(57)【要約】繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフェノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等を、効率よく、安価に、かつ簡便に行なう手段を提供すること。フラムリナ属菌類の培養物、該菌類を、ｐＨ７を超えるｐＨ条件下で培養して得られ、かつフェノールオキシダーゼ様活性を有する、該菌類由来の培養物、該培養物の製造法、該培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させる、染色方法、並びに該培養物を含有した染色用組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノールオキシダーゼ様活性を有し、かつ下記▲１▼〜▲５▼：
▲１▼  式（Ｉ）：
2004020617.tif 000023
に示されるエバンスブルー、式（ＩＩ）：
2004020617.tif 000024
に示されるアシッドブルー８０、式（ＩＩＩ）：
2004020617.tif 000025
に示されるレマゾールブリリアントブルーＲ、及び式（ＩＶ）：
2004020617.tif 000026
に示されるアシッドバイオレット１７のそれぞれに対する酸化的脱色反応を触媒する〔脱色活性〕、
▲２▼  リグニンに対する酸化的分解反応を触媒する〔酸化的分解活性〕、
▲３▼  式（Ｖ）：
2004020617.tif 000027
に示されるインディゴカルミン、及び式（ＶＩ）：
2004020617.tif 000028
に示されるナチュラルオレンジ６の酸化的重合反応を触媒する〔酸化的重合活性〕
▲４▼  ４−アミノアンチピリンと、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた１種の化合物との酸化的カップリング反応を触媒する〔酸化的カップリング活性〕、
、並びに
▲５▼  フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた１種の化合物に対する直接的酸化反応を触媒する〔直接的酸化活性〕、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの基質特異性を有する、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類由来の培養物。
【請求項２】
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類が、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）である、請求項１記載の培養物。
【請求項３】
エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）が、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＩＦＯ  ３０６０１株である、請求項２記載の培養物。
【請求項４】
ｐＨ７を超えるｐＨ条件下で、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類を培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られる、請求項１〜３いずれか１項に記載の培養物。
【請求項５】
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類をｐＨ７を超えるｐＨ条件下で培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られ、かつフェノールオキシダーゼ様活性を有する、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類由来の培養物。
【請求項６】
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類を培養し、得られた培養液から菌糸体を除去して、培養物を得ることを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項に記載のフラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類由来の培養物の製造方法。
【請求項７】
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類が、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）が、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＩＦＯ  ３０６０１株である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５いずれか１項に記載の培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させることを特徴とする、染色方法。
【請求項１０】
請求項１〜５いずれか１項に記載の培養物を含有してなる染色用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、フェノールオキシダーゼ様活性を有する培養物及びその製造方法、染色方法並びに染色用組成物に関する。より詳しくは、繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフェノール化合物等の除去、内分泌攪乱物質の分解、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等に有用な培養物、簡便、安価で、かつ大量に該培養物を得ることができる製造方法、種々の染料による染色が可能な、繊維や毛髪等の染色方法、並びに該染色に有用な染色用組成物に関する。
【背景技術】  フェノール化合物、ポリフェノール化合物等の種々の基質に対して酸化作用を示す酸化酵素は、主に、ペルオキシダーゼ類とフェノールオキシダーゼ類との２つのグループに分類されうる。
前記ペルオキシダーゼ類は、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、反応系中に過酸化水素の存在を必要とする。一方、フェノールオキシダーゼ類は、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、分子状酸素の存在を必要とする。したがって、既知の酸化酵素類の中でも、前記フェノールオキシダーゼ類は、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で中間体としてのラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適する。
前記フェノールオキシダーゼ類は、反応中間体として生成するラジカル種の作用に基づく多様な触媒能を有する。例えば、メディエーターとしてフェノチアジン−１０−プロピオン酸を用いた場合、フェノールオキシダーゼ類であるラッカーゼによるインジコの分解反応を効率よく行なうことができることが開示されている（平成１３年度  福井大学地域共同研究センター  高度技術研修資料集、第５５頁）。
前記酸化酵素は、従来から種々の植物、細菌類及び真菌類等に見出されている。例えば、植物では、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）の分泌性導管、桃類、栗類、マキ科（Ｐｏｄｏｃａｒｐａｃｅａｅ）等において、前記酸化酵素が見出されている。真菌類では、不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ペスタロチア（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）等；担子菌亜門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する、プロイロータス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、レンティナス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、ポリポラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）等；子嚢菌亜門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属するポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、モノシリウム（Ｍｏｎｏｃｉｌｌｉｕｍ）等において、前記酸化酵素が見出されている。細菌では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾスピリウム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アエロバクタ（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）等において、前記酸化酵素が見出されている。また、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｓｅｔｅｓ）である食用キノコでは、例えば、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ヒイロタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｃｔｒｅａｔｕｓ）、ベッコウタケ（Ｆｏｍｉｔｅｌｌａ  ｆｒａｘｉｎｅａ）等に、前記酸化酵素が見出されている。
しかしながら、多くのフェノールオキシダーゼは至適ｐＨを酸性付近に有することから、使用用途が限定されるという欠点がある。また、中性やアルカリ性に至適ｐＨを有するフェノールオキシダーゼでは、用いる基質によって至適ｐＨが大きく変動し、中性付近で種々の基質に効率よく作用しない場合があるという欠点がある。
一方、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）は、ｐＨ６．０の培地で培養することにより、ラッカーゼ活性を発現することが見出されている（特開昭６０−１５６３８５号公報）。
しかしながら、前記ラッカーゼは、酸性側に至適ｐＨを有する酵素であり、中性やアルカリ性領域のｐＨでは、活性が低下するという欠点がある。
【発明の開示】
本発明は、種々の化合物、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミノフェノール化合物を基質とする反応に用いることができ、繊維や毛髪の効率的な染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフェノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等への応用性に優れる、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類由来の培養物を提供することを目的とする。また、本発明は、前記培養物を、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができる、培養物の製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、種々の染料、具体的には、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物、天然物（フラボノイド等）、動植物の黒色色素構成物等により、効率よく、簡便に染色することができる染色方法を提供することを目的とする。また、本発明は、種々の染料、具体的には、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物、天然物（フラボノイド等）、動植物の黒色色素構成物等による染色を可能にし、取扱いが簡便である染色用組成物を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  フェノールオキシダーゼ様活性を有し、かつ下記▲１▼〜▲５▼：
