(57)【要約】アトピー性皮膚炎の原因因子として、患者自らが産生するアトピー性皮膚炎誘引蛋白質を提供する。すなわちこの蛋白質は、ヒト生体より分泌される蛋白質であって、この蛋白質を分泌するヒト自らのＩｇＥ抗体に結合し、マスト細胞および好塩基球を活性化することを特徴とするアトピー性皮膚炎誘引蛋白質である。さらに詳しくは、この発明の蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるｓａｌｉｖａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ、配列番号４のアミノ酸配列からなるＰｒｏｌａｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ並びにその翻訳後修飾体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生体より分泌される蛋白質であって、この蛋白質を分泌するヒト自らのＩｇＥ抗体に結合し、マスト細胞および好塩基球を活性化することを特徴とするアトピー性皮膚炎誘引蛋白質。
【請求項２】
唾液腺または汗腺から分泌される請求項１の蛋白質。
【請求項３】
４以上のアミノ酸残基からなる同一アミノ酸繰り返し配列を２以上有する請求項１の蛋白質。
【請求項４】
蛋白質が、配列番号２のアミノ酸配列からなるｓａｌｉｖａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎである請求項３の蛋白質。
【請求項５】
蛋白質が、配列番号４のアミノ酸配列からなるＰｒｏｌａｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎである請求項１の蛋白質。
【請求項６】
構成アミノ酸残基の少なくとも一つが翻訳後修飾されている請求項１の蛋白質。
【請求項７】
修飾されているアミノ酸残基がリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、フエニルアラニン、プロリン、アスパラギン、チロシンからなる群より選択される１以上のアミノ酸残基である請求項６の蛋白質。
【請求項８】
修飾基がアルキル基である請求項７の蛋白質。
【請求項９】
蛋白質が、配列番号４のアミノ酸配列からなるＰｒｏｌａｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎである請求項８の蛋白質。
【請求項１０】
配列番号４の少なくとも第８４番目チロシン残基がメチル化修飾されている請求項９の蛋白質。
【請求項１１】
請求項１の蛋白質の一部であって、ＩｇＥ抗体との結合領域を構成するアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１２】
請求項３または４の蛋白質の一部である請求項１１のペプチド。
【請求項１３】
配列番号２の少なくとも連続４アミノ酸配列を含む請求項１２のペプチド。
【請求項１４】
請求項５の蛋白質の一部である請求項１１のペプチド。
【請求項１５】
請求項６から１０のいずれかの蛋白質の一部である請求項１１のペプチド。
【請求項１６】
配列番号４の少なくとも連続４アミノ酸配列を含む請求項１４または１５のペプチド。
【請求項１７】
請求項１の蛋白質または請求項１１のペプチドを抗原として調製された抗体であって、請求項１の蛋白質に結合する抗体。
【請求項１８】
請求項３または４の蛋白質、もしくは請求項１２または１３のペプチドを抗原として調製された抗体であって、請求項３または４の蛋白質に結合する抗体。
【請求項１９】
請求項５の蛋白質または請求項１６のペプチドを抗原として調製された抗体であって、請求項５の蛋白質に結合する抗体。
【請求項２０】
請求項６から１０のいずれかの蛋白質、または請求項１６のペプチドを抗原として調製された抗体であって、請求項６から１０のいずれかの蛋白質に結合する抗体。
【請求項２１】
被験者の血清中に、請求項１から１０の蛋白質のいずれか１以上、または請求項１１から１６のペプチドのいずれか１以上と結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験者をアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者と判定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の診断方法。
【請求項２２】
被験者の血液から採取した白血球画分に、請求項１から１０の蛋白質のいずれか１以上、または請求項１１から１６のペプチドのいずれか１以上を添加し、ヒスタミン遊離の程度からアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者と判定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の診断方法。
【請求項２３】
被験者の生体試料に、請求項１７から２０のいずれか１以上の抗体と結合する蛋白質が存在するか否かを試験し、試料中にその蛋白質が存在する被験者をアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者と判定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の診断方法。
【請求項２４】
請求項１から１０の蛋白質のいずれか１以上、または請求項１１から１６のペプチドのいずれか１以上を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の減感作治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、アトピー性皮膚炎患者自らが分泌するアトピー性皮膚炎誘引蛋白質と、この蛋白質またはその抗体を用いたアトピー性皮膚炎の診断方法、並びにこの蛋白質を有効成分とするアトピー性皮膚炎の減感作治療薬剤に関するものである。
背景技術
近年、アトピー性皮膚炎患者は急増しており、皮膚科にかかる患者中のアトピー性皮膚炎患者比率は５０％を越える情況で、主たる皮膚病の一つになっている。アトピー性皮膚炎は、通常の抗原に対しＩｇＥ抗体を産生しやすい遺伝的要因により引き起こされるアトピー性疾患の一つであり、乳児期から発症し、加齢と共に慢性的に経過し、多くは思春期前に軽快する。完成した病巣は苔癬化が鮮明であり、掻痒は常に著しく、しばしば発作的であり、他のアトピー性疾患と一定の関連をもって増悪、軽快を繰り返すというものである。
このようなアトピー性皮膚炎の発症機序には、明らかにされていない部分が多く、他の皮膚疾患との識別にもいまだ問題があり、治療方法はいまだ確立されていないが、従来より、副腎皮質ホルモン剤の外用、抗ヒスタミン剤、化学伝達物質遊離抑制剤の投薬療法、あるいは卵、牛乳、大豆等を除く食事療法等が試みられてきた。しかし、投薬療法の場合は、薬剤を成長期の子供に、しかも長期にわたって使用することは、副作用の点で問題がある。また食事療法では、完全にアレルギー源を除くことは困難であり、精神的負担も大きいという問題点があった。
