(57)【要約】高度に純化したミラフィオリレタスウイルスからその外被タンパク質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列の情報を基に設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、ミラフィオリレタスウイルス外被タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、その一次構造を解明した。得られた配列情報を基に設計したプライマーを用いた５’ＲＡＣＥを実施することにより、ミラフィオリレタスウイルス外被タンパク質をコードする複数のＤＮＡ分子を単離するとともに、その一次構造を決定することに成功した。これを利用してミラフィオリレタスウイルス抵抗性植物の作出およびミラフィオリレタスウイルスの感染の診断を行なうことが可能であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミラフィオリレタスウイルスの外被タンパク質をコードする下記（ａ）または（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ａ）に記載の核酸。
【請求項２】
ＲＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸の相補鎖に相補的なセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２に記載の核酸と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２に記載の核酸を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項３に記載の核酸または請求項７に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸によりコードされるタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項９に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
請求項４から６のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸、請求項４から６のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項７もしくは１２に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１７】
ミラフィオリレタスウイルスの感染を診断する方法であって、植物細胞またはミラフィオリレタスウイルスの媒介菌であるＯｌｐｉｄｉｕｍ  ｂｒａｓｓｉｃａｅにおける、請求項１に記載の核酸または請求項９に記載のタンパク質を検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードする核酸および該核酸によりコードされるタンパク質、並びにそれらの製造および用途に関する。
【背景技術】  ミラフィオリレタスウイルス（ＭｉＬＶ）は、２０００年イタリアでビッグベイン症状を示したレタスより分離され（Ｐ．Ｒｏｇｇｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４５：２６２９−２６４２）、２００２年にはレタスビッグベイン病の病原ウイルスはレタスビッグベインウイルス（ＬＢＶＶ）ではなく、本ウイルスではないかという報告がされた（Ｈ．Ｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９２：２８８−２９３）。本ウイルスはＯｌｐｉｄｉｕｍ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（糸状菌）によって伝搬する土壌伝搬性ウイルスで、アメリカ、日本、ヨーロッパでレタスビッグベイン病を発生させ問題となっている。本ウイルスはＯｐｈｉｏｖｉｒｕｓに属し、３分節ゲノムのマイナス鎖ＲＮＡからなり、それぞれの大きさは８．５、１．９および１．７ｋｂで４８ｋＤａの外被タンパクを構造タンパクとして持っていることが報告されている。本ウイルスは最近発見されたためにその遺伝子情報などは明らかとされておらず、的確な遺伝子学的な診断法の確立が行われていない。
本ウイルス病に対する抵抗性品種は数品種あるがその抵抗性は低く、また、有用な抵抗性素材も見つかっていない。そこで、本ウイルスに対する強度抵抗性の植物を作出するには、ウイルス遺伝子を植物に導入する方法が有用である。そのためにはウイルスの遺伝子配列を決定する必要がある。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を単離し、その構造を解明することを目的とする。また、本発明は、植物における該核酸またはそのアンチセンスの発現を通じて、植物にミラフィオリレタスウイルスに対する抵抗性を付与することを目的とする。さらに、本発明は、該核酸あるいは該核酸によりコードされるタンパク質を検出することによるミラフィオリレタスウイルスの感染を診断する方法を提供することも目的とする。
ミラフィオリレタスウイルスはＲＮＡウイルスであり、該ウイルスのタンパク質をコードするＤＮＡまたはそのアンチセンスＤＮＡを植物体内で発現させれば、転写レベルあるいは翻訳レベルでミラフィオリレタスウイルスタンパク質の産生や機能を阻害することができると考えられる（Ｐ．Ｆ．Ｔｅｎｎａｎｔ，（１９９４），Ｐｈｙｔｏｐａｔｏｌｏｇｙ  ８４，１３５９−１３６６、Ｃ．Ｃ．Ｈｕｎｔｌｅｙ  ＆  Ｔ．Ｃ．Ｈａｌｌ，（１９９３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９２，２９０−２９７、Ｄ．Ｃ．Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，（１９９６），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，８，１８３３−１８４４）。
本発明者等は、このような発想に着目してミラフィオリレタスウイルスに対する抵抗性植物を作製するため、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードする遺伝子の単離を行なった。
具体的には、本発明者らは、まず、ミラフィオリレタスウイルスを高度に純化し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、該ウイルスを構成する外被タンパク質を検出した。この検出された外被タンパク質を精製し、ペプチドに分解後エドマン法によりその部分のアミノ酸配列を決定した。さらに、決定したアミノ酸配列の情報を基に設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、ミラフィオリレタスウイルス外被タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、その一次構造を決定した。
次いで、ミラフィオリレタスウイルスの全外被タンパク質をコードする遺伝子を決定するために、純化ウイルスからＲＮＡを調製し、このＲＮＡ分子を用いて５’ＲＡＣＥ（ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓ）を実施した。その結果、ミラフィオリレタスウイルス外被タンパク質をコードする複数のＤＮＡ分子を単離するとともに、その一次構造を決定することに成功した。
