(57)【要約】ＨＬＡ・Ａ２拘束性に細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導する腫瘍抗原をコードする遺伝子を、ヒト・グリオーマ細胞株ＫＮＳ６０のｃＤＮＡライブラリーから単離・同定した。また、得られた遺伝子にコードされる腫瘍抗原に基づいて、該腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを見い出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチド。
【請求項４】
細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第３項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するポリペプチド。
【請求項６】
細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドからなる医薬。
【請求項８】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する癌ワクチン。
【請求項９】
脳腫瘍の治療に用いる請求の範囲第８項に記載の癌ワクチン。
【請求項１０】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項１１】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１２】
下記工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法：
ｉ）  配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞とを培養する工程
または
ｉｉ）  配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞で発現させる工程、
および
ｉｉｉ）  前記工程ｉ）または前記工程ｉｉ）で得られた細胞を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。
【請求項１３】
多発性硬化症の防止および／または治療に用いる請求の範囲第７項に記載の医薬。
【請求項１４】
配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号１９から配列番号２３のいずれか１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号１９から配列番号２３のいずれか１に記載の塩基配列であって、該塩基配列にコードされるポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するものである塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１７】
細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第１１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求の範囲第１４項から第１７項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項２０】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第１９項に記載の組換えベクター。
【請求項２１】
請求の範囲第１９項または第２０項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項２２】
請求の範囲第１項、第３項若しくは第４項に記載のペプチドまたは請求の範囲第２項、第５項若しくは第６項に記載のポリペプチドの製造方法であって、請求の範囲第２０項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む方法。
【請求項２３】
請求の範囲第１項、第３項若しくは第４項に記載のペプチド、および／または、請求の範囲第２項、第５項若しくは第６項に記載のポリペプチドを、免疫学的に認識する抗体。
【請求項２４】
請求の範囲第４項に記載のペプチド若しくは請求の範囲第６項に記載のポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子と相互作用して、少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物の、同定方法であって、請求の範囲第４項に記載のペプチド、請求の範囲第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第１９項若しくは第２０項に記載の組換えベクター、請求の範囲第２１項に記載の形質転換体、または請求の範囲第２３項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求の範囲第２４項に記載の方法で同定された化合物。
【請求項２６】
請求の範囲第４項に記載のペプチドまたは請求の範囲第６項に記載のポリペプチドの少なくとも１つに対するＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物。
【請求項２７】
請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物。
【請求項２８】
請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第１９項または第２０項に記載の組換えベクター、請求の範囲第２１項に記載の形質転換体、請求の範囲第２３項に記載の抗体、および請求の範囲第２５項から第２７項のいずれか１項に記載の化合物のうちの少なくとも１つを有効量含有してなる癌治療に用いる医薬組成物。
【請求項２９】
請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第１９項または第２０項に記載の組換えベクター、請求の範囲第２１項に記載の形質転換体、請求の範囲第２３項に記載の抗体、および請求の範囲第２５項から第２７項のいずれか１項に記載の化合物のうちの少なくとも１つを有効量含有してなる多発性硬化症の防止および／または治療に用いる医薬組成物。
【請求項３０】
請求の範囲第１項、第３項若しくは第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項若しくは第６項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、定量的および／または定性的に測定する方法。
【請求項３１】
癌疾患検査に用いる請求の範囲第３０項に記載の方法。
【請求項３２】
請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、および請求の範囲第２３項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【請求項３３】
請求の範囲第２４項、第３０項、または第３１項に記載の方法に用いる試薬キットであって、請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、および請求の範囲第２３項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腫瘍抗原に関し、さらに詳しくは腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドまたはポリペプチド、該ペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチドまたは該ポリペプチドに対する抗体、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用する化合物、該ペプチドおよび／または該ポリペプチドからなる医薬、該ペプチドおよび／または該ポリペプチドからなる多発性硬化症の防止剤および／または治療剤、該ペプチドおよび／または該ポリペプチドを含有する癌ワクチンまたは細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、これらの１種以上を含む医薬組成物、該ペプチドまたは該ポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用する化合物の同定方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの測定方法、並びに該同定方法または該測定方法に使用する試薬キットに関する。
背景技術
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞性免疫に係る細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）が重要な役割を果たしている。例えば、癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている（非特許文献１）。このような腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子、いわゆる腫瘍抗原は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８個乃至１１個のアミノ酸からなるペプチド、いわゆる腫瘍抗原ペプチドになり、主要組織適合性抗原（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略称する。）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；以下、ＨＬＡと略称する。）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はこのＨＬＡ分子と腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識し、可溶性因子等、例えばインターフェロン−γ等のサイトカインを放出し、さらには腫瘍細胞を溶解する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示す。
ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドと共に認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ等に分類され、ヒトでは有核細胞がそれぞれ異なった量のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃを有している。また、その遺伝子は多型性に富むことが報告されている。例えば、ＨＬＡ−ＡにはＡ１、Ａ２、Ａ２４およびＡ２６等の、ＨＬＡ−ＢにはＢ８、Ｂ２７およびＢ４６等の、ＨＬＡ−ＣにはＣｗ３やＣｗ６等の多型が存在する。そのため、それぞれの個体が有するＨＬＡの型は必ずしも同一ではない。ＨＬＡ−Ａ亜領域の多型の１つであるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカ白人の約４９％、南アメリカ白人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％でみられる。
細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するとき、ＨＬＡの型をも認識する。また、ＨＬＡ分子と結合する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列には、ＨＬＡの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られている。ＨＬＡの型によって結合するペプチドが異なるため、腫瘍抗原ペプチドを用いて抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化するためには、各型のＨＬＡに結合するペプチドを選択する必要がある。
近年、腫瘍拒絶抗原遺伝子およびＴ細胞抗原受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等の特異免疫に関与する分子が、種々の癌、例えばメラノーマや食道癌等で同定されてきており、進行癌または転移性癌においてペプチドによる特異的免疫療法が検討されている（非特許文献２、３、４、５、６および７）。
現在欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法が開発されつつあり、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２を静脈内投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（非特許文献８）。
このように腫瘍抗原は、癌ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
しかしながら、癌の多様性を考えると、一種類の腫瘍抗原からなる癌ワクチンを用いて全ての癌を治療することは不可能である。癌細胞の種類や組織の違いにより、発現している腫瘍抗原の種類や発現量が異なる。実際、複数ペプチドを用いた免疫療法（ｍｕｌｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）が、癌治療において有効であることが報告されている（非特許文献９、１０および１１）。
さらに、ＨＬＡ遺伝子の多型により各個体において機能する腫瘍抗原ペプチドの種類が異なることから、各ＨＬＡ拘束性に抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化する腫瘍抗原ペプチドを同定することは、癌治療において高い効果を得るために重要である。
勿論、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を活性化せしめる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、ＨＬＡ拘束性および癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。
以下に、本背景技術の説明に引用した文献を列記する。
非特許文献１：「アチーブス  オブ  サージェリー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）」，１９９０年，第１２６巻，ｐ．２００−２０５。
非特許文献２：「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９１年，第２５４巻，ｐ．１６４３−１６４７。
非特許文献３：「ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９６年，第１８３巻，ｐ．１１８５−１１９２。
非特許文献４：「ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，１９９９年，第１６３巻，ｐ．４９９４−５００４。
非特許文献５：「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９９５年，第９２巻，ｐ．４３２−４３６。
非特許文献６：「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９５年，第２６９巻，ｐ．１２８１−１２８４。
非特許文献７：「ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９７年，第１８６巻，ｐ．７８５−７９３。
非特許文献８：「ネイチャー  メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９８年，第４巻，ｐ．３２１−３２７。
