(57)【要約】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に由来する新規アルドラーゼを用いることにより、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から、モナティン合成における中間体として有用な４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を合成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
下記（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
下記（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡ。
（ｅ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列又は同配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列又は同配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
下記（ｇ）または（ｈ）のＤＮＡ。
（ｇ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとを接続して得られることを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項７】
請求の範囲第６項記載の細胞を培地中で培養し、培地および／または細胞中にアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項８】
下記（ｉ）または（ｊ）のタンパク質。
（ｉ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項９】
下記（ｋ）または（ｌ）のタンパク質。
（ｋ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｌ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１０】
（Ａ）インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性、および／または、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有し、
（Ｂ）（Ａ）記載の活性の至適ｐＨが３３℃において約９であり、かつ、
（Ｃ）ゲルろ過法により測定した分子量が約１４６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したサブユニットあたりの分子量が約２５ｋＤａである
ことを特徴とするタンパク質。
【請求項１１】
（Ａ）アルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
（Ｂ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に由来し、
（Ｃ）ｐＨ６以上でｐＨ安定性を有し、
（Ｄ）７０℃以下で温度安定性を有し、かつ、
（Ｅ）ゲルろ過法により測定した分子量が約１４６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したサブユニットあたりの分子量が約２５ｋＤａである
ことを特徴とするタンパク質。
【請求項１２】
酵素反応系に無機リン酸を含有させることによって、前記アルドラーゼ活性が向上することを特徴とする請求の範囲第１１項記載のタンパク質。
【請求項１３】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を培地中で培養し、培地および／または細胞中に下記（ｉ）〜（ｌ）のうちいずれかのタンパク質を蓄積させ、前記培地および／または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物。
（ｉ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｋ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｌ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１４】
下記一般式（１）
2004018672.tif 000049
（一般式（１）において、Ｒ１は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ１は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。）
で表される置換α−ケト酸と、
下記一般式（２）
2004018672.tif 000050
（一般式（２）において、Ｒ２は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ２は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。ただし、一般式（１）において、Ｒ１が水素、メチル基またはカルボキシメチル基である場合は、Ｒ２は水素ではない。）で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式（３）
2004018672.tif 000051
（一般式（３）におけるＲ１およびＲ２は、一般式（１）および（２）におけるＲ１およびＲ２と同義である。）
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項１５】
前記Ｒ２は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、請求の範囲第１４項記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項１６】
前記Ｒ２は、水素であることを特徴とする、請求の範囲第１５項記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項１７】
前記Ｒ１は、ベンジル基または３−インドリルメチル基であり、前記Ｒ２は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、請求の範囲第１４項記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項１８】
インドール−３−ピルビン酸と、オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、下記式（４）
2004018672.tif 000052
に表す置換α−ケト酸を製造する方法であって、当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項１９】
前記反応を触媒するタンパク質は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、請求の範囲第１４項〜第１８項のいずれか一項に記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項２０】
前記微生物は、シュードモナス  タエトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）、シュードモナス  コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス  デスモリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ）、エルウィニア  エスピー（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．）、フラボバクテリウム  レナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ）、またはキサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）であることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項２１】
前記微生物は、シュードモナス  タエトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）ＡＴＣＣ４６８３、またはシュードモナス  コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ２７９１であることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項２２】
前記反応を触媒するタンパク質は、下記（ｉ）〜（ｌ）のうちいずれかのタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１４項〜第２１項のいずれか一項に記載の置換α−ケト酸の製造方法。
（ｉ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｋ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｌ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２３】
下記一般式（１’）
2004018672.tif 000053
（一般式（１’）において、Ｒ１は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体であり、Ｒ３は、水素またはカルボキシル基である。Ｒ１は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。）
で表される化合物と、
下記一般式（２’）
2004018672.tif 000054
（一般式（２’）において、Ｒ４は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ４は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。）で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式（３’）
2004018672.tif 000055
（一般式（３’）におけるＲ１、Ｒ３およびＲ４は、一般式（１’）および（２’）におけるＲ１、Ｒ３およびＲ４と同義である。）
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
請求の範囲第８項または第９項のいずれか一項に記載のタンパク質の存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
【請求項２４】
前記Ｒ４は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、請求の範囲第２３項記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法に関し、より詳細には、モナティン合成における中間体として有用な４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（４−（Ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ；以下、ＩＨＯＧ）の合成に好適に利用できるアルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法に関する。
【背景技術】  下記式（５）に示す構造を有するモナティンは、南アフリカの潅木の根から単離・抽出された天然の甘味アミノ酸であり、ショ糖の数十倍〜数千倍に相当する強い甘味を有し、甘味剤として利用が期待されている。しかし、まだモナティンの有用性に関しては発見されたばかりであり、工業的生産レベルでのモナティンの合成方法に関しては確立されていない。
2004018672.tif 000002
かかる状況下、本発明者らは、試薬として購入可能であるインドールピルビン酸とピルビン酸とを用いて、下記の反応▲１▼および▲２▼からなる新たなモナティンの合成方法を開発した。
▲１▼  インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合により前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応工程
▲２▼  ＩＨＯＧの２位をアミノ化する反応工程
2004018672.tif 000003
上記モナティンの合成ルートにおける▲１▼のアルドール縮合反応について、微生物酵素系を用いてインドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成させた例は、これまでに報告されていない。
２分子のα−ケト酸（ないしは置換α−ケト酸）を基質としたアルドール縮合を触媒する微生物酵素としては、これまでに、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ、および、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどに存在する４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅの２例が報告されている。
前者の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅは、ピルビン酸２分子から４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ：４−ＨＭＧ）を生成する反応、および、４−ｏｘａｌｏｃｉｔｒａｍａｌａｔｅからオキサロ酢酸１分子とピルビン酸１分子を生成する反応を触媒することが報告されている（Ｋｉｙｏｆｕｍｉ  Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０８，３２７−３３３（１９９０））。また、後者の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅは、グリオキシル酸１分子とピルビン酸１分子から４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ：４ＨＧ）を生成する反応を触媒することが知られている。
