(57)【要約】アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓにおいて、第１１番目のＬｅｕを含む連続した少なくとも３個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列よりなり、該Ｌｅｕとその直前及び／又は直後に位置するアミノ酸との間にペプチド結合に代えてヒドロキシエチレン基を有し、Ｎ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよいＣ１〜１０アルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよいＣ１〜１０アルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されており、第１０番目のＴｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基により置換されていてもよいものである化合物又はその塩が、γセクレターゼ活性を阻害する化合物として開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１）において、第１１番目のＬｅｕを含む連続した少なくとも３個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列よりなり、該Ｌｅｕとその直前及び／又は直後に位置するアミノ酸との間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されており、第１０番目のＴｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基により置換されていてもよいものであることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項２】
請求項１の化合物において、該アミノ酸配列の第１４番目のＬｅｕがＩｌｅであってよい疎水性アミノ酸又はＰｒｏで置換され、第１１番目のＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸で置換され、又は第１０番目のＴｈｒがＳｅｒで置換され、又は第９番目のＩｌｅが、Ｌｅｕであってよい疎水性アミノ酸で置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項３】
アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ（配列番号２）において、第３番目のＬｅｕを含む連続した３、４、５又は６個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列よりなり、該Ｌｅｕとその直前及び／又は直後に位置するアミノ酸との間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されており、Ｔｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基により置換されていてもよいものであることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項４】
アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ（配列番号３）において、第１番目のＬｅｕと第２番目のＶａｌと間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸残基間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項５】
アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（配列番号４）において、第１番目のＴｈｒと第２番目のＬｅｕとの間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されており、Ｔｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基により置換されていてもよいものであることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項６】
請求項３の化合物であって、Ｖａｌの直前に位置するＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸により置換され、又はＮ末端のＬｅｕがＩｌｅであってよい疎水性アミノ酸若しくはＰｒｏにより置換されていることを特徴とする化合物及びその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項７】
請求項４の化合物であって、Ｖａｌの直前に位置するＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸により置換され、又はＮ末端のＬｅｕがＩｌｅであってよい疎水性アミノ酸若しくはＰｒｏにより置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項８】
請求項５の化合物であって、Ｖａｌの直前に位置するＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸により置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項９】
請求項３の化合物であって、ＴｈｒがＳｅｒにより置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項１０】
請求項３の化合物であって、Ｉｌｅが、Ｌｅｕであってよい疎水性アミノ酸により置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項１１】
請求項５の化合物であって、ＴｈｒがＳｅｒにより置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項１２】
請求項１ないし１１の何れかの化合物であって、該アルキルオキシカルボニル基がＢｏｃ基であることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項１３】
請求項１ないし１２の何れかの化合物において、アルキルオキシカルボニル基の代わりにＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号５）よりなるポリペプチドを融合して有することを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
【請求項１４】
請求項１ないし１３の何れかの化合物を含んでなるガンマセクレターゼ阻害剤。
【請求項１５】
請求項１ないし１３の何れかの化合物に対する抗体。
【請求項１６】
アミロイドタンパク質生成阻害薬のスクリーニングにおける請求項１ないし１３の何れかの化合物の、ガンマセクレターゼ阻害剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質からアミロイドタンパク質を産生する分解酵素であるガンマセクレターゼを阻害する化合物に関する。さらに詳しくは、本発明は、該化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、これらを含んでなるガンマセクレターゼ阻害剤、抗老化薬又は抗痴呆薬のスクリーニングにおける該化合物の使用及び該化合物に対する抗体に関する。
背景技術
アミロイドタンパク質はアルツハイマー病、ダウン症ばかりでなく正常に老化した脳組織にあらわれる組織病変である。このアミロイドタンパク質は疎水性アミノ酸に富む４０個から４２個／４３個のアミノ酸からなり、その前駆体であるアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下ＡＰＰという。）から加水分解切断によって産生される。ＡＰＰは６９５個、７５１個あるいは７７０個のアミノ酸からなる、膜を１回通過するタイプ１型膜タンパク質であり、アミノ末端側が細胞外にある。アミノ酸数の違いは細胞外領域にあるキュニッツ型と呼ばれるプロテアーゼインヒビター活性部位の有無による。神経細胞では６９５個のアミノ酸からなるＡＰＰ（以下、「ＡＰＰ６９５」といい、そのアミノ酸配列を配列番号７に示す）が主成分になっている。ＡＰＰ６９５は、１番目のメチオニンから６９５番目のアスパラギンまでのアミノ酸６９５個からなる、主として神経細胞で発現しているアイソフォームであり、細胞膜を１回通過する膜通過ドメイン（６２５番目のグリシンから６４８番目のロイシンまでの２４個のアミノ酸）をもつタイプ１型膜タンパク質である。アミロイドタンパク質は、ＡＰＰ６９５の細胞外部にある５９７番目のアスパラギン酸から細胞膜内の６３６番目のバリンまでのアミノ酸４０個の短いタンパク質分子種と、６３８番目のアラニンあるいは６３９番目のトレオニンまでのアミノ酸４２個あるいは４３個からなる長いタンパク質分子種からなる。
一方、アミノ酸７７０個からなるＡＰＰ（以下、「ＡＰＰ７７０」といい、そのコード領域の塩基配列を配列番号８に、アミノ酸配列を配列番号９に示す。）は、１番目のメチオニンから７７０番目のアスパラギンまでのアミノ酸７７０個からなるＡＰＰ遺伝子であり、ＡＰＰ６９５分子種にないアミノ酸配列（２８９番目のグルタミン酸から３６３番目のリジンまでの７５個のアミノ酸）を含む。この挿入アミノ酸配列以外はＡＰＰ６９５と全くアミノ酸配列をもつ分子種である。ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７７０以外にはＡＰＰ７５１というアイソフォームがあるが、これはＡＰＰ７７０の３４５番目のメチオニンから３６３番目のリジンの１９個のアミノ酸がなく、全部で７５１個のアミノ酸からなる。ＡＰＰ７５１とＡＰＰ７７０に共通して挿入されるアミノ酸配列（ＡＰＰ７７０のアミノ酸配列で示すと、２８９番目のグルタミン酸から３４４番目のアラニンまでの５６個のアミノ酸）はキュニッツ型プロテアーゼインヒビターの活性があり、神経細胞以外の細胞において発現されていると考えられている。
