(57)【要約】本発明により、幹細胞（例えば、造血幹細胞）をその未分化性と多能性を持たせたまま維持することが達成された。これは、ＷＩＦドメインを有するポリペプチド（例えば、ＷＩＦ−１）を幹細胞に提供することにより達成された。好ましくは、このポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートを含む。好ましくは、これは、ＳＣＦのような幹細胞生存因子とともにＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供することにより達成された。このことにより、簡便に、大量かつ機能的な前駆細胞を含んだ幹細胞（例えば、造血幹細胞）集団を提供することが可能となった。また、幹細胞により効率良く遺伝子導入を行うことが可能になった。加えて、本発明の幹細胞組成物は、均質で不純物をほとんど含まないため、従来の造血幹細胞治療で問題となっていた副作用（例えば、感染）などを顕著に改善することができた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を分化させずにその多能性を維持する、ＷＩＦドメインを有するポリペプチド。
【請求項２】
前記ＷＩＦドメインは、配列番号４に記載の配列の約３０位〜約１８０位のうちの少なくとも５アミノ酸を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＷＩＦドメインは、配列番号４に記載の配列の約３０位〜約１８０位を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＥＧＦ様リピートは、ＣＸ３ＣＸ５ＣＸ５ＣＸＣＸ８ＣＸ４からなる少なくとも１つのリピートを含み、ここで、Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸を表す、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、配列番号４に示される配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記幹細胞は、造血幹細胞である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
幹細胞を分化させずに多能性を維持するための組成物であって、該組成物は、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドを含む、組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、配列番号４に示される配列を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに、幹細胞生存因子を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記幹細胞生存因子はＳＣＦである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
インビトロで分化せず、かつ、多能性を保持する、幹細胞。
【請求項１４】
造血幹細胞である、請求項１３に記載の幹細胞。
【請求項１５】
前記多能性を保持する期間は、少なくとも６日間である、請求項１３に記載の幹細胞。
【請求項１６】
前記多能性は、血液細胞への分化能を包含する、請求項１３に記載の幹細胞。
【請求項１７】
長期多能性保持細胞組成物であって、幹細胞；およびＷＩＦドメインを有するポリペプチド、を包含する、長期多能性保持細胞組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、請求項１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
【請求項１９】
前記幹細胞は、造血幹細胞である、請求項１７に記載の長期多能性維保持細胞組成物。
【請求項２０】
前記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、請求項１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
【請求項２１】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に記載の配列を含む、請求項１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
【請求項２２】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
【請求項２３】
さらに、幹細胞生存因子を含む、請求項１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
【請求項２４】
前記幹細胞生存因子はＳＣＦである、請求項２３に記載の長期多能性保持細胞組成物。
【請求項２５】
前記幹細胞生存因子はＦＬＴ−３  リガンドである、請求項２３に記載の長期多能性保持細胞組成物。
【請求項２６】
前記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
分化細胞を調製するための、請求項２３に記載の組成物であって、該分化細胞は、血液細胞の障害を処置するために使用される、組成物。
【請求項２８】
幹細胞を分化させずに、多能性を維持させる方法であって、
１）該幹細胞にＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドは、ＥＧＦ様ドメインをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞は、造血幹細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示す配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、
２）幹細胞生存因子を前記幹細胞に提供する工程、
を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記幹細胞生存因子はＳＣＦである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記幹細胞生存因子はＦＬＴ−３  リガンドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
長期多能性保持細胞組成物を生産する方法であって、
１）幹細胞を提供する工程、
２）該幹細胞にＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する工程、および
３）処理された該幹細胞を収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞は、造血幹細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、
２）幹細胞生存因子を前記幹細胞に提供する工程、
を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記幹細胞生存因子はＳＣＦである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置する方法であって、
１）被検体に長期多能性保持細胞組成物を投与する工程であって、該長期多能性保持細胞組成物は、
幹細胞；および
ＷＩＦドメインを有するポリペプチドを包含する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記分化細胞は血液細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記幹細胞は、造血幹細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記長期多能性保持細胞組成物は、幹細胞生存因子をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記幹細胞生存因子はＳＣＦである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
前記被検体は、ヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列またはその改変体の配列を含むヒト組換えＷＩＦ−１である、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置するための医薬組成物であって、
幹細胞；
ＷＩＦドメインを有するポリペプチド；および
薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、医薬組成物。
【請求項６３】
前記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記分化細胞は血液細胞である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記幹細胞は、造血幹細胞である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、ＷＩＦ−１である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
幹細胞生存因子をさらに含む、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記幹細胞生存因子はＳＣＦである、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記疾患または障害がヒトの疾患または障害である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
前記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列またはその改変体の配列を含むヒト組換えＷＩＦ−１である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
幹細胞を分化させずに、多能性を維持させるための、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドの使用。
【請求項７６】
前記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
前記幹細胞は、造血幹細胞である、請求項７５に記載の使用。
【請求項７８】
前記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、請求項７５に記載の使用。
【請求項７９】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含む、請求項７５に記載の使用。
【請求項８０】
前記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項７５に記載の使用。
【請求項８１】
幹細胞生存因子と組み合わせた、請求項７５に記載の使用。
【請求項８２】
前記幹細胞生存因子はＳＣＦである、請求項８１に記載の使用。
【請求項８２】
前記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
前記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、請求項８１に記載の使用。
【請求項８４】
前記疾患または障害は、ヒトの疾患または障害である、請求項７５に記載の使用。
【請求項８５】
前記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列またはその改変体の配列を含むヒト組換えＷＩＦ−１である、請求項７５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、幹細胞の生あるいは死を制御する因子に関する。さらに詳しくは、造血幹細胞の死への過程を抑制し、生への過程を促進する機構を制御するタンパク質に関する。
背景技術
再生医学（再生医療）による疾患治療が最近注目を浴びている。しかし、これを臓器ないし組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至っていない。現在まで、そのような患者の治療として、臓器移植のほか、医療機器での補助システムの利用がごく限られた患者に適応されているにすぎない。しかし、これらの治療法には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。特に、ドナー不足は深刻な問題であり、骨髄移植の場合、国内外で骨髄ないし臍帯血バンクが次第に充実してきたといっても、限られたサンプルを多くの患者に提供することが困難である。従って、これらの問題を克服するために幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期待がますます高まっている。
本明細書において「再生」とは、損傷した組織ないし臓器が元通りに回復することをいい、病理的再生ともいう。生物の体は一生の間に外傷や病気によって臓器の一部を失ったり、大きな傷害を受けたりする。その場合、損傷した臓器が再生できるか否かは、臓器によって（または動物種によって）異なる。自然には再生できない臓器（または組織）を再生させ、機能を回復させようというのが再生医学である。組織が再生したかどうかは、その機能が改善したかにどうかによって判定することができる。哺乳動物は、組織・器官（臓器）を再生する力をある程度備えている（例えば、皮膚、肝臓および血液の再生）。しかし、心臓、肺、脳などの臓器は再生能力に乏しく、一旦損傷すると、その機能を再生させることができないと考えられてきた。従って、従来であれば、例えば、臓器が損傷した場合、臓器移植による処置しかほとんど有効な措置がなかった。
再生能力の高い臓器には幹細胞が存在することが古くから想定されていた。この概念が正しいことは動物モデルを用いた実験的骨髄移植によって証明された。そして、その後の研究によって骨髄中の幹細胞がすべての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。幹細胞は骨髄、皮膚等の再生能力の高い臓器に存在することも明らかにされた。さらに、再生されないと長年思われてきた脳にも、幹細胞が存在することが明らかとなってきた。すなわち、体内のあらゆる臓器には幹細胞が存在し、多かれ少なかれ、各臓器の再生を司っていることがわかってきた。また、各組織に存在する幹細胞には予想以上に可塑性があり、ある臓器中の幹細胞は他の臓器の再生にも利用できる可能性が指摘されている。
幹細胞は今まで不可能であった臓器の再生にも利用できる可能性がある。幹細胞治療を中心として、再生医学はその注目度を増している。近年、医学・医療分野から再生に関する研究の必要性が高まるにつれて、幹細胞または器官形成に関する知見が毎年、増大している。例えば、全能性を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の樹立と成体体細胞からのクローン個体の作製が特に注目されている。幹細胞治療に発生・再生に関する技術を利用できるからで、幹細胞を用いた再生医学は各分野で臨床応用を目的とした、準備段階にはいっている。また、すでに実用化がすすんでいる分野もある。
再生医学の源として再構築生物学の存在がある。再構築生物学は、１９０７年にＷｉｌｓｏｎが海綿をピペットで処理して細胞を分解し、再度混合すると海綿個体になることを示したことに端を発する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｖ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．５：２４５−２４８．１９０７）。高等生物での組織再構築は、１９５５年のＴｏｗｎｅｓおよびＨｏｌｔｆｒｅｔｅｒによる両生類の胚再構築が注目される。ここでは、両生類の胚を希アルカリ溶液で処理した解離細胞を混合すると再構築されることが見い出された。その後も種々の再構築が試みられたが、成体組織の再構築について、目立った進展は１９８０年代になるまではなかった。
再生医学が一般に認識し始められたのは火傷の治療への応用であった。１９８１年にＢｅｌｌは人工皮膚をはじめて作製し火傷の治療へと応用した（Ｂｅｌｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１１：１０５２−５４，１９８１）。ここでは、皮膚の線維芽細胞をコラーゲンゲル中に埋め込み、その表面に表皮細胞を培養し、入工皮膚を作製した。ここでは、細胞と細胞外マトリクスとを材料として三次元的に器官を再構築する発想が注目された。
再生医学においては、器官・臓器の再構築が最重要となる。この場合、大きく分けて生体外で器官を構築し人工器官として用いる方法と、生体内で器官を再構築させる方法とがある。いずれの場合でも、器官の構築には幹細胞が必要となる。ここで用いられる幹細胞にとって重要な性質としては、多能性および自己複製能がある。
幹細胞には大きく分けて、胚性幹細胞と体性幹細胞とが存在する。体性幹細胞の中でも古くから注目されていたものとして、造血幹細胞がある。寿命の短い成熟血球をヒトの一生の間維持するためには、造血幹細胞の自己複製能と多分化能とが必要であり、このことは、１９６１年にすでに提唱されていた（Ｔｉｌｌ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１４：２１３−２２２）。１９７２年にマウスモデルを用いた骨髄移植法が確立され（Ｍｉｃｋｌｅｍ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７９：２９３−２９８，１９７２）、造血系再構築を調べることにより造血幹細胞を検出することができるようになって以来、造血幹細胞の研究は飛躍的に進展した。その後の研究により、自己複製能と多分化能との両方を有する造血幹細胞の存在が示された（Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ  ４２；７１−７９，１９８５）。しかし、造血幹細胞は、マウスの場合でも１０万個の骨髄細胞中に数個程度という低い頻度で存在することから、実際の研究または臨床応用する場合には、濃縮・純化する必要がある。