しかし、これらのいずれの菌株からも、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、ＰＨＯＧ）分解活性や、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からモナティンの前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する活性についての報告・知見は全く無く、これらの菌株が産生するアルドラーゼを上述のモナティンの合成ルートに使用できるかについては不明であった。
本発明は、モナティン合成における中間体として有用なＩＨＯＧの合成に好適に利用できるアルドラーゼ、および、置換α−ケト酸の製造方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは上記問題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ある種の微生物に、目的とするＩＨＯＧの合成に好適に利用できるアルドラーゼが存在することを見出し、本発明に想到した。
即ち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔２〕  下記（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔３〕  下記（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡ。
（ｅ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列又は同配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列又は同配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔４〕  下記（ｇ）または（ｈ）のＤＮＡ。
（ｇ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔５〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとを接続して得られることを特徴とする組換えＤＮＡ。
〔６〕  〔５〕記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
〔７〕  〔６〕記載の細胞を培地中で培養し、培地および／または細胞中にアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
〔８〕  下記（ｉ）または（ｊ）のタンパク質。
（ｉ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔９〕  下記（ｋ）または（ｌ）のタンパク質。
（ｋ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｌ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔１０〕  （Ａ）インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性、および／または、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有し、
（Ｂ）（Ａ）記載の活性の至適ｐＨが３３℃において約９であり、かつ、
（Ｃ）ゲルろ過法により測定した分子量が約１４６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したサブユニットあたりの分子量が約２５ｋＤａである
ことを特徴とするタンパク質。
〔１１〕  （Ａ）アルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
（Ｂ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に由来し、
（Ｃ）ｐＨ６以上でｐＨ安定性を有し、
（Ｄ）７０℃以下で温度安定性を有し、かつ、
（Ｅ）ゲルろ過法により測定した分子量が約１４６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したサブユニットあたりの分子量が約２５ｋＤａである
ことを特徴とするタンパク質。
〔１２〕  酵素反応系に無機リン酸を含有させることによって、前記アルドラーゼ活性が向上することを特徴とする〔１１〕記載のタンパク質。
〔１３〕  シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を培地中で培養し、培地および／または細胞中に下記（ｉ）〜（ｌ）のうちいずれかのタンパク質を蓄積させ、前記培地および／または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物。
（ｉ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｋ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｌ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔１４〕  下記一般式（１）
2004018672.tif 000004
（一般式（１）において、Ｒ１は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ１は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。）
で表される置換α−ケト酸と、
下記一般式（２）
2004018672.tif 000005
（一般式（２）において、Ｒ２は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ２は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。ただし、一般式（１）において、Ｒ１が水素、メチル基またはカルボキシメチル基である場合は、Ｒ２は水素ではない。）で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式（３）
2004018672.tif 000006
（一般式（３）におけるＲ１およびＲ２は、一般式（１）および（２）におけるＲ１およびＲ２と同義である。）
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔１５〕  前記Ｒ２は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔１４〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔１６〕  前記Ｒ２は、水素であることを特徴とする、〔１５〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔１７〕  前記Ｒ１は、ベンジル基または３−インドリルメチル基であり、前記Ｒ２は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔１４〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔１８〕  インドール−３−ピルビン酸と、オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、下記式（４）
2004018672.tif 000007
に表す置換α−ケト酸を製造する方法であって、当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔１９〕  前記反応を触媒するタンパク質は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、〔１４〕〜〔１８〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔２０〕  前記微生物は、シュードモナス  タエトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）、シュードモナス  コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス  デスモリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ）、エルウィニア  エスピー（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．）、フラボバクテリウム  レナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ）、またはキサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）であることを特徴とする〔１９〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔２１〕  前記微生物は、シュードモナス  タエトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）ＡＴＣＣ４６８３、またはシュードモナス  コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ２７９１であることを特徴とする〔２０〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔２２〕  前記反応を触媒するタンパク質は、下記（ｉ）〜（ｌ）のうちいずれかのタンパク質であることを特徴とする〔１４〕〜〔２１〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
（ｉ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｋ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｌ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔２３〕  下記一般式（１’）
2004018672.tif 000008
（一般式（１’）において、Ｒ１は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体であり、Ｒ３は、水素またはカルボキシル基である。Ｒ１は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。）
で表される化合物と、
下記一般式（２’）
2004018672.tif 000009
（一般式（２’）において、Ｒ４は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ４は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。）で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式（３’）
2004018672.tif 000010
（一般式（３’）におけるＲ１、Ｒ３およびＲ４は、一般式（１’）および（２’）におけるＲ１、Ｒ３およびＲ４と同義である。）
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
〔８〕または〔９〕のいずれかに記載のタンパク質の存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔２４〕  前記Ｒ４は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔２３〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本発明のアルドラーゼの製造工程を示すフローチャートである。
第２図は、ＰＨＯＧ濃度に対するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３由来のアルドラーゼ（ＰｔＡＬＤ）のアルドラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
第３図は、ＭｇＣｌ２濃度に対するＰｔＡＬＤのアルドラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
第４図は、ＫＰｉ濃度に対するＰｔＡＬＤのアルドラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
第５図は、ＰｔＡＬＤのｐＨ安定性を測定した結果を示すグラフである。
第６図は、ＰｔＡＬＤの温度安定性を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について、
［Ｉ］アルドラーゼ
［ＩＩ］アルドラーゼを用いた置換α−ケト酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
［Ｉ］  アルドラーゼ
本発明者らの研究により、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）の分解活性を有するアルドラーゼを生成する菌株が存在することが確認された。
