(57)【要約】本発明は、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストを含有する皮膚バリアー機能回復促進剤及び皮膚バリアー機能回復促進活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストを含有することを特徴とする、皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項２】
前記興奮性細胞受容体がグルタミン酸受容体、ＡＴＰ受容体、熱刺激受容体及びアドレナリンβ２受容体から成る群から選ばれる、請求項１記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項３】
前記グルタミン酸受容体がＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体である、請求項２記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項４】
前記ＮＭＤＡ受容体のアンタゴニストがＭＫ−８０１（ジゾシルピン）又はＤ−ＡＰ５（Ｄ−（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸）である、請求項３記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項５】
前記ＡＴＰ受容体がＰ２Ｘ受容体（変力性プリノレセプター）である、請求項２記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項６】
前記ＡＴＰ受容体のアンタゴニストがスラミン、ＰＰＡＤＳ（ピリドキサルホスフェート−６−アゾフェニル  ２’，４’−ジスルホン酸）又はＴＮＰ−ＡＴＰ（トリニトロフェニル−ＡＴＰ）である、請求項２記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項７】
前記熱刺激受容体がＶＲ−１（バニロイド受容体サブタイプ１）である、請求項２記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項８】
前記ＶＲ−１のアンタゴニストがカプサゼピンである、請求項７記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項９】
前記アドレナリンβ２受容体のアンタゴニストがＩＣＩ−１１８，５５１（（±）−１−［２，３−（ジヒドロ−７−メチル−１Ｈ−インデン−４−イル）オキシ］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−２−ブタノール）である、請求項２記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項１０】
前記抑制性細胞受容体がＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）受容体又はグリシン受容体である、請求項１記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項１１】
前記ＧＡＢＡ受容体がＡ型−ＧＡＢＡ受容体（Ｃｌ−チャネル内蔵型ビククリン感受性型受容体）である、請求項１０記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項１２】
前記Ａ型−ＧＡＢＡ受容体のアゴニストがＧＡＢＡ、ムシモール又はイソグバシンである、請求項１１記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項１３】
皮膚外用剤である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の皮膚バリアー機能回復促進剤。
【請求項１４】
皮膚バリアー機能回復促進物質をスクリーニングする方法であって、興奮性細胞受容体の興奮活性を抑制する、又は抑制性細胞受容体の抑制活性を促進する候補となる物質を選定し、当該物質を哺乳動物の皮膚に塗布して当該皮膚の経皮水分蒸散量を減少させる物質又は乾燥刺激を受けた当該皮膚の厚みを減少させるもしくはその増大を抑制する物質を選定することを含んで成る方法。
【請求項１５】
前記興奮性細胞受容体の興奮活性を抑制する又は抑制性細胞受容体の抑制活性を促進する候補となる物質の選定を、当該物質が細胞内のカルシウムイオンもしくはナトリウムイオン又は塩素イオン濃度に対して及ぼす影響を評価することで実施する、請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記興奮性細胞受容体がグルタミン酸受容体、ＡＴＰ受容体、熱刺激受容体又はアドレナリンβ２受容体であり、前記抑制性細胞受容体がγ−アミノ酪酸受容体又はグリシン受容体である、請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
皮膚バリアー機能回復活促進物質をスクリーニングする方法であって、皮膚バリアー機能回復活促進物質の候補となる物質を哺乳動物細胞に作用させ、しかる後に当該細胞内塩素イオン濃度を測定し、当該細胞内塩素イオン濃度を上昇させる物質を皮膚バリアー機能回復活促進物質として選定することを含んで成る方法。
【請求項１８】
皮膚バリアー機能回復活促進物質をスクリーニングする方法であって、皮膚バリアー機能回復活促進物質の候補となる物質を哺乳動物細胞に作用させ、しかる後に当該細胞内カルシウム又はナトリウムイオン濃度を測定し、当該細胞内カルシウム又はナトリウムイオン濃度を低下させる物質を皮膚バリアー機能回復活促進物質として選定することを含んで成る方法。
【請求項１９】
肌改善方法であって、皮膚に興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストを含有する皮膚外用剤を塗布して皮膚バリアー機能を回復促進させることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストを含有する皮膚バリアー機能回復促進剤及び皮膚バリアー機能回復促進活性を有する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
種々の皮膚疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等に見られる肌荒れ症状においては、皮膚からの水分の消失が、健常な皮膚に比べて盛んであることが知られている。このいわゆる経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の増加には、皮膚内において水分の保持やバリアーとしての機能を担っていると考えられる成分の減少が関与しているものと考えられてきた。
従来、皮膚疾患や肌荒れに対して改善・予防効果を有する有効成分として、水分保持機能や皮膚バリアー機能を担う皮膚内成分を皮膚に補充するという観点から、ＮＭＦ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）としてのアミノ酸や、角質細胞間脂質としての脂質類、その他ヒアルロン酸等のムコ多糖あるいはこれらの類似物質が、安全性も高いことから、化粧料や皮膚外用剤に配合されている。
また、最近では、皮膚バリアー機能を担う皮膚内成分の生合成を活性化させるような特定の物質が、肌荒れに対して改善効果を有するという報告もなされている（特開平９−２９５２号公報）。
肌荒れ改善・予防効果を有する物質については多くの研究がなされてきたが、皮膚バリアー機能の改善若しくは回復効果を有する物質についての研究は十分ではなく、皮膚バリアー機能に対する改善効果と肌荒れ改善・予防効果との関係は明らかになっていないため、肌荒れ改善・予防効果がある物質が必ずしも皮膚バリアー機能に対する改善効果があるとは限らない。
