(57)【要約】血管平滑筋細胞およびメサンギウム細胞の遊走に対して優れた阻害作用を有する成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有する、血管平滑筋細胞およびメサンギウム細胞の遊走を伴った血管疾患および腎機能障害の予防・治療剤。動脈硬化や血管形成術後に再発する血管内膜肥厚、さらには糸球体硬化を抑制することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有する細胞遊走阻害剤。
【請求項２】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有するＰＤＧＦ誘発性細胞遊走阻害剤。
【請求項３】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有するアンジオテンシンＩＩ誘発性細胞遊走阻害剤。
【請求項４】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有する血管平滑筋細胞の遊走阻害剤。
【請求項５】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有する血管平滑筋細胞の遊走を伴った血管疾患の予防・治療剤。
【請求項６】
前記血管疾患が動脈硬化である請求の範囲第５項に記載の予防・治療剤。
【請求項７】
前記血管疾患が血管形成術後の血管内膜の再肥厚を伴った疾患である請求の範囲第５項に記載の予防・治療剤。
【請求項８】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を含有するメサンギウム細胞の遊走阻害剤。
【請求項９】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を含有するメサンギウム細胞の遊走を伴った腎機能障害の予防・治療剤。
【請求項１０】
前記腎機能障害が糸球体腎炎である請求の範囲第９項に記載の予防・治療剤。
【請求項１１】
前記糸球体腎炎がメサンギウム増殖性糸球体腎炎である請求の範囲第１０項に記載の予防・治療剤。
【請求項１２】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有する筋線維芽細胞の遊走阻害剤。
【請求項１３】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有する臓器線維化の予防・治療剤。
【請求項１４】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質が成長ホルモン分泌促進物質および／または成長ホルモン放出ペプチドである請求の範囲第１、２、３、４、８または１２項に記載の細胞遊走阻害剤。
【請求項１５】
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質が成長ホルモン分泌促進物質および／または成長ホルモン放出ペプチドである請求の範囲第５、６、７、９、１０、１１または１３項に記載の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有する細胞の遊走阻害剤、特にＰＤＧＦおよびアンジオテンシンＩＩに誘発される細胞の遊走阻害剤、および血管平滑筋細胞、メサンギウム細胞の遊走を伴った疾患の予防・治療剤に関する。
背景技術
胚形成、癌、炎症などにおいて細胞の遊走は、その細胞の増殖に先立ち現れる現象である。血管平滑筋細胞やメサンギウム細胞の遊走もまた増殖の前に現れ、よく知られる病態にそれぞれ動脈硬化と糸球体腎炎がある。
正常な血管平滑筋細胞は、細胞内の大部分を筋フィラメントが占め、血管の収縮、弛緩を担い、収縮型（分化型）と呼ばれている。一方、動脈硬化巣で見られる平滑筋細胞は、筋フィラメントが著しく減少し、代わって小胞体やミトコンドリアなどの器官が発達し、増殖、遊走能が亢進している。この形質の平滑筋細胞を合成型（増殖型）と呼んでいる。平滑筋細胞が合成型へ形質変換し、異常増殖することが、動脈硬化進展の主因の一つと考えられている（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（１９８６）５８，４２７−４４４）。一般に血管平滑筋細胞は、生体内より摘出して培養すると、速やかに収縮型の形質が失われ合成型に変化してしまう。
動脈硬化の発症・進展や血管の狭窄・閉塞は、Ｒｏｓｓが提唱した「傷害−反応仮説」（Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６２：８０１−８０９）が広く受け入れられている。この説によれば、高血圧・高脂血症等の危険因子が内皮を傷害し、傷害された内皮細胞や傷害部位に集積した炎症性細胞から血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、以下ＰＤＧＦという）等の成長因子やサイトカインを含む血管作動性物質が放出され、血管中膜にある平滑筋細胞を内膜に遊走させる。遊走した平滑筋細胞は、増殖能や細胞外基質産生能を亢進させる。
