(57)【要約】本発明は、被験試料中の蛋白質の遊離ＳＨ基を化学修飾することにより保護し、遊離ＳＨ基が保護された蛋白質のジスルフィド結合を切断してＳＨ基を露出させ、露出したＳＨ基を検出することを含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質の検出方法に関する。
2004017073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中の蛋白質の遊離ＳＨ基を化学修飾することにより保護し、遊離ＳＨ基が保護された蛋白質のジスルフィド結合を切断してＳＨ基を露出させ、露出したＳＨ基を検出することを含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法。
【請求項２】
露出したＳＨ基とＳＨ基標識物質とを反応させて、標識されたＳＨ基を検出することにより、露出したＳＨ基を検出する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標識されたＳＨ基を検出する前に、二次元電気泳動により被験試料中の蛋白質を分離することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
化学修飾がヨードアセトアミドによるアルキル化であり、ＳＨ基標識物質がモノブロモビマンである、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
被験試料中の蛋白質の遊離ＳＨ基を化学修飾することにより保護し、遊離ＳＨ基が保護された蛋白質のジスルフィド結合を切断してＳＨ基を露出させ、露出したＳＨ基を検出することを含む、アレルゲン蛋白質の検出方法。
【請求項６】
露出したＳＨ基とＳＨ基標識物質とを反応させて、標識されたＳＨ基を検出することにより、露出したＳＨ基を検出する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
標識されたＳＨ基を検出する前に、二次元電気泳動により被験試料中の蛋白質を分離することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
化学修飾がヨードアセトアミドによるアルキル化であり、ＳＨ基標識物質がモノブロモビマンである、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
被験試料がイネ科植物の種子、花粉、ダニ又はハウスダストからの蛋白質抽出物である、請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ＳＨ基保護剤及びＳＨ基検出物質を含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を検出するためのキット。
【請求項１１】
ヨードアセトアミド及びモノブロモビマンを含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を検出するためのキット。
【請求項１２】
還元剤をさらに含む、請求項１０又は１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、蛋白質の検出方法、特にアレルゲン蛋白質の検出方法に関する。
【背景技術】  アレルゲン蛋白質は我々の生活環境に広く存在している。アレルゲン蛋白質は食品アレルギー、ハウスダストアレルギー、花粉症等をもたらす有害な作用を示し、時にはアナフィラキシー等の致命的な症状を引き起こすこともある。アレルギー発症のメカニズムを解明し、防御法を開発するためには、アレルゲン蛋白質を包括的にスクリーニングすることが重要な課題である。
従来のアレルゲン蛋白質のスクリーニング法としては、イムノブロッティング法による検出法、すなわち蛋白質をニトロセルロースやＰＶＤＦ等の膜に転写し、その蛋白質とアレルギー患者の血清中のＩｇＥ抗体とを反応させて、蛋白質に結合した抗体を検出する方法が用いられている（例えば、Ｗｅｉｓｓ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８，８２６−８３３（１９９７））。この方法を用いる場合、膜に転写する際に微量なアレルゲン蛋白質が失われやすく、重要なアレルゲン蛋白質が検出されずに見逃される可能性があった。そのため、ブロッティング手順を必要とせずにアレルゲン蛋白質を検出できる方法が求められている。
一方、一般的な蛋白質の検出方法としては、蛋白質を含む試料を二次元電気泳動（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５０，ｐｐ４００７−４０２１（１９７５））した後、銀染色、色素染色（クーマシー染色）、ネガティブ染色又は蛍光染色等によりゲルを染色して蛋白質を可視化する方法が慣用されている。
さらに、試料中の蛋白質を予め還元してからモノブロモビマンにより蛍光標識し、それを二次元電気泳動に供し、蛍光シグナルを可視化することにより、蛋白質を高感度に検出する方法も知られている（Ｕｒｗｉｎ，Ｖ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９，５７−６２（１９９３））。
しかしながら、アレルゲン蛋白質を高感度に検出できる方法は知られていない。
【発明の開示】
本明細書は、本願の優先権の基礎となる特願２００２−２３６０４８号の明細書及び図面に記載された内容を包含する。
本発明は、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を高感度に検出する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、被験試料中の蛋白質の遊離ＳＨ基を保護し、次いで該蛋白質のジスルフィド結合を切断して該結合を形成していたＳＨ基を露出させ、露出したＳＨ基を検出することにより、ジスルフィド結合を有する蛋白質を検出する方法を開発した。本発明者はさらに、この方法を用いて、被験試料に含まれるアレルゲン蛋白質を検出することに成功した。
これらの成果に基づき完成された本発明は、以下の通りである。
［１］  被験試料中の蛋白質の遊離ＳＨ基を化学修飾することにより保護し、遊離ＳＨ基が保護された蛋白質のジスルフィド結合を切断してＳＨ基を露出させ、露出したＳＨ基を検出することを含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法。
この方法において、露出したＳＨ基の検出は、露出したＳＨ基と、ＳＨ基標識物質とを反応させて、標識されたＳＨ基を検出することによって行うことが好ましい。またこの場合、その標識されたＳＨ基の検出の前に、二次元電気泳動により被験試料中の蛋白質を分離することが好ましい。
この方法においては、特に、ヨードアセトアミドによるアルキル化によって遊離ＳＨ基を化学修飾すること、またＳＨ基標識物質としてモノブロモビマンを用いることが好適である。
［２］  上記［１］に記載したジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法を利用する、アレルゲン蛋白質の検出方法。
被験試料の好適な例としては、イネ科植物の種子、花粉、ダニ又はハウスダストからの蛋白質抽出物が挙げられる。
