(57)【要約】低ランニングコスト、低価格でかつ高精度の測定が可能なＤＮＡマイクロアレイシステムである。電界効果トランジスタのゲート絶縁物表面に核酸プローブ（３）を固定化し、ターゲット遺伝子とゲート絶縁物表面でハイブリダイゼーションを行わせ、その際に生ずる表面電荷密度の変化を電界効果を利用して検出する。
2003052097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブを固定化した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタと、参照電極とを備えることを特徴とするポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２】
複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタが形成された基板を備え、前記基板の表面において、各絶縁ゲート電界効果トランジスタのチャネル部のゲート絶縁物上に直接又は担体を介してそれぞれ異なる種類の一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブを固定化したことを特徴とするポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
検出すべき核酸の一部と相補的な塩基配列を有する核酸プローブを直接又は担体を介してゲート絶縁物表面に固定化した第１の絶縁ゲート電界効果トランジスタと、
検出すべき核酸のどの部分とも相補的ではない塩基配列を有する核酸プローブを直接又は担体を介してゲート絶縁物表面に固定化した第２の絶縁ゲート電界効果トランジスタと、
前記第１の絶縁ゲート電界効果トランジスタと前記第２の絶縁ゲート電界効果トランジスタの出力を比較検出する回路とを備えることを特徴とするポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
（ａ）それぞれ異なる種類の一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブがゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して固定化された複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを有する基板上に、少なくとも１種類の核酸を含む試料溶液を導入して、前記一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイゼーションを行わせるステップと、
（ｂ）洗浄液を前記基板上に導入して、未反応の核酸を前記基板上から除去するステップと、
（ｃ）インターカレータ溶液を上記基板上に導入して、二本鎖となった核酸と反応させるステップと、
（ｄ）洗浄液を前記基板上に導入して、未反応のインターカレータを基板上から除去するステップと、
（ｅ）緩衝液を前記基板上に導入して、前記絶縁ゲート電界効果トランジスタの出力値を測定するステップとを有することを特徴とする核酸解析方法。
【請求項５】
請求項４記載の核酸解析方法において、
（ｆ）前記基板を加熱して前記一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイズした核酸を解離させるステップと、
（ｇ）洗浄液を前記基板上に導入して、前記一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブから解離した核酸及びインターカレータを除去するステップとを更に有し、
その後、前記ステップ（ａ）からステップ（ｅ）を反復することを特徴とする核酸解析方法。
【請求項６】
（ａ）それぞれ異なる種類の一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブがゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して固定化された複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを有する基板上に、荷電粒子を取り込みうる分子で標識された核酸断片を含む試料溶液を導入して、前記一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイゼーションを行わせるステップと、
（ｂ）洗浄液を前記基板上に導入して、未反応の核酸断片を基板上から除去するステップと、
（ｃ）前記標識分子と複合体を形成するイオンを含む溶液を前記基板上に導入して、二本鎖となった核酸に標識されている分子と反応させ、前記イオンと前記標識分子との複合体を形成させるステップと、
（ｄ）前記絶縁ゲート電界効果トランジスタの出力値を測定するステップとを備えることを特徴とする核酸解析方法。
【請求項７】
請求項６記載の核酸解析方法において、前記荷電粒子を取り込みうる分子は、１価又は２価の陽イオン又は陰イオンと選択的に複合体を形成する分子であることを特徴とする核酸解析方法。
【請求項８】
請求項６又は７記載の核酸解析方法において、荷電粒子を取り込みうる複数種類の分子をそれぞれ異なる核酸断片に標識し、前記各分子に対応した荷電粒子（イオン）を前記基板上に導入することにより複数種類の遺伝子又は遺伝子多型を同時又は順次に測定することを特徴とする核酸解析方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の核酸解析方法において、
（ｅ）前記基板を加熱して前記一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイズした核酸断片を解離させるステップと、
（ｇ）洗浄液を前記基板上に導入して、前記一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブから解離した核酸断片を除去するステップとを更に有し、
その後、前記ステップ（ａ）からステップ（ｄ）を反復することを特徴とする核酸解析方法。
【請求項１０】
絶縁物基板の第１の表面にシリコン膜を形成するステップと、
前記シリコン膜をパターニングして複数のシリコン膜形成領域に分離するステップと、
各シリコン膜形成領域中にそれぞれ電界効果トランジスタのソース・ドレイン領域、ヒーター、温度センサとなる複数のｐｎ接合を形成するステップと、
前記ソース・ドレイン領域の間をチャネルとし、前記ソース・ドレイン領域から信号配線を形成するステップと、
前記絶縁物基板の前記シリコン膜を形成した面と反対側の第２の表面において、前記電界効果トランジスタのチャネルに対応する部分に核酸プローブを直接又は担体を介して固定化するステップとを有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製作方法。
【請求項１１】
絶縁物基板の表面にシリコン膜を形成するステップと、
前記シリコン膜をパターニングして複数のシリコン膜形成領域に分離するステップと、
各シリコン膜形成領域中にそれぞれ電界効果トランジスタのソース・ドレイン領域、ヒーター、温度センサとなる複数のｐｎ接合を形成するステップと、
前記ソース・ドレイン領域の間をチャネルとし、前記ソース・ドレイン領域から信号配線を形成するステップと、