このような状況に鑑み、最近では、遺伝子工学的な知見を駆使してアトピー性皮膚炎の発症機構を解明しながら、その発生機構の一部を阻害することにより、治療効果を上げようとする研究が行われている。例えば、上記したように抗原に対してＩｇＥ抗体を産生することが症状を発生させる機構の一部になっていることに着目し、抗原に対するＩｇＥ抗体の産生を抑制する物質を外用することによって症状を緩和することが考えられている（特開平７−１０９２９０号公報、特開平７−１０９２９２号公報、特開平９−１００２３６号公報）。
しかしながら、抗原に対するＩｇＥ抗体の産生抑制物質を投与する方法は、ある程度の効果を発揮するものの、病原を本質的に遮断するものではないから、症状の緩和には役立っても本質的な治療にはなっていない。また病原の由来をすべて食物または環境中に存在する外来性物質に求めているため、体内で産生される物質に関しては全く無対応であった。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、アトピー性皮膚炎の原因因子として、患者自らが産生するアトピー性皮膚炎誘引蛋白質を提供することを課題としている。
さらにこの出願の発明は、前記蛋白質の一部であって、その抗原性に関与するペプチドを提供することを課題としている。
さらにまた、この出願の発明は、前記の蛋白質および／またはペプチド、あるいはこれらに対する抗体を用いたアトピー性皮膚炎の診断方法を提供することを課題としている。
また、さらにこの出願の発明は、前記の蛋白質および／またはペプチドを有効成分とするアトピー性皮膚炎の減感作治療薬を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、以下の（１）から（２５）の発明を提供する。
（１）ヒト生体より分泌される蛋白質であって、この蛋白質を分泌するヒト自らのＩｇＥ抗体に結合し、マスト細胞および好塩基球を活性化することを特徴とするアトピー性皮膚炎誘引蛋白質。
（２）唾液腺または汗腺から分泌される発明（１）の蛋白質。
（３）４以上のアミノ酸残基からなる同一アミノ酸繰り返し配列を２以上有する発明（１）または（２）の蛋白質。
（４）蛋白質が、配列番号２のアミノ酸配列からなるｓａｌｉｖａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎである発明（３）の蛋白質。
（５）蛋白質が、配列番号４のアミノ酸配列からなるＰｒｏｌａｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎである発明（１）または（２）の蛋白質。
（６）構成アミノ酸残基の少なくとも一つが翻訳後修飾されている発明（１）または（２）の蛋白質。
（７）修飾されているアミノ酸残基がリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、フエニルアラニン、プロリン、アスパラギン、チロシンからなる群より選択される１以上のアミノ酸残基である発明（６）の蛋白質。
（８）修飾基がアルキル基である発明（７）の蛋白質。
（９）蛋白質が、配列番号４のアミノ酸配列からなるＰｒｏｌａｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎである発明（８）の蛋白質。
（１０）配列番号４の少なくとも第８４番目チロシン残基がメチル化修飾されている発明（９）の蛋白質。
（１１）発明（１）の蛋白質の一部であって、ＩｇＥ抗体との結合領域を構成するアミノ酸配列を含むペプチド。
（１２）発明（３）または（４）の蛋白質の一部である発明（１１）のペプチド。
（１３）配列番号２の少なくとも連続４アミノ酸配列を含む発明（１２）のペプチド。
（１４）発明（５）の蛋白質の一部である発明（１１）のペプチド。
（１５）発明（６）から（１０）のいずれかの蛋白質の一部である発明（１１）のペプチド。
（１６）配列番号４の少なくとも連続４アミノ酸配列を含む発明（１４）または発明（１５）のペプチド。
（１７）発明（１）の蛋白質または発明（１１）のペプチドを抗原として調製された抗体であって、発明（１）の蛋白質に結合する抗体。
（１８）発明（３）または（４）の蛋白質、もしくは発明（１２）または（１３）のペプチドを抗原として調製された抗体であって、発明（３）または（４）の蛋白質に結合する抗体。
（１９）発明（５）の蛋白質または発明（１６）のペプチドを抗原として調製された抗体であって、発明（５）の蛋白質に結合する抗体。
（２０）発明（６）から（１０）のいずれかの蛋白質、または発明（１６）のペプチドを抗原として調製された抗体であって、発明（６）から（１０）のいずれかの蛋白質に結合する抗体。
（２１）被験者の血清中に、発明（１）から（１０）の蛋白質のいずれか１以上、または発明（１１）から（１６）のペプチドのいずれか１以上と結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験者をアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者と判定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の診断方法。
（２２）被験者の血液から採取した白血球画分に、発明（１）から（１０）の蛋白質のいずれか１以上、または発明（１１）から（１６）のペプチドのいずれか１以上を添加し、ヒスタミン遊離の程度からアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者と判定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の診断方法。
（２３）被験者の生体試料に、発明（１７）から（２０）のいずれか１以上の抗体と結合する蛋白質が存在するか否かを試験し、試料中にその蛋白質が存在する被験者をアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者と判定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の診断方法。
（２４）発明（１）から（１０）の蛋白質のいずれか１以上、または発明（１１）から（１６）のペプチドのいずれか１以上を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の減感作治療薬。
以上の各発明における態様や用語、概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の治療方法等に使用可能な薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
