(57)【要約】本発明は、臍帯血、骨髄、末梢血等由来の未分化の幹細胞および該細胞を単離する方法を提供し、本発明はヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞集団ならびにヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の単核球と抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させ、抗ヒト分化抗原抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示す細胞を分離することを含む、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞集団。
【請求項２】
ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の単核細胞から得られ、芽球様の形態学的所見を示す、請求項１記載の未分化幹細胞集団。
【請求項３】
蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときの蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときに最大蛍光強度を示す細胞の蛍光強度の１％〜１０％である、請求項１または２記載の未分化幹細胞集団。
【請求項４】
免疫不全マウスの骨髄中に移植したときに生着し得る、請求項１から３のいずれか１項に記載の未分化幹細胞集団。
【請求項５】
さらに、免疫不全マウスの特定の骨の骨髄中に移植したときに他の骨の骨髄中に移動する遊走能力がＣＤ３４＋細胞に比較して高い、請求項４に記載の未分化幹細胞集団。
【請求項６】
さらに、造血前駆細胞コロニー形成能を有さない、請求項５に記載の未分化幹細胞集団。
【請求項７】
ヒト臍帯血、骨髄または末梢血からｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法であって、ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の単核球と抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させ、抗ヒト分化抗原抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示す細胞を分離することを含む、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法。
【請求項８】
抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させる前に、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＧＰＡからなる群から選択される一つ以上の分化抗原と結合する単核球を分離除去する、請求項７記載のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法。
【請求項９】
蛍光色素で標識されている抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体との結合の有無を標識抗体−細胞結合体の蛍光強度を測定することにより決定する、請求項７または８記載のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法。
【請求項１０】
ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーを用いて、抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示す細胞を分離する、請求項９記載のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法。
【請求項１１】
蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体と接触させたときの抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示す細胞の蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体と接触させたときの全白血球細胞中で最大蛍光強度を示す細胞の１％〜１０％である、請求項９または１０記載のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法。
【請求項１２】
抗ヒト分化抗原抗体がＰＥで標識されている請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体がＦＩＴＣまたはＣｙ５で別々に標識されている請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法であって、該細胞と抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させ、該細胞が抗ヒト分化抗原抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示すか否かを決定することを含む、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法。
【請求項１５】
蛍光色素で標識された抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いる、請求項１４記載の、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法。
【請求項１６】
ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーを用いる、請求項１５記載の、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法。
【請求項１７】
蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときの蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときに最大免疫強度を示す細胞の蛍光強度の１％〜１０％である場合にＣＤ４５ｌｏｗであると決定する、請求項１５または１６記載の、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法。
【請求項１８】
抗ヒト分化抗原抗体がＰＥで標識されている請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体がＦＩＴＣまたはＣｙ５で別々に標識されている請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法であって、該細胞集団と抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させ、該細胞が抗ヒト分化抗原抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示すか否かを決定することを含む、細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法。
【請求項２１】
蛍光色素で標識された抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いる、請求項２０記載の、細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法。
【請求項２２】
ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーを用いる、請求項２１記載の、細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法。
【請求項２３】
蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときの蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときに最大免疫強度を示す細胞の蛍光強度の１％〜１０％である場合にＣＤ４５ｌｏｗであると決定する、請求項２１または２２記載の、細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法。
【請求項２４】
抗ヒト分化抗原抗体がＰＥで標識されている請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体がＦＩＴＣまたはＣｙ５で別々に標識されている請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトの臍帯血、骨髄、末梢血等由来の未分化幹細胞およびその細胞の単離方法に関する。
【背景技術】  すべての血液細胞を作り出す力があるとされる造血幹細胞の存在がＴｉｌｌらにより提唱され（Ｔｉｌｌ  Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｔ．Ｒｅｓ  １４：２１３，１９６１）、今日においては造血能力を持つ細胞が、骨髄のみならず末梢血、膀帯血中にも存在することが明らかにされた。特にヒトにおいてはＣＤ３４抗原を発現する細胞の中に高い造血能力を有する細胞が存在することが示され（Ｃｉｖｉｎ  ＣＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：１５７，１９８４）、ＣＤ３４抗原に対する抗体を用いた免疫磁気ビーズ法などによりＣＤ３４陽性細胞が純化される方法が開発されている（Ｖｏｇｅｌ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １８：８７，２０００）。これら造血幹細胞を白血病患者や再生不良性貧血などの造血障害のある患者に対し、他人の造血幹細胞または自己の正常な造血幹細胞を移植するいわゆる造血幹細胞移植療法が普及し、その有用性が示されている（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ７７：１７１７，１９９１、Ｃｏｒｒｌｎｇｈａｍ  ＲＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ８６：２０５２，１９９５、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ  ＷＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．８８：４１３２，１９９６、Ｄｕｎｂａｒ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．８５：３０４８，１９９５、Ｎｅｇｒｉｎ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．６：２６２，２０００、Ｍｉｃｈａｌｌｅｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２８：８５８，２０００）。
