(57)【要約】本発明は、線維芽細胞増殖因子−２３に対する抗体の提供を目的とする。本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ線維芽細胞増殖因子−２３活性を有するポリペプチドを動物に免疫することによって得られ、リン酸代謝又はビタミンＤ代謝調節活性を有する抗体であって、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で示される抗体である。（ａ）配列番号１に示す第１８０番目〜第１９４番目若しくは第２３７番目〜第２５１番目のアミノ酸配列を認識する抗体（ｂ）受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとの結合において、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体と競合する抗体
2003057733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ線維芽細胞増殖因子−２３活性を有するポリペプチドを動物に免疫することによって得られ、リン酸代謝又はビタミンＤ代謝調節活性を有する抗体であって、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で示される抗体。
（ａ）配列番号１に示す第１８０番目〜第１９４番目若しくは第２３７番目〜第２５１番目のアミノ酸配列を認識する抗体
（ｂ）受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとの結合において、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体と競合する抗体
【請求項２】
モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍性骨軟化症、ＡＤＨＲ、ＸＬＨ、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、低リン血症、クル病、骨軟化症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、骨伸長障害、骨石灰化障害、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害および低１，２５Ｄ血症から選ばれる少なくとも１つの疾患に有効である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
腫瘍性骨軟化症、ＸＬＨ、低リン血症、骨粗鬆症、骨伸長障害、骨石灰化障害および骨軟化症から選ばれる少なくとも１つの疾患に有効である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む骨形成促進剤。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体のうち異なる部位を認識する少なくとも２種類の抗体を有効成分として含む請求項４から６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗体が、配列番号１に示す第１８０番目〜第１９４番目のアミノ酸配列を認識する抗体である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項１０】
配列番号１に示す第２５番目〜第１７９番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体、及び配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体を用いて被検試料と反応させることを特徴とする線維芽細胞増殖因子−２３の検出方法。
【請求項１１】
配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体が、配列番号１に示す第１８０番目〜第１９６番目のアミノ酸配列を認識する抗体である請求項１０記載の検出方法。
【請求項１２】
更に、トロンビンインヒビターを用いる請求項１０記載の検出方法。
【請求項１３】
抗体が受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体である請求項１０または１１に記載の検出方法。
【請求項１４】
配列番号１に示す第２５番目〜第１７９番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体、及び配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体を含む、線維芽細胞増殖因子−２３の検出キット。
【請求項１５】
配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体が、配列番号１に示す第１８０番目〜第１９６番目のアミノ酸配列を認識する抗体である請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
抗体が受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体である請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１〜３に記載の抗体から選ばれる少なくとも一つの抗体を結合させた抗線維芽細胞増殖因子−２３抗体結合材。
【請求項１８】
請求項１７記載の結合材を備えた医療器具。
【請求項１９】
血液中の線維芽細胞増殖因子−２３を除去するための請求項１８記載の医療器具。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ−２３）に対する抗体に関する。
詳しくは、本発明は、生体内のＦＧＦ−２３を適切に検出、測定することにより、ＦＧＦ−２３蛋白質の蓄積又は減少を伴う疾患や病的状態を診断する方法を提供するとともに、ＦＧＦ−２３が過剰に作用することで生じる疾患や病的状態において、ＦＧＦ−２３を抑制することにより病状の改善又は治療を可能とする抗体とその作製方法、使用方法に関する。
背景技術
線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）は、最初に線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３の増殖を刺激する物質としてウシの下垂体より精製された。以降、種々の組織より類似の蛋白質が同定されており、それら一群の物質はポリペプチドファミリー（ＦＧＦファミリー）を形成している。現在までのところ、ＦＧＦファミリーに属するものとして脊椎動物において２２種の蛋白質が同定されている。これらの蛋白質の生物活性としては、線維芽細胞増殖活性だけでなく中胚葉や神経外胚葉の増殖や血管新生作用、発生段階における肢芽形成など多岐にわたる作用が知られている。ＦＧＦはその遺伝子の発現部位、発現時期についても多様であり、発生段階や成人における特定部位においてのみ発現しているというものも多い。ＦＧＦの受容体をコードする遺伝子としてはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４の少なくとも４種が知られており、またＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３においてはスプライシングの違いにより細胞外ドメインの異なる受容体蛋白質がそれぞれにおいて存在することが知られている。また、ヘパリンやヘパラン硫酸プロテオグリカンがＦＧＦやＦＧＦ受容体と相互作用することにより作用を調節することが知られている。また、構造的類似性よりＦＧＦファミリーに属するが、その生物活性や受容体結合性等について、ほとんど解明されていないものも多い。このようなＦＧＦファミリーの特徴については、総説としてまとめられている（Ｏｒｎｉｔｚ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，Ｎ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：３００５．１−３００５．１２，２００１）。
ＦＧＦ−２３は、ＦＧＦ−１５との相同性を利用したデータベース検索とＰＣＲ法にて最初にマウスよりクローニングされ、さらにマウスＦＧＦ−２３の配列相同性を利用してヒトＦＧＦ−２３がクローニングされた（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，Ｎ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ−２３，Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ  Ｔｈａｌａｍｉｃ  Ｎｕｃｌｅｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７：４９４−４９８，２０００）。続いて常染色体優性低リン血症性クル病・骨軟化症（Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ／ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｈｉａ：以下ＡＤＨＲという）の研究において、ＡＤＨＲ患者における変異遺伝子領域を絞り込み、責任遺伝子の同定を進めるなかで、ＡＤＨＲ患者のＦＧＦ−２３の遺伝子にミスセンス変異が特徴的に見出された（Ｔｈｅ  ＡＤＨＲ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＦＧＦ２３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２６：３４５−３４８，２０００）。この発見により生体内における生理的重要性が強く示唆された。しかしながら、ＦＧＦ−２３の生物学的活性については依然不明であった。一方、ＦＧＦ−２３の生物活性を決定づけたのは腫瘍性骨軟化症の研究であった。この疾患では、疾患の責任腫瘍が液性の疾患惹起因子を分泌産生し、この疾患惹起因子の作用により低リン血症、骨軟化症等の病態に陥ることが考えられていた。
この責任腫瘍が産生する疾患惹起因子の探索において、腫瘍に高発現する遺伝子としてＦＧＦ−２３がクローニングされ、さらにこの因子を投与することにより、低リン血症や骨軟化症が再現されることが示された（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｓ．，Ｍｕｔｏ，Ｔ．，Ｙｏｎｅｙａ，Ｔ．，Ｈｉｎｏ，Ｒ．Ｔａｋｅｄａ，Ｓ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．，Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，Ｓ  ａｎｄ  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｔａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＧＦ２３  ａｓ  ａ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：６５００−６５０５，２００１）。この研究により、ＦＧＦ−２３が生体内のリンやカルシウムに関連する代謝調節に関わることが示されるとともに、生体内を循環して作用を発現する全身性因子として作用することが示唆された。しかしながら、ＦＧＦ−２３の作用発現に必要な体内濃度や代謝については明らかではなく、また、ＦＧＦ−２３の生理的役割については不明な点が多い。また、臨床的所見において類似した様態を呈する疾患としてＸ染色体性低リン血症性クル病が知られているが、この病態におけるＦＧＦ−２３の関与についてはこれまで明らかにされておらず、ＡＤＨＲや腫瘍性骨軟化症以外にＦＧＦ−２３が関連することが証明されている疾患はこれまでには知られていない。
前述の腫瘍性骨軟化症は、腫瘍形成に伴い血中リンと１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（以下、１，２５Ｄという）が異常低値を示すことを特徴とし、筋力低下、骨軟化症を伴い時には、歩行障害、起立障害に至る。この疾患の責任腫瘍は間葉系細胞に由来する良性のものが多い。責任腫瘍の多くは増殖性に乏しく、経過観察において著しい増大は認められず、また病態の進行が認められるものの責任腫瘍の発見に全身ＭＲＩ検査等の精査を要する場合も少なくない。このことから、現在原因不明の低リン血症として確定診断が下されない症例においても腫瘍性骨軟化症が疑われるケースが存在している。腫瘍性骨軟化症の確定診断は、現在では腫瘍摘出手術により病状が回復することを確認する以外に方法がない。これは腫瘍形成と病状の因果関係を臨床検査により調べる方法が存在しないためであり、時には病状と全く関係のない非責任腫瘍の摘出手術に踏み切ってしまうケースもあり得る。このような状況を改善するためにも、腫瘍性骨軟化症を鑑別診断できる臨床検査方法の開発に期待が寄せられている。
ＦＧＦ−２３が生体のリン代謝調節作用を有することが見出されてきたが、これまでリン代謝調節作用が知られている副甲状腺ホルモンや１，２５Ｄは、リン代謝調節よりもむしろカルシウム代謝調節において重要な役割を果たしている。リン代謝を中心的に調節する分子はこれまで知られておらず、ＦＧＦ−２３にそのような活性が期待されている。一方で、リン代謝とカルシウム代謝が密接に関連することは、臨床学的に知られているところであり、特に骨組織の石灰化や病的な異所性の石灰化を考える上で切り離して考えることは困難である。ＦＧＦ−２３の過剰な状態が骨軟化症を導くことや、１，２５Ｄを低下させる作用を有していることからも、ＦＧＦ−２３がリン代謝だけでなく石灰化の調節や骨代謝に広く関わっていることが考えられ、腸管、腎臓、骨組織を中心としたミネラル代謝調節器官の異常疾患においてＦＧＦ−２３の過剰蓄積や欠乏状態を伴うものが存在する可能性が考えられる。このような疾患を理解し、的確に治療を施すためにもＦＧＦ−２３の体内濃度を検査する方法の開発が望まれる。
ＦＧＦ−２３の過剰が疾患を引き起こす病態において、ＦＧＦ−２３を抑制あるいは除去することが疾患の治療方法となりうることが考えられる。考えられる一つの方法としては、ＦＧＦ−２３の受容体拮抗物質やＦＧＦ−２３結合物質によるリガンド−受容体相互作用の阻害やＦＧＦ−２３結合物質を用いたＦＧＦ−２３の除去が考えられる。しかしながら、上記のような方法でＦＧＦ−２３を選択的に抑制あるいは除去する物質は知られていない。
発明の開示
本発明は、ＦＧＦ−２３を認識する抗体、並びに該抗体を用いてＦＧＦ−２３が関連する疾患の診断方法、治療方法及び予防方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＦＧＦ−２３蛋白質の部分的構造を特異的に認識して結合する抗体を得、さらに該抗体を用いてＦＧＦ−２３を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ線維芽細胞増殖因子−２３活性を有するポリペプチドを動物に免疫することによって得られ、リン酸代謝又はビタミンＤ代謝調節活性を有する抗体であって、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で示される抗体。
（ａ）配列番号１に示す第１８０番目〜第１９４番目若しくは第２３７番目〜第２５１番目のアミノ酸配列を認識する抗体
（ｂ）受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとの結合において、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０若しくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体と競合する抗体
（２）前記抗体を有効成分として含む医薬組成物。本発明の医薬組成物には、配列番号１に示す第１８０番目〜第１９４番目のアミノ酸配列を認識する抗体が含まれる。本発明の組成物は、腫瘍性骨軟化症、ＡＤＨＲ、ＸＬＨ、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、低リン血症、クル病、骨軟化症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、骨伸長障害、骨石灰化障害、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害および低１，２５Ｄ血症から選ばれる少なくとも１つの疾患に有効であり、これらの疾患の治療又は予防に使用することができる。
該医薬組成物は、前記抗体を有効成分として含む骨形成促進剤を含む。
（３）配列番号１に示す第２５番目〜第１７９番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体、及び配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体を用いて被検試料と反応させることを特徴とする線維芽細胞増殖因子−２３の検出方法。
上記検出方法において使用される抗体（配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体）としては、例えば配列番号１に示す第１８０番目〜第１９６番目のアミノ酸配列を認識する抗体が挙げられる。また、本発明の検出方法には、更に、トロンビンインヒビターを用いることもできる。
（４）配列番号１に示す第２５番目〜第１７９番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体、及び配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体を含む、線維芽細胞増殖因子−２３の検出キット。
本発明のキットには、配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体として、配列番号１に示す第１８０番目〜第１９６番目のアミノ酸配列を認識する抗体が含まれる。
（５）前記抗体から選ばれる少なくとも一つの抗体を結合させた抗線維芽細胞増殖因子−２３抗体結合材。
（６）前記結合材を備えた医療器具。本発明の医療器具は、血液中の線維芽細胞増殖因子−２３を除去するために使用される。
（７）前記抗体のうち異なる部位を認識する少なくとも２種類の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
以下、本発明を詳細に説明する。
ＦＧＦ−２３は腫瘍性骨軟化症の責任腫瘍において高発現していることが知られており、実験的にＦＧＦ−２３を分泌する細胞をヌードマウスに移植することで腫瘍性骨軟化症の特徴である低リン血症、骨軟化症が再現されることから、腫瘍性骨軟化症の誘発因子であると考えられる。一方で遺伝性低リン血症の一つの様態である常染色体遺伝性低リン血症性クル病（ＡＤＨＲ：ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ）の責任遺伝子の探索研究が進められ、ＡＤＨＲ患者において特異的に変異が認められる遺伝子としてＦＧＦ−２３が同定されている。これらのことからＦＧＦ−２３が低リン血症性疾患の病原性因子として関与していることが考えられる。ＦＧＦ−２３の生物活性については組換え体ＦＧＦ−２３をマウスに投与する実験において、低リン血症を誘導することが確認されている。これらのことから、ＦＧＦ−２３は生体内で液性因子として作用してリン代謝や骨代謝を調節していることが推察される。従って、体内のＦＧＦ−２３を定量的および定性的に評価することは、疾患の理解、診断に非常に有用である。また、ＦＧＦ−２３の生物活性を調節することにより、先に述べたＦＧＦ−２３の関与が明らかな低リン血症性疾患を治癒できることが期待されるだけでなく、リン代謝や骨代謝の制御を可能とし、ミネラル代謝異常や代謝性骨疾患などの治療への応用も考えられる。
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本願明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。（Ｇ）グリシン、（Ａ）アラニン、（Ｖ）バリン、（Ｌ）ロイシン、（Ｉ）イソロイシン、（Ｓ）セリン、（Ｔ）スレオニン、（Ｄ）アスパラギン酸、（Ｅ）グルタミン酸、（Ｎ）アスパラギン、（Ｑ）グルタミン、（Ｋ）リジン、（Ｒ）アルギニン、（Ｃ）システイン、（Ｍ）メチオニン、（Ｆ）フェニルアラニン、（Ｙ）チロシン、（Ｗ）トリプトファン、（Ｈ）ヒスチジン、（Ｐ）プロリン。またＤＮＡを表記するために用いられるアルファベットの一文字の意味は、各々次に示す。（Ａ）アデニン、（Ｃ）シトシン、（Ｇ）グアニン、（Ｔ）チミン。
リン酸調節活性とは、血中のリン酸濃度を調節する活性を指す。
ビタミンＤ代謝調節活性とは、生体内に存在するビタミンＤおよびそれにより体内にて合成される代謝物の絶対量の変化、又は存在率の変化を調節する効力を指す。
１．ＦＧＦ−２３を認識する抗体
本発明でいうヒトＦＧＦ−２３とは、後述するアミノ酸配列（配列番号１）を有するポリペプチドのことであり、また前述に例示したような特徴（活性）を有するものである。さらに、本発明におけるＦＧＦ−２３及びその一部には、後述する本願発明の抗体が反応性を有する限りにおいて、その天然型のタンパク一次構造と実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ−２３誘導体及びその一部も包含される。
ここで実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ−２３誘導体なる用語は、天然型のヒトＦＧＦ−２３と実質的に同等の性質（活性）を有する限り、そのアミノ酸配列中の１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び、または修飾されているアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加が複数の組み合わせの場合であってもよい。ヒトＦＧＦ−２３の活性とは、前記と同様低リン血症又は骨軟化症を誘発し得る活性を意味する。
本発明におけるヒトＦＧＦ−２３は、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる公知の方法又はその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。またヒトＦＧＦ−２３の部分配列は、後述する技術的分野において知られる公知の方法又はその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したヒトＦＧＦ−２３をタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
本発明における抗体とは、前記に定義したようなヒトＦＧＦ−２３またはその一部に反応性を有する抗体あるいは抗体の一部である。本発明の抗体には、抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／または軽鎖からなり、ＦＧＦ−２３と結合し得るモノクローナル抗体も包含される。本発明のヒトＦＧＦ−２３または抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。これらの改変技術は当業者に周知であり、市販の突然変異導入キット等を使用することができる。
（１）ＦＧＦ−２３蛋白質の部分的構造を特異的に認識して結合する抗体
ＦＧＦ−２３の検出や生物活性の調節に有用な抗体を取得するには、ＦＧＦ−２３の構造的特徴を認識する抗体、高親和性を有する抗体、生物活性を中和できる抗体などの取得が有効である。ＦＧＦ−２３の構造や抗原性については不明であるので、ＦＧＦ−２３の部分配列に相当する複数のペプチドを合成して、各ペプチドに対する抗体の取得を行った。これらを用いて発現細胞が分泌したＦＧＦ−２３の検出をウエスタンブロッティングにより行ない、発現細胞の培養上清中には成熟型ＦＧＦ−２３蛋白質の他に多量のＦＧＦ−２３蛋白に由来する低分子量のペプチドが含まれていることを明らかにした。また、得られた抗体は成熟型ＦＧＦ−２３とその切断により生じるペプチドに対して多様な結合特異性を示した。
さらに、免疫沈降法により、抗体の液相での結合活性を明らかにした。さらに、これらの部位特異的抗体を組み合わせて用いることで、多様なＦＧＦ−２３由来ペプチドの中から特定の配列領域を持つペプチドを検出することを可能にした。ＦＧＦ−２３の修飾、代謝に関しての詳細は明らかにされていないが、我々はＦＧＦ−２３をＣＨＯ細胞で発現させた場合にシグナル配列を消失した全長蛋白質だけでなく、１７９番目のＡｒｇ残基と１８０番目のＳｅｒ残基の間で切断に基づく代謝物の存在を本発明で得た種々の抗体を用いた検出実験で明らかにした。さらに、ＦＧＦ−２３を含む血液サンプルを血漿および血清として採取して代謝物を検出する実験、および精製組換え体と血清との混和実験により、血漿中ではＦＧＦ−２３は全長型で存在するのに対して、血清中ではＦＧＦ−２３の１９６番目Ａｒｇ残基と１９７番目のＡｌａ残基の間で切断が生じることを明らかにした。これはＴｈｒｏｍｂｉｎによるものと考えられ、１９８番目のＡｒｇと１９９番目のＭｅｔの間でも切断が生じていることが考えられる。
（２）抗体の製造
本発明の抗体は、例えば、下記のような製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、前記で定義したようなヒトＦＧＦ−２３又はその一部、あるいは抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ等）との結合物を、必要に応じて免疫賦活剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ等）とともに、ヒト抗体産生トランスジェニックマウス等を含む非ヒト哺乳動物に免疫する。あるいは、ＦＧＦ−２３を組み込んだ発現ベクターを投与することにより免疫感作を行うことができる。ポリクローナル抗体は、免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
さらに具体的には下記のようにして製造することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５  Ｖｏｌ．２５６：４９５−４９７）及びそれに準じて行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃等、好ましくはリンパ節または脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等でのインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えば哺乳類細胞細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換型抗体を調製することができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
本発明のポリクローナル抗体は、実施例５に示すように、化学合成したＦＧＦ−２３の部分ペプチドとキャリア蛋白質であるウシサイログロブリンと結合させたものを作製し、ウサギを免疫した。免疫により誘導された各ペプチドに対する抗体は、免疫に用いたペプチドを固相化したアフィニティーカラムで精製した。このようにして得た抗体の特性については、ウェスタンブロッティングとＥＬＩＳＡにて検討しＦＧＦ−２３蛋白質に対する反応性を明らかにした。
本発明のモノクローナル抗体の作製は、実施例３に示した２つの方法で免疫し、得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の特性として、実施例９に示す固相化したＦＧＦ−２３部分ペプチドとの反応性や実施例１０に示す免疫沈降実験でのＦＧＦ−２３蛋白質との反応性を調べ、各抗体とＦＧＦ−２３との結合特性や認識部位の特異性について明らかにした。
２．ＦＧＦ−２３の検出方法
（１）生体試料中のＦＧＦ−２３とその代謝物を区別して定量的に検出する方法
臨床検査において生体試料中の活性を有するＦＧＦ−２３を的確に測定する必要があるが、我々が見出したＦＧＦ−２３の産生時に生じるＦＧＦ−２３蛋白切断や血液サンプル調製におけるＦＧＦ−２３の蛋白切断による断片化産物がＦＧＦ−２３の測定の妨害因子となりうることが考えられる。特に、我々は配列番号１に示す第１７９番目と１８０番目の間の切断で活性が消失することを明らかにしている。従って、生体試料中の活性を有するＦＧＦ−２３を検出するためには、配列番号１に示す第２５番目〜第１７９番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体と、配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体とを組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法が有効であり、我々が取得したＮ末側認識抗体である２Ｃ３Ｂ抗体または２Ｃ５Ｌ抗体と、Ｃ末側認識抗体である３Ｃ１Ｅ抗体または１Ｄ６Ａ抗体とを組み合わせることで実施できる（図５）。さらには、血液サンプルの調製においても血清サンプルを用いた場合に血中に存在する全長ＦＧＦ−２３が１９６番目と１９７番目、あるいは１９８番目と１９９番目との間で切断されることがあることから、この場合では１９７番目以降のＣ末側を認識する抗体を用いた場合に本来の血中存在量を反映する測定が不能となる。この切断は血漿中では観察されないので（実施例２６）、血清サンプルを用いた場合でも、我々が取得した１８０番目から１９６番目の間を認識する抗体である３Ｃ１Ｅ抗体をＣ末認識抗体として用いることで本来の血中存在量を反映する測定が可能となる。
また血清サンプルの調製の際に、ＦＧＦ−２３を切断する酵素はトロンビンであることが明らかになった（実施例１７）。従って、トロンビンインヒビターを血清サンプル調製の際加えることによって血清サンプル調製に伴うＦＧＦ−２３の主たる切断を抑制し、検出におけるＦＧＦ−２３の切断による影響を回避することも可能である。トロンビンインヒビターとしては、ＦＧＦ−２３の検出を妨げないものであれば何でも良く、好ましくはヒルジンがあげられる。
