(57)【要約】被標識物質（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）との結合基を有し、希土類イオンと容易に錯体を形成し、更に該錯体が水溶液中で充分に安定であり、バッファーの種類によらず、十分な蛍光強度と長い蛍光寿命を有するという特徴を有する新規な標識試薬と、該標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体、該錯体を含んでなる蛍光標識剤、及び該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法等の提供。２，２’：６’，２’’−トリピリジン骨格又は２，６−ジピラゾールピリジン骨格を有し、標識される物質（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）との結合基と、希土類イオンとの錯形成結合基とを有する化合物からなる標識試薬、該標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体、該錯体を含んでなる蛍光標識剤及び該錯体を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法及び蛍光測定法用試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，２’：６’，２’’−トリピリジン骨格又は２，６−ジピラゾールピリジン骨格を有し、標識される物質との結合基と、希土類イオンとの錯形成結合基とを有する化合物からなる標識試薬。
【請求項２】
該化合物が一般式［１］
2003076938.tif 000020
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物である、請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項３】
該化合物が一般式［１］における基Ｒが、４’−アミノ−４−ビフェニル基である請求の範囲第２項に記載の標識試薬。
【請求項４】
該化合物が一般式［２］
2003076938.tif 000021
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物である、請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項５】
該化合物が一般式［２］における基Ｒが、４−ビフェニル基である請求の範囲第４項に記載の標識試薬。
【請求項６】
該化合物が一般式［３］
2003076938.tif 000022
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物である、請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項７】
該化合物が一般式［４］
2003076938.tif 000023
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物である、請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項８】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を含んでなる蛍光標識剤。
【請求項１０】
希土類金属イオンが三価のユウロピウムイオン、三価のサマリウムイオン、三価のテルビウムイオン又は三価のジスプロシウムイオンである請求の範囲第９項に記載の蛍光標識剤。
【請求項１１】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を標識剤として用いることを特徴とする蛍光標識方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを用いることを特徴とする蛍光標識方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を含んでなる蛍光標識剤で標識した生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１４】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを用いて蛍光標識した生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１５】
生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤（抗生物質を含む）である請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の標識した生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１６】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として用いることを特徴とする蛍光測定法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを用いることを特徴とする蛍光測定法。
【請求項１８】
蛍光測定法が、時間分解蛍光測定法である請求の範囲第１６項又は第１７項に記載の蛍光測定法。
【請求項１９】
時間分解蛍光測定法が、時間分解蛍光イムノアッセイ、時間分解蛍光ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、時間分解蛍光顕微鏡イメジング又は時間分解蛍光クロマトグラフイーである請求の範囲第１８項に記載の蛍光測定法。
【請求項２０】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として含んでなる蛍光測定法用試薬。
【請求項２１】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを含んでなる蛍光測定法用試薬。
【請求項２２】
生体由来物質又は生理活性物質を測定する請求の範囲第２０項又は第２１項に記載の蛍光測定法用試薬。
【請求項２３】
生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチト、又は薬剤（抗生物質を含む）である請求の範囲第２２項に記載の蛍光測定法用試薬。
【請求項２４】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として含んでなる試薬キット。
【請求項２５】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを含んでなる試薬キット。
【請求項２６】
一般式［１］
2003076938.tif 000024
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【請求項２７】
一般式［１−１］
2003076938.tif 000025
で示される請求の範囲第２６項に記載の化合物、又はその塩。
【請求項２８】
一般式［２］
2003076938.tif 000026
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【請求項２９】
一般式［２−１］
2003076938.tif 000027
で示される請求の範囲第２８項に記載の化合物、又はその塩。
【請求項３０】
一般式［３］
2003076938.tif 000028
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【請求項３１】
一般式［４］
2003076938.tif 000029
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規標識試薬、該標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体、該錯体を含んでなる蛍光標識剤及び該錯体を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法及び蛍光測定法用試薬に関する。
背景技術
従来から、生体試料中の微量物質の分析法として、抗体−抗原反応を利用したイムノアッセイや、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイなどがよく使用されている。これらの分析方法においては、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＤＮＡ塩基誘導体、ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどを標識する標識剤を使う必要があり、高感度検出を可能とする標識剤として、蛍光による標識、放射性アイソトープによる標識、またはエンザイム（酵素）による標識等がよく用いられている。
放射性アイソトープによる標識は高感度ではあるが、貯蔵、使用、処理に際して危険を伴う欠点がある。また、エンザイム（酵素）による標識は、酵素の分子量が大きく、温度などの外的環境に影響されやすく不安定であり、再現性が低いという問題点や、酵素標識剤を被標識物に結合させることにより、酵素及び被標識物の活性が低下してしまうという欠点がある。
また蛍光による標識方法としては、有機蛍光色素による標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロライドなど）が知られているが、励起光の散乱光によるバックグラウンドノイズやサンプル中に存在する他の共存物質の蛍光に由来するバックグラウンドノイズにより有機蛍光色素の蛍光検出が大きく妨害され、高感度の測定が困難となるという欠点がある。
蛍光による標識方法としては、この他に、希土類蛍光錯体による標識が知られている。希土類蛍光錯体は、長い蛍光寿命（普通の蛍光物質の数ナノ秒の蛍光寿命に比べて、希土類蛍光錯体は数十或いは数百マイクロ秒以上の蛍光寿命を持つ）、大きいストークスシフト、シャープな蛍光ピークという蛍光特性を有している。この特性を生かして、希土類蛍光錯体を標識剤とした時間分解蛍光測定法が既に開発されている。かかる特性により、時間分解蛍光測定を用いて、励起光や生体サンプルに由来する短寿命のバックグラウンド蛍光による妨害を除去し、高感度測定が可能となる。
希土類錯体を標識剤として用いる時間分解蛍光測定システムのひとつは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（旧Ｗａｌｌａｃ社）が開発した“ＤＥＬＦＩＡ”（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）システムがある。このシステムは、イソチオシアナトフェニル−ＥＤＴＡあるいはイソチオシアナトフェニル−ＤＴＴＡ（ＤＴＴＡ＝ジエチレントリアミン４酢酸）と希土類イオンとの錯体を標識剤として用い、タンパク質や核酸などを標識し、蛍光を測定する前に、β−ジケトン−トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）−トリトンＸ−１００を含むいわゆる蛍光増強溶液を加え、非蛍光性の錯体から希土類金属イオンを遊離させると共に、β−ジケトン−希土類イオン−ＴＯＰＯ三元錯体のミセル溶液を生成させることにより、蛍光測定を行う方法である（Ｅ．Ｓｏｉｎｉ，Ｔ．Ｌｏｖｇｒｅｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，１８，１０５−１５４；Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｔ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，６２，１１４９Ａ−１１５７Ａ；Ｉ．Ｈｅｍｍｉｌａ，Ｊ．Ａｌｌｏｙｓ  Ｃｏｍｐｄ．，１９９５，２２５，４８０−４８５）。しかし、このＤＥＬＦＩＡシステムでは、過剰のβ−ジケトンとＴＯＰＯが測定溶液中に存在し、環境からの希土類金属イオンと反応すれば、強い蛍光を発することができるため、希土類金属イオンの汚染を非常に受けやすいという大きな欠点がある。更に、ＤＥＬＦＩＡシステムは蛍光増強溶液を加える必要があり、測定のステップが多いという欠点、また固相測定が出来ないという欠点がある。
また、もうひとつの、希土類錯体を標識剤として用いる時間分解蛍光測定システムは、カナダのＤｉａｍａｎｄｉｓらが開発したＦＩＡｇｅｎシステムがある。（Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｃｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，２１，１３９−１５０；Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｐｏｌｌａｋ，Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，１９９５，６６，２０７−２３５）。ＦＩＡｇｅｎシステムは、タンパク質を直接標識できる蛍光性ユウロピウム錯体（４，７−ビス（クロロスルホフェニル）−１，１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボン酸（ＢＣＰＤＡ）−Ｅｕ３＋）を用いた測定法である。このシステムは環境からのユウロピウムの汚染の問題がなく、固相測定も可能である。しかし、このシステムの標識剤の蛍光強度は上記ＤＥＬＦＩＡシステムと比べると２桁以上弱く、検出感度が低く、高感度分析が困難であるという欠点がある。
そのほかの希土類錯体を標識剤として用いる時間分解蛍光測定システムとしては、フランスＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のＴＲＡＣＥ（ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｃｒｙｐｔａｔｅ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）測定システムがある（Ｇ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，４１，１３９１−１３９７；Ｇ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ，１９９７，２０，１４１−１４７）。このシステムでは、ユウロピウム蛍光標識剤トリス（ビピリジン）クリプテート−Ｅｕ３＋と有機蛍光標識剤アロフィコシアニンを蛍光エネルギー移動のドナーとレセプターとして用い、均一溶液中の反応が終わった後、そのまま時間分解蛍光測定ができるという利点があり、固相材料を使用せず、Ｂ／Ｆ分離や洗浄操作がないというメリットがあるが、感度が低いという欠点があるため、高感度の測定に応用することができない。
上記の希土類蛍光錯体標識剤とそれらを用いた時間分解蛍光測定法の欠点を克服するために、本発明者らはすでに、アミノ基を持つタンパク質を直接標識できるクロロスルホニル化４座β−ジケトン型の標識剤を開発し、それらを用いた時間分解蛍光測定法への応用を検討してきた（特開平９−２４１２３３号公報；特開２０００−１１１４８０号公報；Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｇ，Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｍａｊｉｍａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，７３，１８６９−１８７６；Ｓ．Ｓｕｅｄａ，Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０００，１１，８２７−８３１；Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｇ，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，２７６，８１−８７；Ｊ．Ｙｕａｎ．Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，５９６−６０１；Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｇ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２５４，２８３−２８７）。
