(57)【要約】非ステロイド性抗炎症薬および筋弛緩薬が、ウィルスベクターの搭載遺伝子の発現を抑制することを見出した。これらの薬剤は、ウィルスベクターによる細胞傷害性も抑制した。本発明は、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を用いてウィルスベクター搭載遺伝子発現を制御する方法を提供する。薬剤による効果は可逆的であり、薬剤の投与を止めるとウィルスベクターからの遺伝子発現は再び上昇し、ウィルスベクターによる細胞傷害性の上昇が観察された。本発明の薬剤は、遺伝子治療用ウィルスベクターを用いた遣伝子治療におけるウィルス遺伝子および治療遺伝子の発現制御、並びに該ウィルスベクターによる細胞傷害性の抑制に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬をウィルスベクター導入細胞に接触させる工程を含む、該ウィルスベクターが搭載する遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項２】
ウィルスベクターによる細胞傷害を減弱させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非ステロイド性抗炎症薬が、アスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク、およびメフェナム酸からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非ステロイド性抗炎症薬が、アスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、およびインドメタシンからなる群より選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非ステロイド性抗炎症薬が、アスピリンおよび／またはケトプロフェンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
筋弛緩薬がパパベリンである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウィルスベクターが、マイナス鎖ＲＮＡウィルスベクターである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
マイナス鎖ＲＮＡウィルスが、パラミクソウィルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を含む、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現抑制剤。
【請求項１１】
ウィルスベクターによる細胞傷害を減弱させる作用を有する請求項１０に記載の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は非ステロイド性抗炎症薬等を用いてウィルスベクター搭載遺伝子発現を制御する方法に関する。
背景技術
ウィルスベクターは細胞への遺伝子導入効率が高く、導入遺伝子の高い発現が得られることから、遺伝子治療を含めた多くの遺伝子導入法において用いられている。しかしながら、細胞に導入されたウィルスベクターからの導入遺伝子の発現を制御する方法はほとんど知られていない。ウィルスベクターが搭載する遺伝子の発現を制御したり、あるいはウィルスによる細胞傷害性を低減させる方法の開発が望まれている。
Ｃｈｅｎらは、水疱性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）の増殖が、アスピリンにより抑制されることを報告している（Ｃｈｅｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６，４４−５１（２０００））。しかしＣｈｅｎらは水疱性口内炎ウィルスが搭載する遺伝子の発現に与えるアスピリンの作用については開示していない。さらに、アスピリンを遺伝子導入用ベクターの搭載遺伝子の発現制御に使用することについては全く示唆していない。またアスピリンを取り除いたときにウィルスの増殖性が可逆的に制御可能であるかということについてもＣｈｅｎらは検討していない。
他方、近年ウィルス遺伝子の操作により、腫瘍細胞におけるウィルス増殖能を保ちつつ、正常組織における病原性を消失した、増殖性ウィルスベクターの開発が進んでいる。そのなかでも増殖性ウィルスベクターとして単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶベクター）、アデノウィルス、およびレオウィルスが注目されている。また遺伝子発現ベクターの増殖性ウィルスの効果を高める方法として、免疫遺伝子治療および自殺遺伝子治療が注目されている。さらに特異性を高めるために、増殖性ウィルスベクターに対して組織特異的プロモーターの利用も試みられている（脳腫ようの遺伝子診断・治療  遺伝子治療研究の最前線  増殖性ウィルスベクターを用いた脳腫よう治療，藤堂具紀，脳の科学，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５，３７９−３８７，２００１）。なかでも、ベクターとしてのＨＳＶの特徴は、一過性の目的遺伝子の発現であり、また神経細胞等の非分裂細胞にも導入可能であるという点である。ＨＳＶベクターについて以下の性能が注目されている。１）ＨＳＶの細胞傷害性の利用、２）特定の腫瘍細胞のみを攻撃する、肝細胞癌特異的組換ＨＳＶ株の利用、３）アンプリコンプラスミド及びヘルパーＨＳＶを利用した欠損ＨＳＶの利用などである（遺伝子治療用ウィルスベクターの開発と展望  遺伝子治療用ベクターとしての単純ヘルペスウィルス，宮武伸一，ウィルス，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．２，２３９−２４６，１９９７）。
細胞傷害性の治療に対する積極的な活用は単純ヘルペスウィルス、アデノウィルス、およびレオウィルスをベースとしたウィルスベクターの利点であるが、これらのベクターの生産はやはり細胞で生産せざる得ないため、医薬に応用するための大量のウィルスを生産する場合、この利点が両刃の剣となり、培養細胞から十分なウィルスを得ることができないという欠点を持っている。細胞傷害性を制御する薬剤を培養時に利用することができれば、薬剤を添加することでウィルスを得ることが期待できる。
発明の開示
