(57)【要約】本発明は、Ｑ１０等のユビキノンを含有する培地中で物質を生産する能力を有する動物細胞を培養し、培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、およびユビキノンを含有する培地中で物質を生産する能力を有する動物細胞を培養することを特徴とする物質生産性の向上方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキノンを含有する培地中で物質を生産する能力を有する動物細胞を培養し、培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
【請求項２】
ユビキノンがＱ１０である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
動物細胞がミエローマ細胞、ミエローマ細胞に由来する細胞または卵巣細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培地が無血清培地または無蛋白培地である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
培養がバッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
物質が免疫機能分子、生体触媒分子、構造の形成・保持分子またはワクチンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
免疫機能分子が抗体である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ユビキノンを含有する培地中で物質を生産する能力を有する動物細胞を培養することを特徴とする物質生産性の向上方法。
【請求項１１】
ユビキノンがＱ１０である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
動物細胞がミエローマ細胞、ミエローマ細胞に由来する細胞または卵巣細胞である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
培地が無血清培地または無蛋白培地である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
培養がバッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
物質が免疫機能分子、生体触媒分子、構造の形成・保持分子またはワクチンである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
免疫機能分子が抗体である、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動物細胞を培養することによる物質の製造方法、物質生産性の向上方法に関するものである。
背景技術
動物細胞または組換え動物細胞を用いた物質生産は広く行われているが、とりわけ医薬品への応用例は多く、今後ますますその重要性が高まることが予想される。
医薬品として有用な物質は、高次構造や糖鎖を有するものが多いため、このような物質を製造する場合には、生理活性型のものが獲得できる動物細胞培養が一般的に用いられる。
しかし、動物細胞は増殖速度が遅いこと、培養に用いられる培地が高価であること、培地あたりの生産性が低いこと、細胞あたりの生産性が低いことなどが問題とされ、問題を解決するために種々の検討がなされている。物質の生産性を向上させる方法としては、温度を変更する方法（特開平９−７５０７７号）や、ｎ−酪酸（特開平８−９９６８号）、クエン酸鉄、エタノールアミン（特開平４−９１７８６号）を添加する方法などが知られている。
動物細胞の培養には、アミノ酸、ビタミン類、糖質、塩類等からなる基礎培地に、ウシ胎児血清等の動物の血清を添加した培地や、インスリン、トランスフェリン、２−エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン、細胞増殖因子等を添加することで動物血清を代替した無血清培地が使用されている。しかし、血清、インスリン、細胞増殖因子等は高価であるために培地のコストが高くなり、有用物質の製造コストも高くなる。
また、動物細胞を培養して製造した抗体等の所望の物質を、体内診断薬や治療薬に使用する場合には、夾雑蛋白質成分等を安全性に問題がない濃度にまで下げる必要がある。このため、培地への添加成分である血清、インスリン、トランスフェリン、細胞増殖因子等は、製造した所望の物質から分離、除去する必要がある。
さらに、近年、動物血清や血清代替物に代表される動物由来原料は、培地成分としての使用を極力避けることが望まれている。しかし、多くの動物細胞にとって、これらの物質を添加しないと、有用物質の生産性が著しく低下することが多い。
ユビキノンは細胞生育におけるミトコンドリア呼吸鎖において重要な役割を持つことや抗酸化作用を有することから、健康飲料または医薬品として利用されている。また、培地へユビキノンを添加すると、ＨｅＬａ細胞やマウス繊維芽細胞〔Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ，１８４，２１４（１９９５）〕や、ウシ胚細胞〔Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６１，５４１（１９９９）〕の増殖が促進されることが知られている。
しかし、ユビキノンと物質の生産性との関係については知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、動物細胞を用いて物質を効率良く生産する方法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）ユビキノンを含有する培地中で物質を生産する能力を有する動物細胞を培養し、培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
（２）ユビキノンがＱ１０である、（１）記載の方法。
（３）動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）動物細胞がミエローマ細胞、ミエローマ細胞に由来する細胞、または卵巣細胞である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）細胞が物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）培地が無血清培地または無蛋白培地である、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）培養がバッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）物質が免疫機能分子、生体触媒分子、構造の形成・保持分子またはワクチンである、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）免疫機能分子が抗体である、（８）記載の方法。
（１０）ユビキノンを含有する培地中で物質を生産する能力を有する動物細胞を培養することを特徴とする物質生産性の向上方法。
（１１）ユビキノンがＱ１０である、（１０）記載の方法。
（１２）動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）動物細胞がミエローマ細胞、ミエローマ細胞に由来する細胞、または卵巣細胞である、（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載の方法。
（１４）細胞が物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞である、（１０）〜（１３）のいずれか一項に記載の方法。
（１５）培地が無血清培地または無蛋白培地である、（１０）〜（１４）のいずれか一項に記載の方法。