しかし、上記クロロスルホニル化４座β−ジケトン型の標識剤は一般的に水溶性が乏しいため、小さい生体物質（例えば、アミノ基を持つ分子量の小さい核酸塩基やそのほかの有機化合物）を標識すると、標識された生体物質体の水溶性が低下し、溶液中から沈殿してしまうという欠点がある。また、キレート力が十分でないため、使用できるバッファーの種類に制限があるという欠点もある。そのため、これらの物質の直接標識への応用は困難を伴う。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては次のものがある。
１．  特開平９−２４１２３３号公報
２．  特開２０００−１１１４８０号公報
３．  Ｅ．Ｓｏｉｎｉ，Ｔ．Ｌｏｖｇｒｅｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，１９８７，１８，１０５−１５４；
４．  Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｔ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，６２，１１４９Ａ−１１５７Ａ
５．  Ｉ．Ｈｅｍｍｉｌａ，Ｊ．Ａｌｌｏｙｓ  Ｃｏｍｐｄ．，１９９５，２２５，４８０−４８５
６．  Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｐｏｌｌａｋ，Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，１９９５，６６，２０７−２３５
７．  Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，２１，１３９−１５０
８．  Ｇ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，４１，１３９１−１３９７
９．  Ｇ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ，１９９７，２０，１４１−１４７
１０．  Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｇ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｍａｊｉｍａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，７３，１８６９−１８７６；
１１．  Ｓ．Ｓｕｅｄａ，Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０００，１１，８２７−８３１；
１２．  Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｇ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，２７６，８１−８７；
１３．  Ｊ．Ｙｕａｎ．Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，５９６−６０１；
１４．  Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｇ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２５４，２８３−２８７
発明の開示
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、被標識物質（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）との結合基を有し、希土類イオンと容易に錯体を形成し、更に該錯体が水溶液中で充分に安定であり、バッファーの種類によらず、十分な蛍光強度と長い蛍光寿命を有するという特徴を有する新規な標識試薬と、該標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体、該錯体を含んでなる蛍光標識剤、及び該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法等を提供することを目的とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、２，２’：６’，２’’−トリピリジン骨格又は２，６−ジピラゾールピリジン骨格を有し、標識される物質との結合基と、希土類イオンとの錯形成結合基とを有する化合物からなる標識試薬、より詳細には蛍光標識試薬に関する。
また、本発明は、上記標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体、及び該錯体を含んでなる蛍光標識剤、並びに該錯体を標識剤として用いることを特徴とする蛍光標識方法に関する。
更に、本発明は、上記蛍光標識剤で標識した生体由来物質又は生理活性物質に関する。
更にまた、本発明は、上記錯体を蛍光標識剤として用いることを特徴とする蛍光測定法、及び該錯体を蛍光標識剤として含んでなる蛍光測定法用試薬、並びに該錯体を蛍光標識剤として含んでなる試薬キットに関する。
また、本発明は、上記標識試薬と希土類金属イオンとを用いることを特徴とする蛍光標識方法に関する。
更に、本発明は、上記標識試薬と希土類金属イオンとを用いて蛍光標識した生体由来物質又は生理活性物質に関する。
更にまた、本発明は、上記標識試薬と希土類金属イオンとを用いることを特徴とする蛍光測定法、及び上記標識試薬と希土類金属イオンとを含んでなる蛍光測定法用試薬、並びに上記標識試薬と希土類金属イオンとを含んでなる試薬キットに関する。
また、本発明は、一般式［１］
2003076938.tif 000002
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩に関する。
更に、本発明は、一般式［２］
2003076938.tif 000003
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩に関する。
更にまた、本発明は、一般式［３］
2003076938.tif 000004
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩に関する。
また、本発明は、一般式［４］
2003076938.tif 000005
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩に関する。
即ち、本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、有機配位子分子中に２，２’：６’，２’’−トリピリジン骨格又は２，６−ジピラゾールピリジン骨格を有し、且つ、多数のカルボン酸基或いはクラウンエーテル基を併せ有する化合物が、水に溶けやすく、且つ、希土類イオンと容易に安定な蛍光錯体を形成できること、また、同じ有機配位子分子中に、標識される物質（被標識物質）と容易に結合できる活性置換基を導入することにより、タンパク質などの生体分子を穏やかな条件下で標識できることを見出し本発明を完成するに到った。
標識される物質（被標識物質）と結合できる活性置換基は、これらの被標識物質が有する特定の置換基と反応し、共有結合基を形成し得る基である。
また、本発明に係る新規標識試薬は水に溶けやすいため、被標識物質が小分子であっても標識後においても十分な水溶性を有することとなる。
本発明に係る、２，２’：６’，２’’−トリピリジン骨格又は２，６−ジピラゾールピリジン骨格を有し、標識される物質との結合基と、希土類イオンとの錯形成結合基とを有する化合物の具体例としては、例えば、下記一般式［１］
2003076938.tif 000006
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩、下記一般式［２］
2003076938.tif 000007
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩、下記一般式［３］
2003076938.tif 000008
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩、及び下記一般式［４］
2003076938.tif 000009
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物又はその塩等が挙げられる。
上記一般式［１］〜［４］で示される化合物は何れも新規化合物である。
上記一般式［１］〜［４］において、Ｒで表されるアリール基、活性置換基を有するアリール基におけるアリール基としては、例えば、炭素数６〜３０、好ましくは６〜２０、より好ましくは６〜１４の単環、多環又は縮合環式の芳香族炭化水素基が挙げられ、より具体的には、例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、メチルナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、２−ビフェニル基、３−ビフェニル基、４−ビフェニル基等が挙げられる。
また、複素環基、活性置換基を有する複素環基における複素環基としては、環中に少なくとも１個以上の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を有し、１個の環の大きさが５〜２０員、好ましくは５〜１０員、より好ましくは５〜７員であって、シクロアルキル基、シクロアルケニル基又はアリール基などの炭素環式基と縮合していてもよい飽和又は不飽和の単環、多環又は縮合環式のものが挙げられ、より具体的には、例えば、ピリジル基、チエニル基、フェニルチエニル基、チアゾリル基、フリル基、ピペリジル基、ピペラジル基、ピロリル基、モルホリノ基、イミダゾリル基、インドリル基、キノリル基、ピリミジニル基等が挙げられる。
これらアリール基及び複素環基の活性置換基としては、標識される物質（被標識物質）と結合できる活性置換基であって、これらの被標識物質が有する特定の置換基と反応し、共有結合基を形成し得る基であればどのような置換基でも良いが、例えば、アミノ基、イソチオシアナト基、ハロゲノアセチルアミノ基、ヒドラジノ基、（４，６−ジハロゲノ−１，３，５−トリアゼン−２−イル）アミノ基、カルボキシル基等が好ましいものとして挙げられる。
ここで、ハロゲノアセチルアミノ基、（４，６−ジハロゲノ−１，３，５−トリアゼン−２−イル）アミノ基におけるハロゲノ基としては、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ等が挙げられる。
上記一般式［１］〜［４］における好ましいＲ基としては、フェニル基、４−アミノフェニル基、２−ピリジル基、６−アミノ−２−ピリジル基、２−チエニル基、５−アミノ−２−チエニル基、４−ビフェニル基、４’−アミノ−４−ビフェニル基などが例示される。
上記一般式［１］〜［４］に示される化合物の塩としては、カルボキシル基などの酸性の基についてはナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩などが例示され、アミノ基などの塩基性の基については塩酸、硫酸などの酸の塩が例示される。
上記した如き本発明に係る化合物からなる標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体についての構造上の制限はない。希土類イオンの種類としては、形成される錯体の蛍光強度、蛍光波長、蛍光寿命等を考慮して選択することは容易である。三価のランタノイドイオンとの錯体が好ましく、特に三価のユウロピウムイオン、三価のテルビウムイオン、三価のサマリウムイオン、三価のジスプロシウムイオンとの錯体が好ましい。
希土類金属イオンと本発明に係る標識試薬とが錯形成し生成する錯体は、蛍光錯体であり、従って、本発明に係る錯体は蛍光標識剤として使用し得る。
本発明に係る蛍光標識剤は、本発明に係る錯体を含んでなるものであるが、本発明に係る蛍光標識剤は、錯体として単離されたもの、該錯体を含む溶液、及び希土類金属イオンと本発明に係る標識試薬とを含んでなる溶液の何れをも包含する。
本発明に係る蛍光標識方法は、本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体を標識剤として用いる、換言すれば、上記本発明に係る蛍光標識剤を用いるか、或いは、上記本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとを用いて、種々の被標識物質を蛍光標識することにより実施される。
標識試薬と希土類金属イオンとを用いる場合は、（１）先ず被標識物質と標識試薬とを反応させ、その後に適当な希土類金属イオンを作用させて、錯体を形成させることにより蛍光標識する方法と、（２）標識試薬と希土類金属イオンと被標識物質とを同時に反応させて、錯体形成と蛍光標識とを併行して行う方法とがあるが何れの方法で行うかは任意である。
本発明に係る標識試薬又は蛍光標識剤により標識される被標識物質に特に制約はなく、生体由来物質、生理活性物質、その他の化学物質等に広く適用され得る。また、被標識物質の分子サイズ、存在形態（溶液又は固相）、単一か組成物か等には制限されない。本発明に係る蛍光標識剤により標識される被標識物質の条件としては、該被標識物質の一部に、本発明に係る蛍光標識剤と共有結合し得る反応基が少なくとも１つあればよい。或いは、斯かる基を導入可能であればよい。
そのような、本発明に係る蛍光標識剤により標識可能な生体由来物質、生理活性物質としては、例えば、酵素、タンパク質、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド）、糖、糖タンパク質、ホルモン、リピッド、核酸、核酸誘導体、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、細胞、脂肪類化合物、アミノ酸、薬物（抗生物質を含む）等が挙げられる。
また、タンパク質の具体例としては、抗体及びその誘導体、抗原およびその誘導体、アビジン（ストレプトアビジンを含む）、血清アルブミン、種々のハプテン、ホルモン、プロテインＡ、プロテインＧ等が挙げられる。
その他の化学物質としては、例えば、農薬、日常化学品、化学試薬、工業化学品等が挙げられる。
本発明に係る蛍光測定法は、上記本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として用いて測定を行うか、或いは、上記本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとを用いて、種々の被標識物質を蛍光標識して測定を行う点にするに特徴を有する。
蛍光測定法の代表的なものとしては、例えば時間分解蛍光測定法が挙げられる。
時間分解蛍光測定法の応用例としては、例えば、時間分解蛍光免疫測定法やＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ法、クロマトグラフイー法、蛍光顕微鏡法等を挙げることができる。
本発明に係る蛍光測定法用試薬は、上記本発明に係る蛍光測定法に用いられる試薬であり、上記本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として含んでなるか、或いは、上記本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとを含んでなる点に特徴を有する。
本発明に係る蛍光測定法用試薬は、生体由来物質、生理活性物質、その他の化学物質等の測定に使用し得るが、特に、生体由来物質、生理活性物質の測定により効果的である。
生体由来物質、生理活性物質の具体例は、先に記載した通りである。
また、本発明に係る試薬キットは、上記本発明に係る蛍光測定法に用いられる試薬キットであり、上記本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として含んでなるか、或いは、上記本発明に係る標識試薬と希土類金属イオンとを含んでなるものである。
本発明に係る標識試薬の合成方法、出発物質等については特に制約はなく、何れの標識試薬も通常の有機合成法を適宜組合わせることにより合成することが可能である。生成物の構造同定は、通常の有機化合物構造分析法、例えば、１Ｈ  ＮＭＲ、有機元素分析法などを用いて行えばよい。
