(57)【要約】本発明は、多種類の標的に対し高い親和性を示す機能性分子の製造方法を提供することを目的とする。このため、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を含む機能性分子の製造方法である。修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する選別工程と、選別した修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する配列解読工程と、塩基配列を決定した修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する翻訳工程とを含む態様が好ましい。
2003078623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的に対し親和性を有する機能性分子の製造方法であって、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を含むことを特徴とする機能性分子の製造方法。
【請求項２】
修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程において、修飾オリゴヌクレオチド配列を製造し該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作製する請求の範囲第１項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項３】
修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する選別工程を含む請求の範囲第１項から第２項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項４】
選別した修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する配列解読工程を含む請求の範囲第３項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項５】
塩基配列を決定した修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する翻訳工程を含む請求の範囲第４項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項６】
核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれかである請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項７】
修飾ヌクレオチドｎ量体が５〜４ｎ種である請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項８】
修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体であり、該修飾ヌクレオチド２量体が５〜１６種である請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項９】
修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体であり、該修飾ヌクレオチド３量体が５〜５６種である請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１０】
置換基が、ヌクレオシドにおけるピリミジン塩基の５位に導入された請求の範囲第１項から第９項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１１】
置換基が、下記構造式（Ｉ）で表される基から選択される請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
2003078623.tif 000018
但し、構造式（Ｉ）中、Ｒは、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、及び下記式（１）〜（１０）から選ばれるいずれかの基を表す。
Ｐは、ピリミジン塩基を表す。
2003078623.tif 000019
【請求項１２】
修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾オリゴヌクレオチドアミダイトである請求の範囲第１項から第１１項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１３】
修飾オリゴヌクレオチド配列が、ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成される請求の範囲第１項から第１２項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１４】
修飾オリゴヌクレオチド配列が、ヌクレオチドランダム配列に対しヌクレオチドモノマーをアニーリングさせ、該ヌクレオチドモノマーをＤＮＡライゲース及びＲＮＡライゲースの少なくともいずれかにより連結させて合成される請求の範囲第１項から第１２項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１５】
修飾オリゴヌクレオチド配列が、両端に固定オリゴヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１項から第１４項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１６】
選別工程が、標的を結合させたビーズを充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行われる請求の範囲第３項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１７】
選別工程が、標的と修飾オリゴヌクレオチド配列との解離定数をモニターしながら該修飾オリゴヌクレオチドを前記標的から解離させることにより行われる請求の範囲第３項及び第１６項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１８】
選別工程が、２種以上の標的を一次元乃至三次元の空間配置を持つマトリックス上に固定し、前記標的が固定された該マトリックスに対し前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作用させた後、前記標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を精製することにより行われる請求の範囲第３項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１９】
標的のマトリックス上への固定が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法及びスロットブロット法から選択されるいずれかにより行われる請求の範囲第１８項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２０】
マトリックス上に固定された標的が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されている請求の範囲第１８項から第１９項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２１】
ランダム重合体プールに含まれる修飾オリゴヌクレオチド配列が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されている請求の範囲第１７項から第２０項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２２】
選別工程が、マトリックス上に固定された標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を該マトリックスと共に切断して切断片を得た後、直接ＰＣＲを行うこと及び該切断片から修飾オリゴヌクレオチド配列を回収することのいずれかにより行われる請求の範囲第１７項から第２１項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２３】
修飾オリゴヌクレオチド配列を切断片からの回収が、イオン性溶液を用い電圧を印加するエレクトロエリューション法、及び熱水を用いる方法のいずれかにより行われる請求の範囲第２２に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２４】
標的が、蛋白質、リポ蛋白質、糖蛋白質、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類、核酸、環境ホルモン、薬物、及びこれらの複合体から選択される少なくとも１種である請求の範囲第１項から第２３項のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２５】
増幅工程が、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法及びＬＡＭＰ法から選択されるいずれかの方法により行われ、クローニングにより塩基配列が決定される請求の範囲第４項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２６】
翻訳工程が、修飾ヌクレオチドｎ量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における５’末端側からｎ塩基ずつ、対応表に基づいて行われる請求の範囲第５項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２７】
修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体であり、翻訳工程が、該修飾ヌクレオチド２量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における５’末端側から２塩基ずつ、対応表に基づいて行われる請求の範囲第２６項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２８】
修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体であり、翻訳工程が、該修飾ヌクレオチド３量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における５’末端側から３塩基ずつ、対応表に基づいて行われる請求の範囲第２６項に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項２９】
請求の範囲第１項から第２８項のいずれかに記載の機能性分子の方法により製造されることを特徴とする機能性分子。
【請求項３０】
標的に対し親和性を有し、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）を有してなる請求の範囲第２９項に記載の機能性分子。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、多種の標的（標的物質）に対し高い親和性を示し、増幅・複製が容易であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服、遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野で好適であり、特に蛋白質の解析に好適な機能性分子及びその製造方法に関する。
背景技術
２００２年に人間の全遺伝子情報のドラフトが発表され、２００３年にはその完全情報が明らかにされる予定である。その結果、研究者や科学者の興味の中心は、遺伝子からの遺伝子産物である蛋白質の解析に移行してきている。前記蛋白質の解析は、対象となる個々の蛋白質に対し親和性を有する分子が存在して初めて可能になるといっても過言ではない。解析の対象である前記蛋白質は、細胞中に非常に多種存在し、そのアミノ酸配列や構造等が全く未知であるものが多数であるので、該蛋白質を解析するための分子も多種必要になる。
しかしながら、前記蛋白質を解析するための分子を作製乃至入手等するための効率的な方法が現在知られていないのが現状である。従来より知られており、ある特定の蛋白質に対して親和性のある分子を得る最も一般的な方法としては、動物の免疫系を用いてアフィニティー抗体を選別する方法がある。ところが、この方法の場合、動物を使っているため、多量の蛋白質が必要となり、工程数が多く、高コストである。しかも、この方法で選別し入手したアフィニティー抗体は、モノクローナル抗体にし、その細胞を維持することにより複製可能であるものの、高コストであり、改良を行うことができない。また、同一標的に対し親和性を有するアフィニティー抗体しか選別することができない、という問題がある。したがって、細胞内に存在する全種類の蛋白質に対し親和性を有する各アフィニティー抗体を選別し入手することは極めて困難である。
近年、ヌクレオチドランダム配列から特定の働きを持つ分子を選別し、その遺伝情報を基にして該分子の同定を行う研究が多数なされている。その結果、特定の標的に親和性のある分子や特定の反応を触媒するＲＮＡなどが数多く報告されている。
しかしながら、ヌクレオチドの構成単位数はＲＮＡ及びＤＮＡのどちらも４個であり、これらの重合体に存在する官能基の種類は著しく制限され、その働きも制限されたものにならざるを得なかった。この問題を打開するために修飾ヌクレオチドを用いた研究もなされているが、特定の部位に選択的に、あるヌクレオチドを導入したものが前記分子であることを決定するためには、修飾ヌクレオチドに対応する天然のヌクレオチドを実験系から除く必要があり、結局、ヌクレオチドの構成単位数は４＋１−１＝４個のままであり、根本的な問題の解決にはなっていない。また、ＲＮＡは酵素的に非常に不安定であり、同様の働きを持つ前記分子を安定なＤＮＡで合成する試みもなされているが成功するには至っていない。これらの場合、特定の標的に対し親和性を有する分子を得るためには、増幅及び精製の操作を繰り返して行う必要があり、前記分子を多種合成することは依然として困難である。
一方、アミノ酸や人工物質を構成単位にし、コンビナトリアルケミストリーにより前記分子を選別する研究においては、構成単位からなる該分子自体が遺伝情報を持たないために、配列情報を増幅することができず、前記分子の配列を決定するためには多大な工程が必要であった。
また、遺伝情報を持つ蛋白質の合成に関しては、ｍＲＮＡの３’末端にピューロマイシンを導入した研究がある（例えば、特許文献１参照）。これはピューロマイシンが翻訳系においてアミノ酸と間違われて蛋白質に組み込まれやすいという性質を利用したものである。しかしながら、この場合、現在までのところ、ピューロマイシンの組み込み効率が悪く、ランダムなアミノ酸３残基のライブラリーから前記分子を選別できたという報告がなされている程度である。また仮に、ピューロマイシンの組み込み効率が改善できたとしても、ＤＮＡランダム配列には３／６４の割合で終止コドンが存在し、細胞が好まないレアーコドンの存在まで考慮に入れるとＤＮＡランダムプールの内、最終的に遺伝情報を持つ蛋白質になる可能性のあるライブラリープールの数は非常に小さくなってしまう、という問題がある。
特許文献１
特開２００２−２９１４９１号公報
本発明は、標的に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗体の親和性や特異性に匹敵し、狭義において抗体と同様に機能することが可能で、広汎な標的を認識可能であり、多種の標的（標的物質、検出標的）に対して高い親和性を示し、増幅・複製が容易であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服、遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野で好適であり、特に蛋白質の解析に好適な機能性分子を提供することを目的とする。
本発明は、前記機能性分子を煩雑な増幅、精製等の操作を繰り返して行う必要がなく、効率よく一括して製造可能な機能性分子の製造方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明の機能性分子の製造方法は、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を含む。本発明の機能性分子の製造方法では、前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程において、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）がランダムに重合されて、修飾オリゴヌクレオチド配列が製造される。該修飾オリゴヌクレオチド配列は、核酸を構成する４種のヌクレオチドに比べて、標的を認識する置換基数が多い上に核酸の自己複製能をそのまま保持しており、親和性及び特異性が抗体に匹敵するため、該修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅・複製することにより、前記標的を認識可能な機能性分子が多種効率良く製造される。
