(57)【要約】ＴＳＡ２３０６遺伝子及びその発現産物の生理学的機能を解明し、ＴＳＡ２３０６が関与する種々の病態を解明するかあるいは該病態を治療する方法を研究するために有用なモデル動物、すなわちＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物を提供する。本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物は、ＴＳＡ２３０６遺伝子の全部若しくは一部が欠損、または任意の部位に他の遺伝子が挿入若しくは置換されることにより、実質的に血清中の脂質濃度が正常動物に比べて低下してなるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列の全部若しくは一部が欠損するか、またはその任意の部位に任意の塩基配列が挿入されるか、若しくは任意の部位が他の塩基配列によって置換されることにより、実質的に血清中の脂質濃度が、対応する正常非ヒト動物に比べて低下してなるＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項２】
ＴＳＡ２３０６遺伝子の第１エキソンが欠失している請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項３】
ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列の任意部位に挿入または置換する塩基配列がネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列である請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項４】
ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型またはＴＳＡ２３０６遺伝子ヘテロ欠損型である、請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項５】
ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型である、請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項６】
非ヒト動物がマウスである請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項７】
血清中の総コレステロール、中性脂肪、及び遊離脂肪酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも１つの脂質の濃度が、対応する正常非ヒト動物に比べて低下してなる請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項８】
脂質代謝異常モデル動物として用いられる請求項５に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項９】
低脂質血症（低リポ蛋白血症）のモデル動物として用いられる請求項５に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項１０】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２８として寄託されている受精卵及び該受精卵と同一の形質的特徴を有する受精卵から発生する非ヒト動物である、請求項５に記載ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項１１】
下記の工程を有する、脂質代謝改善薬の有効物質のスクリーニング方法：
（ａ）請求項１に記載するＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に、脂質と共に被験物質を投与する工程、
（ｂ）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）を測定し、被験物質投与前後におけるその増減を、被験物質を投与せずに脂質単独を投与した上記に対応するＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の脂質投与前後における体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増減と比較する工程、
（ｃ）上記比較結果に基づいて、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増加を抑制または低下させる被験物質を選択する工程。
【請求項１２】
ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物がＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物がマウスである請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
脂質代謝改善薬が、抗高脂質血症（高リポ蛋白血症）薬、抗高コレステロール血症薬、抗高ＶＬＤＬ血症薬、抗高ＨＤＬ血症薬、コレステロール低下薬、中性脂肪低下薬、遊離脂肪酸低下薬、動脈硬化性疾患改善薬及びリポ蛋白代謝改善薬から選択されるいずれかの薬物である請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
脂質代謝改善薬が、脂質減量化をもたらす薬物である請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドに対する抗体、及び医薬的に許容される担体を含有する、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等の予防または治療用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ血清中の脂質濃度を増加させる活性を有するポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の脂質代謝異常モデル動物としての使用。
【請求項１８】
請求項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の低脂質血症（低リポ蛋白血症）のモデル動物としての使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子又はその発現産物（蛋白質、ポリペプチド）の新規用途に関する。詳細には、本発明は、上記ＴＳＡ２３０６遺伝子を欠損した非ヒト動物及びその脂質代謝異常モデル動物としての利用、上記遺伝子またはその発現産物を利用した脂質代謝異常疾患の診断または改善に関する臨床的な応用、脂質代謝異常疾患治療のための候補薬のスクリーニングへの応用に関する。
背景技術
近年、循環器疾患による死亡率は年々増加しており、心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化に起因した疾患を合わせると、成人死亡原因の第一位を占めている。
動脈硬化の原因としては様々のものがあるが、血清脂質、特に血清コレステロール値の上昇が最も重要な危険因子の一つとされている。
血清コレステロール値上昇の原因としては、遺伝的な要因のほか、近年の食生活の変化にともなう脂肪の過剰摂取が挙げられており、これは、若年令層にも顕著になりつつある。高脂質血症に対しては、食事療法と同時にコレステロール合成阻害剤、陰イオン交換樹脂製剤、蛋白同化ステロイド、またはニコチン酸やクロフィブラート等のコレステロール吸収抑制、等の薬剤が使用されているが、これらの薬剤は、その有効率とともに肝毒性や胃腸障害等の副作用も長期薬剤投与上の問題となっている。
一方、遺伝子工学技術によって単離、クローン化された様々な遺伝子の機能を明らかにする技術が進んでいる。例えば、種々の疾患において特徴的にｍＲＮＡや蛋白質の発現量が変化する遺伝子を検出するディファレンシャル・ディスプレイ（ＤＤ）法などの手法によって、新規に発見された遺伝子について、各種疾患との関係を示す疾患寄与率の算出、各種臓器に特異的な発現の有無、発現の経時的な変動を調べることが可能となり、また線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）や酵母などの他の生物のゲノム情報との相関性などを基にして、近年では各種の疾患に対する候補遺伝子の検索が行われるようになっている。
医薬業界においても、このような特定の疾患に関係する遺伝子の決定に基づいてｃＤＮＡを取得し、これから蛋白質を合成し、ハイスループット・スクリーニング系を用いるスクリーニングにより、当該疾患の治療や予防に有用な候補化合物を探索したり最適化を行うといった新しい創薬手法のアプローチが行われつつある。
また遺伝子工学技術によって、生物から単離、クローン化された様々な遺伝子の生理学的機能や役割を明らかにするために、その生物における該遺伝子の発現を抑制するか、あるいはその生物の該遺伝子領域に外来性の遺伝子配列（当該生物に本来備わっていない遺伝子の配列）を付加することによって、人為的に該遺伝子の発現を消失もしくは抑制させた様々の形質転換動物が遺伝子疾患のモデル動物として作り出されており、この形質転換動物を利用した実験や研究が盛んになっている。
また、従来より、胚幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）に所望の形質を生み出す遺伝子（形質転換遺伝子）を注入すると胚体の形成に参加してキメラ動物を形成するという性質を利用して、様々な遺伝子変異動物の作出が試みられている（Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１））。
こうした胚幹細胞を利用した遺伝子変異マウスの作製とこれを用いた研究は、上記Ｅｖａｎｓらの研究を発端に急速に進展している（Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５（１９８４）：Ｔｈｏｍａｓ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１，５０３（１９８７）：Ｋｏｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８９２７（１９８９））。また上記の遺伝子変異マウスの作製には、胚幹細胞株の樹立が必要とされ、その大部分が１２９系のマウスより樹立されている（ＥＳ−Ｄ３細胞；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌｐｈ．，８７，２７（１９８１）：ＣＣＥ細胞；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，４４５（１９８６）：ＢＬ／６ＩＩＩ細胞；Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｂｕｒｋｉ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９７，２５４（１９８６））。このような胚幹細胞を用いて作出された遺伝子発現不全動物としては、ＨＰＲＴ遺伝子欠損マウス（Ｈｏｏｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９２（１９８７）：Ｋｎｅｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７））、癌抑制遺伝子の一つであるｐ５３を欠失したｐ５３欠失マウス（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５６，２１５（１９９２））、β２ミクログロブリン遺伝子変異マウス（Ｚｉｊｌｓｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，７４２（１９９０））、免疫疾患モデルマウスのＲＡＧ−２（Ｖ（Ｄ）Ｊ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ）変異マウス（Ｓｉｎｋａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８，８５５（１９９２）、等が報告されている。近年では、アンギオテンシノーゲン遺伝子欠損動物（特開平８−１３１０２１号公報）、線維芽細胞及び軟骨細胞によって分泌されるマトリックスメタロエンドプロティナーゼの酵素一種であるストロメリシンの欠失したストロメリシン−１欠損トランスジェニックマウス（特表平８−５０７９２５号公報）、免疫系疾患、及び骨形成異常のモデル動物として使用可能なＴＲＥＢ５遺伝子の一部をネオマイシン耐性遺伝子に置換されたＴＲＥＢ５遺伝子欠損マウス（特開平８−１４０５２７号公報）、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素遺伝子の、そのエキソンＩＩからエキソンＶがネオマイシン耐性遺伝子に置換されたＬ−ＰＧＤＳ遺伝子欠損マウス（特開平１１−３３２４１７号公報）、マウスのＣＤ４及びＣＤ８の発現を欠くようにヒトＣＤ４をコードする転写遺伝子とＨＬＡ  ＤＧ座の対立遺伝子をコードする転写遺伝子によって置換された敗血症モデルとなるダブルノックアウト遺伝子組換え非ヒト哺乳動物（特開平９−５０００２５号公報）、ミエロペルオキシダーゼ遺伝子機能欠損マウス（特開２０００−１１６２８０号公報）等、生物に本来保有されている遺伝子を欠損するかまたはそれが他の遺伝子で置換された様々な非ヒト動物が作成されている。こうした変異動物の作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術についても、例えば「野田哲生編、実験医学，増刊，１４（２０）（１９９６）、羊土社」などに記載されている。
ところで、本出願人は、既に、肝臓や腎臓に特異的に発現する遺伝子であって、その発現産物が血管新生を促進することが知られているアンギオポエチン１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  １：Ｃｅｌｌ，Ｄｅｃ．２７，８７（７），１１６１−１１６９（１９９６））および血管新生を抑制することが知られているアンギオポエチン２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２：Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｕｌ．４，２７７，５５−６０（１９９７））と、アミノ酸配列レベルにおいてそれぞれ３３％の相同性を有する遺伝子を新たに単離することに成功し、この遺伝子をＴＳＡ２３０６遺伝子及びその発現産物（蛋白質）をＴＳＡ２３０６と命名している（特開２０００−３２５０８７号公報）。このＴＳＡ２３０６は、正常肝臓・腎臓組織において特に強く発現するが、悪性度の高い肝臓癌や腎臓癌においてはその発現が見られないことから、血管新生に抑制的に関与する機能を有する蛋白質であると考えられた。しかしながら、これらＴＳＡ２３０６遺伝子及びその発現産物の生理学的機能については十分に解明されておらず、その生体内における働きについて解明すべき点が数多く残されている。
発明の開示
ＴＳＡ２３０６遺伝子及びその発現産物（ＴＳＡ２３０６）の生体における作用を解明していくうえで、ＴＳＡ２３０６を全く産生しないか若しくは少量しか産生しない、所謂ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損動物（ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全動物）のモデルを作出することは極めて有用である。
そこで、本発明の目的は、ＴＳＡ２３０６遺伝子及びその発現産物（ＴＳＡ２３０６）の生理学的機能を解明し、これらが関与する種々の病態を解明するかあるいは該病態を治療する方法を研究するために有用なモデル動物、すなわちＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物（ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全非ヒト動物）を提供することである。
さらに本発明の目的は、当該モデル動物の利用によって解明されたＴＳＡ２３０６遺伝子及びその発現産物（ＴＳＡ２３０６）の生理学的機能に基づいて、ＴＳＡ２３０６遺伝子及びその発現産物、並びにそれらの派生物〔遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）断片、ＲＮＡｉ、アンチセンス分子、抗体、ペプチド断片等〕の新規用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全のモデル動物を作出し、ＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物の生理学的機能を検討したところ、驚くべきことに血管新生に抑制的に関与する機能を有すると考えられた当初の予想に反して、ＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物が生体内の脂質代謝に関わる機能を有することを見出した。具体的には、ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全のモデル動物であるＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウスが、ＴＳＡ２３０６遺伝子を正常に有する野生型マウスに比べて、脂肪重量が有意に減少しており、さらに、血清コレステロール、中性脂肪、及び遊離脂肪酸などの血清中の脂質量がいずれも有意に低下していることが認められた。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明はＴＳＡ２３０６の生理的な役割、特にＴＳＡ２３０６が関与する種々の病態の解明またはその治療法を研究するのに有用なモデル動物としてＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物（ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全非ヒト動物）を提供する。また本発明は、脂質代謝異常モデル動物として上記ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物を提供する。さらに本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物またはＴＳＡ２３０６遺伝子発現細胞を利用した、脂質代謝改善薬の有効成分として有用な候補化合物をスクリーニングする方法を提供するものである。
またさらに本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物の脂質代謝改善薬としての医薬用途を提供する。さらにまた、本発明はＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物と拮抗的に相互作用するアンチセンス分子または抗体等のアンタゴニストの脂質代謝改善薬としての医薬用途を提供する。
具体的には、本発明は下記項１〜１０に掲げるＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物を提供する：
１．  ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列の全部若しくは一部が欠損するか、またはその任意の部位に任意の塩基配列が挿入されるか、若しくは任意の部位が他の塩基配列によって置換されることにより、実質的に血清中の脂質濃度が、対応する正常非ヒト動物に比べて低下してなるＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
２．  ＴＳＡ２３０６遺伝子の第１エキソンが欠失している項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
３．  ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列の任意部位に挿入または置換する塩基配列がネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列である項１または２に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
４．  ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型またはＴＳＡ２３０６遺伝子ヘテロ欠損型である、項１乃至３のいずれかに記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
５．  ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型である、項１乃至３のいずれかに記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
６．  非ヒト動物がマウスである項１乃至５のいずれかに記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
７．  血清中の総コレステロール、中性脂肪、及び遊離脂肪酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも１つの脂質の濃度が、対応する正常非ヒト動物に比べて低下してなる項１乃至６のいずれかに記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
８．  脂質代謝異常モデル動物として用いられる項５に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
