(57)【要約】本発明の目的は、オワンクラゲ以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質を提供することである。本発明によれば、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。（１）励起極大波長が４５５ｎｍであり、蛍光極大波長は４８８ｎｍである；（２）４５５ｎｍにおけるモル吸光係数が、３８７００又は２７７００である；（３）量子収率が０．８５又は０．８１である；及び（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜９で安定である：並びに、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。（１）励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５６１ｎｍである；（２）５４８ｎｍにおけるモル吸光係数が、７５９００又は５１０００である；（３）量子収率が０．４４又は０．５０である；及び（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＫａ＜５．０である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。
（１）励起極大波長が４５５ｎｍであり、蛍光極大波長は４８８ｎｍである；
（２）４５５ｎｍにおけるモル吸光係数が、３８７００又は２７７００である；
（３）量子収率が０．８５又は０．８１である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜９で安定である：
【請求項２】
クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。
（１）励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５６１ｎｍである；
（２）５４８ｎｍにおけるモル吸光係数が、７５９００又は５１０００である；
（３）量子収率が０．４４又は０．５０である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＫａ＜５．０である：
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
【請求項５】
配列番号３に記載のアミノ酸配列において６４番目のシステインがアラニンに置換されているアミノ酸配列、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において２１１番目のグルタミン酸がアラニンに置換されているアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列番号５又は６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号５又は６に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号５又は６に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列番号７又は８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号７又は８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号７又は８に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項１１】
請求項６から１０の何れか１項に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項１２】
請求項６から１０の何れか１項に記載のＤＮＡ又は請求項１１に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１３】
請求項１から５の何れか１項に記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。
【請求項１４】
他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項１３に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項１３又は１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
請求項１３から１５の何れか１項に記載の融合蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。
【請求項１７】
請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光蛋白質、請求項６から１０の何れかに１項に記載のＤＮＡ、請求項１１に記載の組み換えベクター、請求項１２に記載の形質転換体、又は請求項１３から１５の何れか１項に記載の融合蛋白質を含む、蛍光試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、改善された特性を有する新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。
背景技術
クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
また、ＧＦＰ変異体の他の例として、シアン色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）があり、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。また、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｍａ  ｓｐ．）からは赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）も単離されており、ＤａｓＲｅｄが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の４種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。
発明の開示
本発明は、オワンクラゲ又はイソギンチャク以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、オワンクラゲ又はイソギンチャク由来の蛍光蛋白質と比較して改善された蛍光特性を有する新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために、本発明者らは蛍光を発するサンゴに着目し、既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列に基づいて設計した好適なプライマーを用いてサンゴから蛍光蛋白質遺伝子を取得すべく鋭意研究を重ねた結果、先に蛍光蛋白質遺伝子を取得したアザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）とは別種のサンゴであるクサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）のｃＤＮＡライブラリーから上記プライマーを用いて蛍光蛋白質遺伝子を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたクサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の蛍光蛋白質の蛍光特性を調べた結果、当該蛍光蛋白質が所望の蛍光特性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。
（１）励起極大波長が４５５ｎｍであり、蛍光極大波長は４８８ｎｍである；
（２）４５５ｎｍにおけるモル吸光係数が、３８７００又は２７７００である；
（３）量子収率が０．８５又は０．８１である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜９で安定である：
