(57)【要約】本発明は、脂質過酸化反応産物をリガンドとする新規なＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子を提供する。また、新規なリガンド及び作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）の同定方法、及び、リガンド、作用薬等を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。詳細には、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する精製された蛋白質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する精製された蛋白質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質とその全長にわたり７５％以上のアミノ酸配列の相同性を有する蛋白質であり、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質。
【請求項４】
脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される１以上のものである、請求項２又は３に記載の蛋白質。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンドによる刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンドによる刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
【請求項５】
脂質過酸化反応産物が４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項６】
組換え蛋白質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項７】
哺乳動物の蛋白質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項７記載の蛋白質。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする塩基配列を有する単離された核酸。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有する単離された核酸。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有する核酸と相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
【請求項１１】
配列番号１の核酸と、その翻訳領域の全長にわたり少なくとも７５％以上の相同性を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
【請求項１２】
脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される１以上のものである、請求項１０又は１１に記載の核酸。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンドによる刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンドによる刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
【請求項１３】
脂質過酸化反応産物が４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４】
ＤＮＡである、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１５】
哺乳動物の核酸である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項１８】
請求項９〜１６のいずれか１項に記載の核酸、又は、請求項１７に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
【請求項１９】
請求項６に記載の組換え蛋白質を細胞表面上に発現している、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１７に記載の組換えベクターを用いて、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の細胞における機能又は生物学的活性を増強する方法。
【請求項２２】
以下の工程を含む、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質の製造方法。
（Ａ）請求項１８又は１９に記載の細胞を培養する工程、
（Ｂ）培養物から蛋白質を回収する工程。
【請求項２３】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ、該核酸の発現を抑制し得るアンチセンス核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載のアンチセンス核酸を細胞に導入することからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質の機能又は生物学的活性を中和する抗体。
【請求項２６】
請求項２５に記載の抗体と細胞とを接触させることを含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
【請求項２７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
【請求項２８】
下記の工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質に対するリガンドを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物と接触させる工程、
（Ｂ）該蛋白質と該試験化合物との特異的結合を検出する工程、
（Ｃ）該蛋白質と試験化合物との特異的結合の有無又は強度を判定する工程。
【請求項２９】
下記の工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物及び所望によりリガンドと接触せしめる工程、
（Ｂ）細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を検出する工程、及び
（Ｃ）該試験化合物が、細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
【請求項３０】
下記の工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物及び所望によりリガンドと接触させる工程、
（Ｂ）細胞内のＣａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化又はＫ＋の濃度変化を測定する工程、
（Ｃ）該変化の測定により、該試験化合物が、細胞内シグナル伝達を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
【請求項３１】
下記の工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）試験化合物及び所望によりリガンドの存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合を検出する工程、
（Ｄ）該結合を検出することにより、該試験化合物がＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
【請求項３２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質が、該蛋白質を含む膜画分の形態のもの、又は、該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞の形態のものである請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞が、該蛋白質をコードする核酸又はこれを含む発現ベクターを導入して該蛋白質を発現させた細胞である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
医薬の選別、同定もしくは特徴づけのために使用されるものである、請求項２７〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
リガンドが、４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法により、アゴニスト又はアンタゴニストを同定し、当該アゴニスト又はアンタゴニストを、担体とともに混合することからなる、医薬組成物の製造方法。
【請求項３７】
請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法により同定されたアンタゴニストを、細胞と接触せしめて、該細胞における脂質過酸化反応産物の受容体の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、脂質過酸化反応産物をリガンドとする新規なＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子に関する。また、これらを用いた医薬品候補化合物の同定方法及び医薬組成物に関する。
背景技術
多くの神経伝達物質、ホルモン、オータコイドなどの生理活性物質は、細胞表面に存在する特異的な受容体蛋白質を介して、生体の機能を調節している。このような受容体の多くは、細胞内に存在する三量体のＧＴＰ結合蛋白質（以下、Ｇ蛋白質と称する）と共役しており、その活性化を通じて情報を細胞内に伝達することが知られている。このことから、これら受容体はＧ蛋白質共役型受容体と総称される。Ｇ蛋白質共役型受容体は、いずれも７個の膜貫通領域を含む共通の構造を有していることが知られている。
Ｇ蛋白質は、α、β及びγサブユニットで構成される三量体であり、基底状態ではこれらサブユニットが会合した不活性型（ＧＤＰ結合型）として存在する。リガンド刺激を受けたＧ蛋白質共役型受容体により、不活性型（ＧＤＰ結合型）Ｇ蛋白質が活性型（ＧＴＰ結合型）へと変換され、ＧＴＰと結合したαサブユニット（Ｇα）とβ／γサブユニット複合体（Ｇβγ）とに解離する。そして、ＧＴＰと結合したＧα（また場合によってはＧβγ）が、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣなどの効果器を制御してシグナルを伝達する。
Ｇ蛋白質はＧαに多様性があり、Ｇαの種類によって異なる効果器を制御する。
一般に、Ｇ蛋白質共役型受容体は特定の種類のＧ蛋白質を活性化し、そのＧ蛋白質により特定の情報を細胞内に伝える。
Ｇ蛋白質共役型受容体としては、これまでに、α−及びβ−アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アンジオテンシン受容体、エンドセリン受容体、ゴナドトロピン放出因子受容体、Ｈ１−及びＨ２−ヒスタミン受容体、ドーパミン受容体、代謝型グルタミン酸受容体、ソマトスタチン受容体、プリン受容体などが知られている。