従来から造血幹細胞移植治療は行われていたが、天然の細胞を濃縮したものを使用していたことから、種々の副作用があった。例えば、大量抗癌剤または放射線照射を用いた移植前処置による副作用（ＲＲＴ）が存在していた。また、前処置による骨髄抑制中の細菌・真菌感染症、出血；他人からの移植の場合、ドナーの白血球が生着して増えてきた時に患者臓器を異物（他人）とみなして攻撃する反応（移植片対宿主病＝ＧＶＨＤ）；サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）肺炎を中心とする様々な肺合併症；血管内皮細胞（血管の内側を覆っている細胞）の障害による種々の内臓障害；生着後にも遷延する免疫抑制状態（少なくとも１〜２年）の間に罹患する様々な感染症；遷延し様々な症状を呈する慢性ＧＶＨＤ；二次性発癌、性腺機能障害、不妊などの晩期障害などの副作用があった。
以上のような合併症のために、移植を行ったがために、かえって一時的に全身状態が悪くなるということはしばしば起こる。また、合併症のために死亡する患者も、自家移植でも１０〜２０％、他人からの移植では２０〜４０％程度認められる。また、これらの合併症を乗り越えても、もとの病気が再発する可能性があり、現在の移植治療の限界があった。
骨髄移植後の合併症による早期死亡を予防することを目的に幹細胞を分離・純化し、生体外で幹細胞から前駆細胞を大量に産生し、それを幹細胞とともに移植することによって行う治療法が登場した。国外ではすでに臨床試験が試みられようとしている。
一方、幹細胞に遺伝子を導入し、その幹細胞を移植することによって遺伝子治療を行う試みがはじまった。例えば、Ｘ連鎖性重症複合免疫不全症の患者にＩＬ−２受容体γ鎖を導入した幹細胞（ＣＤ３４陽性骨髄細胞）を移植することによって臨床症状が改善することが報告されている（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８：６６９−６７２）。幹細胞に遺伝子導入する際には、幹細胞を短期間培養する必要があり、その期間、いかに幹細胞を分化させないで生存させることができるかどうかが遺伝子治療成功の鍵である。
ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）が１９８０年代に提唱されて以来、ＦＡＣＳを使用した方法が造血幹細胞の濃縮・純化に多用されている。多重染色した骨髄細胞からＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を分離することによって純度の高い造血幹細胞が得られることが明らかになっている（Ｏｓａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：２４２−２４５，１９９６）。上述のように、多分化能および自己複製能は幹細胞の本質である。その能力を十二分に引き出すためには幹細胞を濃縮・純化し、それを体外培養によって増幅することが重要となる。
幹細胞の分化を調節する機構として種々のタンパク質が重要な役割を果たす。例えば、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒまたはｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦともいう）は、造血幹細胞では注目されている因子である。
ＳＣＦは、骨髄ストローマ細胞により生成され、多能性幹細胞、ＣＦＵ−ＧＭのＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｍｅｇなどの骨髄系細胞、リンパ系幹細胞に作用し、これらの分化を支持する。すなわち造血幹細胞から分化細胞へのほぼすべての系統の分化段階の細胞に作用して、他のサイトカインによる最終分化段階への分化誘導する作用を助けるとされる（北村聖（Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ）、サイトカインの最前線、羊土社、平野俊夫（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ）編、１７４頁〜１８７頁、２０００）。
しかし、ＳＣＦ単独の作用は弱く、他の因子と協働でなければ充分に機能しないようである。例えば、ＳＣＦは、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの他のサイトカインの存在下で、造血幹細胞の分化・増殖を強く誘導する。また、肥満細胞、赤芽球系前駆細胞、顆粒球マクロファージ系前駆細胞、巨核球系前駆細胞などの分化・増殖も誘導する。
従って、ＳＣＦは分化そのものを制御するというよりは、多くの種類の造血系細胞の生存を支持しながら、種々のサイトカインに対する反応性を高めると位置づけることができる。
トロンボポイエチン（ＴＰＯ）もまた注目されている。この因子は、巨核球系の分化と血小板産生を支持するが、幹細胞にも作用しその分化を誘導する。また、幹細胞の自己複製にも関与することが分かっている。
このように、従来の因子では、幹細胞の分化を促進することはなしえても、未分化のままその多能性を維持することができないという問題点があった。
従って、本発明は、幹細胞を未分化のまま（分化させずに）多能性を維持する方法および物質を提供することを課題とする。
発明の要旨
従って、本発明は、ＷＩＦドメインを有するタンパク質を提供する。より特定すると、このＷＩＦドメインを有するタンパク質はＷＩＦ−１（例えば、配列番号２、４、６、８、１０など）である。ＷＩＦ−１のようなＷＩＦドメインを有するタンパク質は、必要に応じてＳＣＦのような幹細胞の生存を支持する因子とともに用いることによって、分化せずに多能性を保持した幹細胞を提供することができる。従来、ＷＩＦドメインを有するタンパク質はＷＮＴタンパク質の機能を阻害することが示されていたが、幹細胞に作用して、その未分化性および多分化性を維持し、分化を停止させることは全く知られておらず、従ってこの事項は格別の効果ということができる。
本発明は、以下を提供する。
１．  幹細胞を分化させずにその多能性を維持する、ＷＩＦドメインを有するポリペプチド。
２．上記ＷＩＦドメインは、配列番号４に記載の配列の約３０位〜約１８０位のうちの少なくとも５アミノ酸を含む、項目１に記載のポリペプチド。
３．上記ＷＩＦドメインは、配列番号４に記載の配列の約３０位〜約１８０位を含む、項目１に記載のポリペプチド。
４．上記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、項目１に記載のポリペプチド。
５．上記ＥＧＦ様リピートは、ＣＸ３ＣＸ５ＣＸ５ＣＸＣＸ８ＣＸ４からなる少なくとも１つのリピートを含み、ここで、Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸を表す、項目４に記載のポリペプチド。
６．上記ポリペプチドは、配列番号４に示される配列を有する、項目１に記載のポリペプチド。
７．上記幹細胞は、造血幹細胞である、項目１に記載のポリペプチド。
８．幹細胞を分化させずに多能性を維持するための組成物であって、上記組成物は、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドを含む、組成物。
９．上記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに有する、項目８に記載の組成物。
１０．上記ポリペプチドは、配列番号４に示される配列を有する、項目８に記載の組成物。
１１．さらに、幹細胞生存因子を含む、項目８に記載の組成物。
１２．上記幹細胞生存因子はＳＣＦである、項目８に記載の組成物。
１３．インビトロで分化せず、かつ、多能性を保持する、幹細胞。
１４．造血幹細胞である、項目１３に記載の幹細胞。
１５．上記多能性を保持する期間は、少なくとも６日間である、項目１３に記載の幹細胞。
１６．上記多能性は、血液細胞への分化能を包含する、項目１３に記載の幹細胞。
１７．長期多能性保持細胞組成物であって、幹細胞；およびＷＩＦドメインを有するポリペプチド、を包含する、長期多能性保持細胞組成物。
１８．上記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、項目１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
１９．上記幹細胞は、造血幹細胞である、項目１７に記載の長期多能性維保持細胞組成物。
２０．上記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、項目１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
２１．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に記載の配列を含む、項目１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
２２．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
２３．さらに、幹細胞生存因子を含む、項目１７に記載の長期多能性保持細胞組成物。
２４．上記幹細胞生存因子はＳＣＦである、項目２３に記載の長期多能性保持細胞組成物。
２５．上記幹細胞生存因子はＦＬＴ−３  リガンドである、項目２３に記載の長期多能性保持細胞組成物。
２６．上記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目２３に記載の組成物。
２７．分化細胞を調製するための、項目２３に記載の組成物であって、上記分化細胞は、血液細胞の障害を処置するために使用される、組成物。
２８．幹細胞を分化させずに、多能性を維持させる方法であって、
１）上記幹細胞にＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する工程、
を包含する、方法。
２９．上記ポリペプチドは、ＥＧＦ様ドメインをさらに含む、項目２７に記載の方法。
３０．上記幹細胞は、造血幹細胞である、項目２７に記載の方法。
３１．上記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、項目２７に記載の方法。
３２．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示す配列を含む、項目２７に記載の方法。
３３．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目２７に記載の方法。
３４．さらに、
２）幹細胞生存因子を上記幹細胞に提供する工程、
を包含する、項目２７に記載の方法。
３５．上記幹細胞生存因子はＳＣＦである、項目３４に記載の方法。
３６．上記幹細胞生存因子はＦＬＴ−３  リガンドである、項目３４に記載の方法。
３７．上記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目３４に記載の方法。
３８．長期多能性保持細胞組成物を生産する方法であって、
１）幹細胞を提供する工程、
２）上記幹細胞にＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する工程、および
３）処理された上記幹細胞を収集する工程、
を包含する、方法。
３９．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、項目３８に記載の方法。
４０．上記幹細胞は、造血幹細胞である、項目３８に記載の方法。
４１．上記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、項目３８に記載の方法。
４２．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含む、項目３８に記載の方法。
４３．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目３８に記載の方法。
４４．さらに、
２）幹細胞生存因子を上記幹細胞に提供する工程、
を包含する、項目３８に記載の方法。
４５．上記幹細胞生存因子はＳＣＦである、項目４４に記載の方法。
４６．上記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、項目４４に記載の方法。
４７．上記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目４４に記載の方法。
４８．分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置する方法であって、
１）被検体に長期多能性保持細胞組成物を投与する工程であって、上記長期多能性保持細胞組成物は、
幹細胞；および
ＷＩＦドメインを有するポリペプチドを包含する、工程、
を包含する、方法。
４９．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、項目４８に記載の方法。
５０．上記分化細胞は血液細胞である、項目４８に記載の方法。
５１．上記幹細胞は、造血幹細胞である、項目４８に記載の方法。
５２．上記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、項目４８に記載の方法。
５３．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含む、項目４９に記載の方法。
５４．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目４９に記載の方法。
５５．上記長期多能性保持細胞組成物は、幹細胞生存因子をさらに含む、項目４９に記載の方法。
５６．上記幹細胞生存因子はＳＣＦである、項目５５に記載の方法。
５７．上記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、項目５５に記載の方法。
５８．上記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目５５に記載の方法。
５９．上記幹細胞を分化させる工程をさらに包含する、項目４９に記載の方法。
６０．上記被検体は、ヒトである、項目４９に記載の方法。
６１．上記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含むヒト組換えＷＩＦ−１である、項目４９に記載の方法。
６２．分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置するための医薬組成物であって、
幹細胞；
ＷＩＦドメインを有するポリペプチド；および
薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、医薬組成物。
６３．上記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、項目６２に記載の医薬組成物。
６４．上記分化細胞は血液細胞である、項目６２に記載の医薬組成物。
６５．上記幹細胞は、造血幹細胞である、項目６２に記載の医薬組成物。
６６．上記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、項目６２に記載の医薬組成物。
６７．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、ＷＩＦ−１である、項目６２に記載の医薬組成物。
６８．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目６２に記載の医薬組成物。
６９．幹細胞生存因子をさらに含む、項目６２に記載の医薬組成物。
７０．上記幹細胞生存因子はＳＣＦである、項目６９に記載の医薬組成物。
７１．上記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、項目６９に記載の医薬組成物。
７２．上記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目６９に記載の医薬組成物。
７３．上記疾患または障害がヒトの疾患または障害である、項目６２に記載の医薬組成物。
７４．上記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含むヒト組換えＷＩＦ−１である、項目６２に記載の医薬組成物。
７５．幹細胞を分化させずに、多能性を維持させるための、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドの使用。
７６．上記ポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートをさらに含む、項目７５に記載の使用。
７７．上記幹細胞は、造血幹細胞である、項目７５に記載の使用。
７８．上記幹細胞は、少なくとも１０３細胞存在する、項目７５に記載の使用。
７９．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含む、項目７５に記載の使用。
８０．上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目７５に記載の使用。
８１．幹細胞生存因子と組み合わせた、項目７５に記載の使用。
８２．上記幹細胞生存因子はＳＣＦである、項目８１に記載の使用。