また本願は、配列番号１に示す第２５番目〜第１７９番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体、及び配列番号１に示す第１８０番目〜第２５１番目のアミノ酸配列の一部を認識する抗体を含む、ＦＧＦ−２３の検出キットに関する。本出願のＦＧＦ−２３の検出キットにおいて、抗ＦＧＦ−２３抗体の他、安定剤、ｐＨ調整剤等を必要に応じて含有させることができる。
（２）ＦＧＦ−２３を高感度に検出する方法
ＦＧＦ−２３の生体での作用と病態との関連を明らかにすることは臨床上有用であり、腫瘍性骨軟化症の鑑別診断や遺伝性低リン血症性クル病（ＡＤＨＲ、ＸＬＨ：Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ）の診断において有用である。栄養不良および家族歴が認められない低リン血症、クル病、骨軟化症については病因が特定できない疾患として診断が困難であるのが現状である。このような患者においてＦＧＦ−２３の血中濃度上昇が認められた場合、遺伝子変異の確認による遺伝性疾患の鑑別診断や精緻な腫瘍検出法を応用して腫瘍を発見することにより腫瘍性骨軟化症の治療を可能にするなどの治療指針を導くことができるようになる。また、ＦＧＦ−２３がリン代謝調節因子、ビタミンＤ代謝調節因子として深く生体機能に関与している可能性から、ミネラル代謝異常を伴う疾患、腎機能疾患、骨代謝疾患などの病態において血中濃度が変動していることが考えられ、健常人の平均的なＦＧＦ−２３の血中濃度と、これら疾患患者のＦＧＦ−２３血中濃度とを比較することで、病態の理解、治療方法の選択や治療方針の決定に有用であることが考えられる。このような、ＦＧＦ−２３の検出系を構築する上で、血中のＦＧＦ−２３濃度が測定可能な検出感度が求められる。我々は取得した抗体の種々の組み合わせをサンドイッチＥＬＩＳＡ法で検討し、健常人および疾患患者におけるＦＧＦ−２３の血中濃度を定量的に測定することを可能にした。
抗体を活用して抗体が認識する物質（抗原分子という）を検出する方法としては、抗体と抗原分子との結合を利用して検出可能量の基質を回収する方法、検出対象の抗原分子に特異的に結合した抗体を検出することで抗原分子の存在を検出する方法、既知量の基質と抗体との特異的結合において、検出対象の抗原分子を存在させることで生じる競合を測定することで抗原分子の存在を検出する方法などがある。これらを活用して定性的な検出方法としては、ウエスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫染色などがあり、さらに定量的に測定する方法としては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどの方法が一般的に知られている。また、抗体が認識する抗原分子が修飾や切断を受け多様な形態を呈し、その一部の様態のものを特定して検出する方法としては、対象物質の異なる部位を認識する抗体を組み合わせることが有効であり、代表例としてサンドイッチＥＬＩＳＡがある。
本発明のＦＧＦ−２３の検出方法を完成するにあたり、ＦＧＦ−２３には蛋白切断に起因する複数の分子種の存在が図１Ａで明らかである。特に、実施例１６に示すように血中で全長として存在するＦＧＦ−２３が血清中で切断されることが明らかとなり、生体内でのＦＧＦ−２３を的確に定量的に検出するためにはこのような切断を考慮した検出系の開発が必要であった。これには上述のＦＧＦ−２３蛋白質の部分配列を認識する抗体を組み合わせて用いることが非常に有用であった。ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡについては、実施例７に示すようにＦＧＦ−２３蛋白質とその切断断片を選択的に測定することができることを示した。また、実施例３、実施例４で取得した抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体についても、ＦＧＦ−２３蛋白質の認識部位の特異性が解析されており、またＦＧＦ−２３との結合特性からサンドイッチＥＬＩＳＡへの応用が可能であることを明らかにした。取得した抗体のうち、１Ｄ６Ａ抗体、２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体は、それぞれ固相化抗体としても検出抗体としても用いることができることが判明した。一方、２Ａ２Ｂ抗体はいずれの用途にも不適であった。また、ＦＧＦ−２３蛋白質の蛋白切断が生体内および血清調製時に生じることが明らかとなった。配列番号１に示したＦＧＦ−２３蛋白質のアミノ酸の２５番目〜１７９番目までの配列領域、１８０番目〜１９６番目までの配列領域、１９７番目〜２５１番目までの配列領域をそれぞれ認識する抗体を組み合わせることで、ＦＧＦ−２３蛋白質の代謝物の検出、測定を実現できる。本発明の抗体のなかで、２Ｃ３Ｂ抗体は配列番号１に示したＦＧＦ−２３蛋白質のアミノ酸の２５番目〜１７９番目までの配列領域を認識する抗体であり、３Ｃ１Ｅ抗体は１８０番目〜１９６番目までの配列領域を認識する。１Ｄ６Ａ抗体は、配列番号１の２３７番目〜２５１番目の配列領域を認識する抗体であった。特に臨床検査等の目的で活性を有するＦＧＦ−２３蛋白質の検出を考えた場合に血清調製時生じるような切断も考慮して、２５番目〜１７９番目までの配列領域を認識する抗体と、１８０番目〜１９６番目までの配列領域を認識する抗体とを組み合わせることが好ましく、特に、２Ｃ３Ｂ抗体または２Ｃ５Ｌ抗体を固相化抗体として用い、３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体として用いることで高感度の検出系を実現している。また、全長のＦＧＦ−２３蛋白質を検出する上では、２５番目〜１７９番目までの配列領域を認識する抗体と、２３７番目〜２５１番目までの配列領域を認識する抗体とを組み合わせることが好ましく、特に、２Ｃ３Ｂ抗体を固相化抗体として用い、１Ｄ６Ａ抗体を検出抗体として用いることで高感度の検出系を実現している。
３．低リン血症性疾患、クル病、骨軟化症の診断方法
ＡＤＨＲの患者においてＦＧＦ−２３遺伝子のミスセンス変異が低リン血症性疾患の惹起に関与していることが示唆された（Ｔｈｅ  ＡＤＨＲ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＦＧＦ２３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２６：３４５−３４８，２０００）。さらに我々は腫瘍性骨軟化症において腫瘍が産生する疾患惹起因子としてＦＧＦ−２３を同定した（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｓ．，Ｍｕｔｏ，Ｔ．，Ｙｏｎｅｙａ，Ｔ．，Ｈｉｎｏ，Ｒ．Ｔａｋｅｄａ，Ｓ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．，Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，Ｓ  ａｎｄ  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｔａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＧＦ２３  ａｓ  ａ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：６５００−６５０５，２００１）。これらの研究により、ＦＧＦ−２３が低リン血症性疾患やクル病・骨軟化症を伴う疾患に関与している可能性がある。しかし、これまで生体内のＦＧＦ−２３を定量的に解析する方法がなかった。本発明において、我々は上述のようにＦＧＦ−２３の特異的検出系を確立した。これを用いて実施例１９に示すように、腫瘍性骨軟化症患者より腫瘍摘出前に採取した血液サンプルと腫瘍摘出後の血液サンプルに含まれるＦＧＦ−２３を定量的に測定した。図１４Ｂに示すように手術前では血中ＦＧＦ−２３は著しい高値を示したが、腫瘍摘出後の血中ＦＧＦ−２３濃度は検出限界付近まで低下していた。腫瘍性骨軟化症では、一般に腫瘍は小さく、低リン血症、筋力低下、骨痛、骨軟化症等の症状を呈するにも関わらず、原因腫瘍が見つからない場合がある。また、腫瘍が認められた場合においても、腫瘍がＦＧＦ−２３を産生していることを確認出来ないため、類似の症状を示す低リン血症疾患との鑑別診断が困難である。本発明の測定は、腫瘍性骨軟化症疾患における血中ＦＧＦ−２３の上昇レベルを検出することを可能とするものであり、従来不可能であった診断を可能にするものである。
遺伝性低リン血症のなかで最も罹患率の高い疾患であるＸＬＨは約２万人に１人の割合で存在するといわれている。ＸＬＨの責任遺伝子はＰＨＥＸとして同定されているが、本遺伝子は２２個のエクソンからなり、その遺伝子領域は２２０ｋｂにわたるため遺伝病の原因となる変異解析は現在のところ診断目的では不可能な状況である。突発的発症例や成人発症型の存在も示唆されている。これまでのところＰＨＥＸとＦＧＦ−２３の関連は明らかにされていない。ＸＬＨのモデル動物として自然発症変異マウスであるＨｙｐマウスが知られている。このマウスではＰＨＥＸ遺伝子の３’領域の欠損が確認されており、低リン血症、クル病・骨軟化症を呈することが知られている。本発明の測定系を用いて、実施例２３に示すように、我々はＨｙｐマウスにおけるＦＧＦ−２３の血中濃度の測定を行い、ＦＧＦ−２３の濃度が著しく高いことを見出した。これらのことから、本発明の抗体およびそれを用いた検出法や測定法が腫瘍性骨軟化症、ＸＬＨの診断を可能にするものである事が明らかとなった。さらには他の低リン血症疾患でＦＧＦ−２３の変異が原因とされるＡＤＨＲにおいても本発明の測定法は活用できると考えられる。
ＦＧＦ−２３は、血中のリン濃度と１，２５Ｄ濃度を低下させる活性を有しているが、その生理的役割についてはよく解明されていない。後述するＦＧＦ−２３活性の中和実験により、我々はＦＧＦ−２３が健常時においてもリンや１，２５Ｄの代謝バランスを維持する上で重要な役割を有することを明らかにした。従って、ＦＧＦ−２３は、リン代謝およびリン代謝が深く関わる腎臓疾患、腸管疾患、ミネラル代謝性疾患、ビタミンＤ代謝異常疾患の病態に関与していることが考えられる。さらに、１，２５Ｄ又はその誘導体の投与を受けている患者においてもＦＧＦ−２３が変動することにより病態や治療効果に影響を与えていることが考えられる。本発明の測定系はこれらの病態の理解を深め、より的確な医療行為を可能にするものであると考えられる。
４．ＦＧＦ−２３活性を抑制することを特徴とする疾患治療方法
ＦＧＦ−２３の過剰作用が疾患を惹起することが、腫瘍性骨軟化症、ＡＤＨＲで知られている。また、本発明の中でＸＬＨにおいてもＦＧＦ−２３が血中高値を呈することを我々は明らかにした。ＦＧＦ−２３を抑制することは、低リン血症やクル病、骨軟化症の改善につながると考えられる。ＦＧＦ−２３が腎臓の近位尿細管上皮細胞に作用することを考えると、尿細管の機能障害の治療に有用である可能性が考えられる。また、ＦＧＦ−２３のリン代謝調節やビタミンＤ代謝調節における役割を考えると、リン代謝異常疾患やＣａ代謝異常疾患、骨代謝異常疾患、腎機能低下に伴う代謝異常疾患、腎不全血液透析に伴う代謝異常、腎移植に伴う疾患においてＦＧＦ−２３が好ましくない作用として働いている可能性が考えられる。同様に腎移植後に高頻度で低リン血症が認められ、骨減少症を伴うことが報告されており、このような症例においてもＦＧＦ−２３の関与が示唆されている。このような場合においては、異常に上昇したＦＧＦ−２３を正常レベルに戻すだけでなく、薬理的処置として正常値を示すＦＧＦ−２３をさらに低下させる必要がある場合も考えられる。実施例２７、実施例２８に示すようなＦＧＦ−２３の活性を中和あるいは修飾しうる抗体は種々の疾患の治療に有用であると考えられる。実施例２５に示すように腎機能低下による高リン血症を呈する動物において、ＦＧＦ−２３が著しく高値を示すことが見出された。腎機能低下に伴うビタミンＤ代謝異常の少なくとも一部はこのＦＧＦ−２３の上昇による作用であることが考えられる。本発明の抗体を用いてＦＧＦ−２３の活性を中和あるいは除去することで、このＦＧＦ−２３の異常高値に伴う疾患を治療できることが考えられる。とくにリン代謝、カルシウム代謝、ビタミンＤ代謝の是正により、低カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒などのミネラル代謝異常に伴う疾患や腎性骨異栄養症、透析骨症といった腎機能低下に伴う骨代謝異常疾患に有用であると考えられる。さらには血液透析患者で問題となっている石灰化を伴う心血管機能低下症にも有用であると考えられる。また、実施例２７に示すように、正常な代謝状況においてもＦＧＦ−２３がミネラル代謝やビタミンＤ代謝に重要な役割を有していることが明らかとなった。上述の高リン血症でＦＧＦ−２３が誘導されるだけでなく、ＦＧＦ−２３が速やかに１，２５Ｄを低下させることと１，２５ＤによりＦＧＦ−２３が速やかに誘導されることを考えると、本発明のＦＧＦ−２３の活性を中和あるいは修飾しうる抗体は、ＦＧＦ−２３の作用を抑制してリン代謝やビタミンＤ代謝、カルシウム代謝を調節するだけでなく、間接的に副甲状腺ホルモンやカルシトニンといったカルシウム代謝ホルモンを調節し、ミネラル代謝異常疾患において広範な有用性があると考えられる。特に、ミネラル代謝のバランスと代謝回転が関連して様々な病態を示す骨粗鬆症や骨減少症、骨硬化症、パジェット病あるいは、高カルシウム血症や副甲状腺機能低下症の治療に有効であることが期待される。以上のように本発明の抗体が上述した疾患の一つ以上の疾患に有用であることが考えられる。
５．ＦＧＦ−２３の生物活性に対する中和抗体
ＦＧＦ−２３は上述のように生体の代謝調節において重要な役割を有していると考えられる。このような因子の生物活性を調節する方法は、種々の疾患の治療や予防に役立つと考えられる。抗体は抗原分子との特異的結合を特徴とするが、その認識部位により抗原分子の構造や機能に影響を与えることが知られている。そこで我々は、ＦＧＦ−２３の機能調節とくに生物活性を抑制することができる抗体を単離同定することを目指した。実施例２７、２８に示すように、ＦＧＦ−２３を認識する抗体を投与することによって血清リンの上昇と血清１，２５Ｄ濃度が上昇することを見出した。特に、用いた発明の抗体は実験的にマウスの体内で生産させたヒトＦＧＦ−２３の血清リンおよび１，２５Ｄを低下させる活性を完全に消失させた。さらに、ヒトＦＧＦ−２３を産生させていない対照マウスにおいても、血清リンの上昇とビタミンＤの上昇が確認された。この減少はＦＧＦ−２３を投与した場合に見られる変化と全く逆のものであり、発明の抗体はマウスの内因性ＦＧＦ−２３をも抑制したと考えられる。一方でこの現象は、ＦＧＦ−２３は病態時だけでなく正常時においてもリンやビタミンＤ代謝を制御する因子として働いていることを示すものである。発明のＦＧＦ−２３の生物活性を消失あるいは減弱させることができる抗体は、ＦＧＦ−２３の生物活性が反映する生理的および病理的状況を調節しうるものである。この発明の抗体が制御しうるＦＧＦ−２３の生物活性の範囲はリン代謝やビタミンＤ代謝だけに規定されるものではなく、ＦＧＦ−２３が有するあらゆる生物活性、生理活性を制御しうるものである。
また、実施例３１に示すようにＦＧＦ−２３の異なる部位、すなわち異なるエピトープを認識する２種類以上の抗体を用いてもよく、この場合、抗体の中和活性が増強され、抗体の作用時間も長時間維持され得る。２種類以上の抗体の組み合わせとしては、例えば配列番号１に示す第１８０番目〜第１９４番目若しくは第２３７番目〜第２５１番目のアミノ酸配列を認識する抗体の組み合わせ、あるいは受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０もしくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８であるハイブリドーマが生産する抗体の組み合わせ等がある。
６．抗ＦＧＦ−２３抗体を含む医薬組成物
本発明の抗体または医薬組成物は、体内で生産されたＦＧＦ−２３やＦＧＦ−２３を発現する細胞が関連する種々の疾患または症状の治療または予防への適用が可能である。本発明の抗体は、腫瘍性骨軟化症、ＡＤＨＲ、ＸＬＨに対して医薬組成物として用いることができ、これらの疾患に共通して認められる低リン血症、骨石灰化不全、骨痛、筋力低下、骨格の変形、成長障害、低１，２５Ｄ血症について改善効果が期待できる。また上述のようにＦＧＦ−２３が生理的条件下で重要な役割を果たしており、ＦＧＦ−２３のリン代謝調節作用やＦＧＦ−２３が調節するビタミンＤ代謝を介したカルシウム代謝調節作用を本発明の抗体が制御することによって、骨粗鬆症、クル病、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、骨伸長障害、骨石灰化障害、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、掻痒等のミネラル代謝やビタミンＤ代謝の異常に起因する疾患に対して治療的および予防的に医薬組成物として用いることができる。さらに腎不全において血中のＦＧＦ−２３濃度の上昇が明らかであることから、腎性骨異栄養症、透析骨症、尿細管機能障害等に代表される腎不全や血液透析に合併する疾患に対しても治療的および予防的に医薬組成物として用いることができる。
また、本発明の抗体に治療試薬を結合させたものを医薬組成物として用いることができる。腫瘍性骨軟化症においては、腫瘍がＦＧＦ−２３を過剰産生して病態を惹起することが知られおり、現在で唯一の治療法はその原因腫瘍を除去することである。しかしながら、原因腫瘍は小さい事が多く、ＭＲＩでの精力的な検索でようやく発見できるという例も複数報告されている。また、腫瘍が発見できないことから原因不明の低リン血症や骨軟化症と診断されている例も多いと考えられている。このような疾患に対して本発明の抗体は、ＦＧＦ−２３との親和性により、ＦＧＦ−２３産生腫瘍に集積することが考えられる。この性質を利用して腫瘍を退縮させる方法として治療試薬を本発明の抗体に結合させて用いることが有効である。抗体へ結合させる治療用試薬としては、▲１▼ヨード（１３１Ｉｏｄｉｎｅ：１３１Ｉ，１２５Ｉｏｄｉｎｅ  １２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙｔｔｒｉｕｍ：９０Ｙ）、インジウム（１１１Ｉｎｄｉｕｍ：１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｅｃｈｎｅｔｉｕｍ：９９ｍＴｃ）等の放射核種（Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）、▲２▼緑膿菌毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）、リシン（Ｒｉｃｉｎ）のような細菌毒素、および▲３▼メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、カリキアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）などの化学療法剤（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ、Ｍ．Ｌ．Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．，１９９８  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ）等が挙げられ、より好ましくは、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ等のプロドラッグが良い（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２  Ｖｏｌ５２：１２７，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９９６  Ｖｏｌ９３：８６８１）。
また、抗ヒトＦＧＦ−２３抗体の精製品を含有する製剤もまた本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。
本発明の医薬組成物を患者に投与する場合は、有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり２０ｎｇから２００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．００１〜１００００ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは０．００５〜２０００ｍｇ／ｂｏｄｙ、さらに好ましくは０．０１〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
７．抗ＦＧＦ−２３抗体を含む医療器具
血液透析、血漿交換、細胞採取を目的とする治療技術において、採取した体液の一部や体外循環させた体液から生体内の物質の除去、交換、採取が行われている。このような治療技術において、本発明の抗体はＦＧＦ−２３分子と特異的に結合する性質を利用して、生体内のＦＧＦ−２３分子の選択的除去やＦＧＦ−２３発現細胞の選択的回収に有用である。血液透析や血漿交換においては、体液が接する素材の一部に本発明の抗体を固定化する方法などが考えられる。透析膜の材質としては、セルロース膜などのほか、合成高分子膜であるポリアクリロニトリル膜、ポリメチルメタクリテート膜、エチレンビニルアルコール膜、ポリスルフォン膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルフォン／ポリアリレート膜などが用いられているが、このような膜に抗体を共有結合にて固定し、血液透析に用いることが考えられる。また、セファロースなどのビーズに抗体を結合させたものを充填したカラムとして体液の分離を行う方法も考えられる。また、磁気ビーズ上に抗体を固定化し、抗体結合分子と混和して結合を促したのちに、磁石を用いて抗体と対象物質の複合体を回収する方法なども可能であり、このような方法で細胞を回収して治療に用いることも行われている。このように、医療用具として適切な基材に本発明の抗体を結合させて医療器具として用いることができる。
８．ＦＧＦ−２３の分子構造や生物活性を制御する方法
蛋白質がもつ生物活性を生体内で維持する上で重要な点は、蛋白質の３次構造を生体内で維持したまま存在させることである。生体因子のなかでも、インスリン様成長因子（ＩＧＦ：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）や腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）に見られるように生体で別の蛋白質と結合して、その生物活性を制御している例が多く認められる。ＦＧＦ−２３においては、これまでのところ結合蛋白というものは知られていない。本発明の抗体の中には、実施例９に示すように部分ペプチドとは結合せずにＦＧＦ−２３の構造を強く認識していると考えられる２Ｃ３Ｂ抗体が含まれている。これらの抗体あるいは抗体の一部を用いてＦＧＦ−２３に結合させた状態を作り出すことによりＦＧＦ−２３の生体内での生物活性を調節できることが考えられる。
９．ＦＧＦ−２３を効率良く除去する方法
腎機能の著しい低下を来すと、尿毒症物質の体内からの除去が必要となる。低分子量の尿毒症物質の除去については、透析膜を利用した血液透析が実用化されている。しかしながら、高分子量の蛋白質の除去については依然として課題となっている。本発明の抗体は、ＦＧＦ−２３の特異的除去としても利用可能である。血液透析において行われているように、血液を体外循環させる血液を本発明の抗体を固相化した器材に接触させることでＦＧＦ−２３を選択的に除去することができる。ＦＧＦ−２３が過剰に存在するような疾患の治療用具としての応用が考えられる。実施例２５に示すように腎機能不全時においてＦＧＦ−２３が高値を示すことからＦＧＦ−２３が透析合併症の惹起因子である可能性が考えられる。特にＦＧＦ−２３が１，２５Ｄを低下させる作用があることから、腎機能低下に伴う１，２５Ｄの低下の惹起因子としてＦＧＦ−２３が働いている可能性が高く、透析患者において本発明の抗体を用いてＦＧＦ−２３を除去する方法は透析合併症の治療に有用であることが考えられる。
以上のように、本発明はＦＧＦ−２３を認識するだけでなく、ＦＧＦ−２３が関係する生理的、薬理的、病理的作用を調節することができ、疾患の治療、予防、診断に応用することができる抗体を取得することにより本発明を完成した。
１０．競合抗体の特定
ＦＧＦ−２３との結合において本発明の抗体と同じ部位あるいは極めて近傍部位を認識する抗体は、ここで示した特性と同等の性質を示すものと考えられる。このような事実上同等な抗体は、競合実験を行うことで見分けることができる。二種以上の抗体間を共存させた場合、抗原結合において互いに排他的な結合特性を示すものが競合する抗体と定義される。発明の競合抗体を特定するには、標識した発明抗体とＦＧＦ−２３蛋白質が結合する条件において標識していない抗体を過剰量存在させることで判定できる。添加した抗体が発明抗体とＦＧＦ−２３蛋白質の結合を著しく低下させる場合は競合すると判断できる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願２００１−４０１６８９号および特願２００２−２６２０２０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
配列表フリーテキスト
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１１：合成ペプチド
配列番号１２：合成ペプチド
配列番号１３：合成ペプチド
配列番号１４：合成ペプチド
配列番号１５：合成ペプチド
配列番号１６：合成ペプチド
配列番号１７：合成ペプチド
配列番号１８：合成ペプチド
配列番号１９：合成ペプチド
配列番号２０：合成ペプチド
配列番号２１：合成ペプチド
配列番号２２：合成ペプチド
配列番号２３：合成ペプチド
配列番号２４：合成ペプチド
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ＤＮＡ
配列番号２９：合成ＤＮＡ
配列番号３０：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＤＮＡ
配列番号３４：合成ＤＮＡ
配列番号３５：合成ＤＮＡ
配列番号３６：合成ＤＮＡ
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される様態や技術的範囲のみに限定されるものではない。
（実施例１）組換え体ＦＧＦ−２３発現ベクターの作製
（１）  ＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質発現ベクターの構築
ＦＧＦ−２３をコードするｃＤＮＡは、腫瘍性骨軟化症の責任腫瘍のＣＤＮＡライブラリーを鋳型とし、Ｆ１ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号２）とＬＨｉｓＮｏｔプライマー（配列番号３）とＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて９６℃で１分間保温した後、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲを実施することにより増幅した。Ｆ１ＥｃｏＲＩプライマーはＦＧＦ−２３をコードする塩基配列のさらに５’側上流に存在する配列にアニールし、その増幅断片のＦＧＦ−２３をコードする領域の５’側にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を付加する。ＬＨｉｓＮｏｔプライマーはＦＧＦ−２３をコードする配列の終始コドンの５’側の配列とアニールする配列とＨｉｓ６−ｔａｇ配列（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）をコードする配列に続く終始コドンとＮｏｔＩ制限酵素配列を含む。その結果、増幅断片はＦＧＦ−２３蛋白質のＣ末端にＨｉｓ６−ｔａｇ配列を付加したものをコードすることになり、その下流にＮｏｔＩ制限酵素部位を有する。この増幅断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、同様にＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（米国  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のＨｉｓ６−ｔａｇ配列が付加されたＦＧＦ−２３蛋白質をコードしていることを確認した。このベクターをｐｃＤＮＡＦＧＦ−２３Ｈと称す。
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（２）  ＦＧＦ−２３蛋白質発現ベクターの構築
ｐｃＤＮＡ／ＦＧＦ−２３Ｈを鋳型としてＦ１ＥｃｏＲＩプライマーとＬＮｏｔプライマー（配列番号４）とＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて９４℃で１分間保温した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分からなる工程を１サイクルとした２５サイクルのＰＣＲを実施することにより増幅した。反応終了後、ＰＣＲ産物の末端をＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（スイス、Ｒｏｃｈｅ社）により平滑化したのち、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（スイス、Ｒｏｃｈｅ社）を用いてＤＮＡ末端のリン酸化を行うことでＦＧＦ−２３蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片を調製した。発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１９９１，１０８：１９３−１９９）をＥｃｏＲＩで消化しＫｌｅｎｏｗ断片（スイス、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて末端を平滑化し、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（日本、宝酒造社）を用いて脱リン酸化を行った。このように調製したＦＧＦ−２３をコードするｃＤＮＡ断片とｐＧＡＧＧＳベクターを連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のＦＧＦ−２３蛋白質をコードする配列が的確に挿入されていることを確認した。このベクターをｐＧＡＧＧＳ／ＦＧＦ−２３と称す。
