(57)【要約】軟骨形成促進作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルと、を含有する軟骨組織形成用製剤。
2003043672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨形成促進作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルと、を含有する軟骨組織形成用製剤。
【請求項２】
前記重合体は生体内で前記薬物の放出を制御する重合体であり、前記多孔性マトリックス及び前記ハイドロゲルは生体内で軟骨組織形成のための足場となるべき足場形成材である、請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項３】
前記薬物と前記重合体とは、前記薬物が前記重合体に担持された担持物を形成しており、前記足場形成材は、該担持物と接触して存在している請求の範囲２記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項４】
前記担持物は、前記足場形成材中に分散されている請求の範囲３記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項５】
前記足場形成材は層を形成しており、前記担持物は該層上に固定されている請求の範囲３記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項６】
前記担持物は、マイクロスフィア、フィルム又は不織布の形状を有している請求の範囲３〜５のいずれかに記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項７】
前記マイクロスフィアは、前記薬物及び前記重合体の有機溶剤溶液の水分散体から、該有機溶剤及び水を除去して得られたものである請求の範囲６記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項８】
前記担持物は、前記薬物を持続放出可能な担持物である請求の範囲３〜５のいずれかに記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項９】
前記足場形成材が前記ハイドロゲルである請求の範囲４記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１０】
前記足場形成材が前記ハイドロゲルであり、前記担持物がフィルム又は不織布の形状を有している請求の範囲５記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１１】
前記薬物が、一般式（Ｉ）
2003043672.tif 000029
｛式中、Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、又は−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｌＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子又は低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい）で表される基を示し；Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−、−ＮＨ−又は−Ｏ−を示し、ｎは０〜４の整数を示す｝で表される化合物又はその塩である、請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１２】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記式（Ａ）で表される化合物である請求の範囲１１記載の軟骨組織形成用製剤。
2003043672.tif 000030
【請求項１３】
前記重合体が、５００以上の重量平均分子量を有するものである請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１４】
前記重合体が、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体である請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１５】
前記重合体が、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、及びヒドロキシ吉草酸からなる群より選ばれる化合物の重合体又は共重合体である請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１６】
前記重合体が、乳酸・グリコール酸共重合体である請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１７】
前記重合体の少なくとも一部が、不飽和二重結合を有する反応性重合物である請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１８】
前記反応性重合物が、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体からなる骨格と、該骨格に結合した少なくとも一つの（メタ）アクリロイル基とを有する化合物である請求の範囲１７記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項１９】
前記多孔性マトリックスが、１０〜５００μｍの平均孔径を有する多孔性マトリックスである請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２０】
前記多孔性マトリックスが、生体内における消失速度が１日〜５週間の多孔性マトリックスである請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２１】
前記多孔性マトリックスが、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物からなる多孔性マトリックスである請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２２】
前記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物が、５００以上の重量平均分子量を有する化合物である請求の範囲２１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２３】
前記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物が、ヒアルロン酸誘導体及び／又はコラーゲンである請求の範囲２１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２４】
前記ヒアルロン酸誘導体が、物理架橋ヒアルロン酸又は低架橋密度の化学架橋ヒアルロン酸である請求の範囲２３記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２５】
前記物理架橋ヒアルロン酸が、水素結合型物理架橋ヒアルロン酸又はイオン結合型物理架橋ヒアルロン酸である請求の範囲２４記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２６】
前記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物が、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体である請求の範囲２１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２７】
前記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物が、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、及びヒドロキシ吉草酸からなる群より選ばれる化合物の重合体又は共重合体である請求の範囲２１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２８】
前記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物が、乳酸・グリコール酸共重合体である請求の範囲２１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項２９】
前記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物の少なくとも一部が、不飽和二重結合を有する反応性重合物である請求の範囲２１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項３０】
前記反応性重合物が、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体からなる骨格と、該骨格に結合した少なくとも一つの（メタ）アクリロイル基とを有する化合物である請求の範囲２９記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項３１】
前記ハイドロゲルが、生体内における消失速度が１日〜５週間のハイドロゲルである請求の範囲１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項３２】
前記ハイドロゲルが、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化することが可能なハイドロゲルである請求の範囲３１記載の軟骨組織形成用製剤。
【請求項３３】
軟骨欠損部に、請求の範囲４記載の軟骨組織形成用製剤を導入させる軟骨組織の形成方法。
【請求項３４】
軟骨欠損部に、請求の範囲５記載の軟骨組織形成用製剤を、前記層が前記軟骨欠損部の表面に接触するように導入させる軟骨組織の形成方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、軟骨組織形成に適した製剤に関する。
背景技術
関節軟骨はいったん損傷すると、再生しないことが知られている（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２１  ２５８９−２５９８（２０００））。これまでの約４０年間、多くの関節軟骨欠損、変形性関節症等の軟骨疾患治療方法が提案されてきており、現在では、自家細胞移植による軟骨再生法も試みられているが、数度の手術を必要とし、簡便さに欠け、患者の負担は甚大である。一方、人工関節を用いる場合においては、生体適合性や耐久性の問題がある。したがって、これらの問題を解決するような薬物による治療方法が長らく望まれている。
軟骨形成を促進、あるいは軟骨細胞を増殖する効果がある物質としては、種々の生体由来物質や低分子物質が知られている。かかる物質としては、例えば、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β）等の成長因子、ＢＭＰ−２（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７９−Ａ（１０）：１４５２〜１４６３，１９９７）、レクチンの１種であるコンカナバリンＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０１２５〜１０１３１，１９９０）、あるいはオステオゲニン（ＢＭＰ−７）、ビタミンＤ誘導体（１α，２５−Ｄ３）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：５４３５〜５４４２，１９８９）、ビタミンＡ誘導体（レチノイン酸）（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３０：７６７〜７７３，１９８８）、ヴァナデート（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０４：３１１〜３１９，１９８７）、ベンズアミド（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．，８５：１６３〜１７５，１９８５）、ベンジルβ−Ｄ−キシロサイド（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４：９７７〜９８８，１９８４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１１：４６２〜４６８，１９８２）、プロスタグランジン誘導体（ＰＧＥ２，Ｕ４４０６９）（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ，１９：３９１〜４０６，１９８０）、ｄｂｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）、ＴＡＫ−７７８（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２６１：１３１〜１３８，１９９９）等が挙げられる。また、国際公開ＷＯ００／４４７２２号公報には、特定の構造を有するインドリン−２−オン誘導体が軟骨形成促進作用を有することが開示されている。
