(57)【要約】コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質を有効成分とする洗浄剤。この洗浄剤は、コレステロールエステルによる脂質汚れを効果的に分解して落とすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質を有効成分とする洗浄剤。
【請求項２】
タンパク質が、シュードモナス属由来の酵素である請求の範囲第１項記載の洗浄剤。
【請求項３】
タンパク質が、シュードモナス  アエルギノーザ由来の酵素である請求の範囲第１項記載の洗浄剤。
【請求項４】
タンパク質が、以下の理化学的性質を有するコレステロールエステラーゼである請求の範囲第１項記載の洗浄剤。
（１）基質特異性：リノール酸コレステロール、オレイン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ｎ−カプリル酸コレステロール、ミリスチン酸コレステロール、ラウリン酸コレステロール、カプリン酸コレステロールに高い活性
（２）最適ｐＨおよびｐＨ安定性：リノール酸コレステロールを基質とした時の加水分解の最適ｐＨは５．５〜９．５、ブリットン−ロビンソン広域緩衝液を用いた場合、２５℃、１９時間後の残存活性はｐＨ５〜１０で約１００％
（３）最適温度および温度安定性：リノール酸コレステロールを基質とした時の加水分解の最適温度は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約５３℃、同緩衝液中、各温度で３０分間処理後の残存活性は５０℃まではほぼ１００％
（４）等電点：蔗糖密度勾配アンフォライン電気泳動でｐＨ３付近
【請求項５】
タンパク質が、トリコデルマ属由来の酵素である請求の範囲第１項記載の洗浄剤。
【請求項６】
タンパク質が、トリコデルマ属  スギハラ菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｇｉｈａｒａ；寄託機関  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、寄託日  ２００２年１２月２５日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７３）由来の酵素である請求の範囲第１項記載の洗浄剤。
【請求項７】
コンタクトレンズ用洗浄液である請求の範囲第１項記載の洗浄剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、衣類、食器、眼鏡、髭剃り、ブラシなどの生体由来の脂質汚れが付着するものの洗浄剤に関する。とくにはコンタクトレンズ洗浄剤に関する。
背景技術
従来、衣類、食器、眼鏡、髭剃り、ブラシなどの生体由来の脂質汚れが付着するものの洗浄剤としては、界面活性剤、およびワックスエステルやトリグリセリドなどの脂質汚れの分解成分としてリパーゼを用いたものが知られている。
しかし、脂質汚れの中で付着しやすく、かつ落ちにくい物質がコレステロールエステルであるという知見が得られていなかったため、従来品では脂質汚れを充分に分解除去することができなかった。
本発明は、前記従来技術に鑑み、コレステロールエステルによる脂質汚れを効果的に分解して落とすことができる洗浄剤を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質を有効成分とする洗浄剤に関する。
前記洗浄剤において、タンパク質が、シュードモナス属由来の酵素であることが好ましく、とくにシュードモナス  アエルギノーザ由来の酵素であることが好ましい。
前記洗浄剤において、タンパク質が、以下の理化学的性質を有するコレステロールエステラーゼであることが好ましい。
（１）基質特異性：リノール酸コレステロール、オレイン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ｎ−カプリル酸コレステロール、ミリスチン酸コレステロール、ラウリン酸コレステロール、カプリン酸コレステロールに高い活性
（２）最適ｐＨおよびｐＨ安定性：リノール酸コレステロールを基質とした時の加水分解の最適ｐＨは５．５〜９．５、ブリットン−ロビンソン広域緩衝液を用いた場合、２５℃、１９時間後の残存活性はｐＨ５〜１０で約１００％
（３）最適温度および温度安定性：リノール酸コレステロールを基質とした時の加水分解の最適温度は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約５３℃、同緩衝液中、各温度で３０分間処理後の残存活性は５０℃まではほぼ１００％
（４）等電点：蔗糖密度勾配アンフォライン電気泳動でｐＨ３付近
