(57)【要約】本発明は、ヒトの小胞体のＮ結合型糖鎖合成酵素の遺伝子を明らかにすることにより、糖タンパク質糖鎖不全症候群（ＣＤＧＳ）の診断あるいは治療に有効な手段を提供する。本発明では、酵母小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素遺伝子と相同性を有し、かつ酵母における該遺伝子の欠失株に対して該遺伝子の機能を相補し得ることを指標として、ヒトＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素の遺伝子を見いだす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素遺伝子と相同性を有し、かつ酵母における該遺伝子の欠失株に対して該遺伝子の機能を相補し得るものであって、ヒトＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素を合成するためのヒト遺伝子。
【請求項２】
ヒトＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素が糖転移酵素である請求の範囲第１項記載のヒト遺伝子。
【請求項３】
配列番号２、４、６、８または１０で示されるアミノ酸配列、あるいはその一部アミノ酸の欠失、置換、付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号１、３、５、７、または９で示される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項５】
請求の範囲第３項に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子、あるいは配列番号１、３、５、７、または９で示される遺伝子を用いたヒト糖鎖不全症候群の診断あるいは治療薬。
【請求項６】
請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の遺伝子により組み換えられた組み換えベクター。
【請求項７】
請求の範囲第６項に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からヒトＮ結合型糖鎖の合成を触媒する酵素を採取することを特徴とする、ヒトＮ結合型糖鎖の合成を触媒する酵素の製造方法。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載の酵素を用いることを特徴とする、ヒトＮ結合型糖鎖の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、ヒト由来のＮ結合型糖鎖合成に関わる酵素を合成するためのヒト遺伝子、該遺伝子を用いた糖タンパク質糖鎖不全症候群（ＣＤＧＳ）の診断あるいは治療薬、該遺伝子により組み換えられた組み換えベクター及び形質転換体、該形質転換体を用いてヒトＮ結合型糖鎖の合成を触媒する酵素を製造する方法、若しくは該酵素あるいは上記形質転換体を用いて、ヒトＮ結合型糖鎖を合成する方法に関する。
【背景技術】    糖タンパク質糖鎖不全症候群ＣＤＧＳの原因遺伝子を特定するためには、糖鎖合成に関わる遺伝子を網羅的にクローニングする必要がある．特に、ヒトＮ結合型糖鎖の根本の合成に関わる遺伝子であるヒト小胞体での合成過程における遺伝子群は、特に重要である。
現に、糖タンパク質糖鎖不全症候群のうち、いくつかの原因遺伝子が究明されているが、これらの多くは小胞体でのＮ結合型糖鎖の合成に関わる遺伝子の不全によることが知られている。この小胞体でのＮ結合型糖鎖の合成経路は、酵母からヒトに至るまで共通して存在し、その合成に関わる遺伝子の多くは、酵母で単離されてきている。
一方、ヒトの遺伝子については、データベース上にほぼ全ての配列があると考えられているにもかかわらず、その機能が未知であるために、そのほとんどの遺伝子が単離されていない。このため、さらなるＣＤＧＳの詳しい診断、治療のためには、これらの遺伝子の単離が重要な課題となっている。
一方、このＮ結合型糖鎖の合成において、基本骨格となる小胞体での生合成酵素は、生体外での大量合成を行う際には必須のものである。このことから、これらの遺伝子を単離する事は、糖鎖工学への応用として酵素の供給をする際にも非常に重要となる。
本発明は、小胞体でのＮ結合型糖鎖合成系に関わるヒトの遺伝子を明らかにし、これを用いて、糖タンパク質糖鎖不全症侯群の診断、治療を行うとともに、糖鎖工学への応用として該酵素を大量合成する手段を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酵母の小胞体でのＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素の遺伝子と相同性の高いヒト遺伝子を見いだし、これをクローニングした。そして、該クローニングされた上記ヒト遺伝子は、驚くべきことに、酵母小胞体における該遺伝子の欠失株に対して該遺伝子の機能を相補し得たことにより、ヒトの小胞体のＮ結合型糖鎖合成酵素の遺伝子であると確信し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりのものである。
（１）酵母小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素遺伝子と相同性を有し、かつ酵母における該遺伝子の欠失株に対して該遺伝子の機能を相補し得るものであって、ヒトＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素を合成するためのヒト遺伝子。
