(57)【要約】本発明は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法。
【請求項２】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、インターロイキン−２レセプターを高発現するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、ＣＤ８陽性細胞を高比率で含有するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、細胞傷害活性が高く維持されたものである請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物が固相に固定化されてなるものである請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
固相が細胞培養用器材または細胞培養用担体である請求項５記載の方法。
【請求項７】
細胞培養用器材がシャーレ、フラスコまたはバッグであり、細胞培養用担体がビーズ、メンブレンまたはスライドガラスである請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つをフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を含む培地中で行なう請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう請求項１記載の方法であって、
（ａ）培養開始時の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が、１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、および
（ｂ）培養開始時の培地中の細胞の濃度が、１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌである、
のいずれかの条件を満たす方法。
【請求項１３】
希釈する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含しない請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３いずれか１項に記載の方法により得られる細胞傷害性リンパ球。
【請求項１５】
請求項１〜１３いずれか１項に記載の方法により得られる細胞傷害性リンパ球を有効成分として含有する医薬。
【請求項１６】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする細胞のインターロイキン−２レセプター発現増強剤。
【請求項１７】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである請求項１６記載のインターロイキン−２レセプター発現増強剤。
【請求項１８】
フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである請求項１７記載のインターロイキン−２レセプター発現増強剤。
【請求項１９】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである請求項１７記載のインターロイキン−２レセプター発現増強剤。
【請求項２０】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とするリンパ球中のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤。
【請求項２１】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである請求項２０記載のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤。
【請求項２２】
フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである請求項２１記載のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤。
【請求項２３】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである請求項２１記載のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤。
【請求項２４】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする細胞傷害性リンパ球における細胞傷害活性の向上剤または維持剤。
【請求項２５】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである請求項２４記載の細胞傷害活性の向上剤または維持剤。
【請求項２６】
フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである請求項２５記載の細胞傷害活性の向上剤または維持剤。
【請求項２７】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである請求項２５記載の細胞傷害活性の向上剤または維持剤。
【請求項２８】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球でのインターロイキン−２レセプターの発現を増大する方法。
【請求項２９】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率を向上する方法。
【請求項３０】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含むことを特徴とする細胞傷害性リンパ球において細胞傷害活性を向上または維持させる方法。
【請求項３１】
細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む請求項１〜１３いずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
外来遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはシミアンウイルスを用いて導入する請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医療分野において有用な、細胞傷害性リンパ球を取得する方法に関する。
背景技術
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨと記載する）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔ＴＣ；細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体〔ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある〕クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特に免疫機能が正常なヒト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（イン・ビトロ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で誘導した後、もしくは誘導を行わず、リンパ球を拡大培養し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルにおいて養子免疫療法がウイルス感染および腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されている〔グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．）著、アドバンセズ・イン・イムノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１９９２年発行；ロイゼル  Ｐ．ら（Ｒｅｕｓｓｅｒ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第７８巻、第５号、第１３７３〜１３８０頁（１９９１）〕。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。
上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、イン・ビトロでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。
ＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持および増強するためには、ＣＴＬについて抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られるＣＴＬ数が減少し、十分な細胞数が得られない。
疾病の治療に有効なＴ細胞を調製する方法としては、例えば、高濃度のＩＬ−２を用いて誘導した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる養子免疫療法〔ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、第３１６巻、第１３１０〜１３２１頁（１９８６）；ローゼンバーグ  Ｓ．Ａ．ら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻、第２５号、第１６７６〜１６８０頁（１９８８）；ホ  Ｍ．ら（Ｈｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｌｏｏｄ、第８１巻、第８号、第２０９３〜２１０１頁（１９９３）〕が知られている。
次に、抗原特異的なＣＴＬの調製に関しては、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とインターロイキン−２（ＩＬ−２）〔リデル  Ｓ．Ａ．ら（Ｒｉｄｄｅｌｌ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１４６巻、第８号、第２７９５〜２８０４頁（１９９１）〕、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２〔リデル  Ｓ．Ａ．ら（Ｒｉｄｄｅｌｌ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１２８巻、第２号、第１８９〜２０１頁（１９９０）〕を用いて、それぞれＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法が報告されている。
さらに、国際公開第９６／０６９２９号パンフレットにはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬおよびＴＨを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供可能であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、末梢血単核細胞）とエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢＶと略す）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増加させることが特徴である。
また、国際公開第９７／３２９７０号パンフレットには改変ＲＥＭ法が開示されており、当該方法はＰＢＭＣとは区別されるＴ細胞刺激成分を発現する分裂していない哺乳動物細胞株をフィーダ細胞として使用し、ＰＢＭＣの使用量を低減させる方法である。
リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。この際、抗ＣＤ３抗体を加えて培養することにより、さらにＬＡＫ細胞の増殖は加速する。このようにして得られたＬＡＫ細胞は非特異的にさまざまながん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。ＬＡＫ細胞も上記ＣＴＬと同様に、養子免疫療法に使用される。
上記のとおり、細胞傷害性リンパ球、例えばＣＴＬ、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ等を取得する工程においてはＩＬ−２の利用を欠かすことができない。ＩＬ−２が細胞表面のインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）に結合することにより細胞はさらに活性化される。また、ＩＬ−２Ｒはリンパ球の活性化マーカーとして知られている。これらの点において、細胞表面のＩＬ−２Ｒの発現を上昇させることは重要である。また、ＣＴＬの誘導においては、抗原による刺激に供されたＣＴＬの前駆細胞がＣＴＬとして誘導される効率を向上させること、すなわち、誘導後の細胞群におけるＣＤ８陽性細胞の割合（比率）を向上させることが重要である。
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する。）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する。）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。（Ｄｅａｎｅ  Ｆ．Ｍｏｍｅｒ，ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ  ＩＮＣ．，ｐ１−８（１９８８）、Ｋｉｍｉｚｕｋａ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０  ｐ２８４−２９１（１９９１）、Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８  ｐ２１９３−２２０６（１９９７））
発明の開示
本発明の目的は、医療への使用に適した、細胞傷害活性を高いレベルで保持した細胞傷害性リンパ球を取得する方法を提供することにある。
すなわち、本発明は、
［１］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法、
［２］  細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、インターロイキン−２レセプターを高発現するものである前記［１］記載の方法、
［３］  細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、ＣＤ８陽性細胞を高比率で含有するものである前記［１］記載の方法、
［４］  細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、細胞傷害活性が高く維持されたものである前記［１］〜［３］いずれか１項に記載の方法、
［５］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物が固相に固定化されてなるものである前記［１］〜［４］いずれか１項に記載の方法、
［６］  固相が細胞培養用器材または細胞培養用担体である前記［５］記載の方法、
［７］  細胞培養用器材がシャーレ、フラスコまたはバッグであり、細胞培養用担体がビーズ、メンブレンまたはスライドガラスである前記［６］記載の方法、
［８］  細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つをフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を含む培地中で行なう前記［１］〜［４］いずれか１項に記載の方法、
［９］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである前記［１］〜［８］いずれか１項に記載の方法、
［１０］  フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである前記［９］記載の方法、