８２．上記幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンドである、項目８１に記載の使用。
８３．上記幹細胞生存因子は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ存在する、項目８１に記載の使用。
８４．上記疾患または障害は、ヒトの疾患または障害である、項目７５に記載の使用。
８５．上記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含むヒト組換えＷＩＦ−１である、項目７５に記載の使用。
発明の詳細な説明
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（配列の説明）
配列番号１は、本発明のマウスＷＩＦ−１の全長ヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、本発明のマウスＷＩＦ−１の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号３は、本発明のヒトＷＩＦ−１の全長ヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、本発明のヒトＷＩＦ−１の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号５は、本発明のラットＷＩＦ−１の全長ヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、本発明のラットＷＩＦ−１の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号７は、本発明のＸｅｎｏｐｕｓ  ＷＩＦ−１の全長ヌクレオチド配列を示す。
配列番号８は、本発明のＸｅｎｏｐｕｓ  ＷＩＦ−１の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号９は、本発明のＺｅｂｒａｆｉｓｈ  ＷＩＦ−１の全長ヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、本発明のＺｅｂｒａｆｉｓｈ  ＷＩＦ−１の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、実施例１で使用した縮重プライマー（順向き）の配列を示す。
配列番号１２は、実施例１で使用した縮重プライマー（逆向き）の配列を示す。配列番号１１および１２を含め本明細書において、使用される核酸表記は、以下のとおりである。ａ：アデニン；ｃ：シトシン；ｇ：グアニン；ｔ：チミン；ｕ：ウラシル；ｍ：ＡまたはＣ；ｒ：ＧまたはＡ；ｗ：ＡまたはＴもしくはＵ；ｓ：ＧまたはＣ；ｙ：ＴもしくはＵまたはＣ；ｋ：ＧまたはＴもしくはＵ；ｖ：ＡまたはＧまたはＣ；ｈ：ＡまたはＣまたはＴもしくはＵ；ｄ：ＡまたはＧまたはＴもしくはＵ；ｂ：ＧまたはＣまたはＴもしくはＵ；およびｎ：（ＡまたはＣまたはＧまたはＴもしくはＵ）または（不明または他の塩基）。
配列番号１３は、ｐＣＡＧＧＳ−６Ｈｉｓベクターの配列を示す。
配列番号１４、１６、１８、２０は、本発明のＷＩＦドメインを有するポリペプチドの保存的置換改変体のヌクレオチド配列を示し、配列番号１５、１７、１９、２１は、本発明のＷＩＦドメインを有するポリペプチドの保存的置換改変体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＷＩＦドメインのみを含む改変体のヌクレオチド配列を示し、配列番号２３は、ＷＩＦドメインのみを含む改変体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＥＧＦ様リピートのみを含む改変体のヌクレオチド配列を示し、配列番号２５は、ＥＧＦ様リピートのみを含む改変体のアミノ酸配列を示す。
（用語の定義）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。
本発明では、通常幹細胞が使用され得るが本発明の因子による処理によって多能性を獲得し未分化状態になることができる細胞であれば、どのような細胞でも使用することができる。「幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有した細胞と定義され、実際には組織が傷害を受けたときに少なからずその組織を再生することができる細胞をいう。本明細書において、幹細胞の「生」とは未分化状態のまま多能性を失うことなく生存ないし増殖すること意味し、幹細胞の「死」とは分化ないしアポトーシスに至る現象を意味する。本発明において使用される幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。従って、本発明の１つの好ましい実施形態では、細胞として胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓおよびＥｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）が使用され得る。別の好ましい実施形態では、組織幹細胞（例えば、造血幹細胞）が使用され得る。
組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が比較的限定されている細胞であり、組織中に存在し、未分化な細胞内構造をしている。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。従って、本発明の１つの好ましい実施形態において、細胞として血液細胞へと方向付けられた組織幹細胞が使用され得る。
組織幹細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の組織幹細胞には、脳に存在する神経幹細胞や皮膚存在にする表皮幹細胞や毛包幹細胞さらに色素幹細胞が含まれる。中胚葉由来の組織幹細胞には、骨髄中および血液中に認められるに血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞が含まれる。内胚葉由来の組織幹細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞、腸管上皮幹細胞が含まれる。そのほかに精巣および卵巣にはｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍが存在する。本発明の好ましい実施形態では、中胚葉由来の幹細胞が使用され得る。本発明のより好ましい実施形態では、造血幹細胞が使用され得る。
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。血液細胞は造血幹細胞に由来することから、本発明の１つの実施形態では、造血幹細胞が使用され得る。
造血幹細胞は、幹細胞の中では最も研究されている幹細胞のひとつである。しかし、造血幹細胞については、例えばその可塑性など、解明すべき点も多く残っている。造血幹細胞の同定には確立された移植実験系が不可欠である。造血幹細胞の研究にはもっぱらマウスモデルが用いられている。造血幹細胞は、１０万個の骨髄細胞中に約３〜４個の頻度で存在する（Ｂ６マウスの場合）。造血幹細胞を実験または医療において応用する場合、他の骨髄細胞から分離することが必要となる。造血幹細胞純化のために現在最も効率的な方法は、骨髄細胞を種々の細胞表面抗原に対する蛍光標識された抗体で染色し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）を用いてそれぞれの抗原に対して陽性または陰性の細胞画分にわけ、造血幹細胞の存在する画分を選択することによって、造血幹細胞を濃縮する方法である。
骨髄中の造血幹細胞は、ＣＤ３４陰性または弱陽性、ｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性、ｌｉｎｅａｇｅマーカー陰性（ＣＤ３４−ＫＳＬ）細胞分画に高頻度に存在する。競合的骨髄再構築法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を用いて、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞１個をマウスに移植するとレシピエントマウスのおよそ３匹中に１匹の割合で長期の造血系再構築が起こることが知られており、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の３個に１個は造血幹細胞であるといえる（実験医学、Ｖｏｌ．１９  Ｎｏ．１５（増刊）５５−５９  ２００１）。再構築レベルが不均一であることから、造血幹細胞集団は均一ではないようである。この造血幹細胞濃縮画分は、充分に実験室レベルおよび臨床レベルで使用することが可能である。
本発明では、そのように濃縮または純化した造血幹細胞集団を細胞供給源として用いることができる。
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞、血液細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、胆管細胞、血液細胞（例えば、赤血球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。従って、本発明の１つの実施形態において、ある分化細胞を本発明の因子で処理することによって、分化せず、かつ、多能性を獲得することができる場合、そのような分化細胞もまた本発明の範囲内にある。本発明の幹細胞から調製した分化細胞もまた、種々の疾患および障害の治療および／または予防に利用することができる。従って、分化細胞および分化細胞を含む組成物もまた本発明の範囲内に入る。そのような分化細胞は、本発明の幹細胞に分化因子（例えば、ＥＰＯ，種々のインターロイキン（ＩＬ−３）のような造血因子など）を適用することによって調製することができる。本明細書において「分化因子」とは、幹細胞に作用して、分化を促進させる因子（例えば、ポリペプチドなど）をいう。分化因子の例としては、例えば、種々のインターロイキン（ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１など）、コロニー刺激因子（ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ，、Ｍ−ＣＳＦなど）のようなサイトカインなど、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＦＧＦ）のような各種増殖因子などが挙げられる。
本明細書において「単離（された）」とは、ある物質または細胞の状態についていい、その物質または細胞が天然に存在する状態とは別の状態にあることをいい、その物質または細胞が天然に存在するときに付随する少なくとも１つの物質または細胞が伴わない状態をいう。本明細書において、細胞を「濃縮」するとは、ある特定の細胞の存在頻度を天然に存在する頻度より高くすることをいう。本明細書において細胞を「純化する」とは、その細胞の存在頻度が高い状態にすることであって、実質的にその細胞以外の細胞が、その細胞の機能に影響を与えない程度で存在させることをいう。従って、好ましい状態では、純化された細胞または細胞組成物は、ある特定の細胞のみを含む。本明細書において物質を「精製する」とは、その物質の存在頻度が高い状態にすることであって、実質的にその物質以外の物質が、その物質の機能に影響を与えない程度で存在させることをいう。従って、好ましい状態では、純化された物質または物質を含む組成物は、ある特定の物質のみを含む。
また、本発明の多能性を有する細胞は、その細胞が造血幹細胞である場合、少なくとも１つの血球・リンパ球系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、好中球、巨核球、血小板、赤芽球、赤血球など）へと分化することができ、好ましくは本発明の多能性を有する細胞は、すべての血球・リンパ球系細胞へと分化することができる。従って、本発明の好ましい分化細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、好中球、巨核球、血小板、赤芽球、赤血球などの血球・リンパ球系リンパ系細胞であり得る。
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的・機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別の型の細胞に分化することは例外的にしか起こらない。従って、「未分化（状態）」とは、形態的・機能的に質的な差を未だ持たない細胞の状態をいう。
本明細書において、「多能性」とは、細胞の性質をいい、種々の組織または器官（臓器）に属する細胞に分化し得る能力をいう。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され，成体では一つの組織または器官を構成する分化細胞が別の組織または器官の細胞に変化することは少ない。したがって多能性は通常失われている。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。本明細書において、「多能性を維持する」とは、幹細胞などの細胞の多能性保つことをいう。本発明は、通常の幹細胞よりも長く多能性を維持する幹細胞を生産することを達成した画期的な発明である。
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）でもよい。好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。
本明細書において、「ＷＩＦドメイン」とは、ＷＩＦ−１のシグナルペプチドを除いたＮ末端領域のうち、ＥＧＦ様リピートが始まるまでの領域をいう。従って、マウスＷＩＦドメインの場合は、配列番号１においてアミノ酸番号が約３０位〜約１８０位までが相当する。本明細書では、「ＷＩＦドメイン」は、配列番号２に示される配列のアミノ酸番号の約３０位〜約１８０位と同一のもののほか、配列番号４に示されるヒトＷＩＦドメインの約３０位〜約１８０位と同一のもの、配列番号８に示されるＸｅｎｏｐｕｓのＷＩＦドメインの約３０位〜約１８０位と同一のもの、配列番号１０に示されるＺｅｂｒａｆｉｓｈのＷＩＦドメインの約３０位〜約１８０位と同一のもの、ならびにそれらに類似する配列をも含む。ここで類似する配列とは、好ましくは、上記マウス、ヒト、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＺｅｂｒａｆｉｓｈのＷＩＦドメインから選択される１つの配列に示される配列の保存的置換体をいう。保存的置換は下記に定義される。本発明においては、通常、上記長さのＷＩＦドメインを有するポリペプチドが用いられるが、それより短いＷＩＦドメインの部分を含むポリペプチドも用いることができる。そのようなより短いＷＩＦドメインを含むポリペプチドがＷＩＦドメインの機能を有するかどうかは、Ｈｓｉｅｈ  Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，４３１−４３６，１９９９に記載されるＷｎｔたのインビトロ阻害活性アッセイを用いて判定することができる。従って、そのようなより短いＷＩＦドメインは、配列番号２に示される配列のアミノ酸番号の約３０位〜約１８０位と同一のもののほか、配列番号４に示されるヒトＷＩＦドメインの約３０位〜約１８０位と同一のもの、配列番号８に示されるＸｅｎｏｐｕｓのＷＩＦドメインの約３０位〜約１８０位と同一のもの、配列番号１０に示されるＺｅｂｒａｆｉｓｈのＷＩＦドメインの約３０位〜約１８０位のうち、少なくとも５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、４０アミノ酸、５０アミノ酸、６０アミノ酸、７０アミノ酸、８０アミノ酸、９０アミノ酸、１００アミノ酸、１１０アミノ酸、１２０アミノ酸、１３０アミノ酸、１４０アミノ酸または１５０アミノ酸を含み得る。本明細書において、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドで好ましいものはＷＩＦ−１である。ＷＩＦ−１のアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号２、４、６、８および１０（それぞれ、マウス、ヒト、ラット、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＺｅｂｒａｆｉｓｈ）があり、これらは、種間でよく保存されている（図１を参照のこと）。
本明細書において、「ＥＧＦ様リピート」とは、上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）において特徴的なドメインをいう。６つのシステインを１単位とする重複配列で、上皮増殖因子（ＥＧＦ）では、「ＣＸ７ＣＸ４−５ＣＸ１０−１３ＣＸＣＸ８Ｃ（Ｘは任意のアミノ酸）」からなるリピートを９つ有する。本明細書において有用なポリペプチドは、好ましくは、少なくとも１つのＥＧＦ様リピートを含み、より好ましくは、２、３、４または５つのＥＧＦ様リピートを含み得る。ＷＩＦ−１は、「ＣＸ３ＣＸ５ＣＸ５ＣＸＣＸ８ＣＸ４（Ｘは任意のアミノ酸）」からなるリピートを５つ有する。本発明のＷＩＦ−１ポリペプチドには、ＥＧＦ様リピートが５個存在し、その位置は、マウスＷＩＦ−１ポリペプチド（配列番号２）の場合、１８２〜２１３、２１４〜２４５、２４６〜２７７、２７８〜３０９、３１０〜３４１にある。ＥＧＦ様リピートを有するポリペプチドとしては、ｎｏｔｃｈ−１、ｎｏｔｃｈ−２、ｊａｇｇｅｄ−１、Ｄｌｌ−１、ＤＬＫなどが挙げられる。ＥＧＦ様リピートを有するポリペプチドは、ひろく幹細胞の分化制御に関わることは示されていた（ＷＯ９７３１６４７Ａ１）が、造血幹細胞を、その分化を停止または遅延させつつ（すなわち未分化のまま）多能性を保持させる活性がＷＩＦ−１に見い出されたのは本発明が初めてであり、その技術的意義は大きい。
