(57)【要約】核酸チップ基板上にマトリクス状に配置された核酸プローブを、基板上に標準として利用できるリンを含有する領域を設けることによって、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより精度よく定量分析することができる。
2004003531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸プローブが固定されたプローブ固定領域を担体上に有するプローブ担体において、
前記担体が、リンを既知の濃度で含むリン含有領域を有し、該リン含有領域に含まれるリンが、前記核酸プローブの定量を該核酸プローブの有するリンを検出することにより行う際の標準として使用されるものであることを特徴とするプローブ担体。
【請求項２】
前記プローブ固定領域の多数がそれぞれ独立して前記担体上にマトリックス状に配置されている請求項１に記載のプローブ担体。
【請求項３】
前記リン含有領域は前記担体の少なくとも一部にリンを注入することで形成されたものである請求項１に記載のプローブ担体。
【請求項４】
前記リン含有領域は、前記担体表面の少なくとも一部に形成された膜として形成されたものである請求項１に記載のプローブ担体。
【請求項５】
前記膜中のリン濃度は深さ方向に一定である請求項４に記載のプローブ担体。
【請求項６】
前記リン含有領域は前記担体の前記プローブ固定領域を有する面を構成する部分全体にリンを含有させることによって形成されたものである請求項１に記載のプローブ担体。
【請求項７】
前記担体が、前記プローブ固定領域を有する面を構成し、該担体全体がリンを一様に含有する基板である請求項６に記載のプローブ担体。
【請求項８】
該担体がガラス基板である請求項７に記載のプローブ担体。
【請求項９】
前記リン含有領域のリンの含有量（重量比）が０．１ｐｐｍ以上１０％以下である請求項６に記載のプローブ担体。
【請求項１０】
前記膜がＰＳＧ（リンシリケートグラス）またはＢＰＳＧ（ボロンリンシリケートグラス）からなる膜である請求項５に記載のプローブ担体。
【請求項１１】
前記核酸プローブの核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）及びｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）の少なくとも１種である請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のプローブ担体。
【請求項１２】
前記リンの定量が、飛行時間型二次イオン質量分析法（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によるリンの二次イオンの検出により行われる請求項１に記載のプローブ担体。
【請求項１３】
核酸プローブが固定されたプローブ固定領域と、リンを既知の濃度で含むリン含有領域を担体上に有するプローブ担体の分析方法であって、
前記プローブ固定領域内の核酸プローブの有するリンの量を第１の信号強度として検出する工程と、
前記リン含有領域内のリンの量を第２の信号強度として検出する工程と、
前記リン含有領域における既知のリン濃度と前記第２の信号強度とにより、前記第１の信号強度を規格化して、前記プローブ固定領域内の核酸プローブの定量を行う工程を有することを特徴とするプローブ担体の分析方法。
【請求項１４】
前記プローブ固定領域の多数がそれぞれ独立して前記担体上にマトリックス状に配置されている請求項１３に記載の分析方法。
【請求項１５】
前記リン含有領域は前記担体の少なくとも一部にリンを注入することで形成されたものである請求項１３に記載の分析方法。
【請求項１６】
前記リン含有領域は、前記担体表面の少なくとも一部に形成された膜として形成されたものである請求項１５に記載の分析方法。
【請求項１７】
前記膜中のリン濃度は深さ方向に一定である請求項１６に記載の分析方法。
【請求項１８】
前記リン含有領域は前記担体の前記プローブ固定領域を有する面を構成する部分全体にリンを含有させることによって形成されたものである請求項１３に記載の分析方法。
【請求項１９】
前記担体が、前記プローブ固定領域を有する面を構成し、該担体全体がリンを一様に含有する基板である請求項１８に記載の分析方法。
【請求項２０】
該担体がガラス基板である請求項１９に記載の分析方法。
【請求項２１】
前記リン含有領域のリンの含有量（重量比）が０．１ｐｐｍ以上１０％以下である請求項１８に記載の分析方法。
【請求項２２】
前記膜がＰＳＧ（リンシリケートグラス）またはＢＰＳＧ（ボロンリンシリケートグラス）からなる膜である請求項１６に記載の分析方法。
【請求項２３】
前記核酸プローブの核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）及びｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）の少なくとも１種である請求項１３に記載の分析方法。
【請求項２４】
上記リンを含みかつ前記膜の深さ方向に一定であるリン濃度が、同一の条件で作製した別の膜のリン濃度を次に示す分析方法：
１）二次イオン質量分析法（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＳＩＭＳ）、
２）飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）、
３）Ｘ線光電子分光法（Ｘ−ｒａｙ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＸＰＳ）、
４）オージェ電子分光法（Ａｕｇｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＡＥＳ）、
５）誘導結合プラズマ原子発光分光法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＩＣＰ−ＡＥＳ）、
６）誘導結合プラズマ質量分析法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＩＣＰ−ＭＳ）、
７）フーリエ変換赤外分光法（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＴ−ＩＲ）、
の一つまたは複数の分析法で分析し、この分析結果で規定されている請求項１７に記載の分析方法。
【請求項２５】
前記第１及び第２の信号強度が、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）で検出される二次イオンの強度である請求項１３に記載の分析方法。
【請求項２６】
前記二次イオンが、Ｐ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−のいずれかである請求項２５に記載の分析方法。
【請求項２７】
前記膜から検出される信号強度が、該領域を一定量だけスパッタエッチングした後に得られる信号強度である請求項１６に記載の分析方法。
【請求項２８】
前記核酸プローブの固定領域の配置のイメージが定量的に表示できる請求項１３に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、複数の核酸プローブの固定領域が基板などの担体上にマトリクス状に配置された、いわゆる、核酸チップなどのプローブ担体に関する。また、本発明は、プローブ担体上に構成されたドット状などの形状の各固定領域中の核酸プローブの量を飛行時間型二次イオン質量分析法（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＴＯＦ−ＳＩＭＳと略す）などにより分析する方法に関する。
【背景技術】  ＤＮＡチップ、また、ＲＮＡチップ等の核酸チップはゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの遺伝子情報の取得を目的として利用されるようになってきており、また、それらの解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
上記核酸チップの作製方法にはいくつかの方法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、基板上にフォトリソグラフィーを用いてＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、あらかじめ合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１−１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２７０，４６７，１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製方法である。
一般的には、これらいずれかの方法によって核酸チップが作製されるが、これらの核酸チップを先に述べた用途に使用しようとする場合、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには各マトリクスに存在するプローブの量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も重要である。しかし、チップ上のプローブは原理的に単分子膜レベルで存在するので、これらの分析はきわめて高感度な表面解析技術が必要となる。
これらの高感度な表面解析技術としてはプローブをアイソトープラベルする方法が知られてはいるが、手法が煩雑、危険であり、かつ特殊な施設、装置が必要である等の理由で一般的ではない場合が多い。
別の方法としてはプローブを蛍光標識する方法、または、プローブと特異的に結合する物質に蛍光標識を施し、これとプローブを結合させる方法、すなわち、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられるが、蛍光色素の安定性、クエンチング、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着、また特異的結合（ハイブリダイゼーション）の定量性（安定性、再現性）等の問題があり、プローブ自体の存在量を定量的に把握するには課題が残る場合が多い。