これらの微生物が産生するアルドラーゼは、ＰＨＯＧ１分子を分解して、フェニルピルビン酸１分子およびピルビン酸１分子を生成する反応を触媒することから、本発明者らは、当該アルドラーゼが、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒しうると考えた。この考えに基づき、本発明者らは、新規アルドラーゼの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からアルドラーゼを精製単離するとともに、この酵素がインドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合によりＩＨＯＧを合成することを発見した。
また、本発明者らは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３由来のアルドラーゼ（以下、ＰｔＡＬＤと略す場合がある）を精製し、該アルドラーゼのアミノ酸配列を決定した。さらに、該アルドラーゼのアミノ酸配列から演繹した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、これを用いてＰＣＲ法により当該アルドラーゼをコードするＤＮＡの一部を単離・取得し、さらに該ＤＮＡ断片をプローブとして利用し、ＰｔＡＬＤをコードするＤＮＡ全長をこの微生物の染色体ライブラリーから単離することに成功した。
上記方法によって特定された本発明のＰｔＡＬＤをコードするＤＮＡを配列表の配列番号１に示す。また、配列表の配列番号２および３に、配列表の配列番号１の塩基配列がコードするＰｔＡＬＤのアミノ酸配列を示す。配列表の配列番号２は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列がコードするＰｔＡＬＤのアミノ酸配列である。また、配列表の配列番号３は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号４４４〜１１１８の塩基配列がコードするＰｔＡＬＤのアミノ酸配列であり、配列番号２記載のアミノ酸配列中、残基番号５〜２２５のアミノ酸配列に相当する。配列表の配列番号２および３記載のいずれのＰｔＡＬＤも、アルドラーゼ活性を有し、インドールピルビン酸１分子とオキサロ酢酸（ないしピルビン酸）１分子から、下記式（４）に示す４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒する。
さらに、本発明者らは、取得したＰｔＡＬＤをコードするＤＮＡ断片をプローブとして利用し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３由来のアルドラーゼ（以下、ＰｃＡＬＤと略す場合がある）をコードするＤＮＡ全長を、該微生物の染色体遺伝子ライブラリーから単離することに成功した。上記方法によって特定された本発明のＰｃＡＬＤをコードするＤＮＡを配列表の配列番号１５に示す。また、配列表の配列番号１６に、配列表の配列番号１５の塩基配列がコードするＰｃＡＬＤのアミノ酸配列を示す。配列表の配列番号１６は、配列表の配列番号１５記載の塩基配列のうち、塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列がコードするＰｃＡＬＤのアミノ酸配列である。配列表の配列番号１６記載のＰｃＡＬＤもまたアルドラーゼ活性を有し、インドールピルビン酸１分子とオキサロ酢酸（ないしピルビン酸）１分子から、下記式（４）に示す４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒する。
2004018672.tif 000011
次に、本発明のアルドラーゼについて、
（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ、
（２）アルドラーゼの性質、
（３）アルドラーゼの製造方法
の順に詳細に説明する。
（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述したようにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。配列表の配列番号１の塩基配列は、既知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｃｈｒａｃｅａｅ細菌由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（遺伝子名ｐｒｏＡ）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５（１２），２７０１−２７０９（２００１）Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，）とアミノ酸配列において、２９％の相同性を示す。
また、配列表の配列番号１５の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述したようにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。配列表の配列番号１５の塩基配列は、既知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｃｈｒａｃｅａｅ細菌由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（遺伝子名ｐｒｏＡ）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５（１２），２７０１−２７０９（２００１）Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，）とアミノ酸配列において、２８％の相同性を示し、また、上述の本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来のアルドラーゼと４１％の相同性を示す。
なお、ここでの相同性の解析は、遺伝子解析ソフト「Ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．６」（ゲネティクス社）を用い、パラメータを初期設定値として算出した値である。
アルドラーゼ産生菌からアルドラーゼをコードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
はじめに、精製されたアルドラーゼのアミノ酸配列を決定する。この際、エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４，２２７（１９５０））を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼについて、プロテアーゼで限定分解した後に逆相ＨＰＬＣにてペプチド断片を分取し、それら断片のうち２つについて内部アミノ酸配列を決定したところ、配列表配列番号４および５に示される配列が明らかとなった。
明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９（１９８１）に開示されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を、アルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはアルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長をアルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
ＰＣＲ法の操作については、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９）等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）に記載されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼをコードするＤＮＡを配列表配列番号１に示し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株由来アルドラーゼをコードするＤＮＡを配列表配列番号１５に示す。
なお、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する反応を触媒するアルドラーゼをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１および１５に示されるＤＮＡだけではない。すなわち、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のうち、種および株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
また、本発明のＤＮＡは単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、アルドラーゼ産生菌の染色体ＤＮＡから単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、アルドラーゼをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Ｍｅｔｈｏｄ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４（１９８７）に記載されている部位特異的変異導入法がある。
また、配列表配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、「アルドラーゼ活性」とは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
また、配列表配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、「アルドラーゼ活性」とは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
さらに、配列表の配列番号１または１５に記載のＤＮＡがコードするアルドラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡである。ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、アルドラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個である。また、「アルドラーゼ活性」とは、前述のとおり、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する活性を意味する。ただし、配列表の配列番号２、３または１６に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３３℃、ｐＨ９の条件下で３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２、３または１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
（２）アルドラーゼの性質
つぎに、精製されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼ（ＰｔＡＬＤ）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株由来アルドラーゼ（ＰｃＡＬＤ）の性質について説明する。
本発明のＰｔＡＬＤは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、配列表配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列表の配列番号２および３に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をも含むものである。
また、本発明のＰｃＡＬＤは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、配列表配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をも含むものである。
すなわち、本発明のアルドラーゼは、下記（ｉ）〜（ｌ）のタンパク質である。
（ｉ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中、残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中、残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｋ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｌ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
ここで、「数個」および「アルドラーゼ活性」の定義は（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
本発明のアルドラーゼは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からアルドール縮合により４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒する。
本発明のアルドラーゼのアルドラーゼ活性の測定は、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から生成するＩＨＯＧ量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することにより行うことが可能である。
具体的には、１００ｍＭ  バッファー、５０ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭ  ピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液にアルドラーゼを添加し、３３℃で４時間振とう反応させ、ＨＰＬＣにて生成したＩＨＯＧ量を定量することにより、アルドラーゼ活性を見積もることができる。
ＩＨＯＧの定量は、例えば、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量できる。分析条件の一例を以下に示す。
