(57)【要約】閉鎖され、かつ、無菌状態の内部空間を有する箱体の培養装置内で、培養容器において生体由来の細胞または組織を培養する自動培養装置であって、培養装置の箱体内に複数に区分けされた空間、開閉窓付きガスインキュベーター、培養液の供給装置と排出装置、培養状態の観察装置並びにこれら装置に培養容器を連続的もしくは断続的に移動させる移動装置が配置されているとともに、培養状態の観察装置からのデータ信号によって、前記の装置の少なくともいずれかのものの動作を電気信号により指示制御する指示制御装置が具備され、交叉汚染を防止することができることを特徴とする。
2004011593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖され、かつ、無菌状態の内部空間を有する箱体の培養装置内で、培養容器において生体由来の細胞または組織を培養する自動培養装置であって、培養装置の箱体内に複数に区分けされた空間、開閉窓付きガスインキュベーター、培養液の供給装置と排出装置、培養状態の観察装置並びにこれら装置に培養容器を連続的もしくは断続的に移動させる移動装置が配置されているとともに、培養状態の観察装置からのデータ信号によって、前記の装置の少なくともいずれかのものの動作を電気信号により指示制御する指示制御装置が具備され、交叉汚染を防止することができることを特徴とする生体由来の細胞または組織の自動培養装置。
【請求項２】
培養装置箱体内の一部または全部に滅菌ガスを導入する設定装置が具備されていることを特徴とする請求項１の自動培養装置。
【請求項３】
滅菌ガスが、オゾンガスであることを特徴とする請求項２の自動培養装置。
【請求項４】
培養装置箱体内の一部または全部を外部よりも陽圧とする環境条件の設定装置が具備されていることを特徴とする請求項１ないし３いずれかの自動培養装置。
【請求項５】
培養装置の箱体内が複数の空間に区分けされ、空間同士は閉鎖可能とされていることを特徴とする請求項１ないし４いずれかの自動培養装置。
【請求項６】
培養装置の箱体内における複数の空間の区分けには、遮断板により区分けされ、この遮断板は培養容器の移動のための開閉自在な遮断板ドアを具備されていることを特徴とする請求項５の自動培養装置。
【請求項７】
細胞または組織の洗浄のための装置が配設され、培養容器のこの洗浄装置への移動と、それらの動作が指示制御装置により行われることを特徴とする請求項１ないし６いずれかの自動培養装置。
【請求項８】
薬剤添加のための装置が配設され、培養容器のこの薬剤添加装置への移動と、それらの動作が指示制御装置により行われることを特徴とする請求項１ないし７いずれかの自動培養装置。
【請求項９】
培養容器の中の培養物が、培養容器の外部に対して遮断性を保持して培養容器内外へ移動することを特徴とする請求項１ないし８いずれかの自動培養装置。
【請求項１０】
請求項１ないし９いずれかの自動培養装置であって、培養装置箱体内には培養容器から培養物を剥離もしくは回収のための装置を配設され、この装置への培養容器の移動が移動装置により可能とされていることを特徴とする自動培養装置。
【請求項１１】
剥離または回収のための装置が、振動装置または回転装置であることを特徴とする請求項１０の自動培養装置。
【請求項１２】
請求項１ないし１１いずれかの自動培養装置であって、培養装置箱体内には培養環境条件を変更する圧迫装置が配設され、この装置への培養容器の移動が移動装置により可能とされていることを特徴とする自動培養装置。
【請求項１３】
圧迫装置は磁石の着脱もしくは機械的押圧によるものであることを特徴とする請求項１２の自動培養装置。
【請求項１４】
培養液、洗浄液、もしくは薬剤が充填されている容器が再使用されないことを特徴とする請求項１ないし１３いずれかの自動培養装置。
【請求項１５】
培養液、洗浄液、もしくは薬剤の培養容器への供給が、滅菌済シリンジを介してなされることを特徴とする請求項１ないし１４いずれかの自動培養装置。
【請求項１６】
培養液、洗浄液、もしくは薬剤の培養容器への供給が、培養液、洗浄液もしくは薬剤の容器に接続された滅菌済チューブを介してなされることを特徴とする請求項１ないし１４いずれかの自動培養装置。
【請求項１７】
生体由来の細胞または組織を培養する培養容器を用いた静置接着培養において、生体由来の細胞または組織の量および／または質の分析測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備されていることを特徴とする自動培養装置。
【請求項１８】
培養容器には、電気容量測定用電極が備えられ、かつ、２個以上の電気容量測定用電極の間に培養物が配置され、電気容量測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備した請求項１７の自動培養装置。
【請求項１９】
培養容器上方にＸＹスキャニング装置付き変位計を設置し、変位計による細胞の厚み測定に基づいて、生体由来の細胞または組織の分析測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備した請求項１７の自動培養装置。
【請求項２０】
培養容器上方にＸＹスキャニング装置付き蛍光測定装置を設置し、蛍光測定に基づいて、生体由来の細胞または組織の分析測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備した請求項１７の自動培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、細胞または組織の自動培養装置に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、再生医療等を目的とする細胞または組織の培養操作および培養環境の制御が自動化された培養装置に関するものである。
またこの出願の発明は、細胞または組織に対して非侵襲性の測定装置を具備した自動培養装置に関するものである。
【背景技術】  近年、生体細胞や生体組織を体外で培養して得られた細胞や組織を体内あるいは体表面の欠陥や欠損もしくは不完全部位の修復に用いるという再生医療が、多くの基礎研究の蓄積と展開によりその実現性が高まり、社会的にも大きく期待されている。実際、これまでの研究で、皮膚、軟骨、骨、血管、肝細胞、膵臓等の多くの組織が再生医療の対象と成り得ることが報告されている。このような再生医療のための細胞または組織の起源としては、皮膚や軟骨等の分化した組織あるいはその組織中の細胞、骨髄液中等に存在すると言われている造血幹細胞、間葉系幹細胞や肝臓中に存在する肝幹細胞等の体性幹細胞、さらには受精卵の内部細胞塊に由来し、体内のほとんどの組織の細胞に分化する能力を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等がある。
いずれの起源の細胞にせよ、生体から得られる細胞数には限りがあるため、これらを再生医療に用いる場合には一般に体外で培養、増殖、分化させる必要がある。このため、たとえば、表皮細胞に由来する皮膚、軟骨細胞に由来する軟骨等の場合にはそれらの分化状態を維持したまま増殖させることが、また、体性幹細胞や胚性幹細胞を用いる場合には、幹細胞を増殖させた後に治療部位に応じた細胞へと分化させる必要があると考えられている。さらにまた、幹細胞を増殖させて細胞数を増やして生体に移植させ、生体内で分化や組織形成を行う方法も考えられている。