本発明によれば、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質もまた提供される。
（１）励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５６１ｎｍである；
（２）５４８ｎｍにおけるモル吸光係数が、７５９００又は５１０００である；
（３）量子収率が０．４４又は０．５０である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＫａ＜５．０である：
本発明の別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
さらに、本発明の別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質もまた提供される。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号３に記載のアミノ酸配列において６４番目のシステインがアラニンに置換されているアミノ酸配列、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において２１１番目のグルタミン酸がアラニンに置換されているアミノ酸配列を有する蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡもまた提供される。
（ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡもまた提供される。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号５又は６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号５又は６に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号５又は６に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡもまた提供される。
（ａ）配列番号７又は８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号７又は８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号７又は８に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。好ましくは、他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質であり、さらに好ましくは他の蛋白質は細胞内小器官に特異的な蛋白質である。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の融合蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛍光蛋白質
本発明の蛍光蛋白質は、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来のもので、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）励起極大波長が４５５ｎｍであり、蛍光極大波長は４８８ｎｍである；
（２）４５５ｎｍにおけるモル吸光係数が、３８７００又は２７７００である；
（３）量子収率が０．８５又は０．８１である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜９で安定である：
本発明のもう一つの蛍光蛋白質は、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）由来のもので、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５６１ｎｍである；
（２）５４８ｎｍにおけるモル吸光係数が、７５９００又は５１０００である；
（３）量子収率が０．４４又は０．５０である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＫａ＜５．０である
クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）はサンゴの１種で、主に西部大西洋に生息し、群体の外形は多角形で触手が長く、全体が鮮やかなオレンジ色を呈することを特徴とする。
なお、本書中以下の実施例では、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）を出発材料として上記特性を有する本発明の蛍光蛋白質を単離したが、クサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）以外の蛍光を発するサンゴから本発明の蛍光蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような蛍光蛋白質も本発明の範囲内である。
本発明の第１の蛍光蛋白質（ＫＣｙ−１）は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が４５５ｎｍであり、蛍光極大波長は４８８ｎｍである。モル吸光係数は３８７００（４５５ｎｍ）あり、量子収率は０．８５である。本発明の第２の蛍光蛋白質（ＫＣｙ−２）は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が４５５ｎｍであり、蛍光極大波長は４８８ｎｍである。モル吸光係数は２７７００（４５５ｎｍ）であり、量子収率は０．８１である。これに対してＥＣＦＰ（クロンテック）のモル吸光係数は２８７５０（４３５ｎｍ）であり、量子収率は０．４０である。
本発明の第３の蛍光蛋白質（ＫＯ−１）は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５６１ｎｍである。モル吸光係数は７５９００（５４８ｎｍ）であり、量子収率は０．４４である。本発明の第４の蛍光蛋白質（ＫＯ−２）は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５６１ｎｍである。モル吸光係数は５１０００（５４８ｎｍ）であり、量子収率は０．５０である。これに対してＤｓＲｅｄ（クロンテック）のモル吸光係数は８６１００（５５９ｎｍ）であり、量子収率は０．２９である。
モル吸光係数は蛍光分子１モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発する事が出来るかを表した数値であるため、モル吸光係数、量子収率の値が大きいことは蛍光が強いことを示す。従って、上記の本発明蛍光蛋白質のうちシアン系蛍光蛋白質であるＫＣｙ−１及びＫＣｙ−２は、ＥＣＦＰよりもモル吸光係数、量子収率の値が大きいので、ＥＣＦＰよりもより強い蛍光を発する。具体的には、ＫＣｙ−１はＥＣＦＰよりも約２〜３倍明るく、ＫＣｙ−２はＥＣＦＰよりも約１．５倍明るい。
また、励起および蛍光の極大波長に関してはＥＣＦＰと本発明の蛍光蛋白質ＫＣｙ−１及びＫＣｙ−２との間に大きな差はないが、本発明の蛍光蛋白質ＫＣｙ−１及びＫＣｙ−２の励起、蛍光スペクトルはＥＣＦＰのように長波長側に肩がなくシャープであるため、他の蛍光分子との組み合わせて行うマルチカラーイメージング等に際して有利と言える。
また、ＫＣｙ−１及びＫＣｙ−２は、ｐＨ５〜９の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低いことを特徴とする。即ち、ｐＨ５〜９の範囲において蛍光強度のピーク値の変動が少なく、このｐＨ範囲において高い蛍光強度を維持することができる。従来から使用されているＥＣＦＰの場合には、ｐＨ７以下では蛍光強度が低下するため生体内での使用に際して制約があったが、本発明の蛍光蛋白質にはそのような制約がない。
一方、上記の本発明蛍光蛋白質のうちオレンジ蛍光蛋白質であるＫＯ−１、ＫＯ−２は、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）由来赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ）より約２倍明るい。また、ＫＯ−１、ＫＯ−２は、既存の蛍光タンパク質とは異なる波長に蛍光スペクトルのピークを有している。即ち、ＥＹＦＰ（黄色）（クロンテック社）は５３０ｎｍ付近に蛍光スペクトルのピークを持ち、ＤｓＲｅｄ（クロンテック社）は５８０ｎｍ付近に蛍光スペクトルのピークを持つのに対し、本発明のＫＯ−１及びＫＯ−２は、５６１ｎｍ付近に蛍光スペクトルのピークを持つ。
