(57)【要約】Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞、および該細胞を用いて抗体組成物を製造する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞。
【請求項２】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた、請求の範囲１記載の細胞。
【請求項３】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた請求の範囲１または２に記載の細胞。
【請求項４】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求の範囲４に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲４に記載の細胞。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項７】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲７記載の細胞。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
【請求項９】
細胞が、下記の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞；
（ｊ）植物細胞。
【請求項１０】
抗体分子をコードする遺伝子を含む請求の範囲１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる抗体分子である、請求の範囲１０に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項１２】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲１０または１１に記載の細胞。
【請求項１３】
親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を生産する能力を有する、請求の範囲１〜１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求の範囲１３に記載の細胞。
【請求項１５】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲１４に記載の細胞。
【請求項１６】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、請求の範囲１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、請求の範囲１３〜１６いずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
請求の範囲１０〜１７のいずれか１項に記載の細胞を用いること特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
【請求項１９】
請求の範囲１０〜１８のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
【請求項２０】
抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物よりも、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、請求の範囲１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物より高いことを特徴とする、請求の範囲２０に記載の方法。
【請求項２２】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、請求の範囲２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、請求の範囲２０〜２３いずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求の範囲１〜９のいずれかに記載の細胞を用いて作製された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項２６】
トランスジェニック非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルおよびウサギからなる群から選ばれる動物である、請求の範囲２４に記載のトランスジェニック非ヒト動物、またはその子孫。
【請求項２７】
抗体分子をコードする遺伝子を導入した請求の範囲２５または２６に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項２８】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる抗体分子である、請求の範囲２７に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項２９】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲２７または２８に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項３０】
請求の範囲２７〜２９のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物を飼育し、飼育した動物あるいは植物から導入した抗体組成物を含む組織あるいは体液を取得し、該組織あるいは体液から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
【請求項３１】
請求の範囲２６〜２９のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫の抗体生産細胞を取得し、取得した抗体生産細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
【請求項３２】
抗体組成物が、ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫から得られる抗体組成物よりも、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、請求の範囲３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫から得られる抗体組成物より高いことを特徴とする、請求の範囲３２に記載の方法。
【請求項３４】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、請求の範囲３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、請求の範囲３２〜３５いずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
Ｎ−グリコシド結合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグリコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物。
【請求項３８】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲３７記載の抗体組成物。
【請求項３９】
請求の範囲１８〜２４のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【請求項４０】
請求の範囲２７〜３６のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【請求項４１】
請求の範囲３７〜４０のいずれか１項に記載の記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項４２】
医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、請求の範囲４１に記載の医薬。
【請求項４３】
請求の範囲４１または４２に記載の医薬を製造するための、請求の範囲３７〜４０のいずれか１項に記載の抗体組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも低下または欠失するように、ゲノムが改変された細胞および該細胞を用いた抗体分子の製造方法に関する。
背景技術
抗体ＩｇＧ分子のＦｃ領域には、２個所のＮ−グリコシド型の糖鎖結合部位が存在しており、血清中のＩｇＧでは、通常、この部位に、シアル酸やバイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンの付加の程度が少ない複数本の枝を持つコンプレックス型糖鎖が結合している。このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクトースの付加および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性があることが知られている［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６，１３０，１９９７］。
このような糖鎖の構造は、糖鎖遺伝子、すなわち、糖鎖を合成する糖転移酵素と糖鎖を分解する糖分解酵素の遺伝子によって規定されていると考えられている。
以下に、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成に関して述べる。
糖蛋白質は、小胞体（以下、ＥＲと表記する）内腔で糖鎖の修飾を受ける。Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成過程では、比較的大きな糖鎖が、ＥＲ内腔で伸長しつつあるポリペプチド鎖に転移される。この際、糖鎖はまず、ドリコールリン酸（以下、Ｐ−Ｄｏｌとも表記する）と呼ばれるα−イソプレン単位を２０個程度含む長鎖の脂質担体のリン酸基に順次付加される。すなわち、ドリコールリン酸にＮ−アセチル−グルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡとも表記する）が転移されＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなり、続いてもう１個ＧｌｃＮＡｃが転移されＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなる。次いで、マンノース（以下、Ｍａｎとも表記する）が５個転移され（Ｍａｎ）５−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌに、さらに、Ｍａｎが４個、グルコース（以下、Ｇｌｃとも表記する）が３個転移される。このようにして、コアオリゴ糖と呼ばれる糖鎖の前駆体（Ｇｌｃ）３−（Ｍａｎ）９−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌができる。この１４個の糖からなる糖鎖の前駆体はアスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン配列を持ったポリペプチドへＥＲ内腔でひとかたまりのまま転移される。この際、コアオリゴ糖に結合していたドリコールピロリン酸（Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌ）は遊離するが、ピロホスファターゼの分解を受けて再びドリコールリン酸となり再利用される。糖鎖のトリミングは、糖鎖がポリペプチドに結合すると直ちに開始される。すなわち、３個のＧｌｃと１ないし２個のＭａｎがＥＲ上で除去され、この除去にはα１、２グルコシダーゼＩ、α１、３−グルコシダーゼＩＩおよびα１、２マンノシダーゼが関与することが知られている。ＥＲ上でトリミングを受けた糖蛋白質はゴルジ体へ輸送され様々な修飾を受ける。ゴルジ体シス部には、マンノースリン酸を付加するＮ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン１−ホスホジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびα−マンノシダーゼＩが存在し、Ｍａｎ残基を５個にまで減少させる。ゴルジ体メディア部には、コンプレックス型のＮ−グリコシド結合糖鎖の最初の外側のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）、２個のＭａｎを除去するα−マンノシダーゼＩＩ、外側から２個目のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するα１，６−フコシルトランスフェラーゼが存在する。ゴルジ体トランス部にはガラクトースを付加するガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルノイラミン酸などのシアル酸を付加するシアル酸転移酵素が存在する。このような各種酵素の作用を受けてＮ−グリコシド結合糖鎖が作られることが知られている。
抗体の糖鎖に関しては、抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加修飾によって、抗体の抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）が大きく変化することが報告されている（ＷＯ００／６１７３９）。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしていることを示している。
一般的に、医薬への応用が考えられているヒト化抗体の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞などを宿主細胞として用いて製造されているが、上述したように、抗体のエフェクター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、宿主細胞によって発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違いが観察されることから、より高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望まれている。
また、糖鎖の修飾に関わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられており、その具体的な例としては、１）ラットのβ−ガラクトシドα２、６−シアリルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が可能であること［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８，１９８９］、２）ヒトのβ−ガラクトシド２−αフコシルトランスフェラーゼをマウスＬ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−）の発現が可能であること［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８，１９９１］、３）β１、４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を生産することでＮ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること［グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）：ＷＯ９９／５４３４２］が報告されている。ＧｎＴＩＩＩを導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性が得られることが示されている。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩあるいはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すと報告されているため、抗体医薬の生産には適切ではない。
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されており、その具体的な例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）の活性が欠損しているＣＨＯ細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する抗体を生産した報告を挙げることができる［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。また、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターやＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、ガラクトースの付加のない抗体の発現例が報告されているが、医薬への応用に適したエフェクター作用が向上した抗体の発現には成功していない［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。これら変異株は、変異剤処理によりランダムに変異が導入された結果の株として取得されており、医薬品製造に用いる株としては適切ではない。一方、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を標的とし意図的に標的遺伝子のみを破壊した細胞株を用いて糖蛋白質である抗体の生産を試みた報告はこれまでにない。
このように、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に関わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、実際には糖鎖の修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。特に、抗体のエフェクター機能は糖鎖構造により大きな影響を受けることが明らかになりつつあるが、最適な糖鎖構造で修飾された抗体分子を生産しうる宿主細胞の取得には至っていない。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（４３）に関する。
（１）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞。
（２）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた、（１）記載の細胞。
（３）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた（１）または（２）に記載の細胞。
（４）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の細胞。
（５）  α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（６）  α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（４）に記載の細胞。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（７）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の細胞。
（８）  少なくとも、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、（７）記載の細胞。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
（９）  細胞が、下記の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の細胞。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を生産するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞；
（ｊ）植物細胞。
（１０）  抗体分子をコードする遺伝子を含む（１）〜（９）のいずれか１項に記載の細胞。
（１１）  抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる抗体分子である、（１０に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（１２）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、（１０）または（１１）に記載の細胞。
（１３）  親株細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を生産する能力を有する、（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の細胞。
（１４）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、（１３）に記載の細胞。
（１５）  フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（１４）に記載の細胞。
（１６）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の細胞。
（１７）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、（１３）〜（１６）のいずれか１項に記載の細胞。
（１８）  （１０）〜（１７）のいずれか１項に記載の細胞を用いること特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
（１９）  （１０）〜（１８）のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
（２０）  抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物よりも、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物より高いことを特徴とする、（２０）に記載の方法。
（２２）  フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（２１）に記載の方法。
（２３）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、（２０）〜（２２）のいずれか１項に記載の方法。
