(57)【要約】本発明は、有機化合物をグラフト鎖として有するゼラチン誘導体および該ゼラチン誘導体を含む高分子ミセルに関する。有機化合物として、コハク酸、エチレンジアミン等の低分子化合物や、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸等の高分子化合物が使用できる。該高分子ミセルは、これに薬剤等を担持させることにより、除放性の制御やターゲッティング性に優れた医薬組成物となる。また、該ゼラチン誘導体は、これを架橋することにより、優れた癒着防止膜となる。
2003091283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチン分子の官能基に有機化合物が共有結合したゼラチン誘導体。
【請求項２】
有機化合物が親水性高分子である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項３】
有機化合物が生分解性ポリエステルである請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項４】
有機化合物がポリアルキレングリコール誘導体である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項５】
有機化合物がポリ乳酸誘導体である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項６】
有機化合物が下式（１）：
2003091283.tif 000008
（式中、Ｒは、炭素数１〜２４の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基もしくはアルケニル基であり、ＯＡは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。また、ａとｂとはそれぞれオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、０≦ａ≦２００、４≦ｂ≦２０００、かつａ／（ａ＋ｂ）≦０．５を満足する数である。また、Ｚは、ＯまたはＯＣ（Ｏ）であり、ｍは０〜３である）で表されるポリエチレングリコール誘導体である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項７】
有機化合物が、アルキルジアミン、アルキルジオール、アルキルジカルボン酸、アミノアルキルアルコールあるいはアミノアルキルカルボン酸から選ばれる１種以上の有機化合物と下式（１）：
2003091283.tif 000009
（式中、Ｒは、炭素数１〜２４の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基もしくはアルケニル基であり、ＯＡは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。また、ａとｂとはそれぞれオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、０≦ａ≦２００、４≦ｂ≦２０００、かつａ／（ａ＋ｂ）≦０．５を満足する数である。また、Ｚは、ＯまたはＯＣ（Ｏ）であり、ｍは０〜３である）で表されるポリエチレングリコール誘導体である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項８】
有機化合物が、コハク酸および下式（１）：
2003091283.tif 000010
（式中、Ｒは、炭素数１〜２４の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基もしくはアルケニル基であり、ＯＡは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。また、ａとｂとはそれぞれオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、０≦ａ≦２００、４≦ｂ≦２０００、かつａ／（ａ＋ｂ）≦０．５を満足する数である。また、Ｚは、ＯまたはＯＣ（Ｏ）であり、ｍは０〜３である）で表されるポリエチレングリコール誘導体である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項９】
有機化合物が、エチレンジアミンおよび下式（１）：
2003091283.tif 000011
（式中、Ｒは、炭素数１〜２４の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基もしくはアルケニル基であり、ＯＡは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。また、ａとｂとはそれぞれオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、０≦ａ≦２００、４≦ｂ≦２０００、かつａ／（ａ＋ｂ）≦０．５を満足する数である。また、Ｚは、ＯまたはＯＣ（Ｏ）であり、ｍは０〜３である）で表されるポリエチレングリコール誘導体である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項１０】
有機化合物が、ポリ乳酸誘導体および下式（１）：
2003091283.tif 000012
（式中、Ｒは、炭素数１〜２４の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基もしくはアルケニル基であり、ＯＡは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。また、ａとｂとはそれぞれオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、０≦ａ≦２００、４≦ｂ≦２０００、かつａ／（ａ＋ｂ）≦０．５を満足する数である。また、Ｚは、ＯまたはＯＣ（Ｏ）であり、ｍは０〜３である）で表されるポリエチレングリコール誘導体である請求項１記載のゼラチン誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のゼラチン誘導体を含むことを特徴とする高分子ミセル。
【請求項１２】
粒径が１０〜１０００ｎｍであることを特徴とする請求項１１に記載の高分子ミセル。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の高分子ミセルに第２成分物質を担持させた高分子ミセル複合体。
【請求項１４】
第２成分物質が薬物である請求項１３記載の高分子ミセル複合体。
【請求項１５】
第２成分物質が細胞増殖因子である請求項１３記載の高分子ミセル複合体
【請求項１６】
請求項１４または１５記載の高分子ミセル複合体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１または請求項６記載のゼラチン誘導体を含むことを特徴とする癒着防止膜。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ゼラチン誘導体、該誘導体からなる高分子ミセル、該ミセルに第２成分物質を担持した高分子ミセル複合体および該高分子ミセル複合体を含む医薬品組成物に関する。
背景技術
薬物が効くのは、口から服用または注射された薬物分子が、体内のある特定の細胞に到達し、細胞に刺激を与えるためである。しかし、実際には、投与された薬物のほんの一部しか作用部位に到達できず、ほとんどは何もしないままに排泄されるか、または、しばしば正常細胞に作用し副作用の原因となる。
そこで、必要な量の薬物を必要な細胞のみに必要なときだけ送り込むことができれば理想的である。これを目的として、種々の材料を利用することによって薬効をコントロールする研究分野が薬物送達システム（ＤＤＳ）であり、これまで様々なアプローチによる研究開発が行われてきている。
ＤＤＳの目的は、ある一定期間にわたって薬物を一定速度で放出させていくこと（徐放化）、生体内半減期が短い薬物を長寿命化すること、皮膚の角質や粘膜組織からの薬物の吸収を促進すること、あるいは目的とする標的細胞のみをねらい打ちする薬物ターゲッティングである。この中でもっとも古くから広範囲な試みがあるのが薬物の徐放である。
たとえば、ポリ乳酸系の担体等、生体吸収性高分子化合物のハイドロゲルからの薬物の徐放化が研究されている（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００２，４３，３−１２）。２つ目の目的には水溶性高分子、あるいはＰＥＧなどによる薬物の修飾（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，２００２  Ｊａｎ，５７（１），５−２９）あるいはＰＥＧ化リポソームなどを利用した報告（特開平１１−１７１７７１号公報、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９８  Ｍａｒ，５６（３），６３２−６３７）があり、薬物ターゲティングには、高分子を用いたもの、抗体を用いたもの、リポソームを用いたもの（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１９８７，３（３），２３３−２６１）等が試みられている。
ハイドロゲルを用いた薬物の徐放化では、通常、ハイドロゲル内の水相中での薬物の自己拡散により、その徐放化が制御されているため、薬物の分子サイズ、あるいはその水溶性にも依存するが、徐放パターンのコントロールが難しく、例えば、水溶性薬物では３日以上の徐放化はきわめて困難である。このような拡散律速の薬物徐放システムでは、その徐放化担体であるハイドロゲルが注射可能な小さいサイズの場合には、ハイドロゲル担体の体積あたりの表面積が大きく、短い期間で薬物が放出されてしまい、薬物の徐放化はより難しく、静脈内投与に適用できるナノメートルオーダーのサイズをもつハイドロゲル担体からの薬物の徐放化は事実上不可能であった。
ハイドロゲルからの水溶性薬物、例えば、タンパク質、遺伝子などの徐放に対しては、これらの薬物をゲル内部に物理的に固定化し、ゲル担体の分解に伴う薬物の水可溶化によって徐放を達成できることが報告され、その徐放化を３日以上にわたって可能となっている（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，１９９８  Ｍａｙ  ４，３１（３），２８７−３０１）。また、このシステムにおいては、油中でハイドロゲル構成高分子水溶液を分散させ、ハイドロゲル微粒子を作製する方法により、そのサイズを数十マイクロメートルにまで下げることにも成功している。しかしながら、これらのハイドロゲルを作製する分散法では、そのサイズは数マイクロメートルが限界であった。また、たとえそれらの微粒子が得られたとしてもハイドロゲル同士が凝集するというような問題点があった。
リポソームでは、サイズと凝集の問題は解決できるが体内での安定性が低く、徐放期間のコントロールが困難であった。
また、疎水性ポリアミノ酸と親水性高分子との共重合体からなる高分子ミセルを使用する方法（特許公報２７７７５３０）が報告されている。これもサイズと凝集の問題は解決されるが、高分子ミセルからの薬物の徐放化が、ミセル中に包含されている薬物の拡散によっているため、薬物の徐放性のコントロールに問題点があった。
発明の開示
本発明者らは、ナノメートルオーダーのサイズをもち、お互いに凝集することなく、また、薬物の徐放性をコントロールできるシステムを創製するために鋭意検討した結果、種々の薬物と相互作用ができ、生体内分解性のゼラチンを利用して、それに誘導体化を行うことによって安定な高分子ミセルを形成し、またこのミセルに薬物等の第２成分物質を担持させることによってさらに安定な高分子ミセル複合体を形成し、上記問題点を解決する薬物の担体として有用であるとの知見から本件発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ゼラチン分子のアミノ基、水酸基、カルボキシル基などの官能基に、有機化合物を共有結合させて誘導体化したゼラチン誘導体、該誘導体からなり、好ましくは粒径が１０〜１０００ｎｍであることを特徴とする高分子ミセル、および該ミセルに第２成分物質を担持した高分子ミセル複合体さらには該高分子ミセル複合体を含む医薬品組成物に関する。
ゼラチン分子の誘導体化に用いる有機化合物としては、ゼラチンのアミノ基、水酸基あるいはカルボキシル基などの官能基と共有結合させることができる有機化合物であれば、その分子量、親水性、疎水性、荷電、非荷電に関係なく、任意のものが使用され得る。これらの有機化合物をゼラチンのアミノ基、水酸基あるいはカルボキシル基などの官能基と共有結合させることにより、ゼラチン誘導体を作製する。