さらに本発明の蛋白質ＫＯ−１の変異体の具体例としては、
（１）ＫＯ−１のアミノ酸配列中において６４番目のシステインをアラニンに置換することにより得られる、蛍光特性がＫＯに較べて短波長側にシフトした緑色（蛍光極大５０８ｎｍ、励起極大４９６ｎｍ）の蛍光を放つ変異体、並びに、
（２）ＫＯ−１のアミノ酸配列中において２１１番目のグルタミン酸をアラニンに置換することにより得られる、ＫＯに較べて蛍光特性が長波長側にシフトした赤色（蛍光極大５７８ｎｍ、励起極大５６３ｎｍ）の蛍光を放つ変異体、
を挙げることができる。
本発明の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
本発明の蛍光蛋白質のさらなる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「同等の蛍光特性」とは、同等の蛍光強度、同等の励起波長、同等の蛍光波長、同等のｐＨ感受性などを有することを意味する。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１から４の何れかに記載したアミノ酸配列並びに配列番号５から８の何れかに記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて上記したような各種の公知の蛍光蛋白質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡもまた挙げられる。
（ａ）配列番号５又は６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号５又は６に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号５又は６に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡもまた挙げられる。
（ａ）配列番号７又は８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号７又は８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ配列番号７又は８に記載の塩基配列がコードする蛋白質と同等の蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性蛋白プロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス  ＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１から４の何れかに記載したアミノ酸配列及び配列番号５から８の何れかに記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片も入手する。
次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモータ活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモータの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモータの活性を測定することが可能である。被検プロモータとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記被検アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモータ活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「ｐＮＥＯ」（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．ＭＯｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）、「ｐＣＡＧＧＳ」（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ．Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））、「ｐＲｃ／ＣＭＶ」（インビトロゲン社製）、「ｐＣＤＭ８」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「ｐＲＳ３０３」，「ｐＲＳ３０４」，「ｐＲＳ３０５」，「ｐＲＳ３０６」，「ｐＲＳ３１３」，「ｐＲＳ３１４」，「ｐＲＳ３１５」，［ｐＲＳ３１６］（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−２７）、「ｐＲＳ４２３」，「ｐＲＳ４２４」，「ｐＲＳ４２５」，「ｐＲＳ４２６」（Ｔ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄａｎｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｓｈｅｒｏ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１２２）などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、Ｌ細胞、ＢａｌｂＣ−３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＲＫ（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」などの酵母細胞や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社  アキシオフォト  フィルターセット  ０９）や画像解析装置（ＡＴＴＯ  デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の蛍光蛋白質のうち励起極大波長が４５５ｎｍであり、蛍光極大波長は４８８ｎｍである蛍光蛋白質の場合は、励起光４４０〜４６０ｎｍ、蛍光４８０〜５２０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。また、本発明の蛍光蛋白質のうち励起極大波長が５４８ｎｍであり、蛍光極大波長は５６１ｎｍである蛍光蛋白質の場合は、励起光５３０〜５５０ｎｍ、蛍光５５０〜６００ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
（６）本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
（実施例１）珊瑚（クサビライシ）からの新規蛍光蛋白遺伝子の単離
（１）  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料には口盤部分が赤色とオレンジ色を呈する２個体のクサビライシ（Ｆｕｎｇｉａ  ｓｐ．）を用いた。クサビライシをハンマーで砕き、湿重量４ｇに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を７．５ｍｌ加えて攪拌し、１５００×ｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム１．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、３分間静置した。７５００×ｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール３．７５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後１０分間静置した。１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。赤色個体から５１．６μｇ、オレンジ色の個体から７０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
