(57)【要約】本発明により、抗体可変領域のＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用を測定するための新規な方法が与えられた。本発明の方法は蛋白質の間の相互作用を検出する目的で、広く使用することが可能である。本発明の方法に従って、アンバーコドンを有するファージミドベクターによってアンバーサプレッサー株大腸菌を形質転換してファージを調製すると、ＶＨ・ＶＬ断片の両者がファージ粒子上に提示される。一方非アンバーサプレッサー株大腸菌を形質転換してファージを調製した際には、アンバーコドンが存在するために、ＶＨ断片のみがファージ粒子上に提示されてＶＬ断片は培養上清中に分泌されるという提示切り替えが起こる。培養上清中に分泌されたＶＬ断片を固相に固定化し、ファージ上に提示されたＶＨ断片との相互作用を定量化することにより、ＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用を測定することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターであって、（１）一の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列、（２）当該一の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列、（３）他の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列、（４）ホストによる提示切り替えを可能とする終止コドン、及び（５）当該他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列、の少なくとも上記５つのＤＮＡ配列を、当該ベクターの５’方向から３’方向にかけて、（１）（２）（３）（４）（５）の順番に又は（３）（４）（５）（１）（２）の順番に備える構造を有し、当該ホストによる提示切り替えを可能とする終止コドンが存在することにより、当該ベクターをサプレッサー変異体宿主に導入した際には、当該一の蛋白質又はその断片と当該他の蛋白質又はその断片の両者をその上に提示する２蛋白質提示型のファージを提供し、かつ、当該ベクターを非サプレッサー株宿主に導入した際には、当該一の蛋白質又はその断片のみをその上に提示する１蛋白質提示型のファージ及び当該非サプレッサー株宿主から培養上清中に分泌された当該他の蛋白質又はその断片を提供することを特徴とする、ベクター。
【請求項２】
前記一の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＨ断片であって、前記他の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＬ断片である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
前記一の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＬ断片であって、前記他の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＨ断片である、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
前記ベクターが大腸菌のファージベクター又はファージミドベクターである、請求項１ないし請求項３のいずれか１つの請求項記載のベクター。
【請求項５】
前記一の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＩＸ蛋白質をコードするＤＮＡ配列であって、前記他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＶＩＩ蛋白質をコードするＤＮＡ配列である、請求項１ないし請求項４のいずれか１つの請求項記載のベクター。
【請求項６】
前記一の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＶＩＩ蛋白質をコードするＤＮＡ配列であって、前記他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＩＸ蛋白質をコードするＤＮＡ配列である、請求項１ないし請求項４のいずれか１つの請求項記載のベクター。
【請求項７】
前記ホストによる提示切り替えを可能とする終止コドンがアンバーコドンである、請求項１ないし請求項６のいずれか１つの請求項記載のベクター。
【請求項８】
一の蛋白質又はその断片と他の蛋白質又はその断片との間の相互作用を測定する方法であって、
（１）請求項１ないし請求項７のいずれか１つの請求項記載のベクターを用いて非サプレッサー株宿主の形質転換を行うことにより、当該一の蛋白質又はその断片のみをその上に提示した１蛋白質提示型のファージと、当該非サプレッサー株宿主から分泌された当該他の蛋白質又はその断片を含む培養上清を取得し、
（２）培養上清中の当該他の蛋白質又はその断片を適切な担体に固定化し、
（３）固定化された当該他の蛋白質又はその断片と、当該１蛋白質提示型のファージ上に提示された当該一の蛋白質又はその断片とを反応させて、当該一の蛋白質又はその断片と当該他の蛋白質又はその断片とを結合させ、
（４）標識された抗ファージ抗体を用いた免疫測定法により、ファージの固体化量を測定することにより、当該一の蛋白質又はその断片と当該他の蛋白質又はその断片との結合能を評価する；
上記の過程よりなる、一の蛋白質又はその断片と他の蛋白質又はその断片との間の相互作用を測定する方法。
【請求項９】
前記一の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＨ断片であって、前記他の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＬ断片である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記一の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＬ断片であって、前記他の蛋白質又はその断片が抗体可変領域のＶＨ断片である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが大腸菌のファージベクター又はファージミドベクターである、請求項８ないし請求項１０のいずれか１つの請求項記載の方法。
【請求項１２】
前記一の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＩＸ蛋白質をコードするＤＮＡ配列であって、前記他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＶＩＩ蛋白質をコードするＤＮＡ配列である、請求項８ないし請求項１１のいずれか１つの請求項記載の方法。
【請求項１３】
前記一の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＶＩＩ蛋白質をコードするＤＮＡ配列であって、前記他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列が繊維状ファージのｐＩＸ蛋白質をコードするＤＮＡ配列である、請求項８ないし請求項１１のいずれか１つの請求項記載の方法。
【請求項１４】
前記ホストによる提示切り替えを可能とする終止コドンがアンバーコドンである、請求項８ないし請求項１３のいずれか１つの請求項記載の方法。
【請求項１５】
前記サプレッサー変異体宿主が、大腸菌アンバーサプレッサー株である、請求項８ないし請求項１４のいずれか１つの請求項記載の方法。
【請求項１６】
前記大腸菌アンバーサプレッサー株が大腸菌ＴＧ１株であり、かつ前記非サプレッサー株宿主が大腸菌ＨＢ２１５１株である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗原が存在することによりＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用が変化する抗体可変領域を得るための方法であって、
（１）請求項２記載のベクターを用いてサプレッサー変異体宿主の形質転換を行うことにより、当該ベクターをサプレッサー変異体宿主に導入した際にはＶＨ断片とＶＬ断片の両者をそのファージ上に提示する、ＶＨ／ＶＬ提示型のファージを取得し、
（２）上記（１）において取得された当該ＶＨ／ＶＬ提示型のファージと抗原との結合能を確認し、
（３）上記（２）においてＶＨ／ＶＬ提示型のファージを提供することが確認された請求項２記載のベクターを用いて非サプレッサー株宿主の形質転換を行うことにより、あるいは上記（１）において取得されたＶＨ／ＶＬ提示型のファージを用いて非サプレッサー株宿主の形質導入を行うことにより、当該ＶＨ断片のみをその上に提示するＶＨ提示型のファージと、当該非サプレッサー株宿主から培養上清中に分泌された当該ＶＬ断片を含む培養上清を取得し、
（４）培養上清中の当該ＶＬ断片を適切な担体に固定化し、
（５）抗原の存在下及び非存在下で、固定化された当該ＶＬ断片とファージ上に提示された当該ＶＨ断片を反応させ、
（６）標識された抗ファージ抗体を用いた免疫測定法により、ファージの固体化量を測定することにより、当該ＶＨ断片と当該ＶＨ断片の間の結合能を評価し；
（７）抗原の存在下における当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能が、抗原の非存在下における当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能の２倍以上である場合に、抗原が存在することによりＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用が変化する抗体可変領域が得られたと判定する過程よりなる、上記方法。
【請求項１８】
抗原が存在することによりＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用が変化する抗体可変領域を得るための方法であって、
（１）請求項３のベクターを用いてサプレッサー変異体宿主の形質転換を行うことにより、当該ベクターをサプレッサー変異体宿主に導入した際にはＶＨ断片とＶＬ断片の両者をそのファージ上に提示する、ＶＨ／ＶＬ提示型のファージを取得し、
（２）上記（１）において取得された当該ＶＨ／ＶＬ提示型のファージと抗原との結合能を確認し、