（２４）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、（２０）〜（２３）いずれか１項に記載の方法。
（２５）  （１）〜（９）のいずれかに記載の細胞を用いて作製された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（２６）  トランスジェニック非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルおよびウサギからなる群から選ばれる動物である、（２４）に記載のトランスジェニック非ヒト動物、またはその子孫。
（２７）  抗体分子をコードする遺伝子を導入した（２５）または（２６）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（２８）  抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる抗体分子である、（２７）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（２９）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、（２７）または（２８）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（３０）  （２７）〜（２９）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物を飼育し、飼育した動物あるいは植物から導入した抗体組成物を含む組織あるいは体液を取得し、該組織あるいは体液から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
（３１）  （２６）〜（２９）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫の抗体生産細胞を取得し、取得した抗体生産細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
（３２）  抗体組成物が、ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫から得られる抗体組成物よりも、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、（３０）または（３１）に記載の方法。
（３３）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫から得られる抗体組成物より高いことを特徴とする、（３２）に記載の方法。
（３４）  フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（３３）に記載の方法。
（３５）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、（３２）〜（３４）のいずれか１項に記載の方法。
（３６）  抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、（３２）〜（３５）いずれか１項に記載の方法。
（３７）  Ｎ−グリコシド結合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグリコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物。
（３８）  フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、（３７）記載の抗体組成物。
（３９）  （１８）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
（４０）  （２７）〜（３６）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
（４１）  （３７）〜（４０）のいずれか１項に記載の記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
（４２）  医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、（４１）に記載の医薬。
（４３）  （４１）または（４２）に記載の医薬を製造するための、（３７）〜（４０）のいずれか１項に記載の抗体組成物の使用。
本発明のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞（以下、「本発明の細胞」と表記する）は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素（以下、「α１，６−フコース修飾酵素」と表記する）の活性が親株細胞よりも低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞であれば、ゲノムの改変の手段はいかなるものであってもよい。
親株細胞とは、α１，６−フコース修飾酵素の活性が低下または欠失させるための方法をゲノムに対して施す前の細胞をいう。親株細胞としては、特に限定はないが、例えば、以下の細胞があげられる。
ＮＳＯ細胞の親株細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳＯ細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳＯ細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
α１，６−フコース修飾酵素としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素としては、該反応に影響を与える酵素も包含される。
α１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼやα−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素としては、上述のα１，６−フコース修飾酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明において、α１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）あるいは（ｄ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）あるいは（ｊ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡまたは、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｆ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｇ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｊ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１または２で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡをいい、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１または２で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号４または５で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、配列番号４または５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号４または５に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である蛋白質であることを意味する。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞より低下または欠失するようにゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を低下または欠失させるように該酵素の遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、あるいは該酵素の機能を低下または欠失させるように該遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することをいう。変異を導入するとは、ゲノム上の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加といった塩基配列の改変を行うことをいう。
ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞とは、ゲノム遺伝子の発現または機能を完全に抑制することをいう。ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞の具体的な例としては、標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから削除された細胞があげられる。このような細胞を取得する方法としては、目的とするゲノムの改変を行うことができれば、いずれの手法でも用いることができるが、遺伝子工学的な手法が望ましい。その具体的な手法としては、
（ａ）α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する方法
（ｃ）α１，６−フコース修飾酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）α１，６−フコース修飾酵素の転写または翻訳を抑制する手法などがあげられる。
また、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選択する方法を用いることにより、本発明の細胞を選択することができる。
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞をいう。有効濃度とは、親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上である。
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌである。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来の  Ｐｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
本発明の細胞としては、抗体分子を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、これらの細胞の具体的な例としては、後述の３．に記載のものがあげられる。動物細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を生産するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。好ましくは、抗体組成物の製造に用いられる、上述のミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞、ヒト化抗体およびヒト抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するヒト以外のトランスジェニック動物を製造するために用いる胚性幹細胞または受精卵細胞、ならびにヒト化抗体およびヒト抗体を生産するトランスジェニック植物を製造するために用いる植物細胞などがあげられる。
本発明の細胞は、親株細胞が生産する抗体組成物より、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体組成物を生産することができる。
また、本発明の細胞は、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞よりも高い抗体組成物を生産することができる。
本発明は、本発明の細胞を用いることを特徴とする抗体組成物の製造方法に関する。
抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物をいう。
抗体は、重鎖および軽鎖（以下、それぞれ「Ｈ鎖」および「Ｌ鎖」と表記する）の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。Ｈ鎖のＮ末端側の約４分の１とＬ鎖のＮ末端側の約４分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。Ｖ領域以外の部分の大半は定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）と呼ばれる。抗体分子はＣ領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスはＣ領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
Ｈ鎖はＮ末端側よりＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｃ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体などの糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の構造式（Ｉ）に示す基本となる共通のコア構造を有する［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］。
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上記構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式（Ｉ）のコア構造を有するものであればいかなるものでもよいが、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明において、本発明の細胞を用いて製造される抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。そのような本発明により得られる抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノムが改変されていない親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い抗体組成物があげられる。
また、本発明において、α１，６−フコース修飾酵素の活性が欠失または低下するようにゲノムが改変された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を用いて製造した抗体組成物も、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
そのような抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫（以下、親個体と称す）が生産する抗体組成物よりも高い抗体組成物があげられる。
α１，６−フコース修飾酵素の活性が欠失または低下するようにゲノムが改変された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫は、胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物細胞を用いて作製することができる。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
本発明の抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合としては、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％である抗体組成物があげられる。
親株細胞または親個体が生産する抗体組成物よりもＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞または親個体が生産する抗体組成物の該割合よりも高いものがあげられる。具体的には、該割合が２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上高い抗体組成物があげられ、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の全てが、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である抗体組成物が最も好ましい。
上述の糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が１００％である抗体組成物、または抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合するＮ−グルコシド結合複合型糖鎖の全てが、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である抗体組成物としては、後述５に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的には検出できない程度である場合をいう。
本発明により得られる抗体組成物において、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株または親個体が生産する抗体組成物よりも高い場合、本発明により得られる抗体組成物は、親株または親個体が生産する抗体分子からなる抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ  ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３─糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することによっても決定することができる。
また、本発明の抗体としては、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１−３３６，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０−２６６，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１−１５１６，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３−４９７，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７−３９５，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９−２９１１，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１−９９１５，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６−２４０１，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９，１９９７）、抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８−２１４６，２０００）、抗ＣＡ１２５抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗インテグリンαｖβ３抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１（８）、４０３−４１０（２０００））、抗ＣＤ１０抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３，３７４−３８２，２０００）などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１−３８１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２−５６７，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１−５０，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３−１９０，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７−２４５，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）、抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３−１３８１，１９９７）、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１（８）、４０３−４１０（２０００））、抗ＣＲＴＨ２抗体（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，１２７８−１２８６（１９９９））、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００−１７４０４，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８−１１６４，２０００）などが挙げられる。
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１−６８，２０００）などが挙げられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５−３９５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５−２０７６，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６−３９９，１９９９）、自己免疫疾患（乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗インテグリンα４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１（８）、４０３−４１０（２０００））などが挙げられる。
抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質などがあげられる。
