(57)【要約】Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸、並びに該酵素の遺伝子の発現量を指標とする癌及び／又は腫瘍、特に消化器の癌及び／又は腫瘍の診断方法が記載されている。ヒトの胃細胞から、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する新規な酵素の遺伝子をクローニングして塩基配列を決定し、この酵素を発現させた。この酵素は、癌及び／又は腫瘍、特に消化器の癌又は腫瘍細胞中ではほとんどあるいは全く生産されないので、この酵素の遺伝子の発現を指標として癌及び／又は腫瘍を診断することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質は、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する請求項１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質は、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有する請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を有する領域を含み、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
配列表の配列番号２又は４に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項８記載の核酸。
【請求項１０】
配列表の配列番号２又は４に示される塩基配列を有する請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
【請求項１２】
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
【請求項１３】
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸。
【請求項１４】
請求項１０記載の領域中の部分領域と相補的な配列を有する請求項１３記載の測定用核酸。
【請求項１５】
プローブ又はプライマーである請求項１３又は１４記載の測定用核酸。
【請求項１６】
塩基数が１５塩基以上である請求項１５記載の測定用核酸。
【請求項１７】
癌及び／又は腫瘍の診断に用いられる請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸。
【請求項１８】
消化器の癌及び／又は腫瘍の診断に用いられる請求項１７記載の核酸測定用核酸。
【請求項１９】
大腸癌の診断に用いられる請求項１８記載の核酸測定用核酸。
【請求項２０】
生体から分離された試料細胞中における、請求項６記載のタンパク質又はその遺伝子の発現量を調べることを含む、癌及び／又は腫瘍の診断方法。
【請求項２１】
前記試料細胞が消化器由来の細胞であり、消化器の癌及び／又は腫瘍を診断する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記試料細胞が、大腸由来の細胞であり、大腸癌を診断する請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸と、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸とを接触させることによりハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を測定することを含む、請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【請求項２４】
請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の一対をプライマーとし、請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸を鋳型として核酸増幅法を行い、増幅産物を測定することを含む、請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【請求項２５】
請求項６記載のタンパク質の遺伝子の発現量を、請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸と、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを鋳型として生成されるｃＤＮＡとを接触させることによりハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を測定することを含む、請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載の癌及び／又は腫瘍を診断する方法。
【請求項２６】
請求項６記載のタンパク質の遺伝子の発現量を、請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の一対をプライマーとし、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを鋳型として生成されるｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅法を行い、増幅産物を測定することを含む、請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載の癌及び／又は腫瘍を診断する方法。
【請求項２７】
請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の、請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の核酸の測定用核酸製造のための使用。
【請求項２８】
請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用。
【請求項２９】
前記癌及び／又は腫瘍は、消化器の癌及び／又は腫瘍である請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
前記消化器の癌及び／又は腫瘍は、大腸癌である請求項２９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を測定するための核酸に関する。さらに本発明は、前記酵素又はその遺伝子の発現量を指標とする癌又は腫瘍診断に関する。
背景技術
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する、ポリラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有する酵素は、現在までに５種類同定されている（Ｔｏｇａｙａｃｈｉ，Ａ．等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１，２７６，２２０３２−４０，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｎ．等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１，２７６，３４９８−５０７，Ｓａｓａｋｉ，Ｋ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９７，９４，１４２９４−９）。しかし、これらの遺伝子を細胞に発現させるとポリラクトサミンが細胞表面に増加するが、発現酵素にするとその活性は非常に弱いものも存在する。すなわち、ポリラクトサミンを作る酵素は、それぞれ違った特徴を備えていると考えられるが、未だここの酵素の特徴付けは十分ではない。従って、この酵素活性を必要とするポリラクトサミン糖鎖構造の作製または製造は、化学合成するか、生体成分より分離するか、または、酵素学的に組織ホモジネートを使用して合成しなければならない。