本発明は、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を用いてウィルスベクター搭載遺伝子発現を制御する方法、およびウィルスベクター搭載遺伝子発現を制御するための薬剤を提供する。本発明者らは、ヒトを含めた哺乳動物に適用される様々な薬剤が、ウィルスベクターの搭載遺伝子の発現にどのように影響するのかを鋭意研究した。その結果、驚くべきことに、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤとも称す）および筋弛緩薬が、ウィルスベクターからの遺伝子発現を有意に抑制する活性を示すことを見出した。ウィルスベクター導入細胞からのベクター搭載遺伝子の発現に対する抑制効果は、アスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク、およびメフェナム酸を含む調べた全ての非ステロイド性抗炎症薬で顕著に見出された。さらに平滑筋弛緩薬であるパパベリンも、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現に対する強い抑制効果が見出された。
ウィルスベクター導入細胞において、ベクター導入により惹起する細胞傷害性に対するこれらの薬剤の投与効果を検査したところ、特にアスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、およびインドメタシンは、細胞傷害性を減弱させる強い効果を有していることが判明した。中でもアスピリンおよびケトプロフェンは細胞傷害性の抑制効果が特に高いことが明らかとなった。
アスピリンについて、ウィルスベクター搭載遺伝子発現の抑制効果を詳しく調べたところ、この抑制作用は一過的なものであり、薬剤の適用を中止すると短い日数のうちにベクター搭載遺伝子の発現の抑制が解除されることが判明した。この知見は、ベクター搭載遺伝子の発現を抑制したい場合、あるいはウィルスベクターによる細胞傷害性を抑制する必要が生じた場合に本発明の薬剤を適用することでその目的を達成することができ、必要がなくなれば薬剤の適用を中止することによりウィルスベクターからの発現を可逆的に制御できることを示している。すなわち、本発明によりベクター搭載遺伝子の発現をダイナミックに制御することが可能となる。
本発明の薬剤は、特に遺伝子治療などの臨床場面においてウィルスベクターにより導入した治療遺伝子等のウィルス搭載遺伝子の発現レベルおよび細胞傷害性を迅速に制御することを可能とする。本発明は、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を用いてウィルスベクター搭載遺伝子発現を制御する方法、およびウィルスベクター搭載遺伝子発現を制御するための薬剤に関し、より具体的には、
（１）非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬をウィルスベクター導入細胞に接触させる工程を含む、該ウィルスベクターが搭載する遺伝子の発現を抑制する方法、
（２）ウィルスベクターによる細胞傷害を減弱させる（１）に記載の方法、
（３）非ステロイド性抗炎症薬が、アスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク、およびメフェナム酸からなる群より選択される（１）に記載の方法、
（４）非ステロイド性抗炎症薬が、アスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、およびインドメタシンからなる群より選択される（３）に記載の方法、
（５）非ステロイド性抗炎症薬が、アスピリンおよび／またはケトプロフェンである（４）に記載の方法、
（６）筋弛緩薬がパパベリンである（１）に記載の方法、
（７）ウィルスベクターが、マイナス鎖ＲＮＡウィルスベクターである、（１）から（６）のいずれかに記載の方法、
（８）マイナス鎖ＲＮＡウィルスが、パラミクソウィルスである、（７）に記載の方法、
（９）パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、（８）に記載の方法、
（１０）非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を含む、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現抑制剤、
（１１）ウィルスベクターによる細胞傷害を減弱させる作用を有する（１０）に記載の抑制剤、に関する。
本発明は、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現を制御する方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬をウィルスベクター導入細胞に接触させる工程を含む方法である。非ステロイド性抗炎症薬および筋弛緩薬としては特に制限はなく、所望の非ステロイド性抗炎症薬および筋弛緩薬を単独で、または複数組み合わせて用いることができる。
非ステロイド性抗炎症薬とはステロイド以外で抗炎症作用を持つ薬物群を指す総称で、アスピリン様薬物（ａｓｐｉｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｒｕｇｓ）とも呼ばれる（グッドマン・ギルマン薬理書，ｐ７７５）。特に酸性非ステロイド性抗炎症薬がプロスタグランディンの生合成を抑制する（Ｖａｎｅ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂｏｔｔｉｎｇ，Ｒ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１，８９−９６（１９８７）；Ｖａｎｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｎａｔ．Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．２３１（２５），２３２−２３５（１９７１））ことが知られている。非ステロイド性抗炎症薬としては、例えば、サリチル酸系（サリチル酸、アスピリン、アスピリンＤＬリジン、などのアスピリン塩、ジスルファニル）、アリール酢酸系（インドメタシン、ジクロフェナク、スリンダク、ナブメトン、プログルメタシン、インドメタシンファネシル、エトドラク）、プロピオン酸系（イブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、チアプロフェン、プラノプロフェン、ロキソプロフェン、アルミノプロフェン、ケトプロフェン）、フェナム酸系（メフェナム酸、トルフェナム酸）、ピラゾロン系（フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン）、オキシカム系（ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム）がある。非酸性の非ステロイド性抗炎症薬としてはエピリゾール、チアラミド、エモルファゾンを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の薬剤とすることができる非ステロイド性抗炎症薬としては酸性非ステロイド性抗炎症薬が好ましく、より好ましい非ステロイド性抗炎症薬としては、特にアスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク（ジクロフェナク・ナトリウムを含む）、およびメフェナム酸が挙げられる。より好ましい非ステロイド性抗炎症薬としてはアスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、およびインドメタシンが挙げられ、特にアスピリンおよびケトプロフェンは最も好ましい非ステロイド性抗炎症薬に含まれる。
