(57)【要約】実質的に単離された神経系細胞を大量に供給し、神経変性疾患、神経損傷等に対する神経再生医療等への応用手段を提供すること。アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養する、実質的に単離された神経系細胞の製造方法及びそれにより得られた神経系細胞、該神経幹細胞を有効成分とする細胞医薬組成物、並びに該神経系細胞を神経変性部位又は神経損傷部位に導入する、神経変性疾患又は神経損傷の治療方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養することを特徴とする、実質的に単離された神経系細胞の製造方法。
【請求項２】
胚性幹細胞が、哺乳動物由来の胚性幹細胞である、請求項１記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項３】
哺乳動物が、マウス、カニクイザル、ヒト、及びラットからなる群より選ばれたものである、請求項２記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項４】
（Ａ）アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養して、幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）を形成させる工程を含む、請求項１〜３いずれか１項に記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項５】
工程（Ａ）の後に、
（Ｂ）塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下、かつ細胞接着分子の存在下、該工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）を培養する工程、
を行ない、それにより、ＳＣＳから遊走した細胞として神経幹細胞を得る、請求項４記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項６】
工程（Ｂ）における培養が、工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）と、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて行なわれる、請求項５記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項７】
（Ａ’）アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、かつ塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養する工程、
を行ない、それにより、幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）内に神経幹細胞を得る、請求項１〜３いずれか１項に記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項８】
工程（Ａ）の後に、
（Ｂ’）塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の非存在下、かつアストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）と、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて培養する工程、
を行ない、それにより、神経細胞を得る、請求項４記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項９】
工程（Ａ）の後に、
（Ｂ）塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下、かつ細胞接着分子の存在下、該工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）を培養する工程、及び
（Ｃ）ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦの非存在下、該工程（Ｂ）で得られたＳＣＳと、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて培養する工程、
を行ない、それにより、ＳＣＳから遊走した細胞としてグリア細胞を得る、請求項４記載の神経系細胞の製造方法。
【請求項１０】
塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の非存在下、かつアストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、請求項１〜７いずれか１項に記載の製造方法により得られた神経幹細胞を、細胞接着分子を保持した接着性培養基質と接着させて培養する、神経細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜７いずれか１項に記載の製造方法により胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された神経幹細胞。
【請求項１２】
凍結保存されてなる、請求項１０記載の神経幹細胞。
【請求項１３】
請求項８又は１０記載の製造方法により得られる、実質的に単離された神経細胞。
【請求項１４】
クラスＩＩＩ  βチューブリン、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素及びコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種を発現してなる、請求項１３記載の実質的に単離された神経細胞。
【請求項１５】
請求項９記載の製造方法により得られる、実質的に単離されたグリア細胞。
【請求項１６】
請求項１〜７いずれか１項に記載の製造方法により胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された神経幹細胞を有効成分として含有してなる、細胞医薬組成物。
【請求項１７】
請求項８又は１０記載の製造方法により得られる、実質的に単離された神経細胞を有効成分として含有してなる、細胞医薬組成物。
【請求項１８】
請求項９記載の製造方法により得られる、実質的に単離されたグリア細胞を有効成分として含有してなる、細胞医薬組成物。
【請求項１９】
（１）請求項１〜７いずれか１項に記載の製造方法により胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された神経幹細胞、
（２）請求項８又は１０記載の製造方法により得られる、実質的に単離された神経細胞、及び
（３）請求項９記載の製造方法により得られる、実質的に単離されたグリア細胞からなる群より選ばれた少なくとも１つの細胞を、神経変性部位又は神経損傷部位に適用することを特徴とする、神経変性疾患又は神経損傷の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、実質的に単離された神経系細胞を得ることが可能な、神経系細胞の製造方法、実質的に単離された神経幹細胞、実質的に単離された神経細胞、実質的に単離されたグリア細胞、細胞医薬組成物及び神経変性疾患又は神経損傷の治療方法に関する。
【背景技術】  現在、胚性幹細胞から神経系細胞を作製するためには、主に４つの方法：
▲１▼胚性幹細胞凝集体の浮遊培養物をレチノイン酸で処理し、それにより、種々の神経系細胞へ分化誘導する方法［ベイン（Ｂａｉｎ，Ｇ．）ら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８：６４２−６５７（１９９５）］；
▲２▼胚様体〔ＥＢ（ｅｍｂｒｉｏｉｄ  ｂｏｄｙ）という〕を作製し、該ＥＢを無血清の培養液で培養して、ネスチン陽性細胞として神経幹細胞を得、該神経幹細胞を塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）存在下に培養して神経系細胞への分化誘導に用いる方法［オカベ（Ｏｋａｂｅ，Ｓ．）ら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，５９：８９−１０２（１９９６）］；
▲３▼株化したストローマ細胞上で胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を培養することによりコロニーを形成させ、神経系細胞へ分化誘導する方法（ＳＤＩＡ法）［カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．）ら，Ｎｅｕｒｏｎ，２８：３１−４０（２０００）］；並びに
▲４▼白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下、ＥＳ細胞を浮遊培養し、ＥＳ細胞中に約０．２％存在する神経幹細胞からｎｅｕｒａｌ  ｓｐｈｅｒｅを作製し、ついで神経系細胞へ分化誘導する方法［トロペッペ（Ｔｒｏｐｅｐｅ  Ｖ．）ら，Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：６５−７８（２００１）］
が行なわれている。しかしながら、これらの方法によれば、レチノイン酸による分化細胞の催奇性、神経幹細胞を作製に要する時間、分化の割合、収量の効率等の観点から、再生医療に用いるための細胞を十分量確保することが困難であるのが現状である。
神経幹細胞は、神経細胞やグリア細胞に分化できる多分化能をもち、また自己複製能をもつ細胞であり、神経系の移植再生医学にとって重要な役割をはたす細胞である。神経幹細胞を未分化な状態で維持し増殖させる方法として、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法が確立されている［レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：４５６５−４５７４，（１９９２）、レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１７０７−１７１０（１９９２）］。前記Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法によれば、脳から分離した神経幹細胞を含む細胞群を、Ｎ２添加物〔Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；インスリン、トランスフェリン、セレン及びプロゲステロン〕と２０ｎｇ／ｍｌ  上皮増殖因子（ＥＧＦという）及び／又は２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦとを含むＤＭＥＭ：Ｆ−１２無血清培地中で培養すると、前記培地条件下で生存することができる神経幹細胞のみが増殖する。増殖した神経幹細胞は、マーカーである中間径フィラメントのネスチンに陽性であり、細胞凝集体（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を形成し、浮遊状態で培養することができるようになる。前記ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは、成長促進因子を除いて接着性の基質プレート上で培養すると、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等に分化する（多分化能）ことが見出されている。さらに、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを単一の細胞にまで分離し、成長促進因子を含む無血清培地で該細胞を培養すると、再び、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成すること（自己複製能）が示されている。しかしながら、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは、全ての細胞からではなく一部の細胞からしか形成されないという欠点がある。
また、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法とは異なる方法として、接着性の基質でコートしたプレート上で神経幹細胞を培養し増殖分化させる単層培養法も確立されている。前記単層培養法としては、密度勾配遠心分離により神経幹細胞を濃縮して単層培養を行なう方法［パルマー（Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ．Ｄ．）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９：８４８７−８４９７（１９９９）］、低密度で単層培養して神経幹細胞をクローン化し増殖を行なう方法［レイ（Ｒａｙ，Ｊ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：３６０２−３６０６（１９９３）、ゲージ（Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１８７９−１１８８３（１９９５）］が行なわれる。前記単層培養法は、それぞれの細胞を同定できるため、神経幹細胞からどのような細胞に分化していくかの細胞系譜の解析に適している。しかしながら、神経幹細胞を未分化な状態に保つことが難しく、該神経幹細胞の増殖が遅いため、大量の神経幹細胞を必要とする目的には適していないのが現状である。
したがって、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法及び単層培養法のいずれの方法においても、どの細胞が未分化なまま神経幹細胞として増殖するか正確に判断することが困難である。
【発明の開示】
本発明は、実質的に単離された神経系細胞を得ること、該神経系細胞を大量に得ること及び胚性幹細胞の供給源に限定されることなく神経系細胞を提供することの少なくとも１つを達成しうる、神経系細胞の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、脊髄損傷、脳梗塞等に対する神経再生医療等における細胞又は組織の供給源として有用な、実質的に単離された神経幹細胞を提供することを目的とする。さらに、本発明は、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、脊髄損傷、脳梗塞等に対する神経細胞移植治療等の再生医療に有用な神経細胞を提供することを目的とする。また、本発明は、神経細胞及び神経幹細胞と同時に移植して、神経細胞の分化成長を支持し、さらに血液脳関門を形成して栄養物質の補給を行なうのに有用なグリア細胞を提供することを目的とする。さらに、本発明は、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、脊髄損傷、脳梗塞等に対する神経細胞移植治療等の再生医療に有用であり、細胞治療の際、安定した治療効果、高い治療効果等を得ることができる、細胞医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、神経変性又は神経損傷に起因する状態を、安定な状態で治療することが可能な、神経変性疾患又は神経損傷の治療方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養することを特徴とする、実質的に単離された神経系細胞の製造方法、
