(57)【要約】体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物を有効成分として含有するダイオキシン類排除促進剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物を有効成分として含有するダイオキシン類排除促進剤。
【請求項２】
微生物が乳酸菌である、請求の範囲１記載の促進剤。
【請求項３】
微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、請求の範囲１記載の促進剤。
【請求項４】
体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物をヒトまたは動物に投与することを特徴とする、ダイオキシン類排除促進方法。
【請求項５】
微生物が乳酸菌である、請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、請求の範囲４記載の方法。
【請求項７】
体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進のための使用。
【請求項８】
体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進剤の製造のための使用。
【請求項９】
微生物が乳酸菌である、請求の範囲７または８記載の使用。
【請求項１０】
微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、請求の範囲７または８記載の使用。
【請求項１１】
請求の範囲１〜３のいずれか１項記載の促進剤を含む機能性食品。
【請求項１２】
請求の範囲１〜３のいずれか１項記載の促進剤のダイオキシン類排除用機能性食品の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、非意図的に身体に吸収蓄積してしまうダイオキシン類を体外に排出させる作用をもつ微生物を有効成分とするダイオキシン類排除促進剤に関する。
背景技術
Ｔｈｅｏ  Ｃｏｌｂｏｒｎらによる″Ｏｕｒ  Ｓｔｏｌｅｎ  Ｆｕｔｕｒｅ″（邦題「奪われし未来」１９９６年初版発行、２００１年改訂）により、その存在が示されて以来、内分泌撹乱化学物質（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、いわゆる環境ホルモン）は広く社会的な関心を集めるようになった。内分泌撹乱作用を持つと疑われている化学物質は多数知られているが、日本では平成１１年７月に公布された法律「ダイオキシン類対策特別措置法」により、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ジオキシン（ＰＣＤＤ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、コプラナーポリ塩化ビフェニル（ｃＰＣＢ）など６７種の化学物質がダイオキシン類と定義されている。ダイオキシン類の毒性は極めて高く、急性毒性としては皮膚炎、肝障害、神経障害、免疫毒性などが知られており、慢性毒性としては、催奇形性や胎児毒性、発がん性、異物代謝酵素誘導などが疑われている。日常生活で曝露するダイオキシン類の量は約２．３ｐｇ−ＴＥＱ（毒性等量）程度と推定されており、急性毒性を示す量をはるかに下回っている。しかしながら、ダイオキシン類は生体内で脂肪組織に残留し、蓄積されることが分かっており、毒性を発揮する濃度よりも低い濃度で体内で合成されるホルモンに似た働きを示す可能性がある。この作用がダイオキシン類をして環境ホルモンといわれる所以である。
ダイオキシン類の多くは非意図的な生成過程を経て環境へ放出されるが、ｃＰＣＢは難燃性と絶縁性から電気部品などに大量に使用されたポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）に副生物としてふくまれ、１９７１年にその製造が禁止された後にも環境中へ放出される続ける結果となった。これらダイオキシン類は環境中で極めてゆっくりとした分解をうけるが、その間に様々な生物の生体へ取り込まれ、食物連鎖の中で生体濃縮される。それらの汚染された生物を食品として摂取することで、ヒトへの防ぎようの無い曝露が懸念されている。
ダイオキシン類の生体内における吸収、代謝、排出に関しては不明な点が多い。ダイオキシン類は油溶性であることから、前述のように身体に取り込まれた後、脂肪組織に移行する。特に肝臓においてはレセプターを介した情報伝達経路により特定の遺伝子発現を誘導する。特にシトクロムＰ４５０タンパク質の発現はその酵素活性がダイオキシン類の水酸化、もしくは還元脱ハロゲン化をおこなうことが示されており、こうした代謝を経て水溶性を増し、胆汁中に分泌されることで生体外へ排出されているのではないかと考えられている。
