(57)【要約】特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中の特定物の有無を測定する方法で、食品の中に含まれる微量成分の検出や有害な特定物のアレルゲンの識別に優れる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中の特定物の有無を測定する方法。
【請求項２】
食品中の微量成分の有無を食品に表示するために、特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、特定物の有無を測定し、食品に表示する方法。
【請求項３】
食品摂取者にとって有害な特定物のアレルゲンを含む食品を識別するために、特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計して遺伝子増幅反応ＰＣＲを行い、食品中の特定物の有無を測定する方法。
【請求項４】
前記特定物が、特定の穀類である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記食品が、加工処理された食品である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記食品が、食品原料である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記特定穀類が、ソバである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子が、配列表の配列番号１１に示すソバ遺伝子であり、前記プライマーが、
▲１▼１２１番目のｇから３６０番目のｃまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマーである；もしくは、
▲２▼１３８１番目のｔから１６８０番目のｃまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマーである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーを用いて、ＰＣＲを行い、電気泳動像で、明瞭な増幅バンドが、ダッタンソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ）および・またはソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）を含む被検体において認められるが、ソバカズラ（Ｆａｌｌｏｐｉａ）を含む被検体において認められない請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計された、食品中の特定物の有無および／または濃度を測定するためのＰＣＲ用プライマー。
【請求項１１】
特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計されたＰＣＲ用プライマーを含有する、食品中の特定物の有無および／または濃度を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は食品の検査方法に関し、特にアレルギー物質が食品中に含まれているか否かを表示するために、食品の全ての流通段階において微量に含まれる特定物の存在を検出する方法に関する。
背景技術
近年、アレルギー物質を含む食品に起因する健康危害を防止するために、表示による情報提供の要望が高まり、平成１３年４月の食品衛生法関連法令の改正に伴い、アレルギー物質を含む食品の表示が義務づけられた。特に症例数が多い卵、乳、小麦と症状が重篤なそば、落花生の５品目（特定原材料）については、食品の全ての流通段階において適切な表示を行うことが義務化されることになった。アレルギー物質としてどの食品をアレルゲンとして認識するか否かは、個体差により異なるので、食品に含まれる特定物がごく微量であっても適切に表示されていれば、食品を摂取するものは自己にとってアレルゲンが含まれるか否かを知ることができる。しかし、ごく微量の特定物の有無を加熱等の加工が行われた食品で検出することは、従来公知の食品分析法では困難であった。
特定物を生産者が自社で用いていれば加工食品に表示できることは当然であるが、末端製品の中間原料として特定物質が用いられた場合、特に購入される中間原料に微量含まれているか否かについては確認できない場合がある。また、実際に意図しない混入もありうる。
食品メーカーでは、加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存あるいは製造ライン間の相互汚染の実態を正確に把握し、適切な対応をとるとともに、消費者に対しては法律にもとずく正しい情報を提供することが重要であり、そのためにはアレルギー物質の正確な分析技術の提供が望まれていた。
わが国においてそばは日常的な食品であるが、そのそばに対してアレルギー反応を呈する患者がいる。反応の多くがアナフイラキシー型であり、最重症例では死亡に至る。食品衛生法のアレルギー物質を含む食品の表示においては、そばは特定原材料の１つとして規定され、食品中に混入がある場合はその旨を表示することが義務化された。しかし適切な測定方法はなかった。そのため微量成分の確実な測定方法が望まれている。