非特許文献９：「クリニカル  キャンサー  リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２００１年，第７巻，ｐ．３９５０−３９６２。
非特許文献１０：「ジャーナル  オブ  クリニカル  オンコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」，２００１年，第１９巻，ｐ．３８３６−３８４７。
非特許文献１１：「ネイチャー  メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９８年，第４巻，ｐ．３２８−３３２。
発明の開示
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
また、本発明の一態様は、配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドである。
さらにまた、本発明の一態様は、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである前記ペプチドである。
またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するポリペプチドである。
本発明の一態様は、また、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである前記ポリペプチドである。
本発明の一態様は、さらに、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドからなる医薬である。
本発明の一態様は、さらにまた、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する癌ワクチンである。
本発明の一態様は、またさらに、脳腫瘍の治療に用いる前記癌ワクチンである。
また、本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤である。
さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、下記工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である：
ｉ）  配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞とを培養する工程
または
ｉｉ）  配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞で発現させる工程、
および
ｉｉｉ）  前記工程ｉ）または前記工程ｉｉ）で得られた細胞を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。
またさらに、本発明の一態様は、多発性硬化症の防止および／または治療に用いる前記医薬である。
本発明の一態様は、また、配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドである。
本発明の一態様は、さらに、配列表の配列番号１９から配列番号２３のいずれか１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の一態様は、さらにまた、配列表の配列番号１９から配列番号２３のいずれか１に記載の塩基配列であって、該塩基配列にコードされるポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するものである塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の一態様は、またさらに、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである前記ポリヌクレオチドである。
また、本発明の一態様は、前記いずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
さらに、本発明の一態様は、前記いずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターである。
さらにまた、本発明の一態様は、組換えベクターが発現組換えベクターである前記組換えベクターである。
またさらに、本発明の一態様は、前記いずれかの組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
本発明の一態様は、また、前記いずれかのペプチドまたは前記いずれかのポリペプチドの製造方法であって、前記いずれかのポリヌクレオチドを含有する発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む方法である。
本発明の一態様は、さらに、前記いずれかのペプチドおよび／または前記いずれかのポリペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
さらにまた、本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子と相互作用して、少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または、前記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物の、同定方法であって、該ペプチド、該ポリペプチド、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記いずれかの組換えベクター、前記形質転換体、または前記抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする方法である。
またさらに、本発明の一態様は、前記方法で同定された化合物である。
本発明の一態様は、また、前記ペプチドまたは前記ポリペプチドの少なくとも１つに対するＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物である。
本発明の一態様は、さらに、前記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物である。
本発明の一態様は、さらにまた、前記いずれかのペプチド、前記いずれかのポリペプチド、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記いずれかの組換えベクター、前記形質転換体、前記抗体、および前記いずれかの化合物のうちの少なくとも１つを有効量含有してなる癌治療に用いる医薬組成物である。
本発明の一態様は、またさらに、前記いずれかのペプチド、前記いずれかのポリペプチド、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記いずれかの組換えベクター、前記形質転換体、前記抗体、および前記いずれかの化合物のうちの少なくとも１つを有効量含有してなる多発性硬化症の防止および／または治療に用いる医薬組成物である。
また、本発明の一態様は、前記いずれかのペプチド、前記いずれかのポリペプチド、または前記いずれかのポリヌクレオチドを、定量的および／または定性的に測定する方法である。
さらに、本発明の一態様は、癌疾患検査に用いる前記測定する方法である。
さらにまた、本発明の一態様は、前記いずれかのペプチド、前記いずれかのポリペプチド、前記いずれかのポリヌクレオチド、および前記抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キットである。
またさらに、本発明の一態様は、前記いずれかの方法に用いる試薬キットであって、前記いずれかのペプチド、前記いずれかのポリペプチド、前記いずれかのポリヌクレオチド、および前記抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００１−３３３２１９号からの優先権を請求するものである。
本発明の理解のために、本明細書において用いる用語についてまず説明する。腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであり、腫瘍細胞が有する蛋白質またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得るアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。
ここで、「認識する（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された腫瘍抗原ペプチドにＴ細胞抗原受容体（以下、ＴＣＲと略称することもある）を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに増強するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された抗原を認識することにより、例えばＩＦＮ−γを産生すること、あるいは細胞傷害性Ｔ細胞が認識した標的細胞（ターゲットともいう）に対し細胞傷害活性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を分化および／または増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。
本明細書においては、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち長鎖ペプチドをポリペプチドという。例えば蛋白質も本明細書においてはポリペプチドに含まれる。また、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを、単にペプチドという。以降、アミノ酸配列を表記する場合、１文字にて表記する場合と３文字にて表記する場合がある。
その他、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料はそれらを引用することにより本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものとして導入される。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
本発明において提供するペプチドは、ヒト脳腫瘍細胞株であるＫＮＳ６０細胞（「ヒューマン  セル（Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ）」，１９９０年，第３巻，ｐ．２５５−２５６）のｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子発現クローニング法を用いて単離・同定したｃＤＮＡがコードするポリペプチドに含まれる部分ペプチドである。該ｃＤＮＡを細胞に導入して発現させると、該細胞は腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。より具体的には、ＨＬＡ−Ａ２を有する細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。
かかるｃＤＮＡがコードするポリペプチドに含まれる上記ペプチドは、その特性の１つとして、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。より具体的には、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、当該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。
上記ｃＤＮＡの単離・同定は、以下のように行なった。まず、ＨＬＡ−Ａ２と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２拘束性且つ腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を既報（非特許文献４）に記載の方法で大腸癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１）の腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ；以下、ＴＩＬと略称する。）から樹立した。以下、この細胞をＯＫ−ＣＴＬと呼称する。ＯＫ−ＣＴＬは、細胞表面マーカーがＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋であり、その抗原認識はＨＬＡ−Ａ遺伝子座拘束性である。すなわち、ＨＬＡ−Ａ２陽性（以下、ＨＬＡ−Ａ２＋と表記する。）細胞を認識するが、ＨＬＡ−Ａ２陰性（以下、ＨＬＡ−Ａ２−と表記する。）細胞を認識しない。ＨＬＡ−Ａ２陽性とは、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の抗原特異性がＡ２であることを意味する。ＨＬＡ−Ａ２陰性とは、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の抗原特異性がＡ２以外のものであることを意味する。
次いで、ＫＮＳ６０腫瘍細胞由来のｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ０２０７ｃＤＮＡとをＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入し、該導入遺伝子が発現された細胞のうち、ＯＫ−ＣＴＬからのインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと略称することもある。）産生を促進するものを選択した。その結果、ＯＫ−ＣＴＬによりＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識される遺伝子産物をコードする５種類のｃＤＮＡクローン（配列番号１９から配列番号２３）を得た。
これらの塩基配列について、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）等の既存のデータベースに対して相同性検索を行ったところ、クローン８Ｂ６（配列番号１９）およびクローン２Ｇ２（配列番号２０）には相同性の高いヒト由来の遺伝子が見出されたが、クローン４Ｇ３（配列番号２１）、クローン７Ｈ９（配列番号２２）およびクローン１Ｂ１０（配列番号２３）の合計３種類の遺伝子については相同性の高いものはなかった（下記の表１を参照。）。クローン８Ｂ６（配列番号１９）またはクローン２Ｇ２（配列番号２０）と相同性の高いヒト由来遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列は開示されているが、これらが腫瘍抗原をコードしているという報告はされておらず、２００１年１１月７日に閲覧したＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）公開データベースにおいても開示されていなかった。
クローン８Ｂ６（配列番号１９）とクローン２Ｇ２（配列番号２０）の塩基配列は平成１３年４月２４日付け、クローン４Ｇ３（配列番号２１）、クローン７Ｈ９（配列番号２２）およびクローン１Ｂ１０（配列番号２３）の塩基配列は平成１３年７月６日付けで、国立遺伝子研究所・日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録したが、２００１年１０月３０日の時点において公開はしていない。
本発明において得られた遺伝子はＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ；以下、ＣＴＬと略称することもある。）により認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子である。これら遺伝子は、それぞれ配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードしている（表１参照。）。これら遺伝子は、上記のように細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬに認識され、該ＣＴＬを活性化できる。