（２）  Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ３μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。使用したプライマーの配列を以下に記載する。
2003054191.tif 000002
（ここで、Ｒ＝Ａ又はＧを示し、Ｙ＝Ｃ又はＴを示し、Ｖ＝Ａ、Ｃ又はＧを示し、Ｄ＝Ａ、Ｇ又はＴを示す。）
以下のＰＣＲ反応液組成を使用した。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）      ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１                              １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ２                              １μｌ
ミリＱ                                                ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）              １μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３秒（変性）
５２℃で３０秒（テンプレートへのアニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行い、アニーリング温度１サイクルごとに０．３℃下げた。即ち、３０サイクル時の温度は４３℃となる。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で、予想された大きさの３５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。
（４）  サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）  ５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として（１）で調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを３μｇを使用した。
オレンジ色個体のＤＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には、
2003054191.tif 000003
のプライマーを用いた（ここで、Ｉはイノシンを示す）。
二回目の増幅には
2003054191.tif 000004
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された７００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
同じく赤色個体のＤＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には、
2003054191.tif 000005
のプライマーを用いた（ここで、Ｉはイノシンを示す。）
二回目の増幅には
2003054191.tif 000006
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された５００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）  ３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴｄＴプライマーのＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調製したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを３μｌ使用した。
作成したプライマーは以下の通りである。
2003054191.tif 000007
以下のＰＣＲ反応組成を使用した。
ＰＣＲ反応液組成：
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）      ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ３またはｐｒｉｍｅｒ４            １μｌ
１０μＭ  ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ                １μｌ
ミリＱ                                                ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）              １μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５５℃で３０秒（テンプレートへアニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
アガロースゲル電気泳動で、増幅された約８５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（７）  大腸菌での蛋白発現
得られた全長の塩基配列より、蛋白のＮ末端、Ｃ末端に相当する部分でプライマーを作製し、（２）で調製したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーはオレンジ色、赤色個体由来、共にｐｒｉｍｅｒ５を使用した。
2003054191.tif 000008
以下のＰＣＲ反応液組成を使用した。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）        ３μｌ
Ｘ１０  ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー                        ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                    ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ５                                  １μｌ
２０μＭ  ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ                  １μｌ
ミリＱ                                                  ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）      １μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５５℃で３０秒（テンプレートへのプライマーのアニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約１０００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＲＳＥＴ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。しかしながら、大腸菌で発現させた蛋白質はオレンジ色、赤色個体由来共に蛍光は発しなかった。
今回クローニングされた遺伝子による翻訳蛋白（オレンジ個体由来の翻訳蛋白をＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、赤色固体由来の翻訳蛋白をＫｕｓａｂｉｒａ−Ｃｙａｎとする）は、既知の蛍光蛋白（ＦＰ４８６、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）にくらべてＮ末端の約１０アミノ酸を欠失することが明らかとなった（表１）。よってＮ末端に２種類の約１０個のアミノ酸から成るセグメントを補充することとした。