▲１▼  式（Ｉ）：
2004020617.tif 000002
に示されるエバンスブルー、式（ＩＩ）：
2004020617.tif 000003
に示されるアシッドブルー８０、式（ＩＩＩ）：
2004020617.tif 000004
に示されるレマゾールブリリアントブルーＲ、及び式（ＩＶ）：
2004020617.tif 000005
に示されるアシッドバイオレット１７のそれぞれに対する酸化的脱色反応を触媒する〔脱色活性〕、
▲２▼  リグニンに対する酸化的分解反応を触媒する〔酸化的分解活性〕、
▲３▼  式（Ｖ）：
2004020617.tif 000006
に示されるインディゴカルミン、及び式（ＶＩ）：
2004020617.tif 000007
に示されるナチュラルオレンジ６の酸化的重合反応を触媒する〔酸化的重合活性〕
▲４▼  ４−アミノアンチピリンと、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた１種の化合物との酸化的カップリング反応を触媒する〔酸化的カップリング活性〕、
、並びに
▲５▼  フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた１種の化合物に対する直接的酸化反応を触媒する〔直接的酸化活性〕、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの基質特異性を有する、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類由来の培養物、
〔２〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類が、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）である、前記〔１〕記載の培養物、
〔３〕  エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）が、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＩＦＯ  ３０６０１株である、前記〔２〕記載の培養物、
〔４〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類をｐＨ７を超えるｐＨ条件下で培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られる、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の培養物、
〔５〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類をｐＨ７を超えるｐＨ条件下で培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られ、かつフェノールオキシダーゼ様活性を有する、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類由来の培養物、
〔６〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類を培養し、得られた培養液から菌糸体を除去して、培養物を得ることを特徴とする、前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のフラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類由来の培養物の製造方法、
〔７〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類が、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）である、前記〔６〕記載の製造方法、
〔８〕  エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）が、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＩＦＯ  ３０６０１株である、前記〔７〕記載の製造方法、
〔９〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させることを特徴とする、染色方法、並びに
〔１０〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の培養物を含有してなる染色用組成物、
に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の培養物の至適温度を調べた結果を示す図である。図のパネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＢは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示す。
図２は、本発明の培養物の熱安定性を調べた結果を示す図である。図のパネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＢは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示す。
図３は、本発明の培養物の至適ｐＨを調べた結果を示す図である。図３中、図のパネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＢは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示し、パネルＣは、ｐ−フェニレンジアミンを基質とする場合を示す。
図４は、本発明の培養物のｐＨ安定性を調べた結果を示す図である。図４中、パネルＡ及びＢは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＣ及びＤは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示す。また、パネルＡ及びＣは、１時間後のｐＨ安定性を示し、パネルＢ及びＤは、２０時間後のｐＨ安定性を示す。
図５は、本発明の培養物により、ヤク毛束及び羊毛布を染色した結果を示す図である。図５中、パネルＡは、ヤク毛束を用いた結果、パネルＢは、羊毛布を用いた場合の結果を示す。
図６は、培養ｐＨ条件による活性誘導の変化を調べた結果を示す図である。
図７は、本発明の培養物及びｐＨ６．０で培養して得られた培養物それぞれのフェノールオキシダーゼ様活性の至適ｐＨを比較した結果を示す図である。パネルＡ及びパネルＢは、ｐＨ６．０で培養して得られた培養物の至適ｐＨ、パネルＣ及びＤは、本発明の培養物の至適ｐＨを示す。また、パネルＡ及びパネルＣは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、パネルＢ及びＤは、ｐ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の培養物は、フェノールオキシダーゼ様活性を有するので、酸素存在下で反応中間体としてのラジカル種の生成に起因する多様な化学反応を触媒的に行なうことができ、また、用いられる基質による至適ｐＨの変動が小さく、中性付近で高い活性を有する。したがって、本発明の培養物によれば、繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフェノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造等に応用することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の培養物は、食用である後述のエノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）に代表されるＦｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類由来のものであるため、菌糸体外に放出される培養生成物から容易に供給することができるという優れた効果を発揮する。
前記Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類としては、具体的には、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）が挙げられ、より具体的には、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＩＦＯ  ３０６０１株が挙げられる。
本明細書において、フェノールオキシダーゼ様活性とは、酸素存在下で、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、フェニレンジアミン化合物等を触媒的に酸化することをいう。かかるフェノールオキシダーゼ様活性は、例えば、フェノール、アニリン誘導体等を水素供与体として用い、酸素分子を還元する反応による発色反応で測定されうる。前記水素供与体としては、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物、複素環化合物等が挙げられる。
本発明の培養物は、下記▲１▼〜▲５▼：
▲１▼  式（Ｉ）：
2004020617.tif 000008
に示されるエバンスブルー、式（ＩＩ）：
2004020617.tif 000009
に示されるアシッドブルー８０、式（ＩＩＩ）：
2004020617.tif 000010
に示されるレマゾールブリリアントブルーＲ、及び式（ＩＶ）：
2004020617.tif 000011
に示されるアシッドバイオレット１７のそれぞれに対する酸化的脱色反応を触媒する〔脱色活性〕、
▲２▼  リグニンに対する酸化的分解反応を触媒する〔酸化的分解活性〕、
▲３▼  式（Ｖ）：
2004020617.tif 000012
に示されるインディゴカルミン、及び式（ＶＩ）：
2004020617.tif 000013
に示されるナチュラルオレンジ６の酸化的重合反応を触媒する〔酸化的重合活性〕
▲４▲  ４−アミノアンチピリンと、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた１種の化合物との酸化的カップリング反応を触媒する〔酸化的カップリング活性〕、
、並びに
▲５▼  フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物からなる群より選ばれた１種の化合物に対する直接的酸化反応を触媒する〔直接的酸化活性〕、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの基質特異性を有する。
前記フェノール化合物としては、例えば、フェノール、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、１−ナフトール、カテキン等が挙げられる。また、前記アミノフェノール化合物としては、例えば、ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール等が挙げられる。さらに、前記ジアミノフェノール化合物としては、例えば、ｏ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン等が挙げられる。前記複素環化合物としては、５−ヒドロキシインドール、２，６−ジアミノピリジン等が挙げられる。