［３］  ＳＨ基保護剤及びＳＨ基検出物質を含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を検出するためのキット。
［４］  ヨードアセトアミド及びモノブロモビマンを含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を検出するためのキット。
これらの［３］及び［４］のキットは、さらに還元剤を含んでいてもよい。
本発明の方法は、限定するものではないが、典型的には例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程によって実施することができる。図１には、これらの工程を模式的に示す。
（Ａ）被験試料中の蛋白質を、ＳＨ基保護剤と反応させる。これにより、蛋白質の遊離ＳＨ基は化学修飾されてその反応性を喪失し、保護された状態となる（図１［Ａ］）。
（Ｂ）遊離ＳＨ基が保護された蛋白質を、還元剤と反応させる。これにより、該蛋白質のもつジスルフィド結合（図１中、「Ｓ−Ｓ」として示す）が開裂し、ジスルフィド結合を形成していたＳＨ基が露出する（図１［Ｂ］）。
（Ｃ）ＳＨ基が露出した蛋白質と、ＳＨ基標識物質とを反応させる。これにより、該蛋白質の露出したＳＨ基だけが標識される（図１［Ｃ］）。次いで、標識されたＳＨ基を検出することにより、露出したＳＨ基を有する蛋白質を検出する。このようにして検出される蛋白質を、ジスルフィド結合を有する蛋白質として同定する。
本発明の方法によれば、ジスルフィド結合を有する蛋白質を、特異的かつ高感度に検出することができる。さらに、このようなジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法を利用してアレルゲン蛋白質の検出を行うことにより、被験試料中のアレルゲン蛋白質を効率良く検出することができる。本発明のアレルゲン蛋白質の検出方法によれば、従来のアレルゲン蛋白質のスクリーニング法では検出されにくかった微量なアレルゲン蛋白質も、高感度に検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本明細書で使用する基本的な用語の定義
本明細書では、以下の用語を定義した意味に従って使用する。
（１）「蛋白質」とは、原則として、アミノ酸が互いに脱水縮合して生成されるポリペプチド鎖又はペプチド鎖を意味する。但し本発明の「蛋白質」には、加水分解によりアミノ酸だけを生成する単純蛋白質だけでなく、加水分解によりアミノ酸とアミノ酸以外の有機物とを生成する複合蛋白質（例えば、核蛋白質、糖蛋白質、リポ蛋白質、燐蛋白質、色素蛋白質等）、誘導蛋白質（例えば、ゼラチン、ペプトン、プロテオース等）等も包含する。これらの蛋白質は、さらに酵素的又は化学的に修飾されていてもよい。
（２）「ジスルフィド結合を有する蛋白質」とは、非還元条件下で、蛋白質分子内又は蛋白質分子間においてジスルフィド結合を形成している蛋白質を意味する。このジスルフィド結合は、当該蛋白質において、生体内で形成されるジスルフィド結合であってもよいが、生体内では形成されないジスルフィド結合でもよい。
（３）「アレルゲン」とは、ヒト又は哺乳動物におけるアレルギー反応の原因となる抗原物質を意味する。「アレルゲン蛋白質」とは、ヒト又は哺乳動物におけるアレルギー反応の原因となり得る（すなわち、アレルゲンとしてはたらく）蛋白質を意味する。アレルゲン蛋白質は、遺伝子からの転写及び翻訳により産生される全長蛋白質でもよいし、その断片であってもよい。また、物質の「アレルゲン性」とは、ヒト又は哺乳動物においてアレルギー反応を惹起する能力を意味する。
（４）「ＳＨ基」とは、蛋白質のもつスルフヒドリル基を意味する。一般に、この基はチオール基、メルカプト基とも呼ばれる。
２．ジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法
（１）被験試料
本明細書においては、本発明の方法を適用する対象である試料を「被験試料」と称する。被験試料としては、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を含有することが予想される試料である限り、任意の試料を用いることができる。この被験試料は、１種類の蛋白質を含有するものでもよいし、複数種類の蛋白質を含有するものであってもよい。被験試料はまた、単離されていない蛋白質を含有してもよいが、予め単離された蛋白質を含有してもよく、予め単離された蛋白質のみを含有してもよい。
被験試料としては、例えば、食品、医薬、医療材料、化粧品、繊維製品、建築材料、環境検査用試料（例えば空気、水、土壌等の試料）、植物性試料、動物性試料、アレルゲン候補物質、既知アレルゲン、既知アレルゲン蛋白質及び研究用試料（例えば、ジスルフィド結合の形成が予想される蛋白質等）が挙げられる。限定するものではないが、具体的には例えば、魚、肉、乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、卵使用製品（マヨネーズ、菓子類、麺類等）、惣菜、調味料、香辛料、栄養補助食品、ウール製品、羽毛製品、ハウスダスト、ダニ（例えば、コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウダニ）、花粉（例えばスギ花粉、ブタクサ花粉）、食物アレルゲン（コメ、コムギ等のイネ科植物の種子、ソバ、ダイズ、卵白及び牛乳等）、動物由来アレルゲン（イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、ウシ等）、植物由来アレルゲン（ピーナッツ、ウルシ等）、昆虫アレルゲン、寄生虫アレルゲン及びカビアレルゲン等から調製した蛋白質抽出物が挙げられる。被験試料のさらなる例としては、卵白アルブミン、オボムコイド、βラクトグロブリン、αカゼイン、ダニ抗原（例えばコナヒョウヒダニ抗原）、ウシ血清アルブミン、トリプシン／アミラーゼインヒビター、グルテリン、α−グログリン、グリシニン、単離された天然蛋白質、組換え蛋白質、天然のアミノ酸配列を改変した蛋白質、合成蛋白質及びアレルゲン候補蛋白質等の精製蛋白質が挙げられる。これらの被験試料は単独で用いてもよいが、組み合わせて１つの被験試料として用いてもよい。
（２）被験試料中の蛋白質の遊離ＳＨ基の保護
本方法ではまず、上記２−（１）に記載した被験試料に含まれる蛋白質の遊離ＳＨ基を化学修飾することによって保護して、遊離ＳＨ基の反応性を喪失させる。本明細書において「遊離ＳＨ基」とは、ジスルフィド結合を形成可能な条件（例えば中性又は酸性条件等の非還元条件）下においてジスルフィド結合を形成していない、蛋白質中のＳＨ基を意味する。
本発明の方法においては、被験試料に含まれる蛋白質の遊離ＳＨ基を保護するために、被験試料にＳＨ基保護剤を加えて蛋白質と反応させる。ＳＨ基保護剤を加える際の反応条件は、非還元条件であれば特に限定されないが、用いるＳＨ基保護剤に適した条件に適合させることが好ましい。
本発明の方法においては、蛋白質の遊離ＳＨ基をまず保護することにより、ジスルフィド結合の切断に続いてＳＨ基を検出する際に、遊離ＳＨ基が検出されずに、ジスルフィド結合を形成していたＳＨ基だけが検出されるようにする。
本明細書では、化学修飾により蛋白質の遊離ＳＨ基を保護し、その結果、遊離ＳＨ基に対する反応が起こらないようにする物質を、「ＳＨ基保護剤」と称する。ＳＨ基保護剤による「遊離ＳＨ基の化学修飾」としては、具体的には、ＳＨ基に対するメルカプチドの形成、アルキル化、ジスルフィド交換を伴う酸化等が挙げられる。
