(57)【要約】下記式一般式〔Ｉ〕2003103667.tif 000022（式中、Ｒはハロゲンを含む置換基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基である）で表されるピリジノール誘導体もしくはその互変異性体である下記一般式〔ＩＩ〕2003103667.tif 000023（式中、Ｒはハロゲンを含む置換基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基である）で表される２−ピリドン誘導体、またはそれらの塩を含有する化合物を有効成分とする電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤であって、ｎＭオーダーで複合体ＩＩを強い活性で阻害する。それ故、２−ピリジノール誘導体もしくはその互変異性体である２−ピリドン誘導体は、複合体ＩＩ阻害剤として有用である。
2003103667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式〔Ｉ〕
2003103667.tif 000016
（式中、Ｒはハロゲンを含む置換基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基である）で表されるピリジノール誘導体もしくはその互変異性体である下記一般式〔ＩＩ〕
2003103667.tif 000017
（式中、Ｒはハロゲンを含む置換基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基である）で表される２−ピリドン誘導体、またはそれらの塩を含有する化合物を有効成分とする電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項２】
前記の複合体ＩＩ阻害剤が、下記式〔ＩＩＩ〕
2003103667.tif 000018
で表されるアトペニンＡ４である請求の範囲１記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項３】
上記の式〔ＩＩＩ〕で表されるアトペニンＡ４がウシ心臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲２記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項４】
上記の式〔ＩＩＩ〕で表されるアトペニンＡ４がラット肝臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲２記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項５】
上記の式〔ＩＩＩ〕で表されるアトペニンＡ４がブタ回虫複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲２記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項６】
前記の複合体ＩＩ阻害剤が、下記式〔ＩＶ〕
2003103667.tif 000019
で表されるアトペニンＡ５である請求の範囲１記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項７】
上記の式〔ＩＶ〕で表されるアトペニン５がウシ心臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲６記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項８】
上記の式〔ＩＶ〕で表されるアトペニン５がラット肝臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲６記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項９】
上記の式〔ＩＶ〕で表されるアトペニン５がブタ回虫複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲６記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１０】
前記の複合体ＩＩ阻害剤が、下記式〔Ｖ〕
2003103667.tif 000020
で表されるアトペニンＢである請求の範囲１に記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１１】
上記の式〔Ｖ〕で表されるアトペニンＢがウシ心臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲１０記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１２】
上記の式〔Ｖ〕で表されるアトペニンＢがラット肝臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲１０記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１３】
上記の式〔Ｖ〕で表されるアトペニンＢがブタ回虫複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲１０記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１４】
前記の複合体ＩＩ阻害剤が、下記式〔ＶＩ〕
2003103667.tif 000021
で表されるハージアノピリドンである請求の範囲１記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１５】
上記の式〔ＶＩ〕で表されるハージアノピリドンがウシ心臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲１４記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１６】
上記の式〔ＶＩ〕で表されるハージアノピリドンがラット肝臓複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲１４記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１７】
上記の式〔ＶＩ〕で表されるハージアノピリドンがブタ回虫複合体ＩＩに対して阻害活性を有する請求の範囲１４記載の電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤。
【請求項１８】
