(57)【要約】本発明は、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｍｕ１−１等）、ネフ、１４−３−３蛋白質、チオレドキシン等のＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチド、これらの発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を含むことを特徴とし、各種サイトカインやケモカインの産生抑制作用を有する、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症、シェーグレン症候群、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、敗血症等の免疫疾患の予防または治療剤を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＫ１阻害物質を含む、免疫疾患の予防または治療剤。
【請求項２】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項３】
ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体がＫ７０９ＲまたはＫ７０９Ｍである、請求項２記載の予防または治療剤。
【請求項４】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項５】
ＡＳＫ１阻害物質がグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３蛋白質およびチオレドキシンから選択されるＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項６】
免疫疾患が自己免疫疾患である、請求項１〜５のいずれかに記載の予防または治療剤。
【請求項７】
免疫疾患がアレルギー性疾患である、請求項１〜５のいずれかに記載の予防または治療剤。
【請求項８】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症およびシェーグレン症候群から選択される疾患である、請求項６記載の予防または治療剤。
【請求項９】
アレルギー性疾患が気管支喘息、アトピー性皮膚炎または敗血症である、請求項７記載の予防または治療剤。
【請求項１０】
ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することを含む、免疫疾患の予防または治療方法。
【請求項１１】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１０記載の予防または治療方法。
【請求項１２】
ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体がＫ７０９ＲまたはＫ７０９Ｍである、請求項１１記載の予防または治療方法。
【請求項１３】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１０記載の予防または治療方法。
【請求項１４】
ＡＳＫ１阻害物質がグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３蛋白質およびチオレドキシンから選択されるＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１０記載の予防または治療方法。
【請求項１５】
免疫疾患が自己免疫疾患である、請求項１０〜１４の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項１６】
免疫疾患がアレルギー性疾患である、請求項１０〜１４の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症およびシェーグレン症候群から選択される疾患である、請求項１５記載の予防または治療方法。
【請求項１８】
アレルギー性疾患が気管支喘息、アトピー性皮膚炎または敗血症である、請求項１６記載の予防または治療方法。
【請求項１９】
免疫疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのＡＳＫ１阻害物質の使用。
【請求項２０】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体がＫ７０９ＲまたはＫ７０９Ｍである、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１９記載の使用。
【請求項２３】
ＡＳＫ１阻害物質がグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３蛋白質およびチオレドキシンから選択されるＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１９記載の使用。
【請求項２４】
免疫疾患が自己免疫疾患である、請求項１９〜２３の何れかに記載の使用。
【請求項２５】
免疫疾患がアレルギー性疾患である、請求項１９〜２３の何れかに記載の使用。
【請求項２６】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症およびシェーグレン症候群から選択される疾患である、請求項２４記載の使用。
【請求項２７】
アレルギー性疾患が気管支喘息、アトピー性皮膚炎または敗血症である、請求項２５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＡＳＫ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｓｅ  １）阻害物質を含む、免疫疾患の予防または治療剤、ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することを含む、免疫疾患の予防または治療方法、および免疫疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのＡＳＫ１阻害物質の使用に関するものである。
背景技術
ＡＳＫ１はＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）ファミリーに属するキナーゼの一種であり、例えば、ヒトＡＳＫ１は１３７５個のアミノ酸により構成され（下記文献１参照）、マウスＡＳＫ１は１３７９個のアミノ酸から構成されており（下記文献２参照）、ヒトＡＳＫ１とマウスＡＳＫ１には９１．９％の極めて高い相同性が認められることが報告されている。同様に、ヒトＡＳＫ１のｃＤＮＡ（下記文献３参照）やマウスＡＳＫ１のｃＤＮＡ（下記文献２参照）が開示されている。ＭＡＰＫＫキナーゼは、ヒトを含む哺乳類から酵母に至るまで保存された細胞内シグナル伝達経路として知られているＭＡＰ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）キナーゼスーパーファミリーによるシグナル伝達カスケードに属するキナーゼであり、ＭＡＰＫＫキナーゼの下流には、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）およびＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）の２種類のキナーゼが存在する。（下記文献４〜６参照）
