(57)【要約】生分解性ポリエステルの諸物性を制御しうる生分解性ポリエステルの製造方法を提供する。ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を進化工学的手法よって改変し、上記ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を宿主内で発現させ、当該宿主内で効率よく多様なコポリマーを合成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を進化工学的手法によって改変する工程と、
上記ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を宿主内で発現させ、当該宿主内でコポリマーを合成する工程と
を含む生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項２】
上記宿主は、３−ヒドロキシブタン酸と炭素数３〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸とのコポリマーを生合成することを特徴とする請求の範囲１記載の生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素における１４９番目のアスパラギン及び／又は１７１番目のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を、宿主内で発現させる工程と、
当該宿主内でコポリマーを合成する工程と
を含む生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項４】
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、上記１４９番目のアスパラギンをセリンに置換したものであることを特徴とする請求の範囲３記載の生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項５】
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、上記１７１番目のアスパラギンをグリシンに置換したものであることを特徴とする請求の範囲３記載の生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項６】
請求の範囲１〜請求の範囲５いずれか１項の生分解性ポリエステルの製造方法により製造された生分解性ポリエステル。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素における１４９番目のアスパラギン及び／又は１７１番目のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
【請求項８】
上記１４９番目のアミノ酸がセリンであることを特徴とする請求の範囲７記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
【請求項９】
上記１７１番目のアミノ酸がグリシンであることを特徴とする請求の範囲７記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生分解性ポリエステルの諸物性を制御しうる生分解性ポリエステルの製造方法、所望の物性を示す生分解性ポリエステルの製造方法及び当該製造方法により得られる生分解性ポリエステル並びに所望の物性を示す生分解性ポリエステルを製造できるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素に関する。
背景技術
持続可能な社会を築いていく一環として、環境調和型の生分解性プラスチックの創製が注目されている。ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）等の微生物によって生産されるポリ３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ；ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ））は、熱可塑性及び生分解性を兼ね備えていることから、生分解性プラスチックとしての応用が検討され、既に一部で実用化が始まっている。
生分解性プラスチックを、より広範に実用化するためには、より安価な生産システムの構築及び所望の物性を示す生分解性プラスチックを自在に生産することのできる微生物の育種が重要である。これを達成するために、これまでに、新しいタイプの生分解性ポリエステル合成酵素の探索、遺伝子工学的手法による酵素生産量の増強、細胞内の生合成経路の代謝工学的改変等が試みられている。
例えば、生分解性プラスチックがコポリマーの場合には、モノマーの組成比によって当該生分解性プラスチックの諸物性を制御することができる。しかしながら、コポリマーにおけるモノマー組成比を効率的に改変する手法は特に確立されておらず、所望の物性を示す生分解性プラスチックは得られていない。
ところで、最近、酵素の性質の改変に、進化工学的手法が用いられている。進化工学的手法とは、ダーウィン進化の原理を工学的に利用するもので、具体的には、目的の酵素をコードする遺伝子に人工的に変異を誘発し、多数の変異遺伝子の中から所望の活性に改変された酵素をコードする遺伝子を選択し、それを増幅する工程を、試験管内でより迅速に行うことによって、所望の性質を有する酵素を取得する方法である。この方法は、洗剤用酵素等の改変に適用され、すでに成功例がいくつか報告されているものの、生分解性プラスチック生産系酵素の改変への応用は知られていない。
そこで、本発明は、生分解性ポリエステルの諸物性を制御しうる生分解性ポリエステルの製造方法、所望の物性を示す生分解性ポリエステルの製造方法及び当該製造方法により得られる生分解性ポリエステル並びに所望の物性を示す生分解性ポリエステルを製造できるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、進化工学的手法によって、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成に関与する酵素を所望の性質を有する酵素に改変することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を進化工学的手法によって改変し、上記ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を宿主内で発現させ、当該宿主内でコポリマーを合成することを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
（２）上記宿主は、３−ヒドロキシブタン酸と炭素数３〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸とのコポリマーを生合成することを特徴とする（１）記載の生分解性ポリエステルの製造方法。
（３）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素における１４９番目のアスパラギン及び／又は１７１番目のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を宿主内で発現させ、当該宿主内でコポリマーを合成することを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
（４）ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、上記１４９番目のアスパラギンをセリンに置換したものであることを特徴とする（３）記載の生分解性ポリエステルの製造方法。