他に、一般的な高感度表面分析手段としてはＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも核酸チップのプローブの定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの基板として一般的なガラスを用いる場合には、例えばＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）ではガラスに起因する吸収の影響、ＸＰＳではチャージアップの影響等もあり、有効な分析手段とならない場合がある。
他の高感度表面分析手段としては、レーザー共鳴イオン化法（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＲＩＳ）によるＤＮＡの検出方法がＵＳＰ５，８２１，０６０に開示されている。これは試料表面から放出される注目元素のイオン化エネルギーに相当する波長のレーザービームを照射して当該元素をイオン化し検出するもので、試料表面から元素を放出させる手段としては、レーザービームを用いる方式が開示されているが、装置が大掛かりになる、検出対象の元素に制限がある、といった問題を持つ。
さらに他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ）があるが、この手法は二次イオンが生成する過程で有機化合物が小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうために質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しくなり、核酸関連物質のような有機物の分析には適していない。
一方、高感度な表面分析手段としては飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法が知られている。ＴＯＦ−ＳＩＭＳとは、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、以下のような特長を持つ。
すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２（最表面１原子層の１／１０５に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
以下、この方法の原理を簡単に説明する。高真空中で、高速のパルスイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。このとき発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。一次イオンをパルス状に固体表面に照射すると、試料表面の組成に応じて様々な質量をもった二次イオンが発生するが、軽いイオンほど速く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行するため、二次イオンが発生してから検出されるまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。一次イオンが照射されると固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面（深さ数Å〜数ｎｍ程度）の情報を得ることができる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、質量スペクトルから有機化合物の構造を知ることができる。また、固体試料が絶縁物の場合には、パルスで照射される一次イオンの間隙に電子線をパルスで照射することにより、固体表面に蓄積する正の電荷を中和できるため絶縁物を分析することも可能である。加えて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは、一次イオンビームを走査することによって、試料表面のイオン像（マッピング）を測定することもできる。
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により、基板に固定した単分子膜レベルでの核酸が検出された例はすでに報告があり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  １２ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ９５１，１９９９）、この例では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳで検出可能な核酸フラグメントイオンとして塩基の分解フラグメントイオン、および、リン酸バックボーンの分解フラグメントイオンがあげられている。
また、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いた定量分析の試みとしては、異なる濃度の標準溶液を清浄なシリコン基板上に塗布、乾燥後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでこれを測定し、二次イオンピーク強度から検量線を得、被分析試料の二次イオンピーク強度と比較する方法（Ｃ．Ｍ．Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＭＳ  ＶＩＩＩ，ｐ６５７，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９２）や、シリコン基板上に微量金属元素をスピンコートした全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料を用いる方法（Ｐ．Ｌａｚｚｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．２９，７９８（２０００））などが知られている。
【発明の開示】
しかしながら、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより定量分析をする上では以下のような問題点があった。すなわち、Ｃ．Ｍ．Ｊｏｈｎらが報告した、異なる濃度の標準溶液を清浄なシリコン基板上に塗布、乾燥後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでこれを測定し、二次イオンピーク強度から検量線を得、被分析試料の二次イオンピーク強度と比較する方法では、一度作製したシリコン基板上の標準試料は、時間とともにハイドロカーボン等（コンタミネーション）が堆積したり、標準物質自体が化学変化したりするなど、同一の標準試料を継続して使用することは信頼性に欠けてしまう。このような理由で、定量精度を向上させるために該標準溶液を毎回調製する必要があり、煩雑であるという問題点があった。
また、Ｐ．Ｌａｚｚｅｒｉらが報告した、シリコン基板上に微量金属元素をスピンコートした全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料を用いる方法においても、長期間保存すると上記の表面汚染や酸化などが問題となり信頼性に欠けるといった問題点や、スピンコート等により塗布した場合の注目元素の分布の不均一性により、分析対象領域が数十μｍから数百μｍになるＴＯＦ−ＳＩＭＳの測定では必ずしも適切な方法とはなりえなかった。さらに、該全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料は導電性を有するのに対して、核酸チップは絶縁物基板上に形成されている場合があり、シリコン基板の標準試料で決定されたＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定条件は必ずしも核酸チップの測定条件とはなり得ない場合があり、測定条件の違いに起因する誤差が生じてしまうという問題点もあった。
すなわち、本発明が解決しようとしている課題は、核酸チップ基板上にマトリクス状に配置された核酸プローブを、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより分析する上での問題点を克服し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより精度よく分析する方法を提供することを目的とする。
本発明にかかるプローブ担体は、核酸プローブが固定されたプローブ固定領域を担体上に有するプローブ担体において、前記担体が、リンを既知の濃度で含むリン含有領域を有し、該リン含有領域に含まれるリンが、前記核酸プローブの定量を該核酸プローブの有するリンを検出することにより行う際の標準として使用されるものであることを特徴とするプローブ担体である。
また、本発明にかかるプローブ担体の分析方法は、核酸プローブが固定されたプローブ固定領域と、リンを既知の濃度で含むリン含有領域を担体上に有するプローブ担体の分析方法であって、
前記プローブ固定領域内の核酸プローブの有するリンの量を第１の信号強度として検出する工程と、
前記リン含有領域内のリンの量を第２の信号強度として検出する工程と、
前記リン含有領域における既知のリン濃度と前記第２の信号強度とにより、前記第１の信号強度を規格化して、前記プローブ固定領域内の核酸プローブの定量を行う工程を有することを特徴とするプローブ担体の分析方法である。
上記のリンの量を信号強度として得る方法としては、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）が好ましい。
本発明によれば、核酸プローブ担体に安定的に保持し得るリン定量用の標準として利用できるリン含有領域を設けたことで、より正確なプローブ担体の有する核酸プローブの量の定量が可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１Ａおよび１ＢはＰＳＧ膜付き合成石英基板の一例を示す模式図である。
図２Ａおよび２ＢはＰＳＧ膜付き合成石英基板を用いた核酸プローブアレイ製造工程の模式図である。
図３Ａおよび３ＢはＰＳＧ膜付き合成石英基板を用いた核酸プローブアレイ製造工程の模式図である。
図４はスパッタエッチング後の核酸プローブアレイの断面図である。
