(57)【要約】ＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤を提供する。また、式（Ｉ）2004017995.tif 000069［式中、Ｒ１は置換もしくは非置換の低級アルキル等を表し、Ｒ２は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル等を表し、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって水素、低級アルキル等を表し、ｎは０または１を表し、Ｘは−（ＣＨ２）２−等を表し、Ｙは式（ＩＩ）2004017995.tif 000070（式中、ＷはＣＨまたは窒素原子を表し、Ｚ１およびＺ２は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル等を表し、Ｚ３は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル等を表す）を表す］で表される含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を提供する。
2004017995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
【請求項２】
以下の１）〜４）
１）配列番号１２記載の塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
２）配列番号１４記載の塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
３）配列番号１８記載の塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
４）配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
のいずれか一つを有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
【請求項３】
以下の１）〜４）
１）配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
２）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
３）配列番号１７記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
４）配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、
のいずれか一つを有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
【請求項４】
式（Ｉ）
2004017995.tif 000067
［式中、Ｒ１は置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ５Ｒ６（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、Ｒ５およびＲ６が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＯＲ７（式中、Ｒ７は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表す）、−ＳＲ７ａ（式中、Ｒ７ａは前記Ｒ７と同義である）、−ＣＯＮＲ５ａＲ６ａ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａはそれぞれ前記Ｒ５および前記Ｒ６と同義である）、−ＣＯ２Ｒ７ｂ（式中、Ｒ７ｂは前記Ｒ７と同義である）、−Ｎ＋Ｒ５ｂＲ６ｂＲ８（式中、Ｒ５ｂおよびＲ６ｂはそれぞれ前記Ｒ５および前記Ｒ６と同義であり、Ｒ８は低級アルキル、低級アルケニル、またはアラルキルを表す）、ホルミル、カルボキシ、またはシアノを表し、
Ｒ２は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表し、
Ｒ３およびＲ４は同一または異なって水素、低級アルキル、またはハロゲンを表し、
ｎは０または１を表し、
Ｘは−（ＣＨ２）２−または−ＣＨ＝ＣＨ−を表し、
Ｙは式（ＩＩ）
2004017995.tif 000068
（式中、ＷはＣＨまたは窒素原子を表し、
Ｚ１およびＺ２は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、Ｚ１およびＺ２がそれぞれ隣接する２つの炭素原子と一緒になって置換もしくは非置換の芳香環または置換もしくは非置換の複素環を形成し、
Ｚ３は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表す）を表す］で表される含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
【請求項５】
Ｒ１が−ＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ５およびＲ６が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する請求の範囲第（４）項に記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
【請求項６】
Ｒ２が水素である請求の範囲第（４）項または第（５）項に記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
【請求項７】
Ｒ３およびＲ４が水素である請求の範囲第（４）項〜第（６）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
【請求項８】
ＺｌおよびＺ２がそれぞれ隣接する２つの炭素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環を形成する請求の範囲第（４）項〜第（７）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
【請求項９】
請求の範囲第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項１０】
請求の範囲第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
【請求項１１】
請求の範囲第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能の抑制剤。
【請求項１２】
以下の１）〜４）
１）ヒトを除く哺乳類動物にスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）を皮下および皮内投与することによりヒトを除く哺乳類動物における掻破行動を誘発する工程、
２）試験化合物存在下または非存在下でのＳＰＣにより誘発されたヒトを除く哺乳類動物における掻破行動の回数を測定する工程、
３）試験化合物存在下と試験化合物非存在下でのＳＰＣにより誘発されたヒトを除く哺乳類動物における掻破行動の回数を比較する工程、および
４）試験化合物からＳＰＣにより誘発された掻破行動の回数を減少させる物質を選択する工程、
を含む掻痒治療剤のスクリーニング法。
【請求項１３】
請求の範囲第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
【請求項１４】
掻痒の予防および／または治療剤の製造のための請求の範囲第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
【請求項１５】
掻痒が皮膚疾患、肝・胆道疾患、腎疾患、内分泌・代謝疾患、血液疾患、悪性腫瘍、神経疾患およびＡＩＤＳから選択される疾患に伴う掻痒である請求の範囲第（１）〜（３）項および第（１０）項のいずれかに記載の掻痒の予防および／または治療剤。
【請求項１６】
掻痒が皮膚疾患に伴う掻痒であり、該皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、湿疹・皮膚炎、蕁麻疹、痒疹、乾皮症、虫刺症、疥癬、真菌症、皮膚掻痒症、肥厚性瘢痕、乾癬、水疱症および薬疹から選択される皮膚疾患である請求の範囲第（１５）項記載の掻痒の予防および／または治療剤。
【請求項１７】
配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質の治療有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
【請求項１８】
請求の範囲第（２）項に記載の１）〜４）のいずれか一つのオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体の治療有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
【請求項１９】
請求の範囲第（３）項に記載の１）〜４）のいずれか一つの抗体の治療有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
【請求項２０】
掻痒の予防および／または治療剤の製造のための、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質の使用。
【請求項２１】
掻痒の予防および／または治療剤の製造のための、請求の範囲第（２）項に記載の１）〜４）のいずれか一つのオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体の使用。
【請求項２２】
掻痒の予防および／または治療剤の製造のための、請求の範囲第（３）項に記載の１）〜４）のいずれか一つの抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤に関する。また、本発明は、掻痒の予防および／または治療剤として有用な含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩に関する。さらに、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）が誘発する掻破行動の回数の減少を指標とした掻痒治療剤のスクリーニング法に開する。
【背景技術】  痒みは炎症性皮膚疾患をはじめとする多くの皮膚疾患において重要な症状であり、掻破行動を誘起して皮膚症状を悪化させる。また、内科的全身疾患の中にも慢性腎不全、糖尿病等の痒みを伴うものがある。代表的な掻痒性皮膚疾患の一つである蕁麻疹の痒みが、主にヒスタミンによって生じることは知られているが、それ以外の痒みの発生機序は明らかにされていない。治療には、抗アレルギー薬、抗ヒスタミン剤、ステロイド外用剤が用いられているが、すべての掻痒に有効とはいえない。また、ステロイド外用剤の長期使用は副作用を伴うことから、さらに優れた掻痒の予防または治療剤が求められている。
一方、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、ＧＰＣＲと略す）であるＧＰＲ４はスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を内在性リガンドとする受容体である［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７６巻、４１３２５−４１３３５頁（２００１年）］。ＳＰＣについては、ヒト表皮角化細胞においてＩＣＡＭ−１発現、ＴＮＦ−α産生を誘導すること［ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）、１１２巻、９１−９６頁（１９９９年）］、トランスグルタミナーゼ活性を増強することからアトピー性皮膚炎をはじめとする皮膚炎で見られる皮膚の角化、炎症・アレルギー反応に関与していることが示唆されている［ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．）、４２巻、１５６２−１５７０頁（２００１年）］。さらに、アトピー性皮膚炎患者の角層では、健常人に比べ、ＳＰＣを産生する酵素活性が増強するため、ＳＰＣの蓄積が見られる［ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）、１０６巻、１２４２−１２４９頁（１９９６年）］。また、ＳＰＣによるＣａ２＋上昇を抑制する生薬成分がアトピー性皮膚炎に効果があることも報告されている（特開平９−１２４５００）。しかし、ＳＰＣの掻痒への直接関与を示す報告はない。Ｋｕｒａｉｓｈｉらはｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０またはｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐをマウスの皮下に投与すると掻破行動が誘発されることを報告した［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファルマコロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、２７５巻、２２９−２３３頁（１９９５年）］。その後、掻破行動は掻痒の動物モデルとして用いられているが、ＳＰＣが掻破行動を誘発するという報告もない。
ＧＰＲ４のもう一つのリガンドであるＬＰＣは乾癬の病変部で蓄積し［ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファルマコロジー（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１３４巻、３９８−４０２頁（１９９５年）］、ヒトに皮内投与することにより、浮腫、紅斑、細胞浸潤を誘導する［アクタ・デルマト・ベネレオロジカ（Ａｃｔａ．Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．）、８０巻、２４２−２４６頁（２０００年）］ことから、皮膚炎への関与が示唆されている。ＳＰＣ、ＬＰＣともＧＰＲ４以外に、ＯＧＲ−１［ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）、２巻、２６１−２６７頁（２０００年）］、Ｇ２Ａ［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９３巻、７０２−７０５頁（２００１年）］の各受容体に結合し、シグナル伝達を誘導することが報告されているが、各受容体の作用はいまだ解明されていない。
ＷＯ０２／２４２２２にはＧＰＲ４拮抗剤をアトピー性皮膚炎の治療に用いることが文言上開示されている。
掻痒を引き起こす疾患は多岐に及ぶことが知られており、該疾患としては、種々の皮膚疾患（アトピー性皮膚炎、湿疹・皮膚炎、蕁麻疹、痒疹、乾皮症、虫刺症、疥癬、真菌症、皮膚掻痒症、肥厚性瘢痕、乾癬、水疱症、薬疹等）、肝・胆道疾患（原発性胆汁性肝硬変、胆汁うっ滞症、肝硬変等）、腎疾患（慢性腎不全等）、内分泌・代謝疾患（糖尿病、甲状腺機能異常等）、血液疾患（真性多血症、鉄欠乏性貧血等）、悪性腫瘍（悪性リンパ腫、消化器癌等）、神経疾患（多発性硬化症、神経症等）、ＡＩＤＳ等が挙げられる。また妊娠、薬剤等によって掻痒が引き起こされる場合もある（「医薬ジャーナル」（医薬ジャーナル社）、３７巻、第１１号（平成１３年１１月１日発行）、７３〜７７及び７９〜８２頁）。
ＧＰＣＲには、細胞内で過剰に発現すると、リガンドが存在しなくてもシグナルを流す、構成活性型ＧＰＣＲと呼ばれるＧＰＣＲが知られている。リガンド非存在時に流れるシグナルは構成的活性と呼ばれる。構成活性型ＧＰＣＲには、天然に存在するものと、アミノ酸の置換、欠失などの変異を導入することにより造成された変異ＧＰＣＲ［モレキュラー・ファルマコロジー（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、５７巻、８９０頁（２０００年）、ＷＯ９８／４６９９５］がある。ＧＰＣＲの構成的活性を抑制するアンタゴニストはインバースアゴニストと呼ばれる。
文献［ブレチン・デ・ラ・ソシエテ・シミック（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｄｅ  ｌａ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ｃｈｉｍｉｑｕｅ）、１８５頁（１９８１年）およびヨーロピアン・ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、１２巻、２１９頁（１９７７年）］に、後述の式（Ｉ）においてＲ１がモルホリノを表し、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が水素を表し、Ｙに相当する置換基がモルホリノであり、ｎが１であり、Ｘが−（ＣＨ２）２−を表す化合物が開示されている。
【発明の開示】
本発明の目的は、
１）ＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤を提供すること、
２）掻痒の予防および／もしく治療作用、またはＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能の抑制作用を有する含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を提供すること、
３）含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤を提供すること、ならびに
４）含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能の抑制剤を提供することである。
また、本発明の別の目的は、ＳＰＣ誘発掻破行動の回数の減少を指標にした掻痒治療剤のスクリーニング法を提供することである。
本発明は、以下の（１）〜（２２）に関する。
（１）配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
（２）以下の１）〜４）
１）配列番号１２記載の塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
２）配列番号１４記載の塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
３）配列番号１８記載の塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
４）配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体、
のいずれかを一つを有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
（３）以下の１）〜４）
１）配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
２）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
３）配列番号１７記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
４）配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、
のいずれか一つを有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
（４）式（Ｉ）
2004017995.tif 000003
［式中、Ｒ１は置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ５Ｒ６（式中、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、Ｒ５およびＲ６が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＯＲ７（式中、Ｒ７は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表す）、−ＳＲ７ａ（式中、Ｒ７ａは前記Ｒ７と同義である）、−ＣＯＮＲ５ａＲ６ａ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａはそれぞれ前記Ｒ５および前記Ｒ６と同義である）、−ＣＯ２Ｒ７ｂ（式中、Ｒ７ｂは前記Ｒ７と同義である）、−Ｎ＋Ｒ５ｂＲ６ｂＲ８（式中、Ｒ５ｂおよびＲ６ｂはそれぞれ前記Ｒ５および前記Ｒ６と同義であり、Ｒ８は低級アルキル、低級アルケニル、またはアラルキルを表す）、ホルミル、カルボキシ、またはシアノを表し、
Ｒ２は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表し、
Ｒ３およびＲ４は同一または異なって水素、低級アルキル、またはハロゲンを表し、
ｎは０または１を表し、
Ｘは−（ＣＨ２）２−または−ＣＨ＝ＣＨ−を表し、
Ｙは式（ＩＩ）
2004017995.tif 000004
（式中、ＷはＣＨまたは窒素原子を表し、
Ｚ１およびＺ２は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、Ｚ１およびＺ２がそれぞれ隣接する２つの炭素原子と一緒になって置換もしくは非置換の芳香環または置換もしくは非置換の複素環を形成し、
Ｚ３は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表す）を表す］で表される含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
（５）Ｒ１が−ＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ５およびＲ６が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する第（４）項に記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
（６）Ｒ２が水素である第（４）項または第（５）項に記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
（７）Ｒ３およびＲ４が水素である第（４）項〜第（６）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
（８）Ｚ１およびＺ２がそれぞれ隣接する２つの炭素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環を形成する第（４）項〜第（７）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
（９）第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
（１０）第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤。
（１１）第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能の抑制剤。
（１２）以下の１）〜４）
１）ヒトを除く哺乳類動物にスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）を皮下および皮内投与することによりヒトを除く哺乳類動物における掻破行動を誘発する工程、
２）試験化合物存在下または非存在下でのＳＰＣにより誘発されたヒトを除く哺乳類動物における掻破行動の回数を測定する工程、
３）試験化合物存在下と試験化合物非存在下でのＳＰＣにより誘発されたヒトを除く哺乳類動物における掻破行動の回数を比較する工程、および
４）試験化合物からＳＰＣにより誘発された掻破行動の回数を減少させる物質を選択する工程、
を含む掻痒治療剤のスクリーニング法。
（１３）第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
（１４）掻痒の予防および／または治療剤の製造のための第（４）項〜第（８）項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
（１５）掻痒が皮膚疾患、肝・胆道疾患、腎疾患、内分泌・代謝疾患、血液疾患、悪性腫瘍、神経疾患およびＡＩＤＳから選択される疾患に伴う掻痒である第（１）〜（３）項および第（１０）項のいずれかに記載の掻痒の予防および／または治療剤。
（１６）掻痒が皮膚疾患に伴う掻痒であり、該皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、湿疹・皮膚炎、蕁麻疹、痒疹、乾皮症、虫刺症、疥癬、真菌症、皮膚掻痒症、肥厚性瘢痕、乾癬、水疱症および薬疹から選択される皮膚疾患である第（１５）項記載の掻痒の予防および／または治療剤。
（１７）配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質の治療有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
（１８）第（２）項に記載の１）〜４）のいずれか一つのオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体の治療有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
（１９）第（３）項に記載の１）〜４）のいずれか一つの抗体の治療有効量を投与することを特徴とする、掻痒の予防および／または治療方法。
（２０）掻痒の予防および／または治療剤の製造のための、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質の使用。
（２１）掻痒の予防および／または治療剤の製造のための、第（２）項に記載の１）〜４）のいずれか一つのオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体の使用。
（２２）掻痒の予防および／または治療剤の製造のための第（３）項に記載の１）〜４）のいずれか一つの抗体の使用。
本発明者らは、ＧＰＣＲであるＧＰＲ４の有するシグナル伝達に関する機能を抑制する物質が、掻痒の予防および／または治療に有効であるとの新知見を見い出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、構成活性型のＧＰＣＲであるＧＰＲ４の構成的活性を抑制する物質の探索を行い、ＧＰＲ４の構成的活性を抑制する物質が、掻痒の予防および／または治療に有効であることを見い出した。
ＧＰＲ４の有するシグナル伝達に関する機能を抑制する物質としては、ＧＰＲ４自身の発現を阻害または抑制する物質、リガンドのＧＰＲ４への結合を阻害する物質、ＧＰＲ４へのリガンド結合により生ずるシグナル伝達［例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化（上昇または低下）、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化（上昇）、ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）キナーゼのリン酸化等が含まれる］を抑制する物質、ＧＰＲ４の構成的活性により生ずるシグナル伝達を抑制する物質（例えばＧＰＲ４のインバースアゴニスト等が含まれる）等が含まれる。上記物質は、これら機能を有する物質であれば、その構造は特に限定されず、公知の構造を有するものでもよい。ＧＰＲ４としては、例えば配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有する蛋白質等が挙げられる。
配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有する蛋白質は、文献［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７年）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等］記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加したアミノ酸の数は特に限定されないが、１個〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列において一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したとは、該アミノ酸配列中の任意かつ１もしくは複数の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、欠失、置換または付加されるアミノ酸残基については、天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＬ−システインの各残基等が挙げられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、配列番号１１、１３および１７から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列において一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質が、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有するには、そのアミノ酸配列と配列番号１１記載のアミノ酸配列とが、少なくとも７５％以上、通常は８０％以上、好ましくは９０％以上、さらには９５％以上の同一性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ（塩基対塩基データベース）やＢＬＡＳＴＸ（塩基対アミノ酸データベース）とよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいたＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる［Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴについては文献（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））を参照］。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照）。
ＧＰＲ４自身の発現を阻害または抑制する物質としては、例えば、配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ばれる連続した１５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、アンチセンス・オリゴヌクレオチドともいう）、配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制するオリゴヌクレオチド、これらのオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等が挙げられる。
上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ばれる連続した１５〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドであれば特に限定されないが、好ましくは１７〜６０塩基、より好ましくは２０〜６０塩基、さらに好ましくは３０〜６０塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドが挙げられる。特に好ましくは上記オリゴヌクレオチドの翻訳開始領域の相補的配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドが挙げられる。該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列またはその断片の塩基配列に関する情報に基づき、常法により、例えばＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステルとの結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾリルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を用い、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕、トリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）〕、リボザイム技術〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２７４（１９９９）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２３，２５７（１９９９）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４，Ｄ４９７（１９９９）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，Ｒ３３（１９９９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，５２３７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，４３８（１９９８）〕、あるいはデコイＤＮＡ法〔Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５６，５６３（１９９８）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８２，１０２３（１９９８）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，５，４２９（１９９７）、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５４，２５８３（１９９６）〕に準じて、ＧＰＲ４自身の発現を阻害または抑制することができる。