９．  低脂質血症（低リポ蛋白血症）のモデル動物として用いられる項５に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
１０．受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２８として寄託されている受精卵及び該受精卵と同一の形質的特徴を有する受精卵から発生する非ヒト動物である、項５に記載ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物。
また、本発明は下記項１１〜１５に掲げる脂質代謝改善薬の有効物質のスクリーニング方法を提供する：
１１．下記の工程を有する、脂質代謝改善薬の有効物質のスクリーニング方法：
（ａ）項１記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に、脂質と共に被験物質を投与する工程、
（ｂ）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）を測定し、被験物質投与前後におけるその増減を、被験物質を投与せずに脂質単独を投与した上記に対応するＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の脂質投与前後における体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増減と比較する工程、
（ｃ）上記比較結果に基づいて、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増加を抑制または低下させる被験物質を選択する工程。
１２．  ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物が項５に記載するＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型非ヒト動物である、項１１に記載のスクリーニング方法。
１３．  ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物がマウスである請求項１１または１２に記載のスクリーニング方法。
１４．  脂質代謝改善薬が、抗高脂質血症（高リポ蛋白血症）薬、抗高コレステロール血症薬、抗高ＶＬＤＬ血症薬、抗高ＨＤＬ血症薬、コレステロール低下薬、中性脂肪低下薬、遊離脂肪酸低下薬、動脈硬化性疾患改善薬及びリポ蛋白代謝改善薬から選択されるいずれかの薬物である項１１乃至１３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
１５．  脂質代謝改善薬が、脂質減量化をもたらす薬物である項１１乃至１３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
さらに本発明は下記項１６に掲げる医薬組成物を提供する：
１６．  以下の（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドに対する抗体、及び医薬的に許容される担体を含有する、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等の予防または治療用医薬組成物。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ血清中の脂質濃度を増加させる活性を有するポリペプチド。
当該高脂質血症（高リポ蛋白血症）等には、高脂質血症（高リポ蛋白血症）、高ＶＬＤＬ血症、高ＨＬＤ血症、高コレステロール血症、及びこれらに起因して発症する各種の疾患［例えば動脈硬化性疾患など］が含まれる。
また本発明は下記項１７及び１８に掲げるＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の用途を提供する：
１７．項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の脂質代謝異常モデル動物としての使用。
１８．項１に記載のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の低脂質血症（低リポ蛋白血症）のモデル動物としての使用。
なお、本発明でいう「ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物」はＴＳＡ２３０６を全く産生しないか、若しくは少量しか産生しないように形質変換されてなるヒト以外の哺乳動物であり、また「ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全非ヒト動物」も同意義で用いられる。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明で使用する用語の定義
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
また、ＤＮＡの合成、外因性遺伝子を含有するベクター（発現ベクター）の製造、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法、該宿主細胞を用いて所望蛋白質を製造する方法などは、一般的遺伝子工学的手法に従うか若しくはそれらに準じて容易に行うことができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。
本発明において遺伝子またはＤＮＡとは、特に言及しない限り、２本鎖ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡを含む）、１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）及び該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）（ｃＤＮＡを含む）、およびそれらの断片をいずれも包含する趣旨で用いられ、またその長さに何ら制限されるものではない。またポリヌクレオチドにはＲＮＡ及びＤＮＡが含まれ、ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡが、またＲＮＡには１本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡｉがいずれも含まれる。また、本発明でいう遺伝子は、特に言及しない限り、リーダ配列、コード領域、エキソン及びイントロン等の領域の有無を問わない。
さらに、本発明において特定のアミノ酸配列からなる（ポリ）ペプチドには、その同等効果物（同族体、誘導体、変異体）がいずれも含まれる。なお、変異体（遺伝子、（ポリ）ペプチド）には、天然において突然変異や翻訳後の修飾等によって生じる変異体（例えばアレル変異体）、天然由来の遺伝子又は（ポリ）ペプチドの配列の任意部位を人為的に欠失、置換または、付加（若しくは挿入）させることによって作成される変異体が包含される。
（２）ＴＳＡ２３０６遺伝子
本発明が対象とするＴＳＡ２３０６遺伝子は、遺伝子レベルまたは発現後蛋白質レベルで、血清中の脂質濃度を増大させるように機能する遺伝子である。ヒトに由来するＴＳＡ２３０６遺伝子は、前述するように、肝臓や腎臓に特異的に発現する遺伝子として既にその塩基配列も公知である（配列番号２、３）。またマウスに由来するＴＳＡ２３０６遺伝子も公知である（配列番号７）。
本発明が対象とするＴＳＡ２３０６遺伝子は、その由来を問わず、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物（非ヒト動物）、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、サル、ネコ、ウサギ、クマ、マウスおよびラットなどの哺乳動物に由来する遺伝子である。
かかるＴＳＡ２３０６遺伝子の一例として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトのＴＳＡ２３０６をコードするＴＳＡ２３０６遺伝子（ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子）、または配列番号６に示すアミノ酸配列からなるマウスのＴＳＡ２３０６をコードするＴＳＡ２３０６遺伝子（マウスＴＳＡ２３０６遺伝子）を挙げることができる。但し、ＴＳＡ２３０６（蛋白質）は、配列番号１または６に示すアミノ酸配列に制限されることなく、これらの蛋白質と同様の生物学的機能を有する同効物であってもよい。ここで「ＴＳＡ２３０６の生物学的機能」とは、間接または直接的な作用によって血清中の脂質濃度を増大させる機能または体脂肪量を増大させる機能を挙げることができる。上記ヒトまたはマウスＴＳＡ２３０６の同効物には、その他の哺乳動物（例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、サル、ネコ、ウサギ、クマ、及びラット等）に由来するＴＳＡ２３０６が含まれる他、これらのＴＳＡ２３０６と配列相同性を有し、構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性、及び生物学的機能の類似性によりひとつのファミリーと認識される一連の関連蛋白質（ＴＳＡ２３０６の相同物）も含まれる。これらのＴＳＡ２３０６相同物には、本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子のアレル体（対立遺伝子）から生成される一連の蛋白質も含まれる。
ＴＳＡ２３０６遺伝子の具体的態様としては、配列番号２または７に示される塩基配列を有する遺伝子が例示できる。配列番号２及び７の塩基配列はそれぞれ配列番号１（ヒトＴＳＡ２３０６）及び６（マウスＴＳＡ２３０６）に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例である。コドンの縮重に鑑みれば、ＴＳＡ２３０６遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，４３（１９８１）〕。
ＴＳＡ２３０６遺伝子は、本発明により開示されたＴＳＡ２３０６遺伝子の配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。
具体的には、ＴＳＡ２３０６遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、ＴＳＡ２３０６遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７８，６６１３（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）など〕。上記において、ｃＤＮＡの起源としては、ＴＳＡ２３０６遺伝子を発現する組織、例えば肝臓または腎臓組織、並びにその組織細胞やこれらに由来する培養細胞などが例示される。
また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらのｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリー、特に肝臓や腎臓組織を起源として調製されたｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
ＴＳＡ２３０６遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
ここで用いられるプローブとしては、ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得されたＴＳＡ２３０６遺伝子（配列番号２または７）やその断片も良好に利用できる。プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、具体的には配列番号２または７に記載される塩基配列に相補的なポリヌクレオチドの部分配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基を有するものを例示することができる。かかるプローブの例として、配列番号８（ＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＴＣＴ）及び配列番号９（ＴＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＣＧ）に示す５’プローブ、または配列番号１０（ＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡ）及び配列番号１１（ＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧ）に示す３’プローブを挙げることができる。
また、ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列（例えば配列番号２または７に記載の塩基配列）またはその相補配列を有するいわゆる陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることも出来るし、ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列情報に基づき設定される各種のセンス・プライマーやアンチセンス・プライマー（例えば、配列番号４、配列番号１２、配列番号５、配列番号１３等が例示される。）をスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
ＴＳＡ２３０６遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６），３５（１９９４）〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８，８９９８（１９８８）〕などの採用が好適である。
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされたＴＳＡ２３０６遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。かかるプライマーとしては、例えば実施例１に記載するオリゴヌクレオチドＴＳＡ２３０６  Ｐ１（配列番号４）、オリゴヌクレオチドＴＳＡ２３０６  Ｐ２（配列番号５）、実施例８に記載するフォワード・プライマー（配列番号１２）及びリワード・プライマー（配列番号１３）を挙げることができる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、例えばゲル電気泳動法などの常法に従って行うことができる。
また、上記で得られるＴＳＡ２３０６遺伝子或いはその部分ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３（１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）〕などに従って、簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
また、ＴＳＡ２３０６遺伝子或いはその部分ＤＮＡ断片等のＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法等の化学合成によって行うこともでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるかまたは適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
（３）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物
本発明が対象とするＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）が有するＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子またはその発現に関連する遺伝子（ＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡへの転写やＴＳＡ２３０６（蛋白質）への翻訳に関わる遺伝子を含む）に人為的に変異（欠失、置換、付加、挿入）を加えることにより、該ＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子の発現能が抑制乃至は喪失するか、若しくは該遺伝子がコードするＴＳＡ２３０６の機能が実質的に抑制乃至は喪失することによって、ＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子及びその発現に関わる遺伝子を正常に有する対応の非ヒト動物（対応の正常非ヒト動物）に比して実質的に体脂肪量または血清中の脂質濃度が低下してなるＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全非ヒト動物（以下、ノックアウト動物ともいう）である。なお、以下、本明細書においてＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物とＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全非ヒト動物とは同意義で使用される。
ここで、非ヒト動物としては、動物モデルを作出するうえで、個体発生期間及び生涯サイクルが短くかつ繁殖が比較的容易なマウスやラット等のゲッ歯動物が好ましいが、特にこれに限定されるものではなく、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、クマ、イヌ、ネコ及びウシ等のヒト以外の哺乳動物もこれに含まれる。
また上記「対応の正常非ヒト動物」とは、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物と同一種であって、ＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子及びその発現に関連する遺伝子（ＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡへの転写やＴＳＡ２３０６（蛋白質）への翻訳に関わる遺伝子を含む）を構造的にも機能的にも正常に有する非ヒト動物を意味する。以下、本明細書においてＴＳＡ２３０６遺伝子野生型非ヒト動物は、上記正常非ヒト動物とは同意義で使用される。なお、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物と血清中の脂質濃度を比較する正常非ヒト動物としては、対象のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物と動物種は勿論、由来（起源）、雌雄、週齢、飼育環境や条件（例えば、明暗周期など）、飼料の種類や投与数などを同じくしたものを用いることが好ましい。
上記でいうＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子またはその発現に関連する遺伝子に人為的に変異を加える方法としては、遺伝子工学的手法により該遺伝子の塩基配列の全部を欠失するか、またはコドンの読み取り枠をずらしたりプロモーターやエキソンの機能を破壊するように、上記ゲノム遺伝子の塩基配列の一部を欠失したり、ＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子の任意部位に任意の塩基配列を挿入するか、またはＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子の任意部位を他の塩基配列で置換することによって行なうことができる。ここで欠失、挿入または置換するＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子上の部位は、結果としてＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡまたはＴＳＡ２３０６の発現が構造的または機能的に不全（喪失または低下）となる部位であればよく、またエキソン領域及びイントロン領域の別も特に制限されない。好ましくは後述するようにエキソン領域、より好ましくは第１エキソン領域を挙げることができる。またＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子に挿入または置換する塩基配列としても、結果としてＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡまたはＴＳＡ２３０６の発現が構造的または機能的に不全（喪失または低下）となる塩基部位であればよく特に制限されない。また挿入または置換に使用する塩基配列は何らかの機能を有する遺伝子（例えば蛋白質をコードするｃＤＮＡ）であっても、また機能を有さないＤＮＡ（断片）をコードするものであってもよい。好ましくは、後述するようにＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子の変異を検出するための選択マーカー（ポジティブ選択マーカー）としても機能する遺伝子など、なんらかの機能を有する遺伝子を用いることが望ましい。
上記遺伝子の人為的変異方法は、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）〕及びそれらを組み合わせることによって実施できる。
本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物は、具体的には、例えば下記のようにして作出することができる。