一方、生体の細胞や組織の由来には、本人自身の細胞や組織を用いる場合と、本人以外のヒト由来の細胞や組織を用いる場合とがある。前者の場合、移植の際における拒絶反応の可能性が低いと言う利点がある反面、移植を受ける患者ごとに材料となる細胞や組織を準備する必要がある。後者の場合は、同じ個体由来の細胞や組織を用いて多くの患者の再生医療を行える可能性があるが、患者によって必要とする再生組織の形や大きさが異なる等の医療内容が異なるため、患者ごとに異なるロットでの細胞または組織の培養が必要となる。さらに、再生医療を目的とした細胞または組織の培養は、その培養スケールは非常に小さいと言う特徴を有している。たとえば、骨髄液１０ｍｌに含まれる間葉系幹細胞を増殖させた後、軟骨細胞に分化させ、軟骨の再生医療に用いる場合の培養スケールは１００ｍｌ以下と考えられている。すなわち、再生医療を目的とした細胞または組織の培養には、「小スケール、多ロット並行培養」が求められている。
また、細胞または組織の培養の際には、ウイルスや細菌、種々の化学物質等による汚染を防止するための注意および対策を厳格に講じる必要がある。移植等の再生医療を目的とする場合は、ウイルスや細菌、種々の化学物質等が混入し、汚染が発生した場合、培養中の細胞や組織がガン化する等、その性質が著しく変化する可能性があり、この性質が変化した細胞や組織を生体に移植する事は、ガンの発生誘発等の新たな疾患、また汚染の原因となったウイルスや細菌等が新たな病因となる可能性を有するため、厳重に汚染の防止を実践しなければならない。そのため、細胞または組織の培養には、厳重な管理体制を有する施設内で行い、高度な無菌操作等の培養操作基準を設ける必要がある。たとえば、産業技術総合研究所では、クラス１０００のクリーンルーム内で、作業者が無人衣を着用し、クラス１００のクリーンベンチを用いて高度な無菌操作によって、培養を実施している。
また、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）において指摘されているように（ヒト体細胞を用いた細胞治療用の医薬製品の製造および品質管理上考慮するべき点）、生体細胞や組織の内、患者自身の細胞や組織（自家細胞）には、患者によって必要となる再生組織の大きさや形状が異なり、また患者固有に保有している感染源を他の患者由来の細胞や組織培養に混入することは、絶対に避けなければならない。
そして、再生医療を目的とする細胞または組織の培養には、長い期間を要する。一般に哺乳類等の動物由来の培養細胞は、生体外における増殖速度は遅く、細胞数の倍化にかかる時間は２〜３日要する。一方、細菌等の雑菌の増殖速度は速く、その倍化時間は２０分〜１時間ほどであるため、わずか１個でも細菌等の雑菌が混入した場合、培養中の細胞または組織の増殖よりも、細菌等の雑菌の方が大量に増殖してしまい、培養中の細胞または組織は全くの使い物にならなくなる。
以上のような問題を解決するため、多くの改善策が構想され、試行されてきたが、次のような問題点が依然と残されていた：
（１）手作業のため、汚染の可能性がわずかでも存在する；
（２）作業者自身がウイルスやマイコプラズマ、細菌等の感染源となる可能性がある；
（３）厳重な管理の下にあるような条件や環境等が整備された特殊な培養施設が必要である；
（４）作業効率が低いこと；
（５）作業には高度な熟練性を要するため、作業者が限られ、人件費が高くなる；および
（６）自家細胞の場合、複数の細胞種が同時に同じ施設内で操作されるため、相互混入される可能性がある；
そこで、これら問題点を解決するために、環境条件を任意に制御できる培養チャンバとこれに培養液貯留容器と廃培養液貯留器が配管により接続された装置（特開２００１−２３８６６３）やＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ社（米国）の「Ｃｅｌｌ  ｍａｔｅ」、同社の「Ｓｅｌｅｃｔ  Ｔ」等が開発されてきている。しかしながら、これらいずれのものも、再生医療を目的とした細胞や組織の培養で要求される特徴である「小スケール、多ロット並行培養」という特徴を有していない、専用の培養容器を必要としており、一台の培養装置だけでは同時に複数の培養の実施ができず、長期間の培養時における定期的洗浄等のメンテナンスへの対応や培養中に任意に培養条件の変更ができない等の問題がある。
さらに、動物細胞は、そのほとんどは何かの基質に物理的に接着していないと生存できない接着依存性を有している。そのため、一般にはプラスチック製等の培養容器底面に細胞を接着させて、培養している。増殖や分化させた細胞を生体に移植する等をして、再生医療に利用するように培養後の細胞を用いる際には、培養容器に接着したままで使用するような一部の場合を除き、細胞を培養容器から剥離させ、浮遊状態にする必要がある。従来は、このような細胞の脱着、剥離のために、トリプシンやコラーゲナーゼ等の蛋白質分解酵素を用いている。しかしながら、酵素処理だけでは完全に細胞を剥離することは難しく、また細胞が培養容器表面から剥離しても、細胞の凝集塊が残ることが多い。そこでこのよう場合には、通常、ピペットを用いて、培養液あるいは洗浄液を培養容器の細胞接着面に噴出させて剥離あるいは、細胞塊の解離させる操作を繰り返す、ピペッティング操作を行うことになる。このピペッティング操作は、培養操作において重要であるが、噴出させる速度の調整や噴出方向と培養容器内の細胞接着面との角度の調節等、その操作には熟練を要することから、作業者を限定されたものとなっていた。また、培養液等を無菌的に培養容器内に注入する方法としては、たとえば、以下のような方法があった：
（１）培養液容器にセットされたチューブをチュービングポンプでしごいて、培養液を培養容器へ注入する方法：および
（２）培養液容器内へピペット等の器具を挿入し、培養液を採取し、この培養液を培養容器へ注入する方法；
しかしながら、このような注入方法では、培養液を培養容器内へ注入する際にチューブやピペット等の先端に培養物が付着し、別の培養容器へ混入する可能性やピペット等の器具に培養液を採取するためのガスを介した相互混入の可能性もあった。しかも、この培養物が異なる細胞種であったり、培養物に細菌や病原体が付帯していたりした場合、その影響は問題となる可能性があった。再生医療を目的とした培養において、多ロット並行培養が有用であるため、その影響は特に大きかった。
細胞培養においても、機能や活性が高い細胞を得るために生体内で各組織および各細胞が置かれている生理的な環境を模倣した培養環境の制御は重要であるが、この生体内における環境因子には、張力、箭断力、静圧力、圧迫力等の物理的な力がある。たとえば、血管内皮細胞は血流による箭断力により細胞形態が変化し、またサイトカイン産生量が増減することが知られている。従来では張力、箭断力および静圧力に関する培養環境の制御法や装置についての報告は多いが、圧迫力を制御する装置の例はない。