電子伝達系の複合体ＩＩに対して阻害活性を有する前記の式〔ＩＩＩ〕で表されるアトペニンＡ４、式〔ＩＶ〕で表されるアトペニンＡ５および式〔Ｖ〕で表されるアトペニンＢを産生する微生物が、ペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−１２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０４８）である微生物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、例えばミトコンドリアでアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を合成するための酸化的リン酸化を司る電子伝達系に関与するタンパク質複合体に関し、更に詳しくは電子伝達系の複合体ＩＩ（コハク酸−ユビキノン酸化還元酵素）阻害剤に関する。
背景技術
ミトコンドリアでＡＴＰを合成するための酸化的リン酸化を司る電子伝達系には主として４種のタンパク質複合体が関与し、複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶと呼ばれている（内海耕慥・井上正康監修：新ミトコンドリア学、８−１３頁、金森崇・太田成男著：電子伝達とエネルギー転換系、共立出版、２００１年）。この複合体のうち、複合体Ｉ（ＮＡＤＨ−ユビキノン酸化還元酵素）、複合体ＩＩＩ（ユビキノール−シトクロムｃ酸化還元酵素）、及び複合体ＩＶ（シトクロムｃ酸化還元酵素）に対しては、それぞれ優れた阻害剤が知られており、生化学研究などにおいて用いられている（内海耕慥・井上正康：新ミトコンドリア学、４２４−４２６頁、内海耕慥著：ミトコンドリアのエネルギー転換研究に用いられる阻害剤一覧、共立出版、２００１年）。
複合体ＩＩ（コハク酸−ユビキノン酸化還元酵素）阻害剤としては、テノイルトリフルオロアセトン（ｔｈｅｎｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）などがよく用いられていたが、その阻害濃度はμＭオーダという活性の弱いものであった（日本生化学会編：生化学実験講座１２エネルギー代謝と生体酸化（上）２１５−２５５頁、香川靖雄・浅野朗著：ミトコンドリアおよびその構成成分の調整法、東京化学同人、１９７６年）。またカルボキシンがこれまで知られていた複合体ＩＩ阻害剤としては最も強い阻害活性を示すと言われていたが（Ｐ．Ｃ．Ｍｏｗｅｒｙ，Ｂ．Ａ．Ｃ．Ａｃｋｒｅｌｌ，ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｓｉｎｇｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ．７１．ｐ３５４−３６１、１９７６）、複合体Ｉ阻害剤のロテノン（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）や複合体ＩＩＩ阻害剤のアンチマイシン等と比較するとかなり弱い活性であった（日本生化学会編：生化学実験講座１２エネルギー代謝と生体酸化（上）２１５−２５５頁、香川靖雄・浅野朗著：ミトコンドリアおよびその構成成分の調整法、東京化学同人、１９７６年）。
発明の開示
そこで本発明者らは、電子伝達系の複合体ＩＩに対する優れた阻害剤の探索を行った。その結果、２−ピリジノール誘導体もしくはその互変異性体の２−ピリドン誘導体である既知の抗生物質アトペニンＡ４、アトペニンＡ５、アトペニンＢ及びハージアノピリドンに意外にも優れた複合体ＩＩ阻害活性を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、その目的とするところは複合体ＩＩ阻害剤としてこれまでに用いられていたテノイルトリフルオロアセトンやカルボキシンに比べ極めて高い阻害活性を示し、生化学研究などに用いて極めて有益となり得る電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤を提供するものである。
すなわち、本発明は、下記一般式〔Ｉ〕
2003103667.tif 000003
（式中、Ｒはハロゲンを含む置換基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基である）で表される２−ピリジノール誘導体もしくはその互変異性体である下記一般式〔ＩＩ〕
2003103667.tif 000004
（式中、Ｒはハロゲンを含む置換基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基である）で表される２−ピリドン誘導体、またはそれらの塩を含有する化合物を有効成分とする電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関する。
アルキル基としては例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル等が挙げられ、アルケニル基としては例えば、１−プロペニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、ゲラニル等が挙げられる。
本発明はまた、下記式〔ＩＩＩ〕
2003103667.tif 000005
で表されるアトペニンＡ４である電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関し、該阻害剤はウシ心臓複合体ＩＩ、ラット肝臓複合体ＩＩ、ブタ回虫複合体ＩＩのいずれかに対して阻害活性を有する電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関する。
本発明はまた、下記式〔ＩＶ〕
2003103667.tif 000006
で表されるアトペニンＡ５である電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関し、該阻害剤はウシ心臓複合体ＩＩ、ラット肝臓複合体ＩＩ、ブタ回虫複合体ＩＩのいずれかに対して阻害活性を有する電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関する。
本発明はまた、下記式〔Ｖ〕
2003103667.tif 000007
で表されるアトペニンＢである電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関し、該阻害剤はウシ心臓複合体ＩＩ、ラット肝臓複合体ＩＩ、ブタ回虫複合体ＩＩのいずれかに対して阻害活性を有する電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関する。
本発明は更にまた、下記式〔ＶＩ〕
2003103667.tif 000008
で表されるハージアノピリドンである電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関し、該阻害剤はウシ心臓複合体ＩＩ、ラット肝臓複合体ＩＩ、ブタ回虫複合体ＩＩのいずれかに対して阻害活性を有する電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤に関する。