まず目的とする非ヒト動物のＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子を単離し、そのエキソン部分に任意の塩基配列を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる塩基配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入することによって、完全なｍＲＮＡが合成できないように構築した配列を有するＤＮＡ鎖（以下、「ＴＳＡ２３０６遺伝子破壊用ベクター」または「ターゲティングベクター」と略する）を作成する。これをエレクトロポレーション法等の方法で上記と同一種の非ヒト動物の細胞（胚幹細胞）の染色体に導入して組み換え胚幹細胞を作成する。次いで、得られた組み換え胚幹細胞について、ＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子が破壊されたＴＳＡ２３０６ノックアウト胚幹細胞を選別して、これを動物胚へ注入し、仮親の子宮に移植して生殖系列のキメラ動物を取得する。このキメラ動物を同一種のＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子が正常な非ヒト動物と交配させてＴＳＡ２３０６遺伝子ヘテロ欠損型動物（＋／−）を作出する。さらに得られたヘテロ欠損型同士を交配させることにより、ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型動物（−／−）、すなわち遺伝子座の双方ともＴＳＡ２３０６を実質的にコードしない本発明の所望のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物（ノックアウト動物）を得ることができる。
上記操作において、目的とする非ヒト動物のＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子の単離は、例えば公知のヒトＴＳＡ２３０６ｃＤＮＡ配列（特開２０００−３２５０８７号公報の配列番号２参照）（後記配列表、配列番号２：ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子のＯＲＦ領域）をプローブとして非ヒト動物のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、蛋白質コード領域を含む陽性クローンを単離し、これをベクターに挿入後、制限酵素で消化し、特定のエキソンを含む染色体ＤＮＡをサブクローニングすることによって取得できる。例えばマウスゲノムＤＮＡライブラリーの作成は、「ラボマニュアル遺伝子工学」（丸善株式会社発行，村松正實編，１９９０）の第１００−１１２頁に記載の方法に従って行うことができ、また上記方法に従う具体的なマウスＴＳＡ２３０６ｃＤＮＡの作成は、例えば、「ラボマニュアル遺伝子工学」（丸善株式会社発行，村松正實編，１９９０）の第８３−９９頁の記載に従って行うことができる。
また、得られた非ヒト動物のＴＳＡ２３０６がヒトＴＳＡ２３０６の同効物であるかどうかの一確認法としては、ラディエーション・ハイブリッド・マッピング（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ）によって、非ヒト動物のＴＳＡ２３０６ｃＤＮＡクローンの染色体マッピングを行ない（Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，２４５−２５０（１９９０））、非ヒト動物のＴＳＡ２３０６遺伝子の染色体座位と、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子が存在する染色体座位が相同領域であるかどうかで判断するとよい。
かくして、上記非ヒト動物のゲノムＤＮＡライブラリーよりＴＳＡ２３０６ゲノムＤＮＡクローンを得、これを用いてターゲティングベクターを作成し、遺伝子ターゲッティング法（標的遺伝子組み換え法）により、目的とする遺伝子領域の構造を破壊する。
ターゲッティングベクターの作成において、ＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子のエキソン部分に任意の塩基配列を挿入する場合、挿入する塩基配列としてはＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子の変異を検出するための選択マーカー（ポジティブ選択マーカー）としても機能する遺伝子の塩基配列を挿入することが好ましい。このような遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏという）等のアミノグリコシド系抗生物質耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）やＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポーター遺伝子等を挙げることができる。好ましくはネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）である。この場合、組み換えが生じたことがネオマイシン（あるいはそのアナログであるＧ４１８）耐性の獲得により判定可能となる。
さらにランダム組み換え体を除くにはポジティブ−ネガティブ選別法を行うことが好ましい。この場合、相同部位（ＴＳＡ２３０６遺伝子の保存塩基配列領域）の外側にジフテリア毒素Ａ断片遺伝子（以下「ＤＴ−Ａ」という）のような細胞に対して致死性を有する遺伝子をネガティブ選択マーカーとして導入することが望ましい。こうして得られるターゲティングベクターはランダム組み換えにより致死性遺伝子が導入され、このような細胞は致死となり自動的に除去される。
以上のようなポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを用いたポジティブ−ネガティブ選別法を行うことによって、相同遺伝子組み換え体を効率的に取得することが可能となる。なお、これらの遺伝子の挿入は、試験管内で慣用のＤＮＡ組換え技法により行うことができる。
本発明の実施にあたっては、ＴＳＡ２３０６遺伝子の第１エキソンが欠失しており、その欠失領域にポジティブ選択マーカー遺伝子が挿入されていることが好ましい。具体的には、ポジティブ選択マーカーとしてＭＣ１−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡ〔ＭＣ１プロモーター（Ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ由来変異エンハンサー配列およびチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター配列からなるプロモーター）の下流にネオマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナルを連結したもの：Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ．Ｍ．Ｒ．：Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．：Ｃｅｌｌ，５１，５０３（１９８７）〕が好適に使用される。また、ネガティブ選択マーカーとして、ＭＣ１−ＤＴ−Ａ〔ＭＣ１プロモーターの下流にジフテリア毒素Ａ断片が連結されたもの：Ｙａｇｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４，７７，（１９９３）〕が好適に使用される。
後述する実施例においては、第１エキソン上流のＳａｌＩ−ＭｕｎＩ断片（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ７．３ｋｂ）および下流のＳｃａＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １．１ｋｂ）が相同部位（ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列の保存領域）として保存されるように、ポジテイブ選択マーカーとしてＭＣ１−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡ（ストラタジーン社製）、ネガテイブ選択マーカーとしてＭＣ１−ＤＴ−Ａ（インビトロジェン（株）社製）を用いて、遺伝子相同組換えを行っている（図１参照）。
尚、本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物作成のためのターゲットとなるマウスＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子は少なくとも３つのエキソンからなる遺伝子である。後述する実施例においては第１のエキソン部分を含む塩基配列領域をネオマイシン耐性遺伝子で相同置換させているが、これに限定されることなく、他のエキソン部分のいずれか、或いは複数のエキソン部分を組み合わせて、ネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択マーカー遺伝子と相同置換させるか、または欠失させてもよい。
上記方法によって得られたターゲティングベクターを導入する胚幹細胞としては、例えば既に樹立されたものを用いてもよく、またエバンスとカウフマンの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１））に準じて新しく樹立したものでもよい。
例えば、マウスの胚幹細胞の場合、一般的には１２９系の胚幹細胞が使用される。しかし、これに限定されることなく、純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかな胚幹細胞を取得するために、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立した胚幹細胞等も良好に使用し得る。かかる胚幹細胞は、採卵数が多くかつ卵が丈夫であるというＢＤＦ１マウスの利点に加えてＣ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景を有する病態モデルマウスが作出できる点で有利に用い得る。
また、胚幹細胞を樹立する場合、一般には受精後３〜５日目の胚盤胞を使用するが、それ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することも可能である。また、雌雄いずれの胚幹細胞を用いてもよいが、通常雄の胚幹細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。
胚幹細胞にターゲティングベクターを導入するには、胚幹細胞を生殖細胞への分化能を保つように未分化の状態で培養維持する必要がある。そのためには、培地に適当な栄養細胞をフィーダー細胞として加え、また、ヒトＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）を添加し、さらに牛胎仔血清、ヌクレオシド、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノールなどを添加して培養することを要する。栄養細胞（フィーダー細胞）としては、ＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５０３）、あるいはマウス胎仔線維芽細胞を好ましく例示できる。
栄養細胞（フィーダー細胞）の添加濃度は、２．５×１０５細胞／ｍｌ（１０ｍｌ／１００ｍｍ培養皿、２ｍｌ／３５ｍｍ培養皿、４ｍｌ／６０ｍｍ培養皿、０．５ｍｌ／ｗｅｌｌ：２４−ウエルプレート等の使用）が好ましい。ヒトＬＩＦの添加濃度は、１０３ユニット／ｍｌが好ましいがそれ以上でもよい。牛胎仔血清の添加濃度は２０％、ヌクレオシドの添加濃度は１０〜３０ｎＭが好ましい。非必須アミノ酸としては、例えば、ギブコ社製の非必須アミノ酸溶液が好ましく、その濃度は各０．１ｍＭが好ましい。２−メルカプトエタノールの濃度は０．１ｍＭが好ましい。
エレクトロポレーション法で胚幹細胞にターゲティングベクターを導入するには、胚幹細胞を一定の濃度になるように緩衝液に浮遊させ、適当な制限酵素で処理して線状化したターゲティングベクターを添加し、ＥＣＭ６００（ＢＴＸ社製）、或いはジーンパルサー（バイオ・ラッド社製）等の適当なエレクトロポレーション装置を用い、例えば２７０Ｖ／１．８ｍｍ、または２５０Ｖ／４ｍｍ、及び５００μＦＤでエレクトロポレーションを行うことが好ましい。緩衝液としては、ｐＨ７に調整したＰＢＳ等を用いることが好ましい。制限酵素はターゲティングベクターの制限酵素部位を考慮して選択することができる。
ターゲティングベクターを導入した後、胚幹細胞を上記の培地で２４〜４８時間培養し、その後、ネオマイシンのアナログであるＧ４１８（ジェネティシン：Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ：Ｓｉｇｍａ社製）を含む培地と交換する。１日ごとに新しいＧ４１８添加培地と交換し、約１週間培養を続ける。
次いで、ターゲティングベクターが導入された所謂ＴＳＡ２３０６ノックアウト胚幹細胞は、上記培地で薬剤（Ｇ４１８）耐性胚幹細胞を増殖させ、得られたＧ４１８抵抗性（アミノグリコシド系抗生物質抵抗性）のクローンから相同組み換え体を単離することによって行うことができる。
相同組み換え体の検出は、ＴＳＡ２３０６遺伝子上あるいはその近傍の塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡをプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲティングベクター上の塩基配列を有するＤＮＡとターゲティングベクターの作成に使用したＴＳＡ２３０６遺伝子以外の該遺伝子近傍領域の塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法による解析により、行うことができる。
具体的には、上記のＧ４１８添加培地で増殖したＧ４１８抵抗性のクローンの一部からＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡを抽出後、制限酵素処理を行い、アガロース電気泳動を行った後、ＴＳＡ２３０６遺伝子のｃＤＮＡまたはその部分断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行う。こうして、ターゲティングベクターの断片を検出できれば、その胚幹細胞は標的ＴＳＡ２３０６遺伝子の一方の対立遺伝子がターゲティングベクターと相同組み換えを起こしたクローン（ヘテロ欠損型胚幹細胞）であることが確認できる。
次いで、生殖系のキメラ動物およびＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子が破壊された改変遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物の作出は、以下のようにして行うことができる。
まず、目的の非ヒト動物の胚に上記で得られたヘテロ欠損型胚幹細胞を注入し、仮親の子宮に移植する。ここで、非ヒト動物の胚としてはキメラの形成に好適であるという理由から胚盤胞が用いられる。胚幹細胞は通常約１０〜１５個注入される。こうして、胚幹細胞が注入された胚は直ちに仮親の子宮に移植される。
上記の方法によって妊娠した仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。胚幹細胞の寄与率の高いキメラ動物は生殖系列のキメラ動物である可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交配して、得られた子マウスの毛色を指標とすることによって生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。
斯くして生殖系列のキメラ動物と正常動物（野生型：表現型（＋／＋））との交配によりヘテロ欠損型非ヒト動物が得られ、次いでヘテロ欠損型同士の交配によりＴＳＡ２３０６対立遺伝子の両方が破壊されたＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型非ヒト動物を得ることができる。
このようにして得られたホモ欠損型動物であるトランスジェニック非ヒト動物は、ＴＳＡ２３０６遺伝子を欠損している。
前記で得られるＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウス作成のために使用される受精卵の一具体例としては、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２８として日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに国際寄託されている「ＴＳＡ２３０６  遺伝子欠損マウス由来受精卵」を例示することができる。かくして本発明によれば、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２８として寄託されている受精卵及び該受精卵と同一の形質的特徴を有する受精卵から発生する非ヒト動物である、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物を提供することができる。
このようなトランスジェニック非ヒト動物を含む本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物は、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現が不活性化（ＴＳＡ２３０６遺伝子の欠損を含む）していることから、構造的にもまた機能的にも正常なＴＳＡ２３０６遺伝子を有する同種の非ヒト動物（ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型非ヒト動物）と比して、ＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡまたはＴＳＡ２３０６（蛋白質）が発現しないかまたは発現していても発現量が減退している、所謂ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全非ヒト動物である。
なお、上記において、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の作成方法として、塩基配列の一部を他の遺伝子で置換したＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列を有するターゲティングベクターをマウス胚幹細胞あるいはマウス卵細胞に導入してマウス胚幹細胞あるいはマウス卵細胞の染色体上のＴＳＡ２３０６遺伝子と相同組換えすることにより、マウスのＴＳＡ２３０６ゲノム遺伝子を破壊して調製する方法を記載したが、別の方法でＴＳＡ２３０６遺伝子の発現を不全化することもできる。
例えば、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現を不全化する別の方法として、ＴＳＡ２３０６の構造遺伝子をレポーター遺伝子で置換する方法を例示することができる。この方法によって作成したＴＳＡ２３０６発現不全非ヒト動物の確認は、レポーター遺伝子がＴＳＡ２３０６遺伝子のプロモーターの支配下に存在することから、レポーター遺伝子の発現の有無を確認することによって行うことができる。
具体的には、例えばＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列の一部をレポーター遺伝子として大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換した場合、本来ＴＳＡ２３０６が発現する組織でＴＳＡ２３０６の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて当該組織を染色することにより、簡便にＴＳＡ２３０６発現不全非ヒト動物が作成されたか否かを確認することが出来る。また、本来ＴＳＡ２３０６が発現する組織でのｌａｃＺｍＲＮＡ発現の有無を、常法に従って検出することによっても確認ができる。
ところで、このようにＴＳＡ２３０６の構造遺伝子をレポーター遺伝子で置換することによって作成された本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物によれば、ＴＳＡ２３０６プロモーターを活性化あるいは不活性化する物質をレポーター遺伝子の発現の有無を指標としてスクリーニングすることができる。こうした本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物は、ＴＳＡ２３０６プロモーターを活性化または不活性化に起因するＴＳＡ２３０６発現異常（発現増加、不発現または発現低下）によって生じる脂質代謝性疾患などの各種疾患の原因究明あるいは治療薬の開発に大きく貢献しうる。
また、本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物、特にＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型非ヒト動物（表現型（−／−））は、後述する実施例に示すように、血中の脂質濃度、特に血清中の脂質濃度（血清コレステロール（Ｃｈ）値、血清中性脂肪（ＴＧ）量、および血清遊離脂肪酸（ＦＦＡ）量）が、対応する正常の非ヒト動物（ＴＳＡ２３０６発現が正常な非ヒト動物：ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型、表現型（＋／＋））に比べて有意に低下している。一般に血清の脂質濃度は、生体内の脂質代謝系によってコントロールされていることから、本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物は何らかの機序によって生体内の脂質代謝に異常が生じ、血清中の脂質量（濃度）が低下していると考えられる。
