(57)【要約】本発明の目的は、ＰＴＨ活性を損なうことなくバイオアベイラビリティを高め、副作用の少ないＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体を提供することである。ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体にＰＥＧを結合させることにより、ＰＴＨ活性を保持しつつバイオアベイラビリティが増し、副作用も軽減される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧ結合副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項２】
該ＰＥＧの分子量が１ｋＤａ以上２０ｋＤａ未満である請求項１に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項３】
該ＰＥＧの分子量が１ｋＤａ以上５ｋＤａ以下である請求項２に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項４】
該ＰＥＧの分子量が２ｋＤａ以上５ｋＤａ以下である請求項３に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項５】
該ＰＥＧの分子量が２ｋＤａである請求項４に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項６】
該ＰＥＧが、１又は複数箇所に結合している請求項１〜５のいずれか１項に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項７】
該ＰＥＧが、１〜４箇所に結合している請求項６に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項８】
該ＰＥＧが、Ｎ末端以外の部位に結合している請求項６又は７に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項９】
該ＰＥＧが９位〜Ｃ末端に結合している請求項８に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１０】
該ＰＥＧが１１位〜Ｃ末端に結合している請求項９に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１１】
該ＰＥＧが１４位〜Ｃ末端に結合している請求項１０に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１２】
該ＰＥＧが２０位〜Ｃ末端に結合している請求項１１に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１３】
該ＰＥＧが２８位〜Ｃ末端に結合している請求項１２に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１４】
該ＰＥＧがＣ末端に結合している請求項１３に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１５】
該ＰＥＧが、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体に導入したＰＥＧ結合部位を介して結合している請求項６〜１４のいずれか１項に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１６】
該ＰＥＧ結合部位がシステイン残基である請求項１５に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を含有するＰＥＧ結合ＰＴＨ組成物。
【請求項１８】
薬効を保つのに有効な量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を有効成分として含有するＰＴＨ製剤。
【請求項１９】
ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体にシステイン残基を導入した［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２０】
該システイン残基をＮ末端以外の部位に導入した請求項１９に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２１】
該システイン残基を９位〜Ｃ末端に導入した請求項２０に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２２】
該システイン残基を１１位〜Ｃ末端に導入した請求項２１に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２３】
該システイン残基を１４位〜Ｃ末端に導入した請求項２２に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２４】
該システイン残基を２０位〜Ｃ末端に導入した請求項２３に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２５】
該システイン残基を２８位〜Ｃ末端に導入した請求項２４に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２６】
該システイン残基をＣ末端に導入した請求項２５に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２７】
［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）である請求項２６に記載の［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体。
【請求項２８】
ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体中のアミノ基とＰＥＧ誘導体とを縮合させるか、またはアミノ基にＰＥＧ誘導体を付加させることを包含する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体の製造方法。
【請求項２９】
ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体に導入したＰＥＧ結合部位に、ＰＥＧを結合させることを包含する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体の製造方法。
【請求項３０】
該ＰＥＧ結合部位がシステイン残基である請求項２９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧ結合副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体、これらを含有するＰＥＧ結合ＰＴＨ組成物、これらを有効成分として含有するＰＴＨ製剤、及びこれらの製造方法に関するものである。
背景技術
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、主に副甲状腺から分泌され、血中カルシウム濃度を制御するホルモン（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐｐ１８５−２０１，１９９３）であり、骨代謝における重要なホルモンの一つとして知られている。血中カルシウム濃度が低下すると副甲状腺よりＰＴＨが分泌される。ＰＴＨは腎臓でカルシウムの再吸収を促進し、２５ビタミンＤ−１α水酸化酵素を誘導してビタミンＤを活性型に変換する。また、ＰＴＨはこの活性化型ビタミンＤを介して腸管からのカルシウム吸収を促進する。骨では骨芽細胞に作用して骨吸収を促進する。
副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）は、１４１個のアミノ酸で構成されており、腫瘍随伴性液性高カルシウム血症（Ｈｕｍｏｒａｌ  ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ  ｍａｌｉｇａｎｎｃｙ：ＨＨＭ）の主な原因物質として発見された（Ｓｕｖａ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１：８９３−８９６，１９８７）。
ＰＴＨ及びＰＴＨｒＰはＰＴＨ１受容体に作用することが知られている（Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０２４−１０２６，１９９１）。ＰＴＨ１受容体はＰＴＨ及びＰＴＨｒＰと同程度の結合性で結合し、細胞内にＰＫＡのシグナルを上昇させるとともに、細胞内カルシウム濃度を上昇させてＰＬＣのシグナルを活性化する（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２７３２−２７３６，１９９２；Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８，１９９３）。
ＰＴＨが骨のリモデリングにおける必須の全身性因子の一つであることは周知である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＴＨの間歇的注射は卵巣摘出（ＯＶＸ）ラット（Ｈｏｃｋ等、１９８８；Ｌｉｕ等、１９９１；Ｉｂｂｏｔｓｏｎ、１９９２）又は健常ラット（Ｈｏｃｋ及びＧｅｒａ、１９９２；Ｄｏｂｉｎｇ、１９９５）における骨質量の増大をもたらす。したがって、骨形成刺激はｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＴＨの拍動性分泌の生理学的役割の一つと見なされている。実際、臨床においては、ＰＴＨ（１−８４）とＰＴＨ（１−３４）は共に他の薬剤に比較して強力な骨形成促進作用を示すことが報告されており、ＰＴＨ（１−３４）の皮下投与は、腰椎と大腿骨頚部の骨折率を大幅に抑制した（Ｒｉｔｔｍａｓｔｅｒ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，８５：２１２９−２１３４，２０００；Ｎｅｅｒ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９：１４３４−１４４１，２００１）。
