(57)【要約】本発明の目的は、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）に由来する新規な色素蛋白質を提供することである。本発明によれば、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。（１）吸収極大波長が５５９ｎｍであり、蛍光極大波長が５７８ｎｍである；（２）５５９ｎｍにおけるモル吸光係数が６１１５０である；（３）量子収率が０．０１未満である；（４）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ４〜１０で安定である：【特許請求の範囲】
【請求項１】
コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の下記の特性を有する色素蛋白質。
（１）吸収極大波長が５５９ｎｍであり、蛍光極大波長が５７８ｎｍである；
（２）５５９ｎｍにおけるモル吸光係数が６１１５０である；
（３）量子収率が０．０１未満である；
（４）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ４〜１０で安定である：
【請求項２】
以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
【請求項３】
請求項１又は２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
【請求項５】
以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
【請求項６】
請求項４又は５に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項７】
請求項４又は５に記載のＤＮＡ又は請求項６に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の色素蛋白質をアクセプター蛋白質として用いてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法。
【請求項１０】
請求項１又は２記載の色素蛋白質、請求項３から５の何れかに記載のＤＮＡ、請求項６に記載の組み換えベクター、請求項７に記載の形質転換体、又は請求項８に記載の融合蛋白質を含む、吸光試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な色素蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の新規な色素蛋白質及びその利用に関する。
背景技術
クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
また、ＧＦＰ変異体の他の例として、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）があり、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。また、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｍａ  ｓｐ．）からは赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）も単離されており、ＤａｓＲｅｄが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の４種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。
発明の開示
本発明は、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）に由来する新規な色素蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、既知の蛍光蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づいて好適なプライマーを設計し、紫色を呈するコモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）のｃＤＮＡライブラリーから上記プライマーを用いて新規な色素蛋白質をコードする遺伝子を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたコモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の色素蛋白質の光吸収特性及びｐＨ感受性を解析した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。
（１）吸収極大波長が５５９ｎｍであり、蛍光極大波長が５７８ｎｍである；
（２）５５９ｎｍにおけるモル吸光係数が６１１５０である；
（３）量子収率が０．０１未満である；
（４）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ４〜１０で安定である：
本発明の別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質をアクセプター蛋白質として用いてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、吸光試薬キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の色素蛋白質
本発明の色素蛋白質は、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）吸収極大波長が５５９ｎｍであり、蛍光極大波長が５７８ｎｍである；
（２）５５９ｎｍにおけるモル吸光係数が６１１５０である；
（３）量子収率が０．０１未満である；
（４）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ４〜１０で安定である：
コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）は、刺胞動物（ＣＮＩＤＡＲＩＡ）の花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）に属するイソギンチャクの１種であり、わが国のイソギンチャクのなかで、最も色彩変異が多い。体高は常に低く、体壁にたくさんのイボをもつ。触手は約２００本で短い。親は発生の進んだ胚を口部から吐き出し、自分の体壁に着ける。胚はさらに発生が進み親の体壁上で赤ちゃんイソギンチャクとなるためにコモチイソギンチャクとの名が付いた。本種は北海道〜房総半島の岩礁海岸の潮間帯とその直下に分布する。
なお、本書中以下の実施例では、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）を出発材料として上記特性を有する色素蛋白質を単離したが、コモチイソギンチャク以外のイソギンチャクから本発明の色素蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような色素蛋白質も本発明の範囲内である。
本発明の色素蛋白質は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が５５９ｎｍであり、蛍光極大波長が５７８ｎｍである。また、５５９ｎｍにおけるモル吸光係数は６１１５０であり、量子収率は０．０１未満である。
モル吸光係数は蛍光分子１モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。本発明の色素蛋白質の量子収率は０．０１未満と極めて低いため、発せられる赤色（５７８ｎｍ）の蛍光も極めて弱い。この性質から、本発明の色素蛋白質は、（１）ＦＲＥＴのアクセプター分子（エネルギー受容体）として用いたり、（２）照射した光のエネルギーを光以外のエネルギーに変換させるシステムの開発に利用したり、あるいは（３）蛋白質のアミノ酸配列に変異を導入して蛍光を発するように改変することなどに用いることができる。
また、本発明の色素蛋白質は、光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ４〜１０で安定であることを特徴とする。即ち、本発明の色素蛋白質では、ｐＨ４〜１０の範囲において吸収スペクトルのピーク値の変動が少ない。従って、本発明の色素蛋白質は、広範囲のｐＨ環境において同様の条件で使用することができ、生体内での使用に際しての制約は少ない。
