(57)【要約】定量化する運動動作に基づいて動物表面の複数の運動動作追跡位置を決定する（第一のステップ）。その複数の運動動作追跡位置に、色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布する（第二のステップ）。光照射下（特に夜行性生物では紫外線照射下）で生物を撮像する（第三のステップ）。撮像された画像において、前記複数のマーキング部分を弁別し、マーキング部分の代表点位置を決定する（第四のステップ）。前記複数の代表点位置データに基づいて、特定の運動動作を判定して出力する第五のステップを行う。それらステップを実行するコンピュータ装置を構成した。
2003067973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の特定の運動動作に基づいて決定された生物表面の複数の運動動作追跡位置を、色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布することにより、かかる運動動作を定量化する方法であって、
生物の患部位置と、生物が該患部に動作をする生物部位とを、運動動作追跡位置として決定する第一のステップと、
前記運動動作追跡位置を色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布することで、マーキングする第二のステップと、
光照射下で生物を撮像する第三のステップと、
撮像された画像において、前記マーキング部を弁別し、マーキング部の代表点位置を決定する第四のステップと、
前記代表点位置データに基づいて、特定の運動動作を判定して運動動作回数を出力する第五のステップと、
を有する生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項２】
前記生物が皮膚炎の自然発症モデル動物であり、前記特定の運動動作が、掻痒動作であり、前記患部位置が、頭部から背部であり、前記患部に動作をする生物部位が、前肢あるいは後肢である、ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項３】
前記患部を刺激して特定の運動動作を誘導する刺激物質を、前記患部に塗布する、あるいは、その刺激物質を生物に投与する、ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項４】
前記生物が皮膚科疾患モデル動物であり、前記特定の運動動作が、掻痒動作であり、前記刺激物質が、痒みを誘導する刺激物質であり、前記患部に動作をする生物部位が、前肢あるいは後肢である、ことを特徴とする請求の範囲第３項記載の生物運動動作の観察自動化方法。
【請求項５】
前記生物が耳鼻科疾患あるいは眼科疾患モデル動物であり、前記特定の運動動作が、クシャミないしは鼻すすり動作であり、前記刺激物質が、クシャミないしは鼻すすりを誘導する刺激物質であり、前記患部に動作をする生物部位が、前肢あるいは後肢である、ことを特徴とする請求の範囲第３項記載の生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項６】
前記生物が内科及び／又は外科の痛み疾患モデル動物であり、前記特定の運動動作が、自らの体表を噛む動作であり、前記刺激物質が、痛みを誘導する刺激物質であり、前記患部に動作をする生物部位が、口唇部である、ことを特徴とする請求の範囲第３項記載の生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項７】
前記生物が内科及び／又は外科の痛み疾患モデル動物であり、前記特定の運動動作が、自らの体表を掻く動作であり、前記刺激物質が、痛みを誘導する刺激物質であり、前記患部に動作をする生物部位が、前肢あるいは後肢である、ことを特徴とする請求の範囲第３項記載の生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項８】
前記生物が夜行性生物であり、前記第三のステップが、紫外光の照射下で実施される、ことを特徴とする請求の範囲第１項から第７項のうちのいずれか１項記載の生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項９】
前記第五のステップが、複数の代表点位置データから代表点間の距離を求め、かかる距離によって、特定の運動動作の有無を判定するものである、ことを特徴とする請求の範囲第１項から第８項のいずれか１項記載の生物運動動作の観察自動化の方法。
【請求項１０】
生物の特定の運動動作に基づいて決定された生物表面の複数の運動動作追跡位置を、色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布することにより、かかる運動動作を定量化する装置であって、
運動動作追跡位置として決定された生物の患部位置及び生物が該患部に動作をする生物部位に、色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布した生物に、光を照射する照射手段と、
生物を前記照射手段の下で撮像する撮像手段と、
撮像された画像データ及び弁別条件データから、前記の塗料塗布部を弁別する弁別手段と、
弁別された塗料塗布部の座標データ及び動作判定条件データとから、特定の運動動作を判定してその動作回数を出力する運動動作カウント手段と、
を有することを特徴とする生物運動動作の観察自動化装置。
【請求項１１】
前記生物が夜行性生物であり、前記照射手段が、紫外光の照射手段である、ことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の生物運動動作の観察自動化装置。
【請求項１２】
前記弁別手段が、撮像された画像データと、あらかじめ設定された輝度の条件データあるいは色彩の弁別条件データとを入力し、それらを比較して条件に合致する画像データの座標を塗料塗布部の座標データとして抽出するものであって、