これとは反対に、ＰＴＨの持続的注入を受けた副甲状腺摘出（ＰＴＸ）ラット（Ｋｉｔａｚａｗａ等、１９９１）又は健常犬（Ｍａｌｌｕｃｈｅ等、１９８２）の骨形態計測は、骨形成と骨吸収の同時的増大を示したが、骨質量の正味の増大を示さなかった。これらのことから、ＰＴＨの持続投与は骨粗鬆症の治療には適しておらず、ＰＴＨを間歇投与して速やかに血中から消失することこそ重要であると考えられてきた。
ＰＴＨの副作用としては、血中カルシウム濃度上昇作用がある。正常ラットではＰＴＨ皮下間歇投与で血中カルシウム濃度の上昇をほとんど認めないが（Ｆｏｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ，２１：１６３−１６９，１９９７）、ＰＴＨをヒヨコに投与すると低用量でカルシウム濃度上昇作用が認められる（Ｐａｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，９２：４５４−４６２，１９７３）。また、甲状腺、副甲状腺摘出（ＴＰＴＸ）ラット及びＰＴＸラットに投与してもカルシウム濃度上昇作用が認められる（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２４４：Ｅ５８９−５９５，１９８３；Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ３４：５５３−５５７，１９８２）。臨床では、２０〜４０μｇのｈＰＴＨ（１−３４）を単回皮下投与すると投与後４〜６時間に一過性の血中カルシウム濃度上昇が認められる（Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，７７：１５３５−１５３９，１９９３，Ｎｅｅｒ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９：１４３４−１４４１，２００１）。以上のことから、正常のげっ歯類ではＰＴＨによる血中カルシウム濃度上昇作用は弱いが、臨床応用においてはＰＴＨによる血中カルシウム濃度上昇作用は強いことが予想される。
ＰＴＨのもう一つの副作用は血圧低下作用であり、ＰＴＨ（１−３４）はラット及びイヌで血圧低下作用を引き起こすことが報告されている（Ｐａｎｇ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，７７：６７５−６７８，１９８０）。ラットにおいては、ＰＴＨアナログの血圧低下作用も調べられており、ＰＴＨ（１−３４）は皮下投与で強い血圧低下作用を示す（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ，６０：３０２−３０８，１９９７）。臨床応用においてもＰＴＨ（１−３４）の静脈内投与では血圧低下作用が認められることが報告されており、また、ＰＴＨ投与後に一過性の頭痛が報告されている（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａ，３：７９−８５，１９８２）。ＰＴＨ（１−３４）の臨床試験では、４０μｇの用量で投与した場合、副作用として嘔気や頭痛が統計上有意に出現しており、２０μｇの用量ではプラセボ群と同程度の出現頻度であったことから、２０μｇの用量が臨床上使用可能な用量であると判断されている（Ｎｅｅｒ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９：１４３４−１４４１，２００１）。抗がん剤の場合は副作用上容認できない用量の１段下の用量を臨床投与量とすることはガイドラインでも容認されている。しかしながら、一般に、慢性疾患においては長期に渡って安全に治療を継続できることが重要であることから、副作用上容認できない用量と臨床投与量とは十分に余裕をもって乖離していることが望まれている。従って、ＰＴＨ投与に関しては、今だ十分に臨床上の要請に対応できているとはいえず、更なる改善が求められている。
一般に、薬剤を皮下投与した場合は、静脈内投与した場合に比べてバイオアベイラビリティ（ＢＡ）が低い。さらに、ＰＴＨは皮下に投与すると速やかに吸収され代謝されるという性質を有する（Ｆｏｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ，２１：１６３−１６９，１９９７）。ＰＴＨ（１−３４）とプロテアーゼ阻害剤を混ぜてヒヨコに皮下投与すると血中カルシウム濃度上昇作用が増加することから、ＰＴＨは皮下でプロテアーゼによる分解を受けることが示唆されている（Ｐａｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃ，６６：２５−３２，１９７９）。また、ＰＴＨ（１−３４）の代謝部位は主に肝臓と腎臓であることも報告されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，５８：７８１−７８８，１９７６；Ｍａｒｔｉｎ  Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，６０：８０８−８１４，１９７７）。
ＷＯ９６／３５４４７号は、持続投与用の注入液をパッチ又はイオン導入法で経皮的に持続投与することにより活性成分の放出時間を２〜６時間にするＰＴＨの製剤投与形態について開示している。しかしながら、この投与形態には、経皮投与であるために以下のような問題があった。すなわち、パッチでは簡便な反面、経皮吸収のための添加剤や粘着剤へのアレルギーやかぶれが起き易いため患者の負担が大きく、また、イオン導入法では装置が大がかりである。一般に、薬剤を皮下投与すると静脈内投与に比べてＢＡが低い。経皮吸収では、更に皮膚を通過する必要があるため、ＰＴＨの体内への吸収率が極めて低くなることが予測され、一定の投与量に対して個体差や部位による吸収量のばらつきが大きくなり、薬効と副作用のコントロールが難しくなると考えられる。その上、ＷＯ９６／３５４４７号には、高カルシウム血症や血圧低下については何ら記載されてはおらず、この投与形態には副作用の軽減効果はないものと考えられる。
ＷＯ０１／８１４１５では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰの活性調節ドメインに抗体のＦｃドメインを結合させることにより徐放性を付与している。その際、骨吸収抑制剤を同時投与することによって高カルシウム血症の発症を抑制している。しかし、単剤投与では正常マウスにおいてさえも強い血中カルシウム濃度上昇作用が認められていることから、臨床応用における血中カルシウム濃度上昇作用は非常に強いことが予想され、臨床上の有用性はないものと考えられる。
さらに実験動物と異なり、実際の骨粗鬆症患者においては、Ｆｃドメインを結合させたＰＴＨに対する反応性と骨吸収の程度には個人差が出ることが容易に考えられる。骨吸収抑制剤の併用についても、その反応性に個人差がでる可能性があり、両薬物を適切な投与量および投与間隔で、安全に同時投与することは極めて困難であることは容易に予測できる。また、Ｆｃドメインとのキメラタンパク質を用いると、特に長期間継続的に投与する必要がある骨粗鬆症患者において、抗原性によるアナフィラキシー反応やＰＴＨに対する中和抗体出現が危惧される。
一方、特開平７−１９６９２５号公報は、タンパク質を水溶性ポリマーで修飾することにより、タンパク質に望ましい性質を付与する方法及び組成物を開示している。具体的には、タンパク質上のアルデヒド基、ケトン基、ラクトール、活性化されたカルボン酸又は活性化されたカルボン酸誘導体と、ヒドラゾン結合若しくはオキシム結合を形成可能な水溶性ポリマー又はオキシルアミン水溶性ポリマーの誘導体（例えば、ＰＥＧ）とを共有結合により結合させることにより修飾されたタンパク質について記載している。これらの修飾タンパク質には水溶液中の溶解度の上昇、貯蔵期間中の安定性の増加、免疫原性の減少、酵素的分解に対する抵抗性の増加、より広範な種類の薬物投与系との適合性、及びｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加といった性質が付与される。この公報によれば、水溶性高分子、例えばＰＥＧは、タンパク質又は糖タンパク質を構成するアミノ酸又は糖の種々の遊離基に結合して、１分子のタンパク質に対して６〜３４個のＰＥＧ（分子量２，０００〜１２，０００）をカップリングさせており、これによって初めて上述の新たな性質が付与されている。
しかしながら、このように多数のＰＥＧを結合させたＰＥＧ修飾タンパク質又は糖タンパク質ではＰＥＧの結合位置、結合個数を制御することが難しく、均一なＰＥＧ修飾タンパク質又は糖タンパク質を得ることは困難である。したがって、この方法によって得られるＰＥＧ修飾タンパク質又は糖タンパク質を医薬品として製剤化することには問題があった。
また、近年ＰＥＧ修飾タンパク質医薬品として海外で市販されたインターフェロンα２ｂ製剤「ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ」（シューリングプラウ社）は、分子量１２，０００のＰＥＧを結合させたものであるのに対し、後に市販された「ＰＥＧＡＳＹＳ」（ホフマン・ラ・ロシュ社）は、薬効持続性の延長を期待して、より長い分子量４０，０００のＰＥＧを結合させたインターフェロンα２ａ製剤である。このようにＰＥＧ修飾タンパク質医薬品の開発においては、薬効を持続させるにはＰＥＧ鎖長は長いほど良いと考えられている。
即ち、従来のＰＴＨ製剤では、皮下投与や経皮、経粘膜投与におけるＢＡが極めて低いため、薬効と副作用のコントロールが難しいという問題があり、ＰＴＨのＢＡ改善および薬効増強と副作用のコントロールができる技術の開発が望まれていた。