本発明の機能性分子は、本発明の前記機能性分子の製造方法により製造される。該機能性分子は、標的に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗体の親和性や特異性に匹敵し、多種の標的を認識可能であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服やその遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野に好適に使用可能である。
発明を実施するための最良の形態
（機能性分子及びその製造方法）
本発明の機能性分子は、本発明の機能性分子の製造方法により製造される。以下、本発明の機能性分子の製造方法の説明を通じて本発明の機能性分子の内容を明らかにする。
本発明の機能性分子の製造方法は、修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を少なくとも含み、選別工程、配列解読工程、翻訳工程を含むのが好ましく、更に目的に応じて適宜選択したその他の工程を含む。
−修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程−
前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程は、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する工程である。
なお、前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を行った結果、得られた前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含む反応物は、精製・分離等することなくそのまま、該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールとして前記選別工程等において使用可能である。
前記修飾ヌクレオチドｎ量体は、前記修飾ヌクレオチドを含んでなる。
前記修飾ヌクレオチドは、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入されてなる。
前記修飾ヌクレオチドｎ量体におけるｎは、整数を表し、２以上が好ましく、２〜１０がより好ましく、２〜３が特に好ましい。
前記ｎが、２未満であると、前記修飾ヌクレオチドの種類が核酸を構成する４種類のヌクレオチドと差がなく、標的に対する認識力を向上させることができなくなることがある。なお、前記ｎが、４以上であると、増幅過程に起こる可能性のある１塩基欠損や１塩基付加を塩基配列類似性から判別し難くなり、ｎが３であっても最大６４種類もの異なる側鎖を導入することができるので、アミノ酸２０種類から多種多様な蛋白質ができていることを考慮すると、ｎが３でも十分であり、ｎが４以上であってもそれに見合う効果が十分には期待できない一方、合成の負荷の増大が懸念される。
前記核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよく、また、ＤＮＡ及びＲＮＡは一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。
前記ＤＮＡは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の４種の塩基を有し、ＤＮＡポリヌクレオチド鎖において前記塩基は、中心軸に対して垂直な平面内で互いに内側に突出した形で存在して、いわゆるワトソン−クリック型塩基対を形成し、アデニンに対してはチミンが、グアニンに対してはシトシンが、それぞれ特異的に水素結合している。その結果、前記２本鎖ＤＮＡにおいては、２本のポリペプチド鎖が互いに相補的に結合している。
前記ＤＮＡの４種のヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド）としては、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）等が挙げられる。
前記ＲＮＡは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）及びシトシン（Ｃ）の４種の塩基を有し、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３種に大別できる。
前記ＲＮＡの４種のヌクレオシド（リボヌクレオシド）としては、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）等が挙げられる。
前記修飾ヌクレオチドｎ量体におけるｎが２である場合の修飾ヌクレオチド２量体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記核酸を構成する４種のヌクレオシドと該修飾ヌクレオシドとの組合せであってもよいし、該修飾ヌクレオシド同士の組合せであってもよい。なお、置換基を導入するのがヌクレオシド（プリン又はピリミジン塩基に糖が結合したもの）でなく、ヌクレオチド（ヌクレオシドにリン酸基が付加したもの）であってもよい。
前記修飾ヌクレオシドにおいて前記置換基が導入される位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ピリミジンにおける５位、プリンにおける７位、プリンにおける８位、環外アミンの置換、４−チオウリジンの置換、５−ブロモの置換、５−ヨード−ウラシルの置換、などが挙げられる。これらの中でも、増幅（複製）の際の酵素反応を阻害し難い点で、ピリミジンにおける５位、プリンにおける７位などが好ましく、合成の容易さの点で、ピリミジンにおける５位がより好ましい。
前記ヌクレオシドに置換基を導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記式で示されるヌクレオシドのピリミジン塩基における５位に置換基Ｒを導入する方法、などが好適に挙げられる。
2003078623.tif 000003
なお、前記置換基Ｒとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、下記式（１）〜（１０）で表される基、などが挙げられる。
2003078623.tif 000004
前記天然又は非天然のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリン、などが挙げられる。
前記金属錯体としては、金属イオンに配位子が配位した化合物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｕビピリジル錯体、フェロセン錯体、ニッケルイミダゾール錯体、などが挙げられる。
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素、などが挙げられる。
前記酸化還元色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロイコアニリン、ロイコアントシアニン、等のロイコ色素、などが挙げられる。
前記スピンラベル体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄Ｎ−（ジチオカルボキシ）サルコシン（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、ＴＥＭＰＯ（テトラメチルピペリジン）誘導体、などが挙げられる。
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、などが挙げられる。
これらは、置換基で更に置換されていてもよい。
前記修飾ヌクレオチド２量体を合成する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法、などが挙げられる。これらの中でも、ホスホロアミダイト法が好適である。
前記ホスホロアミダイト法は、一般的には、テトラゾールを促進剤としたヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドとの縮合反応を鍵反応として用いる。この反応は、通常、糖部分の水酸基とヌクレオシド塩基部のアミノ基との両方に競合的に起こるが、所望のヌクレオチド合成のためには、糖部分の水酸基にのみ選択的に反応を起こさせる。したがって、アミノ基への副反応を防止するため、保護基で修飾する。例えば、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＵ１）は、下記式で示したように、デオキシアデノシンと修飾デオキシウリジンとから合成することができる。
2003078623.tif 000005
但し、前記式において、ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチル基を表す。
なお、後述する下記表１の対応表に示す、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＣ１、Ｃ２Ａ、Ｃ３Ｃ、Ｃ４Ｇ、Ｃ５Ｔ、ＧＣ６、ＧＵ２、Ｕ３Ａ、Ｕ４Ｃ、Ｕ５Ｇ、Ｕ６Ｔ）についても同様の方法により合成することができる。
ここで、前記合成した修飾ヌクレオチド２量体を、前記核酸を構成する４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表の１６個のいずれかと１対１に対応付け（関係付け）する。
前記修飾ヌクレオチド２量体の種類が、５未満であると、核酸を構成する４種のヌクレオチドと大差がなく、標的に対する認識力を十分に向上させることができないことがある。
前記対応表としては、例えば、下記表１に示すものが挙げられる。この表１は、横方向（５’側）にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの順に４種のヌクレオシドの塩基を配置し、一方、縦方向（３’側）にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの順に４種のヌクレオシドの塩基を配置し、これら塩基がそれぞれ１対１に対応した１６個のパターン（マス）が形成されている。
2003078623.tif 000006
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また、前記修飾ヌクレオチド２量体の場合と同様に、修飾ヌクレオチド３量体を用いることもでき、この場合における前記対応表としては、例えば、下記表２に示すものが挙げられる。表２には、５６個のパターン（５６種の修飾ヌクレオチド３量体）が形成されている。なお、前記修飾ヌクレオチド２量体や前記修飾ヌクレオチド３量体の場合と同様に、修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）を用いることもでき、この場合における前記対応表には、例えば、４ｎ個のパターン（４ｎ種の修飾ヌクレオチドｎ量体）を形成しておくことができる。
2003078623.tif 000008
2003078623.tif 000009
前記表１の対応表においては、下記に示すように１２種の修飾ヌクレオチド２量体が条件付けられている。
具体的には、塩基配列は、５’側から３’側方向に読み取り、塩基配列ＡＣには修飾ヌクレオチド２量体ＡＣ１が対応する。配列ＡＴには修飾ヌクレオチド２量体ＡＵ１が対応する。塩基配列ＣＡには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ２Ａが対応する。塩基配列ＣＣには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ３Ｃが対応する。塩基配列ＣＧには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ４Ｇが対応する。塩基配列ＣＴには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ２Ａが対応する。塩基配列ＧＣには修飾ヌクレオチド２量体ＧＣ６が対応する。塩基配列ＧＴには修飾ヌクレオチド２量体ＧＵ２が対応する。塩基配列ＴＡには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ３Ａが対応する。塩基配列ＴＣには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ４Ｃが対応する。塩基配列ＴＧには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ５Ｇが対応する。塩基配列ＴＴには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ６Ｔが対応する。
なお、表１の対応表における、塩基配列と修飾ヌクレオチド２量体との条件付けとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、表１はあくまでもその一例である。また、修飾ヌクレオチド２量体を１２種作製することが困難であれば、一部が重複してもよいが、その分、標的に対する認識力は低下することがある。
前記表１の対応表において、プリン塩基同士の組合せであるＡＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＧについては、プリン塩基が修飾に用いる酵素の反応が低いため、修飾ヌクレオチド２量体を作製していないが、これは、プリン塩基同士の修飾ヌクレオチド２量体が作製することができないことを意味しない。
前記表１の対応表に基づいて、１２種の２量体修飾ヌクレオシドを対応付けることにより、従来の核酸では４種でしかなかったものが、一挙に１２種にまで拡がり、その結果、数多くの種の標的に対して識別力を発揮し得るものである。
前記ランダム重合体プールを構成するオリゴヌクレオチド１は、図１に示したように、修飾オリゴヌクレオチド配列１０の両端に固定オリゴヌクレオチド配列２０，２０を有することが、後述する配列解読工程においてＰＣＲ法を行う際に固定オリゴヌクレオチド配列部分にプライマーを結合させて、効率よく増幅（複製）することができる点で好ましい。
前記修飾オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０〜１００個が好ましく、１０〜５０個がより好ましい。
前記固定オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常１５個以上が好ましく、２０〜４０個がより好ましい。
前記ランダム重合体プールを作製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用いる方法、などが好適である。
前記ＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用いる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、図２に示すようなＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用い、合成した前記修飾ヌクレオチド２量体を複数種混合したもの（図２に示す例では１２種であり、図２中「Ｘ」で表される）を試薬とし、この試薬をコントローラーによる制御の下、ノズル１５により吸い上げて重合させることにより、ランダムであらゆる配列順序の修飾オリゴヌクレオチド配列を有する前記ランダム重合体プールを作製する方法などが好ましい。この場合、前記ランダム重合体プールを効率よく作製することができる点で有利である。
なお、前記固定ヌクレオチド配列を合成する場合には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の４種により同様に合成することができる。
前記ランダム重合体プールを作製する方法としては、また、予め作製しておいたオリゴヌクレオチドランダム配列に対しモノマーブロックを並べてアニーリングし、ＤＮＡライゲース又はＲＮＡライゲースを働かせて結合させることによりランダム重合体プールを作製する方法、なども挙げられる。この方法の場合も、ランダムであらゆる配列順序の修飾オリゴヌクレオチド配列を含む前記ランダム重合体プールを作製することができる。
前記ＤＮＡライゲースは、ＤＮＡリガーゼともいい、隣接したヌクレオチドの５’リン酸基と３’水酸基の間の、共有結合の形成を触媒する酵素である。
前記ＲＮＡライゲースは、ＲＮＡリガーゼともいい、５’リン酸基末端のポリヌクレオチドと３’水酸基末端のポリヌクレオチドを連結させる酵素である。ＲＮＡリガーゼの基質は本来はＲＮＡであるが、５’リン酸基末端のポリデオキシリボヌクレオチドと３’端のみがリボヌクレオチドであるポリデオキシリボヌクレオチドも効率的に連結する。
なお、前記ランダム重合体プールは、前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むが、更に必要に応じて、置換基で修飾していないＤＮＡ若しくはＲＮＡのモノマー又はオリゴマーをランダムに重合させた配列を含んでいてもよい。
−選別工程−
