(57)【要約】ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物およびその作製方法。ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト胚性幹細胞。心不全予防および／または治療薬をスクリーニングする方法。心不全予防および／または治療薬。
2003096804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物。
【請求項２】
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能の改変が、細胞膜からのヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遊離阻害またはヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子の発現抑制である請求項１記載の動物。
【請求項３】
動物が哺乳動物である請求項１または２に記載の動物。
【請求項４】
哺乳動物がマウスである請求項３記載の動物。
【請求項５】
マウスがＣ５７ＢＬ６マウス系統の遺伝的背景を有する請求項４記載の動物。
【請求項６】
心不全を約８週までに発症する請求項１〜５のいずれか１項に記載の動物。
【請求項７】
心不全が心臓内腔の拡大と心筋細胞の変性および／または線維化の進行を特徴とする、拡張型の心筋症である請求項６記載の動物。
【請求項８】
心筋細胞の変性が、血管障害による虚血、高血圧、感染および自己免疫反応以外の原因で起こる請求項７記載の動物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の動物からなる、心筋症モデル動物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の動物に被験物質を投与することを含む、心不全予防および／または治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
心不全予防および／または治療薬が拡張型の心筋症予防および／または治療薬である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物の作製方法であって、以下の工程：
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有するターゲッティングベクターを相同組換えにより非ヒト動物の胚性幹細胞に導入し；
前記胚性幹細胞を胚盤胞内に注入または８細胞胚と凝集させ；
前記胚を成長させてキメラ非ヒト動物となし；
前記キメラ非ヒト動物の中から、前記胚性幹細胞が生殖細胞に導入された非ヒト動物を選択し；そして、
前記選択した非ヒト動物同士を交配することにより、前記ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物を作製することを含む、前記の方法。
【請求項１３】
ターゲッティングベクターが、クレリコンビナーゼ認識配列に挟まれた、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部または全部のＤＮＡ配列を有するものであり、前記クレリコンビナーゼ認識配列に挟まれた、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部または全部のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物を作製した後、さらに、クレリコンビナーゼを発現する非ヒト動物と前記非ヒト動物を交配して、前記ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部または全部を欠損した非ヒト動物を作製する工程を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
非ヒト動物が哺乳動物である請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物がマウスである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
マウスの胚性幹細胞のヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領域が、配列番号１〜４の配列を有する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ターゲッティングベクターが、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子蛋白の少なくとも１個のアミノ酸を改変する変異を導入したヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子のｃＤＮＡを含む請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ターゲッティングベクターが、クレリコンビナーゼの認識配列で挟んだヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子のｃＤＮＡを含む請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物胚性幹細胞。
【請求項２０】
下記ｉ）〜ｉｉｉ）の物質の少なくとも１つを含有する、心不全予防および／または治療薬。
ｉ）上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子、
ｉｉ）上皮増殖因子と同様の生化学的作用を有する化合物、および
ｉｉｉ）上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子の細胞膜からの遊離を促進する物質。
【請求項２１】
ｉｉｉ）の物質が酵素である、請求項２０記載の心不全予防および／または治療薬。
【請求項２２】
上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子がヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子である、請求項２０または２１記載の心不全予防および／または治療薬。
【請求項２３】
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子またはその変異体が組み込まれたベクターであって、前記ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子またはその変異体を動物において発現しうる前記ベクターを含有する、心不全の遺伝子治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子機能改変動物、スクリーニング方法、胚性幹細胞、並びに心不全予防および／または治療薬に関する。
背景技術
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（以下、「ＨＢ−ＥＧＦ」と記す）は、当初、単球類似の細胞Ｕ９３７から線維芽細胞増殖因子として単離された上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーに属する増殖因子である（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：９３６−９，１９９１）。可溶性のＨＢ−ＥＧＦは膜結合型ＨＢ−ＥＧＦからプロテアーゼにより分解されて細胞膜から遊離され上皮増殖因子受容体に結合し機能を発揮する。ＨＢ−ＥＧＦは線維芽細胞や平滑筋細胞に対して増殖活性を有し胚盤胞の生着、創傷治癒、腫瘍増殖、動脈硬化等に関わることが報告されている。（総説として、Ｒａａｂ  Ｇ  ａｎｄ  Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  Ｍ  Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３３３：Ｆ１７９−９９，１９９７；Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｄａ  Ｅ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １１：３３５−４４，２０００）
近年、カテコラミンやアンジオテンシンなどの７回膜貫通型受容体に結合するサイトカインのシグナル情報伝達に膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞膜からの遊離が重要であるという報告が培養細胞を使用してなされた（Ｐｒｅｎｚｅｌ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：８８４，１９９９）。さらに本発明者らにより、心臓においてＨＢ−ＥＧＦの膜からの遊離をメタロプロテアーゼ阻害剤により抑制すると心筋細胞の肥大が抑制されることが培養心筋細胞、マウスの大動脈縮窄モデルを用いて証明され、心臓において細胞膜よりＨＢ−ＥＧＦが遊離されＥＧＦ受容体を刺激することが心筋細胞肥大のシグナルとして重要なことが示された。このことは上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのなかでも特にＨＢ−ＥＧＦが心筋細胞に特異的に重要なシグナルを担うことを示唆している（Ａｓａｋｕｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：３５−４０，２００２）。
そこで、ＨＢ−ＥＧＦの心臓における重要性をより明確にするために、本発明者らはＨＢ−ＥＧＦが細胞膜から遊離されないマウスを遺伝子改変手法を用いて作製した。まずマウスＨＢ−ＥＧＦのゲノム遺伝子の一部を欠如させ、かわりに変異ＨＢ−ＥＧＦのｃＤＮＡを導入したマウスを作製した。このマウスにおいては、本来のＨＢ−ＥＧＦ遺伝子は破壊され、その転写産物は発現されず、変異ＨＢ−ＥＧＦのみが発現した。この系統のマウスをＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスと記す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスにおいて発現する変異ＨＢ−ＥＧＦは先に細胞発現系等の実験において、プロテアーゼにより分解を受けず細胞膜から遊離されないことが確かめられている。すなわち、ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスでは、発現したＨＢ−ＥＧＦが細胞膜にとどまり、遊離されない。
従って、本発明の一態様において、このＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスを使用することにより、ＨＢ−ＥＧＦが細胞膜から遊離せず、ＥＧＦ受容体を刺激できないときに、マウスの生態にどういう異常がでるかを解析できる。よって、ＨＢ−ＥＧＦの細胞膜からの遊離の重要性を検討することができる。
さらに、このＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスが心不全を呈したことにより、遊離されたＨＢ−ＥＧＦが心臓のＥＧＦ受容体を刺激できなかったために心機能不全をきたしたのか、あるいはＨＢ−ＥＧＦがプロテアーゼによる切断・遊離を受けず細胞膜にとどまることが心筋細胞の機能に悪影響を及ぼしたのか明確にする必要が生じた。これを解決するためＨＢ−ＥＧＦの機能を完全に欠損したマウスを作製した。このマウスではＨＢ−ＥＧＦのゲノム遺伝子配列を欠損させ、同部位に相同組み換えを利用して、クレリコンビナーゼ認識配列にはさんだＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を導入した。このマウスをクレリコンビナーゼを発現したマウスと交配することにより完全にＨＢ−ＥＧＦの遺伝子の機能不全をきたしたマウスを作製できた。このマウスを以後ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウスと命名する。
従って、本発明の一態様において、このＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウスを用いることにより、ＨＢ−ＥＧＦの生体内での作用をより明確にすることができる。
さらに本発明の一態様において、ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス及びＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウスが著明な心不全をきたしたことから、このマウスを使用して心不全の発症におけるＨＢ−ＥＧＦの病理学的機能を検討することができる。これにより、心筋細胞の恒常性維持におけるＨＢ−ＥＧＦの役割を明らかにし、ヒト拡張型心筋症などによる心不全の発症におけるＨＢ−ＥＧＦの重要性を検討する。