発明の開示
上記のように、ＰＴＨに徐放性を付与する試みや免疫原性および安定性を改善する試みはいくつか報告されている。しかしながら、これらには、煩雑な方法が必要であったり、副作用が増強される等の問題があった。
そこで、本発明者等は、上記問題を解決するため種々の検討を行った。その結果、驚くべきことに、ＰＴＨにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させると、ＰＥＧを結合していないＰＴＨと比較してＰＴＨの血中濃度が持続する一方、皮下投与で顕著に高いＢＡを実現し、血圧低下を大幅に軽減することを見出した。更に本発明では、ＰＴＨに結合させるＰＥＧ鎖長を、通常では薬効増強にはむしろ短かいと判断される範囲で選択することで、血中カルシウム濃度の急激な上昇もないことを見出し、薬効と副作用を制御することが可能であることを示した。本発明はこれらの知見に基づき完成したものである。
したがって、本発明は、皮下投与に際して高いＢＡが得られ、副作用の少ないＰＴＨを提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、ＰＥＧを結合させたＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を提供する。
また、本発明は、上記ＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を含有するＰＥＧ結合ＰＴＨ組成物を提供する。
更に、本発明は、薬効を保つのに有効な量の上記ＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を有効成分として含有するＰＴＨ製剤を提供する。
また、本発明は、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体にシステイン残基を導入した［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体を提供する。
更に、本発明は、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体中のアミノ基とＰＥＧ誘導体とを縮合させるか、またはアミノ基にＰＥＧ誘導体を付加させることを包含する、上記ＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体の製造方法を提供する。
また、本発明は、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体に導入したＰＥＧ結合部位に、ＰＥＧを結合させることを包含する、上記ＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体の製造方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＰＥＧを結合させたＰＥＧ結合副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体に関するものである。
本発明におけるＰＴＨは、天然型のＰＴＨ、遺伝子工学的手法で製造された組換えＰＴＨ、化学的に合成されたＰＴＨを包含し、例として、８４アミノ酸残基よりなるヒトＰＴＨ（ヒトＰＴＨ（１−８４））、特に遺伝子工学的手法で製造された組換えヒトＰＴＨ（１−８４）が挙げられる。またＰＴＨ誘導体とは、前記のＰＴＨの部分ペプチドや、ＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドの構成アミノ酸を一部他のアミノ酸に置換したもの、ＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を欠失したもの、およびＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドに１種以上のアミノ酸を付加したペプチドなどで、天然由来のＰＴＨと同様の生物学的活性を有するものを意味する。アミノ酸の一部を置換、欠失及び／又は付加したものとは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により置換、欠失及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたものを意味する。ＰＴＨの部分ペプチドとしては、例えばヒトＰＴＨ（１−９）、ヒトＰＴＨ（１−１１）、ヒトＰＴＨ（１−１４）、ヒトＰＴＨ（１−２０）、ヒトＰＴＨ（１−２８）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−３５）、ヒトＰＴＨ（１−３７）、ヒトＰＴＨ（１−３８）、ヒトＰＴＨ（１−６４）、ヒトＰＴＨ（３５−８４）、ウシＰＴＨ（１−３４）などが挙げられる。ＰＴＨ（１−３４）とはＰＴＨのＮ末端から３４番目のアミノ酸までの３４個のアミノ酸からなるＰＴＨの部分ペプチドあるいはそのカルボキシ末端をアミノ化したもの（即ち、ヒトＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ２）を示す。また、アミノ酸置換の例としては、８位の構成アミノ酸のロイシンやノルロイシンへの置換、１８位の構成アミノ酸のロイシンやノルロイシンへの置換、３４位の構成アミノ酸のチロシンへの置換などが挙げられる。
また、ＷＯ２００１／２３５２１号、ＷＯ２００１／２３４２７号、ＷＯ２０００／３１２６６号、ＷＯ２０００／３９２７８号、ＷＯ０１／８１４１５号、Ｎａｏｔｏ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，Ｉｓｓｕｅ  ５２，４９００３−４９０１２，２００１に記載されている誘導体も用いることができる。
また、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体として、システイン残基を導入したもの、すなわちＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体の１又は複数のアミノ酸残基をシステイン残基に置換した、および／またはＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体に１又は複数のシステイン残基を付加又は挿入した、［Ｃｙｓ］−ＰＴＨ誘導体を用いることもできる。システイン残基を導入する部位は特に限定されないが、例えば、システイン残基は、Ｎ末端以外の部位に導入されており、例えば、９位〜Ｃ末端、１１位〜Ｃ末端、１４位〜Ｃ末端、２０位〜Ｃ末端、あるいは２８位〜Ｃ末端に導入されており、特にＣ末端に導入されている。例えば、ＰＴＨ（１−３４）のＣ末端にシステイン残基を付加した［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）を用いることができる。ここで例えば、９位〜Ｃ末端へのシステイン残基の導入とは、９位〜Ｃ末端のいずれかのアミノ酸残基のシステイン残基への置換、９位と１０位との間〜Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基との間のいずれかへのへのシステイン残基の挿入、およびＣ末端アミノ酸残基へのシステイン残基の付加を意味する。
本発明に用いるＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体の純度は必ずしも１００％である必要はなく、これらのＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体は実質的に純粋であればよい。本発明において「実質的に純粋」とは、少なくともＨＰＬＣにて単一ピークを示すように精製されたものであり、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動等の手法を組み合わせて単一であることが確認されたものを意味する。かかるＰＴＨ類は特開平６−８７８９７号公報（米国特許第５，２０８，０４１号に対応）に記載された方法を用いて、あるいは、特表平４−５０５２５９号公報（ＷＯ９０／１４４１５号に対応）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１５８５４，１９９０に記載された方法又はそれらの改良法を用いても製造、確認することができる。
本発明において、活性エステルを片末端に有するＰＥＧ誘導体をＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体に反応させることにより、ＰＥＧを結合させることができる。本発明において使用されるＰＥＧ誘導体としては、片末端をメトキシ化したものが挙げられる。また、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体と結合させるために、メトキシ化されていない片末端に、アミノ基若しくはチオール基と縮合するかまたはこれらに付加可能な官能基を導入したＰＥＧ誘導体、例えばサクシンイミジル低級脂肪酸エステル化したＰＥＧ、アルデヒド化したＰＥＧ、ベンゾトリアゾールカーボネート化したＰＥＧ、グリシジルエーテル化したＰＥＧ、オキシカルボニルイミダゾール化したＰＥＧ、ニトロフェニルカーボネート化したＰＥＧ、イソシアネート化したＰＥＧ、例えばメトキシＰＥＧ−サクシンイミジル低級脂肪酸エステル、特にサクシンイミジル・プロピオン酸エステル化したメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）又はサクシンイミジル・酪酸エステル化したメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）を使用することができる。これらＰＥＧ誘導体をタンパク質中のアミノ基に結合させる方法としては、米国特許第５，６７２，６６２号、ＷＯ９６／１１９５３号、ＷＯ９４／１３２２２号、Ｃｒｉｓｔｉｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，６：６２−６９，１９９５、Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｏ．Ｂｅｕｃｈａｍｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３１：２５−３３，１９８３、Ｓｔｅｖｅｎ，Ｍ．Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，５：１３３−１４０，１９９４に記載の方法などを用いることができる。