一方、皮膚バリアー機能が低下すると、皮膚の皮膚機能が低下し、皮膚増殖性異常等が起こることが報告されている。特に、高齢者の場合は、低下した皮膚バリアー機能の回復には長い時間がかかり、加齢に伴う皮膚の皮膚機能の低下による皮膚増殖性異常等を防止するために有効な新規の皮膚バリアー機能回復促進剤に開発が要望されていた。
ところで、哺乳動物の皮膚細胞表層にも、神経細胞表層において認められる各種神経細胞受容体と同等のものが存在することが近年見出されている（Ｇｅｎｅｖｅｒ，ｅｔ．ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９９），Ｖｏｌ．１１２，ｐｐ．３３７−３４１）。神経細胞の化学的シナプスにおける情報伝達を担う神経細胞におけるこのような興奮性受容体及び抑制性受容体の作用機序についてはかなり解明されるに至っているが、皮膚細胞におけるそれらの働きについてはほとんど研究されていない。
皮膚細胞も神経細胞等と同様にエネルギーを消費しながら細胞膜内外において電位差を造っている。かかる電位差は、主として細胞表層上の各種受容体によるＣａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−イオンチャネルの開閉によるものである。特開平２０００−２９０１３５号公報においては、一定のＣａ２＋チャネルの阻害剤又はＣａ２＋チャネルの阻害作用を有する金属塩、例えば、マンガン塩、ストロンチウム塩、ランタン塩、コバルト塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、鉄塩、バリウム塩、ジルチアゼム及びその塩、ベラパミル及びその塩、ニフェジピン及びその塩等がダメージを受けた皮膚バリアー機能を極めて短時間のうちに回復させることが開示されている。かかる金属塩が皮膚バリアー機能の回復を促進するメカニズム及び作用機序については不明とされているが、金属塩による外部電位の負荷と皮膚バリアー回復機能の促進との間に何らかの関係があることがある程度想定できる。
本発明者は、このように、皮膚細胞にも神経細胞表層に存在する受容体が存在し、また細胞内外電位変化により皮膚バリアー機能回復が図れるという事実から、皮膚細胞に存在する興奮性・抑制性受容体の皮膚バリアー機能回復への関与を調べ、更にかかる細胞受容体の作用機序の観点から、従来にはない新規な皮膚バリアー機能回復促進剤を発見できるかどうかを検討した。
発明の開示
鋭意研究の結果、本発明者は、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストが、皮膚バリアー機能回復促進に有効であることを見出した。
従って、本発明は、第一の態様において、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストを含有することを特徴とする皮膚バリアー機能回復促進剤を提供する。
一の観点において、前記興奮性細胞受容体はグルタミン酸受容体、ＡＴＰ受容体、熱刺激受容体及びアドレナリンβ２受容体から成る群から選ばれる。
更なる観点において、前記グルタミン酸受容体はＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体である。
更なる観点において、前記ＮＭＤＡ受容体のアンタゴニストはＭＫ−８０１（ジゾシルピン）又はＤ−ＡＰ５（Ｄ−（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸）である。
更なる観点において、前記ＡＴＰ受容体はＰ２Ｘ（変力性プリノ受容体）、好ましくはＰ２Ｘ３受容体（変力性プリノ受容体サブタイプ３）である。
更なる観点において、前記ＡＴＰ受容体のアンタゴニストはスラミン、ＰＰＡＤＳ（ピリドキサルホスフェート−６−アゾフェニル  ２’，４’−ジスルホン酸）又はＴＮＰ−ＡＴＰ（トリニトロフェニル−ＡＴＰ）である。
更なる観点において、前記熱刺激受容体はＶＲ−１（バニロイド受容体サブタイプ１）である。
更なる観点において、前記ＶＲ−１のアンタゴニストはカプサゼピンである。
更なる観点において、前記アドレナリンβ２受容体のアンタゴニストはＩＣＩ−１１８，５５１（（±）−１−［２，３−（ジヒドロ−７−メチル−１Ｈ−インデン−４−イル）オキシ］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−２−ブタノール）である。
別の観点において、前記抑制性細胞受容体はＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）受容体又はグリシン受容体である。
更なる観点において、前記ＧＡＢＡ受容体はＡ型−ＧＡＢＡ受容体（Ｃｌ−チャネル内蔵型ビククリン感受性型受容体）である。
別の観点において、前記Ａ型−ＧＡＢＡ受容体のアゴニストはＧＡＢＡ、ムシモール又はイソグバシンである。
好ましくは、前記皮膚バリアー機能回復促進剤は皮膚外用剤である。
本発明は、第二の態様において、皮膚バリアー機能回復活促進物質をスクリーニングする方法であって、興奮性細胞受容体の興奮活性を抑制する、又は抑制性細胞受容体の抑制活性を促進する候補となる物質を選定し、当該物質を哺乳動物の皮膚に塗布して当該皮膚の経皮水分蒸散量を減少させる物質又は乾燥刺激を受けた当該皮膚の厚みを減少させるもしくはその増大を抑制する物質を選定することを含んで成る方法を提供する。
一の観点において、前記興奮性細胞受容体の興奮活性を抑制する又は抑制性細胞受容体の抑制活性を促進する候補となる物質の選定を、当該物質が細胞内のカルシウムイオンもしくはナトリウムイオン又は塩素イオン濃度に対して及ぼす影響を評価することで実施する。
別の観点において、前記興奮性細胞受容体はグルタミン酸受容体、ＡＴＰ受容体、熱刺激受容体又はアドレナリンβ２受容体であり、前記抑制性細胞受容体はγ−アミノ酪酸受容体又はグリシン受容体である。
更に、本発明は、皮膚バリアー機能回復活促進物質をスクリーニングする方法であって、皮膚バリアー機能回復活促進物質の候補となる物質を哺乳動物細胞に作用させ、しかる後に当該細胞内塩素イオン濃度を測定し、当該細胞内塩素イオン濃度を上昇させる物質を皮膚バリアー機能回復活促進物質として選定することを含んで成る方法を提供する。
好ましくは、細胞としてヒト表皮角化細胞を使用する。
更に、本発明は、皮膚バリアー機能回復活促進物質をスクリーニングする方法であって、皮膚バリアー機能回復活促進物質の候補となる物質を哺乳動物細胞に作用させ、しかる後に当該細胞内カルシウム又はナトリウムイオン濃度を測定し、当該細胞内カルシウム又はナトリウムイオン濃度を低下させる物質を皮膚バリアー機能回復活促進物質として選定することを含んで成る方法を提供する。
好ましくは、細胞としてヒト表皮角化細胞を使用する。
本発明は、第三の態様において、肌改善方法であって、皮膚に興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストを含有する皮膚外用剤を塗布して皮膚バリアー機能を回復促進させることを特徴とする方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の構成について詳述する。
興奮性細胞受容体