ＡＳＫ１は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、大腸、脳、肺を始め、ヒトの殆どの臓器に分布し、ＴＮＦ受容体を介してＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−αにより活性化され、活性化されたＡＳＫ１が当該シグナル伝達カスケードを介して細胞のアポトーシス誘導に関与していることが確認されている。また、ヒトＡＳＫ１の変異体であるドミナントネガティブ体をＪｕｒｋａｔ細胞に高発現させた場合、ＴＮＦ−αにより誘導されるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。それ故、ＡＳＫ１が悪性腫瘍治療剤または悪性腫瘍遺伝子治療剤として有用であることが開示されている。（下記文献４及び５参照）更には、ＡＳＫ１が皮膚角化細胞において高発現していることが報告され、その分化促進に関与していることが示唆されている。（下記文献７参照）しかしながら、ＡＳＫ１が免疫疾患の発症や進展に関与していることは何ら報告されていない。
免疫疾患の発症原因の一つとして、サイトカインやケモカインの産生異常が関係していることは種々報告されている。例えば、ＩＬ−１は、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、移植拒絶反応、気管支喘息等の発症に関与し、ＩＬ−６は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸炎、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病、メサンギウム増殖性腎炎等の免疫疾患の発症に関与し、ＩＬ−８は、慢性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、炎症性大腸炎、乾癬、気管支喘息等の発症に関与していることが報告されている。ＭＩＰ−３α〔別名：ＬＡＲＣ（ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）〕は、乾癬の病巣部に非常に高発現しており、またアトピー性皮膚炎患者の皮膚で顕著な増加が認められる。更に、ＭＩＰ−３αは、抗原提示細胞である未熟樹状細胞、組織指向性メモリーＴ細胞や皮膚の重要な抗原提示細胞であるランゲルハンス細胞の浸潤、遊走、常駐に関与しており、炎症性大腸炎、移植拒絶反応、気管支喘息等の発症にも関係している。ＭＩＰ−１αやＭＩＰ−１βは、Ｔｈ１細胞やマクロファージ等の遊走、浸潤に関与し、また慢性関節リウマチ、移植拒絶反応、移植片対宿主病、気管支喘息等の病態において発現しており、その病態形成に重要な役割を果たしてしていることが報告されている。（例えば、下記文献８〜２８参照）
慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎を始め、免疫疾患の患者数は年々増加している。現在、これらの患者に対しステロイド療法等が繁用されているが、症状の改善が認められないことが多く、また長期に使用した場合には糖尿病、高脂血症、骨粗鬆症、高血圧、易感染症などが認められることがあり、薬物療法上、未だ満足できるものとは言えない。それ故、目下免疫疾患に関して種々の研究が鋭意行われており、当該疾患の予防または治療剤の早期開発が大いに嘱望されている。
文献１：ＷＯ９７／４０１４３号公報記載の配列表配列番号１
文献２：口腔病学会雑誌，Ｎｏ．３，ｐ．４５（１９９８）図１
文献３：ＷＯ９７／４０１４３号公報記載の配列表配列番号２
文献４：Ｉｃｈｉｊｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．９０−９４（１９９７）
文献５：ＷＯ９７／４０１４３号公報
文献６：飛梅圭，口腔病学会雑誌，Ｎｏ．３，ｐｐ．４２−５２（１９９８）
文献７：Ｓａｙａｍａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．２，ｐｐ．９９９−１００４（２００１）
文献８：小野崎菊夫，サイトカイン，日本医学館，ｐｐ．９５−１０５
文献９：桑名正隆，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．８，ｐｐ．９００−９０７（２００１）
文献１０：武井修治，小児内科，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６，ｐｐ．８６１−８６５（２００１）
文献１１：戸倉新樹，日本皮膚アレルギー学会雑誌，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．４，ｐｐ，１１７−１２１（１９９７）
文献１２：うの原順一，臨床病理，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，ｐｐ．５８７−５９２（１９９８）
文献１３：田中泰史他，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１７４，Ｎｏ．１４，ｐｐ．１２１８−１２２２（１９９５）
文献１４：原田明久他，炎症と免疫，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２，ｐｐ．２１１−２２０（１９９４）
文献１５：杉本正道他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．４，ｐｐ．４１０−４１７（２００１）
文献１６：大谷明夫他，現代医療，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１５２７−１５３２（２００１）
文献１７：姉崎一弥他，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１７３，Ｎｏ．６，ｐｐ．５８８−５９２（１９９５）
文献１８：佐田誠他，ぜん息，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２，ｐｐ．３１−３５（１９９７）
文献１９：倉島一喜，現代医療，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１５１７−１５２１（２００１）
文献２０：松島綱治他，感染・炎症・免疫，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１，ｐｐ．９−１７（１９９４）
文献２１：向田直史，臨床病理，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．４，ｐｐ．３１７−３７９（１９９２）