前記選別工程は、前記修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する工程である。
前記選別の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、フィルター結合、液−液分割、ろ過、ゲルシフト、密度勾配遠心分離、などの各種方法が挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。これらの中でも、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい。
前記アフィニティークロマトグラフィーは、特定の成分同士が結合し易い生物学的親和性を利用した分離・精製手段であり、具体的には、前記標的を樹脂等のカラム充填材に固定化し、結合用緩衝液で平衡化してから、前記ランダム重合体プールを含む溶液をカラム中に流し込み、一定条件に放置すると、該標的と親和性を有するオリゴヌクレオチド配列がカラムに吸着し、結合用緩衝液で充分洗浄することにより、残留したオリゴヌクレオチド配列以外の成分を除去することができる。前記標的を含む溶液あるいは希薄緩衝溶液をカラムに流すことにより、修飾オリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを回収し、選別することができる。
また、特に前記標的が未知で多種存在する場合（例えば、臓器や血清など）には、前記選別のための手段としては、２種以上の標的を一次元乃至三次元の空間配置を持つマトリックス上に固定し、該標的が固定されたマトリックスに対し前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作用させた後、前記標的と結合した前記修飾オリゴヌクレオチド配列を精製する方法が好適に挙げられる。
前記マトリックス上に前記標的を固定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記標的が蛋白質である場合には、該標的をポリアクリルアミド電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなど）した後で膜状の該マトリックスに転写するウエスタンブロット法、膜状の該マトリックスに前記標的又はその希釈液を直接染み込ませるドットブロット法やスロットブロット法、などが挙げられる。これらの中でも、細胞抽出液などの複雑な組成の溶液中に微量に含まれる蛋白質でも明瞭に検出可能な点で、前記ウエスタンブロット法が好ましい。
なお、前記ウエスタンブロット法は、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、蛋白質混合物から特定の蛋白質を検出する手法であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、二次元電気泳動等の後、ゲルから蛋白質を電気的に膜状の前記マトリックスに移動・固定化させる方法である。該膜状のマトリックスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記蛋白質が結合し易い疎水性の高いニトロセルロース膜、疎水性に優れたＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜、などが好適に挙げられる。
本発明においては、前記標的が、例えば、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されているか、あるいは、前記ランダム重合体プールに含まれる修飾オリゴヌクレオチド配列が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されているのが好ましい。
前記放射性同位元素としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、等が挙げられる。
前記化学発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール又はこれらの誘導体、等が挙げられる。前記化学発光による検出には、Ｘ線フィルムへの露光検出、あるいは化学発光を検出可能なスキャナーを必要としますが、他の発色法に比べて１０〜５０倍以上も感度が高いので、微量蛋白質の検出が容易であるとい利点がある。
前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）等の希土類キレート、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、４−メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、等が挙げられる。
前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、等が挙げられる。
更に前記標識物質としては、ビオチン、リガンド、特定の核酸、蛋白質、ハプテン等が挙げられる。なお、前記標識物質がビオチンである場合にはこれに特異的に結合するアビジン又はストレプトアビジンが、前記標識物質がハプテンである場合にはこれに特異的に結合する抗体が、前記標識物質がリガンドである場合にはレセプターが、前記標識物質が特定の核酸、蛋白質、ハプテン等である場合にはこれらと特異的に結合する核酸、核酸結合蛋白質、特定の蛋白質と親和性を有する蛋白質等が、それぞれ組合せ可能である。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記ウエスタンブロット法により前記膜状のマトリックス（ニトロセルロース膜等のメンブランなど）上の所定の位置（領域）に固定され、前記標的と結合した前記修飾オリゴヌクレオチド配列を、該マトリックス（ニトロセルロース膜等のメンブランなど）と共に、前記所定の位置（領域）毎に一緒に切断して切断片を得た後、該切断片から前記修飾オリゴヌクレオチド配列を回収する方法、などが特に好適に挙げられる。この場合、特別な精製処理が不要であり、前記修飾オリゴヌクレオチド配列を簡便に効率よく精製することができる点で有利であり、また、前記所定の位置（領域）毎に異なる前記修飾オリゴヌクレオチド配列を効率よく精製することができる点で有利である。
なお、前記切断片から前記修飾オリゴヌクレオチド配列を回収は、イオン性溶液を用い電圧を印加してエレクトロエリューションにより行うことができ、また、熱水を用いて行うことができる。
また、前記精製は、他の方法、即ち前記標的と前記修飾オリゴヌクレオチド配列との解離定数をモニターしながら該修飾オリゴヌクレオチドを前記標的から解離させることにより行ってもよい。この場合、最小一回の処理で所望の解離定数を持つ前記機能性分子を選び出すこともできる。このように前記選別工程において解離定数を測定し、解離定数をコントロールすることで、前記機能性分子を効率よく選び出すことができる。なお、前記解離定数は前記標的に応じて適宜設定することができ、例えば、ワービスプラズモン共鳴を用いた測定機器により測定することができる。
本発明においては、前記選別工程において、例えば、解離定数の異なる２種以上の分子の相互作用を利用し、小さい解離定数に適応した洗浄操作で前記機能性分子を選別する一方、大きい解離定数に適応する過激な洗浄操作により、選別する担体の再生を行うことできる。この方法の場合、前記標的が２種以上あっても、再生が可能となるので１枚の基板を用いて複数種の前記機能性分子を一括して効率よく選別することができ、無駄を省くことができコストダウンが図られる。
また、前記選別工程において、複数種の分子と反応性の異なるリンカーを一対一に対応させることにより、異なる後処理により各々の分子を認識することができる前記機能性分子を順次選び出すこともできる。これにより、前記機能性分子を選別することができる。この場合、前記ランダム重合体プールを共通に用いて複数種の前記機能性分子を効率よく選別することができる。
前記異なる後処理としては、リンカーの結合強度を調整することができる試薬を流す方法、リンカーの結合の切れ易さを調整できる試薬を流す方法、光反応や電極反応により特定の位置を選択的に切断する反応を利用する方法、などが挙げられる。
前記標的（標的物質）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛋白、リポ蛋白、糖蛋白、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類、核酸、環境ホルモン、薬物、これらの複合体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用することができ、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、血漿蛋白、腫瘍マーカー、アポ蛋白、ウイルス、自己抗体、凝固・線溶因子、ホルモン、血中薬物、ＨＬＡ抗原、環境ホルモン、核酸などが好適に挙げられる。
前記血漿蛋白としては、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、補体成分（Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５，Ｃ１ｑ）、ＣＲＰ、α１−アンチトリプシン、α１−マイクログロブリン、β２−マイクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチンなどが挙げられる。
前記腫瘍マーカーとしては、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、γ−セミノプロテイン、ＴＰＡ、エラスターゼＩ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）などが挙げられる。
前記アポ蛋白としては、例えば、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＢ、アポＣ−ＩＩ、アポＣ−ＩＩＩ、アポＥなどが挙げられる。
前記ウイルスとしては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＢＣ）、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶなどが挙げられる。また、ウイルス以外の感染症としては、ＡＳＯ、トキソプラズマ、マイコプラズマ、ＳＴＤなどが挙げられる。
前記自己抗体としては、例えば、抗マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗核抗体、リュウマチ因子、抗ミトコンドリア抗体、ミエリン抗体などが挙げられる。
前記凝固・線溶因子としては、例えば、フィブリノゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、プラスミノゲン、α２−プラスミンインヒビター、アンチトロンビンＩＩＩ、β−トロンボグロブリン、第ＶＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳなどが挙げられる。
前記ホルモンとしては、例えば、下垂体ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＨ、ＡＣＴＨ、ＴＳＨ、プロラクチン）、甲状腺ホルモン（Ｔ３、Ｔ４、サイログロブリン）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質ホルモン（アルドステロン、コルチゾール）、性腺ホルモン（ｈＣＧ、エストロゲン、テストステロン、ｈＰＬ）、膵・消化管ホルモン（インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、ガストリン）、その他（レニン、アンジオテンシンＩ，ＩＩ、エンケファリン、エリスロポエチン）などが挙げられる。
前記環境ホルモンは、外界に広く存在して生物の生活活動と共に体内に取り込まれてその生殖、発生、行動などを含む生理的な内分泌の諸現象に影響を及ぼす外因性内分泌撹乱化学物質であり、該環境ホルモンとしては、例えば、ノニルフェノール、オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ブチルベンジル、トリブチルスズ、ＰＣＢ、ポリ塩化ジベンゾジオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、ダイオキシン類、ＤＤＴ、ＤＤＥ、ＤＤＤ、エンドスルファン、メトキシクロル、ヘプタクロル、トキサフェン、ディルドリン、リンデン、ジエチルスチベロール（ＤＥＳ）、エチニルエストラジオール（ピルの成分）、クメストロール、フォルモノネテイン、ゲニステイン、などが挙げられる。
前記血中薬物としては、例えば、カルバマゼピン、プリミドン、バルプロ酸等の抗てんかん薬、ジゴキシン、キニジン、ジギトキシン、テオフィリン等の循環器疾患薬、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質などが挙げられる。
前記核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子、などが挙げられる。
前記癌関連遺伝子としては、例えば、ｋ−ｒａｓ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、ｓｒｃ遺伝子、ｒｏｓ遺伝子又はＡＰＣ遺伝子などが挙げられる。
前記遺伝病に関連する遺伝子としては、例えば、各種先天性代謝異常症、例えばフェニールケトン尿症、アルカプトン尿症、シスチン尿症、ハンチントン舞踏病、Ｄｏｗｎ症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、血友病などが挙げられる。
前記ウイルス及び細菌遺伝子としては、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＨＩＶウイルス、マイコプラズマ、リケッチア、レンサ球菌、サルモネラ菌などが挙げられる。
前記多型性を示す遺伝子とは、病気等の原因とは必ずしも直接は関係のない個体によって異なる塩基配列を持つ遺伝子、例えば、ＰＳ１（プリセリニン１）遺伝子、ＰＳ２（プリセリニン２）遺伝子、ＡＰＰ（ベーターアミロイドプレカーサー蛋白質）遺伝子、リポプロテイン遺伝子、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）や血液型に関する遺伝子、あるいは高血圧、糖尿病等の発症に関係するとされている遺伝子などが挙げられる。
前記標的を含む検体としては、例えば、細菌、ウイルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、あるいは糞尿等の排泄物が挙げられる。更に、出生前診断を行う場合は、羊水中に存在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部などであってもよい。また、これらの検体は、直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、これらの組合せ等による細胞破壊処理を予め施されていてもよい。
−配列解読工程−
前記配列解読工程は、前記選別工程により選別した前記修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する工程である。
前記増幅の方法としては、対象となる前記修飾オリゴヌクレオチド配列の数を増やすことができれば、特に制限はなく、当該技術分野において公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、などが挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。
前記ＰＣＲ法は、ポリメラーゼ連鎖反応法を意味し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応の試験管内での繰り返しにより、その特定のオリゴヌクレオチド領域を数１０万倍に増幅可能な方法である。該ＰＣＲ法においては、使用するプライマーの伸長反応は、４種又は５種のヌクレオチド三リン酸（デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、及びチミジン三リン酸あるいはデオキシウリジン三リン酸（これらの混合物をｄＮＴＰということもある））を基質として該プライマーに取り込ませることにより行われる。
この伸長反応を行う場合、通常核酸鎖を増幅するために上記単位核酸及び核酸伸長酵素を含む増幅反応試薬が用いられ、この場合、核酸伸長酵素としてはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ等の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、特にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、これによりサイクル毎に新たな酵素の添加の必要性がなくなり、自動的にサイクルを繰り返すことが可能になり、更にアニーリング温度を５０〜６０℃に設定することが可能なためプライマーによる標的塩基配列認識の特異性を高めることができ、迅速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる（特開平１−３１４９６５号、同１−２５２３００号公報等参照）。
