(57)【要約】血管内皮細胞を用いた解析により、ＶＥカドヘリンがエンドスタチン受容体として機能し、エンドスタチンがＶＥカドヘリンと結合することによりＶＥカドヘリンのリン酸化、さらには内皮細胞のアポトーシスが誘導された。このエンドスタチン受容体とエンドスタチンとの結合を阻害し得る化合物を選択することによりエンドスタチン受容体のアゴニスト、アンタゴニストを得ることが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片であって、エンドスタチンに対し結合活性を有する断片をコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
エンドスタチンに対する受容体タンパク質が、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、請求項１に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡによりコードされる単離されたエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項１もしくは２に記載のＤＮＡまたは請求項４に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞において発現させたエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片を回収する工程を含む、請求項３に記載のエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片の製造方法。
【請求項７】
請求項３に記載のエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片に結合する抗体。
【請求項８】
エンドスタチンとその受容体との結合を阻害する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
エンドスタチン受容体とエンドスタチンとの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
被験試料存在下で、エンドスタチン受容体とエンドスタチンとを接触させる工程、
接触後における前記エンドスタチン受容体とエンドスタチンとの結合活性を測定する工程と、
前記結合活性を低下させた被験試料を選択する工程、を含むスクリーニング方法。
【請求項１０】
エンドスタチン受容体に対するアゴニストのスクリーニング方法であって、
（ａ）エンドスタチン受容体を発現する細胞に被験試料を接触させる工程と、
（ｂ）接触工程後、前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを測定する工程、
（ｃ）前記測定結果に基づき、前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを促進する被験試料を選択する工程とを含む方法。
【請求項１１】
エンドスタチン受容体に対するアンタゴニストのスクリーニング方法であって、
（ａ）エンドスタチン受容体を発現する細胞に被験試料およびエンドスタチンを接触させる工程と、
（ｂ）接触工程後、前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを測定する工程、
（ｃ）前記測定結果に基づき、エンドスタチンによる前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを抑制する被験試料を選択する工程とを含む方法。
【請求項１２】
被験試料が請求項７に記載の抗体である、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項９から１１のいずれかに記載の方法により選択された化合物。
【請求項１４】
抗体である、請求項１３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血管新生阻害因子、特にエンドスタチンに対する受容体タンパク質もしくはＤＮＡおよび血管新生阻害因子のスクリーニング方法に関する分野に属する。
背景技術
血管新生は、胎児期の発育あるいは正常な組織の修復などにおいて認められる他、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節症など、種々の疾患の発症にも不可欠であることが知られている。これら血管新生を伴う疾患は、血管新生を阻害することによって治療が可能であるという共通点を持つ。
血管新生は、発生初期に見られる心臓・脈管系の形成などの脈管形成と区別されている。脈管形成は、血管芽細胞が基となり、この血管芽細胞が血管内皮細胞に分化し、増殖・癒合して血管網を形成する過程である。一方、血管新生は、既存の血管が基となり、既存血管から内皮細胞が分枝して新たな血管網を形成する過程を言う。したがって、成長による血管網の発達や胎盤形成、組織再生に伴う血管網の発達などは血管内皮細胞と血管周皮細胞あるいは基底膜成分との相互作用によって高度な制御を受けている。しかし、組織が傷害された場合は血管内皮細胞の急速な増殖が誘導され、内皮細胞が新しいものへと置き換えられていく。血管内皮細胞の急激な増殖と静止のバランスは、互いに拮抗する作用を持つ血管新生因子と血管新生阻害因子とのバランスによって決定されていると考えられている。
例えば、腫瘍組織内で血管誘導能を持った腫瘍細胞が一定量に達すると腫瘍血管新生が始まる。これは腫瘍細胞が血管新生因子を大量に放出することで血管新生因子と血管新生阻害因子のバランスが崩壊させられたためであると考えられる。
一般に、血管新生は、（１）血管基底膜の融解、（２）血管内皮細胞の基底膜への浸潤の促進、（３）血管内皮細胞の増殖亢進、（４）内皮細胞の管腔形成というような多段階の過程で行われる。このように血管誘導能を持った腫瘍細胞は宿主の血管網に対して多様な働きかけを行い、腫瘍細胞の栄養補給のための血管網を確保している。特に、上記（２）、（３）段階は、腫瘍血管新生因子に要求される重要な性質である。換言すれば、この段階を阻害できれば血管新生が阻害でき、腫瘍組織への栄養源供給を絶つことができる。
今までに血管新生を促進する血管新生因子として明らかにされているものには、血管内皮細胞増殖因（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）や塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）がある。しかし、これらは腫瘍特異的な因子ではないことがわかっている。