前記信号配線を形成した面の上に絶縁膜を形成するステップと、
前記絶縁膜の表面において、前記電界効果トランジスタのチャネルに対応する部分に核酸プローブを直接又は担体を介して固定化するステップとを有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製作方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子診断、ＤＮＡ配列解析、あるいは遺伝子多型解析など、バイオテクノロジーの分野、特に遺伝子検査分野の技術に関し、より詳細には、複数の異なる核酸を高精度に並列的に解析することのできるポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイ、その作成方法、及び核酸解析方法に関する。
背景技術
ヒトゲノムプロジェクトをはじめ各種生物のゲノム塩基配列解析プロジェクトが急速に進展し、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。既にヒトゲノムの全塩基配列が決定されつつある。今後は生体中における遺伝子の機能を明らかにすることにより、各種疾病の診断、医薬品の開発、農作物の品種改良など広範囲な分野で遺伝子関連技術の開発が飛躍的に進むものと思われる。これらの新規分野発展の基礎となるのが、塩基配列情報に加えて遺伝子の発現及び機能情報である。遺伝子の機能及び発現解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる技術として、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイ（以下、両者を総称してＤＮＡマイクロアレイという）がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｎａｎｏｇｅｎ社などで開発されている。しかし、現状のＤＮＡマイクロアレイの多くは蛍光検出を基本原理としているので、レーザや複雑な光学系が必要となり、システムが大型化し高価である。
また、現在開発されている全てのＤＮＡマイクロアレイは、原則として１回のみの使用で廃棄される。洗浄して繰り返し使用できたとしてもせいぜい２回から３回の使用が限度である。このため多くの試料を用いた解析や、検体の数が多い遺伝子診断などの分野ではランニングコストが大きな問題となる。特に医療の分野では医療費抑制の観点からも、高額な検査が広く普及することは困難である。一方では、医療の分野、すなわち遺伝子診断の分野では高い精度、定量性が求められる。したがってコスト低減と高精度化の両方を満足させる技術が求められる。
これらの問題を解決する方法として、酸化・還元標識と組み合わせた電流検出方式のＤＮＡマイクロアレイがいくつが報告されている。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社では分子ワイヤーと称する分子の一端を金属電極上に固定化し、他端に核酸プローブを結合させ、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーションに基づく酸化・還元標識と金属電極の電子の授受を電流変化として検出し、ターゲット遺伝子を検出する方式を開発している（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６，（１９９８）ｐ２７，ｐ．４０）。この方式では高価なレーザや複雑な光学系を必要としないため、簡単で小型のシステムを構築することができる。しかしながら、金属電極上での酸化・還元反応を検出の基本原理としているため、試料中に酸化物質あるいは還元物質（例えばアスコルビン酸）が存在すると、酸化又は還元に基づく電流が流れ、遺伝子検出の妨害となり検出精度が劣化する。また、電流計測に伴い、金属電極上で電極反応が進行する。電極反応は不可逆で非平衡反応であるため電極の腐食、ガスの生成などが生じ、電流測定の安定性が損なわれ、特に繰返し測定する場合に検出精度が劣化する。
そこで本発明は低ランニングコスト、低価格システムでかつ高精度の測定が可能なＤＮＡマイクロアレイとその製造方法、及びそのＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸解析方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、絶縁物表面に核酸プローブを固定化し、ターゲット遺伝子と絶縁物表面でハイブリダイゼーションを行い、その際に生じる電荷密度の変化を検出するＤＮＡマイクロアレイである。好ましくは、電界効果トランジスタのゲート絶縁物表面に核酸プローブを固定化し、ターゲット遺伝子とゲート絶縁物表面でハイブリダイゼーションを行わせ、その際に生ずる表面電荷密度の変化を電界効果を利用して検出する方式のＤＮＡマイクロアレイである。表面電荷密度の変化を大きくするために、核酸自身が持っている電荷に加えて、インターカレータの導入やイオンなどの荷電粒子と複合体を形成する分子を核酸に標識するなどして、大きな信号／雑音比で表面電位変化のポテンシオメトリック検出が可能なＤＮＡマイクロアレイを実現した。本発明のＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子解析法は、高価なレーザや複雑な光学検出系を必要とせず、また電流検出（アンペロメトリック）方式と異なり、絶縁物基板に核酸プローブを固定化して平衡状態での表面電位を検出するので、基板の腐食やガスの発生、酸化／還元物質の妨害などによる信号値の不安定性は問題とならず、安定性に優れた高精度の遺伝子検出が可能となる。
すなわち、本発明によるポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブを固定化した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタと、参照電極とを備えることを特徴とする。
本発明によるポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイは、また、複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタが形成された基板を備え、基板の表面において、各絶縁ゲート電界効果トランジスタのチャネル部のゲート絶縁物上に直接又は担体を介してそれぞれ異なる種類の一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブを固定化したことを特徴とする。
本発明によるポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイは、また、検出すべき核酸の一部と相補的な塩基配列を有する核酸プローブを直接又は担体を介してゲート絶縁物表面に固定化した第１の絶縁ゲート電界効果トランジスタと、検出すべき核酸のどの部分とも相補的ではない塩基配列を有する核酸プローブを直接又は担体を介してゲート絶縁物表面に固定化した第２の絶縁ゲート電界効果トランジスタと、第１の絶縁ゲート電界効果トランジスタと第２の絶縁ゲート電界効果トランジスタの出力を比較検出する回路とを備えることを特徴とする。