また、この反応を行う際、反応溶液の水分の蒸発を防止するためにオイルを添加することができる。この場合、オイルは水と分配可能で、かつ水より比重の軽いものであればよく、具体的にはシリコーンオイル、ミネラルオイル等が例示される。また、遺伝子増幅装置によってはこのような媒体を必要としないものもあり、このような遺伝子増幅装置を用いてプライマーの伸長反応を行うこともできる。
このように、前記プライマーを用いて伸長反応を繰り返すことにより、目的とするオリゴヌクレオチドを効率的に遺伝子増幅させることができオリゴヌクレオチドを大量に作製することができる。なお、この遺伝子増幅反応を行う条件等の具体的な方法については、実験医学、羊土社、８，Ｎｏ．９（１９９０）、ＰＣＲ  テクノロジー  ストックトン  プレス（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））等の文献に記載された公知の方法が挙げられる。
なお、ＰＣＲ法を行うことにより、前記修飾オリゴヌクレオチド配列は、置換基の修飾のない天然のオリゴヌクレオチド配列に置換される。
また、前記修飾オリゴヌクレオチド配列がＤＮＡではなくＲＮＡである場合、逆転写反応を行うことによりＤＮＡを合成することができる。前記逆転写反応とは、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する方法であり、対象となるＲＮＡにより、逆転写反応の反応液や反応条件は異なる。例えば、ＲＮＡ溶液にＲＮａｓｅフリーの滅菌蒸留水と３’−プライマーを添加し、インキュベートした後、冷却して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２などを含む逆転写緩衝液、ＤＴＴ、ｄＮＴＰｓを加え、逆転写酵素を添加した後インキュベートすること等により行うことができる。該逆転写反応の停止は、インキュベートの条件を調整して行うことができる。なお、このような逆転写反応は、逆転写ＰＣＲによっても行うことができる。
前記増幅されたオリゴヌクレオチドの塩基配列の決定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、遺伝子クローニングによる方法、チェーンターミネーター法、サンガー法、ジデオキシ法等によるＤＮＡシーケンサー（ＤＮＡ塩基配列自動決定装置）、などが挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。
前記遺伝子クローニングでは、増幅したオリゴヌクレオチド配列を組み込んだ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すること等により製造することができる。
前記発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、プラスミドとファージとのキメラベクター、などが挙げられる。
前記宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物、動物細胞などが挙げられる。
−翻訳工程−
前記翻訳工程は、塩基配列を決定した前記修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体の少なくとも１種と、前記修飾ヌクレオチドｎ量体の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する工程である。
前記翻訳工程では、前記配列解読工程で増幅され、塩基配列が決定されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する。
前記翻訳は、塩基配列が決定された修飾ヌクレオチドｎ量体からなる修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側からｎ塩基ずつ対応表に基づいて行われることが好ましく、定期的にブロックを規定する固定塩基を入れることがより好ましい。例えば、修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体である場合、該修飾ヌクレオチド２量体からなる塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側から２塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、下記表１で表される対応表に基づいて翻訳される。
2003078623.tif 000010
例えば、図３に示すように、決定された修飾オリゴヌクレオチド配列が“ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＴ”である場合には、対応表に基づき翻訳すると“ＡＵ１ＧＣ６Ｕ４ＣＵ３ＡＧＣ６Ｃ３ＣＣ５Ｔ”という配列であることが確認され、前記機能性分子の配列を求めることができる。
前記修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体である場合、該修飾ヌクレオチド３量体からなる塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側から３塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、下記表２で表される対応表を用いて翻訳される。
2003078623.tif 000011
なお、修飾ヌクレオチド３量体を超える場合（ｎ≧４）にも上記同様に、例えば、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体（ｎ≧４）の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体（ｎ≧４）の１種とを対応させた対応表に基づいて翻訳することができる。
本発明の機能性分子の製造方法により得られる本発明の機能性分子は、抗体に匹敵する親和性及び特異性を有し、各種分野に幅広く好適に使用可能である。例えば、特定の蛋白質に親和性を有する前記機能性分子として確認され、本発明の機能性分子の製造方法により製造された本発明の機能性分子は、薬品、ドラッグデリバリーの分野に好適に使用可能である。また、特定のＤＮＡ配列に親和性を有する前記機能性分子として確認され、本発明の機能性分子の製造方法により製造された本発明の機能性分子は、遺伝子異常による疾病の克服やその遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明に好適に使用可能である。また、反応中間体をミックした分子に親和性を有する前記機能性分子として確認され、本発明の機能性分子の製造方法により製造された本発明の機能性分子は、該反応を効率よく進めるための触媒の開発に好適に使用可能である。
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
図３に示すようにして、特定の蛋白質に対し親和性を有する機能性分子の製造（合成及び同定）を行った。具体的には、先ず、下記式に示す方法により、シトシンにおける５位から６種の官能基を持つデオキシシチジン類縁体（Ｃ１−６）、及び、ウラシルにおける５位から６種の官能基を持つデオキシウリジン類縁体（Ｕ１−６）を各々合成（作製）した。
2003078623.tif 000012
2003078623.tif 000013
次に、合成（作製）した１２種の修飾ヌクレオシド２量体を、ＤＮＡを構成する４種のヌクレオシドを１対１に組合せた下記表１に示す対応表の１６個のパターンから選ばれるいずれかと、１対１に対応付けした。
2003078623.tif 000014
2003078623.tif 000015
次に、ホスホルアミダイト法により、上記表１の対応表に示す１２種の修飾オリゴヌクレオチドアミダイト（Ｍ）を化学合成した。具体的には、例えば、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＵ１）は、下記式に示すように、デオキシアデノシンと修飾デオキシウリジンとから合成することができる。
2003078623.tif 000016
但し、前記式において、ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチル基を表す。
そして、図２に示すようなＤＮＡシンセサイザーを用いて、固定オリゴヌレオチド配列２０量体（Ｎ２０）−修飾オリゴヌクレオチドランダム配列２０量体（Ｍ２０）−固定オリゴヌクレオチド配列２０量体（Ｎ２０）からなるランダムオリゴヌクレオチドＮ２０−Ｍ２０−Ｎ２０（ＤＮＡ８０量体）を含むランダム重合体プールを作製した。以上が前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程である。
次に、このランダム重合体プール（図３Ａ）を用いて、特定の蛋白質に強く結合する修飾オリゴヌクレオチド配列（機能性分子）の同定を行った。図３Ａにおいて「□」は、固定ヌクレオチド配列を表し、「〜」は、修飾ヌクレオチドランダム配列を表す。
まず、標的としてヒトアルブミンを結合したビーズを充填したアフィニティーカラムを用意し、このカラムに前記ランダム重合体プールを含む溶液を流し一定条件に放置すると、該標的に対し親和性を示す修飾オリゴヌクレオチド配列がカラムに吸着し（図３Ｂ）、緩衝液で充分洗浄することにより、残留した修飾オリゴヌクレオチド配列以外の成分を除去し、ヒトアルブミンを含む溶液を流すことにより、前記修飾オリゴヌクレオチドランダム配列を含むオリゴヌクレオチドを選別し、回収した（図３Ｃ）。以上が前記選別工程である。
この選別された修飾オリゴヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅し、クローニングによりそのＤＮＡの塩基配列を求めたところ、決定された修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の一部が“ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＴ”であった（図３Ｄ）。以上が前記配列解読工程である。
この塩基配列を上記対応表に基づき翻訳すると“ＡＵ１ＧＣ６Ｕ４ＣＵ３ＡＧＣ６Ｃ３ＣＣ５Ｔ”となり、機能性分子の構造が同定できた（図３Ｄ）。以上が前記翻訳工程である。
得られた機能性分子は、ヒトアルブミンと特異的に結合し、抗体と類似の働きを示すことが認められた。
（実施例２）
前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールとして、実施例１で合成したＤＮＡランダムプール（総量２０ＯＤ）｛ヌクレオチド固定配列２０量体ＤＮＡ（Ｎ２０）｝の５’−３２Ｐ放射性ラベル標品（予め修飾塩基を含むヌクレオチドモノマーに放射性元素をラベルしたもの）を作製した。以上が前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程である。
一方、ラット肝臓組織から常法に従って細胞質画分を精製した。この画分に含まれる蛋白質混合物を常法に従って一次元目等電点電気泳動（ｐＨ４〜７）を行った後、二次元目電気泳動としてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動した後、ウエスタンブロット法によりニトロセルロース膜に、前記蛋白質混合物中の蛋白質をブロッティングした。
この放射性ラベルされた修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールであるＮ２０Ｍ２０Ｎ２０（ＤＮＡ８０量体）の希釈溶液に、蛋白質混合物を固定したニトロセルロース膜を浸して１時間震盪した。その後、このニトロセルロース膜を緩衝溶液で洗浄して非特異的な残留物を除去し、Ｘ−ｒａｙフィルムを用いて該ニトロセルロース膜上における放射能の強い位置（放射性ラベルされた修飾オリゴヌクレオチドが強く結合した位置）を同定した。
前記ニトロセルロース膜上の放射能の強い位置３０箇所を切り取り、イオン溶液（３Ｍ  Ｎａ  Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ＝４．８、０．１％ブロモフェノールブルー溶液）中で電圧を印加してエレクトロエリューションにより修飾オリゴヌクレオチドを回収した。各々の溶液中の放射能を確認した後、固定配列の相補鎖をプライマーとするＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅した。各々のＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル電気泳動により確認した結果、２８種類の修飾オリゴヌクレオチド配列の明確なバンドが確認できた。以上が前記選別工程である。
得られた２８種類の前記修飾オリゴヌクレオチド配列について、各々プラスミドベクターを用いてクローニングを行い、ＤＮＡ配列を決定した。以上が前記配列解読工程である。その後、実施例１と同様にして修飾ＤＮＡの配列を求め、修飾ＤＮＡ（機能性分子）をＤＮＡ自動合成機により合成した。以上が前記翻訳工程である。
得られた修飾ＤＮＡは、二次元電気泳動で分離された蛋白質を特異的に認識できることが確認できた。また、入手可能な蛋白質について解離定数を表面プラズモン共鳴法により測定した結果、１．０×１０−７〜１．０×１０−９であり、親和性を示すことが確認された。
なお、二次元目の電気泳動としてＳＤＳ−ＰＡＧＥではなく、蛋白質の分子構造を保持して分離するネイティブ電気泳動を適用した場合にも同様な効果が得られた。
また、実施例２では、放射性ラベルしたランダム重合体プールを用いた標識物質としては、放射性同位元素以外にも、酵素、蛍光物質、化学発光物質等の標識物質から適宜選択することができる。更に、ブロッティングされたニトロセルロース膜などの転写用担体上の転写物を染色や分光等によって可視化し、転写物の多い部分からＤＮＡの配列を抽出し、クローニングして配列を決定することもできる。
産業上の利用可能性
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、標的に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗体の親和性や特異性に匹敵し、狭義において抗体と同様に機能することが可能で、広汎な標的を認識可能であり、多種の標的（標的物質、検出標的）に対して高い親和性を示し、増幅・複製が容易であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服、遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野で好適であり、特に蛋白質の解析に好適な機能性分子を提供することができる。
本発明によると、前記機能性分子を煩雑な増幅、精製等の操作を繰り返して行う必要がなく、効率よく一括して製造可能な機能性分子の製造方法を提供することができる。
【配列表】
2003078623.tif 000017
【図面の簡単な説明】
図１は、ランダム重合体プールを構成する修飾オリゴヌクレオチドと固定オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの一例を示す模式図である。
図２は、ランダム重合体プールを合成するのに用いるＤＮＡシンセサイザーの一例を示す概略図である。
図３Ａは、本発明の機能性分子の製造方法において、ランダム重合体プールを合成した状態を説明するための概略図であり、図３Ｂは、アフィニティーカラムの一例を示す概略図であり、図３Ｃは、修飾ヌクレオチドランダム配列を含むオリゴヌクレオチドを選別し回収した状態を説明するための概略図であり、図３Ｄは、選別された修飾オリゴヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅しその配列を決定し、翻訳を行っている状態を説明するための概略図である。
【図１】
2003078623.tif 000020
【図２】
2003078623.tif 000021
【図３Ａ】
2003078623.tif 000022
【図３Ｂ】
2003078623.tif 000023
【図３Ｃ】
2003078623.tif 000024
【図３Ｄ】
2003078623.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月27日(2004.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的に対し親和性を有する機能性分子の製造方法であって、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を含むことを特徴とする機能性分子の製造方法。
【請求項２】
修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程において、修飾オリゴヌクレオチド配列を製造し該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作製する請求項１に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項３】