上記の生体由来物質ないし低分子物質のうち、最も有用な治療薬となることが期待されたＴＧＦ−βに関して、ＴＧＦ−βのアイソフォームの一つであるＴＧＦ−β１は、これを関節内に投与した際に軟骨形成を促進することが報告されている（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１（２）：２７９〜２９０，１９９４）。また、このＴＧＦ−β１は、実験的に関節炎を生じさせたモデル動物において、関節炎による関節軟骨のプロテオグリカンの消失を抑制する。すなわち、関節内投与時の関節軟骨への同化的作用により関節軟骨の破壊を抑制するため、リウマチ等の関節疾患の有用な治療薬としての可能性が示唆されている（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８（２）：１３３〜１４２，１９９８）。
しかしながら、このように最も有用な治療薬となることが期待されたＴＧＦ−βにおいても、該物質は軟骨形成を促進する一方で顕著な滑膜炎を惹起することが報告されており、前述した軟骨疾患の治療薬として大きな問題点を有しているため（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１（２）：２７９〜２９０，１９９４）、該疾患の治療薬として実用化されるに至っていない。
これら軟骨形成を促進する薬物の副作用を回避するため、現在まで種々の製剤が提案されている。例えば、軟骨形成を促進する薬物を薬物担持素材（Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に含有させ、その放出期間をコントロールする方法として、生分解性ポリマーを用いる方法や、また、軟骨形成促進物質を含有する乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロカプセルを関節内に投与する方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ２６１，１３１−１３８（１９９９））等が報告されているが、投与部位に炎症を起こしたり、自然修復を阻害する可能性があった。また、こういった組織刺激性を回避するために、薬物をリポソームに含有させる方法（特開２００１−３０２４９６号公報）も報告されているが、薬物の放出期間が短い等の問題があった。
一方で、軟骨組織修復のための足場となるマトリックス（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）の研究も行われており（例えば、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，２０５−２１３（１９９９））、これまでに、コラーゲンスポンジ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，１５５−１６２（１９９６））、ゼラチンスポンジ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，２４６−２５５（２０００））、フィブリン（Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，５，１５８０−１５８５（１９９８））、アガロースゲル（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，６，５０−６５（１９９８））、ＰＬＧＡ−ポリエチレンオキサイド（ＰＥＧ）スポンジ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（２），２２９−２３５（２００１））、ヒアルロン酸（特開２０００−２３９３０５号公報）、エステル変換ヒアルロン酸（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０，１０１−１０９（２０００））や、キトサン−多糖ゲル（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，２５８９９−２５９８（２０００））等が報告されている。
発明の開示
しかしながら、上記従来技術においては上述の問題点が存在するため、軟骨形成促進作用を有する薬剤を有効成分とする製剤で、医薬品として実際に販売されるに至ったものは、現在のところ存在しない。
本発明者らは、上述の問題点を解決すべく、既に、軟骨細胞増殖作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、水溶性及び／又は水分散性を有する有機溶媒とを含有する軟骨組織形成用製剤を報告している（国際公開ＷＯ０１／６６１４２号公報）。かかる製剤は非常に優れた軟骨細胞の増殖作用を発揮するが、その増殖作用が場合により不安定化することがあった。
本発明は、かかる問題点及び上記従来技術における問題点に鑑みてなされたものであり、治療に高度の技術や設備を必要とせず、生体適合性に優れるとともに、安定且つ良好な軟骨修復効果を得ることが可能な軟骨組織形成用製剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、軟骨形成促進作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、軟骨組織修復のための足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）となる多孔性マトリックス及び／又はハイドロゲルとを含有させた製剤により、薬物放出性、生分解性及び／又は生物侵食性、並びに軟骨組織修復のための足場形成性を、それぞれ独立に制御することが可能になり、これにより上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の軟骨組織形成用製剤は、軟骨形成促進作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルと、を含有することを特徴とするものである。ここで、上記重合体は生体内で上記薬物の放出を制御する重合体であり、上記多孔性マトリックス及び上記ハイドロゲルは生体内で軟骨組織形成のための足場となるべき足場形成材である。
本発明の軟骨組織形成用製剤においては、薬物と重合体とは、薬物が重合体に担持された担持物を形成しており、多孔性マトリックス及び／又はハイドロゲル（足場形成材）は、該担持物と接触して存在していることが好ましい。
担持物としては、マイクロスフィア、フィルム又は不織布の形状を有しているものが使用でき、マイクロスフィアとしては、薬物及び重合体の有機溶剤溶液の水分散体から、該有機溶剤及び水を除去して得られたものであることが好ましい。更に、担持物は、前記薬物を持続放出可能な担持物であることが好ましい。
なお、軟骨組織形成用製剤の態様としては、上記担持物が上記足場形成材（足場形成材は上記ハイドロゲルが好ましい。）中に分散されているもの、上記足場形成材（足場形成材は上記ハイドロゲルが好ましい。）が層を形成しており、上記担持物（担持物はフィルム又は不織布の形状を有していることが好ましい。）が該層上に固定されているものが挙げられる。
本発明においては、薬物が、一般式（Ｉ）
2003043672.tif 000003
｛式中、Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、又は−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｌＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子又は低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい）で表される基を示し；Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−、−ＮＨ−又は−Ｏ−を示し、ｎは０〜４の整数を示す｝で表される化合物又はその塩であることが好ましい。
そして、一般式（Ｉ）で表される化合物としては、下記式（Ａ）で表される化合物が好適である。
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重合体は、５００以上の重量平均分子量を有するものであることが好ましく、重合体としては、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体が挙げられ、なかでも、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、及びヒドロキシ吉草酸からなる群より選ばれる化合物の重合体又は共重合体が好ましい。そして、重合体としては、乳酸・グリコール酸共重合体が特に好ましい。
本発明においては、上記重合体の少なくとも一部が、不飽和二重結合を有する反応性重合物であってもよい。かかる反応性重合物としては、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体からなる骨格と、該骨格に結合した少なくとも一つの（メタ）アクリロイル基とを有する化合物が挙げられる。
本発明における多孔性マトリックスは、１０〜５００μｍの平均孔径を有する多孔性マトリックスが好ましく、生体内における消失速度が１日〜５週間の多孔性マトリックスであることが好ましい。
多孔性マトリックスは、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物からなる多孔性マトリックスが好適であり、かかる化合物は、５００以上の重量平均分子量を有することが好ましい。
生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物としては、ヒアルロン酸誘導体及び／又はコラーゲンが挙げられ、ヒアルロン酸誘導体としては、物理架橋ヒアルロン酸又は低架橋密度の化学架橋ヒアルロン酸が例示でき、物理架橋ヒアルロン酸としては、水素結合型物理架橋ヒアルロン酸又はイオン結合型物理架橋ヒアルロン酸が例示可能である。
上記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物としては、また、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体が挙げられ、なかでも、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、及びヒドロキシ吉草酸からなる群より選ばれる化合物の重合体又は共重合体が好ましい。そして、上記生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物として特に好ましいものは、乳酸・グリコール酸共重合体である。
生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物の少なくとも一部は、不飽和二重結合を有する反応性重合物であってもよく、かかる反応性重合物としては、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体からなる骨格と、該骨格に結合した少なくとも一つの（メタ）アクリロイル基とを有する化合物が挙げられる。
本発明におけるハイドロゲルは、生体内における消失速度が１日〜５週間のハイドロゲルであることが好ましい。また、ハイドロゲルは、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化することが可能なハイドロゲルであることが好ましく、その素材としては、上述の生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物が挙げられる。
本発明は上記に加え、担持物が足場形成材（足場形成材は上記ハイドロゲルが好ましい。）中に分散された軟骨組織形成用製剤を、軟骨欠損部に導入させる軟骨組織の形成方法を提供し、更に、足場形成材（足場形成材は上記ハイドロゲルが好ましい。）が層を形成しており、担持物（前記担持物はフィルム又は不織布の形状を有していることが好ましい。）が該層上に固定されている軟骨組織形成用製剤を、上記層が軟骨欠損部の表面に接触するように、軟骨欠損部に導入させる軟骨組織の形成方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」及び「％」は、特に断らない限り重量基準とする。