動脈硬化の予防的薬物療法として危険因子の軽減に高血圧・高脂血症治療薬の投与や動脈硬化病変での血栓予防に抗血小板剤の投与が行われている。現在、血管平滑筋細胞の遊走・増殖・細胞外基質産生のいずれかの機能を抑制する薬剤を動脈硬化や血管形成術後の再肥厚の予防・治療に応用する試みがなされている。例えば、トラニラストは、有効濃度１×１０−５Ｍ〜１×１０−３Ｍと弱いが、インビトロで血管平滑筋細胞の遊走・増殖・細胞外基質産生抑制作用を有し（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９９４）１０７：１７９−１８５）、経皮的冠動脈形成術（以下ＰＴＣＡという）後の再狭窄予防剤として臨床研究されている。また、内因性の血管作動性ペプチドであるＣ型ナトリウムペプチドは、インビトロ試験での血管平滑筋細胞の遊走に対して優れた抑制作用を示すことが報告され、Ｃ型ナトリウムペプチドやその分解酵素阻害剤は動脈硬化等の治療薬として期待されている（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）１６：１０８０−１０８７）。
メサンギウム細胞は、動脈平滑筋細胞に由来し、その遊走、増殖は腎機能障害へ進展する。糸球体は、糸玉状の毛細血管網であり、糸球体内皮細胞、毛細血管を束ねているメサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、糸球体基底膜、メサンギウム基質により構成されている。メサンギウム細胞が分泌するメサンギウム基質の増加により糸球体構築は破壊し糸球体硬化は生じる。
糸球体腎炎の原因、進展のメカニズムは完全に解明されていないが、現在支持されている説の一つが、Ｆｌｏｅｇｅらが提唱した仮説である（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．（１９９３）３９：Ｓ４７−Ｓ５４）。この説では、血小板やマクロファージが糸球体で活性化し、ＰＤＧＦや塩基性線維芽細胞増殖因子を放出し、メサンギウム細胞が増殖して糸球体硬化に至る。その後の研究から、メサンギウム細胞の増殖に先立ち、メサンギウム細胞の遊走が起こることが確認されている。
糸球体腎炎のような腎機能障害の治療法として根治的なものはなく、腎機能の保持、尿蛋白の減少、高血圧やその他の合併症の管理が主眼である。その予後は極めて悪く、比較的短期間で腎不全に陥り、大多数の例が透析療法を要し、また死亡にいたる。したがって、根治的な治療薬物の登場が望まれている。
成長ホルモン分泌促進物質は視床下部や下垂体に存在する成長ホルモン分泌促進物質受容体を介して脳下垂体から成長ホルモンを分泌させる。成長ホルモン分泌促進物質受容体の内因性リガンドであるグレリンは胃抽出物から見出され、血中にも高濃度に存在する。成長ホルモン分泌促進物質受容体は、血管、心臓、肺、膵臓、腎、肝、脂肪などにもタンパク質レベルあるいはｍＲＮＡレベルで発現が確認されており、末梢臓器における成長ホルモン分泌促進物質の生理的および薬理学的研究が盛んである（Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０２：６５６−６６０）。最近、成長ホルモン分泌促進物質受容体発現は、ヒトの冠動脈硬化病変部位で亢進していることが報告されているが、その役割については明らかにされていない（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００１）１３４：１４３−１４９）。Ｒｏｓｓｏｎｉらは、成長ホルモン放出ペプチドの一つであるヘキサレリンが、ラットの下垂体除去によって誘発されるエンドセリン誘発性の血管過収縮反応やアセチルコリン誘発性の弛緩反応の低下を改善することを報告しているが（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９３）３４：４５４−４６０）、その作用は血管内皮細胞への作用を示唆している。また、腎では多量にグレリンが産生されているが（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２０００）４８６：２１３−２１６）、グレリンの腎における役割に関する報告はない。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題は、動脈硬化や血管形成術後に再発する血管内膜肥厚、さらには糸球体硬化の抑制のために血管平滑筋細胞およびメサンギウム細胞の遊走に対して優れた阻害作用を有する化合物を見出すことである。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を行った結果、驚くべきことに成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質が、血管平滑筋細胞およびメサンギウム細胞の遊走に対してすぐれた阻害作用を有していることを見出し、これに基づいて本発明を完成した。
