(57)【要約】下記式2003050104.tif 000017で表されるＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＦＫＩ−１０８３物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１０８３物質を採取するものであって、得られたＦＫＩ−１０８３物質は微生物、線虫、節足動物に対して発育阻害活性を有し、抗蠕虫剤や殺虫剤として有用である。
2003050104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
2003050104.tif 000014
で表される化合物であることを特徴とする新規ＦＫＩ−１０８３物質。
【請求項２】
請求の範囲１に記載の化合物が微生物に対して発育阻害活性を有することを特徴とする新規ＦＫＩ−１０８３物質。
【請求項３】
請求の範囲１に記載の化合物が線虫に対して発育阻害活性を有することを特徴とする新規ＦＫＩ−１０８３物質。
【請求項４】
請求の範囲１に記載の化合物が節足動物に対して発育阻害活性を有することを特徴とする新規ＦＫＩ−１０８３物質。
【請求項５】
上記の線虫の生育阻害により抗蠕虫剤として用いられることを特徴とする請求の範囲３に記載の新規ＦＫＩ−１０８３物質。
【請求項６】
上記の節足動物の生育阻害により殺虫剤として用いられることを特徴とする請求の範囲４に記載の新規ＦＫＩ−１０８３物質。
【請求項７】
糸状菌に属し、下記式
2003050104.tif 000015
で表されるＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＦＫＩ−１０８３物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１０８３物質を採取することを特徴とする新規ＦＫＩ−１０８３物質の製造法。
【請求項８】
ＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物が、糸状菌に属するバーチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１０８３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０４）であることを特徴する請求の範囲７に記載の製造法。
【請求項９】
ＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物が、バーチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１０８３である微生物。
【請求項１０】
微生物が、バーチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１０８３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０４）である請求の範囲９に記載の微生物。
【請求項１１】
下記式
2003050104.tif 000016
で表されるＦＫＩ−１０８３物質からなるＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害活性を有する物質であり、医薬品、動物薬、農薬に有効な下記式
2003050104.tif 000003
で表される化合物である新規ＦＫＩ−１０８３物質およびその製造法に関する。
背景技術
寄生虫症は、衛生環境の改善、駆虫薬の進歩などにより減少してきたが、近年になって輸入寄生虫症、人獣共通寄生虫症、日和見寄生虫症、生鮮食品に由来する寄生虫症などが目立つようになり、改めて多種にわたる寄生虫症が問題となっている。また、牧畜や農業においても、寄生虫症は多大な経済的負担をもたらしているのが現状である。寄生虫の中で蠕虫の感染症については、現在、例えばイベルメクチン、メベンダゾール、プラジカンテルなど多くの化合物が使用されている。
しかしながら、現在使用されているイベルメクチン、メベンダゾール、プラジカンテルなどの抗蠕虫剤がその有効性、毒性などの面ですべて満足できるとはいい難く、新しい薬剤が求められている。
本発明者らは、抗蠕虫剤の有望な標的のひとつである電子伝達系の中のＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼに注目し、本酵素の阻害物質について微生物培養物中からの探索を続けた結果、ＦＴ−０５５４物質（ナフレジン）を見いだし、既に国際出願を行った（国際公開番号ＷＯ９９／２４４３９）。そして、この国際出願は米国へ移行され、Ｎｏ．０９／５０９７７０の出願番号が付与された。
このＦＴ−０５５４物質（ナフレジン）を生産する能力を有する微生物は糸状菌に属するアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＦＴ−０５５４であり、この菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（新名称；独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４４３が付与された。本菌株の菌学的性状の概要は下記の通りである。
各種寒天培地上での培養性状については、ツァペック・イーストエキストラクト寒天培地、麦芽汁寒天培地、２０％ショ糖を含むツァペック・イーストエキストラクト寒天培地、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、三浦寒天培地において生育は良好で、ビロード状で周辺平滑である。コロニー直径は、４０ｍｍ〜８５ｍｍである。コロニー表面の色調は黒褐色であり、コロニー裏面の色調は薄黄色、白色である。
形態的特徴については、海水（塩分濃度３．４％）を５０％含むツァペック・イーストエキストラクト寒天培地、麦芽汁寒天培地、ショ糖２０％を含むツァペック・イーストエキストラクト寒天培地、バレイショ・ブドウ糖寒天培地などで良好に生育し、分生子も豊富に着生した。