また、マレイミド化、ビニルスルホン化、オルソピリジルジスルフィド化、あるいはヨードアセトアミド化などしたＰＥＧ誘導体を使用することもできる。これらは、ＰＴＨの末端あるいはアミノ酸配列中にシステイン残基を付加するか又はシステイン残基で置換したＰＴＨ誘導体に、ＰＥＧを結合させるために用い、ＰＥＧ結合部位を特定することができる。特定の位置にシステイン残基を付加するか又はシステイン残基で置換したタンパク質にＰＥＧを結合させる方法としては、特表平４−５０４８０１号公報（ＷＯ９０／１２８７４号に対応）、ＷＯ９９／０３８８７号、ＷＯ００／４２１７５号公報に記載の方法を用いることができる。これらの方法によって得られる本発明のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体は、例えばＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体１分子当たり１〜４分子のＰＥＧが結合している。モノ−メトキシＰＥＧ−ＰＴＨ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＰＴＨ）は、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体１分子当たり、１分子のＰＥＧが結合している。
例えば、［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）のＣ末端にＰＥＧを結合させると、アミノ基にＰＥＧをランダムに結合させる場合に比べて、活性（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃＡＭＰ産生能）がより高く、品質（例えば品質規格）も均一性が高く、有用性が高い。ＰＥＧの結合位置をコントロールしない場合、ＰＥＧがＮ末端、又は１３位、２６位若しくは２７位のＬｙｓに結合するものが多い。このように結合位置をコントロールしないで作製したＰＥＧ結合ＰＴＨなどでは、Ｃ末端に結合したものに比べて、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＰＴＨ受容体を高発現していない細胞）の試験において活性がやや低下する傾向がある（データは示していない）。
修飾に使用されるＰＥＧの分子量は、得られるＰＥＧ結合ＰＴＨなどに要求される薬効持続効果の程度と副作用の程度、及びＰＴＨ活性の低下の程度等により適宜変更することができるが、ＰＥＧ１分子の分子量は、１ｋＤａ以上２０ｋＤａ未満、好ましくは１ｋＤａ以上５ｋＤａ以下、さらに好ましくは２ｋＤａ以上５ｋＤａ以下、特に２ｋＤａである。ＰＥＧは直鎖型だけでなく分枝型あるいは星型等でも使用可能である。
本発明において、ＰＥＧは、ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体中の１又は複数箇所に結合しており、好ましくは１〜４箇所に結合している。結合部位は特に限定されないが、例えば、ＰＥＧは、Ｎ末端以外の部位に結合しており、例えば、９位〜Ｃ末端、１１位〜Ｃ末端、１４位〜Ｃ末端、２０位〜Ｃ末端、あるいは２８位〜Ｃ末端に結合しており、特にＣ末端に結合している。これまで、ＰＴＨ（１−９）、ＰＴＨ（１−１１）、ＰＴＨ（１−１４）、ＰＴＨ（１−２０）にもＰＴＨ活性が確認されている（Ｌｕｃｋ，ＭＤ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９９，１３，６７０−６８０；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５，２１８３６−２１８４３；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２，４１，１３２２４−１３２３３）。また、ＰＴＨ（１−２７）はＰＴＨ（１−２８）に比較し、活性が弱いことが知られている（Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，１３４５３−１３４６０，１９９９）。したがって、２８位〜Ｃ末端にＰＥＧが結合したＰＴＨが好ましい。
ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体にＰＥＧ結合部位を導入し、このＰＥＧ結合部位を介してＰＴＨを結合させてもよい。ＰＥＧ結合部位にはシステイン残基が含まれる。
ＰＥＧ結合ＰＴＨなどの精製には、ＰＥＧ／デキストラン２相分配、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを用いることができる。
実施例１において、分子量が２ｋ、５ｋ及び２０ｋＤａのＰＥＧを結合させたＰＴＨ、即ち２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ、５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ及び２０ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨの調製例を示す。実施例２においては、これらのＰＥＧ結合ＰＴＨが、ＰＴＨ活性の１つであるｃＡＭＰ産生能を保持することを明らかにする。実施例３においては、これらのＰＥＧ結合ＰＴＨがＰＥＧの分子量に応じた血中濃度推移を示すのみならず、ＢＡがＰＥＧを結合していないＰＴＨに比べて著しく改善したことを明らかにする。また、実施例４で詳述するように、副作用として問題になる血中カルシウム濃度上昇作用は、２ｋ及び５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨではＰＥＧを結合しないＰＴＨと大きく変わることがないが、２０ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨでは血中カルシウム濃度上昇作用が強く、更に上昇した血中カルシウム濃度が長時間持続する傾向があり、５ｋＤａ以下のＰＥＧを結合させたＰＥＧ結合ＰＴＨは、ＷＯ０１／８１４１５号のＦｃドメインを結合させたＰＴＨに比べてより安全であることを明らかにする。また、５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨでは、通常の骨量増加作用を有するＰＴＨと若干異なる挙動を示すことも明らかにする。更に、実施例５で詳述するように、ＰＴＨの副作用の１つである血圧低下作用について、５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを用いて調べ、ＰＥＧを結合しないＰＴＨに比べて血圧低下が非常に低いことを明らかにする。実施例６では、ＰＥＧの結合位置をコントロールして２ｋＤａのＰＥＧを結合させたＰＴＨが、骨密度増加作用を示すことを明らかにする。
さらに、本発明は、上記ＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を含有するＰＥＧ結合ＰＴＨ組成物、及び薬効を保つのに有効な量の上記ＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を有効成分として含有するＰＴＨ製剤に関するものである。
本発明のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体、例えばモノ−メトキシＰＥＧ−ＰＴＨを用いることにより、高いＢＡによって薬効と副作用のコントロールが容易になり、かつ、ＰＴＨ投与による血圧低下に起因する副作用が抑えられ、また血中カルシウム濃度の過度の上昇もない、安全かつ効果的な骨粗鬆症治療が可能になる。したがって、ＰＴＨの長期投与が必要な患者が被る嘔気・頭痛等の副作用による肉体的及び精神的苦痛を軽減または解消し、患者の生活の質（ＱＯＬ）の向上が可能になる。さらに苦痛が少なく効果的な治療法を提供することで患者の治療に対するコンプライアンスが向上し、骨粗鬆症に起因する骨折患者が減少して、老人医療のコスト抑制を可能にする。
ＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体は、例えば皮下注射では１日１回、あるいは週１〜２回の投与が可能であり、例えば皮下注射では１日１回の投与量は、例えば成人の場合、１人当り１〜２００μｇ、好ましくは５〜１００μｇ、さらに好ましくは５〜５０μｇとなることが予測される。
本発明によるＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体は、皮下注射、静脈内注射、経粘膜投与（例えば経肺、経鼻など）、経皮投与などの投与経路により患者へ投与することができる。
採用する投与方法にあわせて、溶液製剤、凍結乾燥製剤、プレフィルドシリンジ、無痛針あるいは無針型皮下投与製剤、イオントフォレシスあるいは皮内埋め込み型の徐放製剤（例えばマイクロカプセル、高分子ミセル、高分子を含むゲル化製剤、リポソームなど）などに製剤化することが可能である。本発明のＰＴＨ製剤は、従来のＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体よりも安定な製剤を提供することができることから、従来のものよりも更に有用である。
実施例