アミロイドタンパク質の生理活性については神経細胞毒性があるとする考えが実験的に証明されて〔Ｙａｎｋｎｅｒ，−Ｂ−Ａ；Ｄａｗｅｓ，−Ｌ−Ｒ；Ｆｉｓｈｅｒ，−Ｓ；Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ，−Ｌ；Ｏｓｔｅｒ−Ｇｒａｎｉｔｅ，−Ｍ−Ｌ；Ｎｅｖｅ，−Ｒ−Ｌ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４５（４９１６）：４１７−２０、及び、Ｙａｎｋｎｅｒ，−Ｂ−Ａ；Ｄｕｆｆｙ，−Ｌ−Ｋ；Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，−Ｄ−Ａ．Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｂｙ  ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０  ２５０（４９７８）：２７９−８２〕以来、アルツハイマー病発症の鍵分子と考えられている。アミロイド前駆体タンパク質からアミロイドタンパク質が産生されるためには２段階の重要な反応がおこらなければならない。第１段階はβセクレターゼによるアミロイドタンパク質のアミノ末端側の切断である。第２段階は、γセクレターゼによるアミロイドタンパク質のカルボキシル末端側で切断され、アミロイドタンパク質の遊離とＡＰＰの細胞質断片の解離を生じることになる。従来の知見では、第２段階の切断点がアミロイドタンパク質のカルボキシル末端であるガンマ（γ）部位（ＡＰＰ７７０でいうアミノ酸残基で７１１番目のバリンと７１２番目のイソロイシン間、７１３番目のアラニンと７１４番目のトレオニン間あるいは７１４番目のトレオニンと７１５番目のバリン間）で生じていると考えられてきたが、最近の知見ではさらにアミノ酸残基５から１０個分下流（カルボキシル末端方向）の細胞質寄りのイプシロン（ε）部位（ＡＰＰ７７０でいうアミノ酸残基で７１９番目のトレオニンと７２０番目のロイシン間あるいは７２０番目のロイシンと７２１番目のバリン間）で生じるとする報告がある。
アルツハイマー病の脳内神経病変は、臨床的な異常症状である失見当識、記憶低下、記憶喪失、判断力低下、行動異常などが生じる前に生じている。神経病変は、アミロイドタンパク質の沈着と神経原線維変化、細胞脱落変性であるが、この中でも、アミロイドタンパク質の沈着は最初期の病理反応である。
アルツハイマー病の進行には、アミロイドタンパク質の産生・沈着によって引き起こされているとするアミロイド仮説が重要であると考えられており、その根拠として家族性アルツハイマー病研究がある。
γセクレターゼは、早期発症型家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として発見された、染色体１４にあるプレセニリン１〔Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，−Ｒ；Ｒｏｇａｅｖ，−Ｅ−Ｉ；Ｌｉａｎｇ，−Ｙ；Ｒｏｇａｅｖａ，−Ｅ−Ａ；Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，−Ｇ；Ｉｋｅｄａ，−Ｍ；Ｃｈｉ，−Ｈ；Ｌｉｎ，−Ｃ；Ｌｉ，−Ｇ；Ｈｏｌｍａｎ，−Ｋ；ｅｔ−ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３７５（６５３４），７５４−７６０〕とプレセニリン２〔Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ，−Ｅ；Ｗａｓｃｏ，−Ｗ；Ｐｏｏｒｋａｊ，−Ｐ；Ｒｏｍａｎｏ，−Ｄ−Ｍ；Ｏｓｈｉｍａ，−Ｊ；Ｐｅｔｔｉｎｇｅｌｌ，−Ｗ−Ｈ；Ｙｕ，−Ｃ−Ｅ；Ｊｏｎｄｒｏ，−Ｐ−Ｄ；Ｓｃｈｍｉｄｔ，−Ｓ−Ｄ；Ｗａｎｇ，−Ｋ；ｅｔ−ａｌ．Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｏｃｕｓ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９（５２２６），９７３−９７７、及び、Ｒｏｇａｅｖ，−Ｅ−Ｉ；Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，−Ｒ；Ｒｏｇａｅｖａ，−Ｅ−Ａ；Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，−Ｇ；Ｉｋｅｄａ，−Ｍ；Ｌｉａｎｇ，−Ｙ；Ｃｈｉ，−Ｈ；Ｌｉｎ，−Ｃ；Ｈｏｌｍａｎ，−Ｋ；Ｔｓｕｄａ，−Ｔ；ｅｔ−ａｌ．Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｋｉｎｄｒｅｄｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ３  ｇｅｎｅ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６（６５４３），７７５−７７８〕の遺伝子産物であるとする考えもあるが、なお確定していない。
ＡＰＰもまた早期発症型家族性アルツハイマー病の原因遺伝子である（Ｇｏａｔｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  １９９１）ことから、１つのアルツハイマー病という痴呆症の病因に複数の因子が関連していることが示されている。
前述のように、アミロイドタンパク質は２つの構成成分を含む。１つはアスパラギン酸から始まり４０番目のバリンで終了する短いアミロイドタンパク質成分と、この４０個のアミノ酸からなる成分と同じくアスパラギン酸から始まるが２残基分のアミノ酸もしくは３残基分のアミノ酸だけ長い４２番目のアラニンあるいは４３番目のトレオニンで終了する４２個あるいは４３個のアミノ酸からなる長いアミロイドタンパク質成分である。後者の長い成分は疎水性が高くより難溶性である。この長い成分が核となりこれに短い成分が付加することによって、直径約５から６ｎｍの線維状のアミロイド線維が形成される。
プレセニリン１あるいはプレセニリン２に遺伝変異が存在すると、長いアミロイドタンパク質の産生が増加することが示されている。この変異効果によって、アミロイドタンパク質重合の閾値を決定していると考えられている長いアミロイドタンパク質成分が多量に形成され、病因反応を加速すると考えられている。
ＡＰＰにも多くの遺伝変異が同定されているが、代表的な変異は大きく、アミロイドタンパク質のアミノ末端の直前にあるスウェーデン変異（Ｍｅｔ６７０Ａｓｎ、Ｌｙｓ６７１Ｌｅｕ：但しＡＰＰ７７０のアミノ酸番号に従う。以下、変異型について同じ。）、オランダ型変異（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ）、ロンドン変異（Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）及びオーストラリア変異（Ｌｅｕ７２３Ｐｒｏ）に分けられる。スウェーデン変異では２つのアミロイドタンパク質成分の産生が増加するが、ロンドン変異やオーストラリア変異では長いアミロイドタンパク質成分のみの産生が増加する。オランダ型変異の意義についてはなお議論の途上であり、結論は得られていない。
アポリポタンパク質Ｅの危険因子アレルとしてＥ４がある。一方のみの染色体アレルがＥ４の場合で８年から１０年、両方の染色体アレルがＥ４／Ｅ４になった場合は１６年から２０年、アルツハイマー病の発症が早まることが統計学的に証明されている〔Ｃｏｒｄｅｒ，−Ｅ−Ｈ；Ｓａｕｎｄｅｒｓ，−Ａ−Ｍ；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，−Ｗ−Ｊ；Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌ，−Ｄ−Ｅ；Ｇａｓｋｅｌｌ，−Ｐ−Ｃ；Ｓｍａｌｌ，−Ｇ−Ｗ；Ｒｏｓｅｓ，−Ａ−Ｄ；Ｈａｉｎｅｓ，−Ｊ−Ｌ；Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ，−Ｍ−Ａ．Ｇｅｎｅ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｔｙｐｅ  ４  ａｌｌｅｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｌａｔｅ  ｏｎｓｅｔ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１（５１２３）：９２１−３〕。
βセクレターゼおよびγセクレターゼの活性阻害はアミロイドタンパク質産生を抑制し、アルツハイマー病の進行を停止もしくは遅らせられる治療薬になると考えられる。ＡＰＰの加水分解の第１段階では、βセクレターゼ以外にもαセクレターゼ反応があるが、第２段階であるγセクレターゼ反応は両者の第１段階に共通して生じることからより広いスペクトル効果が期待される。
γセクレターゼの同定については未だ最終的な結論が得られていないが、プレセニリン１が重要な役割をもっていることは証明されている。このプレセニリン１の働きを無くした動物実験や培養細胞での実験によると、脳神経発生や脊柱形成異常あるいはリンパ球発生の異常が生じるという。つまりプレセニリン１はアミロイドタンパク質以外にも多様な作用があることが知られている。
γセクレターゼの非特異的な活性抑制は癌化誘導などの重篤な副作用を誘導する可能性があるということを考えなくてはならない（Ｈａｒｄｙ，Ｊ．，Ｉｓｒａｅｌ，Ａ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ．３９８（６７２７），４６６−７）。