生理学的性状については、最適生育条件はｐＨ５〜７、温度１６〜３６℃、海水濃度５０〜１００％である。生育範囲はｐＨ３〜１０、温度は１２〜４５℃、海水濃度は０〜１００％である。
発明の開示
本発明者らはその後も微生物培養物中からの探索を続けた結果、糸状菌ＦＫＩ−１０８３株の生産する新規化合物のＦＫＩ−１０８３物質がＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害活性を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は、ＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害活性を有する物質であり、有効性、毒性などの面で満足し得る医薬品、動物薬、農薬として有効な新規ＦＫＩ−１０８３物質を提供することを目的とするものである。
すなわち、下記式
2003050104.tif 000004
で表される化合物である新規ＦＫＩ−１０８３物質を提供するものであり、新規ＦＫＩ−１０８３物質は微生物、線虫、および節足動物に対してそれぞれ発育阻害活性を有するものである。
更に本発明は、ＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害活性を有する新規ＦＫＩ−１０８３物質の製造法を提供することを目的とするものである。
すなわち、糸状菌に属し、下記式
2003050104.tif 000005
で表されるＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＦＫＩ−１０８３物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１０８３物質を採取する製造法を提供するものである。
更に、本発明はＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物が、糸状菌に属するバーチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１０８３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０４）であるＦＫＩ−１０８３物質の製造法を提供するものである。
更にまた本発明は、糸状菌に属し、ＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物自体を提供するものである。更に本発明は微生物としてバーチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１０８３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０４）を提供するものである。
更にまた本発明は、下記式
2003050104.tif 000006
で表されるＦＫＩ−１０８３物質からなるＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害剤を提供するものである。
前記の式で表される新規ＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物（以下「ＦＫＩ−１０８３物質生産菌」と称する）は糸状菌であるが、本発明のＦＫＩ−１０８３物質生産能を有するものであればよく、特に制限されることはない。本発明のＦＫＩ−１０８３物質を生産するために使用される菌株の好ましい一例としては、例えば本発明者らによって鹿児島県の土壌より新たに分離された糸状菌ＦＫＩ−１０８３株が挙げられる。本菌株の菌学的性状を示すと以下の通りである。
（１）形態的特徴
本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、ジャガイモ・ニンジン寒天培地、土壌抽出液寒天培地、コーン・ミール寒天培地、三浦寒天培地などで比較的良好に生育した。分生子の着生はジャガイモ・ニンジン寒天培地、土壌抽出液寒天培地、コーン・ミール寒天培地、三浦寒天培地において良好で、バレイショ・ブドウ糖寒天培地ではやや抑制的であった。
コーン・ミール寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は無色で隔壁を有しており、分生子柄は気生菌糸より直立し、ときに分岐することがある。分生子柄の途中もしくは先端にフィアライドを生じる。このフィアライド（１７．０〜３４．０×１．５〜２．５μｍ）は、単独あるいは２〜４輪生して生じ、基部はわずかに膨らみ、先端は細まる錐形である。フィアライドの先端からは亜球形から広楕円形（２．５〜５．０×２．５〜３．０μｍ）の分生子が生じ、粘性球形を形成する。
（２）各種寒天培地上での培養性状
本菌株を各種寒天培地上で２５℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果を下記の第１表に示した。
2003050104.tif 000007
2003050104.tif 000008
（３）生理的性状
（１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、ｐＨ５〜８、温度１６〜２５℃である。
（２）生育範囲
本菌株の生育範囲は、ｐＨ３〜１０、温度６〜２９℃である。
（３）好気性、嫌気性の区別
好気性