（３）上記（２）においてＶＨ／ＶＬ提示型のファージを提供することが確認された請求項３記載のベクターを用いて非サプレッサー株宿主の形質転換を行うことにより、あるいは上記（１）において取得されたＶＨ／ＶＬ提示型のファージを用いて非サプレッサー株宿主の形質導入を行うことにより、当該ＶＬ断片のみをその上に提示するＶＬ提示型のファージと、当該非サプレッサー株宿主から培養上清中に分泌された当該ＶＨ断片を含む培養上清を取得し、
（４）培養上清中の当該ＶＨ断片を適切な担体に固定化し、
（５）抗原の存在下及び非存在下で、固定化された当該ＶＨ断片とファージ上に提示された当該ＶＬ断片を反応させ、
（６）標識された抗ファージ抗体を用いた免疫測定法により、ファージの固体化量を測定することにより、当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能を評価し；
（７）抗原の存在下における当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能が、抗原の非存在下における当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能の２倍以上である場合に、抗原が存在することによりＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用が変化する抗体可変領域が得られたと判定する過程よりなる、上記方法。
【請求項１９】
抗体可変領域のＶＬ断片を得る方法であって、
（１）請求項２記載のベクターを用いて非サプレッサー宿主の形質転換を行うか、あるいは当該ベクターを有するＶＨ／ＶＬ提示型のファージを用いて非サプレッサー株宿主の形質導入を行い、
（２）当該非サプレッサー株宿主から当該ＶＬ断片を培養上清に分泌させ、
（３）当該培養上清から当該ＶＬ断片を精製する、
上記過程よりなる、抗体可変領域のＶＬ断片を得る方法。
【請求項２０】
抗体可変領域のＶＨ断片を得る方法であって、
（１）請求項３記載のベクターを用いて非サプレッサー宿主の形質転換を行うか、あるいは当該ベクターを有するＶＨ／ＶＬ提示型のファージを用いて非サプレッサー株宿主の形質導入を行い、
（２）当該非サプレッサー株宿主から当該ＶＨ断片を培養上清に分泌させ、
（３）当該培養上清から当該ＶＨ断片を精製する、
上記過程よりなる、抗体可変領域のＶＨ断片を得る方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．本発明の分野
本発明は、蛋白質の間の相互作用、特に抗体可変領域のＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用を測定するための方法に関する。更に本発明は本方法に使用するために構築されたベクターに関する。
２．背景技術
本発明者らは、抗体のＶＨ／ＶＬ間の相互作用を測定することで間接的に抗原濃度を測定する新規免疫測定法である、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発し、特開平１０−７８４３６において開示した。抗原・抗体反応の特異性を利用した様々な免疫測定法によって、混合物中の微量の物質を高感度で検出することができるが、このオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法に比べて操作が簡便であり、また単価抗原の測定が可能であるといったメリットを有する。
図１にサンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ａ）と、本発明者が提案したオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｂ）の概念を示す模式図を示す。サンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ａ）においては、測定対象の抗原に対する１次抗体を固相上に固定し、抗原を含む溶液と酵素標識した２次抗体を順次添加して洗浄し、酵素活性により抗原濃度を定量する。一方、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｂ）においては、対象の抗原に対する抗体のＶＬを固定化し、抗原溶液と酵素標識したＶＨを同時に添加して酵素活性により定量する。本方法においてはサンドイッチＥＬＩＳＡ法と比較して洗浄操作が一回短縮できる。
オープンサンドイッチＥＬＩＳＡに用いる抗体断片ＶＨ，ＶＬには、ｉ）抗原に対して高い親和性を持つ、ｉｉ）抗原非存在下でＶＨ，ＶＬは相互作用が弱い、等の条件が必須である。よって、測定対象の抗原に対してこの条件を満たす抗体断片を調製することが必要となる。将来的にオープンサンドイッチＥＬＩＳＡを測定法・検出系として確立するには、本方法は広範囲の抗原にわたって測定可能な系である必要がある。よって、あらゆる抗原に対して上に述べた条件を満たすものを、膨大な抗体ライブラリーから迅速・簡便にスクリーニングすることができる系を確立することができるならば、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡを実用化するために役に立つと思われる。
即ち、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡの実用化にあたり、抗体の抗原結合能と、抗原の存在下、非存在下でのＶＨ／ＶＬ相互作用を迅速に測定できる系を利用することが極めて望ましく、本発明はこれを可能とする。本発明はまた、ライブラリー中から応答性のより高い抗体の選択を可能にすることも目的としている。
一方、ファージ提示技術がこれまでに複数提案されている。ファージ提示技術は、各種抗体の可変領域のＶＨ断片とＶＬ断片を繊維状ファージの粒子上に同時に提示し、これと抗原との結合能をもって抗体の抗原結合能を評価し、さらに結合能の高い抗体を選択する技術である。ファージディスプレイ法において多くの場合には、Ｍ１３，ｆｄなどの繊維状ファージのコートタンパク質であるｐＩＩＩあるいはｐＶＩＩＩの表面にライブラリーを、融合タンパク質として発現・提示させる。
ｐＩＩＩを用いたファージディスプレイ法の概略を図２に示す。ファージのコート蛋白質ｐＩＩＩをコードするｇｅｎｅＩＩＩ上流にランダムな配列を導入したファージミドベクターを構築する。大腸菌を形質転換してヘルパーファージでレスキューすることにより、ｐＩＩＩにランダムな配列を含む蛋白質を提示したファージが得られる。この様に作製したファージライブラリーから標的分子のスクリーニングを行い、特異的に結合するものを選択することができる。標的分子を固定化した系についてライブラリーを投入し、結合、洗浄、溶出の操作（パニング，ｐａｎｎｉｎｇ）を行うことで高い結合活性を持つファージを選択できる。回収したファージについては大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に感染させ増幅して次のサイクルに投入する。スクリーニングを繰り返すことにより、ライブラリー中の結合性ファージの比率を効果的に高めていくことができる。
この選択系のメリットとしては、表現型と遺伝子型がリンクしているために、選択したタンパク質の配列決定が容易であること、スクリーニング中に増幅の過程が入るため効率的に目的タンパク質を濃縮できること、感染宿主を替えることによってタンパク質の切り離しが可能であることなどが挙げられる。また提示されるタンパク質としては、短い数残基のランダムペプチド、抗体断片、プロテアーゼ、ヒト成長ホルモン、核酸結合性タンパク質など多種多様なものが挙げられる。
一般的には、ファージディスプレイにおいて抗体断片を提示する場合には、ＶＨ、ＶＬをリンカーで繋げたｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）の形を用いる。ところが近年新たなファージ提示提示技術として、ＶＨにｇＶＩＩ  ｐｒｏｔｅｉｎを、ＶＬにｇＩＸ  ｐｒｏｔｅｉｎを提示させることにより、ＶＨ断片とＶＬ断片を別々に提示させる新規な方法が報告された（Ｋｉｍ  Ｄ．Ｊａｎｄａら、ＷＯ００／７１６９４Ａ１）。図３に従来の抗体断片を一本鎖の形で提示させる方法（Ａ）と、上記のＶＨ・ＶＬ断片を別々に提示させる方法（Ｂ）の模式図を示す。
ファージディスプレイに用いられる抗体のライブラリーとして、免疫をしていない動物のＶ遺伝子から作製したナイーブ・ライブラリー（Ｎａｉｖｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）、ナイーブ・ライブラリーの超可変部領域に人工的に変異を導入した合成ライブラリー（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ）、そして目的の抗原で免疫した動物を用いて作製した免疫ライブラリー（Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）が主に挙げられる。
ナイーブ・ライブラリーは抗原刺激によって親和成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）が起こる以前のＩｇＭ抗体のＶ遺伝子を用いているために、原理的には様々な抗原に対する抗体が選択可能であること、免疫操作を必要としないためヒト型抗体のライブラリーの構築が可能であること、などのメリットがある。一方、アフィニティーを向上させるためにライブラリーのサイズを大きくすることが必要不可欠であるために、作製に手間がかかることや、不要な要素を多く含むなどのデメリットがある。合成ライブラリーはナイーブ・ライブラリーのＣＤＲに部位特異的変異導入やＰＣＲの手法により変異を導入したもので、これにより多様性を制御することができる。
免疫ライブラリーはあらかじめ目的の抗原で免疫したマウスから抗体遺伝子を採取するため、非常に抗原特異性・結合活性の高いライブラリーが得られるメリットがある。しかし免疫に長い期間（１〜３ヶ月）を要する、免疫応答が不可能な毒性分子・自己分子に対する抗体の取得が困難である、ヒト型の抗体が調製しにくいなどのデメリットも挙げられる。
上記で述べたように、これまでに、繊維状ファージの粒子上に各種抗体の可変領域のＶＨ断片とＶＬ断片を同時に提示させ、抗体断片を提示させた繊維状ファージと抗原の間の結合能によって抗体の抗原結合能を評価することにより、結合能の高い抗体を選択する技術（ファージ提示技術）が複数提案されている。しかしこれらの提示法では、ＶＨ断片とＶＬ断片の両者を含む抗体可変領域全体の抗原結合能は評価できるが、ＶＨ／ＶＬ間の相互作用を評価することはできなかった。また、前記のオープンサンドイッチＥＬＩＳＡに適した抗体断片を取得するためには、抗原非存在下で相互作用の弱いＶＨ・ＶＬのペアを選択することが必要である。
発明の概要