（１６）培養がバッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、（１０）〜（１５）のいずれか一項に記載の方法。
（１７）物質が免疫機能分子、生体触媒分子、構造の形成・保持分子またはワクチンである、（１０）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（１８）免疫機能分子が抗体である、（１７）記載の方法。
本発明に用いられる培地は、ユビキノンが好ましくは１〜１００００μＭ、さらに好ましくは１０〜１０００μＭ、特に好ましくは１００〜１０００μＭとなるように添加されること以外は、動物細胞培養に用いられる培地が用いられる。
ユビキノン（補酵素Ｑ、２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−ポリプレニル−１，４−ベンゾキノンともいう）としては、Ｑｎ（ｎはイソプレン単位の数を表す）のｎが１〜１２のものが好適に用いられ、Ｑ６、Ｑ８、Ｑ１０がさらに好適に用いられ、Ｑ１０が特に好適に用いられる。
ユビキノンとしては、例えば、Ｑ１０のポリエチレングリコール５０００修飾体（ＷＯ９６／１７６２６）など、水溶性を高めるために造成された類縁物質も含まれる。
ユビキノンは、そのまま培地に添加してもよいが、ユビキノンの脂溶性が高いことから、ユビキノンの水溶性を向上させて培地に添加することが好ましい。ユビキノンの水溶性を向上させる方法としては、例えば、シクロデキストリンを用いる方法〔Ａｃｔａ  Ｐｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，５３，１９３（１９９６）〕、加温してホモジナイズする方法〔Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６１，５４１（１９９９）〕等があげられる。
また、ユビキノンを含有する製品としては、例えばＳＡＮＯＭＩＴ（商標名、ＭＳＥ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｃａ社製）があげられる。
ユビキノンの培地中への添加量は、動物細胞の種類、所望の物質の種類、ユビキノンの添加時期、等により適宜選択すればよいが、培地中のユビキノンの濃度は、１〜１００００μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、１０〜１０００μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましく、１００〜１０００μｍｏｌ／Ｌであることが特に好ましい。
動物細胞培養に用いられる培地としては、血清含有培地、無血清培地、無蛋白培地等、いずれの培地も用いられるが、培地中に動物蛋白質由来の夾雑物を含まない、無血清培地または無蛋白培地を用いることが好ましい。
血清含有培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる基本培地に血清が添加されたものが用いられる。
基本培地としては、例えばＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、イーグルのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７，９２３（１９７８）〕またはこれらの混合培地等があげられるが、好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ等が用いられる。
血清含有培地は、基本培地に、ウシ、ウマ等の動物血清を適当量、通常は５〜１０％前後を添加したものが用いられる。
無血清培地としては、血清培地に用いられる基本培地に、血清の代わりに生理活性物質、栄養因子、動物細胞が資化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な栄養因子、生理活性物質等を添加する。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させることが好ましい。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ミオ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、血清アルブミン、増殖因子を含む血清分画物等があげられる。
動物由来原料を含まない培地のために、血清アルブミンや血清分画物等の動物由来原料の代わりに添加される物質としては、遺伝子組換え法で製造した蛋白性の生理活性物質や、大豆加水分解物、動物由来原料不含のコレステロール脂質があげられる。
無蛋白培地としては、ＡＤＰＦ培地〔Ａｎｉｍａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ；ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）社製〕、ＣＤ  ハイブリドーマ培地〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、ＣＤ  ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）等があげられる。
長期間または高密度で培養する場合は、アミノ酸類およびビタミン類を高濃度に含有した培地、例えばＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭおよびＦ１２培地を１：１：１の比率で混合した培地、ＤＭＥＭおよびＦ１２培地を１：１の比率で混合した培地、ハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）等が好適に用いられる。
本発明に用いられる動物細胞としては、物質を生産する能力を有する動物細胞であれば、例えば哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類および昆虫類のいずれかに属する動物細胞等、いずれを用いてもよいが、哺乳類に属する動物細胞が好適に用いられる。哺乳類に属する動物細胞としては、ミエローマ細胞、ミエローマ細胞に由来する細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞、結合組織細胞、乳腺細胞等があげられるが、特にミエローマ細胞、ミエローマ細胞に由来する細胞、または卵巣細胞が好ましい。また、所望の物質が抗体である場合は、抗体産生細胞であることが好ましい。
哺乳類に属する動物細胞としては、例えばヒト細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＣＬ−２４０）、ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＣＬ−１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＣＬ−２）、２９３（ＥＣＡＣＣＮｏ：８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１４３２）およびＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕、サル細胞株であるＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＣＬ−８１）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１６１６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１５８１）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１５）、ラット細胞株であるＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．