(57)【要約】本発明の目的は、実用化の可能な放射化学的収率と純度で９９ｍＴｃなどの短半減期金属放射性核種とＣＤとの錯体を封入したリポソームを作製する方法を提供することである。本発明によれば、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体と、エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることを含む、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体と、エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることを含む、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法。
【請求項２】
９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとエチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることを含む、９９ｍＴｃ−エチレンジステイン（ＣＤ）錯体封入リポソームの製造方法。
【請求項３】
短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体と、エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることにより製造される、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソーム。
【請求項４】
９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとエチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることにより製造される、９９ｍＴｃ−エチレンジステイン（ＣＤ）錯体封入リポソーム。
【請求項５】
請求項３または４に記載のリポソームを含む、診断剤又は治療剤。
【請求項６】
１種類以上のリポソーム形成物質；エチレンジステイン（ＣＤ）；エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソーム；短半減期金属放射性核種；Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン；または、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体：から成る群から選択される少なくとも１種類以上の物質を含む、請求項１に記載の短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法を行うための試薬キット。
【請求項７】
短半減期金属放射性核種が、９９ｍＴｃまたはその塩である、請求項６に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、９９ｍＴｃなどの短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法に関する。より詳細には、Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンを配位させた９９ｍＴｃなどの短半減期金属放射性核種の錯体を用いた、９９ｍＴｃなどの短半減期金属放射性核種の錯体を封入したリポソームの製造方法、該方法で製造されたリポソーム、該方法で使用するための試薬キットに関する。
背景技術
放射性核種を用いた癌の画像診断は、非侵襲的な早期診断を可能とする。画像診断に汎用されるラジオアイソトープ（ＲＩ）のうち、金属ＲＩであるテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）は、画像診断に適切な半減期（６時間）とγ線のエネルギー（１４１ｋｅＶ）を有し、さらに９９Ｍｏを親核種とするジェネレーターシステムにより生理食塩水溶液として容易に入手可能であるため、臨床応用に最も適した核種である。９９ｍＴｃを腫瘍へ選択的に送達する目的で、標識母体に抗体やペプチドを用いる研究がこれまで多くなされているが、リポソームも画像診断への利用が検討されてきたキャリアのひとつである。リポソームは、脂質二分子膜で構成される閉鎖小胞であり、化学療法剤などの薬物、タンパク質、核酸などのカプセル型ＤＤＳキャリアとして注目されている。核医学診断においても、内部に大量の放射能を内包でき、粒子径の調節や膜表面の化学修飾により標的指向化が可能であることから、９９ｍＴｃで標識したリポソームは固形癌のほか、センチネルリンパ節や、炎症・感染部位の高感度画像診断への応用が期待される。
腫瘍組織では血管透過性が亢進しており、またリンパ系を介する回収が欠如しているため、高分子が血中から腫瘍組織間質へ漏出し、蓄積しやすいことが明らかになっている。また、このような特性から組織間質に透過したリポソームは、腫瘍組織内において、細胞内へ取り込まれることなく細胞間質に存在することが示唆されている。しかし血流を循環するリポソームは、主に肝臓、脾臓などの細網内皮系組織に捕捉され、血中から除去される。これまでよく検討されてきた同じく腫瘍の画像診断を目的とした６７Ｇａおよび１１１Ｉｎのｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＮＴＡ）錯体を封入したリポソームは、実験動物において優れた腫瘍集積性を示すものの、肝臓や脾臓への高い放射能集積も認められ、実用化への大きな障害となっている。肝臓や脾臓に取り込まれたリポソームは、実質細胞内のリソソームと融合し代謝されるが、このときリソソーム内に放出された封入錯体６７Ｇａおよび１１１Ｉｎ−ＮＴＡは水溶性であるため膜を透過できず、またその低い安定性から錯体が分解し、リソソーム内に放射性核種が貯留する。その結果、これらの組織内に長時間にわたる放射能の滞留を示すと考えられる。
そこでリポソームが細胞内リソソーム内に取り込まれ、代謝を受けた後に放出されるＲＩ錯体に、リソソームから血中へ移行し、速やかに尿中へと排泄される性質を付与することで、これらの非特異的な放射能滞留を解消されると考えた。このような性質を有する錯体として９９ｍＴｃ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉｃｙｓｔｅｉｎｅ（９９ｍＴｃ−ＣＤ）（図１）を選択した。９９ｍＴｃ−ＣＤは２分子の遊離カルボン酸と安定な５価中性錯体構造を有し、パラアミノ馬尿酸と同様に、腎臓の有機アニオントランスポータを介して、安定な化学形で尿排泄されることが報告されている。本発明者らのこれまでの研究によれば、９９ｍＴｃと同族の長半減期金属放射性核種であるレニウム−１８６（１８６Ｒｅ）のＣＤ錯体、１８６Ｒｅ−ＣＤをリポソーム内に封入することで、肝臓や脾臓に集積する放射能を１８６Ｒｅ−ＣＤとして速やかに尿中へ排泄し、これらの臓器の放射能滞留を大きく低減できることが明らかになっている。これらの結果は、９９ｍＴｃ−ＣＤ錯体封入リポソームも同様に、肝臓や脾臓での放射能滞留の解消が可能であることを示唆している。