本発明に係る一般式［１］で示される標識試薬の合成方法を、Ｒが５−アミノ−２−チエニル基である場合を例にして反応スキームで示すと以下のようになる。
2003076938.tif 000010
また、本発明に係る一般式［２］で示される標識試薬の合成方法を、Ｒが５−アミノ−２−チエニル基である場合を例にして反応スキームで示すと以下のようになる。
2003076938.tif 000011
更に、本発明に係る一般式［３］で示される標識試薬の合成方法を、Ｒが５−アミノ−２−チエニル基である場合を例にして反応スキームで示すと以下のようになる。
2003076938.tif 000012
更にまた、本発明に係る一般式［４］で示される標識試薬の合成方法を、Ｒが５−アミノ−２−チエニル基である場合を例にして反応スキームで示すと以下のようになる。
2003076938.tif 000013
本発明の一般式［１］〜［４］で表される化合物又はその塩における好ましい化合物の例としては、Ｒ基が５−アミノ−２−チエニル基の前記した化合物の他に、Ｒ基が４−ビフェニル基の化合物及び４’−アミノ−４−ビフェニル基の化合物が挙げられる。Ｒ基が４−ビフェニル基の化合物及び４’−アミノ−４−ビフェニル基の化合物のより具体的な例示としては、次の一般式［１−１］、
2003076938.tif 000014
で示される化合物、さらに具体的な例示としては、次の一般式［１−２］、
2003076938.tif 000015
で示される化合物、及び次の一般式［２−１］、
2003076938.tif 000016
で示される化合物などを挙げることができる。
なお、特願２００２−０６３９６１明細書、及び、特願２００２−２７１９２４明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
実施例
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［（４’−（５’’’−アミノ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（酢酸）（ＡＴＴＴＡと略す。）の合成
（１）４’−（２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン
［化合物（１）］の合成
Ｎ−［２−（ピリド−２’−イル）−２−オキソエチル］ピリジニウムアイオダイド（１６．３ｇ，５０ｍｍｏｌ）、（Ｅ）−３−（２’’−チエニル）−１−（ピリド−２’−イル）−２−プロペノン（１０．７６ｇ，５０ｍｍｏｌ）及び酢酸アンモニウム（２３．１ｇ）を５００ｍｌの乾燥メタノールに加え、撹拌下、２４時間還流した。反応液を冷却して、沈澱を濾取し、冷メタノールで十分洗浄した後、アセトニトリルから再結晶し、化合物（１）を得た。真空乾燥後の収率は４３．８％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．７４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．６９（ｓ，２Ｈ），８．６４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．８７（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３８−７．３２（ｍ，１Ｈ）。
（２）４’−（２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−１，１’’−ジオキシド［化合物（２）］の合成
化合物１（１２．６ｇ，４０ｍｍｏｌ）を５００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した後、４０ｇの３−クロロペルオキシ安息香酸を加え、室温で２０時間撹拌した。反応液を４×２００ｍｌの１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥した後、溶媒を減圧留去した。生成物を３００ｍｌのメタノールに溶解し、微量の不溶物を濾去した後、溶媒を減圧留去した。生成物をアセトニトリルでよく洗い、真空乾燥して化合物（２）を得た。収率は６１．４％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ９．２３（ｓ，２Ｈ），８．３５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４５−７．２８（ｍ，５Ｈ），７．１６−７．１３（ｍ，１Ｈ）。
（３）４’−（２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジカーボニトリル［化合物（３）］の合成
３００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に化合物（２）（８．６９ｇ，２５ｍｍｏｌ）と（ＣＨ３）３ＳｉＣＮ（２４．８ｇ，２５０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分間撹拌した後、塩化ベンゾイル１００ｍｍｏｌを約２０分を要して徐々に滴下した。反応液を室温で２０時間撹拌した後、溶媒を減圧下半分まで留去した。残りの溶液に１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液６００ｍｌを加え、室温で１時間攪拌後、沈澱を濾取し、水で充分洗浄し、更に冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した後、真空乾燥して化合物（３）を得た。収率は９８．５％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．９５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．６２（ｓ，２Ｈ），８．３２−８．２６（ｍ，２Ｈ），８．１９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２８−７．３１（ｍ，１Ｈ）。
（４）４’−（２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジカーボキシレートジメチル［化合物（４）］の合成
Ｈ２ＳＯ４４５ｍｌ／ＣＨ３ＣＯＯＨ４５ｍｌ／Ｈ２Ｏ１２ｍｌの混合溶媒に化合物（３）４．４０ｇを加え、７５−８０℃で４８時間撹拌した。反応液を４００ｇの氷に加え、撹拌後、沈澱を濾取し、水とエタノールで充分洗浄した後、真空乾燥して、４．８５ｇの加水分解物を得た。
氷−水で冷却した４００ｍｌの乾燥メタノールにＳＯＣｌ２８ｇを加え、１５分間撹拌した後、上で得た加水分解物４．８５ｇを加え、撹拌下２０時間還流した。溶媒を減圧留去し、生成物を３５０ｍｌのＣＨＣｌ３に溶解し、１５％ＮａＨＣＯ３水溶液で有機層を充分洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧留去し、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９９：１ｗ／ｗ）で精製した。これをトルエンから再結晶し、化合物（４）を得た。収率は４８．１％であった。
元素分析結果（Ｃ２３Ｈ１７Ｎ３Ｏ４Ｓ）：
計算値（％），Ｃ＝６４．０３，Ｈ＝３．９７，Ｎ＝９．７４．
実測値（％），Ｃ＝６３．７６，Ｈ＝３．８３，Ｎ＝９．５２．
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），８．７８（ｓ，２Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），８．０３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２２−７．１９（ｍ，１Ｈ），４．０８（ｓ，６Ｈ）。
（５）４’−（２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジヒドロキシメチル［化合物（５）］の合成
２００ｍｌの乾燥エタノールに化合物（４）（２．８９ｇ，６．７ｍｍｏｌ）とＮａＢＨ４１．０５ｇを加え、室温で３時間撹拌した後、１時間還流した。溶媒を減圧留去し、生成物を１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に加え、撹拌下、沸騰まで加熱した。冷却後、沈澱を濾取し、水で充分洗浄した後、真空乾燥した。生成物を２００ｍｌのＴＨＦに溶かし、微量の不溶物を濾去した後、溶媒を減圧留去した。生成物をアセトニトリルで充分洗浄し、真空乾燥して化合物（５）を得た。収率は７２．２％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．６３（ｓ，２Ｈ），８．５０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），７．２８−７．３１（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｓ，４Ｈ）。
（６）４’−（５’’’−ニトロ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジヒドロキシメチル［化合物（６）］の合成
化合物（５）（１．５０ｇ，４ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの無水酢酸に加え、室温で１時間撹拌した後、６０℃で更に１時間撹拌した。反応液を室温に冷却し、発煙硝酸２ｇと酢酸２０ｍｌの混合溶液を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液を２００ｍｌの水に加え、一晩撹拌した後、ＣＨＣｌ３４×５０ｍｌで抽出した。ＣＨＣｌ３溶液を水洗し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を減圧留去した。生成物をエタノール１００ｍｌに溶解し、ＫＯＨ４ｇと水５ｍｌを加え、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、生成物を水洗後、真空乾燥して化合物（６）を得た。収率は７５．１％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．５７（ｓ，２Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），５．５０（ｓｂ，２Ｈ），４．７２（ｓ，４Ｈ）。
（７）４’−（５’’’−ニトロ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジブロモメチル［化合物（７）］の合成
化合物（６）（１．２６ｇ，３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１２０ｍｌ−ＤＭＦ１５ｍｌ混合溶媒に溶解し、ＰＢｒ３２．４０ｇを加え、撹拌下５時間還流した。溶媒を減圧留去した後、生成物にＣＨＣｌ３２００ｍｌを加え、１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液４×８０ｍｌでＣＨＣｌ３溶液を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥し、溶媒を減圧留去して得られた残査をヘキサンで充分洗浄し、真空乾燥して化合物（７）を得た。収率は７０．１％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．５５（ｓ，２Ｈ），８．４６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．８０（ｓ，４Ｈ）。
（８）テトラエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［（４’−（５’’’−ニトロ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（アセテート）［化合物（８）］の合成
化合物（７）（１．０９ｇ，２ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ１５０ｍｌに溶解し、４．１ｍｍｏｌのジエチルイミノジアセテートと２０ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３を加え、撹拌下、２４時間還流した。不溶物を濾去し、溶媒を減圧留去した後、生成物にＣＨＣｌ３２００ｍｌを加え、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液４×１００ｍｌでＣＨＣｌ３溶液を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥し、溶媒を減圧留去した後、油状生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ３ＣＯＯＥｔ−ＣＨ３ＯＨ−ＴＨＦ＝９０：６：４ｗ／ｗ／ｗ）で精製して化合物（８）を得た。収率は５０．１％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．７０（ｓ，２Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，８Ｈ），４．０８（ｓ，４Ｈ），３．７１（ｓ，８Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１２Ｈ）。
（９）テトラエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［（４’−（５’’’−アミノ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（アセテート）［化合物（９）］の合成
化合物８（０．７６ｇ，１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ７０ｍｌに溶解し、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１．３２ｇ，６ｍｍｏｌ）を加えた後、７０−８０℃で１時間撹拌した。室温に冷却後、氷水浴で冷却したＨ２Ｏ１００ｍｌ−ＤＴＰＡ５ｇの溶液に注入し、撹拌した後、この溶液に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液２０ｍｌを加えた。室温で３０分間撹拌した後、水溶液をＣＨＣｌ３３×１００ｍｌで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥した。溶媒を減圧留去し、残査を真空乾燥して化合物（９）を得た。収率は９３．５％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．４４（ｓ，２Ｈ），８．４１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，８Ｈ），４．０８（ｓ，４Ｈ），３．７４（ｓ，８Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１２Ｈ）。
（１０）テトラエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［（４’−（５’’’−アミノ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス酢酸［ＡＴＴＴＡ，化合物（１０）］の合成
化合物（９）（５８６ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ４０ｍｌ−Ｈ２Ｏ５ｍｌ−ＫＯＨ１．２ｇの溶液に溶解し、室温で２４時間撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残査を６０ｍｌの水に溶解し、撹拌下１％のＣＦ３ＣＯＯＨ水溶液を徐々に滴下し、溶液のｐＨを約１まで調節した。溶液を室温で３時間撹拌した後、沈澱を濾取し、０．５％のＣＦ３ＣＯＯＨ水溶液でよく洗浄した後、真空乾燥して化合物（１０）を得た。収率は９０．０％であった。
元素分析結果（Ｃ２９Ｈ２８Ｎ６Ｏ８Ｓ）：
計算値（％），Ｃ＝５６．１３，Ｈ＝４．５５，Ｎ＝１３．５４。
実測値（％），Ｃ＝５５．９４，Ｈ＝４．３８，Ｎ＝１３．６２。
