塩基配列に対する検索結果と、その結果に基づく予測エクソンを示す。ＢＮＧＨがＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）の、ＢＲＡＭＹがＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）の、そしてｈＲＸＲαがＲＸＲα１の予測エクソンを示す。斜線を付けたのは、各アイソフォームに固有のエクソンである。
図２７は、脾臓と脳におけるＲＸＲα２（Ｃ−ＢＮＧＨ４２００８６４９）／レーン４およびＲＸＲα３（Ｃ−ＢＲＡＭＹ２００３２８７）／レーン５とＲＸＲα１／レーン３の発現レベルを測定した結果を示す写真。レーン１は１００ｂｐラダー、レーン２はＧＡＰＤＨの結果を示す。
図２８は、各ＲＸＲαアイソフォームのホモダイマーが有する転写調節活性に与えるＬＧ１００２６８（ＲＸＲαアゴニスト）の影響を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸はＬＧ１００２６８の濃度（Ｍ）を示す。各カラムは左から順に、レポータプラスミドのみ（ｒｅｐＲＸＲＥ  ａｌｏｎｅ）、ＲＸＲα１ホモダイマー（ｒｅｐ＋ＲＸＲａ１）、ＲＸＲα２ホモダイマー（ｒｅｐ＋ＲＸＲａ２）、およびＲＸＲα３ホモダイマー（ｒｅｐ＋ＲＸＲａ３）の結果を示す。
図２９は、ＰＰＡＲγと各ＲＸＲαアイソフォームのヘテロダイマーが有する転写調節活性に与えるＬＧ１００２６８（ＲＸＲαアゴニスト）の影響を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸はＬＧ１００２６８の濃度（Ｍ）を示す。各カラムは左から順に、レポータプラスミドのみ（ｒｅｐＲＸＲＥ  ａｌｏｎｅ）、ＰＰＡＲγ＋ＲＸＲα１ヘテロダイマー（ｒｅｐ＋ＰＰＡＲｇ＋ＲＸＲａ１）、ＰＰＡＲγ＋ＲＸＲα２ヘテロダイマー（ｒｅｐ＋ＰＰＡＲｇ＋ＲＸＲａ２）、およびＰＰＡＲγ＋ＲＸＲα３ヘテロダイマー（ｒｅｐ＋ＰＰＡＲｇ＋ＲＸＲａ３）の結果を示す。
図３０は、種々のコアクチベータ存在下における、ＲＸＲαアイソフォームのリガンドによって誘導される転写活の違いを示す。図中、縦軸はルシフェラーゼ活性の補正値、横軸はＬＧ１００２６８の濃度（Ｍ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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