本発明でいう「興奮性細胞受容体」とは、皮膚細胞、即ち、角層、表皮、基底膜、真皮等を構成する細胞、例えばケラチノサイトの表層において存在する、細胞を興奮状態へと誘導する興奮性受容体をいう。かかる興奮は、上記受容体にそのアゴニストが結合することでＣａ２＋やＮａ＋イオンが細胞内に流入することにより引き起こされる。このような興奮性細胞受容体であって現在皮膚細胞に見出されているものには、例えばグルタミン酸（ＮＭＤＡ型）受容体、ＡＴＰ受容体、熱刺激受容体、アドレナリンβ受容体、アセチルコリン・ニコチン酸様受容体、セロトニン受容体等が挙げられる。本発明においては、グルタミン酸（ＮＭＤＡ型）受容体、ＡＴＰ受容体、熱刺激受容体、例えばＶＲ−１、又はアドレナリンβ２受容体が好ましい。本発明は、上記の興奮性受容体や現在皮膚細胞において存在する興奮性受容体に限定されず、その他の受容体及び将来その存在が見出される受容体にも及ぶものと理解されるべきである。
かかる興奮性受容体は、各々固有のアンタゴニストが細胞周囲に存在することでその活性は抑制される。グルタミン酸（ＮＭＤＡ型）受容体のアンタゴニストには、ＭＫ−８０１、Ｄ−ＡＰ５、Ｄ−ＡＰ７、コナントキン（Ｃｏｎａｎｔｏｋｉｎ  Ｔ）、（Ｒ）−ＣＰＰ等が挙げられる。本発明においては、ＭＫ−８０１又はＤ−ＡＰ５が好ましい。ＡＴＰ受容体のアンタゴニストには、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ＴＮＰ−ＳＴＰ等が挙げられる。熱刺激受容体であるＶＲ−１のアンタゴニストにはカプサゼピン等が挙げられる。アドレナリンβ２受容体のアンタゴニストにはＩＣＩ−１１８，５５１、アルプレノロール、（±）−アテノロール、Ｓ（−）−アテノロール、ブロモアセチルアルプレノロールメンタン、（±）−ＣＧＰ−１２１７７Ａ、ＩＣＩ−８９４０６、プラクトロール、プロネタノール、ＤＬ−プロプラノロール塩酸塩、プロプラノロール、Ｒ−（＋）プロプラノロール、Ｓ−（−）プロプラノロール、ソタロール、Ｓ−（−）リスリド等が挙げられる。アセチルコリン・ニコチン酸様受容体のアンタゴニストには、ベンゾキノニウム、コンデルフィン（Ｃｏｎｄｅｌｐｈｉｎｅ）、α−コノトキシン−Ｅ１（α−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  Ｅ１）等が挙げられる。セロトニン受容体のアンタゴニストには、ＭＤＬ−７２２２２、Ｙ−２５１３０、メトクロプラミド（Ｍｅｔｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ）等が挙げられる。本発明は、上記のアンタゴニストや現在皮膚細胞において存在する興奮性受容体のアンタゴニストに限定されず、その他及び将来その存在が見出されるアンタゴニストにも及ぶものと理解されるべきである。
抑制性神経細胞受容体
本発明でいう「抑制性細胞受容体」とは、皮膚細胞を構成する細胞、例えばケラチノサイトの表層において存在する、細胞を興奮状態から抑制状態へと誘導する抑制性受容体をいう。かかる抑制は、上記受容体にそのアゴニストが結合することでＣｌ−が細胞内に流入することにより引き起こされる。このような抑制細胞受容体であって現在皮膚細胞に見出されているものには、例えばＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、等が挙げられる。本発明は、現在皮膚細胞において存在する抑制性受容体に限定されず、将来見出される受容体にも及ぶものと理解されるべきである。
かかる抑制性受容体は、各々固有のアゴニストが結合することでその活性は抑制される。ＧＡＢＡ受容体のアゴニストには、ＧＡＢＡ、ムシモール、イソグバシン、ＴＡＣＡ又はＴＨＩＰ等が挙げられる。本発明においては、ＧＡＢＡ、ムシモール又はイソグバシンが好ましい。グリシン受容体のアゴニストには、グリシン、アラニン、ヒポタウリン、セリン、タウリン等が挙げられる。本発明においては、グリシンが好ましい。本発明は、上記のアゴニストや現在皮膚細胞において存在する抑制性受容体のアゴニストに限定されず、その他及び将来見出されるアゴニスト受容体にも及ぶものと理解されるべきである。
皮膚バリアー機能回復促進効果試験
本発明において、皮膚バリアー機能回復促進効果は様々な方法で評価することができ、例えば、哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ等）の皮膚にテープストリッピングを施すことによって破壊された皮膚バリアー機能がもとの状態へ回復していく過程を経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を指標として評価することにより、定量的又は定性的に測定することができる。かかる測定は、例えば下記の通りにして実施することができる。
１．水分蒸散量測定装置によりヘアレスマウス背部付近の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定する。この際の値をＴＥＷＬの回復率１００％とする。
２．皮膚のバリアーを、セロファンテープ等を使用し、ヘアレスマウスの表皮角層を剥がすことにより破壊する。このときＴＥＷＬの値が約８００〜９００となるまでこの作業を繰り返すのが好ましい。角層を剥がした後の測定値から角層を剥がす前の測定値を差し引いた値を、最もダメージの深い状態、即ち回復率０％とする。
３．試験試料を適宜の濃度（例えば１ｍＭ）で適量（例えば１００μｌ）にて適当な基材、例えばプラスチックラップの上に載せ、哺乳動物の背部に貼付し、適当な時間（例えば５分）経過後、それを剥がす。
４．適当な時間（例えば０、２、４、６時間）経過後、水分蒸散量測定装置によりＴＥＷＬを測定する。角層除去時と同様、各時間の測定値から角層除去前のＴＥＷＬ値を差し引き、回復率を算出する。
即ち、回復率は下記の式に従いもとめることができる：
2003053466.tif 000002
本発明において、「皮膚バリアー機能の回復を促進する」とは、皮膚のテープストリッピング直後の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の値を０％、テープストリッピング前の値を１００％として、各測定時間におけるＴＥＷＬの値が、コントロールと比較した場合に明らかに有意差が認められ、ＴＥＷＬ回復率を促進させる効果を有することを意味し、Ａｎｄｒｅｗらの方法（Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，８６；５９８，１９８６）に従って、４％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液をしみ込ませたＣｏｔｔｏｎ  ｂａｌｌにより皮膚を処理して判定を行ういわゆる肌荒れ改善防止効果とは異なる。
皮膚厚み測定試験
皮膚バリアー機能回復促進効果は皮膚の厚みの測定に基づき行なうこともできる。皮膚に乾燥刺激を与えると皮膚組織が損傷して皮膚バリアー機能が低下し、その結果表皮細胞の増殖異常により皮膚の厚みが増大する。従って、皮膚のバリアー機能の低下は皮膚の厚みの組織学的観察により測定することができる。かかる組織学的観察は、例えば次のようにして実施してよい。哺乳動物、好ましくはヘアレスマウスを乾燥条件、例えば室温、湿度１０％以下の環境にて前もって飼育し、ＴＥＷＬが所望の程度、例えば２．５〜３．５ｍｇ／ｃｍ２／ｈ程度になるまでアセトンを用いて皮膚のバリアーを破壊する。次に、被験物質をその処置皮膚に滴下し、しかる後に上記環境下にて適当な時間飼育して乾燥刺激を与えた後、処置した部分の皮膚を採取し、そしてその皮膚試料を染色等して顕微鏡観察により表皮の厚みを計測する。
本発明に係る興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストは皮膚バリアー機能を回復促進させることで、乾燥刺激により惹起される表皮増殖異常を有意に抑制し、さらには皮膚の厚みを減少させることさえもできる。
スクリーニング方法