しかし、大沢らによるマウスの造血幹細胞研究において、Ｌｉｎ−／ｃ−Ｋｉｔ＋／Ｓｃａ−１＋細胞画分のうちＣＤ３４が検出できないか、弱く発現している細胞画分（ＣＤ３４−／ｌｏｗ）に骨髄球系統ならびにリンパ球系統に長期にわたり分化しうる細胞が存在することが明らかにされた（Ｏｓａｗａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７３：２４２，１９９６）。またＭｏｒｅｌらもＣＤ３４−分画に幹細胞が存在することを証明した（Ｍｏｒｅｌ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２６：４４０，１９９８）。別の観点からＧｏｏｄｅｌｌらは色素排出法（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２  ｅｆｆｌｕｘ  ａｓｓａｙ）による幹細胞純化法により色素を排出する細胞群をＳＰ細胞（Ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と名づけ、生着可能な細胞であることを示し、またそれらマウス骨髄細胞から得たＳＰ細胞はＣＤ３４ｌｏｗ／−であることを見出した（Ｇｏｏｄｅｌｌ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ３：１３３７，１９９７）。これらの事実から従来のＣＤ３４を利用した移植医療に疑問がもたれるようになった。そしてヒトにおける幹細胞についても改めてＣＤ３４陰性細胞に目が向けられることとなった。
佐藤、田島、小川らは、マウス幹細胞におけるＣＤ３４の発現は可逆的であることを示し、抗がん剤（５−ＦＵ）や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で刺激をすることにより幹細胞がＣＤ３４−からＣＤ３４＋細胞に変化することを示した（Ｓａｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９４：２５４８，１９９９、Ｔａｊｉｍａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９６：１９８９，２０００、Ｔａｊｉｍａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９７：２６１８，２００１）。
ヒトの造血幹細胞に関しては、Ｂｈａｔｉａらが、ヒトの骨髄（臍帯血）のＬｉｎ−ＣＤ３４−ＣＤ３８−は幹細胞としての高い能力を持つ細胞を含むことを免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）に対する異種間の移植実験により明らかにした（Ｂｈａｔｉａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：１０３８，１９９８）。また、Ｚａｎｊａｎｉらはヒト骨髄（臍帯血）に由来するＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ３４陰性細胞を免疫寛容な胎仔ヒツジ腹腔へ移植することにより、ＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ３４陰性細胞中に長期に渡り高いヒト細胞のキメリズムを維持する細胞が存在することを明らかにした。（Ｚａｎｊａｎｉ  ＥＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２６：３５３，１９９８、Ｚａｎｊａｎｉ  ＥＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９２：５０４ａ，１９９８）。
中村、安藤（東海大）らは、ヒト臍帯血中のＬｉｎ−ＣＤ３４−細胞をマウスストローマ細胞ＨＥＳＳ−５とｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養することでＣＤ３４＋細胞を誘導できることを示した。すなわち、ＣＤ３４−画分にＣＤ３４＋細胞よりも上流の幹細胞が存在することを明らかにした（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９４：４０５３，１９９９）。さらに彼らは、骨髄移植を受けた患者について、全骨髄を移植した患者とＣＤ３４陽性細胞分画を移植した患者について、Ｌｉｎ−ＣＤ３４陰性細胞からＣＤ３４＋細胞を誘導する能力を比較したところＣＤ３４＋細胞分画を移植した患者の骨髄にはＣＤ３４＋細胞を誘導できるＣＤ３４−幹細胞が欠如していることを示唆している（Ｋａｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２８：５８７，２００１）ことから、ヒト由来のＣＤ３４＋細胞分画がどこまで造血を長期にわたり維持できるのか疑問がもたれている。
このように、ＣＤ３４−細胞集団がＣＤ３４＋細胞よりも未分化な幹細胞を含む可能性が示されていたが、ＣＤ３４−細胞も種々の分化段階の亜細胞集団を含んでいる可能性が有り、ＣＤ３４−細胞がすべて多分化能を有する幹細胞とはいえない。ヒトＣＤ４５抗原陽性かつＣＤ３４抗原陰性かつ分化抗原陰性の細胞を分離する方法（特開２０００−１６６５４１号公報）やＣＤ７抗原陽性かつＣＤ３４抗原陰性かつ分化抗原陰性の細胞集団（特表２００１−５２５１７６号公報）についての報告も存在するが、これらはＣＤ３４陰性のみを指標に細胞を選択しているに過ぎず、ＣＤ３４陰性細胞集団の中からさらに真の幹細胞を得ようとする試みはされていない。このように従来から、ＣＤ３４−細胞集団の未分化細胞としての重要性は示唆されていたものの、その細胞集団をさらに分画し、真の幹細胞ともいえる細胞集団を単離しようとする試みは達成されていなかった。
【発明の開示】
本発明は、臍帯血、骨髄、末梢血等から未分化の幹細胞を得ることを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく、ヒト臍帯血から細胞表面の種々の分化抗原の発現を指標に特定の細胞集団を選択し、該細胞集団の分化能について検討を行い、ＣＤ３４陰性細胞の中でも分化抗原（ｌｉｎｅａｇｅ抗原）が陰性で、ＣＤ４５の発現が弱い細胞が、ＣＤ３４陽性細胞よりもより未分化な細胞であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）  ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞集団、
（２）  ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の単核細胞から得られ、芽球様の形態学的所見を示す、（１）の未分化幹細胞集団、
（３）  蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときの蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときに最大蛍光強度を示す細胞の蛍光強度の１％〜１０％である、（１）または（２）の未分化幹細胞集団、
（４）  免疫不全マウスの骨髄中に移植したときに生着し得る、（１）から（３）のいずれかの未分化幹細胞集団、
（５）  さらに、免疫不全マウスの特定の骨の骨髄中に移植したときに他の骨の骨髄中に移動する遊走能力がＣＤ３４＋細胞に比較して高い、（４）の未分化幹細胞集団、
（６）  さらに、造血前駆細胞コロニー形成能を有さない、（５）の未分化幹細胞集団、
（７）  ヒト臍帯血、骨髄または末梢血からｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法であって、ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の単核球と抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させ、抗ヒト分化抗原抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示す細胞を分離することを含む、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法、
（８）  抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させる前に、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＧＰＡからなる群から選択される一つ以上の分化抗原と結合する単核球を分離除去する、（７）のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法、
（９）  蛍光色素で標識されている抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体との結合の有無を標識抗体−細胞結合体の蛍光強度を測定することにより決定する、（７）または（８）のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法、
（１０）  ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーを用いて、抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示す細胞を分離する、（９）のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法、
（１１）  蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体と接触させたときの抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示す細胞の蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体と接触させたときの全白血球細胞中で最大蛍光強度を示す細胞の１％〜１０％である、（９）または（１０）のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を単離する方法、
（１２）  抗ヒト分化抗原抗体がＰＥで標識されている（９）〜（１１）のいずれかの方法、
（１３）  抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体がＦＩＴＣまたはＣｙ５で別々に標識されている（１２）の方法、
