【手続補正書】
【提出日】平成13年2月1日(2001.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】合成ペプチドおよび自己免疫疾患治療のための使用方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】芳香族酸、負に荷電したアミノ酸、正に荷電したアミノ酸、および脂肪族アミノ酸からなるアミノ酸の群から選択される少なくとも３個の残基を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、長さが少なくとも７アミノ酸残基であり、かつ、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスＩＩタンパクに結合することができる合成ペプチド。
【請求項２】芳香族アミノ酸が、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】正に荷電したアミノ酸がリシン（Ｋ）であり、その配列が、リシン−チロシン（ＫＹ）、リシン−バリン（ＫＶ）、およびリシン−フェニルアラニン（ＫＦ）からなる群から選択される、請求項２記載の組成物。
【請求項４】負に荷電したアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）であり、その配列が、グルタミン酸−リシン−チロシン（ＥＫＹ）、グルタミン酸−リシン−バリン（ＥＫＶ）、およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン（ＥＫＦ）からなる群から選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項５】脂肪族であるアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、その配列が、グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン（ＥＫＹＡ）、グルタミン酸−リシン−バリン−アラニン（ＥＫＶＡ）、およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＥＫＦＡ）からなる群から選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】その配列が、アミノ末端アラニンをさらに含み、その配列が、アラニン−グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン（ＡＥＫＹＡ）、アラニン−グルタミン酸−リシン−バリン−アラニン（ＡＥＫＶＡ）、およびアラニン−グルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＥＫＦＡ）からなる群から選択される、請求項５記載の組成物。
【請求項７】自己免疫疾患が、関節炎の状態である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】関節炎の状態が、リューマチ性関節炎である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】脂肪族アミノ酸がアラニンであり、アミノ酸配列が、リシン−グルタミン酸−チロシン−アラニン（ＫＥＹＡ）、リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＫＹＡＥ）、リシン−グルタミン酸−バリン−アラニン（ＫＥＶＡ）、リシン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＫＶＡＥ）、リシン−グルタミン酸−フェニルアラニン−アラニン（ＫＥＦＡ）、およびリシン−フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＫＦＡＥ）からなる群から選択される、請求項２記載の組成物。
【請求項１０】脂肪族アミノ酸がアラニン（Ａ）であり、アミノ酸配列が、リシン−チロシン−アラニン−アラニン（ＫＹＡＡ）またはリシン−リシン−チロシン−アラニン（ＫＫＹＡ）、リシン−バリン−アラニン−アラニン（ＫＶＡＡ）またはリシン−リシン−バリン−アラニン（ＫＫＶＡ）、リシン−フェニルアラニン−アラニン−アラニン（ＫＦＡＡ）、およびリシン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＫＫＦＡ）からなる群から選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項１１】ペプチドが、２個のアラニン残基をさらに含み、その配列が、アラニン−リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＹＡＥ）、グルタミン酸−アラニン−リシン−チロシン−アラニン（ＥＡＫＹＡ）、アラニン−リシン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＶＡＥ）；およびグルタミン酸−アラニン−リシン−バリン−アラニン（ＥＡＫＶＡ）、およびアラニン−リシン−フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＦＡＥ）；およびグルタミン酸−アラニン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＥＡＫＦＡ）からなる群から選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項１２】ペプチドが、７〜１００アミノ酸残基の長さである、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】医薬的に許容可能な担体中で単一用量として製剤化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】実質的に純粋である、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】ＩＩ型コラーゲン２６１−２７３ペプチドよりも自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスＩＩタンパクの抗原結合グルーブに対してより大きい親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】自己免疫疾患を患う個体において治療活性を有する合成ペプチドである組成物であって、ペプチドが、グルタミン酸、リシンおよびアラニン、およびチロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸、の各アミノ酸の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を有する組成物。
【請求項１７】ペプチドが、７〜１００アミノ酸の長さである、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】ペプチドが、７〜５０アミノ酸の長さである、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】ペプチドが、７〜２５アミノ酸の長さである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】ペプチドが、７〜１５アミノ酸の長さである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】個体におけるペプチドのプロテアーゼ分解を阻害するのに充分な量で残基の位置にアミノ酸アナログを含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項２２】以下のものからなる群から選択される配列を有する単離されたペプチド組成物：ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１５）、およびＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１８）。
【請求項２３】チロシン（Ｙ）が、バリン（Ｖ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている、請求項２２記載のペプチドのいずれかの単離されたペプチド。
【請求項２４】ペプチドがＭＨＣクラスＩＩタンパクに対する高親和性を有し、以下のものからなる群から選択される配列を有する単離されたペプチド組成物：ＡＥＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号６）、ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）、ＫＥＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１０）、ＡＥＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１１）、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１３）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＥＡＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１６）、ＥＫＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１７）、ＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１８）、ＡＫＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２１）、ＡＡＥＹＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２６）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２９）、ＡＥＹＡＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３２）、ＡＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３３）、ＡＹＫＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３５）、およびＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３６）。
【請求項２５】チロシン（Ｙ）が、バリン（Ｖ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている、請求項２４記載の配列のいずれかの単離されたペプチド。
【請求項２６】個体における自己抗原に対する免疫応答を阻害することができるアミノ酸配列を有する単離されたペプチド組成物であって、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲタンパクのペプチド結合グルーブの抗原結合ポケットに相当するペプチドのアミノ酸配列中の位置が、特定のアミノ酸として同定される、ペプチド組成物。
【請求項２７】自己抗原が、多発性硬化症および関節炎からなる群から選択される状態と関連する、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。
【請求項２８】ＭＨＣクラスＩＩタンパクが、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ１タンパク、およびＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ４タンパクからなる群から選択される、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。
【請求項２９】ＭＨＣクラスＩＩタンパクが、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ２タンパクである、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。
【請求項３０】ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブのＰ１ポケットに相当する配列の位置のアミノ酸残基が、チロシン、バリン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。
【請求項３１】ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブのＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸位置のアミノ酸残基が、アラニンである、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。
