(57)【要約】本発明は、コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有する生体触媒を、水性媒体中で、コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルに接触させ、該水性媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させ、該水性媒体からＣＤＰ−コリンを採取することを特徴とするＣＤＰ−コリンの製造法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有する生体触媒を、水性媒体中で、コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルに接触させ、該水性媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させ、該水性媒体からＣＤＰ−コリンを採取することを特徴とするＣＤＰ−コリンの製造法。
【請求項２】
生体触媒が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞からなる群より選ばれる細胞、該細胞の培養液、または該細胞の処理物を含有する生体触媒である、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項３】
細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター属（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属からなる群より選ばれる１もしくは２以上の属に属する微生物である請求の範囲第２項記載の製造法。
【請求項４】
細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属からなる群より選ばれる１もしくは２以上の属に属する微生物である、請求の範囲第２項の製造法。
【請求項５】
細胞が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物およびエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、請求の範囲第２項記載の製造法。
【請求項６】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である、請求の範囲第３〜第５項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求の範囲第３〜第５項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項８】
細胞が、ウリジン５’−三リン酸からシチジン５’−三リン酸を生成する活性を有するシチジン−５’−トリリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡ、コリンからホスホリルコリンを生成する活性を有するコリンキナーゼをコードするＤＮＡまたはシチジン５’−三リン酸とホスホリルコリンからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有するコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入して得られる形質転換体であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法に関する。
背景技術
シチジン５’−ジリン酸コリン（以下、ＣＤＰ−コリンと略す）は、リン脂質であるホスファチジルコリン（レシチン）の生合成中間体であり、頭部外傷、脳手術に伴う意識障害、パーキンソン病、脳卒中片マヒ等の治療に用いられている。
ＣＤＰ−コリンの製造法としては、化学的合成法、微生物菌体を用いてシチジン５’−三リン酸（以下、ＣＴＰと略す）、シチジン５’−二リン酸（以下、ＣＤＰと略す）またはシチジン５’−一リン酸（以下、ＣＭＰと略す）から製造する方法（特公昭４８−２３５８、特公昭４８−４０７５８、特公昭４８−２３５９）等が知られているが、いずれも収率が低い、原料が高価である、などの問題がある。
微生物を用いて生産する方法においては、遺伝子組み換え微生物を利用して、オロット酸、およびコリンまたはホスホリルコリンから製造する方法（特開平５−２７６９７４）、ウリジン５’−一リン酸（以下、ＵＭＰと略す）、およびコリン（またはホスホリルコリン）から製造する方法（ＷＯ９９／４９０７３）、ＣＭＰとコリンから製造する方法（特開２００１−１０３９７３）が報告されている。オロット酸は比較的安価であるので、これらの反応の基質としての製造原料として優れているが、さらに安価な原料を利用することができれば、さらに生産コストを下げることができる。しかし、これまでにさらに安価な基質としてウラシルを用いる方法は知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、ＣＤＰ−コリンの効率のよい製造法を提供することにある。
本発明は、安価なコリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルを基質とする、ＣＤＰ−コリンの新規な製造法に関する。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）に関する。
（１）  コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有する生体触媒を、水性媒体中で、コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルに接触させ、該水性媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させ、該水性媒体からＣＤＰ−コリンを採取することを特徴とするＣＤＰ−コリンの製造法。
（２）  生体触媒が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞からなる群より選ばれる細胞、該細胞の培養液、または該細胞の処理物を含有する生体触媒である、上記（１）の製造法。
（３）  細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター属（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属からなる群より選ばれる１もしくは２以上の属に属する微生物である上記（２）の製造法。
（４）  細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属からなる群より選ばれる１もしくは２以上の属に属する微生物である、上記（２）の製造法。
（５）  細胞が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物およびエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、上記（２）の製造法。
（６）  コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である、上記（３）〜（５）いずれか１つの製造法。
（７）  エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、上記（３）〜（５）いずれか１つの製造法。