図５はシリコン基板上のＰＳＧ膜のｄｙｎａｍｉｃ  ＳＩＭＳ分析結果の一例を示すグラフである。
図６はＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析でドット中のＤＮＡ分子数を求めるための検量線の一例を示す図であり、ＰＳＧ膜に代えて基板からの強度を用いることでリン含有基板の検量線として使用できる。
図７は本発明の核酸チップ基板の平面模式図である。
図８は本発明の核酸チップ基板の断面模式図である。
図９は標準領域で測定されたデプスプロファイルを示す図である。
図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは本発明の核酸チップ基板の作製方法の断面模式図である。
図１１は本発明の核酸チップ基板の平面模式図である。
図１２はリンを含む基板から放出される二次イオンの強度のデプスプロファイルの一例を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明において担体上に固定されたプローブは、特定の標的物質に対して特異的に結合可能なものである。例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の場合は、標的核酸の有する塩基配列と相補的な配列をプローブが有することで、これらのハイブリッド体を形成し得るものである。
担体としては、各種形状及び材料からなるものから選択することができ、例えばガラス基板、シリコン基板、金属基板、樹脂基板等を好適なものとして挙げることができ、また、適当な表面処理をしたそれぞれの基板でも構わない。
プローブを構成する核酸としては、オリゴデオキシヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）等のＤＮＡ、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ、または骨格がペプチドで構成されるＰＮＡ（ペプチド核酸）で代表される核酸アナログがあげられる。これらの少なくとも１種を用いることができる。これらは、一本鎖の状態で担体に固定化できる。また、担体に固定化した一本鎖核酸に更に別の一本鎖核酸をハイブリダイゼーションにより結合させたハイブリッド体に対しても本発明は適用可能である。
また、担体上への核酸プローブの固定化は定法に従って行うことができる。例えば、標的核酸とハイブリダイゼーション可能な塩基配列よりなる部分を有する核酸プローブを、必要に応じてリンカーを介して担体と結合させる。その際、これらの結合部がハイブリダイゼーションに影響を与えないように結合部の配置を考慮することが好ましい。
本発明においては、ドット状などの形状で核酸プローブが固定されたプローブ固定領域を担体上に有するものをプローブ担体といい、プローブ固定領域の複数あるいは多数のそれぞれを互いに独立させて担体上の所定位置に配列したものをプローブアレイという。
本発明にかかるプローブ担体の有する定量における標準として利用されるリンを含有するリン含有領域は、担体の少なくとも一部にリンを注入することで形成されたもの、担体表面の少なくとも一部に形成された膜として形成されたもの、担体のプローブ固定領域を有する面を構成する部分全体にリンを含有させて形成されたもの、担体自体をリンを含有する材料から形成したもの、などの形態とすることができる。
なお、リン含有量域におけるリンの濃度は既知の濃度とし、担体の深さ方向に一定としたり、分布を持たせたりすることができる。例えば、リンを含有する膜を利用する場合や担体のプローブ固定面を構成する材料や担体全体にリンを含有させる場合は、厚さ方向にリンの濃度が一定であることが好ましい。また、イオン注入のように担体の少なくとも一部にリン含有領域を形成する場合は、その深さ方向の変化に対する積分値を既知のリン濃度として採用することができる。
なお、「担体の深さ方向に一定」とは、リンの濃度の深さ方向での分布が変化しないか、あるいは微小に変化した場合でも定量用の標準としてこれを利用する際に支障のない範囲で変化していることをいう。
更に、担体の核酸プローブが固定されている面を構成する材料にリンが一様に含有されているものを利用することもできる。この場合における「一様」もまた、リンの濃度の材料全体での分布が変化しないか、あるいは微小に変化した場合でも定量用の標準としてこれを利用する際に支障のない範囲で変化していることをいう。
以下、担体にリンを含有した領域の好ましい実施態様例について説明する。
（１）リンを含有する膜でリン含有領域を形成する場合
膜状にリン含有領域を形成する場合には、ＰＳＧ（リンシリケートグラス）またはＢＰＳＧ（ボロンリンシリケートグラス）からなる膜を用いるのが好ましい。
ＰＳＧ膜やＢＰＳＧ膜の作製には一般的には化学気相成長法（ＣＶＤ）が用いられる。
化学反応式は次の通りである。
ＳｉＨ４＋ＰＨ３＋Ｏ２→ＳｉＯ２＋Ｐ２Ｏ５＋Ｈ２Ｏ
ＳｉＨ４＋ＰＨ３＋Ｂ２Ｈ６＋Ｏ２→ＳｉＯ２＋Ｐ２Ｏ５＋Ｂ２Ｏ３＋Ｈ２Ｏ
これらの膜は、複数の核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された、いわゆる、核酸チップの基板表面の少なくとも一部に形成される。膜厚は特に限定されるものではないが、一般的には２ｎｍ〜１０μｍの範囲に設定される。ただし、膜が薄すぎると後述のスパッタエッチングの際にリンを含む膜が消失してしまう可能性があり、また厚すぎると基板作製のコストアップ要因となったり、膜のクラックを発生させる原因となったりするので、特に好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲に設定される。
両者とも、膜中のリン濃度は０．００１〜３０重量％の範囲に設定されることが好ましく、０．１〜１０重量％の範囲に設定されることが特に好ましい。ただし、リンの含有量を少なくし、膜を厚くした場合、クラックが生じ易くなるので注意を要する。
上記リンを含む膜を核酸基板表面の一部に形成するには一般的には、該基板全面にリンを含む膜を形成した後に、マスクエッチングなどの手法を用いればよい。
また、上記リンを含む膜は表面の形態をできる限り平坦にすることが好ましい。これは、後述のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析での測定精度を向上させるため、および、全面形成した場合の核酸チップの歩留まりを向上させるためである。表面形態が平坦なＰＳＧ膜の作製方法としては、例えば、特許登録第２９８３４７６号公報などが知られているが、本発明はこれらに限定されるものではない。
担体に設けたリン含有領域内の深さ方向のリン濃度の分布などは、同条件で作製した測定用サンプルを用いて測定した値を利用することができる。このリン濃度の規格化に利用できる方法としては、
１）二次イオン質量分析法（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＳＩＭＳ）、
２）飛行時間型二次イオン質量分析法（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）、
３）Ｘ線光電子分光法（Ｘ−ｒａｙ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＸＰＳ）、
４）オージェ電子分光法（Ａｕｇｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＡＥＳ）、
５）誘導結合プラズマ原子発光分光法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＩＣＰ−ＡＥＳ）、
６）誘導結合プラズマ質量分析法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＩＣＰ−ＭＳ）、
７）フーリエ変換赤外分光法（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＴ−ＩＲ）、
を挙げることができ、これらの少なくとも一種を用いることができる。
上記の内、１）から４）に示す分析方法は、上記リンを含みかつリン濃度が深さ方向に一定の膜が、実際にリン濃度が深さ方向に一定であることを確認することを主目的とするものである。この中では１）または２）が好適に用いられる。また、２）を使用すれば、後述のＴＯＦ−ＳＩＭＳによる核酸チップの分析をした後、同じ装置を使ってリン濃度の深さ方向分析を行うことができるため好都合である。なお、この場合は、上記リンを含みかつリン濃度が深さ方向に一定の膜は、同一の条件で作製した別の膜である必要はなく、同一の膜であってもよい。また、１）から４）に示す方法で、リンの感度係数を用いることにより、上記リンを含みかつリン濃度が深さ方向に一定の膜中のリン濃度の絶対値を求めることも可能だが、この目的に対して一般的には以下に示す化学的分析手法に比べると定量精度は低い。
上記の内、５）から７）に示す分析方法は、上記リンを含みかつリン濃度が深さ方向に一定の膜中のリン総量を求める分析方法である。５）と６）は、適当な酸を用いて該膜を溶解させてから分析するもので高精度な定量結果が得られる。この値と、膜の密度、膜厚からリン濃度が求まる。７）の方法は、例えばシリコン基板上に成膜すれば透過法で簡便に測定でき、膜中リン濃度が求まるが、５）や６）の方法に比べると定量精度は一般的には悪い。なお、７）の方法は水分の影響を避けるため、真空中で測定することが好ましい。
本発明のプローブ担体の分析方法の特徴とするところは、複数の核酸プローブの例えばドット状の固定領域が担体上にマトリクス状に配置された、いわゆる、核酸チップ内の各ドット中の核酸量を、該ドット領域と、上記のリンを含み、好ましくはリン濃度が深さ方向に一定の膜領域の両方において検出される信号強度に基づいて決定することである。上記の検出される信号強度とは、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）で検出される二次イオンの強度であることが好ましく、特に、Ｐ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−のいずれかであることが好ましい。