［１１］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである前記［９］記載の方法、
［１２］  細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう前記［１］記載の方法であって、
（ａ）培養開始時の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が、１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、および
（ｂ）培養開始時の培地中の細胞の濃度が、１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌである、
のいずれかの条件を満たす方法、
［１３］  希釈する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含しない前記［１２］記載の方法、
［１４］  前記［１］〜［１３］いずれか１項に記載の方法により得られる細胞傷害性リンパ球、
［１５］  前記［１］〜［１３］いずれか１項に記載の方法により得られる細胞傷害性リンパ球を有効成分として含有する医薬、
［１６］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする細胞のインターロイキン−２レセプター発現増強剤、
［１７］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである前記［１６］記載のインターロイキン−２レセプター発現増強剤、
［１８］  フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである前記［１７］記載のインターロイキン−２レセプター発現増強剤、
［１９］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである前記［１７］記載のインターロイキン−２レセプター発現増強剤、
［２０］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とするリンパ球中のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤、
［２１］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである前記［２０］記載のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤、
［２２］  フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである前記［２１］記載のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤、
［２３］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである前記［２１］記載のＣＤ８陽性細胞の比率向上剤、
［２４］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする細胞傷害性リンパ球における細胞傷害活性の向上剤または維持剤、
［２５］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドである前記［２４］記載の細胞傷害活性の向上剤または維持剤、
［２６］  フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである前記［２５］記載の細胞傷害活性の向上剤または維持剤、
［２７］  フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドより選択されるポリペプチドである前記［２５］記載の細胞傷害活性の向上剤または維持剤、
［２８］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球でのインターロイキン−２レセプターの発現を増大する方法、
［２９］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率を向上する方法、
［３０］  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含むことを特徴とする細胞傷害性リンパ球において細胞傷害活性を向上または維持させる方法、
［３１］  細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む前記［１］〜［１３］いずれか１項に記載の方法、並びに
［３２］  外来遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはシミアンウイルスを用いて導入する前記［３１］記載の方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、フィブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下に調製された細胞傷害性リンパ球において、細胞傷害活性が高く維持され、ＩＬ−２Ｒの発現量が有意に上昇し、およびＣＤ８陽性細胞の比率が向上することを見出し、完成するに至ったものである。
なお、本明細書において細胞傷害性リンパ球の製造とは、当該細胞の誘導（活性化）、維持、拡大培養の各工程、もしくはこれらを組み合わせた工程を包含する工程を指す。また、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造を、細胞傷害性リンパ球の培養とも称する。
以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明に使用されるフィブロネクチン、およびそのフラグメント
本明細書中に記載のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、天然から得られたもの、または人為的に合成されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンおよびそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ  Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ  Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等より得ることができる。
本発明においては、フィブロネクチンフラグメントとしては、例えば、少なくともＩＩＩ−８（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−９（配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１０（配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、およびＣＳ−１（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（第１図参照）が例示される。
また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
さらにフィブロネクチンのフラグメントとしては、Ｃ−２７４（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２７１（配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２７１（配列表の配列番号１１で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列）、またはＣ−ＣＳ１（配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列）より選択されるポリペプチドが例示される。
上記のＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６はＶＬＡ−４に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。さらに、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１およびＣＨ−２９６はヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。
本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは３つのＩＩＩ型配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型配列のうちの一つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合領域、Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）と一つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９０（配列表の配列番号１５で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９２（配列表の配列番号１６で表されるアミノ酸配列）、あるいは二つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列表の配列番号１７で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−１８１（配列表の配列番号１８で表されるアミノ酸配列）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３をそれぞれ含んでいる。
また、上記の各フラグメントにさらにアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用することができる。当該フラグメントは、例えば、後述の製造例に記載のＨ−２７５−Ｃｙｓの製造方法に準じて上記各フラグメントに所望のアミノ酸を付加することにより製造可能である。例えば、Ｈ−２７５−Ｃｙｓ（配列表の配列番号１９で表されるアミノ酸配列）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。
なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。
アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものである。例えば、アミノ酸の置換は、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入である。
また、「同等な機能を有する」とは、フィブロネクチンフラグメントが有する、（ｉ）細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性の維持機能、（ｉｉ）ＩＬ−２Ｒの発現量の増強機能、または（ｉｉｉ）ＣＤ８陽性細胞の比率向上機能の少なくともいずれかの機能を有することをいう。アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントが、それらの機能を有するかについては後述の実施例に記載の方法に準じて適宜確認することができる。また、アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適である。細胞接着活性およびヘパリン結合活性は、それらの前記活性測定方法に準じて評価することができる。
アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとして、例えば、２つの異なるドメイン間にリンカーとして１以上のアミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明に使用することができる。
なお、フィブロネクチン自体についても同様、そのポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、少なくとも前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの機能を有するポリペプチドを、本発明において使用することができる。
本明細書中に記載のフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて遺伝子組換え体より製造することもできる。例えば、上記のＨ−２７１（配列番号９）、Ｈ−２９６（配列番号１０）、ＣＨ−２７１（配列番号１１）、ＣＨ−２９６（配列番号１２）の各フラグメントならびにこれらを取得する方法は当該特許明細書に詳細に記載されている。また、上記のＣ−２７４（配列番号８）フラグメントは米国特許第５，１０２，９８８号明細書に記載された方法により得ることができる。さらに、Ｃ−ＣＳ１（配列番号１３）フラグメントは日本特許第３１０４１７８号明細書に記載された方法により得ることができる。上記ＣＨＶ−８９（配列番号１４）、ＣＨＶ−９０（配列番号１５）、ＣＨＶ−１７９（配列番号１７）の各フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書に記載された方法により得ることができる。また、ＣＨＶ−１８１（配列番号１８）フラグメントは国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載された方法に準じて得ることができる。ＣＨＶ−９２（配列番号１６）フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書および国際公開第９７／１８３１８号パンフレットを参照し、それらの文献に記載されたプラスミドに基づいて定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子工学的に取得することができる。
これらのフラグメントまたはこれらフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託された微生物を用いて製造する、あるいは各微生物の保持するプラスミドを公知の方法により改変することにより製造することができる；
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年１月３０日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（ＣＨ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２０（Ｈ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９１５（Ｃ−２７４をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８８年６月１７日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２３（Ｃ−ＣＳ１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９０年３月５日）、
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８２（ＣＨＶ−８９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）、
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８３（ＣＨＶ−１７９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）。
