(57)【要約】本発明はＬＩＮＥをレトロ転移させる方法を提供する。本発明は、ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを細胞内で転写させ、ウイルスベクターを用いてこのＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質をトランスに供給することにより、このＲＮＡをレトロ転移させる方法に関する。また本発明は、ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを他のＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインに置換することにより、ＬＩＮＥのレトロ転移の標的部位を改変する方法に関する。本発明のＬＩＮＥのレトロ転移の方法は、新規な遺伝子送達のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを細胞内で転写させる工程、（２）前記ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質を前記ＲＮＡ以外から発現させる工程、を含む、前記ＲＮＡをレトロ転移させる方法。
【請求項２】
前記ＬＩＮＥがＡＰＥドメイン含有型ＬＩＮＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＩＮＥが部位特異的ＬＩＮＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（１）ＡＰＥドメイン含有型部位特異的ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを細胞内で転写させる工程、（２）前記ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質を前記細胞内で発現させる工程、を含む、前記ＲＮＡをレトロ転移させる方法。
【請求項５】
（１）ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを細胞内で転写させる工程、（２）前記ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質であって、そのエンドヌクレアーゼドメインが他のＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインと置換されたＯＲＦ蛋白質を細胞内で発現させる工程、を含む、前記ＲＮＡをレトロ転移させる方法。
【請求項６】
前記他のＬＩＮＥがＡＰＥドメイン含有型ＬＩＮＥである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記他のＬＩＮＥが部位特異的ＬＩＮＥである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記部位特異的ＬＩＮＥがテロメアリピート特異的ＬＩＮＥである、請求項３、４、または７に記載の方法。
【請求項９】
前記テロメアリピート特異的ＬＩＮＥがＴＲＡＳファミリーまたはＳＡＲＴファミリーのメンバーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＯＲＦ蛋白質および／または前記ＲＮＡをウイルスベクターから発現させる、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをコードするレトロ転移ベクターであって、前記ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質を発現しないベクター。
【請求項１２】
ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質であって、そのエンドヌクレアーゼドメインが、部位特異的ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質のエンドヌクレアーゼドメインに置換されている蛋白質をコードするベクター。
【請求項１３】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１１または１２に記載のベクター。
【請求項１４】
ウイルスが染色体非組み込み型ウイルスである、請求項１３に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
染色体非組み込み型ウイルスがバキュロウイルスである、請求項１４に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
（１）ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質を発現するベクター、および（２）前記ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをコードし、前記ＯＲＦ蛋白質を発現しないベクターを含む、前記ＲＮＡのレトロ転移を介した遺伝子送達のためのキット。
【請求項１７】
前記ＯＲＦ蛋白質が部位特異的ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質のエンドヌクレアーゼドメインを有する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＬＩＮＥのレトロ転移のための方法に関する。本発明の方法は、染色体への標的特異的な核酸の導入に有用である。
背景技術
近年のゲノムプロジェクトの進展により、高等真核生物ゲノムにおける多量のトランスポーザブルエレメント（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ；可動因子）の存在が明らかとなった。ヒトにおいては、ゲノムの約４５％がトランスポーザブルエレメントで構成されている（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９，８６０−９２１）。これらのエレメントの中で、ＤＮＡトランスポゾンは３％を説明するに過ぎず、大半のトランスポーザブルエレメントは、ＲＮＡを介して転移すると考えられているレトロトランスポーザブルエレメントに属する。その中でも最も多いグループはＬＩＮＥ（ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ロングインタースパーストエレメント）であり、ゲノムの２１％を占める（Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，６３１−６６１；Ｓｍｉｔ，Ａ．Ｆ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，６，６５７−６６３）。ＬＩＮＥはレトロトランスポーザブルエレメントの主要なクラスであり、自身がコードする逆転写酵素（ＲＴ）活性によりＲＮＡ中間体を介して転移する。ＬＩＮＥは新規な疾患形成、エクソンシャッフリング、並びにＳＩＮＥ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ショートインタースパーストエレメント）およびプロセッシングを受けた偽遺伝子の可動化を通して哺乳動物のゲノムを形作る（Ｋａｚａｚｉａｎ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２，１６４−１６６；Ｍｏｒａｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，１５３０−１５３４；Ｅｓｎａｕｌｔ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２４，３６３−３６７）。ＬＩＮＥはｎｏｎ−ＬＴＲレトロトランスポゾンとも呼ばれ、ＬＴＲレトロトランスポゾンおよびレトロウイルスが逆転写に必須のシスエレメントとして働くＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ；ロングターミナルリピート）を用いるのに対し（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｔｏｙｅ，Ｊ．Ｐ．（１９９７）Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ，ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｉｎ  Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｖａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．（ｅｄｓ），Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．３４３−４３５）、ＬＩＮＥが用いる転移機構はよく分かっていない。
ＬＩＮＥは２つのサブタイプに分類することができる（Ｍａｌｉｋ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，６，７９３−８０５）。その１つはＲＴドメインの３’に制限酵素様のエンドヌクレアーゼドメインが存在することにより特徴付けられ、ほとんどの場合単一のＯＲＦを持つ。このグループがコードするエンドヌクレアーゼは、原核生物の様々な制限酵素に見られるアミノ酸残基の幾つかのモチーフと類似性が認められる（Ｙａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７８４７−７８５２）。このグループは１つの進化的な古代起源を持っており、全ての場合でレトロ転移は特異的な標的配列を指向する。そのようなエレメントであるＲ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学的な解析から、ｎｏｎ−ＬＴＲレトロ転移の現在のモデルが導き出された。Ｒ２  ＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ；オープンリーディングフレーム）がコードする蛋白質（ＯＲＦがコードする蛋白質を「ＯＲＦ蛋白質」とも称す）は２８Ｓ  ｒＤＮＡの標的部位に特異的なニックを入れ、このニックを用いて自身のＲＮＡの逆転写を開始することができた（Ｌｕａｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ，７２，５９５−６０５）。この機構はＴＰＲＴ（ｔａｒｇｅｔ−ｐｒｉｍｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；標的をプライマーとする逆転写）と呼ばれる。しかしながら、第２鎖の合成を含むその後のステップについてはほとんど知られておらず、またＴＰＲＴが他のＬＩＮＥにも広く用いられているのかも分かっていない。