また、上記の、リンを含みかつリン濃度が深さ方向に一定の膜領域から検出される信号強度が、該領域を一定量だけスパッタエッチングした後に得られる信号強度であることも本発明の特徴とするところである。なお、リンを含む膜などのリン含有領域における面方向のリンの濃度は、定量に利用する特定領域、例えば一次イオンの照射スポット内において一定とされる。
後述するように、核酸プローブは基板上に共有結合で固定されていることが好ましく、この場合、例えば、担体表面処理過程で、該担体表面がアミノ基を結合したシランカップリング剤（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）および架橋剤であるＮ−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミド（ＥＭＣＳ）で覆われることなる。さらに、分析の前処理段階で微量の各種汚染物が担体表面に付着することもあり、そのためスパッタエッチングは、分析方法としてＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いる場合、必須の操作となる。したがって、スパッタエッチングは、リン濃度が既知の膜が露出するまで行う必要がある。このスパッタエッチングの条件は予め求めておくことが好ましい。なお、スパッタエッチングでは特定元素の選択スパッタにより（表面）組成が変化することが知られているが、例えば一定の条件で作製したＰＳＧ膜などではＳＩＭＳ分析でリン濃度が深さ方向に一定であることが示されている。したがって、ＰＳＧなどのリン濃度が既知の膜について、表層のスパッタエッチングで膜中のリン濃度を変動させない条件設定を行う。
本発明のプローブ担体の分析方法においてＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いる場合、核酸プローブに起因する二次イオンのイメージが定量的に表示できることも特徴である。
さて、本発明のプローブ担体の分析方法では、プローブ担体内の各ドットから放出される二次イオンの強度と、プローブ担体表面の少なくとも一部に形成されたリンを含みかつリン濃度が好ましくは深さ方向に一定の膜などから放出される二次イオンの強度を、それぞれの二次イオン化効率（感度）等で補正すれば定量的な評価が可能になる。この場合、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでの分析条件をこれら２つの領域間で同じにしておく。
これには、化学分析等で核酸プローブ密度を求めた標準プローブの固定領域を、上記のようにリンを含み、好ましくはリン濃度が深さ方向に一定の膜を設けた担体上に作製し、上記二つの強度の関係式（検量線）を予め求めておけばよい。具体的な上記関係式（検量線）の例を図６に示した。一旦この関係式（検量線）を作成しておけば、以後は上記リンを含みかつリン濃度が深さ方向に一定の膜から放出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−等の二次イオン強度を基準としてドット中のＤＮＡ分子数、すなわち核酸プローブ密度を評価できることになる。
なお、上述の二次イオン強度とは、計数率ではなく、一定条件で一定時間計数した積分強度であることが好ましい。正確には、一次イオンのドーズ量を、いわゆるｓｔａｔｉｃ条件と言われる１×１０１２／ｃｍ２以下の一定値とし、一定の面積から放出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−等の二次イオンの計数値（カウント数）とすることが好ましい。なお、１次イオンのドーズ量は１×１０１４／ｃｍ２以下とする必要がある。ただし、上記リンを含みかつリン濃度が深さ方向に一定の膜から放出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−等の二次イオン強度に関しては、上記ｓｔａｔｉｃ条件を超えた一次イオンドーズ量を用いることもできる（ただし、一次イオンドーズ量自体は毎回揃える必要がある）。
（２）リンのイオン注入によりリン含有領域を形成する場合
担体としてリンのイオン注入が可能な材料からなるものを利用し、イオン注入は任意の加速エネルギーと任意の注入量に設定して行うことができるが、後述するようにＴＯＦ−ＳＩＭＳにより標準領域でのデプスプロファイルの測定を行う場合には、スパッタリングと測定を独立して行うことから比較的長い測定時間が必要になる。そのために、イオン注入の加速エネルギーは可能な限り低く設定し、注入元素の分布する深さを浅くするのが好ましい。また、多量の元素をイオン注入する設定にするのが好ましい。
ＴＯＦ−ＳＩＭＳの測定において１次イオンとしては、Ｃｓ＋イオンまたは、Ｇａ＋イオンを用いる。二次イオン種としては、先に述べたとおり、核酸プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）の場合、核酸の骨格を構成するリン酸ユニットに起因するＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などを検出する。また、ガラス基板上の核酸チップのような絶縁物基板を用いる時に併用する電子線については、一次イオンのパルス幅、周波数および試料の誘電率を考慮して、適切な照射条件を決定する必要がある。
リンをイオン注入した標準領域ではＰ−を検出する。ただし、核酸チップの基板にイオン注入法で形成された標準領域と核酸チップのドットでは主成分が異なるため、厳密には該標準領域で検出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などの強度と、核酸チップのドットで検出されるＰ−の強度を比較して単純に定量することはできない（マトリクス効果）。これを考慮して、あらかじめ、感度の補正をする必要がある。補正の方法としては、注目している核酸ドットと同条件で別途作成した多数の核酸ドットを溶解して化学分析を行い、得られた核酸ドットの平均形成密度および核酸チップ基板上の注目している核酸ドットにおける平均的な二次イオン強度から得られる核酸ドットでの感度係数１と、イオン注入領域における注入量および該領域での二次イオン強度から得られる感度係数２とから相互の感度係数を変換する補正値をあらかじめ求めておき、以降は核酸チップ基板の標準領域（リンをイオン注入した領域）を基準に、核酸チップ基板上の注目する核酸ドットの個々の形成密度を決定する方法がある。この方法は、測定毎に感度係数を決定しているため、測定日が異なっても精度の高い形成密度の値を決定することが可能となる。
また、本発明に含まれる核酸チップの分析法の特徴は、核酸ドットの形態をその核酸形成密度の分布とあわせて表示することである。
（３）リン含有担体（基板）を用いてリン含有領域を形成する場合
担体に一様にリンを含有させた材料で構成されたものを利用することで、プローブ担体に本発明でいうリン含有領域を形成することができる。この場合に好適な担体としてはガラス基板、Ｓｉを含む基板、Ｓｉを含まない基板などを挙げることができる。担体中でのリンの含有量（重量比）としては０．１ｐｐｍ以上１０％以下であることが好ましい。リン含有領域を定量における標準として利用し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによって定量を行う際の二次イオンとしては、先に挙げた場合と同様に、Ｐ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などのいずれかが利用できる。また、担体のみの領域（核酸プローブが固定化されていない領域）から検出される信号強度としては、該領域を一定量だけスパッタエッチングした後に得られる信号強度であることがこのましい。
以下、図６、１０Ａ〜１０Ｃ、１１及び１２を用いて、本発明の核酸チップ基板及びバイオチップの分析方法について説明する。
ここで図１０Ａ〜１０Ｃは核酸チップ基板の作製方法を示す模式図である。図１１は基板上に核酸を複数個スポット状に形成したプローブアレイを有する核酸チップ基板の平面模式図である。また図１０Ｃは図１１の１０Ｃ−１０Ｃでの断面の模式図である。ここで１は基板、２は有機物からなる表面処理層、３は核酸からなるドット、４は定量の標準として用いる標準領域（プローブを形成していない基板のみの領域であればどこに設定してもかまわない）である。さらに図１２ではリンを含む基板（すなわち標準領域）から放出される二次イオンの強度のデプスプロファイルの一例を示した。また図６にＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析でドット中のＤＮＡ分子数を求めるための検量線の一例を示した。
以下、図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃおよび図１１に示したようなプローブアレイの作製法について、公知の方法（特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法）に準じて説明する。
（１）基板準備及び洗浄
核酸チップ基板に使用するリンを含有する基板を準備した後に、該基板の洗浄を行なう（図１０Ａ）。
ここでリンを含有する基板としては、ガラス基板、Ｓｉ基板、金属基板、樹脂基板などが挙げられるが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
またそのうちガラス基板においては、Ｓｉを含有するケイ酸塩ガラスでも、Ｓｉを含有しない非ケイ酸塩ガラスでも良く、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
さらにそのうちガラス基板においては、結晶成分を含有する結晶化ガラスでも、結晶成分を含有しない非晶質ガラスでも良く、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
また、本発明の対象とする核酸チップは、その外形サイズが一般的には１ｃｍ×１ｃｍ、１インチ×１インチ（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ）、あるいは、スライドグラスサイズ（例えば、２６ｍｍ×７６ｍｍ）であり、マトリクスは、その内部（表面）に配置されている。
