(57)【要約】本発明は、新規Ｋ＋トランスポーター活性を有するたん白質、及び塩ストレス下、浸透圧ストレス下においても生育可能な植物を提供することを目的とする。本発明のＫ＋トランスポーター活性を有するたん白質は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を含む、Ｋ＋トランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項２】
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩；
（ｂ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩；及び
（ｃ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を含む、Ｋ＋トランスポーター活性を有するタンパク質組成物。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質又はその部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子。
【請求項４】
配列番号：４で表わされる塩基配列を有する、請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクター。
【請求項６】
前記ＤＮＡが、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号：４で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項５に記載の組換ベクター。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の組換ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の組換ベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項９】
植物が、植物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞である請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の組換ベクターが導入されたトランスジェニック植物を培養又は栽培してなる環境ストレス耐性植物。
【請求項１１】
環境ストレスが、塩ストレスである、請求項１０に記載の環境ストレス耐性植物。
【請求項１２】
環境ストレスが、低浸透圧ストレス又は高浸透圧ストレスである、請求項１０に記載の環境ストレス耐性植物。
【請求項１３】
請求項２記載のタンパク質又はその部分ペプチド（ａ）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、タンパク質又はその部分ペプチド（ｂ）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、及びタンパク質又はその部分ペプチド（ｃ）をコードする塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子。
【請求項１４】
前記タンパク質又はその部分ペプチド（ａ）をコードする塩基配列が配列番号：４で表わされ、前記タンパク質又はその部分ペプチド（ｂ）をコードする塩基配列が配列番号：５で表わされ、前記タンパク質又はその部分ペプチド（ｃ）をコードする塩基配列が配列番号：６で表わされる、請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
（ｄ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（ｆ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクター。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ（ｄ）が、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号：４で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡであり、
前記ＤＮＡ（ｅ）が、配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号：５で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡであり、かつ
前記ＤＮＡ（ｆ）が、配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号：６で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件、下でハイブリダイズし、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１５に記載の組換ベクター。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の組換ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の組換ベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１９】
植物が、植物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞である請求項１８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
請求項１５又は１６に記載の組換ベクターが導入されたトランスジェニック植物を培養又は栽培してなる環境ストレス耐性植物。
【請求項２１】
環境ストレスが、塩ストレスである、請求項２０に記載の環境ストレス耐性植物。
【請求項２２】
環境ストレスが、低浸透圧ストレス又は高浸透圧ストレスである、請求項２０に記載の環境ストレス耐性植物。
【請求項２３】
請求項７又は請求項１７に記載の形質転換体を培養し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を生成、蓄積し、該タンパク質を採取することを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の製造方法。