皮膚バリアー機能回復促進物質をスクリーニングする方法は、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストの候補となる物質を選定し、当該物質を哺乳動物の皮膚に塗布して当該皮膚の経皮水分蒸散量を減少させる物質を選定することにより実施できる。冒頭でも述べた通り、興奮性受容体はアゴニストがそれに結合することでＣａ２＋やＮａ＋イオンの細胞内流入を引き起こし、細胞を興奮状態へと誘導するものであり、また抑制性受容体はアゴニストがそれに結合することでＣｌ−イオンの細胞内流入を引き起こし、細胞を興奮状態から抑制状態へと誘導するものである。興奮性受容体のアンタゴニストはアゴニストとは逆の作用、即ち細胞内のＣａ２＋やＮａ＋イオンの減少を引き起こすものであることから、その候補となる物質は細胞内のＣａ２＋やＮａ＋イオンの減少や、Ｃｌ−イオンの増加を評価すること等で選定できる。また、抑制性受容体のアゴニストは細胞内のＣｌ−イオンの増加を引き起こすものであることから、その候補となる物質は細胞内のＣｌ−イオンの増加やＣａ２＋やＮａ＋イオンの減少を評価すること等で選定できる。
細胞内のＣａ２＋やＮａ＋イオン、Ｃｌ−イオンの濃度は慣用の方法で測定することができる。例えば、特願２００１−１８０３６６においては、上皮系細胞表面上のカルシウムイオン濃度を評価することで、受容体のアゴニストをスクリーニングする方法が記載されている。詳しくは、この出願明細書においては、上皮系細胞表面上の刺激受容体であるＶＲ１受容体（バニロイド受容体サブタイプ１）やＰ２Ｘ受容体のアゴニストが細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させることから、被験物質の作用による上皮系細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇を評価することで、上記受容体のアゴニストをスクリーニングする方法が開示されている。また、細胞内のＣｌ−イオンの指標としては例えば所定のキノリン誘導体がよく利用されている。かかるキノリン誘導体はハロゲン化物イオンの存在によるその蛍光の崩壊的消失機能に基づきＣｌ−イオンの指標として利用される。このようなキノリン誘導体にはＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３−スルフォプロピル）キノリニウム・１水和物）、ＭＱＡＥ（Ｎ−エトキシカルボニルメチル−６−メトキシキノリニウムブロミド）、ＤｉＨ−ＭＥＱ（６−メトキシ−Ｎ−エチルキノリニウムアイオダイド）等がある。ＤｉＨ−ＭＥＱはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社よりその酸化形態ＭＥＱ（６−メトキシ−Ｎ−エチルキノリニウム）として入手できる。
従って、例えば、興奮性細胞受容体のアンタゴニストや抑制性細胞受容体のアゴニストの候補となる被験物質の選定は、下記の通りにして、細胞内のカルシウムイオン濃度を評価することで行なうことができる。
１）被験物質による細胞の刺激
まず、表皮細胞、例えば表皮角化細胞を適当な細胞培養培地、例えばＫＧＭ培地で常法に従い培養する。カルシウムイオンの測定を行なう前日に、この培養細胞を９６穴ウェルプレートに適当な細胞濃度（例えば２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ個程度）において播種する。翌日、細胞が剥がれないようにして、上記の培養液を静かにピペットで吸い取る。次に、適当な緩衝液、例えば、ＢＢＳ（Ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及びカルシウム感受性蛍光色素、例えばＦｌｕｏ３−ＡＭ（大日本製薬製）を、上記培養表皮角化細胞に添加し（例えば、ウェル内に５μＭとなるように添加）、適当な条件下でインキュベーション（例えば３７℃で６０分）を行い、この蛍光色素を上記培養表皮角化細胞内への取込みを行なう。色素としては、他にＱｕｉｎ２、Ｑｕｉｎ２−ＡＭ、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３、Ｒｈｏｄ−２等のカルシウム感受性蛍光色素、エクオリン等のカルシウム感受性発光タンパク質、５−ＦＢＡＰＴＡ等の１９Ｆによる核磁気共鳴法に用いる試薬等を使用してよい。取込み終了後、細胞を洗浄し、新鮮な同緩衝液（ＢＢＳ）を加え、放置する（例えば１５分）。その後、緩衝液を上記培養表皮角化細胞から取り除き、同緩衝液に溶解した被験物質を細胞に添加し、細胞を被験物質刺激する。コントロールとして、被験物質の溶解していない同緩衝液を細胞に添加する。
２）細胞内のカルシウムイオン濃度の測定
蛍光測定は、常法に従い、蛍光マイクロプレートリーダーで、色素に応じた励起及び発光波長において、例えば経時的に測定することで行なう。
細胞内のカルシウムイオン濃度は下記の式に従って算出できる。
Ｃａ２＋（ｎＭ）＝（ΔＦ−Ｆｍｉｎ／Ｆｍａｘ−ΔＦ）Ｋｄ
Ｆｍｉｎ：ＥＤＴＡを加え、Ｃａ２＋をブロックしたときの色素の蛍光値（最小蛍光強度）
Ｆｍａｘ：Ｃａ２＋の過剰存在下での色素の蛍光値（界面活性剤により細胞膜を破壊）（最大蛍光強度）
Ｋｄ：色素とＣａ２＋の解離定数（例えば色素がＦｌｕｏ３−ＡＭの場合、３９０ｎＭ）
これにより、細胞内のカルシウムイオン濃度を有意に減少させれば、被験物質は興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストであると期待される。
また、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストの候補となる被験物質の選定は、例えばＤｉＨ−ＭＥＱを利用し、下記の通りにして細胞内の塩素イオン濃度を評価することで行なうこともできる。
１）被験物質による細胞の刺激
被験物質による細胞の刺激は細胞内カルシウム濃度の評価に関して記載した方法と同様にして実施することができる。
２）細胞内の塩素イオン濃度の測定
黄色油のＤｉＨ−ＭＥＱ（６−メトキシ−Ｎ−エチルキノリニウムアイオダイド）を適当な生理緩衝液（例えばＰＢＳ）に溶解して２５〜５０μＭのＤｉＨ−ＭＥＱ充填溶液を調製する。尚、ＤｉＨ−ＭＥＱはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のＭＥＱからＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｊａｎｕａｒｙ  ３１，２００１）ＭＰ０６８８６に記載の通りにして調製することができる。必要ならば、ＤｉＨ−ＭＥＱをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）により濃厚ストック溶液に調製し（２５〜５０ｍＭ）、そのストック溶液を生理緩衝液に希釈してよい。
上記刺激した細胞をＤｉＨ−ＭＥＱ充填溶液と５〜１０分インキュベーションする。
その細胞を生理緩衝液で洗浄し（２回程度）、そして３７℃で１５分インキュベーションしてこの色素を均一に分散させ、次いでＭＥＱの最大励起及び発光波長（例えばそれぞれ約３４４ｎｍ及び約４４０ｎｍ）用のフィルターを用いて蛍光顕微鏡観察する。蛍光の有意な消失が認められたら、細胞内のＣｌ−イオンの増加が引き起こされたことを意味し、被験物質は興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストの候補として期待される。
このようにして選定された興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストの候補となる物質を上述の皮膚バリアー機能回復促進効果試験にかけ、経皮水分蒸散量を減少させる物質又は乾燥刺激を受けた当該皮膚の厚みを減少させるもしくはその増大を抑制する物質を選定することにより、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト及び抑制性細胞受容体のアゴニストをスクリーニングすることができる。