〔２〕  胚性幹細胞が、哺乳動物由来の胚性幹細胞である、前記〔１〕記載の神経系細胞の製造方法、
〔３〕  哺乳動物が、マウス、カニクイザル、ヒト、及びラットからなる群より選ばれたものである、前記〔２〕記載の神経系細胞の製造方法、
〔４〕  （Ａ）アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養して、幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）を形成させる工程を含む、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の神経系細胞の製造方法、
〔５〕  工程（Ａ）の後に、
（Ｂ）塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下、かつ細胞接着分子の存在下、該工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）を培養する工程、
を行ない、それにより、ＳＣＳから遊走した細胞として神経幹細胞を得る、前記〔４〕記載の神経系細胞の製造方法、
〔６〕  工程（Ｂ）における培養が、工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）と、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて行なわれる、前記〔５〕記載の神経系細胞の製造方法、
〔７〕  （Ａ’）アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、かつ塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養する工程、
を行ない、それにより、幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）内に神経幹細胞を得る、
前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の神経系細胞の製造方法、
〔８〕  工程（Ａ）の後に、
（Ｂ’）塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の非存在下、かつアストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）と、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて培養する工程、
を行ない、それにより、神経細胞を得る、前記〔４〕記載の神経系細胞の製造方法、
〔９〕  工程（Ａ）の後に、
（Ｂ）塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下、かつ細胞接着分子の存在下、該工程（Ａ）で得られた幹細胞球状凝集体（ＳＣＳ）を培養する工程、及び
（Ｃ）ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦの非存在下、該工程（Ｂ）で得られたＳＣＳと、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて培養する工程、
を行ない、それにより、ＳＣＳから遊走した細胞としてグリア細胞を得る、前記〔４〕記載の神経系細胞の製造方法、
〔１０〕  塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び／又は上皮成長因子（ＥＧＦ）の非存在下、かつアストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の製造方法により得られた神経幹細胞を、細胞接着分子を保持した接着性培養基質と接着させて培養する、神経細胞の製造方法、
〔１１〕  前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の製造方法により胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された神経幹細胞、
〔１２〕  凍結保存されてなる、前記〔１０〕記載の神経幹細胞、
〔１３〕  前記〔８〕又は〔１０〕記載の製造方法により得られる、実質的に単離された神経細胞、
〔１４〕  クラスＩＩＩ  βチューブリン、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素及びコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種を発現してなる、前記〔１３〕記載の実質的に単離された神経細胞、
〔１５〕  前記〔９〕記載の製造方法により得られる、実質的に単離されたグリア細胞、
〔１６〕  前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の製造方法により胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された神経幹細胞を有効成分として含有してなる、細胞医薬組成物、
〔１７〕  前記〔８〕又は〔１０〕記載の製造方法により得られる、実質的に単離された神経細胞を有効成分として含有してなる、細胞医薬組成物、
〔１８〕  前記〔９〕記載の製造方法により得られる、実質的に単離されたグリア細胞を有効成分として含有してなる、細胞医薬組成物、並びに
〔１９〕  （１）前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の製造方法により胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された神経幹細胞、
（２）前記〔８〕又は〔１０〕記載の製造方法により得られる、実質的に単離された神経細胞、及び
（３）前記〔９〕記載の製造方法により得られる、実質的に単離されたグリア細胞
からなる群より選ばれた少なくとも１つの細胞を、神経変性部位又は神経損傷部位に導入することを特徴とする、神経変性疾患又は神経損傷の治療方法、
に関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で浮遊培養させたマウス胚性幹細胞（ＨＫ細胞株）コロニー（ＳＣＳ）について、神経幹細胞のマーカーであるネスチンの発現の分布及び細胞分裂の指標であるＢｒｄＵの取り込みを調べた結果を示す写真である。なお、観察には、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社製の共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡を用いた。図中、パネルＡは、ＳＣＳの位相差観察像を示し、パネルＢは、抗ネスチン抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、抗ＢｒｄＵ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＤは、パネルＢ及びパネルＣの二重露光像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第２図は、浮遊培養を７日間継続したＳＣＳについて、幼弱ニューロンのマーカーであるクラスＩＩＩ  βチューブリンの発現を調べた結果を示す写真である。なお、観察には、Ｎｉｋｏｎ社製の正立蛍光顕微鏡を用いた。図中、パネルＡは、ＳＣＳの位相差観察像を示し、パネルＢは、抗クラスＩＩＩ  βチューブリン抗体による免疫蛍光染色像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第３図は、浮遊培養４日後、接着性基質でコートした培養ディッシュの培養面側（すなわち、培地が入ってる側）の表面で４日間接着培養したＳＣＳにおける分化誘導を調べた結果を示す写真である。パネルＡは、位相差像を示し、パネルＢは、抗ネスチン抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、抗ニューロフィラメント（ＮＦ）抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＤは、パネルＢとパネルＣとの二重露光像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第４図は、接着培養したＳＣＳにおけるＢｒｄＵの取り込み及びニューロフィラメントの発現の分布を調べた結果を示す写真である。なお、観察には、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いた。図中、パネルＡは、抗ＮＦ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＢは、抗ＢｒｄＵ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、パネルＡとパネルＢとの二重露光像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第５図は、接着したＳＣＳにおける神経伝達物質合成酵素の発現を調べた結果を示す写真である。なお、観察には、正立蛍光顕微鏡を用いた。図中、パネルＡは、位相差像を示し、パネルＢは、抗ＮＦ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ）抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＤは、パネルＢとパネルＣとの二重露光像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第６図は、接着したＳＣＳにおける神経伝達物質合成酵素の発現を調べた結果を示す写真である。なお、観察には、正立蛍光顕微鏡を用いた。パネルＡは、抗グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＢは、抗ＮＦ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、パネルＡとパネルＢとの二重露光像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第７図は、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の発現を調べた結果を示す写真である。なお、観察には、正立蛍光顕微鏡を用いた。パネルＡは、抗ＣｈＡＴ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＢは、抗ＮＦ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、パネルＡとパネルＢとの二重露光像を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。
第８図は、ＳＣＳを接着培養し、かつ培養液として、ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７を用いた場合のＳＣＳを調べた結果を示す写真である。パネルＡは、位相差像を示し、パネルＢは、抗ネスチン抗体による免疫蛍光染色像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第９図は、１個のＳＣＳから遊走してきた神経幹細胞のコロニーを示す写真である。スケールバーは、５０μｍを示す。
第１０図は、ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７中、神経幹細胞を遊走させるＳＣＳにおけるＢｒｄＵの取り込み及びネスチンの発現の分布を調べた結果を示す写真である。パネルＡは、抗ＢｒｄＵによる免疫蛍光染色像を示し、パネルＢは、抗ネスチン抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、パネルＡとパネルＢとの二重露光像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第１１図は、マウス胚性幹細胞ＨＫ細胞株からＳＣＳ作製時に浮遊培養液中に初めからｂＦＧＦを加えたときの、神経幹細胞のマーカーのネスチン及び細胞分裂の指標となるＢｒｄＵの分布を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、抗ネスチン抗体の免疫蛍光染色像を示す。また、図中、パネルＢは、抗ＢｒｄＵ抗体の免疫蛍光染色像を示す。パネルＣは、パネルＡ及びパネルＢの二重露光像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第１２図は、ＳＣＳから遊走した神経幹細胞の神経細胞への分化を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７を、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物に交換した直後のＳＣＳ及び神経幹細胞の位相差像を示し、パネルＢは、交換１日後の位相差像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
第１３図は、遊走した神経幹細胞由来の神経細胞における神経伝達物質合成酵素の発現を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、位相差像を示し、パネルＢは、抗ＮＦ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、抗ＴＨ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＤは、パネルＢとパネルＣとの二重露光像を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。
第１４図は、遊走した神経幹細胞由来の神経細胞におけるＴＨ及びＧＡＤの発現の分布を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、位相差像を示し、パネルＢは、抗ＴＨ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、抗ＧＡＤ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＤは、パネルＢとパネルＣとの二重露光像を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。