上記のような受容体は、いずれも生理活性物質の標的として、生体内での重要な役割を担っている。さらに、現在までに知られている医薬品の多くが、やはりＧ蛋白質共役型受容体を標的とするリガンド、あるいはアゴニストやアンタゴニストであったという事実も非常に意義深い。
これらのことから、Ｇ蛋白質共役型受容体は、医薬品開発の標的として注目されている。従って、新たなＧ蛋白質共役型受容体を見出すこと、そのリガンドを同定すること、及び、それらのアゴニストやアンタゴニストを同定する方法を見出すことは、新たな医薬品候補化合物の同定につながり、そのような同定や開発が強く望まれている。
しかしながら、これまでにすべてのＧ蛋白質共役型受容体が確認されているわけではなく、未だ、未知の受容体（オーファン受容体）が数多く存在していると考えられる。このため、それらのオーファン受容体の特定とそれに対応するリガンドの探索を行い、その機能解明と利用が切望されている。
近年、生体内で発現しているｃＤＮＡの配列をランダムに解析し、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されてきているが、ＥＳＴ情報の多くは配列情報のみが開示されているにすぎず、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質の探索の分野においても、ＥＳＴ配列から遺伝子の活性や機能を推定することは容易ではない。
一方、生体が酸化ストレスを受けた場合、脂質膜の過酸化反応産物（脂質の過酸化物の分解物）として４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ヒドロキシノネナールまたは４−ヒドロキシノン−２−エナールとも称する）等のアルデヒドが生体内で産生されることが知られている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：８１−１２８，１９９１）。これらの脂質過酸化反応産物は、生成後にタンパク質と結合することが報告されており、例えば、老化（Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１２２０−１２２４，１９９２）、動脈硬化（Ｐａｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１３７２−１３７６，１９８９）、パーキンソン病（Ｙｏｒｉｔａｋａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２６９６−２７０１，１９９６）、アルツハイマー病（Ｍａｒｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６８：２５５−２６４，１９９７；Ｋｒｕｍａｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：５０８９−５１００，１９９７）等の疾患と関係していることが報告されている。しかしながら、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体についてはこれまで報告されていない。
発明の開示
本発明の目的は、脂質過酸化反応産物をリガンドとする新規なＧ蛋白質共役型受容体及びその遺伝子を提供することにある。また、当該受容体蛋白質を用いたリガンド及び作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）の同定方法及び医薬組成物を提供することにある。さらには、上記以外の目的については以下の記載より明らかである。
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、新しいＧ蛋白質共役型受容体をコードする全長ｃＤＮＡをヒトから単離した。また、この受容体蛋白質を遺伝子組換え技術により細胞中で発現させることに成功した。さらにリガンドの同定を行い、この受容体が脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体であることを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３７）を提供する。
（１）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質。
（３）  配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質とその全長にわたり７５％以上のアミノ酸配列の相同性を有する蛋白質であり、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質。
（４）  脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される１以上のものである、（２）又は（３）に記載の蛋白質。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンドによる刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンドによる刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
（５）  脂質過酸化反応産物が４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、（２）〜（４）のいずれかに記載の蛋白質。
（６）  組換え蛋白質である、（１）〜（５）のいずれかに記載の蛋白質。
（７）  哺乳動物の蛋白質である、（１）〜（６）のいずれかに記載の蛋白質。
（８）  哺乳動物がヒトである、（７）に記載の蛋白質。
（９）  （１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質をコードする塩基配列を有する単離された核酸。
（１０）  以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有する単離された核酸。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有する核酸と相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
（１１）  配列番号１の核酸と、その翻訳領域の全長にわたり少なくとも７５％以上の相同性を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
（１２）  脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される１以上のものである、（１０）又は（１１）に記載の核酸。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンドによる刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンドによる刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
（１３）  脂質過酸化反応産物が４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の核酸。
（１４）  ＤＮＡである、（９）〜（１３）のいずれかに記載の核酸。
（１５）  哺乳動物の核酸である、（９）〜（１４）のいずれかに記載の核酸。
（１６）  哺乳動物がヒトである、（１５）に記載の核酸。
（１７）  （９）〜（１６）のいずれかに記載の核酸を含む組換えベクター。
（１８）  （９）〜（１６）のいずれかに記載の核酸、又は、（１７）に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
（１９）  （６）に記載の組換え蛋白質を細胞表面上に発現している、（１８）に記載の細胞。
（２０）  （１０）〜（１２）のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
（２１）  （１７）に記載の組換えベクターを用いて、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の細胞における機能又は生物学的活性を増強する方法。
（２２）  以下の工程を含む、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質の製造方法。
（Ａ）（１８）又は（１９）に記載の細胞を培養する工程、
（Ｂ）培養物から蛋白質を回収する工程。
（２３）  （９）〜（１１）のいずれかに記載の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ、該核酸の発現を抑制し得るアンチセンス核酸。
（２４）  （２３）に記載のアンチセンス核酸を細胞に導入することからなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
（２５）  （１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質の機能又は生物学的活性を中和する抗体。
（２６）  （２５）に記載の抗体と細胞とを接触させることを含んでなる、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
（２７）  （１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質を用いて、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（２８）  下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するリガンドを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物と接触させる工程、
（Ｂ）該蛋白質と該試験化合物との特異的結合を検出する工程、
（Ｃ）該蛋白質と試験化合物との特異的結合の有無又は強度を判定する工程。
（２９）  下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物及び所望によりリガンドと接触せしめる工程、
（Ｂ）細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を検出する工程、及び
（Ｃ）該試験化合物が、細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３０）  下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）該蛋白質を試験化合物及び所望によりリガンドと接触させる工程、
（Ｂ）細胞内のＣａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化又はＫ＋の濃度変化を測定する工程、
（Ｃ）該変化の測定により、該試験化合物が、細胞内シグナル伝達を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３０）  下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）試験化合物及び所望によりリガンドの存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合を検出する工程、