修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する選別工程を含む請求項１から２のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項４】
選別した修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する配列解読工程を含む請求項３に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項５】
塩基配列を決定した修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する翻訳工程を含む請求項４に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項６】
選別工程が、標的を結合させたビーズを充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行われる請求項３に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項７】
選別工程が、標的と修飾オリゴヌクレオチド配列との解離定数をモニターしながら該修飾オリゴヌクレオチドを前記標的から解離させることにより行われる請求項３及び６のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項８】
選別工程が、２種以上の標的を一次元乃至三次元の空間配置を持つマトリックス上に固定し、前記標的が固定された該マトリックスに対し前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作用させた後、前記標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を精製することにより行われる請求項３、６及び７のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
【請求項９】
増幅が、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法及びＬＡＭＰ法から選択されるいずれかの方法により行われ、クローニングにより塩基配列が決定される請求項４に記載の機能性分子の製造方法。
【請求項１０】
翻訳工程が、修飾ヌクレオチドｎ量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における５’末端側からｎ塩基ずつ、対応表に基づいて行われる請求項５に記載の機能性分子の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多種の標的（標的物質）に対し高い親和性を示し、増幅・複製が容易であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服、遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野で好適であり、特に蛋白質の解析に好適な機能性分子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００２年に人間の全遺伝子情報のドラフトが発表され、２００３年にはその完全情報が明らかにされる予定である。その結果、研究者や科学者の興味の中心は、遺伝子からの遺伝子産物である蛋白質の解析に移行してきている。前記蛋白質の解析は、対象となる個々の蛋白質に対し親和性を有する分子が存在して初めて可能になるといっても過言ではない。解析の対象である前記蛋白質は、細胞中に非常に多種存在し、そのアミノ酸配列や構造等が全く未知であるものが多数であるので、該蛋白質を解析するための分子も多種必要になる。
しかしながら、前記蛋白質を解析するための分子を作製乃至入手等するための効率的な方法が現在知られていないのが現状である。従来より知られており、ある特定の蛋白質に対して親和性のある分子を得る最も一般的な方法としては、動物の免疫系を用いてアフィニティー抗体を選別する方法がある。ところが、この方法の場合、動物を使っているため、多量の蛋白質が必要となり、工程数が多く、高コストである。しかも、この方法で選別し入手したアフィニティー抗体は、モノクローナル抗体にし、その細胞を維持することにより複製可能であるものの、高コストであり、改良を行うことができない。また、同一標的に対し親和性を有するアフィニティー抗体しか選別することができない、という問題がある。したがって、細胞内に存在する全種類の蛋白質に対し親和性を有する各アフィニティー抗体を選別し入手することは極めて困難である。
【０００３】
近年、ヌクレオチドランダム配列から特定の働きを持つ分子を選別し、その遺伝情報を基にして該分子の同定を行う研究が多数なされている。その結果、特定の標的に親和性のある分子や特定の反応を触媒するＲＮＡなどが数多く報告されている。
しかしながら、ヌクレオチドの構成単位数はＲＮＡ及びＤＮＡのどちらも４個であり、これらの重合体に存在する官能基の種類は著しく制限され、その働きも制限されたものにならざるを得なかった。この問題を打開するために修飾ヌクレオチドを用いた研究もなされているが、特定の部位に選択的に、あるヌクレオチドを導入したものが前記分子であることを決定するためには、修飾ヌクレオチドに対応する天然のヌクレオチドを実験系から除く必要があり、結局、ヌクレオチドの構成単位数は４＋１−１＝４個のままであり、根本的な問題の解決にはなっていない。また、ＲＮＡは酵素的に非常に不安定であり、同様の働きを持つ前記分子を安定なＤＮＡで合成する試みもなされているが成功するには至っていない。これらの場合、特定の標的に対し親和性を有する分子を得るためには、増幅及び精製の操作を繰り返して行う必要があり、前記分子を多種合成することは依然として困難である。
一方、アミノ酸や人工物質を構成単位にし、コンビナトリアルケミストリーにより前記分子を選別する研究においては、構成単位からなる該分子自体が遺伝情報を持たないために、配列情報を増幅することができず、前記分子の配列を決定するためには多大な工程が必要であった。
また、遺伝情報を持つ蛋白質の合成に関しては、ｍＲＮＡの３’末端にピューロマイシンを導入した研究がある（例えば、特許文献１参照）。これはピューロマイシンが翻訳系においてアミノ酸と間違われて蛋白質に組み込まれやすいという性質を利用したものである。しかしながら、この場合、現在までのところ、ピューロマイシンの組み込み効率が悪く、ランダムなアミノ酸３残基のライブラリーから前記分子を選別できたという報告がなされている程度である。また仮に、ピューロマイシンの組み込み効率が改善できたとしても、ＤＮＡランダム配列には３／６４の割合で終止コドンが存在し、細胞が好まないレアーコドンの存在まで考慮に入れるとＤＮＡランダムプールの内、最終的に遺伝情報を持つ蛋白質になる可能性のあるライブラリープールの数は非常に小さくなってしまう、という問題がある。
【特許文献１】特開２００２−２９１４９１号公報
【０００４】
本発明は、標的に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗体の親和性や特異性に匹敵し、狭義において抗体と同様に機能することが可能で、広汎な標的を認識可能であり、多種の標的（標的物質、検出標的）に対して高い親和性を示し、増幅・複製が容易であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服、遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野で好適であり、特に蛋白質の解析に好適な機能性分子を提供することを目的とする。
本発明は、前記機能性分子を煩雑な増幅、精製等の操作を繰り返して行う必要がなく、効率よく一括して製造可能な機能性分子の製造方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の機能性分子の製造方法は、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を含む。本発明の機能性分子の製造方法では、前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程において、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）がランダムに重合されて、修飾オリゴヌクレオチド配列が製造される。該修飾オリゴヌクレオチド配列は、核酸を構成する４種のヌクレオチドに比べて、標的を認識する置換基数が多い上に核酸の自己複製能をそのまま保持しており、親和性及び特異性が抗体に匹敵するため、該修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅・複製することにより、前記標的を認識可能な機能性分子が多種効率良く製造される。
本発明の機能性分子は、本発明の前記機能性分子の製造方法により製造される。該機能性分子は、標的に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗体の親和性や特異性に匹敵し、多種の標的を認識可能であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服やその遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野に好適に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ランダム重合体プールを構成する修飾オリゴヌクレオチドと固定オリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの一例を示す模式図である。
【図２】図２は、ランダム重合体プールを合成するのに用いるＤＮＡシンセサイザーの一例を示す概略図である。
【図３】図３Ａは、本発明の機能性分子の製造方法において、ランダム重合体プールを合成した状態を説明するための概略図であり、図３Ｂは、アフィニティーカラムの一例を示す概略図であり、図３Ｃは、修飾ヌクレオチドランダム配列を含むオリゴヌクレオチドを選別し回収した状態を説明するための概略図であり、図３Ｄは、選別された修飾オリゴヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅しその配列を決定し、翻訳を行っている状態を説明するための概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（機能性分子及びその製造方法）
本発明の機能性分子は、本発明の機能性分子の製造方法により製造される。以下、本発明の機能性分子の製造方法の説明を通じて本発明の機能性分子の内容を明らかにする。
本発明の機能性分子の製造方法は、修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を少なくとも含み、選別工程、配列解読工程、翻訳工程を含むのが好ましく、更に目的に応じて適宜選択したその他の工程を含む。
【０００８】
−修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程−
前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程は、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する工程である。
なお、前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を行った結果、得られた前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含む反応物は、精製・分離等することなくそのまま、該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールとして前記選別工程等において使用可能である。
【０００９】
前記修飾ヌクレオチドｎ量体は、前記修飾ヌクレオチドを含んでなる。
前記修飾ヌクレオチドは、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入されてなる。
前記修飾ヌクレオチドｎ量体におけるｎは、整数を表し、２以上が好ましく、２〜１０がより好ましく、２〜３が特に好ましい。
前記ｎが、２未満であると、前記修飾ヌクレオチドの種類が核酸を構成する４種類のヌクレオチドと差がなく、標的に対する認識力を向上させることができなくなることがある。なお、前記ｎが、４以上であると、増幅過程に起こる可能性のある１塩基欠損や１塩基付加を塩基配列類似性から判別し難くなり、ｎが３であっても最大６４種類もの異なる側鎖を導入することができるので、アミノ酸２０種類から多種多様な蛋白質ができていることを考慮すると、ｎが３でも十分であり、ｎが４以上であってもそれに見合う効果が十分には期待できない一方、合成の負荷の増大が懸念される。
【００１０】
前記核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよく、また、ＤＮＡ及びＲＮＡは一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。
前記ＤＮＡは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の４種の塩基を有し、ＤＮＡポリヌクレオチド鎖において前記塩基は、中心軸に対して垂直な平面内で互いに内側に突出した形で存在して、いわゆるワトソン−クリック型塩基対を形成し、アデニンに対してはチミンが、グアニンに対してはシトシンが、それぞれ特異的に水素結合している。その結果、前記２本鎖ＤＮＡにおいては、２本のポリペプチド鎖が互いに相補的に結合している。
前記ＤＮＡの４種のヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド）としては、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）等が挙げられる。
前記ＲＮＡは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）及びシトシン（Ｃ）の４種の塩基を有し、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３種に大別できる。
前記ＲＮＡの４種のヌクレオシド（リボヌクレオシド）としては、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）等が挙げられる。
【００１１】
前記修飾ヌクレオチドｎ量体におけるｎが２である場合の修飾ヌクレオチド２量体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記核酸を構成する４種のヌクレオシドと該修飾ヌクレオシドとの組合せであってもよいし、該修飾ヌクレオシド同士の組合せであってもよい。なお、置換基を導入するのがヌクレオシド（プリン又はピリミジン塩基に糖が結合したもの）でなく、ヌクレオチド（ヌクレオシドにリン酸基が付加したもの）であってもよい。
前記修飾ヌクレオシドにおいて前記置換基が導入される位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ピリミジンにおける５位、プリンにおける７位、プリンにおける８位、環外アミンの置換、４−チオウリジンの置換、５−ブロモの置換、５−ヨード−ウラシルの置換、などが挙げられる。これらの中でも、増幅（複製）の際の酵素反応を阻害し難い点で、ピリミジンにおける５位、プリンにおける７位などが好ましく、合成の容易さの点で、ピリミジンにおける５位がより好ましい。
前記ヌクレオシドに置換基を導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記式で示されるヌクレオシドのピリミジン塩基における５位に置換基Ｒを導入する方法、などが好適に挙げられる。
【００１２】
2003078623.tif 000026
【００１３】
なお、前記置換基Ｒとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、下記式（１）〜（１０）で表される基、などが挙げられる。
2003078623.tif 000027
【００１４】
前記天然又は非天然のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリン、などが挙げられる。
前記金属錯体としては、金属イオンに配位子が配位した化合物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｕビピリジル錯体、フェロセン錯体、ニッケルイミダゾール錯体、などが挙げられる。
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素、などが挙げられる。
前記酸化還元色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロイコアニリン、ロイコアントシアニン、等のロイコ色素、などが挙げられる。