（５）ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、上記１７１番目のアスパラギンをグリシンに置換したものであることを特徴とする（３）記載の生分解性ポリエステルの製造方法。
（６）（１）〜（５）いずれか１に記載された生分解性ポリエステルの製造方法により製造された生分解性ポリエステル。
（７）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素における１４９番目のアスパラギン及び／又は１７１番目のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（８）上記１４９番目のアミノ酸がセリンであることを特徴とする（７）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（９）上記１７１番目のアミノ酸がグリシンであることを特徴とする（７）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００１−３７６２３７号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
（配列表フリーテキスト）
配列番号２及び３は合成ＤＮＡである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る生分解性ポリエステルの製造方法は、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を進化工学的手法によって改変し、その後、進化工学的手法によって改変したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を所定の宿主内で発現させ、当該宿主内でコポリマーを合成するものである。
ここで、「ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素」とは、ポリエステル合成に必須な鍵酵素であり、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡモノマーの重合を触媒する酵素である。ポリ３−ヒドロキシアルカン酸とは、３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとし、エステル結合によって３−ヒドロキシアルカン酸が結合した重合物であって、生物によって生合成され且つ土中や水中の微生物によって分解されるエステル重合物を意味する。
一般に、細菌中でのポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成経路は、図１のように、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸を構成するモノマーユニットを供給する系（モノマー供給系）とモノマーユニットを重合する系（モノマー重合系）の２つの系から構成される。例えば、細菌中でのポリ３−ヒドロキシンアルカン酸の生合成は、図２及び３のように、３−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ、ＢｋｔＢ）やアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈｂＢ）等により構成されるアセチルＣｏＡ二量体化系や、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）や３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）等により構成される脂肪酸分解経路、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ−ＣｏＡトランスアシラーゼ（ＰｈａＧ）、３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ）、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）等により構成される脂肪酸生合成経路などを経て生合成されたモノマーユニット（図２中：（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ，（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；図３中：（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ）が、ポリ３−ヒドロキシブタン酸合成酵素やポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素によって重合されることによって行われる。ここで、ポリ３−ヒドロキシブタン酸は、３−ヒドロキシブタン酸のホモポリマーであり、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸は、炭素数４のヒドロキシブタン酸、炭素数５のヒドロキシ吉草酸、炭素数６のヒドロキシヘキサン酸、炭素数７のヒドロキシヘプタン酸、炭素数８のヒドロキシオクタン酸、炭素数９のヒドロキシノナン酸、炭素数１０のヒドロキシデカン酸及び炭素数１２のヒドロキシドデカン酸等、様々なモノマーユニットから構成される広範囲の３−ヒドロキシアルカン酸ホモポリマーを意味する。
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素は、炭素数３〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸を基質とする重合酵素である。なお、ポリ３−ヒドロキシブタン酸生合成酵素は、炭素数３〜５の短鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸を特異的な基質とする重合酵素である。したがって、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素は、ポリ３−ヒドロキシブタン酸生合成酵素と比較して基質特異性が広い酵素であるといえる。
一方、本明細書において「進化工学的手法」とは、目的のタンパク質をコードする遺伝子に対して試験管内で人為的に突然変異を誘発し、その後、所望の性質に改変されたタンパク質選択することによって、目的のタンパク質分子を改変する技術をいう。ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の進化工学的手法による改変は、具体的には以下のようにして行うことができる。
１．ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の進化工学的改変
（１）ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素（図４中「ＰＨＡ合成酵素」と記載）の比活性は、図４に示すように、産生されるポリ３−ヒドロキシアルカン酸の細胞内含量（図４中「ＰＨＡ含量」と記載）及びポリ３−ヒドロキシアルカン酸の分子量に影響し、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の基質特異性は、モノマー組成に影響する。従って、当該酵素の比活性及び基質特異性を改変することにより、産生されるポリ３−ヒドロキシアルカン酸の細胞内含量、分子量及びモノマー組成を改変することができる。