【請求項３２】ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブのＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸位置から８残基越えて位置するアミノ酸残基が、リシン残基およびアラニン残基からなる群から選択される、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。
【請求項３３】第一のペプチド配列および第二のペプチド配列を含む医薬調製物であって、調製物が、ともに請求項２６記載の異なるアミノ酸配列の第一のペプチドおよび第二のペプチドの医薬的に許容可能な担体中の混合物であり、第一の配列がさらにリシン残基を有し、第二の配列がＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブのＰ１ポケットに相当するアミノ酸を越えて８残基に相当するアミノ酸位置にアラニン残基を有する、調製物。
【請求項３４】以下の工程を含む、個体において治療活性を有する合成ペプチドヘテロポリマーの混合物中のＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフのアミノ酸配列を得る方法：
（ａ）合成ヘテロポリマーの混合物をＭＨＣクラスＩＩタンパク分子に結合させて、ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合体を形成させる工程；
（ｂ）前記ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合体から突出しているヘテロポリマーのアミノ末端アミノ酸残基をペプチダーゼ酵素消化により除去して、ヘテロポリマーのアミノ末端をＭＨＣタンパク複合体の辺縁と整列させる工程；および
（ｃ）前記複合体を解離させることにより前記整列させたヘテロポリマーをＭＨＣタンパクから溶出させ、結合モチーフを有するアミノ末端整列ヘテロポリマーを遊離させる工程。
【請求項３５】付加的な工程（ｄ）が、整列されたヘテロポリマーのアミノ末端配列を決定し、結合モチーフを同定することを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】付加的な工程（ｅ）が、整列されたヘテロポリマーのアミノ末端配列を合成ヘテロポリマー組成物のアミノ酸配列と比較することを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】ＭＨＣクラスＩＩタンパクが、自己免疫疾患に関連する、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】自己免疫疾患が、関節炎の状態または脱髄状態である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】付加的な工程（ｅ）が、各ペプチド調製物が結合モチーフアミノ酸配列を有する複数のペプチド調製物を合成することを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】付加的な工程（ｆ）が、ＭＨＣクラスＩＩタンパクに対する各々の合成ペプチドの親和性を決定することを含む、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、自己免疫疾患の治療のための、定義された配列を有する種々の態様のペプチド組成物およびこれらの組成物の製造および使用の方法を提供する。精製ＭＨＣクラスＩＩタンパクを用いて、結合、および試験抗原との競合における結合のためのモチーフを決定し、潜在的治療活性を有するペプチド組成物を同定する。
【０００２】
背景
自己免疫疾患は、自分の抗原（自己抗原）に対して向けられた不適切な免疫応答によってもたらされるものであり、自己寛容性の正常な状態からの逸脱である。自己寛容性は、自己抗原に対して反応することができるＴ細胞およびＢ細胞の産生が、生涯の初期に免疫系の発達において起こる事象によって妨げられた場合に生じる。プロセッシングされたペプチドを結合し、Ｔ細胞に対して提示する能力を通じて免疫応答の調節において中心的な役割を果たす細胞表面タンパクは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子である（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，  Ｊ．  Ｂ．ら、１９９１年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：５２７）。
【０００３】
多数の治療剤が、自己免系疾患を治療するために開発されてきた。これらには、「スーパーアスピリン類」、例えば低分子量炎症化合物の形成を、シクロオキシゲナーゼを阻害することによって防止し得る一般的抗炎症薬；例えば炎症性タンパク腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を抗ＴＮＦ特異的モノクローナル抗体または抗体フラグメントでまたはＴＮＦレセプターの可溶性形態で封鎖することにより、タンパク炎症媒介因子を阻害することによって機能し得る薬剤；ＣＤ４レセプターまたは細胞接着レセプターＩＣＡＭ−１を阻害することによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用を一般に妨害する、Ｔ細胞表面のタンパクを標的とする薬剤、が挙げられる。しかし、治療剤として天然の折りたたまれたタンパクを含む組成物は、生産、製剤化、貯蔵およびデリバリーにおいて問題を有し得る。これらの問題のいくつかは、病院の設定に患者を送達することを必要とする。
【０００４】
自己免疫応答の阻害のさらなる標的は、リンパ球表面タンパクＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩＩ遺伝子によってコードされるタンパクのセット、例えばＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱ、および−ＤＰである。ＭＨＣ遺伝子の各々は、哺乳類集団内で多数の代替的または対立遺伝子的（ａｌｌｅｌｉｃ）形態で見出される。ある種の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）およびリューマチ性関節炎（ＲＡ）に罹患した個体のゲノムは、その疾患がリンクしている１または２以上の特徴的ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を担持する可能性が高い。
【０００５】
ＲＡは、ヒトの一般的な自己免疫疾患で、罹患率はコーカサス人種において約１％であり（Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｊ．ら、１９９７年、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ中、８９８−９３２）、現在２５０万人のアメリカ人が罹患している。ＲＡは、滑液関節の慢性的炎症および活性化Ｔ細胞、マクロファージおよび形質細胞による浸潤を特徴とし、関節の軟骨の進行性の破壊がもたらされる。これは、関節疾患の最も深刻な形態である。ＲＡに対する遺伝性の感受性は、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲＢ１遺伝子座に対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、またはＤＲＢ１＊０４０５またはＤＲＢ１＊０１０１対立遺伝子を有する罹患個体と強く関連している。ＲＡにおける自己抗原の性質は、ほとんどわかっていないが、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）が有力な候補である。残基２６１〜２７３に相当するＩＩ型コラーゲン中の免疫優性Ｔ細胞エピトープが同定された（Ｆｕｇｇｅｒ，  Ｌ．ら、１９９６年、  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６：９２８−９３３）。
【０００６】
１または２以上のリンクしたＭＨＣクラスＩＩ分子に特異的に結合することができ、それによって不適切な免疫応答を阻害し得る因子を同定することが望ましいであろう。比較的非特異的にいくつかのＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用し結合するひとつの因子は、コポリマー１（Ｃｏｐ１）であり、これは、マウスにおいて誘発できＭＳのモデルである実験的アレルギー脳髄膜炎を抑制し得ることが示された合成アミノ酸ヘテロポリマーである（ＥＡＥ；  Ｓｅｌａ，  Ｍ．，  Ｒ．  Ａｒｎｏｎら、１９９０年、Ｂｕｌｌ．  Ｉｎｓｔ．  Ｐａｓｔｅｕｒ  （Ｐａｒｉｓ））。ポリ（Ｙ、Ｅ、Ａ、Ｋ）であるＣｏｐ１は、一文字アミノ酸略号を用いて、ここでは「ＹＥＡＫ」として示され（上記参照；Ｙはチロシンを表し、Ｅはグルタミン酸、Ａはアラニン、そしてＫはリシンである）、それは、ＭＳの再発形態を治療するために用いられてきたが、この疾患を完全に抑制していない（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  Ｂ．ら、１９８７年、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１７：４０８；  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．  Ｐ．ら、１９９５年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４５：１２６８）。
【０００７】
自己免疫疾患のための改良された治療の需要が存在する。このような治療の潜在的な供給源は、精製されたＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子タンパク分子、特に自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の生成物であるタンパクに、インビトロで選択的に結合する因子を同定することであろう。そのうえ、その因子は、インビボで抗原提示細胞の表面に生じるそのタンパクにも結合すべきであり、それによって自己免疫疾患の原因となるＴ細胞をブロックし、アネルギー化し、または不活性化し得るべきである。
【０００８】
概要
本発明の一つの態様において、芳香族酸、負に荷電したアミノ酸、正に荷電したアミノ酸、および脂肪族アミノ酸からなるアミノ酸の群から選択される少なくとも３個の残基を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、長さが少なくとも７アミノ酸残基であり、かつ、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスＩＩタンパクに結合することができる合成ペプチドである、組成物が提供される。したがって、芳香族アミノ酸は、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され、正に荷電したアミノ酸はリシン（Ｋ）であり、その配列はリシン−チロシン（ＫＹ）、リシン−バリン（ＫＶ）、およびリシン−フェニルアラニン（ＫＦ）からなる群から選択される。さらに、本発明のその態様は、負に荷電したアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）であり、その配列が、グルタミン酸−リシン−チロシン（ＥＫＹ）、グルタミン酸−リシン−バリン（ＥＫＶ）およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン（ＥＫＦ）からなる群から選択される、組成物を提供する。さらに、提供される組成物において、脂肪族であるアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、その配列は、グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン（ＥＫＹＡ）、グルタミン酸−リシン−バリン−アラニン（ＥＫＶＡ）、およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＥＫＦＡ）から選択される。その組成物は、さらにアミノ末端アラニンを含むことができ、その配列は、アラニン−グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン（ＡＥＫＹＡ）、アラニン−グルタミン酸−リシン−バリン−アラニン（ＡＥＫＶＡ）、およびアラニン−グルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＥＫＦＡ）からなるアミノ酸配列の群から選択される。