発明を実施するための最良の形態
本発明の態様によると、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有することを特徴とする細胞遊走阻害剤を提供する。
本発明でいう「細胞遊走」とは、ＰＤＧＦやアンジオテンシンＩＩ等の遊走活性を持った生理活性物質によって誘発される細胞の遊走をいう。例えば、摘出した血管をＰＤＧＦ溶液に浸すと、平滑筋細胞が遊走してくる。細胞遊走の阻害剤はこのような遊走を阻害するが、より定量的には実施例に記載のボイデンチャンバーを用いた方法で阻害活性は測定される。
本発明の別の態様によると、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有することを特徴とする血管平滑筋細胞の遊走を伴った疾患およびメサンギウム細胞の遊走を伴った腎機能障害の予防・治療剤を提供する。
本発明の別の態様によると、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分として含有することを特徴とするＰＤＧＦもしくはアンジオテンシンＩＩに誘発される細胞遊走を伴った疾患の予防・治療剤を提供する。
本発明でいう「血管平滑筋細胞の遊走を伴った疾患」とは、血管平滑筋細胞が何らかの原因によって血管中膜から内膜へ遊走し、または既に内膜に存在する血管平滑筋細胞がさらに内腔側に遊走し、増殖または細胞外基質の産生により生じた内膜肥厚を起こす疾患を言い、例えば閉塞性動脈硬化症、冠動脈硬化症、ＰＴＣＡ後の再閉塞などが挙げられる。血管平滑筋細胞の遊走を伴った疾患は、特定の臓器を支配する血管に限定されるものではない。また、動脈血管肥厚だけに限定されるものではなく、静脈血管、例えば透析患者静脈のシャント血管などの閉塞性病変も含まれる。
本発明でいう「血管形成術」とは、狭心症や心筋梗塞などの動脈硬化病変を背景とする冠動脈疾患の治療に用いられる術式を言い、例えば経皮的冠動脈形成術、粥腫切除術、冠動脈バイパス術、ステント留置術などが挙げられる。
本発明でいう「メサンギウム細胞の遊走を伴った腎機能障害」とは、メサンギウム細胞が何らかの原因によって障害部位へ遊走し、増殖またはメサンギウム基質の産生により糸球体が圧迫され、糸球体機能が損なわれた状態を言い、例えば腎不全、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、などが挙げられる。さらに、この疾患は原発性疾患に限定するものではなく感染性糸球体症など多臓器疾患関連の二次的糸球体症も含まれる。
本発明でいう「成長ホルモン分泌促進物質受容体（以下ＧＨＳＲという）」とは、成長ホルモン放出ペプチドおよび成長ホルモン分泌促進物質の受容体であり、典型的には脳下垂体での成長ホルモン（以下ＧＨという）分泌・放出を司るが、その受容体サブタイプも含め他の臓器（例えば、心臓、肺、膵臓等）に発現するＧＨＳＲにおいては、その機能が公知のＧＨ分泌または分泌促進に限定されるものではない。
本発明でいう「成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質（ＧＨＳＲ  ａｇｅｎｔ）」とは、ＧＨＳＲに作用し、何らかの細胞応答刺激を与える活性を有する物質であって、成長ホルモン放出ペプチド並びに成長ホルモン分泌促進物質が含まれるが、ＧＨの分泌または分泌促進活性で示されるものに限定されない。また、あらゆる種の動物の臓器に恒常的に発現しているＧＨＳＲに作用することに限定されるものでなく、例えば株化細胞への遺伝子導入によって人工的に発現させた受容体に作用する物質も含まれる。
本発明でいう「成長ホルモン放出ペプチド（以下ＧＨＲＰという）」とは、ＧＨＳＲに作用しＧＨ分泌を促進させる薬理活性を有するペプチドであって、このような同等の活性を有する限り、内因性のペプチド並びにその合成品や各種誘導体なども包含される。
本発明でいう「成長ホルモン分泌促進物質（以下ＧＨＳという）」とは、ＧＨＳＲに作用しＧＨ分泌を促進させる薬理活性を有する非ペプチド性物質であって、このような同等の活性を有する限り、各種誘導体も包含される。
成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質としては、ＧＨＲＰであるプラルモレリン、ヘキサレリン、ＧＨＲＰ−６など、合成ＧＨＳとしてはイブタモレリンメタンスルホネート、タビモレリン、カプロモレリンなど、生体内ＧＨＳＲリガンドとしてはグレリンやＧＨＳＲリガンドポリペプチド（ＷＯ０１／３２７０５）、アデノシンなどがある。