ゼラチンの誘導体化に用いる有機化合物としては、低分子あるいは高分子量の有機化合物を用いることができる。
低分子有機化合物としては、分子量５００以下のものが好ましく、炭素数が１〜２４のアルカン、アルケン、アルキン残基を導入するため、これらの１，２，３級の水酸基、１，２，３級のアミノ基、カルボキシル基、硫酸基、リン酸基、チオール基、酸アミド基、芳香族基、および複素環などを含む誘導体があげられ、たとえば、無水コハク酸、コハク酸、炭素数が１〜２４で片末端あるいは両末端にハロゲン、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基をもつアルカン、アルケン、アルキンあるいはこれらのベンゼン誘導体、具体的には、塩化もしくは臭化アルカン（例えば、塩化エチル、臭化エチル、塩化オクチル、塩化ヘキシル、塩化イソブチルなど）、アルキルアルコール（例えば、プロピルアルコール、オクチルアルコール、イソブチルアルコールなど）、アルキルアミン（例えば、エチルアミン、プロピルアミン、イソブチルアミンなど）、アルキルジアミン（例えば、エチレンジアミン、プロパンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、スペルミン、スペルミジンなど）、アルキルジオール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールなど）、アミノアルキルアルコール（例えば、３−アミノ−１−プロパノール）、アルキルカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸）、塩化もしくは臭化アルキルカルボン酸（例えば、クロロ酢酸）、アミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノ酢酸、アミノ酪酸）、水酸化アルキルカルボン酸（例えば、グリコール酸）、アルキルジカルボン酸（例えば、エチレンジカルボン酸）、アルキルリン酸（例えば、トリエチルリン酸）、塩化もしくは臭化アルキルリン酸、アミノアルキルリン酸等が含まれる。
高分子有機化合物としては、あらゆる種類の合成高分子化合物および天然高分子化合物およびその上述のような誘導体が含まれる。
ゼラチンの誘導体化に利用される合成高分子化合物としては、たとえば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びこれらの共重合体）、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリアリルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、生分解性ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリε−カプロラクトン、サクシネート系重合体、ポリヒドロキシアルカノエート）、ポリグリコール酸、ポリリンゴ酸、ポリジオキサノンおよび、ポリアミノ酸などの低分子、オリゴマー及び合成高分子およびそれらの誘導体が挙げられる。またこのうち、ポリアミノ酸としてはポリαグルタミン酸、ポリγグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリセリン等の酸性、塩基性、非荷電親水性および疎水性アミノ酸単独重合体及び共重合体が挙げられる。サクシネート系重合体として、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネートアジペート等が挙げられ、ポリヒドロキシアルカノエートとして、ポリヒドロキシプロピオナート、ポリヒドロキシブチラート、ポリヒドロキシパリラート等が挙げられる。
ゼラチンの誘導体化に利用される天然高分子化合物としては、たんぱく質、多糖、核酸などが挙げられ、それらの誘導体、あるいは上記合成高分子化合物との共重合体も含まれる。多糖としては、デキストラン、プルラン、マンナン、カードラン、キサンタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、アガロース等が挙げられる。
高分子化合物の分子量は特に限定されるものではないが、たとえば分子量５００〜１００万、好ましくは、１０００〜１０万のものが使用できる。
また、ゼラチン誘導体は、上述の低分子化合物および高分子化合物の１種類のみだけではなく、２種類以上をその導入率、混合比に関係なく、ゼラチンと共有結合させたものも含まれる。たとえば、コハク酸又はエチレンジアミン等の低分子化合物およびＰＥＧ誘導体等の高分子化合物の両方をゼラチンと共有結合することもできるし、ポリ乳酸等の疎水性高分子とＰＥＧ誘導体等の高分子化合物の両方をゼラチンと共有結合することもできる。この場合のポリ乳酸とＰＥＧ誘導体のゼラチンへの共有結合の比率は担持すべき第２成分物質により適宜選択され得る。また、ゼラチンの誘導体化に使用される有機化合物の種類も、担持すべき第２成分物質により適宜選択され得る。
特に好ましい高分子化合物に由来する残基としては、化学反応様式がわかりやすく、合成物のキャラクタリゼーションが容易であることから、片末端のみに反応性官能基を持つＰＥＧからのものであり、その化学構造が下式（１）：
2003091283.tif 000003
（式中、Ｒは、炭素数１〜２４の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基もしくはアルケニル基であり、ＯＡは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。また、ａとｂとはそれぞれオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、０≦ａ≦２００、４≦ｂ≦２０００、かつａ／（ａ＋ｂ）≦０．５を満足する数である。また、Ｚは、ＯまたはＯＣ（Ｏ）であり、ｍは０〜３である）で表されるポリエチレングリコール誘導体である。
式（１）中、Ｒは、好ましくは炭素数１〜１２、さらに好ましくは炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基またはアルケニル基である。
Ｒは、たとえば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、イソステアリル基等のアルキル基、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基等のアルケニル基が挙げられ、これらの１種または２種以上を用いてよい。
ＯＡのオキシアルキレン基としては、オキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基があげられる。
ａは、好ましくは０〜２００、より好ましくは０〜１００、最も好ましくは０〜５０であり、ｂは、好ましくは４〜２０００、より好ましくは１０〜１０００、最も好ましくは５０〜２００である。ａ／（ａ＋ｂ）は、好ましくは０〜０．５、より好ましくは０〜０．３、最も好ましくは０〜０．１である。ａ／（ａ＋ｂ）が０．５を超えると親水性が低下する。
ｍは、好ましくは１〜３である。
Ｚは、好ましくはＯＣ（Ｏ）である。
ポリ乳酸の合成に用いる乳酸はＤ−乳酸、Ｌ−乳酸、またはＤ−乳酸とＬ−乳酸の混合物のいずれでもよく、原料として乳酸の二量体であるラクチドを用いることもできる。これらの重合法としては縮合重合法、開環重合法など、公知のいずれの方法を採用することも可能である。
ゼラチンとしては、その出発原料であるコラーゲンのタイプあるいはコラーゲンの由来動物および採取体内部位などに関係なく、またヒト遺伝子組み替え型のものなどあらゆる種類の任意のゼラチンが使用できる。たとえば、等電点約５のアルカリ処理ゼラチン、等電点約９の酸処理ゼラチン等が挙げられる。
本発明のゼラチン誘導体として特に好ましいのは、ゼラチン分子のアミノ基、水酸基の一部または全てに、前記式（１）で示されるグラフト鎖を有するゼラチン誘導体である。
前記式（１）で示される片末端のみに反応性官能基を持つＰＥＧは公知の方法を用いてゼラチンにグラフトすることが可能である。
ゼラチン分子への有機化合物の共有結合による導入率は、包含したい第２成分物質のゼラチン誘導体との親和性によって異なるが、ゼラチン分子のアミノ基、水酸基、カルボキシル基等の全官能基の５〜１００％が好ましく、より好ましくは５０〜８０％である。特に好ましくは、ゼラチン分子の全アミノ基の少なくとも５０％以上、最も好ましくは８０％以上に有機化合物を導入する。
本発明における高分子ミセルは、上記したゼラチン誘導体を含む分子集合体およびゼラチン誘導体と第２成分物質との相互作用によって形成される分子集合体の両方を意味し、後者のみを意味する場合は、高分子ミセル複合体という。
該ゼラチン誘導体を含む高分子ミセルは、たとえば１０〜１０００ｎｍ、好ましくは２０〜５００ｎｍ、特に好ましくは２０〜３００ｎｍの平均粒子径を有する。
本発明のミセルは、非常に小さいＣＭＣを有することから、体内に投与したのち急速に希釈されるｉｎ  ｖｉｖｏ静脈内投与においても血液中で安定なミセルを形成していると考えられる。また、平均粒子径が小さいことから、従来のμｍオーダーの粒子と異なり、血管内投与後の細網内皮系による血中からの取り込み除去あるいは血管の塞栓を回避できることや、経気管内投与後の肺の深部までミセルが到達すると、また極めて微量の溶液で治療に充分な薬物量を投与することが可能と考えられる。
本発明は、ゼラチン誘導体を含む高分子ミセルに第２成分物質を担持させた高分子ミセル複合体にも関する。この高分子ミセル複合体では、ゼラチンと内包される物質とが安定な相互作用を行っていることから、通常の水溶液中では複合体からの物質の放出は起こらないが、例えば、酵素などによるゼラチンの分解により複合体が崩壊する場合には、崩壊とともに物質が複合体から放出される。この機構により、凝集もない、ナノメートルオーダーの大きさを持つ複合体担体から物質の徐放化が達成される。
本発明で使用される第２成分物質としては薬物をはじめ、金属、セラミックス、有機化合物等の薬効を有するものや標識化合物となるものなどのいずれのものもその適用となる。
本発明の高分子ミセルの構造は、ゼラチン誘導体の組成、第２成分物質の種類によっても異なるが、コアにゼラチン部分、シェルにゼラチンに共有結合した誘導体部分、または、逆に、シェルにゼラチン部分、コアにゼラチンに共有結合した誘導体部分となる。前者の場合には、第２成分物質とゼラチンとの相互作用により高分子ミセルはさらに安定化される。また、後者の構造をとるのは、例えば、疎水性化合物によりゼラチンの誘導体化を行った場合であり、内部に疎水性化合物の会合によるコアができ、シェル部分にゼラチン部分が露出したような構造をとる。この場合には、ゼラチンに相互作用する物質を高分子ミセル表層にもつ高分子ミセルができる。また、後者の場合には、高分子ミセル内に疎水性物質を内包することができ、これは、難水溶性物質の可溶化法として有効である。
加えて、ミセル内に薬物を包含させることで、酸や酵素による加水分解から薬物を守ることが可能となる。この特性は、経口投与時における腸溶性コーティング剤として利用できる。すなわち本ミセルシステムは薬物のエマルジョンタイプの腸溶性コーティング技術を実現する。また、ミセル内に物質を内包することによる物質の安定化は美白剤、ＵＶカット剤などの化粧品添加物質に対しても有用である。
第２成分物質として考えられる薬物には、低分子から高分子量の薬物で、親水性、疎水性、電荷、非電荷に関係なくあらゆる種類の薬物が含まれる。例えば、アドレアマイシン、パクリタキセル、カンプトテシン、ダウノマイシン、マイトマイシンＣ、メソトレキセート、シスプラチン等の抗癌剤、インドメタシン等の鎮痛消炎剤、中枢神経系用薬、抹消神経系用薬、アレルギー用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、代謝性医薬品、抗生物質、化学療法剤、インシュリン、カルシトニン、ＬＨＲＨなどのペプチド薬物、ケモカイン、サイトカイン、細胞増殖因子、インターフェロン、インターロイキンなどのタンパク質薬物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセスＤＮＡ、デコイ遺伝子などの核酸薬物等が挙げられる。
細胞増殖因子には、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）−β１、ＶＥＧＦ（内皮細胞増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）など一般に細胞増殖因子と呼ばれているもの、あるいは血管内皮細胞、平滑筋細胞などの血管を構成する細胞またはその周辺細胞を増殖させる活性を持つ物質、たとえばインターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、生理活性ペプチド類などが含まれる。