現在知られているγセクレターゼ阻害剤としては、その酵素が作用するアミロイドタンパク質のカルボキシル末端にある基質ＡＰＰのγ部位の報告〔Ｍｏｒｉ  Ｈ．，Ｔａｋｉｏ  Ｋ．，Ｏｇａｗａｒａ  Ｍ．＆  Ｓｅｌｋｏｅ  Ｄ．Ｊ．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１７０８２−１７０８６；Ｒｏｈｅｒ  Ａ．Ｅ．，Ｌｏｗｅｎｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．，Ｃｌａｒｋｅ  Ｓ．，Ｗｏｌｋｏｗ  Ｃ．，Ｗａｎｇ  Ｒ．，Ｃｏｔｔｅｒ  Ｒ．Ｊ．，Ｒｅａｒｄｏｎ  Ｉ．Ｍ．，Ｚｕｒｃｈｅｒ−Ｎｅｅｌｙ  Ｈ．Ａ．，Ｈｅｉｎｒｉｋｓｏｎ  Ｒ．Ｌ．，Ｂａｌｌ  Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｙ  ａｃｃｏｕｎｔ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８（５），３０７２−３０８３〕に基づくペプチド模倣化合物である阻害剤と、アスパラギン酸活性部位が重要であるとの報告〔Ｗｏｌｆｅ  Ｍ．Ｓ．，Ｘｉａ  Ｗ．，Ｏｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ  Ｂ．Ｌ．，Ｄｉｅｈｌ  Ｔ．Ｓ．，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  Ｗ．Ｔ．，Ｓｅｌｋｏｅ  Ｄ．Ｊ．Ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｐａｒｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９８（６７２７），５１３−５１７〕にもとづく酵素阻害剤とがある。
ペプチド模倣化合物としてはＤＦＫ−１６７〔Ｗｏｌｆｅ  Ｍ．Ｓ．，Ｃｉｔｒｏｎ  Ｍ．，Ｄｉｅｈｌ  Ｔ．Ｓ．，Ｘｉａ  Ｗ．，Ｄｏｎｋｏｒ  Ｉ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ  Ｄ．Ｊ．；Ａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｆｌｕｏｒｏ  ｋｅｔｏｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｇ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１（１），６−９〕が知られている。
酵素阻害剤としては、既知阻害剤の中からスクリーニングされた化合物が報告されている。すなわち、エイズ治療薬開発の過程で作成されたＬ−６８５，４５８〔Ｓｈｅａｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｂｅｈｅｒ，Ｄ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｈ．Ｄ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｕｎｔ，Ｐ．，Ｎａｄｉｎ，Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｌ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｃａｓｔｒｏ，Ｊ．Ｌ．Ｌ−６８５，４５８，ａｎ  ａｓｐａｒｔｙｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｍｉｍｉｃ，ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（３０），８６９８−８７０４〕と、α−キモトリプシン阻害剤であるＪＬＫ−６〔Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｋ．，Ｐｏｗｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．，Ａｓｈｅ，Ｂ．Ｍ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｇ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  １−ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１０），４０２７−３２〕とがある。
基質ＡＰＰのγ部位に基づくペプチド模倣化合物の阻害剤と酵素活性部位に基づく阻害剤のいずれもがアミロイドタンパク質産生の強力な阻害剤であるが、各々重大な問題点がある。まず、ＤＦＫ−１６７はγ部位に対して設計された阻害剤であり、最近の知見であるε部位での知見とは全く独立した化合物であり、阻害剤の設計目標が異なる。阻害剤Ｌ−６８５，４５８やＪＬＫ−６は、本来ＡＰＰのアミロイドタンパク質産生をするγセクレターゼに対する特異的な阻害剤として開発された化合物ではないことがあげられる。γセクレターゼ阻害剤としての特異性の問題点以外にも標的組織での有効性などの課題もある。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題の一つは、γセクレターゼ活性を阻害する新規な化合物提供することである。
本発明の更なる課題は、γセクレターゼ側ではなく、基質であるＡＰＰのアミノ酸配列に焦点を当てたγセクレターゼ阻害化合物を提供することである。
本発明の更なる課題は、最新の、ε部位に関する知見に準拠したγセクレターゼ阻害化合物を提供することである。
本発明の尚も更なる課題は、アルツハイマー病をはじめとする類縁疾患の診断方法、有用な治療薬・治療方法、治療薬開発のスクリーニング方法等を提供することである。ここでいう類縁疾患とは、ダウン症をはじめとする、アミロイドタンパク質が直接・間接に病因として関与することが知られ又は可能性が疑われている疾患、及びアミロイドタンパク質が神経病変中に認められる疾患をいう。
本発明は、関連の研究知見に照らしつつ、ＡＰＰの（γ部位ではなく）ε部位に着目して創意工夫を重ねた結果、ＡＰＰのε部位を含む数個のアミノ酸配列と類似の化学構造を有するがしかし酵素切断部位であるε部位のＬｅｕとその直前及び／又は直後に位置するアミノ酸との間のペプチド結合を酵素に対し安定な結合に置き換えたペプチド類似化合物が、γセクレターゼを阻害してアミロイドタンパク質産生を抑制することを見出し、それに基づき本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１）において、第１１番目のＬｅｕを含む連続した少なくとも３個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列よりなり、該Ｌｅｕとその直前及び／又は直後に位置するアミノ酸との間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されてされており、第１０番目のＴｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基により置換されていてもよいものであることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（２）上記（１）の化合物において、該アミノ酸配列の第１４番目のＬｅｕがＩｌｅであってよい疎水性アミノ酸又はＰｒｏで置換され、第１１番目のＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸で置換され、又は第１０番目のＴｈｒがＳｅｒで置換され、又は第９番目のＩｌｅが、Ｌｅｕであってよい疎水性アミノ酸で置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（３）アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ（配列番号２）において、第３番目のＬｅｕを含む連続した３、４、５又は６個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列よりなり、該Ｌｅｕとその直前及び／又は直後に位置するアミノ酸との間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されてされており、Ｔｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基により置換されていてもよいものであることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（４）アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ（配列番号３）において、第１番目のＬｅｕと第２番目のＶａｌと間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸残基間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（５）アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（配列番号４）において、第１番目のＴｈｒと第２番目のＬｅｕとの間において、ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−に代えてヒドロキシエチレン基−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−を有し、他のアミノ酸間の結合はペプチド結合であり、且つＮ末端に、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルに基づくアルキルオキシカルボニル基を有し、Ｃ末端が、フェニル基又はナフチル基で置換されていてよい炭素数１〜１０のアルキルによるアルキルエステル化又はアルキルアミド化されてされており、Ｔｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基により置換されていてもよいものであることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（６）上記（３）の化合物であって、Ｖａｌの直前に位置するＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸により置換され、又はＮ末端のＬｅｕがＩｌｅであってよい疎水性アミノ酸若しくはＰｒｏにより置換されていることを特徴とする化合物及びその薬剤学的に許容し得る塩、