本発明は上記の課題を解決するための第１の手段として下記の、（１）一の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列、（２）当該一の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列、（３）他の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列、（４）ホストによる提示切り替えを可能とする終止コドン、及び（５）当該他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列、の少なくとも上記５つのＤＮＡ配列を、当該ベクターの５’方向から３’方向にかけて、（１）（２）（３）（４）（５）の順番に又は（３）（４）（５）（１）（２）の順番に備える構造を有し、当該ホストによる提示切り替えを可能とする終止コドンが存在することにより、当該ベクターをサプレッサー変異体宿主に導入した際には、当該一の蛋白質又はその断片と当該他の蛋白質又はその断片の両者をその上に提示する２蛋白質提示型のファージを提供し、かつ、当該ベクターを非サプレッサー株宿主に導入した際には、当該一の蛋白質又はその断片のみをその上に提示する１蛋白質提示型のファージ及び当該非サプレッサー株宿主から培養上清中に分泌された当該他の蛋白質又はその断片を提供することを特徴とするベクターを提供する。
また本発明は上記の課題を解決するための第２の手段として下記の、一の蛋白質又はその断片と他の蛋白質又はその断片との間の相互作用を測定する方法であって、
（１）上記のベクターを用いて非サプレッサー株宿主の形質転換を行うことにより、当該一の蛋白質又はその断片のみをその上に提示した１蛋白質提示型のファージと、当該非サプレッサー株宿主から分泌された当該他の蛋白質又はその断片を含む培養上清を取得し、
（２）培養上清中の当該他の蛋白質又はその断片を適切な担体に固定化し、
（３）固定化された当該他の蛋白質又はその断片と、当該１蛋白質提示型のファージ上に提示された当該一の蛋白質又はその断片とを反応させて、当該一の蛋白質又はその断片と当該他の蛋白質又はその断片とを結合させ、
（４）標識された抗ファージ抗体を用いた免疫測定法により、ファージの固体化量を測定することにより、当該一の蛋白質又はその断片と当該他の蛋白質又はその断片との結合能を評価する；
上記の過程よりなる、一の蛋白質又はその断片と他の蛋白質又はその断片との間の相互作用を測定する方法を提供する。
また本発明は上記の課題を解決するための第３の手段として下記の、抗原が存在することによりＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用が変化する抗体可変領域を得るための方法であって、
（１）抗体可変領域のＶＨ断片及びＶＬ断片をコードするＤＮＡ配列を含む上記のベクターを用いてサプレッサー変異体宿主の形質転換を行うことにより、当該ベクターをサプレッサー変異体宿主に導入した際にはＶＨ断片とＶＬ断片の両者をそのファージ上に提示する、ＶＨ／ＶＬ提示型のファージを取得し、
（２）上記（１）において取得された当該ＶＨ／ＶＬ提示型のファージと抗原との結合能を確認し、
（３）上記（２）においてＶＨ／ＶＬ提示型のファージを提供することが確認された上記のベクターを用いて非サプレッサー株宿主の形質転換を行うことにより、あるいは上記（１）において取得されたＶＨ／ＶＬ提示型のファージを用いて非サプレッサー株宿主の形質導入を行うことにより、当該ＶＨ断片のみをその上に提示したＶＨ提示型のファージと当該非サプレッサー株宿主から培養上清中に分泌された当該ＶＬ断片を含む培養上清、あるいは当該ＶＬ断片のみをその上に提示したＶＬ提示型のファージと当該非サプレッサー株宿主から培養上清中に分泌された当該ＶＨ断片を含む培養上清、のいずれかを取得し、
（４）培養上清中の当該ＶＬ断片又は当該ＶＨ断片を適切な担体に固定化し、
（５）抗原の存在下及び非存在下で、固定化された当該ＶＬ断片とファージ上に提示された当該ＶＨ断片、又は固定化された当該ＶＨとファージ上に提示された当該ＶＬ断片を反応させ、
（６）標識された抗ファージ抗体を用いた免疫測定法により、ファージの固体化量を測定することにより、当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能を評価し；
（７）抗原の存在下における当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能が、抗原の非存在下における当該ＶＨ断片と当該ＶＬ断片の間の結合能の２倍以上である場合に、抗原が存在することによりＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用が変化する抗体可変領域が得られたと判定する過程よりなる、上記方法を提供する。
以下の記載と図面を用いて本発明を更に詳細に説明するが、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】  図１は、サンドイッチＥＬＩＳＡと、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡの原理を示す模式図である。
図２は、ファージディスプレイ法の原理を示す模式図である。
図３は、抗体断片を一本鎖の形で提示させる方法と、ＶＨ・ＶＬ断片を別々に提示させる方法の原理を示す模式図である。
図４は、ファージミドベクターｐＫＳの配列を示す模式図である。
図５は、ＥＬＩＳＡにより抗体提示の検討を行った結果を示すグラフである。
図６は、ＥＬＩＳＡにより抗原結合活性の検討を行った結果を示すグラフである。
図７は、ＨｙＨＥＬ１０を提示したｓｃＦｖ型とｓｐｉｌｉｔＦｖ型のファージにおいて、１０１０ｃｆｕ／ｍｌのファージ濃度で、ＥＬＩＳＡによりＨＥＬ結合活性の検討を行った結果を示すグラフである。
図８は、ＨｙＨＥＬ１０を提示したｓｃＦｖ型とｓｐｉｌｉｔＦｖ型のファージにおいて、１０９ｃｆｕ／ｍｌのファージ濃度で、ＥＬＩＳＡによりＨＥＬ結合活性の検討を行った結果を示すグラフである。
図９は、ｐＫＳ１（ＨｙＨＥＬ１０）／ｓｕｐ＋について、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡを行った結果を示すグラフである。
図１０は、この実験系における提示切り替えのしくみを示す模式図である。
図１１は、ＨｙＨＥＬ１０とＤ１．３を用いたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
図１２は、パニングを行った際の陽性クローンの割合を示すグラフである。
図１３は、ＨｙＨＥＬ−１０型又はＤ１．３型のｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片の作製の過程を示す模式図である。
図１４は、ファージライブラリーの作製からＨＥＬ結合能の高いクローンの選択までの過程を示す模式図である。
図１５は、ＨＥＬに対する結合能とオープンサンドイッチへの適性の関係を示す図である。
図１６は、ＨＥＬに対する結合能とＶＨ／ＶＬ相互作用の関係を示す図である。
好適形態の詳細な説明
本発明は、抗体のＶＨ／ＶＬ間の相互作用を測定することを可能とする新規な方法である。本発明の方法は、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる目的により適した抗体の選択を可能とする。本発明は、抗体ｃＤＮＡ断片を組み込むためのファージミドベクター、当該ベクターによって形質転換したサプレッサー大腸菌あるいは非サプレッサー大腸菌、これにヘルパーファージを感染させて作製したファージおよび可溶性抗体断片を含む培養上清から構成される。
目的物質（抗原）との結合能を有する抗体可変領域ｃＤＮＡとＶＨ、ＶＬ断片を組み込んだファージミドベクターを作製し、当該ファージミドベクターをアンバーサプレッサー大腸菌に形質転換し、ヘルパーファージで感染させることにより常法でファージを作製する。このファージはその粒子上にＶＨ、ＶＬの両者を提示しており、可変領域（ＶＨ＋ＶＬ）の抗原結合能を確認することができる。同じファージを非アンバーサプレッサー大腸菌に形質転換してファージを調製すると、下記において詳細に述べる提示切り替えによってＶＬ断片は培養上清に分泌され、ＶＨ断片のみがファージ上に提示された形で同様に培養上清に得られる。
菌体培養液を遠心し、培養上清をＶＬ断片結合性を持つプロテインＬをコートしたマイクロプレートに注ぐ。このとき、ＶＬ断片は固相化されるのでＶＨ／ＶＬ断片相互作用の強弱に応じて、ファージのマイクロプレートへの固定化量が変化する。これをペルオキシダーゼ標識抗ファージ抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定すれば、簡単にＶＨ／ＶＬ断片間の相互作用を測定することができる。よって本方法により、従来より飛躍的に簡便に抗体ＶＨ／ＶＬ相互作用を評価することが可能となる。また本発明の方法によって抗原結合性の高い抗体断片を選択することができる。
また測定の際に抗原を共存させることによって、抗原によってＶＨ／ＶＬ間の相互作用が大きく変化するクローンを迅速にスクリーニングすることができる。ＶＨ／ＶＬ間の相互作用が弱い抗体断片においては、担体上に固定化されたＶＬ断片とファージ上に提示されたＶＨ断片が直接に結合することは少なく、そのために担体上ファージが結合することはほとんどない。しかし、一部の抗体では抗原が存在する場合にはＶＨ断片とＶＬ断片が共に抗原と結合し、複合体が安定化するために、抗原を介してファージが担体に結合することができる。よって、担体に結合しているファージの量を、例えば抗ファージ抗体を用いて定量することにより、抗原の存在によりファージ結合量が大きく変化する抗体断片を選択することができる。その様な抗体断片はＶＨ／ＶＬ間の相互作用が抗原の結合により大きく変化すると考えられ、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡを行うのに際して好適である。なお、抗原の存在により抗体可変領域のＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用が２倍以上変化するならば、そのような抗体断片は本目的のために使用することが可能である（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８６，２３８−２４６（２０００））。