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ３）：δ  ８．１０（ｓ，２Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），６．１４（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｓ，４Ｈ），３．５１（ｓ，８Ｈ）。
実施例２  ［（４’−（５’’’−アミノ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−ビス（３，６−ジオキサ−トリエチレン）（ＡＴＴＢＢと略す。）の合成
（１）［（４’−（５’’’−ニトロ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−ビス（３，６−ジオキサートリエチレン）の合成
４’−（５’’’−アミノ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジブロモメチル（１．０９ｇ，２ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ１５０ｍｌに溶解し、４，１３−ジアザ−１８−クラウン６−エーテル２．１ｍｍｏｌとＫ２ＣＯ３２０ｍｍｏｌを加え、撹拌下２４時間還流した。不溶物を濾去し、溶媒を減圧留去した後、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９：１ｗ／ｗ）で精製した。収率は６５．３％であった。ＦＡＢ−ＭＳで生成物は目的化合物とＫＢｒの錯体（１：１，Ｍ．Ｗ．＝７６５．７２７）であることを確認した。
ＦＡＢ−ＭＳ：測定値：７６６。
（２）［（４’−（５’’’−アミノ−２’’’−チエニル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−ビス（３，６−ジオキサ−トリエチレン）（ＡＴＴＢＢと略す。）の合成
上記（１）で得たＫＢｒ錯体（７６５．７ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を乾燥メタノール５０ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒１５０ｍｇを加えた後、ＮａＢＨ４４０ｍｇを加えた。室温で２時間撹拌し、不溶物を濾去した後、溶媒を減圧留去し、生成物を水３０ｍｌに溶解した。水溶液をＣＨＣｌ３４×５０ｍｌで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥した。収率は４０．３％であった。ＦＡＢ−ＭＳで生成物は目的化合物とＫＢｒの錯体（１：１，Ｍ．Ｗ．＝７３５．７４４）であることを確認した。
ＦＡＢ−ＭＳ：測定値：７３６。
実施例３  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−アミノ−２’’−チエニル）ピリジン］テトラキス酢酸（ＢＡＰＴＡと略す。）の合成
（１）２，６−ジブロモ−４−（２’−チエニル）ピリジン［化合物（１１）］の合成
酢酸２５０ｍｌに４−アミノ−２，６−ジブロモピリジン（３．２５ｇ，１２．９ｍｍｏｌ）及びチオフェン１２．９ｇを溶解し、撹拌下硝酸イソアミル１．９３ｇを加え、室温で２４時間撹拌した後、更に約４５℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残査を１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液４０ｍｌで中和した後、ＣＨＣｌ３４×６０ｍｌで抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥し、溶媒を減圧留去した後、残査をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９：１ｗ／ｗ）で精製し、更にメタノールで２回再結晶して化合物（１１）を得た。収率は４７．９％であった。
元素分析結果（Ｃ９Ｈ５ＮＢｒ２Ｓ）：
計算値（％），Ｃ：３３．８８，Ｈ＝１．５８，Ｎ＝４．３９．
実測値（％），Ｃ＝３３．４６，Ｈ＝１．４６，Ｎ＝４．２３．
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６０（ｓ，２Ｈ），７．５０−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．１６−７．１３（ｍ，１Ｈ）。
（２）２，６−ビス（３’−メトキシカルボニル−１’−ピラゾリル）−４−（２’’−チエニル）ピリジン［化合物（１２）］の合成
乾燥ＴＨＦ１００ｍｌに３−メトキシカルボニルピラゾール１０．１ｇを溶解し、これに金属カリウム３．１２ｇを加え、約６０℃で金属が全部溶解するまで撹拌した。その溶液に化合物（１１）（６．３８ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌下１週間還流した。溶媒を減圧留去し、残査をＣＨＣｌ３６×１５０ｍｌで抽出した後、溶媒を再度減圧留去した。生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９：１ｗ／ｗ）で精製し、更にベンゼンで再結晶して化合物（１２）を得た。収率は４５．５％であった。
元素分析結果（Ｃ１９Ｈ１５Ｎ５Ｏ４Ｓ）：
計算値（％），Ｃ＝５５．７４，Ｈ＝３．６９，Ｎ＝１７．１０。
実測値（％），Ｃ＝５５．４７，Ｈ＝３．６２，Ｎ＝１６．８２。
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．６０（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，２Ｈ），８．２２（ｓ，２Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．１８（ｍ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｓ，６Ｈ）。
（３）２，６−ビス（３’−ヒドロキシメチル−１’−ピラゾリル）−４−（２’’−チエニル）ピリジン［化合物（１３）］の合成
乾燥ＴＨＦ３００ｍｌにＬｉＡｌＨ４１，３０ｇと化合物（１２）（２．７２ｇ，６．６４ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した後、水１．１ｍｌ、次いで１５％ＮａＯＨ１．１ｍｌと水４．５ｍｌを徐々に滴下した。室温で３０分間撹拌した後、沈澱を濾去し、少量のＴＨＦで更に沈澱を洗い、ＴＨＦ溶液を合わせた。溶媒を減圧留去し、残査をアセトニトリルで充分洗浄した後、真空乾燥して化合物（１３）を得た。収率は７１．３％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．８８（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，２Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｓ，２Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９−７．２６（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５８（ｓ，４Ｈ）。
（４）２，６−ビス（３’−ヒドロキシメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−ニトロ−２’’−チエニル）ピリジン［化合物（１４）］の合成
化合物（１３）（１．５９ｇ，４．５ｍｍｏｌ）を無水酢酸２０ｍｌに加え、室温で１時間撹拌した後、６０℃で更に１時間撹拌した。反応液を室温に冷却し、発煙硝酸１．５ｇと酢酸２０ｍｌの混合溶液を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液を２００ｍｌの水に加え、一晩撹拌した後、ＣＨＣｌ３４×５０ｍｌで抽出した。ＣＨＣｌ３溶液を水洗し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、溶媒を減圧留去し、残査を真空乾燥した後、シリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９：１ｗ／ｗ）で精製した。生成物をエタノール１００ｍｌに溶解し、ＫＯＨ４ｇと水５ｍｌを加え、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残査を水洗した後、真空乾燥して化合物（１４）を得た。収率は７０．４％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．０１（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，２Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｓ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５７（ｓ，４Ｈ）。
（５）２，６−ビス（３’−ブロモメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−ニトロ−２’’−チエニル）ピリジン［化合物（１５）］の合成
ＴＨＦ２００ｍｌに化合物（１４）（１．５９ｇ，４ｍｍｏｌ）を溶解し、これにＰＢｒ３３．２０ｇを加え、撹拌下４時間還流した。溶媒を減圧留去した後、残査にＣＨＣｌ３２００ｍｌを加え、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液４×８０ｍｌでＣＨＣｌ３溶液を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥し、溶媒を減圧留去した。残査をヘキサンで充分洗浄した後、真空乾燥して化合物（１５）を得た。収率は９４．１％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ９．０４（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，２Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｓ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ），４．６６（ｓ，４Ｈ）。
（６）テトラエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−ニトロ−２’’−チエニル）ピリジン］テトラキスアセテート［化合物（１６）］の合成
化合物（１５）（１．０５ｇ，２ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ１５０ｍｌに溶解し、イミノジ酢酸ジエチル４．１ｍｍｏｌとＫ２ＣＯ３２０ｍｍｏｌを加え、撹拌下２４時間還流した。不溶物を濾去し、溶媒を減圧留去した後、残査にＣＨＣｌ３２００ｍｌを加え、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液４×１００ｍｌでＣＨＣｌ３溶液を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥し、溶媒を減圧留去した後、油状生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ３ＣＯＯＥｔ−ＣＨ２Ｃｌ２＝９：１ｗ／ｗ）で精製して化合物（１６）を得た。収率は５０．０％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ９．０３（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，２Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｓ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ），４．１８（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，８Ｈ），４．０８（ｓ，４Ｈ），３．６５（ｓ，８Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１２Ｈ）。
（７）テトラエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−アミノ−２’’−チエニル）ピリジン］テトラキスアセテート［化合物（１７）］の合成
化合物（１６）（７４１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ７０ｍｌに溶解し、これにＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１．３２ｇ，６ｍｍｏｌ）を加えた後、７０−８０℃で１時間撹拌した。室温に冷却した溶液を氷−水浴で冷却したＨ２Ｏ１００ｍｌ−ＤＴＰＡ５ｇの溶液に注入し、撹拌した後、この溶液に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液２０ｍｌを加えた。室温で３０分間撹拌した後、ＣＨＣｌ３３×１００ｍｌで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥した。溶媒を減圧留去した後、生成物を真空乾燥して化合物（１７）を得た。収率は９１．７％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．８１（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｓ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，８Ｈ），４．０８（ｓ，４Ｈ），３．６５（ｓ，８Ｈ），１．２６．（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１２Ｈ）。
（８）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−アミノ−２’’−チエニル）ピリジン］テトラキス酢酸［ＢＡＰＴＡ、化合物（１８）］の合成
化合物（１７）（５６９ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ４０ｍｌ−Ｈ２Ｏ５ｍｌ−ＫＯＨ１．２ｇの溶液に溶解し、室温で２４時間撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残査を水６０ｍｌに溶解し、撹拌下１％ＣＦ３ＣＯＯＨ水溶液を徐々に滴下し、溶液のｐＨを約１まで調整した。溶液を室温で３時間撹拌した後、沈澱を濾取し、０．５％のＣＦ３ＣＯＯＨ水溶液で充分洗浄した後、真空乾燥して化合物（１８）を得た。収率は９１．３％であった。
元素分析結果（Ｃ２５Ｈ２６Ｎ８Ｏ８Ｓ）：
計算値（％），Ｃ＝５０．１７，Ｈ＝４．３８，Ｎ＝１８．７１。
実測値（％），Ｃ＝５０．２９，Ｈ＝４．２５，Ｎ＝１８．４８。
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．１６（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７２（ｓ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｓ，４Ｈ），３．５５（ｓ，８Ｈ）。
実施例４  ［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−アミノ−２’’−チエニル）ピリジン］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−ビス（３，６−ジオキサ−トリエチレン）（ＢＡＡＰＢと略す。）の合成
（１）［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−ニトロ−２’’−チエニル）ピリジン］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−ビス（３，６−ジオキサ−トリエチレン）の合成