（８）  細胞が、ウリジン５’−三リン酸（以下、ＵＴＰと略す）からＣＴＰを生成する活性を有するシチジン−５’−トリリン酸シンセターゼ（以下、ＰｙｒＧと略す）をコードするＤＮＡ、コリンからホスホリルコリンを生成する活性を有するコリンキナーゼ（以下、ＣＫＩと略す）をコードするＤＮＡ、またはＣＴＰとホスホリルコリンからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有するコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ（以下、ＣＣＴと略す）をコードするＤＮＡを導入して得られる形質転換体であることを特徴とする、上記（２）の製造法。
本発明に用いられる生体触媒としては、コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルからＣＤＰ−コリンを生成する活性（以下、ＣＤＰ−コリン生成活性と略す）を有する生体触媒であれば、いずれのものも用いることができる。
このような生体触媒としては、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する細胞、該細胞の培養液、該細胞の処理物等をあげることができる。
細胞としては、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する細胞であればいずれの細胞でも用いることができる。例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等をあげることができるが、微生物が好適に用いられる。
微生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター属（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する微生物をあげることができる。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに属する微生物をあげることができる。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物としては、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ等に属する微生物をあげることができる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ等に属する微生物をあげることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ等に属する微生物をあげることができる。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等に属する微生物をあげることができる。シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物としては、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ等に属する微生物をあげることができる。ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属に属する微生物としては、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等に属する微生物をあげることができる。アースロバクター属に属する微生物としては、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ等に属する微生物をあげることができる。オーレオバクテリウム属に属する微生物としては、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｐｅｒｄａｅ、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ等に属する微生物をあげることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等に属する微生物をあげることができる。セルロモナス属に属する微生物としては、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｉｇｅｎａ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｃａｒｔａ等に属する微生物をあげることができる。クラビバクター属に属する微生物としては、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｒａｔｈａｙｉ等に属する微生物をあげることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ６８７２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ等に属する微生物をあげることができる。クルトバクテリウム属に属する微生物としては、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｉｄｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｕｍ等に属する微生物をあげることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４等のＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｃｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｐｅｒｉａｌｅ等に属する微生物をあげることができる。ピメロバクター属に属する微生物としては、Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ等に属する微生物をあげることができる。
サッカロマイセス属に属する微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等に属する微生物をあげることができる。シゾサッカロマイセス属に属する微生物としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等に属する微生物をあげることができる。クリュイベロマイセス属に属する微生物としては、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ等に属する微生物をあげることができる。トリコスポロン属に属する微生物としては、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ等に属する微生物をあげることができる。シワニオマイセス属に属する微生物としては、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等に属する微生物をあげることができる。ピヒア属に属する微生物としては、Ｐｉｃｈｉａ ａｃａｃｉａｅ等に属する微生物をあげることができる。キャンディダ属に属する微生物としては、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等に属する微生物をあげることができる。
微生物としては、上記の微生物をあげることができるが、エシェリヒア属、バチルス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、およびサッカロマイセス属に微生物が好ましく用いられ、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物がさらに好ましく用いられる。
動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