本発明において使用される筋弛緩薬としては、例えば骨格筋弛緩薬（ツボクラリン、スキサメトニウム、デカメトニウム、ダントレロン）、平滑筋弛緩薬（パパベリン、リトドリン、テルブタリン、硫酸マグネシウム）を挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の薬剤とすることができる好ましい筋弛緩薬としては平滑筋弛緩薬が挙げられ、特に平滑筋弛緩薬として作用するアヘンアルカロイド、中でもイソキノリン誘導体が好ましく、例えばパパベリンが挙げられる。
上記の非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬は、塩（例えばナトリウム塩）、水和物、または錯体等の形態も含まれる。また同族体、アナログ、誘導体、エステルなども含まれる。本発明の薬剤は、ウィルスベクター導入細胞における該ウィルスベクターが搭載する遺伝子の発現を抑制するための試薬並びに医薬または医薬品原料として有用である。また、ウィルスベクターによる細胞傷害を減弱させるための試薬並びに医薬または医薬品原料として有用である。
本発明の方法においてウィルスベクター導入細胞における該ウィルスベクターが搭載する遺伝子の発現を抑制するには、該細胞に非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を接触させる。接触の操作は、ウィルスベクターを細胞に導入する前に行ってもよく、同時、あるいはウィルスベクターの導入後に行ってもよい。これらの態様は全て本発明に含まれる。ウィルスベクター導入細胞に本発明の薬剤が接触することにより、該細胞におけるウィルスベクター搭載遺伝子の発現が抑制される。
本発明においてウィルスベクター搭載遺伝子とは、該ベクターにより細胞に導入される遺伝子を言う。これらの遺伝子には、細胞で発現させるためにベクターに組み込まれている外来遺伝子、およびウィルスベクターが元来保持しているウィルス遺伝子、およびベクターが保持しうるマーカー遺伝子など、ウィルスベクターにより細胞に導入される全ての遺伝子が含まれる。また、遺伝子とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる。一般に、遺伝子は蛋白質をコードしてもよく、また蛋白質をコードしていなくてもよい。例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。
本発明の方法は、特にウィルスベクターに搭載された外来遺伝子の発現を制御するために好適に用いられる。例えば、外来遺伝子を発現するウィルスベクターを導入した細胞においては、本発明の方法により外来遺伝子の発現を抑制することができる。例えばウィルスベクターを用いた遺伝子治療において、治療遺伝子の高レベルの発現が望まない副作用を示す場合に、本発明の方法により治療遺伝子の発現を抑制することが可能となる。外来遺伝子としては制限はなく、例えばベクター導入の対象となる宿主で機能し得る生理活性蛋白質などが挙げられ、具体的にはサイトカイン／ケモカイン、ホルモン、酵素、可溶性受容体、抗体断片などが含まれる。
また本発明の方法により、ウィルスベクターが持つウィルス遺伝子などの発現を抑制することもできる。ベクターが有するウィルス遺伝子から発現される蛋白質は、導入細胞で発現することにより細胞傷害性を惹起するものが多く知られている。本発明の方法を用いてウィルスベクター搭載遺伝子の発現を抑制することにより、ウィルスベクターによる細胞傷害性を減弱させることができる。先に述べたように、単純ヘルペスウィルス、アデノウィルス、およびレオウィルスをベースとしたウィルスベクターは細胞傷害性を持っている。本発明はこれらのウィルスベクターによる細胞傷害を抑制するために有用である。
本発明の方法により所望のウィルスベクターの搭載遺伝子の発現を抑制することできる。特に本発明の方法の適用には哺乳動物細胞感染性ウィルスベクターが好ましく、これらには例えば、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどが挙げられ、好ましくは単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、レオウィルスベクター、セムリキ森林ウィルスベクター、シンドビスウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、およびフォウルポックスウィルスベクターが挙げられ、最も好ましくは狂犬病ウィルスベクター、麻疹ウィルスベクター、センダイウィルスベクターなどのマイナス鎖ＲＮＡウィルスベクターが挙げられるがこれらに制限されない。また上記のように、細胞傷害性を持つウィルスベクターは本発明の方法の適用に好適である。本発明は、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬をウィルスベクター導入細胞に接触させる工程を含む、ウィルスベクターによる細胞傷害を減弱させる方法を提供する。非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を含む薬剤は、ウィルスベクターによる細胞傷害を減弱させるための薬剤となる。
本発明において、マイナス鎖ＲＮＡウィルスとは、マイナス鎖（ネガティブ鎖）をゲノムに持つＲＮＡウィルスを言う。マイナス鎖ＲＮＡウィルスとしては、例えばパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、オルトミクソウィルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のインフルエンザウィルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ラブドウィルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）の水疱性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウィルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。中でも本発明の方法の適用においてより好ましいマイナス鎖ＲＮＡウィルスベクターは非分節型（すなわち一本鎖の）マイナス鎖ＲＮＡウィルスであり、さらに好ましくはパラミクソウィルスである。
