(57)【要約】本発明は、これまでとは全く異なった、アミノアシルｔＲＮＡの化学的合成法であって、遺伝子工学的手法を必要とせず、簡便で、且つどのような非天然アミノ酸でもアミノアシル化することが出来、更には、放射性同位体を用いずに検出することが出来る、アミノアシルｔＲＮＡの効率的で且つ実用性の高い合成法を提供することを目的とする。本発明は、ｔＲＮＡとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させるか、又は、ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることによりｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させる、上記アミノアシル化方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化してアミノアシルｔＲＮＡを製造するに際し、ｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させることを特徴とする、ｔＲＮＡのアミノアシル化方法。
【請求項２】
ｔＲＮＡとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させる、請求の範囲第１項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項３】
アミノ酸のカルボキシル基を活性化して、これをミセル中に閉じこめ、このミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中界面近傍で、当該３’末端水酸基と活性化されたカルボキシル基とを近接させて反応させる請求の範囲第２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項４】
アミノ酸のカルボキシル基をミセル内部で縮合剤を用いて活性化し、このミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中の界面近傍で、当該３’末端水酸基と活性化されたカルボキシル基とを近接させて反応させる請求の範囲第２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項５】
ペプチド核酸末端へ疎水性官能基を導入したものを、ｔＲＮＡの３’末端近傍へ疎水基が来るように、ｔＲＮＡへ部位特異的相補結合させて、３’末端基部分を疎水性にすることにより、ミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入する、請求の範囲第３項又は第４項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項６】
アミノ基を保護したアミノ酸を用いる請求の範囲第２項〜第５項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項７】
界面活性剤の存在下で反応を行う請求の範囲第２項〜第６項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項８】
ポリエチレンイミン又は表面にカチオン性基を持ったデンドリマーの存在下で反応を行う請求の範囲第２項〜第６項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項９】
Ｏ／Ｗ（水中油滴）型のミセル中で反応を行う請求の範囲第２項〜第８項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１０】
オイルフリーの系で反応を行う請求の範囲第２項〜第８項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１１】
中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒を用いて反応を行う請求の範囲第２項〜第１０項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１２】
ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることによりｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させる、請求の範囲第１項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１３】
アミノ酸を予めエステル結合によりアンチセンス分子に結合させて、ｔＲＮＡと反応させる請求の範囲第１２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１４】
アミノ酸を活性エステルを介してアンチセンス分子に結合させたものを用いて反応を行う、請求の範囲第１３項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１５】
アンチセンス分子と活性エステルの間にリンカーを存在させたものを用いて反応を行う、請求の範囲第１４項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１６】
アンチセンス分子の他端にカチオン性アミノ酸が導入されたものを用いる請求の範囲第１３項〜第１５項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１７】
下記一般式［１］
Ｈ−ｃＡｍ−ＰＮＡ−Ｌ−Ｅ−Ａｍ      ［１］
［式中、−ｃＡｍ−はカチオン性アミノ酸残基又は２〜５のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、−ＰＮＡ−はペプチド核酸残基を表し、−Ｌ−はリンカーを表し、−Ｅ−は活性エステル残基を表し、−ＡｍはｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸残基を表す。］で示される化合物を用いてｔＲＮＡと反応を行う請求の範囲第１２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１８】
中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒を用いて反応を行う請求の範囲第１２項〜第１７項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１９】
反応停止剤を用いる請求の範囲第１２項〜第１８項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項２０】
反応停止剤がｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸と相補対を形成するペプチド核酸である請求の範囲第１９項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２１】
ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸以外に、更に、ＤＮＡをアンチセンス分子として用いて反応を行う請求の範囲第１２項〜第１８項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項２２】
反応系の温度を上昇させて反応を停止させる請求の範囲第２１項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２３】
反応系の温度を２５℃に上昇させて反応を停止させる請求の範囲第２２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２４】
一般式［１］
Ｈ−ｃＡｍ−ＰＮＡ−Ｌ−Ｅ−Ａｍ      ［１］
［式中、−ｃＡｍ−はカチオン性アミノ酸残基又は２〜５のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、−ＰＮＡ−はペプチド核酸残基を表し、−Ｌ−はリンカーを表し、−Ｅ−は活性エステル残基を表し、−ＡｍはｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸残基を表す。］で示される化合物。
【請求項２５】