例えば、本方法においては、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来のポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素ＰｈａＣＡｃ（アミノ酸配列を配列番号１に示す。）の進化工学的改変を行う。本方法においては、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素ＰｈａＣＡｃに限らず、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６１−３株由来のポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素ＰｈａＣ１、同細菌由来のポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素ＰｈａＣ２等を使用することができる。なお、上記の各酵素をコードするＤＮＡは、それぞれの微生物由来のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ等の周知の手法によって容易に取得することができる。
ＰｈａＣＡｃは、ポリ３−ヒドロキシブタン酸ホモポリマーだけでなく、アルカン酸や油脂などの炭素源から３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のランダムコポリマーを合成できる。ポリ３−ヒドロキシブタン酸ホモポリマーは堅くて脆い性質を示すが、３−ヒドロキシブタン酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のランダムコポリマーはよりしなやかな性質を示すことから、有用な生分解性ポリエステルとして注目されている。このようなことから、ＰｈａＣＡｃの分子育種は、コポリマー組成の制御および生産性の向上を検討するのに非常に有効と考えられる。
（２）ランダム変異
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子に対してランダムに突然変異を導入し、所望の性質を示すポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素をコードする変異遺伝子を取得する。前記酵素をコードする遺伝子へのランダムな変異の導入は、変異原物質、放射線、ＰＣＲ法等を用いて、以下のようにして行うことができる。すなわち、目的の酵素遺伝子を保有する微生物を、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、ブロモデオキシウリジン等の塩基類似物質、核酸塩基の酸化的脱アミノを誘発する亜硝酸、シトシン・グアニンと反応するヒドロキシアミン、マスタードガス、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等のアルキル化試薬等の化学物質に暴露することによって行うことができる。また、放射線によるランダム変異の導入は、目的の酵素遺伝子を保有する微生物を、紫外線、Ｘ線等に放射線に暴露することによって行うことができる。
さらに、ＰＣＲ法によるランダム変異の導入は、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子の一部又は全部を含むＤＮＡ断片を鋳型とする該遺伝子の増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼの複製反応の忠実性を低める条件下でＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ配列中に複製エラーを蓄積させる、いわゆるｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法によって行うことができる。ここで、複製反応の忠実性の調節は、ＤＮＡポリメラーゼ反応におけるｐＨをアルカリ側に設定したり、反応系中のマグネシウムイオンの濃度を通常より高めに設定したり、添加する２価金属イオンをマグネシウムイオンからマンガンイオンに変えたり、基質である４種類のデオキシリボ核（４×ＮＴＰ）の濃度を変化させることによって行うことができる。例えば、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲにおけるｐＨは好ましくは８．３〜８．８、最も好ましくは８．５〜８．８である。また、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲにおけるマグネシウムイオン濃度は１５〜５０ｍＭ、好ましくは５０ｍＭである。
例えば、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来のポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素ＰｈａＣＡｃをｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法によって変異させる場合には、当該遺伝子の一部又は全部を含有するプラスミドを鋳型として、前記酵素遺伝子増幅用のプライマーを用い、忠実度の低下する条件下でＰＣＲを行う。次いで、得られたＰＣＲ断片を適当な発現ベクターに連結し、宿主細胞（例えば、大腸菌）に導入する。次いで、得られた導入宿主細胞の保有する変異処理酵素の性質を検証することにより前記酵素の改変を検証する。
（３）変異酵素の酵素学的性質の検証
上記（２）において得られたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の酵素学的性質の変化は、各変異酵素を、必要に応じて分離・精製後、比活性、基質特異性、至適温度、至適ｐＨ、温度安定性、ｐＨ安定性等の酵素学的パラメーターについて、改変前の野生型酵素と比較することにより行うことができる。
３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の比活性は、以下のようにして調べることができる。すなわち、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の比活性は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが当該酵素に取り込まれる際に遊離するＣｏＡ−ＳＨを、ＣｏＡ−ＳＨと等モルで反応するＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））がＴＮＢ−に酸化されることに伴う４１２ｎｍの吸光度の増加を測定し、以下に示す式によって比活性を算出することができる。
2003050277.tif 000002
上記の式において、ＶＴ：反応液量（ｍｌ）、ＶＥ：酵素液量（ｍｌ）、ε４１２：１５．６×１０３（Ｍ−１・ｃｍ−１）、ΔＡ４１２／分：１分間当たりの吸光度の差である。なお、その他の本発明における進化工学的改変の対象となり得る酵素の比活性は、当該技術分野において公知の文献に従って調べることができる。
また、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の基質特異性は、上記測定法において、基質として様々な種類のものを用い、それらに対する比活性を測定することによって調べることができる。