前記スピンラベル体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄Ｎ−（ジチオカルボキシ）サルコシン（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、ＴＥＭＰＯ（テトラメチルピペリジン）誘導体、などが挙げられる。
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、などが挙げられる。
これらは、置換基で更に置換されていてもよい。
【００１５】
前記修飾ヌクレオチド２量体を合成する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法、などが挙げられる。これらの中でも、ホスホロアミダイト法が好適である。
前記ホスホロアミダイト法は、一般的には、テトラゾールを促進剤としたヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドとの縮合反応を鍵反応として用いる。この反応は、通常、糖部分の水酸基とヌクレオシド塩基部のアミノ基との両方に競合的に起こるが、所望のヌクレオチド合成のためには、糖部分の水酸基にのみ選択的に反応を起こさせる。したがって、アミノ基への副反応を防止するため、保護基で修飾する。例えば、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＵ１）は、下記式で示したように、デオキシアデノシンと修飾デオキシウリジンとから合成することができる。
【００１６】
2003078623.tif 000028
【００１７】
但し、前記式において、ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチル基を表す。
なお、後述する下記表１の対応表に示す、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＣ１、Ｃ２Ａ、Ｃ３Ｃ、Ｃ４Ｇ、Ｃ５Ｔ、ＧＣ６、ＧＵ２、Ｕ３Ａ、Ｕ４Ｃ、Ｕ５Ｇ、Ｕ６Ｔ）についても同様の方法により合成することができる。
【００１８】
ここで、前記合成した修飾ヌクレオチド２量体を、前記核酸を構成する４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表の１６個のいずれかと１対１に対応付け（関係付け）する。
前記修飾ヌクレオチド２量体の種類が、５未満であると、核酸を構成する４種のヌクレオチドと大差がなく、標的に対する認識力を十分に向上させることができないことがある。
【００１９】
前記対応表としては、例えば、下記表１に示すものが挙げられる。この表１は、横方向（５’側）にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの順に４種のヌクレオシドの塩基を配置し、一方、縦方向（３’側）にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの順に４種のヌクレオシドの塩基を配置し、これら塩基がそれぞれ１対１に対応した１６個のパターン（マス）が形成されている。
【００２０】
【表１】
2003078623.tif 000029
【００２１】
また、前記修飾ヌクレオチド２量体の場合と同様に、修飾ヌクレオチド３量体を用いることもでき、この場合における前記対応表としては、例えば、下記表２に示すものが挙げられる。表２には、５６個のパターン（５６種の修飾ヌクレオチド３量体）が形成されている。なお、前記修飾ヌクレオチド２量体や前記修飾ヌクレオチド３量体の場合と同様に、修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）を用いることもでき、この場合における前記対応表には、例えば、４ｎ個のパターン（４ｎ種の修飾ヌクレオチドｎ量体）を形成しておくことができる。
【００２２】
【表２】
2003078623.tif 000030
【００２３】
上記表１の対応表においては、下記に示すように１２種の修飾ヌクレオチド２量体が条件付けられている。
具体的には、塩基配列は、５’側から３’側方向に読み取り、塩基配列ＡＣには修飾ヌクレオチド２量体ＡＣ１が対応する。配列ＡＴには修飾ヌクレオチド２量体ＡＵ１が対応する。塩基配列ＣＡには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ２Ａが対応する。塩基配列ＣＣには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ３Ｃが対応する。塩基配列ＣＧには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ４Ｇが対応する。塩基配列ＣＴには修飾ヌクレオチド２量体Ｃ２Ａが対応する。塩基配列ＧＣには修飾ヌクレオチド２量体ＧＣ６が対応する。塩基配列ＧＴには修飾ヌクレオチド２量体ＧＵ２が対応する。塩基配列ＴＡには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ３Ａが対応する。塩基配列ＴＣには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ４Ｃが対応する。塩基配列ＴＧには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ５Ｇが対応する。塩基配列ＴＴには修飾ヌクレオチド２量体Ｕ６Ｔが対応する。
なお、表１の対応表における、塩基配列と修飾ヌクレオチド２量体との条件付けとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、表１はあくまでもその一例である。また、修飾ヌクレオチド２量体を１２種作製することが困難であれば、一部が重複してもよいが、その分、標的に対する認識力は低下することがある。
【００２４】
上記表１の対応表において、プリン塩基同士の組合せであるＡＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＧについては、プリン塩基が修飾に用いる酵素の反応が低いため、修飾ヌクレオチド２量体を作製していないが、これは、プリン塩基同士の修飾ヌクレオチド２量体が作製することができないことを意味しない。
上記表１の対応表に基づいて、１２種の２量体修飾ヌクレオシドを対応付けることにより、従来の核酸では４種でしかなかったものが、一挙に１２種にまで拡がり、その結果、数多くの種の標的に対して識別力を発揮し得るものである。
【００２５】
前記ランダム重合体プールを構成するオリゴヌクレオチド１は、図１に示したように、修飾オリゴヌクレオチド配列１０の両端に固定オリゴヌクレオチド配列２０，２０を有することが、後述する配列解読工程においてＰＣＲ法を行う際に固定オリゴヌクレオチド配列部分にプライマーを結合させて、効率よく増幅（複製）することができる点で好ましい。
前記修飾オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０〜１００個が好ましく、１０〜５０個がより好ましい。
前記固定オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常１５個以上が好ましく、２０〜４０個がより好ましい。
【００２６】
前記ランダム重合体プールを作製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用いる方法、などが好適である。
前記ＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用いる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、図２に示すようなＤＮＡシンセサイザー（ＤＮＡ自動合成機）を用い、合成した前記修飾ヌクレオチド２量体を複数種混合したもの（図２に示す例では１２種であり、図２中「Ｘ」で表される）を試薬とし、この試薬をコントローラーによる制御の下、ノズル１５により吸い上げて重合させることにより、ランダムであらゆる配列順序の修飾オリゴヌクレオチド配列を有する前記ランダム重合体プールを作製する方法などが好ましい。この場合、前記ランダム重合体プールを効率よく作製することができる点で有利である。
なお、前記固定ヌクレオチド配列を合成する場合には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の４種により同様に合成することができる。
【００２７】
前記ランダム重合体プールを作製する方法としては、また、予め作製しておいたオリゴヌクレオチドランダム配列に対しモノマーブロックを並べてアニーリングし、ＤＮＡライゲース又はＲＮＡライゲースを働かせて結合させることによりランダム重合体プールを作製する方法、なども挙げられる。この方法の場合も、ランダムであらゆる配列順序の修飾オリゴヌクレオチド配列を含む前記ランダム重合体プールを作製することができる。
前記ＤＮＡライゲースは、ＤＮＡリガーゼともいい、隣接したヌクレオチドの５’リン酸基と３’水酸基の間の、共有結合の形成を触媒する酵素である。
前記ＲＮＡライゲースは、ＲＮＡリガーゼともいい、５’リン酸基末端のポリヌクレオチドと３’水酸基末端のポリヌクレオチドを連結させる酵素である。ＲＮＡリガーゼの基質は本来はＲＮＡであるが、５’リン酸基末端のポリデオキシリボヌクレオチドと３’端のみがリボヌクレオチドであるポリデオキシリボヌクレオチドも効率的に連結する。
【００２８】
なお、前記ランダム重合体プールは、前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むが、更に必要に応じて、置換基で修飾していないＤＮＡ若しくはＲＮＡのモノマー又はオリゴマーをランダムに重合させた配列を含んでいてもよい。
【００２９】
−選別工程−
前記選別工程は、前記修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する工程である。
前記選別の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、フィルター結合、液−液分割、ろ過、ゲルシフト、密度勾配遠心分離、などの各種方法が挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。これらの中でも、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい。
【００３０】
前記アフィニティークロマトグラフィーは、特定の成分同士が結合し易い生物学的親和性を利用した分離・精製手段であり、具体的には、前記標的を樹脂等のカラム充填材に固定化し、結合用緩衝液で平衡化してから、前記ランダム重合体プールを含む溶液をカラム中に流し込み、一定条件に放置すると、該標的と親和性を有するオリゴヌクレオチド配列がカラムに吸着し、結合用緩衝液で充分洗浄することにより、残留したオリゴヌクレオチド配列以外の成分を除去することができる。前記標的を含む溶液あるいは希薄緩衝溶液をカラムに流すことにより、修飾オリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを回収し、選別することができる。
【００３１】
また、特に前記標的が未知で多種存在する場合（例えば、臓器や血清など）には、前記選別のための手段としては、２種以上の標的を一次元乃至三次元の空間配置を持つマトリックス上に固定し、該標的が固定されたマトリックスに対し前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作用させた後、前記標的と結合した前記修飾オリゴヌクレオチド配列を精製する方法が好適に挙げられる。
前記マトリックス上に前記標的を固定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記標的が蛋白質である場合には、該標的をポリアクリルアミド電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなど）した後で膜状の該マトリックスに転写するウエスタンブロット法、膜状の該マトリックスに前記標的又はその希釈液を直接染み込ませるドットブロット法やスロットブロット法、などが挙げられる。これらの中でも、細胞抽出液などの複雑な組成の溶液中に微量に含まれる蛋白質でも明瞭に検出可能な点で、前記ウエスタンブロット法が好ましい。
なお、前記ウエスタンブロット法は、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、蛋白質混合物から特定の蛋白質を検出する手法であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、二次元電気泳動等の後、ゲルから蛋白質を電気的に膜状の前記マトリックスに移動・固定化させる方法である。該膜状のマトリックスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記蛋白質が結合し易い疎水性の高いニトロセルロース膜、疎水性に優れたＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜、などが好適に挙げられる。
【００３２】
本発明においては、前記標的が、例えば、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されているか、あるいは、前記ランダム重合体プールに含まれる修飾オリゴヌクレオチド配列が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されているのが好ましい。
前記放射性同位元素としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、等が挙げられる。
前記化学発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール又はこれらの誘導体、等が挙げられる。前記化学発光による検出には、Ｘ線フィルムへの露光検出、あるいは化学発光を検出可能なスキャナーを必要としますが、他の発色法に比べて１０〜５０倍以上も感度が高いので、微量蛋白質の検出が容易であるとい利点がある。
【００３３】
前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素、緑色蛍光蛋白質(ＧＦＰ)、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）等の希土類キレート、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、４−メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、等が挙げられる。
前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、等が挙げられる。
更に前記標識物質としては、ビオチン、リガンド、特定の核酸、蛋白質、ハプテン等が挙げられる。なお、前記標識物質がビオチンである場合にはこれに特異的に結合するアビジン又はストレプトアビジンが、前記標識物質がハプテンである場合にはこれに特異的に結合する抗体が、前記標識物質がリガンドである場合にはレセプターが、前記標識物質が特定の核酸、蛋白質、ハプテン等である場合にはこれらと特異的に結合する核酸、核酸結合蛋白質、特定の蛋白質と親和性を有する蛋白質等が、それぞれ組合せ可能である。
【００３４】
前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記ウエスタンブロット法により前記膜状のマトリックス（ニトロセルロース膜等のメンブランなど）上の所定の位置（領域）に固定され、前記標的と結合した前記修飾オリゴヌクレオチド配列を、該マトリックス（ニトロセルロース膜等のメンブランなど）と共に、前記所定の位置（領域）毎に一緒に切断して切断片を得た後、該切断片から前記修飾オリゴヌクレオチド配列を回収する方法、などが特に好適に挙げられる。この場合、特別な精製処理が不要であり、前記修飾オリゴヌクレオチド配列を簡便に効率よく精製することができる点で有利であり、また、前記所定の位置（領域）毎に異なる前記修飾オリゴヌクレオチド配列を効率よく精製することができる点で有利である。
なお、前記切断片から前記修飾オリゴヌクレオチド配列を回収は、イオン性溶液を用い電圧を印加してエレクトロエリューションにより行うことができ、また、熱水を用いて行うことができる。
【００３５】
また、前記精製は、他の方法、即ち前記標的と前記修飾オリゴヌクレオチド配列との解離定数をモニターしながら該修飾オリゴヌクレオチドを前記標的から解離させることにより行ってもよい。この場合、最小一回の処理で所望の解離定数を持つ前記機能性分子を選び出すこともできる。このように前記選別工程において解離定数を測定し、解離定数をコントロールすることで、前記機能性分子を効率よく選び出すことができる。なお、前記解離定数は前記標的に応じて適宜設定することができ、例えば、ワービスプラズモン共鳴を用いた測定機器により測定することができる。