本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウィルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウィルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、例えばパラミクソウィルス科のセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウィルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウィルス１，２，３型等が挙げられる。本発明においてパラミクソウィルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスであり、より好ましくはレスピロウィルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明の適用に特に好ましいレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明の方法の適用に最も好ましいパラミクソウィルスはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および入為的に構築された株などに由来してもよい。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウィルスの搭載遺伝子発現も、本発明の方法により抑制することが可能である。
本発明において「マイナス鎖ＲＮＡウィルスベクター」とは、マイナス鎖ＲＮＡウィルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクターを指す。ベクターとは、遺伝子を細胞に導入するための担体である。本発明の方法により、複製能を有する（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔな）マイナス鎖ＲＮＡウィルスベクターおよび複製能を有さない（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔな）マイナス鎖ＲＮＡウィルスベクターの両方において、ベクター搭載遺伝子の発現を抑制することができる。特に複製能を有するマイナス鎖ＲＮＡウィルスベクターが導入された細胞に対して本発明の方法を適用すれば、該ウィルスベクターの複製を抑制することもできる。これにより、ウィルスベクターの過度な増幅や拡散を阻止することができる。
本発明の方法によれば、ウィルスベクターの搭載遺伝子の発現を可逆的に抑制することができる。すなわち、本発明の薬剤をベクター導入細胞に接触させている間は、ウィルスベクターの搭載遺伝子の発現が抑制され、ベクターにより惹起し得る細胞傷害性を抑制することができる。薬剤適用を停止することにより、ベクター搭載遺伝子の発現抑制は解除される。本発明の方法は、インビボおよびインビトロ（エクスビボを含む）において使用することができる。インビボでの適用においては、本発明の薬剤は生体内に投与することによりウィルス導入細胞に接触させる。投与ルートは薬剤がウィルス導入細胞に接触する限り制限はなく、有効成分の性質に応じて、例えば経口的、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。インビトロ（エクスビボを含む）での適用においては、本発明の薬剤は標的細胞に接触するように添加される。例えば細胞培養液に添加される。
適用される薬剤の濃度は特に限定されない。薬剤の種類、塩の種類、投与経路などにより適宜決定すればよい。一般に、薬剤の用量に依存してウィルス搭載遺伝子に対する発現抑制効果は高まることが期待されるが、薬剤によっては高用量で細胞毒性が現れる可能性がある。当業者であれば、個々の薬剤の種類や使用目的に応じて濃度や投与量は調整することができる。例えば、アスピリンの経口投与の場合、１回０．５〜１．５ｇ、１日１．５〜４．５ｇを標準的な投与量とし、推定中毒量３００ｍｇ／Ｋｇ（ＬＤ５０１７５０ｍｇ／Ｋｇの１／６）を超えない量を限度量とすることが好ましい。
本発明の方法の適用対象となる生物としては、ウィルスベクターによる遺伝子導入が可能である限り特に制限はない。例えば、ニワトリ、ウズラ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類および哺乳動物が挙げられる。本発明の方法をインビトロ（エクスビボを含む）で用いる場合は、適用個体としては、例えばヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類などが挙げられる。本発明の方法をインビボで用いる場合は、適用個体としては特に非ヒト哺乳動物および鳥類などが挙げられる。
本発明は、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現を制御するための薬剤を提供する。具体的には、本発明は、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬を含む、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現抑制剤を提供する。本発明の薬剤には、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現を抑制するための試薬および医薬が含まれる。本発明の薬剤は、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬自体であってもよく、また、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤等と適宜組み合わせて組成物としてもよい。これらは混ぜ合わさっていてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。また、本発明の薬剤は公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化することができる。また本発明の薬剤は、水溶液、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、吸入液、軟膏、貼付剤、または坐剤などの形態であり得る。製剤における非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬の含有率は適宜決定すればよい。
例えば、経口製剤を製造するには、非ステロイド性抗炎症薬および／または筋弛緩薬の１種以上に、賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とすることができる。