さらに本発明の一態様において、ＨＢ−ＥＧＦ等の上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー因子及びその細胞膜からの遊離促進をきたす物質の心不全治療薬としての可能性を検討する。
発明の開示
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物。
（２）ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能の改変が、細胞膜からのヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遊離阻害またはヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子の発現抑制である（１）記載の動物。
（３）動物が哺乳動物である（１）または（２）に記載の動物。
（４）哺乳動物がマウスである（３）記載の動物。
（５）マウスがＣ５７ＢＬ６マウス系統の遺伝的背景を有する（４）記載の動物。
（６）心不全を約８週までに発症する（１）〜（５）のいずれか１つに記載の動物。
（７）心不全が心臓内腔の拡大と心筋細胞の変性および／または線維化の進行を特徴とする、拡張型の心筋症である（６）記載の動物。
（８）心筋細胞の変性が、血管障害による虚血、高血圧、感染および自己免疫反応以外の原因で起こる（７）記載の動物。
（９）（１）〜（８）のいずれか１つに記載の動物からなる、心筋症モデル動物。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１つに記載の動物に被験物質を投与することを含む、心不全予防および／または治療薬をスクリーニングする方法。
（１１）心不全予防および／または治療薬が拡張型の心筋症予防および／または治療薬である、（１０）記載の方法。
（１２）ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物の作製方法であって、以下の工程：ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有するターゲッティングベクターを相同組換えにより非ヒト動物の胚性幹細胞に導入し；
前記胚性幹細胞を胚盤胞内に注入または８細胞胚と凝集させ；
前記胚を成長させてキメラ非ヒト動物となし；
前記キメラ非ヒト動物の中から、前記胚性幹細胞が生殖細胞に導入された非ヒト動物を選択し；そして、
前記選択した非ヒト動物同士を交配することにより、前記ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物を作製することを含む、前記の方法。
（１３）ターゲッティングベクターが、クレリコンビナーゼ認識配列に挟まれた、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部または全部のＤＮＡ配列を有するものであり、前記クレリコンビナーゼ認識配列に挟まれた、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領城の一部または全部のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物を作製した後、さらに、クレリコンビナーゼを発現する非ヒト動物と前記非ヒト動物を交配して、前記ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部または全部を欠損した非ヒト動物を作製する工程を含む、（１２）記載の方法。
（１４）非ヒト動物が哺乳動物である（１２）または（１３）記載の方法。
（１５）哺乳動物がマウスである（１４）記載の方法。
（１６）マウスの胚性幹細胞のヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のゲノムＤＮＡ領域が、配列番号１〜４の配列を有する（１５）記載の方法。
（１７）ターゲッティングベクターが、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子蛋白の少なくとも１個のアミノ酸を改変する変異を導入したヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子のｃＤＮＡを含む（１２）〜（１６）のいずれか１つに記載の方法。
（１８）ターゲッティングベクターが、クレリコンビナーゼの認識配列で挟んだヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子のｃＤＮＡを含む（１２）〜（１６）のいずれか１つに記載の方法。
（１９）ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の機能を改変するような変異が導入されたヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子のＤＮＡ配列を有する非ヒト動物胚性幹細胞。
（２０）下記ｉ）〜ｉｉｉ）の物質の少なくとも１つを含有する、心不全予防および／または治療薬。
ｉ）上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子、
ｉｉ）上皮増殖因子と同様の生化学的作用を有する化合物、および
ｉｉｉ）上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子の細胞膜からの遊離を促進する物質
（２１）ｉｉｉ）の物質が酵素である、（２０）記載の心不全予防および／または治療薬。
（２２）上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子がヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子である、（２０）または（２１）記載の心不全予防および／または治療薬。
（２３）ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子またはその変異体が組み込まれたベクターであって、前記ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子またはその変異体を動物において発現しうる前記ベクターを含有する、心不全の遺伝子治療薬。
発明を実施するための最良の形態
本発明の動物は、遺伝子ターゲティング法により作製することができる。遺伝子ターゲティング法は、目的とするＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部を別個の遺伝子ＤＮＡにより置換し、ゲノム上のその遺伝子本来の機能を改変または欠失させることを目的とする方法である。そのため、遺伝子ターゲティングを行うためには、まず、機能を欠損させようとする目的のＨＢ−ＥＧＦ遺伝子についてゲノムＤＮＡを単離することが必要である。さらにこれらの動物（好適には、マウス）の解析によりＨＢ−ＥＧＦが心筋恒常性維持に必須であることが明らかになり、逆に心筋障害により心機能が低下した部位には保護的に働く可能性が示唆された。
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムの単離
ゲノムＤＮＡは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の相同組み換えを行うための、ターゲティングベクターを構築するために使用する。従って、ゲノムＤＮＡは、相同組み換えをおこなうときにより効率よく組み換えが生じるよう、作製しようとするＥＳ細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離、使用することが望ましい。より望ましくは、相同組み換えの効率をさらに上げるために、ＥＳ細胞が由来する同一種の動物のうち同じ系統の動物から、ゲノムＤＮＡを単離して使用する。同種であっても系統が異なるとゲノム中にＤＮＡの配列変異が散在し、それらの変異が相同組み換えの確率を下げる可能性があるからである。
マウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムクローンを採取する場合には、マウス由来のｃＤＮＡプローブまたはゲノムＤＮＡプローブを使用して、マウスゲノムライブラリーからスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡプローブを使用する場合は、目的とするＨＢ−ＥＧＦ遺伝子についてのｃＤＮＡの全長を使用しても、その一部を使用してもよい。
プローブに結合したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムＤＮＡを制限酵素で切り出し、市販のクローニング用ベクター中に挿入する。クローニング用ベクターとしては、市販されるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣなどのいずれのプラスミドを用いてもよい。このように単離されたゲノムクローンを部分塩基配列決定することにより、単離されたゲノムクローンが目的とするＨＢ−ＥＧＦ遺伝子についてのゲノムクローンであることを確認することができる。
ターゲティングベクターの構築
ターゲティングベクターは、改変したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子により、ＥＳ細胞中のＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムＤＮＡを相同組み換えするために使用するものである。従って、本発明におけるＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のターゲティングベクターは、一部を改変したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムＤＮＡを含むことを必要とする。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡを挿入したプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて当該ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムＤＮＡ配列を改変することにより、ゲノムＤＮＡの切り出し・ライゲーションなどの工程を行うことなくターゲティングベクターとすることができる。
本発明において「ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムＤＮＡの一部を改変する」とは、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムＤＮＡの一部に変更、削除、挿入または置換を生じさせることをいう。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の機能を改変するためには、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対して、変更、削除、挿入または置換のうち２またはそれ以上の方法を同時に使用してもよい。
本発明において、ゲノムＤＮＡの「変更」とは、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列中に１またはそれ以上の塩基置換を導入し、当該変更したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現産物がＨＢ−ＥＧＦ分子として改変された機能を有することをいう。本発明においてゲノムＤＮＡの「削除」とは、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムの一部または全部を欠損させることによりＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現産物がＨＢ−ＥＧＦ分子として機能しないかまたは存在しないようにすることをいう。本発明において、ゲノムＤＮＡに対して「挿入」とは、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子以外の配列を有するＤＮＡを挿入することにより、当該ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子以外のＤＮＡを挿入したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現産物がＨＢ−ＥＧＦ分子として機能を変化させることをいう。本発明において、ゲノムＤＮＡの「置換」とは、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムの一部または全部をＨＢ−ＥＧＦ遺伝子とは関連しない別個の配列により置換し、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現産物がＨＢ−ＥＧＦ分子として機能しないかまたは存在しないようにすることをいう。