（１４）  ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法であって、該細胞と抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させ、該細胞が抗ヒト分化抗原抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示すか否かを決定することを含む、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法、
（１５）  蛍光色素で標識された抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いる、（１４）の、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法、
（１６）  ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーを用いる、（１５）の、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法、
（１７）  蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときの蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときに最大免疫強度を示す細胞の蛍光強度の１％〜１０％である場合にＣＤ４５ｌｏｗであると決定する、（１５）または（１６）の、細胞がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞であるかを決定する方法、
（１８）  抗ヒト分化抗原抗体がＰＥで標識されている（１４）〜（１７）のいずれかの方法、
（１９）  抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体がＦＩＴＣまたはＣｙ５で別々に標識されている（１８）記載の方法、
（２０）  ヒト臍帯血、骨髄または末梢血由来の細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法であって、該細胞集団と抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を接触させ、該細胞が抗ヒト分化抗原抗体および抗ヒトＣＤ３４抗体と結合せず、抗ヒトＣＤ４５抗体と弱い結合を示すか否かを決定することを含む、細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法、
（２１）  蛍光色素で標識された抗ヒト分化抗原抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いる、（２０）の、細胞集団中のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法、
（２２）  ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーを用いる、（２１）の、細胞集団のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法、
（２３）  蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときの蛍光強度が、ヒト白血球細胞集団を蛍光標識抗ＣＤ４５抗体で蛍光免疫染色したときに最大免疫強度を示す細胞の蛍光強度の１％〜１０％である場合にＣＤ４５ｌｏｗであると決定する、（２１）または（２２）の、細胞集団のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を分析する方法、
（２４）  抗ヒト分化抗原抗体がＰＥで標識されている（２０）〜（２３）のいずれかの方法、ならびに
（２５）  抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ４５抗体がＦＩＴＣまたはＣｙ５で別々に標識されている（２４）記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の細胞の取得および本発明の細胞の性質
本発明の細胞は、分化抗原（系統特異的抗原）が陰性で、ＣＤ４５の発現が弱くかつＣＤ３４が陰性であることを特徴とする細胞（以下、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞とする）であり、ＣＤ３４陽性細胞よりも未分化な幹細胞である。また、本発明の細胞は、芽球様細胞の特徴も有する。本発明の細胞は、臍帯血、骨髄、末梢血中に存在し、これらの組織・器官から単離することができる。
分化抗原が陰性（ｌｉｎ−）とは、造血幹細胞からの特定系統の細胞への分化に対応して出現する表面抗原を有していないこと、すなわち該表面抗原を細胞表面に発現していないことをいい、本発明においてはＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＧＰＡが陰性であることをいう。前記表面抗原中、ＣＤ３はＴ細胞と関連を有し、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３およびＣＤ２４はＢ細胞と関連を有し、ＣＤ１６およびＣＤ５６はＮＫ細胞等と関連を有し、ＣＤ２およびＣＤ７はＴ細胞、ＮＫ細胞と関連を有し、ＣＤ４１は血小板と関連を有し、ＧＰＡは赤血球と関連を有し、ＣＤ６６ｂは顆粒球と関連を有する。
ＣＤ４５ｌｏｗとは、ＣＤ４５の発現が弱いことをいう。ＣＤ４５は、末梢血のリンパ球、単球、顆粒球、好酸球、好塩基球を含むすべての白血球が有している。本発明でＣＤ４５の発現が弱いとは、細胞表面上に有意の量のＣＤ４５の存在が認められるが、ＣＤ４５を発現している全白血球集団の中で相対的にＣＤ４５の存在が低いことをいい、蛍光色素で標識した抗ＣＤ４５抗体で本発明の細胞および前記白血球細胞集団を同一の条件で染色したときに染色される細胞の最大蛍光強度の１％〜１０％の蛍光強度を示す細胞をいう。例えば、ヒト血液由来の白血球細胞集団と本発明の細胞を混ぜ蛍光色素標識抗ヒトＣＤ４５抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）を用いて、蛍光強度を測定したときに最大蛍光強度を示す白血球細胞の蛍光強度の１％〜１０％の蛍光強度を示す細胞集団中に本発明の細胞集団が含まれ、最大蛍光強度を示すリンパ球細胞の蛍光強度の１％〜１０％の蛍光強度を示す細胞集団中、ＣＤ３４−ｌｉｎ−の細胞が本発明の細胞である。
ＣＤ３４−とは、ＣＤ３４抗原が陰性であること、すなわち細胞の表面にＣＤ３４が発現していないことあるいは非常に発現が低いことをいう。ＣＤ３４は造血幹細胞に関連を有するとされている表面抗原である。
これらの表面抗原が陰性かどうか、発現が弱いかどうかはこれらの抗原に対する抗体であって、発色酵素、蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁性ビーズを用いても決定することができる。また、ＦＡＣＳまたはフローサイトメーターを用いても表面抗原があるかどうか決定することができる。ＦＡＣＳ、フローサイトメーターとしては例えばＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いることができる。
本発明の細胞は、これらの細胞表面の抗原特性に基づいて単離することができる。
臍帯血から例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ比重遠心法により単核細胞を分離し、それぞれ異なる蛍光色素で標識した分化抗原に対する抗体、ＣＤ３４に対する抗体およびＣＤ４５に対する抗体で前記分離細胞を染色し、ＦＡＣＳを用いて、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞をソーティングすることにより本発明の細胞を単離することができる。この際、単核細胞から直接ＦＡＣＳで単離してもよいし、ＦＡＣＳでソーティングする前に分化抗原のうちの１種類以上の抗原に対する抗体を結合させた磁気ビーズを用いて、分化抗原を有する細胞を除去し、残った細胞からＦＡＣＳを用いて本発明の細胞を単離することができる。この際用い得る蛍光色素として、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＰＣ５、ＰＥ−Ｃｙ５（Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ、ＰＥとＣｙ−５のタンデム色素）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰｅｒＣＰ（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。免疫磁気ビーズ法で回収した細胞の５０％以下、４０％以下、２０％以下、１０％以下または５％以下がｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞である。
このような単離方法により単離した細胞集団であって、実質的に本発明の細胞からなる細胞集団も本発明の範囲に包含される。実質的に本発明の細胞からなる細胞集団とは、表面抗原特性すなわち表面抗原の発現パターンが異なる細胞からなる細胞集団であり、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞が含まれる細胞集団である。また、本発明の細胞は、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞が含まれるｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞の組成物である。
例えば、ヒト臍帯血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ比重遠心法を用いて単核細胞を分離し、上述の分化抗原のうち、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０もしくはＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂおよびＧＰＡが陰性のものを単離し、該単離細胞について、異なる蛍光色素で標識したヒトＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ５６およびＧＰＡに対する抗体のうちの複数の抗体、好ましくは１０種類以上の抗体を含む抗体混合物、抗ヒトＣＤ３４抗体ならびに抗ヒトＣＤ４５抗体を用いて細胞を３重染色し、ＦＡＣＳで分化抗原陰性、ＣＤ３４陰性かつＣＤ４５が弱陽性である細胞を単離すればよい。３重染色の際、前記抗体混合物、ＣＤ３４抗体およびＣＤ４５抗体は別々の蛍光色素で標識するが、このうちヒトＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ５６およびＧＰＡに対する抗体のうちの複数の抗体、好ましくは１０種類以上の抗体を含む抗体混合物をＰＥで標識するのが好ましい。ＰＥ標識することにより、蛍光強度は最大２０００チャネルとなり、ＦＩＴＣで染色した場合の約２００チャネルに比べ約１０倍の感度で、ヒトＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ５６およびＧＰＡのいずれかを発現している細胞を検出することが可能である。このため上記分化抗原を弱く発現している細胞を高精度で除外することができる。後述の実施例１の条件でＦＡＣＳ解析を行った場合に、図１に示すスキャッタグラム（散布図）において分画Ｃに存在する細胞が本発明の細胞である。