：８５１１０５０３）、Ｙ３−Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０１）およびＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１６６２）、ハムスター細胞株であるＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．：８５０５０３０２）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ／ＤＧ４４〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）〕およびＢＨＫ２１（ｃｌｏｎｅ１３）（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．：８５０１１４３３）、イヌ細胞株であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＣＬ−３４）等があげられる。鳥類に属する動物細胞としては、例えばニワトリ細胞株ＳＬ−２９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１５９０）等、魚類に属する動物細胞としては、例えばゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−２０５０）等、昆虫類に属する動物細胞としては、例えばガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣＮｏ．：ＣＲＬ−１７１１）等、がそれぞれあげられる。また、ワクチン製造に使用される初代培養細胞として、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞、初代ウズラ胎児細胞等があげられる。
ミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞としては、ラットミエローマ細胞株であるＮＳ０、Ｙ３−Ａｇ１．２．３．およびＹＯ、ミエローマと他の細胞の融合細胞、例えばラットミエローマ細胞株Ｙ３−Ａｇ１．２．３．とラット脾臓細胞の融合細胞株であるＹＢ２／０、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８とマウス脾臓細胞の融合細胞株であるＳｐ２／０−Ａｇ１４等があげられる。卵巣細胞としては、チャイニーズハムスターの卵巣細胞株であるＣＨＯ、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４等があげられる。また、腎臓細胞としては、ヒト腎臓細胞株である２９３、サル腎臓細胞株であるＶｅｒｏおよびＣＯＳ−７、ハムスター腎臓細胞株であるＢＨＫ  ２１（ｃｌｏｎｅ１３）、イヌ腎臓細胞株であるＭＤＣＫ、血球細胞としてはヒト前骨髄球細胞株であるＨＬ−６０、ヒトＢ細胞株であるＮａｍａｌｗａおよびＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１、子宮細胞としては、ヒト子宮頸部細胞株であるＨｅＬａ、結合組織細胞としては、ヒト繊維細胞株であるＨＴ−１０８０、マウス繊維芽細胞株であるＮＩＨ／３Ｔ３、乳腺細胞としては、マウス乳腺細胞株であるＣ１２７Ｉ等があげられる。
本発明の動物細胞としては、所望の物質を産生する動物細胞、変異処理を施して所望の物質を産生するようになった細胞、所望の物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞、非ヒト哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞とミエローマ細胞との融合細胞等が好適に用いられる。
物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞は、物質の生産に関与するＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターを、宿主細胞に導入することによって得られる。宿主細胞としては上記の動物細胞が用いられる。
物質の生産に関与するＤＮＡとしては、例えば蛋白質などの物質をコードするＤＮＡ、物質の生合成を触媒する酵素をコードするＤＮＡ等、いずれも用いられる。
該組換え体ベクターを調製するために用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９号、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡ６／ＨｉｓＡ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０（ＷＯ９７／１０３５４）等があげられる。
プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等があげられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等をプロモーターとともに用いてもよい。
宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）〕等があげられる。
形質転換細胞としては、例えば抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ−８７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５１２、特開平５−３０４９８９号）、７−９−５１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６９１、ＷＯ  ０１／２９２４６）および６１−３３γ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３２５、ＷＯ  ０１／２９２４６）、抗ＧＤ３ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８８７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９０、ＷＯ０１／２３４３２）、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４、ＷＯ  ０１／６５７５４）、Ｎｅｇａ−１３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５６、ＷＯ０２／３１１４０）、５０３ＬＣＡ５００Ｄ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３９）およびＮＳ０／ＬＣＡ−ＣＣＲ４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９６４）、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ１３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６５０、ＷＯ９７／１０３５４）およびＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４９、ＷＯ９７／１０３５４）、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４８、ＷＯ９７／１０３５４）およびＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４７、ＷＯ９７／１０３５４）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１０５、特開平１０−２５７８９３号）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１０６、特開平１０−２５７８９３号）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２７、特開平１０−２５７８９３号）およびＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２８、特開平１０−２５７８９３号）等があげられる。