ターゲティングベクターの構築についてデザインする場合、後の工程において行わなければいけない相同組み換え体のスクリーニングを、より容易に行うことができるように考慮することが望ましい。たとえば、相同組み換え体のスクリーニングは、（１）ターゲティングベクターにより組み換え体内に導入した薬剤耐性遺伝子を用いて、培養中で行う細胞レベルの第一段階のスクリーニング、そして（２）第一段階のスクリーニングにより選択された組み換え体について、さらにＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことからなるＤＮＡレベルの第二段階のスクリーニングの２工程により行うことが好ましい。従って、この２工程のスクリーニングをより容易に行うことができるようにターゲティングベクターをデザインすることが好ましい。
本発明においては、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、選択マーカー遺伝子ＤＮＡなどと置換する方法により、ターゲティングベクターを作製する。これは、ターゲティングベクター中のＤＮＡによって相同組み換えされた相同組み換え体を、選択マーカーなどを用いることで、より容易にスクリーニングすることができるようにするためである。より具体的には、単離されたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部を制限酵素処理により削除し、削除されたＤＮＡ領域の代わりに改変したＨＢ−ＥＧＦのＤＮＡ及び選択マーカー遺伝子を挿入することにより、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のターゲティングベクターを作製する。
また後述の実施例ではベクター内にプロモーターは挿入していないが、ＥＳ細胞中で強い発現活性を有するプロモーターを置換するＤＮＡに挿入し組み換え体の選択を容易にすることも可能である。
選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ネガティブ選択用にはジフテリア毒素Ａ遺伝子断片、さらにｌａｃＺ遺伝子などを目的に応じて使用することができる。
選択マーカー遺伝子はたとえばネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏカセット、ｐＫＪ２として供与）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子カセット（ｈｐｈカセット）、チミジンキナーゼプロモーター付ジフテリア毒素Ａ遺伝子カセット（ｐＭＣ１ＤＴ−Ａとして供与）、ｌａｃＺ遺伝子カセット（ｐＢＳｌａｃＺとして供与）などの、プラスミドに挿入された状態で市販されている選択マーカー遺伝子を使用してもよい。ターゲッティングベクターは、これらのプロモーターを連結した選択マーカーのうち、どの選択マーカーを使用して構築してもよい。またプロモーターを使用せず内因性のプロモーターを使用することも可能である。
ターゲッティングベクターによる相同組み換え
次いで、上記の方法により作製したターゲッティングベクターを使用して、相同組み換えを行う。本発明において「ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の相同組み換え」とは、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子と同一または類似の塩基配列を有する改変したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノム上に、人工的に組み換えさせることをいう。
目的とする遺伝子の相同組み換えが起こる頻度は１０−８程度であることが知られている。したがって目的とする相同組み換え体を得るためには、理論上１０８以上の細胞に組み換え操作を行う必要があり、少なくとも数十〜数百検体の組み換え体をスクリーニングする必要がある。しかし、１０８個の受精卵を使用することは事実上不可能であることから、受精卵に変わるものとして、受精卵と同様の多分化能を有し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することが可能な細胞を使用することが必要である。このような目的を達成することができる方法として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法を使用することができるが、これだけに限定されるものではない。
現在確立されている遺伝子ターゲッティング法では、ＥＳ細胞を使用することが望ましい。現時点においてＥＳ細胞はマウス由来のものしか作製されていないが、将来多種の動物でマウスＥＳ細胞と同様な細胞が樹立されれば、同様な方法を用いて遺伝子改変動物を作製することができる。
現在使用することができるマウス由来のＥＳ細胞は、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ−１細胞、Ｒ−１細胞、Ｅ１４．１細胞などがある。ターゲッティング動物を作出するために、これらのうちいずれのＥＳ細胞を用いるかは、採取したゲノムＤＮＡの由来するマウス系統、キメラ動物の選別方法など、実験の目的や方法により任意に決定することができる。
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の機能を改変したターゲッティングベクターをＥＳ細胞中に導入する。そしてＥＳ細胞中の目的とするＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、ターゲッティングベクター中の機能改変されたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ＤＮＡ配列と相同組み換えによって置換する。相同組み換えは、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子ゲノムＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクター中の非改変部分の配列との相同性を利用して、確率的に生じさせることができる。
ターゲッティングベクターをＥＳ細胞中に導入する方法としては、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などを使用することができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレクトロポーレーション法を用いることが好ましい。
そしてＥＳ細胞中で、相同組み換えによってＥＳ細胞に導入された選択マーカーを用いて、第一段階のスクリーニングである選択培養を行う。当該第一段階の選択工程においては、前述した選択マーカーのうち、複数の選択マーカー遺伝子を用いることもできる。ＥＳ細胞を培養するための培養液は毎日交換するとよい。培養液中には、選択マーカー遺伝子の種類に依存して、たとえばネオマイシン（Ｇ４１８，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）やハイグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が含まれている。選択培養６−８日目に生存するコロニーを耐性クローンとして採取する。
耐性クローンをピックアップし、増殖させる。その後、目的とするＨＢ−ＥＧＦ遺伝子がターゲッティングされたかどうかを確認するため、第二段階のスクリーニングを行うことができる。第２段階のスクリーニングは、ＤＮＡレベルで目的とするＨＢ−ＥＧＦ遺伝子がターゲッティングされたかどうかを確認する工程である。このような方法としては、ＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などが存在するが、そのうちのいずれを用いてもよく、またその中から２つ以上の方法を組み合わせて用いてもよい。
本発明においては、まず、第一段階のスクリーニングにより選択されたＥＳ細胞クローンのプールのそれぞれからゲノムＤＮＡを調整し、このゲノムＤＮＡを鋳型としてサザンブロットハイブリダイゼーション法を行うことで、ＥＳ細胞について第二段階のスクリーニングをする。この方法を用いたスクリーニングにより組み替えが起こったクローンを単離する。
これらのプローブをどのように設計するかは、ターゲッティングベクターを構築する際にどの選択マーカーを使用するかにより、個々具体的に異なる。本発明のＨＢ−ＥＧＦ遺伝子についてのサザンブロットハイブリダイゼーション解析においては、プローブとして、ゲノムクローンを適宜制限酵素処理することにより得られるゲノムＤＮＡ断片およびＰＣＲにより増幅されたゲノムＤＮＡ断片、選択マーカーとして使用する薬剤耐性遺伝子に対するプローブ等を使用することが望ましい。このようにサザンブロットハイブリダイゼーション解析に用いるプローブ数を増やして、さらに確実に相同組み換え体を選択することもできる。
ノックアウト動物の作出
次いで、相同組み換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期または胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製することができる。遺伝子改変動物は、好適にはマウスであるが、これに限定されるものではなく、受精卵または胚の遺伝子組み換え技術が使用可能な種々の動物から作出することができる。
ＥＳ細胞を胚内に移植する方法としては、たとえばマイクロマニュピレーション法、凝集法などが知られている。また移植する方法は適宜改変することができる。マウスの場合、まず、ホルモン剤（たとえば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）により過排卵処理を施したメスマウスを、オスマウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このように回収した胚に対して、ターゲッティングベクターを用いて相同組み換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて注入し、キメラ胚を作製する。
一方、仮親にするための偽妊娠メスマウスは、正常性周期のメスマウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作成したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラ動物を作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実におきるようにするために、受精卵を採取するメスマウスと仮親になる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にあるメスマウス群から作出することが望ましい。
このようなキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来のオスマウスを選択する。選択したＥＳ細胞移植胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統のメスマウスと交配させ，そして次世代産仔にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するためには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色により行うことが望ましい。マウスにおいては、野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）、黒色（ｂｌａｃｋ）、黄土色（ｃｉｎｎａｍｏｎ）、チョコレート色（ｃｈｏｃｏｌａｔｅ）、及び白色（アルビノ、ａｌｂｉｎｏ）の被毛色が知られているが、使用するＥＳ細胞の由来系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統を適宜選択することができる。例えば本発明においては、野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）系統（Ｃ５７ＢＬ６＋ＣＢＡマウス）由来のＥＳ細胞を使用して作出したオスのキメラマウスを、黒色であるＣ５７ＢＬ６メスマウスと交配させる。そして次世代産仔の被毛色が野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）と黒色（ｂｌａｃｋ）であることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。このように、胚内に移植された組み換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖することにより目的とする遺伝子を欠損する個体を得ることができる。得られた遺伝子改変ヘテロ接合体マウス同士を交配させることにより、目的とする遺伝子改変ホモ接合体マウスを得ることができる。