本発明では、ＳＨ基保護剤として、上記のようにＳＨ基を化学修飾して保護する任意の物質を用いることができる。ＳＨ基保護剤の具体的な例としては、蛋白質中のＳＨ基の保護修飾剤として用いられるＳＨ試薬、蛋白質のＳＨ基と反応してその活性を阻害するＳＨ阻害剤等が挙げられる。
具体的なＳＨ基保護剤の例としては、限定するものではないが、以下の（１）〜（４）に示すものが挙げられる：
（１）重金属（例えば水銀、銀、カドミウム、鉛、銅等）及びそれらの化合物（例えばｐ−メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）、ｐ−メルクリベンゼンスルホン酸（ＰＭＢＳ）、酢酸フェニル水銀（ＰＭＡ）、エチル水銀、４−クロロメルクリ−４’−ジメチルアミノベンゼン、４−クロロメルクリフェニルアゾ−β−ナフトール、サリルガン、Ｓ−メルクリダンシルステイン等）等のメルカプチド形成剤、
（２）ハロゲン化アルキル（例えばヨード酢酸、ヨードアセトアミド）、マレイミド誘導体（例えばＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ））等のアルキル化剤、
（３）５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ，エルマン試薬）、４，４−ジチオピリジン、２，２’（４，４’）−ジピリジルジスルフィド、テトラチオン酸（塩）、テトラニトロメタン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、酸化型グルタチオン等の酸化剤、及び
（４）三酸化二ヒ素、亜ヒ素塩。
本発明のＳＨ基保護剤は、ジスルフィド結合に対する還元作用を妨げないものであることが好ましい。還元作用を妨げるＳＨ基保護剤を用いる場合には、遊離ＳＨ基を保護した後、ジスルフィド結合を還元処理する前に、脱塩等の処理により被験試料中からＳＨ基保護剤を除去することが好ましい。
本発明におけるＳＨ基保護剤としては、アルキル化剤を用いることが好ましく、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いることが特に好ましい。
（３）ジスルフィド結合の切断
次いで、蛋白質が有するジスルフィド結合を切断して、そのジスルフィド結合を形成していたＳＨ基を露出させる。このジスルフィド結合の切断は、還元剤を用いてジスルフィド結合を還元することによって行うことが好ましい。還元剤を用いてジスルフィド結合を切断する場合は、上記２−（２）の記載に従って被験試料中の蛋白質の遊離ＳＨ基を保護した後に、該蛋白質と還元剤とを反応させる。還元剤は、蛋白質の遊離ＳＨ基をＳＨ基保護剤と反応させた後に被験試料に加えればよい。しかしながら、蛋白質の遊離ＳＨ基を保護した後に、その蛋白質と還元剤とを反応させる限りにおいては、蛋白質の遊離ＳＨ基とＳＨ基保護剤との反応工程の前又はその工程と同時に被験試料に還元剤を加えてもよい。例えば、可溶性カプセル中に封入された還元剤をＳＨ基保護剤とともに被験試料に添加することにより、ＳＨ基保護剤によって遊離ＳＨ基が保護された後に、溶解したカプセルから反応液中に放出された還元剤が蛋白質のジスルフィド結合を切断するようにしてもよい。
本発明においてジスルフィド結合の切断に用いる「還元剤」としては、蛋白質が有するジスルフィド結合を切断して、ＳＨ基を露出させることができる任意の物質を用いることができる。具体的な還元剤の例としては、限定するものではないが、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、チオレドキシン、グルタチオンレダクターゼ、メルカプトエタノール、トリブチルフォスフィン、ＮａＢＨ４、ＮＡＤＰＨ、チオグリコール酸、ＮＯ（一酸化窒素）等が挙げられる。
（４）露出したＳＨ基の検出
続いて、ジスルフィド結合の切断により露出したＳＨ基を検出する。この露出したＳＨ基の検出は、ＳＨ基の検出や定量に用いることができる公知の方法を用いて行えばよい。
例えば、ＳＨ試薬を用いた公知のＳＨ基検出法により、露出したＳＨ基を検出及び／又は定量することができる。そのようなＳＨ基検出法としては、例えば、ＳＨ試薬であるメルカプチド形成剤を用いて、露出したＳＨ基をメルカプチド化することを利用する電流滴定法や、ｐ−メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）等を露出したＳＨ基と反応させ、得られる生成物の吸光度を測定することによるＳＨ基の定量法等が挙げられる。好適に用いられる他のＳＨ試薬としては、４’４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンズハイドロール等も挙げられる。
別の実施形態においては、ＳＨ基結合物質（例えば、ＳＨ基と結合する固相）を、露出したＳＨ基を有する蛋白質と反応させて、蛋白質と結合したＳＨ基結合物質を検出することにより、露出したＳＨ基を検出及び／又は定量することができる。あるいは、ＳＨ基結合物質と結合した蛋白質を分離して検出することにより、露出したＳＨ基を有する蛋白質を検出及び／又は定量することもできる。例えば、露出したＳＨ基をＳＨ基と結合する固相（例えばビーズ、フィルター、膜、カラム等）に選択的に結合させて、固相に結合した蛋白質のみを被験試料中から分離し、次いでその分離した蛋白質を検出すればよい。ＳＨ基と結合する固相としては、具体的には例えば、グルタチオンカラム（ファルマシア社製グルタチオンセファロースカラム）、マレイミド基を導入した磁性ビーズ等が挙げられる。この方法では、ＳＨ基結合物質と前記蛋白質との結合による質量の増加を測定し、その増加量に基づいて、蛋白質のもつジスルフィド結合の定量や結合部位の決定を行うことが可能である。
さらに別の例としては、ＳＨ基標識物質を、露出したＳＨ基を有する蛋白質と反応させて、標識されたＳＨ基を検出することにより、露出したＳＨ基を検出及び／又は定量することができる。ここで「標識」とは、限定するものではないが、蛍光標識、放射性同位体標識、抗体標識、酵素標識等が挙げられる。
ＳＨ基標識物質を用いる場合、標識の検出方法は、標識の種類に依存して決定される。標識が蛍光標識である場合には、その標識シグナルは、例えば標識された蛋白質に紫外線を照射することによって放射される蛍光を、蛍光検出装置によって検出すればよい。その蛍光シグナルは、分光光度計を用いてその蛍光波長に対する吸光度で蛍光量を測定することによって検出することができる。蛍光は一般に定量性が高いので、定量した蛍光の測定値からジスルフィド結合の量や結合部位を決定することが可能である。また標識が放射性同位体標識である場合には、液体シンチレーションカウンター等によって放射活性を測定することにより、該標識シグナルの検出を行うことができる。あるいは、該標識シグナルの検出のために、オートラジオグラフィーにより可視化して、放射活性の検出を行ってもよい。標識が抗体標識である場合には、例えば、標識に用いた抗体にたいして特異的な抗原を該抗体と反応させることにより、標識の検出を行うことができる。さらに標識が酵素標識である場合には、該酵素の基質を加えて該酵素と反応させ、その酵素反応の結果得られる発色反応又は蛍光反応等を検出することにより、該標識の検出を行うことができる。これらの非蛍光性の標識を用いる場合にも、検出の際に標識シグナル量の定量を行って、その測定値からジスルフィド結合量や結合部位を推定することが可能である。