ポリラクトサミン糖鎖を基幹とする糖鎖構造上にはルイス抗原などの糖鎖構造があることが知られている（Ｋａｎｎａｇｉ  Ｒ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．１９９７  Ａｕｇ；１４（５）：５７７−８４．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｎｏｖ  １８；２６９（４６）：２９２７１−８）。同様にポリラクトサミン糖鎖の長さなどの構造が癌転移、ＮＫ細胞などをはじめとした細胞免疫機能に関係していると言われている（Ｏｈｙａｍａ  Ｃ  ｅｔ  ａ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９９  Ｍａｒ  １５；１８（６）：１５１６−２５．）。同様にヘリコバクターピロリ菌はルイス抗原などの関連糖鎖を介してヒト胃組織に感染することが知られている（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００  Ｊｕｎ；３６（６）：１１８７−９６．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｆａｌｋ  ＰＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９５  Ｆｅｂ  ２８；９２（５）：１５１５−９）。従って、もし、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素遺伝子をクローニングでき、また、該遺伝子を利用して遺伝子工学的に該酵素を生産できるようになれば、該酵素に対する抗体も生産可能となる。従って、これらは癌、免疫病及びピロリ菌感染症の診断、治療及び予防に有用である。しかしながら、該酵素は、未だ精製分離もされておらず、該酵素の単離及び遺伝子の同定についての手がかりはない。そのために、該酵素に対する抗体も作製されていない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸を提供することである。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する組換えベクター及び該核酸が導入され、前記核酸および酵素タンパク質を発現する細胞および酵素タンパク質を提供することである。さらに、本発明の目的は、上記本発明の核酸を測定するための測定用核酸を提供することおよび活性を有する該酵素の生産法を提供するものである。
上記の通り、目的とする酵素は、未だ単離されていないので、その部分アミノ酸配列を知ることもできない。一般に、細胞に微量しか含まれていないタンパク質を単離精製することは容易ではなく、現在に至るまで単離されていない酵素を細胞から単離することは容易でないことが予想される。本願発明者は、目的とする酵素と比較的類似した作用を有する種々の酵素遺伝子の塩基配列間に、もしも相同性の高い領域が存在していれば、目的とする酵素の遺伝子もその相同配列を有しているかもしれないと考えた。そして、公知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、β１，３−ガラクトース転移酵素およびβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子等の塩基配列を検索した結果、相同な領域が見つかった。そこで、この相同領域にプライマーを設定してｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲでクローニングすることを基本として種々検討した結果、該酵素の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定することができ、本発明に至った。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸を提供する。さらに、本発明は、該測定用核酸の癌又は腫瘍の診断用途を提供する。さらに、本発明は、生体から分離された試料細胞中における、上記酵素又はその遺伝子の発現量を調べることを含む、癌又は腫瘍の診断方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸と、上記本発明の核酸とをアニーリングすることによりハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を測定することを含む、上記本発明の核酸の測定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸の、上記本発明の核酸の測定用核酸製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用を提供する。
本発明により、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸が初めて提供された。また、本発明により、該核酸を測定するための核酸がはじめて提供された。さらに、本発明により、該酵素又はその遺伝子の発現量を指標とする、癌又は腫瘍、とりわけ消化器の癌又は腫瘍の簡便で正確な診断方法及びそれに用いられる測定用核酸が初めて提供された。したがって、本発明は、消化器癌や腫瘍の診断に大いに貢献するものと期待される。
発明を実施するための最良の形態
下記実施例において詳述する方法により、ヒト幽門洞（ａｎｔｒｕｍ）ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸から開始コドン（ＡＴＧ）を除いた核酸は、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番３には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。配列番号４に示される塩基配列を有する核酸は、下記実施例において、発現ベクターに組み込まれ、昆虫細胞中で発現され、実際に、上記酵素活性を有するタンパク質が生産されることが確認されている。配列番号３に示されるアミノ酸配列と、他の類似の酵素（具体的な酵素名：β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子のｂｅｔａ３ＧｎＴ２：ＡＢ０４９５８４）のアミノ酸配列とを比較、検討した結果、比較的ホモロジーの高い領域、すなわち、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の第４５番目のアミノ酸からＣ末端までの領域が酵素活性ドメインであると考えられ、この２８３アミノ酸から成る領域が含まれていれば上記酵素活性が発揮されると考えられる。この２８３アミノ酸を取り出して配列番号１に示し、また、これをコードする核酸を配列番号４から取り出して配列番号２に示す。
下記実施例で得られた本発明のタンパク質（「ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７」と命名）は、次の性質を有する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記実施例において詳述されている。
作用：  Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する。触媒する反応を反応式で記載するとＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｄ−グルコシル−Ｒ
→  ＵＤＰ＋Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル−１，３−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｄ−グルコシル−Ｒ、または、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−Ｒ
→  ＵＤＰ＋Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル−１，３−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−Ｒ
基質特異性：  Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基。生体物質では、例えば、糖蛋白質（Ｏ−グリカン、Ｎ−グリカン）や糖脂質（ラクト・ネオラクト系列糖鎖など）上のポリラクトサミン構造を始めとして多数存在しており、またプロテオグリカン（ケラタン硫酸）などの基幹構造等に含まれるＧａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基。
なお、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１又は３に示されるアミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有するものが特に好ましい。さらに、配列番号１若しくは３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はこれらの修飾タンパク質を含むタンパク質であって、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質も当然、本発明の範囲に含まれる。例えば、下記実施例では、配列番号３に示されるアミノ酸配列の上流に、膜貫通領域を含む領域が結合された、膜結合型の酵素をコードする核酸もクローニングされたが、このような膜結合型の酵素も当然本発明の範囲に含まれる。
