(57)【要約】ラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントインの酵素によるＤ立体選択的加水分解を利用し、医薬品中間体として有用なＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩を安価で入手容易な原料から簡便に製造できる方法を提供する。ラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントインの酵素によるＤ立体選択的加水分解を利用しＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインとし、硫黄化剤との反応でＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインを合成しこれを加水分解することによりＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）；
2004022766.tif 000009
（式中、Ｘはハロゲン原子を表す）で表される５−ハロメチル−５−メチルヒダントインのラセミ体を、ヒダントイナーゼによりＤ立体選択的に加水分解することを特徴とする、一般式（２）；
2004022766.tif 000010
（式中、Ｘは前記と同じ）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインの製造方法。
【請求項２】
Ｘが塩素原子であることを特徴とする請求の範囲第１記載の製造方法。
【請求項３】
ヒダントイナーゼが、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する微生物由来である請求の範囲第１又は第２記載の製造方法。
【請求項４】
ヒダントイナーゼが、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）又はリゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ１４１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）由来である請求の範囲第１又は第２記載の製造方法。
【請求項５】
ヒダントイナーゼが、形質転換微生物エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＴＨ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６５）、又はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６６）由来である請求の範囲第１又は第２記載の製造方法。
【請求項６】
前記式（２）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを、酢酸エチル、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、及びアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種の溶媒を用いて晶析することにより、光学純度を向上させることを特徴とするＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインの製造方法。
【請求項７】
貧溶媒として、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、及びシクロヘキサンからなる群から選択される少なくとも１種の溶媒を併用する請求の範囲第６記載の製造方法。
【請求項８】
晶析に供するＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインが、請求項１記載の方法で製造されたものである請求の範囲第６又は第７記載の製造方法。
【請求項９】
前記式（２）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させることを特徴とする、一般式（３）；
2004022766.tif 000011
（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖又は分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有しても良いベンジル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基を表し、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子もしくはＣ１〜Ｃ２０のアルカノイル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基を表し互いに同じ又は異なっていてもよい）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインの製造方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１から第５のいずれかに記載の方法で得られたＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させることを特徴とする、請求の範囲第９記載のＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインの製造方法。
【請求項１１】
硫黄化剤として、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水硫化物、水硫化アンモニウム、アルキルメルカプタン、アラルキルメルカプタン、又はチオ酢酸もしくはそのアルカリ金属塩を用いることを特徴とする請求の範囲第９又は第１０記載の製造方法。
【請求項１２】
硫黄化剤として水硫化ナトリウム、水硫化カリウム、チオ酢酸カリウム、ｔ−ブチルメルカプタン、ベンジルメルカプタン、又はｐ−メトキシベンジルメルカプタンを用いることを特徴とする、請求の範囲第９又は第１０記載の製造方法。
【請求項１３】
請求の範囲第９から第１２のいずれかに記載の方法で得られた前記式（３）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインを酸またはアルカリで加水分解および必要に応じて窒素原子，硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（４）；
2004022766.tif 000012
（式中、Ｒ１は水素原子，Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有しても良いベンジル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基、又はＣ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基を表す）で表されるＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１４】
塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、酢酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群より選択される少なくとも一種の酸を用いて加水分解を行う請求の範囲第１３記載の製造方法。
【請求項１５】
水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、炭酸ナトリウム、及び炭酸カリウムからなる群より選択される少なくとも一種のアルカリを用いて加水分解を行う請求の範囲１３記載の製造法。
【請求項１６】
前記式（２）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインと硫黄化剤をアルカリ水溶液中で反応させ硫黄化と加水分解をワンポットで行い、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（４）；
2004022766.tif 000013
（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有しても良いベンジル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基を表す）で表されるＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１から第５のいずれかに記載の方法で得られたＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを用いることを特徴とする請求の範囲第１６記載の製造方法。
【請求項１８】
前記式（４）においてＲ１が水素原子であるＬ−α−メチルシステインまたはその塩を製造するにあたり、副生したジスルフィド体のジスルフィド結合を還元剤を用いて切断することにより、Ｌ−α−メチルシステインまたはその塩に変換することを特徴とする請求の範囲第１３から第１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
還元剤がトリアルキルホスフィンあるいはトリアリールホスフィンであることを特徴とする請求の範囲第１８記載の製造法。
【請求項２０】
還元剤がトリフェニルホスフィンであることを特徴とする請求の範囲第１８記載の製造法。
【請求項２１】
一般式（２）；
2004022766.tif 000014