また、薬物以外の第２成分としては、化粧品添加物、金属、無機化合物なども含まれる。金属としてはガドリニウム、マグネシウム、チタン、プラチナ、銅、亜鉛等が挙げられる。
また、無機化合物としては、特に限定されることはないが、例えばハイドロキシアパタイト、αあるいはβ−リン酸３カルシウム、燐酸カルシウム等のセラミックスおよび遷移元素、典型元素からなる化合物が挙げられる。
化粧品添加物質としては、特に限定されることはないが、例えば、肌美白剤、紫外線吸収物質、無機物質などとして化粧品に添加される物質、あるいは美白、紫外線カットなどの性質を化粧品に付加する物質などがこれに含まれる。
また、第２成分物質の有機化合物としては特に限定はないが、フラーレン、カーボンナノチューブ、およびそれらの誘導体、その他の元素との化合物など、あるいは有機色素化合物、有機蛍光化合物、放射性同位体等の標識化合物が挙げられる。
本発明は、上記高分子ミセル複合体を含む医薬組成物、診断薬組成物、薬物伝達システムも包含する。高分子ミセルに包含される第２成分物質により、各種の医薬組成物等が製造できる。
本発明の医薬組成物は、慣用の賦形液、添加剤等を含み得、液剤、シロップ剤、注射剤等の形態であり得る。また、本発明の医薬組成物は、経口、経皮、経肺、経粘膜、皮下、皮内、筋肉内、静脈内等により投与し得る。
さらに、本発明は、上記ゼラチン誘導体を含む癒着防止膜を含む。癒着防止膜は、例えば、ゼラチン誘導体をゲル化させることにより、あるいはゼラチン誘導体をゲル化させた後、加熱やグルタルアルデヒドなどの架橋剤等により架橋することによって調製することができるが、好ましくは後者である。また、他の膜材料の表面に上記ゼラチン誘導体をコーティングあるいはラミネートさせることにより、膜材料に癒着防止作用を付加することも可能である。炎症性細胞であるマクロファージなどの付着を抑制する性質もあることから、それ自身の膜あるいは上述のように他の膜と組み合わせて用いることにより、異物作用や炎症作用を起こさない生体適合性材料として利用でき、あるいは材料に生体適合性を付与するための基材としての利用も可能である。
癒着防止膜には、必要により、血液凝固を制御するフィブリノーゲン、フィブリン、トラシロール、アプロチニン、トロンビンなどの止血用薬剤、組織プラスミノーゲンアクチベータやプラスミノーゲンアクチベータ類似物、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼなどの繊維素溶解酵素類、トロンビンインヒビター、キマーゼ阻害剤など術後癒着を防止するための薬剤や五単糖、構造体の物性を制御するためのデルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸などのグリコサミノグリカン類、酸性酸化セルロース、アルギン酸などの天然高分子類、ポリグリコール酸，ポリラクチド、ポリペプチドなどの生体内吸収性合成高分子類、カルシウムチャンネル遮断薬、術後の炎症や疼痛を低減するハイドロコルチゾン、酪酸クロベタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾンなどのステロイド類やアスピリン、インドメタシン、スリンダク、ジクロフェナク、フェンブフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ピロキシカム、メフェナム酸、チアラミドなどの非ステロイド系抗炎症剤、創傷治癒を早める表皮由来の成長因子、血小板由来成長因子等を加えることができる。
発明を実施するための最良の形態
本発明のゼラチン誘導体は、たとえば、適当な溶媒に溶解したゼラチンに、適当な溶媒に溶解した有機化合物もしくは有機化合物誘導体またはそれらの活性化誘導体を化学反応させることにより製造することができる。
誘導体作製に利用される化学結合反応は、一般の有機化学で知られているあらゆる公知の反応方法が利用できるが、ゼラチンの分子鎖の切断が生じるような過激な反応条件は避けられるべきである。例えば、たんぱく質の化学修飾反応に用いられているような緩和な反応（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ．１９９６）を用いることが好ましい。
例えば、親水性の高分子化合物の１つであるＰＥＧをゼラチンのアミノ基に化学結合させる場合には、アミノ基に対する反応性を有する活性化誘導体を用いるか、または、縮合剤を使用するカップリング反応で行うことが好ましい。活性化誘導体としては、活性化エステル体、カルボジイミダゾール誘導体、酸無水物誘導体、酸塩化物誘導体、アルデヒド誘導体等が挙げられる。
アミノ基以外のゼラチン分子の官能基、たとえば、水酸基またはカルボキシル基の誘導体化は、アミノ基の場合と同様な方法または同業者にとって自明な方法を用いて実施することができる。
アミノ基を誘導体化する親水性高分子化合物の活性化誘導体として、好ましくは下式（２）：
2003091283.tif 000004
（式中、Ｒは、式（１）と同じであり、ｎは、４〜２０００、好ましくは２０〜１０００、より好ましくは４０〜５００である）で示されるＰＥＧのスクシンイミジルスクシネート誘導体等が挙げられる。
ゼラチンまたは親水性高分子化合物もしくはその活性化誘導体を溶解する溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水などが挙げられる。
生分解性ポリエステル、例えばポリ乳酸誘導体のゼラチンへの導入方法は、以下の方法で行なうことができる。
乳酸のゼラチンへのグラフト化法は乳酸やラクチドを直接付加重合しながらグラフトしていく方法、ポリ乳酸を重合した後グラフトする方法のいずれの方法でも良いが、本発明のゼラチン誘導体では第２成分によってグラフト化率を適宜変更する可能性があるため、グラフト化率の制御のしやすさから、重合したポリ乳酸をグラフトする方法が好ましい。また、ポリ乳酸をゼラチンにグラフト化する方法はゼラチンの分子鎖の切断が生じるような過激な反応条件を避ければ、公知のいずれの方法を用いても良い。例えばポリ乳酸の水酸基を公知の方法でゼラチンのアミノ基、カルボキシル基、水酸基と反応し得る形態に変換する方法や、あついはポリ乳酸の水酸基とゼラチンのカルボキシル基とを公知の方法により縮合する方法などを用いることができる。
ゼラチンの誘導体化反応は、０〜５０℃、好ましくは０〜３０℃の温度で１〜１２時間、好ましくは２〜６時間行われる。
誘導体化反応における有機化合物の使用量は、ゼラチン分子鎖中の反応すべき官能基（たとえば、水酸基、アミノ基またはカルボキシル基）に対して、０．１〜５０倍モル、好ましくは０．５〜１０倍モル、より好ましくは０．５〜２倍モルである。この量比を調節することにより、あるいは反応温度、反応時間、ゼラチン濃度などを変化することにより、ゼラチンの誘導体化反応、すなわちゼラチンへの有機化合物のグラフト化率をコントロールできる。
本発明のゼラチン誘導体は、誘導体化すべきゼラチンの官能基の全部または一部が有機化合物で誘導体化されたものであるが、その誘導体化率は、第２成分物質の種類によって異なり、高分子ミセルの形成が生じる適度なもの、または疎水性の薬剤等の第２物質成分の可溶化が生じる適度なものから選ばれる。
本発明の高分子ミセルは、たとえば、水中に臨界ミセル形成濃度（ＣＭＣ）の上記ゼラチン誘導体を分散することにより製造することができる。あるいは、本発明の高分子ミセルは、ＣＭＣのゼラチン誘導体を有機溶媒に溶解後、水に対して透析することによっても製造することができる。
ゼラチンを水中に分散させる方法としては、加温処理、超音波処理等が挙げられ、これらは単独であるいは組み合わせて用いられる。加温処理は２０〜１００℃の範囲で１分〜１２時間行う。超音波処理は１〜２００Ｗの範囲で１秒〜２時間行う。
ＣＭＣの測定は、後述する実施例に記載のように、常法により測定することができる。
本発明のミセルは、使用するゼラチン、誘導体化する有機化合物の種類、誘導体化の割合等によって、種々の平均粒子径を有しえるが、たとえば１０〜１０００ｎｍ、好ましくは２０〜５００ｎｍ、さらに好ましくは２０〜３００ｎｍの平均粒子径を有する。
粒子径の測定は、後述する実施例に記載のように、動的光散乱装置等を用いた常法により測定することができる。
本発明の高分子ミセル複合体は、上記の高分子ミセルに薬物等の第２成分物質を担持させることによって製造できる。
薬物等の第２成分物質の担持方法には、たとえば、凍結乾燥したゼラチン誘導体に第２成分物質を含浸させた後、上記と同様にしてミセル溶液を調製して、ミセルに第２成分物質を担持する方法、あるいは、上記と同様にしてゼラチン誘導体と第２成分物質を含む溶液を加温処理、超音波照射処理する方法などがある。
また、ゼラチン誘導体からなる高分子ミセル溶液を凍結乾燥した後、第２成分物質の水溶液を加え、放置しておくことによって、ゼラチン誘導体と第２成分物質とからなる高分子ミセル複合体を得ることができる。
本発明の医薬組成物は、上記高分子ミセルから製造することができ、必要により慣用の賦形剤、添加剤等を混合できる。
本発明の医薬組成物は、薬物等の徐放化、薬物等の長寿命化、薬物等の皮膚や粘膜組織からの吸収、薬物等の標的細胞へのターゲッティング、難水溶性薬物等の可溶化により、優れた効果を奏する。
本発明の癒着防止膜は、前記ゼラチン誘導体から、たとえば、これを架橋することにより製造することができ、腹腔や子宮漿膜等の術後の癒着を防止するために効果的に使用できる。
実施例
以下、実施例により、更に具体的に本発明について述べるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ＰＥＧでグラフト化されたゼラチン誘導体の調製
〔実験方法〕
ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製；牛骨由来；分子量１０００００；等電点５）を濃度が１０％（ｗ／ｗ）となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。また、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ（日本油脂株式会社製；分子量５３３０）をＤＭＳＯに溶解した。ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳの濃度はゼラチンに存在するアミノ基の２倍モル量とした。また、ＤＭＳＯはあらかじめモレキュラーシーブ３Ａを用いて脱水したものを用いた。
ゼラチン溶液１０ｍｌを攪拌しながら、これにＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ溶液１０ｍｌを少量ずつ加え、室温で３時間反応させた。合成スキームを図１に示した。
反応後、セルロースチューブ（分画分子量１２０００〜１４０００）を用いて超純水に対して透析した。超純水は透析開始後１、２、４、８、１２、２４、３６及び４８時間後に交換し、ＤＭＳＯ及び未反応のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ、またはスクシンイミジルスクシネートがカルボキシル基となったもの、スクシンイミジル基の脱離物などを完全に除去した。得られた化合物（ＰＥＧグラフト化ゼラチン）を凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。
（実施例２）ＰＥＧグラフト化ゼラチンの評価
〔実験方法〕
実施例１で調製したＰＥＧグラフト化ゼラチンについて、アミノ基の定量を行うことにより、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳのゼラチンに対するグラフト化の割合を評価した。
アミノ基の定量はＴＮＢＳ法を用いて行った。すなわち、ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液を用いて０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＰＥＧグラフト化ゼラチン水溶液１ｍｌに４％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍｌ加えた。さらに０．１％（ｗ／ｖ）の２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ）を１ｍｌ加え、４０℃で２時間反応させた。反応後、黄色に呈した水溶液の吸光度を波長４１５ｎｍにて測定した。標準試料としてβ−アラニンを用いてキャリブレーションカーブを作り、それからグラフト化率を求めた。