【請求項２４】
請求項１７に記載の形質転換体を培養し、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を生成、蓄積し、該タンパク質を採取することを特徴とする、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩；
（ｂ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩；及び
（ｃ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を含むタンパク質混合物の製造方法。
【請求項２５】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項２６】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項２７】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項２８】
請求項７又は請求項１７に記載の形質転換体を用いて製造されたものである、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項１７に記載の形質転換体を用いて製造されたものである、請求項２６又は２７に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なＫ＋トランスポーターの用途に関する。更に詳細には、新規Ｋ＋トランスポーター活性を有するタンパク質、及び塩ストレス下においても生育可能な植物に関する。
背景技術
カリウムイオン（Ｋ＋）は、生物（微生物、動物及び植物）の細胞内に約１００ｍＭ程度に維持されている、細胞内における主要な陽イオンである。このように、細胞内のＫ＋濃度が高濃度に維持されることにより、一定の生体膜電位が形成され、この電気化学的ポテンシャルを利用することによって、種々の物質の輸送及びエネルギー変換が行われている。
それぞれの生物においては、細胞内のＫ＋を高濃度に維持するために種々の輸送システムを有しており、例えば動物細胞では、Ｎａ＋／Ｋ＋交換輸送体によってＡＴＰを消費してＮａ＋を排出し、Ｋ＋を細胞内に輸送している。一方、植物細胞では、細胞内にＫ＋チャネルやＫ＋トランスポーターが存在しており、細胞内のＫ＋濃度を維持し、Ｎａ＋の細胞内への侵入を、細胞内主要イオンのＫ＋が防いでいる。このような輸送体等により、生物は外界環境変化への応答や細胞内の情報伝達に対応している。
また、藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）のゲノムにはＫ＋トランスポーターとして主要なファミリーの１つである植物のＮａ＋／Ｋ＋トランスポーター（ＨＫＴ系）や海洋性細菌Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓのＫ＋トランスポーター（ＫｔｒＢ）と高い相同性を示す遺伝子が存在することが知られている。しかし、その遺伝子の構造等については明らかになっていなかった。
一方、近年における化学肥料の大量使用や長期にわたる連作等により、土壌中に塩類が高濃度に集積するようになってきている。また、海岸や河口近くの土壌は塩分を多く含んでいる。更に、世界各地における乾燥地帯を中心に砂漠化が進行しており、毎年約６００万ヘクタールの広大な面積が砂漠化しているといわれている。我が国の全耕作面積は約５４０万ヘクタールであるから、全世界において１年間に砂漠化する面積は我が国の耕作面積を上回っている。このような砂漠化した土壌には塩分が多量に含まれている。このように、塩分が多量に含まれる土壌は年々増加しており、このような土壌においては植物が塩ストレスに曝されており、植物が生育することが困難であるという問題が存在する。この問題に対する抜本的な解決策は未だ見出されておらず、耕作面積が減少することにより食糧の安定供給が困難になる可能性がある。
上述したように、塩分を多量に含む土壌において栽培される植物は塩ストレスに曝されており、多くの高等植物の生育を阻害する大きな要因となっている。このような塩ストレスに曝されることにより、農産物生産量が減少し、食糧の安定供給が困難になるという問題があった。
従って、食糧の安定供給を可能にするためには、塩ストレス等の環境ストレスに曝されるような過酷な土地でも生育可能な農作物の作出が望まれている。
従って、本発明は、新規Ｋ＋トランスポーター活性を有するたん白質、及び塩ストレス下においても生育可能な植物を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討した結果、藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）由来の遺伝子産物が、機能未知の藍藻由来の遺伝子産物と共同して細胞外（培養液）から細胞内にＫ＋を輸送するＫ＋トランスポーター活性を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩（以下、本明細書において「ＫｔｒＢタンパク質」ともいう）を含む、Ｋ＋トランスポーター活性を有するタンパク質を提供するものである。
また、本発明は、（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩；
（ｂ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩（以下、本明細書において「ＫｔｒＡタンパク質」ともいう；及び
（ｃ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩（以下、本明細書において「ＫｔｒＣタンパク質」ともいう）を含む、Ｋ＋トランスポーター活性を有するタンパク質組成物を提供する。
また、本発明は、ＫｔｒＢタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子、前記ＤＮＡを含有する組換ベクター、該組換ベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は前記組換ベクターを含むトランスジェニック植物を提供するものである。トランスジェニック植物作成のために使用される植物としては、植物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞が挙げられる。また、植物の種類は、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものが挙げられる。