動物細胞を培養する方法としては、所望の物質を効率よく生産できる培養方法であれば、バッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養、パーフュージョン培養等、いずれの培養方法を用いてもよいが、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養を用いることが好ましい。
１．バッチ培養
バッチ培養は、動物細胞培養に用いられる培地中において、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で３〜１２日間行う。
ユビキノンは、最初から培地に添加してもよいし、培養期間中に培地に添加してもよい。
培養期間中、必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
２．リピートバッチ培養
リピートバッチ培養は、動物細胞培養に用いられる培地中において、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃で、１回のバッチ培養で２〜５日間行う。ユビキノンは、最初から培地に添加してもよいし、培養期間中に培地に添加してもよい。
培養期間中、必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
バッチ培養終了時に、培養液の一部に新鮮培地を所定量加え、バッチ培養を所定の回数連続して繰り返した後に、培養を終了する。なお、バッチ培養で増殖した細胞が、次のバッチ培養の種細胞として用いられる。
３．フェドバッチ培養
フェドバッチ培養は、動物細胞培養に用いられる培地中において、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃で、３〜２０日間行う。
ユビキノンは、最初から培地に添加してもよいし、培養期間中に培地に添加してもよい。
培養期間中、必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは、通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
フェドバッチ培養において、生理活性物質、栄養因子等を添加する場合は、通常に使用される濃度よりも高い濃度で添加することが好ましい。例えば、培地量の１／３０〜１／３好ましくは１／２０〜１／５を一回分として添加する。培養液中に添加する場合は、培養期間中、連続的にまたは数回〜十数回に分けて追加供給することが好ましい。生理活性物質、栄養因子等を連続的、または間欠的に少量ずつ追加供給する上記フェドバッチ培養法は、細胞の代謝効率が高く、培養物中に老廃物が蓄積されることによる培養細胞の到達細胞密度の低下を防止することができる。また、回収した培養物中における所望の物質の濃度はバッチ培養法に比べて高濃度であるため、該物質の分離・精製が容易になり、バッチ培養に比べ、培地当りの該物質の生産量を増大させることができる。
４．パーフュージョン培養
パーフュージョン培養は、動物細胞培養に用いられる培地中において、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で１０〜４０日間行う。
ユビキノンは、最初から培地に添加してもよいし、培養期間中に培地に添加してもよい。
培養期間中、必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは、通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
上記のとおり、ユビキノンを含有する培地中で物質を生産する能力を有する動物細胞を培養し、培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することにより、該物質を製造することができる。
本発明の方法により製造される物質としては、動物細胞が生産できる物質であればいずれでもよいが、哺乳類に属する動物細胞が生産できる物質であることが好ましい。
動物細胞が生産できる物質は、少なくとも動物細胞がその一部分を生産できる物質であれば、融合蛋白質等、人工的に改変された物質であってもよく、その部分断片であってよい。
本発明の方法により製造される物質は、抗体等の免疫機能分子、酵素等の生体触媒分子、構造蛋白質等の構造の形成・保持分子、ウィルス等のワクチンなど、いずれの物質でもよいが、免疫機能分子であることが好ましい。
免疫機能分子としては、生体内で免疫反応に関与する物質であれば、抗体、インターフェロン分子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３，１００７（１９７６）〕、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）〔Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，５５，２８０（１９９４）〕、コロニー刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９０１７（１９８３）〕、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２６９（１９９２）〕、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，１９９８（１９７７）〕、増殖因子であるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，５５５８（１９７７）〕、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）〔Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５３３（１９９４）〕等の蛋白質、ペプチドなど、いかなる物質であってもよい。
抗体としては、免疫動物由来の細胞とミエローマ細胞等の細胞を細胞融合させて作製した融合細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体等があげられる。
抗体としては、例えば融合細胞が生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体等があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲという）移植抗体等があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＶＨともいう）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＶＬともいう）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨともいう）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬともいう）とからなる抗体をいう。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、融合細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、以下の方法により製造することができる。モノクローナル抗体を生産する融合細胞よりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入して、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。