２，６−ビス（３’−ブロモメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−ニトロ−２’’−チエニル）ピリジン（０．８０ｇ，２ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ１００ｍｌに溶解し、これに４，１３−ジアザ−１８−クラウン６−エーテル２．１ｍｍｏｌとＫ２ＣＯ３２０ｍｍｏｌを加え、撹拌下２４時間還流した。不溶物を濾去し、溶媒を減圧留去した後、生成物（残査）をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９：１ｗ／ｗ）で精製した。収率は５３．８％であった。ＦＡＢ−ＭＳで生成物は目的化合物とＫＢｒの錯体（１：１，Ｍ．Ｗ．＝７４３．６６７）であることを確認した。
ＦＡＢ−ＭＳ：測定値：７４４。
（２）［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−（５’’−アミノ−２’’−チエニル）ピリジン］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−ビス（３，６−ジオキサ−トリエチレン）（ＢＡＡＰＢ）の合成
上記（１）で得たＫＢｒ錯体（７４３．７ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を乾燥メタノール５０ｍｌに溶解し、これに１０％Ｐｄ／Ｃ触媒１５０ｍｇを加えた後、ＮａＢＨ４４０ｍｇを加えて、室温で２時間撹拌した。不溶物を濾去し、溶媒を減圧留去した後、残査を水３０ｍｌに溶解した。水溶液をＣＨＣｌ３４×５０ｍｌで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を減圧留去し、残査を真空乾燥して目的化合物（錯体）を得た。収率は５２．４％であった。ＦＡＢ−ＭＳで生成物はＢＡＡＰＢとＫＢｒの錯体（１：１，Ｍ．Ｗ．＝７１３．６８４）であることを確認した。
ＦＡＢ−ＭＳ：測定値：７１４。
実施例５  各種配位子とユウロピウムとの錯体の合成
実施例１〜４で得られた４種の配位子の内、ＡＴＴＴＡ及びＢＡＰＴＡのユウロピウム錯体の合成は、先ず配位子をｐＨ９．１の０．０５Ｍホウ酸緩衝液に溶解し、続いて同じモル量のＥｕＣｌ３を加え、室温で１時間撹拌することにより、錯体ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋及びＢＡＰＴＡ−Ｅｕ３＋の溶液を得た。
また、ＡＴＴＢＢ及びＢＡＡＰＢのユウロピウム錯体の合成は、先ずＡＴＴＢＢ・ＫＢｒ或いはＢＡＡＰＢ・ＫＢｒをエタノールに溶解し、続いて２倍モル量のＥｕＣｌ３を加え、撹拌下に２時間還流した。溶媒を減圧留去し、残査をＣＨＣｌ３に溶解し、不溶物を濾去した後、溶媒を減圧留去して得られた残査を真空乾燥して、錯体ＡＴＴＢＢ−Ｅｕ３＋或いはＢＡＡＰＢ−Ｅｕ３＋を得た。
実施例６  ４種のユウロピウム錯体の蛍光特性の評価
実施例５で得られた４種の錯体をｐＨ９．１の０．０５Ｍホウ酸緩衝液に溶解し、１．０×１０−６Ｍの溶液を調製した。これらの溶液を用いて、それぞれのＵＶスペクトル、蛍光スペクトル、蛍光量子収率、モル吸光係数および蛍光寿命を測定した。その結果を表１に示した。また、ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋の蛍光スペクトルを第１図に示した。
2003076938.tif 000017
表１から明らかなように、４種の錯体はいずれも強い蛍光と長い蛍光寿命を有し、時間分解蛍光測定のラベル化剤として効果的に使用し得ることを示している。
実施例７  本発明に係る錯体を用いた時間分解蛍光測定
錯体ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋を用い、時間分解蛍光測定による該錯体の測定感度を測定した。錯体希釈用溶媒はｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液であり、測定装置はＶｉｃｔｏｒ  １４２０時間分解蛍光測定装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）であった。測定条件は、励起波長＝３４０ｎｍ、測定波長＝６１５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．２ｍｓ、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝０．４ｍｓ、循環時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝１．０ｍｓであった。
第２図に、ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋希釈溶液の時間分解蛍光測定の結果を示した。
バックグラウンドシグナルの標準偏差の２倍を用いて計算した結果、ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋を用いた時間分解蛍光測定の最低検出限界は８．０×１０−１３Ｍであった。この結果はＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋を用いた時間分解蛍光測定が非常に高感度であることを示している。
実施例８  ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋を用いたタンパク質ストレプトアビジン（ＳＡ）の標識
標識を行う前に、先ず２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジンを用いて、ＡＴＴＴＡのアミノ基の活性化を行った。その方法は次の通りである。
ＡＴＴＴＡ（１２４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）をｐＨ４．９の０．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液５ｍｌに溶解し、撹拌下、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン（３６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を含むアセトン溶液１ｍｌを滴下し、室温で３０分間撹拌した。１ＭのＨＣｌで反応溶液のｐＨを約１に調整し、沈澱を遠心分離で回収し、１００倍希釈したＨＣｌ溶液で洗浄した後、真空乾燥した。この方法で活性置換基（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）基を持つＡＴＴＴＡの誘導体を得た。得られたものは精製する必要がなく、タンパク質の標識に直接使用することができた。
５ｍｇのＳＡをｐＨ９．１の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌに溶解した後、（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）基を持つＡＴＴＴＡ誘導体１０ｍｇを加え、そのまま室温で１時間撹拌した。反応溶液をゲル濾過することで、未反応の標識試薬と標識タンパク質を分離した。１．０×４０ｃｍのセファデックス  Ｇ−５０カラムを使用し、０．０５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液で展開した。少量の標識タンパク質溶液を取り、標準ＥｕＣｌ３水溶液を用いた蛍光滴定により標識ＳＡ溶液中のＡＴＴＴＡ濃度を測定し、標識ＳＡの標識率を計算したところ、ＳＡ（ＡＴＴＴＡ）２１の溶液が得られた。ＳＡ（ＡＴＴＴＡ）２１の溶液にＡＴＴＴＡモル量の１．５倍モル量のＥｕＣｌ３を加え、撹拌した後、防腐剤としてＮａＮ３２５ｍｇを、また、標識タンパク質の容器への吸着を防ぐためＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）５０ｍｇを加えた後、−２０℃で保存した。時間分解蛍光イムノアッセイに使用する際に、０．２％ＢＳＡ−０．９％ＮａＣｌ−０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液で１０００倍希釈した後、使用する。
実施例９  ＳＡ（ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋）２１を用いたヒト血清中のＣＥＡ（癌胎児性抗原）の時間分解蛍光イムノアッセイ
アッセイは９６−ウェルマイクロタイタープレートを用いて行った。具体的な操作法は次の通りである。
（ｉ）ビオチン化抗体の調製：０．５ｍｌ（２．４ｍｇ／ｍｌ）のウサギ抗ヒトＣＥＡ抗体溶液（Ｄａｋｏ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，デンマーク）を３Ｌの生理食塩水に対して４℃で２４時間ずつ２回透析した後、純水０．５ｍｌ、ＮａＨＣＯ３８．４ｍｇ及びスルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）６ｍｇを加え、室温で１時間撹拌した後、４℃で２４時間インキュベートした。反応溶液をＮａＮ３０．２５ｇを含む３Ｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液に対して４℃で２４時間ずつ２回透析した後、ＢＳＡ１０ｍｇを加え、イムノアッセイに使用するまで、−２０℃で保存した。イムノアッセイに使用する際には、０．２％ＢＳＡ−０．９％ＮａＣｌ−０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液で１００倍希釈した後、使用する。
（ｉｉ）９６−ウェルマイクロタイタープレートのコーティング：ｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸緩衝液でヤギ抗ヒトＣＥＡポリクローナル抗体を８μｇ／ｍｌに希釈した後、９６ウェルの透明ポリスチレン製マイクロタイタープレート（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ  ｐｌａｔｅ）に６０μｌずつ分注し、４℃で２４時間インキュベートした。その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（バッファー１）で２回洗浄し、更にｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（バッファー２）で１回洗浄した。
（ｉｉｉ）ＣＥＡのイムノアッセイ：コーテイング済みの９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５０μｌずつＣＥＡ標準溶液（生化学工業（株））を分注し、３７℃で１時間インキュベートした後、バッファー１で２回、バッファー２で１回プレートを洗浄した。各ウェルにビオチン化ウサギ抗ヒトＣＥＡ抗体を５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした後、バッファー１で２回、バッファー２で１回プレートを洗浄した。各ウェルにＳＡ（ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋）２１溶液を５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした後、バッファー１でプレートを４回洗浄し、そのまま固相時間分解蛍光測定に用いた。
本測定に用いた時間分解蛍光測定装置はＶｉｃｔｏｒ  １４２０時間分解蛍光測定装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）であり、測定条件は、励起波長＝３４０ｎｍ、測定波長＝６１５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．２ｍｓ、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝０．４ｍｓ、繰り返し時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝１．０ｍｓであった。
以上のイムノアッセイで得られた検量線を第３図に示した。バックグラウンドシグナル＋３ＳＤ（標準偏差）を検出限界とすると、この方法での検出限界は６０ｐｇ／ｍｌであった。この値は、市販のラジオイムノアッセイ、またはエンザイムイムノアッセイなどより、約２倍の高感度であった。
実施例１０  一般式［１−１］で示される化合物の製造
Ｒが４’−アミノ−ビフェニル−４−イル基である一般式［１−１］で示される化合物を、以下に示す反応スキームにしたがって製造した。
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一般式［１−１］で示される化合物（［４’（４’’’’−アミノ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル］ビス（メチレンニトリル）テトラキス酢酸（以下、ＡＴＢＴＡと略す。））の合成
（１）４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン［（前記反応スキームの化合物（１））］の合成
Ｎ−［２−（ピリド−２’−イル）−２−オキソエチル］ピリジニウムアイオダイド（１６．３ｇ，５０ｍｍｏｌ）、（Ｅ）−３−（ビフェニル−４’’−イル）−１−（ピリド−２’−イル）−２−プロペノン（１４．２６ｇ，５０ｍｍｏｌ）、及び酢酸アモニウム（２３．１ｇ）を５００ｍｌの乾燥メタノールに加え、撹拌下、２４時間還流した。反応液を冷却して、沈澱を濾取し、冷メタノールで十分洗浄した後、アセトニトリルから再結晶し、化合物（１）を得た。真空乾燥後の収率は４９．３％であった。
元素分析結果（Ｃ２７Ｈ１９Ｎ３）：
計算値（％），Ｃ＝８４．１３，Ｈ＝４．９７，Ｎ＝１０．９０。
実測値（％），Ｃ＝８４．０１，Ｈ＝４．８２，Ｎ＝１０．８８。
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
８．８０（ｓ，２Ｈ），８．７５（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ），８．６９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４１−７．３３（ｍ，３Ｈ）。
（２）４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−１，１’’−ジオキシド［（前記反応スキームの化合物（２））］の合成
前記反応スキームの化合物（１）（１９．２７ｇ，５０ｍｍｏｌ）を７００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶かした。これに、５０ｇの３−クロロペルオキシ安息香酸を加え、室温で２０時間を撹拌した。反応液を３ｘ３００ｍｌの１０％  Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥した後、溶媒を減圧蒸去した。生成物を３００ｍｌのメタノールに溶かし、濾過により微量の不溶物を除いた後、減圧蒸留で溶媒を除去した。生成物をアセトニトリルでよく洗い、真空乾燥して化合物（２）を得た。収率は９１．４％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
９．２９（ｓ，２Ｈ），８．３８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５０−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．２９（ｍ，５Ｈ）。
（３）４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジカーボニトリル［（前記反応スキームの化合物（３））］の合成