そこで本発明では、食品中のソバの混入の有無を正確に分析する方法の開発を目的として、ソバに特異的なプライマーの構築ならびにその検出限界の確認、および加工食品への応用を試みた知見により、食品中の特定物の有無を測定する方法を提供することを目的とする。
発明の開示
〔１〕すなわち本発明は、特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中の特定物の有無を測定する方法を提供する。
〔２〕また、食品中の微量成分の有無を食品に表示するために、特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、特定物の有無を測定し、食品に表示する方法を提供する。
〔３〕さらに、食品摂取者にとって有害な特定物のアレルゲンを含む食品を識別するために、特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中の特定物の有無を測定する方法、食品アレルギー患者またはその疑いがある者にとって有害なアレルゲンを含む特定物が食品に含まれるか否かの情報を提供する方法、または、これらのいずれかを食品に表示する方法を提供することができる。食品は、ヒトの食品のみならず動物用の食品（飼料）を含む。
〔４〕ここで、前記特定物が、特定の穀類である方法が、好ましい。
〔５，６〕また、前記食品は、加工処理された食品であってもよいし、食品原料であってもよい。
〔７〕前記特定穀類が、ソバである方法を提供する。
〔８〕ここで、前記遺伝子が、配列表の配列番号１１に示すソバ遺伝子であり、前記プライマーが、
▲１▼１２１番目のｇから３６０番目のｃまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマーである；あるいは、
▲２▼１３８１番目のｔから１６８０番目のｃまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマーである方法が、好ましい。
プライマーは、ターゲットの遺伝子の相補鎖であり、ターゲット遺伝子のＮ−末側の配列部分とＣ−末側の配列部分とがペアーで選択される。ペアーの長さは同じでもよいし異なっていても良い。
〔９〕特に、後に表１で示すＦＡＧ３（配列番号１）／ＦＡＧ４（配列番号２），ＦＡＧ１７（配列番号５）／ＦＡＧ１８（配列番号６），ＦＡＧ１９（配列番号７）／ＦＡＧ２０（配列番号８），ＦＡＧ１９（配列番号７）／ＦＡＧ２２（配列番号９），ＦＡＧ１９（配列番号７）／ＦＡＧ２４（配列番号１０）のプライマーペアーが好ましい。
ＰＣＲに用いられるプライマーは、鋳型となるＤＮＡ（ソバの場合を例示すれば、配列番号１１の配列が挙げられる）の該当領域が同様の領域であれば、プライマーの個々の配列の５’−上流側、３’−下流側の塩基の位置が、対応する同一鋳型上で、または数塩基ないしは１０数塩基ずれても同様の機能を有し、同様の結果（ＰＣＲ産物）が得られることが知られている。
したがって、好ましいプライマーペアーは、上記表１のものに限定されず、実質的に上記表１のプライマーペアーと同一の機能をＰＣＲで達成することができるものも、好ましいプライマーペアーに含まれる。
上記プライマーについては、各プライマーの１または数塩基を欠失、置換、付加および／または挿入したプライマーで、鋳型となるＤＮＡの該当領域へハイブリダイズするプライマーも上記プライマーと実質的に同一である。具体的には、例えば、配列番号１〜１０の各プライマーについて、対応する鋳型ＤＮＡに対し５’−上流側および／または３’−下流側に１または数塩基ないしは１０数塩基ずれているもので、配列番号１〜１０の配列のうち、連続した少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列を含むプライマー等が、本発明の好ましいプライマーに含まれる。
〔１０〕また、前記プライマーを用いて、遺伝子増幅反応を行い、電気泳動像で、明瞭な増幅バンドが、ダッタンソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ）および・またはソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）を含む（ソバカズラを含まない）タデ科ソバ属被検体において認められるが、ソバカズラ（Ｆａｌｌｏｐｉａ）を含む（ダッタンソバおよび・またはソバを含まない）ソバ属以外のタデ科被検体、ソバ以外の動植物（由来食品原料）を含む被検物質において認められない方法が提供される。
〔１１〕特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計されたＰＣＲ用プライマーおよびこれを含有する、食品中の特定物の有無および／または濃度を測定するための試薬一式（キット）を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲ反応を行い、食品中の特定物の有無を測定する方法である。
検体として測定される食品は、原材料であっても、加工段階のいずれかであっても、加工後の食品であってもよい。本発明方法は、食品中のたとえば、ＤＮＡレベルの体積比または特定物の全食品に対する質量比で好ましくは０．１％以下、１００ｐｐｍ以下、さらには５０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下の微量の特定物の存在の有無を検出する方法であり、特定物の遺伝子が食品中に含まれる場合は、生産者が意図していない物が、調味料や添加物の一部として微量存在しても検出することができる．さらにＤＮＡはタンパク質等の生物由来の他の物質に比べて、加熱等の食品加工に対して比較的安定であり、加熱、調理等、加工された食品中の微量の存在が検出できる。