（Ｄ）該結合を検出することにより、該試験化合物がＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３１）  下記の工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
（Ａ）  （１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）試験化合物及び所望によりリガンドの存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合を検出する工程、
（Ｄ）該結合を検出することにより、該試験化合物がＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
（３２）  （１）〜（８）のいずれかに記載の蛋白質が、該蛋白質を含む膜画分の形態のもの、又は、該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞の形態のものである（２７）〜（３１）に記載の方法。
（３３）  該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞が、該蛋白質をコードする核酸又はこれを含む発現ベクターを導入して該蛋白質を発現させた細胞である（３２）に記載の方法。
（３４）  医薬の選別、同定もしくは特徴づけのために使用されるものである、（２７）〜（３１）のいずれか記載の方法。
（３５）  リガンドが、４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、（２９）〜（３１）のいずれか記載の方法。
（３６）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の方法により、アゴニスト又はアンタゴニストを同定し、当該アゴニスト又はアンタゴニストを、担体とともに混合することからなる、医薬組成物の製造方法。
（３７）  （２９）〜（３１）のいずれか記載の方法により同定されたアンタゴニストを、細胞と接触せしめて、該細胞における脂質過酸化反応産物の受容体の機能又は生物学的活性を抑制する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−１１３８２９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、第１の態様において、以下の蛋白質を提供する。
第１の蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を提供する。このような蛋白質としては、配列番号１で示される当該ｃＤＮＡにコードされる受容体蛋白質（以下、「ＴＧ００３９蛋白質」と称する）のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
第２の蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質を提供する。
このような蛋白質としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが挙げられる。ここで、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が失われない程度であればよく、通常１〜約８０個、好ましくは１〜約６０個、より好ましくは１〜約４５個、さらに好ましくは１〜約３０個、さらに一層好ましくは１〜約１５個である。また、本発明の蛋白質の具体例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と比較して１若しくはそれ以上の保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を有する蛋白質が挙げられる。
このような蛋白質には、自然界で発見される変異型蛋白質のほか、人為的に改変した変異型蛋白質、異種生物由来の蛋白質等が含まれる。従って、このような蛋白質には、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の保存的置換変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ）及び自然発生対立変異体（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）が含まれる。
第３の蛋白質としては、配列番号２のアミノ酸配列からなる蛋白質とその全長にわたり７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに一層好ましくは約９５％以上のアミノ酸配列の相同性を有する蛋白質であり、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質を提供する。
「相同性」とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上の蛋白質（又はポリヌクレオチド）の間の関係であって、蛋白質（又はポリヌクレオチド配列）間の適合によって決定されるような、蛋白質（又はポリヌクレオチド配列）間の配列の相関の程度を意味する。「相同性」は、当該技術分野において公知の方法により容易に決定できる。例えば、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）プログラムを用いて決定することができる。
上記の各種蛋白質はＧ蛋白質共役型受容体の一種であり、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する。本明細書において、脂質過酸化反応産物とは脂質の過酸化物の分解物などを意味し、これには、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（別称：４−ヒドロキシノネナールまたは４−ヒドロキシノン−２−エナール、以下、４−ＨＮＥと称する）が含まれる。本発明の蛋白質は、脂質過酸化反応産物（４−ＨＮＥ等）と特異的に結合する。そして、これらの特異的結合により、受容体蛋白質は刺激されて細胞内シグナル伝達が誘導される。
また、本発明の受容体蛋白質は、該蛋白質に特異的に結合する上記のような物質により刺激を受けると、Ｇｉサブファミリーに属するＧ蛋白質を活性化する。例えば、Ｇ蛋白質のαサブユニットに着目すると、本発明の受容体蛋白質は、特異的に結合する物質による刺激を受けるとＧｉα（Ｇｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニット、例えばＧｉα１）を活性化型（ＧＴＰ結合能を有する状態）に変換する。そして、かかるＧ蛋白質の活性化を介して細胞内でシグナルを伝える。
従って、本発明の蛋白質は、脂質過酸化反応産物の受容体であり、以下にまとめた（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１以上の機能又は生物学的活性を有する。そして、このことは、本願明細書実施例に記載の通りである。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
ここで、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）としては、４−ＨＮＥなどが挙げられる。
本発明の蛋白質は、哺乳動物、例えば、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物又はヒトに由来するペプチドであってよく、また、合成蛋白質であってもよい。蛋白質の合成は、当該技術分野で公知の常法によって実施することができる。
本発明は、第２の態様において、前記蛋白質をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を提供する。さらに詳しくは、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの塩基配列を包含する単離された核酸を提供する。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸。
なお、配列番号１は、ＴＧ００３９蛋白質の遺伝子（以下、「ＴＧ００３９遺伝子」と称する）のヒト由来ｃＤＮＡ（翻訳領域全長を含む）の塩基配列を表すものである。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る」とは、通常、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことによりハイブリダイゼーションを実施できることを意味する。また、「ハイストリンジェントな条件（より高いストリンジェンシーを有する条件）」とは、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できることを意味する。なお、配列番号１で示されるＴＧ００３９遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体受容体としての機能又は生物学的活性を有する蛋白質をコードするものであればよい。
また、本発明の核酸には、配列番号１で示される塩基配列と、その翻訳領域の全長にわたり、通常約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸をも含まれる。
以上のような遺伝子又は核酸には、自然界で発見されるか、又は、人為的に改変された変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等も含まれる。
本発明の核酸は、例えば、哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源として同定を行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利用する上では、ヒト由来のものを用いることが望ましい。
また、本発明の核酸は、配列番号１で表される遺伝子の配列情報を利用して取得することもできる。例えば、配列番号１の配列情報に基づいてプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法を適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得することができる。
具体的には、哺乳動物の細胞や組織から調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡ断片を得る。得られたｃＤＮＡをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法又はプラークハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡライブラリーを同定して、全長ｃＤＮＡを取得できる。また、ゲノミックＤＮＡライブラリーを同定することにより、ゲノム遺伝子を単離することができる。また、他の哺乳動物のＤＮＡライブラリーを同定することにより、異種生物由来の相同遺伝子（オルソローグ）を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子産物の蛋白質をコードする翻訳領域を決定でき、取得した蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。