また、本発明は、前記組換ベクターが導入されたトランスジェニック植物を培養又は栽培してなる環境ストレス（特に塩ストレス、高浸透圧及び低浸透圧）耐性植物を提供するものである。
また、本発明は、ＫｔｒＢタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ＫｔｒＡタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ及びＫｔｒＣタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを有する遺伝子、前記ＤＮＡを含有する組換ベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は前記組換ベクターを含むトランスジェニック植物を提供するものである。トランスジェニック植物作成のために使用される植物としては、上述したものと同様である。
また、本発明は、前記組換ベクターが導入されたトランスジェニック植物を培養又は栽培してなる環境ストレス（特に塩ストレス、高浸透圧及び低浸透圧）耐性植物を提供するものである。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、ＫｔｒＢタンパク質（又はＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質）を生成し、蓄積し、該ＫｔｒＢタンパク質を採取することを特徴とする、ＫｔｒＢタンパク質（又はＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質）の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質に対する抗体を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を含む、Ｋ＋トランスポーター活性を有するタンパク質（ＫｔｒＢタンパク質）について説明する。
ＫｔｒＢタンパク質は、藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）由来の遺伝子産物であり、このＫｔｒＢタンパク質は、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質と共同して細胞外（培養液）から細胞内にＫ＋を輸送する、いわゆるＫ＋トランスポーター活性を有するタンパク質である。また、ＫｔｒＢタンパク質は、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質と共同して細胞内からＮａ＋を排出する活性を有する。
ＫｔｒＢタンパク質は、上述したように藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）由来の遺伝子産物であり、本発明においては、藍藻からクローニングし、クローニングしたＤＮＡを用い、該ＤＮＡから生産したタンパク質が用いられる。また、ＫｔｒＢタンパク質は、従来公知のタンパク質合成法により合成されたものであってもよい。
次いで、本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩（ＫｔｒＡタンパク質）、及び本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩（ＫｔｒＣタンパク質）について説明する。
ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質は、前記ＫｔｒＢタンパク質と同様、藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）由来の遺伝子産物であり、ＫｔｒＡタンパク質とＫｔｒＣタンパク質とは共同してＫｔｒＢタンパク質にＫ＋トランスポーター活性を発揮させるタンパク質である。ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質は、ＫｔｒＢタンパク質と同様、合成したタンパク質であってもよいが、本発明においては、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質をクローニングし、クローニングしたＤＮＡを用い、該ＤＮＡから生産したタンパク質が用いられる。
ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質の遺伝子のクローニングは、かずさＤＮＡ研究所の遺伝子データベースの塩基配列を基に、ＰＣＲプライマー（オリゴヌクレオチド）を作成し、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質の遺伝子を増殖し、カルシウムイオン法やエレクトロポレーション法等の従来公知の大腸菌導入法によりクローニングを行う。
本明細書において、「実質的に同一」とは、タンパク質の活性、すなわちＫ＋トランスポーター活性が実質的に同一であることを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加された場合、活性が同一であれば、その欠失、置換又は付加がなされたタンパク質は欠失、置換又は付加されていないものと実質的に同一である。
一般的に、配列番号：１又は配列番号：２又は配列番号：３で表わされる全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の約８０％以上、好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質も実質的に同一である。
ＫｔｒＢタンパク質としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する遺伝子で形質転換された形質転換体を用いて製造されたものを用いることができる。
ＫｔｒＡタンパク質としては、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する遺伝子で形質転換された形質転換体を用いて製造されたものを用いることができる。
ＫｔｒＣタンパク質としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する遺伝子で形質転換された形質転換体を用いて製造されたものを用いることができる。