（式中、Ｘはハロゲン原子を表す）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントイン。
【請求項２２】
Ｘが塩素原子である請求の範囲第２１記載の化合物。
【請求項２３】
一般式（５）；
2004022766.tif 000015
（式中、Ｒ４はＣ１〜Ｃ２０の直鎖または２級、あるいは環を形成していても良いアルキル基，置換基を有しても良いベンジル基，Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基，Ｃ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基、Ｒ５，Ｒ６はそれぞれ独立に水素原子もしくはＣ１〜Ｃ２０のアルカノイル基を表し、互いに同じまたは異なっていてもよい）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン。
【請求項２４】
Ｒ５，Ｒ６が水素原子，Ｒ４がベンジル基もしくはｐ−メトキシベンジル基である請求の範囲第２３記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ４，Ｒ６がアセチル基，Ｒ５が水素原子である請求の範囲第２２記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６が全てアセチル基である請求の範囲第２３記載の化合物。
【請求項２７】
一般式（６）；
2004022766.tif 000016
（式中、Ｒ７は置換基を有していても良いベンジル基，Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基またはＣ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基を表す）で示されるＬ−α−メチルシステイン誘導体又は該化合物と酸との塩。
【請求項２８】
Ｒ７がベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基またはアセチル基である請求の範囲第２７記載の化合物。
【請求項２９】
酸が塩酸，臭化水素酸，硫酸，ｐ−トルエンスルホン酸またはカンファースルホン酸である請求の範囲第２７記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、医薬品中間体として有用なＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩及びそれらの製造方法、上記Ｌ−α−メチルシステイン誘導体の中間体であるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントイン及びその製造方法、及びＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン及びその製造法に関する。
【背景技術】  Ｌ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩の製造方法としては、以下の方法が知られている。
１）光学活性システインとピバルアルデヒドより得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉アルキル化による方法（特表２０００−５１５１６６号公報、ＷＯ０１／７２７０２号公報およびＷＯ０１／７２７０３号公報（ＵＳＰ６４０３８３０、ＵＳＰ６５８６４７４、ＥＰ１２６５８５９Ａ２、ＥＰ１２６５８６０Ａ１）
２）光学活性アラニンとベンズアルデヒドより得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉チオアルキル化による方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９９年，５５巻，１０６８５〜１０６９４頁）
３）光学活性バリンとアラニンより合成される光学活性ジケトピペラジン化合物を不斉ブロモメチル化し、得られた化合物の臭素原子をアルカリ金属アルキルチオラートで置換する方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年，５７巻，５５６８〜５５７３頁）。
４）２−メチル−２−プロペン−１−オールのシャープレス不斉酸化により得られる光学活性な２−メチルグリシドールから光学活性アジリジン化合物を合成し、これにチオールを反応させる方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，６０巻，７９０〜７９１頁）。
５）アミノマロン酸誘導体をアルキル化した後に、豚肝臓エステラーゼ（以下ＰＬＥと略す）による非対称化を行い、得られた光学活性エステルをチオ酢酸アルカリ金属塩と反応させる方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３年，１１５巻，８４４９〜８４５０頁）。
６）システイン誘導体より合成されるチアゾリン化合物のメチル化により得られるラセミ体のチアゾリン化合物をキラルＨＰＬＣにて分離精製する方法（Ｓｙｎｌｅｔｔ．，１９９４年，９巻，７０２−７０４頁）。
しかしながら、１），２），３）のいずれの方法においても、ブチルリチウム等の高価な塩基を用いた低温反応が含まれ、特殊な製造設備が必要である。また、４）の方法は工程数が長くて煩雑であり、工業的に不利である。５）の方法ではＰＬＥを用いたジエステルの非対称化を鍵工程としているが、ＰＬＥは大量生産が困難であるため工業的規模での安定確保は難しく、実用的とは言い難い。６）の方法ではチアゾリン化合物の不斉アルキル化は知られておらず、ラセミ体のキラルＨＰＬＣによる分割が不可欠であるが、不要の鏡像異性体をラセミ化して再利用することができないために生産性が低く、工業規模での製造は有利ではない。以上のように、いずれの方法においても光学活性α−置換システインまたはその塩の工業的製造方法としては解決すべき課題を有している。
一方、ハロアセトンから容易に得られる５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを、ヒダントイナーゼによる立体選択的な加水分解により光学活性なＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインとし、これと硫黄化剤との反応でＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインを合成、これを加水分解することでＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩の効率的なプロセスを構築できると考えられるが、ヒダントイナーゼを用いた立体選択的加水分解による５位に２つの異なった置換基を有する光学活性ヒダントインの効率的な製造方法、および得られたヒダントインを加水分解することによるα位に２つの異なる置換基を有する光学活性アミノ酸誘導体の製造方法は全く知られていない。
上記に鑑み、本発明の目的は、ラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントインのヒダントイナーゼによるＤ立体選択的加水分解プロセスを利用して、医薬品の中間体として有用なＬ−α−メチルシステインおよびその塩を安価で入手容易な原料から簡便に製造できる方法を提供することにある。
発明の要約
本発明者等は上記に鑑み、鋭意検討を行った結果、安価に入手可能なハロアセトンより容易に得られる５−ハロメチル−５−メチルヒダントインをヒダントイナーゼによりＤ立体選択的に加水分解し光学活性なＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインとし、これと硫黄化剤との反応でＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインを合成、これを加水分解することによりＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩を得る方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は一般式（１）；
2004022766.tif 000002
（式中、Ｘはハロゲン原子を表す）で表される５−ハロメチル−５−メチルヒダントインのラセミ体を、ヒダントイナーゼによりＤ立体選択的に加水分解することを特徴とする、一般式（２）；
2004022766.tif 000003
（式中、Ｘは前記と同じ）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインの製造方法に関する。
また本発明は、前記式（２）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させることを特徴とする、一般式（３）；
2004022766.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有してもよいベンジル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基、又はＣ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子もしくはＣ１〜Ｃ２０のアルカノイル基を表し、互いに同じまたは異なっていてもよい）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインの製造方法に関する。
さらに本発明は、前記式（３）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインを酸またはアルカリで加水分解し、必要に応じて窒素原子、硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（４）；