もう１つのタイプのＬＩＮＥはＲＴドメインの５’にＡＰＥ（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ−ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；アプリン／アピリミジン様エンドヌクレアーゼ）ドメインが存在することにより特徴付けられ、ほとんどの場合２つのＯＲＦを持つ。このグループは真核生物中に広い範囲の分布を示し、ヒトＬ１、ショウジョウバエＩ因子、およびカイコＲ１が含まれる（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１，６２５−６２８；Ｆａｗｃｅｔｔ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ，４７，１００７−１０１５；Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｔ．Ｈ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，１１４−１２３）。このタイプのＬＩＮＥがコードする２つのＯＲＦ蛋白質はほとんど解析されていない。ＯＲＦ１蛋白質は細胞質性の多量体リボ核蛋白質複合体を形成し（Ｈｏｈｊｏｈ，Ｈ．ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５，６３０−６３９；Ｄａｗｓｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６，４４４８−４４５５；Ｐｏｎｔ−Ｋｉｎｇｄｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，５，３０８８−３０９４）、核酸シャペロン活性を有する（Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂｕｓｈｍａｎ，Ｆ．Ｄ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１，４６７−４７５）ことが示されている。第２のＯＲＦはＮ末端にＡＰＥドメイン（Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７，９０５−９１６）、中央にＲＴドメイン（Ｍａｔｈｉａｓ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１８０８−１８１０）、そしてＣ末端にシステイン−ヒスチジンモチーフがある蛋白質をコードしている。薬剤耐性マーカーを用いたｉｎ  ｖｉｖｏレトロ転移アッセイがヒトＬ１において開発され、レトロ転移に重要な幾つかのＯＲＦアミノ酸残基が同定されている（Ｍｏｒａｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７，９１７−９２７）。しかしＬ１に挿入部位特異性がないことが、レトロ転移の機構をさらに解析し、その応用を開発することを困難にしている。
発明の開示
本発明はレトロ転移のための方法に関する。また本発明は、レトロ転移における標的特異性を制御する方法を提供する。また本発明は、レトロ転移に用いられる新たなベクターを提供する。本発明の方法は、遺伝子治療などにおける遺伝子送達に有用である。
本発明者らは、細胞の染色体へ核酸を組み込むことができる新たな遺伝子送達ベクターを開発するため、レトロトランスポーザブルエレメントの遺伝子工学的研究を行った。ＴＲＡＳファミリーおよびＳＡＲＴファミリーは、上述のＬＩＮＥのうち後者のサブタイプに典型的な構造を有しており、そのＲＴドメインの５’にＡＰＥドメインを有する（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，４５４５−４５５２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１５７８−１５８４）。それらは多くの組織において高いレベルで転写されており、その転写は自らも転写される内部プロモーターにより駆動される（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７，２０１５−２０２１）。それらの長さは６〜８ｋｂであり、重なり合った２つのＯＲＦと３’のポリ（Ａ）テールを持つ。ＴＲＡＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｄ３８４１４）とＳＡＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｄ８５５９４）のＲＴドメインのアミノ酸配列の同一性は２９．３％と比較的低い。それらの遺伝子の配置はヒトＬ１と似ているが、ＴＲＡＳ１とＳＡＲＴ１のユニークな点は、カイコＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのテロメアリピート（ＴＴＡＧＧ）ｎの特異的な塩基部位に存在していることである（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３，１４２４−１４３２；Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７，３０２５−３０３１）。従って、ＴＲＡＳおよびＳＡＲＴファミリーは後者のサブタイプのＬＩＮＥのレトロ転移を解析することができるよいモデル系ともなる。
本発明者らは、ＳＡＲＴ１およびＴＲＡＳ１を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏのＬＩＮＥレトロ転移を解析することができる新たな系を開発した。本発明者らは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＡｃＮＰＶ）ベクターを利用し、このベクターに含まれるポリヘドリンプロモーターの制御下でカイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）ＳＡＲＴ１エレメントをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（Ｓｆ９）で発現させた。Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａはＢ．ｍｏｒｉと同じ鱗翅目に属し、（ＴＴＡＧＧ）ｎリピートをテロメアに有するので（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，３２１８−３２２８）、宿主細胞（Ｓｆ９）の染色体テロメアリピートへのレトロ転移が起こると期待した。この異種発現系を用いて、本発明者らはＳＡＲＴ１が実際に宿主染色体のテロメアリピートに転移することをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたアッセイにより実証した。その転移部位は、カイコゲノムにおけるこのエレメントの特異的塩基部位と同じ位置であり、全ＲＮＡ転写ユニットの完全な逆転写による確証的なレトロ転移が観察された。レトロ転移には、ＯＲＦ１のシステイン−ヒスチジンモチーフ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｍｏｔｉｆｓ）を含む、２つのＯＲＦ両者の保存されたドメインが必要であった。また本発明において、転移させるＲＮＡに対して転移に必要な蛋白質をトランスに供給する（すなわち該蛋白質を該ＲＮＡ以外から発現させる）ことにより、このＲＮＡをレトロ転移させることに成功した。レトロ転移には３’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ；非翻訳領域）配列の認識が重要であり、これにより効率的なトランスコンプリメンテーションによるレトロ転移が起こることが判明した。さらに本発明者らは、エンドヌクレアーゼドメインをＳＡＲＴ１のそれからＴＲＡＳ１のそれに交換したキメラエレメントでは、レトロ転移の挿入特異性がＴＲＡＳ１のそれに変換されることを見出した。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏの標的選択の主要な決定要因はエンドヌクレアーゼドメインであることが実証された。これらの知見に基づけば、ＬＩＮＥに標的部位特異性を付与することが可能となると共に、トランスコンプリメンテーションにより遺伝子を導入できる新たなレトロ転移ベクターを開発することが可能である。転移に必要な蛋白質がトランスに供給される改変ＬＩＮＥは、特異的なゲノム位置に目的の遺伝子のみをトランスに送達し、レトロトランスポゾンのＯＲＦ蛋白質をコードする遺伝子は送達しない遺伝子治療ベクターとして極めて有用である。
２１世紀には、遺伝病の治療手段として遺伝子治療が期待されている。そのためには、安定なヒト発現ベクターが必要である。現在のところ、ほとんどの遺伝子送達ベクターはレトロウイルスに由来する。これらのベクターは、ゲノム中にランダムにインテグレートし、必須遺伝子が破壊され得るという問題を持っている。従って、ゲノムの特定の位置に挿入される遺伝子送達ベクターを開発することが重要である。この目的を達成するために、可動性グループＩＩイントロンが特定の配列に挿入されるように加工されている（Ｇｕｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，４５２−４５７）。しかしながら、これらのイントロンはバクテリアに由来するため、生きたヒトにおいて首尾よく発現し、ゲノム中にレトロ転移するかについては疑問がある。これに対して、ＬＩＮＥは動物のゲノムにおいて安定に保持されてきた。従って、ＬＩＮＥは哺乳動物のトランスフォーメーションベクターとして適した候補である。実際、ヒトＬ１はマウス細胞においてレトロ転移する（Ｍｏｒａｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７，９１７−９２７）。キメラＳＡＲＴ１／ＴＲＡＳ１からの結果を基に、本発明者らは、ＡＰＥドメインを他の部位特異的ＬＩＮＥのＡＰＥドメインと交換することにより、ＬＩＮＥに標的部位特異性を持たせるように加工できることを示した。さらに、ＬＩＮＥはトランスにレトロ転移を起こせることが示されたため、レトロ転移させる配列からＯＲＦを分離することができるという利点も有する。これらの改変ＬＩＮＥは、目的の遺伝子のみを特定のゲノム位置に送達し、レトロトランスポゾン自身は送達されないという無害な遺伝子送達ベクターとして開発することができる。これによって、必須遺伝子への有害なレトロ転移を回避し安定な蛋白質発現を達成することが可能と考えられる。このような安全なゲノム位置の１つとしてサブテロメリック領域が挙げられる。テロメアリピートに特異性を持つＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを利用して、外来遺伝子を染色体のサブテロメリック領域に導入することが可能となる。
本発明はＬＩＮＥのレトロ転移の方法およびレトロ転移に用いられるベクター等に関し、より具体的には
（１）（１）ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを細胞内で転写させる工程、（２）前記ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質を前記ＲＮＡ以外から発現させる工程、を含む、前記ＲＮＡをレトロ転移させる方法、
（２）前記ＬＩＮＥがＡＰＥドメイン含有型ＬＩＮＥである、（１）に記載の方法、
（３）前記ＬＩＮＥが部位特異的ＬＡＮＥである、（１）に記載の方法、
（４）（１）ＡＰＥドメイン含有型部位特異的ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを細胞内で転写させる工程、（２）前記ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質を前記細胞内で発現させる工程、を含む、前記ＲＮＡをレトロ転移させる方法、
（５）（１）ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを細胞内で転写させる工程、（２）前記ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質であって、そのエンドヌクレアーゼドメインが他のＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインと置換されたＯＲＦ蛋白質を細胞内で発現させる工程、を含む、前記ＲＮＡをレトロ転移させる方法、
（６）前記他のＬＩＮＥがＡＰＥドメイン含有型ＬＩＮＥである、（５）に記載の方法、
（７）前記他のＬＩＮＥが部位特異的ＬＩＮＥである、（５）に記載の方法、
（８）前記部位特異的ＬＩＮＥがテロメアリピート特異的ＬＩＮＥである、（３）、（４）、または７に記載の方法、