本発明は更にまた、電子伝達系の複合体ＩＩに対して阻害活性を有する前記の式〔ＩＩＩ〕で表されるアトペニンＡ４、式〔ＩＶ〕で表されるアトペニンＡ５、及び式〔Ｖ〕で表されるアトペニンＢを産生する微生物が、ペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−１２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０４８）である微生物に関する。
本発明に用いた既知の抗生物質アトペニンＡ４、アトペニンＡ５、及びアトペニンＢは、本発明の発明者らのうち、大村智、供田洋らがペニシリウム  エスピ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−１２５菌株の培養液中に抗真菌活性を有する物質を見出し、ＦＯ−１２５Ａ４、Ａ５、Ｂと命名して特許出願を行った抗真菌抗生物質である（特開平１−１９９５８２号）。従って、本物質アトペニンＡ４、Ａ５、及びＢは、特開平１−１９９５８２号に記載の方法、あるいはその変法にしたがって、ペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｌｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−１２５菌株を培養し、その培養液を精製することにより、得ることができる。
すなわち、本菌株を種培養後、ジャーファーメンターで培養し、培養液を遠心分離して上清を得る。これを酢酸エチルで抽出し、濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ヘキサン−酢酸エチル系で溶出する。こうして得られたアトペニン各成分粗物質を、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム−メタノール系で溶出することにより、単一なアトペニンＡ４、Ａ５、Ｂを得ることができる。また、上記アトペニン各成分粗物質は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を含んだアセトニトリルを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーを１回または繰り返し行うことによっても、単一なアトペニンＡ４、Ａ５、Ｂを得ることができる。
上記のアトペニンＡ４、Ａ５、Ｂを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．ＦＯ−１２５菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ  ３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］に所在する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］に平成１４年（２００２）５月２２日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０４８が付与された。
本菌株Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．ＦＯ−１２５の菌学的性状については特開平１−１９９５８２号に述べてあるが、本菌株は再寄託のため、以下にその菌学的性状の概要を説明する。
（ａ）形態的性質
本菌株は、麦芽汁寒天培地、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地などで比較的良好に生育し、分生子の着生も良好である。ＹｐＳｓ培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は透明で隔壁を有しており、分生子柄は基底菌糸より直生している。
ペニシラスは複輪生−対称体である。大きさは変化に富み、まれに単輪生体も認められる。基底梗子の大きさは１５〜２０×３〜４μｍで３〜５個着生する。梗子はペン先型で３〜６個群生し、大きさは１０〜１５×２〜４μｍである。
はじめはフィアロ型分生子が梗子の頂端に１個着生し、培養時間の経過とともに連鎖状となり、最終的にはこの連鎖は１５０μｍ前後に達する。電子顕微鏡で観察すると、分生子は楕円形で、大きさは２．２〜３．１×１．６〜２．０μｍであり、その表面は平滑である。
（ｂ）各培地上での性状
各種培地上で２７℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果を下記の第１表に示す。
2003103667.tif 000009
2003103667.tif 000010
（ｃ）生理学的、生態的性状
本菌株の最適生育条件は、ＹｐＳｓ培地においてｐＨ４〜８、温度２２〜３３℃である。本菌株の生育範囲はＹｐＳｓ培地においてｐＨ２〜９、温度１５〜３９℃であり、好気性菌である。
前記の諸性状を有するペニシリウム  エスピー  ＦＯ−１２５菌株から得られたアトペニンＡ４、アトペニンＡ５及びアトペニンＢの理化学的性状は文献記載値と一致した（Ｓ．Ｏｍｕｒａ，Ｈ．Ｔｏｍｏｄａ，Ｋ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｄ．−Ｚ．Ｚｈｅｎ，Ｈ．Ｋｕｍａｇａｉ，Ｋ．Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｎ．Ｉｍａｍｕｒａ，Ｙ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｉｗａｉ、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．第４１巻、１７６９−１７７３頁、１９８８年、およびＨ．Ｋｕｍａｇａｉ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｎ．Ｉｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｔｏｍｏｄａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｏｍｕｒａ、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．第４３巻、１５５３−１５５８頁、１９９０年）。
本物質アトペニンＡ４、Ａ５及びＢの理化学的性状を要約すると以下のとおりである。
［アトペニンＡ４］
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子量：３３１
（３）分子式：Ｃ１５Ｈ２２ＮＯ５Ｃｌ
（４）紫外部吸収極大（エタノール中）：２３５ｎｍ、２６７ｎｍ、３２０ｎｍに極大吸収を有する。