昆虫細胞としては、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｐｄａ）の卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、トリコプルシア・ニー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）の卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕等あげることができる。
植物細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
細胞が、ＣＤＰ−コリン生成活性を有していない場合には、該細胞に、ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡを常法によって導入するか、または、該活性を有する他の細胞と融合させることにより、該活性が付与された細胞を作製し、これを用いることができるが、ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡを以下に示す方法によって細胞に導入して得られる形質転換体が好ましく用いられる。
ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素としては、例えば、ウラシルからウリジンを生成する活性を有するウリジンホスホリラーゼ〔ＥＣ  ２．４．２．３〕、ウリジンからＵＭＰを生成する活性を有するウリジンキナーゼ〔ＥＣ  ２．７．１．４８〕、ＵＭＰからウリジン５’−二リン酸（以下、ＵＤＰと略す）を生成する活性を有するウリジル酸・シチジル酸キナーゼ〔ＥＣ  ２．７．４．１４〕、ＵＤＰからＵＴＰを生成する活性を有するヌクレオシド二リン酸キナーゼ〔ＥＣ  ２．７．４．６〕、ＵＴＰからＣＴＰを生成する活性を有するシチジン−５’−トリリン酸シンセターゼ〔ＥＣ  ６．３．４．２〕（ＰｙｒＧ）、コリンからホスホリルコリンを生成する活性を有するコリンキナーゼ〔ＥＣ  ２．７．１．３２〕（ＣＫＩ）、ＣＴＰとホスホリルコリンからＣＤＰ−コリンを生成する活性を有するコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ〔ＥＣ  ２．７．７．１５〕（ＣＣＴ）等をあげることができる。
ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡとしては、上記の酵素をコードするＤＮＡがあげられ、ＰｙｒＧ、ＣＫＩまたはＣＣＴをコードするＤＮＡが好適に用いられる。
ＰｙｒＧをコードするＤＮＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，５５６８（１９８６）〕。ＰｙｒＧをコードするＤＮＡの供給源としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのベクターｐＵＣ８〔Ｇｅｎｅ，１９，２５９（１９８２）〕のマルチクローニングサイトのＳｍａＩ−ＰｓｔＩ部位にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＰｙｒＧをコードするＤＮＡを含む２４２６ｂｐのＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片が挿入されたプラスミドであるｐＭＷ６などがあげられる。
ＣＣＴをコードするＤＮＡは、その全塩基配列が決定されている〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６９，４７７（１９８７）〕。ＣＣＴをコードするＤＮＡの供給源としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのベクターｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕のマルチクローニングサイトのＳｍａＩ部位に酵母由来のＣＣＴをコードするＤＮＡを含む１２９６ベースペア（以下「ｂｐ」と略記する）のＤｒａＩ断片が挿入されたプラスミドｐＣＣ４１〔生化学，６０，７０１（１９８８）〕などがあげられる。
ＣＫＩをコードするＤＮＡも同様に酵母染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２０５３（１９８９）〕。ＣＫＩをコードするＤＮＡの供給源としては、酵母とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのシャトルベクターＹＥｐＭ４〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２９（１９８７）〕に酵母由来のＣＫＩをコードするＤＮＡを含む２６９２ｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片が挿入されたプラスミドｐＣＫ１Ｄなどがあげられる。
上記ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡの塩基配列情報をもとに、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕に従って、これらのＤＮＡを取得し、該ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、組換え体ＤＮＡを作製し、上記細胞を宿主細胞として形質転換を行い、得られた形質転換体より、ＣＤＰ−コリン生成活性を有する生体触媒を容易に取得することができる。
例えば、ＰｙｒＧ、ＣＣＴまたはＣＫＩをコードするＤＮＡを、上記プラスミドｐＭＷ６、プラスミドｐＣＣ４１またはプラスミドｐＣＫ１Ｄより取得し、得られたＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
また、必要に応じて、ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡはＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素の効率的発現に有用である。
ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡの断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際、それぞれのＤＮＡ断片は、それぞれ別個に発現ベクターに挿入してもよいし、複数のＤＮＡを同じ発現ベクターに挿入してもよい。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、上記細胞をあげることができる。
発現ベクターとしては、該宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
宿主細胞として、細菌等の原核生物を用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕、ｐＱＥ−８〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
宿主細胞として酵母を用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
宿主細胞として動物細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
宿主細胞として昆虫細胞を用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