前記運動動作カウント手段が、弁別された塗料塗布部の座標データと、あらかじめ設定された動作判定の距離の条件データとを入力し、塗料塗布部の座標データから、塗料塗布部の代表点座標を決定し、代表点座標データから代表点間の距離を演算し、代表点間距離と、距離の条件データとから、特定の運動動作の発生を判定して、運動動作回数をカウントするものである、
ことを特徴とする請求の範囲第１０項または第１１項記載の生物運動動作の観察自動化装置。
【請求項１３】
生物の特定の運動動作に基づいて決定された生物表面の複数の運動動作追跡位置をマーキングすることにより、かかる運動動作を定量化する装置であって、
運動動作追跡位置として決定された生物表面にマーキングされた生物を撮影した画像データ及び弁別条件データとから、前記マーキング部を弁別するマーキング部の弁別手段と、
弁別されたマーキング部の座標データと、動作判定条件データとから、特定の運動動作を判定してその動作回数を出力する運動動作カウント手段と、
を有することを特徴とする特定の運動動作を定量化する装置。
【請求項１４】
前記弁別手段が、画像データと、あらかじめ設定された輝度の条件データあるいは色彩の弁別条件データとを入力し、それらを比較して条件に合致する画像データの座標をマーキング部の座標データとして抽出するものであって、
前記運動動作カウント手段が、弁別されたマーキング部の座標データと、あらかじめ設定された動作判定の距離の条件データとを入力し、マーキング部の座標データから、マーキング部の代表点座標を決定し、代表点座標データから代表点間の距離を演算し、代表点間距離と、距離の条件データとから、特定の運動動作の発生を判定して、運動動作回数をカウントするものである、
ことを特徴とする請求の範囲第１３項記載の特定の運動動作を定量化する装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、実験生物による薬効試験の観察の自動化に関わる分野で、生物の特定の運動動作を定量化する技術を提供するものである。特に夜行性の実験生物であっても、その運動動作を定量化できる技術である。
背景技術
実験動物、特に病理モデル動物をもちいた薬効試験において、データの統計学的信頼度を上げるため、多数のモデル動物を実験対象として、その運動状態、挙動動作を逐一観察するスクリーニングテストが行われる。このスクリーニングテストにおいては、明確な指標を持ち（客観性）、臨床効果を試験する薬物がその指標において有効となるか否かを定量的に判定できることが求められる。これが生物の特定の運動動作の定量化が必要となる所以である。このスクリーニングテストは可能な限り簡便で安価であることが望まれる。
スクリーニングテストで、動物の運動動作を人の肉眼による観察で識別したり、一定の動作回数を人が見てカウントする方法は問題があった。つまり、動物の掻痒動作、クシャミ鼻すすり動作などを弁別することは熟練を要する長時間の過酷な労働であるし、客観性、人件費に問題があり、これを自動化することが望まれていた。しかし従来の自動化方法、装置には、いずれも欠点があった。従来の動物運動動作の観察自動化の技術を列挙し、それぞれの問題を説明する。
動物ケージの床に振動センサーを装着し、その検知振動から動物の運動内容を自動記録する、特開平１０−０１９６５８号公報記載の「動物の行動観察・解析装置」が開示されている。これによれば、振動から全体像はつかめるものの、運動動作の種別は判別しがたい。この振動センサーに代わり、光センサーを用いる以下の技術がある。
投受光遮光型の光センサーによって非接触で実験動物の運動量を測定する、特開平０７−１８４５１３号公報記載の「実験用動物の運動量測定方法及びその装置（東洋産業（株））」、特開昭６３−０７４４３６号公報記載の「実験動物の運動挙動の記録およびまたは評価のための方法と装置（チバガイギー）」、光センサー波長を遠赤外線領域として動物温度情報も取り込める受動型遠赤外センサーを用い、動物のすくみ反応を客観測定する、特許２９６９１０８号の「すくみ反応の測定方法。並びに化学物質が学習又は記憶に与える影響の評価方法（（財）残留農薬研究所）」がある。また、同じく赤外線センサーで水槽内の実験動物などの温度分布の変化を検知し、それによって動物の元気さを判定して抗うつ薬の薬効を客観的に評価する、特開平１０−１９７３４５号の「実験動物の強制水泳試験装置（室町機械（株）他）」などがある。
しかしながら、これらの技術は光センサーから得られる情報量が少なく、前記同様、細かな運動動作の種別は判別しがたい。また、光センサーの能力や設置の条件によっては、肝心の動物の運動動作を検知し損ねる、といった問題もある。
細かな運動種別までも判別できる情報をとりこむため、実験動物をビデオ撮影し、その動画像を種々の画像解析アルゴリズムをもちいて画像解析する方法がある。たとえば特開平１１−２９６６５１号公報記載の「実験動物の行動観察の自動化方法（中央電子（株）他）」では、画像差分法、２値化法、楕円近似および重心抽出より成る画像処理を行って画像パラメータを抽出し、動物のＬｏｃｏｍｏｔｉｏｎ（移動活動）、Ｓｔｒｅｃｈｉｎｇ（伸び）、Ｒｅａｒｉｎｇ（後肢立ち）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ（不動）、Ｓｎｉｆｆｉｎｇ（嗅ぎ）、Ｇｒｏｏｍｉｎｇ（毛づくろい）の行動を弁別する方法が開示されている。
しかしこの画像解析による方法では、イメージ動画像として得られる情報が過多で、情報処理に時間がかかる。ゆえに、情報処理量を上記方式より減らし、かつ、動物ケージ床振動センサー方式や、投受光遮光型の光センサー方式のような情報不足のものより多い情報、すなわち定量化に必要かつ十分な運動動作情報だけを取り込んで処理するようにすればよい。
たとえば運動動作定量化に必要な筋肉や関節などの運動部分だけに情報取り込みを限定して、その部分だけのイメージ動画像をビデオ等で取り込めばよい。しかし、従来は適当な技術がなかった。
一方、生物（人体）に複数の発光器や磁性体などの位置マーカを装着し、これによって動作をデジタル化する方法がある。これはモーションキャプチャ技術として公知である。モーションキャプチャ技術は、バイオメカニックス（生物機械学）、リハビリテーション医療、スポーツサイエンス、バーチャルリアリティ（仮想現実感）の産業利用など、広い科学分野で利用されている。