抗体としては、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に生産される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものであればいかなるものでもよいが、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物あるいはヒト抗体生産トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた非ヒト動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体生産トランスジェニック動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。ヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体生産ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を生産蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギ等があげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスがＩｇＧのヒト抗体が好ましい。
抗体の断片は、上記抗体の少なくともＦｃ領域の一部を含んだ断片をいう。Ｆｃ領域とは、抗体のＨ鎖のＣ末端側の領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともＦｃ領域の一部とは、好ましくはＣＨ２領域を含む断片、より好ましくはＣＨ２領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）らのＥＵ  Ｉｎｄｅｘ［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］のナンバリングで２２６番目のＣｙｓからＣ末端、あるいは２３０番目のＰｒｏからＣ末端までを意味する。抗体の断片としては、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域の一部を有する融合蛋白質とは、抗体のＦｃ領域の一部を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質（以下、Ｆｃ融合蛋白質と称す）を意味する。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の細胞は、α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する酵素としては、具体的にはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）相同組換え法による本発明の抗体生産細胞の作製
本発明の細胞は、α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の染色体工学の手法を用い、例えば以下のように行うことができる。
α１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡを取得する。
取得したｃＤＮＡの塩基配列に基づき、α１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを調製する。
該ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、α１，６−フコース修飾酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするα１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の細胞があげられる。
α１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
α１，６−フコース修飾酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列、に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、α１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、α１，６−フコース修飾酵素をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
α１，６−フコース修飾酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、α１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片がα１，６−フコース修飾酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、α１，６−フコース修飾酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、α１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、α１，６−フコース修飾酵素のＤＮＡを取得することもできる。
取得したα１，６−フコース修飾酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でα１，６−フコース修飾酵素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるα１，６−フコース修飾酵素をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１または２に記載の塩基配列が挙げられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、α１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
α１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法が挙げられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、α１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
上記の方法で得られるα１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号３に記載の塩基配列があげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３．に記載の各種細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
また、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に係わる酵素活性の変化を指標として、相同組換え体を取得することもできる。具体的な方法としては、例えば、以下に記載の形質転換体を選択する方法が挙げられる。
形質転換体を選択する方法
α１，６−フコース修飾酵素の活性が低下または欠失した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３─糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
レクチン耐性細胞であることを確認する方法としては、ＧＤＰ−フコース合成酵素、α１，６−フコース修飾酵素またはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の発現を確認する方法、直接レクチンを加えた培地に細胞を培養する方法などがあげられる。具体的には細胞内のα１，６−フコース修飾酵素の一つであるα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡの発現量を測定し、ｍＲＮＡの発現が低下していればレクチン耐性の細胞であるといえる。
また、α１，６−フコース修飾酵素の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などが挙げられる。生産抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の５．に記載の方法が挙げられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法が挙げられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等が好ましい。
具体的には、数１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地にで１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、本発明の宿主細胞を選択することができる。
（ｂ）ＲＤＯ方法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
α１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、α１，６−フコース修飾酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちα１，６−フコース修飾酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするα１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
α１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
α１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、上記１の（１）の（ａ）に記載の、α１，６−フコース修飾酵素活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」を用いることもできる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６，（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５，（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２，（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９，（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８，（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３，（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｃ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、α１，６−フコース修飾酵素の活性、あるいは生産抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするα１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
本発明の細胞を宿主細胞として抗体分子をコードする遺伝子を導入するには、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
α１，６−フコース修飾酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の、α１，６−フコース修飾酵素活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」が挙げられる。
（ｄ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、α１，６−フコース修飾酵素をコードしている遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９，（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７，（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３，（１９９５）、細胞工学，１３，２５５，（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法又はリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
標的遺伝子のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、標的遺伝子の翻訳領域の部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を得ることもできる。
本発明の細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞が挙げられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」及び「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載の「形質転換体を選択する方法」があげられる。
また、標的遺伝子がコードする蛋白質の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などが挙げられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の５．に記載の方法が挙げられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、上述の、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法が挙げられる。
また、発現ベクターを用いず、標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、標的遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（ｅ）ＲＮＡｉ方法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。ＲＮＡｉ法とは、２本鎖のＲＮＡを細胞中に導入して、細胞中に存在する該ＲＮＡの配列に相同なｍＲＮＡを分解破壊し、遺伝子発現を抑える方法をいう。
標的遺伝子のｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、標的遺伝子の翻訳領域の部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼＩＩＩにより転写が行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法が挙げられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法が挙げられる。
標的遺伝子がコードする蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載された「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２，（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９，（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９，（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．），２，７０，（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
本発明のＲＮＡｉ法に用いられるＲＮＡとしては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質をコードするＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。好ましくはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼであるＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。
本発明のＲＮＡｉ法で使用されるＲＮＡとしては、ＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡであればいかなるものでもよいが、ＲＮＡの長さとしては、好ましくは１〜３０、より好ましくは５〜２９、さらに好ましくは１０〜２９、最も好ましくは１５〜２９の連続したＲＮＡがあげられる。
（２）ドミナントネガティブ体を導入する手法による、本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、α１，６−フコース修飾酵素を標的とし、該蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。
ドミナントネガティブ体の具体的な例として、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の例が挙げられる。
細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターは、小胞体及びゴルジ体の膜上においてダイマーを形成して機能していることが知られている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８，２０００］。また、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を細胞内で強制発現させることにより、野生型トランスポーターとヘテロダイマーを形成し、形成したヘテロダイマーは野生型ホモダイマーに対して阻害活性を示すことが報告されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８，２０００］。従って、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を作製し細胞内に導入することで、ドミナントネガティブ体として機能させることが可能である。このような変異体の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
本発明の細胞は、上述のように作製したα１，６−フコース修飾酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
α１，６−フコース修飾酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
α１，６−フコース修飾酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
標的蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）に記載の方法が挙げられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の４．に記載の方法が挙げられる。
（３）酵素についての突然変異を導入する手法
本発明の細胞は、α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する酵素としては、具体的にはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
具体的には、１）突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、α１，６−フコース修飾酵素活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などが挙げられる。
突然変異誘発処理としては、親株細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術  第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
α１，６−フコース修飾酵素活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の、α１，６−フコース修飾酵素活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」が挙げられる。
（４）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法
本発明の宿主細胞は、α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
２．本発明の、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明の、抗体分子の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が制御されるようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、α１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的として、１．に記載の手法を用いて作製した胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物細胞より、公知の方法を用い作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する酵素としては、具体的にはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
具体的な方法について、以下に記す。
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、α１，６−フコース修飾酵素の活性が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