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Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｃｙａｎともにイタリック部分（矢印より後ろ）の配列がクローニングされた。
一つは全体的にアミノ酸配列の似ているＦＰ４８６のＮ末端の１１アミノ酸（ＭＡＬＳＮＫＦＩＧＤＤ）、もう一つは以前にクローニングしたＡｚａｍｉ−ＧｒｅｅｎのＮ末端の７アミノ酸（ＭＳＶＩＫＰＥ）を用いた。その結果どちらのアミノ酸配列を付加した場合もオレンジ色個体由来のものはオレンジ色の蛍光を発するようになったが、赤色個体由来のものはシアンの蛍光を発するようになった。オレンジ色個体由来のものにＡｚａｍｉ−ＧｒｅｅｎのＮ末端の７アミノ酸を付加したものをＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ−１（ＫＯ−１）（配列番号３）、オレンジ色個体由来のものにＦＰ４８６のＮ末端の１１アミノ酸を付加したものをＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ−２（ＫＯ−２）（配列番号４）とし、赤色個体由来のものにＡｚａｍｉ−ＧｒｅｅｎのＮ末端の７アミノ酸を付加したものをＫｕｓａｂｉｒａ−Ｃｙａｎ−１（ＫＣｙ−１）（配列番号１）、赤色個体由来のものにＦＰ４８６のＮ末端の１１アミノ酸を付加したものをＫｕｓａｂｉｒａ−Ｃｙａｎ−２（ＫＣｙ−２）（配列番号２）とした。
また、ＫＣｙ−１、ＫＣｙ−２、ＫＯ−１、及びＫＯ−２の全塩基配列をそれぞれ配列番号５から８に記載する。
上記４種類の蛋白はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。
（８）  蛍光特性の解析
２０μＭ蛍光蛋白、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。ＫＣｙ−１、ＫＣｙ−２では４５５ｎｍに吸収のピークが認められ、４００ｎｍにおける吸収が０．００５となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈して、４００ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５２０ｎｍにおける蛍光による励起スペクトルを測定した。ＥＣＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を同様に４００ｎｍにおける吸収が０．００５となるようにして蛍光スペクトルを測定し、ＥＣＦＰの量子収率を０．４としてＫＣｙ−１、ＫＣｙ−２の量子収率を求めた。ＫＯ−１、ＫＯ−２では５４８ｎｍに吸収のピークが認められ、５００ｎｍにおける吸収が０．００２５となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈して、５００ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５９０ｎｍにおける蛍光による励起スペクトルを測定した。ＤｓＲｅｄ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を同様に５００ｎｍにおける吸収が０．００２５となるようにして蛍光スペクトルを測定し、ＤｓＲｅｄの量子収率を０．２９としてＫＯ−１、ＫＯ−２の量子収率を求めた。結果を表２及び図１に示す。
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（９）Ｎ末端アミノ酸配列の違いによる発現の差
上記各蛋白を大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで発現誘導をかけてから１７時間、５０時間、７４時間でサンプリングを行い、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルの変化を解析した。結果を図２及び図３示す。蛍光出現の様子はＮ末端に付加したアミノ酸によって違いが見られた。オレンジ、シアンともにＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（アザミクサビライシ（Ｇａｌａｘｅａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）蛍光蛋白質）のＮ末端の７アミノ酸を付加したもののほうが蛍光を発するのが早かった。
ＫＯ−１、ＫＯ−２ではグリーンの蛍光がでてからオレンジへと移行するが、その成熟過程が明らかにＫＯ−１のほうが速かった。
（１０）ｐＨ感受性の測定
ＫＣｙ−１、ＫＣｙ−２では４００ｎｍの吸収が０．００５となるように下記の緩衝液で希釈し、ＫＯ−１、ＫＯ−２では５００ｎｍの吸収が０．００２５となるように下記の緩衝液で希釈して蛍光スペクトルを測定した。測定結果を図４に示す。
各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、５    ：  酢酸バッファー
ｐＨ６        ：  ＭＥＳバッファー
ｐＨ７        ：  ＭＯＰＳバッファー
ｐＨ８        ：  ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０  ：  グリシンバッファー
ｐＨ１１      ：  リン酸バッファー
（実施例２）Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）のアミノ酸置換変異体の作製
Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）はオレンジ（蛍光極大５６１ｎｍ、励起極大５４８ｎｍ）の蛍光を放つ蛍光蛋白質であるが、ＫＯ−１のアミノ酸配列の６４番目のシステインをアラニンに置換することにより、蛍光特性がＫＯに較べて短波長側にシフトした緑色（蛍光極大５０８ｎｍ、励起極大４９６ｎｍ）の蛍光を放つ変異体を得た（図５）。また、ＫＯ−１の２１１番目のグルタミン酸をアラニンに置換することにより、ＫＯに較べて蛍光特性が長波長側にシフトした赤色（蛍光極大５７８ｎｍ、励起極大５６３ｎｍ）の蛍光を放つ変異体を得た（図６）。
産業上の利用の可能性
本発明により、クラゲ以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質が提供されることになった。本発明の蛍光蛋白質は、所望の蛍光特性を有し、またｐＨ感受性が低いことから、分子生物学的分析において有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のクサビライシ由来の蛍光蛋白質（ＫＣｙ−１、ＫＣｙ−２）とＥＣＦＰ、本発明のクサビライシ由来の蛍光蛋白質（ＫＯ−１、ＫＯ−２）とＤｓＲｅｄの蛍光スペクトル及び励起スペクトルを比較した結果を示す。
図２は、本発明のクサビライシ由来の蛍光蛋白質であるＫＣｙ−１とＫＣｙ−２、ＫＯ−１とＫＯ−２の蛍光特性を解析した結果を示す。
（１）Ｋｃｙ−１とＫｃｙ−２の大腸菌での発色の違い
（４００ｎｍで励起したときの４８８ｎｍの蛍光）
（２）ＫＯ−１とＫＯ−２の大腸菌での発色の違いを示す。
（５００ｎｍで励起したときの５６１ｎｍの蛍光）
（３）ＫＯ−１とＫＯ−２における蛍光変化
（４７０ｎｍで励起したときのオレンジ成分（５６１ｎｍ）／グリーン成分（５０８ｎｍ）の値（成熟度））
図３は本発明のクサビライシ由来の蛍光蛋白質（ＫＯ−１及びＫＯ−２）のグリーン成分（５０８ｎｍ）、オレンジ成分（５６１ｎｍ）の時間経過による変化を示す。
図４は本発明のクサビライシ由来の蛍光蛋白質（ＫＣｙ−１、ＫＣｙ−２、ＫＯ−１及びＫＯ−２）の蛍光強度のｐＨ感受性を示す。
図５は、本発明のクサビライシ由来の蛍光蛋白質の変異体（ＫＯ−Ｃ６４Ａ）の蛍光（ｅｍ）及び励起（ｅｘ）スペクトル（左図）、並びに吸収スペクトル（右図）を示す。
図６は、本発明のクサビライシ由来の蛍光蛋白質の変異体（ＫＯ−Ｅ２１１Ａ）の蛍光（ｅｍ）及び励起（ｅｘ）スペクトル（左図）、並びに吸収スペクトル（右図）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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