一方、リンを含有する基板におけるリンの含有量としては、各分析手法において定量分析の標準試料として使用可能なリンの含有量であれば特に限定されるものではないが、分析手法がＴＯＦ−ＳＩＭＳである場合には、リンの含有量（重量比）が０．１ｐｐｍ以上１０％以下であることが望ましい。
さらに、リンを含有する基板の組成は、定量分析のための標準として使用する目的から既知であることが望まれるが、実際に各種分析手法を用いて求めても良いし、信頼できる場合にはメーカー側の保証値を使用しても良く、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
またリンを一様に含有する基板の組成は、バルクレベルで組成がほぼ一様であることが望まれる。
たたしバルクレベルで組成が一様であっても、基板最表面の組成がバルクレベルの組成と多少異なっている場合もあるが、その場合には基板最表面よりも深い箇所（バルクレベルの組成を有する箇所）での測定値を定量分析の標準として使用することにすれば、本発明の分析方法を適用することができる。
また基板の洗浄方法としては、洗浄溶液中に浸す方法、洗浄溶液中で超音波振動を与える方法などが挙げられるが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
さらに基板の洗浄溶液としては、純水、洗剤を希釈した溶液、アルカリを希釈した溶液などが挙げられるが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
（２）表面処理
次に基板の表面処理を行ない、基板１上に有機物からなる表面処理層２を形成した（図１０Ｂ）。
ここで基板の表面処理は、核酸からなるプローブを基板上への固定を促進するために行なうものであり、この固定としては共有結合によるものが好ましいが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
また基板の表面処理剤としては、シランカップリング剤、架橋剤などが挙げられるが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
（３）核酸の準備
次に核酸チップ基板のプローブとして使用する核酸を準備する。
ここで核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などが挙げられる。
（４）プローブの基板への形成
次に有機物からなる表面処理層２を有する基板１上に、核酸を含むプローブ３を複数形成した核酸チップを形成する（図１０Ｃ）。また図１０Ｃは図１１の１０Ｃ−１０Ｃでの断面の模式図である。
ここでプローブの形成方法としては、該核酸を表面において逐次的に合成する方法、該核酸があらかじめ合成され、その後、核酸チップ表面に供給する方法などが挙げられるが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
またそのうち該核酸があらかじめ合成され、その後、核酸チップ表面に供給する手段においては、インクジェット法などが挙げられるが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
さらに該核酸を核酸チップ表面に供給する手段としてのインクジェット法においては、ピエゾジェット法、サーマルジェット法などが挙げられるが、プローブの結合及び分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
（５）核酸チップ基板のプローブの分析
次に核酸チップ基板のプローブの分析を行なう。
この分析において、該核酸プローブが存在する領域と、基板のみの領域（標準領域）の両方において検出される信号強度に基づいてプローブに存在する核酸の量を決定する。
ここでプローブの分析に用いる信号としては、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）で検出される二次イオン強度などが挙げられる。
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定においては、使用するＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置としてはセクター型、リフレクトロン型などが挙げられるが、分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
またＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定においては、一次イオン種としては、Ｃｓ＋イオンまたは、Ｇａ＋イオンが挙げられるが、分析に不都合がなければ特に限定されるものではない。
さらにＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定においては、二次イオン種としてプローブの核酸およびハイブリダイゼーションで導入された核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）の場合は、核酸の骨格を構成するリン酸に由来するＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などが挙げられる。
なお、上述の二次イオン強度とは、計数率ではなく、一定条件で一定時間計数した積分強度であることが好ましい。正確には、一次イオンのドーズ量を、いわゆるｓｔａｔｉｃ条件と言われる１×１０１２／ｃｍ２以下の一定値とし、一定の面積から放出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などの二次イオンの計数値（カウント数）とすることが特に好ましい。なお、一次イオンのドーズ量は少なくとも１×１０１４／ｃｍ２以下とする必要がある。ただし、リンを含む基板から放出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などの二次イオン強度に関しては、上記ｓｔａｔｉｃ条件を超えた一次イオンドーズ量を用いることもできる（ただし、一次イオンドーズ量自体は毎回揃える必要がある）。
さらにまたＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定においては、基板の導電性が低い場合にはチャージアップ抑制のための電子線照射や磁場印加を併用しても良い。
次にＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いた核酸チップの核酸プローブの定量について説明する。
本発明の核酸チップの分析方法では、核酸チップ内の各ドットから放出される二次イオンの強度と、リンを含む基板から放出される二次イオンの強度を、それぞれの二次イオン化効率（感度）等で補正すれば定量的な評価が可能になる。ここでリンを含む基板から放出される二次イオンの強度のデプスプロファイルの一例を図１２に示した。
これには、化学分析等でプローブ核酸密度を求めた標準核酸チップを、上記のリンを含む基板上に作製し、上記二つの強度の関係式（検量線）を予め求めておけばよい。具体的な上記関係式（検量線）の例を図６に示した。一旦この関係式（検量線）を作成しておけば、以後は上記リンを含む基板から放出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などの二次イオン強度を基準としてドット中のＤＮＡ分子数、すなわちプローブ核酸密度を評価できることになる。
（６）核酸チップ基板のプローブの形成密度分布の画像表示
次に同じ核酸チップ基板の複数のＤＮＡプローブを含む領域を設定して１次イオンを試料面で走査し、発生する二次イオンを各走査点に対応させて表示する。同様な測定を行い、各走査点で得られたＰＯ３−のカウント数を段階に分け、各段階に対して擬似カラーを設定し、その強度分布を得る。すなわち、形成密度の分布を定量的に比較することが可能となる。
本発明のチップの分析方法では、核酸チップ内の各ドット中の核酸が、プローブ核酸のみの場合、さらにプローブ核酸と、プローブ核酸とのハイブリダイゼーションにより導入された標的核酸の両者から構成される場合の両者に適用可能である。
また、核酸チップ内の各ドット中の核酸が、ＰＮＡからなるプローブ核酸と、該プローブ核酸とのハイブリダイゼーションにより導入されたＤＮＡからなる標的核酸の両者から構成される場合、さらに、核酸チップ内の各ドット中の核酸が、ＤＮＡ若しくはＲＮＡからなるプローブ核酸と、該プローブ核酸とのハイブリダイゼーションにより導入されたＤＮＡからなる標的核酸の両者から構成される場合に好ましく適用される。
本発明のチップの分析方法では、プローブ担体内の各ドット（プローブ固定領域）中の核酸が、核酸プローブのみの場合、さらに核酸プローブと、核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより導入された標的核酸の両者から構成される場合の両者に適用可能である。
また、プローブ担体内の各ドット中の核酸が、ＰＮＡからなる核酸プローブと、該核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより導入されたＤＮＡからなる標的核酸の両者から構成される場合、さらに、プローブ担体内の各ドット中の核酸が、ＤＮＡ若しくはＲＮＡからなる核酸プローブと、該核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより導入されたＤＮＡからなる標的核酸の両者から構成される場合に好ましく適用される。
本発明の対象とするプローブ担体は、その外形サイズが一般的には１ｃｍ×１ｃｍ、１インチ×１インチ（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ）、あるいは、スライドグラスサイズ（例えば、２６ｍｍ×７６ｍｍ）であり、マトリクスは、その内部（表面）に配置されている。本発明は既に述べたように、複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、いわゆる、プローブ担体の基板、および該基板表面の各マトリクスの組成をＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて分析する方法に関する。