一方、このような培養工程において、培養物の培養経過の分析・測定も重要である。特に、（１）培養中の細胞や組織の「量」および（２）培養中の細胞や組織の「質」の分析・測定は、培養の継続、もしくは中止、培養条件の変更等に重要である。たとえば、細胞や組織の量的な変化を経時的に測定することによって、適切な培養操作（培養の継続や培養の完了の判断等）がスムーズに行うことができるし、また、培養している細胞の代謝活性や生死、分化状態等の質的情報の分析や測定によって、細胞の状態が正確に把握することもできる。しかしながら、従来のこのような測定手段としては、培養容器中の細胞や組織の一方向（主に培養容器上方から）から光学顕微鏡等による観察、画像解析が一般的であり、このような測定手段では、一方向から得た情報（平面的な情報）、すなわち、細胞が接着している面積の総和（細胞接着面）に対する情報しか得ることができない。さらに、細胞には接着面に対しての厚みが多種多様であり、光学顕微鏡観察像の画像解析からだけでは、培養中の細胞や組織の量的測定が困難である。
さらに、再生医療等の目的で、細胞や組織を培養する場合、前記のとおり、「小スケール、多ロット並行培養」であるため、従来の抜き取り検査（侵襲性検査）によって細胞等を測定するには同ロットの培養を多数行う必要性が生じる。また、侵襲性検査のような細胞を破壊して検査・測定を行うのでは、生産効率が大幅に低下する。さらにまた、患者の身体へ移植する目的がある以上、医薬品生産よりもより厳正な品質管理が要求されるため、測定用の器具や装置等が、培養中の細胞や組織、培養液等に直接の接触をできる限り避けることが重要である。そのため、再生医療を目的とした細胞の培養には、自動化された培養装置が有用であり、さらに、非侵襲性（すなわち、非接触性、非破壊性）を特徴とし、かつ、自動化された測定手段も有用であると期待されている。
非侵襲性の測定方法としては、たとえば、ＫＥＹＥＮＣＥ社の「レーザーフォーカス変位計」や日本バイナリー社の「波長コンフォーカル方式」等が開発されてきている。しかしながら、これら非侵襲性の測定装置は、静置接着培養においては例がなく、また一連の培養操作とともに分析や測定作業が自動化されたものはない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みて、従来のような特殊な無菌施設を必要とせず、極めてクリーンな環境で培養でき、しかも高度な熟練性を有した限られた作業者に依存することなく、簡便、かつ効率的に、メンテナンスも容易に、培養経過に応じて培養環境の環境因子である圧迫力等も任意に、自動的に制御が可能として、長期間の培養を可能とする、新しい培養装置を提供することを課題としている。また、この出願の発明は、異なる細胞種や組織種間での相互混入防止をも可能とした新しい自動培養装置を提供することを課題としている。
さらにまた、この出願の発明は、生体由来の細胞や組織をその量および／または質を、非侵襲的、かつ、３次元的に分析・測定を行うことのできる測定装置を具備した新しい自動培養装置を提供することを課題としている。
【発明の開示】
この出願は、前記の課題を解決するための発明としてなされたものであって、閉鎖され、かつ、無菌状態の培養装置内で一連の培養操作を自動化した培養装置を提供する。またこの出願は、細胞や組織の量および／または質を非侵襲的、かつ、３次元的な分析・測定操作を自動化した測定装置をも提供する。
すなわち、この出願の発明は、第１には、閉鎖され、かつ、無菌状態の内部空間を有する箱体の培養装置内で、培養容器において生体由来の細胞または組織を培養する自動培養装置であって、培養装置の箱体内に複数に区分けされた空間、開閉窓付きガスインキュベーター、培養液の供給装置と排出装置、培養状態の観察装置並びにこれら装置に培養容器を連続的もしくは断続的に移動させる移動装置が配置されているとともに、培養状態の観察装置からのデータ信号によって、前記の装置の少なくともいずれかのものの動作を電気信号により指示制御する指示制御装置が具備され、交叉汚染を防止することができることを特徴とする生体由来の細胞または組織の自動培養装置を提供する。
また、この出願の発明は、第２には、培養装置箱体内の一部または全部に滅菌ガスを導入する設定装置が具備されていることを特徴とする自動培養装置を、第３には、滅菌ガスが、オゾンガスであることを特徴とする自動培養装置を、第４には、培養装置箱体内の一部または全部を外部よりも陽圧とする環境条件の設定装置が具備されていることを特徴とする自動培養装置を提供する。
第５には、培養装置の箱体内が複数の空間に区分けされ、空間同士は閉鎖可能とされていることを特徴とする自動培養装置を提供し、第６には、培養装置の箱体内における複数の空間の区分けには、遮断板により区分けされ、この遮断板は培養容器の移動のための開閉自在な遮断板ドアを具備されていることを特徴とする自動培養装置を提供する。
さらに、この出願の発明は、第７には、細胞または組織の洗浄のための装置が配設され、培養容器のこの洗浄装置への移動と、それらの動作が指示制御装置により行われることを特徴とする自動培養装置を、第８には、薬剤添加のための装置が配設され、培養容器のこの薬剤添加装置への移動と、それらの動作が指示制御装置により行われることを特徴とする自動培養装置、第９には、培養容器の中の培養物が、培養容器の外部に対して遮断性を保持して培養容器内外へ移動することを特徴とする自動培養装置を提供する。
さらにまた、この出願の発明は、第１０には、上記いずれかの自動培養装置であって、培養装置箱体内には培養容器から培養物を剥離もしくは回収のための装置を配設され、この装置への培養容器の移動が移動装置により可能とされていることを特徴とする自動培養装置を提供する。
第１１には、剥離または回収のための装置が、振動装置または回転装置であることを特徴とする自動培養装置を、第１２には、以上いずれかの自動培養装置であって、培養装置箱体内には培養環境条件を変更する圧迫装置が配設され、この装置への培養容器の移動が移動装置により可能とされていることを特徴とする自動培養装置を提供し、第１３には、圧迫装置は磁石の着脱もしくは機械的押圧によるものであることを特徴とする自動培養装置を提供する。
また、この出願の発明は、第１４には、培養液、洗浄液、もしくは薬剤が充填されている容器が再使用されないことを特徴とする自動培養装置を、第１５には、培養液、洗浄液、もしくは薬剤の培養容器への供給が、滅菌済シリンジを介してなされることを特徴とする自動培養装置を、第１６には、培養液、洗浄液、もしくは薬剤の培養容器への供給が、培養液、洗浄液もしくは薬剤の容器に接続された滅菌済チューブを介してなされることを特徴とする自動培養装置を提供する。