本発明の皮膚バリアー機能回復促進物質、即ち、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト又は抑制性細胞受容体のアゴニストは、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の化粧料、医薬品、医薬部外品に配合されて、好ましくは皮膚外用剤として皮膚に適用することが出来る。その配合量は特に制限がないが、これらの基剤全量に基づき０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度であろう。
実施例
皮膚バリアー機能回復促進効果試験方法
以降の各実験において、皮膚バリアー機能回復促進効果は、ヘアレスマウス（Ｔｙｐｅ  ＨＲ−１，ＨＯＳＨＩＮＯ，Ｊａｐａｎ）の皮膚にテープストリッピングを施すことによって破壊された皮膚バリアー機能がもとの状態へ回復していく過程を経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を指標とし、以下の通り評価した。
１．水分蒸散量測定装置ＭＥＥＣＯ（Ｍｅｅｃｏ社製，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）によりヘアレスマウス背部付近の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定する。この際の値をＴＥＷＬの回復率１００％とする。
２．皮膚のバリアーを、セロファンテープを使用し、ヘアレスマウスの表皮角層を剥がすことにより破壊する。このときＴＥＷＬの値が約８００〜９００となるまでこの作業を繰り返す。角層を剥がした後の測定値から角層を剥がす前の測定値を差し引いた値を、最もダメージの深い状態、即ち回復率０％とする。
３．試験試料を１ｍＭで１００μｌにてプラスチックラップの上に載せ、背部に貼付し、５分後、それを剥がす。
４．０、２、４、６又は０、１、３、６時間経過後、ＭＥＥＣＯによりＴＥＷＬを測定する。角層除去時と同様、各時間の測定値から角層除去前のＴＥＷＬ値を差し引き、回復率をもとめる。
即ち、回復率は下記の式に従い算出する：
2003053466.tif 000003
１）興奮性受容体の検討
実施例１
グルタミン酸受容体と皮膚バリアー機能回復との関係の検討
実験ａ）  Ｄ−、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸は生体内でグルタミン酸受容体に結合して神経興奮作用を発揮させる神経伝達物質であることが知られる。
Ｄ−グルタミン酸（和光純薬（株））、Ｌ−グルタミン酸（和光純薬（株））及びＬ−アスパラギン酸（和光純薬（株））の各水溶液を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮にそれぞれ塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図１に示す。
図１の結果から明らかな通り、Ｄ−グルタミン酸は皮膚のバリアー回復を促進させるのに対し、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸は皮膚のバリアー回復を遅延させた。従って、興奮性受容体であるグルタミン酸受容体が皮膚のバリアー回復に関与していることが示唆された。
実験ｂ）  ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるＭＫ−８０１（Ｔｏｃｒｉｓ社）及びアゴニストであるＮＭＤＡ（Ｔｏｃｒｉｓ社）のそれぞれの水溶液を、上記試験方法に記載の通りにしてそれぞれヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図２に示す。
図２の結果から、アンタゴニストＭＫ−８０１は皮膚のバリアー回復を促進させるが、アゴニストＮＭＤＡはバリアー回復を遅延させることが明らかとなった。
実験ｃ）  次に、ＭＫ−８０１及びＮＭＤＡを混合し、上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図３に示す。
図３の結果から、ＭＫ−８０１及びＮＭＤＡを同時にマウスの表皮に塗布すると、ＮＭＤＡによるバリアー効果の遅延効果がＭＫ−８０１により解消されることも認められた。
実験ｄ）  ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるＤ−ＡＰ５（Ｔｏｃｒｉｓ社）についても、その水溶液を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図４に示す。
図４の結果から、アンタゴニストＤ−ＡＰ５は皮膚のバリアー回復を促進させることが明らかとなった。
以上の結果をまとめると、興奮性細胞受容体であるＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性を抑制することで皮膚のバリアー機能の回復を促進させることができ、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストが皮膚のバリアー機能の回復に有効であることが明らかとなった。
実施例２
皮膚厚み測定試験
前述の通り、皮膚に乾燥刺激を与えると皮膚組織が損傷して皮膚バリアー機能が低下し、その結果表皮増殖異常により皮膚の厚みが増大する。従って、皮膚のバリアー機能回復促進効果を有する興奮性酸受容体のアンタゴニストＭＫ−８０１の皮膚の厚みに対する効果を組織学的観察した。
ヘアレスマウスを温度２２〜２５℃、湿度１０％以下の環境にて前もって飼育した。ＴＥＷＬが２．５〜３．５ｍｇ／ｃｍ２／ｈになるまでアセトンを用いてヘアレスマウス背部皮膚のバリアーを破壊した。次いでＭＫ−８０１、ＮＭＤＡ又はＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）の１ｍＭの水溶液をそれぞれ２００μｌ皮膚に滴下し、しかる後に上記環境下にて４８時間飼育して乾燥刺激を与えた後、処置した部分の皮膚を採取した。４％のパラフォルムアルデヒドで固定後、パラフィン包埋し、４μｍの切片にし、ヘマトキシリン−エオシン染色し、顕微鏡にて表皮の厚みを計測した。ＡＭＰＡはＮＭＤＡと同様イオノトロープグルタミン酸受容体に特異的なリガンドである。コントロールはいずれの溶液も塗布してないものである。その結果を図５に示す。
図５の結果から、コントロールと比べ、ＭＫ−８０１を塗布すると皮膚の厚みが有意に減少することが示され、従って興奮性酸受容体のアンタゴニストＭＫ−８０１は乾燥刺激により惹起される表皮増殖異常を有意に抑制し、皮膚バリアー効果を改善することが実証された。また驚くべきことに、興奮性酸受容体のアゴニストＮＭＤＡを塗布した場合、コントロールと比べ皮膚の厚みが有意に増大し、従って乾燥刺激により惹起される表皮増殖異常を有意に促進し、皮膚の状態を悪化させることが明らかとなった。更に驚くべきことに、ＡＭＰＡはＮＭＤＡと同様イオノトロープグルタミン酸受容体に特異的なリガンドであるにもかかわらず、コントロールと比べ皮膚の厚みを有意に増大することがなく、ＮＭＤＡとは異なる挙動を示すことが示された。
実施例３
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニスト及びアンタゴニストの細胞内のカルシウムイオン濃度に対する影響
次に、興奮性細胞受容体であるＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストＮＭＤＡ及びアンタゴニストＭＫ−８０１が細胞内カルシウム濃度に対しどのような影響を及ぼすかを検討した。