移動相：４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５ｍＭ  リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
本発明のアルドラーゼは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合によりＩＨＯＧを合成する反応を触媒できる。２分子のα−ケト酸（ないしは置換α−ケト酸）を基質としたアルドール縮合を触媒する微生物酵素としては、これまでに、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ、および、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどに存在する４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅの２例が報告されているが、前者についてはＰＨＯＧあるいはＩＨＯＧに作用するといった知見・報告は全く無く、この酵素をもちいてＰＨＯＧ（およびＩＨＯＧ）を合成することが可能であるかについては全く不明であった。また、後者についてはＰＨＯＧ分解活性が認められず、この酵素を用いてもＰＨＯＧ（およびＩＨＯＧ）の合成は不可能であった。すなわち、本発明のアルドラーゼは、今まで報告されていたアルドラーゼと異なり、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合によりＩＨＯＧを合成する反応を触媒できる点に特徴を有するものである。
つぎに、精製されたＰｔＡＬＤについて調べた酵素化学的性質を以下に述べる。
ＰｔＡＬＤは、下記一般式（１’）
2004018672.tif 000012
（一般式（１’）において、Ｒ１は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体であり、Ｒ３は、水素またはカルボキシル基である。Ｒ１は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。）
で表される化合物と、
下記一般式（２’）
2004018672.tif 000013
（一般式（２’）において、Ｒ４は、水素、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ４は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。）で表される置換α−ケト酸とから、
下記一般式（３’）
2004018672.tif 000014
（一般式（３’）におけるＲ１、Ｒ３およびＲ４は、一般式（１’）および（２’）におけるＲ１、Ｒ３およびＲ４と同義である。）
で表される置換α−ケト酸を生成する反応を触媒する。したがって、本発明のＰｔＡＬＤを用いて一般式（１’）および一般式（２’）から一般式（３’）を製造する方法も本発明に属する。ここで、前記Ｒ４は、水素またはカルボキシル基であることが好ましい。
ＰｔＡＬＤの至適ｐＨは、３３℃において、約９付近にある。また、ｐＨ６以上でｐＨ安定性を有し、特にｐＨ６〜１１の範囲で高いｐＨ安定性を有する。また、７０℃以下で温度安定性を有し、特に２０〜６０℃の範囲内で高い温度安定性を有する。また、ＰｔＡＬＤは、酵素反応系にＫＰｉ等の無機リン酸を添加することにより、アルドラーゼ活性が向上する性質を有する。
ＰｔＡＬＤの分子量をゲル濾過法により測定したところ約１４６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したところ約２５ｋＤａであったことから、ＰｔＡＬＤは、分子量約２５ｋＤａのサブユニット６量体構造をとると推察される。
（３）アルドラーゼの製造方法
次に本発明のアルドラーゼの製造方法について説明する。本発明のアルドラーゼの製造方法としては、（ｉ）アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法と、（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法の２つがある。
（ｉ）微生物培養により生成蓄積する方法
アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法において、アルドラーゼの取得源となる微生物としてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物があげられる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のうち、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成する微生物であれば、いかなるものも本発明に使用可能であるが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ  ＡＪ１５８２、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ２９１７、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ  ＡＪ２７９７、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ  ＡＪ２４６８がより好ましい。このうち、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１が好ましい。これらの微生物の寄託先を下記に示す。
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８１より移管）
（ｉｉ）受託日    ２００２年６月１０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ  ＡＪ１５８２株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８２より移管）
（ｉｉ）受託日    ２００２年６月１０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（３）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ２９１７株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８０より移管）
（ｉｉ）受託日    ２００２年６月１０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（４）Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ  ＡＪ２４６８株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２
（ｉｉ）受託日    １９８５年９月３０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
（５）Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ  ＡＪ２７９７株
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−８４６２より移管）
（ｉｉ）受託日    １９８５年９月３０日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
アルドラーゼの取得源となる微生物の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。
通気条件としては、好気条件を採用する。培養温度としては、菌が発育し、アルドラーゼが生産される範囲であれば良い。従って、厳密な条件は無いが、通常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、アルドラーゼが最も生産される時間まで培養すれば良く、通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度である。
培養後、菌体を遠心分離（たとえば、１０，０００ｘｇ、１０分）により集菌する。アルドラーゼの大部分は菌体中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させることにより、アルドラーゼの可溶化を行う。菌体破砕には、超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
アルドラーゼ産生菌由来のアルドラーゼを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残査を除いた方が、精製に有利である。
アルドラーゼの精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を採用することができる。その結果、より比活性が高いアルドラーゼ含有画分を得ることができる。
（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術による製法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってアルドラーゼを製造する方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
図１は、本発明のアルドラーゼの製造工程のフローチャートである。
先ず、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡを調製する（ステップＳ１）。
次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡを作製し（ステップＳ２）、該組み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する（ステップＳ３）。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にアルドラーゼを生成蓄積させる（ステップＳ４）。
その後、ステップＳ５に進み、該酵素を回収・精製することによって精製アルドラーゼを製造する。
また、ステップＳ５で生産した精製アルドラーゼまたはステップＳ４のアルドラーゼが蓄積された培地および／または細胞をアルドール反応に用いることで、目的とする置換α−ケト酸を大量に製造することができる（ステップＳ６）。
なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡは、本発明のアルドラーゼが発現可能であればよい。
ここで、ベクターＤＮＡに接続されるアルドラーゼ遺伝子としては、上述の
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号４４４〜１１１８若しくは塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号５〜２２５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列又は同配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号１５記載の塩基配列又は同配列中塩基番号３９８〜１１４１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
などを使用できる。
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパクを生産する形質転換体内で該タンパクが会合し、タンパクの封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させることが好ましい。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク封入体は、タンパク変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパクに変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク封入体から活性型タンパクを得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパクを生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパクを菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパクを封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパクとの融合タンパクとして発現させる方法がある。
さらに、融合タンパクとして発現させた後に、目的のタンパクを切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。宿主−ベクター系が開発されている細菌細胞としてはエシェリヒア属細菌、シュードモナス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌などが挙げられるが、好ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。エシェリヒア・コリを用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてアルドラーゼを製造する方法を説明する。
アルドラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