他方、悪性腫瘍などの異常な血管新生の亢進は、正常組織のように血管新生抑制機構が適切に作動しなかった結果とも見なせる。したがって、血管新生阻害因子を補給できれば血管新生因子の作用を抑制し、腫瘍組織の増殖阻止だけでなく腫瘍血管を介する腫瘍細胞の遠隔転移の阻止も可能性となる。
近年、米国ハーバード大のＦｏｌｋｍａｎらのグループにより、２種類の血管新生阻害因子、アンギオスタチンとエンドスタチンが精製、同定された。アンギオスタチンは、プラスミノーゲンの断片で４つのクリングルドメインを持つタンパク質であり、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ刺激によるウシ毛細血管内皮細胞の増殖を抑制する。また、エンドスタチンはコラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端２０ｋＤａのタンパク質であり、腫瘍の増殖は抑えないがｂＦＧＦで刺激したウシ毛細血管内皮細胞の増殖を抑えることがわかっている。最近の研究において、このエンドスタチンを、各種の癌を接種したマウスに投与することにより腫瘍の退縮がみられた（Ｄｈａｎａｂａｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｊａｎ  １；５９（１）：１８９−９７、Ｓａｕｔｅｒ  ＢＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００  Ａｐｒ  ２５；９７（９）：４８０２−７、Ｊｏｋｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１  Ｊａｎ；１９（１）：３５−９、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ＭＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９９７  Ｊａｎ  ２４；８８（２）：２７７−８５、Ｋｕｏ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１  Ａｐｒ  １０；９８（８）：４６０５−１０、Ｋｉｓｋｅｒ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｏｃｔ  １５；６１（２０）：７６６９−７４、Ｓｈｉ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００２  Ｊｕｎ；９（６）：５１３−２１、Ｂｏｅｈｌｅ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１  Ｎｏｖ  １；９４（３）：４２０−８、Ｋｉｓｋｅｒ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｏｃｔ  １５；６１（２０）：７６６９−７４、Ｅｄｅｒ  ＪＰ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２  Ｓｅｐ  １５；２０（１８）：３７７２−８４）。さらに、第１相臨床試験において、難治性癌患者１５人中３人にエンドスタチンの抗腫瘍効果が見られた（Ｅｄｅｒ  ＪＰ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２  Ｓｅｐ  １５；２０（１８）：３７７２−８４）。
発明の開示
上記二つの血管新生阻害因子は、血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有することから、腫瘍組織を兵糧攻めにする薬剤として有望視され、臨床応用が急がれているが、これら因子の血管新生抑制における作用機序は解明されずに残されている。
特に、上記アンギオスタチンについては細胞表面上のナトリウムポンプに結合することが知られているが、一方のエンドスタチンについてはヘパラン硫酸プロテオグリカンやインテグリンに結合することが報告されたが、いずれも内皮細胞に対する特異性はなく、機能面での解析も十分になされていない。
そこで、本発明は、エンドスタチンの受容体を同定することによりエンドスタチンによる血管新生抑制における機構解明を行なうことを第一の目的とし、また、この受容体と作用し得る天然あるいは合成化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決すべく、本願発明者らは鋭意研究を行なった結果、血管内皮細胞に特異的に発現しているＶＥ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ）カドヘリンにエンドスタチンが結合し、この結合によりβ−カテニンを介してシグナルを伝達し、内皮細胞の細胞死を誘導することを見出した。これら知見に基づき、本発明は、エンドスタチン受容体であるＶＥカドヘリンタンパク質の断片、これをコードするＤＮＡ、これらを保持したベクター、前記タンパク質の断片に特異的な抗体を提供し、さらに、上記エンドスタチン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
より具体的には、本願は、以下の発明を提供する。
（１）  エンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片であって、エンドスタチンに対し結合活性を有する断片をコードする単離されたＤＮＡ。
（２）  エンドスタチンに対する受容体タンパク質が、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、（１）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質
（３）  （１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされる単離されたエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片。
（４）  （１）または（２）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
（５）  （１）もしくは（２）に記載のＤＮＡまたは（４）に記載のベクターを保持する宿主細胞。
（６）  （５）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞において発現させたエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片を回収する工程を含む、（３）に記載のエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片の製造方法。