〔結果〕
ゼラチン及び調製したＰＥＧグラフト化ゼラチンそれぞれのアミノ基の数をＴＮＢＳ法により測定した。ＰＥＧグラフト化前のゼラチンには１分子あたり２８残基のアミノ基が存在した。しかし、ＰＥＧグラフト化ゼラチンにはアミノ基は検出されなかった。このことから、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳは、ゼラチンを構成する各種アミノ酸の側鎖のアミノ基全てと反応したことが明らかとなった。
〔考察〕
ゼラチン分子のアミノ基に末端活性型ＰＥＧであるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳをグラフト化することができた。ＰＥＧグラフト化ゼラチンに残存するアミノ基をＴＮＢＳ法により定量した結果、分子量１０００００のゼラチン１モルに２８モルのＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳがグラフトしたことから、ＰＥＧグラフト化ゼラチンの分子量は２５００００であると考えられた。
（実施例３）ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルの調製
〔実験方法〕
実施例１で調製したＰＥＧグラフト化ゼラチンをｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、プローブ型ソニケータを用いて超音波処理（１０μＡ）を５秒間施すことにより透明なミセル溶液を得た。
（実施例４）ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルの動的光散乱（ＤＬＳ）の測定
〔実験方法〕
ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液を用いて１０ｍｇ／ｍｌに調製した実施例３のＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルについて、ＤＬＳ−７０００（大塚電子株式会社製）により分子サイズを測定した。散乱角は３０°、９０°および１５０°とし、温度は２５℃で測定した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルの粒子径をＤＬＳにより測定した結果を図２に示した。
ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルの平均粒子径は５０ｎｍであった。
〔考察〕
固体試料からのミセル調製法として、合成により得られた固体試料を水へ溶解する方法および固体試料を有機溶媒に溶解後、水に対して透析する方法が用いられてきた。いずれの方法でも本発明のミセルを調製できるが、作業の簡便性や、正確な濃度のミセルを得るためには、前者のほうが適していると考えられる。このため本実施例においても、前者の方法を用いた。ＰＥＧグラフト化ゼラチンをｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液中に溶解した後、超音波処理を施すことにより、単分散な粒度分布を有するミセルを調製することができた。
（実施例５）臨界ミセル形成濃度（ＣＭＣ）の測定
〔実験方法〕
調製したＰＥＧグラフト化ゼラチンについて、臨界ミセル形成濃度（ＣＭＣ）を測定した。ＣＭＣはＮ−フェニル−１−ナフチルアミン（ＰＮＡ）のミセル中への取り込みにより測定した。ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液を用いて種々の濃度のＰＥＧグラフト化ゼラチン水溶液を調製した。濃度が５．０×１０−３Ｍとなるようにメタノールに溶解したＰＮＡ溶液０．１ｍｌをＰＥＧグラフト化ゼラチン溶液２ｍｌに加え、２分間攪拌した後、分光光度計を用いて波長５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル中へのＰＮＡの取り込みを測定した結果を図３に示した。
ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルのＣＭＣは０．３ｍｇ／ｍｌであった。また、ゼラチンのみまたはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳのみではＣＭＣは認められなかった。
〔考察〕
今回用いたミセルのＣＭＣは０．３ｍｇ／ｍｌと非常に小さいことから、体内に投与したのち急速に希釈されるｉｎ  ｖｉｖｏ静脈内投与においても血液中で安定なミセルを形成していると考えられる。また、平均粒子径が５０ｎｍであることから、従来のμｍオーダーの粒子と異なり、血管内投与後のＲＥＳや塞栓を回避できることや、経気管内投与後の肺の深部までミセルが到達すること、また極めて微量の溶液で治療に充分な薬物量を投与することが可能と考えられる。
（実施例６）アフィニティーカラムによるミセルの形態評価
〔実験方法〕
ミセル内核（コア）および外核（シェル）の形態について、ゼラチンが吸着するアフィニティーカラムを用いて検討した。すなわち、ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｂｌｕｅ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液１０ｍｌで洗浄した後、ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル溶液０．５ｍｌを適用した。結合緩衝液としてｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍｌ、溶出緩衝液として２Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍｌを用いた。０．４ｍｌずつ分画し、各分画中のゼラチンをローリー法により測定した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル溶液をＨｉＴｒａｐ（商標）Ｂｌｕｅ  ＨＰカラムにより分画した結果を図４に示した。
ゼラチン溶液を適用した場合、ゼラチンはアフィニティーカラムに吸着するのに対して、ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル溶液を適用した場合は、ＰＥＧグラフト化ゼラチンはアフィニティーカラムに吸着することなく溶出された。このことからミセル表面にはゼラチンが存在しないことが明らかとなった。
〔考察〕
アフィニティーカラムによるミセルの分画から、コアにゼラチン、シェルにＰＥＧが存在するミセルを形成していると考えられる。
（実施例７）種々の溶液におけるＣＭＣの測定
〔実験方法〕
ミセルコアの形成に関与しているゼラチン分子間相互作用に関して、静電的相互作用および疎水的相互作用について検討した。静電的相互作用について検討するため、塩化ナトリウムを用いて種々のイオン強度（０．１、０．２、０．６および２）に調製したリン酸緩衝液中で、上記と同様にＣＭＣを測定した。また、疎水的相互作用について検討するため、６Ｍ塩酸グアニジン水溶液中でＣＭＣを測定した。
〔結果〕
ミセルコアの形成に関与しているゼラチン分子間相互作用について、静電的相互作用および疎水的相互作用について検討した結果を図５及び図６に示した。
その結果、種々のイオン強度を有する水溶液中で測定したＰＥＧグラフト化ゼラチンのＣＭＣに変化は見られず、ＣＭＣに対するイオン強度の影響は認められなかった。一方、疎水的相互作用を阻害することが知られている６Ｍ塩酸グアニジン水溶液中においてはＰＥＧグラフト化ゼラチンのＣＭＣを測定することができなかった。
〔考察〕
ゼラチンの分子間相互作用のうち、静電的相互作用はミセルコアの形成に影響を与えないことが明らかとなった。これに対し、６Ｍ塩酸グアニジン水溶液中においてはＣＭＣを測定することができず、静電的相互作用よりむしろ疎水的相互作用によりゼラチン分子が集合し、ミセルコアが形成されていると考えられる。
（実施例８）ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル中へのペプチド性薬物の取り込み
〔実験方法〕
調製したＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル中への薬物の取り込みについて検討した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を薬物として用いた。クロラミンＴを用いて１２５Ｉ標識したｂＦＧＦの水溶液（０．０２ｍｌ）および非標識ｂＦＧＦ水溶液（０．０３ｍｌ）を、実施例１で得た凍結乾燥後のＰＥＧグラフト化ゼラチン（５ｍｇ）に加え、２５℃で２４時間放置させた後、ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液（０．５ｍｌ）にて溶解し、上記と同様にミセル溶液を調製した。ｂＦＧＦを吸着するＨｉＴｒａｐ（商標）Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液１０ｍｌで洗浄した後、ｂＦＧＦ含有ミセル溶液０．５ｍｌを適用した。結合緩衝液としてｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍｌ、溶出緩衝液として２Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍｌを用いた。０．４ｍｌずつ分画し、ミセル分画中に含まれるｂＦＧＦをγカウンターを用いて測定することによりミセル中への薬物の封入率を求めた。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル中へのｂＦＧＦの封入率について検討した結果、２５℃で２４時間、ｂＦＧＦとＰＥＧグラフト化ゼラチンとを混合することにより、加えた３５％のｂＦＧＦがミセル内に封入されることがわかった。
〔考察〕
今回作製したミセルはコアにゼラチン、シェルにＰＥＧを有している。コアはゼラチン分子間の疎水性相互作用により形成されていることから、タンパク結合率の大きな疎水性薬物のミセルへの封入により、ミセルコアはさらに安定に形成されると考えられる。
また、今回用いた等電点５のゼラチンは、ｐＨ７．４の水溶液中において、アミノ酸側鎖のカルボキシル基がイオン型となっているため負に帯電している。反応生成物であるＰＥＧグラフト化ゼラチンにおいては、正に帯電する要因であるアミノ基が全てＰＥＧ化されているため、ミセルコアはゼラチンのカルボキシル基により負に帯電していると考えられる。そのため、ｐＨ７．４において正電荷を有するｂＦＧＦとミセルコアの負電荷が形成するポリイオンコンプレックスによっても、ミセルコアの安定性が増大すると考えられる。今回の結果からも、２５℃においてｂＦＧＦをミセル内に封入することができた。このようにミセルコアへの薬物の封入によりコアの安定性が増大し、内封薬物の徐放化が可能になることからＤＤＳ製剤としての応用が考えられる。
（実施例９）コハク化ゼラチンの調製
〔実験方法〕
実施例１に記載のゼラチンを１２．５ｗｔ％（ｗ／ｗ）となるようにＤＭＳＯに溶解した。これに種々の濃度でＤＭＳＯに溶解した無水コハク酸（ナカライテスクより購入）を混合し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、過剰量のアセトン中に再沈殿した後、アセトンで３回洗浄した。得られたサンプルを真空乾燥し、コハク化ゼラチンを得た。ＴＮＢＳ法によりコハク化ゼラチンのアミノ基を定量した。
〔結果〕
ＴＮＢＳ法によりゼラチンおよびコハク化ゼラチンのアミノ基を定量したところ、加えた無水コハク酸が０．１３２、０．２６６および０．５４２ｍｍｏｌの時、反応に用いたゼラチンの６．６％、２８．３％および８３．５％のアミノ基がカルボキシル基に変換されたことがわかった。ゼラチン１分子中に２８モルのアミノ基が存在することから、加えた無水コハク酸が０．１３２、０．２６６および０．５４２ｍｍｏｌの時、コハク化ゼラチン１分子中に２６モル、２０モルおよび５モルのアミノ基が存在することがわかった。
（実施例１０）ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン誘導体の調製
〔実験方法〕