アルドラーゼを融合タンパク封入体として生産させるためには、アルドラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク遺伝子とする。このような他のタンパクをコードする遺伝子としては、融合タンパクの蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパクの溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とアルドラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ  Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
プロモータ、アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、特にエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
融合タンパクとして発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、アルドラーゼ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてアルドラーゼを切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクを回収するには、以下の方法などがある。アルドラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりアルドラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、アルドラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパクとともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパクとして再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したアルドラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
また、当該アルドラーゼ遺伝子がシュードモーナス属細菌に由来するものである場合、好ましい一つの様態として、シュードモーナス属細菌を宿主として該アルドラーゼを発現・生産せしめることもできる。この場合の宿主細胞としては、例えばＳｈｉ−Ｅｎ  ＬｕらはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅでの組み換え発現法を報告している（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１０（２００２）ｐ１１５−１２１）。また、Ｏｌｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．らはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａでの組換え発現法について報告している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，（１９８２）１５０，ｐ６０−６９）。またＧｒａｐｎｅｒ，Ｓ．らはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉでの組換え発現法について報告している（Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．，（２０００），１７，ｐ１１−１６）。ただし、アルドラーゼ発現のための宿主細胞としてのシュードモナス属細菌はこれらに限定されるわけではない。
次にアルドラーゼ遺伝子をシュードモナス属細菌に導入するためのベクターについてであるが、シュードモナス属細菌細胞内で機能する複製開始点を有するプラスミドを用いることが出来る。例を挙げるとＥｚａ  ＫａｌｙａｅｖａらはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで機能するレプリコンＴＦＫを有するプラスミドｐＫＬＨ４．０５を報告している。また、グラム陰性細菌の形質転換に用いられる、いわゆる広宿主域ベクターを用いることも出来る。これらのベクターとしてはＲＫ４０４（Ｄｉｔｔａ，Ｇ．ら、Ｐｌａｓｍｉｄ  １３（１９８５）ｐ１４９−１５３）やＲＳＦ１０１０（Ｆｒｅｙ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  ２４（１９８２）ｐ２８９−２９６）などがシュードモナス属細菌でも機能することが知られている。
アルドラーゼをコードするＤＮＡとして、配列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を有するアルドラーゼが生産され、配列表配列番号１５に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するアルドラーゼが生産される。
［ＩＩ］アルドラーゼを用いた置換α−ケト酸の製造方法
次に、本発明の置換α−ケト酸の製造方法について述べる。本発明の置換α−ケト酸の製造方法は、下記一般式（１）
2004018672.tif 000015
で表される置換α−ケト酸と、
下記一般式（２）
2004018672.tif 000016
で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式（３）
2004018672.tif 000017
で示される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施する点に特徴を有する。
一般式（１）において、Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ１は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。Ｒ１は、炭素数４以上、好ましくは炭素数６以上の置換基であることが好ましく、中でも、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基（フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基等のアリール基；ベンジル基、ベンズヒドリル基、スチリル基、フェネチル基、トリチル基、シンナミル基等のアラルキル基）、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基（フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基等の複素環基；これらの複素環基によって置換されたアルキル基）であることが好ましい。Ｒ１は、ベンジル基または３−インドリルメチル基であることが特に好ましく、３−インドリルメチル基であることが最も好ましい。すなわち、一般式（１）の置換α−ケト酸としては、フェニルピルビン酸またはインドールピルビン酸が好ましく、特にインドールピルビン酸が好ましい。
一般式（２）において、Ｒ２は、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシル基、炭素数２〜９のカルボキシアルキル基、炭素数２０までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数１１までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。Ｒ２が芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、ハロゲン原子、水酸基、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシ基およびアミノ基から選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。ただし、一般式（１）において、Ｒ１が水素、メチル基またはカルボキシメチル基である場合は、Ｒ２は水素ではない。Ｒ２は、水素またはカルボキシル基であることが好ましく、特に水素であることが好ましい。すなわち、一般式（２）の置換α−ケト酸としては、オキサロ酢酸またはピルビン酸が好ましく、特にピルビン酸が好ましい。
一般式（３）において、Ｒ１およびＲ２は、一般式（１）および（２）におけるＲ１およびＲ２と同義である。
本発明の置換α−ケト酸の製造方法においては、一般式（１）の置換α−ケト酸としてインドールピルビン酸を用い、一般式（２）の置換α−ケト酸としてピルビン酸を用いて、下記式（４）に示すＩＨＯＧを合成することが最も好ましい。
2004018672.tif 000018
当該反応を触媒するタンパク質とは、前記一般式（１）で表される置換α−ケト酸と、前記一般式（２）で表される置換α−ケト酸とのアルドール縮合により、前記一般式（３）で示される置換α−ケト酸を合成する反応を触媒できるタンパク質であれば、特に限定なく使用できる。すなわち、当該反応を触媒するタンパク質であれば、微生物由来のタンパク質であってもよいし、化学合成法によって合成されたタンパク質であってもよい。
このようなタンパク質としては、［Ｉ］アルドラーゼの項で説明したアルドラーゼが好ましい。この場合、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のうち、当該反応を触媒するタンパク質（アルドラーゼ）を生成する菌体を培養して得たアルドラーゼを用いても良いし、（２）組み換えＤＮＡ技術により当該反応を触媒するタンパク質を生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養して得たアルドラーゼを用いても良い。
当該反応を触媒するタンパク質は、前記一般式（３）で示される置換α−ケト酸を合成する反応を触媒可能な限り、いかなる形態で反応系に添加してもよい。すなわち、当該反応を触媒するタンパク質を単体で反応系に添加してもよいし、当該反応を触媒するタンパク質（アルドラーゼ）を含むアルドラーゼ活性を有する組成物の形態で反応系に添加してもよい。
ここで「アルドラーゼ活性を有する組成物」とは、当該反応を触媒するタンパク質（アルドラーゼ）を含むものであればよく、具体的には培養物、培地（培養物から菌体を除去したもの）、菌体（培養菌体、洗浄菌体のいずれも含む）、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、前記培地および／または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物（粗酵素液、精製酵素）などを含む。例えば、アルドラーゼ産生菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、置換α−ケト酸を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からアルドラーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、アルドラーゼ活性を有する画分であれば、どのような形態であっても本発明の置換α−ケト酸の製造方法に使用することが可能である。
アルドラーゼまたはアルドラーゼ活性を有する組成物を用いてアルドール反応を進行させるには、前記一般式（１）で表される置換α−ケト酸、前記一般式（２）で表される置換α−ケト酸、当該反応を触媒するタンパク質またはアルドラーゼ含有物を含む反応液を２０〜５０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ６〜１２に保ちつつ、３０分〜５日静置、振とう、または攪拌すればよい。
当該反応液にＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋などの２価のカチオンを添加することによって反応速度を向上させることもできる。コスト等の面から、好ましくはＭｇ２＋を用いることがある。
これら２価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれの塩を用いてもよいが、好ましくはＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＳＯ４等を用いることがある。これら２価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定することができるが、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で添加することができる。
以下、本発明の置換α−ケト酸の製造方法を実施する際の好ましい反応条件の一例を挙げれば、１００ｍＭ  バッファー、５０ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭ  ピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に、酵素源としてアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３３℃で４時間振とう反応させることにより、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）が得られる。
生成した一般式（３）の置換α−ケト酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
本発明の置換α−ケト酸の製造方法を用いることにより、インドールピルビン酸と、オキサロ酢酸（ないしピルビン酸）とから、モナティンの前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を生成できる。ＩＨＯＧは、２位をアミノ化することによりモナティンを導出できるため、モナティン合成における中間体として有用である。
【実施例】  以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例において、基質として用いたＩＨＯＧおよびＰＨＯＧは、参考例１および２に記載の方法により合成したものである。
【実施例１】〔Ｉ〕ＰＨＯＧアルドラーゼ活性菌の採取
４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）を基質としたアルドラーゼ活性菌株の採取を実施した。