本発明の細胞は、さらにＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスなどの免疫不全マウスの骨髄中に従来の尾静脈注入移植では生着せず、直接注入法で移植すると生着するという特徴を有する。生着の有無は、細胞を免疫不全マウスの骨髄腔内に移植し、移植１２週間後に細胞を移植した骨または別の骨の骨髄腔内に移植した細胞に由来するヒト血液細胞が存在しているかどうかを例えばＣＤ４５抗原の存在を指標に確認すればよい。本発明の細胞は、ＣＤ３４陰性ＳＲＣ（ｓｃｉｄ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）細胞とも呼ぶ。ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスは（財）実験動物中央研究所から入手することができる。
さらに、本発明の細胞は、ＣＤ３４陽性細胞に発現する、ＣＸＣＲ４等のケモカイン受容体の発現が認められないという特徴を有し、同様にＣＤ３４陽性細胞には発現するＣＤ３１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１０６等の接着因子が発現していないという特徴を有する。蛍光色素で標識したこれらに対する抗体を用いて、免疫染色を行うことにより、発現の有無を確認することができる。
さらに、本発明の細胞は、造血前駆細胞コロニー形成能を有しないという特性を有する。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで至適濃度のＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチンと培養した場合にコロニーを形成しない。
さらに、本発明の細胞は、胸腺、脾臓および肝臓において移植後１２週の時点でＴリンパ球へ分化しないという特徴を有する。また、肝臓、脾臓における生着率がＣＤ３４陽性細胞より低いという特徴を有する。
さらに本発明の細胞はＣＤ３４陽性細胞よりも遊走能力が有意に高いという特性を有する。遊走能力とは、細胞がある組織から別の組織へと移動し得る能力をいい、本発明の細胞の場合、特定の骨の骨髄腔内に移植した場合に、一定期間経過後に他の骨の骨髄腔内に移動し得る能力をいう。遊走能については、Ｎａｇａｓａｗａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６３５，１９９６、ＭａＱ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ９５：９４４８，１９９８、Ｚｏｕ  Ｙ−Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：５９５，１９９８、Ｐｅｌｅｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８４５，１９９９、Ｖｏｅｒｍａｎｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２７：１８０６，１９９９に詳細に記載されている。
上述の本発明の細胞の単離方法に用いた技法により、ある細胞が本発明の細胞であるか否か、ある細胞集団が本発明の細胞を含むか否かを決定することができる。本発明の細胞と決定された細胞を以下に述べるように種々の用途に適用することができる。この決定方法も本発明の範囲に包含される。さらに、本発明の細胞の単離方法に用いた技法により、ある細胞集団中の本発明の細胞を分析、すなわちある細胞集団中に本発明の細胞が含まれるか否か、どの程度の割合で含まれるかどうか、等について分析することができる。この分析の結果を利用して被分析細胞から本発明の細胞を単離することができるし、またその細胞集団を以下に述べる種々な用途にそのまま適用できるか否か等も評価することができる。この分析方法も本発明の範囲に包含される。
２．本発明の細胞の利用
本発明の細胞をヒト臍帯血、骨髄または末梢血から集めて、または種々の方法により増殖させて利用することができる。例えば、ストローマ細胞層上で増殖させることができる。
また、本発明の細胞を免疫不全マウスに移植し、８〜１６週間後にマウス骨髄から未分化の本発明の細胞を回収し、さらに回収した該細胞を再び免疫不全マウスに再移植する。この移植および回収を繰り返すことにより、他の細胞の混入のない純度の高い細胞を大量に得ることができる。
本発明のマウスを用いて得られたヒト幹細胞を、エクソ・ビボで増殖させ、白血病等の治療のためにヒトに移植することが可能であるし、また肝臓等の再生医療のための組織形成のための幹細胞として用いることもできる。
さらに、本発明の細胞をＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＦＬＴ３リガンド、ＴＰＯ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６レセプター、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６レセプターの融合タンパク質（例えば、ＷＯ  ００／０１７３１、ＷＯ  ９７／３２８９１、ＷＯ  ９９／０２５５２参照）等の生理活性物質とともに培養し、成熟させ、増殖させ特定の造血細胞を得ることができる。
本発明の細胞に外来遺伝子を導入し、ヒト造血幹細胞を標的とした遺伝子治療に用いることもできる。幹細胞への遺伝子導入は、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて行うことができる。ここで用いる遺伝子として例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症患者に対してＡＤＡ遺伝子等が挙げられる。
さらに、本発明の細胞はｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−で特徴づけられる未分化な幹細胞であり、本発明の細胞を新しい幹細胞のマーカーの探索のために用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、臍帯血由来ｌｉｎ−細胞の各種ｌｉｎ抗体（ＦＩＴＣ標識）、ＣＤ３４抗体（ＰＥ標識）、ＣＤ４５抗体（ＰＣ５標識）による三重染色後のｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍを示す図である。
図２は、分画Ａ〜Ｃの細胞のサイトスピン標本（Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色）を示す写真である。
図３は、分画Ａ〜Ｄの造血前駆細胞コロニー形成能を示す図である。
図４は、臍帯血由来のＣＤ３４陽性、ＣＤ３４陰性細胞におけるＣＸＣＲ４、各種接着因子の発現を示す図である。
図５は、マウス脛骨骨髄腔内直接移植法による分画Ａおよび分画Ｃの移植成績を従来の尾静脈よりの移植成績と比較して示す図である。
図６は、分画Ａ移植後のマウス骨髄中のヒト由来細胞の多血球系統解析の結果を示す図である。
図７は、分画Ｃ移植後のマウス骨髄中のヒト由来細胞の多血球系統解析の結果を示す図である。
図８は、分画ＡおよびＣを移植後のマウス骨髄内ヒトＣＤ４５陽性細胞（全細胞）中の各種抗原発現細胞の比較の結果を示す図である。
図９は、分画Ａ（ＣＤ３４陽性ＳＲＣ）移植後の胸腺、脾臓、肝臓に存在するリンパ球系細胞を示す図である。
図１０は、分画Ａ、分画Ｃ細胞移植後のマウス骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞の経時的な解析の結果を示す図である。
図１１は、分画Ａ（ＣＤ３４陽性ＳＲＣ）と分画Ｃ（ＣＤ３４陰性ＳＲＣ）の遊走能力の比較の結果を示す図である。
図１２Ａは、臍帯血由来ｌｉｎ−細胞の各種ｌｉｎ抗体（ＦＩＴＣ標識）、ＣＤ３４抗体（ＰＥ標識）、及びＣＤ４５抗体（ＰＣ５標識）による３重染色後のスキャッタグラムを示し、Ｂは、臍帯血由来ｌｉｎ−細胞の各種ｌｉｎ抗体（ＰＥ標識）、ＣＤ３４抗体（ＰＣ５標識）、及びＣＤ４５抗体（ＦＩＴＣ標識）による３重染色後のスキャッタグラムを示す図である。
図１３は、限外希釈法による臍帯血由来ｌｉｎ−ＬＮ細胞におけるＣＤ３４ｎｅｇＳＲＣの頻度を示す図である。臍帯血に由来するｌｉｎ−ＬＮ細胞の５，０００、２０，０００、４０，０００個／マウスを８週齢のＮＯＤ／ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスの左脛骨中にＩＢＭＩ法で移植した。１２週後にマウスを犠牲死させて、骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞の割合をＦＡＣＳで解析した（０．１％以上を陽性と判定）。ＣＤ３４ｎｅｇＳＲＣの頻度はポアソン解析により計算した。
図１４は、臍帯血由来ＣＤ３４陽性ＳＲＣのマウス骨髄中の生着率を示す。Ｌｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞を１２５０，５０００，２００００，５００００個／マウスで移植し、１２週間後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞の割合をＦＡＣＳで測定した。図より明らかなように、５０００個／マウス以上移植したすべてのマウスで生着が認められた。しかし、２００００個／マウス以上移植した場合には、生着率がプラトーレベルに達することが明らかになった。＊Ｐ＜０．０２  ＊＊Ｐ＜０．０１
図１５は、１個のＣＤ３４陽性あるいはＣＤ３４陰性ＳＲＣの産生する血液細胞数を示す図である。図１５中、ａ）はＣＤ４５陽性細胞数を示し、ｂ）はＣＤ３４陽性細胞数を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
〔実施例１〕  新規な幹細胞の純化
本発明の幹細胞は、満期正常分娩児由来のヒト臍帯血より単離した。
臍帯血としては、臍帯血バンクに提供されたものの移植用に登録されなかった場合には、研究用または廃棄処分となる旨の文書によるインフォームドコンセントを取った上で、協力病院において採取されたものを使用した。