しかし、１８６Ｒｅ−ＣＤリポソーム作製時、脂質に１８６Ｒｅ−ＣＤ錯体をそのまま添加して膨潤させる直接封入では、封入効率は３．２％と著しく低かったことから、１８６Ｒｅ−ＣＤまたは９９ｍＴｃ−ＣＤのリポソームへの封入法の確立が必要とされる。また、臨床で使用する際は、直接封入リポソームは使用直前にリポソームを調製する必要があり、実用性の面からもあらかじめ調製したリポソームを臨床で標識する方法が望ましい。６７Ｇａや１１１Ｉｎの効率的かつ簡便な封入法として、高い脂溶性と置換活性を有する錯体である６７Ｇａおよび１１１Ｉｎ−ｏｘｉｎｅ錯体を作製し、ＮＴＡ内包リポソームとインキュベートすることにより、リポソーム膜を透過した錯体が内部で配位子交換反応を起こし、水溶性キレートである６７Ｇａおよび１１１Ｉｎ−ＮＴＡとしてリポソーム内に保持させる手法が報告されている（図２）。配位子交換反応と呼ばれるこの封入法を用いた場合、６７Ｇａや１１１Ｉｎの封入効率は約９０％に達する。また、９９ｍＴｃ標識リポソームを高い放射化学的収率で得る方法として、脂溶性錯体である９９ｍＴｃ−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｐｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ  ｏｘｉｍｅ（９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ）を、グルタチオン内包リポソームとインキュベートすることにより、内部で９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯを還元的に水溶性分解物に変換させる。封入効率はおよそ６０％から９０％であり、最近では核医学的に用いられるＲＩ標識リポソームは、この封入法によって調製されるものがもっとも一般的であるが、６７Ｇａ、１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃのいずれの標識リポソームにおいても、前述のような肝臓・脾臓への放射能滞留の問題が生じる。
発明の開示
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、投与した放射能が速やかに排泄されるためには、高い封入効率のみでなく、内部の９９ｍＴｃ−ＣＤの放射化学的純度を十分に向上させることも同時に必要である。従って、本発明の目的は、実用化の可能な放射化学的収率と純度で９９ｍＴｃなどの短半減期金属放射性核種とＣＤとの錯体を封入したリポソームを作製する方法を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決することを目的として、高い膜透過性と置換活性を有する２種の９９ｍＴｃ錯体である９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯと９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン（ＭＲＰ２０）（図３）を配位子交換反応において利用し、両者を比較検討した。また、作製した９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームの体内放射能動態を検討し、９９ｍＴｃによる画像診断および１８６Ｒｅによる内用放射線治療に対する本標識法の有用性について評価した。その結果、９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン（９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０）を用いて配位子交換反応により９９ｍＴｃ−ＣＤをリポソームに封入することにより、肝臓や脾臓への非特異的放射能滞留を解消する９９ｍＴｃ封入リポソームを作製することが可能であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体と、エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることを含む、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法が提供される。
好ましくは、９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとエチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることを含む、９９ｍＴｃ−エチレンジステイン（ＣＤ）錯体封入リポソームの製造方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体と、エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることにより製造される、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームが提供される。
好ましくは、９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとエチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることにより製造される、９９ｍＴｃ−エチレンジステイン（ＣＤ）錯体封入リポソームが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記したリポソームを含む、診断剤又は治療剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、１種類以上のリポソーム形成物質；エチレンジステイン（ＣＤ）；エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソーム；短半減期金属放射性核種；Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン；または、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体：から成る群から選択される少なくとも１種類以上の物質を含む、本発明による短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法を行うための試薬キットが提供される。
好ましくは、短半減期金属放射性核種は、９９ｍＴｃまたはその塩である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明により提供される、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法は、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体と、エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームとを混合し、インキュベートすることを特徴とするものである。
本発明で用いることができる短半減期金属放射性核種の種類は特に限定されないが、好ましくは、９９ｍＴｃ（テクネシウム９９ｍ）、または１８６／１８８Ｒｅであり、特に好ましくは、９９ｍＴｃである。
本発明で用いる短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン（ＭＲＰ２０）との錯体は、例えば、短半減期金属放射性核種が９９ｍＴｃである場合には、ＭＲＰ２０のエタノール溶液と塩化第一スズの塩酸溶液を混和し、これに９９ｍＴｃＯ４−溶液を加え室温で放置することにより製造することができる。９９ｍＴｃ以外の短半減期金属放射性核種を使用する場合には、９９ｍＴｃＯ４−溶液の代わりに、対応する短半減期金属放射性核種を含有する溶液を使用すればよい。
本発明で用いるエチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームは、リポソーム形成物質を用いて常法により製造することができる。
リポソーム形成物質は、当分野で通常使用されるものであれば特に限定されないが、生体内において安定なリポソームを提供するという点から、リン脂質あるいはその誘導体、リン脂質以外の脂質あるいはその誘導体が好適に用いられる。
