(57)【要約】本発明は生体適合性が高く、迅速な骨再生を可能とする骨代替用インプラントを提供することを目的とする。すなわち、本発明は増殖因子の遺伝子を導入した細胞を含む生体適合性材料からなるインプラントに関する。該インプラントは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子を導入した骨髄由来細胞を多孔性セラミックス等の生体適合性材料に播種して培養することにより製造される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖因子の遺伝子を導入した細胞を含む生体適合性材料からなる骨代替用インプラント。
【請求項２】
前記増殖因子が、血管新生および／または骨形成を促す増殖因子である、請求の範囲第１項に記載のインプラント。
【請求項３】
前記増殖因子が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求の範囲第２項に記載のインプラント。
【請求項４】
前記細胞が胚性幹細胞または骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項５】
前記細胞が骨芽細胞である、請求の範囲第４項に記載のインプラント。
【請求項６】
前記細胞が患者から採取された細胞である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項７】
前記生体適合性材料がハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれる、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項８】
以下の工程を含む、骨代替用インプラントの製造方法。
１）  骨髄由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞へ分化誘導する工程
２）  上記細胞に、増殖因子の遺伝子をトランスフェクトする工程
３）  上記細胞を、生体適合性材料に播種して増殖させる工程
【請求項９】
前記増殖因子が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体適合性材料がハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれる、請求の範囲第８項または第９項に記載の方法。
【請求項１１】
増殖因子の遺伝子がアデノウィルスベクターまたはレトロウィルスベクターを用いてトランスフェクトされることを特徴とする、請求の範囲第８項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
分化誘導がデキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成タンパク質、および骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種または２種以上を用いて行われる、請求の範囲第８項〜第１１項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、増殖因子の遺伝子を導入した細胞を含むインプラントおよびその製造方法に関する。さらに詳しくは、血管内皮細胞増殖因子の過剰発現により、迅速な骨再生を可能とする骨代替用インプラントに関する。
背景技術
従来、骨のように再生能力の限られた組織の修復には、自己組織の再移植や人工インプラントによる置換・補充が行われている。しかし、自己組織の使用は患者の負担が大きく、その採取量にも限界があり、人工インプラントには自己組織に匹敵するだけの機械的・構造的特性や生体適合性が期待できないという問題がある。
一方、生体から取り出した自己の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養・組織化して限りなく生体に近い組織を再構築し、これを再び生体内に戻すという「再生医療」の研究が進められている。この再生医療が実現すれば、それは欠損した組織修復の最も理想的な治療方法となる。通常、再生医療におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組織再生は、細胞を適当な足場材料に播種、培養して行う。この細胞培養時に、細胞をより早く目的の組織に増殖・分化させること、また生体適用後に、移植組織を速やかに増殖させ、欠損部に融合・組織化させることが、再生医療においては重要な問題となる。
これを解決する方法として、細胞の分化誘導をつかさどるサイトカイン（液性因子）を直接細胞に導入するいくつかの技術が知られている。たとえば、特開２００１−３１６２８５号には、ＴＧＦ−β１を含浸させたコラーゲンスポンジ上で骨髄細胞等を培養する技術が開示されている。また、特開平８−３１９９号には、ｂＦＧＦを含有するコラーゲン−軟骨細胞複合体による、軟骨組織再生治療材が開示されている。しかしながら、これらの技術は増殖因子そのものを細胞に添加するため、増殖因子活性の十分な持続が望めない。特に、生体内では添加した増殖因子が速やかに拡散してしまうため、その効果は数時間から１日程度で急激に低下するという。
一方、肝臓等の組織再生においては、血管新生が重要な過程であることが知られているが（Ａｊｉｏｋａ，Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９  ３９６−４０２，（１９９９））、骨再生における血管新生の影響については、未だ十分な検討はなされていない。
発明の開示