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配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列から
なるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに適合するペプチドとして上記遺伝子または該遺伝子と相同性を有する遺伝子がコードするアミノ酸配列に基づいて設計して合成したペプチドから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬにより認識されるペプチドを選択して得た。ＨＬＡ−Ａ２分子に結合可能な腫瘍抗原ペプチドには、そのアミノ酸配列にモチーフ（規則的配列）があることが知られている。そこで、まずＨＬＡ−Ａ２結合モチーフをインターネットホームページ＜ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／＞を用いて検索し、上記遺伝子がコードするアミノ酸配列、並びに上記遺伝子と高い相同性を有する遺伝子の遺伝子産物のアミノ酸配列について該モチーフに適合するアミノ酸配列を特定した。その結果に基づいて、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するそれぞれ異なる９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計して合成した。合成した各ペプチドをパルスしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）とＯＫ−ＣＴＬとを共に培養し、該ＯＫ−ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを測定した。合成したペプチドのうち１３種類のペプチド（配列番号１から配列番号１３）が、用量依存的にＯＫ−ＣＴＬにより認識され、該ＯＫ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した。また、これらのペプチドは、癌患者から得た末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ；以下、ＰＢＭＣと略称することもある。）から、ＣＴＬを誘導した。誘導されたＣＴＬは、標的細胞すなわち対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）および／またはＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を認識して、ＩＦＮ−γを産生し且つ該標的細胞を溶解した。かくして、本発明において、ＣＴＬを誘導および／または活性化できる１３種類の腫瘍抗原ペプチドを得た。
さらに、これら１３種類のペプチドのうち、配列表の配列番号１から配列番号６に記載のペプチドそれぞれを多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（以下、ＭＳと略称することもある）の患者または健常人から得たＰＢＭＣと共に培養したところ、該ＰＢＭＣは、対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）を認識してＩＦＮ−γの産生を促進したが、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を認識しなかった。この刺激されたＰＢＭＣによる、ペプチドをパルスしたＴ２細胞の認識が抗ＣＤ４抗体により抑制されたこと、また、該刺激されたＰＢＭＣから抗ＣＤ４抗体を用いて精製したＣＤ４＋細胞が対応する各ペプチドを認識したことから、健常人あるいは多発性硬化症患者の末梢血単核細胞において上記ペプチドの刺激により誘導された各ペプチドを認識し得る細胞は、ＣＤ８＋ＣＴＬではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞であると考えられる。一般的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドとの複合体を認識して各種サイトカイン、例えばＩＦＮ−γを産生すると考えられている。しかし、最近ＣＤ４＋細胞がクラスＩ拘束性に抗原認識する例も報告されており（「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９９年，第５９巻，ｐ．６２３０−６２３８）、上記誘導されたＣＤ４＋細胞はクラスＩ拘束性に抗原認識するものである可能性がある。
多発性硬化症は中枢神経系の代表的な脱髄疾患であり、その病態および経過は、臨床学的および病態学的に、複雑で多様性を示す（マーチンアール（Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ．）ら，「ネイチャー  イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，２００１年，第２巻，ｐ．７８５−７８８）。また、その発症機序は複雑であり未だ解明されていないが、脳細胞に存在する種々の蛋白質やペプチドを抗原として認識する脳炎惹起性Ｔ細胞（Ｔヘルパー１に属するＣＤ４＋細胞）が関与する自己免疫疾患であると言われている（マツモト  ワイ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．）ら，「クリニカル  イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，１９９７年，第２９巻，ｐ．１２０７−１２１２；山村  隆，「脳と神経」，２００１年，第５３巻，ｐ．７０７−７１３）。該脳炎惹起性Ｔ細胞が認識する抗原には多様性があり、例えばミエリン塩基性蛋白質（Ｍｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＢＰ）、プロテオリピッド蛋白質（Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；（ＰＬＰ）、ミエリン結合糖蛋白質（Ｍｙｅｌｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＡＧ）、グリア細胞繊維性酸性蛋白質（Ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＡＰ）およびＳ−１００βや、脳炎惹起性の明らかなミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（Ｍｙｅｌｉｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＯＧ）が抗原である可能性が示唆されている。
本発明に係るペプチドは、これらペプチドおよび該ペプチドが由来したポリペプチドをコードするｃＤＮＡが脳腫瘍由来であること、およびこれらのペプチドで刺激されたＭＳ患者由来のＰＢＭＣが、対応する各ペプチドを認識してＩＦＮ−γ産生を促進したことから、ＭＳに関与していると考えられる。また本発明において、これらペプチドを認識するイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）がＭＳ患者の血液中に存在していることが判明したことから、これらのペプチドを認識するＩｇＥによるマスト細胞の刺激がＭＳの病態形成に係わっている可能性等も考えられる。
現在行われている多発性硬化症の治療法としては、その再発および進行の免疫調節機構を介した抑制を目的とするインターフェロン−βの投与療法、および抗炎症作用およびリンパ球細胞死誘導を介した治療を目的としたステロイド・パルス療法等が知られている。さらに、ＭＳの再発および進行の抑制を目的として、脳炎惹起性Ｔ細胞が認識するペプチドや該ペプチドの一部を他のアミノ酸で置換したアナログペプチドを用いて、該Ｔ細胞が認識する抗原に対する免疫寛容を誘導する方法が、ＭＳおよびＭＳの動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＥＡＥ）において検討されている（ヤマムラ  ティー（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｔ．），「クリニカル  イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，１９９７年，第２９巻，ｐ．１２１３−１２１８；ガウアー  エイ（Ｇａｕｒ，Ａ．），「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９２年，第２５８巻，ｐ．１４９１−１４９４）。免疫寛容とは、特定の抗原に対する免疫応答性が欠如している状態になっていることをいう。すなわち、ＭＳにおいて免疫寛容が誘導されれば、自己抗原に対する免疫応答が亢進した結果引き起こされる自己免疫疾患の１つであるＭＳの進行の抑制、寛解および再発の防止等が期待できる。このような免疫寛容の誘導に、本発明に係るペプチドを使用できる。すなわち、ＭＳの防止および／または治療を目的として本発明に係るペプチドを利用できると考えられる。
かくして、本発明においては、ＫＮＳ６０腫瘍細胞から得られた上記遺伝子がコードするポリペプチドを提供する。好ましくは配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原特異的ＣＴＬに認識されるので、該ＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原として使用できる。さらに、これらポリペプチドは、腫瘍抗原エピトープを特定して腫瘍抗原ペプチドを得るための材料として使用できる。
本発明に係るペプチドは、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、例えばＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに適合するものを設計し、該設計されたペプチドからＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬに認識されるものを選択することにより得られる。該ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２と結合して抗原提示細胞表面上に提示され、かつＣＴＬにより認識される腫瘍抗原エピトープとしての性質を有するものであればよく、少なくとも５個以上、好ましくは７個以上、より好ましくは９個乃至１０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。さらに好ましくは、配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。これらのペプチドはＨＬＡ−Ａ２拘束性に抗原特異的なＣＴＬにより認識されるので、ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原特異的ＣＴＬを誘導および／または活性化するために使用できる。
上記ポリペプチドまたは上記ペプチドは、ＣＴＬを誘導および／または活性化するために、単独で使用してもよいし、２つ以上を組み合わせて使用してもよい。ＣＴＬは種々の抗原を認識する複数の細胞集団であることから、好ましくはこれらを２つ以上組み合わせて用いることが推奨される。
また、このように特定されたポリペプチドまたはペプチドに、１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。好ましくは、このような変異を導入したポリペプチドまたはペプチドであって、ＣＴＬにより、例えば少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬにより認識されるポリペプチドまたはペプチドである。変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９８３年，第２１９巻，ｐ．６６６−）を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１から１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列番号１４から１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをそれぞれコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドである。より好ましくは、配列表の配列番号１９から配列番号２３のいずれか１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。さらに、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列中で腫瘍抗原エピトープをコードする領域に対応する少なくとも１５個以上、好ましくは２１個乃至３０個以上の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。本発明において、相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを相補鎖と称することもある。この有用なポリヌクレオチドの選択および塩基配列の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して、発現させたポリペプチドまたはペプチドがＣＴＬにより認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導するかどうかを試験することにより可能である。
さらに、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。ポリヌクレオチド分子としてＤＮＡ分子を代表例にとると、「ＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子」は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク等に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ（終濃度１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ２を有する細胞で発現させたときに、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原特異的なＣＴＬにより認識されることおよび／または該ＣＴＬを誘導することができる。また、該ポリヌクレオチドはその３′末端にポリ（Ａ）構造を持つが、ポリ（Ａ）の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではなく、したがって該ポリヌクレオチドの有するポリ（Ａ）の数は特に限定されるものではない。
上記ポリヌクレオチドは、いずれも本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬や標準品としても利用できる。
上記ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換えベクターが得られる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列およびエンハンサー等とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製する。前記ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択し、これを用いてＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターを得ることができる。