本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質は、通常Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここで、エステルにおけるＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどの炭素数１〜６個のアルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの炭素数３〜８個のシクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどの炭素数６〜１２個のアリール基、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。
また、上記タンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものを用いることもできる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などの炭素数１〜６個のアシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などの炭素数１〜６個のアシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
上記タンパク質又はその部分ペプチドの塩としては、特に生理学的に許容される酸付加塩であることが好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを用いることが好ましい。また、配列番号：４で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを用いることが好ましい。また、配列番号：５で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：２で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを用いることが好ましい。また、配列番号：６で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
配列番号：４、５又は６で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４、５又は６で表わされる塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、更に好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡである。ハイブリダイゼーションは、従来より公知の方法、又はそれに準ずる方法、例えばモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合には、添付された使用説明書に記載された方法に従って行うことができる。本明細書に置いて、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件をいう。
配列番号：４、５又は６で表わされるＤＮＡ、又は配列番号：４、５又は６で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質又はＫｔｒＣタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする手段としては、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質又はＫｔｒＣタンパク質と実質的に同一のタンパク質の部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質又はＫｔｒＣタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
一旦、本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質又はＫｔｒＣタンパク質の遺伝子の塩基配列が決定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質又はＫｔｒＣタンパク質の遺伝子を得ることができる。更に、部位特異的突然変異誘発法等によって、本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＣタンパク質又はＫｔｒＡタンパク質の遺伝子の変異型を合成することも可能である。
なお、遺伝子に変異を導入する方法としては、例えばＫｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、変異の導入を行うことができる。
ＫｔｒＢタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクター、及びＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質を含有する組換ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、適当なベクターに、本発明のＫｔｒＢタンパク質の遺伝子、又はＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
本発明のＫｔｒＢタンパク質の遺伝子、又はＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより実施される。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ１３又はＹＣｐ５０等）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルス等の動物ウイルス等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、１ｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター等が好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞等が用いられる。
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