４５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に２５ｍｍｏｌの前記反応スキームの化合物（２）（１５．６５ｇ，３７．５ｍｍｏｌ）と（ＣＨ３）３ＳｉＣＮ（３７．２ｇ，３７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分撹拌した後、塩化ベンゾイル１５０ｍｍｏｌを約２０分を要して徐々に滴下した。反応液を室温で２４時間撹拌した後、溶媒を減圧下半分まで留去した。残りの溶液に１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液６００ｍｌを加え、室温で１時間攪拌後、沈澱を濾取し、水で充分洗浄し、更に冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した後、真空乾燥して化合物（３）を得た。収率は８０．８％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ
８．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），８．７５（ｓ，２Ｈ），８．３１（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５４−７．４２（ｍ，３Ｈ）。
（４）４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’ターピリジン−６，６’’−ジカーボキシレートジメチル［（前記反応スキームの化合物（４））］の合成
Ｈ２ＳＯ４  ９０ｍｌ／ＣＨ３ＣＯＯＨ  ９０ｍｌ／Ｈ２Ｏ  ２０ｍｌの混合溶媒に前記反応スキームの化合物（３）８．７１ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加え、９０−１００℃で２４時間撹拌した。反応溶液を８００ｇの氷に加え、撹拌後、沈澱を濾取し、水とエタノールで充分洗浄した後、真空乾燥して、９．１３ｇの加水分解物を得た。
氷−水で冷却した６００ｍｌの乾燥メタノールにチオニルクロライドＳＯＣｌ２２４ｇを加え、１５分間撹拌した後、上で得た加水分解物９．１３ｇを加え、撹拌下２４時間還流した。溶媒を減圧留去し、生成物を１０００ｍｌのクロロホルムＣＨＣｌ３に溶解し、１５％のＮａＨＣＯ３水溶液で有機層を充分洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧留去し、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９９：１ｗ／ｗ）で精製した。これをトルエンから再結晶し、化合物（４）を得た。収率は４８．５％であった。
元素分析結果（Ｃ３１Ｈ２３Ｎ３Ｏ４）：
計算値（％），Ｃ＝７４．２４，Ｈ＝４．６２，Ｎ＝８．３８。
実測値（％），Ｃ＝７４．１５，Ｈ＝４．５５，Ｎ＝８．３８。
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
８．８８（ｓ，２Ｈ），８．８６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），８．０６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝６．９，２Ｈ），７．５２−７．３０（ｍ，３Ｈ），４．０７（ｓ，６Ｈ）。
（５）４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジヒドロキシメチル［（前記反応スキームの化合物（５））］の合成
４００ｍｌの乾燥エタノールに前記反応スキームの化合物（４）（７．０２ｇ，１４ｍｍｏｌ）とＮａＢＨ４３．０２ｇを加え、室温で３時間撹拌した後、１時間環流した。溶媒を減圧留去し、生成物を２００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に加え、撹拌下、沸騰まで加熱した。冷却後、沈澱を濾取し、水で充分洗浄した後、真空乾燥して化合物（５）を得た。収率は９２．０％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ
８．７５（ｓ，２Ｈ），８．５５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．０７−８．００（ｍ，４Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５７−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．４０（ｍ，１Ｈ），５．５７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，４Ｈ）。
（６）４’−（４’’’’−ニトロ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジヒドロキシメチル［（前記反応スキームの化合物（６））］の合成
前記反応スキームの化合物（５）（１．７８ｇ，４ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの無水酢酸に加え、６０℃で１５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、生成物に２０ｍｌの無水酢酸を加え、氷−水で外部冷却下、２０ｍｌの酢酸−３ｍｌの発煙硝酸溶液を滴下した。氷−水で外部冷却下、２時間撹拌した後、更に室温で２４時間撹拌した。反応液を２５０ｍｌの水に加え、１時間撹拌した後、ＣＨＣｌ３３ｘ１００ｍｌで抽出した。ＣＨＣｌ３溶液を５％のＮａＨＣＯ３水溶液で洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を減圧留去した。生成物に１５０ｍｌのエタノール、１０ｇのＫＯＨと１５ｍｌの水を加え、室温で３６時間撹拌した。反応液に３００ｍｌの水を加え、沈澱を遠心分離で収集し、５時間真空乾燥した後、水で充分洗浄した。真空乾燥して化合物（６）を得た。収率は９０．７％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物と４’−（２’’’’−ニトロ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジヒドロキシメチルの混合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ
８．８１−８．７９（ｍ，２Ｈ），８．６１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．３７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１７−８．０３（ｍ，６Ｈ），７．８８−７．８０（ｍ，１Ｈ），７．７５−７．５８（ｍ，４Ｈ），４．７８（ｓ，４Ｈ）。
（７）４’−（４’’’’−ニトロ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジブロモメチル［（前記反応スキームの化合物（７））］の合成
前記反応スキームの化合物（６）（１．７８ｇ，３．６３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２００ｍｌ−ＤＭＦ８０ｍｌ混合溶媒に溶解し、ＰＢｒ３３．５２ｇを加え、撹拌下６時間環流した。溶媒を減圧留去した後、生成物にＣＨＣｌ３３００ｍｌを加え、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液４ｘ２００ｍｌで有機層を洗浄した後、更に、１０％のＮａＨＣＯ３水溶液２００ｍｌで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥し、溶媒を減圧留去し、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９９．５：０．５ｖ／ｖ）で精製した。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して化合物（７）を得た。収率は５６．３％であった。
元素分析結果（Ｃ２９Ｈ２０Ｂｒ２Ｎ４Ｏ２）：
計算値（％），Ｃ＝５６．５２，Ｈ＝３．２７，Ｎ＝９．０９。
実測値（％），Ｃ＝５６．６４，Ｈ＝３．３２，Ｎ＝９．１０。
質量分析結果（ＦＡＢ−ＭＳ）：
ｍ／ｅ，６１７．３（Ｍ＋Ｈ＋），５７１．３（Ｍ−ＮＯ２）
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物と４’−（２’’’’−ニトロ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジブロモメチルの混合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
８．７０（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．５７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１０−８．００（ｍ，６Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７０−７．５５（ｍ，４Ｈ），４．８４（ｓ，４Ｈ）。
（８）テトラエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’［（４’−（４’’’’−ニトロ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）−ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（アセテート）（前記反応スキームの化合物（８））の合成
１．９８ｍｍｏｌの前記反応スキームの化合物（７）（１．２２ｇ）を２５０ｍｌＣＨ３ＣＮ−５０ｍｌ  ＴＨＦの混合溶媒に溶かし、４．１ｍｍｏｌのジエチルイミノジアセテートと２０ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３を加え、撹拌下、２４時間還流した。不溶物を濾去し、溶媒を減圧留去した後、生成物に２５０ｍｌのＣＨＣｌ３を加え、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液２ｘ２００ｍｌでＣＨＣｌ３溶液を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥し、溶媒を減圧留去した後、油状生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ３ＣＯＯＥｔ）で精製した。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して化合物（８）を得た。収率は４６．１％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物と４’−（２’’’’−ニトロ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（アセテート）の混合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
８．７７（ｓ，２Ｈ），８．５７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９８−７．７９（ｍ，６Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５７−７．４２（ｍ，２Ｈ），４．２１（ｓ，４Ｈ），４．１７（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，８Ｈ），３．７１（ｓ，８Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１２Ｈ）。
（９）テトラエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’［（４’−（４’’’’−アミノ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（アセテート）（前記反応スキームの化合物（９））の合成
０．９１ｍｍｏｌの前記反応スキームの化合物（８）（０．７６ｇ）を６０ｍｌのＥｔＯＨに溶かし、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（５．７ｍｍｏｌ，１．２５ｇ）を加えた後、７０−８０℃で１時間撹拌した。室温に冷却後、氷水浴で冷却したＨ２Ｏ  １２０ｍｌ−ＤＴＰＡ  ７．８５ｇの溶液に注入し、撹拌した後、この溶液に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液２０ｍｌを加えた。室温で３０分間撹拌した後、水溶液をＣＨＣｌ３  ４ｘ１００ｍｌで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥した。溶媒を減圧留去した後、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ３ＣＯＯＥｔ−ＣＨ３ＯＨ＝９８：２  ｖ／ｖ）で精製した。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して化合物（９）を得た。収率は７９．２％であった。１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目標化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
８．７６（ｓ，２Ｈ），８．５５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），８．００−７．８４（ｍ，４Ｈ），７．７２−７．６２（ｍ，４Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．２１（ｓ，４Ｈ），４．１７（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，８Ｈ），３．７１（ｓ，８Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１２Ｈ）。
（１０）［４’−（４’’’’−アミノ−ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル］ビス（メチレンニトリル）テトラキス（酢酸）（ＡＴＢＴＡ，前記反応スキームの化合物（１０））の合成
前記反応スキームの化合物（９）（０．７２ｍｍｏｌ，５８０ｍｇ）をＥｔＯＨ  １００ｍｌ−Ｈ２Ｏ  ５ｍｌ−ＫＯＨ  ２．２ｇの溶液に溶かし、室温で２０時間撹拌した後、溶媒を減圧留去した。生成物を１００ｍｌの水に溶かし、撹拌下、１０倍希釈した塩酸水溶液を徐々に滴下し、溶液のｐＨを約１まで調節した。溶液を室温で３時間撹拌した後、沈澱を遠心収集し、１００倍希釈した塩酸水溶液で充分洗浄した後、真空乾燥して化合物（１０）を得た。収率は６５．９％であった。
元素分析結果（ＡＴＢＴＡ・３ＨＣｌ・４Ｈ２Ｏ，Ｃ３７Ｈ４５Ｎ６Ｏ１２Ｃｌ３）：
計算値（％），Ｃ＝５０．９５，Ｈ＝５．２０，Ｎ＝９．６４。
実測値（％），Ｃ＝５１．０５，Ｈ＝５．３６，Ｎ＝９．６５。
更に１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目標化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ
８．８９（ｓ，２Ｈ），８．７５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．２３−８．０５（ｍ，４Ｈ），７．９６−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６０−７．４５（ｍ，４Ｈ），４．６８（ｓ，４Ｈ），４．２４（ｓ，８Ｈ）。
上記ＡＴＢＴＡ・３ＨＣｌ・４Ｈ２Ｏを更に純水とアセトニトリルで十分洗浄した後、真空乾燥してＡＴＢＴＡを得た。
元素分析結果（Ｃ３７Ｈ３４Ｎ６Ｏ８）：
計算値（％），Ｃ＝６４．３４，Ｈ＝４．９６，Ｎ＝１２．１７。
実測値（％），Ｃ＝６３．８９，Ｈ＝５．１１，Ｎ＝１２．１４。
更に１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目標化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ
８．７５（ｓ，２Ｈ），８．５６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．０６−８．００（ｍ，４Ｈ），７．９３−７．７１（ｍ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６０−７．４０（ｍ，４Ｈ），４．１３（ｓ，４Ｈ），３．５９（ｓ，８Ｈ）。