よって、本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物、特にＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型の非ヒト動物は、脂質代謝異常に関わる疾患（脂質代謝異常疾患）を反映したモデル動物として位置づけることができる。当該モデル動物は、ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全に起因する脂質代謝性疾患の原因究明に有用であり、また治療薬の開発に大きく貢献することができる。
例えば、本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物は、脂質代謝調節剤（脂質代謝改善薬を含む）の有効成分の候補化合物のスクリーニングに有効に利用できる。かかるスクリーニングは、具体的には被験物質を本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物（脂質代謝異常モデル動物）に投与し、該動物の脂質代謝の改善効果を、その体内の脂質濃度（例えば、体脂肪量、血清コレステロール（Ｃｈ）、血清中性脂肪（ＴＧ）、または血清遊離脂肪酸（ＦＦＡ））から臨床的に評価することによって、脂質代謝改善薬として有効な化合物（候補化合物）を選別することが可能となる。なお、脂質代謝改善薬としては、コレステロール低下または増加薬、中性脂肪低下または増加薬、遊離脂肪酸低下または増加薬等を挙げることができる。
（４）ＴＳＡ２３０６またはその派生物の新規用途
また、本発明はＴＳＡ２３０６またはその派生物（抗体）の新規用途を提供する。
前述のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に関する知見から、ＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物（ＴＳＡ２３０６）は、直接または間接的に生体内の脂質代謝に関わっており、ＴＳＡ２３０６遺伝子の欠損によりＴＳＡ２３０６の産生が抑制されると体内の脂質量が減少することが判明した。このことから、ＴＳＡ２３０６遺伝子またはＴＳＡ２３０６は、体内脂質量の増加に関わる機能を有すると考えられる。
（４−１）かかる機能を利用して、ＴＳＡ２３０６は、体内の脂質量（特に血清中のコレステロール、中性脂肪及び遊離脂肪酸などの血清脂質量：以下、同じ）の減少を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内の脂質量の低下に起因する各種の疾患（例えば、低脂質血症（低リポ蛋白血症）、低ＶＬＤＬ血症（低プレβリポ蛋白血症）、低ＨＬＤ血症、低コレステロール血症またはこれらに起因して発症する各種の疾患）の予防・治療剤、または体内の脂質量の増加をもたらす脂質増量剤（例えば、血清コレステロール増加剤、血清中性脂肪増加剤、血清遊離脂肪酸増加剤など）の有効成分として利用することができる。
本発明は、ＴＳＡ２３０６について、脂質減少を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内脂質量の低下に起因する各種疾患（以下、これらの疾患を「低脂質血症（低リポ蛋白血症）等」と総称する）の処置剤、または脂質増量剤としての医薬用途を提供する。
すなわち、本発明は、ＴＳＡ２３０６を有効成分とする脂質代謝異常改善用医薬組成物、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等処置用医薬組成物、または脂質増量化医薬組成物を提供する。
これらの医薬組成物の有効成分として利用するにあたって、本発明が対象とするＴＳＡ２３０６には、例えば配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＴＳＡ２３０６）の他、他の哺乳動物（例えば、マウス（配列番号６）、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等）に由来する同効物も包含される。但し、ヒトを対象とした医薬組成物の場合は、ヒトＴＳＡ２３０６を用いることが好ましい。
さらに、本発明が対象とするＴＳＡ２３０６には、上記ヒト、マウス、その他の哺乳動物に由来するＴＳＡ２３０６の相同物も包含される。当該相同物としては、ＴＳＡ２３０６と共通に保存する構造的な特徴を備え、ＴＳＡ２３０６と同等の生物学的機能を有しているものが挙げられる。ここで対象とする生物学的機能としては、生体内における脂質代謝に関わる機能、及び生体内における脂質増加機能（例えば血清脂質量増加機能、特に血清コレステロール増加機能など）を挙げることができる。好ましくはヒトＴＳＡ２３０６の相同物である。
かかる相同物には、ＴＳＡ２３０６の同族体（ホモログ）、誘導体及び変異体が含まれる。ここで変異体には、ＴＳＡ２３０６遺伝子の変異体（天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体）の発現産物、及びＴＳＡ２３０６のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入によって改変されたアミノ酸配列からなる変異体が包含される。こうしたＴＳＡ２３０６の相当物は、ヒトＴＳＡ２３０６（配列番号１）とアミノ酸レベルで、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上の相同性を有する蛋白質またはポリペプチドであることができる。なお、かかるアミノ酸配列の相同性は、配列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用した方法（Ｃｌｕｓｔａｌ，Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５，３０７−３１８（１９９４））或いはＳＷＩＳＳＰＬＯＴＳで解析することができる。
なお、上記ＴＳＡ２３０６の相同物には、元来のアミノ酸残基に代えて保存的な置換アミノ酸残基を有するものも含まれる。即ち、ＴＳＡ２３０６の相当物には、ＴＳＡ２３０６が有するの元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換してもＴＳＡ２３０６と同等の活性が保存されているであろうアミノ酸残基（保存的な置換アミノ酸残基）と置換されてなる蛋白質が含まれる。こうした保存的な置換アミノ酸残基の具体例としては、特開２０００−３２５０８７号公報の段落
【００２８】に記載されているものを挙げることができる（特開２０００−３２５０８７号公報の該当記載をここに援用する。）。
本発明が対象とするＴＳＡ２３０６は、ＴＳＡ２３０６遺伝子（ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子：配列番号２）の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，５９９０（１９８３）など参照〕に従って調製することができる。
該蛋白質の製造は、より詳細には、ＴＳＡ２３０６遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより行われる。ここでＴＳＡ２３０６の製造に使用される宿主細胞、発現ベクター、プロモーター、形質転換法、培養培地などについては、特開２０００−３２５０８７号公報
【００５９】〜
【００７０】に詳述されており、本発明においても同様に使用することができる（特開２０００−３２５０８７号公報の当該記載をここに援用する。）。
かくして得られるＴＳＡ２３０６は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３（１９８７）など参照〕により分離、精製できる。当該分離・精製方法も、特開２０００−３２５０８７号公報
【００７２】に詳述されており、本発明においても同様に使用することができる（特開２０００−３２５０８７号公報の当該記載をここに援用する。）。
尚、ＴＳＡ２３０６相同物をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、配列番号２に示されるヒトＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列を好適に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。また、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を上記保存的な置換アミノ酸残基等で置換するか、または欠失や付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した遺伝子の人為的変異方法により行うことができる。
またヒトＴＳＡ２３０６又はマウスＴＳＡ２３０６は、それぞれ配列番号１または６に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。当該ペプチド合成法等の詳細は、特開２０００−３２５０８７号公報
【００７５】〜
【００８１】に詳述されており、本発明においても同様に使用することができる（特開２０００−３２５０８７号公報の当該記載をここに援用する。
）。
本発明のヒトＴＳＡ２３０６及びその相同物の上記医薬組成物（脂質代謝異常改善剤、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等処置剤、または脂質増量剤）としての有用性は、上記蛋白質が有する、脂質低下をもたらす脂質代謝異常を改善して体内の脂質量を増加させる機能（コレステロール増加機能）に基づいている。ヒトＴＳＡ２３０６の当該機能は、ヒトＴＳＡ２３０６の同効物であるマウスＴＳＡ２３０６についてその発現が抑制された前述のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウス（ＴＳＡ２３０６発現不全マウス）の病理学的解析、表現型解析、脂質代謝制御関連遺伝子の発現解析などの結果から想定されるものであるが、その確認方法としては下記の方法を挙げることができる。
例（１）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウス表現型の解析：
ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウスの脂質代謝への制御関連遺伝子の発現解析並びに各種生化学試験を行い、かくして、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウスの表現型解析により、脂質の変化を観察することができる。具体的には、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウスの肝臓などの組織よりＲＮＡ抽出し、サザンブロットなどでそれらの遺伝子の発現の違いを野生型マウスと比較することで、脂質代謝異常のメカニズムを解析したり、又、血中の脂質量やレプチン等の酵素量を生化学的に測定することで、表現型の違いを見ることができる。
例（２）ＴＳＡ２３０６トランスジェニックマウスの作製：
ＴＳＡ２３０６遺伝子導入トランスジェニックマウスの作製を行い、ＴＳＡ２３０６を過剰発現させることでコレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸などの血清脂質の増加作用を各種生化学試験により検討することができる。
例（３）ＴＳＡ２３０６タンパク質の投与：
ＴＳＡ２３０６タンパク質をマウスなどの哺乳動物に投与（例えば静脈注射等）し、体内におけるコレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸などの血清脂質の増加作用を各種生化学試験により検討することができる。
（４−２）また、上記ＴＳＡ２３０６に結合する抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を含む。）はＴＳＡ２３０６のアンタゴニストとして、具体的には体内の脂質量（特に血清中のコレステロール、中性脂肪及び遊離脂肪酸などの血清脂質量：以下、同じ）の増加を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内の脂質量の増加に起因する疾患（例えば、高脂質血症（高リポ蛋白血症）、高ＶＬＤＬ血症、高ＨＬＤ血症、高コレステロール血症またはこれらに起因して発症する各種の疾患［例えば動脈硬化性疾患など］）の予防・治療剤、または体内の脂質量の低下をもたらす脂質減量剤（例えば、血清コレステロール低下剤、血清中性脂肪低下剤、血清遊離脂肪酸低下剤など）の有効成分として利用することができる。
よって本発明は、ＴＳＡ２３０６に対する抗体について、脂質増加を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内脂質量の増加に起因する各種疾患（以下、これらの疾患を「高脂質血症（高リポ蛋白血症）等」と総称する）の処置剤（予防または治療剤）、または脂質減量剤としての医薬用途を提供する。
すなわち、本発明はまた、ＴＳＡ２３０６に対する抗体を有効成分とする脂質代謝異常改善用医薬組成物、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等処置用（予防または治療用）医薬組成物、または脂質減量化医薬組成物を提供する。
当該対象とするＴＳＡ２３０６の抗体には、ヒトＴＳＡ２３０６のほか、その同効物（他の哺乳動物に由来するＴＳＡ２３０６）、及びこれらＴＳＡ２３０６の相同物に対する抗体が含まれるが、ヒトを対象とした医薬組成物の有効成分としてはヒトＴＳＡ２３０６に対する抗体が好ましい。
当該抗体は、抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体のいずれも、ヒトＴＳＡ２３０６（配列番号１）またはエピトープを保存するその一部（ポリペプチド）を免疫抗原として用いて、常法により容易に調製することができる（例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（１９８６）など参照。）。
なお、ＴＳＡ２３０６に対する抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）は、上記医薬組成物の有効成分としての用途以外に、例えばＴＳＡ２３０６の精製や、その免疫学的手法による検出や定量などに有利に利用することができる。より具体的には、ＴＳＡ２３０６の諸組織における発現分布を見ることによってＴＳＡ２３０６の生理学的機能を調べたり、またＴＳＡ２３０６遺伝子の欠損および発現不全が脂質代謝異常（体内脂質の低下）をもたらすことが確認されていることから、該抗体を用いて脂質代謝異常（体内脂質の低下あるいは増加）の診断に利用することもできる。
（４−３）ＴＳＡ２３０６を上述する医薬組成物の有効成分として用いる場合、ＴＳＡ２３０６は、その医薬的に許容される塩の態様であってもよい。
かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム及びリチウム等との無毒性アルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム及びバリウム等との無毒性アルカリ土類金属塩；アンモニウムなどとの無毒性アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、有効成分としての蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との反応によって得られる無毒性酸付加塩も包含される。
またＴＳＡ２３０６またはその抗体を、各々上述する医薬組成物の有効成分として用いる場合、他の成分として医薬的に許容される担体または添加剤を含んでいてもよい。
上記医薬組成物に配合する担体としては、調製する医薬組成物（医薬製剤）の使用形態に応じて通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤及び滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などが例示でき、これらは対象とする医薬組成物（医薬製剤）の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。特に好ましい医薬組成物（医薬製剤）は、上記担体のほか、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の添加剤、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、または界面活性剤などを適宜使用して調製され得る。
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常蛋白質の安定に用いられるＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などが例示できる。これらは単独に使用することもできるが、必要に応じて、各々を組み合わせたりまた界面活性剤と組合せて使用することができる。界面活性剤との組合せることによって、安定性をより向上させる場合がある。また本発明の医薬組成物（医薬製剤）中に配合される添加剤の添加量は、常法に従って適宜決定できる。また、医薬組成物（医薬製剤）中に含ませる有効成分（ＴＳＡ２３０６、またはＴＳＡ２３０６に対する抗体）の量は、広範囲から適宜選択され、特に制限されないが、いずれも通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲内とするのが適当である。
また医薬組成物（医薬製剤）の剤型としては、各種の剤型が投与目的や投与経路に応じて選択できる。その代表的なものには、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液体が含まれる。これら各種剤型は、投与経路に応じて経口剤、非経口剤〔注射剤、点滴剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、経皮剤（軟膏剤、クリーム剤等）〕などに分類される。上記各剤型は、それぞれ、通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。なお、液体製剤として投与される場合、当初から溶液製剤として調製することもできるが、これを凍結乾燥製剤として調製することもできる。かかる凍結乾燥製剤は、用時に水または生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度の液剤として使用することができる。
上記医薬組成物（医薬製剤）の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。上記医薬組成物（医薬製剤）の投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、通常、１日当り患者体重１ｋｇ当り、有効成分量が０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度となる量とするのがよい。該製剤は１日に１回投与することもでき、また２回以上、数回に分けて投与することもできる。
（５）ＴＳＡ２３０３遺伝子及びその派生物の新規用途
また、本発明はＴＳＡ２３０６遺伝子またはその派生物（アンチセンス分子、ＲＮＡｉ等）の新規用途を提供する。
（５−１）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に関する知見から、前述するようにＴＳＡ２３０６遺伝子は、体内脂質量の増加に関わる機能を有すると考えられる。かかる機能を利用して、生体内から単離されたＴＳＡ２３０６遺伝子は、体内の脂質量（特に血清中のコレステロール、中性脂肪及び遊離脂肪酸などの血清脂質量：以下、同じ）の減少を生じる脂質代謝異常症（例えば、甲状腺機能亢進症、吸収不良栄養失調症、または実質性肝障害等）の改善薬、体内の脂質量の低下に起因する各種の疾患（例えば、低脂質血症（低リポ蛋白血症）、低ＶＬＤＬ血症、低ＨＬＤ血症、低コレステロール血症またはこれらに起因して発症する各種の疾患）の予防・治療剤、または体内の脂質量の増加をもたらす脂質増量剤（例えば、血清コレステロール増加剤、血清中性脂肪増加剤、血清遊離脂肪酸増加剤など）の有効成分として利用することができる。
本発明は、生体内から単離されたＴＳＡ２３０６遺伝子について、特に脂質減少を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内脂質量の低下に起因する各種疾患（以下、「低脂質血症（低リポ蛋白血症）等」と総称する）の処置剤、または脂質増量剤としての医薬用途を提供する。
すなわち、本発明は、単離されたＴＳＡ２３０６遺伝子を有効成分とする脂質代謝異常改善用医薬組成物、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等処置用医薬組成物、または脂質増量化医薬組成物を提供する。
これらの医薬組成物の有効成分として利用するにあたって、本発明が対象とするＴＳＡ２３０６遺伝子は生体内から単離されたポリヌクレオチドであり、具体的にはＴＳＡ２３０６の遺伝子からなるＤＮＡ、ＴＳＡ２３０６の構造遺伝子からなるＤＮＡ（ポリヌクレオチド）、ＴＳＡ２３０６をコードするｃＤＮＡ（ポリヌクレオチド）、及びＴＳＡ２３０６の一部をコードするオリゴヌクレオチド等、ＴＳＡ２３０６またはその機能同等物をコードするポリ（またはオリゴ）ヌクレオチドがいずれも包含される。