本発明のＷＩＦ−１ポリペプチドのシステイン残基は、配列番号２の１４０位、１７７位、１８２位、１８６位、１９２位、１９８位、２００位、２０９位、２１４位、２１８位、２２４位、２３０位、２３２位、２４１位、２４６位、２５０位、２５６位、２６２位、２６４位、２７３位、２７８位、２８２位、２８８位、２９４位、２９６位、３０５位、３１０位、３１４位、３２０位、３２６位、３２８位、３３７位に存在する。これらは種間で保存されている。
また、糖鎖が付加され得る部分としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分として、配列番号２の１２０位、１５８位、１７０位、１９３位、２２０位、２４０位、２４５位、２５２位、２８４位、３２４位、３３８位などが挙げられる。これらもまた種間で保存されている。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合をする部分としては、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が挙げられる。これらの糖鎖が付加されたタンパク質は、通常生体内での分解に対して安定であり、強い生理活性を有し得る。従って、これら糖鎖が付加されたポリペプチドもまた、本発明の範囲内にある。
本発明のポリペプチドは、任意の生物由来であり得る。好ましくは、その生物は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、魚類、鳥類など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、齧歯類（マウス、ラットなど）、霊長類（ヒトなど）など）であり得る。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、合成されたものであってもよい。アミノ酸を合成する方法は、当該分野において周知である。そのような合成方法としては、ペプチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）などを利用した方法が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパク質を発現させて、ジスルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくは活性に影響を与えないほかの方法でジスルフィド結合を生じさせる形態で、Ｃ末端、Ｎ末端または他の場所において発現するように作製された融合タンパク質を含む二量体以上高い比活性を有する多量体型ポリペプチドもまた利用され得る。また、配列番号２のような本発明の配列を直列で並べて多量体構造を持たせる方法も本発明において利用可能である。従って遺伝子工学技術により作製される任意の二量体またはそれを超える形態は、本発明の範囲内にある。
本明細書において「幹細胞生存因子」とは、幹細胞の生存に必須の因子をいう。従来、幹細胞の生存（および分化）には、ＳＣＦが必要と考えられていた。しかし、Ｏｒｎｉｔｚ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．１０，１７３−１８２，１９９９）は、ＳＣＦのレセプターであるｃ−Ｋｉｔを発現しない多能性造血幹細胞を発見した。従って、ＳＣＦ自体が全ての幹細胞生存に必須であるとは限らないことが示されている。従って、当業者は、幹細胞生存因子は、幹細胞に依存して変動することを認識する。幹細胞生存因子としては、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ｆｌｔ−３リガンドなどが挙げられる。１つの実施形態では、幹細胞生存因子は、ＳＣＦ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（幹細胞因子）、ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒとしても知られる）であり得る。ＳＣＦは、幹細胞の機能を制御する因子として同定された。しかし、本明細書において示されるように、ＳＣＦ自体には幹細胞の自己複製に関連する活性はなく、むしろ、ｃ−Ｋｉｔレセプターを有する細胞についてその生存を支持するものの、結果的には細胞を分化の方向へ向けてしまうことが明らかとなった。従って、ＳＣＦは、幹細胞生存因子の一種として働くものと考えられ、本明細書においては、ＳＣＦは幹細胞生存因子の好ましい例として記載される。
また、従来ＣＤ３４陽性は多能性の有力なマーカーと考えられており、このマーカーの発現をもって多能性を有することの指標とされていたが、本明細書において多能性とは必ずしも相関しないことが示された。従って、本発明において、ＷＩＦドメインを有するタンパク質が幹細胞の分化をさせずに多能性を維持する機能を有することが見出されたことは驚くべき効果であるといえる。
ＮｏｔｃｈのリガンドとしてＪａｇｇｅｄ−１が知られている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１３６５−１３７２，２０００）。ここでは、Ｊａｇｇｅｄ−１は造血細胞との関連は示されていたが、これ単独ないしＳＣＦとの共存下で未分化のまま多能性を保持させることは見出されていなかった。
ＴＰＯのような造血因子もまた、造血幹細胞における分化制御に関連があることが示されている。Ｂｌｏｏｄ，１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００１，Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．７，ｐｐ．２０９１−２１００では、造血因子による正常臍帯血および骨髄ＣＤ３４陽性細胞におけるアポトーシス抑制因子群のｓｕｒｖｉｖｉｎの役割が示された。その中で、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ）、ＳＣＦの組合せが２４時間以内にＣＤ３４＋細胞のｓｕｒｖｉｖｉｎの発現を上方制御することが示されている。また、細胞周期に入ることとｓｕｒｖｉｖｉｎの発現が同期することが示唆されている。しかし、細胞分化との関連は検討されていない。
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子（重合体）をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド（ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド）がある。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することが挙げられる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、そのポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清から組換え生理活性物質を得ることができる（例えば、細胞増殖因子）。上記宿主細胞は、そのポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られたポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、１以上の糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。機能的に等価であるかどうかは、本明細書において記載される任意のアッセイを用いて指標となるポリペプチドと同じ機能を有するかを評価することにより判定することができる。
用語「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。
本明細書において使用されるポリペプチドをコードする核酸分子は、発現されるポリペプチドが本発明のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、このポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような核酸分子を作製する方法は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変異誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
ある核酸分子の断片を、それが由来した元の核酸分子に対する選択的プローブまたは選択的プライマーとして使用するためには、特異的にハイブリダイズし得る断片である必要がある。本明細書においてあるＤＮＡが「特異的にハイブリダイズ」するとは、提供された核酸分子を互いに区別して検出または増幅し得ることをいう。選択的プローブには、代表的には、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも３０、４０または５０ヌクレオチド長であり得、５０を超えるヌクレオチド長も使用され得る。選択的プローブは、選択的プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物として入手され得る。１対のプライマーの少なくとも一方に、選択的プライマーをＰＣＲに使用する場合、選択的プライマーは、代表的には少なくとも９ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０または５０ヌクレオチド長であり得る。
遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では塩基配列の同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。
「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２，４または６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。記載の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
「誘導体オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドをいう。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。
本明細書において、「アミノ酸」は、上述のように天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸は、当該分野において周知である。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。本発明の１実施形態であるＷＩＦドメインを有するタンパク質の場合は、その生物学的活性は、Ｗｎｔファミリーのレセプターの少なくとも１つへの結合活性を包含する。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。本明細書において、核酸分子の「ホモログ（種相同体）」とは、参照核酸分子のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ホモログは、代表的には、参照核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。本発明の核酸分子についていう場合、「ホモログ」とは、そのタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列と相同性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、その生物学的機能が本発明のプロモーターと同一または類似する核酸分子をいう。従って、「ホモログ」と「改変体」とは一部重複する概念である。従って、ホモログは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのようなホモログを取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。例えば、本発明のＷＩＦ−１のホモログは、同じ種の相同遺伝子または他の種の対応する遺伝子であり得る。従って、本発明のＷＩＦドメインを有するタンパク質には、すべてのＷＩＦ−１のホモログが包含される。
本明細書において、ベクターを導入することが必要である場合、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換などが挙げられる（例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。プロモーターとしては、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１［Ｐｒｏｍｅｇａ］、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）などが例示される。
酵母細胞に対する「組換えベクター」としては、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが例示される。
動物細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］などが例示される。
植物細胞に対する「組換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどが例示される。
昆虫細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。
原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。
酵母細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属などに属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどを挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５などが例示される。
植物細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ダイズ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、ライムギ、アルファルファ、アマなどの植物細胞などを挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）などが例示される。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞などを用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）など、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ４などが例示される。
ポリペプチドまたはその塩の製造法は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、その培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、本明細書においては、抗体の全部およびそのフラグメント、誘導体、結合体なども包含する。好ましくは、本発明のポリペプチドを認識する抗体であり、より好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体である。そのような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
本発明の因子によって調製された細胞または細胞組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。
１つの実施形態において、本発明の因子は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
本明細書においてポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。
「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンプロット法、ドットプロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
（発明を実施する最良の形態）
１つの局面において、本発明は、幹細胞を未分化のままか分化を抑制しつつ多能性を維持する、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する。ここで、未分化のまま（または分化させない）とは、未分化状態を保つか、またはほとんど分化させないことをいう。従って、分化しないことと、未分化であること、および分化を抑制することは本明細書において同義である。また、分化していないとは、生物の発生初期において一つ一つの細胞や細胞群が何ら形態的または機能的特徴を示さず区別しがたい状態である。