本発明のＫｔｒＢタンパク質をコードする遺伝子、又はＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質をコードする遺伝子を植物に形質転換し、トランスジェニック植物を得る場合は、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に遺伝子を導入することができる。例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜６００Ｖ、１００μＦ、２０ｍｓｅｃの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等の適当なアグロバクテリウムに導入し、この株をバキュームインフィルトレーション法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｓｅｒ．ＩＩＩ  Ｓｃｉ．Ｖｉｅ，３１６，１１９４−１１９９に記載の方法）等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）自体をそのまま使用するか、切片を調製した後に使用するか、又はプロトプラストを調製して使用する。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＯＳ  １０００／Ｈｅ；ＢｉｏＲａｄ等）を用いて処理する。処理の条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１１００ｐｓｉ程度の圧力、５〜１０ｃｍ程度の距離で行う。
また、形質転換に用いられる植物としては、例えば、アブラナ科のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ナス科のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、イネ科のトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、マメ科のダイズ（Ｃｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、その他の農作物や樹木等に対しても有用である。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物等いずれであってもよい。
一旦、ゲノム内に本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫又はクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得、それらから植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質をコードするＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料も含まれる。
上述の形質転換法により得られる、カルス、腫瘍組織、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることができる。また従来より知られている植物組織培養法により、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の添加等により植物体に再生させることができる。
大腸菌等の細菌への組換ベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換ベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換ベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が揚げられる。
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために用いた条件と同様の条件にて行われる。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質は、前記形質転換体を培養し、ＫｔｒＢタンパク質、又はＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質を生成、蓄積し、該タンパク質を採取することにより製造することができる。培養し、前記タンパク質が蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。
例えば、宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、浸透培養又は通気攪拌培養等の好気的条件の下で行う。培養温度、培養時間は、宿主が大腸菌の場合、約１５〜４３℃の温度で約１２〜４８時間行う。宿主がバチルス属菌の場合、約３０〜４０℃の温度で約１２〜１００時間行う。宿主が酵母の場合は、約２０〜３５℃の温度で約２４〜１００時間行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることができる。ｐＨの調製を行う必要がある場合、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して培養を行う。例えば、Ｔ７プロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＰＴＧ等を培地に添加して培養を行ってもよい。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＡＡ等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する場合、用いられる培地としては、一般に用いられているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、通常、５％程度の二酸化炭素の存在下で約３７℃の温度で１〜３０日間行う。
培養後、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質又はＫｔｒＣタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質又はＫｔｒＣタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。すなわち、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を生成することができる。