実施例９で調製したコハク化ゼラチンを濃度が１０％（ｗ／ｗ）となるようにＤＭＳＯに溶解した。また、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳをＤＭＳＯに溶解した。ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳの濃度はコハク化ゼラチンに存在するアミノ基の２倍モル量とした。また、ゼラチン溶液１０ｍＬを攪拌しながらＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ溶液１０ｍＬを少量ずつ加え、室温で３時間反応させた。反応後、ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｔｕｂｅ（分画分子量１２０００−１４０００）を用いて超純水に対して透析した。超純水は透析開始後１、２、４、８、１２、２４、３６および４８時間後に交換し、ＤＭＳＯおよび未反応のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳを完全に除去した。得られた化合物（ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン）を凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。
（実施例１１）ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン誘導体の評価
〔実験方法〕
調製したＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン誘導体について、アミノ基の定量を行うことにより、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳのゼラチンに対するグラフト化の割合を評価した。アミノ基の定量はＴＮＢＳ法を用いて行った。
この結果、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン誘導体中にアミノ基は検出されなかった。このことから、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳは、コハク化ゼラチン側鎖のアミノ基全てと反応したことが明らかとなった。
〔考察〕
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳが、コハク化ゼラチン側鎖のアミノ基すべてと反応したことから、加えた無水コハク酸が０．１３２、０．２６６および０．５４２ｍｍｏｌの時、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン誘導体１分子中のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳは、それぞれ２６モル、２０モルおよび５モルであった。このことから、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン誘導体の分子量はそれぞれ２４００００、２０００００および１３００００であると考えられた。
（実施例１２）ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセルの調製
調製したＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン誘導体のｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、プローブ型ソニケータを用いて超音波処理（１０μＡ）を５秒間施すことにより透明なミセル溶液を得た。
（実施例１３）ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンの臨界ミセル形成濃度（ＣＭＣ）の測定
〔実験方法〕
調製したＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンについて、臨界ミセル形成濃度（ＣＭＣ）を測定した。ＣＭＣはＮ−フェニル−１−ナフチルアミン（ＰＮＡ）のミセル中への取り込みにより測定した。ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液を用いて種々の濃度のＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン水溶液を調製した。濃度が５．０×１０−３Ｍとなるようにメタノールに溶解したＰＮＡ溶液０．１ｍｌをＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン溶液２ｍｌに加え、２分間攪拌した後、分光光度計を用いて波長５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル中へのＰＮＡの取り込みを測定した結果を図７に示した。
ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセルのＣＭＣはコハク化率によらず０．３ｍｇ／ｍｌであった。
（実施例１４）アフィニティーカラムによるＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセルの形態評価
〔実験方法〕
ミセル内核（コア）および外核（シェル）の形態について、ゼラチンが吸着するアフィニティーカラムを用いて検討した。すなわち、ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｂｌｕｅ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液１０ｍｌで洗浄した後、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル溶液０．５ｍｌを適用した。結合緩衝液としてｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍｌ、溶出緩衝液として２Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍｌを用いた。０．４ｍｌずつ分画し、各分画中のゼラチンをローリー法により測定した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル溶液をＨｉＴｒａｐ（商標）Ｂｌｕｅ  ＨＰカラムにより分画した結果を図８に示した。
ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン溶液を適用した場合、いずれのコハク化率を有するＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル溶液でも、アフィニティーカラムに吸着することなく溶出された。このことからミセル表面にはゼラチンが存在しないことが明らかとなった。
〔考察〕
アフィニティーカラムによるミセルの分画から、コアにコハク化ゼラチン、シェルにＰＥＧが存在するミセルを形成していると考えられる。
（実施例１５）ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル中へのペプチド性薬物の取り込み
〔実験方法〕
調製したＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル中への薬物の取り込みについて検討した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を薬物として用いた。クロラミンＴを用いて１２５Ｉ標識したｂＦＧＦの水溶液（０．０２ｍｌ）および非標識ｂＦＧＦ水溶液（０．０３ｍｌ）を、実施例１０で得た凍結乾燥後のＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン（５ｍｇ）に加え、２５℃で２４時間放置させた後、ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液（０．５ｍｌ）にて溶解し、上記と同様にミセル溶液を調製した。ｂＦＧＦを吸着するＨｉＴｒａｐ（商標）Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液１０ｍｌで洗浄した後、ｂＦＧＦ含有ミセル溶液０．５ｍｌを適用した。結合緩衝液としてｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍｌ、溶出緩衝液として２Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍｌを用いた。０．４ｍｌずつ分画し、ミセル分画中に含まれるｂＦＧＦをγカウンターを用いて測定することによりミセル中への薬物の封入率を求めた。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル中へのｂＦＧＦの封入率について検討した結果、２５℃で２４時間、ｂＦＧＦとＰＥＧグラフト化ゼラチンとを混合することにより、コハク化率が６．６％、２８．３％および８３．５％のＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンにおいて、それぞれ４２．３％、４０．０％および２８．０％のｂＦＧＦがミセル内に封入されることがわかった。
〔考察〕
ミセルコアにコハク化ゼラチンを有するミセル内にｂＦＧＦを封入することができた。これは、ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝溶液中でコハク化ゼラチンが負に荷電しているのに対し、ｂＦＧＦは正に荷電していることから、静電的な相互作用により、ｂＦＧＦがミセルコアに取り込まれたものと考えられる。また、ゼラチンをコハク化することにより、コハク化していないゼラチンに比べてコアの負電荷を増大させることができたことから、正電荷を有するｂＦＧＦの取り込み率が大きくなったと考えられる。
（実施例１６）ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセルからのｂＦＧＦ徐放実験
〔実験方法〕
クロラミンＴを用いて１２５Ｉ標識したｂＦＧＦの水溶液（０．０２ｍｌ）、非標識ｂＦＧＦ水溶液（０．０３ｍｌ）およびｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液（０．０２５ｍｌ）を、実施例１０で得た凍結乾燥後のＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン（５ｍｇ）に加え、２５℃で２４時間放置させた後、ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液（０．５ｍｌ）にて溶解し、上記と同様にミセル溶液を調製した。ｂＦＧＦを吸着するＨｉＴｒａｐ（商標）Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液１０ｍｌで洗浄した後、ｂＦＧＦ含有ミセル溶液０．５ｍｌを適用した。結合緩衝液としてｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍｌを用いて封入されなかったｂＦＧＦを除き、ミセル分画のみを得た。このミセル溶液を３７℃の水溶液中でインキュベートした。０．５、１、３、６時間後のミセル溶液を上記と同様にＨｉＴｒａｐ（商標）Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラムを用いて分画することにより、ミセル中に封入されているｂＦＧＦの減少量を測定した。
〔結果〕
３７℃におけるＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチン中のｂＦＧＦの減少量を測定した結果を図９に示す。この結果、コハク化していないゼラチンを用いて調製したＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルからは、ｂＦＧＦが速やかにリリースされたのに対し、コハク化ゼラチンを用いて調製したＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセルにおいては、封入されたｂＦＧＦはリリースされなかった。
〔考察〕
ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンを用いたミセルにおいて、封入されたｂＦＧＦはリリースされなかった。このことは、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンを用いたミセルコアの負電荷と正電荷を有するｂＦＧＦが静電的相互作用を示し、ｂＦＧＦがミセルコアにとどまっていると考えられる。このことから、ｂＦＧＦを封入したＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセルは、体内に投与した後、酵素などによるゼラチンの分解によりミセルが崩壊するとともにｂＦＧＦをリリースすることが考えられる。