モーションキャプチャ技術では人体、生物などのアクター（運動動作演技者）に複数の発光器や磁性体などの位置マーカを装着して動画像を撮影し、そのデータによって動作を再現、解析する。位置マーカには、磁気式マーカ、光学式マーカ、筋電図方式などがある。光学式には色彩でマーカを弁別するカラーマーカも特開平０４−９３７０４号公報記載の「動作解析装置（アニマ（株））」、特開平０６−５０９８３号公報記載の「被検体部位の動作解析装置（アニマ（株））」などで開示されている。
このモーションキャプチャ技術は、３次元の運動動作の再現、解析を目的としているため、多数の位置マーカから多くのデータを取り込み、複雑な情報処理を行うため情報処理に時間がかかる。そのため実験動物の観察自動化に適用できるものではない。しかも、動物に多数の発光器や磁性体などの位置マーカを装着することは、装着時の動物損傷が問題であるし、装着後も動物ストレスになるので適切でない。無用なストレスは特にアトピー掻痒行動の観察などでは禁物である。さらに、公知のマーカは、動物の掻痒行動などで容易に離脱してしまうために使い物にならなかった。
また一方、種々の動物実験、動物試験ではマウス、猫、コウモリなどの夜行性生物を用いることもある。それら生物では、明るいと自然な行動をとらないので、暗視環境下で実験しなければならないという条件がある。一般に夜行動物の行動観察では、特開平１１−３０６３１３号公報記載の「野性動物の通過検出器（三洋測器（株））」のように暗視カメラ（赤外線カメラ）が用いられている。しかし、暗視カメラそのままではイメージ動画像が得られるだけであり、前述のように運動動作解析には時間がかかり、観察自動化に適用できるものではなかった。
本発明では、上記暗視環境下の実験における問題を解決すべく、紫外光による蛍光発光を利用する。紫外光は、ブラックライトとも呼ばれる。蛍光物質は紫外波長域の見えない光を受けて、可視波長で発光する。これは蛍光灯の原理である。蛍光発光させる紫外線は、３４０ｎｍ付近の波長領域が用いられている。蛍光剤としては、紫外線の照射によって蛍光を発するものであればいかなるものであってもよく、例えば、市販のローダミンやオーラミン等の中から発光色調や毒性等を考慮して、目的に応じて選定されている。
この蛍光発光を生物に適用したものは、鶏卵に紫外線を照射し、鶏卵が発する蛍光を画像処理して鶏卵の鮮度を判定する、特開平１１−２３０９６０号公報記載の「卵の鮮度自動判定装置（共和機械（株））」、生物活性炭槽の処理濃縮水に紫外光を照射し、生物が発する蛍光を画像処理して生物活性炭の性能低下を判定する、特開平０８−２５２５８７号公報記載の「生物活性炭による水処理方法及び水処理システム（（株）日立製作所）」などがある。
また、蛍光発光を被プロセス材のトラッキング（位置追跡）に利用した、特開平０７−１４９４２０号公報記載の「トラッキング異常検知方法（日本鋼管（株））」および、動物の追跡へ利用したものとして、動物に蛍光物質を摂取させ、その排泄物を紫外蛍光発光させ追跡する、特開平１０−１１１３６４号公報記載の「動物通路の探査方法（イカリ消毒（株））」などがある。
本発明の課題は、生物をもちいた種々の実験で、その運動動作の定量化に必要かつ十分な情報だけを取り込んで情報処置し、実用的な情報処理時間で定量的な実験結果を得る方法と装置を提供することである。また、生物損傷や生物ストレスのない運動動作データ採取法を提供すること、特に、マウス、猫、コウモリなどの夜行性生物が、自然な行動をとる暗い環境でデータを採取する方法と装置を提供することである。
発明の開示
本発明は、生物の特定の運動動作に基づいて決定された生物表面の複数の運動動作追跡位置を、色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布することにより、かかる運動動作を定量化する方法である。本発明に係る方法の作業フロー説明図を図１に示す。本発明では、まず、生物の患部位置と、生物が該患部に動作をする生物部位とを、運動動作追跡位置として決定する第一のステップがある。
患部位置、該患部に動作をする生物部位、特定の運動動作及び運動追跡位置の関係を説明する図を図２２に示す。たとえば、患部が頭で、頭を後肢で掻く動作を特定の運動動作とした場合には、頭と後肢が運動追跡位置である。図２２記載のその他の例は、以下の説明の途中で適宜参照されたい。
上記運動動作追跡位置として決定する第一のステップに続いて、色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布することで、前記運動動作追跡位置をマーキングする第二のステップ、光照射下で生物を撮像する第三のステップ、撮像された画像にて前記マーキング部を弁別しマーキング部の代表点位置を決定する第四のステップ、前記複数の代表点位置データに基づいて、特定の運動動作を判定して運動動作回数を出力する第五のステップを行う。これらステップで生物の特定の運動動作を定量化して観察を自動化する。
生物体表面とは、文字通り生物の表面である。かかる表面には表皮組織、表皮細胞があり、魚類爬虫類では鱗状組織でもよい。毛も表皮の変形であるので、毛髪、獣毛があってもよい。感覚器に分化した部分や、角質化された表面でもよい。よって、生物体表面の運動動作追跡位置は、表皮あるいは毛髪、獣毛の集合部であってもよいし、鱗状組織でも感覚器に分化した部分であってもよい。以下、動物を用いた薬効試験で各ステップを説明する。
たとえば、ＮＣ／Ｎｇａマウスはアトピー性皮膚炎を自然発症するモデル動物として知られている。図２は、その発症マウスを示す。発症マウスの一体に、アトピー性皮膚炎の新薬を、もう一体に、プラシーボ（疑似薬）をそれぞれ与え、その掻痒行動を観察して薬効試験を実施する。その際の観察すべき行動は、図２（ｂ）のような、後肢で頭部を掻く行動の回数である。従来は目視観察で行動のありなしを判定して、その回数をカウントしていた。また、モーションキャプチャ技術を、こういった回数カウントに適用することはなされていなかった。