こうして得られた本発明のタンパク質は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に断片化することもできる。また、キナーゼ等のタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることもできる。本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質が組み込まれた組換えベクターを微生物又は植物に導入した場合は、Ｋ＋を細胞内に取り込む活性が増強されると共に、Ｎａ＋を細胞外に排出する活性が増強され、耐塩性が向上した微生物又は植物となり、環境ストレス、特に塩ストレス、高浸透圧及び低浸透圧に耐性を有する微生物又は植物となる。このような植物は、例えば砂漠化した土壌、乾燥地帯、寒冷地や海岸近くの土壌等においても生育することができるものである。
このような植物は、塩ストレスを研究するための実験植物としても使用可能である。また、塩ストレスとは、土壌中に塩が高濃度に含まれており、通常の植物が生育することができない状態をいう。
一方、塩ストレス耐性が低下した植物は、上述のような砂漠化した土地等においては生育することができないので、雑草等の塩ストレス耐性を低下することにより、環境から排除することができる。従って、本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質の活性（特にＫ＋トランスポーター活性）を阻害する化合物をスクリーニングし、又はＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質に対する抗体を作製し、前記化合物又は抗体を利用し、塩ストレスの多い土壌に散布し、雑草等の塩ストレス耐性を低下させた後に農作物を生育させることもできる。
上述した、本発明のＫ＋トランスポーター活性を有するタンパク質である、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質は、以下に述べるように抗体を産生するために用いることができる。
以下、本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質に対する抗体について説明する。
本発明のＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質に対する抗体は、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。該抗体は、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質を抗原として用い、従来公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製方法について、以下に説明する。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス等が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等の温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素等で標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。ハイブリドーマの選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））等を用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧ等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、前記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、前記の方法で免疫された温血動物の血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、前記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上述のようにして作製された抗体は、例えば上述したように、前記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物と同様に利用することができる。この場合、モノクローナル抗体を用いた場合は、前記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の阻害活性が単一であるため、使用しやすいという利点がある。
また、上述のようにして作製された抗体は、ＫｔｒＢタンパク質、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質がどのくらいの量発現されているかを検査すること等に用いることができる。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）中においてＫｔｒＢタンパク質がＫ＋トランスポーター活性を示すことを確認する実験を行った。
実験は以下のように行った。
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）に相同的組換によりＫｔｒＢ遺伝子にカナマイシン耐性遺伝子を挿入し、ＫｔｒＢ遺伝子を分断破壊し、ＫｔｒＢ遺伝子が破壊された藍藻を作成した。以下、ＫｔｒＢ遺伝子が破壊された藍藻をΔＫｔｒＢという。
かずさＤＮＡ研究所の遺伝子データベースの塩基配列を基に、配列番号：９及び１０で表されるＰＣＲ用ＤＮＡプライマー（オリゴヌクレオチド）を作成して、配列番号：１で表わされるタンパク質（ＫｔｒＢタンパク質）の遺伝子を増殖し、大腸菌で複製可能なｐＢＲ３２２由来の増幅ベクター（宝酒造（株）製）に組み込み、組換えベクターを得た。カルシウムイオン法により、大腸菌（ＪＭ１０９）を該組換ベクターで形質転換し、形質転換体を作成した。形質転換体を培養し、配列番号：１で表わされるタンパク質（ＫｔｒＢタンパク質）の遺伝子を得た。ＫｔｒＢタンパク質遺伝子を相同的組換による遺伝子導入によって染色体へ導入した。以下、このＫｔｒＢタンパク質遺伝子が導入された藍藻を＋ＫｔｒＢという。