さらに成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質は、例えば以下の特許に開示されている。但し、これらによって限定的に解釈されるものではない。
ＷＯ００／１０５６５、ＷＯ００／０１７２６、ＷＯ９９／６４４５６、ＷＯ９９／５８５０１、ＷＯ９９／４５０２９、ＷＯ９９／３６４３１、ＷＯ９９／０９９９１、ＷＯ９９／０８６９９、ＷＯ９８／５８９５０、ＷＯ９８／５８９４９、ＷＯ９８／５８９４８、ＷＯ９８／５８９４７、ＷＯ９８／５１６８７、ＷＯ９８／５００３６、ＷＯ９８／４６５６９、ＷＯ９８／４６２２０、ＷＯ９８／２５８９７、ＷＯ９８／２５６２２、ＷＯ９８／１６５２７、ＷＯ９８／１６５２７、ＷＯ９８／１０６５３、ＷＯ９８／０３４７３、ＷＯ９７／４６２５２、ＷＯ９７／４２２２３、ＷＯ９７／４００７１、ＷＯ９７／４００２３、ＷＯ９７／３９７６８、ＷＯ９７／３４６０４、ＷＯ９７／２７２９８、ＷＯ９７／２５０５７、ＷＯ９７／２４３６９、ＷＯ９７／２３５０８、ＷＯ９７／２２６２２、ＷＯ９７／２２６２０、ＷＯ９７／２２３６７、ＷＯ９７／２１７３０、ＷＯ９７／１８２３３、ＷＯ９７／１５５７４、ＷＯ９７／１５５７３、ＷＯ９７／１５１９１、ＷＯ９７／１１６９７、ＷＯ９７／００８９４、ＷＯ９６／３８４７１、ＷＯ９６／３５７１３、ＷＯ９６／３３１８９、ＷＯ９６／３２９４３、ＷＯ９６／３２１２６、ＷＯ９６／２４５８７、ＷＯ９６／２４５８０、ＷＯ９６／２２９９７、ＷＯ９６／２２７８２、ＷＯ９６／１５１４８、ＷＯ９６／１３２６５、ＷＯ９６／１００４０、ＷＯ９６／０５１９５、ＷＯ９６／０２５３０、ＷＯ９５／３４３１１、ＷＯ９５／１７４２３、ＷＯ９５／１７４２２、ＷＯ９５／１６７０７、ＷＯ９５／１６６９２、ＷＯ９５／１６６７５、ＷＯ９５／１４６６６、ＷＯ９５／１３０６９、ＷＯ９５／１２５９８、ＷＯ９５／０９６３３、ＷＯ９５／０３２９０、ＷＯ９５／０３２８９、ＷＯ９４／１９３６７、ＷＯ９４／１８１６９、ＷＯ９４／１３６９６、ＷＯ９４／１１３９７、ＷＯ９４／１１０１２、ＷＯ９４／０８５８３、ＷＯ９４／０７５１９、ＷＯ９４／０７４８６、ＷＯ９４／０７４８３、ＷＯ９４／０５６３４、ＷＯ９３／０４０８１、ＷＯ９２／１６５２４、ＷＯ９２／０１７１１、ＷＯ８９／１０９３３、ＷＯ８９／０７１１１、ＷＯ８９／０７１１０、ＷＯ８３／０２２７２、ＵＳＰ６，２７８，０００、ＵＳＰ６，２４８，７１７、ＵＳＰ６，１１０，９３２、ＵＳＰ５，９３６，０８９、ＵＳＰ５，８７７，１８２、ＵＳＰ５，８７２，１００、ＵＳＰ５，８５４，２１１、ＵＳＰ５，８３０，４３３、ＵＳＰ５，８１７，６５４、ＵＳＰ５，８０７，９８５、ＵＳＰ５，８０４，５７８、ＵＳＰ５，７９８，３３７、ＵＳＰ５，７８３，５８２、ＵＳＰ５，７７７，１１２、ＵＳＰ５，７７６，９０１、ＵＳＰ５，７７３，４４８、ＵＳＰ５，７７３，４４１、ＵＳＰ５，７６７，１２４、ＵＳＰ５，７６７，１１８、ＵＳＰ５，７６７，０８５、ＵＳＰ５，７３１，３１７、ＵＳＰ５，７２６，３１９、ＵＳＰ５，７２６，３０７、ＵＳＰ５，７２１，２５１、ＵＳＰ５，７２１，２５０、ＵＳＰ５，６９１，３７７、ＵＳＰ５，６７２，５９６、ＵＳＰ５，６６８，２５４、ＵＳＰ５，６６３，１７１、ＵＳＰ５，６６３，１４６、ＵＳＰ５，６５６，６０６、ＵＳＰ５，６５２，２３５、ＵＳＰ５，６４６，３０１、ＵＳＰ５，６３５，３７９、ＵＳＰ５，５８３，１３０、ＵＳＰ５，５７８，５９３、ＵＳＰ５，５７６，３０１、ＵＳＰ５，５５９，１２８、ＵＳＰ５，５４５，７３５、ＵＳＰ５，５３６，７１６、ＵＳＰ５，５３４，４９４、ＵＳＰ５，５０６，１０７、ＵＳＰ５，４９４，９１９、ＵＳＰ５，４９２，９２０、ＵＳＰ５，４９２，９１６、ＵＳＰ５，４８６，５０５、ＵＳＰ５，４８６，５０５、ＵＳＰ５，４３４，２６１、ＵＳＰ５，４３０，１４４、ＵＳＰ５，４１６，０７３、ＵＳＰ５，３７４，７２１、ＵＳＰ５，３１７，０１７、ＵＳＰ５，３１０，７３７、ＵＳＰ５，２８４，８４１、ＵＳＰ５，２８３，２４１、ＵＳＰ５，２０６，２３５、ＵＳＰ５，０３０，６３０、ＵＳＰ４，８８０，７７７、ＵＳＰ４，８５１，４０８、ＵＳＰ４，６５０，７８７、ＵＳＰ４，４８５，１０１、ＵＳＰ４，４１１，８９０、ＵＳＰ４，４１０，５１３、ＵＳＰ４，４１０，５１２、ＵＳＰ４，２２８，１５８、ＵＳＰ４，２２８，１５７、ＵＳＰ４，２２８，１５６、ＵＳＰ４，２２８，１５５、ＵＳＰ４，２２６，８５７、ＵＳＰ４，２２４，３１６、ＵＳＰ４，２２３，０２１、ＵＳＰ４，２２３，０２０、ＵＳＰ４，２２３，０１９。
また、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質およびその塩を２種以上組み合わせて用いても良い。