（７）  （３）に記載のエンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片に結合する抗体。
（８）  エンドスタチンとその受容体との結合を阻害する、（７）に記載の抗体。
（９）  エンドスタチン受容体とエンドスタチンとの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
被験試料存在下で、エンドスタチン受容体とエンドスタチンとを接触させる工程、
接触後における前記エンドスタチン受容体とエンドスタチンとの結合活性を測定する工程と、
前記結合活性を低下させた被験試料を選択する工程、を含むスクリーニング方法。
（１０）  エンドスタチン受容体に対するアゴニストのスクリーニング方法であって、
（ａ）エンドスタチン受容体を発現する細胞に被験試料を接触させる工程と、
（ｂ）接触工程後、前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを測定する工程、
（ｃ）前記測定結果に基づき、前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを促進する被験試料を選択する工程とを含む方法。
（１１）  エンドスタチン受容体に対するアンタゴニストのスクリーニング方法であって、
（ａ）エンドスタチン受容体を発現する細胞に被験試料およびエンドスタチンを接触させる工程と、
（ｂ）接触工程後、前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを測定する工程、
（ｃ）前記測定結果に基づき、エンドスタチンによる前記エンドスタチン受容体のリン酸化、または前記エンドスタチン受容体へのβ−カテニンのリクルート、または内皮細胞のアポトーシスを抑制する被験試料を選択する工程とを含む方法。
（１２）  被験試料が（７）に記載の抗体である、（９）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）  （９）から（１１）のいずれかに記載の方法により選択された化合物。
（１４）  抗体である、（１３）に記載の化合物。
以下、本発明の実施の形態について図面に基づき詳細に説明する。
本発明は、エンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片であって、エンドスタチンに対し結合活性を有する断片に関する。本願発明者らは、既に血管内皮細胞の接着因子として同定されているＶＥカドヘリンがエンドスタチンと結合する活性を有することを発見した。そのため、本発明の「断片」として、ＶＥカドヘリンの断片を好適に用いることができる。ＶＥカドヘリンは、ヒト内皮細胞などで発現していることから、ヒト内皮細胞の抽出液から、例えばＶＥカドヘリン抗体を用いたアフィニティー精製などにより単離することができる。また、ヒトに限らず、他の哺乳動物、例えばウシなどの内皮細胞でも発現しており、同様に、これら哺乳動物細胞抽出液からも単離することができる。また、ＶＥカドヘリンの断片は、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは該ＶＥカドヘリンを適切なペプチダーゼで切断することによって、製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
なお、本書において「単離」とは、本来の環境（たとえば自然に発生するのであればその自然環境）に置かれている状態と区別するために使用され、本来の環境から取り出され、該物質が実質的に富んだ試料中に存在している状態あるいは該物質が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合物を含むことを意味する。ここで「実質的に精製した」という用語は、その天然の環境から切り離されて、天然に関連している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、および最も好ましくは９０％含まない化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指す。
上記ＶＥカドヘリンは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質として同定されている。本発明における「断片」は、このタンパク質の断片に限定されず、上記エンドスタチンと結合活性を保持する範囲で、上記配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質の断片も含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の置換等は、人為的または天然に生じたもののいずれをも含む。
天然に生じたアミノ酸置換等を有する受容体タンパク質の調製は、例えば、公知の技術であるファージライブラリースクリーニング技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，ｐｐ．２．１−２．１１７）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，ｐｐ．８．１−８．１２６）技術を利用して行なうことができる。すなわち、ＶＥカドヘリンをコードしたＤＮＡ（配列番号１）またはその一部をプローブやプライマーとして、配列番号１と相同性を有するＤＮＡを得て、このＤＮＡを基にタンパク質を生成することにより得ることができる。ここで得られるタンパク質は、通常、ＶＥカドヘリンタンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。この高い相同性とは、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９５％以上、さらに好ましくは少なくとも９７％以上（例えば、９８から９９％）の配列の相同性を意味する。
