(57)【要約】本発明は、ゲラニルゲラニルアセトン等の熱ショックタンパク質誘導性化合物を含む、がんの温熱療法における免疫賦活剤に関する。本発明の免疫賦活剤は、温熱療法と組合わせることにより、温熱療法単独では治療の困難な腫瘍組織を効果的に退縮し、また、転移がんを効果的に抑制でき、副作用も殆どない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱ショックタンパク質誘導性化合物を含む、がんの温熱療法における免疫賦活剤。
【請求項２】
熱ショックタンパク質誘導性化合物がイソプレノイド、低級脂肪族アルコール、重金属イオン、砒素、セレン、抗ガン剤、局所麻酔剤、脱共役剤及びプロテアソーム阻害剤からなる群から選択される請求項１に記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
イソプレノイドがゲラニルゲラニルアセトンである、請求項２に記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
がんの温熱療法が磁性微粒子又はその針状成形物を使用するものである、請求項１〜３の何れか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
磁性微粒子がＭＣＬである、請求項４に記載の免疫賦活剤。
【請求項６】
がんの温熱療法における免疫賦活剤としての、熱ショックタンパク質誘導性化合物の使用。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか１項に記載の免疫賦活剤と磁性微粒子又はその針状成形物とを含む温熱療法における腫瘍治療剤。
【請求項８】
磁性微粒子がＭＣＬである請求項７に記載の腫瘍治療剤。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、がんの温熱療法、特に磁性微粒子を用いる温熱療法における免疫賦活剤に関する。本発明の免疫賦活剤は、温熱療法におけるがんの治療効果を飛躍的に向上させるものである。
（背景技術）
現在、がん治療の主流は外科的な手術である。外科手術で最も問題になっているのはがんの転移である。外科手術は医師自身の目で腫瘍を捉え、切除する。そのため、ある程度の大きさにならないと切除できないが、その頃にはがんが既に転移してしまうか、あるいは、腫瘍を取りきれない可能性がでてしまう。そこで、外科的手術後に抗ガン剤を使わざるを得ない。しかし、激しい副作用のため、抗ガン剤の使用が制限される場合も多い。
がんの別の治療法に温熱療法があるが、これは、体温からわずかに高い温度領域（４２℃〜４５℃）において腫瘍組織が正常組織よりも温度感受性が高いという性質を利用して、腫瘍組織を加温殺傷する治療法である。現在実施されている温熱療法においては、体外からラジオ波をあて、体組織とのわずかなラジオ波の吸収の違いを利用して加熱しているため、体表面が過熱されるなどの問題点が多く、深部の腫瘍や小さな腫瘍のみを効果的に治療できる方法ではなかった。
本発明者らは、既に、上記したがん治療の問題点を解決した新しいがん治療法として、サブミクロンオーダーのマグネタイトを発熱体として用いるがんの温熱療法を提案している。この治療法は、マグネタイトをカチオン性のリン脂質で被覆し、場合によってはがん細胞に対して特異的な抗体を固定化したリポソームであるマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）やマグネタイトをカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液に分散させたＣＭＣマグネタイトを用いるか、あるいは、針状に成形・固化した針状成形マグネタイトを用いる。
ＭＣＬ等の磁性微粒子は、がん細胞に特異的に吸着する。このため、腫瘍組織の電磁波の吸収が体組織よりも優れ、腫瘍組織のみを選択的に加温でき、誘導加温による温熱療法を効果的に実施できる。この治療法では、腫瘍組織を熱で殺傷するだけでなく、体内の防御システムである免疫を増強することによって高い抗腫瘍効果を発揮することが分っている。この免疫賦活には、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が関与すると考えられている。