前記リン脂質は、例えば、リン脂質は、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルトイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエアノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、大豆レチシン、卵黄レシチン、等の天然または合成のリン脂質、あるいはこれらを常法に従って水素添加したものが挙げられる。
さらに、親水性高分子の脂質誘導体を添加してリポソームの表面を修飾することもできる。使用することができる親水性高分子の脂質誘導体としては、リポソームの構造安定を損なうものでなければ特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン、及びこれらの誘導体などが挙げられ、特に好ましくは、ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール誘導体を使用することができる。
本発明で用いるリポソームには、必要に応じ、安定化剤、酸化防止剤等を用いることも可能である。安定化剤は、例えば、膜流動性を低下させるコレステロール等のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類が挙げられる。酸化防止剤は、例えば、トコフェロール同族体、例えば、ビタミンＥなどが挙げられる。
リポソームを製造するためには、フラスコ中で溶媒に溶解したリポソーム形成物質（２種類以上の混合物でもよい）を、減圧下で溶媒を留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成させることができる。
溶媒としては使用する脂質を溶解し得るものが何れも使用でき、例えば、クロロホルム、メチルクロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類等を挙げることができる。
次いで、減圧デシケーターに移し減圧下で溶媒を完全に留去した後、ＣＤ水溶液を添加し、脂質を膨潤させ、懸濁液として多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を得ることができる。さらに、０．２μｍ、０．０５μｍなどのメンブランフィルターを用いて順次加圧ろ過することにより、単膜リポソームを得ることができる。
得られたリポソーム分散液は、ゲル濾過、遠心分離等の公知の方法に準じて精製することによって、リポソームとリポソームに内封されなかった物質とを分離することができる。
次いで、上記で得られたエチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームに、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体（特に好ましくは、９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンなど）を添加して、インキュベートすることにより、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームを製造することができる。インキュベートの温度および時間は特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、室温で３０分から数時間程度インキュベートすることにより、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームを製造することができる。
上記した本発明の方法で得られる短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームは、短半減期金属放射性核種（例えば、９９ｍＴｃ）−ＣＤ錯体の純度が高いことを特徴とする。このようにリポソーム内部の短半減期金属放射性核種（例えば、９９ｍＴｃ）−ＣＤ錯体の放射化学的純度が高いほど、肝臓や脾臓からの速やかな放射能消失が期待できるため、本発明の方法で製造される短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームは、従来の９９ｍＴｃ封入リポソームや９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ−ＣＤリポソームよりも大幅に肝臓や脾臓での放射能滞留が低減しているという特徴を有している。このような特徴を有するリポソーム自体も本発明の範囲内に属する。
本発明の方法で得られる短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームは、例えば、癌または腫瘍などを含む各種疾患の診断剤または治療剤として有用である。
本発明のリポソームは、経口または非経口投与により生体に投与することができる。投与法は、注射による投与が好ましく、癌または腫瘍の存在部位により静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、動脈内注射などの何れも用いることができるが、好ましくは静脈内注射である。
本発明のリポソームを診断剤または治療剤として投与する場合、リポソームをそのまま投与してもよいが、リポソームを含む医薬組成物の形態で投与することが好ましい。前記医薬組成物は、本発明のリポソームおよび薬学的に許容される賦形剤を含み、必要に応じて、他の薬学的製剤、担体、補助薬等を含んでいてもよい。
本発明のリポソームを注射により被験者に投与する場合、液体の医薬組成物を調製することが好ましい。
液体の医薬組成物は、例えば、本発明のリポソームを、水、生理食塩水、水性ブドウ糖、グリセロール、グリコール、エタノール等のような担体中に、必要に応じてアジュバントを添加して、溶解または分散させることにより、溶液または懸濁液として調製することができる。
また、本発明の医薬組成物には、所望により、湿潤剤、乳化剤、または可溶化剤、ｐＨ緩衝剤等、例えば、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、一ラウリン酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等のような助剤を少量含有させてもよい。このような医薬組成物の調製方法は、当業者に自明である。
本発明のリポソームの投与量は、投与の目的、封入された短半減期金属放射性核種の種類や封入量などにより異なるが、通常成人に対し０．１ｍｇ〜１ｇ程度投与される。
さらに、本発明では、下記式：
2003072142.tif 000002
で表される９９ｍＴｃ−Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン（９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０）を使用する。
９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０は、Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン（ＭＲＰ２０）のエタノール溶液と塩化第一スズの塩酸溶液を混和し、これに９９ｍＴｃＯ４−溶液を加え室温で放置することにより製造することができる。
さらに、本発明によれば、１種類以上のリポソーム形成物質；エチレンジステイン（ＣＤ）；エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソーム；短半減期金属放射性核種；Ｎ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミン；または、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体：から成る群から選択される少なくとも１種類以上の物質を含む、短半減期金属放射性核種とエチレンジステイン（ＣＤ）との錯体を封入したリポソームの製造方法を行うための試薬キットが提供される。