本発明に用いられる成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質は、公知の製剤技術により、単独でまたは薬理学的に許容しうる担体、添加剤とともに、注射剤、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤またはドラッグデリバリーシステム（例えば、徐放剤等）などの剤型に製剤可能であり、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質の含有量としては所望の効果を奏する限り特に限定されない。
本発明の予防・治療剤の製剤化に使用できる担体、添加剤としては以下のような通常医薬品の調剤に使用されるものが挙げられ、例えば生理食塩水、水（常水、蒸留水、精製水、注射用水など）、リンゲル液などの水性溶剤、例えば油性溶剤（植物油など）、水溶性溶剤（プロピレングリコール、マクロゴール、エタノール、グリセリンなど）などの非水性溶剤、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、マイクロクリスタリンワックス、サラシミツロウ、流動パラフィン、白色ワセリンなどの基剤、例えばショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、ブドウ糖、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどの賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビヤゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプンなどの結合剤、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウムなどの崩壊剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、例えばクエン酸、メントール、グリシン、ソルビトール、オレンジ末などの矯味剤、例えばパラオキシ安息香酸エステル、ベンジルアルコール、クロロブタノール、四級アンモニウム塩（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）などの保存剤および防腐剤、例えばアルブミン、ゼラチン、ソルビトール、マンニトールなどの安定剤、例えばメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなどの懸濁化剤、例えばグリセリン、ソルビトールなどの可塑剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの分散剤、例えば塩酸等の溶解補助剤、例えばモノステアリン酸ナトリウムなどの乳化剤、例えば塩化ナトリウムなどの電解質ならびに例えば糖アルコール類、糖類およびアルコールなどの非電解質の浸透圧調整剤が使用できる。
本製剤は、通常、静脈注、経口、皮下、点鼻、経肺、動脈注投与等の手段により、ヒトを含む哺乳動物に投与され、本製剤の投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路等により差異はあるが、例えば成人に使用するに際し、プラルモレリンを例とすると、体重１ｋｇ当たり約０．１から１０００μｇを１日に点滴であるいは１回ないし数回に分けて静脈内投与することができ、体重１ｋｇ当たり約１０μｇから１０ｍｇを数回に分けて経口投与することができる。
本発明の予防・治療剤は、冠拡張剤、利尿剤、強心剤、ＡＣＥ阻害剤、高血圧治療剤、抗血小板剤等の循環器疾患、腎疾患の治療薬と同時にまたは時間をおいて併用することができる。
成長ホルモン分泌促進物質または成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質が、血管平滑筋細胞やメサンギウム細胞の遊走を伴う疾患の予防・治療するような薬剤として有効であることが本発明によって初めて明らかとなった。本発明の成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分とする予防・治療剤は、直接、血管平滑筋細胞やメサンギウム細胞に作用することにより優れた遊走阻害活性を有し、種々の動物に対する毒性も低く、またヒトに対しても安全性が高い。
以下に実施例等を示して具体的に説明するが、本発明は実施例等に限定されるものではない。
［実施例１］プラルモレリン液剤
プラルモレリン・二塩酸塩（以下ＫＰ−１０２という）を生理食塩液（日本薬局方）に溶解し、おのおの０．１％、０．２％および１．０％の液剤を調製した。
［試験例１］血管平滑筋細胞の遊走に対する成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質の効果
１．材料
