(57)【要約】本発明は、生物の器官の組織を再生するためおよび疾患を治療するための組成物およびキットを提供する。この組成物は、細胞生理活性物質および細胞を、心臓への移入に適した形態で含む。このキットは、細胞生理活性物質、細胞および指示書を備える。本発明はまた、生物の器官の組織を再生するための方法および疾患を治療する方法を提供する。この方法は、細胞生理活性物質を提供する工程および細胞を提供する工程を包含する。本発明により、臓器移植および医療機器での補助システムを全く使用することなく、損傷した生物の器官の組織を再生することが可能になった。従って、本発明を利用することにより心筋梗塞のような疾患を治療することができる。
2003059375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の器官の組織を再生するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、該器官への移入に適した形態で含む、
組成物。
【請求項２】
前記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞生理活性物質は、造血活性またはコロニー刺激活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞生理活性物質は、細胞増殖活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞生理活性物質は、ＨＧＦである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞は、胚性幹細胞または組織幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞は、分化した細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞は、骨髄系の組織幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞は、骨髄由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記細胞は、自己由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記細胞生理活性物質は、タンパク質形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記細胞生理活性物質は、核酸形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記細胞生理活性物質は、ＨＶＪリポソームの形態で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
徐放性形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
さらに生体親和性材料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
シリコーン、コラーゲン、ゼラチンおよびグリコール酸・乳酸の共重合体からなる群より選択される少なくとも１つの生体親和性材料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記細胞生理活性物質は２種類以上の細胞生理活性物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
さらに他の薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記細胞は２種類以上の細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記器官は、虚血性病変を伴う器官である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記器宮は、心臓、脳、肺、膵臓、肝臓、四肢末梢および網膜からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記器官は、心臓である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記器官は、脳である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４１】
前記器官は、肺である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４２】
前記細胞は、ヒト由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記生物は、ヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４４】
生物の器官の疾患を治療するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、該器官への移入に適した形態で含む、
組成物。
【請求項４５】
生物の器官の組織を再生するためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
該細胞生理活性物質および該細胞の該器官への移植に関する指示書、
を備え、ここで、該指示書は、
該細胞生理活性物質を該細胞の該器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。
【請求項４６】
前記指示書は、前記細胞生理活性物質を前記細胞の前記器官への移植の前に投与することを指示する、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記指示書は、前記細胞生理活性物質および前記細胞を前記器官の傷害部位または虚血部位へと投与することを指示する、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
前記指示書は、前記器官が心臓であり、該心臓が心不全、心筋梗塞および心筋症から選択される状態であるときに、前記投与を指示する、請求項４５に記載のキット。
【請求項４９】
生物の器官の疾患を治療するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、上記器官への移入に適した形態で含む、
組成物。
【請求項５０】
生物の器官の疾患を治療するためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
上記細胞生理活性物質および上記細胞の上記器官への移植に関する指示書、
を備え、ここで、上記指示書は、
上記細胞生理活性物質を上記細胞の上記器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。
【請求項５１】
生物の器官の組織を再生するための方法であって、
細胞生理活性物質を該器官へ提供する工程；および
細胞を該器官へ提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
生物の器官の疾患を治療するための方法であって、
細胞生理活性物質を該器官へ提供する工程；および
細胞を該器官へ提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
生物の器官の組織を再生するための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用。
【請求項５４】
生物の器官の疾患を治療するための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本願発明は、細胞移植併用療法（「ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」）の分野に関する。より詳細には、細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）と細胞移植を組み合わせて用いて生物の臓器または器官（例えば、心臓、脳、肺など）の組織を再生させる方法および心疾患を治療する方法ならびにそれを実現するための組成物およびキットなどに関する。
背  景  技  術
再生医学を利用した疾患治療の発展には、近年目を見張るものがある。しかし、臓器移植を必要とする疾患に対して利用されるまでには至っていない。従って、そのような疾患の治療として、臓器移植のほか、医療機器での補助システムを利用することが現在行われている。しかし、これらの処置には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。
例えば、心臓外科の分野において、上記事情は同様である。心不全治療の医学的、外科的な処置においては近年目を見張る進展がある。しかし、末期心不全、特に虚血が原因のものは、世界的にも未だ主要な死因である。心臓移植（文献１）および医療機器での補助システム（ＬＶＡＳ）移植（文献２）は、これら患者を補助する究極の助命手段として充分に認知されている。しかし、これらの処置には、ドナー不足、拒絶、心臓移植に関する感染（文献３）、ＬＶＡＳの耐用年数のような制限がある。例えば、米国では年間約７万例の心臓移植対象者がいるが、移植例はここ数年間わずか２０００例にとどまっている。また、日本でも臓器移植法施行後、脳死者からの心臓移植が行われているが、２００２年１月の時点で通算して１４例にとどまっており、実用的な処置法にはほど遠い。
分子生物学の近年の進歩により、生物の器官を修復する試みがなされている。例えば、心臓機能損傷を回復するための新たなアプローチが提供されている（文献５）。しかし、この方法には、問題がいくつか残存している。細胞が移植されてもその部位に十分な生着をえるのは困難である。さらに、心筋細胞等が注射によって移植されても、心筋梗塞に陥った部位をこの細胞によっては再生することはできない。また、移植されたばらばらの細胞が細胞間接着を再構築し、心臓組織形態に変化するか不明である。
細胞を移植して組織を再生させる試みも行われている。例えば、心筋細胞またはその前駆細胞（組織幹細胞）に特定の遺伝子を導入して移植に適した細胞にする治療法の開発が試みられているが、いまだに実用レベルには達しておらず、移植した細胞が損傷を受けた心臓組織を再生させるまでには至らない。このような状況は、脳細胞、骨格筋細胞などでも同様であり、実用化には程遠い。
他方、細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）が注目されている。細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）は、免疫系、造血系、内分泌系、神経系などの生体の種々の高次機能を維持する上で重要な生理活性物質である。その多機能性を利用して、臨床応用が試みられている。例えば、貧血治療のためにエリスロポエチン（ＥＰＯ）が用いられている。しかし、本発明者らの知る限り、サイトカインのような細胞生理活性物質を再生医療に利用することに成功したという報告はなされていない。
心臓組織の再生についても、ＥＰＯ、インターロイキンのような細胞生理活性物質は、単独で心臓組織の再生に効果があるという報告はない。細胞生理活性物質が心臓再生に効果の可能性を記載する報告においても、完全な再生を達成したものはない。心臓再生を必要とする疾患または障害に本格的に利用することができるものは皆無である。
このように、従来の内科的、外科的治療により改善しない重症心不全に対する現在の治療方法は補助人工心臓と心移植であるが、現段階では前者はその耐久性に、後者はドナーの確保に問題があり、すべての症例に対する普遍的治療と言いがたいのが実情である。
これらの状況のもと、どのような臓器または器官でも適用可能な新たなコンセプトの代用療法への開発が試みられつつある。
（発明が解決しようとする課題）
従って、本発明は、心臓移植および医療機器での補助システムに代わる、全く新しい概念の新規の心疾患・心障害の治療システムの開発を課題とする。
発  明  の  要  旨
（課題を解決するための手段）
本発明は、細胞を心臓へ移植する際に、細胞生理活性物質（例えば、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなど）を投与することで、心臓組織の再生が促進されるという予想外の発見に基づいて開発された。
本発明の要旨は以下のとおりである。
本発明は、具体的には、以下を提供する。
１．生物の器官の組織を再生するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、上記器官への移入に適した形態で含む、
組成物。
２．上記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有する、項目１に記載の組成物。
３．上記細胞生理活性物質は、造血活性またはコロニー刺激活性を有する、項目１に記載の組成物。
４．上記細胞生理活性物質は、細胞増殖活性を有する、項目１に記載の組成物。
５．上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有する、項目１に記載の組成物。
６．上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用を有する、項目１に記載の組成物。
７．上記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、項目１に記載の組成物。
８．上記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、項目１に記載の組成物。
９．上記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
１０．上記細胞生理活性物質は、ＨＧＦである、項目１に記載の組成物。
１１．上記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦである、項目１に記載の組成物。
１２．上記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔである、項目１に記載の組成物。
１３．上記細胞は、胚性幹細胞または組織幹細胞である、項目１に記載の組成物。
１４．上記細胞は、分化した細胞である、項目１に記載の組成物。
１５．上記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞である、項目１に記載の組成物。
１６．上記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞である、項目１に記載の組成物。
１７．上記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞である、項目１に記載の組成物。
１８．上記細胞は、間葉系幹細胞である、項目１に記載の組成物。
１９．上記細胞は、骨髄系の組織幹細胞である、項目１に記載の組成物。
２０．上記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞である、項目１に記載の組成物。
２１．上記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
２２．上記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞である、項目１に記載の組成物。
２３．上記細胞は、骨髄由来である、項目１に記載の組成物。
２４．上記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞である、項目１に記載の組成物。
２５．上記細胞は、自己由来である、項目１に記載の組成物。
２６．上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態である、項目１に記載の組成物。
２７．上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態である、項目１に記載の組成物。
２８．上記細胞生理活性物質は、核酸形態である、項目１に記載の組成物。
２９．上記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在する、項目１に記載の組成物。
３０．上記細胞生理活性物質は、ＨＶＪリポソームの形態で存在する、項目１に記載の組成物。
３１．徐放性形態である、項目１に記載の組成物。
３２．さらに生体親和性材料を含む、項目１に記載の組成物。
３３．シリコーン、コラーゲン、ゼラチンおよびグリコール酸・乳酸の共重合体からなる群より選択される少なくとも１つの生体親和性材料を含む、項目１に記載の組成物。
３４．上記細胞生理活性物質は２種類以上の細胞生理活性物質である、項目１に記載の組成物。
３５．さらに他の薬剤を含む、項目１に記載の組成物。
３６．上記細胞は２種類以上の細胞を含む、項目１に記載の組成物。
３７．上記器官は、虚血性病変を伴う器官である、項目１に記載の組成物。
３８．上記器官は、心臓、脳、肺、膵臓、肝臓、四肢末梢および網膜からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
３９．上記器官は、心臓である、項目１に記載の組成物。
４０．上記器官は、脳である、項目１に記載の組成物。
４１．上記器官は、肺である、項目１に記載の組成物。
４２．上記細胞は、ヒト由来である、項目１に記載の組成物。
４３．上記生物は、ヒトである、項目１に記載の組成物。
４４．生物の器官の疾患を治療するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、上記器官への移入に適した形態で含む、
組成物。
４５．生物の器官の組織を再生するためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
上記細胞生理活性物質および上記細胞の上記器官への移植に関する指示書、
を備え、ここで、上記指示書は、
上記細胞生理活性物質を上記細胞の上記器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。
４６．上記指示書は、上記細胞生理活性物質を上記細胞の上記器官への移植の前に投与することを指示する、項目４５に記載のキット。
４７．上記指示書は、上記細胞生理活性物質および上記細胞を上記器官の傷害部位または虚血部位へと投与することを指示する、項目４５に記載のキット。
４８．上記指示書は、上記器官が心臓であり、上記心臓が心不全、心筋梗塞および心筋症から選択される状態であるときに、上記投与を指示する、項目４５に記載のキット。
別の実施形態では、本発明のキットは、上記項目２〜４４のいずれかの項目に記載された特徴を含む。
４９．生物の器官の疾患を治療するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、上記器官への移入に適した形態で含む、
組成物。