以下の実験例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）  ＰＥＧ−ＰＴＨの調製（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性試験およびＢＡ試験用試料）
２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解させた１ｍｇ／ｍＬ  ｈＰＴＨ（１−３４）溶液２．１６ｍＬ、１．３５ｍＬ及び１．０８ｍＬに、それぞれｍＰＥＧ  ２ｋ−ＳＰＡ  ２１．１ｍｇ、ｍＰＥＧ  ５ｋ−ＳＰＡ  ３７．０ｍｇ及びｍＰＥＧ  ２０ｋ−ＳＰＡ  １０６．１ｍｇをそれぞれ溶解し、室温下に２時間穏やかに振とうした。得られた溶液に、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）をそれぞれ１．８４ｍＬ、０．７ｍＬ及び３ｍＬ加え、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。ｍＰＥＧ  ５ｋ−ＳＰＡとＰＴＨを反応させた混合液は、陽イオン交換クロマトグラフィーに供する前に、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）で平衡化したＰＤ−１０に通して溶媒置換を行った。陽イオン交換クロマトグラフィーの条件を以下に示す。
2003064462.tif 000002
１分子のＰＥＧが結合したｍｏｎｏ−２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ、ｍｏｎｏ−５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ及びｍｏｎｏ−２０ｋＰＥＧ−ＰＴＨ画分をそれぞれ分取し、セントリコン−３、１０及び３０で濃縮して、それぞれ４４５μｇ、４５６μｇ及び２３９μｇ（ｈＰＴＨ（１−３４）相当量）得た。得られた試料のうち、５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ及び２０ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨについてはＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ２０（図１ａ）を、２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨについてはＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ（図１ｂ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色した。図中、レーンＭは分子量マーカー（２５１２，６２１４，８１５９，１０７００，１４４０４，１６９４９  Ｄａ）を、レーンＰは未反応ＰＴＨを、レーン１はｍｏｎｏ−２０ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを、レーン２は陽イオン交換クロマトグラフィーに供する前の２０ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ反応混合液を、レーン３はｍｏｎｏ−５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを、レーン４は陽イオン交換クロマトグラフィーに供する前の５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ反応混合液を、レーン５は陽イオン交換クロマトグラフィーに供する前の２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ反応混合液を、レーン６はｍｏｎｏ−２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを、レーン７はｍｏｎｏ−及びｄｉ−２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ混合画分を、レーン８はｄｉ−２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを表す。
（２）  ＰＥＧ−ＰＴＨの調製（血圧低下抑制試験用試料）
２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解させた１ｍｇ／ｍＬ  ｈＰＴＨ（１−３４）溶液０．５４ｍＬに、９．６３ｍｇのｍＰＥＧ  ５ｋ−ＳＰＡを溶解し、室温下に２時間穏やかに振とうした。得られた溶液に、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）を３．５ｍＬ加え、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。陽イオン交換クロマトグラフィーの条件は上記（１）の場合と同様である。１分子のＰＥＧを結合させたｍｏｎｏ−５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ画分を分取し、セントリコン−１０で濃縮して１９４μｇ（ｈＰＴＨ（１−３４）相当量）を得た。得られた試料についてＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ２０を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色した。結果を図２に示す。図中、レーンＭは分子量マーカーを、レーンＰは未反応ＰＴＨを、レーン１は陽イオン交換クロマトグラフィーに供する前の５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ反応混合液を、レーン２はｍｏｎｏ−５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを、レーン３はｄｉ−５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを、レーン４はｔｒｉ−５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨを表す。
（３）  ｍＰＥＧ  ２ｋ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）の調製
７０．５ｍｇの［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）を、３３．４８８ｍＬの１００ｍＭクエン酸ナトリウム／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ４．０）溶液に溶解した。この溶液に１．７６３ｍＬの２０ｍＭトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩溶液を加えた。さらに、１．１０２ｇのｍＰＥＧ  ２ｋ−ＭＡＬ（２ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミド）を加えて溶解し、室温下に４時間静置した。３．５２５ｍＬの２２０ｍＭジチオスレイトールを加えて反応を停止させた後、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）に置換した。得られた溶液を８回に分けてイオン交換クロマトグラフィー（条件は以下に示す。）に供し、それぞれｍＰＥＧ  ２ｋ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）溶出画分を分取した。
カラム：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ、６ｍＬ
溶出液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム
濃度勾配：０〜１Ｍ  ＮａＣｌ、１０分
検出器：ＵＶ、吸光度２８０ｎｍ
分取した画分を濃縮し、２８０ｎｍにおける吸光度から［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）換算濃度を算出した。得られたｍＰＥＧ  ２ｋ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）は、［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）換算で４８．５ｍｇ（収率６８．８％）であった。
実施例２
ＰＥＧ−ＰＴＨ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｃＡＭＰ産生能の測定
各ＰＥＧ−ＰＴＨについて、ＰＴＨの骨増加作用の指標となるｃＡＭＰ産生能を以下の方法で測定した。ブタ腎臓由来の細胞であるＬＬＣ−ＰＫ１細胞にヒトＰＴＨ１受容体を遺伝子的に過剰発現させた細胞であるＨＫＲＫ−Ｂ７細胞及びＨＫＲＫ−Ｂ６４細胞（１細胞あたりヒトＰＴＨ１受容体をそれぞれ約１×１０６個及び９×１０４個発現）、並びにＥＷ２９（１細胞あたりラットＰＴＨ１受容体を約１．９×１０５個発現）（高須ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４：１１−２０，１９９９）を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭで培養した。これらの細胞を９６穴プレートに１ウェルあたり１×１０５細胞蒔きこみ、一晩放置した。次の日に、２００μＬの結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＫＣｌ／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／５％非動化ウマ血清／０．５％非動化ウシ血清、ｐＨ７．７）で細胞を一度洗浄し、氷上にて１００μＬのｃＡＭＰアッセイバッファー（ＤＭＥＭ／２ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン／１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン／３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）を加えた。次に結合バッファーで各濃度に調整したｈＰＴＨ（１−３４）及び実施例１で調製したＰＥＧ−ＰＴＨをそれぞれ５０μＬ加え、細胞を３７℃の水浴に載せて２０分間放置した。反応液を除去し、パウダー状にしたドライアイス上にプレートを載せて細胞を凍結させた後、プレートをドライアイス上からはずし、５０μＬの５０ｍＭ  ＨＣｌを加えて細胞を融解させ、再度ドライアイス上に載せて細胞を凍結させた。細胞中のｃＡＭＰ量は、市販のＥＩＡキット（Ｂｉｏｔｒａｋ  ｃＡＭＰ  ＥＩＡ  ｓｙｓｔｅｍ、アマシャム社製）を用いて測定した。
