(57)【要約】ｙｄｄＧ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を増強することによってＬ−アミノ酸生産性が増強されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミノ酸を該培地中から採取することにより、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニン又はＬ−トリプトファンを製造する。
2003044192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、前記細菌によるＬ−アミノ酸生産性が、前記細菌の細胞内において以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が増強されたことにより増強された細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質であって、細菌のＬ−フェニルアラニンおよび／またはアミノ酸アナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が、同タンパク質をコードするＤＮＡによる前記細菌の形質転換により、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列の改変により増強された請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記形質転換は、前記ＤＮＡを含むマルチコピーベクターにより行われる請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
前記ＤＮＡの固有のプロモーターがより強力なプロモーターで置換された、請求項２に記載の細菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養し、同培地中に生成および蓄積したＬ−アミノ酸を培地から採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項６】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−フェニルアラニンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌のフェニルアラニン生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファンである請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌のトリプトファンの生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌であって、Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、得られたＬ−フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体から、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法。
【請求項１１】
さらに、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化し、このＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを前記アスパラギン酸の誘導体としてＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物と縮合させ、この反応混合物からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、バイオテクノロジーに関し、特に発酵によるアミノ酸、特に芳香族アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニンおよびＬ−トリプトファンの製造方法、より具体的にはエシェリヒア・コリ由来の遺伝子に関する。同遺伝子は、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−トリプトファン生産性の改良のために有用である。
背景技術
従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界から得られた微生物菌株、または、それらの菌株のＬ−アミノ酸生産性を増強するように改変された変異株を利用する発酵方法により、工業的に生産されてきた。
Ｌ−アミノ酸生産能を増強するための多くの技術が開示されており、例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換によるものがある（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号参照）。これらの技術は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性の増加、および／または生産されるＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害からの目的とする酵素の脱感作に基づいている（例えば、特開昭５６−１８５９６号（１９８１）、ＷＯ９５／１６０４２、または米国特許第５，６６１，０１２号および第６，０４０，１６０号参照）。
他方で、Ｌ−アミノ酸生産株の生産能は、アミノ酸排出活性の増強によって改良し得る。Ｌ−リジン排出遺伝子（ｌｙｓＥ遺伝子）の発現が増強されたコリネバクテリウム属細菌のリジン生産株が開示されている（ＷＯ９７２３５９７Ａ２）。さらに、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリンまたはチアゾリジン誘導体の分泌に適した流出タンパク質をコードする遺伝子も開示されている（米国特許第５，９７２，６６３号）。
現在のところ、Ｌ−アミノ酸生産性を増強する推定上の膜タンパク質をコードする数個のエシェリヒア・コリの遺伝子が開示されている。ｒｈｔＢ遺伝子のコピー数を増加させることによって、細菌はＬ−ホモセリンに対してより耐性になり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンの生産性が増強される（欧州特許公開第９９４１９０Ａ２号）。ｒｈｔＣ遺伝子のコピー数を増加させることによって、細菌はＬ−ホモセリンおよびＬ−スレオニンに対してより耐性となり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−ロイシンの生産性が増強される（欧州特許公開第１０１３７６５Ａ１号）。ｙａｈＮ、ｙｅａＳ、ｙｆｉＫおよびｙｇｇＡ遺伝子は、コピーを増加させることによって、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンの生産性を増強する（欧州特許公開第１０１６７１０Ａ２号）。