さらにまたこの出願の発明は、第１７には、生体由来の細胞または組織を培養する培養容器を用いた静置接着培養において、生体由来の細胞または組織の量および／または質の分析測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備されていることを特徴とする自動培養装置を提供し、第１８には、培養容器には、電気容量測定用電極が備えられ、かつ、２個以上の電気容量測定用電極の間に培養物が配置され、電気容量測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備した自動培養装置を、第１９には、培養容器上方にＸＹスキャニング装置付き変位計を設置し、変位計による細胞の厚み測定に基づいて、生体由来の細胞または組織の分析測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備した自動培養装置を、そして第２０には、培養容器上方にＸＹスキャニング装置付き蛍光測定装置を設置し、蛍光測定に基づいて、生体由来の細胞または組織の分析測定を行うことを特徴とする非侵襲性測定装置を具備した自動培養装置をも提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、培養操作および培養環境の自動制御化を行った培養装置の実施形態を例示した概略図である。
図２は、図１における培養装置を遮断板により複数に区分けした培養装置の実施形態を例示した概略図である。
図３は、図１における培養装置に空気制御を施し、清浄、かつ、陽圧に維持させた培養装置の実施形態を例示した概略図である。
図４は、図１における培養装置に回収培養物貯槽、回収培養物移送装置および振動・回転装置を備えた、本発明の培養装置の実施形態を例示した概略図である。
図５は、振動・回転装置を拡大例示した模式図である。
図６は、図１における培養装置に圧迫装置を備えた培養装置の実施形態を例示した概略図である。
図７は、図６における圧迫装置で、磁石式圧迫装置の拡大模式図である。
図８は、図６における圧迫装置で、隔離式圧迫装置の拡大模式図である。
図９は、自動培養装置に設置される滅菌済シリンジを例示した模式図である
図１０は、自動培養装置に設置される滅菌済チューブを例示した模式図である
図１１は、電気容量測定による自動測定装置の実施形態を例示した模式図とその要部の拡大図である。
図１２は、変位計測定による自動測定装置の実施形態を例示した模式図である。
図１３は、蛍光測定による自動測定装置の実施形態を例示した模式図である。
なお、図中の符号は、次のものを示す。
１  培養装置
２  培養容器
３  ガスインキュベーター
４  ガスボンベ
５  ガス供給装置
６  培養容器移動装置
７  新鮮培地貯槽
８  新鮮培地供給装置
９  使用済み培地貯槽
１０  使用済み培地移送装置
１０１  回収培養物貯槽
１０２  回収培養物移送装置
１１  顕微鏡観察ステージ
１２  顕微鏡ＣＣＤカメラ
１３  観察画像データ移送装置
１４  計測データ移送装置
１５  制御信号伝達装置
１６  制御コンピュータ
１７  遮断板
１８  遮断板ドア
１９  インキュベート区分領域−ａ
２０  操作および測定区分領域
２１  インキュベート区分領域−ｂ
２２  滅菌ガス発生装置
２３  滅菌ガス導入管
２４  インキュベート区分領域−ｂ用滅菌ガス導入弁
２５  操作および測定区分領域用滅菌ガス導入弁
２６  インキュベート区分領域−ａ用滅菌ガス導入弁
２７  インキュベート区分領域−ｂ用滅菌ガス排出弁
２８  操作および測定区分領域用滅菌ガス排出弁
２９  インキュベート区分領域−ａ用滅菌ガス排出弁
３０  滅菌ガス排出管
３１  滅菌ガス排出装置
３２  除菌フィルター
３３  返送風管
３４  排出風管
３５  外気取り込み管
３６  返送風弁
３７  排出風弁
３８  外気取り込み弁
３９  空気循環ポンプ
４０  培養装置内圧力計
４１  圧力信号伝送装置
４２  圧力制御器
４３  ポンプ運転制御信号
４４  振動・回転装置
４５  振動発生器
４６  回転盤
４７  培養容器の圧迫装置
４８  圧迫装置
４９  培養液
５０  培養物
５１  錘
５２  電磁石
５３  電流回路
５４  スイッチ
５５  伸縮性培養容器上蓋
５６  圧迫物
５７  作用軸
５８  上下駆動装置
５９  滅菌包装
６０  ピストン部
６１  シリンダー部
６２  滅菌済み培養液
６３  キャップ
６４  培養液容器
６５  チューブ
６６  ポンプ
６７  培養容器
６８  細胞
６９  電極
７０  キャパシタンス計
７１  ＸＹスキャンニング装置
７２  変位計
７３  レーザー光
７４  蛍光測定装置
７５  励起光
７６  蛍光
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明は、上記のとおりの構成によって、閉鎖され、かつ、無菌状態の培養装置内で細胞または組織の培養の一連の培養操作および各種の培養環境制御を自動化した培養装置であることを特徴としており、さらには、培養装置内が複数の空間に区分けされていることを特徴としてもいる。
またこの出願の発明は、細胞や組織等の培養物に対して、非侵襲的に培養物の特性や状態等を測定でき、かつ、これら一連の測定作業を自動化された測定装置であることを特徴としてもいる。
そこで以下にこの出願の発明について、その実施の形態について詳しく説明する。
まず、この出願の発明における「無菌状態」とは、クリーン度がクラス１０００以下、望ましくは１００以下としている。
また、この出願の発明の自動化培養装置が対象としている細胞または組織について説明すると、これらは、いずれも生体由来である。ここで、「生体」とは、植物、昆虫および動物であり、動物としては鳥類、爬虫類、両生類、魚類、哺乳類等が挙げられる。さらに、哺乳類としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネズミ、ウマ等が例示できる。
培養する「細胞」は、いかなる由来の培養細胞でもよく、たとえば植物細胞、昆虫細胞、動物細胞があり、また異種由来の細胞同士あるいは細胞とコラーゲンゲル膜、繭糸、マイクロチップやナイロンメッシュ等の非細胞との融合細胞でもよい。もちろん、初代細胞や株化細胞でもよい。特に動物細胞であることを好ましい態様としている。さらに、動物細胞における初代細胞としては、ラット初代肝細胞、マウス初代骨髄細胞、ブタ初代肝細胞、ヒト初代臍帯血細胞、ヒト初代骨髄造血細胞、ヒト初代神経細胞等が例示される。また、株化細胞では、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞、ヒト子宮ガン由来のＨｅＬａ細胞、ヒト肝ガン由来のＨｕｈ７細胞等が例示できる。また、これら細胞にプラスミド導入やウイルス感染等の遺伝子操作により得られた細胞もこの出願の発明に用いることができる。なお、「初代細胞」とは、一般に生体から細胞を採取して、５０回程度の限られた回数のみ増殖および分裂する細胞を指し、「株化細胞」は、生体から細胞を採取した後も、５０回以上の増殖および分裂する細胞のことを言う。
一方、「組織」とは、たとえば肝臓、心臓、腎臓、皮膚、骨、軟骨、骨髄等や、これら例示した組織から派生して形成された組織等が挙げられる。
細胞を培養する際、任意の種類の細胞または組織を得るため、分化を促進させる因子として分化誘導因子と呼ばれる薬剤を用いることもあるが、この種々の分化誘導因子の中から、最も適した分化誘導因子を用いるには、分化前の細胞の種類と分化後に得られる細胞の種類に依存する。また、単独あるいは複数の分化誘導因子の利用が可能である。これら分化誘導因子として、赤血球細胞に分化誘導させるエリスロポエチン、骨芽細胞への分化誘導を促進させるｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）、肝実質細胞等への分化誘導を行うｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、軟骨細胞へ分化を促進させるｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）等が例示できる。