なお、前記基質特異性に関し、前記▲１▼の脱色活性、前記▲２▼の酸化的分解活性及び前記▲３▼の酸化的重合活性は、
ａ）基質（染料、リグニン等）を含有した１０５．３ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９５０μｌを２５℃で、５分間プレインキュベートして、基質溶液を得るステップ、
ｂ）前記ステップａ）で得られた基質溶液と、本発明の培養物を含有した培養物溶液５０μｌとを混合して、２５℃で、６０分間インキュベートするステップ、及び
ｃ）前記ステップｂ）で得られた産物について、基質に応じた波長における吸光度を測定するステップ
により決定されたものである。ここで、前記染料として、エバンスブルー、アシッドブルー８０、レマゾールブリリアントブルーＲ及びアシッドバイオレット１７について、前記ステップｃ）において、それぞれ、６００ｎｍ、６００ｎｍ、６００ｎｍ及び５５０ｎｍの吸光度を測定することにより、各染料に対する脱色活性を評価することができる。また、前記リグニンに関して、前記ステップｃ）において、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、各染料に対する酸化的分解活性を評価することができる。さらに、前記染料として、インディゴカルミン及びナチュラルオレンジ６について、前記ステップｃ）において、それぞれ、６００ｎｍ及び４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、各染料に対する酸化的重合活性を評価することができる。
また、前記▲４▼の酸化的カップリング活性は、
ａ）  ０．４μｍｏｌの水素供与体と４．０μｍｏｌの４−アミノアンチピリンとを含有した１０５．３ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９０μｌを、２５℃で、１分間プレインキュベートして、基質溶液を得るステップ、
ｂ）前記ステップａ）で得られた基質溶液と、本発明の培養物を含有した培養物溶液１０μｌとを混合して、２５℃で、６０分間インキュベートするステップ、及び
ｃ）前記ステップｂ）で得られた産物について、水素供与体に応じた波長で吸光度を測定するステップ、ここで、フェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物を基質とする場合、４９０ｎｍにおける吸光度の変化、アミノフェノール化合物を基質とする場合、４５０ｎｍにおける吸光度の変化を測定する
により決定されたものである。
さらに、前記▲５▼の直接的酸化活性は、
ａ）  ０．１ｍｍｏｌの基質を含有した０．８９ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１８０μｌを、２５℃で、１分間プレインキュベートして、基質溶液を得るステップ、
ｂ）前記ステップａ）で得られた基質溶液と、本発明の培養物を含有した培養物溶液２０μｌとを混合して、２５℃で、６０分間インキュベートするステップ、及び、
ｃ）前記ステップｂ）で得られた産物について、基質に応じて、４９０ｎｍ、４５０ｎｍ又は４０５ｎｍの吸光度の変化を測定するステップ
により決定されたものである。
本発明の培養物は、ｐＨ６．０〜８．０の範囲で、優れたフェノールオキシダーゼ様活性を示す。本発明の培養物は、前記ｐＨの範囲において種々のフェノール化合物に対して優れたフェノールオキシダーゼ様活性を示すため、特別なｐＨ調整を行なうことなく、効率よく反応を行なうことができるという優れた性質を発現する。
また、本発明の培養物は、２０〜６０℃の範囲で、優れたフェノールオキシダーゼ様活性を示す。本発明の培養物は、前記温度の範囲において優れたフェノールオキシダーゼ様活性を示すため、特別な温度条件に調節することなく、日常の生活温度（室温、水温、体温、気温等）で高い活性を示す。したがって、染色、廃液処理、高分子合成等を簡便に行なうことができる。
また、本発明の培養物は、ｐＨ５．０〜９．５において、３０℃で１時間インキュベートしたとき、インキュベート前の活性と比較して、約７５％以上の相対残存活性を保持し、ｐＨ４．０〜１０．５において、３０℃で１時間インキュベートしたとき、インキュベート前の活性と比較して、約４０％以上の相対残存活性を保持する。なお、本発明のフェノールオキシダーゼ化合物のｐＨ安定性は、３０℃で２０時間インキュベートしたとき、インキュベート前の活性と比較して、ｐＨ７．０〜９．０において、約７５％以上の相対残存活性を保持する。本発明の培養物は、前記ｐＨの範囲において優れたｐＨ安定性を呈するため、特別なｐＨ条件に調節することなく、水ベースの反応溶液を用いることができるという優れた性質を発現する。
さらに、本発明の培養物は、０〜４０℃において、ｐＨ６．０で１時間インキュベートしたとき、インキュベート前の活性と比較して、約７５％以上の相対残存活性を保持する。本発明の培養物は、前記温度の範囲において優れた熱安定性を呈するため、特別な温度条件に調節することなく、日常温度での使用、及び保存が可能であるという優れた効果を発揮する。したがって、染色、廃水処理、高分子合成等を安価にかつ簡便に行なうことができるという優れた効果を発揮する。
本発明の培養物は、ｐＨ７を超えるｐＨ条件下で、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類を培養して、得られた培養液から菌糸体を除去して得られた培養物である点にも１つの大きな特徴がある。
本発明の培養物は、ｐＨ７を超えるｐＨ条件下で、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する菌類から培養されて得られたものであり、ｐＨ６．０〜８．０の範囲で、安定で高いフェノールオキシダーゼ様活性を示すという優れた性質を発現する。
なお、本明細書において、「ｐＨ７を超えるｐＨ条件」とは、ｐＨ７を超える値以上であり、ｐＨ１３．０以下である条件、好ましくは、ｐＨ７．５〜１１．０、より好ましくは、ｐＨ８．０〜１０．０である条件をいう。
本発明の培養物は、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類を培養して得られた培養液であってもよく、該培養液から菌糸体を除去して得られた産物であってもよい。したがって、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類を適切な培地で培養し、菌糸体外の培養生成物から簡便に供給することができる。また、除去された菌糸体を、新たな培地で培養することにより、本発明の培養物を得ることができるので、該菌糸体を、リサイクルすることができる。本発明には、本発明の培養物の製造方法も含まれる。
本発明の製造方法は、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類を培養し、得られた培養液から菌糸体を除去して、培養物を得ることを１つの大きな特徴とする。
本発明の製造方法によれば、前記Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類を培養することにより、フェノールオキシダーゼ様活性を有する培養物を簡便、かつ大量に得ることができるという優れた効果を発揮する。また、除去された菌糸体を、新たな培地で培養することにより、本発明の培養物を得ることができ、リサイクルすることができるため、安価に、かつ簡便に本発明の培養物を簡便に得ることができるという優れた効果を発揮する。
Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類の培養には、液体培地、又は固体培地のいずれを用いてもよい。
本発明の製造方法に用いられる培地の炭素源としては、例えば、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類が同化しうるものであればよく、グルコース、ショ糖、糖蜜、でんぷん等の糖類、ふすま、みかんパルプ等が挙げられ、前記炭素源は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いられうる。また、窒素源としては、おから、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸、酵母エキス、麦芽エキス、脱脂大豆粉、コーンスティープリカー、尿素等の有機窒素源；硝酸カリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等が挙げられ、前記窒素源は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いられうる。また、本発明の製造方法に用いられる培地には、必要に応じて、リン酸塩、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、カリウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト等の無機塩類、ビタミン類等を添加してもよい。培地中における前記炭素源、窒素源等の濃度は、本発明の培養物を生産する担子菌、特に、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類を十分に生育させ、フェノールオキシダーゼ様活性を発現させるに適した濃度であればよく、具体的には、炭素源は、０．１〜２０重量％、好ましくは、１〜１０重量％であることが望ましく、窒素源は、０．１〜１０重量％、好ましくは、１〜５重量％であることが望ましい。
前記培地のｐＨは、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類を十分に生育させ、フェノールオキシダーゼ様活性、特に、前記基質特異性を伴なうフェノールオキシダーゼ様活性、さらに、前記反応至適ｐＨを伴なうフェノールオキシダーゼ様活性を発現させるに適したｐＨであればよく、前記性質（例えば、基質特異性、反応至適ｐＨ等）を伴なうフェノールオキシダーゼ様活性を十分発現させる観点から、ｐＨ７．０を超えるｐＨ（初期ｐＨ）、好ましくは、ｐＨ７．５〜１１．０、より好ましくは、ｐＨ８．０〜１０．０であることが好ましい。したがって、培地を、かかるｐＨに調整し、滅菌して使用することが望ましい。
培養温度は、糸状株が生育する温度であればよく、実用上、１０〜４０℃、好ましくは、２０〜３５℃であることが望ましい。
なお、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属に属する菌類を液体培養する場合、好ましくは、通気培養又は振盪培養が望ましい。
培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通気培養の場合は、通常、２〜１０日間であることが望ましい。また、前記培養時間は、培養液の活性値が最大となることを指標として、設定することもできる。
本発明の培養物は、菌体外に分泌生産され、培養液中に蓄積される。したがって、前記培養液をそのまま用いることもできるが、培養後、菌体等の不要物を遠心分離、濾紙又は濾布等による濾過等により除去し、培養上清として得ることもできる。
また、本発明においては、前記培養液として得られた培養物及び培養上清として得られた培養物について、フェノールオキシダーゼ様活性をより高めてもよく、また、化粧品、医薬部外品等の製品に配合する観点から、脱色、濃縮、凍結乾燥、透析、塩析等に供してもよい。
また、本発明の培養物によれば、種々の染料、色素等とともに用いることにより、ケラチン繊維の染色を行なうことができる。したがって、本発明により、染色方法が提供される。