本発明は、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２および配列番号４に示されている。配列番号２又は配列番号４に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下（すなわち、５ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ，６ｘ  ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ又は０．１％ＳＤＳといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反応を行なう）において、ハイブリダイズし、かつ、上記修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に入る。
上記本発明の核酸は、下記実施例に詳述する方法により調製することもできるし、また、本発明によりその塩基配列が明らかにされたので、下記実施例で用いているヒト幽門洞を材料として用い、常法であるＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより容易に調製することができる。また、上記本発明のタンパク質は、例えば下記実施例に詳述するように、上記本発明の核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞中で発現させ、精製することにより容易に調製することができる。
上記本発明の核酸を、発現ベクターのクローニング部位に挿入することにより、宿主細胞中で上記核酸を発現させることができる組換えベクターを得ることができる。発現ベクターとしては、種々の宿主細胞用の種々のプラスミドベクター及びウイルスベクターが周知であり、市販もされている。本発明では、このような市販の発現ベクターを好ましく用いることができる。また、このような組換えベクターで宿主細胞を形質転換又は形質導入する方法も周知である。本発明はまた、該核酸が形質転換、形質導入又はトランスフェクション等により宿主細胞に導入され、該核酸を発現する細胞を提供する。宿主細胞に外来遺伝子を導入する方法自体は周知であり、上記組換えベクターを用いること等により容易に行うことができる。宿主細胞としては、特に限定されず、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等を用いることができる。なお、組換えベクターの構築及びそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が下記実施例に詳述されている。
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タンパク質」をも包含する。
本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする、前記本発明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明により提供された。ここで、「特異的」とは、検査対象となる細胞中に存在する他の核酸とハイブリダイズせず、上記本発明の核酸とのみハイブリダイズするという意味である。測定用核酸は、上記本発明の核酸、とりわけ配列番号２又は４に示される塩基配列を有する核酸中の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましいが、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えないことが多い。測定用核酸は、プローブ又は核酸増幅法におけるプライマーとして用いることができる。特異性を確保するために、測定用核酸の塩基数は１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上である。サイズは、プローブとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上、コード領域の全長以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上、５０塩基以下が好ましい。被検核酸の部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例には、ヒト細胞中の本発明の酵素のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体的に詳述されている。なお、本明細書において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。
ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。すなわち、例えば、鋳型となる被検核酸（例えば、本発明の酵素の遺伝子のｃＤＮＡ）と本発明の測定用核酸（プライマー）の一対とを、緩衝液中で、Ｔａｑポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で、変性、アニーリング、伸長の各工程を反応液の温度を変化させることにより行う。通常、変性工程は、９０〜９５℃、アニーリング工程は、鋳型とプライマーのＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）、伸長工程はＴａｑポリメラーゼの至適温度である７２℃で行われる。各工程は３０秒〜２分程度で適宜選択される。この熱サイクルを例えば２５〜４０回程度繰り返すことにより、一対のプライマーで挟まれた鋳型核酸の領域が増幅される。なお、核酸増幅法はＰＣＲに限定されるものではなく、この分野において周知の他の核酸増幅法も用いることができる。このように、上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。核酸の標識方法自体は周知である。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。なお、核酸プローブを用いた被検核酸の測定方法もこの分野において周知であり、緩衝液中、核酸プローブを被検核酸とＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）で接触させることによりハイブリダイズさせ、洗浄後、ハイブリダイズした標識プローブ又は固相プローブに結合された鋳型核酸を測定することにより行うことができる。このような方法には、下記実施例に記載されるノーザンブロットやインサイチューハイブリダイゼーション、さらにはサザンブロット法等の周知の方法が包含される。
本発明の酵素を、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基を有する糖タンパク質、オリゴ糖、糖脂質又は多糖等に作用させることにより、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンがβ−１，３結合で結合される。従って、本発明の酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾、糖脂質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明の酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。このような抗体及び上記した測定用核酸は、生体中の該酵素を測定することに有用であり、該測定は、癌、免疫病及びピロリ菌感染症の診断、治療及び予防に有用である。
本発明の酵素と抗原抗体反応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、本発明の酵素を免疫原として動物に投与することを含む周知の方法により作製することができる。このような抗体は、癌又は腫瘍、好ましくは消化器系の癌又は腫瘍、特に大腸の癌又は腫瘍、さらに好ましくは大腸癌の診断に用いることができる。抗体を癌又は腫瘍の診断に用いる場合、試料となる細胞中の上記酵素と、該抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定方法により、上記酵素を測定し、正常細胞における測定結果と比較し、酵素の測定量が正常細胞よりも少なければ、特に、酵素が検出されなければ、癌又は腫瘍の可能性が高いと診断することができる。免疫測定方法自体は、周知であり、周知のいずれの免疫測定方法をも採用することができる。すなわち、測定形式で分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法などがあり、用いる標識で分類すれば蛍光法、酵素法、放射法、ビオチン法等があるが、これらのいずれをも用いることができる。さらに、免疫組織染色によって診断することもできる。免疫測定方法に標識抗体を用いる場合、抗体の標識方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができる。また、周知のとおり、抗体をパパイン分解やペプシンで分解することにより、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、対応抗原との結合性を有する抗体断片（本明細書において「抗原結合性断片」という）が得られることが知られているが、本発明の抗体の抗原結合性断片も本発明の抗体と同様に用いることができる。
なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、本発明の抗体又はその抗原結合性断片を第１抗体として固相に不動化し、検体と反応させ、洗浄後、本発明の酵素と抗原抗体反応する第２抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した第２抗体を測定する。第２抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ビオチン等で標識しておくことにより固相に結合した第２抗体を測定することができる。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。なお、第１抗体と第２抗体を上記の説明と入れ替えてもよい。また、凝集法では、ラテックス等の粒子に本発明の抗体又はその抗原結合性断片を不動化し、検体と反応させて吸光度を測定する。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。
また、各免疫測定に必要な試薬類も周知であり、用いる抗体に特徴があること以外は、通常の免疫測定キットを用いて免疫測定を行うことができる。例えば、通常、緩衝液、固相、標識第２抗体等が含まれる。
下記実施例に具体的に記載するように、本発明の酵素の発現量を指標として癌及び／又は腫瘍の診断を行うことができることが確認されたので、本発明は、生体から分離された試料細胞中における、上記本発明の酵素の遺伝子の発現量を調べることを含む、癌又は腫瘍の診断方法をも提供するものである。なお、下記実施例に具体的に示されるように、本発明の診断方法により検出可能な腫瘍は、癌又は癌が強く疑われる腫瘍である。前記試料細胞としては、消化器系器官の細胞が好ましく、特に大腸由来の細胞が好ましく、これらの細胞を対象とすることで消化器の癌又は腫瘍、特に大腸の癌及び／又は腫瘍の診断を行うことができる。遺伝子の発現量は、細胞中の、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ若しくは該ｍＲＮＡを鋳型として作製されたｃＤＮＡの量を調べることによって測定することができるし、試料細胞中で生産された酵素を、上記本発明の抗体を用いた免疫測定法により測定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの量の測定は、上記した本発明の測定用核酸を用いて、上記のようにして行うことができる。
実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記の記述において、例えば配列表の配列番号５で表される塩基配列を有する核酸を、便宜的に「配列番号５」のように記載することがある）。
１．遺伝子データベースの検索とｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の塩基配列決定
既存のβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、β−１，３−ガラクトース転移酵素およびβ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子ＡＢ０４９５８４、ＡＢ０４９５８５、ＡＢ０４９５８６、ＡＢ０４５２７８、β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の配列ＡＦ１１７２２２、Ｙ１５０６０、Ｙ１５０１４、ＡＢ０２６７３０、ＡＦ１４５７８４、ＡＦ１４５７８４、１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子の配列Ｙ１５０６２（すべてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録番号）で、プログラムはＢＬＡＳＴのｔＢｌａｓｔｎを使用し、ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）に相当するアミノ酸全てについて検索を行った。
その結果、ＥＳＴ配列Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ０００７７０とヒトゲノム配列Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０１７１０４が見出された。そこでＡＣ０１７１０４を用いてライブラリーのスクリーニングを行った。
用いたサンプルは常法（Ｙｕｚｕｒｕ  Ｉｋｅｈａｒａ，Ｈｉｓａｓｈｉ  Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．９  ｎｏ．１１  ｐｐ．１２１３−１２２４，１９９９）により作製したヒトＡｎｔｒｕｍ（幽門洞）ｃＤＮＡライブラリーである。また、スクリーニング手法はラジオアイソトープを使用した一般的な核酸プローブによる方法を用いた。具体的には以下に述べるとおりである。
まず、ヒトＡｎｔｒｕｍ（幽門洞）ｃＤＮＡライブラリーより常法に従って調製したラムダファージを鋳型とし、プライマーＣＢ−６３５（５’−ｃａｇｃａ  ｇｃｔｇｃ  ｔｇｇｃｃ  ｔａｃｇａ  ａｇａｃ−３’）（ＡＣ０１７１０４における塩基番号６８１４−６８３７）とＣＢ−６３８（５’−ｇｃａｃａ  ｔｇｃｃｃ  ａｇａａａ  ｇａｃｇｔ  ｃｇｔｃ−３’）（塩基番号７２２１−７２４５）を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片約４３０ｂｐをＡｍｅｒｓｈａｍ社製Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射能ラベルした。
このプローブを用いて、大腸菌上に形成されたラムダファージのプラークのうち、プローブとハイブリダイゼーションする単一のプラークを拾い、上記プライマーＣＢ６３５とＣＢ６３８を用いてＰＣＲで目的とするＤＮＡ部位の存在を確認した。挿入が確認されたプラークより得られたファージはＬａｍｄａ  ＺＡＰ  ＩＩベクター（ストラタジーン社）で構築されているため（Ｙｕｚｕｒｕ  Ｉｋｅｈａｒａ，Ｈｉｓａｓｈｉ  Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．９  ｎｏ．１１  ｐｐ．１２１３−１２２４，１９９９）、付属の説明書に従った方法によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクターに挿入されたｃＤＮＡクローンとして調製（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）することが出来る。同方法によりこれを調製し、得られたコロニーよりＤＮＡを得た。その後、通常の方法に従ってｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した（配列番号６）。
上記方法で得られた配列番号６はＡＣ０１７１０４の塩基番号４８２８から７０５２に該当し、ＯＲＦの３’側が欠けていたため、３’側をｃＤＮＡからＰＣＲでクローニングしてつなげることとした。即ち、コンピューターによる検索結果のＡＣ０１７１０４より予想される配列から終止コドンの後の配列でプライマーＣＢ−６２５（５’−ｃｇｔｔｃ  ｃｔｇｇｇ  ｃｃｔｃａ  ｇｔｔｔｃ  ｃｔａｇ−３’）（塩基番号７６３８−７６６１）を設計し、上記ＣＢ６３５と組み合わせて上記ヒトＡｎｔｒｕｍ（幽門洞）ｃＤＮＡライブラリーよりＤＮＡ断片を得た。常法によりこのＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号７（ＡＣ０１７１０４における６８１４−７６６１）（以下配列３という）が得られた。これを配列番号６と組み合わせ、理論上のＯＲＦ９８７ｂｐ（ＡＣ０１７１０４における６４６６−７４５２）が得られ、このＯＲＦから３２８アミノ酸が推定されｂｅｔａ３ＧｎＴ−７と名づけた（配列番号８）。一般的には、糖転移酵素は２型の膜１回貫通タンパクであることが知られているが、このＯＲＦ配列には、Ｎ末端には疎水性領域が見出されなかった。しかし、ヒト血清中にβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素活性が検出されることが報告されていることから（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：β１，３−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｈｏｓｏｍｉ，Ｏ．，Ｔａｋｅｙａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｏｇｕｒｅ，Ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，１６５５−１６５９（１９８４））、おそらくこのＯＲＦは膜貫通領域が無い分泌型酵素であると考えられた。