プローブは安定性を考えると、基板表面に共有結合によって結合されていることが望ましい。
本発明にかかるプローブ担体を作製する際に用いる各種プロセスには公知の方法が利用できる。場合によっては、プローブが、担体表面において逐次的に合成されたものであってもよいし、また、あらかじめ合成され、その後、担体表面に供給されたものであってもよい。その際、プローブを担体表面に供給する手段としてインクジェット法を用いれば、微細かつ高密度にドット状の核酸プローブの固定領域を担体上に、必要に応じてマトリックス上に配置することが可能となる。インクジェット法としては既知の、ピエゾジェット法、サーマルジェット法を用いることができる。
以下に核酸と、それに特異的なフラグメントイオンについて限定的でない例をあげる。核酸は、リン酸ジエステルからなるバックボーンを有するので、フラグメントイオンとしては上記リン酸バックボーンのフラグメントイオンであるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−のいずれをも好適に検出することができる。また、核酸には、それがＤＮＡであれば、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ＲＮＡであればチミンの替わりにウラシルの計５種の塩基を有する。また、代表的な核酸アナログであるＰＮＡも４種の塩基、アデニン、チミン、グアニン、シトシンをもつので、これらの塩基のフラグメントイオン、すなわち、（アデニン−Ｈ）−、（チミン−Ｈ）−、（グアニン−Ｈ）−、（シトシン−Ｈ）−、（ウラシル−Ｈ）−を二次イオンとして利用することができる。これら塩基に起因するフラグメントイオンは、その強度がプローブ中のそれぞれの塩基の存在量に対応している。ただし、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは塩基配列に関する情報は一般的には得られない。なお、これらの塩基からのフラグメントイオンから得られる分析値についても、標準としてのリン含有領域を用いて標準化することができる。
また、ＰＮＡはバックボーンがペプチド結合で構成されているので、ペプチド結合のフラグメントイオンをＴＯＦ−ＳＩＭＳの検出に好適に利用し得る。
【実施例】  以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１（ＰＳＧ膜付き合成石英基板の作製）
作製したＰＳＧ膜付き合成石英基板の模式図を図１Ａおよび１Ｂに示した。図１Ａは平面図、図１Ｂは図１Ａの１Ｂ−１Ｂでの断面図であり、１は合成石英基板、２はＰＳＧ膜である。以下、これらを参照して作製方法を説明する。
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行い、その後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
次にこの基板を、（Ｂ）ＰＳＧ成膜装置に導入し、ＳｉＨ４，ＰＨ３，Ｏ２の原料ガスを用い、ＰＳＧ膜を全面に形成させた。なお、基板温度は４００℃とし、リン濃度は３．０重量％、膜厚は１μｍとした。なお、このリン濃度は次のようにして決定した。基板温度や原料ガスの混合比を変えた複数の条件でシリコン基板上にＰＳＧ膜を形成した。これをＦＴ−ＩＲ，ＩＣＰ−ＡＥＳで分析し、膜厚と密度の値を用い、それぞれの条件で作製したＰＳＧ膜中のリン濃度を求めた。この内、リン濃度が３．０重量％となる条件で上記ＰＳＧ膜を作製した。なお、上記リン濃度の分析にはＩＣＰ−ＭＳなど他の分析手法を用いても良い。その後、マスクを用いたエッチングにより合成石英基板の周辺部のみにＰＳＧ膜を設けた基板１を作製した。図１ＡにおけるＰＳＧ膜の幅は３ｍｍとした。
実施例２（ＢＰＳＧ膜付き合成石英基板の作製）
実施例１で作製したＰＳＧ膜の代わりにＢＰＳＧ膜を作製した。原料ガスとして、ＳｉＨ４，ＰＨ３，Ｂ２Ｈ６，Ｏ２を使用し、基板温度を４５０℃とする以外は実施例１と同様にしてＢＰＳＧ膜を設けた基板１を作製した。
実施例３（ＰＳＧ膜付きシリコン基板の作製：ｄｙｎａｍｉｃ  ＳＩＭＳ分析用）
実施例１で使用した合成石英基板の代わりに不純物を含まないシリコン基板を使用し、基本的には実施例１と同様の手順でＰＳＧ膜付きシリコン基板を作製した。基板温度、リン濃度、膜厚は実施例１と同様とした。ここで作製したＰＳＧ膜付きシリコン基板はＳＩＭＳ分析に供した。
実施例４（ＰＳＧ膜付きシリコン基板のｄｙｎａｍｉｃ  ＳＩＭＳ分析）
実施例１で作製したＰＳＧ膜中のリンが深さ方向に一定であることを確認するため、実施例３で作製したＰＳＧ膜をｄｙｎａｍｉｃ  ＳＩＭＳ分析することで間接的に評価した。
標準的な条件で得たｄｙｎａｍｉｃ  ＳＩＭＳ分析の結果を図５に示した。図５に示すように、ＰＳＧ膜中のリン濃度はほぼ一定であることがわかった。なお、（Ｂ）ＰＳＧ成膜装置でＣＶＤを開始した直後はＰＳＧ膜中のリン濃度が変動する（ｆａｃｔｏｒ２程度）が、一定時間が経過すれば上記リン濃度はほぼ一定となることも確認した。
実施例５（ＰＳＧ膜付き合成石英基板とｄＴ４０プローブによる核酸プローブアレイの作製）
実施例１で作製したＰＳＧ膜付き合成石英基板を用い、核酸プローブアレイを作製した。この製造工程の模式図を図２Ａおよび２Ｂ、および図３Ａおよび３Ｂに示した。図２Ａはは平面図、図２Ｂは図２Ａの２Ｂ−２Ｂでの断面図である。図３Ａは平面図、図３Ｂは図３Ａの３Ｂ−３Ｂでの断面図である。１は合成石英基板、２はＰＳＧ膜、３は有機物からなる表面処理層、４はＤＮＡを含むドットである。以下、これらを参照して核酸プローブアレイの作製方法を説明する。なお、本作製方法は前記特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法に準じた。
（１）基板洗浄
実施例１で作製したＰＳＧ膜２を有する合成石英基板１をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、そのまま次工程に供した。
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン  ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１重量％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
次いでＮ−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシンイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。このようにして、有機物からなる表面処理層３およびＰＳＧ膜２を有する合成石英基板１を作製した（図２Ａおよび２Ｂ）。
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して配列番号：１の一本鎖核酸（Ｔの４０量体）を合成した。なお配列番号：１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
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（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列番号：１の一本鎖ＤＮＡを８μＭの濃度でグリセリン７．５重量％、尿素７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１重量％を含む溶液を溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ここにスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。このようにして、有機物からなる表面処理層３およびＰＳＧ膜２を有する合成石英基板１上に、ＤＮＡを含むドット４を複数形成した核酸プローブアレイを作製した（図３Ａおよび３Ｂ）。
なお、ＤＮＡ結合基板（ＤＮＡチップ）をＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析に供する場合は、分析直前に上記ＤＮＡ結合基板に窒素ガスを吹き付けて乾燥し、真空デシケーター中でさらに乾燥した。
比較例１（合成石英基板とｄＴ４０プローブによる核酸プローブアレイの作製）
実施例５で作製したＰＳＧ膜付き合成石英基板の代わりに合成石英基板を用い、核酸プローブアレイを作製した。他の作製方法は実施例５と同様とした。
実施例６（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析）
実施例５で作製したＰＳＧ膜付き合成石英基板上のｄＴ４０プローブからなる核酸プローブアレイのドット形成部およびＰＳＧ膜形成部をＴＯＦ−ＳＩＭＳで分析した。測定にＩＯＮ−ＴＯＦ製のＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ型装置を使用した。主な測定条件を以下に示す。
一次イオン：２５ｋＶ  Ｇａ＋、０．６ｐＡ（パルス電流値）、ランダムスキャンモード一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（４００μｓ／ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：１ｎｓ
一次イオンビーム直径：５μｍ
一次イオンスキャン範囲（測定領域）：１００μｍ×１００μｍ
一次イオンドーズ量：約１×１０１２ｉｏｎｓ／ｃｍ２
二次イオン検出モード：ｎｅｇａｔｉｖｅ
二次イオンｉｍａｇｅのｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算回数：１６
なお、ＰＳＧ膜形成部のＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定では、予め左記ＰＳＧ膜形成部の上部を以下の条件でスパッタエッチングし、ＰＳＧ膜を露出させた後に行った。
＜スパッタエッチング条件＞
エッチングイオン：Ｏ２＋（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置内のイオン銃を使用）