2004022766.tif 000005
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩の製造方法に関する。
また、本発明は前記式（２）；
2004022766.tif 000006
（式中、Ｘは前記と同じ）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインである。
更に本発明は前記式（５）；
2004022766.tif 000007
（式中、Ｒ４はＣ１〜Ｃ２０の直鎖または２級、あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有してもよいベンジル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基、又はＣ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に水素原子もしくはＣ１〜Ｃ２０のアルカノイル基を表し、互いに同じまたは異なっていてもよい）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインでもある。
さらに本発明は前記式（６）；
2004022766.tif 000008
（式中、Ｒ７は置換基を有していても良いベンジル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基、またはＣ１〜Ｃ２０のアルコキシカルボニル基を表す）で示されるＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩でもある。
発明の詳細な開示
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、まず、前記式（１）で表されるラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントインをヒダントイナーゼを用いてＤ立体選択的に加水分解して、前記式（２）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを製造する。
ラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントイン（１）は、例えばＢｕｃｈｅｒｅｒ法により容易に取得できる。すなわち相当するハロケトンをシアン化ナトリウムあるいはシアン化カリウムおよび炭酸アンモニウムと水，エタノール混合溶媒中で攪拌することにより目的とするヒダントインを合成することができる。
本工程で用いるヒダントイナーゼとは、５−置換ヒダントイン誘導体を加水分解してＮ−カルバモイル−α−アミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素である。本発明で用いる立体選択的な加水分解を触媒するヒダントイナーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物を挙げることができる。
すなわち、細菌に属するものとしてはアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシエリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルチナ属（Ｓａｒｔｉｎａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）など、
放線菌に属するものとしてはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）など、
かびに属するものとしてはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、パエシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）など、
酵母に属するものとしてはキャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピヒア属（Ｐｈｉｃｈｉａ）、ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）又はトルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などがある。
好ましくは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。
さらに好ましくは、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）又はリゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ１４１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）由来の酵素が挙げられる。
なお、本発明中、当該ヒダントイナーゼは酵素自体、或いは本酵素活性を有する微生物若しくはその処理物等、及び本酵素活性を有する形質転換微生物或いはその処理物で用いられ得る。
ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。酵素の固定化に使用される支持体としては、例えば、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ５６８またはＤＳ１７１８６（ローム・アンド・ハース社：登録商標）などのフェノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９３５、ＩＲＡ９４５、ＩＲＡ９０１（ローム・アンド・ハース社：登録商標）、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＯＣ１０３７（バイエル社：登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＥＸ−０５（三菱化学：登録商標）などのポリスチレン樹脂のような各種アミンやアンモニウム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他、ＤＥＡＥ−セルロースなどの支持体も使用することができる。
固定化酵素の好適な製造方法としては、例えば、ＷＯ９６／２０２７５に示す方法で行い得る。すなわち、ヒダントイナーゼ活性を有する菌株の培養液を集菌、超音波などにより菌体を破砕後、得られた酵素液に例えば陰イオン交換樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８を加えて攪拌して酵素を吸着させることができる。この酵素を吸着した樹脂に例えばグルタルアルデヒドなどの架橋試薬を加えて攪拌することで架橋処理を行い、さらに安定性を向上させることもできる。これらの処理を行った後に樹脂を濾集、洗浄して固定化ヒダントイナーゼを得ることができる。
ヒダントイナーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばＷＯ９６／２０２７５記載のように、ヒダントイナーゼ活性を示す菌株からヒダントイナーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されている。
このようにして得られた、ヒダントイナーゼを高生産する形質転換微生物としてはＷＯ９６／２０２７５記載の、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＴＨ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６５）、又はシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１  ｐＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６６）を挙げることができる。
これら形質転換体によるヒダントイナーゼの生産、あるいは、前述のヒダントイナーゼ活性を示す菌株によるヒダントイナーゼの生産は、例えば、ＷＯ９６／２０２７５記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行えば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
本発明の酵素反応は以下の方法で行うことができる。基質としては前記式（１）で表されるラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを用いてヒダントイナーゼ存在下、水性媒体中で反応を行う。
基質の仕込み濃度は０．１％以上、９０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は１０℃以上、８０℃以下の適当な温度で調節し、ｐＨ４以上、１０以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質を連続的に添加しうる。反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。ヒダントイナーゼとしては、前述のごとく酵素自体、或いは、本酵素活性を有する微生物若しくはその処理物等、及び本酵素活性を有する形質転換微生物或いはその処理物で用いられ得る。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