本発明者等は以前に、エシェリヒア・コリＫ−１２株について、最小培地中の高濃度のスレオニン又はホモセリンに対する耐性に関連する変異ｔｈｒＲ（本明細書中ではｒｈｔＡ２３と称する）を有する突然変異株を得た（Ａｓｔａｕｒｏｖａ，Ｏ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１，６１１−６１６，１９８５）。この変異は、Ｌ−スレオニン（ＳＵ特許第９７４８１７号）、ホモセリンおよびグルタミン酸（Ａｓｔａｕｒｏｖａ，Ｏ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，５５６−５６１，１９９１）を生産するエシェリヒア・コリのそれぞれのアミノ酸生産性を改善する。
さらに本発明者等は、ｒｈｔＡ遺伝子は、グルタミン輸送系の構成成分をコードするｇｌｎＨＰＱオペロンに近接するエシェリヒア・コリ染色体上の１８ｍｉｎに存在すること、及び、ｒｈｔＡ遺伝子はｐｅｘＢとｏｍｐＸ遺伝子の間にあるｙｂｉＦ  ＯＲＦと同一であることを明らかにしている。このＯＲＦによりコードされるタンパク質を発現するユニットは、ｒｈｔＡ（ｒｈｔ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ：ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性）遺伝子と命名されている。
さらに、ｒｈｔＡ遺伝子の増幅は、ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性を付与することを本発明者等は見出した。ｒｈｔＡ２３突然変異は、ＡＴＧ開始コドンに対して−１の位置でのＧからＡへの置換である（ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ  ｏｆ  １７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙならびに１９９７  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ａｕｇｕｓｔ  ２４−２９，１９９７，ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．４５７）。ＳＤ配列と開始コドンの間のスペーサーのヌクレオチド組成、特に開始コドンのすぐ上流の配列は、ｍＲＮＡ翻訳能力に多大な影響を及ぼすことが知られている。開始コドンの前の３つのヌクレオチドの性質に応じて、発現レベルの２０倍の変化が見出されている（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，３６５−４０３，１９８１；Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，６２３−６２９，１９８４）。したがって、ｒｈｔＡ２３突然変異はｒｈｔＡ遺伝子発現を増加させる、ということが示唆され得る。
ｒｈｔＡ遺伝子は２９５アミノ酸残基からなる、計算上の分子量３１．３ｋＤａのタンパク質をコードする。ＲｈｔＡ配列の分析により、同タンパク質が１０個の予想上の膜貫通セグメントを含む高疎水性タンパク質であることが示された。エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリＫ−１２株のヌクレオチド配列のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４（１９９７））により、ＲｈｔＡと相同の少なくとも１０個のタンパク質が明らかにされた。それらの中には、ｙｄｅＤおよびｙｄｄＧ遺伝子によりコードされるタンパク質が含まれる。以前に、ｙｄｅＤ遺伝子がシステイン経路代謝物質の流出に関与することが示された（Ｄａｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６，１１０１−１１１２，２０００；米国特許第５，９７２，６６３号）。ｙｄｄＧ遺伝子は推定上のＣＤＳとして知られており、機能的に未知のタンパク質をコードしている可能性がある（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＥ０００２４４  Ｕ０００９６の塩基配列の塩基番号３６８７〜４５６８）。
発明の開示
本発明の課題は、Ｌ−フェニルアラニン生産株の生産性を増強すること、およびこれらの株を用いたＬ−フェニルアラニンの製造方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、Ｌ−トリプトファン生産株の生産性を増強すること、およびこれらの株を用いたＬ−トリプトファンの製造方法を提供することである。
上記課題は、ＲｈｔＡと相同であり、膜タンパク質をコードし、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路に関与しないが、その野生型対立遺伝子を微生物内においてマルチコピーベクターで増幅すると、フェニルアラニンおよびいくつかのアミノ酸アナログに対する耐性が微生物に付与されるｙｄｄＧ遺伝子を同定することによって、達成された。さらに、ｙｄｄＧ遺伝子の付加的コピーをＬ−フェニルアラニン生産株の細胞に導入すると、Ｌ−フェニルアラニン生産性を増強することができる。さらに、ｙｄｄＧ遺伝子は、Ｌ−トリプトファン酸生産株の細胞内において発現を増強するとＬ−トリプトファン生産性を増強することができる。このようにして本発明は完成された。
本発明は、以下のとおりである：
１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、前記細菌によるＬ−アミノ酸生産性が、前記細菌の細胞内において以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が増強されたことにより増強された細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列中において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質であって、細菌のＬ−フェニルアラニンおよび／またはアミノ酸アナログ（例えばｐ−フルオロ−フェニルアラニンおよび５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン等）に対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質（以下、上記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質を、「本発明のタンパク質」と称することがある）。
２）前記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が、同タンパク質をコードするＤＮＡによる前記細菌の形質転換により、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列の改変により増強された前記細菌。
３）前記形質転換は、前記ＤＮＡを含むマルチコピーベクターにより行われる、前記細菌。
４）前記ＤＮＡの固有のプロモーターがより強力なプロモーターで置換された、前記細菌。
５）上記細菌を培地中で培養し、生成および蓄積したＬ−アミノ酸を培地から採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
６）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−フェニルアラニンである、前記方法。
７）前記細菌のフェニルアラニン生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、前記方法。