エッチング領域：５００μｍ×５００μｍ
なお、このエッチングでは、表面の炭化水素に起因するＣｘＨｙ−イオンとＰＳＧ膜に起因するＰＯ２−イオンを同時にモニターし、該ＣｘＨｙ−イオン強度が無視できるレベルまで低下し、該ＰＯ２−イオン強度が一定になるまで続けた。
スパッタエッチング後の前記核酸プローブアレイの断面図を図４に示した。
図４において、１は合成石英基板、２はＰＳＧ膜、３は有機物からなる表面処理層、４はＤＮＡを含むドットである。なお、ＰＳＧ膜を全面に形成した場合でもこの操作は必要となる。
ＰＳＧ膜２が露出した部分において、上記の条件でＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定を行ったところ、上記ＰＯ２−イオンの積算強度は約１８８００カウントとなった。同様の測定を、測定日を変えて５回測定したところ、上記ＰＯ２−イオンの積算強度は１８６００〜１８９００カウントとなった。
上記ドット形成部の一定面積からの二次イオン強度を、上記ＰＳＧ膜が露出した部分の一定面積からの主二次イオン強度（例えば、ＰＯ２−）で規格化した。このようにして、各プローブ中の核酸量を評価した。
上記の操作を、製造日が異なる５つの核酸プローブアレイについて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定をそれぞれ異なる日に実施した。これら５つのＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定結果について、上記のＰＳＧ膜からのＰＯ２−イオン強度で、ドット部からのＰＯ２−イオン強度を規格化した。その結果、後者のイオン強度の変動はプラスマイナス１５％以内であった。
比較例２（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析）
比較例１で作製した合成石英基板上のｄＴ４０プローブからなる核酸プローブアレイを、実施例６と同様の条件でＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析した。ただし、本例では合成石英基板上にＰＳＧ膜がないため、この部分は測定せず、また、規格化できる（標準となる）二次イオン（強度）がないため、前記ドット形成部の一定面積からの二次イオン強度のみを使用した。
上記の操作を、製造日が異なる５つの核酸プローブアレイについて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定をそれぞれ異なる日に実施した。ただし、核酸プローブアレイの製造日とＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定日自体は、実施例６と同日とした。この場合、ドット部からのＰＯ２−イオン強度（測定値）の変動はプラスマイナス３０％以内であった。
なお、実施例６および比較例２では、製造日が異なる５つの核酸プローブアレイを分析対象としているため、上記二次イオン強度の変動は、測定上のばらつきの他に、核酸プローブアレイ自体のばらつきにも起因する。この両者の寄与分を明確に求めることは難しいが、実施例６および比較例２で示した結果より、少なくともＰＳＧ膜からの主二次イオン強度（例えば、ＰＯ２−イオン）で規格化することにより測定上のばらつきを小さくできたと考えられる。
実施例７（リンをイオン注入した合成石英基板上に形成したｄＴ４０核酸チップの作製）
図７は基板上に核酸を複数個スポット状に形成した核酸ドットアレイの平面の模式図、図８は図７の８−８での断面の模式図である。１は基板、２は有機物からなる表面処理層、３は核酸ドット、４は既知量のリンをイオン注入により基板に注入して形成した標準領域である。図７では標準領域を基板の一部に形成した場合を示しているが、基板全面に形成してもかまわない。また、図９には標準領域４で測定されたデプスプロファイルの一例を示した。
以下、図７および図８に示したようなドットアレイの作製法について、公知の方法（特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法）に準じて説明する。
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行った。
（２）イオン注入
洗浄を終了した合成石英基板の領域４にリン（Ｐ）を注入エネルギー１ｋｅＶ、注入ドーズ量１×１０１５ａｔｏｍｓ／ｃｍ２の条件でイオン注入を行った。
（３）表面処理
図７の８−８で示す位置の断面図を図８に示した。
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン  ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１重量％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（２）で得た基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
次いでＮ−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板２００をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシンイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。このようにして、合成石英基板１上に有機物からなる表面処理層２を形成した。
（４）ドットＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して配列番号：１の一本鎖ＤＮＡ（塩基種をチミンとした４０量体）を合成した。なお配列番号：１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
2004003531.tif 000004
（５）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列番号：１の一本鎖ＤＮＡを８μＭとなる濃度でグリセリン７．５重量％、尿素７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１重量％を含む溶液に溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ここにＤＮＡドットを形成した。なお、ドット形成時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。ドットを形成した後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基とＤＮＡドット末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。このようにして、有機物からなる表面処理層２を有する合成石英基板１上に、ＤＮＡを含むドット３を複数形成した核酸チップを作製した（図７）。
実施例８（核酸ドットにおけるＳＩＭＳの感度係数の決定）
実施例７に準じて、注目している核酸ドット３と同条件で基板上の２０ｍｍ×３０ｍｍの領域に１２７μｍ間隔でドットを形成（１５７行２３６列）した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基とＤＮＡドット末端のチオール基とを反応させたＤＮＡチップを別途２０枚作製した。次に酸で洗浄してＤＮＡドットを溶解させた後、該酸溶液をリンが飛散しない条件で１ｍｌ以下になるまで濃縮した。次いで該濃縮溶液に超純水を加えて１ｍｌになるように定容した。この溶液をＩＣＰ−ＭＳ装置に導入してリンの重量を測定した。この値をもとに測定に供したドットの数を考慮して、各濃度で作製したＤＮＡドットのＤＮＡ分子数の平均的な形成密度ｄａｖ（単位面積でのリンの数）を決定した。なお、ここで作製した基板の枚数は、ＩＣＰ−ＭＳ装置でのリンの検出限界濃度（約１０ｐｐｂ）と、各基板上のＤＮＡの分子数を考慮して決定すればよく、ここで示した枚数に限定されるものではない。
次に、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置に核酸ドットチップを導入し、１次イオンＧａ＋、１０ｋＨｚで核酸チップ上のドットに時間ｔ２の間一次イオンをパルス状に照射し、得られるＰ−二次イオン強度の累積値を複数のドットで測定し、その平均値として決定されるＩａｖと、先に化学分析で求めた平均的な形成密度ｄａｖ（単位面積でのリンの数）とから核酸ドットでの感度係数Ｒ１を式（１）から求める。
Ｒ１＝ｄａｖ／Ｉａｖ    …  （１）
実施例９（核酸チップにおけるＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定）
核酸チップのドットでの核酸の定量は次のようにして行う。まず、ＴＯＦ−ＳＩＭＳのスパッタ用と測定用のイオンガンを交互に用いて標準領域におけるリン（Ｐ）のデプスプロファイルを測定する。測定は、時間ｔ１の間スパッタイオンを連続照射した後、時間ｔ２の間一次イオンをパルス状に照射する操作を最終的に注目するＰ−２次イオンの強度が一定になるまで交互に行う。このようにして得られたデプスプロファイルを図３Ａ及び３Ｂに示す。図３Ａ及び３Ｂにおいて二次イオンＰ−のカウント数の総和Ｃ、測定された深さＸおよび標準領域に注入されたイオンのドーズ量Φから、当該測定条件での感度係数Ｒ２を式（２）から求める。
Ｒ２＝Φ／Ｘ・Ｃ      …  （２）
（１）、（２）から、Ｒ１／Ｒ２＝ｄａｖ／｛φ・（Ｉａｖ／Ｘ・Ｃ）｝
ここで、ｄａｖとφはともに既知であるのでｄａｖ／｛φ・（Ｉａｖ／Ｘ・Ｃ）｝＝Ｋとすれば
Ｒ１＝Ｒ２・Ｋ        …  （３）
このようにして、核酸ドットでの感度係数と標準領域の感度係数間のパラメータＫを決定する。次に、任意の核酸ドット３において、時間ｔ２の間１次イオンをパルス状に照射し二次イオン強度Ｉを測定する。核酸ドット３の形成密度ｄは（１）、（２）、（３）から以下のように決定した。
ｄ＝Ｉ・Ｒ１
＝Ｉ・Ｒ２・Ｋ
実施例１０（形成密度分布の画像表示）