本発明による核酸解析方法は、（ａ）それぞれ異なる種類の一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブがゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して固定化された複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを有する基板上に、少なくとも１種類の核酸を含む試料溶液を導入して、一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイゼーションを行わせるステップと、（ｂ）洗浄液を基板上に導入して、未反応の核酸を前記基板上から除去するステップと、（ｃ）インターカレータ溶液を基板上に導入して、二本鎖となった核酸と反応させるステップと、（ｄ）洗浄液を基板上に導入して、未反応のインターカレータを基板上から除去するステップと、（ｅ）緩衝液を基板上に導入して、絶縁ゲート電界効果トランジスタの出力値を測定するステップとを有することを特徴とする。
上記ステップ（ａ）からステップ（ｅ）に加えて、（ｆ）基板を加熱して一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイズした核酸を解離させるステップと、（ｇ）洗浄液を基板上に導入して、一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブから解離した核酸及びインターカレータを除去するステップとを更に有し、その後、前記ステップ（ａ）からステップ（ｅ）を反復するようにすると、複数の測定を連続して行うことができる。
本発明による核酸解析方法は、また、（ａ）それぞれ異なる種類の一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブがゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して固定化された複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを有する基板上に、荷電粒子を取り込みうる分子で標識された核酸断片を含む試料溶液を導入して、一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイゼーションを行わせるステップと、（ｂ）洗浄液を基板上に導入して、未反応の核酸断片を基板上から除去するステップと、（ｃ）標識分子と複合体を形成するイオンを含む溶液を基板上に導入して、二本鎖となった核酸に標識されている分子と反応させ、イオンと標識分子との複合体を形成させるステップと、（ｄ）絶縁ゲート電界効果トランジスタの出力値を測定するステップとを備えることを特徴とする。
荷電粒子を取り込みうる分子は、１価又は２価の陽イオン又は陰イオンと選択的に複合体を形成する分子、例えば、バリノマイシン、ノナクチン／モナクチン、ビスクラウンエーテル、カリックスアレン誘導体、非環状ポリエーテル誘導体、第４級アンモニウム塩、ポルフィリン、又はこれらの分子の誘導体とすることができる。
このとき、荷電粒子を取り込みうる複数種類の分子をそれぞれ異なる核酸断片に標識し、各分子に対応した荷電粒子（イオン）を基板上に導入することにより複数種類の遺伝子又は遺伝子多型を同時又は順次に測定することができる。
前記ステップ（ａ）からステップ（ｄ）に加えて、（ｅ）基板を加熱して一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブとハイブリダイズした核酸断片を解離させるステップと、（ｇ）洗浄液を基板上に導入して、一本鎖核酸プローブ又は分枝核酸プローブから解離した核酸断片を除去するステップとを更に有し、その後、前記ステップ（ａ）からステップ（ｄ）を反復するようにすると、複数の測定を連続して行うことができる。
本発明によるポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイの製作方法は、絶縁物基板の第１の表面にシリコン膜を形成するステップと、シリコン膜をパターニングして複数のシリコン膜形成領域に分離するステップと、各シリコン膜形成領域中にそれぞれ電界効果トランジスタのソース・ドレイン領域、ヒーター、温度センサとなる複数のｐｎ接合を形成するステップと、ソース・ドレイン領域の間をチャネルとし、ソース・ドレイン領域から信号配線を形成するステップと、絶縁物基板のシリコン膜を形成した面と反対側の第２の表面において、電界効果トランジスタのチャネルに対応する部分に核酸プローブを直接又は担体を介して固定化するステップとを有することを特徴とする。
本発明によるポテンシオメトリックＤＮＡマイクロアレイの製作方法は、また、絶縁物基板の表面にシリコン膜を形成するステップと、シリコン膜をパターニングして複数のシリコン膜形成領域に分離するステップと、各シリコン膜形成領域中にそれぞれ電界効果トランジスタのソース・ドレイン領域、ヒーター、温度センサとなる複数のｐｎ接合を形成するステップと、ソース・ドレイン領域の間をチャネルとし、ソース・ドレイン領域から信号配線を形成するステップと、信号配線を形成した面の上に絶縁膜を形成するステップと、絶縁膜の表面において、電界効果トランジスタのチャネルに対応する部分に核酸プローブを直接又は担体を介して固定化するステップとを有することを特徴とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明をより詳細に説述するために、添付の図面に従ってこれを説明する。以下の図において、同じ機能部分には同じ符号を付けて説明する。
〔実施例１〕
図１は、本発明による遺伝子検出用電界効果トランジスタの一例を説明する断面模式図である。
絶縁ゲート電界効果トランジスタ１のゲート絶縁物２の表面に核酸プローブ３を固定化した構造である。核酸プローブはオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡ又は途中で枝分かれしたＤＮＡの断片を用い、通常３００個以下の塩基から構成されており、適切な反応条件の下で測定すべきターゲット遺伝子とハイブリダイズでき、オリゴヌクレオチドの場合は８０個以下の塩基長の核酸断片であることが望ましい。ゲート絶縁物は酸化シリコン（ＳｉＯ２）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）などの材料を単独又は組み合わせて用い、通常はトランジスタ動作を良好に保つため、酸化シリコン（ＳｉＯ２）の上に窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）を積層する二層構造とする。
核酸プローブを上記絶縁物表面に固定化するために、核酸プローブの一端をアミノ基（ＮＨ２基）、チオール基（ＳＨ基）、ビオチンなどで化学修飾する。アミノ基で化学修飾した核酸プローブを用いる場合は、絶縁物の表面をアミノプロピルエトキシシラン、ポリリジンなどで化学修飾して絶縁膜表面にアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレン  ジイソシアネート（ＰＤＣ）と反応させてアミノ基で化学修飾した核酸プローブを絶縁物表面に固定化する。チオール基で化学修飾した核酸プローブを絶縁物表面に固定化する場合は、絶縁物上に金薄膜を形成し、チオール基と金との親和性を利用して核酸プローブを固定化する。また、ビオチンで化学修飾した核酸プローブを固定化する場合には、絶縁物表面にストレプトアビジンを導入し、ビオチンとストレプトアビジンの親和性を利用して、核酸プローブをゲート絶縁物表面に固定化する。実際の固定化に際しては、核酸プローブを含む溶液をＦＥＴのチャネル上のゲート絶縁物表面にのみ滴下又はスポットし、チャネル部のゲート絶縁物上にのみ核酸プローブを固定化する。