特定物の遺伝子配列は、未知の場合は公知の遺伝子検出法によって検出してもよいが、今日では多くの既知の遺伝子情報を用いることができる。例えば国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）等のデーターベースから特定物の遺伝子の全配列の情報を得て、配列の一部の情報からＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応に適したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーのペアー（対、組）を選択してプライマー（プローブ）とすることができる。
プライマーの設計は、本発明の検査方法を考慮して以下の事項に留意した。まず、（ｉ）プライマーのＧＣ含量が４０〜６０％である、（ｉｉ）プライマーの融解温度（Ｔｍ値、下記参照）が、５５〜７０℃である、（ｉｉｉ）２つのプライマー対のＴｍ値が近い、（ｉｖ）２つのプライマーの３’末端間で相補的配列を保有していない、（ｖ）プライマー自身がヘアピンのような高次構造を形成しない、（ｖｉ）プライマーの全長は１５〜３５ｍｅｒとする、（ｖｉｉ）プライマーの３’末端側のＧＣ含量を低くする、（ｖｉｉｉ）プライマー内で同一ヌクレオチドが多数連続する配列は回避する、（ｉｘ）プライマーは増幅したい鋳型ＤＮＡの片側１本鎖の配列と完全に一致している必要はないが、３’末端側の相補性を高くする、（ｘ）使用するＤＮＡサンプルにおいて、他にプライマーと同様の配列がない、等である。
本発明のプライマーは、原材料のソバだけでなく、加工段階の食品や加熱、調理等の加工後の食品にも使用可能であることを必要とする。したがって、使用されるソバの鋳型ＤＮＡはインタクトなものではなく、非常に細かく切断されたＤＮＡ断片であると考えられ、（ｘｉ）２つのプライマーによって増幅される遺伝子の一部は、比較的短い領域である。さらに、各種のソバが共通して有する１つの遺伝子領域の中で、（ｉ）〜（ｘｉ）の全ての条件を満たすプライマーを設計する必要がある。しかし、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔわずか４つのヌクレオチドからなるＤＮＡ配列で、これらの条件を全て満たすプライマーを作成することは非常に難しく、それ故、プライマーの設計は、ＰＣＲを行う上で非常に困難な問題となっている。また、仮にこれらの多数の条件を全て満たすプライマーを設計できたとしても、それはＰＣＲを行う上での必要条件でしかなく、意図したＰＣＲを成功させることは実際にＰＣＲを行ってみないと判らない。
ＰＣＲ法は特に限定されず、公知である種々の改良方法を含むが、１例を挙げれば、プライマーのペアー、鋳型（被検）ＤＮＡの他にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲの反応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、プライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の３つのステップからなっている。各ステップはそれぞれ異なった、場合によっては同じ反応温度と反応時間を必要とするので増幅しようとするＤＮＡ領域の塩基配列とその長さによって適切な範囲とする。このような操作のためのｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒが市販されている。ＧＣ含量と配列の長さから得られる下記式
Ｔｍ（℃）＝４×（Ｇ＋Ｃ）＋２×（Ａ＋Ｔ）
を、アニーリング温度の指標とする。ＰＣＲ増幅産物が５０〜５００ｂｐ、より好ましくは１００〜１５０ｂｐ程度になるようにする。この範囲とすれば、加工食品中で断片化しているＤＮＡの検出もできるからである。
特定穀類がソバである場合は、前記遺伝子が、配列番号１１に示すソバ遺伝子であり、前記プライマーが、配列番号１１に示す▲１▼１２１番目のｇから３６０番目のｃまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマーである；あるいは、
▲２▼１３８１番目のｔから１６８０番目のｃまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマーであるのが好ましい。プライマーは、ターゲットの遺伝子の相補鎖であり、ターゲット遺伝子のＮ−末側の配列部分とＣ−末側の配列部分とがペアーで選択される。ペアーの長さは同じでもよいし異なっていても良い。
特に、下記表１のＦＡＧ３（配列番号１）／ＦＡＧ４（配列番号２），ＦＡＧ１７（配列番号５）／ＦＡＧ１８（配列番号６），ＦＡＧ１９（配列番号７）／ＦＡＧ２０（配列番号８），ＦＡＧ１９（配列番号７）／ＦＡＧ２２（配列番号９），ＦＡＧ１９（配列番号７）／ＦＡＧ２４（配列番号１０）のプライマーペアー、またはこれらと実質的に同一なプライマーペアーが好ましい。後に比較例で説明するように同じＴｍ値をとるプライマーペアー［ＦＡＧ５（配列番号３）／ＦＡＧ６（配列番号４）］でも検出に不適当な場合があり、プライマーの選択が重要である。