ｈＰＴＨ（１−３４）及び各ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）分子の、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞内におけるｃＡＭＰ産生能を表１に示す。ｈＰＴＨ（１−３４）のＥＣ５０値は１．５ｎＭであったのに対して、２ｋ  ＰＥＧ−ｈＰＴＨ（１−３４）及び５ｋ  ＰＥＧ−ｈＰＴＨ（１−３４）のＥＣ５０値はそれぞれ０．７ｎＭ及び１．６ｎＭであった。このことから、５ｋＤａ以下のＰＥＧをＰＴＨに結合させてもｃＡＭＰ産生能にはほとんど影響がないことが示された。一方、２０ｋ  ＰＥＧ−ｈＰＴＨ（１−３４）のＥＣ５０値は１１ｎＭであり、ｃＡＭＰ産生能の低下が認められたが、活性を保持していることが示された。
2003064462.tif 000003
次に、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）及び各ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］ＰＴＨ（１−３５）分子の細胞内ｃＡＭＰ産生能を表２に示す。ヒトＰＴＨ１受容体を高発現しているＨＫＲＫ−Ｂ７細胞においては（１）、ｈＰＴＨ（１−３４）のＥＣ５０値は０．４ｎＭであったのに対して、２ｋ及び５ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）のＥＣ５０値はそれぞれ０．５ｎＭ及び０．９ｎＭであり、ｃＡＭＰ産生能はほとんど低下しなかった。一方、２０ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）のＥＣ５０値は２．７ｎＭであり、ｃＡＭＰ産生能の低下が認められた。
ヒトＰＴＨ１受容体の発現量が少ないＨＫＲＫ−Ｂ６４細胞においては（２）、ｈＰＴＨ（１−３４）のＥＣ５０値は０．３ｎＭであったのに対して、２ｋ及び５ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）のＥＣ５０値はそれぞれ０．６ｎＭ及び１．０ｎＭであり、ｃＡＭＰ産生能はあまり低下しなかった。一方、２０ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）のＥＣ５０値は８．０ｎＭであり、ｃＡＭＰ産生能の低下が認められた。
ラットＰＴＨ１受容体を発現しているＥＷ２９細胞においても同様の傾向が認められた（３）。ｈＰＴＨ（１−３４）のＥＣ５０値は０．２ｎＭであったのに対して、２ｋ及び５ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）のＥＣ５０値はそれぞれ２．２ｎＭ及び３．５ｎＭであり、ｃＡＭＰ産生能の低下は１０〜２０分の１程度であった。一方、２０ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）のＥＣ５０値は９．１ｎＭであり、ｃＡＭＰ産生能の大幅な低下が認められた。
このことから、５ｋＤａ以下のＰＥＧをＰＴＨに結合させる場合は、ｃＡＭＰ産生能はある程度保持されるが、それ以上の分子量のＰＥＧを結合させるとｃＡＭＰ産生能が顕著に低下することが認められた。
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実施例３
ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）のラットにおけるバイオアベイラビリティ
実施例１で作製したモノＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）を用いて、ラットにおけるバイオアベイラビリティを測定した。
各サンプルは、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ及び０．０５ｖｏｌ％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて８０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、投与溶液とした。６週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本クレア社製）を実験に供した。静脈内投与は、大腿動脈、大腿静脈にポリエチレンチューブ（ＳＰ−３１、夏目製作所製）を挿入したラットを用いて行った。投与溶液を１ｍＬ／ｋｇの投与用量で大腿静脈に挿入したポリエチレンチューブを介して投与し、投与前、並びに投与後５、１５、３０、４５分、及び１、２、４、６、８、２４時間に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。皮下投与は、大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用いて行った。投与溶液を１ｍＬ／ｋｇの投与用量でラットの頚背部皮下に投与し、静脈内投与の場合と同様に血液を採取した。血液を遠心分離して得られた血漿は、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の濃度を測定するまで−４０℃で保管した。
ＰＴＨ（１−３４）またはＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の濃度測定は、Ｒａｔ  ＰＴＨ  ＩＲＭＡ  Ｋｉｔ（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ社製）を用いてＲＩＡ法により行った。放射活性は、コブラ  クワンタム５００５型ガンマーカウンター（パッカード社製）を用いて測定した。血漿中のＰＴＨ（１−３４）またはＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の濃度は、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）を用いて作成した検量線を用いて算出した。得られた血漿中のＰＴＨ（１−３４）またはＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の濃度の時間推移をＷｉｎｎｏｎｌｉｎ（Ｖｅｒ．２．１、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を用いて解析し（図３：静脈内投与、及び図４：皮下投与）、薬物速度論的パラメータとして最高血漿中濃度への到達時間（Ｔｍａｘ）、最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、血漿中半減期（ｔ１／２）、全身クリアランス（Ｃｌｔｏｔａｌ）、平均体内滞留時間（ＭＲＴ）、バイオアベイラビリティ（ＢＡ）を算出した。結果を表３（静脈内投与）及び表４（皮下投与）に示す。
皮下投与時のＢＡは、ＰＴＨ（１−３４）で約１３．６％であったのに対し、２ｋＤａ、または５ｋＤａのＰＥＧを結合させることにより、それぞれ約５６．１％、７１．０％に上昇し、ＰＥＧを結合させることによって、１０数％であったＰＴＨのＢＡが５０％を超えることが可能になった。
このことから、結合させるＰＥＧの分子量を変えることにより、血中への吸収時間、血中滞留性、およびバイオアベイラビリティを制御することが可能であると考えられた。
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実施例４
ＰＥＧ−ＰＴＨの正常マウスにおける血中カルシウム濃度上昇作用
（１）ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）
正常マウスにおけるＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の血中カルシウム濃度上昇作用の有無について、以下の方法で検討した。ｈＰＴＨ（１−３４）を、２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−クエン酸緩衝液／１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０溶液（ｐＨ５．０）を用いて希釈し、１００、３０、１０ｎｍｏｌ／ｍＬに調製した。２ｋ及び５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）も同様に３０ｎｍｏｌ／ｍＬ（ＰＴＨ相当量）に調製し、投与直前まで氷冷放置した。