細胞及びその培養
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を新生児包皮由来の低温保存した一次継代細胞（クラボウ社）から獲得した。この細胞をコラーゲン被覆カバーガラスに載せ、ウシ下垂体エキス（０．４容量％）、ヒト組換え表皮成長因子（０．１ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びアンフォテリシン−Ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）入りのＨｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ社）から成る無血清表皮角化細胞培養培地の中で培養した。
単独の表皮角化細胞のＣａ２＋イメージング
単独の細胞内の［Ｃａ２＋］の変化を、ｆｕｒａ−２法（Ｇｒｙｎｋｉｃｗｉｃｚ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．（１９８５）Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，３４４０−３４５０）を若干改良した方法（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＡＴＰ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２２，５１−５８）により測定した。簡単には、まず、カバーガラス上で培養した細胞の培養培地を以下の組成のＢＳＳ緩衝液と交換した：（全てｍＭ表示）ＮａＣｌ  １５０；ＫＣｌ  ５；ＣａＣｌ２  １．８；ＭｇＣｌ２  １．２；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２５；Ｄ−グルコース１０（ｐＨ７．４）。この細胞を５μＭの色素ｆｕｒａ−２  アセトキシメチルエステル（ｆｕｒａ−２ＡＭ）（モレキュラープローブス社）と室温（２０〜２２℃）において、ＢＳＳの中で４５分間インキュベーションすることにより、ｆｕｒａ−２を細胞に装填した。次に細胞をＢＳＳ緩衝液で洗い、更に１５分間インキュベーションして装填した色素の脱エステル化を図った。
次に、ＢＳＳ緩衝液を上記細胞から取り除き、同緩衝液に溶解した被験物質（ＮＭＤＡ又はＭＫ−８０１＋ＮＭＤＡ：それぞれ１ｍＭ）を細胞に添加し、細胞を約３０分、被験物質刺激した。
このカバーガラスを７５Ｗのキセノンランプ並びに３４０及び３６０ｎＭのバンドパスフィルターを備えた倒立蛍光顕微鏡（ＴＭＤ−３００；ニコン社）に載せ、測定を室温で行なった。イメージデーターを高感度シリコン・インテンシファイアー・ターゲットカメラ（Ｃ−２７４１−０８；浜松ホトニクス（株））を用いて記録し、Ｃａ２＋分析システム（フルサワラボラトリースアプライアンス社）を用いて分析した。その結果を図６に示す。
図６の結果から、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストＮＭＤＡは細胞内Ｃａ２＋濃度を有意に増大させる効果を発揮することが示された。また、ＮＭＤＡのそのような効果をアンタゴニストであるＭＫ−８０１が相殺し、ＭＫ−８０１が細胞内Ｃａ２＋濃度を有意に低下させることも示唆された。従って、細胞内Ｃａ２＋濃度の増減の測定を介し、被験物質が興奮性受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのいずれであるかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定できることが実証された。
実施例４
イオンチャネル型ＡＴＰ受容体と皮膚バリアー機能回復との関係の検討
実験ａ）  皮膚においてイオンチャネル型ＡＴＰ受容体Ｐ２Ｘ３の存在が証明されている。従って、表皮においてもこれらの受容体が興奮を誘導している可能性があると考えられる。
Ｐ２Ｘ３のアゴニストであるＡＴＰ（和光純薬（株））の水溶液を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図７に示す。
図７の結果から、ＡＴＰは皮膚バリアー回復を遅延させることが明らかとなった。従って、興奮性細胞受容体であるイオンチャネル型ＡＴＰ受容体Ｐ２Ｘ３の活性を抑制することで皮膚のバリアー機能の回復を促進させることができ、その結果ＡＴＰ受容体のアンタゴニストも皮膚のバリアー機能の回復に有効であると考えられる。
実験ｂ）  次に、ＡＴＰ受容体のアンタゴニストであるＰＰＡＤＳ（シグマ社）、ＴＮＰ−ＡＴＰ（モレキュラープローブ社）及びスラミン（シグマ社）の各水溶液をそれぞれ上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図８に示す。尚、ＰＰＡＤＳ及びＴＮＰ−ＡＴＰはＰ２Ｘ３型受容体に対して特異性を示すが、スラミンはＰ２Ｘ３型受容体に対する特異性を示さないＡＴＰ受容体アンタゴニストである。
図８に示す結果から、ＰＰＡＤＳ、ＴＮＰ−ＡＴＰ及びスラミンの全てが皮膚のバリアー機能を回復させ、ＡＴＰ受容体アンタゴニストが皮膚バリアー機能の回復に有効であることが実証された。また、Ｐ２Ｘ３型受容体に対して特異性なＰＰＡＤＳ及びＴＮＰ−ＡＴＰと特異性を示さないスラミンとの間でバリアー回復率において有意差がないことから、ＡＴＰ受容体アンタゴニストは、Ｐ２Ｘ３型受容体に対する特異性に関係なく、皮膚バリアー機能回復に有効であることが示された。
実施例５
熱受容体ＶＲ−１と皮膚バリアー機能回復との関係の検討
上述の通り、熱受容体であるＶＲ−１は上皮細胞表面上において発現されることが知られている。従って、表皮においてもこれらの受容体が興奮を誘導しているか検討した。
ＶＲ−１のアゴニストであるカプサイシン（Ｔｏｃｒｉｓ社）水溶液（１ｍＭ）、アンタゴニストであるカプサゼピン（Ｔｏｃｒｉｓ社）水溶液（１ｍＭ）及びカプサイシンとカプサゼピンとの混合水溶液（各々１ｍＭ）を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図９に示す。
図９の結果から、カプサイシン（ＣＰＣ）は皮膚バリアー回復を遅延させるが、アンタゴニストであるカプサゼピン（ＣＰＺ）は皮膚のバリアー機能の回復を促進させた。また、カプサゼピンにカプサイシンを組合わせると（ＣＰＣ＋ＣＰＺ）、カプサゼピンに基づくの皮膚のバリアー機能回復効果は低下した。従って、熱受容体であるＶＲ−１のアンタゴニストが皮膚バリアー機能回復に有効であることが示された。
実施例６
アドレナリンβ受容体と皮膚バリアー機能回復との関係の検討
次に、アドレナリンβ受容体と皮膚バリアー機能回復との関係についても検討した。
アドレナリンβ１受容体のアゴニストであるキサモテロール半フマル酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ社）水溶液（１ｍＭ）、アンタゴニストである塩酸ベータキソロール半水和物（Ｔｏｃｒｉｓ社）水溶液（１ｍＭ）及びキサモテロール半フマル酸塩と塩酸ベータキソロール半水和物との混合水溶液（各々１ｍＭ）を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。
また、アドレナリンβ２受容体のアゴニストである塩酸プロカテロール（Ｔｏｃｒｉｓ社）水溶液（１ｍＭ）、アンタゴニストであるＩＣＩ−１１８，５５１（Ｔｏｃｒｉｓ社）水溶液（１ｍＭ）及び塩酸プロカテロールとＩＣＩ−１１８，５５１との混合水溶液（各々１ｍＭ）を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。
その結果を図１０に示す。