一方、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法によってポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子を変異させた場合には、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法によって得られた変異処理済ＰＣＲ断片を連結した発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成が可能な条件下で培養し、細胞内におけるポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成蓄積状況を調べる。例えば、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生産蓄積状況は、ポリ３−ヒドロキシブタン酸に特異的に染色するＮｉｌｅ  Ｒｅｄを寒天培地プレートに含有させることによって、プレート上に生育したコロニーのピンク色の呈色度合いを調べることによって判別することができる。ここで、呈色度が強い程、ポリ３−ヒドロキシブタン酸の細胞内含量が高いと評価することができ、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の活性が高いと評価することができる。また、３１２ｎｍの光照射によって発する蛍光の強度によっても高感度に観察できる［Ｓｐｉｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７１：７３−８０（１９９９）］。
また、各クローン中のポリ３−ヒドロキシブタン酸含量の正確な定量は、以下のようにして行うことができる。すなわち、ポリ３−ヒドロキシブタン酸含量が乾燥菌体重量換算で約１％以上の場合には、菌体からポリ３−ヒドロキシブタン酸を、有機溶媒（例えば、クロロホルム）により抽出後、メタノール−濃硫酸溶液中でメタノリシスさせ、３−ヒドロキシブタン酸のメチル化体をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析する方法により行うことができる。また、ポリ３−ヒドロキシブタン酸含量が乾燥菌体重量換算で約１％未満の場合には、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を、高温下濃硫酸によってクロトン酸変換（脱離反応）し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供試し、他成分と分離させ、２１０ｎｍでの吸収を分光学的に検出する方法等によって行うことができる［Ｋａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６：１３３９−１３４４（１９８３）；Ｓｅｅｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４：３１７−３２８（１９９４）］。
なお、進化工学的手法により、酵素学的性質が様々に変化したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を得られることは、例えば、縦軸を酵素活性（他には各種環境に対する安定性）、横軸をクローン番号とする適応度地形を描くことにより明瞭化することができる。
（４）酵素学的性質の改変に寄与するアミノ酸部位の特定
上記（３）において酵素学的性質の変化が認められたクローンについて、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定し、推定アミノ酸配列を野生型のアミノ酸配列と比較することにより、機能マッピング、すなわち、酵素タンパク質上において酵素学的性質の改変にどのアミノ酸が寄与しているのかを特定することができる。なお、塩基配列の決定は、当該技術分野で公知の手法（例えば、ジデオキシ法）により、自動塩基配列決定機（例えば、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー等）を用いて行うことができる。
ここで、酵素学的性質の改変が見出されたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素について、そのアミノ酸配列上に複数のアミノ酸置換が同定された場合には、それぞれのアミノ酸置換が、酵素学的性質の改変にどの程度寄与しているのかを、遺伝子工学的手法によってワンポイント変異酵素（酵素タンパク質上の１つのアミノ酸のみが別のアミノ酸に置換された変異体）を作成し調べることができる。すなわち、例えば、酵素をコードするＤＮＡ上の、変異を生じさせたい部位を含む領域を、制限酵素で除去し、代わりに所望のアミノ酸にワンポイント置換されたコドンを含むＤＮＡ断片を挿入する。これにより、１つのアミノ酸置換のみを含む変異型酵素をコードするＤＮＡを作製することができる。当該ＤＮＡを適当な発現ベクターに連結して、宿主に導入し、当該宿主中でワンポイント変異酵素を発現させ、その酵素学的性質を野生型酵素と比較することにより、酵素学的性質に影響を及ぼすそのアミノ酸の寄与度を調べることが可能である。（５）部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
上記（４）において見出された酵素学的性質の改変に寄与するアミノ酸部位に対し、部位特異的変異を導入することによって、所望の性質を有する酵素に最適化することができる。目的酵素遺伝子への部位特的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の変異を導入した変異プライマーと前記遺伝子の一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマーに対して相補的な配列を有する変異用プライマーと前記遺伝子のもう一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーでもう片側を増幅し、得られた２つの増幅断片をアニール後、さらに前記２種類の増幅用プライマーでＰＣＲをすることにより行うことができる［ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，３ｒｄ  ｅｄ，１９９５，Ｆ．Ａ．Ｓｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＩＬＥＹ］。得られた部位特異的変異構築物について、上記（３）の酵素学的性質について調べ、所望の性質に改変した酵素の活性を調べ、所望の性質を有する酵素を保有するクローンを選択する。
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
上記「１．ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の進化工学的改変」で得られたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素をコードする遺伝子を、適当なベクターに連結することによって、所定の宿主でポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を発現しうる組換えベクターを得ることができる。また、得られた組換えベクターを所定の宿主に導入することによって、当該ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を発現する形質転換体を得ることができる。
遺伝子を挿入するためのベクターは、所定の宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等をベクターとして用いることができる。