さらに前記洗浄剤において、タンパク質が、トリコデルマ属由来の酵素であることが好ましく、とくにトリコデルマ属  スギハラ菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｇｉｈａｒａ；寄託機関  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、寄託日２００２年１２月２５日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７３）由来の酵素であることが好ましい。
また、本発明は、コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質を有効成分とするコンタクトレンズ用洗浄液に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質とは、コレステロールエステラーゼ活性を有し、洗浄対象、人体、環境に悪影響をおよぼさないものであればどのようなものでもよく、コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質を生産する微生物を培養することにより得られるものや、また市販品では和光純薬工業株式会社、シグマ−アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）、ＴＯＹＯＢＯ、富士紡績株式会社、名糖産業株式会社、天野エンザイム株式会社、ノボザイムズなどから入手することができるものがあげられる。
好ましいものとしては、コレステロールエステラーゼ（和光純薬工業株式会社製）（以下、Ｃ．Ｅ．という）、リパーゼＯＦ（以下、ＯＦという）、リパーゼＭＹ（以下、ＭＹという）（名糖産業株式会社製）、リパーゼＡＹ「アマノ」３０（以下、ＡＹ）（天野エンザイム株式会社製）などの市販品や、大阪市立工業研究所で培養精製されたシュードモナス  アエルギノーザ  Ｍ１菌株由来のコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素（以下、Ｎｏ．３という）およびトリコデルマ属  スギハラ菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｇｉｈａｒａ；奇託機関  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、寄託日  ２００２年１２月２５日、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７３）由来のコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素（以下、Ｓ−ＣＥＩＩという）があげられる。
ここで、コレステロールエステラーゼＮｏ．３およびＳ−ＣＥＩＩは、それぞれ以下の理化学的性質を有する酵素である。
＜コレステロールエステラーゼＮｏ．３＞
（１）基質特異性：リノール酸コレステロール、オレイン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ｎ−カプリル酸コレステロール、ミリスチン酸コレステロール、ラウリン酸コレステロール、カプリン酸コレステロールに高い活性
（２）最適ｐＨおよびｐＨ安定性：リノール酸コレステロールを基質とした時の加水分解の最適ｐＨは５．５〜９．５、ブリットン−ロビンソン広域緩衝液を用いた場合、２５℃、１９時間後の残存活性はｐＨ５〜１０で約１００％
（３）最適温度および温度安定性：リノール酸コレステロールを基質とした時の加水分解の最適温度は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約５３℃、同緩衝液中、各温度で３０分間処理後の残存活性は５０℃まではほぼ１００％
（４）等電点：蔗糖密度勾配アンフォライン電気泳動でｐＨ３付近
＜コレステロールエステラーゼＳ−ＣＥＩＩ＞
（１）基質特異性：リノール酸コレステロール、オレイン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ｎ−カプリル酸コレステロール、ミリスチン酸コレステロール、ラウリン酸コレステロール、カプリン酸コレステロール、カプリル酸コレステロール、カプロイン酸コレステロール、酪酸コレステロール、プロピオン酸コレステロール、酢酸コレステロールおよび安息香酸コレステロールに対し、非特異的に高い活性
（２）最適ｐＨおよびｐＨ安定性：リノール酸コレステロールを基質としたときの加水分解の最適ｐＨは４．５〜６．５、ブリットン−ロビンソン広域緩衝液を用いた場合、２５℃、１６時間後の残存活性はｐＨ４〜８．５で約１００％
（３）最適温度および温度安定性：リノール酸コレステロールを基質としたときの加水分解の最適温度は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約４０℃、同緩衝液中、各温度で３０分処理後の残存活性は６０℃までほぼ１００％
（４）等電点：蔗糖密度勾配アンフォライン電気泳動でｐＨ４．７±０．３
（５）分子量：約１１４ｋＤａ（約５７ｋＤａのサブユニット２個）