図１０の結果からアドレナリンβ２受容体に関し、アゴニストである塩酸プロカテロール（β２Ｇ）は皮膚バリアー回復を遅延させるが、アンタゴニストであるＩＣＩ−１１８，５５１（β２Ｎ）は皮膚のバリアー機能の回復を促進させた。また、塩酸プロカテロールにＩＣＩ−１１８，５５１を組合わせると（β２Ｇ＋Ｎ）、ＩＣＩ−１１８，５５１に基づく皮膚のバリアー機能回復効果は低下した。従って、アドレナリンβ２受容体のアンタゴニストが皮膚バリアー機能回復に有効であることが示された。一方、アドレナリンβ１受容体に関しては、そのアゴニスト（β１Ｇ）及びアンタゴニスト（β１Ｎ）は共に皮膚バリアー機能回復に対し顕著な効果を示さなかった。
抑制性受容体の検討
実施例７
ＧＡＢＡ受容体と皮膚バリアー機能回復との関係の検討
ＧＡＢＡ受容体は抑制性神経細胞受容体であり、Ｃｌ−チャネル内蔵・ビククリン感受性型（Ａ型−ＧＡＢＡ）、Ｇタンパク質連関型（Ｂ型−ＧＡＢＡ）及びＣｌ−チャネル内蔵・ビククリン非感受性型（Ｃ型−ＧＡＢＡ）が存在する。
実験ａ）  Ｃｌ−チャネル内蔵・ビククリン感受性型受容体のアゴニストであるＧＡＢＡ（和光純薬（株））、ムシモール（ＭＵＳ）（Ｔｏｃｒｉｓ社）、イソグバシン（Ｔｏｃｒｉｓ社）、及びそのアンタゴニストであるビククリンメトブロミド（ＢＭ）（ＩＣＮ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ社）の各水溶液を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮にそれぞれ塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。また、ＧＡＢＡとビククリンメトブロミドを混合し、上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図１１及び１２に示す。
図１１及び１２の結果から、アゴニストであるＧＡＢＡ、ムシモール（ＭＵＳ）、イソグバシン（ＩＧ）は皮膚のバリアー回復を促進させるが、アンタゴニストであるビククリンメトブロミド（ＢＭ）はバリアー機能の回復を促進させることはないことが明らかとなった。
実験ｂ）  また、ＧＡＢＡとビククリンメトブロミドとを同時にマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図１２に示す。
図１２の結果から、ＧＡＢＡのバリアー機能回復促進効果がビククリンメトブロミドにより阻害されることも認められた。
以上をまとめると、抑制性細胞受容体であるＣｌ−チャネル内蔵型ビククリン感受性受容体を活性化することで皮膚のバリアー機能の回復を促進させることができ、その結果Ｃｌ−チャネル内蔵型ビククリン感受性受容体のアゴニストが皮膚のバリアー機能の回復に有効であることが明らかとなった。
実施例８
皮膚厚み測定試験
実施例２と同様にして抑制性受容体のアゴニストＧＡＢＡについて皮膚厚み測定試験を行なった。即ち、皮膚のバリアー機能回復促進効果を有するＧＡＢＡの皮膚の厚みに対する効果を組織学的観察した。
ヘアレスマウスを温度２２〜２５℃、湿度１０％以下の環境にて前もって飼育した。ＴＥＷＬが２．５〜３．５ｍｇ／ｃｍ２／ｈになるまでアセトンを用いてヘアレスマウス背部皮膚のバリアーを破壊した。次いでＧＡＢＡの１ｍＭの水溶液、ＧＡＢＡとＢＭとの混合水溶液（それぞれ１ｍＭ）、又は水をそれぞれ２００μｌ皮膚に滴下し、しかる後に上記環境下にて４８時間飼育して乾燥刺激を与えた後、処置した部分の皮膚を採取した。４％のパラフォルムアルデヒドで固定後、パラフィン包埋し、４μｍの切片にし、ヘマトキシリン−エオシン染色し、顕微鏡にて表皮の厚みを計測した。コントロールはいずれの溶液も塗布してないものである。その結果を図１４に示す。
図１４の結果から、水を塗布した場合、皮膚の厚みが有意に増大し、乾燥刺激により惹起される表皮増殖異常が有意に促進され、ＧＡＢＡを塗布するとそのような皮膚の厚みの増大が生ぜず、乾燥刺激により惹起される表皮増殖異常を有意に抑制できることが示された。そして、ＧＡＢＡにＢＭを混合すると皮膚の厚みは水を塗布した場合と同程度にまで増大し、ＧＡＢＡによる表皮増殖異常抑制効果がＢＭにより解消されてしまうことも明らかとなった。
実施例９
ＧＡＢＡ受容体のアゴニスト及びアンタゴニストの細胞内の塩素イオン濃度に対する影響
次に、抑制性細胞受容体であるＧＡＢＡ受容体のアゴニスト（ＧＡＢＡ）及びアンタゴニスト（ＢＭ）が細胞内塩素濃度に対しどのような影響を及ぼすかを検討した。
実施例３と同様にして正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を無血清表皮角化細胞培養培地の中で培養し、そのＣｌ−イメージングを行なった。
Ｃｌ−イメージングは、簡単には、ＤｉＨ−ＭＥＱ（モレキュラープローブ社）をＰＢＳに溶解して２５〜５０μＭのＤｉＨ−ＭＥＱ充填溶液を調製した。尚、ＤｉＨ−ＭＥＱはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のＭＥＱからＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｊａｎｕａｒｙ  ３１，２００１）ＭＰ０６８８６に記載の通りにして調製した。必要ならば、ＤｉＨ−ＭＥＱをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）により濃厚ストック溶液に調製し（２５〜５０ｍＭ）、そのストック溶液を生理緩衝液に希釈してよい。
被験物質による細胞刺激は、細胞をＤｉＨ−ＭＥＱ充填溶液と５分間インキュベーションし、続いてＧＡＢＡ又はＧＡＢＡ＋ＢＭ（それぞれ１ｍＭの水溶液）を細胞に添加し、約５分インキュベーションした。
その細胞を生理緩衝液で洗浄し（２回程度）、そして３７℃で１５分インキュベーションしてこの色素を均一に分散させた。次いでＭＥＱの最大励起及び発光波長（それぞれ３４４ｎｍ及び４４０ｎｍ）用のフィルターを用いて蛍光顕微鏡観察した。その結果を図１４に示す。
図１４の結果から、ＧＡＢＡ受容体のアゴニストＧＡＢＡは細胞内Ｃｌ−濃度を有意に上昇させる効果を発揮し、そしてＧＡＢＡのそのような効果をアンタゴニストであるＢＭが相殺することが示された。従って、細胞内Ｃｌ−濃度の増減の測定を介し、被験物質が抑制性受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのいずれであるかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定できることが実証された。
実施例１０
グリシン受容体と皮膚バリアー機能回復との関係の検討
表皮細胞に存在することの認められているグリシン受容体のアゴニストであるグリシン（和光純薬（株））を、上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図１５示す。
図１５の結果から、アゴニストであるグリシンは皮膚のバリアー回復を促進させることが認められた。従って、抑制性細胞受容体であるグリシン受容体を活性化することで皮膚のバリアー機能の回復を促進させることができ、その結果グリシン受容体のアゴニストも皮膚のバリアー機能の回復に有効であることが明らかとなった。
実施例１１
本実施例は、各種イオンの細胞内流入と皮膚バリアー機能回復との関係を実証する。
Ｃｌ−イオノフォア（クロライドイオノフォア  １）（Ｆｌｕｋａ，スイス国）又はＣａ２＋イオノフォア（イオノマイシン）（和光純薬工業（株））を上記試験方法に記載の通りにしてヘアレスマウスの表皮に塗布し、ＴＥＷＬ試験を行った。その結果を図１６に示す。