組換えベクターを導入する宿主としては、３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとし、エステル結合によって３−ヒドロキシアルカン酸を重合させポリ３−ヒドロキシアルカン酸を合成できるものであれば限定されないが、例えば、大腸菌ＬＳ５２１８（ｆａｄＲ−）、ＬＳ１２９８（ｆａｂＢ−）、ＬＳ１３００（ｆｒｅ）、ＬＳ６５９６（ｆａｄＡ３０）等のＬＳシリーズの大腸菌株を挙げることができる。これらＬＳシリーズの大腸菌株は、脂肪酸β酸化経路関連酵素遺伝子のマイナス制御因子であるｆａｄＲが破壊された変異株であり、他の大腸菌と比較して脂肪酸を効率よく代謝できるといった特徴を有している。また、宿主としては、通常の大腸菌であっても、アクリル酸（最適濃度０．２４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって脂肪酸β酸化経路を阻害することによって使用することができる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，１．８．１頁，１９９４年］やエレクトロポレーション法［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，１．８．４頁，１９９４年］等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９−１９３３（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３）］等が挙げられる。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。３．ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の製造
本発明のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、本発明の形質転換体を培地で培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に生成蓄積させ、該培養物から採取することにより製造することができる。
形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は３７℃で好気的に１２〜１４時間培養することによりポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を菌体内に蓄積させ、回収する。
炭素源は微生物の増殖に必要であり、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。窒素源としては例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。プラスミド保持用の選択圧など必要に応じて、培地中に、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の精製は、得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーターにて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単独で又は適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
４．生分解性ポリエステルの製造
上記２において得られた形質転換体を適当な培地で培養することによって、生分解性ポリエステルを製造することができる。得られたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を用いれば、形質転換体内で所望の特性を示すコポリマーを製造することができる。
ここで、コポリマーとしては、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＡ）とのコポリマー、例えば、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）とのコポリマーを例示することができる。なお、以下において、３ＨＢと３ＨＡとのコポリマーを「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）」と記載し、３ＨＢと３ＨＨｘとのコポリマーを「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）」と記載する場合もある。
すなわち、上記２において得られた形質転換体を適当な培地で培養することによって、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を製造することができる。例えば、上記２において、宿主として大腸菌ＬＳ５２１８を用いた場合には、菌体内部にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を製造することができる。
上記２で得られた形質転換体においては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）の蓄積量が多量であり、且つ、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を用いる場合と異なる組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を製造することができる。特に、上記１において、ポリ３−ヒドロキシブタン酸の細胞内含量を指標として、活性が高いと評価されたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を発現することによって、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）の蓄積量が多量であり、且つ、３ＨＡの組成比が高いポリ３−ヒドロキシアルカン酸を合成することができる。ポリ３−ヒドロキシアルカン酸において、３ＨＡの組成比が高いことにより柔軟なものとなり、実用的に優れた特性を示すこととなる。
なお、細胞内に蓄積されたポリエステルの細胞内含量及びポリエステルの組成は、加藤らの方法［Ｋａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５，３６３（１９９６）；Ｋａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６９，５１５（１９９６）］に従い、細胞からクロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出後、抽出物をガスクロマトグラフィー、ＮＭＲなどに供試することに測定・分析することができる。
実施例
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法によるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の改変
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法によって、アエロモナス・キャビエＦＡ４４０由来のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子（ＰｈａＣＡｃ）におけるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ領域にランダム変異を導入した。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法には、制限酵素ＰｓｔＩ認識配列を含む順方向プライマー５’−ｇｃｔｇｃｔｇｃａｇａｃｃａａｔｃ−３’（配列番号２）及び制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を含む逆方向プライマー５’−ｇｃｃｔｃａｔｔｔｔｇｃｇｃｃｔｃｇ−３’（配列番号３）を用い、鋳型としてＰｈａＣＡｃを含むプラスミドベクターｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢ（図５参照）を用い、ポリメラーゼの基質取り込み忠実性を低下させる条件でＰＣＲを行うことにより、変異の場所を限定することなくＰｈａＣＡｃにおけるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ領域全域への変異の導入を試みた。