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが挙げられる。結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、植物油などが挙げられる。着色剤および矯味矯臭剤としては医薬品に添加することができる様々な化合物が知られている。これらは錠剤、マイクロカプセル、または顆粒剤であってよく、例えば糖衣またはその他のコーティングがされていてもよい。
注射用製剤を製造するには、主剤にｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤などを加え、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化することができる。製剤化において用いられる基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。使用する基剤原料として具体的には、例えば動物油、植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられる。さらに必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができるがこれらに限定されない。
本発明の薬剤は、所望の投与経路で投与されてよく、上記の通り、例えば経口的、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうる。また、全身的または局所的に投与され得る。投与量、投与方法は、医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者等の投与対象の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。投与は１回から数回に分けて行うことができる。本発明の薬剤は、所望の培養細胞系および個体に適用することができる。対象となる個体および細胞の由来は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなどの任意の哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。特に、本発明の薬剤は、ウィルスベクターを用いたヒト遺伝子治療におけるベクター搭載遺伝子の発現制御のために有用である。また本発明の薬剤は、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現の可逆的抑制剤としても有用である。
特に適した投与経路においては、例えば本発明の薬剤は、皮下及び角質層の直下または近傍に投与されたベクターの発現量を、皮内の局所でコントロールするための経皮吸収製剤として調製されることが好ましい。経皮吸収製剤は軟膏、パップ、テープなどの剤型であっても良く、配合する基材、助剤及び賦形剤として通常医薬品及び化粧品に配合される成分が好ましい。たとえば、粘着性樹脂材料（ポリテルペン樹脂、炭化水素樹脂等）、天然ゴム又は合成ゴム（ポリイソブチレン、スチレン−ブチレン重合体、スチレン−イソプレン重合体、スチレン−エチレン−ブチレン重合体、１，４−ポリイソプレン等）またはガラクトマンナンなどの水中で膨潤することのできるポリマーを主成分とする貼付剤であっても良く、ポリエチレングリコールと脂肪酸エステルが配合されていてもよい。用いられる脂肪酸エステルは具体的にはオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸コレステリル、アジピン酸ジイソプロピルなどがあげられる。用いられるポリエチレングリコールは具体的にはポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール１０００、ポリエチレングリコール１５００、ポリエチレングリコール１５４０、ポリエチレングリコール４０００などがあげられる。必要に応じ、これらの配合に吸水高分子が含まれていてもかまわない。例えば吸水高分子は、好ましくは自重の１０倍以上の水を吸収しゲル化膨潤するものであって、好ましくは微粉体のもので、カルボキシメチルセルロース及びその金属塩、カルボキシメチルポリマー等に軽度の架橋結合を導入したもの、ポリアクリル酸及びその金属塩、ナトリウム塩、カルボキシメチル化されたポリビニルアルコール、又はデンプンアクリロニトリルグラフトケン化物金属塩等があげられる。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において引用された文献は、全て本明細書の一部として組込まれる。
［実施例１］  アスピリン添加によるＳｅＶ転写複製抑制
ＮＳＡＩＤｓの最も代表的な薬剤としてまずアスピリン［ａｓｐｉｒｉｎ；アセチルサリチル酸（ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）とも言う］を選択し、センダイウィルス（ＳｅＶ）の増殖（転写複製）に影響を与えるか否かに関して検証した。評価法としては、抗ウィルス剤的な評価ではなく発現制御という観点からの評価を行う為に、ＳｅＶ感染２日後で、ある程度ウィルスが増えた状態でアスピリン（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加するという方法で行った。
サル腎由来細胞であるＬＬＣ−ＭＫ２を６ｗｅｌｌ培養プレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１０％ウシ血清（ＦＢＳ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で、３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター下、２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）及び緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）両遺伝子を搭載したＦ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ：図１）をｍ．ｏ．ｉ．３で感染した。使用したＦ欠失型ＳｅＶはＬｉらの方法で調製したものである（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）。感染後は血清を含まないＭＥＭで培養を継続し、２日後に０．６２５，１．２５，２．５，５ｍＭのアスピリンを含む或いは含まないＭＥＭ（血清無し）に置換し２日毎に培養上清を回収し、同時に新しい同条件の培地を添加し経時的にサンプリングを行った。回収した上清について、ビリオン形成量の指標となる赤血球凝集活性（ＨＡ活性）、細胞傷害性の指標となる乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＬＤＨ）定量及び搭載遺伝子発現量の指標となるＳＥＡＰ活性測定を行った。また、経時的に蛍光顕微鏡で観察しＧＦＰ発現量や細胞傷害性の観察を行った。