文献２２：末延則子他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，ｐｐ．１４４−１５１（２００１）
文献２３：中山隆志他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，ｐｐ．１２６−１３４（２００１）
文献２４：石川昌他，実験医学，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１５，ｐｐ．１５０−１５６（２０００）
文献２５：稗島州雄，細胞工学，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５，ｐｐ．７０８−７１６（２０００）
文献２６：義江修，臨床免疫，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１，ｐｐ．８６−９４（２００１）
文献２７：村井政子他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，ｐｐ．１６８−１７４（２００１）
文献２８：鈴木盛一，臨床免疫，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４，ｐｐ．５０４−５１１（２０００）
発明の開示
本発明は、免疫疾患の発症や進展に深く関与する各種サイトカインやケモカインの産生抑制作用を有する、免疫疾患の予防または治療剤を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、免疫疾患の予防または治療に有用な薬剤を見出すべく鋭意検討した結果、ＡＳＫ１が免疫疾患の発症や進展に関与し、ＡＳＫ１阻害物質が免疫疾患に有用であるという知見を得、本発明を成すに至った。
詳細に述べれば、第一に、本発明者らは、ＡＳＫ１の生理的機能を調べるため、活性型ＡＳＫ１を過剰発現した正常ヒト培養皮膚角化細胞を樹立し、各種サイトカインやケモカインの発現量を測定した。その結果、活性型ＡＳＫ１過剰発現細胞において、ＩＬ−１やＩＬ−６のサイトカイン、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＩＰ−３αのケモカインが高発現していることを確認した。これらの事実から、ＡＳＫ１が、免疫疾患の発症や進展に深く関係している、これらのサイトカインやケモカインの発現亢進に関与していることが判った。
また、本発明者らは、ＡＳＫ１ノックアウトマウスを後述した方法により作製した。作製したＡＳＫ１ノックアウトマウスより胎児線維芽細胞および脾臓細胞を採取し、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激により誘導されるＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１αの産生量を測定した。その結果、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞および脾臓細胞においては野生型（正常）マウスの胎児線維芽細胞および脾臓細胞の場合と比較して有意にＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１αの産生が抑制されていた。これら事実から、ＡＳＫ１の活性を低下させることにより、実際にサイトカインやケモカインの産生を抑制できることが判明した。それ故、以上の実験結果から、ＡＳＫ１阻害物質が各種免疫疾患の予防や治療に極めて有用であることが認められる。
更に、本発明者らは、敗血症モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスはその生存率が野生型マウスと比較して顕著に向上し、またＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいては血中ＴＮＦ−α濃度が殆ど上昇しないことを観察した。これらの事実から、ＡＳＫ１の活性を低下させることにより、敗血症の如く各種免疫疾患の病態が顕著に改善できることが判った。これらは、ＡＳＫ１阻害物質が各種免疫疾患の予防や治療に極めて有用であることが更に裏付けられたことに他ならない。
即ち、ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として含有させることにより、免疫疾患の予防または治療に有用な薬剤を提供することができる。また、ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することにより、免疫疾患の有用な予防または治療方法を提供することができる。
本明細書において、「＋／＋」は、マウスまたはマウス由来細胞において１対の相同染色体それぞれに存在する２ヶ所のＡＳＫ１遺伝子座が共に正常であること、即ち野生型であることを示し、「−／−」は、１対の相同染色体それぞれに存在する２ヶ所のＡＳＫ１遺伝子座の両方に変異が導入されており、ＡＳＫ１蛋白の発現がないホモ接合体、即ちＡＳＫ１がノックアウトされているマウスまたはマウス由来細胞であることを示す。
本発明において、免疫疾患とは、各種細胞の機能異常による免疫系の破綻により発症または進展する疾患をいい、例えば、慢性関節リウマチ、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、全身性硬化症、溶血性貧血、血小板減少症、好中球減少症、シェーグレン症候群、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、多発性筋炎、橋本病、バセドウ病、アジソン病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、硬直性脊髄炎、自己免疫性肝炎、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、抗糸球体基底膜病、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病、セリアック病、Ｇｒａｖｅｓ病等の自己免疫疾患、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、敗血症等のアレルギー性疾患、移植拒絶反応、移植片体宿主病（ＧＶＨＤ）等を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、特には慢性関節リウマチ、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、敗血症等のアレルギー性疾患に好適である。