上記において、１種類以上のリポソーム形成物質、及びエチレンジステイン（ＣＤ）は、エチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソームを製造するための試薬であり、これらの単独又は両方を試薬キットに含めてもよいし、あるいは製造後のエチレンジステイン（ＣＤ）封入リポソーム自体を試薬キットに含めてもよい。
同様に、短半減期金属放射性核種、及びＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンは、短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体を製造するための試薬であり、これらの単独または両方を試薬キットに含めてもよいし、あるいは製造後の短半減期金属放射性核種とＮ−［２（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）エタン−１，２−ジアミンとの錯体を試薬キットに含めてもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
（実験材料と方法）
１．一般的方法
９９ｍＴｃＯ４−溶液は、９９Ｍｏ／９９ｍＴｃジェネレーター（Ｕｌｔｒａ  Ｔｅｃｈｎｅ  Ｋｏｗ，第一アイソトープ）の生理食塩水溶出液を用いた。錯体合成における生成物の確認は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ペーパークロマトグラフィー（ＰＣ）、セルロースアセテート膜電気泳動法（ＥＰ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いた。ＴＬＣはＭｅｒｃｋ社製シリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４）を用い、クロロホルムとメタノールの混合溶媒（４：１）で展開した。ＰＣはＷｈａｔｍａｎ社製ろ紙（Ｎｏ．１）を用い、５０％アセトニトリルで展開した。ＥＰは、泳動膜にセルロースアセテート膜（ＳＥＬＥＣＡ−Ｖ，東洋濾紙会社）、緩衝液にベロナール緩衝液（ｐＨ＝８．６，Ｉ＝０．０６，ナカライテスク）を使用し、一定電流（１ｍＡ／ｃｍ）で２５分間泳動した。ＲＰ−ＨＰＬＣはカラムにＣＯＳＭＯＳＩＬ  Ｃ１８−ＡＲ−３００（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，ナカライテスク）を用いてこれにフラクションコレクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を接続し、採取した全フラクションをガンマカウンター（ＡＲＣ−３８０Ｍ，Ａｌｏｋａ）で測定した。標識化合物の分析は、流速を０．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相は（Ａ）０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ：７．０）とアセトニトリルを用いて、アセトニトリルの割合が１０分で０−１００％になる測定条件、（Ｂ）０．０１２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝２．５）とアセトニトリルを用いて、アセトニトリルの割合が１２分で０〜９％、２０分から４０分で９〜１００％になる測定条件で行った。
２．ＣＤおよびＭＲＰ２０の合成
Ｎ，Ｎ’−ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＣＤ）の合成はＢｒｏｎｄｅａｕらの方法に準じて行った（Ｂｌｏｎｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  ４５：４９−５２，１９６７）。Ｌ−ｔｈｉｏｐｒｏｌｉｎｅ（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ，東京化成）のアンモニア溶液に金属ナトリウムを加え撹拌した後、ＮＨ４Ｃｌを加え室温で一晩撹拌し、生成した結晶を水に溶解し塩酸で析出させて得た（収率２３％，融点２５１−２５４℃）。
Ｎ−［２（１Ｈ−ｐｙｒｏｌｙｌｍｅｔｈｙｌ）］−Ｎ’−（４−ｐｅｎｔｅｎｅ−３−ｏｎｅ−２）ｅｔｈａｎｅ−１，２−ｄｉａｍｎｅ（ＭＲＰ２０）の合成はＭｏｒｇａｎらの方法に準じて行った（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９０：２５７−２６４，１９９１）。Ｐｙｒｒｏｌｅ−２−ａｌｄｅｈｙｄｅとｅｔｈｙｌｅｎ  ｄｉａｍｉｎｅをアセトニトリル中で一晩撹拌後、メタノール溶媒下ＮａＢＨ４で還元し、塩基性条件でクロロホルムに抽出して中間体を得た。次いで中間体とａｃｅｔｙｌ  ａｃｅｔｏｎｅをアセトニトリル中で撹拌後、クロロホルムで抽出し、シリカゲルカラム（溶媒は酢酸エチル：メタノール＝５：１）とベンゼンによる再結晶で精製した。収率１５．９％，融点７４−７５℃（文献値７５℃）。
３．９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯおよび９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０の合成
９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ（９９ｍＴｃ−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｐｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ  ｏｘｉｍｅ）は日本メジフィジックスから供給されたキット（Ｃｅｒｅｂｒｏｔｅｃ（登録商標），Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｎｌｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によって調製した。キットに９９ｍＴｃＯ４−生理食塩水溶液を加え、溶解直後に使用した。
９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０はＭＲＰ２０のエタノール溶液（１７１ｍＭ）１９０μｌと塩化第一スズの０．０１ＮＨＣｌ溶液（１．３５Ｍ）１０μｌを混和し、これに９９ｍＴｃＯ４−溶液２００μｌを加え室温で１５分放置したものを使用した。
得られた９９ｍＴｃ錯体（９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０および９９ｍＴｃ−ＣＤ）の放射化学的収率はＴＬＣ，ＰＣ，ＥＰ，ＲＰ−ＨＰＬＣにより求めた。放射化学的収率の算出は、乾燥後のＴＬＣプレート、ろ紙、およびセルロースアセテート膜を５ｍｍの幅に切断し、各切片をガンマカウンターで測定し、各プレート上のすべての放射能を１００％としたときのそれぞれのＲｆ値における放射能の割合を求めることで行った。
４．ＨＭＰＡＯおよびＭＲＰ２０の分配係数の測定
オクタノール５００μｌと、ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝液またはｐＨ１２．０のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨ緩衝液５００μｌに、生理食塩水で８ｍＭに調製したＨＭＰＡＯまたはＭＲＰ２０溶液を２０μｌ加え、撹拌・静置した後、オクタノール層、水層の吸光度を測定し、二錯体の脂溶性を比較した。
５．９９ｍＴｃ錯体の水溶液中での安定性