本発明の軟骨組織形成用製剤は、上述のように、軟骨形成促進作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルと、を含有するものである。
（軟骨形成促進作用を有する薬物）
本発明における軟骨形成促進作用を有する薬物としては、蛋白製剤、あるいは低分子化合物（ここで、低分子化合物とは、当該分野で低分子とされる化合物一般をいい、例えば、分子量が約１０００以下の有機化合物等が含まれる）のような非蛋白製剤、のいずれもが使用可能である。軟骨形成促進作用は軟骨分化誘導能あるいは軟骨基質産生亢進能等によりもたらされると考えられており、この軟骨形成促進作用は、例えば軟骨細胞や軟骨前駆細胞を処理したときにＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：４０〜４６，１９７７に記載の方法による３５Ｓ硫酸の取り込みを測定する方法、あるいはＣｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．９：２４７〜２４８，１９８２の記載に基づいて硫酸化グリコサミノグリカンの産生量を測定する方法により確認することができる。軟骨形成促進作用を有する薬物としては、上記測定方法により、対照群と比べて２倍程度以上の作用を有しているものを用いることが好ましい。
軟骨形成促進作用を有する薬物としては、例えば、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β）及びそのアイソフォーム（ＴＧＦ−β１等）等の成長因子、ＢＭＰ−２（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７９−Ａ（１０）：１４５２〜１４６３，１９９７）、レクチンの１種であるコンカナバリンＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０１２５〜１０１３１，１９９０）、あるいはオステオゲニン（ＢＭＰ−７）、ビタミンＤ誘導体（１α，２５−Ｄ３）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：５４３５〜５４４２，１９８９）、ビタミンＡ誘導体（レチノイン酸）（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３０：７６７〜７７３，１９８８）、ヴァナデート（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０４：３１１〜３１９，１９８７）、ベンズアミド（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．，８５：１６３〜１７５，１９８５）、ベンジル  β−Ｄ−キシロサイド（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４：９７７〜９８８，１９８４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１１：４６２〜４６８，１９８２）、プロスタグランジン誘導体（ＰＧＥ２，Ｕ４４０６９）（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ，１９：３９１〜４０６，１９８０）、ｄｂｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）、ＴＡＫ−７７８（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２６１：１３１〜１３８，１９９９）、上記一般式（Ｉ）で表される化合物（インドリン−２−オン誘導体、国際公開ＷＯ００／４４７２２号公報）等が挙げられる。
これらのうち、軟骨形成促進作用を有する薬物として好ましいものは、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、国際公開ＷＯ９４／１９３２２号公報（特開平７−４８３４９号公報）、ＷＯ００／４４７２２号公報、ＷＯ０１／６６１４２号公報等に記載された方法に従って得ることができる。
以下、かかる一般式（Ｉ）で表される化合物について説明するが、先ず、本発明において用いられる、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、低級アルコキシ基、アシル基、アリール基、低級アルキレン基、シクロアルキル基、及び複素環基の用語について説明する。
本発明においてハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
本発明において低級アルキル基とは、直鎖又は分岐鎖状の、炭素数１〜６のアルキル基を意味し、たとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等があげられる。
低級アルケニル基とは、直鎖又は分岐鎖状の炭素数２〜６のアルケニル基を意味し、たとえばビニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等があげられる。
低級アルキニル基とは、直鎖又は分岐鎖状の炭素数２〜６のアルキニル基を意味し、たとえばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等があげられる。
低級アルコキシ基とは、直鎖又は分岐鎖状の炭素数１〜６のアルコキシ基を意味し、たとえばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペントキシ基、ヘキソキシ基等があげられる。
アシル基とは、水素原子や置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アミノ基等で置換されたカルボニル基を意味し、たとえばアセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基、シクロヘキサンカルボニル基等のアルキルカルボニル基及びベンゾイル基、ナフトイル基、トルオイル基等のアリールカルボニル基があげられる。
アリール基とは、芳香族炭化水素から水素原子１個を除いた１価の基を意味し、たとえばフェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基等があげられる。
低級アルキレン基とは直鎖又は分岐鎖状の、炭素数１〜６のアルキレン基を意味し、たとえばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基等があげられる。
シクロアルキル基とは、炭素数３〜８の環状飽和炭化水素基を意味し、たとえばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等があげられ、置換基を有するシクロアルキル基としてはメンチル基、アダマンチル基等があげられる。
複素環基とは、１個以上のヘテロ原子を有する芳香族複素環基を意味し、たとえばピリジル基、フリル基、チエニル基、イミダゾリル基、ピラジニル基、ピリミジル基等があげられる。
上記した低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、低級アルコキシ基、アシル基、アリール基、シクロアルキル基、複素環基は、必要に応じて、１以上の種々の置換基により置換されていてもよい。このような置換基の例としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、水酸基、低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、ハロゲン原子で置換されていてもよい）、アリールオキシ基、低級アルキルチオ基、複素環基、ホルミル基（このホルミル基はアセタールとして保護されていてもよい）、低級アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、アミノ基（このアミノ基は、低級アルキル基等を有していてもよい）、イミノ基、チオアセタール基、ニトロ基、ニトリル基、トリフルオロメチル基等があげられる。
次に、上記一般式（Ｉ）で表される化合物（インドリン−２−オン誘導体）について詳説する。
一般式（１）におけるＲ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、なかでもＲ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、又はニトロ基であることが好ましい。
ｎは０〜４の整数を示すが、ｎは０又は１であることが好ましく、特に０であることが好ましい。
Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は置換基を有していてもよい複素環基を示す。
Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であることが好ましく、軟骨細胞増殖作用の観点からは、更には置換基（この置換基は、ハロゲン原子で置換されていてもよい）を有していてもよい低級アルキル基であることが好ましい。
なかでも、Ｒ２は２つの低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい）又は−Ｏ−Ｚ−Ｏ−基（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）が同一炭素上に置換されている低級アルキル基であることが好ましく、更には一般式（ＩＩ）
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（式中、Ｒ１０，Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、それぞれ１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示し、少なくとも一方は１〜５個のハロゲン原子を有する低級アルキル基であることが好ましい）、
又は一般式（ＩＩＩ）
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（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）で表される基であることが好ましい。
このようなＲ２としては、より具体的には、２，２−ジエトキシエチル基、２，２−ジメトキシエチル基、２，２−ジイソプロポキシエチル基、２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基、又は２，２−ビス（２−クロロエトキシ）エチル基が好ましく、なかでも、２，２−ジエトキシエチル基、又は２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基がより好ましく、２，２−ジエトキシエチル基が特に好ましい。
Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は置換基を有していてもよい複素環基を示す。Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であることが好ましく、なかでも置換基を有していてもよいアリール基がより好ましい。このような置換基としては、低級アルキル基（好ましくは、メチル基、エチル基；より好ましくはメチル基）又は低級アルキル基を有していてもよいアミノ基が好ましく、前記Ｒ３としては、４−メチルフェニル基が好ましい。
Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、又は−ＮＲ６Ｒ７を示す。ここに、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｌＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子又は低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい。
Ｒ４は、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、又は−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は前記と同義）で表される基であることが好ましく、更には−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子又は置換基を有していてもよいアリール基を示す）で表される基であることがより好ましい。