一方、発酵乳に用いられる乳酸菌や納豆などに用いられる枯草菌などの微生物は食品や飼料へ広く利用されており、菌体や発酵生成成分などが宿主に有益な作用をもたらしていることが数多く知られている。特に乳酸菌や枯草菌、ビフィズス菌は直接もしくは間接的に腸内細菌叢に作用し、有害菌を排除することなどで宿主の健康に貢献している。また腸内細菌叢に関与しない作用として、発酵産物であるペプチドが作用する血圧降下作用などが知られている。乳酸菌が肝機能へ有益な作用を与える発明として、肝臓コレステロールを低減する乳酸菌（特開平７−２５０６７０）やストレス性肝障害を緩和する酵素処理された米糠乳酸菌発酵物（特開平９−１３２５３３）、プランタラム乳酸菌とアルギニンを併用した腸注液（特表平１１−５０４９３６）などが示されている。しかしながら、環境汚染物質の生体外への排出に関するものは知られていない。
本発明の目的は、肝臓等の体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排出を促進する作用をもつ微生物を有効成分として含有するダイオキシン類排除促進剤を提供することにある。ダイオキシン類は食物や空気、水、土壌などから無意識のうちに摂取してしまい、避けることが困難であることから、有効な成分をヒトにおいては日常の食生活で摂食できること、また食用家畜においては常用できる飼料添加物であることが重要である。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物を有効成分として含有するダイオキシン類排除促進剤。
（２）微生物が乳酸菌である、（１）記載の促進剤。
（３）微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、（１）記載の促進剤。
（４）体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物をヒトまたは動物に投与することを特徴とする、ダイオキシン類排除促進方法。
（５）微生物が乳酸菌である、（４）記載の方法。
（６）微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、（４）記載の方法。
（７）体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進のための使用。
（８）体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進剤の製造のための使用。
（９）微生物が乳酸菌である、（７）または（８）記載の使用。
（１０）微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、（７）または（８）記載の使用。
（１１）（１）〜（３）のいずれか１項記載の促進剤を含む機能性食品。
（１２）（１）〜（３）のいずれか１項記載の促進剤のダイオキシン類排除用機能性食品の製造のための使用。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、微生物を経口摂食することでダイオキシン類の代謝排泄に寄与していると考えられている肝臓シトクロームＰ４５０がダイオキシン類によって受ける変性を緩和し、体内からのダイオキシン類排出を促進することを見出し、本発明を完成させた。
本発明の体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物（以下、「本発明の微生物」と略記する）は、（１）ダイオキシン類を投与したラットに対して投与できる微生物で、（２）一定期間の微生物投与後における肝臓組織の電子常磁性共鳴吸収（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＰＲ）測定において異常Ｐ４５０分子種の抑制を検出することで、選ばれた微生物である。
本発明のダイオキシン類排除促進剤（以下、「本発明の促進剤」と略記する）は、体内に蓄積したダイオキシン類の排出を促進するので、ダイオキシン類吸収阻害剤のような予防薬にくらべて、曝露後の摂取でも効果が期待できる点で有利である。
ダイオキシン類としては、特に限定されず、通常ダイオキシン類に分類されているものがあげられる。具体的には、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ジオキシン（ＰＣＤＤ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、コプラナーポリ塩化ビフェニル（ｃＰＣＢ）、およびこれらの異性体等があげられる。
麻布大学獣医学部森田助教授らによると、ダイオキシン類を摂取したラットのシトクロムＰ４５０タンパク質において、酵素活性に関与する第六配位座にタンパク質分子自身のヒスチジンが配位して酵素活性を妨げている可能性があることが見出された（森田  英利ら、第９８回  日本畜産学会大会Ｘ３０−２１、２００１）。この変化はＥＰＲ測定法により観測することができる。
ＥＰＲ測定法とは、別名電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＳＲ）測定法とも呼ばれ、電子が持つ磁気モーメントの運動を利用して、物質中の電子の様子や電子が入っている環境の様子を調べることができる。測定できる物質は不対電子を持つ必要があるため測定の選択性が高く、また１Ｔ以下の定磁場と０．１ｍＴ以下のマイクロ波振動磁場で測定するため試料に加わるエネルギーが低く、非破壊測定をおこなうことができる。ＥＰＲ測定法の原理は、次のようである。不対電子を持つ原子や分子を磁場に置くと電子は低エネルギー軌道に入る。このとき更に高周波のマイクロ波振動磁場をかけると、不対電子は高エネルギー軌道へ遷移する。軌道遷移はマイクロ波の吸収として観測される。この時、どのような磁場で共鳴が観測されるかを示す因子としてｇ値がある。ｇ値は測定チャート上の位置として示され、測定対象分子の電子状態を探る重要な要素である。