しかしながら、上記のＭＣＬ等の磁性微粒子を用いる温熱療法によっても、完全に満足できるがんの治療効果が得られない場合がある
したがって、がんの温熱療法において、がんの治療効果を格段に高める手立てが求められていた。
（発明の開示）
本発明は、がんの温熱療法において、ある種の化合物を腫瘍組織に投与すると、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の誘導が促進され、その結果、ホストの免疫が賦活化され、がんの温熱療法の効果が高まるとの知見に基くものである。
すなわち、本発明は、熱ショックタンパク質誘導性化合物を含む、がんの温熱療法における免疫賦活剤である。
本発明におけるがんには温熱療法によって治療され得るあらゆるがんが含まれ得るが、特にグリオブラストーマなどの悪性脳腫瘍、メラノーマ（悪性黒色腫）、乳がん、前立腺がん等が好ましい。
本発明におけるがんの温熱療法には、腫瘍組織を加温することによって治療するあらゆる治療法が含まれるが、好ましくは、磁性微粒子を使用する温熱療法である。磁性微粒子とは、鉄、コバルト、ニッケル等及びその化合物等、特にマグネタイト等の磁性を持つ微粒子のことである。磁性微粒子の直径は１０〜７０ｎｍ、好ましくは約４０ｎｍである。
磁性微粒子を使用するがんの温熱療法とは、磁性微粒子を発熱体として用いるがんの温熱療法である。この治療法では、発熱体として、磁性微粒子をカチオン性のリン脂質で被覆し、場合によってはがん細胞に対して特異的な抗体を固定化したリポソームであるカチオニックリポソーム（ＣＬ）や磁性微粒子をカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液に分散させたＣＭＣ−磁性微粒子を用いることができ、また、磁性微粒子を針状に成形・固化した針状成形物を用いることもできる。
本発明におけるカチオニックリポソーム（ＣＬ）とは、マグネタイト等の磁性微粒子をカチオン性の脂質を含むリン脂質二重膜で被覆したものである。リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸等のグリセロリン脂質及びスフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質の単独又はこれらの混合物、特にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールの単独又はこれらの混合物が好ましい。カチオン性の脂質としては、炭素数１０〜１８程度のカチオン性の脂質、特にＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｏ−グルタメートが好ましい。リン脂質とカチオン性の脂質の混合割合は、１０：１〜１：１であり、好ましくは４：１〜３：１である。リン脂質二重膜の厚さは、５〜４０ｎｍ、好ましくは約１０ｎｍである。
ＣＬは、例えば、以下のようにして調製することができる。上記した脂質混合物のクロロホルム溶液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターにて減圧下でクロロホルムを蒸発させて、脂質混合物をフラスコ内部にフィルム状に乾固させる。次に、予めコロイド状にした磁性微粒子をフラスコに適当量添加し、混合物に超音波処理を施す。これによりＣＬが調製される。磁性微粒子としてマグネタイトを用いたＣＬをマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）という。
ＣＭＣ−磁性微粒子は、以下のようにして調製することができる。０．１〜１．５ｇ、好ましくは０．３ｇの磁性微粒子を撹拌容器に入れ、蒸留水を最終的に１０ｍｌになるように添加する。これを６℃の恒温槽で加温し、６％ＣＭＣ溶液を１０〜３０ｍｌ、好ましくは２０ｍｌ加える。混合物を３０分撹拌した後、１５分間超音波処理を施し、ＣＭＣ−磁性微粒子を調製する。
磁性微粒子の針状成形物は、以下のようにして調製することができる。磁性微粒子とＣＭＣを重量比で４：１〜１５：１の範囲、好ましくは８：１で水に溶解し、９０分間混練する。これを押出成型器を用いて直径０．１〜２．０ｍｍで適当な長さ、好ましくは腫瘍の大きさに合わせて、特に好ましくは８０ｍｍに成形し、２日間自然乾燥した後に８０〜１００℃で熱風乾燥して調製する。