なかでも、Ｒ４が−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、あるいはアリール基（このアリール基は、低級アルキル基又はアミノ基（このアミノ基は、さらに低級アルキル基を有していてもよい）を有している））で表される基であることが好ましく、更には−ＮＨＲ７（式中、Ｒ７は４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、又は４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル基）で表される基であることが特に好ましい。
Ｘ、Ｙは同一でも異なっていてもよく、それぞれ−ＣＨ２−、−ＮＨ−又は−Ｏ−を示し、Ｘが−ＣＨ２−、−ＮＨ−又は−Ｏ−、Ｙが−ＣＨ２−又は−ＮＨ−をそれぞれ示すことが好ましい。なかでも、軟骨細胞増殖作用の観点からは、Ｘ及びＹは同一又は異なり、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であることがより好ましく、Ｘは−ＮＨ−、Ｙが−ＣＨ２−であることが特に好ましい。
また、本発明において用いられるインドリン−２−オン誘導体は、製薬学的に許容される塩の形態として使用してもよい。このような塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、りん酸塩等の無機塩類、コハク酸塩、マロン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、安息香塩、サリチル酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の金属塩が挙げられる。
更に、本発明において用いられるインドリン−２−オン誘導体は、その光学活性体であってもよい。光学活性体である場合には、その３位の絶対配置がＲ配置であるものが好ましい。
本発明において用いられるインドリン−２−オン誘導体の具体的な化合物の例としては、たとえば国際公開９４／１９３２２号公報の実施例に記載されている化合物、ないしは特開平７−４８３４９号公報の実施例に記載されている化合物、すなわち下記表１〜表９に示す化合物番号１〜２０１の化合物があげられる。なお、下記の表１〜表９中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ、Ｙ及びｎは、前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。
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また、本発明において用いられるインドリン−２−オン誘導体のより好適な具体的化合物の例として、下記式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）で表される化合物を挙げることができる。なお、下記式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）で表される化合物を、以下それぞれ化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧと呼ぶ。
（化合物Ａ）
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（化合物Ｂ）
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（化合物Ｃ）
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（化合物Ｄ）
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（化合物Ｅ）
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（化合物Ｆ）
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（化合物Ｇ）
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また、化合物Ａの生体内代謝物の例として、下記式（Ｈ）及び（Ｉ）で表される化合物を挙げることができる。なお、下記式（Ｈ）及び（Ｉ）で表される化合物を、以下それぞれ化合物Ｈ及びＩと呼ぶ。
（化合物Ｈ）
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（化合物Ｉ）
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表１〜９に記載の化合物は、特開平７−４８３４９号公報記載の方法により合成することができる。また、上記した化合物Ａ〜Ｇのうち、化合物Ａ〜Ｄは、特開平７−４８３４９号公報記載の方法に従い合成することができる。
また、上記化合物Ｅ、化合物Ｆ、及び化合物Ｇは、特開平７−４８３４９号公報に記載された方法に従い合成した、本願合成例記載のアルデヒド中間体を原料として、例えば、下記の反応経路（特開平７−４８３４９号公報の「反応経路６」に相当する）に従い合成することができる。
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上記化合物Ｈは特開平７−４８３４９号公報に記載されている「反応経路７」に従い合成することができる。また、上記化合物Ｉはラセミ体もしくは光学活性体として次のような方法により得ることができる。
すなわち、化合物Ｉのラセミ体は、ヒドロキシ基を適当な保護基（例えば、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基等の置換シリル基）で保護したイソシアナートを用い、例えば、下記の反応経路（特開平７−４８３４９号公報の「反応経路５」に相当する）に従い合成できる。
また、化合物Ｉの光学活性体はヒドロキシ基を適当な保護基（例えば、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基等の置換シリル基）で保護したイソシアナートを用い、例えば、下記の反応経路（特開平７−４８３４９号公報の「反応経路７」に相当する）に従い合成するか、化合物Ｉの立体異性体混合物を当業者に周知の方法（例えば、光学活性カラムを用いる方法）により光学分割して得ることができる。
得られた化合物の同定及び構造決定、純度は、通常の方法（ＮＭＲ，ＩＲ等の分光学的方法、及び高速液体クロマトグラフィー等）により行うことができる。
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（生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体）
次に、本発明において用いられる生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体に関して説明する。
本発明において用いられる重合体は、生物分解性及び／又は生物侵食性を有するものであるが、本発明において、生物分解性とは、生物由来の酵素（例えば、プロテアーゼやエステラーゼ等）や水により分子内及び／又は分子間の結合が分解される性質をいい、生物侵食性とは、生体内における化学的反応（酵素や水による化学的反応）や物理的作用（食細胞による取り込み等）により不溶性の物質が侵食される性質をいう。
生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体は、軟骨形成促進作用を有する薬物を包含することの可能な重合体であって、該薬物を担持して担持物を形成する重合体が好ましい。かかる重合体は、その生物分解性及び／又は生物侵食性により、生体内で徐々に分解（低分子化）及び／又は侵食されるため、これにともなって薬物を生体内に徐々に放出させることができる。したがって、本発明の軟骨組織形成用製剤は薬物の徐放性を有するものとすることができる。
上記担持物の形態は任意であるが、薬物担持量や放出期間を制御するため、マイクロスフィア状や、フィルム状、不織布状にすることが好ましい。マイクロスフィア状とする成形方法としては、例えば、Ｏ／Ｗエマルジョンの液中乾燥法が挙げられる。また、フィルム状に成形する方法としては、例えばキャスト法が挙げられ、不織布状に成形する方法としては、例えば、凍結乾燥でスポンジ状に成形した後、プレスで圧縮し、フェルト状にする方法が挙げられる。担持物中に担持（包含）される軟骨形成促進作用を有する薬物の量は、薬物の必要放出量、放出期間によって決定され、好ましくは、１〜６０％ｗｔ／ｗｔ、特に好ましくは、５〜４０％ｗｔ／ｗｔである。なお、薬物の放出期間と放出パターンは、重合体の生物分解性及び／又は生物侵食性を変化させることにより制御することができる。具体的には、成形した重合体の大きさ（マイクロスフィアの場合は粒子径）、共重合体の重合比、重合体の多孔化度等を変化させることにより制御可能である。
薬物の徐放性は、用いる重合体の種類や分子量を変化させることによっても制御することが可能である。すなわち、重合体の生物分解性及び／又は生物侵食性が高いほど薬物の放出速度が速くなり、重合体の分子量が大きくなるほど、疎水性が高くなることによる水の浸透性の低下や生物分解性及び／又は生物侵食性の低下のために薬物の放出速度が遅くなる。
薬物の放出期間及び放出パターン、並びに重合体の生物分解性及び／又は生物侵食性を考慮すれば、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体は、５００以上の重量平均分子量を有するものであることが好ましく、５００〜２００，０００の重量平均分子量を有することがより好ましい。特に好ましくは、重合体の平均分子量は１，０００〜１００，０００である。
生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体としては、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、又は、これらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体が挙げられる。これらの重合体は単独で、もしくは２種以上を組み合わせて使用することができる。
ポリヒドロキシアルカン酸としては、グリコール酸の重合体（ポリグリコール酸）、乳酸の重合体（ポリ乳酸）、ヒドロキシ酪酸の重合体（ポリヒドロキシ酪酸）、ヒドロキシ吉草酸の重合体（ポリヒドロキシ吉草酸）等のヒドロキシアルカン酸の重合体が挙げられる。また、ヒドロキシアルカン酸の共重合体として、乳酸・グリコール酸共重合体、ヒドロキシ酪酸・ヒドロキシ吉草酸共重合体等が挙げられる。なお、ポリヒドロキシアルカン酸及びヒドロキシアルカン酸の共重合体は、置換基を有していてもよく、炭素数は１２以下であることが好ましい。本発明においてはこれら重合体のうち、乳酸・グリコール酸共重合体が特に好ましい。
ラクトン開環重合体としては、ブチロラクトン開環重合体（ポリブチロラクトン）、バレロラクトン開環重合体（ポリバレロラクトン）、カプロラクトン開環重合体（ポリカプロラクトン）、ジオキサノン開環重合体（ポリジオキサノン）等が挙げられ、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体としては、グリコール酸・ラクトン共重合体、乳酸・バレロラクトン共重合体等のような、上記のヒドロキシアルカン酸と上記のラクトンとの共重合体が挙げられる。
ポリアミドとしては、ポリアミンとポリカルボン酸の反応生成物であって生物分解性及び／又は生物侵食性を有するものが用いられ、好適なものとしては、炭素数１２以下の脂肪族ポリアミンと炭素数１２以下の脂肪族ポリカルボン酸の反応生成物が挙げられる。なお、ポリアミノ酸とは、アミノカルボン酸（アミノ酸）の重合体を意味し、オリゴペプチド及びポリペプチド（タンパク質）を含む。
ポリウレタンは、ポリオールとポリイソシアネートの反応生成物であって生物分解性及び／又は生物侵食性を有するものであればよく特に制限されないが、炭素数１２以下の脂肪族ポリオールと炭素数１２以下の脂肪族イソシアネートの反応生成物が好ましい。
ポリエステルアミドとしては、分子中にエステル結合とアミド結合の両方を有するものであって生物分解性及び／又は生物侵食性を有するものが用いられ、好適なものとしては、炭素数１２以下の脂肪族ポリオールと炭素数１２以下の脂肪族ポリカルボン酸からなるポリエステル骨格と、炭素数１２以下の脂肪族ポリアミンと炭素数１２以下の脂肪族ポリカルボン酸からなるポリアミド骨格と、を有するものが挙げられる。
ポリカルボン酸としては、ポリマレイン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸等のカルボキシル基を２以上含む化合物の重合体が挙げられ、ポリ無水物としては、ポリセバシン酸無水物、ポリマレイン酸無水物等の無水カルボン酸構造を有する重合体が挙げられる。また、ポリアルキレンとしては、ポリアルキレンシュウ酸エステル、ポリアルキレンコハク酸エステル等のアルキレン基とエステル基を有する重合体が挙げられる。