さらに、広範囲の脂肪酸エステルに作用し、アルカリｐＨや温度に強く、界面活性剤や空気酸化に対して安定であるという理由から、前記シュードモナス  アエルギノーザ  Ｍ１菌株由来のＮｏ．３およびトリコデルマ属  スギハラ菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｇｉｈａｒａ；寄託機関  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、寄託日２００２年１２月２５日、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７３）由来のＳ−ＣＥＩＩがさらに好ましく、トリコデルマ属  スギハラ菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｇｉｈａｒａ；寄託機関  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、寄託日２００２年１２月２５日、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７３）由来のＳ−ＣＥＩＩが最も好ましい。
これらの菌株は土壌から新たに採取されたものであり、その菌学的諸性質を以下に示す。
＜シュードモナス  アエルギノーザ  Ｍ１菌株＞
（ａ）形態学的性状
（１）胞の形態：１×２μｍの桿菌
（２）運動性：有（１本の鞭毛を有する）
（３）胞子：無
（４）コロニー形態：普通寒天培地上、３０℃、４８時間培養で、周縁波状の凸状円形のコロニーを形成し、水溶性褐色色素を生産する。表面は光沢がある
（ｂ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陰性
（２）カタラーゼ：陽性
（３）オキシダーゼ：陽性
（４）Ｏ−Ｆテスト：陰性
（５）インドールの産生：陰性
（６）硝酸塩の還元：陽性
（７）ウレアーゼ：陰性
（８）チトクロームオキシダーゼ：陽性
（９）ブドウ糖の酸性化：陰性
（１０）アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
（１１）資化性試験：ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ｄｌ−リンゴ酸、クエン酸ナトリウムは資化するが、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、マルトース、酢酸フェニルは資化しない
（１２）エスクリンの分解：陰性
（１３）ゼラチンの分解：陽性
（１４）β−ガラクトシダーゼ：陰性
（１５）生育温度：１０〜４５℃
（１６）生育ｐＨ：４〜９
このシュードモナス  アエルギノーザ  Ｍ１菌株は、バイオハザードレベル２であることから独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センターに寄託を拒否されたため、分譲については本出願人が保証するものである。
＜トリコデルマ属  スギハラ菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｇｉｈａｒａ；寄託機関  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、寄託日２００２年１２月２５日、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７３）＞
（ａ）形態学的性状
（１）巨視的観察結果：２５℃で、じゃがいもデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）、オートミール寒天培地（ＯＡ）および麦芽抽出物寒天培地（ＭＥＡ）上での培養では、菌糸による表面の色調は白ないし黄白色のビロード状ないしは羊毛状を呈し、５日以降から分生子の着性が認められ、ＰＤＡプレート上では黄白色、ＯＡおよびＭＥＡ上では緑色へのコロニー色長の変化が認められる。コロニー表面は乾燥性となり、滲出液は認められず、可溶性色素の産生も認められない。分生子は分生子柄の先端より塊状となり、分生子柄も集塊し、瘤状となる。
（２）微視的観察結果：分生子柄は規則的に分岐したトリコデルマ属のかびの分生子柄様のものが多数あり、分生子は一細胞性で２〜３μｍ、表面は平滑、形状は球ないし亜球状である。菌糸の先端にあって分生子を出芽形成する梗子は散開し、９０％以上が２〜４分岐しており、平滑で短く、中腹で膨れている。また、気中菌糸基部より球形で平滑な厚壁胞子も存在する。
これら菌株の培養は、この分野における公知の方法により実施することができる。