発明を実施するための最良の形態
発明（１）のアトピー性皮膚炎誘引蛋白質は、ヒト（特にアトピー性皮膚炎患者またはそのハイリスク者）の人体（特に汗腺または唾液腺）より分泌される蛋白質であって、この蛋白質を分泌するヒト自らのＩｇＥ抗体に結合し、マスト細胞および好塩基球を活性化することを特徴とする単離精製蛋白質である。この蛋白質は、後記実施例１の方法によって、単離精製することができる。
この発明（１）の蛋白質は、具体的には３つの異なる蛋白質が含まれる。第１は発明（３）の蛋白質であり、４以上のアミノ酸残基からなる同一アミノ酸繰り返し配列を２以上有する蛋白質であり、そのさらに具体例は、発明（４）の蛋白質である。
すなわち、発明（４）の蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるｓａｌｉｖａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＰＲＰ蛋白質」と記載する）である。このＰＲＰ蛋白質は、ＱＧＰＰの繰り返し配列を９個、ＱＧＰＰＱＱＧＧの繰り返し配列を４個、ＰＱＧＰＰの繰り返し配列を５個、ＱＱＧＰＰの繰り返し配列を３個有している。なお、このＰＲＰ蛋白質の存在とその構造は知られていたが（例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１１１２３−１１１３０，１９８５等）、このＰＲＰ蛋白質がそれを分泌するヒト自らのＩｇＥ抗体に結合し、マスト細胞および好塩基球を活性化することよってアトピー性皮膚炎を引き起こす誘引蛋白質であることは従来全く知られていない。
発明（１）の蛋白質の第２の具体的態様は発明（５）の蛋白質、すなわち配列番号４のアミノ酸配列からなるＰｒｏｌａｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＰＩＰ蛋白質」と記載する）である。このＰＩＰ蛋白質の存在とその構造は知られていたが（例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１５２３６−１５２４１，１９８７等）、マスト細胞および好塩基球を活性化することよってアトピー性皮膚炎を引き起こす誘引蛋白質となることは従来全く知られていない。
発明（１）の蛋白質の第３の具体的態様は発明（６）の蛋白質（すなわち、構成アミノ酸残基の少なくとも一つが翻訳後修飾されている蛋白質）である。具体的には、修飾されているアミノ酸残基がリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、フエニルアラニン、プロリン、アスパラギン、チロシンからなる群より選択される１以上のアミノ酸残基であり、また修飾基がアルキル基であることが好ましい。そしてこの発明（６）の蛋白質の具体例は、配列番号４のアミノ酸配列における第８４番目チロシン残基がメチル化修飾されているＰＩＰ蛋白質（以下「修飾ＰＩＰ蛋白質」と記載することがある）である。またこの修飾ＰＩＰ蛋白質は、配列番号４におけるいずれかのアルギニン残基がメチル化修飾されている可能性がある。そして、このようなアミノ酸残基が修飾されたＰＩＰ蛋白質がマスト細胞と好塩基球を活性化し、それによってアトピー性皮膚炎を誘引することは、従来全く知られていない。
ＰＲＰ蛋白質およびＰＩＰ蛋白質、あるいは修飾ＰＩＰ蛋白質は、後記実施例１と同様の方法によってヒトの汗や唾液から単離精製することができる。また、公知のペプチド合成法によってそれぞれ配列番号２および４のアミノ酸配列を化学合成する方法によっても作製することができる。ペプチド合成は種々の固相法を用いて行うことができ（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２，１９９５；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３−１３，１９９７参照）、また例えばＡＢＩ４３１Ａペプチド・シンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）等を用いることによって自動的に行うこともできる。なお、少なくとも第８４番目チロシン残基（そしていずれかのアルギニン残基）がメチル化修飾されたＰＩＰ蛋白質を作製するには、ペプチド合成法は好ましい方法の一つである。
ＰＲＰ蛋白質およびＰＩＰ蛋白質または修飾ＰＩＰ蛋白質を作製するための別の方法は、それぞれをコードする公知のＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１および３）を用いて遺伝子工学的に蛋白質を調製する方法である。例えば、前記のＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで蛋白質を産生することができる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞から各ＤＮＡ配列がコードしている蛋白質を調製することができる。
蛋白質をインビトロ翻訳で発現させる場合には、前記のＤＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。なお、このインビトロ転写・翻訳による方法は、少なくとも第８４番目チロシン残基（そしていずれかのアルギニン残基）がメチル化修飾されたＰＩＰ蛋白質を作製するための好ましい方法の一つである。
蛋白質を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のＤＮＡ配列を組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、目的の蛋白質を微生物から得ることができる。この際、他の蛋白質との融合蛋白質（例えばグルタチン？Ｓ？トランスフェラ？ゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質）として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
蛋白質を、真核細胞で発現させる場合には、前記のＤＮＡ配列、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、目的の蛋白質を形質転換真核細胞から得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質として目的の蛋白質を発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明の蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