クレリコンビナーゼ認識配列を含んだ配列と置換したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を導入したホモ接合体マウスは次にクレリコンビナーゼを恒常的に発現するマウス（Ｓａｋａｉ  Ｋ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：３１８−２４，１９９７）と交配させることによりＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を欠損したヘテロ接合体マウスを作製することができる。さらに得られたヘテロ接合体マウスの雌雄を交配することにより，ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を欠損したホモ接合体マウスを作製することができる。
一般に実験動物を用いて研究するためには、系統として確立された動物、すなわち遺伝的にホモの状態の動物を用いることが望ましい。このような動物では、遺伝的背景が詳細に調べられているため、かかる既知の遺伝的背景の下で、当該動物に施した処置の効果のみを特定できるからである。一方、雑種動物においては生じた効果が、当該処置にのみ由来するものかまたは遺伝的背景に由来するものかを判別することが困難である。
遺伝子改変マウスの作成の過程では、ＥＳ細胞が生殖系列に導入されたか否かを被毛色の違いを指標にして確認するために、交雑を行い雑種子孫を作製する工程を必ず行う必要がある。またさらにクレリコンビナーゼを発現する遺伝子の導入を必要とする場合は別系統のマウスとのさらなる交配が必要である。したがって、多くの遺伝子がヘテロの状態で存在するため、結果としてＨＢ−ＥＧＦ遺伝子が改変することによる特有の効果を調べることが困難となってしまう。そこで、遺伝子改変の特有の効果のみを抽出するために、得られた遺伝子欠損マウスを純系のマウス系統と戻し交配し、ターゲッティングを行った遺伝子を含むすべての遺伝子について可能な限り遺伝的にホモにすることが好ましい。目的とする遺伝的構成の動物を得るためには、５〜８世代程度同一系統と戻し交配を行うことが好ましい。戻し交配に用いるマウスは当業者らが適宜選択することができる。使用することができるマウスとしては、例えばＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ６、ＤＢＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、自然交配のみにより戻し交配を行うと長い年月がかかる場合もあるので、世代交代を早めたい場合には適宜体外受精技術を用いることもできる。
作出された遺伝子改変マウスを用いたそれぞれの実験では、性別及び年齢が適合した成熟マウスを用いることが好ましい。性別や年齢に依存する因子が実験の結果に与える影響を排除するためである。また、実験は動物実験に対する研究所内倫理ガイドライン及び遺伝子操作実験に対する安全性ガイドラインに基づいて行う。
以上のように作出したＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウスは、ＨＢ−ＥＧＦが心不全という病態においてどのような働きをしているかを調べるための試験に用いることができる。
特に、本発明の心不全を発症するＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変動物は、心不全、例えば拡張型心筋症の発症の研究に使用できるばかりでなく、それら疾患の治療薬の探索に使用することもできる。
したがって、本発明は、本発明の疾患モデル動物を使用して、心不全の予防および／または治療薬を探索する方法も提供する。本発明の探索方法は、当業者らが適宜定めることができるが、例えば次の工程からなる：心不全モデル動物、好ましくは約４〜８週齢の心不全モデルマウスに、薬剤候補の化合物または物質を、静脈、皮下、筋肉内、経口等のルートで１日１〜数回に分けて、１または複数回投与する。投与する化合物または物質は、医薬用の溶媒または医薬用の希釈媒体により希釈して用いてもよく、あるいは水もしくは餌に混合して与えてもよい。心不全の予防もしくは治療効果の判定は、候補化合物の代わりに、同量の溶媒または媒体を投与したモデル動物に比べて、疾患の発症が抑制され、もしくは症状が軽減されていることにより判定する。試験には、陽性対照として、市販の心不全治療薬であるアンジオテンシン変換酵素阻害剤やカテコラミンベータ受容体遮断剤を与えた群をふくめてもよい。
本発明は、下記ｉ）〜ｉｉｉ）の物質の少なくとも１つを含有する、心不全予防および／または治療薬を提供する。
ｉ）上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子、
ｉｉ）上皮増殖因子と同様の生化学的作用を有する化合物、および
ｉｉｉ）上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子の細胞膜からの遊離を促進する物質
上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子としては、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、ＴＧＦ−α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−α）ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ、ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ、ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１−６などを例示することができる。
ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、ＴＧＦ−α、ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ、ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ、ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１−６、は昆虫細胞の蛋白合成系を利用して合成することができる。具体的には、これらのｃＤＮＡの蛋白翻訳部位をすべて含む配列をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣＴＭ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してウイルスベクターに組み込んだ後、昆虫細胞に導入し、その培養上清中の増殖因子を精製する。また合成蛋白は大腸菌、酵母、脊椎動物細胞を利用して合成してもよい。精製は培養上清を脱塩後、イオン交換樹脂、逆相クロマトグラフィー等を組み合わせて行う。あるいは、ペプチド合成により調製してもよい。（Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００２Ｆｅｂ；２４（１）：１１７−２２）（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｄｅｃ  ９；２６９（４９）：３１３１５−２１）
上皮増殖因子と同様の生化学的作用を有する化合物としては、細胞上の上皮細胞増殖因子受容体に２量体を作らせ活性化するような生化学的作用を有する化合物を挙げることができ、このような化合物は、上皮細胞増殖因子を発現した細胞に化合物を加え細胞増殖の程度によりスクリーニングしたり、上皮増殖因子受容体の３次元構造から類推した結合する化合物をスクリーニングして得ることができる。
上皮増殖因子のファミリーに属する増殖因子の細胞膜からの遊離を促進する物質としては、メタロプロテアーゼなどの酵素を例示することができる。メタロプロテアーゼは、昆虫細胞または大腸菌からリコンビナント蛋白を合成し、金属キレートカラムあるいはメタロプロテアーゼの阻害剤のアフィニティーカラムにて精製、調整するとよい（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ２００１；２１（２）：２６８−７４）。
ｉ）〜ｉｉｉ）の物質を心不全の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
上記のｉ）〜ｉｉｉ）の物質は、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に投与できる。例えば、ｉ）〜ｉｉｉ）の物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに製剤化することができる。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、心不全の治療目的で、ＨＢ−ＥＧＦを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につきＨＢ−ＥＧＦを約１０μｇ−２ｍｇ、好ましくは約１００μｇ−１ｍｇ、より好ましくは約３００μｇ−５００μｇ投与するとよい。非経口的に投与する場合は、ＨＢ−ＥＧＦの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、心不全の治療目的でＨＢ−ＥＧＦを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につきＨＢ−ＥＧＦを約１μｇ−２００μｇ、好ましくは約１０μｇ−１００μｇ、より好ましくは約３０μｇ−５０μｇ程度を注射することにより投与するとよい。他の動物の場合も、上記の成人（体重６０ｋｇ）に対する投与量に基づいてその動物の体重当たりの量に換算した量を投与することができる。
また、本発明は、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子またはその変異体が組み込まれたベクターであって、前記ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子またはその変異体を動物において発現しうる前記ベクターを含有する、心不全の遺伝子治療薬を提供する。
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子は公知の方法により調製することができ、例えば、マウスヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子は、後述の試験例１に記載の方法により、クローニングすることができる。あるいは、そのＤＮＡ配列情報に基づいて、市販のＤＮＡ合成機により合成してもよい。
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の変異体は、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子遺伝子の塩基配列に変異が生じたもの、具体的には、少なくとも１個の塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡである。この変異体は、ＨＢ−ＥＧＦと同様の生化学的作用（例えば、上皮増殖因子受容体を活性化する）を有する物質をコードするものであるとよい。このような変異体は、例えば、公知の遺伝子工学的手法によりＤＮＡ配列の一部又は全部を削除したり、他のＤＮＡを挿入、置換したりすることにより得られる。