一般式［１］において、−ｃＡｍ−が−ＬｙｓＬｙｓ−であり、−ＰＮＡ−が−ＣＧＴＧＧＴ−であり、−Ａｍが非天然アミノ酸である請求の範囲第２４項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ｔＲＮＡのアミノアシル化方法に関する。詳しくは、本発明は、非天然アミノ酸を蛋白質に導入する際に必須となる、アミノ酸（非天然アミノ酸）のｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ）への付加方法（ｔＲＮＡのアミノアシル化法）に関するものである。なお、本方法は当然のことながら天然アミノ酸にも適用可能である。
【背景技術】  ゲノム研究が進み、総合的なプロテオーム研究が現実的なものとなってきている。とは言え、構造が複雑で、数も多い蛋白質の働きを把握しようというのは並大抵の難しさではない。そこで蛋白質の機能解析方法として蛋白質のある特定部位に機能性アミノ酸を導入することで複雑な蛋白質に人工的な機能を付加し、蛋白質の構造及び機能を解明することが必要とされるようになってきた。
一方、非天然アミノ酸を導入した蛋白質の作成が、プロテオーム解析、薬効など有意な性能を示す蛋白質の創製、などから、必要視されている。
非天然アミノ酸含有蛋白質の作製には、非天然アミノ酸のｔＲＮＡへの付加（ｔＲＮＡのアミノアシル化）が、必須である。これについては、多くの研究がなされているが、その代表的手法も非常に煩雑なものである。これが、非天然アミノ酸含有蛋白質の開発のネックとなっている。
現在、世界中の研究者達がアミノアシル化を様々な手法で試みている。最も一般的な手法として用いられているのはＨｅｃｈｔらが開発した化学的アミノアシル化である。この手法は通常のｔＲＮＡよりも２残基短いｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔＲＮＡを生化学的手法にて作製し、一方で化学的にアミノアシル化した２残基を化学合成し、次に両者を連結酵素リガーゼで結合させる、という煩雑で、高度な技術が必要とされる手法である（例えば、先行技術文献１参照。）。また、この手法では合成、できるアミノアシルｔＲＮＡの収量も少なく、収率アップもあまり期待出来ない。
また、Ｓｃｈｕｌｔｚらは遺伝子工学的手法を用いて天然のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を改変し非天然アミノ酸の導入を試みている（例えば、先行技術文献２参照。）。この手法は高度な技術が必要とされ、収率も低い。そして種々の側鎖構造を持ち得る非天然アミノ酸を基質とする為には技術的に限界がある。
更に、菅らはＨｅｃｈｔらとは異なった手法でアミノアシル化を試みている。この手法は試験管内で進化させた機能性ＲＮＡ（リボザイム）を作製し、ｔＲＮＡをアミノアシル化させる（例えば、先行技術文献３参照。）。この手法では非天然アミノ酸を用いたアミノアシル化は成功しておらず、また、ｔＲＮＡに対して基質となるアミノ酸−ＲＮＡを１００倍等量加えなくては生成物を得られない。そして、何よりも操作が煩雑である。
山下らはアミノアシルｔＲＮＡヒドロラーゼを利用したアミノアシル化を報告している（例えば、先行技術文献４参照。）。この手法は実用性に乏しく、現実には殆ど用いられていない。理由としては、基質特異性の問題も含めてアミノアシル化の収率が低いこと、酵素の安定性が低いこと等が挙げられる。
また、本発明者らは、先にアンチセンス分子を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化について検討した結果を日本化学会で発表しているが（例えば、先行技術文献５参照。）、ここではその可能性について発表したに過ぎず、この段階では、未だｔＲＮＡのアミノアシル化に成功したわけではなく、ｔＲＮＡのアミノアシル化の新規で効果的な方法が見出されたわけでも、ｔＲＮＡのアミノアシル化の具体的な操作手順が確立されたわけでもない。
本出願の発明に関連する先行技術文献としては以下のものがある。
１．  Ｈｅｃｋｌｅｒ，Ｔ．Ｇ．；Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｈ．；Ｚａｍａ，Ｙ．；Ｎａｋａ，Ｔ．；Ｃｈｏｒｇｈａｄｅ，Ｍ．Ｓ．；Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９８４，２３，１４６８−．
２．  Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ，；Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９８９，２４４，２８２−．
３．  Ｂｅｓｓｈｏ，Ｙ．；Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｄ．Ｒ−Ｗ；Ｓｕｇａ，Ｈ．ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），２００２，２０，７２３−７２８．
４．  特開平６−２６１７５６号公報
５．  日本化学会講演予稿集，ＶＯＬ．７９ｔｈ，Ｎｏ．２，８７３頁，２００１年
【発明の開示】
本発明は、これまでとは全く異なった、アミノアシルｔＲＮＡの化学的合成法であって、遺伝子工学的手法を必要とせず、簡便で、且つどのような非天然アミノ酸でもアミノアシル化することが出来、更には、放射性同位体を用いずに検出することが出来る（従来技術として記載した上記４例（先行技術文献１〜４）は何れも放射性同位体を用いている。）、アミノアシルｔＲＮＡの効率的で且つ実用性の高い合成法を提供することを目的とする。
本発明は、ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化してアミノアシルｔＲＮＡを製造するに際し、ｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させることを特徴とする、ｔＲＮＡのアミノアシル化方法に関する。
より具体的には、本発明は、ｔＲＮＡとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させるか、又は、ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることにより両者を近接させて反応させる、上記アミノアシル化方法に関する。
また、本発明は、下記一般式［１］
Ｈ−ｃＡｍ−ＰＮＡ−Ｌ−Ｅ−Ａｍ      ［１］
［式中、−ｃＡｍ−はカチオン性アミノ酸残基又は２〜５のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、−ＰＮＡ−はペプチド核酸残基を表し、−Ｌ−はリンカーを表し、−Ｅ−は活性エステル残基を表し、−ＡｍはｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸残基を表す。］で示される化合物を用いてｔＲＮＡとの反応を行う上記アミノアシル化方法に関する。
更に、本発明は、上記アミノアシル化方法に使用し得る上記一般式［１］で示される化合物に関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ミセル系でのアミノアシル化に用いるペプチド核酸の構造を示す。
第２図は、アンチセンス分子によるｔＲＮＡアミノアシル化の反応機構を示す。
第３図は、アンチセンス分子を用いたｔＲＮＡアミノアシル化方法において用いられるアミノ酸−アンチセンス分子の構造を示す。
第４図は、アンチセンス分子を用いた二元系におけるアミノアシル化の解析方法を示す。
第５図は、ＤＮＡをテンプレートとしたペプチド核酸によるアミノアシル化（アンチセンス分子を用いた三元系アミノアシル化）の解析方法を示す。
第６図は、各種非天然アミノ酸の例示である。
第７図は、ＨＰＬＣ及びＴＯＦ−ＭＳによるアミノアシル化の検出を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  ｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させる方法としては、例えば、ｔＲＮＡとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させる方法（以下、方法１と呼ぶ。）、ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることにより両者を近接させて反応させる方法（以下、方法２と呼ぶ。）等がある。