具体例としては、染色体上のα１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンなどがあげられる。作製した胚性幹細胞（例えば、該変異クローン）を用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞でα１，６−フコース修飾酵素の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。具体的には、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をＧ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない）ことにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−Ｄｉｌ−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ、ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨ  ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ等があげられる。
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、α１，６−フコース修飾酵素の活性が低下した本発明の受精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、α１，６−フコース修飾酵素の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルスまたは細胞に、１．に記載の手法を施すことでα１，６−フコース修飾酵素の活性が低下した本発明の植物細胞からなるカルスを作製することができる。
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、α１，６−フコース修飾酵素の活性が低下したトランスジェニック植物を作製することができる。
３．抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、モノクローナル・アンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディ・エンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調製した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞として、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
抗体組成物の製造法に用いられる宿主細胞としては、上記１．で作製した、本発明の細胞をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、上記１．の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」に従い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊「ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養、ホロファイバー培養などの培養法を用いて１日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合タンパク質などを挙げることができる。
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物およびＦｃ融合蛋白質の製造方法について記すが、他の抗体組成物を上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
Ａ．ヒト化抗体の組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を生産するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］および．ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域では、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製において、該抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定することが、最も重要な点である。抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸を同定する方法としては、Ｘ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等の抗体の立体構造の構築および解析方法があげられる。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらした。しかしながら、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されていない。したがって、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項３の（５）に記載のＰＣＲ法により行うことができる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、１．に記載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４、モノクローナル・アンティボディズ］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズＣｈａｐｔｅｒ  ８、モノクローナル・アンティボディズ］。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２、モノクローナル・アンティボディズ］等で測定することができる。
Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造
（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（レキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
前記の（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、抗体分子を発現する能力を有している細胞の場合には、上記１．に記載の方法を用いて抗体生産細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、抗体組成物を製造することができる
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナル・アンチボディズ、あるいはアンチボディ・エンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
５．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏＮ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識「ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
６．本発明により得られる抗体組成物の利用
本発明により得られる抗体組成物は高いＡＤＣＣ活性を有する。高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、本発明により得られる抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１−３３６，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０−２６６，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１−１５１６，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３−４９７，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７−３９５，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９−２９１１，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１−９９１５，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６−２４０１，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９，１９９７）、抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８−２１４６，２０００）、抗ＣＡ１２５抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗インテグリンαｖβ３抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１（８）、４０３−４１０（２０００））、抗ＣＤ１０抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３，３７４−３８２，２０００）などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１−３８１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２−５６７，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１−５０，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３−１９０，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７−２４５，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）、抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３−１３８１，１９９７）、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１（８）、４０３−４１０（２０００））、抗ＣＲＴＨ２抗体（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，１２７８−１２８６（１９９９））、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００−１７４０４，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８−１１６４，２０００）などが挙げられる。
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１−６８，２０００）などが挙げられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５−３９５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５−２０７６，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６−３９９，１９９９）、自己免疫疾患（乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗インテグリンα４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１（８）、４０３−４１０（２０００））などが挙げられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞の作製
ＷＯ０１／６４７５４記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
１０μｇの抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）［ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社製）を５％含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を実施例２（２）項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を実施例２（２）項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、得られたクローン化株をＫＭ２７６０＃５８−３５−１６と名付けた。尚、ＷＯ００／６１７３９記載のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、「ＦＵＴ８」と表記する）の遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物が比較的低い株を優良株として選択し用いた。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量を実施例２（２）記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株は５−０３株と名付けた。
実施例２．ＦＵＴ８遺伝子の発現が低下した抗体生産細胞が生産する抗体組成物と親株細胞が生産する抗体組成物との比較
α１，６−フコース修飾酵素の活性が親株細胞より低下した抗体生産細胞が生産する抗体組成物と、親株細胞が生産する抗体組成物とのＡＤＣＣ活性の比較を行った。
（１）抗体組成物の調製
α１，６−フコース修飾酵素の活性が親株より低下した抗体生産細胞が生産する抗体組成物としては、実施例１の（１）記載のＦＵＴ８遺伝子の転写物量が低いＫＭ２７６０＃５８−３５−１６株の培養上清より精製した抗体組成物ＫＭ２７６０−１を用いた。
親株細胞であるラットミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）が生産する抗体組成物は、以下のようにして調製した。
１０μｇの抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０（ＷＯ０１／６４７５４記載）を４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）［ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社製）を５％含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を本項（２）記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を本項（２）記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株を１−１５株と名付けた。尚、１−１５株に関しては限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行わなかった。
取得した形質転換株１−１５が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製は以下のように行った。
抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換株１−１５を２００ｎＭ  ＭＴＸ、Ｄａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬製）を５％の濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（インビトロジェン社製）培地に２×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、スピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて３７℃の恒温室内でＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ攪拌培養した。８−１０日間培養して回収した培養上清より、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムおよびゲルろ過法を用いて、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体をＫＭ２７６０−２と名づけた。
（２）抗体組成物の抗原結合活性
本実施例（１）で得られた２種類の抗体組成物について抗原結合活性を以下に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号６）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ｍＬに、１００ｍｌの２５ｍｇ／ｍＬ  ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液を撹拌しながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬ  ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬ  ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ  ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）を撹拌しながら添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、ＴｗｅｅＮ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅＮ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、２０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後４１５ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、精製したＫＭ２７６０−１およびＫＭ２７６０−２のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性を上記記載のＥＬＩＳＡにより測定した結果、同等の結合活性を示した。
（３）抗体組成物のＡＤＣＣ活性
精製したＫＭ２７６０−１およびＫＭ２７６０−２のＡＤＣＣ活性を以下の方法で測定した。
抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒトＣＣＲ４高発現細胞であるＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞（ＷＯ０１／６４７５４）に対するＡＤＣＣ活性は、以下のようにして測定した。
（ａ）標的細胞溶液の調製
ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトＣＣＲ４を発現しているＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞の１．５×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を５．５５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間３０分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、培地を用いた懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を１５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（ｂ）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血６０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．６ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。培地で３回遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ヒトエフェクター細胞溶液とした。
（ｃ）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。さらに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度０．０００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性（％）は下式（Ｉ）により求めた。
2003085107.tif 000003
上記記載の方法により測定した結果、ＫＭ２７６０−１とＫＭ２７６０−２では有意に活性が相違し、ＫＭ２７６０−２の方が有意に低かった（第１図）。
（４）抗体組成物の糖鎖解析
ＫＭ２７６０−１およびＫＭ２７６０−２の糖鎖分析を以下の方法に従って行った。
ＫＭ２７６０−１およびＫＭ２７６０−２についてそれぞれヒドラジン分解を行い、糖鎖を蛋白質から切断した［メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３，１９８２］。減圧留去することによってヒドラジンを除去した後、酢酸アンモニウム水溶液と無水酢酸加えてＮ−アセチル化を行った。凍結乾燥後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７，１９８４］。蛍光標識した糖鎖群（ＰＡ化糖鎖群）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ  １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った（第２図）。
緩衝液Ａとしてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、緩衝液Ｂとして０．５％１−ブタノールを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）を用い、以下のグラジェントで分析した。
2003085107.tif 000004
第２図で示した（１）〜（８）のピークは、それぞれ以下の構造を示す。
2003085107.tif 000005
2003085107.tif 000006
ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。
第２図において、α１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は、（１）〜（８）のうち（１）〜（４）のピークが占める面積、α１，６−フコースが結合した糖鎖群の割合は、（１）〜（８）のうち（５）〜（８）のピークが占める面積から算出した。