ヒト臍帯血の採取、凍結保存および解凍は以下のようにして行った。
実験に用いた臍帯血は、すべて満期正常分娩児に由来する。すなわち、児娩出後に臍帯動脈の拍動が停止した後に臍帯を胎児に近い部位で２ヶ所クランプし、その中間で切断する。次に、断端を消毒用のアルコール綿で拭き、さらにポピドンヨード液にて十分に消毒する。ポピドンヨード液が乾燥してから臍帯静脈を臍帯血採取用バッグ（ＡＣＤ入り、テルモ社製）に付いている１７ゲージ採血針で穿刺して、臍帯血を自然落下によりバッグ内に採取する。採取した臍帯血からｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｓｔａｒｃｈ（ＨＥＳ、ニプロ）を加えることで赤血球を除去し、バフィーコート細胞を回収する。この細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に浮遊させ、細胞密度を２〜１０×１０７個／ｍｌに調製する。２５％ヒト血清アルブミン添加ＣＰ−１（極東製薬）を等量加えて氷上で穏やかに混和し、凍結保存用のバッグに注入する。プログラムフリーザーあるいは簡易凍結法を用いてサンプルの温度を−８０℃まで下げた後に、液体窒素中に保存した。使用時には、バッグを３７℃の恒温糟中に浸して、サンプルを急速融解して以下の実験に用いた。
解凍した臍帯血はα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄後に、適当量のα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に再浮遊させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）比重遠心法（１５００ｒｐｍ，３０分）を用いて単核細胞（以下ＭＮＣと略）を分離した。
既報（Ｍｉｎａｍｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１０：３２７，２０００）の如く、ＭＮＣより９種類のモノクローナル抗体（ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２４，ＣＤ５６，ＣＤ６６ｂ，ＧＰＡ）と免疫磁気ビーズ（ＳｔｅｍＳｅｐ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、分化抗原陰性（以下ｌｉｎ−と略）細胞を分離した。
このｌｉｎ−細胞を抗ヒトＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ７，ＣＤ１０，ＣＤ１４，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２３，ＣＤ２４，ＣＤ４１，ＣＤ５６，ＧＰＡ（ＦＩＴＣ標識，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＤＡＫＯ，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）と抗ヒトＣＤ３４抗体（ＰＥ標識，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），および抗ヒトＣＤ４５抗体（ＰＣ５標識，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）で三重染色後、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いてソーティングすることにより、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞を純化した（図１ｂの分画Ｃの細胞である）。免疫染色法は、既報の方法（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９０：４７６７，１９９７；Ｍｉｎａｍｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１０：３２７，２０００）に従った。本細胞におけるＣＤ３４、ＣＤ４５の発現レベルの定義については後述する。本細胞は、Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色所見では完全な芽球様細胞であり、その純度は＞９８％であった（図２Ｃ参照）。Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色は、通常の方法に従って行った。すなわち、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ液で５分間染色後に水で洗浄し、５％Ｇｉｅｍｓａ液（ｐＨ６．４リン酸バッファーで調製）で３０分間染色し、検鏡と写真撮影を行った。
臍帯血中に認められる各種造血幹（前駆）細胞分画の結果は以下の通りであった。
臍帯血ｌｉｎ−細胞を前述したように１４種類のｌｉｎｅａｇｅ抗体（ＦＩＴＣ標識）、ＣＤ３４抗体（ＰＥ標識），ＣＤ４５抗体（ＰＣ５標識）で三重染色すると、図１ｂに示すようにＡ〜Ｄの４つの分画に分かれることが明らかになった。分画ＡとＢは、ＣＤ３４抗原の発現レベルが各々ｈｉｇｈ（蛍光強度ｍａｘ〜１５％）、ｌｏｗ（同１０〜１％）であり、全細胞数に対する比率が約８０％、約５％である。一方、ＣＤ３４抗原陰性（蛍光強度ｍａｘの０．５％以下）細胞は、ＣＤ４５の発現レベルにより分画Ｃと分画Ｄに分けられた。分画ＤとＣは、ＣＤ４５抗原の発現レベルが各々ｈｉｇｈ（蛍光強度ｍａｘ〜１５％）、ｌｏｗ（同１０〜１％）であり、全細胞数に対する比率が約５％、約０．５％である。図１ｂ中の細胞の正確な頻度は、ｂに示されている細胞全体の中でＡ；７９．７％、Ｂ；４．７％、Ｃ；０．５％、Ｄ；５．２％であった。
図１に臍帯血由来ｌｉｎ−細胞のＦＩＴＣで標識した各種ｌｉｎ抗体、ＰＥで標識したＣＤ３４抗体、ＰＣ５で標識したＣＤ４５抗体による三重染色後のスキャッタグラム（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍ）を示す。図１ａはコントロールを、図１ｂは三重染色後のスキャッタグラムを示す。図１ｂには分画Ａ〜Ｄのソーティングウィンドウ（ｓｏｒｔｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ）を示してあるが、分画Ｃの細胞が本発明のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞である。図２には、Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色細胞の写真を示す。図２Ｃが本発明の細胞の写真である。
Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色による形態学的な所見は、図２に示すように分画Ａ〜Ｃはいずれも芽球様（核網は繊細、数個の核小体が認められ、核細胞比は大きい）の細胞である。図２中のＡ、ＢおよびＣは分画を示す。
〔実施例２〕  臍帯血ｌｉｎ−細胞中の分画Ａ〜Ｄの造血前駆細胞コロニー形成能
方法は、既報（Ｓｏｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ８４：４０９９，１９９４；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９０：４７６７，１９９７）のメチルセルロース法により、刺激因子として至適濃度のＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチンを添加し、図１に示した分画Ａ〜Ｄ由来細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける造血前駆細胞コロニー形成能を調べた。分画Ｃが本発明の細胞である。結果を図３に示す。図３は培養細胞２００細胞当たりのコロニー数を示してある。図３中、ＣＦＵ−ＧＭはｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅを、ＢＦＵ−ＥはＥｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔを、ＣＦＵ−Ｍｉｘはｍｉｘｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔを意味する。図３より明らかなように、分画ＡおよびＢのコロニー形成率は概ね５０％である。分画Ａには、顆粒球系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、さらに多能性前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）が認められた。分画Ｂはその大半がＢＦＵ−Ｅであり、赤血球系に分化した造血前駆細胞集団であることが示された。図には示さないが、分画Ａの細胞からは巨核球系前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）由来のコロニーも認められ、全ての系統の造血前駆細胞集団が含まれることが示された。ＣＦＵ−Ｍｅｇ由来のコロニーの形成は、既報（Ｔａｎｉｍｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２５：１０２５，１９９７）の如く１０％ヒト血漿存在下で至適濃度のＴＰＯを添加した。一方、分画Ｃ、Ｄからはほとんどコロニー形成を認めなかった。
〔実施例３〕  ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞のｓｃｉｄ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ（ＳＲＣ）活性
ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（（財）実験動物中央研究所より入手）を用いて、図１の分画Ａ〜Ｄのｓｃｉｄ−ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌ（ＳＲＣ）活性について検討した。方法は、Ｂｈａｔｉａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ４：１０３８，１９９８）に準じて行った。すなわち、予め２．５Ｇｙのγ線照射を行った８〜１２週令のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスを用い、分画Ａ、Ｂ、Ｄに関しては２〜５×１０４個、分画Ｃに関して２〜５×１０３個（一部のマウスでは最大２×１０４個）の細胞を尾静脈より移植した。移植８〜１２週間後にマウスを犠牲死させ、無菌的に大腿骨、頸骨、上腕骨を取り出した。各々の断端を滅菌クーパーにより切断し、２６ゲージ針を用いてα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）を注入することにより骨髄細胞を採取し、単一細胞懸濁液を調製した。当該細胞懸濁液をナイロンメッシュに通すことにより細胞凝集塊や破片を除去し、２％牛胎児血清（ＦＣＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）加ＰＢＳ−で洗浄し、以下の免疫染色を行った。方法は既報の方法（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９０：４７６７，１９９７；Ｍｉｎａｍｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１０：３２７，２０００）に従った。ヒト造血細胞の生着は、細胞懸濁液をＰＣ５標識抗ヒトＣＤ４５抗体で染色後に、全骨髄細胞にＲ１ゲートをかけてヒトＣＤ４５陽性細胞を測定することにより確認した。その結果、表１に示すように分画Ａに由来する細胞を移植したマウスでは、全例で生着（１２／１２）がみられ、そのＣＤ４５陽性細胞率は３．０〜８２．３％（平均４４％）であった。一方、分画Ｂ，Ｃ，Ｄ由来の細胞を移植したマウスではいずれもヒトＣＤ４５陽性細胞の生着は認められなかった。図５には、全骨髄（脛骨、大腿骨、上腕骨）中のヒトＣＤ４５陽性細胞の割合（％）を示してある。図５中、白丸が尾静脈より移植した場合（従来法）の結果を表し、黒丸は後述の実施例５の脛骨骨髄腔内に直接移植した場合の結果を表す。また、図５中横線は平均生着率を示す。
2004005496.tif 000002
〔実施例４〕  臍帯血由来ＣＤ３４＋／−細胞における各種接着分子等の発現
造血幹細胞の骨髄内ｎｉｃｈｅへのホーミングには、ＣＸＣＲ４などのケモカイン受容体あるいは各種接着分子が重要な役割を果たしていることが多くの報告により知られている（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９１：２２３１，１９９８；Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９２：８９４，１９９８；Ｖｏｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２７：１８０６，１９９９；Ｚａｎｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ９４：２５１５，１９９９；Ｐｅｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８４５，１９９９；Ｖｏｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １８：４３５，２０００）。そこで、臍帯血由来ＣＤ３４＋／−細胞におけるこれらの分子の発現パターンについて詳細な解析を行った。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＸＣＲ４，ＣＤ３１，ＣＤ５４，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ１０６，ＣＤ４９ｄ，ＣＤ４９ｅ，ＣＤ６２Ｐ抗体は、各々Ｃｏｕｌｔｅｒ／Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓｅｒｏｔｅｃより購入した。臍帯血由来のｌｉｎ−細胞を既述の如く、ＦＩＴＣ標識抗ＣＸＣＲ４あるいは抗各種接着分子抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体（ＰＥ標識，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），および抗ヒトＣＤ４５抗体（ＰＣ５標識，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）で三重染色後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて解析した。
図４に結果を示す。図４中、（ａ）〜（ｈ）は、以下の接着分子を示す。（ａ）Ｒ１  ｇａｔｅ、（ｂ）Ｒ２  ｇａｔｅ、（ｃ）ｃｏｎｔｒｏｌ、（ｄ）ＣＸＣＲ４、（ｅ）ＣＤ３１、（ｆ）ＣＤ５４、（ｇ）ＣＤ６２Ｌおよび（ｈ）ＣＤ１０６である。図４に示すように、ＣＸＣＲ４はＣＤ３４陽性細胞の一部に発現が認められるが、一方ＣＤ３４陰性細胞には全く発現が見られなかった。同様に、ＣＤ３１，ＣＤ５４，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ１０６などの接着分子もＣＤ３４陽性細胞に有意な発現を認め、ＣＤ３４陰性細胞には発現されていないことが明らかになった。一方、ＣＤ４９ｄはＣＤ３４陽性細胞に弱く発現していたが、ＣＤ４９ｅ，ＣＤ６２Ｐなどは両細胞とも明らかな発現を認めなかった。
以上より、分画Ｃに未分化な幹細胞が存在していても、尾静脈よりの移植では骨髄内のｎｉｃｈｅにホーミング出来ない可能性が示唆された。
〔実施例５〕  ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス脛骨骨髄腔内直接移植法によるＣＤ３４陰性ＳＲＣの同定
分画Ｃの細胞を直接マウス骨髄腔内へ移植する方法を開発し、以下の移植実験を行った。
（１）マウス脛骨骨髄腔内直接移植法の開発
ネンブタール麻酔を施した８〜１２週令のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（予め２．５Ｇｙのγ線照射済み）を仰臥位で固定し、左膝関節周囲を消毒用アルコールで清拭し、剃毛を行った。その後、２６Ｇ針にて膝蓋骨腱経由に左脛骨を穿刺し、骨髄液の逆流を確認した。次に、予め準備した滅菌２６Ｇハミルトン針を用いて１０μＬの培養液中に調製した移植細胞（分画Ａ、Ｂ、Ｄに関しては２〜５×１０４個、分画Ｃに関して２〜５×１０３個、最大２×１０４個）を脛骨骨髄腔内に直接注入した。穿刺部位はポピドンヨード液にて十分に消毒した。移植１２週間後に実施例３に記載の方法で脛骨、大腿骨、上腕骨骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を測定した。
（２）移植成績
実施例３の尾静脈より移植した場合は、図５に示すように分画Ａのみが全例生着（平均生着率４４．０％）したが、分画Ｃの移植では全例生着しなかった。
一方、脛骨骨髄腔内直接移植法を用いると、分画Ａは同様に全例生着（平均生着率５４．９％）したが、分画Ｃの細胞を移植した７匹のマウス全例においても生着（生着率範囲４〜５２．６％、平均生着率２４．４％）が認められた（図５）。
以上の結果より、分画Ｃ、すなわちヒト臍帯血由来のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞中にＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスにおいてヒトの造血を再構築する未分化幹細胞の存在が初めて直接的に証明された。
従来の唯一の報告（Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ４：１０３８，１９９８）では、臍帯血由来のｌｉｎ−ＣＤ３４−細胞の１×１０５個以上を尾静脈より移植し、その生着率も大半が０．１〜１％という低率であった。彼らの報告ではヒトＣＤ４５陽性細胞の測定時にマウス骨髄細胞のリンパ球ウインドウにＲ１ゲートをかけており、本実施例の方法（全骨髄細胞にＲ１ゲート）によればその生着率は０，１％以下の低率となる。さらに移植細胞数と生着率との間に量反応関係も認められないなどその信頼性は低いものと推測された。
そこで、この未分化幹細胞をＣＤ３４陰性ＳＲＣと命名した。
〔実施例６〕  ＣＤ３４陰性ＳＲＣの多分化能、ＣＤ３４陽性ＳＲＣとの比較検討
本発明の細胞と従来から知られていたＣＤ３４陽性ＳＲＣとの幹細胞特性の違いについて詳細な検討を行った。
ＣＤ３４陰性ＳＲＣの多分化能を明らかにするために、マウス骨髄内に生着したヒト造血細胞の多血球系統解析を行ない、ＣＤ３４陽性ＳＲＣと比較検討した。方法は、基本的に実施例３で述べた免疫染色法と同様である。マウス全骨髄（大腿骨、脛骨、上腕骨）より採取した細胞を抗ヒトＣＤ４５抗体（ＰＣ５標識、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、抗ヒトＣＤ３４（ＰＥ標識、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、さらにＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３，ＣＤ１９，ＣＤ１４，ＣＤ３３，ＣＤ４１，およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎｅ  Ａ（ＧＰＡ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＤＡＫＯ）で三重染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて測定した。解析は、マウスの全骨髄細胞にＲ１ゲートをかけてこの中に含まれるヒトＣＤ４５陽性細胞を算定した。さらに、このＣＤ４５陽性細胞中のＣＤ３４，ＣＤ３，ＣＤ１９，ＣＤ１４，ＣＤ３３，ＣＤ４１陽性細胞の割合を測定した。ＧＰＡ陽性細胞については、全骨髄細胞（Ｒ１ゲート）中の割合を測定した。
図６に分画Ａ（ＣＤ３４陽性ＳＲＣ）の多血球系統解析の結果を示す。図６には、ＣＤ４５陽性細胞中のＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４１の発現率と全細胞中のＧＰＡ陽性細胞の割合を示してある。このマウスの骨髄細胞中のヒトＣＤ４５陽性細胞の比率は８０．１％であり、１５．６％はＣＤ３４陽性細胞で占められていた。分化マーカー別にみると、ＣＤ１９陽性のＢ細胞が４９．１％と最も多く認められた。この他、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＧＰＡ陽性細胞も認められ、ＣＤ３４陽性ＳＲＣの多分化能（Ｂリンパ球、骨髄球、単球、巨核球、赤血球系への分化能）が確認された。
次に、図７に分画Ｃ（ＣＤ３４陰性ＳＲＣ）の多血球系統解析の結果を示す。図７には、図６と同様にＣＤ４５陽性細胞中のＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４１の発現率と全細胞中のＧＰＡ陽性細胞の割合を示してある。このマウスの骨髄細胞中のヒトＣＤ４５陽性細胞の比率は５２．６％であり、６．７％はＣＤ３４陽性細胞で占められていた。分化マーカー別にみると、ＣＤ１９陽性のＢ細胞が２３．８％と最も多く認められた。この他、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＧＰＡ陽性細胞も認められ、ＣＤ３４陽性ＳＲＣと同様に多分化能を示すことが確認された。しかし、いずれの場合にもＣＤ３陽性のＴ細胞は認められなかった。すなわち、ＣＤ３４陰性細胞分画を移植することで、ＣＤ３４陽性細胞が出現した。このことは、ＣＤ３４陰性ＳＲＣは、ＣＤ３４陽性ＳＲＣに比べてより未分化な幹細胞であることを示している。