上記のようにして得られる本発明の核酸は、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードするものであり、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の機能又は生物学的活性を有することは、本願明細書実施例に記載の通りである。
本発明は、第３の態様において、上記蛋白質を産生する方法を提供する。産生する方法は、本発明の核酸を含む組換えベクターを調製し、本発明の核酸又は該組換えベクターで形質転換した細胞を取得し、該細胞を培養し、培養物から蛋白質を回収することによって達成することができる。
上記方法は、具体的には、通常の遺伝子組換え技術により本発明の蛋白質を発現させ生産する方法が挙げられるが、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の形で発現させ生産する方法も含まれる。
本発明の蛋白質を発現する細胞は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入する。
発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系などが挙げられる。このうち、機能がよく保存された蛋白質を得るためには、昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ＳＦ９、ＳＦ２１等）及び哺乳動物細胞（サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等）を宿主として用いることが好ましい。
本発明の蛋白質を発現させるためのプロモーターとしては、哺乳動物細胞系の場合、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等、昆虫細胞系の場合、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。
ベクターとしては、哺乳動物細胞系の場合、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等、昆虫細胞系の場合、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。
上記発現系で用いる本発明の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、自然界に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるもの）を用いることができるが、これに限定されない。例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したＰＣＲ法や部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２〜５６６６頁、１９８４年）等によって実施できる。
本発明の蛋白質は、上記のような発現ベクターを導入した細胞の培養物中に産生され、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法など）を適宜組合せることによって、分離精製できる。
本発明は、第４の態様において、細胞における本発明の蛋白質の機能又は生物学的活性を増強する方法を提供する。
増強する方法としては、細胞における本発明の蛋白質の発現を高めることによって達成できる。具体的には、上記第３の態様において得られた、組換え発現ベクターを細胞に導入することによって行うことができる。また、本発明の蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸を当技術分野において公知の技術を用いて細胞に直接導入してもよい。
本発明は、第５の態様において、本発明の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ、該核酸の発現を抑制し得るアンチセンス核酸と、それを用いた本発明の蛋白質としての機能又は生物学的活性を抑制する方法を提供する。
例えば、本発明の請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸に相補的な塩基配列を有し、かつ、該核酸の発現を抑制し得るアンチセンス核酸は、リボザイム、デコイとして使用することもできる。この場合、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸（センス鎖又はアンチセンス鎖）の、通常、連続する１４塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を有するヌクレオチドを用いるのが好ましい。
該アンチセンス核酸は、細胞に導入し、該蛋白質をコードする遺伝子の発現を変調させることによって、本発明の受容体蛋白質としての機能又は生物学的活性を変化（例えば、抑制）することができる。
例えば、アンチセンス核酸は、標的核酸配列を含む細胞に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などのＤＮＡトランスフェクション法、又はウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用を含む遺伝子導入法などの当該技術分野で公知の方法を用いて導入することによって、本発明の蛋白質としての機能又は生物学的活性を変調（例えば、抑制）することができる。例えば、適切なレトロウイルスベクターを用いて該オリゴヌクレオチドを発現するベクターを調製し、その後、該発現ベクターを細胞とｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入すればよい。
また、該オリゴヌクレオチド又はその相補物をプローブとして用いることによって、本発明の遺伝子を検出することもできる。
本発明は、第６の態様において、本発明の蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質の機能又は生物学的活性を中和する抗体、及び、該抗体を用いて本発明の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制する方法を提供する。
本発明の蛋白質を認識し、特異的に結合する抗体は、本発明の蛋白質、又はこれと免疫学的同等性を有する蛋白質若しくはペプチド、例えば、蛋白質の断片又は部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて取得することができる。ここで、免役学的同等性を有するとは、例えば、本発明の蛋白質に対する抗体と交差反応を生じるということを意味する。また、抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができる。モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。また、モノクローナル抗体の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体等を作製できる。
上記で得られた抗体を用いて、通常の免疫化学的方法（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ法など）により、本発明の蛋白質の細胞中又は組織中などにおける発現を検出することができる。あるいは、抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより本発明の蛋白質の精製を実施することができる。
また、本発明の中和抗体と細胞とを接触させることによって、本発明の蛋白質の機能又は生物学的活性を抑制することができる。例えば、本発明の中和抗体を免疫原性アジュバント等の不活性成分又は治療的使用のためにさらなる有効成分と、安定化剤及び賦形剤とともに組み合わせ、濾過滅菌後、凍結乾燥物、又は安定化水性調製物中の貯蔵物として得ることができる。被験者へ投与する場合には、例えば、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射などの当該技術分野において公知である方法により行い得る。投与量は、患者、投与方法に応じて、当業者であれば適当な投与量を適宜選択し得る。
本発明の蛋白質は、前記のように以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から選択される機能又は生物学的活性を有する。
（ｉ）リガンドとの特異的結合。
（ｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導。
（ｉｉｉ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧ蛋白質の活性化。
ここで、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）には４−ＨＮＥが含まれ、細胞内シグナル伝達には、Ｃａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化及びＫ＋の濃度変化等が含まれる。
本発明の蛋白質（受容体）は、脂質過酸化反応産物と特異的に結合し、その結合により蛋白質が刺激され、Ｇ蛋白質を活性化し、その活性化を介して細胞内にシグナル伝達が誘導される。
「Ｇ蛋白質を活性化し、その活性化を介して」とは、Ｇ蛋白質を活性型（ＧＴＰ型）へと変換し、Ｇ蛋白質を構成するα、β及びγサブユニットをαサブユニット（以下、Ｇαと称する）とβ／γサブユニット複合体（以下、Ｇβγと称する）とに解離し、Ｇαがアデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣなどの効果器を制御してシグナルを細胞内に伝達することを意味する。また、Ｇαとしては、Ｇｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニット、例えば、Ｇｉα１が挙げられる。
（ｉ）の機能又は生物学的活性の検出方法は、例えば、次の工程を行うことによって達成できる。
（Ａ）本発明の蛋白質と検出可能に標識されたリガンドとを接触させる工程、
（Ｂ）該蛋白質とリガンドとの特異的結合の有無又は強度を検出する工程。
かかる結合の検出には、例えば、検出可能な標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付したリガンドを用い、この標識を測定することにより実施できる。また、その際、標識を付したリガンドとともに、非標識のリガンドを混合して用いる通常の競合アッセイにより特異的結合を検出してもよい。
（ｉｉ）の機能又は生物学的活性の検出方法は、例えば、次の工程を行うことによって達成できる。
（Ａ）本発明の蛋白質とリガンド（アゴニストとして作用するリガンド）とを接触させる工程、
（Ｂ）細胞内のＣａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化又はＫ＋の濃度変化を測定する工程。
本発明の蛋白質をより低いレベルで発現している（又は発現していない）細胞を対照として用い、このような対照細胞における細胞内シグナル伝達のレベルと比較して、それよりも細胞内シグナル伝達のレベルが高ければ、その程度に応じ（ｉｉ）の機能又は生物学的活性を有すると認められる。