（２）ヒトＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素が糖転移酵素である（１）記載のヒト遺伝子。
（３）配列番号２、４、６、８または１０で示されるアミノ酸配列、あるいはその一部アミノ酸の欠失、置換、付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（４）配列番号１、３、５、７または９で示される塩基配列を有する遺伝子。
（５）上記（３）に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子、あるいは配列番号１、３、５、７、または９で示される遺伝子を用いたヒト糖鎖不全症候群の診断あるいは治療薬。
（６）上記（１）〜（３）いずれか一項に記載の遺伝子により組み換えられた組み換えベクター。
（７）上記（６）に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
（８）上記（７）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からヒトＮ結合型糖鎖の合成を触媒する酵素を採取することを特徴とする、該酵素の製造方法。
（９）上記（８）に記載の酵素を用いることを特徴とする、ヒトＮ結合型糖鎖の合成方法。
【図面の簡単な説明】    第１図は、形質転換体試料、ＪＹ７４６株（野生株）試料およびｇｍｄ３株試料について行った電気泳動の結果を示す図である。
第２図は、形質転換体試料、Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料およびａｌｇ８株試料について行った電気泳動の結果を示す図である。
第３図は、形質転換体試料、Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料およびａｌｇ９株試料について行った電気泳動の結果を示す図である。
第４図は、形質転換体試料、Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料およびａｌｇ１０株試料について行った電気泳動の結果を示す図である。
第５図は、形質転換体試料、Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料およびａｌｇ１２株試料について行った電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】    本発明において、ヒトＮ結合型糖鎖合成を触媒する酵素の遺伝子をクローニングするために用いる遺伝子は、酵母小胞体のＮ結合型糖鎖合成に関与する酵素群の遺伝子であり、例えば、ＡＬＧ１１遺伝子、ＡＬＧ８遺伝子、ＡＬＧ９遺伝子、ＡＬＧ１０遺伝子、ＡＬＧ１２遺伝子等に属する遺伝子である。具体的には、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のａｌｇ１１遺伝子、サッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＬＧ８遺伝子、ＡＬＧ９遺伝子、ＡＬＧ１０遺伝子、ＡＬＧ１２遺伝子等である。
上記シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のａｌｇ１１遺伝子は、Ｎ結合型糖鎖合成系におけるグリコリピドα−マンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１３１）をコードする遺伝子である。
サッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ）のＡＬＧ８遺伝子はＮ結合型糖鎖合成系におけるグリコリピドα−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．−）をコードする遺伝子である。
サッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＬＧ９遺伝子はＮ結合型糖鎖合成系におけるグリコリピドα−マンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１３０）をコードする遺伝子である。
サッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＬＧ１０遺伝子はＮ結合型糖鎖合成系におけるグリコリピドα−グルコシルトランスフェラーゼ（ＢＣ２．４．１．−）をコードする遺伝子である。
サッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＬＧ１２遺伝子はＮ結合型糖鎖合成系におけるグリコリピドα−マンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１３０）をコードする遺伝子である。
これら酵母の遺伝子と相同性を有し、かつ酵母におけるこれら遺伝子の欠失あるいは変異株に対してその機能を相補できるヒト遺伝子は、ヒト小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子といえる。
したがって、本発明においてヒト小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子を得るには、酵母小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子と相同性のあるヒト遺伝子をクローニングする。これには、例えば、酵母の上記Ｎ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子の塩基配列を基に合成プライマーを作成し、ヒトのｃＤＮＡライブラリーを用いＰＣＲ法により、酵母小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子と相同性のあるクローニングされたヒトＤＮＡを得ることができる。