（７）上記（４）の化合物であって、Ｖａｌの直前に位置するＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸により置換され、又はＮ末端のＬｅｕがＩｌｅであってよい疎水性アミノ酸若しくはＰｒｏにより置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（８）上記（５）の化合物であって、Ｖａｌの直前に位置するＬｅｕが、Ｉｌｅであってよい疎水性アミノ酸により置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（９）上記（３）の化合物であって、ＴｈｒがＳｅｒにより置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（１０）上記（３）の化合物であって、Ｉｌｅが、Ｌｅｕであってよい疎水性アミノ酸により置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（１１）上記（５）の化合物であって、ＴｈｒがＳｅｒにより置換されていることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（１２）上記（１）ないし（１１）の何れかの化合物であって、該アルキルオキシカルボニル基がＢｏｃ基であることを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩、
（１３）上記（１）ないし（１２）の何れかの化合物において、アルキルオキシカルボニル基の代わりにＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号５）よりなるポリペプチドを融合して有することを特徴とする化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩。
（１４）上記（１）ないし（１３）の何れかの化合物を含んでなるガンマセクレターゼ阻害剤、
（１５）上記（１）ないし（１３）の何れかの化合物に対する抗体、
（１６）アミロイドタンパク質生成阻害薬のスクリーニングにおける上記（１）ないし（１３）の何れかの化合物の、ガンマセクレターゼ阻害剤としての使用。
本発明の化合物及びその薬剤学的に許容し得る塩は、アルツハイマー病及びその類縁疾患、例えば、ダウン症をはじめとする、アミロイドタンパク質が直接・間接に病因として関与することが知られ又は可能性が疑われている疾患、及びアミロイドタンパク質が神経病変中に認められる疾患の治療に、及び治療薬のスクリーニングのために用いることができる。また本発明の抗体は、例えば、治療のためにヒトに投与された本発明の化合物の血中濃度等を測定するために使用することができる。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、アルキルオキシカルボニル基における「アルキル」は、炭素数１〜１０、より好ましくは炭素数１〜７、更に好ましくは炭素数１〜５のアルキルである。そのようなアルキルは、直鎖のものでも、分岐を有するものでもよく、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、ｔ−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。例えばｔ−ブチルは特に好ましい一例である。またそれらは、何れか１つ又は２つ以上の水素原子がフェニル基又はナフチル基で置換されたものであってもよい。そのような置換体の特に好ましい例の一つとして、ベンジルオキシカルボニル基が挙げられる。
また本発明において、「アルキルエステル化又はアルキルアミド化」における、「アルキル」は、炭素数１〜１０、より好ましくは炭素数１〜７、更に好ましくは炭素数１〜５のアルキルである。そのようなアルキルは、直鎖のものでも、分岐を有するものでもよく、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、ｔ−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。それらの特に好ましい例として、メチル及びｔ−ブチルが挙げられる。またそれらは、何れか１つ又は２つ以上の水素原子がフェニル基又はナフチル基で置換されたものであってもよい。そのような置換体の特に好ましい例の一つとして、ベンジル基が挙げられる。
また本発明において、Ｔｈｒのヒドロキシル基の水素が炭素数１〜４の疎水性基又はＺ基（すなわち、カルボベンゾキシ基）によって置換されているとき、それら炭素数１〜４の疎水性基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル等の疎水性保護基が挙げられる。
また本発明において、「アミノ酸」というときは、Ｌ−アミノ酸を意味する。
本発明のペプチド模倣化合物は、ＡＰＰ分解物に関するこれまでの詳細な研究成果に照らし、酵素に対するε部位の安定化によりγセクレターゼ活性を阻害することが可能であるとの仮定のもとに、ε部位の構造と類似でありしかも酵素に対し安定化された化合物を作り出す試みから得られたものであり、孤発性アルツハイマー病のアミロイド産生のみならず早期発症型家族性アルツハイマー病の遺伝変異を有するアミロイド産生に対しても抑制活性が確認された。
ＡＰＰのε部位付近と同様のアミノ酸配列を有するがしかしγセクレターゼによる切断部位を安定化させるように変更した種々のペプチド類似化合物で、γセクレターゼ阻害活性を有するものを、本発明の目的に使用することができる。例えば、ε部位付近のあるアミノ酸残基−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−を、Ｒについて類似の性質（疎水性／親水性、酸性／塩基性、イオウの有無、ヒドロキシル基の有無等）を有する他のアミノ酸残基で置換した形の化合物であってγセクレターゼ阻害活性を有するものが、そのような化合物の例である。例えば、Ｌｅｕに置換できるアミノ酸としてはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ等が、Ｉｌｅに置換できるアミノ酸としてはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ等が、Ｔｈｒに置換できるアミノ酸としてはＳｅｒ等が、Ｍｅｔに置換できるアミノ酸としてはＡｌａ等が、Ａｌａに置換できるアミノ酸としてはＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ等が、Ｌｙｓに置換できるアミノ酸としてはＡｒｇ、Ｈｉｓ等が、それぞれ挙げられる。また、配列番号１における１４番目のＬｅｕ（配列番号２における第６番目のＬｅｕ、及び配列番号３における第４番目のＬｅｕに同じ。）については特に、Ｐｒｏによっても置換してよい。これは、当該部位のアミノ酸がＰｒｏに変異している変異体では、Ａβ４２アミロイドタンパク質の成分が増加すること（すなわち、そのような変異体タンパク質がγセクレターゼに対する高い親和性を有することを示唆する）が報告されているからである〔Ｋｗｏｋ，−Ｊ−Ｂ；Ｌｉ，−Ｑ−Ｘ；Ｈａｌｌｕｐｐ，−Ｍ；Ｗｈｙｔｅ，−Ｓ；Ａｍｅｓ，−Ｄ；Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ，−Ｋ；Ｍａｓｔｅｒｓ，−Ｃ−Ｌ；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，−Ｐ−Ｒ，Ｎｏｖｅｌ  Ｌｅｕ７２３Ｐｒｏ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ４２（４３）ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｎｎ−Ｎｅｕｒｏｌ．２０００  Ｆｅｂ；４７（２）：２４９−５３〕。
本発明の化合物を合成するための素材および合成の各ステップにおいて用いる方法は、周知であるから、当業者は合成、単離、精製等を適宜行なって目的とする化合物を適宜製造することができる。また大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞の自体公知の宿主を利用した遺伝子組み換え技術によって、本発明の化合物のポリペプチド部分を製造することも可能である。化学合成としては、例えば、後述の実施例に準じて行なうことができるが、目的とする化合物が得られる限り、いかなる方法を用いてもよい。例えば周知の方法であるＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）化反応、ＤＭＳＯ酸化、アルカリ反応、酸性反応、エポキシ化反応、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、アルキル化反応、ケン化反応、加熱反応、脱炭酸反応、縮合反応、逆相高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行なうことができる。好ましくは、本発明の化合物の構造要素部分を順次反応させ、効率と反応物純度の検定を適宜実施する方法をとる。
本発明の化合物は、合成や精製を促進するための修飾、物理・化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾、更には、脳血管関門通過を含む臓器搬送効率の高進と低下をもたらす制御修飾を含むものであってよい。ここにいう制御修飾としては、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３）の１１個のアミノ酸よりなる配列を指す（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｈｏ，Ａ．，Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ，Ａ．＆  Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−１５７２）。Ｎ末端側にペプチド結合で連結された該制御配列を含むことにより、該化合物は、血液脳関門の通過が容易化され、脳内の目標部位によりよい効率で到達することが可能となる。