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＷＩＦ−１である。ＷＩＦ−１は好ましくは、配列番号２（マウス）、配列番号４（ヒト）、配列番号６（ラット）、配列番号８（Ｘｅｎｏｐｕｓ）または配列番号１０（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）に示される配列含む。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号４に示される配列またはその改変体の配列を含む。さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号４に示される配列を含む。ＷＩＦ−１は、Ｗｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ−１の略で、Ｗｎｔタンパク質に結合し、その活性を阻害する新規分泌タンパク質として、１９９９年に初めて報告された（Ｈｓｉｅｈ  Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，４３１−４３６，１９９９）。Ｈｓｉｅｈらは、ヒト、マウス、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＺｅｂｒａｆｉｓｈでこのＷＩＦ−１の遺伝子産物およびそ発現パターンを同定し、Ｗｎｔタンパク質のインビトロでの阻害活性を示した。Ｈｓｉｅｈらの報告ではさらに、Ｘｅｎｏｐｕｓで体節・体軸形成活性を阻害することが示された。しかし、他の生物での活性は示されなかった。
Ｗｎｔは、胎生期の体軸形成および器官形成を制御する因子として知られている（Ｃａｄｉｇａｎ  Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ  Ｒ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１：３２８６−３３０５）。Ｗｎｔは、別々の研究において、マウス（当初ｉｎｔ−１と呼ばれていた）、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ；ｗｇ（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）と呼ばれていた）で見出されたが、後になって、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ヒトを含む哺乳動物、両生類などのような広範囲の脊椎動物にも存在することが見出された。しかし、Ｗｎｔには、Ｗｎｔ−１など２０種類程度ホモログが存在し、各々の機能が多岐にわたる。ある種のＷｎｔは細胞質内でのβカテニンの安定化およびそれに伴う遺伝子発現を介していると考えられているが、癌形成に関与していると示唆されているＷｎｔもあり、Ｗｎｔ全体としての機能は混沌としている。Ｗｎｔと相互作用するタンパク質として、Ｆｚ（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）レセプターが知られているが、その作用機能は種々説があり、解明されていない。
従って、ＷＩＦ−１は、Ｗｎｔの阻害活性を有する因子として単離されたが、実際の機能は今日まで不明なままであった。ＷＩＦ−１は、その配列からも明らかなように、ＥＧＦ様リピートを有していることから、本発明では、ＥＧＦ様リピートは分化調節機能が注目される。別の局面では、ＷＩＦ特有のドメインである、マウスＷＩＦ−１のアミノ酸配列約３０位〜約１８０位に相当するＷＩＦドメインもまたその分化調節機能が注目される。本発明では、ＷＩＦドメインを有するタンパク質であって、必要に応じてＥＧＦ様リピートを有するタンパク質が、必要に応じてＳＣＦのような生存に必須の因子の存在下で、細胞の分化をさせずに、多能性を維持しつつ増殖させる機能を有することが明らかになった。従って、好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＷＩＦドメインとＥＧＦ様リピートとを含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートを含む他のポリペプチドであり得る。ＥＧＦ様リピートを有するポリペプチドが造血幹細胞の多能性を喪失させずに分化を抑制するということは、これまでに報告されておらず、このことにより、臨床応用が可能な造血幹細胞の大量培養が達成されたという意味で発見は意義深い。従って、好ましい実施形態では、本発明において使用される幹細胞は、造血幹細胞であり得る。
また、ＷＩＦ−１の遺伝子をクローニングするために次の方法も考慮され得る。ＷＩＦ−１は、多種の生物において見出されていることから、生物の進化の過程で一部のアミノ酸配列が保存されていると考えられる。従って、保存されたアミノ酸配列（例えば、ＷＩＦドメインまたはＥＧＦ様ドメインなど）に対応するＤＮＡ配列を設計し、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）のプライマーとして利用し、他の生物由来のＰＣＲテンプレートをＰＣＲ反応によって増幅することによって、本発明のポリペプチドに対応する他の生物の等価物が得られ得る。従って、そのような等価物もまた、本発明の範囲内にある。また、ヒトゲノムプロジェクトのようなゲノムデータ、ＧｅｎＢａｎｋのような遺伝子情報データベースに対して、ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いて相同性検索を行って得られた配列もまた、本発明の範囲内にある。
検索により見い出された断片をプローブとして用いて、発現臓器のようなｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、さら長い遺伝子配列遺伝子、または全長遺伝子をクローニングすることによって得られた配列もまた、本発明の範囲内にある。このようなスクリーニング方法としては、放射性同位体を使用するかまたはしない方法が挙げられる。また、５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法のようなライブラリーを使用しない方法も利用可能である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換された幹細胞が提供される。
別の局面では、本発明は、幹細胞を未分化のまま多能性を維持するための組成物を提供する。この組成物は、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドを含む。本発明の組成物は、必要に応じて、さらに、幹細胞生存因子を含む。「幹細胞生存因子」は、上述のように幹細胞の生存に必須の因子をいう。従来、幹細胞の生存（および分化）には、ＳＣＦが必要と考えられていた。しかし、Ｏｒｎｉｔｚ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．１０，１７３−１８２，１９９９）は、ＳＣＦのレセプターであるｃ−Ｋｉｔを発現しない多能性造血幹細胞を発見した。従って、ＳＣＦ自体が全ての幹細胞生存に必須であるとは限らないことが示されている。また、ＳＣＦ自体には分化活性はないことが示されている。したがって、本明細書において使用される幹細胞は、それが生存する状況下であれば、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドの存在下で、未分化のままかつ多能性を保持したまま増殖することができる。通常は、幹細胞は上述のようにＳＣＦを必要とすることから、好ましくは、ＷＩＦドメインを有するポリペプチド（例えば、ＷＩＦ−１）とＳＣＦとの存在下で、未分化のままかつ多能性を保持したまま増殖する。従って好ましい実施形態では、上記幹細胞生存因子は、ＳＣＦである。なお、ＳＣＦ単独の存在下では、本明細書において実施例で示されるように、生存を維持するものの、多能性を徐々に消失させることが明らかになった。
本発明の別の局面において、本発明は、インビトロで未分化のまま、かつ、多能性を有する、幹細胞を提供する。好ましい実施形態では、本発明の細胞は造血幹細胞である。好ましくは、本発明の、インビトロで未分化のまま、かつ、多能性を有する、幹細胞は、少なくとも３日間または少なくとも５日間、好ましくは、少なくとも６日間、さらに好ましくは少なくとも１０日間、さらに好ましくは少なくとも２０日間、３０日間、２カ月、３カ月、６カ月、１年間、多能性を保持する。天然には、分化せず、かつ、多能性を保持する、幹細胞としては、新鮮な幹細胞（例えば、造血幹細胞）があるが、本発明の因子の非存在下では、すぐに分化してしまうかまたは死滅することから、上記のように長期間（例えば、数日〜数年）未分化のままの状態を維持することは、従来技術では達成できなかった格別の効果といえる。生体から分離した直後の幹細胞と同じ機能を、従来では達成できなかったほど長時間保持することができるということは格別の効果といえる。本明細書において多能性保持期間とは、分化するように運命付けられるまでの期間をいう。分化したかどうかの判定は、種々の公知の方法を用いて行うことでき、そのような方法としては、例えば、コロニーアッセイによる判定がある。１つの実施形態において、コロニーアッセイによって判定される場合、本発明のインビトロで単離された幹細胞は、それは少なくとも１４日間多能性を保持する。
好ましい実施形態において、本発明の細胞に備わる多能性は、血液細胞への分化能を包含する。
別の局面において、本発明は、長期多能性維持細胞組成物を提供する。本明細書において、「長期多能性維持細胞組成物」とは、細胞を含む組成物であって、その細胞（好ましくは幹細胞）が長期にわたって（例えば、少なくとも３日以上、好ましくは、少なくとも５日間、より好ましくは、少なくとも１０日間、さらに好ましくは少なくとも２０日間、３０日間、２カ月、３カ月、６カ月、１年間）、多能性を保持しながら分化しない、組成物をいう。本発明の長期多能誠意時細胞組成物は、幹細胞；およびＷＩＦドメインを有するポリペプチドを含有する。
本発明の１つの実施形態において、上記幹細胞は、造血幹細胞であり得る。別の実施形態において、上記幹細胞は、他の組織幹細胞であり得る。他の実施形態において、上記幹細胞は胚性幹細胞であり得る。
好ましくは、本発明の組成物において、幹細胞は、少なくとも１０３細胞、好ましくは、少なくとも２×１０３細胞、少なくとも５×１０３細胞、少なくとも１０４細胞、少なくとも２×１０４細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも２×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１０７細胞、少なくとも２×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１０８細胞、少なくとも２×１０８細胞、少なくとも５×１０８細胞、少なくとも１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞、少なくとも１０１０細胞、または少なくとも１０１０細胞を超えて存在する。適切な量は、使用する状況に応じて変動し、当業者であれば、組成物中に存在する因子の状態、医薬に使用する場合は、患者の状態、患者の疾患の状態、投与経路、投与形態などにより応じて適宜決定することができる。
好ましい実施形態において、上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチドは、ＷＩＦ−１（例えば、配列番号２、４、６、８または１０に示される配列を含む）であり得る。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＥＧＦ様リピートを有するポリペプチドであり、そのようなポリペプチドとしては、ｎｏｔｃｈファミリータンパク質のメンバー（ｎｏｔｃｈ−１、ｎｏｔｃｈ−２、ｊａｇｇｅｄ−１、Ｄｌｌ−１、ＤＬＫなど）が挙げられる。本発明のポリペプチドまたは本発明において使用されるポリペプチドは、天然型のポリペプチドであってもよく、機能的に等価なものであれば、組換え産生されたポリペプチド、合成ポリペプチドでも、改変体でもよい。本発明のポリペプチドは、幹細胞に対して核酸形態で提供され得る。その場合、その幹細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子で形質転換され得る。形質転換の方法は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において詳述されている。従って、当業者であれば、本明細書の教示に従って、そのような形質転換を行うことができる。
本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在する。より好ましくは、上記ポリペプチドは、１．０ｎｇ／ｍｌ少なくとも２．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１０．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌを超えて存在し得る。
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、幹細胞生存因子をさらに含む。好ましくは、この幹細胞生存因子はＳＣＦであり得る。未分化のまま多能性を維持する活性は、本発明のポリペプチドにこれら幹細胞生存因子を共存させることによって増強される。
好ましい実施形態において、上記幹細胞生存因子（例えば、ＳＣＦ）は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在し得る。より好ましくは、上記幹細胞生存因子（例えば、ＳＣＦ）は、１．０ｎｇ／ｍｌ少なくとも２．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１０．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌを超えて存在し得る。
別の好ましい実施形態において、幹細胞生存因子はＴＰＯであり得る。未分化のまま多能性を維持する活性は、本発明のポリペプチドにＴＰＯを共存させることによって増強される。ＴＰＯは、ＳＣＦおよび／またはＦＬに加えて添加することによって未分化のまま多能性を維持する活性を増強することができる。
好ましい実施形態において、ＴＰＯは、１．０ｎｇ／ｍｌ少なくとも２．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１０．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌを超えて存在し得る。
別の好ましい実施形態において、幹細胞生存因子はｆｌｔ−３  リガンド（ＦＬ）であり得る。より好ましくは、未分化のまま多能性を維持する活性は、本発明のポリペプチドに複数の幹細胞生存因子（例えば、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦＬの少なくとも２つ、好ましくは３つ）とを共存させることによってさらに増強される。
好ましい実施形態において、ＦＬは、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ存在し得る。より好ましくは、ＦＬは、１．０ｎｇ／ｍｌ少なくとも２．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５００．０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも２．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１０．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌを超えて存在し得る。
別の好ましい実施形態において、本発明は、分化細胞を調製するための組成物が提供する。この分化細胞は、血液細胞の障害を処置するために使用され得る。分化細胞を幹細胞から調製する方法は当該分野において周知であり、例えば造血因子を添加する方法などが挙げられる。
別の局面において、本発明は、幹細胞を未分化のまま、多能性を維持する方法を提供する。この方法は、１）該幹細胞にＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する工程、を包含する。
本発明の幹細胞の多能性を維持する方法の実施形態において、上記組成物の好ましい実施形態における特定事項はまた、本発明の方法の特定事項であり得る。
本発明の１つの実施形態において、上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチド（例えば、ＷＩＦ−１（配列番号２、４、６、８および１０に示される配列を含むポリペプチドなど））は、ポリペプチド形態で直接提供され得る。別の実施形態において、このポリペプチドは、核酸形態で提供され得る。核酸形態で提供される場合は、本発明の方法は、上記幹細胞をそのポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子で形質転換する工程をさらに包含する。
本発明の別の実施形態において、本発明の方法は、幹細胞生存因子（例えば、ＳＣＦ）を上記幹細胞に提供する工程をさらに包含する。幹細胞生存因子は、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドの提供前、後、または同時に提供される。この幹細胞生存因子は、ポリペプチド形態で直接提供され得る。別の実施形態において、この幹細胞生存因子は、核酸形態で提供され得る。核酸形態で提供される場合は、本発明の方法は、上記幹細胞をその幹細胞生存因子をコードする核酸配列を含む核酸分子で形質転換する工程をさらに包含する。
別の局面において、本発明は、長期多能性保持細胞組成物を生産する方法を提供する。この方法は、１）幹細胞を提供する工程、２）該幹細胞にＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する工程、および３）処理された該幹細胞を収集する工程、を包含する。
本発明の長期多能性保持細胞組成物を生産する方法の実施形態において、上記組成物の好ましい実施形態における特定事項はまた、本発明の方法の特定事項であり得る。