ここで対象とするＴＳＡ２３０６には、例えば配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＴＳＡ２３０６）の他、他の哺乳動物（例えば、マウス（配列番号６）、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等）に由来する同効物、またはこれらの相同物も包含される。但し、ヒトを対象とした医薬組成物の場合は、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子を用いることが好ましい。
ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子として具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２の塩基配列を一部に含むポリヌクレオチド（例えば配列番号３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、または配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示することができる。
なお、これらに限定されることなく、本発明が対象とするＴＳＡ２３０６遺伝子には、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子（配列番号２）（または配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子）と配列相同性を有し、構造的特徴、遺伝子発現パターンにおける共通性、生物学的機能の類似性などにより、ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子が含まれる。これにはヒトＴＳＡ２３０６遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。なお、ここで「生物学的機能」としては、生体内における脂質代謝に関わる機能、及び生体内における脂質増加機能（例えば血清脂質増加機能、特に血清コレステロール増加機能など）を挙げることができる。
ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子（例えば、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド）の相同物としては、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子と同様の生物学的機能（脂質増加機能、特に血清脂質増加作用、好ましくは血清コレステロール増加作用）を有することを限度として、例えば、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９７％の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。また、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子の相同物としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃といったストリンジェントな条件下で配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドを例示することもできる。また、これらの相同物には「配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列（改変されたアミノ酸配列）からなるポリペプチドをコードする遺伝子」もまた包含される。ここで、「アミノ酸の欠失、置換または付加」の程度およびそれらの位置などは、改変されたアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒトＴＳＡ２３０６蛋白質）と同様の生物学的機能を有する相同物であれば、特に制限されない。
上記目的で利用されるヒトＴＳＡ２３０６遺伝子の具体的態様としては、配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子が例示できる。この塩基配列中のコーディング領域（塩基番号２８位〜１４０７位、配列番号２に示す塩基配列）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。しかし、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，４３（１９８１）〕。
またヒトＴＳＡ２３０６遺伝子は、本明細書または特開２０００−３２５０８７号公報により開示された具体的な塩基配列情報（本明細書：配列番号２、３）に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。またヒトＴＳＡ２３０６遺伝子の取得、合成、ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング方法、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子発現産物の発現方法または蛋白質の取得方法、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子センス・プライマー、アンチセンス・プライマーの調製、取得、並びにスクリーニング用プローブの調製については、上記（２）及び（３）の欄に記載する方法に従って容易に実施できるが、また通常の遺伝子工学的手法を利用することによっても容易に行うことができる。
ＴＳＡ２３０６遺伝子を有効成分とする医薬組成物（体内の脂質量の減少を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内の脂質量の低下に起因する疾患の予防・治療剤、または脂質増量剤）は、先天的または後天的に該遺伝子の発現が不全になることによって上記脂質代謝異常症等や低脂質血症（低リポ蛋白血症）等に罹患した患者に対して、該遺伝子の発現を誘導するか亢進させるように処置するという戦略に基づくものである。ゆえに、ＴＳＡ２３０６遺伝子を有効成分とする医薬組成物は、特に下記（６）に記載する遺伝子療法に有効に用いることができる。また、当該遺伝子療法においては、ＴＳＡ２３０６遺伝子のほか、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子を含有するベクター、該ベクターを有する形質転換体もまた有効に利用される。
また、ＴＳＡ２３０６遺伝子は、上記医薬組成物としての用途以外に、ＴＳＡ２３０６のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列を使用することによって、個体或は組織におけるＴＳＡ２３０６遺伝子の発現産物の検出、該遺伝子の変異（欠失や点変異）の有無、または発現異常等を検出することが可能となることから、脂質代謝の生理的メカニズムの解明や脂質代謝異常疾患の診断方法の確立に有効に利用することができる。
（５−２）さらにＴＳＡ２３０６遺伝子を利用することによりアンチセンス分子の作成が可能である。こうしたアンチセンス分子は、ＴＳＡ２３０６遺伝子のアンタゴニストとして、具体的には体内の脂質量（特に血清中のコレステロール、中性脂肪及び遊離脂肪酸などの血清脂質量：以下、同じ）の増加を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内の脂質量の増加に起因する疾患（例えば、高脂質血症（高リポ蛋白血症）、高ＶＬＤＬ血症、高ＨＬＤ血症、高コレステロール血症またはこれらに起因して発症する各種の疾患［例えば動脈硬化性疾患など］）の予防・治療剤、または体内の脂質量の低下をもたらす脂質減量剤（例えば、血清コレステロール低下剤、血清中性脂肪低下剤、血清遊離脂肪酸低下剤など）の有効成分として利用することができる。よって本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子に対するアンチセンス分子について、脂質増加を生じる脂質代謝異常症の改善薬、体内脂質量の増加に起因する各種疾患（以下、「高脂質血症（高リポ蛋白血症）」等と総称する）の処置剤、または脂質減量剤としての医薬用途を提供する。すなわち、本発明はまた、ＴＳＡ２３０６遺伝子に対するアンチセンス分子を有効成分とする脂質代謝異常改善用医薬組成物、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等処置用医薬組成物、または脂質減量化医薬組成物を提供するものでもある。なお、アンチセンス分子の具体的な使用方法は、下記（６）の欄で詳述する。
尚、上記アンチセンス分子を含有するベクターの製造においては、導入されるＴＳＡ２３０６アンチセンス分子の全部または一部は、その遺伝子の塩基配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。ＲＮＡｉ法で採用するベクターも、同様に一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
その方法としては、前記アミノ酸の人為的改変方法の項において詳述した方法をいずれも準用することができる。上記ＴＳＡ２３０６アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＴＳＡ２３０６ＲＮＡｉ・オリゴヌクレオチドを用いた高脂質血症の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ・オリゴヌクレオチドを組込み、これを脂肪細胞または肝細胞などに感染させてアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ・オリゴヌクレオチドを導入させることにより、ＴＳＡ２３０６の発現を阻害し、所望の脂質代謝抑制効果およびその結果としての動脈硬化の進展抑制効果を得ることができる。
このように脂肪細胞または肝細胞、あるいはそれらの組織および周辺組織に、ＴＳＡ２３０６遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ・オリゴヌクレオチドを導入してＴＳＡ２３０６蛋白質の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ・オリゴヌクレオチドは、例えばＴＳＡ２３０６遺伝子の全長とする必要はなく、該ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現を阻害する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であってもよく、また該機能を保持した一部配列からなるオリゴヌクレオチド配列であってもよい。
（６）遺伝子治療用組成物、遺伝子治療方法
実施例で示すように、ＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物（ＴＳＡ２３０６）は、生体における脂質代謝に関わる機能を有し、生体内中の脂質の蓄積（増加）に働くことが分かった。
（６−１）この知見から、ＴＳＡ２３０６遺伝子を含有する発現ベクターを作成して、該発現ベクターを肝臓または脂肪組織などに導入して、これらの組織内でＴＳＡ２３０６遺伝子を発現させることによって、体内の脂質量、特に血清中の脂質量が増加することが期待される。こうした体内脂質量、特に血清脂質量の増加によって、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等及びこれらの疾患に起因して発症する各種の疾患が予防または治療できると期待される。また、ＴＳＡ２３０６遺伝子の欠損や発現不全に起因する脂質代謝異常疾患の場合、上記方法は脂質代謝改善療法として有用である。
従って、ＴＳＡ２３０６遺伝子、これを有する発現ベクターまたは該ベクターを有する細胞は、こうした体内脂質増加作用（体内リポ蛋白増加作用）（抗低脂質血症作用、抗低ＶＬＤＬ血症作用、抗低ＨＤＬ血症作用、抗低コレステロール血症作用、抗やせ症など）または体内脂質（体内リポ蛋白）の低下をもたらす脂質代謝異常症を改善する作用を有することから、遺伝子治療用組成物（遺伝子治療剤）の有効成分として有用であり、また上記疾患の遺伝子治療に有効に利用される。
よって本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子、これを有する発現ベクターまたは該ベクターを有する細胞について、脂質減少を生じる脂質代謝（リポ蛋白代謝）異常症の改善、体内脂質量（体内リポ蛋白量）の低下に起因する各種疾患〔低脂質血症（低リポ蛋白血症）等〕の予防または治療、または脂質増量を目的とした遺伝子療法における用途を提供する。
すなわち、本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子、これを有する発現ベクターまたは該ベクターを有する細胞を有効成分とする脂質代謝異常改善用の遺伝子治療用組成物、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等処置用の遺伝子治療用組成物、または脂質増量化（リポ蛋白増量化）のための遺伝子治療用組成物を提供する。また、これらの遺伝子治療用組成物を用いた遺伝子処置方法（脂質（リポ蛋白）代謝異常改善方法、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等の予防・治療方法、脂質増量化方法）を提供する。
上記遺伝子治療用組成物を利用した遺伝子治療は、具体的には、ＴＳＡ２３０６遺伝子を、必要に応じて発現ベクターまたは形質転換細胞を介して、脂質（リポ蛋白）代謝異常等の上記疾患患者の肝臓または脂肪組織またはこれらの細胞に、投与することによって実施される。かくして、これら組織におけるリポ蛋白代謝などの脂質代謝を改善して、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等を改善することができ、さらにかかる疾患に起因して生じる各種の疾患の発生を予防することができる。
（６−３）またＴＳＡ２３０６遺伝子の全部または一部に対するアンチセンス分子（ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子または合成分子）（以下、「ＴＳＡ２３０６アンチセンス分子」ともいう）を含有する発現ベクターを作成して、該発現ベクターを肝臓または脂肪組織などに導入して、これらの組織内でＴＳＡ２３０６アンチセンス分子を強制的に発現させることによって（アンチセンス法）、肝臓または脂肪組織におけるＴＳＡ２３０６遺伝子の発現が抑制され、その結果、体内の脂質（リポ蛋白）量、特に血清中の脂質（リポ蛋白）量が低下することが期待される。こうした体内脂質量（体内リポ蛋白量）、特に血清脂質量（血清リポ蛋白量）を減少させることによって、体内の脂質量の増加を伴う疾患〔例えば高脂質血症（高リポ蛋白血症）、高ＶＬＤＬ血症、高ＨＤＬ血症、高コレステロール血症など〕及びこれらの疾患に起因して発症する各種の疾患（動脈硬化症や肥満症）（以上、総括して「高脂質血症（高リポ蛋白血症）等」という）が予防でき、または治療できると期待される。また、ＴＳＡ２３０６遺伝子の多量発現（発現亢進）に起因する脂質代謝異常疾患の場合、上記アンチセンス法は脂質代謝改善療法として有用である。
なお、上記アンチセンス法は、ＲＮＡｉ（２本鎖ＲＮＡ：Ｚａｍｏｒｅ  ＰＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０００，Ｍａｒ．３１，ｐ２５−３３）を用いても同様に行うことができる。
従って、アンチセンス分子またはＲＮＡｉ、これらを有する発現ベクターまたは該ベクターを有する細胞は、こうした体内脂質（リポ蛋白）低下作用（抗高脂質血症作用、抗高ＶＬＤＬ血症作用、抗高ＨＤＬ血症作用、抗高コレステロール血症作用、抗肥満症など）または体内脂質の増加をもたらす脂質代謝異常症を改善する作用から、当該疾患の遺伝子治療用組成物（遺伝子治療剤）の有効成分として有用であり、また上記疾患の遺伝子治療に有効に利用される。
よって本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子に対するアンチセンス分子またはＲＮＡｉ、これを有する発現ベクターまたは該ベクターを有する細胞について、脂質増加を生じる脂質代謝異常症の改善、体内脂質量の増加に起因する各種疾患の処置、または脂質量低下を目的とした遺伝子療法における用途を提供する。
すなわち、本発明は、ＴＳＡ２３０６遺伝子に対するアンチセンス分子またはＲＮＡｉ、これを有する発現ベクターまたは該ベクターを有する細胞を有効成分とする脂質代謝異常改善用の遺伝子治療用組成物、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等処置用の遺伝子治療用組成物、または脂質減量化のための遺伝子治療用組成物を提供する。また、これらの遺伝子治療用組成物を用いた遺伝子処置方法（脂質代謝異常改善方法、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等の予防・治療方法、脂質減量化方法）を提供する。
上記遺伝子治療用組成物を利用した遺伝子治療は、具体的には、ＴＳＡ２３０６遺伝子を、必要に応じて発現ベクターまたは形質転換細胞を介して高脂質血症患者（例えば、肝臓または脂肪組織やこれらの細胞）に、投与することによって実施される。かくして、これら組織におけるリポ蛋白代謝などの脂質代謝を改善し、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等、特に高コレステロール血症、高中性脂肪血症を改善することができる。即ち、肝臓および脂肪組織における脂質代謝を改善するとともに、結果として動脈硬化の進展の予防、または退縮に良好な効果を得ることができる。
（６−４）以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１））、アウスベル（Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２））、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８５））、アナンド（Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２））、グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９１））およびフィンク（Ｆｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１１−１９（１９９２）に記載されている。
遺伝子治療は、治療の目的に応じて、（１）例えば低脂質血症（低リポ蛋白血症）等をもたらす体内脂質代謝異常の改善、低脂質血症（低リポ蛋白血症）等の予防・治療、または脂質増量化を目的とする場合は、ＴＳＡ２３０６遺伝子含有発現ベクター（ＴＳＡ２３０６遺伝子導入用ベクター）または該ベクターによりＴＳＡ２３０６遺伝子が導入された細胞を用いて、（２）また高脂質血症（高リポ蛋白血症）等をもたらす体内脂質代謝異常の改善、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等の予防・治療、または脂質減量化を目的とする場合は、ＴＳＡ２３０６アンチセンス分子またはＲＮＡｉを含有する発現ベクター（ＴＳＡ２３０６アンチセンス分子またはＲＮＡｉ導入用ベクター：以下、これらを総称して「アンチセンス導入用ベクター」という）または該ベクターにより上記アンチセンス分子またはＲＮＡｉが導入された細胞を用いて実施できる。（１）の遺伝子治療は、ＴＳＡ２３０６遺伝子の全部または一部が欠損するかもしくはその発現不全が認められる細胞に、正常な遺伝子を導入して正常な発現を誘導する方法である。（２）の遺伝子治療は、例えばＴＳＡ２３０６遺伝子の発現が認められる細胞に、その発現を阻止または抑制する分子を導入して該遺伝子の発現乃至その機能を阻害する方法である。こうした遺伝子治療によって、受容細胞／標的細胞周囲の脂質代謝が改善される。
本発明に係わる脂質代謝の改善（抑制、亢進）または低脂質血症（低リポ蛋白血症）等若しくは高脂質血症（高リポ蛋白血症）等（動脈硬化症が含まれる）の予防・治療のための遺伝子治療は、以下の如くして実施される。
まず、例えば、患者の肝臓または脂肪組織に由来する細胞についてＴＳＡ２３０６遺伝子発現の有無を確認する。この確認は、例えばＰＣＲ法の如き方法によって行うことができ、まずＴＳＡ２３０６遺伝子配列の一部を用いてプローブを作成し、上記細胞から抽出したＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物をスクリーニングすることにより実施できる。
また、ＴＳＡ２３０６遺伝子発現の有無の確認に代えて、発現不全をもたらすＴＳＡ２３０６遺伝子の変異（例えば野生型ＴＳＡ２３０６遺伝子の塩基配列への任意塩基配列の挿入・欠失・置換または点突然変異のごとき変異）を確認してもよい。上記変異の確認は、種々の方法、例えば直接的ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６，２７６６−２７７０（１９８９））、ドットブロット分析、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）分析、サザンブロット分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．，８６，１４−１６（１９９０））、一本鎖コンホメーション（ＳＳＣＡ；Ｏｒｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６，２７６−２７７０（１９８９）：Ｏｒｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５，８７４−８７９（１９８９））、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７，１６７−１７２（１９９０））、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ；Ｃｏｎｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０，２７８−２８２（１９８３））、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｒａｎｏ，＆  Ｋｉｄｄ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７，８３９２（１９８９））などにより行うことができる。これらの確認は、任意の組織（ヒトまたはその他の哺乳動物）に由来するＤＮＡに対して行うことができる。好適な方法としては、血液を取り、血液細胞からＤＮＡを抽出するか、標的とする組織（例えば肝臓）から直接得られた細胞からＤＮＡを抽出する方法を挙げることができる。