ＭＣＬを使用するがんの温熱療法は以下のように実施される。上記のようにして調製したＭＣＬを腫瘍組織に局所注入、動脈注入、静脈注入、腹腔注入等により投与すると、ＭＣＬは腫瘍組織に特異的に吸着される。磁場を照射すると、ＭＣＬの吸着した腫瘍組織は電磁波の吸収が体組織より優れるために、腫瘍組織のみが選択的に加温される。温度感受性の腫瘍組織は誘導加熱により殺傷される。
ＭＣＬによる温熱療法は、ＭＣＬを投与されていない部位の腫瘍（転移がん）も退縮させ得る。このことは、ＭＣＬによる温熱療法により抗腫瘍免疫が誘導されることを示している。本発明の免疫賦活剤は、がんの温熱療法における免疫誘導を一段と強く誘導することにより、極めて優れたがん治療効果をもたらすものである。
ＣＭＣ−磁性微粒子を使用する温熱療法は、ＭＣＬを用いた治療法に準じて行うことができる。
磁性微粒子の針状成形物を使用するがんの温熱療法は以下のように実施される。上記のようにして調製した磁性微粒子の針状成形物を腫瘍組織に局所刺入等により適用し、磁場を照射すると、磁性微粒子の針状成形物が存在する腫瘍組織は電磁波の吸収が体組織より優れるために、腫瘍組織のみが選択的に加温される。温度感受性の腫瘍組織は誘導加熱により殺傷される。磁性微粒子の針状成形物による温熱療法は、該針状成形物を適用していない部位の腫瘍（転移がん）も退縮させ得る。このことは、磁性微粒子の針状成形物による温熱療法により抗腫瘍免疫が誘導されることを示している。本発明の免疫賦活剤は、がんの温熱療法における免疫誘導を一段と強く誘導することにより、極めて優れたがん治療効果をもたらすものである。
本発明における熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、熱ショックによって合成が誘導されるタンパク質を意味し、例えば、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０，ＨＳＰ６０などが含まれ、特にＨＳＰ７０が好ましい。
本発明における熱ショックタンパク質誘導性化合物とは、熱ショックタンパク質の誘導を促進する化合物を意味し、例えば、ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）、レチノイン酸等のイソプレノイド；エタノール等の低級脂肪族アルコール；亜鉛、カドミウム等の重金属イオン；砒素；セレン；ＴＮＦ−α（組織壊死因子α）、シスプラチン、５−ＦＵ（５’−フルオロ−ウラシル）、アドリアマイシン等の抗ガン剤；ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、ヘルビマイシナド（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎｎａｄ）等；局所麻酔剤としてのリドカイン等；脱共役剤としてのカルボニルシアニド−３−クロロフェニルヒドラゾン等；プロテアソーム阻害剤としてのラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）等を含むが、好ましいのはイソプレノイドであり、特に好ましいのはＧＧＡである。
本発明の免疫賦活剤が温熱療法におけるがんの治療効果を飛躍的に高めるメカニズムは明らかではないが、該免疫賦活剤を投与された腫瘍組織では、温熱療法で熱ストレスを受けると、ＨＳＰの合成がより促進されるためと考えられる。すなわち、合成が促進されたＨＳＰは腫瘍抗原ペプチドと複合体を形成し、この複合体が腫瘍組織から溶出し、腫瘍ワクチンとして作用することによって、腫瘍特異的免疫を効果的に誘導でき、その結果、がんの転移を抑制するためと考えられる。
本発明の免疫賦活剤は、液剤、膏剤、固形剤、粉末剤等の何れの剤形であってもよいが、投与のし易さ等から、溶液、懸濁液、乳濁液等の液剤の剤形であるのが好ましい。
本発明の免疫賦活剤には、その剤形に応じて、水、澱粉、乳糖等の賦形剤；ｐＨ調節剤、抗酸化剤等の安定剤；保存剤；溶解補助剤；界面活性剤等の乳化剤；ショ糖、アラビアゴム、クエン酸ナトリウム等の懸濁化剤；着色剤；滑沢剤；結合剤；崩壊剤；被覆剤を含ませることができる。