実験動物のラット肝臓のＥＰＲ測定をおこなうとｇ＝２．４０の位置にチトクロムＰ４５０タンパク質に含まれる鉄原子の共鳴吸収が観測される。ラットに対してダイオキシン類を投与した場合、正常な共鳴吸収以外にｇ＝２．４９の位置に非投与時には観測されない異常な共鳴吸収がシグナルとなって現われる。投与するダイオキシン量の増加に従って異常シグナルの強度も増加することから、汚染状況を示す生体指標になる。
本発明の微生物は、このＥＰＲ測定におけるダイオキシン類に由来するｇ＝２．４９の位置の異常シグナルを正常化させることができる微生物であれば、どのような微生物も使用することができる。具体的には、細菌、酵母などがあげられる。
本発明の促進剤は、ヒトまたは動物に投与したときに、好ましくは５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重以上の有効菌数となるように微生物を含有する。
本発明の微生物は、その微生物の特性に従い様々な発酵食品として利用することができる。また、ダイオキシン類排除用機能性食品としても利用することができる。
乳酸菌であれば発酵乳やヨーグルト、乳酸菌飲料、アシドフィラスミルク等の乳製品としたり、それぞれに砂糖や酸味料、香料等を適宜添加して利用しやすい形態とすることができる。また、有効菌数が含まれていれば良いので、有効微生物を凍結乾燥することで菌体粉末製剤としたり、打錠して錠剤製品として簡便に経口摂取させることもできる。
このような微生物は有効菌数量を含む形態であれば液体状の発酵乳以外にも、納豆や米コウジのような固体発酵物でも構わず、そのため無理なく日常的に摂取することができることが期待できる。
その他、薬剤、食品、飼料等を製造する上で、許容される担体を含むことができる。例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
また、本発明の微生物の菌体破砕物または菌体抽出物も、本発明のダイオキシン類排除作用促進能を有する限り、本発明の促進剤の有効成分として使用することができる。
本発明の微生物は、生菌であっても死菌であってもよいが、好ましくは生菌である。
本発明の促進剤は単独であるいは他の食品、飲料、飼料等の添加剤として、ヒトおよびヒト以外の動物（牛、豚、鶏等の家畜、養殖用の魚等）に投与することができる。
投与量は対象とする動物やその症状等により異なるが、一般的に、１日当たり一般的に１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重以上、好ましくは５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重以上で、１回から数回投与される。投与量の上限は特に限定されない。
このような方法で選択された微生物として以下の乳酸菌を一例としてあげることができる。この乳酸菌はあくまで例示であり、この乳酸菌株に権利が限定されるものではない。
乳酸菌ラクトバチルスｓｐ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）ＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）
（形態的性質）
１）細胞の形：短桿菌、
２）運動性の有無：無、
３）胞子の有無：無、
４）グラム染色性：陽性
（培養的性質）
培養条件：リトマスミルク、３０℃
１）凝固性：なし、
２）液化：なし、
３）酸生成：あり、
４）生育可能ｐＨ範囲：５−７、
５）生育可能温度：１５−４５℃
（生理学的性質）
１）カタラーゼ：陰性、
２）インドールの生成：陰性、
３）硝酸塩の還元：陰性、
４）酸素に対する態度：通性嫌気性、
５）１５℃での生育性：有、
６）脱窒反応：陰性、
７）ＭＲテスト：陽性、
８）ＶＰテスト：陰性、
９）硫化水素の生成：陰性、
１０）デンプンの加水分解：陰性、
１１）クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ）：陽性、（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：陰性、
１２）硝酸塩の利用：陰性、
１３）アンモニウム塩の利用：陰性、
１４）色素の生成：陰性、
１５）ウレアーゼ活性：陰性、
１６）オキシダーゼ活性：陰性、
１７）Ｏ−Ｆテスト：好気嫌気ともに陽性、
１８）各種糖類からの酸産生試験［アンモニウム塩−糖培地（ＡＳＳ；Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ｒ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｅ．＆  Ｃｌａｒｋ，Ｆ．Ｅ．（１９５２），Ａｅｒｏｂｉｃ  ｓｐｏｒｅｆｏｒｍｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，ｎｏ．１６，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）を基礎培地とした好気培養］の結果は以下の通り