９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯと９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０の水溶液中での安定性を比較する目的で、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ水溶液を５０ｍＭアンモニア緩衝液（ｐＨ９．４）で最終リガンド濃度が１ｍＭとなるよう希釈し、２５℃または３７℃の水浴中でインキュベートし、一定時間（０．５，２，４，８，２４時間）後に上述の分析法によってそれぞれの放射化学的純度を求めた。９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０水溶液は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）で希釈し、同様の操作を行った。
また遊離リガンドの安定性への影響を検討する目的で、９９ｍＴｃ錯体溶液をＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、１００％アセトニトリル中に溶出された精製９９ｍＴｃ錯体溶液を緩衝液で１：１の割合で混和・希釈して、精製前と同様に、錯体の放射化学的純度の時間変化を調べた。
６．９９ｍＴｃ錯体のＣＤとの配位子交換反応性
ＣＤを１Ｎ  ＮａＯＨで６６．７ｍＭとなるよう溶解した後、緩衝液で１０倍に希釈し、２Ｎ  ＨＣｌでｐＨを調整したものをＣＤ水溶液とした。このＣＤ水溶液と９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯおよび９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０溶液を３：１の割合で混合し、３７℃で３０分間インキュベート後、ＥＰによってＴｃ−ＣＤの放射化学的収率を求めた。ＣＤを希釈する緩衝液として、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０またはｐＨ８．３、アンモニア緩衝液ｐＨ９．４または１０．５、リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．２（すべて５０ｍＭ）を用いた。ＣＤ溶液と９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯおよび９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０溶液を溶液混合後のＣＤ濃度は５ｍＭ，ＨＭＰＡＯおよびＭＲＰ２０濃度は２ｍＭであった。
７．リポソームの調製
ナス型フラスコにクロロホルム２ｍｌで溶解したｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＳＰＣ，日本油脂）とｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＣＨ，Ｓｉｇｍａ）をモル比として２：１（１５μｍｏｌｅ：７．５μｍｏｌｅ）で混合させた後、減圧下６５℃で溶媒を留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成させた。減圧デシケーターに移し４時間以上減圧下で溶媒を完全に留去した後、ほぼ等張の封入物質の水溶液を添加し、６５℃にて脂質を膨潤させ、懸濁液として多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を得た。０．２μｍ、０．０５μｍのポリカーボネート・メンブランフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（登録商標），野村マイクロサイエンス）を用いて順次加圧ろ過をして単膜リポソーム（ＳＵＶ）を得た。生成したリポソームは５％マンニトール水溶液で膨潤したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ−１．５ｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を担体とするゲルろ過（エコノカラム，１×３０ｃｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に付し、５％マンニトール水溶液で溶出して精製した。次いでリポソーム溶液を４００，０００ｇ、２０分で遠心分離し、沈殿を生理食塩水で再懸濁してリポソーム溶液を調製した。
８．９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームの作製
９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームは配位子交換反応により作製した。ＣＤを生理食塩水に溶解し２Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを１１．８とした５ｍＭのＣＤ溶液１．５ｍｌを、上記の方法で作製したリン脂質の薄膜に添加し、リポソームを調製した後、ゲルろ過で未封入のＣＤを除去した。得られた精製リポソーム５００μｌを同量の生理食塩水で希釈した後、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ溶液および９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０溶液１４０μｌをこれに加え、３７℃で６０分間インキュベートし、９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームを得た。反応溶液を遠心分離し沈殿した画分を９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソーム画分とした。
９．９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソームの作製
９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソームは従来の方法に準じて調製した。ＧＳＨを１３５ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶かし２Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ＝６．７とし、５０ｍＭ  ＧＳＨ溶液を調製した。ＧＳＨ溶液１．５ｍｌをリン脂質の薄膜に添加し、リポソームを調製した後、ゲルろ過で未封入のＧＳＨを除去した。次に９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ２５０μｌを精製リポソーム５００μｌに加え、２５℃で４０分間インキュベートし９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソームを得た。反応溶液を遠心分離し沈殿した画分を９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソーム画分とした。
１０．９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームの内容物の分析
９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯを用いて調製した９９ｍＴｃ−ＣＤリポソーム（９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ−ＣＤリポソーム）および９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０を用いて調製した９９ｍＴｃ−ＣＤリポソーム（９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０−ＣＤリポソーム）の各沈殿画分に、およそ２５０ｋＢｑ／ｍｌとなる量のエタノールを加え十分に撹拌し、２０分静置して脂質膜を溶解した。溶出させたリポソーム内容物をＥＰによって分析した。