フィブロネクチンは巨大な糖タンパク質であるため、天然起源のタンパク質を調製して使用することは産業上および医薬品製造上、必ずしも容易ではない。さらにフィブロネクチンは生体内では血しょう中に多量に存在しており、血液製剤として血しょうから得られるフィブロネクチンを使用する場合は、フィブロネクチン以外の成分のコンタミネーションの恐れがあり、安全面においても問題あることも考えられる。また、フィブロネクチンは多機能タンパク質であることから、その使用の状況によっては、本発明の方法に効果を示す領域とは異なる領域に起因する不都合が起こることも考えられる。これらのことから、本発明においては、入手、取り扱いの容易さ、安全面の観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメント、さらに好適には前記のようにして得られる組換えフィブロネクチンフラグメントを使用することができる。さらに、後述するリンパ球の拡大培養率の向上、拡大培養されたリンパ球におけるＩＬ−２Ｒの発現量の上昇、および拡大培養されたリンパ球集団中のＣＤ８陽性細胞の比率の向上等の効果を示すことができるフィブロネクチンフラグメントが特に好適に使用できる。また、本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量としては、特に限定はないが、好適には１〜２００ｋＤ、より好適には５〜１９０ｋＤ、さらに好適には１０〜１８０ｋＤである。
（２）本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法
以下、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法について具体的に説明する。本発明の方法は、前記したフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう細胞傷害性リンパ球の製造方法である。
本明細書において細胞傷害性リンパ球とは細胞傷害性リンパ球を含有する細胞群を意味する。なお、狭義には前記細胞群に含有されている細胞傷害性リンパ球のみを示すことがある。また、本発明において細胞傷害性リンパ球の製造とは、本発明の細胞傷害性リンパ球になり得る前駆細胞からの細胞傷害活性を有するリンパ球への誘導、細胞傷害性リンパ球の維持、細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞を用いた細胞傷害性リンパ球の拡大培養のいずれをも包含するものである。
本発明の細胞傷害性リンパ球としては、特に限定するものではないが、例えば抗原特異的な細胞傷害活性を有する、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞等が挙げられる。
本発明において、細胞傷害性リンパ球になり得る、すなわち、該リンパ球への分化能を有する前駆細胞としては、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球等が例示される。また、血球系細胞であれば本発明において前駆細胞として使用できる。これらの細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。なお、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物から選択される有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球を製造することを１つの大きな特徴とする。
本発明の方法において、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および／または拡大培養は、通常、本発明の前記有効成分の存在下に、所定の成分を含む培地中で行なわれる。
例えば、本発明の方法において、細胞傷害性リンパ球の誘導もしくは拡大培養を意図する場合、本発明において使用される培養開始時の細胞（細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞）数としては、特に限定はないが、例えば１〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好適である。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法において使用される培地には特に限定はなく、細胞傷害性リンパ球、その前駆細胞の維持、生育に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍｌ、より好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍｌである。
また、抗ＣＤ３抗体をさらに含有する培地中で細胞傷害性リンパ球になり得る前駆細胞を共培養することもできる。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．０１〜１００μｇ／ｍｌが好適である。抗ＣＤ３抗体はリンパ球上のレセプターを活性化する目的で添加することができる。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
なお、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
いずれの場合も前記成分の固定化は、公知の方法、例えば、後述するフィブロネクチンフラグメントの固定化方法に準じて行なうことができる。
さらに、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖およびそれらの塩からなる群より選択される化合物や、下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いてもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
前記ＣＤ４４に結合活性を有する物質としては、例えばＣＤ４４リガンドおよび／または抗ＣＤ４４抗体が例示される。ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素の阻害剤が挙げられる。成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質としては、例えば成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質が挙げられる。さらに、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素の阻害剤が挙げられる。これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。
なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
本発明において前記有効成分の存在下とは、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持または拡大培養を行なう際に、前記有効成分がその機能を発揮し得る状態で存在することをいい、その存在状態は特に限定されるものではない。例えば、有効成分を使用する培地に溶解させる場合、共培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．０１〜１００００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、有効成分は、このように培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。培養された細胞傷害性リンパ球を生体に投与する観点からは、特に限定はないが、前記有効成分を固定化して使用することが望ましい。
前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法により細胞傷害性リンパ球を得た後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、有効成分等と該リンパ球とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐことができる。
本発明の有効成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。有効成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
例えば、フィブロネクチンのフラグメントの固定化は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法により実施することができる。
本発明の製造方法によって得られた細胞傷害性リンパ球についてＩＬ−２Ｒの発現量を測定すると、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なった細胞傷害性リンパ球に比較して有意なＩＬ−２Ｒ発現量の増加が認められる。ここで、ＩＬ−２Ｒ発現量は公知の方法、例えば、抗ＩＬ−２Ｒ抗体を使用して測定することができる。
上記のように、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球はＩＬ−２Ｒの発現量が増加している。ＩＬ−２Ｒは活性化Ｔ細胞表面に発現する活性化マーカーであり、この分子の発現に伴い、サイトカイン産生、細胞傷害活性、増殖活性等が活性化される。よって、本発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球は高い機能を有する細胞群である。
また、本発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球は、ＩＬ−２Ｒの発現量が増加していることから、培地中に添加されたＩＬ−２、あるいは細胞傷害性リンパ球の前駆細胞、リンパ球自体もしくは共存するその他の細胞が産生したＩＬ−２による刺激に対する感受性が向上している。このため、ＩＬ−２の少ない環境下（例えば体内等）でも自ら活性化することかできる。
さらに、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球では、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものに比べてＣＤ８マーカーを有する（ＣＤ８陽性）細胞の存在する比率が高い。このことは、例えば、▲１▼ＣＤ８陽性細胞はインターフェロン−γ等のサイトカインを産生して、免疫賦活を引き起こし、ヘルパーＴ細胞バランスをＴｈ１系にする、▲２▼ＣＤ８陽性細胞は細胞性免疫担当細胞であり、ウィルスや腫瘍細胞等の異物を効率よく排除することができる、▲３▼ＣＤ８陽性細胞を得る場合は、従来はマグネットビーズやフローサイトメーターでＣＤ８陽性細胞を精製していたが、本発明の方法では培養しながらＣＤ８陽性細胞をエンリッチにすることができる、▲４▼ＣＤ８陽性細胞比が多いことから、ＣＴＬを誘導する際の前駆細胞としての使用に適している、▲５▼ＣＤ８陽性細胞比の少ない細胞集団からでも、ＣＤ８陽性細胞比率を高めながら培養することができる、等の利点がある。よって、本発明の方法は細胞傷害性リンパ球の調製において極めて有用である。
なお、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率は、特に限定するものではないが、例えば抗ＣＤ８抗体を使用して測定することができる。
また、本発明の方法により調製された細胞傷害性リンパ球、特にＣＴＬについては培養後の細胞を長期間にわたって維持、あるいはこれを増殖させても、従来観察されたような細胞傷害活性の著しい低下がないという優れた性質を有している。すなわち、該細胞傷害性リンパ球は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、細胞傷害活性が高く維持されたものである。従って、培養された細胞傷害性リンパ球をクローン化することにより、安定した細胞傷害活性を有するリンパ球として維持することもできる。また、誘導されたＣＴＬに抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させ、拡大培養することができる。この細胞傷害性リンパ球の維持、拡大培養には、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。
上記の細胞傷害性リンパ球の維持とは、細胞傷害性リンパ球を細胞傷害活性を保ったままで維持することをいう。その際の培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は前記と同様である。
本発明の方法における細胞傷害性リンパ球の維持および拡大培養は、本発明の有効成分、すなわちフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地中で細胞傷害性リンパ球をそれぞれ継続培養および拡大培養することを１つの大きな特徴とする。拡大培養によれば、細胞傷害性リンパ球の有する細胞傷害活性を維持させた状態でその細胞数を増加させることができる。すなわち、本発明の方法は、１つの態様として、細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法を提供する。
本発明の細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法において、その培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は前記と同様である。
本発明の拡大培養方法によれば、例えばＣＴＬの拡大培養の場合、１４日間の拡大培養によって１００〜１０００倍に細胞数の増加したＣＴＬを得ることができる。また、ＬＡＫ細胞の拡大培養の場合の一例としては、７日間の培養で約２００倍、９日間の培養で１０００倍に増加したＬＡＫ細胞を得ることができる。さらに、こうして得られた細胞傷害性リンパ球、特にＣＴＬについては従来の細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法、例えばＲＥＭ法や改変ＲＥＭ法で得られたものに比べてより高い細胞傷害活性を保持している。このような本発明の効果は、本発明の方法で拡大培養されたＣＴＬ等の有する細胞傷害活性を後述の実施例に記載の方法により測定し、確認することができる。
さらに、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法の特徴として、低細胞数から培養を開始することが可能である。養子免疫療法を行うためには大量のリンパ球が必要となるが、患者から大量のリンパ球を取得することは困難である。また、通常の細胞傷害性リンパ球の拡大培養では、使用する細胞数に応じた適切な培養面積の細胞培養用器材の選択や、適切な培地量での培養が必要となる。すなわち、通常は細胞培養用器材における培養面積〔すなわち、培地に接触している器材表面部分の面積（ｃｍ２）〕に対する細胞量（個数）は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上、細胞濃度は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の高密度で培養が開始され、これ以下の細胞量条件では、拡大培養率〔拡大培養前の細胞数に対する拡大培養後の細胞数の比（拡大培養後の細胞数／拡大培養前の細胞数）〕が非常に低くなり、大量の細胞傷害性リンパ球を得るまでに長期の培養期間を要する。よって、一般的には、例えば、小さな細胞培養用器材を用いて培養を開始した後、段階的に大きなスケールの細胞培養用器材を使用する、もしくは細胞培養用器材の数を増やして希釈操作を繰り返す等の方法により、大量のリンパ球を製造するのが現状である。このように、通常の細胞傷害性リンパ球の拡大培養では、複数の培養系を必要とする。
