(57)【要約】ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から第２０６残基の領域または他の種における同等の領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素が開示される。本発明はまた、上述の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。
2004005499.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項２】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から第２０６残基の領域または他の種における同等の領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項３】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの１９２番目のグルタミン残基もしくは他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項４】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されている、請求項４記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項６】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基と１６７番目のアスパラギン酸残基が同時に他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されている、請求項６記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されており、かつ１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されている、請求項６記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項９】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項９記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基がトレオニン残基で置換されている、請求項９記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１２】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１２記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基がトレオニン残基で置換されている、請求項１２記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１５】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの１９３番目のロイシン残基もしくは他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１６】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９３番目のロイシン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９３番目のロイシン残基が、アラニン残基、グリシン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、またはリジン残基で置換されている、請求項１６記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１８】
ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
（式中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、Ｘａａ１がＧｌｎであるときＸａａ２はＬｅｕではない）
を含むことを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項１９】
Ｘａａ１がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、Ｘａａ２がＡｌａまたはＧｌｙである、請求項１８記載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項２０】
請求項１−１９のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項２３】
請求項２０に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれている、請求項２２記載の形質転換体。
【請求項２４】
請求項１−１９のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【請求項２５】
請求項１−１９のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
【背景技術】  血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。また、微生物を用いる発酵生産においては、プロセスをモニタリングするためにグルコース濃度を定量する。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しかし、ＧＯＤを用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要があった。Ｇ６ＰＤＨは分光学的手法に基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならない。
そこで、これまでのグルコース酵素定量方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素としてＰＱＱＧＤＨの応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。
ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。例えば、ＡＭ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２，６３０８−６３１５を参照されたい。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約５０ｋＤａのホモダイマーである。他のＰＱＱ酵素とは蛋白質の一次構造上でのホモロジーがほとんどない。
最近、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨのＸ線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が明らかとなった。（Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９）；Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９）５１８７−５１９４（１９９９）；Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９））。これらの論文によれば、水溶性ＰＱＱＧＤＨは６つのＷ−モチーフから構成されるβプロペラ蛋白質であることが明かとなった。
ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。しかしながらＰＱＱＧＤＨはグルコースに対する選択性が低いことが問題であった。
したがって本発明は、グルコースに対する選択性が高い改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者は水溶性ＰＱＱＧＤＨを遺伝子工学的に改良してそのグルコースに対する選択性を高め、臨床検査や食品分析などに応用できる改変型ＰＱＱＧＤＨを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶性ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸変異を導入することにより、グルコースに対する選択性が高い酵素を得ることに成功した。
すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース脱水素酵素を提供する。本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対して高い選択性を有する。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する反応性と比べて、ラクトースあるいはマルトースに対する反応性が野生型より低下している。より好ましくは、グルコースに対する反応性を１００％とした場合、ラクトースあるいはマルトースに対する活性が５０％以下であり、より好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下である。
本発明の１つの態様においては、本発明の改変型グルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から第２０６残基の領域または他の種における同等の領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基（すなわち天然に存在するＰＱＱグルコース脱水素酵素中の対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基）で置換されている。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号付けする。