なお本方法を実施するにあたり、ファージミドベクターを使用することは好適である。ファージミドベクターは繊維状ファージゲノムの一部を含むようにして作製されたプラスミドであるために、ファージミドベクターを用いて大腸菌を形質転換した後、更にヘルパーファージに感染させる必要がある。これによって粒子形成のためのコート蛋白質が供給されて、ヘルパーファージ粒子とファージミド粒子が混合したファージが得られる。この際に使用するヘルパーファージは下記の実施例において使用しているＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージは特に好ましいが、それに限定されるものではない。またより簡便な方法として、必要なＤＮＡ配列を含むファージベクターを利用することもまた可能である。ファージベクターの場合には、当該ファージベクターを大腸菌に感染させることによって直接ファージを得ることが可能であり、ヘルパーファージを使用する必要はない。
本願明細書において「提示切り替え」とは、サプレッサー変異体宿主に導入された時には前記「一の蛋白質」と前記「他の蛋白質」の両蛋白質をファージ上に提示するが、非サプレッサー株宿主に導入された時には一つの蛋白質をファージ上に提示し、他のもう一つの蛋白質を分泌するという切り替えの現象を意味する。なお本願明細書中において、両蛋白質を提示しているファージを「２蛋白質提示型のファージ」と、一つの蛋白質をファージ上に提示するファージを「１蛋白質提示型のファージ」と称する。「１蛋白質提示型のファージ」が取得された場合には、「１蛋白質提示型のファージ」の上に上記「一の蛋白質」が提示されると共に、上記「他の蛋白質」をコードする遺伝子が大腸菌内で発現して菌体外へ分泌される。
なお上記の蛋白質が抗体可変領域断片である場合には特に、ＶＨ断片とＶＬ断片の両者を提示しているファージを「ＶＨ／ＶＬ提示型のファージ」と称する。また、ＶＨ断片をファージ上に提示してＶＬ断片は大腸菌より培養上清中に分泌する場合を「ＶＨ提示型の培養上清」と、ＶＬ断片をファージ上に提示してＶＨ断片を培養上清中に分泌する場合を「ＶＬ提示型の培養上清」と、それぞれ称する。
上記の提示切り替えは、提示切り換えを可能とする終止コドンが存在することによって可能となる。提示切り換えを可能とする終止コドンとして、下記の実施例で使用しているアンバーコドンは特に好ましい。なおアンバーコドンは、タンパク質合成終止コドンの一つであるＴＡＧのコドンである。しかし本発明で使用される終止コドンはそれに限定される訳ではなく、それ以外の終止コドンであるオパールコドン（ＴＧＡ）やオーカーコドン（ＴＡＡ）もまた同じ目的において使用することができる。
アンバーコドンを有しているベクターが大腸菌のアンバーサプレッサー株に導入された時には、当該終止コドンの読み違い（アンバーサプレッション）が一定の割合で起こって菌体内で融合蛋白質が発現するために、上記の２蛋白質提示型のファージを得ることができる。一方非サプレッサー株宿主に導入された場合にはアンバーサプレッションを起こさないので、アンバーコドンは正確に終止コドンとして認識されて融合蛋白質は発現せず、アンバーコドンの下流に存在する遺伝子がコードするタンパク質は分泌されて提示切り換えが起こる。なおオパールコドンをオパールサプレッションを起こすサプレッサー変異体宿主に導入することにより、またオーカーコドンをオーカーサプレッションを起こすサプレッサー変異体宿主に導入することによっても、提示切り換えを起こすことが可能である。
本発明の目的でサプレッサー変異体宿主として使用することができるのはｓｕｐＥあるいはｇｌｎＶを持つ菌であり、その例としては大腸菌ＴＧ１株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ５ａ株、ＪＭ１０９株およびＮＭ５２２株などを挙げることができる。なお、非サプレッサー宿主としては大腸菌ＪＭ１０５株、ＮＶ１１８４株やＨＢ２１５１株などを挙げることができる。しかし本発明において使用するサプレッサー変異体宿主と非サプレッサー宿主は、繊維状ファージが感染可能なＦ’プラスミドを保持している必要はあるが、上記に述べたものに限定されるものではなく、同等に機能を有する他の宿主に変更することができる。
本発明の方法において使用するベクターは、（１）一の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列、（２）当該一の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列、（３）他の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列、（４）ホストによる提示切り替えを可能とする終止コドン、及び（５）当該他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなる。当該ベクターは（１）（２）（３）（４）（５）をその順番に、又は（３）（４）（５）（１）（２）の順番に備えることができる。
この様な構成を有するベクターは、上記「一の蛋白質」をファージ上に提示する。一方、「他の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列」と「当該他の蛋白質又はその断片をファージ上に提示するためのＤＮＡ配列」の間に提示切り替えを可能とする終止コドンが存在するために、非サプレッサー株宿主に導入した際には「他の蛋白質」は融合蛋白質としてファージ上に発現せず、提示切り替えによって培養上清中に分泌される。
上記の「蛋白質又はその断片をファージ上に提示するための蛋白質をコードするＤＮＡ配列」として使用することが可能なＤＮＡ配列は、好ましくは繊維状ファージの表面蛋白質をコードするＤＮＡ配列である。その例として繊維状ファージの表面蛋白質をコードするＤＮＡ配列であるｐＶＩＩ蛋白質、ｐＩＸ蛋白質、ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩをコードしているＤＮＡ配列を挙げることができるが、特に好ましいのは下記の実施例で使用している繊維状ファージのｐＶＩＩ蛋白質あるいはｐＩＸ蛋白質をコードしているＤＮＡ配列である。しかしそれらに限定されるものではなく、他のファージ表面蛋白質をコードするＤＮＡ配列も、当該ＤＮＡ配列が目的とする蛋白質と融合蛋白質を作製することが可能であって本発明の目的のために使用できる蛋白質をコードする限り、適宜選択して使用することができる。
本発明の方法は、抗体のＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用を測定する目的において特に優れている。しかし本発明の方法は理論的には、抗体の可変領域断片以外の、ヘテロダイマーとして存在している多量体蛋白質において、当該多量体蛋白質を繊維状ファージの上に提示してダイマーを構成しているモノマー間の相互作用を評価する目的で使用することが可能である。例えばある特定のモノマーである「一の蛋白質」と、それとは異なるモノマーである「他の蛋白質」の相互作用を測定することは基礎研究の現場のみならず、臨床的な診断の目的においても重要である。本発明において「一の蛋白質」と「他の蛋白質」は限定されるものであるとは解されるべきではなく、本発明の方法は、蛋白質相互間の相互作用を測定することを可能とする新規な技術を提供するものである。
本発明の方法によって得られた、抗原非存在下でＶＨ／ＶＬ相互作用が弱く、かつ抗原存在下でＶＨ／ＶＬ相互作用が強い抗体を用いて、例えば以下のような測定キットを作製することが可能である。
１）ＶＬ断片をビオチン・アビジン相互作用を利用して、または物理的吸着を利用してチューブあるいはマイクロプレートに固定化する。
２）ＶＨ断片とレポーター酵素（例えばアルカリフォスファターゼ）との融合蛋白質を作製しておき、これをサンプルと共にＶＬを固定化した固相と一定時間接触させる。
３）洗浄後、固相化された酵素活性を測定し、サンプル中の抗原濃度の指標とする。
また、以下の測定キットを作製することがもまた可能である。
１）ＶＨ断片とＶＬ断片を互いに吸収・蛍光スペクトル重なる二種類の蛍光色素（例えばフルオレセインとローダミン）で標識しておく。
２）これらをサンプルと混合し、５分程度おいて短波長側の蛍光色素のみを励起光で励起する。二種類の蛍光色素由来の蛍光強度を測定することで、ＶＨ／ＶＬの会合による蛍光エネルギー移動現象を検出することができる。二つの蛍光強度の比をサンプル中の抗原濃度の指標とする。この方法では前の方法に比べて、短時間で洗浄操作なしに抗原濃度が測定できる。
また、以下の測定キットを作製することもまた可能である。
１）ＶＨ断片とＶＬ断片を、それぞれ単体では活性がないか、低いが近接させると活性の増大する二種類の酵素断片（例えばＬａｃＺ△αおよびＬａｃＺ△ω）との融合蛋白質として大腸菌で発現させ、精製しておく。
２）二種類の融合蛋白質とサンプルを混合し、一定時間おいたのち基質（例えば発光基質Ｇａｌａｃｔｏｎ  Ｐｌｕｓ）と混合し、融合蛋白質複合体の活性を測定することでサンプル中の抗原濃度の指標とする。この方法では、前の２つの方法に比べてはるかに高感度に抗原濃度を測定することが可能であり、また洗浄操作を含まない（Ｙｏｋｏｚｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４（１１），２５００−２５０４，２００２）。
本発明方法によって測定する対象としては、第一に臨床検査における血清中の特定蛋白質、ペプチド、各種ホルモン、麻薬あるいは治療用薬物等が考えられる。また、環境水中のダイオキシン、ビスフェノールＡ、ノニルフェノール等の毒性が疑われる化学物資や農薬類もまた本発明によって測定される対象となる。
下記の実施例において、提案した非サプレッサー株によるＶＬ提示切り替えが適切に行われているかどうかについて検討を行った。より具体的には、本発明者らによってオープンサンドイッチＥＬＩＳＡが可能であることが既に示されている抗ＨＥＬ（Ｈｅｎ  Ｅｇｇ−Ｗｈｉｔｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ニワトリ卵白リゾチーム）抗体のＨｙＨＥＬ−１０を用いてスクリーニングのモデル系を構築し、提案した系が機能することを実験的に証明した。構築したｇＩＸ  ｐｒｏｔｅｉｎにＶＨ、ｇＶＩＩ  ｐｒｏｔｅｉｎにＶＬを別々に提示（ｓｐｌｉｔ  Ｆｖ）させるファージミドベクターｐＫＳ１について、ホストのＥ．ｃｏｌｉの代替によるＶＬ提示の切り替えをオープンサンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。
下記の実施例の選択の第１段階において、ＶＨ・ＶＬ提示型のファージを用いた。作製したベクターによりＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１，ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどのアンバーサプレッサー株を形質転換した場合には、アンバーコドンは一定の割合で読み違いが起こりグルタミン酸に置換される。菌体内ではｐＩＸ−ＶＨ、ｐＶＩＩ−ＶＬの融合タンパク質が発現し、ヘルパーファージの感染によってＶＨ・ＶＬ提示型のファージを得ることができる。