単離したＤＮＡ分子またはそのアンチセンス分子は、その発現により植物体にミラフィオリレタスウイルス抵抗性を付与することが可能であり、これにより植物の生産性の向上を図ることができる。また、単離したＤＮＡ分子の配列情報を基にミラフィオリレタスウイルス特異的プライマーを設計し、これを利用することによりミラフィオリレタスウイルスの遺伝診断を行うことも可能である。また、得られた配列情報を基に、ミラフィオリレタスウイルス外被タンパク質に結合する抗血清を作製して、これをミラフィオリレタスウイルスの血清学的診断法に利用することも可能である。
本発明は、以上のような知見を基に完成されたものであり、ミラフィオリレタ  スウイルスタンパク質および該タンパク質をコードする核酸、並びにそれらの製造および用途を提供する。より詳しくは、本発明は、
（１）  ミラフィオリレタスウイルスの外被タンパク質をコードする下記（ａ）または（ｂ）の核酸、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ａ）に記載の核酸。
（２）  ＲＮＡである、（１）に記載の核酸、
（３）  ＤＮＡである、（１）に記載の核酸、
（４）  （２）に記載の核酸の相補鎖に相補的なセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（５）  （２）に記載の核酸と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（６）  （２）に記載の核酸を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（７）  （３）に記載の核酸を含むベクター、
（８）  （３）に記載の核酸または（７）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
（９）  （１）に記載の核酸によりコードされるタンパク質、
（１０）  （９）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（１１）  （８）に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（９）に記載のタンパク質の製造方法、
（１２）  （４）から（６）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
（１３）  （１）に記載の核酸、（４）から（６）のいずれかに記載のＤＮＡ、または（７）もしくは（１２）に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
（１４）  （１３）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
（１５）  （１４）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（１６）  （１４）または（１５）に記載の形質転換植物体の繁殖材料、および
（１７）  ミラフィオリレタスウイルスの感染を診断する方法であって、植物細胞またはミラフィオリレタスウイルスの媒介菌であるＯｌｐｉｄｉｕｍ  ｂｒａｓｓｉｃａｅにおける、（１）に記載の核酸または（９）に記載のタンパク質を検出することを特徴とする方法、
を提供するものである。
本発明は、ミラフィオリレタスウイルスの外被タンパク質および該タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明に含まれる、本発明者らにより単離されたミラフィオリレタスウイルスの外被タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示した。単離したｃＤＮＡは１５１４ｂｐの塩基配列からなり、４３７アミノ酸をコードしていた。これはミラフィオリレタスウイルスの遺伝子およびタンパク質の一次構造を示した初めての例である。
本発明のタンパク質をコードする核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。このＤＮＡにはｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれ、また、ＲＮＡにはウイルスゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡが含まれる。本発明の核酸は、当業者にとって常套手段を利用して調製することが可能である。具体的には、純化ウイルスをＳＤＳ−フェノール法などの方法で除タンパク質して調製したＲＮＡ、あるいはＣＴＡＢ法などでウイルス感染葉から抽出した全核酸を鋳型として、本発明の核酸の配列から設計したプライマーあるいはランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なうことで第一鎖ＤＮＡを合成できる。この方法で作製した第一鎖ＤＮＡから、Ｇｕｂｌｅｒ  ＆  Ｈｏｆｆｍａｎ法（Ｕ．Ｇｕｌｂｅｒ  ＆  Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ，（１９８３），Ｇｅｎｅ  ２５，２６３）により第二鎖ＤＮＡを合成し、市販の数々のプラスミドあるいはファージミドベクターにクローニングできる。あるいは、第一鎖ＤＮＡを鋳型とし、本発明の核酸の配列から設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により本ウイルスのＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔベクターなどを用いたＴＡクローニング、あるいはプライマーに制限酵素サイトを付けることにより市販の数々のプラスミドベクターにクローニングできる。
本発明の核酸は、組換えタンパク質の調製やミラフィオリレタスウイルス抵抗性植物の作出に利用することもできる。
組換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、発現ベクターを変えることにより、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍ．Ｍａｎｄｅｌ，＆  Ａ．Ｈｉｇａ，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５８−１６２、Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，（１９８３），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，５５７−５８０）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することができる。組換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去した血清より調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明の抗体には、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれら抗体の断片が含まれる。
ミラフィオリレタスウイルス抵抗性植物を作出する場合には、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質の産生や機能を抑制するＤＮＡを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させればよい。
ミラフィオリレタスウイルスタンパク質の産生や機能を抑制するＤＮＡとしては、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードするＲＮＡのいずれかの鎖（センス鎖またはその相補鎖）にハイブリダイズするＲＮＡをコードするＤＮＡを用いることができる。