2003101472.tif 000002
１９）各種糖類からのガス産生は以下の通り
2003101472.tif 000003
尚、乳酸菌ラクトバチルスｓｐ  ＣＰ３０１２は、平成１４年５月２７日付で独立行政法人産業技術総合技術研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−５８６６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２として国際寄託されている。
また、非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌の一例としてバチルス・ズブチリスｃ−３１０２を挙げることができる。バチルス・ズブチリスｃ−３１０２は、昭和６１年６月２８日付で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３（郵便番号３０５）［現・独立行政法人産業技術総合技術研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−５８６６）］に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６として国際寄託されている。この非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌はあくまで例示であり、この菌株に権利が限定されるものではない。
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
（モデル動物構築）
実験モデルとして、ＰＣＢ１２６（３，３’，４，４’，５−ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ）を投与したラットを用意した。このラットは六週齢のＳｐｒａｎｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（日本チャールス・リバー株式会社より購入）を用い、およそ一週間の慣熟飼育をおこなった後、市販コーン油（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）にＰＣＢ１２６（Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，純度９９．９９％以上）を適切な濃度に溶解したものを用いて、コーン油量が同じでｃＰＣＢが０（コントロール），０．３，３，３０，１００μｇ／ｋｇ体重（ｂｗ）となるようにゾンデにより強制投与した。投与から２４時間後、ＰＣＢ投与ラットをエーテルにより安楽死させ、肝臓を摘出し、１．１５％ＫＣｌ緩衝液で充分に還流してから、組織片をＥＰＲ測定法により分析した。
（ＥＰＲ測定法）
ＥＰＲ測定装置はＪＥＳ−ＴＥ３００（日本電子（株））を用い、取扱説明書に準じて次のような条件で測定した。
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ            ７７Ｋ
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ                ９．１１ＧＨｚ
Ｐｏｗｅｒ                        １０ｍＷ
Ｓｗｅｅｐ  Ｔｉｍｅ              ４ｍｉｎ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｗｉｄｔｈ  ０．３２ｍＴ
Ｔｉｍｅ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ        ０．３ｓｅｃ
Ｆｉｅｌｄ：ｗｉｄｔｈ            ３００±１００ｍＴ
第１図にｃＰＣＢを投与したラットの肝臓組織片のＥＰＲスペクトルパターンを示す。このスペクトルの中で、ｇ＝２．４０シグナルが正常なチトクロムＰ４５０のヘム鉄原子に由来するピークである。その前にｇ＝２．４９シグナルに示される特異的なピークが現われている。その強度は投与量に依存していることが分かる。
（数値化）
このｇ＝２．４０およびｇ＝２．４９シグナルの強度を数値化するため、標準化をおこなった。典型的なシグナルチャートを示した模式図、第２図にＣで示されるマンガン原子に由来するシグナルの強度を基準とした。肝臓に含まれるマンガン原子の量は食餌中のマンガン量に影響を受け難いことが知られている［Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８４１，２０８−２１４（１９８５）］。このためピークＣの最大値と最小値の差をＨｃとし、そのＨｃの中点Ｈｃｅｎを決めた。このＨｃｅｎと図中にＥで示されるＡシグナルより低磁場側の「３０サンプリング点の平均値」のそれぞれを結ぶ点同士を線分で結び、その線分に対してｇ＝２．４９およびｇ＝２．４０のピークからおろした垂線の長さを、それぞれＨＡ、ＨＢとした。測定に用いた試料の重量を勘案するため、ＨＡ、ＨＢをＨＣで除したもの、すなわちｇ＝２．４９シグナルの強度をＨＡ／ＨＣ、またｇ＝２．４０シグナルの強度をＨＢ／ＨＣとした。
（微生物菌株）