実施例１１  ＡＴＢＴＡとユウロピウムとの錯体の合成
前記実施例１０で製造したＡＴＢＴＡ・３ＨＣｌ・４Ｈ２Ｏ（０．２ｍｍｏｌ，１６４．４ｍｇ）を水４．０ｍｌに加え、固体のＮａＨＣＯ３で溶液のｐＨを６．５に調節した後、ＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．２２ｍｍｏｌ，８０．６ｍｇ）−Ｈ２Ｏ  １．５ｍｌの溶液を加え、ＮａＨＣＯ３で溶液のｐＨを６．５に保ちつつ、１．５時間撹拌した。１ＭのＮａＯＨ溶液で反応液のｐＨを８．５に調節した後、沈澱を濾去し、濾液を回収した。濾液に８０ｍｌのアセトンを加え、錯体を析出させた。錯体を遠心収集し、アセトンで充分洗浄した後、真空乾燥してＡＴＢＴＡとユウロピウムとの錯体を得た。収量は１８０ｍｇであった。
元素分析結果［Ｎａ［Ｃ３７Ｈ３０Ｎ６Ｏ８Ｅｕ］・（ＮａＨＣＯ３）３・（ＮａＣｌ）２・（Ｈ２Ｏ）４］：
計算値（％），Ｃ＝３６．８８，Ｈ＝３．１７，Ｎ＝６．４５。
実測値（％），Ｃ＝３６．７４，Ｈ＝３．０９，Ｎ＝６．２６。
実施例１２  ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋錯体にアミノ反応活性置換基の導入：
実施例１１に記載の方法で作ったＡＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋錯体をｐＨ＝４．９の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液３．０ｍｌに溶かし、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアゼン（０．２ｍｍｏｌ，３６ｍｇ）を加え、攪拌下、アセトン２ｍｌと水２ｍｌを加えた。室温で３０分撹拌した後、１２０ｍｌのアセトンを加え、錯体を析出させた。沈澱を遠心収集し、アセトンで充分洗浄した後、真空乾燥して活性置換基を持つ錯体を得た。収量は１３９ｍｇであった。
実施例１３  活性置換基を持つＡＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋錯体の蛍光特性
実施例１２で製造した活性置換基を持つＡＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋錯体の蛍光スペクトルを、１．５ｘ１０−６Ｍ，ｐＨ＝９．１の０．０５Ｍホウ酸緩衝溶液中で測定した。
測定結果を第４図に示す。第４図の縦軸は相対蛍光強度を示し、横軸は波長（ｎｍ）を示す。第４図中のＥｘは励起スペクトルを、Ｅｍは発光スペクトルを、Ｅｘ−ＴＲは時間分解励起スペクトルを、Ｅｍ−ＴＲは時間分解発光スペクトルをそれぞれ示す。
このものの蛍光特性は、吸収極大波長が３３５ｎｍ、モル吸光係数が３．１１ｘ１０４Ｍ−１ｃｍ−１、蛍光極大波長が６１６ｎｍ、蛍光量子収率が０．０９１、蛍光寿命が１．０２ｍｓであった。
実施例１４  一般式［２−１］で示される化合物の製造
Ｒがビフェニル−４−イル基である一般式［２−１］で示される化合物を、以下に示す反応スキームにしたがって製造した。
2003076938.tif 000019
一般式［２−１］で示される化合物の合成
（１）４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジブロモメチルの合成
４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジヒドロキシメチル（４．４６ｇ，１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ４００ｍｌ−ＤＭＦ  １５０ｍｌ混合溶媒に溶解し、ＰＢｒ３８．１ｇを加え、撹拌下１６時間環流した。溶媒を減圧留去した後、生成物にＣＨＣｌ３４００ｍｌを加え、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液４ｘ２００ｍｌで有機層を洗浄した後、更に、１０％のＮａＨＣＯ３水溶液２００ｍｌで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥し、溶媒を減圧留去し、生成物をシリカゲルカラム（展開溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＝９９：１  ｖ／ｖ）で精製した。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジブロモメチルを得た。収率は８０．６％であった。
元素分析結果（Ｃ２９Ｈ２１Ｂｒ２Ｎ３）：
計算値（％），Ｃ＝６０．９７，Ｈ＝３．７０，Ｎ＝７．３５。
実測値（％），Ｃ＝６０．９４，Ｈ＝３．５４，Ｎ＝７．３３。
更に、１Ｈ  ＮＭＲで生成物は目的化合物であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
８．８１（ｓ，２Ｈ），８．５９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５５−７．４７（ｍ，４Ｈ），７．５０−７．３５（ｍ，１Ｈ）。
（２）［（４−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−（３，６−ジオキサ−トリエチレン）の合成
０．５０ｍｍｏｌの４’−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジブロモメチル（０．２９ｇ）をＣＨ３ＣＮ  ２５０ｍｌに溶かし、０．５０ｍｍｏｌの４，１３−ジアザ−１８−クラウン−６−エテールと５．０ｍｍｏｌのＮａ２ＣＯ３を加え、攪拌下２４時間還流した。濾過により不溶物を除去し、溶媒を減圧留去した後、生成物をアルミニウムカラム（展開溶媒：ＣＨＣｌ３−ＣＨ３ＯＨ＝９７：３  ｗ／ｗ）で精製した。収率は５１％であった。ＦＡＢ−ＭＳで生成物は目標化合物とＮａＢｒの１：１錯体（分子量６９４．７）であることを確認した。更に１Ｈ  ＮＭＲで目標化合物を確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ
８．５５（ｓ，２Ｈ），８．３９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），８．１５−８．０９（ｍ，４Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５６−７．４９（ｍ，４Ｈ），７．４７−７．４０（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｓ，４Ｈ），３．７０−３．４０（ｍ，１６Ｈ）；３．００−２．５５（ｍ，８Ｈ）。
実施例１５  ［（４−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−（３，６−ジオキサ−トリエチレン）とユウロピウムとの錯体の合成
０．７０ｍｍｏｌの実施例１４で製造した［（４−（ビフェニル−４’’’−イル）−２，２’：６’２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル）ビス（メチレンニトリロ）］−Ｎ：Ｎ’，Ｎ：Ｎ’−（３，６−ジオキサ−トリエチレン）−ＮａＢｒ錯体（０．５４ｇ）を１６０ｍｌ無水メタノールに溶かし、１ｍｍｏｌのＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏを加え、攪拌下２４時間還流した。室温に冷却し、反応液にエーテル８０ｍｌを加え、錯体を析出させた。沈澱を遠心収集し、真空乾燥して目標化合物を得た。収率は６２％であった。
ＦＡＢ−ＭＳで生成物は目標化合物であることを確認した。
ｍ／ｅ：８９４．６［Ｍ＋Ｅｕ＋２Ｃｌ］，
８５９．７［Ｍ＋Ｅｕ＋Ｃｌ］，
４１２．４［Ｃｒｏｗｎ＋Ｅｕ＋Ｃｌ］
実施例１６  アミノ反応活性置換基をもつ新規ラベル剤｛｛４’−［４’’’’−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアゼン−２−イル）アミノ−ビフェニル−４’’’−イル］−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル｝ビス（メチレンニトリル）テトラキス（アセテト）｝ユウロピウム（ＩＩＩ）（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋と略す）を用いた時間分解蛍光イムノアッセイによるヒト血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡと略す）の測定
１、ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を用いるストレプトアビジン（ＳＡと略す）の標識
２ｍｇのＳＡを１．５ｍｌのｐＨ９．１の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液に溶かした後、０．７ｍｌのｐＨ９．１の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液に溶かした２．８ｍｇのＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を加え、そのまま室温で３時間撹拌した。反応溶液をゲル濾過することで、未反応の標識試薬と標識タンパク質を分離した（１．０ｘ４０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムで、０．０５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３溶液で展開した）。３３５ｎｍにおける標識ＳＡ溶液の吸光度を測定することにより、標識ＳＡ溶液中のＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋濃度を計算し（標識前後ラベル剤のモル吸光係数が変化しないという仮設の条件下で）、標識ＳＡの標識率を計算したところ、ＳＡ（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）２６の溶液が得られた。ＳＡ（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）２６の溶液に防腐剤として１５ｍｇのＮａＮ３を、標識タンパク質の容器への吸着を防ぐため、３０ｍｇのＢＳＡを加えた後、−２０℃で保存した。時間分解蛍光イムノアッセイに使う時に、０．２％  ＢＳＡ−０．９％ＮａＣｌ−０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液で４００倍希釈した後、使用する。
２、ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を用いるＳＡ−ＢＳＡ結合体の標識
１ｍｇのＳＡと１ｍｇのＢＳＡを１．０ｍｌのｐＨ７．１の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液に溶かした後、０．０３ｍｌの１％グルタルアルデヒトを加え、撹拌した後、４℃で２４時間放置した。２ｍｇのＮａＢＨ４を加え、撹拌した後、室温で２時間放置した。得られた溶液を３Ｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に対し、４℃で２回（２４時間ずつ）透析した後、０．６ｍｌのｐＨ９．１の０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液を加え、０．８２ｍｌのｐＨ９．１の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液に溶かした１．６４ｍｇのＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を加え、そのまま室温で３時間撹拌した。反応溶液をゲル濾過することで、未反応の標識試薬と標識タンパク質を分離した。３３５ｎｍにおける標識ＳＡ−ＢＳＡ溶液の吸光度を測定することにより、標識ＳＡ−ＢＳＡ溶液中のＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋濃度を計算し、標識ＳＡ−ＢＳＡの標識率を計算したところ、約ＳＡ（ＢＳＡ）０．９（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）４２の溶液が得られた。ＳＡ（ＢＳＡ）０．９（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）４２の溶液に防腐剤として１５ｍｇのＮａＮ３を、標識タンパク質の容器への吸着を防ぐため、３０ｍｇのＢＳＡを加えた後、−２０℃で保存した。時間分解蛍光イムノアッセイに使う時に、０．２％  ＢＳＡ−０．９％ＮａＣｌ−０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液で４００倍希釈した後、使用する。
３、ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を用いるマウス抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体の標識
０．６ｍｌの透析後のマウス抗ＰＳＡモノクロナール抗体（ＯＥＭ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，０．５ｍｇ／ｍｌ，Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：１３１−１４２３４）に０．２ｍｌのｐＨ９．１の０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液を加え、０．０３２ｍｌのｐＨ９．１の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液に溶かした０．１１７ｍｇのＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋を加え、そのまま室温で２．５時間撹拌した。反応溶液をゲル濾過することで、未反応の標識試薬と標識タンパク質を分離した。３３５ｎｍにおける標識抗体溶液の吸光度を測定することにより、標識抗体溶液中のＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋濃度を計算し、標識抗体の標識率を計算したところ、標識率約２０の標識抗体溶液が得られた。溶液に防腐剤として１０ｍｇのＮａＮ３を、標識タンパク質の容器への吸着を防ぐため、１０ｍｇのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加えた後、−２０℃で保存した。時間分解蛍光イムノアッセイに使う時に、０．２％  ＢＳＡ−０．９％ＮａＣｌ−０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液で２００倍希釈した後、使用する。
４、ＳＡ（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）２６及びＳＡ（ＢＳＡ）０．９（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）４２を用いたヒトＰＳＡの時間分解蛍光イムノアッセイ
アッセイは９６−ウェルマイクロタイタープレートを用いて行った。具体的な操作法は次の通りである。
（１）  ビオチン化抗体の調製：透析後の０．４ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）のマウス抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液（ＯＥＭ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：１３１−１４２３４）に、０．６ｍｌの純水、８．４ｍｇのＮａＨＣＯ３と２ｍｇのスルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、４℃で２４時間インキュベートした。反応溶液を０．２５ｇ  ＮａＮ３を含む３Ｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液に対して４℃で２４時間ずつ２回透析した後、１０ｍｇのＢＳＡを加え、イムノアッセイに使用するまで、−２０℃で保存した。イムノアッセイに使う時に、０．２％  ＢＳＡ−０．９％ＮａＣｌ−０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液で１０００倍希釈した後、使用する。