α１，６−フコースを持たない糖鎖の割合に関して違いが観察され、ＫＭ２７６０−２の方が有意に低かった。
（５）抗体組成物を生産する細胞のＦＵＴ８遺伝子の発現量
親株細胞であるラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＫＭ２７６０−１生産株であるＫＭ２７６０＃５８−３５−１６株、およびＫＭ２７６０−２生産株である１−１５株のＦＵＴ８およびβ−アクチン遺伝子の転写物の量を、ＷＯ００／６１７３９の実施例８に記載の定量法にしたがって測定した結果を第３図に示す。１−１５株のＦＵＴ８遺伝子の発現量は、親株細胞であるラットミエローマＹＢ２／０細胞と同等であったが、ＫＭ２７６０＃５８−３５−１６株の発現量はこれら株と比較して明らかに低かった。
以上の結果より、α１，６−フコース修飾酵素の活性が親株細胞より低下した抗体生産細胞は、親株細胞が生産する抗体組成物よりＡＤＣＣ活性の高い抗体組成物を生産することが可能であることが確認された。
実施例３．ＦＵＴ８遺伝子が破壊されたＣＨＯ細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８遺伝子のエクソン２を含むゲノム領域を欠失したＣＨＯ細胞を作製し、該細胞が生産する抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
１．チャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築
（１）プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏの構築
以下の手順でプラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏを構築した（第４図）。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、特開平１１−３１４５１２に記載のプラスミドｐｌｏｘＰ  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．０ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．５μｌ、プラスミドｐｌｏｘＰ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約２．０Ｋｂ）０．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐｌｏｘＰＰｕｒｏと称す。
（２）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１の構築
参考例（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１を構築した（第５図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ２．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２由来のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．５μｌ、プラスミドＬＩＴＭＵＳ２８由来のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（約２．８Ｋｂ）０．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１と称す。
（３）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２の構築
本項（２）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２を構築した（第６図）。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１  ２．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏ  １．０μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＨｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１由来のＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏ由来のＨｐａＩ−ＫｐｎＩ断片（約３．５Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２と称す。
（４）プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築
参考例（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３を構築した（第７図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４  ２．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｐａＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用い、添付の説明書に従ってＤＮＡ末端の平滑化を行った。フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行ってＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４由来のＨｐａＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．５Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３９由来のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約２．８Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３と称す。
（５）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築
参考例（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３を構築した（第８図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４  ２．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．０ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１．８Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３．０Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３と称す。
（６）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４の構築
本項（４）および（５）で得たプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３およびｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４を構築した（第９図）。
プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３  １．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．６ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３  １．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３５μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．５μｌを添加し、６５℃で３０分間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
上記で得たプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．１Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約４．８Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４と称す。
（７）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５の構築
本項（３）および（６）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２およびｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５を構築した（第１０図）。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて２５℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３０μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．０μｌを添加し、６５℃で１時間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて２５℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約５．２ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．０Ｋｂ）０．５μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．４Ｋｂ）４．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で１５時間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５と称す。
（８）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築
本項（７）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを構築した（第１１図）。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ジフテリアトキシン発現ユニットを含む約１．２ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３０μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．０μｌを添加し、６５℃で１時間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ由来のＲｓｒＩＩ−ＲｓｒＩＩ断片（約１．２Ｋｂ）１．０μ１、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５由来のＲｓｒＩＩ−ＲｓｒＩＩ断片（約１０．４Ｋｂ）１．０μｌ、滅菌水３．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏと称す。
２．ＦＵＴ８遺伝子エクソン２を含むゲノム領域が１コピー破壊されたＣＨＯ細胞の作製
（１）ターゲティングベクターの導入
本実施例第１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを実施例１の（２）で作製した５−０３株へ導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの５−０３株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ  １５０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．８ｍｌに溶解し、６００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、５−０３株をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２）に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。同様にしてキュベット３０本分に対し遺伝子導入した後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）３０枚へ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１５μｇ／ｍｌＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％  ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１０ｍｌずつ分注した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１０日間の培養を行い、ピューロマイシン耐性株を取得した。
（２）ターゲティングベクター導入株の取得
本項（１）で得たピューロマイシン耐性株より任意の９００個のコロニーを以下の手順で採取した。
まず、ピューロマイシン耐性株が出現した１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、１５μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地（２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ）と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。レプリカプレートは、１５μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養することにより作製した。
（３）ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断
本項（２）で得た９００クローンに対し、以下の手順でゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断を行った。
まず、本項（２）で作製したレプリカプレートより公知の方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ）３０μｌに一晩溶解した。また、参考例で得たＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１５に示す）およびベクター内のｌｏｘＰ配列に結合するプライマー（配列番号１６に示す）を設計した。
ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液を各々１０μｌ含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１５および配列番号１６）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとした３８サイクルの条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＣＨＯ細胞ゲノム領域とターゲティングベクター相同領域との境界部を含む約１．７Ｋｂの特異的増幅が認められるものを陽性クローンとした。本法により陽性を示す１クローンを見出した。
（４）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（３）で陽性が確認された１クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、本項（３）で見出された陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、陽性クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ）１５０μｌに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに溶解し、２５単位の制限酵素ＰｓｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）２０μｌに溶解し、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、参考例で得たＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号９および配列番号１０）を設計した。次に、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、参考例（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号９および配列番号１０）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μｌに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ］１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で二晩暴露し現像した。
前述の制限酵素ＰｓｔＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約４．４ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約６．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。
本法により、本項（３）における陽性クローンのゲノムＤＮＡより上記約４．４Ｋｂおよび約６．０Ｋｂの特異的断片が見出された。両断片の量比が１：１であったことから、本クローンは、ＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊したクローンであることが確認された。本クローンを以下、１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６株と称す。
３．ＦＵＴ８遺伝子が１コピー破壊されたＣＨＯ細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例第２項で作製した１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６株へ、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を導入した。
プラスミドｐＢＳ１８５の１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６株をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）をプラスミドｐＢＳ１８５  ４μｇと混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。導入後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０ｍｌに懸濁し、さらに同培地を用いて２万倍希釈した。接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）７枚へ播種後、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。培養後、上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１０ｍｌずつ分注した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１０日間の培養を行った。
（２）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
本項（１）で得た株より任意の４００個のコロニーを以下の手順で採取した。
まず、１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地（２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ）と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレプリカプレートを作製する一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
次に、レプリカプレートを１５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて６日間培養した。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によりｌｏｘＰ配列に挟まれたピューロマイシン耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、ピューロマイシン存在下で死滅する。本選択法により９１個の陽性クローンを見出した。
（３）ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項（２）で見出された陽性クローンのうち任意の６クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、上記６クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、上記クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ）１５０μｌに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ）２０μｌに溶解し、０．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、参考例で得たＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号９および配列番号１０）を設計した。次に、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、参考例（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号９および配列番号１０）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μｌに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で二晩暴露し現像した。