上記ＦＫＩ−１０８３株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株をバーチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する一菌株と同定し、バーチシリウム・エスピー  ＦＫＩ−１０８３と命名した。なお、本菌株は、バーチシリウム・エスピー  ＦＫＩ−１０８３（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．ＦＫＩ−１０８３）として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ  ３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］に所在する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に国際寄託されている。寄託日は平成１３年（２００１）１１月１９日、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０４である。
本発明のＦＫＩ−１０８３物質を製造するに当たっては、先ず糸状菌に属するＦＫＩ−１０８３物質生産菌を培地で培養し、その培養物から分離・精製すればよい。本発明に用いることのできる菌株は上記菌株、その変異株をはじめ、糸状菌に属するＦＫＩ−１０８３物質生産菌のすべてが使用できる。
上記ＦＫＩ−１０８３物質生産に適した栄養源としては、糸状菌の栄養源として使用し得るものであればよい。例えば、市販のペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼインの水和物、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、グリセリン、澱粉、グルコース、ガラクトース、マンノース等の炭水化物、あるいは脂肪等の炭素源、及び食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等の無機塩を単独あるいは組み合わせて使用できる。
その他必要に応じて微量の金属塩、消泡剤として動・植・鉱物油等を添加することもできる。これらのものは生産菌が利用しＦＫＩ−１０８３物質の生産に役だつものであればよく、公知の糸状菌の培養材料は、すべて用いることができる。ＦＫＩ−１０８３物質の大量培養には液体培養が好ましく、培養温度は生産菌が発育し、ＦＫＩ−１０８３物質を生産できる範囲で適用できる。培養は以上に述べた条件を使用するＦＫＩ−１０８３物質生産菌の性質に応じて適宜選択して行なうことができる。
ＦＫＩ−１０８３物質は、培養液よりクロロホルム、酢酸エチル等の水不混和性の有機溶媒で抽出することができる。上述の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーよりのかき取り、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組合わせあるいは繰返すことによって純粋に採取することができる。
本発明によるＦＫＩ−１０８３物質の理化学的性状については次の通りである。
（１）性状  ：無色油状
（２）分子量：３４３．２２４７（Ｍ＋Ｎａ、高分解能高速原子衝撃質量分析による）、
（３）分子式：Ｃ２０Ｈ３２Ｏ３、
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、２０４ｎｍ（ε＝２０５００）、２１５ｎｍ（ショルダー、ε＝１３７２０）、２５０ｎｍ（ε＝１０４６０）に極大吸収を有する、
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、２９２７、２８５４、１７３２、１６７０、１６０５、１４６４、１４０８、１３７９、１３２５、１２５０、１１６５、９８５、７６８ｃｍ−１に極大吸収を有する、
（６）１Ｈプロトン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）およびスピン結合定数（Ｈｚ）を第２表に示す、
（７）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中の化学シフト（ｐｐｍ）を第２表に示す、
（８）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、酢酸エチル、メタノールに可溶、水、ｎ−ヘキサンに難溶、
（９）呈色反応：硫酸、ヨウ素に陽性。
2003050104.tif 000009
2003050104.tif 000010
但し、表中の記号、ｓは一重線、ｄは二重線、ｔは三重線、ｑは四重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数、Ｊはスピン結合定数（Ｈｚ）を示す。
以上、本発明のＦＫＩ−１０８３物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本ＦＫＩ−１０８３物質は下記式で表される化学構造であることが決定された。
2003050104.tif 000011
以上のとおり、本発明ＦＫＩ−１０８３物質の各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまで報告されておらず、本ＦＫＩ−１０８３物質は新規物質であると決定した。
次に、本発明ＦＫＩ−１０８３物質のＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害活性について詳しく説明する。
豚回虫筋肉を１２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中でホモジナイズ後、３０００×ｇ、１０分間遠心して上清を集めた。それをさらに１００００×ｇ、２０分間遠心して沈殿を集めた。その沈殿を１２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）に懸濁することにより、ミトコンドリア画分とした。９６穴マイクロプレートに本ＦＫＩ−１０８３物質の５０％ジメチルスルホキシド溶液１０μｌを添加後、０．３５ｍＭのＮＡＤＨ、７．２ｍＭのフマル酸二ナトリウムを含んだ１２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）８０μｌを加えて、マイクロプレートリーダーＥＬＸ８０８（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、米国）にて３７℃、５分間プレインキュベーションを行った。