一方、ＦＥＴのゲート絶縁物表面に固定化担体を形成し、核酸プローブを該固定化担体の表面又は内部に間接的に固定化してもよい。固定化担体の材料としては、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）などを用いることができ、固定化担体をアミノ基やストレプトアビジンなどで化学修飾し、上記したように、それぞれグルタルアルデヒドやＰＤＣ、又はアビジンとの親和性を利用して核酸プローブを固定化担体に固定化することができる。このように固定化担体を介して間接的にＦＥＴのゲート絶縁物上に核酸プローブを形成することもできる。
試料中に測定すべきターゲット遺伝子を含む多数の遺伝子が存在し、上記遺伝子検出用ＦＥＴのゲート絶縁物上にターゲット遺伝子と相補的塩基配列を有する核酸プローブが固定化されていると、適切な反応条件のもとでターゲット遺伝子と核酸プローブがハイブリダイズして、ターゲット遺伝子と核酸プローブが複合体を形成する。反応に用いるバッファ溶液のｐＨの適切な条件下では、核酸は負に帯電している。したがって、ハイブリダイズによる複合体形成によりＦＥＴのゲート絶縁物近傍で電荷密度が変化し、ゲート絶縁物の表面電位が変化する。この変化がＦＥＴのゲート電圧変化と同等の作用となり、チャネルの導電率を変化させる。したがって、ソース４及びドレイン５の間を流れるドレイン電流変化として複合体の形成、すなわちターゲット遺伝子の存在を検出することができる。
〔実施例２〕
図２は、図１に示した遺伝子検出用電解効果トランジスタ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＦＥＴ）を用いた遺伝子検査システムの構成例を示す図である。
この遺伝子検査システムは、図１に示した遺伝子検出用ＦＥＴ１の他に参照ＦＥＴ６を用い、遺伝子検出用ＦＥＴと参照ＦＥＴの差動測定を行う。遺伝子検出用ＦＥＴ１のゲート絶縁物表面には試料中のターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有する核酸プローブ３が固定化されている。一方、参照ＦＥＴ６のゲート絶縁物表面にはターゲット遺伝子と相補的な塩基配列とは異なる塩基配列を有する核酸プローブ７が固定化されている。
このような差動測定を行うことにより、ＦＥＴの電気的特性の違いによる周囲の温度や光の変化による出力値の変化を補償したり、あるいは試料中の荷電粒子がゲート絶縁物上に非特異的に吸着することによる出力値の変化を相殺して、ターゲット遺伝子と核酸プローブのハイブリダイゼーションによる出力変化のみを精度良く検出することができる。遺伝子検出用ＦＥＴと参照ＦＥＴは電気的特性がそろっているのが望ましいので、同じ基板に集積化された一対のＦＥＴを用いることが望ましい。
遺伝子検出用ＦＥＴと参照ＦＥＴの表面電位を安定に測定するために、電位測定の基準となる参照電極８を設置する。参照電極は通常、所定組成・濃度の内部溶液に銀／塩化銀電極又はかんこう電極を浸漬した電極が用いられ、塩橋又は多孔性材料による液絡部で内部溶液と試料溶液が接触する構成のものを用いる。遺伝子検出用ＦＥＴ１と参照ＦＥＴ６は駆動回路９によりそれぞれの表面電位を計測し、２つの出力は差動測定回路１０を介して信号処理回路１１に入力される。複数の遺伝子検出用ＦＥＴを集積化して複数遺伝子を同時計測する場合、参照ＦＥＴを共通に使用することができ、異なる遺伝子検出用ＦＥＴと共通の参照ＦＥＴとの差動測定を行う。
〔実施例３〕
図３は、本発明のＤＮＡマイクロアレイとインターカレータを組み合わせた測定システムの説明図である。図示した例のＤＮＡマイクロアレイの場合、３個のＧｅｎｅｔｉｃ  ＦＥＴ１２〜１４が集積化されており、第１のＦＥＴ１２は第１のターゲット遺伝子を検出する遺伝子検出用ＦＥＴ、第２のＦＥＴ１３は第２の遺伝子を検出する遺伝子検出用ＦＥＴ、第３のＦＥＴ１４は参照ＦＥＴとして用いられる。第１、第２のＦＥＴのゲート絶縁物上にはそれぞれ第１、第２の遺伝子と相補的な塩基配列を有する核酸プローブが固定化されている。参照ＦＥＴのゲート絶縁物表面には第１及び第２の遺伝子の相補的塩基配列とは異なる塩基配列を有する核酸プローブが固定化されている。
図３は、第１の遺伝子のみを含有する試料溶液を上記集積化ＤＮＡマイクロアレイに導入し、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションを行わせた後、インターカレータを作用させたときの状態を示している。第１の遺伝子は第１のＦＥＴ１３の核酸プローブとのみハイブリダイズして二本鎖を形成する。インターカレータ１５は二本鎖の核酸とのみ反応して結合し、一本鎖の核酸には結合しない。インターカレータ１５は電荷を有しているので、第１の遺伝子検出用ＦＥＴ１２の表面電荷密度のみが変化してＦＥＴの出力信号が変化し、第２の遺伝子検出用ＦＥＴ１３及び参照ＦＥＴ１４の表面電荷密度は変化しないので出力信号が変化しない。したがって、第１の遺伝子検出用ＦＥＴ１２と参照ＦＥＴ１４の差動測定、及び第２の遺伝子検出用ＦＥＴ１３と参照ＦＥＴ１４の差動測定を行うことにより、前者の出力信号のみが変化して第１のターゲット遺伝子が検出される。または、第１の遺伝子検出用ＦＥＴ１２と参照ＦＥＴ１４の出力比の測定、及び第２の遺伝子検出用ＦＥＴ１３と参照ＦＥＴ１４の出力比の測定を行うことにより、前者の出力比が変化して第１のターゲット遺伝子が検出される。このように複数のＦＥＴの出力を比較することでターゲット遺伝子が検出できる。インターカレータとしてはエチジウムブロマイド、ヘキスト３３２５８（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）などを用いることができる。
具体例について以下に説明する。アルコールデヒドロギナーゼ関連遺伝子には一塩基多型（ＳＮＰｓ）が存在することが知られており、その一塩基多型部位をはさんで前後８塩基を有する１７塩基長の第１及び第２の核酸プローブを合成した。その塩基配列を下に示す。
2003052097.tif 000003
５’末端から９番目の部位がＳＮＰ部位であり、第１核酸プローブではその部位の塩基がＡ、第２プローブではＧとなっている。この第１及び第２の核酸プローブをそれぞれ第１及び第２のＦＥＴのゲート上に固定化する。参照用ＦＥＴのゲートには第１、第２の核酸プローブと異なる配列を有する核酸プローブ、例えばすべてＡから構成される１７塩基長の核酸プローブを固定化する。参照用ＦＥＴのゲート上には核酸プローブを固定化しなくてもよい。上記核酸プローブの５’末端をアミノ基で修飾する。一方、本実施例のＦＥＴのゲート絶縁膜には窒化シリコンが用いられており、その表面をγ−アミノプロピルトリエトキシシランで化学修飾して窒化シリコン表面にアミノ基を導入する。核酸プローブのアミノ基と窒化シリコンのアミノ基を例えばグルタルアルデヒドのような２官能性試薬と反応させ、シッフ塩基による結合を形成することにより、核酸プローブを窒化シリコン表面に固定化する。