本発明の化合物のその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介のタンパクへのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーション等がある。
更に、本発明の化合物および抗体の検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、構造の付加、変更、置換することは技術的に容易であり、これらの生成物も本発明の範囲に包含される。なお、修飾付加にはＦＬＡＧ−ｔａｇ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片やＧＦＰ等の遺伝子工学手法による生成物も本発明の範囲に包含される。
〔抗体〕
抗体は、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物を選別し、これらを抗原として用いて精製することができる。抗原は当該化合物あるいはそれらの派生物でもよく、例えば２０個以下のアミノ酸残基、好ましくは５個以下のアミノ酸残基、さらに好ましくは３個、最も好ましくは２個のアミノ酸残基で構成される。精製にはそれらの抗原を組み合わせて用いてもよい。抗原としては必ずしも本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物そのものでなくとも、ＡＰＰのε部位近傍の一次配列を立体構造上外部へ露出して有する化合物であればよい。ここでいう近傍とは、２ヶ所あるε部位からアミノ末端側およびカルボキシル末端側へ４個までのアミノ酸までの領域を指す。
また本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物に対する免疫特異的な抗体を作製するためには、上記したε部位近傍の構造のアミノ酸配列を含んだ化合物を抗原として用いることが好ましい。好ましい抗体としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（配列番号１０）のカルボキシル末端のトレオニンを認識する抗体、
（２）Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（配列番号１１）のカルボキシル末端のロイシンを認識する抗体、
（３）Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２）のアミノ末端のロイシンを認識する抗体、
（４）Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ〔配列番号１３〕のアミノ末端のバリンを認識する抗体、
（５）前記（１）から（４）までのアミノ酸配列において認識されるアミノ酸を含む少なくとも２つの連続するアミノ酸を有する抗原を用いて得られる抗体。
これらの抗体は、当該部位に免疫学的に結合またはこれを認識する限り、種類及び量は特に限定されない。抗体の結合または認識の有無は、公知の抗原抗体反応によって決定される。「免疫特異的」とは、先行技術の他の関連タンパク質あるいは化合物よりも、当該化合物に対する親和性が実質的に大きいことを意味する。
抗体の生産は、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物を抗原として、アジュバントの存在または非存在下に、単独または担体に結合あるいは同居した状態で、該抗原に対して体液性応答および／または細胞性応答の免疫誘導を行うことによって実施される。あるいは培養条件下でリンパ球もしくはその前駆細胞を免疫刺激することによっても免疫誘導することができる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、重合アミノ酸、アルブミンおよびそれらの混合物等が例示されるがこれに限らない。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の方法により血清として、また血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体の生産は、上記の免疫誘導した動物から抗体活性を含む組織（例えば脾臓またはリンパ節）あるいは培養細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、上記抗体産生細胞と永久増殖細胞とから作製されたハイブリドーマをクローン化し、本発明に係る新規な化合物を特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。実例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７）、トリオーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）、およびＥＢＶ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８５）：７７−９６）に記載されるような種々の技法がある。
上記抗体は、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物の同定、検出、定量、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによる該化合物の調製と精製に用いることができる。上記抗体はヒト型抗体へと、自体公知の手法を用いて改変することができる。
具体的には、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物、およびそれらに対する特異的抗体で本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物の活性を増加させる活性を持つものは、アミロイドタンパク質生成阻害薬のスクリーニングに付される化合物の標準物として、またスクリーニング手段として有用である。
本発明の化合物は、アルツハイマー病およびその類縁疾患に対し、有効量を医薬上許容される担体に入れて若しくは単独で患者に投与して、アミロイドタンパク質産生量を制御しそれにより、それらの疾患の予防、治療、及び症状を改善のため用いられる。本発明の化合物には、該化合物の脳組織への輸送効率を高める適切な製剤化を施してよい。
本発明の化合物は、そのうち１種を単独で使用しても、あるいは複数を組み合わせて使用してもよい。更には、治療上有利となる他の化合物と併用してもよい。本発明の化合物を含んでなる医薬品組成物の全身投与の好ましい形態は、注射であり、とりわけ静脈注射である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフクジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与である。さらに、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらの医薬品組成物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物に対する抗体を用いたアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
〔実施例１〕  化合物Ｂｏｃ−Ｌｅｕ＊−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−ＯＭｅの合成
図１〜５に示す合成経路に沿って、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ＊Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ〔式中、「＊」は、ＬｅｕとＶａｌの間のペプチド結合「−ＣＯ−ＮＨ−」がドロキシエチレン基「−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−」に置き換えられていることを示す。〕を以下のようにして合成した。該化合物において、ヒドロキシエチレン基のα炭素周りの立体構造としてはＲ型のものを選択した。当該化合物の構造式を式（１）に示す。
2003091278.tif 000002
Ｌ−ロイシノール塩酸塩（２）（９．８７ｇ，６４．２ｍｍｏｌ）をアセトン１００ｍｌ，水５０ｍｌを加えて溶解、トリエチルアミン（２１．５ｍｌ，１２８ｍｍｏｌ）を加えて−１０℃に冷却した。−１０℃でＢｏｃ２Ｏ（２０ｇ，９２ｍｍｏｌ）を滴下、その後冷却を外して終夜攪拌後、アセトンを留去、０．１Ｍ塩酸約５００ｍｌを加えて酢酸エチル５００ｍｌで抽出した。有機層を０．１Ｍ塩酸、水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、乾燥剤を濾去後、濃縮した。シリカゲルオープンカラム（２５０ｇ，酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）で精製して目的物Ｂｏｃ−ロイシノール（３）を得た。収量１２．８８ｇ（９２％）。
Ｂｏｃ−ロイシノール（３）（１２．８８ｇ，５８．９ｍｍｏｌ）をトルエンフラッシュ後、アルゴン置換した。ジメチルスルフォキシド（脱水、２００ｍｌ）に溶解、トリエチルアミン（２２ｍｌ，１５８ｍｍｏｌ）を加えて１５℃の水浴で冷却する。一方、別のフラスコにて、アルゴン気流下、三酸化硫黄ピリジン錯体（２５．３ｇ，１５９ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＳＯ（１００ｍｌ）に溶解、１０分間攪拌する。Ｂｏｃ−ロイシノール（３）の溶液中へ、１５℃冷却下、三酸化硫黄溶液を滴下し（４分）その後、８分攪拌後、冷水１５００ｍｌ中へ反応混合物を投入して反応を終了した。酢酸エチルで抽出し、有機層を０．１Ｍ塩酸、水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、乾燥剤を濾去後、濃縮した。シリカゲルオープンカラム（２５０ｇ，酢酸エチル／ヘキサン＝１／５）で精製して目的物Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ（アルデヒド）（４）を得た。収量１０．９ｇ（８５．８％）。