ＨＡ活性はＫａｔｏらの方法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６）））に倣って行った。即ち、丸底の９６穴プレートを使用し、ウィルス液を段階的にＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で希釈し各ｗｅｌｌ  ５０μＬの２倍希釈系列を作製した。その５０μＬに１％濃度にＰＢＳで希釈したニワトリ保存血（コスモバイオ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）５０μＬを混合し、４℃で１時間放置し赤血球の凝集を観察し、凝集したもののうち最もウィルス希釈率の高いものの希釈率をＨＡ活性として判定した。また、１ＨＡＵを１×１０６ウィルスと換算して、ウィルス数で表した。５ｍＭアスピリン添加によりＨＡ活性上昇は抑制しており、ビリオン形成量が減少したと判断された（図２（Ａ））。ＬＤＨ定量はＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。アスピリン濃度依存的にＬＤＨ放出量が減少し、特に５ｍＭアスピリン存在下においては殆ど傷害が観察されなかった（図２（Ｂ））。ＳＥＡＰ活性測定はＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＳＥＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って測定した。ＳＥＡＰ活性変化に関してもアスピリン濃度依存的に減少し、アスピリン５ｍＭでの減少が顕著であった（図２（Ｃ））。
アスピリン添加４日後（ＳｅＶ感染６日後）及び添加６日後（ＳｅＶ感染８日後）の蛍光顕微鏡下の写真を図３に示した。アスピリン濃度依存的にＧＦＰ発現量が減少し、細胞傷害性も減弱していることが確認され、アスピリン５ｍＭ添加条件での作用が顕著であった。
転写複製量を別の観点から評価する為に、ウィルス蛋白をウェスタンブロッティングによって半定量的に解析した。上述と同サンプル、即ちＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、２日後にアスピリンを添加後２日毎に回収した培養上清、及びアスピリン処理６日後（感染８日後）に回収した細胞を用いた。培養上清は４８，０００ｇで４５分間遠心しウィルス蛋白を回収し、細胞は直接セルスクレーパーで回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロッティングを行い、抗Ｍ抗体及び主にＮＰ蛋白を認識するＤＮ−１抗体（共にラビットポリクローナル）で検出した。ウェスタンブロッティングは以下の方法で行った。６ｗｅｌｌ培養プレートの１ｗｅｌｌから回収した細胞（−８０℃で凍結保存後のもの）及び培養上清から調製したウィルス蛋白について、１×に希釈したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（Ｒｅｄ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐａｃｋ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１００μＬで溶解し、９８℃で１０分間加熱した。遠心後、上清１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（マルチゲル１０／２０；Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にロードした。１５ｍＡで２．５時間泳動後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にセミドライ法にて１００ｍＡで１時間転写した。転写膜をブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ；Ｓｎｏｗ  Ｂｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）で４℃１時間以上放置した後、１０％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含み抗Ｍ抗体を１／４０００容量或いはＤＮ−１抗体を１／１０００容量添加した一次抗体溶液に浸し、４℃で一晩放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３回、更にＴＢＳで３回洗浄した後、１０％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含みＨＲＰを結合した抗ラビットＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｇｏａｔ）Ｈ＋Ｌ  ｃｏｎｊ．；ＩＣＮ  Ｐ．，Ａｕｒｏｌａ，ＯＨ）を１／５０００容量添加した二次抗体溶液に浸し、室温で１時間振盪した。ＴＢＳＴで３回、ＴＢＳで３回洗浄した後、化学発光法（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により検出した。培養上清中のウィルス蛋白及び感染細胞中のウィルス蛋白共にウィルス蛋白量が減少していることが確認された（図４）。また、抗Ｍ抗体で半定量的に解析した結果（図５）がＨＡ活性値（図２（Ａ））と非常に良い相関を示し、アスピリン添加によってＳｅｖ転写複製抑制が間違いなく生じているものと判断された。
［実施例２］  アスピリン添加処理期間のＳｅＶ転写複製抑制活性への影響
確認されたアスピリン添加によるＳｅＶ転写複製抑制が添加処理期間によって影響を受けるか否か、即ちアスピリン添加が持続的か或いはトランジエントな効果であるかを判断する為に、アスピリンを添加する処理期間を変えて、その後のウィルス増殖の違いを調べた。
実施例１記載と同様の方法で行った。即ち、ＬＬＣ−ＭＫ２を６ｗｅｌｌ培養プレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１０％ウシ血清を含むＭＥＭ培地で、３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター下、２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染した。感染後は血清を含まないＭＥＭで培養を継続し、２日後に５ｍＭのアスピリンを含むＭＥＭ（血清無し）に置換し２日毎に培養上清を回収し、同時に５ｍＭのアスピリンを含む或いは含まない新しい培地を添加し経時的にサンプリングを行った。アスピリン処理は０，２，４，６及び８日間の処理で違いを調べた。回収した上清について、ＨＡ活性、ＬＤＨ定量及びＳＥＡＰ活性測定を行った。また、経時的に蛍光顕微鏡で観察しＧＦＰ発現量や細胞傷害性の観察を行った。