以上のようにして得られたＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインは、特に精製せずにそのまま次工程に用いることができるが、光学純度、化学純度向上のためには晶析にて精製することが好ましい。
晶析に用いる溶媒としては、例えば、酢酸エチル，メチルアルコール，エチルアルコール，プロピルアルコール，イソプロピルアルコール，ｎ−ブチルアルコール，ｓｅｃ−ブチルアルコール，ｔ−ブチルアルコール，アセトン，テトラヒドロフラン，アセトニトリル等が挙げられる。これらは、単独で使用しても２種以上の混合溶媒として用いてもよい。なかでも酢酸エチル，又はエタノールが好ましい。また、晶析においては、収率向上の観点から貧溶媒を併用してもよく、貧溶媒の例としてはベンゼン，トルエン，ヘキサン，ヘプタン，シクロヘキサンが挙げられ、好ましくはヘキサン，ヘプタンである。
次に、前記式（２）で表されるＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させて前記式（３）で表されるＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインを製造する方法について説明する。
前記式（３）において、Ｒ１は水素原子，Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基，置換基を有してもよいベンジル基，又はＣ１〜Ｃ２０のアルカノイル基を表わす。
Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基としてはメチル基，エチル基，プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓｅｃ−ブチル基，ｔ−ブチル基，ペンチル基，ヘキシル基，シクロプロピル基，シクロブチル基，シクロペンチル基，シクロヘキシル基などが挙げられるが、脱保護の容易さからｔ−ブチル基が好ましい。
置換基を有してもよいベンジル基としては、ベンジル基，ｏ−またはｐ−メトキシベンジル基，ｏ−またはｐ−ヒドロキシベンジル基，ｏ−またはｐ−アセトキシベンジル基，ｐ−ニトロベンジル基，２，４，６−トリメチルベンジル基，２，４，６−トリメトキシベンジル基が挙げられるが、脱保護の容易さからベンジル基またはｐ−メトキシベンジル基が好ましい。
Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基としてはアセチル基，プロパノイル基，ブタノイル基，ペンタノイル基，ヘキサノイル基などが挙げられるが、導入，脱保護の容易さからアセチル基が好ましい。
Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシカルボニル基としては一般的にＳ（硫黄）の保護基として用いられるものであれば特に制限されるものではないが、ベンジルオキシカルボニル基，ｔ−ブチルオキシカルボニル基が好ましい。Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子もしくはＣ１〜Ｃ２０のアルカノイル基を表し、互いに同じまたは異なっていてもよい。
Ｃ１〜Ｃ２０のアルカノイル基としてはアセチル基，プロパノイル基，ブタノイル基，ペンタノイル基，ヘキサノイル基などが挙げられるが、導入，脱保護の容易さからアセチル基が好ましい。
本反応で用いる硫黄化剤としては、例えば水硫化ナトリウム、水硫化カリウム、水硫化カルシウム、水硫化バリウム、水硫化マグネシウム、水硫化リチウム、水硫化ルビジウム等のアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水硫化物；水硫化アンモニウム；ｔ−ブチルメルカプタン等のアルキルメルカプタン；ベンジルメルカプタン、ｐ−メトキシベンジルメルカプタン等のアラルキルメルカプタン；チオ酢酸カリウム、チオ酢酸等のチオアシル化合物等が挙げられる。
工業的に安価で入手が容易であることや取り扱いの簡便さおよび反応収率が良好で硫黄原子の脱保護操作が不要であることなどの点から、水硫化ナトリウムまたは水硫化カリウムが望ましい。なお、チオ酢酸やチオ酢酸カリウム等のチオカルボン酸又はその塩を硫黄化剤として用いた場合、窒素上にアシル基が導入されることがある。
本反応は塩基の共存下に行うことが好ましく、塩基としては例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
反応溶媒としては、使用する硫黄化剤にもより特に限定されるものではないが、例えば水硫化ナトリウムまたは水硫化カリウム等を用いる場合、水またはメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の非プロトン性極性溶媒の群より選ばれる溶媒を単独あるいは混合して用いることが好ましい。
得られたＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（３）は、特に精製操作を行わずに次工程に使用しても良いし、化学純度向上，光学純度向上のために晶析等により精製してもよい。
次に、Ｌ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン（３）の加水分解について説明する。
ヒダントイン部分の加水分解は酸もしくはアルカリ性水溶液のどちらでも可能であるが、ヒダントイン（３）におけるＲ１と加水分解条件によって、加水分解後にＬ−α−メチルシステインもしくはその塩が得られる場合と、更に硫黄原子の脱保護が必要となる場合がある。
例えば、Ｒ１がｔ−ブチル基の場合、アルカリ性水溶液では、更なる硫黄原子の脱保護が必要となるが、塩酸による加水分解では硫黄原子の脱ｔ−ブチル化反応が同時に進行しＬ−α−メチルシステイン塩酸塩が得られることがわかった。
またＲ１がアセチル基の場合には酸でもアルカリでも硫黄原子の脱アセチル化が同時に進行し、Ｌ−α−メチルシステインまたはその塩が得られる。  さらにＲ１がベンジル基の場合、加水分解後ナトリウム等を用いた脱保護が必要となる。
酸加水分解を行う場合、酸としては特に限定されないが、例えば塩酸，硫酸，硝酸，臭化水素酸，酢酸等が挙げられ、これらを単独または混酸として用いることが好ましい。
アルカリ加水分解を行う場合、アルカリの例としては水酸化ナトリウム，水酸化バリウム，水酸化リチウム，水酸化カリウム，水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げら、反応収率の面から水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化バリウム，水酸化カルシウム，水酸化リチウムが特に好ましい。
加水分解の反応温度については好ましくは７０℃から１８０℃であり、用いた溶媒の沸点以上で反応を行う場合には耐圧反応器を用い封管中で行うことが好ましい。反応温度があまり低いと反応時間が非常に長くなり数日を要するだけでなく、ジスルフィド体が副生する傾向にあり、高すぎると他の副反応も懸念されるため、加水分解は９０℃から１５０℃の範囲で行うことがより好ましい。
Ｌ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインへの硫黄化および加水分解は、アルカリ水溶液中、ワンポットで行うことも可能である。
用いるアルカリ水溶液としては例えば、水酸化ナトリウム，水酸化バリウム，水酸化リチウム，水酸化カリウム，水酸化カルシウム，水酸化セシウムなどが挙げられるが、水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化リチウムが好ましい。この場合の硫黄化剤としては、特に限定されるのもではないが、例えばベンジルメルカプタン，ｐ−メトキシベンジルメルカプタン，ｎ−ブチルメルカプタン，ｓｅｃ−ブチルメルカプタン，プロピルメルカプタンなどが挙げられるが、ベンジルメルカプタンあるいはｔ−ブチルメルカプタンが好ましい。
反応温度は硫黄化反応は０℃から１００℃が好ましく、特には２０℃から８０℃が好ましい。続く加水分解は前記と同じく好ましくは７０℃から１８０℃であり、更に好ましくは９０℃から１５０℃である。
ヒダントイン（３）の加水分解によりＬ−α−メチルシステインまたはその塩を製造する場合、ジスルフィド体が副生することがあるが、その場合副生したジスルフィド体は還元剤にて、Ｌ−α−メチルシステインまたはその塩に戻すことができる。
還元剤としては、ジスルフィド結合を切断し得るものであれば特に限定されるものではないが、例えば亜鉛，錫，マグネシウムなどの金属あるいはホスフィン化合物が挙げられる。中でも優れた切断能を有し、しかも抽出操作での除去が容易なトリアリールホスフィン又はトリアルキルホスフィン化合物が好ましく、トリフェニルホスフィンが取り扱いの容易さ，価格の面から特に好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（参考例１）５−メチル−５−クロロメチルヒダントインの製造法