選択の第２段階において、上記において得られた結合活性の高いファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ２１５１のような非サプレッサー株に感染させ、ヘルパーファージによるレスキューで、ＶＨ提示のファージと遊離のＶＬ断片を培養上清に得る。この場合はアンバーコドンが正確に終止コドンとして認識されるため、得られるファージはいずれもＶＨのみを提示している。ＶＬの上流には分泌シグナルであるｏｍｐＡ配列を配置しており、ファージ粒子と同様に菌体外へ分泌される。
【実施例】  以下において実施例を示し、さらに詳しくこの発明の実施の形態について説明する。
【実施例１】（ａ）抗リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０遺伝子をｇ７ｇ９上に提示するファージミドベクターの構築
ポリメラーゼ連鎖増幅（ＰＣＲ）法により必要となる断片を作製し，これらを連結させて目的ファージミドベクターを作製した．ＰＣＲの条件は下の表１にまとめた。なお、表１において反応条件はいずれも９４℃で５ｍｉｎ．ｘ１，（９４℃  ３０ｓｅｃ，５５℃  ３０ｓｅｃ，−７２℃  １ｍｉｎ．）ｘ３５，７２℃  ８ｍｉｎ．ｘ１であり、ＤＮＡポリメラーゼはいずれも２．５ｕｎｉｔ／１００μｌ  ＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ）である。
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ＯｍｐＡ−ＦＬＡＧのクローニング
プラスミドｐＦＬＡＧ−ＡＴＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を鋳型とし、ＶＬのＮ末端に配置する大腸菌ｏｍｐＡ分泌シグナル配列およびＦＬＡＧタグ配列をＰＣＲ法により増幅した。プライマー配列には増幅断片５’側および、３’側にそれぞれ制限酵素部位Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉが導入されるよう設計した。クローニングベクターｐＨＳＧ３９７（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）へクローニングした後、蛍光ＤＮＡシーケンサーＳＱ−５５００（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ）を用いてシーケンスを確認した（以下ｐＨＳＧ３９７／ｏｍｐＡ−ＦＬＡＧ）。
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ｇｅｎｅ  ＩＸ，ｇｅｎｅ  ＶＩＩのクローニング
ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＴａｋａｒａＢｉｏ）から一本鎖ＤＮＡを調製し、これを鋳型にしてＰＣＲ法によりｇｅｎｅ  ＶＩＩ，ｇｅｎｅ  ＩＸの配列を増幅した。それぞれの５’および３’側に、制限酵素切断部位としてｇｅｎｅ  ＶＩＩではＫｐｎ  ＩおよびＥｃｏＲＩ、ｇｅｎｅ  ＩＸではＸｈｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉを導入するため以下のプライマーを用いた。
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増幅されたｇｅｎｅ  ＶＩＩ断片はＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断してｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｔｏｙｏｂｏ）へ、ｇｅｎｅ  ＩＸ断片はＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断してｐＨＳＧ３９７／ｏｍｐＡ−ＦＬＡＧへクローニングし、そのシーケンスを確認した（以下ｐＢＳ−ｇ７およびｐＨＳＧ３９７／ｏｍｐＡ−ｇ９）。
リンカーの作製
オーバーラップ−イクステンジョン（Ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲによるＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ（ＨｙＨＥＬ−１０）の作製
ＶＨ，ＶＬ，Ｌｉｎｋｅｒを以下のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ増幅した後、ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ、ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬの各断片をオーバーラップ−イクステンジョンＰＣＲにより増幅した。さらにＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ、ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬのオーバーラップ−イクステンジョンＰＣＲによりＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬの断片を得た。この断片を両端のＮｃｏ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉで制限酵素切断した。
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ファージミドベクターｐＫＳ１の構築
ファージミドベクターｐＫＳ１はｐＫ１（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９８）Ｆｏｌｄｉｎｇ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ  ３，３２１−３２８）を改変したｐＳｃＦｖ３上に構築した。まずＰＣＲ法により抗ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードするファージミドベクターｐＩＴ（１３ＣＧ２）（ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｇｏｒｉｃｋ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８，９８９−９９４）をテンプレートとし，プライマーＭ１３ＲＶおよびＭｙｃＡＫｐｎＦｏｒ（５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣ−３’）で抗ＢＳＡ  ｓｃＦｖおよびＨｉｓ−ＭｙｃタグをコードするＤＮＡ断片を増やし，これをＳｆｉ  Ｉで切断後Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化したのちＫｐｎ  Ｉで処理し精製した。
次にこれをファージミドベクターｐＫ１をｇＩＩＩ遺伝子５’近傍のＰｓｔ  Ｉで処理した後Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化しＫｐｎ  Ｉで処理した断片とライゲーションさせた。この，抗ＢＳＡ  ｓｃＦｖ遺伝子−Ｈｉｓ−Ｍｙｃタグを持つベクターｐＳｃＦｖ３をＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩで処理し，これにＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩで処理したｐＢＳ−ｇ７から得たｇｅｎｅ  ＶＩＩ断片を挿入した（ｐＳｃＦｖ／ｇ７）。続いてＮｃｏ  Ｉ，Ｎｏｔ  Ｉで処理したＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬをｐＳｃＦｖ／ｇ７へ挿入し、ｐＫＳ１を得た。ファージミドベクターｐＫＳ１の配列を図４に示す。
ファージの作製（ＶＨ・ＶＬ提示型、ＶＨ提示型）
構築したファージミドｐＫＳ１（アンピシリン耐性）により形質転換した大腸菌を対数増殖期に達するまで３７℃で２ＴＹＡＧ培地（２ＴＹ＋アンピシリン：１００μｇ／μＬ，グルコース：２％）１００ｍＬで培養し、Ｏ．Ｄ．６００＝０．５の時点で培養液中の１０ｍＬへ、菌体量に対し２０当量のヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を加えた。３７℃で３０ｍｉｎ．静置した後、グルコースを含む培養上清を除去し、１００ｍＬの２ＴＹＡＫ培地（２ＴＹ＋アンピシリン：１００μｇ／ｍＬ，Ｋｍ：２５μｇ／ｍＬ）で再懸濁し３０℃で終夜培養した。次に培養液を４０００ｇ，１５ｍｉｎ遠心し、上清を回収して２０％  ＰＥＧ６０００・２．５Ｍ  ＮａＣｌを１／５ｖｏｌ．加え氷上で１ｈ静置し、４０００ｇ，１５ｍｉｎ遠心して沈殿物を２ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で再懸濁した。再び遠心して上清を回収し、ファージ溶液を得た。得られたファージについてはタイターを測定（後述）し、ファージ粒子の濃度をコロニー形成能（タイター，ｃｆｕ，ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ／ｍＬ）により決定した。
ｉ）サプレッサー株
プラスミドｐＫＳ１により大腸菌アンバーサプレッサー株ＴＧ−１及びＸＬ−１Ｂｌｕｅを形質転換し、ｐＩＸにＶＨ、ｐＶＩＩにＶＬを提示したＶＨ，ＶＬ両者提示型のファージを得た。
ｉｉ）非サプレッサー株
ｐＫＳ１により大腸菌非サプレッサー株ＨＢ２１５１を形質転換し、ｐＩＸにＶＨを提示しＶＬを提示していないファージ、及び遊離のＶＬ断片を含むファージ溶液を得た。このファージについてはＰＥＧ  ＮａＣｌによる沈殿の過程を省き、培養上清をそのまま用いた。
ファージタイターの測定
ファージの濃度の目安としてタイターを測定した。対数増殖期まで２ＴＹ培地で培養した大腸菌ＴＧ１  １００μＬ〜１ｍＬに、原液をＰＢＳで１０００倍希釈したファージ溶液１μＬを入れ、３７℃で３０ｍｉｎ．静置して感染させた。その後２ＴＹ培地で希釈し、各希釈溶液から１０μＬを２ＴＹＡＧプレート上にスポッティングした。終夜放置後に各スポットで形成されたコロニー数を数えて、ファージ原液１ｍＬから何個のコロニーが形成されたかを計算しファージ濃度の指標とした。
ファージＥＬＩＳＡ