８）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファンである、上記方法。
９）前記細菌は、トリプトファン生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、前記方法。
１０）前記のいずれかの細菌であって、Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、得られたＬ−フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体から、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法。
１１）さらに、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化し、このＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを前記アスパラギン酸の誘導体としてＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物と縮合させ、この反応混合物からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成させることを含む、前記の方法。
本発明において、特記しない限りアミノ酸はＬ−体である。
Ｌ−アミノ酸の製造方法は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質等のような本発明のタンパク質の活性が増強された、Ｌ−フェニルアラニン生産菌を用いたＬ−フェニルアラニンの製造を含む。また、Ｌ−アミノ酸の製造方法は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質等のような本発明のタンパク質の活性が増強された、Ｌ−トリプトファン生産細菌を用いたＬ−トリプトファンの製造を含む。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、細菌の細胞内において本発明のタンパク質の活性が増強されたことにより、同細菌によるＬ−アミノ酸生産性が増強された細菌である。
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、細菌を培地で培養したときに、同Ｌ−アミノ酸を生成し、培地に蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、同細菌が野生株が持つ性質として保持していてもよいし、育種によって付与されてもよい。
本発明の細菌の好ましい形態は、本発明のタンパク質の活性が増強された、エシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産細菌である。さらに具体的には、本発明の細菌は、細菌の染色体上、またはプラスミド中にあって過剰発現するｙｄｄＧ遺伝子を有するＤＮＡを保持し、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニンを生産する増強された能力を有する。
本発明の細菌の別の好ましい形態は、細菌の染色体上、またはプラスミド中にあって過剰発現するｙｄｄＧ遺伝子を有するＤＮＡを保持し、これらの株を用いて、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−トリプトファンを生産する増強された能力を有する。
本発明のタンパク質としては、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のものを含む：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質であって、細菌のＬ−アミノ酸、例えばフェニルアラニン、および／またはアミノ酸アナログ、例えばｐ−フルオロ−フェニルアラニンおよび５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン等に対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。
「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類によって異なる。その数は、タンパク質（Ａ）に対して、２〜３０個、好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜５個であり得る。
Ｌ−フェニルアラニンおよび／またはアミノ酸アナログに対する耐性とは、非改変株又は野生型の細菌、または細菌の親株が生育できない濃度でＬ−フェニルアラニンまたはアミノ酸アナログを含有する最小培地上で細菌が生育する能力、あるいは非改変株又は野生型の細菌、または細菌の親株より早く、Ｌ−フェニルアラニンまたはアミノ酸アナログを含有する培地上で細菌が生育する能力を意味する。Ｌ−アミノ酸アナログは、ｐ−フルオロ−フェニルアラニン、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファン等により例示される。Ｌ−アミノ酸またはアミノ酸アナログの上記の濃度は、Ｌ−フェニルアラニンの場合は一般に１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｍｌである。アミノ酸アナログの上記の濃度は、ｐ−フルオロ−フェニルアラニンの場合は一般に０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌ、５−フルオロ−ＤＬ−トリプトファンの場合は一般に０．２〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜５μｇ／ｍｌである。
本発明の細菌としては、本発明のタンパク質の活性が、（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを用いた上記の細菌の形質転換により、あるいは細菌の染色体上の上記のＤＮＡの発現制御配列の改変により増強されるものを含む。
本発明の細菌の改変のために用いられるＤＮＡは、Ｌ−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードし得る。さらに具体的には、同ＤＮＡはｙｄｄＧ遺伝子により代表される。ｙｄｄＧ遺伝子は、例えば配列番号１に示すヌクレオチド配列に基づいたプライマーを用いたＰＣＲにより得られる。