第１５図は、遊走した神経幹細胞由来の神経細胞における神経伝達物質のセロトニンの存在を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、位相差像を示し、パネルＢは、抗セロトニン抗体による免疫蛍光染色像を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。
第１６図は、遊走した神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、ＳＣＳを中心にした位相差像を示し、パネルＢは、パネルＡと同じ部位における抗ＧＦＡＰ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、パネルＡと同じ部位における抗ＮＦ抗体による対照の染色像を示し、パネルＤは、ＳＣＳから離れた部位の位相差像を示し、パネルＥは、パネルＤと同じ部位における抗ＧＦＡＰ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＦは、コロニー周辺部における抗ＧＦＡＰ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＧは、同じく、コロニー周辺部における抗ＧＦＡＰ抗体による免疫蛍光染色像（高倍率）を示し、パネルＨは、コロニー周辺部での抗ＧＦＡＰ抗体による免疫蛍光染色像（高倍率）を示す。パネルＡ〜Ｆのスケールバーは、５０μｍを示し、パネルＧとＨのスケールバーは、２０μｍを示す。
第１７図は、分散させた遊走神経幹細胞の神経細胞への分化を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、抗ネスチン抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＢは、抗ＴＨ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、パネルＡとパネルＢとの二重露光像を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。
第１８図は、凍結保存された神経幹細胞の神経細胞への分化を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、位相差像を示し、パネルＢは、抗ＴＨ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、抗ＣｈＡＴ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＤは、パネルＡとパネルＢとの二重露光像を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。
第１９図は、市販されている胚性幹細胞樹立株（１２９ＳＶ細胞株）について、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中での浮遊培養を行なった結果を示す写真である。スケールバーは、５０μｍを示す。
第２０図は、カニクイザルより樹立した胚性幹細胞株のＣＭＫ−６細胞株におけるＳＣＳを作製したときのネスチンの分布を示す写真である。図中、パネルＡは、抗ネスチン抗体による、浮遊ＳＣＳの免疫蛍光染色像である。図中、パネルＢは、抗ネスチン抗体による、ＳＣＳを接着させ遊走してきた細胞の免疫蛍光染色像である。スケールバーは、５０μｍを示す。
第２１図は、カニクイザル由来のＣＭＫ−６細胞株について、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中での浮遊培養を行なった結果を示す写真である。スケールバーは、２０μｍを示す。
第２２図は、カニクイザル胚性幹細胞のＣＭＫ−６細胞株から得られたＳＣＳから遊走してくる神経細胞における神経伝達物質の合成酵素の発現を調べた結果を示す写真である。図中、パネルＡは、抗ＴＨ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＢは、抗ＮＦ抗体による免疫蛍光染色像を示し、パネルＣは、パネルＡとパネルＢとの二重露光像を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。
第２３図は、胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導に伴う遺伝子発現を調べた結果を示す図である。図中、レーン１は、未分化な胚性幹細胞クローン、レーン２は、浮遊培養４日間によって形成されたＳＣＳ、レーン３は、接着培養５日間で得られた細胞塊の結果を示す。
第２４図は、胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導に伴う遺伝子発現の経時的変化を示す図である。Ｏｃｔ−４、ネスチン（図中、Ｎｅｓｔｉｎ）及びＴＨそれぞれの量を、ＧＡＰＤＨの量で割り、Ｏｃｔ−４／ＧＡＰＤＨ、ネスチン／ＧＡＰＤＨ、ＴＨ／ＧＡＰＤＨとして相対的な発現量を求め、さらに、相対的な発現量の最高値を１として、グラフに示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の実質的に単離された神経系細胞の製造方法は、アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養することを１つの大きな特徴とする。本発明は、アストロサイト細胞培養上清、すなわち、アストロサイト馴化培地を用い、未分化な胚性幹細胞を浮遊培養することにより、該胚性幹細胞から神経幹細胞へ短期間で分化誘導することができ、かつ、大量に神経幹細胞を調製することができること、及びさらに分化誘導した神経幹細胞を用いて神経細胞、特に、ドーパミン作動性ニューロン；グリア細胞、特に、アストロサイトへの分化誘導を行なうことができるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
本発明の神経系細胞の製造方法によれば、胚性幹細胞の培養に際して、アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分を用いるため、未分化の胚性幹細胞から、短期間で効率よく、実質的に単離された神経系細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。本発明の神経系細胞の製造方法によれば、胚性幹細胞の浮遊培養後２〜４日という、例えば、ＳＤＩＡ法等に比べ、驚くべく短期間に神経幹細胞を得ることができる。また、本発明の神経系細胞の製造方法によれば、胚性幹細胞を浮遊培養するため、驚くべく効率で、驚くべく短期間に神経系細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。具体的には、本発明の神経系細胞の製造方法によれば、該胚性幹細胞から、神経系細胞以外の外胚葉性細胞、中胚葉性細胞及び内胚葉性細胞を誘導することなく効率よく、実質的に単離された神経系細胞を提供することができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の製造方法によれば、胚性幹細胞から、神経幹細胞を経て、神経細胞又はグリア細胞のいずれか１種を選択的に分化させることができるという優れた効果を奏する。
なお、本明細書において、「神経系細胞」の語は、神経幹細胞、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（例えば、アストロサイト等）等を包含するものとする。
前記神経幹細胞は、脳、脊髄等を構成するニューロン、グリア細胞等への多分化能を有し、自己複製能を有する中枢神経系多能性未分化細胞をいう。前記神経幹細胞は、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）、ＲＣ２、ムサシ１（Ｍｕｓａｓｈｉ１）等のマーカーの発現を指標として、例えば、対応する遺伝子の発現を慣用の核酸の検出方法により調べること又はタンパク質の発現を免疫細胞組織化学的手法により調べることにより同定されうる。
前記神経細胞、すなわち、ニューロンは、情報伝達物質の受容体の発現に特徴があり、例えば、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリンアセチルトランスフェラーゼ等の発現を特徴とする。また、ニューロンの形態的特徴としては、細胞体、樹状突起、軸索、軸索成長円錐等が挙げられる。
本発明の神経系細胞の製造方法により得られる神経細胞としては、ニューロン等が挙げられ、前記ニューロンとしては、より具体的には、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン等が挙げられる。前記ドーパミン作動性ニューロンは、例えば、パーキンソン病等への応用が期待される。また、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、抑制性ニューロンであり、過剰興奮の抑制等への応用が期待される。また、前記コリン作動性ニューロンは、アルツハイマー病等への応用が期待される。
前記グリア細胞は、ニューロンとニューロンとの隙間を埋め、該ニューロンの代謝の仲介をするとともに、支持組織として働く細胞である。前記グリア細胞としては、中枢神経系では、アストロサイト、オリゴデンドロサイト及びミクログリオサイトが挙げられ、末梢神経系では、外套細胞、シュワン細胞及び終末神経膠細胞が挙げられる。本発明の神経系細胞の製造方法によれば、前記グリア細胞のなかでも、特に、アストロサイトが得られうる。前記アストロサイトは、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現を特徴とする。また、前記アストロサイトの形態的特徴としては、特有の分岐した数多くの突起を有することが挙げられる。
本発明の神経系細胞の製造方法としては、具体的には、
（Ａ）アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、胚性幹細胞を浮遊培養して、幹細胞球状凝集体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｓｐｈｅｒｅ；ＳＣＳという）を形成させる工程を含む方法が挙げられる。
本発明に用いられるアストロサイト馴化培地は、アストロサイトの培養物の上清であり、例えば、Ｎ２添加物〔インスリン、トランスフェリン、セレン、プロゲステロン；例えば、ボテンシュタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５１４（１９７９）等を参照のこと〕を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とＦ−１２培地との混合培地〔（体積比＝１：１〜１：３）；以下、前記混合培地を「ＤＭＥＭ：Ｆ−１２」という〕を基本培地として用いてアストロサイトを、例えば、１日培養し、得られた培養物から、例えば、遠心分離等でアストロサイトを除去することにより得られうる。なお、アストロサイトの培養のための基本培地としては、前記ＤＭＥＭ：Ｆ−１２の他に、例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＭＥＭ、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ〔ギブコ  ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社製〕等が挙げられる。これらの培地は、例えば、フレシュニー（Ｆｒｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉａｎ）、カルチャー・オブ・アニマルセルズ・ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニック、第２版（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ  ｅｄ．）、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ．Ｉｎｃ．，６６−８４（１９８７）等の記載に基づき調製されうる。また、アストロサイト馴化培地の調製に際して用いられうるアストロサイトには、特に限定されるものではない。また、前記アストロサイトは、既報の方法［バンカー（Ｂａｎｋｅｒ，Ｇ．）ら編，カルチャリング  ナーブ  セルズ（Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ），（１９９１），ザ  エムアイティー  プレス（Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ）（ケンブリッジ，イギリス）発行］に従い、例えば、任意の動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ウサギ等）の脳、例えば、マウス胎仔脳、ラット胎仔脳等から、脳膜を取り除いた後、慣用の細胞単離操作で行なわれる酵素処理（例えば、トリプシン処理、ディスパーゼ処理等）に供して細胞を解離・分散させ、グリア繊維性産生タンパク質を発現する細胞を選別し、動物由来の血清、例えば、ウシ胎仔血清等を含む動物細胞培養用栄養培地〔例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、改変イーグル培地（ＭＥＭ）等〕で増殖させることにより採取されうる。
前記「馴化培地と実質的に同等な成分」とは、馴化培地と同じ作用を発揮しうる成分をいい、アストロサイトの培養物から、用いられた基本培地の成分とアストロサイトとを除去して得られた成分、例えば、代謝産物等をいう。
本発明の神経系細胞の製造方法に用いられる胚性幹細胞は、その供給源となる個体の種類に特に限定されるものでなく、例えば、哺乳動物、具体的には、例えば、マウス、サル（例えば、カニクイザル等）、ヒト、ラット等に由来する胚性幹細胞等が挙げられる。具体的には、例えば、マウス由来のＨＫ細胞株、マウス由来の１２９ＳＶ細胞株、カニクイザル由来のＣＭＫ−６細胞株等が挙げられる。本発明においては、市販の胚性幹細胞であってもよい。特に、得られた神経系細胞を細胞移植治療等に用いる場合、生体適合性の観点から、細胞移植治療等の適用対象の個体と同種の個体由来の胚性幹細胞であることが望ましい。
胚性幹細胞の培養に用いられる培地としては、前記アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分と、前記アストロサイト基本培地、例えば、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＭＥＭ、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ等のいずれかの培地との混合物等が挙げられ、混合比は、体積比として、１：１〜１：３であることが望ましい。