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターＤＮＡを、自体公知の宿主に自体公知の方法で導入することにより形質転換体が得られる。宿主としては、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞または動物細胞等が例示できる。遺伝子の導入を行う場合、より好ましい系としては遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、サムブルック等編，「モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル」，第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９８９年等に記載されている標準的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。
上記形質転換体に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件で培養される。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの作用、例えば少なくともＣＴＬを誘導および／または活性化する作用あるいは宿主中または宿主外に産生された該ポリペプチドまたはペプチド量を指標にして行ってもよいし、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、上記ベクターまたは形質転換体を利用して上記のように遺伝子工学的技術で製造可能である。また、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、「ペプチド合成」，１９７５年，丸善株式会社や「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，１９９６年，インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載の方法が例示できるが、無論既知の方法が広く利用可能である。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの精製および回収は、その性質や生理活性、例えば少なくとも該ペプチドがＣＴＬにより認識されることおよび／またはＣＴＬを誘導することを指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィー等を組み合わせるか、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段によって精製回収できる。より好ましくは、回収しようとするポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法を使用する。
抗体は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチド、あるいはそれらの断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドに特異的な抗体を作製するためには、該ポリペプチドまたは該ペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも該ポリペプチドまたは該ペプチドのアミノ酸配列と相同である必要はなく、該ポリペプチドまたは該ペプチドの立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に該ポリペプチドおよび／または該ペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。
抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを、アジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等が例示される。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせが例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギおよびウマ等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られた、上記ポリペプチドおよび／または上記ペプチドを認識し結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ポリペプチドまたは該ペプチドの精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。
上記ポリペプチドまたは上記ペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数を組み合わせることにより、ＣＴＬによる該ポリペプチドまたは該ペプチドの認識を増強し得る物質の同定に有効な手段を提供する。本発明に係る同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、腫瘍抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞または腫瘍抗原を発現させた抗原提示細胞を用いてＣＴＬを刺激し、該ＣＴＬによる腫瘍抗原ペプチド若しくは腫瘍抗原の認識および／または該ＣＴＬの活性化を測定する実験系を構築し、被検物質を試験することにより、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドのＣＴＬによる認識を増強する物質を選別できる。抗原提示細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２を保持する細胞、例えばＨＬＡ−Ａ２を保持する細胞株、より具体的にはＴ２細胞等が例示できる。あるいは、ＨＬＡ−Ａ２を保有しない細胞であっても、ＨＬＡ−Ａ２  ｃＤＮＡを遺伝子導入して細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２分子を発現させた細胞を用いることもできる。抗原提示細胞への腫瘍抗原のパルスは、抗原提示細胞と腫瘍抗原とを常法により共に培養することにより実施可能である。腫瘍抗原は、それをコードするポリヌクレオチドを、抗原提示細胞に一般的な遺伝子工学的手法で導入することにより、該細胞で発現させることができる。ＣＴＬとしては、例えばＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ株またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ系、例えば、ＯＫ−ＣＴＬ等を用いる。該ＣＴＬによる腫瘍抗原ペプチド若しくは腫瘍抗原の認識および／または該ＣＴＬの活性化は、簡便には該ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量を指標にして測定できる。この実験系は同定方法の１つを説明するものであり、本発明に係る同定方法はこれに限定されない。
本発明は、上記同定方法によって得られた化合物も対象とする。該化合物は、本発明に係るポリペプチド若しくはペプチド、例えば配列表の配列番号１から１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくは配列表の配列番号１４から１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用してＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる該ポリペプチド若しくは該ペプチドの認識を増強する化合物であり得る。また、本発明に係るポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物等も本発明の範囲に包含される。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。
本発明において提供されるポリペプチドまたはペプチドは、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドとして、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に抗原特異的なＣＴＬを誘導および／または活性化するために使用できる。すなわち、上記ポリペプチドから選ばれた１種以上のポリペプチドおよび／または上記ペプチドから選ばれた１種以上のペプチドからなる医薬、上記ポリペプチドから選ばれた１種以上のポリペプチドおよび／または上記ペプチドから選ばれた１種以上のペプチドを使用することを特徴とするＣＴＬの誘導方法、並びに上記ポリペプチドから選ばれた１種以上のポリペプチドおよび／または上記ペプチドから選ばれた１種以上のペプチドを含有するＣＴＬの誘導剤も、本発明の範囲に包含される。上記ＣＴＬの誘導方法は、その一態様として、本発明に係るペプチドを抗原提示細胞にパルスする工程、または本発明に係るポリペプチドを抗原提示細胞に発現させる工程、およびこれら工程のいずれかで得られた抗原提示細胞を用いてＣＴＬの前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程を含む。抗原提示細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２を保持する細胞、例えばＨＬＡ−Ａ２を保持する細胞株、より具体的にはＴ２細胞等が例示できる。あるいは、ＨＬＡ−Ａ２を保有しない細胞であっても、ＨＬＡ−Ａ２  ｃＤＮＡを遺伝子導入して細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２分子を発現させた細胞を用いることもできる。抗原提示細胞へのペプチドのパルスは、抗原提示細胞と腫瘍抗原とを常法により共に培養することにより実施可能である。ポリペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドを、抗原提示細胞に一般的な遺伝子工学的手法で導入することにより、該細胞で発現させることができる。ＣＴＬの前駆細胞を含む細胞集団は、例えば末梢血細胞、より好ましくは末梢血単核細胞である。
また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき作製した組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換させた細胞、該ポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、該ポリペプチド若しくは該ペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用してＣＴＬによる該ポリペプチド若しくは該ペプチドの認識を増強する化合物、または該ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物を、単独または複数組み合わせて利用することにより、これらのうち少なくとも１つを有効量含有する医薬組成物を提供できる。例えば、該医薬組成物は癌の治療、例えば脳腫瘍の治療において有用である。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカ白人の約４９％、南アメリカ白人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％においてみられることから、本発明に係る医薬組成物は、多数の患者においてその効果を期待できる。
具体的には、例えば上記ポリペプチドから選ばれた１種以上のポリペプチドおよび／または上記ペプチドから選ばれた１種以上のペプチドからなる医薬、さらに上記ポリペプチドから選ばれた１種以上のポリペプチドおよび／または上記ペプチドから選ばれた１種以上のペプチドを有効量含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用できる。ここでいう癌ワクチンとは、腫瘍細胞に対する特異的免疫応答を誘導および／または増強することにより、腫瘍細胞を選択的に傷害し得る薬物を意味する。その投与量は、ＣＴＬによる該ポリペプチドまたは該ペプチドの認識の程度により適宜変更を加えて決定できるが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ乃至１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ乃至１０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。投与方法は、公知の医療用ペプチドの投与方法に準じて行なえばよく、好適には皮下投与、静脈内投与または筋肉内投与にて行われる。投与に際して、免疫応答を誘導および／または増強するために、本発明に係るポリペプチドおよび／またはペプチドは適当なアジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して用いてもよい。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸およびアルブミン等が例示される。アジュバントは、通常のペプチドワクチン接種に用いられるものであればよく、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）および鉱物油等が例示される。また、剤形は、ペプチドを製剤化する自体公知の手段を応用して適宜選択できる。
あるいは、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを用いて、患者の末梢血から採取した単核細胞画分においてＣＴＬを誘導および／または活性化した後、当該画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。培養条件、例えば単核細胞濃度、ポリペプチドまたはペプチドの濃度、または培養時間等は、簡単な繰り返し実験により決定できる。培養時にインターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
癌ワクチンとして本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを使用する場合、１種類のポリペプチドまたは１種類のペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数種類の上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを組み合わせて使用することもできる。複数ペプチドに基づく免疫療法が有効であると報告されていること（非特許文献９、１０および１１）、および癌患者のＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、１種類のポリペプチドまたは１種類のペプチドを癌ワクチンとして使用するより、複数種類を組み合わせて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られるときがある。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、好ましくはペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、癌の、例えば脳腫瘍の遺伝子治療のために有用である。これらポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入する方法またはヒトから細胞を採取した後に体外で導入する方法があるが、いずれも利用できる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。これらウイルスは複製欠陥性のものを用いる。投与量は、ＣＴＬによる該ポリペプチドまたは該ペプチドの認識の程度により適宜変更を加えて決定できるが、一般的には本発明に係るポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ含量として０．１μｇ乃至１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ乃至５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。