培養液からコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素を採取するには、培養液をろ過または遠心分離によって菌体を除去し、該ろ液または上清液から硫酸アンモニウム塩析、アルコール、アセトンなどを用いる溶剤沈殿、限外ろ過膜による濃縮などの公知の方法で酵素標品（以下、粗酵素液という）を得ることができる。さらに、高度に精製された酵素標品（以下、精製酵素液という）を得るには、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの従来から用いられている精製法で精製すればよい。本発明においては、前記粗酵素液と前記精製酵素液のどちらも使用し得る。
本発明の洗浄剤におけるコレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質の含有量は、好ましくは０．００１〜２０重量％であり、より好ましくは０．０１〜１５重量％である。コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質の含有量が０．００１重量％より少ないと、充分な脂質除去効果を得られない可能性があり、２０重量％より大きいと、洗浄対象にタンパク質が残存し、洗浄対象または人体に悪影響をおよぼす可能性がある。
本発明の洗浄剤には、さらにコレステロールエステラーゼ活性の失活を防ぐためのｐＨ調整剤や、界面活性剤などを添加してもよい。
本発明に用いるｐＨ調整剤はその調整作用により、酵素剤および／または最終調製液にコレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質が安定に存在できるｐＨ条件を提供でき、洗浄対象、人体、環境に悪影響をおよぼさないものであればどのようなものでもよい。
このようなｐＨ調整剤としては、たとえば、ＡＤＡ｛Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸｝、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ｛２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸｝、ＴＥＳ｛Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸｝、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ビス−トリス、ビス−トリスプロパン、酢酸、ベロナール、塩化アンモニウム、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、炭酸、フマル酸、マレイン酸、グリシン、グリシルグリシン、クエン酸、リン酸、ヒスチジン、ピロリン酸、ＥＤＴＡ（エデト酸）およびそれらの塩に代表されるような緩衝剤成分；また塩酸、ホウ酸化合物、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどｐＨ調整機能をもつことが公知であるものなどが使用できる。
ｐＨ調整剤の添加量は、０．０１ｍＭ〜５Ｍが好ましく、１ｍＭ〜２Ｍがより好ましい。ｐＨ調整剤の添加量が０．０１ｍＭより少ないとｐＨ調整剤が充分に緩衝能を発揮できない場合があり、５Ｍより多いと、過剰量となり、洗浄剤の製造コストをむやみに増大させてしまう傾向がある。具体的には、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタンを用いる場合、０．００１〜３０重量％が好ましく、０．０１〜２０重量％がより好ましい。
界面活性剤は、洗浄効果をさらに向上させるために用いられる。本発明に用いられる界面活性剤は、コレステロールエステラーゼ活性を不用意に阻害することなく、洗浄対象、人体、環境に悪影響をおよぼさないものであればどのようなものでもよい。
このような界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、アニオン性界面活性剤のいずれも使用することができる。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタンモノアルキレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノアルキレート、グリセロールモノアルキレート、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ジ（ポリオキシエチレン）アルキルアミン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなどがあげられる。
両性界面活性剤としては、ジメチルアルキルベタイン、アルキルグリシン、アルキルアラニン、アルキルアミドベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインなどがあげられる。
アニオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウムのような胆汁酸塩、タウロコール酸ナトリウムのような抱合胆汁酸塩、またはアルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ｎ−アシルアミノ酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩、アルキルスルホカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩などがあげられる。
なかでも、酵素活性に影響を及ぼさず、かつ高い洗浄力を発揮する胆汁酸塩、抱合胆汁酸塩が好ましく、とくにコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムが好ましい。
界面活性剤の添加量は、０．００１〜３０重量％が好ましく、０．０１〜２５重量％がより好ましい。界面活性剤の添加量が０．００１重量％より少ないと、充分な洗浄効果が得られない傾向があり、３０重量％より多いと、洗浄対象、人体に悪影響を及ぼす可能性がある。
また、本発明の洗浄剤を液剤として用いる場合には必要に応じて水などをさらに添加する。そのほか、用途に応じて殺菌剤、防腐剤、キレート剤、等張剤、増粘剤ならびに殺菌剤および洗浄剤の助剤などを添加することも出来る。
本発明において、「コレステロールエステラーゼ活性を有する」とは、たとえば、以下の活性試験により確認することができる。
＜コレステロールエステラーゼ活性試験＞
コレステロールエステラーゼ活性の測定は、コレステロールエステルを基質とするコレステロールエステラーゼ反応により遊離させたコレステロールをコレステロールオキシダーゼで酸化したのち、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼにより４−アミノアンチピリンと反応させ、生成したキノン色素を分光光度計により定量する方法を用いて行なうことができる。
試験液は、たとえば試験対象であるタンパク質１０ｍｇを５ｍｌの０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび、０．２％ＢＳＡを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に加え調製することができる。
また、試験対象のタンパク質として、粗酵素溶液を使用する場合は、たとえば粗酵素液を、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび０．２％ＢＳＡを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈して各種濃度の希釈液を調製し、適当な吸光度を測定できる試験液を選択して使用することができる。
試験液のコレステロールエステラーゼ活性［Ｕ／ｍｌ］は市販のコレステロールエステラーゼ（たとえば、和光純薬工業株式会社製  コレステロールエステラーゼ１６Ｕ／ｍｇ）を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび、０．２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させることにより、活性［Ｕ／ｍｌ］が既知である対照液を調製し、検量線法を用いて算出することができる。
また、５００ｎｍの吸光度変化を１分間記録し、その初期勾配から１分間あたりの吸光度変化（ΔＡｔ）を求め、盲検値の吸光度変化（ΔＡｂ）を差し引いた値を（ΔＡｔ−ΔＡｂ）とし、試験液のコレステロールエステラーゼ活性を次式で求めることもできる。
活性（単位／ｍｌ）＝（ΔＡｔ−ΔＡｂ）×４．２８１
ただし、コレステロールエステラーゼ活性は、１分間に１μモルのコレステロールを生成する酵素量を１単位と定義した。
つぎに、本発明の洗浄剤を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
製造例１  コレステロールエステラーゼＮｏ．３の粗酵素液の調製
ペプトン２％（ｗ／ｖ）、カツオ肉エキス１％（ｗ／ｖ）、食塩０．１％（ｗ／ｖ）、第一リン酸カリウム０．１％（ｗ／ｖ）および水道水からなる培地（ｐＨ７．０）１５０ｍｌを５００ｍｌ容の振とうフラスコに入れて、１２０℃で１５分間殺菌した。この培地にシュードモナス  アエルギノーザ  Ｍ１菌株一白金耳を接種し、これを２６℃で約４日間振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に粉末硫安を終濃度７０％飽和になるまで加え、１５℃で１日放置した。これを遠心分離して生じた沈殿を集め、１５ｍｌの水に溶解し、２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、粗酵素液を得た。
製造例２  コレステロールエステラーゼＳ−ＣＥＩＩの粗酵素液の調製