５週齢の雄ＢＤＦ１マウス（日本チャールス・リバー株式会社）の体重を測定した。薬剤投与直前に眼窩よりヘパリンコートしたキャピラリに血液を採取し、薬剤投与前の血中イオン化カルシウム濃度及びｐＨを、Ｃａ２＋／ｐＨ測定機（３４８型／バイエルメディカル）にて測定し、ｐＨ７．４の時の補正イオン化カルシウム濃度を得た。緩衝液、並びに５００、１５０及び５０ｎｍｏｌ／ｋｇのｈＰＴＨ（１−３４）は一群６匹ずつ、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇの５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）は３匹、１５０ｎｍｏ／ｋｇの２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）は１匹に、各薬剤５ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。投与後１、３、６時間に眼窩採血を行って補正血中イオン化カルシウム濃度を経時的に測定した。投与前及び投与後の補正イオン化カルシウム濃度の経時変化を平均値±標準誤差で図５（ａ）に示す。
その結果、イオン化カルシウム濃度の最大値はどれも同程度であり、ｈＰＴＨ（１−３４）とＰＥＧ−ＰＴＨの血中濃度推移（図４）およびＡＵＣ（表４）の違いに比べて大きな違いがなく、従って、ＰＥＧを結合させることによって血中カルシウム濃度が急激に上昇することはないと考えられた。
詳細にイオン化カルシウム濃度の推移をみると、緩衝液投与群のイオン化カルシウム濃度は徐々に低下したが、ｈＰＴＨ（１−３４）は全ての用量で投与後１時間に最大の血中イオン化カルシウム濃度上昇を示し、その後低下した。２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）も投与後１時間で最大の血中イオン化カルシウム濃度上昇を示し、３時間まで持続してその後低下した。２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）とｈＰＴＨ（１−３４）を比較した場合、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇの２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）は、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのｈＰＴＨ（１−３４）とほぼ同程度のイオン化カルシウム濃度上昇を示した。一方、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇの５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の血中イオン化カルシウム濃度の変化は、ｈＰＴＨ（１−３４）や２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）と異なり、投与後徐々に上昇して３時間でｈＰＴＨ（１−３４）と同程度の最大値を示し、その後持続する傾向が認められた。
５週齢の雌ＤＤＹマウス（日本チャールス・リバー株式会社）についても同様の実験を行った。緩衝液、並びに５００、１５０及び５０ｎｍｏｌ／ｋｇのｈＰＴＨ（１−３４）は一群６匹ずつ、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇの５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）は３匹に、各薬剤５ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。投与後１、３、６時間に眼窩採血を行って補正血中イオン化カルシウム濃度を経時的に測定した。投与前及び投与後の補正イオン化カルシウム濃度の経時変化を平均値±標準誤差で図５（ｂ）に示す。
緩衝液投与群のイオン化カルシウム濃度は徐々に低下したが、ｈＰＴＨ（１−３４）は全ての用量で投与後３時間に最大の血中イオン化カルシウム上昇を示し、その後低下した。一方、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇの５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の血中イオン化カルシウム濃度の変化は、投与後徐々に上昇して３時間で５００ｎｍｏｌ／ｋｇのｈＰＴＨ（１−３４）と同程度の最大値を示し、その後持続する傾向が認められた。
（２）ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）
正常マウスにおけるＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３５）の血中カルシウム濃度上昇作用の有無について、以下の方法で検討した。ｈＰＴＨ（１−３４）を、２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−クエン酸緩衝液／１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０溶液（ｐＨ５．０）を用いて希釈し、１００、３０、１０ｎｍｏｌ／ｍＬに調製した。２ｋ、５ｋ及び２０ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）も同様に３０、１０、２ｎｍｏｌ／ｍＬ（ＰＴＨ相当量）に調製し、投与直前まで氷冷放置した。
６週齢の雌ＤＤＹマウス（日本ＳＬＣ株式会社）を用いて上記（１）と同様にしてｐＨ７．４の時の補正イオン化カルシウム濃度を得た。緩衝液は一群５匹、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのｈＰＴＨ（１−３４）は一群４匹、１５０及び５０ｎｍｏｌ／ｋｇのｈＰＴＨ（１−３４）は一群５匹ずつ、並びに１５０ｎｍｏｌ／ｋｇの２ｋ、５ｋ及び２０ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）は一群４匹ずつ、５０及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇは一群５匹ずつに、各薬剤５ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。投与後１、３、６、９、２４時間に眼窩採血を行って補正血中イオン化カルシウム濃度を経時的に測定した。投与前及び投与後２４時間までの補正血中イオン化カルシウム濃度を表５に示す。
緩衝液投与群のイオン化カルシウム濃度は経時的に若干の変動は認められたが、大きな変化は認められなかった。それに対し、ｈＰＴＨ（１−３４）は投与後１時間で上昇し、投与後３時間で最大値を示し、その後低下した。２ｋ及び５ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）は、投与後３時間で最大の血中イオン化カルシウム濃度上昇を示し、６時間まで持続してその後低下した。２０ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）は投与後３時間で高い値を示し、投与後９時間でも緩衝液投与群よりも明らかに高い値を示した。
また、投与から２４時間後の血中イオン化カルシウム濃度を見ると、２０ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）投与群では、全ての用量で非常に高い血中イオン化カルシウム濃度を示しており、高カルシウム血症を呈していることが明らかとなった。
このように、５ｋＤａ以下のＰＥＧをＰＴＨに結合させた場合、血中イオン化カルシウム濃度上昇作用は、ｈＰＴＨ（１−３４）と比較して若干持続する傾向は認められるが、最大値はそれほど変わらないのに対して、２０ｋＤａのＰＥＧを結合させると、高カルシウム血症を呈することが明らかとなった。
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実施例５
ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の麻酔下ラットにおける血圧低下作用
ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の副作用の有無を調べるため、麻酔下ラットにおける血圧低下作用を以下の方法で測定した。ｈＰＴＨ（１−３４）（株式会社ペプチド研）は２５ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液で２．５ｍｇ／ｍＬに調製し、使用するまで−２０℃以下にて冷凍保存した。試験当日に、２．５ｍｇ／ｍＬ  ｈＰＴＨ（１−３４）を２５ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０溶液（ｐＨ５．０）にて希釈し、５０、２５及び１２．５μｇ／ｍＬに調製した。実施例１（２）で調製したモノ−メトキシ５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）も同様に３６．５、１８．３及び９．１μｇ／ｍＬ（ＰＴＨ（１−３４）相当量）に調製した。調製後は氷冷にて保存し、投与約３０分前に室温に戻した。