方法１には、アミノ酸のカルボキシル基を活性化して、これをミセル中に閉じこめ、このミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中界面近傍で、当該３’末端水酸基と活性化されたカルボキシル基とを近接させて反応させる方法（方法１−１）と、アミノ酸のカルボキシル基をミセル内部で縮合剤を用いて活性化し、このミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中の界面近傍で、当該３’末端水酸基と活性化されたカルボキシル基とを近接させて反応させる方法（方法１−２）とが有る。
即ち、アミノアシル化反応とはｔＲＮＡの３’末端の水酸基（２’−，３’−何れも可）とアミノ酸のカルボキシル基とが脱水縮合することを言うのであるが、ここで問題になるのは、どちらも反応性が低いｔＲＮＡの水酸基とカルボキシル基とを副反応（例えば溶媒に用いている水とカルボキシル基との縮合等）させることなく両者を反応させることである。その為にアミノ酸のカルボキシ基を反応性が高い構造（活性化）にした上でこれを用いている。活性化の方法としては二つ有り、その一つは有機合成的手法を用いてアミノ酸を活性化する方法（即ち、上記方法１−１）で有り、他の一つはミセル内部で縮合剤を用い、アミノ酸を活性化する方法（即ち、上記方法１−２）である。
どちらの方法で行うかは任意であるが、方法１−２のメリットとしては、例えば、１）アミノ酸を活性化させずに用いることが出来る、２）ミセル中で活性エステルを形成させるので活性化アミノ酸のように単離精製する必要が無く不安定な活性化アミノ酸でも用いることが出来る、等の点が挙げられる。
方法１−１で用いられる活性化アミノ酸としては、例えば、以下の如きものが挙げられる。
ａ）エステル系
アミノ酸シアノメチルエステル（Ｎｖｏｃ−ａａ−ＯＣＭ）
アミノ酸フェノールエステル（Ｎｖｏｃ−ａａ−ＯＰｈｅ）
ｂ）スクシンイミド系
アミノ酸スクシンイミドエステル（Ｎｖｏｃ−ａａ−ＯＳｕ）
ｃ）チオエステル系
アミノ酸チオエステル（Ｎｖｏｃ−ａａ−ＳＥ）
アミノ酸チオフェノールエステル（Ｎｖｏｃ−ａａ−ＳＰｈｅ）
ｄ）イミダゾール系
アミノ酸イミダゾライド（Ｎｖｏｃ−ａａ−Ｉｍ）
ｅ）酸無水物系
アミノ酸対称酸無水物（（Ｎｖｏｃ−ａａ）２Ｏ）
アミノ酸混合酸無水物（Ｎｖｏｃ−ａａ−Ｏ−Ｘ）
注）Ｎｖｏｃ：６−ニトロベラトリル基、−ａａ−：アミノ酸残基
方法１−２（ミセル内部で縮合剤を用い、アミノ酸を活性化する方法）で用いられる縮合剤としては、例えば、以下の如きものが挙げられる。
２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジウム  ヘキサフルオロホスフェイト：ＣＩＰ
Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール：ＣＤＩ
ジエチルホスフォロシアニデート：ＤＥＰＣ
ジシクロヘキシルカルボジイミド：ＤＣＣ
なお、方法１で用いられるアミノ酸は、アミノ基を保護して用いることが好ましい。保護基導入が必要な理由は、アミノ酸の活性化部位とアミノ基とを分子間で反応させないためである。アミノ基の保護基としては、アミノアシル化後、容易に除去可能なもので有れば、何れの保護基でも良いが、例えば６−ニトロベラトリル基（Ｎｖｏｃ：３５４ｎｍの紫外光を照射することで脱離可能）やペンテノイル基（Ｐｅｎｔｅｎｏｙｌ）等が好ましいものとして挙げられる。前者はアミノアシル化後蛋白質合成系に用いる際、ＵＶランプを１０分ほど照射することで脱離可能である。また、後者はアミノアシル化後、蛋白質合成系に用いる際、約１０ｍＭのヨウ素液で１０分位室温で処理することにより簡単に脱離可能である。
本発明の方法１は、通常、界面活性剤の存在下で行われる。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでも良く、また、数種の界面活性剤を混合した系（例えば非イオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤）も使用可能であるが、カチオン性界面活性剤を用いた系が最も高収率でアミノアシルｔＲＮＡを得ることが出来る。カチオン性界面活性剤の好ましい具体例としては、例えばセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）等が挙げられる。アニオン性界面活性剤の好ましい具体例としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。両性界面活性剤の具体例としては、例えばホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。また、非イオン性界面活性剤としては、エーテル型、エーテルエステル型、エステル型、含窒素型等何れのものでも良いが、例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等のエーテルエステル型の非イオン性界面活性剤が好ましいものとして挙げられる。より具体的な商品名としては、Ｔｗｅｅｎ＃−２０，４０，６０，８５等が挙げられる。
また、界面活性剤を使用する代りに、ポリエチレンイミンや表面にカチオン性基を持ったデンドリマーを使用した系も可能である。
ミセルはＯ／Ｗ（水中油滴）型が好ましいが、Ｗ／Ｏ型（逆ミセル）やオイルフリーの系等も可能である。なお、オイルフリーの系で用いられる溶剤としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等が挙げられる。
また、Ｏ／Ｗ（水中油滴）型でのオイル分としては、例えば、トルエンや酢酸エチル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等が挙げられる。
本発明の方法１において、ミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入する方法としては、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）末端へ疎水性官能基を導入したものを、ｔＲＮＡの３’末端近傍へ疎水基が来るように、ｔＲＮＡへ部位特異的相補結合させて、３’末端基部分を疎水性にする方法が挙げられる。
本発明の方法１において用いられるペプチド核酸（ＰＮＡ）としては、合成し易くｔＲＮＡとの結合を制御しやすい、鎖長ｎ＝４〜１０のものが挙げられる。
また、ＰＮＡに導入する官能基としては、例えば、リトコール酸等のコール酸残基（ステロイド骨格を有する）、デカン酸等の水に難溶性の脂肪族カルボン酸残基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等のアミノ保護基等が挙げられる。
疎水性官能基をアミド結合によりペプチド核酸に導入する方法としては固相合成を用いる方法が一般的である。
方法１で用いられるペプチド核酸（ＰＮＡ）の他端は、通常、水溶性を高めるため、及びポリアニオンであるｔＲＮＡとの親和性を高めるためにカチオン性アミノ酸、例えばリジン等が１乃至数分子（通常２分子、例えばＬｙｓＬｙｓ等）導入される。
方法１で用いられるＰＮＡの構造の具体例を第１図に示す。
本発明の方法１におけるｔＲＮＡのアミノアシル化反応は、通常、エステル交換触媒の存在下に行われる。
本発明の方法において用いられるエステル交換触媒としては、中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒が挙げられ、より具体的には、例えば、イミダゾール、ピリジン、ジメチルアミノピリジン等が挙げられ、イミダゾール（ｐＫａ６．８）が特に好ましい。
アミノアシル化反応における反応温度は、通常０〜５０℃である。
反応温度の決定は用いるＰＮＡの鎖長に依存する。即ち、短い鎖長を用いる場合は低温、長い鎖長は高温で、となる。
反応ｐＨは生理的条件範囲、即ち、ｐＨ７付近（±１．０）で行われる。
以下に、方法１のアミノアシル化方法の操作手順の一例を示す。
アミノアシル化操作手順：
１．イミダゾール緩衝液をマイクロチューブに入れ、次に界面活性剤を加える。
２．超音波処理を５分間行いミセル化する。
３．アミノ酸活性エステルを加え激しく撹拌する。
４．ｔＲＮＡを加えて撹拝し室温にて反応を開始させる（１時間）
反応後は、抽出（フェノールクロロホルム抽出）によりペプチド核酸をｔＲＮＡから除去後、塩析（エタノール沈殿）によりｔＲＮＡを沈殿させることで単離する。