ＫＰ−１０２（ＷＯ９３／０４０８１公報にＧＨＲＰ−２として記載の化合物を常法により二塩酸塩として製造）、イブタモレリンメタンスルホネート（ＷＯ９４／１３６９６公報に記載の方法により製造：実施例５５の化合物、以下ＭＫ−０６７７という）、タビモレリン（ＷＯ９７／２３５０８公報に記載の方法により製造：実施例１の化合物、以下ＮＮ−７０３という）、カプロモレリン（ＷＯ９８／５８９４９公報に記載の方法により製造：実施例２０の化合物、以下ＣＰ−４２４，３９１という）、Ｓ−３８８５５（ＷＯ００／４８６２３公報に記載の方法により製造：実施例４の化合物）、ヘキサレリン（ＰＥＮＩＮＳＵＬＡ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）は、ジメチルスルホキシド（ナカライテスク）に溶解し、以後１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）を含む注射用水（日本薬局方、大塚製薬）で所定の濃度に希釈して用いた。ヒト型グレリン、ヒト型ＧＨＲＨ（以上、ペプチド研究所）、遺伝子組換えヒト成長ホルモン（和光純薬）、ＧＨＲＰ−６（ＢＡＣＨＥＭ）、Ｌ−７５６８６７（ＢＡＣＨＥＭ）は、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む注射用水で溶解し所定の濃度に希釈して用いた。その他の試薬は、平滑筋細胞基礎培地：ＳｍＢＭ、添加因子：ＳｍＧＭ−２添加因子セット（ヒト上皮細胞増殖因子、ヒト線維芽細胞増殖因子、インスリン、ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ）（以上、三光純薬）、ＤＭＥＭ培地、ウシ胎児血清、トリプシン（以上、ＧＩＢＣＯ）、ＰＤＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、アンジオテンシンＩＩ（ＳＩＧＭＡ）を使用した。
２．方法
（１）血管平滑筋細胞の培養
ヒト血管平滑筋細胞は、添加因子を含むＳｍＢＭ培地で培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２−９５％空気）内で培養し、５から９代に継代培養した細胞を試験に用いた。ウサギ血管平滑筋細胞は、ウサギ胸部大動脈の中膜より移植片法により得、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで培養し、５から７代に継代培養した細胞を試験に用いた。
（２）遊走活性の評価法
コンフルエントに増殖した細胞をトリプシンで剥離し、添加因子を含まない培地で２回洗浄した後、０．１％ウシ胎児血清を含むＳｍＢＭ培地に分散し、５×１０５個／ｍＬになるように調製した。細胞遊走の評価は、４８穴ボイデンチャンバー（Ｎｅｕｒｏ  ｐｒｏｂｅ）を用いて小山らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６３：１３３０１−１３３０８）に準じて行った。すなわち、下層側チャンバーにはＰＤＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬおよび０．１％ＦＢＳを含むＳｍＢＭ培地を２８μＬ注入し、上層側チャンバーには予め各評価化合物で１０分間インキュベートした細胞分散液５０μＬを注入した。上層側チャンバーと下層側チャンバーは、Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン社）で予めコートしたポリカーボネートフィルター（８μｍのポアサイズ）で分離した。チャンバーは、細胞分散液を注入した時点から、培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２−９５％空気）内で４時間インキュベートした。フィルターの上層側の細胞を削り取り、フィルター上をチャンバーの上層側から下層側に移動した細胞をメタノールで固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色液（国際試薬）で染色した。フィルターは、スライドガラス上で風乾後、エンテランニューで封入した。遊走細胞は、高出力顕微鏡下（倍率：２００倍）に観察される細胞数を１穴当たり４視野測定し、平均値を算出した。
（３）統計解析
結果はいずれも各処置群３穴の平均値±標準偏差値で示した。有意差検定は、一元配置分散分析を行い、危険率５％未満の時は、遊走刺激剤添加溶媒処置群に対する比較検定をＤｕｎｎｅｔｔ法にて行い、危険率５％未満の時に有意差ありとした。
３．結果および考察
血管内皮が傷害すると血小板が凝集しＰＤＧＦなどを放出する。さらに傷害された内皮下に侵入した単球由来マクロファージもＰＤＧＦを分泌する。ＰＤＧＦは中膜平滑筋細胞を刺激し、強力な遊走因子として働き、増殖を促進させ、動脈硬化や血管形成術後の血管内膜肥厚の初期において重要な働きをしている。