この配列番号８によるＯＲＦとそれがコードするアミノ酸が実際に存在し、機能している（＝発現している）ものであることを示すため、ＲＴ−ＰＣＲと、ＰＣＲ増幅産物の制限酵素による確認およびＰＣＲ増幅産物の配列のダイレクトシークエンシング（通常の方法）によるｍＲＮＡの確認を行った。その結果上記理論上のＯＲＦが確かに存在し、実際に機能していることが確認された。
また、上述のように、糖転移酵素は通常２型の膜貫通タンパク質であることが知られているが、配列番号８のアミノ酸配列のＮ末側に疎水性領域が無く、一般的な糖転移酵素とは異なっていると考えられた。そこで、Ｎ末側に疎水性領域（膜貫通領域）を持つスプライシングバリアントがさらに存在するか否か、５′−側の核酸配列（＝アミノ酸配列のＮ末端側）について解析を行なった。
まず、Ｈｕｍａｎ  ｓｔｏｍａｃｈ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）を行なった。具体的には、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ１プライマーと（ＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、さらにその両内側にＡＰ２のアダプターがついている）、見出した配列部分に設定したプライマーｂｅｔａ３ＧｎＴ−７ＲＡＣＥ−５（５’−ＧＡＣＣＧ  ＡＣＴＴＧ  ＡＣＡＡＣ  ＣＡＣＣＡ  ＧＣＡ−３’）でＰＣＲ（９４℃６０秒、９４℃３０秒−７２℃３分を５サイクル、９４℃３０秒−７０℃３分を５サイクル、９４℃−６８℃３分を２５サイクル）を行い、そのＤＮＡ産物についてさらに、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ２プライマーと、配列部分に設定したプライマーｂｅｔａ３ＧｎＴ−７ＲＡＣＥ−４（５’−ＧＴＡＧＡ  ＣＡＴＣＧ  ＣＣＣＣＴ  ＧＣＡＣＴ  ＴＣＴ−３’）でｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（９４℃６０秒、９４℃３０秒−７２℃３分を５サイクル、９４℃３０秒−７０℃３分を５サイクル、９４℃−６８℃３分を１５サイクル）を行なった。これをｐＧＥＭｅａｓｙ（クロンテック社）にクローニングして塩基配列を決定した。その結果、先に見出した配列番号６の開始コドンより上流部分の配列が得られ、アミノ酸配列にすると膜貫通領域が認められた。しかし、この膜貫通領域の配列近傍の５′−側の核酸配列を解析したが、ＯＲＦの開始点は認められなかった。
そこで、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７を含むヒトゲノム配列ＡＣ０１７１０４を遺伝子領域解析ソフトのＧｅｎｅＳｃａｎ、ＨＭＭｇｅｎｅ等を用いて翻訳領域を解析した。その結果、開始コドンを含み、１１塩基（約３アミノ酸）の第一エクソン（ＡＣ０１７１０４の塩基番号４３３１−４３４１）が予測された。そこで、開始コドンより前の部分にプライマーを設計してＰＣＲを行い、予測された領域がトランスクリプトとして存在するかどうか確認することにした。
具体的には、プライマーとしてｂｅｔａ３ＧｎＴ−７ＲＡＣＥ−８（５’−ＧＣＣＣＡ  ＧＡＧＣＴ  ＧＣＧＡＧ  ＣＣＧＣＴ−３’）（ＡＣ０１７１０４における４２７８−４３００）とＣＢ−６３８（５’−ＧＣＡＣＡ  ＴＧＣＣＣ  ＡＧＡＡＡ  ＧＡＣＧＴ  ＣＧ−３’）（（ＡＣ０１７１０４における７２２４−７２４５）、鋳型としてＨｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡおよびＬＡ−Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクル）を行なった。その結果、１０４６塩基の増幅産物が得られた。ＰＣＲ増幅産物を精製してシークエンスを行ってこの配列を検証したところ、上記翻訳領域の解析で予測されたとおり、第１エクソンの３’側（塩基番号４３４１）が下流の塩基番号６２５８につながっていることが判明した。
そこでさらに配列番号６、７と、この結果を組み合わせて配列番号５に示す１２０６の核酸および配列番号９に示す４０１のアミノ酸が得られた。この配列番号５は、配列番号８（配列番号６と配列番号７の合成）の塩基配列に上流部分の２１９塩基（７３アミノ酸）（（ＡＣ０１７１０４における４３３１−４３４１と６２５８−６４６５）付加したもので、塩基番号４３４２−６２５７はスプライスされたと考えられた。配列番号５は膜貫通領域（ＡＣ０１７１０４の塩基番号６２６５−６３２２）を含むため、配列番号５と配列番号８は同じ活性を持つ酵素の膜貫通型と分泌型であると考えられた。
２．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の発現ベクターへの挿入
ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の活性を調べるためにｂｅｔａ３ＧｎＴ−７を昆虫細胞内で発現させた。活性を確認するには配列番号９の少なくとも他のファミリー遺伝子と比較的ホモロジーが保たれている１１９番アミノ酸からＣ末端までの活性領域を発現させれば十分であると考えられるが、ここではｂｅｔａ３ＧｎＴ−７（配列番号９）の７５番アミノ酸からＣ末端までの活性領域を発現させることとした。
そこでインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＦａｓｔＢａｃに組込み、さらにインビトロジェン社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムによるバクミドを作成した。
▲１▼エントリークローンの作成
ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７Ｓプライマー（５’−ＧＧＧＧＡ  ＣＡＡＧＴ  ＴＴＧＴＡ  ＣＡＡＡＡ  ＡＡＧＣＡ  ＧＧＣＴＴ  Ｃｇｃｃｔ  ｃｔｃａｇ  ｇｇｇｃｃ  ｃｃａｇｇ  ｃｃｔ−３’）とｂｅｔａ３ＧｎＴ−７Ａプライマー５’−ＧＧＧＧＡ  ＣＣＡＣＴ  ＴＴＧＴＡ  ＣＡＡＧＡ  ＡＡＧＣＴ  ＧＧＧＴＣ  ｃａｔｇｇ  ｇｇｇｃｔ  ｃａｇｇａ  ｇｃａａｇ  ｔｇｃｃ−３’）（大文字は後述するＧＡＴＥＷＡＹ用の付加配列ａｔｔＬである）、鋳型にはスクリーニングによって得られたｃＤＮＡクローンとＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片より生成したｂｅｔａ３ＧｎＴ−７クローン（理論上のＯＲＦ配列を有するクローン）のＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。
この産物をＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１  １μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ  ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして行った。プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分おき反応を終了させた。
その後上記ｍｉｘ全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認した。さらに確実を期すためシーケンシングによりＤＮＡ配列の確認をした後、ベクター（ｐＤＯＮＲ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７）を抽出・精製した。
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
まずエントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＦを０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲクロナーゼｍｉｘ  ２μｌを２５℃で１時間反応させ、プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐＦＢＩＦ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７が生成される）。ｐＦＢＩＦは、ｐＦａｓｔＢａｃ１にｌｇκシグナル配列（ＭＨＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ）と精製用のＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を入れたもので、ｌｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、ＦＬＡＧペプチドは精製のため挿入したものである。ＦＬＡＧペプチドはＯＴ３（５’−ｇａｔｃａ  ｔｇｃａｔ  ｔｔｔｃａ  ａｇｔｇｃ  ａｇａｔｔ  ｔｔｃａｇ  ｃｔｔｃｃ  ｔｇｃｔａ  ａｔｃａｇ  ｔｇｃｃｔ  ｃａｇｔｃ  ａｔａａｔ  ｇｔｃａｃ  ｇｔｇｇａ  ｇａｔｔａ  ｃａａｇｇ  ａｃｇａｃ  ｇａｔｇａ  ｃａａｇ−３’）を鋳型とし、プライマーＯＴ２０（５’−ｃｇｇｇａｔｃｃａｔ  ｇｃａｔｔｔｔｃａａ  ｇｔｇｃａｇ−３’）と、ＯＴ２１（５’−ｇｇａａｔ  ｔｃｔｔｇｔ  ｃａｔｃｇ  ｔｃｇｔｃ  ｃｔｔｇ−３’）によって得られたＤＮＡ断片をＢａｍ  Ｈ１とＥｃｏ  Ｒ１で挿入した。さらに、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅを入れた。
その後上記混合液全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＦＢＩＦ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７）を抽出・精製した。
▲３▼  Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムによるバクミドの作成
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−とｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）にＧ１０その他の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、バクミドを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がバクミドへとりこまれるというものである。またバクミドにはｌａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
即ち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬＢプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、バクミドを回収した。
３．  バクミドの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたバクミドに目的配列が挿入していることを確認した後、このバクミドを昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９ｘ１０５細胞／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）を加え、２７℃で１時間培養して細胞を接着した。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ）精製したバクミドＤＮＡ  ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ）ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡおよびＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌを加えた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを混合して作製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩ  ８００μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を細胞に加え、２７℃で５時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１ｘ１０７細胞／２０ｍｌ  Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら一次ウイルスを８００μｌを添加して、２７℃で４８時間培養した。４８時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１ｘ１０７細胞／２０ｍｌ  Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら二次ウイルス液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。加えて、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６ｘ１０５細胞／ｍｌ濃度で１００ｍｌを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
一次から三次までのセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名））細胞粗抽出液をＨ２Ｏで２０倍にし、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動について抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするｂｅｔａ３ＧｎＴ−７タンパク質の発現を確認した。その結果約３８−４０ｋＤａの位置を中心としてブロードに複数のバンド（糖鎖などの翻訳後修飾の違いによるものと考えられる）が検出、発現が確認された。
４．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７のレジン精製
上記四次感染のＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７上清１０ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ社）（５０μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（３０００ｒｐｍ  ５分４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ  ５分４℃）し、ペレットを２００μｌの１ｍＭ  ＣａＣｌ２・ＴＢＳに浮遊させ活性測定のサンプル（ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７酵素液）とした。
５．  ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の受容体基質の探索
ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素類およびβ１，３−ガラクトース転移酵素類と比較して分子進化学的に解析した結果、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素類に分類された。そこで、第一に供与体基質（ｄｏｎｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて検討した。