（実施例１７）カチオン化ゼラチンの調製
〔実験方法〕
ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製  豚皮由来  分子量１０００００  等電点９）１０ｇを４％（ｗ／ｗ）となるように０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した。これに２７．９ｇのエチレンジアミンを混合した後、塩酸にてｐＨを５．０に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを５．３ｇ加えた後、リン酸緩衝液にて５００ｍＬとした。３７℃で１８時間反応させた後、セルロースチューブ（分画分子量１２０００−１４０００）を用いて超純水に対して透析した。超純水は透析開始後１、２、４、８、１２、２４、３６および４８時間後に交換し、未反応のエチレンジアミンおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを除去した。得られたサンプルを凍結乾燥し、カチオン化ゼラチンを得た。ＴＮＢＳ法によりカチオン化ゼラチンのアミノ基を定量することにより、ゼラチンのカチオン化度を求めた。
〔結果〕
ＴＮＢＳ法によりゼラチンおよびカチオン化ゼラチンのアミノ基を定量したところ、反応に用いたゼラチンの４７％のカルボキシル基がアミノ基に変換されたことがわかった。
（実施例１８）ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン誘導体の調製
〔実験方法〕
上記で調製したカチオン化ゼラチンを濃度が１０％（ｗ／ｗ）となるようにＤＭＳＯに溶解した。また、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳをＤＭＳＯに溶解した。
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳの濃度はカチオン化ゼラチンに存在するアミノ基の０．５倍モル量とした。
また、ゼラチン溶液１０ｍＬを撹拌しながらＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ溶液１０ｍＬを少量ずつ加え、室温で３時間反応させた。反応後、セルロースチューブ（分画分子量１２０００−１４０００）を用いて超純水に対して透析した。超純水は透析開始後１、２、４、８、１２、２４、３６および４８時間後に交換し、ＤＭＳＯおよび未反応のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳを完全に除去した。得られた化合物（ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン）を凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。
（実施例１９）ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン誘導体の評価
〔実験方法〕
調製したＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンについて、アミノ基の定量を行うことにより、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳのゼラチンに対するグラフト化の割合を評価した。アミノ基の定量はＴＮＢＳ法を用いて行った。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンのアミノ基数をＴＮＢＳ法により測定した結果、反応に用いたカチオン化ゼラチンのアミノ基の５０．９％にＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳが反応したことが明らかとなった。
（実施例２０）ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンとプラスミドＤＮＡとの相互作用（１）
〔実験方法〕
調製したＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンをドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）におけるＤＮＡキャリアーとして用いるため、ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンとプラスミドＤＮＡとの相互作用について検討した。モデルプラスミドＤＮＡとしてｐＳＶ−ｌａｃＺを用いた。ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン／プラスミドＤＮＡの重量比が０．２５、０．５、１、２．５、５、１０および５０となるように調製した溶液を０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。アガロースゲル中にはあらかじめエチジウムプロマイドを含ませておいた。
〔結果〕
電気泳動を行った結果を図１０に示す。
〔考察〕
電気泳動の結果、ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン／プラスミドＤＮＡの重量比が２．５以上の時、プラスミドＤＮＡはＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンとコンプレックスを形成しているため泳動されないことが考えられた。
このことから、調製したＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンとプラスミドＤＮＡのコンプレックスはＤＤＳにおけるＤＮＡキャリアーとして用いることができる可能性が考えられた。
（実施例２１）ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンとプラスミドＤＮＡとの相互作用（２）
〔実験方法〕
ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン／プラスミドＤＮＡの重量比が０．２５、０．５、１、２．５、５、１０および５０となるように調製した溶液を、ゼラチンが吸着することが知られているＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｂｌｕｅ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検討した。
すなわち、ＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｂｌｕｅ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液１０ｍＬで洗浄した後、ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン／Ｉ１２５−プラスミドＤＮＡ溶液０．５ｍＬを適用した。結合緩衝液としてｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍＬ、溶出緩衝液として２Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬを用いた。０．４ｍＬずつ分画し、各分画中のプラスミドＤＮＡ量をγ−カウンターにより測定した。この測定により、結合緩衝液で溶出されたプラスミドＤＮＡはＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンと相互作用していないと考えることができ、各混合重量比におけるプラスミドＤＮＡとＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンとのコンプレックス形成率を算出した。
〔結果〕
カラムを用いて行った結果を図１１に示す。
〔考察〕
いずれの混合率においてもＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンはプラスミドＤＮＡとコンプレックスを形成し、そのコンプレックス形成率は混合重量比とともに大きくなることが明らかとなった。また、予想通りプラスミドＤＮＡ自身はカラムに吸着しなかった。
このことから、調製したＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチンとプラスミドＤＮＡとはコンプレックスを形成することがわかった。
（実施例２２）各種分子量のＰＥＧにより異なるグラフト化率でグラフト化されたゼラチン誘導体の調製
〔実験方法〕
異なる量の各種分子量のメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネートを用いて、実施例１に記載の方法により、異なるグラフト化率でグラフト化されたゼラチン誘導体を調製した。
用いたメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネートのＰＥＧ部分の分子量は、２０００、５０００および１２０００であった。また、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネートは、ゼラチンに存在するアミノ基に対して０．０５〜２倍モルを用いた。
得られたゼラチン誘導体のグラフト化率を実施例２と同様にして測定した。
〔結果〕
ゼラチン誘導体におけるグラフト化率を図１２に示した。ゼラチンに存在するアミノ基に対して０．１倍モルのＰＥＧ誘導体の使用により約２０〜４０％、０．５倍モルのＰＥＧ誘導体の使用により約５０〜５５％、１倍モルのＰＥＧ誘導体の使用により約８０〜８５％、２倍モルのＰＥＧ誘導体の使用によりほぼ１００％のグラフト化率を示した。
（実施例２３）各種のＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体のＣＭＣ測定
〔実験方法〕
実施例２２で得られたＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体から、実施例３に準じて、ミセル溶液を調製し、実施例５に準じて、ＣＭＣを測定した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体のＣＭＣを図１３に示した。分子量２０００のＰＥＧでグラフト化したゼラチン誘導体は約０．２ｍｇ／ｍｌのＣＭＣであり、分子量５０００のＰＥＧでグラフト化したゼラチン誘導体は約０．３ｍｇ／ｍｌのＣＭＣであり、分子量１２０００のＰＥＧでグラフト化したゼラチン誘導体は約１ｍｇ／ｍｌのＣＭＣであった。
（実施例２４）各種のＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体のアフィニティークロマトグラフィー
〔実験方法〕
実施例２２で得られたＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体を、実施例６と同様にして、アフィニティーカラムを用いて検討した。
〔結果〕
得られた結果を図１４に示した。この結果から、ＰＥＧの分子量にかかわらず、コアにゼラチン、シェルにＰＥＧが存在するミセルを形成していると考えられる。
（実施例２５）各種ＰＥＧグラフト化ゼラチンのｉｎ  ｖｉｖｏ体内動態
〔実験方法〕
実施例２２で得られた各種のＰＥＧグラフト化ゼラチンのｉｎ  ｖｉｖｏ体内動態を以下の方法で検討した。
各ＰＥＧグラフト化ゼラチン５０ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬに溶解し（５０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬをクロラミンＴ法により１２５Ｉラベル化する。ラベル化したＰＥＧグラフト化ゼラチンは、ＰＤ−１０カラムを用いて精製した。これに非放射標識のＰＥＧグラフト化ゼラチン溶液９９０μＬを添加した。この溶液１００μＬ（５ｍｇ）をマウス頸静脈よりボーラス投与した。１、３、６、１２および２４時間後にマウスを安楽死させ、血液中の放射活性をγカウンタにより定量した。実験結果は各臓器中の放射活性からｋｏｎｉｓｈｉらの方法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１）により計算した。
〔結果〕
血液中の残存率を、図１５に示した。