以下に、本発明のアミノアシル化方法全てに、ほぼ共通した単離精製方法の操作手順の一例を示す。
単離精製法操作手順
１．反応混合液（〜２０μＬ）に４０μＬの１．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）を加える。
２．溶液と同量のフェノールを加える。
３．激しく撹拌後、４℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心する。
４．上層（水層）を取り他のマイクロチューブに移す。このときＰＮＡは界面にあるので一緒に取らないようにする。
５．下層（フェノール層）に４０μＬの１．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）を加える。
６．激しく撹拌（ボルテツクスで）後に４０℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心する。
７．上層（水層）を取り他のマイクロチューブに移す。このときＰＮＡは界面にあるので一緒に取らないようにする。集めた上層と同量のクロロホルムを加え、撹拌後に４℃、１５０００ｒｐｍで、２分間遠心しクロロホルム層（下層）を除去する。
８．溶液の３倍量の１００％エタノールを加え、軽く撹拌し−３０℃で，３０分間放置する。
９．４℃、１５０００ｒｐｍで、３０分間遠心する。
１０．上清（上澄液）をピペットマンで取り除く。このときに下の沈殿物（核酸）を取らないように注意する。
１１．９０％エタノール２００μＬを静かに加える。
１２．４℃、１５０００ｒｐｍで、５分間遠心する。
１３．上清（上澄液）をピペットマンで取り除く。このときに下の沈殿物（核酸）を取らないように注意する。
１４．乾燥（減圧下）する。
アミノアシル化の解析はＨＰＬＣ及びＴＯＦ−ＭＳを用いて行えば良い。方法としてはアンチセンス分子によりアミノアシル化されたｔＲＮＡをｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１にてアミノアシル末端をモノヌクレオチドに分解する方法が好適である。
もし、アミノアシル化されているのであればアミノアシルＡＭＰを検出出来る。
次に、ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることによりｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させる方法（方法２）について述べる。
ｔＲＮＡの３’末端水酸基とアミノ酸を反応させるために、ｔＲＮＡに対して相補的配列をもつアンチセンス分子としてペプチド核酸（ＰＮＡ）を用い、且つ、このＰＮＡ末端に予めアミノ酸活性化エステルを結合させておき（必要に応じてリンカーなども併用）、このアミノ酸結合ＰＮＡを、アミノ酸がｔＲＮＡの３’水酸基に近接するように、ｔＲＮＡへ相補結合させる、このようにして、エステル交換反応させれば、３’水酸基が選択的にアミノアシル化されることを本発明者らは見出した。
また、ＤＮＡをアンチセンス分子として併用し、このＤＮＡへ、上記のアミノ酸結合ＰＮＡを相補結合させると共に、アミノ酸が３’水酸基に近接するようにＤＮＡをｔＲＮＡに相補結合させる、これを、同様にエステル交換させて、３’水酸基がアミノアシル化出来ることも確認した。
便宜上、前者を二元系、後者を三元系と呼ぶ。
いずれにおいても、アンチセンス分子は、反応後、離脱させる。
それぞれの特徴は反応停止剤が異なる点であり、前者（二元系）の場合はアンチセンス分子と相補対形成するアンチセンス分子を用いる点であり、後者（三元系）は温度を上昇させる（例えば２５℃）点である。
また、前者は、ＤＮＡを用いないため、反応場の環境対応性に巾がある（ＰＮＡがより安定）点であり、後者は、より多種類の非天然アミノ酸に対応出来る点である。
アミノアシル化の反応機構を第２図に示す。
アンチセンス分子（ＡＯと記載）は１）混合することでｔＲＮＡを塩基配列特異的に結合する、２）反応開始剤を加えることでアミノアシル化活性を発現する、３）反応停止剤を加えることでｔＲＮＡと解離する、の三段階にて目的とするｔＲＮＡを完璧な制御の下にアミノアシル化する。
以下、二元系、三元系で用いられるアンチセンス分子の構造について順を追って説明する。
（１）二元系で用いられるアンチセンス分子について
好ましいアンチセンス分子（ＡＯ）の構造：
ＰＮＡとしては、ｔＲＮＡと結合する配列として、鎖長４〜１０（合成し易くｔＲＮＡとの結合を制御しやすい鎖長範囲）のものが好ましい。具体例としては、例えば、鎖長ｎ＝９のＡＡＧＣＧＴＧＧＴ、鎖長ｎ＝８のＡＧＣＧＴＧＧＴ、鎖長ｎ＝７のＧＣＧＴＧＧＴ、鎖長ｎ＝６のＣＧＴＧＧＴ等が好ましいものの例として挙げられる。
水溶性を高めるため、そしてポリアニオンであるｔＲＮＡとの親和性を高めるために末端にはカチオン性アミノ酸、例えばリジン等を１乃至数分子（通常２分子）導入することが好ましい。また、活性エステルとｔＲＮＡの水酸基とを近接させるためにリンカーを用いるのが好ましい。
リンカーとしては、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、或いは、下式
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で示される基（ａｂＺと略す。）等が挙げられる。
上記ａｂＺはペプチド結合とフエニル環との間が共役系になっているためにＰＮＡ−ｔＲＮＡの塩基対の共役系とπ電子系相互作用することが期待され、結果として反応部位の近接が狙える可能性がある。
活性エステル化の方法としては、固相合成によりこれを行えばよい。
アミノ酸−アンチセンス分子（ａａ−ＰＮＡ）の合成法の一例を以下に示す。
Ｆｍｏｃ−ＳＡＬ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎ（ＷＡＴＡＮＡＢＥ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）にＰＮＡモノマー（アプライド  バイオシステム社）を合成する配列に従い伸長させる。
縮合剤としては、例えば、ｏ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート：ＨＡＴＵ（ＷＡＴＡＮＡＢＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ジイソプロピルエチルアミン：ＤＩＥＡ（ＷＡＴＡＮＡＢＥ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）等が使用し得る。
溶媒としては、例えば、ジメチルアセトアミド：ＤＭＡＡ（ＷＡＤＮＡＢＥ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用）等が好ましく使用し得る。
次いでリンカー、活性エステル、アミノ酸を順次縮合させることで合成し、合成後はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にて切り出しを行い、ＨＰＬＣにて精製することにより目的物が得られる。
活性エステルとしては、例えば、チオエステル誘導体、シアノメチルエステル誘導体、スクシンイミドエステル、ｍ−（又はｐ−）置換フェニルエステル誘導体等が好ましく用いられる（第３図に構造式記載）。
本発明で用いられるアミノ酸−アンチセンス分子（ａａ−ＰＮＡ）の好ましい例としては、例えば、下記一般式［１］
Ｈ−ｃＡｍ−ＰＮＡ−Ｌ−Ｅ−Ａｍ      ［１］
［式中、−ｃＡｍ−はカチオン性アミノ酸残基又は２〜５のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、−ＰＮＡ−はペプチド核酸残基を表し、−Ｌ−はリンカーを表し、−Ｅ−は活性エステル残基を表し、−ＡｍはｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸残基を表す。］で示される化合物が挙げられる。
各構成成分の詳細については既に述べた通りである。
なお、ｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸は、天然、非天然の何れにても良いが、これまでｔＲＮＡへの付加（ｔＲＮＡのアミノアシル化）が非常に困難とされていた非天然アミノ酸に適用するのがより効果的である。
適用可能な非天然アミノ酸としては、例えば、蛍光性アミノ酸、電子供与性アミノ酸、電子受容性アミノ酸、光分解性アミノ酸、光異性化アミノ酸等種々のアミノ酸が挙げられる。