胚性幹細胞の浮遊培養は、用いられる胚性幹細胞の種類により異なるが、例えば、前記胚性幹細胞の浮遊培養に用いられる培養容器の大きさが、３５ｍｍディッシュであることが望ましく、培地中の胚性幹細胞の濃度は、２ｍｌの培養液中で２０個以下のＳＣＳとなる濃度であることが望ましく、さらに、培養気相の条件は、ＨＫ細胞株の場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましい。具体的には、マウス由来のＨＫ細胞株又はマウス由来の１２９ＳＶ細胞株の場合、前記アストロサイト馴化培地と前記アストロサイト基本培地との混合物（体積比＝１：１）２ｍｌが入った３５ｍｍディッシュ中、３７℃、空気中５％  ＣＯ２及び１００％  加湿雰囲気下で、約１０〜２０個を培養することにより行なわれうる。なお、ここで用いられるマウス由来胚性幹細胞の大きさは、操作の容易性、胚性幹細胞の状態の安定維持、及びＳＣＳを効率よく得る観点から、フィーダー細胞層上での大きさとして、直径約４００〜５００μｍであることが望ましい。また、カニクイザル由来のＣＭＫ−６細胞株の場合、前記アストロサイト馴化培地と前記アストロサイト基本培地との混合物（体積比＝１：１）２ｍｌが入った３５ｍｍディッシュ中、３７℃、空気中５％  ＣＯ２及び１００％  加湿雰囲気下で、約１０〜２０細胞を培養することにより行なわれうる。なお、ここで用いられるカニクイザル由来胚性幹細胞の大きさは、操作の容易性、胚性幹細胞の状態の安定維持、及びＳＣＳを効率よく得る観点から、直径４００〜５００μｍであることが望ましい。
また、前記胚性幹細胞として、適切な培地上、さらに必要によりフィーダー細胞上、細胞接着状態で増殖させて、未分化な胚性幹細胞のコロニーの塊として得られたものを用いることができる。
ＳＣＳは、用いられる胚性幹細胞の種類により異なるが、マウス由来胚性幹細胞の場合、前記浮遊培養の条件下、例えば、２〜７日、好ましくは、４〜５日に形成され、サル、特にカニクイザル由来胚性幹細胞の場合、前記浮遊培養の条件下、例えば、４〜１５日、好ましくは、１０〜１２日に形成される。なお、ＳＣＳの形成は、実体顕微鏡下もしくは位相差倒立顕微鏡下で芯構造の形成により確認できる。
なお、本発明の神経系細胞の製造方法により、神経幹細胞を製造する場合、より効率よく神経幹細胞を得る観点から、好ましくは、
工程（Ａ）の後に、
（Ｂ）ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦの存在下、かつ細胞接着分子の存在下、該工程（Ａ）で得られたＳＣＳを培養する工程、
を行なうこと〔「神経幹細胞の製造方法１」ともいう〕、あるいは
前記工程（Ａ）の代わりに、
（Ａ’）アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、かつｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦの存在下、胚性幹細胞を浮遊培養する工程、を行なうこと〔「神経幹細胞の製造方法２」ともいう〕
ができる。
前記神経幹細胞の製造方法１において、前記工程（Ｂ）を行なうことにより、ＳＣＳから遊走した細胞として神経幹細胞が得られる。また、前記神経幹細胞の製造方法２において、前記工程（Ａ’）を行なうことにより、ＳＣＳ内に大量の神経幹細胞が得られる。
前記「神経幹細胞の製造方法１」において、ＳＣＳの培養に用いられる培地としては、ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦを含み、かつ前記アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分と、例えば、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＭＥＭ等との混合物が挙げられる。培地中におけるｂＦＧＦの濃度は、細胞の分化の抑制能と神経幹細胞の細胞分裂能とを十分に発揮させる観点から、例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。また、培地中におけるＥＧＦの濃度は、細胞の分化の抑制能を十分に発揮させる観点から、例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。さらに、ｂＦＧＦとＥＧＦとを組み合わせて用いる場合、例えば、ｂＦＧＦを１０〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度、ＥＧＦを１０〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度となるように混合して用いてもよい。
本発明においては、前記ｂＦＧＦ及びＥＧＦの代わりに、該ｂＦＧＦ及びＥＧＦと同様に分化の抑制作用を呈する物質を用いてもよい。
工程（Ｂ）に用いられる培地において、前記アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分と、前記ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＭＥＭ等との混合比は、体積比として、１：１〜１：３であることが望ましい。
前記細胞接着分子としては、ポリリジン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、マトリゲルＴＭ〔ビーディー・バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕等が挙げられる。
前記工程（Ｂ）における培養は、工程（Ａ）で得られたＳＣＳと、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて培養してもよく、適切な支持体に該細胞接着分子を保持させた担体を浮遊若しくは立体配置させた培養容器内でＳＣＳを培養してもよい。
前記接着性培養基質としては、慣用の細胞培養用ディッシュの培養側の表面を前記細胞接着分子でコートしたもの等が挙げられる。例えば、ポリリジンを細胞接着分子として用いる場合、最終濃度約０．１ｍｇ／ｍｌのポリリジンを含む純水に、培養容器（細胞培養用ディッシュ）の培養側の表面が十分に浸るようにし、室温で１〜２時間インキュベートし、ついで溶液を培養容器から除去することにより接着性培養基質を得ることができる。また、フィブロネクチンを細胞接着分子として用いる場合、最終濃度２〜２０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水を用い、３７℃で３０〜９０分インキュベートすればよく、ラミニンを細胞接着分子として用いる場合、最終濃度１０〜１００μｇ／ｍｌのラミニンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水を用い、３７℃で２時間以上インキュベートすればよく、ビトロネクチンを細胞接着分子として用いる場合、１〜１０μｇ／ｍｌのビトロネクチンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水を用い、３７℃で２時間以上インキュベートすればよい。マトリゲルを接着分子として用いる場合、培地で１０〜２０倍希釈して３７℃で１時間以上インキュベートすればよい。
ここで、ＳＣＳと接着性培養基質との接着は、例えば、適切な培地を入れた接着性培養基質にＳＣＳを添加することにより行なわれうる。
また、前記支持体は、培養容器内に浮遊させる場合、培地よりも比重が小さい物質からなる支持体であってもよく、培養容器内に立体配置させる場合、慣用の細胞培養用ディッシュと同じ材質からなる支持体であってもよい。
前記工程（Ｂ）における培養条件は、用いられるＳＣＳの供給源となる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができる。例えば、培養容器の大きさは、３５ｍｍディッシュ又は６０ｍｍディッシュであることが望ましい。胚性幹細胞のコロニーの数、すなわち、ＳＣＳの数は、マウス由来胚性幹細胞の場合、例えば、２ｍｌの培地が入った３５ｍｍディッシュ中、１〜２０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜２個であることが望ましく、サル由来胚性幹細胞の場合、例えば、２ｍｌの培地が入った３５ｍｍディッシュ中、１〜２０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜２個であることが望ましい。さらに、培養気相の条件は、マウスの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましく、サルの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましい。
また、前記工程（Ｂ）における培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができ、マウス由来胚性幹細胞の場合、５〜１０日であることが望ましく、サルの場合、５〜２０日であることが望ましい。
なお、前記工程（Ｂ）においては、浮遊培養中、適切な時期（例えば、１日間隔、２日間隔等）、適切な濃度となるように、ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦを添加してもよい。
前記「神経幹細胞の製造方法１」によれば、用いられる胚性幹細胞の種類により異なるが、マウス由来胚性幹細胞の場合、ＳＣＳは、前記浮遊培養の条件下、浮遊培養開始後、例えば、２〜７日で形成され、神経幹細胞は、２〜５日、好ましくは、２〜４日という驚くべく短期間に得られ、サル、特にカニクイザル由来胚性幹細胞の場合、ＳＣＳは、前記浮遊培養の条件下、浮遊培養開始後、例えば、４〜１５日で形成され、神経幹細胞は、４〜７日、好ましくは、４〜５日という驚くべく短期間に得られるという優れた効果を発揮する。
前記「神経幹細胞の製造方法２」の工程（Ａ’）において、胚性幹細胞を培養するための培地としては、ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦを含み、かつ前記アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分と、例えば、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＭＥＭ等との混合物が挙げられる。培地中におけるｂＦＧＦの濃度は、細胞の分化の抑制能と神経幹細胞の細胞分裂能とを十分に発揮させる観点から、例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。また、培地中におけるＥＧＦの濃度は、細胞の分化の抑制能と神経幹細胞の細胞分裂能を十分に発揮させる観点から、例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。さらに、ｂＦＧＦとＥＧＦとを組み合わせて用いる場合、例えば、ｂＦＧＦを１０〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度、ＥＧＦを１０〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度となるように混合して用いてもよい。
前記「神経幹細胞の製造方法２」において、胚性幹細胞の浮遊培養は、用いられる胚性幹細胞の種類により異なるが、例えば、前記胚性幹細胞の浮遊培養に用いられる培養容器の大きさは、前記工程（Ａ）の場合と同様に、３５ｍｍディッシュであることが望ましく、培地中の胚性幹細胞の濃度は、２ｍｌの培養液中で２０個以下であることが望ましく、さらに、培養気相の条件は、ＨＫ株の場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましい。具体的には、マウス由来のＨＫ細胞株又はマウス由来の１２９ＳＶ細胞株の場合、前記培地  ２ｍｌが入った３５ｍｍディッシュ中、３７℃、空気中５％  ＣＯ２及び１００％  加湿雰囲気下で、約１０〜２０個を培養することにより行なわれうる。また、カニクイザル由来のＣＭＫ−６細胞株の場合、前記培地  ２ｍｌが入った３５ｍｍディッシュ中、３７℃、空気中５％  ＣＯ２及び１００％  加湿雰囲気下で、約１０〜２０細胞を培養することにより行なわれうる。
また、前記工程（Ａ’）における培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができ、マウス由来胚性幹細胞の場合、４〜５日であることが望ましく、サルの場合、７〜１０日であることが望ましい。
なお、前記工程（Ａ’）においては、浮遊培養中、適切な時期（例えば、１日間隔、２日間隔等）、適切な濃度となるように、ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦを添加してもよい。
前記「神経幹細胞の製造方法２」によれば、用いられる胚性幹細胞の種類により異なるが、マウス由来胚性幹細胞の場合、ＳＣＳは、前記浮遊培養の条件下、例えば、２〜７日で形成され、神経幹細胞は、２〜５日、好ましくは、２〜４日という驚くべく短期間に得られ、サル、特にカニクイザル由来胚性幹細胞の場合、ＳＣＳは、前記浮遊培養の条件下、例えば、４〜１５日で形成され、神経幹細胞は、４〜７日、好ましくは、４〜５日という驚くべく短期間に得られるという優れた効果を発揮する。
得られた細胞が、神経幹細胞であることは、ネスチン、ＲＣ２、ムサシ１等のマーカーの発現を指標として、例えば、対応する遺伝子の発現を慣用の核酸の検出方法により調べること又はタンパク質の発現を免疫学的手法により調べることにより確認されうる。さらに、得られた細胞が、神経幹細胞であることは、レチノイン酸等の存在下、得られた細胞を、各種細胞又は組織への分化を妨げない培地における培養により分化して生じた分化細胞又は分化組織の形態又は該分化細胞若しくは分化組織に特異的なマーカーの発現により確認してもよい。さらに、得られた細胞を、前脳、中脳、網膜、嗅球等の中枢神経系内に移植し、ニューロン等の形成等を指標として確認することもできる。前記分化細胞又は分化組織の形態及び分化細胞若しくは分化組織に特異的なマーカーとしては、前記神経細胞及びグリア細胞の形態的特徴及び特異的マーカーが挙げられる。なお、前記神経幹細胞は、前記指標に加え、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みに対し、弱陽性〜強陽性を示す。