水素化ナトリウム（鉱油中６２．６％）を０．５３ｇの鉱油を除去しアルゴン置換した。これにＤＭＳＯ（脱水、５０ｍｌ）を加え５０℃に加温、１時間攪拌し、これにＴＨＦ（脱水、５０ｍｌ）を加えて氷冷した。（ＣＨ３）Ｓｌ（３．１ｇ，１５．２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１５ｍｌ）溶液を滴下し、滴下開始から１分後、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ（アルデヒド）（４）（２．０ｇ，９．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液を滴下した。滴下終了後、冷却を外し１時間攪拌した。反応液を冷水１０００ｍｌ中に投入して反応終了し、酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、乾燥剤濾去後、濃縮して２．２ｇの粗精製物を得た。また、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ（アルデヒド）（４）（４．５８ｇ，２１．３ｍｍｏｌ）を同様の条件で反応し、４．８１ｇの粗精製物（５ａ及び５ｂ）を得た。この反応２回分の粗製製品を合わせて、シリカゲルオープンカラム（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）で精製した。収量５．６ｇ（８０％）。これをシリカゲルオープンカラム（トリクロロメタン／アセトン＝１００／１）で分離し、ジアステレオマーを精製して５ａ、５ｂをそれぞれ豊富に含む画分を回収した。ジアステレオマー５ａ、５ｂの判別はＮＭＲにより行なった。５ａリッチの画分（５ａ／５ｂ＝５／１）を後の工程に用いた。
エポキシ化合物５ａ（０．９６ｇ，４．２ｍｍｏｌ）とマロン酸ジエチル（０．７６ｍｌ，１．２当量）をエタノール（脱水）３ｍｌに溶解後、氷冷下、２０％ナトリウムエトキシド２ｍｌ（３当量）を滴下した。冷却をはずし、室温で２０時間攪拌後、冷１０％クエン酸水溶液中へ投入して、反応終了した。酢酸エチルで抽出、水洗、飽和食塩水洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、乾燥剤濾去し、シリカゲルカラム（酢酸エチル／ヘキサン＝１／５）で精製して化合物６ａを得た。収量１．２ｇ（８３％）。
アルゴン気流下、化合物６ａ（１．１３ｇ，３．２９ｍｍｏｌ）を脱水エタノール１０ｍｌに溶解し、氷冷下、２０％ナトリウムエトキシド（１．４ｍｌ，１．２当量）、ヨウ化イソプロピル（１．８ｍｌ，３当量）を加えた後、６０℃にて５時間攪拌、室温で終夜攪拌、翌日６０℃で７時間攪拌した。冷１０％クエン酸水溶液へ投入して反応終了した。酢酸エチルで抽出し、有機層を洗浄後、硫酸ナトリウムを加えて乾燥、乾燥剤を濾去、溶媒を留去して粗生成物を得た。シリカゲルカラム（２０ｇ，酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）で精製して、目的物７を得た。収量０．８ｇ（６３％）。
ラクトン−エステル（７）（０．７８ｇ，２．０ｍｍｏｌ）をジオキサン約１０ｍｌに溶解。氷冷下、１Ｎ水酸化ナトリウム（４ｍｌ）を滴下後、室温にて攪拌した。
１．５時間攪拌後、ジオキサンを留去、冷０．２規定ＨＣｌ水溶液へ投入、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、濾過後、濃縮し、ラクトン−カルボン酸（８）の粗精製物を得た。これをそのままトルエンに溶解、９５℃のオイルバス上で加熱する（３時間）、その後、終夜放冷、翌日再度９５℃に加熱する。１．５時間後トルエンを留去、シリカゲルカラム（酢酸エチル／ヘキサン＝１／５）で精製した。生成物のＴＬＣ上近接した２つのスポット中、下方のスポットに対応する化合物（９ａ）０．４ｇ、及び上方のスポットに対応する化合物（９ｂ）０．２ｇを得た。それぞれ収率６３％及び３２％。
化合物９ａ（０．３７ｇ，１．１８ｍｍｏｌ）をジオキサン２．５ｍｌに溶解、氷冷下、１規定水酸化ナトリウム溶液を滴下後、室温で２時間攪拌した。これに２０％クエン酸水溶液を加えて反応を終了させ、酢酸エチルで抽出した。水次いで飽和食塩水で洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過、濃縮してヒドロキシカルボン酸（１０）を得た。これを無水ＤＭＦに溶解して、イミダゾール（１．７ｇ，２５ｍｍｏｌ）、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（１．８ｇ，１２ｍｍｏｌ）ＤＭＡＰ（２５ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を順次加えて、終夜室温にて攪拌した。これにメタノール約１ｍｌを加えて３０分攪拌して試薬を潰した後、２０％クエン酸に投入、酢酸エチル抽出した。有機層を水洗、飽和食塩水洗浄し、硫酸ナトリウム乾燥後、濾過、濃縮した。これ（ジシリル体）を酢酸に溶解して、室温で４時間攪拌し（ＴＬＣ、及び反応液のＭＳより、シリルエステルの切断を確認）、酢酸を減圧留去後、シリカゲルカラム（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）で精製して、化合物１１を得た。収量０．５ｇ（９６％）
〔化合物１１の異性体の合成〕
また９ｂから上記と同様の処理により、シリル化合物１１の異性体を得た。収量０．２ｇ（８８％）
〔Ｌｅｕ−ＯＭｅ塩酸塩の合成〕
脱水メタノール（１５０ｍｌ）をフラスコ中に入れ、冷却した（−１５℃）。ＳＯＣｌ２（４０ｍｌ）を滴下、１０分後Ｌ−ロイシンを粉末のまま投入、冷却をはずし、室温にて攪拌した。約１０分後脱水メタノールを１００ｍｌを追加して終夜攪拌した。２０時間後、溶媒を減圧留去、メタノールフラッシュを２回した後、結晶性の残渣にジエチルエーテルを加えて沈殿を濾取、水酸化ナトリウム上で減圧乾燥した。収量２４．２３ｇ（８７．８％）
〔Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−ＯＭｅの合成〕
５００ｍｌコルベンにＨＣｌ，Ｌｅｕ−ＯＭｅ（５．３ｇ，２９．２ｍｍｏｌ），Ｂｏｃ−Ｍｅｔ（７．６４ｇ，３０．６ｍｍｏｌ），１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４．３４ｇ，３２ｍｍｏｌ）を量りこみ、ＤＭＦに溶解した。冷却下、ＷＳＣＤ（５．８８ｍｌ，３２ｍｍｏｌ）を滴下した。２時間後、冷２％重曹水へ投入、析出した沈殿を濾取、水洗した。これを酢酸エチル３００ｍｌに溶解、０．２規定塩酸、水、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去、析出した沈殿をヘキサンで濾取した。５酸化リン上で減圧乾燥して、目的物（１３）を得た。収量１０．４ｇ（９４．６％）。
〔脱Ｂｏｃ処理〕
Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ（１．０９ｇ，２．８９ｍｍｏｌ）に冷却下ＴＦＡを加え、冷却下１０分後、冷却をはずして室温にて５０分攪拌した。ＴＦＡを留去、４．９規定塩酸／ジオキサン（０．７１ｍｌ）を加えて、ヘキサンで数回デカント後、濃縮、減圧乾固して固体を得た。収量０．８ｇ（塩酸塩として９０％）
〔縮合反応〕
上記塩酸塩（０．２９ｇ，０．９３ｍｍｏｌ）に、化合物１１（０．３４ｇ，０．７６ｍｍｏｌ）と、ＨＯＯＢｔ（１５０ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）を加えて、ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。冷却下ＷＳＣＤ（１７０μｌ，０．９３ｍｍｏｌ）を滴下後、冷却をはずし、室温にて攪拌した。２０時間後、冷２％重曹水へ投入して反応を終了し、酢酸エチルで抽出し、１０％クエン酸、水、食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮、シリカゲルカラム（酢酸エチル／ヘキサン＝１／４）で精製し化合物１４を得た。収量０．５ｇ（９３％）。
保護体１４（０．５ｇ，１５−０２０１１２２１）を脱水ＴＨＦに溶解し、ＴＢＡＦ・３Ｈ２Ｏ（３３０ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２４時間攪拌することにより、脱シリル化した。ＴＨＦを留去後、シリカゲルカラム（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１〜１／２）で精製。目的化合物（１）の粗精製品０．２５ｇ、原料回収０．１４ｇを得た。逆相ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ＯＤＳ，アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡ）で精製、凍結乾燥して目的物を得た。収量１０６ｍｇ（２５％）。ＥＳＩ−ＭＳ：５９０．３（Ｍ＋Ｈ，理論値５９０．３８），６１２．３（Ｍ＋Ｎａ）
〔化合物１の異性体の合成〕
前述の化合物１１の異性体（０．１８ｇ）を用いて、同様に縮合、脱保護、精製して化合物１の異性体４６ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：５９０．３（Ｍ＋Ｈ，理論値５９０．３８），６１２．３（Ｍ＋Ｎａ）
〔実施例２〕  溶解性検討
実施例１において合成した化合物の溶解度を肉眼と顕微鏡により検討した。結果を次表に示す。
2003091278.tif 000003
〔実施例３〕  阻害活性の測定