また、本発明に係るポリペプチドおよびペプチドは脳腫瘍由来ｃＤＮＡライブラリーから同定されたものであること、これらのペプチド、例えば配列表の配列番号１から配列番号６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドで刺激された多発性硬化症（ＭＳ）患者由来のＰＢＭＣが、対応する各ペプチドを認識してＩＦＮ−γ産生を促進したこと、並びにＭＳ患者血清中にこれらのペプチドを認識するＩｇＥが検出されたことから、ＭＳの病態形成に、これらポリペプチドおよびペプチドが関与している可能性がある。したがって、これらポリペプチドまたはペプチド、好ましくはペプチドを使用することにより、ＭＳの防止および／または治療が可能である。
例えば、本発明に係るペプチドを使用し、ＭＳ患者において免疫寛容を誘導することにより、ＭＳの進行の抑制、寛解および再発の防止等が可能である。このような免疫寛容の誘導に使用するペプチドの投与量、投与時期、投与方法および投与時の性状等は、自己免疫疾患に対する抗原ペプチド療法で一般的に適用されている処方に準じて、病態の重篤度等により適宜変更を加えて決定することができる。一般的に、ペプチドによる免疫寛容の誘導には多量投与が必要であり、例えば０．０１ｍｇ乃至１００ｍｇ／日／ヒトが例示される。投与方法は、公知の医療用ペプチドの投与方法に準じて行なえばよく、好適には皮下投与、静脈内投与、鼻腔内投与または筋肉内投与にて行われる。投与に際しては、ペプチドを単独で用いてもよく、適当な公知のアジュバントと共に用いてもよい。免疫寛容の誘導において、単一のペプチドを使用してもよく、また複数のペプチドを組み合わせて使用してもよい。また、ペプチドに１個乃至数個のアミノ酸置換を導入したアナログペプチド、アシル化したペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合させたペプチド等を使用して、免疫寛容の誘導効果を高めることもできる。
また、本発明に係るポリペプチド、例えば配列表の配列番号１４または配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドも、ＭＳの防止および／または治療に使用可能である。さらにまた、本発明に係るペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖をベクターに担持させ、該ペプチドまたは該ポリペプチドを細胞や生体内で発現させることによって、ＭＳの防止および／または治療が可能である。また、上記医薬組成物を、ＭＳの防止および／または治療に使用することができる。
上記ポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチド若しくは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、並びに該ポリペプチドまたは該ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んであってもよい。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体等それぞれに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。
これら試薬および試薬キットは、上記本発明に係るスクリーニング方法に使用できる。また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、またはこれらのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの定量的および／または定性的な測定に使用できる。当該測定をするための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。利用できる方法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ等が例示できる。また、核酸は、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルでの検出および定量が可能である。
上記試薬、試薬キット、および測定方法は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの発現または活性に関連した疾患の検出方法に利用できる。当該疾患としては、例えば癌疾患等、より好ましくは癌がＨＬＡ−Ａ２陽性の癌である癌疾患、さらに好ましくは脳腫瘍が例示できる。
測定される試料として、個体由来の細胞、例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等を例示できる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。また、正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出できる。また、増幅ＤＮＡを、標識した上記ポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。
すなわち、個体由来の試料について、例えば当該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとの相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在を検出すること、その存在量を決定することおよび／またはその変異を同定すること、当該ポリペプチドまたはペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および／または当該ポリペプチドまたはペプチドの存在を検出すること、その存在量を決定することまたはその変異を検出することによって、上記疾患の検出が可能である。
さらに、本発明に係るポリペプチド若しくはペプチドまたはこれらをコードしている核酸を診断マーカーとして定性的にあるいは定量的に測定することにより、上記疾患の検査および診断が可能である。すなわち、上記検出方法を利用して、さらに上記疾患の検査方法または診断方法が実施可能である。
実施例
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの樹立）
ＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞株は、大腸癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１、ＨＬＡ−Ｂ４６／５１、ＨＬＡ−Ｃｗ１）の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から、文献に記載の方法に準じて樹立した（「インターナショナル  ジャーナル  オブ  キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」，１９９９年，第８１巻，ｐ．４５９−４６６；非特許文献４）。まず、大腸癌患者から得たＴＩＬを１００Ｕ／ｍｌの組換えヒト・インターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して５０日以上長期培養した。培養７日毎にこれらＩＬ−２活性化ＴＩＬの一部を採取し、種々の腫瘍細胞または正常細胞と共に培養して、ＩＦＮ−γ産生の測定、および該腫瘍細胞からの５１Ｃｒ遊離試験により、そのＣＴＬ活性を検定した（非特許文献４）。ＩＦＮ−γの測定は、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）で行った。培養５８日目に、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害活性を示すサブラインの１つＯＫ−ＣＴＬが得られた。ＯＫ−ＣＴＬは、その８０％がＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋の表現型を持ち、残りの２０％がＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−の表現型であった。
ＯＫ−ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋Ｐａｎｃ−１膵臓腺癌細胞、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋ＳＷ６２０結腸腺癌細胞、ＨＬＡ−Ａ０２０６＋ＫＥ３食道扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞、ＨＬＡ−Ａ０２０７＋ＣＡ９−２２口部ＳＣＣ細胞、ＨＬＡ−Ａ２＋Ｕ２５１アストロサイトーマ細胞およびＨＬＡ−Ａ２＋ＫＮＳ６０グリオーマ細胞を認識してＩＦＮ−γを産生し、かつ十分な細胞傷害活性を示した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換自己Ｂ細胞（以下、ＥＢ−ＢＣと略称することもある。）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化自己Ｔ細胞（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＰＨＡ−ｂｌａｓｔｏｉｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ；以下、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔと略称することもある。）に対しては細胞傷害活性を示さなかった。また、ＯＫ−ＣＴＬは試験した全てのＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１＋のＲ２７乳腺癌細胞、ＨＡＫ−２原発性肝細胞癌細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−５メラノーマ細胞およびＳＦ１２６星状細胞腫細胞、ＨＬＡ−Ａ０２０６＋ＰＣ９肺腺癌細胞、並びにＨＬＡ−Ａ０２０７＋の１−８７肺腺癌細胞およびＯＭＣ−４頚部ＳＣＣ細胞）を溶解した。ＯＫ−ＣＴＬによるこれらの細胞の認識およびその結果としてのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ８ｍＡｂまたは抗ＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂによって阻害されたが、他のｍＡｂによっては阻害されなかった。このことから、ＯＫ−ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示すことが明らかになった。
実施例２
（腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの単離・同定）
ヒト脳腫瘍由来グリオーマ細胞ＫＮＳ６０のｃＤＮＡライブラリーから、実施例１で得たＯＫ−ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子を、既知の方法（「ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９８年，第１８７巻，ｐ．２７７−２８８）に準拠して単離・同定した。まず、ＫＮＳ６０腫瘍細胞（財団法人・発酵研究所にＩＦＯ５０３５７として寄託されている。）のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを常法に従って調製した。得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに転換してＳａｌＩアダプターにライゲーションし、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。また、ＨＬＡ−Ａ０２０７、ＨＬＡ−Ａ２４０２、およびＨＬＡ−Ａ２６０１の各ｃＤＮＡを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）によって増幅し、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にそれぞれクローン化した。
ＫＮＳ６０腫瘍細胞から得た上記ｃＤＮＡクローンは１００クローンずつプールし、９６ウエルＵ底型プレートの各ウエルにプールしたｃＤＮＡ１００ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ０２０７ｃＤＮＡ、ＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡ、またはＨＬＡ−Ａ２６０１ｃＤＮＡの１００ｎｇとを、１００μｌのリポフェクトアミン／オプチ−メム（ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１：２００混液中で３０分間混合した。この混合物の５０μｌをＣＯＳ−７細胞（１×１０４）に加え、９６ウエルＵ底型プレート中で６時間インキュベーションして共遺伝子導入した。次いで１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて２日間培養し、ＯＫ−ＣＴＬ（２×１０５）を各ウエルに添加した。さらに１８時間インキュベーションした後、上清の１００μｌを採り、産生されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定し、ｃＤＮＡライブラリーのプールをスクリーニングした。このとき、ネガティブコントロールとして遺伝子を導入していないＣＯＳ−７細胞を標的細胞としてＯＫ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を検討し、産生されたＩＦＮ−γの値をバックグランドとして各測定値から減算した。
その結果、ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した上記ＫＮＳ６０腫瘍細胞ｃＤＮＡライブラリーのプールについて再現性を確認し、次いで当該再現性が確認されたｃＤＮＡプールから個別にクローンを取り出し、上記同様にスクリーニングを行って、ＣＴＬに認識される独立プール由来のクローンを選別した。さらに、得られたクローンの用量依存性を上記同様の方法で確認し、最終的に５種類のクローンを得た。これら５種類のｃＤＮＡクローンは、それぞれＨＬＡ−Ａ０２０７  ｃＤＮＡと共にＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入したときに、用量依存的にＯＫ−ＣＴＬにより認識されて、ＯＫ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した。しかし、これらのｃＤＮＡクローンをＨＬＡ−Ａ２４０２  ｃＤＮＡまたはＨＬＡ−Ａ２６０１  ｃＤＮＡと共に共遺伝子導入したときには、ＯＫ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生の促進は観察されなかった。このことから、これら５種類のｃＤＮＡクローンがＨＬＡ−Ａ２拘束性にＯＫ−ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原をコードしていることが明らかになった。代表例としてクローン８Ｂ６およびクローン２Ｇ２についての結果をそれぞれ第１図および第２図に示した。他のクローンについても同様の結果が得られた。