配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドとは、配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズするヌクレオチドとしては、例えば上記ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有するＤＮＡの相補的配列を有するＤＮＡと少なくとも７５％以上の相同性を有するＤＮＡが好ましく、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。ヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等いずれも用いられるがＤＮＡが好適に用いられる。
上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドもしくは該アンチセンス・オリゴヌクレオチド誘導体、または配列番号１２、１４および１８から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドもしくは該ヌクレオチド誘導体を単独でまたはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクター等の遺伝子治療用ベクターに挿入した後、下記に記載した常法に従って製剤化したものを掻痒の予防および／または治療剤として使用することもできる。
遺伝子治療用ベクターを該予防および／または治療剤として用いる場合には、該遺伝子治療用ベクターと遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）〕。
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、例えば蒸留水、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、乳糖、デキストラン、ブドウ糖等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油またはレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液または分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
該予防および／または治療剤は、液体の場合はそのままで、固体の場合は、投与直前に、必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して使用することができる。
投与方法としては、例えば患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法を挙げることができる。また、非ウイルス遺伝子移入法によっても目的とする治療部位にＤＮＡを輸送することができる。
非ウイルス遺伝子移入法としては、リン酸カルシウム共沈法〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２（１９８０）〕、マイクロインジェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４（１９８１）〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４（１９８９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１（１９９２）〕、直接ＤＮＡ取り込みまたは受容体−媒介ＤＮＡ移入法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９１）〕等を挙げることができる。
リガンドのＧＰＲ４への結合を阻害する物質としては、例えばＧＰＲ４を認識する抗体、ＧＰＲ４に拮抗作用を有する化合物等を挙げることができる。
上記抗体としては、ＧＰＲ４を認識する抗体であればいずれも用いることができるが、ＧＰＲ４を特異的に認識する抗体が好ましい。また該抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。このような抗体として、例えば、ＧＰＲ４を認識する中和抗体等をあげることができる。また、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体等も本発明の抗体として用いることができる。
上記抗体は、例えば、以下の方法に準じて調製することができる。
（１）ポリクローナル抗体の作製
ＧＰＲ４またはその部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいはＧＰＲ４の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物としては、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独でまたは組み合わせて処理する方法が挙げられる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いたＧＰＲ４またはその部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいはＧＰＲ４の一部のアミノ酸配列を有するペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体例として、以下の方法を挙げることができる。
免疫の際、抗原に用いたＧＰＲ４またはその部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいはＧＰＲ４の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、抗原に用いたポリペプチドに特異的に反応するものを本発明で用いられるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明で用いられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明で用いられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチド量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
上記、ＧＰＲ４を認識する抗体を含有する掻痒の予防および／または治療剤は以下のように調製することができる。
該抗体を有効成分として含有する医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または静脈内投与等の非経口投与を挙げることができる。投与形態としては、錠剤、注射剤等が挙げられる。
経口投与に適当な製剤としては、錠剤等が挙げられる。錠剤等は、乳糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤等が挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液または両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。また、非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
ＧＰＲ４の構成的活性により生じるシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は、該構成的活性により生ずるシグナル伝達を抑制することのできる物質を探索することによっても取得することができる。
ＧＰＲ４に拮抗作用を有する化合物としては、例えば、式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。以下、式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）という。他の式番号の化合物についても同様である。
化合物（Ｉ）の各基の定義において、以下の例示が挙げられる。
（ｉ）低級アルキルおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数１〜１０のアルキルが挙げられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル等が挙げられる
（ｉｉ）シクロアルキルとしては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキルが挙げられ、具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。
（ｉｉｉ）低級アルケニルとしては、例えば直鎖、分岐または環状の炭素数２〜８のアルケニルが挙げられ、具体的にはビニル、アリル、１−プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、シクロヘキセニル、２，６−オクタジエニル等が挙げられる。
（ｉｖ）低級アルキニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルキニルが挙げられ、具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル等が挙げられる。
（ｖ）ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の各原子を表す。
（ｖｉ）アリールおよびそれぞれが隣接する２つの炭素原子と一緒になって形成される芳香環から水素原子を一つ除いた基としては、例えば炭素数６〜１４の単環性、二環性または三環式のアリールが挙げられ、具体的にはフェニル、ナフチル、インデニル、アントラニル等が挙げられる。
（ｖｉｉ）アラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分は、前記の低級アルキル（ｉ）の定義から水素原子を一つ除いたものと同義である。
（ｖｉｉｉ）アラルキルのアリール部分としては、前記アリール（ｖｉ）の定義で挙げた基に加え、例えば前記アリールがシクロアルキルと縮合した二環性縮合環基が挙げられ、具体的にはインダニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプチル等が挙げられる。
（ｉｘ）複素環基および複素環アルキルの複素環基部分ならびにそれぞれが隣接する２つの炭素原子と一緒になって形成される複素環から水素原子を一つ除いた基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環式であって窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性複素環基等が挙げられ、具体的にはピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ベンゾイミダゾリル、２−オキソベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、プリニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾジオキソリル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチルリジニル、キノキサリニル、ピロリル、ピラゾリル、キナゾリニル、シンノリニル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チエニル、フリル、ピロリジニル、２，５−ジオキソピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ホモピペリジル、ホモピペリジノ、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ピラニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、オクタヒドロキノリル、インドリニル等が挙げられる。
（ｘ）隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも１個の窒素原子を含む５員または６員の単環性複素環基（該単環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、３〜８員の環が縮合した二環または三環式で少なくとも１個の窒素原子を含む縮環性複素環基（該縮環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）等が挙げられ、具体的にはピリジル、テトラヒドロピリジル、インドリニル、イソインドリニル、ピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジノ、ホモピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、ペルヒドロアゼピニル、ペルヒドロアゾシニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、オクタヒドロキノリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、プリニル、ジヒドロインドリル、ピロリル、ジヒドロピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル等が挙げられる。
（ｘｉ）置換低級アルキルおよび置換低級アルカノイルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数１〜３の、シクロアルキル、低級アルカノイル、低級アルコキシ、アリールオキシ、置換アリールオキシ［該置換アリールオキシにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数１〜３の、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、シアノ  ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ等が挙げられる。ここで低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義であり、ハロゲンは前記ハロゲン（ｖ）と同義であり、低級アルコキシおよび低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分は前記低級アルキル（ｉ）と同義である］、アラルキルオキシ、置換アラルキルオキシ［該置換アラルキルオキシにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数１〜３の、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ等が挙げられる。ここで低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義であり、ハロゲンは前記ハロゲン（ｖ）と同義であり、低級アルコキシおよび低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分は前記低級アルキル（ｉ）と同義である］、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、低級アルキルチオ、置換低級アルキル［該置換低級アルキルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数１〜３のヒドロキシ、ハロゲン等が挙げられる］、置換低級アルカノイル［該置換低級アルカノイルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数１〜３のハロゲン等が挙げられる］、モノまたはジ低級アルキルアミノ、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、低級アルコキシカルボニルアミノ、低級アルカノイルアミノ、モノまたはジ低級アルキルアミノカルボニル、モノまたはジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ、複素環基等が挙げられる。
ここで示したアリールオキシおよびアラルキルオキシのアリール部分、シクロアルキル、ハロゲン、複素環基、ならびに低級アルカノイル、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルチオ、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、低級アルコキシカルボニルアミノおよび低級アルカノイルアミノの低級アルキル部分は、それぞれ前記アリール（ｖｉ）、シクロアルキル（ｉｉ）、ハロゲン（ｖ）、複素環基（ｉｘ）、および低級アルキル（ｉ）と同義であり、アラルキルオキシのアルキレン部分は、前記低級アルキル（ｉ）から水素原子を一つ除いたものと同義である。
モノまたはジ低級アルキルアミノ、モノまたはジ低級アルキルアミノカルボニルおよびモノまたはジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの低級アルキル部分は、それぞれ前記低級アルキル（ｉ）と同義であり、ジ低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノカルボニルおよびジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの２つの低級アルキル部分は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
（ｘｉｉ）置換アリール、置換アラルキル、置換シクロアルキル、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換複素環基、置換複素環アルキル、隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基、それぞれが隣接する２つの炭素原子と一緒になって形成される置換芳香環およびそれぞれが隣接する２つの炭素原子と一緒になって形成される置換複素環における置換基としては、前記置換低級アルキルにおける置換基（ｘｉ）の定義で挙げた基に加え、低級アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、複素環基、置換複素環基、複素環アルキル、置換複素環アルキル等が挙げられる。さらに、置換アリールおよび隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は低級アルキル［該低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義である］または置換低級アルキル［該低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義であり、該置換低級アルキルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル等が挙げられる。ここでハロゲンは前記ハロゲン（ｖ）と同義であり、低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分は前記低級アルキル（ｉ）と同義である］であってもよい。
ここで示した低級アルキル、アリール、複素環基および複素環アルキルの複素環基部分、アラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分ならびにアラルキルのアリール部分は、それぞれ前記低級アルキル（ｉ）、アリール（ｖｉ）、複素環基（ｉｘ）、アラルキルのアルキレン部分（ｖｉｉ）およびアラルキルのアリール部分（ｖｉｉｉ）と同義である。また、置換アリール、置換アラルキル、置換複素環基、置換複素環アルキルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数１〜３の、低級アルキル［該低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義である］、低級アルコキシ［該低級アルコキシの低級アルキル部分は前記低級アルキル（ｉ）と同義である］、ハロゲン［該ハロゲンは前記ハロゲン（ｖ）と同義である］等が挙げられる。
化合物（Ｉ）の四級アンモニウム塩としては、化合物（Ｉ）の塩基性部位にハロゲン化低級アルキル（該低級アルキルおよび該ハロゲンはそれぞれ前記と同義である）、ハロゲン化アラルキル（該ハロゲンおよび該アラルキルはそれぞれ前記と同義である）、ヒドロキシ低級アルキル（該低級アルキルは前記と同義である）等が付加した四級アンモニウム塩であれば特に限定されないが、例えばジメチルアミノ基を有する化合物（Ｉ）にヨウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニウム塩、ピペリジノ基を有する化合物（Ｉ）にヨウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニウム塩、ピロリジノ基を有する化合物（Ｉ）にヨウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニウム塩、モルホリノ基を有する化合物（Ｉ）に臭化ベンジルを作用させて得られる四級アンモニウム塩、ピロリジノ基を有する化合物（Ｉ）にヨウ化エチルを反応させて得られる四級アンモニウム塩においてヨウ化物イオンと水酸化物イオンが交換されて得られる四級アンモニウム塩等が挙げられる。
化合物（Ｉ）の薬理学的に許容される塩としては、毒性のない、水溶性のものが好ましく、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩、モルホリン付加塩、ピペリジン付加塩等の有機アミン付加塩、またはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
次に化合物（Ｉ）の製造法について説明する。
なお、以下に示した製造法において、定義した基が反応条件下変化するか、または方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される方法、例えば官能基の保護、脱保護等［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス  第三版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）、ワッツ（Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）］の手段に付すことにより容易に製造を実施することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
化合物（Ｉ−ａ）は、以下に示す製造方法によって得ることができる。
製造法１
2004017995.tif 000005
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｒ９は低級アルキル、アリルまたはベンジルを表し、Ｒ１０およびＲ１１は同一または異なって低級アルキルまたはシクロアルキルを表すか、Ｒ１０およびＲ１１が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成し、Ｕはハロゲン、アルコキシスルホニルオキシ、アリールオキシスルホニルオキシ、アルキルスルホニルオキシまたはアリールスルホニルオキシを表す）
上記の定義において、低級アルキル、シクロアルキルおよびハロゲンはそれぞれ前記と同義である。アルコキシスルホニルオキシおよびアルキルスルホニルオキシのアルキル部分、アリールオキシスルホニルオキシおよびアリールスルホニルオキシのアリール部分は、それぞれ前記低級アルキル、アリールと同義である。隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基は前記と同義である。
＜工程１＞
化合物（ＩＩＩａ）を原料として用い、特開平７−６１９８３に開示された方法に従い、１当量〜大過剰のＹＨ（式中、Ｙは前記と同義である）と反応させることにより、化合物（ＩＶ）を得ることができる。なお、化合物（ＩＩＩａ）は特開平７−６１９８３に開示された方法またはそれに準じた方法により合成することができる。
＜工程２＞
化合物（ＩＶ）を不活性溶媒中、１当量〜大過剰のホルムアルデヒド水溶液存在下に、１当量〜大過剰のＲ５Ｒ６ＮＨ（式中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ前記と同義である）またはその塩酸塩と反応させることにより、化合物（Ｉ−ａ）を得ることができる。また、ホルムアルデヒド水溶液に代え、トリオキシメチレン、パラホルムアルデヒド等のホルムアルデヒド等価体を用いることもできる。
反応は通常、酸性条件下で良好に進行するので、必要に応じて塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等の酸を反応系内に添加するのが好ましい。反応は通常、０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは室温〜８０℃の間の温度で行い、５分間から１００時間で終了する。不活性溶媒としては、例えば水、メタノール、エタノール、酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、アセトン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはクロロホルムと酢酸の混合溶媒が用いられる。
化合物（Ｉ−ｂ）から、以下に示す方法に．よって化合物（Ｉ−ｃ）を製造することができる。
製造法２
2004017995.tif 000006
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ８、Ｕ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程３＞
化合物（Ｉ−ｂ）を不活性溶媒中、１当量〜大過剰のＲ８Ｕ（式中、Ｒ８およびＵはそれぞれ前記と同義である）と、通常−１０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは室温で、１〜４８時間反応させることにより、化合物（Ｉ−ｃ）を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えば水、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、アセトン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくは酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム等が用いられる。
化合物（Ｉ−ｃ）から、以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｂ）を製造することができる。
製造法３
2004017995.tif 000007
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ８、Ｕ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程４＞
化合物（Ｉ−ｃ）を不活性溶媒中、１当量〜大過剰のＲ５Ｒ６ＮＨ（式中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ前記と同義である）と、通常−１０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは２０℃〜１００℃の間の温度で、１〜１００時間反応させることにより、化合物（Ｉ−ｂ）を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えば水、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、アセトン等が単独でまたは混合して用いられ、好ましくはクロロホルム、ジメチルホルムアミド等が用いられる。反応は通常、塩基性条件下で良好に進行するので、必要に応じて適当な塩基を反応系内に添加することが望ましい。塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム、ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデック−７−エン等を用いることができ、中でもトリエチルアミンが好ましい。
化合物（Ｉ−ｂ）中、化合物（Ｉ−ｄ）を用い、以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｅ）を製造することができる。
製造法４
2004017995.tif 000008
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｒ１４およびＲ１５は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、Ｒ１４およびＲ１５が隣接するＣＨ（ＣＨ２）ｍＮと一緒になって置換もしくは非置換の複素環を形成してもよい。Ｒ１６は水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換のアリールを表し、ｍは０〜３の整数を表す）
低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アラルキル、複素環アルキル、およびアリールはそれぞれ前記と同義であり、それらの置換基もそれぞれ前記と同義である。
Ｒ１４およびＲ１５が隣接するＣＨ（ＣＨ２）ｍＮと一緒になって形成される置換もしくは非置換の複素環としては、テトラヒドロピリジン、ピロリジン、ピペリジン、ホモピペリジン、ピペラジン、ホモピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ペルヒドロアゼピン、ペルヒドロアゾシン、テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン等があげられ、それらの置換基は前記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基の置換基と同義である。
＜工程５＞
化合物（Ｉ−ｄ）を不活性溶媒中、通常−７８℃〜４０℃の間の温度で、２〜４当量の水素化アルミニウムリチウム、ジイソプロピル水素化アルミニウムリチウム等、好ましくはジイソプロピル水素化アルミニウムリチウム等の還元剤存在下で１０分間〜２４時間、好ましくは１〜３時間処理することにより化合物（Ｉ−ｅ）を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジクロロメタンまたはトルエンが用いられる。
化合物（Ｉ−ｄ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｆ）を製造することができる。
製造法５
2004017995.tif 000009
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、ｎ、Ｘ、Ｙおよびｍはそれぞれ前記と同義である）
＜工程６＞
化合物（Ｉ−ｄ）を不活性溶媒中、通常０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは室温〜１００℃の間の温度で、１当量〜大過剰の適当な塩基存在下、１〜４８時間、好ましくは１〜３時間処理することにより化合物（Ｉ−ｆ）を得ることができる。
適当な塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、ナトリウムメトキシド等が例示され、好ましくは水酸化ナトリウムが挙げられる。不活性溶媒としては、例えば水、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、プロパノール、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはテトラヒドロフランもしくはメタノール、またはそれらと水の混合溶媒が用いられる。
化合物（Ｉ−ｃ）中、化合物（Ｉ−ｇ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｈ）を製造することができる。
製造法６
2004017995.tif 000010
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｎ、Ｘ、Ｙおよびｍはそれぞれ前記と同義であり、Ｒ１７およびＲ１８ａはそれぞれ前記Ｒ１４および前記Ｒ１５と同義であり、Ｔはアルカリ金属、アンモニウム、トリアルキルシリル、またはトリアルキルチンを表す）
上記の定義においてトリアルキルシリルおよびトリアルキルチンにおけるアルキルは前記低級アルキルと同義である。アルカリ金属としてはナトリウム、カリウム等があげられる。
＜工程７＞
化合物（Ｉ−ｇ）を不活性溶媒中、０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは室温〜２００℃の間の温度で、１当量〜大過剰、好ましくは２〜４当量のＴＮ３（式中、Ｔは前記と同義である）と、通常反応を加速させるために触媒量〜大過剰、好ましくは０．５〜２当量の適当な添加剤の存在下、１〜２００時間、好ましくは３〜４８時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｈ）を得ることができる。