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ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２の濃度や反応サイクル数等好適なＰＣＲ条件の検討、あるいはｎｅｓｔｅｄＰＣＲを用いれば、更に検出感度が向上する可能性がある。
ＰＣＲの反応物は、免疫反応を用いて同定しても、どのように同定してもよいが、電気泳動させて、必要な場合は陽性コントロールや、陰性コントロールを用いて電気泳動像で明瞭なバンドが認められれば、検体中に被検物質が存在することが確認できる。
本発明の検出方法は、特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計されたプライマーを、試薬として含有した試薬一式（キット）を用いて行えば、容易に実施することもできる。試薬一式（キット）は、ＰＣＲに広く用いられる公知の試薬を含有していても、電気泳動装置等の他の装置が付属していてもよい。具体的に試薬としては、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等が挙げられる。これらの試薬は試薬一式（キット）の中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。試薬一式（キット）中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、本発明のＰＣＲを実施するについて可能な範囲であればよい。また、試薬一式（キット）には、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。
本発明の方法は、被検物質は食品であれば限定されないが、穀類を例にとれば、コムギ、イネ、トウモロコシ、アワ、キビ、ヒエ、ソバ、およびマメ類を含む。ＤＮＡは熱に安定であり加工食品中でも微量で検出できるので得られた結果は食品に表示したり、食品のアレルギー情報として利用できるほか、食品中の特定の穀類の有無を検出することにより加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存、あるいは製造ライン間の相互汚染の有無等の生産者の意図していない混入を検出することができる。
以下にソバを１例に用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）ソバ検知のためのプライマーの構築
ソバ由来ＤＮＡを検知するためのプライマーを構築するにあたって、まず国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）のデータベースにアクセスし、ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の既知遺伝子の検索を行い、得られたソバに関する遺伝子情報の中からＦａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＦ１５２００３、全長１８２５ｂｐ）を選択した。次に、ＤＤＢＪのＢＬＡＳＴ検索によって、選択したソバの遺伝子配列と類似の配列がソバ以外の植物にはないことを確認した。
発明者は、プライマーを設計するために、特定物の遺伝子配列についてソフトウェア”ＧＥＮＥＴＹＸ  ＭＡＣ”を使用して、プライマーの候補となる配列の検索を行った。ＧＥＮＥＴＹＸ  ＭＡＣは、プライマー設計の上記条件のうち、手計算では解析困難な種々の条件、例えば（ｉ）ＧＣ含量、（ｉｉ）Ｔｍ値の範囲設定を行えることから使用した。その結果、候補となる配列を６７対検索することができた。その中で上記（ｉ）〜（ｘｉ）のプライマー設計のための条件を全て満たす配列を、発明者が独自に検索することにより、本発明の検査方法で使用可能なプライマー配列を見出した。このようにして発見したプライマー配列を含む、９対のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマー（バイオロジカ（株）で合成）を作製した。
（２）ＤＮＡの抽出
ソバおよびその他の植物の種子については表面を１％ＴｒｉｔｏｎＸ（和光純薬）により洗浄した後蒸留水ですすぎ、よく乾燥させた後マルチビーズショッカー（安井機械）で微粉砕した。次に粉砕サンプル１〜１．５ｇをＤｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。また加工食品については水分含量の高いものは２４時間凍結乾燥後１ｇを、水分含量の低いものについてはそのまま１ｇからＧｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ２０／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡは吸光度の測定により濃度を求めた後、純水を用いて１０ｎｇ／μｌに希釈し、これをＰＣＲの鋳型（被検）ＤＮＡ試料液として用いた。
（３）ＰＣＲと電気泳動像によるソバの検出