本発明の態様である合成ペプチドは、例えば関節炎の状態（例えばリューマチ性関節炎）のような自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスＩＩタンパクに結合することができる。別の態様においては、本発明の態様である合成ペプチド組成物は、アラニンである脂肪族アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列は、リシン−グルタミン酸−チロシン−アラニン（ＫＥＹＡ）、リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＫＹＡＥ）、リシン−グルタミン酸−バリン−アラニン（ＫＥＶＡ）、リシン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＫＶＡＥ）、リシン−グルタミン酸−フェニルアラニン−アラニン（ＫＥＦＡ）、およびリシン−フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＫＦＡＥ）からなる群から選択される。脂肪族アミノ酸がアラニン（Ａ）であるさらに別の態様においては、アミノ酸配列は、リシン−チロシン−アラニン−アラニン（ＫＹＡＡ）またはリシン−リシン−チロシン−アラニン（ＫＫＹＡ）、リシン−バリン−アラニン−アラニン（ＫＶＡＡ）またはリシン−リシン−バリン−アラニン（ＫＫＶＡ）、リシン−フェニルアラニン−アラニン−アラニン（ＫＦＡＡ）、およびリシン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＫＫＦＡ）からなるアミノ酸配列の群から選択される。この態様においては、ペプチドは、２個のアラニン残基をさらに含むことができ、そのアミノ酸配列は、アラニン−リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＹＡＥ）、グルタミン酸−アラニン−リシン−チロシン−アラニン（ＥＡＫＹＡ）、アラニン−リシン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＶＡＥ）；およびグルタミン酸−アラニン−リシン−バリン−アラニン（ＥＡＫＶＡ）、およびアラニン−リシン−フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＦＡＥ）；およびグルタミン酸−アラニン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＥＡＫＦＡ））からなる群から選択されることができる。本発明のこの態様のペプチド組成物は、長さが７〜１００アミノ酸残基であることができる。
【０００９】
本発明の別の態様は、自己免疫疾患を患う個体において治療活性を有する合成ペプチドである組成物であって、アミノ酸配列が、グルタミン酸、リシンおよびアラニン、およびチロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸の、アミノ酸の各々の少なくとも１つを含む組成物を提供する。この組成物は、長さ７〜１００アミノ酸、例えば長さ７〜５０アミノ酸、長さ７〜２５アミノ酸、長さ７〜１５アミノ酸のペプチドであることができる。この組成物は、医薬的に許容可能な担体中の単一用量として、例えば実質的に純粋な合成ペプチドとして製剤化することができる。本発明の一態様は、ＩＩ型コラーゲン２６１−２７３ペプチドよりも、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスＩＩタンパクの抗原結合グルーブに対してより大きい親和性を有する合成ペプチドである。これらの態様のさらなる例においては、個体中のペプチドのプロテアーゼ分解の量で残基位置にアミノ酸アナログを含む組成物が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様は、以下のものからなる群から選択される配列を有する単離されたペプチド組成物である：ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１５）、およびＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１８）。本発明のさらなる一態様は、前記の単離されたペプチドのひとつの例であって、チロシン（Ｙ）がバリン（Ｖ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されているものである。さらに、本発明の一態様は、以下のものからなる群から選択される配列を有する単離されたペプチド組成物であって、そのペプチドはＭＨＣクラスＩＩタンパクに対する高親和性を有するペプチドである組成物であることができる：ＡＥＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号６）、ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）、ＫＥＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１０）、ＡＥＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１１）、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１３）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＥＡＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１６）、ＥＫＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１７）、ＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１８）、ＡＫＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２１）、ＡＡＥＹＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２６）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２９）、ＡＥＹＡＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３２）、ＡＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３３）、ＡＹＫＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３５）、およびＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３６）。本発明のさらに別の態様は、チロシン（Ｙ）がバリン（Ｖ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている前記の配列のいずれかに記載の単離されたペプチドである。
【００１１】
本発明の別の態様は、自己抗原に対する個体における免疫応答を阻害することができるアミノ酸配列を有する単離されたペプチド組成物であって、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲタンパクのペプチド結合グルーブ中の抗原結合ポケットに相当する前記ペプチドのアミノ酸配列中の位置が、特定のアミノ酸として同定されるペプチド組成物を提供する。例えば、自己抗原が多発性硬化症および関節炎からなる群から選択される状態と関連する単離されたペプチド組成物が提供される。ＭＨＣクラスＩＩタンパクは、ＨＬＡ−ＤＲ１タンパク、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパクからなる群から選択されることができる。別の態様においては、ＭＨＣクラスＩＩタンパクは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ２である。本発明の一態様は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する配列中の位置のアミノ酸残基が、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される単離されたペプチドを提供する。この態様は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸位置のアミノ酸残基がアラニンである単離されたペプチド組成物をさらに提供する。この態様は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸位置を８残基越えた位置にあるアミノ酸残基がリシン残基およびアラニン残基からなる群から選択され、Ｐ１ポケットに相当するアミノ酸残基がチロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される、単離されたペプチド組成物をさらに提供する。
【００１２】
本発明の別の例は、第一のペプチド配列および第二のペプチド配列を含む医薬調製物であって、調製物が第一のペプチド配列および第二のペプチド配列の混合物であって、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当するアミノ酸を８残基越えた相当するアミノ酸位置に、第一の配列がリシン残基を有し、第二の配列がアラニン残基を有する調製物を提供する。
【００１３】
自己免疫疾患は、以下のものからなる群から選択される：多発性硬化症、重症筋無力症、橋本病、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ギヤン−バレー症候群、グレーヴズ病、特発性粘液水腫、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫性血小減少性紫斑病、大腸炎、糖尿病、乾癬、尋常性天疱瘡およびリューマチ性関節炎。
【００１４】
特に、本発明の治療組成物の態様は、関節炎の状態の自己免疫疾患を治療するために使用することができる。さらに、本発明の治療組成物の態様は、脱髄性疾患である自己免疫疾患を治療するために使用することができる。さらに別の態様においては、本発明の治療組成物の態様は、炎症性疾患である自己免疫疾患を治療するために使用することができる。例えば、本発明の一態様は、自己免疫疾患リューマチ性関節炎を治療するための治療組成物である。別の例においては、本発明の態様は、自己免疫疾患多発性硬化症を治療するための治療組成物である。
【００１５】
本発明の別の態様においては、個体において治療活性を有する合成ペプチドヘテロポリマーの混合物中のＭＨＣクラスＩＩアミノ酸結合モチーフ配列を得る方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：（ａ）合成ヘテロポリマーの混合物をＭＨＣクラスＩＩタンパク分子に結合させて、ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合体を形成させる工程；（ｂ）前記ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合体から突出しているヘテロポリマーのアミノ末端アミノ酸残基をペプチダーゼ酵素消化により除去し、ヘテロポリマーのアミノ末端をＭＨＣタンパク複合体の辺縁と整列させる工程；および（ｃ）複合体を解離させることにより整列させたヘテロポリマーをＭＨＣタンパクから溶出させ、結合モチーフを有するアミノ末端整列ヘテロポリマーを放出させる工程。この方法には、付加的な工程（ｄ）が含まれ得る：整列させたヘテロポリマーのアミノ末端配列を決定し、結合モチーフを得る工程。さらに、この方法には、付加的な工程（ｅ）が含まれ得る：整列されたヘテロポリマーのアミノ末端配列を合成ヘテロポリマー組成物のアミノ酸配列と比較する工程。この方法においては、ＭＨＣクラスＩＩタンパクは、自己免疫疾患と関連しており、例えば、その自己免疫疾患は、関節炎の状態または脱髄の状態である。
【００１６】
この方法の別の態様においては、付加的な工程（ｅ）は以下の工程を含むことができる：複数のペプチド調製物であって、各々のペプチド調製物が結合モチーフのアミノ酸配列を有するペプチド調製物を合成する工程。この方法のさらなる側面においては、付加的な工程（ｆ）は、以下の工程を含むことができる：各々の合成ペプチドのＭＨＣクラスＩＩタンパクに対する親和性を決定する工程。
【００１７】
具体的な態様の詳細な説明
文脈が別のことを必要としない限り、本明細書および以下の特許請求の範囲において使用される場合、以下の用語は以下に規定するとおりの意味を有する：
「自己免疫状態」という用語は、自己抗原として知られる自己がコードするものに対して向けられた不適切な免疫応答によって引き起こされる疾患状態を意味する。
【００１８】