ＰＲＰ蛋白質またはＰＩＰ蛋白質、もしくは修飾ＰＩＰ蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的の蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。そして、このようにして単離精製された蛋白質のなかから、少なくとも第８４番目チロシン残基（そしていずれかのアルギニン残基）がメチル化修飾されたＰＩＰ蛋白質を特定するためには、アトピー性皮膚炎患者の血清と蛋白質とを反応させ、血清中の抗体と結合する蛋白質を選択すればよい。
この出願の発明（１１）は、発明（１）のアトピー性皮膚炎誘引蛋白質の一部であって、ＩｇＥ抗体との結合領域（抗原決定基またはエピトープ）を構成するアミノ酸配列からなるペプチドである。このペプチドは、発明（１）の蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解することによって得ることができる。このペプチドは具体的には発明（３）または（４）の蛋白質の一部であるペプチド（発明（１２））、発明（５）の蛋白質の一部であるペプチド（発明（４））、発明（６）から（１０）のいずれかの蛋白質の一部であるペプチド（発明（１５））である。さらに具体的にはＰＲＰ蛋白質およびＰＩＰ蛋白質の一部としてのペプチド（発明（１３）、（１６））である。ＰＲＰ蛋白質およびＰＩＰ蛋白質の一部としてのペプチドの場合には、それぞれ配列番号２および４に基づいて公知のペプチド合成法により所望のアミノ酸配列からなるペプチドを得ることもできる。さらには、配列番号１または３のＤＮＡ配列から所望ペプチドのコード領域を切断し、またはＰＣＲ増幅するなどして、このＤＮＡ配列から前記のような遺伝子工学的方法によってペプチドを作製することもできる。
なお、発明（１）から（１０）の蛋白質は、２以上のエピトープを有することによって２以上の抗体に結合し、それによって生理的活性を発揮する。従って、発明（１１）、（１２）、（１４）、（１６）のペプチドは、２以上のエピトープ領域を構成するアミノ酸配列を含むものとすることができる。このようなペプチドは、蛋白質（１）から（１０）と同様の生理活性（すなわちアトピー性皮膚炎誘引活性）を有するため、例えば発明（２４）の減感作治療薬の有効成分として有用である。また、この発明のペプチドは、１つのエピトープを有するものであってもよい。そのようなペプチドは、抗体作製のための抗原として、あるいは発明（２１）、（２２）の診断方法の材料として使用することができる。
ＰＲＰ蛋白質由来のペプチド（発明（１３））は、配列番号２の少なくとも連続４アミノ酸配列を含むペプチドであって、例えば配列番号２におけるアミノ酸繰り返し配列を含む領域（第４７−１５８番アミノ酸配列中）の、連続４アミノ酸配列、５−１０アミノ酸配列、１１−３０アミノ酸配列、３１−５０アミノ酸配列、５１−８０アミノ酸配列、８１−１１１アミノ酸配であることが好ましい。またＰＩＰ蛋白質由来のペプチドとしては、配列番号４のアミン酸配列におけるメチル化修飾された第８４番目チロシン残基を含む連続４アミノ酸配列以上であることが好ましい。さらに好ましくは、メチル化修飾された第８４番目チロシン残基と、メチル化修飾されている可能性のあるいずれかのアルギニン残基（すなわち、配列番号４の第２番目、第９番目、第３３番目、第４７番目、第１０６番目、第１１８番目、第１３６番目のアルギニン残基）を含むペプチドである。
発明（１７）は、発明（１）の蛋白質または発明（１１）のペプチドを抗原として調製された抗体である。また、発明（１８）から（２０）の抗体は、それぞれ発明（３）から（１０）の蛋白質または発明（１２）から（１６）のペプチドを抗原として調製された抗体である。
これらの抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、前記の各蛋白質エピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”Ｊａｍｅｓ  Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）に従い、例えば以下の様な手順で作製することができる。
１：ハイブリドーマ細胞群の作製
前記のアトピー性皮膚炎誘引蛋白質またはエピトープペプチドを抗原（免疫原）として哺乳動物を免疫し、必要に応じて適宜に追加免疫して動物を充分に感化する。次いでこの動物から抗体産生細胞（リンパ細胞または脾臓細胞）を摘出し、これとミエローマ（骨髄種）細胞株との融合細胞を得る。そして、これらの融合細胞株から、目的とするモノクローナル抗体をそれぞれに産生する複数の細胞を選択し、培養することによって、ハイブリドーマ細胞群を得ることができる。以下、各工程を詳しく説明する。
ａ）免疫原の調製
前記の発明（１）から（１０）の蛋白質、または発明（１１）から（１６）のペプチドを適宜に選択して免疫原とすることができる。これらの免疫原は、他のタンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ：ＧＳＴ）との融合タンパク質の形で使用することもできる。このような融合タンパク質の使用は、宿主−ベクター系の発現産物からの目的タンパク質の単離、および後記するハイブリドーマ細胞のスクリーニング工程を容易かつ確実とする点において特に好ましい。なお、短鎖ペプチドを抗原とする抗体作製については、例えば以下の文献にその成功例が記載されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６６：４９７−５０４，１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８８：１９５−２０５，１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：２１５９−２１６３，１９８８）。
ｂ）動物の免疫
被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等である。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点からは、マウスまたはラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＲ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＲＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではｌｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週齢は５〜１２週齢が好ましい。
動物の免疫は、免疫原の溶液を動物の皮内または腹腔内に投与することによって行うことができる。免疫原の投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また、抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、１０−１００μｇ／ｍｌ程度とする。