本発明で用いられるアミノ酸−アンチセンス分子（ａａ−ＰＮＡ）の好ましい例を構造式で示すと第３図のようになる。
（２）三元系で用いられるアンチセンス分子について、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）と併用するアンチセンス分子としては、ＤＮＡが好ましい。ＲＮＡは高価（ＤＮＡの１０倍程度）であり、安定性がＤＮＡと比較して低く、ｔＲＮＡとの結合がＤＮＡと比較して弱いので好ましくない。また、ＰＮＡは、長鎖ＰＮＡになると合成が容易ではなく、また、ｔＲＮＡとの結合が強すぎるので温度での制御が難しい等の問題点がある。
好ましいＤＮＡの鎖長としては（７〜１２）＋（０〜２）＋（１０〜２３）のものが挙げられる。
（７〜１２）：ＰＮＡと結合（ハイブリッド）する配列。制御し易い長さに限定。
（０〜２）：活性エステル部位の長さに対応したスペーサー配列。
（１０〜２３）：ｔＲＮＡと結合する配列。制御し易い長さに限定。
一方、アンチセンス分子（ＡＯ）のＰＮＡとしては、ＤＮＡと結合し、ｔＲＮＡとは結合しない配列（鎖長７〜１２）のものが好ましい。
長すぎるとＤＮＡとの結合が強すぎる結果、結合を温度で解離することが難しくなり、一方、短すぎるとＤＮＡとの結合が弱すぎる結果、アミノアシル化が起こらなくなる。
なお、三元系で用いられる好ましいアミノ酸−アンチセンス分子（ａａ−ＰＮＡ）の構造及び合成法は、２元系におけるそれに準ずる。
次に、アンチセンス分子を用いた本発明のアミノアシル化法の反応条件について述べる。
反応温度は、通常、アミノアシル化活性がある０〜２０℃で行われる。３７℃では不活性である。結合が完全に切れるのは４５℃であるが、それぞれの成分がしっかりと結合しないと反応効率は低下する。
反応温度の決定は用いるＰＮＡの鎖長に依存する。即ち短い鎖長を用いる場合は低温、長い鎖長は高温で、となる。反応ｐＨは生理的条件範囲、つまりｐＨ７付近（±１．０）で行う。
反応は、反応開始剤（触媒）の存在下で行われるが、用いられる反応開始剤としては、中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒が挙げられ、より具体的には、例えば、イミダゾール、ピリジン、ジメチルアミノピリジン等が挙げられ、イミダゾール（ｐＫａ６．８）が特に好ましい。
また、本反応においては、酢酸ナトリウム緩衝液等も反応開始剤として効果的に使用し得る。
反応の停止は、２元系では反応停止剤を用いて行われる。
反応停止剤としては、ａａ−ＰＮＡと相補対を形成するＰＮＡオリゴマー（ｃＰＮＡ）が好ましく用いられる。二重鎖を形成するときの安定性はＰＮＡ−ＰＮＡ＞ＰＮＡ−ＲＮＡ＞ＰＮＡ−ＤＮＡであることが知られている。従って、ｃＰＮＡはｔＲＮＡと結合したａａ−ＰＮＡをｔＲＮＡから引き剥がしてＰＮＡ二重鎖を形成し得る。これにより反応を停止させることが出来る。
３元系では、反応の停止は、温度を上昇させることにより行われる。上昇させる温度としては、通常２５℃乃至それ以上の温度である。
以下に、方法２のアミノアシル化方法の操作手順の一例を示す。
アミノアシル化操作手順：
２元系の場合
１．バッファーをマイクロチューブに入れ、ｔＲＮＡ、ａａ−ＰＮＡを加える。
２．氷上に５分間静置し、ｔＲＮＡとａａ−ＰＮＡとを結合させる。
３．反応開始剤（イミダゾール緩衝液）を加え氷上にて反応させる（通常１〜２時間）。
１〜２時間反応させた後、反応停止剤ｃＰＮＡを加え、反応を停止させる。
また、３元系の場合は概略、以下の通りである。
１．バッファーをマイクロチューブに入れ、ｔＲＮＡ及びテンプレートＤＮＡを加えて、ボルテックス撹拌し、スピンダウンして、両者をハイブリッドさせる。
２．これにａａ−ＰＮＡを加えて、ボルテックス撹拌し、スピンダウンして、氷上に５分間静置する。
３．反応開始剤（イミダゾール緩衝液）を加え氷上にて反応させる（通常２時間）。
２時間反応させた後、氷浴を外し、温度を２５℃に上昇させて、反応を停止させる。
どちらの場合も、反応後の単離精製方法は、ミセル系での方法（方法１）のところで記載した単離精製法に準じてこれを行うことで足りる。
２元系におけるアミノアシル化及び３元系におけるアミノアシル化（ＤＮＡをテンプレートしたＰＮＡによるアミノアシル化）のそれぞれについて解析し、図示化した結果を第４図及び第５図にそれぞれ示す。
本発明の方法によれば（方法１及び２の何れの方法においても）、天然、非天然を問わず、種々のアミノ酸を効率よくｔＲＮＡに導入、アミノアシル化することが出来るが、特に、従来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素ではｔＲＮＡに結合出来なかった非天然アミノ酸、例えば天然アミノ酸と大きく構造が異なる非天然アミノ酸や、蛍光性を有するアミノ酸、光異性化能を有するアミノ酸、酸化能力を有するアミノ酸、ＨＩＶウィルスに薬効があるアミノ酸等をｔＲＮＡに導入するのがより効果的である。
第６図に本発明の方法によりｔＲＮＡに導入可能な非天然アミノ酸を例示する。
第６図中、１，８，２１〜２３，３０〜３５のアミノ酸は、蛍光性を有するアミノ酸であり、２５のアミノ酸は光異性化能を有するアミノ酸であり、２８のアミノ酸は酸化能力を有するアミノ酸であり、１５のアミノ酸はＨＩＶウィルスに薬効があるアミノ酸である。
なお、特願２００２−２６２３０１明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
【実施例】  以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１（非イオン性ミセルを用いたｔＲＮＡのアミノアシル化）
非天然アミノ酸として側鎖にナフチル基を有する２−ナフチルアラニンを活性エステル化して用い、これをペプチド核酸（ＰＮＡ）の存在下、ｔＲＮＡと反応させてアミノアシル化を行った。なお、ＰＮＡとしては、疎水基としてＦｍｏｃ基を、また、可溶化部位としてＬｙｓＬｙｓ基を導入した、鎖長ｎ＝６のＣＧＴＧＧＴを用いた。
〈アミノアシル化反応液の組成〉
０．５Ｍ  Ｔｗｅｅｎ＃２０                ５μＬ（最終濃度＝２５０ｍＭ）
Ｎｖｏｃ−ｎａｐＡｌａ−ＯＣＭ（１Ｍ／トルエン）
１μＬ（最終濃度＝１００ｍＭ）
４Ｍイミダゾール−ＡｃＯＨ  ＰＨ６．５    １μＬ（最終濃度＝４００ｍＭ）
０．４ｍＭ  ｔＲＮＡ                      ２μＬ（最終濃度＝８０μＭ）
０．８ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＰＮＡ              １μＬ（最終濃度＝８０μＭ）
１０μＬ
〈操作手順〉
イミダゾール緩衝液、次いでＴｗｅｅｎ＃２０を加え、超音波によりミセル化させた。次に活性化アミノ酸Ｎｖｏｃ−ｎａｐＡｌａ−ＯＣＭを加え、ピペッチングにて混合した。透明になっていることを確認後、ｔＲＮＡ及びＦｍｏｃ−ＰＮＡを加えて反応を開始した。
１時間反応させた後、段落［００１６］に記載の単離精製法の操作手順に従ってフェノールクロロホルム処理及びエタノール沈殿によるｔＲＮＡ精製を行なった。収率：１４％。
〈ｎｕｃｌｅａｓｅ処理及びＨＰＬＣ分析〉
得られた化合物にｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１緩衝液（ＰＨ４．５）を１０μＬ加え、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１（１００ｕｎｉｔｓ／μＬ）を０．５μＬピベッティングしながら加えた。３７℃で１０分間インキュベートした後、ＨＰＬＣで分析した。
（ＨＰＬＣ測定条件）
０．１Ｍ酢酸アンモニウム／ＭｅＯＨ、流速＝０．６ｍｌ／ｍｉｎ、ＣＩ８カラム、２％ｕｐ（０−１００％）。
検出波長：２６０ｎｍ（ＵＶ−ｖｉｓ検出器），２８５／３３０ｎｍ（蛍光検出器）
その結果、ＨＰＬＣによりナフチルアラニルＡＭＰと思われるピークを検出し、そしてそのピークをＴＯＦ−ＭＳで分子量分析した結果、目的物であることが同定出来た（第７図参照）。
実施例２（非イオン性ミセルを用いたｔＲＮＡのアミノアシル化）
アミノアシル化反応液の組成を下記の如くした以外は実施例１と全く同様にして、反応及び後処理を行ない、得られた生成物を実施例１と同様にして分析して、実施例１と同様の結果を得た。収率：１３％。
〈アミノアシル化反応液の組成〉
０．５Ｍ  Ｔｗｅｅｎ＃４０                ５μＬ（最終濃度＝２５０ｍＭ）