次いで、酵母小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子と相同性のあるヒト遺伝子を、酵母において発現可能なベクター、例えばｐＲＥＰ１、ＹＥｐ５１、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ、ｐＳＨ１９、ｐＹＯ３２５等に連結し、該組み換え発現ベクターを用いて、Ｎ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子が欠失あるいは変異された酵母を形質転換する。形質転換された酵母が、該酵素遺伝子の欠失または変異により喪失した機能を回復していれば、上記ヒト遺伝子はヒト小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子である。以後、ＰＣＲによる増幅、あるいは形質転換体の培養で、上記組み換えベクターを多数取り出し、該ベクターの制限酵素等による切り出し等の当該分野で周知の方法により、ヒト小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子を得ることができる。
この点について、さらに具体的にいえば、例えば、上記シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のａｌｇ１１遺伝子は、Ｎ結合型糖鎖合成系におけるグリコリピドα−マンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１３１）をコードする遺伝子であり、この遺伝子に変異のあるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ｇｍｄ３株は、温度感受性であり、また糖鎖付加不全となり、糖蛋白質である酸性フォスファターゼの糖鎖付加において不全があるため、野生型に比べ小さい分子量のものを生産する。一方、ａｌｇ１１遺伝子の配列を基にプライマーを作成し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲにより増幅を行い、ａｌｇ１１遺伝子と相同性の高いヒト遺伝子（例えばＦＬＪ２１８０３）を得る。該遺伝子を用いて、上記ｇｍｄ３株を形質転換し、温度感受性および酸性フォスファターゼの分子量の大きさをみる。形質転換体が温度感受性マイナスで、酸性フォスファターゼの分子量を野生型株と同じ位置に戻していれば、上記ヒト遺伝子は、ヒト小胞体におけるＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子であり、常法により該遺伝子を大量生産できる。
上記Ｎ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子が欠失あるいは変異された酵母株には、例えば、ａｌｇ１１遺伝子が変異したシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ｇｍｄ３株、ＡＬＧ８遺伝子が変異したサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ａｌｇ８株等が挙げられるが、放射線、紫外線照射等の突然変異手段により、酵母を変異させ、糖タンパク質の分子量の減少や温度感受性などを指標として、Ｎ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子が欠失あるいは変異された酵母株をスクリーニングして得ることができる。
ＣＤＧＳは常染色体劣性遺伝性疾患であり、小脳形成不全や肝障害、末梢神経傷害等様々な病体を呈し、そのうちＩ型はＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子の欠失あるいは変異より該酵素の欠損により引き起こされるとされており、本発明において初めてヒトＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子として同定された遺伝子は、有用なＣＤＧＳの診断薬である。例えば、本発明の配列番号１で示されるグリコリピドα−マンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１３１）の塩基配列と、対応する患者の酵素遺伝子の塩基配列と対比して、遺伝子の異常をみることにより、ＣＤＧＳか否かを診断することができる。
本発明のヒトＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子を使用して診断を行う場合において、対比の対象となる患者の酵素遺伝子は、本発明の該酵素遺伝子をプローブとして患者の血液等から対象遺伝子を取り出し、これを適宜ＰＣＲ法により増幅することにより得ることができる。
また、本発明のヒトＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子は、遺伝子治療においても有用であり、これには、本発明のヒトＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子を、例えば、アデノウィルス、レトロウイルス、センダイウイルス等の遺伝子治療用のベクターに組み込み、ヘルパー細胞などを用いて当該遺伝子を含むウイルス粒子を調製し、これを人体に接種することにより導入する。