使用する菌株は、乳酸菌としてラクトバチルスｓｐ  ＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）を、また枯草菌としてバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）を使用した。尚、バチルス・ズブチリスｃ−３１０２は、昭和６１年６月２８日付で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３（郵便番号３０５）［現・独立行政法人産業技術総合技術研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−５８６６）］に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６として国際寄託されている。
（微生物の培養）
微生物を純粋培養するにあたっては、使用する微生物ごとに適した培地を用いて、一般的な方法を用いることができる。微生物がラクトバチルス属乳酸菌であれば培地はＭＲＳ培地（ｄｉｆｃｏ社製）を添付の指示書に従って調製したものを用いた。バチルス属枯草菌であればトリプケースソイ培地（ＢＢＬ社製）を用いた。ラクトバチルス属乳酸菌は３７℃嫌気条件下で静置培養し、バチルス属枯草菌の培養は３７℃で振とう培養した。
すべての培養において、菌数の測定は血球計算盤（トーマ盤、萱垣医理科工業（株）社製）を添付取扱説明書に従っておこなった。
（投与試料調製）
１．疑似発酵乳試料
牛乳、脱脂乳、還元脱脂乳などを９８℃達温にて殺菌し、３７℃まで冷却した後、プロペラなどで攪拌しながら食品添加物グレードの乳酸（和光純薬１２２−０１９３６など）をゆっくりと添加してゆき、ｐＨ４．５に調整した。前述のホモジナイザを用いて同様に均質化を行い、疑似発酵乳試料とした。
２．菌体添加疑似発酵乳試料
前述の疑似発酵乳試料に対して、別に培養した上記微生物をそれぞれ懸濁し、１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌体濃度にしたものを菌体添加疑似発酵乳試料とした。
（投与試験）
前述のＰＣＢ１２６投与ラットに対して、微生物含有試料を６０日間にわたって投与した。投与量は５ｍｌ／ｋｇ体重とし、少なくとも平日（月曜〜金曜の５日間）は連続して投与した。投与期間終了後、ラットを安楽死させ、その肝臓を摘出した。１．１５％ＫＣｌ緩衝液による充分な還流の後、組織をＥＰＲ測定法による解析とｃＰＣＢ濃度の測定に供試した。
（シグナル強度評価）
前述のシグナル強度の標準化をおこなったＥＰＲ測定の結果を第３図に示す。統計学的処理により有意な差と認められたものに、危険率に応じて″＃″（Ｐ＜０．１０）、″＊″（Ｐ＜０．０５）が付けられている。乳酸菌ラクトバチルスｓｐ  ＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）と枯草菌バチルス・ズブチリスｃ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）でコントロール処理に対して、有効性が示された。
（肝臓組織内ｃＰＣＢ濃度の測定）
肝臓組織は２ｇを乳鉢にとり、無水硫酸ナトリウム（関東化学社製ＰＣＢ分析用）と共に均質化を行ったのち、円筒ろ紙へ入れてジエチルエーテルとヘキサン（共に関東化学社製残留農薬試験用）を３：１に混合した溶液２００ｍｌを用いて７時間のソックスレー抽出をおこなった。抽出液をＫＤ濃縮器で１０ｍｌ以下に濃縮し、エタノール（関東化学社製残留農薬試験用）を溶媒とした１Ｎ水酸化カリウム（和光純薬社製特級）５０ｍｌとＣ１３マスラベル化標準混合液（ＷＥＬＬＩＮＧＴＯＮ社製３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ，３，３’，４，４’，５−Ｐ５ＣＢ，３，３’，４，４’，５，５’−Ｈ６ＣＢを特級ノナンで希釈し、６０ｐｇ／μｌに調製したもの）１００μｌを加えて、１００℃で１時間還流して鹸化処理をおこなった。内容液を分液漏斗に移してヘキサン（同上）５０ｍｌとヘキサン洗浄した蒸留水５０ｍｌを加えて、１５分間振とうすることで抽出をおこなった。有機溶媒層を回収し無水硫酸ナトリウム（同上）で脱水した後、ＫＤ濃縮機を用いて高純度（９９．９９％）窒素気流下で５ｍｌに濃縮した。この濃縮物は活性化シリカゲルカラムで展開した。活性化シリカゲルカラムは、まずシリカゲル（和光純薬社製ワコーゲルＳ−１）を１３０℃で３時間加熱し、その１．５ｇをｎ−ヘキサン（同上）へ懸濁し、内径１０ｍｍのガラスカラムに湿式充填することで準備した。展開はｎ−ヘキサンを用いて１滴／１秒の流速でおこなった。総量１５０ｍｌまでを分取し、全量を濃硫酸（和光純薬社製特級）１０ｍｌと共に分液漏斗にて振とうし、硫酸の着色がなくなるまで繰り返した。ついでヘキサン洗浄した蒸留水で水層が中性になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム（同上）で脱水した後、再びＫＤ濃縮器で１００μｌ以下になるまで濃縮し、トルエン（関東化学社製ダイオキシン分析用）にて１００μｌとした。この試料をガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）にて分析した。ＧＣ−ＭＳは日本電子社製ＭＳｔａｔｉｏｎにＳＵＰＥＬＣＯ社製ＳＰＢ−Ｏｃｔｙｌｅ（５０ｃｍ×０．２ｍｍ×０．２５μｍ）を取り付け、分解能８０００以上のＨＲ−ＳＩＭ法で測定した。