本発明の方法により、少量の細胞量より開始された場合でも細胞培養用器材の大きさに関わらず、高い拡大培養率で培養を行うことができる。よって、従来のような面倒な細胞培養用器材の交換や希釈操作は不要となる。すなわち、本発明の方法によれば、１つの細胞培養用器材を用いた培養操作により、換言すれば、１つの培養系により、充分な細胞傷害性リンパ球の拡大培養を行なうことができる。よって、本発明の方法は、希釈する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含しない細胞傷害性リンパ球の製造方法である。特に、本発明の方法でＬＡＫ細胞を拡大培養する場合、大容量の細胞培養用器材にＬＡＫ細胞となり得る細胞と培地を添加し、それ以降はＩＬ−２を添加するのみでＬＡＫ細胞の拡大培養を行うことが可能である。簡便な操作で大量のＬＡＫ細胞を得ることができる点において、本発明は非常に有用である。この際、使用する本発明の有効成分としては、より高い拡大培養率を得るという観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメントが使用できる。このように、本発明の方法によれば、短時間に必要量の細胞傷害性リンパ球を得ることができる。
例えば、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを、本発明の有効成分の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で低細胞数から開始する場合、培養開始時において、下記（ａ）および（ｂ）から選択される条件を満たす細胞量を使用して行うことができる。
（ａ）使用する細胞培養用器材における培養面積に対する細胞量の比率が、好適には１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好適には１０〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、特に好適には１×１０２〜５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。
（ｂ）培地中の細胞の濃度が、好適には１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、より好適には１０〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、特に好適には１×１０２〜５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。
なお、ここで細胞量とは、細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞の個数をいう。
また、本発明の方法においては、細胞培養用器材の交換や希釈操作の工程を包含しない、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを１つの培養系で行なう方法が例示される。
以下、本発明の製造方法によりＣＴＬを製造することを例に説明する。
ＣＴＬの誘導は、前記有効成分の存在下、ＣＴＬに所望の抗原に対する認識能力を付与するために、適切な抗原提示細胞とともにＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞を、例えば、任意の培地中でインキュベート（培養）することにより実施される。前駆細胞はＣＴＬになる前段階で、しかもＣＴＬに分化するように運命付けられている細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブ細胞、メモリー細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞等が挙げられる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して認識すべき抗原を提示する能力を有する細胞であれば特に限定はない。例えば、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞等に所望の抗原を提示させ、本発明に使用することができる。
本発明においては、例えばＣＴＬを製造する際の前駆細胞等の培養条件は一般的な公知の条件〔例えば、カーター  Ｊ．ら（Ｃａｒｔｅｒ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第５７巻、第１号、第１２３〜１２９頁（１９８６）を参照〕に従えばよい。
また、適切なフィーダ細胞と共培養することもできる。ＣＴＬをフィーダ細胞と共培養する場合には、ＣＴＬ、フィーダ細胞の両者の維持、生育に適した培地であることが望ましい。当該培地としては、市販の培地が使用できる。
本発明の方法に使用されるフィーダ細胞は、抗ＣＤ３抗体と協同してＣＴＬを刺激し、Ｔ細胞レセプターを活性化するものであれば特に限定はない。本発明には、例えば、ＰＢＭＣやエプスタイン−バールウィルスによって形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）が使用される。通常、フィーダ細胞は放射線照射のような手段で増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は公知の方法に従って決定すればよく、例えば、１×１０５〜７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好適である。
特に好ましい態様においては、フィーダ細胞として、非ウィルス感染細胞、例えば、ＥＢＶ−Ｂ細胞以外のものが使用される。これにより、拡大培養されたＣＴＬ中にＥＢＶ−Ｂ細胞が混在する可能性を排除することができ、養子免疫療法のようなＣＴＬを利用した医療の安全性を高めることが可能となる。
抗原提示細胞は、抗原提示能を有する細胞に抗原ペプチドを付加し、その表面に抗原ペプチドを提示させることにより調製することができる〔例えば、ベンドナレク  Ｍ．Ａ．ら（Ｂｅｎｄｎａｒｅｋ  Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、第１２号、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）を参照〕。また、抗原提示能を有する細胞が抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）する能力を有している場合には、当該細胞に抗原を負荷することにより、抗原が細胞内に取り込まれてプロセッシングを受け、断片化された抗原ペプチドが細胞表面に提示される。なお、抗原ペプチドを抗原提示能を有する細胞に付加する場合、使用される抗原提示細胞、誘導しようとするＣＴＬのＭＨＣ拘束性に合致する抗原ペプチドが使用される。
なお、本発明において使用される抗原は特に限定されるものではなく、例えば、細菌、ウィルスなどの外来性抗原や腫瘍関連抗原（癌抗原）などの内存性抗原等が挙げられる。
本発明においては、抗原提示細胞は非増殖性とすることが好ましい。細胞を非増殖性とするためには、例えばＸ線等の放射線照射またはマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行えばよい。
本発明における、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物から選択される有効成分の存在下、ＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞とともにインキュベート（共培養）してＣＴＬを誘導するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、ベンドナレク  Ｍ．Ａ．ら（Ｂｅｎｄｎａｒｅｋ  Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、第１２号、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）を参照〕に従えばよい。共培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。この共培養は通常、２〜１５日程度実施されるが、その間に抗原提示細胞を新たに調製したものに取り替えて再刺激を行ってもよい。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。
本発明の方法により得られるＣＴＬは所望の抗原を特異的に認識する能力を有しており、例えば該抗原を有する細胞を、その細胞傷害活性により特異的に破壊する。このＣＴＬの細胞傷害活性は公知の方法により評価できる。例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対するＣＴＬの細胞傷害活性を、ＣＴＬにより破壊された標的細胞に由来する放射能や蛍光強度を測定することによって評価できる。また、ＣＴＬや標的細胞より抗原特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することもできる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させた後に第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）分析することによりＣＴＬの細胞傷害活性を評価することができる。
なお、本発明のＣＴＬの拡大培養方法については、前記有効成分が、当該方法に使用される培養系に存在しておれば特に限定は無く、上記以外の従来のＣＴＬ拡大培養方法において、その培養系に前記有効成分を存在させて、すなわち、本発明の有効成分の存在下に前駆細胞等の培養（例えば、培養に使用される培地に前記有効成分を添加して）が行なわれる態様も本発明に包含される。
次にＬＡＫ細胞の培養方法について詳細に説明する。
ＬＡＫ細胞の培養は、前記有効成分の存在下、ＩＬ−２とともにＬＡＫ細胞となり得る細胞をインキュベートすることにより実施される。ＬＡＫ細胞となり得る細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられる。
また、ＬＡＫ細胞を培養するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、細胞工学、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．２、ｐ２２３〜２２７、（１９９５年）；細胞培養、１７、（６）、ｐ１９２〜１９５、（１９９１年）；ＴＨＥ  ＬＡＮＣＥＴ、Ｖｏｌ．３５６、ｐ８０２〜８０７、（２０００）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １７，  ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。共培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。この共培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換してもよい。
上記のＣＴＬ、ＬＡＫ細胞の誘導、維持、拡大培養と同様に、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に培養することにより、ＴＩＬについても高い細胞傷害活性を有する細胞群を調製することができる。本発明においては、これらの細胞の活性化操作においてフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を共存させる他には特に限定はなく、前記細胞の培養、活性化に適した培地を使用して実施することができる。フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の使用量、添加方法等については前記方法に準じて適切なものを選択すればよい。
以上の本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法により、細胞傷害活性が高く維持され、ＩＬ−２Ｒの発現量が有意に上昇し、ＣＤ８陽性細胞の比率が向上した、医療への使用に適する細胞傷害性リンパ球が得られる。よって、本発明の方法は、その一態様として、さらに、本発明の有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球でのインターロイキン−２レセプターの発現を増大する方法、本発明の有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率を向上する方法、並びに本発明の有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球において細胞傷害活性を向上または維持させる方法を提供する。
本発明の別の態様として、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有する細胞表面上のＩＬ−２Ｒ発現増強剤が提供される。当該増強剤は、有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、たとえば、活性化しようとする細胞に適した培地、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また、前記増強剤を含有する培地は細胞傷害性リンパ球でのＩＬ−２Ｒ発現増強用培地として使用することができる。前記培地は細胞培養のための基本的な成分を任意に含むものである。なお、前記増強剤およびＩＬ−２Ｒ発現増強用培地は、本発明の有効成分を用い、公知の方法に準じて製造することができる。前記増強剤またはＩＬ−２Ｒ発現増強用培地中の本発明の有効成分等の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。また、前記増強剤は、直接生体に投与することにより、生体内細胞上のＩＬ−２Ｒの発現を増強させることもできる。
また、本発明の別の態様として、フィブロネクチン、そのフラグメントおよびそれらの混合物から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする、培養されたリンパ球集団におけるＣＤ８陽性細胞の比率向上剤が提供される。当該比率向上剤は、有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、たとえば、活性化しようとする細胞に適した培地、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また、前記比率向上剤を含有する培地は細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率向上用培地として使用することができる。前記培地は細胞培養のための基本的な成分を任意に含むものである。なお、前記比率向上剤および比率向上用培地は、本発明の有効成分を用い、公知の方法に準じて製造することができる。前記比率向上剤またはＣＤ８陽性細胞の比率向上用培地中の本発明の有効成分等の含有量は、前記ＩＬ−２Ｒ発現増強剤等の場合と同様にして、所望により、適宜、決定することができる。また、前記比率向上剤は、直接生体に投与することにより、生体中の細胞傷害性リンパ球の比率を向上させることもできる。
また、本発明の別の態様として、フィブロネクチン、そのフラグメントおよびそれらの混合物から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする細胞傷害性リンパ球における細胞傷害活性の向上剤または維持剤が提供される。当該向上剤または維持剤は有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、例えば、活性化しようとする細胞に適した培地、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また前記向上剤または維持剤を含有する培地は細胞傷害性リンパ球における細胞傷害活性の向上用または維持用の培地として使用することができる。前記培地は細胞培養のための基本的な成分を任意に含むものである。なお、向上剤、維持剤、向上用培地および維持用培地は、本発明の有効成分を用い、公知の方法に準じて製造することができる。前記向上剤、維持剤、向上用培地および維持用培地の本発明の有効成分の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。また、前記向上剤および維持剤は、直接生体に投与することにより、生体中の細胞傷害性リンパ球の活性を向上または維持させることもできる。
さらに、上記の発現増強剤、比率向上剤、細胞傷害活性の向上剤および維持剤はその成分が適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化された形態のものであってもよい。