ポリリン酸としては、オルトリン酸の脱水縮合によって生じる直鎖状高分子が例示でき、ポリオルトエステルとしては、３，９−ビス（エチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン系ポリマー（３，９−ｂｉｓ（ｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ−２，４，８，１０−ｔｅｔｒａｏｘａｓｐｉｒｏ［５．５］ｕｎｄｅｃａｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）が挙げられる。
本発明においては、重合体の少なくとも一部に、不飽和二重結合を有する反応性重合物を用いることも可能である。不飽和二重結合を有する反応性重合物は、重合触媒との混合、熱もしくは光エネルギーの付与等により重合反応を生じる。そして、不飽和二重結合が２以上ある反応性重合物を用いる場合においては、重合反応により三次元架橋が形成される。
反応性重合物としては、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体からなる群より選ばれる少なくとも一つの重合体からなる骨格と、該骨格に結合した少なくとも一つの（メタ）アクリロイル基とを有する化合物を用いることが好ましい。ここで、（メタ）アクリロイル基とは、アクリロイル基又はメタアクリロイル基（メタクリロイル基）を意味する。
反応性重合物の骨格である、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、及びポリオルトエステルとしては、上記と同様のものを用いることができる。
（メタ）アクリロイル基が上記骨格に結合する部位及び数は特に制限されないが、（メタ）アクリロイル基は上記骨格の末端の少なくとも一つに結合することが好ましい。
（メタ）アクリロイル基が、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体等のポリエステルの末端に結合した場合は、（メタ）アクリロイルオキシ結合（（メタ）アクリル酸エステル結合）が形成される。
軟骨組織形成用製剤に用いられる重合体が上記の反応性重合物を含む場合は、使用に先立って軟骨組織形成用製剤に反応性重合物の重合開始剤を添加することが好ましい。この場合においては、軟骨組織形成用製剤の経時安定性の観点から、重合開始剤は使用直前に添加することが好ましい。用いる重合開始剤は特に制限されないが、例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等の二元系レドックス開始剤、α，α−ジメトキシ−α−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）等の光開始剤等が挙げられる。
本発明の軟骨組織形成用製剤は生体に用いることから、重合開始剤は、体温付近もしくは体温以下の温度において触媒活性を有するものであることが好ましい。
（実質的に軟骨修復を阻害しない、多孔性マトリックス及びハイドロゲル）
次に、実質的に軟骨修復を阻害しない、多孔性マトリックス及びハイドロゲルについて説明する。
本発明の軟骨組織形成用製剤は、上述した薬物及び重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルとを含むものであり、多孔性マトリックス及びハイドロゲルは、生体内で軟骨組織形成の足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）として機能する足場形成材である。しかし、足場が長期間生体内（関節内等）に留まると、逆に軟骨組織の修復を妨げることが考えられるため、多孔性マトリックスやハイドロゲルは、実質的に軟骨組織修復を阻害しない必要がある。
本発明の軟骨組織形成用製剤においては、含有する上記薬物及び重合体の種類や組み合わせ等を変化させることにより生体内での薬物放出性を制御することができ、これとは独立に、含有する多孔性マトリックス及び／又はハイドロゲルの組成等を変化させることにより軟骨組織修復の足場形成性能を変化させることができる。したがって、薬物放出性及び軟骨組織修復の足場形成性を、それぞれ独立に制御することができるために、薬物と重合体を含むが多孔性マトリックスやハイドロゲルを含まない組成に比べて、軟骨組織の修復をより効率的に且つ安定に行うことが可能になる。
軟骨組織修復の足場として多孔性マトリックスを用いる場合においては、多孔性マトリックスは、軟骨細胞が侵入可能な大きさの孔径（直径）を有していることが好ましく、そのサイズは平均孔径として１０〜５００μｍが好ましい。
また、多孔性マトリックスは、上述のように生体内（関節内）で長期間留まるとかえって軟骨組織の修復を妨げることがあるために、生体内において適度に分解及び／又は侵食され、比較的短期間に消失するものであることが好ましい。すなわち、多孔性マトリックスは、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物からなるものであることが好ましい。そして、生体内における消失速度が、１日〜５週間であるもの、好ましくは、１週間〜４週間であるものが好適である。また、毒性、抗原性等の問題の発生する可能性の低い化合物からなることが好ましく、重量平均分子量が５００以上のものが好ましい。
多孔性マトリックスとして用いられる、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物としては、多孔性マトリックス以外の構成成分として上述した生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と同種の重合体を用いることができる。すなわち、ポリヒドロキシアルカン酸、ラクトン開環重合体、ヒドロキシアルカン酸・ラクトン共重合体、ポリアセタール、ポリケタール、ポリメチルビニルエーテル、キチン、キトサン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリカルボン酸、ポリ無水物、ポリアルキレン、ポリリン酸、ポリオルトエステル、及びこれらの少なくとも一つを分子中に含む共重合体を用いることができ、なかでも、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、及びヒドロキシ吉草酸からなる群より選ばれる化合物の重合体又は共重合体が好ましく、乳酸・グリコール酸共重合体が特に好ましい。
そして、多孔性マトリックスとして用いられる生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体の少なくとも一部としては、不飽和二重結合を有する反応性重合物を用いることができる。その具体例等は、多孔性マトリックス以外の構成成分として上述した生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体におけるのと同様である。
実質的に軟骨修復を阻害しない多孔性マトリックスとしては、ヒアルロン酸誘導体又はコラーゲン等からなるものも好適に用いることができる。ヒアルロン酸誘導体としては、物理架橋ヒアルロン酸、低架橋密度の化学架橋ヒアルロン酸（例えば、１０％以下の架橋密度）等が挙げられ、これらのうち、水素結合型物理架橋ヒアルロン酸、イオン結合型物理架橋ヒアルロン酸が好ましい。また、コラーゲンとしては、コラーゲンＩ、ＩＩ等を好適例として例示することができる。
多孔性マトリックスとして用いられる生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物として特に好ましいものは、乳酸・グリコール酸共重合体、水素結合型物理架橋ヒアルロン酸、イオン結合型物理架橋ヒアルロン酸及びコラーゲンである。
多孔性マトリックスを作製する方法は特に限定されないが、例えば、希薄溶液や、ゲルを凍結乾燥する方法や、フィラーを共存させた状態で成形し、フィラーを溶解抽出する方法等が挙げられる。
本発明においては、上述した多孔性マトリックスに代えて、又は上述した多孔性マトリックスと共に、実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルを用いることができる。かかるハイドロゲルは、水や体液により膨潤してゲル化する材料であり、上述した多孔性マトリックスと同様に、軟骨組織修復の足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）として機能する。
ハイドロゲルはｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化させることができ、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化させる方法としては、例えば、ゲル化していない状態（又は、流動性を有する程度のゲル化しか生じていない状態）のハイドロゲルを含んだ軟骨組織形成用製剤をシリンジ等で軟骨欠損部に注入する方法が挙げられる。この場合において、注入部分ではハイドロゲルのゲル化が生じるために、軟骨組織修復の足場が形成される。すなわち、軟骨組織修復の足場として、ハイドロゲルを用いることにより、注入及び足場形成を容易化できるため、軟骨組織形成用製剤の適用が容易となる。
ハイドロゲルは、生体内（関節内）で長期間留まると逆に軟骨組織の修復を妨げることが考えられるため、多孔性マトリックスと同様に、生体内において適度に分解及び／又は侵食され、比較的短期間に消失するものからなることが好ましい。すなわち、ハイドロゲルは、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物からなるものであることが好ましい。この場合において、生体内における消失速度が、１日〜５週間であるもの、好ましくは、１週間〜４週間であるものが好適である。また、毒性、抗原性等の問題の発生する可能性の低い化合物からなることが好ましく、重量平均分子量が５００以上のものが好ましい。
ハイドロゲルとして用いられる生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物としては、上記多孔性マトリックスで例示した、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物と同様の化合物が適用可能である。また、ｉｎ  ｓｉｔｕでのゲル化を効率化させるために、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する化合物にビニル基等の重合性官能基を導入し、光や熱でラジカルを発生する重合開始剤とともに、軟骨欠損部に注入後、光、又は熱で架橋固化させる方法を採用することもできる（Ｊ．Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２  ６１９（２００１）、Ｊ．Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．，１１，４３９（２０００）等）。更に、シナメイト基等の光で架橋できる光応答性官能基を導入したハイドロゲル素材を欠損部に注入後、光照射で架橋固化（ゲル化）させる方法（特開平６−７３１０２号公報、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．３０，２４５１（１９９２）等）、注入後体温による温度上昇によって物理的に架橋固化（ゲル化）させる方法（ＢＳＴ−Ｇｅｌ（商品名）（Ｂｉｏｓｙｎｔｅｃｈ社）、ＲｅＧｅｌ（商品名）（Ｍａｃｒｏｍｅｄ社）等）も適用可能である。この場合において、ハイドロゲルの生体内における消失速度を１日〜５週間（好ましくは１週間〜４週間）とするために、ハイドロゲルの架橋性官能基の導入率を低くして、ハイドロゲルの架橋密度を低架橋密度（例えば１０％以下）にすることが好ましい。
（軟骨組織形成用製剤）
次に、本発明の軟骨組織形成用製剤について説明する。本発明の軟骨組織形成用製剤は、軟骨形成促進作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルと、を含有するものであればよい。この場合において、薬物と重合体とは、薬物が重合体に担持された担持物を形成しており、多孔性マトリックス及び／又はハイドロゲルは、該担持物と接触して存在していることが好ましい。
かかる軟骨組織形成用製剤の製造方法については特に制限はなく、軟骨組織形成を促進する薬物と、生分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルとを、適宜混合等すればよい。