本発明の方法においては、ＳＨ基標識物質として、ＳＨ基に対する蛍光標識試薬を好適に用いることができる。ＳＨ基標識物質の具体例としては、限定するものではないが、モノブロモビマン、ベンゾフラザン（ベンゾオキサジアゾール）誘導体（例えば４−フルオロ−７−スルファモイルベンゾフラザン（ＡＢＤ−Ｆ））、ダンシルアジリジン等のアジリジン、フルオレセインマーキュリ酢酸（ＦＭＡ）、Ｓ−メルクリ−Ｎ−ダンシルステイン（ＭＤＣ）、Ｎ−（ヨードアセチルアミノエチル）−５−ナフチルアミン−１−スルホン酸（１，５−Ｉ−ＡＥＡＮＳ）及びその１，８−異性体、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）（ＮＢＤ−Ｃｌ）、蛍光性基（例えば２−フェニルベンゾイミダゾール、フルオレセイン、各種ローダミン、シアニン色素等）を導入したＮ−置換マレイミド（例えばＮ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニル）マレイミド（ＤＡＣＭ）、Ｎ−［４−（６−ジメチルアミノ−２−ベンゾフラニル）フェニル］マレイミド、シアニン色素−マレイミド）等が挙げられる。
本明細書においては、ＳＨ基の検出や定量に用いることができる物質、例えば上述のようなＳＨ試薬、ＳＨ基結合物質及びＳＨ基標識物質等を、「ＳＨ基検出物質」と称する。
本発明の方法において用いるＳＨ基検出物質は、上記２−（２）に記載したＳＨ基保護剤としても用いることが可能なものであってもよい。但し、本発明の方法において、単一の検出系では、好ましくはＳＨ基保護剤とＳＨ基検出物質として異なる物質を用いる。さらに、露出したＳＨ基を特異的に検出するためには、例えばＳＨ基保護剤として非蛍光試薬、ＳＨ基検出物質として蛍光試薬を使用することによって、ＳＨ基検出物質を用いた検出の際にＳＨ基保護剤による保護修飾が同時に検出されないようにすることが好ましい。
本発明の方法において、特に好適に用いることができるＳＨ基保護剤とＳＨ基検出物質との組み合わせは、ＳＨ基保護剤としてヨードアセトアミド、ＳＨ基検出物質としてモノブロモビマンを用いるものである。
ＳＨ基検出物質は、蛋白質のＳＨ基を上述のようにして露出させた後に該蛋白質と反応させる限りにおいては、還元剤の添加と同時、又はそれより前若しくは後に、あるいはＳＨ基保護剤の添加と同時、又はそれより前若しくは後に、被験試料に加えてもよい。そのような場合の１つの例としては、ＳＨ基検出物質が可溶性カプセル等に包含されており、そのようなＳＨ基検出物質を被験試料にＳＨ基保護剤とともに添加すると、ＳＨ基保護剤が遊離ＳＨ基を化学修飾した後にＳＨ基検出物質が反応液中に放出される場合が挙げられる。このような場合、ＳＨ基検出物質は、還元剤と同じカプセル中に含有させて用いてもよく、別々のカプセルに含有させて用いてもよく、ＳＨ基検出物質だけをカプセルに含有させて用いてもよい。本明細書において、ＳＨ基検出物質を被験試料に「加える」とは、被験試料中にＳＨ基検出物質を混合することだけでなく、被験試料とＳＨ基検出物質とを他の様々な状態で接触させること、例えばＳＨ基検出物質がＳＨ基と結合する固相である場合には、被験試料中にＳＨ基検出物質を配置すること、又はＳＨ基検出物質上に被験試料を添加することなども包含する。
本発明に用いるＳＨ基検出物質は、ＳＨ基保護剤及び／又は還元剤との共存下で、露出したＳＨ基との反応が妨げられないものであることが好ましい。しかしながら、ＳＨ基保護剤及び／又は還元剤との共存によりＳＨ基との反応が妨げられるＳＨ基検出物質を用いる場合には、ＳＨ基検出物質を添加する前に、脱塩又は蛋白質の分離等によりＳＨ基保護剤及び／又は還元剤を除去しておけばよい。なお、本発明のＳＨ基検出物質は、必要であれば発色基質等の補助物質とともに添加してもよい。
本発明の方法において、ＳＨ基検出物質を用いる露出したＳＨ基の検出は、常法によって行えばよい。ＳＨ基検出物質を用いて露出したＳＨ基の検出を行う場合には、露出したＳＨ基とＳＨ基検出物質とを反応させた後、複数種類の蛋白質が含有されている被験試料についてそのまま検出を行うことができる。しかしながら、露出したＳＨ基とＳＨ基検出物質とを反応させた後の被験試料を、従来公知の蛋白質分離法によって予め分離してから、露出したＳＨ基の検出を行ってもよい。例えば、前記被験試料について、当業者に公知の一次元電気泳動、二次元電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、カラムクロマトグラフィー、質量分析等の方法で、蛋白質を分離してもよい。蛋白質を分離した後、被験試料を電気泳動で分離する場合には電気泳動ゲル、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離する場合には、溶出させた分子量画分について検出を行えばよい。本発明の方法では特に、二次元電気泳動により蛋白質を分離してから検出を行うことが好ましい。二次元電気泳動を用いることによって、蛋白質が高い解像度で精度良く単離されるだけでなく、その後の検出を１つの被験試料について一回で行うことができるという利点がある。
別の態様において、露出したＳＨ基をＳＨ基検出物質を用いて検出する際に、遊離のＳＨ基検出物質も一緒に検出されてしまうおそれがある場合には、露出した検出の前に、被験試料中の蛋白質を遊離のＳＨ基検出物質から分離することが好ましい。このような場合としては、ＳＨ基検出物質として、それ自体が標識シグナルを発するＳＨ基標識物質（例えばフルオレセインを蛍光基として導入したマレイミド試薬）を用いる場合が挙げられる。一方、それ自体は無蛍光性であるがＳＨ基と反応して生成する誘導体が蛍光性である物質（例えば２−フェニルベンゾイミダゾールを蛍光性基として導入したＮ−置換マレイミド）をＳＨ基検出物質として用いる場合には、蛋白質を遊離のＳＨ基検出物質から分離しなくても、標識されたＳＨ基を選択的に検出できる。
別の実施形態においては、例えば、ジスルフィド結合を切断するための還元剤としてジチオトレイトールを使用して、ジチオトレイトールとジスルフィド結合との反応により生成される分子内Ｓ−Ｓ結合を有する環状構造物に対して２８０ｎｍ付近に現れる吸収を測定することにより、露出したＳＨ基を検出及び定量することができる。このような手法により、ジスルフィド結合の還元反応に伴って得られる生成物を検出又は定量することによっても、露出したＳＨ基を検出することができる。
本発明の方法では、上記のようにして露出したＳＨ基を検出することにより、ジスルフィド結合を有する蛋白質を同定することができる。本発明の方法によって被験試料において露出したＳＨ基が検出されるならば、その被験試料はジスルフィド結合を有する蛋白質を含む。また電気泳動等により分離した各蛋白質において露出したＳＨ基が検出されるならば、その蛋白質はジスルフィド結合を有する蛋白質である。
３．ジスルフィド結合を有する蛋白質の単離及び同定