細胞内シグナル伝達の検出の具体的な方法については、例えば、文献〔Ｃｈｅｎらの方法、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２６巻、第３４９−３５４頁、１９９５年（Ｃａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化）；  Ｇｒａｍｉｎｓｋｉらの方法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、第５９５７−５９６４頁、１９９３年（ホスホリパーゼＣの活性化）；  Ｓａｋｕｒａｉらの方法、Ｃｅｌｌ、第９２巻、第５７３−５８５頁、１９９８年（Ｃａ２＋の濃度変化）；  Ｈｏｌｌｏｐｅｔｅｒらの方法、Ｎａｔｕｒｅ、第４０９巻、第２０２−２０７頁、２００１年（Ｋ＋の濃度変化）；  Ｔａｔｅｍｏｔｏらの方法、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２５１巻、第４７１−４７６頁、１９９８年（ｐＨの変化）；  Ｈｉｎｕｍａらの方法、Ｎａｔｕｒｅ、第３９３巻、第２７２−２７３頁、１９９８年（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ）；特開平９−２６８号公報など〕に記載された方法に準じて行うことができる。
（ｉｉｉ）の機能又は生物学的活性の検出方法は、例えば、以下のようにして行うことができる。
（Ａ）本発明の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）の存在下又は非存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識を測定する工程、
（Ｄ）該検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合の存在又はレベルを検出する工程、
（Ｅ）リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）の存在下又は非存在下における該結合の有無又は強度を比較することにより、リガンド（アゴニストとして作用するリガンド）による刺激に基づくＧ蛋白質の活性化を判定する工程。
標識したＧＴＰ又はそのアナログには、例えば、ＧＴＰγＳ（グアノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））などの分解されにくいＧＴＰアナログを利用することができる。脂質過酸化反応産物の非存在下での結合レベルと比較して、脂質過酸化反応産物の存在下での結合レベルの方がより高ければ、その程度に応じ（ｉｉｉ）の機能又は生物学的活性があるものと認められる。
ここで、Ｇｉα及びその遺伝子については、既にアミノ酸配列及び塩基配列が知られている〔ヒトＧｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）／Ｂａｈｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、第１１５５５−１１５６２頁、１９９８年：ヒトＧｉα１／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ０５５０１３、ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ０４８９８：等〕。従って、ＧｉαをコードするＤＮＡは、開示されている前記の既知配列情報を利用して、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、コロニーハイブリダイゼーション法）プラークハイブリダイゼーション法又はこれらを適宜組合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得できる。ＧｉαをコードするＤＮＡを、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの下流に結合し、それを適当なプロモータを含むベクターに組込んで、融合蛋白質を発現させるためのベクターを得ることができる。その融合蛋白質の発現ベクターを、細胞に導入して、融合蛋白質を発現させることができる。
本発明は、第７の態様において、本発明の蛋白質に対するリガンドを同定するための方法を提供する。
ここで、「リガンド」とは、受容体蛋白質に特異的に結合する化合物を意味する。リガンドには、天然の化合物及び人工的に合成された化合物の両方が含まれる。
なお、リガンドには下記のアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得る。また、本方法で用いる本発明の蛋白質には、該蛋白質を含む膜画分の形態のもの、又は、該蛋白質が細胞表面上に発現している細胞の形態のものをも含む。
リガンドの同定は、具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。
（Ａ）本発明の蛋白質を試験化合物と接触させる工程、
（Ｂ）該蛋白質と該試験化合物との特異的結合を検出する工程、
（Ｃ）該蛋白質と試験化合物との結合能力の有無又は強度を判定する工程。
かかる特異的結合の検出は、例えば、検出可能な標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付した既知リガンド化合物を、非標識の試験化合物とともに混合して用いる通常の競合アッセイ法などにより実施できる。試験化合物には特に制限はなく、低分子化合物、ペプチドなどが挙げられ、また、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであっても良い。特異的結合能を有する試験化合物（リガンド）は、作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）である可能性が高い。
本発明は、第８の態様において、本発明の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法を提供する。
ここで、「アゴニスト」とは、受容体蛋白質と特異的に結合することなどにより該受容体蛋白質を刺激して細胞内シグナル伝達を誘導する能力を有する化合物を意味する。また、「アンタゴニスト」とは、受容体蛋白質を刺激して細胞内シグナル伝達を誘導する能力を有する化合物の作用に対して、これを抑制する能力を有する化合物を意味する。
アゴニスト又はアンタゴニストの同定は、例えば、以下のようにして実施できる。
（Ａ）本発明の蛋白質を試験化合物および必要に応じリガンド（好ましくはアゴニストとして作用するリガンド）と接触せしめる工程、
（Ｂ）細胞内シグナル伝達（例えば、Ｃａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、及び、Ｋ＋の濃度変化等）を検出するか、又は、Ｇ蛋白質（Ｇ１ファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニット等）の活性化を検出する工程、及び
（Ｃ）該試験化合物が、細胞内シグナル伝達又はＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
具体的には、次のような方法を実施することができる。
１．細胞内シグナル伝達の検出による同定
（Ａ）本発明の蛋白質を試験化合物および必要に応じリガンド（好ましくはアゴニストとして作用するリガンド）と接触させる工程、
（Ｂ）細胞内のＣａ２＋の濃度変化、ｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化又はＫ＋の濃度変化を測定する工程、
（Ｃ）該変化の測定により、該試験化合物が、細胞内シグナル伝達を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
２．Ｇ蛋白質の活性化の検出による同定
（Ａ）本発明の蛋白質とＧｉサブファミリーに属するＧ蛋白質のαサブユニットとの融合蛋白質を細胞膜上に発現させた細胞から膜画分を調製する工程、
（Ｂ）試験化合物および必要に応じリガンド（好ましくはアゴニストとして作用するリガンド）の存在下で、該膜画分を検出可能に標識されたＧＴＰ又はそのアナログと接触させる工程、
（Ｃ）検出可能な標識の測定により、該膜画分とＧＴＰ又はそのアナログとの結合を検出する工程、
（Ｄ）該結合を検出することにより、該試験化合物がＧ蛋白質の活性化を誘導又は抑制する能力の有無又は強度を判定する工程。
試験化合物の能力を決定するにあたっては、適切な対照をとることが望ましい。このような対照としては、試験化合物の非存在下での検出・試験、本発明の受容体蛋白質を発現していないか、あるいは同受容体蛋白質の発現レベルがより少ない細胞を用いた検出・試験があげられる。さらに正確な決定のためにこれら対照を複数組合せてもよい。
前記方法などにより、アンタゴニストとして同定された化合物は、（本発明の蛋白質を発現している細胞）と接触せしめることにより、該細胞における脂質過酸化反応産物の受容体の生物学的機能又は活性を抑制することができる。
また、本発明の蛋白實（脂質過酸化反応産物の受容体）に対するアンタゴニストは、医薬の有効成分として使用できることが期待される。従って、前記方法などにより、本発明の蛋白質（脂質過酸化反応産物の受容体）に対するアンタゴニストとして同定された化合物は、医薬の製造のために使用できる。医薬の製造においては、慣用の担体とともに混合して医薬組成物を製造することができ、かかる組成物を医薬として販売することができる。
医薬として用いる際．投与方法は特に限定されず、一般的な経口もしくは非経口的な方法（経口、静脈内、筋肉内、皮下など）を適用すればよい。また，必要に応じては、投与方法に応じた不活性な担体と共に、慣用の医薬製剤（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、注射剤、吸入剤等）として製剤化して用いればよい。例えば、一般的な医薬において許容される結合剤、崩壊剤、増量剤，充填剤、滑沢剤などの賦活剤あるいは希釈剤とともに化合物を用い、通常の方法により、製剤化して用いることができる。
投与量は、投与方法、患者の年令、体重、状態によっても異なるが、一般的な投与量、例えば１日当たり、経口投与の場合は、１〜３００ｍｇ／ｋｇ、非経口投与の場合には、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で設定される。
リガンド、アゴニスト又はアンタゴニストの同定のために使用する本発明の蛋白質は、該蛋白質を含む膜画分の形態、あるいは、該蛋白質を細胞表面上に発現している細胞の形態等で用いることができる。
受容体蛋白質若しくは蛋白質を細胞表面上に発現している細胞としては、該受容体蛋白質若しくは蛋白質を過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させた細胞などを用いることができ、例えば、該受容体蛋白質若しくは蛋白質コードする核酸を含む組換えベクターを導入した細胞などを用いることができる。
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、外来受容体蛋白質を、その機能を損なうことなく細胞膜上に発現し得る細胞（哺乳類の細胞、昆虫細胞など）を使用できる。また、宿主細胞としては、組換えベクターを導入する前の細胞それ自体は、対象の受容体蛋白質又は蛋白質を発現していないか、低いレベルでのみ発現している細胞を用いることが望ましい。