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の免疫賦活剤は、がんの温熱療法と組合わせて用いられる。本発明の免疫賦活剤は、腫瘍組織の温熱療法に先立って腫瘍組織に投与されるか、腫瘍組織の温熱療法の際に腫瘍組織に投与されるか、または、腫瘍組織の温熱療法の後（好ましくは、温熱療法後２４時間以内）に腫瘍組織に投与することができ、いずれの場合も、本発明の免疫賦活剤の投与により、高い腫瘍治療効果が得られるが、好ましくは、本発明の免疫賦活剤は温熱療法に先立って投与される。また、本発明の免疫賦活剤は、ＭＣＬ等の磁性微粒子と同時に投与したり、あらかじめ全身的に投与してもよい。
本発明の免疫賦活剤の腫瘍組織への投与方法は、局所注入、動脈注入、静脈注入又は腹腔注入等、好ましくは局所注入によるものである。
本発明の免疫賦活剤の投与量は、患者の病状、年齢、性別等によって変化し得るが、例えば、腫瘍組織１ｇ当たり０．０２ｍｇ〜２０ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ、更に好ましくは約０．２ｍｇである。
（実施例）
実施例１  インビトロ実験
（Ａ）悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）細胞の培養
ＭＦＨ細胞の培養を、１０ｍｌの培地を入れた１００ｍｍ細胞培養用シャーレを用い、５％二酸化炭素付加のインキュベーター内で３７℃で２４時間行った。培地はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍに１０％のウシ胎児血清と抗生物質としてペニシリンＧカリウム（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸塩（９０ｍｇ／ｍｌ）を含む培地を用いた。
（Ｂ）ＧＧＡの添加
所定時間培養したＭＦＨ細胞に、エタノール中に０．１Ｍの濃度で溶解したＧＧＡを、培地中に１０−５Ｍ又は１０−４Ｍの濃度になるように直接添加した。
（Ｃ）ＭＦＨ細胞の加熱
ＧＧＡを添加してすぐにＭＦＨ細胞培養シャーレの蓋を軟プラスチックフィルムで密封し、これを４５℃の恒温槽に１５分間沈めて加熱した。
（Ｄ）ＨＳＰ７０の測定
加熱終了６時間後に、培養シャーレから培養液を取り除き、細胞を生理食塩水で２回洗浄し、ＨＳＰ７０免疫測定キットに付属の細胞溶解液を所定量添加して細胞からＨＳＰ７０を抽出した。これを同免疫測定キットにて定量した。また、細胞抽出液は電気泳動を行い、ウェスタンブロットにてＨＳＰ７０の量を定性的に調べた。
（Ｅ）結果
ＨＳＰ７０の発現量を分析した結果、熱ストレスを加えた後のＨＳＰ７０の発現量は、添加したＧＧＡの量に依存して増加していた。
実施例２  動物実験
（Ａ）実験個体
実験個体としてＦ３４４ラット（メス、７〜８週令）を用いた。細胞培養用シャーレ上で培養したＭＦＨ細胞１×１０７個を約５０μｌの生理食塩水で分散させた後、同細胞懸濁液を翼付静注針（２５Ｇ×５／８″）（テルモ）を用いて実験個体の左大腿部皮下に移植し、担癌実験個体とした。麻酔にはネンブタール（大日本製薬株式会社）を用い、５倍希釈したものを腹腔に投与した（５０ｍｇ／ｋｇ体重）。
（Ｂ）ＭＣＬの調製
マグネタイト（粒子直径１０ｎｍ；戸田工業株式会社製）のスラリーを蒸留水で十分に洗浄して余分なイオン成分を取り除き、超音波処理を行い、コロイド状マグネタイトを得た。コロイド状マグネタイト２ｍｌ（マグネタイト重量：４０ｍｇ）を、ナス型フラスコ内壁にフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミンおよびＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−ｏ−グルタメートの組成が２：２：１（モル比；総脂質量３０ｍｇ）になるようあらかじめ作製したリン脂質膜に加え、ボルテックス撹拌しながら膜を膨潤させた。膨潤させた膜と磁性微粒子に１５分間の超音波処理を施し（２８Ｗ）、その後１０倍濃度の生理食塩水２００μｌを加え、更に超音波処理を１５分間行い（２８Ｗ）、ＭＣＬを得た。
（Ｃ）ＭＣＬの投与
ラット麻酔下にて、濃度７．５ｍｇ／ｍｌ及び正味マグネタイト３．３ｍｇのＭＣＬをマイクロシリンジポンプ（ＳＰ１００ｉ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｐｕｍｐ、ＷＰＩ社製）を用いて３０分間かけてＭＦＨ細胞移植後１０日目のラットの腫瘍組織に投与し、その後３０分ほど静置した。磁場照射はＭＣＬを注入後２４時間置いてから行った。