この出願の発明における移植に用いる細胞または組織の由来および移植対象は、両者が同じ個体である場合の自家移植、両者が同じ生物種であるが、個体が異なる場合の多家移植、または両者が異なる生物種である場合の異種移植等が例示できる。
そして、この出願の発明に用いる「培養容器」については、その素材はいかなるものでも良く、たとえばプラスチック製、ガラス製等がある。たとえば、プラスチックの素材としては、セルロース等の天然繊維、ポリスチレン、ポリスルフォン、ポリカーボネイト等の合成化合物およびこれらを組み合わせた混合物等がある。また、ポリ乳酸、ポリグリクロン酸等のような生体吸収性または生体分解高分子を用いてもよい。さらに、これらプラスチック素材をコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン等の天然細胞外マトリックスやエチレンビニルアルコール共重合体等の人工化合物によりコーティングし親水化させて、培養容器として利用してもよい。ジエチルアミン、ジエチルアミノエチル等により修飾したものやプラズマ放電処理等を施し、表面に荷電基を導入したものも利用できる。
このような培養容器は、一般の研究室や実験室で使用されることを主な目的として設計されて市販されているものでもよく、その内容積は一般的には１００μＬ〜５００ｍＬであるが、大量培養用の培養容器を使用することもできる。また、培養容器内に細胞や組織を接着や固定をする担体を含ませた培養容器も利用できる。この場合の担体としては、不織布、織物、ゲル、発泡体、繭糸、針金、凍結乾燥された多孔体等が例示できる。さらにまた、培養容器内での物質の移動阻害、促進、選択あるいは細胞の接着等を目的とした限外濾過膜、精密濾過膜、逆浸透膜等のような膜を内部に含ませた培養容器を使用することもできる。
また、培養容器の形状は、受け皿部と蓋部とからなるディッシュ型、液体等を出し入れする開口部が一つまたは複数備えたフラスコ型が例示できる。ディッシュ型の培養容器において、ディッシュ内が複数に区分けされたマルチウェル型やフラスコ型の培養器において、内面の全部または一部がガス透過性を有する多孔質膜からなるものもあり、これらも当然に使用することができる。
この出願の発明における、「培養液」および「培養操作」において説明すると、基本的には公知の組成成分および方法を用いることができる。もちろん、これに限定されることはない。「播種操作」についても、この出願の発明により自動化が可能である。たとえば、培養物が入った任意の容器やカートリッジ等を、培養装置内に用意された培養容器に培養物を播種するための装置である播種装置に設置し、該播種装置から該培養物を該培養容器に注入あるいは播種する等が考えられる。なお、「培養液」において、血清含有あるいは血清不含でもよく、また必要に応じ各種の増殖因子や分化誘導因子を加えて利用してもよい。増殖因子や分化誘導因子としては、表皮成長因子、血小板由来成長因子、トランスフェリン、インシュリン、血清アルブミン等が例示され、またコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックス等も例示できる。これらは、脳下垂体、黄体、網膜、腎臓、胸腺、胎盤等の生体の臓器、組織、細胞等から抽出される場合、また遺伝子操作技術等の遺伝子工学的に製造された場合も含む。さらに、これら因子の修飾体であって増殖因子や分化誘導因子として作用するものも含み、たとえば上記の因子群のアミノ酸配列に別のアミノ酸を付加したもの、あるいは他のアミノ酸に置換したもの、またあるいはアミノ酸の一部が欠損したもの等が例として挙げられる。さらにまた、上記増殖因子において、由来によってタイプが異なる場合はヒト型でも他の動物型等でもよい。
「培養操作」としての「薬剤の添加」は、培養中の細胞または組織に特定の培地因子の添加を行う操作であり、通常は該培地因子の溶液を培養容器内の培養液に注入することを意味している。該培地因子としては、血清、各種の増殖因子や分化誘導因子、グルコースやサッカロース等の糖類、アンピシリンやＧ４１８、テトラサイクリン等の抗生物質、ベクターウイルス等がある。
この出願の発明の培養装置では前記のとおり、一連の培養工程が自動化されており、そして培養環境の制御も自動化されている。ここで、「培養環境の制御」とは、培養における細胞の代謝、形態、機能等に影響する要因を操作する事である。コンタミネーション防止のための滅菌ガスの導入操作や培養中の細胞や組織の形態観察、細胞数の計測、活性測定等の分析操作も含まれる。培養中の細胞や組織に影響を及ぼす要因の操作は、具体的には培養液の温度、ガスの濃度、培養液内の静圧、培養液への栄養分供給速度、培養液中の老廃物濃度、培養液のｐＨ等が例示できる。そして、培養工程および培養環境の制御が自動化されることにより、異なる細胞間の交叉汚染等のコンタミネーションの防止、細胞や組織の増殖挙動にも対応、作業効率の向上等の効果が得られる。またこの出願の発明において、培養のために使用する「ガス」については、気体であればいかなるものでもよく、好ましくは炭酸ガスとしている。
なお、上記の「交叉汚染」とは、自動培養装置の箱体内で、複数に区分けされている空間において、ある区分け空間が、培養中のある細胞や該細胞に感染しているウイルス等や雑菌、化学物質、あるいは、培養中の培養物とは由来の異なるものの混入等によって汚染され、この汚染の影響が他の区分け空間にも伝播し、汚染されることを指す。
さらにこの出願の発明の自動培養装置では、培養装置箱体内を複数の空間に区分けされたものとしてもいる。ここで、「区分け」とは、培養装置箱体内の空間が複数の閉鎖された空間に区分け可能な状態をいう。隣接する区分けされた空間同士の間に、たとえば遮断板が置かれて、遮断閉鎖されており、必要に応じて、開閉が可能となっている。なお、該遮断板の表面積に占める開口部の割合は、好ましくは１０％、さらに好ましくは１％未満とすることが考慮される。これにより、多ロットの細胞または組織が並行に培養でき、さらに各ロットの細胞や組織の増殖挙動にも対応でき、さらにまた区分けごとの滅菌や洗浄等のメンテナンスが容易となり、また遮断板によって他の区分けと遮断することによって、培養と前記メンテナンスが同時に行うこともできる。また、このような構成とすることにより、前記のとおりの交叉汚染等のコンタミネーションを防止することもできる。
上記「遮断板」は、ステンレススチール等の金属類、プラスチック製あるいはガラス製等、培養装置箱体内を複数の空間に区分けすることのできるものであれば、その材質等は特に制限されるものではない。また、この「遮断板」には、培養容器の移動を円滑に行うために開閉自在な「遮断板ドア」が具備されていることが好ましい。さらにこの「遮断板ドア」の開閉動作の機構としては、開閉動作を電気信号により指示制御することによって自動開閉とすることもできる。