上記５種類のｃＤＮＡクローン、すなわちクローン８Ｂ６、クローン２Ｇ２、クローン４Ｇ３、クローン７Ｈ９およびクローン１Ｂ１０の塩基配列の決定は、ＤＮＡシーケンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ登録商標３７７ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、ダイデオキシヌクレオチドシーケンシング法で行った（配列番号１９から配列番号２３）。さらに、各ｃＤＮＡクローンがコードするアミノ酸配列を塩基配列から推定した（配列番号１４から配列番号１８）。また、得られた各クローンの塩基配列について、ＧｅｎＢａｎｋに対して相同性検索を行った。これらの結果は上記表１に示した。
実施例３
（ペプチドの調製およびＣＴＬ活性化試験）
実施例２で単離・同定した腫瘍抗原をコードする遺伝子から腫瘍抗原ペプチドを得た。まずＨＬＡ−Ａ２分子に結合し得るモチーフの検索を、当該各遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子がコードするアミノ酸配列についてコンピューターを用いて行った＜ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍ  ａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／＞。その結果に基づいて、それぞれ異なる９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計して自体公知の方法で合成し、７０％以上の純度を有するペプチドを得た。
上記合成した各ペプチド（０．００１μＭ〜３０μＭまたは０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）を、ＨＬＡ−Ａ２分子がペプチドと結合しない形で細胞表面に発現しているＴ２細胞（「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９４年，第５４巻，ｐ．１０７１−１０７６）と、５％ＣＯ２−９５％エア（Ａｉｒ）の条件下で３７℃にて２時間インキュベーションし、細胞表面上に発現しているＨＬＡ−Ａ２分子に当該各ペプチドを結合させた。このように各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を標的細胞（Ｔ）として用いた。また、実施例１で得たＯＫ−ＣＴＬをエフェクター細胞（Ｅ）として用いた。標的細胞１×１０４とエフェクター細胞１×１０５とを混合し（Ｅ／Ｔ比＝１０）、１８時間インキュベーションした。インキュベーション後の上清１００μｌを回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γを測定した。ペプチドをパルスしていないＴ２細胞に対するＣＴＬのＩＦＮ−γ産生量をバックグランドとして、各測定値から減算した。
その結果、１３種類のペプチドが、それぞれ用量依存的にＯＫ−ＣＴＬにより認識され、ＯＫ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した。これらペプチドは、クローン８Ｂ６由来のＰ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）；クローン２Ｇ２由来のＰ１０４（配列番号４）、Ｐ１０５（配列番号５）およびＰ１０６（配列番号６）；クローン４Ｇ３由来のＰ１（配列番号７）、Ｐ２（配列番号８）およびＰ３（配列番号９）；クローン７Ｈ９由来のＰ６（配列番号１０）；並びにクローン１Ｂ１０由来のＰ１４（配列番号１１）、Ｐ１８（配列番号１２）およびＰ１９（配列番号１３）である。クローン８Ｂ６由来の３種類のペプチドおよびクローン２Ｇ２由来の３種類のペプチドについての結果をそれぞれ第３図および第４図に、クローン４Ｇ３、クローン７Ｈ９およびクローン１Ｂ１０由来の７種類のペプチドについての結果を第５図に示した。第５図中、ＣＴＬにより認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導するペプチドと判定したものは実線で示した。また、ネガティブコントロールとして使用したヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＩＶと略称する。）由来のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２分子と結合し得るペプチドであるが、ＣＴＬにより認識されず、ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進しなかった。
実施例４
（ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬの誘導）
実施例３で得た１３種類のペプチドのうち、クローン８Ｂ６由来の３つのペプチド、Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）、並びにクローン２Ｇ２由来の３つのペプチド、Ｐ１０４（配列番号４）、Ｐ１０５（配列番号５）およびＰ１０６（配列番号６）について、ＨＬＡ−Ａ２＋脳腫瘍患者または健常人から得たＰＢＭＣからのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ誘導能を試験した。
転移性脳腫瘍患者（以下、患者例１と称する。）および髄膜腫患者（以下、患者例２と称する。）または２人の健常人の血液から、ＰＢＭＣを常法により調製した。それぞれのＰＢＭＣ  １×１０５を、培養培地〔４５％ＲＰＭＩ−１６４０培地、４５％ＡＩＭ−Ｖ登録商標培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、０．１ｍＭのＭＥＭノンエッセンシャルアミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）からなる。〕２００μｌを加えた９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエル中で、ペプチド各１０μＭとインキュベーションした。培養４日目および７日目に半量の培地を除き、対応する各ペプチドを含む上記組成の培地と交換した。
培養１０日目に細胞を回収し、洗浄してエフェクター細胞として用い、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を標的細胞として用いて、実施例３と同様の方法で両細胞を混合して培養し、産生されるＩＦＮ−γ量を測定した。このとき、エフェクター細胞を誘導するのに用いたペプチドとＴ２細胞にパルスしたペプチドとが同じものになるようにエフェクター細胞と標的細胞とを組み合わせた。患者例１および患者例２についての結果をそれぞれ第６図Ａおよび第６図Ｂに示す。患者例１において、Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０３（配列番号３）、およびＰ１０６（配列番号６）の３つのペプチドはＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進した。また、患者例２においては、特にＰ１０４（配列番号４）がＩＦＮ−γ産生を促進した。すなわち、これらのペプチドは、脳腫瘍患者のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導した。しかし、いずれのペプチドも健常人のＰＢＭＣからはＣＴＬを誘導しなかった。一方、ポジティブコントロールとして使用したインフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ；以下、ｆｌｕと略称することもある。）由来のＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するペプチドは、患者例１のＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を有意差をもって促進したが、患者例２のＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生の促進には有意差が認められなかった。このように、ＯＫ−ＣＴＬを活性化し得るペプチドであっても、上記条件で培養したときに脳腫瘍癌患者のＰＢＭＣからＣＴＬを誘導しないものがあること、また同じペプチドであってもＣＴＬを誘導する例と誘導しない例とがあることは、癌患者の末梢血中に存在するＣＴＬ前駆体が種々の抗原を認識し得る複数の細胞集団であることに起因すると考えられる。したがって、ここでＯＫ−ＣＴＬにより認識されそのＩＦＮ−γ産生を促進したが脳腫瘍患者のＰＢＭＣからＣＴＬを誘導し得なかったペプチドであっても、別の患者においてはＣＴＬを誘導できることは充分に考えられる。
また、ペプチドで刺激して１０日間培養した上記細胞をさらに１０日間培養後に、各種標的細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）に対する細胞傷害活性を、標準的な６時間の５１Ｃｒ遊離試験で測定した。測定は、エフェクター細胞／標的細胞（Ｅ／Ｔ）の比率を変えて行ない、得られた結果を％特異的溶解（％  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）で表した。標的細胞として、ＫＮＳ６０腫瘍細胞、ＫＡＬＳ−１腫瘍細胞、エプスタイン・バーウイルス形質転換自己Ｂ細胞（ＥＢ−ＢＣ）およびＰＨＡ−ｂｌａｓｔを用いた。
その結果、Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０３（配列番号３）またはＰ１０６（配列番号６）によりＩＦＮ−γ産生が促進された上記患者例１由来のＰＢＭＣは、いずれもＫＮＳ６０腫瘍細胞を特異的に溶解した（それぞれ第７図Ａ、第７図Ｂ、および第７図Ｃ）。また、Ｐ１０４（配列番号４）によりＩＦＮ−γ産生が促進された上記患者例２由来のＰＢＭＣも、ＫＮＳ６０腫瘍細胞を特異的に溶解した（第７図Ｄ）。これらから、上記ペプチドは癌患者のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できることが明らかになった。
実施例５
（ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬの誘導）
実施例３で得た１３種類のペプチドのうち、クローン８Ｂ６由来の３つのペプチド、Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）、並びにクローン２Ｇ２由来の３つのペプチド、Ｐ１０４（配列番号４）、Ｐ１０５（配列番号５）およびＰ１０６（配列番号６）〕について、ＨＬＡ−Ａ２＋脳腫瘍患者から得たＰＢＭＣからのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ誘導能を試験した。
原発性脳腫瘍患者３例と転移性脳腫瘍患者１例の血液から、ＰＢＭＣを常法により調製した。得られたＰＢＭＣを、実施例４と同様に各ペプチドと共にインキュベーションして刺激し、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞またはＫＮＳ６０腫瘍細胞を標的細胞として用いて、実施例３と同様の方法で培養し、産生されるＩＦＮ−γ量を測定した。標的細胞としてペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いたときは、ＰＢＭＣを刺激するのに用いたペプチドとＴ２細胞にパルスしたペプチドとが同じものになるように組み合わせた。
Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）についての代表的な結果を第８図に、Ｐ１０４（配列番号４）Ｐ１０５（配列番号５）およびＰ１０６（配列番号６）についての代表的な結果を第９図に示した。患者例３（第８図Ａ）ではＰ１０１（配列番号１）およびＰ１０３（配列番号３）、患者例４（第８図Ｂ）ではＰ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）、並びに患者例５（第９図）ではＰ１０４（配列番号４）およびＰ１０６（配列番号６）により刺激されたＰＢＭＣが、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞および／またはＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進した。すなわち、これらペプチドは、脳腫瘍患者のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導した。
実施例６
（多発性硬化症患者末梢血単核細胞におけるペプチドの認識）
実施例３で得た１３種類のペプチドのうち、クローン８Ｂ６由来の３つのペプチド、Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）、並びにクローン２Ｇ２由来の３つのペプチド、Ｐ１０４（配列番号４）、Ｐ１０５（配列番号５）およびＰ１０６（配列番号６）〕について、ＨＬＡ−Ａ２をＨＬＡの型として有する多発性硬化症患者および健常人から得たＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導能を、実施例５と同様に試験した。
Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）についての代表的な結果を第１０図に、Ｐ１０４（配列番号４）、Ｐ１０５（配列番号５）およびＰ１０６（配列番号６）についての代表的な結果を第１１図に示した。ＭＳ患者例６（第１０図Ａ）ではＰ１０３（配列番号３）、ＭＳ患者例７（第１０図Ｂ）ではＰ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）、並びにＭＳ患者例８（第１１図）ではＰ１０４（配列番号４）、Ｐ１０５（配列番号５）、およびＰ１０６（配列番号６）により刺激されたＰＢＭＣが、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進した。しかしＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞は認識せず、ＩＦＮ−γ産生は認められなかった。また、該刺激されたＰＢＭＣは、上記腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を示さなかった。健常人から得たＰＢＭＣについても、同様の結果が得られた。
多発性硬化症は、中枢神経系の代表的な脱髄疾患である。その発症機序は未だ解明されていないが、脳細胞に存在する種々の蛋白質やペプチド、例えばＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧ、ＭＡＧまたはＳ−１００β等を抗原として認識する脳炎惹起性Ｔ細胞が関与する自己免疫疾患であると言われている。本実施例で用いたペプチドは脳腫瘍由来の遺伝子にコードされているものであること、また、これらのペプチドで刺激されたＭＳ患者由来のＰＢＭＣが、対応する各ペプチドを認識してＩＦＮ−γ産生を促進したことから、これらペプチドおよび該ペプチドが由来したポリペプチドがＭＳに関与している可能性がある。
実施例７
（多発性硬化症患者末梢血単核細胞からペプチドにより誘導された細胞の解析）
実施例６において、多発性硬化症患者および健常人から得たＰＢＭＣから、Ｐ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）、Ｐ１０３（配列番号３）、Ｐ１０４（配列番号４）、Ｐ１０５（配列番号５）およびＰ１０６（配列番号６）を用いて、これらペプチドを認識し得る細胞を誘導した。次に、これら細胞について解析を試みた。