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子またはその変異体は、心不全の治療・予防薬などの医薬として使用することができる。例えば、生体内においてＨＢ−ＥＧＦが減少・欠損している患者あるいは、ＨＢ−ＥＧＦが必要な量供給されない状態にある患者において（１）ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子またはその変異体を該患者に投与し、生体内でＨＢ−ＥＧＦを発現させることによって、（２）細胞にＨＢ−ＥＧＦ遺伝子またはその変異体を挿入し、ＨＢ−ＥＧＦを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、該患者におけるＨＢ−ＥＧＦの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子またはその変異体を心不全の治療・予防薬として使用する場合は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子またはその変異体を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子またはその変異体は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００２−１４１７９１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これは本発明の範囲を限定するためのものではない。実施例においてすべてのマウスは、大阪大学医学部附属動物実験施設（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）において、特定病原体フリー（ＳＰＦ）の条件下、環境的に調節されたクリーンルーム内で飼育した。ケージ、水ビン、木屑そして餌粒を含めたすべての器具及び糧食は、滅菌して用いた．また、本明細書中を通じて、結果の統計学的評価のために、ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を使用した。
（例１）ＨＢ−ＥＧＦの細胞膜からの遊離の際に蛋白分解酵素の標的となる配列に変異を導入し生体内でＨＢ−ＥＧＦが細胞膜から遊離されないマウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）の作出、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡクローニング
マウスＨＢ−ＥＧＦに対するゲノムＤＮＡは、マウスＨＢ−ＥＧＦのｃＤＮＡ全長（配列番号５）をプローブとして、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した１２９／ｓｖマウスゲノムファージライブラリから単離した。およそ９ｘ１０５のファージクローンをプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、そして３０個の陽性クローンを得た。これらのクローンがＨＢ−ＥＧＦをコードしているか否かを決定するために、ＨＢ−ＥＧＦプローブを用いた第２スクリーニングを別個に行った。この結果単一のファージクローン由来の３個のＨＢ−ＥＧＦ陽性クローンを得た。得られたクローンのいくつかの制限酵素によるゲノムクローンの消化及び部分配列決定により、ゲノムクローンの構造地図を作製した（図１）。得られたＨＢ−ＥＧＦクローンは、遺伝子の３０．４ｋｂをカバーし、そしてヒトＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のエクソン１からエクソン６に対応する相同配列を含んでいた。
ＨＢ−ＥＧＦターゲッティングベクターの構築
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のターゲッティングストラテジーを図１に示す。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のターゲッティングベクターを作製するために、単離したゲノムクローンの一部を制限酵素により削除し、そこにＨＢ−ＥＧＦ蛋白の１４８番目のリジンをセリンに１４９番目のプロリンをスレオニンに改変する変異を導入したＨＢ−ＥＧＦのｃＤＮＡ（以下ΔＨＢ−ＥＧＦ）（配列番号６）と陽性選択マーカー遺伝子（ＩＲＥＳ−ｎｅｏ  ｐｏｌｙＡカセット）（ＩＲＥＳはＩｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅの略−配列番号７、ｐｏｌｙＡはポリＡを意味する）を挿入した。上記のＨＢ−ＥＧＦのアミノ酸変異によりＨＢ−ＥＧＦの細胞膜からの遊離が阻害されることがｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験により確かめられている（Ｈｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ２８３：９１５−２２，２００１）。
ＨＢ−ＥＧＦのターゲッティングベクターの構築は、それぞれエクソン１及びイントロン３中のＳａｃＩＩ及びＨｉｎｄＩＩ１部位間の成熟ＨＢ−ＥＧＦについてのＮ−末端コード領域からエクソン３までを含む約６ｋｂのＤＮＡ断片を削除し、そしてΔＨＢ−ＥＧＦ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡカセットをＤＮＡ断片の代わりに挿入した。さらに陰性マーカーとしてジフテリア毒素Ａ断片遺伝子（ＤＴ）をチミジンキナーゼプロモーター調節下においてベクターの３’末端に挿入した（図１）。５’及び３’末端の相同領域は、それぞれ約７ｋｂ及び４ｋｂであった。
ターゲッティングベクターを導入したＥＳ細胞の作製
本発明において使用するＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ６＋ＣＢＡマウスから得られたＴＴ２細胞である。ＴＴ２細胞は、相沢慎一博士（実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社，１９９５）に記載されているように取得することができる。ＥＳ細胞に対してエレクトロポーレーションを行うことにより、１０７細胞あたり約２０−２５μｇの直鎖化ターゲッティングベクターを導入する。エレクトロポーレーションは例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ中で、２５０Ｖ及び５００μＦで行うことができる。次いで細胞を、ＥＳ培地（２０％ウシ胎児血清（シグマ）、マウス白血病阻止因子（ＬＩＦ，エズグロアムラド社）、ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク）、非必須アミノ酸（和光）、及びベータメルカプトエタノール（ナカライテスク）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ナカライテスク）中で、ネオマイシン（２００μｇ／ｍｌ，シグマ）を選択薬剤として用いて選択培養する。薬剤を含む培地は毎日交換する。
ネオマイシン存在下に生育した１１６個のＥＳクローンをプールし、それらからゲノムＤＮＡを単離した。クローンは相同組み換えが起こったかどうかを確認するため、サザンブロットハイブリダイゼーション法によってスクリーニングした。プライマー（５’−ＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号９）と５’−ＴＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号１０））で増幅された断片を５’プローブ（図１プローブＡ）として、そしてＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ−断片を３’プローブ（図１プローブＢ）として使用し、ターゲッティングされたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーション解析を行った。ＥＳ細胞から得られたゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、０．５％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションバッファー中（東洋紡）で３２Ｐで標識されたプローブＡ及びＢを用いて６８℃で行う。メンブレンは洗浄後フィルムに感光させ検出した。
サザンハイブリダイゼーションにより、ＨＢ−ＥＧＦの野生型アリル由来のバンドに相当する２１ｋｂ（プローブＡ）および９ｋｂ（プローブＢ）のバンド、及び変異アレル由来のバンドに相当する１６ｋｂ（プローブＡ）及び１１ｋｂ（プローブＢ）の予想されるＤＮＡバンドを検出した（図２）。このことはターゲッティングされるＥＳクローン中の野生型アレルのうち１つが、変異遺伝子により正しく置換されていることを示していた。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のターゲッティング効率は、６．０％であった。このうちターゲッティングされる遺伝子の生殖系列への導入は、２クローン中２クローンで確認された。
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）の作出
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子をターゲッティングしたＥＳ細胞を、受精胚中に移植する。移植する方法は当業者が適宜改変することができるが、本実施例においては、オリジナルの報告（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，８４２４−８４２８）から改変した、８細胞期胚に対するインジェクション法により、キメラ胚を作製した。すなわち、プラスチックディッシュ上の穴の中で、コンパクションを起こしていない８細胞期の透明体と割球の間にＥＳ細胞を入れ、そしてＢＢＷ培地またはＭ１６培地中で一晩培養し、その後十分に形成した胞胚を偽妊娠メスマウスの子宮内に移植した（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｎｉｐｕｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ，ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，１９９４）。インジェクション法において８細胞期胚として使用することができる胚の由来する系統は、純系どうしの交配に由来するものでも純系間での交配に由来するものでもよい。本発明においては、ＩＣＲのＦ１由来の胚を使用した。
ＥＳ細胞導入胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統のメスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色により、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認した。本実施例においては、前述した様に野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）系統（ＴＴ２）由来のＥＳ細胞を使用するため、作出したオスのキメラマウスを、黒色であるＣ５７ＢＬ６メスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）＋黒色（ｂｌａｃｋ）であることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認した。得られたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウスヘテロ接合体同士を交配させることにより、目的とする遺伝子改変ホモ接合体マウスを得た。
表現型解析
本実施例で作出されたＨＢ−ＥＧＦ改変マウスの仔において、ヘテロ接合体は健康で繁殖能力も有していた。ヘテロ接合体同士の交配で得られたマウスにおいて、相同組み換えされたＨＢ−ＥＧＦｐｒｏのアレルを持つかどうかを尻尾から単離されたＤＮＡを使用したＰＣＲにてスクリーニングを行った。
ＰＣＲ反応はプライマーＰ１：５’−ＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１１）及びＰ２：５’−ＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１２）さらにＰ３：５’−ＣＡＴＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＡＣ−３’（配列番号１３）ＰＣＲ反応バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，０．００１％のＴｗｅｅｎ２０，０．００１％のＮＰ−４０，５０％グリセロール，２５ｍＭＭｇＳＯ４，２ｍＭｄＮＴＰそして１Ｕ／μｌのポリメラーゼ（ＫＯＤＰｌｕｓ，東洋紡）にて行った。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃で１５秒、６２℃で３０秒，６８℃で１分を１サイクルとして３０サイクルの反応を行った。図３に示すようにヘテロ接合体ではＨＢ−ＥＧＦｐｒｏのアレルと野生型のアレル両方を，ホモ接合体ではＨＢ−ＥＧＦｐｒｏのアレルのみ持つことが確認された。またホモ接合体（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）はヘテロ接合体同士の交配でメンデル比に従って産まれることを見出した。このことはＨＢ−ＥＧＦの細胞膜からの遊離が阻害されても、胚発生においては重大な異常を来たさないことを示している。