１１．正常マウスにおける体内動態
９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソーム画分あるいは９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソーム画分をリン脂質濃度１．４〜１．８μｍｏｌｅ／ｍｌとなるように生理食塩水で希釈した。それぞれのリポソーム溶液０．１ｍｌを一群５匹で５週令のｄｄＹ系雄性マウスの尾静脈より投与した。投与１０分、１、３、６、２４時間後に断頭によって屠殺した後、各組織を摘出し、臓器重量ならびに放射能をγ線検出装置で測定した。各臓器に分布した放射能は、投与した量を１００％としたときのそれぞれの臓器１ｇあたりの放射能（％ＩＤ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅ）として表した。
投与２４時間後に、尿中放射能の分析を行った。採取した尿３００μｌを遠心ろ過用フィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に付し４℃で８８００ｒｐｍ、１５分間遠心してタンパクを除去した後、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過したものをＥＰ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
（結果）
１．９９ｍＴｃ化合物の化学的性質
９９ｍＴｃＯ４−は、ＥＰでは８．０ｃｍ陽極側に泳動し、クロロホルムとメタノールの混合溶媒で展開するＴＬＣではＲｆ値は０．８から０．９、５０％アセトニトリルで展開するＰＣではＲｆ値は０．９から１．０であった。９９ｍＴｃＯ４−の加水分解によって生じる９９ｍＴｃＯ２は、ＥＰ、ＴＬＣおよびＰＣは原点に残存すると考えられる。９９ｍＴｃ−ＣＤは、ＥＰでは６．０ｃｍ陽極側に泳動し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂ）において２２．０分後に溶出された。９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯは、ＥＰでは原点から泳動せず、ＴＬＣでＲｆ値は０．９であるため、ＴＬＣ  Ｒｆ値が０．９付近の放射能の割合から、ＥＰで求められる９９ｍＴｃＯ４−の割合を差し引いた値を放射化学的収率とした。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａ）での保持時間は１６．９分であった。次に示す方法で合成した９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０は、ＥＰでは原点から泳動せず、ＰＣではＲｆ値は０．８から１．０であるため、ＥＰで原点に残存する放射能の割合と、ＰＣで原点に残存する放射能の割合を求めることで、放射化学的収率を算出した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａ）での保持時間は１８．１分であった。これらの結果をまとめたもの（９９ｍＴｃ化合物の分析値）を表１に示す。
2003072142.tif 000003
２．ＨＭＰＡＯおよびＭＲＰ２０の分配係数
オクタノール層に移行したＨＭＰＡＯの吸光度は検出限界以下であった。ＭＲＰ２０のオクタノール層の吸光度と水層の吸光度の比は、緩衝液のｐＨが７．０のときに２．１±０．７、ｐＨが１２．０のときは５．０±１．６であった。
３．９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０の合成
通常の操作でＭＲＰ２０を９９ｍＴｃで標識した場合、負電荷を有する加水分解物が５０％以上生成し、目的標識物の収率は３５〜４０％程度にとどまった。そこで、溶媒であるエタノールと塩酸を６時間以上窒素ガスで置換し、またスズ・塩酸溶液を少量ずつ反応溶液に加えるようにしたところ、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０が８１〜９２％の放射化学的収率で得られた。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａ）による精製後の９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０の放射化学的純度はほぼ１００％であった。
４．９９ｍＴｃ錯体の水溶液中での安定性
９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯと９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０の両錯体溶液をＲＰ−ＨＰＬＣによる精製前と精製後について、溶液中に存在する各錯体の放射化学的純度の時間変化を調べた。その結果を図４に示す。
未精製の９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯは、錯体形成後３０分でおよそ４０％まで分解し、その後の分解は比較的緩やかに進んだ。一方、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０は、錯体形成後２時間でも放射化学的純度はおよそ７０％であり、２５℃において約４０％まで分解が進んだのは４時間後であった。精製後については、３７℃では２錯体の間で安定性に大差は見られなかったが、２５℃では逆に９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯの方が９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０よりも安定であった。２４時間後では９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０は６％まで分解したのに対し、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯの放射化学的純度は５９％であった。
５．９９ｍＴｃ錯体のＣＤとの配位子交換反応性
９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯと９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０の両錯体をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する前後で、ＣＤとの配位子交換反応性に及ぼすｐＨの影響を調べた結果を図５に示す。
未精製の９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯとＣＤとの交換反応において、混和溶液のｐＨが上昇するに伴い９９ｍＴｃ−ＣＤの収率は増加し、ｐＨ１１．９では収率は５７％であった。また、精製後の交換反応率もｐＨ１１．９で収率は７４％に達した。
９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０とＣＤとの交換反応性は精製前後とも９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯよりもはるかに高く、測定範囲内のｐＨでは９０％以上の９９ｍＴｃ−ＣＤ収率を示した。とくに精製後の９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０では、つねに９５％以上の９９ｍＴｃ−ＣＤ収率を示し、ｐＨによる影響は見られなかった。
６．９９ｍＴｃ封入リポソームの作製