ｃ）細胞融合
上記の投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
次いで、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ，ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、アミノプテリン存在下で生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞および融合細胞をＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
ｄ）ハイブリドーマのスクリーニング
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光抗体法等により行うことができる。また、融合蛋白質を免疫原とした場合には、融合パートナーである蛋白質について上記の各スクリーニング方法を併せて実施することによって、より確実にハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることができる。
このようなスクリーニングによって、発明（１）から（１０）の蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体をそれぞれに産生するハイブリドーマ細胞群が得られる。
なお、スクリーニング後のハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
２：モノクローナル抗体の取得および精製
上記１で作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法で培養することによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。
培養は、例えば、前記のクローニング法で使用した同じ組成の培地中で培養してもよく、あるいはモノクローナル抗体を大量に産生するためには、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取してもよい。
このようにして得たモノクローナル抗体は、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
次に、発明（２１）は、前記発明（１）から（１０）の蛋白質のいずれか１以上、または発明（１１）から（１６）のペプチドのいずれか１以上を用いてアトピー性皮膚炎を診断する方法である。すなわち、発明（１）から（１０）の蛋白質は、アトピー性皮膚炎患者の血清中の抗体（ＩｇＥ抗体）と結合する蛋白質として特定されたものであり、発明（１１）から（１６）はそれら蛋白質のエピトープを含むペプチドであるから、被験者の血清と反応させ、これらの蛋白質またはペプチドと結合する抗体を含む血清を、アトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク患者の血清として判定することができる。
具体的な診断は、例えば前記の蛋白質またはペプチドに被験者血清を接触させ、蛋白質またはペプチドと被験者血清中のＩｇＥ抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中のＩｇＥ抗体と特異的に結合する標識化抗ＩｇＥ抗体を反応させて、標識化抗ＩｇＥ抗体のシグナルを検出すればよい。標識化抗ＩｇＥ抗体の標識物質は、酵素、放射性同位体、蛍光色素を用いることができる。酵素は、代謝回転数が大であること、抗ＩｇＥ抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗ＩｇＥ抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡ等で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光法に用いられるものの他、緑色蛍光蛋白質等の蛍光蛋白質を使用することができる。またシグナルの検出は、酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
シグナル検出のための試料は、ウエスタンブロット分析や、蛋白質／ペプチド＋血清中抗体＋標識化抗ＩｇＥ抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識化抗ＩｇＥ抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。
発明（２１）の診断方法はまた、蛋白質／ペプチドの１種類以上をプレート上に固定化し、このプレート上において被験者血清の抗体との結合を試験することもできる。蛋白質／ペプチドをプレート上に固定化することによって、未結合の標識化結合分子を容易に除去することができる。
なお、この発明（２１）の方法は、アトピー性皮膚炎の診断のみならず、検出目的の抗体がどの程度存在するかを定量することも可能とする。事前に、スタンダード（検量線等）を作製し、被験者の血清から得られた抗体量をスタンダードと比較することによって、正確な抗体量を測定することができ、疾患の程度または発症の危険性の程度を高い精度で推定することが可能となる。
発明（２２）の方法は、被験者の血液から採取した白血球画分に、発明（１）から（１０）の蛋白質のいずれか１以上、または発明（１１）から（１６）のペプチドのいずれか１以上を添加し、白血球からのヒスタミン遊離の程度を指標としてアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者を判別することを特徴とする。すなわち発明（１）から（１０）の蛋白質、または発明（１１）から（１６）のペプチドの刺激によって遊離してくるヒスタミンがアトピー性皮膚炎を発症させるのであるから、ヒスタミン遊離量を測定することによって、疾患の有無やその程度、あるいは発症の危険性の程度等を高い精度で診断することが可能となる。なお、ヒスタミン量は、例えば公知の方法（Ｋｏｒｏ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０３，６６３−６７０，１９９９）で測定することができる。また、診断の基準としては、例えば被験者から採取した白血球画分を前記蛋白質またはペプチドで刺激した場合に遊離してくるヒスタミンの増加量が、無刺激の時と比較して５％以上である場合を陽性と判定することができる。