適当な添加剤としては、例えば四塩化けい素、塩化リチウム、塩化アルミニウム、塩化アンモニウム、塩化トリアルキルすず、酸化ジアルキルすず、トリアルキルアルミニウム、トリエチルアミン・塩酸塩、トリエチルアミン・臭化水素酸塩、水素化ナトリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、臭化亜鉛等が例示され、好ましくは塩化アンモニウム、酸化ジアルキルすず等が挙げられる。不活性溶媒としては、例えば水、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシド、酢酸、氷酢酸、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、キシレン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジメチルホルムアミドまたはトルエンが用いられる。
化合物（Ｉ−ｃ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｉ）を製造することができる。
製造法７
2004017995.tif 000011
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｕ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｒ１８は置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、Ｑはアルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、Ｑがアルカリ金属の場合にはｐは１を表し、Ｑがアルカリ土類金属の場合にはｐは２を表す）
上記の定義においてアルカリ金属は前記アルカリ金属と同義であり、アルカリ土類金属としてはマグネシウム、カルシウム等が挙げられる。
＜工程８＞
化合物（Ｉ−ｃ）を不活性溶媒中、０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは７０℃〜８０℃の間の温度で、１当量〜大過剰、好ましくは４〜８当量の（Ｒ１８ＣＯ２）ｐＱ（式中、Ｒ１８、Ｑおよびｐはそれぞれ前記と同義である）と、１〜１００時間、好ましくは３〜７２時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｉ）を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えばジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシド等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジメチルスルホキシドが用いられる。
化合物（Ｉ−ｃ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｊ）を製造することができる。
製造法８
2004017995.tif 000012
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７ａ、Ｒ８、Ｕ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程９＞
化合物（Ｉ−ｃ）を不活性溶媒中、０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは３０℃〜８０℃の間の温度で、１当量〜大過剰、好ましくは２〜８当量のＲ７ａＳＨ（式中、Ｒ７ａは前記と同義である）と、１当量〜大過剰、好ましくは１〜３当量の適当な塩基存在下、１〜１００時間、好ましくは３〜７２時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｊ）を得ることができる。
適当な塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム、ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデック−７−エン等を用いることができ、中でも１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデック−７−エンが好ましい。不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシド等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはクロロホルムが用いられる。
化合物（Ｉ−ｊ）中、化合物（Ｉ−ｋ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｌ）を製造することができる。
製造法９
2004017995.tif 000013
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１５、Ｒ１６、ｍ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１０＞
化合物（Ｉ−ｋ）を用いて製造法５の工程６と同様な反応を行うことにより化合物（Ｉ−ｌ）を製造することができる。
化合物（Ｉ−ｉ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｍ）を製造することができる。
製造法１０
2004017995.tif 000014
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１８、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１１＞
化合物（Ｉ−ｉ）を用いて製造法５の工程６と同様な反応を行うことにより化合物（Ｉ−ｍ）を製造することができる。
化合物（Ｉ−ｍ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｎ）を製造することができる。
製造法１１
2004017995.tif 000015
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｕ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｒ７ｃは前記Ｒ７の定義から水素を除いた基を表す）
＜工程１２＞
化合物（Ｉ−ｍ）を不活性溶媒中、０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは室温から８０℃の間の温度で、１当量〜大過剰、好ましくは１〜３当量の適当な塩基存在下、１当量〜大過剰、好ましくは１〜３当量のＲ７ｃＵ（式中、Ｒ７ｃおよびＵはそれぞれ前記と同義である）と、１〜４８時間、好ましくは３〜２４時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｎ）を得ることができる。
適当な塩基としては、例えば炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム、低級アルキルリチウム等が例示され、好ましくは、水素化ナトリウム、水素化カリウム等が挙げられる。不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはクロロホルムが用いられる。
化合物（Ｉ−ｍ）においてｎ＝１である化合物（Ｉ−ｍａ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｏ）を製造することができる。
製造法１２
2004017995.tif 000016
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１３＞
化合物（Ｉ−ｍａ）を不活性溶媒中、０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは室温から６０℃の間の温度で、１当量〜大過剰、好ましくは３〜６当量の適当な酸化剤存在下、１〜４８時間、好ましくは３〜２４時間処理することにより化合物（Ｉ−ｏ）を得ることができる。
適当な酸化剤としては、例えば二酸化マンガン、クロム酸、クロロクロム酸ピリジニウム、二クロム酸ピリジニウム、過マンガン酸カリウム、三酸化硫黄−ピリジン、オキソン等が挙げられ、好ましくは二酸化マンガンが挙げられる。不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリフルオロ酢酸、水、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン等が用いられる。
化合物（Ｉ−ｏ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｐ）を製造することができる。
製造法１３
2004017995.tif 000017
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１４＞
化合物（Ｉ−ｏ）を不活性溶媒中、０℃から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは室温から９０℃の間の温度で、１当量〜大過剰、好ましくは１〜３当量のヒドロキシルアミンもしくはその塩酸塩、硫酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等、Ｏ−フェニルカーバミルヒドロキルアミンもしくはその塩酸塩、硫酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等、またはＮ−ヒドロキシベンズアミド、好ましくはヒドロキシルアミンと、１〜４８時間、好ましくは３〜２４時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｐ）を得ることができる。必要により、１当量〜大過剰、好ましくは１〜３当量の適当な脱水剤の添加や、１当量〜大過剰、好ましくは２〜６当量の適当な塩基の添加、またはマイクロ波照射を行ってもよい。
適当な脱水剤としては、例えば無水酢酸、無水フタル酸、硫酸水素ナトリウム、オキソン、ギ酸ナトリウム、酸化ジアルキルすず、アルミナ、シリカゲル、酢酸ナトリウム、ホルムアミド、五酸化二リン、塩化鉄（ＩＩＩ）、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、オキシ塩化リン、パラトルエンスルホン酸等が例示され、好ましくは無水酢酸、無水フタル酸等が挙げられる。適当な塩基としては、例えばトリエチルアミン、ピリジン、水素化ナトリウム、水素化カリウム等が例示され、好ましくはトリエチルアミンまたはピリジンが挙げられる。
不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ニトロベンゼン、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリフルオロ酢酸、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、プロパノール等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはアセトニトリル、ジメチルホルムアミド等が用いられる。
化合物（Ｉ−ｐ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｑ）を製造することができる。
製造法１４
2004017995.tif 000018
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｔ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１５＞
化合物（Ｉ−ｐ）を用いて製造法６の工程７と同様な反応を行うことにより化合物（Ｉ−ｑ）を製造することができる。
化合物（Ｉ−ｃ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｒ）を製造することができる。
製造法１５
2004017995.tif 000019
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ８、Ｕ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｑａは前記と同義のアルカリ金属を表す）
＜工程１６＞
化合物（Ｉ−ｃ）を不活性溶媒中、室温から反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、好ましくは４０℃〜８０℃の間の温度で、１当量〜大過剰、好ましくは２〜４当量のＱａＣＮ（式中、Ｑａは前記と同義である）、好ましくは青酸ナトリウムと、１〜４８時間、好ましくは３〜２４時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｒ）を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジメチルホルムアミド等が用いられる。
化合物（Ｉ−ｒ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｓ）を製造することができる。
製造法１６
2004017995.tif 000020
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｔ、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１７＞
化合物（Ｉ−ｒ）を用いて製造法６の工程７と同様な反応を行うことにより化合物（Ｉ−ｓ）を製造することができる。
化合物（Ｉ−ｒ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｔ）を製造することができる。
製造法１７
2004017995.tif 000021
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１８＞
化合物（Ｉ−ｒ）を用いて製造法５の工程６と同様な反応を行うことにより化合物（Ｉ−ｔ）を製造することができる。
化合物（ＩＩＩｂ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｕ）を製造することができる。
製造法１８
2004017995.tif 000022
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１８、Ｑ、ｐ、Ｕ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程１９＞
化合物（ＩＩＩｂ）を用いて製造法７の工程８と同様な反応を行うことにより化合物（Ｖ）を製造することができる。
＜工程２０＞
化合物（Ｖ）を用いて製造法５の工程６と同様な反応を行うことにより化合物（ＶＩ）を製造することができる。
＜工程２１＞
化合物（ＶＩ）を用いて製造法１２の工程１３と同様な反応を行うことにより化合物（ＶＩＩ）を製造することができる。
＜工程２２＞
化合物（ＶＩＩ）を不活性溶媒中、通常０℃〜８０℃の間の温度で、２〜４当量の硝酸銀、酸化銀（Ｉ）、酸化銀（ＩＩ）、クロム酸、クロロクロム酸ピリジニウム、二クロロクロム酸ピリジニウム、過マンガン酸カリウム、過ヨウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、過酸化水素、亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤、好ましくは硝酸銀または過塩素酸ナトリウム存在下で、１０分間〜２４時間、好ましくは１〜４時間処理することにより化合物（ＶＩＩＩ）を製造することができる。必要により、添加剤として、０．１〜４当量の酢酸等の有機物、または硫酸、リン酸二水素ナトリウム、スルファミン酸、酸化ルテミウム等の無機物を加えてもよい。
不活性溶媒としては、例えばジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、塩酸、酢酸、無水酢酸、硫酸、水等が挙げられ、好ましくはアセトニトリル、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いることができる。
＜工程２３＞
化合物（ＶＩＩＩ）を不活性溶媒中、通常０℃〜８０℃の間の温度、好ましくは室温で、１〜２０当量のハロゲン化剤と１０分間〜２４時間反応させ、その後、１当量〜大過剰のＲ７ｃＯＨ（式中、Ｒ７ｃは前記と同義である）と反応させることにより化合物（ＩＸ）を製造することができる。
ハロゲン化剤としては、例えば塩化チオニル、オキサリルクロリド、オキシ塩化リン等が挙げられ、好ましくは塩化チオニルが挙げられる。不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いることができる。不活性溶媒として好ましくはジクロロメタンが挙げられる。
＜工程２４＞
化合物（ＩＸ）を用いて製造法１の工程２と同様な反応を行うことにより化合物（Ｘ）を製造することができる。
＜工程２５＞
化合物（Ｘ）を用いて製造法２の工程３と同様な反応を行うことにより化合物（ＸＩ）を製造することができる。
＜工程２６＞
化合物（ＸＩ）を用いて製造法１の工程１と同様な反応を行うことにより化合物（Ｉ−ｕ）を製造することができる。
化合物（Ｉ−ｕ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｖ）を製造することができる。
製造法１９
2004017995.tif 000023
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７ｃ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程２７＞
化合物（Ｉ−ｕ）を用いて製造法５の工程６と同様な反応を行うことにより化合物（Ｉ−ｖ）を製造することができる。
化合物（Ｉ−ｖ）から以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｗ）を製造することができる。
製造法２０
2004017995.tif 000024
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
＜工程２８＞
化合物（Ｉ−ｖ）を不活性溶媒中、通常０℃〜８０℃の間の温度、好ましくは室温で、１〜２０当量のハロゲン化剤と１０分間〜２４時間反応させ、その後、１当量〜大過剰のＲ５ａＲ６ａＮＨ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａはそれぞれ前記と同義である）と反応させることにより化合物（Ｉ−ｗ）を製造することができる。必要に応じて、１当量〜大過剰の適当な塩基を加えてもよい。
ハロゲン化剤としては、例えば塩化チオニル、オキサリルクロリド、オキシ塩化リン等が挙げられ、好ましくは塩化チオニルが挙げられる。適当な塩基としては、例えばピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等が例示され、好ましくはトリエチルアミンが挙げられる。不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いることができる。不活性溶媒として好ましくはジクロロメタンが挙げられる。
化合物（Ｉ−ｗ）の製造においては、ペプチド化学で常用される手法を用いることもできる。すなわち、化合物（Ｉ−ｖ）に不活性溶媒中、０．５〜１０当量の適当な縮合剤と共に１〜１０当量のＲ５ａＲ６ａＮＨ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａはそれぞれ前記と同義である）を加え、通常、０℃〜５０℃の間の温度で１０分間〜７０時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｗ）を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えばジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、アセトニトリル、酢酸エチル、ピリジン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等が挙げられ、好ましくはテトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。
適当な縮合剤としては、例えば１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド結合ポリスチレンレジン（ＥＤＣレジン）等が挙げられる。また、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等、好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の添加剤を加えることもできる。
ＥＤＣレジンは、テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、３４巻、４８号、７６８５頁（１９９３年）記載の方法で製造することができる。
化合物（Ｉ）中、化合物（Ｉ−ｘ）から、以下に示す方法によって化合物（Ｉ−ｙ）を製造することができる。
製造法２１
2004017995.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、ｎ、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｒ２２およびＲ２３は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表す）
上記の定義において低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アラルキル、および複素環アルキルはそれぞれ前記と同義であり、それらの置換基もそれぞれ前記と同義である。
＜工程２９＞
化合物（Ｉ−ｘ）を不活性溶媒中、１当量〜大過剰の、好ましくは１〜１０当量のＲ２２Ｒ２３ＣＯ（式中、Ｒ２２およびＲ２３はそれぞれ前記と同義である）と、１当量〜大過剰、好ましくは１〜３当量の適当な還元剤の存在下、通常−７８℃〜１００℃の間の温度、好ましくは０℃〜５０℃の間の温度で１０分間〜４８時間反応させることにより化合物（Ｉ−ｙ）を得ることができる。
適当な還元剤としては、例えば水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等が挙げられ、好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。必要により、触媒量〜溶媒量、好ましくは０．５当量〜溶媒量の適当な酸を添加してもよい。適当な酸としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、塩酸等が挙げられ、好ましくは酢酸が挙げられる。
不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ヘキサン、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、塩酸等が例示され、これらを単独でまたは混合して用いることができる。好ましくは、テトラヒドロフラン、酢酸等が挙げられる。
化合物（Ｉ）および原料化合物における各官能基の変換および置換基に含まれる官能基の変換は、公知の方法［例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ  第二版（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｒ．Ｃ．ラロック（Ｌａｒｏｃｋ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレーティッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）に記載の方法］等によっても行うことができる。
上記の方法等を適宜組み合わせて実施することにより、所望の位置に所望の官能基を有する化合物（Ｉ）を得ることができる。
上記製造法における中間体および生成物の単離、精製は、通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行うことができる。さらに一般的な並列合成法で常用される精製法、例えば、スカベンジャーレジン、イオン交換レジンを用いた精製法によっても行うことができる。また、中間体においては、特に精製することなく次の反応に供することもできる。
化合物（Ｉ）には、位置異性体、幾何異性体、光学異性体または互変異性体のような異性体が存在し得るものもあるが、これらを含め可能な全ての異性体および該異性体のいかなる比率における混合物も本発明に包含される。
化合物（Ｉ）の塩を取得したい場合には、化合物（Ｉ）の塩が得られるときはそのまま精製すればよく、また化合物（Ｉ）が遊離の形で得られるときは化合物（Ｉ）を適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えて単離・精製すればよい。
また、化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に包含される。
本発明の掻痒治療剤のスクリーニング法において、掻痒治療活性を有する化合物は、
１）ヒトを除く哺乳類動物にＳＰＣを皮下および皮内投与することによりヒトを除く哺乳類動物における掻破行動を誘発させ、
２）試験化合物存在下または非存在下でのＳＰＣにより誘発されたヒトを除く哺乳類動物における掻破行動の回数を測定し、
３）試験化合物存在下と試験化合物非存在下でのＳＰＣにより誘発されたヒトを除く哺乳類動物における掻破行動の回数を比較し、
４）試験化合物からＳＰＣにより誘発された掻破行動の回数を減少させる物質を選択することにより取得することができる。
上記のヒトを除く哺乳類動物としては、例えばマウス等が挙げられ、掻破行動とは動物が後肢で自身の体部を掻く行動をいう。掻痒治療剤のスクリーニング法のより具体的な例としては、例えば後記の試験例２に記載の方法等が挙げられる。
以下、第１表〜第１２表に本発明によって得られる化合物（Ｉ）の具体例を示すが、本発明の範囲はこれらの化合物に限定されることはない。また、ＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能を抑制するその他の化合物の具体例を第１３表に示す。
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2004017995.tif 000039
2004017995.tif 000040
【図面の簡単な説明】  第１図は化合物１（経口投与）のＳＰＣ誘発掻痒に対する抑制作用を示す。第１図において、符号（＃＃、＊＊）は各々下記の意味を表す。
＃＃：Ｐ＝０．００８３の有意差を表す（陽性対照群の陰性対象群比；Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ  ｔｅｓｔ）。
＊＊：Ｐ＝０．００３１の有意差を表す（化合物１経口投与群の陽性対照群比；Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ  ｔｅｓｔ）。
第２図は化合物３（経口投与）のＳＰＣ誘発掻痒に対する抑制作用を示す。第２図において、符号（＃＃、＊＊）は各々下記の意味を表す。
＃＃：Ｐ＝０．００２９の有意差を表す（陽性対照群の陰性対象群比；Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ  ｔｅｓｔ）。
＊＊：Ｐ＝０．００３１の有意差を表す（化合物３経口投与群の陽性対照群比；Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ  ｔｅｓｔ）。
次に化合物の薬理作用について試験例で説明する。
試験例１：ＧＰＲ４拮抗作用
参考例５で得られたＧＰＲ４アッセイ細胞（該アッセイ細胞は１７β−エストラジオールの刺激によりＧＰＲ４を発現する）を白色プレートに１ウェル当たり１０５個を播種し、反応液中１０ｎｍｏｌ／Ｌになるように１７β−エストラジオール（１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ、シグマ社製）を培地で希釈したものと試験化合物を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６時間反応した。その後、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液を加え反応を停止し、トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）で１秒間の発光量を測定した。
試験化合物の活性（拮抗作用）は、下の式に示す通り１７β−エストラジオール添加時と非添加時のカウント数（ｃｏｕｎｔ  ｐｅｒ  ｓｅｃｏｎｄ）をもとに算出した阻害率で表した。ＩＣ５０値は、阻害率からＬｏｇｉｔ−Ｌｏｇ変換法の線形近似解析法によって算出した。
式中、Ａ、Ｂ、Ｃは各々以下の意味を表す。
Ａ：１７β−エストラジオール及び試験化合物を添加時のカウント数
Ｂ：１７β−エストラジオールおよび試験化合物の両方が非添加時のカウント数
Ｃ：１７β−エストラジオールのみ添加時のカウント数
阻害率（％）＝［１−｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）｝］Ｘ１００
結果を第１５表に示す。
2004017995.tif 000041
以上の結果より、化合物（Ｉ）はＧＰＲ４拮抗作用を有することが示された。
試験例２：ＳＰＣ誘発掻痒に対する抑制作用
ｄｄＹ雄性マウス（３〜４週齢）背部にＳＰＣ（５０μｇ／ｓｉｔｅ）を皮下投与（ＳＰＣ投与群）後、該マウスをアクリル製観察用ケージ（７．５ｘ７．５ｘ１５ｃｍ）に入れ、ビデオカメラを用いて６０分間無人下でマウスの行動を撮影した。ビデオを再生し、後肢による掻破行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の回数を目視でカウントした。陰性対照群（生理食塩液投与群）にはＳＰＣの代わりに生理食塩液（０．１ｍＬ／ｓｉｔｅ）を投与した。化合物投与群では、０．５重量／容量（ｗ／ｖ）％メチルセルロース（ＭＣ）水溶液に化合物１および化合物３（３００ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ懸濁し、ＳＰＣ投与１時間前に経口投与した。なおＳＰＣ投与群および生理食塩液投与群ではそれぞれＳＰＣおよび生理食塩液投与１時間前に０．５ｗ／ｖ％ＭＣ水溶液（１０ｍＬ／ｋｇ）を経口投与した。試験は１群１０匹で行った。化合物によるＳＰＣ誘発掻破行動の抑制率は以下の数式で求めた。
数式中、Ａ、Ｂはそれぞれ以下の意味を表す。
Ａ：ＳＰＣ投与群の掻破行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の回数
Ｂ：化合物投与群の掻破行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の回数
抑制率（％）＝［（Ａ−Ｂ）／Ａ］Ｘ１００
化合物１の結果を第１図、化合物３の結果を第２図に示す。
第１図に示すように、ＳＰＣ投与群の掻破行動回数（７８回）は陰性対照群の掻破行動回数（２３回）と比べ有意に増加した（Ｐ＝０．００８３）。化合物１投与群の掻破行動回数は１３回であり、化合物１投与群では陽性対照群の掻破行動回数が８３％抑制された（Ｐ＝０．００３１）。
第２図に示すように、ＳＰＣ投与群の掻破行動回数（６９回）は陰性対照群の掻破行動回数（１８回）と比べ有意に増加した（Ｐ＝０．００２９）。化合物３投与群の掻破行動回数は１８回であり、化合物１投与群では陽性対照群の掻破行動回数が７４％抑制された（Ｐ＝０．００３１）。
以上の結果から、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は掻痒治療剤として有用であることが示唆された。
試験例３：Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（シグマ社製）誘発掻痒に対する作用
ｄｄＹ系マウス（４週齢）背部にＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（１０μｇ／ｓｉｔｅ）を皮下投与（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与群）後、該マウスをアクリル製観察用ケージ（７．５ｘ７．５ｘ１５ｃｍ）に入れ、ビデオカメラを用いて６０分間無人下でマウスの行動を撮影した。ビデオを再生し、後肢による掻破行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の回数を目視でカウントした。陰性対照群（生理食塩液投与群）ではＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０の代わりに生理食塩液（０．１ｍＬ／ｓｉｔｅ）を投与した。化合物投与群では、０．５ｗ／ｖ％ＭＣ水溶液に化合物１および化合物３（３００ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ懸濁し、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与１時間前に経口投与した。なおＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与群および生理食塩液投与群ではそれぞれＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０および生理食塩液投与１時間前に０．５ｗ／ｖ％ＭＣ水溶液を経口投与した。試験は各群１０匹で行った。化合物によるＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０誘発掻破行動の抑制率は以下の数式で求めた。