本発明においては、ヒトＮ結合型糖鎖合成系の酵素遺伝子を、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ−３、ＹＥｐ５１、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ等のベクターに組み込み、該ベクターで細菌あるいは酵母等の宿主を形質転換し、該形質転換体を培地に培養することにより、該遺伝子に対応するヒトＮ結合型糖鎖合成系の酵素を大量に生産することも可能である。本発明の酵素の製造方法において用いるベクターとしては、例えば大腸菌が宿主の場合ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ−３等があげられる。酵母が宿主の場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０、ＹＥｐ５１、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ、ｐＳＨ１９、ｐＲＥＰ１等がが挙げられる。さらに、該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いられるプロモーターは、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。宿主としては大腸菌（ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）など）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなど）等が挙げられる。
上記した製造方法により得られるヒトＮ結合型糖鎖合成系の酵素は、それ自体ＣＤＧＳの治療薬として有用であるほか、該酵素を用いて生体外でヒトＮ結合型糖鎖を合成することもできる。例えば、ヒトＡＬＧ１１相同遺伝子にコードされるαマンノシルトランスフェラーゼの場合、基質としてＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２−ｐｐ−ＤｏｌとＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅを用いることにより、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ｐｐ−Ｄｏｌを合成できる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれに限定されるものではない。
【実施例１】    〈ＡＬＧ１１ヒトホモログＦＬＪ２１８０３のクローニング〉
ヒトのｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲ法により遺伝子をクローニングした。ｃＤＮＡライブラリーはＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＱＵＩＣＫ．Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡを用いた．プライマーは、データーベース上に登録されている配列をもとに、制限酵素でタンパク質をコードしている部分が容易に切り出せるように、Ｎ−末端部分にＮｄｅＩサイト、Ｃ−末端部分にＳｍａＩサイトをあらかじめ含んだプライマーを作製した。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
2004015110.tif 000002
ＰＣＲの条件は以下のとおりである。
第１段階：９４℃    １５秒
第２段階：４９℃    ３０秒
第３段階：７２℃      ３分
３０サイクル
この条件で得られた約１．５ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片をＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入した。このクローニングされた遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認した。該遺伝子は配列番号１で示される塩基配列を有していた、なお、配列番号１には該遺伝子の塩基配列とともに対応するアミノ酸配列を示した。また、該遺伝子に対応する蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
〈形質転換〉
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入されているＦＬＪ２１８０３遺伝子をＮｄｅＩ−ＳｍａＩで切り出し、分裂酵母のプロモーターｎｍｔｌとそのターミネーターの間にマルチクローニングサイトをもつ分裂酵母多コピー発現用ベクターｐＲＥＰｌのＮｄｅＩ−ＳｍａＩサイトに挿入して、２１８０３／ｐＲＥＰｌを構築した。この発現ベクターを分裂酵母のシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ｇｍｄ３変異株へ形質転換した。
〈ｇｍｄ３変異株の機能〉
得られた形質転換体について、Ｎ結合型糖鎖合成の有無の指標となる温度感受性を調べた。形質転換体及びコントロールであるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＪＹ７４６株（野生株）とｇｍｄ３株を以下の組成を有するＭＭ−１ｅｕ培地で３７℃で３日間培養して、温度感受性を調べた。
その結果、形質転換体と野生株は３７℃でも生育できることが確認された。これに対してｇｍｄ３株は３７℃では生育できなかった。