本発明の染色方法は、培養物の存在下に、染色対象物と染料とを接触させることを１つの大きな特徴とする。本発明の染色方法によれば、本発明の培養物を用いるため、種々の染料により、染色対象物を、安価に、かつ簡便に染色することができる。また、本発明の染色方法によれば、本発明の培養物を用いるため、特別な温度条件、ｐＨ条件の調節をすることなく、外界環境条件下において行なうことができる。
前記染色対象物としては、例えば、綿、ジアセテート、亜麻、リンネル、リオセル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーエン、テンセル、トリアセテート、毛皮、獣皮、皮革、絹又はウール製の布帛、糸、繊維、衣料、木材、毛髪、フィルム等が挙げられる。
前記染料としては、例えば、インドリン及びインドリン化合物、インドール化合物、医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料等を基質として酸化することができ、カップリング剤を用いることもできる。
インドリン及びインドリン化合物としては、具体的には、インドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリンカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドキシインドリン、並びにこれらの塩類等を例示されうる。
インドール化合物として、具体的には、４−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−トリ（ｔ−ブトキシカルボニルオキシ）インドール、５，６−ジ（ｔ−ブトキシカルボニルオキシ）インドール、５−ｔ−ブトキシカルボニルオキシ−６−ヒドロキシインドール、６−ｔ−ブトキシカルボニルオキシ−５−ヒドロキシインドール、５，６−ジ（エトキシカルボニルオキシ）インドール、５，６−ジ（エチルカルバモイルオキシ）インドール、１−ピバロイル−５−（ピバロイルオキシメトキシ）−６−ピバロイルオキシインドール、１−ピバロイル−５−ピバロイルオキシメトキシ−６−ヒドロキシインドール、５，６−（オキシカルボニルメトキシ）インドール等が挙げられる。
医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料としては、具体的に、５−アミノ−ｏ−クレゾール、ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、２，６−ジアミノピリジン、５−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−２−メチルフェノール、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシ）−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｐ−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン、ｐ−ニトロ−２’，４’−ジアミノアゾベンゼン・硫酸ナトリウム、トルエン−２，５−ジアミン、５−アミノ−ｏ−クレゾール・硫酸塩、ｐ−アミノフェノール・硫酸塩、ｏ−クロロ−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、４，４’−ジアミノジフェニルアミン・硫酸塩、ｐ−メチルアミノフェノール・硫酸塩、ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｍ−フェニレンジアミン・硫酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノキシエタノール・塩酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・塩酸塩、ｍ−フェニレンジアミン・塩酸塩、２，４−ジアミノフェノール・塩酸塩、３，３’−イミノジフェノール、ｐ−フェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン・酢酸塩、１，５−ジヒドキシナフタレン、トルエン−３，４−ジアミン、ｐ−メチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ’−ビス（４−アミノフェニル）−２，５−ジアミノ−１，４−キノンジイミン、ｏ−アミノフェノール・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノール・硫酸塩、ｍ−アミノフェノール・硫酸塩等を例示されうる。
また、本発明においては、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、１−アミノ−４−メチルアミノアントラキノン、ニトロ−ｐ−フェニレンジアミン・塩酸塩、１，４−ジアミノアントラキノン、ニトロ−ｐ−フェニレンジアミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、２−アミノ−５−ニトロフェノール・硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｐ−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｐ−ニトロ−ｍ−フェニレンジアミン・硫酸塩等の直接染料も用いられうる。
培養物の存在下における染色対象物と染料との接触は、例えば、染料と培養物を使用時に混合して染色対象物と接触するか、或いは嫌気性条件下で保存した染料と培養物の混合物を使用時に大気中で染色対象物と接触することにより行なわれうる。
また、本発明の培養物によれば、染色用組成物が提供される。
本発明の染色用組成物は、本発明の培養物を含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の染色用組成物によれば、酸素の存在下、外界環境条件下おいて、種々の染料、特に、フェノール化合物と、アミノフェノール化合物と、フェニレンジアミン化合物とのいずれに対しても至適ｐＨに大きな変動がなく、中性付近のｐＨで効率よく染色を行なうことができるという優れた効果を発揮する。
本発明の染色用組成物において、本発明の培養物の含有量は、実用的な染色時間とする観点から、例えば、毛髪染色用組成物１００ｇに対して、フェノールオキシダーゼ様活性として０．０５〜１００ＫＵとされ、０．５〜２５ＫＵであることが望ましい。なお、前記フェノールオキシダーゼ様活性は、３０ｍＭのｐ−フェニレンジアミンを基質として用い、２５℃の条件下、ｐＨ７．０で１分間に４９０ｎｍにおける吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義される値である。
本発明の染色用組成物は、染料若しくは色素、具体的には、前記したインドリン及びインドリン化合物、インドール化合物、医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料等を用いることができ、カップリング剤を用いることもできる。また、前記した直接染料も用いることもできる。
本発明の染色用組成物において、染料若しくは色素の含有量は、実用的な染色時間とする観点から、染色用組成物中０．０００５〜１２重量％であり、好ましくは、０．００５〜６重量％であることが望ましい。
また、本発明の染色用組成物は、本発明の培養物の生理活性を発現させ、染色を行なうに適した酸、アルカリ、それらの緩衝液等により、ｐＨを調整してもよい。具体的には、例えば、塩酸、硫酸等の無機酸；リン酸、酢酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、スルホン酸等の有機酸；アンモニア；モノイソプロパノールアミン、モノエタノールアミン等のアミン類；炭酸アンモニウム等の炭酸塩類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物塩等を挙げることができる。
本発明の染色用組成物には、フェノールオキシダーゼ様活性を阻害しない範囲で、チオ乳酸、亜硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等の還元剤を配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲で上記した成分の他、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、香料等を適宜配合することもできる。
また、本発明の染色用組成物を毛髪用の染色用組成物とする場合、例えば、嫌気性条件下で、染料と培養物とを含有した一剤式の染色用組成物とし、使用時に毛髪上に塗布して空気と接触させることで毛髪を染色することができる。さらに、培養物を含有した組成物と、染料を含有した組成物との多剤式の染色用組成物とし、使用時に両組成物を混合して毛髪上に塗布して毛髪を染色することもできる。なお、本発明の染色用組成物は、液剤、クリーム剤、ゲル剤等の種々の染色に適した剤型として用いることができる。
本発明の培養物は、フェノールオキシダーゼ様活性を有することから、上記した繊維や毛髪の染色の他、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフェノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等への利用に有用である。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により、何ら限定されるものではない。
実施例１  エノキダケ［Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ（ＩＦＯ３０６０１株）］の培養物の調製
（１）培養物の調製１
以下の操作をクリーンベンチ内で行なった。
固体培養用寒天培地〔組成：２．４重量％  ポテトデキストロースブロス〔ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、２．０重量％  寒天、残部  水〕１０ｍｌを含む滅菌シャーレに、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ（ＩＦＯ３０６０１株）を１白金耳相当量播種し、２５℃で１０日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳で５ｍｍ四方の小片に切り分けた。
前記小片  １０片を、液体培養用培地１〔組成：２．４重量％  ポテトデキストロースブロス〔ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部  水  （ｐＨ５．２）；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕に播種し、２５℃で７日間、往復振盪培養（１５０往復／分）を行なった。
得られた培養液全量を、２Ｌの三角フラスコ中５００ｍｌの前記液体培養用培地に添加し、２５℃で３週間、往復振盪培養（１００往復／分）を行なった。
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、培養液を取り去り、残部の菌糸体に、液体培養用培地２〔組成：１．０重量％  グルコース、０．１重量％  酵母エキス、０．１４重量％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３６重量％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２重量％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％  ミネラル混合液（組成：１．０重量％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．０重量％  ＺｎＣｌ２、０．７重量％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．５重量％  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５重量％  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、ｐＨ９．２；１２１℃、１５分間滅菌〕５００ｍｌを添加し、さらに２５℃で３日間培養した。