試料は、血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、上記ＳＮＰ部位を含む１００塩基長の領域を増幅した後、第１、第２の遺伝子検出用ＦＥＴ、及び参照ＦＥＴに導入して、４５℃で８時間、ハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイゼーション後、緩衝液により洗浄して未反応の試料を除去し、インターカレータとしてエチジウムブロマイドを導入した。測定はまず第１、第２の遺伝子検出用ＦＥＴ、及び参照ＦＥＴに緩衝液を導入して、それぞれのＦＥＴの出力電圧、第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力、及び第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力を測定し、その後、試料を導入、ハイブリダイゼーション、洗浄後、インターカレータを導入し、それぞれのＦＥＴの出力電圧、第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力、及び第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力を測定した。試料及びインターカレータ導入前後の出力電圧の変化を測定した。
第１の核酸プローブに対応する塩基配列を有する試料（Ｎｏｒｍａｌ）では、第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は５．０ｍＶであった。一方、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は０．５ｍＶであり、有意な差が得られた。これら一連の差動出力測定は同時に行われることが望ましいが、同一検査時間内であれば順次行うこともできる。第２の核酸プローブに対応する塩基配列を有する試料（Ｍｕｔａｎｔ）では第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は０．３ｍＶであった。一方、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は４．０ｍＶであり、やはり有意な差が得られた。第１と第２の核酸プローブに対応する塩基配列を半分ずつ有する試料（ヘテロ）では第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は２．３ｍＶ、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は２．０ｍＶであり、ほぼ１対１の比が得られた。以上より、本発明によるＳＮＰ解析により、Ｎｏｒｍａｌ／Ｎｏｒｍａｌのホモ、Ｍｕｔａｎｔ／Ｍｕｔａｎｔのホモ、Ｎｏｒｍａｌ／Ｍｕｔａｎｔのヘテロの３種類の試料を識別することができた。インターカレータ使用の場合は、試料ＤＮＡに標識化合物を化学結合して標識する必要が無い。
図２に示したように、インターカレータを使用せず、ターゲットＤＮＡが本来有している電荷だけで検出する場合には、Ｎｏｒｍａｌ／ＮｏｒｍａｌあるいはＭｕｔａｎｔ／Ｍｕｔａｎｔのホモの試料の測定において、遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は２．２ｍＶの大きさであった。したがって、インターカレータの使用により、約２倍の高感度化を図ることができた。
〔実施例４〕
図４は、本発明のＤＮＡマイクロアレイと標識分子を組み合わせた測定システムの説明図である。図示した例のＤＮＡマイクロアレイの場合、３個のＧｅｎｅｔｉｃ  ＦＥＴ１２〜１４が集積化されており、第１のＦＥＴ１２は第１のターゲット遺伝子を検出する遺伝子検出用ＦＥＴ、第２のＦＥＴ１３は第２の遺伝子を検出する遺伝子検出用ＦＥＴ、第３のＦＥＴ１４は参照ＦＥＴとして用いられる。第１、第２のＦＥＴのゲート絶縁物上にはそれぞれ第１、第２の遺伝子と相補的な塩基配列を有する核酸プローブが固定化されている。参照ＦＥＴのゲート絶縁物表面には第１及び第２の遺伝子の相補的塩基配列とは異なる塩基配列を有する核酸プローブが固定化されている。
図４は、第１の遺伝子のみを含有する試料溶液を上記集積化ＤＮＡマイクロアレイに導入し、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションを行わせたときの状態を示している。第１の遺伝子は第１のＦＥＴの核酸プローブとのみハイブリダイズして二本鎖を形成する。第１の遺伝子には帯電した分子又はイオンと複合体を形成する分子１６が標識されており、上記の特異的なハイブリダイゼーションによりゲート絶縁物表面の電荷密度が変化する。第２の遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの表面電荷密度は変化しないので出力信号が変化しない。したがって、第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照ＦＥＴの差動測定、及び第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照ＦＥＴの差動測定を行うことにより、前者の出力信号のみが変化して第１のターゲット遺伝子が検出される。
イオンと複合体を形成する分子（リガンド）としては、バリノマイシン、ノナクチン／モナクチン、ビスクラウンエーテル、カリックスアレン誘導体、非環状ポリエーテル誘導体、第４級アンモニウム塩などが用いられる。例えばターゲット遺伝子をビス１２クラウン４（Ｂｉｓ（１２−ｃｒｏｗｎ−４））で標識する場合、ビス１２クラウン４はナトリウムイオンと選択的に複合体を形成するので、ゲート絶縁物上の核酸プローブとハイブリダイズさせた後、ナトリウムイオンを含む緩衝液をＤＮＡマイクロアレイ上に導入すると、ビス１２クラウン４とナトリウムイオンが選択的に複合体を形成し、ゲート絶縁物表面の電荷密度が局所的に変化する。この変化をＦＥＴで検出する。
本実施例の具体的応用としてＳＮＰ解析を行った例について以下に説明する。実施例３で示したアルコールデヒドロギナーゼ関連遺伝子を用い、
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をそれぞれ第１及び第２の遺伝子検出用ＦＥＴのゲート上に固定化する。参照用ＦＥＴのゲートには第１、第２の核酸プローブと異なる配列を有する核酸プローブ、例えばすべてＡから構成される１７塩基長の核酸プローブを固定化する。試料ＤＮＡは血液中の白血球から抽出し、ＳＮＰ部位を含む１００塩基長の領域を増幅すると同時に、Ｎｏｒｍａｌ  ＤＮＡにはバリノマイシン、Ｍｕｔａｎｔ  ＤＮＡにはビスクラウンエーテルで標識化した。