ＨＢ−ＥＧＦの発現量を野生型のマウス（ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋マウス）と、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）で各組織のノーザンブロッティング法により比較した。ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋及びＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏの各臓器よりＲＮＡを抽出し、アガロースゲルにて展開後、ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションバッファー中（東洋紡）で３２Ｐで標識されたマウスＨＢ−ＥＧＦのｃＤＮＡ（配列番号５）をプローブとして使用し，６０℃で行う。メンプレンは２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの液（６０℃）で５分間２回洗浄し，その後フィルムに感光させ検出した。
外来遺伝子の導入により改変した遺伝子の発現量や各臓器での発現パターンが変化することもあるが本実施例においては図４に示すように、ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋マウスとほぼ同程度に各臓器で変異ＨＢ−ＥＧＦが発現していることが確認された。同時に変異ＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡは大きさが変異のないＨＢ−ＥＧＦと比して大きいためそれぞれの発現を明確に区別できた。図４においてＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスでは、下段バンドが殆ど検出できなかったため、変異のないＨＢ−ＥＧＦの発現はほぼ完全に阻害されていることが示された。すなわちＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスでは変異のないＨＢ−ＥＧＦの発現は遺伝子の改変によりほぼ完全に抑制され、細胞膜から遊離されない変異ＨＢ−ＥＧＦのみが発現していることが確認された。またその発現量は各臓器でＨＢ−ＥＧＦ＋／＋マウスの変異のないＨＢ−ＥＧＦと同程度であったことが示された。
ＨＢ−ＥＧＦ変異ホモ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）は胎児期発生には重大な障害は見られないものの、早期に死亡することが確認された。その生存曲線を同条件で飼育した野生型マウス（ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋マウス）と比較した（図５）。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスは半数が約１８週で死亡した。
死亡したＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスを解剖したところ、もっとも顕著な所見は心拡大で、重度の肺臓と肝臓のうっ血を伴っていた（図６、７）。冠動脈、心臓弁膜、大血管系には殆ど異常は見られなかった。また他の臓器にも死因となる病的所見が見られなかったため死因は心不全によることが推察された。
ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスは死亡数日前には、極端に運動能が低下すること及びメスのＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスは出産後早期に子宮血流の還流によると思われる心臓負荷により心不全死を呈することが多いことがＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスの心機能のき弱性を示唆する。
ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス及びＨＢ−ＥＧＦ＋／＋マウスの生存時（生後１２週）の心機能を観察するため、心エコー等による心機能の追跡を行った。心エコーはペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔したのち  ＳＯＮＯＳ  ５５００，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄにて１５−Ｍｈｚのトランスデューサーを使用して経胸的に行った。同時に心電図（ＳＰ９７，Ｓｏｆｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ）、血圧及び脈拍（ＢＰ９８−Ａ，ｓｏｆｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）の測定を行った。
心エコーによる観察ではＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋マウスに比し有意に左心室内腔が収縮期拡張期共に拡張し、壁運動が全周性に低下していた。局所壁短縮率（％ＦＳ＝（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ））も著明に低下していた（図８）。なお血圧は軽度に低下し、心拍数は軽度に増加している傾向にあり、心機能の低下を反映するものと考えられた。
組織学的な観察は生後１２週のマウスを４％パラホルムアルデヒドにより還流固定した後、１晩浸潤固定し、脱水後パラフィン包埋した。ミクロトームにより６μｍの切片を作製後ヘマトキシリン・エオジン染色、アザンマロリー染色により観察した。
生後１２週のＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスでは、両心室共に拡大し心筋の全層にわたって心筋細胞の変性が観察された（図９，１０，１１）。心筋細胞は大小不同・空砲変性等をきたし変性の強い箇所では心筋細胞が線維性の組織に置換されるている像（線維化）が見られた（図１１）。これらの心筋変性は生後４週までの心筋組織では顕著ではなく８週を超えた組織で見られるようになり、１２週以降では繊維化を伴った心筋の脱落が顕著になった。４、８，１２週の各時期において炎症細胞の浸潤や冠動脈を含めた血管の異常は殆ど見られずこの心筋変性に自己免疫機序、心筋炎や虚血等の関与は少ないと考えられた。対象となる同一条件で飼育したＨＢ−ＥＧＦ＋／＋マウスでは上記の異常は殆ど見られなかった。
次に電子顕微鏡による観察を行った。生後１２週のＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスを２．５％のグルタールアルデヒドで還流固定したあとエポン樹脂に包埋後ウルトラミクロトームにより約３０ｎｍの切片を作製し観察した。電子顕微鏡上で変性した心筋は収縮構造の消失やミトコンドリアの変化など非特異的な所見が見られたが、蓄積疾患を思わす所見やアミロイドーシスなどの間質の異常等は観察されなかった。
ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスは以下の理由によりヒトの特発性拡張型心筋症ときわめて類似したモデル動物である。まず第一にＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスは若年で発症し心筋細胞自体の変性をきたす心不全により早期に死亡する。次に心筋変性を２次的に起こす他の病態、例えば、高血圧、自己免疫性心筋炎、感染性心筋炎、虚血性心筋障害、アミロイドーシスやＦａｂｒｙ病などの蓄積疾患、などの関与が生理学的・組織学的な検討により極めて低いと思われる。最後に筋ジストロフィーなどの筋肉の興奮収縮連関にかかわる因子の異常によって起こる筋肉疾患で見られる骨格筋や横隔膜などの他の筋肉の異常は観察した範囲では殆どなく心筋細胞のみが特異的に進行性に変性する。以上より  ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスは主として心筋細胞の変性を主体に発症する拡張型心筋症のモデル動物として心不全の病態解明や心不全治療薬のスクリーニングに使用可能である。
（例２）ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子欠損マウスの作出；ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノムＤＮＡクローニング、ターゲッティングベクターの構築
マウスＨＢ−ＥＧＦに対するゲノムＤＮＡは、試験例１と同じものを使用した。ＨＢ−ＥＧＦのターゲッティングベクターの構築は、それぞれエクソン１及びイントロン３中のＳａｃＩＩ及びＥｃｏＲＶ部位間の成熟ＨＢ−ＥＧＦについてのＮ−末端コード領域からエクソン３までを含む約６ｋｂのＤＮＡ断片を削除し、そして  ｌｏｘＰ−ＨＢ−ＥＧＦ−ｐｏｌｙＡ−ｌｏｘＰ−ｌａｃＺ−ｐＡカセット（ｌｏｘＰにはさんだＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡ領域をｌｏｘＰ配列とあわせて配列番号８にしめす、この配列のあとにさらにｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅにつないだｌａｃＺ遺伝子を挿入している）をＤＮＡ断片の代わりに挿入した。また薬剤選択マーカーとしてネオマイシン遺伝子をＰＧＫプロモーター下にいれたものをベクターの３’側に導入した。さらに陰性マーカーとしてジフテリア毒素Ａ断片遺伝子（ＤＴ）をチミジンキナーゼプロモーター調節下においてベクターの５’末端に挿入した（図１２）。５’及び３’末端の相同領域は、それさぞれ約７ｋｂ及び９ｋｂであった。
ターゲッティングベクターを導入したＥＳ細胞の作製
本実施例において使用したＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ６＋ＣＢＡマウスから得られたＴＴ２細胞である。ＴＴ２細胞は、相沢慎一博士（実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティングーＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社，１９９５）に記載されているように取得した。ＥＳ細胞に対してエレクトロポーレーションを行うことにより、１０７細胞あたり約２０−２５μｇの直鎖化ターゲッティングベクターを導入した。エレクトロポーレーションは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ中で、２５０Ｖ及び５００μＦで行った。次いで細胞を、ＥＳ培地（２０％ウシ胎児血清（シグマ）、マウス白血病阻止因子（ＬＩＦ，エズグロアムラド社）、ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク）、非必須アミノ酸（和光）、及びベータメルカプトエタノール（ナカライテスク）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ナカライテスク）中で、ネオマイシン（２００ｕｇ／ｍｌ，シグマ）を選択薬剤として用いて選択培養した。薬剤を含む培地は毎日交換した。
ネオマイシン存在下に生育した２２８個のＥＳクローンをプールし、それらからゲノムＤＮＡを単離した。クローンは相同組み換えが起こったかどうかを確認するため、サザンブロットハイブリダイゼーション法によってスクリーニングした。プライマー（５’−ＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号９）と５’−ＴＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号１０））で増幅された断片を５’プローブ（図１２プローブＡ）として、そしてプライマー（５’−ＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧ−３’（配列番号１５）と５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＴＡＡＧ−３’（配列番号１６）増幅された断片を３’プローブ（図１２プローブＢ）として使用し、ターゲッティングされたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーション解析を行った。ＥＳ細胞から得られたゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、０．５％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションバッファー中（東洋紡）で３２Ｐで標識されたプローブＡ及びＢを用いて６８℃で行う。メンブレンは洗浄後フィルムに感光させ検出した。サザンハイブリダイゼーションにより、ＨＢ−ＥＧＦの野生型アリル由来のバンドに相当する２１ｋｂ（プローブＡ）および９ｋｂ（プローブＢ）のバンド、及び変異アレル（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ）由来のバンドに相当する１６ｋｂ（プローブＡ）及び１５ｋｂ（プローブＢ）の予想されるＤＮＡバンドを検出した（図１３）。このことはターゲッティングされるＥＳクローン中の野生型アレルのうち１つが、変異型遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ）により正しく置換されていることを示していた。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のターゲッティング効率は、２．８％であった。このうちターゲッティングされる遺伝子の生殖系列への導入は、２クローン中２クローンで確認された。