本発明は、生体適合性が高く、迅速な骨再生を可能とする骨代替用インプラントを提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究した結果、細胞に増殖因子の遺伝子を導入して過剰発現させれば、増殖因子の効果が持続的に得られ、より迅速な組織再生が可能になると考えた。そして、血管新生を促す血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を導入することにより、骨再生が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）に関するものである。
（１）増殖因子の遺伝子を導入した細胞を含む生体適合性材料からなる骨代替用インプラント。
（２）前記増殖因子が、血管新生および／または骨形成を促す増殖因子である、上記（１）記載のインプラント。
（３）前記増殖因子が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、上記（２）記載のインプラント。
（４）前記細胞が胚性幹細胞または骨髄由来の間葉系幹細胞である、上記（１）〜（３）のいずれか１に記載のインプラント。
（５）前記細胞が骨芽細胞である、上記（４）記載のインプラント。
（６）前記細胞が患者から採取された細胞である、上記（１）〜（５）のいずれか１に記載のインプラント。
（７）前記生体適合性材料がハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれる、上記（１）〜（６）のいずれか１に記載のインプラント。
（８）以下の工程を含む、骨代替用インプラントの製造方法。
１）骨髄由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞へ分化誘導する工程
２）上記細胞に、増殖因子の遺伝子をトランスフェクトする工程
３）上記細胞を、生体適合性材料に播種して増殖させる工程
（９）前記増殖因子が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、上記（８）記載の方法。
（１０）前記生体適合性材料がハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれる、上記（８）または（９）に記載の方法。
（１１）増殖因子の遺伝子がアデノウィルスベクターまたはレトロウィルスベクターを用いてトランスフェクトされることを特徴とする、上記（８）〜（１０）のいずれか１に記載の方法。
（１２）分化誘導がデキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成タンパク質、および骨形成液性因子からなる群より選ばれる、上記（８）〜（１１）のいずれか１に記載の方法。
以下、本発明について詳細に説明する。
１．インプラントの構成
本発明のインプラントは、増殖因子の遺伝子を導入した細胞を含む、生体適合性材料からなる骨代替用インプラントである。
１．１  増殖因子
本発明のインプラントに用いられる増殖因子は特に限定されず、たとえば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板分化増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、グリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。
特に、血管新生および／または骨形成を促す増殖因子が好ましい。そのような増殖因子としては、たとえば骨形成因子（ＢＭＰ）、骨増殖因子（ＢＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）を挙げることができる。なかでも、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管誘導を飛躍的に向上させ、迅速な骨再生を可能にする点で最も好ましい。
前記増殖因子の遺伝子は、通常の方法に従い、公知の配列を基に調整することができる。たとえば、骨芽細胞からＲＮＡを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、ＰＣＲ法でクローニングすることにより目的とする増殖因子遺伝子のｃＤＮＡが調整できる。また、市販のものを購入、あるいは供与してもらって用いても良い。
１．２  細胞
本発明に用いられる細胞は、分化・増殖能力を有する未分化の細胞であり、たとえば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞および肝臓幹細胞等を挙げることができる。特に、骨髄由来の胚幹細胞（ＥＳ細胞）および骨髄由来の間葉系幹細胞が好ましい。
前記細胞は、樹立された培養細胞株のほか、患者の生体から単離された細胞を好適に用いることができる。該細胞は患者から採取された後、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。また、常法により一次培養を行い、予め増殖させてから用いてもよい。
１．３  生体適合性材料
本発明に用いられる生体適合性材料は、細胞培養の足場になると同時に、細胞ごと生体内に適用され、骨代替用インプラントとして機能する。ここで、「生体適合性材料」とは、生体に対して親和性が高く、安全性の確認されている材料を意味する。そのような材料としては、ＳＵＳ３１６Ｌ、バイタリウムおよびＴｉ−６Ａｌ−４Ｖ等の金属材料、超高分子量ポリエチレン、ＭＭＡ骨セメント、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレンテレフタレートおよびポリプロピレン等の高分子材料、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、α−ＴＣＰおよびバイオガラス等のセラミックス材料等を挙げることができる。ただし、細胞培養の足場として用いられるという点で、特にハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、α−ＴＣＰ等の多孔性セラミックス材料、コラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにこれらの複合体、あるいは吸収性合成ポリマーを用いることが好ましい。