なお、ＤＮＡを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば適宜選択することができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×テンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行なう。その後の洗浄の洗浄液および温度条件は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃程度で、より厳しい条件としては、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃程度で、さらに厳しい条件では、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃程度で実施することができる。これらＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、適宜改変することは可能である。
配列の相同性は、ＢＬＡＳＴｎ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴｘ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
配列番号２に記載の配列を人為的に改変する場合には、一般的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内であると考えられるが、エンドスタチンとの結合活性を保持し得る範囲内でアミノ酸配列を置換等してもよい。この人為的にアミノ酸配列を改変する手法は、例えば、公知の手法であるｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ作製方法、ＰＣＲ法、カセット変異法などを用いたｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓにより実行することができる。
上記天然に生じたあるいは人為的に加えられた改変を有するタンパク質の断片が、エンドスタチンに対する結合活性を有するか否かは、後述する実施例に記載されているように、得られたタンパク質の断片とエンドスタチンとを接触させ、エンドスタチンに対する抗体などで該タンパク質が共に免疫沈降されるかにより確認することができる。または別の手法として、酵母のｔｗｏ−ｈｙｂｉｄシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １８，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １，ｐｐ．１８．６−１８．４７）を用いて、両者が直接結合するかを確認することができる。
上記「断片」は、エンドスタチンとその受容体との結合を阻害する化合物（例えば抗体）の効率的な調製に利用できる。
本発明はまた、上述した断片をコードするＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡの別を問わず、また天然由来であっても、人為的に合成したものであっても、本発明に含まれる。
配列番号１またはこれと相同なｃＤＮＡの調製は、配列番号１に記載のＤＮＡまたはその一部をプローブまたはプライマーとして用い、例えば、哺乳動物細胞の内皮細胞等のｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得ることができる。他の方法としては、内皮細胞より回収したｍＲＮＡを鋳型に用い、配列番号１に記載のＤＮＡの一部をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ８，ｐｐ．８．４６−８．５３）により得ることもできる。なお、ここでＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、上述した通りである。
また、上記ｃＤＮＡは市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することもできる。例えば、配列番号１に記載のＤＮＡおよび相補鎖をそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて二本鎖にすることにより調製することができる。
ゲノムＤＮＡの調製もまた、上記と同様に配列番号１に記載のＤＮＡまたはその一部をプローブまたはプライマーとして用い、例えば、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡライブラリーや哺乳動物細胞のＤＮＡより、ハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により得ることができる。
上記本発明のＤＮＡは、エンドスタチン受容体タンパク質のうちエンドスタチン結合活性を有する断片をコードしているため、第一にこの断片を生産するために用いることができる。本発明の断片の生産目的に用いる場合には、該断片をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組込むことが好ましい。ここで適当な発現ベクターは、タンパク質生産に用いる翻訳系により、適宜選択することができる。翻訳系は細胞系、無細胞系のいずでもよく目的により選択することができる。細胞系では、例えば、大腸菌で発現させるためのベクターとして、ｐＫＫ２２３−３などを用いることができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよい。また、タンパク質をペリプラズムや菌体外に分泌させるためのベクターとしてはｐＫＴ２８０やｐＲＩＴなどが挙げられる（岡田雅人・宮崎香  編、無敵のバイオテクニカルシリーズ  タンパク質実験ノート上  抽出と分離精製、羊土社。１９９６年発行  ｐｐ．２４２−２４６）。また、昆虫細胞や哺乳動物細胞を用いて本発明の断片を生産させる場合には、バキュロウイルスを用いることができる。哺乳動物細胞に使用できるバキュロウイルスベクターとしては、例えば、ｐＡｃＣＡＧＭＣＳ１が挙げられる（村松正実  編、ラボマニュアル遺伝子工学第３版、丸善株式会社、１９９６年発行、ｐｐ．２４２−２４６）。
上記本発明のＤＮＡが組込まれたベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養することにより、上記断片が生産される。ここでベクターを細胞に導入する手法は、細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクターやファージを介した生物学的な手法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などの化学的な手法、エレクトロポーレション法などの物理的な手法などを用いることができる。宿主細胞において生産された断片は、必要に応じて、例えば、アフィニティー精製等を行い、使用することができる。