本発明においては、前記選別工程において、例えば、解離定数の異なる２種以上の分子の相互作用を利用し、小さい解離定数に適応した洗浄操作で前記機能性分子を選別する一方、大きい解離定数に適応する過激な洗浄操作により、選別する担体の再生を行うことできる。この方法の場合、前記標的が２種以上あっても、再生が可能となるので１枚の基板を用いて複数種の前記機能性分子を一括して効率よく選別することができ、無駄を省くことができコストダウンが図られる。
また、前記選別工程において、複数種の分子と反応性の異なるリンカーを一対一に対応させることにより、異なる後処理により各々の分子を認識することができる前記機能性分子を順次選び出すこともできる。これにより、前記機能性分子を選別することができる。この場合、前記ランダム重合体プールを共通に用いて複数種の前記機能性分子を効率よく選別することができる。
前記異なる後処理としては、リンカーの結合強度を調整することができる試薬を流す方法、リンカーの結合の切れ易さを調整できる試薬を流す方法、光反応や電極反応により特定の位置を選択的に切断する反応を利用する方法、などが挙げられる。
【００３６】
前記標的（標的物質）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛋白、リポ蛋白、糖蛋白、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類、核酸、環境ホルモン、薬物、これらの複合体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用することができ、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、血漿蛋白、腫瘍マーカー、アポ蛋白、ウイルス、自己抗体、凝固・線溶因子、ホルモン、血中薬物、ＨＬＡ抗原、環境ホルモン、核酸などが好適に挙げられる。
前記血漿蛋白としては、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、補体成分（Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５，Ｃ１ｑ）、ＣＲＰ、α１−アンチトリプシン、α１−マイクログロブリン、β２−マイクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチンなどが挙げられる。
前記腫瘍マーカーとしては、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、γ−セミノプロテイン、ＴＰＡ、エラスターゼＩ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）などが挙げられる。
前記アポ蛋白としては、例えば、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＢ、アポＣ−ＩＩ、アポＣ−ＩＩＩ、アポＥなどが挙げられる。
前記ウイルスとしては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＢＣ）、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶなどが挙げられる。また、ウイルス以外の感染症としては、ＡＳＯ、トキソプラズマ、マイコプラズマ、ＳＴＤなどが挙げられる。
前記自己抗体としては、例えば、抗マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗核抗体、リュウマチ因子、抗ミトコンドリア抗体、ミエリン抗体などが挙げられる。
前記凝固・線溶因子としては、例えば、フィブリノゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、プラスミノゲン、α２−プラスミンインヒビター、アンチトロンビンＩＩＩ、β−トロンボグロブリン、第ＶＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳなどが挙げられる。
前記ホルモンとしては、例えば、下垂体ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＨ、ＡＣＴＨ、ＴＳＨ、プロラクチン）、甲状腺ホルモン（Ｔ３、Ｔ４、サイログロブリン）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質ホルモン（アルドステロン、コルチゾール）、性腺ホルモン（ｈＣＧ、エストロゲン、テストステロン、ｈＰＬ）、膵・消化管ホルモン（インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、ガストリン）、その他（レニン、アンジオテンシンＩ，ＩＩ、エンケファリン、エリスロポエチン）などが挙げられる。
前記環境ホルモンは、外界に広く存在して生物の生活活動と共に体内に取り込まれてその生殖、発生、行動などを含む生理的な内分泌の諸現象に影響を及ぼす外因性内分泌撹乱化学物質であり、該環境ホルモンとしては、例えば、ノニルフェノール、オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ブチルベンジル、トリブチルスズ、ＰＣＢ、ポリ塩化ジベンゾジオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、ダイオキシン類、ＤＤＴ、ＤＤＥ、ＤＤＤ、エンドスルファン、メトキシクロル、ヘプタクロル、トキサフェン、ディルドリン、リンデン、ジエチルスチベロール（ＤＥＳ）、エチニルエストラジオール（ピルの成分）、クメストロール、フォルモノネテイン、ゲニステイン、などが挙げられる。
前記血中薬物としては、例えば、カルバマゼピン、プリミドン、バルプロ酸等の抗てんかん薬、ジゴキシン、キニジン、ジギトキシン、テオフィリン等の循環器疾患薬、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質などが挙げられる。
前記核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子、などが挙げられる。
前記癌関連遺伝子としては、例えば、ｋ−ｒａｓ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、ｓｒｃ遺伝子、ｒｏｓ遺伝子又はＡＰＣ遺伝子などが挙げられる。
前記遺伝病に関連する遺伝子としては、例えば、各種先天性代謝異常症、例えばフェニールケトン尿症、アルカプトン尿症、シスチン尿症、ハンチントン舞踏病、Ｄｏｗｎ症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、血友病などが挙げられる。
前記ウイルス及び細菌遺伝子としては、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＨＩＶウイルス、マイコプラズマ、リケッチア、レンサ球菌、サルモネラ菌などが挙げられる。
前記多型性を示す遺伝子とは、病気等の原因とは必ずしも直接は関係のない個体によって異なる塩基配列を持つ遺伝子、例えば、ＰＳ１（プリセリニン１）遺伝子、ＰＳ２（プリセリニン２）遺伝子、ＡＰＰ（ベーターアミロイドプレカーサー蛋白質）遺伝子、リポプロテイン遺伝子、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）や血液型に関する遺伝子、あるいは高血圧、糖尿病等の発症に関係するとされている遺伝子などが挙げられる。
前記標的を含む検体としては、例えば、細菌、ウイルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、あるいは糞尿等の排泄物が挙げられる。更に、出生前診断を行う場合は、羊水中に存在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部などであってもよい。また、これらの検体は、直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、これらの組合せ等による細胞破壊処理を予め施されていてもよい。
【００３７】
−配列解読工程−
前記配列解読工程は、前記選別工程により選別した前記修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する工程である。
前記増幅の方法としては、対象となる前記修飾オリゴヌクレオチド配列の数を増やすことができれば、特に制限はなく、当該技術分野において公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、などが挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。
前記ＰＣＲ法は、ポリメラーゼ連鎖反応法を意味し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応の試験管内での繰り返しにより、その特定のオリゴヌクレオチド領域を数１０万倍に増幅可能な方法である。該ＰＣＲ法においては、使用するプライマーの伸長反応は、４種又は５種のヌクレオチド三リン酸（デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、及びチミジン三リン酸あるいはデオキシウリジン三リン酸（これらの混合物をｄＮＴＰということもある））を基質として該プライマーに取り込ませることにより行われる。
この伸長反応を行う場合、通常核酸鎖を増幅するために上記単位核酸及び核酸伸長酵素を含む増幅反応試薬が用いられ、この場合、核酸伸長酵素としてはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ等の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、特にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、これによりサイクル毎に新たな酵素の添加の必要性がなくなり、自動的にサイクルを繰り返すことが可能になり、更にアニーリング温度を５０〜６０℃に設定することが可能なためプライマーによる標的塩基配列認識の特異性を高めることができ、迅速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる（特開平１−３１４９６５号、同１−２５２３００号公報等参照）。
また、この反応を行う際、反応溶液の水分の蒸発を防止するためにオイルを添加することができる。この場合、オイルは水と分配可能で、かつ水より比重の軽いものであればよく、具体的にはシリコーンオイル、ミネラルオイル等が例示される。また、遺伝子増幅装置によってはこのような媒体を必要としないものもあり、このような遺伝子増幅装置を用いてプライマーの伸長反応を行うこともできる。
このように、前記プライマーを用いて伸長反応を繰り返すことにより、目的とするオリゴヌクレオチドを効率的に遺伝子増幅させることができオリゴヌクレオチドを大量に作製することができる。なお、この遺伝子増幅反応を行う条件等の具体的な方法については、実験医学、羊土社、８，Ｎｏ．９（１９９０）、ＰＣＲ  テクノロジー  ストックトン  プレス（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））等の文献に記載された公知の方法が挙げられる。
なお、ＰＣＲ法を行うことにより、前記修飾オリゴヌクレオチド配列は、置換基の修飾のない天然のオリゴヌクレオチド配列に置換される。
【００３８】
また、前記修飾オリゴヌクレオチド配列がＤＮＡではなくＲＮＡである場合、逆転写反応を行うことによりＤＮＡを合成することができる。前記逆転写反応とは、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する方法であり、対象となるＲＮＡにより、逆転写反応の反応液や反応条件は異なる。例えば、ＲＮＡ溶液にＲＮａｓｅフリーの滅菌蒸留水と３’−プライマーを添加し、インキュベートした後、冷却して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２などを含む逆転写緩衝液、ＤＴＴ、ｄＮＴＰｓを加え、逆転写酵素を添加した後インキュベートすること等により行うことができる。該逆転写反応の停止は、インキュベートの条件を調整して行うことができる。なお、このような逆転写反応は、逆転写ＰＣＲによっても行うことができる。
【００３９】
前記増幅されたオリゴヌクレオチドの塩基配列の決定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、遺伝子クローニングによる方法、チェーンターミネーター法、サンガー法、ジデオキシ法等によるＤＮＡシーケンサー（ＤＮＡ塩基配列自動決定装置）、などが挙げられる。これらは、１種単独で行ってもよいし、２種以上を行ってもよい。
前記遺伝子クローニングでは、増幅したオリゴヌクレオチド配列を組み込んだ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すること等により製造することができる。
前記発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、プラスミドとファージとのキメラベクター、などが挙げられる。
前記宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物、動物細胞などが挙げられる。
【００４０】
−翻訳工程−
前記翻訳工程は、塩基配列を決定した前記修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体の少なくとも１種と、前記修飾ヌクレオチドｎ量体の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する工程である。
【００４１】
前記翻訳工程では、前記配列解読工程で増幅され、塩基配列が決定されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する。
前記翻訳は、塩基配列が決定された修飾ヌクレオチドｎ量体からなる修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側からｎ塩基ずつ対応表に基づいて行われることが好ましく、定期的にブロックを規定する固定塩基を入れることがより好ましい。例えば、修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体である場合、該修飾ヌクレオチド２量体からなる塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側から２塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、上記表１で表される対応表に基づいて翻訳される。
【００４２】
例えば、図３に示すように、決定された修飾オリゴヌクレオチド配列が“ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＴ”である場合には、対応表に基づき翻訳すると“ＡＵ１ＧＣ６Ｕ４ＣＵ３ＡＧＣ６Ｃ３ＣＣ５Ｔ”という配列であることが確認され、前記機能性分子の配列を求めることができる。
前記修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体である場合、該修飾ヌクレオチド３量体からなる塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列の５’末端側から３塩基ずつ対応表に基づいて翻訳することができる。具体的には、上記表２で表される対応表を用いて翻訳される。
【００４３】
なお、修飾ヌクレオチド３量体を超える場合（ｎ≧４）にも上記同様に、例えば、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体（ｎ≧４）の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体（ｎ≧４）の１種とを対応させた対応表に基づいて翻訳することができる。
【００４４】
本発明の機能性分子の製造方法により得られる本発明の機能性分子は、抗体に匹敵する親和性及び特異性を有し、各種分野に幅広く好適に使用可能である。例えば、特定の蛋白質に親和性を有する前記機能性分子として確認され、本発明の機能性分子の製造方法により製造された本発明の機能性分子は、薬品、ドラッグデリバリーの分野に好適に使用可能である。また、特定のＤＮＡ配列に親和性を有する前記機能性分子として確認され、本発明の機能性分子の製造方法により製造された本発明の機能性分子は、遺伝子異常による疾病の克服やその遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明に好適に使用可能である。また、反応中間体をミックした分子に親和性を有する前記機能性分子として確認され、本発明の機能性分子の製造方法により製造された本発明の機能性分子は、該反応を効率よく進めるための触媒の開発に好適に使用可能である。
【００４５】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
図３に示すようにして、特定の蛋白質に対し親和性を有する機能性分子の製造（合成及び同定）を行った。具体的には、先ず、下記式に示す方法により、シトシンにおける５位から６種の官能基を持つデオキシシチジン類縁体（Ｃ１−６）、及び、ウラシルにおける５位から６種の官能基を持つデオキシウリジン類縁体（Ｕ１−６）を各々合成（作製）した。