ＰＣＲの反応液は以下のように調整した。すなわちＰＣＲ緩衝液（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒＩＩ、アプライドバイオシステムズ社），２００μｍｏｌ／ｌ；ｄＮＴＰ，１．５ｍｍｏｌ／ｌ；ＭｇＣｌ２，０．５μｍｏｌ／ｌ；センスおよびアンチセンスプライマー、および０．６２５ｕｎｉｔｓ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、アプライトバイオシステムズ社）を含む液に１０ｎｇ／μｌに調整したＤＮＡ試料液２．５μｌを加え、全量を２５μｌとした。表３で鋳型ＤＮＡ量の記載のないものはこの場合の濃度である。但し、抽出されたＤＮＡの濃度が１０ｎｇ／μｌ以下の場合、または添加物が多い加工食品等で、得られたＤＮＡの吸光度ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の値が１．７以下と夾雑物が多くＤＮＡの純度が低い場合には、抽出ＤＮＡ原液または１０ｎｇ／μｌ希釈液を２．５μｌ〜１７．８μｌ  ＰＣＲの反応液に添加し、その量に応じて全量が２５μｌとなるように純水を用いて調整した。表３で鋳型ＤＮＡ量が付記されているものはこの場合の濃度である。
ＰＣＲ増幅装置にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。まず９５℃に１０分間保ち反応を開始させ、次に９５℃  ３０秒間、６０℃  ３０秒間、７２℃  ３０秒間を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲの増幅を行った。最後に終了反応として７２℃  ７分間保った後４℃で保存し、得られた反応液をＰＣＲ増幅反応液とした。
ＰＣＲ増幅反応液はエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲル（２％Ｅ−Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による電気泳動に供し、陽性コントロール（蕎麦粉より抽出したＤＮＡ）および陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなしのブランク反応液）の増幅バントの有無によってＰＣＲの妥当性を判断すると共に、各プライマーによる至適サイズのＤＮＡ増幅バンドを確認することによってサンプル中のソバの混入の有無を判定した。
（４）実験１．ソバ検知プライマーの特異性の確認
ソバを特異的に検出するプライマーの選抜を目的として、ソバおよびその他の植物の種子から得たＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ソバのサンプルとしては７種類のソバの種子［マンカン（アメリカ、カナダ、中国）、内蒙古（中国）、楡林（中国）、キタワセ（北海道）、会津在来（福島）］および２種類の業務用ソバ粉Ａ、Ｂを用いた。また、他の植物としてコムギ２種（農林６１号、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ａｍｂｅｒ  Ｄｕｒｕｍ）、ライムギ（カナダ）、オオムギ（ミノリムギ）、コメ（コシヒカリ）、トウモロコシ（飼料用ｎｏｎＧＭＯ）、ダイズ（ムラユタカ）、アワ（熊本）、ナタネ（Ｃａｎｏｌａ）、オーツムギ（競争馬向け飼料用）およびソバカズラ（岡山大学資源生物科学研究所より入手）の種子を用いた。
ＰＣＲ後電気泳動を行い、至適サイズの明瞭な増幅バンドがソバサンプルにおいてのみ認められ、他の植物では認められないプライマーをソバを特異的に検知するプライマーとして選抜した。
図１ａにソバ検知用プライマー；ＦＡＧ１９／２２の特異性を示す検出結果の電気泳動像を示す。図１ａで、Ｍ：１００ｂｐラダーマーカー、ＮＣ：Ｎｏ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。図１ａのレーン番号（サンプル名）およびその結果を下記表２に示す。
図１ｂに表１に示すプライマー：ＦＡＧ５／ＦＡＧ６の特異性を示す検出結果の電気泳動像を示す。図１ｂで、レーン番号１：マンカン種（カナダ）、２：内蒙古種（中国）、３：楡林種（中国）、４：会津在来種（日本）、５：業務用ソバ粉Ａ、Ｍ：１００ｂｐラダーマーカーを示す。図１ｂでは、非特異的バンドの出現が認められソバ検知用プライマーとして適当ではないことがわかる。
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実験１の結果、以下の実験のプライマーとして、ＦＡＧ１９／２２（増幅サイズ１２７ｂｐ）のセットを選抜した。
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ソバ以外の植物の内ソバカズラはソバと同じタデ科植物であるが、このプライマーセットにおいて交差反応は認められなかった（図１ａ、表２）。
（５）実験２．ＰＣＲによるソバの検出限界の碓認
実験２ではＦＡＧ１９／２２プライマーを用いたＰＣＲによるソバの検出限界を調べることを目的として、ＤＮＡレベルおよび粉体レベルでソバの擬似混入サンプルを作製し、それらのＤＮＡ試料液を用いてＰＣＲを行いソバの検出限界を確認した。
ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルは、コムギおよびソバの種子より抽出されたＤＮＡをそれぞれ１０ｎｇ／μｌに希釈し、それらをコムギＤＮＡ中のソバＤＮＡの混入率が０．１、１０、５０、１００、１０００ｐｐｍおよび１％となるように体積比で混合して作製した。また、粉体レベルの擬似混入サンプルは、コムギ粉中のソバ粉の混入率が０．１、１０、５０、１００、１０００ｐｐｍおよび１％となるように質量比で混合してサンプルを作製し、各混入サンプルを微粉砕した後ＤＮＡを抽出した。