前記生体適合性材料は、細胞の均一な播種が可能となるよう、多孔性であることが好ましい。なお、本明細書中において「多孔（性）」とは、気孔率が４０％以上を意味するものとする。また、孔の大きさは特に限定されないが、骨再生が起きやすいという点では直径２００μｍ〜５００μｍが好ましい。
前記生体適合性材料は、インプラントの目的や適用部位により、適宜最適なものを選ぶことが好ましい。たとえば、強度を必要とする移植箇所（あるいは手術法）については、ハイドロキシアパタイトが好ましく、強度を必要としない移植箇所（あるいは手術法）については、生体吸収性のβ−ＴＣＰ等が好ましい。
前記生体適合性材料の形態および形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、およびペースト状等、任意の形態および形状を用いることができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。
２．インプラントの作製方法
本発明のインプラントは、次の工程によって製造される。
▲１▼ヒト骨髄由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨細胞へ分化誘導する工程
▲２▼上記細胞に、増殖因子の遺伝子をトランスフェクトする工程
▲３▼上記細胞を、生体適合性材料に播種して増殖させる工程
以下、各工程の詳細について説明する。
２．１  細胞の分化誘導
細胞は適当な薬剤を用いて処理することにより、目的とする組織を構築する細胞に分化誘導をしておくことが必要である。たとえば、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６およびシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子から選ばれる１種または２種以上を添加することにより細胞を骨系細胞に分化誘導する。
２．２  増殖因子の遺伝子の導入
増殖因子の遺伝子は、常法に従い、公知の配列を基に調整することができる。たとえば、骨芽細胞からＲＮＡを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、ＰＣＲ法でクローニングすることにより目的とする増殖因子遺伝子のｃＤＮＡが調整できる。
本発明において、増殖因子の遺伝子の細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションに通常用いられる方法、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、レトロウィルスやバキュロウィルスをベクターとして用いる方法等を用いることができるが、アデノウィルスまたはレトロウィルスをベクターとして用いる方法が安全性、導入効率の点から好ましく、特にアデノウィルスを用いた方法が最も好ましい。
前記アデノウィルスベクターの調整は、例えばＭｉｙａｋｅらの方法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１３２０−１３２４，（１９９３））に基づいて行えばよいが、市販のＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いることもできる。このキットはＰ１ファージのＣｒｅリコンビナーゼとその認識配列であるｌｏｘＰを用いた新たな発現制御系（Ｋａｎｅｇａｅ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，１９９５  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３８１６）による組換えアデノウィルスベクター作製キットで、転写因子遺伝子を組み込んだ組換えアデノウィルスベクターを簡便に作製することができる。
なお、アデノウィルス感染のｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、１０以上、好ましくは５０〜２００、より好ましくは１００前後（８０〜１２０程度）がよい。
２．３  細胞培養
前記増殖因子遺伝子を導入した細胞の培養は、前記した生体適合性材料からなる足場に、該細胞を播種して、通常の方法により行えばよい。
細胞の播種は、足場である生体適合性材料に単に播種するだけでもよく、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、あるいはコラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種してもよい。また、材料によって、細胞が孔の中にスムーズに入らない場合は、引圧条件下で播種してもよい。
播種する細胞の数（播種密度）は細胞の形態を維持して組織再生をより効率よく行わせるため、用いる細胞や足場材料に応じて適宜調整することが望ましい。たとえば、骨芽細胞であれば、播種密度は１００万個／ｍｌ以上であることが望ましい。
細胞培養は、足場である生体適合性材料のもとで行う。培地としては、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、公知の培地を培養する細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。また、該培地には、ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）等の抗生物質等を添加しても良い。培養は、３〜１０％ＣＯ２、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ２、３７℃の条件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも４日、好ましくは７日、より好ましくは２週間以上であるとよい。