本発明の色素蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「吸光特性」とは、ある波長の光を吸収できる特性を意味し、例えば、本明細書に示した色素蛋白質と同様に吸収極大波長が５５９ｎｍであってもよいし、あるいは吸収極大波長の値がシフトしたものであってもよい。なお、光吸収特性のｐＨ感受性は、ｐＨ４〜１０で安定であることが好ましい。
本発明の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列を有する色素蛋白質は量子収率が０．０１未満であり極めて弱い蛍光を発するものである。本発明においては、配列番号１に記載したアミノ酸配列に対して１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を導入することにより、より強い蛍光を発する蛋白質を作製してもよく、このような蛋白質も本発明の範囲内に含まれる。
本発明の色素蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列並びに配列番号２に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の色素蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の色素蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の色素蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の色素蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
本発明の色素蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡの作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）本発明の色素蛋白質及びそれを含む融合蛋白質の利用
本発明の色素蛋白質は、他の蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質を構築することができる。本発明の色素蛋白質に融合させる他の蛋白質の種類は特に限定されないが、他の分子と相互作用する蛋白質であることが好ましく、例えば、受容体蛋白質又はそのリガンド、あるいは抗原又は抗体などが挙げられる。
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え融合蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本発明の色素蛋白質をコードするＤＮＡおよびそれに融合すべき他の蛋白質をコードするＤＮＡは、本明細書中上記した方法またはそれに準じてそれぞれ入手することができる。次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を産生することができる。
分子間の相互作用を分析する手法の一つとして、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）が知られている。ＦＲＥＴでは、例えば、第一の蛍光蛋白質としてのシアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）で標識した第一の分子と、第二の蛍光蛋白質としての黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）で標識した第二の分子とを共存させることにより、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）をアクセプター分子として作用させ、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）をドナー分子として作用させ、両者の間でＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を生じさせることにより、第一の分子と第二の分子との間の相互作用を可視化することができる。即ち、ＦＲＥＴでは２種類の分子にそれぞれ異なる色素を導入し、エネルギーレベルの高い方の色素（ドナー分子）を選択的に励起し、その色素の蛍光を測定し、もう一方の色素（アクセプター分子）からの長波長蛍光も測定して、それらの蛍光変化量によって分子間の相互作用を可視化する。両方の色素が、２種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少とアクセプター分子の蛍光の増加が１波長励起２波長測光法により観測される。しかし、アクセプター分子に色素蛋白質を用いた場合は、両方の色素が、２種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少を生じ１波長励起１波長測光法により観測することができる。即ち、測定機器の簡易化が可能となる。
本発明の色素蛋白質は、特に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）におけるアクセプター分子としての利用価値が高い。即ち、本発明の色素蛋白質と被験物質との融合体（第一の融合体）を作製する。次いで、該被験物質と相互作用する別の被験物質と別の蛍光蛋白質との融合体（第２の融合体）を作製する。そして、第一の融合体と第２の融合体とを相互作用させ、発する蛍光を分析することにより、上記２種類の被験物質間の相互作用を分析することができる。なお、本発明の色素蛋白質を用いたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）は、試験管内で行ってもよいし、細胞内で行ってもよい。
（６）本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した色素蛋白質、融合蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、吸光試薬キットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
色素蛋白質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
実施例１：イソギンチャクからの新規色素蛋質白遺伝子の単離
（１）全ＲＮＡの抽出
紫色を呈する珊瑚より色素蛋白質遺伝子の単離を行った。材料には紫色を呈するコモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）を用いた。凍結したコモチイソギンチャクを乳鉢で砕き、湿重量１グラムに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を７．５ｍｌ加えてホモジナイズし、１５００ｘｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム１．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、３分間静置した。７５００ｘｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール３．７５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後１０分間静置した。１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解した全ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。紫色の個体から２ｍｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡ４μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３ｕｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。
プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。使用プライマーの配列を以下に示す。
2003104461.tif 000002
（ここで、ＲはＡ又はＧを示し、ＹはＣ又はＴを示し、ＶはＡ、Ｃ又はＧを示し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを示す。）
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）      ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１                              １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ２                              １μｌ