ペプトン２％（ｗ／ｖ）、カツオ肉エキス１％（ｗ／ｖ）、食塩０．１％（ｗ／ｖ）、第一リン酸カリウム０．１％（ｗ／ｖ）および水道水からなる培地（ｐＨ７．０）１５０ｍｌを５００ｍｌ容の振とうフラスコに入れて、１２０℃で１５分間殺菌した。この培地にトリコデルマ属  スギハラ菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｇｉｈａｒａ；寄託機関  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、寄託日２００２年１２月２５日、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７３）一白金耳を接種し、これを２６℃で約４日間振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に粉末硫安を終濃度７０％飽和になるまで加え、１５℃で１日放置した。これを遠心分離して生じた沈殿を集め、１５ｍｌの水に溶解し、２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、粗酵素液を得た。
参考例１  コレステロールエステラーゼ活性測定１
リパーゼＯＦ  名糖産業株式会社製（以下、ＯＦという）、リパーゼＭＹ  名糖産業株式会社製（以下、ＭＹという）、リパーゼＡ「アマノ」６  天野エンザイム株式会社製（以下、Ａという）、リパーゼＡ「アマノ」１０  天野エンザイム株式会社製（以下、Ｍという）、リパーゼＦ−ＡＰ１５  天野エンザイム株式会社製（以下、Ｆ−ＡＰ１５という）、リパーゼＡＹ「アマノ」３０  天野エンザイム株式会社製（以下、ＡＹという）、リパーゼ＜サイケン＞１００  ナガセ生化学工業株式会社製（以下、サイケンという）、およびシュードモナス  アエルギノーザ  Ｍ１菌株由来のコレステロールエステラーゼＮｏ．３（大阪市立工業研究所）について、コレステロールエステラーゼ活性を以下の方法で測定した。
ＯＦ、ＭＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ−ＡＰ１５、ＡＹおよびサイケンについては、各タンパク質１０ｍｇを５ｍｌの０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび、０．２％ＢＳＡを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に加え試験液とした。シュードモナス  アエルギノーザ  Ｍ１菌株由来のコレステロールエステラーゼＮｏ．３（大阪市立工業研究所）については、試験液として、製造例１で得られた粗酵素液を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび０．２％ＢＳＡを含有する２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で適宜希釈したものを使用した。
コレステロールリノレート（シグマ−アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）社製）を基質として、同基質のイソプロパノール溶液（０．０３ｍＭ）を７２〜７４℃に加温した１．０ｖ／ｖ％のトリトンＸ−１００水溶液と混和し、さらに７２〜７４℃の湯浴中で３０分間撹拌したのち、流水中で室温まで冷却した。ついで６００ｍｇのコール酸ナトリウムを加えて溶解し、前記１．０ｖ／ｖ％トリトンＸ−１００水溶液で最終液量を１００ｍｌとした。これに０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液１５０ｍｌ、１．７６ｗ／ｖ％の４−アミノアンチピリン水溶液５ｍｌ、６ｗ／ｖ％のフェノール水溶液１０ｍｌ、および１５０ＰＵ／ｍｌの西洋わさび由来ペルオキシダーゼ水溶液（７５００プリプロガリン単位を５０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させたもの）１０ｍｌと混和した。この反応混合液１．３７５ｍｌを試験管にとり２４Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製）水溶液０．０５ｍｌを加え、３７℃で２分間加温した。
ついで、試験液０．０５ｍｌを加えて混和した。
そののち、水を対照として３７℃で制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を１分間記録した。
試験液のコレステロールエステラーゼ活性［Ｕ／ｍｌ］は市販のコレステロールエステラーゼ（たとえば、和光純薬工業株式会社製  コレステロールエステラーゼ１６Ｕ／ｍｇ）を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび、０．２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させることにより、活性［Ｕ／ｍｌ］が既知である対照液を調製し、検量線法を用いて算出した。
結果を表１に示す。
参考例２  コレステロールエステラーゼ活性測定１