ＴＳＡ２３０６遺伝子発現の有無の確認は、またＴＳＡ２３０６をスクリーニングすることによっても行うことができる。該方法は、ＴＳＡ２３０６と免疫反応性を有するモノクローナル抗体を用いて、組織をスクリーニングすることにより実施できる。ＴＳＡ２３０６の欠如は、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現不全を示す。なお、かかる免疫学的なアッセイには、ウェスタンブロット、免疫組織学的アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなどの当該分野で知られた方法が好適に利用できる。
なお、上記したＴＳＡ２３０６遺伝子発現の有無を確認するための各種の方法は、本発明の遺伝子治療において、標的細胞若しくは組織にＴＳＡ２３０６遺伝子、またはＴＳＡ２３０６アンチセンス分子若しくはＲＮＡｉを導入した結果（導入の有無）を確認する際に利用することができる。
次いでＴＳＡ２３０６遺伝子導入用ベクターまたはアンチセンス導入用ベクターを作成する。ＴＳＡ２３０６遺伝子導入用ベクターまたはアンチセンス導入用ベクターは、当該遺伝子治療の分野において既に知られている各種のベクターであって肝臓および肝臓周辺組織内で複製できるウイルスまたはプラスミドベクターに、発現制御エレメントに連結したＴＳＡ２３０６遺伝子、または発現制御エレメントに連結したＴＳＡ２３０６アンチセンス分子もしくはＲＮＡｉを導入することによって作成できる。
ここで適当なベクターとしては、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（具体的にはｐＷＰ−７Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを用いて調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターを挙げることができる。
なお、一般に遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。本発明に係る肝臓に対しては、例えばアルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、またはトランススチレンのプロモーターを利用することができる。
次いで、作成したＴＳＡ２３０６遺伝子導入用ベクターまたはアンチセンス導入用ベクターを肝臓および肝臓周囲組織内に局所的に、または（他の部位に転移し得るいずれの肝細胞にも到達させるためには）全身的に患者に注射投与する。導入した遺伝子が、標的肝細胞の染色体に恒久的に取り込まれない場合には、該処理を定期的に繰り返すことができる。
なお、本発明において、遺伝子治療法は、遺伝子導入用ベクターを直接体内に投与するｉｎ  ｖｉｖｏ法と、患者の体内より一旦標的とする細胞（本発明の場合は肝細胞）を取り出して体外で遺伝子導入用ベクターを導入して、その後当該ベクターを介して遺伝子が導入された細胞を体内（肝臓組織）に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法の両者の方法を適宜選択できる。また、アンチセンス分子またはＲＮＡｉ・オリゴヌクレオチドの場合、これらを直接標的細胞内に導入する治療法もある。
遺伝子導入用ベクターを標的細胞に導入する方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈法、またはウイルス形質導入法など、細胞にＤＮＡを導入する当該分野における公知の方法を用いることができる。なお、ここでベクターを介してＴＳＡ２３０６遺伝子が導入された細胞は、脂質増加のため、または低脂質血症（低リポ蛋白血症）等の予防または治療のための医薬や治療研究のためのモデル系として利用できる。またベクターを介してＴＳＡ２３０６アンチセンス分子またはＲＮＡｉが導入された細胞は、脂質低下のため、または高脂質血症（高低リポ蛋白血症）等の予防・治療若しくは動脈硬化進展抑制のための医薬や治療研究のためのモデル系として利用できる。
ＴＳＡ２３０６遺伝子、またはＴＳＡ２３０６遺伝子のアンチセンス分子若しくはＲＮＡｉを導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、該標的細胞としては、脂肪細胞や脂肪組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、如き細胞などを挙げることができる。
上記遺伝子治療におけるＴＳＡ２３０６遺伝子、またはＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉの導入方法には、ウイルス的導入方法および非ウイルス的導入方法が含まれる。
ウイルス的導入方法としては、例えば、ＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉを導入する場合は、それらが正常肝臓および腎臓の細胞に対して外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。またその他のウイルスベクターとして、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）ベクターなどを用いることもできる。
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；導入するＴＳＡ２３０６遺伝子、またはＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉ（以下、ここではこれらを総称して単に「目的分子」という）を封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させて目的分子を細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Ｋａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２２０７１−２２０７４（１９９１）〕；プラスミドに導入した目的分子を金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内に目的分子を導入する方法〔Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７，９５６８−９５７２（１９９０）〕；目的分子を含むプラスミドを直接インビボで臓器に注入するネイキッド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ法〔Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６７（１９９０）〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した目的分子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１７５，Ｎｏ．９，６３５−６３７（１９９５）〕；特定細胞のみに目的分子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドを目的分子と結合させてそれを投与する、所謂リガンド−ＤＮＡ複合体法〔Ｆｒｉｎｄｅｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，２０２（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ．，９，１９０（１９９５）〕などを使用することができる。
また上記遺伝子導入法は、上述した各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。
上記ウイルス的導入方法の別法として、ＴＳＡ２３０６遺伝子、またはＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉを含有するウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と患者の標的細胞とを共培養して、予め標的細胞にＴＳＡ２３０６遺伝子、またはＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉを導入し、これを体内に戻す方法（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）を採用することもできる。
本発明の遺伝子治療法のうち、高脂質血症患者を対象とした高脂質血症の治療方法としては、患者から肝細胞やその他の細胞（例えば脂肪細胞）或いはそれらの周囲細胞を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立し、次いで、例えばレトロウイルスにて所望のＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉを標的とする上記細胞に導入し、薬剤耐性等を指標としてスクリーニングした後、選択した細胞を放射線処理して、患者肝臓内または傍肝臓に接種導入する肝治療法を一例として挙げることができる。
本発明は、こうした遺伝子治療に使用されるＴＳＡ２３０６遺伝子導入用ベクター、ＴＳＡ２３０６アンチセンス若しくはＲＮＡｉ導入用ベクター、またはＴＳＡ２３０６遺伝子が導入された細胞、またはＴＳＡ２３０６アンチセンス若しくはＲＮＡｉが導入された細胞を有効成分とし、それを薬学的有効量、医薬的に許容される担体または添加剤と共に含有する遺伝子治療用の医薬組成物（遺伝子治療剤）を提供する。
本発明の遺伝子治療用組成物に利用できる担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用できる。
遺伝子治療用組成物の投与形態としては、ＴＳＡ２３０６遺伝子導入用ベクター、またはＴＳＡ２３０６アンチセンス若しくはＲＮＡｉ導入用ベクターを有効成分とする組成物は、該ベクターをリポソームに包埋したリポソーム形態、または上記ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合は該ウイルスによって感染された培養細胞の形態を例示することができる。これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した懸濁液状の注射剤または点滴剤の形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
上記遺伝子治療用組成物の投与方法は、特に制限がなく、筋肉投与、静脈内投与、経皮投与及び経肺投与など、各種投与形態に応じて決定される。
上記遺伝子治療用組成物中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与経路、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。例えば、ＴＳＡ２３０６遺伝子、またはＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉを有効成分として含むベクターを投与する場合、そのベクター投与量は、導入する標的細胞の種類に応じて適宜選択されるが、ウイルス的導入方法を採用する場合は、通常、ウイルス価として、例えば標的細胞１×１０８細胞に対して１×１０３ｃｆｕから１×１０８ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。特に、ＴＳＡ２３０６アンチセンスまたはＲＮＡｉを含有するレトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０３ｐｆｕから１×１０１５ｐｆｕ程度とするのがよい。またＴＳＡ２３０６遺伝子、ＴＳＡ２３０６アンチセンス若しくはＲＮＡｉが導入された細胞を投与する場合、その投与量は１×１０４細胞／ｂｏｄｙから１×１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度の範囲から選ばれるのが適当である。
本発明の遺伝子治療用組成物は、１日に１回または数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。また、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与してもよい。
（６）脂質代謝改善薬の有効物質のスクリーニング方法
（６−１）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物を利用した脂質代謝改善薬の有効物質のスクリーニング方法
本発明は、前述する本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物を利用して、当該非ヒト動物の体内に脂質（コレステロール、以中性脂肪、遊離脂肪酸等）を負荷することによって誘導され得る血清脂質の上昇に対して拮抗作用（上昇する脂質の代謝を改善、又は脂質の上昇を抑制する作用）をもたらす物質を選別する方法を提供する。
当該方法によれば、血清脂質の上昇に対して拮抗作用（上昇する脂質の代謝を改善、または脂質の上昇を抑制する作用）を有する化合物、及び脂質代謝改善薬の有効物質の候補化合物を選別することができる。
ここで脂質代謝改善薬とは、具体的には体内の脂質量（特に血清中のコレステロール、中性脂肪及び遊離脂肪酸などの血清脂質量）の増加を生じる脂質代謝異常症の改善薬（例えば、リポ蛋白代謝改善薬など）、体内の脂質量の増加に起因する疾患〔例えば、高脂質血症（高リポ蛋白血症）、高ＶＬＤＬ血症、高ＨＬＤ血症、高コレステロール血症またはこれらに起因して発症する各種の疾患［例えば動脈硬化性疾患など］〕の予防または治療剤、または体内の脂質量の低下をもたらす脂質減量剤（例えば、血清コレステロール低下剤、血清中性脂肪低下剤、血清遊離脂肪酸低下剤など）を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法は、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の血清脂質の上昇に対して拮抗作用（上昇する脂質の代謝を改善、または脂質の上昇を抑制する作用）をもたらす候補化合物を選別することからなる方法であって、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に、脂質と共に被験物質を投与する工程、
（ｂ）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）を測定し、被験物質投与前後におけるその増減を、被験物質を投与せずに脂質単独を投与した上記に対応するＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の脂質投与前後における体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増減と比較する工程、
（ｃ）上記比較結果に基づいて、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増加を抑制または低下させる被験物質を選択する工程。
当該スクリーニング方法は、上記脂質代謝改善薬の有効物質となる候補化合物の選別方法として提供することができる。
ここでＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物としては、前述する本発明のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物を用いることができるが、好ましくはＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型非ヒト動物であり、より好ましくはＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウスである。
被験物質となりえるものとしては、特に制限されないが、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは具体的にはこれらの被験物質となりえる物質を含む試料（被験試料）をＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に投与させて行うことができる。かかる被験試料としては、核酸含有ベヒクル（ベクターや細胞など）、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子または高分子化合物、合成ペプチド、または天然植物抽出物が制限されることなく例示される。好ましくは、核酸、ペプチドまたは蛋白質を含む核酸含有ベヒクル、細胞抽出物、合成ペプチドまたは遺伝子ライブラリーの発現産物等を挙げることができる。
上記スクリーニングにおいて使用される脂質としては、コレステロール、中性脂肪、及び遊離脂肪酸を挙げることができる。これらの脂質は１種単独または２種以上を組み合わせてＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に投与することができる。投与時期は特に制限されず、被験物質の前であってもまた被験物質と同時であってもよい。
脂質の負荷によって生じるＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内の脂質（またはリポ蛋白）の増加を抑制または低下させる物質は、高カロリーまたは高脂質の食事を摂取することによって生じる疾患〔高低脂質血症（高リポ蛋白血症）等〕の予防または治療薬、または脂質代謝を改善して体内の脂質低減化をもたらす薬剤の有効物質として有用であると考えられる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、脂質の負荷によって生じるＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増加に対して、それを抑制又は低下するように働く物質を探索することによって、脂質代謝改善薬、特に高脂質血症（高リポ蛋白血症）等を予防または治療する薬剤の有効成分となる候補化合物を提供するものである。
候補化合物の選別は、具体的には下記のようにして行うことができる。すなわち、ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に、脂質投与後または脂質と同時に被験物質を投与して、投与前と投与一定期間後の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増減を測定し、その差を、被験物質を投与せずに脂質だけを投与した上記に対応する対照のＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物についての上記所定期間の体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増減と比較して、その体内脂質量（または体内リポ蛋白量）の増加の抑制（または低下）を指標として、被験物質の中から候補化合物を選別する。ここで指標とする体内脂質量（または体内リポ蛋白量）としては、体脂質率、または血清コレステロール値、血清中和脂肪量若しくは血清遊離脂肪酸量等の血清脂質量（または体内リポ蛋白量）のいずれであってもよい。好ましくは血清脂質量（または血清リポ蛋白量）である。なお、体脂質率、または血清コレステロール値、血清中和脂肪量若しくは血清遊離脂肪酸量の測定は常法に従って行うことができ、また商業的に入手できる試薬を用いて容易に測定することができる。
なお、上記方法によって選別された候補化合物は、更に高脂質血症モデル動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに高脂質血症（高リポ蛋白血症）患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することにより、より実用的な予防・治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
（６−２）ＴＳＡ２３０６遺伝子発現細胞を利用した脂質代謝改善薬の有効物質のスクリーニング方法
本発明は、高脂質を生じる疾患（高脂質血症（高リポ蛋白血症）、高ＶＬＤＬ血症、高ＨＤＬ血症、高コレステロール血症など）もしくはこれに起因して発生する各種の疾患（例えば動脈硬化性疾患）〔「高脂質血症（高リポ蛋白血症）等」と総称する〕を体内の脂質代謝を改善して予防または治療する薬剤、または体内の脂質代謝を改善して体内の脂質減量化をもたらす薬剤、の有効成分となり得る候補化合物を、前述するＴＳＡ２３０６遺伝子を発現する細胞を利用して選別する方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とＴＳＡ２３０６遺伝子を発現可能もしくは発現している細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞についてＴＳＡ２３０６遺伝子発現量を測定し、被験物質を接触させない上記に対応する対照細胞についてのＴＳＡ２３０６遺伝子発現量と比較する工程、