上記の細胞傷害性リンパ球の製造方法を用いて得られたリンパ球含有培養物中には、通常、ヘルパーＴ細胞等の細胞傷害性リンパ球以外の細胞も混在している。しかしながら、本発明により得られたリンパ球含有培養物中には細胞傷害活性を保持するリンパ球が多く含まれているため、該培養物から遠心分離等により該培養物中の細胞を回収し、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球としてそのまま使用することができる。しかも、前記有効成分等を細胞培養用器材等に固定化しておけば、得られた細胞傷害性リンパ球における該成分等の混入の心配はない。
また、さらに該培養物から公知の方法により、細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団（あるいは培養物）を分離し、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球として使用することもできる。すなわち、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、当該方法により得られた培養物から細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団を選択する工程を含むことができる。
細胞傷害性リンパ球を高含有する該細胞集団の選択方法については特に限定はないが、例えば培養物から所望の細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ８抗体を結合させた細胞培養用器材もしくは担体を用いて目的の細胞のみを選択的に回収する方法や、フローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。前記担体としては磁気ビーズやカラムが例示される。また、培養物から所望の細胞以外の細胞を吸着除去することにより、目的の細胞を高含有する細胞集団を得ることもできる。例えば、ヘルパーＴ細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ４抗体を使用し、当該リンパ球培養物からヘルパーＴ細胞を除去することができる。この工程にはフローサイトメーターを用いることもできる。このようにして得られた細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団は、培養物から非選択的に回収された細胞集団と比較してより強い細胞傷害活性を有しており、特に医療分野において好適に使用できる。
さらに本発明は、上記の本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法で得られた、細胞傷害性リンパ球を提供する。当該リンパ球、特にＣＴＬは、高い細胞傷害活性を有しており、長期間にわたる継続培養や拡大培養を行っても細胞傷害活性の低下が少ないという性質を有する。また、本発明は、当該リンパ球を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。特に、当該リンパ球を含有する前記治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適した細胞傷害活性を有するリンパ球が、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該リンパ球を有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定できる。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法においては、当該リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含することができる。すなわち、本発明は、その一態様として、細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む細胞傷害性リンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法、特に細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法を行うことにより、培養されるリンパ球のＤＮＡ複製能が増強される。よって、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法に、遺伝子の導入工程を包含することにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、細胞傷害性リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記リンパ球の誘導、維持および／または拡大培養のいずれかの工程と同時に、あるいは該工程の後に実施するのが、作業効率の観点から好適である。
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはシミアンウイルスが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
レトロウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、細胞傷害性リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
本発明において細胞傷害性リンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やリボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
本発明の方法によれば、例えば、がん等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子を細胞傷害性リンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのような細胞傷害性リンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）が例示される。
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子を細胞傷害性リンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
製造例１  フィブロネクチンフラグメントの調製
（１）フィブロネクチンフラグメントの調製
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｈ−２７１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４）より、米国特許第５，１９８，４２３号明細書に記載の方法により調製した。
また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６はそれぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）を用い、これを上記の明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｃ−２７４は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴＦ７２２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９１５）を用い、これを米国特許第５，１０２，９８８号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｃ−ＣＳ１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＳ２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２３）を用い、日本特許３１０４１７８号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−１７９は、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ１７９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８３）を用い、日本特許２７２９７１２号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−９０は日本特許２７２９７１２号明細書に記載の方法で調製した。すなわち、当該明細書に記載の操作によってプラスミドｐＣＨＶ９０を構築したうえ、該プラスミドを保有する形質転換体を培養し、該培養物よりＣＨＶ−９０を調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−１８１は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載の方法で、ＣＨＶ−１８１をコードするＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＣＨＶ１８１）を構築した後、該プラスミドを導入された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ１８１）を培養し、該培養物より、上記のＣＨＶ−１７９と同様の方法で調製した。
（２）ＣＨＶ−９２の調製
上記のポリペプチドＣＨＶ−１８１を発現させるためのプラスミド  ｐＣＨＶ１８１について、ＣＨＶ−１８１をコードする領域中のＩＩＩ−１３領域をコードする領域を欠失したプラスミドＣＨＶ９２を構築した。欠失操作は日本特許２７２９７１２号明細書に記載の、プラスミドｐＣＨＶ１７９からのＩＩＩ−１４コード領域の欠失操作に準じて行った。
上記のプラスミドｐＣＨＶ９２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ９２）を培養し、該培養物より日本特許第２７２９７１２号明細書に記載のＣＨＶ−８９ポリペプチドの精製方法に準じて精製操作を行い、精製ＣＨＶ−９２標品を得た。
（３）Ｈ−２７５−Ｃｙｓの調製
ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓを発現させるためのプラスミドは以下に示す操作に従って構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）よりプラスミドｐＣＨ１０２を調製した。このプラスミドを鋳型とし、配列表の配列番号２０に塩基配列を示すプライマー１２Ｓと配列表の配列番号２１に塩基配列を示すプライマー１４Ａとを用いたＰＣＲを行い、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインをコードする約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ（ともにタカラバイオ社製）で消化した後、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）とライゲーションすることにより、プラスミドｐＲＨ１を構築した。
プラスミドベクターｐＩＮＩＩＩ−ｏｍｐＡ１〔グーライェプ  Ｊ．ら（Ｇｈｒａｙｅｂ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第３巻、第１０号、第２４３７〜２４４２頁（１９８４）〕をＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩ（タカラバイオ社製）とで消化し、リポプロテインターミネーター領域を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩで消化した上記のプラスミドｐＲＨ１と混合してライゲーションを行い、ｌａｃプロモーター、ヘパリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片およびリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ１−Ｔを得た。
このプラスミドｐＲＨ１−Ｔを鋳型とし、配列表の配列番号２２に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ａと配列表の配列番号２３に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ｓとを用いたＰＣＲ反応の後、回収した増幅ＤＮＡ断片をＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で消化し、さらに該ＤＮＡ断片をセルフライゲーションさせた。こうして得られた環状ＤＮＡをＳｐｅＩとＳｃａＩ（タカラバイオ社製）とで消化して得られる２．３ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＲＨ１−ＴをＳｐｅＩとＳｃａＩ（タカラバイオ社製）とで消化して得られる２．５ｋｂのＤＮＡ断片とを混合してライゲーションを行い、プラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓを得た。該プラスミドには、前記のＨ−２７１のＮ末端側にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒの４アミノ酸が付加され、さらにＣ末端にＣｙｓが付加されたポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓがコードされている。
ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓは以下の方法により調製した。上記のプラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＲＨ−Ｃｙｓ）を１２０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で１晩培養した。培養液より回収した菌体を４０ｍｌの破砕用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。遠心分離を行って得られた上清を精製用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化されたハイトラップ−ヘパリンカラム（ファルマシア社製）にかけた。同緩衝液でカラム内の非吸着画分を洗浄した後、０〜１Ｍ  ＮａＣｌ濃度勾配を持つ精製用緩衝液で溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、Ｈ−２７５−Ｃｙｓの分子量に相当する画分を集めて精製Ｈ−２７５−Ｃｙｓ標品を得た。
実施例１  ＣＴＬにおけるＣＤ８陽性細胞比率
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたＨＬＡ−Ａ２．１保有ヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をＰＢＳ（−）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）上に重層して５００×ｇで２０分間遠心分離した。中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＢＳ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）／１０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