ウイルスゲノムのセンス鎖およびｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、本発明者らにより単離された配列番号：２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、好ましくは配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡの転写産物に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。ここで「相補的」とは、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質の産生を有効に阻害できる限り、完全に相補的でない場合も含まれる。転写されたＲＮＡは、標的とするミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードするＲＮＡに対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。ここで「相補性」とは、２つの配列の対応する領域を、相補的塩基対の数が最大となるように整列させた場合における、該領域における全塩基数に対する相補的塩基対を形成した塩基数の％である。
ウイルスゲノムＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズするＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、本発明者らにより単離された配列番号：２に記載のタンパク質をコードするＲＮＡ、好ましくは配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＲＮＡの相補鎖に相補的なセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを用いることができる。ここで「相補的」とは、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質の産生を有効に阻害できる限り、完全に相補的でない場合も含まれる。転写されたセンスＲＮＡは、標的とするミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードするＲＮＡ（相補鎖）に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。
効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、上記アンチセンスＲＮＡやセンスＲＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上であり、通常、５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
また、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質の産生を抑制するＤＮＡとしては、ミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードするＲＮＡの少なくとも一方の鎖を切断するリボザイムをコードするＤＮＡを用いることも可能であると考えられる。
リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，（１９９０），蛋白質核酸酵素，３５：２１９１）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５、小泉誠および大塚栄子，（１９９６），蛋白質核酸酵素，３５：２１９１、Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７０５９）。例えば、本発明の遺伝子（配列番号：１）中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３：３４９，１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｙ．Ｋｉｋｕｃｈｉ  ＆  Ｎ．Ｓａｓａｋｉ，（１９９２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１、菊池洋，（１９９２）化学と生物３０：１１２）。
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたＲＮＡの５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｋ．Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．３：７３３、Ａ．Ｍ．Ｄｚｉａｎｏｔｔ  ＆  Ｊ．Ｊ．Ｂｕｊａｒｓｋｉ，（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：４８２３、Ｃ．Ａ．Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ  ＆  Ｒ．Ｔ．Ｃｅｃｈ，（１９９１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３８７５、Ｋ．Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１２５）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｎ．Ｙｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：１２７１）。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入されたＤＮＡを発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。好適なベクターとしては、例えば、ｐＢＩバイナリーベクターが挙げられる。ベクターの導入される「植物細胞」には特に制限はないが、本発明の目的から、ミラフィオリレタスウイルスが感染性を有する植物が好適である。ミラフィオリレタスウイルスが感染性を有する植物としては、レタス以外に、例えば、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ（アカザ科）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（ナス科）（Ｐ．Ｒｏｇｇｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４５：２６２９−２６４２）が挙げられる。「植物細胞」の形態は、植物体への再生が可能である限り、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、ポリカチオン法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、文献（Ｓ．Ｚ．Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９：８９９−９０９）に記載の方法は好適な方法の一例である。
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。好適な再生の方法としては、例えば、文献（Ｓ．Ｅｎｏｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：６−９）に記載の方法が挙げられる。
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