そこに豚回虫ミトコンドリア画分を１０μｌ（蛋白量０．３ｍｇ）添加して、３７℃、１０分間インキュベーションを行い、３４０ｎｍのＮＡＤＨの吸収を１５秒ごとに測定した。３４０ｎｍの吸光度の減少の傾きをＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ酵素活性として定量した結果、ＦＫＩ−１０８３物質は４．１ｎＭの濃度でＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ活性を５０％阻害した。したがって、ＦＫＩ−１０８３物質は蠕虫感染症の治療用あるいは予防用組成物として使用し得ることが期待される。
また、本発明ＦＫＩ−１０８３物質の栄養寒天培地上での各種微生物に対する最小発育阻止濃度（寒天平板希釈法による）を下記の第３表に示した。
2003050104.tif 000012
2003050104.tif 000013
上記の第３表から明らかなように、本発明ＦＫＩ−１０８３物質はいくつかの微生物に対して発育阻害活性を示した。
次に、本発明のＦＫＩ−１０８３物質の抗線虫及び抗節足動物活性について以下に詳しく説明する。
９６穴プレート（コーニング社製、米国）に本発明ＦＫＩ−１０８３物質のメタノール溶液を加え、真空ポンプ下でメタノールを留去した後、検定用培地（レシチン０．０１％、炭酸水素ナトリウム７．５ｍＭ、塩化カリウム７．５ｍＭ、塩化カルシウム二水和物７．５ｍＭ、硫酸マグネシウム七水和物７．５ｍＭ）２５０μｌを加え、１５分間振とうした。
そこに、線虫増殖用寒天培地［バクトアガー（ディフコ社製、米国）１．７％、バクトペプトン（ディフコ社製、米国）０．５％、酵母エキス（ディフコ社製、米国）１．０％、塩化ナトリウム０．３％、コレステロール０．０００５％、塩化カルシウム０．００７％、硫酸マグネシウム０．０３％、リン酸水素カリウム０．３４％、リン酸水素二カリウム０．１１％からなる培地で大腸菌を生育させたもの］上で飼育した線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓを１０匹程度加え、また、緩衝液（トリス０．２４％、塩化ナトリウム２．５７％、塩化マグネシウム０．４７％、塩化カリウム０．０７％、炭酸ナトリウム０．０２％、硫酸マグネシウム０．６４％、塩化カルシウム０．１１％、ｐＨ７．１に調整）中で孵化させた節足動物Ａｒｔｅｍｉａ ｓａｌｉｎａのノープリウス幼生を数匹含む緩衝液を５０μｌ加えた。
これらの生物の様子を２日後に顕微鏡下で観察したところ、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓに対しては２０μｇ／ｍｌの濃度で生育を阻害した。また、節足動物Ａｒｔｅｍｉａ ｓａｌｉｎａに対しては２μｇ／ｍｌの濃度で生育を阻害した。したがって、本発明のＦＫＩ−１０８３物質は抗蠕虫剤や殺虫剤などの薬剤として有効である。
発明を実施するための最良の形態
次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
寒天斜面培地で培養したバーチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１０８３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０４）より、グルコース２．０％、ポリペプトン（日本製薬社製、日本国）０．５％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製、日本国）０．２％、寒天０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％からなる液体培地（ｐＨ５．７）が１００ｍｌ入った５００ｍｌ容三角フラスコに１白金耳接種し、２７℃で３日間振盪培養した。それを種培養液として、ポテト・デキストロース・ブロス（ディフコ社製、米国）２．４％、マルト・エクストラクト（ディフコ社製、米国）１．５％、リン酸マグネシウム八水和物０．５％、寒天０．１％からなる液体培地（ｐＨ６．０）を１００ｍｌずつ分注した５００ｍｌ容三角フラスコ２０本に１ｍｌずつ接種し、２７℃で７日間振盪培養した。
培養液は遠心分離し、得られた菌体をメタノールで抽出し、減圧濃縮してメタノールを留去後、更に酢酸エチルで抽出して減圧濃縮し、１．２１ｇの粗物質Ｉを得た。これをヘキサン−酢酸エチル（１０：１）で充填したシリカゲルカラム（Ａｒｔ．７７３４、メルク社製、米国）にのせ、ヘキサン−酢酸エチル（３：１）で洗浄後、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出し、減圧濃縮により８１．０ｍｇの粗物質ＩＩを得た。これをさらに、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）で充填したシリカゲルカラム（Ａｒｔ．７７３４、メルク社製、米国）にのせ、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）で溶出し、減圧濃縮することによって、無色油状のＦＫＩ−１０８３物質を６１．１ｍｇ得た。
産業上の利用分野
以上説明したように、糸状菌に属するＦＫＩ−１０８３物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＦＫＩ−１０８３物質を蓄積せしめ、該培養物から本ＦＫＩ−１０８３物質を単離することにより製造され、得られたＦＫＩ−１０８３物質は微生物、線虫および節足動物に対して生育阻害活性を有するため、医薬品、動物薬、農薬として有効な物質であると期待される。
【国際調査報告】
2003050104.tif 000018
2003050104.tif 000019