コレステロールエステラーゼＳ−ＣＥＩＩのコレステロールエステラーゼ活性を以下の方法で測定した。
試験液として、製造例２で得られた粗酵素液を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび０．２％ＢＳＡを含有する２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で適宜希釈したものを使用した。
コレステロールエステラーゼ活性はリノール酸コレステロール（（株）ＩＣＮ  ファーマスーティカルズ製）を基質として用い、０．０３Ｍの同基質溶液（イソプロパノールに溶解したもの）２ｍｌを７２〜７４℃の１％トリトンＸ−１００水溶液１００ｍｌと混和して３０分間この温度に保ったのち、室温まで冷却した。これに０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液１５０ｍｌ、１．７６％の４−アミノアンチピリン水溶液５ｍｌ、６％のフェノール水溶液１０ｍｌ、および西洋わさび由来のペルオキシダーゼ水溶液（１５０プルプロガリン単位を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したもの）１０ｍｌを混和した。この反応混合液２．７５ｍｌを試験管にとり３７℃で５分間加温し、コレステロールオキシダーゼ水溶液（３００単位／ｍｌ）０．１ｍｌを加えてさらに２分間加温した。ついで、試験液０．１ｍｌを加えて混和したのち、水を対照として、３７℃に温度制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を１分間記録し、その初期勾配から１分間あたりの吸光度変化（ΔＡｔ）を求めた。盲検値として試験液の代わりに５分間煮沸して完全失活させた酵素を０．１ｍｌ加え、前記と同様の操作を行ない１分間あたりの吸光度変化（ΔＡｂ）を求めた。両吸光度の差を（ΔＡｔ−ΔＡｂ）とし、試験液のコレステロールエステラーゼ活性は次式で求めた。ただし、コレステロールエステラーゼ活性は前記条件で、１分間に１μモルのコレステロールを生成する酵素量を１単位と定義した。
活性（単位／ｍｌ）＝（ΔＡｔ−ΔＡｂ）×４．２８１
結果を表１に示す。
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実施例１〜６および比較例１〜４
実施例１〜４として、それぞれ酵素Ｃ．Ｅ．、ＯＦ、ＭＹまたはＡＹ１６ｍｇを８ｍｌの０．５ｗ／ｖ％のタウロコール酸ナトリウムを含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（以下、トリス緩衝液という）（ｐＨ７．４）に溶解させた。実施例５は、製造例１で製造したＮｏ．３の粗酵素液２．５ｍｌを、１．０ｗ／ｖ％のタウロコール酸ナトリウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）７．５ｍｌに溶解させた。実施例６は製造例２で製造したＳ−ＣＥＩＩの粗酵素液４．４ｍｌを、１．０ｗ／ｖ％のタウロコール酸ナトリウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）７．６ｍｌに溶解させた。比較例１としては、酵素Ｍ１６ｍｇを８ｍｌの０．５ｗ／ｖ％のタウロコール酸ナトリウム含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、比較例２としては酵素を含まない０．５ｗ／ｖ％のタウロコール酸ナトリウム含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。比較例３としては、酵素Ｍ１６ｍｇを８ｍｌの１．０ｗ／ｖ％のタウロコール酸ナトリウム含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、比較例４としては、酵素を含まない１．０ｗ／ｖ％タウロコール酸ナトリウム含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。
試験例１  脂質除去試験１
人工的に脂質汚れを付着させたシリコーン系コンタクトレンズ（脂質汚れ付着レンズ）を、実施例１〜４および比較例１〜２により処理し、処理後のレンズに残存した脂質汚れをガスクロマトグラフィーにより定量することにより、コレステロールエステラーゼ活性をもつタンパク質の脂質除去能を評価した。
＜脂質汚れ付着レンズの作製＞
トリパルミチン（ナカライテスク株式会社製）、オレイン酸コレステロール（東京化成工業株式会社製）、およびステアリルステアレート（フナコシ株式会社製）を各２５ｍｇ秤量し、０．５ｍｌのクロロホルムに溶解させ、さらに２４．５ｍｌ生理食塩水を加えたのち、激しく撹拌して懸濁液を調製した。前記懸濁液１００ｍｌをシリコーン系コンタクトレンズの凹面側に滴下し、そのまま室温で３日間乾燥させ、人工的に脂質汚れが付着した脂質汚れレンズを作製した。