ＨＡ活性変化（図６）では、アスピリン処理期間中はＨＡ活性の上昇が少ない、即ちビリオン形成が抑制されているが、処理を終了した２日後にはＨＡの上昇が見られビリオン形成が亢進していた。重要なのはこの現象が処理期間に因らずに見られている点であり、アスピリン添加効果がトランジエントであることを示している。ＬＤＨ量は更に２日遅れで反応し、アスピリン処理を終了した４日後にＬＤＨ放出量の上昇が見られ、ＨＡ活性と同様に同じ現象が処理期間に因らずに観察された（図７）。ＨＡ活性の変化よりも２日遅れで反応したのは、ウィルスの転写複製亢進（ＨＡ活性上昇）後、細胞傷害が生じＬＤＨを培地に放出するまでのタイムラグを反映していると考えられた。ＳＥＡＰ活性変化では、ＨＡ活性やＬＤＨ量変化のようなアスピリン処理開始及び解除に敏感な変化は観察されなかったが、アスピリン処理後ＳＥＡＰ活性が一度落ちて次に回復するまでに、処理終了から６日間程度掛かっている傾向が見られた（図８）。
蛍光顕微鏡像を図９に示した。結果は前述のＨＡ活性、ＬＤＨ量及びＳＥＡＰ活性変化結果を支持するものであり、アスピリン処理期間中はＧＦＰ発現量が少なく細胞傷害性も観察されないが、処理終了後のＧＦＰ発現亢進と細胞傷害性惹起が観察された。これらの変化は処理期間の長さに関わらずほとんど同じ変化を示し、アスピリンによるＳｅＶ転写複製抑制活性はトランジエントな効果であると判断された。
［実施例３］  アスピリン以外のＮＳＡＩＤｓの作用
ＳｅＶに対する転写複製抑制活性に関して、アスピリン以外の薬剤の検索を行った。評価を行った薬剤は、ケトプロフェン（Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ），フルルビプロフェン（Ｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ）（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ），インドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ），ジクロフェナクナトリウム（Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ  ｓｏｄｉｕｍ）（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ），メフェナム酸（Ｍｅｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及びＮＳＡＩＤｓではないがサイトメガロウィルスに対する増殖抑制が報告（Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １８６，４１−４６（１９８７））されており平滑筋弛緩活性のあるパパベリン（Ｐａｐａｖｅｒｉｎ）（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）である。
実施例１記載と同様の方法で行った。即ち、ＬＬＣ−ＭＫ２を６ｗｅｌｌ培養プレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１０％ウシ血清を含むＭＥＭ培地で、３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター下、２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳＥＡＰ遺伝子を有さないＦ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）をｍ．ｏ．ｉ．３で感染した。感染後は血清を含まないＭＥＭで培養を継続し、２日後に記載濃度の薬剤を含むＭＥＭ（血清無し）に置換し２日毎に培養上清を回収し、同時に新しい同条件の培地を添加し経時的にサンプリングを行った。回収した上清について、ＨＡ活性及びＬＤＨ定量を行った。また、経時的に蛍光顕微鏡で観察しＧＦＰ発現量や細胞傷害性の観察を行った。
その結果、調査した薬剤はいずれも、ＳｅＶの搭載遺伝子の発現を抑制することが判明した。調査した薬剤は大きく３つのグループに分類された。１）アスピリンと同様にＳｅＶの転写複製を抑制すると共に、細胞傷害性を減弱するケトプロフェン、２）ＳｅＶの転写複製を抑制するがその濃度では細胞傷害性を中程度に惹起するフルルビプロフェン及びインドメタシン、３）ＳｅＶの転写複製を抑制し、細胞傷害性惹起が顕著なジクロフェナクナトリウム、メフェナム酸、及びパパベリンの３グループに分類された（図１０〜１１）。これらの結果より、作用メカニズムの面での相違も予想されるが、多くのＮＳＡＩＤｓでＳｅＶの転写複製抑制は達成されることが明らかとなった。また、ＳｅＶ搭載遺伝子発現コントロールという観点からは、ＳｅＶの転写複製を抑制すると共に細胞傷害性を減弱するアスピリン及びケトプロフェンが特に有効な性質を有していると考えられた。それ以外の薬剤に関しても最終的に発現を減弱できたことから、アスピリン及びケトプロフェンと同様にベクター搭載遺伝子発現の制御の目的で使用することが可能であることが証明された。
［実施例４］  作用メカニズムの探索
アスピリンによるＶＳＶの増殖抑制の作用メカニズムに関してはＮＯによる抗ウィルス効果が指摘されている（Ｃｈｅｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６，４４−５１（２０００））。即ち、ＮＳＡＩＤｓの作用点と考えられているシクロオキシゲナーゼ（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ＣＯＸ）の活性阻害に因り、ＮＯ合成酵素（ＮＯ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＯＳ）の活性を抑制的に作用するプロスタグランディン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）Ｅ２の産生が抑制され、結果的にＮＯＳの活性化からＮＯ産生亢進が生じＶＳＶの転写複製を阻害すると考えられている。また、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１２によるＶＳＶの転写複製抑制に関してもＮＯＳの関与が示唆されている（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５９，３３４−３４１（１９９９））。そこで、ＮＳＡＩＤｓによるＳｅＶの転写複製抑制に関してもＮＯの関与について調査した。