数式中、Ｃ、Ｄはそれぞれ以下の意味を表す。
Ｃ：Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与群の掻破行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の回数
Ｄ：化合物投与群の掻破行動（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の回数
抑制率（％）＝［（Ｃ−Ｄ）／Ｃ］Ｘ１００
化合物１の結果を第１６表、化合物３の結果を第１７表に示す。
2004017995.tif 000042
2004017995.tif 000043
第１６表に示すように、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与群の掻破行動回数は３５回で、陰性対照群の掻破行動回数（７回）と比べ増加した。化合物１投与群の掻破行動回数は１６回であり、化合物１投与群ではＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与群の掻破行動回数が５４％抑制された。
第１７表に示すように、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与群の掻破行動回数は５４回で、陰性対照群の掻破行動回数（１３回）と比べ増加した。化合物３投与群の掻破行動回数は２６回であり、化合物３投与群ではＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０投与群の掻破行動回数が５２％抑制された。
以上の結果から、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は掻痒治療剤として有用であることが示唆された。
試験例４：ハプテン反復塗布慢性皮膚炎モデルにおける掻痒に対する作用
ハプテン反復塗布慢性皮膚炎モデルの作製は、北垣らの方法「ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）、１０５巻、７４９−７５５頁（１９９５年）」を若干改変して行った。
ハプテンとしてオキサゾロン（シグマ・アルドリッチ社製）を用い、これをアセトン（関東化学社製）に溶解して０．５ｗ／ｖ％オキサゾロン−アセトン溶液（抗原溶液）とした。抗原溶液をＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（６週齢）の剃毛した吻側背部へ１０μＬ塗布して該マウスを感作し、７日後（ｄａｙ０）から、同一部位に１０μＬ抗原溶液を２日、または３日間隔でｄａｙ１６まで反復塗布チャレンジし、慢性皮膚炎モデルを作製した。
化合物１は、０．５ｗ／ｖ％ＭＣ水溶液に１０および３０ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ懸濁し、ｄａｙ１６における抗原溶液塗布１時間前に１０ｍＬ／ｋｇを経口投与した。また、コントロール群として０．５ｗ／ｖ％ＭＣ水溶液のみを同様に経口投与した群を設けた。
Ｄａｙ１６におけるマウスの掻痒反応の解析は倉石らの方法「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２７５巻、２２９−２３３頁（１９９５年）」を若干改変して行った。
マウスを新しい環境に適応させるため、アクリル製観察用ケージ（７．５ｘ８ｘ１５ｃｍ）に１時間放置した。抗原溶液を吻側背部へ塗布（Ｄａｙ１６）後直ちにケージに戻し、８ｍｍビデオカメラレコーダーで無人環境下に行動を撮影した。ビデオの再生により、抗原溶液塗布後１時間の掻破行動を観察した。後肢による塗布部位およびその周辺への掻破行動の回数を数えた。マウスは約１秒間に数回の非常に速い連続した掻破行動を示すが、この一連の行動を１回の掻破行動とみなした。
結果を第１８表に示す。
2004017995.tif 000044
化合物１投与群の掻破行動回数は１００ｍｇ／ｋｇで１３８±３３（平均±標準誤差）、３００ｍｇ／ｋｇで２±１と、コントロール群の掻破行動回数（２６４±２９）に比べて有意に減少していた（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｔｅｓｔ）。
以上の結果から、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は掻痒治療剤として有用であることが示唆された。
試験例５：マウス皮膚および後根神経節（ＤＲＧ）におけるＧＰＲ４  ｍＲＮＡの発現解析
マウス皮膚および後根神経節（ＤＲＧ）におけるＧＰＲ４  ｍＲＮＡの発現解析は、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行った。なお、以下の遺伝子実験操作はモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法で行った。
（１）プライマーの設定・・・プライマーは、マウスＧＰＲ４（配列番号１４）の６４１−６６０番目（センス鎖、配列番号１９）および９４３−９６１番目（アンチセンス鎖、配列番号２０）の塩基配列に相当するプライマーを設定し合成した（インビトロジェン社）。
（２）鋳型ｃＤＮＡの作製・・・ＢＡＬＢ／ｃマウスより、背中の皮膚およびＤＲＧを摘出した。各組識からの全ＲＮＡの抽出は、ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法にて行った。得られた全ＲＮＡ（５μｇ）を用いて、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により、マニュアルに従ってｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡ作製の際、ゲノムの混入を確認するためにネガティブコントロールとして、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｓｎｃｒｉｐｔａｓｅを添加しないサンプルを作製した［ＲＴａｓｅ（−）］。
（３）ＲＴ−ＰＣＲによる発現の確認・・・ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、上記ｃＤＮＡ１μＬ、各成分２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１０μｍｏｌ／Ｌのプライマー（配列番号１９および配列番号２０）、Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）２．５単位および１ＸＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｍｇ  ｐｌｕｓ）バッファーを含む反応溶液２０μＬを用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で１分、６３℃で３０秒を１サイクルとして２８サイクル行い、さらに７２℃で５分間加熱することによって行った。反応終了後、得られたＰＣＲ反応液より１０μＬを分取し、２％アガロースゲル〔Ａｇａｒｏｓｅ  Ｎｕｓｉｅｖｅ（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ社）をＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅバッファー（４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄに溶かして作製）〕にて電気泳動した。ゲルをＶｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ  ＲＰＮ５７８７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）１００００倍希釈液にて３０分間染色し、Ｆｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）で予想されるＤＮＡ断片（０．３２ｋｂ）の増幅を確認した。
その結果、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｓｎｃｒｉｐｔａｓｅの非存在時［ＲＴａｓｅ（−）］には電気泳動後にバンドが検出されず、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｓｎｃｒｉｐｔａｓｅの存在時［ＲＴａｓｅ（＋）］時には電気泳動後にバンドが検出されたことから、ＧＰＲ４  ｍＲＮＡが皮膚およびＤＲＧに発現していることが確認された。
以上の結果からもＧＰＲ４拮抗剤である化合物（Ｉ）は、掻痒治療剤として有用であることが示唆された。
ＧＰＲ４が皮膚に発現していることから、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は、角化性皮膚疾患、乾癬群（尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、関節症性乾癬）、魚鱗癬群（尋常性魚鱗癬、水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症、非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症）、掌蹄角化症、毛孔性紅色粃糠疹・紅斑性角化症、ダリエー病、掌蹠膿疱症、口腔白板症、口腔乳頭腫・口腔扁平苔癬、アミロイド苔癬、天疱瘡群、類天疱瘡、ケロイド等の治療剤として有用であることが示唆される。
一方、ＧＰＲ４がＤＲＧに発現していることから、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は、術後や癌の痛み、頭痛、歯痛、月経痛、耳痛、咽喉痛、外傷痛、症候性神経痛等の治療剤としても有用であることが示唆される。
また、血管内皮にＧＰＲ４が発現している［ｈｔｔｐ：／／ａｊｐｈｅａｒｔ．ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／００３５９．２００３ｖｌ．ｐｄｆ参照］ことから、配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は、低血圧、浮腫、動脈硬化等の治療剤として有用であることが示唆される。
さらに、ＷＯ０２／９０９２５には、ＧＰＲ４拮抗剤を癌の治療に用いることが開示されているので、化合物（Ｉ）は、癌の治療剤としても有用であると考えられる。
本発明に係る医薬は、式（Ｉ）で表される含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩、ならびにそれらの水和物および溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分として含むことを特徴とする。本発明に係る医薬としては、有効成分である上記物質をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と１または２以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。このような医薬組成物は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って製造することが可能である。また、医薬組成物の形態である本発明に係る医薬には、他の医薬の有効成分が１または２以上含まれていてもよい。なお、本発明の医薬は、ヒトを含む哺乳類動物に適用可能である。
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与または静脈内投与等の非経口投与のいずれかから治療および／または予防のために最も効果的な投与経路を適宜選択することができる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤等を挙げることができる。
錠剤等の固形製剤の製造には、例えば、乳糖、マンニット等の賦形剤；デンプン等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤を用いることができる。
非経口投与に適する製剤のうち注射剤等の血管内投与用製剤は、好ましくはヒト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、塩水とブドウ糖溶液の混合物等から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液、または分散液として調製することができる。非経口用の製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１または２以上の製剤用添加物を用いることもできる。
本発明の医薬の投与量および投与頻度は特に限定されず、有効成分である上記物質の種類、投与経路、治療および／または予防の目的、患者の年齢および体重、症状の性質および重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。例えば、成人１日当り０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを３〜４回に分けて投与するのが好ましい。しかしながら、これら投与量および投与回数は前述の種々の条件等により変動する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、本発明を実施例、参考例および製剤例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例等により限定されることはない。
下記実施例および参考例中の各化合物の物理化学的データは、以下の機器類によって測定した。
１Ｈ  ＮＭＲ：  ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＸ２７０（２７０ＭＨｚ）またはＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＧＸ２７０（２７０ＭＨｚ）
ＭＳ：  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴまたはＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｒｏ（ＡＰＣＩ法により測定）
実施例１：化合物１｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
特開平７−６１９８３に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン（３０．０ｇ，７８．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３００ｍＬ）と酢酸（３００ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、１−メチルピペラジン（２３．６ｇ，２３６ｍｍｏｌ）およびホルムアルデヒド（３７％水溶液、７．６４ｇ，９４．１ｍｍｏｌ）を加え、６０℃に加熱し、１８時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、氷冷下に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。析出した結晶を酢酸エチルでトリチュレーションし、化合物１（２７．４ｇ，５５．４ｍｍｏｌ，収率７１％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４９５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｍ，８Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），６．５７−６．６６（ｍ，２Ｈ），６．７９−７．００（ｍ，５Ｈ）．
また、対応するフマル酸塩を以下の方法に従って調製した。
上記の化合物１（１５ｇ）をメタノール（１１０ｍＬ）に溶解し、フマル酸７．０ｇ（２．０当量）を加えた。結晶の析出した懸濁液を一旦濃縮乾固し、アセトニトリル（１００ｍＬ）を加え懸濁液を１時間以上攪拌した。その後、結晶を濾取して、減圧下、乾燥することによりにより化合物１の２フマル酸塩を得た（２０．１ｇ，収率９１％）。
実施例２：化合物２｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
１−メチルピペラジンの代わりに１，２，３，６−テトラヒドロピリジンを用い、実施例１と同様にして、特開平７−６１９８３に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンから収率２０％で化合物２を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４７８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．０４（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２，６０（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．８６−３．０２（ｍ，６Ｈ），３．４５（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｓ，２Ｈ），５．６４（ｍ，１Ｈ），５．７４（ｍ，１Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），６．５７−６．７０（ｍ，２Ｈ），６．７８−６．８２（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９５−７．００（ｍ，２Ｈ）．
実施例３：化合物３｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（ピロリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
１−メチルピペラジンの代わりにピロリジンを用い、実施例１と同様にして、特開平７−６１９８３に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンから収率２０％で化合物３を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４６６（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．７８（ｍ，４Ｈ），２．５０（ｍ，４Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．５０（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），６．５８−６．６６（ｍ，２Ｈ），６．７９−６．８１（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９８−７．０２（ｍ，２Ｈ）．
実施例４：化合物４｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−モルホリノメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
１−メチルピペラジンの代わりにモルホリンを用い、実施例１と同様にして、特開平７−６１９８３に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンから収率４６％で化合物４を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４８２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．４３（ｍ，４Ｈ），２．６０（ｍ，３Ｈ），２．６３（ｍ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，２Ｈ），３．６９（ｍ，４Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），６．５８−６．６７（ｍ，２Ｈ），６．７８−６．８１（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９６−７．０１（ｍ，２Ｈ）．
実施例５：化合物５〜化合物１２の合成
特開平７−６１９８３に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン（１９ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（０．３０ｍＬ）と酢酸（０．３０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、対応するＲ５Ｒ６ＮＨのクロロホルム溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ，０．１５ｍＬ）およびホルムアルデヒド（３７％水溶液、０．００５ｍＬ）を加え、６０℃に加熱し、２０時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、溶媒を留去し、残渣をクロロホルムに溶解させ、水洗を２回施した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、残渣にクロロホルム（０．５０ｍＬ）およびＮ−メチルイサト酸無水物  ポリスチレン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓａｔｏｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ、ノババイオケム社製、０．１５ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物中のレジンを濾別し、残渣をイオン交換クロマトグラフィー（ボンデシルＳＣＸ、バリアン社製、２ｍｏｌ／Ｌアンモニア−メタノール溶液で溶出）で精製し、目的物である化合物５〜化合物１２を得た。
化合物の構造を第１表に、分析値（ＡＰＣＩ−ＭＳ）を第１４表に記した。
実施例６：化合物１３｛ヨウ化  １−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−１−メチルピロリジニウム｝の合成
実施例３で得られた化合物３（１１．４ｇ，２４．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、ヨウ化メチル（１．９８ｍＬ，３１．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０時間撹拌した。反応溶液を減圧下、濃縮した後、酢酸エチルを加えた。得られた懸濁液を６０℃に加熱し０．５時間撹拌し、その後室温で１時間撹拌した。析出した固体を濾取して、化合物１３（１３．７ｇ，２２．５ｍｍｏｌ，収率９２％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４８０（［Ｍ−Ｉ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．１３（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），２．２５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，２Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８５（ｍ，４Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．８３（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），６．７６（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９５−７．１８（ｍ，４Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ）．
実施例７：化合物１４｛２−（２，５−ジヒドロピロール−１−イルメチル）−８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
１−メチルピペラジンの代わりに２，５−ジヒドロピロールを用い、実施例１と同様にして、特開平７−６１９８３号に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンから収率８２％で化合物１４を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４６４（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９−３．１（ｍ，４Ｈ），３．４５（ｓ，４Ｈ），３．７０（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），５．８７（ｓ，２Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），６．７５−６．８５（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．００−７．０５（ｍ，２Ｈ）．
実施例８：化合物１５〈｛Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−メチルアミノ｝酢酸メチルエステル〉の合成
１−メチルピペラジンの代わりにサルコシンメチルエステル塩酸塩を用い、実施例１と同様にして、特開平７−６１９８３号に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンから収率３１％で化合物１５を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４９８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．２３（ｓ，２Ｈ），３．５３（ｓ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），５．９８（ｓ，１Ｈ），６．５９−６．６７（ｍ，２Ｈ），６．８２（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９７−７．０２（ｍ，２Ｈ）．
実施例９：化合物１６｛１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル｝の合成
１−メチルピペラジンの代わりにイソニペコチン酸エチルエステルを用い、実施例１と同様にして、特開平７−６１９８３号に記載された２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンから収率６０％で化合物１６を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５５２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），１．６８−１．９０（ｍ，６Ｈ），１．９７（ｔｄ，Ｊ＝１１．３，２．７Ｈｚ，２Ｈ），２．２６（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８３（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．３６（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），５．３３（ｓ，２Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），６．５７−６．６６（ｍ，２Ｈ），６．７８−６．８２（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９４−６．９９（ｍ，２Ｈ）．
実施例１０：化合物１７〈２−｛Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−メチルアミノ｝エタノール〉の合成
水素化アルミニウムリチウム（１５．７ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．３ｍＬ）に懸濁させ、氷冷下、攪拌しながら、テトラヒドロフラン（０．９ｍＬ）に溶解した、実施例８で得られた化合物１５（１２６ｍｇ，０．２５３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、撹拌しながら水（０．０１６ｍＬ）、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（０．０１６ｍＬ）、水（０．０４８ｍＬ）を順次滴下した。析出物を濾過し、濾液を濃縮した残渣をＮＨ−シリカゲルクロマトグララィー（溶出溶媒：酢酸エチル）で精製して化合物１７（４７．６ｍｇ，０．１０１ｍｍｏｌ，収率４０％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４７０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．４４（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），５．９９（ｓ，１Ｈ），６．５９−６．６７（ｍ，２Ｈ），６．８１（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９１−６．９８（ｍ，２Ｈ）．
実施例１１：化合物１８〈｛１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−イル｝メタノール〉の合成
化合物１５の代わりに化合物１６を用い、実施例１０と同様にして、収率５０％で化合物１８を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５１０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），１．２４−１．７４（ｍ，６Ｈ），１．９１（ｍ，２Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８６−３．０２（ｍ，６Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），３．４８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），５．９８（ｓ，１Ｈ），６．５８−６．６７（ｍ，２Ｈ），６．８２（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．９４−７．００（ｍ，２Ｈ）．
実施例１２：化合物１９〈｛Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−メチルアミノ｝酢酸〉の合成
実施例８で得られた化合物１５（１５１ｍｇ，０．３０３ｍｍｏｌ）をメタノール（３．０ｍＬ）に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム／メタノール溶液（１．５ｍＬ）を加え、６０℃に加熱し、９時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、室温に冷却し、４ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え、ｐＨを６．０に調整した。析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥した。この結晶をエチルエーテルに懸濁させ、加熟還流条件下、１時間撹拌し、さらに室温で１時間撹拌した。結晶を濾取し、減圧下で乾燥させ化合物１９（１１９ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４８３（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．４８−２．５２（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．７８（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８９（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｓ，２Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．７５−７．０２（ｍ，７Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ）．
実施例１３：化合物２０｛１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボン酸｝の合成
化合物１５の代わりに化合物１６を用い、実施例１２と同様にして、収率７０％で化合物２０を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５２４（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．５２（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），１．９７（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ），２．４８−２．５４（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．７１−２．９２（ｍ，８Ｈ），３．３２（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．７５−６．９４（ｍ，７Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ）．