本発明のＤＮＡとしては、タンパク質の活性を失わない限り、タンパク質（Ａ）上の１またはそれ以上の位置における１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類によって異なるが、その数は、タンパク質（Ａ）に対して、２〜３０個、好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜５個であり得る。（Ａ）に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されるように、部位特異的突然変異法を用いた（Ａ）に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変により得られる。このような改変されたＤＮＡは、突然変異を生じさせる試薬および条件による処理を用いた従来の方法により得られ得る。このような処理としては、ヒドロキシルアミンを用いたタンパク質をコードするＤＮＡの処理、又は当該ＤＮＡを保持する細菌のＵＶ照射、または；Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたは亜硝酸のような試薬を用いた処理が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、自然界の多様性により、エシェリヒア属細菌の異なる菌株および変種で見い出される得る変異体を含む。このような変異体をコードするＤＮＡは、ｙｄｄＧ遺伝子または遺伝子の一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｌ−フェニルアラニン生産性を増強するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られる。「ストリンジェントな条件」という用語は、本明細書中では、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドは形成されない条件として言及される。例えばストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば互いに７０％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の普通の条件、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、を含む条件が挙げられる。変異体をコードし、ｙｄｄＧ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡに対するプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列も用いられ得る。このようなプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて作製されるオリゴヌクレオチド、および鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を用いたＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐの長さのＤＮＡ断片がプローブとして用いられる場合、ハイブリダイゼーションの洗浄の条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳが挙げられる。
タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換は、例えば、常法により、細菌細胞へＤＮＡを導入し、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加し、細菌細胞内におけるタンパク質の活性を増強することを意味する。
遺伝子発現の増強方法としては、遺伝子コピー数の増加を含む。エシェリヒア属細菌中で機能し得るベクターへの遺伝子の導入は、同遺伝子のコピー数を増加させる。このような目的のために、マルチコピーベクターが好ましく用いられ得る。マルチコピーベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１９、ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂ等が挙げられる。
さらに、遺伝子発現の増強は、例えば相同組換え法等による細菌染色体への遺伝子のマルチコピーの導入により達成され得る。
２つ以上の遺伝子の発現が増強される場合、各遺伝子は同一プラスミド上に一緒に保持されてもよく、あるいは異なるプラスミド上に別々に保持されてもよい。また、各遺伝子のうちの１つが染色体上に保持され、他方がプラスミド上に保持されてもよい。
一方、遺伝子発現の増強は、固有のプロモーターの代わりに、強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを置くことにより達成され得る。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，Ｕ．，Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｗ．，Ｇｅｎｔｚ，Ｒ．，Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８６，５，２９８７−２９９４）等に記載されている。例えば、ＰＬプロモーターが強力な構成的プロモーターとして知られている。その他ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。強力なプロモーターの使用は、遺伝子コピーの増幅と組合せてもよい。
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化および連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に既知の一般的方法でよい。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）等に記載されている。
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を生来有するエシェリヒア属細菌に上記のＤＮＡを導入することにより得られる。あるいは、本発明の細菌は、上記のＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌にＬ−アミノ酸を生産する能力を付与することにより得られる。
エシェリヒア属細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するか、又は付与され得るものであれば特に制限されない。エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。
本発明のタンパク質の活性が増強される親株として、エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産菌、例えばエシェリヒア・コリＡＪ１２７３９（ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０，ｔｙｒＲ）（ＶＫＰＭ  Ｂ−８１９７）、ｐｈｅＡ３４遺伝子を保持するＨＷ１０８９（ＡＴＣＣ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．５５３７１）（米国特許第５，３５４，６７２号）、変異株ＭＷＥＣ１０１−ｂ（ＫＲ８９０３６８１）、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４１、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４５、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４６およびＮＲＲＬ  Ｂ−１２１４７（米国特許第４，４０７，９５２号）等を用いることができる。