また上述のＦ１ＥｃｏＲＩプライマーとＬＮｏｔプライマーで増幅したＦＧＦ−２３をコードする断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化したのち精製した。これを、発現ベクターであるｐＥＡＫ８（米国、Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）に分子内リボゾームエントリー配列（ＩＲＥＳ）と増強型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）を連結したｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限酵素部位に挿入してクローニングした。取得したプラスミドの塩基配列を決定し、ＦＧＦ−２３蛋白質をコードしていることを確認した。このベクターをｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ＦＧＦ−２３と称す。
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ｐＧＡＧＧＳ／ＦＧＦ−２３をＥｃｏＲＩで消化して直鎖化したのち、Ｋｌｅｎｏｗ断片（スイス、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて末端を平滑化した。これをさらにＢａｍＨＩで消化してＦＧＦ−２３のｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で分離精製した。また、発現ベクターＩＮＰＥＰ４をＢｇｌＩＩで消化した後、Ｋｌｅｎｏｗ断片（スイス、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて末端を平滑化した。さらにＢａｍＨＩで消化したのちアガロース電気泳動でベクターを精製した。これらのＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡを含む断片とベクターを連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のＦＧＦ−２３蛋白質をコードする配列が的確に挿入されていることを確認した。このベクターをＩＮＰＥＰ４／ＦＧＦ−２３と称す。
（３）  ＦＧＦ−２３ＲＱＨの発現ベクターの構築
ＦＧＦ−２３蛋白質は、１７９番目のＡｒｇ残基と１８０番目のＳｅｒ残基の間で蛋白切断を受けやすいことが見出された。この切断部位のＮ末側アミノ酸配列は蛋白変換酵素の認識配列であるＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ配列に一致するＡｒｇ１７６−Ｈｉｓ１７７−Ｔｈｒ１７８−Ａｒｇ１７９（配列番号３１）であり、またＡＤＨＲでのミスセンス変異がこの１７６番目又は１７８番目のＡｒｇ残基の置換変異であることが知られている。そこで我々は、蛋白変換酵素による切断に耐性を示し、尚かつＡＤＨＲに見られる変異ＦＧＦ−２３のモデルとしてＣ末端にＨｉｓ６−ｔａｇを有し、１７６番目と１７９番目のＡｒｇ残基をＧｌｎ残基に置換した変異ＦＧＦ−２３蛋白質（以下ＦＧＦ−２３ＲＱＨという）を実験的に作製するためのベクター構築を行った。作製方法は、ＡｒｇをＧｌｎに置換するための塩基置換配列を含む順方向プライマーであるＲＱＦ（配列番号５）と逆方向プライマーであるＲＱＲ（配列番号６）を合成した。さらに、この塩基置換プライマーと組み合わせて変異導入部位の５’側と３’側のＦＧＦ−２３配列を増幅するためのプライマーであるＭＥ１（配列番号７）とＨＮｔ（配列番号８）を作製した。ＭＥ１はＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡがコードする開始コドンを含む部分の順方向のプライマーでありＥｃｏＲＩ制限酵素配列を有する、ＨＮｔはＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡがコードする終始コドンの前にＨｉｓ６−ｔａｇ配列をコードするコドン配列を挿入でき、ＮｏｔＩ制限酵素配列を付加することができる逆方向プライマーである。
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１０ｎｇのｐＧＡＧＧＳ／ＦＧＦ−２３を鋳型としてＲＱＦとＨＮｔの組み合わせとＭＥ１とＲＱＲの組み合わせのプライマー（各２００ｎＭ）でＰＣＲ反応を実施した。反応はｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（米国、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、９４℃で１分間保温した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分からなる工程を１サイクルとした２５サイクル実施した。この様にして得た２種類の反応液を１０倍に希釈し、そのうちの１μｌずつを混和して鋳型とし、これにＭＥ１とＨＮｔが終濃度２００ｎＭとなるように添加した５０μｌのＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間保温した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分からなる工程を１サイクルとした２５サイクルのＰＣＲ反応を実施した。ここではＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本、宝酒造社）を使用した。得られた約８００ｂｐの増幅産物を、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化したのちに精製してインサートＤＮＡを取得した。これを、発現ベクターであるｐＥＡＫ８（米国、Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）に分子内リボゾームエントリー配列（ＩＲＥＳ）と増強型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）を連結したｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限酵素部位に挿入してクローニングした。取得したプラスミドの塩基配列を決定し、目的の１７６番目と１７９番目のＡｒｇがＧｌｎに変換され、Ｃ末端にＨｉｓ６−ｔａｇ配列が付加された変異ＦＧＦ−２３蛋白質をコードしていることを確認した。このベクターをｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ＦＧＦ−２３ＲＱＨと称す。
（実施例２）組換え体ＦＧＦ−２３蛋白質および組換え体変異ＦＧＦ−２３蛋白質の発現
（１）  ＦＧＦ−２３Ｈ発現細胞の取得
約２０μｇのｐｃＤＮＡＦＧＦ−２３Ｈをベクター中のアンピシリン耐性遺伝子内にあるＦｓｐＩ制限酵素部位で切断して直鎖化し、精製した。これを１０μｌの純水に溶解し、１ｘ１０７個のＣＨＯ  Ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞（Ｓｈｉｒａｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５９：３４５−３４７，１９９５）と混和してＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（米国、Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）を用いて電気穿孔法にて細胞への遺伝子導入を行った。この細胞１０％ＦＣＳを含むＭＥＭα培養液（米国、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）で２４時間培養したのち、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＺｅｏｃｉｎ（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して１週間培養した。接着し増殖した細胞をトリプシンで遊離して、終濃度０．３ｍｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ存在下で限界希釈法によるクローニングを行い、３５種のクローン化細胞を得た。これらの細胞の中でＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を最もよく発現する細胞を以下に示すウエスタンブロッティングにて同定した。各クローン化細胞の培養上清を採取して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行ったのち、ＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に蛋白質を転写し、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｃ末）抗体（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＥＣＬ発光システム（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて約３２ｋＤａ付近のＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質に由来するシグナルを検出した。その結果、＃２０と称すクローンにおいて最も高い発現が認められ、これをＣＨＯ−ＯＳＴ３１１と命名して独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２０００年８月１１日付で寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７３）。本明細書では、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１をＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈと称する。
（２）  ＦＧＦ−２３およびＦＧＦ−２３ＲＱＨ発現細胞の取得
ｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ＦＧＦ−２３とｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ＦＧＦ−２３ＲＱＨベクターのＣＨＯ  Ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞への導入は膜融合脂質を用いた遺伝子導入法により行った。ＣＨＯ  Ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに底面の約６０％を細胞が覆う程度に培養する。そして培養液を除去し、血清を含まないＭＥＭα培養液を１ｍｌ添加する。導入するベクター２．５μｇと１０μｌのＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（米国、Ｐｒｏｍｅｇａ社）をそれぞれ５０μｌの血清を含まないＭＥＭα培養液と混和して、両者を混合して１０分間静置したのち、両者を混合してめ準備しておいた６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに添加した。２時間培養した後、このＤＮＡを含む培養液を除去して１０％のＦＣＳを含む培養液に置換して終夜培養した。翌日、終濃度が５μｇ／ｍｌとなるようにＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（米国、Ｓｉｇｍａ社）を添加して、薬剤耐性細胞を選択した。この様にして得られた薬剤耐性細胞は前述のＦＧＦ−２３Ｈ発現細胞の取得と同様に限界希釈法にてクローン化を行った。さらにウエスタンブロッティングにより目的の蛋白質を最もよく発現する細胞株を取得した。これらの細胞をそれぞれ、ＣＨＯ−ＦＧＦ２３、ＣＨＯ−ＦＧＦ２３ＲＱと称す。
（３）  組換え体蛋白質の精製
ＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈの培養上清中の組換え体をＣ末端のＨｉｓ６−ｔａｇ配列に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにて検出すると、図１Ａに示すように３２ｋＤａ付近のバンドと１０ｋＤａ付近のバンドが認められた。この二つのバンドをゲルから切り出しＮ末端側のアミノ酸配列を決定したところ、分子量の大きい方のバンドは配列番号１の２５番目からのアミノ酸配列が検出され、ＦＧＦ−２３蛋白質から分泌過程でシグナル配列が除去されたものと考えられた。一方、分子量の小さいバンドからは配列番号１の１８０番目からのアミノ酸配列が確認され、１７９番目と１８０番目の間での切断により生じた断片であることが判明した。また、ＦＧＦ−２３のＮ末側を認識するポリクローナル抗体を用いて検出することで、１７９番目までの配列を持つと考えられるペプチドの存在も認められた。
ＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈ細胞の培養上清１０００ｍｌを１６，２００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、浮遊細胞を除去した後、上清を内径３０ｍｍ  Ｘ長さ２００ｍｍのカラムに充填したＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（登録商標）（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通すことで、配列番号１の１８０から２５１番目に相当するペプチドにＨｉｓ６−ｔａｇが付加したペプチドが素通りし、２５〜２５１番目のペプチド（以下、全長ＦＧＦ−２３蛋白質ということがある）にＨｉｓ６−ｔａｇ配列を付加したものはカラムに吸着した。このカラムに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）中で０から０．７ＭまでのＮａＣｌ濃度勾配で吸着物質を溶出させたところ、約０．３ＭのＮａＣｌで溶出される画分にＨｉｓ６−ｔａｇが付加した全長ＦＧＦ−２３蛋白質が認められ、約０．４Ｍで溶出される画分に配列番号１の１７９番目よりＮ末側の配列を持つと考えられるペプチドが確認された。このようにＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで分離された画分は次に、金属アフィニティカラム、Ｔａｌｏｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）（米国、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にかけることでさらに分離する事が出来た。１７９番目よりＮ末側の配列についても金属カラムとの親和性を有しており、精製に有効であった。さらにＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにて精製を行い、ＣＢＢ染色で単一のバンドとして全長のＦＧＦ−２３Ｈを取得することができた。この結果を図１Ｂに示す。
ＦＧＦ−２３蛋白質も同様の方法で精製することができる。ＣＨＯ−ＦＧＦ２３の培養上清をポアサイズが０．２μｍのメンブレンであるＳｕｐｅｒＣａｐ（登録商標）（米国、Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）でろ過し、ろ過された溶液をＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通した。カラムとの親和性が弱い物質を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．７で洗浄、溶出させた。カラム保持された蛋白を０から０．７ＭまでのＮａＣｌ濃度勾配で溶出させたところ、約０．３ＭのＮａＣｌで溶出される画分に全長ＦＧＦ−２３蛋白質が認められた。これを金属アフィニティカラムであるＴａｌｏｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）（米国、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に吸着させたのち、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．７で洗浄したのち、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅの濃度を変化させて添加し蛋白を溶出精製した。さらに、目的の蛋白質を含む画分をＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに吸着、溶出させて精製した。同様な方法でＣＨＯ−ＦＧＦ２３ＲＱ上清より全長ＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質を精製した。
（実施例３）ヒトＦＧＦ−２３に対するヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行１９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。被免疫動物は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用い、ヒトＦＧＦ−２３の免疫は免疫源の違いにより以下の２種類の方法で行なった。
（１）  ベクター投与と組換え体蛋白質投与の組み合わせによる免疫
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、実施例１で作製したＩＮＰＥＰ４／ＦＧＦ−２３ベクター（１０または５０μｇ／匹）をＴｒａｎｓ  ＩＴ（登録商標）Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ試薬（日本、宝酒造社）を静脈より導入して初回免疫を実施した。初回免疫から同ベクターを１週間後に１回導入し追加免疫した。さらに、実施例２で作製したＦＧＦ−２３ＲＱＨ蛋白質（２０−３０μｇ／匹）をスクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  ＡおよびＴｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅを含むＲＩＢＩアジュバント（米国、Ｃｏｒｉｘａ社）に懸濁しエマルジョンを調製した後、腹腔内注射により４回または５回追加免疫し、さらに以下に述べる脾臓細胞の取得４日前に実施例２で作製したＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質（１８μｇ／匹）を尾静脈内注射により免疫した。
（２）  ヒトＦＧＦ−２３を用いた免疫
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、実施例２で作製したＦＧＦ−２３（２２μｇ／匹）を上述のＲＩＢＩアジュバントに懸濁して腹腔内注射により初回免疫した。さらに、同蛋白質を腹腔内注射により１週間毎に１回、４週間にわたり追加免疫し、以下に述べる脾臓細胞の取得３日前にＦＧＦ−２３（１０μｇ／匹）を尾静脈内注射により免疫した。
（３）  ハイブリドーマの作製と選別
上述のように免疫したマウスから脾臓を摘出し、それより回収した脾臓細胞をマウスミエローマＳＰ２／０（ＡＴＣＣ：ＣＲＬＩ５８１）と５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール１５００（日本、ロッシュダイアグノスティクス社）を用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）を含有するＨＡＴ含有ＤＭＥＭ培地（米国、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）中で培養することにより行った。さらに、ＨＴ含有ＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりクローニングを実施した。単一細胞に由来するクローン化ハイブリドーマを取得した。
（４）  抗ＦＧＦ−２３抗体を産生するクローン化したハイブリドーマの選別
ハイブリドーマが産生する抗体とＦＧＦ−２３蛋白質との結合性を調べることで、ＦＧＦ−２３蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別した。上述の第一の方法で免疫して得たハイブリドーマの選別は以下のように実施した。５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３の溶液に１μｇ／ｍｌの濃度に希釈したＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質溶液を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに５０μｌずつ加え、３７℃で３０分または４℃で１２時間インキュベートし、ＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質をマイクロプレートに吸着させた。次にこの溶液を除去し、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ，米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を加え室温で３０分間インキュベートしたのち、各ウェルを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（５００ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＴＲＩＺＭＡ  ｐｒｅ−ｓｅｔ  ｃｒｙｓｔａｌｓ（登録商標）米国、Ｓｉｇｍａ社）（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。このようにＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清を５０μｌ加え、３０分間反応させた後、各ウェルを、Ｔ−ＴＢＳで２回洗浄した。次いで、各ウェルに５０μｌずつ３０００倍希釈した過酸化酵素標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（米国、Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を加え、室温下で３０分間インキュベートした。これをＴ−ＴＢＳで３回洗浄後、テトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を含む基質緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加え、室温下で１５分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ硫酸を各ウェルに５０μｌずつ加え、反応を止めた。参照波長を５７０ｎｍとして波長４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）で測定した。ここで、明確な吸光度の上昇を示したハイブリドーマを選別し、さらに、ＦＧＦ−２３蛋白質を用いて同様の実験を実施してＦＧＦ−２３との結合が再確認されたクローンを選別した。これより、ＦＧＦ−２３蛋白質を認識する抗体を産生するハイブリドーマとして９種のクローンを得た。
この中には後に示す１Ｃ３Ｈ、１Ｄ６Ａ、２Ａ２Ｂ、２Ｃ３Ｂおよび２Ｃ５Ｌが含まれていた。
上述の第二の方法で免疫して得たハイブリドーマの選別は、以下のように実施した。５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３の溶液に１μｇ／ｍｌの濃度に希釈したＦＧＦ−２３蛋白質溶液を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに５０μｌずつ加え、４℃で１０時間インキュベートしてＦＧＦ−２３蛋白質をマイクロプレートに吸着させた。次にこの溶液を除去し、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ，米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を加え室温で３０分間インキュベートしたのち、各ウェルを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。このようにＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清を５０μｌ加え、３０分間反応させた後、各ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。次いで、各ウェルに５０μｌずつ３０００倍希釈した過酸化酵素標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（米国、Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を加え、室温下で３０分間インキュベートした。これをＴ−ＴＢＳで３回洗浄後、テトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を含む基質緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加え、室温下で１５分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ硫酸を各ウェルに５０μｌずつ加え、反応を止めた。参照波長を５７０ｎｍとして波長４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）で測定した。ここで、明確な吸光度の上昇を示したハイブリドーマを選別した。これより、ＦＧＦ−２３蛋白質を認識する抗体を産生するハイブリドーマとして新たに４種のクローンを得た。この中に３Ｃ１Ｅが含まれていた。
このように取得したＦＧＦ−２３蛋白質を特異的に認識する抗体のサブクラスをＩｓｏ  Ｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（米国、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて同定した。結果は表１に示した。
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上記ハイブリドーマクローンのうち、３つのハイブリドーマクローン２Ｃ３Ｂ、３Ｃ１Ｅおよび１Ｄ６Ａを、２００１年１２月２６日付で、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。またハイブリドーマクローン２Ｃ５Ｌを、２００３年１月６日付で、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。受託番号は以下の通りである。
２Ｃ３Ｂ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３８
３Ｃ１Ｅ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８３９
１Ｄ６Ａ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４０
２Ｃ５Ｌ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６８
（実施例４）モノクローナル抗体の調製
（１）  抗ＦＧＦ−２３抗体を含む培養上清の調製
抗ＦＧＦ−２３抗体産生ハイブリドーマを１０μｇ／ｍｌのウシインシュリン（米国、Ｓｉｇｍａ社）、５．５μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン（米国、Ｓｉｇｍａ社）、０．０１ｍＭのエタノールアミン（米国、Ｓｉｇｍａ社）、５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（米国、Ｓｉｇｍａ社）を含有するｅＲＤＦ培地（日本、極東製薬社）に馴化した。抗体を調製するためのハイブリドーマの培養はスピナ−フラスコで実施した。培養液を孔径が０．２μｍのフィルター（米国、Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を通すことでハイブリドーマ等の雑排物を除去し、抗体を含む培養上清を回収した。
（２）  プロテインＧを用いたモノクローナル抗体の精製
抗ＦＧＦ−２３抗体を含む培養上清をプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦカラム（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通して抗体をカラムに吸着させ、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）を用いて溶出させた。溶出画分は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを添加してｐＨ７．２に調整した。このように調製した抗体溶液を分画分子量１００００カットの透析膜（米国、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてＰＢＳ（−）で透析置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過滅菌し、精製抗ＦＧＦ−２３抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出した。
（３）  プロテインＡを用いたモノクローナル抗体の精製