実施例１４：化合物２１〈｛Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−メチルアミノ｝アセトニトリル〉の合成
実施例６で得られた化合物１３（７００ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１．２ｍＬ）に溶解し、メチルアミノアセトニトリル（３６８ｍｇ，３．４６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．５６１ｍＬ，４．０３ｍｍｏｌ）を加えて加熱還流条件下、終夜撹拌した。反応液を室温まで冷却し、飽和重曹水を加え、クロロホルムで３回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール／クロロホルム＝１／９９）で精製した。目的物を含む画分の濃縮残渣にエタノールを加え、得られた懸濁液を６０℃で０．５時間撹拌し、その後室温で１時間撹拌した。析出した結晶を濾別し、減圧下で乾燥させることにより、化合物２１（４１５ｍｇ，０．８９３ｍｍｏｌ，収率７８％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４６５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．４３（ｓ，２Ｈ），３．４８（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），６．５８−６．６９（ｍ，２Ｈ），６．７８−６．８３（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９５−７．０２（ｍ，２Ｈ）．
実施例１５：化合物２２｛Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−［２−（ピロリジン−１−イル）エチル］アミン・２フマル酸塩｝の合成
工程１
後記の実施例２４で得られた化合物９３（１．２５ｇ，３．０３ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５４ｍＬ）およびアセトン（６ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、二酸化マンガン（２．７ｇ，３１ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、固形物をセライトを通じて濾別し、濾液を濃縮した。残渣に酢酸エチルを加えて得られる懸濁液を加熱還流条件下０．５時間撹拌し、その後室温に冷却してさらに０．５時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下乾燥させることにより８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボアルデヒド（１．０２ｇ，２．４８ｍｍｏｌ，収率８２％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４１１（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６４（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｍ，２Ｈ），５．３７（ｓ，２Ｈ），６．６０−６．９１（ｍ，６Ｈ），７．５２−７．６１（ｍ，２Ｈ），９．７７（ｓ，１Ｈ）．
工程２
工程１で得られた８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボアルデヒド（０．３００ｇ，０．７３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）およびクロロホルム（６ｍＬ）の混合溶媒に懸濁させ、これに２−（ピロリジン−１−イル）エチルアミン（１３９μＬ，１．１０ｍｍｏｌ）を加えて１０分間、加熱還流した。その後、反応溶液を室温まで冷却してトリアセトキシホウ素化ナトリウム（４６４ｍｇ，２．１９ｍｍｏｌ）を加えて１２時間、室温で攪拌した。反応溶液に酢酸エチルと１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加え、有機層を無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。その後、溶液を減圧下、濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／２ｍｏｌ／Ｌアンモニア・メタノール溶液＝２０／１）で精製して、Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−［２−（ピロリジン−１−イル）エチル］アミン（０．３０１ｇ，０．５９２ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。これを実施例１と同様な方法でフマル酸塩として化合物２２を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５０９（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．６５−１．８５（ｍ，４Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．６−２．７（ｍ，４Ｈ），２．７−３．０（ｍ，８Ｈ），３．８６（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．５５（ｓ，４Ｈ），６．７５−６．９５（ｍ，６Ｈ），７．０−７．１５（ｍ，２Ｈ），８．４３（ｓ，１Ｈ）．
実施例１６：化合物２３｛Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−（２−メトキシエチル）アミン・１フマル酸塩｝の合成
２−（ピロリジン−１−イル）エチルアミンの代わりに２−メトキシエチルアミンを用い、実施例１５の工程２と同様にして、収率７８％でＮ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−（２−メトキシエチル）アミンを得た。これを実施例１と同様な方法でフマル酸塩として化合物２３を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４７０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８−３．０（ｍ，６Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．４８（ｓ，２Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８５−７．０（ｍ，４Ｈ），７．０−７．１（ｍ，２Ｈ），８．４３（ｓ，１Ｈ）．
実施例１７：化合物２４〈２−｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］｝アミノエタノール・０．５フマル酸塩〉の合成
２−（ピロリジン−１−イル）エチルアミンの代わりに２−エタノールアミンを用い、実施例１５の工程２と同様にして、収率３９％で２−｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］アミノ｝エタノールを得た。
これを実施例１と同様な方法でフマル酸塩として化合物２４を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４５６（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．７０−２．７５（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８５−２．９（ｍ，４Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．４４（ｓ，１Ｈ），６．７９（ｄｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８５−６．９５（ｍ，４Ｈ），７．０−７．１（ｍ，２Ｈ），８．３９（ｓ，１Ｈ）．
実施例１８：化合物２５〈｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］メチル｝アミン・１フマル酸塩〉の合成
実施例６で得られた化合物１３（０．３００ｇ，０．５１６ｍｍｏｌ）を７ｍｏｌ／Ｌアンモニアメタノール溶液（５ｍＬ）に溶解し、封管して８０℃で４８時間加熱した。その後、反応溶液を減圧下、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／２ｍｏｌ／Ｌアンモニア・メタノール溶液＝２０／１）で精製して、｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］メチル｝アミン（０．１３５ｇ，０．３２９ｍｍｏｌ，収率６４％）を得た。
これを実施例１と同様な方法でフマル酸塩として化合物２５を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４１２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８５−２．９（ｍ，４Ｈ），３．８１（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．４２（ｓ，２Ｈ），６．８−７．０（ｍ，５Ｈ），７．０−７．１５（ｍ，２Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ）．
実施例１９：化合物２６｛Ｎ−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−Ｎ−メチル−Ｎ−（２Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）アミン｝の合成
実施例６で得られた化合物１３（６６７ｍｇ，１．１０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１１ｍＬ）に溶解し、参考例１ａで得られたＮ−メチル−Ｎ−（２−トリチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）アミン（３９０ｍｇ，１．１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．３１ｍＬ，２．３ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で終夜撹拌した。反応液を室温まで冷却し、飽和重曹水を加え、クロロホルムで３回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲル（溶出溶媒：メタノール／クロロホルム＝２／９８）に通じて原点成分を除去し、濃縮した。残渣にアセトン（１．９ｍＬ）、水（１．９ｍＬ）、酢酸（１．９ｍＬ）を加え、６０℃で１．５時間撹拌した。反応液を０℃まで冷却し、析出物を濾過し、濾液を濃縮して得られた残渣をエタノールから再結晶して、化合物２６（６６．７ｍｇ，０．１３１ｍｍｏｌ，収率１２％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５０８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７５−２．７９（ｍ，７Ｈ），２．８１（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０８（ｓ，２Ｈ），４．２８（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７２−６．８０（ｍ，２Ｈ），６．８４−６．９４（ｍ，３Ｈ）．
実施例２０：化合物２７｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−［４−（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イルメチル］−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メチルアミノアセトニトリルの代わりにピペリジン−４−カルボニトリルを用い、実施例１４と同様にして、収率５８％で１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−ピペリジン−４−カルボニトリルを得た。
得られた１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボニトリル（０．２５２ｇ，０．５００ｍｍｏｌ）をトルエン（４ｍＬ）に溶解し、トリメチルシリルアジド（０．１３ｍＬ，１．００ｍｍｏｌ）および酸化ジブチルすず（１２．４ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃で２２時間、加熱攪拌した。反応溶液を減圧下、濃縮した後、残渣にエタノールを加えた。得られた懸濁液を０．５時間、加熱環流した後、固体を濾取して化合物２７（０．１１０ｇ、０．２００ｍｍｏｌ，収率４０％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５４８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．６５−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．９−２．０５（ｍ，２Ｈ），２．２−２．３５（ｍ，２Ｈ），２．４８（ｓ，３Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８５−３．０５（ｍ，７Ｈ），３．５２（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．８５−７．０５（ｍ，８Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ）．
実施例２１：化合物２８〜化合物９０の合成
工程１
ヨウ化  １−（１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル）−１−メチルピペリジニウム（０．０１５ｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解し、対応するＹＨ（式中、Ｙは前記と同義である）のクロロホルム溶液（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ，０．０６０ｍＬ）および水酸化リチウム・１水和物（０．０７０ｇ）を加え、室温で２０時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、溶媒を留去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、得られた溶液を水で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、残渣にクロロホルム（０．６０ｍＬ）およびＮ−メチルイサト酸無水物  ポリスチレン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓａｔｏｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ、ノババイオケム社製、０．１５ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物中のレジンを濾別し、櫨液を濃縮した後に、残渣をイオン交換クロマトグラフィー（ボンデシルＳＣＸ、バリアン社製、２ｍｏｌ／Ｌアンモニア−メタノール溶液で溶出）で精製し、製造法１における化合物（ＩＶ）に相当する各種中間体を得た。
工程２
実施例５と同様にして、工程１で得られた製造法１における化合物（ＩＶ）に相当する各種中間体と相当するＲ５Ｒ６ＮＨ（式中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ前記と同義である）から、目的物である化合物２８〜化合物９０を得た。尚、化合物４１、４２、４８、８９はシュウ酸塩として単離した。
化合物２８〜化合物８７の構造と分析値（ＡＰＣＩ−ＭＳ）を第２表〜第６表に記した。また、化合物２９、３０、３６、４１、４２、４８、５３、５４、６０、６５、６６、７２、７７、７８、８４の分析値（１Ｈ  ＮＭＲ）を以下に示した。
化合物２９｛２−（ベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．０−２．１（ｍ，２Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．７５−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．９−３．０（ｍ，４Ｈ），３．３２（ｓ，２Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），５．５−５．８（ｍ，２Ｈ），６．８−７．１（ｍ，６Ｈ），７．１−７．３（ｍ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ），８．３５（ｓ，１Ｈ）．
化合物３０｛２−（ベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（ピロリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．５−１．７（ｍ，４Ｈ），２．３−２．５（ｍ，４Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｓ，２Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），６．８−６．９５（ｍ，４Ｈ），６．９５−７．０（ｍ，２Ｈ），７．１−７．３（ｍ，２Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ）．
化合物３６｛２−（ベンゾイミダゾ−１−イルメチル）−８−モルホリノメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．２−２．４（ｍ，４Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．２７（ｓ，２Ｈ），３．５−３．６（ｍ，４Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），６．７−７．１（ｍ，６Ｈ），７．１−７．２５（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ）．
化合物４１｛２−（２−フェニルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン・１シュウ酸塩｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．２−２．５（ｍ，２Ｈ），２．７−３．０（ｍ，４Ｈ），３．０−３．２（ｍ，２Ｈ），３．４−３．６（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），５．４５（ｓ，２Ｈ），５．６９（ｍ，１Ｈ），５．８５（ｍ，１Ｈ），６．６−６．８（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０５−７．２（ｍ，２Ｈ），７．２−７．５（ｍ，２Ｈ），７．５−７．７（ｍ，４Ｈ），７．７−７．８５（ｍ，３Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ）．
化合物４２｛２−（２−フェニルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（ピロリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン・１シュウ酸塩｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．８−２．０（ｍ，４Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．０−３．２（ｍ，４Ｈ），４．１２（ｓ，２Ｈ），５．４５（ｓ，２Ｈ），６．６−６．７（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１−７．２（ｍ，２Ｈ），７．２−７．３（ｍ，２Ｈ），７．４−７．６（ｍ，４Ｈ），７．６−７．８（ｍ，３Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ）．
化合物４８｛２−モルホリノメチル−８−（２−フェニルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン・１シュウ酸塩｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．７−３．０（ｍ，８Ｈ），３．６−３．８（ｍ，４Ｈ），３．８３（ｓ，２Ｈ），５．４２（ｓ，２Ｈ），６．６５−６．７（ｍ，２Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０−７．１（ｍ，２Ｈ），７．２−７．３（ｍ，２Ｈ），７．４−７．６（ｍ，４Ｈ），７．６５−７．８（ｍ，３Ｈ），８．４４（ｓ，１Ｈ）．
化合物５３｛２−（２−メチルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．０−２．１（ｍ，２Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．７５−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．８５−３．０（ｍ，４Ｈ），３．３５（ｓ，２Ｈ），５．２８（ｓ，２Ｈ），５．５５−５．７５（ｍ，２Ｈ），６．８−７．０（ｍ，６Ｈ），７．１−７．２（ｍ，２Ｈ），７．４−７．６（ｍ，２Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ）．
化合物５４｛２−（２−メチルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（ピロリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．５−１．８（ｍ，４Ｈ），２．３−２．５（ｍ，４Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｓ，２Ｈ），５．２８（ｓ，２Ｈ），６．７−６．９（ｍ，６Ｈ），７．１−７．２（ｍ，２Ｈ），７．３−７．５（ｍ，２Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ）．
化合物６０｛２−（２−メチルベンゾイミダゾ−１−イルメチル）−８−モルホリノメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．２−２．４（ｍ，４Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｓ，２Ｈ），３．５−３．６（ｍ，４Ｈ），５．２８（ｓ，２Ｈ），６．８−７．０（ｍ，６Ｈ），７．１−７．２（ｍ，２Ｈ），７．５−７．６（ｍ，２Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ）．
化合物６５｛２−（５，６−ジメチルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．０−２．１（ｍ，２Ｈ），２．２−２．４（ｍ，６Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７５−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．８５−３．０５（ｍ，４Ｈ），３．３０（ｓ，２Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），５．６−５．７（ｍ，２Ｈ），６．８−７．０（ｍ，６Ｈ），７．３１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．２７（ｓ，１Ｈ）．
化合物６６｛２−（５，６−ジメチルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（ピロリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．５−１．８（ｍ，４Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），２．３−２．４（ｍ，４Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｓ，２Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），６．８−７．０（ｍ，６Ｈ），７．３０（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ）．
化合物７２｛２−（５，６−ジメチルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−モルホリノメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．２−２．４（ｍ，１０Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｓ，２Ｈ），３．５−３．６（ｍ，４Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），６．８−７．０（ｍ，６Ｈ），７．３０（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ）．
化合物７７｛２−（２−エチルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．９５−２．０５（ｍ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６−３．０（ｍ，８Ｈ），３．３２（ｓ，２Ｈ），５．２８（ｓ，２Ｈ），５．１−５．５（ｍ，２Ｈ），６．７５−７．０（ｍ，６Ｈ），７．１−７．２５（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）．
化合物７８｛２−（２−エチルベンゾイミダゾール−１−イルメチル）−８−（ピロリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．６−１．８（ｍ，４Ｈ），２．３−２．４（ｍ，４Ｈ），２．８−３．０（ｍ，６Ｈ），３．３２（ｓ，２Ｈ），５．２８（ｓ，２Ｈ），６．７−７．０（ｍ，６Ｈ），７．０−７．２（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ）．
化合物８４｛２−（２−エチルベンゾイミダゾ−１−イルメチル）−８−モルホリノメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．２−２．４（ｍ，４Ｈ），２．８−３．０（ｍ，６Ｈ），３．２７（ｓ，２Ｈ），３．５−３．６（ｍ，４Ｈ），５．２７（ｓ，２Ｈ），６．７−７．０（ｍ，６Ｈ），７．１−７．２（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）．
化合物８８〜化合物９０の構造を第７表に、分析値（ＡＰＣＩ−ＭＳ、１Ｈ  ＮＭＲ）を以下に示した。
化合物８８｛２−（イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４２２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．０−２．１（ｍ，２Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７５−２．８（ｍ，２Ｈ），２．８−３．０（ｍ，４Ｈ），３．３０（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｓ，２Ｈ），５．５−５．６（ｍ，２Ｈ），６．８−７．０（ｍ，４Ｈ），７．０−７．０５（ｍ，２Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２７（ｓ，１Ｈ），８．３７（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ）．
化合物８９｛２−（イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン・１シュウ酸塩｝
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４２２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．２−２．３（ｍ，２Ｈ），２．９−３．０（ｍ，４Ｈ），３．４−３．５（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），５．３７（ｓ，２Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９−７．０（ｍ，２Ｈ），７．０−７．１（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｄｄ，Ｊ＝５．４，８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．５５（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ）．
化合物９０｛２−（イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イルメチル）−８−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４２２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．１−２．２（ｍ，２Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．８−２．９（ｍ，２Ｈ），３．０−３．１（ｍ，４Ｈ），３．４８（ｓ，２Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），５．７３（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），６．６５−６．７５（ｍ，２Ｈ），６．９５−７．０（ｍ，２Ｈ），７．０−７．０５（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ）．
実施例２２：化合物１２５｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］酢酸｝の合成
実施例３６で得られた化合物１０５を用い、実施例５２の工程１と同様にして、収率９４％で［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］アセトニトリルを得た。
これを用い、実施例３８と同様にして収率８６％で化合物１２５を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４５５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．７５（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．９−３．１（ｍ，４Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），３．４２（ｓ，２Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９−７．０５（ｍ，６Ｈ）．
実施例２３：化合物９２｛酢酸［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］エステル｝の合成
実施例６で得られた化合物１３（７．９８ｇ，１３．１ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（８７ｍＬ）に溶解し、酢酸リチウム（４．３３ｇ，６５．７ｍＬ）を加えて７０℃で２日間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水（３回）、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル）で精製し、目的物を含む画分を濃縮し、残渣にエタノールを加えて得られる懸濁液を室温で０．５時間撹拌した。析出した結晶を濾取して化合物９２（２．８７ｇ，６．３１ｍｍｏｌ，収率４８％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４５５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．１３（ｓ，１Ｈ），６．５８−６．８３（ｍ，４Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．０１−７．０７（ｍ，２Ｈ）．
実施例２４：化合物９３｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］メタノール｝の合成