上記本発明のＤＮＡはまた、医薬組成物として患者の癌組織の周囲あるいは癌組織内に導入し、上記受容体タンパク質を発現させることにより癌組織の成長抑制あるいは死滅させる目的に応用してもよい。このような目的で使用するためには、上記受容体ＤＮＡを所望の組織または細胞に該ＤＮＡを運搬するためのベクターに組み込み使用することが好ましい。こうした治療目的のベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられる（Ｙ．Ｎｉｉｔｓｕら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５：１３８５−１３９５（１９９８）。
上記本発明のＤＮＡは、全長として用いる場合に限られず、その一部フラグメントとして、ハイブリダイゼーション用プローブ、ＰＣＲプライマーまたはリボザイム誘導体として利用することができる。これら目的で上記ＤＮＡの一部を用いる場合には、プローブ等としての特異性を保持できる長さ、例えば、１５ヌクレオチド長を有していることが好ましい。例えば、こうしたポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするものが挙げられ、配列番号３，４に記載のポリヌクレオチドを例示することができる。ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションにおいて、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。上記プローブ、プライマーは、本発明の断片をコードしたＤＮＡのクローニング等に利用することができる。
本発明は、また断片に結合し得る抗体に関する。本発明の抗体は、上記断片と特異的に結合し得るものであれは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体は、本発明の断片を必要に応じてフロイントアジュバント等と混合し、周知の方法によりウサギ、ヤギ、モルモットなどの非ヒト動物を免疫し、抗体価が上昇したことを確認した上で免疫動物の末梢血から血清を回収することにより調製することができる。一方、モノクローナル抗体はまた、本発明の断片を用い、周知の方法によりマウスなどの動物を免疫し、抗体価が上昇した免疫動物の脾臓またはリンパ節を採取し、これら組織中の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させハイブリドーマを調製する。ハイブリドーマから産生される抗体を培養上清から回収することにより得ることができる。
これら抗体は、上記断片をアフィニティー精製する際に利用することができる他、癌組織周辺または癌組織内での受容体タンパク質の発現量を解析するなどの目的で利用することもできる。
また、本発明の抗体を血管新生に関連した疾患の治療や予防に用いる場合には、エンドスタチンとその受容体との結合を阻害する抗体であることが好ましい。このような抗体には、エンドスタチンがその受容体を介して細胞内へシグナル伝達を行うことを阻害するアンタゴニストが含まれ、また、エンドスタチンに対する受容体に結合して、エンドスタチンと同様に、細胞内へシグナル伝達を行うアゴニストも含まれる。特にアゴニストは、血管新生阻害剤として癌などの治療や予防に有用である。
本発明はエンドスタチン受容体とエンドスタチンとの結合を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。具体的には、被験試料存在下で上記受容体タンパク質とエンドスタチンとを接触させ、接触後に受容体タンパク質とエンドスタチンとの結合活性を測定し、測定の結果に基づき、結合活性を低下させた物質を選択する。用いる受容体タンパク質は、上記本発明の断片であってもよい。このような結合活性を測定する手法として、免疫沈降法、ＢＩＡ  Ｃｏｒｅ（アマシャム・ファルマシア社）を利用した手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １８，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ６，ｐｐ．１８．９６−１８．１１４）、ファージディスプレイ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １８，ｐｐ．１８．１１５−１８．１２２）を用いることができる。
免疫沈降法を利用した場合には、被験試料存在下でエンドスタチン受容体とエンドスタチンとを接触させる。接触後、エンドスタチン受容体またはエンドスタチンに対する抗体を添加し、免疫複合体を沈降させる。エンドスタチン受容体に対する抗体を用いた場合には免疫沈降産物中のエンドスタチン量を、エンドスタチンに対する抗体を用いた場合には免疫沈降産物中のエンドスタチン受容体量を測定する。そして、この測定結果が、被験試料非存在下に比べて、低下している場合には、その被験試料を上記二者の結合を阻害する化合物として回収することができる。
ＢＩＡ  Ｃｏｒｅを利用した手法では、例えば、エンドスタチン受容体を発現している細胞に、被験試料存在下で蛍光標識したエンドスタチンを接触させる。接触後、細胞をフローサイトメトリーで分画する。フローサイトメトリーのヒストグラムにおいて、被験試料非存在下に比べて、蛍光標識された細胞数が低下した被験試料を上記阻害物質として選択することができる。
さらに、ファージディスプレイ法では、エンドスタチン受容体またはエンドスタチンを発現させたファージに、被験試料存在下で、それぞれエンドスタチンまたはエンドスタチン受容体を接触させる。接触後、ファージを回収し、結合しているエンドスタチンまたはエンドスタチン受容体を測定する。この測定において、回収された上記エンドスタチンまたはエンドスタチン受容体の量が、コントロールの被験試料非存在下に比べて低下した場合に、その被験試料を阻害剤として選択することができる。
上記スクリーニング方法における被験試料としては、細胞抽出液としてのタンパク質、精製タンパク質、もしくはペプチド、これらに結合する抗体、人工的に合成された低分子化合物などが挙げられ、また、エンドスタチンの断片などを用いることもできるが、本発明は、これらに制限されない。