ここで、核酸の検出方法としては、検出対象の遺伝子をコードする核酸若しくはその特異的断片からなるプローブ又は該核酸若しくはその特異的断片に特異的に結合するプローブを用いるハイブリダイゼーションに基づく検出方法、該核酸若しくはその特異的断片を増幅するためのプライマーを用いるＰＣＲに基づく検出方法等が挙げられる。前記ハイブリダイゼーションに基づく検出方法としては、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション等が挙げられる。ＰＣＲに基づく検出方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる。ここで、プローブ又はプライマーとして用いる核酸は、検出対象の遺伝子の塩基配列に特異的な部分の配列を有することが望ましい。前記「検出対象の遺伝子の塩基配列に特異的な部分」は、例えば、検出対象でない公知配列との配列同一性が、２０％以下、好ましくは、１５％以下、より好ましくは、１０％以下、さらに好ましくは、５％以下、特に好ましくは、０％である部分の配列を選択することに得られうる。前記配列同一性は、２つの核酸間における比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定されうる。また、配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。なお、最適なアラインメント及びホモロジーの算出のために、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らの局所ホモロジーアルゴリズム［Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．，２，４８２（１９８１）］、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）らのホモロジーアラインメントアルゴリズム［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３（１９７０）］、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｇｏｏｄ−Ｋａｎｅｈｉｓａアルゴリズム、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等が用いられうる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントするための条件としては、期待値１０、ワードサイズ３、ギャップコスト（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１）等が挙げられる。
また、免疫学的手法として、検出対象のタンパク質若しくはその特異的断片に対する抗体若しくは抗体断片を用い、免疫学的手法、例えば、慣用のＥＬＩＳＡ、免疫染色等を行なうことができる。抗体は、慣用の方法〔例えば、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）等〕に記載の方法に従い、検出対象のマーカータンパク質を用いて、適切な動物、例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ等を免疫することにより得られる。
本発明には、かかる製造方法により胚性幹細胞から分化誘導された、実質的に単離された神経幹細胞も含まれる。
また、本発明の神経幹細胞は、凍結保存したものであっても、神経細胞、グリア細胞等への分化能を呈するという優れた性質を発現する。
本発明の神経幹細胞は、神経細胞、グリア細胞等に分化させることができるため、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病、ウシ海綿状脳症等）、ポリグルタミン病（球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症等）、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患；脳虚血、脱髄疾患、頭部外傷、脊髄損傷、脳梗塞等における神経再生医療への応用が期待される。
本発明の神経系細胞の製造方法により神経細胞を製造する場合、より効率よく神経細胞を得る観点から、好ましくは、前記工程（Ａ）の後に、（Ｂ’）ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦの非存在下、かつアストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、工程（Ａ）で得られたＳＣＳと、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて培養する工程、を行なうことができる〔「神経細胞の製造方法Ｉ」ともいう〕。かかる工程（Ｂ’）を行なうことにより、神経細胞が得られうる。また、神経細胞を製造する場合の別法として、前記のようにして得られた神経幹細胞を、ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦの非存在下、かつアストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分の存在下、細胞接着分子を保持した接着性培養基質と接着させて培養する方法〔「神経細胞の製造方法ＩＩ」ともいう〕が挙げられる。
前記工程（Ｂ’）又は前記別法で用いられる培地としては、前記アストロサイト馴化培地又は該馴化培地と実質的に同等な成分と、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＭＥＭ、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ等のいずれかの培地との混合物等が挙げられ、混合比は、体積比として、１：１〜１：３であることが望ましい。培養条件は、用いられるＳＣＳの供給源となる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができる。例えば、培養容器の大きさは、３５ｍｍディッシュ又は６０ｍｍディッシュであることが望ましい。ＳＣＳの数は、マウス由来胚性幹細胞の場合、例えば、３５ｍｍディッシュで２ｍｌの培地が入った培養液中、１〜２０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜２個であることが望ましく、サル由来胚性幹細胞の場合、例えば、３５ｍｍディッシュで２ｍｌの培養液中、１〜２０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜２個であることが望ましい。さらに、培養気相の条件は、マウスの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましく、サルの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましい。
また、前記工程（Ｂ’）における培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができ、マウス由来胚性幹細胞の場合、１〜７日であることが望ましく、サルの場合、１〜１４日であることが望ましく、神経細胞の製造方法ＩＩにおける培養時間は、マウス由来胚性幹細胞の場合、１〜７日であることが望ましく、サルの場合、１〜１４日であることが望ましい。
前記神経細胞の製造方法Ｉ及び前記神経細胞の製造方法ＩＩによれば、神経細胞は、１〜７日、好ましくは、２〜５日という驚くべく短期間に得られるという優れた効果を発揮する。
得られた細胞が、神経細胞であることは、ニューロフィラメント、チロシン、水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリナセチルトランスフェラーゼ等の発現を指標として、対応する遺伝子の発現を慣用の核酸の検出方法により調べること又はタンパク質の発現を免疫学的手法、例えば、慣用のＥＬＩＳＡ、免疫染色等により調べることにより確認されうる。また、ニューロンの形態的特徴、例えば、細胞体、樹状突起、軸索、軸索成長円錐等を指標として確認することもできる。
本発明には、かかる製造方法により得られた実質的に単離された神経細胞も含まれる。
本発明の神経細胞は、クラスＩＩＩ  βチューブリン、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素及びコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種を発現するものであり、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病、ウシ海綿状脳症等）、ポリグルタミン病（球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症等）、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患；脳虚血、脱髄疾患、頭部外傷、脊髄損傷、脳梗塞等における神経再生医療への応用が期待される。
本発明の神経系細胞の製造方法によりグリア細胞を製造する場合、より効率よくグリア細胞を得る観点から、好ましくは、工程（Ｂ）の後、（Ｃ）ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦの非存在下、該工程（Ｂ）で得られたＳＣＳと、細胞接着分子を保持した接着性培養基質とを接着させて培養する工程、を行なうことができる。かかる工程（Ｃ）を行なうことにより、ＳＣＳから遊走した細胞としてグリア細胞、特に、アストロサイトが得られうる。
工程（Ｃ）で用いられる培地としては、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７〔ギブコ  ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社製〕１〜２％添加物、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２  Ｎ２添加物等が挙げられる。培養条件は、用いられるＳＣＳの供給源となる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができる。例えば、培養容器の大きさは、３５ｍｍディッシュ又は６０ｍｍディッシュであることが望ましい。ＳＣＳの数は、マウス由来胚性幹細胞の場合、例えば、３５ｍｍディッシュで２ｍｌ培養液中、１〜２０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜２個であることが望ましく、サル由来胚性幹細胞の場合、例えば、３５ｍｍディッシュで２ｍｌの培養液中、１〜２０個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜２個であることが望ましい。さらに、培養気相の条件は、マウスの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましく、サルの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ２濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％であることが望ましい。
また、前記工程（Ｃ）における培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができ、マウス由来胚性幹細胞の場合、２〜７日であることが望ましく、サルの場合、５〜１５日であることが望ましい。
前記グリア細胞の製造方法によれば、グリア細胞は、２〜７日、好ましくは、５〜７日という驚くべく短期間に得られるという優れた効果を発揮する。
得られた細胞が、グリア細胞、特に、アストロサイトであることは、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）等の発現を指標として、対応する遺伝子の発現を慣用の核酸の検出方法により調べること又はタンパク質の発現を免疫学的手法、例えば、慣用のＥＬＩＳＡ、免疫染色等により調べることにより確認されうる。また、アストロサイトの形態的特徴、例えば、特有の星状の分岐した数多くの突起等を指標として確認することもできる。
本発明には、かかる製造方法により得られた、実質的に単離されたグリア細胞も含まれる。
本発明のグリア細胞は、ほぼ純粋なアストログリア細胞であるため、神経細胞、神経幹細胞と同時に移植して、神経細胞の分化成長を支持し、さらに血液脳関門を形成して栄養物質の補給を行なう等への応用が期待される。
本発明の神経系細胞の製造方法により得られた神経系細胞の純度は、例えば、それぞれの細胞特異的マーカーに対する抗体又は抗体断片を用いたフローサイトメトリーにより、全体の細胞数における細胞特異的マーカー発現細胞の割合により求められうる。本発明の神経系細胞の製造方法によれば、実質的に単離された神経系細胞が得られる。
なお、本発明の神経系細胞は、細胞医薬組成物としても提供されうる。かかる細胞医薬組成物も本発明に含まれる。
本発明の細胞医薬組成物は、具体的には、本発明の神経幹細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群より選ばれた細胞を有効成分として含有する。
本発明の細胞医薬組成物は、薬理上許容されうる助剤を適宜含有していてもよい。
なお、細胞医薬組成物の適用対象となる個体の適用部位に対し、神経伝達物質、神経栄養因子等を供給することを目的とする場合、例えば、神経幹細胞に、神経伝達物質をコードする核酸、神経栄養因子をコードする核酸等を導入した細胞、又は、必要により、適切な分化条件下に分化誘導して得られた細胞を、半透膜等のカプセルに封入して得られた細胞医薬組成物を用いてもよい。カプセルに有効成分が封入された細胞医薬組成物に用いられる細胞は、適用対象の個体にとって、同種である細胞であってもよく、異種である細胞であってもよい。
また、本発明の神経幹細胞、神経細胞又はグリア細胞によれば、個体の神経変性部位又は神経損傷部位に導入することにより、神経変性又は神経損傷に起因する状態、例えば、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、脊髄損傷、脳梗塞等の神経損傷等に対する神経細胞移植治療等を行なうことができる。したがって、神経変性疾患又は神経損傷の治療方法も本発明に含まれる。
本発明の神経変性疾患又は神経損傷の治療方法は、
（１）本発明の神経幹細胞、
（２）本発明の神経細胞、及び
（３）本発明のグリア細胞
からなる群より選ばれた少なくとも１つの細胞を、神経変性部位又は神経損傷部位に導入することを１つの大きな特徴とする。
本発明の治療方法によれば、本発明の神経幹細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群より選ばれた少なくとも１つの細胞が用いられているため、細胞治療の際、安定した治療効果、高い治療効果等を得ることができ、神経変性又は神経損傷に起因する状態を、安定な状態で治療することができるという優れた効果を発揮する。
本発明の治療方法は、本発明の神経幹細胞、神経細胞及びグリア細胞それぞれの応用として、上記に列挙した疾患に適用することができる。
神経変性部位又は神経損傷部位への細胞の導入は、注射等により行なわれうる。
本発明の治療方法では、例えば、
−  脳梗塞、脊髄損傷の場合、損傷部位に、本発明の神経幹細胞を導入すること、
−  パーキンソン病の場合、本発明の神経細胞であるドーパミン作動性ニューロンを、線条体、中脳黒質等に導入すること、
−  ハンチントン病の場合、本発明の神経細胞であるＧＡＢＡ作動性ニューロンを、尾状核等に導入すること
等が行なわれうる。