実施例２３で得られた化合物９２（２．７９ｇ，６．１４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６１ｍＬ）に懸濁させ、ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（２８％，６．２ｍＬ，３１ｍｍｏｌ）を加えて室温で３．５時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、反応液に水を加えて室温にて０．５時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下乾燥させた後にエタノールに懸濁させ、加熱還流条件下、１時間撹拌し、さらに室温で１時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させ、化合物９３（２．０４ｇ，４．９５ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４１３（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），１．５６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），６．５９−６．８５（ｍ，３Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．０３（ｍ，２Ｈ）．
実施例２５：化合物９４｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−メトキシメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
水素化ナトリウム（５５％，１１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（０．４０ｍＬ）懸濁液にメタノール（２０μＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を加えて室温で２０分間攪拌した。その後、反応液をテトラヒドロフラン（０．２０ｍＬ）に懸濁した実施例６で得られた化合物１３（３０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）に加え、６０℃で３．５時間反応させた。反応液を濃縮した後、残渣をクロロホルムに溶解し、得られた溶液を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン＝４５／５０／５）で精製して化合物９４（６．５ｍｇ，１５ｍｍｏｌ，収率３０％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４２７（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），４．３２（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０９（ｓ，１Ｈ），６．５８−６．８２（ｍ，４Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．０１（ｍ，２Ｈ）．
実施例２６：化合物９５｛２−アリルオキシメチル−８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりにアリルアルコールを用い、実施例２５と同様にして、収率３４％で化合物９５を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４５３（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），４．００（ｄｔ，Ｊ＝５．６，１．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３９（ｓ，２Ｈ），５．１９（ｄｑ，Ｊ＝１０．２，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｄｑ，Ｊ＝１７．０，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），５．９５（ｍ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），６．５８−６．８３（ｍ，４Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．０３（ｍ，２Ｈ）．
実施例２７：化合物９６｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（２−メトキシエトキシメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりに２−メトキシエタノールを用い、実施例２５と同様にして、収率９．３％で化合物９６を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４９５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．５７（ｍ，４Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．００−７．０６（ｍ，２Ｈ）．
実施例２８：化合物９７｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（２，２，２−トリフルオロエトキシメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりに２，２，２−トリフルオロエタノールを用い、実施例２５と同様にして、収率６４％で化合物９７を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４９５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．７８（ｑ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．５４（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７６−６．８２（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．９８−７．０４（ｍ，２Ｈ）．
実施例２９：化合物９８｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（２−メチルプロポキシメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりに２−メチル−１−プロパノールを用い、実施例２５と同様にして、収率１１％で化合物９８を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４６９（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．８９（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｍ，４Ｈ），３．２０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９８−７．０５（ｍ，２Ｈ）．
実施例３０：化合物９９｛２−ベンジルオキシメチル−８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりにベンジルアルコールを用い、実施例２５と同様にして、収率７８％で化合物９９を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５０３（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，２Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｍ，４Ｈ），４．４２（ｓ，２Ｈ），４．５３（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｓ，２Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．３６（ｍ，５Ｈ）．
実施例３１：化合物１００｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（２−フェニルエトキシメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりに２−フェニルエタノールを用い、実施例２５と同様にして、収率３８％で化合物１００を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５１７（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．３９（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９４−７．０１（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．３０（ｍ，５Ｈ）．
実施例３２：化合物１０１｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（ピリジン−２−イルメトキシメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりにピリジン−２−イルメタノールを用い、実施例２５と同様にして、収率６５％で化合物１０１を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５０４（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），４．５２（ｓ，２Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．２５（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７６−６．８１（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．０３−７．０８（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｂｒ  ｄｄ，Ｊ＝７．６，４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｔｄ，Ｊ＝７．７，１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．５４（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ）．
実施例３３：化合物１０２｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（フラン−２−イルメトキシメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
メタノールの代わりにフラン−２−イルメタノールを用い、実施例２５と同様にして、収率７７％で化合物１０２を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４９３（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｍ，４Ｈ），４．４１（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｓ，２Ｈ），５．３３（ｓ，２Ｈ），６．２１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．３１（ｄｄ，Ｊ＝３．１，０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．３３（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７５−６．８０（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），７．００−７．０４（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｄｄ，Ｊ＝１．８，０．８Ｈｚ，１Ｈ）．
実施例３４：化合物１０３｛８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボニトリル｝の合成
実施例１５の工程１で得られた８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボアルデヒド（６５０ｍｇ，１．５８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１６ｍＬ）に懸濁させ、ヒドロキシルアミン塩酸塩（１５３ｍｇ，２．３８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．３３１ｍＬ，２．３８ｍｍｏｌ）およびフタル酸無水物（３２８ｍｇ，２．２１ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で終夜撹拌した。反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムに溶解し、得られた溶液をアンモニア水（３％）と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール／クロロホルム＝１／９９）で精製し、目的物を含む画分を濃縮して残渣にエタノールを加え、得られた懸濁液を６０℃で０．５時間撹拌し、室温で１時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下乾燥して化合物１０３（４４０ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ，収率６８％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４０８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），５．３６（ｓ，２Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），６．６３−６．９０（ｍ，５Ｈ），７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ）．
実施例３５：化合物１０４｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
実施例３４で得られた化合物１０３を用い、実施例２０の後段と同様にして収率７２％で化合物１０４を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４５１（［Ｍ＋Ｈ］＋）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４５１（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．４８−２．５３（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８６−３．０２（ｍ，４Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９１−６．９８（ｍ，３Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６５−７．７０（ｍ，２Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ）．
実施例３６：化合物１０５｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］アセトニトリル｝の合成
実施例６で得られた化合物１３（２．０４ｇ，３．３６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１７ｍＬ）に溶解して、青酸ナトリウム（３６１ｍｇ，７．３７ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１０時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、酢酸エチルで希釈し、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液、水（２回）、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をエタノールから再結晶し、目的物である化合物１０５（７５１ｍｇ，１．７８ｍｍｏｌ／収率５３％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４２２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｍ，４Ｈ），３．６２（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），６．５９−６．７１（ｍ，２Ｈ），６．８０−６．８４（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９５−７．０１（ｍ，２Ｈ）．
実施例３７：化合物１０６｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−８−（２Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
実施例３６で得られた化合物１０５を用い、実施例２０の後段と同様にして、収率７６％で化合物１０６を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４６５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．４８−２．５２（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．７８（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８６（ｍ，４Ｈ），４．１１（ｓ，２Ｈ），５．２８（ｓ，２Ｈ），６．７５−６．９４（ｍ，７Ｈ），８．３２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
実施例３８：化合物１０７｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］酢酸｝の合成
実施例３６で得られた化合物１０５（２４７ｍｇ，０．５８６ｍｍｏｌ）をエタノール（１２ｍＬ）に懸濁し、水酸化ナトリウム（９３８ｍｇ，２３．５ｍｍｏｌ）を加えて、加熱還流条件下、３時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後に、反応液を室温まで冷却し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ５に調整した。析出した結晶を濾過し、減圧下乾燥した後、エタノールに懸濁し、６０℃で０．５時間撹拌し、室温で１時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下乾燥して化合物１０７（１２２ｍｇ，０．２４３ｍｍｏｌ，収率４１％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４４１（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．４８−２．５３（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．７８（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．８７（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），３．３８（ｓ，２Ｈ），５．３８（ｓ，２Ｈ），６．７４−６．９４（ｍ，７Ｈ），８．２７（ｓ，１Ｈ），１２．１５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
実施例３９：化合物１０８｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチルスルファニル］酢酸メチルエステル｝の合成
実施例６で得られた化合物１３（１．０４ｇ，１．７１ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１７ｍＬ）に溶解して、メルカプト酢酸メチルエステル（０．１９９ｍＬ，２．２３ｍｍｏｌ）および１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデック−７−エン（０．３８４ｍＬ，２．５７ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で７時間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール／クロロホルム＝１／９９）で精製し、化合物を含む画分を濃縮した。残渣にエタノールを加え、得られた懸濁液を６０℃で０．５時間、室温で１時間撹拌した。析出した結晶を濾取して、化合物１０８（６２８ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ，収率７３％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５０１（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．０９（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），６．５９−６．６７（ｍ，２Ｈ），６．８２（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．９６−７．０３（ｍ，２Ｈ）
実施例４０：化合物１０９｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチルスルファニル］酢酸｝の合成
実施例３９で得られた化合物１０８（３５０ｍｇ，０．６９９ｍｍｏｌ）を用い、実施例１２と同様にして、収率３８％で化合物１０９を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４８７（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．４２−２．５０（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．８１（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｍ，６Ｈ），３．４９（ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），６．６７−６．８９（ｍ，７Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ）．
実施例４１：化合物１１０｛８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸エチルエステル｝の合成
工程１
ヨウ化  １−（１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル）−１−メチルピペリジニウム（６．６８ｇ，１５．４ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１１０ｍＬ）に溶解し、酢酸リチウム（５．０７ｇ，７６．９ｍｍｏｌ）を加えて、７０℃で２日間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水（３回）と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝３０／７０）で精製して、酢酸（１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル）エステル（２．８５ｇ，１０．７ｍｍｏｌ，収率６９％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２６８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．０７（ｓ，３Ｈ），３．０７（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），６．０５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．６６−６．８５（ｍ，３Ｈ），７．０２−７．１１（ｍ，４Ｈ）．
工程２
工程１で得られた酢酸（１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル）エステル（２．８５ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）をメタノール（１１０ｍＬ）に懸濁して、ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（３８％，１．１４ｍＬ，５．３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶液を濃縮し、残渣に飽和食塩水とクロロホルムを加えて３回クロロホルムで抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をジイソプロピルエーテルから再結晶して、１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメタノール（１．７３ｇ，７．６８ｍｍｏｌ，収率７２％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２２６（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４９（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０８（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），６．０２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．６６−６．８７（ｍ，３Ｈ），７．０２−７．１１（ｍ，４Ｈ）．
工程３
工程２で得られた１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメタノール（６．１ｇ，７０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（７７ｍＬ）に溶解して、二酸化マンガン（４．５５ｇ，４６．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で８時間攪拌した。反応溶液をセライトを通じて濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０）で精製して１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボアルデヒド（１．１５ｇ，５．１５ｍｍｏｌ，収率６７％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２２４（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．１１（ｍ，４Ｈ），６．４９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．８７−６．９１（ｍ，３Ｈ），７．０７−７．１７（ｍ，２Ｈ），７．５５−７．６２（ｍ，２Ｈ），９．８８（ｓ，１Ｈ）．
工程４
工程３で得られた１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボアルデヒド（６６５ｍｇ，２．９８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１８ｍＬ）および水（１８ｍＬ）の混合溶媒に溶解して、ジメチルスルホキシド（２．１ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）、リン酸２水素ナトリウム（１．４３ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）および亜塩素酸ナトリウム（４０４ｍｇ，４．４７ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で４時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルと水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣に酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒（３：１）を加えて得られる懸濁液を６０℃で０．５時間撹拌し、室温で１時間撹拌した。析出した結晶を濾過して、１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸（５９８ｍｇ，２．５０ｍｍｏｌ，収率８４％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２４０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．１１（ｍ，４Ｈ），６．３９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．７７−６．８０（ｍ，３Ｈ），７．０６−７．１６（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．８４（ｍ，２Ｈ）．
工程５
工程４で得られた１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸（４２６ｍｇ，１．７８ｍｍｏｌ）をエタノール（８．９ｍＬ）に溶解して、塩化チオニル（０．２６ｍＬ，３．６ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流条件下５時間攪拌した。反応溶液を濃縮し、クロロホルムと飽和重曹水を加え、クロロホルムで３回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０）で精製して、１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸エチルエステル（３８３ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２６８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），３．０９（ｍ，４Ｈ），４．３３（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），６．３４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．６９−６．８６（ｍ，３Ｈ），７．０４−７．１４（ｍ，２Ｈ），６．７２−６．７８（ｍ，２Ｈ）．
工程６
工程５で得られた１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸エチルエステル（４４３ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）をクロロホルム（８．３ｍＬ）および酢酸（８．３ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、ピペリジン（０．５７３ｍＬ，５．８０ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（１４９ｍｇ，４．９７ｍｍｏｌ）を加え、６０℃に加熱し、１．５日間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣に酢酸エチルと飽和重曹水を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン＝７０／２５／５）で精製し、目的物を含む画分を濃縮した。残渣をジエチルエーテルでトリチュレーションし、８−ピペリジノメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸エチルエステル（２４９ｍｇ，０．６８３ｍｍｏｌ，収率４１％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ３６５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３４−１．４６（ｍ，５Ｈ），１．６７（ｍ，４Ｈ），２．３６（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），３．０８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，２Ｈ），４．３３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），６．３２（ｓ，１Ｈ），６．６７−６．７４（ｍ，２Ｈ），６．９９−７．０６（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．７６（ｍ，２Ｈ）．
工程７