（９）前記テロメアリピート特異的ＬＩＮＥがＴＲＡＳファミリーまたはＳＡＲＴファミリーのメンバーである、（８）に記載の方法、
（１０）前記ＯＲＦ蛋白質および／または前記ＲＮＡをウイルスベクターから発現させる、（１）から（９）のいずれかに記載の方法、
（１１）ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをコードするレトロ転移ベクターであって、前記ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質を発現しないベクター、
（１２）ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質であって、そのエンドヌクレアーゼドメインが、部位特異的ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質のエンドヌクレアーゼドメインに置換されている蛋白質をコードするベクター、
（１３）ベクターがウイルスベクターである、（１１）または（１２）に記載のベクター、
（１４）ウイルスが染色体非組み込み型ウイルスである、（１３）に記載のウイルスベクター、
（１５）染色体非組み込み型ウイルスがバキュロウイルスである、（１４）に記載のウイルスベクター、
（１６）（１）ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質を発現するベクター、および（２）前記ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをコードし、前記ＯＲＦ蛋白質を発現しないベクターを含む、前記ＲＮＡのレトロ転移を介した遺伝子送達のためのキット、
（１７）前記ＯＲＦ蛋白質が部位特異的ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質のエンドヌクレアーゼドメインを有する、（１６）に記載のキット、
（１８）ベクターがウイルスベクターである、（１７）に記載のキット、に関する。
本発明においてＬＩＮＥとは、真核生物の染色体に存在するＤＮＡまたはその転写産物で、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を持たない長型のレトロトランスポーザブルエレメントを言う。天然のＬＩＮＥの長さは通常３ｋｂ〜１５ｋｂ程度であり、好ましくは４ｋｂ〜１０ｋｂ程度である。典型的なＬＩＮＥは自身にＲＴ様ドメインを含むＯＲＦをコードするが、完全なＯＲＦを欠損するＬＩＮＥも存在する（Ｍａｌｉｋ  Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６：７９３−８０５）。ＬＩＮＥはｎｏｎ−ＬＴＲレトロポゾンとも言われる。通常、ＬＩＮＥ  ＯＲＦは上記のように逆転写酵素（ＲＴ）とアミノ酸配列の類似性を有する蛋白質をコードしており、また、末端にポリ（Ａ）を含むことが多い。既知の典型的なＬＩＮＥとしては、例えばＭａｌｉｋ  Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６：７９３−８０５およびＸｉｏｎｇ，Ｙ．ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｔ．Ｈ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．５：６７５−６９０などに記載されているエレメントが挙げられる。ＬＩＮＥが保持するＯＲＦがコードするアミノ酸配列は共通性を持っており、このような特徴を基にＬＩＮＥを同定することができる。ＬＩＮＥはＲＴドメインのアミノ酸配列などを基にした系統学的解析により１つのグループを形成することが示されている。
本発明は、ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡとＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質とを別々のベクターから発現させることにより、そのＲＮＡをレトロ転移させる方法を提供する。このような、トランスコンプリメンテーションによるレトロ転移を利用すれば、遺伝子導入用のベクターと、導入に必要な蛋白質を供給するベクターとを分離することが可能となる。遺伝子導入用ベクターには、所望の遺伝子を組み込むことができ、これを転移に必要なＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質を発現するベクターと共に標的細胞に導入することにより、遺伝子導入ベクターからの転写産物が染色体にインテグレートされる。ＯＲＦ蛋白質を発現するベクターには、遺伝子導入用ベクターに含まれるＬＩＮＥの３’ＵＴＲを持たないように設計すれば、ＯＲＦ蛋白質発現ベクターの転写産物は標的細胞の染色体に組み込まれない。一方、遺伝子導入用ベクターは、ＯＲＦ蛋白質を発現しないように設計すれば、レトロ転移により一度組み込まれたベクターが転写されても、転移に必要なＯＲＦ蛋白質が発現しないためにさらに転移を繰り返す危険がない。このように、ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをコードする遺伝子導入ベクターは、自身だけではレトロ転移する能力を持たない自己転移能欠損型ベクターとすることができる。
本発明においてＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片とは、ＬＩＮＥの転写される鎖（センス鎖）における３’側の非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列の全体またはその部分を言う。３’端にポリ（Ａ）テールを含むＬＩＮＥにおいては、そのポリ（Ａ）配列を含むことが好ましい。ポリ（Ａ）配列を含むＲＮＡを転写させる場合、ポリ（Ａ）配列の長さは、例えば２〜１００ヌクレオチド、好ましくは５〜６０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜４０ヌクレオチド（例えば約２０ヌクレオチド）とすることができる。ポリ（Ａ）テールの上流部分の３’ＵＴＲ断片の長さは、レトロ転移活性を示す限り適宜調節することが可能である。効率的なレトロ転移のためには、できる限り長い領域を含むことが好ましい。具体的には３’ＵＴＲ断片の長さは、好ましくは２０ヌクレオチド以上、より好ましくは５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２００ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは３００ヌクレオチド以上である。レトロ転移活性に必要なＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片は、通常３０００ヌクレオチド以下、例えば２０００、１０００、または８００ヌクレオチド以下である。例えば、３’ＵＴＲの中央の７０％程度を含む断片を好適に用いることができる。
ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片は、非全長ＬＩＮＥから取得することもできる。ゲノム中に見出されるＬＩＮＥはしばしば５’欠失が見られるが、このような非全長ＬＩＮＥの３’端を単離して、レトロ転移ベクターを構築することができる（Ｓａｓｓａｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，３７−４３；Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，３７５６−３７６４；Ｌｕａｎ，Ｄ．Ｄ．ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｔ．Ｈ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，３８８２−３８９１；Ｊｕｒｋａ，Ｊ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１８７２−１８７７）。
３’ＵＴＲ配列は、１または複数のヌクレオチドが欠失および／または挿入していてもよい。本発明においてＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片としては、例えばＬＩＮＥの３’ＵＴＲの全長配列を含む配列を用いることが好適である。このような配列としては、例えばＯＲＦ２のストップコドンの次の塩基から３’端の塩基（あるいはポリＡを含む因子においてはポリＡの直前の塩基まで）の配列が挙げられる。また、本発明において３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡは、３’ＵＴＲに加えＬＩＮＥ  ＯＲＦまたはその部分を含んでもよい。ＯＲＦまたはその部分を含むＲＮＡは、そのＯＲＦの開始コドンを欠失させたり、あるいは終止コドンやフレームシフト変異の導入によりＯＲＦ２蛋白質またはその部分を発現しないようにすることができる。またＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡは、ＬＩＮＥの全長ＲＮＡを含んでもよい。例えば全長ＬＩＮＥ配列において、そこに含まれるＯＲＦに変異を導入して機能的蛋白質を発現できないようにされたＲＮＡなども、本発明に従ってレトロ転移させることができる。
ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲ（配列番号：５２）の場合、４６１塩基からなる３’ＵＴＲの５’端から７０塩基および３’端から１６８塩基はレトロ転移活性には必須ではなく、５’端から７１〜２９３番目の塩基だけでレトロ転移活性を示す。従って、３’ＵＴＲの５’端から７１〜２９３番目の塩基配列（配列番号：５２の７１〜２９３番目の塩基配列）を含むポリヌクレオチドを、レトロ転移のための３’ＵＴＲ断片として用いることができる。３’ＵＴＲ中のこの約２００塩基の配列中に、レトロ転移に必須の配列が含まれていることが示唆される。但し、短い３’ＵＴＲ断片からなるＲＮＡのレトロ転移効率は、長い３’ＵＴＲ断片または全長３’ＵＴＲを含むＲＮＡに比べて低い。また、３’ＵＴＲ下流のポリＡを欠失させるとレトロ転移効率が低下する。従って、ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲはできる限り長く、例えば２５０ヌクレオチド以上、好ましくは３００ヌクレオチド以上、さらに好ましくは３５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは４００ヌクレオチド以上の３’ＵＴＲ断片を用いることが好適である。
ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片をコードするＲＮＡおよびＯＲＦ蛋白質は、所望のベクター系を利用して細胞で発現させることができる。好ましい態様においてはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターを用いてＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡおよび／またはＯＲＦ蛋白質を高発現させることにより、シス嗜好性（ｃｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を持つＬＩＮＥにおいても効率的なトランスコンプリメンテーションが可能になると考えられる（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，６−７；Ｗｅｉ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１，１４２９−１４３；Ｏｋａｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ，２０５，２２９−２４３）。ウイルスベクターとしては、特に染色体非組み込み型ウイルスベクターが好ましい。
ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質とは、ＬＩＮＥが持つＯＲＦによりコードされる蛋白質を言う。ＯＲＦ蛋白質は、天然のＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質であってもよく、あるいはそのＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをレトロ転移させる限り、他のＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質または他のＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質とのキメラ蛋白質であってもよい。２つのＯＲＦを持つＬＩＮＥにおいてＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質とは、１つ目のＯＲＦ（ＯＲＦ１）と２つ目のＯＲＦ（ＯＲＦ２）の両者によりコードされる蛋白質を言う。複数のＯＲＦを持つ場合は、ＯＲＦ蛋白質はＯＲＦごとに異なるＬＩＮＥに由来してもよいが、ＥＮドメイン以外は同一のＬＩＮＥのものであることが好ましい。ＯＲＦ蛋白質は、他のＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質とのキメラにする以外にも、レトロ転移活性を有する限り例えばアミノ酸配列に変異を有していてもよい。
人為的にアミノ酸に変異を導入する方法としては、例えばＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４８８；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７）、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法（ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３，５９２）、ＡｌｔｅｒｅｄＳｉｔｅ法（Ｌｅｓｌｅｙ  Ｓ．Ａ．＆  Ｂｏｈｎｓａｃｋ，Ｒ．Ｎ．，１９９４，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  Ｍａｇａｚｉｎｅ，４６，６−１０）、Ｉｔｏ法（Ｉｔｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０２，６７）、ＰＣＲ法（Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．，ｉｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），８．５．１−８．５．９，１９８７）、またはオリゴヌクレオチド連結法（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．，１９８８，Ｇｅｎｅ，７１，２９−４０；Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，１９８７，ｉｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），８．２．８−８．２．１３，１９８７）などの部位特異的変異誘発法が挙げられる。また、ｄｅｌｅｔｉｏｎ法（Ａｕｓｕｂｅｒ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．ｉｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”１．０２−５．１０．２，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．，５．１−６．６２，１９８７）、リンカーインサーション法（Ａｕｓｕｂｅｒ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．ｉｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１．０２−５．１０．２，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．，５．１−６．６２，１９８７）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，ｉｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），８．３．１−８．３．６，１９８７）、縮重オリゴヌクレオチド法（Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｄｏｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５，５５８−５６８，１９８７；Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｅ．，ｉｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），８．２．１−８．２．７，１９８７）、またはリンカースキャニング法（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，３６４６−３６５５，１９８７）などを用���て、ランダムな変異を導入することにより変異蛋白質をコードする核酸を生成することもできる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。本発明には、このように人工的か自然に生じたものかを問わず、野生型ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質にアミノ酸変異を有する蛋白質で、レトロ転移活性を有する蛋白質を用いることができる。レトロ転移活性は、実施例に記載のＰＣＲアッセイ等により測定することができる。
このような変異体における変異するアミノ酸数に制限はないが、人為的にアミノ酸配列を変異させるのであれば、通常そのＯＲＦがコードする全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは５％以内、より好ましくは３％以内、最も好ましくは１％以内である。具体的には、変異するアミノ酸数は通常１００アミノ酸以内、好ましくは８０アミノ酸以内、さらに好ましくは６０アミノ酸以内、さらに好ましくは３０アミノ酸以内（例えば１０アミノ酸）である。但し、ＯＲＦの末端（Ｎ末端またはＣ末端）にアミノ酸を付加する場合は、その数は特に制限されない。アミノ酸を置換する場合、例えば他のＬＩＮＥ  ＯＲＦの対応する位置のアミノ酸に置換することができる。
また、アミノ酸を人為的に置換する場合、側鎖の化学的性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとの蛋白質の活性が維持されやすいと考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。このようなアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質は、幾つかの保存されたモチーフを有しており、それぞれのモチーフは特定の部位に保存されているアミノ酸により特徴付けられる。ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質においては、これらの保存されたアミノ酸は特に天然のＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質のそれのまま維持するか、あるいは上記のように性質が似たアミノ酸に置換することが好ましい。ＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質の保存されたモチーフとしては、システイン−ヒスチジンモチーフ（ジンクフィンガーモチーフまたはＣＣＨＣモチーフとも言う）、エンドヌクレアーゼドメイン、およびＲＴ（逆転写酵素）ドメインの保存されているアミノ酸が挙げられる。ＯＲＦを複数持つＬＩＮＥにおいて、それぞれのＯＲＦに１つまたは複数のシステイン−ヒスチジンモチーフを持つ場合には、それら全てのシステイン−ヒスチジンモチーフが維持されるようにすることが好ましい。ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質の保存モチーフおよび保存されたアミノ酸残基は当業者によく知られている（Ｍａｌｉｋ  Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６：７９３−８０５；Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｔ．Ｈ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．５：６７５−６９０）。
上記本発明のレトロ転移方法に用いるＬＩＮＥは、好ましくはＥｘｏ＿ｅｎｄｏ＿ｐｈｏｓドメイン（Ｐｆａｍ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＰＦ０３３７２）を含むＬＩＮＥである。さらに好ましくは、ＡＰＥドメインを含むＬＩＮＥである。ＡＰＥドメインとは、アプリン／アピリミジン様エンドヌクレアーゼドメインを言い、このドメインを持つＬＩＮＥは真核生物中に広い範囲の分布を示し、ＬＩＮＥの中で主要なグループを形成している。上記のように、ＬＩＮＥはＡＰＥドメイン含むタイプと含まないタイプに分類され、それぞれのグループ内では、そのＯＲＦの構造およびアミノ酸配列の特徴に共通性が認められる。ＡＰＥドメイン含有型ＬＩＮＥとしては、哺乳動物Ｌ１、ショウジョウバエＩ因子、昆虫Ｒ１等の多数のＬＩＮＥが含まれる（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１，６２５−６２８；Ｆａｗｃｅｔｔ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ，４７，１００７−１０１５；Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｔ．Ｈ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，１１４−１２３）。また、昆虫のテロメアリピート中に見出されるＳＡＲＴファミリーおよびＴＲＡＳファミリーも、ＡＰＥドメイン含有型ＬＩＮＥの典型である。これらのＬＩＮＥのほとんどは２つのＯＲＦ（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）を有し、ＡＰＥドメインはＯＲＦ２のＮ末端付近に位置している。ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の読み枠はしばしば重複している。ＡＰＥドメインは、保存されたアミノ酸残基により同定することができる。ＡＰＥドメインに特徴的なアミノ酸残基は既に同定されている（Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｂｏｅｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１８０８１−１８０９３；Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ，，１９９６，Ｃｅｌｌ  ８７：９０５−９１６；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１２１９−１２２６；Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：２０３３−２０８８；Ｍａｌｉｋ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６：７９３−８０５；ＭａｒｔｏＡｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：４９−５９；Ｆｒｅｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１９５０−１９５３）。例えば、ＡＰＥドメインに特徴的な７つのドメイン（ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９６：１４７−１５８，Ｆｉｇ．４）が同定されるかにより、ＡＰＥドメインを含有しているかを判断することができる。