３．インプラントの利用
前記方法によって再生された組織は、足場材料である生体適合性材料とともに、埋入あるいは注入することで、骨代替用インプラントとして利用することができる。
本発明のインプラントの形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。
本発明のインプラントは、その目的と効果を損なわない範囲において、適宜他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板分化増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、グリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の増殖因子、骨形成タンパク質、Ｓｔ、Ｍｇ、Ｃａ及びＣＯ３等の無機塩、クエン酸及びリン脂質等の有機物、薬剤等を挙げることができる。
本発明のインプラントにおいて、骨細胞・組織は増殖因子の遺伝子を導入した細胞から構築される。骨細胞・組織の構築は移植前（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のみならず、移植後の骨欠損部（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においても引き続き行われてよい。本発明のインプラントは、骨親和性及び骨形成能が高く、生体適用後すみやかに生体骨と一体化し、骨欠損部の再生を可能にする。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００２−４１６０４号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕  ＶＥＧＦ遺伝子導入ラット骨芽細胞による血管新生促進
１．実験方法
１）アデノウィルスベクターの作製
▲１▼マウスＶＥＧＦのｃＤＮＡ
マウスＶＥＧＦのｃＤＮＡ（配列番号１）は、東京工業大学  渡辺氏より供与を受けた。
▲２▼組換えアデノウィルスの作製
上記ＶＥＧＦのｃＤＮＡを市販のＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩサイトに挿入し、キットの説明書に従い組換えアデノウィルスベクターを作製した。ＶＥＧＦの挿入は制限酵素パターンとシークエンスにより確認した。このウイルスはＥ１領域欠失のため、標的細胞内では増殖することはできず、一過性の性質をもつ。また、目的遺伝子の上流にスタッファーをもつため、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ウィルスと共感染のときのみ遺伝子を発現する。なお、作製したウィルスの力価は、約２．４×１０９ＰＦＵ／ｍｌで、感染効率は非常に高かった。
２）骨髄細胞の採取および培養
ラット骨芽細胞（Ｒａｔ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｏｓｔｅｏｂｒａｓｔ：ＲＢＭＯ）は、６週齢のＦｉｓｈｅｒラット（オス）の大腿骨よりＭａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓらの方法（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．，Ｓｏｄｅｋ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｈ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２５４，３１７−３３０）に従って採取した。採取した細胞を、１５％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）添加ＭＥＭ培地（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社製）でコンフルエントになるまで培養した。つぎに、直径３．５ｃｍのディッシュに、５ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、
１０ｍＭ  β−グリセロフォスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸フォスフェート（Ｗａｋｏ社製）を添加した上述の培地を入れ、１ディッシュあたり細胞が約４０万個となるように培養液を加えて継代培養した。翌日、継代培養したラット骨芽細胞（９０％コンフルエント）にＬａｃＺ遺伝子発現ウィルス（ＡＤ−ＬａｃＺ）とＣｒｅリコンビナーゼ発現ウィルス（ＡＤ−ＣＲＥ）をｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｍｏｉ）＝１００で感染させた。
３）Ｘｇａｌ染色法によるＬａｃＺ遺伝子発現細胞の観察
アデノウィルス感染〜４週間後のラット骨芽細胞におけるＬａｃＺの発現をＳｃｈｏｌｅｒらの方法（Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．，８，２５５１−２５５７）に従ってＸｇａｌ染色法により観察した（図１）。なお、非感染細胞をコントロールとして用いた。染色した細胞をＮＩＨ  ｉｍａｇｅを用いて画像解析を行い、発現細胞数を数値化することにより遺伝子導入効率を求めた（図２）。結果：発現効率は４日目が最大であり、９０％以上の発現効率が見られた。わずかであるが、４週目までは発現がある。
４）ノザンハイブリダイゼーション▲１▼＜転写確認＞