宿主細胞として植物細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
細胞がＣＤＰ−コリン生成活性を有していない場合は、ＣＤＰ−コリン生合成活性が得られるように、適宜異なる２種以上の細胞を組み合わせて、ＣＤＰ−コリン生合成活性を有する細胞として用いてもよい。
細胞が、ＣＤＰ−コリン生成活性を有している場合であっても、該細胞に、上記ＣＤＰ−コリン生成活性に関わる酵素をコードするＤＮＡを常法によって導入することにより、ＣＤＰ−コリン生成活性の強化された細胞を得ることができる。
なお、細胞が、ＣＤＰ−コリン生成活性を有している場合であっても、異なる２種以上の細胞を組み合わせて用いることができる。
組み合わせとしては、例えばコリネバクテリウム属に属する微生物とエシェリヒア属に属する微生物の組み合わせ等をあげることができる。
上記細胞が細菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合は、該細胞を培養する培地として、該細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該細胞の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該細胞が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜５０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア水などを用いて行う。
該細胞が、動物細胞である場合は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
該細胞が、昆虫細胞である場合は、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製〕、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地〔ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもジェイ・アール・エイチ・バイオサイエンス（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
該細胞が、植物細胞である場合、培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
該細胞が形質転換体であって、かつ、該細胞を形質転換するために用いた組換え体ＤＮＡが抗生物質耐性遺伝子を保有している場合は、該細胞を培養する培地に、該組換え体ＤＮＡが保有する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加してもよい。
生体触媒として２種以上の異なる細胞、該細胞の培養液または処理物を用いる場合は、それぞれの細胞を上記方法に従って別々にあるいは同一の培地中で培養して得られるものを用いることができる。
２種以上の異なる細胞を同一の培地中で培養する場合、これら細胞を同時に培養しても、一つの細胞の培養中、あるいは培養終了後に残りの細胞を該培地中で培養してもよい。
２種以上の細胞の組合せは、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞から選ばれるいずれの細胞の組み合わせであってもよいが、微生物との組み合わせであることが好ましい。例えば、微生物と微生物、微生物と動物細胞、微生物と昆虫細胞、または微生物と植物細胞、微生物と動物細胞と植物細胞、微生物と動物細胞と昆虫細胞の組み合わせ等があげられるが、微生物と微生物の組み合わせが好ましい。
例えば、微生物と微生物の組み合わせとしては、上記微生物のいずれの組み合わせであってもよく、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、シュードモナス属、ストレプトコッカス属、シノリゾビウム属、ヘモフィラス属、アースロバクター属、オーレオバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、セルロモナス属、クラビバクター属、コリネバクテリウム属、クルトバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ピメロバクター属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クリュイベロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオマイセス属、ピヒア属およびキャンディダ属からなる群より選ばれる２以上の属に属する微生物の組み合わせがあげられる。
例えば、コリネバクテリウム属に属する微生物とエシェリヒア属に属する微生物の組み合わせがあげられる。
ＣＤＰ−コリン生成活性を有する生体触媒の一つである、上記細胞の処理物としては、上記で得られる細胞の培養液を濃縮機もしくは乾燥機等で濃縮もしくは乾燥処理して得られる該細胞の培養液の濃縮物もしくは乾燥物、該細胞の培養液を濾過もしくは遠心分離等で固液分離して得られる細胞、該細胞を乾燥機等で乾燥処理して得られる該細胞の乾燥物、該細胞を界面活性剤または有機溶剤等で処理して得られる該細胞の界面活性剤または有機溶剤処理物、該細胞をリゾチーム等の細胞溶解酵素で処理して得られる該細胞の細胞溶解酵素処理物等があげられる。
該細胞処理物をさらに塩析処理、等電点沈殿処理、有機溶媒沈殿処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理等、通常の酵素の精製手段を施して得られる粗酵素または精製酵素も細胞処理物として用いることができる。
２種以上の細胞を用いる場合、２種以上の細胞から別々に調製して得られる細胞の処理物を別々にＣＤＰ−コリン生合成活性を有する生体触媒として用いてもよいし、これら細胞処理物を混合して得られる混合物を、ＣＤＰ−コリン生合成活性を有する生体触媒として用いてもよい。
また、上記の細胞または細胞の処理物を水不溶性の担体やゲル等に固定化し、これを生体触媒として用いてもよい。
以下、ＣＤＰ−コリンの製造方法について述べる。
ＣＤＰ−コリンは、上記生体触媒と基質とを水性媒体中で接触させることによって該水性媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させ、該水性媒体からＣＤＰ−コリンを採取することによって製造することができる。
具体的には、上記生体触媒と、基質であるコリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルとを水性媒体中で混合して得られる混合物に、必要に応じて、他の成分を添加して、ｐＨを５〜１０、より好ましくは６〜８に保持して、２０〜５０℃で２〜４８時間保持する。
生体触媒の使用量は、当該生体触媒の比活性等により異なる。例えば、生体触媒として細胞の培養液もしくは細胞の処理物を用いる場合は、該培養液もしくは細胞の処理物を遠心分離して得られる湿菌体として、ウラシル１ｍｇに対して、５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜３００ｍｇとなるように用いることが好ましい。
コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩としては、例えば、コリン、塩化コリン、臭化コリン、ヨウ化コリン等のハロゲン化コリン、重炭酸コリン、重酒石酸コリン、硫酸メチルコリン、クエン酸二水素コリン、ホスホリルコリン、塩化ホスホリルコリン等のホスホリルコリンのハロゲン化物等があげられるが、コリンもしくはホスホリルコリンのハロゲン化物が好ましく用いられ、塩化コリン、塩化ホスホリルコリンがさらに好ましく用いられる。
コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルは、化学合成して得てもよいし、発酵法などにより微生物から得てもよい。また、必ずしも純粋に精製されたものでなくても、ＣＤＰ−コリン生成反応を阻害しない限り、塩などの不純物を含んでいてもよい。また、市販のものを用いてもよい。
コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルの濃度は、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌが好ましく、１０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。
必要に応じて添加される他の成分としては、エネルギー供与体、リン酸イオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン、界面活性剤および有機溶剤などがあげられる。これらの成分は、生体触媒等から必要量が持ち込まれる場合には添加する必要がない。
エネルギー供与体としては、グルコース、フラクトース、シュークロースなどの糖、糖蜜、澱粉加水分解物、有機酸（ピルビン酸、乳酸、酢酸、α−ケトグルタル酸等）、アミノ酸（グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）等が用いられる。これらは、０．０２〜２．０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
リン酸イオンとしては、正リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸等のポリリン酸、ポリメタリン酸、リン酸カリウム、リン酸２カリウム、リン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム等の無機のリン酸塩等を用いることができる。これらのリン酸イオンは、１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
マグネシウムイオンとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機のマグネシウム塩等を用いることができる。マグネシウムイオンは５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
アンモニウムイオンとしては、アンモニア水、アンモニアガス、各種無機あるいは有機のアンモニア塩、酵母エキス、コーンスチープリカー等に含有されるアンモニウムイオン等を用いることができる。また、アンモニウムイオンに代えて、グルタミンやカザミノ酸等のアンモニウムイオンを含有する有機栄養源を用いることもできる。これらのアンモニウムイオンは、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
界面活性剤としては、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（例えばラビゾールＢ−８０、日本油脂社製）、ラウロイルザルコシネート等の陰イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンセチルエーテル（例えばノニオンＰ−２０８、日本油脂社製）等の非イオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）等の三級アミン類等、ＣＤＰ−コリンの生成を促進するものであればいずれでも使用できる。これらは、通常０．１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／Ｌの濃度で用いられる。
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール等）、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド等があげられる。これらは通常、０．１〜１００ｍｌ／Ｌ、好ましくは１〜５０ｍｌ／Ｌの濃度で用いられる。
水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕塩酸緩衝液等の緩衝液があげられる。
また、水性媒体としては、生体触媒として使用する細胞を培養するための培地、該細胞の培養液、該培養液の培養上清等を用いることもできる。培地、培養液、培養上清等を水性媒体として用い、生体触媒として細胞を用いる場合は、該細胞の培養中または培養終了後のいずれかにおいて、該細胞とコリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩およびウラシルを接触させればよい。なお、該細胞の培地および培養条件は上記のものがあげられる。
このようにして、水性媒体中にＣＤＰ−コリンを生成蓄積させることができる。生成蓄積したＣＤＰ−コリンは、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析等の通常の単離精製手段により単離精製することができる。
以下に本発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４株に酵母由来のＣＣＴ遺伝子およびＣＫＩ遺伝子と由来のＰｙｒＧ遺伝子を組み込んだプラスミドｐＣＫＧ５５を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株（特開平５−２７６９７４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７１７）を５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬ培地〔１０ｇ／Ｌバクトトリプトン［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製］、５ｇ／Ｌ酵母エキス（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウムを含みｐＨを７．２に調整した培地〕２００ｍｌの入った２Ｌバッフル付き三角フラスコに接種し、２５℃、２４時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。この培養液２０ｍｌを、５ｇ／Ｌグルコース（別殺菌）、５ｇ／Ｌペプトン（極東製薬工業社製）、６ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、２５０ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物（別殺菌）および４ｍｇ／ＬビタミンＢ１（別殺菌）を含む液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の培養条件下で、１４％（ｖ／ｖ）アンモニア水を用いてｐＨ７．０に調整しつつ培養を行った。
培養中、培養液をサンプリングし、サンプリングした培養液を遠心分離して得られる上清中のグルコース濃度を測定した。該上清中のグルコース濃度がゼロになった時点で、培養液を２５０ｍｌ無菌的に採取した。
採取した培養液を５ｇ／Ｌグルコース（別殺菌）、５ｇ／Ｌペプトン（極東製薬工業社製）、６ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、２５０ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物（別殺菌）および４ｍｇ／ＬビタミンＢ１（別殺菌）を含む液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の培養条件下で、１４％（ｖ／ｖ）アンモニア水を用いてｐＨ７．０に調整しつつ培養を行った。