ＫＰ−１０２は、ＰＤＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬによって誘発されるヒト血管平滑筋細胞の遊走を１ｎＭから１０００ｎＭにおいて有意に抑制し、１ｎＭから１００ｎＭで濃度依存的であった（図１）。グレリンは、０．１ｎＭから１０００ｎＭで抑制作用を示し、０．１ｎＭから１００ｎＭで濃度依存的であった（図２）。この作用をウサギ血管平滑筋細胞で検討した結果、ＫＰ−１０２およびグレリンの１０ｎＭ処置はいずれも有意な抑制作用を示した（図３）。さらにヒト血管平滑筋細胞の遊走に対して既知の成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質であるヘキサレリン、ＭＫ−０６７７、ＮＮ−７０３、ＣＰ−４２４，３９１、Ｓ−３８８５５、ＧＨＲＰ−６の効果を検討した結果、１０ｎＭの濃度でいずれも化合物も有意な抑制作用を示した。一方、成長ホルモン（ＧＨ）０．１μｇ／ｍＬおよび成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）１０ｎＭは、いずれも作用を示さなかった（図４）。
次に、ＫＰ−１０２、グレリンおよびヘキサレリンの血管平滑筋細胞の遊走抑制作用に対して、ＧＨＳ受容体拮抗剤であるＬ−７５６８６７の効果を検討した結果、Ｌ−７５６８６７  １０００ｎＭは、ＫＰ−１０２、グレリンおよびヘキサレリンのそれぞれ１０ｎＭでの遊走抑制作用に対して拮抗作用を示した（図５）。
以上のように、構造の異なる様々な成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質がＰＤＧＦ誘発性遊走を抑制し、ＧＨＳ受容体拮抗剤で作用が失われたことから、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質はＰＤＧＦ受容体の拮抗剤として遊走を抑制するのではなく、ＧＨＳＲを介した機序で遊走を抑制していることは明白である。
我々が見出した細胞遊走の新しい機序は、他の要因に因る遊走を抑制するかもしれないという示唆を我々に与えた。レニン・アンジオテンシン系は循環調節系において重要な働きをしていることはよく知られる。アンジオテンシンＩＩは通常、血管収縮に働くが、血管平滑筋細胞が形質変換し合成型になると遊走促進に働く。
ＫＰ−１０２は、アンジオテンシンＩＩ  １００ｎＭによって誘発されるヒト血管平滑筋細胞の遊走を０．１ｎＭから１０００ｎＭにおいて有意に抑制した（図６）。また、グレリンも同様に０．１ｎＭから１０００ｎＭにおいて有意に抑制した（図７）。このように、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質はＰＤＧＦのみならずアンジオテンシンＩＩによる遊走をも抑えることが明らかとなった。
従って、本発明の成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質を有効成分とする予防・治療剤は、血管平滑筋細胞の遊走を抑制し、動脈硬化や血管形成術後の血管内膜肥厚に伴う疾患の予防・治療剤として有効である。
さらに、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質はヒト由来細胞のみならず、ウサギ由来細胞の遊走をも阻害した。このことから、本遊走阻害作用は、ヒトに限定されるものではない。たとえば、ペットの生活習慣病である動脈硬化等の予防・治療剤としても有効である。
［試験例２］メサンギウム細胞の遊走に対する成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質の効果
１．材料および方法
ヒトメサンギウム細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）は、ＭｓＧＭ添加因子セット（ＦＢＳ、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ）を含むＭｓＧＭ培地：メサンギウム細胞基礎培地（以上、三光純薬）で培養し、５から７代に継代培養した細胞を試験に用いた。これ以外の材料および方法は試験例１に同じである。
２．結果および考察
メサンギウム細胞は、腎糸球体で内皮細胞を束ね、収縮・弛緩により糸球体の血流を調節している。内皮の傷害あるいは機能異常は、血小板を活性化させ、凝集した血小板、さらに内皮下に侵入した単球由来マクロファージはＰＤＧＦを分泌する。ＰＤＧＦは、メサンギウム細胞の強力な遊走因子として働き、増殖を促進させ、メサンギウム基質の産生増加を促進させる。このＰＤＧＦの作用は、組織修復にとって有益である反面、過剰な場合は糸球体硬化の原因ともなる。
ＧＨＳＲは、腎に発現することが確認されているが、その機能は未だ不明である。そこで、メサンギウム細胞の遊走に及ぼす成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質の作用を検討した。ＰＤＧＦ誘発性遊走をＫＰ−１０２は０．１ｎＭから有意に抑制した（図８）。この抑制作用は、グレリンを用いても確認された（図９）。