ブイヨン平板培地（栄研化学）に供試微生物（細菌・酵母）を接種し、３０℃で２４時間培養した。これをグリセロール０．５ｇ／ｄｌ、フマル酸０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．３ｇ／ｄｌ、ペプトン０．２ｇ／ｄｌ、硫安０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．１ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５ｇ／ｄｌ、フタル酸ナトリウム０．２５ｇ／ｄｌ、寒天末２ｇ／ｄｌ（ｐＨ６．５）を含むプレートに接種し、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体を湿菌体重量で約１％（ｗ／ｖ）となるように、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  リン酸カリウム溶液（ＫＰｉ）、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に接種し、３０℃で２４時間反応させた。該反応液中の遊離ピルビン酸濃度はｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｅ（ＬＤＨ）を用いた酵素法にて定量した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５Ｕ／ｍｌ  ＬＤＨからなる反応液２００μＬにサンプル１０μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。反応後の３４０ｎｍの吸光度を測定し、ＮＡＤＨの減少量からサンプル中のピルビン酸量を定量した。
また生成フェニルピルビン酸量はジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
本条件により、ＰＨＯＧは約９．８分に、フェニルピルビン酸は約１２分の保持時間に溶出され、それぞれ分別、定量できた。
供試菌体添加区においてＰＨＯＧより生成したピルビン酸ないしフェニルピルビン酸量より対照区（菌体無添加区）の生成量を差し引いた値をアルドラーゼによる生成量とした。その結果、表１に掲げる菌株においてＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性を見出した。
2004018672.tif 000019
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３を選抜し、フェニルピルビン酸とオキサロ酢酸ないしピルビン酸からのＰＨＯＧの合成反応を検討した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  フェニルピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＰｉ、１００ｍＭ  オキサロ酢酸ないしピルビン酸、１％（ｗ／ｗ）トルエンからなる反応液に、Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３（ＡＪ２２１２）菌体を終濃度で約１％（ｗ／ｖ）となるように接種し、３０℃で１６時間反応させた。反応終了後、生成ＰＨＯＧ量をＨＰＬＣにて定量した。フェニルピルビン酸とオキザロ酢酸ないしピルビン酸からのＰＨＯＧの生成量を表２に示す。
2004018672.tif 000020
表２より、菌体添加区においてＰＨＯＧの生成量の増加が認められ、フェニルピルビン酸＋オキサロ酢酸およびフェニルピルビン酸＋ピルビン酸のいずれの組み合わせにおいても、該アルドラーゼの作用によりＰＨＯＧを生成せしめることが明らかとなった。
〔ＩＩ〕  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来ＩＨＯＧアルドラーゼの精製
Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株の可溶性画分からＩＨＯＧアルドラーゼの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．２ｍＭＫＰｉ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μＬ酵素／６００μＬ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
（１）可溶性画分の調製
ブイヨン平板培地で３０℃、２４時間培養したＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３菌体を一白金耳かきとり、５０ｍｌの酵素生産培地（０．５ｇ／ｄｌ  グリセロール、０．５ｇ／ｄｌ  フマル酸、０．５ｇ／ｄｌ硫酸アンモニウム、０．３ｇ／ｄｌ  Ｋ２ＨＰＯ４０．１ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．０５ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ／ｄｌ、酵母エキス、０．２ｇ／ｄｌ  ペプトン、０．２５ｇ／ｄｌ  フタル酸ナトリウム、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）、ｐＨ６．５にＫＯＨで調整）を含む５００ｍｌ容フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。該培養液０．５ｍｌを酵素生産培地５０ｍｌを含む５００ｍｌ容フラスコ４０本に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を２００ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、さらに超遠心分離（ｘ５００００ｒｐｍ、３０分間）し、得られた上清を可溶性画分とした。
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ
上記の可溶性画分８０ｍｌをバッファーＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて（ｔｏｔａｌ  １４０ｍｌ）吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてＰＨＯＧアルドラーゼ活性を検出したところ、約０．５Ｍ相当の画分にＰＨＯＧアルドラーゼ活性のピークを検出した。同様のクロマト操作を２度繰り返して実施した。
（３）疎水性クロマトグラフィー：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析し０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０（ファルマシア社製）に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＢを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．２Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
（４）ゲルろ過クロマトグラフィー：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨＰ  １６／６０
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、バッファーＡに対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーＣ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１Ｍ  ＫＣｌ）で平衡化されたゲルろ過Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨＰ  １６／６０（ファルマシア社製）に供し、１ｍｌ／ｍｉｍの流速で溶出した。この操作によりアルドラーゼは６６−７１ｍｌの画分に溶出された。活性のピークの溶出位置より、該アルドラーゼの分子量は約１４６ｋＤａと見積もられた。
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５
得られた画分を０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＡで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム  Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ  ５／５（ファルマシア社製）に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着した。バッファーＡにより非吸着タンパク質を洗い流した後、ＫＣｌ濃度を直線的に０ｍＭから７００ｍＭへ変化させてタンパク質の溶出をおこなった（Ｔｏｔａｌ  ２４ｍｌ）。各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、ＫＣｌ濃度が約０．４Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
（６）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー：ＣＨＴ−ＩＩ
得られた画分をバッファーＤ（１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０））に４℃で一晩透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＤで平衡化されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラム  ＣＨＴ−ＩＩ  ５ｍｌ（ＢｉｏＲａｄ社製）に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着せず、吸着タンパクと分離することができた。
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約２５ｋＤａに相当する位置にほぼ単一なバンドとして検出された。ゲルろ過クロマトグラフィーでの推定分子量が約１４６ｋＤａであることから、該アルドラーゼは６量体を形成していると推定された。精製表を表３に示す。
2004018672.tif 000021
〔ＩＩＩ〕  ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅの内部アミノ酸配列の決定
精製したアルドラーゼ約２μｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の試料をトリプシン処理し（ｐＨ８．５、３５℃、２０時間）、逆相ＨＰＬＣに供して断片ペプチドを分離した。分取したフラクションのうち、２つのフラクションについてそれぞれ２０残基、１２残基分のアミノ酸配列（配列番号４、５）を下記の通り決定した。
2004018672.tif 000022
〔ＩＶ〕  Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ遺伝子のクローニング
（１）染色体ＤＮＡの調製
Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株を５０ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
（２）ＰＣＲによる内部配列の取得
決定したＩＨＯＧアルドラーゼの内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマー（配列番号６、７）を合成した。
2004018672.tif 000023
作製したミックスプライマーを用いて、Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＰＥＲＳＯＮＥＬ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて行い、以下の条件で３０サイクル行った。
９４℃  ３０秒
５５℃  ３０秒
７２℃  １分
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約５００ｂｐの断片の増幅が認められた。該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、ＩＨＯＧアルドラーゼの内部アミノ酸配列と一致しており、目的のアルドラーゼ遺伝子が取得されたことが確認された。
（３）コロニーハイブリダイゼーションによる全長遺伝子の取得
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。ＤＮＡプローブの作製はＤＩＧＨｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃でＯ／Ｎインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析は染色体ＤＮＡ１μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、Ｏ／Ｎでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。その結果、該ＰＣＲ断片をプローブとして強くハイブリダイゼーションする約４ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を検出した。次に、このＰｓｔＩ断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体ＤＮＡ２０μｇをＰｓｔＩで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約４ｋｂｐ大きさの断片を回収した。これをｐＵＣ１１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。その結果、プローブと強くハイブリダイゼーションするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号１に記載の塩基配列を有することが明らかになった。決定した内部アミノ酸配列に対応する塩基配列（配列番号１にて５０７〜５６６番目、および、１０４６〜１０８２番目）を含む６７８ｂｐのｏｒｆを見出し、目的とするアルドラーゼの全長を取得した。