本実施例に用いるヒトＡＰＰ６９５遺伝子（そのコード領域の塩基配列を配列番号６に示す。）は正常者の死後脳から通常の方法により作成しｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングしたものであり、全塩基配列は通常の方法によってすべて確認した。すなわち、凍結脳組織約１ｇをフェノール処理し、水溶液上清を得た。この操作を繰り返した後、エタノールによりｍＲＮＡ画分を沈殿させた。２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０．１ｍＭＥＤＴＡにより溶解後、オリゴｄＴプライマーを用いてｍＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成させた。ＲＮａｓｅにより残存ＲＮＡを分解させた後、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡポリメラーゼにより２重鎖ｃＤＮＡを合成させた。この後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって２重鎖ｃＤＮＡを平滑化させた。ＥｃｏＲ１メチラーゼにより、ＥｃｏＲ１制限酵素部位にメチル化させた後、ＥｃｏＲ１リンカーアダプターをリガーゼにより結合させた。ゲル濾過により非反応のフリーアダプターを除去した後に、ラムダｇｔ１１ベクターとＤＮＡリガーゼにより結合させたものをパッケージングキットによりラムダファージへ組み込んだ。得られたラムダファージ混合物を寒天プレートの大腸菌に感染させ、増幅させたファージ液をｃＤＮＡライブラリとした。ＡＰＰｃＤＮＡのクローニングには、アミロイドタンパク質から類推されるオリゴヌクレオチドをγ３２Ｐ−ＡＴＰを用いてＤＮＡキナーゼにより放射性標識しておき、この標識ヌクレオチドをプローブとして、１０６ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）のファージを寒天上でプラーク形成させてから、ナイロン膜に接触させた。このナイロン膜をアルカリ処理することにより、膜に結合したファージＤＮＡを１本鎖に変性させてから、中和しておき、ここに、鮭精子ＤＮＡを含む溶液で保温した後に、３２Ｐ放射能標識した標識ヌクレオチドプローブを加え、１２時間ハイブリダイズ反応させた。ここで目的とするファージに組み込んだＡＰＰ遺伝子とオリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列をしたものは、２重鎖として形成される。このナイロン膜をエックス線フィルムに接触させ、感光部に対応する寒天上のプラークをＡＰＰ遺伝子（断片）を含むファージとした。この操作を繰り返すことにより、最終的に単一のファージを得た。ファージに組み込まれたからＡＰＰ遺伝子の塩基配列は、公知のサンガー法によって決定した。
サル腎臓由来の培養細胞株であるＣＯＳ細胞に、外部からＡＰＰ遺伝子をリポフェクタミンプラス試薬（インビトローゲン（株））を用いて試薬プロトコールに従い、効率よく細胞内導入した。すなわち、ＡＰＰ遺伝子１μｇを１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに溶解し、プラス試薬６μｌと混合してから室温で１５分放置させた。平行してやはり１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に溶解した４μｌのリポフェクトアミンを調製しておき、これとＡＰＰ遺伝子溶液とを混合してから、さらに１５分室温放置した。あらかじめ１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液を含む培養液で７５％から８０％細胞密度で培養したＣＯＳ細胞の培養液をＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に培地交換し、この各８００μｌを加えた６穴培養プレートを用意しておき、各培養ウェルに遺伝子を含む２００μｌの反応液を加えた。遺伝子導入の１２時間後に、培地を、導入遺伝子反応液を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地から、導入遺伝子を含有しない１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液に交換した。この培養液に実施例１で得た化合物を添加し、３６から４８時間後の培養液上清を得、遠心チューブに移し、室温で１０，０００ｒｐｍ回転、５分間遠心した遠心上清をアミロイドタンパク質を含む検体とした。各検体に含まれる短いアミロイドタンパク質成分と長いアミロイドタンパク質成分は市販のアミロイドタンパク質測定ＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ３４４１：Ｓｉｇｎａｌ  ＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ｈｕｍａｎ  β  Ａｍｙｌｏｉｄ１−４２  ＥＬＩＳＡ  ＫｉｔあるいはＫＨＢ３４８１：Ｓｉｇｎａｌ  ＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ｈｕｍａｎ  β  Ａｍｙｌｏｉｄ１−４０  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ，ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）によって別個に測定することができる。このアミロイド測定ＥＬＩＳＡキットには、あらかじめ２種類のアミロイドタンパク質に対する１次抗体を塗布してある９６穴ＥＬＩＳＡプレートが用意されており、非特異的な通常のブロック反応をさせて非特異的な抗原抗体反応を消去してから、測定しようとするアミロイドタンパク質を含む培養液検体を反応させた。その後、通常の洗浄操作を経て、２次抗体を加えた。この２次抗体は２種類のアミロイドタンパク質を区別する２種類の抗体であり、一方は短いアミロイドタンパク質、他方は長いアミロイド抗体を識別し、両者の交差反応はない。両アミロイドタンパク質の違いはカルボキシル末端のアミノ酸２残基（イソロイシンとアラニン）の有無であり、前者を識別する抗体はアミロイドタンパク質のカルボキシル末端のバリンを、後者を識別する抗体はアラニンを特異的に認識すると考えられる。
該キットを使用したアミロイドタンパク質の測定結果を次表で示す。
2003091278.tif 000004
2003091278.tif 000005
表１，２からわかるように本阻害剤は、Ａβ４２（４３）の産生については約７１％、Ａβ４０の産生については約９８％とほぼ１００％に近い阻害活性を示した。アミロイドタンパク質全量でも約９８％の阻害を示すことから、本阻害剤は有効な活性を示すことが明らかになった。
全アルツハイマー病の数％と症例数の少ない疾患ではあるが家族性早期発症型アルツハイマー病について、アミロイドタンパク質の産生に対する阻害効果も検討した。それによると、ロンドン変異と呼ばれるＡＰＰのＶａｌ７１７Ｉｌｅ変異では、野生型配列の場合とほぼ同等の阻害効果が得られた。一方、スウェーデンで発見された変異であるＭｅｔ６７０Ａｒｎ、Ｌｙｓ６７１Ｌｅｕの２重変異では、Ａβ４０に対する阻害活性は約９０％、Ａβ４２（４３）に対する阻害活性は約４８％であった。いずれの家族性疾患型変異を持つ場合にも、総アミロイドタンパク質の産生については約８０％をこえる阻害活性が認められた。
〔実施例４〕  阻害活性の測定
実施例３では、ヒトＡＰＰのフルサイズ遺伝子を使用している。アミロイドタンパク質は、ＡＰＰのαもしくはβセクレターゼの第１段階とγセクレターゼの第２段階からなるタンパク質分解によって形成されるが、γセクレターゼ以外の第１段階での阻害によってもアミロイドタンパク質の産生が抑制される。本発明の化合物の阻害効果が（βセクレターゼの阻害によるものでなく）γセクレターゼの阻害によるものであることをことを直接的に証明するため、第１段階で切除されるポリペプチド部分を予め欠いたＡＰＰ人工断片（Ｃ１００という）をＡＰＰ６９５の代わりに使用するほかは、実施例４と同様の方法で実験を行なって、生成したアミロイドタンパク質を測定した。結果を次の表に示す。
2003091278.tif 000006
Ｃ−１００のＡＰＰ（野生型）を用いた結果では、スウェーデン型変異とほぼ同様の阻害活性を示した。すなわち、Ａβ４０への阻害活性が約９０％、Ａβ４２（４３）への阻害活性は約５０％であった。いずれの家族性疾患型変異を持つ場合にも、総アミロイドタンパク質の産生については約８０％をこえる阻害活性が認められた。
〔実施例５〕  化合物ｔ−Ｂｕｔ−ＯＣＯ−Ｔｈｒ＊−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ−Ｂｚｌの合成
図７〜図１２に示す合成経路に従って、ｔ−Ｂｕｔ−ＯＣＯ−Ｔｈｒ＊−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ−Ｂｚｌ〔式中「＊」は、ＴｈｒとＬｅｕとの間のペプチド結合「−ＣＯ−ＮＨ−」がドロキシエチレン基「−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−」に置き換えられていること及びＴｈｒのヒドロキシル基がｔ−ブチルエーテル化されていることを示す。〕を以下のようにして合成した。該化合物において、該ヒドロキシエチレン基のα炭素周りの立体配置落としてはＲ型、Ｓ型の双方を合成した。それらの化合物の構造式のうち、Ｒ型のものを式（１ａ）に示す。
2003091278.tif 000007
アルデヒド３’の合成：