ミリＱ                                                ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）              １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーのテンプレートへのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行い、アニーリング温度を１サイクルごとに０．３℃下げた。３０サイクル時の温度は４３℃となる。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で、３５０ｂｐ（紫色の個体由来）のバンドを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりプラスミドＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として（１）で調整した全ＲＮＡを３μｇ使用した。
紫色の個体由来のＤＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には
2003104461.tif 000003
のプライマーを用いた。
（ここで、Ｉはイノシンを示す）
二回目の増幅には
2003104461.tif 000004
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された４５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、以下のプライマー（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したｐｒｉｍｅｒ７と、以下のｐｒｉｍｅｒ８を用いたＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調整したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを３μｌ使用した。使用したライマーを以下に示す。
2003104461.tif 000005
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）      ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ７                                １μｌ
１０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ８                                １μｌ
ミリＱ                                                ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）              １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５５℃  ３０秒（プライマーのテンプレートへのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
アガロースゲル電気泳動で、増幅された約１２００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた全長の塩基配列を配列番号２に示し、全長のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
実施例２：大腸菌での蛋白質の発現
実施例１で得られた全長の塩基配列より、蛋白のＮ末端、Ｃ末端に相当する部分でプライマーを作製し、（２）で調整したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
使用プライマー
2003104461.tif 000006
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）      ３μｌ
Ｘ１０  ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー                      ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ９                              １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１０                            １μｌ
ミリＱ                                                ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）    １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５５℃  ３０秒（プライマーのテンプレートへのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約７００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＲＳＥＴ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。発現蛋白はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。
実施例３：蛋白質の解析
（１）光吸収特性の解析
実施例２で発現させた蛋白質を用いて光吸収特性を解析した。
２０μＭの色素蛋白、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。紫色の個体由来色素蛋白（ＫＰとした）では５５９ｎｍに吸収のピークが認められた（表１、図１）。ＫＰは５７８ｎｍピークをもつ非常に弱い蛍光が認められた（図３）。
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（２）ｐＨ感受性の測定
実施例２で発現させた蛋白質を用いてｐＨ感受性を解析した。
１００ｍＭの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スペクトルを測定した（図２）。各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、５    ：酢酸バッファー
ｐＨ６        ：ＭＥＳバッファー
ｐＨ７、８    ：ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０  ：グリシンバッファー
各ｐＨでピークの値はほとんど変化しなかった。
産業上の利用の可能性
本発明により、コモチイソギンチャク（Ｃｎｉｄｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の新規な色素蛋白質が提供されることになった。本発明の色素蛋白質は、所望の蛍光特性を有し、またｐＨ感受性が低いことから、分子生物学的分析において有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のコモチイソギンチャク由来の色素蛋白質（ＫＰ）の吸光スペクトルを測定した結果を示す。横軸は吸収光の波長を示し、縦軸は吸光度を示す。
図２は、本発明のコモチイソギンチャク由来の色素蛋白質（ＫＰ）の吸光スペクトルのｐＨ感受性を示す。横軸はｐＨ値を示し、縦軸は吸光度を示す。５５９ｎｍは本発明のコモチイソギンチャク由来の色素蛋白質（ＫＰ）特有の吸光度を示し、２７５ｎｍは一般的に蛋白質定量として使われる吸光度（芳香族アミノ酸の吸光）を示す。つまり、２７５ｎｍの値で蛋白質量が一定である事を示し、５５９ｎｍの値で本発明のコモチイソギンチャク由来の色素蛋白質（ＫＰ）特有の吸光度がｐＨ４〜ｐＨ１０においてほとんど変化しないことを示す。
図３は、本発明のコモチイソギンチャク由来の色素蛋白質（ＫＰ）の蛍光スペクトルを示す。横軸は波長を示し、縦軸は蛍光の強度を示す。ｅｍは蛍光スペクトルを示し、ｅｘは励起スペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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