９９ｍＴｃを封入したリポソームの遠心後の上清を分取し、沈殿と上清のそれぞれの放射能を測定することで封入効率を求めた。封入効率は沈殿の放射能を沈殿の放射能と上清の放射能の和で除した値とした。９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯを用いた配位子交換反応による９９ｍＴｃ−ＣＤの封入効率は６６．４％であり、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０を用いた９９ｍＴｃ−ＣＤの封入効率は７０．０％であった。また、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯを用いたＧＳＨリポソームへの封入効率は７５．１％であった。
９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームの内容物を分析した結果を図６、図７に示す。９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソーム、９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソームのどちらの内容物もＥＰでは主要ピークが７．５ｃｍから８．０ｃｍ陽極側にあらわれた。しかし、９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソームは、内部に存在する放射能のうち、９９ｍＴｃ−ＣＤに相当するピークは５４％にとどまった。それに対して９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソームの内容物については、ＥＰでは９１．１％の放射能が陽極側に６．５ｃｍ泳動し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂ）ではほぼすべての放射能が２２．３分の保持時間で溶出された。
７．正常マウスにおける体内動態
９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯおよび９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０を用いて標識した９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームおよび比較対照となる９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソームを正常マウスに静脈投与したときの体内放射能動態を図８に示す。三者の血中からの消失は同程度であり、投与早期には肝臓や脾臓への放射能集積に大きな相違が見られなかった。しかし時間経過に伴い、９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソームではこれらの臓器への放射能集積の増加が認められ、６時間後９９ｍＴｃ−ＣＤリポソームとの差は顕著になり、２４時間後においては肝臓は臓器１ｇあたり投与放射能の２０％が滞留し、脾臓では２４時間後も放射能の蓄積傾向が見られ、投与放射能の５６％が残存した。一方、９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームでは、肝臓の放射能は投与３０分、脾臓では投与３時間を最高値としてその後は経時的に減少した。また、２種の９９ｍＴｃ−ＣＤリポソームを比較すると、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０−ＣＤリポソームは９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソームに比べ、特に投与６時間と２４時間でより速やかな放射能消失を示した。
投与２４時間後に体外排泄された放射能量を図９に、また尿中放射能を分析した結果を図１０に示す。投与放射能のうち、尿中排泄された放射能の割合は、９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソーム投与群では５９％、９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソーム投与群では７４％であった。９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソーム投与後に排泄された尿中放射能は、そのうちの９１．２％がＥＰで陽極側に６．０ｃｍ泳動し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂ）では保持時間２２．５分後に溶出された。
（考察）
リポソームの９９ｍＴｃ標識法としてもっとも一般的な、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯとグルタチオン内包リポソームによる封入は、高い効率での封入を可能とする。しかし、このような９９ｍＴｃ封入リポソームは９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯの還元的分解物を内包しており、９９ｍＴｃ化合物が細網内皮系へ蓄積することにより生じる非特異的放射能滞留が、画像精度低下の問題を引き起こす。一方、直接封入による９９ｍＴｃ−ＣＤリポソームの作製は、封入効率が著しく低く実用性に劣るが、リポソームに内包される９９ｍＴｃ−ＣＤの放射化学的純度は理論的にはほぼ１００％であり、実際にマウス投与後には投与放射能の約８０％が尿中排泄され、速やかな非標的組織からの放射能消失を示すことが先の検討から明らかになっている。画像診断への応用を考慮すると、従来の標識法と同等の高い放射化学的収率ともに、直接封入法に匹敵する高い放射化学的純度を同時に達成する必要がある。
本実施例で、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯまたは９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０を用いた配位子交換反応により９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームを作製したところ、１８６Ｒｅ−ＣＤ直接封入時は３．２％であった封入効率が、６６％から７０％と大きく向上した。膜透過性錯体として９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯと９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０のどちらを使用しても、封入効率に大きな違いは見られなかったが、封入後リポソームに内包される９９ｍＴｃ−ＣＤの放射化学的純度に顕著な差が認められた。９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０と比較すると、９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソーム内の９９ｍＴｃ−ＣＤ純度ははるかに低い。これは、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯの加水分解物と思われる、負電荷を有する放射性化合物の生成が原因である。配位子交換反応では、出発原料となる錯体は置換活性が高く比較的不安定である必要があり、そのため目的とする錯体の生成反応は、原料となる錯体の分解反応と競合的に進行する。どちらの反応が優位に進行するかは、原料錯体の安定性に強く依存するが、錯体そのものの安定性だけでなく、リポソーム内配位子濃度も重要な因子であると推測される。ＨＭＰＡＯとＭＲＰ２０の分配係数から明らかなように、遊離状態でのＭＲＰ２０は、ＨＭＰＡＯよりもはるかに脂溶性が高い。膜外のＭＲＰ２０が受動拡散によりリポソーム膜を容易に透過することで、リポソーム内部においても高い遊離ＭＲＰ２０濃度を示し、このような過剰な遊離配位子の共存が、錯体の加水分解を受けにくい状態にしている可能性が考えられる。また錯体としての９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０自体が９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯよりも安定性が高いこと（図４）、またＣＤとの反応性が高い錯体であること（図５）が示され、これらの要因がＣＤとの配位子交換反応に有利に働き、リポソーム内でも高い純度で９９ｍＴｃ−ＣＤが生成すると考察される。