別の実施形態では、本発明の治療組成物は、上記項目２〜４４のいずれかの項目に記載された特徴を含む。
５０．生物の器官の疾患を治療するためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
上記細胞生理活性物質および上記細胞の上記器官への移植に関する指示書、
を備え、ここで、上記指示書は、
上記細胞生理活性物質を上記細胞の上記器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。
別の実施形態では、本発明の治療キットは、上記項目２〜４４および４６〜４８のいずれかの項目に記載された特徴を含む。
５１．生物の器官の組織を再生するための方法であって、
細胞生理活性物質を該器官へ提供する工程；および
細胞を該器官へ提供する工程、
を包含する、方法。
別の実施形態では、本発明の再生方法は、上記項目２〜４４および４６〜４８のいずれかの項目に記載された特徴を含む。
５２．生物の器官の疾患を治療するための方法であって、
細胞生理活性物質を該器官へ提供する工程；および
細胞を該器官へ提供する工程、
を包含する、方法。
別の実施形態では、本発明の治療方法は、上記項目２〜４４および４６〜４８のいずれかの項目に記載された特徴を含む。
５３．生物の器官の組織を再生するための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用。
別の実施形態では、本発明の再生のための使用は、上記項目２〜４４および４６〜４８のいずれかの項目に記載された特徴を含む。
５４．生物の器官の疾患を治療するための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用。
別の実施形態では、本発明の治療するための使用は、上記項目２〜４４および４６〜４８のいずれかの項目に記載された特徴を含む。
発  明  の  詳  細  な  説  明
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｄｅｓ」、「ｌｅ」、「ｌａ」、「ｌｅｓ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（用語の定義）
本明細書において使用される「併用療法」（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｈｅｒａｐｈｙ）とは、細胞移植と細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）の投与とを組み合わせた治療をいう。「組合せ（併用）」とは、同じ被検体（または患者）に両方の処置が何らかの形態で施されることをいい、両方の処置が同時に施される必要はないが、同時に両方の処置が行われてもよい。本明細書では、併用療法は、複合療法ともいい、両用語は同義で用いられる。
本明細書において用いられる「細胞生理活性物質」（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞に作用する物質を言う。細胞生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。細胞生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、細胞生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものである。本明細書では、細胞生理活性物質はタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。
本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。
サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
サイトカインおよび増殖因子などの細胞生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される細胞生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性を有してさえいれば、本発明の併用療法の好ましい実施形態において使用することができる。
本発明の併用療法では、どのような細胞生理活性物質も使用され得る。本発明の併用療法の１つの好ましい実施形態において、細胞生理活性物質として、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有するサイトカインまたは増殖因子が使用される。造血活性またはコロニー刺激活性を有するサイトカインとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）などが挙げられる。細胞増殖活性を有する増殖因子としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。本発明の１つの好ましい実施形態では、細胞増殖活性を有する細胞生理活性物質（例えば、サイトカインまたは増殖因子）が使用され得る。
サイトカインおよび増殖因子のような細胞生理活性物質はまた、そのレセプター（例えば、サイトカインレセプター）によって分類することもできる。サイトカインレセプターは、非キナーゼ型およびキナーゼ型に分類される。非キナーゼ型としては、Ｇタンパク質結合型レセプター、ＮＧＦ／ＴＮＦレセプターファミリー、ＩＦＮレセプターファミリー、サイトカインレセプタースーパーファミリーなどが挙げられる。キナーゼ型としては、増殖因子型レセプター（チロシンキナーゼ型、例えば、ＨＧＦの場合はｃ−ｍｅｔ）、ＴＧＦβレセプターファミリー（セリン・スレオニンキナーゼ型）などが挙げられる。本発明の併用療法の好ましい実施形態では、キナーゼ型（特に増殖因子型レセプターに結合する細胞生理活性物質（例えば、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦなど））が使用される。細胞生理活性物質は、場合により、レセプターサブユニットを共有することから、上記好ましいサイトカイン及び増殖因子とレセプターサブユニットを共有するサイトカイン及び増殖因子もまた、好ましいサイトカイン及び増殖因子であり得る。
サイトカインおよび増殖因子のような細胞生理活性物質はまた、タンパク質型または核酸型の場合、相同性比較により分類され得る。従って、本発明の好ましい実施形態として、本発明の好ましい細胞生理活性物質と相同性のある細胞生理活性物質が使用される。そのような相同性を有する細胞生理活性物質としては、例えば、Ｂｌａｓｔのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対照の細胞生理活性物質に対して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の相同性を有する細胞生理活性物質が挙げられる。
本発明の別の好ましい実施形態において、増殖因子は、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦである。最も好ましい実施形態では、サイトカイン及び増殖因子はＨＧＦであり得る。
ＨＧＦは分子量約８５０００のタンパク質であり、肝臓の一部を切ったラットの血液中から、肝細胞の増殖を促進する物質として分離された。１９８９年にこのタンパク質のアミノ酸配列が解明され、四つ葉のクローバーのような独特の分子構造を持つことが示された。ＨＧＦは細胞の増殖・遊走・形態形成を促して組織の再構築をもたらす活性を有しており、それゆえに様々な急性・慢性臓器疾患に対し強い発症阻止・治癒作用を示す。とりわけ肝硬変や慢性腎不全などの慢性疾患では線維化を促すＴＧＦ−βの過剰発現と相反して内因性ＨＧＦの発現低下が起こり、これが線維性疾患の発症につながる。これに対し、ＨＧＦは上皮細胞や内皮細胞の再生を促す一方でＴＧＦ−βの発現を抑制し、強い治癒・再生作用を示す。従って、血管新生作用および／または抗線維化作用を有する他のサイトカイン及び増殖因子もまた、本発明の併用療法の好ましい実施形態において使用され得る。
近年ＨＧＦは、血管新生作用を有し（文献８および９）、抗線維化作用を有する（文献１０）ことが明らかになった。このＨＧＦは、オートクライン様作用（文献１０）およびパラクライン様作用（文献１１）を有する。さらに、ＨＧＦは、細胞間相互作用および細胞と細胞外マトリクスとの間の相互作用を増強する（文献１２）。この相互作用は、β１インテグリン、ラミニンおよびフィブロネクチンの調節により制禦される（文献１２）。従って、血管新生作用および／または抗線維化作用を有する他のサイトカイン及び増殖因子もまた、本発明の併用療法の好ましい実施形態において使用され得る。
本明細書において用いられる「血管新生作用（活性）」とは、ある因子が標的に作用したとき、その標的において血管を新たに形成する能力をいう。血管新生作用を測定する方法としては、代表的には、コントラスト剤を用いた超音波測定、血管に特異的な遺伝子産物に対する抗体を用いた血管数計数などが挙げられる。本明細書において、増殖因子が血管新生作用を有するか否かは、第ＶＩＩＩ因子関連抗原等で免疫組織化学染色した後に血管数を計数することによって判定される。この計数方法では、検体を１０％の緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、各々の検体から数個の連続切片を調製し、凍結する。次いで、凍結切片をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド溶液で５分間、室温にて固定し、３％過酸化水素を含むメタノール中に１５分間浸漬し、次いでＰＢＳで洗浄する。このサンプルをウシ血清アルブミン溶液で約１０分間覆って、非特異的反応をブロックする。検体を、ＨＲＰと結合する、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対するＥＰＯＳ結合体化抗体と共に一晩インキュベートする。サンプルをＰＢＳで洗浄した後、これらを、ジアミノベンジジン溶液（例えば、ＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン）中に浸漬して、陽性染色を得る。染色された血管内皮細胞を、例えば、２００倍の倍率の光学顕微鏡下で計数し、例えば、計数結果を、１平方ミリメートルあたりの血管の数としてあらわす。特定のサイトカイン及び増殖因子の処置後、血管数が統計学的に有意に増加しているか否かを判定することにより、血管新生活性を判定することができる。
本明細書において用いられる「抗線維化作用」とは、ある因子が標的に作用したとき、その標的における線維症を抑制する能力をいう。抗線維化作用は、マッソントリクローム染色法により判定することができる。
マッソントリクローム染色法は以下のとおりである：マッソントリクローム染色では、鉄ヘマトキシリンで核が染められ、その後に拡散速度の大きい小色素分子（酸フクシン、ポンソーキシリジン）が細胞の細網孔へ浸透し、次いで拡散速度の小さい大色素分子（アニリン青）が膠原線維の粗構造に入り込み青色に染め出す。
マッソントリクローム染色で使用される試薬
Ａ）媒染剤
１０％トリクロル酢酸水溶液          １容
１０％重クロム酸カリウム水溶液      １容
Ｂ）ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液（使用時に１液と２液を等量混合）
１液
ヘマトキシリン                  １ｇ
１００％エタノール        １００ｍｌ
２液
塩化第二鉄                  ２．０ｇ
塩酸（２５％）                １ｍｌ
蒸留水                      ９５ｍｌ
Ｃ）１％塩酸７０％アルコール
Ｄ）Ｉ液
１％ビーブリッヒスカーレット    ９０ｍｌ
１％酸性フクシン                １０ｍｌ
酢酸                              １ｍｌ
Ｅ）ＩＩ液
リンモリブデン酸                    ５ｇ
リンタングステン酸                  ５ｇ
蒸留水                        ２００ｍｌ
Ｆ）ＩＩＩ液
アニリン青                      ２．５ｇ
酢酸                              ２ｍｌ
蒸留水                        １００ｍｌ
Ｇ）１％酢酸水
マッソントリクローム染色法の手順
１．脱パラ、水洗、蒸留水
２．媒染（１０〜１５分）
３．水洗（５分）
４．ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液（５分）
５．軽く水洗
６．１％塩酸７０％アルコールで分別
７．色出し、水洗（１０分）
８．蒸留水
９．Ｉ液（２〜５分）
１０．軽く水洗
１１．ＩＩ液（３０分以上）
１２．軽く水洗
１３．ＩＩＩ液（５分）
１４．軽く水洗
１５．１％酢酸水（５分）
１６．水洗（すばやく）
１７．脱水、透徹、封入
マッソントリクローム染色法では、膠原線維、細網線維、糸球体基底膜は、鮮やかな青に染まり、核は黒紫色に染まり、細胞質は淡赤色に染まり、赤血球は橙黄色〜深紅色に染まり、粘液は青色に染まり、細胞分泌顆粒は好塩基性が青に好酸性が赤に染まり、線維素は赤に染まる。従って、青く染まった面積を線維化した部位として算出することができる。本明細書において、特定のサイトカイン及び増殖因子の処置後、線維症化した面積が統計学的に有意に減少しているか否かを判定することにより、抗線維化作用を判定することができる。
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の併用療法においては、どのような細胞も使用され得る。本発明で使用される「細胞」は移植に適した形態で提供されることが好ましく、本明細書においてそのような細胞を「移植細胞」ともいう。
本発明において、細胞は、幹細胞または分化した細胞であり得る。「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能を有し、組織が傷害を受けたときに再生することができる細胞をいう。本発明において使用される幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある（文献２７）。従って、本発明の１つの好ましい実施形態では、細胞として胚性幹細胞が使用され得る。本発明の併用療法において胚性幹細胞が使用されるときは、予め心筋細胞へ分化させてから使用することもできる。心筋細胞への分化は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）で処理することによって誘導することができる。
組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。従って、本発明の１つの好ましい実施形態において、細胞として心臓組織へと方向付けられた組織幹細胞が使用され得る。
組織幹細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の組織幹細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞が含まれる。中胚葉由来の組織幹細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞が含まれる。内胚葉由来の組織幹細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、中胚葉由来の幹細胞が使用され得る。本発明のより好ましい実施形態では、間葉系幹細胞が使用され得る。
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。心臓組織を構成する心筋細胞は間葉系幹細胞に由来することから、本発明の併用療法の１つの実施形態では、骨髄系の組織幹細胞が使用され得、本発明の併用療法の１つの好ましい実施形態では、間葉系幹細胞が好ましく使用され得る。
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本発明の１つの実施形態において、骨髄に由来する細胞（例えば、骨芽細胞）が使用され得る。本発明の好ましい実施形態においては、心筋細胞、骨格筋芽細胞、骨芽細胞のような間葉系幹細胞に由来する細胞が使用され得る。本発明のより好ましい実施形態では、心筋細胞が使用され得る。心筋細胞は、初代細胞でも、幹細胞などから分化誘導させた細胞でもよい。
本明細書において用いられる心筋原細胞は、幹細胞を５−アザシチジンで処理することにより作製することができる。心筋原細胞を得るためには以下のような処置を行うことができる。例えば、ラットなどの被検体から大腿骨の骨髄初代培養を作成し、５−アザシチジンで分化誘導する。分化誘導した細胞から自己拍動能を有する細胞をスクリーニングして心筋原細胞を得ることができる。
本発明の併用療法で使用される細胞は、同系由来（自己（自家）由来）でも、同種異系由来（他個体（他家）由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合同種異系由来であってもよい。
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）でもよい。好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。
本発明が対象とする組織は、生物のどの臓器または器官でもよい。本明細書において臓器または器官とは、互換的に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする器官は、虚血性または糖尿病性の器官（脳虚血、虚血性の脳梗塞を患った脳、心筋梗塞を起こした心臓、虚血を起こした骨格筋など）が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする器官は、心臓、脳、肺、膵臓、肝臓、四肢末梢、網膜などが挙げられる。１つの好ましい実施形態では、本発明が対象とする器官は、心臓である。
本発明が対象とする組織および使用する細胞の組合せとしては、例えば、心疾患（例えば、虚血性心疾患）を起こした心臓への心筋細胞の投与、脳虚血または脳梗塞を起こした脳への神経細胞、神経細胞へ分化可能な細胞または神経前駆細胞の投与、心筋梗塞、骨格筋虚血部位への血管内皮細胞または血管内皮細胞に分化可能な細胞の投与が挙げられる。
本発明が対象とする組織は、どのような種類の生物由来であり得る。本発明が対象とする生物としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）である。より好ましくは、本発明が対象とする生物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。