（５）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：１６４５、１６００、１４４０、１３２０、１２００、１１６０、９９５ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（６）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）及びＪは結合定数（Ｈｚ）：δ４．１９（３Ｈ，ｓ）、４．１８（１Ｈ，ｍ）、４．１４（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝３．１，６．７）、３．８０（３Ｈ，ｓ）、１．８２（１Ｈ，ｍ）、１．７６（１Ｈ，ｍ）、１．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６．２，６．２，１２．４）、１．４５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７）、１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８）、０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７）。
（７）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）：δ２１０．１、１７１．１、１６１．８、１５５．５、１２１．２、１００．５、６３．１、６１．５、５７．９、３９．９、３７．７、３７．１、２２．７、１７．７、１４．１。
以上、各種理化学的性状やスペクトルデータから、本アトペニンＡ４物質は下記式〔ＩＩＩ〕で表される化学構造と解析された。
2003103667.tif 000011
［アトペニンＡ５］
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子量：３６５
（３）分子式：Ｃ１５Ｈ２１ＮＯ５Ｃｌ２
（４）紫外部吸収極大（エタノール中）：２３７ｎｍ、２７２ｎｍ、３２０ｎｍに極大吸収を有する。
（５）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：１６４５、１６００、１４４０、１３２０、１２００、１１６０、９９５ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（６）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）及びＪは結合定数（Ｈｚ）：δ４．２１（３Ｈ，ｓ）、４．２１（１Ｈ，ｍ）、４．１１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．６，５．９，８．５）、３．７７（３Ｈ，ｓ）、３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９，１１．２）、３．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１１．２）、２．１６（１Ｈ，ｍ）、１．９０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝７．１，８．１，１３．６）、１．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６．５，７．３，１３．６）、１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８）、０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５）。
（７）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）：δ２０９．８、１７２．５、１６１．９、１５５．２、１２０．９、１００．８、６５．４、６１．６、５８．３、４５．９、３９．３、３７．５、３２．５、１８．０、１２．９。
以上、各種理化学的性状やスペクトルデータから、本アトペニンＡ５物質は下記式〔ＩＶ〕で表される化学構造と解析された。
2003103667.tif 000012
［アトペニンＢ］
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子量：２９７
（３）分子式：Ｃ１５Ｈ２３ＮＯ５
（４）紫外部吸収極大（エタノール中）：２３７ｎｍ、２７０ｎｍ、３１８ｎｍに極大吸収を有する。
（５）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：１６４５、１６００、１４４０、１３２０、１２００、１１６０、９９５ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（６）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中の化学シフト（ｐｐｍ）及びＪは結合定数（Ｈｚ）：δ４．３０（１Ｈ，ｍ）、３．７８（３Ｈ，ｓ）、３．７１（３Ｈ，ｓ）、１．７１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．３，５．９，１２．５）、１．３８（１Ｈ，ｍ）、１．３３（１Ｈ，ｍ）、１．２１（１Ｈ，ｍ）、１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６）、１．０６（１Ｈ，ｍ）、０．７１（３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３，７．３）、０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４）。
（７）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中の化学シフト（ｐｐｍ）：δ２１１．７、１６５．８、１６２．６、１５９．９、１２４．９、１００．６、６０．６、５４．３、４１．９、４１．１、３０．６、２１．０、１９．１、１７．１、１１．７。
以上、各種理化学的性状やスペクトルデータから、本アトペニンＢ物質は下記式〔Ｖ〕で表される化学構造と解析された。
2003103667.tif 000013
［ハージアノピリドン］