（肝臓内ｃＰＣＢ濃度の評価）
肝臓組織のＧＣ−ＭＳ測定の結果から求められたＰＣＢ１２６濃度の比較を第４図に示す。統計学的処理により有意な差と認められたものに、危険率に応じて″＊＊＊″（Ｐ＜０．００１）が付けられている。ＥＰＲ測定の結果と同様に、乳酸菌ラクトバチルスｓｐ  ＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）と枯草菌バチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）でコントロール処理に対する、有効性が示された。
本出願は、２００２年５月３１日出願の日本特許出願（特願２００２−１６００５５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
産業上の利用可能性
本発明の促進剤は、ダイオキシン類により変性失活したシトクロムＰ４５０の効果を回復させ、自然な排出作用を促すことから、食品、飲料などに利用することができる。また、家畜の飼料等に利用することで、ダイオキシン類の蓄積の少ない安全な食肉などを供給することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＣＢ１２６を経口投与したラット肝臓のＥＰＲスペクトルを示した図である。
第２図は、ｃＰＣＢ投与による典型的なＥＰＲシグナルチャートを示した図である。
第３図は、６０日間試料投与における肝臓組織のｇ＝２．４９シグナルの比較である。
第４図は、６０日間試料投与における肝臓組織のＰＣＢ１２６濃度の比較である。
【図１】
2003101472.tif 000004
【図２】
2003101472.tif 000005
【図３】
2003101472.tif 000006
【図４】
2003101472.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月26日(2004.3.26)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物を有効成分として含有するダイオキシン類排除促進剤。
【請求項２】
微生物が乳酸菌である、請求の範囲１記載の促進剤。
【請求項３】
微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、請求の範囲１記載の促進剤。
【請求項４】
体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物をヒトまたは動物に投与することを特徴とする、ダイオキシン類排除促進方法。
【請求項５】
生物が乳酸菌である、請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、請求の範囲４記載の方法。
【請求項７】
体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進のための使用。
【請求項８】
体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進剤の製造のための使用。
【請求項９】
微生物が乳酸菌である、請求の範囲７または８記載の使用。
【請求項１０】
微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、請求の範囲７または８記載の使用。
【請求項１１】
微生物が５×１０６ｃｅｌｌＳ／Ｋｇ体重以上の有効菌数となる、請求の範囲１〜３記載の促進剤。
【請求項１２】
微生物がラクトバチルスＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）である、請求の範囲１記載の促進剤。
【請求項１３】
微生物がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である、請求の範囲１記載の促進剤。
【請求項１４】
「ダイオキシン類」は平成１１年７月に公布された法律「ダイオキシン類対策特別措置法」でいうところの「ダイオキシン類」である、請求の範囲１〜３記載の促進剤。
【請求項１５】
微生物が５×１０６ｃｅｌｌＳ／Ｋｇ体重以上の有効菌数となる、請求の範囲４〜６記載の方法。
【請求項１６】
微生物がラクトバチルスＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）である、請求の範囲４記載の方法。
【請求項１７】
微生物がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である、請求の範囲４記載の方法。
【請求項１８】
「ダイオキシン類」は平成１１年７月に公布された法律「ダイオキシン類対策特別措置法」でいうところの「ダイオキシン類」である、請求の範囲４〜６記載の方法。
【請求項１９】
微生物が５×１０６ｃｅｌｌＳ／Ｋｇ体重以上の有効菌数となる、請求の範囲７〜１０記載の使用。
【請求項２０】
微生物がラクトバチルスＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）である、請求の範囲７または８記載の使用。
【請求項２１】
微生物がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である、請求の範囲７または８記載の使用。