続いて、露出したＳＨ基が検出された被験試料から、ジスルフィド結合を有する蛋白質を単離することができる。該蛋白質の単離は、当業者に公知の方法によって行えばよい。露出したＳＨ基の検出を、例えば被験試料中の蛋白質を電気泳動によって分離したゲルについて行った場合には、露出したＳＨ基が検出されたゲルの当該スポット部分を採取して、該ゲルから蛋白質を抽出すればよい。露出したＳＨ基の検出を、例えば被験試料中の蛋白質をＨＰＬＣによって分離した分子量画分について行った場合には、必要であればさらにクロマトグラフィー等の精製手法によって該画分に含まれる蛋白質をさらに精製してもよいし、該画分に含まれる蛋白質が充分に精製されていればそのまま単離蛋白質を含む溶液として用いてもよい。あるいは、前記被験試料又は前記画分について、使用した標識に対する抗体を用いてアフィニティーカラム精製を行うことにより、目的の蛋白質を単離してもよい。また、ＳＨ基検出物質として、例えばＳＨ基に結合する固相を用いた場合には、露出したＳＨ基をＳＨ基と結合する固相（例えばビーズ、フィルター、膜、カラム等）に選択的に結合させて、その結合を利用して被験試料中から該ＳＨ基を有する蛋白質を分離し、さらに該ＳＨ基を有する蛋白質を固相から解離させることにより、ジスルフィド結合を有する蛋白質を取得することができる。このようにして取得した蛋白質を、必要であればさらにクロマトグラフィー等の精製手法によってさらにそれぞれの蛋白質の画分に分離精製することによって単離することもできる。以上の単離工程により、ジスルフィド結合を有する蛋白質を単離し、さらにその分子量、被験試料中の含有量等も明らかにすることができる。
本発明の方法では、以上のようにして単離した蛋白質をさらに特性解析することによって同定することもできる。本発明において「蛋白質を同定する」とは、蛋白質を、既知蛋白質又は既知蛋白質と同じクラスに属する蛋白質群に分類することを意味する。
本発明において、単離した蛋白質を同定するためには、該蛋白質について特性解析を行い、その結果示された特性を既知蛋白質の特性と比較して、既知蛋白質と共通した特性を見つければよい。本発明において「共通した特性」とは、一致するか、又は共通点の多い特性を意味する。例えば、その特性がアミノ酸配列であれば、「共通した特性」とは、同一のアミノ酸配列を有するか、又は相同性の高いアミノ酸配列を有することを意味する。また、本発明における「特性解析」とは、単離した蛋白質について、電気泳動結果からの該蛋白質の分子量及び／又は等電点等の決定、一部又は全部のアミノ酸配列の決定、該蛋白質をコードする遺伝子又はｃＤＮＡ配列の探索及び決定、該蛋白質についての質量分析等を行うことを意味する。アミノ酸配列の決定には、蛋白質をペプチダーゼ等により部分分解して、各断片についてエドマン分解法により内部アミノ酸配列を決定することが好ましい。一方、これらの蛋白質の特性を集めたデータベースが複数存在している（ＧｅｎＢａｎｋ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＥＭＢＬ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢＳＴＲ等）。そこで、本発明において単離した蛋白質についての特性を、それらのデータベースにおいて検索すれば、共通した特性を有する既知蛋白質をデータベースから抽出することができる。特性が一致する既知蛋白質がデータベースから抽出された場合は、単離された蛋白質はその既知蛋白質として同定される。特性が類似している既知蛋白質がデータベースから抽出された場合には、その単離された蛋白質はその既知蛋白質と同じクラスの蛋白質に分類されることになる。
以上のようにして、本発明において単離されたジスルフィド結合を有する蛋白質を同定することができる。
４．ジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法を利用した他の実施形態
本発明においては、上記のジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法を利用して、被験試料中に含まれる特定の精製蛋白質についてジスルフィド結合の形成の有無や形成部位を明らかにすることもできる。
近年では、遺伝子組換え法を用いた蛋白質の製造が盛んに行われるようになっている。組換え法による蛋白質製造では、宿主細胞として大腸菌を用いる方法が一般的であるが、大腸菌中では製造された蛋白質において正しいジスルフィド結合が形成されないことが知られているため、場合により昆虫細胞等の他の培養細胞を用いた組換え蛋白質の製造が行われている。蛋白質のジスルフィド結合は、蛋白質の立体構造形成に大きく関与しており、蛋白質の活性の維持に大きな影響を及ぼすことから、組換え法による蛋白質製造において、製造する組換え蛋白質に対応する天然蛋白質がジスルフィド結合を有するか否かを確認し、かつその天然蛋白質のジスルフィド結合の形成部位を同定することは、所望の活性を有する組換え蛋白質を製造する上で重要である。従って、本発明のジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法を用いる天然蛋白質のもつジスルフィド結合の分析は、組換え蛋白質を製造する上で有用に用いることができる。
５．アレルゲン蛋白質の検出方法
後述の実施例に示す通り、上記方法により検出されるジスルフィド結合を有する蛋白質はアレルゲン蛋白質であることが示された。従って、本発明においては、上記のジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法を利用して、被験試料に含まれるアレルゲン蛋白質を検出することができる。本発明のアレルゲン蛋白質の検出方法によってアレルゲン蛋白質を検出できることは、ジスルフィド結合と蛋白質のアレルゲン性とが関連するという報告（例えば、Ｈｕｂｙ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５，２３５−２４６）とも一致する。本発明のアレルゲン蛋白質の検出方法は、従来のＩｇＥ抗体を用いたイムノブロッティング法による検出法と比較して、非常に高感度である。
本発明のアレルゲン蛋白質の検出方法は、上記のジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法と同様の手順で実施すればよく、以下のａ）〜ｃ）のステップによって行うことができる。
ａ）蛋白質の有する遊離ＳＨ基を化学修飾することにより保護し、
ｂ）遊離ＳＨ基が保護された蛋白質のもつジスルフィド結合を切断して、該ジスルフィド結合を形成していたＳＨ基を露出させ、
ｃ）露出したＳＨ基を検出することによって、露出したＳＨ基を有する蛋白質を、アレルゲン蛋白質として同定する。
本発明のアレルゲン蛋白質の検出方法を適用してアレルゲン蛋白質の検出を行うのに適した被験試料は、上記のジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法について記載したものと同様であるが、アレルゲン蛋白質を含有することが予想される蛋白質試料を用いることがより好ましい。被験試料としては、イネ科植物の種子、ハウスダスト、花粉又はダニからの蛋白質抽出物を用いることが特に好ましい。
本発明のアレルゲン蛋白質の検出方法を実施する上で、特に好適である具体的な手順は、以下の通りである：
（１）被験試料に非蛍光試薬ヨードアセトアミドを添加し、
（２）さらに還元剤としてジチオトレイトールを添加し、
（３）さらに蛍光性試薬モノブロモビマンを添加した後、得られた反応溶液を二次元電気泳動で分離し、
（４）電気泳動ゲルに紫外線を照射して、得られた蛍光スポットをアレルゲン蛋白質として検出する。
この方法は、従来法と比較して、特に次のような利点を有する。
・蛍光標識を用いることによって微量なアレルゲン蛋白質を検出できる。