上述のようにして得られたΔＫｔｒＢ、＋ＫｔｒＢ、及び野生株（ＷＴ）の藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）を塩化ナトリウムを含まないＢＧ１１培地（液体培地）にて前培養を行い、次いで塩化ナトリウムを含まないＢＧ１１培地（プレート培地）と０．４Ｍ塩化ナトリウムを含むＢＧ１１培地（プレート培地）に藍藻を移植し、３０℃の温度で０．３％ＣＯ２の存在下で生育状態を観察した。生育を５〜７日間行い、プレート培地の観察を行った。結果を図１に示す。図１は、藍藻を生育したプレート培地の写真である。
図１の上段は塩化ナトリウムを含まないＢＧ１１培地における生育状態を示す図であり、図１の下段は０．４Ｍ塩化ナトリウムを含むＢＧ１１培地における生育状態を示す図である。上段、下段ともに、左からΔＫｔｒＢ、ΔＫｔｒＢ、ＷＴ、＋ＫｔｒＢの生育状態を示す。
図１に示すように、塩化ナトリウムを含まないＢＧ１１培地においては、いずれも増殖することができた。これに対し、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む培地においては、ＷＴ及び＋ＫｔｒＢは増殖することができたが、ΔＫｔｒＢは増殖することができなかった。
上記結果からＫｔｒＢ遺伝子が藍藻の耐塩性に関与するＫ＋トランスポーター活性を有するタンパク質をコードしていることが明らかである。
実施例２
かずさＤＮＡ研究所の遺伝子データベースの塩基配列を基に、配列番号：７及び８で表されるＰＣＲ用ＤＮＡプライマー（オリゴヌクレオチド）を作成して、配列番号：２で表わされるタンパク質（ＫｔｒＡタンパク質）の遺伝子を増殖し、大腸菌で複製可能なｐＴＷＶ２２８増幅ベクターに（宝酒造（株）製）に組み込み、組換えベクターを得た。次いで、得られた組換えベクターを、実施例１で得られた組換ベクターと共にカルシウムイオン法により大腸菌  ＬＢ２００３株に導入し、クローン化を行い、ＫｔｒＢタンパク質及びＫｔｒＡタンパク質産生大腸菌（以下、「ＫｔｒＡＢ」という）を得た。
なお、ＬＢ２００３株はＫｄｐ、Ｔｒｋ及びＫｕｐを欠損する株であり、Ｋ＋取り込み機能を有していない株である。すなわち、ＬＢ２００３株はＫ＋を取り込む機能を有していないので、低濃度のカリウム存在下では生育できず、高濃度のカリウムが存在する場合のみ生育することができる。
また、同様にかずさＤＮＡ研究所の遺伝子データベースの塩基配列を基に、配列番号：１１及び１２で表されるＰＣＲ用ＤＮＡプライマー（オリゴヌクレオチド）を作成して、配列番号：１で表わされるタンパク質（ＫｔｒＢタンパク質）の遺伝子及び配列番号：３で表わされるタンパク質（ＫｔｒＣタンパク質）の遺伝子を増殖し、大腸菌で複製可能なｐＢＲ３２２由来増幅ベクター（宝酒造（株）製）に組み込み、組換えベクターを得た。次いで、得られた組換えベクターをカルシウムイオン法により大腸菌  ＬＢ２００３株に導入し、クローン化を行い、ＫｔｒＢタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質産生大腸菌（以下、「ＫｔｒＢＣ」という）を得た。
更に、配列番号：２で表わされるタンパク質（ＫｔｒＡタンパク質）の遺伝子の組換ベクターと、配列番号：１で表わされるタンパク質（ＫｔｒＢタンパク質）と配列番号：３で表わされるタンパク質（ＫｔｒＣタンパク質）の遺伝子の組換えベクターをカルシウムイオン法により大腸菌  ＬＢ２００３株に導入し、クローン化を行い、ＫｔｒＡタンパク質、ＫｔｒＢタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質産生大腸菌（以下、「ＫｔｒＡＢＣ」という）を得た。
次いで、上述のようにして得られたＫｔｒＡＢ、ＫｔｒＢＣ及びＫｔｒＡＢＣを、先ず１２０ｍＭ塩化カリウムを含む最小培地にて前培養を行った後、１０ｍＭ又は３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む最小培地に移植し、生育状態を観察した。生育は３０℃の温度で行った。なお、ＬＢ２００３株（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ）についても同様に生育状態を観察した。結果を図２に示す。図２は、大腸菌を生育したプレート培地の写真である。
図２の上段は１０ｍＭ塩化カリウムを含む培地における生育状態を示す図であり、図２の下段は３０ｍＭ塩化カリウムを含む培地における生育状態を示す図である。上段、下段ともに、左からｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ、ＫｔｒＡＢ、ＫｔｒＢＣ及びＫｔｒＡＢＣの生育状態を示す。
図２に示すように、３０ｍＭ塩化カリウムを含む培地においては、いずれの大腸菌も増殖することができた。これに対し、１０ｍＭ塩化カリウムを含む培地においては、ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ、ＫｔｒＡＢ、ＫｔｒＢＣは増殖することができず、ＫｔｒＡＢＣのみが増殖することができた。この結果より、ＫｔｒＡＢ及びＫｔｒＢＣはカリウム取り込み機能を大腸菌に付与することができず、すなわち、ＫｔｒＡ及びＫｔｒＢを、又はＫｔｒＢ及びＫｔｒＣを大腸菌に発現させてもカリウム取り込み機能が付与されず、ＫｔｒＡ、ＫｔｒＢ及びＫｔｒＣ全てを大腸菌に発現させた場合にカリウム取り込み機能が発揮されることがわかる。
実施例３
実施例２で用いた、ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ、ＫｔｒＡＢ、ＫｔｒＢＣ及びＫｔｒＡＢＣを導入した大腸菌の液体培地中における増殖について調べた。
まず、それぞれの菌体を１２０ｍＭ塩化カリウムを含む最小培地にて前培養を行い、菌体を塩化カリウムを含まない最小培地で２回洗浄し、３０ｍＭ塩化カリウムを含む最小培地に移植し、３０℃の温度で１分間に１００往復の振盪をしながら培養を行った。培養開始から１時間ごとにサンプリングし、培地の６１０ｎｍにおける吸光度を測定し、増殖曲線を作成した。結果を図３に示す。なお、液体培地での培養開始時のＯＤ６１０は０．０５であった。
図３において、横軸は時間を示し、縦軸は６１０ｎｍにおける吸光度を示す。