また、血液中の残存パターンから、０〜２４時間のＡＵＣとＰＥＧ分子量との関係を図１６に示した。
〔考察〕
図１５からＰＥＧをグラフトすることによってゼラチンの血中寿命が有意に延長していることが明らかである。また、図１６からＰＥＧグラフト化ゼラチンのＡＵＣもグラフトしていないゼラチンに比較して高い値を示し、ミセル表面に存在しているＰＥＧ鎖の効果であると考えられた。
（実施例２６）ＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体ミセルの酵素に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性試験
〔実験方法〕
実施例２２で得られた各種ＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体のうち、分子量５０００のＰＥＧを２倍モル使用して得たゼラチン誘導体５０ｍｇをＤＤＷ１ｍＬに溶解し（５０ｍｇ／ｍＬ）、５００μＬをそれぞれ日本薬局方第１液（ｐＨ１．２）、第２液（ｐＨ６．８）、ペプシン（１０Ｕ／ｍＬ）＋第１液またはトリプシン（１０Ｕ／ｍＬ）＋第２液４．５ｍＬ中に添加し、崩壊試験を行った。試験条件は日本薬局方崩壊試験に基づいて行った。試験後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことでゼラチンの分解を評価した。また、コントロール群としてサンプル５００μＬを４．５ｍＬのＤＤＷに添加したものを作製した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化ゼラチンにおいては、コントロール、第１液、第２液、ペプシン＋第１液およびトリプシン＋第２液のいずれにおいてもゼラチン分子量の低下は認められなかった。
比較例１
ＰＥＧグラフト化していないゼラチン５０ｍｇをＤＤＷ１ｍＬに溶解し、その５００μＬをそれぞれＤＤＷ、第１液、第２液、ペプシン＋第１液およびトリプシン＋第２液４．５ｍＬ中に添加し、崩壊試験を行った。試験条件は日本薬局方崩壊試験に基づいて行った。試験後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことで、ゼラチンの分解を評価した。
〔結果〕
ＰＥＧグラフト化していないゼラチンはコントロールおよび第２液群以外は、ゼラチン分子量の低下が認められた。
〔考察〕
これらの結果は、ＰＥＧ鎖が表面に存在したミセル構造が形成されることにより、ｐＨ１．２の酸性条件下によるゼラチンの加水分解が抑制できること、およびペプシン、トリプシンなどによる酵素分解に対するゼラチンの抵抗性が向上することを示している。例えば、これらの性質はミセル内に薬物を内包することによって、酸および酵素加水分解から薬物を守ることのできる、薬物の腸溶性コーティング材料として利用可能であると考えられる。これはこれまでの腸溶性高分子材料による薬物のカプセル化、あるいはコーティングとは違った新しいタイプのミセル型腸溶性材料の概念を提示する。
（実施例２７）乳酸オリゴマーでグラフト化されたゼラチン誘導体の調製
（１）Ｌ−乳酸オリゴマー（ＬＬＡｏ）の調製
〔実験方法〕
Ｌ−ラクチド（ＰＵＲＡＣ社製）２０ｇ（０．１３８ｍｏｌ）を１００ｍＬナスフラスコに仕込み、真空ポンプで脱気、一晩乾燥させた。窒素置換後、Ｌ−ラクチドに対して１／１０モル当量の２−（２−メトキシエトキシ）エタノールを添加し、１３０℃まで昇温した。Ｌ−ラクチド融解後、あらかじめ０．１ｇ／ｍＬトルエン溶液として調製しておいたオクチル酸スズ（ＳｎＯｃｔ２）をＬ−ラクチドに対して１／１００モル当量添加し、反応を開始した。窒素気流下で１３０℃、４時間反応させた。反応終了後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍＬに溶解させた。不溶成分は遠心により除去し、上清を５００ｍＬの冷水に滴下して再沈殿させ、これを遠心により回収した。得られた沈殿を酢酸エチル２００ｍＬに再溶解させた。硫酸マグネシウムを加えて一晩乾燥させた後、濾過し、ロータリーエバポレーションにより減圧濃縮した。析出した試料を再度ＴＨＦに溶解し、冷水に再沈殿させ、洗浄し、遠心により回収、真空乾燥させた。
（２）ＬＬＡｏの重合度（ＤＰ）の評価
〔実験方法〕
ＣＤＣｌ３を溶媒として１Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。得られたスペクトルの３．３８ｐｐｍのピークと１．４１〜１．６３ｐｐｍのピークの積分値の比より重合度を算出した。
〔結果〕
計算により、ＤＰ＝１４．７、Ｍｎ＝１０００であった。図１７にＬＬＡｏの構造式と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
（３）ＬＬＡｏでグラフト化されたゼラチン誘導体の調製
〔実験方法〕
ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製；牛骨由来分子量１０００００、等電点５）を、濃度が０．０２ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。別に、ＬＬＡｏをゼラチンのアミノ基に対して仕込み比が５：２８、１０：２８、２０：２８、３０：２８となるように溶解させたＤＭＳＯ溶液を２５ｍＬ調製した。このＬＬＡｏ／ＤＭＳＯ溶液に各々当モルの炭酸Ｎ，Ｎ′−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を加え、４０℃で６時間反応させた。その後、この反応溶液にゼラチン／ＤＭＳＯ溶液を撹拌しながら２５ｍＬ混合し、４０℃で１２時間反応させた。また、ＤＭＳＯはあらかじめモレキュラーシーブ３Ａを用いて脱水したものを用いた。反応後、セルロースチューブ（分画分子量１２０００〜１４０００）を用いて超純水に対して透析した。超純水は透析開始後１、２、４、８、１２、２４、３６及び４８時間後に交換し、ＤＭＳＯを除去した。析出した未反応のＬＬＡｏを遠心により除去し、上清を凍結乾燥した。得られた化合物（ゼラチン−ＬＬＡｏ）は、使用するまで真空乾燥下で保存した。
（４）グラフト化ゼラチン誘導体の評価
〔実験方法〕
調製したゼラチン−ＬＬＡｏ各々について、アミノ基の定量を行うことにより、ＬＬＡｏのゼラチンに対するグラフト化率を評価した。アミノ基の定量はＴＮＢＳ法を用いて行った。すなわち、ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液を用いて０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したゼラチン−ＬＬＡｏ水溶液１ｍＬに４％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍＬ加えた。さらに０．１％（ｗ／ｖ）の２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ）を１ｍＬ加え、４０℃で２時間反応させた。反応後、黄色に呈した水溶液を波長４１５ｎｍにて吸光度を測定した。標準試料としてβ−アラニンを用いて検量線を作り、それからグラフト化率を求めた。
〔結果〕
ゼラチンおよび調製したゼラチン−ＬＬＡｏのアミノ基数をＴＮＢＳ法により測定した。ゼラチンには、１分子あたり２８残基のアミノ基が存在した。一方、ゼラチン−ＬＬＡｏではアミノ基の減少がみられ、それぞれのグラフト化率は表１の通り算出された。
2003091283.tif 000005
〔考察〕
ＬＬＡｏの末端水酸基をＤＳＣにより活性化し、ゼラチンのアミノ基に対して反応させることができた。ゼラチンのアミノ基に対してＬＬＡｏの仕込み比を変えることでグラフト化率の異なるグラフト化ゼラチン誘導体を得ることができた。仕込み比が比較的小さな試料では、グラフト化率は仕込み比に応じて増加したが、仕込み比が大きい試料では予想される値より小さく５０〜６０％で飽和した。この原因の１つとしてはグラフト鎖の立体障害が考えられる。
（実施例２８）ＬＬＡｏ−ＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体
（１）ＬＬＡｏグラフト化ゼラチン誘導体に対するＰＥＧのグラフト化
〔実験方法〕
実施例２７（３）で得られたＬＬＡｏグラフト化ゼラチンを濃度が５％（ｗ／ｗ）となるようにＤＭＳＯに溶解した。また、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ（日本油脂株式会社製；分子量５３３０）をＤＭＳＯに溶解した。ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳの濃度はゼラチンに存在するアミノ基の２倍モル量とした。また、ＤＭＳＯはあらかじめモレキュラーシーブ３Ａを用いて脱水したものを用いた。
ＬＬＡｏグラフト化ゼラチン溶液２ｍｌを攪拌しながら、これにＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ溶液１ｍｌを少量ずつ加え、室温で３時間反応させた。
反応後、セルロースチューブ（分画分子量１２０００〜１４０００）を用いて超純水に対して透析した。超純水は透析開始後１、２、４、８、１２、２４、３６及び４８時間後に交換し、ＤＭＳＯ及び未反応のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ、またはスクシンイミジルスクシネートがカルボキシル基となったもの、スクシンイミジル基の脱離物などを完全に除去した。得られた化合物（ＬＬＡｏ−ＰＥＧグラフト化ゼラチン）を凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。
（２）ＬＬＡｏ−ＰＥＧグラフト化ゼラチンによるパクリタキセルの可溶化
〔実験方法および結果〕
（ａ）
パクリタキセルの１０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液を作製した（ＰＴＸ溶液）とした。ＬＬＡｏ−ＰＥＧグラフト化ゼラチンの２％水溶液を作製し、グラフト化ゼラチン溶液とした。３０μｌのＰＴＸ溶液と５００μｌのグラフト化ゼラチン溶液とを混合したところ青白色のミセル溶液になった。
（ｂ）
３０μｌのＰＴＸ溶液と５００μｌの水とを混合撹拌したところ白色沈殿を生じた。
（ｃ）
ゼラチンの２％水溶液を作製し、ゼラチン溶液とした。３０μｌのＰＴＸ溶液と５００μｌのゼラチン溶液とを混合撹拌したところ白色沈殿を生じた。
（実施例２９）ＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体を含むシート
（１）ＰＥＧでグラフト化したゼラチン誘導体の調製
実施例１と同様の方法により、ＰＥＧでグラフト化したゼラチン誘導体を得た。
（２）ＰＥＧグラフト化ゼラチンのＤＳＣ測定
上記（１）で得られたＰＥＧグラフト化ゼラチンの熱分析を下記の条件でＤＳＣによって測定した。
機種：セイコー電子工業株式会社製、ＤＳＣ２１０
測定温度：−３０℃〜２５０℃、１０℃／分
昇温条件：１０℃／分
ＤＳＣの測定結果を図１８に示した。
（３）生体内吸収性評価用試料の作製方法
ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製；牛骨由来；分子量１０００００；等電点５）及びＰＥＧグラフト化ゼラチンのそれぞれ１ｇを１０ｍＬの精製水に加温しながら溶解させた。この溶液をガラス板上に２００μｌづつ載せ、４℃で１２時間静置して充分ゲル化させた後、凍結乾燥した。減圧真空下に１６０℃で０、３、６、１２または２４時間加熱することで架橋処理し、架橋程度の異なる生体内吸収性評価用試料を調製した。
（４）生体内吸収性の試験方法
上記（３）に従って調製した生体内吸収性評価用試料をポリプロピレン製の小容器に充填した。８週齢の雄性ｄｄｙマウスの背部腰骨付近を正中線に直交するように約２ｃｍ切開した。試料を充填した小容器を切開部より皮下へ埋入した後、切開部を縫合した。試料を埋入したマウスを、翌日から５日間飼育した後、再切開して埋入した試料の有無を判定した。
（５）生体内吸収性の試験結果
前記（４）に従い、ゼラチンおよびＰＥＧグラフト化ゼラチンについて、生体内吸収性の試験を行った。その結果を表２に示した。
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表２より、ＰＥＧグラフト化ゼラチンを１６０℃で３時間加熱架橋処理した試料は、５日後には完全に消失していたが、ＰＥＧグラフト化ゼラチンを６時間以上架橋処理した試料は、５日後もほぼ原型で残存していた。腹腔、子宮漿膜の術後修復に要する期間はほぼ５日であることから、ＰＥＧグラフト化ゼラチンからの試料によりほぼ理想的な吸収性が達成できることがわかる。