以下の反応系を用いて、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、ｐＮｐ−α−Ｇｌｃ、ｐＮｐ−β−Ｇｌｃ、ｐＮｐ−α−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮｐ−β−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮｐ−α−Ｇａｌ、ｐＮｐ−β−Ｇａｌ、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ、Ｂｚ−α−ＧａｌＮＡｃ、ｐＮｐ−α−Ｘｙｌ、ｐＮｐ−β−Ｘｙｌ、ｐＮｐ−α−Ｆｕｃ、Ｂｚ−α−Ｍａｎ、Ｂｚ−α−ＭａｎＮＡｃ、ＬａｃＣｅｒ、ＧａｌＣｅｒ  ｔｙｐｅｌ、Ｂｚ−β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（すべてＳｉｇｍａ社）およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮｐ（トロントリサーチケミカル社）を用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（１０ｎｍｏｌ）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（５０ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４（商品名）（０．４％）、ＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（４８０μＭ）、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡＣ（１７５ｎＣｉ）、ＣＤＰ−ｃｏｌｉｎｅ（５ｍＭ）から成り、これにｂｅｔａ３ＧｎＴ−７酵素液を１０μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量２５μｌとした。
上記反応混合液を３７℃で５時間反応させ、反応終了後、０．１Ｍ  ＫＣｌを２００μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。１０ｍｌのメタノールで１回洗浄後、１０ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄して平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ  ｐｌｕｓ  Ｃ１８  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）に該上清を通し、上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。１０ｍｌのＨ２Ｏにて２回カートリッジを洗浄後、５ｍｌのメタノールで吸着した基質および生成物を溶出した。溶出液を４０℃のヒートブロックにて加熱しながら、窒素ガスを吹き付け蒸発乾固させた。これに、メタノール２０μｌを添加し、ＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ  ｐｌａｔｅ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０：ＭＥＲＣＫ社製）にプロットし、クロロホルム：メタノール：水（０．２％ＣａＣｌ２含む）＝６５：３５：８の組成からなる展開溶媒を用いて展開した。ＴＬＣプレートの上端から５ｍｍの所まで展開し、プレートを乾燥後、バイオ・イメージアナライザーＦＬＡ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて生成物に取り込まれている放射線の量を測定した。
その結果、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７はＢｚ−β−ラクトシドおよびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮｐにＧｌｃＮＡｃを転移させる活性を有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であること、すなわち、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）−Ｒの非還元末端のガラクトースにＧｌｃＮＡｃを転移する酵素であることが判明した。
６．  Ｎ−グリカンに対するβ３ＧｌｃＮＡｃＴ活性の測定
酵素源は前記と同様にリコンビナント酵素（ＦＬＡＧ配列融合蛋白）として発現し、精製したものを使用した。アクセプター基質には表１に示す市販のＰＡ化糖鎖基質（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は、１４ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ドナー基質）、２０ｐｍｏｌアクセプター基質、１００ｎｇ酵素タンパク質液で３７℃、１６時間反応した。反応後９５℃、３分で反応を止め、８０μｌの水を加えてＵｌｔｒａ−ｆｒｅｅ  ＭＣ  ｃｏｌｕｍｎ（ウオーターズ社製）を通し、この通過液から４５μｌをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。尚、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ドナー基質）を含まない溶液を対象として転換酵素活性（％）を求めた。その結果を下記表１に示す。
（ＨＰＬＣ条件）
Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ．ａ：１００ｍＭ酢酸／トリエチルアミン，ｐＨ４．０
Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ．ｂ：１００ｍＭ酢酸／トリエチルアミン，ｐＨ４．０（０．５％  １−ブタノール含有）
ｇｒａｄｉｅｎｔ：５−５５％：Ｂｕｆ．Ｉ．ｂ（０−６０  ｍｉｎ．）、
ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
ｃｏｌｕｍｎ：ＰａｌＰａｋ  Ｔｙｐｅ  Ｒ（ＴａＫａＲａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＡ８０００）
ｃｏｌｕｍｎ  ｏｖｅｎ  ｔｅｍｐ：４０℃
ＨＰＬＣシステム：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＤ  ｖｐ、ＣＴＯ−１０ＡＣ  ｖｐ、ＤＧＵ−１４Ａ、ｃｅｌｌ  ｔｅｍｐ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
検出器：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＲＦ−１０ＡＸＬ、ＵＶ：ＳＰＤ−１０Ａｖｐ
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７．  フローサイトメトリーによる酵素発現の測定
ｐＤＥＳＴ１２．２ベクター（インビトロジェン社製）にｂｅｔａ３ＧｎＴ−７（Ｇ１０）遺伝子を組み込んだｐＤＥＳＴ１２．２−Ｇ１０ベクターＤＮＡを作製した。これは具体的に次のようにして行った。下記のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｇａｔｅｗａｙシステムの配列を組み込んだプライマーを用いてＣｏｌｏ２０５細胞（大腸ガン細胞）のｃＤＮＡよりＰＣＲ法で増幅後、その増幅産物をまずｐＤＯＮＲベクターにＢＰ反応により組み込んだ。そのベクターのシーケンシングを行い、ＤＮＡ配列の確認後、ｐＤＯＮＲベクターからｐＤＥＳＴ１２．２ベクターにＬＲ反応により入れ替えた。なお、上記操作は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のキットに含まれるベクター、試薬を用いて商品の指示書に従い行った。
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以上の操作により、ｐＤＥＳＴ１２．２ベクター（インビトロジェン社製）に、配列番号５に示すｃＤＮＡの５’側及び３’側に、上記プライマー中の、ｃＤＮＡ配列以外の領域が付加されたＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターが得られた。この組換えベクターを、常法により、ＨＣＴ１５細胞株、ＬＳＣ細胞株（ともに大腸癌細胞株）に導入した。また、コントロールとして遺伝子導入のないｐＤＥＳＴ１２．２ベクターＤＮＡを用いて、同様に細胞株に導入した（Ｍｏｃｋ細胞）。０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８薬剤（インビトロジェン社製）によるセレクションを１ヶ月行った後に細胞を回収した。回収した細胞を１％ＢＳＡ／０．１％ＮａＮ３／ＰＢＳ（−）で２回洗った。細胞数を１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして１サンプルあたり１００μｌ（１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ）使用した。遠心後上清を除いて、１０μｇ／ｍｌになるよう希釈した。下記ＦＩＴＣラベルレクチンをそれぞれ１００μｌ加え、細胞を懸濁した。４℃で暗所（冷蔵庫）３０分反応させた後、１％ＢＳＡ／０．１％ＮａＮ３／ＰＢＳ  １００μｌをウェルに入れて洗浄を行い、１０００ｒｐｍで５分遠心し、上清を取り除いた。さらにもう一度洗浄を繰り返した。０．５％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ  １ｍｌに懸濁して細胞固定を行い、ナイロンメッシュを通した後、フローサイトメトリーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン  ディッキンソン社製）を用いて解析した。その結果を図１〜３に示す。