本発明の併用療法において、細胞生理活性物質（サイトカイン、増殖因子など）はどのような形態でも送達され得る。従って、細胞生理活性物質は、タンパク質形態でも核酸形態でもよく、最終的に機能する細胞生理活性物質（サイトカインおよび増殖因子の場合はタンパク質形態）が標的に送達される限り、他の形態も可能である。本発明の併用療法ではまた、細胞生理活性物質はどのような経路でも送達され得る。細胞生理活性物質が機能するとは、細胞生理活性物質の少なくとも１つの上述した機能（例えば、細胞増殖活性、血管新生作用、抗線維化作用など）を少なくとも一つ発揮することをいう。
タンパク質形態の場合、直接または間接的に送達され得る。直接投与する場合は、タンパク質形態の細胞生理活性物質を直接処置部位に投与し得る。間接的に送達する場合は、目的とするタンパク質形態の細胞生理活性物質が最終的に処置部位に送達される、当該分野において公知の任意の方法を使用することができる。そのような方法としては、注射により注入を用いる投与方法が挙げられる。
本発明の併用療法において、細胞生理活性物質の投与は、細胞移植と同時でもよく、細胞生理活性物質投与が細胞移植前でも細胞生理活性物質が細胞移植後でもよい。細胞生理活性物質が細胞移植より前であることが好ましい。
本明細書において「再生」とは、損傷した組織が元通りに回復することをいい、病理的再生ともいう。生物の体は一生の間に外傷や病気によって臓器の一部を失ったり、大きな傷害を受けたりする。その場合、損傷した臓器が再生できるか否かは、臓器によって（または動物種によって）異なる。自然には再生できない臓器（または組織）を再生させ、機能を回復させようというのが再生医学である。組織が再生したかどうかは、その機能が改善したかにどうかによって判定することができる。哺乳動物は、組織・器官を再生する力をある程度備えている（例えば、皮膚および肝臓の再生）。しかし、心臓を含むほとんどの器官は、一旦損傷すると、哺乳動物はほとんど再生させることができない。従って、例えば、心臓組織が損傷した場合、従来は心臓移植による処置しか有効な措置がなかった。本発明は、心臓などの臓器の組織を「再生させる」画期的な方法を提供するという有用性および格別の効果を提供する。
本明細書において「器官への移入に適した」とは、器官（例えば、心臓）に細胞を移植をするために適切な任意の形態をいう。そのような形態は当該分野において公知であり、そのような方法としては、例えば、注射器を使用して細胞を注入する方法が挙げられる。当業者は、例えば、日本薬局方、米国薬局方などを参照して容易にその形態を調製することができる。細胞生理活性物質の「心臓への移入に適した」としては、例えば、リポソーム形態が挙げられる。
本発明の併用療法が対象とする「疾患」は、組織に傷害がある任意の心疾患であり得る。そのような心疾患としては、心不全、心筋梗塞、心筋症などが挙げられる。本発明の併用療法は、組織傷害の再生を目的とする限り、心臓以外の臓器の傷害を再生するためにも適用され得る。
「心不全」とは、心機能不全、循環機能不全、収縮力減退など心臓自体に障害があって、全身の臓器へ必要な量および質の血液を循環し得なくなった状態をいう。心不全は、心筋梗塞、心筋症などの心臓疾患の末期の症状である。重症心不全とは、その程度が重症であるものをいい、末期心不全ともいう。
「心筋梗塞」とは、冠状動脈の種々の病変による高度狭窄、閉塞によってその灌流領域に虚血性壊死が生じる疾患である。心筋梗塞の重傷度判定には、種々の分類がある。そのような分類としては、例えば、時間的経過による分類、形態学的分類（心筋層内範囲、部位、壊死の大きさなど）、心筋の壊死形態、梗塞後の心室再構築、血行動態的分類（治療、予後などに関連する）、臨床的重症度による分類などが挙げられる。ここで重症度が高いものを特に重症心筋梗塞という。
「心筋症」とは、心筋の器質的および機能的な異常に起因する疾患の総称であり、高血圧、代謝異常症、虚血などの基礎疾患に続発する二次性心筋症、および見かけ上の基礎疾患なしに発症する突発性心筋症に分類される。病理的変化としては、心筋肥大、線維化、変性などが認められる。
（発明を実施する最良の形態）
本発明は、１つの局面において、生物の器官の組織を再生するための組成物を提供する。この組成物は、細胞生理活性物質および細胞を、器官への移入に適した形態で含む。
別の局面において、本発明は、生物の器官の疾患を治療するための組成物を提供する。この組成物は、細胞生理活性物質および細胞を、上記器官への移入に適した形態で含む。
別の局面において、本発明は、生物の器官の組織を再生するためのキットを提供する。このキットは、細胞生理活性物質；細胞；ならびに上記細胞生理活性物質および上記細胞の生物の器官への移植に関する指示書を備える。ここで、上記指示書は、上記細胞生理活性物質を上記細胞の生物の器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
別の局面において、本発明は、生物の器官の疾患を治療するためのキットを提供する。このキットは、細胞生理活性物質；細胞；ならびに上記細胞生理活性物質および上記細胞の上記器官への移植に関する指示書、を備える。、ここで、上記指示書は、上記細胞生理活性物質を上記細胞の上記器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する。
本発明の組成物およびキットは、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
１つの実施形態において、上記細胞生理活性物質は、サイトカインまたは増殖因子であり得る。１つの実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有し得る。別の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性またはコロニー刺激活性を有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、細胞増殖活性を有し得る。
別の好ましい実施形態において、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の両方を有し得る。
他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔであり得る。
他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択され得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、ＨＧＦであり得る。他の好ましい実施形態では上記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦであり得る。
本発明で用いる細胞生理活性物質は、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなどを含め、公知の物質であり、医薬として使用することができる程度に精製された物であれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。市販されている細胞生理活性物質製剤を使用してもよい（例えば、東洋紡Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１（ＨＧＦ）など）。
タンパク質形態の細胞生理活性物質を製造する方法としては、例えば、その細胞生理活性物質を産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりその細胞生理活性物質を得ることができる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、その細胞生理活性物質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清から組換え細胞生理活性物質を得ることができる（例えば、文献３１、文献３２）。上記宿主細胞は、機能性細胞生理活性物質を発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られた細胞生理活性物質は、天然型の細胞生理活性物質と実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（文献３３）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。文献３４（米国特許第４、５５４、１０１号）に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中において、機能的に等価なペプチドフルクトース化合物を作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
用語「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。
本明細書において使用される細胞生理活性物質の核酸形態は、その細胞生理活性物質のタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現される細胞生理活性物質が天然型の細胞生理活性物質と実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、細胞生理活性物質をコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その細胞生理活性物質と実質的に同一の機能を有する細胞生理活性物質をコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
別の実施形態では、本発明で使用される細胞生理活性物質は、合成された物質である。
他の実施形態において、上記細胞は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞または組織幹細胞）または分化した細胞であり得る。
別の実施形態において、上記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞であり得る。好ましくは、上記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞であり得る。より好ましくは、上記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞であり得る。さらに好ましくは、上記細胞は、間葉系幹細胞であり得る。他の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄系の組織幹細胞であり得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞であり得る。
他の好ましい実施形態において、上記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択され得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄由来であり得る。
他の実施形態において、上記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞であり得る。
他の実施形態において、上記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞であり得る。同系由来が好ましい。同種異系由来の場合は、拒絶反応を起こさない系統のものが好ましいが、拒絶反応を起こすものも必要に応じて拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。異種由来の細胞もまた、拒絶反応が問題にならない場合または必要に応じて拒絶反応を解消する処置を講じる場合に使用され得る。
本発明の併用療法において、上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態であり得る。核酸形態の場合、上記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在し得る。核酸形態の場合はまた、上記細胞生理活性物質は、ＨＶＪ−リポソームの形態で存在し得る。
本発明の組成物またはキットは、生物の器官への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。ＨＶＪ−リポソームのようなリポソーム形態の場合には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤のようなリポソーム製剤に必要な試薬を加えることができる。リポソームは、非経口的に投与することが好ましい。従って、リポソームを投与する場合には、非侵襲的なカテーテルまたは非侵襲的な注射器などによる投与方法を用いることができる。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法としては、例えば、心室内腔により心筋内に直接本発明の組成物を注入することが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明の組成物またはキットは、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
徐放性形態の場合、徐放性製剤（ミニペレット製剤など）を投与部位付近に埋め込むこともできる。または、徐放性製剤は、オスモチックポンプなどを用いて投与部位に連続的に徐々に投与することもできる。
本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
核酸形態の細胞生理活性物質を投与する場合、その細胞生理活性物質は、非ウイルスベクター形態またはウイルスベクター形態による投与、またはｎａｋｅｄ  ＤＮＡでの直接投与の形態などで投与され得る。このような投与形態は、当該分野において周知であり、例えば、文献２８、文献２９などに詳説されている。
非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などが利用され得る。発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ（文献３５）、ｐＢＪ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどから入手可能である）などが挙げられる。
ＨＶＪ−リポソーム法は、脂質二重膜で作製されたリポソーム中に核酸分子を封入し、このリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、ＨＶＪ）とを融合させることを包含する。このＨＶＪ−リポソーム法は、従来のリポソーム法よりも、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする。ＨＶＪ−リポソーム調製法は、文献２８、文献２９および下記実施例に詳述されている。ＨＶＪとしては、任意の株が利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５など）、Ｚ株が好ましい。
ウイルスベクター形態の場合、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターが利用される。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、核酸形態の細胞生理活性物質を導入し、細胞にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞内に遺伝子を導入することができる。これらウイルスベクターでは、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターによる効率よりも遙かに高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ法の場合、上述の非ウイルスベクターである発現プラスミドを生理食塩水などに溶解し、そのまま投与する。例えば、文献３０に記載される方法により、生物の器官の組織などに直接注入することができる。
本発明では、細胞生理活性物質は２種類以上の細胞生理活性物質であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質が使用される場合、類似の機能を発揮する細胞生理活性物質が組み合わされてもよく、異なる機能を有する細胞生理活性物質が補完的に組み合わされてもよい。
本発明の組成物またはキットは、さらに他の薬剤を含み得る。そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤であり得る。当然、本発明の組成物またはキットは、２種類以上の他の薬剤を含んでいてもよい。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などの最新版において掲載されているものなどが挙げられる。そのような薬剤は、好ましくは、生物の器官に対して効果を有するものであり得る。そのような薬剤としては、例えば、血栓溶解剤、血管拡張剤、組織賦活化剤が挙げられる。
他の実施形態において、上記細胞は２種類以上の細胞を含み得る。２種類以上の細胞を使用する場合、類似の性質または由来の細胞を使用してもよく、異なる性質または由来の細胞を使用してもよい。
本発明の組成物およびキットにおいて含まれる細胞生理活性物質および細胞の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
従って、本発明の組成物およびキットにおいて含まれる細胞生理活性物質の量は、例えば、タンパク質の場合、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５μｇ〜約１００ｍｇであり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約１ｍｇの間の任意の数値であり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の上限は、例えば、約１０００ｍｇ、約９００ｍｇ、約８００ｍｇ、約７００ｍｇ、約６００ｍｇ、約５００ｍｇ、約４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、約７５ｍｇ、約５０ｍｇ、約２５ｍｇ、約１０ｍｇ、約５ｍｇなど、約１０００ｍｇ〜約１ｍｇの任意の数値であり得る。核酸の場合、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは約５μｇ〜約４００μｇであり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約２０μｇの間の任意の数値であり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の上限は、例えば、約１０ｍｇ、約９ｍｇ、約８ｍｇ、約７ｍｇ、約６ｍｇ、約５ｍｇ、約４ｍｇ、約３ｍｇ、約２ｍｇ、約１ｍｇ、約７５０μｇ、約５００μｇ、約２５０μｇ、約１００μｇなど、約１０ｍｇ〜約１０μｇの任意の数値であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質が含まれる場合も、上記の量が個々に適用される。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターとして投与される場合は、通常、０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。投与頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。