この例では、アトピー性皮膚炎患部が頭であって、後肢という生物部位が該患部に対して頭を後肢で掻くという特定の運動動作をする場合であるので、運動動作追跡位置のひとつを例えば頭頂部、もうひとつを例えば後肢先端部とする。これら追跡位置の接近をもって掻痒行動のありなしを判定する。そこで、図３に示すように、頭頂部を不定形に包含するＭ１の部分に赤色、後肢先端部を不定形に包含するＭ２の部分に緑色の塗料を塗布する。（第二のステップ）
塗料塗布は、マウスに麻酔を施して損傷やストレスのない状況で行う。塗料材質は、マウスに対する安全性を考慮して、天然色素などを主体とした材質を選んで使用する。また物性も、動物一般の習性として「べとべとした」ものを前肢や後肢に塗布するとストレスを感じるので、それを考慮して後肢には即乾性の塗料を使う。
アトピー性皮膚炎に限らず、一般の皮膚科疾患症を発症したモデル動物でも、こういった後肢で頭部を掻く掻痒行動を観察して試験が実施される。掻痒動作は後肢で頭部を掻く行動に限らず、前肢で掻く動物もあるし、患部も背部である場合もある。したがって、運動動作追跡位置もそういった患部と動物行動に準じて、頭部、背部、前肢、後肢を使い分ければよい。（図２２参照）
このようにして色素塗料を塗布したマウス４体を個別ケージに移し、可視光照明下でデジタルビデオカメラにて撮影した（第三のステップ）。撮像画像を模式的に図４に示す。また、蛍光塗料をマウス４体それぞれのＭ１部、Ｍ２部に塗布し、それらを暗室内のケージに移し、このケージにブラックライトの紫外線を照明して、蛍光塗料が可視光で発光した状態でデジタルビデオにて撮影した。その撮像画像を模式的に図５に示す。
前者の色素塗料の場合でも、後者の蛍光塗料の場合でも、Ｍ１部、Ｍ２部は市販のデジタルビデオカメラで十分に目視弁別できる画像が得られた。特に後者の蛍光塗料の場合では、Ｍ１部、Ｍ２部のコントラストがはっきりとして弁別が容易であった。マウスは夜行性生物であるので、暗室で観察した方が、活発で自然な行動をとりやすいので、薬効試験としても望ましい。すなわち、対象生物が夜行性であれば、塗料を蛍光塗料として前記第三のステップが、紫外光の照射下で暗室等にて実施するのが望ましい。
デジタルカメラの画像データには、各画像フレームの画素ごとの色彩ＲＧＢ（赤緑青）のデータがあり、これを画素の位置座標データと共に取り出すことができる。また同様に、各画像フレームの画素ごとの輝度（光パワー）のデータがあり、これも画素の位置座標データと共に取り出すことができる。
これら色彩あるいは輝度データによって、Ｍ１部、Ｍ２部の画像上の座標を弁別して抽出することは容易である。たとえば、Ｍ１の部分に赤色を塗布した場合に、Ｒ（赤）のデータ値が大きい部分を抽出すれば、Ｍ１のマーキング部が抽出できる。これが、第四のステップ中の、画像から塗料塗布によるマーキング部を弁別するサブステップである。
図４や図５のように複数のＭ１部、複数のＭ２部が混在する画像でも、図中（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）の個別ケージの位置は固定されているので、それぞれの個別ケージ内の位置座標に含まれるという条件付きで、Ｒ（赤）のデータ値が大きい部分がＭ１、Ｇ（緑）のデータ値が大きい部分がＭ２とすれば、ケージ別のＭ１、Ｍ２の弁別が可能である。また（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）それぞれのマウスごとに、赤、青、緑、黄などと色を変えて弁別してもよいし、個々のマーキング部それぞれすべて別の色として区別することも可能である。ひとつの生物のマーキング部が３つ以上であっても、このように色彩をかえればよいので弁別が容易である。ブラックライトなどによる紫外線蛍光発光の場合も、塗布する蛍光物質を変えれば、可視の発光色が変わるので、色による弁別は上記同様に可能である。
各画像フレームには、画素ごとの輝度（光パワー）のデータもあるので、画素の輝度データの差のみで弁別してもよいし、色彩データと輝度データとを組み合わせて用いて弁別してもよい。撮像で得られるデータは、照明の大きさや位置など実験条件によって変わる。対象となる実験で得られるマーキング部の輝度、色彩データを事前実験であらかじめ計測しておけば、弁別は可能である。当然であるが、実験条件良好で、マーキング部の画像上の特徴が顕著であって、画像処理のみでマーキング部の弁別が可能であるならば、必ずしも塗料等をマウスに塗布しなくてもよい。たとえば、目、あるいは前肢、後肢の画像上の特徴を画像処理だけで抽出できれば塗布は不必要である。
次に、第四のステップ中の、マーキング部の代表点位置を決定するサブステップを説明する。図６にそのマーキングされたマウス画像から代表点を決定する例図を示す。前記のように、色彩あるいは輝度データにより特定されたＭ１部、Ｍ２部に該当する画像上の全画素座標から、それらの最大座標と最小座標を抽出する。そしてそれらの中間点を代表点とする。つまり、図６に示す上下座標の幅５（最大座標と最小座標）から上下座標中間６、図６に示す左右座標の幅７（最大座標と最小座標）から左右座標中間８を求め、代表点４を決定すればよい。図５の画像に代表点「×」，「＋」を加えたものを参考として図７に示す。
上記第四のステップ中の、ふたつのサブステップ、すなわちマーキング部の弁別サブステップとその代表点位置決定サブステップは、画像処理技術で多くの手法が公知であり、任意の方法の採用が可能である。具体的には、画像差分法、２値化法、楕円近似および重心抽出などの画像処理法を必要に応じて採用すればよい。
次に、決定された複数の代表点位置データに基づいて、特定の運動動作を判定して出力する第五のステップを説明する。図７に示す代表点「×」，「＋」は、座標データがわかっているので、それらの距離を演算するのは容易である。ここでは、平面画像での平面距離であり、必要あれば公知のモーションキャプチャ技術をもちいて複数台のカメラで３次元の代表点データを求め、より絶対距離に近いものを得ることもできる。しかし、実用上、平面距離で問題はない。