・二次元電気泳動で分離することにより、蛋白質の解析解像度が高くなる。
・膜への転写を必要とせず、微量な蛋白質を消失する危険度が低い。
本発明の別の実施形態においては、上記のアレルゲン蛋白質の検出方法を利用して、被験試料について、アレルゲン性を有するか否かを判定することができる。この場合、被験試料中にアレルゲン蛋白質が検出されれば、被験試料はアレルゲン性を有すると判定される。
また別の実施形態では、上記のアレルゲン蛋白質の検出方法を利用して、被験試料中に含まれるアレルゲン蛋白質のスクリーニングを行うことができる。この場合、被験試料において検出されたアレルゲン蛋白質を単離することにより、被験試料中に含まれるアレルゲン蛋白質をスクリーニングすることができる。この蛋白質の単離は、上述のジスルフィド結合を有する蛋白質の単離と同様に、通常公知の方法に従って行うことができる。
上記のように単離したアレルゲン蛋白質についても、ジスルフィド結合を有する蛋白質と同様に、特性解析による同定を行うことができる。すなわち、単離したアレルゲン蛋白質について特性解析を行い、その結果示された特性を既知アレルゲン蛋白質の特性と比較して、既知アレルゲン蛋白質と共通した特性を見つければよい。「共通した特性」「特性解析」については、上記のジスルフィド結合を有する蛋白質についての記載と同様である。
アレルゲン蛋白質の特性の情報も、データベース等から入手することができる（ＧｅｎＢａｎｋ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＥＭＢＬ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢＳＴＲ、Ｆａｒｒｐ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／）等）。本発明において単離したアレルゲン蛋白質についての特性を、例えばそれらのデータベースにおいて検索すれば、共通した特性を有する既知アレルゲン蛋白質をデータベースから抽出することができる。特性が一致する既知アレルゲン蛋白質がデータベースから抽出された場合は、単離されたアレルゲン蛋白質はその既知アレルゲン蛋白質として同定される。特性が類似している既知アレルゲン蛋白質がデータベースから抽出された場合には、その単離された蛋白質はその既知アレルゲン蛋白質と同じクラスのアレルゲン蛋白質に分類されることになる。
アレルゲン蛋白質の同定においては、当技術分野において、次のような方法が慣用されている。すなわち、エドマン分解法により目的の蛋白質の内部アミノ酸配列（部分配列）を決定し、その部分配列をクエリー配列としてアミノ酸配列データベースにおいて検索して、その蛋白質の部分配列と完全に一致するアレルゲン蛋白質の部分配列がデータベースから抽出されれば、その蛋白質をデータベースから抽出されたアレルゲン蛋白質として同定する。同様にして、その蛋白質の部分配列と高い相同性を有するアレルゲン蛋白質の部分配列がデータベースから抽出されれば、その蛋白質を、データベースから抽出された該アレルゲン蛋白質と同じクラスに属するアレルゲン蛋白質として同定する。本発明においても、単離されたアレルゲンの同定に、この方法を利用することが好ましい。
６．検出方法以外の実施形態
本発明の蛋白質分析方法は、いずれも上記の「ジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法」を利用する。従って、ジスルフィド結合を有する蛋白質を検出するために用いるＳＨ基保護剤及びＳＨ基検出物質を含むキットは、本発明のジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法、アレルゲン蛋白質の検出方法、及びそれらを利用する蛋白質の分析方法を実施する上で、好適に使用することができる。このように、ＳＨ基保護剤及びＳＨ基検出物質を含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を検出するためのキットも、本発明の範囲に包含される。好適には、これらのキットは、ヨードアセトアミド及びモノブロモビマンを含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を検出するためのキットである。これらのキットは、さらに還元剤（好ましくはジチオトレイトール）を含むものでもよい。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のジスルフィド結合を有する蛋白質の検出方法を実施するための典型的な工程を模式的に示している。左側はジスルフィド結合を有する蛋白質、右側はジスルフィド結合を有しない蛋白質を表す。白抜き丸（○）はＳＨ基保護剤、塗りつぶし丸（●）はＳＨ基標識物質による、ＳＨ基の修飾を示す。［Ａ］は蛋白質の遊離ＳＨ基とＳＨ基保護剤との反応、［Ｂ］は遊離ＳＨ基が保護された蛋白質と還元剤との反応、［Ｃ］は蛋白質の露出したＳＨ基とＳＨ基標識物質との反応を意味する。
図２は、コメ種子からの抽出物を被験試料として本発明の方法に従って得られた二次元電気泳動の結果を示す写真である。Ａは、含まれる全ての蛋白質をクーマシーブルー染色で可視化した結果を示す。Ｂは、本発明の方法に従って露出させたＳＨ基をモノブロモビマンにより蛍光標識した蛋白質の蛍光検出の結果を示す。１〜８は、内部アミノ酸配列を決定した蛋白質のスポットを示す。
図３は、花粉からの抽出物を被験試料として本発明の方法に従って得られた二次元電気泳動の結果を示す写真である。モノブロモビマンにより蛍光標識された蛋白質が蛍光検出されて、白色で示されている。１〜６は、内部アミノ酸配列を決定した蛋白質のスポットを示す。
図４は、ダニからの抽出物を被験試料として本発明の方法に従って得られた二次元電気泳動の結果を示す写真である。モノブロモビマンにより蛍光標識された蛋白質が蛍光検出されて、白色で示されている。１〜３は、内部アミノ酸配列を決定した蛋白質のスポットを示す。
図５は、ソイビーントリプシンインヒビター（ＳＴＩ）とミオグロビン（Ｍｇ）を被験試料として本発明の方法に従って得られた二次元電気泳動の結果を示す写真である。Ａは、被験試料に含まれる蛋白質をクーマシーブルー染色で可視化した結果を示す。Ｂは、露出したＳＨ基をモノブロモビマンにより蛍光標識した蛋白質の蛍光検出の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明を、実施例を用いて以下に具体的に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：コメ抽出物におけるジスルフィド結合を有する蛋白質の検出
コメ種子２０ｇを乳ばちを用いて粉砕した。この粉末を１Ｍ塩化ナトリウム溶液４００ｍｌ中に入れ、１時間にわたり攪拌することによって、該種子に含まれる蛋白質を緩衝液中に溶出させた。この溶液を１４，０００Ｇで、５分間遠心分離して不溶成分を沈澱させた後、上清を採取した。この上清を、透析により脱塩し、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥物の１／８０量（コメ種子０．２５ｇに相当する）を、８Ｍ尿素、０．５％ＣＨＡＰＳ、０．１％Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅｓを含む等電点電気泳動用緩衝液に溶解した。この溶液にＳＨ基保護剤としてヨードアセトアミドを添加（最終濃度５ｍＭ）し、室温で１時間保温した。さらに還元剤としてジチオトレイトールを添加（最終濃度５ｍＭ）し、室温で１時間保温した。さらにＳＨ基標識物質としてモノブロモビマンを添加（最終濃度１０ｍＭ）し、室温で１５分間保温した。