本発明の組成物およびキットにおいて含まれる細胞の量は、例えば、約１×１０３細胞〜約１×１０１１細胞、好ましくは約１×１０４細胞〜約１×１０１０細胞、より好ましくは約１×１０５細胞〜約１×１０９細胞などであり得る。これらの細胞は、例えば、約０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌの生理食塩水のような溶液として存在し得る。細胞の量の範囲の上限としては、例えば、約１×１０１１細胞、約５×１０１０細胞、約２×１０１０細胞、約１×１０１０細胞、約５×１０９細胞、約２×１０９細胞、約１×１０９細胞、約５×１０８細胞、約２×１０８細胞、約１×１０８細胞、約５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約１×１０７細胞などが挙げられる。細胞の量の下限としては、例えば、約１×１０３細胞、約２×１０３細胞、約５×１０３細胞、約１×１０４細胞、約２×１０４細胞、約５×１０４細胞、約１×１０５細胞、約２×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞などが挙げられる。
組成物およびキットの処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方、などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべき細胞生理活性物質および細胞量を決定することができる。
１つの実施形態において、本発明のキットに備えられる指示書には、上記細胞生理活性物質を上記細胞の生物の器官への移植の前に投与することを指示する文言が記載され得る。細胞生理活性物質を事前に投与することにより、損傷部位およびその周辺部位が組織再生により適した状況となるからである。
別の実施形態において、上記指示書には、上記細胞生理活性物質および上記細胞を生物の器官の傷害部位または心虚血部位へと投与することを指示する文言が記載され得る。
別の実施形態において、上記指示書には、上記生物の器官が心不全、心筋梗塞および心筋症から選択される状態であるときに、上記投与を指示する文言が記載され得る。
他の局面において、本発明は、生物の器官の組織を再生するための方法を提供する。この方法は、細胞生理活性物質を生物の器官へ提供する工程；および細胞を生物の器官へ提供する工程、を包含する。
他のさらなる局面において、本発明は、心疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、細胞生理活性物質を生物の器官へ提供する工程；および細胞を生物の器官へ提供する工程、を包含する。
本発明の方法の１つの実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有し得る。別の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性またはコロニー刺激活性を有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、細胞増殖活性を有し得る。
別の好ましい実施形態において、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の両方を有し得る。
他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔである細胞生理活性物質であり得る。
他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択され得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、ＨＧＦであり得る。他の好ましい実施形態では上記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦであり得る。
他の実施形態において、上記細胞は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞または組織幹細胞）または分化した細胞であり得る。
別の実施形態において、上記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞であり得る。好ましくは、上記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞であり得る。より好ましくは、上記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞であり得る。さらに好ましくは、上記細胞は、間葉系幹細胞であり得る。他の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄系の組織幹細胞であり得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞であり得る。
他の好ましい実施形態において、上記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択され得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄由来であり得る。
他の実施形態において、上記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞であり得る。
他の実施形態において、上記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞であり得る。同系由来が好ましい。同種異系由来の場合は、拒絶反応を起こさない系統のものが好ましいが、起こすものも必要に応じて拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。異種由来の細胞もまた、拒絶反応が問題にならない場合または必要に応じて拒絶反応を解消する処置を講じる場合に使用され得る。従って、本発明の方法の好ましい実施形態では、本発明の方法は、拒絶反応を回避する工程をさらに包含する。拒絶反応を回避する手順は当該分野において公知であり、例えば、文献３６に記載されている。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられる。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」（サンディミュン／ネオーラル）、「タクロリムス」（プログラフ）、「アザチオプリン」（イムラン）、「ステロイドホルモン」（プレドニン、メチルプレドニン）、「Ｔ細胞抗体」（ＯＫＴ３、ＡＴＧなど）があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われている方法は、「シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモン」の３剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の併用療法と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしもひつようではない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の併用療法の前または後にも投与され得る。
本発明の方法において、上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態であり得る。核酸形態の場合、上記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在し得る。核酸形態の場合はまた、上記細胞生理活性物質は、ＨＶＪリポソームの形態で存在し得る。
１つの実施形態において、本発明の方法では、細胞生理活性物質および／または細胞は、徐放性形態で提供され得る。本発明の生物の器官の組織を再生するための方法で使用される組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチンおよびグリコール酸・乳酸の共重合体からなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。
本発明の方法で使用される細胞生理活性物質は、２種類以上の細胞生理活性物質であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質が使用される場合、類似の機能を発揮する細胞生理活性物質が組み合わされてもよく、異なる機能を有する細胞生理活性物質が補完的に組み合わされてもよい。これらの細胞生理活性物質は、同時に投与されても別の時期に投与されてもよい。
本発明の方法では、他の薬剤でのさらなる処置が施され得る。そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤であり得る。そのような薬剤は、２種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方の最新版において掲載されているものなどが挙げられる。そのような薬剤は、好ましくは、生物の器官のに対して効果を有するものであり得る。
他の実施形態において、上記細胞は２種類以上の細胞を含み得る。２種類以上の細胞を使用する場合、類似の性質または由来の細胞を使用してもよく、異なる性質または由来の細胞を使用してもよい。
本発明において使用される細胞は、どのような生物に由来する細胞でもよい。１つの実施形態では、脊椎動物から得られた細胞であり得る。別の実施形態では、上記細胞は、哺乳動物の細胞である。好ましい実施形態では、上記細胞は霊長類の細胞であり、最も好ましくは、ヒト細胞である。
本発明では、上記生物は、どのような生物でもよい。１つの実施形態では、上記生物は、脊椎動物である。別の実施形態では、上記生物は、哺乳動物である。好ましい実施形態では、上記生物は霊長類であり、最も好ましい実施形態では、上記生物はヒトである。
本発明では、上記器官はどのような器官でもよい。１つの実施形態では、上記器官は、虚血性病変を伴う器官であり得る。別の実施形態では、上記器官は、心臓、脳、肺、膵臓、肝臓、四肢末梢および網膜からなる群より選択される。好ましくは、上記器官は、心臓であり得る。別の好ましい実施形態では、上記器官は、脳である。他の好ましい実施形態では、上記器官は、肺である。
本発明の方法において使用される細胞生理活性物質および細胞の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
好ましい実施形態では、上記細胞生理活性物質の提供工程は、上記細胞を生物の器官のへ提供する工程の前に行われ得る。細胞生理活性物質を事前に投与することにより、損傷部位およびその周辺部位が組織再生により適した状況となるからである。
好ましい実施形態では、上記細胞生理活性物質および上記細胞は、生物の器官のの傷害部位または心虚血部位へと投与され得る。
１つの実施形態において、上記器官は心臓であり、この心臓は心不全、心筋梗塞および心筋症から選択される状態であり得る。
このように、本発明により生物の器官の移植および医療機器での補助システムを全くまたはほとんど使用することなく、損傷した生物の器官の組織を再生することが可能になった。これは、生物の器官の移植以外には実質的に根本的な治癒が期待できなかった重症心不全、重症心筋梗塞、心筋症などの患者に対して、新規な救済処置を提供することになった。従って、このような効果は、従来技術にはない格別な効果であるといえ、その有用性は筆舌に尽くしがたい。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
実  施  例
（実施例１：ＨＧＦと心筋細胞移植との併用療法）
本実施例では、例示として、ＨＧＦと心筋細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
４４匹の雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いた。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。
急性心筋梗塞を文献１３に記載されるように誘導した。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮した。
心筋の単離および培養
心筋細胞を、文献１４に記載されるように新生Ｌｅｗｉｓ系統ラットから単離した。簡潔には、生後１−２日後の新生仔Ｌｅｗｉｓラットより心筋細胞を単離した。新生仔ラットを犠死させ、すばやく心臓を摘出し、ＰＢＳにて数回洗浄した。摘出心を砕片し、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ｔｒｙｐｓｉｎ存在下に、３７℃、３０分間静置し、数回ピペッティングを行った。溶解した心臓をメッシュに通し、１０ｍｌの１０％ＤＭＥＭを添加した。この溶液を１０００回転５分間遠心し、沈殿物を１０％ＤＭＥＭに溶解し、１時間３７℃にてｐｒｅｐｌａｔｉｎｇを行い、心筋細胞を純化した。
心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を、ｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（文献１５）中に入れた。
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は文献１６の記載に従っておこなった。以下に簡潔に示す。ＤＮＡ溶液２００μｌを加え、３０秒間振盪し、３７度恒温槽に３０秒間静置する。これを８回繰り返す。５秒間超音波処理をし、３０秒間振盪する。０．３ｍｌのＢＳＳを加え、３７度恒温槽で振盪する。不活化したＨＶＪを加え、氷上で１０分間置く。３７度恒温槽にて１時間振盪する。超遠心チューブに６０％と３０％のショ糖溶液をそれぞれ１ｍｌ、６ｍｌで重層し、ＨＶＪリポソーム液をのせ、ＢＳＳをチューブの付近まで加える。６２，８００ｇ、４度で１．５時間超遠心する。３０％ショ糖溶液層のすぐ上を回収し、４度に保存し、遺伝子導入に用いた。
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、ｈＨＧＦ  ｃＤＮＡのがんｙベクターを梗塞を起こした心筋にトランスフェクトした。心臓組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（文献１７）。完結には抗原をＰＢＳにて１μｇに調製し、ＥＬＩＳＡ用の９６穴プレートに５０ｎｇ（５０μｌ）ずつ加え、ＰＢＳで２−３回水洗した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μｌ／ｗｅｌｌ加え室温で２時間放置する。一次抗体を加える。室温１時間放置した後、２次抗体を加え、室温で１時間放置する。反応を止めたのち、４０５ｎｍの求光度で定量する。
心筋細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。Ｔ群（新生ラット心筋細胞懸濁物（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ、ｎ＝１１）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体投与、ｎ＝１０）；Ｔ−Ｈ群（新生ラット心筋細胞懸濁物と、ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体同時投与、ｎ＝１０）；Ｃ群（培養培地単独、ｎ＝１３）。これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いて左前下降枝結紮２週後に梗塞部位に移植した。
ラット心臓の心機能の測定
梗塞モデル作成２週後、移植後４週、８週後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて心機能を測定した。１２−ＭＨｚのｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。Ｂ−ｍｏｄｅにて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍ−ｍｏｄｅにて、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳを算出した。
ＬＶＥＦ（％）＝（（ＬＶＤｄ３−ＬＶＤｓ３）／ＬＶＤｄ３）×１００
ＬＶ％ＦＳ    ＝（（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ）×１００
心筋コントラスト剤での心エコー検査
ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、陽圧呼吸を行った後、２１Ｆｒのカテーテルを、右の大腿静脈に挿入し、コントラスト剤Ｌｅｖｏｂｉｓｔ（日本、大阪、日本シェーリング（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を注入した。ＳＯＮＯＳ５５００を用いて、左室短軸像を描出し、評価を行った。
１．  画像面の深さ、パワー、ゲイン、リジェクションおよび周波数設定を実験のはじめに最適化し、そして実験中は変更しなかった。コントラスト剤の注射前およびその間に撮った画像はすべて、ビデオ記録して後に分析した。文献１９を参考にして、梗塞部位及び非梗塞領域の局所血流を、評価した。
右大腿静脈に挿入したカテーテルより約０．３ｍｌ／ｋｇのコントラスト剤を注入した。収縮末期の像をコンピュータに保存し、この収縮末期像より、各領域の時間強度曲線を作成した。時間強度曲線が山型のピークを示した時、灌流良好と判定した。他方、平坦な時間強度曲線を示した場合、灌流不良と判定した。
組織学的分析
心筋細胞移植後、８Ｗ後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行った。切片を作成し、ヘマトキシリン−エオジン染色、マッソン−トリクローム染色を行った。また同時期の凍結切片を作成し、ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩ免疫染色、各種接着蛋白（インテグリン、ラミニン、α−ジストログリカン、β１−ジストログリカン）免疫染色を行った。