本発明の１つの実施形態において、上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチド（例えば、ＷＩＦ−１）は、ポリペプチド形態で直接提供され得る。別の実施形態において、このポリペプチドは、核酸形態で提供され得る。核酸形態で提供される場合は、本発明の生産方法は、上記幹細胞をそのポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子で形質転換する工程をさらに包含する。
本発明の別の実施形態において、本発明の生産方法は、幹細胞生存因子（例えば、ＳＣＦ）を上記幹細胞に提供する工程をさらに包含する。幹細胞生存因子は、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドの提供前、後、または同時に提供される。この幹細胞生存因子は、ポリペプチド形態で直接提供され得る。別の実施形態において、この幹細胞生存因子は、核酸形態で提供され得る。核酸形態で提供される場合は、本発明の生産方法は、上記幹細胞をその幹細胞生存因子をコードする核酸配列を含む核酸分子で形質転換する工程をさらに包含する。形質転換などの技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の箇所において説明されている。
別の局面において、本発明は、分化細胞を大量生産する方法を提供する。この方法は、１）幹細胞を提供する工程、２）該幹細胞にＷＩＦドメインを有するポリペプチドを提供する工程、３）処理された該幹細胞を収集する工程、および４）該幹細胞に分化因子を提供する工程を包含する。
本発明の分化細胞を大量生産する方法の実施形態において、上記組成物の好ましい実施形態における特定事項はまた、本発明の方法の特定事項であり得る。
本発明の１つの実施形態において、上記ＷＩＦドメインを有するポリペプチド（例えば、ＷＩＦ−１）は、ポリペプチド形態で直接提供され得る。別の実施形態において、このポリペプチドは、核酸形態で提供され得る。分化因子もまた、ポリペプチド形態または核酸形態で提供され得る。核酸形態で提供される場合は、分化因子が本発明のポリペプチドよりも遅く発現するようなベクター構築物を作製してその構築物で幹細胞を形質転換することもできる。そのようなベクター構築物の作製方法および形質転換する方法は、当該分野において周知であり、当業者であれば、本願明細書の教示に従い容易に実施することができる。
本発明の別の実施形態において、本発明の生産方法は、幹細胞生存因子（例えば、ＳＣＦ）を上記幹細胞に提供する工程をさらに包含する。幹細胞生存因子は、ＷＩＦドメインを有するポリペプチドの提供前、後、または同時に提供される。この幹細胞生存因子は、ポリペプチド形態で直接提供され得る。別の実施形態において、この幹細胞生存因子は、核酸形態で提供され得る。核酸形態で提供される場合は、本発明の生産方法は、上記幹細胞をその幹細胞生存因子をコードする核酸配列を含む核酸分子で形質転換する工程をさらに包含する。形質転換などの技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の箇所において説明されている。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび幹細胞生存因子をコードする核酸配列は、一定期間の後に発現が低下または停止するように操作することができる。その場合、さらに、一定期間の後に分化因子を発言させるように操作することもできる。
他の局面において、本発明は、分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置する方法を提供する。この方法は、１）被検体に長期多能性保持細胞組成物を投与する工程であって、この長期多能性保持細胞組成物は、幹細胞；およびＷＩＦドメインを有するポリペプチドを包含する、工程、を包含する。投与方法は、当該分野において周知の任意の方法を使用し得る。投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。好ましくは、上記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列またはその改変体の配列を含み得、そしてヒト組換えＷＩＦ−１であり得る。
本発明の分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置する方法の実施形態において、上記組成物の好ましい実施形態における特定事項はまた、本発明の方法の特定事項であり得る。
他の局面において、本発明は、分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置する方法を提供する。この方法は、１）本発明のポリペプチドで処理した幹細胞から調製された分化細胞を被検体に投与する工程、を包含する。投与方法は、当該分野において周知の任意の方法を使用し得る。投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
本発明の分化細胞（例えば血液細胞）の障害に起因する疾患または障害を処置する方法の実施形態において、上記組成物の好ましい実施形態における特定事項はまた、本発明の方法の特定事項であり得る。
本発明の処置方法は、分化細胞に起因する疾患または障害に罹患し得る生物であれば、脊椎動物または無脊椎動物のようなどのような生物をも対象とすることができる。好ましい実施形態では、そのような生物は、脊椎動物であり、より好ましくは、そのような生物は、哺乳動物（例えば、齧歯類など）であり、さらに好ましくは霊長類であり、最も好ましくはヒトであり得る。
そのような製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべきポリペプチド量および細胞量を決定することができる。
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。
本発明により処置され得る疾患または障害は、本発明の幹細胞が分化し得る分化細胞の障害に関連する疾患または障害であり得る。好ましい実施形態において、上記分化細胞は血液細胞であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群のみ）、第２寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期以降の寛解期）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）、好中球減少症など。好ましい実施形態において、本発明により処置される疾患または障害は、ヒトの疾患または障害であり得る。
本発明の幹細胞によって、従来の天然物由来の造血幹細胞移植治療に伴う副作用（特に、異物、異種細胞に伴うもの、例えば、感染、移植片対宿主病など）が回避された。この効果は、未分化のまま多能性を維持する技術が本発明によって初めて達成されたことによって、達成されたもので、格別の効果といえる。また、幹細胞を長期間未分化のまま多能性を維持することが可能になったことで、多能性幹細胞を大量培養することも可能になった。その上、大量培養された幹細胞から大量に分化細胞も調製することが可能になった。このような効果は、従来の技術では達成不可能であった格別の効果であるといえる。
別の実施形態では、本発明の処置方法は、さらに他の薬剤もまた投与する工程を包含し得る。そのような薬剤は、当該分野において公知の任意の医薬であり得、例えば、そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤（例えば、抗生物質など）であり得る。当然、そのような薬剤は、２種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方最新版、米国薬局方最新版、他の国の薬局方の最新版において掲載されているものなどが挙げられる。そのような薬剤は、好ましくは、造血系に対して効果を有するものであり得る。
他の実施形態において、上記細胞は２種類以上の細胞を含み得る。２種類以上の細胞を使用する場合、同一もしくは類似の性質または由来の細胞を使用してもよく、異なる性質または由来の細胞を使用してもよい。
本発明の方法において使用される因子および細胞の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、因子の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
別の局面において、本発明は、分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置するための医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、幹細胞；ＷＩＦドメインを有するポリペプチド；および薬学的に受容可能なキャリア、を含む。好ましくは、上記ＷＩＦ−１ドメインを有するポリペプチドは、配列番号４に示される配列またはその改変体の配列を含み得、そしてヒト組換えＷＩＦ−１であり得る。
１つの実施形態において、この医薬組成物が対象とする疾患または障害は、上述のとおりである。
本発明の医薬組成物の種々の実施形態において、上記組成物の好ましい実施形態における特定事項はまた、本発明の医薬組成物の特定事項であり得る。
別の局面において、本発明は、分化細胞の障害に起因する疾患または障害を処置するための医薬組成物を提供する。この医薬組成物は本発明のポリペプチドを用いて処理された幹細胞から調製された分化細胞；および薬学的に受容可能なキャリア、を含む。
１つの実施形態において、この医薬組成物が対象とする疾患または障害は、上述のとおりである。
本発明の医薬組成物の種々の実施形態において、上記組成物の好ましい実施形態における特定事項はまた、本発明の医薬組成物の特定事項であり得る。
本発明の医薬組成物に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能な因子としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント。代表的には、本発明の医薬組成物は、精製されたポリペプチド、フラグメント、改変体または誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または入工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。その溶液のｐＨはまた、種々のｐＨにおいて、本発明のポリペプチドの相対的溶解度に基づいて選択されるべきである。
組成物における溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進するための他の処方物材料を含み得る。
本発明の組成物は、非経口的に投与され得る。あるいは、その組成物は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当業者の技術範囲内である。
本発明の治療処方物は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照のこと）と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。
受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
本発明の細胞、組成物などは、調製後すぐに使用することもできるが、保存後（例えば、約４℃、約−１８℃、約−７０℃、液体窒素下など）で一定期間（例えば、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年など）にわたり保存した後に使用することもできる。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
（実施例１：組換えＷＩＦ−１の調製）
（１．）
ＰＡ−６細胞株（奥羽大学小玉博明博士より供与）をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）に１０％のｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍを添加し、５％ＣＯ２存在下３７℃でコンフルエントまで培養した。
ＰＡ−６細胞を回収し、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してｍＲＮＡを単離し、次にＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ−  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成して縮重ＰＣＲに用いた。
ＮｏｔｃｈファミリーのＥＧＦ様リピートの保存配列から、配列番号１１および１２の縮重プライマーを合成し、以下の条件にて、ＷＩＦ−１遺伝子の部分配列を単離した：
ａ）反応溶液
プライマー（配列番号１１および１２）；各々１０μＭ、ｃＤＮＡ；１，５００ｎｇ／ｍｌ、ｄＮＴＰｓ；各々０．２５ｍＭ、ポリメラーゼ；０．５Ｕ／ｍｌ（Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ、宝酒造、滋賀）、緩衝液；ＭｇＣｌ２：０．１５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ８．３）：１０ｍＭ、ＫＣＬ：５０ｍＭ
ｂ）反応サイクル
（ｉ）  ９４℃、６０秒；１サイクル
（ｉｉ）９４℃、２０秒、６０℃、２０秒、
７２℃、２０秒；３０サイクル
（ｉｉｉ）７２℃、３分；１サイクル。
反応産物のゲル電気泳動後に約１８０ｂｐの核酸フラグメントを回収し配列を決定し、このフラグメントがＷＩＦ−１遺伝子由来のフラグメントであることを確認した。
このフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、Ｍｏｕｓｅ  Ｄａｙ１５  Ｅｍｂｒｙｏ  ５’−Ｓｔｒｅｔｃｈ  Ｐｌｕｓ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）からＷＩＦ−１の全長クローンを単離した。配列は、配列番号１（核酸配列）および配列番号２（アミノ酸配列）に示す。
（２．組換えＷＩＦ−１の発現および精製）
上記１．で単離したＷＩＦ−１の全長クローンを制限酵素Ｘｈｏ  ＩとＮｈｅＩで切断し、切断した断片を、ｐＣＡＧＧＳ−６Ｈｉｓベクター（熊本大学  宮崎純一博士から供与されたｐＣＡＧＧＳベクターに制限酵素サイトを持つ６Ｈｉｓシークエンスを挿入した）（配列番号１３）に連結し、このベクターをｐＣＡＧＧＳ／ｍＷＩＦ−１−６Ｈｉｓと命名した。
このｐＣＡＧＧＳ／ｍＷＩＦ−１−６Ｈｉｓを、リン酸カルシウム法により、ＣＯＳ７細胞に形質導入し、１０％  ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて５％ＣＯ２存在下３７℃でコンフルエントまで培養した。
形質導入したＣＯＳ７細胞から、以下の方法で、組換えＷＩＦ−１を精製した。培養上清をニッケルカラム（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通し、ｍＷＩＦ−１を結合させた。非特異的結合蛋白を除去するため、１００ｍＭイミダゾール添加リン酸バッファーで十分異洗浄した後、３００ｍＭイミダゾール添加リン酸バッファーでｍＷＩＦ−１−６Ｈｉｓを溶出させた。この溶出液は細胞毒性を持つイミダゾールを含むため、ゲルクロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてバッファーをＰＢＳに置換した。得られた精製蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動し銀染色後に精製の程度を確認した。
（実施例２：ＦＡＣＳを用いたＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分離）
骨髄中の造血幹細胞を、ＣＤ３４陰性または弱陽性、ｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性、分化抗原（Ｌｉｎ）陰性の細胞（ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞）を分離することによって、純度の高い造血幹細胞が得られることが公知である（Ｏｓａｗａ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：２４２〜２４５、１９９６）。そこで、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いる以下の方法によって、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を分離した。そのスキームを図２示す。
（１．骨髄細胞の懸濁液の調製）
約８〜１０週齢のＢ６マウスの大腿骨および脛骨を下腿から摘出した。筋肉、脂肪組織などを取り除き、骨のみを分離した。長管骨の両端を切断し、ハリを接続した注射器を用いて、その片側からＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を注入し、骨の内容物（骨髄）を得た。ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）に浮遊させ、ナイロンフィルター（７０μｍ）を通し、細胞塊や筋肉などの混入した組織を除去した。ナイロンフィルターによって濾過した細胞懸濁液中の細胞数を計数し（通常１匹のマウスから約４〜５×１０７個の細胞が得られる）、細胞濃度をＰＢＳによって１×１０７細胞／ｍｌ程度に調整した。約５ｍｌの細胞懸濁液を、５ｍｌのフィコール（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ｎｙｃｏｍｅｄ社（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）に重層し、室温、４００×ｇにて２０分間遠心分離し、赤血球や好中球を除去した。遠心分離後、境界面の細胞を回収して、染色培地（ＳＭ；５％ウシ胎児血清および０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞を計数する（通常、遠心分離前の細胞数の約半分の細胞が回収される）。