また、本発明の神経幹細胞、神経細胞及びグリア細胞は、神経変性疾患又は神経損傷を治療するための医薬の製造に使用することもできる。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。また、以下の実施例において、神経幹細胞及び神経細胞分化誘導培地として、アストロサイト馴化培地を用いた。なお、アストロサイトの培養のための基本培地（アストロサイト基本培地）として、Ｎ２添加物（インスリン、トランスフェリン、セレン、プロゲステロン）を含むＤＭＥＭ：Ｆ−１２を用いた。アストロサイトの調製は、マウス胎仔脳及びラット胎仔脳を用い、既報の方法［バンカー（Ｂａｎｋｅｒ，Ｇ．）ら編，カルチャリング  ナーブ  セルズ（Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ），（１９９１），ザ  エムアイティー  プレス（Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ）（ケンブリッジ，イギリス）発行］に従って行なった。
実施例１  神経幹細胞の作製
胚性幹細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞（膣栓確認後３．５日目）から、慣用の方法によって樹立されたＨＫ細胞株（継代数１０未満）を用いた。前記ＨＫ細胞は、継代数が少なく、自発的な分化がおこりにくいものである。
また、妊娠１４日目の同系マウスから調製した繊維芽細胞を、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで培養した。ついで、得られた細胞培養物に、マイトマイシンＣ（１μｇ／ｍｌ）を添加して３時間インキュベートし、不活化細胞を得た。不活化細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄して、ついで、トリプシンで処理した。得られた細胞を、ゼラチンコートされたプレートに播種し、フィーダー細胞層を得た。なお、前記プレートとして、６０ｍｍプレート（１．５×１０６細胞／プレート）及び４ウェルプレート（３×１０５細胞／ウェル）のそれぞれを用いた。
前記ＨＫ細胞株を、６０ｍｍプレートのフィーダー細胞層上に、プレートあたり１００〜２００個となるように播種した。培養液として、最終濃度で、１５％（ｖ／ｖ）ノックアウト  セラム  リプレースメント（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）〔ケーエスアール  ギブコ  ビーアールエル（ＫＳＲ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社製〕と、１０３Ｕ／ｍｌ  白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）〔ＬＩＦ、ＥＳＧＲＯ，ケミコン・インターナショナル・インコーポレーティッド（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．），米国カルフォルニア州〕と、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μＭ  非必須アミノ酸と、１００μＭ  β−メルカプトエタノールと、５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリンと、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンとを含むＤＭＥＭを用いた。培地は、１〜２日おきに交換した。
７〜１０日後、胚性幹細胞コロニーの直径が約４００〜５００μｍにまで増殖しているプレートを、ＤＭＥＭ（血清及びその他の成分を含まない）で２〜３回洗浄した。胚性幹細胞のコロニーを、先端を細く加工したガラスキャピラリーによって、フィーダー細胞層から機械的に剥離させ、拾い上げた。得られた胚性幹細胞のコロニーを、培養用ディッシュ中、血清不含ＤＭＥＭで２〜３回洗浄した。その後、培養側表面が無処理の浮遊培養用３５ｍｍバクテリアディッシュに、胚性幹細胞のコロニーを移し、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物（体積比＝１：１）中、ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行なった。ＣＯ２インキュベーター内での培養条件は、３７℃、空気中５％  ＣＯ２及び１００％加湿雰囲気であった。培養に際し、３５ｍｍディッシュ中２ｍｌの培養液で約１０〜２０個の胚性幹細胞のコロニーを培養した。なお、分化誘導中は、培養液の交換を行なわなかった。
浮遊培養４日目、培養物に、プロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を最終濃度１０μＭになるように添加した。なお、ＢｒｄＵの取り込みは、細胞分裂の指標となる。培養物を、前記と同様の培養条件で８時間インキュベートした。ついで、得られた細胞を、ＢｒｄＵを含まない培地で１時間培養して、洗浄した。その後、得られた細胞を、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド、０．４Ｍ  ショ糖、５０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．４で３０分間固定し、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００処理と１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳによるブロッキングとに供した。
ブロッキング後の細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｓｐｈｅｒｅ；以下、ＳＣＳと略す）と、マウス由来抗ネスチン抗体とを４℃で一晩インキュベートした。得られた混合物と蛍光標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体とを、室温で２時間インキュベートし、さらに、ビオチン標識マウス抗ＢｒｄＵ抗体と４℃で一晩インキュベートした。ついで、得られた混合物と、蛍光標識ストレプトアビジンとを室温で２時間インキュベートした。その後、得られた細胞について、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社製の共焦点レーザー走査顕微鏡（商品名：ＬＳＭ５１０）で観察した。第１図に免疫蛍光染色像を示す。
第１図に示すように、ＳＣＳ表層の細胞群において、神経幹細胞のマーカーであるネスチンに対する強いシグナルが観察され（ネスチン強陽性）が、ＢｒｄＵに対する弱いシグナルが観察された（ＢｒｄＵ弱陽性）。したがって、前記ＳＣＳ表層の細胞群は、神経幹細胞であることが示唆された。
また、ＳＣＳの芯にあたる部分の細胞群において、ＢｒｄＵに対する強いシグナルが観察された（ＢｒｄＵ強陽性）。したがって、前記ＳＣＳの芯にあたる部分の細胞群においては、細胞分裂が盛んに行なわれていることが示された。さらに、ＳＣＳの芯にある細胞群では、ネスチンに対するシグナルが観察されなかった。かかる結果と、後述のＲＴ−ＰＣＲの結果とから、前記ＳＣＳの芯にあたる部分の細胞群は、未分化の胚性幹細胞であると考えられる。
また、ＳＣＳ表層と芯との間にある細胞において、ネスチン及びＢｒｄＵのどちらに対してもシグナルは観察されなかった（ネスチン陰性及びＢｒｄＵ陰性）。したがって、前記ＳＣＳ表層と芯との間にある細胞は、胚性幹細胞から神経幹細胞へ分化誘導される移行段階の状態である細胞であることが示唆された。
第１図に示すように、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物を用いた浮遊培養により形成されるＳＣＳは、惑星構造に類似した層構造を有することがわかる。すなわち、ＳＣＳは、地殻層に対応するネスチン陽性の神経幹細胞層と、マントル層にあたるネスチン及びＢｒｄＵのいずれに対しても陰性の前神経幹細胞層と、核にあたるＢｒｄＵ陽性の胚性幹細胞層とから構成される三層構造を有することがわかる。これらの構造は、液滴法等により、１乃至数個の胚性幹細胞を凝集体として形成させたＥＢの構造とは全く異なっている。なお、前記ＥＢの作製においては、血清の存在下で胚性幹細胞を凝集体形成させており、血清中の不明確な種々の分化誘導因子により、内胚葉と外胚葉と中胚葉とがそれぞれ分化誘導される。
それに対して、本実施例において、胚性幹細胞の浮遊培養に用いたアストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物は、血清不含であるため、アストロサイトから放出される因子（群）によって、短期間で効率よく神経幹細胞のみがＳＣＳ表層に分化誘導されることが明らかである。コロニーから分散した単一の胚性幹細胞をアストロサイト馴化培地で浮遊培養しても凝集体を形成することができなかった。したがって、細胞接着状態で増殖した未分化な胚性幹細胞のコロニーを塊として用いて浮遊培養を行なうことが、神経幹細胞の分化誘導に必要であることが示唆される。
また、ＳＣＳの形成に際して用いる胚性幹細胞のコロニーの大きさを検討した。その結果、マウスの場合、フィーダー細胞層上で単一の胚性幹細胞を培養しはじめて、７〜９日後、直径で約４００〜５００μｍの大きさのコロニーが生じた場合、前記と同様の浮遊培養により、ほとんどの胚性幹細胞がＳＣＳを形成することがわかった。かかるコロニーの大きさは、浮遊培養後に球形になったときに、直径が約２００〜３００μｍに相当する。
実施例２  神経細胞への分化
神経幹細胞が表層に分化誘導されたＳＣＳ〔前記実施例１で得られたＳＣＳ（浮遊培養４日間）〕を、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物（体積比＝１：１）中、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃、空気中５％  ＣＯ２及び１００％  加湿雰囲気で浮遊培養を行なった。
なお、ＳＣＳにおける分化状態の経時変化を調べるため、１〜４日培養で、浮遊培養したＳＣＳを前記と同様に固定した。
神経細胞への分化の指標としては、幼弱ニューロンのマーカーであるクラスＩＩＩ  βチューブリンを認識する抗体ＴＵＪ１を用いた。免疫蛍光組織化学の観察は、ニコン（Ｎｉｋｏｎ）社製の正立蛍光顕微鏡（商品名：Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００）により行なった。
その結果、浮遊培養開始後直ぐにＴＵＪ１に弱く反応する細胞がＳＣＳの内部で観察された。
さらに、前記ＳＣＳを、６〜７日間浮遊培養した結果を第２図に示す。
第２図に示すように、ＴＵＪ１に対して強陽性で神経突起をＳＣＳ内で長く伸展させる細胞が観察された。即ち、ＳＣＳ中で分化した神経細胞から、抗クラスＩＩＩ  βチューブリン抗体によって染色された神経突起がＳＣＳ中を網状に伸展していることがわかる。この結果により、アストロサイト馴化培地中の因子（群）によって、神経幹細胞がＳＣＳの状態で幼弱ニューロンにまで分化誘導できることが示される。
実施例３  神経細胞分化法の改良
ＳＣＳをアストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物で浮遊培養することにより、神経幹細胞を作製し幼弱ニューロンに分化誘導させることができた。
ついで、ＳＣＳ表層に形成された神経幹細胞からの神経細胞への分化を効率よく進めるための培養至適条件を検討した。
ポリリジンでコートした培養ディッシュの培養側の表面を、０．１ｍｇ／ｍｌ  ラミニン又は１０〜２０倍希釈したマトリゲルＴＭ〔ビーディーバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕でさらに処理して接着性培養基質を作製した。４日間浮遊培養したＳＣＳをガラスキャピラリーで吸い上げて、予めアストロサイト馴化培地を添加しておいた接着性の培養ディシュに移し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％  ＣＯ２及び１００％加湿雰囲気で数時間培養した。その結果、ＳＣＳは培養基質に接着した。
さらに、位相差倒立顕微鏡〔ニコン（Ｎｉｋｏｎ）社製〕を用い、ＳＣＳ及びその周辺の形態の観察を行なった。その結果、接着培養して１日目から神経突起を伸展させるＳＣＳが認められた。
また、さらに４〜７日間、接着培養を続けることにより、多数の神経細胞の分化誘導が生じた。細胞へのＢｒｄＵの取り込みを前記実施例１と同様に調べた。また、ＳＣＳ及びその周辺について、神経幹細胞マーカーであるネスチン、分化した神経細胞マーカーであるニューロフィラメント、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるチロシン水酸化酵素（以下、ＴＨと略す）、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのマーカーであるグルタミン酸脱炭酸酵素（以下、ＧＡＤと略す）及びコリン作動性ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼのそれぞれの発現を、各マーカーに対する抗体を用い、前記実施例１におけるネスチンの検出と同様に、免疫組織化学的手法により調べた。結果を第３図〜第７図に示す。
第３図及び第４図に示すように、接着したＳＣＳは、ＢｒｄＵを取り込んで分裂を盛んに行なうネスチン陽性の神経幹細胞として全体が分化した。さらに、ＳＣＳ周辺では、ＮＦに対する抗体で強く染色される、遊走した神経細胞と細胞体から伸展した神経突起とが数多く観察され、ネスチン陽性の神経幹細胞はその内部に存在していることがわかる。また、第４図に示すように、接着培養面をＮＦ陽性の神経突起が多数伸びていることがわかる。また、第４図に示すように、第３図でネスチン陽性の神経幹細胞が存在するＳＣＳの部位がＢｒｄＵに陽性で、細胞分裂が盛んであることがわかる。
さらに、第５図に示すように、ＳＣＳ全体がドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるＴＨに対する抗体によって強く染色されており、伸展している神経突起も多数がＴＨ陽性であることがわかる。また、第６図に示すように、ＴＨと同様に、ＳＣＳ全体が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのマーカーであるＧＡＤに対する抗体によって強く染色されており、伸展している神経突起も多数がＧＡＤ陽性であることがわかる。さらに、第７図に示すように、ＳＣＳがコリン作動性ニューロンのマーカーであるＣｈＡＴに対する抗体によって強く染色されていることがわかる。即ち、第５図、第６図及び第７図に示すように、ＴＨ、ＧＡＤ及びＣｈＡＴのそれぞれの発現の誘導が起きていることがわかる。