Ｅｘｏ＿ｅｎｄｏ＿ｐｈｏｓドメイン（ＰＦ０３３７２）は、Ｐｆａｍ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ＨＭＭｓ）プログラムを用いたｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）に基づく検索により同定することができる（Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ，，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８：４０５−４２０；Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（１）：２７６−２８０；Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２６３−２６６；Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２６０−２６２；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３２０−３２２；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８：４０５−４２０）。Ｐｆａｍは、例えばＰｆａｍ  ７．１プログラム（Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：２７６−２８０）などを用いることができる。クエリー配列に対して、Ｅｘｏ＿ｅｎｄｏ＿ｐｈｏｓドメインに対するスコア（ｂｉｔｓ値）が、ｌｓモード（Ｐｆａｍ＿ｌｓ）において１１．０以上（ＨＭＭ構築方法：ｈｍｍｂｕｉｌｄ−Ｆ  ＨＭＭ＿ｌｓ，ａｎｎ  ＳＥＥＤ．ａｎｎ；ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅ−−ｓｅｅｄ  ０  ＨＭＭ＿ｌｓ．ａｎｎ）またはｆｓモード（Ｐｆａｍ＿ｆｓ）において１９．６以上（ＨＭＭ構築方法：ｈｍｍｂｕｉｌｄ−ｆ−Ｆ  ＨＭＭ＿ｆｓ．ａｎｎ  ＳＥＥＤ．ａｎｎ；ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅ−−ｓｅｅｄ  ０  ＨＭＭ＿ｆｓ．ａｎｎ）である場合に、この配列はＥｘｏ＿ｅｎｄｏ＿ｐｈｏｓドメインの配列であると同定される。好ましくは、Ｐｆａｍ＿ｌｓのｂｉｔｓ値が１１．６以上および／またはＰｆａｍ＿ｆｓのｂｉｔｓ値が１９．９以上である。より好ましくはｌｓモードのｂｉｔｓ値が１５以上、より好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上、最も好ましくは４０以上である。あるいはｆｓモードのｂｉｔｓ値が２５以上、より好ましくは３０以上、より好ましくは３５以上、最も好ましくは４０以上であることが好ましい。このようにＰｆａｍでホメオボックスが検出された時のＥｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）ｖａｌｕｅは通常１×１０−３未満であり、好ましくは１×１０−５未満であり、より好ましくは１×１０−７未満であり、より好ましくは１×１０−９未満であり、より好ましくは１×１０−１１未満である。Ｐｆａｍによる検索はウェブサイト（Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＫ），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ（ＵＳＡ），Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ（Ｓｗｅｄｅｎ），またはＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ（Ｆｒａｎｃｅ））上のサーバーを利用して実施することもできるし、ＦＴＰサイトからＰｆａｍデータベースをダウンロードしてローカルで検索を行うこともできる。
また、上記本発明におけるＬＩＮＥは、好ましくは部位特異的ＬＩＮＥである。部位特異的ＬＩＮＥとは、宿主ゲノムＤＮＡの特異的な部位に見出されるＬＩＮＥを言う。ＬＩＮＥは挿入されているＤＮＡ配列が一定していないグループと、特定の塩基配列中に挿入されているグループに分類される。ランダムに挿入されている前者のＬＩＮＥは哺乳動物Ｌ１などに代表され、挿入位置に関して幾分の嗜好性が存在することはあるが、その塩基配列は実質上保存されていない。これに対して、部位特異的ＬＩＮＥは特定の塩基配列中に挿入されており、通常、挿入されている塩基部位は正確に同一である。例えばアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のＴｘ１は他のトランスポゾン因子の中に挿入されている（Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：３０１８−３０２７）。ＣＲＥ１、ＳＬＡＣＳ、およびＣＺＡＲはトリパノソーマのスプライスリーダーエクソンに見出される（Ａｋｓｏｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７８５−７９２；Ｇａｂｒｉｅｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６１５−６２４；Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６１３９−６１４８）。Ｒ１およびＲ２はほとんどの昆虫において、２８Ｓ  ｒＤＮＡの特定部位に存在している（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｔ．Ｈ．ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓ，Ｂ．，１９８５，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２２８１−２２８５；Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６８６１−６８６９；Ｊａｋｕｂｃｚａｋ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３２９５−３２９９）。２種の蚊では、ＲＴ１およびＲＴ２がＲ１の挿入部位の約６３０ｂｐ下流の同一部位に挿入されている（Ｂｅｓａｎｓｋｙ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５１０２−５１１０；Ｐａｓｋｅｗｉｔｚ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．Ｈ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：８１２５−８１３３）。これらのＬＩＮＥは部位特異的ＬＩＮＥである。このうちＲ２、ならびにＣＲＥ１およびＣＺＡＲは１つのＯＲＦを持ち、Ｃ末端付近に非ＡＰＥ型のエンドヌクレアーゼをコードする。この領域は、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ｘ１２−１９−Ａｓｐ／Ｇｌｕ（ＰＤＤ）という共通したモチーフにより特徴付けられる。一方、Ｌ１、Ｒ１、およびＴｘ１Ｌなどは２つのＯＲＦを持ち、ＯＲＦ２のＮ末端にＡＰＥドメインを保持している。上記本発明の方法におけるＬＩＮＥは、最も好ましくは、このようなＡＰＥドメイン含有型の部位特異的ＬＩＮＥである。このようなＬＩＮＥには、特に真核生物のテロメアリピートに特異的に挿入されているＡＰＥドメイン含有型ＬＩＮＥが挙げられる。ＳＡＲＴファミリーおよびＴＲＡＳファミリーはＡＰＥドメインを持つ部位特異的ＬＩＮＥであり、テロメアリピート中の特異的塩基部位に位置している。ＳＡＲＴファミリーおよびＴＲＡＳファミリーのＬＩＮＥは本発明において特に好���に用いられる。
本発明はまた、ＡＰＥドメイン含有型の部位特異的ＬＩＮＥのレトロ転移系を提供する。本発明により提供される方法を用いれば、ＡＰＥドメイン含有型の部位特異的ＬＩＮＥを、その標的指向性に従ってレトロ転移させることができる。本発明者らは、部位特異的ＬＩＮＥであるＳＡＲＴ１を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるレトロ転移系を確立した。この系においては、ＡＰＥドメイン含有型の部位特異的ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡとこのＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質とを、このＬＩＮＥの標的ＤＮＡを含む細胞で発現させる。細胞内で発現したＯＲＦ蛋白質は、そのＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡを認識し、部位特異的にこのＲＮＡをレトロ転移させる。本発明のレトロ転移方法において、ＲＮＡおよび／またはＯＲＦ蛋白質をウイルスベクターを用いて発現させることが極めて好適であることが判明した。本発明は、特にＡＰＥドメイン含有型の部位特異的ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片をコードするウイルスベクターを提供する。このウイルスベクターにより、効率的にレトロ転移を誘導することが可能である。また本発明は、ＡＰＥドメイン含有型の部位特異的ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質を発現するウイルスベクターにも関する。ウイルスベクターとしては、特に染色体非組み込み型ウイルスベクターが好ましい。染色体非組み込み型ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスベクターおよびＲＮＡウイルスベクターの両者が含まれる。特に好ましいウイルスベクターとしては、染色体非組み込み型ＤＮＡウイルスベクターが挙げられ、例えばバキュウロウイルスベクターが例示できる。