該発現ベクターを宿主細胞へ導入して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型キメラ抗体を製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ヒトＩｇという）に属すればいかなるものでもよいが、ヒトＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにヒトＩｇＧクラスに属するヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ヒトＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、以下の方法により製造することができる。ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入して、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築する。該発現ベクターを宿主細胞へ導入して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型ＣＤＲ移植抗体を製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ヒトＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ヒトＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにヒトＩｇＧクラスに属するヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ヒトＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
一本鎖抗体は、以下の方法により製造することができる。抗体のＶＨおよびＶＬをそれぞれコードするＤＮＡをリンカーで結合させ、これを宿主細胞用発現ベクターに挿入して、一本鎖抗体発現ベクターを構築する。該発現ベクターを宿主細胞へ導入して得られる形質転換体を培養することにより、一本鎖抗体を製造することができる。
抗体の具体例としては、例えばガングリオシドＧＤ３に対する抗体（以下、抗ＧＤ３抗体という）、ケモカイン受容体ＣＣＲ４に対する抗体（以下、抗ＣＣＲ抗体という）、ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体（以下、抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体という）、ガングリオシドＧＭ２に対する抗体（以下、抗ＧＭ２抗体という）等があげられる。例えば、抗ＧＤ３抗体としては、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＧＤ３キメラ抗体という）ＫＭ−８７１（特開平５−３０４９８９号）、抗ＧＤ３ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８７１（ＷＯ０１／２３４３２）、抗ＣＣＲ４抗体としては、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＣＣＲ４キメラ抗体という）ＫＭ２７６０（ＷＯ０１／６５７５４）、抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体としては、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型キメラ抗体ＫＭ１３９９およびＫＭ７３９９（ＷＯ９７／１０３５４）、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８３９９およびＫＭ９３９９（ＷＯ９７／１０３５４）、抗ＧＭ２抗体としては、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８９６６、ＫＭ８９６７、ＫＭ８９６９およびＫＭ８９７０（特開平１０−２５７８９３号）等があげられる。
生体触媒分子としては、酵素、リボザイム等があげられる。
構造の形成・保持分子としては、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、レシリン、フィブロイン等があげられる。
ワクチンとしては、痘瘡ワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン等があげられる。また、動物用ウイルスワクチンとは、ウシ流行熱ワクチン、イバラキ病ワクチン、ウシ伝染性気管炎ワクチン等があげられる。
培養終了後、所望の物質は、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３号、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、宿主細胞外に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換え手法を用いて、物質をＮ末にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、該物質を宿主細胞外に分泌させることができる。
本発明の方法により製造される物質は、例えば蛋白質等、通常の物質の単離、精製法を用いて単離および精製することができる。
本発明の方法により製造される物質が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の物質の単離、精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−セファロースＦＦ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、等電点電気泳動等の電気泳動法等を、単独あるいは組み合わせて用いることにより、粗精製物または精製物を得ることができる。
本発明の方法により製造される物質が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該有用物質を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離、精製法を用いることにより、粗精製物または精製標品を得ることができる。
本発明によれば、物質の比生産速度（ＳＰＲ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）を増大させることによって、物質の生産性を向上させることができる。
このように、ユビキノンを培地に添加することで、動物細胞の培養環境に対するストレス耐性の上昇、蛋白質等の物質の生合成または分泌の活性化などを通じて、動物細胞の細胞当たりの物質の生産性を向上させることができる。
以下に本発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１：Ｑ１０を含有する培地を用いた抗体の生産（１）
ラットミエローマ細胞株由来の融合細胞株ＹＢ２／０を宿主細胞とした抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３２５、ＷＯ０１／２９２４６）を用いて、以下のバッチ培養を実施した。
Ｑ１０、水、グリセリン、エタノールおよびレシチンからなる健康飲料であるＳＡＮＯＭＩＴ（ＭＳＥ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ社製）を、培地中のＱ１０濃度が５００μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した無血清培地〔０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、２０ｍｇ／Ｌインシュリン、２０ｍｇ／Ｌトランスフェリンおよび２００ｎｍｏｌ／Ｌメトトレキセート（以下、ＭＴＸと略す）を含むハイブリドーマーＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）〕を３０ｍＬ入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコに、上記細胞を細胞密度が３×１０５細胞／ｍＬとなるように播種した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６日間静置培養した（Ｑ１０添加培養区）。また、上記無血清培地中にＳＡＮＯＭＩＴ（ＭＳＥ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ社製）を添加しない以外は、上記と同様な方法により、上記細胞を６日間静置培養した（Ｑ１０不含培養区）。