このようにして得た反応溶液を、二次元電気泳動にかけ、反応液中の蛋白質を分離した。
一次元目の電気泳動はバイオラッド社製のプロティアンＩＥＦセルシステムを用い、製造者のマニュアルに従って実施した。上限８，０００Ｖ、電圧時間積算３５，０００ＶＨの条件で６時間泳動した。泳動後、ゲルを６２．５ｍＭのトリス塩酸バッファー、５％メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、５％スクロースを含む緩衝液に１０分間浸し、二次元目の電気泳動に供した。
二次元目の電気泳動はＬａｅｍｍｌｉの手法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））に従って行った。３７５ｍＭのトリス／グリシンバッファーを含み、１０〜２０％の濃度勾配をもつアクリルアミドゲルを用いた。泳動バッファーには０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス／グリシンバッファーを用いた。２５０Ｖにて、３時間にわたる泳動を行った。
このようにして得た泳動ゲルについて、蛍光検出装置（ＦＡＳ−２５２５、ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、蛍光シグナルを検出した。蛍光検出されたゲル上のスポットが、モノブロモビマンで蛍光標識された蛋白質に相当する（図２Ｂ）。図２Ｂでは、例えば１〜６で示している蛍光スポットが見出された。
また、この実施例では対照実験として、クーマシーブルー染色により全蛋白質の検出を行った（図２Ａ）。図２Ａでは、例えば１〜８で示している染色スポットが見出された。
図２Ａと図２Ｂとを比較したところ、図２Ａで示された１〜６の染色スポットに対して、図２Ｂにおける１〜６の蛍光スポットが、それぞれ対応する位置に存在していた。すなわち、１〜６のスポットに相当する蛋白質は、ジスルフィド結合を有する蛋白質であることが示された。この結果から、１〜６のスポットに存在する蛋白質は、アレルゲン蛋白質であることが示唆された。
一方、図２Ａにおける７及び８の染色スポットは、図２Ｂの対応する位置に蛍光スポットが示されなかった。このことから、図２Ａにおける７及び８のスポットに相当する蛋白質は、アレルゲン蛋白質ではないことが示唆された。
実施例２：コメ抽出物に含まれるアレルゲン蛋白質の解析
図２Ｂにおいて蛍光シグナルが検出されたスポット（１〜６）をゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化を行って、スポットに含まれる蛋白質を断片化した。断片化した蛋白質をＨＰＬＣにかけて分離した後、エドマン法により内部アミノ酸配列を決定した。各スポットに含まれる蛋白質について、決定した内部アミノ酸配列を表１に示す。表１に示した内部アミノ酸配列中の「ＣｍＢＢｒ」は、モノブロモビマンで標識されたＳＨ基を有するシステイン残基を表す。次に、それらの内部アミノ酸配列をそれぞれクエリー配列として用いて、アミノ酸配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＰＩＲ）において、ＦＡＳＴＡプログラム及びＢＬＡＳＴプログラムを用いた相同性検索を行った。その検索結果から、各スポット由来の蛋白質の内部アミノ酸配列が、既知アレルゲン蛋白質の部分アミノ酸配列と同一か又は高い相同性を有することが示された（表１）。
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表１に示されるように、スポット２〜６に相当する蛋白質の内部アミノ酸配列は、相同性の高い蛋白質としてデータベースから抽出された既知アレルゲン蛋白質の部分アミノ酸配列と１００％一致していた。このことからスポット２〜６の蛋白質は、既知アレルゲン蛋白質として同定された。一方、スポット１の蛋白質の１つの内部アミノ酸配列は、相同性の高い蛋白質としてデータベースから抽出された既知アレルゲン蛋白質であるトリプシン／アミラーゼインヒビターの部分アミノ酸配列（配列番号１）と、７７．８％の相同性を有していた。一方、スポット１に相当する蛋白質の別の２つの内部アミノ酸配列（配列番号２及び３）については、データベースから相同性の高い蛋白質が抽出されなかった（表１中、ｎ．ｄ．として示す）。このことから、スポット１の蛋白質は、トリプシン／アミラーゼインヒビターと同じアレルゲン蛋白質のクラスに属するが、未知のアレルゲン蛋白質であると推定された。
このように、本発明の方法により蛍光検出されたコメ抽出物中に含まれるジスルフィド結合を有する蛋白質を、既知アレルゲン蛋白質と同じクラスに属する未知アレルゲン蛋白質（スポット１）又は既知アレルゲン蛋白質（スポット２〜６）として同定することができた。
実施例３：花粉抽出物におけるジスルフィド結合を有する蛋白質の検出
ラグウィード（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ｔｒｉｆｉｄａ；オオブタクサ）の花粉を１ｍＭ  ＰＡＳＦと１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で乳ばちを用いて破砕し、１４，０００Ｇで、３０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を採取して遠心フィルターＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）でろ過し、さらに遠心フィルターＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０を通して脱塩した。脱塩した残渣を８Ｍ尿素、０．５％ＣＨＡＰＳ、０．１％Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅｓを含む等電点電気泳動用緩衝液に溶解した。この溶液にＳＨ基保護剤としてヨードアセトアミドを添加（最終濃度５ｍＭ）し、室温で１時間保温した。さらに還元剤としてジチオトレイトールを添加（最終濃度５ｍＭ）し、混合し、室温で１時間保温した。さらにＳＨ基標識物質としてモノブロモビマンを添加（最終濃度１０ｍＭ）し、混合し、室温で１５分間保温した。このようにして得た反応溶液を二次元電気泳動にかけ、実施例１と同様にして反応液中の蛋白質を分離し、蛍光検出装置により、蛍光シグナルを検出した（図３）。
実施例４：花粉抽出物に含まれるアレルゲン蛋白質の解析
図３において蛍光シグナルが検出されたスポット（１〜６）をゲルから切り出し、実施例２と同様にして蛋白質の内部アミノ酸配列を決定した。次いで、内部アミノ酸配列を用いて実施例２と同様の相同性検索を行った。この検索結果から、各スポット由来の蛋白質の内部アミノ酸配列が、既知アレルゲン蛋白質が有する部分アミノ酸配列と高い相同性を有することが示された（表２）。