まず、健常人のＰＢＭＣを用いて、実施例５と同様にＰ１０４（配列番号４）またはＰ１０６（配列番号６）と共に培養して刺激した。ペプチドで刺激したこれらの細胞は、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識して、ＩＦＮ−γを産生した。Ｐ１０４（配列番号４）についての結果を第１２図Ａに、Ｐ１０６（配列番号６）についての結果を第１２図Ｂに示す。この認識は、抗ＣＤ８抗体あるいは抗Ａ２４抗体では阻害されなかったが、抗クラスＩ抗体で弱く、また抗ＣＤ４抗体、抗Ａ２抗体、あるいは抗クラスＩＩ抗体で完全に阻害された。なお、ペプチドのネガティブコントロールとしてＨＩＶ由来のペプチドを使用した。
各ペプチドで刺激された上記細胞から、抗ＣＤ４抗体を用いて一般的に用いられている方法によりＣＤ４＋細胞を精製し、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞と共に培養したところ、ＩＦＮ−γの産生が観察された〔第１３図Ａ：Ｐ１０４（配列番号４）および同図Ｂ：Ｐ１０６（配列番号６）〕。このＩＦＮ−γの産生は、抗クラスＩ抗体または抗クラスＩＩ抗体により完全に阻害された。
これらから、ペプチドの刺激により誘導された上記細胞は、いわゆるＣＤ８＋ＣＴＬではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞であると考えられる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、一般的に、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドとの複合体を認識して各種サイトカイン、例えばＩＦＮ−γを産生すると考えられている。しかし、上記のように抗クラスＩ抗体でＩＦＮ−γの産生が抑制されたこと、また最近ＣＤ４＋細胞がクラスＩ拘束性に抗原認識する例も報告されていることから（「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９９年，第５９巻，ｐ．６２３０−６２３８）、本実施例において誘導されたＣＤ４＋細胞がクラスＩ拘束性に抗原認識するものである可能性がある。すなわち、各ペプチドにより誘導された上記細胞はＣＤ４＋細胞であり、この細胞がＴ２細胞表面に存在するＨＬＡ−Ａ２分子上に提示された各ペプチドを認識してＩＦＮ−γを産生していることが示唆された。また、上記ＩＦＮ−γ産生が抗クラスＩＩ抗体によって阻害されたことから次の推論が導かれる。誘導された上記ＣＤ４＋細胞上にはクラスＩＩ分子が発現しており、一方、Ｔ２細胞上にはＣＤ４分子が発現している。ＣＤ４分子はＭＨＣクラスＩＩ分子のβ２領域に結合し、該結合はＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）／ペプチド／ＭＨＣ複合体を安定化することが知られている（「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９９年，第５９巻，ｐ．６２３０−６２３８）。したがって、このクラスＩＩ分子を介したＴ２細胞とＣＤ４陽性細胞の結合が、Ｔ２細胞上のクラスＩ分子とペプチドとの複合体とＣＤ４＋細胞上のＴＣＲとの結合の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の増強に関与していると推察される。あるいはＣＤ４＋細胞上に発現しているクラスＩＩ分子に、親和性が弱いもののペプチドが結合し、この複合体を近傍のＣＤ４＋細胞が認識している可能性もある。
本実施例は、実施例６に示した結果、すなわちＭＳ患者または健常人由来のＰＢＭＣから上記各ペプチドにより誘導された細胞が、ペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識するが細胞傷害活性を示さなかったことに基づいて実施されたものである。したがって、本実施例においては健常人由来のＰＢＭＣを用いているが、健常人由来のＰＢＭＣを用いて本実施例で明らかになったこれらの事実は、ＭＳ患者由来のＰＢＭＣについても同様であると推察できる。
実施例８
（多発性硬化症患者血清中のペプチド特異的抗体の検出）
多発性硬化症患者、脳腫瘍患者および健常人の血清について、Ｐ１０２（配列番号２）、Ｐ１０３（配列番号３）、Ｐ１０４（配列番号４）またはＰ１０６（配列番号６）を特異的に認識するイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）およびイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の存在を、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
上記各ペプチド（２０μｇ／ウエル）を９６ウエル  ヌンク  コバリンク（Ｎｕｎｃ  Ｃｏｖａｌｉｎｋ）平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｂｅｒａｔｅ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて製品指示書に従って固相化（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）した。このプレートをブロックエース（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ）（雪印社）でブロックして０．０５％のツイーン２０−リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で洗浄し、血清または血漿サンプルを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅで希釈して１００μｌ／ウエルでプレートに加えた。３７℃で２時間インキュベーション後、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄し、それぞれ１：１０００倍希釈したウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ε鎖特異的）、抗ヒトＩｇＧ抗体（γ鎖特異的）（ＤＡＫＯ社）または抗ヒトＩｇＧサブクラス特異的抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と共にさらに３７℃で２時間インキュベーションした。このプレートを９回洗浄し、１：１００倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇ抗体を結合させたホースラディッシュ  パーオキシダーゼ−デキストランポリマー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、ＤＡＫＯ）を１００μｌずつ各ウエルに加えて室温で４０分間インキュベーションした。洗浄後にテトラメチルベンジジン基質溶液（ＫＰＬ社）１００μｌを加え、その後に１Ｍのリン酸を添加することにより反応を停止して、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。このとき、対照として、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＳＡＲＴ２（特開平１１−３１８４５５号公報）またはＳＡＲＴ３（「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９９年，第５９巻，ｐ．４９５６−４０６３）由来のペプチドを用いて同様に測定を行った。また、ＨＩＶ由来のペプチドを用いて得られた非特異的反応により生じるＯＤ値を、上記のＯＤ値から減算した。さらに、各抗体の測定系に、固相化したそれぞれのペプチドに対応する可溶性ペプチドを加えたときには反応が阻害されて吸光度が低下したが、関連性のないペプチドを加えても阻害がみられなかったことから、上記測定されたＩｇＥおよびＩｇＧはそれぞれのペプチドに対する特異抗体であることが明らかになった。
ＭＳ患者、脳腫瘍患者および健常人の血清についての結果をそれぞれ第１４図、第１５図および第１６図に示した。各図において、図ＡはＩｇＥを、図ＢはＩｇＧを示す。第１４図Ａから明らかなように、ＭＳ患者の血清中にＰ１０２（配列番号２）またはＰ１０４（配列番号４）を特異的に認識するＩｇＥが存在することが判明した。しかし、ＩｇＧは検出されなかった。一方、脳腫瘍患者および健常人の血清では、ＩｇＥおよびＩｇＧの両方ともに検出されなかった。
今まで、ＭＳに関して抗体の関与を示唆する文献は報告されていない。これは、ＭＳがヘルパーＴ１細胞優勢の病態であることに起因すると考えられる。一方、このような病態メカニズムの解析に基づいて実施された動物実験の結果は、臨床実験の結果とは全く結びついていない（マーチン  アール（Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ．）ら，「ネイチャー  イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，２００１年，第２巻，ｐ．７８５−７８８）。したがって、ＭＳについては、まだ解明されていないメカニズムが病態に関与している可能性がある。本実施例において、本発明に係るペプチドを認識するＩｇＥがＭＳ患者の血液中に存在していることが判明した。したがって、上記ペプチドを認識するＩｇＥによるマスト細胞の刺激がＭＳの病態形成に係わっている可能性等も考えられる。これらから、上記ペプチドを用いることにより、例えば免疫寛容を誘導する等の方法によって、ＭＳの防止および／または治療が可能であると考えられる。
産業上の利用可能性
ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子を、遺伝子発現クローニング法を用いて、ヒト・グリオーマ細胞株ＫＮＳ６０のｃＤＮＡライブラリーから単離・同定した。さらに得られた遺伝子にコードされる腫瘍抗原に基づいて、該腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドおよびポリペプチドを見出した。
これらペプチドおよびポリペプチドは、脳腫瘍患者由来末梢血単核細胞から、該ペプチドおよびポリペプチドを認識して腫瘍細胞を傷害し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカ白人の約４９％、南アメリカ白人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％においてみられる。したがって、本発明により、癌の、例えば脳腫瘍等の特異的免疫療法が可能になり、癌治療において多大な貢献を期待できる。また、本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞による癌の認識に関する分子の基礎的研究にも多大に寄与するものである。
さらに、本発明に係るペプチドで刺激した多発性硬化症患者由来末梢血単核細胞が、対応する各ペプチドを認識してＩＦＮ−γ産生を促進するが、腫瘍細胞は認識しないこと、該ＩＦＮ−γ産生はＣＤ４陽性細胞によること、および多発性硬化症患者血清中には該ペプチドを認識するＩｇＥが存在することを見出した。本発明に係るペプチドは多発性硬化症に関与する可能性があり、多発性硬化症の解明、並びに防止および／または治療に使用できる。
配列表フリーテキスト
配列表の配列番号１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号１０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号１１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号１２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号１３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される設計されたペプチド。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図中、＊は、両側スチューデントｔ検定により有意差（Ｐ＜０．０５）があると認められたものを示す。
第１図は、ヒト・グリオーマ細胞ＫＮＳ６０由来のｃＤＮＡクローン８Ｂ６が、プラスミド用量依存的かつＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞株ＯＫ−ＣＴＬに認識されて、ＯＫ−ＣＴＬのインターフェロン−γ産生を促進したことを示す。
第２図は、ヒト・グリオーマ細胞ＫＮＳ６０由来のｃＤＮＡクローン２Ｇ２が、プラスミド用量依存的かつＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞株ＯＫ−ＣＴＬに認識されて、ＯＫ−ＣＴＬのインターフェロン−γ産生を促進したことを示す。
第３図Ａ、第３図Ｂおよび第３図Ｃは、クローン８Ｂ６由来のペプチドであるＰ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）およびＰ１０３（配列番号３）が、それぞれペプチド用量依存的にＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞株ＯＫ−ＣＴＬに認識されて、ＯＫ−ＣＴＬのインターフェロン−γ産生を促進したことを示す。
第４図Ａ、第４図Ｂおよび第４図Ｃは、クローン２Ｇ２由来のペプチドであるＰ１０４（配列表の配列番号４）、Ｐ１０５（配列表の配列番号５）およびＰ１０６（配列表の配列番号６）が、それぞれペプチド用量依存的にＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞株ＯＫ−ＣＴＬに認識されて、ＯＫ−ＣＴＬのインターフェロン−γ産生を促進したことを示す。
第５図は、クローン４Ｇ３、クローン７Ｈ９、およびクローン１Ｂ１０由来の７つのペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ６、Ｐ１４、Ｐ１８およびＰ１９）が、それぞれペプチド用量依存的にＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞株ＯＫ−ＣＴＬに認識されて、ＯＫ−ＣＴＬのインターフェロン−γ産生を促進したことを示す。
第６図Ａおよび第６図Ｂは、それぞれ転移性脳腫瘍患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および髄膜腫患者由来のＰＢＭＣを、クローン８Ｂ６由来のペプチドであるＰ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）またはＰ１０３（配列番号３）、またはクローン２Ｇ２由来のペプチドであるＰ１０４（配列表の配列番号４）、Ｐ１０５（配列表の配列番号５）またはＰ１０６（配列表の配列番号６）で刺激したときに、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）を認識し、その結果、該ＰＢＭＣによるインターフェロン−γ産生が促進されたことを示す。
第７図Ａ、第７図Ｂ、第７図Ｃおよび第７図Ｄは、転移性脳腫瘍患者由来の末梢血単核細胞が、それぞれクローン８Ｂ６由来のペプチドＰ１０１（配列表の配列番号１）、クローン８Ｂ６由来のペプチドＰ１０３（配列表の配列番号３）、クローン２Ｇ２由来のペプチドＰ１０６（配列表の配列番号６）およびクローン２Ｇ２由来のペプチドＰ１０４（配列表の配列番号４）で刺激したときに、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞株ＫＮＳ６０を認識して細胞傷害活性を示し、該腫瘍細胞株を溶解したが、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞株ＫＡＬＳ−１および正常細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔおよびＥＢ−ＢＣ）は認識しなかったことを示す。