Ｎｏｒｍａｌ  ＤＮＡからなる試料を第１、第２の遺伝子検出用ＦＥＴ、及び参照ＦＥＴに導入して、４５℃で８時間、ハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイゼーション後、緩衝液により洗浄して未反応の試料を除去し、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液を導入して、第１、第２の遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの出力電圧、第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力、及び第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力を測定した。第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は４ｍＶ、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力０．２ｍＶであった。その後、５０ｍＭ  ＫＣｌ水溶液を導入して同様に出力電圧を測定した結果、第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は０．１ｍＶ、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力０．３ｍＶであり、試料中のＮｏｒｍａｌ  ＤＮＡは第１の核酸プローブとのみハイブリダイゼーション反応し、第１の遺伝子検出用ＦＥＴが選択的に応答することが確認された。
一方、Ｍｕｔａｎｔ  ＤＮＡからなる試料を、上記と同様に測定すると、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液を導入したときの第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は０．１ｍＶ、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力０．２ｍＶであった。５０ｍＭ  ＫＣｌ水溶液導入後の第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は０．１ｍＶ、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力５．０ｍＶであり、試料中のＭｕｔａｎｔ  ＤＮＡは第２の核酸プローブとのみハイブリダイゼーション反応し、第２の遺伝子検出用ＦＥＴが選択的に応答することが確認された。ＮｏｒｍａｌとＭｕｔａｎｔのＤＮＡを半分ずつ有する試料（ヘテロ）では、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液を導入したときの第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は２．３ｍＶ、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は０．１ｍＶであり、５０ｍＭ  ＫＣｌ水溶液導入後の第１の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力は０．１ｍＶ、第２の遺伝子検出用ＦＥＴと参照用ＦＥＴの差動出力２．５ｍＶであり、ほぼ１対１の比が得られた。
以上より、本発明によるＳＮＰ解析により、Ｎｏｒｍａｌ／Ｎｏｒｍａｌのホモ、Ｍｕｔａｎｔ／Ｍｕｔａｎｔのホモ、Ｎｏｒｍａｌ／Ｍｕｔａｎｔのヘテロの３種類の試料を識別することができた。本実施例では、ＳＮＰ解析の工程に、ハイブリダイゼーションとイオン−リガンド複合体の形成の２つの選択的化学反応工程が含まれている。したがって、高精度のＳＮＰ解析を行うことができる。
ＳＮＰ解析以外に、多数種類の核酸プローブをＦＥＴのゲート上に固定化し、バリノマイシンとビスクラウンエーテルをそれぞれターゲット用と参照用の試料に標識化し、発現解析を行うこともできる。
〔実施例５〕
図５は、本発明による薄膜ゲート型遺伝子検出電界効果トランジスタを備えるＤＮＡマイクロアレイの製造工程例を示す図である。まず、図５（ａ）に示すように、ガラス基板１７に低圧化学気相成長法（Ｌｏｗ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）により、ｐ型のポリシリコン薄膜１９を形成する。ポリシリコン薄膜の厚さは１０〜１００００ｎｍの範囲が望ましく、本実施例では１０００ｎｍとした。次に、図５（ｂ）に示すように、ポリシリコン膜のパターニングと酸化を行う。フォトリソグラフィプロセスにより、レジスト塗布、フォトマスクを介した光照射、レジスト現像を行い、ドライエッチングあるいはフッ酸と硝酸の混合液によるウエットエッチングにより、シリコン膜形成領域１９を形成する。その後、酸素雰囲気中、９００℃でシリコン膜を熱酸化し、ポリシリコン薄膜１９の表面に二酸化シリコン膜４４を形成する。
次に、図５（ｃ）に示すように、酸化膜のエッチングと不純物核酸領域の形成を行う。フォトリソグラフィプロセスにより、レジスト塗布、フォトマスクを介した光照射、レジスト現像を行い、ドライエッチングあるいはフッ酸とフッ化アンモニウムの混合液によるウエットエッチングにより、不純物拡散領域の二酸化シリコン膜を除去する。Ａｓ＋又はＰ＋のイオン注入によりｐ型のポリシリコン薄膜１９の中にｎ型領域を形成し、ｐｎ接合２０を設ける。その後、酸素雰囲気中、９００℃で不純物拡散領域のシリコン膜を熱酸化し、その表面に二酸化シリコン膜４４を形成する。
次に、図５（ｄ）に示すように、金属電極配線を形成する。フォトリソグラフィプロセスにより、レジスト塗布、フォトマスクを介した光照射、レジスト現像を行い、ドライエッチングあるいはフッ酸とフッ化アンモニウムの混合液によるウエットエッチングにより、電極用コンタクト穴部の二酸化シリコン膜を除去する。アルミニウム薄膜を真空蒸着により形成し、フォトリソグラフィプロセスにより、レジスト塗布、フォトマスクを介した光照射、レジスト現像を行い、りん酸によるウエットエッチングによりアルミニウム配線２５をパターン形成し、外部回路との接続を行った。水素雰囲気中でアニールし、それぞれＦＥＴのソース・ドレイン領域２１、ヒーター２２、温度センサ２３とする。ソース、ドレイン領域の間が電界効果トランジスタのチャネル２４となる。
最後に、図５（ｅ）に示すように、ＤＮＡプローブを固定化する。ガラス基板１７の第２の表面（シリコン膜を形成した面と反対の表面）２６において、電界効果トランジスタのチャネルに対応する部分に核酸プローブ３を固定化し、遺伝子検出用ＦＥＴとする。測定の高精度化を図るために、少なくとも遺伝子検出用ＦＥＴ、参照ＦＥＴ、ヒーター、温度センサを同一のシリコン膜形成領域１９の中に集積化することが望ましい。
絶縁物基板１７の表面のうち、核酸プローブ３が形成された表面は溶液が導入されるため、配線、トランジスタなどの電子デバイスの信号線が時として溶液に接触して短絡し、動作不良を起こすことがある。本実施例では、溶液が接触する、核酸プローブ３が形成された面と反対側の面に配線２５を形成し、信号線を取り出す構造としたので、溶液への接触による動作不良の問題は無くなり、信頼性の高い測定システムを提供することができる。