複数のマウスにおけるＣＤ３４陰性ＳＲＣとＣＤ３４陽性ＳＲＣの多血球系統解析の結果を比較したものが図８である。図８中、分画Ａの細胞は斜線カラムで、分画Ｃの細胞は黒塗りカラムで示してある。ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ４１は各々ＣＤ４５陽性細胞中の比率、ＧＰＡは全細胞中の比率で示してある（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０２、＊＊＊Ｐ＜０．０１）。
ＣＤ３４陽性細胞の比率は両者間で差がなく、一方、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４およびＧＰＡ陽性細胞の比率は、ＣＤ３４陽性ＳＲＣの方が有意に高い値を示した。
以上の結果より、移植後１２週間でみるとＣＤ３４陽性ＳＲＣの方が分化した血球細胞をより多く供給できることが示された。このことは換言するとＣＤ３４陰性ＳＲＣの方がより未分化な幹細胞であることを示唆している。
〔実施例７〕  胸腺等におけるＴリンパ球系細胞への分化能力
マウス骨髄中ではＴ細胞への分化は認められなかった。そこで胸腺、脾臓、肝臓におけるＴリンパ球系細胞への分化能力について検討した。方法は、各臓器よりピンセットとメスを用いて単一細胞懸濁液を作製し、ナイロンメッシュを通した後に、ＰＣ５標識抗ヒトＣＤ４５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ４（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、さらにＰＥ標識抗ヒトＣＤ５６（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）で２重染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで解析した。
図９に結果を示す。図９中、ａは胸腺中のＣＤ３陽性細胞、ｂは脾臓中のＣＤ４陽性細胞、ｃは肝臓中のＣＤ５６陽性細胞を示す。図９に示すように、ＣＤ３４陽性ＳＲＣを移植した場合には、胸腺においてＣＤ３陽性細胞、脾臓においてＣＤ４陽性細胞、さらに肝臓においてＣＤ５６陽性細胞が認められた。このことから、ＣＤ３４陽性ＳＲＣがＴ細胞系への分化能力を保持していると考えられた。
一方、ＣＤ３４陰性ＳＲＣを移植した場合には、移植後１２週の時点ではこれらの細胞の出現はほとんど認められなかった。この結果は、本発明の細胞がＣＤ３４陽性細胞よりも未分化なためより深い細胞静止状態にあり、移植後も各血球に分化するのに時間を要することを示唆している。
肝臓、脾臓における生着率と分化能の検討の結果は以下の通りであった。
ＣＤ３４陽性ＳＲＣの肝臓、脾臓における生着率は各々１０．３％、５１．４％であり、主にＣＤ１０、ＣＤ１９陽性のＢ細胞系への分化細胞が認められた。一方、ＣＤ３４陰性ＳＲＣの肝臓、脾臓における生着率は各々２．１％、６．３％であり、同様にＣＤ１０、ＣＤ１９陽性のＢ細胞系への分化細胞が主に認められた。
〔実施例８〕  ＣＤ３４陰性ＳＲＣの階級制（Ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）についての解析
（１）  経時的な骨髄再構築能の解析
ＣＤ３４陰性ＳＲＣの分化段階について、ＣＤ３４陽性ＳＲＣと比較検討した。分画Ａ（５×１０４個）および分画Ｃ（５×１０３個）の細胞を脛骨骨髄腔内直接移植法を用いて移植し、５、８、１２週間後に経時的に骨髄におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を測定した。方法は、既に述べた方法と同様であり、各解析時点で３匹のマウスを解析してその平均値を示した。
結果を図１０に示す。図１０中、黒丸は分画Ａの結果を、白丸は分画Ｃの結果を示す。図１０に示すように、移植５週間後には両分画ともに生着が確認（分画Ａ＞分画Ｃ）された。８週間後では、ＣＤ３４陽性ＳＲＣによる生着率が高くなり、ＣＤ３４陰性ＳＲＣによる骨髄再構築は遅れて起こることが明らかになった。このことはＣＤ３４陽性ＳＲＣの方がより分化した幹細胞であり、ＣＤ３４陰性ＳＲＣはより深い細胞静止状態にあることを示唆している。
（２）  幹細胞の遊走能力の解析
未分化な幹細胞はより高い遊走能力を示すことが知られている（Ｎａｇａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６３５，１９９６；ＭａＱ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ９５：９４４８，１９９８；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：５９５，１９９８；Ｐｅｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８４５，１９９９；Ｖｏｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２７：１８０６，１９９９）。そこでＣＤ３４陽性および陰性ＳＲＣの遊走能力をｉｎ  ｖｉｖｏで比較した。方法は、前項目と同様に分画Ａおよび分画Ｃの細胞を脛骨骨髄腔内直接移植法を用いて移植し、１２週間後に骨髄におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を測定した。その際に、移植細胞を注入した左脛骨骨髄中のＣＤ３４陽性細胞の比率と回収細胞数から、増殖分化したＣＤ３４陽性細胞の絶対数を計算した（Ａ）。さらに直接注入した左脛骨の他に、右脛骨、両側の大腿骨と上腕骨について同様の検討を行い、増殖分化したＣＤ３４陽性細胞の絶対数を計算した（Ｂ）。分画Ａあるいは分画Ｃの細胞を直接注入した左脛骨以外の骨髄において生成されたＣＤ３４陽性細胞は、注入部位より遊走したＳＲＣに由来すると考えられる。そこでＢ／Ａをｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（ＭＩ）として両分画に由来するＳＲＣの遊走能力を比較した。
図１１に代表的なＦＡＣＳ解析結果を示す。図１１において、分画Ａを直接移植した左脛骨骨髄中のＣＤ３４陽性細胞の比率は６．４３％であり、その他の骨髄中のＣＤ３４陽性細胞の比率は１．１３％である。各々の細胞数をかけてＣＤ３４陽性細胞の絶対数を計算すると左脛骨中で１９．３×１０４個、その他の骨髄中で３３．５×１０４個となり、ＭＩは３３．５／１９．３＝１．７４となる。
一方、分画Ｃを直接移植した左脛骨骨髄中のＣＤ３４陽性細胞の比率は０．１４％であり、その他の骨髄中のＣＤ３４陽性細胞の比率は１．７３％である。各々の細胞数をかけてＣＤ３４陽性細胞の絶対数を計算すると左脛骨中で０．１３×１０４個、その他の骨髄中で３０．８×１０４個となり、ＭＩは３０．８／０．１３＝２３６．９となる。
分画ＡのＭＩは１．７〜４１．７（中央値７．９）であり、分画ＣのＭＩは２３．７〜２３６．９（中央値７０．７）であった。中央値の比（Ｃ／Ａ）を取ると、９となり、分画Ｃすなわち、ＣＤ３４陰性ＳＲＣの方が格段に高い遊走能力を示すといえる。
まとめると、ＭＩを比較した場合、ＣＤ３４陽性ＳＲＣで１．７〜４４．７（中央値７．９）、一方、ＣＤ３４陰性ＳＲＣでは２３．７〜２３６．９（中央値７０．７）と中央値で約９倍に達した。この結果は、ＣＤ３４陰性ＳＲＣの遊走能力が、ＣＤ３４陽性ＳＲＣに比べて非常に高いことを示している。これらの結果は、ＣＤ３４陰性ＳＲＣは、ＣＤ３４陽性ＳＲＣに比べてより未分化な幹細胞であることを示している。
〔実施例９〕  改良された方法による新規な幹細胞の純化
幹細胞は、満期正常分娩児由来のヒト臍帯血より単離した。
臍帯血としては、臍帯血バンクに提供されたものの移植用に登録されなかった場合には、研究用または廃棄処分となる旨の文書によるインフォームドコンセントを取った上で、協力病院において採取されたものを使用した。
ヒト臍帯血の採取、凍結保存および解凍は実施例１と同様の方法で行った。
解凍した臍帯血はα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄後に、適当量のα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に再浮遊させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）比重遠心法（１５００ｒｐｍ，３０分）を用いて単核細胞（以下ＭＮＣと略）を分離した。
既報（Ｍｉｎａｍｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１０：３２７，２０００）の如く、ＭＮＣより９種類のモノクローナル抗体（ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２４，ＣＤ５６，ＣＤ６６ｂ，ＧＰＡ）と免疫磁気ビーズ（ＳｔｅｍＳｅｐ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、分化抗原陰性（以下ｌｉｎ−と略）細胞を分離した。
このｌｉｎ−細胞を１３種類のＰＥで標識した抗ヒトＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ７，ＣＤ１０，ＣＤ１４，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２４，ＣＤ４１，ＣＤ５６，ＧＰＡモノクローナル抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＤＡＫＯ，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）と抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体（ＰＣ５標識，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），および抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体（ＦＩＴＣ標識，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）で三重染色後、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いてソーティングすることにより、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞（ｌｉｎ−ＬＮ）を純化した。