上記スクリーニングにより選択されるものには、受容体タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストが含まれる。アゴニストは、一般に受容体に結合し、受容体を介する種々の生物活性を増強または延長させる化合物をいい、逆にアンタゴニストは、受容体に結合し、受容体を介する種々の生物活性の持続または量を減少させる化合物をいう。上記スクリーニングにより選択された物質がアゴニストかアンタゴニストかであるかの更なる同定は、受容体タンパク質であるＶＥカドヘリンとエンドスタチンとが結合した際の生物活性を指標に行なうことができる。すなわち、ＶＥカドヘリンとエンドスタチンとが結合することにより、ＶＥカドヘリンのリン酸化が誘導され、ＶＥカドヘリンにβ−カテニンが相互作用し、最終的には内皮細胞のアポトーシスが誘導される。したがって、選択された被験試料をＶＥカドヘリンに作用させた際に上記活性（ＶＥカドヘリンのリン酸化、ＶＥカドヘリンへのβ−カテニンの相互作用、内皮細胞のアポトーシス）のいずれかを誘導、促進または作用持続させるものをアゴニストとして同定することができる。逆に、上記ＶＥカドヘリンとエンドスタチンとを接触させた際の活性誘導を低下または阻害するものをアンタゴニストとして同定することができる。
また、上記受容体タンパク質であるＶＥカドヘリンの上述した生理活性（エンドスタチン結合によりＶＥカドヘリンのリン酸化、ＶＥカドヘリンへのβ−カテニンのリクルート、内皮細胞のアポトーシス）を指標として、エンドスタチン受容体のアゴニスト、アンタゴニストを直接スクリーニングしてもよい。すなわち、ＶＥカドヘリンを発現している細胞に被験試料を接触させ、その際のＶＥカドヘリンのリン酸化、β−カテニンのリクルート、あるいは内皮細胞のアポトーシスを解析する。そして、被験試料により、これらいずれかの生物活性指標が誘導された場合、その被験試料をＶＥ−カドヘリンのアゴニストとして選択することができる。一方、エンドスタチン受容体のアンタゴニストをスクリーニングする場合には、ＶＥカドヘリンを発現している細胞に、被験試料存在下でエンドスタチンを作用させ、上記生理活性指標を解析する。この解析結果、被験試料が、エンドスタチンにより誘導される上記生理活性の誘導が抑制または阻害した場合、その被験試料をエンドスタチン受容体のアンタゴニストとして選択することができる。
上記において得られるアゴニストは、とりわけエンドスタチンに代わって上記受容体タンパク質を介する血管新生阻害を誘導し得るため、これを癌組織周囲または癌組織内に投与することにより、エンドスタチン受容体を介して癌組織周囲または癌組織内の血管新生阻害を誘導し得る。そのため、アゴニストは血管新生阻害剤、さらには癌組織の成長抑制またはその死滅を誘導し得る制癌剤として利用し得る。また、癌治療の目的以外にも、血管新生亢進を伴う疾患、例えば、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎などに対する血管新生阻害剤の開発に利用してもよい。一方、アンタゴニストは、エンドスタチン受容体を介した血管新生阻害により生じる疾患の治療剤として利用することができる。
上記受容体タンパク質のアゴニストやアンタゴニストを有効成分として医薬組成物を調製し、該受容体タンパク質が関連する疾患の予防又は治療剤として用いる場合、公知の製剤学的製造法によって、製剤化して投与することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（パラベン）、等と適宜組み合わせて、生体への効果的な投与に適した注射剤、経口剤等の医薬用製剤に調製することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
［実施例１］エンドスタチンによる血管内皮細胞のアポトーシス誘導
先ず、エンドスタチンがウシ肺動脈血管内皮（ＣＰＡＥ）細胞（ＨＳＲＲＢ：Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂａｎｋより入手）の細胞死を誘導するか否かを解析した。
ウシ肺動脈血管内皮（ＣＰＡＥ）細胞を５×１０６個となるように各培養用ディッシュに播いた。細胞がディッシュ表面に接着した後、細胞培養液を血清を含まない培養液に交換し、そのまま６時間培養した。マウス組換えエンドスタチン（カルビオケム社）を０．３あるいは１．０μｇ／ｍｌとなるように添加し、所定の時間培養後、細胞の生存率の算出を行った。なお、細胞の生存率の算出は、トリパンブルー染色法を用いて行なった。
上記エンドスタチン（０．３または１．０μｇ／ｍｌ）存在下でＣＰＡＥ細胞を４８時間培養した結果、有意な細胞死の誘導が見られた（図．１（Ａ））。また、１μｇ／ｍｌエンドスタチン濃度存在下における、２４時間、３６時間および４８時間処理した細胞の生存率は、それぞれ７５．０±８．９、４０．２±６．０、２９．７±１５．４％であり、処理時間に依存して死細胞が増加することが観察された。
次に、この細胞死が壊死かアポトーシスであるかを確認するためにアポトーシスの特徴的な現象の一つであるＤＮＡの断片化が見られるかどうかを確認した。エンドスタチン処理後の細胞からプロテアーゼＫを用いた方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ．ｅｄ．（ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌ．１，ｐｐ．６．４−６．１１）によりゲノムＤＮＡを回収し、アガロースゲル電気泳動（１．５％アガロースゲル）により分離した結果、断片化したＤＮＡは、エンドスタチン処理３６時間後から検出された（図１（Ｂ））。
同様に、０．３μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのエンドスタチンで４８時間処理した細胞からＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、濃度依存的なアポトーシスの誘導が見られた（図１（Ｃ））。
［実施例２］エンドスタチンとＶＥカドヘリンとの特異的結合
免疫沈降法を用いてエンドスタチンがＶＥカドヘリンに結合するかどうかの解析を行った。
ＣＰＡＥ細胞を無血清培養液で６時間培養した後、１μｇ／ｍｌとなるようにエンドスタチンを添加し、培養した。一定時間（０分、５分、１５分）ごとに細胞を回収し、１％  ＮＰ−４０含む緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０，１００ｍＭ  ＮａＦ，２ｍＭ  Ｎａ−ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｉｏｒｉｄｅ，２０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，ａｎｄ  ２０μＭ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）中で４℃、２０分間インキュベートしタンパク質を抽出し、不溶分離を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分）により除いた。抽出液中のタンパク質濃度をブラッドフォード法により定量し、それぞれが同じ濃度となるように調製した。