図６は、こうして作製されたＤＮＡマイクロアレイの一例を示す平面図である。本例のＤＮＡマイクロアレイは、絶縁物基板１７に１４４個のシリコン膜形成領域１９が分離形成されている。一つのシリコン膜形成領域１９の大きさは５００μｍ角である。シリコン膜形成領域１９を裏面から見たときの拡大図を図７に示す。シリコン膜形成領域１９の中にそれぞれ複数のｐｎ接合２０を形成した。シリコン膜がｐ型の場合はｎ型の不純物拡散領域を形成し、シリコン膜がｎ型の場合にはｐ型の不純物拡散領域を形成する。これらの不純物拡散領域を電界効果トランジスタのソース、ドレイン領域２１、あるいはヒーター２２、あるいは温度センサ２３とした。各不純物拡散領域は電気配線２５により外部の駆動回路と接続している。
図７に示すように、本実施例では１つのシリコン膜形成領域１９に２個の電界効果トランジスタが形成されており、その１つを遺伝子検出用ＦＥＴ、他を参照ＦＥＴとした。温度センサ２３の出力を用いてヒーター２２を制御することにより各シリコン膜形成領域１９の温度を所定の値に設定することができ、解離温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）のそろった核酸プローブを同一のシリコン膜形成領域１９の遺伝子検出用ＦＥＴ上に固定化し、解離温度の異なる核酸プローブを異なるシリコン膜形成領域に固定化することにより、高精度の遺伝子検出を実現することができる。温度変化に伴いＦＥＴの特性も変化するが、遺伝子検出用ＦＥＴと参照ＦＥＴの差動測定を行うことにより、各ＦＥＴ出力の温度変化を相殺することができる。
図８に、図６に示したＤＮＡマイクロアレイを裏面からみた斜視図を示す。電気配線２５は裏面に形成され、核酸プローブは反対側の面に固定化される。
〔実施例６〕
図９及び図１０を用いて本発明の他の実施例を説明する。図９は本発明による放熱フィン付ＤＮＡマイクロアレイを示す平面図、図１０はそれを裏面から見た斜視図である。
実施例５と同様に、絶縁物基板１７の第１の表面１８にシリコン膜を形成し、フォトリソグラフィとエッチングにより不要な部分のシリコン膜を除去して、複数のシリコン膜形成領域１９に分離した。シリコン膜の厚さは０．１〜１０μｍの範囲が好ましく、本実施例では１μｍとした。各シリコン膜形成領域１９には、実施例５と同様に、遺伝子検出用ＦＥＴ、参照ＦＥＴ、ヒーター及び温度センサが形成されている。
各遺伝子検出用ＦＥＴに形成する核酸プローブの解離温度に応じて、それぞれ最適な反応温度でハイブリダイゼーション・洗浄を行うため、本実施例では各シリコン膜形成領域１９を囲うように格子状の放熱フィン２７をシリコン膜で形成し、各シリコン膜形成領域１９の温度制御精度を向上させた。放熱フィン２７はシリコン膜で形成されているので熱伝導性がよく、隣接するシリコン膜形成領域で発生する熱を効率よく放熱し、隣のシリコン膜形成領域への影響を低減し、独立に各シリコン膜形成領域１９の温度を制御することができる。本実施例では、一つのシリコン膜形成領域１９の大きさは１ｍｍ角、シリコン膜形成領域１９と放熱フィン２７との間隔は０．５ｍｍ、放熱フィン２７の幅は０．５ｍｍとし、この構造により各シリコン膜形成領域１９の温度を室温から９５℃まで１℃の精度で制御できた。
図１０は上記チップを裏面から見た斜視図である。本実施例ではシリコン膜形成領域及び放熱フィンをウエットエッチング技術により形成したため、その断面形状は三角形及び台形になっているが、たとえば、リアクティブ・イオン・エッチング（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈｉｎｇ）技術を用いれば矩形状の断面形状のシリコン膜形成領域及び放熱フィンを製作することができる。
〔実施例７〕
図１１は、本発明による薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップの一例を示す断面図である。
本実施例の薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップは、実施例５で説明したＤＮＡマイクロアレイにおいて、遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴのゲート部のガラス基板を薄くした構造である。薄膜ゲート部２８のガラス基板の厚さは０．０１〜１μｍの範囲が好ましく、本実施例では０．１μｍとした。本構造により、ＦＥＴのトランスコンダクタンスを大きくすることができ、ゲート上で起こる電荷の変化を高感度に検出することができる。ＦＥＴのゲート部のみの薄膜化だけではなく、シリコン膜形成領域のガラス基板部分全体を薄膜化することもでき、薄膜化した凹部を反応セルとして使用することができる。
〔実施例８〕
図１２は、本発明による薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップの他の例を示す断面図である。
実施例５，６，７ではシリコン薄膜形成領域と反対面のガラス表面上に核酸プローブ３を形成する方式であるが、本実施例ではシリコン薄膜形成領域１９上に形成した絶縁膜２であるシリコン酸化膜の上に、第２の絶縁膜２９を形成し、その上に核酸プローブ３を固定化した。第２の絶縁膜２９の材料としては窒化シリコン、酸化アルミニウム、酸化タンタルを用いることができる。本実施例ではＦＥＴのゲート絶縁膜の厚さを正確にコントロールすることができ、トランスコンダクタンスを大きくし、ゲート上で起こる電荷の変化を高感度に検出することができる。
〔実施例９〕
図１３は、本発明の薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップを用いた測定システムの一例を説明する図でる。
少なくとも遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴを搭載したＤＮＡマイクロアレイチップをフローセル３０にマウントし、流路３１に接続する。流路３１にはハイブリダイゼーション液３２及び洗浄液３３がバルブ３４を介して接続されており、ポンプ３５を駆動して、ハイブリダイゼーション液及び洗浄液をフローセル３０に導入することができる。また、試料及びインターカレータは分注器３６によりバルブ３４中に分注し、フローセル３０に導入して遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴと反応させることができる。反応後、使用済みの液はポンプ３５により廃液ボトル３７に送られる。反応後の遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの出力は信号処理回路３８により処理／演算される。
図１４に、フローセル３０の構造を示す。フローセル３０の中のプリント基板３９に遺伝子検出用ＦＥＴチップ４０をマウントし、ワイヤー４１で電気的にプリント基板３９と接続させる。プリント基板３９にはピン４２が設けられており、信号処理回路３８と接続されている。試料溶液４３は流路３１により遺伝子検出用ＦＥＴチップ４０に導入される。試料溶液４３が信号線となるワイヤー４１に接触しないようにワイヤー部分を保護キャップ４４で保護する。保護キャップ４４の材料はアクリル、ポリプロピレン、ポリカーボネイトなどが適している。
図１５に、フローセル３０の分解図を示す。フローセル本体３０には流路３１となる直径１ｍｍの穴が形成されており、遺伝子検出用ＦＥＴチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）４０の表面に試料／試薬が導入される。流路３１の入口部及び出口部にはネジ４５がきってあり、チューブ４６を通したボルト４７をねじ込むことにより、外部の流路系と接続した。チューブ４６の端面は平坦化処理が施してあり、ボルトをねじ込むことにより平坦部がシール４８として作用して液漏れを防ぐ。