（ｃ）上記比較結果に基づいて、上記細胞についてＴＳＡ２３０６遺伝子の発現を抑制または低下させる被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、ＴＳＡ２３０６遺伝子を発現する細胞（発現可能な状態にあるか、または発現している細胞）であれば特に制限されない。またここで用いられるＴＳＡ２３０６遺伝子は、その由来は特に制限されず、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子の他、ヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、サル、ネコ、ウサギ、クマ等）に由来するＴＳＡ２３０６遺伝子、またはこれらの相同物であってもよい。また、ＴＳＡ２３０６遺伝子を発現する細胞は、内因性のＴＳＡ２３０６遺伝子を有する上記ヒトまたは各種の哺乳動物に由来する細胞（例えば、肝細胞）であってもよいが、例えばヒトＴＳＡ２３０６遺伝子などを遺伝子工学的手法により導入した細胞（原核細胞、真核細胞、昆虫細胞または動物細胞）を用いることもできる。
被験物質となりえるものとしては、特に制限されないが、核酸またはその修飾物（アンチセンス分子を含む）、ペプチド、蛋白質、抗体、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは具体的にはこれらの被験物質となりえる物質を含む試料（被験試料）をＴＳＡ２３０６遺伝子発現細胞と接触させて行うことができる。また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、細胞が死滅せず且つＴＳＡ２３０６遺伝子が発現できる培養条件（温度、ｐＨ．培地組成）を選択することが望ましい。
実施例に示すＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物に関する知見から、ＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物は体内の脂質増量（リポ蛋白増量）に関与しているものと考えられる。よって、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現を抑制させる物質は、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現亢進異常等によりＴＳＡ２３０６遺伝子が多量に発現することに起因して発生する疾患（例えば、高脂質血症（高リポ蛋白血症）、高ＶＬＤＬ血症、高ＨＤＬ血症、高コレステロール血症など）及び該疾患から派生的に生じる例えば動脈硬化性疾患等の疾患〔高脂質血症（高リポ蛋白血症）等〕の予防または治療のための有効物質として有用であると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現を阻止または抑制する物質を探索することによって、上記疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる候補化合物を提供するものである。
候補化合物の選別は、具体的には下記のようにして行うことができる。すなわち、被験物質をＴＳＡ２３０６遺伝子発現可能細胞に添加した場合に、該細胞におけるＴＳＡ２３０６遺伝子の発現レベルが被験物質を添加しない対照細胞のそのレベルに比して有意に低くなることを指標として、被験物質の中から候補化合物を選別する。なお、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、ＴＳＡ２３０６遺伝子特有の塩基配列をマーカー（プローブ）として用いて、細胞から調製したＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された該ＲＮＡと相補的なポリヌクレオチド（ｃＤＮＡなど）との反応を調べる方法（ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など）を挙げることができる。
以上のスクリーニング方法により、被験物質から選別される物質は、ＴＳＡ２３０６遺伝子の発現を阻止もしくは抑制することによって、高脂質血症（高リポ蛋白血症）等を予防または治療する薬剤、または体内の脂質減量化をもたらす薬剤の有効成分として有力な候補化合物となる。
なお、上記方法によって選別された候補化合物は、更に高脂質血症（高リポ蛋白血症）モデル動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに高脂質血症（高リポ蛋白血症）患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することにより、より実用的な予防・治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
実施例
以下に実施例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。ただし、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
実施例１
（１）ＴＳＡ２３０６遺伝子破壊用ベクター（ターゲッティングベクター）の作製
Ｇｅｎｂａｎｋで公表されているマウスＥＳＴの中から、ヒトＴＳＡ２３０６遺伝子の蛋白質コード領域（ＣＤＳ）の塩基配列に類似した配列からなるものをＢＬＡＳＴプログラムにより検索し、得られた各ＥＳＴをシークエンチャー（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて連結してマウスＴＳＡ２３０６ｃＤＮＡの仮想配列を決定した。この配列情報をもとに、オリゴヌクレオチドＴＳＡ２３０６  Ｐ１（配列番号４）及びＴＳＡ２３０６  Ｐ２（配列番号５）を合成し、これらをプライマーとして１２９／Ｓｖ／／ＥｖマウスＢＡＣライブラリー（リサーチ・ジェネティクス社製）をＰＣＲによってスクリーニングし、マウスＴＳＡ２３０６遺伝子を含むゲノムＤＮＡクローン（ｍＴＳＡ２３０６ＢＡＣ）を単離した。
得られたマウスＴＳＡ２３０６の遺伝子は、３つのエキソンからなり、配列番号６に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする領域（ＯＲＦ領域）を有している（ＯＲＦ領域の塩基配列：配列番号７）。尚、蛋白質コード領域（ＯＲＦ領域）と５’および３’非翻訳領域を含むｃＤＮＡ配列、すなわちマウスＴＳＡ２３０６の全長ｃＤＮＡは１４９２塩基を有している。得られたマウスＴＳＡ２３０６  ｃＤＮＡクローンと、ヒトＴＳＡ２３０６  ｃＤＮＡクローン（特開２０００−３２５０８号公報）の相同性は核酸レベルで８０．５％であり、推定されるアミノ酸配列レベルでは７６．７％であった。
ターゲティングベクターの作製には、このゲノムＤＮＡクローン「ｍＴＳＡ２３０６ＢＡＣ」のＤＮＡを制限酵素でＫｐｎＩ消化した後、上記オリゴヌクレオチド（ＴＳＡ２３０６  Ｐ１（配列番号４）及びＴＳＡ２３０６  Ｐ２（配列番号５））をプライマーとして増幅取得したＰＣＲ産物をプローブとするハイブリダイゼーションによって蛋白質翻訳開始エキソンを含む約１６ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を回収し、ｐＢｕｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ｐＢＳＫ：ストラタジーン社製）にサブクローンした。
次いでショットガン法［Ｋａｗａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ｔａｎｐａｋｕｓｈｉｔｓｕ  ｋａｋｕｓａｎ  ｋｏｓｏ，２４５８，４１，１９９６］により、該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。この塩基配列とターゲティングベクターとの相同領域として、第１エキソンより上流のＳａｌＩ−ＭｕｎＩ断片（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ７．３ｋｂ）および下流のＳｃａＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ｄｏｗｎ  ｓｔｒｅａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １．１ｋｂ）を採用し、またポジティブ選択マーカーとしてＭＣ１ＮｅｏＰｏｌｙＡ（ストラタジーン社製）、およびネガテイブ選択マーカーとしてＭＣ１プロモーターに連結したジフテリア毒素Ａ断片遺伝子（ＤＴ−Ａ）（東京大学医科研、勝木研究室より分与）を使用し、これらをそれぞれｕｐｓｔｒｅａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔとｄｏｗｎ  ｓｔｒｅａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔとの間、およびｄｏｗｎ  ｓｔｒｅａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔの下流に組み入れてターゲティングベクターを構築した（図１Ａ参照）。
実施例２  ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウスの作製
実施例１で作製した、マウスＴＳＡ２３０６遺伝子の遺伝子破壊用ベクター（ターゲティングベクター）を導入するマウス胚幹細胞、並びにフィーダー細胞及び培地として、ザ・マウス・キット（Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｉｔ：Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：レキシコン・ジェネティクス社製）を使用した。マウス胚幹細胞の培養は製品の使用説明書に従って行い、次いでＳａｌＩ消化により線状化させたターゲティングベクター５０μｇをエレクトロポレーションによって３．０×１０７個の胚幹細胞に導入した。遺伝子導入装置にはＥＣＭ６００（ＢＴＸ  Ｉｎｃ．社製）を用い、条件は２７０Ｖ／１．８ｍｍおよび５００μＦとした。導入後４８時間にジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（２５０μＭ，シグマ社製）を添加して、以後ネオマイシンに対する耐性を指標とした薬剤選択を７日間行い、２９９個のジェネティシン耐性コロニーの中から１２０クローンを回収した。回収されたこれらの胚幹細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、５’プローブ（２０２ｂｐ，ｍＴＳＡ２３０６ＢＡＣ  ＤＮＡを鋳型として以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより作製した：ｍＴＳＡ２３０６下流−３：ＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＴＣＴ：配列番号８、ｍＴＳＡ２３０６下流−４：ＴＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＣＧ：配列番号９）、３’プローブ（１６８ｂｐ，ｍＴＳＡ２３０６ＢＡＣ  ＤＮＡを鋳型として以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより作製した：ｍＴＳＡ２３０６上流−３：ＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡ：配列番号１０、ｍＴＳＡ２３０６上流−４：ＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧ：配列番号１１）およびｎｅｏプローブを用いてサザンブロット解析を行った結果、８株が相同組換え体として同定された。これらの胚幹細胞のうち２株（クローン番号７および３８）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス胚盤胞へ注入し、キメラマウスを作製した。
次いで作製したキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス（日本クレア株式会社より入手）と交配させた。その結果、クローン番号７に由来するキメラマウスからヘテロ欠損型マウス（＋／−）が得られた。さらにヘテロ欠損型マウス（＋／−）同士を交配させてホモ欠損型マウス（−／−）を作製した。
なお、得られたホモ欠損型マウス（−／−）の雌から取り出した卵子をホモ欠損型マウス（−／−）の雄から取り出した精子で受精させて調製したホモ欠損型マウス（−／−）の受精卵を、平成１３年７月３０日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、微生物の表示：（寄託者が付した識別のための表示）ＴＳＡ２３０６  遺伝子欠損マウス由来受精卵、（受託番号）ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４４０として国内寄託した。なお、上記特許生物寄託センターに国内寄託された当該受精卵は、平成１４年７月２６日付けで、同住所、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにおいてブタペスト条約に基づく寄託（国際寄託）に移管され、微生物の表示：（寄託者が付した識別のための表示）ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウス由来受精卵、（受託番号）ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２８として受領されている。
実施例３  遺伝子型の判定
ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス、実施例２で調製した胚幹細胞（クローン番号７）、ＴＳＡ２３０６遺伝子ヘテロ欠損型マウスおよびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウスについて、遺伝子型を判定した。
遺伝子型の判定には、ターゲティングベクターの構築に使用した５’プローブ（ｍＴＳＡ２３０６下流−３：ＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＴＣＴ：配列番号８、ｍＴＳＡ２３０６下流−４：ＴＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＣＧ：配列番号９）、および３’プローブ（ｍＴＳＡ２３０６上流−３：ＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡ：配列番号１０、ｍＴＳＡ２３０６上流−４：ＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧ：配列番号１１）用いた（図１参照）。
野生型マウス、ヘテロ欠損型マウスおよびホモ欠損型マウスのゲノムＤＮＡ、胚幹細胞（クローン番号７）のＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩまたはＥｃｏＲＩで消化し、ＫｐｎＩ消化の場合には５’プローブを、またＥｃｏＲＩ消化の場合には３’プローブを用いて、常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）に従ってサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行った。５’プローブによるサザンブロット解析（制限酵素ＫｐｎＩ使用時）において、野生型および欠損型（ホモ欠損型およびヘテロ欠損型）には、それぞれ３０ｋｂおよび１５ｋｂのバンドが検出された（結果示さず）。また３’プローブによるサザンブロット解析（制限酵素ＥｃｏＲＩ使用時）において、図２に示すように、野生型では６．２ｋｂのバンドだけが検出されて４．４ｋｂのバンドは検出されなかったのに対し、欠損型では４．４ｋｂのバンドが検出され、第１エキソン部がネオマイシンの構造遺伝子に置換されていることが確認された（図１Ｂ、図２参照）。なお、図２のレーン４は陽性コントロール（胚幹細胞クローンＮｏ．７）を示す。
実施例４  ノーザンブロット解析  −組織中でのＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡ発現−
肝臓組織中でのＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡの発現の有無を、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス、ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウス、およびＴＳＡ２３０６遺伝子ヘテロ欠損型マウスで調べて比較した。
まず、ＲＮＡ抽出試薬の使用説明書に従ってマウス組織からＲＮＡを抽出した。具体的には、マウスの肝臓に、変性剤であるＩＳＯＧＥＮ（商品名：ニッポンジーン社製）を加えて全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡ２０μｇをホルムアルデヒド法により電気泳動し、ハイボンドＮ＋（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）ナイロンメンブラン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）へ転写した。プローブには実施例１においてマウスＴＳＡ２３０６Ｐ１およびマウスＴＳＡ２３０６Ｐ２をプライマーとして調製したＰＣＲ産物（ｍＴＳＡ２３０６ＢＡＣ）を用いた。
ハイブリダイゼーション後、得られたハイボンドＮ＋（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）ナイロンメンブランについて６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で１５分間の洗浄を２回行い、その後、Ｘ線フィルム（コダック社製：Ｋｏｄａｋ）に−８０℃で約２０時間露光を行うオートラジオグラフィーを行なった。
その結果、マウスＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡは、野生型マウス及びヘテロ欠損型マウスの肝臓において強く発現していた（図３、レーン１及びレーン３）。この結果は、ヒトＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡの発現がヒト肝臓に特異的にみられるという結果と一致した。一方、ホモ欠損型マウスにおいてはマウスＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡの発現は認められなかった（図３，レーン２）。このことから、ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウスは、ＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡの発現能またはＴＳＡ２３０６産生能を消失していることが確認された。
実施例５  ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウスの表現型解析
＜実験方法＞
１１週齢（雄）のＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（正常マウス：表現型（＋／＋））、およびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウス（表現型（−／−））を対象として、自由に飼料を摂食させるか（自由摂食群）あるいは２４時間絶食させた（絶食群）後に、エーテル麻酔下で後大静脈より採血した。なお、各マウスは、自由摂食前後及び絶食前後にそれぞれ体重を測定した。採血後マウスの動脈を切開して失血死させ、諸臓器を摘出した。摘出した臓器は中性緩衝ホルマリンを用い冷暗所にて３日間固定した。アルコール脱水後、パラフィンに包埋して厚さ３μｍの切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色の他、必要に応じてアザンマロリー染色、鍍銀染色などの特殊染色を施した。また、精巣上体の脂肪を採取してその重さを測定し、体重３０ｇの脂肪重量に換算した（脂肪ｇ／３０ｇ体重）。採取した血液から血清を分離し、血清脂質濃度（血清中の中性脂肪量、遊離脂肪酸量、および総コレステロール値：いずれも日本クレア社に測定を依託）を測定した。
かくして得られた値に対して、乱塊法モデル（要因：遺伝子型、観察者：遺伝子型ｘ観察者）による分散分析［Ｈｕｙｎｈ，Ｈ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｔ，Ｌ．Ｓ．（１９７６）；Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｘ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｏｆ  ｆｒｅｅｄｏｍ  ｆｏｒ  ｓａｍｐｌｅ  ｄａｔａ  ｉｎ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｔ−ｐｌｏｔ  ｄｅｓｉｇｎｓ．；Ｊ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，１，６９−８２）を行い、群間の違いに関してはターキー（Ｔｕｋｅｙ）検定（Ｔｕｋｅｙ，Ｊ．Ｗ．（１９４９）；Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｅａｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ．；Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ６，９０−１１４）を行った。この場合の検定の有意水準は５％とし、ＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳジャパン社製、Ｒ６．１２）により検定した。