また、この自動開閉の動作機構とし、センサーを用いることも考慮することができる。たとえば、遮断板ドア近傍に培養容器の重さや動き等を感知するセンサーを配置して、培養容器が遮断板ドア近傍に移動してきた際、前記のセンサーが反応して遮断板ドアが自動開閉するように指示制御装置を設定する等が考えられる。
上記の「滅菌」操作には、たとえば、滅菌ガス、乾熱滅菌、γ線滅菌、光滅菌等が挙げることができるが、培養装置の箱体内全体を確実に滅菌することができ、また滅菌時間の短縮等を考慮すると、滅菌ガスの導入による滅菌操作が好ましい。もちろん、この滅菌ガスの導入操作も、指示制御装置の制御によって自動化することができ、培養装置箱体内の複数の空間に区分けされた一部または全部に任意で導入することもできる。また、この「滅菌ガス」は、たとえば、オゾンガス、エチレンオキサイド（ＥＯＧ）、過酸化水素蒸気（ＶＨＰ）等が挙げることができるが、細胞培養サイクルの効率化を考慮すると、滅菌時間が短くて済むオゾンガスであることが好ましい。滅菌時間は、特に制限されるものではないが、培養装置の箱体内全体の滅菌および培養サイクルの効率化を行うことが望ましいという観点から、３０分から１０時間の範囲であることが好ましい。特に滅菌ガスをオゾンガスとした場合は、３０分から１時間の範囲で行うことが好ましい。
さらにまた、この出願の発明の培養装置では、連続的または間欠的、または周期的に有限方向から圧迫しながら培養物を培養することを可能としている。これにより、培養環境因子の一つである圧迫力の自動制御を可能とする。圧迫の動力源としては、たとえば重力および磁石の磁力を利用することができる。なお、「磁石」は、磁力を有するものであればいかなるものでもよく、また固体でも液体でもよいが、固体が好ましい。磁力の大きさは一定でもよいし、電磁石のような任意に変化できるものでもよい。
この出願の発明の自動培養装置は、培養液、洗浄液、もしくは薬剤が充填されている容器が再使用されないことを特徴とし、また培養容器の中の培養物が、培養容器の外部に対して遮断性を保持して培養容器内外へ移動することを特徴としている。これらにおける「再使用されない」とは、培養液、洗浄液、もしくは薬剤を各容器から採取し、１度に１個以上の培養容器へ注入した後、これら培養液等が充填されていた各容器は、１度の培養作業において、再使用しないことを意味する。前記の培養液等が充填される各容器は、１度の培養作業が完了後、十分に洗浄および滅菌（オートクレーブ滅菌やＵＶ照射滅菌、γ線滅菌等）をすることによって、次の培養作業に利用することができるが、他の培養容器への供給・混入の防止を確実にするためには、前記の各容器は、使い捨て（ディスポーザブル）であることがより好ましい。これによって、１個以上の培養容器に培養液等を供給した後、別の細胞種等が培養されている培養容器への供給（混入）を防止することとなる。なお、「１度の培養作業」とは、この出願の発明に具備されている制御コンピュータに入力・指示された一連の培養操作のことであり、この１度の操作時間は、培養の目的や環境等によって変動するため限定されないが、３０分以内が好ましい。また、培養容器の数量においては、３０個以内が好ましく、５個以内がさらに好ましい。「遮断性」とは、培養容器外の外気（空気や炭酸ガス等）やピペット、培養容器等の培養用器具との接触がないことを意味する。これによって、培養容器における密閉性をより高くすることができるため、培養物や培養液等の採取・注入の際の細菌等の混入の可能性をさらに減少させることができる。そして、培養液、洗浄液、もしくは薬剤の培養容器への供給が滅菌済シリンジ、もしくは培養容器に接続された滅菌済チューブを介してなされることも特徴としている。
「滅菌済シリンジ」とは、各種の滅菌方法で滅菌されたシリンジ（注射筒）であり、このシリンジの形状としては、容器部とピストン部から構成されている。注射針の有無は問わず、またその材質はプラスチック製（ポリエチレン等）やガラス製でもよい。また、「滅菌済チューブ」とは、滅菌済シリンジと同様に各種の滅菌方法で、滅菌されたチューブ（管状）である。内径が、０．１ｍｍ以上、かつ、２０ｍｍ以下が好ましい。前記の滅菌方法としては、たとえば、γ線照射や滅菌ガス、オートクレーブ等が挙げられる。なお、これら滅菌済シリンジおよび滅菌済チューブは、培養容器間での相互混入を防止するため、ディスポーザブル（使い捨て）のものが好ましい。
この出願の発明は、たとえば、培養容器上方にＸＹスキャニング装置付きの各種装置等を利用した、電気容量測定、変位計測定、もしくは、発光測定に基づいて、細胞または組織の量および／または質の分析測定を行うことを可能としている。しかも、この分析測定は、細胞や組織に対して非侵襲的に観察や分析測定を行うことを可能としている。
前記の「電気容量測定」としては、たとえば、２個以上の電極の間に配置された培養容器（培養容器内には、培養中の細胞や組織を含む）に、周期的に電圧を加えた際に電気容量を起因として生じる電流周期の位相の差異を検出して、電気容量を計算する方法等がある。細胞に存在する細胞膜は、脂質２重膜となっており、絶縁体であるため、誘電率を有している。塩類を含む培養液中において、脂質２重膜で包まれた細胞に電圧を加えた場合、電気容量の大きさは、細胞膜の表面積に比例し、細胞膜の厚みに反比例することから、電気容量を測定することによって細胞の大きさや厚みが測定することができる。
「変位計測定」は、種々の原理のものが利用されるが、たとえば、被測定物（培養中の細胞や組織等）にレーザー光を照射し、反射してくる光の計測を利用したレーザー変位計、可視光の共焦点を利用した波長コンフォーカル方式等を採択することができるが、これらに限定されるものではない。
また、「蛍光測定」は、たとえば、蛍光色素化合物、蛍光蛋白質、蛍光半導体（量子ドット）等、蛍光を発する物質（蛍光物質）を検出することによって、細胞や組織等の特性や形状等を測定する。蛍光物質としては、蛍光蛋白質が好ましく、特に内在性の蛍光蛋白質が好ましい。たとえば、細胞中に必ず存在するＮＡＤＨ等が挙げられる。また、外来性の蛍光蛋白質としては、たとえば緑色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質等が挙げられる。また、蛍光測定装置の励起光波長および励起光強度は、特に限定されるものではないが、励起光波長は、たとえば３００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲であることが好ましく、励起光強度は、細胞に対するダメージを考慮すると１００ｍＷ以下が好ましい。蛍光測定方式も、フォトマルチプライヤ方式やＣＣＤ方式等が例示でき、適宜に採択することができる。
これらの測定方法は、コンピュータ制御によって自動化され、また非侵襲的、かつ、３次元的に細胞や組織を観察、分析の測定ができる。「非侵襲的」とは、培養物である細胞や組織に接触する必要がなく、またホモゲナイズ等のような破壊的な操作も必要のない、細胞や組織に対して極めて負荷の少ないことを意味し、「３次元的」とは、平面的な情報だけでなく、細胞や組織の形成や形状等の立体的な情報、すなわち細胞の厚みや形状等のことを意味する。そして、細胞や組織の「量および／または質」とは、培養されている細胞や組織の、増殖度や成長度、あるいは、形状や各種の分泌物等のことである。