前述の制限酵素ＢａｍＨＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約２５．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。また、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約２０．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。さらに、相同組換えが起こった対立遺伝子からピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去された場合には、同処理により約１８．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。
本法により、上記６クローンのうち５クローンのゲノムＤＮＡより上記約２５．５Ｋｂおよび約１８．５Ｋｂの特異的断片が見出された。両断片の量比が１：１であったことから、ＦＵＴ８ゲノム領域を１コピー破壊した株よりピューロマイシン耐性遺伝子が除去されたことが示された。本クローンを以下、１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６−１株と称す。尚、上述の１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６−１株、１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６株、および、５−０３株のゲノムサザンの結果を第１２図に示した。なお１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６−１株は２−４６−１の株名で、平成１３年９月２６日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５５として寄託されている。
４．ＦＵＴ８遺伝子破壊株が生産する抗体組成物の精製
本実施例第３項で得たＦＵＴ８対立遺伝子が１コピー破壊された株１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６−１株を、３×１０５個／ｍｌの密度で１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）へ懸濁後、接着細胞培養用Ｔ１８２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）２本に計６０ｍｌ各々播種した。３日間の培養後、上清を除去し、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）計６０ｍｌへ交換した。
これらを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養後、生細胞数をカウントしてバイアビリティーが同程度（各々３０％以下）であることを確認した後、各細胞懸濁液を回収した。該細胞懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収し、１００００ｒｐｍ、４℃の条件で１時間の遠心分離を行った後、０．２２μｍ孔径１５０ｍｌ容ＰＥＳ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（ＮＡＬＧＥＮＥ社製）を用いて濾過した。
０．８ｃｍ径のカラムにＰｒｏｓｅｐ−Ａ  ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ（ｂｉｏＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ社製）を厚さ２ｃｍで充填し、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１０ｍｌおよび１ｍｏｌ／ｌグリシン／ＮａＯＨ−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１０ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清各１００ｍｌをカラムに通筒し、１ｍｏｌ／ｌグリシン／ＮａＯＨ−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）５０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）２．５ｍｌを用いてＰｒｏｓｅｐ−Ａに吸着した抗体の溶出を行い、溶出液を５００μｌずつ分画すると共に、各画分をそれぞれ２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌと混合して中和した。ＢＣＡ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１５０，７６（１９８５）］を用いて抗体を高濃度で含む２画分（計１．２ｍｌ）を選択して合一し、１０ｍｏｌ／ｌクエン酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。
５．ＦＵＴ８遺伝子破壊株が生産する抗体組成物のＡＤＣＣ活性
本実施例第４項で精製した抗ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性を評価するため、ＷＯ０１／６４７５４に記載のＣＣＲ４陽性細胞株ＣＣＲ４／ＥＬ−４を用いたＡＤＣＣ活性を測定した。
１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）（以下、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）と略記する）で継代培養したＣＣＲ４／ＥＬ−４株１×１０６個をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５００μｌに懸濁し、Ｎａ２５１ＣｒＯ４  ３．７ＭＢｑを添加して３７℃で９０分間培養することにより、細胞の放射線標識を行った。１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、標識細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５ｍｌに懸濁した。この洗浄操作を３回繰り返した後、細胞懸濁液を氷上で３０分間静置して放射性物質を自然解離させた。再び上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５ｍｌに懸濁することにより、２．０×１０５個／ｍｌの標的細胞懸濁液を調製した。
一方、健常人の静脈血３０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍｌを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水（大塚製薬社製）３０ｍｌと混合した。混合後、各１０ｍｌをそれぞれＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ  ＰＨＡＲＭＡ  ＡＳ社製）４ｍｌ上に穏やかに重層し、室温下２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。分離された単核球画分を各遠心管より集めて合一し、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）３０ｍｌに懸濁した。室温下１２００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、該細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）２０ｍｌに懸濁した。この洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）を用いて２．５×１０６個／ｍｌのエフェクター細胞懸濁液を調製した。
９６穴Ｕ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各穴に標的細胞懸濁液を５０μｌずつ（１×１０４個／穴）分注した。続いて各穴にエフェクター細胞懸濁液を１００μｌずつ（２．５×１０５個／穴）分注することにより、エフェクター細胞と標的細胞の比を２５：１とした。次にＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）を用いて、本実施例第４項で得た各抗ＣＣＲ４抗体より０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの希釈系列を調製し、該希釈溶液を各ウェルに５０μｌ添加することにより、終濃度０．００２５μｇ／ｍｌ、０．０２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌとした。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４時間反応させた後、プレートに対し１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。各穴の上清７５μｌを１２ｍｍ径ＲＩＡチューブ（ＩＷＡＫＩ社製）に分取し、ＭＩＮＡＸ−αオートガンマーカウンター５５５０（ＰＡＣＫＲＤ社製）を用いて解離５１Ｃｒ量の測定を行った。
また、エフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えてＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）１５０μｌを添加した系で上記の反応を行うことにより、自然解離５１Ｃｒ量の値を求めた。さらにエフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えて１規定塩酸１００μｌおよびＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５０μｌを添加した系で上記の反応を行うことにより、全解離５１Ｃｒ量の値を求めた。これらの値を用いて実施例２（３）記載の式（Ｉ）により、ＡＤＣＣ活性を求めた。
第１３図に各種抗ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性を示した。ＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊された１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６−１株より得た抗体組成物は、該遺伝子破壊前のＣＨＯ細胞５−０３株が生産する抗体組成物に比べ有意に高いＡＤＣＣ活性を示した。また、これら抗体組成物での抗原結合活性には変化は観察されなかった。以上の結果より、宿主細胞のＦＵＴ８対立遺伝子を破壊することにより、生産される抗体組成物のＡＤＣＣ活性を高めることができることが明らかになった。
実施例４．ＦＵＴ８遺伝子が１コピー破壊されたＣＨＯ細胞からの高薬剤耐性株の取得
ターゲットベクターを用い相同組換えの方法で取得されたゲノム遺伝子の片方のアリルが破壊された細胞を、ターゲットベクター挿入株を選抜する際に用いたポジティブ選択のための薬剤濃度を１０倍程度高くした培地で培養し、該薬剤に対する高耐性株を取得することで、両方のアリルが破壊された株が取得されることが一般的に知られている（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）。
そこで、実施例３の２（３）で得た１ｓｔ．ΔＦＵＴ８  ２−４６株を用い、公知の方法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２，２３９１，（１９９２）］に従ってＦＵＴ８遺伝子が２コピー破壊された形質転換株を以下のようにして作製した。
（１）高濃度ピューロマイシン耐性株の取得
１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）へ１ｓｔ．ΔＦＵＴ８  ２−４６株１×１０８個を懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）２０枚へ播種した後、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。培養後、上清を除去し、１５０μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１０ｍｌずつ分注した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１２日間の培養を行った。
出現した薬剤耐性コロニー９０個を以下の手順で採取した。まず、１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、１５０μｇ／ｍｌＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレフリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。レプリカプレートは、１５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＩＶＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した。
（２）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（１）で得た全ての薬剤耐性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
本項（１）で作製したレプリカプレートに対しトリプシン処理を行った後、全クローンを接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１５０μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて全クローンを１週間培養した後、トリプシン処理を行い接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ］１５０ｍｌに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに溶解し、２５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ］２０μｌに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、参考例（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号９および配列番号１０）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５ｍｌに対し、［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ］１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で二晩暴露し現像した。
前述の制限酵素ＢａｍＨＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約２５．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約２０．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。
本法により、相同組換え領域特異的な上記約１４．０Ｋｂの断片のみを認めるクローンが見出された（第１４図）。本クローンを２−４６−Ｈ１０株と称す。実施例５．ゲノム上に存在する全てのＦＵＴ８遺伝子を破壊したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
ＦＵＴ８両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株の造成をおこなった。
１．チャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築
実施例３第１項で得たターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの保有するピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットを以下の手順でネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットに置換することによって、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ＮｅＯを構築した（第１５図）。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）５０μｌに溶解し、制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＡｐａＬＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて２５℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．６ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ  １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３０μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．０μｌを添加し、６５℃で１時間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約１．６Ｋｂ）１．０μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約１０．１Ｋｂ）１．０μｌ、滅菌水３．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏと称す。２．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子を１コピー破壊したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
（１）ターゲティングベクター導入株の取得
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］に対し、本実施例第１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏのＣＨＯ／ＤＧ４４細胞への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．２ｍｌにプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏ２８０μｇを溶解し、４００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入した細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ナカライテスク社製）、１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０ｍｌ／穴ずつ分注した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、Ｇ４１８耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断
本項（１）で取得したＧ４１８耐性クローンに対し、以下の手順でゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断を行った。
９６穴プレートに得たＧ４１８耐性クローンに対しトリプシン処理を行った後、２倍量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
レプリカプレートに対し、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ナカライテスク社製）、１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した後、公知の方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ］３０μｌに一晩溶解した。
参考例で得たＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１３または配列番号１５）およびベクター内配列に結合するプライマー（配列番号１４または配列番号１６）を用いて、以下のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。即ち、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液を各々１０μｌ含む２５μｌの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマーは配列番号１３または配列番号１５、リバースプライマーは配列番号１４または配列番号１６）］を調製し、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとした条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＣＨＯ細胞ゲノム領域とターゲティングベクター相同領域との境界部を含む約１．７Ｋｂの特異的増幅が認められるものを陽性クローン（５０−１０−１０４）と判定した。
（３）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（２）で陽性が確認されたクローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、本項（２）で見出された陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、陽性クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ナカライテスク社製）、１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ］１５０μｌに一晩溶解した。