また、本発明のタンパク質の活性が増強される親株として、エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産細菌であるエシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５６６）、エシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２６５９）、エシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２６６２）およびＡＪ１２６０４を命名されたエシェリヒア・コリＫ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢ］（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５７９）等も用いられ得る（欧州特許第４８８４２４Ｂ１号）。
本発明のタンパク質の活性が増強される親株として、エシェリヒア属に属するトリプトファン生産菌、例えば変異型ｔｒｐＳ遺伝子によりコードされ、トリプトファニル−ｔＲＮＡ合成酵素を欠損するエシェリヒア・コリＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８（ＤＳＭ１０１２２）およびＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１（ＤＳＭ１０１２３）（米国特許第５，７５６，３４５号）、セリンによるフィードバック阻害が解除されたｓｅｒＡ対立遺伝子を有するエシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）（米国特許第６，１８０，３７３号）、トリプトファナーゼ酵素を欠損するエシェリヒア・コリＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６３）およびＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４）（米国特許第４，３７１，６１４号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されたエシェリヒア・コリＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０、ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ（欧州特許９７／０８３３３号、米国特許６，３１９，６９６号）等が用いられ得る。
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、培地中にＬ−アミノ酸を生成および蓄積させる工程と、培地からＬ−アミノ酸を採取する工程を含むＬ−アミノ酸の製造方法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、培地中にＬ−フェニルアラニンを生成および蓄積させる工程と、培地からＬ−フェニルアラニンを採取する工程を含むＬ−フェニルアラニンの製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、培地中にＬ−トリプトファンを生成および蓄積させる工程と、培地からＬ−トリプトファンを採取する工程を含むＬ−トリプトファンの製造法を含む。
本発明において、培養、培地からのＬ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニンおよびＬ−トリプトファンの採取および精製等は、微生物を用いてアミノ酸を生産する従来の発酵法と同様の方法で実施され得る。培養のために用いられる培地は、培地が炭素源および窒素源および無機質、ならびに必要な場合には微生物が生育に必要とする適量の栄養素を含む限り、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、種々の炭水化物、例えばグルコースおよびシュークロース、ならびに種々の有機酸が挙げられる。用いられる微生物の資化性によって、アルコール、例えばエタノールおよびグリセロールが用いられ得る。窒素源としては、種々のアンモニウム塩、例えばアンモニアおよび硫酸アンモニウム、その他の窒素化合物、例えばアミン、天然窒素源、例えばペプトン、ダイズ加水分解物、および消化発酵微生物が用いられる。無機質としては、リン酸−カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が用いられる。いくつかの付加的栄養素が、必要な場合には培地に添加され得る。例えば微生物が生育のためにチロシンを必要とする場合（チロシン栄養要求株）、十分量のチロシンが培養のための培地に添加され得る。
培養は、好ましくは好気性条件下で、例えば振盪培養および通気撹拌培養で、２０〜４０℃、好ましくは３７〜４０℃の温度で実施される。培養のｐＨは通常は５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基および緩衝液を用いて調整され得る。通常、１〜５日の培養により、液体培地中に目的とするＬ−アミノ酸が蓄積する。
培養後、固体、例えば細胞は、遠心分離または膜分離法により液体培地から除去され、次に目的とするＬ−アミノ酸がイオン交換、濃縮および結晶化法等の常法により採取、精製され得る。
本発明の方法によって製造されたフェニルアラニンは、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステル（「アスパルテーム」とも呼ばれる）の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、Ｌ−フェニルアラニンを原料として用いるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造法を含む。同方法は、上記の本発明の方法によって製造されたＬ−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する工程を含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
本発明の方法においては、Ｌ−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にＬ−フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる（米国特許第３，７８６，０３９号）。Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このＬ−フェニルアラニンアルキルエステルを、β−カルボキシル基が保護され、α−カルボキシル基がエステル化されて活性化されたＬ−アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、Ｎ−ホルミル−、Ｎ−カルボベンゾキシ−、又はＮ−ｐ−メトキシカルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物のようなＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンと、Ｎ−アシル−β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、３７℃における酸解離定数が１０−４以下の有機酸の存在下で行うと、β−体に対するα−体の割合が上昇する（特開昭５１−１１３８４１）。続いて、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを得る。
発明を実施するための最良の形態