一方、免疫沈降を行なうために、プロテインＡ結合セファロース４Ｂに抗エンドスタチン抗体を予め４℃で結合させ、洗浄用緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＦ，２ｍＭ  Ｎａ−ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，ａｎｄ  １ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で洗浄した。この洗浄後のセファロースビーズに、各時間の上記タンパク質抽出液を加え、４℃で８時間インキュベートした。なお、ここで用いたエンドスタチンに対するポリクローナル抗体は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのエンドスタチン部位を用い、定法によりウサギに免疫することにより調製した。
インキュベート後のビーズを前記洗浄用緩衝液Ａで３回洗浄し、ビーズを回収した。このビーズをＳＤＳサンプル緩衝液（５０μｌ）中に懸濁し、１００℃、５分間加熱後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２分間）を行った。この遠心上清これをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分離した。ゲル中で分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をＶＥカドヘリンまたはβ−カテニンの各抗体（共にサンタクルズ社より入手）とインキュベートし、洗浄後、さらに二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体あるいは抗ウサギＩｇＧ抗体）と反応させて、ＥＣＬシステム（アマシャム・ファルマシア社）による発光法によりシグナルを検出した。
エンドスタチン添加５分後、１５分後の上記タンパク質抽出液において、ＶＥカドヘリン（ＶＥ−ＣＤＨ）が検出されたことから、明らかにエンドスタチンとＶＥカドヘリンとの結合が見られた（図２（Ａ））。他のカドヘリン（ＰカドヘリンおよびＥカドヘリン）とエンドスタチンの結合についても解析したが、エンドスタチンとの免疫沈降では、シグナルは検出されなかった（図２（Ｂ））。
カドヘリンがカルシウム依存性の膜結合タンパク質であることから、エンドスタチンとの結合もカルシウム依存性であるか否かを確認した。先ず、細胞を予め５ｍＭ  ＥＤＴＡで１５分間処理し、その後に１μｇ／ｍｌのエンドスタチンを添加し、１５分間インキュベートした。５ｍＭ  ＥＤＴＡで処理することにより、エンドスタチンのＶＥカドヘリンへの結合が５０％抑制された。この抑制は７ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加することにより回復した（図２（Ｃ））。このことからエンドスタチンのＶＥカドヘリンに対する結合はカルシウム依存的であることが示唆された。
次に、エンドスタチンがＶＥカドヘリンに結合することによってアポトーシスが誘導されているか否かを、ＶＥカドヘリンに対する特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて解析した。
まず、ホスホロチオエート化したＶＥカドヘリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴ−３’：配列番号３／Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ：Ｘ７９９８１）を合成した。オリゴヌクレオチドをそれぞれＣＰＡＥ細胞に導入した。この細胞への導入は、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（プロメガ社）を用い、添付のプロトコールに従ったリポフェクション法により実施した。導入４８時間後に、上述した方法によりエンドスタチン処理を行った。オリゴヌクレオチド導入４８時間後に細胞を回収し、上記と同様にタンパク質抽出液を調製して、ウェスタンブロット法によりＶＥカドヘリンの発現量を確認した。なお、コントロールとして、同じヌクレオチドから構成されるスクランブルオリゴヌクレオチド（Ｓｃｒ：５’−ＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧ−３’：配列番号４）を用いて、またはオリゴヌクレオチドを用いないで（ＴＦ）、上記同様の操作を行った際のＶＥカドヘリンの発現量を並行して確認した。
シグナルの強度より発現量を定量した結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入細胞では、コントロールのスクランブルオリゴヌクレオチド導入細胞またはオリゴヌクレオチド非導入細胞に比べて、５９．２±５．６％の発現抑制が見られた（図３（Ａ））。
次に、細胞の生存率を測定した。１μｇ／ｍｌエンドスタチンで３０時間処理した細胞の生存率は５５．２±５．４％であったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入細胞では、エンドスタチン処理を行なってコントロールのレベルまで生存率が回復していた（ｐ＝０．０３２９）（図３（Ｂ））。さらにＶＥカドヘリンを発現していない２種類の乳癌培養細胞株（ＭＣＦ−７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に１μｇ／ｍｌのエンドスタチンを添加し、４８時間培養を行ったが、両細胞共に有意な細胞生存率の変化は見られなかった（図示せず）。これらの結果から、エンドスタチンによるアポトーシスの誘導は、エンドスタチンがＶＥカドヘリンに結合がすることにより生じ、また、エンドスタチンとＶＥカドヘリンとの結合にはカルシウムイオンが必要であることが明らかになった。
［実施例３］ＶＥカドヘリンのチロシンリン酸化とβ−カテニンのリクルート
エンドスタチンがＶＥカドヘリンに結合することが確認されたことから、さらに細胞内の情報伝達系の解析として、ＶＥカドヘリンのリン酸化を解析した。エンドスタチン（１μｇ／ｍｌ）で所定時間（０、３、５、１０分）処理したＣＰＡＥ細胞より上記実施例２と同様にタンパク質抽出液を調製し、このタンパク質抽出液を抗リン酸化チロシン抗体を予め結合させたプロテインＡ結合セファロース４Ｂに添加し、免疫沈降させた。ビーズを上記洗浄用緩衝液Ａで洗浄し、このビーズ回収した。このビーズを上述と同様にＳＤＳサンプル緩衝液中に懸濁、加熱し、遠心分離後の上清を実施例２と同様にＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分離して、ニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をＶＥカドヘリンに対する抗体、次いで二次抗体と順次反応させて、最終的にＥＣＬシステムによりシグナルを検出した。