アミノ酸の「誘導体」という用語は、付加的な置換基、例えば、アミノ酸の原子に付着した、Ｎ−カルボキシ無水物基、γ−ベンジル基、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル基、またはハロゲン化物基を有するそのアミノ酸の化学的に関連した形態を意味する。
【００１９】
「アナログ」という用語は、異なる形状を有するそのアミノ酸の化学的に関連した形態、例えばアイソマー、またはＬ型でなくＤ型、またはアミノ酸のおよその大きさおよび形を有する有機分子、または、ペプチドまたはポリペプチドに重合されたときにプロテアーゼ耐性であるようにペプチド結合に関与する原子に改変を有するアミノ酸、を意味する。
【００２０】
「アミノ酸」および「アミノ酸配列」という句は、その配列により示される２０種の天然アミノ酸のいずれか１または２以上の残基の一部または全体を構成するアミノ酸誘導体および／またはアミノ酸アナログである１または２以上の成分を含むことができる。例えば、１または２以上のチロシン残基を含むアミノ酸配列においては、これらの残基の１または２以上の一部分はホモチロシンで置換されることができる。さらに、２つの隣接残基の間に１または２以上の非ペプチドまたはペプチドミメティックな結合を有するアミノ酸配列は、この定義内に含まれる。
【００２１】
「疎水性」アミノ酸という用語は、脂肪族アミノ酸であるアラニン（Ａまたはａｌａ）、グリシン（Ｇまたはｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉまたはｉｌｅ）、ロイシン（Ｌまたはｌｅｕ）、プロリン（Ｐまたはｐｒｏ）、およびバリン（Ｖまたはｖａｌ）（括弧内の用語は、各アミノ酸についての一文字または三文字略号である）、および芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｗまたはｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｆまたはｐｈｅ）、およびチロシン（Ｙまたはｔｙｒ）を意味する。これらのアミノ酸は、タンパク中の残基として見出される場合、脂肪族側鎖の長さおよび芳香族側鎖の大きさの関数として疎水性を付与する。
【００２２】
「荷電した」アミノ酸という用語は、アミノ酸アスパラギン酸（Ｄまたはａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅまたはｇｌｕ）、ヒスチジン（Ｈまたはｈｉｓ）、アルギニン（Ｒまたはａｒｇ）およびリシン（Ｋまたはｌｙｓ）を意味し、これらは、これらの残基を含むタンパクに水性溶液中で生理学的ｐＨ値で正（ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびａｒｇ）または負（ａｓｐ、ｇｌｙ）電荷を与える。
【００２３】
「アネルギー」という用語は、抗原に対する個体の免疫系の不応答を意味する。
【００２４】
ここで用いる場合、「個体」という用語は、哺乳類を示す。
【００２５】
「関節炎（の）状態」という用語は、その状態を有する個体の少なくとも単一の関節（例えば肩、膝、腰または個体の指）に見出されるリューマチ性関節炎の少なくとも１つの症状を意味する。関節炎の状態の例としては、２以上の関節を侵す関節炎状態である「多発性関節炎」；２１歳未満の個体の関節炎状態である「若年性関節炎」；およびリューマチ性関節炎（ＲＡ）の症状と共に好中球減少症、巨脾腫症、体重減少、貧血症、リンパ節症、および皮膚の色素斑の症状もまた含む「フェルティ症候群」が挙げられる。
【００２６】
「異種（ヘテロ）細胞」という用語は、個体の細胞に関係しないＭＨＣタンパクの産生のための細胞を意味し、すなわち、異種細胞は、哺乳類の細胞ではない。好ましくは、異種細胞は、温血動物由来ではなく、より好ましくは、異種細胞は脊椎動物由来ではない。最も好ましい態様においては、異種細胞は、昆虫細胞、または酵母細胞のような微生物の細胞である。
【００２７】
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、生理学的に適合性の、任意のすべての溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤のような抗微生物剤、等張吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋内、経口、腹腔内、経皮、または皮下投与に適するものであり、活性化合物は、酸の作用または他の不利な天然状態による不活性化からそれを保護する物質で被膜されていることができる。
【００２８】
本発明は、特異的ＭＨＣクラスＩＩタンパクに結合することができる薬剤のクラスの使用方法に向けられている。このような薬剤は、クラスＩＩタンパクに結合することができ、したがって、自己免疫疾患に関与する自己抗原の結合を阻害および／または防止することができ、あるいは、結合に際してアネルギーを引き起こすことができ、自己抗原に対する免疫系の応答がないようにする。
【００２９】
クラスＩＩ  ＭＨＣタンパクは、２つのほぼ等しい大きさのサブユニットであるαおよびβからなっており、これらは膜貫通タンパクである。ペプチド結合分割部分（ｃｌｅｆｔ）は、αおよびβ両サブユニットのアミノ末端からのタンパクの特徴によって形成されており、Ｔ細胞に対する抗原の提示の部位である。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子には少なくとも３つのタイプ、すなわちＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ―ＤＰがあり、各タイプの多数の対立遺伝子がある。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、Ｂリンパ球およびマクロファージのような抗原提示細胞の表面上に主に発現される（Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇａｗ，  Ｌ．，  「Ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  （ＭＨＣ）」、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中、  Ｏｘｆｏｒｄ：  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  １９９４年、６０２〜６０６頁）。
【００３０】
本発明の方法における治療組成物
本発明の組成物は、当業者にはわかるであろう当業界で公知の種々の他の方法によって投与することができる。活性化合物は、移植物（インプラント）、経皮パッチ、微小カプセルデリバリー系を含む制御放出製剤のような、それを急速な放出から保護するであろう担体を用いて調製することができる。このような製剤の調製のための多くの方法は特許されており、当業者に一般に公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，ＮＹ、１９７８年を参照されたい。医薬的に許容可能な担体中のデリバリーのための治療組成物は、無菌的であり、好ましくは製造および貯蔵の条件下で安定である。組成物は、溶液、微小乳剤、リポソーム、または高薬剤濃度に適するその他の規則正しい構造として処方することができる。
【００３１】
投薬養生法は、最適な望ましい応答（例えば治療応答）を提供するように調整することができる。例えば、単一の巨丸剤を投与することができ、いくつかに分割した用量を経時的に投与することができ、あるいは用量を疾患状況の緊急性によって示されるように比例して低減または増大させることができる。
【００３２】
一般に、本発明の好ましい態様は、治療効果（例えば症状の軽減）を生じる最低有効用量であろう治療組成物の、好適な一日用量を投与することである。本発明の治療化合物は、好ましくは、適切な最少出発用量として１個体当たり１日当たり少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、または少なくとも２０ｍｇの用量で投与される。一般に、本発明の組成物の有効用量の化合物は、１日当たり個体１ｋｇ当たり５０〜４００μｇの化合物の範囲で投与することができる。
【００３３】
業界の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要な医薬組成物の有効用量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師または獣医師は、望ましい治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物中に使用される本発明の化合物の用量を開始し、望ましい効果が達成されるまで時間と共に用量を増大させることができる。
【００３４】
別の好ましい態様においては、医薬組成物は、付加的な治療剤をも含む。したがって、本発明の方法において、医薬組成物は、組み合わせ療法の一部として、すなわち付加的な１または複数の治療剤と組み合わせて、投与することができる。付加的な治療剤として自己免疫疾患および関節炎の状態の治療のために本発明のペプチドと共に組み合わせ治療剤として用いることができる物質の例としては、以下のものが挙げられる：インターロイキン−６、インターロイキン−８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子−αのような炎症性分子または望ましくないサイトカインに特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメント；α１−アンチトリプシンまたはアプロチニンのようなタンパクであることができる酵素阻害剤；シクロオキシゲナーゼ阻害剤であることができる酵素阻害剤；工学処理（改変）された結合タンパク、例えば工学処理されたカリクレイン阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤である工学処理されたタンパク；抗菌剤、これはアモキシリン、リファンピシン、エリスロマイシンのような抗生物質であることができる；抗ウイルス剤、これはアシクロビルのように、低分子量化学物質であることができる；ステロイド、例えばコルチコステロイド、またはプロゲステロンのような性ステロイド；アスピリン、イブプロフェン、またはアセトアミノフェンのような非ステロイド性抗炎症剤；メトトレキセートまたはアドリアマイシンのような抗ガン剤；またはサイトカイン。付加的な治療剤は、サイトカインであることができ、それは、本明細書で用いる場合、制限なしに、天然のタンパクまたは変異体であって、成長因子、リンフォカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、脈管形成性因子または抗脈管形成性因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン、成熟因子、走化性タンパク等として機能する薬剤を含む。本発明の組成物とともに使用されるべき好ましい組み合わせ治療剤であってサイトカインであるものとしては、インターロイキン−４およびインターロイキン−１０が挙げられる。本発明の組成物とともに使用されるべき治療剤は、遺伝子融合によってビリオンコートタンパクに共有結合により付着したタンパクをリモデリングする技術の当業者に公知の、工学処理された結合タンパクであることができ（Ｌａｄｎｅｒ，  Ｒ．ら、米国特許第５，２３３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒ，  Ｒ．ら、米国特許第５，４０３，４８４号）、当業界で公知の方法によって作製することができる。他の種々の標的のいずれかに結合するタンパクは、工学処理することができ、本発明のペプチドとの組み合わせで本発明において治療剤として用いることができる。
【００３５】
このような投与の結果としての症状の改善は、１または複数の関節の浮腫の軽減によって、１または２以上の関節における炎症の軽減によって、または１または２以上の関節の運動性の増大によって、注目される。治療的に有効な用量は、非処理個体と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約８０％、浮腫および関節の炎症を軽減し、運動性を改善することが好ましい。
【００３６】
本発明の治療性化合物は、自己免疫疾患の症状、すなわち、橋本甲状腺炎；特発性粘液水腫、すなわち重篤な甲状腺機能低下の一種；多発性硬化症、すなわち脳または脊髄の硬化した組織またはパッチを特徴とする脱髄性疾患；神経筋ジャンクションでのアセチルコリンレセプターに対する自己免疫性攻撃により引き起こされる進行性の筋の弱化を有する疾患である重症筋無力症；ギャン−バレー症候群、すなわち多発性神経炎の一種；全身性エリテマトーデス；ブドウ膜炎；自己免疫性卵巣炎；慢性免疫性血小板減少性紫斑病；大腸炎；糖尿病；グレーブズ病、すなわち甲状腺機能低下の一形態；乾癬；尋常性天疱瘡；およびリューマチ性関節炎（ＲＡ）を含む不全のクラスを治療するために用いることができる。
【００３７】