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈澱させ、デカンテーションにより培養物を回収した。得られた培養物は、淡黄色、又は黄褐色の清澄又は濁った液体であった。
（２）培養物の調製２
前記（１）で得られたＦｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＩＦＯ  ３０６０１株の培養物を、減圧濾過して、濾液を得た。
前記濾液のｐＨを１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液により７．５に調整した。得られた混合物  １Ｌに対して、５ｇのＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕担体を添加し、４℃で３０分間振盪攪拌した。その後、１０分間静置し、上清を除去した。
得られたＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ担体に、該担体の３倍容量の１Ｍ塩化ナトリウムを含有した０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を添加した。得られた混合物を５分間振盪攪拌して、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ担体に吸着したタンパク質を溶出した。得られた溶出液を、減圧濾過にて回収し、４℃で脱イオン水に対して透析し、得られた産物を凍結乾燥し、凍結乾燥産物として、培養物を得た。
実施例２  本発明の培養物の反応至適温度
前記実施例１の（２）で得られた培養物（凍結乾燥産物）１０２ｍｇ（タンパク質量：２３ｍｇ、比活性１５Ｕ／ｍｇ  タンパク質）を、０．０２ｍｇタンパク質／ｍｌとなるように溶解させて、培養物を得た。
得られた培養物について、フェノールオキシダーゼ様活性を、種々の温度条件（０、２０、３０、４０、５０、６０、７０及び８０℃）下にて測定した。具体的には、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合、マイクロセントリフュージチューブ〔ポレックスバイオプロダクツインコーポレティッド（ＰｏｒｅｘＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．）社製〕中、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．８９ｍｌと、５０ｍＭ  ｏ−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液０．１ｍｌと、培養物溶液０．０１ｍｌとを混合し、得られた混合物について、各反応温度にて１０分間反応を行なった。その後、反応液に、２Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）０．１ｍｌ添加することにより、反応を停止させた。また、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合、前記ｏ−アミノフェノールの場合において、ｏ−アミノフェノールの代わりに、５０ｍＭ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液を用いて同様に操作を行なった。
ついで、得られた各反応産物について、分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕により、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合、４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合、４７０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、活性を評価した。なお、前記活性は、１分間に、吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。その結果を図１に示す。なお、図１において、最大活性を１００として、相対活性で示す。また、図のパネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＢは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示す。
図１に示されるように、本発明の培養物の反応至適温度は２０〜６０℃であることがわかった。
実施例３  本発明の培養物の熱安定性
前記実施例２と同様の培養物溶液  ０．０２ｍｌを、種々の温度条件（０、２０、３０、４０、５０、６０、７０及び８０℃）下にて、０．１８ｍｌの１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で６０分間インキュベートすることにより、前処理を行なった。
ｏ−アミノフェノールを基質とする場合、得られた産物  ０．０５ｍｌと、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．８５ｍｌ、５０ｍＭ  ｏ−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液  ０．１ｍｌとを、マイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕で測定することにより、活性を評価した。また、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合、前記ｏ−アミノフェノールを基質とする場合において、５０ｍＭ  ｏ−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液の代わりに、５０ｍＭ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液を用い、同様の操作を行ない、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、活性を評価した。なお、前記活性は、１分間に、吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。その結果を図２に示す。なお、図２において、最大活性を１００として、相対残存活性で示す。また、図のパネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＢは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示す。
図２に示されるように、本発明の培養物は、２，６−ジメトキシフェノールの場合、４０℃までで、８４％の相対残存活性、５０℃で、４５％の相対残存活性、６０℃で２２％の相対残存活性を示した。また、ｏ−アミノフェノールの場合、本発明の培養物は、４０℃までで、９１％の相対残存活性、５０℃で、６２％の相対残存活性、６０℃で４０％の相対残存活性を示した。
実施例４  本発明の培養物の至適ｐＨ
本発明の培養物と各基質との反応に際して、緩衝液として、ｐＨに応じて、０．２Ｍ  グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５，ｐＨ１０．５，ｐＨ９．５）、０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０，ｐＨ９．０，ｐＨ８．０，ｐＨ７．０）、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５，ｐＨ７．０，ｐＨ６．５，ｐＨ６．０，ｐＨ５．５）、０．２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５，ｐＨ５．０，ｐＨ４．５，ｐＨ４．０，ｐＨ３．５）並びに０．２Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４．０，ｐＨ３．５，ｐＨ３．０，ｐＨ２．０）を用いた。
ｏ−アミノフェノールを基質とする場合、前記実施例２と同様の培養物溶液０．０２ｍｌと、前記各種緩衝液  ０．８８ｍｌと、５０ｍＭ  ｏ−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液  ０．１ｍｌとをマイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕で測定することにより、活性を評価した。また、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合、前記ｏ−アミノフェノールを基質とする場合において、５０ｍＭ  ｏ−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液の代わりに、５０ｍＭ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液を用い、同様の操作を行ない、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、活性を評価した。
ｐ−フェニレンジアミンを基質とする場合、反応に際して、緩衝液として、ｐＨに応じて、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０，ｐＨ８．５，ｐＨ８．０，ｐＨ７．５，ｐＨ７．０）、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０，８．５，８．０，ｐＨ７．５，ｐＨ７．０，ｐＨ６．５，ｐＨ６．０）、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０，ｐＨ７．５，ｐＨ７．０，ｐＨ６．５，ｐＨ６．０，ｐＨ５．０  ｐＨ４．０，ｐＨ３．０）を用いた。前記培養物溶液  ５μｌと、前記各種緩衝液  ０．８９５ｍｌと、１００ｍＭ  ｐ−フェニレンジアミンの水溶液とをマイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４９０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕で測定することにより、活性を評価した。
なお、前記活性は、１分間に、吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。その結果を図３に示す。なお、図３において、最大活性を１００として、相対活性で示す。また、図のパネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＢは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示し、パネルＣは、ｐ−フェニレンジアミンを基質とする場合を示す。
図３に示されるように、本発明の培養物は、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約６．０、ｏ−アミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約６．０、ｐ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、６．５〜８．０であることがわかった。
実施例５  本発明の培養物のｐＨ安定性