解析の結果、１μｇ／ｍｌエンドスタチン処理によりＶＥカドヘリンのリン酸化が誘導され、リン酸化チロシン抗体でＶＥカドヘリンが免疫沈降した（図４（Ａ））。なお、ＶＥカドヘリンの発現レベルを確認するために、抗ＶＥカドヘリン抗体を用いて免疫沈降し、抗カドヘリン抗体でウェスタンブロットを並行して実施した。その結果、エンドスタチン処理時間に関りなくＶＥカドヘリンの発現レベルは一定であった（図４（Ｂ））。
次に、ＶＥカドヘリンに結合することが報告（Ｃａｒｎｅｌｉｅｔ  Ｐ．ら（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８：１４７−１５７  ＰｕｂＭｅｄ  １０４２８０２７）されているβ−カテニンとの結合を見るために、ＶＥカドヘリンに対する抗体で免疫沈降し、β−カテニンに対する抗体を用いてウェスタンブロッティング法で解析した。その結果、１０分後からＶＥカドヘリンとβ−カテニンとの結合が見られた（図４Ｃ）。なお、β−カテニンの発現レベルを、β−カテニン抗体を用いた免疫沈降およびウェスタンブロットにより測定した結果、エンドスタチン処理時間にかかわらず一定であった（図４（Ｄ））。
［実施例４］チロシンリン酸化阻害剤によるアポトーシス誘導の抑制
エンドスタチン処理によりＶＥカドヘリンのチロシンリン酸化が見られたことから、チロシンリン酸化阻害剤によりエンドスタチンによって誘導されるアポトーシスが回避できるかどうかを解析した。チロシンリン酸化阻害剤であるハービマイシンＡ（ＨＡ）（カルビオケム社）（０．２，２．０，２０ｎＭの各濃度）で予め６時間処理した細胞にエンドスタチン（１μｇ／ｍｌ）を添加し１５分間インキュベート後、細胞を回収し、上記抗リン酸化チロシン抗体で免疫沈降し、抗ＶＥカドヘリン抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した。その結果、ＶＥカドヘリンのチロシンリン酸化はハービマイシンＡ処理細胞で完全に抑制された（図５（Ａ））。
さらに、β−カテニンとの結合を、実施例３と同様に抗ＶＥカドヘリン抗体を用いた免疫沈降と抗β−カテニン抗体を用いたウェスタンブロット法により解析した。その結果、ハービマイシンＡ処理細胞では、ＶＥカドヘリンへのβ−カテニンの結合も阻害されていた（図５（Ｂ））。
これらの結果から、エンドスタチンはＶＥカドヘリンをリン酸化させ、このリン酸化によりＶＥカドヘリンにβ−カテニンを結合させると考えられる。
さらに、チロシンリン酸化を阻害することでエンドスタチンによるアポトーシスの誘導が回避されるかどうかを検討した。予めハービマイシンＡで処理した細胞にエンドスタチン（１μｇ／ｍｌ）を添加し、３６時間培養した。一方、同様にエンドスタチン非処理の細胞も同様に培養を行なった。さらに、対照として、ハービマシシン非処理の細胞について、エンドスタチン処理、非処理で同様に培養を行なった。
その結果、ハービマイシンＡで前処理されていない細胞群では、エンドスタチン非処理群（白抜き）に比べ、処理群では（黒塗り）生存率が約半分まで低下した。これに対し、ハービマイシンＡで前処理した細胞群では、エンドスタチン処理の有無にかかわらず生存率に有意な差はみられなかったことから、ハービマイシンＡ前処理によりエンドスタチンによるアポトーシス誘導が抑制されたことが示された（図５（Ｃ））。
以上の結果より、エンドスタチンはＶＥカドヘリンに結合し、ＶＥカドヘリンをチロシンリン酸化して、β−カテニンを結合させることにより、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導していることが示唆された。
産業上の利用の可能性
本発明により、エンドスタチンに対する受容体タンパク質の断片であって、エンドスタチンに対し結合活性を有する断片、これをコードするＤＮＡが提供され、さらには、エンドスタチン受容体タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストをスクリーニングし得る方法が提供された。ここでアゴニストは、エンドスタチンに代わり血管新生阻害を誘導し得るため、これを利用してエンドスタチン受容体を介した血管新生阻害、さらには癌組織を特異的に死滅させる制癌剤の開発が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ウシ肺動脈血管内皮（ＣＰＡＥ）細胞にエンドスタチンを作用させた際の細胞の生存率を測定した際のグラフ（Ａ）、ＤＮＡの断片化を指標としてエンドスタチン処理によるアポトーシスを経過観察した結果（Ｂ）およびエンドスタチンの濃度を変えた際のＤＮＡの断片化を測定した結果を示す図および写真である。
図２は、エンドスタチンとＶＥカドヘリンとの結合を免疫沈降により観察した結果（Ａ）並びに対照実験としてＶＥカドヘリンに代えてＰカドヘリンを用いて免疫沈降を行った結果（Ｂ）およびカルシウムイオンによるエンドスタチンとＶＥカドヘリンとの結合への影響を解析した結果（Ｃ）を示す写真である。
図３は、エンドスタチンとＶＥカドヘリンとの結合によりアポトーシスが誘導されるかを解析するために、ＶＥカドヘリンに対する特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＶＥカドヘリンの発現を抑制し（Ａ）、その際の細胞生存率における変化を測定した結果（Ｂ）を示す図および写真である。
図４は、エンドスタチンとＶＥカドヘリンとの結合によるＶＥカドヘリンのリン酸化の誘導を示した結果（Ａ）、エンドスタチンとの結合時のＶＥカドヘリンの発現量を解析した結果（Ｂ）、エンドスタチンとＶＥカドヘリンとの結合によるＶＥカドヘリンへのβ−カテニンのリクルートが観察された結果（Ｃ）およびエンドスタチン処理後のβ−カテニンの発現量を測定した結果（Ｄ）を示す写真である。
図５は、チロシンリン酸化阻害剤によるＶＥカドヘリンのリン酸化阻害（Ａ）、β−カテニンのリクルート阻害（Ｂ）およびアポトーシス誘導抑制（Ｃ）を示す図および写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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