培養開始より培養終了まで、培養液を毎日一回ずつサンプリングし、生細胞密度（細胞／ｍＬ）、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）をそれぞれ測定した。なお、生細胞密度は０．４％トリパンブルー溶液を用いた色素排除法により計測した。
累積生細胞数は、生細胞密度と経過時間の積の総和として示される。本実施例においては生細胞密度を１日１回測定したので、累積生細胞数は毎回測定した生細胞密度を加算した値（細胞／ｍＬ×日）として示した。
また、比抗体生産速度および相対比抗体生産速度は、それぞれ下式より算出した。
比抗体生産速度（μｇ／細胞／日）＝抗体濃度（μｇ／ｍＬ）÷累積生細胞数（細胞／ｍＬ×日）
相対比抗体生産速度（％）＝試験区の比抗体生産速度÷Ｑ１０不含培養区の比抗体生産速度×１００
その結果、培養終了時における累積細胞数は、Ｑ１０不含培養区で１．７１×１０７細胞／ｍＬ×日、Ｑ１０添加培養区で１．５１×１０７細胞／ｍＬ×日であり、培地中にＱ１０を添加した結果、累積細胞数に大きな変化は認められなかった。
一方、培養終了時の相対比抗体生産速度は、Ｑ１０不含培養区で１００％、Ｑ１０添加培養区で１６６．３％であり、培地中にＱ１０を添加した結果、比抗体生産速度は増大した。
実施例２：Ｑ１０を含有する培地を用いた抗体の生産（２）
ラットミエローマ細胞株由来の融合細胞株ＹＢ２／０を宿主細胞とした抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３２５）を用いて、フェドバッチ培養を行った。
無血清培地（ハイブリドーマ−ＳＦＭ培地；インビトロジェン社製）３０ｍＬを入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコに、上記細胞を細胞密度が３×１０５細胞／ｍＬとなるように播種した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間静置培養した。
培養終了後、得られた細胞を、０．７Ｌのハイブリドーマ−ＳＦＭ培地を入れた１Ｌ容スピナーフラスコ（柴田ハリオ社製）に、３×１０５細胞／ｍＬ接種し、培養液のｐＨを７．１±０．１、溶存酸素濃度を３±０．２ｐｐｍに制御しながら、３７℃、５０ｒｐｍで１１日間攪拌培養を行った。通気はスピナーフラスコ内に設置した多孔性ポリテトラフルオロエチレンチューブを用いて行い、空気、酸素、二酸化炭素の混合ガスを供給した。また、空気と二酸化炭素の比率を変えること、および１ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液を供給することにより、ｐＨの制御を行った。さらに、空気と酸素の比率を変えることにより、溶存酸素濃度の制御を行った。
なお、Ｑ１０添加培養区では、Ｑ１０をＴｗｅｅｎ８０で溶解した溶液を培地中のＱ１０濃度が５０μｍｏｌ／Ｌとなるようにハイブリドーマ−ＳＦＭ培地へ添加し、Ｑ１０不含培養区では、Ｔｗｅｅｎ８０のみを同量だけハイブリドーマ−ＳＦＭ培地へ添加した。
通常の添加濃度より高濃度に調製された、アミノ酸（Ｌ−アラニン０．１４０ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．４７０ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１５９ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．５１１ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．４２０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン４．６７７ｇ／Ｌ、グリシン０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２３５ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．５８８ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．５８８ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸０．８１８ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．３７０ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２２４ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２３５ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．５３２ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．０９０ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．５８１ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．５２６ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０７２８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２２４ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２２４ｇ／Ｌ、葉酸０．０２２４ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０４０３ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２２４ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２２４ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２２４ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２２４ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０７２８ｍｇ／Ｌ）、インシュリン０．２ｇ／Ｌ、トランスフェリン０．２ｇ／Ｌ、ウシ血清アルブミン１．６ｇ／Ｌから構成されるフィード液を、アミノ酸の比消費速度から推測される消費量を補う目的で生細胞密度が４×１０６細胞／ｍＬ×日を超えた場合に、１回以内／１日の頻度で０．０７Ｌずつ添加した。すなわち、培養３日目、５日目、６日目、７日目、８日目に、フィード液を０．０７Ｌずつ添加した。また、培養３日目以降、添加直後の培養液中のグルコース濃度が約２５００ｍｇ／Ｌとなるように、１００ｇ／Ｌグルコース溶液を適時添加した。
培養開始より培養終了まで、培養液を毎日一回ずつサンプリングし、生細胞密度（細胞／ｍＬ）、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）をそれぞれ測定し、累積生細胞数、比抗体生産速度および相対比抗体生産速度は、実施例１に記載した方法により算出した。