プロテインＡ担体カラム（日本、免疫生物研究所社）を用い、吸着緩衝液としてグリシン緩衝液（ｐＨ８．９）、溶出緩衝液としてクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて抗ＦＧＦ−２３抗体を含む培養上清から抗体をアフィニティー精製した。この抗体を含む溶出画分に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを添加してｐＨ７．２付近に調整した。次に透析膜を用いてこの抗体を含む溶液をＰＢＳ（−）に置換し、さらに孔径０．２２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し、精製抗ＦＧＦ−２３抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出した。
このようにして得られた各精製モノクローナル抗体を、産生するハイブリドーマの名前を用いて示すことにする。例えばハイブリドーマ１Ｄ６Ａが産生する抗体に関しては１Ｄ６Ａ抗体と記載することにする。
（実施例５）抗ＦＧＦ−２３部分ペプチドポリクローナル抗体の作製
（１）  ＦＧＦ−２３部分配列に相当するペプチドの合成
配列番号１のポリペプチドをＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．５．１の計算機能を用いて、疎水性度を予測し、ペプチド抗体作製に適した部位を予測した。親水性の程度が高く、かつ糖鎖修飾やリン酸化部位となりうる部位を除外するという条件で抗体作製に適切と考えられる部分配列を抽出した。その結果、配列番号１の残基番号２５番目チロシンから始まる１５残基のアミノ酸からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したペプチドｈＦＧＦ２３−２５（配列番号９）、４８番目アルギニンから始まる２０アミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したペプチドｈＦＧＦ２３−４８（配列番号１０）、１１４番目アルギニンから始まる１５アミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したｈＦＧＦ２３−１１４（配列番号１１）、１４８番目グリシンから始まる１６アミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したペプチドｈＦＧＦ２３−１４８（配列番号１２）、１７０番目アスパラギンから始まる１０アミノ酸残基からなるペプチドのＮ末端にシステイン残基を付加したペプチドｈＦＧＦ２３−１７０（配列番号１３）、１７４番目プロリンから始まる１４アミノ酸残基からなるペプチドにＣ末端にシステイン残基を付加したｈＦＧＦ２３−１７４（配列番号１４）、１８０番目セリンから始まる１５アミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したペプチドｈＦＧＦ２３−１８０（配列番号１５）、２１０番目Ｌｅｕから始まる１３アミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したペプチドｈＦＧＦ２３−２１０（配列番号１６）および２３７番目グリシンから始まる１５アミノ酸残基からなるペプチドｈＦＧＦ２３−２３７（配列番号１７）を抗原として選択し化学合成した。
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（２）  抗ＦＧＦ−２３部分ペプチドに対するポリクローナル抗体の調製
上述の全てのペプチドはそれぞれの持つシステイン残基を介してキャリア蛋白質であるウシサイログロブリンと結合させ、免疫に供した。免疫は一つの抗原ペプチドに対して３羽のウサギを用いた。初回免疫は、１羽あたり１００μｇのキャリア蛋白に結合したペプチドをフロイト完全アジュバントでエマルジョンとしたものをウサギの皮内または皮下に投与した。初回免疫の１週間後に１００μｇのキャリア蛋白に結合したペプチドをフロイト不完全アジュバントでエマルジョンとしたものを同様に投与した。これと同じ投与を２週間間隔で６回実施し、最終投与の１週間後に全採血を行ない、抗血清を調製した。
ウサギ血清からの抗ＦＧＦ−２３部分ペプチド抗体を精製するためのアフィニティカラムを作製するために、免疫に用いたそれぞれのペプチドをＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｋｉｔ（米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を用いてゲル上に固相化した。吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）を用いて抗血清をこのカラムに添加し、免疫に用いたペプチドと結合する抗体をカラムに保持した。次に溶出緩衝液として０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５−３．３）を用いてカラムに結合した抗体を溶出させ、回収した。溶出画分は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを添加してｐＨ７．２付近に調整した。このように調製した抗体溶液を、ゲルろ過カラムＮＡＰ２５（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供してＰＢＳ（−）に緩衝液を置換した後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過滅菌し、各ペプチドに対する抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出した。このようにして得られた各精製抗体を、免疫に用いたペプチドの名前を用いて示すことにする。例えば配列番号９のｈＦＧＦ２３−２５ペプチドを免疫して得られた抗体に関してはｈＦＧＦ２３−２５抗体と記載することにする。
（３）  抗ＦＧＦ−２３部分ペプチド抗体によるＦＧＦ−２３蛋白質およびその代謝物の認識
上述の方法により取得したｈＦＧＦ２３−４８抗体とｈＦＧＦ２３−１４８抗体を用いてＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈ発現細胞上清中のＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質およびその代謝物をウエスタンブロッティングにて解析した。図１Ａに示すように、いずれの抗体でも３２ｋＤａ付近の全長ＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質が検出された。また１８ｋＤａ付近以下の大きさの代謝物が認められたが、これはＦＧＦ−２３蛋白質が配列番号１に示すアミノ酸配列番号の１７９番目と１８０番目の間で切断されて生じたＮ末側の断片に由来すると考えられる。ｈＦＧＦ２３−４８抗体では、より小断片化した代謝物を認識していた。また、１７９番目と１８０番目の間での切断を回避する変異蛋白質を産生するＣＨＯ−ＦＧＦ２３ＲＱの培養上清中のＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質とその代謝物に関してｈＦＧＦ２３−１４８抗体を用いて検討した。図１Ｃに示すようにＦＧＦ−２３Ｈで認められていた断片化ペプチドは検出されなくなった。以上のことからＦＧＦ−２３蛋白質の蛋白切断による代謝は、１７９番目と１８０番目の間が切断されることにより生じたＮ末断片はさらに小断片化していくが、このような小断片は１７９番目と１８０番目の間での切断が生じたのちに生成されると考えられた。従ってＦＧＦ−２３蛋白質の代謝を考える上で１７９番目と１８０番目の間での切断の有無を見分けることが非常に重要であることが判明した。
（実施例６）ビオチン化抗体の作製
上述の精製した９種のＦＧＦ−２３部分ペプチドに対するポリクローナル抗体および１３種の抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体の一部を用いてビオチン化を行った。５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した抗体溶液１ｍｌに、Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−Ｏｓｕ（日本、同仁化学社）をジメチルホルムアミドに１．８２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を１０μｌ添加し、４℃において２時間転倒混和した。その後、この反応液をＮＡＰ１０カラム（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供し、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−Ｏｓｕを除き、溶媒をＰＢＳ（−）に置換した。９種類のビオチン標識抗ＦＧＦ−２３部分ペプチドポリクローナル抗体および５種のビオチン標識抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体（１Ｃ３Ｈ抗体、１Ｄ６Ａ抗体、２Ａ２Ｂ抗体、２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体）を得た。
（実施例７）  ＦＧＦ−２３の特定部位を認識するポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法
（１）  サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築
上述のＦＧＦ−２３の部分ペプチド配列に対する９種類のポリクローナル抗体のうち、８種類の抗体（ｈＦＧＦ２３−２５抗体、ｈＦＧＦ２３−４８抗体、ｈＦＧＦ２３−１１４抗体、ｈＦＧＦ２３−１４８抗体、ｈＦＧＦ２３−１７０抗体、ｈＦＧＦ２３−１８０抗体、ｈＦＧＦ２３−２１０抗体およびｈＦＧＦ２３−２３７抗体）を固相化用抗体および検出用抗体として組み合わせて、サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築を検討した。
抗体を固相化するために、抗ＦＧＦ−２３部分ペプチドポリクローナル抗体８種（ｈＦＧＦ２３−２５抗体、ｈＦＧＦ２３−４８抗体、ｈＦＧＦ２３−１１４抗体、ｈＦＧＦ２３−１４８抗体、ｈＦＧＦ２３−１７０抗体、ｈＦＧＦ２３−１８０抗体、ｈＦＧＦ２３−２１０抗体およびｈＦＧＦ２３−２３７抗体）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で３０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃で１．５時間静置した。その後、反応液を除去し、（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え室温で６０分間インキュベートしてブロッキングを行った。溶液を除去した後、１μｇ／ｍｌのＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を、１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で１時間静置して固相化した抗体と結合させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄した後、１０％Ｂｌｏｃｋａｃｅ（日本国、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した上述のビオチン標識した抗ＦＧＦ−２３部分ペプチド抗体８種（ｈＦＧＦ２３−２５抗体、ｈＦＧＦ２３−４８抗体、ｈＦＧＦ２３−１１４抗体、ｈＦＧＦ２３−１４８抗体、ｈＦＧＦ２３−１７０抗体、ｈＦＧＦ２３−１８０抗体、ｈＦＧＦ２３−２１０抗体、ｈＦＧＦ２３−２３７抗体）および対照として１０％Ｂｌｏｃｋａｃｅ（日本国、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳ溶液をそれぞれ１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置し二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＴＢＳで３回洗浄した後、１０％Ｂｌｏｃｋａｃｅを含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で１５分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えることにより反応を停止させた。測定は９６穴プレート用の吸光度測定装置ＭＴＰ−３００（日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値を求めた（表２）。ビオチン標識抗体を加えていない対照では４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値は全て０．０６以下であったが、表２に示すように、複数の固相化抗体、検出抗体の組み合せにおいて顕著に４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値が上昇していた。図１に示すように、ＦＧＦ−２３蛋白質の切断により生じるポリペプチドの存在が知られており、同一試料中にＦＧＦ−２３に由来する異なる分子種のポリペプチドが存在することが考えられる。ここで用いている抗体は、ＦＧＦ−２３の特定の部位を認識することから、抗体の組み合わせに従って、測定対象の分子種を絞り込むことができる。例えばｈＦＧＦ２３−１７０抗体を固相化し、ｈＦＧＦ２３−２５抗体で検出する組み合わせを用いた場合は、両抗体の抗原部位が配列番号１に示すＦＧＦ−２３蛋白質アミノ酸配列の２５−１７９残基のＮ末側部分ポリペプチド断片に含まれるため、これらの組み合わせによる���ンドイッチＥＬＩＳＡでは配列番号１の２５−２５１残基の全長ポリペプチドを検出できるのみならず、そのＮ末部分ポリペプチド断片も検出できると予想される。一方、ｈＦＧＦ２３−１８０抗体を固相化しｈＦＧＦ２３−２３７抗体で検出すると、全長ポリペプチドのみならず配列番号１で示すＦＧＦ−２３蛋白質の１８０−２５１残基に相当するＣ末側部分ポリペプチド断片を検出できると予想される。また、例えば、ｈＦＧＦ２３−２３７抗体を固相化しｈＦＧＦ２３−２５抗体で検出すると切断後のＮおよびＣ末側部分ポリペプチドを検出することなく全長のＦＧＦ−２３蛋白質のみを検出できると予想される。したがって、これらの組み合わせを複合的に用いることにより、生体試料等の検体中のＦＧＦ−２３全長ポリペプチドと部分ポリペプチドの絶対量の測定と存在比の識別が可能となる。
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横が固相化抗体の種類、縦が検出抗体の種類を表し、各組み合わせで得られた測定値を示す。
（２）  サンドイッチＥＬＩＳＡによるＦＧＦ−２３蛋白質の定量的検出
上述のサンドイッチＥＬＩＳＡ系作製方法に従い、ｈＦＧＦ２３−２５抗体を固相化し、検出用抗体としてｈＦＧＦ２３−２３７抗体を用いて、１、０．３３、０．１、０．０３３、０．０１、０．００３３および０．００１μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質溶液を被験物質として測定を実施した。その結果を図２に示す。０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲内で濃度依存的な４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値の上昇が得られたことから、少なくともこの濃度範囲におけるＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を濃度依存的に検出可能であることが判明した。
（実施例８）  ＦＧＦ−２３部分ペプチドの作製
実施例５で作製したＦＧＦ−２３の部分配列に相当するペプチドのほかに以下の配列を有するＦＧＦ−２３の部分配列を有するペプチドを化学合成した。配列番号１の残基番号３８番目グリシンから始まる１３個のアミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したｈＦＧＦ２３−３８（配列番号１８）、配列番号１の残基番号６８番目トレオニンから始まる２８個のアミノ酸残基からなるペプチドｈＦＧＦ２３−６８（配列番号１９）、配列番号１の残基番号９６番目メチオニンから始まる１８個のアミノ酸残基からなるペプチドｈＦＧＦ２３−９６（配列番号２０）、配列番号１の残基番号１２９番目セリンから始まる２２個のアミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したｈＦＧＦ２３−１２９（配列番号２１）、配列番号１の残基番号１６１番目アルギニンから始まる１３個のアミノ酸残基からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したｈＦＧＦ２３−１６１（配列番号２２）、配列番号１の残基番号１９７番目アラニンから始まる１６個のアミノ酸残基からなるペプチドｈＦＧＦ２３−１９７（配列番号２３）および配列番号１の残基番号２２０番目セリンから始まる２４個のアミノ酸残基からなるペプチドｈＦＧＦ２３−２２０（配列番号２４）。
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（実施例９）  モノクローナル抗体のＦＧＦ−２３認識領域の決定
抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列を含む領域をヒトＦＧＦ−２３の部分配列を含むペプチドとの反応性を調べて決定した。
（１）  固相化ペプチドとの結合実験１
実施例５で合成したペプチド（配列番号７〜１７）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃で１時間静置してＦＧＦ−２３部分ペプチドを固相化した。その後、溶液を除去してブロッキング溶液（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温で６０分間インキュベートしてブロッキングを行った。溶液を除去した後、実施例３で取得したハイブリドーマの培養上清、または対照としてＨＴ含有ＤＭＥＭ培地を１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で１時間静置することでＦＧＦ−２３部分ペプチドと結合させた。抗体結合反応終了後にＴ−ＴＢＳで３回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで３０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ｆ（ａｂ’）２を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置して二次抗体を結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えることにより反応を停止させた。測定は９６穴プレート用の吸光度測定装置（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値を求めた。対照としてＨＴ含有ＤＭＥＭ培地のみを加えた場合の４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値は全て０．０６以下であったが、ハイブリドーマ培養上清を添加したものにおいて、特定のペプチドを固相化したもので明らかな吸光度値の上昇を認めた。その結果を表３に示す。２Ａ２Ｂ抗体は配列番号１２のｈＦＧＦ２３−１４８ペプチドに結合した。１Ｄ６Ａは配列番号１７のｈＦＧＦ２３−２３７ペプチドとの結合を示した。よってハイブリドーマ２Ａ２Ｂの産生する抗体は配列番号１に示すＦＧＦ−２３の１４８から１６３番目に示す領域あるいはその一部に結合すると考えられる。さらに１Ｃ３Ｈは配列番号１に示すＦＧＦ−２３の１８０から１９４番目に示す領域あるいはその一部と結合し、１Ｄ６Ａは配列番号１に示すＦＧＦ−２３の２３７から２５１番目に示す領域あるいはその一部に結合すると考えられる。
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（２）  固相化ペプチドとの結合実験２
ＦＧＦ−２３は、配列番号１に示す配列の１７９番目と１８０番目の間での切断が認められるが、この切断部位よりＣ末側を認識する抗体について詳細に検討する目的で、この領域の一部に相当する配列を持つ合成ペプチドを用いた結合実験を実施した。実施例５で合成したペプチド（配列番号１４、１５、１６および１７）および実施例８で合成したペプチド（配列番号２３および２４）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、４℃で１２時間静置してプレート上に固相化した。その後、溶液を除去し、ブロッキング溶液（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で６０分間インキュベートしてブロッキングを行った。溶液を除去した後、実施例３および実施例４で精製、取得した１Ｄ６Ａ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体を１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで１０μｇ／ｍｌになるように希釈した溶液を１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。対照として１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳを５０μｌ加えたウェルを設定した。これを室温で１時間静置することで固相化したペプチドと抗体を反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで３０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ｆ（ａｂ’）２を１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で６０分間静置し二次抗体を反応させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で２０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えることにより反応を停止させた。測定は９６穴プレート用の吸光度測定装置（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値を求めた。この結果を表４に示す。対照として希釈用液のみを加えたウェルの４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値は全て０．０５以下であった。これに対して３Ｃ１Ｅ抗体はペプチドｈＦＧＦ２３−１８０（配列番号１５）と結合し、１Ｄ６Ａ抗体はペプチドｈＦＧＦ２３−２３７（配列番号１７）結合した。
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（実施例１０）  免疫沈降によるＦＧＦ−２３蛋白質およびそれに由来するポリペプチドの検出
固相化ペプチドに比べて、より生理的条件に近い液相において、取得したモノクローナル抗体とＦＧＦ−２３蛋白質およびそれに由来するポリペプチドとの反応性を明らかにするため、免疫沈降を実施し、沈降蛋白質をウエスタンブロッティングで検出した。
実施例２で作製したＦＧＦ−２３Ｈを発現するＣＨＯ−ＦＧＦ２３細胞をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（米国、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）で４日間培養し、ＦＧＦ−２３蛋白質、Ｎ末側ポリペプチド断片およびＣ末側ポリペプチド断片を含む培養上清を得た。この上清４００μｌあたり実施例３および実施例４で作製した５種の抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を０．５μｇ添加した溶液を調製した。緩衝液のみを添加したものを実験対照とした。この溶液を４℃で１．５時間転倒混和し、抗体と培養上清中の蛋白質を反応させた。その後、プロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦレジン（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を３０μｌ添加し、４℃で３時間転倒混和した後、レジンに結合しなかった物質をＰＢＳで３回洗い流した。このレジンの半分量に対して、３０μｌの２０ｍＭ  ＤＴＴ含有および非含有サンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００１％ブロムフェノールブルー、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、９５℃で５分間加熱した後に遠心して上清を回収した。このように回収された免疫沈降物を１０−２０％の濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、セミドライブロッティング装置（米国、Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ゲル中の蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。ブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）でこのＰＶＤＦ膜をブロッキングした後、Ｔ−ＴＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識した２Ａ２Ｂ抗体または１Ｃ３Ｈ抗体溶液中で４℃で１２時間インキュベーションした。さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を反応させ、洗浄後、ＥＣＬプラス発光システム（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてフィルムに１時間露光し、自動現像機（日本、フジフィルム社）で現像した。その結果を図３に示す。ウエスタンブロッティングで用いた２Ａ２Ｂ抗体は、配列番号１のアミノ酸残基番号１４８〜１６３番目に相当する部位を認識する抗体である。また、ここで用いた１Ｃ３Ｈ抗体は、配列番号１の１８０〜１９４番目に相当する部位を認識する抗体であることが判明しているものである。両者を用いることで１７９番目と１８０番目の切断で生じる断片化ポリペプチドを区別して認識することができる。従って本実験の結果よりモノクローナル抗体は以下の３種類の抗体に分類された。すなわち▲１▼配列番号１のアミノ酸残基２５〜１７９番目に相当するＮ末側断片ポリペプチド内に認識配列を持ち、かつＮ末側断片ポリペプチドおよびＦＧＦ−２３全長蛋白質と免疫複合体を形成する２種類の抗体（２Ｃ３Ｂ抗体および２Ｃ５Ｌ抗体）、▲２▼配列番号１のアミノ酸残基１８０〜２５１番目に相当するＣ末側断片ポリペプチドに認識配列を持ち、かつＣ末側断片ポリペプチドおよびＦＧＦ−２３全長蛋白質と免疫複合体を形成する２種類の抗体（１Ｄ６Ａ抗体および３Ｃ１Ｅ抗体）、および▲３▼免疫沈降物が検出できなかった抗体（２Ａ２Ｂ抗体）である。
（実施例１１）  抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体と抗ＦＧＦ−２３ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによるＦＧＦ−２３蛋白質の検出
２種類のモノクローナル抗体（１Ｄ６Ａ抗体、２Ｃ３Ｂ抗体）をそれぞれ固相化し、実施例７で検出抗体として有用性が示された５種類のポリクローナル抗体（ｈＦＧＦ２３−２５抗体、ｈＦＧＦ２３−１７０抗体、ｈＦＧＦ２３−１８０抗体、ｈＦＧＦ２３−２１０抗体およびｈＦＧＦ２３−２３７抗体）をそれぞれ検出抗体に用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系で精製したＦＧＦ−２３蛋白質の検出を行った。
プロテインＧアフィニティカラムで精製した上述の２種のモノクローナル抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃で１時間静置して固相化した。その後、反応液を除去し、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含有するＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄した後、それぞれ実施例２で作製された０．１μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質精製物、Ｎ末側断片ポリペプチド精製物、Ｃ末側断片ポリペプチドにＨｉｓ６  ｔａｇが付加された精製物の溶液を１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で２時間静置して固相化した抗体と反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで２．５μｇ／ｍｌに希釈した５種のビオチン標識抗ＦＧＦ−２３部分ペプチドポリクローナル抗体（ｈＦＧＦ２３−２５抗体、ｈＦＧＦ２３−１７０抗体、ｈＦＧＦ２３−１８０抗体、ｈＦＧＦ２３−２１０抗体、ｈＦＧＦ２３−２３７抗体）を室温で３０分間インキュベートして二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温でインキュベートした。７分後に０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えて反応を停止させた。測定は９６ウェルプレート用の吸光度測定装置（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値を求めた。その結果を図４に示す。抗体を加えていない対照の４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値は全て０．０１５以下であったが、固相化抗体と検出抗体の組み合わせに応じて、それぞれＦＧＦ−２３全長蛋白質（図４Ａ）、Ｎ末側断片ポリペプチド（図４Ｂ）またはＣ末側断片ポリペプチド（図４Ｃ）に特異的な反応が観察された。この反応性の違いにより抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体の認識部位を確認することができた。すなわち２Ｃ３Ｂ抗体を固相化した場合、３種類のビオチン化ポリクローナル抗体（ｈＦＧＦ２３−１８０抗体、ｈＦＧＦ２３−２１０抗体、ｈＦＧＦ２３−２３７抗体）を検出抗体として使用する組み合わせにおいて全長ＦＧＦ−２３蛋白質は検出されたが、Ｎ末側断片ポリペプチドまたはＣ末側断片ポリペプチドは検出されなかった。一方、Ｎ末側断片ポリペプチドを認識するビオチン標識ポリクローナル抗体（ｈＦＧＦ２３−２５抗体、ｈＦＧＦ２３−１７０抗体）で全長ＦＧＦ−２３蛋白質とＮ末側断片ポリペ���チドが強く検出されたが、Ｃ末側断片ポリペプチドは全く検出されなかった。