発明（２３）は、被験者の生体試料に、発明（１７）から（２）のいずれか１以上の抗体と結合する蛋白質が存在するか否かを試験し、試料中にその蛋白質が存在する被験者をアトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎ハイリスク者と判定することを特徴とする。すなわち、発明（１７）から（２０）の抗体は、発明（１）から（１０）の蛋白質と特異的に結合する抗体であり、発明（１）から（１０）の蛋白質はアトピー性皮膚炎の原因となる誘引蛋白質であるから、この抗体と結合する蛋白質を含む生体試料を、アトピー性皮膚炎患者またはそのハイリスク患者の試料として判定することができる。生体試料は、被験者から単離した任意の試料であってよいが、特に唾液または汗が好ましい。
この発明（２３）の診断方法における一つの態様は、抗体と蛋白質との結合を液相系において行う方法である。例えば、前記発明（２１）に例示したような標識物質で標識した抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体と目的の蛋白質とを結合させ、この結合体を前記発明（２１）と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。
液相系での診断の別の方法は、抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と目的蛋白質を結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋蛋白質結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記発明（２１）と同様とすることができる。
発明（２３）の診断方法における別の態様は、抗体と目的蛋白質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の蛋白質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、抗体（一次抗体）を樹脂プレート等に固定化し、この固定化抗体に目的蛋白質を結合させ、非結合蛋白質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋蛋白質結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）」として広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は前記発明（２１）と同様とすることができる。
なお、この発明（２３）の方法は、アトピー性皮膚炎の診断のみならず、アトピー性皮膚炎誘引蛋白質がどの程度存在するかを定量することも可能とする。事前に、スタンダード（検量線等）を作製し、被験者の生体試料から得られた蛋白質量をスタンダードと比較することによって、正確な蛋白質を測定することができ、疾患の程度または発症の危険性の程度を高い精度で推定することが可能となる。
発明（２４）は、発明（１）から（１０）の蛋白質いずれか１以上、および／または発明（１１）から（１６）のペプチドのいずれか１以上を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の減感作治療薬である。「減感作治療」とはＩｇＥ抗体が関与するアレルギーにおいて、微量の治療用アレルゲンを一定日数をあけてしだいに増量しつつ投与し、原因アレルゲンが進入してもアレルギー反応が生じないようにする治療法である。発明（１）から（１０）の蛋白質および発明（１１）から（１６）のペプチドは、前記のとおりにアトピー性皮膚炎の誘引活性を有するものであるから、減感作における治療用アレルゲンとなりうる。なお、この場合のペプチドは、蛋白質と同様に２以上のエピトープ領域を有し、蛋白質と同一の生理活性（アトピー性皮膚炎誘引活性）を発揮するペプチドであることが望ましいが、１つのエピトープ領域を有するペプチド（いわゆる「ハプテン」）であってもよい。
この発明（２３）の減感作治療薬は、前記の蛋白質／ペプチドと、薬理学的に許容しうる担体とを均一に混合して製剤化することができる。担体は、薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜に選択することができるが、この発明の薬剤は、経口的にまたは注射により投与しうる単位服用形態にあることが望ましい。
懸濁剤およびシロップ剤のような経口液体調製物は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤およびカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の製剤における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセルを製造する際には、固体の製薬担体が用いられる。
また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。
この発明の減感作治療薬の投与スケジュールは、患者の年齢や体重、症状、投与経路等によって異なるが、治療用アレルゲンとしての蛋白質／ペプチド量は、予め皮内テストを行い、個人毎に閾値を測定し、その閾値の前後の量を初回投与とすることが好ましい。２回目以降の投与間隔とアレルゲン増量幅はアレルギー反応の有無や程度に応じて適宜とすることができる。最終的には閾値量の１０，０００倍程度のアレルゲンを投与することができる。従って、例えば、この発明の減感作治療薬においては、初回投与のアレルゲン量を１ｎｇ／ｍｌ×０．０５ｍｌとして製剤化した場合、最終投与の薬剤を１０ｍｇ／ｍｌ×０．０５ｍｌとして製剤化することができる。
実施例
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに具体的かつ詳細に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１
ヒト汗中からのアトピー性皮膚炎誘引蛋白質の精製・同定
健常人、アトピー性皮膚炎患者およびアレルギー性鼻炎患者の汗を回収し、濾過滅菌後、本人に皮内テストを行ったところ、健常人はほとんど陽性反応を生じなかった（１１％）が、アトピー性皮膚炎患者（８５％）およびアレルギー性鼻炎患者（７１．４％）において高率に膨疹を生じた。そこで、上記回収汗中の物質を次のような方法で抽出し、物質同定を行った。