Ｎｖｏｃ−ｎａｐＡｌａ−ＯＣＭ（ＩＭ／トルエン）
１μＬ（最終濃度＝１００ｍＭ）
４Ｍイミダゾール−ＡｃＯＨ  ＰＨ６．５    １μＬ（最終濃度＝４００ｍＭ）
０．４ｍＭ  ｔＲＮＡ                      ２μＬ（最終濃度＝８０μＭ）０．８ｍＭ  Ｆｍｏｃ−ＰＮＡ              １μＬ（最終濃度＝８０μＭ）
１０μＬ
実施例３（カチオン性ミセルを用いたｔＲＮＡのアミノアシル化）
〈アミノアシル化反応液の組成〉
２０ｍＭ  ＣＴＡＣｌ／１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．５）    １８μＬ
１００ｍＭ  Ｐｅｎｔｅｎｏｙｌ−ｎａｐＡｌａ−ＯＣＭ／ＤＭＦ    １μＬ
２００μＭ  ｔＲＮＡ                                            １μＬ
２０μＬ
上記の反応液をボルテックスミキサーを用いて１０分間撹拌した。なお、撹拌を２０−４０秒行う毎に卓上遠心器で遠心し、壁面に付着した溶液を落とした。反応液に１．５Ｍ  ＡｃＯＫ  ６０μＬを加え、更にフェノール／クロロホルム（１：１）８０μＬを加えボルテックスミキサーで数秒間撹拌した（白色の懸濁液になった）。続いて１５０００ｒｐｍ、４℃で数秒間遠心し、上清を取った。採取した上清にＣＨＣｌ３／ｉ−ＰｒＯＨ（２４：１）８０μＬを加えボルテックスミキサーで数秒間撹拌した（白色の懸濁液になった）。先程と同様に１５０００ｒｐｍ、４℃で数秒間遠心し、上清を取った。上清にエタノール３６０μＬを加えて軽く混合し、−３０℃で１時間放置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心し、上清を除いた。
７０％エタノール（−３０℃）２００ｍＬを加えて１５０００ｒｐｍ，４℃で数秒間遠心し、上清を除いた。最期に１５分間程度減圧乾燥して、エタノールを完全に蒸発させたのを確認した。乾燥した試料は使用時まで−３０℃で保存した。
乾燥した試料に１０×ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１緩衝液１０ｍＬ、ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１  １ｍＬを加えて、３７℃で１５分間インキュベートした後、実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析を行ない、実施例１と同様の結果を得た。収率：５０％。
実施例４（アニオン性ミセルを用いたｔＲＮＡのアミノアシル化）
〈アミノアシル化反応液の組成〉
１０ｍＭ  ＳＤＳ／ｍｉｌｌｉＱ（超純水）                      １７μＬ
２００μＭ  ｔＲＮＡ                                            １μＬ
１００ｍＭ  Ｐｅｎｔｅｎｏｙｌ−ｎａｐＡｌａ−ＯＣＭ／ＴＨＦ    １μＬ
１００ｍＭ  イミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）                    １μＬ
２０μＬ
上記の反応液を室温で５時間撹拌反応させた。その後、反応液に１．５Ｍ  ＡｃＯＫを６０μＬ加え、フェノール／クロロホルム８０μＬで抽出し、更に、クロロホルム８０μＬで抽出した。
エタノール３６０μＬを加え、軽く混合し、−３０℃で一時間静置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心して、上清を除いた。７０％エタノール（−３０℃）２００μＬを加えて、１５０００ｒｐｍ、４℃で５秒間遠心し、上清を除いた後、減圧乾燥した。１０×ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１緩衝液１０μＬ及び、ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１  １μＬを加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析を行ない、実施例１と同様の結果を得た。収率：７％。
実施例５［アンチセンス分子を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化（２元系）］
非天然アミノ酸として側鎖にナフチル基を有する２−ナフチルアラニンを選択し、これをアンチセンス分子に導入したａａ−ＰＮＡを用いて、ｔＲＮＡのアミノアシル化を行った。なお、使用したａａ−ＰＮＡは、前記第３図に示したａａ−ＰＮＡの構造式において、リンカーが前記したａｂＺ（パラ体）のものである。
〈アミノアシル化反応液の組成〉
ａａ−ＰＮＡ（１ｍＭ）                      ０．５μＬ
ｔＲＮＡ（５００μＭ）                          １ｕＬ
１ｍＭイミダゾール                              １μＬ
（５００ｍＭ又は１Ｍ）イミダゾール              １μＬ
反応停止剤（ｍＬＭ）                          ０．５μＬ
４μｌ
〈操作手順〉
ａａ−ＰＮＡ、ｔＲＮＡ、１ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）を混合し、４℃で５分間静置した。次に１Ｍ（又は５００ｍＭ）イミダゾール（ｐＨ７．０）を加え、室温で２時間静置しアミノアシル化を行った。反応停止剤であるｃＰＮＡ、ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１緩衝液４μｌを加え、３７℃で１分間インキュベートして二重鎖ＰＮＡを形成させた。５℃に急冷後、１００倍に希釈したｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１（１００ｕｎｉｔｓ／μＬ）１μｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートした。
反応後は実施例１と同様にして後処理を行ない、得られた生成物を実施例１と同様にして分析して、実施例１と同様の結果を得た。収率：約５％。
実施例６［アンチセンス分子を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化（２元系）］
実施例５において、ａａ−ＰＮＡとして、第３図に記載の鎖長＝６のａａ−ＰＮＡを用いる代りに鎖長＝９（ＡＡＧＣＧＴＧＧＴ）のａａ−ＰＮＡを用いて反応を行った。
〈アミノアシル化反応液の組成〉
ａａ−ＰＮＡ（４００μＭ）                      １μＬ
ｔＲＮＡ（２００μＭ）                          ２ｕＬ
１ｍＭリン酸緩衝液                              ２μＬ
リン酸ナトリウム                                ３μＬ
ｍｉｌｌｉＱ（超純水）                          ２μＬ
１０μＬ
反応停止剤
４００μＭ  ｃＰＮＡ                            １μＬ
〈操作手順〉
１ｍＭリン酸緩衝液、ｍｉｌｌｉＱ及びｔＲＮＡを混合し、８０℃で２分間インキュベートした後、ａａ−ＰＮＡを加え、５℃で２分間静置してハイブリダイゼーションさせた。
次いで、リン酸ナトリウムを加え、アミノアシル化を行った。
反応停止剤であるｃＰＮＡ及び３００ｍＭ  ＡｃＯＫ（ｐＨ４．５）９μＬを加え、反応停止した後、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿を行った。
沈殿物をＭｉｌｌｉＱ  １０μｌに溶かし、１０×ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１緩衝液９μＬ及びｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１  １μｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートした。
反応後は実施例１と同様にして後処理を行ない、得られた生成物を実施例１と同様にして分析して、実施例１と同様の結果を得た。収率１９％。
実施例７［アンチセンス分子を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化（３元系）］