遊走は、メサンギウム細胞に認められる特徴的な現象の一つである。成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質の遊走抑制は、試験例１に示されたように、ＰＤＧＦ受容体における拮抗作用ではなく、ＧＨＳＲを介したものであり、容易に他の遊走因子に因る遊走をも抑制すると考えられる。したがって、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質はメサンギウム細胞の遊走を引き金とする様々な腎疾患の治療に有効であると考えられる。
産業上の利用の可能性
試験例１において、ＰＤＧＦによって誘発される血管平滑筋細胞の遊走に対して優れた阻害作用を示したＫＰ−１０２、ヘキサレリン、ＧＨＲＰ−６、グレリン、ＭＫ−０６７７、ＮＮ−７０３、ＣＰ−４２４，３９１およびＳ−３８８５５は、ＧＨＲＰおよびＧＨＳであり、且つＫＰ−１０２、ヘキサレリン、ＧＨＲＰ−６、ＭＫ−０６７７、ＮＮ−７０３（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９９）１４１：１８０−１８９）、グレリン（Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０２：６５６−６６０）、ＣＰ−４２４，３９１（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ（２００１）１４：１２１−１３２）は、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質である。一方、成長ホルモン分泌促進物質受容体に結合し（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９６）１０：５７−６１）、ＧＨＲＰやＧＨＳ刺激による下垂体細胞からのＧＨの分泌を抑制するＬ−７５６８６７は（Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９７）１５２：１５５−１５８）、ＧＨＳ受容体拮抗剤として知られている。本試験においてＫＰ−１０２、グレリンおよびヘキサレリンの遊走抑制作用がＬ−７５６８６７で拮抗された。また、成長ホルモンや（ＧＨ）や成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、ＰＤＧＦによって誘発される血管平滑筋細胞の遊走に対して作用を示さなかった。これらのことより、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質による細胞の遊走抑制作用がＧＨＳＲを介する作用であることを示した。
また、試験例１および２の結果は、成長ホルモン分泌促進物質受容体作用物質の細胞遊走に対する抑制作用が、必ずしも血管平滑筋細胞およびメサンギウム細胞に限定されるものではなく、他の細胞、例えば筋線維芽細胞の遊走をも抑制するのではないかと容易に推測させる。血管平滑筋細胞やメサンギウム細胞は、形質転換により筋線維芽細胞様となるからである。さらに、筋線維芽細胞も同じくＰＤＧＦにより遊走する。筋線維芽細胞は、肝硬変、尿細管間質障害、肺線維症などの臓器線維化との関連が指摘されており、ＧＨＳはその予防・治療薬としても有効と考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト血管平滑筋細胞のＰＤＧＦ誘発性遊走に対するＫＰ−１０２の抑制作用を示す図である。
図２は、ヒト血管平滑筋細胞のＰＤＧＦ誘発性遊走に対するグレリンの抑制作用を示す図である。
図３は、ウサギ血管平滑筋細胞のＰＤＧＦ誘発性遊走に対するＫＰ−１０２およびグレリンの抑制作用を示す図である。
図４は、ヒト血管平滑筋細胞のＰＤＧＦ誘発性遊走に対するＧＨ、ＧＨＲＨ、ヘキサレリン、ＭＫ−０６７７、ＮＮ−７０３、ＣＰ−４２４，３９１、Ｓ−３８８５５、ＧＨＲＰ−６の作用を示す図である。
図５は、ヒト血管平滑筋細胞のＰＤＧＦ誘発性遊走に対するＫＰ−１０２，グレリンおよびヘキサレリンの遊走抑制作用に対するＬ−７５６８６７の拮抗作用を示す図である。
図６は、ヒト血管平滑筋細胞のアンジオテンシンＩＩ誘発性遊走に対するＫＰ−１０２の抑制作用を示す図である。
図７は、ヒト血管平滑筋細胞のアンジオテンシンＩＩ誘発性遊走に対するグレリンの抑制作用を示す図である。
図８は、ヒトメサンギウム細胞のＰＤＧＦ誘発性遊走に対するＫＰ−１０２の抑制作用を示す図である。
図９は、ヒトメサンギウム細胞のＰＤＧＦ誘発性遊走に対するグレリンの作用を示す図である。
図中、＊および＊＊の符号は、遊走刺激剤添加溶媒処置群に対し、それぞれ危険率５％および１％で有意差があることを示す。＃＃の符号は、比較された２群間に危険率１％で有意差があることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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