（２）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導は、Ｂｅｄｎａｒｅｋらの方法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１４７巻、第１２号、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）〕を一部改変して実施した。すなわち、５％ヒトＡＢ型血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＢｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）（以下５ＨＲＰＭＩと略す）に１〜４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例２−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、２４穴細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１ｍｌ／ウェルずつまき、５％ＣＯ２湿式インキュベーター中、３７℃で１．５時間インキュベートし、プラスチック接着性の単球を分離した。その後、非接着性の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地を用いて回収し、レスポンダー細胞として氷上に保存した。分離した単球には、抗原ペプチドとして５μｇ／ｍｌのインフルエンザウイルスタンパク質由来エピトープペプチド（配列表の配列番号２４に記載のマトリックスプロテイン由来Ａ２．１結合性ペプチド）および１μｇ／ｍｌのβ２マイクログロブリン（スクリプス社製）を含む５ＨＲＰＭＩを０．５ｍｌづつ添加し、２時間室温にてインキュベート後、Ｘ線照射（５５００Ｒ）して抗原提示細胞とした。各ウェルからペプチド液を吸引除去し、ウェルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄後、氷上保存しておいたレスポンダー細胞を０．５〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５ＨＲＰＭＩに懸濁し、１ｍｌ／ウェルづつ抗原提示細胞上に添加した。このとき、製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（以下、ＦＮｆｒと記載する）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。対照として、ＦＮｆｒを添加しない群も設定した。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。培養開始後２日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（塩野義製薬社製）と１０μｇ／ｍｌのＦＮｆｒを含む１ｍｌの５ＨＲＰＭＩ（対照は、ＩＬ−２のみ含有）を各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後同様のＩＬ−２およびＦＮｆｒ含有培地（対照はＩＬ−２のみ含有）を１ｍｌずつ添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあと、１週間培養したレスポンダー細胞を０．５〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁し、調製した抗原提示細胞上に１ｍｌ／ウェルずつ添加し、再刺激した。このとき、ＦＮｆｒを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（対照は無添加）。再刺激後２日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１０μｇ／ｍｌのＦＮｆｒを含む（対照はＩＬ−２のみ含有）１ｍｌの５ＨＲＰＭＩを各ウェルに添加した。また５日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍｌづつ添加し、さらに培養を２日続け、ＣＴＬを誘導した。
（３）ＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例１−（２）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。一晩エピトープペプチドと共培養、もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名  ２２１Ａ２．１）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（ドータイト社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後２０倍量のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）と混合し、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞はレスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。
実施例１−（２）で調製したメモリーＣＴＬをエフェクター細胞として１×１０５〜９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μｌ／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清１００μｌを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたｃａｌｃｅｉｎ量（蛍光強度）を測定した。ＣＴＬの細胞傷害活性は以下の式１にしたがって算出した。
式１：細胞傷害活性（％）＝
〔（各ウェルの測定値−最小放出量）／最大放出量−最小放出量）〕×１００
上式において最小放出量は標的細胞およびＫ５６２細胞のみ含有するウェルのｃａｌｃｅｉｎ放出量であり、標的細胞からのｃａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は標的細胞に界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を０．１％加えて細胞を完全破壊した際のｃａｌｃｅｉｎ放出量を示している。この結果、誘導直後において、細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（４）ＣＴＬ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例１−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを１％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社製）を含むＰＢＳ（ニッスイ社製）を用いて固定した後、ＰＢＳで洗浄した。固定細胞を１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１００μｌのＰＢＳ中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１もしくはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ともにＤＡＫＯ社製）を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再度１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳに懸濁した。この細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表１に示す。
2003080817.tif 000002
表１に示されるように、ＣＴＬ誘導時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、これらを添加しない対照に比較して、ＣＴＬ誘導開始後１４日目におけるＣＤ８陽性細胞の比率が高い。すなわち、フィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＣＤ８陽性細胞を有意に増殖させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかとなった。
実施例２  インターロイキン−２レセプター発現の誘導
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）ＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現率の測定
実施例２−（１）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現率の測定は、実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。なお、今回の操作ではＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体をＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）抗体（ＤＡＫＯ社製）に変更した。結果を表２に示す。
2003080817.tif 000003
表２に示されるように、各種のフィブロネクチンフラグメントを添加して誘導されたＣＴＬにおいてはいずれも細胞集団中のＩＬ−２Ｒ発現率の上昇が見られた。すなわち、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導を行うことにより、ＩＬ−２Ｒ発現量を増加させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかとなった。
実施例３  ＣＴＬの拡大培養
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）ＣＴＬの拡大培養
実施例３−（１）で調製したＣＴＬを５ＨＲＰＭＩで洗浄後、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。一方、実施例１−（１）と同様の方法により採取したＨＬＡ−Ａ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣをＸ線照射（３３００Ｒ）し、培地で洗浄後２〜５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。これらのＣＴＬ（３×１０４ｃｅｌｌｓ）とａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣ（４〜１０×１０６ｃｅｌｌｓ）を１０ｍｌの５ＨＲＰＭＩもしくは１０％ＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＢｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）（以下、１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩと略す）に懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ２のフラスコ（ファルコン社製）に入れ、３７℃湿式ＣＯ２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、ＣＴＬ誘導の際に添加したものと同じ終濃度１０μｇ／ｍｌのＦＮｆｒを添加した。また、ＦＮｆｒを添加せずに誘導を行った対照群にはＦＮｆｒは添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩもしくは１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩ  ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、ＦＮｆｒ添加群の培地には同濃度のＦＮｆｒを添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの細胞傷害活性を測定し、拡大培養前の細胞傷害活性をどれだけ維持しているかを「細胞傷害活性維持（％）」として算出した。
「細胞傷害活性維持（％）」は以下の式２にしたがって算出した。
式２：細胞傷害活性維持（％）＝
〔拡大培養後の細胞傷害活性（％）／拡大培養前の細胞傷害活性（％）〕×１００
測定結果を表３に示す。なお、表中においてＥ／Ｔ  ｒａｔｉｏは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を示す。
2003080817.tif 000004
表３に示されるように、誘導時ならびに拡大培養時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群のＣＴＬは、フィブロネクチンフラグメントを添加しなかった対照に比べて、１４日間の拡大培養の後も特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導、拡大培養を行うことにより、高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養が可能であることが明らかになった。
実施例４  ＣＴＬ拡大培養後細胞集団におけるＩＬ−２Ｒの発現
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現率の測定
実施例４−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養後のＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞の比率を測定した。結果を表４に示す。
2003080817.tif 000005
表４に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも拡大培養後の細胞集団上におけるＩＬ−２Ｒ発現細胞の比率の上昇が認められた。
つまり、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬを誘導し、拡大培養することにより、ＩＬ−２Ｒの発現量を増加させながら、ＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
実施例５  フィブロネクチン存在下でのＣＴＬ誘導、拡大培養
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、ＦＮｆｒにかえてフィブロネクチン（カルビオケム社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（対照は無添加）。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチン添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）ＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現率の測定
実施例５−（１）で調製したＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞の比率を測定した。結果を表５に示す。
2003080817.tif 000006
表５に示されるように、フィブロネクチン存在下に誘導されたＣＴＬでは、細胞集団上におけるＩＬ−２Ｒの発現量の上昇が見られた。
つまり、フィブロネクチン存在下にＣＴＬの誘導を行うことにより、ＩＬ−２Ｒの発現量を増加させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかになった。
（３）ＣＴＬの拡大培養
実施例５−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。このとき、誘導時にフィブロネクチンが添加されていたものにはフィブロネクチン（カルビオケム社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（対照は無添加）。得られたＣＴＬの細胞傷害活性を実施例１−（３）と同様の方法にて測定し、拡大培養前の細胞傷害活性をどれだけ維持しているかを「細胞傷害活性維持（％）」として算出した。
測定結果を表６に示す。
2003080817.tif 000007