（２）  ９６−ウェルマイクロタイタープレートのコーティング：ｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸緩衝溶液でマウス抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（ＯＥＭ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：１３１−１１２１４）を１２．５μｇ／ｍｌに薄めた後、９６ウェルの透明ポリスチレンのマイクロタイタープレート（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ  ｐｌａｔｅ）に５０μｌずつ分注し、４℃で２４時間インキュベートした。その後、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むｐＨ７．８の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（バッファー１）で２回洗浄し、更にｐＨ７．８の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（バッファー２）で１回洗浄した。
（３）  ＰＳＡのイムノアッセイ：コーテイング済みの９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェルに４５μｌずつＰＳＡ標準溶液（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．）を分注し、３７℃で２時間インキュベートした後、バッファー１で２回、バッファー２で１回プレートを洗浄した。各ウェルにビオチン化抗ヒトＰＳＡ抗体を４５μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした後、バッファー１で２回、バッファー２で１回プレートを洗浄した。各ウェルにＳＡ（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）２６或いはＳＡ（ＢＳＡ）０．９（ＤＴＢＴＡ−ＥＵ３＋）４２を４５μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした後、バッファー１でプレートを４回洗浄し、そのまま固相時間分解蛍光測定に用いた。
本測定に用いた時間分解蛍光測定装置はＤＥＬＦＩＡ  １２３４時間分解蛍光測定装置（Ｗａｌｌａｃ社製）であり、測定条件は、励起波長＝３４０ｎｍ、測定波長＝６１５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．２ｍｓ、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝０．４ｍｓ、繰り返し時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝１．０ｍｓであった。
以上のイムノアッセイで得られた検量線を第５図に示した。バックグラウンドシグナル＋３ＳＤ（標準偏差）を検出限界とすると、ＳＡ（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）２６を用いた方法の検出限界は２２ｐｇ／ｍｌであり、ＳＡ（ＢＳＡ）０．９（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）４２を用いた方法の検出限界は８ｐｇ／ｍｌあった。
５、ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識マウス抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体を用いたヒトＰＳＡの時間分解蛍光イムノアッセイ
マウス抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（ＯＥＭ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：１３１−１１２１４）でコーテイング済みの９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェルに４５μｌずつＰＳＡ標準溶液を分注し、３７℃で２時間インキュベートした後、バッファー１で２回、バッファー２で１回プレートを洗浄した。各ウェルにＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識マウス抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（ＯＥＭ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：１３１−１４２３４）を４５μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした後、バッファー１でプレートを４回洗浄し、そのまま固相時間分解蛍光測定に用いた。測定条件は上と同じである。
以上のイムノアッセイで得られた検量線を第６図に示した。バックグラウンドシグナル＋３ＳＤ（標準偏差）を検出限界とすると、この方法の検出限界は４１ｐｇ／ｍｌあった。
産業上の利用可能性
本発明は、被標識物質（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）との結合基を有し、希土類金属イオンと容易に錯体を形成し得る新規な標識試薬を提供するものである。該錯体は水溶液中で非常に安定であり、十分な蛍光強度と長い蛍光寿命を有する。それ故、該錯体を用いることにより、アミノ基やメルカプト基等の官能基を有する酵素、タンパク質、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド）、ホルモン、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、薬物（抗生物質を含む）及びその他の有機化合物等を水溶液中で直接標識することが可能となる。
また、本発明に係る新規標識試薬は、共有結合形成により被標識物質（具体的には、アミノ基やメルカプト基等を有する酵素、タンパク質、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド）、ホルモン、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、薬物（抗生物質を含む）及びその他の有機化合物等）と非常に安定な標識複合体を形成し、それを希土類イオンと反応させることにより非常に安定な希土類蛍光錯体標識複合体が得られる。その標識複合体も同様に非常に長い蛍光寿命と強い蛍光を有し、時間分解蛍光イムノアッセイやＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ等に直接応用可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋の溶液の蛍光スペクトルを示す図である。［ＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋］＝１．０×１０−６Ｍ，ｐＨ９．１の０．０５Ｍホウ酸緩衝液中。
第２図は、本発明のＡＴＴＴＡ−Ｅｕ３＋希釈溶液の時間分解蛍光測定の結果を示す図である。
第３図は、本発明の時間分解蛍光イムノアッセイで得られた検量線を示す図である。
第４図は、本発明の活性置換基を持つＡＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋錯体の蛍光スペクトルを示す図である。［ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋］＝１．５ｘ１０−６Ｍ，ｐＨ＝９．１の０．０５Ｍホウ酸緩衝溶液中。
第５図は、ＳＡ（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）２６（□）及びＳＡ（ＢＳＡ）０．９（ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋）４２（○）を用いた時間分解蛍光イムノアッセイによるヒトＰＳＡ測定の検量線を示す図である。
第６図は、ＤＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋標識マウス抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体を用いた時間分解蛍光イムノアッセイによるヒトＰＳＡ測定の検量線を示す図である。
【図１】
2003076938.tif 000030
【図２】
2003076938.tif 000031
【図３】
2003076938.tif 000032
【図４】
2003076938.tif 000033
【図５】
2003076938.tif 000034
【図６】
2003076938.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月2日(2004.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］
2003076938.tif 000036
（式中、Ｒは、４−ビフェニル基、又は活性置換基を有する４−ビフェニル基を表す。）
で示される化合物、もしくは一般式［２］
2003076938.tif 000037
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物からなる２，２’：６’，２’’−トリピリジン骨格、又は２，６−ジピラゾールピリジン骨格を有し、標識される物質との結合基と、希土類イオンとの錯形成結合基とを有する化合物からなる蛍光標識用の標識試薬。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
該化合物が一般式［１］における基Ｒが、４’−アミノ−４−ビフェニル基である請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
該化合物が一般式［２］における基Ｒが、４−ビフェニル基である請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項６】
該化合物が一般式［３］
2003076938.tif 000038
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物である、請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項７】
該化合物が一般式［４］
2003076938.tif 000039
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物である、請求の範囲第１項に記載の標識試薬。
【請求項８】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体。
【請求項９】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を含んでなる蛍光標識剤。
【請求項１０】
希土類金属イオンが三価のユウロピウムイオン、三価のサマリウムイオン、三価のテルビウムイオン又は三価のジスプロシウムイオンである請求の範囲第９項に記載の蛍光標識剤。
【請求項１１】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を標識剤として用いることを特徴とする蛍光標識方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを用いることを特徴とする蛍光標識方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を含んでなる蛍光標識剤で標識した生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１４】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを用いて蛍光標識した生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１５】
生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤（抗生物質を含む）である請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の標識した生体由来物質又は生理活性物質。
【請求項１６】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として用いることを特徴とする蛍光測定法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを用いることを特徴とする蛍光測定法。
【請求項１８】
蛍光測定法が、時間分解蛍光測定法である請求の範囲第１６項又は第１７項に記載の蛍光測定法。
【請求項１９】
時間分解蛍光測定法が、時間分解蛍光イムノアッセイ、時間分解蛍光ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、時間分解蛍光顕微鏡イメジング又は時間分解蛍光クロマトグラフィーである請求の範囲第１８項に記載の蛍光測定法。
【請求項２０】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として含んでなる蛍光測定法用試薬。
【請求項２１】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを含んでなる蛍光測定法用試薬。
【請求項２２】
生体由来物質又は生理活性物質を測定する請求の範囲第２０項又は第２１項に記載の蛍光測定法用試薬。
【請求項２３】
生体由来物質又は生理活性物質が、酵素、タンパク質、ホルモン、ペプチド、核酸、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤（抗生物質を含む）である請求の範囲第２２項に記載の蛍光測定法用試薬。
【請求項２４】
請求の範囲第１項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとからなる錯体を蛍光標識剤として含んでなる試薬キット。
【請求項２５】
請求の範囲第１項、第３項、及び第５項〜第７項の何れかに記載の標識試薬と、希土類金属イオンとを含んでなる試薬キット。
【請求項２６】
一般式［１］
2003076938.tif 000040
（式中、Ｒは、４−ビフェニル基、又は活性置換基を有する４−ビフェニル基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【請求項２７】
一般式［１−１］
2003076938.tif 000041
で示される請求の範囲第２６項に記載の化合物、又はその塩。
【請求項２８】
一般式［２］
2003076938.tif 000042
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【請求項２９】
一般式［２−１］
2003076938.tif 000043
で示される請求の範囲第２８項に記載の化合物、又はその塩。
【請求項３０】
一般式［３］
2003076938.tif 000044
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【請求項３１】
一般式［４］
2003076938.tif 000045
（式中、Ｒは、アリール基、活性置換基を有するアリール基、複素環基又は活性置換基を有する複素環基を表す。）
で示される化合物、又はその塩。
【国際調査報告】
2003076938.tif 000046
2003076938.tif 000047
2003076938.tif 000048
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