該蛋白質を含む膜画分は、該蛋白質又は該蛋白質を発現している細胞を破砕した後、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力を利用した分画法を用いて、調製できる。例えば、細胞破砕液を、低速（約５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清について、さらに高速（約１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常約３０〜１２０分程度遠心し、得られた沈殿画分を、膜画分として用いる。
本発明のリガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの化合物は脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の活性化を誘導又は抑制する作用を有するので、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の機能又は生物学的活性が関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物の有効成分となり得る。
本発明は、第９の態様において、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体の機能又は生物学的活性が関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
第８の態様によって得られる化合物を有効成分として含有する医薬組成物を得るための工程としては、以下のような常法により製剤化することができる。例えば、有効量のリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストとして確認された化合物又はその薬理的に許容される塩と、薬理学的に許容され得る担体とを混合する。次いで、投与形態に応じた剤型とする。本発明で用いられる医薬品組成物の投与形態には、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下内投与、脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、経鼻粘膜投与、経腸投与、局所投与、舌下投与、或いは経直腸投与が挙げられるが、これに限定されるものではない。
経口投与に用いる組成物としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、及び散剤などの固体剤型、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁液剤などの液体剤型が含まれる。非経口投与に用いる場合には、無菌溶液剤、懸濁液剤、乳剤等の剤型が含まれる。また、上記担体としては、例えば、糖類、デンプン類、脂肪酸、タルク、植物油、ガム、グリコール類、生理食塩水、緩衝食塩水、等が挙げられる。
以下に、本発明の上記の同定方法により確認された、本発明の脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質のリガンド（アゴニスト）、４−ＨＮＥ（４−ヒドロキシ−２−ノネナール）について説明する。
本発明の蛋白質（受容体）のアゴニストである４−ＨＮＥは、生体が酸化ストレスを受けた場合、脂質過酸化反応産物として生体内で産生されることが知られている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：８１−１２８，１９９１）。
そして、４−ＨＮＥやその他の脂質過酸化反応産物は、例えば、以下の疾患、老化（Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１２２０−１２２４，１９９２）、動脈硬化（Ｐａｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１３７２−１３７６，１９８９）、パーキンソン病（Ｙｏｒｉｔａｋａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：２６９６−２７０１，１９９６）、アルツハイマー病（Ｍａｒｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６８：２５５−２６４，１９９７；Ｋｒｕｍａｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：５０８９−５１００，１９９７）等と関係していることが報告されている。
従って、上記同定方法によって得られた、本発明の蛋白質（受容体）のアゴニスト、アンタゴニスト、抗体等を有効成分として含有する医薬組成物は、老化、動脈硬化、パーキンソン病又はアルツハイマー病等の疾患の治療又は予防に有効であると期待される。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
［実施例１］  ヒトＴＧ００３９遺伝子のｃＤＮＡの単離
（１）  ヒトプリン受容体Ｐ２Ｙ５（ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ４３６５７）、Ｐ２Ｙ７（ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ１５７２２）及びＰ２Ｙ９（ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ９９６７７）のアミノ酸配列をクエリー配列とし、ホモロジー検索法としてｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、第４０３−４１０頁、１９９０年）を用いて、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のヒトＥＳＴデータベースに対する検索を行った。その結果、ホモロジーの高いＥＳＴクローンとして「ＩＭＡＧＥ；６８２９４２」（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＡ２１０７３９）を見出した。このＥＳＴクローンの塩基配列中には一つの大きなオープンリーディングフレームが存在すると推定された。
次に、ＮＣＢＩのヒトゲノムデータベースに対して、前記ＡＡ２１０７３９配列でｂｌａｓｔｎ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、第４０３−４１０頁、１９９０年）を行った結果、このＥＳＴは、その塩基配列からヒトＧ蛋白質共役型受容体遺伝子がコードされていることが推定されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ０００５４５）の一部であることが判明した。
（２）上記（１）で得られたＡＦ０００５４５の塩基配列情報をもとにプライマーを設計し、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）により、翻訳領域全長を含むｃＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、以下のように行った。
ＰＣＲの鋳型としては、ヒトゲノムＤＮＡ（商品名「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ」；クロンテック社製）を用いた。センスプライマーとしては、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、アンチセンスプライマーとしては、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。なお、これらのプライマーは、ＰＣＲ産物の両端に制限酵素認識部位（ＫｐｎＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
これらのプライマー及び鋳型ＤＮＡを含む以下の組成のＰＣＲ反応液（５０μｌ）を調製し、ＰＣＲ〔条件：９５℃  １分、（９５℃  ３０秒→６６℃  ３分）×３５回、６６℃  ３分〕を実施した。
ＰＣＲ反応液組成：
鋳型ＤＮＡ  １μｌ
滅菌水４０μｌ
ＰＣＲ用緩衝液（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、クロンテック社製）５μｌ
デオキシヌクレオチド溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、各１０ｍＭ）１μｌ
ポリメラーゼ溶液（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ、クロンテック社製）１μｌ
センスプライマー（１０μＭ）１μｌ
アンチセンスプライマー（１０μＭ）１μｌ
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、バンドを切り出して、約１，０００ｂｐのｃＤＮＡ断片を精製取得した。これを、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ、プロメガ社製）に連結し、得られたプラスミドを用いて、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（Ｌｉ−ＣＯＲ  ＬＩＣ−４２００Ｌ（Ｓ）−２  ＤＮＡアナリシスシステム、アロカ社製）を用い、ダイデオキシ法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ、ＵＳＢ社製）により決定した。その結果、配列番号１に示した塩基配列（１，０３８ｂｐ）を取得した。この塩基配列がコードしていると推定されるＧ蛋白質共役型受容体の遺伝子をＴＧ００３９遺伝子と称することにした。このクローン化されたＴＧ００３９遺伝子の塩基配列をＮＣＢＩのヒトゲノムデータベース中のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ０００５４５の塩基配列と比較すると、１塩基の相違が見られたが、これは、遺伝的多型性のため、若しくはＰＣＲの誤りのためと考えられた。
また、かくして得られた配列番号１で表されるＴＧ００３９遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列（３３９アミノ酸残基）は配列番号２に示した通りであった。配列番号２で表されるアミノ酸について、ＳＯＳＵＩによる膜貫通領域の予測を行った結果、Ｇ蛋白質共役型受容体に特徴的である７回膜貫通領域が推定された。
図１に、前記ＴＧ００３９遺伝子の塩基配列及び該配列に対応するアミノ酸配列とともに、その膜貫通領域（下線部）を示す。
［実施例２］  ＴＧ００３９遺伝子の発現分布
ヒトの各種組織・細胞におけるＴＧ００３９遺伝子の発現分布を、ドットブロット解析により調べた。ドットブロットは、ヒト組織由来及びヒト培養細胞由来のｍＲＮＡ（ナイロンメンブレンにドットされたもの）（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ、クロンテック社製）及びＲＩ標識プローブを用いて行った。メンブレンには、図２に示した各種ヒト組織由来及びヒト培養細胞由来のｍＲＮＡ〔ポリ（Ａ）ＲＮＡ〕が吸着固定されている。