軟骨組織修復の足場として、実質的に軟骨修復を阻害しない多孔性マトリックスを用いる場合は、以下に例示する方法によって軟骨組織形成用製剤を作製することができる。例えば、薬物と重合体とが担持物を形成している場合において、担持物がマイクロスフィアの形状を有しているときは、マイクロスフィアをマトリックス素材（多孔性マトリックスとなるべき素材）と共に溶媒中に分散させ、凍結乾燥や、フィラー抽出等の方法でマトリックスの多孔化を行うことにより軟骨組織形成用製剤を製造することができる。また、担持物がフィルムや不織布の形状を有しているときは、マイクロスフィアの場合と同様の方法を採用することも可能であるが、これ以外にも、凍結乾燥やフィラー抽出等の方法でマトリックスを多孔化させた後に、これにフィルム状又は不織布状の担持物を固定化する方法も採用可能である。担持物がフィルムや不織布の形状を有しているときの多孔性マトリックスとの固定化は、軟骨組織形成用製剤を軟骨欠損部に埋め込んで適用する場合においては、埋め込み前に行ってもよく、あるいは、多孔性マトリックスを欠損部に埋め込んだ後に担持物を固定化するようにしてもよい。後者の場合においては、生分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体が軟骨組織再生を阻害しないように、軟骨再生の開始部位から離れた位置に担持物を固定することが好ましい。
また、軟骨組織修復の足場として、実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルを用いる場合は、以下に例示する方法によって軟骨組織形成用製剤を作製することができる。すなわち、薬物と重合体とが担持物を形成している場合において、担持物がマイクロスフィアの形状を有しているときは、あらかじめマイクロスフィアをゲル化前のハイドロゲルに分散させればよい。かかる製造法による製剤は、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）に注入等することによりハイドロゲルのゲル化が生じる。なお、ハイドロゲルの流動性を確保できる場合は、生体内に注入する前にゲル化を行ってもよい。また、担持物がフィルムや不織布の形状を有しているときは、マイクロスフィアの場合と同様の方法を採用することも可能であるが、これ以外にも、ハイドロゲルをゲル化した後に、これにフィルム状又は不織布状の担持物を固定化する方法も採用可能である。担持物がフィルムや不織布の形状を有しているときのハイドロゲルとの固定化は、軟骨組織形成用製剤を軟骨欠損部に埋め込んで適用する場合においては、埋め込み前に行ってもよく、あるいは、ゲル化したハイドロゲルを欠損部に埋め込んだ（又は欠損部でハイドロゲルをゲル化した）後に担持物を固定化するようにしてもよい。後者の場合においては、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体が軟骨組織再生を阻害しないように、軟骨再生の開始部位から離れた位置に担持物を固定することが好ましい。
本発明において、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルの合計１００重量部に対する、軟骨組織形成促進作用を有する薬物と生分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体との合計重量は、０．１〜５０重量部であることが好ましく、０．１〜３０重量部であることが特に好ましい。
本発明の軟骨組織形成用製剤は、欠損軟骨に直接埋め込む埋め込み用製剤として、又は、欠損軟骨に直接塗布する塗布用製剤として使用することが可能である。さらには、注射により生体内に投与する注射用製剤、又は内視鏡により生体内に投与する内視鏡用製剤として使用することができる。このようにして使用することにより、先天性及び外傷性の軟骨欠損患者の欠損した軟骨を生体内で修復、再生する治療薬となる。さらに、固化した製剤中に軟骨細胞を入れて培養することにより生体外で軟骨を形成させることができ、自家軟骨細胞から必要な形状の軟骨を形成させてそれを生体内に移植するという治療への応用も可能である。このように、本発明の軟骨組織形成用製剤は、現在盛んに研究されている再生医工学（組織工学）の分野で、生体内外における軟骨の修復、再生、形成に応用可能な製剤として利用することが可能である。
（実施例）
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕軟骨形成促進作用を有する薬物の合成
前述の化合物Ａを、特開平７−４８３４９号公報の「実施例１７４（２）」に記載されている方法により合成した。
〔実施例２〕実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス又はハイドロゲルの調製
（実施例２−１）物理架橋ヒアルロン酸によるハイドロゲルの調製
重量平均分子量１．８×１０６のヒアルロン酸（スベニール（商品名）中外製薬株式会社製）を蒸留水に溶解し、２％溶液とした。これに１Ｎ塩酸を加え、ｐＨ１．０に調整した後、直径１ｍＬのシリンジに吸い取り、−２０℃で１２０時間凍結させた。室温に戻した後、リン酸緩衝生理食塩液（以下、ＰＢＳと略す）で洗浄し、２４時間ＰＢＳ中で放置して、難水溶性のハイドロゲル（物理架橋ＨＡハイドロゲル）を得た。なお、ＨＡはヒアルロン酸を意味する（以下同様）。
（実施例２−２）乳酸・グリコール酸共重合体による多孔性マトリックスの調製
乳酸・グリコール酸共重合体（以下、ＰＬＧＡと略す）（重量平均分子量：９５０００、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ（商品名）Ａｌｋｅｒｍｅｓ社製）を１，４−ジオキサン（純正化学工業社製）に溶かし（１．０ｗ／ｖ％）、１ｍＬシリンジに吸い取り、−８０℃で凍結後、真空乾燥し多孔性マトリックス（ＰＬＧＡスポンジ）を得た。
（実施例２−３）コラーゲンＩによる多孔性マトリックスの調製
コラーゲンＩ（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｉ（商品名）新田ゼラチン社製）の０．３ｗ／ｖ％ＨＣｌ溶液（ｐＨ３．０）を１ｍＬシリンジに吸い取り、−８０℃で凍結後、真空乾燥しスポンジ状とし、ＵＶ照射（ＵＶ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｒ  ＣＬ−１０００（フナコシ社製））により架橋して、多孔性マトリックス（コラーゲンＩスポンジ）を得た。
（実施例２−４）コラーゲンＩＩによる多孔性マトリックスの調製
コラーゲンＩＩ（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＩＩ（商品名）新田ゼラチン社製）の０．３ｗ／ｖ％ＨＣｌ溶液（ｐＨ３．０）を１ｍＬシリンジに吸い取り、−８０℃で凍結後、真空乾燥しスポンジ状とし、ＵＶ照射（ＵＶ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｒ  ＣＬ−１０００（フナコシ社製））により架橋して、多孔性マトリックス（コラーゲンＩＩスポンジ）を得た。
（比較例２−１）化学架橋ヒアルロン酸によるハイドロゲルの調製
ＨＡの０．２Ｎ  ＮａＯＨ溶液（２ｗ／ｖ％）にジビニルスルホン（以下、ＤＶＳと略す）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え（ＨＡモノマー／ＤＶＳ＝０．５ｗｔ／ｗｔ）、１ｍＬシリンジに吸い取り、１時間後に取り出し、水洗した後ＰＢＳに浸漬してハイドロゲル（化学架橋ＨＡハイドロゲル）を得た。
（比較例２−２）化学架橋ヒアルロン酸による多孔性マトリックスの調製
ＨＡの０．２Ｎ  ＮａＯＨ溶液（２ｗ／ｖ％）にＤＶＳ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加え（ＨＡモノマー／ＤＶＳ＝０．５ｗｔ／ｗｔ）、１ｍＬシリンジに吸い取り、１時間後ゲルを取り出し水洗した。これを凍結乾燥し、多孔性マトリックス（化学架橋ＨＡスポンジ）を得た。
（試験例２−１）走査型電子顕微鏡による多孔性マトリックスの微細構造の確認  実施例２−２〜２−４、比較例２−２の多孔性マトリックスの微細構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ−４２００（日立製））で観察した。得られた電子顕微鏡写真を図１〜図４に示す。これにより、ＰＬＧＡスポンジは１０〜１００μｍ程度の孔径を持つ多孔質構造であることが確認された。一方、コラーゲンＩスポンジ及びコラーゲンＩＩスポンジは、面により仕切られた１００〜６００μｍ程度の孔径を持つ多孔質構造であり、化学架橋ＨＡスポンジは、面により仕切られた１００〜３００μｍ程度の孔径を持つ多孔質構造であった。
（試験例２−２）多孔性マトリックス又はハイドロゲル基材上でのウサギ骨髄由来間葉系幹細胞の増殖
３週令の雄性日本白色種ウサギ（北山ラベス社製）１羽を安楽死させた後、大腿骨、脛骨を摘出した。それぞれ膝関節面に穴を開け、反対側の骨端部は切断した。膝関節側から１８Ｇ注射針を挿入し、洗浄培地（６，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬヘパリン（ＳＩＧＭＡ社製）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン・５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）含有ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（日研生物医学研究所社製））で骨髄内を洗浄した。骨髄細胞を含む洗浄培地を１，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、細胞を沈殿させた。得られた骨髄細胞は培養用１０ｃｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播き、１０％ウシ胎児血清（ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製）、抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（日研生物医学研究所社製）中で培養した。３日目、培地を交換し、非接着細胞を除去した。５日目より培地に１ｎｇ／ｍＬの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した。以後２〜３日毎に培地交換を行った。１４日目、コロニー状に増殖した間葉系幹細胞をＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ社製）で回収し、５，０００個／ｃｍ２の密度で、細胞を播きなおした。細胞がほぼ集密的になった時点で、再び細胞をＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ社製）で回収し、Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋｅｒ（ダイアヤトロン社製）を用いて凍結保存し、以下の実験に供した。
上記、ウサギ骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ社製）で回収して１０７個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液１０μＬ（１０５個）を予め直径５ｍｍ、長さ７ｍｍのシリンダー状に成型した多孔性マトリックス又はハイドロゲル基材（実施例２−２〜２−４、比較例２−１〜２−２）に接種し、３７℃、２時間３０分放置して細胞を吸着させた。細胞吸着後、１ｎｇ／ｍＬの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１０％ウシ胎児血清（ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製）、抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（日研生物医学研究所社製）を加え、各多孔性マトリックス又はハイドロゲル基材上での培養を開始した。培地交換は２〜３日毎に行った。培養開始後、７日目、１４日目、２１日目に多孔性マトリックス又はハイドロゲル（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を回収し、蒸留水中で超音波処理することにより培養された細胞を破砕した。１０，０００ｒｐｍで５分間遠心して、多孔性マトリックス片又はハイドロゲル片等の不溶物を除き、上清中に含まれるＤＮＡ含量をＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて測定した。
各多孔性マトリックス又はハイドロゲルあたりのＤＮＡ含量を図５に示した。いずれの多孔性マトリックス及びハイドロゲル基材においてもウサギ骨髄由来間葉系幹細胞の増殖が認められた。