次に、添付した図面に沿って、この出願の発明の実施の形態についてさらに詳細に説明するが、この出願の発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、添付した図面では、ガスボンベ４の設置場所を培養装置１内として例示してあるが、培養装置１の外でもよい。また図面に例示していないが、細胞含有培養液から細胞と培養液とを分離するための装置として、培養装置１内に遠心分離装置等の設置も可能としている。
図１は、培養工程および培養環境制御が自動化された実施形態を例示している。この図１の例では、閉鎖された空間を有する箱体である培養装置１の内部には、ガスボンベ４およびガス供給装置５により、ガス濃度を一定に保つことが可能で、培養物を有した培養容器２を静置可能とした箱体であるガスインキュベーター３があり、この中に静置された培養容器２の中で細胞または組織が培養される。また、このガスインキュベーター３には、培養容器２をガスインキュベーター３の内外を円滑に移動するための開閉自在な遮断板ドア１８が具備されている。培養中の培養容器２は、培養容器移動装置６により、任意に順行または逆行に培養装置１の内部を移動する。この移動の過程で、新鮮培地貯槽７内の新鮮培地供給装置８による培養液吸引量の位置制御によって一定量吸引し、培養容器２へ培養液が注入されたり、培養容器２の培養液上清を使用済み培地移送装置１０の下端を培養容器２内に入れ、貯槽内が陰圧に保たれた使用済み培地貯槽９に吸引排出されたりする事により、連続的あるいは断続的に培養液の供給および交換が可能とされている。また、図に示していないが、緩衝液等の洗浄液が入った貯槽や、薬剤の入った貯槽も培養装置１内に設置することによって、洗浄や薬剤を培養液に加えることも可能とされる。もちろん、これら各々の工程を繰り返したり、あるいはスキップしたりすることも培養容器移動装置６と制御コンピュータ１６により任意に制御可能とされている。また、培養容器２は顕微鏡ステージ１１へも移動可能で、たとえば顕微鏡ＣＣＤカメラ１２を使用して観察され、その観察画像データは観察画像データ移送装置１３を介して制御コンピュータ１６に送られる。また、温度、湿度、ガス濃度等の培養環境のデータが培養装置１から計測データ移送装置１４を介し、同様に制御コンピュータ１６に送られ、これらのデータを元に演算を行い、培養容器２の移動や遮断板ドア１８の開閉、温度制御のためのデータ、ガス濃度の制御等の制御信号が制御信号伝達装置１５を通じて培養装置１に伝達される。このように、ほとんど全ての培養操作が培養装置１内で行われるため、培養中に培養装置外からの化学物質、埃や雑菌等の汚染発生の可能性は極めて低い。
図２では、図１に例示した培養装置１に遮断板１７によって複数の空間に区分けされている実施の形態を例示している。培養装置１の内部は、遮断板１７により３つの空間、すなわちインキュベート区分領域−ａ  １９、操作および測定区分領域２０、インキュベート区分領域−ｂ  ２１、に仕切られている。培養容器２は、遮断板１７にある開閉自在な遮断板ドア１８を通じて、各空間に任意に順行または逆行で移動することが可能で、この３つの空間を往来可能とされている。また、遮断板ドア１８を閉じることによって３つの空間は互いに封鎖され、独立した空間となる。滅菌ガス発生装置２２より滅菌ガスが、滅菌ガス導入管２３および滅菌ガス導入弁２４、２５および２６を介して、任意の空間に注入されて、滅菌が可能とされている。さらに、この図中の例示したインキュベート区分領域−ａ  １９内に滅菌ガスを注入する際、任意にガスインキュベーター３の遮断板ドア１８の開閉を行うことによって、ガスインキュベーター３の内部にも滅菌ガスを注入することが可能となっている。滅菌中の空間に注入された滅菌ガスは他の空間には全く混入しないため、影響を及ぼさない。滅菌終了後、滅菌ガスは、滅菌中であった空間の滅菌ガス排出弁２７、２８および２９および滅菌ガス排出管３０を介して、滅菌ガス排出装置３１に排出され、該空間内には滅菌ガスは残存しない。これにより、長期間に及ぶ培養期間中でも、随時培養装置内を滅菌でき、極めてクリーンな環境を維持できる。これら遮断板ドア１８の開閉および滅菌ガス操作も制御コンピュータ１６により任意に制御でき、しかも自動開閉式とすることもできる。なお、遮断板１７の数を増減する事によって、区分けされる空間数も増減でき、その結果、より多くの培養操作工程が同時に行う事ができ、また多くのロットの培養細胞の培養ができる。
図３では、圧力制御の機能を備えた培養装置１の実施形態を例示している。この例では、培養装置１の内部の気体は、排出風管３４および排出弁３７を介して空気循環ポンプ３９に送られる。ここで外気取り込み管３５および外気取り込み弁３８を介し、培養装置１の外の気体も取り入れ、両者を合わせた気体が返送風管３３および返送風弁３６を介し、さらに除菌フィルター３２を通過し培養装置１の内部に戻される。この気体の循環により、培養装置１内は、清浄な空気が維持される。培養装置１内部の静圧は、培養容器内圧力計４０により測定され、そのデータは圧力信号伝送装置４１を介し圧力制御器４２に送られる。そして、培養装置１内を外部より陽圧に保つために、圧力制御器４２は、排出風速度、外気取り込み速度、返送風速度等の設定値を演算、計算し、その結果をポンプ運転制御信号４３として空気循環ポンプ３９に伝達する。その結果、培養装置１の内部の空気は、常時清浄に維持され、また培養装置外より陽圧に保持される。このため、培養装置の外部からの汚染物質の混入も極めて効果的に抑えられる。またこの図３では、圧力制御器４２で陽圧の制御を行っている例示をしたが、制御コンピュータ１６をさらに連結設置させた場合、制御コンピュータ１６による圧力制御器４２の制御が可能となり、この制御を介して、陽圧の制御も可能となる。
図４では、培養装置１に回収培養物貯槽１０１、回収培養物移送装置１０２および振動・回転装置４４を備えた実施形態を例示している。なお、図４では、顕微鏡ＣＣＤカメラ１２、観測画像データ伝送装置１３および制御コンピュータ１６の図による例示は省略しているが、顕微鏡ＣＣＤカメラ１２および観測画像データ伝送装置１３としての機能動作、また制御コンピュータ１６による、培養装置１内の環境等の各制御機構は働いている。培養容器２中の細胞は、培地置換、洗浄、酵素処理により細胞の脱着および剥離等といった一連の培養操作により、培養容器内部の細胞接着面から脱着する傾向がある。しかしながら、全ての細胞が脱着には至らなく、また細胞同士も凝集している場合が多々ある。この状態にある培養容器２を培養容器移動装置６により、振動・回転装置４４に移動させて、任意に振動および回転を与えることで、ほとんどの細胞が脱着および剥離し、また凝集した細胞も解離し、細胞が均一に分散した細胞懸濁液を得ることができる。この細胞懸濁液を含んだ培養容器２を培養容器移動装置６により回収培養物貯槽１０１まで移動させ、回収培養物移送装置１０２を介して、回収培養物貯槽１０１に回収される。拡大概略図として図５に例示したように、振動・回転装置４４では、振動発生器４５により培養容器２に振動が伝えられ、また回転盤４６により培養容器２に回転を与えることができる。