ＲＩ標識プローブは、以下のように調製したものを用いた。すなわち、前記実施例１の（２）項で得たｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを鋳型にしてＰＣＲを行った。その際、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、各々、配列番号５及び配列番号６に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により約５６０ｂｐのＤＮＡ断片（ＴＧ００３９遺伝子の翻訳領域を含むｃＤＮＡ断片）を精製・取得した。このｃＤＮＡ断片を鋳型とし、ランダムプライマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ヌクレオチド混液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むラベリング用キット（Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてラベリングを行った後、ゲルろ過で精製し、ＲＩ標識プローブを調製した。
ドットブロットのハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。ｍＲＮＡの固定されたメンブレンを、溶液Ｉ〔Ｓａｌｍｏｎ  Ｔｅｓｔｅｓ  ＤＮＡ（９．４μｇ／μｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１６０μｌを９７℃で５分間処理後、氷中で冷却し、これに６０℃のＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）１５ｍｌを加えて調製したもの〕中で、６８℃、３０分間プレインキュベートした。ついで、このメンブレンを、標識プローブ含有ハイブリダイゼーション溶液〔前記ＲＩ標識プローブ２０μｌ、ｈｕｍａｎ  ＣＯＴ−１  ＤＮＡ（１μｇ／μｌ：Ｒｏｃｈｅ社製）３０μｌ、Ｓａｌｍｏｎ  Ｔｅｓｔｅｓ  ＤＮＡ（９．４μｇ／μｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１６μｌ、２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、３００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）５０μｌ、及びＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２０（プロメガ社製）８４μｌを加えて、２００μｌの溶液を調製し、これを９７℃で５分間処理後、６８℃で３０分間インキュベートし、さらに前記溶液Ｉ  ５ｍｌを加えて調製したもの〕中で、６５℃、１２時間ハイブリダイズさせた。ついで、メンブレンを、１％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）にて、６５℃、２０分間、５回、プレ洗浄した後、さらに、０．５％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）にて５５℃、２０分間、２回洗浄した。
イメージアナライザー（Ｂｉｏ−ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２０００、フジフィルム社製）を用いてハイブリダイゼーションのシグナルを検出した結果を図２に示す。図２から明らかなように、リンパ節、末梢血白血球、脾臓、虫垂、回盲腸、胸腺、肺及びＤａｕｄｉ細胞由来のｍＲＮＡで強いシグナルが見られた。これらの結果から、ＴＧ００３９遺伝子は、リンパ節、末梢血白血球、脾臓、虫垂、回盲腸、胸腺、肺及びＤａｕｄｉ細胞において比較的高発現していると考えられた。
［実施例３］  ＴＧ００３９蛋白質のリガンド同定
ＴＧ００３９蛋白質は、前記実施例１の結果から、Ｇ蛋白質共役型受容体であると推定された。そこで、ＴＧ００３９蛋白質とＧ蛋白質の融合蛋白質を含む膜画分を用い、以下のようにして、ＧＴＰγＳ（グアノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））とのリガンド依存的な結合を検出する方法〔Ｗｅｎｚｅｌ−Ｓｅｉｆｅｒｔら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５８巻、第９５４−９６６頁、２０００年；  Ｂａｈｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、第１１５５５−１１５６２頁、１９９８年〕により、リガンドの同定を行った。
（１）融合蛋白質を発現させるためのプラスミドの調製
以下、（イ）〜（ニ）のようにして、ＴＧ００３９蛋白質とＧ蛋白質〔Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、Ｇｑα、又はＧｓαＬ〕との融合蛋白質を発現させるためのプラスミドを調製した。融合蛋白質の概略図は図３に示した。ここで、Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）は、Ｇｉα１蛋白質の３５１番目のシステイン残基をイソロイシン残基に変換した変異型Ｇｉα１蛋白質を意味する。
（イ）ＴＧ００３９遺伝子ｃＤＮＡの調製
前記実施例１の（２）項で得られたＴＧ００３９遺伝子ｃＤＮＡ（翻訳領域全長を含む）を含むプラスミドを鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、各々、配列番号７及び配列番号８に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーはＴＧ００３９遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物として、ＴＧ００３９蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡ（終止コドンを除く）を含み、その両端に制限酵素認識部位（Ｎ末端にＸｈｏＩ部位、Ｃ末端にＣｐｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるよう設計されている。
かくして得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ＰＣＲ産物クローニング用ベクターシステム）（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結し、得られたプラスミドを、制限酵素ＮｏｔＩ及びＣｐｏＩで処理して、生じた約１，０００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
（ロ）Ｇ蛋白質（Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ））との融合蛋白質発現用プラスミドの調製
ヒト脳由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｂｒａｉｎ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧｉα１−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧｉα１−２）としては、各々、配列番号９及び配列番号１０に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、Ｇｉα１蛋白質をコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ０５５０１３）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物としてＧｉα１蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡが得られるよう設計されている。
ついで、前記ＰＣＲで得られた産物を鋳型として、２回目のＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧｉα１−３）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧｉα１−４）としては、各々、配列番号１１及び配列番号１２に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、ＰＣＲ産物として、Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）（Ｇｉα１蛋白質の３５１番目のシステイン残基がイソロイシン残基に置換された変異型Ｇｉα１蛋白質）の全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで処理し、生じた約１，１００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）を得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）を得た。
（ハ）Ｇ蛋白質（Ｇｑα）との融合蛋白質発現用プラスミドの調製
ヒト前立腺由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧｑα−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧｑα−２）としては、各々、配列番号１３及び配列番号１４に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーは、ＧｑαをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｕ４３０８３）を元に設計したものであり、ＰＣＲ産物としてＧｑαの全長をコードするｃＤＮＡが得られるよう設計されている。
ついで、前記ＰＣＲで得られた産物を鋳型として、２回目のＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧｑα−３）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧｑα−４）としては、各々、配列番号１５及び配列番号１６に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。これらプライマーは、ＰＣＲ産物として、Ｇｑαの全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで処理し、生じた約１，１００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／Ｇｑαを得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇｑαを得た。
（ニ）Ｇ蛋白質（ＧｓαＬ）との融合蛋白質発現用プラスミドの調製
ヒト骨髄由来ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ、クロンテック社製）を鋳型として用い、ＰＣＲを行った。その際、センスプライマー（プライマーＧｓαＬ−１）及びアンチセンスプライマー（プライマーＧｓαＬ−２）としては、各々、配列番号１７及び配列番号１８に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