本発明者らは、テロメアリピートを標的とするＳＡＲＴ１をウイルスベクターに挿入し、このウイルスベクターを細胞に感染させることにより、効率的にＳＡＲＴ１をレトロ転移させる方法を開発した。また本発明は、ＴＲＡＳ１を用いてやはりテロメアリピートを標的とするレトロ転移に成功した。本発明は、ＳＡＲＴファミリーおよびＴＲＡＳファミリーのメンバーを発現するベクターを細胞に導入することにより、テロメアリピートにこれらのＬＩＮＥをレトロ転移させる方法に関する。また、これと同様に、所望のＡＰＥドメイン含有型部位特異的ＬＩＮＥをウイルスベクターなどに挿入し、これを標的ＤＮＡを含む細胞に導入することにより、ベクターから転写されたＬＩＮＥを部位特異的にレトロ転移させることが可能である。実施例４に示したように、ＬＩＮＥの全長ＲＮＡ、あるいはＬＩＮＥ  ＯＲＦと３’ＵＴＲ断片とを含む部分をコードするＲＮＡをウイルスベクターから発現させれば、これらのＲＮＡから発現したＯＲＦ蛋白質により自身のＲＮＡをレトロ転移させることができる。このように、ＡＰＥドメイン含有型の部位特異的ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片をコードするベクターであって、そのＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質を発現するベクターは本発明に含まれる。このようなベクターを構築するには、例えばＬＩＮＥの全長、またはＯＲＦ全体と３’ＵＴＲ断片とを含む部分をウイルスベクター等の発現ベクターに挿入すればよい。ＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質を発現するこのようなＲＮＡから外来蛋白質も発現させるには、例えばＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ；内部リボソームエントリー部位）または不完全スプライシング等を利用することができる。あるいは、ＯＲＦ部分と３’ＵＴＲ断片とを同一のベクターから別々の転写単位として発現させるようにしてもよい。また３’ＵＴＲ断片をコードするＲＮＡを転写するベクターとＯＲＦ蛋白質を発現するベクターを分離して、トランスコンプリメンテーションにより部位特異的ＬＩＮＥを転移させることも可能である。
本発明者らは、テロメアリピート中にＡＰＥ含有型の部位特異的ＬＩＮＥの複数のファミリーを同定している（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４５４５−４５５２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１５７８−１５８４）。本発明者らは、これらのＬＩＮＥを用いてテロメアリピートを標的としたレトロ転移を起こさせることに初めて成功した。本発明に従って、これらのテロメアリピートに部位特異性を持つＬＩＮＥを用いてＲＮＡをテロメアリピート中にレトロ転移させることが可能となる。このようなＬＩＮＥのファミリーとしてＴＲＡＳファミリーおよびＳＡＲＴファミリーが挙げられる。ＴＲＡＳファミリーおよびＳＡＲＴファミリーは、昆虫のサブテロメリック領域のテロメアリピート（ＴＴＡＧＧ）ｎ中に、互いに反対方向に挿入されているＡＰＥ含有型ＬＩＮＥである（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４５４５−４５５２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１５７８−１５８４）。ＴＲＡＳファミリーはテロメアリピートのＣＡリッチ鎖にセンス鎖があり、ＳＡＲＴファミリーはＧＴリッチ鎖にセンス鎖がある。各ファミリーは数多くのメンバーを持ち、それらは共通する構造的特徴を有している。例えば、ＴＲＡＳファミリーのメンバーとしては、ＴＲＡＳ１、ＴＲＡＳ３、ＴＲＡＳ４、ＴＲＡＳ５、ＴＲＡＳ６、ＴＲＡＳＹ、ＴＲＡＳＺ、ＴＲＡＳＷ、ＴＲＡＳＤＪ、ＴＲＡＳＳＣ３、ＴＲＡＳＳＣ４、およびＴＲＡＳＳＣ９などが挙げられる。ＳＡＲＴファミリーとしては、ＳＡＲＴ１およびＳＡＲＴ２が同定されている。同じファミリーに属するメンバーがコードするＯＲＦ蛋白質のアミノ酸配列は、互いに高い類似性を共有していることから、これを基にＴＲＡＳファミリーまたはＳＡＲＴファミリーのメンバーを同定することができる（Ｋｕｂｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１８（５）：８４８−５７；ＷＯ０１／８８１４９）。例えばエンドヌクレアーゼドメインからＲＴドメインまでの範囲のアミノ酸配列のホモロジーを、同定されているＳＡＲＴまたはＴＲＡＳファミリーのメンバーのいずれかと比較する。アミノ酸配列の同一性が、ＳＡＲＴまたはＴＲＡＳファミリーに近縁の他のファミリーのメンバー（例えばＲ１）に対するそれに比べ有意に高ければ、この配列はそれぞれＳＡＲＴまたはＴＲＡＳファミリーに属すると判定することができる。例えば、エンドヌクレアーゼドメインからＲＴドメインまたはそれに類似した範囲におけるアミノ酸配列の同一性が、同定されているＴＲＡＳファミリーのいずれかに対して約３１％以上、より確実には約３３％以上、より好ましくは約３５％以上、さらに好ましくは約３７％以上（例えば約４０％以上）であれば、このエレメントはＴＲＡＳファミリーのメンバーであると考えられる。また塩基配列の同一性であれば、ＴＲＡＳファミリーのメンバーは、このアミノ酸配列のコード領域において、同定されているＴＲＡＳファミリーのいずれかに対して約４５％以上、より確実には約４７％以上、より好ましくは約５０％以上、さらに好ましくは約５２％以上の同一性を有する。ＳＡＲＴファミリーのメンバーも、これと同様にして同定することができる。
アミノ酸または塩基配列の同一性は、公知のコンピュータプログラムにより決定することができる。例えばＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−８０）などの整列化プログラムによりアミノ酸または塩基配列を整列させ、一致するアミノ酸残基または塩基を計数することにより算出することができる。ギャップはミスマッチを同様に扱い、ギャップを含む塩基総数の中の一致した塩基の割合として同一性を算出することができる。または、例えばｂｌａｓｔｎまたはｂｌａｓｔｐプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆  Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆  Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）を利用することができる。例えば、ｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎによりそれぞれ２つのアミノ酸または塩基配列の比較を行うＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），”Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０；ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳのウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）を参照のこと）において、アミノ酸配列の比較の場合はスコアリングのためのマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓｔｅｖｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｒｇａ  Ｇ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９）（Ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：１１，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：１）を用い、ＦＩＬＴＥＲ（Ｌｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ配列に対するフィルター処理）をかけずに検索を行い、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ（％）として同一性の値を得ることができる。
また、ＳＡＲＴファミリーまたはＴＲＡＳファミリーのメンバーは、系統学的なグルーピングによっても同定される。例えば、ＳＡＲＴまたはＴＲＡＳファミリーのメンバーであれば、既知のＳＡＲＴまたはＴＲＡＳファミリーと共に、ＳＡＲＴまたはＴＲＡＳファミリーに近縁の他のファミリーのメンバー（例えばＲ１）を含まないグループを形成する。グルーピングは、ＤＮＡの塩基配列またはそれによりコードされるアミノ酸配列に基づいて、公知の方法により行うことができる。例えば、エンドヌクレアーゼドメインからＲＴドメインのアミノ酸配列を基に、系統樹を作成する。系統樹の作成には、近隣結合法および最尤法を含む所望の階層的手法が用いられ得る。好ましい一例としては近隣結合法（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５）が用いられる。グループの信頼性は、ブートストラップ確率により評価することができる。好ましくは、あるファミリーを他から分離する分枝のブートストラップ確率は５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば９９．０％以上）である。試行回数は例えば１０００回行うことができる。
本発明の方法によりレトロ転移させた部位特異的ＬＩＮＥは、宿主染色体ＤＮＡのサザンブロッティングまたはＦＩＳＨなどの染色体のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出することができる。特に、部位特異的ＬＩＮＥのレトロ転移は挿入配列が固定されているため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて容易にアッセイすることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９；”Ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”（Ｅｄｓ．Ｊ．Ｅｌｌｉｎｇｂｏｅ  ａｎｄ  Ｕ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ），”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９；”Ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＩＩ”（Ｅｄｓ．Ｕ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅｌｌｉｎｇｂｏｅ），”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９；”ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，１９８９，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）。すなわち、転移させるＲＮＡ部分に一方のプライマーを、標的部位の配列に他方のプライマーを設計し、境界部分を挟みこむようにＰＣＲ増幅を行うことによって、レトロ転移したＲＮＡのみを特異的に検出することができる（実施例参照）。上記のウイルスベクターを用いてレトロ転移系を組み合わせることにより、部位特異的ＬＩＮＥのレトロ転移を解析できる有効性の高い系を構築することができる。