このことから、２Ｃ３Ｂ抗体はＮ末側断片ポリペプチドを認識することが確かめられた。１Ｄ６Ａ抗体を固相化した場合、Ｎ末側断片ポリペプチドを認識するポリクローナル抗体を検出抗体として用いることで全長蛋白質が検出されたが、Ｎ末断片およびＣ末側断片ポリペプチドは全く検出されなかった。一方でＣ末側断片ポリペプチドを認識するポリクローナル抗体を検出抗体として用いて全長蛋白質およびＣ末側断片ポリペプチドの検出を行うと、１Ｄ６Ａ抗体はｈＦＧＦ２３−１８０との組み合わせで検出が可能であった。本結果は、１Ｄ６Ａ抗体はポリクローナル抗体ｈＦＧＦ２３−２３７抗体と競合する事を示しており、１Ｄ６Ａ抗体は配列番号１のアミノ酸残基２３７〜２５１番目の領域を認識することが確かめられた。
（実施例１２）  抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡによるＦＧＦ−２３蛋白質の検出
実施例３と実施例４で取得した４種類の抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を固相化し、実施例６で調製した４種のビオチン標識抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを実施し、精製したＦＧＦ−２３蛋白の検出を行った。
４種類のＦＧＦ−２３モノクローナル抗体（１Ｄ６Ａ抗体、２Ａ２Ｂ抗体、２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、４℃で１２時間静置して固相化した。その後、反応液を除去し、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で２０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有するＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で３回洗浄した後、０．１μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−２３蛋白質精製物を１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で１時間静置して固相化抗体と反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社））を含むＴ−ＴＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した３種類のビオチン標識抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体（１Ｄ６Ａ抗体、２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体）を添加して、室温で１時間静置して二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で２０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温でインキュベートした。３０分後に０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えて反応を停止させた。測定は９６ウェルプレート用の吸光度測定装置（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値を求めた。その結果を表６に示す。固相化抗体または検出抗体を加えていない対照の４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値は全て０．０３３以下であったが、固相化抗体と検出抗体の組み合わせに応じて吸光度の上昇が認められた。例えば配列番号１に示すＦＧＦ−２３蛋白質アミノ酸配列中の２５〜１７９番目の領域中に認識部位を有する２Ｃ３Ｂ抗体を固相化抗体とし、配列番号１に示すＦＧＦ−２３蛋白質アミノ酸配列中の１８０〜２５１番目の領域中に認識部位を有するビオチン標識した１Ｄ６Ａ抗体３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体とした組み合せのサンドイッチＥＬＩＳＡを行なった場合、４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値は全て２．９以上という高値を示した。配列番号１に示すＦＧＦ−２３蛋白質アミノ酸配列の１７９番目のアルギニンと１８０番目のセリンの間で切断されて生じた断片化ポリペプチドは、このようなサンドイッチＥＬＩＳＡの測定対象から除外されるため、このような抗体の組み合わせを用いることでＮ末側ポリペプチド断片やＣ末側ポリペプチド断片を認識することなく、切断されていないＦＧＦ−２３蛋白質を高感度に検出することができる。実施例２で精製した全長ＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質、Ｎ末側ポリペプチド断片、Ｃ末側ポリペプチド断片を既報の方法と同様にマウスに投与したところ血清リンの低下誘導は全長ＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質にのみ認められた。このことより、配列番号１に示すＦＧＦ−２３蛋白質アミノ酸配列の１７９番目のアルギニンと１８０番目のセリンの間での切断は、ＦＧＦ−２３蛋白質の活性を大きく変化させることが明らかとなった。ここで示した切断されたポリペプチドを除外して切断されていないＦＧＦ−２３蛋白質を選択的に検出する方法は試料内に含まれる活性を有するＦＧＦ−２３をより的確に検出および測定することを可能にするものである。一方、配列番号１に示すＦＧＦ−２３蛋白質アミノ酸配列中の１８０〜２５１番目の領域中に認識部位を有する１Ｄ６Ａ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体を固相化抗体とし、さらに検出抗体としてもビオチン標識した１Ｄ６Ａ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体を用いた場合、同様に抗体の競合から配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１８０〜１９４番目の領域を認識する３Ｃ１Ｅ抗体のグループと配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２３７〜２５１番目の領域を認識する１Ｄ６Ａ抗体は異なる認識部位を持つことが明らかとなった。またこれらの抗体を組み合せることによって、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２５〜１７９番目の領域内に位置するポリペプチド断片を除外し、且つ、１８０〜２５１残基のＣ末側断片ポリペプチドを感度良く検出できる測定法の確立することができることが明らかとなった。
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（実施例１３）  抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＦＧＦ−２３蛋白質の定量的測定
２Ｃ３Ｂ抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１０μｇ／ｍｌに希釈したものを９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、４℃で１２時間静置して固相化した。その後、反応液を除去し、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり２５０μｌ加え、室温で３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有するＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。これに、実施例２で精製したＦＧＦ−２３蛋白質を１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１および０．００３ｎｇ／ｍｌとなるように希釈した各溶液を１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で１時間静置して固相化抗体と反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した２種類のビオチン標識抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体（１Ｄ６Ａ抗体および３Ｃ１Ｅ抗体）を添加して、室温で３０分間静置し二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温でインキュベートした。２５分後に０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えて反応を停止させた。測定は９６ウェルプレート用の吸光度測定装置（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値を求めた。その結果を図６に示す。少なくとも０．０３ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−２３蛋白質が存在することで有意な測定値の上昇が観察され、３ｎｇ／ｍｌ程度までの範囲内で濃度依存的な４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値の上昇が得られ、この濃度範囲におけるＦＧＦ−２３蛋白質の検出が可能であることが明らかとなった。
（実施例１４）  抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体固定化カラムの作製
ＦＧＦ−２３蛋白質の免疫沈降による回収やＦＧＦ−２３蛋白質の精製用の抗体カラムとして有用な抗ＦＧＦ−２３抗体を固定化したカラムを市販の固定化試薬（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて作製した。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に１Ｃ３Ｈ抗体、１Ｄ６Ａ抗体、および２Ｃ３Ｂ抗体を希釈し、それぞれ、１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌおよび０．４ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製した。この抗体溶液１ｍｌに対して、６ｍｇの２−メルカプトエタノールアミンを添加し３７℃で１時間転倒混和して還元反応により抗体内のジスルフィド結合を解離させた。ＮＡＰ１０カラム（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてバッファーを１．５ｍｌの結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）溶液に交換しするとともに２−メルカプトエタノールアミンを除き還元反応を停止させた。これらの抗体溶液を予め結合バッファーで洗浄した１ｍｌのＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｇｅｌ（米国、Ｐｉｅｒｃｅ社）に添加し室温で３０分転倒混和し結合反応を行った。遠心分離後、レジンを結合バッファーで洗浄し、未反応チオール基のブロッキングのため、１ｍＬの０．０５ｍＭのＬ−システイン−ＨＣｌ溶液を添加して室温３０分転倒混和した。その後、１Ｍ  ＮａＣｌを用いてレジンを洗浄して未反応の抗体およびＬ−システインを除去した。
（実施例１５）  ＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈ細胞移植マウスの血清中に存在するＦＧＦ−２３蛋白質の免疫沈降法による検出
血中でのＦＧＦ−２３蛋白質の存在様態を調べるためＦＧＦ−２３Ｈを発現する細胞をヌードマウスに移植し、この細胞より血中に分泌されたＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を免疫沈降法で検出した。１匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに対して２ｘ１０７個のＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈ細胞、あるいは対照としてＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞を皮下に移植し、移植後３２日後の時点で細胞が生着して腫瘍を形成したマウスより血清を採取した。５匹のＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１移植マウスおよび６匹のＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈ移植マウスより採取した血清をそれぞれ等量ずつ混合し、その１５０μｌの混合血清に対して、実施例１４で作製した１Ｄ６Ａ抗体、および２Ｃ３Ｂ抗体をそれぞれ固定化したレジンおよび抗体固定化をしていないレジンをそれぞれ１０μｌ添加し４℃において１時間転倒混和して抗体とＦＧＦ−２３を反応させた。その後ＰＢＳでレジンを３回洗浄し、未反応物を除去した。それぞれのレジンに５０μｌのサンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００１％ブロムフェノールブルー、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＤＴＴ）を添加し９５℃で５分間加熱したのち、遠心分離して得た上清を回収した。これを１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、セミドライブロッティング装置（米国、Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。このＰＶＤＦ膜をＢｌｏｃｋａｃｅ（登録商標、日本、大日本製薬社）で０．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識した２Ａ２Ｂ抗体又は１Ｃ３Ｈ抗体溶液中で、４℃で１２時間インキュベーションした後、さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を反応させた。これをＥＣＬプラス発光システム（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてフィルムに１時間露光し、自動現像機（日本国フジフィルム社）で現像した。その結果を図７に示す。抗体を固定化していないレジンにおいては全くシグナルは観察されなかったが、１Ｃ３Ｈ抗体で免疫沈降し、２Ａ２Ｂ抗体で検出した場合２２ｋＤａのシグナルが検出され、１Ｃ３Ｈ抗体で検出した場合、２２ｋＤａと１０ｋＤａのシグナルが検出された。また、１Ｄ６Ａ抗体で免疫沈降し、２Ａ２Ｂ抗体で検出した場合２２ｋＤａのシグナルが検出されず、１Ｃ３Ｈ抗体で検出した場合、１０ｋＤａのみのシグナルが検出された。さらに２Ｃ３Ｂ抗体で免疫沈降し、２Ａ２Ｂ抗体で検出した場合２２ｋＤａと１６ｋＤａのシグナルが検出され、１Ｃ３Ｈ抗体で検出した場合、２２ｋＤａのみのシグナルが検出された。２Ａ２Ｂ抗体は配列番号１のアミノ酸残基１４８〜１６３番目の領域を認識し、１Ｃ３Ｈ抗体は配列番号１のアミノ酸残基１８０〜１９４番目の領域を認識することが判明している。また２Ａ２Ｂ抗体はウエスタンブロッティング法において配列番号１のアミノ酸残基２５〜１７９番目に相当するＮ末側断片ポリペプチドを認識しそのシグナルの大きさは電気泳動上で１６ｋＤａに検出されること、１Ｃ３Ｈ抗体は配列番号１のアミノ酸残基１８０〜２５１番目のＣ末側断片ポリペプチド���認識し、そのシグナルの大きさは１０ｋＤａに検出されることが判明している。本実験で検出された１６ｋＤａのシグナルはＮ末側断片ポリペプチドを示し、１０ｋＤａのシグナルはＣ末側断片ポリペプチドを示していることは明らかである。また、マウス血清中より回収された２２ｋＤａのポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基２５〜１７９番目で示されるＮ末側領域を認識する２Ｃ３Ｂ抗体とアミノ酸残基１４８〜１６３番目の領域を認識する２Ａ２Ｂ抗体およびアミノ酸残基１８０〜１９４番目の領域を認識する１Ｃ３Ｈの産生する抗体で認識することが出来るが、アミノ酸残基２３７〜２５１番目の領域を認識する１Ｄ６Ａ抗体では認識できないものであった。本実験において観察されている２２ｋＤａ付近のシグナルはＦＧＦ−２３蛋白質が切断されて生じたものと考えられ、その切断部位は１Ｃ３Ｈ抗体が認識する領域よりもＣ末端側に存在するものである。これまで着目してきた配列番号１に示すアミノ酸番号の１７９番目のアルギニンと１８０番目のセリンとの間の切断とは異なる切断とそれにより生じる断片が血清中で認められることが明らかとなった。
（実施例１６）ＦＧＦ−２３蛋白質の血清中での切断
（１）ラット血清と精製ＦＧＦ−２３蛋白質の混和実験
血清によるＦＧＦ−２３蛋白質の切断について、精製ＦＧＦ−２３蛋白質とラット血清を混和して検討した。２０ｎｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質にラット血清を終濃度で５０％になるように添加して混和し、０、０．５、１、２、４、８、２４時間インキュベートした。この溶液をポリアクリルアミド電気泳動にて分離し、セミドライブロッティング装置（米国、Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施し、精製ＦＧＦ−２３蛋白質に由来する代謝物を検出した。その結果を図８に示す。血清と混和後、インキュベート時間の増加に伴い、全長ＦＧＦ−２３蛋白質の存在量は減少し、新たに２２ｋＤａの断片が出現し、増加することが認められた。
（２）ヒト血清および血漿と精製ＦＧＦ−２３蛋白質の混和実験
２０ｎｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質にヒト血清またはヒト血漿を終濃度５０％になるように添加して３７℃で３時間インキュベートした。この溶液をポリアクリルアミド電気泳動にて分離し、セミドライブロッティング装置（米国、Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施し、精製ＦＧＦ−２３蛋白質に由来する代謝物を検出した。その結果を図９に示す。ヒト血清とＦＧＦ−２３蛋白質を混合した場合では、２２ｋＤａのバンドが出現したが、ヒト血漿とＦＧＦ−２３蛋白質を混合しても２２ｋＤａのバンドは認められなかった。従って、２２ｋＤａのバンドは血清中に存在する蛋白切断酵素によるものと推定された。
（実施例１７）  ＦＧＦ−２３蛋白質の切断酵素の同定
（１）トロンビンでのＦＧＦ−２３の切断
２０ｎｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質にトロンビン（米国、Ｓｉｇｍａ社）を終濃度１ｕｎｉｔ／ｍｌで添加し、３時間インキュベートした。この溶液をポリアクリルアミド電気泳動にて分離し、セミドライブロッティング装置（米国、Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施し、精製ＦＧＦ−２３蛋白質に由来する代謝物を検出した。その結果を図１０に示す。全長のＦＧＦ−２３蛋白質は消失し、２２ｋＤａのバンドに変換された。
（２）血清によるＦＧＦ−２３蛋白質の切断に対するヒルジンの阻害作用
血清によるＦＧＦ−２３の切断への血清中トロンビンの関与について検討する目的でトロンビン選択的阻害剤として知られているヒルジンの影響を検討した。２０ｎｇの精製したＦＧＦ−２３蛋白質にラットの血清を終濃度５０％になるように添加して４時間インキュベートした。また、ラットの血清添加時にヒルジンを１．０ｕｎｉｔ／ｍｌで添加して同様にインキュベートした。この溶液をポリアクリルアミド電気泳動にて分離し、セミドライブロッティング装置（米国、Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施し、精製ＦＧＦ−２３蛋白質に由来する代謝物を検出した。その結果を図１１に示す。ラットに血清を添加することでＦＧＦ−２３蛋白質の一部が２２ｋＤａのポリペプチドに変換されたが、ヒルジンを共存させることで２２ｋＤａのバンドの出現が抑制された。このことから血清により生じるＦＧＦ−２３蛋白質の切断はトロンビンまたはトロンビンに類似した酵素によるものであることが示された。
（実施例１８）  血清によるＦＧＦ−２３蛋白質の切断部位の同定
ＦＧＦ−２３の血清による切断部位を同定するため、１０μｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質とラットの血清を２４時間混和して２２ｋＤａのポリペプチドを生成させた。この溶液中の２２ｋＤａのポリペプチドを実施例１４で作製した抗１Ｃ３Ｈ抗体カラムに吸着させ、溶出して精製した。ここで用いた抗体カラムは２００μｇのビオチン化１Ｃ３Ｈ抗体を５００μｌのストレプトアビジン固定化レジン（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に吸着させることにより作製した。抗体カラムからのＦＧＦ−２３由来蛋白質の溶出は、０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ２．７）を用いて行った。このように精製したポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＣＢＢ染色を行ない、図１２に示すように精製した２２ｋＤａポリペプチドを同定した。このバンドを切り出しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析に供した。それにより得られた分子量より、２２ｋＤａのポリペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列の２５番目のチロシンから１９６番目のアルギニンまでの配列を有していることが明らかになった。
これらの結果より、ＦＧＦ−２３蛋白質は血清中においては血清中に含まれるトロンビンにより配列番号１に示すアミノ酸配列の１９６番目に位置するアルギニンの後ろで切断され配列番号１の２５〜１９６番目の配列で示されるポリペプチドに変換されることが明らかとなった。血中で活性を有するＦＧＦ−２３蛋白質の測定には配列番号１のアミノ酸配列の１７９番目と１８０番目の間で切断されていないポリペプチドを検出する必要があることを上述したが、活性を有する全長型ＦＧＦ−２３蛋白質が血清サンプル調製の過程で１９６番目と１９７番目の間で一部切断を受けることが明らかとなり、Ｃ末端を認識する抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体ではこの代謝物を認識できないことが判明した。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列２５〜１７９番目の領域を認識する抗体と配列番号１のアミノ酸配列１８０〜１９６番目の領域を認識する抗体の組み合せでサンドイッチＥＬＩＳＡを行った場合では、血清化による切断の影響を無視することができるが、配列番号１のアミノ酸配列２５〜１７９番目の領域を認識する抗体と配列番号１のアミノ酸配列１９７〜２５１番目の領域を認識する抗体を用いた場合、血漿中に比べ血清中では測定値が低下する可能性がある。今回取得されてきた抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体のうち１Ｃ３Ｈ抗体および３Ｃ１Ｅ抗体は配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１８０〜１９４番目の領域を認識する抗体であることから、ＦＧＦ−２３が血清中で切断されて産生された２２ｋＤａ蛋白質（配列番号１のアミノ酸配列２５−１９６番目に相当）を配列番号１のアミノ酸配列の１７９番目と１８０番目の間で切断により生じるポリペプチド断片と区別して認識することが可能であり、血清サンプルの測定法を作製するにあたり非常に有用な抗体であることが明らかとなった。
（実施例１９）  腫瘍性骨軟化症患者血清および血漿中のＦＧＦ−２３蛋白質濃度の定量的解析
腫瘍性骨軟化症においては腫瘍でＦＧＦ−２３が過剰産生されていることが報告されており、この原因腫瘍を取り除くことによって治癒することが知られている。しかしながら、腫瘍性骨軟化症の原因腫瘍は一般に増殖性が低いために腫瘍が小さく発見することが困難である場合が多く、他の低リン血症性疾患との鑑別診断が容易でない。血中のＦＧＦ−２３濃度が腫瘍性骨軟化症を診断する上での指標となることが実証でき、尚かつ定量的に測定可能な方法が開発されれば臨床上有用である。
腫瘍性骨軟化症患者の血清および血漿サンプルを入手し、抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系にて検体中のＦＧＦ−２３を定量的に解析することを試みた。抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系は上述の方法を用いた。２Ｃ３Ｂ抗体を固相化抗体として用い、検出用抗体としてビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体または１Ｄ６Ａ抗体を用いた。精製した２Ｃ３Ｂ抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、４℃で１２時間静置して固相化した。その後、反応液を除去し、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり２５０μｌ加え、室温で３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有するＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。腫瘍性骨軟化症患者血清および血漿サンプルにはマウス抗体への非特異的反応を避けるため、アイソタイプコントロールとして８０μｇ／ｍｌの濃度のマウスＩｇＧ１を含むＴ−ＴＢＳ溶液で２倍希釈した。また、ＦＧＦ−２３蛋白質への特異的反応を確認するため固相化に用いた抗体２Ｃ３Ｂ抗体を過剰量（８０μｇ／ｍｌ）含むＴ−ＴＢＳで２倍希釈したものを調製した。検量線を作成するための標準液は、同様にアイソタイプコントロール抗体を含む溶液で希釈した健常人の血清または血漿に、精製ＦＧＦ−２３蛋白質を０．５、０．２５、０．１２５、０．０６１、０．０３１、および０．０１５ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加えて調製した。それぞれのサンプルを１ウェルあたり５０μｌずつマイクロタイタープレートに加え、室温で１時間静置して検体中のＦＧＦ−２３蛋白質を固相化抗体と反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した２種類のビオチン標識抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体（１Ｄ６Ａ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体）を添加し、室温で３０分間静置して二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温でインキュベートした。３０分間後に、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えて反応を停止させた。測定は９６ウェルプレート用の吸光度測定装置（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値を求めた。ＦＧＦ−２３特異的な反応を示す値として、過剰量のアイソタイプコントロール抗体存在下で測定したＡ４５０−Ａ５７０値から過剰量の２Ｃ３Ｂ抗体存在下で測定したＡ４５０−���５７０値を減じることにより求めた。その結果を図１３に示す。１Ｄ６Ａを検出抗体に用いた場合、血漿サンプルおよび血清サンプルの測定値はそれぞれ０．０３３、０．００８であり、明らかに血清において血漿よりも低い測定値を示した。一方で、３Ｃ１Ｅを検出抗体として用いた場合では、血清サンプルと血漿サンプルの測定値はほぼ同程度の値を示した。この結果は、実施例１８で示した血清中でのＦＧＦ−２３蛋白質の切断が本サンプルでも一部において生じていることが考えられ、上述のように検出抗体の違いにより臨床サンプルでも測定値の差が出てしまうことが明らかとなった。そこで、血清調製により生じる切断体も測定可能な３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体として用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、本患者の腫瘍摘出手術前後に採取された血漿中のＦＧＦ−２３濃度を測定した。健常人も血漿サンプルに種々の濃度の精製したＦＧＦ−２３蛋白質を添加した溶液を標準液とし、添加した精製蛋白質量に応じた吸光度の増加に基づき検量線を作成した。このようにして求めた検量線に関して図１４Ａに示す。２倍希釈したヒト血漿および血清中においても標準液中のＦＧＦ−２３蛋白質を３０ｐｇ／ｍｌの濃度から有意な測定値の上昇として検出し少なくとも５００ｐｇ／ｍｌ程度までの範囲内で定量に使用できる検量線が得られた。このような条件下で腫瘍性骨軟化症患者より腫瘍摘出手術前日採取した血漿と腫瘍摘出手術後１ヶ月以上経過して採取した血漿サンプル中のＦＧＦ−２３濃度を定量的に測定した。その結果を図１４Ｂに示す。腫瘍摘出手術摘出前の血漿中には約２７０ｐｇ／ｍｌのＦＧＦ−２３蛋白質が存在していたが、手術後に採取したサンプルではＦＧＦ−２３蛋白質は検出感度（３０ｐｇ／ｍｌ）以下に低下していた。腫瘍性骨軟化症においては原因腫瘍の存在により測定可能な濃度のＦＧＦ−２３が血中に存在し、腫瘍の除去により血中のＦＧＦ−２３濃度が著しく低下することが明確に示された。以上のことから、抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡが腫瘍性骨軟化症の診断に有用であるとともに、認識部位を特定した抗体を用いることで血清によるＦＧＦ−２３の切断の影響も加味して定量的に測定することができることが示された。