約１〜１０ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞懸濁的に対して、ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗体（最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの抗Ｍａｃ−１抗体（クローン：Ｍ１／７０）、最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの抗Ｇｒ−１抗体（クローン：ＲＢ６−８Ｃ５）、最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの抗Ｂ２２０抗体（クローン：ＲＡ３−６Ｂ２）、最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４抗体（クローン：ＲＭ４−５）、最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ８抗体（クローン：５３−６．７）、および最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの抗赤血球抗体（クローン：抗赤血球抗体ＴＥＲ１１９）；全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社；（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を添加し、氷上で３０分間反応させた。ＳＭで２回洗浄し、１００μｌのＳＭに再浮遊させた。
このＳＭに再浮遊させた細胞を精製するために使用するＤｙｎａｂｅａｄｓを以下のように前処理した：ストレプトアビジン化したＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０：Ｄｙｎａｌ社；Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を５〜６ビーズ／細胞になるように添加し、マグネットスタンドを用いてＳＭで洗浄する。洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓを１０ｍｌのＳＭに再浮遊させた。
上記のＳＭに再浮遊させた細胞と前処理したＤｙｎａｂｅａｄｓを氷上で３０分間反応させた。７ｍｌのＳＭを添加した後、マグネットスタンドを用いて、ＳＭに再浮遊させた細胞からＤｙｎａｂｅａｄｓと結合したＬｉｎｅａｇｅ陽性細胞（ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗体と結合した細胞）を除去し、細胞数を算定した（通常、除去前の細胞数の約５〜１０％の細胞が残る）。
遠心分離（４℃、４００×ｇ、５分間）後、細胞ペレットに対して、以下：
１）ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗体（最初に用いた量の５〜１０％の量）；
２）最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）標識化抗Ｓｃａ−１抗体（クローン：Ｅ１３−１６１．７）
３）最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識化抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（クローン：ＡＣＫ２または２Ｂ８）
４）最終濃度として０．００１〜０．１μｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗ＣＤ３４抗体（クローン：ＲＡＭ３４抗体）
を添加した。この時、（２）〜（４）を同時に添加した。
氷上で３０分間ほどインキュベーションした後、細胞を洗浄し、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−テキサスレッドを添加した。氷上で３０分間ほどインキュベーションした後、細胞を洗浄し、ＳＭを用いて細胞浮遊液の濃度を５×１０５細胞／ｍｌ程度に調整した。
ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用した。テキサスレッドを指標としてｌｉｎｅａｇｅ抗原陰性の細胞を選択し（図３Ａ）、次にＡＰＣとＰＥを指標としてＳｃａ−１とｃ−Ｋｉｔで展開してＫＳＬ細胞を選択し（図３Ｂ）、そしてＦＩＴＣを指標として１０％未満のＣＤ３４陰性細胞またはＣＤ３４弱陰性細胞を選択した（図３Ｃ）。
選択したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、ソーティングして造血幹細胞として使用した。
（実施例３：ヒト造血幹細胞の調製）
ヒトでもマウスと原理的には同じプロトコールを用いて造血幹細胞を分離することができる。従って、ヒトでは抗Ｓｃａ−１抗体の等価物を用いて上記と同様に造血幹細胞を分離することができる。
実施例３では、別の実験手法で本発明を実証した。ヒトではＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ヒツジなどをレシピエントとした異種骨髄移植の系を用いて造血幹細胞をアッセイせざるをえない。この方法を用いて検出したヒト造血幹細胞が同種骨髄移植の系を用いてアッセイしたマウス造血幹細胞と実質的に同等であると考えられることから、本発明の実証方法に利用した。以下はヒト造血幹細胞の分離方法別法を示す。
１）  インフォームドコンセントを得た後に、成人（１８歳から３０歳位までの男女）骨髄細胞や出生時に得られる臍帯血をペハリンでコートした注射器に採取した。骨髄液ないし臍帯血をＰＢＳで３倍希釈した。約３５ｍｌの細胞懸濁液を、約１５ｍｌのフィコール（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ｎｙｃｏｍｅｄ社；Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に重層し、室温、４００×ｇにて３０分間遠心分離し、赤血球や好中球を除去した。遠心分離後、境界面の細胞を回収して、ＳＭで２回洗浄し、細胞数を算定した。
２）  約１〜１０ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞懸濁的に対して、ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗体（それぞれ０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの最終濃度として抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ６６ｂ抗体および抗Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ抗体を添加し、氷上で３０分間反応させた。ＳＭで２回洗浄し、ＳＭに再浮遊させた。
３）  マウスの場合と同様にマグネットビーズを用いて、ｌｉｎｅｇａｅマーカー陽性の細胞を除去した。遠心後、最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）、最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのＰＥ標識抗ヒトｃ−Ｋｉｔ抗体、最終濃度として０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３８抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で染色した。また、ｌｉｎｅａｇｅ抗体でも再度、染色した。
４）氷上で３０分間ほどインキュベーションした後、細胞を洗浄し、０．０１−０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−テキサスレッドを添加した。氷上で３０分間ほどインキュベーションした後、細胞を洗浄し、ＳＭを用いて細胞浮遊液の濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調整した。
ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用した。ｌｉｎｅａｇｅ抗原陰性かつＣＤ３８陰性分画を選択し、ＣＤ３４とｃ−Ｋｉｔで展開した。ヒト造血幹細胞は主にＣＤ３４＋Ｋｉｔ＋分画に濃縮されているが、マウスと同様にＣＤ３４−分画にも存在するとが、最近明らかとなってきた。そこで、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＫＬ細胞とＣＤ３４−ＣＤ３８−ＫＬ細胞の２種類を対象としてソーティングを行った。
（実施例４：造血幹細胞の増殖および分化に対するＷＩＦ−１の効果）
造血幹細胞の増殖および分化に対する各種タンパク質の効果を調べるために、造血幹細胞としてＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を使用し、その増殖（細胞分裂能を指標とする）および分化（成熟血球からなるコロニーの形成能を指標とする）を調べた。
（１．単一ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂能およびコロニー形成能の測定方法）
丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を、培養に使用した。５×１０−５Ｍの２−β−メルカプトエタノールおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＳｔｅｍ−Ｐｒｏ−３４  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２００μｌをウェルに添加した。補充した可溶性因子は、１．０ｎｇ／ｍｌ  ＷＩＦ−１（実施例１において調製）、１００ｎｇ／ｍｌ  マウスＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  マウスＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−１１（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ、、Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、および１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＧＣＳ−Ｆ。ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＧ−ＣＳＦは、キリンビール株式会社（高崎市）製品を使用した。細胞を、加湿した５％ＣＯ２環境下で、３７℃で培養した。ウェルあたりの細胞数を培養７日目までモニターし、コロニー形成は培養１４日目に判定した。
種々の所定のタンパク質存在下において、１４日間単一細胞培養を行ない、少なくとも１回の細胞分裂を行なった細胞を細胞分裂陽性細胞とし、５０個以上の細胞から構成されるコロニー形成を行なった細胞を、コロニー形成陽性細胞とした。
（２．組換えＷＩＦ−１タンパク質単独でのＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂およびコロニー形成に対する効果）
ＷＩＦ−１が単独でＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂および／またはコロニー形成を誘導するのか検討した。
ＳＣＦは、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞のある程度の分裂を誘導するが、そのコロニー形成を誘導しないことが公知であるので（Ｅｍａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ｖｏｌ  １９２、Ｎｕｍｂｅｒ  ９、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ６，２０００）、比較対象としてＳＣＦを用いた。
上記１．の方法に従って、種々のタンパク質を添加し、単一ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂能およびコロニー形成能に対するＳＣＦおよびＷＩＦ−１の影響を調べた。その結果を表１に示す。
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表１に示されるように、ＷＩＦ−１単独では、１個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞が２個以上なることも、コロニーを形成することもなかった。ＳＣＦとの相乗作用により、２個以上の細胞の割合（細胞分裂の割合）が有意に増加した。しかし、ＳＣＦ＋ＷＩＦ−１の存在下でもコロニーを形成するまでには至らなかった。
（２．他のタンパク質と組み合わせた場合の、ＷＩＦ−１タンパク質によるＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂および二次コロニー形成に対する効果）
ＳＣＦおよびＦＬと組み合わせた場合の、ＷＩＦ−１タンパク質によるＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂に対する効果と培養１４日後に分裂した細胞中にコロニー形成細胞が残存するかどうかを検討した。コロニー形成細胞の生存を認めた場合に二次コロニー陽性と判定した。その結果を表２に示す。
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表２の結果は、ＳＣＦと組み合わせた場合、ＷＩＦ−１は造血幹細胞であるＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂を支持し、分裂した細胞中にはコロニー形成能を有する未熟な細胞が１４日以上経ても生存していることを示す。従って、ＷＩＦ−１は、ＳＣＦと組み合わせて使用した場合、造血幹細胞の軽度の増殖を誘導するが、軽度に分裂した細胞は確かに生存細胞を含み、生存細胞はほとんど分化誘導をうけていないことが明らかとなった。さらに、ＷＩＦ−１は、ＳＣＦ＋ＦＬと組み合わせて使用した場合、未熟な細胞の生存をより支持することが明らかとなった。
（実施例５：生体内で再構築することのできる造血幹細胞の維持に対するＷＩＦ−１の効果）
単離された造血幹細胞を生体内に移植した場合に、その増殖能および分化能によって造血系が再生される。そこで、単離された造血幹細胞としてＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を培養細胞し、培養後にも培養細胞中に生体の造血を再生する能力があるかどうか、すなわち培養後にも造血幹細胞が維持されているかどうかを検討した。この培養液中にＷＩＦ−１を添加し、ＷＩＦ−１の造血幹細胞維持に対する直接作用を検討した。
造血幹細胞の増殖能および分化能を比較定量するために、以下に示す競合的骨髄再構築法を用いた。
（１．競合的骨髄再構築法（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ））
造血幹細胞を致死量の放射線照射したマウスに移植すると、造血幹細胞が持つ自己複製能と多分可能によって長期にわたってレシピエントマウス造血系が再構築される。逆に、この長期造血系再建能を調べることによって、移植された細胞中の造血幹細胞の有無を判定できる。競合的骨髄再構築法（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）とは調べたい細胞（テスト細胞）とある一定量の骨髄細胞（コンペティター細胞）を同時に放射線照射したマウスに移植する方法である。この方法によってレシピエントマウスの短期間の生存に必要な前駆細胞や長期生存に必要な造血幹細胞がテスト細胞中に存在しなくてもレシピエントマウスの生存が可能である。また、テスト細胞中の造血幹細胞活性を相対的に評価することもできる。具体的には、以下のとおりに実験を行なった。
Ｌｙ５コンジェニックマウスを利用した競合的骨髄再構築法（Ｄ．Ａ．ＯｇｄｅｎおよびＨ．Ｓ．Ｍｉｃｋｌｅｍ、（１９７６）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２２：２８７〜２９３；ならびにＤ．Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎら、（１９７８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１５２６〜１５３１）を行なって、調製した造血幹細胞について評価した（Ｈ．Ｅｍａら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ．９５：２２８４〜２２８８）。手短には、培養中のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞またはＣＤ３４−ＫＳＬ細胞由来の複数の細胞（Ｂ６−Ｌｙ５．１）を２×１０５個の骨髄コンペティター細胞（Ｂ６−Ｆ１）と混合し、所定の期間培養し、１０個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を含む２００μｌの細胞浮遊液を９．５Ｇｙの線量で照射されたＢ６−Ｌｙ５．２マウスに尾静脈から注射した（図５）。