本発明において、ＡＳＫ１阻害物質とは、それ自体ＡＳＫ１阻害作用を有しているものに限定されるものではなく、生体内または培養系においてＡＳＫ１阻害作用を有しているものを産生するものを含み、例えば、アミノ酸配列において１以上のアミノ酸を付加、挿入、置換および／または欠損（例えば、９６０番目のアラニン残基の欠損）させた誘導体を含む（例えば、下記文献２９参照）、ヒトＡＳＫ１に対するドミナントネガティブ体（例えば、Ｋ７０９Ｒ、Ｋ７０９Ｍ；以下、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体と称する）、ヒトＡＳＫ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドと称する）、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質（例えば、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｍｕ１−１等）、ネフ（Ｎｅｆ）、１４−３−３蛋白質、チオレドキシン、熱ショック蛋白質Ｈｓｐ７２、プロテインフォスファターゼ５（ＰＰ５）、Ａｋｔ（Ａｋｔ３等）、ＣＤＣ２５Ａなど）（例えば、下記文献３０〜３７参照）やそのセンスオリゴヌクレオチド（それらの薬理学的に許容される塩を含む）、並びにＡＳＫ１ドミナントネガティブ体またはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列を複製し、標的組織または宿主細胞内で当該ドミナントネガティブ体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる組換えベクター（以下、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する）、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを標的組織または宿主細胞内で発現することができる組換えベクター（以下、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターまたはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する）、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞（以下、場合によりＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞と称する）等を例示することができる。
本発明のＡＳＫ１阻害物質の使用方法としては、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクター、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターや、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を生体内の標的組織に適当な方法により導入し、所望のＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを発現させることによる遺伝子的な予防または治療剤としての使用や、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする製剤を経口または非経口的に投与させることによる薬物的な予防または治療剤としての使用を挙げることができる。
ＡＳＫ１の７０９番目のリジン残基はＡＴＰ結合サイトであり、これをアルギニンまたはメチオニンに置換することによってキナーゼ触媒活性を不活化できるため、遺伝子的な予防または治療方法としては、ドミナントネガティブ（優性抑制型）体として機能する変異体ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ、Ｋ７０９Ｍ）をコードする塩基配列を発現ベクターに組み込み、そのベクターをリポフェクチン法やアデノウイルス感染法などにより細胞にトランスフェクションまたはインフェクションすることで、細胞内に過剰発現させることを例示することできる。このようにして形質転換されたＡＳＫ１の過剰発現細胞は、サイトカインやケモカインの産生を顕著に抑制することができる。
尚、本明細書において、特定の変異体であるドミナントネガティブ体を表す場合には、本来のアミノ酸残基（一文字表記）を最初に、位置番号を二番目に、置換された後のアミノ酸残基（一文字表記）を三番目に示し、「Ｋ７０９Ｒ」や「Ｋ７０９Ｍ」は７０９番目のアミノ酸残基であるＫ（Ｌｙｓ：リジン）がＲ（Ａｒｇ：アルギニン）またはＭ（Ｍｅｔ：メチオニン）で置換されていることを表す。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等を挙げることができる。
組換えベクターにおいては、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体やＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列の他に、これを実際に標的組織または宿主細胞に導入して所望の当該ドミナントネガティブ体やアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるために、その発現を制御する塩基配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列）や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びにＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミンク肺上皮細胞（例えば、Ｍｖ１Ｌｕ）、リンパ球、線維芽細胞、血液系細胞および腫瘍細胞等の動物細胞を挙げることができる。
組換えベクターの標的組織または宿主細胞への導入方法としては、ＨＶＪリポソーム法（下記文献３８及び３９参照）、ＡＳＫ１阻害物質を注射等により直接投与する方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法（下記文献４０参照）、リポフェクション法によって投与する方法（下記文献４１参照）、ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等）を使う方法等を挙げることができる。
ＡＳＫ１阻害物質を有効成分とする製剤を実際に免疫疾患の予防または治療において用いる場合、用法に応じ種々の製剤形態のものが使用される。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤、注射剤、直腸投与剤、座剤等を挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
ＡＳＫ１阻害物質を含有するこれらの各種製剤は、上記ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として、通常用いられている賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合または希釈若しくは溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。