本構成の遺伝子検出用ＦＥＴ測定システムは、フロー方式の測定であるため多数の試料を連続に自動的に処理することができ、高スループットの測定に有効である。実施例３に示したインターカレータを用いる場合、次のステップで測定が行われる。
（１）洗浄液をフローセル中に導入
（２）ハイブリダイゼーション液をフローセル中に導入（洗浄液を置換）
（３）各シリコン膜形成領域の温度を各核酸プローブの最適温度に設定
（４）遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの出力を測定、差の演算
（５）試料をバルブに分注して、ハイブリダイゼーション液でフローセルに導入
（６）フローセル中でハイブリダイゼーション
（７）緩衝液をフローセルに導入して、未反応の試料を除去
（８）インターカレータ溶液をフローセルに導入・反応
（９）緩衝液を導入して未反応のインターカレータ液を除去
（１０）遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの出力を測定、差の演算
（１１）各シリコン膜形成領域の温度を９５℃に設定
（１２）洗浄液を導入して、フローセル中を洗浄
（１３）（１）に戻る
上記測定シーケンスを図１６に示す。試料及びインターカレータを導入して洗浄し、ＦＥＴの出力電位を測定した後、シリコン膜形成領域の温度を９５℃に上昇させて、ハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡを解離させて一本鎖ＤＮＡとし、二本鎖に挿入されたインターカレータとともに洗浄液で除去する。すると、ＦＥＴのゲート上には核酸プローブのみが残り、最初の状態に戻って次の測定を行うことができる。
実施例４に示したイオンと複合体を形成する分子（リガンド）を用いたＳＮＰ解析の場合、次のステップで測定が行われる。
（１）洗浄液をフローセル中に導入
（２）ハイブリダイゼーション液をフローセル中に導入（洗浄液を置換）
（３）各シリコン膜形成領域の温度を各核酸プローブの最適温度に設定
（４）遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの出力を測定、差の演算
（５）試料をバルブに分注して、ハイブリダイゼーション液でフローセルに導入
（６）フローセル中でハイブリダイゼーション
（７）緩衝液をフローセルに導入して、未反応の試料を除去
（８）５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液をフローセルに導入・反応
（９）遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの出力を測定、差の演算
（１０）５０ｍＭ  ＫＣｌ溶液をフローセルに導入・反応
（１１）遺伝子検出用ＦＥＴ及び参照ＦＥＴの出力を測定、差の演算
各ＦＥＴの核酸プローブ情報とＮａＣｌ中及びＫＣｌ中の差動出力からＮｏｒｍａｌ／Ｎｏｒｍａｌ、Ｍｕｔａｎｔ／Ｍｕｔａｎｔ、Ｎｏｒｍａｌ／Ｍｕｔａｎｔを判定
（１２）緩衝液を導入してＫＣｌ溶液を除去
（１３）各シリコン膜形成領域の温度を９５℃に設定
（１４）洗浄液を導入して、フローセル中を洗浄
（１５）（１）に戻る
産業上の利用可能性
本発明では、電界効果トランジスタのゲート絶縁物表面に核酸プローブを固定化し、ターゲット遺伝子とゲート絶縁物表面でハイブリダイゼーションを行わせ、その際に生ずる表面電荷密度の変化を電界効果を利用して検出する方式のＤＮＡマイクロアレイを提供する。表面電荷密度の変化を大きくするために、核酸自身が持っている電荷に加えて、インターカレータの導入やイオンなどの荷電粒子と複合体を形成する分子を核酸に標識することにより、大きな信号／雑音比で表面電位変化のポテンシオメトリック検出が可能なＤＮＡマイクロアレイを実現できる。本発明のＤＮＡマイクロアレイシステムは高価なレーザや複雑な光学検出系を必要とせず、また電流検出（アンペロメトリック）方式と異なり、絶縁物基板に核酸プローブを固定化して平衡状態での表面電位を検出するので、基板の腐食やガスの発生、酸化／還元物質の妨害などによる信号値の不安定性は問題とならず、安定性に優れた高精度の遺伝子検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による遺伝子検出用電界効果トランジスタの一例を説明する断面模式図である。
図２は、本発明の遺伝子検出用電解効果トランジスタを用いた測定システムの構成例を示す図である。
図３は、本発明のＤＮＡマイクロアレイとインターカレータを組み合わせた測定システムの説明図である。
図４は、本発明のＤＮＡマイクロアレイと標識分子を組み合わせた測定システムの説明図である。
図５は、本発明の薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）の製作工程を説明する図である。
図６は、本発明のＤＮＡマイクロアレイの一例を示す平面図である。
図７は、ＦＥＴ、ヒーター、温度センサの配置例の説明図である。
図８は、本発明のＤＮＡマイクロアレイを裏面から見た斜視図である。
図９は、本発明による放熱フィン付ＤＮＡマイクロアレイを示す平面図である。
図１０は、本発明による放熱フィン付ＤＮＡマイクロアレイを裏面から見た斜視図である。
図１１は、本発明による薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップの一例を示す断面図である。
図１２は、本発明による薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップの他の例を示す断面図である。
図１３は、本発明の薄膜ゲート型遺伝子検出用ＦＥＴチップを用いた測定システムの説明図である。
図１４は、本発明の遺伝子検出用ＦＥＴチップを装備したフローセルの説明図である。
図１５は、図１４に示したフローセルの分解図である。
図１６は、本発明の遺伝子検出用ＦＥＴによる測定プロトコルの説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2003052097.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月3日(2004.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
(1) 明細書第８頁６行目の「アビジン」を「ビオチン」と訂正する。
(2) 明細書第９頁下から１行目の「第１のＦＥＴ１３」を「第１のＦＥＴ１２」と訂正する。
(3) 明細書第１３頁１７−１８行に「Normal ＤＮＡにはバリノマイシン、Mutant ＤＮＡにはビスクラウンエーテルで標識化した。」とあるを、「Normal ＤＮＡにはビスクラウンエーテル、Mutant ＤＮＡにはバリノマイシンで標識化した。」と訂正する。
【国際調査報告】
2003052097.tif 000021
2003052097.tif 000022
2003052097.tif 000023
2003052097.tif 000024