移植後、所定の期間マウスをＳｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）の環境で飼育した後、マウスをエーテル吸入によって麻酔し、１００μｌのキャピラリーチューブ（予め、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ・Ｎａ２／Ｈ２Ｏを、毛管現象を使って少量採取している）がいっぱいになるまで、眼窩静脈より採血した。採取した血液をエッペンドルフチューブに移して、よく攪拌し、２，０００ｒｐｍで数秒間遠心して血液を落とした。３５０μｌの蒸留水を添加した後、３０秒間室温に放置した。２倍濃度のＰＢＳを３５０μｌ添加し、よく攪拌した後、２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。溶血した赤血球を含む上清を捨て、血球のペレットをＳＭに再浮遊し、２等分して、遠心した。
細胞ペレットに対して２種類の抗体染色、ビオチン化抗Ｌｙ５．１（Ａ２０）抗体、およびＦＩＴＣ結合化Ｌｙ５．２（１０４）抗体を用いて実施例１に記載のように染色した。細胞を同時に、ＰＥ結合体化Ｂ２２０抗体、またはＰＥ結合体化抗Ｍａｃ−１抗体およびＰＥ結合体化抗Ｇｒ−１抗体、またはＰＥ結合体化抗ＣＤ４抗体およびＰＥ結合体化抗ＣＤ８抗体を用いて、実施例１に記載のように染色した。ビオチン化抗体を、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて発色させた。４℃で２０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、２００μｌのＳＭに再浮遊してＦＡＣＳによる解析を行なった。Ｌｙ５．１とＬｙ５．２で展開しテスト細胞由来およびコンペティター細胞由来細胞さらにレシピエントの残存細胞を区別して検出した。一方では、テスト細胞由来の細胞が顆粒球・マクロファージ系、Ｂ細胞系およびＴ細胞系の細胞によって構築されているかどうかを調べた。
％キメリズムは、以下の式：
総キメリズム（％）＝％Ｌｙ５．１細胞×１００／（Ｌｙ５．１細胞＋％Ｆ１細胞）
を用いて計算した。
この計算式において、陽性マウスとは、顆粒球・マクロファージ系、Ｔリンパ球系、およびＢリンパ球系の全の血球系において１％以上のキメリズムを示すマウスであり、陰性マウスとはそれ未満のマウスと定義した。
（２．ＷＩＦ−１による造血幹細胞の維持に対する効果）
ＳＣＦおよびＷＩＦ−１を使用して、上記１．に記載の方法を用いて、造血幹細胞の維持を調べた。結果を表３に示す。
2003076613.tif 000004
表３に示されるように、ＳＣＦと組み合わせたＷＩＦ−１は、ＳＣＦを単独で使用した場合には見られなかった、造血幹細胞の培養期間中の維持をもたらした。
次に、ＳＣＦと組み合わせたＴＰＯ（ＳＣＦ＋ＴＰＯ）と、ＷＩＦ−１にＳＣＦとＴＰＯとを組み合わせた場合を比較した（ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＷＩＦ−１）。
さらに、表４に示すように、ＷＩＦ−１を添加せず、ＳＣＦとＴＰＯとを組み合わせて、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞培養時に添加した場合、再現性のよい造血幹細胞の維持は見られなかったが、それに対して、ＷＩＦ−１にＳＣＦとＴＰＯとを組み合わせた場合は、再現性よく、かつ高い割合で、造血幹細胞の維持が見られた。
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（実施例６：ＷＩＦ−１存在下における幹細胞への遺伝子導入）
マウス骨髄細胞よりＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を分離後、３００から６００個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞に対してＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカー遺伝子としてＷＩＦ−１存在下あるいは非存在下に導入後、放射線照射した５匹のマウスに移植した。
レトロウイルスの準備：２９３Ｔ細胞株とＰａｃｋａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ＬｉｎｅであるＰＧ１３、２９３ＧＰおよび２９３ＧＰｇ細胞株は１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭを用いた培養した。ｐＧＣｓａｐＥＧＦＰ（レトロウイルスベクターで筑波大学小野寺雅史博士より供与）をリン酸カルシウム法により２９３ＧＰ細胞株にトランスフェクションした。ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、ＰＧ１３細胞株に感染させた。さらに、このＰＧ１３細胞株の培養上清を用いて２９３ＧＰｇ細胞株（テトラサイクリン感受性発現誘導システム：ｔｅｔ  ｏｆｆ）に感染した。Ｔｅｔ  ｏｆｆにして得られた培養上清を６，０００ｇで１６時間遠心し、Ｓｔｅｍ−Ｐｒｏ３４無血清培養液にウイルス粒子を再浮遊させた。
レンチウイルスの準備：ｐＣＳ−ＣＧ−ＰＲＥ（ＧＦＰの下流にｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔを挿入したＳＩＮベクター）、ｐＭＤＬｇ／ｐＰＲＥ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（Ｒｅｖ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｕｃｔ）、ｐＭＤ．Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｕｃｔ）はすべて筑波大学三好浩之博士から供与された。これらのプラスミドを同時に２９３Ｔ細胞株にリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションした。培養上清を回収し、超遠心にて得たウイルス粒子濃縮液を感染実験に用いた。
１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦと１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ存在下にＤ３４−ＫＳＬ細胞をＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（宝酒造）コートした９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ内で無血清培養した（コントロール）。また、同じ条件下に１ｎｇ／ｍｌ  ＷＩＦ−１を追加して培養した（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）。レトロウイルス粒子濃縮液を５μｇ／ｍｌのｐｒｏｔａｍｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）とともに培養２４時間後に添加した。培養４８時間後に放射線照射したマウスに培養細胞を移植した（競合的造血系再構築法）。
１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ存在下にＤ３４−ＫＳＬ細胞を無血清培養した（コントロール）。また、同じ条件で１ｎｇ／ｍｌ  ＷＩＦ−１を添加して培養した。レンチウイルス粒子濃縮液は培養開始時点に添加した。培養２４時間以内に培養細胞を放射線照射したマウスに移植した（競合的造血系再構築法）。
移植後３月以降の培養細胞による再構築と再構築された血液細胞への遺伝子導入効率を評価した。その結果、ウイルス感染時にＷＩＦ−１を添加したグループで有意に遺伝子導入率が高いことが明らかとなった。
（実施例７：マウスＷＩＦ−１およびヒトＷＩＦ組換えタンパク質の大量生産）
生体内におけるＷＩＦ−１の作用を調べるためには大量の精製タンパク質を調製する必要がある。従って、マウスおよびヒトＷＩＦ−１の組換えタンパク質を安定して産生する細胞株を樹立した。ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にマウスまたはヒトｃＤＮＡを組み込んだ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＷＩＦ−１、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＷＩＦ−１）。ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＷＩＦ−１、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＷＩＦ−１を、リン酸カルシウム法により、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞株に形質導入し、１０％  ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。
引き続きゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）存在下で培養することにより薬剤耐性細胞を得た。さらにＦＡＣＳを用いて単細胞をソーティングした。これによって細胞株はクローン化された。次にＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いてＷＩＦ組換えタンパク質を高発現しているクローンを選択した。
高発現しているクローンを１０％  ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて５％ＣＯ２存在下３７℃で培養することによりマウスＷＩＦ−１およびヒトＷＩＦ組換えタンパク質の大量生産を行った。
（実施例８：ＷＩＦ−１の保存的置換改変体の効果）
配列番号２に示す配列において、アミノ酸番号５５位のイソロイシンをロイシン、１０９位のロイシンをイソロイシン、２４４位のアラニンをバリン、２７１位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置き換えた改変体を部位特異的変異誘発法により作製した（配列番号１５、１７、１９および２１）。部位特異的変異誘発には、Ｑｕｉｃｋ  ＣｈａｎｇｅＴＭ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示書に従って利用した。概説すると、以下のとおりである。
１．  二本鎖プラスミドＤＮＡを熱変性させ，変異を導入した２種のプライマーを，それぞれ相補的ＤＮＡ鎖の同じ塩基配列部位にアニールさせる。
２．ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて，温度サイクリング法（サイクリング数：１０〜１６回）によりプライマーの伸長を行うと，変異を含むニックの入った環状のＤＮＡ鎖が合成される。
３．Ｄｐｎ  Ｉにより，テンプレートＤＮＡを分解する。ｄａｍ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅが欠損していないＥ．ｃｏｌｉ株から調製したＤＮＡはメチル化されているので，メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎ  Ｉ（５’−ＧＭ６ＡＴＣ−３’）により分解される。一方，変異が導入されたＤＮＡは分解されない。
４．  ニックの入った変異を含むＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉを形質転換する。変異を含むプラスミド中のニックは，Ｅ．ｃｏｌｉ中で修復される。
この手法により上記の４種の改変体（ヌクレオチドは配列番号１４、１６、１８および２０に示す）を作製し、以下の実験に用いた。
（造血幹細胞に対するＷＩＦ−１改変体の効果）
実施例４および５に記載のように実験を行って、造血幹細胞の増殖および分化、ならびに生体内に移植された造血幹細胞の維持に対する効果を確認した。
野生型配列同様、ＳＣＦと組み合わせた場合、ＷＩＦ−１改変体は造血幹細胞であるＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂とコロニー形成の両方を誘導することを示した。従って、ＷＩＦ−１改変体は、ＳＣＦと組み合わせて使用した場合、造血幹細胞の増殖および分化の両方を誘導したことが実証された。さらに、ＷＩＦ−１改変体は、ＳＣＦと組み合わせて使用した場合、造血幹細胞の増殖と分化の両方を誘導する他の因子であるＦＬの効果をさらに増強したことが実証された。
ＳＣＦと組み合わせたＷＩＦ−１改変体は、ＳＣＦを単独で使用した場合には見られなかった、移植された造血幹細胞の維持をもたらした。
上記４種の改変体であってもＳＣＦとＴＰＯとを組み合わせた場合は、再現性よく、かつ高い割合で、造血幹細胞の維持が見られた。
従って、保存的置換改変体は、野生型配列同様に本発明の効果を持つことが実証された。
（実施例９：ドメインの重要性）
次に、ＷＩＦドメインを残し、他の領域を欠如させた改変体、およびＥＧＦ様リピートを残し他の領域を欠如させた改変体を作製した。具体的には、配列番号２の最初のアミノ酸番号１位〜１７６位に６Ｈｉｓ−ｔａｇを付加した改変体（ヌクレオチド配列を配列番号２２に示し、アミノ酸配列を配列番号２３に示す）、およびシグナルシークエンス（アミノ酸番号１位〜２４位）とＥＧＦ様リピート（アミノ酸番号１７７位から３７９位）とを融合し６Ｈｉｓ−ｔａｇを付加した改変体（ヌクレオチド配列を配列番号２４に示し、アミノ酸配列を配列番号２５に示す）を該当分野において周知の方法で作製した。
（造血幹細胞に対するドメインの重要性）
実施例４および５に記載のように実験を行って、造血幹細胞の増殖および分化、ならびに生体内に移植された造血幹細胞の維持に対する効果を確認した。
野生型配列同様、ＳＣＦと組み合わせた場合、これらのＷＩＦ−１改変体は造血幹細胞であるＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の分裂とコロニー形成の両方を誘導することを示した。従って、これらのＷＩＦ−１改変体は、ＳＣＦと組み合わせて使用した場合、造血幹細胞の増殖と分化の両方を誘導した。さらに、ＷＩＦ−１改変体は、ＳＣＦと組み合わせて使用した場合、造血幹細胞の増殖および分化の両方を誘導する他の因子であるＦＬの効果をさらに増強していた。
ＳＣＦと組み合わせたＷＩＦ−１改変体は、ＳＣＦを単独で使用した場合には見られなかった、移植された造血幹細胞の維持をもたらした。
上記改変体であってもＳＣＦとＴＰＯとを組み合わせた場合は、再現性よく、かつ高い割合で、造血幹細胞の維持が見られた。
ただし、ＷＩＦドメインのみを有する改変体、ＥＧＦ様リピートのみを有する改変体は、それぞれ、野生型配列よりも効果がわずかに減少していた。従って、両方のドメインを有することが本発明の実施においてより好ましいことが分かる。
従って、ＷＩＦドメインのみを有する改変体、ＥＧＦ様リピートのみを有する改変体は、野生型配列同様に本発明の効果を持つことが実証された。
産業上の利用可能性
本発明により、幹細胞を未分化のまま多能性を維持することが達成された。このことにより、簡便に、大量の幹細胞（例えば、造血幹細胞）を提供することが可能となった。加えて、本発明の幹細胞組成物は、均質で不純物もかなり減らすことができることから、従来の造血幹細胞治療で問題となっていた副作用（例えば、感染、拒絶反応）などを顕著に改善することができた。また、有効な遺伝子治療に利用できることが示された。これらのことは、格別の効果といえる。また、本発明の処置方法のために使用する組成物、細胞、キット、医薬などを製造することには、産業上の利用可能性が十分ある。本発明は、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として本発明の組成物などを生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、事業目的の治験そのものとして有用であることから、産業上の利用可能性がある。また、本発明の治療方法を間接的または直接的に実施することが、医療業周辺の産業において利用する可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にある。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１（図１Ａおよび１Ｂ）は、ＷＩＦ−１遺伝子のドメイン別領域を示す。上からマウス、ヒト、ラット、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈの配列（それぞれ、配列番号２、４、６、８および１０）である。アミノ酸残基のほぼ３０位〜ほぼ１８０位は、本明細書において定義されるＷＩＦドメインである。アミノ酸残基のほぼ１８０位以降にはＥＧＦ様リピートが存在する。
図２は、ＦＡＣＳを用いたＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の純化方法を示すスキームである。
図３は、Ｌｉｎ−およびｃ−Ｋｉｔ＋／Ｓｃａ−１＋で展開したＦＡＣＳ図を示す。
図４は、単細胞培養法（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を示すスキームである。この方法で調製した細胞の生存率、細胞分裂およびコロニー形成を本明細書に記載の方法により調査することができる。
図５は、マウスを利用した幹細胞を調べるためのスキームを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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