図１２に臍帯血由来ｌｉｎ−細胞のＰＥで標識した各種ｌｉｎ抗体、ＰＣ５で標識したＣＤ３４抗体、ＦＩＴＣで標識したＣＤ４５抗体による三重染色後のスキャッタグラム（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍ）を示す。図１２中ａで示すスキャッタグラムはＬｉｎ−細胞のゲート（Ｒ２）を、図１２中ｂで示すスキャッタグラムは三重染色後のＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈ（Ｒ３ゲート）、Ｌｉｎ−ＣＤ３４ｌｏｗ（Ｒ４ゲート）、およびＬｉｎ−ＣＤ３４−（Ｒ５ゲート）を示す。図１２中ｂにおいて一番下のソーティングウインドウ（Ｒ５）中に本発明のＬｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−細胞が含まれている。
本実施例の改良法による純化度（実施例１に記載の方法との比較）
本３重染色によって得られる蛍光強度は、分化抗原を染色したＰＥで最大約２，０００チャネル（図１２Ｂ−ａ）であり、実施例１に示すＦＩＴＣの場合の最大２００チャネル（図１２Ａ−ａ）に比べて約１０倍の感度であった。一方、ＰＣ５で染色したＣＤ３４とＦＩＴＣで染色したＣＤ４５の最大蛍光レベルは、各々２，０００および１，０００チャネルであり、従来法とほぼ同等の蛍光強度を示した（図１２Ａ−ｂ，Ｂ−ｂ）。以上の結果より、１）本改良法によって従来法では除去出来なかった分化抗原を弱く発現している細胞を除外することが可能になり、２）目的とするｌｉｎ−ＬＮ細胞をＣＤ３４およびＣＤ４５抗原の発現強度に関してはほぼ同質の細胞として純化することが可能になった。
実施例１に記載の方法では、免疫磁気ビーズ法で回収したｌｉｎ−細胞中のＣＤ３４陰性細胞分画の２０〜４０％がＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いてソーティングする際にｌｉｎ−ＣＤ３４−細胞分画として回収されていた（図１２Ａ−ａ）。一方、ＰＥ標識抗体を用いる本実施例の改良法では、免疫磁気ビーズ法で回収したｌｉｎ−細胞中のＣＤ３４陰性細胞分画の約２％がＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いてソーティングする際にｌｉｎ−ＣＤ３４−細胞分画として回収された（図１２Ｂ−ａ）。
以上より、実施例１に記載の方法に比べて標的細胞の１０〜２０倍の濃縮が可能になったといえる。
次に、実施例１に記載の方法で得られたｌｉｎ−ＣＤ３４−ＬＮ細胞におけるＣＤ３４陰性ＳＲＣ（ＣＤ３４ｎｅｇＳＲＣ）の頻度を測定した。臍帯血に由来するｌｉｎ−ＬＮ細胞の５，０００、２０，０００、４０，０００個／マウスを８週齢のＮＯＤ／ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスの左脛骨中にＩＢＭＩ法で移植した。１２週後にマウスを犠牲死させて、骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞の割合をＦＡＣＳで解析した（０．１％以上を陽性と判定した）。ＣＤ３４ｎｅｇＳＲＣの頻度はポアソン解析により計算した。限外希釈実験により１／２４，１００（図１３）と計算された。従って、本改良法を用いることにより、ＣＤ３４ｎｅｇＳＲＣの頻度は約１／１，２００〜２，４００に上昇するものと推測される。
ＣＤ３４ｎｅｇＳＲＣをより多く含む（純度の高い）細胞集団を回収することは、本細胞の生物学的な特性のさらなる解明に有用であるだけでなく、本細胞に特異的に発現しているマーカー遺伝子の探索にとって極めて有利であると考えられる。
〔実施例１０〕  本発明の未分化幹細胞の未分化性に関する検討
上記実施例に示すように、本発明のＣＤ３４陰性幹細胞は１）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植後の増殖状態がＣＤ３４陽性ＳＲＣに比べて緩除であることから、より深い細胞静止状態にあると推測される、２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ３４陽性ＳＲＣを産生する、そして３）移植した左脛骨より他の骨への遊走能力がＣＤ３４陽性ＳＲＣに比べて有意に高い。これらは本発明のＣＤ３４陰性幹細胞の未分化性を示していた。本発明のＣＤ３４陰性幹細胞の未分化性についてさらに検討を行った。
ヒト臍帯血に由来する５ｘ１０３個のＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈあるいは５ｘ１０４個のＬｉｎ−ＣＤ３４−細胞を８〜１２週齢の雌ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスの左脛骨にＩＢＭＩ法で移植し、１２週間後にマウスを犠牲死させて解析を行った。左脛骨とその他の骨の骨髄を別々に採取して、抗ヒトＣＤ４５，ＣＤ３４モノクローナル抗体で染色後にＦＡＣＳで各々の陽性率を測定した。回収した骨髄生細胞数より各々の細胞の絶対数を計算した。
実験に先立って、Ｌｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞の至適移植細胞数を決定するために、ＣＤ３４陽性ＳＲＣのｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ能について検討した（図１４）。図に示すように、Ｌｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞を１２５０，５０００，２００００，５００００個／マウスで移植し、１２週間後のマウス骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞の割合を比較した。その結果、２００００個／マウス以上移植した場合には、生着率がプラトーレベルに達し、個々のＳＲＣのｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ能を正確に評価できないことが明らかになった。以上の結果に基づいて、本実験では５ｘ１０３個のＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞を移植したマウスにおけるＣＤ３４陽性ＳＲＣのｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ能を５ｘ１０４個のＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞を移植したマウスにおけるＣＤ３４陰性ＳＲＣのｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ能と比較検討した。
移植したＳＲＣの数は、既報の限界希釈実験に基づいて計算した。方法の概略を以下に述べる。まず、１匹当たり臍帯血由来のＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈ細胞の３００〜１２５０個を合計２６匹の８週齢のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに移植し、１２週間後にマウス骨髄細胞中に０．１％以上のヒトＣＤ４５陽性細胞を認めた場合に生着と判断した。同様に、Ｌｉｎ−ＣＤ３４−細胞の５０００〜４００００個を合計２１匹のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに移植し解析した。ＳＲＣの頻度は既報（Ｂｈａｔｉａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９４：５３２０−５３２５，１９９７）に従ってポアソン解析を行った。その結果、ＣＤ３４陽性ＳＲＣの頻度は１／１０１０個、一方、ＣＤ３４陰性ＳＲＣの頻度は１／２４１００個と計算された。以上より、５ｘ１０３個のＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈあるいは５ｘ１０４個のＬｉｎ−ＣＤ３４−細胞は、各々約５個、２個のＳＲＣを含むことになる。
この検討より以下のことが明らかになった。
１）１個のＣＤ３４陽性あるいは陰性ＳＲＣが産生するヒト血液細胞数
図１５に示すように、１個のＳＲＣが産生するＣＤ４５陽性細胞数は、ＣＤ３４陽性ＳＲＣが５３．６ｘ１０４個に対して、ＣＤ３４陰性ＳＲＣは２８６ｘ１０４と有意（Ｐ＜０．０５）に多かった。また、ＣＤ３４陽性細胞数は、各々１０．２ｘ１０４個と１５．５ｘ１０４個とＣＤ３４陰性ＳＲＣの方がより多くのＣＤ３４陽性細胞を産生した（Ｐ＜０．０５）。
２）一次マウス骨髄に由来するＣＤ３４陽性細胞の再移植実験
５ｘ１０３個のＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉｇｈあるいは５ｘ１０４個のＬｉｎ−ＣＤ３４−細胞を移植した一次マウス骨髄より、ＣＤ３４陽性細胞をソーティングにより回収し、各々５匹の二次マウス左脛骨中にＩＢＭＩ法で再移植した。その結果、Ｌｉｎ−ＣＤ３４−細胞に由来するＣＤ３４陽性細胞のみが二次マウス中でヒトの造血を再構築した。以上より、ＣＤ３４陽性ＳＲＣとＣＤ３４陰性ＳＲＣにはその増殖能力だけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ３４陽性ＳＲＣの産生能に関しても明瞭な差異のあることが明らかになった。
最近、ヒト骨髄由来の幹細胞でＣＤ３４抗原が逆転するという報告（Ｄａｏ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１１２−１１８，２００３；Ｚａｎｊａｎｉ  ＥＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３１：４０６−４１２，２００３）がなされているが、本実施例の結果より、この２種類の幹細胞がまったく別のクラスの幹細胞であること、換言するとＣＤ３４陰性幹細胞の方がより未分化であることが判明した。
産業上の有用性
実施例に示すように本発明のｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞集団は従来造血幹細胞であるとされていたＣＤ３４陽性細胞よりも未分化な細胞であり、従来の治療に用いられていたＣＤ３４陽性細胞にとって代わり、種々の用途に利用でき、特に、ヒトの一生涯に渡る長期の造血再構築を考える時、ＣＤ３４陽性細胞よりも幹細胞として有利な効果を奏することが可能である。
また、本発明の細胞の単離方法により、ｌｉｎ−ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４−未分化幹細胞を効率的に取得することが可能である。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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