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇを溶解し、２５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ］２０μｌに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、参考例で得たＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号９および配列番号１０）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、参考例（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号９および配列番号１０）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μｌに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １．７５ＭＢｑおよび  Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ］１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
前述の制限酵素ＢａｍＨＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約２５．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約２０．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。
本法により、陽性クローン５０−１０−１０４のゲノムＤＮＡより上記約２５．５Ｋｂおよび約２０．０Ｋｂの特異的断片が見出された（第１６図）。両断片の量比が１：１であったことから、本クローンはＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊したヘミノックアウトクローンであることが確認された。
３．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
（１）ターゲティングベクター導入株の取得
本実施例第２項で得たＦＵＴ８ヘミノックアウトクローン５０−１０−１０４に対し、実施例３第１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの５０−１０−１０４への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２．４ｍｌにプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ  ４４０μｇを溶解し、８００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、５０−１０−１０４をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入した細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０ｍｌずつ分注した。この培地交換作業を７日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、薬剤耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（１）で得た薬剤耐性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
ピューロマイシン耐性クローンが出現した１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ各クローンを播種し、１５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ］１５０μｌに一晩溶解した。
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇを溶解し、２５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ］２０μｌに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１１および配列番号１２）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、参考例（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１１および配列番号１２）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μｌに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ］１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
前述の制限酵素ＢａｍＨＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約２５．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約２０．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。
本法により、薬剤耐性クローンＷＫ７０４のゲノムＤＮＡより相同組換え領域特異的な約２０．０Ｋｂの断片のみが見出された（第１７図）。野生型対立遺伝子特異的断片が消失していたこと（矢印の部分）から、本クローンはゲノム上に存在する全てのＦＵＴ８対立遺伝子を破壊したクローンであることが確認された。
４．ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例第３項で作製したＦＵＴ８ダブルノックアウトクローンのうちＷＫ７０４に対し、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を導入した。
プラスミドｐＢＳ１８５の各ＦＵＴ８ダブルノックアウトクローンへの遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、各ＦＵＴ８ダブルノックアウトクローンをＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）をプラスミドｐＢＳ１８５  ４μｇと混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。導入後、各細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌに懸濁し、さらに同培地を用いて２万倍希釈した。各希釈液を接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）７枚へ播種後、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で１０日間の培養を行い、コロニーを形成させた。
（２）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
ＷＫ７０４に対し遺伝子導入して得たコロニーより任意のクローンを以下の手順で採取した。まず、１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレプリカプレートを作製する一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
次に、レプリカプレートを６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ナカライテスク社製）、１５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて７日間培養した。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によりｌｏｘＰ配列に挟まれた両対立遺伝子上の薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、Ｇ４１８およびピューロマイシン存在下で死滅する。本ネガティブ選択法により陽性クローンを見出した。
（３）ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項（２）で見出された陽性クローン（４−５−Ｃ３）に対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、上記陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、上記クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ］１５０μｌに一晩溶解した。
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇを溶解し、２０単位の制限酵素ＮｈｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ］２０μｌに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１１および配列番号１２）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、参考例（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１１および配列番号１２）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μｌに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ］１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
前述の制限酵素ＮｈｅＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約８．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。また、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約９．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。さらに、相同組換えが起こった対立遺伝子からネオマイシン耐性遺伝子（約１．６Ｋｂ）またはピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去された場合には、同処理により約８．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。
本法により、供試した陽性クローン４−５−Ｃ３（実施例５の４（３）陽性クローン）のゲノムＤＮＡより、薬剤耐性遺伝子が除去された相同組換え領域特異的な約８．０Ｋｂ断片のみが見出された（第１８図）。
実施例６．ＦＵＴ８対立遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における抗体分子の発現
１．抗ＣＤ２０キメラ抗体発現ベクターの作製
（１）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築  ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号１７）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＬの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、および２４の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行ない、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で２時間反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第１９図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌを得た。
（２）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築  ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号１８）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＨの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、および３０の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行い、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４９ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。
この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第２０図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを得た。
次に、１４番目のアミノ酸残基をＡｌａからＰｒｏへ置換するために、配列番号３１で示した合成ＤＮＡを設計し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により、以下の様に塩基の置換を行った。上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ上記の変異導入用プライマー（配列番号３１、ＧＥＮＳＥＴ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを２５サイクル行なった。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。また、同様に、上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ７  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ  ＭＵＴ  Ｂ１  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）］のＰＣＲ反応を行った。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。続いて、上記で得られた０．４４ｋｂのＰＣＲ産物と０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を０．５μＬずつ４７．５μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造社製）、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９０℃にて１０分間加熱した後、６０分間かけて３７℃まで冷却した後、３７℃で１５分間保持することによってＤＮＡをアニーリングさせた。２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を添加して７２℃にて３分間反応させた後、１０ｐｍｏｌずつのＴ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とＴ７  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）を添加して反応液を５０μＬとし、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行った。該反応液２５μＬをＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した後、半量を１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位の制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）１μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位のＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲ産物由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。
こうして目的の塩基配列を有する第２０図に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを得た。
（３）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５，２０００）と本項（１）および（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８ＬおよびｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを用いて抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＣＤ２０キメラ抗体と表記する）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを以下の様にして構築した。
本項（１）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４１ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．７５ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌ由来ＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のらＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、第２１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌを得た。
次に、本項（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの２μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌの３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．１６ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて、添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した。
得られたプラスミドを用い、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を同社のＤＮＡシークエンサー３７７を用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされている第２１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐが得られたことを確認した。
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体の発現
実施例５第３項で作製したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４に対し、本実施例第１項で得た抗ＣＤ２０抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを導入した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８ＰのＷＫ７０４への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐ  １０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００μｌに溶解し、４０単位の制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、ＷＫ７０４をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌを注入した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、形質転換株ＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐを取得した。なお、ＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐ株はＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐの株名で、平成１５年３月２０日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３７として寄託されている。
３．抗ガングリオシドＧＤ３キメラ抗体の発現