第８図Ａおよび第８図Ｂは、それぞれ別個の脳腫瘍患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、クローン８Ｂ６由来のペプチドであるＰ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）またはＰ１０３（配列番号３）で刺激したときに、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）および／または腫瘍細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋）を認識し、その結果、該ＰＢＭＣによるインターフェロン−γ産生が促進されたことを示す。図中、ＨＩＶ、ＥＢおよびｆｌｕは、それぞれ免疫不全ウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルス由来のコントロールペプチドを示す。
第９図は、脳腫瘍患者由来末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、クローン２Ｇ２由来のペプチドであるＰ１０４（配列表の配列番号４）、Ｐ１０５（配列表の配列番号５）またはＰ１０６（配列表の配列番号６）で刺激したときに、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）および／または腫瘍細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋）を認識し、その結果、該ＰＢＭＣによるインターフェロン−γ産生が促進されたことを示す。図中、ＨＩＶ、ＥＢおよびｆｌｕは、それぞれ免疫不全ウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルス由来のコントロールペプチドを示す。
第１０図Ａおよび第１０図Ｂは、それぞれ別個の多発性硬化症患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、クローン８Ｂ６由来のペプチドであるＰ１０１（配列番号１）、Ｐ１０２（配列番号２）またはＰ１０３（配列番号３）で刺激したときに、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識し、その結果、該ＰＢＭＣによるインターフェロン−γ産生が促進されたが、該ＰＢＭＣは腫瘍細胞を認識しなかったことを示す。図中、ＨＩＶ、ＥＢおよびｆｌｕは、それぞれ免疫不全ウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルス由来のコントロールペプチドを示す。
第１１図は、多発性硬化症患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、クローン２Ｇ２由来のペプチドであるＰ１０４（配列表の配列番号４）、Ｐ１０５（配列表の配列番号５）またはＰ１０６（配列表の配列番号６）で刺激したときに、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識し、その結果、該ＰＢＭＣによるインターフェロン−γ産生が促進されたが、該ＰＢＭＣは腫瘍細胞を認識しなかったことを示す。図中、ＨＩＶ、ＥＢおよびｆｌｕは、それぞれ免疫不全ウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびインフルエンザウイルス由来のコントロールペプチドを示す。
第１２図Ａおよび第１２図Ｂは、それぞれクローン２Ｇ２由来のペプチドＰ１０４（配列表の配列番号４）およびＰ１０６（配列表の配列番号６）で刺激した健常人由来末梢血単核細胞からの、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識することにより促進されたインターフェロン−γ産生が、抗ＨＬＡ−クラスＩＩ抗体、抗ＣＤ４抗体、または抗ＨＬＡ−Ａ２抗体で抑制されたことを示す図である。
第１３図Ａおよび第１３図Ｂは、それぞれクローン２Ｇ２由来のペプチドＰ１０４（配列表の配列番号４）およびＰ１０６（配列表の配列番号６）で刺激した健常人由来末梢血単核細胞より精製されたＣＤ４陽性細胞からの、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識することにより促進されたインターフェロン−γ産生が、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体または抗ＨＬＡ−クラスＩＩ抗体により抑制されたことを示す図である。
第１４図Ａおよび第１４図Ｂは、多発性硬化症患者の血清について、クローン８Ｂ６由来のペプチドであるＰ１０２（配列番号２）またはＰ１０３（配列番号３）、またはクローン２Ｇ２由来のペプチドであるＰ１０４（配列番号４）またはＰ１０６（配列番号６）に対する特異的ＩｇＥ抗体および特異的ＩｇＧ抗体をそれぞれ定量した結果を示す。
第１５図Ａおよび第１５図Ｂは、脳腫瘍患者の血清について、クローン８Ｂ６由来のペプチドであるＰ１０２（配列番号２）またはＰ１０３（配列番号３）、またはクローン２Ｇ２由来のペプチドであるＰ１０４（配列番号４）またはＰ１０６（配列番号６）に対する特異的ＩｇＥ抗体および特異的ＩｇＧ抗体をそれぞれ定量した結果を示す。
第１６図Ａおよび第１６図Ｂは、健常人の血清について、クローン８Ｂ６由来のペプチドであるＰ１０２（配列番号２）またはＰ１０３（配列番号３）、またはクローン２Ｇ２由来のペプチドであるＰ１０４（配列番号４）またはＰ１０６（配列番号６）に対する特異的ＩｇＥ抗体および特異的ＩｇＧ抗体をそれぞれ定量した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月19日(2003.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチド。
【請求項４】
細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第３項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するポリペプチド。
【請求項６】
細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドからなる医薬。
【請求項８】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する癌ワクチン。
【請求項９】
脳腫瘍の治療に用いる請求の範囲第８項に記載の癌ワクチン。
【請求項１０】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項１１】
配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のポリペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１２】
下記工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法：
ｉ）  配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞とを培養する工程
または
ｉｉ）  配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞で発現させる工程、
および
ｉｉｉ）  前記工程ｉ）または前記工程ｉｉ）で得られた細胞を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。
【請求項１３】
多発性硬化症の防止および／または治療に用いる請求の範囲第７項に記載の医薬。
【請求項１４】
配列表の配列番号１から配列番号１３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列表の配列番号１４から配列番号１８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、またはその相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号１９から配列番号２３のいずれか１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号１９から配列番号２３のいずれか１に記載の塩基配列であって、該塩基配列にコードされるポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するものである塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１７】
細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第１１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求の範囲第１４項から第１７項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項２０】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第１９項に記載の組換えベクター。
【請求項２１】
請求の範囲第１９項または第２０項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項２２】
請求の範囲第１項、第３項若しくは第４項に記載のペプチドまたは請求の範囲第２項、第５項若しくは第６項に記載のポリペプチドの製造方法であって、請求の範囲第２０項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む方法。
【請求項２３】
請求の範囲第１項、第３項若しくは第４項に記載のペプチド、および／または、請求の範囲第２項、第５項若しくは第６項に記載のポリペプチドを、免疫学的に認識する抗体。
【請求項２４】
請求の範囲第４項に記載のペプチド若しくは請求の範囲第６項に記載のポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子と相互作用して、少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物の、同定方法であって、請求の範囲第４項に記載のペプチド、請求の範囲第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第１９項若しくは第２０項に記載の組換えベクター、請求の範囲第２１項に記載の形質転換体、または請求の範囲第２３項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求の範囲第２４項に記載の方法で同定された化合物。
【請求項２６】
請求の範囲第４項に記載のペプチドまたは請求の範囲第６項に記載のポリペプチドの少なくとも１つに対するＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物。
【請求項２７】
請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物。
【請求項２８】
請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第１９項または第２０項に記載の組換えベクター、請求の範囲第２１項に記載の形質転換体、請求の範囲第２３項に記載の抗体、および請求の範囲第２５項から第２７項のいずれか１項に記載の化合物のうちの少なくとも１つを有効量含有してなる癌治療に用いる医薬組成物。
【請求項２９】
請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第１９項または第２０項に記載の組換えベクター、請求の範囲第２１項に記載の形質転換体、請求の範囲第２３項に記載の抗体、および請求の範囲第２５項から第２７項のいずれか１項に記載の化合物のうちの少なくとも１つを有効量含有してなる多発性硬化症の防止および／または治療に用いる医薬組成物。
【請求項３０】
請求の範囲第１項、第３項若しくは第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項若しくは第６項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、定量的および／または定性的に測定する方法。
【請求項３１】
癌疾患検査に用いる請求の範囲第３０項に記載の方法。
【請求項３２】
請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、および請求の範囲第２３項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【請求項３３】
請求の範囲第２４項、第３０項、または第３１項に記載の方法に用いる試薬キットであって、請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項または第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１４項から第１８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、および請求の範囲第２３項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【請求項３４】
ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドおよび／またはポリペプチドからなる脳腫瘍の防止剤および／または治療剤であって、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドおよび／またはポリペプチドからなる防止剤および／または治療剤。
【請求項３５】
ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドおよび／またはポリペプチドからなる脳腫瘍用癌ワクチンであって、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドおよび／またはポリペプチドからなる癌ワクチン。
【請求項３６】
ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドおよび／またはポリペプチドからなる脳腫瘍の防止用および／または治療用細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤であって、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドおよび／またはポリペプチドからなる誘導剤。
【請求項３７】
ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドおよび／またはポリペプチドを使用することを特徴とする脳腫瘍の防止用および／または治療用細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法であって、配列表の配列番号１から配列番号１３に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１４から配列番号１８に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドおよび／またはポリペプチドを使用する誘導方法。
【請求項３８】
請求の範囲第１１項、第１２項または第３７項に記載の方法で誘導される細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項３９】
請求の範囲第１１項、第１２項または第３７項に記載の方法で誘導される脳腫瘍患者または多発性硬化症患者から得られる末梢血由来細胞傷害性Ｔ細胞。
【国際調査報告】
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