表６に示されるように、フィブロネクチンの存在下にＣＴＬ誘導および拡大培養を行った群においては高い細胞傷害活性が保持されていた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもフィブロネクチンを添加しなかった対照の細胞傷害活性は明らかに低下していた。つまり、フィブロネクチンをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養が可能であることが明らかになった。
実施例６  固定化されたフィブロネクチン（ＦＮ）フラグメント存在下でのＣＴＬ拡大培養
（１）ＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にフィブロネクチンフラグメントを固定化した。すなわち、２４穴細胞培養プレート、１２．５ｃｍ２フラスコに各種フィブロネクチンフラグメント（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを１〜２ｍｌずつ添加し、室温で５時間インキュベートした後、使用時まで４℃で保存した。また上記のプレート、フラスコは使用前にＰＢＳで２回洗浄した。
（２）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）の方法に準じて、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、培養器材としてＦＮｆｒを固定化したプレートを使用した（対照には固定化処理を行っていないプレートを使用）。誘導後のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時に使用したプレートのＦＮｆｒ固定化の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（３）ＣＴＬの拡大培養
実施例６−（２）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）の方法に準じて拡大培養した。この際、培養器材として各種ＦＮｆｒを固定化したフラスコを使用した（対照には固定化処理を行っていないフラスコを使用）。また、培地には１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩを用いた。
こうして拡大培養されたＣＴＬの細胞傷害活性が拡大培養前に比較してどれだけ維持されているかを「細胞傷害活性維持（％）」として表し評価した。
測定結果を表７に示す。
2003080817.tif 000008
表７に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材（プレート、フラスコ）を使用した群のＣＴＬは拡大培養後にも特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもフィブロネクチンフラグメントを固定化しない器材を使用した対照では、細胞傷害活性は明らかに低下していた。つまり、固定化されたフィブロネクチンフラグメントを使用することにより、培地中に溶解しているフラグメントと同様に高い細胞傷害活性を長期的に保持したＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
実施例７  ＣＴＬ拡大培養後細胞集団におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例７−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養後のＣＴＬについて、実施例１−（４）に記載の方法でＣＤ８陽性細胞含有比率を測定した。結果を表８に示す。
2003080817.tif 000009
表８に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも拡大培養後の細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の上昇が認められた。
つまり、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬを誘導し、拡大培養することにより、ＣＤ８陽性細胞を有意に増殖させながら、ＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
実施例８  固定化されたフィブロネクチンフラグメント存在下で誘導されたＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現の誘導
（１）ＦＮフラグメント固定化
実施例６−（１）と同様の方法で、培養器材（容器）にフィブロネクチンフラグメントを固定化した。
（２）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）の方法に準じて、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、培養器材として実施例８−（１）で作成したＦＮｆｒ固定化プレートを使用した（対照には固定化処理を行っていないプレートを使用）。誘導後のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時に使用したプレートのＦＮｆｒ固定化の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（３）ＣＴＬの拡大培養
実施例８−（２）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）の方法に準じて拡大培養した。この際、培養器材として実施例８−（１）で作成したＦＮｆｒ固定化フラスコを使用した（対照には固定化処理を行っていないフラスコを使用）。また、培地には１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩを用いた。
こうして得られた拡大培養前後のＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞比率を測定した。
測定結果を表９に示す。
2003080817.tif 000010
表９に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材（プレート、フラスコ）を使用した群のＣＴＬは拡大培養前後のどちらにおいても対照群と比較してＩＬ−２Ｒ発現率の上昇がみられた。つまり、固定化されたフィブロネクチンフラグメントを使用することにより、培地中に溶解しているフラグメントと同様にＩＬ−２Ｒ発現量を高く維持しながらＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
実施例９  ＣＤ８細胞表面上のインターロイキン−２レセプター発現の誘導
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）ＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現率の測定
実施例９−（１）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬ（特にＣＤ８細胞表面上）におけるインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現率の測定は、実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。なお、今回の操作では１次抗体としてＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体を、２次抗体としてＰＥ標識マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）抗体（ＤＡＫＯ社製）を使用した。結果を表１０に示す。
2003080817.tif 000011
表１０に示されるように、各種のフィブロネクチンフラグメントを添加して誘導されたＣＴＬにおいてはＣＤ８陽性細胞集団におけるＩＬ−２Ｒ発現率の上昇が見られた。すなわち、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導を行うことにより、ＣＤ８細胞表面上のＩＬ−２Ｒ発現量を増加させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかとなった。
実施例１０  ＣＴＬ拡大培養前後細胞集団におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（フィブロネクチンとフィブロネクチンフラグメントとの比較）
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチンおよびＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例１０−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養前後のＣＴＬについて、実施例１−（４）に記載の方法でＣＤ８陽性細胞含有比率を測定した。結果を表１１に示す。
2003080817.tif 000012
表１１に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも対照群に対して拡大培養前および拡大培養後の細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の上昇が認められた。
つまり、フィブロネクチンそのものに比べ、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬ誘導し、拡大培養を行う方が、ＣＤ８陽性細胞を拡大培養前および拡大培養後いずれにおいても有意に増殖させながら、ＣＴＬを拡大培養するのに好適であることが明らかになった。
実施例１１  ＣＴＬ拡大培養前後細胞集団におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導
（フィブロネクチンとフィブロネクチンフラグメントとの比較）
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチンおよびＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有比率の測定
実施例１１−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養前後のＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有比率を測定した。結果を表１２に示す。
2003080817.tif 000013
表１２に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも対照群に対して拡大培養前および拡大培養後の細胞集団中におけるＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有比率の上昇が認められた。この上昇率はフィブロネクチン添加した群と比較して有意に高いものであった。
つまり、フィブロネクチンそのものに比べ、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬを誘導し、拡大培養を行う方が、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞を拡大培養前および拡大培養後いずれにおいても有意に増殖させながら、ＣＴＬを拡大培養するのに好適であることが明らかになった。
実施例１２  ＣＴＬの拡大培養（フィブロネクチンとフィブロネクチンフラグメントとの比較）
（１）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチンおよびＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
（２）ＣＴＬの拡大培養
実施例１２−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。また、培地には１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩを用いた。
こうして拡大培養されたＣＴＬの細胞傷害活性が拡大培養前に比較してどれだけ維持されているかを「細胞傷害活性維持（％）」として表し評価した。
測定結果を表１３に示す。
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表１３に示されるように、誘導時ならびに拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを添加した群のＣＴＬは、フィブロネクチンフラグメントを添加しなかった対照群に比べて、１４日間の拡大培養後も特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。またその活性はフィブロネクチンを添加した群と比較して有意に高いものであった。
つまり、フィブロネクチンそのものに比べ、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導、拡大培養を行うのが、高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養に好適であることが明らかになった。
実施例１３  ＬＡＫ細胞（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ）培養系における拡大培養率の測定
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮもしくはＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（容器）に抗ヒトＣＤ３抗体およびフィブロネクチンまたはＦＮフラグメントを固定化した。すなわち２４穴細胞培養プレートまたは１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）（終濃度５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを１ｍｌ（２４穴プレートの場合）または２ｍｌ（１２．５ｃｍ２フラスコの場合）ずつ添加した。この時、フィブロネクチンまたはＦＮフラグメント添加群にはフィブロネクチンまたは製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（ＦＮｆｒ）を終濃度１０μｇ／ｍｌ（２４穴プレートの場合）または２５μｇ／ｍｌ（１２．５ｃｍ２フラスコの場合）となるように添加した。対照として、フィブロネクチンおよびＦＮｆｒを添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、５％ヒトＡＢ型血清（Ｂｉｏ  ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＸＶＩＶＯ２０培地（Ｂｉｏ  ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）（以下５ＨＸＶＩＶＯ２０と略す）で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
５ＨＸＶＩＶＯ２０に０．５〜１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびフィブロネクチンもしくはＦＮｆｒ固定化プレートに１ｍｌ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目には１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＸＶＩＶＯ２０を１ｍｌ／ウェルずつ添加した。培養開始後４日目には適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようＩＬ−２を添加した。培養を継続し、２〜３日毎に培養開始５日目と同様に適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈し終濃度３００〜５００Ｕ／ｍｌとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後７〜１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表１４に示す。