図２ａおよび図２ｂに検出結果の電気泳動像を示す。上部の数字はソバの混入率を示し、Ｍ：１００ｂｐラダー、ＮＣ：Ｎｏ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。ここで図２ａは、ソバＤＮＡをコムギＤＮＡで希釈した、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルを被検体とし、図２ｂは、ソバ粉をコムギ粉で希釈した、粉体レベルの擬似混入サンプルを被検体とした。
実験２においてＦＡＧ１９／２２を用いたＰＣＲによるソバ検出限界を確認した結果、ＤＮＡレベルおよび粉体レベルのいずれの擬似混入サンプルにおいてもソバ混入率として１０ｐｐｍが検出限界であった（図２）。但し複数回行った実験の内、数回の検出限界は５０ｐｐｍであり、このＰＣＲで安定して検出される限界は５０ｐｐｍであることが示唆された。食物アレルギーは人によってはごく微量のアレルギー物質によって発症することがあるため、食品衛生法の改正による「アレルギー物質を含む食品の表示の義務化」においては指定原材料が含まれる食品は、含有量にかかわらず微量でも表示しなくてはならないとしている。厚生労働省のアレルギー表示検討会の中間報告（平成１３年１０月１７日）において表示の必要性を判断する基準が示されているが、そこでは加工食品中に特定原材料の総タンパク量として数μｇ／ｍｌ（ｇ）以上（１〜９ｐｐｍ以上）が含まれる場合に表示が必要であると報告している。そば全層粉のタンパク質含量は約１２質量％（五訂食品成分表より）であることから、本ＰＣＲの検出限界５０ｐｐｍはソバのタンパク質の混入率に換算すると６ｐｐｍとなる。すなわちここで示したＰＣＲによるソバの検知法は、表示検討会の示した表示のための基準を検知するために十分な分析方法であると考えられる。
（６）実験３．ＰＣＲによる加工食品からのソバの検知
ソバ検知プライマーとしてＦＡＧ１９／２２を用いて、原料としてソバが含まれる加工食品からのソバの検知を行った。用いたサンプルは乾麺２種（十割そば、三割そば）、菓子４種類（そば餅Ａ、Ｂ、そばかりんとう、そばボウロ、焼き菓子）およびそば茶で、それぞれ微粉砕後、乾麺はＤｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、菓子およびそば茶はＧｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ２０／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲに供した。そば餅Ｂについては得られたＤＮＡの純度が１．２と低かったので、ＰＣＲの反応チューブ当たり５０〜１８００ｎｇ（吸光度からの計算値）のＤＮＡを添加した。
図３ａ、図３ｂのレーン番号（サンプル名）を以下の表３に示す。
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ＦＡＧ１９／２２を用いて加工食品からのソバの検知を行った結果（実験３）、そば餅Ｂを除いて鋳型ＤＮＡ量がＰＣＲの反応当たり２５ｎｇの規定量でソバが検出された（図３ａ）。一方そば餅Ｂにおいては、鋳型ＤＮＡ量の添加量を５０ｎｇまたは１２０ｎｇに増やしてもＰＣＲ増幅バントが認められなかったが、１８００ｎｇまで増量することによってソバの検出が可能となった（図３ｂ）。
現在食品アレルギの検査として臨床現場では、誘発試験やプリック・スクラッチ試験、ＲＡＳＴ法等が実施されているが、これらの方法はアレルギー患者自身あるいは血液を対象として実施する検査であり、食品分析への適用は困難である。一方、アレルゲンそのものを検出、定量するための特定タンパク質の分離検出法として、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）やウェスタンブロッティング法、免疫化学的手法（ＥＬＩＳＡ法）が使われているが、これらは既知の主要アレルゲンの検出のためには有効であるが、未知のアレルゲンの検出あるいは加熱工程によってタンパク質が変性している可能性のある加工食品においては必ずしも適当ではない。
産業上の利用可能性
ＤＮＡはタンパク質よりも加熱耐性が高いため加工食品中でも残存している場合が多い。このため本発明で示したＤＮＡを指標としたＰＣＲ法による特定物の検出法は、特に加工食品において従来からのタンバク質の検出法を補う間接的な食品中のアレルギー原因物質の分析手段として極めて有用であると考えられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１ａは、ソバ検出プライマー；ＦＡＧ１９／２２のソバ特異性の結果を示す電気泳動像である。図１ｂは、ＦＡＧ５／ＦＡＧ６の特異性を示す電気泳動像である。
図２は、ＰＣＲによるソバ検出系の検出限界を示す電気泳動像である。図２ａは、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルの測定結果であり、図２ｂは、粉体レベルの擬似混入サンプルの測定結果を示す電気泳動像である。
図３は、ＰＣＲによる加工食品からのソバの検出結果を示す電気泳動像である。図３ａ、図３ｂはそれぞれ測定した加工食品がレーン毎に異なっている。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【国際調査報告】
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