（実施例２０）  抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色
抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いて腫瘍性骨軟化症原因腫瘍の免疫組織染色を行なった。摘出腫瘍を凍結切片作製用包埋液に浸し液体窒素で冷却したアセトンで凍結し、腫瘍凍結ブロックを作製した。また対照として手術時に同時に摘出された腫瘍組織の周辺の正常と思われる組織についても同様に凍結ブロックを作製した。クリオスタット（ＣＭ１９００、ドイツ、ＬＥＩＣＡ社）を用いて凍結ブロックを４μｍの厚さに薄切し、切片をＭＡＳコートスライドグラス（日本、松浪ガラス社）上に冷却乾燥させながら接着させた。このように調製した凍結切片は−２０℃で保存した。凍結切片を接着させたスライドガラスをアセトン中で室温にて５分間静置し、組織をスライドガラス上に固定した。ＰＢＳで洗浄後、１％の過酸化水素、０．１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で３０分間室温にてインキュベートし、内因性のペルオキシダーゼを不活性化した。その後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、４％のスキムミルクを含有するＰＢＳ中で３０分間室温でインキュベートし、ブロッキングを行なった。その後、１０μｇ／ｍｌのビオチン標識した１Ｃ３Ｈ抗体および２Ｃ３Ｂ抗体を含有するＰＢＳで１時間室温でインキュベートして組織中のＦＧＦ−２３と添加したモノクローナル抗体を反応させた。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ（登録商標）、米国、ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて組織切片に特異的に結合したビオチン標識モノクローナル抗体に西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを結合させた。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄後ペルオキシダーゼと基質の反応（ＤＡＫＯ  ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、デンマーク、ＤＡＫＯ社）を行なった後、ＰＢＳで反応を停止させた。脱イオン交換水を用いて洗浄後、ヘマトキシリン・マイヤー（米国、メルク社）を脱イオン交換水で５倍希釈した溶液中で３０秒間室温でインキュベートしたのち、流水で洗浄した。その後エタノールを用いて脱水し、キシレンを用いて透徹した後、封入液を用いて封入した。その結果を図１５に示す。腫瘍組織においてＦＧＦ−２３と反応したと考えられる部位が茶色に染色されたが、このような染色像は腫瘍周辺部の組織では観察されなかった。このことから、腫瘍性骨軟化症の原因腫瘍においてＦＧＦ−２３が高濃度に存在することが確認された。
（実施例２１）  マウスＦＧＦ−２３蛋白質の発現と精製
マウスのＦＧＦ−２３配列は既に報告されている（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７：４９４−４９８，２０００）。この配列をもとにＮＣＢＩ遺伝子配列データベースを検索することで、マウスのＦＧＦ−２３の配列情報を入手することができる。このようにして得た配列情報をもとに、マウスのＦＧＦ−２３蛋白質をコードするｃＤＮＡを取得するため、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを実施した。第一段階の増幅反応に用いるプライマーとしてマウスＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡ配列の５’および３’非翻訳領域にそれぞれ相補的な配列をもつｍＦ５プライマー（配列番号２５）とｍＦ３プライマー（配列番号２６）を合成した。マウスの肺由来のｃＤＮＡ（米国、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、ＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本、宝酒造社）を用いて９４℃で１分間保温した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４５秒からなる工程を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを実施した。次に第二段階の反応は、開始コドンから翻訳領域を含む配列番号２７に示すｍＦ２３Ｆプライマーと翻訳領域から終始コドンを含む配列番号２８に示すｍＦ２３Ｒプライマーを用いて行った。ｍＦ２３Ｆプライマーにはクローニング用のＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列とＫｏｚａｋ配列が導入されている。一方、ｍＦ２３Ｒプライマーには、終始コドンのあとにＮｏｔＩ制限酵素認識配列が導入されている。第１段階の反応液を鋳型として、ＰｙｒｏＢｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本、宝酒造社）を用いて９８℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５８℃で１０秒、７２℃で６０秒からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲを実施することによりマウスＦＧＦ−２３蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を増幅した。このｃＤＮＡをｐＥＡＫ８ベクター（米国、Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）のＥｃｏＲＩ部位とＮｏｔＩ部位にクローニングした。このベクターをｐＥＡＫ８ｍＦＧＦ−２３と称す。さらに、実施例１で示したＦＧＦ−２３ＲＱＨの作製方法に準じて、マウスＦＧＦ−２３の切断酵素認識部位のアルギニン残基をグルタミン残基に置換した変異を導入したマウスＦＧＦ−２３ＲＱを構築した。変異導入は、実施例１の（３）に記載した方法に従って実施した。変異導入用の順方向のｍＲＱＦプライマー（配列番号２９）と逆方向のｍＲＱＲプライマー（配列番号３０）を合成した。まず、ｐＥＡＫ８ｍＦＧＦ−２３を鋳型としてｍＦ２３ＦプライマーとｍＲＱＲプライマーの組み合わせとｍＦ２３ＲプライマーとｍＲＱＦプライマーの組み合わせでＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ断片を取得した。次にこの両方の産物を混合して鋳型としてマウスＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡの両端に位置するｍＦ２３ＦプライマーとｍＦ２３ＲプライマーでＰＣＲを行い変異が導入されたマウスＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡを増幅した。これをｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰプラスミドのＥｃｏＲＩ制限酵素部位とＮｏｔＩ制限酵素部位にクローン化した。これを精製し塩基配列決定を行い、目的の変異を導入したマウスＦＧＦ−２３ｃＤＮＡがクローニングできていることを確認した。これをｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／���ＧＦＰ／ｍＦＧＦ−２３ＲＱと称す。さらにこのプラスミドをＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１に導入して、５μｇ／ｍｌのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（米国、Ｓｉｇｍａ社）を添加して薬剤耐性細胞を選択し、クローニングして、マウスＦＧＦ−２３発現細胞を取得した。この細胞をＣＨＯ−ｍＦＧＦ２３ＲＱと称す。このＣＨＯ−ｍＦＧＦ２３ＲＱ細胞をローラーボトルで培養し、約１２リットルの培養上清を取得した。これを、実施例２の（３）に記載したＦＧＦ−２３蛋白質の精製法に従って精製を行い、精製マウスＦＧＦ−２３ＲＱを取得した。
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（実施例２２）  抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体とＦＧＦ−２３の反応交差性
精製したマウスＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に蛋白質を転写し、３Ｃ１Ｅ抗体でウエスタンブロッティングを実施したところ、図１６Ａに示すように約３２．５ｋＤａにバンドを検出した。この精製マウスＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質溶液を段階希釈して、抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡでの検出を試みた。ここで用いたマウスＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質溶液の濃度は正確には求めていないが、濃度が既知の精製ヒトＦＧＦ−２３蛋白質と並べてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＣＢＢ染色で検出したバンドの濃さから判断したところ、図１６Ｂで相対値１０として表したものは、１〜５μｇ／ｍｌの範囲ではないかと考えられた。２Ｃ３Ｂ抗体を固相化し、検出用抗体として３Ｃ１Ｅ抗体を用いて、希釈したマウスＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質溶液を被験物質として測定を実施した結果を図１６Ｂに示す。精製マウスＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質の濃度依存的な４５０ｎｍ−５７０ｎｍ値の上昇が認められたことから、ここで用いた抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡでマウスのＦＧＦ−２３蛋白質を濃度依存的に検出することができることが判明した。また、抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体がマウスＦＧＦ−２３蛋白質を認識しうることが確認できたことから、実施例２７、実施例２８で認められた抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体の作用は、マウスの内在性のＦＧＦ−２３との結合により活性を中和あるいは修飾しているものと考えられた。
（実施例２３）  遺伝性低リン血症モデルマウスにおける血中ＦＧＦ−２３蛋白質の検出
ＦＧＦ−２３が腫瘍性骨軟化症の惹起因子であること、またＡＤＨＲでＦＧＦ−２３遺伝子のミスセンス変異が認められ、疾患惹起にＦＧＦ−２３が関連していることが知られている。しかしながら、もう一つの遺伝性低リン血症疾患であるＸＬＨでは、責任遺伝子が解明されているにもかかわらず、その疾患惹起メカニズムはよく分かっていない。また、ＦＧＦ−２３との関連性についても知られていない。この疾患におけるＦＧＦ−２３の関与を検討する目的でＸＬＨのモデルマウスであるＨｙｐマウスの血中ＦＧＦ−２３濃度の測定を試みた。
ＥＬＩＳＡ実施にあたり２Ｃ３Ｂ抗体を固相化抗体として用い、検出用抗体としてビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体を用いた。精製した２Ｃ３Ｂ抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、４℃で１２時間静置して固相化した。その後、反応液を除去し、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり２５０μｌ加え、室温で３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有するＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。２７〜３０週齢のＨｙｐマウスおよび同腹より得られた正常な対照マウスより眼窩採血により採取した血清を調製した。これを２Ｃ３Ｂ抗体またはアイソタイプコントロールであるマウスＩｇＧ１抗体を４０μｇ／ｍｌの濃度で含むＴ−ＴＢＳで２倍希釈した。それぞれのサンプルを１ウェルあたり５０μｌずつマイクロタイタープレートに加え、室温で１時間静置して検体中のＦＧＦ−２３蛋白質を固相化抗体と反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈した３Ｃ１Ｅ抗体を添加し、室温で３０分間静置して二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温でインキュベートした。３０分間後に、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えて反応を停止させた。測定は９６ウェルプレート用の吸光度測定装置（ＭＴＰ−３００、日本、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値（Ａ４５０−Ａ５７０）を求めた。反応時にアイソタイプコントロール抗体を添加して得たＡ４５０−Ａ５７０値から吸収抗体として用いた２Ｃ３Ｂ抗体を添加して得たＡ４５０−Ａ５７０値を減じた値をＦＧＦ−２３特異的反応とした。その結果を図１７に示す。図１７の結果より、Ｈｙｐマウスでは血中のＦＧＦ−２３濃度が著しく上昇していることが明らかである。ＨｙｐマウスがＰＨＥＸ遺伝子の欠損による低リン血症を呈することと、ヒトの低リン血症疾患であるＸＬＨがＰＨＥＸ遺伝子の変異や欠損が原因であることから、ＨｙｐマウスがＸＬＨのモデルマウスであると考えられている。このことは、ＸＬＨにおいて低リン血症惹起因子としてＦＧＦ−２３血中濃度上昇が存在することが強く示唆される結果である。
（実施例２４）  ＦＧＦ−２３と１，２５Ｄの相互調節作用
（１）  ＦＧＦ−２３Ｈ投与による１，２５Ｄの低下
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス６匹に精製したＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を一匹あたり５μｇ尾静脈より投与し、投与後１，４，９時間経過したところで採血し、血中の１，２５Ｄ濃度を測定した。その結果を図１８Ａに示す。ＦＧＦ−２３Ｈの投与後３時間で有意な１，２５Ｄの低下が認められ、９時間ではさらに低下することが見出された。
（２）  １，２５Ｄ投与によるＦＧＦ−２３の誘導
１，２５Ｄをマウスに投与して血中のＦＧＦ−２３の変化を検討した。７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス６匹を１群として、０．０５％ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳに溶解させた０．０２５μｇの１，２５Ｄを投与する群と、対照としてその媒体である０．０５％ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳを投与する群を設定した。投与は腹腔内に行った。投与後８時間経過したところで、麻酔下で心臓より採血を行い、血清を調製した。このサンプルを実施例２３の方法と同じ方法でＥＬＩＳＡに供し、ヒトＦＧＦ−２３蛋白質標準液を用いて作製した検量線を用いて血中のＦＧＦ−２３量を測定した。その結果を図１８Ｂに示す。１，２５Ｄの投与後８時間で著しい血中ＦＧＦ−２３の上昇が認められた。
以上のことから、ＦＧＦ−２３は、１，２５Ｄと密接な相互調節関係を有することが示された。
（実施例２５）  腎機能不全高リン血症モデルにおける血中ＦＧＦ−２３濃度
７週齢のＷｉｓｔａｒラットに０．７５％の割合でアデニンを混餌したＣＥ−２（日本、クレア社）を与え、腎機能不全高リン血症モデルを作製した。対照群には、ＣＥ−２を与えた。混餌食を与えて３週間目に尾動脈より採血し、血清を採取した。採血後、ラットを代謝ケージ入れて尿を２４時間採取した。血清中のリン酸濃度を測定した。この結果を図１９Ａに示す。血清中および尿中のクレアチニンは、市販のキット（ＣＲＥ−ＥＮカイノス（登録商標）、日本、カイノス社）を用いた酵素法で測定した。この結果を図１９Ｂに示す。また、２Ｃ３Ｂ抗体を固相化し、３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体としたＥＬＩＳＡ系を用いて血清中のＦＧＦ−２３濃度を測定した。この結果を図１９Ｃに示す。
本モデルにおいて腎機能の障害が進行していることが尿中クレアチニンの低下と血中クレアチニンの上昇から明らかであった。また、それに伴い高リン血症を呈していた。このモデルにおいて血中のＦＧＦ−２３蛋白質は著しい高値を示した。このモデルは腎不全の一様態を反映していることが考えられ、ＦＧＦ−２３が腎機能低下や血液透析患者において合併症の惹起因子として作用している可能性を示すものである。
（実施例２６）腫瘍性骨軟化症患者血漿中に存在するＦＧＦ−２３蛋白質の免疫沈降法による検出
血中でのＦＧＦ−２３蛋白質の存在様態を調べるため健常人血漿または腫瘍性骨軟化症患者血漿より免疫沈降法での検出を行った。４００μｌの混合血漿に対して、実施例１４で作製した２Ｃ３Ｂ抗体を固定化したレジンおよび抗体固定化をしていないレジンをそれぞれ２０μｌ添加し、４℃において１時間転倒混和して抗体とＦＧＦ−２３を反応させた。その後ＰＢＳでレジンを４回洗浄し、未反応物を除去した。それぞれのレジンに５０μｌのサンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００１％ブロムフェノールブルー、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＤＴＴ）を添加し、９５℃で５分間加熱したのち、遠心分離して得た上清を回収した。これを１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、セミドライブロッティング装置（米国、Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。このＰＶＤＦ膜をＴ−ＴＢＳ（米国Ｓｉｇｍａ社）で０．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体溶液中で、室温で２時間インキュベーションした後、さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を反応させた。これをＥＣＬプラス発光システム（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてフィルムに１時間露光し、自動現像機（日本国フジフィルム社）で現像した。その結果を図２０に示す。抗体を固定化していないレジンにおいては血漿由来の非特異的なシグナルのみが観察されたが、２Ｃ３Ｂ抗体で免疫沈降した免疫沈降物に関して、腫瘍性骨軟化症患者血漿では全長型ＦＧＦ−２３と考えられる３２ｋＤａにバンドが検出された。また、トロンビンで切断された２２ｋＤａのバンドはまったく観察されなかった。一方、健常人では２２ｋＤ、３２ｋＤのバンドともに観察されなかった。これらの結果から、腫瘍性骨軟化症で高発現しているＦＧＦ−２３は血中では切断を受けずに全長体として存在していることが明らかとなった。
（実施例２７）  正常マウスにおける抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体投与試験
抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体の正常マウスへの影響を検討するため、以下の実験を実施した。正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雄、１２週齢）を４匹ずつからなる５つの群に無作為に分別し、図２１Ａに示すように、第１群には媒体としてＰＢＳを、第２群〜第４群には０．６７ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体（１Ｄ６Ａ、２Ｃ３Ｂ、３Ｃ１Ｅ）を、また第５群には対照として０．６７ｍｇ／ｍｌの抗ＴＰＯモノクローナル抗体を、それぞれ０．１５ｍｌずつ尾静脈内に単回投与した。投与から２４時間後に、エーテル麻酔下、心採血を実施し、マイクロテイナ（米国  ベクトンディッキンソン社）を用いて血清を分離した。得られた血清中のリン酸濃度をリン−テストワコー（日本国  和光純薬社）、血清中のカルシウム濃度をカルシウム−テストワコー（日本国  和光純薬社）、血清１，２５Ｄ濃度を１，２５（ＯＨ）２Ｄ  ＲＩＡキットＴＦＢ（米国  テイエフビー社）をそれぞれ用いて添付の文書に従い測定した。投与から採血までの間、各群毎にプラスチックケージで飼育し、リンおよびカルシウムを１％ずつ含む固形食ＣＥ−２（日本国  日本クレア社）および水道水を自由摂取させた。
得られた結果を図２１Ａに示す。測定値は各群における平均値＋／−標準偏差で表されている。＊を付与した群は、ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、媒体（ＰＢＳ）投与群および抗ＴＰＯ抗体投与群の双方に対し、ｐ＜０．０１を示した群を表す。
（実施例２８）
実施例２７で３Ｃ１Ｅ抗体では血清リン濃度の上昇が認められるにも関わらず、血清１，２５Ｄ濃度が低下しているという結果が認められたが、血中の１，２５Ｄ濃度の変化は俊敏であり、１，２５Ｄ濃度を一過性に上昇させた場合、その後に低値を示すことが知られている。そこで、３Ｃ１Ｅ抗体の投与試験を再度実施した。正常マウス６匹に対して４００μｇ／ｈｅａｄの３Ｃ１Ｅ抗体を静脈内投与して、８時間後の血清１，２５Ｄ濃度を測定した。対照としてＰＢＳを投与して同様に処置したマウスの血清１，２５Ｄ濃度を測定した。その結果を図２１Ｂに示す。この実験では、３Ｃ１Ｅ抗体による著しい血清１，２５Ｄ濃度の上昇が認められた。
（実施例２９）  アデニン誘発腎不全ラットでの抗ＦＧＦ−２３抗体（３Ｃ１Ｅ）の１，２５（ＯＨ）２Ｄ回復作用
実施例２５に記載したように、アデニン誘発腎不全ラットではモデル作製から３週間目において有意な血清リン濃度および血中ＦＧＦ−２３濃度の上昇が認められる。一方、本モデルでは、アデニン投与後７日目においてすでに、腎機能低下に伴った血中１，２５Ｄ濃度の低下も認められる（図２２Ａ）。そこで、この腎機能障害初期における血中ＦＧＦ−２３濃度についても比較検討するため、下記の要領で定量を行った。
ＥＬＩＳＡ測定には、固相化抗体として２Ｃ３Ｂ抗体を、検出用抗体としてビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体を用いた。まず、精製した２Ｃ３Ｂ抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で５μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、４℃で１２時間静置して固相化した。その後、反応液を除去し、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり２５０μｌ加え、室温で３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有するＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。血清を調製し、これをＴ−ＴＢＳで２倍希釈した。また標準物の希釈は、実施例１４で作製した抗２Ｃ３Ｂ抗体固定化レジンに供し、内在性のＦＧＦ−２３を除去したラット血清をＴ−ＴＢＳで２倍希釈したもので行った。それぞれのサンプルを１ウェルあたり５０μｌずつマイクロタイタープレートに加え、室温で１時間静置して検体中のＦＧＦ−２３蛋白質を固相化抗体と反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで１．５μｇ／ｍｌに希釈した３Ｃ１Ｅ抗体を添加し、室温で３０分間静置して二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温でインキュベートした。３０分間後に、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えて反応を停止させた。測定は９６ウェルプレート用の吸光度測定装置を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で減じた値（Ａ４５０−Ａ５７０）を求め、検量線から組換えヒトＦＧＦ−２３蛋白質精製物に換算した濃度を算出した。
その結果、図２２Ｂに示すように、アデニン混餌群における血中ＦＧＦ−２３濃度は有意な上昇を示していた。ところで、実施例２４に示したように、正常マウスへのＦＧＦ−２３投与は血中１，２５Ｄ濃度を速やかに低下させ得ることから、腎機能低下時における血中１，２５Ｄの低下と、血中ＦＧＦ−２３濃度の上昇の間には何らかの相互作用が存在することが示唆される。この可能性を検証するため、アデニン混餌後の血中１，２５Ｄ濃度と血中ＦＧＦ−２３濃度を個体別にプロットしたところ、有意な負の一次相関を示すこと（図２２Ｃ）が明らかとなった。これらの結果から、血中ＦＧＦ−２３濃度を制御することで、血中１，２５Ｄ低下を是正し得る可能性が示唆された。そこで、本モデルへの抗ＦＧＦ−２３中和抗体投与試験を以下の要領で実施した。
７週齢雄性Ｗｉｓｔｅｒラット１２匹に、げっ歯類用市販粉末飼料ＣＥ−２（日本、クレア社）にアデニン（６−ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ、米国、シグマ社）を終濃度０．７５％となるよう配合した混合飼料を７日間自由摂餌させることにより、腎機能低下モデルとした。対照群１２匹には、ＣＥ−２のみを与えた。モデル作製から７日後の血中クレアチンの値を指標に腎機能障害程度が同等となるよう、アデニン混餌群、対照群をそれぞれ６匹ずつ２群に分け、３Ｃ１Ｅ抗体を１ｍｇ／ｋｇ、または媒体としてＰＢＳを１ｍｌ／ｋｇ、それぞれ尾静脈内単回投与し、１２時間後に尾動脈より部分採血し、これを遠心分離することにより血清を得た。得られた血清中の１，２５Ｄ濃度を１，２５（ＯＨ）２Ｄ  ＲＩＡキットＴＦＢ（米国  テイエフビー社）、血清クレアチニン濃度をＣＲＥ−ＥＮカイノス（（登録商標）、日本、カイノス社）をそれぞれ用いて測定した。
その結果、図２２Ｄに示すように、対照群、アデニン混餌群いずれにおいても、媒体投与群に比し有意な１，２５Ｄ濃度の上昇を認めた。以上の結果から、腎機能低下に伴う低１，２５Ｄ血症にはＦＧＦ−２３が関与していること、またこの時ＦＧＦ−２３の作用を抑制することで低１，２５Ｄ血症を改善し得ることが示唆された。
（実施例３０）  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ（ＸＬＨ）患者における血中ＦＧＦ−２３蛋白質の検出
ＸＬＨは伴性遺伝形質を示す低リン血症性クル病であり、その病態には腫瘍性骨軟化症と共通点が多く認められる。近年、原因遺伝子としてメタロエンドペプチダーゼファミリーに属するｐｈｅｘが同定され、その仮想基質が病態の惹起因子であることが示唆されている。一方、実施例２３に示したように、ＸＬＨと同じｐｈｅｘに遺伝子変異を伴った遺伝性低リン血症性モデルマウスであるＨｙｐマウスにおいてＦＧＦ−２３の血中濃度が極めて高値であることが判明している。これらの事象から、ＸＬＨにおける低リン血症が、腫瘍性骨軟化症と同様に、血中ＦＧＦ−２３濃度の上昇に起因する可能性が示唆された。そこでまず、この疾患におけるＦＧＦ−２３の関与を検討する目的で健常人およびＸＬＨ患者血清中のＦＧＦ−２３濃度の測定を実施した。なお測定に供した血清は、健常人およびｐｈｅｘ遺伝子変異を確認したＸＬＨ患者より、事前に十分な承認を得た上で提供されたものである。患者の年齢、性別、ｐｈｅｘ遺伝子の変異位置は図２３に記載した。