2003080817.tif 000015
表１４に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。また、各フィブロネクチンフラグメント固定化群の拡大培養率は培養開始後１５日目にはフィブロネクチンを固定化した培養器材を使用した群よりも高いものであった。よって、拡大培養が長期に渡る場合、フィブロネクチンそのものに比べ、ＬＡＫ細胞誘導初期にフィブロネクチンフラグメントを共存させることが、より高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養するのに好適であることが明らかとなった。
実施例１４  ＬＡＫ細胞培養系における増殖率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際の培養開始後４日目から７日目までの細胞の増殖率を算出した。結果を表１５に示す。
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表１５に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して培養開始４日目から７日目までのＬＡＫ細胞の増殖率が高い。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、早い増殖速度でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例１５  ＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導・培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際、培養開始時の細胞濃度を２×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１×１０５〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）となるようにした。培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。結果を表１６に示す。
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表１６に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導時に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養開始時の細胞数に関わらず、培養開始後１５日目に高い拡大培養率が得られた。これに対して対照群では、培養開始時の細胞数が低い場合、培養開始後１５日目の拡大培養率が低かった。すなわち低細胞数からＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、培養開始時の細胞数に関わらず、高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例１６  ＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導・培養／希釈操作なしでの培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
５ＨＸＶＩＶＯ２０に１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１３−（１）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびフィブロネクチンもしくはＦＮｆｒ固定化６ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルずつまき、５ＨＸＶＩＶＯ２０  ４ｍｌを加え（１ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）、さらに終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目、４日目には終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、培養開始後７日目以降２〜３日毎に終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようＩＬ−２を添加した。この間培養液の希釈操作は全く行わなかった。
培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。結果を表１７に示す。
2003080817.tif 000018
表１７に示されるように、低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導時に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、誘導途中の細胞の希釈操作を必要とすることなしに培養開始後１５日目に高い拡大培養率が得られた。また、この拡大培養率はフィブロネクチンを固定化した培養器材を使用した群と比較しても高いものであった。これに対して対照群では培養開始１５日目でもほとんど増殖しなかった。すなわち低細胞数からＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンもしくはフィブロネクチンフラグメント、好ましくはフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、全く希釈操作を必要とすることなく、高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例１７  ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例１７−（１）で誘導・培養したＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定は実施例２−（２）に記載の方法に準じて行った。結果を表１８に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
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表１８に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。また、このＩＬ−２Ｒ発現率はフィブロネクチンを固定化した培養器材を使用した群と比較しても高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、フィブロネクチンそのものよりも好適にＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例１８  ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例１８−（１）で誘導・培養した７日目のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定を実施例９−（２）に記載の方法に準じて行った。なお、今回の操作では１次抗体としてＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体またはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体を、２次抗体としてＰＥ標識マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）抗体を使用した。結果を表１９に示す。
2003080817.tif 000020
表１９に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８陽性の両細胞）表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわちＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＣＤ４およびＣＤ８陽性の両細胞表面上のＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例１９  ＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例１９−（１）で誘導・培養した１５日目のＬＡＫ細胞中における、ＣＤ８陽性細胞含有比率の測定を実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。結果を表２０に示す。
2003080817.tif 000021
表２０に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわちＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例２１  ＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
５ＨＸＶＩＶＯ２０に０．５〜１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化プレートに１ｍｌ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目には１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＸＶＩＶＯ２０を１ｍｌ／ウェルずつ添加した。培養開始後４日目には適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始８または９日目には実施例１３−（１）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコ（ただし、固定化に用いる抗ヒトＣＤ３抗体の濃度は０．５μｇ／ｍｌとした）に適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を移し、終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１日目または１２日目に再度適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表２１および表２２に示す。表中においてｄｏｎｏｒはＰＢＭＣドナーの記号を示す。
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2003080817.tif 000023
表２１および表２２に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、より高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例２１  ＬＡＫ細胞培養系における増殖率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２０−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際の培養開始後４日目から８日目までの細胞の増殖率および培養開始後１１日目から１５日目までの細胞の増殖率を算出した。結果を表２３および表２４に示す。
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表２３および表２４に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して誘導後期におけるＬＡＫ細胞の増殖率が高い。これらの増殖率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における誘導後期のＬＡＫ細胞の増殖率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、より高い増殖率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例２２  ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２０−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例２２−（１）で誘導・培養後１５日目のＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定は実施例２−（２）に記載の方法に準じて行った。その結果を表２５および表２６に示す。かかる表においてはＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
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表２５および表２６に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して培養開始１５日目のＬＡＫ細胞表面上のＩＬ−２Ｒ発現率が高い。これらのＩＬ−２Ｒ発現率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群におけるＩＬ−２Ｒ発現率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントを用いて刺激することにより、より高いＩＬ−２Ｒ発現率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
実施例２３  ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞比率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２０−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例２３−（１）で誘導・培養した１５日目のＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定は実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。その結果を表２７に示す。
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表２７に示されるように、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して培養開始１５日目のＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率が高い。これらのＣＤ８陽性細胞含有比率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群におけるＣＤ８陽性細胞含有比率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントを用いて刺激することにより、より高いＣＤ８陽性細胞含有比率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
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産業上の利用の可能性
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法によれば、細胞傷害活性が高く維持され、ＩＬ−２Ｒの発現量が有意に上昇し、ＣＤ８陽性細胞の比率が向上した細胞傷害性リンパ球が得られる。当該リンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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