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表２に示す通り、スポット１に相当する蛋白質の内部アミノ酸配列は、相同性の高い蛋白質としてデータベースから抽出されたシステインリッチ−抗真菌蛋白質の部分アミノ酸配列と８１．８％の相同性を有していた。またスポット２に相当する蛋白質の内部アミノ酸配列は、相同性の高い蛋白質としてデータベースから抽出された葯特異的蛋白質ＳＦ１８の部分アミノ酸配列と８７．５％の相同性を有していた。システインリッチ−抗真菌蛋白質と葯特異的蛋白質ＳＦ１８とはいずれも、アレルゲンであるディフェンシンファミリーに属することが知られている。このことから、スポット１の蛋白質及びスポット２の蛋白質は、システインリッチ−抗真菌蛋白質及び葯特異的蛋白質ＳＦ１８のそれぞれと同じクラスに属するアレルゲン蛋白質であることが示された。さらに、スポット３に相当する蛋白質の内部アミノ酸配列は、相同性の高い蛋白質としてデータベースから抽出されたアレルゲンＡＢＡ−１の部分アミノ酸配列と６６．７％の相同性を有していた。このことから、スポット３の蛋白質は、アレルゲンＡＢＡ−１と同じクラスに属するアレルゲン蛋白質であることが示された。スポット４〜６にそれぞれ相当する蛋白質の内部アミノ酸配列については、データベースから相同性の高い蛋白質が抽出されなかった（表２中、ｎ．ｄ．として示す）。このことは、スポット４〜６の蛋白質が、新規なアレルゲン蛋白質であることを示唆する。
実施例５：ダニ抽出物におけるジスルフィド結合を有する蛋白質の検出
ヤケヒョウダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）を１ｍＭ  ＰＡＳＦと１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で乳ばちを用いて破砕し、１４，０００Ｇで、３０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を採取して遠心フィルターＵｌｔｒａｆｒｅｅ  ＣＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）でろ過し、さらに遠心フィルターＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０を通して脱塩した。脱塩した残渣を８Ｍ尿素、０．５％ＣＨＡＰＳ、０．１％Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅｓを含む等電点電気泳動用緩衝液に溶解した。この溶液にＳＨ基保護剤としてヨードアセトアミドを添加（最終濃度５ｍＭ）し、室温で１時間保温した。さらに還元剤としてジチオトレイトールを添加（最終濃度５ｍＭ）し、室温で１時間保温した。さらにＳＨ基標識物質としてモノブロモビマンを添加（最終濃度１０ｍＭ）し、１５分間保温した。このようにして得た反応溶液を二次元電気泳動にかけ、実施例１と同様にして反応液中の蛋白質を分離し、蛍光検出装置により、蛍光シグナルを検出した（図４）。
実施例６：ダニ抽出物に含まれるアレルゲン蛋白質の解析
図４において蛍光シグナルが検出されたスポット（１〜３）をゲルから切り出し、実施例２と同様にして蛋白質の内部アミノ酸配列を決定した。次いで、内部アミノ酸配列を用いて実施例２と同様の相同性検索を行った。この検索結果から、各スポット由来の蛋白質の内部アミノ酸配列が、既知アレルゲン蛋白質が有する部分アミノ酸配列と高い相同性を有することが示された（表３）。
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表３に示す通り、スポット１及び２に相当する蛋白質の内部アミノ酸配列はいずれも、相同性の高い蛋白質としてデータベースから抽出された既知のアレルゲンであるダニアレルゲンＤＥＲ  Ｐ２の部分アミノ酸配列と１００％の相同性を有していた。また、スポット３に相当する蛋白質の内部アミノ酸配列は、相同性の高い蛋白質としてデータベースから抽出された既知のアレルゲンであるダニアレルゲンＧＬＹ  Ｄ２の部分アミノ酸配列と８０％の相同性を有していた。このことから、スポット３の蛋白質は、ダニアレルゲンＧＬＹ  Ｄ２と同じクラスに属するアレルゲン蛋白質であることが示された。
このように、本発明の方法により蛍光検出されたダニ抽出物中に含まれるジスルフィド結合を有する蛋白質を、既知アレルゲン蛋白質（スポット１及び２）、又は既知アレルゲン蛋白質と同じクラスに属する未知アレルゲン蛋白質（スポット３）として同定することができた。
実施例７：モデル蛋白質を用いた検出
遊離のシステイン残基１個（すなわち、遊離ＳＨ基を１個）と分子内ジスルフィド結合２個をもつアレルゲン蛋白質であるソイビーントリプシンインヒビター（ＳＴＩ）５０ｐｍｏｌと、ジスルフィド結合をもたず遊離のシステイン残基を１個（すなわち、遊離ＳＨ基を１個）もつミオグロビン（Ｍｇ）蛋白質２５０ｐｍｏｌとを、６２．５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳを含む１０μＬの溶液中で混合した。これにＳＨ基保護剤としてヨードアセトアミドを添加し（最終濃度５ｍＭ）、室温で１時間保温した。さらに還元剤としてジチオトレイトールを添加し（最終濃度５ｍＭ）、室温で１時間保温した。さらにＳＨ基標識物質としてモノブロモビマンを添加し（最終濃度１０ｍＭ）、室温で１５分間保温した。このようにして得た反応溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、反応液中の蛋白質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは実施例１と同じく、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従った。
クーマシーブルー染色により全蛋白質の検出を行うと、両方の蛋白質はそれぞれの蛋白質量に矛盾なく検出された（ＳＴＩ：５０ｐｍｏｌ、Ｍｇ：２５０ｐｍｏｌ）（図５Ａ）。これに対し、蛍光物質モノブロモビマンで標識して検出した場合には、分子内ジスルフィド結合をもつアレルゲンＳＴＩのみが検出され、遊離のシステイン残基のみを持ち、ジスルフィド結合をもたないＭｇは検出されなかった（図５Ｂ）。ここで、もし本発明の方法により、ジスルフィド結合を形成していたＳＨ基だけでなく遊離のシステイン残基がもつＳＨ基も一緒にモノブロモビマンにより標識されるのであれば、両者は同じ強度の蛍光で検出されるはずである。従って、本発明の方法によりＳＴＩ蛋白質のみが検出されたことは、ＳＴＩ蛋白質において分子内ジスルフィド結合を形成していたＳＨ基のみがモノブロモビマンによって標識されたことを示唆している。
以上の結果から、本発明の方法によってジスルフィド結合を有する蛋白質（すなわち、アレルゲン蛋白質）を特異的に検出できることが示された。
【産業上の利用の可能性】
本発明は、被験試料中のジスルフィド結合を有する蛋白質を高感度に検出する方法、及び被験試料中のアレルゲン蛋白質を高感度に検出する方法を提供する。本発明の方法に従えば、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質を特異的に検出、単離及び／又は同定することができるだけでなく、そのような蛋白質の分析を、微量な蛋白質を減失することなしに高感度にて行うことができる。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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