培養１１時間目から２４時間目までの間、１６７ｇ／Ｌグルコース、１６７ｇ／Ｌペプトンを含むフィード液を、ペリスタポンプを用いて添加速度３０ｍｌ／時間で培養液に添加した。
一方、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株を、５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌポリペプトン（大五栄養化学社製）、１０ｇ／Ｌイーストエキス（大五栄養化学社製）、５ｇ／Ｌ尿素、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、１ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、３ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．１ｇ／Ｌ塩化カルシウム・二水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、２０ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン・４〜６水和物、２０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン、１０ｍｇ／Ｌ  Ｄ−パントテン酸カルシウム、５ｍｇ／ＬビタミンＢ１、５ｍｇ／Ｌニコチン酸、および３０μｇ／Ｌビオチンを含む液体培地（水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．２に調整）２００ｍｌの入った２Ｌバッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２４時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。この培養液２０ｍｌを、１００ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌポリペプトン、１ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．１ｇ／Ｌ塩化カルシウム・二水和物、２０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、２０ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン・４〜６水和物、１５ｍｇ／Ｌ  β−アラニン、２０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン、０．１ｍｇ／Ｌビオチン、２ｇ／Ｌ尿素（別殺菌）および５ｍｇ／ＬビタミンＢ１（別殺菌）を含む液体培地（水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．２に調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度３２℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の培養条件下で、濃アンモニア水でｐＨを６．８に調整しつつ培養を行った。
培養中、培養液をサンプリングし、サンプリングした培養液を遠心分離して得られる上清中のグルコース濃度を測定した。該上清中のグルコース濃度がゼロになった時点で、培養液を３５０ｍｌ無菌的に採取し、該培養液を、１８０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１０ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．１ｇ／Ｌ塩化カルシウム・二水和物、２０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、２０ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン・４〜６水和物、１５ｍｇ／Ｌ  β−アラニン、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウム、２０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン、０．１ｍｇ／Ｌビオチン、２ｇ／Ｌ尿素（別殺菌）および５ｍｇ／ＬビタミンＢ１（別殺菌）を含む液体培地（水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．２に調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度３２℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の培養条件下で、濃アンモニア水でｐＨを６．８に調整しつつ培養した。培養中、培養液をサンプリングし、サンプリングした培養液を遠心分離して得られる上清中のグルコース濃度を測定した。該上清中のグルコース濃度がゼロになった時点で培養を終了した。
このようにして得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株の培養液５００ｍｌとコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株の培養液１８５ｍｌをそれぞれ２Ｌ容培養槽２本に分注し、それぞれに６０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液８０ｍｌ、２５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物２５ｍｌ、２５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム１６０ｍｌを添加し、さらにキシレンを２０ｍｌ／Ｌの濃度になるように添加し、塩化コリンを８．４ｇ／ｌ（６０ｍＭ）の濃度になるように添加した。
２本の培養槽のうち１本（ポット１）にはウラシル〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を４４ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、他方（ポット２）にはオロット酸（シグマ社製）を４４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。それぞれの培養槽を、３２℃、８００ｒｐｍ、通気量０．２Ｌ／分の条件下、１０規定の水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．２に保ちつつ保持した。２２時間後、混合液中のＣＤＰ−コリンの濃度をＨＰＬＣを用いて測定したところ、ポット１では、１２．１ｇ／ｌ（２４．８ｍｍｏｌ／ｌ）、ポット２では１１．５ｇ／ｌ（２３．６ｍｍｏｌ／ｌ）のＣＤＰ−コリンが生成されていることが示され、基質として、オロット酸よりウラシルを用いることにより、良好な結果を得ることができた。
産業上の利用可能性
本発明により、コリンもしくはホスホリルコリンまたはこれらの塩、およびウラシルからＣＤＰ−コリンを工業的に有利に製造する方法が提供される。
【国際調査報告】
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