ハージアノピリドン（Ｈａｒｚｉａｎｏｐｙｒｉｄｏｎｅ）は、Ｆ．Ｔｒｅｃｏｕｒｔ，Ｍ．Ｍａｌｌｅｔ，Ｏ．Ｍｏｎｇｉｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｑｕｅｇｕｉｎｅｒの方法（Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．第３２巻、１１１７−１１２４頁、１９９５年）にしたがって合成することができる。すなわち、２，３−ジメトキシピリジンより４段階で６−ブロモ−２，３−ジメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカーバメートを得て、ピリドンに変換し、これを（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル（ＳＥＭ）基で保護する。これにブチルリチウムを加え（４Ｅ）−２−メチル−４−ヘキセナールと反応させることで得られるアルコールを、ピリジニウムクロロクロメートでケトンに酸化し、次いでカーバメートおよびＳＥＭの脱保護を行うことでハージアノピリドンを合成できる。得られたハージアノピリドンの理化学的性状は文献記載値と一致した（Ｊｕｌｉａ  Ｍ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｒ．Ｈａｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｂ．Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ、１８８５−１８８７頁、１９８９年）。
本ハージアノピリドン物質の理化学的性状を要約すると以下のとおりである。
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子量：２８１
（３）分子式：Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ５
（４）紫外部吸収極大（エタノール中）：２４３ｎｍ、２６７ｎｍ、３３１ｎｍに極大吸収を有する。
（５）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：１７２５、１６５０、１６００、７２０ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（６）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）及びＪは結合定数（Ｈｚ）：δ１６．４（１Ｈ，ｓ）、１２．３（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）、５．４２（１Ｈ，ｍ）、５．３８（１Ｈ，ｍ）、４．１７（３Ｈ，ｓ）、３．９５（１Ｈ，ｍ）、３．７９（３Ｈ，ｓ）、２．４５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６．０，６．０，１４．５）、２．０５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６．５，６．５，１４．５）、１．６５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５）、１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５）。
（７）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）：δ２０９．８、１７２．９、１６１．８、１５５．７、１２８．７、１２７．１、１２１．６、１００．６、６１．５、５７．６、４３．１、３６．１、１７．９、１６．３。
以上、各種理化学的性状やスペクトルデータから、本ハージアノピリドンは下記式〔ＶＩ〕で表される化学構造と解析された。
2003103667.tif 000014
発明を実施するための最良の形態
次に、参考例及び実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
参考例１
テノイルトリフルオロアセトンのウシ心臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩ（コハク酸ユビキノン酸化還元酵素）として、ウシ心臓については、Ｓ．Ｔａｋａｍｉｙａらの方法（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ａｓｃａｒｉｓ  ｍｉｔｈｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１１４１巻、６５−７１頁、１９９３年）で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ、シグマ社製）の酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。
すななち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２（シグマ社製）、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、テノイルトリフルオロアセトンを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
参考例２
カルボキシンのウシ心臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ウシ心臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すななち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、カルボキシンを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例１
アトペニンＡ４のウシ心臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩ（コハク酸ユビキノン酸化還元酵素）として、ウシ心臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＡ４を加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例２
アトペニンＡ４のラット肝臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ラット肝臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＡ４を加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例３
アトペニンＡ４のブタ回虫複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ブタ回虫についてはＦ．Ｓａｒｕｔａらの方法（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩ（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ−Ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ  Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）ｉｎ  Ｍｉｔｈｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｎｅｍａｔｏｄｅ，Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻、９２８−９３２頁、１９９５年）で調製した精製複合体ＩＩを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。
すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＡ４を加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例４
アトペニンＡ５のウシ心臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ウシ心臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＡ５を加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例５
アトペニンＡ５のラット肝臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ラット肝臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＡ５を加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例６
アトペニンＡ５のブタ回虫複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ブタ回虫については、実施例３と同様の方法で調製した精製複合体ＩＩを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＡ５を加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例７
アトペニンＢのウシ心臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ウシ心臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＢを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例８
アトペニンＢのラット肝臓複合体に対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ラット肝臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＢを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例９
アトペニンＢのブタ回虫複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ブタ回虫については、実施例３と同様の方法で調製した精製複合体ＩＩを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、アトペニンＢを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例１０
ハージアノピリドンのウシ心臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ウシ心臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、ハージアノピリドンを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例１１
ハージアノピリドンのラット肝臓複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ラット肝臓については、参考例１と同様の方法で調製したミトコンドリアを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、ハージアノピリドンを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
実施例１２
ハージアノピリドンのブタ回虫複合体ＩＩに対する阻害活性
複合体ＩＩとして、ブタ回虫については、実施例３と同様の方法で調製した精製複合体ＩＩを用いた。複合体ＩＩのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、コハク酸添加によるＤＣＩＰの酸化型から還元型への変化速度を電子受容体（ＤＣＩＰ）に特有な吸収極大の吸光度の変化として測定した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中にユビキノン−２、ＤＣＩＰをそれぞれ終濃度１００μＭ、７０μＭになるように加え、ハージアノピリドンを加え、さらに複合体ＩＩを加えた後、終濃度１０ｍＭのコハク酸カリウムの添加で２５℃で反応を開始した。反応速度は、コハク酸からの電子を受け取ったＤＣＩＰの還元型（εｍＭ−１１ｃｍ−１：２１）の生成速度を６００ｎｍの吸光度変化で測定した。活性は１分間に還元されたＤＣＩＰのモル数で表した。また末端酸化酵素を阻害して還元力の漏出を防ぐ必要から、終濃度１０ｍＭのシアン化カリウムを加えた。測定結果は第２表に示す通りであった。
以上の参考例および各実施例における阻害活性については、下記第２表に示す通りであり、複合体ＩＩの５０％阻害濃度（ＩＣ５０、ｎＭ）として示した。
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上記の測定結果から、２−ピリジノール誘導体もしくは互変異性体の２−ピリドン誘導体であるアトペニンＡ４、Ａ５、Ｂやハージアノピリドンは、ウシ心臓複合体ＩＩ、ラット肝臓複合体ＩＩや、ブタ回虫複合体ＩＩに対してｎＭオーダーの強い阻害を示した。また、それらのウシ心臓複合体ＩＩに対する阻害活性を、これまで報告されている複合体ＩＩ阻害剤のテイノルトリフルオロアセトンやカルボキシンと比較すると、６０〜１６００倍強い阻害活性を示した。
産業上の利用分野
以上に説明したように、２−ピリジノール誘導体もしくはその互変異性体である２−ピリドン誘導体、またはそれらの塩を含有するアトペニンＡ４、Ａ５、及びＢやハージアノピリドンは、ｎＭオーダーでウシ心臓複合体ＩＩ、ラット肝臓複合体ＩＩや、ブタ回虫複合体ＩＩなどを強い活性で阻害した。したがって、本発明の２−ピリジノール誘導体もしくはその互変異性体である２−ピリドン誘導体は、電子伝達系の複合体ＩＩ阻害剤として有用であると期待される。
【国際調査報告】
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