血管数を定量化するため、第ＶＩＩＩ因子関連抗原の免疫組織化学染色を行った。凍結切片をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド溶液で５分間、室温にて固定し、３％過酸化水素を含むメタノール中に１５分間浸漬し、次いでＰＢＳで洗浄した。このサンプルをウシ血清アルブミン溶液（デンマーク、ＤＡＫＯ  ＬＳＡＢ  Ｋｉｔ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）で１０分間覆って、非特異的反応をブロックした。標本を、ＨＲＰと結合した、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対するＥＰＯＳ結合体化抗体（ＤＡＫＯ  ＥＰＯ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅ  ｂｒａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ／ＨＲＰ、デンマーク、ＤＡＫＯ）と共に一晩浸透した。サンプルをＰＢＳで洗浄した後、これらを、ジアミノベンジジン溶液（ＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン）中に浸透した。染色された血管内皮細胞を、２００倍の倍率の光学顕微鏡下で計数した。計数結果を、１平方ミリメートルあたりの血管の数としてあらわした。
いくつかの接着蛋白の免疫染色を行うため、以下の抗体を用いた。一次抗体、ラミニンに対するウサギポリクローナル抗体（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）、β１−インテグリンに対するハムスターモノクローナル抗体（住友電気工業株式会社（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、日本、大阪）、α−ジストログリカン（ａｌｐｈａ−Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ  １２９４６）およびβ−ジストログリカンに対するマウスモノクローナル抗体（ＣＡＳＴＲＡ  ＮＯＶＯ，ＵＫ）；二次抗体、ビオチン化抗ウサギ免疫グロブリン（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ビオチン化抗ハムスター免疫グロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）およびビオチン化抗マウス免疫グロブリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）。
データ分析
データを、平均±標準偏差として表した。群間の差の有意性を評価するために、独立ｔ検定によって統計学的評価を行った。有意なＦ比が得られた場合、２因子反復測定分散分析を用いて評価した。０．０５未満のｐ値を有する場合、統計学的有意差があると決定した。
（結果）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの心臓のヒトＨＧＦ遺伝子導入
ヒトＨＧＦを心臓に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された心臓のＨＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定した。ヒトＨＧＦ遺伝子を遺伝子導入した心臓において、遺伝子導入後３日目に７±１．２ｎｇ／ｇのヒトＨＧＦタンパク質を検出した。一方、ヒトＨＧＦ遺伝子を含まないリポソームを注入した群においては、ヒトＨＧＦタンパクを検出しなかった（図１）。
心機能評価
術前における駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期断面積および左室前壁厚は、４つの群の間で有意差を認めなかった。
注射の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群における駆出率（図２）および左室短縮率（図３）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示した。これらの機能改善は、移植後８週間まで維持された。左室収縮末期断面積は、移植の４週後および８週後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に縮小した（図４）。移植の４週後、左室前壁は、Ｔ−Ｈ群では有意に増加した。そしてこの壁厚は、移植後８週まで維持された（図５）。
組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、左室前壁厚の有意な増加および左室断面積の有意な減少を示した。Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、移植心筋細胞は、梗塞巣に層状に生着した。左室前壁は、Ｔ−Ｈ群において顕著な増大を認めた。さらに、Ｔ−Ｈ群において、移植した心筋細胞は、著明に重合したサルコメアを形成した。（図６）。マッソン−トリクローム染色法により、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維化の有意な減少を認めた。非梗塞領域での線維化率は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少した（Ｔ−Ｈ：Ｔ：Ｈ：Ｃ＝１３．５±３．５：２４．５±６．８：１８．５±１２．０：３６．７±８．２％；Ｐ＜０．０５）（図７）。
移植の８週後、Ｔ−Ｈ群において、心筋細胞表面にてβ１−インテグリンおよびβ−ジストログリカンは強く濃染された。Ｔ群では、β１−インテグリンおよびβ−ジストログリカンの発現を認めたが、Ｔ−Ｈ群と比較して、発現は顕著に弱く、そして、Ｈ群およびＣ群においては、発現を認めなかった。α−ジストログリカンおよびラミニンの発現は、Ｔ−Ｈ群において、基底膜に強い濃染性を認めた。Ｔ群においては、極めて弱い発現を認めた。Ｈ群およびコントロール群において染色性を認めなかった（図６）。
梗塞巣内の血管密度を評価するために、光学顕微鏡を用いて、第ＶＩＩＩ因子関連抗原陽性細胞を計数した。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高値であった（Ｔ−Ｈ：Ｔ：Ｈ：Ｃ＝１４．２±２．３：３．９±０．７：４．９±０．６：１．５±０．７×１０２／ｍｍ２；Ｐ＜０．０５）（図８）。
梗塞巣における血液灌流の改善
Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークを伴った山型の曲線を示し、梗塞巣における血液灌流が良好であった。他方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示し、血液灌流は不良であった。
（考察）
心臓移植および左心補助人工心臓の装着は、普遍的な治療とはなりえず、これまでの置換型治療にかわる新しい治療法として再生型治療が注目されている。不全心に、いくつかの増殖因子を遺伝子導入することにより、血管新生を促進し、心機能の改善が得られることが報告されている。しかし、この機能改善は、血管新生のみによるものであり、左室拡張の一つの原因である梗塞巣を治療対象としていないため、心筋細胞の欠失を伴った心不全の治療には、不十分であるものと思われる。他方、心筋細胞移植は、心筋細胞が絶対的に減少した梗塞部に対する治療であり、虚血及び間質の線維化に対して無治療のままである。それゆえ、本発明者らは、心筋細胞移植を、心筋再生・血管新生因子の遺伝子治療を併用することにより、各々の治療の欠点を補い、そしてより優れた心筋再生効果をもたらすと仮定した。
本発明の併用療法の効果を調べるために、本発明者らは、ラット心筋梗塞モデルにおいて心機能評価、及び組織学的評価を行った。本発明の併用療法により、心筋の再生、血管新生、線維化の軽減、および左室前壁厚の顕著な増加を認めた。移植心筋細胞間、移植心筋細胞−細胞外マトリックス間の接着蛋白の発現増強を認めた。心筋細胞移植とｈＨＧＦ遺伝子導入併用療法は、梗塞心の心筋再生に有用であることが示唆された。
移植細胞への血液供給は、移植細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙの維持に重要である。Ｔａｙｌｏｒらは、移植した細胞の分化増殖において、移植細胞を栄養する血管の構築は、不可欠であることを述べている（文献６）。さらに、ＲｅｉｎｌｉｂおよびＦｉｅｌｄは、移植された心筋細胞は、虚血に弱く、細胞移植に加え、血管を新生させる付加治療が必要であると強調している（文献７）。本研究において、移植細胞は十分な血液の供給を受けることにより、良好な細胞−細胞間の接着、及び著明に発達したサルコメアを形成した。よって、移植細胞に十分血液を供給することは、移植細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙの維持に重要であると思われる。
これまで、多くの血管新生因子が報告されており、その中でＶＥＧＦは公知の最も強力な因子である。しかし、過度のＶＥＧＦは、多数の未熟な血管を誘導し、顕著な出血および浮腫をもたらす。ＨＧＦもまた、強力な血管新生因子であり、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａらは、ＨＧＦによる閉塞性動脈硬化症患者に対する血管新生療法は有効であることを報告している（文献８）。さらに、ＨＧＦは、血管新生因子であるだけでなく、抗線維化作用および心筋肥大作用を含む種々の機能を有することで知られている。また、ＨＧＦはａｕｔｏｃｒｉｎｅ、ｐａｒａｃｒｉｎｅ作用を有し、レシピエント心、及び移植細胞に対して、その効果を発揮するものと思われる。よって、ＨＧＦ遺伝子導入と心筋細胞移植の併用は、不全心の機能組織再生に有効であるものと思われる（文献１１）。
移植細胞間接着および移植細胞−細胞外マトリクス間接着は、移植細胞の生着、機能維持の点で重要である。免疫染色にて、β１−インテグリンおよびβ−ジストログリカンは、心筋細胞膜上で強発現を認め、α−ジストログリカンおよびラミニンも、基底膜において強い発現を認めた。インテグリンは、細胞−細胞外マトリクス接着において、最も重要な分子である。インテグリンを介する細胞−細胞外マトリクス間接着が阻害された場合、細胞は「アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）」と呼ばれる、アポトーシスに陥る。また、細胞は、インテグリンによって媒介される細胞−マトリクス相互作用を通して、種々の機能（細胞の増殖、分化、細胞の運動性およびタンパク質産生）を発揮する。本発明の併用療法群により、β１−インテグリンが細胞膜上で極めて強い発現を認めたことより、細胞外マトリクスとの接着により、移植心筋細胞が、最も効果的に機能する可能性があるものと思われる。インテグリン分子以外に、筋原性細胞は、その機能を発揮するため、ジストログリカンを必要とする。β−ジストログリカンは、骨格筋細胞膜上に発現し、そして、アクチンフィラメントに結合しているジストロフィンと呼ばれる別の分子に細胞内で結合している。また、細胞外では、β−ジストログリカンは、α−ジストログリカンと結合し、これは、基底膜に存在するラミニンと結合する。β−ジストログリカンは、細胞膜上にて、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニットおよびδサブユニットから構成されるサルコグリカン（ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ）複合体に結合している。α−ジストログリカンおよびβ−ジストログリカンは、サルコグリカン複合体と共に複合体を形成する。この複合体は、ジストロフィンと結合し、骨格筋の機能において重要な役割を果たす：この系におけるこの分子の点変異は、いくつかの種類の筋ジストロフィーを引き起こすことが知られている。近年、この接着系は、心筋細胞においても重要であることが報告され、これらの分子における変異は、心筋症を引き起こし得る（文献２０）。本発明の併用療法群によって、α−ジストログリカンおよびβ−ジストログリカンが強発現したことより、ＨＧＦ遺伝子導入と心筋細胞移植を併用することにより、心筋細胞における別の細胞接着分子の発現が誘導されている可能性があるものと思われる。ラミニンは、基底膜の主成分である。ラミニンレセプターとしては、筋原性細胞膜上の、インテグリンならびにα−ジストログリカンおよびβ−ジストログリカン複合体が挙げられる。併用療法により、基底膜におけるラミニンの発現が増強されることは、移植された心筋細胞が基底膜のラミニンに最も有効に接着し得るだけでなく、併用療法が細胞−細胞外マトリクス接着の再構築を通して、移植細胞が生着するための、最も適切な微小環境を誘導し得ることを示唆するものと思われる。
心筋梗塞では、機能不全に陥った心筋細胞は線維芽細胞に置き換わり、間質の線維化が起こる（文献２１）。特に、非梗塞領域における間質の線維化は、虚血性心筋症における「左室拡大の主な原因」であると考えられる（文献２２）。従って、心筋細胞移植を行う場合でさえ、梗塞心の完全な再生のためには、間質の線維化に対する付加治療が必要と思われる。
ＴＧＦ−βおよびアンギオテンシン−ＩＩは、不全心の線維化に重要な役割を果たすと考えられている（文献２３）。興味深いことに、これらの分子は、局所ＨＧＦ産生の強力な負の調節因子である（文献２４、２５）。さらに、ＨＧＦは、その抗線維化作用だけでなく（文献９）、アンギオテンシン−ＩＩ産生の阻害作用により（文献２６）、不全心の線維化を抑制する。本発明では、ＨＧＦは、おそらく、これらの機構を通して、非梗塞領域の線維化を顕著に抑制することが考えられる。
心筋細胞移植とＨＧＦ遺伝子導入との併用療法にて、血管の構築、線維化の抑制、移植心筋細胞の著明に重合したサルコメア形成を主とした組織再生がもたらされ、強力な左室拡大抑制と、心収縮能の回復が認められた。このようにＨＧＦと心筋細胞の移植を用いた併用療法は梗塞心の組織機能再生に有効であることが実証された。
（実施例２：ＦＧＦと心筋細胞移植との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＦＧＦと心筋細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。
心筋細胞
心筋細胞は、実施例１に記載されるように単離および培養を行った。
ＦＧＦ
ＦＧＦは、核酸送達系を利用して送達した。具体的には、ヒトＦＧＦ  ｃＤＮＡを、ｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（文献１５）中に入れた。
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１と同様に行った。
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトＦＧＦ濃度を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（文献１７）
細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（胎児ラット心筋細胞移植（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｆ群（ヒトＦＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｆ群（胎児ラット心筋細胞移植と、ヒトＦＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。
ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。
心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。
組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
（結果）
インビボでの心臓のＦＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＦＧＦを用いて心臓に遺伝子導入した３日後、本発明者らは、遺伝子導入された心臓のＦＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＦＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＦＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＦＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に１０．０ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＦＧＦタンパク質を含んでいた。対照的に、ヒトＦＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されなかった
梗塞を起こした心筋層の機能評価
注射の４週間後、心エコー検査では、Ｔ−Ｈ群における駆出率、および左室短縮率は、他の３つの群と比較して優れた効果が見られる。これらの機能的改善は、注射後８週間まで保たれる。
組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、左室前壁厚の有意な増加および左室断面積の有意な減少が見られる。Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、移植心筋細胞は、梗塞巣に層状に生着が見られる。左室前壁は、Ｔ−Ｈ群において顕著な増大を認める。マッソン−トリクローム染色法により、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維化の有意な減少を認める。
心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定された。梗塞巣内の血管密度を評価するために、光学顕微鏡を用いて、第ＶＩＩＩ因子関連抗原陽性細胞を計数した。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも優れた効果が認められる。
瘢痕における心筋層灌流の改善
Ｔ−Ｈ群は瘢痕における良好な心筋層灌流が見られる。
（考察）
本実施例より、ＦＧＦでも本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。
（実施例３：ＶＥＧＦと骨格筋芽細胞移植との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＶＥＧＦと心筋細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
心筋梗塞ビーグル犬モデル
心筋梗塞ビーグル犬モデル（体重８〜１０ｋｇ、２４匹）は、実施例１に記載に従って以下の改変を施して作製した。ビーグル犬を全身麻酔下、左開胸にて心臓を露出し、ＬＡＤ結紮により心筋梗塞モデルを作成した。
骨格筋芽細胞移植
骨格筋芽細胞の単離および培養