ポリスチレン製９６穴マイクロプレートの各ウェルに１〜１０μｇ／ｍＬの一次抗体または抗原の溶液を１００μＬ入れ、４℃で一晩固定化した。次にウェルの水分を除去した後、各ｗｅｌｌに２００μＬの１％スキムミルクを含むＰＢＳ（ＭＰＢＳ）を入れ、２ｈ．室温で静置しブロッキングした。続いてプレートを０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、１０１１〜１０１２ｃｆｕ／ｍＬのファージ溶液（ＭＰＢＳ中）を１００μＬ入れて３７℃で１ｈ．静置した。マイクロプレートを３回洗浄し、ＭＰＢＳで５０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ファージ抗体（マウス抗−Ｍ１３  ＨＲＰ，アマシャムバイオサイエンス）を各ウェルへ１００μＬずつ添加し室温で１ｈ．静置した。
マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、あらかじめ調製した酵素反応溶液（５０ｍＬ  １００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．０，ＴＭＢＺ（ｉｎ  ＤＭＳＯ）５００μＬ，Ｈ２Ｏ２  １０μＬ）を各ｗｅｌｌへ添加して反応を開始した。暗所で１０〜３０ｍｉｎ．反応させた後３．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ添加して反応を止め、プレートリーダーで吸光度を測定した（４５０ｎｍ，対照は６５０ｎｍ）。
オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ
基本的な操作は上述のファージＥＬＩＳＡと同様に行った。タグを付加したＶＬを固定化する一次抗体（ａＦＬＡＧ−Ｍ２またはａｍｙｃ  ９Ｅ１０）をマイクロプレート上に固定化しブロッキングした後、濃度既知の抗原（ＨＥＬ，０．６〜１０μｇ／ｍＬ）をあらかじめ混ぜたファージ溶液（１％ＭＰＢＳ中）を１００μＬ入れ３７℃で１ｈ．静置した。以降ファージＥＬＩＳＡと同様にＨＲＰ標識抗ファージ抗体の酵素活性を吸光度により測定した。
ＶＬ断片提示の確認
ファージに提示されたＶＬのＮ末端にはｍｙｃ  ｔａｇが、Ｃ末端にはＦＬＡＧ  ｔａｇが組み込まれており、抗体断片の提示を確認するためにこれらのｔａｇに対する抗体を用いてファージＥＬＩＳＡを行った。この結果、少なくともＶＬ断片は充分に提示が行われていることが示唆された。提示の確認の結果を図５に示す。
抗原結合活性の確認
抗体断片ＶＨ・ＶＬがファージに充分提示されているか、またファージに提示されたＶＨ・ＶＬが充分な結合活性、抗原特異性を保持しているかどうかを確認するため、ＨＥＬを固定化したマイクロプレートを用いてファージＥＬＩＳＡを行った。この結果、ファージ濃度１０９（ｃｆｕ／ｍＬ）以上において抗原に対する特異的な結合が確認でき、このことからＶＨの提示も充分に行われていることが明らかになった。抗原結合活性の確認の結果を図６に示す。
ｓｃＦｖとｓｐｌｉｔＦｖの比較
ＨｙＨＥＬ−１０をｓｃＦｖ型及びｓｐｌｉｔＦｖ型で提示した各ファージについて、抗原（ＨＥＬ）を固定化したＥＬＩＳＡを行い抗原結合活性を比較した。ＳｐｌｉｔＦｖ型においてもｓｃＦｖと同様に充分な結合活性を示していることから、従来と同様の選択条件により結合性ファージのスクリーニングが可能なことが示された。なお図７は１０１０ｃｆｕ／ｍｌにおける結果であり、図８は１０９ｃｆｕ／ｍｌにおける結果である。
ＶＨ提示型ファージの作製
大腸菌ＨＢ２１５１：非サプレッサー株の形質転換
構築したベクターｐＫＳ１について、非サプレッサー株である大腸菌ＨＢ２１５１の形質転換を行い、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージでレスキューしてファージを作製した。得られたファージにはＶＨのみが提示され、ＶＬはファージと共に培養上清に分泌される。同様にタイターを測定し以降の実験に用いた。
非サプレッサー株による提示切り替えの確認
非サプレッサー株によって、アンバーによる提示の切り替えが充分に行われているかどうかを確認するため、培養上清を直接用いて抗原（ＨＥＬ）濃度０〜１０μｇ／ｍＬの範囲においてオープンサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ファージ濃度１ｘ１０１１（ｃｆｕ／ｍＬ）においてＨＥＬに特異的な濃度依存的なシグナルの上昇が見られたことから、切り替えは充分に起こっていると考えられた。またＶＬの分泌についても充分量行われていることが示唆された。結果を図９に示す。また、この実験系における提示切り替えのしくみを示す模式図を図１０に示す。
また実際にスクリーニングを行う時には、ＶＨ／ＶＬ提示型のファージライブラリーから選択した抗原に強い結合を示す各クローンについて９６穴プレートで培養を行いファージを作製するが、９６穴プレートにおける培養上清のファージタイターはウェルのどの位置においてもそれほど差異はなくおよそ１０１２のオーダーであることから、直接オープンサンドイッチＥＬＩＳＡによりスクリーニングが行えることが示唆された。
ファージミドベクターｐＫＳ２の作製
前項で作製したｐＫＳ１は，抗体クローニングのための制限酵素部位としてＶＨ上流に６塩基認識ＮｃｏＩサイトしか持って居らず，内部にＮｃｏＩ切断部位をもつ遺伝子断片の挿入は難しいという欠点があった。これを改良するため，ＮｃｏＩに加えて８塩基認識ＳｆｉＩをクローニングに用いることのできるベクターｐＫＳ２を作製した。
具体的にはＰＫＳ１（ＨｙＨＥＬ−１０）をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し，０．８ｋｂの挿入断片をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断したファージミドベクターｐＣａｎｔａｂ５Ｅ（アマシャムバイオサイエンス）にライゲーションさせ組み込んだ。
ターミネーターを組み込んだファージミドベクターの作製
挿入する抗体遺伝子によっては発現誘導前の融合蛋白質発現が大腸菌の生育に有害となり，挿入した遺伝子が高率で欠損する現象が見受けられた。これを防ぐため，転写開始信号の前と，融合遺伝子下流にグルタミンパーメアーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ）オペロン由来の転写終結配列（ターミネーターｔＨＰ，Ｎｏｈｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０５：２６０−２６９）を挿入した。これにより，非誘導時にファージミドベクター中に存在するプロモーター様配列から転写開始されるｍＲＮＡからの融合蛋白質発現を減少させることが出来ると期待された。
ファージミドベクターｐＫＳ２をＬａｃプロモーター上流のＳａｐＩ部位で切断し，ここに以下の４種のオリゴヌクレオチドをリン酸化後アニールさせて作製したターミネーター遺伝子を挿入した。
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組み換えたファージミドは，そのシーケンスを決定し設計通りの配列となっていることを確認した（ｐＫＳ２Ｔ）。
次に，ｐＫＳ２Ｔを融合遺伝子下流にあるＥｃｏＲＩ部位で切断し，以下の２つのプライマーおよびｔＨＰ２，ｔＨＰ３をアニールさせて作製したターミネーター遺伝子を挿入した。
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遺伝子の挿入されたファージミドのシーケンスを決定したところ，ＥｃｏＲＩ部位にターミネータ遺伝子が２個タンデムに挿入されていた。これをｐＫＳＴ２とした。
オープンサンドイッチ法に適した抗体の判別
このシステムを用いてある抗体がオープンサンドイッチ法に適しているかどうかを判別可能かどうか検討した。抗体遺伝子として，抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０およびＤ１．３を用いた。Ｄ１．３はＶＨ−ＶＬ相互作用が抗原結合の有無にかかわらず強い事が知られている。Ｄ１．３  Ｆｖ遺伝子をテンプレートとし，上記と同様にＰＣＲでｓｐｌｉｔ  Ｆｖ遺伝子を作製し，ｐＫＳＴ２に組み込んだ。非サプレッサー株であるＨＢ２１５１を形質転換し，ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を用いてＶＨ提示ファージおよび分泌型ＶＬを含む培養上清を調製した。
この上清および抗原を抗ＦＬＡＧタグ抗体を固定化したマイクロプレートに注ぎ，ファージ結合の抗原濃度依存性を調べた結果，Ｄ１．３を用いた場合，サンプル中のリゾチーム濃度を変えてもＶＬ断片を介して固相化されるファージの量は殆ど変化しなかった。これに対し，ＨｙＨＥＬ−１０を用いた場合，サンプル中のリゾチーム濃度に応じてＶＬ断片を介して固相化されるファージ量が顕著に増加した。このことから，この系がオープンサンドイッチ法に適した抗体の簡便なスクリーニング法として機能することが確かめられた．結果を図１１に示す。
モデルパニング
このシステムを用いて特異的結合抗体を提示するファージの選択が可能であることを証明するため，二種の特異性の異なるファージ抗体の混合液から目的の特異性を持ったファージ抗体をパニング法で濃縮することを試みた。
ファージミドとして，ＨｙＨＥＬ−１０をコードするｓｐｌｉｔ  Ｆｖを提示可能なｐＫＳＴ２−Ｈ１０（Ｈ１０）および抗フルオレセインｓｐｌｉｔ  Ｆｖを提示可能なｐＫＳＴ２−３１ＩＪ３（ＩＪ３）を用いた。これらを形質転換した大腸菌ＴＧ−１にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させ，ｓｐｌｉｔ  Ｆｖ提示ファージを作製した．これらをＭＰＢＳ  １００μｌ中のｔｉｔｅｒがＨ１０：ＩＪ３＝１０５：１０１１あるいは１０９：１０１１となる様に混合したファージ液を調製し，ニワトリ卵白リゾチームＨＥＬを固定化したマイクロプレートに注いで３７℃１時間置き，ＰＢＳ−Ｔで２回，ＰＢＳで２回洗浄し１００μＬの０．２ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２），１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを注ぎ溶出されたファージを６μｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和し対数増殖期の大腸菌ＴＧ−１に感染させた（一回目のパニング）。これをＹＴＡＧプレートにまいて３７℃一晩おき，コロニーを４８個回収してそれぞれを培養し，ファージを調製した（モノクローナルファージ）。これと共に残りのコロニーを集めてこれから同様にファージを調製し，再度ＨＥＬを固定化したマイクロプレートを用いたパニングを行った。そして４８クローンからモノクローナルファージを調製し，それぞれについて，ＨＥＬへの結合能をＥＬＩＳＡ法で測定した。