ＥＬＩＳＡ測定には、固相化抗体として２Ｃ３Ｂ抗体を、検出用抗体としてビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体を用いた。まず、精製した２Ｃ３Ｂ抗体を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液で１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、４℃で１２時間静置して固相化した。その後、反応液を除去し、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）、米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり２５０μｌ加え、室温で３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有するＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。ＸＬＨ患者より採取した血清を調製し、これをＦＧＦ−２３に結合性を持たないマウスＩｇＧ１抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度で含むＴ−ＴＢＳで２倍希釈した。また標準物の希釈は、実施例１４で作製した抗２Ｃ３Ｂ抗体固定化レジンに供し、内在性のＦＧＦ−２３を除去した健常人血清を、ＦＧＦ−２３に結合性を持たないマウスＩｇＧ１抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度で含むＴ−ＴＢＳで２倍希釈したもので行った。それぞれのサンプルを１ウェルあたり５０μｌずつマイクロタイタープレートに加え、室温で１時間静置して検体中のＦＧＦ−２３蛋白質を固相化抗体と反応させた。抗体反応後、Ｔ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで１．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体を添加し、室温で３０分間静置して二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、１０％のブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ（登録商標）、日本、大日本製薬社）を含むＴ−ＴＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン標識抗体と結合させた。各ウェルをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加えて室温でインキュベートした。３０分間後に、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えて反応を停止させた。測定は９６ウェルプレート用の吸光度測定装置を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５９５ｎｍの吸光度で減じた値（Ａ４５０−Ａ５９５）を求めた。
その結果、健常成人１０４名（男性３０名、女性７４名）の血中ＦＧＦ−２３濃度値は、８．２〜５４．３ｎｇ／ｌの範囲に集約し、これらの平均値およびその標準誤差は２８．９＋／−１．１ｎｇ／ｌであった。一方、図２３に示すように、ＸＬＨ患者における血清中ＦＧＦ−２３濃度値は、いずれも健常人の平均値に比して高値を示し、また平均値においても健常人のそれに対し有意に高値であった（ｐ＜０．０００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔにより算出）。このことから、ＸＬＨ患者血清中における高濃度のＦＧＦ−２３は、当該疾患の惹起因子として作用している可能性が強く示唆された。
（実施例３１）  ２種類の異なる中和抗体を混合した時の中和活性の増強作用
異なる部位を認識する中和抗体を混合した場合の生理作用の変化について、正常マウスを用いて検討した。
８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６を６匹ずつからなる４つの群に無作為に分別し、第１群には媒体としてＰＢＳを、第２群にはマウス１匹あたり１００μｇの２Ｃ３Ｂ抗体を、第３群には１００μｇの３Ｃ１Ｅ抗体を、また第４群には５０μｇの２Ｃ３Ｂ抗体および５０μｇの３Ｃ１Ｅ抗体を混和した抗体をそれぞれ尾静脈内に単回投与した。投与から１日目および２日目に、エーテル麻酔下、眼窩採血を実施しマイクロテイナ（米国  ベクトンディッキンソン社）を用いて血清を分離した。得られた血清中のリン酸濃度をリン−テストワコー（日本  和光純薬社）を用いて添付の文書に従い測定した。投与から採血の間各群毎にプラスチックケージで飼育し、ＣＥ−２（日本  日本クレア社）および水道水を自由摂取させた。
得られた結果を図２４に示す。１００μｇの２Ｃ３Ｂ抗体あるいは３Ｃ１Ｅ抗体は、投与後１日目に単独で有意に血清リン濃度を上昇させた。一方、混合抗体投与群では、各抗体の用量が半減しているにもかかわらず、有意な血清リン上昇作用を示し、また単独投与群のいずれに比しても、有意な高値を示した。さらに、投与後２日目においては、２Ｃ３Ｂ抗体あるいは３Ｃ１Ｅ抗体投与群では、血清リン上昇作用が消失したのに対し、混合抗体投与群では依然有意に血清リン濃度を上昇させていた。以上の結果より、２種類の異なる部位を認識する抗体を混合した方が１種類の抗体を単独に投与した時より、中和活性が増強され、かつその作用時間が維持され得ることが示された。
（実施例３２）  遺伝性低リン血症性モデルマウスにおけるＦＧＦ−２３中和抗体投与試験
実施例２３および実施例３０に示したように、ＸＬＨならびにＨｙｐマウスにおける血中ＦＧＦ−２３濃度の上昇が明らかとなり、ＦＧＦ−２３がこれら疾患の病態である低リン血症、ビタミンＤ代謝異常あるいは骨石灰化障害の責任因子である可能性が示唆された。そこで、Ｈｙｐマウスに抗ＦＧＦ−２３中和モノクローナル抗体を投与し、上述の病態が改善され得るかどうか検討した。
（１）抗ＦＧＦ−２３中和抗体の反復投与試験
４〜７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈｙｐマウスおよび同腹の野性型雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、中和抗体の反復投与による、Ｈｙｐマウスの血中リン酸濃度および血中１，２５Ｄ濃度に対する効果を検討した。本試験における群構成は、野性型マウス媒体投与群、野性型マウス抗体投与群、Ｈｙｐマウス媒体投与群、Ｈｙｐマウス抗体投与群の４群で、１群４匹とした。抗体投与群には、３Ｃ１Ｅ抗体及び２Ｃ３Ｂ抗体をそれぞれ終濃度１．７ｍｇ／ｍｌとなるよう混和したものをマウス一匹あたり１７ｍｇ／ｋｇの用量で背部皮下に投与し、抗体投与群における抗体投与と同容量に相当する１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳをマウス一匹あたりに投与した。さらに初回投与後２，４，６日目において同様の投与を行った。初回投与から１日後および７日後に、エーテル麻酔下で尾部末端を切開して部分採血を行った。血中リン酸、１，２５Ｄ濃度、および血中総アルカリ性フォスファターゼ活性の測定には、それぞれピーテストワコー（登録商標、日本、和光純薬）、カルシウムテストワコー（登録商標、日本、和光純薬）、１，２５（ＯＨ）２Ｄ  ＲＩＡキットＴＦＢ（米国、テイエフビー社）、ならびにアルカリ性フォスファＢテストワコー（登録商標、日本、和光純薬）を使用した。
この結果を図２５Ａに示す。野性型マウス抗体投与群では、投与後１日目から７日目にかけて顕著な血中リン酸濃度の上昇を認めた。Ｈｙｐマウスへの抗体投与においても、投与後１日目で媒体投与群に比し有意な血中リン酸濃度の上昇を認めた。この上昇は投与後７日目でより顕著となり、野性型マウス抗体投与群と同程度の値を示した。また、中和抗体投与により、野生型マウスおよびＨｙｐマウスいずれにおいても、投与後１日目で著しい血中１，２５Ｄ濃度の上昇を認めた。他方、ＨｙｐマウスあるいはＸＬＨ等の低リン血症性くる病において血中総アルカリホスファターゼ活性の異常な上昇が報告されている。Ｈｙｐマウスへの中和抗体投与は、この正常マウスに比べて異常高値を示す血中総アルカリホスファターゼ活性を投与２４時間後より減弱せしめ、さらには初回投与後７日目において野生型マウスと同程度の活性にまで有意に低下させることが明らかとなった。
４〜７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｈｙｐマウス（Ｈｙｐマウス）および正常対照群である同腹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野性型マウス（野性型マウス）を用いて、抗ＦＧＦ−２３中和抗体の反復投与による、Ｈｙｐマウスの骨組織に対する効果を検討した。本試験における群構成は、野性型マウス媒体投与群、野性型マウス抗体投与群、Ｈｙｐマウス媒体投与群、Ｈｙｐマウス抗体投与群の４群で、１群４匹とした。抗体投与群には３Ｃ１Ｅ抗体及び２Ｃ３Ｂ抗体をそれぞれ終濃度１．７ｍｇ／ｍｌとなるよう混和した溶液を調製し、マウス一匹あたり１７ｍｇ／ｋｇの用量で背部皮下に投与した。媒体投与群には、マウス一匹あたり１０ｍｌ／ｋｇのＰＢＳを背部皮下に投与した。初回投与日を０日目として、２，４，６，８，２１，４０日目において同様の投与を行った。初回投与後４９日目に、エーテル麻酔下で心採血を行った後に右大腿骨、右脛骨及び肋骨の採材を行った。摘出大腿骨、脛骨及び肋骨のＸ線拡大画像は、マイクロフォーカスＸ線拡大撮像システムμＦＸ−１０００（日本、富士フィルム）を用いて１００μＡ，２５ｋＶの出射条件で５秒間のＸ線照射により撮影し、ＢＡＳイメージングアナライザー（日本、富士フィルム）を用いてデジタル画像化することにより得た。
得られた摘出大腿骨、脛骨及び肋骨のＸ線拡大画像を図２７に示す。ＨｙｐマウスあるいはＸＬＨ等の低リン血症性くる病において、石灰化障害に伴い認められる軟骨細胞増加と長管骨骨幹端部や肋骨における骨軟骨移行部の肥大化が報告されている。Ｘ線画像解析の結果、Ｈｙｐマウス媒体投与群に認められる大腿骨及び脛骨の骨幹端部の肥大化、骨密度の低下、並びに皮質骨の菲薄化について、Ｈｙｐマウス抗体投与群において改善傾向が認められた。さらにＨｙｐマウス媒体投与群において認められる大腿骨及び脛骨の長軸方向へ伸長不全も、Ｈｙｐマウス抗体投与群において改善傾向が認められた。また、Ｈｙｐマウス媒体投与群の肋骨・肋軟骨接合部の肥大化もＨｙｐマウス抗体投与群では消失した。Ｈｙｐマウスへの抗ＦＧＦ−２３中和抗体の反復投与は、骨の伸長障害と石灰化障害を改善させることが明らかとなった。
さらに抗ＦＧＦ−２３抗体の骨組織に対する作用を詳細に検討する目的で、本試験に供した動物の骨組織標本を作製した。屠殺後、左脛骨および左大腿骨を摘出し、７０％エタノールで固定した後にＶｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｂｏｎｅ染色（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｂｏｎｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｐｏｗｄｅｒ、日本、マルトー）を行い、順次濃度を上昇させたエタノール溶液で脱水した後Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７１００（独国、クルツァー）に包埋した。約５μｍの厚さに薄切し、脛骨近位部および大腿骨遠位部について顕微鏡下で観察した。その骨組織標本像を図２８に示す。野生型マウスでは、軟骨細胞が整然と配列した成長板が認められるのに対して（図２８Ａ、Ｄ）、Ｈｙｐマウスの骨組織では、成長板領域の拡大と軟骨細胞の不規則な配列を特徴とする柱状構造が乱れた領域が観察された（図２８Ｂ、Ｅ）。これに対し、ＦＧＦ−２３に対する中和抗体を反復投与したＨｙｐマウスでは、成長板幅の拡大が抑制され、軟骨細胞の不規則な配列も消失していることが観察された（図２８Ｃ、Ｆ）。
（２）抗ＦＧＦ−２３中和抗体の単回投与試験
１２〜２０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈｙｐマウスおよび同腹の野性型雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、中和抗体の単回投与による、Ｈｙｐマウスの血中リン酸濃度および血中１，２５Ｄ濃度に対する効果を検討した。本試験における群構成は、野性型マウス媒体投与群（ｎ＝４）、野性型マウス抗体投与群（ｎ＝５）、Ｈｙｐマウス媒体投与群（ｎ＝３）、Ｈｙｐマウス抗体投与群（ｎ＝３）の４群とした。抗体投与群には、３Ｃ１Ｅ抗体及び２Ｃ３Ｂ抗体をそれぞれ終濃度１．７ｍｇ／ｍｌとなるよう混和したものをマウス一匹あたり１７ｍｇ／ｋｇの用量で背部皮下に単回投与し、媒体投与群にはＰＢＳをマウス一匹あたり１０ｍｌ／ｋｇの用量で投与した。投与から４日後に、エーテル麻酔下、心採血および腎臓の摘出を行った。
得られた血清中のリン酸および１，２５Ｄ濃度の測定結果を図２５Ｂに示す。野生型マウスへの抗体単回投与により、４日目の血清リン酸、１，２５Ｄは共に有意な上昇を示した。この上昇作用はＨｙｐマウスにおいても認められ、抗体投与により、低下していた血清リン酸濃度は正常レベルにまで是正し、１，２５Ｄ濃度は有意な上昇を示した。
（３）抗ＦＧＦ−２３中和抗体によるＮａＰｉ２ａおよび１αＯＨａｓｅの発現制御作用
血清リン酸濃度は、主に腎臓近位尿細管に存在するナトリウム依存性リン酸共役輸送単体（ＮａＰｉ２ａ）による再吸収率により決定される。また、その再吸収率は、ＮａＰｉ２ａ自身の発現量あるいはＮａＰｉ２ａ蛋白質の局在比率によって制御されることが、すでに報告されている。そこで、抗ＦＧＦ−２３中和抗体による血清リン酸上昇作用が、ＮａＰｉ２ａを介するものであるかどうか検討した。
凍結融解した腎臓よりＮａＰｉ２ａが局在する腎臓近位尿細管刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）を、ＫａｔａｉらがＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐｐ．２８８４５−２８８４８，１９９９ですでに報告したカルシウム沈殿法に準じて調製した。得られたＢＢＭＶを２０μｇずつ実施例１６に記載した方法に準じて、ウエスタンブロッティングに供した。ＮａＰｉ２ａ蛋白質の検出には、マウスＮａＰｉ２ａ蛋白質のＣ末端部分ペプチド（配列番号３２）を、実施例５と同様にウサギに免疫して得られた抗血清より精製した抗マウスＮａＰｉ２ａウサギポリクローナル抗体を用いて行った。その結果を図２５Ｃに示す。ＨｙｐマウスＢＢＭＶ上のＮａＰｉ２ａ蛋白質レベルは、著しく低下していることはすでに報告されている。しかし、抗ＦＧＦ−２３中和抗体の投与により、このＮａＰｉ２ａの発現は顕著に増加していた。また、野生型マウスに対しても、さらなるＮａＰｉ２ａ蛋白質の上方修正が認められた。さらに、上述のＢＢＭＶを用いて、ＮａＰｉ２ａ蛋白質によるリン酸輸送活性を測定した。各個体より調製したＢＢＭＶを各々０．１ｍｇずつ用い、迅速濾過法により６０秒間のナトリウム依存性のリン酸取り込み活性を測定した。試薬、反応条件は、ＫａｔａｉらがＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐｐ．２８８４５−２８８４８，１９９９で報告している方法に準じた。その結果、図２５Ｃに示すように、野生型マウス、Ｈｙｐマウスのいずれにおいても、抗体投与によりリン酸輸送活性の上昇を認めた。これらの結果から、抗ＦＧＦ−２３中和抗体による野生型マウス、あるいはＨｙｐマウスにおける血清リン酸濃度上昇作用は、腎臓近位尿細管に存在するＮａＰｉ２ａ蛋白質レベルの上方修正に起因することが示唆された。
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次に、血清１，２５Ｄ濃度上昇の作用機序を解明するために、腎臓２５ヒドロキシビタミンＤ−１α水酸化酵素（１αＯＨａｓｅ）の発現様式を解析した。凍結した腎臓よりトータルＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ試薬（日本、ニッポンジーン）を用いて抽出した。得られたＲＮＡを２０μｇずつ定法に従いノザンブロッティングに供した。ハイブリダイゼーションはＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ試薬（日本、東洋紡）を用い、ブロットの反応および洗浄は添付の文書に従った。プローブには、マウス腎臓より作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、配列番号３３、３４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法により増幅したマウス１αＯＨａｓｅ部分ｃＤＮＡ、または内部標準として配列番号３５、３６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法により増幅したグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）部分ｃＤＮＡを、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（米国、アマシャムバイオサイエンス）を用いて３２Ｐ標識したものを用いた。シグナルの検出は、ＢＡＳイメージングアナライザー（日本、富士フィルム）を用いて行った。その結果を図２５Ｄに示す。中和抗体の投与により、野生型マウスならびにＨｙｐマウスにおいて、顕著な１αＯＨａｓｅの発現亢進が確認された。この結果から、抗ＦＧＦ−２３中和抗体による野生型マウス、あるいはＨｙｐマウスにおける血清１，２５Ｄ濃度上昇作用は、腎臓に存在する１αＯＨａｓｅの遺伝子発現レベルの亢進に起因することが示唆された。
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以上の結果より、Ｈｙｐマウス、即ちヒトＸＬＨにおける血中リン酸濃度低下、血中１，２５Ｄ低下にはＦＧＦ−２３が強く関与しており、抗ＦＧＦ−２３抗体投与によるＦＧＦ−２３作用阻害によりこれらの病態が改善され得る可能性が示唆された。またさらに、Ｈｙｐマウスにおける血中総アルカリホスファターゼ活性の異常高値、並びに骨の伸長障害、骨石灰化障害が抗ＦＧＦ−２３抗体投与により正常化したことから、骨代謝回転の正常化を伴った骨軟化症の寛解も期待される。
（実施例３３）  抗ＦＧＦ−２３抗体（３Ｃ１Ｅ）の骨代謝に対する作用
実施例３２（１）に記載したように、抗ＦＧＦ−２３抗体の骨代謝回転に対する作用が示唆された。これをさらに検討するべく、抗ＦＧＦ−２３抗体投与後の血清中オステオカルシン濃度変化を経時的に解析した。実験は以下のようにして行った。７週齢の雄性Ｓ．Ｄ．ラットに３Ｃ１Ｅ抗体を３ｍｇ／ｋｇ、または媒体（ＰＢＳ）を１．１ｍｌ／ｋｇ、尾静脈内へ単回投与した。投与後４，１２，２４，４８，７２時間目において、尾動脈より部分採血し血清を調製した。血清オステオカルシン濃度はオステオカルシンＥＬＩＳＡキット（日本、アマシャム  バイオサイエンス株式会社）を用いて測定した。結果を図２６に示す。抗体投与後１２，２４，４８時間目において、血清オステオカルシン濃度の有意な上昇が認められた。この結果は、抗ＦＧＦ−２３抗体の投与が、直接的あるいは間接的に骨代謝回転に影響を及ぼし得る可能性を示唆するものである。
（実施例３４）抗ＦＧＦ−２３中和抗体（２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体混合）の骨粗鬆症モデルマウスに対する作用
実施例３３に記載した抗ＦＧＦ−２３中和抗体の骨代謝に対する作用をさらに検討する目的で、閉経後骨粗鬆症に認められる骨減少を反映すると考えられる卵巣摘出骨減少モデルマウスに対する抗ＦＧＦ−２３抗体の作用を検討した。８週齢の雌性ｄｄｙマウスの卵巣を摘出し、媒体投与群と抗ＦＧＦ−２３抗体投与群の２群に分けた。また、手術対照群として偽手術を施した偽手術群を設定した。手術３日後から週３回、４週間にわたり、抗体投与群（ｎ＝１０）には、２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体を同量混合した抗ＦＧＦ−２３抗体（３ｍｇ／ｋｇ；２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体それぞれが１．５ｍｇ／ｋｇ）を背部皮下に投与した。また媒体投与群（ｎ＝９）および偽手術群（ｎ＝１０）には媒体としてＰＢＳを抗体溶液と同容量（１０ｍｌ／ｋｇ）投与した。卵巣摘出から２週目にエーテル麻酔下において眼窩採血を実施した。また卵巣摘出から４週目にエーテル麻酔下において心採血を行った。採取した血液から８０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ遠心分離により血清を調製し、血清オステオカルシン（ＩＲＭＡキット、Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ，Ｉｎｃ．）の測定に供した。さらに卵巣摘出から４週目の心採血による屠殺後、大腿骨を摘出し、骨塩量および骨密度（骨塩量測定装置  ＤＣＳ−６００形、アロカ株式会社）を測定した。
図２９Ａ、Ｂに示すように、卵巣摘出から２週目、４週目どちらにおいても、抗ＦＧＦ−２３抗体（２Ｃ３Ｂ、３Ｃ１Ｅ混合）を反復投与した群で、媒体投与群に比して有意な血清オステオカルシンの上昇を認めた。オステオカルシンは骨芽細胞が特異的に産生する蛋白質であり、生体において血清オステオカルシン値の上昇が骨形成の指標とされていることから、抗ＦＧＦ−２３抗体投与が、骨形成を促進させている可能性が示された。
さらに、図３０Ａ、Ｂに示すように、卵巣摘出媒体投与群は、偽手術媒体投与群に比して有意な骨減少を示したが、この卵巣摘出による有意な骨塩量、骨密度の低下に対して、抗ＦＧＦ−２３抗体を投与した卵巣摘出群の骨塩量、骨密度は、有意な高値を示した。これらのことから、抗ＦＧＦ−２３抗体投与は、卵巣摘出により生じる骨減少を抑制したと考えられる。
（実施例３５）  遺伝性低リン血症性くる病モデルマウスにおける抗ＦＧＦ−２３中和抗体（２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体混合）投与試験
実施例３２に記載したように抗ＦＧＦ−２３中和抗体はＨｙｐマウスにおける骨の伸長障害および石灰化障害を寛解することが示された。そこで、実施例３２で用いたマウスよりもより低週齢の成長が著しい４週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈｙｐマウス及び同腹の野生型雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、Ｈｙｐマウスにおける骨伸長障害及び骨石灰化障害に対する上記の抗ＦＧＦ−２３中和抗体の作用をさらに詳細に検討した。本試験における群構成は、野生型マウス媒体（ＰＢＳ）投与群、Ｈｙｐマウス媒体（ＰＢＳ）投与群、Ｈｙｐマウス低用量抗体投与群、Ｈｙｐマウス高用量抗体投与群の４群で、１群６−７匹とした。用いた中和抗体は２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体を同濃度含む混合液を使用し、２種の抗体の総量が低用量群、高用量群でそれぞれ４ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇの用量となるように調製した。中和抗体あるいは媒体は、初回投与日を０日目として、７、１４、２１、２８日目にマウスの背部皮下に１０ｍＬ／ｋｇの容量で反復投与した。体重、尾部全長及び脛骨全長は、抗体投与日と同日に測定した。また、初回投与日より３１日目にエーテル麻酔下心採血により屠殺し、左右の大腿骨及び脛骨を摘出した。
（１）抗ＦＧＦ−２３中和抗体による尾部全長・脛骨全長の伸長作用及び体重増加作用
Ｈｙｐマウスの骨は、長管骨の長軸方向への伸長障害などの特徴的な骨発育不全を伴う、クル病様所見を呈し、個体としても野生型マウスと比較してあきらかに体長が短く、体重も少ない。このようなＨｙｐマウスの発育不全に対する抗ＦＧＦ−２３中和抗体投与の効果を検討するために、試験に用いたＨｙｐマウスの尾部全長・脛骨全長の計測、及び体重の変化について検討した。この結果を図３１Ａ、Ｂ、Ｃに示す。本試験においても正常マウスに比してＨｙｐマウスは著しい尾部および脛骨の低伸長度および低体重を呈した。また、Ｈｙｐマウス媒体投与に比べて、Ｈｙｐマウスへの中和抗体投与は、用量依存的に尾部全長・脛骨全長の伸長作用および体重増加作用を示した。
（２）抗ＦＧＦ−２３中和抗体による骨石灰化作用
Ｈｙｐマウスの骨組織は、正常マウスに比して未石灰化及び低石灰化骨の割合が多く、ミネラル含有量が低いことが知られている。そこで、抗ＦＧＦ−２３中和抗体により、Ｈｙｐマウス大腿骨の骨ミネラル含有量の増加作用が得られるかどうか検討した。本試験で摘出左大腿骨を乾燥機にて１００℃で１２時間乾燥させた後に、その重量を測定して乾燥重量とした。次に、この乾燥骨をマッフル炉において６００℃、１２時間の加熱により灰化し、その重量を測定して骨灰分重量とした。この結果を図３２に示す。Ｈｙｐマウスの乾燥骨重量に対する骨灰重量は、野生型マウスに対し非常に低値である。Ｈｙｐマウス抗体投与群の乾燥骨重量に対する骨灰分重量は、反復投与した中和抗体の用量に依存して有意に増加した。特に、高用量抗体投与群においては野生型マウス群とほぼ同程度の値を示すまでの改善が認められた。
これらの結果より、抗ＦＧＦ−２３中和抗体の投与によりＦＧＦ−２３作用の阻害することでＨｙｐマウスが呈する骨伸長障害、骨石灰化障害を改善することができることが明らかとなった。
（実施例３６）  ２Ｃ５Ｌ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＦＧＦ−２３蛋白質の定量的測定
実施例３で取得したクローン化ハイブリドーマ２Ｃ５Ｌが産生する２Ｃ５Ｌ抗体を実施例４に従い精製した。実施例１０に記載した方法でその認識部位を解析したところ、２Ｃ５Ｌ抗体は、２Ｃ３Ｂ抗体と同様に配列番号１のアミノ酸残基２５〜１７９番目に相当するＮ末側断片ポリペプチド内に認識部位を有し、かつＮ末側断片ポリペプチドおよびＦＧＦ−２３全長蛋白質と免疫複合体を形成することが判明した。また、実施例１２に記載した要領で、２Ｃ５Ｌ抗体と２Ｃ３Ｂ抗体の組み合わせによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法の確立を試みた。それぞれの抗体とＦＧＦ−２３蛋白質との結合において、両者は互いに競合阻害をしないことが明らかとなった。この結果から、２Ｃ５Ｌ抗体は、アミノ酸残基２５〜１７９番目に相当するＮ末側断片ポリペプチド内に認識部位を有しているが、同じくＮ末側断片ポリペプチド内に認識部位を有している２Ｃ３Ｂ抗体とは、認識部位が異なる抗体であることから、両者を組み合わせたＥＬＩＳＡ法が可能であることが判明した。次に、実施例１３に記載した方法で、ビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体として、２Ｃ３Ｂ抗体または２Ｃ５Ｌ抗体を固相化抗体としてそれぞれ用いた際のＦＧＦ−２３蛋白質の検出能を検討した。その結果を図３３に示す。２Ｃ５Ｌ抗体は１０ｐｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの範囲で組換えヒトＦＧＦ−２３精製物を濃度依存的に認識することが確認された。
（実施例３７）  ２Ｃ５Ｌ抗体とマウスＦＧＦ−２３の反応交差性
２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の組み合わせのサンドイッチＥＬＩＳＡ系において実施例２２、２３において示されたようにマウスＦＧＦ−２３もヒトＦＧＦ−２３と同様に認識可能であった。そこで、２Ｃ５Ｌ抗体がマウスＦＧＦ−２３を認識可能かどうか検討した。実施例２４と同様に血中ＦＧＦ−２３高値のマウスの血清を取得し、２Ｃ３Ｂ抗体、ビオチン化標識３Ｃ１Ｅ抗体の組み合わせで測定した結果、約６００ｐｇ／ｍｌを示したサンプルを得た。本サンプルについて、２Ｃ５Ｌ抗体、ビオチン化標識３Ｃ１Ｅ抗体の組み合わせでは実施例３６と同様なサンドイッチＥＬＩＳＡ系を検討したところ、全く反応性が観察されなかった。この結果より、２Ｃ５Ｌ抗体はヒトＦＧＦ−２３には強い結合能を有するが、マウスＦＧＦ−２３には非常に弱い結合能しか有さない、もしくは結合能を有さないことが示された。
（実施例３８）  ２Ｃ５Ｌ抗体のヒトＦＧＦ−２３に対する中和活性能の測定
実施例３７の結果から、２Ｃ５Ｌ抗体は、２Ｃ３Ｂ抗体あるいは３Ｃ１Ｅ抗体に比しマウスＦＧＦ−２３に対する結合能が非常に低いことから、マウス内在性ＦＧＦ−２３への中和活性能も著明ではないことが示唆される。しかしながら実施例３６の結果より２Ｃ５Ｌ抗体はヒトＦＧＦ−２３には強い結合能を持つことから、ヒト内在性ＦＧＦ−２３への中和活性能を有する可能性がある。この可能性を検証するため、動物を用いたヒトＦＧＦ−２３中和活性の測定系を以下の要領で構築し、これを用いて２Ｃ５Ｌ抗体のヒト内在性ＦＧＦ−２３に対する中和活性を検討した。
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮下に、ヒトＦＧＦ−２３組換え体を１．２μｇ／ｄａｙの用量で徐放するよう調整した浸透圧ミニポンプ（ａｌｚｅｔ  ｍｉｃｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐｍｏｄｅｌ  １００７Ｄ、カナダ、ＤＵＲＥＣＴ社）を移植し、ヒトＦＧＦ−２３組換え体持続投与モデルを構築した。このモデルに、２Ｃ５Ｌを含む抗ＦＧＦ−２３中和抗体もしくは媒体をポンプ移植後３日目に腹腔内投与することで、持続的に存在するヒト組換え体ＦＧＦ−２３による血清リン酸濃度低下作用を抑制させ得るかどうか検討した。本試験における群構成は、無処置マウスへ媒体を投与した群（無処置／媒体）、ヒトＦＧＦ−２３組換え体持続投与モデルへ媒体を投与した群（ＦＧＦ−２３／媒体）、ヒトＦＧＦ−２３組換え体持続投与モデルへ２Ｃ５Ｌ抗体を投与した群（ＦＧＦ−２３／２Ｃ５Ｌ）ならびにヒトＦＧＦ−２３組換え体持続投与モデルへ２Ｃ３Ｂ抗体を投与した群（ＦＧＦ−２３／２Ｃ３Ｂ）の四群とした。媒体及び抗体の希釈にはＰＢＳを使用し、抗ＦＧＦ−２３中和抗体は２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。媒体及び中和抗体は、体重１０ｇあたり０．１ｍＬの容量で投与した。抗体投与前及び抗体投与２４時間後に、エーテル麻酔下で眼窩採血を行い血清を得た。血清中リン酸濃度の測定には、ピーテストワコー（登録商標、日本、和光純薬）を使用した。