工程６で得られた８−ピペリジノメチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸エチルエステル（２３１ｍｇ，０．６３４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３．２ｍＬ）に溶解して、ヨウ化メチル（５９．２μＬ，０．９５１ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して、ヨウ化１−（８−エトキシカルボニル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル）−１−メチルピペリジニウム（３２１ｍｇ，０．６３４ｍｍｏｌ，収率１００％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．７５−１．９５（ｍ，６Ｈ），２．９６（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．９０（ｓ，２Ｈ），７．１４−７．３５（ｍ，４Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｍ，２Ｈ）．
工程８
２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（１８０ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解し、攪拌しながら水素化ナトリウム（５５％，３３．６ｍｇ，０．７７０ｍｍｏｌ）を数回に分けて加えた後、５０℃で０．５時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、ジメチルホルムアミド（１．２ｍＬ）に溶解した工程７で得られたヨウ化１−（８−エトキシカルボニル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル）−１−メチルピペリジニウム（１３０ｍｇ，０．２５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール／クロロホルム＝１／９９）で精製し、目的物を含む画分を濃縮した。残渣にジエチルエーテルを加え、加熱還流条件で０．５時間撹拌し、その後室温で１時間で撹拌した。析出した結晶を濾取して化合物１１０（７６．７ｍｇ，０．１６９ｍｍｏｌ，収率６６％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４５５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），１．３６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），５．３６（ｓ，２Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），６．６４−６．７１（ｍ，２Ｈ），６．８２−６．９０（ｍ，３Ｈ），７．７０−７．７４（ｍ，２Ｈ）．
実施例４２：化合物１１１｛８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸｝の合成
実施例４１で得られた化合物１１０（９００ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）を用い、実施例１２と同様にして、収率９７％で化合物１１１を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４２７（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２４（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．５１−２．５４（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．８２−２．９９（ｍ，６Ｈ），５．３７（ｓ，２Ｈ），６．８４−７．０３（ｍ，５Ｈ），７．５８（ｍ，２Ｈ），８．８７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１２．２５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
実施例４３：化合物１１２｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］（４−メチルピペラジン−１−イル）メタノン｝の合成
実施例４２で得られた化合物１１１（１００ｍｇ，０．２３４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（２．３ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（４．６ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、これに４−メチルピペラジン（３９μＬ，０．３５２ｍｍｏｌ）、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・１塩酸塩（８９．７ｍｇ，０．４６８ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３５．８ｍｇ，０．２３４ｍｍｏｌ）を加えて室温で８時間攪拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した後、反応液を濃縮した。残渣をクロロホルムで溶解し、得られた溶液を水（２回）、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣にジエチルエーテルを加え、得られる懸濁液を室温で１時間撹拌した後、固体を濾取して化合物１１２（４７．７ｍｇ，０．０９３８ｍｍｏｌ，収率４０％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５０９（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），５．３５（ｓ，２Ｈ），６．１８（ｓ，１Ｈ），６．６２−６．６９（ｍ，２Ｈ），６．８３（ｍ，２Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），７．１０−７．１５（ｍ，２Ｈ）．
実施例４４：化合物１１３｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］（ピロリジン−１−イル）メタノン｝の合成
４−メチルピペラジンの代わりにピロリジンを用い、実施例４３と同様にして、収率９０％で化合物１１３を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４８０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．８８（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｍ，４Ｈ），３．５６（ｍ，４Ｈ），５．３５（ｓ，２Ｈ），６．１９（ｓ，１Ｈ），６．６２−６．６９（ｍ，２Ｈ），６．８１−６．８６（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．２９（ｍ，２Ｈ）．
実施例４５：化合物１１４｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］（４−ヒドロキシピペリジノ）メタノン｝の合成
４−メチルピペラジンの代わりに４−ピベリジノールを用い、実施例４３と同様にして、収率６２％で化合物１１４を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５１０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．４８−１．５８（ｍ，２Ｈ），１．８６−１．９７（ｍ，２Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，２Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｍ，４Ｈ），３．２２−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．９１−４．００（ｍ，３Ｈ），５．３６（ｓ，２Ｈ），６．２１（ｓ，１Ｈ），６．６２−６．７０（ｍ，２Ｈ），６．８１−６．８５（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），７．０８−７．１４（ｍ，２Ｈ）．
実施例４６：化合物１１５｛８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシエチル）アミド｝の合成
４−メチルピペラジンの代わりにエタノールアミンを用い、実施例４３と同様にして、収率８２％で化合物１１５を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４７０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．７１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（．ｍ，４Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），５．３５（ｓ，２Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），６．５４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６３−６．７１（ｍ，２Ｈ），６．８０−６．８４（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），７．４４−７．４８（ｍ，２Ｈ）．
実施例４７：化合物１１６｛８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸［２−（ピロリジン−１−イル）エチル］アミド｝の合成
４−メチルピペラジンの代わりに２−（ピロリジン−１−イル）エチルアミンを用い、実施例４３と同様にして、収率９２％で化合物１１６を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２３（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５７（ｍ，４Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｍ，２Ｈ），３．５３（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），５．３５（ｓ，２Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），６．６３−６．７２（ｍ，３Ｈ），６．８３（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），７．４５−７．５２（ｍ，２Ｈ）．
実施例４８：化合物１１７｛［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イル］（モルホリノ）メタノン｝の合成
４−メチルピペラジンの代わりにモルホリンを用い、実施例４３と同様にして、収率９８％で化合物１１７を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４９６（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ  Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９９（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，８Ｈ），．５．３５（ｓ，２Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），６．６２−６．７１（ｍ，２Ｈ），６．８１−６．８６（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），７．１０−７．１６（ｍ，２Ｈ）．
実施例４９：化合物１１８｛８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸ビス（２−ヒドロキシエチル）アミド｝の合成
４−メチルピペラジンの代わりに２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）エタノールを用い、実施例４３と同様にして、収率３８％で化合物１１８を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５１４（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｍ，４Ｈ），３．２３（ｂｒｓ，２Ｈ），３．６３（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），３．８７（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），５．３５（ｓ，２Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），６．６２−６．６９（ｍ，２Ｈ），６．８３（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．２９（ｍ，２Ｈ）．
実施例５０：化合物１１９｛８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボン酸アミド｝の合成
４−メチルピペラジンの代わりにアンモニアを用い、実施例４３と同様にして、収率５７％で化合物１１９を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４２６（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．４８−２．５２（ｓｘ２，６Ｈ，ＤＭＳＯとオーバーラップ），２．７８（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２，９２（ｂｒ  ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），６．７８−７．００（ｍ，６Ｈ），７．５２−７．６５（ｍ，３Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ）．
実施例５１：化合物１２０｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−８−（ピロリジン−１−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン｝の合成
実施例３で得られた化合物３（４００ｍｇ，０．８７６ｍｍｏｌ）を酢酸（８．８ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（０．４７ｇ，１６ｍｍｏｌ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２．２ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間撹拌した。反応溶液にクロロホルムと飽和重曹水を加え、水層をクロロホルムで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をＮＨ−シリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／ヘキサン＝５０／５０）で精製して、化合物１２０（３４２ｍｇ，０．７１３ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４８０（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．７６（ｍ，４Ｈ），２．４７（ｍ，４Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），２．７８（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．０６（ｍ，４Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｓ，２Ｈ），５．３５（ｓ，２Ｈ），６．８３−６．９８（ｍ，５Ｈ），７．０２−７．０８（ｍ，２Ｈ）．
実施例５２：化合物１２１｛１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボン酸｝の合成
工程１
実施例９で得られた化合物１６（１．２０ｇ，２．１８ｍｍｏｌ）を酢酸（１０ｍＬ）に溶解し、パラホルムアルデヒド（０．７３ｇ，２１．８ｍｍｏｌ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．５８ｇ，８．７０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルと１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をＮＨ−シリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒）で精製して、１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル（１．２５ｇ，２．１８ｍｍｏｌ，収率１００％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５６６（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），１．６−２．０（ｍ，６Ｈ），２．２３（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），２．７３（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７５−２．９（ｍ，２Ｈ），３．０−３．１５（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｓ，２Ｈ），４．１０（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．８−７．１（ｍ，７Ｈ）．
工程２
工程１で得られた１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステルを用い、実施例１２と同様にして、収率４２％で化合物１２１を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５３８（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．５−１．８（ｍ，２Ｈ），１．８−２．０（ｍ，２Ｈ），２．２−２．４（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．７８（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８−３．０５（ｍ，８Ｈ），３．２２（ｓ，２Ｈ），３．５−３．９（ｍ，２Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０−７．２（ｍ，４Ｈ）．
実施例５３：化合物１２２｛２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−８−［４−（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）ピペリジノメチル］−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン・１塩酸塩｝の合成
実施例２０で得られた１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］−ピペリジン−４−カルボニトリルを用い、実施例５２の工程１と同様にして、収率９２％で１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボニトリルを得た。これを用い、実施例２０の後段と同様にして、収率１０％で２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−８−［４−（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）ピペリジノメチル］−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンを得た。これをクロロホルムに溶解し、４ｍｏｌ／Ｌ塩化水素・酢酸エチル溶液を加えて析出した固体を濾取することで、化合物１２２を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５６２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），２．０−２．５（ｍ，４Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．９−３．２（ｍ，８Ｈ），３．２−３．３（ｍ，４Ｈ），３．４−３．６（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），５．５６（ｓ，２Ｈ），７．０−７．２（ｍ，４Ｈ），７．２−７．４（ｍ，３Ｈ），１０．７９（ｓ，１Ｈ）．
実施例５４：化合物１２３｛｛１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−イルメタノール｝の合成
実施例５２の工程１で得られた１−［８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−イルメチル］ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル（０．６１ｇ，１．０８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解して、−７８℃に冷却し攪拌した。この反応溶液に同温度で１ｍｏｌ／Ｌ水素化ジイソプロピルアルミニウム／トルエン溶液（３．２０ｍＬ，３．２０ｍｍｏｌ）を加え、同温度で３時間、その後室温で１０分間攪拌した。反応溶液に飽和ロッシェル塩水溶液と酢酸エチルを加え、３０分間攪拌した。水層を酢酸エチルで抽出後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチルを用いて再結晶に付し、化合物１２３（０．２６ｇ，０．５０ｍｍｏｌ，収率４６％）を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５２４（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．０−１．１５（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．３（ｍ，１Ｈ），１．５−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．７−１．９（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．７５（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９５−３．０５（ｍ，４Ｈ），３．１５−３．２５（ｍ，５Ｈ），３．２５−３．５０（ｍ，４Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９０−７．０５（ｍ，６Ｈ）．
実施例５５：化合物１２４［２−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−８−（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン］の合成
実施例３４で得られた化合物１０３を用い、実施例５２の工程１と同様にして、収率８３％で８−（２−エチル−５，７−ジメチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−カルボニトリルを得た。
これを用い、実施例２０の後段と同様にして、収率２０％で化合物１２４を得た。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４６５（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．２４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｑ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），３．０−３．１（ｍ，２Ｈ），３．３−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），５．３８（ｓ，２Ｈ），６．９０（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．４Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例１：化合物９１｛１，４−ビス［４−（３−クロロベンジルアミノ）−６−シクロプロピルカルボニル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］ピペラジン｝の合成
化合物９１は、以下の工程１〜工程８に従って合成した。
2004017995.tif 000045
工程１
市販の化合物（Ａ）（１００ｇ，０．３３５ｍｏｌ）をエタノール（１，５００ｍＬ）に溶解し、尿素（１００ｇ，１．６７ｍｏｌ）およびナトリウムメトキシド（２２７ｇ，１．１８ｍｏｌ）を加え、加熱還流条件下、２４時間反応を行った。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認し、冷却後、析出した結晶を濾取した。この結晶を水に懸濁させ、その中へ塩酸（６ｍｏｌ／Ｌ）を加え、ｐＨ６．０に調整した。さらに１時間室温で撹拌し、析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させ、化合物（Ｂ）（６０ｇ，収率７０％）を得た。
工程２
工程１で得られた化合物（Ｂ）（３０．０ｇ，０．１１６ｍｏｌ）にオキシ塩化リン（３００ｍＬ）を加え、加熱条件下で５時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認後、減圧下で過剰のオキシ塩化リンを留去した。その後、残渣に２−プロパノール（３００ｍＬ）を加え、析出した結晶を含む懸濁液を加熱還流条件下、１時間撹拌し、さらに室温で１時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させ、化合物（Ｃ）（３３ｇ，収率８５％）を得た。
工程３
工程２で得られた化合物（Ｃ）（３５．０ｇ，０．１０６ｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（８５０ｍＬ）に溶解し、そこへトリエチルアミン（１４．９ｍＬ，０．１０７ｍｏｌ）およびクロロ蟻酸１−クロロエチル（３４．１ｍＬ，０．３１６ｍｏｌ）を加え、加熱還流条件下、５時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認後、反応混合物を冷却し、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製した。生成物をメタノール（８５０ｍＬ）に溶解し、加熱還流条件下、１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認した後、濃縮乾固させることにより、化合物（Ｄ）（２３．５ｇ，収率９５％）を得た。
工程４
工程３で得られた化合物（Ｄ）（１１．８ｇ，４９．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、シクロプロパンカルボニルクロリド（５．４ｍＬ，１．２当量）とトリエチルアミン（２０．４ｍＬ，３．０当量）を加え、室温で１時間攪拌した。得られた反応溶液を水、飽和重曹水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去した後、残渣にジイソプロピルエーテルを加え、懸濁液を１時間以上攪拌した。その後、析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させることにより、化合物（Ｅ）（１２．５ｇ，収率９４％）を得た。
工程５
工程４で得られた化合物（Ｅ）（１２．５ｇ，４５．９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（４００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１９．２ｍＬ，３当量）および３−クロロベンジルアミン（１１．２ｍＬ，２当量）を加えた後、４０℃で２０時間攪拌した。析出した塩を濾過により除去後、溶媒を留去した。残渣をクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：１→４０：１）で精製し、目的物を含む画分の濃縮残渣にヘキサン／酢酸エチル混合溶媒（３：１）を加え、結晶を析出させた。結晶を含む懸濁液を１時間攪拌後、析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させ、化合物（Ｆ）（１１．９ｇ，収率６９％）を得た。
工程６
工程５で得られた化合物（Ｆ）（５．０ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）をジオキサン（１００ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ−ブチル  １−ピペラジンカルボキシレート（４．９ｇ，２当量）と炭酸ナトリウム（１４．０ｇ，１０当量）を加え、９０℃で３日間攪拌した。得られた反応溶液を濾過し、炭酸ナトリウムを除去後、濾液に水およびクロロホルムを加えて抽出を行い、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去した後、残渣にヘキサン／酢酸エチル混合溶媒（３：１）を加え、懸濁液を１時間攪拌した。その後、析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させ、化合物（Ｇ）（６．４ｇ，収率９２％）を得た。
工程７
工程６で得られた化合物（Ｇ）（６．３ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）に２０％トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）を加え、室温で一時間攪拌した。反応溶液から溶媒を留去した後、残渣にジイソプロピルエーテルを加え、生成した懸濁液を１時間攪拌した。その後、析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させ、化合物（Ｈ）を得た（４．９ｇ，収率９７％）。
工程８
工程７で得られた化合物（Ｈ）（３．８ｇ，８．９０ｍｍｏｌ）と、工程５で得られた化合物（Ｆ）（４．５ｇ，１．０５当量）をジオキサン（１００ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム（１０．６ｇ，１０当量）を加え、９０℃で１週間攪拌した。得られた反応溶液を濾過し、炭酸ナトリウムを除去後、濾液に水を加えクロロホルムで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トリエチルアミン＝１０：１）で精製した。目的物を含む画分の濃縮残渣にヘキサン／酢酸エチル混合溶媒（３：１）を加え、生成した懸濁液を１時間攪拌した。その後、析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させることにより、化合物９１を得た（１．０ｇ，収率２３％）。
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ７６７（［Ｍ＋Ｈ］＋）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７−０．９（ｍ，４Ｈ），１．０−１．１（ｍ，４Ｈ），１．７−１．９（ｍ，２Ｈ），２．６−２．８（ｍ，４Ｈ），３．７５（ｓ，８Ｈ），３．８−４．０（ｍ，４Ｈ），４．３−４．４（ｍ，４Ｈ），４．６−４．７（ｍ，４Ｈ），４．８−４．９（ｍ，２Ｈ），７．１−７．３（ｍ，８Ｈ）．
参考例１ａ  Ｎ−メチル−Ｎ−（２−トリチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）アミンの合成
２−トリチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イルメタノール（２．００ｇ，５．８４ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチル−２−ニトロベンゼンスルホンアミド（１．６４ｇ，７．５９ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．５３ｇ，５．８４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）およびトルエン（２０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、アゾジカルボン酸ジエチルトルエン溶液（４０％，２．６５ｍＬ，５．８４ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜撹拌した。シリカゲルカラムを通過（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０）させて原点成分を除去した後、減圧下濃縮して得られる残渣にアセトン（５ｍＬ）とアセトニトリル（２５ｍＬ）を加えた。