炭酸アンモニウム（７５３ｇ，６．６ｍｏｌ），シアン化ナトリウム（１３５ｇ，２．７５ｍｏｌ）を室温で蒸留水（７３０ｍＬ）に溶かしエタノール（７３０ｍＬ）を加えた。さらにクロロアセトン（２０４ｇ，２．２ｍｏｌ）を加え１０分間攪拌した後、６０℃まで加熱しそのまま一晩攪拌した。反応液を室温まで放冷後、約半分の液量まで減圧下溶媒を留去した。３０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液約４００ｇを加えｐＨを１２に調整し、トルエンで洗浄した（１．５Ｌ×２）。氷冷下、濃塩酸７００ｇを加えｐＨを７とし、酢酸エチルにて抽出した（２Ｌ×２）。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥した後に減圧下濃縮し、白色固体１９８．５ｇを得た。ＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８（ナカライ社製），移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝３０／７０，流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：４０℃）の結果、この白色固体は上記表題化合物を１９２．５ｇ（１．２ｍｏｌ）を含有していた（収率５４％）。この白色固体は精製することなく次の工程に使用した。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ：３．８６（ｄ，１Ｈ），３．７５（ｄ，１Ｈ），１．５１（ｓ，３Ｈ）。
（実施例１）Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントインの製造法
ＷＯ９６／２０２７５記載の培養方法と固定化酵素の調製方法に従い、バチルス  ｓｐ．  ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）を培養、集菌後、超音波破砕して得た酵素液に固定化用担体である陰イオン交換樹脂、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８を添加して酵素を吸着させ、さらにグルタルアルデヒドで架橋処理することで固定化ヒダントイナーゼを得た。
次に、参考例１で得たラセミ体の５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン粗結晶９．１ｇ（８３．６ｗｔ％）に水９１ｍｌと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．１８ｍｌを加え２０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８．７に調整した溶液に、上記の様にして得られた固定化ヒダントイナーゼ３２ｇ（湿重量）を加えて、４５℃、２５時間攪拌して反応させた。反応中は２０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを８．７に保った。反応終了後、固定化ヒダントイナーゼをろ別、洗浄して得られた濾液を６Ｎ塩酸によりｐＨ７に調整した後、等量の酢酸エチルで二回抽出した。得られた酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウム８０ｇを添加して乾燥させた後、減圧濃縮乾固して３．３５ｇの５−クロロメチル−５−メチルヒダントインを取得した。
これをＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ  Ｔ（アドバンスド・セパレーション・テクノロジーズ・インク社製）２本連結，移動相：水／エチルアルコール＝９／１，流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：４０℃）した結果、化学純度は９１．８ｗｔ％、光学純度は９７．０％ｅｅ、ヒダントイン収率は４０．５％であった。
また、得られた光学活性ヒダントインがＬ体であることを、実施例８から２４に示す方法でメチルシステインに誘導して旋光度を測定することで確認した。
（実施例２）Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントインの製造法
アグロバクテリウム  ｓｐ．  ＫＮＫ７１２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）を固体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、１０ｇ／ｌ  肉エキス、５ｇ／ｌ  イーストエキス、１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．５）で３０℃、４８時間培養した。この菌体一白金耳を、５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ１２０℃で１５分間殺菌した５０ｍｌの液体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、１０ｇ／ｌ  肉エキス、５ｇ／ｌ  イーストエキス、ｐＨ７．５）に植菌して３０℃、２４時間振とう培養した。次に、この培養液１ｍｌを、上記液体培地に１ｇ／ｌ  ウラシル、２０ｍｇ／ｌ  塩化マンガンを加えた液体培地に植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１５ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．７）に懸濁し、ラセミ体の５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン４５ｍｇと０．１Ｍ硫酸マンガン水溶液０．０１５ｍｌを添加し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを８．７付近に保ち、４０℃で２６時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライ社製），移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液＝５／９５，流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：４０℃）した結果、ヒダントインの残存率は３９％であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度をＨＰＬＣ分析（実施例１記載の分析条件）したところ９２．７％ｅｅであり、また、実施例１で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較からＬ体であることを確認した。
（実施例３）シュードモナス属細菌を用いたＬ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントインの製造法
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６を固体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、２ｇ／ｌ  イーストエキス、１ｇ／ｌ  硫酸マグネシウム七水和物、１５ｇ／ｌ  寒天、ｐＨ７．０）で３０℃にて２４時間培養した。この菌体一白金耳を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中、１２０℃で１５分間殺菌した１００ｍｌ液体培地（２０ｇ／ｌ  肉エキス、６ｇ／ｌ  グリセロール、１ｇ／ｌ  ウラシル、２ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ  硫酸マグネシウム七水和物、４０ｍｇ／ｌ  塩化カルシウム二水和物、２０ｍｇ／ｌ  硫酸第一鉄七水和物、２０ｍｇ／ｌ  硫酸マンガン四〜六水和物、２０ｍｇ／ｌ  硫酸銅五水和物、ｐＨ５．５）に植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１５ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．７）に懸濁し、ラセミ体の５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン１５ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００３ｍｌを添加後、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを９．０付近に保ちつつ、４０℃で５２時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（実施例２記載の分析条件）した結果、ヒダントインの残存率は７０％であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度をＨＰＬＣ分析（実施例１記載の分析条件）したところ２６．７％ｅｅであり、また、実施例１で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較からＬ体であることを確認した。
（実施例４）バチルス属細菌を用いたＬ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントインの製造法