アストロサイト馴化培地中の分化誘導因子（群）により、浮遊培養によって形成されたＳＣＳ表層の神経幹細胞が、細胞接着分子の働きと協調して非常に効率良く神経細胞へと分化できることがわかった。また、前記アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物を用いた浮遊培養と接着培養との逐次培養法においては、グリア細胞への分化は認められず、アストロサイトが分泌する誘導因子（群）が、神経幹細胞から神経細胞への分化決定に強い作用をもつ可能性が示唆された。アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で浮遊培養されたＳＣＳが接着性培養基質に接着できる割合は、９０％以上であり、接着したＳＣＳが神経分化の指標となる神経突起を伸展させる割合は、ほぼ１００％であった。したがって、実験的な操作ミス等を考慮しても、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物を用いた浮遊培養によって増殖するＳＣＳは、ほぼ全てが神経幹細胞へと条件付けが行なわれ、さらに接着培養による細胞接着分子の働きにより神経への分化が決定付けられたと考えられる。また、接着培養におけるアストロサイト馴化培地は、神経細胞への分化促進作用は示すが、他の神経細胞培養用培地、例えば、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２／Ｎ−２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７〔ギブコ  ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社製〕等によっても神経細胞への分化が認められる。このことは、ＳＣＳが浮遊培養によって神経幹細胞へと分化すると、デフォルトとして神経細胞へと分化し、細胞接着分子との相互作用によりその性質発現が促進されるものと考えられる。
なお、胚性幹細胞のコロニーの塊をそのまま接着させてアストロサイト馴化培地で培養しても分化誘導は起こらなかったため、胚性幹細胞のコロニーを浮遊培養させることが必須条件であると考えられる。
実施例４  神経幹細胞の増殖
浮遊培養したＳＣＳの表層に神経幹細胞層が形成されるが、そのまま浮遊培養又はアストロサイト馴化培地等で接着培養すると神経細胞へと分化していく。そこで、前記ＳＣＳから神経細胞への分化を抑制し、神経幹細胞を増殖させるために、浮遊培養後のＳＣＳを、ｂＦＧＦの存在下、３７℃、ＣＯ２濃度５％、１００％の加湿雰囲気下に培養した。
前記ｂＦＧＦは、神経幹細胞を未分化な状態に維持し、かつ細胞増殖を促進する因子であり、ＳＣＳ表層に形成された神経幹細胞でも有効であろうと考えられた。ＳＣＳを実施例３と同様に接着性培養基質に接着させた。また、培養液として、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７を用いた。１〜２日おきに、培養物に、ｂＦＧＦを２０ｎｇ／ｍｌになるように新たに添加した。正立蛍光顕微鏡〔ニコン（Ｎｉｋｏｎ）社製〕を用い、ＳＣＳ及びその周辺の形態の観察を行なった。
その結果、接着培養直後は、神経細胞の分化が見られ神経突起の伸展が観察された。１〜２日目から接着したＳＣＳから、神経細胞とは形態的に異なる細胞が出現し遊走していた。
さらに、細胞へのＢｒｄＵの取り込みを前記実施例１と同様に調べた。また、ＳＣＳ及びその周辺について、神経幹細胞マーカーであるネスチンの発現を、マウス由来抗ネスチン抗体を用い、前記実施例１におけるネスチンの検出と同様に、免疫組織化学的手法により調べた。結果を第８図に示す。
第８図の免疫蛍光組織化学の結果で示すように、遊走してくる細胞は、ネスチン陽性であり、神経幹細胞であることがわかる。すなわち、培養液をアストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物から、ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７に換えることにより、神経細胞への分化が抑制され、ネスチン陽性の神経幹細胞が増殖しＳＣＳから多数遊走してくることがわかる。
また、１個のＳＣＳから広がった神経幹細胞のコロニーを観察した結果を第９図に示す。その結果、第９図に示すように、驚くべく均一に多数の神経幹細胞が得られることがわかる。遊走してくる神経幹細胞は、密に細胞同士が接着しており、培養基質に接着したＳＣＳを中心にして半径約６００μｍの円心状に遊走し、大量の神経幹細胞が１個のＳＣＳから得られることがわかる。Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法や他の単層培養法では、このように均一で多数の神経幹細胞を調製することは困難であり、本実施例における方法が優れていることがわかる。
また、本実施例のように、ＳＣＳを用いて、神経幹細胞を調製する方法は、ＳＣＳが遊走する神経幹細胞コロニーの種として何回も使用できるという優れた特徴を有する。即ち、ＳＣＳを接着させて神経幹細胞を遊走させた後、中心にあるＳＣＳをガラスキャピラリーで拾い上げ、新たな接着性培養基質上に移すことにより、再びそのＳＣＳから神経幹細胞を遊走させることができる。
ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７中、神経幹細胞を遊走させるＳＣＳにおけるＢｒｄＵの取り込み及びネスチンの発現の分布を調べた。その結果を第１０図に示す。第１０図に示すように、接着して神経幹細胞を遊走させるＳＣＳは、ＢｒｄＵ陽性であり、抗ＢｒｄＵ抗体による染色は、ＳＣＳの芯の部分で強いが、第１図と比較すると、ＢｒｄＵの取り込みが全体に広がっていることがわかる。また、第１０図に示すように、抗ネスチン抗体により芯以外が染色されているため、ＳＣＳ内部で神経幹細胞に分化した割合が増加したことがわかる。神経幹細胞のＳＣＳ内での増殖により培養基質への遊走が生じたと考えられる。ＳＣＳは、それ自体が神経幹細胞として盛んに細胞分裂を繰り返しているために何回も種として使用することが可能となる。
本実施例により、ＳＣＳをｂＦＧＦ存在下で接着培養することにより、多数の神経幹細胞を調製することができることが示される。
【実施例５】  マウス胚性幹細胞ＨＫ細胞のコロニーをアストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で浮遊培養してＳＣＳを形成させる際、該ＨＫ細胞の浮遊培養開始時から、終濃度２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを含む培地〔アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物（体積比＝１：１）〕中、ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行なった。ＣＯ２インキュベーター内での培養条件は、３７℃、空気中５％  ＣＯ２及び１００％加湿雰囲気であった。培養に際し、３５ｍｍディッシュ中２ｍｌの培養液で約１０〜２０個の胚性幹細胞のコロニーを培養した。１〜２日おきに、終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるようにｂＦＧＦを、浮遊培養中の培養物に添加した。
浮遊培養４日目、培養物に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を最終濃度１０μＭになるように添加した。なお、ＢｒｄＵの取り込みは、細胞分裂の指標となる。培養物を、前記と同様の培養条件で８時間インキュベートした。ついで、得られた細胞を、ＢｒｄＵを含まない培地で１時間培養して、洗浄した。その後、得られた細胞を、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド、０．４Ｍ  ショ糖、５０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．４で３０分間固定し、０．１％（ｖ／ｖ）  ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００処理と１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳによるブロッキングとに供した。
ブロッキング後の細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｓｐｈｅｒｅ；以下、ＳＣＳと略す）と、マウス由来抗ネスチン抗体とを４℃で一晩インキュベートした。得られた混合物と蛍光標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体とを、室温で２時間インキュベートし、さらに、ビオチン標識マウス抗ＢｒｄＵ抗体と４℃で一晩インキュベートした。ついで、得られた混合物と、蛍光標識ストレプトアビジンとを室温で２時間インキュベートした。その後、得られた細胞について、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社製の共焦点レーザー走査顕微鏡（商品名：ＬＳＭ５１０）で観察した。神経幹細胞のマーカーであるネスチンと細胞分裂の指標となるＢｒｄＵの分布を調べた免疫蛍光染色像を第１１図に示す。
第１１図に示すように、ＳＣＳ表層から芯を除く大部分がネスチンに陽性な細胞となり増殖していた。また、これらの細胞は、ＢｒｄＵにも陽性であった。アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物への神経幹細胞の増殖因子であるｂＦＧＦの添加により、驚くべく効率よく神経幹細胞を作製できることが示された。
実施例６  増殖した神経幹細胞の神経細胞への分化
実施例４で得られた神経幹細胞が、ＳＣＳ表層に形成される神経幹細胞と同様に神経細胞に分化するかどうかを調べた。具体的には、ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７でＳＣＳを培養し、遊走神経幹細胞を得、分化が抑制されている前記神経幹細胞について、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物に培地を３７℃前後、５％前後ＣＯ２濃度１００％加湿雰囲気下、交換することにより、神経細胞に分化誘導できるかどうかを調べた。結果を第１２図に示す。
第１２図に示すように、細胞同士が密着していた神経幹細胞が、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物に培地を交換することにより、１日後には、お互いが密に接着しながら遊走していた神経幹細胞が離散して広がり、神経細胞へと形態が分化することがわかる。また、ＳＣＳ表層に形成された神経幹細胞と同じく、遊走した神経幹細胞もアストロサイト馴化培地により神経細胞に分化することがわかる。かかる結果により、大量に調製した神経幹細胞から、そのまま大量の神経細胞の作製を行ないうることが示唆される。
また、細胞へのＢｒｄＵの取り込みを前記実施例１と同様に調べた。また、ＳＣＳ及びその周辺について、神経幹細胞マーカーであるネスチン、分化した神経細胞マーカーであるニューロフィラメント、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるチロシン水酸化酵素（以下、ＴＨと略す）、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのマーカーであるグルタミン酸脱炭酸酵素（以下、ＧＡＤと略す）及びコリン作動性ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼのそれぞれの発現を、各マーカーに対する抗体を用い、前記実施例１におけるネスチンの検出と同様に、免疫組織化学的手法により調べた。結果を第１３図、第１４図、第１５図に示す。
第１３図に示すように、ＮＦ陽性の神経細胞の大部分でドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるＴＨが発現することがわかる。すなわち、ＳＣＳ内部にとどまっている神経幹細胞からＴＨ陽性の神経細胞が分化するだけでなく、遊走した神経幹細胞からもＴＨ陽性の神経細胞が分化することがわかる。また、第１３図に示すように、遊走した神経幹細胞由来の神経細胞において、ＴＨとＧＡＤとの共発現を示す神経細胞が認められ、未成熟の神経細胞が存在することが示唆された。さらに、第１５図に示すように、細胞内に神経伝達物質のセロトニンを含む神経細胞が確認できた。これらの結果より、増殖させた神経幹細胞を使うことによって、
▲１▼従来の既報の方法ではできなかった均一な神経細胞を大量に調製することができ、
▲２▼分裂の盛んな胚性幹細胞を出発材料としているので、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇに必要な神経細胞を提供することができ、
▲３▼脳から調製する初代培養神経細胞を用いた場合には困難であった、遺伝子を操作した神経細胞をも大量に調製することができるという優れた効果が得られることがわかる。
実施例７  増殖した神経幹細胞のアストロサイトへの分化。
神経幹細胞は、多分化能を持つ細胞であるため、培養条件を変えることにより神経細胞以外の細胞種に分化できるか検討した。
実施例４と同様にＳＣＳを培養して、接着させたＳＣＳから神経幹細胞が遊走し、広がったコロニーを形成した時点で、ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７を、ｂＦＧＦ不含ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７に交換し、３７℃前後、５％前後ＣＯ２濃度、１００％加湿雰囲気下、培養を続けた。
その結果、神経細胞に分化する時と同じく、数日後にコロニーの周辺部において細胞同士が密着していた状態の細胞が、個々に分離してきた。さらに、分離した細胞が、アストロサイトに特有の分枝した数多くの突起を持つ細胞へと分化してきた。この段階で、免疫蛍光組織化学により、アストロサイトのマーカーであるグリア繊維性酸性タンパク質〔Ｇｌｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）〕の発現を調べた。
その結果、第１６図に示すように、神経幹細胞を供給し続けた種であったＳＣＳ及び遊走した神経幹細胞全てがＧＦＡＰ陽性のアストロサイトに分化しており、ＮＦには陰性であることがわかる。また、第１６図に示すように、コロニー周辺部では、アストロサイト特有の短い分岐した突起が抗ＧＦＡＰ抗体により染色された。即ち、実施例６と併せて、培養条件を変えることにより、神経幹細胞を、神経細胞又はアストロサイトのどちらかに分化決定できることがわかる。
すなわち、従来、神経幹細胞を一つの細胞種に限定して分化させることは困難であったが、本実施例の方法によれば、実質的に均一な神経幹細胞を大量に調製できるため、神経幹細胞を一つの細胞種に限定して分化させることができる。したがって、再生医療、移植医療等において最大の問題となる、移植細胞の催奇化、癌化等に対して、本実施例のように、ＳＣＳを用いた方法の有効性が期待できる。
実施例８  分散された神経幹細胞の神経細胞への分化