ＡＳＫ１阻害物質の免疫疾患に対する薬物的な予防または治療における投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度や疾患の種類等を考慮して適宜決定されるが、通常成人１日当たり約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜１００ｍｇ程度とするのがよく、１日一回または数回に分けて投与することができる。また、ＡＳＫ１阻害物質の免疫疾患に対する遺伝的な予防または治療における投与量もこれに準じて適宜決定することができる。
本発明によれば、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列またはこれを含むベクター、またはそのベクターにより形質転換させた宿主細胞を用いて標的組織に導入することにより、免疫疾患の発症または進展を抑制することができる。また、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤を経口または非経口的に投与することにより、免疫疾患の発症または進展を抑制することができる。
文献２９：Ｗａｎｇ  Ｘ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．３１６０７−３１６１１（１９９６）
文献３０：Ｓｓａｎｇ−Ｇｏｏ  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．１６，ｐｐ．１２７４９−１２７５５（２００１）
文献３１：Ｒｏｍａｓ  Ｇｅｌｅｚｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４１０，ｐｐ．８３４−８３８（２００１）
文献３２：ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．４，ｐｐ．Ａ２３５（２００１）
文献３３：ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．９，ｐｐ．２５９６−２６０６（１９９８）
文献３４：Ｈｅｅ−Ｓａｅ  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２２，ｐｐ．７７２１−７７３０（２００２）
文献３５：ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２１，ｐｐ．６０２８−６０３６（２００１）
文献３６：Ａｌｂｅｒｔ  Ｈ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３，ｐｐ．８９３−９０１（２００１）
文献３７：Ｘｉａｎｇｈｏｎｇ  Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１４，ｐｐ．４８１８−４８２８（２００１）
文献３８：金田，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２，ｐ．７８（１９９４）
文献３９：森下等，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１５，ｐ．１５８（１９９４）
文献４０：Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，ｐｐ．２８６−２９１（１９９２）
文献４１：Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４４，ｐ．１２８５（１９９０）
実施例
本発明の内容を以下の試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
試験例１
活性型ＡＳＫ１発現による正常ヒト培養皮膚角化細胞におけるサイトカインおよびケモカインの誘導実験
ＡＳＫ１分子のＮ末端側の活性抑制領域を欠損させ、恒常的に活性化させた分子である、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ；下記文献４２参照）を細胞に過剰発現させ、ＡＳＫ１の生理的機能を下記の方法により増幅させて検出した。まず、この活性型ＡＳＫ１を組み込んだアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＡＳＫ１−ΔＮ）を作製し、アデノウイルス法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に活性型ＡＳＫ１を過剰発現させた。すなわち、組換えウイルスをｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）５程度の効率で３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの正常ヒト培養皮膚角化細胞に感染させた後、細胞および培養上清５ｍＬを回収した。下記の如く、各種サイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡ発現量の増加をＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法を用いて定量し、また実際の蛋白質発現量として培養上清中に放出された蛋白質濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。コントロールとして、無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼを発現させた細胞と比較した。尚、刺激に対してｍＲＮＡ量が変化しない遺伝子であるＧＡＰＤＨをネガティブコントロールとして用いた。
１）ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法
目的とするｍＲＮＡに対する特異的なラジオアイソトープ標識プローブを用い、エンドヌクレアーゼに耐性である相補的２本鎖オリゴヌクレオチドのみをサンプル内に残存させ、ポリアクリルアミド電気泳動によって分離後、ｍＲＮＡ発現量を高感度に検出し（バンドとして検出できる）、その増加量を定量した。
２）ＥＬＩＳＡ法
目的とする蛋白質に特異的な抗体（２種類の抗体を用い、片側はビオチン標識抗体を使用した）を用いて、ビオチン・アビジン法により、蛋白質の発現量を微量定量した。
その結果を、各種サイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡの発現量については第１図に示し、各種蛋白質の発現量については、それぞれ第２図（ＩＬ−８）、第３図（ＭＩＰ−１α）、第４図（ＭＩＰ−１β）、第５図（ＭＩＰ−３α）に示した。これらの図は、ＡＳＫ１の活性化によって、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βなどのサイトカイン、およびＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３αなどのケモカインのｍＲＮＡまたは各種蛋白質の発現が誘導されることを示している。