本発明を、実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  エシェリヒア・コリ由来のｙｄｄＧ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ−１２株の全ヌクレオチド配列はすでに決定されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４，１９９７）。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により、少なくとも１０個のｒｈｔＡパラログ（例えばｙｄｄＧ遺伝子）がエシェリヒア・コリＫ−１２のゲノム上に存在することが示された。ｙｄｄＧ遺伝子は、機能未知の膜貫通タンパク質をコードする。
報告されているヌクレオチド配列に基づいて、配列番号３（プライマー１）および４（プライマー２）に示すプライマーを合成した。プライマー１は、ｙｄｄＧ遺伝子の終止コドンの下流９１から１１４ｂｐまでの配列と相補的な配列であり、その５’末端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位が導入されている。プライマー２は、ｙｄｄＧ遺伝子の開始コドンの上流２２４から２００ｂｐまでの配列と相補的な配列であり、その５’末端には制限酵素ＳａｌＩ認識部位が導入されている。
通常の方法により、エシェリヒア・コリＴＧ１株の染色体ＤＮＡを調製した。以下の条件で、「パーキンエルマーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００」でＰＣＲを実行した。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）により、９５℃で４０秒、４７℃で４０秒、７２℃で４０秒を３０サイクル。
ｙｄｄＧ遺伝子とそれ自体のプロモーターを含有する得られたＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素で処理し、同一酵素で予め処理されたマルチコピーベクターｐＵＣ１９またはｐＡＹＣＴＥＲ３に挿入した。このようにして、それぞれプラスミドｐＹＤＤＧ１およびｐＹＤＤＧ２を得た。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、プラスミドＲＳＦ１０１０をもとにして構築された適度なコピー数で非常に安定なベクターであるｐＡＹＣ３２（Ｃｈｒｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖ  Ａ．Ｙ．，Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ  Ｙ．Ｄ，Ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ＲＳＦ１０１０  Ｔｎｌ  ｐｌａｓｍｉｄ，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８６，ｖ．１６，ｐｐ．１６１−１６７）の誘導体である。
以下のように、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーおよび強力なターミネーターｒｒｎＢをｐＡＹＣ３２プラスミドへ自身のプロモーターの代わりに導入することにより、ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターを得た。最初に、配列番号５および６に示すプライマーを用いたＰＣＲにより、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーを得た。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で処理した。配列番号７および８に示すプライマーを用いたＰＣＲにより、ターミネーターｒｒｎＢも得た。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で処理した。次に、これら２つのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で予め処理したｐＡＹＣ３２プラスミドに連結した。このようにしてｐＡＹＣＴＥＲ３プラスミドを得た。
実施例２  アミノ酸およびアミノ酸アナログに対するエシェリヒア・コリＴＧ１株の耐性に及ぼすｙｄｄＧ遺伝子増幅の効果
ｐＹＤＤＧ１およびｐＹＤＤＧ２プラスミドならびにｐＵＣ１９およびｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターをエシェリヒア・コリＴＧ１株に導入した。このようにして、ＴＧ１（ｐＹＹＤＤＧ１）株、ＴＧ１（ｐＹＤＤＧ２）株、ＴＧ１（ｐＵＣ１９）株およびＴＧ１（ｐＡＹＣＴＥＲ３）株を得た。
次に、各株に関してこれらの株のアミノ酸およびアミノ酸アナログの存在下で生育する能力を、阻害剤の濃度勾配を含有するＭ９グルコース最小寒天プレート上で測定した。最小培地（プラスミドを有する株に対し１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加）中で生育させた一夜培養の１０６〜１０７個の細胞をプレートにスポッティングした。３７℃で４４時間インキュベーション後、生育を評価した。結果を表１に示す。
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実施例３  フェニルアラニン生産に及ぼすｙｄｄＧ遺伝子増幅の効果
ｙｄｄＧ遺伝子を保持するプラスミドを用いた形質転換のための親株として、フェニルアラニン生産エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株を用いた。ＡＪ１２７３９株は、２００１年１１月６日付でルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＶＫＰＭ）（Ｒｕｓｓｉａ，１１３５４５  Ｍｏｓｃｏｗ，１ｓ  ｔ  Ｄｏｒｏｚｈｎｙ  ｐｒｏｅｚｄ，１）に、受託番号ＶＫＰＭ  Ｂ−８１９７で寄託されている。
フェニルアラニン生産菌ＡＪ１２７３９株をｐＹＤＤＧ２プラスミドまたはｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターで形質転換して、ＡＪ１２７３９／ｐＹＤＤＧ２およびＡＪ１２７３９／ｐＡＹＣＴＥＲ３株を得た。これらの株を各々、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有する栄養ブロス中で３７℃で１８時間培養し、得られた培養液のうち０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する発酵培地３ｍｌに接種して、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中のフェニルアラニンの蓄積量をＴＬＣにより測定した。蛍光指示薬を含有しないＳｏｒｂｆｉｌシリカゲルの０．１１ｍｍ層で被覆した１０×１５ｃｍ  ＴＬＣプレート（Ｓｔｏｃｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｓｏｒｂｐｏｌｙｍｅｒ社，Ｋｒａｓｎｏｄａｒ，Ｒｕｓｓｉａ）を用いた。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートを、移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ）を用いて展開させた。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として用いた。結果を表２に示す。