本発明の別の態様は、ＭＣＨタンパクに対する分析対象物の結合をアッセイするためのキットである。この態様は、非哺乳類細胞において組換えにより産生された水溶性ＭＨＣタンパク；分析対象物およびＭＨＣタンパクを含有するための反応チャンバー；およびＭＨＣタンパクに対する分析対象物の結合を検出するための手段を提供する。好ましい態様においては、ＭＨＣタンパクは、昆虫細胞または酵母細胞のような無脊椎動物または微生物細胞において産生され、したがって抗原分割部分に結合したペプチドがない、すなわち、そのＭＨＣタンパクは「空っぽ（エンプティ）」である。ＭＨＣタンパクに対する分析対象物の結合を検出するための手段は、当業者に公知の、放射性、蛍光計測性、化学発光性、または比色分析性手段であることができる。キットの好ましい態様においては、ＭＨＣタンパクは、クラスＩＩ  ＭＨＣ  ＨＬＡ−ＤＲ１またはＨＬＡ−ＤＲ４タンパクである。さらに、キットは、ＣＩＩペプチドのような自己免疫性ペプチド、またはミエリン塩基性タンパク由来のペプチド、ミエリンオリゴデンドライト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｔｅ）タンパク、または自己免疫疾患に関係のある他の何らかのタンパク由来のペプチドをも含むことができる。
【００３８】
以前の知見は、ＥＡＥおよびＭＳにおけるＹＥＡＫ（Ｃｏｐ１）の活性がペプチド結合グルーブ内のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子への結合に関与し、ＭＳに関連し得る自己免疫性Ｔ細胞応答の抑制をもたらすことを示唆していた（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，  Ｄ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５：９７２４；  Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，  Ｄ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９：１３７；  Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，  Ｍ．ら、１９９８年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０：４３８６、これらの内容は、参照により本明細書に援用される）。
【００３９】
ここでアッセイにおいて使用された空っぽの組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子は、先に結合した内在性ペプチドによる干渉を受けない結合についてのデータを生じた。これに対して、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子への結合の従来の分析については、１０〜２０％のレセプタータンパクのみしか外来性の供給されたペプチドの結合のために利用可能でなく（例えばＨａｍｍｅｒ，  Ｊ．ら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ７４：１９７−２０３を参照されたい）、本発明においてはそれらの報告と異なり、それらと比較してより正確なペプチドに対する結合親和性の決定が得られた。
【００４０】
ＹＥＡＫは、精製ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）およびリューマチ性関節炎（ＲＡ）関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）またはＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子に、高親和性でペプチド特異的な方式で結合する。ＹＥＡＫはランダムポリペプチドの混合物であるため、異なるＨＬＡタンパクに結合する異なる配列を含み得る；この場合、全体の混合物のうちの一部分のみが「活性成分」となろう。あるいは、全体の混合物が能力がある、すなわちすべてのポリペプチドが任意のＨＬＡ−ＤＲ分子に結合する可能性もある。実施例１は、内在性ヒトペプチドからの干渉を最小限にするように産生された「空っぽ」の組換えＨＬＡ−ＤＲ１、ＤＲ２およびＤＲ４分子に結合するＹＥＡＫの画分を単離・精製する方法を示す。実施例２は、ＨＬＡ−ＤＲタンパク分子に結合したＹＥＡＫ分子の画分におけるアミノ酸残基の分布を示す。ＭＨＣクラスＩＩタンパクグルーブに結合するヘテロポリマーの画分のアミノ酸組成、ＨＰＬＣプロフィールおよびプール配列、および免疫学的認識を決定した。
【００４１】
用いたＹＥＡＫポリペプチドの平均長は７５〜８０アミノ酸であったので、ＨＬＡ−ＤＲ分子のグルーブ中に横たわる「エピトープ」に匹敵するアミノ酸配列は、ポリペプチド鎖内に内部的に見出される可能性が高かった。複合体から突出するポリマーの連続アミノ末端の存在は、結合したＹＥＡＫ画分に直接適用される配列分析の微小化学法により得られるべき結合モチーフの配列を曖昧にし得る。この考慮のため、ＹＥＡＫポリペプチドの突出末端の実施例３におけるアミノ末端アミノペプチダーゼ処理を用いて、内部領域にアクセスし、結合モチーフ配列を得た。アミノペプチダーゼは、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパクから突出するペプチドのアミノ末端をトリミングするので、このタンパクのグルーブに結合するエピトープは、アミノペプチダーゼタンパク分解から保護されることができる。
【００４２】
実施例４においては、実施例３において見出された結合モチーフ配列から得られたＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲ−１およびＤＲ−４結合モチーフの配列に似せるために種々の１５マーアミノ酸ペプチドが合成された。これらのペプチドは実施例５において試験され、それらがＹＥＡＫに対する、およびＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）の免疫優性エピトープ２６１−２７３（リューマチ性関節炎（ＲＡ）の自己抗原の候補である）に対する、疾患関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）またはＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）タンパク分子の結合を差別的に阻害するかどうかが決定された。実施例６におけるペプチド配列は、さらに試験されて、インビボで細胞培養物中でＣＩＩエピトープ２６１−２７３へのＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４制限Ｔ細胞クローンの応答を有意に阻害する能力を有するものが得られた。実施例５および６における、ある種のペプチドは高い特異性および親和性で結合し、Ｔ細胞活性化を阻害するという知見は、ＲＡおよびＭＳのような自己免疫疾患の治療における治療剤としてのある種の１５マーアミノ酸ペプチド化合物の利用性を示す。
【００４３】
【実施例】
試薬の調製方法
ペプチドの合成
ヘテロポリマーＹＥＡＫ（Ｃｏｐ１）を、Ｌ−アラニン、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンおよびＬ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物の重合により、記載されているように製造した（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｄ．ら、１９７１年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２４２）。最終生成物は、ランダムポリペプチドの酢酸塩の混合物である。ヘテロポリマーＥＡＫ、バッチＳＤ−１６８９、ＭＷ８，８５０；ＹＥＡ、バッチＳＤ−１６９０、ＭＷ７，６００；ＹＡＫ、バッチＳＤ−１６９１、ＭＷ２０，０００；およびＹＥＫ、バッチＳＤ−１６９７、ＭＷ１１，０５０もまた、Ｎ−カルボキシ無水物基質の重合により合成した（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ、Ｍ．ら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６、その内容を参照により本明細書に援用する）。ヘテロポリマーは、固体状態技術によってもまた合成することができる。配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）を有するインフルエンザヘマグルチニンＨＡペプチド３０６−３１８、および配列ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号２）を有するＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）ペプチド２６１−２７３の天然ペプチド配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において固相技術（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ら、１９７９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１頁）を使用して合成し、そして逆相ＨＰＬＣにより精製した。これらの実施例を通して使用されるこれらおよびその他の方法については、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．９５：１２５２８−１２５３１、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４６９７−４７０４、およびＦｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：６３５−６４１をも参照されたい。これらの内容を参照により本明細書に援用する。
【００４４】
１文字および３文字のアミノ酸コード（および各々が表すアミノ酸）は、以下のとおりである：Ａはａｌａ（アラニン）を意味し；Ｃはｃｙｓ（システイン）を意味し；Ｄはａｓｐ（アスパラギン酸）を意味し；Ｅはｇｌｕ（グルタミン酸）を意味し；Ｆはｐｈｅ（フェニルアラニン）を意味し；Ｇはｇｌｙ（グリシン）を意味し；Ｈはｈｉｓ（ヒスチジン）を意味し；Ｉはｉｌｅ（イソロイシン）を意味し；Ｋはｌｙｓ（リシン）を意味し；Ｌはｌｅｕ（ロイシン）を意味し；Ｍはｍｅｔ（メチオニン）を意味し；Ｎはａｓｎ（アスパラギン）を意味し；Ｐはｐｒｏ（プロリン）を意味し；Ｑはｇｌｎ（グルタミン）を意味し；Ｒはａｒｇ（アルギニン）を意味し；Ｓはｓｅｒ（セリン）を意味し；Ｔはｔｈｒ（トレオニン）を意味し；Ｖはｖａｌ（バリン）を意味し；Ｗはｔｒｐ（トリプトファン）を意味し；そしてＹはｔｙｒ（チロシン）を意味する。
【００４５】
タンパクの発現および精製
組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子を、記載されているようにして（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８：４６５；Ｄｅｓｓｅｎ，Ａ．ら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：４７３）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞で発現させた。細胞を、０〜５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＥｘｃｅｌｌ  ４０１培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、２６℃でローラービン中で生育させた。細胞を、１ｍＭの最終濃度になるＣｕＳＯ４の添加により誘導し、そして細胞をさらに４〜５日インキュベートした。組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４の免疫アフィニティー精製を、以前に報告されたように（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８：４６５；Ｄｅｓｓｅｎ，Ａ．ら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：４７３）行った。収穫された細胞に由来する上清を、プロティンＡ、プロティンＧ、およびプロティンＡ−ＬＢ３．１カラムに連続的に通過させ、続いて、結合したＨＬＡ−ＤＲを５０ｍＭ  ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、ｐＨ１１．５により溶出し、そして２００ｍＭリン酸（ｐＨ６．０）で中和した。溶出物を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０  メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ）上で濃縮した。タンパク濃度を、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）アツセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）により決定した。