１０週齢の雌ＳＤラット（日本チャールス・リバー株式会社）をペントバルビタール  ナトリウム（アボットラボラトリーズ）の腹腔内投与（５０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔し、大腿動脈に血圧測定用カテーテルを、大腿静脈に維持麻酔用カテーテルを挿入した。維持麻酔はシリンジポンプ（テルモ株式会社）を使用し、生理食塩液（大塚製薬株式会社）で溶解した粉末状のペントバルビタール  ナトリウム（東京化成工業株式会社）を２２．５ｍｇ／ｋｇ／ｈｏｕｒの速度で持続投与することにより行った。なお、血圧測定用カテーテルには、生理食塩液にて１００Ｕ／ｍＬに希釈したヘパリンナトリウム（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ）を充填した。全身血圧は、血圧測定用カテーテルに装着した圧力トランスデューサー（日本光電工業株式会社）の信号を血圧用アンプ（日本光電工業株式会社）に入力して測定し、平均血圧を指標とした。心拍数は、全身血圧の出力を瞬時心拍計ユニット（日本光電工業株式会社）に入力して測定した。以上のパラメータは、熱ペン式レコーダー（グラフテック株式会社）上に５ｍｍ／ｍｉｎの速度で連続的に記録した。手術終了後、試験物質投与用注射針を背部皮下に挿入し、各パラメータが安定した後、薬剤の投与を行った。各群４匹ずつのラットを使用し、ｈＰＴＨ（１−３４）を５０、２５及び１２．５μｇ／ｋｇ、５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）を３６．５、１８．３及び９．１μｇ／ｋｇの投与量で１ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与し、投与後９０分まで血圧をモニターした。投与後２０分までの血圧の経時変化の代表例を図６に示す。上から陰性対照物質（緩衝液）、５０μｇ／ｋｇのｈＰＴＨ（１−３４）、３６．５μｇ／ｋｇの５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）をそれぞれ投与した場合の血圧変化を示す。また、ＰＴＨ投与前の平均血圧値と投与後最大血圧低下を示した値を計測し、平均血圧値と最大血圧低下値との差を求めた。結果を平均値±標準誤差として図７に示す。縦軸は最大血圧低下（ｍｍＨｇ）、横軸はＰＴＨの投与量であり、■は緩衝液、●はｈＰＴＨ（１−３４）、▲は５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）を示す。
ｈＰＴＨ（１−３４）は投与直後に強い血圧低下作用を示すのに対し、５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）は投与後の血圧低下作用が緩やかであった（図７）。また、ｈＰＴＨ（１−３４）は１２．５μｇ／ｋｇから５０μｇ／ｋｇまで用量依存的に血圧低下作用を示すのに対し、５ｋＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の血圧低下作用は弱く、特に高投与量の場合、ｈＰＴＨ（１−３４）と比較して非常に弱いことが示された（図７）。
実施例６
ＯＶＸラットにおける２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）の骨量増加作用
ＯＶＸラットにおける２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）の骨量増加作用を以下の方法で検討した。ｈＰＴＨ（１−３４）、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）、２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）を２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−クエン酸緩衝液／１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０溶液（ｐＨ５．０）を用いて希釈し、ｈＰＴＨ（１−３４）、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）は１０ｎｍｏｌ／ｍＬに、２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）は１２０ｎｍｏｌ／ｍｌに調製分注し、使用時まで−８０℃に保存した。
７週齢のメスＳＤ−ＩＧＳラット（日本チャールス・リバー株式会社）を用い、６０匹のラットには両側卵巣摘出術（ＯＶＸ）を、７匹のラットには偽手術を施した。２週間後に卵巣摘出群の体重を測定し、１群６匹で各群の個体の平均体重が均等になるようにラットを振り分けた。
ｈＰＴＨ（１−３４）、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）、２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）を緩衝液で希釈し、ｈＰＴＨ（１−３４）、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）はそれぞれ１０、２．５及び０．６２５ｎｍｏｌ／ｍＬに、２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）は１２０、３０及び７．５ｎｍｏｌ／ｍＬになるように調製した。
次に、偽手術群７匹には緩衝液を投与し、卵巣摘出群については各群６匹に、緩衝液、ｈＰＴＨ（１−３４）、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）（１０、２．５及び０．６２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）、２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）（１２０、３０及び７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）をそれぞれ投与した。投与用量は１ｍｌ／ｋｇとし、週５回４週間、皮下投与を行った。投与最終日にラットを代謝ケージに収容し、２４時間蓄尿を採取するとともに、投与最終日翌日、麻酔下放血によりラットを安楽死させた後、剖検を行い、血液、腰椎および大腿骨を採取した。尿および血液はチューブにとり、遠心分離により上清を採取し、パラメーター測定まで−２０℃に保存した。腰椎および右大腿骨は７０％エタノール中に保存した。腰椎（第二から第五腰椎）の平均骨密度及び右大腿骨の骨密度を二重Ｘ線骨塩量測定装置（ＤＣＳ−６００ＥＸ、アロカ）を用いて測定した。
ｈＰＴＨ（１−３４）、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）及び２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）の、腰椎の平均骨密度増加作用を図８（ａ）に、右大腿骨骨密度増加作用を図８（ｂ）に示す。
卵巣摘出群は、腰椎及び大腿骨において偽手術群に対して有意な骨密度減少を示した。しかしながら、ｈＰＴＨ（１−３４）及び［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）投与により、腰椎及び大腿骨において用量依存的に骨密度が増加し、腰椎では２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇで有意な骨量増加作用を示した。
一方、２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）投与でも、腰椎及び大腿骨において用量依存的な骨密度増加を示し、腰椎及び大腿骨共に７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２０ｎｍｏｌ／ｇの全ての用量で有意な骨密度増加となった。このように、２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）はｉｎ  ｖｉｖｏでも骨量増加作用を保持していることが示された。
産業上の利用の可能性
ＰＴＨ又はＰＴＨ誘導体にＰＥＧを結合させることにより、バイオアベイラビリティを高めるだけでなく、副作用も顕著に軽減させるＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体を容易に得ることができる。したがって、本発明のＰＥＧ結合ＰＴＨ又はＰＥＧ結合ＰＴＨ誘導体は、患者の負担を軽減させるＰＴＨ製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１中、（ａ）は５ｋ及び２０ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨについてＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ２０を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色した電気泳動写真である。（ｂ）は、２ｋＰＥＧ−ＰＴＨについてＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色した電気泳動写真である。
図２は、５ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨについてＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ２０を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色した電気泳動写真である。
図３は、静脈内投与によるＰＴＨ（１−３４）及びＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の血漿中濃度推移を示すグラフである。
図４は、皮下投与によるＰＴＨ（１−３４）及びＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）の血漿中濃度推移を示すグラフである。
図５は、正常マウスにｈＰＴＨ（１−３４）、５ｋ及び２ｋ  ＰＥＧ−ＰＴＨ（１−３４）を投与した場合の補正血中イオン化カルシウム濃度の経時変化を示すグラフである。
図６は、ラットにＰＴＨを投与後２０分までの血圧の経時変化を示すグラフである。
図７は、ＰＴＨ投与前の平均血圧値と、投与後最大血圧低下を示した値との差を平均値±標準誤差として示したグラフである。
図８は、卵巣摘出ラットにおける、ｈＰＴＨ（１−３４）、［Ｃｙｓ３５］−ｈＰＴＨ（１−３５）及び２ｋ  ＰＥＧ−［Ｃｙｓ３５］−ＰＴＨ（１−３５）投与による腰椎骨密度増加作用（ａ）及び大腿骨骨密度増加作用（ｂ）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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