バチルス  ｓｐ．  ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）の乾燥保存菌体を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中、１２０℃で１５分間殺菌した１００ｍｌ液体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、１０ｇ／ｌ  肉エキス、５ｇ／ｌ  イーストエキス、ｐＨ７．５）に植菌し、４５℃にて１５時間振とう培養した。この培養液２ｍｌを、上記培地成分に更に１ｇ／ｌ  ウラシル、２０ｍｇ／ｌ  塩化マンガンを加えた培地に植菌し、４５℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１５ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．７）に懸濁し、ラセミ体の５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン１５ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００３ｍｌを添加後、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを９．０付近に保ちつつ、４０℃で５２時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（実施例２記載の分析条件）した結果、ヒダントインの残存率は７４％であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度をＨＰＬＣ分析（実施例１記載の分析条件）したところ３０．７％ｅｅであり、また、実施例１で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較からＬ体であることを確認した。
（実施例５）リゾビウム属細菌を用いたＬ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントインの製造法
リゾビウム  ｓｐ．  ＫＮＫ１４１５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）の乾燥保存菌体を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中、１２０℃で１５分間殺菌した１００ｍｌ液体培地（１０ｇ／ｌ  ポリペプトン、１０ｇ／ｌ  肉エキス、５ｇ／ｌ  イーストエキス、ｐＨ７．５）に植菌し、３０℃にて１８時間振とう培養した。この培養液１ｍｌを、上記培地成分に更に１ｇ／ｌ  ウラシル、２０ｍｇ／ｌ  塩化マンガンを加えた培地に植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。この培養液１５ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．７）に懸濁し、ラセミ体の５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン１５ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００３ｍｌを添加後、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを９．０付近に保ちつつ、４０℃で３２時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（実施例２記載の分析条件）した結果、ヒダントインの残存率は５４％であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度をＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ  Ｔ（アドバンスド・セパレーション・テクノロジーズ・インク社製、２本連結）、移動相：０．０３６Ｍリン酸二水素カリウム／リン酸水溶液  ｐＨ２．２、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃）したところ２２．５％ｅｅであり、また、実施例１で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較からＬ体であることを確認した。
（実施例６）シュードモナス  ｓｐ．  ＫＮＫ００３Ａ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）を用いたＬ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントインの製造法
シュードモナス  ｓｐ．  ＫＮＫ００３Ａ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）の乾燥保存菌体を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中、１２０℃で１５分間殺菌した１００ｍｌ液体培地（１０ｇ／ｌ  グリセリン、５ｇ／ｌ  グルコース、０．３ｇ／ｌイーストエキス、３．５ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、３．５ｇ／ｌ  リン酸水素二ナトリウム、０．５ｇ／ｌ  硫酸マグネシウム七水和物、０．０２ｇ／ｌ  塩化マンガン四水和物、０．０１ｇ／ｌ  硫酸鉄七水和物、１ｇ／ｌ炭酸カルシウム、３ｇ／ｌ  Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アラニン、ｐＨ７．０、ただしグルコースとＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンは他の成分を加熱殺菌後、ろ過滅菌して添加）に植菌し、４５℃にて４６時間振とう培養した。この培養液４０ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．７）に懸濁し、ラセミ体の５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン１５ｍｇと０．５Ｍ硫酸マンガン水溶液０．００３ｍｌを添加後、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを９．０付近に保ちつつ、４５℃で２４時間攪拌して反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析（実施例２記載の分析条件）した結果、ヒダントインの残存率は５４％であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度をＨＰＬＣ分析（実施例５記載の分析条件）したところ６５．８％ｅｅであり、また、実施例１で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較からＬ体であることを確認した。
（実施例７）Ｌ−５−メチル−５−クロロメチルヒダントインの精製法
実施例１の様にして得られた未精製Ｌ−５−メチル−５−クロロメチルヒダントイン（６８．８５ｇ）をエチルアルコール（１３７．７ｍＬ）に溶かした後、６０°Ｃに加熱した。ヘキサンを内温が６０℃より低くならないように注意しながら、白色の濁りが消えなくなるまでゆっくりと適下した（ヘキサン使用量：１０５ｍＬ）後、−２０℃まで徐々に冷却しそのまま−２０℃で一晩攪拌した。析出した白色結晶をろ別、メチルアルコールの５ｗｔ％ヘキサン溶液（２５０ｇ）にて洗浄することにより表題化合物を化学純度９４．６％，光学純度９８．３％ｅｅで得た（晶析回収率９４．７％）（参考例１記載の分析条件にて分析）。
（実施例８）Ｌ−５−メルカプトメチル−５−メチルヒダントインの製造法
Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン（１５．０ｇ，化学純度８７ｗｔ％，光学純度９８．３％ｅｅ，８０ｍｍｏｌ），水硫化ナトリウム（６０ｇ，純度７０ｗｔ％）を蒸留水１５０ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、１．５時間還流させた。室温まで放冷後、氷冷下、濃塩酸でｐＨ＝１とし、酢酸エチルにて抽出した（５００ｍＬ×４）。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に減圧下で濃縮し、白色固体１４．８ｇを得た。ＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  Ｃ１８−ＡＲ（ナカライ社製），移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９７／３，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：３０℃）の結果、この白色固体は上記表題化合物を１１．１ｇ（６４．５ｍｍｏｌ）を含有していた（化学純度７５．０％，収率８０．７％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ：３．５２（ｄ，１Ｈ），３．３２（ｄ，１Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ）。
（実施例９）Ｌ−５−メルカプトメチル−５−メチルヒダントインの精製法
Ｌ−５−メルカプトメチル−５−クロロメチルヒダントイン（２．０４ｇ，化学純度８３．６％，光学純度９６．１％ｅｅ）を酢酸エチル（４０ｍＬ）に６０℃で溶かし、ヘキサンを白色の濁りが消えなくなるまでゆっくりと適下した（ヘキサン使用量：９０ｍＬ）。０℃まで徐々に冷却しそのまま０℃で１時間攪拌した。析出した白色結晶をろ別、ヘキサン（５０ｍＬ）にて洗浄することにより、表題化合物を晶析回収率９２．４％，化学純度９１．３％，光学純度９８．６％ｅｅで得た（化学純度は実施例８記載の分析条件にて分析。光学純度分析条件；カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（ダイセル社製），移動相：イソプロパノール／ヘキサン＝３／７，流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：３０℃）。
（実施例１０）Ｌ−５−メチル−５−ｔ−ブチルチオメチルヒダントインの製造法
Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン（１０．００ｇ，６１．５１ｍｍｏｌ）を１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液１００ｇに溶解させた後、ｔ−ブチルメルカプタン（１０．４ｍＬ，９２．２７ｍｍｏｌ）を加え、窒素下、５０℃で３時間攪拌した。室温まで放冷後、反応液をトルエンで洗浄した（１００ｍＬ×３）。濃塩酸を加え反応混合物のｐＨを１〜２に調整し、生成する白色固体をろ過にて分離し、水で洗浄した（１００ｍＬ×３）後、減圧下乾燥し、表題化合物を白色固体として得た（７．７９ｇ，収率５８．６％）（参考例１記載の分析条件にて分析）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ：２．８９（ｓ，２Ｈ），１．４６（ｓ，３Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）。
（実施例１１）Ｌ−５−メチル−５−ベンジルチオメチルヒダントインの製造法
Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン（１０ｇ，６１．５ｍｍｏｌ）を１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液１００ｇに溶解させた後、ベンジルメルカプタン（１１．５ｍＬ，９８．４ｍｍｏｌ）を加え、窒素下、５０℃で  ３時間攪拌した。室温まで放冷後、反応液をトルエンで洗浄した（２０ｍＬ×２）。濃塩酸を加え反応混合物のｐＨを２．０に調整し、生成する白色固体をろ過にて分離し、水で洗浄した後、減圧下乾燥し、表題化合物を白色固体として得た（１４．８２ｇ，収率９６．３％）（参考例１記載の分析条件にて分析）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ：８．６１（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．２６（ｍ，５Ｈ），６．０６（ｓ，１Ｈ），３．７６（ｄ，１Ｈ），３．７２（ｄ，１Ｈ），２．７９（ｄ，１Ｈ），２．７２（ｄ，１Ｈ），１．４５（ｓ，３Ｈ）。
（実施例１２）Ｌ−１−Ｎ−アセチル−５−アセチルチオメチル−５−メチルヒダントインの製造法
Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン（５．８８ｇ，３４．２２ｍｍｏｌ，化学純度９４．６％，光学純度９８．３％ｅｅ）を窒素雰囲気下、ジメチルスルホキシド（１３７ｇ）に溶解し、チオ酢酸カリウム（１４．０５ｇ，１２３．０ｍｍｏｌ）を加え７０℃で２１時間反応させた。室温まで放冷後、１０％塩酸水溶液にてｐＨ＝６〜７に調整し、酢酸エチルで抽出した。得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、酢酸エチルを減圧下留去することにより、オレンジ色の固体１２．４５ｇを得た。ＨＰＬＣ分析（参考例１記載の分析条件にて分析）の結果、このオレンジ色固体は上記表題化合物を５．４８ｇ（２２．４３ｍｍｏｌ，化学純度４４％）を含有していた（収率６５．５％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ：８．６１（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），３．９２（ｄ，１Ｈ），３．４８（ｄ，１Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ）。
（実施例１３）Ｌ−１−Ｎ−アセチル−５−アセチルチオメチル−５−メチルヒダントインの精製法
上記実施例で得られたＬ−１−Ｎ−アセチル−５−アセチルチオメチル−５−クロロメチルヒダントイン（５．４８ｇ）を酢酸エチル（２２ｇ）に溶かし、６０℃に加熱した。ヘキサンを白色の濁りが消えなくなるまでゆっくりと適下し（ヘキサン使用量：３９．２ｇ）、室温まで放冷後、そのまま２０時間攪拌、続いて−２０°Ｃまで徐々に冷却し−２０℃で６時間攪拌した。析出した白色結晶をろ別、酢酸エチルの１％ヘキサン溶液（３９．２ｇ）にて洗浄することにより、表題化合物を晶析回収率７８．３％，化学純度８７．１％，光学純度９９．１％ｅｅで得た（化学純度は参考例１記載の分析条件にて分析。光学純度はＨＰＬＣ分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−Ｈ（ダイセル社製），移動相：ヘキサン／イソプロパノール＝９／１，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：３０℃）にて決定）。
（実施例１４）Ｌ−２−ベンジルチオメチルアラニンの製造法
Ｌ−５−ベンジルチオメチル−５−メチルヒダントイン（５．０ｇ，２０ｍｍｏｌ）を２規定水酸化ナトリウム水溶液（４０ｇ）に溶解し、１００℃で２日間、攪拌した。室温まで放冷後、濃塩酸でｐＨ＝７に調整し析出した白色結晶をろ別、水で数回洗浄した。減圧下、乾燥させた後、得られた白色結晶を１Ｈ  ＮＭＲ，ＨＰＬＣにて分析（参考例１記載の分析条件にて分析）し、上記目的物であることを確認した（収率７８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，ＮａＯＤ／Ｄ２Ｏ）  δ：７．２８−７．０８（ｍ，５Ｈ），３．７１（ｓ，２Ｈ），２．８８（ｄ，１Ｈ），２．７２（ｄ，１Ｈ），１．３１（ｓ，３Ｈ）。
（実施例１５）Ｌ−２−ｔ−ブチルチオメチルアラニンの製造法
Ｌ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（１．００ｇ，４．６２ｍｍｏｌ）を１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液（１４．９７ｇ）に溶解し、１１０℃で３日間、攪拌した。室温まで放冷後、４Ｍ塩酸でｐＨ＝６．５に調整し析出した白沈をろ別した。ろ液を濃縮し、生成した白色結晶をろ別後、水で数回洗浄した。減圧下、乾燥させた後、得られた白色結晶を１Ｈ  ＮＭＲ，ＨＰＬＣにて分析（参考例１記載の分析条件にて分析）し、上記目的物であることを確認した（収率７８．８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，ＮａＯＤ／Ｄ２Ｏ）  δ：２．６５（ｄ，１Ｈ），２．６３（ｄ，１Ｈ），１．２５（ｓ，１２Ｈ）。
（実施例１６）Ｌ−２−ベンジルチオメチルアラニンの製造法
Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン（２００ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）を１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液２．０ｇに溶解させた後、ベンジルメルカプタン（０．２３ｍＬ，２．０ｍｍｏｌ）を加え、窒素下、５０℃で５時間攪拌した。反応温度を１００℃に上げ、さらに２６時間攪拌した。３０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液を１．０ｇ加えさらに２４時間１００℃で攪拌し、ＨＰＬＣ分析したところ、表題化合物が生成していることを確認した（収率７８．０％）。
（実施例１７）Ｌ−２−ｔ−ブチルチオメチルアラニンの製造法
Ｌ−５−クロロメチル−５−メチルヒダントイン（５０１．８ｍｇ，３．０８ｍｍｏｌ）を１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液５．０３ｇに溶解させた後、ｔ−ブチルメルカプタン（０．５５ｍＬ，４．８７ｍｍｏｌ）を加え、窒素下、５０℃で５．５時間攪拌した。反応温度を１００℃に上げ、２１時間攪拌した後、さらに１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液（５．００ｇ）を添加し、２日間攪拌した。反応後に室温まで放冷、４Ｍ塩酸水溶液でｐＨ＝６．５に調整し析出した白沈をろ別した。ろ液を濃縮し、生成した白色結晶をろ別後、水で数回洗浄した。減圧下、乾燥させた後、得られた白色結晶を１Ｈ  ＮＭＲ，ＨＰＬＣにて分析（参考例１記載の分析条件にて分析）し、上記目的物であることを確認した（収率５３．１％）。
（実施例１８）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の製造法
Ｌ−β−ベンジルチオメチルアラニン（１ｇ，４．４４ｍｍｏｌ）を窒素下、液体アンモニア（５０ｍＬ）に溶解し−７８℃で金属ナトリウムを少しずつ加えた。溶液が青色を呈したら反応溶液が還流するまで温度を上げ、青色が消えるようであればさらに金属ナトリウムを追加しながら３０分攪拌した。塩化アンモニウムを青色が消え反応溶液が白色となるまで加え、温度を上げて液体アンモニアを気化させることにより除去した。２Ｎ塩酸水溶液でｐＨ＝１〜２となるように調整し、水分を減圧下留去、得られた白色固体をさらに減圧下で一晩乾燥させた。白色固体にＴＨＦ（１３ｍＬ），エチルアルコール（６．５ｍＬ）を加えてスラリー化し約１０分間攪拌し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、得られた白色固体をさらに減圧下で数時間乾燥させた。エチルアルコール，トルエンより晶析を行い、得られた白色結晶（４７３ｍｇ）を１Ｈ  ＮＭＲ，ＨＰＬＣ（カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＳＣＸ（資生堂社製），移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９５／５，流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：３０℃）で分析したところ、上記目的物であることがわかった（収率６２．６％）。また旋光度を測定したところ、［α］Ｄ２０＝８．  ７７（ｃ１．１５，Ｈ２Ｏ）であり、符号が文献値（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，２１３１〜２１３８，ＷＯ９８／３８１７７）と一致することから立体が目的とするＬ体であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ：３．１８（ｄ，１Ｈ），２．８９（ｄ，１Ｈ），１．６（ｓ，３Ｈ）。