実施例９に用いた同じ試料の複数の核酸ドットを設定して一次イオンを試料面で走査し、発生する二次イオンを各走査点に対応させて表示させ、各走査点で得られたＰ−の強度を複数の段階に分け、各段階に対して擬似カラーを設定し、Ｐ−の強度分布すなわち、核酸の面密度（ドットあたりの核酸の分子数）としての形成密度の分布を定量的に比較した。
実施例１１（リンを含有するガラス基板上への形成したｄＴ４０核酸チップの作製）
以下、図６、１０Ａ〜１０Ｃ、１１及び１２を用いて、本発明の核酸チップ基板及びバイオチップの分析方法について説明する。
ここで図１０Ａ〜１０Ｃは核酸チップ基板の作製方法を示す模式図である。図１１は基板上に核酸を複数個スポット状に形成したプローブアレイを有する核酸チップ基板の平面模式図である。また図１０Ｃは図１１の１０Ｃ−１０Ｃでの断面の模式図である。ここで１は基板、２は有機物からなる表面処理層、３は核酸からなるドット、４は定量の標準として用いる標準領域（プローブを形成していない基板のみの領域であればどこに設定してもかまわない）である。図１２は、リンを含む基板（すなわち標準領域）から放出される二次イオンの強度のデプスプロファイルの一例を示す。また図６は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析でドット中のＤＮＡ分子数を求めるための検量線の一例を示す。
以下、図１０Ａ〜１０Ｃおよび図１１に示したようなプローブアレイの作製法について、公知の方法（特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法）に準じて説明する。
（１）基板準備及び洗浄
まず核酸チップ基板に使用するリンを含有する基板を準備した後に、該基板の洗浄を行なう（図１０Ａ）。
ここでリンを含有する基板として、ネオセラムガラス（組成（重量比）ＳｉＯ２：６７％、Ａｌ２Ｏ３：２３％、ＬｉＯ２：４％、ＴｉＯ２：２％、ＺｒＯ２：３％、Ｐ２Ｏ５：１％）からなるガラス基板（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍ）を準備した。次に上記基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。さらに純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行った。
（２）表面処理
次に基板の表面処理を行ない、基板１上に有機物からなる表面処理層２を形成した（図１０Ｂ）。
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン  ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１重量％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。この溶液に上記（２）で得た基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
Ｎ−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った基板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシンイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
このようにして、ガラス基板１上に有機物からなる表面処理層２を作製した。
（３）核酸の準備
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して、核酸として配列番号：１の一本鎖ＤＮＡ（塩基種をチミンとした４０量体）を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
2004003531.tif 000005
（４）プローブの基板への形成
次に有機物からなる表面処理層２を有する基板１上に、核酸を含むプローブ３を複数形成した核酸チップを形成する（図１０Ｃ）。また図１０Ｃは図１１の１０Ｃ−１０Ｃでの断面の模式図である。
上記配列番号：１の一本鎖ＤＮＡを８μＭとなる濃度でグリセリン７．５重量％、尿素７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１重量％を含む溶液を溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キャノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キャノン）を数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ここにＤＮＡプローブを形成した。なお、プローブ形成時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。プローブを形成した後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とＤＮＡプローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。このようにして有機物からなる表面処理層２を有するガラス基板１上に、核酸としてＤＮＡを含むプローブ３を複数形成した核酸チップ基板を作製した。
実施例１２（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定）
次に実施例１１で作製した核酸チップ基板を用いて核酸チップのプローブでの核酸の定量を行なった。
まず核酸チップ内の各ドットから放出される二次イオンの強度と、リンを含む基板（標準領域）から放出される二次イオンの強度を、それぞれの二次イオン化効率（感度）等で補正すれば定量的な評価が可能になる。ここでリンを含む基板から放出される二次イオン強度のデプスプロファイルの一例を図１２に示した。
そのために化学分析等でプローブ核酸密度を求めた標準核酸チップを、上記のリンを含む基板上に作製し、上記二つの強度の関係式（検量線）を予め求めておいた。具体的な上記関係式（検量線）の例を図６に示した。一旦この関係式（検量線）を作成することにより、以後は上記リンを含む基板から放出されるＰ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−などの二次イオン強度を基準としてドット中のＤＮＡ分子数、すなわちプローブ核酸密度を評価した。
以上よりプローブでの核酸の定量分析を行なうことが可能になった。
実施例１３（形成密度分布の画像表示）
次に実施例１２に用いた同じ試料の複数のＤＮＡプローブを含む領域を設定して一次イオンを試料面で走査し、発生する２次イオンを各走査点に対応させて表示した。同様な測定を行い、各走査点で得られたＰＯ３−のカウント数を段階に分け、各段階に対して擬似カラーを設定し、その強度分布すなわち、形成密度の分布を定量的に比較することが可能となった。
実施例１４（リンを含有するガラス基板上への形成したｄＴ４０核酸チップの作製）
ここでＰを含有する基板として、ＪＳＳＣＲ−１ガラス（組成（重量比）ＳｉＯ２：７２．２％、Ａｌ２Ｏ３：１．７５％、Ｆｅ２Ｏ３：０．０８％、ＴｉＯ２：０．０３％、ＣａＯ：６．７２％、ＭｇＯ：４．０１％、Ｎａ２Ｏ：１３．８％、Ｋ２Ｏ：０．８４％、ＳＯ３：０．２０％、Ｐ２Ｏ５：０．０２％、Ａｓ２Ｏ３：０．０７％）からなるガラス基板（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍ）を準備した以外は、実施例１１と同様な方法で核酸チップ基板を作製した。
実施例１５（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定）
次に実施例１４で作製した核酸チップ基板を用いて核酸チップのプローブでの核酸の分析を、実施例１２と同様な方法で行なったところ、定量的評価は可能であった。
実施例１６（形成密度分布の画像表示）
実施例１４で作製した核酸チップ基板を用いて核酸チップのプローブでの核酸の形成密度分布の画像表示を、実施例１３と同様な方法で行なったところ、形成密度の分布を定量的に比較することが可能であった。
比較例３（リンを含有しないガラス基板上への形成したｄＴ４０核酸チップの作製）
ここでリンを含有しない基板として、石英（組成ＳｉＯ２：１００％）からなる基板（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍ）を準備した以外は、実施例１１と同様な方法で核酸チップ基板を作製した。
比較例４（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定）
次に比較例３で作製した核酸チップ基板を用いて核酸チップのプローブでの核酸の定量を、実施例１２と同様な方法で行なったところ、リンを有する標準領域が存在しないので、高精度な定量的評価はできなかった。
比較例５（形成密度分布の画像表示）
比較例３で作製した核酸チップ基板を用いて核酸チップのプローブでの核酸の形成密度分布の画像表示を、実施例１２と同様な方法で行なったところ、リンを有する標準領域が存在しないので、高精度な画像表示はできなかった。
本発明によれば、ＤＮＡ等の核酸を含むドットから放出されるＰＯ２−や塩基に起因する二次イオンの強度を、リンを一定濃度含む領域から放出されるＰＯ２−等の二次イオン強度で規格化することで、上記ドット内の核酸プローブ量やプローブ塩基量、さらにはハイブリダイゼーション後の総核酸量などを定量的に評価することが可能となる。両者の感度係数を予め求めておけば、核酸量や塩基量の絶対値を求めることも理論的には可能となる。
【配列表】
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2004003531.tif 000008
2004003531.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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2004003531.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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