【請求項２２】
「ダイオキシン類」は平成１１年７月に公布された法律「ダイオキシン類対策特別措置法」でいうところの「ダイオキシン類」である、請求の範囲７〜１０記載の使用。
【請求項２３】
請求の範囲１〜３、１１〜１４のいずれか１項記載の促進剤を含む機能性食品。
【請求項２４】
請求の範囲１〜３、１１〜１４のいずれか１項記載の促進剤のダイオキシン類排除用機能性食品の製造のための使用。
【手続補正００２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
食物連鎖の中で生体濃縮される。それらの汚染された生物を食品として摂取することで、ヒトへの防ぎようの無い曝露が懸念されている。
ダイオキシン類の生体内における吸収、代謝、排出に関しては不明な点が多い。ダイオキシン類は油溶性であることから、前述のように身体に取り込まれた後、脂肪組織に移行する。特に肝臓においてはレセプターを介した情報伝達経路により特定の遺伝子発現を誘導する。特にシトクロムＰ４５０タンパク質の発現はその酵素活性がダイオキシン類の水酸化、もしくは還元脱ハロゲン化をおこなうことが示されており、こうした代謝を経て水溶性を増し、胆汁中に分泌されることで生体外へ排出されているのではないかと考えられている。
一方、発酵乳に用いられる乳酸菌や納豆などに用いられる枯草菌などの微生物は食品や飼料へ広く利用されており、菌体や発酵生成成分などが宿主に有益な作用をもたらしていることが数多く知られている。特に乳酸菌や枯草菌、ビフィズス菌は直接もしくは間接的に腸内細菌叢に作用し、有害菌を排除することなどで宿主の健康に貢献している。また腸内細菌叢に関与しない作用として、発酵産物であるペプチドが作用する血圧降下作用などが知られている。乳酸菌が肝機能へ有益な作用を与える発明として、肝臓コレステロールを低減する乳酸菌（特開平７−２５０６７０）やストレス性肝障害を緩和する酵素処理された米糠乳酸菌発酵物（特開平９−１３２５３３）、プランタラム乳酸菌とアルギニンを併用した腸注液（特表平１１−５０４９３６）などが示されている。しかしながら、環境汚染物質の生体外への排出に関するものは知られていない。
本発明の目的は、肝臓等の体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排出を促進する作用をもつ微生物を有効成分として含有するダイオキシン類排除促進剤を提供することにある。ダイオキシン類は食物や空気、水、土壌などから無意識のうちに摂取してしまい、避けることが困難であることから、有効な成分をヒトにおいては日常の食生活で摂食できること、また食用家畜においては常用できる飼料添加物であることが重要である。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）  体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物を有効成分として含有するダイオキシン類排除促進剤。


【手続補正００３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
（２）  微生物が乳酸菌である、（１）記載の促進剤。
（３）  微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、（１）記載の促進剤。
（４）  体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物をヒトまたは動物に投与することを特徴とする、ダイオキシン類排除促進方法。
（５）  微生物が乳酸菌である、（４）記載の方法。
（６）  微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、（４）記載の方法。
（７）  体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進のための使用。
（８）  体内に蓄積したダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物の、ダイオキシン類排除促進剤の製造のための使用。
（９）  微生物が乳酸菌である、（７）または（８）記載の使用。
（１０）  微生物が非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である、（７）または（８）記載の使用。
（１１）  微生物が５×１０６ｃｅｌｌＳ／Ｋｇ体重以上の有効菌数となる、（１）〜（３）記載の促進剤。
（１２）  微生物がラクトバチルスＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）である、（１）記載の促進剤。
（１３）  微生物がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である、（１）記載の促進剤。
（１４）  「ダイオキシン類」は平成１１年７月に公布された法律「ダイオキシン類対策特別措置法」でいうところの「ダイオキシン類」である、（１）〜（３）記載の促進剤。
（１５）  微生物が５×１０６ｃｅｌｌＳ／Ｋｇ体重以上の有効菌数となる、（４）〜（６）記載の方法。