また、マーキング部がかくれて写らない場合があるが、動物は頻繁に動き回るので、かくれて写らない画像時間を排除して処理すればよい。すなわち、マーキング部の数がわかっているので、代表点の数がそれ以下の場合の撮像データは排除する、などとすればよい。例えば新薬投与したマウス画像の排除時間とプラシーボ（疑似薬）投与マウス画像の排除時間を、ともに排除して、両方のマウスのマーキング部すべてが写っている時間だけを処理することにしても大部分の撮像時間は有効であり、実用上問題はない。
代表点の距離は、動物動作に応じて変化する。図８は、横軸時間軸として代表点間の距離データ（Ｄａｔａ）をプロットしたものである。ここで、頭部を不定形に包含するＭ１の部分と後肢部を不定形に包含するＭ２の部分とが、接近した場合をもって、掻痒動作が行われたと判定できる。したがって、それらの代表点間距離が十分に小さい値であれば、掻痒動作が行われたと判定できる。そこで、その動作判定の条件距離をあらかじめ決めておき、その値以下になったら動作が生じた、と判定すればよい。図８中の値Ｔｈが、あらかじめ設定された距離の条件データを示すレベルである。値Ｔｈは動作がありなしを判定するスレッショルド（閾）値といえる。
条件距離Ｔｈは、絶対的に決められるものではない。しかし試験は、例えば新薬投与したマウスとプラシーボ（疑似薬）投与マウスとの運動差で評価されるので、それぞれの動作判定条件距離Ｔｈを同じ値にすれば新薬の相対評価はできる。したがって、マウス個体差、マーキング塗料の状態、撮影条件などを考えて、条件距離Ｔｈを試験ごとに適宜設定すればよい。また、試験の当初にマウス動作の目視やビデオの画像と、演算された距離データの値とを合わせ見て決定してもよい。その際、ビデオのスロー再生などを活用すればよい。
図８（ａ）のプラシーボ（疑似薬）投与マウスのデータグラフでは、図中に示す観察時間中に、距離データ（Ｄａｔａ）の値が７回、条件距離Ｔｈを下回ったので、７回の動作がカウントされた（ｃｏｕｎｔ＝７）。図８（ｂ）の新薬投与したマウスでは、１回（ｃｏｕｎｔ＝１）であった。これらの比較で新薬評価すればよい。図９は、条件距離Ｔｈの値を図８の場合より下げた条件の場合の例であり、カウントは、図９（ａ）では３回であり（ｃｏｕｎｔ＝３）、図９（ｂ）では０回（ｃｏｕｎｔ＝０）である。
観察時間は、新薬投与したマウス、プラシーボ（疑似薬）投与マウス共通に自由に設定できる。また、データ採取時間間隔も新薬投与したマウス、プラシーボ（疑似薬）投与マウス共通に自由に設定できる。たとえば、データ採取時間間隔を図８、図９の場合の三分の一としたものを、それぞれ図１０、図１１に示す。これらの説明は省略する。
動作判定は、上記のように距離データ（Ｄａｔａ）の値がＴｈ値以下になったら動作が生じたと判定しカウントする方法に限定されない。たとえば、距離データ（Ｄａｔａ）の値がＴｈ値より大きな値から小さな値になったら一回にカウントするとしてもよいし、図１２のように、距離データ（Ｄａｔａ）の値がいったんＴｈ値より大きな値から小さな値になり、大きな値に戻る往復運動で、一回とカウントしてもよい。
従来では前記特開平１１−２９６６５１号公報のように、イメージ動画像として得られた情報から直接運動動作を判定する方法が提案されていたが、本発明では情報処理量がイメージ動画像の一部であるマーキング部位だけに制限し、しかも上に説明した単純な距離計算だけで動作判定するので、処理時間が飛躍的に短縮される。
以上のように、皮膚炎の自然発症モデルマウスにて、本発明の観察自動化の方法を説明した。これは自然発症のモデル動物を用いた例であった。この場合、モデル動物は自然に掻痒動作を行う。これに対して、刺激物質を実験動物に塗布あるいは投与して、特定の運動動作をおこさせる感覚を刺激し、動作を誘導することもある。すなわち、たとえば第二のステップ（塗料塗布）の直前あるいは直後に刺激物質を生物表面に塗布する、あるいは刺激物質を生物に投与することで、特定の運動動作をさせる感覚を刺激し、動作を誘導する。
健常である生物でも、上記の塗布や投与によって擬似的な疾患がおこり、一時的な患部が生じる。その患部の位置に対して、特定の運動動作が誘導されるので、その患部位置と、生物が該患部に動作をする生物部位とを、運動動作追跡位置として決定することは容易である。
たとえば、皮膚科疾患の薬効試験では、ヒスタミンやセロトニンなどの痒み感覚の刺激物質を、実験動物表面に塗布あるいは投与し、その痒み部位を患部とし、患部に掻痒動作をさせる。一方、花粉症のような耳鼻科疾患や眼科疾患の薬効試験では、同じくヒスタミンやセロトニンなどの痒み感覚の刺激物質を、実験動物の鼻先に塗布あるいは投与して、鼻を患部としてクシャミや鼻すすり動作を誘導している。
また、動物は、痛み部位を噛んだり前肢や後肢で掻いたりする習性がある。よって、鎮痛剤新薬の薬効試験ではホルムアルデヒドやカプサイシン等の痛み感覚の刺激物質を、実験動物に塗布あるいは投与して、該塗布部や投与物質が影響を与える特定の臓器、組織を患部として、その痛み部位を噛む動作、前肢や後肢で掻く動作を誘導している。
ここで刺激物質の塗布では、多くの場合その塗布位置が患部となるので、塗布部を動作追跡位置とすればよい。たとえば、皮膚科疾患の薬効試験では、背部にヒスタミンを塗布して、運動動作追跡位置のひとつを背部、もうひとつを前肢や後肢部とすればよい。
花粉症のような耳鼻科疾患の薬効試験では、たとえば図１３（ａ）のモルモットの鼻先に刺激物質を塗布し、図１３（ｂ）のようなクシャミや鼻すすり動作を誘導する。この場合には、図１４（ａ），（ｂ）に示すように、刺激物質を塗布した鼻部Ｍ５および前肢部Ｍ６を運動動作追跡位置とすればよい。
ここで、刺激物質の投与では、経口投与、吸入投与、注射投与のいずれでもよい。たとえば、鎮痛剤の薬効試験にて、実験ウサギの後肢に図１５（ａ）のごとく痛み刺激物質を注射器９によって投与する。その後、注射部分の皮下が患部となり、そこに刺激を感じるため、図１５（ｂ）のような注射部１０を噛む動作が誘導される。よって、図１６（ａ）（ｂ）に示すように、口唇部を不定形に包含するＭ３、痛み部位である注射部を不定形に包含するＭ４に塗料を塗布すればよい。