〔発酵培地の組成（ｇ／ｌ）〕
グルコース              ４０．０
（ＮＨ４）２ＳＯ４      １６．０
Ｋ２ＨＰＯ４              ０．１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      １．０
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．０１
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ      ０．０１
チアミンＨＣｌ            ０．０００２
酵母抽出物                ２．０
チロシン                  ０．１２５
ＣａＣＯ３              ２０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ３を１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。滅菌後、抗生物質を培地に添加する。
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表２から、ｙｄｄＧ遺伝子増幅によって、ＡＪ１２７３９株のフェニルアラニン生産性が改良されたことがわかる。
実施例４  エシェリヒア・コリ染色体におけるＰＬプロモーターおよびＳＤｌａｃＺを有するハイブリッド制御因子によるｙｄｄＧ遺伝子の固有の上流領域の置換
ｙｄｄＧ遺伝子発現を増強するために、Ｄａｔｓｅｎｋｏ  Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ  Ｂ．Ｌ．により記載され（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０−６６４５，２０００）、また「Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ組込み（Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」と呼ばれる方法によって、エシェリヒア・コリ由来ｌａｃＺ遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ配列）に連結したλファージの初期ＰＬプロモーター領域（Ｇｉｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０，４８４−４９１，１９９６）を、固有の領域の代わりにエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の染色体のｙｄｄＧコード領域上流に組込んだ。尚、人工ＤＮＡ断片は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）を保持する（図１）。ｙｄｄＧ遺伝子の上流に位置する、置換された本来の領域のヌクレオチド配列を、配列表に示す（配列番号９）。
上記の細菌染色体の対応領域に組込まれた人工ＤＮＡ断片の構築は、数段階で行った。第１段階において、ＰＣＲにより、ＢｇｌＩＩ制限部位を「上流」領域に、ＰＬプロモーターおよびｙｄｄＧ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに直接連結されるエシェリヒア・コリ由来のｌａｃＺ遺伝子のＳＤ配列を「下流」領域に保持するＤＮＡ断片を得た。λＤＮＡ（＃ＳＤ００１１，”Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ”社，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）をＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲは、プライマーＰ１（配列番号１０）およびＰ２（配列番号１１）を用いて行った。プライマーＰ１は、ＢｇｌＩＩ制限部位を含有する。プライマーＰ２は、λＤＮＡ配列、ＸｂａＩ制限部位、エシェリヒア・コリ由来のｌａｃＺ遺伝子のＳＤ配列およびｙｄｄＧリーディングフレーム由来の３６個のヌクレオチドを含有する。細菌染色体への当該断片のさらなるＲｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ組込みのために、ｙｄｄＧ遺伝子由来の配列をプライマーＰ２に導入した。
すべてのＰＣＲにおいて、増幅装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４００  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。総量１００μｌの反応混合液は、反応混合液中における最終濃度２ｍＭになるようにＭｇＣｌ２を添加した１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（”Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ”社，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）、ｄＮＴＰ各２００μｌ、開発したプライマー各４００ｎＭおよびＴａｑポリメラーゼ２ｕ（”Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ”社，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）からなる。目的とするＤＮＡ断片を０．２ｎｇとして計算し、さらなるＰＣＲ−ｄｒｉｖｅｎ増幅のための鋳型ＤＮＡ量を反応混合液に添加した。ＰＣＲの温度条件は次のとおりである。９５℃、５分の初期ＤＮＡ変性後、９５℃、３０秒の変性、５０℃、３０秒のアニーリング、７２℃、３０秒の伸長を３０サイクル、および７２℃、５分の最終のポリメライゼーション。
並行して、本ＤＮＡ断片構築の第２段階を行った。鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号Ｘ０６４０３，”Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ”社，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）およびプライマーＰ３（配列番号１２）およびＰ４（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲによりＣｍＲ遺伝子を増幅させた。プライマーＰ３は、ＰＬプロモーターを保持する先に得られたＤＮＡ断片とさらに結合するために用いられるＢｇｌＩＩ制限部位を含有する。プロモーターＰ４は、細菌染色体への当該断片のさらなるＲｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ組込みに必要なエシェリヒア・コリ由来のｙｄｄＧ遺伝子の上流に位置する３６個のヌクレオチドを含有する。