（Ｄ）ＧＧＡの調製及び投与
ＧＧＡ１ｇをアラビアゴム粉末５００ｍｇに吸着させ、これに０．５％のＴｗｅｅｎ８０溶液を徐々に添加して、かき混ぜながら乳化させ、最終容量を１０ｍｌに調製した。このＧＧＡ懸濁液を生理食塩水にて１００倍に希釈し、その２００μｌをＭＣＬ投与１２時間後に腫瘍組織へ注射器にて局所注入した。
（Ｅ）磁場照射
ＭＣＬを投与してから２４時間後に最初の磁場照射を行い、その後、２４時間間隔でさらに２回の磁場照射を行った。したがって、磁場照射は合計で３回であった。磁場照射は交番磁場発生装置（第一高周波製）を使って行った。高周波磁場は周波数１２０ｋＨｚ、磁場強度３８４Ｏｅであり、１回３０分間の照射とした。磁場照射は横型コイルを用い、この際、細胞を移植した部分がコイルの中心になるように注意を払った。
（Ｆ）腫瘍表面の温度の測定
磁場照射中に腫瘍表面温度を経時的に測定した。光ファイバー温度計の先端を腫瘍表面にテープで固定した。対照として同時に直腸の温度も測定した。
（Ｇ）ＨＳＰ７０の染色
ＧＧＡ投与２時間後に腫瘍塊を取り出し、１０％ホルマリンにて組織を固定、パラフィンに包埋の後、切片を切り出し、脱パラフィン処理を行い、抗ＨＳＰ７０抗体を用いて免疫染色した。
（Ｈ）腫瘍組織容積の測定方法
実験個体麻酔下にて、腫瘍組織の長径と短径をノギスにより測定し、以下の計算式にて算出した。
腫瘍組織容積＝（長径）×（短径）２×０．５
（Ｉ）結果
図−１に示したように、ＨＳＰ７０染色の結果、ＧＧＡを投与した腫瘍組織においてＨＳＰ７０の誘導が確認された。
図−２から明らかなように、ＭＣＬを用いる温熱療法のみの群（ＡＭＦ群）では９個体中４個体の腫瘍が完全退縮し治癒したのに対して、ＭＣＬを用いる温熱療法とＧＧＡの投与とを併用した群（ＧＧＡ＋ＡＭＦ）では８個体中８個体の腫瘍が完全退縮し治癒した。
ＭＣＬのみを用いる温熱療法（ＡＭＦ群）で治癒しなかったラットにおける温熱療法中のラットの腫瘍表面温度をみる限り、温熱療法自体に問題はなかった（図−３参照）。
また、図−４に見られるように、本発明に準じて、ＭＣＬとＧＧＡを投与し３回の磁場照射を行った温熱療法（ＧＧＡ＋ＡＭＦ）群のラットの体重変化は、ＭＣＬ及びＧＧＡの何れも投与せず、磁場照射も行わなかった対照群のラットの体重変化とほぼ同一であることから、本発明の副作用が極めて少ないことがわかる。
（産業上の利用の可能性）
本発明の免疫賦活剤を用いてがんの温熱療法を行うと、温熱療法単独では治療の困難な腫瘍組織を効果的に退縮すると同時に、転移がんも効果的に抑制できる。
さらに、本発明によれば、体重減少等の副作用を極端に抑えながらがんの治療をすることができる。
【図面の簡単な説明】
図−１は、ＭＣＬ投与後の腫瘍塊をＨＳＰ染色した組織切片の写真である。（ａ）は、ＭＣＬ投与後にＧＧＡを注入した場合の組織切片の写真であり、（ｂ）は、ＭＣＬ投与後にＧＧＡを注入しなかった場合の組織切片の写真である。
図−２は、各種治療をした後のラットの腫瘍治療効果を、腫瘍体積を指標として表した図である。（ａ）は、ＭＣＬのみを投与し、磁場照射を行わなかった場合（コントロール群）の治療効果、（ｂ）は、ＭＣＬのみを投与し、計３回の磁場照射を行った場合（ＡＭＦ群）の治療効果、（ｃ）は、ＭＣＬとＧＧＡを投与し、磁場照射を行わなかった場合（ＧＧＡ群）の治療効果、（ｄ）は、本発明に準じて、ＭＣＬとＧＧＡを投与し、計３回の磁場照射を行った場合（（ＧＧＡ＋ＡＭＦ）群）の治療効果を示す。
図−３は、磁場照射した場合のラットの腫瘍表面の温度を示す図である。（ａ）は、ＡＭＦ群の中で腫瘍が完全退縮しなかったラットの腫瘍表面の温度、（ｂ）は、（ＧＧＡ＋ＡＭＦ）群のラットの腫瘍表面の温度を示す。
図−４は、ＭＣＬとＧＧＡを投与し３回の磁場照射を行った温熱療法（ＧＧＡ＋ＡＭＦ）群のラットの体重変化を、ＭＣＬ及びＧＧＡの何れも投与せず、磁場照射も行わなかった対照群のラットの体重変化と比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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