本明細書においてアミノ酸残基の位置または領域に関して用いる場合、「同等の」との用語は、構造上類似するが同一ではない２以上の蛋白質において、あるアミノ酸残基または領域が等価の生物学的または生化学的機能を有することを表す。例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ以外の生物に由来する水溶性ＰＱＱＧＤＨにおいて、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から２０６残基の領域とアミノ酸配列類似性の高い領域が存在し、かつ蛋白質の二次構造から見て該領域がその蛋白質において同じ役割を果たしていると合理的に考えられる場合、該領域は「Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から２０６残基の領域と同等の領域」と言われる。さらに、該領域の第７番目のアミノ酸残基は「Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１９２残基と同等の位置のアミノ酸残基」と言われる。
好ましくは、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの１９２番目のグルタミン残基もしくは１９３番目のロイシン残基、または他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素が提供される。好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基は、アラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基と１６７番目のアスパラギン酸残基が同時に他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素が提供される。好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基は、アラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されている。また好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されており、かつ１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されているグルコース脱水素酵素が提供される。好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されている。また好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基がトレオニン残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素が提供される。好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている。また好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基、またはアスパラギン酸残基で置換されており、かつ４５２番目のアスパラギン残基がトレオニン残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９３番目のロイシン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素が提供される。好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９３番目のロイシン残基がアラニン残基、グリシン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基あるいはリジン残基で置換されている。
また別の観点においては、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、配列：
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
（式中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、Ｘａａ１がＧｌｎであるときＸａａ２はＬｅｕではない）を含む。好ましくはＸａａ１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、Ｘａａ２はＡｌａまたはＧｌｙである。
本発明はまた、上述の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。
本発明の改変型グルコース脱水素酵素の酵素蛋白質はグルコースに対して高い選択性を示し、かつグルコースに対して高い酸化活性を有していることから、グルコースの高選択的かつ高感度の測定に応用することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする突然変異遺伝子を作成するために用いたプラスミドｐＧＢ２の構造を示す。
図２は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする突然変異遺伝子を作成する方法を示す。
図３は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの活性の基質濃度依存性を示すグラフである。
発明の詳細な説明
改変型ＰＱＱＧＤＨの構造
本発明の好ましい改変型グルコース脱水素酵素においては、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から第２０６残基の領域または他の種における同等の領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１９２番目のグルタミン残基がアラニン残基またはグリシン残基で置換されているか、または１９３番目のロイシン残基がアラニン残基、グリシン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、またはリジン残基で置換されている。
また別の態様においては、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、上述の置換に加えて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６７番目のアスパラギン酸残基が同時に他のアミノ酸残基で、特に好ましくはグルタミン酸残基で置換されている。また好ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、上述の置換に加えて、４５２番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基で、特に好ましくはトレオニン残基で置換されている。１６７番目のアスパラギン酸残基および４５２番目のアスパラギン残基がＰＱＱＧＤＨによる基質の認識および結合に関与することは、それぞれ特開２００１−３４６５８７および特開２００１−１９７８８８に記載されている。しかし、一般的には、異なるドメインに存在するアミノ酸残基に同時に変異を導入することにより、基質の選択性や酵素活性がどのように変化するかについては、全く予測することができない。場合によっては、酵素活性が全く失われることもある。したがって、本発明において、これらの変異を同時に導入することによりグルコースの選択性の向上が得られたことは、驚くべき発見であった。
また別の観点においては、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、配列：
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
（式中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、Ｘａａ１がＧｌｎであるときＸａａ２はＬｅｕではない）を含む。好ましくはＸａａ１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｘａａ２はＡｌａまたはＧｌｙである。
改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は配列番号２で規定される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が、当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨにおいては、所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野においてよく知られている。
さらに、当業者は、他の細菌に由来する水溶性ＰＱＱＧＤＨについても、蛋白質の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該酵素の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から第２０６残基の領域と同等の領域を容易に認識することができ、本発明にしたがって、この領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、グルコース選択性の向上した改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。これらの改変型グルコース脱水素酵素も本発明の範囲内である。
上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを調製する。
酵素活性の測定方法
本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。
グルコースに対する選択性