図６は、培養装置１に培養容器圧迫装置４７を備えた例を示したものである。なお、顕微鏡ＣＣＤカメラ１２、観測データ伝送装置１３および制御コンピュータ１６の図による例示は省略しているが、設置および使用することはもちろん可能である。この例では、培養装置１内のガスインキュベーター３の中で、培養中の培養容器２の培養物に培養容器圧迫装置４７により任意の周期で、また任意の強度の圧迫力を加えることができるようにしている。このような圧迫力が加えられることによって、圧迫力という刺激によって、インターロイキン、サイトカイン、ＴＮＦ−αやキナーゼ等、種々の生体因子の活性化、抑制や分泌等の制御機構が働き、またこの刺激信号が次々と分子レベルで伝達（カスケード）され、その結果細胞や組織の成長に対する作用効果が得られ、細胞や組織の培養環境を制御できる。さらにまた、三次元培養の場合、圧迫により培養物が伸縮し、それにより培養物の外と中との間で強制的に培養液の流れが起こり、物質の移動が促進することも期待できる。培養容器の圧迫装置４７としては、各種の方式、機構によるものとすることができ、たとえば以下の図７および８が例示することができる。
そして図７では、磁石式の場合の培養容器圧迫装置４８の構造概略図を例示している。圧迫装置４８内の培養容器２の上蓋内側に錘５１が設置され、また培養容器２の上蓋の上には電磁石５２が設置され、電流回路５３およびスイッチ５４により、その磁力のオンオフを制御コンピュータ１６により自動制御するようにしている。図７−（Ａ）のように、電流回路がオンの状態であれば、電磁石の作用により錘５１は培養容器２内で上方に設置された電磁石５２に引き寄せられ、培養容器２内部の培養液４９中にある培養物５０から隔てられる。また図７−（Ｂ）のように、電源がオフの状態では、電磁石の作用は消失し、錘５１が培養物５０の上に落下して、培養物５０に圧迫力が加えられる。
また図８は、隔離式の場合の培養容器圧迫装置４８の構造概略図例示している。圧迫装置４８内にある培養容器２の伸縮性培養容器上蓋５５は、伸縮性のあるやわらかい素材で作製されている。一方、培養容器２の外側上部では上下駆動装置５８と作用軸５７との作用により圧迫物５６が、制御コンピュータ１６により任意、かつ、自動的に上下運動させることが可能とされている。図８−（Ｂ）に示したように、この圧迫物５６が下降した時、伸縮性培養容器上蓋５５を押し下げ、培養容器２内部の培養液４９中の培養物５０を圧迫する。また、図８−（Ａ）にあるように、圧迫物５６が上方に移動した時は、圧迫物５６は引き上げられ、伸縮性培養容器上蓋５５が通常の上蓋の形に戻り、培養物５０は圧迫されない。つまり、圧迫物５６の上下運動により、培養物５０に対する圧迫作用を制御する。
図９は、自動培養装置に設置される滅菌済シリンジを例示した模式図である。この滅菌済シリンジは、ピストン部６０とシリンダー部６１とからなり、シリンダー内部に滅菌済み培養液６２が入れられ、キャップ６３により密閉され、さらに包装５９によって無菌性が保持されている。新鮮培地貯槽７の代わりに、複数（必要量に応じて）の滅菌済シリンジを包装されたまま自動培養装置１内に設置して、ロボットアーム（図示せず）等によって、滅菌済シリンジを保持し、また所望位置へ移動し、ピストン部６０に適度な圧力をかけて、滅菌済み培養液６２を培養容器へ注入する。
図１０は、自動培養装置に設置される滅菌済チューブを例示した模式図である。この滅菌済チューブは、培養液容器６４とチューブ６５とからなり、培養液容器６４内に培養液６２が入れられており、チューブ６５の先端にはキャップ６３により密閉され、さらに包装５９によって無菌性が保持されている。前記の滅菌済みシリンダーと同様に、新鮮培地貯槽７の代わりに、複数（必要量に応じて）の滅菌済チューブを包装されたまま自動培養装置１内に設置して、ロボットアーム（図示せず）等によって、滅菌済チューブを保持し、また所望位置へ移動し、後付けされたポンプ６６に適度な圧力をかけて、滅菌済み培養液６２を培養容器へ注入する。
なお、前記の滅菌済みシリンジおよび滅菌済みチューブの包装５９およびキャップ６３は、自動培養装置１内で使用直前にロボットアーム等によって外される。また、培養液６２の容量は、培養容器１個分から数個分程度であり、使用後は廃棄されるため、異なる細胞種の培養容器間での相互混入を防止することができる。
図１１は、電気容量測定による自動測定装置の実施形態を例示した模式図と、その要部の拡大図である。培養容器６７内には、細胞６８が培養されており、培養容器６７の底面部には、２個の電極６９が配設されている。この電極６９は、キャパシタンス計７０と連結され、制御コンピュータ１６へと連結されている。このキャパスタンス計７０により得られるキャパスタンス値は、培養容器６７に接着している細胞６８の形状や状態によって変化し、その測定情報は制御コンピュータ１６に伝送され、分析され、細胞量や分化状態等、細胞の量および／または質が測定される。
図１２は、変位計測定による自動測定装置の実施形態を例示した模式図である。図１２に例示したように、たとえば光源を利用したものが利用できる。培養容器６７の上方には、ＸＹスキャニング装置７１に取り付けられた変位計７２があり、変位計７２からレーザー光７３が細胞に照射して、変位計７２にその光が反射する。この細胞上部と細胞下部からの反射の差異を測定することで、細胞の厚みを測定することができる。もちろん、変位計は光源を利用したものに限定されるものではない。
図１３は、蛍光測定による自動測定装置の実施形態を例示した模式図である。この図１３では、培養容器６７内には、細胞６８が接着培養されており、培養容器６７の上方には、ＸＹスキャニング装置７１に取り付けられた蛍光測定装置７４があり、この蛍光測定装置７４から励起光７５が細胞６８に照射される。そして、細胞６８から蛍光７６が発生し、この蛍光７６を蛍光測定装置７４で検出し、細胞６８の分化状態等を分析・測定することができる。
上記いずれの測定装置においても、自動培養装置１内に設置され、また、この測定装置から得られた細胞や組織の各種の情報（形態や、増殖速度、分泌物の観測等）は、制御コンピュータ１６に伝送、分析され、そしてさらに、この制御コンピュータ１６によって自動制御される。
【産業上の利用可能性】  この出願の発明によって、培養工程のほとんどが自動化され、特殊な無菌施設を必要とせず、極めてクリーンな無菌的環境で、しかも培養環境の環境因子も任意、かつ、培養経過に応じて自動制御が可能な培養装置が提供される。
また、この出願の発明の培養装置内は、複数の培養室に区分けされているため、ロットごとに異なる増殖挙動にも対応でき、また小スケールで多ロット並行の培養も可能となり、さらにまた個別に洗浄および殺菌等のメンテナンスも行うことができ、異なる細胞種や組織種間での相互混入防止をも可能なため長期間の培養が可能な培養装置が提供される。
さらにまた、この出願の発明は、培養される細胞や組織に対して非侵襲的、かつ、３次元的に観察や測定、分析等の一連の作業が自動化された測定装置を具備された自動培養装置が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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