この結果，１：１０６および１：１０２のどちらの混合比でも１回目のパニングで顕著なＨＥＬ結合クローンの濃縮が見られ，全クローン中結合クローンの割合はそれぞれ３７．５％および５０％となった。また２回目のパニングにより，どちらの混合比の場合も８０％以上が陽性クローンとなることがわかった（図１２）。
【実施例２】  同じＨＥＬに対する抗体でもＨｙＨＥＬ−１０はオープンサンドイッチ法に適するが、ＶＨ／ＶＬ相互作用の強いＤ１．３は適していない。ＶＨ／ＶＬ相互作用に関与する残基を特定することができれば、その残基をオープンサンドイッチ法が適用可能な抗体のアミノ酸に置換することにより、オープンサンドイッチ法をより多くの抗体に適用することが可能となると期待される。また、これまでに、ＶＨ／ＶＬ相互作用および抗原結合能と抗体フレームワーク領域の配列との関係が系統的に調べられた例はない。そこで、ＶＨ／ＶＬ界面に存在する２番目のフレームワーク領域（ＦＲ２）に着目し、ＨｙＨＥＬ−１０のＶＨおよびＶＬのＦＲ２領域の各残基をＤ１．３型のものにしたとき、オープンサンドイッチ法による測定が可能であるか、また、ＶＨ／ＶＬ相互作用がそれぞれの野生型（ＷＴ）と比較してどのように変化するか、検討した。またそれにより、オープンサンドイッチ法が適用可能なクローンの割合を調べ、オープンサンドイッチ法の適用に必要な２つの条件を満たすには、どの残基が重要なのか検討した。
ｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片の作製
ＨｙＨＥＬ−１０を鋳型とし、以下の方法でＰＣＲを行った。プライマーに混合塩基を入れることでＦＲ２領域をＨｙＨＥＬ−１０型か、Ｄ１．３型にした、ＶＨのＮ末端からＶＬのＣＤＲ２領域に位置する５５番目のＧｌｙ（Ｈ５５）までのＤＮＡ断片（以下：ＶＨ  ＦＲ２と称し、リバースプライマーにＭＨ２ＢａｃｋＳｆｉ、フォワードプライマーにＨ１０ＶＨｆｒａｍｅ２を使用）、ＶＬのＣＤＲ１領域に位置する３０番目のＧｌｙ（Ｌ３０）からＶＬのＮ末端、ｇＶＩＩまでのＤＮＡ断片（以下：ＶＬ  ＦＲ２）（リバースプライマーにＨ１０ＶＬｆｒａｍｅ２、フォワードプライマーにｇ７ＥｃｏＦＲを使用）を増幅した。
ＰＣＲ反応の鋳型には、ｐＫＳＴ２のＦＬＡＧ  ｔａｇをＶＬのＮ末端からＶＨのＣ末端に移動させたＨｙＨＥＬ−１０のｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片を持つファージミド（ｐＫＳＴ２  ＨｙＨＥＬ−１０Ａ）を用いた。また、同様にこの２つのＤＮＡ断片をｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片にするためのリンカーも増幅した。この場合もｐＫＳＴ２  ＨｙＨＥＬ−１０Ａをテンプレートにし、ＶＨのＣＤＲ２領域に位置する４９番目のＧｌｙ（Ｈ４９）からＶＨのＣ末端、ＦＬＡＧ、ｇＩＸ、ＯｍｐＡ、ＶＬのＣＤＲ１領域に位置する３７番目のＧｌｎ（Ｌ３９）までのＤＮＡ断片（以下：ｌｉｎｋｅｒ（ＦＲ２））（リバースプライマーにＨ１０ｌｉｎｋＲＶ、フォワードプライマーにＨ１０ｌｉｎｋＦＲを使用）を増幅した。いずれの場合も、ＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘ  Ｔａｑ（宝バイオ）を用い、反応は９４℃、５分間で開始し、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を３５サイクル行い、７２℃５分間反応させた後、４℃で終了した。
次に、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＬ  ＦＲ２、リンカー（ＦＲ２）をオーバーラップエクステンジョンＰＣＲにより１つのＤＮＡ断片にアセンブリーさせた。まず、プライマーを加えず、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＬ  ＦＲ２、リンカー（ＦＲ２）をＰＣＲ反応液に入れ、９４℃、５分間で開始し、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を７サイクル行い、４℃で反応を終了させた。次に、ＭＨ２ＢａｃｋＳｆｉをリバースプライマー、ｇ７ＥｃｏＦＲをフォワードプライマーとして加え、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を３０サイクル行い、４℃で反応を終了させた。ポリメラーゼは、Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。
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ＦＲ２領域のランダム化の確認
このようにして増幅したｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片をＮｃｏ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉで処理し、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉで処理されたベクターｐＫＳＴ２に組み込み、大腸菌ＴＧ−１ｓｕｐ＋に形質転換した。反応溶液をＹＴＡＧプレート（Ａｐ：１００μｇ／ｍＬ、Ｇｌｕｃｏｓｅ：１％）に塗布し、３０℃で一晩培養した。生じたコロニーからコロニーＰＣＲを行った。ｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片の挿入が確認されたクローンをレプリカプレートから植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。得られた菌体溶液からアルカリ−ＳＤＳ法でプラスミド精製を行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で配列の確認を行った。プライマーは、Ｍ１３ＲＶ、ＯｍｐＡＲＶ（ＯｍｐＡ  ｓｉｇｎａｌ配列の一部に相補的なリバースプライマー）を用いた。また、ファージディスプレイ、続いて抗原のＨＥＬ、ｂｌａｎｋ、ＶＨ、および、ＶＬの提示を確認するため、それぞれ、ａｎｔｉ  ＦＬＡＧ  Ｍ２、９Ｅ１０を固定化し、ファージＥＬＩＳＡを行った。なお、ＨｙＨＥＬ−１０のＦＲ２領域の各残基をＨｙＨＥＬ−１０型か、Ｄ１．３型にしたｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片の作製を示す模式図を図１３に示す。
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ライブラリーの作製
まず上記のｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片を大量に調製した。その後、ベクター（ｐＫＳＴ２）２．１３ｐｍｏｌと挿入ＤＮＡ断片（ＨｙＨＥＬ−１０のＦＲ２領域に変異を導入したｓｐｌｉｔ  Ｆｖ断片）２１．３ｐｍｏｌを混合し、そこへ全量の１／２ｖｏｌ．のＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ）を加え、１６℃で２時間静置し、ライゲーションを行った。次に、エレクトロポレーション法により形質転換を行う前に、エタノール沈殿により脱塩を行った。具体的には、ライゲーション反応液の全量の１／１０ｖｏｌ．の３Ｍ酢酸ナトリウム、２μＬのＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ  Ｃｏ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ（メルク、東京）、２ｖｏｌ．の１００％エタノールを加え、ボルテックスミキサーにより混合し、室温で２分間静置した。静置後、１５０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、上清を除去した。７０％エタノール、続いて１００％エタノールでリンスし、１５０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、上清を除去、遠心乾燥した後、沈殿を２０μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、２等分した。
脱塩を行ったＤＮＡ溶液１０μＬと大腸菌１００μＬ（ＴＧ−１ｓｕｐ＋）を混合し、キュベットに移し、Ｅａｓｙｊｅｃｔ（ＥｑｕｉＢｉｏ）を用いて電圧を加えた。その後、２ＹＴ液体培地９００μＬをキュベットに加え、懸濁し、マイクロチューブに移し、３７℃で３０分間培養した。残りの脱塩を行ったＤＮＡ溶液１０μＬについても、同様の操作を行った。培養を行った後に、培養液１μＬを２ＹＴ液体培地９９μＬで希釈し、このうち１０μＬを２ＹＴ液体培地９０μＬで１０倍希釈、この操作を２回繰り返した。それぞれの希釈液のうち１０μＬずつをＹＴＡＧ（Ａｐ：１００μｇ／ｍＬ、グルコース：１％）プレートにスポッティングし、３０℃で一晩培養した。それぞれのスポットに生じたコロニーの数を数え、ライブラリのサイズを算出した。残りの培養液は、ＹＴＡＧ（Ａｐ：１００μｇ／ｍＬ、グルコース：１％）プレート（バイオトレイ）（住友ベークライト）に塗布し、３０℃で一晩培養した。
ファージライブラリーの調製
コロニーの生えたバイオトレイに２ＹＴ液体培地５ｍｌを注ぎ、コンラージ棒を用いてコロニーを回収し、１／２ｖｏｌ．の５０％グリセロールを加えグリセロールストックを作製し、−８０℃で保存した。回収した菌体溶液５０μＬを２ＹＴ液体培地（Ａｐ：１００μｇ／ｍＬ、グルコース：１％）１００ｍＬに添加し、３７℃で振盪培養した。Ｏ．Ｄ．６００＝０．５に達したとき、培養液１０ｍＬに菌体の２０当量のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加え、３７℃で３０分間静置した。その後、２０００ｒｐｍ、１５分間遠心、培養上清を除去し、２ＹＴ液体培地（Ａｐ：１００μｇ／ｍＬ、Ｋｍ：５０μｇ／ｍＬ）５ｍＬで再懸濁した。これを２ＹＴ液体培地（Ａｐ：１００μｇ／ｍＬ、Ｋｍ：５０μｇ／ｍＬ）４５ｍＬの入ったバッフル付三角フラスコに加え、３０℃で２０時間、毎分２５０回転で振盪培養した。培養後、培養液を６５００ｇ、１０分間遠心し、培養上清を回収、そこへ２０％ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌを１／５ｖｏｌ．加え、氷上で１時間静置した。その後、６５００ｇ、４℃、３０分間遠心し、沈殿物として得られたファージを１ｍＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で再懸濁し、再度１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心し、上清を回収、ファージライブラリーを得た。