使用したレクチンはＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＬＥＡ）ならびにＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（ＷＧＡ）であり、それぞれＮ−アセチルラクトサミンの繰り返し構造、ならびにＮ−アセチルグルコサミン構造を認識するレクチンであり、ＦＩＴＣにより標識されているものを使用した（ホーネン、生化学工業、ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社などより購入）。
図１は、ＨＣＴ１５大腸癌細胞株のＬＥＡレクチンとの結合性を示すフローサイトメトリーの結果、図２は、本発明の遺伝子を導入した組換えベクター又は導入しない組換えベクター形質転換したＬＳＣ大腸癌細胞株のＬＥＡレクチンとの結合性を示すフローサイトメトリーの結果、図３は、ＨＣＴ１５大腸癌細胞株のＷＧＡレクチンとの結合性を示すフローサイトメトリーの結果を示す。各図において、太線がｂｅｔａ３ＧｎＴ−７遺伝子を含む組換えベクターで形質転換した細胞についての結果を示し、細線がｂｅｔａ３ＧｎＴ−７遺伝子を含まないベクターで形質転換した細胞（Ｍｏｃｋ細胞）についての結果を示す。
図１〜３に示す通り、いずれも蛍光強度がシフトしていることから、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７（Ｇ１０）遺伝子を組み込んだｐＤＥＳＴ１２．２−Ｇ１０ベクターＤＮＡの導入細胞株ではＮ−アセチルラクトサミン含有構造が増えていた。
８．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の組織特異的発現の解析
Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｕ．Ｅ．，Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｍ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ６，９９５−１００１）で組織での発現および株化細胞での発現状態を調べた。材料として、ヒト組織ｃＤＮＡは、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ（クロンテック社）を使用した。各種株化細胞は、常法に従い総ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した。ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の検量線は、ｐＤＯＮＲＴＭ２０１  ｖｅｃｔｏｒ  ＤＮＡにｂｅｔａ３ＧｎＴ−７遺伝子を組み込んだプラスミドを使用した。内因性の対照として恒常的に発現しているグリセルアルデヒト３リン酸脱水素酵素（ｈｕｍａｎ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ））を用いた。ＧＡＰＤＨの検量線は、ｐＣＲ２．１（インビトロゲン社）にＧＡＰＤＨ遺伝子を組み込んだプラスミドを使用した。ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７用のプライマーセットおよびプローブは、ＲＴ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７−Ｆ２；５’−ＴＴＣＣＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＴＣ−３’，ＲＴ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７−Ｒ２；５’−ＧＣＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣ−３’，プローブ；５’−Ｆａｍ  ＡＣＴＧＣＣＣＣＣＡＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡ−ＭＧＢ−３’を用いた。ＧＡＰＤＨのプライマーセットとプローブは、キット（Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ登録商標Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））を使用した。ＰＣＲ条件は、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、１サイクル，５０℃，２分間，続いて１サイクル，９５℃，１０分間、そして５０サイクル；９５℃，１５秒−６０℃，１分間を行なった。ＰＣＲ産物の定量はＡＢＩ  ＰＲＩＡＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。Ｇ１１の発現量は、恒常的に発現しているＧＡＰＤＨの転写産物量で割ることによって標準化した。表２にヒト組織、表３に株化細胞の結果をまとめる。
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ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の高発現組織は、膵臓、胃、胎盤、副腎であり、中発現組織は、大腸、白血球、肺、卵巣、小腸、脾臓、精巣、子宮、大脳皮質であった。それ以外の組織では発現量が比較的低いものであった。
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株化細胞でのｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の発現は、正常組織に比べると低下していた。前骨髄芽球性白血病由来の細胞であるＨＬ６０細胞および大腸由来のＳＷ１１１６細胞においては、発現レベルが高かった。
これらのことから、癌化などにより細胞の分化の程度が変化した場合、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の発現量が変化することが容易に考えられ、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の発現量の変化を調べることにより、病気の診断に利用できる可能性が考えられた。また、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７には、記載したように開始点が２つ存在する可能性があり、スプライシングバリアントの変化を調べることによって細胞の分化状態、病的な変化を調べられる可能性もある。
９．  大腸癌患者の正常組織及び癌組織におけるｂｅｔａ３ＧｎＴ−７遺伝子の発現
実際の大腸癌（ＤＫ）患者の正常（Ｎ）または癌（Ｔ）組織におけるｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の発現量を「８．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の組織特異的発現の解析」に記載された方法に従い測定した。その結果を図４に示す。この結果からＤＫ３検体を除いて、ＤＫ１０、ＤＫ１５、ＤＫ１９、ＤＫ２２、ＤＫ２３およびＤＫ２４検体について、癌組織ではｂｅｔａ３ＧｎＴ−７の発現が減少する傾向が見られた。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の遺伝子を導入した組換えベクター又は導入しない組換えベクター形質転換したＨＣＴ１５大腸癌細胞株のＬＥＡレクチンとの結合性を示すフローサイトメトリーの結果を示す。
図２は、本発明の遺伝子を導入した組換えベクター又は導入しない組換えベクター形質転換したＬＳＣ大腸癌細胞株のＬＥＡレクチンとの結合性を示すフローサイトメトリーの結果を示す。
図３は、本発明の遺伝子を導入した組換えベクター又は導入しない組換えベクター形質転換したＨＣＴ１５大腸癌細胞株のＷＧＡレクチンとの結合性を示すフローサイトメトリーの結果を示す。
図４は、大腸癌患者の正常組織及び癌組織中における、本発明の遺伝子の発現量を比較して示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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