ＰＣＲに際しては表１の組成となるように反応溶液を調製した。
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ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃１分間の熱変性、５０℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を１サイクルとして、２５サイクル行った。ＰＣＲには、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いた。
次いで、ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片を精製単離した後にＰｓｔＩとＸｈｏＩによって処理した。次いで、制限酵素によって処理されたＤＮＡ断片を元のプラスミドベクターｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢの同制限酵素サイトに置換挿入することにより変異型ＰｈａＣＡｃの分子集団（変異クローンのプール）を得た。変異型ＰｈａＣＡｃの分子集団には、ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ領域にランダムに突然変異が導入された様々なＰｈａＣＡｃが含まれている。
上記の操作によって得た変異型ＰｈａＣＡｃを含むプラスミドベクターｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株のコンピテント細胞に形質転換した。形質転換処理細胞を、ポリ３−ヒドリキシブタン酸を特異的に染色することができるＮｉｌｅ  Ｒｅｄ、グルコース及びアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地（０．５μｇ／ｍｌ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）上で植え、３７℃で１４時間培養することによって形質転換細胞を選別するとともに、ピンク色の度合いによって、各形質転換細胞におけるポリ３−ヒドリキシブタン酸の生産蓄積量を見積もった。
その結果、ＬＢ寒天培地上に形成された８３３７個のクローンのうち約１５％のものが上記の突然変異導入によってＰＨＢ合成能が不活性化していた。また、活性のあるクローンを、野生型のレベルと比較して同等の活性を示すＳクラス、野生型のレベルよりやや低い活性を示すＭクラス及び野生型のレベルより明らかに低い活性を示すＬクラスからなる３クラスに分類した。この分類によれば、Ｓクラスに１４５個のクローン、Ｍクラスに４３５０個のクローン及びＬクラスに２７５５個のクローンが属した。
次に、Ｓクラスに属する１４５個のクローンと、Ｍクラスに属する１２９個のクローンと、Ｌクラスに属する２３個のクローンと、不活性であった３個のクローンとにおけるＰＨＢ含有量についてＨＰＬＣを用いて分析した（合計３００個のクローン）。なお、ＨＰＬＣによる分析は、濃硫酸処理を行うことによって細胞内ＰＨＢをクロトン酸に変化させた後に行った。
詳細には、菌体を、１．５ｍｌマイクローチューブにて集菌し、凍結させた後に凍結乾燥を行った。乾燥菌体重量を測定した後、濃硫酸による菌体内ＰＨＢのクロトン酸変換を行った。クロトン酸変換は、マイクロチューブ中の乾燥菌体に対し１ｍｌの濃硫酸を加え、１２０℃、４０分間加熱した後、氷中で急冷した。なお、この操作により菌体内のＰＨＢは、高温下濃硫酸によって脱水反応がおこり、クロトン酸に変換される。
次に、冷却したサンプルを、４倍量の０．０１４Ｎ硫酸溶液にて希釈し、さらに冷却した後ＨＰＬＣサンプルとした。サンプルは、親水性ＰＶＤＦ膜、孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、１０μｌをＨＰＬＣ装置へ注入した。ＨＰＬＣ装置は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０Ａｖｐシステムを用いた。カラムは、架橋度８％スチレンジビニルベンゼンコポリマー系陽イオン交換樹脂カラムであるＢｉｏ−ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（３００  ｘ  ７．８ｍｍ）を用いた。また、ガードカラムとしてＢｉｏ−ｒａｄ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ  Ｒｅｆｉｌｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（３０  ｘ  ４．６ｍｍ）を用いた。移動層は、０．０１４Ｎ硫酸溶液を用い、流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎで測定を行った。カラム温度は６０℃に設定し、脱水反応により生成したクロトン酸のカルボニル基に由来する２１０ｎｍの吸収を分光学的に検出した。クロトン酸の保持時間は、２０．４分であった。ＰＨＢ蓄積率は、クロトン酸量と面積の関係式（検量線）を基にして算出した
３００個のクローンについてＨＰＬＣ装置を用いてＰＨＢ蓄積量を測定した結果を、図６に示す。図６は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸をクローン番号とする、いわゆる適応度地形を示す図である。図６において破線は野生型の大腸菌ＪＭ１０９におけるＰＨＢ量を示している。
図６において矢印を記した１０個のクローンについて、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性を測定した。
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性の測定に際しては、先ず、ポリエステルを蓄積しない条件である５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地にて、各プラスミドをそれぞれ宿したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を１４時間培養した後、集菌し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄後、２００μｌの前記緩衝液に再懸濁し、超音波破砕（５ｓｅｃ  ｘ  ５）した。破砕液を１８，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行うことにより、可溶性画分を得た。そして、得られた可溶性画分における（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡ）に対する重合活性を、分光学的手法により決定した。そして、この重合活性をポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性とした。
重合活性の測定は、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  Ｔ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：９３１１−９３２０に記載された手法を参考に、エルマン試薬であるＤＴＮＢによる重合反応により遊離するＣｏＡ−ＳＨを定量する下記のような手法により実施した。この方法では、ＣｏＡ−ＳＨの遊離反応を時間連続的に測定するのではなく、単位時間あたりでトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を反応系に加えることにより、タンパク質を変性させることで重合反応を停止させ、反応停止までの遊離ＣｏＡ−ＳＨ量を定量した。この方法を用いることで、チオール攻撃性のあるＤＴＮＢと活性中心としてシステインを有する酵素が反応溶液中で共存する時間なくすことができ、また遊離ＣｏＡ−ＳＨ量が少なくても定量を行える利点がある。