刺激物質の投与による刺激の影響部位は、必ずしも投与部とは限らない。たとえば、ホルムアルデヒドのような頭痛を誘起させる物質を吸入で投与して、頭に痛み刺激を発生させ、頭を掻く動作を誘導することがある。この場合には、患部は投与された刺激物質が刺激する生物臓器、すなわち頭（脳）であり、運動動作追跡位置も頭部である。同様にカプサイシンのような粘膜組織を刺激する物質を経口で投与し、咽頭粘膜を刺激して、のど部を後肢で掻く動作を誘導することがある。この場合には、患部は咽頭部で、運動動作追跡位置も、痛み部位であるのど部とすればよい。
図２２に、以上説明した生物の患部位置、該患部に動作する生物部位、特定の運動動作、運動追跡位置の関係を示した。
発明を実施するための最良の形態
本発明の実施の形態に係る、生物の特定の運動動作を定量化して観察を自動化する装置を、図１７と図１８で説明する。本装置は、生物の特定の運動動作に基づいて決定された生物表面の複数の運動動作追跡位置を、色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布することにより、かかる運動動作を定量化する装置であって、図２２に例示されるような運動動作追跡位置が決定されていることが前提条件である。
本装置は、運動動作追跡位置として決定された生物の患部位置及び生物が該患部に動作をする生物部位に、図１７中のＭ１、Ｍ２のごとく色素あるいは蛍光物質を含む塗料を塗布した生物１に、光を照射する照射手段２と、生物を前記照射手段の下で撮像する撮像手段３と、撮像された画像データ及び弁別条件データ（図１７中の外部設定入力１６）から、前記の塗料塗布部を弁別する弁別手段１３と、弁別された塗料塗布部の座標データ及び動作判定条件データ（図１７中の外部設定入力１７）から、特定の運動動作を判定してその動作回数を出力する運動動作カウント手段１４とを有することを特徴とする。
夜行性動物を観察する場合には、塗料を蛍光塗料とし、光を照射する照射手段２をブラックライトなどの紫外線照射手段として、Ｍ１、Ｍ２部分の可視光波長の蛍光発光を撮像手段３で撮影すればよい。
撮像手段３は、ＣＣＤカメラなどのカラーデジタル撮像装置であって、デジタルビデオ装置など動画像記録手段１１に接続して、動画像データを一時記録してもよい。動画像は、画像モニター１２でモニターする。市販のデジタルビデオカメラは、撮像手段３と動画像記録手段１１と画像モニター１２が一体化したものも多く、それを用いてもよい。
図１７に示す本装置は、カウント値の表示装置１５（運動動作回数の表示手段）を有する。また、図１７の外部設定入力１６は、弁別条件データである輝度あるいは色彩の条件データであり、図１７の外部設定入力１７は、動作判定条件データである距離の条件データである。図１７における装置３０が、本発明の特定の運動動作を定量化する装置の一実施の形態に係る部分である。この装置３０には、モニター１２があってもなくてもよい。
図１８が、弁別手段１３と、運動動作カウント手段１４の説明図である。図１８でこれらを説明する。弁別手段１３には、撮像手段３あるいは動画像記録手段１１から、画像データが、各画像フレームの画素の輝度データ、色彩データ、その画素の座標データと共に入力される。そして、あらかじめ設定されている色彩の条件データが入力され（図１８中の外部設定入力１６）、この条件データと画像データとを比較して条件に合致する画像データの座標を抽出する。この条件データが輝度の条件であってもかまわないし、色彩と輝度の組み合わせ条件でもかまわない。
簡単な抽出例としては、運動動作追跡位置に赤色の塗料を塗布した場合に、外部設定入力１６の条件データとして、Ｒ（赤）のデータ値が大きいという条件を入力する。そして、画像フレームの各画素の色彩データにて、Ｒ（赤）のデータ値が条件データより大きい画素の座標データを選択抽出する。その座標データを運動動作カウント手段１４に出力する。
運動動作カウント手段１４は、各画像フレームの条件に合致する全座標にて、それらの代表点（代表座標）を決定する代表点決定手段１８、及び、代表点決定手段１８で決定された代表点間の距離を演算する代表点間距離演算手段１９、及び、点間距離演算手段１９で演算された代表点間距離データと、あらかじめ設定された距離の条件データ（図１８中の外部設定入力１７）とから、特定の運動動作の発生を判定して、運動動作回数をカウントする運動動作判定及び計数手段２０、とからなる。
代表点決定手段１８は、弁別手段１３より得られた色彩あるいは輝度の条件データに合致する全座標データにおいて、各座標軸の最大最小の値を抽出し、それらの中間値を演算して代表値とし、その座標データを出力する。弁別手段１３は、上記のような色彩や輝度の条件値との大小で弁別する以外のものでもよい。また、代表点決定手段も、上記のような座標中間値を代表値とする以外のものでかまわない。具体的には、画像差分法、２値化法、楕円近似および重心抽出などの画像処理法を必要に応じて採用し、それらに基づいた弁別、代表点決定を行ってもかまわない。
代表点間距離演算手段１９では、ひとつの画像フレームで決定された代表点間の距離を演算する。運動動作判定及び計数手段２０は、代表点間距離演算手段１９で演算された代表点間の距離と、あらかじめ設定された距離の条件データを入力し（図１８中の外部設定入力１７）、たとえば、その条件データよりも代表点間の距離が小さい場合に、その画像フレームの撮影時刻にて動作が発生したとして、運動動作判定及び計数手段２０の内部にもつカウンターをカウントアップする。この動作判定は、距離の条件データをもちいた任意の方法でかまわない。たとえば、条件値より大きな値から小さな値になったら一回にカウントするとしてもよいし、図１２に示すように、いったん条件値より大きな値から小さな値になり、大きな値に戻る往復運動で、一回とカウントしてもよい。
実験画像を撮影した動物ケージ番号と、各画像フレームの時刻と、代表点間距離と、その画像フレームの画像データの格納記憶アドレスとを、図１９、図２０のようにケージ番号１およびケージ番号２のデータとしてセットで記憶しておくと便利である。座標、色彩データなどは、画像フレームアドレスにセットで格納しておいて、必要に応じて引用すればよい。例えば図１９のデータは、ケージ番号１の新薬投与したマウスに係るもの、図２０のデータは、ケージ番号２のプラシーボ（疑似薬）投与マウスに係るものとしておくと、ある時刻、同時刻の両者の距離データが瞬時に引用でき、比較が容易であるし、そのときの画像も引用できる。