得られた懸濁液にメルカプト酢酸（０．７３ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）と１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデック−７−エン（３．１ｍＬ，２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で７時間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣を酢酸エチルに溶解した。得られた溶液を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：トリエチルアミン／酢酸エチル＝１／９９）で精製し、Ｎ−メチル−Ｎ−（２−トリチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチルアミン（３９６ｍｇ，１．１１ｍｍｏｌ，収率１９．０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．４５（ｓ，３Ｈ），４．０７（ｓ，２Ｈ），７．０７−７．３６（ｍ，１５Ｈ）．
参考例２：宿主・ベクター系の構築
（１）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２の造成
ｐＳＶ２ｂｓｒ（科研製薬社製）をＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して２．６ｋｂのＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。
Ｇａｌ４−ＥＲキメラ遺伝子［セル（Ｃｅｌｌ）、５４巻、１９９頁（１９８８年）、プロシィーデングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９０巻、１６５７頁（１９９３年）］を含有するＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ（東京大学の加藤茂明先生より分与）をＡａｔＩＩとＮｄｅＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のｐＳＶ２ｂｓｒ由来のＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片、およびＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ由来のＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を造成した。ｐＧＥＲｂｓｒＲ２は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の転写因子Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（Ｇａｌ４−ＥＲ）を発現することができる。
（２）ホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドの造成
ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３をＫｐｎＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＫｐｎＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。該プラスミドをＢｇｌＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片を取得した。
ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）をＸｈｏＩとＮｓｉＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ｏｒｉＰ配列を含む２．２ｋｂのＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のＸｈｏＩ切断部位とＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３由来のＢａｌＩＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰを造成した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。
ｐＳＥ０ｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、アンピシリン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｃｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、プラスミドｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１を造成した。ｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、０．１１ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。
上記ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合し、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１を造成した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１をＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断し、ＸｈｏＩ−ｋｐｎＩ断片を取得した。
配列番号１、２、３、および４で表される塩基配列を有する４種のＤＮＡをＤＮＡ合成機で合成した。該合成ＤＮＡは混合してアニールすることによりポリＡ付加シグナルをもつ２本鎖ＤＮＡを形成する。該合成ＤＮＡをそれぞれＴ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いてリン酸化後、混合してアニールさせることにより、二本鎖ＤＮＡとした。
該二本鎖ＤＮＡとｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１由来のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡを造成した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。
ｐＦＲ−ｌｕｃ（ストラタジーン社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、０．１４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）断片、およびｐＦＲ−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１を作製した。ｐＡＧａｌＳｄ１は、Ｇａｌ４ｐ応答配列（ＵＡＳＧ）を５回繰り返した配列を有するプロモーターを含有している。ｐＡＧａｌＳｄ１をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。
ｐＳＥ０ｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理することにより、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のｐＳＥ０ｌｕｃ２由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＧａｌＳｄ１由来のＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃ内に存在する二つのＨｉｎｄＩＩＩサイトのうち、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子からより離れたＨｉｎｄＩＩＩサイトのみをＫｌｅｎｏｗ処理により消失させることにより、ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃＡｓｐ７１８で切断後、ＳｔｕＩで部分消化しｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃ由来の９．５ｋｂのＡｓｐ７１８−ＳｔｕＩ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ処理し、自己結合させることによりプラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃを造成した。
（３）誘導発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄの造成
エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有する発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、ｏｒｉＰを含む６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。
ｐＡＭｏ−ｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｃＲ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。
上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｄのＳｔｕｆｆｅｒ配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｄを造成した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。
ｐＡＭｏ−ｎｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。
上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｎｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｎｄのＳｔｕｆｆｅｒ配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄを造成した。
（４）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２をＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞の染色体ＤＮＡに組み込んだ細胞株ＫＪＭＧＥＲ８の造成
Ｇａｌ４−ＥＲキメラ転写因子発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン４酢酸〕に溶解した後、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３巻、１３３頁（１９９０年）］により、該プラスミドをＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１巻、１５１頁（１９８８年）］に、６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞は、ＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である。
該形質転換細胞を、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地〔ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）に、１／４０量の７．５％ＮａＨＣＯ３、３％２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社製）、０．５％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン社製、５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ）、３μｇ／ｍｌインシュリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１２５ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌガラクトースを添加した培地〕に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ）（ＫＫ−４００：科研製薬社製）を２．０μｇ／ｍｌになるように添加し、９６穴プレートに分注（５００〜２０００細胞／穴）して培養を行い、ｐＧＥＲｂｓｒＲ２が染色体ＤＮＡに組み込まれた安定形質転換株（シングルクローン）を多数取得した。各形質転換株は、２．０μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
下記に示す方法により上記安定形質転換株から、誘導倍率が高く、かつ非誘導時のバックグラウンドが低い優れた安定形質転換株ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
各形質転換株にホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃをエレクトロポレーション法により導入し、２日間培養した。
培養後、１７β−エストラジオール（Ｅ８８７５：シグマ社製）（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに２４時間培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性の測定を行った。活性の測定には、ルミノメーターＬＢ９５３（ベルトールド社製）を用い、細胞溶解用緩衝液〔１％トリトンＸ−１００、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．８）、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール〕１００μｌを、上記培養液に自動注入後、基質溶液〔２５ｍｍｏｌ／Ｌグリシルグリシン（ｐＨ７．８）、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌルシフェリン〕３００μｌを自動注入し、１０秒間の発光量を測定し、ルシフェラーゼ活性とした。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
１７β−エストラジオール添加条件下でのルシフェラーゼ活性と１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性を比較することにより、遺伝子発現の誘導倍率を算出し、該誘導倍率が高く、かつ１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性が低いクローンとして、ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
参考例３：ホタル・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃの造成
ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下にホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を発現することのできるレポータープラスミドであるｐＡＣＲＥｐｌｕｃを以下の方法で造成した。ｐＡＣＲＥｐｌｕｃは、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびエプスタイン・バー・ウィルスのｏｒｉＰを有している。
ｐＡＭｏ［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６８巻、２２７８２頁（１９９３年）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平５−３３６９６３）］をＣｌａＩで部分消化し、一カ所切断されたＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＭｌｕＩで部分消化し、９．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６９巻、１４７３０頁（１９９４年）］をＣｌａＩおよびＭｌｕＩで切断し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片、およびｐＡＧＥ２４８由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＭｏｈを造成した。
ｐＡＭｏｈをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｏｒｉＰ、Ｇａｌ４ＵＡＳを含むＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および上記ｐＡＭｏｈ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌ９ｈを造成した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋（東洋紡績社製）をＳａｌＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５、宝酒造社製）を用いて脱リン酸化処理し、アンピシリン耐性遺伝子を含むＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。配列番号５および６で表される塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをアニールさせることにより、ＣＲＥ配列を２つ含む二本鎖ＤＮＡを調製した。該二本鎖ＤＮＡとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋由来の上記ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を２つ含むプラスミドｐＢＳ−ＣＲＥＩを造成した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩは、該二本鎖ＤＮＡが、ＳａｌＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位が再生する方向に組み込まれたプラスミドであり、上記切断部位をそれぞれ１つ有している。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびでＸｈｏＩ切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を４つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を８つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＶを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を１６含むｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、１６個のＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＧａｌＳｄ１をＭｌｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１．４ｋｂのＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９ｈをＸｂａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＭｌｕＩで切断することによりＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片、ｐＡＧａｌＳｄ１由来のＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＧａｌ９ｈ由来のＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｈを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｈをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＣＲＥ配列を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＣＲＥｈ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＸｈｏＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片、およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片をそれぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来の上記２種のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片を結合することにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃ中のＣＲＥ配列上流のＨｉｎｄＩＩＩサイトが消失したプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＨを造成した。
ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕をＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで切断し、ｌｕｃ＋遺伝子（改変型のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを造成した。
参考例４：ＧＰＲ４誘導発現プラスミドの造成
ヒト肺由来のｍＲＮＡ（クロンテック社製）を１μｇ用い、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ギブコ社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。該一本鎖ｃＤＮＡを水で２５０倍希釈した溶液５μｌを鋳型として、配列番号７および８に示した配列を有する合成ＤＮＡをＧＰＲ４遺伝子特異的プライマーとして用い、ＰＣＲによりＧＰＲ４ｃＤＮＡを取得した。ＧＰＲ４遺伝子特異的プライマーの配列は、ＧＰＲ４遺伝子の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｕ２１０５１）に基いて設計した。酵素としては、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。ＰＣＲを行う際の緩衝液としては、使用する酵素に付加された１０倍濃度の緩衝液を使用した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃で５分間の処理後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を３０サイクル行うことにより実施した。
増幅されたＧＰＲ４  ｃＤＮＡ断片をプライマー上に設計された配列を切断するＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断した。ＧＰＲ４  ｃＤＮＡを含む断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。
該切断断片を、プラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ間へ組み込むことにより、ＧＰＲ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４を構築した。
ｐＡＧａｌ９−ｎｄ中の配列に特異的なプライマー（配列番号９および１０に示した配列を有する合成ＤＮＡ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定しＧＰＲ４をコードしていることを確認した。塩基配列の決定には、パーキン・エルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：アプライド・バイオシステムズ社）を使用した。
プラスミドに組み込んだＤＮＡ断片の配列を決定し、ＧＰＲ４をコードしていることを確認した。
参考例５：ＧＰＲ４のアッセイ細胞の構築
ＧＰＲ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ４（２μｇ）およびレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃ（２μｇ）を、上記エレクトロポレーション法により、６×１０６細胞のＫＪＭＧＥＲ８に共導入した。該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株（ＧＰＲ４アッセイ細胞と呼ぶ）を取得した。該形質転換株を、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
同様にして、コントロールプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄ（２μｇ）およびレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃ（２μｇ）をＫＪＭＧＥＲ８に共導入し、安定形質転換株（コントロール細胞と呼ぶ）を取得した。
参考例６：マウス由来のヒトＧＰＲ４ホモログをコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＧＰＲ４遺伝子の塩基配列情報［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ（ＡＣ）Ｎｏ．Ｕ２１０５１］を基に、ＮＣＢＩのデータベースを対象として検索を行った。その結果、相同性の高い配列として、マウスゲノム配列（ＡＣ０７３７８４）および複数のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ（ＥＳＴ）配列（ＢＦ１７８４６４、ＡＡ９６８１９３、ＡＡ７９８７３２、ＡＩ８４０８９３、ＡＩ８５１０３７）が選択された。該マウスゲノム配列とＥＳＴから構築された遺伝子の塩基配列を配列番号１４に、該遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１３に示した。該アミノ酸配列を、解析プログラム［ＧＥＮＥＴＹＸ  ＷＩＮ  ｖｅｒ．５．０（ソフトウェア社製）］を用いてヒトＧＰＲ４のアミノ酸配列と比較したところ、９２．７％の一致が認められた。
よって、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、マウスのヒトＧＰＲ４ホモログ（マウスＧＰＲ４）であることが推定された。
従って、マウスＧＰＲ４をコードするＤＮＡは、市販、または公知の方法で調製することができるマウスｃＤＮＡライブラリーを鋳型にし、配列番号１４で表される塩基配列に基づき設計、合成できるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いたＰＣＲにより取得することができる。
参考例７：ラット由来のヒトＧＰＲ４ホモログをコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＧＰＲ４遺伝子の塩基配列情報（ＡＣ  Ｎｏ．Ｕ２１０５１）を基に、ＮＣＢＩのデータベースを対象として検索を行った。その結果、相同性の高い配列として２つのラットゲノム配列（ＡＣ１１９４４７．２およびＡＣ０９６１８０．２）および複数のラットＥＳＴ配列（ＢＦ５４４１８２、ＡＩ１７０９４８、ＡＩ００８８５８、ＡＩ２３５３７４、ＡＩ５０２８７１、ＢＱ１９４５１５）が選択された。これらの配列と、配列番号１４で示したマウスの塩基配列情報を基に配列番号１５および配列番号１６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。
該オリゴヌクレオチド各々１．０μｍｏｌ／Ｌをプライマーセットとして用い、ラット肺由来ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡ  ２μＬを鋳型に用い、後記の各成分の濃度が２００μｍｏｌ／ＬとなるようｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  （パーキンエルマー社製）２．５単位および１×Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｍｇ  ｐｌｕｓ）緩衝液（パーキンエルマー社）を含む反応溶液４０μＬを調製し、下記条件下でＰＣＲを行った。
すなわち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の工程を１サイクルとして３０サイクル行い、さらに７２℃で５分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動によりＧＰＲ４をコードするＤＮＡと予想される約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、該製品に添付されたマニュアルに従い、ＤＮＡ断片を溶出し回収した。
上記で回収したＤＮＡ断片５０ｎｇとｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて該製品に添付されたマニュアルに従って連結し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して得られる形質転換株から、常法によりプラスミドｐＴ７ＲＧを得た。プラスミドｐＴ７ＲＧの全塩基配列を決定した結果、ｐＴ７ＲＧには配列番号１８で表される塩基配列を有する約１．１ｋｂのｃＤＮＡが含まれていた。配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１７に示した。該アミノ酸配列を、解析プログラム［ＧＥＮＥＴＹＸ  ＷＩＮ  ｖｅｒ．５．０（ソフトウェア社製）］を用いてヒト、およびマウスＧＰＲ４のアミノ酸配列と比較したところ、それぞれ９３．０％、９９．２％の一致が認められた。
よって、配列番号１７で表されるアミノ酸を有するポリペプチドは、ラットのヒトＧＰＲ４ホモログ（ラットＧＰＲ４）であることが明らかとなった。
製剤例１：錠剤
常法により、次の組成からなる錠剤を調製する。
処方  化合物１                        ２０ｍｇ
乳糖                      １４３．４ｍｇ
デンプン                        ３０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース      ６ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム      ０．６ｍｇ
２００ｍｇ
製剤例２：注射剤
常法により、次の組成からなる注射剤を調製する。
処方  化合物５                          ２ｍｇ
精製ダイズ油                  ２００ｍｇ
精製卵黄レシチン                ２４ｍｇ
注射用グリセリン                ５０ｍｇ
注射用蒸留水                １．７２ｍｌ
２．００ｍｌ
【産業上の利用可能性】  本発明により、ＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤、掻痒の予防および／または治療作用を有する含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩、ＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能の抑制作用を有する含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩、含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する掻痒の予防および／または治療剤、含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニウム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＧＰＲ４のシグナル伝達に関する機能の抑制剤、ならびにＳＰＣ誘発掻破行動の回数の減少を指標にした掻痒治療剤のスクリーニング法が提供される。
【配列表フリーテキスト】配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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