（試験例２−３）ウサギの関節軟骨欠損モデルにおける軟骨組織への多孔性マトリックス又はハイドロゲルの適合性実験
実施例２−１〜実施例２−４、比較例２−１〜比較例２−２の多孔性マトリックス又はハイドロゲルを長さ４ｍｍの円柱状に切り、ウサギの関節軟骨欠損モデルで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨組織への多孔性マトリックス又はハイドロゲルの適合性実験を行った。ウサギは、１２週齢のＫｂｌ：ＪＷ系雄性のものを使用し、ペントバルビタール（ダイナボット社製）麻酔下（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で右側関節包を切開して大腿骨膝蓋面を露出し、ハンドドリル及び直径５ｍｍの金属用ドリル刃（ＫＯＢＥＬＣＯ社製）を用いて深さ４ｍｍの骨髄に達する欠損部を作製した。そこに、上記の長さ４ｍｍの多孔性マトリックス又はハイドロゲルを１ヶ埋め込み、関節包及び皮膚を縫合した。対照として、欠損を作製しただけの個体も設定した。欠損作製及び多孔性マトリックス又はハイドロゲル埋め込み後４週間にウサギをペントバルビタール麻酔下に全身放血して安楽死させ、欠損部を含む右大腿骨を採取し、２０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬社製）に１週間浸漬して固定した。欠損部の中心部をバンドソー（ＥＸＡＫＴ社製）にて横断し、５％蟻酸（和光純薬社製）中で１週間脱灰した。その後、２０％酢酸ナトリウム溶液で一晩中和し、常法に従いパラフィン切片を作製した。その切片をサフラニンＯ−ファストグリーン染色して、光学顕微鏡（ニコン社製）で観察し、欠損部の軟骨下骨修復を組織学的に評価した。
組織標本の結果を図６〜図１１に示す。なお、図６は関節軟骨欠損がない正常組織を示し、図７は欠損を作製しただけの個体の組織を示す。図８、図９、図１０及び図１１は、それぞれ実施例２−１、実施例２−２、比較例２−１及び比較例２−２の多孔性マトリックス又はハイドロゲルを埋め込んだ場合の結果を示す。また、図中、矢印で挟まれた部位が欠損部（矢印の部分が欠損部と正常部の境界）を示す。
図６〜図１１より明らかなように、実施例２−１のハイドロゲルを用いた場合（図８）、実施例２−２の多孔性マトリックスを用いた場合（図９）では欠損部から多孔性マトリックスが消失し、欠損部の軟骨下骨の自然修復は欠損のみの群（図７）と同様であり、組織修復を阻害していなかった。一方、比較例２−１のハイドロゲルを用いた場合（図１０）、比較例２−２の多孔性マトリックスを用いた場合（図１１）では、多孔性マトリックスが欠損部内に残存し、明らかに軟骨下骨の修復を阻害していた。なお、実施例２−３及び２−４の多孔性マトリックスを用いた場合も、実施例２−２の多孔性マトリックスを用いた場合と同様の結果が得られた。
〔実施例３〕軟骨形成促進作用を有する薬物が、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体に担持された担持物の調製
（実施例３−１）
重量平均分子量１０，０００のＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ７５１０、和光純薬工業社製）と化合物ＡをＰＬＧＡ／化合物Ａが９５／５（ｗｔ／ｗｔ）となるように混ぜ、これを塩化メチレン（純正化学社製）１０ｍＬを加えて溶解させ１０％（ｗ／ｖ）の溶液を調製した。これを１％ポリビニルアルコール（８７〜８９％  ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ、ＭＷ＝１３，０００〜２６，０００）（以下、ＰＶＡと略す）水溶液９０ｍＬに１：９（ｖ／ｖ）となるように混合し、スターラーで約７００ｒｐｍにて撹拌させてＯ／Ｗエマルジョンを得た。このエマルジョンを１％  ＰＶＡ水溶液９００ｍＬ中に入れて約２００ｒｐｍにて一晩撹拌し、溶媒を留去させることでマイクロスフィアの懸濁液を得た。この懸濁液を１，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心させ上澄みを除去し、水にて十分洗浄を行い、凍結乾燥したものをマイクロスフィアとして回収した。化合物ＡとＰＬＧＡ７５１０とからなるマイクロスフィアの走査型電子顕微鏡写真を図１２に示す。
（実施例３−２）
ＰＬＧＡ７５１０／化合物Ａを９０／１０（ｗｔ／ｗｔ）とした他は実施例３−１と同様にして、化合物ＡとＰＬＧＡ７５１０とからなるマイクロスフィアを調製した。
（実施例３−３）
ＰＬＧＡ７５１０／化合物Ａを８０／２０（ｗｔ／ｗｔ）とした他は実施例３−１と同様にして、化合物ＡとＰＬＧＡ７５１０とからなるマイクロスフィアを調製した。
（実施例３−４）
ＰＬＧＡ７５１０／化合物Ａを６０／４０（ｗｔ／ｗｔ）とした他は実施例３−１と同様にして、化合物ＡとＰＬＧＡ７５１０とからなるマイクロスフィアを調製した。
（実施例３−５）化合物Ａを１０％含有したＰＬＧＡフィルムの調製
重量平均分子量９２，０００のＰＬＧＡ（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ７５２５、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社製）と化合物ＡをＰＬＧＡ／化合物が９０／１０（ｗｔ／ｗｔ）となるように混ぜ、これを塩化メチレン（純正化学社製）４ｍＬ加えて溶解させ５０％（ｗ／ｖ）の溶液を調製した。この溶液を５分間超音波照射した後、テフロン製シャーレ（φ５０ｍｍ）に移し、室温にて３日間、その後４０℃にて７日間風乾し、更に室温にて８時間真空乾燥したものをフィルムとして回収した。
（試験例３−１）
実施例３−１〜３−５のマイクロスフィア及びフィルムについて、以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化合物Ａの徐放性能実験を行った。
ａ）試験方法
マイクロスフィアを３８μｍ及び７５μｍの篩により篩い、篩過後の３８〜７５μｍのマイクロスフィアを約１０ｍｇずつ正確に秤量し１５ｍＬのテフロンジャーに入れた。フィルムは、コルクポーラーにて直径５ｍｍにくりぬき、約１０ｍｇずつ正確に秤量し１５ｍＬのテフロンジャーに入れた。これに１０ｍＬの０．０７５％  Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）含有１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて密封したものを、３７℃の恒温槽中で振とうさせた。各マイクロスフィア、フィルムにつきｎ＝３で行った。振とう開始後、マイクロスフィアでは１時間、５時間、１、２、３、７、１０、１５、２０、３０、４５、６０日に、フィルムでは２、７、１４、２１、２８、４３、５５日に、一旦振とうを中断し、試料溶液を遠心分離し、この上澄み液を化合物Ａの定量に用いた。また、遠沈管中の固形分は再びテフロンジャーに戻し、新たに１０ｍＬの０．０７５％  Ｔｗｅｅｎ８０含有１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて振とうを再開した。それぞれの時点で取り分けた上澄み液中の化合物Ａの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣにより定量し、製剤からの化合物Ａの放出プロファイルを求めた。
別に同様のマイクロスフィア、フィルム約１０ｍｇをアセトニトリル１ｍＬに溶解させ、アセトニトリルで５０倍に希釈した。これをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）により定量し、各マイクロスフィア及びフィルム中の化合物Ａの含有率を算出した。
ｂ）ＨＰＬＣ条件
カラム：  ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ａ−３１２  １５０ｘ６．０ｍｍ
カラム温度：  室温
サンプル温度：  ４℃
検出波長：  ２４５ｎｍ
移動相：  ６０％アセトニトリル水溶液
流量：  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：  ２０μＬ
定量は検量線法により行った。
ｃ）結果
マイクロスフィアにおける化合物Ａの放出量の時間推移を図１３に、放出速度を図１４に示す。フィルムにおける化合物Ａの放出量の時間推移を図１５に示す。これらの図より、最大放出量として、化合物Ａを４０％含有するマイクロスフィアでは約４００μｇ／ｍｇが可能であることが分かった。また、放出速度としては、化合物Ａを４０％含有するマイクロスフィアでは、約５μｇ／ｍｇ／日で３週間の放出が可能であることが分かった。また、化合物Ａを１０％含有するフィルムでは２０日を過ぎてから放出が始まることが分かった。さらに、これら化合物Ａの総放出量、放出速度は、マイクロスフィアの粒子径、乳酸／グリコール酸共重合比、ＰＬＧＡ分子量等でコントロールできることも分かった。
したがって、上述した、軟骨形成促進作用を有する薬物と、生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルとを組み合わせることにより（好ましくは、上記薬物が上記重合体に担持された担持物と、上記多孔性マトリックス及び／又はハイドロゲルとを組み合わせることにより）、安定且つ良好な軟骨修復効果を得ることができる軟骨組織形成用製剤を提供することが可能である。
〔実施例４〕ウサギの関節軟骨欠損モデルにおける軟骨再生作用実験用の本発明製剤の調製
（実施例４−１）化合物Ａ含有／非含有ＰＬＧＡフィルムの調製
重量平均分子量９２，０００のＰＬＧＡ（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ７５２５、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社製）と化合物ＡをＰＬＧＡ／化合物Ａが９０／１０，９９／１，１００／０（ｗｔ／ｗｔ）となるように混ぜ、これを塩化メチレン（純正化学社製）４ｍＬ加えて溶解させ５０％（ｗ／ｖ）の溶液を調製した。この溶液を５分間超音波照射した後、テフロン製シャーレ（φ５０ｍｍ）に移し、室温にて３日間、その後４０℃にて４日間風乾し、更に室温にて８時間真空乾燥した。これをコルクポーラーにて直径５ｍｍ／個にくり抜いたものを、試験に供した。
（実施例４−２）化合物Ａ含有／非含有ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製
重量平均分子量６３，０００のＰＬＧＡ（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ５０５０、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社製）と化合物ＡをＰＬＧＡ／化合物が６０／４０，９６／４，１００／０（ｗｔ／ｗｔ）となるように混ぜ、これを塩化メチレン（純正化学社製）４０ｍＬ加えて溶解させ１０％（ｗ／ｖ）の溶液を調製した。この溶液１０ｍＬを１％ＰＶＡ水溶液９０ｍＬに１：９（ｖ／ｖ）となるように混合し、スターラーで約７００ｒｐｍにて撹拌させてＯ／Ｗエマルジョンを得た。このエマルジョンを１％  ＰＶＡ水溶液９００ｍＬ中に入れて約２００ｒｐｍにて一晩撹拌し、溶媒を留去させることでマイクロスフィアの懸濁液を得た。この懸濁液を１，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心させ上澄みを除去し、水にて十分洗浄を行い、凍結乾燥したものをマイクロスフィアとして回収した。これを７５μｍ及び１５０μｍの篩により篩い、７５〜１５０μｍのマイクロスフィアを得た。
（実施例４−３）物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル（水素結合型）の調製
重量平均分子量１．８×１０６のヒアルロン酸（スベニール（商品名）中外製薬株式会社製を蒸留水に対して透析し凍結乾燥したもの）を蒸留水に溶解し、塩酸を添加して、１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ１．０のヒアルロン酸水溶液を調製した。これを直径約４ｍｍの１ｍＬシリンジに７０μＬ／個ずつ吸い取り、−２０℃で１週間凍結させた。その後、−８０℃にて試験直前まで保存したものを、試験に供した。
（実施例４−４）実施例４−２で調製したマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの調製
実施例４−３において、１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ１．０のヒアルロン酸水溶液７０μＬ／個に、実施例４−２で調製したマイクロスフィア約３ｍｇを混合して、実施例４−３と同様に調製、保存したものを、試験に供した。