滅菌水、１Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、４．０８ｍＭ（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡを２５℃で１０分間予熱し、可溶性画分溶液を加え反応を開始した。所定時間反応後、２０μｌずつサンプリングし、５０μｌ  ５％  ＴＣＡにより反応を停止した。反応液を４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、可溶性画分を得た。得られた可溶性画分６２．５μｌに、３３７．５μｌ  ５００ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５μｌ  １０ｍＭ  ＤＴＮＢ（５００ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解）を加え、２分間室温に置き、生成するＴＮＢアニオンを４１２ｎｍで測定した。ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性は、１分間あたりに１μｍｏｌのＴＮＢアニオンを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
１０個のクローンについて、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性を測定した結果を図７に示す。図７に示したように、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性及びＰＨＢ蓄積量は、ＰＨＢ蓄積量が４５ｗｔ％程度までは直線的な関係を保って上昇するが、ＰＨＢ蓄積量が約５５ｗｔ％を超えると、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性が上昇してもＰＨＢ蓄積量が比較的に増加しなくなる。これは、細胞内においてＰＨＢを構成するモノマーの供給が十分でないことを示唆している。
また、図７に示したように、クローン名Ｅ２−５０及びＴ３−１１では、野生型と比較してポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性が高く、ＰＨＢ蓄積量が野生型とほぼ同等であることがわかった。また、クローン名Ｔ３−２２及びＴ３−２５では、野生型と比較してポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性が高いが、野生型と比較してＰＨＢ蓄積量が低いことがわかった。
これらＥ２−５０、Ｔ３−１１、Ｔ３−２２及びＴ３−２５について、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の発現量をウエスタンブロット法により確認した。ウエスタンブロット法では、１０μｇの可溶性タンパク質を含む細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰｈａＣＡｃのＣ末端のオリゴペプチドを特異的に認識して結合する抗血清を用いて行った。ウエスタンブロット法の結果を図８に示す。図８から判るように、これらＥ２−５０、Ｔ３−１１、Ｔ３−２２及びＴ３−２５においては、野生型と同等にポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を発現していることが判った。
以上の結果より、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法を用いてアエロモナス・キャビエＦＡ４４０由来のＰｈａＣＡｃにおけるＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ領域に突然変異を導入し、野生型に比較して活性が高く且つ、十分量のモノマーを供給する場合には野生型と比較して多量にＰＨＢを蓄積できるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素を有するクローンＥ２−５０及びＴ３−１１を得ることができた。
〔実施例２〕
実施例１で得られたＥ２−５０及びＴ３−１１について、それぞれに含まれる変異型ＰｈａＣＡｃで大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換し、形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマー蓄積量及びＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を構成するモノマーの組成について検討した。なお、大腸菌ＬＳ５２１８は、ドデカン酸からＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを合成することができる。大腸菌ＬＳ５２１８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した（寄託番号ＣＧＳＣ  ６９６６）。
先ず、実施例１で得られたＥ２−５０及びＴ３−１１それぞれについて、Ｍｉｌｌｅｒらの方法により変異型ＰｈａＣＡｃを含むプラスミドベクターｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢを精製した。次に、精製したプラスミドベクターｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢを用いて大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換した。形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８は、１０ｍＭのドデカン酸及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９培地において７２時間３７℃で培養した。当該Ｍ９培地の組成を表２に示した。
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培養後、細胞内のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマー含有量と、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を構成する３ＨＨｘモノマーの分率を測定した。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマー含有量測定及び３ＨＨｘモノマーの分率測定に際しては、先ず、約３０ｍｇの乾燥菌体を、１．７ｍｌのメタノール、０．３ｍｌの９８％硫酸及び２．０ｍｌのクロロフォルムからなる溶液で１００℃、１４０分間処理してメタノリシスさせ、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの組成物をメチルエステルに変換した。その後、反応液に１ｍｌの水を加え、相分離させた。そして、下層のクロロフォルム層をガスクロマトグラフィー分析に供した。ガスクロマトグラフィー分析は、ニュートラボンド−Ｉキャピラリーカラム及びフレームイオン化検出装置を備える島津ＧＣ−１７Ａシステムを用いて行った。