前記実施例２と同様の培養物溶液  ０．０２ｍｌと、ｐＨ２〜１１．５の各種緩衝液  ０．１８ｍｌとを混合して、３０℃で１時間又は２０時間インキュベートすることにより、前処理を行なった。前処理に際して、緩衝液として、ｐＨに応じて、０．２Ｍ  グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５，ｐＨ１０．５，ｐＨ９．５）、０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０，ｐＨ８．０）、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０，ｐＨ６．０）、０．２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０，ｐＨ４．０）並びに０．２Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０，ｐＨ２．０）を用いた。
ついで、前処理後の培養物溶液  ０．０２ｍｌと、前記緩衝液  ０．８８ｍｌと、５０ｍＭ  ｏ−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液  ０．１ｍｌとを、マイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕で測定することにより、活性を評価した。また、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合、前記ｏ−アミノフェノールを基質とする場合において、５０ｍＭ  ｏ−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液の代わりに、５０ｍＭ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液を用い、同様の操作を行ない、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、活性を評価した。なお、前記活性は、１分間に、吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。その結果を図４に示す。なお、図４において、最大活性を１００として、相対残存活性で示す。また、パネルＡ及びＢは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とする場合を示し、パネルＣ及びＤは、ｏ−アミノフェノールを基質とする場合を示す。さらに、パネルＡ及びＣは、１時間後のｐＨ安定性を示し、パネルＢ及びＤは、２０時間後のｐＨ安定性を示す。
図４に示されるように、本発明の培養物は、１時間処理の場合、ｐＨ６．０〜１０．０で安定であり、７５％の相対残存活性が保持されていた。また、２０時間処理の場合、ｐＨ７．０〜９．０の範囲で安定であり、７５％の相対残存活性が保持されていた。
実施例６  本発明の培養物の基質特異性
培養物溶液の基質特異性を調べるために、ｐ−フェニレンジアミン、４−ヒドロキシインドール、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ｐ−アミノフェノール、ｏ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ、シリンガルダジン及びＬ−タイロシンを基質として用い、基質特異性を調べた。具体的には、前記培養物溶液  ０．０５ｍｌと、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８５ｍｌと、基質溶液（Ｌ−タイロシンは、１．１ｍＭ、シリンガルダジンは、１ｍＭの濃度で使用し、その他は、５０ｍＭの濃度で使用した）０．１ｍｌとをマイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕で測定することにより、活性を評価した。なお、前記活性は、１分間に、吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。その結果を表１に示す。
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表１の結果より、本発明の培養物は、フェノールオキシダーゼ様活性を有することがわかった。
次に、実施例１の（２）で得られた培養物の基質特異性について、培養物の作用により生じた種々の基質の化学的変化を、各基質を含有した緩衝液の吸光度の変化を測定することにより調べた。
基質として、市販の色素（エバンスブルー、アシッドブルー８０、レマゾールブリリアントブルーＲ、インディゴカルミン、アシッドバイオレット１７、ナチュラルオレンジ）、並びにリグニン（商品名：リグニンアルカリ、東京化成社製）を用いた。なお、各基質についての終濃度及び測定波長を、表２に示す。
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具体的には、表２に記した終濃度となるよう調整した基質を含有した１０５．３ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９５０μｌを２５℃で、５分間プレインキュベートし、ついで、得られた産物に、培養物溶液５０μｌを添加して、キュベット内で反応させ、各基質についての測定波長での吸光度を分光光度計（島津製作所社製、商品名：ＵＶ−２４５０）を用いて測定した。比較のために、ミロセシウム属菌類由来のビリルビンオキシダーゼについても、上記の緩衝液を、１０５．３ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に置き換えて、同様に調べた。
なお、活性の１単位〔Ｕ（ユニット）〕は、１分間に吸光度を１減少させる量とした。培養物による活性について、各基質の比活性（Ｕ／ｍｇ  タンパク質）を表３に示す。なお、表３中、符号なしで表記された比活性は、分解活性又は脱色活性であることを示し、−（マイナス）により表記された比活性は、重合活性であることを示す。
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表３に示されるように、本発明の培養物は、中性条件下でアゾ系色素、アントラキノン系色素及びアシッドバイオレット１７の酸化的脱色反応、リグニンの酸化的分解反応、インディゴカルミン及びナチュラルオレンジ６の酸化的重合反応を触媒することがわかった。特に、レマゾールブリリアントブルーＲの酸化的脱色反応及びリグニンの酸化的分解反応を強く触媒した。また、本発明の培養物は、比較のために用いたミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼとは、レマゾールブリリアントブルーＲ、インディゴカルミン、アシッドバイオレット１７、リグニンに対する特異性が大きく異なる。
次に、前記実施例１の（２）で得られた培養物の酸化的カップリング反応について、本発明の培養物が触媒する、基質（水素供与体）と４−アミノアンチピリンとの酸化縮合による発色を指標として測定した。
水素供与体として、フェノール化合物（フェノール、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、１−ナフトール、カテキン）、アミノフェノール化合物（ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール）、ジアミノフェノール化合物（ｏ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン）、及び複素環化合物（５−ヒドロキシインドール、２，６−ジアミノピリジン）を用いた。
４−アミノアンチピリンと、任意の水素供与体とを含む反応系に、前記培養物溶液を添加した後、フェノール化合物、ジアミノフェノール化合物及び複素環化合物については、４９０ｎｍにおける吸光度の変化、アミノフェノール化合物については、４５０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、本発明の培養物の活性を測定した。また、水に対して難溶な基質に対しては、該基質を、少量のジメチルスルホキシドに溶解させ、目的とする濃度まで脱イオン蒸留水で希釈したものを用いた。各基質の測定波長と終濃度を表４に示す。なお、表４中、ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドの略称である。
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具体的には、９６穴のマイクロプレート〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、Ｃｏｓｔｏｒ（登録商標）３３６８〕のウェル内で、０．４μｍｏｌの基質と４．０μｍｏｌの４−アミノアンチピリンとを含有した１０５．３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９０μｌを、２５℃にて、１分間プレインキュベートした。ついで、得られた混合物に、前記培養物溶液  １０μｌを添加し、１時間インキュベートした。得られた産物について、４９０ｎｍ又は４５０ｎｍの吸光度の変化を測定した。なお、酸化カップリング反応に関する活性は、１分間に吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。
また、比較のために、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼについても、前記緩衝液を、１０５．３ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に置き換えて、同様に調べた。各基質に対する比活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）を表５に示す。
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表５に示されるように、本発明の培養物は、中性条件（ｐＨ７．０）下で種々のフェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物と、アニリン化合物の４−アミノアンチピリンとの酸化的カップリング反応を触媒した。フェノール化合物に関しては、没食子酸及び没食子酸プロピル以外の化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、１−ナフトール、カテキンに対して、特に高い活性が見られた。アミノフェノール化合物に関しては、すべての化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、ｏ−アミノフェノール及びｐ−アミノフェノールに対して、特に高い活性が見られた。ジアミノフェノール化合物に関しては、すべての化合物に対して高い活性が見られた。複素環化合物に関しては、すべての化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、２，６−ジアミノピリジンに対して、特に高い活性が見られた。
また、表５に示されるように、本発明の培養物は、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼとは、基質特異性が大きく異なっており、比活性も高いことがわかった。
さらに、前記実施例で得られた培養物の直接的酸化反応について、本発明の培養物が基質に直接作用することによって生じる、基質の酸化重合による発色を指標として測定した。