これらプライマーは、ＧｓαＬをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｘ０４４０８）を元に設計されたものであり、ＰＣＲ産物としてＧｓαＬの全長をコードするｃＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位（ＣｐｏＩ部位及びＸｂａＩ部位）が付加されたＤＮＡ断片が得られるように設計されている。
得られたＰＣＲ産物を、ベクタープラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ、プロメガ社製）に連結した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｂａＩで処理し、生じた約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片を、バキュロウイルスベクタープラスミドｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のＮｏｔＩ／ＸｂａＩ部位に挿入して、プラスミドｐＶＬ１３９２／ＧｓαＬを得た。
このプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ／ＣｐｏＩ部位に、前記（イ）で得たＤＮＡ断片を挿入し、融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−ＧｓαＬを得た。
（２）融合蛋白質を含む膜画分の調製
前記（１）の（ロ）〜（ニ）で得られた３種の発現用プラスミドは、図３（概略図）で示したように、ＴＧ００３９蛋白質のＣ末端に付加されたリンカー配列（−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−）を介して、ＴＧ００３９蛋白質（全長）とＧ蛋白質〔Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、Ｇｑα、又はＧｓαＬ〕が連結した構造の融合蛋白質を発現するプラスミドである。
これら融合蛋白質発現用プラスミドｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）、ｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−Ｇｑα、又はｐＶＬ１３９２／ＴＧ００３９−ＧｓαＬを、以下のようにして、昆虫細胞内で発現させ、融合蛋白質を含む膜画分を調製した。
まず、昆虫細胞Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ＳＦ９）（ファーミンジェン社製）をコラーゲンコート処理済みの３ｃｍシャーレに約６０％コンフルエントとなるように、１．５ｍｌの培地〔１０％牛胎仔血清、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンを含むＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｐＨ６．２：ライフテックオリエンタル社製）〕中、２７℃、１５分間インキュベートした。
培地を取り除き、トランスフェクション用緩衝液（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ、ファーミンジェン社製）３７５μｌを加えた後、予め調製しておいたＤＮＡ溶液〔融合蛋白質発現用プラスミド１μｇ、Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｌｕｓ  ＤＮＡ（ファーミンジェン社製）０．１２５μｇ、滅菌水２５μｌ中で混和し、２５℃で１５分間インキュベートした後、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（ファーミンジェン社製）３７５μｌを加えたもの〕４００μｌを滴下した。
これを２７℃で４時間培養した後、培養液を除き、培地１．２ｍｌを加えて２７℃で５日間培養した。得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、上清をウイルス液Ｉとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの３ｃｍシャーレに約３０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液Ｉ（１００μｌ）と培地１．２ｍｌを加えて２７℃で４日間培養した。得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、その上清をウイルス液ＩＩとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの１０ｃｍシャーレに約７０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液ＩＩ（５００μｌ）と培地１２ｍｌを加え、２７℃で４日間培養した。こうして得られた培養液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、その上清をウイルス液ＩＩＩとして回収した。
Ｓｆ９細胞をコラーゲンコート処理済みの１０ｃｍシャーレに約７０％コンフルエントとなるように播き、前記で得たウイルス液ＩＩＩ（１００μｌ）と培地１２ｍｌを加え、２７℃で４日間培養した。こうして得られた細胞を冷却したＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で洗浄後、冷却した溶解緩衝液〔２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、及び２μｇ／ｍｌアプロチニン〕３．６ｍｌに懸濁し、テフロンホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。この細胞破砕液を遠心分離（６００×ｇ、１０分間）し、得られた上清をさらに遠心分離（５０，０００×ｇ、２０分間）した。得られた沈殿物を冷却した反応緩衝液〔２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム〕４５０μｌに、テフロンホモジナイザーを用いて懸濁して、融合蛋白質を発現した膜画分を得た。
（３）融合蛋白質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの結合試験
前記（２）で得た膜画分（４５０μｌ）を反応緩衝液（７．５４ｍｌ）に懸濁し、これにＧＤＰ（１０ｍＭ）１０μＬを加えた。この溶液１６０μｌに試験検体２０μｌを加え、３０℃で１０分間インキュベーションした後、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（５ｎＭ，５ｎＣｉ／μｌ：アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）２０μｌを加え、反応を開始した。３０℃で１時間インキュベーションした後、ガラスフィルター（ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／Ｂ、パッカード社製）を用いてろ過することで反応を停止した。フィルターを、冷却した反応緩衝液２００μｌで３回洗浄した後、フィルター上の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ量（膜画分との結合量）を液体シンチレーション測定法によって測定した。こうして測定した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合量から、非特異的結合量（１０μＭ  ＧＴＰγＳ存在下で測定した結合量）を差し引き、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの特異的結合量を求めた。
核酸、アミノ酸、ペプチド関連化合物、組織抽出物及び脂質関連化合物約３７０種を試験検体として検定した。その結果を図４に示す。ＴＧ００３９蛋白質とＧｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合蛋白質を含む膜画分を用いた場合、４−ＨＮＥを添加することによって、濃度依存的に［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの特異的結合量が増加した。
一方、ＴＧ００３９蛋白質とＧｑαとの融合蛋白質を含む膜画分を用いた場合、及び、ＴＧ００３９蛋白質とＧｓαＬとの融合蛋白質を含む膜画分を用いた場合には、これら化合物による特異的結合量の増加は、認められなかった。
これらの結果から、ＴＧ００３９蛋白質は、Ｇｉα１蛋白質と共役するタイプのＧ蛋白質共役型受容体であると考えられた。また、４−ＨＮＥがそのアゴニスト（リガンド）として作用することが明らかとなった。すなわち、ＴＧ００３９蛋白質は、４−ＨＮＥをアゴニストとする脂質の過酸化反応産物の受容体であると考えられた。
産業上の利用の可能性
本発明の脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子は、細胞内情報伝達のメカニズム研究のために有用である。また、脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体に関する疾患に対する治療薬の標的分子となり得る。
さらに、本発明の脂質過酸化反応産物をリガンドとするＧ蛋白質共役型受容体蛋白質及びその遺伝子を利用した作用薬（アゴニスト又はアンタゴニスト）の同定、同定及び特徴付けの方法は、新しい医薬の研究開発のために有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＧ００３９蛋白質のアミノ酸配列、塩基配列及び推測される７回膜貫通領域（下線部）を示した図である。
図２は、ヒトの各組織又は細胞におけるＴＧ００３９遺伝子の発現分布（ドットブロットの結果）を示した図である。丸印は、ｍＲＮＡレベルで遺伝子の発現が認められた組織又は細胞を示す。
図３は、ＴＧ００３９蛋白質と各種Ｇ蛋白質との融合蛋白質の構造の概略を示した模式図である。
図４は、ＴＧ００３９蛋白質と各種Ｇ蛋白質との融合蛋白質を含む膜画分とＧＴＰγＳとの特異的結合量に対する４−ＨＮＥの影響を示した図である。特異的結合量は、試験物質を添加しない場合をコントロールとし、その時の結合量に対する相対値（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）で表している。
また、図４中、「○  Ｇｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）」は、ＴＧ００３９蛋白質とＧｉα１（３５１Ｃｙｓ→Ｉｌｅ）との融合蛋白質を含む膜画分における試験結果を示し、「△  Ｇｑα」は、ＴＧ００３９蛋白質とＧｑαとの融合蛋白質を含む膜画分における試験結果を示し、「□  ＧｓαＬ」は、ＴＧ００３９蛋白質とＧｓαＬとの融合蛋白質を含む膜画分における試験結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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