上記データセットを利用するなどで、定量化の処理を行う観察時間を自由に設定できる。すなわち、その設定観察時間内のデータセットのみを運動動作判定及び計数手段２０で処理させれば、その観察時間における新薬投与したマウスとプラシーボ（疑似薬）投与マウスの動作回数データが得られ、これで定量的に評価できる。また、データ採取時間間隔も、上記データセットを３データおきに間引いて用いるなどすれば、容易に変更できる。さらに、動作の画像で実際にどういった状態で動作カウントされたのか、も画像フレームのアドレスを引用してチェックすることもできる。このチェックにて、おかしな動作カウントが多い場合などは、動作判定条件の距離データを設定変更して、運動動作判定及び計数手段２０で再処理させればよい。
このように、さまざまな条件を変えて、それら条件下、同時間における新薬投与したマウスとプラシーボ（疑似薬）投与マウスの運動動作の定量データが得られるので便利である。条件の中でもっとも信頼性の高いもので新薬を評価することができるし、あらたな条件変更が必要で通常は、実験のやりなおしを行うケースでも、本発明の実施の形態では容易に条件変更ができ、再実験しなくても結果が得られる。
図１７の装置３０が、本発明の一実施の形態に係る特定の運動動作を定量化する装置の部分である。本定量化装置は、ここまでに説明した塗料塗布といったマーキング方法は任意でよい。すなわち、本定量化装置は、複数の運動動作追跡位置をマーキングした生物を撮影した画像データ及び弁別条件データ（外部設定入力１６）を入力し、画像データ及び弁別条件データとから、前記マーキング部を弁別する、マーキング部の弁別手段１３と、弁別されたマーキング部の座標データと、動作判定条件データ（外部設定入力１７）とから、特定の運動動作を判定してその動作回数を出力する、運動動作カウント手段１４とを有する。
図２１に本定量化装置（パーソナルコンピュータ）のモニター部の表示例を示す。これは、マーキングされた実験動物の動画像を入力して処理中の画面である。この画面には、ケージ番号１の画像データ再生部である動画像モニター画面のウインドＭｏ１、及びケージ番号２の画像データ再生部である動画像モニター画面のウインドＭｏ２がある。表示部Ｃｒｇｂには、カーソルＣｓの指し示す画像位置の色彩デジタルデータ（ＲＧＢ値）が表示される。使用者は、その色彩デジタルデータをウインドＭｏ１の画像を見ながら、マーキング部の弁別のための色彩の条件データ入力部ＩＮＰ１で条件を入力でき、便利である。
つまり、カーソルＣｓの指し示す画像位置で、ここが抽出部であると確信できるところの色彩デジタルデータ（ＲＧＢ値）を条件データ入力部ＩＮＰ１にコピーすればよい（図１８中の外部設定入力１６）。この例は、色彩データであるが輝度データであっても全く同様である。さらに、図２１の条件データ入力部ＩＮＰ２では、運動動作判定のための距離の条件データ（図１８中の外部設定入力１７）、データ採取時間間隔、観察始まり時刻と終了時刻の入力ができる。これらの条件入力を受けて図１８中の弁別手段１３及び運動動作カウント手段１４に処理を実行させ、表示部Ｃｔ１にケージ番号１のカウント値、表示部Ｃｔ２にケージ番号２のカウント値を表示する。
上記のパーソナルコンピュータなどといった定量化装置で、任意の方法でマーキングされた動物の撮像画像を処理できる。すなわち、任意の方法でマーキングした生物を撮影した画像データを入力する入力インタフェースカードなどが、パソコンに配備され、図２１で説明したマンマシンインターフェイスを司るソフトウェアがパーソナルコンピュータにインストールされればよい。
本装置の弁別手段１３は、前記同様、撮像された画像フレームの輝度あるいは色彩データと、条件データ入力部ＩＮＰ１等であらかじめ設定された輝度の条件データあるいは色彩の条件データとから、それらを比較して条件に合致する画像データの座標を抽出し、その座標を出力するものである。
また、運動動作カウント手段１４も、前記同様、各画像フレームの条件に合致する全座標にて、それらの代表点（代表座標）を決定する代表点決定手段１８、及び、代表点決定手段１８で決定された代表点間の距離を演算する代表点間距離演算手段１９、及び、代表点間距離演算手段１９で演算された代表点間距離データと、条件データ入力部ＩＮＰ２等であらかじめ設定された距離の条件データ（図１８中の外部設定入力１７）とから、特定の運動動作の発生を判定して、運動動作回数をカウントする運動動作判定及び計数手段２０、とからなるものである。
これにより、動物実験で、損傷やストレスのない運動動作データ採取法を提供できる。また、採取データに基づいて、客観的に運動動作を定量化できる簡便かつ安価な方法を提供できる。さらに、マウス、猫、コウモリなどの夜行性動物が、自然な行動をとる暗環境でデータを採取する方法、およびこれらを実現する装置を提供できる。さらに、いちど動画像データを撮影すれば、動画像を見ながら動作判定条件など自由に変更でき動作定量データを再取得できる便利な装置構成を提供できる。
なお、図面中の各符号及び記号の意味は、次の通りである。
１  運動動作追跡位置を不定形に包含するように塗料を塗布された生物
２  可視光ランプやブラックライト等紫外線ランプなど生物に光を照射する照射手段
３  ＣＣＤカメラなど撮像手段
４  塗料塗布部（マーキング部）を弁別して得た座標から決定された代表点
５  塗料塗布部（マーキング部）を弁別して得た上下座標の最大最小の幅
６  幅５の中心位置座標を示す線
７  塗料塗布部（マーキング部）を弁別して得た左右座標の最大最小の幅
８  幅７の中止位置座標を示す線
９  刺激物質を注射投与する注射器
１０  注射器９の注射位置
１１  デジタルビデオ装置など動画像記録手段
１２  画像モニター
１３  塗料塗布部（マーキング部）を弁別する弁別手段
１４  画像データと条件データとから運動動作を判定して動作回数を出力する運動動作カウント手段
１５  カウント値の表示装置（運動動作回数の表示手段）
１６  輝度あるいは色彩の条件データの外部設定入力
１７  距離の条件データの外部設定入力
１８  塗料塗布部（マーキング部）の代表点決定手段
１９  代表点間距離演算手段