【００４６】
クラスＩＩ−ペプチド−結合アッセイ
このアッセイで使用する溶液は、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ、Ｍ．ら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６に記載されている。アッセイは、アフィニティー精製されたＬＢ３．１モノクローナル抗体、ＰＢＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、７．５ｍＭ二塩基リン酸ナトリウム、２．５ｍＭ一塩基リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中１．０μｇ／ウェル、１００μｌで被覆されている９６ウェル微量滴定イムノアッセイ・プレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ）において、４℃で１８時間インキュベートすることにより行った。次に、ウェルを３％ＢＳＡ（ウシ胎児血清）を含むＴＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０、２．７ｍＭ  塩化カリウム）で、３７℃で１時間ブロックし、そしてＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）で３回洗浄した。サンプルを添加する前に、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ、５０μｌを各ウェルに添加した。
【００４７】
水溶性ＨＬＡ−ＤＲ１分子を、異種宿主細胞、例えば、組換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．Ｊ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８：４６５）、特に、上記Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞において組換えにより産生させた。結合分析は、二連で、５０μｌの結合緩衝液中のビオチニル化されたＹＥＡＫ、ＹＥＡ、ＹＡＫ、ＥＡＫ、またはＹＥＫ（最終濃度１．５μｌ）を、濃度を変えた非標識阻害剤（ＹＥＡ、ＹＡＫ、ＥＡＫ、ＹＥＫ、ＹＥＡＫ、ＣＩＩ２６１−２７３またはＨＡ３０６−３１８）、および組換え水溶性ＤＲ分子（０．１５μＭ）と、３７℃で４０時間、ｐＨ５．０で共にインキュベートすることにより行った。
【００４８】
ペプチド−クラスＩＩ複合体の検出
結合したペプチド−ビオチンを、ストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼを使用して以下のように検出した。プレートをＴＴＢＳで三回洗浄し、そして、１００μｌのストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼ（１：３０００、Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）と、３７℃で１時間インキュベートし、次に、トリエタノールアミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中のｐ−ニトロフェニルリン酸を添加した。４１０ｎｍでの吸収を、マイクロプレートリーダー（モデルＭＲ４０００、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）によりモニターした。
【００４９】
Ｔ細胞ハイブリドーマおよび抗原提示アッセイ
以下のＣＩＩ特異的マウスＴ細胞ハイブリドーマを使用した：ＤＲ１制限３．１９および１９．３クローン（Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ、Ｅ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１１３−１１２２）、およびＤＲ４制限３８３８およびＤ３クローン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｅ．Ｃ．ら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．ＵＳＡ）。ＡＰＣは、Ｌ５７．２３（ＤＲ１でトランスフェクトされたＬ細胞（Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ，Ｅ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１１３−１１２２））、ＤＲ４でトランスフェクトされたＬ細胞、およびＰｒｉｅｓｓ細胞（ＤＲＢ１＊０４０１／ＤＲＢ４＊０１０１）。Ｔ細胞刺激実験は、総量０．２ｍｌ中で９６ウェル微量滴定プレート中で行った。照射された（３０００ｒａｄ）ＡＰＣ（２．５×１０４／ウェル）を、ＣＩＩ２６１−２７３（４０μｇ／ｍｌ）および種々の濃度のペプチドと共に３７℃で２時間インキュベートし、次にＴ細胞（５×１０４／ウェル）を添加し、そしてインキュベーションを３７℃で２４時間続けた。上清（３０μｌ）を採取し、そしてＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ（５×１０４／ウェル）と１２時間インキュベートし、続いて、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）で１２時間標識した。プレートを収穫し、そして１４５０マイクロベータＰｌｕｓ液体シンチレーション・カウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して放射能をモニターした。
【００５０】
実施例１  ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子に結合するＹＥＡＫの調製および定量方法
ＹＥＡＫを水溶性ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、または−ＤＲ４分子と１：１のモル比で３７℃で４０時間、インキュベートした。これらの組換え「エンプティ」ＨＬＡ−ＤＲ分子は、外部から添加した抗原の存在下で安定に会合することができた、そしてＹＥＡＫは、安定化を促進するように機能することができ、内在性ペプチドからの干渉をうけない（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．ら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６）。未結合ＹＥＡＫは、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）限外ろ過によって結合ＹＥＡＫから分離した。次に、結合ＹＥＡＫをＨＬＡ−ＤＲ複合体から酸処理により抽出し（Ｃｈｉｃｚ，Ｒ．ら、１９９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７）、アミノ酸分析に供した。
【００５１】
ＨＰＬＣ分離および溶出後のマイクロシークエンシングのために、約５〜１０％のＹＥＡＫ混合物を、ＺｏｒｂａｘＣ１８  １．０ｍｍ逆相カラムを使用し、１０４０ダイオードアレイ検出器を備え付けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０  ＨＰＬＣにおいて、マイクロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）ＨＰＬＣにより分画した。流速５４μｌ／分で、ＹＥＡＫをアセトニトリル中（０〜１０分では０％、７３分では３３％、および１０５分では６０％）０．０５５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のグラジエントで溶出した。ピーク決定の戦略、逆相分離、およびＥｄｍａｎマイクロシークエンシングは、Ｃｈｉｃｚ，Ｒ．ら、１９９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７およびＬａｎｅ，Ｗ．ら、１９９１年、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．  １０：１５１で行われているように行った。
【００５２】
疎水性および大きさによりＹＥＡＫの結合画分をさらに特徴付けるために、サンプルを、アセトニトリルのグラジエントを使用してＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。未処理ＹＥＡＫは、いくつかの小さなピークとともに約４０〜７５分の溶出時間の間に広がった非常に広いピークを示した。この溶出プロフィールは、ランダムポリペプチドの混合物の特徴であり、そして、ＹＥＡＫの他のバッチのＨＰＬＣ分離に類似する。同様のプロフィールは、ＹＥＡＫをＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、または−ＤＲ４分子から溶出したときに得られ、これは、化学的特性において、結合画分は、初めのＹＥＡＫ混合物全体と類似していることを示す。
【００５３】
実施例２  ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子に結合したＹＥＡＫの分析
添加ＹＥＡＫヘテロポリマー分子の少なくとも９５％が、単離されたＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４に結合した画分において観察され、そして、８０％はＨＬＡ−ＤＲ２タンパクと結合した。ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子との複合体から溶出されたＹＥＡＫは、コントロール（対照）の未処理ＹＥＡＫと類似の成分アミノ酸Ｙ：Ｅ：Ａ：Ｋの比を示した。これらの結果は、ＹＥＡＫの結合画分が全混合物のアミノ酸組成を反映し、そして、ＹＥＡＫの集団が異なるＨＬＡ−ＤＲタンパクへの優先的な結合をほとんどまたはまったく示さないということを示している。ＹＥＡＫは、ヒトホモ接合性ＥＢＶ形直転換Ｂ細胞ラインから精製された、各々過剰量のＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子とインキュベートし、そして、複合体をさらにサイズ除去カラムを通過させることにより分画すると、溶出された物質の分布は、各々のＨＬＡ−ＤＲ分子に関し、ほとんど全てのＹＥＡＫが、高分子量複合体に相当する画分で見出され、１０％未満がコントロールＹＥＡＫのより低い分子量の位置であることを示した。
【００５４】
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子の各々に結合するＹＥＡＫの配列を分析するために、実施例５で得られたＨＰＬＣ画分を、溶出面積内でプールし、そしてプールされた画分を、製造者マニュアル３．５を使用し、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇ１００５Ａ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）タンパクシークエンサー上で、自動化されたＥｄｍａｎ分解に付した。
【００５５】
各々のＨＬＡ−ＤＲタンパクについて、結果は、タンパクに結合したＹＥＡＫの４つのアミノ酸成分は、ＹＥＡＫの入力したモル比による配列内にランダムに分布することを示した。アミノ酸アラニン（Ａ）は、ＹＥＡＫ中のＡの当初のより高いモル比から予想されるように、Ｅ、Ｙ、およびＫに比べて有意に高いレベルで見られた。ＹＥＡＫのいずれのアミノ酸の配列特異性または優先的な配置も存在しないことは、結合した画分もまたランダムで未分画のＹＥＡＫ全体と類似することを示す。
【００５６】
抗ＹＥＡＫポリクローナル抗体を用いて、各々のＨＬＡ−ＤＲ分子から溶出されたＹＥＡＫの画分が、コントロールの未処理ＹＥＡＫ中に見られるエピトープを含むかどうかを決定した。ＹＥＡＫと種々のＹＥＡＫ画分の間の交互反応性は、ビオチニル化された抗ＹＥＡＫポリクローナル抗体を使用して直接ＥＬＩＳＡアッセイにより検出された。ＹＥＡＫまたは画分を、０．４μｇ／ｍｌおよび２．０μｇ／ｍｌに希釈し、そして１００μ／ウェルを二連で９６ウェル微量滴定免疫アッセイプレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）にプレーティングし、３７℃で１時間インキュベートし、そして０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで３回洗浄した。次に、ウェルを３％ＢＳＡ含有ＴＢＳでブロックし、次にビオチニル化された抗ＹＥＡＫ抗体（１：５０００の希釈で、１００μｌ／ウェル）を添加した。抗体−リガンド複合体を、ストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼ（１：３０００の希釈で、Ｂｉｏｒａｄ）およびｐ−ニトロフェニルリン酸（トリエタノールアミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中）を使用して検出した。４１０ｎｍでの吸収を、マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ４０００）によりモニターした。