その結果、培養終了時における累積細胞数は、Ｑ１０不含培養区で２．９７×１０７細胞／ｍＬ×日、Ｑ１０添加培養区で３．９８×１０７細胞／ｍＬ×日であり、培地中にＱ１０を添加しても累積細胞数に大きな変化は認められなかった。
一方、培養終了時の相対比抗体生産速度は、Ｑ１０不含培養区で１００％、Ｑ１０添加培養区１３７．１％であり、培地中にＱ１０を添加した結果、比抗体生産速度は増大した。
実施例３：Ｑ１０を含有する培地を用いた抗体の生産（３）
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ／ＤＧ４４由来のレンズマメアグルチニン（以下ＬＣＡと略す）耐性細胞株ＣＨＯ−ＬＣＡをＷＯ０２／３１１４０に記載の方法で作製し、該細胞株に抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＣＡＮＴＥＸ２１６０（ＷＯ０１／６４７５４）を導入した後、遺伝子増幅のためにメトトレキセート（ＭＴＸ）耐性株を選択し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞株５０３ＬＣＡ５００Ｄ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３９）を作製した。該細胞株５０３ＬＣＡ５００Ｄを用いて、以下のフェドバッチ培養を行った。なお、細胞株５０３ＬＣＡ５００Ｄは、平成１４年１１月２０日付で、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番１号  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３９として寄託されている。
無血清培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地；ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）５０ｍＬを入れた２５０ｍＬ三角フラスコに、上記細胞を細胞密度が３×１０５細胞／ｍＬとなるように播種した後、３７℃、１００ｒｐｍで攪拌培養を行った。
アミノ酸（Ｌ−アラニン０．２２ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．７４ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン（無水）０．２２ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２６ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．８ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．６６ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン７．３４ｇ／Ｌ、グリシン０．２６ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．３７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．９２ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．９２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．２９ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２６ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．５８ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．３７ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８４ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１４ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．９２ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．８３ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．１１ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０３５ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０３５ｇ／Ｌ、葉酸０．０３５ｇ／Ｌ、ミオ−イノシトール０．０６３ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０３５ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０３５ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００３５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０３５ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０００１１ｍｇ／Ｌ）、エタノールアミン０．０２５１ｇ／Ｌ、インシュリン０．３１４ｇ／Ｌ、大豆加水分解物ＨＹ−ＳＯＹ（クエスト・インターナショナル社製）８ｇ／Ｌ、エチレンジアミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩（シグマ−アルドリッチ社製）０．０５ｇ／Ｌ、コレステロール脂質濃縮物（１０００×水溶液、インビトロジェン社製）２ｍＬから構成される動物由来蛋白原料不含のフィード液２０ｍＬに、Ｑ１０添加培養区ではＱ１０、水、グリセリン、エタノールおよびレシチンからなる健康飲料であるＳＡＮＯＭＩＴ（ＭＳＥ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ社製）を０．５ｍＬまたは１ｍＬ添加した。ＳＡＮＯＭＩＴ添加後のＦｅｅｄ液中のＱ１０の濃度は、それぞれ１５６３μｍｏｌ／Ｌおよび３１２５μｍｏｌ／Ｌであった。Ｑ１０添加培養区１では０．５ｍＬのＳＡＮＯＭＩＴ添加Ｆｅｅｄ液、Ｑ１０添加培養区２では、１ｍＬのＳＡＮＯＭＩＴ添加Ｆｅｅｄ液、Ｑ１０不含培養区ではＳＡＮＯＭＩＴを添加しない上記のフィード液をそれぞれ培養３日目、５日目、７日目、９日目に培養液に４．２ｍｌずつ添加した。Ｆｅｅｄ液の添加により培地中のＱ１０の濃度は、Ｑ１０添加培養区１では１２１〜３９３μｍｏｌ／Ｌ、Ｑ１０添加培養区２では２４２〜７８６μｍｏｌ／Ｌとなった。また、培養３日目以降、添加直後の培養液中のグルコース濃度が約４０００ｍｇ／Ｌとなるように、２００ｇ／Ｌグルコース溶液を適時添加した。培養はＱ１０添加培養区１およびＱ１０不含培養区は１３日間、Ｑ１０添加培養区２は１５日間行った。
培養開始３日目より培養終了まで、培養液を２日おきにサンプリングし、生細胞密度（細胞／ｍＬ）、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）をそれぞれ測定し、累積生細胞数、比抗体生産速度および相対比抗体生産速度は、実施例１に記載した方法により算出した。
その結果、培養終了時における累積細胞数は、Ｑ１０不含培養区で３．９４×１０７細胞／ｍＬ×日、Ｑ１０添加培養区１で３．６４×１０７細胞／ｍＬ×日、Ｑ１０添加培養区２では２．００×１０７細胞／ｍＬ×日であり、培地中にＱ１０を添加しても累積細胞数増大の効果は認められなかった。
一方、培養終了時の相対比抗体生産速度は、Ｑ１０不含培養区で１００％、Ｑ１０添加培養区１で１２８．８％、Ｑ１０添加濃度が高いＱ１０添加培養区２で１４９．１％であり、培地中にＱ１０を添加した結果、添加濃度依存的に比抗体生産速度は増大した。