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子欠損マウス（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウス）の作出
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子をターゲッティングしたＥＳ細胞を、受精胚中に移植する。移植する方法は当業者が適宜改変することができるが、本実施例においては、オリジナルの報告（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，８４２４−８４２８）から改変した、８細胞期胚に対するインジェクション法により、キメラ胚を作製した。すなわち、プラスチックディッシュ上の穴の中で、コンパクションを起こしていない８細胞期の透明体と割球の間にＥＳ細胞を入れ、そしてＢＢＷ培地またはＭ１６培地中で一晩培養し、その後十分に形成した胞胚を偽妊娠メスマウスの子宮内に移植した（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｎｉｐｕｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ，ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，１９９４）。インジェクション法において８細胞期胚として使用することができる胚の由来する系統は、純系どうしの交配に由来するものでも純系間での交配に由来するものでもよい。本実施例においては、ＩＣＲのＦ１由来の胚を使用した。
ＥＳ細胞導入胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統のメスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色により、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認した。本実施例においては、前述した様に野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）系統（ＴＴ２）由来のＥＳ細胞を使用するため、作出したオスのキメラマウスを、黒色であるＣ５７ＢＬ６メスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）＋黒色（ｂｌａｃｋ）であることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認した。この操作により、クレリコンビナーゼ認識配列を含んだＨＢ−ＥＧＦ遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘアレル）を導入したヘテロ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ／＋）を作成できた。さらにこのヘテロ接合体マウスの雌雄を交配しホモ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ／ｌｏｘ）を作成し、次にクレリコンビナーゼを恒常的に発現するマウス（Ｓａｋａｉ  Ｋ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：３１８−２４，１９９７）と交配させることによりＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のクレリコンビナーゼ認識配列（ＬｏｘＰ配列）にはさまれた部分を欠損したヘテロ接合体マウスを作製できた（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／＋）。さらに得られたヘテロ接合体マウスの雌雄を交配することにより，ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を欠損したホモ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌ）を作製することができた。各個体において尻尾のゲノムＤＮＡを採取しＨＢ−ＥＧＦが正しく欠損しているかをサザンブロッティングにより確認した。採取されたゲノムＤＮＡをＫｐｎ１で制限酵素消化した後、電気泳動で展開し、３’プライマー（５’−ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号１７）と５’プライマー５’−ＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号１８））で増幅された断片をＬｏｘプローブとして使用しサザンブロッティングにより検出したところ、図１４に示したように野生型マウス（ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋）ではみられた９ＫｂのバンドがＨＢ−ＥＧＦｌｏｘアレルをホモに持つマウス（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ／ｌｏｘ）では消失し２ｋｂのバンドのみとなり、さらにＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウスでは２ｋｂのバンドが消失し両方のアレル共にＬｏｘＰではさまれたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子部分が完全に欠損したことを示す５．３ｋｂのバンドのみが検出された。
表現型解析
本実施例で作出されたＨＢ−ＥＧＦ欠損マウスの仔において、ヘテロ接合体（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／＋）は健康で繁殖能力も有していた。またホモ接合体（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウス）もヘテロ接合体同士の交配でメンデル比に従って産まれることを見出した。このことは、ＨＢ−ＥＧＦが欠損しても、胚発生においては重大な異常を来たさないことを示している。
ＨＢ−ＥＧＦ欠損マウスホモ接合体（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウス）におけるＨＢ−ＥＧＦの発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって確認したところＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウスではＨＢ−ＥＧＦは殆ど発現されていないことが示され、ＨＢ−ＥＧＦゲノムＤＮＡの機能の欠損が確認された（図１５）。
ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウスは胎児期発生には重大な障害は見られないものの、早期に死亡することが確認された。また生後１２週における心臓エコーにより心拡大と全周性の心臓壁運動の低下が観察され（図１６）、生後１２週で解剖した結果両心室の著明な拡大を認めた（図１７）。
ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウスとＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウスが類似した表現型（心筋細胞変性による心不全）を示したことにより、心筋細胞の機能維持には細胞膜に結合した状態のＨＢ−ＥＧＦが蛋白分解酵素による分解を受け遊離型となり作用することが必要であることが示された。したがってＨＢ−ＥＧＦは心筋特異的にその機能維持に重要な役割をになっておりＨＢ−ＥＧＦの補充やＨＢ−ＥＧＦの遊離を促進する化合物が心不全の治療に利用できることが示唆された。
そこでＨＢ−ＥＧＦの心筋保護作用を検討するためラット培養心筋細胞を使用して検討した。
（１）Ｃ５７ＢＬ６マウス生直後１〜２日目の心臓を取り出し、細断し、ＰＢＳにて２回洗う。１００ｍｌの三角フラスコに細断した心臓を入れ、コラゲナーゼ入りＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ）を２０ｍｌ添加後、３７℃１３分間、振盪しながら細胞を分離した。これにＤＭＥＭ培養液を加え遠心した後、集めた細胞をコラゲナーゼ入りＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ）２０ｍｌに添加して、３７℃１３分間でさらに細胞を分離し、ＤＭＥＭ培養液添加後遠心するクールを２回行った。遠心にて収集した細胞をＤＭＥＭ細胞中に再分散させ、３７℃で９５％空気−５％二酸化炭素飽和水蒸気状態で１時間インキュベートした。線維芽細胞を除去後、９６ウェルに得られた心筋細胞を撒いた。培養１日後、１０％仔牛血清入りＤＭＥＭ培養液にて培地交換を行い、その後３日間培養した。４日目に血清無しのＤＭＥＭ培養液（１００μｌ／ｗｅｌｌ）に培地交換し、培養５日目にリコンビナントＨＢ−ＥＧＦを１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−８Ｍ、１０−１０Ｍの濃度にて添加し、１８時間培養した。培養６日目にＨ２Ｏ２（１０−４Ｍ）を添加し、さらに４８時間培養した。培養８日目にＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μｌを各上清に添加し、３７度にて１時間インキュベート後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
（２）心筋生存作用
Ｈ２Ｏ２添加による酸化ストレスによる心筋障害の程度をＭＴＳ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ）を使用した上記のＰｒｏｍｅｇａ社のアッセイキットにて評価した。Ｈ２Ｏ２添加による心筋障害の程度は、ＨＢ−ＥＧＦの前投与により有意に改善した。結果の一例を図１８に示す。これらの試験結果から明らかなように、ＨＢ−ＥＧＦは、過酸化水素の酸化ストレスによる心筋障害に対して優れた防御作用を有した。したがって、ＨＢ−ＥＧＦ等ＥＧＦ受容体の活性を起こす物質は、心筋梗塞などの虚血性心疾患や心臓手術時の虚血状態における心筋障害ならびに種々の疾患より生じる心不全などの様々な心疾患の治療、診断、予防薬剤として有用である。
ＨＢ−ＥＧＦはその欠損により重大な心筋障害を起こすのみならず、酸素ラジカル等による心筋障害に対して優れた心筋保護作用を有する。従って、本発明ＨＢ−ＥＧＦは特発性拡張型心筋症、心筋梗塞等の虚血性心疾患、心筋炎などにおける心筋障害並びに心不全を引き起こす種々な心疾患の治療、予防薬剤として有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明のＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウスは、ＨＢ−ＥＧＦが心不全という病態においてどのような働きをしているかを調べるための試験に用いることができる。
特に、本発明の心不全を発症するＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変動物は、心不全、例えば拡張型心筋症の発症の研究に使用できるばかりでなく、それら疾患の治療薬の探索に使用することもできる。
配列表フリーテキスト
配列番号１は、エクソン１及び２を含むマウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノム配列を示す。