【００５７】
抗体結合アッセイは、全ての画分が、抗ＹＥＡＫ抗体によって同様に認識されていることを示し、これは、これらの結合したヘテロポリマー画分が、互いに、そしてコントロールＹＥＡＫと、類似または同一のエピトープを共有していることを示す。
【００５８】
実施例３  ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、または−ＤＲ４分子に結合したＹＥＡＫの突出したアミノ末端のアミノペプチダーゼＩでの除去による、ＹＥＡＫの結合モチーフの特徴付け
実施例２で観察された初めの２０〜２５個のＮ末端アミノ酸の配列は、ＨＬＡ−ＤＲ分子を超えて突出した配列を表し、機能的エピトープ−特異的グルーブ内で結合したＹＥＡＫの実際の結合モチーフに関する情報源ではない。ＭＨＣクラスＩＩタンパク内で結合し、このタンパクにより保護されたＹＥＡＫ分子の部分のアミノ酸配列を得るために、ＹＥＡＫ（１ｍＭ）を、１０ＹＥＡＫ：１ＨＬＡ−ＤＲのモル比において１０μｌの量で各ＨＬＡ−ＤＲ分子（１００μｍ）と、ＰＢＳ中、３７℃で４０時間初めにインキュベートした。ＨＬＡ−ＤＲ分子から突出したＹＥＡＫポリペプチドのアミノ末端を除去し、残りの未結合ＹＥＡＫを消化するために、アミノペプチダーゼＩ、すなわちＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓから単離されたメタロプロテイン（Ｓｐｕｎｇｉｎ，  Ａ．ら、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：４７１；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）を、２単位含む２μｌの量でインキュベーションの残り１８時間で反応に添加した（Ｍｏｕｒｉｔｓｅｎ，Ｓ．ら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１９８７；Ｌａｒｓｅｎ，Ｓ．Ｌ．ら、１９９６年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１８３）。続いてのヘテロポリマーのアミノペプチダーゼでの消化は、２０〜４０の倍率でスケールアップされた容量、例えば、６０μｌのアミノペプチダーゼで消化された３００μｌのヘテロポリマーという容量で行った。サンプルは、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０限外ろ過装置を使用して約１００μｌの最終容量にスピン濃縮した。
【００５９】
ＹＥＡＫ−ＨＬＡ−ＤＲ複合体および未結合ＹＥＡＫを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＯＶＥＸミニセル電気泳動システムで実施した。分離ゲルは、１０％アクリルアミドであり、スタッキング・ゲルは、５％であった。ＨＬＡ−ＤＲ１−ＹＥＡＫ複合体を、２００Ｖで１時間非還元条件下で泳動し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色し、１０％メタノール／１０％酢酸で３時間固定し、そして、Ｃｅｌｌｏｐｈａｎｅ  ｐａｐｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）上で２５℃で乾燥させた。ＹＥＡＫ−ＨＬＡ−ＤＲ複合体は、ＳＤＳに誘導される解離に耐性を有し、ＨＬＡ−ＤＲ１  αβヘテロ二量体とともにより高分子量の複合体を形成することが見出され、そして、ポリアクリルアミドゲル上で５０ｋＤのタンパクの分子量標準よりも高い分子量を有する多数のバンドとして観察され、これは、ＹＥＡＫ−ＤＲ複合体が保護されていたことを示す。アミノペプチダーゼＩ処理は、未反応ＹＥＡＫが、ゲルの下方部分でスメアとして表れるという結果となり、これは、酵素により完全に消化されたことを示す。
【００６０】
結合モチーフの配列を得るために、保護されたＹＥＡＫのピークを含む画分を、ＨＬＡ−ＤＲ複合体の各クラスに対して約４０〜７５分の溶出時間の間の領域で選択した。突出Ｎ末端のない結合したＹＥＡＫを、酢酸（１０％）の添加および７０℃で１５分のインキュベーションによりＨＬＡ−ＤＲから溶出し、次に限外ろ過し、ＳｐｅｅｄＶａｃで真空濃縮した（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ；Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．ら、１９９５年、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２２９）。配列データ（表１）は、ＨＬＡ−ＤＲ１に結合したペプチドについては、第一および第二のサイクルで有意に高いレベルのＥ残基が見出され、第二および第三のサイクルで高いレベルのＫ残基が見出され、そして、第三〜第五のサイクルで高いレベルのＹ残基が見出されたことを示す（ＭＨＣクラスＩＩグルーブ内の結合ペプチド部位のＰ１にほぼ相当する位置と予想される）。Ｅｄｍａｎ分解法による位置３から得られるアミノ酸残基は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合グルーブのＰ１アンカー位置に相当するが、これは、ＨＡ３０６−３１８のＨＬＡ−ＤＲ１との複合体の構造中、Ｐ２アミノ酸残基は、グルーブのフラッシュ末端であり、そしてＰ１の位置は、深いポケット中の第三のアミノ酸、すなわち、Ｙ３０８であるためである（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３６８：２１５）。これらのデータは未処理ＹＥＡＫ中に見られる配列のランダムなパターンと対照的であり、こちらはＹＥＡＫを構成する４つのアミノ酸のいずれのＭＨＣクラスＩＩグルーブ内の配列特異性または優先的な配置がないことが示されている。
【００６１】
ＨＬＡ−ＤＲ２については、ＹとＡの両方の残基レベルが、サイクル３で高められた（表１）。配列特異性または優先的な配置は、Ｐ１に続くアンカー位置に相当する位置については観察されなかった（ＨＬＡ−ＤＲ１または−ＤＲ４のＰ４、Ｐ６、またはＰ９に対応する配列中での位置；ＤＲ２ｂ分子のＰ４、Ｐ７）。全てのサンプルにおいて、ＡのレベルはＥ、Ｙ、およびＫよりも高く、これは予期されたことであり、そして、ＹＥＡＫ中のＡのより高いモル比に相当するものであることが分かった。ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子の各々について、第一のアンカー位置に相当する位置（配列分析中第三の残基）でＹが、次いで後続するポケットに相当する位置でＡが見出された。ＨＬＡ−ＤＲ２に結合するＹＥＡＫにおいても又、Ｐ１に相当する位置はＹに富んでいる。Ｐ−２位置に相当する第一のサイクル位置はＥに富んでおり、そして、Ｐ−１に相当する次に隣接する位置はＫに富んでいた。これらの残基は、ＹＥＡＫとＨＬＡ−ＤＲ分子との安定な相互作用に貢献し、そして、この複合体とＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）との相互作用に貢献し得る。
【００６２】
これらの結果は、ＹＥＡＫは、クラスＩＩ  ＭＨＣ結合モチーフを含むことを示す。いずれの特定の理論にもとらわれないが、これらのデータによって、ＨＬＡ−ＤＲ分子の抗原のグルーブに結合するＹＥＡＫは、ブロッキングペプチドもしくはアンタゴニストまたは部分的アゴニストのいずれかとして作用することができ、その結果、自己免疫Ｔ細胞応答またはアネルギー、または両方の抑制をもたらすことが示される。結合モチーフ配列は、Ｔ細胞エピトープのマッピング、およびヒトにおけるＭＳおよびＲＡのような、自己免疫疾患の治療のための新規な薬剤の設計に有用である。
【００６３】
実施例４  ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子のための結合モチーフを有するペプチドの合成
上記の実施例は、ＹＥＡＫヘテロポリマーが、ペプチド結合グルーブ内で精製されたヒトＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、そして、ＨＡ３０６−３１８ペプチド、すなわちインフルエンザウイルスの高親和性エピトープの、ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）および−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子の両方に対する結合を阻害したことを示す。
【００６４】
【表１】
2003521448.tif 000001
【００６５】
さらに、３つのアミノ酸のみからなるランダムヘテロポリマー（ＥＡＫ、ＹＥＡ、ＹＡＫ、およびＹＥＫ）は、精製されたＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子と結合し、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）および−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）タンパク分子への結合についてＣＩＩ２６１−２７３と競合し、そして、ＣＩＩ反応性Ｔ細胞クローンを阻害した。タンパクに結合するＹＥＡＫの画分を、昆虫細胞中で産生された組換え「エンプティ」ＨＬＡ−ＤＲ分子との複合体から単離し、そして結合モチーフを、ＨＬＡ−ＤＲ１または−ＤＲ４分子の大グルーブ中で複合体と結合するＹＥＡＫのアミノペプチダーゼＩ処理により解析した。続いての溶出されたペプチドのプールシークエンシングは、使用するＨＬＡ−ＤＲ分子にかかわらず、第一および第二のサイクルでのＥレベルの増大、第二および第三サイクルでのＫレベルの増大、第三〜第五サイクルでの（結合ペプチドのＰ１における）Ｙレベルの増大を示した。
【００６６】
この実施例において、定義された配列の１５残基の長さのペプチドを、表１に要約された結合モチーフの配列を使用して合成した。これらのペプチドを、以下の実施例において、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲタンパク分子への結合の親和性および特異性、および競合剤分子の結合阻害能力およびＴ細胞応答阻害能力、自己免疫疾患のための新規な治療化合物として適する機能特性について分析した。
【００６７】
表２に示すペプチドは、固相技術（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ら、１９７９年、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅ．Ｇｒｏｓｓら編集（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で合成し、そして、逆相ＨＰＬＣにより精製した。ペプチド配列は、ＨＡ３０６−３１８、ＰＫＹＶＫＱＧＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）、ＭＷ１７１８；ＣＩＩ２６１−２７３、ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号２）、ＭＷ１５１６；およびＮ末端およびＣ末端でアラニンによりブラケットされたＨＡ３０６−３１８、ＡＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴＡ（配列番号４）を含む。比較のために、Ｎ末端およびＣ末端をアラニンでブラケットされたＣＩＩ２６１−２７３ペプチド、ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号３）を合成することができる。ペプチドはまた、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）を使用して１μｍスケールで合成することができた。ペプチドは、Ｎ末端に遊離アミノ基、Ｃ末端に遊離カルボキシル基を有する、そして、スペーサーＳＧＳＧによりＮ末端に結合し、Ｃ末端に遊離カルボキシル基を有するビオチンを有する、１５マーとして合成した。ペプチド合成は、コントロールとして２つの標準的なペプチド配列を含むことによりモニターし、それらはＨＰＬＣおよび質量分光分析器に付した。ＨＡ３０６−３１８ペプチドもまた、結合実験のためのポジティブ・コントロールとして使用した。ピンペプチドを凍結乾燥し、そしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。これらの条件下で、ペプチドの大部分は完全に溶解した。ビオチニル化は、記載されたように（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４８７２−４８７６）、ＤＭＳＯ中、過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて行った。未反応ビオチンは、透析により除去した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）メンブランＭＷＣＯ５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）。