バイオパニングとモノクローナルファージＥＬＩＳＡ
抗原のＨＥＬに対してバイオパニングを１回もしくは２回行った。バイオパニングによって得られたＨＥＬに対する結合能の高いファージ集団から、ＨＥＬに特異的に結合するクローンを取得するため、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを行った。合計１５３６クローンにつき、ファージ培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い、ＨＥＬを固定化したウェルの吸光度が０．３以上でかつ、その吸光度がブランクの吸光度の５倍以上である７２クローンを、ＨＥＬへの結合が特異的であるか更に検討することにした。
上記においてライブラリーを作製する際に、約７×１０７個のコロニーが生じた。コロニーＰＣＲによりインサートが挿入されていないもの、また、ＰＣＲの際、遺伝子の過不足が起こっているものの割合を差し引くと、ライブラリーの多様性は約５×１０７と推定される。１回、バイオパニングを行い、得られた１５３６クローンにつき、９６穴プレートで調製したファージ培養上清を用い、ＥＬＩＳＡを行った。ＨＥＬを固定化したウェルの吸光度が０．３以上でかつ、その吸光度がブランクの吸光度の５倍以上である７２クローンにつき、５ｍＬスケールでファージを再度調製し、ＥＬＩＳＡを行い、ＨＥＬへの結合が特異的であるか、ＶＨ、ＶＬが提示されているか、検討を行った。
ファージクローンのＨＥＬに対する特異性
モノクローナルファージＥＬＩＳＡでＨＥＬへの結合能があると判断したクローンの特異性を確認するため、それぞれのクローンについて、グリセロールストックから植菌し、５ｍＬスケールでファージディスプレイをし、ファージＥＬＩＳＡを行った。このとき、抗原のＨＥＬ、ブランク、ＶＨ、および、ＶＬの提示を確認するため、それぞれ、ａｎｔｉ  ＦＬＡＧ  Ｍ２、９Ｅ１０を固定化したウェルを用意した。ＶＨ、ＶＬの両方が提示されていて、ＨＥＬに充分特異的に結合すると判断されるクローンが得られたので、これらのクローンにつき、グリセロールストックから植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。得られた菌体溶液からアルカリ−ＳＤＳ法でプラスミド精製を行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔで配列の確認を行った。プライマーは、Ｍ１３ＲＶ、ＯｍｐＡＲＶを用いた。
ａｎｔｉ  ＦＬＡＧ  Ｍ２、９Ｅ１０を固定化したウェルで、充分に大きな吸光度が示されＶＨ、ＶＬ共に提示されていることが確認され、かつ、ＨＥＬを固定化したウェルの吸光度がブランクの吸光度の８倍以上で、充分特異的に結合していると判断される６４クローンを得た。本来保存されているフレームワーク領域に変異を加えたために、非特異的な結合を示すクローンが多くなったと考えられる。これらのクローンにつき、提示されているＶＨ、およびＶＬのアミノ酸配列を調べ、アンバーコドンに置換されているクローン、ＶＨ、ＶＬ両方ともＷＴと全く同じアミノ酸配列を持つクローンを除いた３６クローンにつき、更に解析することにした。なお図１４に、ファージライブラリの作製から、ＨＥＬへの結合能の高いクローンの選択までの流れを示す。
この３６クローンにつき、ファージのタイターを２．５×１０８、１×１０９、４×１０９（ｃｆｕ／ｍｌ）にそろえ、ＨＥＬ、ブランクに対しＥＬＩＳＡを行ったところ、いずれのクローンもＨＥＬに特異的に結合していて、その結合能はＷＴと比較して、弱いものから、同等、強いものまで多種多様であった。ＨＥＬへの結合能の指標に、１×１０９ｃｆｕ／ｍｌでＥＬＩＳＡを行ったときの、ＨＥＬを固定したウェルでの吸光度からブランクの吸光度を引き、ＷＴのその値で割った値を用いることにした。
オープンサンドイッチＥＬＩＳＡによるＶＨ／ＶＬ相互作用の測定
ＨＥＬに充分特異的に結合すると判断され、かつ、アンバーコドンによる置換が起こっていなかった３６クローンにつき、ファージをＨＢ２１５１ｓｕｐ−に感染させ、ＶＨのみが提示されたファージと可溶性ＶＬ断片を含む上清を調製した。ＶＬに結合させたｔａｇのｍｙｃ  ｔａｇに対する抗体９Ｅ１０を固定化したプレートに、この培養上清をアプライし、いくつかの抗原濃度で（ＨＥＬ＝０、０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）、Ｏｐｅｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを行った。この際、プレートへの非特異的吸着による吸光度上昇がどの程度であるか検討するため、ブランクのウェルも用意した。その他の操作は、実施例１において述べたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡと同様の方法で行った。
ＨＥＬ＝１０μｇ／ｍＬでの吸光度をＨＥＬ＝０μｇ／ｍＬでの吸光度で割った値をオープンサンドイッチ法による測定への適性の指標として用いた。この値が１．２未満のものをオープンサンドイッチ法による測定が不可能である、１．２以上のものをオープンサンドイッチ法による測定が可能であると分類した。すると、ＶＨの３９番目の残基であるＨ３９がオープンサンドイッチ法による測定が可能であった１４クローン中、１３クローンでＫであり、オープンサンドイッチ法による測定が不可能であった２２クローン中、２０クローンでＱであった。
次にＨＢ２１５１ｓｕｐ−をホストとし調製したＶＨのみが提示されたファージと可溶性ＶＬ断片を含む上清を用い、抗原非存在下でのＶＨ／ＶＬ相互作用の測定を行った。ＶＬ側のｔａｇのｍｙｃ  ｔａｇに対する抗体９Ｅ１０を４℃、一晩静置、固定化したプレートを２％ＭＰＢＳ２００μＬを加え、室温で２時間静置した。ブロッキング後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗い、この培養上清１０μＬと１％  ＭＰＢＳ  ９０μＬを混合した溶液１００μＬを加え、３７℃で１時間静置した。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗い、５０００倍希釈したマウス由来ＨＲＰ標識抗ファージ抗体１００μＬを各ウェルへ加え、室温で１時間静置した。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗い酵素反応を行った。
９Ｅ１０を固定したウェルの吸光度からブランクの吸光度を引いた値をＶＨ／ＶＬ相互作用の強弱の指標として用い、この値の小さいクローンから順に並び替え、そのＦＲ２領域のアミノ酸配列と比較した。この値が０．５以上のものをＶＨ／ＶＬ相互作用が強い、０．５未満のものをＶＨ／ＶＬ相互作用が弱いと分類した。この場合でも、Ｈ３９のアミノ酸配列が大きな影響を及ぼしていて、Ｈ３９が、ＶＨ／ＶＬ相互作用が強いと判断された１９クローン中、１７クローンでＤ１．３型のＱであり、ＶＨ／ＶＬ相互作用が弱いと判断された１７クローン中、１３クローンでＨｙＨＥＬ−１０型のＫであった。すなわちこの実験により、ＶＨ３９位のアミノ酸残基（Ｈ３９）がオープンサンドイッチ法による測定の可否、およびＶＨ／ＶＬ相互作用の強弱決定に深く関与していることが示唆された。
ＨＥＬへの結合能とオープンサンドイッチ法による測定への適性、次にＶＨ／ＶＬ相互作用の強弱との関係をプロットした。ＨＥＬに対する結合能とオープンサンドイッチへの適性の関係を図１５に示す。また、ＨＥＬに対する結合能とＶＨ／ＶＬ相互作用の関係を図１６に示す。なお図１５と図１６において、黒丸はＨ３９がＨｙＨＥＬ−１０型（Ｋ）のものを、白四角はＤ１．３型（Ｑ）のものを、黒三角は野生型（ＷＴ）を、それぞれ示す。３６クローンについてプロットを行い、Ｈ３９がＫ，Ｑで分類した。
この結果、やはりＶＨの３９番目がＶＨ／ＶＬ相互作用の強弱、オープンサンドイッチ法による測定への適性に深く関与していて、ＨｙＨＥＬ−１０型のＫでは、ＶＨ／ＶＬＶ相互作用が弱く、オープンサンドイッチ法による測定に適していて、Ｄ１．３型のＱでは、ＶＨ／ＶＬ相互作用が強く、オープンサンドイッチ法による測定に適さない傾向があることが示された。これは、主にＶＬの３８番目（Ｌ３８）のＱとの間に水素結合を形成できるか否かによるものと考えられる。
実際に、Ｈ３９がＫのＨｙＨＥＬ−１０、Ｈ３９がＱのＤ１．３についてＨ３９近傍の立体構造を調べた。すると、ＨｙＨＥＬ−１０では、Ｈ３９のＫとＬ３８のＱの間には、水素結合が形成されないが、Ｄ１．３では、Ｈ３９のＱとＬ３８のＱの間に２本の水素結合が形成されることがわかった。それゆえ、Ｈ３９がＫの場合、Ｌ３８のＱと水素結合を形成することができないため、ＶＨ／ＶＬ相互作用が弱く、一方、Ｈ３９がＱの場合、Ｌ３８のＱと２本の水素結合を形成するため、ＶＨ／ＶＬ相互作用が強くなる傾向があるものと考えられる。
以上のことから、ｓｐｌｉｔ  Ｆｖシステムを用いてランダム化した抗体Ｆｖライブラリの選択を行い、野生型より抗原親和性の高いもの、オープンサンドイッチ法により適したものを含めた多数のクローンを得られることが示された。また、この結果からオープンサンドイッチ法に適した抗体の特徴が明らかになった。
本発明により、抗体可変領域のＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用を測定するための新規な方法が与えられた。本発明の方法は蛋白質の間の相互作用を検出する目的で、広く使用することが可能である。本発明の方法に従って、アンバーコドンを有するファージミドベクターによってアンバーサプレッサー株大腸菌を形質転換してファージを調製すると、ＶＨ・ＶＬ断片の両者がファージ粒子上に提示される。一方非アンバーサプレッサー株大腸菌を形質転換してファージを調製した際には、アンバーコドンが存在するために、ＶＨ断片のみがファージ粒子上に提示されて、ＶＬ断片は培養上清中に分泌されるという提示切り替えが起こる。培養上清中に分泌されたＶＬ断片を固相に固定化し、ファージ上に提示されたＶＨ断片との相互作用を定量化することにより、ＶＨ断片とＶＬ断片の間の相互作用を測定することが可能である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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