実施例３で用いたものと同じａａ−ＰＮＡを用い、ＰＮＡとｔＲＮＡとを近接させるテンプレートとしてＤＮＡ１４（ＲＮＡと結合するＤＮＡの鎖長が１４のもの）を用いて、ｔＲＮＡのアミノアシル化を行った。
（１）ｔＲＮＡとテンプレートＤＮＡとのハイブリダイゼーション
マイクロチューブに以下の溶液をピベッティングにより混合し、ボルテックス撹拌し、スピンダウンした。
ｔＲＮＡ（５００μＭ／Ｑ）                ２５μＬ（最終濃度＝３５７μＭ）
ＤＮＡ１４（０．８６ｍＭ／Ｑ）        ７．２６μＬ（最終濃度＝１７８μＭ）
１００ｍＭトリス緩衝液  ｐＨ６．８    １．７５μＬ（最終濃度＝５ｍＭ）
ｍｉｌｌｉＱ（超純水）                ０．９８μＬ
３５μＬ
この溶液を８０℃で１０分間インキュベーション後、ＰＣＲの装置中にて室温まで冷却した。
（２）次に、１．６ｍＬのマイクロチューブを用意しそれに上記ハイブリダイゼーション溶液１３．５μＬを加えて氷上に静置した。
（３）ａａ−ＰＮＡ／１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ６．８を氷上にて調製した。
次いで、マイクロチューブに以下の溶液をピベッティングにより混合し、ボルテックス撹拌し、スピンダウンした。
ａａ−ＰＮＡ（１．５ｍＭ／ＤＭＳＯ）    ０．５２μＬ（室温に戻ってから開ける）
ｍｉｌｌｉＱ（超純水）                  １．５６μＬ
２．０８μＬ
（４）上記（２）のマイクロチューブに上記（３）で調製したａａ−ＰＮＡを０．５μＬづつ加えピペッティング、ボルテックス撹拌、スピンダウンし、氷上に５分間静置した。
（５）上記マイクロチューブに４Ｍイミダゾール−ＡｃＯＨ緩衝液ＰＨ６．５を１．９３μＬ加え、氷上にて反応を開始させた。反応時間は２時間とした。
（６）反応後は実施例１と同様にして後処理を行ない、得られた生成物を実施例１と同様にして分析して、実施例１と同様の結果を得た。収率：６％。
なお、上記（５）において、イミダゾール−ＡｃＯＨ緩衝液の代りに酢酸ナトリウム緩衝液を使用したところ、収率が９％に向上した。
実施例８［アンチセンス分子を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化（３元系）］
実施例４において、ｔＲＮＡとテンプレートＤＮＡとのハイブリダイゼーション溶液における、テンプレートとしてのＤＮＡ１４（０．８６ｍＭ／Ｑ）７．２６μＬ（最終濃度＝１７８μＭ）の代りに、ＤＮＡ２３（ＲＮＡと結合するＤＮＡの鎖長が２３のもの）（０．９２ｍＭ／Ｑ）６．７９μＬ（最終濃度＝１７８μＭ）を用い、ｍｉｌｌｉＱ（超純水）０．９８μＬを１．４６μＬとした以外は、実施例４と全く同様にして、反応及び後処理を行ない、得られた生成物を実施例４と同様にして分析して、実施例４と同様の結果を得た。収率：５％。
実施例９（ポリエチレンイミンを用いたｔＲＮＡのアミノアシル化）
〈アミノアシル化反応液の組成〉
ポリエチレンイミン（１．０９ｍｇ）／ｍｉｌｌｉＱ          １７μＬ
ｔＲＮＡ                                                    １μＬ
０．１Ｍ  Ｐｅｎｔｅｎｏｙｌ−ｎａｐＡｌａ−ＯＣＭ／ＤＭＦ  １μＬ
１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．５）                        １ｕＬ
２０ｕＬ
上記の反応液を室温で３．５時間撹拌反応させた。その後、反応液に１．５Ｍ  ＡｃＯＫ  ７０μＬを加え、フェノール／クロロホルムを等量加えて抽出し、更に、クロロホルムを等量加えて抽出した。エタノール３６０μＬを加えて軽く混合し、−３０℃で１時間静置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心して上清を除いた。７０％エタノール（−３０℃）２００μＬを加えて、１５０００ｒｐｍ、４℃で５秒間遠心し、上清を除いた後、減圧乾燥した。１０×ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１緩衝液１０ｕＬ加え、１０×ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１  １μＬでモノマーに分解した。分解した溶液１１μＬと酢酸アンモニウム溶液４０μＬを取り、これを実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析し、実施例１と同様の結果を得た。収率：５％。
実施例１０（表面にカチオン性基をもったデンドリマーを用いたアミノアシル化）
〈アミノアシル化反応液の組成〉
Ａ液：０．４５ｍＭデンドリマー／１００ｍＭイミダゾール緩衝液  １８μＬ
（Ｇ３−Ｃ６ＮＭｅ  ３１．２ｍｇ，Ｇ３−Ｃ１１ＮＭｅ  ３１．４ｍｇ，Ｇ４−Ｃ６ＮＭｅ  ３２．４ｍｇ，Ｇ４−Ｃ１１ＮＭｅ  ３２．８ｍｇをそれぞれ１００ｍＭイミダゾール緩衝液に加えて溶解した。）
Ｂ液：１００ｍＭ  Ｐｅｎｔｅｎｏｙｌ−ｎａｐＡｌａ−ＯＣＭ／ＤＭＦ
１μＬ
Ｃ液：０．２ｍＭ  ｔＲＮＡ／Ｈ２Ｏ                                １μＬ
２０μＬ
上記Ａ液，Ｂ液，Ｃ液の３液をマイクロチューブ中で混合し、室温で５分間、ボルテックスミキサー（超音波）で撹拌した。その後、反応液に１．５ＭＡｃＯＫ  ６０μＬを加えて反応を停止させ、フェノール／クロロホルム８０μＬを加えて抽出した。上清を回収し、クロロホルム６０μＬを加えて抽出した。次いで、エタノール３６０μＬを加えて−３０℃で１時間静置した。１５０００ｐｐｍ、４℃で３０分間遠心し、上清を取り除いて７０％エタノール（−３０℃）加え、１５０００ｐｐｍ、４℃で５秒間遠心した。上清を取り除き、１５分間減圧乾燥して目的物を得た。収率２１％。
生成物に１０×ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１緩衝液１０μＬと１０×ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１  １μＬを加え、３７℃で１５分間インキュベートしてＳ１分解を行った。
分解した溶液に酢酸アンモニウム溶液を加えて全量を５０μＬにし、これを実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析し、実施例１と同様の結果を得た。
実施例１１（Ｐｅｎｔｅｎｏｙｌ−ｎａｐＡｌａ−ＯＳｕを用いたアミノアシル化）
活性エステルとして、シアノメチルエステル（ＯＣＭ）の代りにスクシンイミドエステル（ＯＳｕ）を用いて、実施例３と同様にしてｔＲＮＡのアミノアシル化を行った。
〈アミノアシル化反応液の組成〉
２０ｍＭ  ＣＴＡＣｌ／１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．５）      １８μＬ
１００ｍＭ  Ｐｅｎｔｅｎｏｙｌ−２−ｎａｐＡｌａ−ＯＳｕ／ＤＭＦ  １μＬ
２００μＭ  ｔＲＮＡ                                              １μＬ
２０μＬ
上記試料を混合し実施例３と同様に超音波で撹拌し反応させた後、実施例３と同様にして後処理を行ない、実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析を行なって、実施例１と同様の結果を得た。収率３０％。
【産業上の利用可能性】  従来のアミノアシル化法の欠点は、１）天然アミノ酸に類似した構造を持つアミノ酸しか導入できない、２）導入したいアミノ酸に対応する人工アミノアシル合成酵素をそれぞれ作製しなくてはならず、また、作製する為に膨大な労力が必要とされる、という点が主に挙げられる。
これに対し、本発明の方法によれば、それぞれのアミノ酸に対応する人工アミノアシル合成酵素を作製、使用する必要が無く、有機化学的手法を用いて所望のアミノ酸をｔＲＮＡに導入することが出来るので、従来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素ではｔＲＮＡに結合出来なかった非天然アミノ酸、例えば天然アミノ酸と大きく構造が異なる非天然アミノ酸や、蛍光性を有するアミノ酸、光異性化能を有するアミノ酸、酸化能力を有するアミノ酸、ＨＩＶウィルスに薬効があるアミノ酸等々、どの様なアミノ酸でも効率よくアミノアシル化することが出来る。