骨格筋芽細胞を、同種同系ビーグル犬の下肢骨格筋から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、骨格筋細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、経代培養し、骨格筋芽細胞を得た
ＶＥＧＦ
ＶＥＧＦは、核酸送達系を利用して送達した。具体的には、ヒトＶＥＧＦ  ｃＤＮＡを、ｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（文献１５）中に入れた。核酸送達系を利用して送達した。
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１と同様に行った。
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１２５μｇのヒトＶＥＧＦ  ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。
細胞移植
レシピエントビーグル犬を麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このビーグル犬を心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群（各々６匹）に分けた。４群は以下のとおりである。ＶＥＧＦ群（新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）と、ヒトＶＥＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ、ｎ＝６）；ＨＧＦ群（新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物と、ＨＧＦ  ｃＤＮＡ（１２５μｇ）を含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ；ｎ＝６）；コントロールとして、Ｌ群（新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物と、ＬａｃＺ（２５０μｇ）を含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ；ｎ＝６）；Ｓ群（Ｓｈａｍ；新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物と、空のＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ；ｎ＝６）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。
ビーグル犬心臓の心機能の測定
ビーグル犬心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。
心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。
組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
（結果）
インビボでの心臓のＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＶＥＧＦを用いて心臓に遺伝子導入した３日後、本発明者らは、遺伝子導入された心臓のＶＥＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＶＥＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＶＥＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に１５．０ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＶＥＧＦタンパク質を含んでいた。対照的に、ヒトＶＥＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されなかった
梗塞を起こした心筋層の機能評価
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積および前壁厚みスコアは、４つの群の間で有意差はなかった。
注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところＶＥＧＦ群における駆出率（示さず）および左室短縮率（示さず）は、ＨＧＦ群同等の改善を示した。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＶＥＧＦ群では有意に回復した。そしてこの前壁の回復は、注射後８週間まで保たれた（示さず）。
このように、ＬａｃＺを含むベクターおよび空のベクター（Ｓｈａｍ）を用いて同様の処置を行った群（それぞれＬ群およびＳ群）、ならびにＨＧＦ  ｃＤＮＡを用いたもの（ＨＧＦ）および本実施例のものを比較したところ、図９に示されるように、ＶＥＧＦはＨＧＦと同様に本発明の併用療法において統計学的に有意な有効性を示すことが実証される。
（組織学的評価）
ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、本発明者らは、新たに形成された心臓組織が、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において顕著に増強された。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群においてのみ観察された（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｖ群において線維化にたいするの有効性が示される。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率％）は、他の群と比較して、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において有効性が示される。
心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価した。血管を、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって識別した。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される。
コントロールとしてＬ群およびＳ群、ならびに実施例１および本実施例のものを比較したところ、図１１に示されるように、ＶＥＧＦ群はＨＧＦ群と同様に本発明の併用療法において統計学的に有意な有効性を示すことが実証された。
コントロール群（Ｌ群およびＳ群）ならびにＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群の結果を処置前のものとともに図１２に示す。図から明らかなように、ＶＥＧＦは、ＨＧＦと同様に、本発明の併用療法の心筋層灌流改善効果においても有効であることが実証された。
（考察）
本実施例より、ＶＥＧＦでもＨＧＦと同様に本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。
（実施例４：ＨＧＦと心筋細胞との併用療法：タンパク質形態）
次に、本実施例では、例示としてタンパク質形態のＨＧＦの投与と心筋細胞移植とを併用して、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。
心筋細胞
心筋細胞は、実施例１に記載されるように単離および培養を行った。
ＨＧＦ
ＨＧＦは、タンパク質形態で送達した。簡潔には、組換え産生したヒトＨＧＦタンパク質を用いた。ヒト組換えＨＧＦは、市販のもの（東洋紡Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１）を用いた。
約１ｍｌ（約１−１００μｇ）のヒト組換えＨＧＦタンパク質の生理食塩水溶液を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、ヒト組換えＨＧＦタンパク質溶液と同容量の生理食塩水溶液を梗塞を起こした心筋に注射した。
細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（胎児ラット心筋細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒト組換えＨＧＦタンパク質を投与）；Ｔ−Ｈ群（ヒト組換えＨＧＦタンパク質と胎児ラット心筋細胞との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。
ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。
心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。
組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
（結果）
（梗塞を起こした心機能評価）
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積および前壁厚みスコアには、４つの群の間で有意差はないことが確認される。
注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群における駆出率（示さず）および左室短縮率（示さず）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示す。これらの機能的改善は、注射後８週間まで保たれる。収縮末期面積は、注射の４週間後および８週間後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に小さく、そしてＬＶ収縮末期面積の拡大が、他の群と比較してＴ−Ｈ群で減少する（示さず）。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復するが、他の群では壁の厚みの回復は見られない。
（組織学的評価）
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強される。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、Ｔ−Ｈ群においてのみ観察される（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示した。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少する（示さず）。
心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。
瘢痕における心筋層灌流の改善
超音波造影心臓図検査では、Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークの形をしたフローを示した。このことは、瘢痕における心筋層灌流が良好であることを示す。他方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示す。このことは、乏しい心筋層灌流を示す。
（考察）
本実施例より、タンパク質形態のＨＧＦでも本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。
（実施例５：ＨＧＦと骨格筋芽細胞との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと骨格筋芽細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。
骨格筋芽細胞の単離および培養
骨格筋芽細胞を、新生Ｌｅｗｉｓ系統ラットの下肢骨格筋から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、骨格筋細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、経代培養し、骨格筋芽細胞を得た。
心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを、実施例１に記載のようにｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（文献１５）中に入れた。
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように文献１６の記載に従っておこなった。
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（文献１７）。具体的手順は実施例１に従って行った。
骨格筋芽細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（ラット骨格筋芽細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ、ｎ＝５）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与、ｎ＝５）；Ｔ−Ｈ群（ラット骨格筋芽細胞と、ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ、ｎ＝５）；Ｃ群（培養培地単独、ｎ＝５）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮後２週間で心筋梗塞領域に注射した。
ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。
心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。
組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
（結果）
ヒトＨＧＦで心臓に遺伝子導入した３日後、本発明者らは、遺伝子導入された心臓のＨＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に７±１．２ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含んでいた。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されなかった。
梗塞を起こした心筋層の機能評価
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積、拡張末期面積および前壁厚みスコアは、４つの群の間で有意差はなかった。
注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群において、駆出率（図１３）および左室短縮率（図１４）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示した。拡張末期面積（図１５）および収縮末期面積（図１６）は、注射の４週間後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に小さく、そしてＬＶ収縮末期面積の拡大が、他の群と比較してＴ−Ｈ群で減少した。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復したが、他の群では壁の厚みの回復は見られなかった。
組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、本発明者らは、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強された。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、Ｔ−Ｈ群においてのみ観察された（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示した。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少した（示さず）。
心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定された。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出された（示さず）。
瘢痕における心筋層灌流の改善
超音波造影心臓図検査によって、Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークの形をしたフローを示した。このことは、瘢痕における良好な心筋層灌流を示す。一方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示した。このことは、乏しい心筋層灌流を示す。
（考察）
本実施例より、ＨＧＦと骨格筋芽細胞とを用いた併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。
（実施例６：ＨＧＦと胚性幹細胞との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと胚性幹細胞とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
心筋梗塞ヌードラットモデル
心筋梗塞ヌードラットモデルは、ヌードラットを用いて実施例１の方法にしたがって行った。
胚性幹細胞の単離および培養ならびに心筋細胞への分化
マウス胚性幹細胞のうちＭＨＣの発現する遺伝子のプロモーターの部位に耐性遺伝子を導入し、分化させると心筋細胞以外に分化する細胞は淘汰される高濃度薬剤選択性培養を行い、心筋細胞を選択した。
心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを、実施例１に記載のようにｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（文献１５）中に入れた。
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように文献１６の記載に従って行った。
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（文献１７）。
分化した胚性幹細胞の移植
レシピエントヌードラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このヌードラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（分化胚性幹細胞懸濁物（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｈ群（分化胚性幹細胞懸濁物と、ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮後２週間で心筋梗塞領域に注射した。
心臓の心機能の測定
心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。