また、本発明は、ミラフィオリレタスウイルスの感染を診断する方法を提供する。本発明の診断方法の一つの態様は、プライマーあるいはプローブを利用したミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードするＲＮＡを検出することを特徴とする方法である。このようなプローブやプライマーとしては、配列番号：２に記載のミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードするＤＮＡに相同的または相補的な少なくとも１５ヌクレオチドからなる核酸を用いることができる。該核酸は、好ましくは配列番号：２に記載のミラフィオリレタスウイルスタンパク質をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸である。
プライマーやプローブは必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射標識が挙げられる。
この診断においては、例えば、ミラフィオリレタスウイルスに感染したことが疑われる植物、本ウイルスを保毒していると疑われるＯｌｐｉｄｉｕｍ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、あるいは本菌を含む土壌から被検試料を調製し、該試料に対し、上記のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法あるいは上記のプローブを利用したノーザンブロッティング法を実施すればよい。
本発明の診断方法の他の一つの態様は、抗体を利用したミラフィオリレタスウイルスタンパク質を検出することを特徴とする方法である。この診断に用いる抗体の調製は、例えば、得られたアミノ酸配列（配列番号：２）から抗原領域を推定してペプチドを合成し、ＫＬＨあるいはＢＳＡなどのキャリアタンパクに結合させ、これをウサギに免疫することにより調製することができる。また、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＶＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、大腸菌で発現させたミラフィオリレタスウイルスの外被タンパク質をヒスチジンでタッギングし，得られたタンパク質をウサギに免疫することにより調製することもできる。抗体は、必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、酵素標識が挙げられる。また、抗体自体を直接標識しなくとも、抗体に結合する物質、例えば、プロテインＡなどを介して標識して、目的のタンパク質を検出してもよい。
この診断においては、例えば、ミラフィオリレタスウイルスに感染したことが疑われる植物、本ウイルスを保毒していると疑われるＯｌｐｉｄｉｕｍ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、あるいは本菌を含む土壌から被検試料を調製し、該試料に対し、上記の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法あるいはウエスタンブロット法を実施すればよい。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ミラフィオリレタスウイルスの外被タンパク質遺伝子のクローニング
１９９９年に兵庫県のレタス圃場より採集した汚染土にレタスを播種し、発病株をＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａに汁液接種し、増殖したウイルスをＣ．ｑｕｉｎｏａでさらに増殖させてウイルス純化材料とした。ウイルス純化は、Ｍｏｒｉｋａｗａら（Ｔ．Ｍｏｒｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６１：５７８−５８１）のチューリップ微班モザイクウイルスの精製法を改変して行った。まず、ミラフィオリレタスウイルス感染葉に、５ｍＭ  Ｎａ−ＤＩＥＣＡ、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えてホモジナイズした。また、四塩化炭素処理を省き、最後のＣｓＣｌ密度勾配遠心の代わりにＣｓ２ＳＯ４の密度勾配遠心し、ウイルス画分を得た。本純化法で得られた純化ウイルスをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動すると、４８ｋＤａの一本のバンドのみが検出された。また、電子顕微鏡観察ではＭｉＬＶの粒子のみが観察され他の不純物が観察されなかったことより、高純度の純化ウイルスが得られていることが分かった。
ウイルス核酸の抽出は、純化ウイルスをフェノール／クロロホルム処理後、エタノール沈殿で行った。１ｓｔｃＤＮＡの作製にはｐ（ｄＮ）６プライマーを用い、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）によって作製した。
ペプチドマップ作成によるＭｉＬＶ外被タンパク質の内部アミノ酸配列の決定は以下のようにして行った。純化ＭｉＬＶを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後クマジー染色し、４８ｋＤａの目的のバンドを切り出し、カルボキシメチル化後、リジルエンドペプチターゼ処理した。処理後、逆相ＨＰＬＣによるペプチドマッピングにより８１本のパターンを得た。それらのパターンのうち数パターンについてアミノ酸の配列を決定した。
得られた数種のアミノ酸配列のうち、ＥＧＥＴＡＩ（配列番号：３）およびＬＰＴＥＶＳ（配列番号：４）を基にｄＹＫ５プライマー（ＧＡＲＧＧＩＧＡＲＡＣＩＧＣＩＡＴ／配列番号：５）およびｄＹＫ８プライマー（ＳＷＩＡＣＹＴＣＩＧＴＩＧＧＩＡＲ／配列番号：６）を設計し、Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＰＣＲを行ったところ、約７５０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングし、外被タンパク質をコードする塩基配列の一部を決定した。
ＭｉＬＶは純化ウイルス中にプラス鎖とマイナス鎖両方を含むため、５’ＲＡＣＥのみで外被タンパク質遺伝子の全配列を決定することができる。ＲＡＣＥ用の１ｓｔｃＤＮＡの作製にはｐ（ｄＮ）６プライマーを用い、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）によって作製した。次いで、外被タンパク質をコードする塩基配列に特異的なプライマーを用いてＲＡＣＥを行い、約７５０ｂｐおよび約７００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングし、塩基配列を決定した。
以上の方法により、配列番号：１に示した１５１４ｂｐの塩基配列を決定した。本遺伝子は８６塩基より翻訳がスタートし、配列番号：２に示した４３７残基のアミノ酸をコードしていた。
【産業上の利用の可能性】
本研究ではＭｉＬＶ抵抗性の形質転換植物を作出するために、ＭｉＬＶの外被タンパク質の遺伝子およびその近傍の遺伝子を決定した。本遺伝情報はＭｉＬＶ外被タンパク質およびその近傍の遺伝子、あるいはそれらのアンチセンスの遺伝子を導入することによりＭｉＬＶ抵抗性形質転換植物の開発が可能となる。本遺伝情報を基にしてＭｉＬＶ特異的プライマーの設計によりＭｉＬＶの遺伝診断法にも利用できる。また、得られたＭｉＬＶ外被タンパク質のアミノ酸配列を基にした合成ペプチドに対する抗血清、あるいは大腸菌で発現させたＭｉＬＶの外被タンパクに対する抗血清を作製し、血清学的診断法にも利用できる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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