また、菌体内に蓄積されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの分子量および多分散度を測定した。分子量及び多分散度は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定した。ＧＰＣ装置には検出器としてＳｈｉｍａｄｚｕ  ＲＩＤ−１０Ａ示差屈折率検出器（島津製作所製）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  １０Ａ  ＧＰＣ  ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所製）を用いた。分離カラムは昭和電工製Ｋ−８０２（分離範囲：１５０〜５，０００）およびＳｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０６Ｍ（分離範囲：５００〜２０，０００，０００）を直列接続し使用した。測定は、カラム温度４０℃、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ、溶媒にはクロロホルムを用いて行った。分子量測定のための検量線は、低多分散度の分子量決定用ポリスチレン（Ｍｗ＝１，３２０〜３，１５０，０００の範囲で９種類）を用いて作製した。この検量線を利用し、サンプルの分子量は、すべてポリスチレン換算により算出した。
測定用のサンプルは、以下のように調製した。乾燥菌体１０ｍｇに対しクロロホルムを２０ｍＬ加え、室温で４８時間撹拌することで、菌体からＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーをクロロホルム層に抽出した。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを含むクロロホルム溶液を、孔径０．５μｍのＰＴＦＥフィルターを用いて菌体成分を除去した後に、ろ液に対して倍量となるようにヘキサンを加え、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを再沈殿させ精製した。風乾させた後、得られたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにクロロホルムに溶解し、孔径０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過することにより、ＧＰＣ測定用サンプルを調製し、分子量測定に供した。
ガスクロマトグラフィー分析の結果及び分子量測定の結果を表３に示す。
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なお、表３において、Ｍｎは数平均分子量を意味し、Ｍｗは重量平均分子量を意味する。この表３から判るように、野生型の大腸菌ＬＳ５２１８では、乾燥菌体重量において２ｗｔ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを含有し、３ＨＨｘモノマーの分率が１０±１％であった。これに対して、Ｅ２−５０及びＴ３−１１においては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマー含有量が野生型と比較してそれぞれ６．５倍及び３倍に増加していた。また、Ｅ２−５０及びＴ３−１１においては、３ＨＨｘモノマーの分率がそれぞれ１８±１％及び１６±０％となっており、野生型と比較して３ＨＨｘの分率が高いコポリマーを生産していることが判った。
また、表３から判るように、野生型の大腸菌ＬＳ５２１８では、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの数平均分子量は９８．４（×１０４）であり、多分散度は２．６であった。これに対して、Ｅ２−５０及びＴ３−１１においては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの数平均分子量はそれぞれ４８．３（×１０４）及び７５．０（×１０４）であり、多分散度はそれぞれ４．１及び３．５であった。このことから、Ｅ２−５０及びＴ３−１１においては、野生型とは異なる分子量及び多分散度のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを発現していることが明らかとなった。
これらＥ２−５０及びＴ３−１１について、精製したプラスミドベクターｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢに含まれる変異型ＰｈａＣＡｃにおける変異箇所を、塩基配列決定を行うことによって特定した。塩基配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡシーケンサー又はＰｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシーケンサーを用いたジデオキシ連鎖ターミネーション法で行った。塩基配列決定により得られた塩基配列情報は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣソフトウェア（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）又はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｉｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎからの提供）を用いて解析した。
その結果、Ｅ２−５０は、１４９番目のアスパラギンをセリンに置換する変異が導入されていた。また、Ｔ３−１１は、１７１番目のアスパラギン酸をグリシンに置換する変異が導入されていた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、生分解性ポリエステルの諸物性を制御しうる生分解性ポリエステルの製造方法、所望の物性を示す生分解性ポリエステルの製造方法及び当該製造方法により得られる生分解性ポリエステル並びに所望の物性を示す生分解性ポリエステルを製造できるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成スキームを示した図である。
図２は、細菌におけるアセチル−ＣｏＡ二量化系からのポリエステル生産とそれにかかわる酵素を示した図である。
図３は、細菌における脂肪酸代謝系からのポリエステル生産とそれにかかわる酵素を示した図である。
図４は、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素の酵素学的性質が産生されるポリ３−ヒドロキシアルカン酸の物性・生産性に及ぼす影響を示した図である。
図５は、プラスミドｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢの構造を示した図である。
図６は、３００個のクローンについてＨＰＬＣを用いてＰＨＢ蓄積量を測定した結果を適応度地形として示した図である。
図７は、１０個のクローンについて、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素活性を測定した結果を示した図である。
図８は、ＰｈａＣＡｃのＣ末端のオリゴペプチドを特異的に認識して結合する抗血清を用いて行ったウエスタンブロット法の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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