図３に示すように、ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ、ＫｔｒＡＢ、ＫｔｒＢＣは液体培地中で８時間まではほとんど増殖しないのに対し、ＫｔｒＡＢＣは経時的に増殖を示すことがわかった。この結果より、ＫｔｒＢタンパク質を生産していない菌株においてはＫ＋取り込み機能を欠くため、高濃度カリウム下でも増殖速度が低いことがわかる。また、ＫｔｒＡＢＣは増殖速度が大きいことより、ＫｔｒＢタンパク質は単独でカリウム取り込み機能を発揮するのではなく、ＫｔｒＡタンパク質及びＫｔｒＣタンパク質と共同して上記機能を発揮することがわかる。
実施例４
ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ、ＫｔｒＡＢ、ＫｔｒＢＣ及びＫｔｒＡＢＣのＫ＋取り込み活性を、大腸菌をタンパク質発現宿主として用いて測定した。まず、それぞれの菌体を３０ｍＭ塩化カリウムを含む最小培地にて生育させた後、Ｎａ＋−Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）で２回洗浄を行い、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁した。測定開始１０分前に１０ｍＭグルコースを添加し、測定開始時に０．５ｍＭ塩化カリウムを添加した。測定条件は２５℃、ｐＨ７．５で行い、Ｋ＋取り込みは経時的に原子吸光光度分析法によるイオン量を測定した。
結果を図４に示す。図４に示すように、ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ、ＫｔｒＡＢが、少量のＫ＋を取り込む活性を有しており、ＫｔｒＢＣはＫ＋をほとんど取り込まないのに対し、ＫｔｒＡＢＣのＫ＋取り込み活性は高いことがわかった。
実施例５
ＫｔｒＡＢＣについて、Ｎａ＋依存性Ｋ＋取り込み活性を調べた。実施例４における活性測定において、測定開始１１分後に５ｍＭ塩化ナトリウムを添加し、同様に実験を行った。その結果を図５に示す。図５に示すように、ＫｔｒＡＢＣのＫ＋取り込み活性はＮａ＋の添加により上昇することがわかった。すなわち、ＫｔｒＡＢＣのＫ＋取り込み活性はＮａ＋依存性である。
実施例６
実施例１で得られた＋ＫｔｒＢ、ΔＫｔｒＢ及び野生株（ＷＴ）の藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）を用いて、浸透圧調節の寄与について調べた。まず、それぞれの菌体をＢＧ１１液体培地に懸濁し、培養を開始した。培養開始後、３０秒後に塩化カリウム濃度が５ｍＭになるように、塩化カリウムを添加した。次いで、培養開始後、１０分後に塩化ナトリウム、又はソルビトールを、それぞれの濃度が１００ｍＭ、ｓ又は２００ｍＭになるように添加した。培地中のＫ＋濃度を経時的に測定した。測定は２５℃、ｐＨ７．５の条件で行い原子吸光度分析用により行った。なお、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び２００ｍＭソルビトールは浸透圧としては同じである。
結果を図６に示す。図６に示すように、１００ｍＭ塩化ナトリウムの存在下ではＫ＋の取り込み活性が増加することがわかった。これに対し、２００ｍＭソルビトールの存在下でＫ＋の取り込み活性はわずかに増加した。この結果より、ＫｔｒＢのＫ＋輸送はＮａ＋により促進され、浸透圧の寄与はあまりないことが明らかである。
実施例７
実施例１で得られた＋ＫｔｒＢ、ΔＫｔｒＢ及び野生株（ＷＴ）の藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）を、塩化ナトリウムを含まないＢＧ１１培地、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍソルビトール及び０．３Ｍソルビトールを含むＢＧ１１培地（液体培地）にて培養を行った。培養は３０℃の温度で０．３％ＣＯ２の存在下で７日間行い、液体培地の観察を行った。結果を図７に示す。図７は、藍藻を生育した液体培地の写真である。図７に示す結果においては、上から、それぞれ塩化ナトリウムを含まないＢＧ１１培地、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍソルビトール及び０．３Ｍソルビトールを含むＢＧ１１培地であり、左から＋ｓＫｔｒＢ、ΔｓＫｔｒＢ及びＷＴの生育状態を示す。
図７に示すように、塩化ナトリウムを含まないＢＧ１１培地においては、いずれも増殖することができた。これに対し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む培地及び０．３Ｍソルビトールを含む培地においては増殖は悪かった。図７に示すように、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む培地においてはΔＫｔｒＢは増殖できたのに対し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと同じ浸透圧を示す０．３Ｍソルビトールを含む培地ではΔＫｔｒＢの増殖は悪かった。一方、＋ＫｔｒＢでは０．３Ｍソルビトールを含む培地でも増殖した。この結果は、ＫｔｒＢ、すなわちＫ＋トランスポーターが浸透圧に対して耐性（耐浸透圧活性）を示しており、菌の浸透圧調節に関与していることがわかった。
以上詳述した通り、本発明のＫ＋トランスポーターの活性はＮａ＋によって促進されるものである。従って、本発明のＫ＋トランスポーター活性を有するタンパク質は宿主に形質転換された際に宿主に耐塩性を付与するものであり、本発明のＫ＋トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、植物や微生物等に耐塩性を付与するために用いることができ、例えば高浸透圧及び塩ストレス下においても生育可能な植物を提供することができる。また、本発明のＫ＋トランスポーター活性を有するタンパク質は菌の浸透圧調節に関与するタンパク質である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、藍藻を生育したプレート培地の写真である。
図２は、大腸菌を生育したプレート培地の写真である。
図３は、大腸菌の増殖曲線を示すグラフである。
図４は、Ｋ＋取り込み量を示すグラフである。
図５は、Ｋ＋取り込み量を示すグラフである。
図６は、Ｋ＋取り込み量を示すグラフである。
図７は、藍藻を生育した液体培地の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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