文献４２：ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．９，ｐｐ．２５９６−２６０６（１９９８）
試験例２
ＡＳＫ１ノックアウトマウスの作製
１２９／ＳｖＪマウスの染色体（ジェノミック）ＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）から、ＡＳＫ１の第１エクソンを含む幾つかの染色体ＤＮＡ断片をクローン化した。そのうちの一つのクローンを用いて、第１エクソンより上流１０ｋｂ及び下流２ｋｂを相同組換え領域とし、第１エクソン及び隣接するイントロン領域を、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とポジティブセレクション用のネオマイシン耐性遺伝子とに置換したターゲッティングベクターを構築した。ターゲッティングベクターには、ネガティブセレクション用のＤＴ−Ａ（ジフテリアトキシンα鎖）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を用いた。ターゲッティングベクターは、エレクトロポーレーション法によってＪ１  ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に導入した。ネオマイシン耐性のＥＳ細胞コロニーを選択した後、更にサザンブロット法により相同組換え細胞の確認を行った。ヘテロ接合変異体ＥＳ細胞は、マイクロインジェクション法によりＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞に導入した。生まれてきたキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの戻し交配によって、Ｆ１（第１世代）ヘテロ接合体マウスが得られた。遺伝子変異が生殖細胞に導入されているか否かをサザンブロット法により確認した後、それらＦ１ヘテロ接合体マウス同士の掛け合わせから、ＡＳＫ１のホモ接合体であるＡＳＫ１ノックアウトマウスを樹立した。
試験例３
ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞での各種サイトカインおよびケモカイン発現量の低下
ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＭＥＦｓ）および脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激による、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６およびケモカインＭＩＰ−１αの発現誘導にＡＳＫ１が関与しているか否かについて検討を行った。胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）については、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した細胞に、１０μｇ／ｍＬのＬＰＳを約０．５ｍＬの培地に添加後、６、１２、２４時間での培養上清中へのＩＬ−６蛋白質の分泌量の時間的変化を測定した。同時に、２４時間後でのＬＰＳ（０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）に対する用量依存性についても測定した。また、脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）については、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した細胞に、１０μｇ／ｍＬのＬＰＳを約０．５ｍＬの培地に添加することによってＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１αの発現を誘導し、ＬＰＳ刺激後、６、１２、２４時間後の培養上清中のＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１α蛋白質の分泌量を測定した。それぞれのサイトカインおよびケモカインの発現量は、試験例１と同様に、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。
第６図及び第７図に胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）での結果を、第８図、第９図及び第１０図に脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）での結果を示した。ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）では、ＩＬ−６蛋白質の発現量が、時間的にも（第６図）、ＬＰＳの用量依存的にも（第７図）、劇的に減少していることが確認された。また、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）では、ＩＬ−１β（第８図）、ＩＬ−６（第９図）およびＭＩＰ−１α（第１０図）のそれぞれの蛋白質の発現量が、いずれも劇的に減少していることが確認された。すなわち、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞において、広範な病態に関わる重要なサイトカインである、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびケモカインであるＭＩＰ−１α等のＬＰＳ刺激による発現量が、それぞれ、劇的に減少することが判明した。これらの実験結果は、ＡＳＫ１の活性阻害が実際にサイトカインおよびケモカイン産生を抑制し、ＡＳＫ１阻害物質が各種免疫疾患に有用であることを明確に証明するものである。
試験例４
敗血症モデルに対するＡＳＫ１ノックアウトマウスの耐性
敗血症モデルに対するＡＳＫ１ノックアウトマウス及び野生型マウスそれぞれの生存率を比較した。敗血症は、ＬＰＳを１８．７ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔの用量でマウス腹腔に注射することで惹起した。敗血症においてはサイトカインの急激な上昇が観察され、それがその後のショック死の原因となることが分かっている。従って、惹起２時間後の血中ＴＮＦ−α濃度を測定し、その後、経時的に個体の生存率を観察した。尚、ノックアウトマウス及び野生型マウスはそれぞれ１０匹用いた。
第１１図に個体の生存率の経時的変化を、第１２図に惹起２時間後の血中ＴＮＦ−α濃度を、それぞれＡＳＫ１ノックアウトマウス及び野生型マウスとで比較して示した。ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいては、血中ＴＮＦ−α濃度の上昇は殆ど見られず（第１２図）、生存率も著しく向上していた（第１１図）。これらの結果は、ＡＳＫ１の活性阻害が、敗血症のような病態改善に顕著に有効であることを示している。
産業上の利用可能性