（実施例１９）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の製造法
Ｌ−β−ｔ−ブチルチオメチルアラニン（４３３．９ｍｇ，２．２７ｍｍｏｌ）を濃塩酸（９ｍＬ）に溶解し、窒素下、４時間還流させた。室温まで放冷後、水分を減圧下留去、得られた白色固体をさらに真空ポンプで減圧乾燥した。白色固体にＴＨＦ（６ｍＬ），エチルアルコール（２ｍＬ）を加えてスラリー化し約１０分間攪拌し不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、得られた白色固体をさらに減圧下で数時間乾燥させた。エチルアルコール，トルエンより晶析を行い、得られた白色結晶（２２９ｍｇ）を１Ｈ  ＮＭＲ，ＨＰＬＣ（実施例１８記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物の塩酸塩であることがわかった（収率５８．７％）。
（実施例２０）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の製造法
Ｌ−５−メルカプトメチル−５−メチルヒダントイン（１．０ｇ，純度８９．２ｗｔ％，光学純度９８．６％ｅｅ，５．５７ｍｍｏｌ）を濃塩酸（２０ｇ）に溶解し、窒素下、６０時間還流させた。室温まで放冷後、塩酸水溶液を減圧下留去し、ＴＨＦ（５０ｍＬ），１Ｎ塩酸水溶液（５ｍＬ）およびトリフェニルホスフィン（２．７３ｇ）を加え、窒素雰囲気下、５０℃で２時間反応させた。室温まで放冷後、全体の容量が約１／５となるまで濃縮し、酢酸エチル（５０ｍＬｘ３）にて洗浄しトリフェニルホスフィン，トリフェニルホスフィンオキシド，未反応ヒダントインおよびその他の不純物を除去した。水相を減圧下濃縮、得られた白色固体をさらに減圧下、一晩乾燥させた。白色固体にＴＨＦ（１５．６ｍＬ），エチルアルコール（７．８ｍＬ）を加えてスラリー化し約１０分間攪拌し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、表題化合物を白色固体として得た（８７９ｍｇ）１Ｈ  ＮＭＲ，ＨＰＬＣ（実施例１８記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることがわかった（収率９２．３％）。
（実施例２１）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の製造法
Ｌ−５−メルカプトメチル−５−メチルヒダントイン（５００ｍｇ，純度８９．２ｗｔ％，光学純度９８．６％ｅｅ，２．７８ｍｍｏｌ）を３０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液（５ｇ）に溶解し、窒素下、３６時間還流させた。室温まで放冷後、濃塩酸にてｐＨ＝１に調整し水分を減圧下留去した。ＴＨＦ（３０ｍＬ），１Ｎ塩酸水溶液（３ｍＬ）およびトリフェニルホスフィン（１．５７ｇ）を加え、窒素雰囲気下、５０℃で２時間反応させた。室温まで放冷後、全体の容量が約１／５となるまで濃縮し、酢酸エチル（５０ｍＬｘ３）にて洗浄しトリフェニルホスフィン，トリフェニルホスフィンオキシド，未反応ヒダントインおよびその他の不純物を除去した。水相を減圧下濃縮、得られた白色固体をさらに減圧下、一晩乾燥させた。白色固体にＴＨＦ（９．３ｍＬ），エチルアルコール（４．７ｍＬ）を加えてスラリー化し約１０分間攪拌し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、表題化合物を白色固体として得た（３４８ｍｇ）１Ｈ  ＮＭＲ，ＨＰＬＣ（実施例１８記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることがわかった（化学純度７４．１％，収率４８．０％）。
（実施例２２）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の製造法
Ｌ−１−Ｎ−アセチル−５−アセチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（３．４ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）を濃塩酸（３４ｇ）に溶解し、窒素下、２０時間還流させた。濃塩酸（３４ｇ）を加えさらに３０時間反応させた。室温まで放冷後、塩酸水溶液を減圧下留去し、ＴＨＦ（５０ｍＬ），１Ｎ塩酸水溶液（５ｍＬ）およびトリフェニルホスフィン（２．１７ｇ）を加え、窒素雰囲気下、５０℃で２時間反応させた。室温まで放冷後、全体の容量が約１／５となるまで濃縮し、酢酸エチルにて洗浄しトリフェニルホスフィン，トリフェニルホスフィンオキシド，未反応ヒダントインおよびその他の不純物を除去した。水相を減圧下濃縮、得られた白色固体をさらに減圧下、一晩乾燥させた。白色固体にＴＨＦ（１８ｍＬ），エチルアルコール（６ｍＬ）を加えてスラリー化し約１０分間攪拌し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、得られた白色固体をさらに減圧下で数時間乾燥させた。エチルアルコール，トルエンより晶析を行い、得られた白色結晶（１．０２ｇ）を１ＨＮＭＲ，ＨＰＬＣ（実施例１８記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることがわかった（収率４３．０％）。
（実施例２３）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の製造法
Ｌ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（２０２．３ｍｇ，０．９３５ｍｍｏｌ）を濃塩酸（４ｍＬ）に溶解し、窒素下、１１０℃で２６時間攪拌した。室温まで放冷後、水分を減圧下留去、得られた残渣を１Ｈ−ＮＭＲ，ＨＰＬＣ（実施例１８記載の分析条件）で分析した結果、Ｌ−α−メチルシステイン収率４２．５％、Ｌ−５−メルカプトメチル−５−メチルヒダントイン収率５３．７％であった。
（実施例２４）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の製造法
Ｌ−５−ｔ−ブチルチオメチル−５−メチルヒダントイン（２０２．５ｍｇ，０．９３６ｍｍｏｌ）を濃塩酸（４ｍＬ）に溶解し、これを耐圧反応容器内に封管し、１５０℃で２６時間攪拌した。室温まで放冷後、水分を減圧下留去、得られた残渣をＨＰＬＣ（実施例１８記載の分析条件）で分析した結果、Ｌ−α−メチルシステイン収率４６．３％、Ｌ−α−メチルシステインのジスルフィド体収率５３．７％であった。
（参考例２）Ｌ−α−メチルシステイン塩酸塩の光学純度決定法
実施例１８記載の方法で得られたＬ−α−メチルシステイン塩酸塩（７４．９ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（１９７．７ｍｇ）を添加し、エタノール３ｍＬを加えた。窒素置換後、クロロ炭酸ベンジルエステル（０．１７ｍＬ，１．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間攪拌した。反応液に濃塩酸を添加してｐＨ＝１．９とし、酢酸エチルで抽出後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。これをＰＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１に少量の酢酸を添加）で精製し１Ｈ  ＮＭＲにて分析したところ目的物（１０６ｍｇ，収率６０％）であることがわかった。これをＨＰＬＣにて分析（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−ＲＨ（ダイセル社製），移動相：リン酸二水素カリウム・リン酸水溶液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝６／４，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２１０ｎｍ，カラム温度：３０℃，保持時間１９．１５分（Ｄ），２２．９２分（Ｌ））した結果、光学純度は９８．６％ｅｅであった。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ：７．３０−７．４０（ｍ，１０Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），３．６０（ｓ，２Ｈ），１．６３（ｓ，３Ｈ）。
【産業上の利用可能性】本発明により、医薬品中間体として有用なＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩を安価で入手容易な原料から簡便に製造することができる。
【国際調査報告】
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