（試験例４−１）実施例４−１で調製したフィルム、実施例４−４のマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの、化合物Ａ含有量の評価
ａ）試験方法
実施例４−１で調製したフィルム１個、実施例４−４のマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル１個を、それぞれアセトニトリル２ｍＬに溶解した。これを更にアセトニトリルにて１０倍希釈した溶液をＲＰ−ＨＰＬＣにより定量し、各フィルム、マイクロスフィア中の化合物Ａの含有量を算出した。
ｂ）ＨＰＬＣ条件
試験例３−１と同様に行った。
ｃ）結果
マイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルに含有されていた化合物Ａの量を以下の表１０に、フィルムに含有されていた化合物Ａの量を以下の表１１に示す。
2003043672.tif 000027
2003043672.tif 000028
（試験例４−２）実施例４−１で調製したフィルム、実施例４−４のマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出実験
ａ）試験方法
実施例４−１で調製したフィルム１個、実施例４−４のマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル１個を、それぞれ１５ｍＬテフロンジャーに入れた。これに１０ｍＬの０．０７５％  Ｔｗｅｅｎ８０含有１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に加えて密封したものを、３７℃の恒温槽中で振とうさせた。振とう開始後、１、４、１４、２１、２８、３６、５０日に、一旦振とうを中断し、試料溶液を遠心分離し、この上澄み液を化合物Ａの定量に用いた。また、遠沈管中の固形分は再びテフロンジャーに戻し、新たに１０ｍＬの０．０７５％  Ｔｗｅｅｎ８０含有１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて振とうを再開した。それぞれの時点で取り分けた上澄み液中の化合物Ａの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣにより定量し、製剤からの化合物Ａの放出プロファイルを求めた。
ｂ）ＨＰＬＣ条件
試験例３−１と同様に行った。
ｃ）結果
化合物Ａのマイクロスフィアからの累積放出率の時間推移を図１６に、フィルムからの累積放出率の時間推移を図１７にそれぞれ示す。
〔実施例５〕ウサギの関節軟骨欠損モデルにおける本発明製剤の軟骨再生作用の実験
（試験例５−１）ウサギの関節軟骨欠損モデルにおける本発明製剤の軟骨再生作用の実験
ａ）試験方法
軟骨形成促進物質として化合物Ａ（国際公開ＷＯ００／４４７２２号公報）、Ｓｃａｆｆｏｌｄとして実施例４−３の物理架橋ヒアルロン酸、化合物Ａの放出制御に実施例４−１のＰＬＧＡフィルム又は実施例４−２のマイクロスフィアを用いた製剤（実施例４−４のマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル）の軟骨再生作用を、ウサギ関節欠損モデルを用いて検討した。
ウサギは、１２週齢のＫｂｌ：ＪＷ系雄性のものを使用し、ペントバルビタール（ダイナボット社製）麻酔下（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で右側関節包を切開して大腿骨膝蓋面を露出し、ハンドドリル及び直径５ｍｍの金属用ドリル刃（ＫＯＢＥＬＣＯ社製）を用いて深さ４ｍｍの骨髄に達する欠損部を作製し、そこに本発明の製剤を埋め込み、関節包及び皮膚を縫合した。製剤は、以下の２つのタイプを投与した。
タイプ１：ウサギの関節軟骨欠損部を埋めるように実施例４−３の物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを配置し、その上部に実施例４−１の化合物Ａ  １ｍｇを含有するＰＬＧＡフィルムを配置した製剤。
タイプ２：ウサギの関節軟骨欠損部を、実施例４−４のマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル（実施例４−２で調製した化合物Ａ  １ｍｇを含有するＰＬＧＡマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル）製剤で埋めたもの。
また、病態対照として欠損を作製しただけの個体、溶媒対照として化合物Ａを含有しない（ＰＬＧＡ／化合物が１００／０（ｗｔ／ｗｔ）である）タイプ１製剤及び化合物Ａを含有しない（ＰＬＧＡ／化合物が１００／０（ｗｔ／ｗｔ）である）タイプ２製剤を投与した個体を設けた。製剤を投与した３ヶ月後、欠損部の中心部をバンドソー（ＥＸＡＫＴ社製）にて横断し、５％蟻酸（和光純薬社製）中で１週間脱灰した。その後、２０％酢酸ナトリウム溶液で一晩中和し、常法に従いパラフィン切片を作製した。その切片をサフラニンＯ−ファストグリーン染色して、光学顕微鏡（ニコン社製）で観察し、欠損部の軟骨下骨修復を組織学的に評価した。
ｂ）結果
組織標本の結果を図１８〜図２３に示す。なお、図１８は関節軟骨欠損がない正常組織を示し、図１９は欠損を作製しただけの個体の組織を示す。図２０は化合物Ａを含有しないタイプ１製剤（溶媒対照）、図２１は化合物Ａ  １ｍｇを含有するタイプ１製剤、図２２は化合物Ａを含有しないタイプ２製剤（溶媒対照）、図２３は化合物Ａ  １ｍｇを含有するタイプ２製剤を投与した個体の組織を示す。また、図中、矢印で挟まれた部位が欠損部（矢印の部分が欠損部と正常部の境界）を示す。
図１８より明らかなように、欠損を作製しただけの個体では欠損部の硝子軟骨は全く再生されない。この病態において、化合物Ａを含有しない製剤（溶媒対照）はタイプ１（図２０）、タイプ２（図２２）ともに欠損部の硝子軟骨再生を惹起しない。それに対して、化合物Ａ  １ｍｇを含有する製剤はタイプ１（図２１）、タイプ２（図２３）ともに欠損部の硝子軟骨再生を惹起することが示された。これらの結果から、本発明の製剤は自然修復の起こらない軟骨欠損において、本来の軟骨組織を再生させることが明らかになった。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明の軟骨組織形成用製剤は、軟骨形成促進作用を有する薬物を持続放出する生物分解性及び／又は生物侵食性を有する重合体と、軟骨組織修復の足場となり実質的に軟骨組織修復を阻害しない多孔性マトリックス及び／又は実質的に軟骨修復を阻害しないハイドロゲルと、を併せ持つことから、治療に高度の技術や設備を必要とせず、生体適合性に優れるとともに、従来の製剤では達成できなかった安定且つ良好な軟骨修復効果を得ることが可能な製剤であり、その有用性は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
図１は、乳酸・グリコール酸共重合体スポンジによる多孔性マトリックス（実施例２−２）の走査型電子顕微鏡写真である。
図２は、コラーゲンＩスポンジによる多孔性マトリックス（実施例２−３）の走査型電子顕微鏡写真である。
図３は、コラーゲンＩＩスポンジによる多孔性マトリックス（実施例２−４）の走査型電子顕微鏡写真である。
図４は、化学架橋ＨＡスポンジによる多孔性マトリックス（比較例２−２）の走査型電子顕微鏡写真である。
図５は、実施例及び比較例の多孔性マトリックス又はハイドロゲルを用いて軟骨細胞の増殖実験を行った結果を示す図である。
図６は、多孔性マトリックスの評価に用いたウサギの正常な関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真に対応する図である。
図７は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、多孔性マトリックス及びハイドロゲルのいずれも埋め込まなかった場合の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図８は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、実施例２−１のハイドロゲルを埋め込んで４週間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図９は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、実施例２−２の多孔性マトリックスを埋め込んで４週間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図１０は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、比較例２−１のハイドロゲルを埋め込んで４週間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図１１は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、比較例２−２の多孔性マトリックスを埋め込んで４週間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図１２は、化合物ＡとＰＬＧＡ７５１０とからなるマイクロスフィアの走査型電子顕微鏡写真である。
図１３は、化合物ＡとＰＬＧＡ７５１０とからなるマイクロスフィアの、薬物放出量の時間推移を示す図である。
図１４は、化合物ＡとＰＬＧＡ７５１０とからなるマイクロスフィアの、薬物放出速度を示す図である。
図１５は、化合物ＡとＭｅｄｉｓｏｒｂ７５２５とからなるフィルムの、薬物放出速度を示す図である。
図１６は、化合物ＡとＭｅｄｉｓｏｒｂ５０５０とからなるマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルからの、化合物Ａの累積放出率の時間推移を示す図である。
図１７は、化合物ＡとＭｅｄｉｓｏｒｂ７５２５とからなるフィルムからの、化合物Ａの累積放出率の時間推移を示す図である。
図１８は、本発明の軟骨組織形成用製剤の評価に用いたウサギの正常な関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図１９は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、本発明の軟骨組織形成用製剤を埋め込まなかった場合の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真に対応する図である。
図２０は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、その欠損部を埋めるように実施例４−３の物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを配置し、その上部に化合物Ａを含有しないＰＬＧＡフィルムを配置した製剤を埋め込んで３ヶ月間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図２１は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、その欠損部を埋めるように実施例４−３の物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを配置し、その上部に実施例４−１の化合物Ａ  １ｍｇを含有するＰＬＧＡフィルムを配置した製剤を埋め込んで３ヶ月間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図２２は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、その欠損部を、化合物Ａを含有しないＰＬＧＡマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル製剤を埋め込んで３ヶ月間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図２３は、ウサギの関節軟骨に欠損を作製し、その欠損部を、化合物Ａ  １ｍｇを含有する実施例４−４のマイクロスフィアを内包した物理架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル製剤を埋め込んで３ヶ月間経過した後の、当該関節軟骨のサフラニンＯ−ファストグリーン染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2003043672.tif 000049
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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