実施例４：Ｑ１０を含有する培地を用いた抗体の生産（４）
参考例１で作製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞株ＮＳ０／ＬＣＡ−ＣＣＲ４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９６４）を用いて、バッチ培養を行った。
Ｑ１０、水、グリセリン、エタノールおよびレシチンからなる健康飲料であるＳＡＮＯＭＩＴ（ＭＳＥ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ社製）を予めＱ１０の終濃度が１００μｍｏｌ／Ｌになるように添加した血清分画物添加培地〔１０％ダイゴＧＦ−２１（日本製薬株式会社製）および５００ｎＭ  ＭＴＸ（シグマ−アルドリッチ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）〕（Ｑ１０添加培養区）およびＱ１０を添加しない血清分画物添加培地（Ｑ１０不含培養区）に細胞密度が３×１０５細胞／ｍＬとなるようにそれぞれ播種した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で静置培養を行い試験に供した。
培養開始４日目に培養液をサンプリングし、生細胞密度（細胞／ｍＬ）、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）をそれぞれ測定した。
累積生細胞数は生細胞密度と経過時間の積の総和として示される。本実施例においては生細胞密度を１回測定したので、累積生細胞数は播種細胞密度と測定細胞密度に対する時間変化による台形面積として以下の式より算出した。
累積細胞数（細胞／ｍＬ×日）＝（播種細胞密度＋測定細胞密度）×経過時間÷２
比抗体生産速度および相対比抗体生産速度は、実施例１に記載した方法により算出した。
その結果、培養終了時における累積細胞数は、Ｑ１０不含培養区で１．５９×１０６細胞／ｍＬ×日、Ｑ１０添加培養区で１．３４×１０６細胞／ｍＬ×日であり、培地中にＱ１０を添加しても累積細胞数増大の効果は認められなかった。
一方、培養終了時の相対比抗体生産速度は、Ｑ１０不含培養区で１００％、Ｑ１０添加培養区１３１．９％であり、培地中にＱ１０を添加した結果、比抗体生産速度は増大した。
参考例１：抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞株ＮＳ０／ＬＣＡ−ＣＣＲ４の作製
（１）ＬＣＡ耐性ＮＳ０株の取得
マウスミエローマ細胞株ＮＳ０（理研セルバンク：ＲＣＢ０２１３）を、体積比１０％のウシ胎児血清（インビトロジェン社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）（以下、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地と表記）にて浮遊培養用フラスコ７５ｃｍ２（岩城硝子社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。本培養液中の細胞に、１×１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、未添加又は０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＭＮＮＧと表記、シグマ−アルドリッチ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベーター（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、浮遊培養用９６ウェルプレート（岩城硝子社製）に１０００細胞／ウェルの密度で播種した。各ウェルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ（ベクター社製）を添加した。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２週間培養後、出現したＬＣＡ耐性コロニーをＬＣＡ耐性ＮＳ０株として取得し、ＮＳ０−ＬＣＡ株と名付けた。
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現細胞の作製
ＷＯ０１／６４７５４記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
１０μｇの抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を４×１０６細胞のＮＳ０−ＬＣＡ株にエレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）〕により導入後、１０ｍｌのＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の蓄積量を参考例１（３）に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート〔グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）社製〕に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量を参考例１（３）に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌ、５００ｎｍｏｌ／Ｌと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＲＰＭＩ−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を一株選択し、ＮＳ０／ＬＣＡ−ＣＣＲ４株と名付けた。なおＮＳ０／ＬＣＡ−ＣＣＲ４株については、平成１４年３月１４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭＢＰ−７９６４として寄託されている。
（３）ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡによる培養上清中の抗体の定量
培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の濃度は以下のようにして測定した。
１ｍｇの抗ヒトＩｇＧ抗体〔アメリカン・クォーレックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）社製〕を１２００ｍｌのＰＢＳに溶解した。該溶液の５０μｌを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、４℃にて一晩放置後、ウェル内の溶液を捨て、１％ウシ血清アルブミン（シグマ−アルドリッチ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（アメリカン・クォーレックス社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔０．５５ｇの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムを１Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に３０％過酸化水素水を１μｌ／ｍＬの割合で添加した溶液〕を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、マイクロプレートリーダー（バイオ−ラッド社製）にて、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
産業上の利用可能性
本発明によれば、動物細胞を用いて物質を効率良く生産する方法を提供することができる。
【国際調査報告】
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