Ｃｌ−イオノフォアは細胞内への塩素イオンの流入を促進する化合物である。図１６の結果から明らかなとおり、Ｃｌ−イオノフォアで処理したマウスの皮膚のおいては、コントロール（水）のみを塗布した場合と比べ有意に皮膚バリアー機能が回復した。従って、細胞内への塩素イオンの流入が皮膚バリアーの機能を回復させることが明らかとなり、細胞内Ｃｌ−濃度の増減の測定を介し、皮膚バリアー機能回復促進物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングできることが確認された。
それに対し、細胞内へのカルシウムイオンの流入を促進するＣａ２＋イオノフォアで処理したマウスの皮膚では、コントロール（水）のみを塗布した場合と比べ有意に皮膚バリアー機能が低下した。従って、細胞内へのカルシウムイオンの流入が皮膚バリアーの機能を低下させることが明らかとなった。
更に、イオンの細胞内流入と皮膚バリアー機能回復との関係を組織学的観察により確認した。
詳しくは、実施例８と同様にヘアレスマウスを温度２２〜２５℃、湿度１０％以下の環境にて前もって飼育し、ＴＥＷＬが２．５〜３．５ｍｇ／ｃｍ２／ｈになるまでアセトンを用いてヘアレスマウス背部皮膚のバリアーを破壊し、次いでＣｌ−イオノフォアの１μＭの水溶液又はＣａ２＋イオノフォアの１μＭの水溶液をそれぞれ２００μｌ皮膚に滴下し、しかる後に上記環境下にて４８時間飼育して乾燥刺激を与えた後、処置した部分の皮膚を採取した。４％のパラフォルムアルデヒドで固定後、パラフィン包埋し、４μｍの切片にし、ヘマトキシリン−エオシン染色し、顕微鏡にて表皮の厚みを計測した。コントロールはいずれの溶液も塗布してないものである。その結果を図１７に示す。
図１７（Ａ）はアセトン処理のみをしたコントロールの結果（倍率×７，５００）、（Ｂ）はＣｌ−イオノフォア処理を施した結果（倍率×７，５００）、（Ｄ）は（Ｂ）の拡大図（倍率×７５，０００）、（Ｃ）はＣａ２＋イオノフォア処理を施した結果（倍率×７，５００）、（Ｅ）は（Ｃ）の拡大図（倍率×７５，０００）を示す。
哺乳類において生体から水分が失われるのを防いでいるのが角質層である。角質層は常に更新され、健康な皮膚ではこれらの構造は間断なく形成され続けている。顆粒層において脂質を含むラメラ顆粒が造られ、細胞の角化に伴いラメラ顆粒の内部の脂質はエキソサイトーシスによって細胞外に放出され、細胞間隙で脂質の層状構造を形成する（傳田光洋著、「皮膚」第４１巻、第５号、第５１８−５２３頁、１９９９年１０月）。脂質層は皮膚バリアー機能を担う角質層の主要構成成分であり、その厚みがあるほどバリアー機能は高まる。
Ｃｌ−イオノフォア処理を施した場合（Ｂ）、コントロール（Ａ）と比べ、脂質層（（Ｂ）において△で示す）が有意に肥厚化しているのが観察された。従って、細胞内への塩素イオンの流入により皮膚バリアー機能が回復することが組織学的観察によっても明らかにされた。また、コントロールでは、脂質含有ラメラ顆粒のエキソサイトーシス（（Ａ）において矢印で示す）が多数認められた。Ｃａ２＋イオノフォア処理の結果を示す（Ｃ）を参照すると、脂質層（（Ｃ）において矢印で示す）が薄くなっているのが観察され、細胞内へのカルシウムイオンの流入により皮膚バリアーの機能が低下することが明らかとなった。特に、Ｃｌ−イオノフォア処理の結果の拡大図を示す（Ｄ）とＣａ２＋イオノフォア処理の結果の拡大図を示す（Ｅ）を比較すると、脂質層の厚みの差が顕著にわかる（（Ｄ）において脂質層を＊で示し、（Ｅ）においては矢印で示す）。また、（Ｃ）においては脂質含有ラメラ顆粒の多数の存在が認められた（（Ｃ）において△で示す）。
図１８は図１７中の（Ａ）アセトン処理のみをしたコントロール、（Ｂ）Ｃｌ−イオノフォア処理、（Ｃ）Ｃａ２＋イオノフォア処理の組織学的観察写真において認められる脂質部分の面積を定量比較した結果である。Ｃｌ−イオノフォア処理をした場合、脂質部分の面積がコントロールに比べ有意に増大し、またＣａ２＋イオノフォア処理をした場合、脂質部分の面積がコントロールに比べ有意に減少することが定量的に明らかとされた。
従って、組織学的観察によっても細胞内塩素イオン濃度の上昇が脂質層の増大、ひいては皮膚バリアー機能の回復をもたらし、反対に細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が皮膚バリアー機能を低下させることが明確に示された。よって、細胞内の各種イオン濃度の測定を介し、皮膚バリアー機能の有効な物質のスクリーニングが可能であることが組織学的観察によっても裏づけされたこととなる。
産業上の利用の可能性
以上の結果から、興奮性細胞受容体のアンタゴニスト及び抑制性細胞受容体のアゴニストは皮膚バリアー機能の回復促進に有効であることが明らかにされた。本願発明に従うと、新規且つ有効な皮膚バリアー機能回復促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸と皮膚のバリアー機能回復との関係を示すグラフである。
図２は、興奮性受容体のアンタゴニストＭＫ−８０１及びアゴニストＮＭＤＡと皮膚バリアー機能回復との関係を示すグラフである。
図３は、ＭＫ−８０１とＮＭＤＡを同時に皮膚に塗布した場合の皮膚バリアー機能回復を示すグラフである。
図４は、興奮性受容体のアンタゴニストＤ−ＡＰ５と皮膚バリアー機能回復との関係を示すグラフである。
図５は、興奮性受容体のアンタゴニストＭＫ−８０１及びアゴニストＮＭＤＡと乾燥刺激を与えた皮膚の厚みとの関係を示すグラフである。
図６は、興奮性受容体のアンタゴニストＭＫ−８０１及びアゴニストＮＭＤＡと細胞内Ｃａ２＋濃度との関係を示すグラフである。
図７は、興奮性受容体であるイオンチャネル型ＡＴＰ受容体Ｐ２Ｘ３と皮膚バリアー回復との関係を示すグラフである。
図８は、興奮性受容体であるイオンチャネル型ＡＴＰ受容体のアンタゴニストであるスラミン、ＰＰＡＤＳ、ＴＮＰ−ＡＴＰを皮膚に塗布した場合の皮膚バリアー機能回復を示すグラフである。
図９は、興奮性受容体ＶＲ−１のアンタゴニストであるカプサゼピン及びアゴニストであるカプサイシンと皮膚バリアー機能回復との関係を示すグラフである。
図１０は、興奮性受容体であるアドレナリンβ１及びβ２受容体各々のアンタゴニスト及びアゴニストと皮膚バリアー機能回復との関係を示すグラフである。
図１１は、抑制性受容体であるＡ型−ＧＡＢＡ受容体と皮膚バリアー機能回復との関係を示すグラフである。
図１２は、抑制性受容体のアゴニストであるＧＡＢＡとアンタゴニストであるビククリンメトブロミドを同時に皮膚に塗布した場合の皮膚バリアー機能回復を示すグラフである。
図１３は、抑制性受容体のアゴニストＧＡＢＡ及びアンタゴニストＢＭと乾燥刺激を与えた皮膚の厚みとの関係を示すグラフである。
図１４は、抑制性受容体のアゴニストＧＡＢＡ及びアンタゴニストＢＭと細胞内Ｃｌ−濃度との関係を示すグラフである。
図１５は、抑制性受容体である興奮性受容体であるグリシン受容体と皮膚バリアー回復との関係を示すグラフである。
図１６は、塩素イオン又はカルシウムイオンの細胞内流入と皮膚バリアー機能回復との関係を示すグラフである。
図１７は、塩素イオン又はカルシウムイオンの細胞内流入と皮膚バリアー機能回復との関係を示す組織学的観察写真である。（Ａ）はアセトン処理のみをしたコントロールの結果（倍率×７，５００）、（Ｂ）はＣｌ−イオノフォア処理を施した結果（倍率×７，５００）、（Ｄ）は（Ｂ）の拡大図（倍率×７５，０００）、（Ｃ）はＣａ２＋イオノフォア処理を施した結果（倍率×７，５００）、（Ｅ）は（Ｃ）の拡大図（倍率×７５，０００）
図１８は、図１７中の（Ａ）アセトン処理のみをしたコントロール、（Ｂ）Ｃｌ−イオノフォア処理、（Ｃ）Ｃａ２＋イオノフォア処理の組織学的観察写真において認められる脂質部分の面積の定量比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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