【００４６】
2003078623.tif 000031
2003078623.tif 000032
【００４７】
次に、合成（作製）した１２種の修飾ヌクレオシド２量体を、ＤＮＡを構成する４種のヌクレオシドを１対１に組合せた上記表１に示す対応表の１６個のパターンから選ばれるいずれかと、１対１に対応付けした。
【００４８】
次に、ホスホルアミダイト法により、上記表１の対応表に示す１２種の修飾オリゴヌクレオチドアミダイト（Ｍ）を化学合成した。具体的には、例えば、修飾ヌクレオチド２量体（ＡＵ１）は、下記式に示すように、デオキシアデノシンと修飾デオキシウリジンとから合成することができる。
【００４９】
2003078623.tif 000033
【００５０】
但し、前記式において、ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチル基を表す。
そして、図２に示すようなＤＮＡシンセサイザーを用いて、固定オリゴヌレオチド配列２０量体（Ｎ２０）−修飾オリゴヌクレオチドランダム配列２０量体(Ｍ２０)−固定オリゴヌクレオチド配列２０量体（Ｎ２０）からなるランダムオリゴヌクレオチドＮ２０−Ｍ２０−Ｎ２０（ＤＮＡ８０量体）を含むランダム重合体プールを作製した。以上が前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程である。
【００５１】
次に、このランダム重合体プール（図３Ａ）を用いて、特定の蛋白質に強く結合する修飾オリゴヌクレオチド配列（機能性分子）の同定を行った。図３Ａにおいて「□」は、固定ヌクレオチド配列を表し、「〜」は、修飾ヌクレオチドランダム配列を表す。
まず、標的としてヒトアルブミンを結合したビーズを充填したアフィニティーカラムを用意し、このカラムに前記ランダム重合体プールを含む溶液を流し一定条件に放置すると、該標的に対し親和性を示す修飾オリゴヌクレオチド配列がカラムに吸着し（図３Ｂ）、緩衝液で充分洗浄することにより、残留した修飾オリゴヌクレオチド配列以外の成分を除去し、ヒトアルブミンを含む溶液を流すことにより、前記修飾オリゴヌクレオチドランダム配列を含むオリゴヌクレオチドを選別し、回収した（図３Ｃ）。以上が前記選別工程である。
この選別された修飾オリゴヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅し、クローニングによりそのＤＮＡの塩基配列を求めたところ、決定された修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の一部が“ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＴ”であった（図３Ｄ）。以上が前記配列解読工程である。
この塩基配列を上記対応表に基づき翻訳すると“ＡＵ１ＧＣ６Ｕ４ＣＵ３ＡＧＣ６Ｃ３ＣＣ５Ｔ”となり、機能性分子の構造が同定できた（図３Ｄ）。以上が前記翻訳工程である。
得られた機能性分子は、ヒトアルブミンと特異的に結合し、抗体と類似の働きを示すことが認められた。
【００５２】
（実施例２）
前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールとして、実施例１で合成したＤＮＡランダムプール（総量２０ＯＤ）{ヌクレオチド固定配列２０量体ＤＮＡ（Ｎ２０）}の５’−３２Ｐ放射性ラベル標品（予め修飾塩基を含むヌクレオチドモノマーに放射性元素をラベルしたもの）を作製した。以上が前記修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程である。
【００５３】
一方、ラット肝臓組織から常法に従って細胞質画分を精製した。この画分に含まれる蛋白質混合物を常法に従って一次元目等電点電気泳動（ｐＨ４〜７）を行った後、二次元目電気泳動としてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動した後、ウエスタンブロット法によりニトロセルロース膜に、前記蛋白質混合物中の蛋白質をブロッティングした。
この放射性ラベルされた修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールであるＮ２０Ｍ２０Ｎ２０（ＤＮＡ８０量体）の希釈溶液に、蛋白質混合物を固定したニトロセルロース膜を浸して１時間震盪した。その後、このニトロセルロース膜を緩衝溶液で洗浄して非特異的な残留物を除去し、Ｘ−ｒａｙフィルムを用いて該ニトロセルロース膜上における放射能の強い位置（放射性ラベルされた修飾オリゴヌクレオチドが強く結合した位置）を同定した。
前記ニトロセルロース膜上の放射能の強い位置３０箇所を切り取り、イオン溶液（３Ｍ  Ｎａ  Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ＝４．８、０．１％ブロモフェノールブルー溶液）中で電圧を印加してエレクトロエリューションにより修飾オリゴヌクレオチドを回収した。各々の溶液中の放射能を確認した後、固定配列の相補鎖をプライマーとするＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅した。各々のＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル電気泳動により確認した結果、２８種類の修飾オリゴヌクレオチド配列の明確なバンドが確認できた。以上が前記選別工程である。
【００５４】
得られた２８種類の前記修飾オリゴヌクレオチド配列について、各々プラスミドベクターを用いてクローニングを行い、ＤＮＡ配列を決定した。以上が前記配列解読工程である。その後、実施例１と同様にして修飾ＤＮＡの配列を求め、修飾ＤＮＡ（機能性分子）をＤＮＡ自動合成機により合成した。以上が前記翻訳工程である。
得られた修飾ＤＮＡは、二次元電気泳動で分離された蛋白質を特異的に認識できることが確認できた。また、入手可能な蛋白質について解離定数を表面プラズモン共鳴法により測定した結果、１．０×１０−７〜１．０×１０−９であり、親和性を示すことが確認された。
【００５５】
なお、二次元目の電気泳動としてＳＤＳ−ＰＡＧＥではなく、蛋白質の分子構造を保持して分離するネイティブ電気泳動を適用した場合にも同様な効果が得られた。
また、実施例２では、放射性ラベルしたランダム重合体プールを用いた標識物質としては、放射性同位元素以外にも、酵素、蛍光物質、化学発光物質等の標識物質から適宜選択することができる。更に、ブロッティングされたニトロセルロース膜などの転写用担体上の転写物を染色や分光等によって可視化し、転写物の多い部分からＤＮＡの配列を抽出し、クローニングして配列を決定することもできる。
【００５６】
ここで、本発明の好ましい態様を付記すると、以下の通りである。
付記１．    標的に対し親和性を有する機能性分子の製造方法であって、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）をランダムに重合させて修飾オリゴヌクレオチド配列を製造する修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程を含むことを特徴とする機能性分子の製造方法。
付記２．    修飾オリゴヌクレオチド配列製造工程において、修飾オリゴヌクレオチド配列を製造し該修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作製する付記１に記載の機能性分子の製造方法。
付記３．    修飾オリゴヌクレオチド配列の中から標的と親和性のあるものを選別する選別工程を含む付記１から２のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記４．    選別した修飾オリゴヌクレオチド配列を増幅し、その塩基配列を決定する配列解読工程を含む付記３に記載の機能性分子の製造方法。
付記５．    塩基配列を決定した修飾オリゴヌクレオチド配列の配列を、４種のヌクレオシドを１対１に組合せた対応表における４ｎ種のヌクレオチドｎ量体の少なくとも１種と修飾ヌクレオチドｎ量体の１種とを対応させた対応表に基づき翻訳する翻訳工程を含む付記４に記載の機能性分子の製造方法。
付記６．    核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれかである付記１から５のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記７．    修飾ヌクレオチドｎ量体が５〜４ｎ種である付記１から６のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記８．    修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体であり、該修飾ヌクレオチド２量体が５〜１６種である付記１から７のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記９.    修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体であり、該修飾ヌクレオチド３量体が５〜５６種である付記１から７のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
１０．  置換基が、ヌクレオシドにおけるピリミジン塩基の５位に導入された付記１から９のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
１１．  置換基が、下記構造式（Ｉ）で表される基から選択される付記１から１０のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
2003078623.tif 000034
但し、構造式（Ｉ）中、Ｒは、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、及び
下記式（１）〜（１０）から選ばれるいずれかの基を表す。
Ｐは、ピリミジン塩基を表す。
2003078623.tif 000035
付記１２．  修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾オリゴヌクレオチドアミダイトである付記１から１１のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記１３．  修飾オリゴヌクレオチド配列が、ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成される付記１から１２のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記１４．  修飾オリゴヌクレオチド配列が、ヌクレオチドランダム配列に対しヌクレオチドモノマーをアニーリングさせ、該ヌクレオチドモノマーをＤＮＡライゲース及びＲＮＡライゲースの少なくともいずれかにより連結させて合成される付記１から１２のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記１５．  修飾オリゴヌクレオチド配列が、両端に固定オリゴヌクレオチド配列を有する付記１から１４のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記１６．  選別工程が、標的を結合させたビーズを充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行われる付記３に記載の機能性分子の製造方法。
付記１７．  選別工程が、標的と修飾オリゴヌクレオチド配列との解離定数をモニターしながら該修飾オリゴヌクレオチドを前記標的から解離させることにより行われる付記３及び１６のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記１８．  選別工程が、２種以上の標的を一次元乃至三次元の空間配置を持つマトリックス上に固定し、前記標的が固定された該マトリックスに対し前記修飾オリゴヌクレオチド配列を含むランダム重合体プールを作用させた後、前記標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を精製することにより行われる付記３に記載の機能性分子の製造方法。
付記１９．  標的のマトリックス上への固定が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法及びスロットブロット法から選択されるいずれかにより行われる付記１８に記載の機能性分子の製造方法。
付記２０.  マトリックス上に固定された標的が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されている付記１８から１９のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記２１．  ランダム重合体プールに含まれる修飾オリゴヌクレオチド配列が、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、酵素、抗体、リガンド及びレセプターから選択される少なくとも１種の標識物質で標識されている付記１７から２０のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記２２．  選別工程が、マトリックス上に固定された標的と結合した修飾オリゴヌクレオチド配列を該マトリックスと共に切断して切断片を得た後、直接ＰＣＲを行うこと及び該切断片から修飾オリゴヌクレオチド配列を回収することのいずれかにより行われる付記１７から２１のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記２３．  修飾オリゴヌクレオチド配列を切断片からの回収が、イオン性溶液を用い電圧を印加するエレクトロエリューション法、及び熱水を用いる方法のいずれかにより行われる付記２２に記載の機能性分子の製造方法。
付記２４．  標的が、蛋白質、リポ蛋白質、糖蛋白質、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類、核酸、環境ホルモン、薬物、及びこれらの複合体から選択される少なくとも１種である付記１から２３のいずれかに記載の機能性分子の製造方法。
付記２５．  増幅工程が、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法及びＬＡＭＰ法から選択されるいずれかの方法により行われ、クローニングにより塩基配列が決定される付記４に記載の機能性分子の製造方法。
付記２６．  翻訳工程が、修飾ヌクレオチドｎ量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における５’末端側からｎ塩基ずつ、対応表に基づいて行われる付記５に記載の機能性分子の製造方法。
付記２７.  修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド２量体であり、翻訳工程が、該修飾ヌクレオチド２量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における５’末端側から２塩基ずつ、対応表に基づいて行われる付記２６に記載の機能性分子の製造方法。
付記２８.  修飾ヌクレオチドｎ量体が修飾ヌクレオチド３量体であり、翻訳工程が、該修飾ヌクレオチド３量体をランダムに重合させてなり、かつ塩基配列が決定された修飾オリゴヌクレオチド配列における５’末端側から３塩基ずつ、対応表に基づいて行われる付記２６に記載の機能性分子の製造方法。
付記２９．  付記１から２８のいずれかに記載の機能性分子の方法により製造されることを特徴とする機能性分子。
付記３０．  標的に対し親和性を有し、核酸を構成するヌクレオシドに置換基が導入された修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオチドｎ量体（ただし、ｎは、整数を表す）を有してなる付記２９に記載の機能性分子。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、標的に対する親和性や特異性が、抗原に対する抗体の親和性や特異性に匹敵し、狭義において抗体と同様に機能することが可能で、広汎な標的を認識可能であり、多種の標的（標的物質、検出標的）に対して高い親和性を示し、増幅・複製が容易であり、薬品、ドラッグデリバリー、バイオセンサー、遺伝子の発現量の制御、遺伝子異常による疾病の克服、遺伝子により翻訳される蛋白質の機能解明、反応触媒の開発などの広い分野で好適であり、特に蛋白質の解析に好適な機能性分子を提供することができる。
本発明によると、前記機能性分子を煩雑な増幅、精製等の操作を繰り返して行う必要がなく、効率よく一括して製造可能な機能性分子の製造方法を提供することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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