一方、３７℃で生育できた形質転換体を採取し、低リン酸培地で生育させた後グラスビーズで破砕した物を試料とし、アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。同様にしてサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＬＧ１１遺伝子を形質転換したｇｍｄ３株から得られた試料、ｇｍｄ３株試料、及び上記ＪＹ７４６株（野生株）試料についても電気泳動を行った。これらの結果を合わせて第１図に示す。
図中１〜３レーンは、上記シゾサッカロミセス・ポンベ形質転換体から得られた試料についてのものであり、４レーンは別途培養して得られたｇｍｄ３株試料であり、５レーンはサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＬＧ１１遺伝子を形質転換したｇｍｄ３株から得られた試料であり、６レーンはＪＹ７４６株（野生株）から得られた試料である。
形質転換体試料とＪＹ７４６株（野生株）試料においては、ともに完全に糖鎖が付加した分子量の大きな酸性フオスフアターゼに対応するバンドがみられるのに対して、ｇｍｄ３株試料では該バンドより分子量の小さな不完全な糖鎖付加が起きたバンドしか見られない。
したがって、このことから、ヒト遺伝子ＦＬＪ２１８０３は分裂酵母内でも機能を相補することが明らかとなった。
【実施例２】    〈ＡＬＧ８ヒトホモログＭＧＣ２８４０のクローニング〉
ヒトのｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲ法により遺伝子をクローニングした。ｃＤＮＡライブラリーはＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡを用いた。プライマーは、データーベース上に登録されている配列をもとに、プライマーを作製した。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
2004015110.tif 000003
ＰＣＲの条件は以下の通りである。
９４℃  ３０秒
５０℃  ３０秒
７２℃  ２分
３０サイクル
この条件で得られた約１．５ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片をＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入した。このクローニングした遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認した。該当遺伝子は配列番号３で示される塩基配列を有していた。なお、該遺伝子に対応する蛋白質のアミノ酸配列を配列番号４に示した。
〈形質転換〉
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入されているＭＧＣ２８４０遺伝子をＥｃｏＲ  Ｉ−Ｎａｅ  Ｉで切り出し、酵母の解糖系のプロモーターＧＡＰＤＨとそのターミネーターの間にｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのうちＥｃｏＲ  ＩからＳａｌ  Ｉまでの部分を持つ発現用ベクターＹＥｐ３５２ＧＡＰのＥｃｏＲ  Ｉ−Ｐｖｕ  ＩＩサイトに挿入した。これらの発現ベクターを出芽酵母のサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ａｌｇ８  ｗｂｐ１変異株へ形質転換した。
〈ａｌｇ８  ｗｂｐ１変異株の機能回復〉
得られた形質転換体について、Ｎ結合型糖鎖合成の有無の指標となる温度感受性を調べた。形質転換体及びコントロールであるサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）とａｌｇ８  ｗｂｐ１変異株を以下の組成を有するＳＤ−ｕｒａ培地で３０℃で５日間培養して、温度感受性を確認した。
その結果、形質転換体と野生株は３０℃でも生育できることが確認された。これに対してａｌｇ８  ｗｂｐ１変異株は３０℃では生育できなかった。
一方、３０℃で生育できた形質転換体を採取し、完全培地で生育させた後、グラスビーズで破砕した物を試料とし、アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。同様にして、ａｌｇ８  ｗｂｐ１株試料、及び上記Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料についても電気泳動を行った。これらの結果を合わせて第２図に示す。
図中１〜４レーンは上記サッカロミセス・セレビジェ形質転換体から得られた試料についてのものであり、５レーンは別途培養して得られたａｌｇ８  ｗｂｐ１株試料であり、６レーンはＷ３０３−１Ａ株（野生株）から得られた試料である。形質転換体試料とＷ３０３−１Ａ株（野生株）試料においては、ともに完全に糖鎖が付加した分子量の大きなカルボキシペプチダーゼＹに対応するバンドがみられるのに対して、ａｌｇ８  ｗｂｐ１株試料では該バンドより分子量が小さく、糖鎖付加が起こっていないバンドしか見られない。
したがって、このことから、ヒト遺伝子ＭＧＣ２８４０は出芽酵母内でも機能を相補することが明らかとなった。
【実施例３】    〈ＡＬＧ９ヒトホモログＦＬＪ２１８４５のクローニング〉
ヒトのｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲ法により遺伝子をクローニングした。ｃＤＮＡライブラリーはＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡを用いた。プライマーは、データーベース上に登録されている配列をもとに、プライマーを作製した。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