本発明は、ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として使用した免疫疾患の予防または治療に関するものである。本発明により、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症、シェーグレン症候群、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、敗血症等の各種免疫疾患の予防または治療剤或いは予防または治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルス法により過剰発現させた場合の正常ヒト培養皮膚角化細胞における各種サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β）、各種ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１β）及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量の増加を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法を用いて定量した図である。縦軸には、検出した遺伝子名、すなわち各種サイトカインおよびケモカインの名称、ならびにネガティブコントロールとしてのＧＡＰＤＨを示し、横軸は群名を示す。
第２図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＩＬ−８の実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−８の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第３図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＭＩＰ−１αの実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−１αの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第４図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＭＩＰ−１βの実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−１βの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第５図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＭＩＰ−３αの実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−３αの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第６図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞として、胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１−／−；白棒）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１＋／＋；黒棒）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−６蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第７図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞として、胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６蛋白質の発現量について、ＬＰＳに対する用量依存性を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１−／−；白棒）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１＋／＋；黒棒）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−６蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸はＬＰＳの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第８図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−１β蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１−／−；白丸）と野生型のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−１β蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第９図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１−／−；白丸）と野生型のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−６蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第１０図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＭＩＰ−１α蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１−／−；白丸）と野生型のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−１α蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第１１図は、敗血症モデルに対するＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ１−／−；白丸）及び野生型マウス（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）それぞれについての生存率を経時的に比較したグラフである。縦軸は生存率（％）を示し、横軸は群名を示す。
第１２図は、敗血症モデルにおけるＬＰＳ惹起２時間後の血中ＴＮＦ−α濃度を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ１−／−；白丸）及び野生型マウス（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）で比較したグラフである。縦軸は血中ＴＮＦ−α濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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