リポソーム内部の９９ｍＴｃ−ＣＤの放射化学的純度が高いほど、肝臓や脾臓からの速やかな放射能消失が期待できるため、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０−ＣＤリポソームが従来の９９ｍＴｃ封入リポソームや９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ−ＣＤリポソームよりも大幅に肝臓や脾臓での放射能滞留を低減したのは、内部９９ｍＴｃ−ＣＤ純度が投与後の体内放射能分布に大きな影響を及ぼした結果であると考えられる。これは、投与放射能の７４％が尿中排泄され、そのうちの９１％が９９ｍＴｃ−ＣＤの化学形で検出されたことからも支持される。以上の結果から、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０を用いた配位子交換反応によって、従来問題とされてきた非特異的放射能滞留を低減させる９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームの、高い放射化学的収率での作製が可能であることが示された。本発明の封入法は高精度画像診断を可能とする９９ｍＴｃ標識リポソームの作製に有用である。また、本発明の封入法は、癌の内用放射線治療を目的とする細胞殺傷性の１８６／１８８Ｒｅ標識リポソームの作製においても基礎的知見を与えることが期待される。
産業上の利用の可能性
膜透過性錯体の９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０は、ＣＤとの配位子交換反応によって９９ｍＴｃ−ＣＤを高収率で与えることから、本発明による９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０を用いた配位子交換反応によって、高い放射化学的収率と純度で９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームを作製することが可能となった。また、本法で作製した９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームは、従来問題とされた肝臓や脾臓での非特異的な放射能滞留を大きく低減することが示された。本発明により、９９ｍＴｃ標識リポソームを用いる画像診断精度を向上させることが可能になった。また、本発明の方法は、癌の内用放射線治療を目的とする細胞殺傷性の１８６／１８８Ｒｅ標識リポソームの作製にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、９９ｍＴｃ−ＣＤの推定構造を示す。ＣＤは配位原子に窒素とイオウを有し、５価の９９ｍＴｃと、安定なオキソ錯体を形成する。
図２は、８６Ｒｅ−ＣＤ直接封入法（Ａ）と、１１１Ｉｎ−ＮＴＡの配位子交換反応（Ｂ）を示す。
■：ＣＤまたはＮＴＡ
▲：８６Ｒｅまたは１１１Ｉｎ
○：オキシン
図３は、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ（左）と、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０（右）の構造を示す。高い脂溶性と置換活性を持つ９９ｍＴｃ錯体であり、比較的容易に加水分解および配位子交換反応を起こすと考えられる。
図４は、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯおよび９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０の水溶液中での安定性を示す。錯体形成０時間後を１００％としたときの、各９９ｍＴｃ錯体の放射化学的純度の時間変化を表す。
（Ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣ未精製の９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ；
（Ｂ）ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後の９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ；
（Ｃ）ＲＰ−ＨＰＬＣ未精製の９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０；
（Ｄ）ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後の９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０；
○：２５℃，□：３７℃
図５は、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ（Ａ）および９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０（Ｂ）とＣＤの配位子交換反応性のｐＨによる影響を示す。交換反応によって生じた９９ｍＴｃ−ＣＤの放射化学的吸収率を縦軸に表す。
○：ＲＰ−ＨＰＬＣ未精製の９９ｍＴｃ錯体との交換；
□：ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後の９９ｍＴｃ錯体との交換：
図６は、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯを用いて調製した９９ｍＴｃ−ＣＤリポソーム（９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソーム）の内容物のＥＰ分析結果を示す。
図７は、９９ｍＴｃ−ＭＲＰ２０を用いて調製した９９ｍＴｃ−ＣＤリポソーム（９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソーム）の内容物のＥＰ分析結果（Ａ）とＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果（Ｂ）を示す。
図８は、９９ｍＴｃ標識リポソームをマウスに静脈投与したときの体内放射能動態を示す。
△：９９ｍＴｃ／ＧＳＨリポソーム；
■：９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソーム：
●：９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソーム：
図９は、９９ｍＴｃ−ＣＤ封入リポソームをマウスに投与後、対外排泄された放射能の投与放射能に対する割合を示す。
■：９９ｍＴｃ（ＨＭＰＡＯ）−ＣＤリポソーム投与群；
□（斜線）：９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソーム投与群；
図１０は、９９ｍＴｃ（ＭＲＰ２０）−ＣＤリポソームをマウスに投与後、尿中排泄された放射能のＥＰ（Ａ）とＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂ）での分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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