アミノアシル化ｔＲＮＡが容易に得られるようになれば、非天然アミノ酸導入蛋白質の実用化が進むであろうが、このとき、本発明者らが先に特許出願しているランダム挿入削除ＤＮＡ変異法（特願２００１−５７４７８号明細書）の技術や、本発明者らが先に文献発表している４塩基コドン法［Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００１）５７：２７４−２８１］の技術を用いて、有用な蛋白質合成がより効果的に行ない得る。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月8日(2004.6.8)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】（削除）
【請求項２】ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化してアミノアシルｔＲＮＡを製造するに際し、ｔＲＮＡとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させることを特徴とする、ｔＲＮＡのアミノアシル化方法。
【請求項３】アミノ酸のカルボキシル基を活性化して、これをミセル中に閉じこめ、このミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中界面近傍で、当該３’末端水酸基と活性化されたカルボキシル基とを近接させて反応させる請求の範囲第２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項４】アミノ酸のカルボキシル基をミセル内部で縮合剤を用いて活性化し、このミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中の界面近傍で、当該３’末端水酸基と活性化されたカルボキシル基とを近接させて反応させる請求の範囲第２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項５】ペプチド核酸末端へ疎水性官能基を導入したものを、ｔＲＮＡの３’末端近傍へ疎水基が来るように、ｔＲＮＡへ部位特異的相補結合させて、３’末端基部分を疎水性にすることにより、ミセル中の界面近傍へｔＲＮＡの３’末端水酸基部分のみを挿入する、請求の範囲第３項又は第４項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項６】アミノ基を保護したアミノ酸を用いる請求の範囲第２項〜第５項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項７】界面活性剤の存在下で反応を行う請求の範囲第２項〜第６項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項８】ポリエチレンイミン又は表面にカチオン性基を持ったデンドリマーの存在下で反応を行う請求の範囲第２項〜第６項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項９】Ｏ／Ｗ（水中油滴）型のミセル中で反応を行う請求の範囲第２項〜第８項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１０】オイルフリーの系で反応を行う請求の範囲第２項〜第８項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１１】中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒を用いて反応を行う請求の範囲第２項〜第１０項の何れかに記載のアミノアシル化方法。
【請求項１２】ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化してアミノアシルｔＲＮＡを製造するに際し、他端にカチオン性アミノ酸が導入された、ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることにより、ｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させることを特徴とする、ｔＲＮＡのアミノアシル化方法。
【請求項１３】ｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸を予めエステル結合によりアンチセンス分子に結合させて、ｔＲＮＡと反応させる請求の範囲第１２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１４】アミノ酸を活性エステルを介してアンチセンス分子に結合させたものを用いて反応を行う、請求の範囲第１３項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１５】アンチセンス分子と活性エステルの間にリンカーを存在させたものを用いて反応を行う、請求の範囲第１４項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１６】（削除）
【請求項１７】下記一般式［１］
Ｈ−ｃＡｍ−ＰＮＡ−Ｌ−Ｅ−Ａｍ      ［１］
［式中、−ｃＡｍ−はカチオン性アミノ酸残基又は２〜５のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、−ＰＮＡ−はペプチド核酸残基を表し、−Ｌ−はリンカーを表し、−Ｅ−は活性エステル残基を表し、−ＡｍはｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸残基を表す。］で示される化合物を用いてｔＲＮＡと反応を行う請求の範囲第１２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１８】中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒を用いて反応を行う請求の範囲第１２項、第１３項、第１４項、第１５項又は第１７項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項１９】反応停止剤を用いる請求の範囲第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第１７項又は第１８項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２０】反応停止剤がｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸と相補対を形成するペプチド核酸である請求の範囲第１９項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２１】ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸以外に、更に、ＤＮＡをアンチセンス分子として用いて反応を行う請求の範囲第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第１７項又は第１８項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２２】反応系の温度を上昇させて反応を停止させる請求の範囲第２１項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２３】反応系の温度を２５℃に上昇させて反応を停止させる請求の範囲第２２項に記載のアミノアシル化方法。
【請求項２４】一般式［１］
Ｈ−ｃＡｍ−ＰＮＡ−Ｌ−Ｅ−Ａｍ      ［１］
［式中、−ｃＡｍ−はカチオン性アミノ酸残基又は２〜５のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、−ＰＮＡ−はペプチド核酸残基を表し、−Ｌ−はリンカーを表し、−Ｅ−は活性エステル残基を表し、−ＡｍはｔＲＮＡに導入すべきアミノ酸残基を表す。］で示される化合物。
【請求項２５】一般式［１］において、−ｃＡｍ−が−ＬｙｓＬｙｓ−であり、−ＰＮＡ−が−ＣＧＴＧＧＴ−であり、−Ａｍが非天然アミノ酸である請求の範囲第２４項に記載の化合物。




【国際調査報告】
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