２’のＤＣＨＡ塩（４９．５ｇ，１００．８８ｍｍｏｌ）（Ｂａｃｈｅｍ１２３４００）を酢酸エチル（５００ｍｌ）に溶解、２０％クエン酸水溶液（５００ｍｌ）で脱塩、有機層を水洗（３回）、飽和食塩水で洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥、乾燥剤を濾去後、濃縮して油状物を得た。これを、脱水ＴＨＦ（５００ｍｌ）に溶解、−１５℃に冷却し、クロロ炭酸イソブチル（１５．７ｍｌ，１２１ｍｍｏｌ）を滴下した。−１５℃で１０分間攪拌後、ＮａＢＨ４を加え、−１５℃で１０分攪拌し、その後−５０℃に冷却してメタノール（５００ｍｌ）を滴下した。１Ｎ塩酸（２００ｍｌ）を滴下後、室温に戻るに任せて３０分間攪拌した。溶媒を留去後、酢酸エチルで抽出し、０．２Ｎ塩酸、水で３回、飽和食塩水で順次洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を留去してアルコール体を得た（３９ｇ）。アルコール体３９ｇを３回に分けて、１３ｇずつ酸化反応に付した。すなわち、Ｚ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ｏｌ（１３ｇ，３３ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解、留去を２回行なった後、脱水ＤＭＳＯ（１２０ｍｌ）に溶解、トリエチルアミン（１３．９ｍｌ，１００ｍｍｏｌ）を加えて１５℃の水浴で冷却した。別のフラスコにて三酸化硫黄ピリジン錯体（１５．９ｇ，１００ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７０ｍｌ）に溶解してＺ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ｏｌ溶液に二分間で滴下した。１５℃水浴で８分攪拌し、氷水中へ投入して反応終了し、酢酸エチルで抽出した。残りのアルコール体も同様に反応に付し、酢酸エチル抽出液を全て合わせて、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮後、シリカゲルカラム（ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘ＝１／４）で精製して目的のアルデヒド（３’）を得た。収量２４．１ｇ（カルボン酸から８１％）。
エポキシ化物（４’）の合成：
アルデヒド（３’）を半量ずつ、２回に分けて反応に付した。水素化ナトリウム（６２．６％ｉｎ  Ｏｉｌ）１．９ｇにＤＭＳＯ（脱水、２００ｍｌ）を加え５０℃に加温し、１時間攪拌した。生成したジムシルアニオン溶液にＴＨＦ（脱水、２００ｍｌ）を加えて氷冷し、これに（ＣＨ３）Ｓｌ（１０ｇ，４９ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（５０ｍｌ）溶液を滴下し（滴下２０秒）、滴下開始から１分後、Ｚ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｈ（１２．０ｇ，４０．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５１０ｍｌ）溶液を滴下した（滴下１分）。滴下終了後、室温（２０℃）にて１時間攪拌し、冷水１５００ｍｌ中に投入して反応終了した。酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮して１０ｇの粗精製物を得た。同様に２回目の反応をして、１０ｇの粗精製品を得、反応２回分を合わせて、シリカゲルカラム（ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘ＝１／２）で精製、更に再度シリカゲルカラム（ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘ＝１／４）精製をして目的のエポキシ化物（４’）を得た。６．３ｇ（２５％）。
化合物（５’）の合成：
エポキシ化合物（４’）（６．３ｇ，２０．５ｍｍｏｌ）を脱水エタノール（１０ｍｌ）に溶解し、マロン酸ジエチル（３．８ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）を加えて、氷冷した。氷冷下、２０％ＮａＯＥｔ（９．６ｍｌ，２４．５ｍｍｏｌ）を滴下し、３時間攪拌後、１０％クエン酸水を加えて酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水、次いで飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、濃縮し、シリカゲルカラム（ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘ＝１／２）で精製して（５’）を得た。収量７．６６ｇ（８９％）。
化合物（６’）の合成：
エチルエステル５’（７．３８ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）をメタノール（３５ｍｌ）に溶解し、氷冷下１Ｎ  ＮａＯＨ（３５ｍｌ）を滴下した。室温にて２時間攪拌後、２０％クエン酸水溶液に投入し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。これをトルエン（５０ｍｌ）に溶解してオイルバス上で９０℃に加熱し、６時間後にトルエンを減圧留去し、シリカゲルカラム（ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘ＝１／２）で精製して化合物（６’）を得た。収量０．９５ｇ（エチルエステルから１５．５％）。
化合物（７’）の合成：
ラクトン化合物（６’）（０．９５Ｇ，２．７２ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解し、−７８℃に冷却、１．１Ｎ  ＬｉＨＭＤＳ（５．４ｍｌ）を滴下し、−７８℃で３０分攪拌後、３ブロモ２メチルプロペン（５５０μｌ，５．４５ｍｍｏｌ）を加えて−７８℃で４０分攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応終了し、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、シリカゲルカラムで精製して、目的アルケン（７’）を０．２９ｇ原料回収を０．１７ｇ得た。回収原料を同様の当量数で再度反応し、後処理、精製して、１回目と合わせた。収量０．３７ｇ（３４％）
化合物（８’）の合成：
アルケン（７’）（０．３７ｇ，０．９２ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、５％Ｐｄ−Ｃを加えて水素を導入して接触還元を行なった。４時間後、窒素を導入して反応終了させた。触媒を濾去し濃縮後、メタノール（２０ｍｌ）に溶解させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（２５６μｌ，１．８４ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ２Ｏ（４００ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）の順に加えて室温で終夜攪拌した。濃縮後シリカゲルカラム（ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘ＝１／４）で精製して目的物（８’）を得た。収量０．４８ｇ。
化合物（９’）、（１０’、１’ｂ、１１’、１’ａ）の合成：
ラクトン（８’）をメタノール中、水酸化ナトリウムでケン化した。これを酸析、抽出後、ＤＭＦ中でアルキルシリルクロリド、イミダゾール、ＤＭＡＰでシリルエーテル化、シリカゲルカラムで精製してカルボン酸（９’）を得た。カルボン酸（９’）と、アミノ成分（ジペプチドＨ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨＢｚｌ）を、ＤＭＦ溶媒中でＥＤＣとＨＯＢｔを用いて縮合させ、反応終了後、抽出、洗浄等の後処理を行ないシリカゲルカラムで精製して（１０’）を得た。シリルエーテル（１０）をＴＨＦ溶媒中、ＴＢＡＦ処理を行なった。反応終了後、濃縮、シリカゲルカラムとＯＤＳ−ＨＰＬＣを組み合わせて精製し（１’ｂ：ＴＬＶＭ−２）を得た。これを、ＤＭＳＯ溶媒中、三酸化硫黄ピリジン錯体とトリエチルアミンを用いてＳｗｅｒｎ酸化に付した。抽出等の後処理の後、副生した硫酸エステル等をＯＤＳ−ＨＰＬＣ分取により除去して、ケトン化合物（１１’）が得られた。このケトン（１１’）をメタノールに溶解させ、ＮａＢＨ４で還元してアルコール体とした。この還元反応で、（１’ａ）と（１’ｂ）の混合物が得られるが、ＯＤＳ−ＨＰＬＣで容易に分離可能であったので、ＨＰＬＣ分取を行ない精製して（１’ａ：ＴＬＶＭ−２）を得た。
なお、このものについて保護基の脱離とＺ基による置換を経て、あるいは、合成途中の適宜の段階でｔ−ブトキシカルボニル基をＺ基に交換しておいて同様に合成を進めた後、ｔ−ブチル基を外すことによって、次の化合物も得られる。
2003091278.tif 000008
〔実施例６〕  阻害活性の測定−３
上記で得られた化合物（１’ａ）及び（１’ｂ）について、実施例３と同様の方法により阻害活性の測定を行った。但し、評価系としては、スウェーデン変異を導入したヒトＡＰＰ６９５遺伝子をヒト由来神経系細胞株ＩＭＲ３２に導入したものを用いた。結果を表５に示す。
2003091278.tif 000009
産業上の利用可能性
本発明はアルツハイマー病およびその類縁疾患の病態に関する新規なペプチド模倣化合物を提供するものであり、この特性を利用した新規医薬組成物、診断手段の提供は本化合物が関与する疾患、特にアルツハイマー病およびその類縁疾患の臨床、異様領域において有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、合成経路を示すフローチャートの最初の一部を示す。
図２は、図１に続くフローチャートの一部を示す。
図３は、図２に続くフローチャートの一部を示す。
図４は、図３に続くフローチャートの一部を示す。
図５は、図２に続くフローチャートの最後の一部を示す。
図６は、化合物５の合成ステップを示す。
図７は、別の化合物の合成経路を示すフローチャートの最初の一部を示す。
図８は、図７に続くフローチャートの一部を示す。
図９は、図８に続くフローチャートの一部を示す。
図１０は、図９に続くフローチャートの一部を示す。
図１１は、図１０に続くフローチャートの一部を示す。
図１２は、図１１に続くフローチャートの最後の一部を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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