（４）Ｅ．ｃｏｌｉでのＩＨＯＧアルドラーゼの発現（その１）
表６に示すプライマー（配列番号８および９）を用いてＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡより増幅した断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐＵＣＡＬＤを構築した。構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪させた（前培養）。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
2004018672.tif 000024
該粗酵素液を用いてＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、ｐＵＣ１８を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはＰＨＯＧアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐＵＣＡＤＬ導入株においては０．８１Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が検出された。このことより、該遺伝子が目的とするアルドラーゼをコードしていることが示された。
〔Ｖ〕  アルドラーゼ発現株を用いたインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成
〔ＩＶ〕にて作製したアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を酵素源として用いて、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成を実施した。ＩＨＯＧの定量はジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５ｍＭ  リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
１００ｍＭ  バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ８．０，９．０ないしＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  １０．０）、５０ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭ  ピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液にアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３３℃で４時間振とう反応させた。酵素反応液を適宜希釈し、生成したＩＨＯＧを定量した。
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その結果、アルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉ添加区において、ＩＨＯＧ生成量が増加しており、該アルドラーゼによりＩＨＯＧを生成せしめることができた。
実施例２  Ｅ．ｃｏｌｉでのＩＨＯＧアルドラーゼの大量発現（その２）
（１）ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドｐＴｒｐ４の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号１０および１１の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。次にｐＴｒｐ２を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号１０および１２の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
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（２）アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドｐｔｒｐＡＬＤ１、ｐｔｒｐＡＬＤ２の構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
表９に示すプライマー（配列番号９および１３）を用いてＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＡＬＤ１を構築した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち４４４番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして配列番号３記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。また、プライマー（配列番号９および１４）を用いてＰ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＡＬＤ２を構築した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち４５６番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。それぞれ構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪させた（前培養）。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるよにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
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該粗酵素液を用いてＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、ｐＴｒｐ４を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはＰＨＯＧアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐｔｒｐＡＤＬ１導入株においては１６．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が、ｐｔｒｐＡＤＬ２導入株においては３６．０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が検出された。このことより、配列番号２ないし３記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼのいずれを用いても、アルドラーゼ活性を有していることが明らかとなった。
実施例３  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株由来ＩＨＯＧアルドラーゼのクローニング
（１）染色体ＤＮＡの調製
Ｐ．ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株を５０ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
（２）サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによる全長遺伝子の取得
Ｐ．ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株由来ＩＨＯＧのアルドラーゼ（以下、ＰｃＡＬＤ）遺伝子のクローニングは、Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来ＩＨＯＧアルドラーゼ遺伝子をプローブとしたサザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションにより実施した。表９に示すプライマーＡＬＤ−５’Ｎｄｅ−１（配列番号１３）およびＡＬＤ−３’Ｈｉｎｄ（配列番号９）を用いて、Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡよりＩＨＯＧアルドラーゼ遺伝子全長をＰＣＲで増幅した。増幅したＤＮＡ断片をプローブとして用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。ＤＮＡプローブの作製はＤＩＧＨｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃でＯ／Ｎインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析はＰ．ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株染色体ＤＮＡ１μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、３７℃で１時間プレハイブリを行った後にプローブを添加して、３７℃でＯ／Ｎ、ハイブリさせた。メンブレンの洗浄は、２×ＳＳＣを用いて室温で５分間の洗浄を２回行ったのち、０．１×ＳＳＣを用いて３７℃で１５分間の洗浄を２回行った。バンドの検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。その結果、プローブとハイブリする約２．２ｋｂｐのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を検出した。次に、このＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体ＤＮＡ２０μｇをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約２．２ｋｂｐ大きさの断片を回収した。これをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。ナイロンメンブレンフィルターをバッファー中に浸し、３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンフィルターの洗浄は、２×ＳＳＣを用いて室温で５分間の洗浄を２回行ったのち、０．１×ＳＳＣを用いて３７℃で１５分間の洗浄を２回行った。プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。その結果、プローブとハイブリするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ７４４ｂｐのｏｒｆを見出し、目的とするアルドラーゼの全長を取得した。構築したＰｃＡＬＤ遺伝子挿入プラスミドをｐＵＣＰｃＡＬＤと命名した。
ｐＵＣＰｃＡＬＤをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（ＬＢ−ａｍｐ培地）で一昼夜３７℃で振盪させた（前培養）。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるよにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
該粗酵素液を用いてＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、ｐＵＣ１８を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはＰＨＯＧアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐＵＣＡＤＬ導入株においては３９．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が検出された。このことより、該遺伝子が目的とするアルドラーゼをコードしていることが示された。
実施例４  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼの組み換え酵素の精製
Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３由来アルドラーゼ（以下、ＰｔＡＬＤ）を高発現させたＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分から組み換えＰｔＡＬＤの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２ｍＭ  ＮＡＤ、０．２ｍＭ  Ｋｐｉ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
（１）可溶性画分の調製：
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐｔｒｐＡＬＤ２菌体を一白金耳かきとり、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地を含む試験管に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。該培養液０．５ｍｌをＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌを含む５００ｍｌ容フラスコ１０本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６））に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を２５ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ
上記の粗抽出画分２３ｍｌをバッファーＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて（ｔｏｔａｌ  １４０ｍｌ）吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてＰＨＯＧアルドラーゼ活性を検出したところ約０．５Ｍ相当の画分にＰＨＯＧアルドラーゼ活性のピークを検出した。
（３）疎水性クロマトグラフィー：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０（ファルマシア社製）に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＢを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．２Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約２５ｋＤａに相当する位置にＣＢＢ染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み換えＰｔＡＬＤ溶液はバッファーＡに対して４℃で一晩透析した。上記の操作により、３５０Ｕ／ｍｌのＰｔＡＬＤ溶液を１７ｍｌ取得した。
実施例５  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１株由来アルドラーゼの組み換え酵素の精製
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ  ＡＪ２７９１由来アルドラ４ゼ（ＰｃＡＬＤ）を高発現させたＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分から組み換えＰｃＡＬＤの精製を行った。
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＵＣＰｃＡＬＤ菌体を一白金耳かきとり、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地を含む試験管に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。該培養液０．５ｍｌをＬＢ−ａｍｐ培地（＋０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ）５０ｍｌを含む５００ｍｌ容フラスコ７本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６））に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を３０ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
得られた粗抽出画分を、実施例４記載の組み換えＰｔＡＬＤの精製と同様の方法にてカラムクロマト精製を行った。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅの２段階のカラムクロマト操作により精製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約２５ｋＤａに相当する位置にＣＢＢ染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み換えＰｃＡＬＤ溶液はバッファーＡに対して４℃で一晩透析した。上記の操作により、１０８Ｕ／ｍｌのＰｃＡＬＤ溶液を１０ｍｌ取得した。
実施例６  ＰｔＡＬＤ，ＰｃＡＬＤを用いたインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成
実施例４および５にて作製したＰｔＡＬＤ、ＰｃＡＬＤを酵素源として用いて、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成を実施した。ＩＨＯＧの定量はジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５ｍＭ  リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭ  ピルビン酸、１ｍＭないし５ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる反応液にＰｔＡＬＤ、ＰｃＡＬＤを１．８Ｕ／ｍｌ、０．８Ｕ／ｍｌとなるように添加し、３３℃で４時間反応させた。酵素反応液を適宜希釈し、生成したＩＨＯＧを定量した。その結果、該アルドラーゼによりＩＨＯＧを生成せしめることができた。
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実施例７  ＰｔＡＬＤを用いた種々の置換α−ケト酸の生成
実施例４にて調製したＰｔＡＬＤを用いて、表１１に掲げた種々の基質に対するピルビン酸のアルドール縮合活性を測定した。１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ９）、５０ｍＭ  基質、２５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＰｔＡＬＤからなる反応液を調製し、３３℃で２時間インキュベートした。得られた反応液を分画分子量１００００の限外ろ過膜Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０（アミコン社製）を用いて限外ろ過した。ろ液２μｌを２００μｌの５０％アセトニトリル／０．１％アンモニア水溶液に希釈し、ＥＳＩ−ＭＳ分析を実施した。
結果、表１２に示した基質に対して、相当するｍ／ｚ値のピークを検出し、目的とするピルビン酸のアルドール縮合物が生成していることが示された。
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実施例８  ＰｔＡＬＤの酵素学的諸性質
実施例４で調製したＰｔＡＬＤを用いて、以下に掲げる項目について検討した。
基本測定条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ８）、１６Ｕ／ｍｌ  Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３０℃にて３４０ｎｍの吸光度の減少を測定。
（１）ＰＨＯＧを基質とした速度論定数
図２〜４示す結果から、Ｖｍａｘ（ｆｏｒ  ＰＨＯＧ）＝９１．７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、Ｋｍ（ｆｏｒ  ＰＨＯＧ）＝０．１０ｍＭ、Ｋｍ（ｆｏｒ  ＭｇＣｌ２）＝０．０１９ｍＭ、Ｋａ（ｆｏｒ  Ｋｐｉ）＝０．９５ｍＭとそれぞれ決定した。また、１ｍＭのＭｇＣｌ２添加により無添加区と比較して２．７倍に、５ｍＭ  ＫＰＢ添加により無添加区の２倍にそれぞれ活性が上昇した。
（２）ｐＨ安定性
ｐＨ３〜１１の範囲におけるｐＨ安定性を測定した。測定に用いた緩衝液は以下の通り。酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３、４、５、６）、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６、６．５、７、７．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７、７．５、８、８．５）、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９、９．５、１０）、ＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０、１０．５、１１）。ＰｔＡＬＤを１００ｍＭのそれぞれの緩衝溶液中で３７℃で３０分間インキュベートした残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図５に示す。
（３）温度安定性
２５℃〜７０℃にて１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．０）中でＰｔＡＬＤを３０分間インキュベートした後、残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図６に示す。
実施例９  ＰｔＡＬＤを用いた置換α−ケト酸の生成
実施例４にて調製したＰｔＡＬＤを用いて、アセトアルデヒドとα−ｋｅｔｏｂｕｔｙｒａｔｅとのアルドール縮合活性を測定した。１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ９）、５０ｍＭ  アセトアルデヒド、２５０ｍＭ  α−ｋｅｔｏｂｕｔｙｒａｔｅ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＰｔＡＬＤからなる反応液を調製し、３３℃で１６時間インキュベートした。得られた反応液を分画分子量１００００の限外ろ過膜Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０（アミコン社製）を用いて限外ろ過した。ろ液１０μｌを２００μｌの５０％アセトニトリル／０．１％アンモニア水溶液に希釈し、ＥＳＩ−ＭＳ分析を実施した。
結果、予想される生成物のＥｘａｃｔ  ｍａｓｓ（計算値）が１４６．０６であるのに対して、〔Ｍ＋Ｈ〕に相当するｍ／ｚ値のピーク（ｍ／ｚ＝＋１４６．８）を検出し、下記の反応により目的とするアルドール縮合物が生成していることが確認された。
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参考例１  ４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成
水酸化カリウム１８．９１ｇ（２８６．５ｍｍｏｌ、含量８５重量％）を溶解した水６４．４５ｍｌに、インドール−３−ピルビン酸７．５０ｇ（３５．８ｍｍｏｌ、含量９７．０重量％）とオキサロ酸１４．１８ｇ（１０７．４ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた。この混合溶液を３５℃にて２４時間攪拌した。
更に、３Ｎ−塩酸４０．０ｍｌを加えて中和（ｐＨ＝７．０）し、１５３．５ｇの反応中和液を得た。この反応中和液には、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸が５．５５ｇ含まれており、収率５３．３％（対インドールピルビン酸）であった。
この反応中和液に水を加え、１６８ｍｌとし、合成吸着剤（三菱化学製  ＤＩＡＩＯＮ−ＳＰ２０７）８４０ｍｌにて充填された樹脂塔（直径４．８ｃｍ）に通液した。更に、流速２３．５ｍｌ毎分にて純水を通液し、１．７３〜２．５５（Ｌ／Ｌ−Ｒ）を収集することにより、高純度の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を３．０４ｇ含む水溶液を、収率５４．７％（樹脂への投入量に対して）にて得た。
（ＮＭＲ測定）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：３．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），３．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），７．０６−７．１５（ｍ，３Ｈ），７．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：３５．４３，４７．９１，７７．２８，１０９．４９，１１２．０５，１１９．４４，１１９．６７，１２１．９１，１２５．４２，１２８．４１，１３６．２１，１６９．７８，１８１．４３，２０３．５８
参考例２  ４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸（ＰＨＯＧ）の合成
水酸化カリウム（純度８５％）１３．８ｇを溶解した水２５ｍｌに対し、フェニルピルビン酸５．０ｇ（３０．５ｍｍｏｌ）、オキサル酢酸１２．１ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）を加えて室温にて７２時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２．２に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸２．８ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）を結晶として得た。
（ＮＭＲ測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：２．４８（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．６０（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．８５−３．３０（ｍ，３．６４Ｈ），７．１７−７．３６（ｍ，５Ｈ）
（分子量測定）
ＥＳＩ−ＭＳ計算値Ｃ１２Ｈ１２Ｏ６＝２５２．２３，分析値２５１．２２（ＭＨ−）
【産業上の利用可能性】  本発明のアルドラーゼは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）とのアルドール縮合反応を触媒する新規アルドラーゼであり、モナティン合成における中間体として有用な４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（４−（Ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ；ＩＨＯＧ）の合成に好適に利用できる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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