アデノウィルス感染１週間目のラット骨芽細胞より、市販のＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製，＃１５５９６−１０５５１）を用い、説明書に従いＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。１０μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを１％アガロース／５．５％ホルムアルデヒドゲルで分離し、２０×ＳＳＣでＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｘ１メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に転写した。その後、８０℃で２時間加熱し、ＵＶ照射を２分間行った。ＶＥＧＦのｃＤＮＡプローブはｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、α−３２ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でラベルし、取り込まれなかったα−３２ＰｄＣＴＰをＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭＧ−２５  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて除いた。このメンブレンを６８℃で３０分間ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ７ＮＰｌｕｓ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  ＢＵＦＦＥＲ（ＳＩＧＭＡ社製）中でインキュベートした後、ラベルしたｃＤＮＡプローブ（２ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を加えてさらに６８℃で１時間インキュベートした。メンブレンは室温で２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５分間洗った後、さらに６８℃で０．５ＸＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで２回各２０分間洗った。その後メンブレンを−８０℃でＫｏｄａｋ  ＸＡＲ  ｆｉｌｍに一昼夜感光した（図３）。さらに、ＶＥＧＦ発現量をｍｏｉ＝０の値を１として１８ｓ  ｒＲＮＡの発現量との相対比で示した（図４）。
結果：ｍｏｉの上昇に従いＶＥＧＦの転写量が増加することが確認された。
５）ノザンハイブリダイゼーション▲２▼＜ＶＥＧＦ発現量の経時変化＞
アデノウィルス感染後４、７、１０、１４日後のＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、前項と同様の方法でノザンハイブリダイゼーションによってＶＥＧＦｍＲＮＡの発現量変化をみた。なお、ＶＥＧＦ発現量はＶＥＧＦとＧＡＰＤＨとの相対比で示した（図５、図６）。
６）ＥＬＩＳＡによる培地中のＶＥＧＦの確認▲１▼＜ｍｏｉの効果＞
種々のｍｏｉでＡＤ−ＶＥＧＦをラット骨芽細胞に感染させ、培地中のＶＥＧＦ量をＥＬＩＳＡにより測定した。測定は４日目（図７−Ａ）と７日目（図７−Ｂ）の上清を用いて行った。結果：発現量はｍｏｉの上昇に伴い増えるはずであったが、ｍｏｉにかかわらず約１０ｎｇ／ｍｌと一定であった。ウィルス感染により細胞数が減少したためと考えられる。
７）ＥＬＩＳＡによる倍地中のＶＥＧＦの確認▲２▼＜ＶＥＧＦ量の経時変化＞
ＡＤ−ＶＥＧＦをｍｏｉ＝１００で感染させ、ＶＥＧＦ濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、その経時変化をみた（図８）。なお、培地交換は３日ごとに行い、その際に上清を回収した。
結果：１０日ごろまではＶＥＧＦ発現量は多く、１４日目には大きく減少することから、ウィルスによるＶＥＧＦ発現効果は２週間程度であることがわかった。８）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用した分泌ＶＥＧＦ活性の確認
ＶＥＧＦ活性を調べるために、９６ウェルにヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播き、種々のｍｏｉでウィルスを感染させたラット骨芽細胞培地上清を２０μｌ／ｗｅｌｌの割合で加えた。その後Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＷＡＫＯ）で細胞の増加率を評価した（図９）。
その結果、ウィルスのＶＥＧＦにより細胞の成育に２倍の差が出ていることが確認された。
２．結論
ＶＥＧＦ導入細胞は、ｍｏｉにかかわらず、非感染細胞の約８〜１０倍のＶＥＧＦ発現を示した。特にｍｏｉは、５０〜２００程度が望ましく、１００程度が最適であると考えられた。また、ＶＥＧＦ感受性のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使った生育実験より、ＡＤ−ＶＥＧＦ感染ラット骨髄細胞培地を加えた細胞は、非感染細胞よりも明らかに血管細胞の成育を促進することが確かめられた。
また、増殖因子の効果も２週間程度持続しており、これは増殖因子そのものの直接導入（増殖因子の拡散が数時間から１日でがおこってしまう）に比較して、非常に高いものであった。
〔実施例２〕  ＶＥＧＦ遺伝子導入ラット骨芽細胞による骨組織再生
１）試験方法