基質として、ジアミノフェノール化合物（２−クロロ  １，４−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、２，５−ジアミノトルエン、Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン、トルイレン−３，４−ジアミン、ｍ−フェニレンジアミン）、アミノフェノール化合物（ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、５−アミノ−ｏ−クレゾール、ｐ−アミノフェノール、ｐ−メチルアミノフェノール）、及びフェノール化合物（２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、１−ナフトール、１，５−ジヒドロナフタレン、２，３，４−トリヒドロキシベンゾフェノン、２，３，４，４−テトラヒドロキシベンゾフェノン）を用いた。水に対して難溶な基質に対しては、該基質を、少量のジメチルスルホキシドに溶解させ、目的とする濃度まで脱イオン蒸留水で希釈したものを用いた。各基質の測定波長と終濃度とを、表６に示す。なお、表６中、「％」は、体積／体積％を示す。
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具体的には、９６穴のマイクロプレート〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、Ｃｏｓｔｏｒ（登録商標）３３６８〕のウェル内で、０．１ｍｍｏｌの基質を含有した０．８９ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１８０μｌを、２５℃で、１分間プレインキュベートした。ついで、得られた混合物に、前記培養物溶液  ２０μｌを添加した。得られた産物について、基質に応じて、４９０ｎｍ、４５０ｎｍ又は４０５ｎｍの吸光度の変化を測定した。なお、直接的酸化反応に関する活性は、１分間に吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。
また、比較のために、ウルシ由来ラッカーゼ及びミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼについても、同様にｐＨ７．０における基質特異性を調べた。
代表的な化学染料である２−クロロ  １，４−フェニレンジアミンを基質とした場合の測定値を１００とした、各基質についての相対活性（％）を表７に示す。
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表７に示されるように、本発明の培養物は、中性条件（ｐＨ７．０）下で、種々のジアミノフェノール化合物、アミノフェノール化合物及びフェノール化合物の直接酸化反応を触媒した。ジアミノフェノール化合物に関しては、ｍ−フェニレンジアミン以外の化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、ｐ−フェニレンジアミン及びＮ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミンに対して、特に高い活性が見られた。アミノフェノール化合物に関しては、ｍ−アミノフェノール以外の化合物に対して高い活性が見られた。なかでも、ｏ−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール及びｐ−メチルアミノフェノールに対して、特に高い活性が見られた。フェノール化合物に関しては、２，６−ジメトキシフェノール、ピロガロール、２，３，４−トリヒドロキシベンゾフェノン、及び２，３，４，４−テトラヒドロキシベンゾフェノンに対して高い活性が見られた。なかでも、２，３，４−トリヒドロキシベンゾフェノン及び２，３，４，４−テトラヒドロキシベンゾフェノンに対して、特に高い活性が見られた。
また、本発明の培養物は、ウルシ由来ラッカーゼと比べて、ｐ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレンジアミン、ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、５−アミノ−ｏ−クレゾール、ｐ−アミノフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、没食子酸、没食子酸プロピル、２，３，４−トリヒドロキシベンゾフェノン及び２，３，４，４−テトラヒドロキシベンゾフェノンに対する活性がより高く、なかでも、ｍ−フェニレンジアミン、ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、５−アミノ−ｏ−クレゾール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ヒドロキノン及び没食子酸に対する活性がより高い。
また、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼと比べて、ｐ−フェニレンジアミン、２，５−ジアミノトルエン、トルイレン−３，４−ジアミン、ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、５−アミノ−ｏ−クレゾール、ｐ−アミノフェノール、ｐ−メチルアミノフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ヒドロキノン、没食子酸プロピル、１−ナフトール、２，３，４−トリヒドロキシベンゾフェノン及び２，３，４，４−テトラヒドロキシベンゾフェノンに対する活性がより高く、なかでも、ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、５−アミノ−ｏ−クレゾール、２，６−ジメトキシフェノール、ヒドロキノン、１−ナフトール、２，３，４−トリヒドロキシベンゾフェノン及び２，３，４，４−テトラヒドロキシベンゾフェノンに対する活性がより高い。
実施例７  本発明の培養物による染色
（１）本発明の培養物による染色性
前記実施例１で得られた培養物による染色試験を行なった。前記培養物により、酸化重合によって、ヤク毛束及び羊毛布を染料（ｐ−フェニレンジアミン及びｏ−アミノフェノール）で染色した。すなわち、染料  ０．５ｇ（２種類の染料を用いる場合は、合計１．０ｇ）と、増粘剤として、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）０．７５ｇと、界面活性剤として、ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油（ＨＣ−２０）１．０ｇと、乳酸  ０．５ｇとを混合し、モノエタノールアミンでｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で重量を５０ｇにし、基材を得た。
前記基材  ２ｇと前記培養物溶液（３．５Ｕ相当量）とを混合し、得られた混合物を、ヤク毛束１ｇと羊毛布１枚（２×３ｃｍ）とに対して、塗布した。塗布後のヤク毛束及び羊毛布のそれぞれを、３０℃で１時間保持した。なお、前記培養物溶液における活性は、３０ｍＭ  ｐ−フェニレンジアミンを基質として用い、ｐＨ７．０、２５℃の条件下での活性である。
染色されたヤク毛束及び羊毛布について、色差計（ミノルタ社製、商品名：Ｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ−３６１０ｄ）を用いて、Ｌ値、ａ値、ｂ値を測定した。ついで、
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ΔＥ値を算出し、かかるΔＥ値により、染色性を評価した。なお、前記ΔＥ値は、染色前のヤク毛束及び羊毛布の色調と、染色後のヤク毛束及び羊毛布の色調色差を示している。なお、比較のために、ウルシ由来ラッカーゼについても、同様に染色試験を行なった。各基質に対するΔＥ値を表８に示す。
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表８に示すように、本発明の培養物によれば、ヤク毛束及び羊毛布に対して、いずれの染料の組み合わせでも明らかな染色性が認められた。また、本発明の培養物によれば、比較のために用いたウルシ由来ラッカーゼとは、ｐ−フェニレンジアミン単独、ｏ−アミノフェノール＋ｐ−フェニレンジアミンにおいて、染色性はやや劣るが、ｏ−アミノフェノール単独及びｏ−アミノフェノール＋ｍ−フェニレンジアミンにおいては、明らかに染色性に優れることがわかった。
（２）本発明の培養物の使用量の検討
前記実施例１で得られた培養物の使用量を変化させ、本発明の培養物による染色試験を行なった。本発明の培養物により酸化される染料（ｏ−アミノフェノール）を用いて、ヤク毛束及び羊毛布を酸化重合によって染色し、色差計を用いて、Ｌ値、ａ値、ｂ値を測定した。
具体的には、染料（基質）として、ｏ−アミノフェノール  ０．５ｇと、カップラーとして、ｍ−フェニレンジアミン  ０．５ｇと、増粘剤として、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）０．７５ｇと、界面活性剤として、ポリオキシエチレン（２０）ヒマシ油（ＨＣ−２０）１．０ｇと、乳酸  ０．５ｇとを混合を混合し、モノエタノールアミンでｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で重量を５０ｇにし、基材を得た。
また、ヤク毛束１ｇと羊毛布１枚（２×３ｃｍ）に対して、前記基材  ２ｇと、タンパク質量として、０から０．８ｍｇになるように調整した培養物溶液とを混合し、得られた混合物を、ヤク毛束１ｇと羊毛布１枚（２×３ｃｍ）とに対して、塗布した。塗布後のヤク毛束及び羊毛布のそれぞれを、３０℃で１時間保持した。
染色されたヤク毛束及び羊毛布について、色差計（ミノルタ社製、商品名：Ｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ−３６１０ｄ）を用いて、Ｌ値、ａ値、ｂ値を測定し、ΔＥを算出した。染色性は、ΔＥ値により評価した。本発明の培養物の使用量によるΔＥ値の変化を図５に示す。図５のパネルＡは、ヤク毛束を用いた結果、パネルＢは、羊毛布を用いた場合の結果を示す。
図５に示されるように、ヤク毛束及び羊毛布において、本発明の培養物の使用量を増加させることにより、ΔＥ値は増加し、ヤク毛束におけるΔＥ値は、０．２ｍｇ  タンパク質相当量の本発明の培養物によって一定値に達し、羊毛布におけるΔＥ値は、０．５ｍｇ  タンパク質相当量の本発明の培養物によって一定値に達した。
実施例８  フェノールオキシダーゼ様活性の誘導条件の検討
（１）菌体の培養
前記実施例１（１）で得られた培養物（液体培養物）を、弱酸性から弱アルカリ性までの範囲の５つの培養ｐＨ条件（初期ｐＨ：ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）の液体培養用培地２（実施例１記載の培地）で培養し、酸化活性（フェノールオキシダーゼ様活性誘導）の差異を調べた。
前記液体培養物をよく撹拌し、得られた培養物  ０．５ｍｌを、１００ｍｌの活性誘導培地に添加し、２８℃の恒温槽内で、振盪培養（振盪速度１３０回転／分）を１０日間行なった。
毎日、１ｍｌずつ培養物を採取し、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ（０．２０μｍ）で濾過することにより、菌体を除去した。
得られた試料を４℃で保存した。
（２）培養ｐＨ条件による活性誘導の変化の検討
前記（１）で得られた各試料のフェノールオキシダーゼ様活性を測定することにより、培養ｐＨ条件による活性誘導の変化を調べた。
フェノールオキシダーゼ様活性の測定は、基質として、２，６−ジメトキシフェノールを用い、ｐＨ６．０の反応ｐＨ条件下に、フェノールオキシダーゼ様活性を測定した。