まず、ＮＯの直接的な作用の有無を調べる為に、ＮＯ剤添加によりＳｅＶの転写複製抑制が生じるかどうかを検討した。イソソルビド・ジニトラート（Ｉｓｏｓｏｒｂｉｄｅ  Ｄｉｎｉｔｒａｔｅ）（ＩＳＤＮ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）或いはニコランジル（Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ）（中外製薬，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を添加した場合、顕著な転写複製抑制は生じなかった（図１２）。即ち、ＮＯによる直接的な影響は観察されなかった。また、実際にＳｅＶの転写複製が抑制された条件、即ち５ｍＭアスピリン添加条件或いは１ｍＭケトプロフェン添加条件にＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥ（同仁化学，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を同時添加した場合も、Ｌ−ＮＡＭＥ添加による転写複製抑制の回復等は観察されなかった（図１３）。このように、本実施例で観察された転写複製抑制作用においては、上記文献で示されているようなＮＯの関与は支持されず、異なる作用メカニズムを介している可能性が示唆される。
産業上の利用の可能性
本発明により、非ステロイド性抗炎症薬および筋弛緩薬の新たな用途が提供された。これらの薬剤を用いれば、ウィルスベクター搭載遺伝子の発現を制御し、またウィルスベクターによる細胞傷害性を抑制することが可能となる。本発明は、特に遺伝子治療において投与ベクターからのウィルス遺伝子および治療遺伝子の発現を制御するために有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、薬剤の評価に使用したＳｅＶの遺伝子構造模式図である。
図２は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に記載濃度のアスピリンを添加後、２日毎に回収した培養上清について測定したアスピリンによる濃度依存的ＳｅＶ転写複製抑制活性（Ａ）ビリオン量を反映するＨＡ活性値、（Ｂ）細胞傷害性を反映するＬＤＨ放出量、（Ｃ）搭載遺伝子発現量を反映するＳＥＡＰ活性の経時変化、を示す図である。
図３は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に記載濃度のアスピリンを添加し、添加４日後及び６日後のＧＦＰ発現量及び細胞傷害性を反映する蛍光顕微鏡写真である。
図４は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．で感染し、感染２日後に記載濃度のアスピリンを添加し、添加２日後、４日後及び６日後の培養上清を遠心後、回収されたビリオンについて（Ａ）抗Ｍ抗体或いは（Ｂ）主にＮＰを認識するＤＮ−１抗体で行ったウェスタンブロッティング解析、及び（Ｃ）アスピリンを添加６日後の細胞について、抗Ｍ抗体、ＤＮ−１抗体及び抗Ｇ３ＰＤＨ抗体で行ったウェスタンブロッティング解析結果、を示す写真である。
図５は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に記載濃度のアスピリンを添加し、添加２日後、４日後及び６日後の培養上清を遠心後、回収されたビリオンについて抗Ｍ抗体でウェスタンブロッティングを行った結果の定量化を示す図である。
図６は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に５ｍＭのアスピリンを添加後、２日毎に５ｍＭのアスピリンを含む或いは含まない新しい培地を添加し（アスピリン処理期間：０，２，４，６及び８日間）、回収した培養上清について測定したＨＡ活性変化を示す図である。
図７は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に５ｍＭのアスピリンを添加後、２日毎に５ｍＭのアスピリンを含む或いは含まない新しい培地を添加し（アスピリン処理期間：０，２，４，６及び８日間）、回収した培養上清について測定したＬＤＨ放出量変化を示す図である。
図８は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に５ｍＭのアスピリンを添加後、２日毎に５ｍＭのアスピリンを含む或いは含まない新しい培地を添加し（アスピリン処理期間：０，２，４，６及び８日間）、回収した培養上清について測定したＳＥＡＰ活性の経時変化を示す図である。
図９は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に５ｍＭのアスピリンを添加後、２日毎に５ｍＭのアスピリンを含む或いは含まない新しい培地を添加し（アスピリン処理期間：０，２，４，６及び８日間）、経時的に観察したＧＦＰ発現量及び細胞傷害性を反映する蛍光顕微鏡写真である。
図１０は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後にアスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナクナトリウム、メフェナム酸、或いはパパベリンを記載濃度で添加後、２日毎に回収した培養上清について測定したＨＡ活性値及びＬＤＨ放出量を示す図である。図１１に続く。
図１１は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後にアスピリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナクナトリウム、メフェナム酸、或いはパパベリンを記載濃度で添加後、２日毎に回収した培養上清について測定したＨＡ活性値及びＬＤＨ放出量を示す図である。図１０から続く。
図１２は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後にイソソルビド・ジニトラート（Ｉｓｏｓｏｒｂｉｄｅ  Ｄｉｎｉｔｒａｔｅ）（ＩＳＤＮ）或いはニコランジル（Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ）を記載濃度で添加後、２日毎に回収した培養上清について測定したＨＡ活性値及びＬＤＨ放出量を示す図である。
図１３は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染２日後に５ｍＭアスピリン或いは１ｍＭケトプロフェンを添加し、その直後に記載濃度のＬ−ＮＡＭＥを添加後、２日毎に回収した培養上清について測定したＨＡ活性値及びＬＤＨ放出量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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