（１６）  微生物がラクトバチルスＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）である、（４）記載の方法。
（１７）  微生物がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である、（４）記載の方法。
（１８）  「ダイオキシン類」は平成１１年７月に公布された法律「ダイオキシン類対策特別措置法」でいうところの「ダイオキシン類」である、（４）〜（６）記載の方法。
（１９）  微生物が５×１０６ｃｅｌｌＳ／Ｋｇ体重以上の有効菌数となる、（７）〜（１０）記載の使用。
（２０）  微生物がラクトバチルスＣＰ３０１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５２）である、（７）または（８）記載の使用。
（２１）  微生物がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である、（７）または（８）記載の使用。
（２２）  「ダイオキシン類」は平成１１年７月に公布された法律「ダイオキシン類対策特別措置法」でいうところの「ダイオキシン類」である、（７）〜（１０）記載の使用。
（２３）  （１）〜（３）、（１１）〜（１４）のいずれか１項記載の促進剤を含む機能性食品。
（２４）  （１）〜（３）、（１１）〜（１４）のいずれか１項記載の促進剤のダイオキシン類排除用機能性食品の製造のための使用。
図面の簡単な説明
第１図は、ＰＣＢ１２６を経口投与したラット肝臓のＥＰＲスペクトルを示した図である。
第２図は、ｃＰＣＢ投与による典型的なＥＰＲシグナルチャートを示した図である。
第３図は、６０日間試料投与における肝臓組織のｇ＝２．４９シグナルの比較である。
第４図は、６０日間試料投与における肝臓組織のＰＣＢ１２６濃度の比較である。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、微生物を経口摂食することでダイオキシン類の代謝排泄に寄与していると考えられている肝臓シトクロームＰ４５０がダイオキシン類によって受ける変性を緩和し、体内からのダイオキシン類排出を促進することを見出し、本発明を完成させた。


【手続補正００４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明に蓄積した体内のダイオキシン類の体外への排除を促進させる能力を有する微生物（以下、「本発明の微生物」と略記する）は、（１）ダイオキシン類を投与したラットに対して投与できる微生物で、（２）一定期間の微生物投与後における肝臓組織の電子常磁性共鳴吸収（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＰＲ）測定において異常Ｐ４５０分子種の抑制を検出することで、選ばれた微生物である。
本発明のダイオキシン類排除促進剤（以下、「本発明の促進剤」と略記する）は、体内に蓄積したダイオキシン類の排出を促進するので、ダイオキシン類吸収阻害剤のような予防薬にくらべて、曝露後の摂取でも効果が期待できる点で有利である。
ダイオキシン類としては、特に限定されず、通常ダイオキシン類に分類されているものがあげられる。具体的には、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ジオキシン（ＰＣＤＤ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、コプラナーポリ塩化ビフェニル（ｃＰＣＢ）、およびこれらの異性体等があげられる。
麻布大学獣医学部森田助教授らによると、ダイオキシン類を摂取したラットのシトクロムＰ４５０タンパク質において、酵素活性に関与する第六配位座にタンパク質分子自身のヒスチジンが配位して酵素活性を妨げている可能性があることが見出された（森田  英利ら、第９８回  日本畜産学会大会  Ｘ３０−２１、２００１）。この変化はＥＰＲ測定法により観測することができる。
ＥＰＲ測定法とは、別名電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＳＲ）測定法とも呼ばれ、電子が持つ磁気モーメントの運動を利用して、物質中の電子の様子や電子が入っている環境の様子を調べることができる。測定できる物質は不対電子を持つ必要があるため測定の選択性が高く、また１Ｔ以下の定磁場と０．１ｍＴ以下のマイクロ波振動磁場で測定するため試料に加わるエネルギーが低く、非破壊測定をおこなうことができる。ＥＰＲ測定法の原理は、次のようである。不対電子を持つ原子や分子を磁場に置くと電子は低エネルギー軌道に入る。このとき更に高周波のマイクロ波振動磁場をかけると、不対電子は高エネルギー軌道へ遷移する。軌道遷移はマイクロ波の吸収として観測される。この時、どのような磁場で共鳴が観測されるかを示す因子としてｇ値がある。ｇ値は測定チャート上の位置として示され、測定対象分子の電子状態を探る重要な要素である。




【国際調査報告】
2003101472.tif 000008
2003101472.tif 000009
2003101472.tif 000010
2003101472.tif 000011
2003101472.tif 000012
2003101472.tif 000013