汗を数人の健常人、あるいはアトピー性皮膚炎患者から採取し、アトピー性皮膚炎患者末梢血好塩基球からのヒスタミン遊離を指標に目的の抗原蛋白質を精製した。数人の健常人、あるいはアトピー性皮膚炎患者からサウナ浴により汗を回収し濾紙で残渣を除去した後２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．０）で希釈して０．０２μｍフィルターで濾過滅菌した。ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍを用いて陰イオン交換樹脂カラム（ｍｏｎｏＱＨＲ１０／１０，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ）で希釈した汗を分画し、そのうち目的の蛋白質を含む画分を２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．７５）で希釈して塩濃度とｐＨを調整し、陽イオン交換樹脂カラム（ｍｏｎｏＳ  ＨＲ５／５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分画した。そのうち目的の蛋白質を含む画分を２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．０）で希釈してＳＭＡＲＴ  ｓｙｓｔｅｍを用いて陰イオン交換樹脂カラム（ｍｏｎｏＱＳＰ１．６／５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分画した。そのうち目的の蛋白質を含む画分を集め、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で１０倍に希釈した後、それを逆相カラム（μ  ＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ）にてさらに分画し、これによって目的の抗原蛋白質を純粋に精製した。この画分を質量分析器Ｑ−ＴＯＦ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製）に供し、蛋白質のアミノ酸の部分配列を決定した。特にＰＩＰデータベースサーチを行ったところこのアミノ酸配列はヒトｓａｌｉｖａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＲＰ）に一致した。
また、別のロット汗のＣｏｎＡカラム吸着画分を同様に精製したところ、ヒトＰｒｏｌａｃｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＩＰ）と共に、第８４番目チロシンがメチル化されている修飾ＰＩＰが確認された。またこの修飾ＰＩＰは少なくとも１個のアルギニン残基がメチル化されていることも確認された。すなわち、精製汗抗原より得られた消化ペプチド断片をＱ−ＴＯＦにより分析した結果、チロシンおよびアルギニンに相当する部位に、各々の理論的分子量よりも１４ダルトンずつ大きな質量を有するマスが含まれていることが判明した。
さらに、アレルギー性疾患またはアレルギー性の素因を有する個人に対し、上記の精製蛋白質のそれぞれを用いて白血球ヒスタミン遊離試験などを実施したところ、高い特異性を持って反応することが確認された。
実施例２
大腸菌による組換えＰＲＰ蛋白質の作製
ヒトＰＲＰをコードするｃＤＮＡ（配列番号１のＤＮＡ配列）をヒト培養細胞株ＺＲ７５−１（ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１５００）のｃＤＮＡライブラリーよりクローニングし、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ）に組み換え、得られた発現ベクター（ｐＱＥ−ＰＲＰ）によって大腸菌Ｍ１５株を形質転換した。それを大量培養したうえで２ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して蛋白発現を誘導した。培養した大腸菌を遠心法にて菌体を集め、菌体を８モル尿素バッファーで懸濁し超音波破砕して蛋白質を可溶化した。遠心法で不溶性画分を除去し、ヒスチジンタグに対するアフィニティーカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ）で組換えＰＲＰを精製した。
実施例３
大腸菌による組換えＰＩＰの作製
ヒトＰＩＰをコードするｃＤＮＡ（配列番号３のＤＮＡ配列）をヒト培養細胞株ＺＲ７５−１のｃＤＮＡライブラリーよりクローニングし、宿主細胞として大腸菌ＪＭ１０９株を用いた以外は実施例２と同様の方法により組換えＰＩＰを精製した。
実施例４
ウサギ抗ＰＲＰポリクローナル抗体の作製
４週齢ＮＺＷウサギの背部皮膚に、実施例２で作製した組換えＰＲＰ１００μｇをＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントとともに皮下投与し、その３週間後に組換えＰＲＰ１００μｇをＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバントとともに皮下投与した。さらにその３週間後に組換えＰＲＰ１００μｇをＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントとともに皮下投与し、その３日後に耳介動脈より血液を採取した。プロテインＧカラムでＩｇＧ画分を精製し、組換えＰＲＰを固相化したイムノプレートを用いたイムノアッセイにより抗体価を測定し、ウサギ抗ＰＲＰポリクローナル抗体を作製した。
実施例５
マウス抗ＰＲＰモノクローナル抗体の作製
実施例２で作製した組換えＰＲＰをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントと混和し、マウス腹腔内に投与し、その２週間後に組換えＰＲＰをＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントと混和し、マウス腹腔内に投与した。さらに２週間後に組換えＰＲＰを腹腔内に投与し、その３日後に免疫マウスを頚椎離断にて屠殺後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓をナイロンメッシュ上で破砕し、ＲＰＭＩ培養液で細胞浮遊液とした。別途に調整しておいたマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞を脾細胞とポリエチレングリコールで細胞融合させ、ＨＡＴ培地中で培養し、骨髄腫細胞−脾細胞融合細胞（ハイブリドーマ）をマイクロタイタープレートで選択培養した。倒立顕微鏡下でコロニー形成が確認できるようになった時点で培養上清を一部回収し、抗原との結合性をイムノアッセイで確認した。抗原との結合が確認されたウェルの細胞を回収して、限界希釈しマイクロタイタープレートで培養した。同様にイムノアッセイで陽性を示すウェルの細胞を回収し、再び限界希釈にて抗体産生細胞を単クローンで回収した。この単クローン細胞株を大量培養し、培養上清をプロテインＧカラムにアプライし、ＩｇＧ画分をアフィニティー精製した。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法でＰＲＰとの結合性を確認し、抗ＰＲＰモノクローナル抗体を作製した。
実施例６
マウス抗ＰＩＰモノクローナル抗体の作製
実施例３で作製した組換えＰＩＰを免疫原とした以外は実施例５と同様の方法によって、マウス抗ＰＩＰ抗体を作製した。
実施例７