５００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．２０ｍｌと、脱イオン蒸留水  ０．６５ｍｌと、５０ｍＭ  前記基質溶液  ０．１０ｍｌと、培養物  ０．０５ｍｌとを、セミマイクロキュベットに添加し、撹拌し、室温下、商品名：ＵＶ−２４００（島津製作所製）で、０〜３０秒の４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。培養ｐＨ条件による活性誘導の変化を図６に示す。
その結果、図６に示されるように、用いた培地のｐＨが高くなるほど、２，６−ジメトキシフェノールの反応至適ｐＨであるｐＨ６．０における酵素活性が高くなることがわかる。特に、用いた培地のｐＨが、ｐＨ７．０（培養時ｐＨ７．３前後）を超える値である場合、２，６−ジメトキシフェノールの反応至適ｐＨであるｐＨ６．０における酵素活性が高くなることがわかる。
一方、用いた培地のｐＨが、ｐＨ５．０である場合、菌体を１０日間培養しても、２，６−ジメトキシフェノールに対する酵素活性は認められなかった。
また、図６に示されるように、用いた培地のｐＨが、ｐＨ９．０である場合、培養１０日目における活性は、用いた培地のｐＨが、ｐＨ６．０である場合の培養１０日目における活性に比べて、約１０倍（０．２８３／０．０２７）活性が高いことがわかる。
したがって、培養物におけるフェノールオキシダーゼ様活性は、ｐＨ７．０を超えるｐＨの培地を用いることにより、より誘導されることがわかる。
試験例
（１）菌体の培養
大豆  ２５０ｇをミキサーで破砕し、得られた破砕物を、１Ｌ容ナス型フラスコに入れ、さらに、ヘキサン  ７５０ｍｌを添加した。得られた混合物を、ヘキサンが淡黄色に変化するまでガラス棒で撹拌した後、オイルバスで８５℃で加熱した。加熱開始から１時間後、加熱を終了させ、得られた産物を、アドバンテック（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製、Ｎｏ．２ろ紙で濾過した。
その後、得られた濾物をさらに吸引濾過した。ドラフト内で２４時間放置して、ヘキサンを蒸発させ、得られた大豆粕を乾燥させた。
ついで、培地（組成：２．０重量％  グルコース、１．０重量％  スクロース、２．０重量％  大豆粕、０．５重量％  コーンスチープリカー、０．１重量％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５重量％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０γ／ｍｌ、ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）を調製した。なお、かかる培地は、特開昭６０−１５６３８５号公報に記載の培地である。
前記実施例１（１）で得られた培養物（液体培養物）０．２ｍｌを、前記培地  ３０ｍｌが入った３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、２８℃の恒温槽内で、振盪培養（振盪速度１３０回転／分）を４日間行なった。ついで、得られた培養液を、前記培地  ３００ｍｌが入った２Ｌ容三角フラスコに添加し、２０〜２５℃の室温条件下で、振盪培養（振盪速度１３０回転／分）を４日間行なった。
培養終了後、培養液を、アドバンテック（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製、Ｎｏ．２ろ紙を用いて、吸引濾過し、菌体を除去した。その後、得られた濾液を４℃、１４，８００ｒｐｍ（３０，０００×ｇ）で３０分間遠心分離し、上清を培養物として得た。得られた培養物は、４℃で保存した。
（２）反応ｐＨ条件による酵素活性の変化
フェノールオキシダーゼ様活性の測定には、基質として、２，６−ジメトキシフェノール及びＰ−フェニレンジアミンのそれぞれを用いた。また、フェノールオキシダーゼ様活性の測定において、ｐＨ２．５〜４．０ではグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ４．０〜５．５では酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５ではリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５〜８．５ではトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１．０ではグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。なお、ｐ−フェニレンジアミンを基質として用いる場合、フェノールオキシダーゼ様活性の測定の際、ｐＨ３．０〜７．０において、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いた測定も行なった。
５００ｍＭ  前記緩衝液  ０．２０ｍｌと、脱イオン蒸留水  ０．６５ｍｌと、５０ｍＭ  前記基質溶液  ０．１０ｍｌと、培養物  ０．０５ｍｌとを、セミマイクロキュベットに添加し、撹拌し、室温下、商品名：ＵＶ−２４００（島津製作所製）で、０〜３０秒の４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。なお、前記実施例１で得られた本発明の培養物についても同様にフェノールオキシダーゼ様活性を測定した。これらの結果を図７に示す。
その結果、実施例１で得られた本発明の培養物（図７のパネルＣ及びパネルＤ）の場合に比べ、前記（１）で得られた培養物（図７のパネルＡ及びＢ）の場合は、いずれの基質を用いた場合にも、酸性側に至適ｐＨを有することが示された。
したがって、本発明の培養物におけるフェノールオキシダーゼ様活性と、ｐＨ６．０の条件下に培養して得られた培養物のフェノールオキシダーゼ様活性とは、明らかに異なることがわかる。
処方例
以下に、本発明に係る染色用組成物の処方例を示す。以下の組成物を白髪の毛髪に適用すると、白髪を目立たなく染色することができる。なお、配合量は重量％である。
処方例１（ジェルタイプ）
ｐ−フェニレンジアミン                      １．５
レゾルシン                                  ０．３
ｍ−メタアミノフェノール                    ０．１
実施例１（２）の培養物                      ０．１
アスコルビン酸ナトリウム                    １．０
ヒドロキシエチルセルロース                  １．０
クエン酸                                      適量
モノエタノールアミン                  ｐＨ７に調整
精製水                                        残部
合    計                            １００．０
処方例２（クリームタイプ）
ｐ−フェニレンジアミン                      １．０
ｐ−アミノフェノール                        ０．８
ｍ−アミノフェノール                        ０．１
セタノール                                  ６．０
実施例１（２）の培養物                      ０．０５
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル    ４．０
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム        １．０
Ｌ−システィン塩酸塩                        ０．２
クエン酸                                      適量
モノエタノールアミン                  ｐＨ７に調整
精製水                                        残部
合    計                            １００．０
処方例３（クリームタイプ）
５，６−ジヒドロキシインドリン              １．０
５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸
０．５
ｏ−アミノフェノール                        ０．５
エタノール                                  ５．０
ステアリルアルコール                        １．５
実施例１（２）の培養物                      ０．２
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油      ３．０
ポリグリセリン脂肪酸エステル                ４．０
Ｎ−アセチルシステイン                      ０．１
キサンタンガム                              ０．５
アキュリン（登録商標）２２                  ０．１
ヒドロキシエチルセルロース                  ０．１
モノイソプロパノールアミン                    適量
モノエタノールアミン                          適量
精製水                                        残部
合    計                            １００．０
処方例４（エアゾールタイプ）
トルエン−２，５−ジアミン                  １．５
ｐ−アミノフェノール                        ０．２
レゾルシン                                  ０．１
ｍ−アミノフェノール                        ０．１
ポリオキシエチレン（１５）セチルエーテル    ２．０
プロピレングリコール                        ５．０
亜硫酸ナトリウム                            ０．３
モノエタノールアミン                          適量
クエン酸                                      適量
実施例１（２）の培養物                      ０．３
液化石油ガス                                ４．０
精製水                                        残部
合    計                            １００．０
【産業上の利用可能性】  本発明の培養物によれば、繊維や毛髪の染色、パルプ及び繊維の漂白、廃液中のフェノール化合物の除去、内分泌攪乱物質の分解、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、木質の改善等に利用でき、しかも、安価に、かつ簡便に行なうことができる。また、本発明の培養物の製造方法によれば、簡便に、安価に、かつ大量に前記培養物を得ることができる。さらに、本発明の染色方法及び染色用組成物によれば、外界環境条件下おいて種々の染料、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、フェニレンジアミン化合物のいずれに対しても至適ｐＨに大きな変動がなく、中性付近のｐＨで効率よく染色対象物を、安価に、かつ簡便に染色することができ、繊維や毛髪の染色に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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