配列番号２は、エクソン３を含むマウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノム配列を示す。
配列番号３は、エクソン４を含むマウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノム配列を示す。
配列番号４は、エクソン５及び６を含むマウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のゲノム配列を示す。
配列番号５は、マウスＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号６は、マウスＨＢ−ＥＧＦｐｒｏアレルの変異ｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号７は、ＩＲＥＳ配列を示す。
配列番号８は、マウスＨＢ−ＥＧＦ  ｌｏｘ  ｏｕｔアレルの変異ｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号９は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１０は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１１は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１２は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１３は、ｌｏｘ  Ｐサイトの塩基配列を示す。
配列番号１４は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１５は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１６は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１７は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号１８は、プライマーの塩基配列を示す。
【配列表】
2003096804.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）作製用ターゲッティングベクターの構築を示す。Ｅ１−Ｅ６；ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子のエクソン１−６、Ｈ；ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、Ｘ；ＸｈｏＩ、Ｓ；ＳａｃＩＩ、ＩＲＥＳ；Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＮＥＯ；ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、  ｐＡ；ｐｏｌｙ  Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＤＴ−Ａ；ｄｉｐｈｔｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａ、ＴＫ；ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  １４８：Ｌ→Ｓおよび１４９：Ｐ→Ｔは、それぞれ、ＨＢ−ＥＧＦ蛋白の１４８番目のリジンをセリンに、１４９番目のプロリンをスレオニンに改変する変異を導入したことを示す。
図２は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）作製用ベクターが導入されたＥＳ細胞のサザンブロッティング法による検索結果を示す。ＥＳ細胞の相同遺伝子のうち片方が改変遺伝子により相同組み換えされていることがわかる。
図３は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏマウス）作製用ベクターが導入されたＥＳ細胞を使用して作製されたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変ヘテロ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／＋）、さらにそれらの交配によりうまれたＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変ホモ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏ）の尻尾から採取したＤＮＡのＰＣＲによるスクリーニング結果を示す。ゲノムＤＮＡ遺伝子上の操作によりＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変マウスが作製できたことを示す。＋／＋は、野生型マウス（ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋）を示す。
図４は、野生型マウス（ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋）及びＨＢ−ＥＧＦ遺伝子改変ホモ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏ）の各臓器でのＨＢ−ＥＧＦ及び変異ＨＢ−ＥＧＦの発現をノーザンブロッティング法により検討した結果を示す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏは遺伝子改変によりＨＢ−ＥＧＦ＋／＋よりサイズが大きい変異ＨＢ−ＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡを発現する。各臓器でＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋の野生型ＨＢ−ＥＧＦとほぼ同量の変異型ＨＢ−ＥＧＦを発現していた。
図５は、ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏ及びＨＢ−ＥＧＦ＋／＋の生存曲線の比較を示す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し早期に死亡した。
図６は、生後１２週におけるＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏ及びＨＢ−ＥＧＦ＋／＋の開胸時の所見を示す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し心臓が著明に拡大している。
図７は、図６の心臓をホルマリンにより還流固定した後、取り出したものを示す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し心臓及び心耳の拡大が観察された。
図８は、生後１２週におけるＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏ及びＨＢ−ＥＧＦ＋／＋の生理学的検査結果を示す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し左心室内腔が拡大し、収縮性も低下していた。（ＬＶＤｄ；左心室拡張末期径、ＬＶＤｓ；左心室収縮末期径、ＦＳ；左室駆出率、ｓＢＰ；収縮期血圧、ｄＢＰ；拡張期血圧、ＨＲ；心拍数）
図９は、図７の心臓をパラフィン包埋後、左心室の乳頭筋レベルで輪切りにしヘマトキシリン・エオジン染色したものを示す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し左心室、右心室の内腔の拡大を認め、内腔の拡大に比し左心室壁の壁厚は相対的に薄かった。
図１０は、図９と同切片をアザンマロリー染色しさらに拡大したものを示す。青く染まる線維化部位を強調した。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し貫壁性に線維化が進行していることが観察される。
図１１は、図９と同切片の拡大像を示す。ＨＢ−ＥＧＦｐｒｏ／ｐｒｏはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し線維化が著明で心筋線維は変性し、大小の不同をきたしている。炎症細胞浸潤等はみられない。
図１２は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子欠損マウス（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌ）の作製に使用したターゲッティングベクターを示す。Ｋ；ＫｐｎＩ、Ｖ；ＥｃｏＲＶ、ＮＴＲ−ｌａｃＺ；ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｌａｃＺ、ＰＧＫ；ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ
図１３は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子欠損マウス（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ／ｌｏｘ）作製用ベクターが導入されたＥＳ細胞のサザンブロッティング法による検索結果を示す。ＥＳ細胞の相同遺伝子のうち片方がＨＢ−ＥＧＦｌｏｘアレルにより相同組み換えされていることがわかる。
図１４は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子欠損マウス（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウス）作製用ベクターが導入されたＥＳ細胞を使用して作製された各種マウスの尻尾から採取したＤＮＡのサザンブロッティングによるスクリーニングの結果を示す。ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘアレルをヘテロで持つマウス（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ／＋）の交配によりできたホモ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｌｏｘ／ｌｏｘ）とクレリコンビナーゼを発現するマウスとの交配によりＨＢ−ＥＧＦの遺伝子が完全に欠損したマウス（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌマウス）を作製できたことを示す。
図１５は、野生型マウス（ＨＢ−ＥＧＦ＋／＋）及びＨＢ−ＥＧＦ遺伝子欠損ホモ接合体マウス（ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌ）の各臓器でのＨＢ−ＥＧＦの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した結果を示す。ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌは遺伝子欠損によりＨＢ−ＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡを殆ど発現していなかったことが組織のＲＴ−ＰＣＲ解析により明らかになった。
図１６は、生後１２週におけるＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌ及びＨＢ−ＥＧＦ＋／＋の心エコー法による観察結果を示す。ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し内腔が拡大し、壁運動も低下していた。（ｓは収縮期左心室内径、ｄは拡張期左心室内径をあらわす）
図１７は、生後１２週におけるＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌ及びＨＢ−ＥＧＦ＋／＋の心臓をホルマリンにより還流固定した後、取り出したものを示す。ＨＢ−ＥＧＦｄｅｌ／ｄｅｌはＨＢ−ＥＧＦ＋／＋に比し心臓及び心耳の拡大が観察された。
図１８は、ラット培養心筋細胞におけるＭＴＳの還元度を吸光度により測定したものである。吸光度が高いほど細胞の生存度が高いことを示す。ＨＢ−ＥＧＦの添加により心筋細胞の生存度が上昇することを示す。
（＊Ｐ＜０．０００１  ｖｓ  Ｈ２Ｏ２＋ＨＢＥＧＦ−、＃Ｐ＜０．００１  ｖｓ  Ｈ２Ｏ２＋ＨＢＥＧＦ−、＄Ｐ＜０．０５  ｖｓ  Ｈ２Ｏ２＋ＨＢＥＧＦ−）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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