【００６８】
ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子のグルーブへのＹＥＡＫの結合のためのモチーフに基づき合成された１５マーペプチド（配列番号５〜３６、表２参照）は、ほとんどのペプチドのＮ末端において種々のＥ、Ｋ、およびＡの組み合わせを有し、続いてＰ１に相当する位置（太字で示す）のＹ、および次に、続く結合ポケット中のＡを含む。配列は、これらのコンセンサス中の位置にしたがって、３つの異なるグループに分けられる（表２）。グループＩのペプチドは、Ｐ８に相当する位置にＫを有し、Ｐ１に相当する位置にＹを有する（表２太字）。溶解性を高めるためにＰ８に相当する位置にリシン（Ｋ）および他の全ての残基にアラニン（Ａ）を有するこのセット中の参照ペプチドは、以前に合成されている（配列番号５、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ，Ｔ．Ｓ．ら、１９９０年、ＥＭＢＯ  Ｊ．９、１７９７−１８０３）。グループＩＩのペプチドは、Ｐ１に相当する位置にＹを有するが、Ｐ８に相当する位置にＡを有していた。グループＩＩＩのペプチドは、ＨＡ３０６−３１８ペプチドに対して１つまたは２つの残基が移動したアミノ酸チロシン（Ｙ）を有していた。全てのグループのペプチドは、上記の結合モチーフにおいて観察されたように、そして溶解性を高めるために１つ以上のグルタミン酸（Ｅ）および／またはリシン（Ｋ）残基を含む。Ｎ末端がビオチニル化された非標識のペプチドセットは、これらの研究のために合成された。
【００６９】
【表２】
2003521448.tif 000002
【００７０】
実施例５  合成１５マーペプチドによるＹＥＡＫおよび抗原のＨＬＡ−ＤＲ分子への結合の阻害
合成ペプチドがＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４への結合についてＹＥＡＫまたは高親和性ＨＡ３０６−３１８ペプチドと成功裡に競合し得るかどうかを調べるために、ともにビオチニル化されたＹＥＡＫまたはＨＡ３０６−３１８（アラニンでブラケットされた）および非標識阻害剤（ＹＥＡＫおよび合成１５マーペプチド）を用いて競合結合アッセイを実施した。速度論研究は、ビオチニル化されたＹＥＡＫが非標識ＹＥＡＫおよびＨＡ３０６−３１８（ペプチド配列番号４）の組換えＨＬＡ−ＤＲ１への結合を、グループＩ〜ＩＩＩのペプチドよりも良好に阻害することを示した。しかし、Ｐ８に相当する位置にＫを含むいくつかのペプチド（グループＩ）は、Ｐ８に相当する位置にＡを有する類似のペプチド（表２のグループＩＩおよびＩＩＩ）よりも良い阻害剤であった。これに対し、ビオチニル化されたＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ４分子への結合は、グループＩ〜ＩＩＩの多くのペプチドにより効率的に阻害されたが、ビオチニル化されたＨＡ３０６−３１８のＨＬＡ−ＤＲ４への結合は、ＨＡ３０６−３１８または１５マーペプチドよりもＹＥＡＫによってより良好に阻害された。
【００７１】
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子への結合に対するＹＥＡＫ、ＨＡ３０６−３１８またはＣＩＩ２６１−２７３の各々との競合における合成１５マーペプチドの相対的親和性をさらに特徴付けるために、ビオチニル化されたマルチピンペプチドおよび３つの非標識阻害剤を用いて競合結合アッセイを実施した。
【００７２】
【表３】
2003521448.tif 000003
【００７３】
ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４の双方に対するグループＩ〜ＩＩＩのペプチドの大部分の結合が、非標識ＹＥＡＫ、ＨＡ３０６−３１８（配列番号４）またはＣＩＩ２６１−２７３（配列番号２）により阻害されたが、ＨＡ３０６−３１８（配列番号４）の結合よりも効率的でなかった。しかし、ＹＥＡＫ、ＨＡ３０６−３１８、またはＣＩＩ２６１−２７３よりも、ＨＬＡタンパクへのより高い親和性を示すペプチドも存在する。
【００７４】
全てのペプチドを、さらに、ＣＩＩ特異的Ｔ細胞応答を阻害する能力について試験した。
【００７５】
実施例６  １５マー合成ペプチドによるＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４制限ＣＩＩ特異的Ｔ細胞応答の阻害
合成ペプチドが自己反応性Ｔ細胞へのＣＩＩ２６３−２７３ペプチドの提示の阻害をもし得るかを決定するために、ＡＰＣおよびペプチドの複合体を、ＨＬＡ−ＤＲ１（３．１９および１９．３）およびＨＬＡ−ＤＲ４（３８３８およびＤ３）に制限されたＣＩＩ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマでテストした。照射されたＡＰＣを、ＣＩＩ２６１−２７３および関連したペプチドの各々とともに２時間インキュベートし、Ｔ細胞を添加し、そしてインキュベーションを２４時間続け、そして上清をテストし、Ｔ細胞活性化の目安としてこれらのハイブリドーマによるＩＬ−２の分泌量を決定した。
【００７６】
ペプチド配列番号１５〜２６は、ＣＩＩペプチドのためにＡＰＣとしてＨＬＡ−ＤＲ１でトランスフェクトされたＬ繊維芽細胞を使用し、ＨＬＡ−ＤＲ１制限Ｔ細胞の最も強力な阻害剤であることが観察された。ペプチド１５、２０、２６、および２７は、１９．３Ｔ細胞に対する応答を本質的に１００％、ＨＡ３０６−３１８で観察されるよりも高い阻害レベルまで阻害した。３．１９細胞では、ペプチド＃２６による阻害は、ＨＡ３０６−３１８によるものと同程度であった。ＹＥＡＫは、このＣＩＩ特異的Ｔ細胞応答にあまり効果を有さなかった（２０％未満の阻害）。ＨＡ３０６−３１８（ペプチド配列番号４）は、ＤＲ１  ３．１９および１９．３Ｔ細胞クローンのいずれをも非常に効率的に阻害した（１９．３および３．１９細胞について、各々９５％および９８％以上）。これらのデータは、配列番号１５、２０、２６、および２７のペプチドは、参照インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチドＨＡ３０６−３１８と同等またはそれよりも良好なＴ細胞応答の阻害剤であったことを示す。
【００７７】
ＨＬＡ−ＤＲ４制限Ｔ細胞については、ＨＬＡ−ＤＲ４でトランスフェクトされたＬ繊維芽細胞をＡＰＣとして使用し、以下のパターンの活性を得た：配列番号６、１１、１６、１７、２２、２３、２７、２８、および３３のペプチドは、ＤＲ４  ３８３８Ｔ細胞クローンの良好な阻害剤であり、これに対し、Ｄ３クローンは、配列番号８、１５、１６、１８、および２７のペプチドにより最善に阻害された。これらのペプチドは、Ｄ３および３８３８細胞において８０％を超える阻害のレベルを生じた。ＹＥＡＫは、ＣＩＩ特異的Ｔ細胞応答に最小の効果、すなわち、一貫して２０％未満の阻害しか有さなかった。ＨＡ３０６−３１８（配列番号４）は、ＤＲ１  ３．１９および１９．３クローンを阻害したよりも、ＤＲ４  ３８３８およびＤ３Ｔ細胞クローンの両方をあまり効率的には阻害しなかった（６０％未満の阻害）。これらのデータは、配列番号８、１５、１６、１８、および２７のペプチドが、参照インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチドＨＡ３０６−３１８よりも、有意により良好なＴ細胞応答阻害剤であることを示す。配列番号１５および２７のペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４制限ＣＩＩ特異的Ｔ細胞の両方の高レベルの阻害剤であった。
【００７８】
【表４】
2003521448.tif 000004
【００７９】
各ペプチドについて少なくとも二連で行われたこれらの実施例のデータは、３２の独特の合成ペプチドのうち、いくつかがＨＡ３０６−３１８およびＹＥＡＫの組換えＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４への結合を阻害したことを示した。ＨＡ３０６−３１８またはＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ１またはＤＲ４分子への結合を阻害するペプチドは、Ｐ１の位置にＹを含んでいた。Ｐ１のＮ末端側に種々の組み合わせのＥ、Ａ、およびＫが存在することは、結合の親和性に影響しないようであった。後続する残基のうち、Ｐ８におけるＫは、ＨＡ３０６−３１８の阻害にとって重要であったが、ＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ１への結合には重要ではなかった。ＨＬＡ−ＤＲ１とは対照的に、多くのペプチドが、ＨＡ３０６−３１８およびＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ４分子への結合を阻害した。これらのペプチドは、Ｐ１に相当する位置にＹを含み、そしてＰ８に相当する位置にＫまたはＡのいずれかを含んでいたが、他の位置では特異的なアミノ酸の優先性はない。組換えＨＬＡ−ＤＲ４に対するＨＡ３０６−３１８の親和性はＨＬＡ−ＤＲ１分子に対するものより低く、ＹＥＡＫの親和性は高く、ヒト血液から精製されたＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子で観察される場合と同様であった。ＨＬＡ−ＤＲ１または−ＤＲ４のいずれかへのビオチニル化されたペプチドのうちのいくつかの結合は、ＣＩＩ２６１−２７３によっても、ＨＡ３０６−３１８およびＹＥＡＫによると同様に阻害され、これらのペプチドが、全ＹＥＡＫ混合物と同様にＣＩＩ反応性Ｔ細胞への提示について競合し得ることを示す。参照天然ペプチドまたはＹＥＡＫ混合物と近いかまたはより高い親和性を有するペプチドが、表３および４に、各々ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４について記載されている。
【００８０】
１５マーペプチドの中には、ＩＩ型コラーゲン特異的Ｔ細胞を阻害するものもあった。これらのペプチドは全てＰ１に相当する位置にＹを有し、そしてＰ８に相当する位置にＫまたはＡのいずれかを有し、他の特異的なパターンは有さなかった。実施例は、Ｙ、Ｅ、Ａ、およびＫからなる群から選択される３つのアミノ酸からなるいくつかのランダムヘテロポリマーにより強力に阻害されることを示す。これらのヘテロポリマー、特にＹＡＫは、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子との結合についてＣＩＩ２６１−２７３と競合し、ＣＩＩ反応性Ｔ細胞クローンを阻害した。さらに、ペプチド配列番号８は、直接配列ＹＡＫを含んでおり、ＹＥＡＫよりも良好にＩＩ型コラーゲン反応性Ｔ細胞を阻害し、これは、１つの配列ＹＡＫを含む、長さ約１５アミノ酸のペプチドが、ヘテロポリマー、ポリ（Ｙ、Ａ、Ｋ）において見出されるランダムポリペプチドの混合物を置換することができることを示す。
【００８１】
本発明の態様である実施例の結果は、Ｙ、Ｅ、Ａ、およびＫの個々の成分または特定のＨＬＡ−ＤＲ分子と適合するアンカー位置の結合モチーフに相当する配列（Ｐ１に相当する位置におけるＹ）を有するペプチドは、自己免疫性疾患のための効果的な治療薬、ランダムポリペプチドの混合物の代替物として作用し得ることを示す。同定された配列の純度の高い、合成された短鎖ポリペプチドを含む医薬組成物は、個体に投与したときにランダム配列のポリペプチド混合物よりも少ない副作用を有し得る。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ分子への結合に効果的な特定のペプチド配列は、例えば、インビボでの安定性を増加させるためまたは他の所望の特性を付与するために、ペプチド配列の同方向の繰り返しまたはアミノ酸アナログのような他の分子を含む、より長い配列にすることができる。純度の高い、合成された、より長い同定された配列を含む医薬組成物は、最良の効力および最小の毒性を有して、最も効果的であり得る。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】削除
【補正の内容】