実施例５第３項で作製したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４に対し、抗ガングリオシドＧＤ３キメラ抗体発現ベクタープラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１を導入し、抗ＧＤ３キメラ抗体の安定的発現株を作製した。ｐＫＡＮＴＥＸ６４１は、ＷＯ００／６１７３９記載の抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクタープラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４およびヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，１０３５（２０００）］より構成された誘導体であり、ｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４より得たタンデム型抗体発現ユニットを含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＫＡＮＴＥＸ９３より得た複製起点を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片へ連結したものである。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１のＷＫ７０４への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１  １０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００μｌに溶解し、４０単位の制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、ＷＫ７０４をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌを注入した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、形質転換株ＷＫ７０４−２８７１を取得した。なお、ＷＫ７０４−２８７１株はＷＫ７０４−２８７１の株名で、平成１５年３月２０日付けで独立法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３６として寄託されている。
４．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現
実施例５第３項で作製したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４に対し、ＷＯ０１／６４７５４記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を導入し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定的発現株を作製した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８ＰのＷＫ７０４への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０  １５μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００μｌに溶解し、４０単位の制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、ＷＫ７０４をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌを注入した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、形質転換株ＷＫ７０４−２７６０を取得した。なお、ＷＫ７０４−２７６０株はＷＫ７０４−２７６０の株名で、平成１５年３月２０日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３５として寄託されている。
５．抗体分子の精製
本実施例第２項で得た抗ＣＤ２０抗体発現株ＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐを、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ３×１０５個／ｍｌの密度で懸濁後、接着細胞培養用Ｔ１８２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）１０本へ計３００ｍｌ播種した。同様にして、本実施例第３項で得た抗ＧＤ３抗体発現株ＷＫ７０４−２８７１および本実施例第４項で得た抗ＣＣＲ４抗体発現株ＷＫ７０４−２７６０を播種した。３日間の培養後、各株の上清全量を除去し、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）へ交換した。これらを３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養後、各細胞懸濁液を回収した。回収した各細胞懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２μｍ孔径５００ｍｌ容ＰＥＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて濾過した。
０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．５ｍｌを充填し、精製水３．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌを順次通筒した。さらに、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清３００ｍｌをカラムに通筒した後、０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．ｌｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１．２５ｍｌを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。初めに溶出する２５０μｌの画分を廃棄し、次に得られる溶出画分１ｍｌを回収して２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２００μｌと混合して中和した。取得した溶出液に対し、１０ｍｏｌ／ｌ  クエン酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。実施例７．ＦＵＴ８対立遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が産生する抗体組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
実施例６で精製した抗ＣＤ２０抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下の記述に従いＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で培養したヒトＢリンパ球培養細胞株Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を遠心分離操作および懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地（ＦＣＳを５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地によって、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体を各最終濃度０．３〜３０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  ＮｏＮ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。標的細胞自然遊離ＬＤＨ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。全標的細胞破壊にともなう全遊離ＬＤＨ量は、抗体溶液、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。これらの値を用いて下式（ＩＩ）により、ＡＤＣＣ活性を求めた。
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第２２図に各抗ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ活性を示した。ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐより得た抗体は、いずれの抗体濃度においても市販ＲｉｔｕｘａｎＴＭより高いＡＤＣＣ活性を示し、最高細胞障害活性値も高かった。ＲｉｔｕｘａｎＴＭは、ＦＵＴ８遺伝子が破壊されていないＣＨＯ細胞を宿主細胞として製造された抗ＣＤ２０キメラ抗体である。また、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４−２８７１株、ＷＫ７０４−２７６０株より得たそれぞれの抗体に関してＡＤＣＣ活性を測定したところ、抗ＣＤ２０抗体の場合と同様に、ＦＵＴ８遺伝子が破壊されてない通常のＣＨＯ細胞株が産生する抗体に比べて高い細胞障害活性を示した。以上の結果より、ＦＵＴ８対立遺伝子を破壊した宿主細胞を用いることにより、ＦＵＴ８遺伝子が破壊されていない宿主細胞を用いた場合より、細胞障害活性の高い抗体の生産が可能となることが分かった。
実施例８．ＦＵＴ８対立遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が産生する抗体組成物の糖鎖解析
実施例６で取得した、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンが生産した抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＤ３抗体および抗ＣＣＲ４抗体の糖鎖解析を実施例２．（４）に記載の方法に従って行った。また、これら抗体の糖鎖の組成に関して単糖組成分析を、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７，（１９８３）］に従って行った。その結果、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４より得たいずれの抗体においても、フコースを含有する糖鎖構造は確認されなかった。以上の結果より、宿主細胞のＦＵＴ８対立遺伝子を破壊することにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する機能を完全に欠失させることが可能であることを明らかとなった。
参考例  ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８遺伝子の取得
（１）ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ｃＤＮＡ配列の取得
ＷＯ００／６１７３９の実施例８（１）の記載に基づき、培養２日目のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より調製した一本鎮ｃＤＮＡより、以下の手順でチャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡを取得した（第２３図）。
まず、マウスＦＵＴ８のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ，ＡＢ０２５１９８）より、５’側非翻訳領域に特異的なフォワードプライマー（配列番号７に示す）および３’側非翻訳領域に特異的なリバースプライマー（配列番号８に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、前述のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ｃＤＮＡ１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、４％ＤＭＳＯ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記特異的プライマー（配列番号７および配列番号８）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を０，８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約２Ｋｂを精製した。このＤＮＡ断片４μｌを、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従ってプラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちｃＤＮＡが組み込まれた８クローンから、公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、全ての挿入ｃＤＮＡが、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のＯＲＦ全長を含む配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、本プラスミドをＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１と称す。決定したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示した。また、そのアミノ酸配列を配列番号４に示した。
（２）ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ゲノム配列の取得
本項（１）で取得したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ＯＲＦ全長ｃＤＮＡ断片をプローブとして用い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来λ−ファージゲノムライブラリー（ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ社製）よりモレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載の公知のゲノムスクリーニングの方法に従いＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ゲノムクローンを取得した。次に、取得したゲノムクローンを各種制限酵素を用いて消化後、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ｃＤＮＡの開始コドンを含むＡｆａＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片（約２８０ｂｐ）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、陽性を示した制限酵素断片のうちＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片（約２．５Ｋｂ）およびＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片（約６．５Ｋｂ）を選択してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）へ各々挿入した。
取得した各ゲノム断片の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片はＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含む上流イントロン約２．５Ｋｂの配列を、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片はＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含む下流イントロン約６．５Ｋｂの配列を各々コードすることを確認した。以下、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を含むプラスミドをｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片を含むプラスミドをｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４と称す。決定したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域の塩基配列（約９．０Ｋｂ）を配列番号３に示した。
産業上の利用可能性
本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、該細胞を用いて作製されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、該製造方法により製造された抗体組成物および抗体組成物を含有する医薬を提供することができる。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ラットミエローマＹＢ２／０細胞ＫＭ２７６０＃５８−３５−１６株および１−１５株が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□がＫＭ２７６０＃５８−３５−１６株生産抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０−１、△が抗ＣＣＲ４キメラ抗体１−１５株生産ＫＭ２７６０−２の活性をそれぞれ示す。
第２図は、ｍｆＦＵＴ８−６、ｐＡＧＥ２４９導入株によって生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。第２Ａ図にｍｆＦＵＴ８−６株によって生産した抗体から調製したＰＡ化糖鎖、第２Ｂ図にｐＡＧＥ２４９導入株によって生産した抗体から調製したＰＡ化糖鎖の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第３図は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた各宿主細胞株におけるＦＵＴ８およびβ−アクチン転写産物量の定量結果を示した写真である。ＫＭ２７６０−１生産株であるＫＭ２７６０＃５８−３５−１６株、ＫＭ２７６０−２生産株である１−１５株、および親株であるラットミエローマＹＢ２／０細胞から調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ＦＵ８特異的プライマーセット（配列番号１３および１４）あるいはβ−アクチン特異的プライマー（配列番号１１および１２）を用いてＰＣＲ反応を行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した結果を示す。
第４図は、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏの構築を示した図である。
第５図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１の構築を示した図である。
第６図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２の構築を示した図である。
第７図は、プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築を示した図である。
第８図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築を示した図である。
第９図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４の構築を示した図である。
第１０図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５の構築を示した図である。
第１１図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築を示した図である。
第１２図は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊ＣＨＯ細胞株である１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６−１株および１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６株のゲノムサザン解析結果を示した写真である。
第１３図は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子破壊ＣＨＯ細胞株である１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６株および２−４６−Ｈ１０株のゲノムサザン解析結果を示した図である。
第１４図は、ＦＵＴ８対立遺伝子破壊株より精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示した写真である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。▲、■はそれぞれ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体生産ＣＨＯ細胞５−０３株由来の精製抗体、および１ｓｔ．△ＦＵＴ８  ２−４６−１株由来の精製抗体の活性をそれぞれ示す。
第１５図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築を示した図である。
第１６図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊したクローンのゲノムサザン解析結果を示した写真である。
第１７図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８両対立遺伝子を破壊したクローンのゲノムサザン解析結果を示した写真である。
第１８図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８両対立遺伝子より薬剤耐性遺伝子を除去したクローンのゲノムサザン解析結果を示した写真である。
第１９図は、プラスミドｐＢｓ−２Ｂ８Ｌの構築を示した図である。
第２０図は、プラスミドｐＢｓ−２Ｂ８ＨおよびプラスミドｐＢｓ−２Ｂ８Ｈｍの構築を示した図である。
第２１図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの構築を示した図である。
第２２図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト株より精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体のヒトＢリンパ球培養細胞株Ｒａｊｉに対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。
第２３図は、プラスミドＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１の構築を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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