２０  運動動作判定及び動作回数計数手段
３０  本発明の一実施の形態に係る特定の運動動作を定量化する装置
Ｃｒｇｂ  画像のカーソルＣｓが示す箇所の色彩デジタルデータ（ＲＧＢ値）の表示部
Ｃｓ  カーソル
Ｃｔ１  ケージ番号１のカウント値の表示部
Ｃｔ２  ケージ番号２のカウント値の表示部
Ｄａｔａ  ある時刻の代表点間の距離（間隔）のデータ・プロット
ＩＮＰ１  マーキング部弁別のための色彩条件データの入力部分
ＩＮＰ２  距離の条件データ（Ｔｈ）、データ採取時間間隔、観察時間の入力部分
Ｍ１  頭部を不定形に包含するように塗料を塗布した部分
Ｍ２  後肢部を不定形に包含するように塗料を塗布した部分
Ｍ３  口唇部を不定形に包含するように塗料を塗布した部分
Ｍ４  痛みを誘導する刺激物質注射部を不定形に包含するように塗料を塗布した部分
Ｍ５  刺激物質を塗布された鼻部を不定形に包含するように塗料を塗布した部分
Ｍ６  前肢部を不定形に包含するように塗料を塗布した部分
Ｍｏ１  ケージ番号１の画像データ再生部
Ｍｏ２  ケージ番号２の画像データ再生部
Ｔｈ  あらかじめ設定された距離の条件データを示すレベル（スレッショルド・レベル）
×  マウス頭頂部のマーキング部の代表点位置を示す記号
＋  マウス後肢先端部のマーキング部の代表点位置を示す記号
産業上の利用可能性
本発明によれば、薬効試験などの生物実験にて、生物に異物を取り付けないので、生物ストレスがなく、かつ夜行性の生物を暗所で撮像できるので、自然な状態であり実験の客観性、信頼性を高くすることができる。マーキングの事前準備が簡単であり、振動センサーや磁気センサーなどの器具を生物に取り付けたりしないので、生物損傷も少ない。検知装置のついたチェンバーも不要である。客観的な動物行動の定量化が自動化でき、行動判定のための多数の人材が必要でなくなり、観察者が常時監視するなどの過酷な労働もなくなる。
また、動画像処理にて全画像データを逐一処理して動作判定するのではなく、マーキング部だけを抽出してその代表点を求めて代表点間の距離演算というきわめて単純な演算で定量データが得られるので、処理時間が短く実用的である。また、動画像を再生し、それを見ながらマーキング部抽出条件、動作判定距離判定条件などを変更入力でき、便利である。しかも、そういった条件変更を同じ動画像データを用いて繰り返して再処理できるので、再実験の頻度が激減する。
さらに、特定の運動動作にて客観性、信頼性が高い最適な判定条件を条件変更しながら探索的に求めることができるので、それら最適判定条件をもとに、運動動作判定の定量化標準が決定できる、というユニークな効果も期待できる。
動物の薬効試験を用いて説明したが、本発明はその他昆虫、魚類などを含む一般の生物実験、生物試験にも応用できる。ヒトの臨床試験等への適用も例外ではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の生物運動動作の観察自動化の方法の作業フロー説明図である。
図２は、アトピー性皮膚炎モデル動物であるマウスと、その掻痒動作の説明図である。
図３は、頭部と後肢をマーキングしたマウスの図である。
図４は、４つのケージにそれぞれマーキングしたマウスを撮影した画像例を示す図である。
図５は、蛍光マーキングされたマウスを紫外線照射下で撮影した画像例を示す図である。
図６は、マーキングされたマウス画像から代表点を決定する方法の説明図である。
図７は、図５の画像に代表点を加えた図である。
図８は、代表点間の距離（間隔）のデータを時間軸上にプロットしたグラフ（Ｔｈ値が高い例）を示す図である。
図９は、代表点間の距離（間隔）のデータを時間軸上にプロットしたグラフ（Ｔｈ値が低い例）を示す図である。
図１０は、データ採取時間間隔を図８の場合の三分の一としたデータプロットグラフを示す図である。
図１１は、データ採取時間間隔を図９の場合の三分の一としたデータプロットグラフを示す図である。
図１２は、運動動作の一回を判定する方法の例を説明する図である。
図１３は、花粉症の薬効試験の実験モルモットとクシャミ動作、鼻すすり動作の説明図である。
図１４は、刺激物質を塗布した鼻先部と前肢をマーキングしたモルモットの図である。
図１５は、鎮痛剤の薬効試験の実験ウサギと痛む部位を噛む動作の説明図である。
図１６は、刺激物質の注射部と口唇部をマーキングしたウサギの図である。
図１７は、本発明の実施の形態に係る生物運動動作の観察自動化装置、及び特定の運動動作を定量化する装置の構成図である。
図１８は、弁別手段１３および運動動作カウント手段１４の説明図である。
図１９は、ケージ番号１のデータの一部（座標、色彩データは画像フレームアドレスに格納）を示す図である。
図２０は、ケージ番号２のデータの一部（座標、色彩データは画像フレームアドレスに格納）を示す図である。
図２１は、本発明の実施の形態に係る特定の運動動作を定量化する装置（パーソナルコンピュータ）の表示例を示す図である。
図２２は、生物の患部位置、該患部に動作する生物部位、特定の運動動作及び運動追跡位置の関係を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2003067973.tif 000016
【図１５】
2003067973.tif 000017
【図１６】
2003067973.tif 000018
【図１７】
2003067973.tif 000019
【図１８】
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【図１９】
2003067973.tif 000021
【図２０】
2003067973.tif 000022
【図２１】
2003067973.tif 000023
【図２２】
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【国際調査報告】
2003067973.tif 000025
2003067973.tif 000026
2003067973.tif 000027
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