本発明のＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノース、アロース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型酵素と比較して、グルコースに対する選択性が向上しており、特にマルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する反応性が高い。したがって、本改変型酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、種々の糖が存在する試料においても高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−７１７６０ならびに２００２−１９６１７７号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例１】改変型酵素ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の構築
配列番号２に示されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、変異の導入を行った。プラスミドｐＧＢ２は、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構造遺伝子を挿入したものである（図１）。常法に従って部位特異的変異法により１９２番目のグルタミン残基または１９３番目のロイシン残基をコードする塩基配列を、それぞれアラニン残基、グリシン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、またはリジン残基をコードする塩基配列に置換した。さらに、１６７番目のアスパラギン酸残基または４５２番目のアスパラギン残基をコードする塩基配列を、それぞれグルタミン酸残基またはグリシン残基をコードする塩基配列に置換した。部位特異的変異はプラスミドｐＧＢ２を用いて、図２に示す方法により行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲットプライマーの配列を表１に示す。２カ所の変異を有する変異体を作成するためには、２種類のオリゴヌクレオチドターゲットプライマーを同時に用いて上記と同様に変異を導入した。
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ベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ（宝酒造（株））にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の一部を含むＫｐｎ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプレート５０ｆｍｏｌと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキットに付属のセレクションプライマー５ｐｍｏｌ、リン酸化したターゲットプライマー５０ｐｍｏｌを全体（２０μｌ）の１／１０量の同キットのアニーリングバッファーとともに混合し、１００℃、３分間の熱処理でプラスミドを変性させ、１本鎖にした。セレクションプライマーはｐＫＦ１８ｋのカナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのものである。これを５分間氷上に置き、プライマーをアニーリングさせた。これに３μｌの同キットエクステンションバッファー、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌの滅菌水を加えて相補鎖を合成した。これをＤＮＡのミスマッチ修復能欠損株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳに形質転換し、一晩振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。
次に、ここから抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４に形質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラスミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子のＫｐｎ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片と入れ替え、改変型ＰＱＱＧＤＨの遺伝子を構築した。
【実施例２】改変型酵素の調製
野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿入し、構築されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株に形質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩振とう培養し、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００μＭＰＱＱを含む７１のＬ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離（５０００×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、この菌体を０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。集菌した菌体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離（１００００×ｇ、１５分、４℃）で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠心分離（１６０５００×ｇ（４００００ｒ．ｐ．ｍ．）、９０分、４℃）し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以下の実施例において用いた。
【実施例３】酵素活性の測定
実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注し、３μｌの活性試薬（６ｍＭＤＣＩＰ４８μｌ，６００ｍＭＰＭＳ  ８μｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０  １６μｌ）および各濃度のＤ−グルコース溶液１０μｌを加え、酵素活性を測定した。
酵素活性の測定は、室温において、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
基質濃度対酵素活性のプロットから、Ｋｍを求めた。結果を表２に示す。
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【実施例４】基質特異性の評価
各改変型酵素の粗精製酵素標品について基質特異性を調べた。実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注し、３μｌの活性試薬（６ｍＭ  ＤＣＩＰ，６００ｍＭ  ＰＭＳ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を含む）および基質を加えた。基質として、それぞれ終濃度２０ｍＭまたは１００ｍＭとなるように４００ｍＭのグルコースまたは他の糖を加え、室温で３０分間インキュベートして、実施例３と同様に酵素活性を測定した。値はグルコースを基質としたときの活性を１００％とし、これに対する相対活性で表した。結果を表３−６に示す。
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また、二重変異を有する本発明の改変型酵素を用いて、酵素活性を測定した結果を表７−８に示す。本発明の改変型酵素はいずれも、マルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する高い反応性を示した。
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【実施例５】基質濃度依存性
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの活性の基質濃度依存性を調べた。各改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化し、各種濃度のグルコースおよび５μＭＰＱＱ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で酵素活性を測定した。方法は実施例３に記載の酵素活性の測定法に準じ、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度の変化を指標とした。結果を図３に示す。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型と比較して高いグルコース濃度において飽和する。また、いずれもグルコース濃度２００ｍＭまで基質阻害が見られず、Ｋｓｉは２００ｍＭ以上であった。
【実施例６】酵素の精製
実施例２で得られた野生型およびＧｌｎ１９２Ａｓｐ粗精製酵素をそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ蛋白質を得た。得られた精製酵素標品について、各基質に対する酵素活性を測定した。結果を表９−１０に示す。
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【実施例７】酵素センサーの作製および評価
５ユニットのＧｌｎ１９２Ａｌａ改変型酵素にカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
産業上の利用性
本発明の改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する選択性が高いため、血中グルコース測定用センサーの素子として有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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