哺乳動物細胞による組換えＰＲＰの作製
実施例２と同様のＰＲＰ  ｃＤＮＡを哺乳動物用発現ベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１７）：５３２２，１９９０）に組換え、得られたプラスミド（ｐＥＦ−ＰＲＰ）をＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、その細胞（ＣＨＯ−ＰＲＰ）を大量に培養して得られた培養上清から遠心法により不溶性画分を除去し、実施例５で作製した抗ＰＲＰモノクローナル抗体を備えたアフィニティカラムにより組換えＰＲＰを精製した。
実施例８
哺乳動物細胞による組換えＰＩＰの作製
シグナル配列を除いた前記ＰＩＰ  ｃＤＮＡ（ＰＩＰｍａｔ  ＤＮＡ）を哺乳動物用発現ベクター（ｐＭＥ１８Ｓ；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８９（１２）：５２０６−５２１０，１９９２）に導入し、得られたプラスミド（ｐＭＥ１８Ｓ−ＰＩＰｍａｔ）をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。続いて組換え細胞（ＣＯＳ−ＰＩＰｍａｔ）を大量に培養し、培養上清から遠心法により不溶性画分を除去して組換えＰＩＰｍａｔを含む画分を得た。同様に、コントロールとしてｐＭＥ１８ＳベクターのみをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、その上清（ｍｏｃｋ）を調整した。
実施例９
ＰＲＰに対する被験者血清中の特異的ＩｇＥ抗体の測定
実施例２で作製した組換えＰＲＰをリン酸緩衝バッファー（ＰＢＳ）で１−５μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレートの全ウェルに分注した。室温で２時間振盪した後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で２回洗浄した。非特異的結合部位のブロッキングのため３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を加えて室温で２時間振盪した。Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄した後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで種々の濃度に希釈した被験者血清１００μｌを加えて２時間振盪した。Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄した後、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体溶液を加え室温で２時間振盪し、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄した。発色基質を加えて数分後、発色したのを確認して停止液を加え、プレートリーダーでＨＲＰのシグナルを検出した。
その結果、アトピー性皮膚炎患者の血清を試験した場合には、特異的ＩｇＥ抗体の存在が検出されたが、健常者の血清にはＰＲＰが結合するＩｇＥ抗体は検出されなかった。
実施例１０
汗中のＰＩＰ定量
実施例６で作製した抗ＰＩＰモノクローナル抗体をＰＢＳで希釈し、イムノプレートに分注した。室温で２時間放置した後Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄した後、非特異的結合部位のブロッキングのため３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を加えて室温で２時間振盪し、ＰＢＳで２回洗浄した。汗試料を各ウェル１００μｌ加えて室温で２間振盪し、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔ−ＰＢＳで希釈した抗ＰＲＰウサギポリクローナル抗体を添加して室温で２時間振盪し、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄した。ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を添加して室温で２時間振盪した後にＴ−ＰＢＳで２回洗浄し、発色基質を加えて数分後、発色したのを確認して停止液を加え、プレートリーダーでＨＲＰシグナルを検出した。
その結果、アトピー性皮膚炎患者の汗試料中には、健常者の汗試料に比べ、抗ＰＩＰモノクローナル抗体と結合する蛋白質（ＰＩＰ）がより高濃度に検出された。
実施例１０
組換えＰＲＰおよびＰＩＰのヒスタミン遊離活性
実施例２で作製した組換えＰＲＰおよび実施例３で作製した組換えＰＩＰを、各々さらにＦＰＬＣシステム（ＳＭＡＲＴ）を用いて逆相カラム（Ｃ２／Ｃ１８）で精製した。その結果、メインピークは、汗の成分を同じカラムで精製した時のヒスタミン遊離活性の溶出部位と同じ分画に現れた。また、その分画にはアトピー性皮膚炎患者の末梢血好塩基球からのヒスタミン遊離活性が検出された。その分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動したところ、１７ｋＤの位置に単一のバンドとして検出された。
以上の結果から、大腸菌で産生させた組換えＰＲＰおよび組換えＰＩＰは、アトピー性皮膚炎患者の末梢血好塩基球からヒスタミン遊離を生じさせる活性を有することが確認された。
実施例１１
哺乳動物で発現させた組換えＰＩＰおよびＰＲＰのヒスタミン遊離活性の測定
実施例８で得られた組換えＰＩＰｍａｔとｍｏｃｋをそれぞれ限界濾過法によって濃縮し、アトピー性皮膚炎患者好塩基球と反応させた。この反応によって細胞外に遊離したヒスタミン量と細胞内のヒスタミン量を測定し、ヒスタミン遊離率を調べたところ、ｍｏｃｋは遊離率１０．３％であったのに対し、組換えＰＩＰｍａｔは４０．９％と高率であった。
同様に、実施例７で作製した組換えＰＲＰにもヒスタミン遊離活性のあることを確認した。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、アトピー性皮膚炎の原因因子として、患者自らが産生するアトピー性皮膚炎誘引蛋白質と、この蛋白質の一部であって、その抗原性に関与するペプチドが提供される。さらに、前記の蛋白質および／またはペプチドを用いたアトピー性皮膚炎の診断方法と、それらを有効成分とするアトピー性皮膚炎の減感作治療薬が提供される。アトピー性皮膚炎の症状の程度や発症の危険性を高精度で診断することが可能となり、また効果的な治療が可能となる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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