心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。
組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
（結果）
ＨＧＦの発現
ヒトＨＧＦで心臓に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された心臓のＨＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に７±１．２ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含んだ。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されない。
梗塞を起こした心筋層の機能評価
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮、末期面積および前壁厚みスコアは、４つの群の間で有意差はない。
注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群において、駆出率および左室短縮率は、他の３つの群と比較して有意な改善を示す。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復したが、他の群では壁の厚みの回復は見られない。
組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強される。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示す。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少する（示さず）。
心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。
（考察）
本実施例より、ＨＧＦと分化した胚性幹細胞とを用いた併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。
（実施例７：ＨＧＦと血管内皮細胞の肺組織への投与との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと血管内皮細胞とを用いて、肺組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
肺梗塞ラットモデル
肺梗塞ラットモデルは、マイクロスフェア（５０ｕｍ）を６０ｍｇ／ｋｇ投与することで肺梗塞ラットモデルを作成した。
血管内皮細胞の単離および培養
血管内皮細胞を、新生Ｌｅｗｉｓ系統ラットの下肢血管から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、血管内皮細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、経代培養した。
心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを、実施例１に記載のようにｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（文献１５）中に入れた。
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように文献１６の記載に従って行った。
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む）を肺梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした肺に遺伝子導入した。肺組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（文献１７）。
血管内皮細胞の移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて左肺動脈を露出させた。このラットを肺梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（血管内皮細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｈ群（血管内皮細胞と、ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いて左肺動脈より肺に注射した。
肺の機能の測定
肺機能のうちガス交換能は動脈血ガス濃度により測定した。
組織学的分析
組織学的分析は、実施例１に記載されるように行った。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
（結果）
ヒトＨＧＦで肺に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された肺のＨＧＦタンパク質含量を測定する。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定する。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した肺は、遺伝子導入後３日目に１０ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含む。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した肺から得られた肺組織では検出されない。
組織学的評価
肺瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。
（考察）
本実施例より、ＨＧＦと血管内皮細胞との併用療法が肺組織の再生に有効であることが実証される。
以上の結果より、どのような細胞を用いても、かつ、どのような細胞生理活性物質を用いても、本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが示される。
（実施例８：ＨＧＦと血管内皮細胞の脳組織への併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと血管内皮細胞とを用いて、脳組織再生に対する併用療法の効果を実証する。
（材料および方法）
脳梗塞ラットモデル
脳梗塞ラットモデルは、２０分間両側の頚動脈を結紮し、再還流し、作成した。
血管内皮細胞の単離および培養
血管内皮細胞を、新生Ｌｅｗｉｓ系統ラットの下肢血管から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、血管内皮細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、継代培養した。
脳へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを、実施例１に記載のようにｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（文献１５）中に入れる。
センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように文献１６の記載に従って行う。
約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む）を脳梗塞領域に注射する。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした脳に遺伝子導入する。脳組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定する（文献１７）。
血管内皮細胞の移植
２０分間両側の頚動脈を結紮し、再還流し、作成した脳梗塞ラットモデルの両側頚動脈より脳梗塞領域に投与した物質に従って４群に分ける。４群は以下のとおりである。Ｔ群（血管内皮細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｈ群（血管内皮細胞と、ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いて両側頚動脈より脳に注射する。
組織学的分析
組織学的分析は、実施例１に記載されるように行う。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行う。
（結果）
ヒトＨＧＦで心臓に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された脳のＨＧＦタンパク質含量を測定する。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定する。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した脳は、遺伝子導入後３日目に１０ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含む。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した脳から得られた脳組織では検出されない。
組織学的評価
脳瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。
（考察）
本実施例より、ＨＧＦと血管内皮細胞との併用療法が脳組織の再生に有効であることが実証される。
（実施例９：ＨＧＦと心筋細胞との併用療法：徐放形態）
次に、本実施例では、例示として徐放形態に処方したタンパク質形態のＨＧＦの投与と心筋細胞移植とを併用して、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。
（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。
心筋細胞
心筋細胞は、実施例１に記載されるように単離および培養を行った。
ＨＧＦ
ＨＧＦは、徐放形態に処方したタンパク質形態で送達した。簡潔には、組換え産生したヒトＨＧＦタンパク質を用いた。ヒト組換えＨＧＦは、市販のもの（東洋紡Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１）を用いた。これを、２％コラーゲン含有水溶液にこのＨＧＦを溶解し、０．６〜６０μｇ／ｍｌのＨＧＦ溶液を調製して溶液状のＨＧＦ徐放性製剤を作製した。
この徐放性製剤を約０．２ｍｌ（約０．１〜１０μｇ）の心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、この製剤と同容量の生理食塩水溶液を梗塞を起こした心筋に注射した。
細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（胎児ラット心筋細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（徐放性ＨＧＦ製剤を投与）；Ｔ−Ｈ群（徐放性ＨＧＦ製剤と胎児ラット心筋細胞との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。
ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。
心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。
組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。
（結果）
（梗塞を起こした心筋層の機能評価）
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積および前壁厚みスコアには、４つの群の間で有意差はないことが確認される。
注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群における駆出率（示さず）および左室短縮率（示さず）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示す。これらの機能的改善は、注射後８週間まで保たれる。収縮末期面積は、注射の４週間後および８週間後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に小さく、そしてＬＶ収縮末期面積の拡大が、他の群と比較してＴ−Ｈ群で減少する（示さず）。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復するが、他の群では壁の厚みの回復は見られない。そしてこの前壁の回復は、注射後８週間まで保たれる（示さず）。
（組織学的評価）
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強される。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、Ｔ−Ｈ群においてのみ観察される（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示した。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少する（示さず）。
免疫組織化学検査では、移植の８週間後、Ｔ−Ｈ群において心筋細胞表面でのβ１−インテグリンおよびβ−ジストログリカンの最大の発現が示される。Ｔ群では、β−１インテグリンおよびβ−ジストログリカンの発現は極めて強いが、他方、Ｔ−Ｈ群においてよりも顕著に低く、そして弱い免疫反応性は、Ｈ群およびＣ群において観察される。α−ジストログリカンおよびラミニンの発現は、Ｔ−Ｈ群における心筋細胞の下の基底膜において検出される。他の群では移植８週間後で、これらの発現は、Ｔ群においてかなり弱い。α−ジストログリカンおよびラミニンの陽性免疫反応は、Ｈ群およびコントロール群において見出されないことが確認される。
心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。
瘢痕における心筋層灌流の改善
超音波造影心臓図検査では、Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークの形をしたフローを示した。このことは、瘢痕における心筋層灌流が良好であることを示す。他方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示す。このことは、乏しい心筋層灌流を示す。
（考察）
本実施例より、徐放化形態のＨＧＦでも本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。徐放化形態のＨＧＦを本発明に用いた場合、そうでないタンパク質形態のＨＧＦを本発明の併用療法に用いた場合よりも、処置後少なくとも８週間までの本発明の効果の持続において顕著な改善が見られることが実証された。
産  業  上  の  利  用  可  能  性
本発明により、心臓移植および医療機器での補助システムを全く使用することなく、損傷した心臓組織を再生することが可能になった。従って、本発明を利用することにより心筋梗塞のような心疾患を治療することができる。本発明の組成物およびキットは、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、間接的または直接的に実施することにより、医療業の隣接産業において利用される可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。
参考文献
文献１．Ｃａｎｖｅｒ  ＣＣ，Ｃｈａｎｄａ  Ｊ．Ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２００１；７２：６５８−６６０
文献２．Ｆｒａｚｉｅｒ  ＯＨ，Ｂｅｎｅｄｉｃｔ  ＣＲ，Ｒａｄｏｖａｎｃｅｖｉｃ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｕｎｌｏａｄｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９６；６２：６７５−６８１
文献３．Ｈｏｓｅｎｐｕｄ  ＪＤ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＬＥ，Ｋｅｃｋ  ＢＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｒｅｐｏｒｔ−１９９８．Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９８；１７：６５６−６６８
文献４．Ｅｌ−Ｂａｎａｙｏｓｙ  Ａ，Ｋｏｒｆｅｒ  Ｒ，Ａｒｕｓｏｇｌｕ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  Ｂｒｉｄｇｅ−ｔｏ−Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２００１；７１：Ｓ９８−１０２
文献５．Ｌｉ  Ｒ−Ｋ，Ｊｉａ  ＺＱ，Ｗｅｉｓｅｌ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｈｅａｒｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９６；６２：６５４−６６１
文献６．Ｔａｙｌｏｒ  ＤＡ，Ａｔｋｉｎｓ  ＢＺ，Ｈｕｎｇｓｐｒｅｕｇｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１９９８；４：９２９−９３３
文献７．Ｒｅｉｎｌｉｂ  Ｌ，Ｆｉｅｌｄ  Ｌ．Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ？  Ａ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｈｅａｒｔ，ｌｕｎｇ，ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０００；１０１：ｅ１８２−ｅ１８７
文献８．Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ａｏｋｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｍｏｄｅｌｓ：ｐ  ｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１；８（３）：１８１−１８９
文献９．Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ  Ｆ，Ｒｅｎｚｏ  ＭＦＤ，Ｚｉｃｈｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２；１１９：６２９−６４１
文献１０．Ｌ  ｉｕ  Ｙ，Ｒ  ａｊｕｒ  Ｋ，Ｔｏｌｂｅｒｔ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２０００；５８（５）：２０２８−２０４３．