結果を以下に示す。ヒトＦＧＦ−２３組換え体を浸透圧ミニポンプを用いて持続投与することで、ポンプ移植後３日目には未処置マウス媒体投与群に比し著明な血中リン濃度の低下を認めた（図３４左）。これらのヒトＦＧＦ−２３組換え体投与群に２Ｃ５Ｌ抗体を投与したところ（ＦＧＦ−２３／２Ｃ５Ｌ群）、２４時間後における血清リン酸濃度低下作用がＦＧＦ−２３／媒体投与群あるいは抗体投与前に比し有意に抑制され、無処置／媒体投与群の血清リン濃度と同程度まで寛解した（図３４右）。以上の結果ならびに実施例３７の結果から、２Ｃ５Ｌ抗体は持続投与したヒトＦＧＦ−２３組換え体依存的な血中リン酸低下作用に対して中和活性を示すことが明らかとなった。一方、２Ｃ３Ｂ抗体投与群では、２４時間後の血清リン濃度は無処置／媒体投与群よりも著しく高値を示した。この結果はマウスＦＧＦ−２３と強い結合能を有する２Ｃ３Ｂ抗体が、投与したヒトＦＧＦ−２３組換え体のみならず、内在性のマウスＦＧＦ−２３に対しても中和活性を示したためと考えられる。
産業上の利用可能性
本発明により、ＦＧＦ−２３に対する抗体が提供される。本発明の抗体は、生体内のＦＧＦ−２３を適切に検出、測定することにより、ＦＧＦ−２３蛋白質の蓄積又は減少を伴う疾患や病的状態を診断するために有用である。さらに、本発明の抗体はＦＧＦ−２３の作用を中和する活性を有していることからＦＧＦ−２３が過剰に作用することで生じる疾患や病的状態において、ＦＧＦ−２３の作用を抑制することにより該疾患や病的状態を治療または緩和し得る。
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１Ａは、ＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈ細胞培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抗ＦＧＦ−２３ポリクローナル抗体でウエスタンブロッティングにより組換え体ＦＧＦ−２３蛋白質およびその代謝物を検出した図である。培養上清中には全長のＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質と配列番号１のアミノ酸配列の配列番号１７９番目と１８０番目の間で切断されたて生じたＮ末側断片とＣ末側断片が存在する。ｈＦＧＦ２３−４８抗体およびｈＦＧＦ２３−１４８抗体で、全長のＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質とＮ末側断片ペプチドが認識された。Ｎ末側断片は小断片化されたペプチドの存在が認められる。抗Ｈｉｓ６−ｔａｇ抗体では、全長蛋白質とＣ末側断片が検出された。（実施例２）
図１Ｂは、ＣＨＯ−ＦＧＦ２３細胞培養上清から精製したＦＧＦ−２３全長蛋白質とＮ末側断片およびＣ末側断片をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、ＣＢＢ染色して検出した図である。（実施例２）
図１Ｃは、ＣＨＯ−ＦＧＦ２３ＨとＣＨＯ−ＦＧＦ２３ＲＱ細胞培養上清をそれぞれ採取し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抗ＦＧＦ２３−１４８抗体でウェスタンブロティングにより組換え体ＦＧＦ−２３蛋白質、組換え体ＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質およびそれらの代謝物を検出した図である。（実施例５）
図２は、抗ＦＧＦ−２３ポリクローナル抗体であるｈＦＧＦ２３−２５抗体を固相化し、検出用抗体としてｈＦＧＦ２３−２３７抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡでＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質の測定を実施した図である。（実施例７）
図３は、抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体でＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を免疫沈降し、それをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、２Ａ２Ｂ抗体および１Ｃ３Ｈ抗体で検出した結果を示す図である。（実施例１０）
図４は、抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を固相化し、抗ＦＧＦ−２３ポリクローナル抗体で検出を行うサンドイッチＥＬＩＳＡにて精製したＦＧＦ−２３Ｈ全長蛋白質、Ｎ末側断片ポリペプチド、Ｃ末側断片ポリペプチドを検出した結果を示す図である。（実施例１１）
図５は、ＦＧＦ−２３蛋白質の全長蛋白質とその切断部位および抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体の認識部位を模式的に表した図である。（実施例１２）
図６は、２Ｃ３Ｂ抗体を固相化抗体として用い、検出抗体として１Ｃ３Ｈ抗体、１Ｄ６Ａ抗体および３Ｃ１Ｅ抗体を用いたＥＬＩＳＡ系で精製したＦＧＦ−２３蛋白質を定量的に測定した結果を示す図である。（実施例１３）
図７は、ＣＨＯ−ＦＧＦ２３Ｈ細胞を移植したヌードマウスより採取した血清に含まれるＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を１Ｃ３Ｈ抗体、１Ｄ６Ａ抗体、および２Ｃ３Ｂ抗体を固定化したレジンを用いて免疫沈降法で回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、２Ａ２Ｂ抗体および１Ｃ３Ｈ抗体で検出した結果を示す図である。（実施例１５）
図８は、２０ｎｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質にラット血清を終濃度で５０％になるように添加して混和し、０、０．５、１、２、４、８、２４時間インキュベートすることで生じる代謝物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングにて検出した結果を示す図である。（実施例１６）
図９は、２０ｎｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質にヒト血清またはヒト血漿を終濃度５０％になるように添加して３７℃で３時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施して、精製ＦＧＦ−２３蛋白質に由来する代謝物を検出した結果を示す図である。（実施例１６）
図１０は、２０ｎｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質にトロンビンを終濃度１ｕｎｉｔ／ｍｌで添加し、３時間インキュベートした後、この溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施し、精製ＦＧＦ−２３蛋白質に由来する代謝物を検出した結果を示す図である。（実施例１７）
図１１は、トロンビン選択的阻害剤であるヒルジンの存在下および非存在下で２０ｎｇの精製したＦＧＦ−２３蛋白質にラットの血清を終濃度５０％になるように添加して４時間インキュベートし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、２Ａ２Ｂ抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施して、精製ＦＧＦ−２３蛋白質に由来する代謝物を検出した結果を示す図である。（実施例１７）
図１２は、１０μｇの精製ＦＧＦ−２３蛋白質とラットの血清を２４時間混和して２２ｋＤａのポリペプチドを生成させた。この２２ｋＤａのポリペプチドを抗２Ａ２Ｂ抗体カラムで精製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、２２ｋＤａポリペプチドをＣＢＢ染色で同定したことを示す図である。（実施例１８）
図１３は、２Ｃ３Ｂ抗体を固相化し３Ｃ１Ｅ抗体または１Ｄ６Ａ抗体で検出するＥＬＩＳＡ系を用いて、腫瘍性骨軟化症患者の原因腫瘍摘出前後で採取した血液サンプル中のＦＧＦ−２３蛋白質を測定した結果を示す図である。（実施例１９）
図１４は、腫瘍性骨軟化症患者の原因腫瘍摘出前後で採取した血液サンプル中のＦＧＦ−２３蛋白質を定量化した結果を示す図である。（実施例１９）
図１５は、腫瘍性骨軟化症患者より摘出した腫瘍組織中のＦＧＦ−２３蛋白質の存在を免疫組織染色にて検出した結果を示す図である。（実施例２０）
図１６Ａは、精製したマウスＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抗ヒトＦＧＦ−２３モノクローナル抗体である３Ｃ１Ｅ抗体でウエスタンブロッティングを実施してマウスＦＧＦ−２３ＲＱ蛋白を検出した結果を示す図である。（実施例２２）
図１６Ｂは、精製したマウスＦＧＦ−２３蛋白質を段階希釈して、２Ｃ３Ｂ抗体を固相化し、検出用抗体として３Ｃ１Ｅ抗体を用いて、マウスＦＧＦ−２３蛋白質溶液を測定した結果を示す図である。（実施例２２）
図１７は、２Ｃ３Ｂ抗体を固相化し、検出用抗体として３Ｃ１Ｅ抗体を用いたＥＬＩＳＡ系を用いて、２７〜３０週齢のＨｙｐマウスおよび対照マウスより採取した血清中の内在性のＦＧＦ−２３蛋白質を測定した結果を示す図である。（実施例２３）
図１８Ａは、６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス６匹に精製したＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質を一匹あたり５μｇ投与し、投与後１，４，９時間経過したところで採血し、血清中の１，２５Ｄ濃度を測定した結果を示す図である。（実施例２４）
図１８Ｂは、７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス６匹に０．０２５μｇの１，２５Ｄを腹腔内に投与し、投与後８時間経過したところで採血を行い、血清中のＦＧＦ−２３量を測定した結果を示した図である。（実施例２４）
図１９Ａは、７週齢のＷｉｓｔａｒラットに０．７５％の割合でアデニンを混餌したＣＥ−２（日本、クレア社）を与え、腎機能不全高リン血症モデルを作製した。対照群には、ＣＥ−２を与えた。混餌食を与えて３週間後に採血し血清中のリン酸濃度を測定した結果を示す図である。（実施例２５）
図１９Ｂは、７週齢のＷｉｓｔａｒラットに０．７５％の割合でアデニンを混餌したＣＥ−２（日本、クレア社）を与え、腎機能不全高リン血症モデルを作製した。対照群には、ＣＥ−２を与えた。混餌食を与えて３週間後に採血したのち、ラットを代謝ケージ入れて尿を２４時間採取した。血清中および尿中のクレアチニンの濃度を測定した結果を示す図である。（実施例２５）
図１９Ｃは、７週齢のＷｉｓｔａｒラットに０．７５％の割合でアデニンを混餌したＣＥ−２（日本、クレア社）を与え、腎機能不全高リン血症モデルを作製した。対照群には、ＣＥ−２を与えた。混餌食を与えて３週間後に採血した。２Ｃ３Ｂ抗体を固相化し、３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体としたＥＬＩＳＡ系を用いて血清中のＦＧＦ−２３濃度を測定した結果を示す図である。（実施例２５）
図２０は、腫瘍性骨軟化症患者血漿中に存在するＦＧＦ−２３蛋白質の免疫沈降法により検出した図である。（実施例２６）
図２１Ａは、各種モノクローナル抗体および媒体を投与後、２４時間目における血清中リン酸、カルシウム、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を示した図である。（実施例２７）
図２１Ｂは、３Ｃ１Ｅモノクローナル抗体および媒体を投与後、８時間目における血清中１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を示した図である。（実施例２８）
図２２Ａは、アデニン混餌食飼育群（ａｄｅｎｉｎｅ）あるいは通常食飼育群（ｃｏｎｔｒｏｌ）における、飼育開始から７日目の血清中１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を示した図である。測定値は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例２９）
図２２Ｂは、アデニン混餌食飼育群（ａｄｅｎｉｎｅ）あるいは通常食飼育群（ｃｏｎｔｒｏｌ）における、飼育開始から７日目の血清ＦＧＦ−２３濃度を示した図である。測定値は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例２９）
図２２Ｃは、アデニン混餌食飼育群における、飼育開始から７日目の血清ＦＧＦ−２３濃度と１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度とを個体別にプロットした相関図である。（実施例２９）
図２２Ｄは、飼育開始から７日間経過したアデニン混餌食飼育群（ａｄｅｎｉｎｅ）あるいは通常食飼育群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に、３Ｃ１Ｅ抗体投与もしくは媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与し、１２時間後における血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の変化を示した図である。測定値は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例２９）
図２３は、Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ（ＸＬＨ）患者６名の性別、同定されたｐｈｅｘ遺伝子の変異部位、採血時年齢、および血清中のＦＧＦ−２３濃度を示した図である。
（実施例３０）
図２４は、正常マウスに２Ｃ３Ｂ抗体、３Ｃ１Ｅ抗体、二つの抗体の混合物または媒体（ＰＢＳ）を投与した後１日目（ｄａｙ  １）ならびに２日目（ｄａｙ  ２）の血清リン酸濃度を示した図である。測定値は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、媒体投与群に比しそれぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１であったことを示す。ａ，ｂはＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例３１）
図２５Ａは、野生型マウス（ＷＴ）およびＨｙｐマウス（Ｈｙｐ）に２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物（Ａｂ）または媒体（ＰＢＳ）を反復投与した後、１、７日目における血中リン酸濃度、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度、総アルカリフォスファターゼ活性を示した図である。血中リンならびにアルカリフォスファターゼ活性値は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であったことを示す。血中１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度は、各群ごと等量ずつ混和した血漿を用いて測定した結果である。（実施例３２）
図２５Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）およびＨｙｐマウス（Ｈｙｐ）に２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物（Ａｂ）または媒体（ＰＢＳ）を単回投与した後、４日目における血中リン酸濃度、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を示した図である。結果は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であったことを示す。（実施例３２）
図２５Ｃは、野生型マウス（ＷＴ）およびＨｙｐマウス（Ｈｙｐ）に２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物（Ａｂ）または媒体（ＰＢＳ）を単回投与した後、４日目における腎臓より調製したＢＢＭＶのＮａＰｉ２ａ蛋白質の発現量をウエスタンブロッティング法で解析した図（上段）、ならびにそれらのリン酸輸送活性を示した図（下段）である。試験に供したＢＢＭＶの蛋白質量を補正するため、ウエスタンブロッティングに用いたブロットをＣＢＢ染色しｂｅｔａ−ａｃｔｉｎを染色した像を同時に示してある。リン酸輸送活性の結果は平均値＋／−標準偏差で表されており、それぞれｎ＝３である。（実施例３２）
図２５Ｄは、野生型マウス（ＷＴ）およびＨｙｐマウス（Ｈｙｐ）に２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物（Ａｂ）または媒体（ＰＢＳ）を単回投与した後、４日目における腎臓より調製したＲＮＡを用いて、１αＯＨａｓｅ遺伝子の発現変化を解析したノザンブロッティングである。（実施例３２）
図２６は、正常ラットに３Ｃ１Ｅ抗体または媒体を投与した後の、血中オステオカルシン濃度の経時変化を示した図である。結果は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であったことを示す。（実施例３３）
図２７は、野生型マウス（ＷＴ）およびＨｙｐマウス（Ｈｙｐ）に２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物（Ａｂ）または媒体（ＰＢＳ）を投与した後に摘出した大腿骨、脛骨及び肋骨のＸ線拡大画像を示す図である。（実施例３２）
図２８は、２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の抗体混合物を反復投与したＨｙｐマウス（Ｈｙｐ／抗体）の脛骨近位部、大腿骨遠位部の骨組織像を、媒体を投与したＨｙｐ（Ｈｙｐ／媒体）および野生型マウス（野生型／媒体）の当該領域の組織像と比較して示した図である。摘出した脛骨及び大腿骨はＶｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｂｏｎｅ染色を施した。これらを樹脂包埋した後に５μｍの厚さの非脱灰切片標本としたものである。可視光下で類骨は紫色、石灰化骨は薄橙色、低石灰化骨は薄茶色、細胞包体は薄紫色に染め分けられている。（実施例３２）
図２９Ａは、偽手術マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ｓｈａｍ／ＰＢＳ）および卵巣摘出処置マウスに２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物を投与した群（ＯＶＸ／Ａｂｓ）または卵巣摘出処置マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ＯＶＸ／ＰＢＳ）を作製し卵巣摘出後２週目における血中オステオカルシン濃度（ＩＲＭＡキット、Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を示した図である。血中オステオカルシン濃度は平均値＋／−標準誤差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１であったことを示す。（実施例３４）
図２９Ｂは、偽手術マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ｓｈａｍ／ＰＢＳ）および卵巣摘出処置マウスに２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物を投与した群（ＯＶＸ／Ａｂｓ）または卵巣摘出処置マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ＯＶＸ／ＰＢＳ）））を作製し卵巣摘出後４週目における血中オステオカルシン濃度（ＩＲＭＡキット、Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を示した図である。血中オステオカルシン濃度は平均値＋／−標準誤差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１であったことを示す。（実施例３４）
図３０Ａは、偽手術マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ｓｈａｍ／ＰＢＳ）および卵巣摘出処置マウスに２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物を投与した群（ＯＶＸ／Ａｂｓ）または卵巣摘出処置マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ＯＶＸ／ＰＢＳ）を作製し卵巣摘出後４週目における大腿骨骨塩量を示した図である。大腿骨骨塩量、骨密度は平均値＋／−標準誤差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例３４）
図３０Ｂは、偽手術マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ｓｈａｍ／ＰＢＳ）および卵巣摘出処置マウスに２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体の混合物を投与した群（ＯＶＸ／Ａｂｓ）または卵巣摘出処置マウスに媒体（ＰＢＳ）を投与した群（ＯＶＸ／ＰＢＳ）を作製し卵巣摘出後４週目における骨密度（骨塩量測定装置  ＤＣＳ−６００形、アロカ株式会社）を示した図である。大腿骨骨塩量、骨密度は平均値＋／−標準誤差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例３４）
図３１Ａは、Ｈｙｐマウスに媒体（Ｈｙｐ／媒体）、２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体混合物４ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体低用量）、または同混合物１６ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体高用量）を、野生型マウスにまたは媒体（野生型／媒体）を週１回反復皮下投与したときの尾椎骨全長を定期的に測定した結果を示した図である。結果は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれＨｙｐ媒体投与群に比べｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例３５）
図３１Ｂは、Ｈｙｐマウスに媒体（Ｈｙｐ／媒体）、２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体混合物４ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体低用量）、または同混合物１６ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体高用量）を、野生型マウスにまたは媒体（野生型／媒体）を週１回反復皮下投与したときの脛骨長を定期的に測定した結果を示した図である。結果は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれＨｙｐ媒体投与群に比べｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例３５）
図３１Ｃは、Ｈｙｐマウスに媒体（Ｈｙｐ／媒体）、２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体混合物４ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体低用量）、または同混合物１６ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体高用量）を、野生型マウスにまたは媒体（野生型／媒体）を週１回反復皮下投与したときの体重変化を定期的に測定した結果を示した図である。結果は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊，＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、それぞれＨｙｐ媒体投与群に比べｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１であったことを示す。（実施例３５）
図３２は、Ｈｙｐマウスに媒体（Ｈｙｐ／媒体）、２Ｃ３Ｂ抗体と３Ｃ１Ｅ抗体混合物４ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体低用量）、または同混合物１６ｍｇ／ｋｇ（Ｈｙｐ／抗体高用量）を、野生型マウスにまたは媒体（野生型／媒体）を週１回反復皮下投与し、３１日後に摘出した大腿骨を灰化した時の、灰重量が乾燥骨重量に占める割合を示した図である。結果は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより有意差検定を実施した結果、Ｈｙｐ媒体投与群に比べｐ＜０．００１であったことを示す。
図３３は、２Ｃ３Ｂ抗体または２Ｃ５Ｌ抗体を固相化抗体として用い、検出抗体として３Ｃ１Ｅ抗体を用いたＥＬＩＳＡ系で精製したＦＧＦ−２３蛋白質を定量的に測定した結果を示した図である。（実施例３６）
図３４は、無処置正常マウスに媒体を投与した群（無処置／媒体）、浸透圧ポンプを用いてヒト組換えＦＧＦ−２３を持続投与させた後、媒体（ＦＧＦ−２３／ＰＢＳ）、２Ｃ５Ｌ抗体（ＦＧＦ−２３／２Ｃ５Ｌ）および２Ｃ３Ｂ抗体（ＦＧＦ−２３／２Ｃ３Ｂ）をそれぞれ投与した群の、抗体投与前ならびに投与後２４時間目における血中リン酸濃度を示した図である。結果は平均値＋／−標準偏差で表されている。＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより抗体投与前各群に関して有意差検定を実施した結果、それぞれ媒体投与群に比べｐ＜０．００１であったことを示す。＊、＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより各群抗体投与前、投与２４時間後に関して有意差検定を実施した結果、それぞれｐ＝０．０１、ｐ＜０．００１であったことを示す。＋、＋＋、＋＋＋はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔにより抗体投与後各群に関して有意差検定を実施した結果、それぞれＦＧＦ−２３／ＰＢＳ抗体投与後２４時間群に比べｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であったことを示す。（実施例３８）
【図１Ａ】
2003057733.tif 000033
【図１Ｂ】
2003057733.tif 000034
【図１Ｃ】
2003057733.tif 000035
【図２】
2003057733.tif 000036
【図３】
2003057733.tif 000037
【図４】
2003057733.tif 000038
【図５】
2003057733.tif 000039
【図６】
2003057733.tif 000040
【図７】
2003057733.tif 000041
【図８】
2003057733.tif 000042
【図９】
2003057733.tif 000043
【図１０】
2003057733.tif 000044
【図１１】
2003057733.tif 000045
【図１２】
2003057733.tif 000046
【図１３】
2003057733.tif 000047
【図１４】
2003057733.tif 000048
【図１５】
2003057733.tif 000049
【図１６Ａ】
2003057733.tif 000050
【図１６Ｂ】
2003057733.tif 000051
【図１７】
2003057733.tif 000052
【図１８Ａ】
2003057733.tif 000053
【図１８Ｂ】
2003057733.tif 000054
【図１９Ａ】
2003057733.tif 000055
【図１９Ｂ】
2003057733.tif 000056
【図１９Ｃ】
2003057733.tif 000057
【図２０】
2003057733.tif 000058
【図２１Ａ】
2003057733.tif 000059
【図２１Ｂ】
2003057733.tif 000060
【図２２Ａ】
2003057733.tif 000061
【図２２Ｂ】
2003057733.tif 000062
【図２２Ｃ】
2003057733.tif 000063
【図２２Ｄ】
2003057733.tif 000064
【図２３】
2003057733.tif 000065
【図２４】
2003057733.tif 000066
【図２５Ａ】
2003057733.tif 000067
【図２５Ｂ】
2003057733.tif 000068
【図２５Ｃ】
2003057733.tif 000069
【図２５Ｄ】
2003057733.tif 000070
【図２６】
2003057733.tif 000071
【図２７】
2003057733.tif 000072
【図２８】
2003057733.tif 000073
【図２９Ａ】
2003057733.tif 000074
【図２９Ｂ】
2003057733.tif 000075
【図３０Ａ】
2003057733.tif 000076
【図３０Ｂ】
2003057733.tif 000077
【図３１Ａ】
2003057733.tif 000078
【図３１Ｂ】
2003057733.tif 000079
【図３１Ｃ】
2003057733.tif 000080
【図３２】
2003057733.tif 000081
【図３３】
2003057733.tif 000082
【図３４】
2003057733.tif 000083
【国際調査報告】
2003057733.tif 000084
2003057733.tif 000085
2003057733.tif 000086
2003057733.tif 000087