2004015110.tif 000004
ＰＣＲの条件は以下の通りである。
９４℃  ３０秒
５０℃  ３０秒
７２℃  ３分
３０サイクル
この条件で得られた約２ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片をＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入した。このクローニングした遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認した。該当遺伝子は配列番号５で示される塩基配列を有していた。なお、該遺伝子に対応する蛋白質のアミノ酸配列を配列番号６に示した。
〈形質転換〉
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入されているＦＬＪ２１８４５遺伝子をＥｃｏＲ  Ｉ−Ｄｒａ  Ｉで切り出し、酵母の解糖系のプロモーターＧＡＰＤＨとそのターミネーターの間にｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのうちＥｃｏＲ  ＩからＳａｌ  Ｉまでの部分を持つ発現用ベクターＹＥｐ３５２ＧＡＰのＥｃｏＲ  Ｉ−Ｐｖｕ  ＩＩサイトに挿入した。これらの発現ベクターを出芽酵母のサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ａｌｇ９  ｗｂｐ１変異株へ形質転換した。
〈ａｌｇ９  ｗｂｐ１変異株の機能回復〉
得られた形質転換体について、Ｎ結合型糖鎖合成の有無の指標となる温度感受性を調べた。形質転換体及びコントロールであるサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）とａｌｇ９  ｗｂｐ１変異株を以下の組成を有するＳＤ−ｕｒａ培地で３０℃で５日間培養して、温度感受性を確認した。その結果、形質転換体と野生株は３０℃でも生育できることが確認された。これに対してａｌｇ９  ｗｂｐ１変異株は３０℃では生育できなかった。
一方、３０℃で生育できた形質転換体を採取し、完全培地で生育させた後、グラスビーズで破砕した物を試料とし、アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。同様にして、ａｌｇ９  ｗｂｐ１株試料、及び上記Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料についても電気泳動を行った。これらの結果を合わせて第３図に示す。
図中１〜３レーンは上記サッカロミセス・セレビジェ形質転換体から得られた試料についてのものであり、４レーンは別途培養して得られたａｌｇ９  ｗｂｐ１株試料であり、５レーンはＷ３０３−１Ａ株（野生株）から得られた試料である。
形質転換体試料とＷ３０３−１Ａ株（野生株）試料においては、ともに完全に糖鎖が付加した分子量の大きなカルボキシペプチダーゼＹに対応するバンドがみられるのに対して、ａｌｇ９  ｗｂｐ１株試料では該バンドより分子量が小さく、糖鎖付加が起こっていないバンドしか見られない。
したがって、このことから、ヒト遺伝子ＦＬＪ２１８４５は出芽酵母内でも機能を相補することが明らかとなった。
【実施例４】  〈ＡＬＧ１０ヒトホモログＸＭ＿０５０１９０のクローニング〉
ヒトのｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法により遺伝子をクローニングした。ｃＤＮＡはヒトｓｔｏｍａｃｈのｃＤＮＡを用いた。プライマーは、データーベース上に登録されている配列をもとに、プライマーを作製した。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
2004015110.tif 000005
ＰＣＲの条件は以下の通りである。
９４℃  ３０秒
５０℃  ３０秒
７２℃  ２分
３０サイクル
この条件で得られた約１．５ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片をＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入した。このクローニングした遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認した。該当遺伝子は配列番号７で示される塩基配列を有していた。なお、該遺伝子に対応する蛋白質のアミノ酸配列を配列番号８に示した。
〈形質転換〉
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入されているＸＭ＿０５０１９０遺伝子をＥｃｏＲ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉで切り出し、酵母の解糖系のプロモーターＧＡＰＤＨとそのターミネーターの間にｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのうちＥｃｏＲ  ＩからＳａｌ  Ｉまでの部分を持つ発現用ベクターＹＥｐ３５２ＧＡＰのＥｃｏＲ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉサイトに挿入した。これらの発現ベクターを出芽酵母のサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ａｌｇ１０  ｗｂｐ１変異株へ形質転換した。
〈ａｌｇ１０  ｗｂｐ１変異株の機能回復〉