実施例４で得られた神経幹細胞を含む６０ｍｍディッシュから培地を除き、ダルベッコのＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇ不含）で洗浄した。ついで、前記６０ｍｍディッシュに、２ｍｌのＰＢＳを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。培養基質との接着が弱くなった神経幹細胞をピペッティングにより剥がし、７００×ｇで５分間の遠心分離によって、該神経幹細胞を回収した。ついで、前記神経幹細胞に、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物  ２ｍｌを添加して懸濁し、細胞接着分子でコートした３５ｍｍディッシュに播種した。その結果、第１７図に示すように、実施例４で得られた神経幹細胞は、一度、接着性培養基質から剥がして単層培養しても、数日のうちに神経細胞へと分化することがわかる。
実施例９  凍結保存した神経幹細胞からの神経細胞への分化
実施例８と同様の方法で神経幹細胞を回収した。得られた神経幹細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／９０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳに懸濁し、ディープフリーザー中、−８０℃で凍結保存した。
凍結保存した神経幹細胞を、３７℃のインキュベーター中で融解し、得られた産物にＤＭＥＭ５ｍｌを添加し、７００×ｇ、５分間の遠心分離を行なうことにより、神経幹細胞を洗浄し、ＦＣＳを除去した。ついで、得られた神経幹細胞に、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物２ｍｌを添加し、神経幹細胞を懸濁し、細胞接着分子でコートした３５ｍｍディッシュに播種した。第１８図に、凍結保存された神経幹細胞の神経細胞への分化を調べた結果を示す。
第１８図で示すように、凍結保存した神経幹細胞を用いて単層培養しても、数日のうちに神経細胞へと分化することがわかる。即ち、大量に調製できる神経幹細胞を凍結し、必要時に融解して使用することができることがわかる。
実施例１０  胚性幹細胞１２９ＳＶ細胞株の神経細胞への分化
前記実施例１〜３におけるＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞から作製され樹立された胚性幹細胞であるＨＫ細胞株の代わりに、市販の１２９ＳＶマウスの胚性幹細胞（継代数１５、大日本製薬株式会社供給）［コントゲン（Ｋｏｎｔｇｅｎ  Ｆ．）ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：９５７−９６４，（１９９３）；マリセン（Ｍａｌｉｓｓｅｎ  Ｍ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２：４３４７−４３５５．，（１９９３）］を用いて、前記実施例１〜３と同様の培養条件で分化誘導を検討した。第１９図に、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中での浮遊培養を行ない、接着性培養基質で接着培養を行なった結果を示す。
第１９図に示すように、浮遊培養後、接着性培養基質で接着培養を行なうと、１２９ＳＶ細胞株から得られたＳＣＳから、多数の神経突起が伸展することがわかる。また、接着培養時の培地を、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ  Ｂ−２７に交換することにより、神経幹細胞の遊走が引き起こされ、ＨＫ細胞株と同じ現象が観察される。即ち、系統の異なるマウス由来の胚性幹細胞でも、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で胚性幹細胞を浮遊培養してＳＣＳを形成させ、ついで、接着培養を行なう方法が適用できることが明らかとなった。
なお、浮遊培養以外の条件の場合、神経系細胞だけでなく他の細胞が確認される場合があり、神経系細胞への選択的な分化誘導は、困難である。
実施例１１  カニクイザル胚性幹細胞（ＣＭＫ−６）の神経細胞への分化
カニクイザルより樹立した胚性幹細胞株ＣＭＫ−６細胞株［スエモリ（Ｓｕｅｍｏｒｉ，Ｈ．）ら，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９，（２００１）］が、マウス胚性幹細胞と同様に、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物による浮遊培養と接着性培養基質での接着培養とによって、神経細胞へと分化誘導されるか否かを検討した。
マウス初代繊維芽細胞を、フィーダー細胞層として、ＣＭＫ−６細胞株を、最終濃度１３．３％（ｗ／ｖ）ＦＣＳと１０３Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦとを含むＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）で培養した。培養条件は、３７℃、５％  ＣＯ２であった。
ＣＭＫ−６細胞株のコロニーが、４００〜５００μｍの大きさになった段階で、マウスの場合と同様に、ガラスキャピラリーによってフィーダー細胞層から機械的に引き剥がした。ついで、得られたＣＭＫ−６細胞株のコロニーを３７℃前後、５％前後のＣＯ２濃度、１００％加湿雰囲気下で３５ｍｍのバクテリアディッシュ中、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物２ｍｌ中で１０〜２０個のコロニーを浮遊培養した。
なお、マウス胚性幹細胞が盛り上がった状態でコロニーを形成するのに対して、ＣＭＫ−６細胞株のコロニーは扁平であるため、引き剥がした直後は、紙がよじれたような状態で浮遊した。しかしながら、数時間後には、ＣＭＫ−６細胞株は、胚性幹細胞同士の細胞間接着によって球状の形態を形成した。
また、マウス胚性幹細胞に比べて、ＣＭＫ−６細胞株は、増殖が遅いため、浮遊培養でもＣＭＫ−６細胞株に由来するＳＣＳの大きさが増大するのに時間を要した。
カニクイザル胚性幹細胞（ＣＭＫ−６細胞株）のＳＣＳ形成時における神経幹細胞への分化の状態を調べるため、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で１０〜１２日浮遊培養後、固定し、マウスの場合と同様に、霊長類に対するウサギ由来抗ネスチン抗体で分布を調べた。さらに、浮遊培養後のＳＣＳを接着培地に接着させ、７〜１０日後に遊走してきた細胞について、ネスチンに対する反応性も調べた。その結果を第２０図に示す。
第２０図に示すように、浮遊ＳＣＳは、全体が抗ネスチン抗体で染色される。また、接着ＳＣＳから遊走してきた細胞も抗ネスチン抗体で染色され、マウスの場合と同じく効率よく神経幹細胞がアストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物と浮遊培養によって作製できることが示された。
接着培養１日目におけるＳＣＳ及びその周辺を位相差顕微鏡により観察した結果を第２１図に示す。
第２１図に示すように、マウス胚性幹細胞由来のＳＣＳと同様に、接着培養後１日目で、カニクイザル胚性幹細胞由来のＳＣＳから神経細胞が遊走し、神経突起を伸展させているのがわかる。また、マウス胚性幹細胞の接着ＳＣＳでも観察されたように、ＳＣＳ内で神経細胞に分化し、神経突起をＳＣＳから盛んに伸展させていることがわかる。
また、カニクイザル胚性幹細胞ＣＭＫ−６細胞株から得られたＳＣＳから遊走してくる神経細胞における神経伝達物質の合成酵素の発現について、前記実施例１におけるネスチンの検出と同様に、免疫組織化学的手法により調べた。結果を第２２図に示す。
第２２図に示すように、ＮＦ陽性の神経細胞のほとんどがＴＨ陽性であり、ドーパミン作動性ニューロンが分化誘導されたことがわかる。すなわち、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物による、浮遊培養及び接着性培養基質を使った接着培養によって、カニクイザル胚性幹細胞ＣＭＫ−６細胞株も容易に神経細胞へと分化することがわかる。
このことから、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で浮遊培養し、接着培養して神経細胞へと分化させる方法が、マウスとは種が異なる霊長類のカニクイザル胚性幹細胞にも普遍的に適用できることがわかる。また、かかる方法は、種を超えて有効であり、普遍性があるものであると考えられる。さらに、カニクイザルが霊長類であることを考慮すると、この方法はヒト胚性幹細胞においても適用できる可能性がある。
なお、浮遊培養以外の条件の場合、神経系細胞だけでなく他の細胞が確認される場合があり、神経系細胞への選択的な分化誘導は、困難である。
実施例１２  遺伝子発現の解析
マウス由来のＨＫ株
未分化の胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導に伴う遺伝子発現を調べた。
未分化の胚性幹細胞を、３７℃、空気中５％  ＣＯ２、１００％加湿雰囲気下、４日間浮遊培養してＳＣＳを形成させ、ついで、３７℃、空気中５％  ＣＯ２、１００％加湿雰囲気下、５日間接着培養して、神経細胞への分化を誘導した。
未分化の胚性幹細胞、浮遊培養によって形成したＳＣＳ及び接着培養で得られた細胞塊のそれぞれ２０個から、慣用の方法でｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡを鋳型として、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて、３７℃６０分間逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
なお、プライマーとして、Ｏｃｔ−４（ＥＳ細胞特有の転写制御因子）、Ｐａｘ−６（神経前駆細胞に特有の転写制御因子）、ネスチン、ＮＦ−Ｍ、Ｎｕｒｒ１（ドーパミンニューロンのマーカー）、ＴＨ、ＧＡＴＡ４（内胚葉のマーカー）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉のマーカー）、サイトケラチン１７（外胚葉表皮細胞のマーカー）、β−アクチン及びＧＡＰＤＨのそれぞれを増幅するためのプライマーを用いた。
ついで、未分化の胚性幹細胞と、浮遊培養によって形成したＳＣＳと、接着培養で得られた細胞塊との間で、ＧＡＰＤＨに対応する断片のＰＣＲ産物の量が、等しくなる量のｃＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーを用いてＯｃｔ−４（２４サイクル）、Ｐａｘ−６（３０サイクル）、ネスチン（２６サイクル）、ＮＦ−Ｍ（３０サイクル）、Ｎｕｒｒ１（２６サイクル）、ＴＨ（３０サイクル）、ＧＡＴＡ４（３０サイクル）、Ｂｒａｃｈｕｒｙ（３０サイクル）及びβ−アクチン（２２サイクル）のそれぞれについて、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃１５秒と５８℃３０秒と７２℃４５秒とを１サイクルとした。得られた各産物を電気泳動に供し分析した。結果を第２３図に示す。
第２３図に示すように、胚性幹細胞（レーン１）において検出されるＯｃｔ−４は、浮遊ＳＣＳ（レーン２）で減少し、接着ＳＣＳで神経に分化する状態（レーン３）では、シグナルは非常に弱くしか認められないことがわかる。また、神経幹細胞で発現しているネスチンは、浮遊ＳＣＳで急速に発現が高まり、接着ＳＣＳの段階でも発現が続くことがわかる。かかるネスチンの発現プロファイルは、神経幹細胞がどんどん分裂し神経細胞に分化することとよく一致している。さらに、神経細胞にしか発現しないＮＦ、ドーパミンニューロンの合成酵素であるＴＨ及びその転写因子のＮｕｒｒ１が、それぞれ浮遊ＳＣＳから接着ＳＣＳへと分化していくに従って遺伝子発現が強くなることがわかる。また、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で胚性幹細胞を浮遊培養してＳＣＳを形成させ、ついで、接着培養を行なう方法により得られた分化神経細胞においては、内胚葉と中胚葉及び外胚葉のマーカー遺伝子の発現はほとんど変化していないため、前記方法は、ＥＢを形成して分化させる方法とは異なっていることが明らかである。
ついで、時間経過による定量的な変化を調べた。未分化な胚性幹細胞クローンを、アストロサイト馴化培地とアストロサイト基本培地との混合物中で、４日間浮遊培養をして、ＳＣＳを形成させ、該ＳＣＳを５日間接着培養して、神経細胞への分化を誘導した。未分化な胚性幹細胞クローン（浮遊培養０日目）、浮遊培養２日目と４日目のＳＣＳ及び接着培養後２日目と５日目の細胞塊のそれぞれ４個又は５個から、慣用の方法でｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
ついで、ＧＡＰＤＨ、Ｏｃｔ−４、ネスチン及びＴＨのｍＲＮＡ量を解析するために、前記と同様のサイクル数のＰＣＲを行なって、産物量を定量し、それにより試料中のＧＡＰＤＨ、Ｏｃｔ−４、ネスチン及びＴＨそれぞれのｍＲＮＡの量を半定量的に求めた。その後、Ｏｃｔ−４、ネスチン及びＴＨそれぞれの量を、ＧＡＰＤＨの量で割り、Ｏｃｔ−４／ＧＡＰＤＨ、ネスチン／ＧＡＰＤＨ、ＴＨ／ＧＡＰＤＨとして相対的な発現量を求め、さらに、相対的な発現量の最高値を１として、グラフに示した。結果を第２４図に示す。
その結果、第２４図に示すように、神経幹細胞で発現しているネスチンは、浮遊ＳＣＳで急速に発現が高まり、接着ＳＣＳの段階でも発現が続くことがわかる。かかるネスチンの発現プロファイルは、神経幹細胞がどんどん分裂し神経細胞に分化することとよく一致している。さらに、ドーパミンニューロンの合成酵素であるＴＨが、浮遊ＳＣＳから接着ＳＣＳへと分化していくに従って遺伝子発現が強くなることがわかる。
【産業上の利用可能性】  本発明の実質的に単離された神経系細胞の製造方法によれば、胚性幹細胞の供給源に限定されることなく、大量に、かつ該胚性幹細胞から、神経系細胞以外の外胚葉性細胞、中胚葉性細胞及び内胚葉性細胞を誘導することなく効率よく、実質的に単離された神経系細胞を提供することができ、移植に適した神経系細胞を大量、かつ安定に供給することができる。したがって、神経再生医療等への応用が期待される。また、本発明の神経系細胞は、胚性幹細胞から、神経幹細胞を経て、神経細胞又はグリア細胞のいずれか１種に選択的に分化誘導されたものであるため、神経変性疾患、脊髄損傷、脳梗塞等に対する神経再生医療等における細胞又は組織の供給源として用いることができる。さらに、本発明の神経細胞によれば、神経変性疾患、脊髄損傷、脳梗塞等に対する神経細胞移植治療等の再生医療において、神経伝達物質の放出、神経間連絡の再構築等を可能にする。さらに、本発明のグリア細胞によれば、神経細胞、神経幹細胞と同時に移植して神経細胞の分化成長を支持し、さらに血液脳関門を形成して栄養物質の補給を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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