＜結果＞
表１に、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（＋／＋）とホモ欠損型マウス（−／−）の各自由摂取群及び絶食群について、得られた脂肪重量＜１−１＞および血清中の脂質量＜１−２＞を示す。なお、脂肪重量は、２４時間自由摂食後または絶食後の体重３０ｇ当たりの脂肪重量ｇとして示す。
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表＜１−１＞に示すように、自由摂食させたマウスにおいては、ホモ欠損型マウスは野生型マウスに比べて脂肪重量が有意（Ｐ＜０．０５）に減少していることが認められた。また２４時間絶食させたマウスにおいても、同様にホモ欠損型マウスは野生型マウスに比べ減少傾向が見られた。
また、表＜１−２＞に示すように、血清中の脂質量については、ホモ欠損型マウスの血清中性脂肪量は、野生型マウスに比べて有意（自由摂食：Ｐ＜０．０５、２４時間絶食：ＰＨ０．０１）に低いことが認められた（図４）。さらに血清遊離脂肪酸量（図５）、血清コレステロール値についても同様の結果が得られた（図６）。
なお、諸臓器の病理解析の結果、ホモ欠損型マウスと野生型マウスとの間に、自由摂食群及び絶食群ともに、特に差は認められなかった。
実施例６  ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウス高脂肪食負荷試験
ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウスに、高脂質血症抑制能があるかどうかを確認するため、１１〜１２週齢（雄）のＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（正常マウス：表現型（＋／＋））、およびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウス（表現型（−／−））に脂肪を多く含む高脂肪食を与え、各血清中の脂質の濃度を比較した。
具体的には、野生型マウスとホモ欠損型マウスのぞれぞれに、コントロール食（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母社製）（コントール食投与群）あるいは高脂肪食（ＣＲＦ−１に無塩バター１５％、コレステロール１．２５％添加、同オリエンタル酵母社製）（高脂肪食投与群）を与え、６週間後、各マウスより血液を採取し、血清を分離して血清中の脂質量（総コレステロール値、中性脂肪量、遊離脂肪酸量）を測定した。
尚、血清中の脂質量の測定は、中性脂肪はリピドス・リキッド（小野薬品株式会社製、日本）、遊離脂肪酸はＮＥＦＡ  Ｃテストワコー（和光純薬社製、日本）、コレステロールはコレステロールＥテストワコー（和光純薬社製、日本）を用いて行った。かくして得られた値は、実施例５と同様にＳＡＳのｔ検定を行なった。
結果を図７に示す。
コレステロール値に関しては、野生型マウスおよびホモ欠損型マウスのいずれも、コントロール食投与群に比べて高脂肪食投与群の方がコレステロール値が高かったが、ホモ欠損型マウスの場合、コントロール食投与群を含めて全体としてコレステロール値が低下しており、その高脂肪食投与群のコレステロール値は、野生型マウスのコントロール食投与群のコレステロール値（すなわち正常値）とほぼ同じであった（図７（ａ））。
また、中性脂肪量および遊離脂肪酸量に関しては、いずれも、コントロール食投与群および高脂肪食投与群の両方共にホモ欠損型マウスの方が野生型マウスに比べて著しく低かった（図７（ｂ）、（ｃ））。
実施例７：  ＴＳＡ２３０６遺伝子欠損マウスの病理解析
１１週齢のＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損マウス（表現型（−／−））とＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（正常マウス：表現型（＋／＋））から肝臓を取り出して液体窒素にて凍結後、ヒストプレップ（フィスト・サイエンス：Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて包埋した。サンプルをカットして厚さ１０μｍの切片を作製した。該切片をズダンＩＩＩ（ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ）染色に供して、中性脂肪を染色した。結果を図８に示す。図８に示されるように、野生型マウスの肝臓組織には大小多数の脂肪滴（オレンジ色に染まった）が認められたが（図８、左）、ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損マウスの肝臓組織では少数の小さな脂肪滴しか認められなかった（図８、右）。このことから、ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損マウスでは野生型マウスに比べて中性脂肪蓄積が減少していることがわかった。
実施例８  ＩＩ型糖尿病モデルｄｂマウスにおけるＴＳＡ２３０６の発現量解析  １０週令（雄）の糖尿病モデル・マウスＣ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂｍＪｃｌ（ｄｂ／ｄｂ）［Ｈｕｍｍｅｌ  ＫＰ，ｅｔ  ａｌ．，：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５３：１１２７−１１２８，１９６６］（日本クレア（株）製）、およびコントロール・マウスＣ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂｍＪｃｌ（ｄｂ／＋ｍ）をそれぞれ２群に分けてＮｏ．１〜５：ｄｂ／ｄｂ（糖尿病群）、Ｎｏ．６〜１０：ｄｂ／＋ｍ（コントロール群）とし、自由摂食させた後、明期２時間後に動脈を切開してマウスを失血死させ、肝臓を摘出した。
（１）定量ＰＣＲ用鋳型ｃＤＮＡの調製
上記条件で取り出した各群のマウスの肝臓より、それぞれ全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理を施した後、逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（２）リアルタイム定量ＰＣＲによる発現量解析
上記１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７００装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて、定量ＰＣＲを行なった。反応に使用したフォワード・プライマー、リワード・プライマー、およびタックマン標識プローブ（５’−ＦＡＭ、３’−ＴＡＭＲＡ標識）の塩基配列を、それぞれ下記に示す。
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反応サンプルは、５μｌの鋳型（上記（１）で調製した１本鎖ｃＤＮＡ）、１μｌの５ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー（フォワード・プライマー、リワード・プライマー）およびタックマン標識プローブ、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）および４．５μｌの蒸留水で、全量が２５μｌとなるように調製し、５０℃で２分、９５℃で１０分の反応を行った後、続いて１サイクル、９５℃で３０秒、６０℃で１分の反応を５０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物の量から、糖尿病群とコントロール群の各マウスの肝臓中のＴＳＡ２３０６の発現量を求めた。なお、ＴＳＡ２３０６の発現量は、β２−ミクログロブリンの発現量によって補正を行なった。
その結果を図９に示す。図９から明らかなように、糖尿病マウス（表現型：ｄｂ／ｄｂ）の肝臓では、コントロールマウス（表現型：ｄｂ／＋ｍ）に比してＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡが約３倍も高く発現していることが分かった。この結果から、糖尿病や肥満といった脂質代謝異常に関わる疾患にＴＳＡ２３０６遺伝子またはＴＳＡ２３０６が大きく関わっているといえる。
実施例９  マウスＴＳＡ２３０６（蛋白質）の調製
マウスＴＳＡ２３０６遺伝子をｐＥＴ２１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、該ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した後、それを培養して発現させて、ヒト組換え蛋白質（ｈＴＳＡ２３０６）を得た。
具体的には、実施例１で得られたマウスＴＳＡ２３０６ｃＤＮＡを鋳型として、５’端に制限酵素ＮｄｅＩサイト、３’端にＸｈｏＩサイトが付加するように設計した、マウスＴＳＡ２３０６ｃＤＮＡの全長が増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた産物を制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで切断した後、同制限酵素で切断したｐＥＴ２１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とライゲーションして発現ベクターを得た。このベクターを用いると、Ｃ末端に６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）が融合した組換え蛋白質が調製される。次いで、このベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。次いでｍＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓを発現した大腸菌を常法に従ってＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  １−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｆｏｓｉｄｅ）で誘導後、集菌し、１０％ショ糖を含む緩衝液（６Ｍ尿素、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム酸緩衝液（ｐＨ８．０））中で超音波破砕処理を行った。次いでこれを超遠心（１００，０００ｘｇ、３０分間、４℃）にかけ、得られた上清をＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ：ＱＩＡＧＥＮ社製）に供し、イミダゾールを含む緩衝液による濃度グラジェント溶出を行った。なお、マウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質の溶出の確認は、各溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ウエスタンブロット（α−Ｈｉｓ抗体使用）を行うことによって実施した。
かくして目的の組換え蛋白質（マウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質）は、５０〜１００ｍＭイミダゾール画分に得られた。
実施例１０  抗ＴＳＡ２３０６抗体の作製
実施例９において取得したマウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質含有溶液をセントリコン−１０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０：ミリポア社製）用いて濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、クマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０：Ｆｕｌｕｋａ社製）で染色し、約４２ｋｄに位置するバンドを切り出した。これからマウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質を抽出して免疫動物に免疫した。
具体的には、免疫動物としてウサギ（ＪＷ：メス８週齢）２羽（Ｒ１，Ｒ２）を用いて、１回あたり２００μｇずつ、マウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質を皮下に投与した。免疫は２週間おきに合計４回行った。４回目の免疫の１週間後に採血し、血清を調製して抗血清とした。
実施例１１  ウェスタンブロット解析
実施例１０で作製した抗血清（ポリクローナル抗体）の反応性を、上記免疫に抗原（免疫源）として用いたマウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質を抗原として使用して、ウェスタンブロットによって確認した。具体的には、マウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質を電気泳動にかけ、分離した蛋白質をそのままニトロセルロース紙に写しとり（４群作成）、次いでニトロセルロース紙をウサギＲ１およびウサギＲ２のそれぞれの免疫前血清または免疫後血清（抗血清）と反応させて、さらに二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．，Ｉｎｃ．，社製））を反応させた。その結果を図１０に示す。図からわかるように、ウサギＲ１およびＲ２のいずれも、免疫後の血清中にマウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質〔分子量４２ｋＤａ〕と特異的に反応する抗体（抗血清）が産生されていることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によって得られたＴＳＡ２３０６遺伝子欠損非ヒト動物、特にホモ欠損型マウスは、血清中の脂質量（濃度）の制御、具体的には脂質代謝の維持に重要な役割を持つＴＳＡ２３０６遺伝子を欠損しており、ＴＳＡ２３０６遺伝子発現不全モデル動物、血清脂質代謝の低下モデル動物、特に血清コレステロール低下モデル動物として有効に利用できる。また本発明によれば、血清脂質（血清リポ蛋白）増加作用を有するＴＳＡ２３０６遺伝子またはその発現産物に基づいて、脂質代謝異常疾患に対する新規医薬用途が提供される。かかる医薬用途としては具体的には脂質代謝改善、血清脂質濃度（コレステロール、中性脂肪など）の低下、抗動脈硬化などを目的とした医薬組成物並びに治療方法を挙げることができる。特に、本発明の遺伝子は肝臓などの組織に特異的な発現が認められることから、これら組織および周辺組織における脂質代謝の異常に基づく患者の治療に有用である。
更に本発明遺伝子のアンチセンス遺伝子またはＲＮＡｉは遺伝子治療法に、また遺伝子治療剤として有用である。
また本発明の遺伝子の提供によれば、該遺伝子がコードするポリペプチドを遺伝子工学的に大量に製造することができ、該ポリペプチドの提供によれば、ＴＳＡ２３０６活性やＴＳＡ２３０６ポリペプチドの結合活性などの機能を調べることもできる。
またＴＳＡ２３０６ポリペプチドは、本発明遺伝子およびその発現産物が関与する疾患（例えば肝臓や脂肪における脂質代謝に関連する疾患、特に高コレステロール血症）の病態解明や診断、治療などに有用である。
またＴＳＡ２３０６ポリペプチドは、本発明遺伝子の発現産物を免疫抗原とするポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の製造に有用である。そしてこれら抗体によれば、脂質代謝改善剤、特に血清コレステロール低下剤、血清中性脂肪低下剤、血清遊離脂肪酸低下剤（高脂質血症または高リポ蛋白血症の改善剤）を提供することができる。
本発明によれば、更にＴＳＡ２３０６遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチド）またはＲＮＡｉ、これらを含有する遺伝子治療のための遺伝子導入用ベクター、該センス・オリゴヌクレオチドを導入された細胞および該ベクターまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法が提供される。
また、本発明によれば、肝臓および脂肪組織における脂質代謝の抑制作用を有し、該作用によるこれらの脂質代謝性の疾患および病態の処置などに使用されるアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉを有効成分とする医薬も提供できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウスのＴＳＡ２３０６野生型（Ｉｎｔａｃｔ  Ａｌｌｅｌｅ）（図Ａ）と欠損型（Ｍｕｔａｎｔ  Ａｌｌｅｌｅ）（図Ｂ）の遺伝子の構造図を示す。なお、ターゲティングベクター中、「Ｎｅｏ」は、ネオマイシン耐性遺伝子、「ＤＴ−Ａ」はジフテリア毒素Ａ断片遺伝子を意味する。
図２は、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス、実施例２で調製したＴＳＡ２３０６遺伝子ヘテロ欠損型マウスおよびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウスのゲノムＤＮＡ、並びに胚幹細胞（クローン番号７）由来ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、３’プローブを使用してサザンブロット解析を行った結果を示す図面に代える写真である（実施例３）。レーン１は野生型マウス、レーン２はヘテロ欠損型マウス、レーン３はホモ欠損型マウス、及びレーン４は胚幹細胞（クローン番号７）の結果を示す。
図３は、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス、ＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウスおよびＴＳＡ２３０６遺伝子ヘテロ欠損型マウスの肝臓におけるＴＳＡ２３０６ｍＲＮＡの発現の有無を示す図面である（実施例４）。レーン１は野生型マウス、レーン２はホモ欠損型マウス、レーン３はヘテロ欠損型マウスについての結果である。なお、図中、Ｇ３ＰＤＨに関するデータは、レーン間のバラツキがないことを示すノーザンブロットの陽性コントロールを示すものである。
図４は、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（＋／＋）およびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損マウス（−／−）について、それぞれ自由摂食または２４時間絶食した後の血清中の中性脂肪量（ｍｇ／ｄｌ）を示す図面である（実施例５）。
図５は、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（＋／＋）およびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損マウス（−／−）について、それぞれ自由摂食または２４時間絶食した後の血清中の遊離脂肪酸量（ｍＥｑ／ｌ）を示す図面である（実施例５）。
図６は、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（＋／＋）およびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損マウス（−／−）について、それぞれ自由摂食または２４時間絶食した後の血清中のコレステロール値（ｍｇ／ｄｌ）を示す図面である（実施例５）。
図７は、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（＋／＋）およびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損マウス（−／−）のそれぞれについて、６週間に亘りコントロール食と高脂肪食を摂取させた後の血清中のコレステロール値（ｍｇ／ｄｌ）（図（ａ））、中性脂肪量（ｍｇ／ｄｌ）（図（ｂ））、および遊離脂肪酸量（ｍＥｑ／ｌ）を示す図面である（実施例６）。
図８は、ＴＳＡ２３０６遺伝子野生型マウス（左図）およびＴＳＡ２３０６遺伝子ホモ欠損型マウス（右図）について、それらの肝臓組織における中性脂肪の蓄積量をズダンＩＩＩ染色により比較評価した結果を示す図面に代える写真である（実施例７）。
図９は、ＩＩ型糖尿病モデルｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ）と正常マウス（ｄｂ／＋）について、ＴＳＡ２３０６遺伝子の肝臓における発現量を比較した図である（実施例８）。
図１０は、実施例１０で作成したＴＳＡ２３０６ポリクローナル抗体の反応性をマウスＴＳＡ２３０６−Ｈｉｓ組換え蛋白質を抗原として用いてウエスタンブロット分析で調べた結果を示す図面に代える写真である（実施例１１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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