得られた形質転換体について、Ｎ結合型糖鎖合成の有無の指標となる温度感受性を調べた。形質転換体及びコントロールであるサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）とａｌｇ１０  ｗｂｐ１変異株を以下の組成を有するＳＤ−ｕｒａ培地で３０℃で５日間培養して、温度感受性を確認した。
その結果、形質転換体と野生株は３０℃でも生育できることが確認された。これに対してａｌｇ１０  ｗｂｐ１変異株は３０℃では生育できなかった。
一方、３０℃で生育できた形質転換体を採取し、完全培地で生育させた後、グラスビーズで破砕した物を試料とし、アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。同様にして、ａｌｇ１０  ｗｂｐ１株試料、及び上記Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料についても電気泳動を行った。これらの結果を合わせて第４図に示す。
図中１〜４レーンは上記サッカロミセス・セレビジェ形質転換体から得られた試料についてのものであり、５レーンは別途培養して得られたａｌｇ１０  ｗｂｐ１株試料であり、６レーンはＷ３０３−１Ａ株（野生株）から得られた試料である。
形質転換体試料とＷ３０３−１Ａ株（野生株）試料においては、ともに完全に糖鎖が付加した分子量の大きなカルボキシペプチダーゼＹに対応するバンドがみられるのに対して、ａｌｇ１０  ｗｂｐ１株試料では該バンドより分子量が小さく、糖鎖付加が起こっていないバンドしか見られない。
したがって、このことから、ヒト遺伝子ＸＭ＿０５０１９０は出芽酵母内でも機能を相補することが明らかとなった。
【実施例５】    〈ＡＬＧ１２ヒトホモログＭＧＣ３１３６のクローニング〉
ヒトのｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲ法により遺伝子をクローニングした。ｃＤＮＡライブラリーはｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅのｃＤＮＡを用いた。プライマーは、データーベース上に登録されている配列をもとに、プライマーを作製した。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
2004015110.tif 000006
ＰＣＲの条件は以下の通りである。
９４℃  ３０秒
５０℃  ３０秒
７２℃  ３分
３０サイクル
この条件で得られた約１．５ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片をＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入した。このクローニングした遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認した。該当遺伝子は配列番号９で示される塩基配列を有していた。なお、該遺伝子に対応する蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１０に示した。
〈形質転換〉
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに挿入されているＭＧＣ３１３６遺伝子をＥｃｏＲ  Ｉで切り出し、酵母の解糖系のプロモーターＧＡＰＤＨとそのターミネーターの間にｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのうちＥｃｏＲ  ＩからＳａｌ  Ｉまでの部分を持つ発現用ベクターＹＥｐ３５２ＧＡＰのＥｃｏＲ  Ｉサイトに挿入した。これらの発現ベクターを出芽酵母のサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ａｌｇ１２変異株へ形質転換した。
〈ａｌｇ１２変異株の機能回復〉
形質転換体を採取し、完全培地で生育させた後、グラスビーズで破砕した物を試料とし、アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。同様にして、ａｌｇ１２株試料、及び上記Ｗ３０３−１Ａ株（野生株）試料についても電気泳動を行った。これらの結果を合わせて第５図に示す。
図中１〜４レーンは上記サッカロミセス・セレビジェ形質転換体から得られた試料についてのものであり、５レーンは別途培養して得られたａｌｇ１２株試料であり、６レーンはＷ３０３−１Ａ株（野生株）から得られた試料である。
形質転換体試料とＷ３０３−１Ａ株（野生株）試料においては、ともに完全に糖鎖が付加した分子量の大きなカルボキシペプチダーゼＹに対応するバンドがみられるのに対して、ａｌｇ１２株試料では該バンドより分子量が小さく、糖鎖付加が起こっていないバンドしか見られない。
したがって、このことから、ヒト遺伝子ＭＧＣ３１３６は出芽酵母内でも機能を相補することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】    本発明においては、ヒトの小胞体のＮ結合型糖鎖合成酵素の遺伝子を初めて明らかにした。ヒトの小胞体のＮ結合型糖鎖合成酵素の遺伝子の欠失あるいは変異は、糖タンパク質糖鎖不全症候群（ＣＤＧＳ）を引き起こすものとして知られているものであり、本発明の上記遺伝子は、糖タンパク質糖鎖不全症候群（ＣＤＧＳ）の診断及び治療等に極めて有用なものである。
【配列表】
2004015110.tif 000007
2004015110.tif 000008
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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