一方、表２より、１６０℃の加熱処理を行わなかったゼラチンからの試料は、５日以内に完全に吸収されていたが、３時間以上の加熱架橋処理をしたゼラチンからの試料は、５日後もほぼ原型で残存していた。このことから、ゼラチンの吸収性を架橋により制御することは困難であり、誘導体化されていないゼラチン試料による癒着防止は困難であることが予想される。
（６）術後癒着試験評価用シートの作製方法
ゼラチンあるいはＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体の１ｇを１０ｍＬの精製水に加温しながら溶解させる。このポリマー溶液をＰＦＡ製シャーレに注入し、４℃で１２時間静置して充分ゲル化させた。これを凍結乾燥後、減圧真空下に１６０℃で３時間加熱架橋処理した。
（７）術後癒着試験の方法
７週齢の雌性ウィスターラット４匹の下腹部を剃毛消毒後、約２ｃｍ正中切開した。子宮周囲の脂肪織を切除し、左右子宮管を露出させ、ヨードチンキを含浸した脱脂綿で１０回擦過した。４匹のラットの左右子宮角に上記（６）に従って調製したゼラチンまたはＰＥＧグラフト化ゼラチンからの術後癒着試験評価用シートを貼付し、腹膜および皮膚を縫合閉腹した。１５日後に再開腹し、癒着の程度を左右の子宮角のそれぞれについて評価した。癒着の程度は、癒着なしを０、子宮管表面の剥離時に出血を伴わない極軽度の癒着を１、出血を伴う軽度の癒着を２、炎症を伴う重度の癒着を３とスコアー判定し、その平均値を癒着の程度として表した。
（８）術後癒着試験の結果
上記（７）に従い、ゼラチンまたはＰＥＧグラフト化ゼラチンからの術後癒着試験評価用シートについて、術後癒着に対する効果を試験した。また、シャムオペ群として、４匹のラットの左右子宮角表面にヨード処理のみ実施して癒着試験用評価シートを貼付せず、１５日後に癒着の程度を左右の子宮各それぞれに対して評価した。
の結果を表３に示す。
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表３に見られるように、ＰＥＧグラフト化ゼラチンからのシートは、左右いずれの子宮角においても残存が確認されず、子宮漿膜部も正常に治癒しており、周囲脂肪織との癒着も認められなかった。
一方、ゼラチンからのシートは、左右いずれの子宮角においてもほぼ原型のまま残存しており、その周囲は著しい異物反応を呈していた。また、被覆内部にも著量の血腫を生じており、炎症を増悪して正常な治癒を遷延化させていた。
シャムオペ群では、周囲脂肪織との癒着あるいは腹膜縫合との軽度の癒着が散見された。
（実施例３０）ＰＥＧグラフト化ゼラチンの粘着能評価
（１）マクロファージ粘着能評価試料の作製方法
ゼラチンあるいはその誘導体１ｇを１０ｍＬの精製水に加温しながら溶解させる。このポリマー溶液をＰＦＡ製シャーレに注入し、４℃で１２時間静置して充分ゲル化させる。凍結乾燥後、減圧真空下に１６０℃で３時間加熱架橋処理する。
（２）マクロファージ粘着能の試験方法
まず、１０週令の雌性ｄｄｙマウスに予め滅菌したＢｒｅｗｅｒ’ｓチオグリコレート培地（Ｄｉｆｃｏ社）２ｍｌを腹腔内投与する。５日後に、瀉血により屠殺し、腹腔内に４℃に冷却した５ｍｌＰＢＳ（−）を投与する。５分後に約４ｍｌの腹腔内浸出液を回収し、８０００回転／分で約５分冷却遠心して浸出マクロファージの細胞塊を得る。この細胞塊に、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地を２ｍｌ加え、十分懸濁させる。
次に、前記（１）の［マクロファージ粘着評価試料の作製方法］に従って調製し、予め充分にＲＰＭＩ１６４０培地で膨潤させたマクロファージ粘着能評価試料を、２４穴培養プレートに挿入し、上記マクロファージ懸濁液をそれぞれ１ｍｌづつ上層する。３７℃、５％ＣＯ２中で２４時間培養を行う。１％グルタルアルデヒドを加えて１時間低温下に固定後、エタノール系列で脱水し、ｔ−ブチルアルコールで置換後凍結乾燥する。走査電子顕微鏡（日立Ｓ−３０００Ｎ型）により表面観察を行い、マクロファージの粘着性を評価する。
（３）ＰＥＧグラフト化ゼラチンの調製
実施例１と同様の方法によってＰＥＧ化ゼラチンを調整した。
（４）マクロファージ非粘着性試料の作製方法
（３）のように合成したＰＥＧグラフト化ゼラチンを用いて前記（１）の［マクロファージ粘着能評価試料の作製方法］に従い熱架橋処理をした粘着性評価用の試料を作製した。
（５）マクロファージ粘着能の試験
前記（２）の［マクロファージ粘着能の試験方法］に従い、粘着能の試験を行った。
ＰＥＧ化ゼラチン誘導体小片上に浸出マクロファージ懸濁液を上層し２４時間培養した材料表面を固定後脱水し、低真空走査電子顕微鏡により無蒸着条件下に観察した。この結果を図１９（Ａ）に示した。これより、１６０℃で３時間加熱架橋処理したゼラチンのＰＥＧ誘導体表面には細胞は全く認められず、粘着性の顕著なマクロファージに対しても足場を提供しないと考えられた。埋植材料に対する異物反応は、持続的炎症や繊維化を伴い、臨床的に弊害が多い。その異物反応において炎症系メディエータ産生など中心的な役割を果す多核巨細胞の形成に先立つ浸出性マクロファージの材料表面への粘着が低減されることは、術後癒着防止膜や生体内埋植用の材料としても極めて有利な特性を有していた。
（６）比較例２：ゼラチン
［マクロファージ非粘着性試料の作製方法］
ＰＥＧ化処理前のゼラチン（新田ゼラチン株式会社製；牛骨由来；分子量１０００００；等電点５）を用いて前記（１）の［マクロファージ粘着能評価試料の作製方法］に従い熱架橋処理した生体内吸収性試料を作製した。
［マクロファージ粘着能の試験］
前記（２）の［マクロファージ粘着能の試験方法］に従い、粘着能の試験を行った。
架橋ゼラチン小片上に浸出マクロファージ懸濁液を上層し、２４時間培養した材料表面を固定後、脱水し低真空走査電子顕微鏡により無蒸着条件下に観察した。この結果を図１９（Ｂ）に示した。これより、１６０℃で３時間加熱架橋したゼラチン表面はマクロファージなどの細胞により間隙無く被覆されていることが明らかである。この様子は埋植材料に対するカプセル化の初期過程を反映するものと考えられ、生体内では炎症系メディエータの放出及び線維芽細胞の遊走などカプセル化をさらに助長する。以上より、熱架橋ゼラチンは生体内に埋植した場合、異物反応を増悪すると考えられ、術後癒着防止膜として好ましくなかった。
産業上の利用可能性
本発明のゼラチン誘導体は安定で、小さな平均粒子径を有する高分子ミセルを形成し、この高分子ミセルは薬物の担体としてＤＤＳに好適に使用できる。この高分子ミセルは、非常に小さいＣＭＣを有することから、体内に投与したのち急速に希釈されるｉｎ  ｖｉｖｏ静脈内投与においても血液中で安定な高分子ミセルを形成しており、また、平均粒子径が小さいことから、従来のμｍオーダーの粒子と異なり、例えば、血管内投与後のＲＥＳや塞栓を回避できること、経気管内投与後の肺の深部まで高分子ミセルが到達すること、また極めて微量の溶液で治療に充分な薬物量を投与することが可能となると考えられる。本発明の高分子ミセルは、その分子サイズに関係なく、低分子薬物からのペプチド、タンパク質などの高分子薬物、多糖、あるいは核酸からなる薬物（ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸など）などの薬物を安定に封入できる。
また、本発明のゼラチン誘導体およびそのミセルは薬物のみでなく診断、予防のため、あるいは化粧品に用いられる物質のＤＤＳキャリアあるいは安定化にも有効である。
さらに、炎症性細胞などが付着しない性質を利用した癒着防止膜材料などの医用材料としての利用も可能である。
さらに、酸や酵素による加水分解から薬物を守ることを可能とする特性を利用して経口投与時における腸溶性コーティング剤として利用できる。すなわち本ミセルシステムは薬物のエマルジョンタイプの腸溶性コーティング技術を実現する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のＰＥＧグラフト化ゼラチンの合成スキームの１例を示す図である。
図２は、ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセルの粒度分布を示す図である。
図３は、ＰＥＧグラフト化ゼラチンのＣＭＣ測定結果を示す図である。ＰＥＧグラフト化ゼラチン（○）、ゼラチン（●）およびＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＣ−５０ＨＳ（▲）を示す。
図４は、ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル溶液のアフィニティーカラムからの溶出プロファイルを示す図である。ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル（○）およびゼラチン（●）を示す。
図５は、各種イオン強度の水溶液中でのＰＥＧグラフト化ゼラチンのＣＭＣの測定結果を示す図である。イオン強度２（○）、０．６（●）、０．２（△）および０．１（▲）を示す。
図６は、６Ｍ塩酸グアニジン水溶液中でのＣＭＣの測定結果を示す図である。
図７は、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンのＣＭＣの測定結果を示す図である。コハク化率６．６％（○）、２８．３％（●）および８３．５％（△）を示す。
図８は、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセル溶液のアフィニティーカラムからの溶出プロファイルを示す図である。コハク化率６．６％（○）、２８．３％（●）および８３．５％（△）を示す。
図９は、ＰＥＧグラフト化コハク化ゼラチンミセルからのｂＦＧＦの徐放結果を示す図である。コハク化率０％（○）、６．６％（●）および２８．３％（△）を示す。
図１０は、ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン／プラスミドＤＮＡの電気泳動の結果を示す写真である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：フリーのプラスミドＤＮＡ；レーン３〜９：ゼラチン誘導体／プラスミドＤＮＡの重量比が０．２５、０．５、１、２．５、５．１０および５０を示す。
図１１は、ＰＥＧグラフト化カチオン化ゼラチン／プラスミドＤＮＡのコンプレックス形成率を示す図である。
図１２は、ＰＥＧ誘導体の使用量とＰＥＧグラフト化ゼラチンのグラフト化率との関係を示す図である。ＰＥＧ部分の分子量が２０００（○）、５０００（△）および１２０００（□）の場合を示す。
図１３は、ＰＥＧグラフト化ゼラチンのＣＭＣの測定結果を示す図である。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＰＥＧ部分の分子量が２０００、５０００および１２０００の場合を示す。グラフト化率０％（○）、８５％（□）および１００％（■）を示す。
図１４は、ＰＥＧグラフト化ゼラチンミセル溶液のアフィニティーカラムからの溶出プロファイルを示す図である。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＰＥＧ部分の分子量が２０００、５０００および１２０００の場合を示す。グラフト化率０％（○）、８５％（□）および１００％（■）を示す。
図１５は、静脈注射後のゼラチンまたはＰＥＧグラフト化ゼラチンの血液中での減少パターンを示す図である。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＰＥＧ部分の分子量が２０００、５０００および１２０００の場合を示す。グラフト化率０％（○）、８５％（□）および１００％（■）を示す。
図１６は、注射後０〜４時間のＡＵＣとグラフト化されたＰＥＧの分子量との関係を示す図である。グラフト化率０％（○）、８５％（□）および１００％（■）を示す。
図１７は、ＬＬＡ０の構造式（Ａ）と１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｂ）を示す図である。
図１８は、ＰＥＧグラフト化ゼラチン誘導体のＤＳＣ曲線を示す図である。
図１９は、実施例３０のマクロファージ粘着能の評価試料表面の電子顕微鏡写真であり、（Ａ）は、架橋ＰＥＧグラフト化ゼラチンからの試料であり、（Ｂ）は、架橋ゼラチンからの試料である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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