２ｍｌの各試験液中に脂質汚れレンズ１枚を浸漬させ、３０℃で２時間静置し、脂質汚れレンズの処理を行なった。処理後、レンズを試験液から取り出し、生理食塩水ですすいだのち、レンズを乾燥させ、ガスクロマトグラフィーによりレンズに残存した脂質汚れを定量した。その結果を表２および図１に示す。
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このように、コレステロールエステラーゼ活性を有しない比較例１および２に比べて、コレステロールエステラーゼ活性を有する洗浄液では残存する脂質量が少なく、より脂質を除去できたことを示す。
試験例２  脂質除去試験２
＜脂質汚れ付着レンズの作製＞
トリパルミチン（ナカライテスク株式会社製）、オレイン酸コレステロール（東京化成工業株式会社製）、およびステアリルステアレート（フナコシ株式会社製）を各２５ｍｇ秤量し、１．０ｍｌのクロロホルムに溶解させ、さらに４９ｍｌの生理食塩水を加えたのち、激しく撹拌して懸濁液を調製した。前記懸濁液２ｍｌにシリコーン系コンタクトレンズを１枚浸漬させ、室温で一晩放置し、人工汚れ付着レンズを作製した。
実施例５ならびに比較例３および４の溶液２ｍＬ中に脂質汚れレンズ１枚を浸漬させ、３０℃で２時間静置し、脂質汚れレンズの処理を行なった。処理後、レンズを試験液または対照液から取り出し、生理食塩水ですすいだのち、レンズを乾燥させ、ガスクロマトグラフィーによりレンズに残存した脂質汚れを定量した。未処理の人工汚れ付着レンズについても対照として脂質汚れを定量した。
その結果を表３および図２に示す。
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このように、コレステロールエステラーゼ活性を有しない比較例３および４に比べて、コレステロールエステラーゼ活性を有する実施例５では残存する脂質量が少なく、より脂質を除去できたことを示す。
試験例３  脂質除去試験３
＜脂質汚れ付着レンズの作製＞
トリパルミチン（ナカライテスク株式会社製）、オレイン酸コレステロール（東京化成工業株式会社製）、およびステアリルステアレート（フナコシ株式会社製）を各５０ｍｇ秤量し、２．０ｍｌのクロロホルムに溶解させ、さらに９８ｍｌの生理食塩水を加えたのち、激しく撹拌して懸濁液を調製した。前記懸濁液３ｍｌにシリコーン系コンタクトレンズを１枚浸漬させ、室温で一晩放置し、人工汚れ付着レンズを作製した。
実施例６ならびに比較例３および４の溶液２ｍＬ中に脂質汚れレンズ１枚を浸漬させ、３０℃で２時間静置し、脂質汚れレンズの処理を行なった。処理後、レンズを試験液または対照液から取り出し、生理食塩水ですすいだのち、レンズを乾燥させ、ガスクロマトグラフィーによりレンズに残存した脂質汚れを定量した。未処理の人工汚れ付着レンズについても対照として脂質汚れを定量した。
その結果を表４および図３に示す。
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このように、コレステロールエステラーゼ活性を有しない比較例３および４に比べて、コレステロールエステラーゼ活性を有する実施例６では残存する脂質量が少なく、より脂質を除去できたことを示す。
試験例１〜３の結果は、コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質が効果的に脂質、とくにコレステロールエステルを分解除去した結果であり、本発明の有効性を証明するものである。
産業上の利用可能性
コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質を用いることで、脂質汚れ成分（とくにコレステロールエステル）を効果的に分解除去できるため、その活性を有しないリパーゼなどを用いた場合よりも固着した脂質を効果的に除去できる。
脂質汚れは、コンタクトレンズの中でもシリコン系低含水ソフトコンタクトレンズに付着しやすい。この脂質汚れのなかでも界面活性剤のみでは除去が困難であるとされるコレステロールエステルを、コレステロールエステラーゼ活性を有するタンパク質を含有させることにより、効率よく分解除去することが可能となり、コンタクトレンズの寿命を延ばし、よりよい装用感を与え、さらにコンタクトレンズの脂質汚れに起因する眼障害を軽減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、脂質除去試験後にレンズに残存している脂質の量および分布を示すグラフである。
図２は、脂質除去試験後にレンズに残存している脂質の量および分布を示すグラフである。
図３は、脂質除去試験後にレンズに残存している脂質の量および分布を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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