文献１１．Ｈａｙａｓｈｉ  Ｓ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｈｉｇａｋｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ−ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６；２２０：５３９−５４５
文献１２．ＴＲＵＳＯＬＩＮＯ  Ｌ，ＧＡＶＡＳＳＡ  Ｓ，ＡＮＧＥＬＩＮＩ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．ＨＧＦ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｖｉｄｉｔｙ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０００；１４：１６２９−１６４０
文献１３．Ｗｅｉｓｍａｎ  ＨＦ，Ｂｕｓｈ  ＤＥ，Ｍａｎｎｉｓｉ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９８８；７８：１８６−２０１．
文献１４．Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｐ，ＭｃＧｒａｔｈ，Ａ，Ｓａｖｉｏｎ  Ｓ．Ｍｙｏｃｙｔｅ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔｅｌ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｂｙ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９８２；５１：７８７−８０１．
文献１５．Ｓｅｋｉ  Ｔ，Ｈａｇｉｙａ  Ｍ，Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ．１９９１；１０２：２１３−２１９
文献１６．Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｉｗａｉ  Ｋ，Ｕｃｈｉｄａ  Ｔ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏ−ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９；２４３：３７５−３７８
文献１７．Ｕｅｄａ  Ｈ，Ｓａｗａ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；６７：１７２６−１７３１
文献１８．Ｇｏｒｃｓａｎ  Ｊ  ３ｒｄ，Ｍｏｒｉｔａ  Ｓ，Ｍａｎｄａｒｉｎｏ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｂｏｒｄｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  Ｒｅｆｌｅｃｔｓ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｖｏｌｕｍｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒ．１９９３；６：４８２−４８９
文献１９．Ｈｅｉｎｌｅ  ＳＫ，Ｎｏｂｌｉｎ  Ｊ，Ｂｅｓｔ  ＰＧ  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂｙ  ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｐｏｗｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｔ  ｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ９９ｍＴｃ  ＳＰＥＣＴ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０００；１０２：５５−６０
文献２０．Ｋａｐｒｉｅｌｉａｎ  ＲＲ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｓ，Ｒｏｔｈｅｒｙ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ａｒｃｏｌｅｍｍａ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｔｕｂｕｌｅｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０００；１０１：２５８６−２５９４
文献２１．Ｔｙａｇｉ  ＳＣ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ：Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８；６８：４０３−４１０
文献２２．Ｂｅｌｔｒａｍｉ  ＣＡ，Ｆｉｎａｔｏ  Ｎ，Ｒｏｃｃｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９４；８９：１５１−１６３
文献２３．Ｂｏｏｚ  ＧＷ，Ｂａｋｅｒ  ＫＭ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．１９９５；３０：５３７−５４３
文献２４．Ｎａｋａｎｏ  Ｎ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ，ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．１９９７；３０：１４４８−１４５４
文献２５．Ｎａｋａｎｏ  Ｎ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＨＧＦ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．１９９８；３２：４４４−４５１
文献２６．Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｎａｋａｇａｍｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ  ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０００；１０２：２４６−２５２
文献２７：Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：３８９−３９５，２０００
文献２８：別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６
文献２９：別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７
文献３０：Ｔｓｕｒｕｍｉ  Ｙ，Ｋｅａｒｎｅｙ  Ｍ，Ｃｈｅｎ  Ｄ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｍ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｙａｎｇ  Ｊ，Ｓｙｍｅｓ  ＪＦ，Ｉｓｎｅｒ  ＪＭ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）、３８２−３８８、１９９７
文献３１：特開平５−０１１１８３公報
文献３２：Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．，Ｈａｇｉｙａ，Ｍ．，Ｓｅｋｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ａ．，Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，４４０−４４３，１９８９
文献３３：Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２
文献３４：米国特許第４，５５４，１０１号
文献３５：Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００、１９９１
文献３６：新外科学体系、心臓移植・肺移植  技術的，倫理的整備から実施に向けて（改訂第３版）
【配列表】
2003059375.tif 000003
2003059375.tif 000004
2003059375.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
図１は、レシピエント心臓におけるｈＨＧＦの検出を示す図である。遺伝子導入の３日後にレシピエント心臓においてＨＧＦが検出された。
図２は、心臓超音波検査における左室機能向上を示す図である。左室機能は、移植の４週間後にＴ−Ｈ群において有意に改善していた。この機能改善は、この併用療法の投与の８週間後まで保持された。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。
図３は、心臓超音波検査における左室収縮性の向上を示す図である。左室収縮性は、移植の４週間後にＴ−Ｈ群において有意に改善していた。この収縮性の改善は、この併用療法の投与の８週間後まで保持された。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。
図４は、心臓超音波検査における収縮末期面積を示す図である。収縮末期面積は、移植の４週間後および８週間後４週間後にＴ−Ｈ群において有意に改善していた。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。
図５は、心臓超音波検査における左室前壁の壁厚を示す図である。ＬＡＤ結紮後に減少した左室前壁の壁厚は、移植の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復したが、他の群では壁の厚みの回復は見られなかった。この前壁の回復は、移植後８週間まで保たれた。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。
図６（図６Ａおよび図６Ｂ）は、細胞移植群では、梗塞巣に移植した心筋細胞が認められるものの、左室内腔が拡大し、非梗塞部に間質の線維化が及んでいる。一方、心筋細胞移植と遺伝子導入を併用した群では、左室前壁は、肥厚し、左室内腔は小さく、非梗塞巣の線維化は抑制された。また、細胞移植群のみでは、α−ジストログリカンの発現を認めなかったが、併用療法群では、α−ジストログリカンの染色性の向上を認めた。β−ジストログリカンの免疫染色において、細胞移植群では、β−ジストログリカンの発現を認めなかったが、併用療法群では、β−ジストログリカンは強く染色された。β１−インテグリンにおいては、併用療法群において、心筋細胞膜状に染色性の向上を認めた。
パネルＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＨは、ヘマトキシリンエオジン染色を示す。パネルＢおよびＥは、マッソントリクローム染色を示す。パネルＨ，Ｉは、α−ジストログリカン免疫染色を示す。パネルＪ、Ｋ、は、β−ジストログリカン免疫染色を示す。パネルＬ、Ｍ、は、併用療法群におけるβ１−インテグリン免疫染色を示す。
図７は、組織線維化率（線維化率％）を示す。線維化率％は、併用療法群において有意に抑制されていることが見出された。細胞移植のみを施したモデルでは、心筋細胞の肥大がみられ、線維症化率％は増加していた。
図８は、血管数を示す図である。第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する免疫染色で評価したところ、併用療法群において、血管数が有意に増加していたことが示された。
図９は、心臓超音波検査における左室前壁の壁厚を示す図である。ＬａｃＺを含むベクターおよびコントロール（Ｓｈａｍ）を用いて同様の処置を行った群（それぞれＬ群およびＳ群）、ならびにＨＧＦおよびＶＥＧＦを用いた。コントロールとして、正常領域のデータおよび処置前のデータを示す。虚血領域における壁厚は、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において顕著に改善していたが、Ｌ群およびＳ群では、有意な回復は見られなかった。
図１０は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原での免疫組織化学染色の様子を示す写真である。ＨＧＦおよびＶＥＧＦでの処置により血管数が増加しているのに対し、ＬａｃＺでの処置では増加が乏しい様子が分かる。
図１１は、虚血領域での毛細血管数の増加を示すグラフである。ＨＧＦおよびＶＥＧＦでの処置により、Ｌ群およびＳ群に比べて有意に血管数が増していることが分かる。
図１２は、虚血領域での局所的血流の変化を示すグラフである。ＨＧＦおよびＶＥＧＦでの処置により、有意に血流が増していることが分かる。虚血領域の局所的血流を正常領域のものの％として示した。局所的血液灌流により、ＨＧＦおよびＶＥＧＦ群の療法で、有意な回復が見られた。ＬａｃＺおよびＳｈａｍでは効果はなかった。
図１３は、骨格筋芽細胞移植後の左室機能の変化を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。
図１４は、骨格筋芽細胞移植後の左室収縮性を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。
図１５は、骨格筋芽細胞移植後の拡張末期の面積を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。
図１６は、骨格筋芽細胞移植後の収縮末期の面積を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。
【図１】
2003059375.tif 000013
【図２】
2003059375.tif 000014
【図３】
2003059375.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2003059375.tif 000019
【図７】
2003059375.tif 000020
【図８】
2003059375.tif 000021
【図９】
2003059375.tif 000022
【図１０】
2003059375.tif 000023
【図１１】
2003059375.tif 000024
【図１２】
2003059375.tif 000025
【図１３】
2003059375.tif 000026
【図１４】
2003059375.tif 000027
【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月19日(2004.3.19)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】自然には再生できない生物の器官の組織を再生するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、該器官への移入に適した形態で別々に含む、
組成物。


【手続補正００２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４４】自然には再生できない生物の器官の疾患を治療するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、該器官への移入に適した形態で別々に含む、
組成物。


【手続補正００３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４５】自然には再生できない生物の器官の組織を再生するためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
該細胞生理活性物質および該細胞の該器官への移植に関する指示書、
を備え、該細胞生理活性物質と該細胞とは別々に存在し、ここで、該指示書は、
該細胞生理活性物質を該細胞の該器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。


【手続補正００４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４９】自然には再生できない生物の器官の疾患を治療するための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、該器官への移入に適した形態で別々に含む、
組成物。


【手続補正００５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５０】自然には再生できない生物の器官の疾患を治療するためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
該細胞生理活性物質および該細胞の該器官への移植に関する指示書、
を備え、該細胞生理活性物質と該細胞とは別々に存在し、ここで、該指示書は、
該細胞生理活性物質を該細胞の該器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。


【手続補正００６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５１】自然には再生できない生物の器官の組織を再生するための方法であって、
細胞生理活性物質を該器官へ提供する工程；および
細胞を該器官へ提供する工程、
を包含し、該細胞生理活性物質と該細胞とは別々に提供される、方法。


【手続補正００７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５２】自然には再生できない生物の器官の疾患を治療するための方法であって、
細胞生理活性物質を該器官へ提供する工程；および
細胞を該器官へ提供する工程、
を包含し、該細胞生理活性物質と該細胞とは別々に提供される、方法。


【手続補正００８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５３】自然には再生できない生物の器官の組織を再生するための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用であって、該細胞生理活性物質と該細胞とは別々に提供される、使用。


【手続補正００９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５４】自然には再生できない生物の器官の疾患を治療するための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用であって、該細胞生理活性物質と該細胞とは別々に提供される、使用。




【国際調査報告】
2003059375.tif 000030
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