フィッシャーラット大腿骨より骨髄液を採取したのちＴ７５フラスコでαＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ中３７℃５％炭酸ガス下で６日間培養した。その後、ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ等、骨芽細胞への分化誘導因子を加えて４日間培養した。Ｔ７５フラスコでほぼコンフルエントになったところで（１−３×１０（７）細胞／フラスコ）で実施例１と同様にしてＡＤ−ＶＥＧＦに感染させ（ｍｏｉ＝１００）、１日経過後トリプシンを用いて細胞をはがし、多孔性セラミックス（オスフェリオン：オリンパス光学工業株式会社、平均ポアサイズ２００μｍ、気孔率７５％）に２００万個／ｍｌ以上の播種密度で播種し、上記と同様の条件で培養した。
１日経過後、フィッシャーラットの大腿骨に骨欠損部位をつくり、その部分に上記セラミックス（２×２×２ｍｍ３）を移植した。移植後２週間後のラットより大腿骨を取り出し、固定後、切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色により骨形成を見た。
２）結果
結果を図１０に示す。ｃｏｎｔ１，ｃｏｎｔ２はウイルス非感染群（コントロール）で、ｃｏｎｔ１は低倍率、ｃｏｎｔ２は高倍率像である。ＶＥＧＦ１，ＶＥＧＦ２はウイルス感染群で、ＶＥＧＦ１は低倍率、ＶＥＧＦ２は高倍率像である。図１０から明らかなように、非感染群では骨形成があまり起こっていないのに対し、感染群では明らかに骨形成が顕著に起こっていることが確認された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、細胞をより早く目的の組織に分化・増殖させ、効果的な骨再生が可能となる。これにより、再生医療における優れた骨代替用インプラントを提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、非感染細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）とアデノウィルス感染細胞（ＡＤ−ｌａｃＺ）のＸｇａｌ染色結果を示す画像である。
図２は、アデノウィルス感染細胞におけるＬａｃＺ遺伝子の導入効率（染色量で評価）を示すグラフである。
図３は、ｍｏｉによるＶＥＧＦ発現量の変化を示すノザンハイブリダイゼーションの結果である。
図４は、ｍｏｉによるＶＥＧＦの発現量（１８ｓ  ｒＲＮＡ発現量との相対値）の変化を示すグラフである。
図５は、ＶＥＧＦ発現量の経時変化を示すノザンハイブリダイゼーションの結果である。
図６は、ＶＥＧＦの発現量（１８ｓ  ｒＲＮＡ発現量との相対値）の経時変化を示すグラフである。
図７は、ｍｏｉによる培地中のＶＥＧＦ量変化を示すグラフ（Ａ：４日目、Ｂ：７日目）である。
図８は、ｍｏｉ＝１００で感染させたときのＶＥＧＦ発現量の経時変化を示すグラフである。
図９は、ＶＥＧＦによるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増加率を示すグラフである。
図１０は、ヘマトキシリン−エオジン染色により骨組織再生をみた写真である（Ａ：ｃｏｎｔｒｏｌ（１０日）、Ｂ：ｃｏｎｔｒｏｌ（２０日）、Ｃ：ＶＥＧＦ（１０日）、Ｄ：ＶＥＧＦ（２０日））。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月2日(2003.10.2)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子を導入した細胞を含む生体適合性材料からなる骨代替用インプラント。
【請求項２】（削除）
【請求項３】（削除）
【請求項４】前記細胞が胚性幹細胞または骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求の範囲第１項に記載のインプラント。
【請求項５】前記細胞が骨芽細胞である、請求の範囲第４項に記載のインプラント。
【請求項６】前記細胞が患者から採取された細胞である、請求の範囲第１項、第４項、または第５項に記載のインプラント。
【請求項７】前記生体適合性材料がハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれる、請求の範囲第１項、第４項、第５項、または第６項に記載のインプラント。
【請求項８】以下の工程を含む、骨代替用インプラントの製造方法。
１）  骨髄由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞へ分化誘導する工程
２）  上記細胞に、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子をトランスフェクトする工程
３）  上記細胞を、生体適合性材料に播種して増殖させる工程
【請求項９】（削除）
【請求項１０】前記生体適合性材料がハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれる、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１１】血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子がアデノウィルスベクターまたはレトロウィルスベクターを用いてトランスフェクトされることを特徴とする、請求の範囲第８項または第１０項に記載の方法。
【請求項１２】分化誘導がデキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成タンパク質、および骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種または２種以上を用いて行われる、請求の範囲第８項、第１０項、または第１１項に記載の方法。




【国際調査報告】
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