得られた２つのＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結処理した（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
プライマーＰ２およびＰ４を用いたＰＣＲにより、連結産物を増幅させた。反応混合液中に、連結産物２ｎｇを含み、伸長時間を上限２分まで延長した以外は、上記のようにしてＰＣＲを行った。構築されたｙｄｄＧ遺伝子上流ＤＮＡ領域の構造を図１に示す。構築されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を配列番号１４に示す。
エタノール沈殿により精製した得られたＤＮＡ断片を、エレクトロポレーションおよびエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の細菌染色体へのＲｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ組込みに用いた。Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ組込み系を担うλファージ由来遺伝子の供与体として、温度感受性レプリコンを有する組換えプラスミドｐＫＤ４６（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０−６６４５，２０００）を用いた。
アンピシリンを添加（１００μｇ／ｍｌ）したＬＢ液体培地にて、３０℃で一晩、ＢＷ２５１１３（ｐＫＤ４６）の細胞を生育させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（プラスミドがコードするＲｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ組込み系の遺伝子を誘導するためにアラビノースを用いた）を添加したＳＯＣ培地（酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ、トリプトン２０ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ）にて１：１００希釈し、細菌培養液の６００ｎｍの光学密度が、ＯＤ値０．４〜０．７に到達するまで、３０℃にて生育させた。細菌培養液１０ｍｌからの生育した細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄後、１００μｌの水中に懸濁した。脱イオン水中に溶解させたＤＮＡ断片（１０ｎｇ）１０μｌを細胞懸濁液に添加しておいた。製品取扱い説明書に従い、エレクトロポレーター（”Ｂｉｏ−Ｒａｄ”社，ＵＳＡ）（Ｎｏ．１６５−２０９８，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２−８９）により、エレクトロポレーションを行った。電気ショックを与えた細胞を１ｍｌのＳＯＣに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天培地上に広げた。ｙｄｄＧ遺伝子上流のＣｍＲマーカーの存在を、プライマーＰ４（配列番号１３）およびＰ５（配列番号１５）を用いたＰＣＲにより、２４時間以内に生育したコロニーについて試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを２０μｌの水に懸濁した後、その１μｌをＰＣＲに用いた。ＰＣＲの条件は次のとおりである。９５℃、１０分の初期ＤＮＡ変性後、９５℃、３０秒の変性、５０℃、３０秒のアニーリング、７２℃、５０秒の伸長を３０サイクル、および７２℃、５分の最終のポリメライゼーション。試験されたいくつかのＣｍＲコロニーは、必要な２１７２ヌクレオチドのＤＮＡ断片を含有していた。
実施例５  増強されたｙｄｄＧ遺伝子発現のトリプトファン生産に及ぼす効果
既知のトリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株を、増強されたｙｄｄＧ遺伝子発現のトリプトファン生産に及ぼす効果を評価するための親株として用いた。ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株については、米国特許６，１８０，３７３号または欧州特許０６６２１４３号に詳細が示されている。
強力な構成的ＰＬプロモーターの制御下における増強されたｙｄｄＧ遺伝子発現の、トリプトファン生産に及ぼす効果を試験するために、上記エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の染色体由来のＤＮＡ断片をトリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株にＰ１形質導入（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）により移入し、ＳＶ１６４  ＰＬ−ｙｄｄＧ（ｐＧＨ５）を得た。
ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）およびＳＶ１６４  ＰＬ−ｙｄｄＧ（ｐＧＨ５）の両株を、２０ｍｇ／ｌテトラサイクリン（ｐＧＨ５プラスミドのマーカー）を添加した栄養ブロス３ｍｌ中で３７℃で１８時間培養し、得られた培養液のうち０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中のテトラサイクリン（２０ｍｇ／ｌ）を含有する発酵培地３ｍｌに接種して、ロータリーシェーカーを用いて２５０ｒｐｍで３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中のスレオニンの蓄積量をＴＬＣにより測定した。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートを、移動相：プロパン−２−オール：アセトン：水：２５％アンモニア水＝２５：２５：７：６（ｖ／ｖ）を用いて展開させた。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として用いた。発酵培地の組成を表３に示す。
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培養後、培地中に蓄積されたトリプトファンの量を、実施例３に記載のようにしてＴＬＣにより決定した。得られた結果を表４に示す。
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表４から、増強されたｙｄｄＧ遺伝子発現により、ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株のトリプトファン生産性が改良されたことがわかる。
産業上の利用の可能性
本発明により、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニンおよびＬ−トリプトファンの生産性が向上したエシェリヒア属細菌、および同細菌を利用したＬ−アミノ酸の製造法が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、構築されたｙｄｄＧ遺伝子の染色体上流領域の構造を示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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