部位特異性のないＬＩＮＥのｉｎ  ｖｉｖｏのレトロ転移は、以前、プラスミドベクターを用いた幾つかのＬＩＮＥにおいて、人工イントロンのスプライシングアウトを基に示されている（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈｅｉｄｍａｎｎ，Ｔ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０，１９２７−１９３７；Ｐｅｌｉｓｓｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８８，４９０７−４９１０；Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８７９２−８７９５；Ｋｉｎｓｅｙ，Ｊ．Ａ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，９３８４−９３８７）。ヒトＬ１のマーカー選択アッセイでは、レトロ転移に必須のアミノ酸残基が同定された（Ｍｏｒａｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７，９１７−９２７）。しかしＬ１等には標的配列特異性がないため、詳細な転移機構を解析することは困難である。本発明によれば、ＳＡＲＴ１およびＴＲＡＳ１などの部位特異的ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを利用して、標的特異的なｉｎ  ｖｉｖｏのＬＩＮＥ転移を検出する新規なアッセイを開発することが可能である。本発明の系を用いたアッセイでは、レトロ転移が２〜３日以内にＰＣＲにより検出することが可能で、レトロ転移のカイネティクスをより詳細に解析することが可能である。これにより、例えば後述のＬＩＮＥのＯＲＦドメインの交換による新たなＬＩＮＥの開発において、レトロ転移に及ぼすドメインの役割を迅速に解明することができるなど、従来のＬ１培養細胞アッセイに比べより簡便でレトロ転移反応に直接リンクした検査および解析を行うことが可能である。レトロ転移のアッセイ系は、例えばＬＩＮＥのレトロ転移機構の解析、遺伝子導入ベクターとしての性能評価、および実際の治療などにおけるレトロ転移の検出および診断に有用である。
また本発明は、ＬＩＮＥのＯＲＦ蛋白質のエンドヌクレアーゼドメインを他のＬＩＮＥのそれと交換し、標的部位を改変する方法を提供する。本発明者らは、ＳＡＲＴ１のエンドヌクレアーゼドメインをＴＲＡＳ１のそれに置換したＬＩＮＥを構築し、本発明の方法によりレトロ転移を行った。驚くべきことに、このキメラＬＩＮＥはＴＲＡＳ１と同一の標的特異性を示した。この結果は、ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬＩＮＥの標的指向性を決定することを示している。従って、例えば標的特異性のないＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを、部位特異的ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインに置換することにより、所望のＬＩＮＥを部位特異的ＬＩＮＢに変換することが可能である。逆に、部位特異的ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを、部位特異性のないＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインに置換することにより、そのＬＩＮＥの標的部位特異性を失わせることができる。このように、ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを交換することにより、エンドヌクレアーゼドメインの標的指向性に従ってＬＩＮＥのレトロ転移の標的指向性を制御することが可能となる。
ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインの範囲は、アミノ酸配列のアライメントを基に同定することができる（Ｋｕｂｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１８（５）：８４８−５７；ＷＯ０１／８８１４９）。アミノ酸配列のアライメントは、例えば上記のＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７）またはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−８０）等のアルゴリズムに基づき、コンピュータプログラムを利用して実施することができる。
具体的には、文献「Ｍａｌｉｋ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，６，７９３−８０５」の記載に基づいて同定することができる。あるいは、エンドヌクレアーゼドメインの範囲は、例えば、Ｅｘｏ＿ｅｎｄｏ＿ｐｈｏｓドメイン（ＰＦ０３３７２）のコンセンサス配列（配列番号：５１）と共に適宜ギャップを入れてアライメントを作成することにより特定することができる。アライメントの作成には、上記のＰｆａｍプログラムを利用することもできる。このアライメントで特定される範囲のアミノ酸配列をエンドヌクレアーゼドメインとすることができる。選択するドメインのＮ端およびＣ端は、配列番倍：５１の両端より短くても長くてもよい。エンドヌクレアーゼドメインの両端は、配列番号：５１とのアライメントにおいて、配列番号：５１の両端から例えば７アミノ酸以内、より好ましくは６アミノ酸以内、より好ましくは５、４、または３アミノ酸以内違っていてよい。具体的な一例は、図６に示すように、ＴＲＡＳ１  ＡＰＥドメイン（ＰＹＲＶ．．．ＩＲＬＱ）と同等の範囲を用いることができる。
また、エンドヌクレアーゼドメインの交換に加え、ＯＲＦの他の領域も交換することにより、その効果を増強またはより確実にできる可能性がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでゲノムＤＮＡはクロマチンとして多くの結合蛋白質と会合していることを考えると、幾つかのＬＴＲレトロトランスポゾンで証明（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１４８８−１４９１；Ｘｉｅ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９，６６０６−６６１４）され、ヒトＬ１で示唆（Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９，５７３−５７７）されているように、ＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質の他のドメインが宿主のクロマチン蛋白質と相互作用することによって標的部位選択に関与している可能性がある。従って、例えば部位特異的ＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質のＡＰＥドメインに加え、他のドメインも移植することにより、ＬＩＮＥの標的特異性の変換をより保証できる可能性がある（Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７，９０５−９１６；Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，２０８３−２０８８；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０，１２１９−１２２６；Ａｎｚａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１，１００−１０８）。例えば、ＴＲＡＳ１  ＯＲＦ２は、ＡＰＥとＲＴドメインの間の中央に、多くのテロメア結合蛋白質で見出されるＭｙｂドメインと弱いホモロジーを有する領域をコードしている（Ｋｕｂｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，１８，８４８−３５７）。この予想されるＭｙｂドメインのような別のドメインが、テロソームを認識することにより「テロメア特異性」を保証し、その後ＡＰＥ切断が挿入位置を決定する可能性がある。従ってＡＰＥ含有型ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを交換する際に、ＡＰＥドメインと共にＭｙｂドメインも共に交換することは好ましいと考えられる。Ｍｙｂドメイン以外にも、例えばＴＲＡＳファミリーで保存されている１２アミノ酸からなるＴＲＡＳ特異的領域（ＴＳＲ）（ＷＯ０１／８８１４９；Ｋｕｂｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１８（５）：８４８−５７）は、テロメアリピートの厳密な認識に貢献する可能性がある。従って、ＡＰＥドメインを交換する場合には、ＡＰＥの下流部分も含めて交換することが好ましい。例えば、ＡＰＥドメインからＲＴドメインの直前までの領域を交換することも好ましい。
ＳＡＲＴおよびＴＲＡＳファミリーは昆虫のテロメアリピート（ＴＴＡＧＧ）ｎ中にレトロ転移することができるが、他の真核生物のテロメアリピートにも同様にレトロ転移することができると考えられる。テロメアリピートは真核生物全般において高度に保存されている（”Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ”（Ｅｄｓ．Ｅ．Ｈ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｇｒｅｉｎｅｒ）ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｂｙ  Ｅ．Ｈｅｎｄｒｅｓｏｎ”Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ＤＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”ｐｐ１１−３４；”Ｔｈｅ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ”ｂｙ  Ｄ．Ｋｉｐｌｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３”Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”３１−６９；Ｚａｋｉａｎ，Ｖ．Ａ．（１９９５）”Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ：ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｎｄ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１６０１−１６０７）。そしてＴＲＡＳ１のＡＰＥドメインは、昆虫のテロメアリピート（ＴＴＡＧＧ）ｎのみならず、ヒトを含む脊椎動物で保存されているテロメアリピート（ＴＴＡＧＧＧ）ｎも切断することができる（ＷＯ０１／８８１４９）。本発明において、エンドヌクレアーゼドメインは細胞内のレトロ転移の標的選択における主要な決定要因であることが示されたことにより、ＳＡＲＴおよびＴＲＡＳファミリーのＡＰＥドメインを持つＬＩＮＥは脊椎動物型のテロメアリピートにも細胞内でレトロ転移できると考えられる。
ＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをコードし、そのＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質を発現しないように構築されたベクターは、そこから転写されるＲＮＡはＯＲＦ蛋白質をトランスに供給することによりレトロ転移を起こすが、転移した後はＯＲＦ蛋白質を発現しないため、転移を繰り返すことがない。本発明は、特にこのようなレトロ転移ベクターを提供する。本発明のレトロ転移ベクターを用いれば、所望の核酸を標的細胞に染色体に組み込むことができる。導入した核酸をレトロ転移後に発現させる必要がなければ、その核酸配列がＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片の５’側に結合されたＲＮＡを転写するベクターを作製すればよい。このようなベクターによるレトロ転移は、例えばマーカーとなる核酸配列を染色体に組み込んだり、あるいはエンハンサートラップ等において有用である。またＲＮＡには、レトロ転移後にプロモーターとして機能する配列を転写産物中に含むようにすることができる。好ましいベクターとしては、例えば、”プロモーター−導入したい遺伝子またはそれを挿入するためのクローニング部位−ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片”を含むベクターが挙げられる。ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片に続いて、ポリ（Ａ）付加シグナルを有することがより好ましい。プロモーターは適宜選択することができるが、単一のプロモーターを含むベクターの場合は、自身が転写され、レトロ転移後にも活性を有する内部プロモーターが好適に用いられる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７，２０１５−２０２１）。内部プロモーターは多くのＬＩＮＥで同定されており、ＬＩＮＥが一般に保持していると考えられる。さらに、昆虫などのＬＴＲ型レトロトランスポゾン（Ａｒｃｈｉｐｏｖａ，Ｉ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１）１０，１１６９−１１７７）、および発生に関連する遺伝子（例えばＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａおよびＥｎｇｒａｉｌｅｄ等のホメオティック遺伝子）にも共通している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１５７８−１５８４；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７，２０１５−２０２１）。
また、プロモーターを二重にしたベクターであってもよい。このような二重プロモーター構造を有するベクターは本発明に含まれる。具体的な構造の一例としては、”第１のプロモーター−第２のプロモーター−導入したい遺伝子またはそれを挿入するためのクローニング部位−ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片−ポリ（Ａ）付加シグナル”を含むベクターが挙げられる。第１のプロモーターによりベクターから転写された産物は、レトロ転移後第２のプロモーターから挿入遺伝子を発現することができる。第２のプロモーターは内部プロモーターにすることも好ましい。このようなベクターの好ましい一例としては例えば、”プロモーター−内部プロモーター−導入したい遺伝子またはクローニングサイト−ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片−ポリ（Ａ）付加シグナル”という構造を持つものが挙げられる。また、第２のプロモーターと導入したい遺伝子を含む配列を、転移時に転写される鎖（ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片をセンスに含む）のアンチセンスにコードさせることもできる（図７参照）。
レトロ転移後に機能させたい第２のプロモーターの前後またはその間には、ベクターからの転写の際に転写を起こさないように適宜制御配列を組み込むことができる。このような制御配列としては、リプレッサー配列、イントロン、およびｌｏｘＰ等の組み換えシグナルなどが挙げられる。第２のプロモーターの下流に外来遺伝子を挿入することにより、所望の外来遺伝子の発現ユニットをレトロ転移させることができる。外来遺伝子としては特に制限はなく、標的細胞で発現させたい所望の遺伝子を挿入することができる。例えば２ｋｂ以上の外来遺伝子を挿入することができる。例えば、遺伝子治療などの場合には、治療遺伝子を挿入する。
上記のレトロ転移ベクターの転写産物は、そこに含まれるＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片を認識するＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質を細胞で発現させることによりレトロ転写させることができる。ＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質は、これを発現するベクターを細胞に導入して発現させることができる。ここで、ＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質のエンドヌクレアーゼドメインを、他のＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインに置換することにより、標的特異性を改変することが可能である。特に、部位特異的ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインへ置換することにより、ＲＮＡをその標的部位に特異的にレトロ転移させることができる。本発明は、ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質であって、そのエンドヌクレアーゼドメインが、部位特異的ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質のエンドヌクレアーゼドメインに置換されている蛋白質をコードするベクターを提供する。エンドヌクレアーゼドメインの置換は、エンドヌクレアーゼドメインの全領域または部分であってもよく、部分を置換する場合は、２つのエンドヌクレアーゼドメインの対応する部分同士を交換する。２つのエンドヌクレアーゼドメインの対応する部分は、両者のアミノ酸配列をアライメントして対応する範囲として同定することができる。ＯＲＦ蛋白質を発現させるには、ＬＩＮＥのＯＲＦが含まれる領域を公知の発現ベクターに含まれるプロモータの下流に挿入すればよい。トランスコンプリメンテーションによりレトロ転移ベクターからの転写産物をレトロ転移させる目的には、ＯＲＦ蛋白質を発現するベクターは、ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲの配列を欠損していることが好ましい。これにより、自身の転写産物は認識されず、ＬＩＮＥ  ３’ＵＴＲ断片を持つ他のＲＮＡ分子のみを認識させることができる。
また本発明は、ＬＩＮＥがコードするＯＲＦ蛋白質を発現するベクター、およびそのＬＩＮＥの３’ＵＴＲ断片を含むＲＮＡをコードし、該ＯＲＦ蛋白質を発現しないベクターを含む、該ＲＮＡのレトロ転移を介した遺伝子送達のためのキットを提供する。ＯＲＦ蛋白質は、上記のようにエンドヌクレアーゼドメインを他のＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインに置換したものを好適に用いることができる。
上記のレトロ転移ベクターおよびＬＩＮＥ  ＯＲＦ蛋白質発現ベクターは適宜公知のベクター系を利用して構築することが可能であるが、ウイルスベクターとして構築することが好適である。ウイルスベクターを用いることにより、宿主細胞に効率的にベクターが導入され、ＲＮＡおよびＯＲＦ蛋白質を高いレベルで発現させることができる。ウイルスベクターとしては、特に染色体に組み込まれないタイプのウイルスベクターが好適である。このタイプのベクターを用いることにより、レトロ転移に必要なコンポーネントを標的細胞内で一過的に発現させることができる。これらのベクターは、時間と共に細胞から排除されるため、レトロ転移が完了した後に不必要に発現することがないため優れている。染色体非組み込み型のウイルスベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター（例えはｐＳｈｕｔｔｌｅ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シンドビスウイルスベクターなどが挙げられる（Ｓｏｉｆｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１４１７−１４２８；Ｋａｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：３３−４０）。また、染色体組み込み型のベクターを用いることにより、その組み込み部位を制御できる可能性もある。染色体組み込み型のベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどが挙げられる。これらのウイルスベクターは、当業者の公知の方法により調製することが可能である。ウイルスベクターは、それぞれの種類に応じて、遠心分離等により精製することができる。
本発明のベクターを動物の生体内または生体外で発現させるためには、プラスミドなどのＤＮＡベクターであればカチオン性脂質やリポソームなどのトランスフェクション試薬と共に投与することができる。ｎａｋｅｄ  ＤＮＡまたはウイルスベクターであれば、直接投与することができる。投与対象は、例えはヒト、および非ヒト哺乳動物が挙げられ、生体外または生体内の細胞、組織、および器官等に投与することができる。生体への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ法においては、本発明のベクターは直接生体内に投与される。ｅｘ  ｖｉｖｏ法においては、生体外の細胞に投与された後、その細胞が生体内に投与される。ｅｘ  ｖｉｖｏ法においては、例えば本発明のウイルスベクターを生産する細胞を投与することも考えられる。標的組織に限局して投与する場合には、ベクターまたは細胞を標的組織に注射針またはカテーテル等を介して投与する。あるいは、特定の組織にベクターを送達できる担体を用いて標的組織にベクターを導入してもよい。これにより、例えば腫瘍細胞などに特異的に本発明のベクターをレトロ転移させることができる。
本発明のベクターは公知の担体や媒体と混合して組成物とすることができる。また本発明のベクターは、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与することが可能である。例えば、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、塩、植物油、安定剤、保存剤、懸濁剤、乳化剤などと混合して組成物とすることができる。また本発明のベクターは、例えばリポソームまたはカチオン性脂質などと共に細胞内へ核酸を導入するための組成物とすることができる。
本発明のベクターを医薬として生体へ投与する場合、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など当業者に公知の方法により局所または全身に投与し得る。また、シリンジ、カテーテル、または無針インジェクター等を介して局所投与することもできる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、症状などにより変動し得るが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与は１回から数回に分けて行うことができる。本発明のベクターの投与は、公知の遺伝子治療プロトコルに従って行うことが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は全て本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］プラスミド構築
プライマー対ＳＡＲＴ１  Ｓ８８０およびＳＡＸ  ３ｐ  Ｎｏｔ１（表１参照）を用いて、ＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１／ＯＲＦ２／３’ＵＴＲ部分をゲノムライブラリークローンＢＳ１０３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１５７８−１５８４）からＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲはＰｆｕ  ＴｕｒｂｏＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、３０サイクルで行った。ＰＣＲ産物はｐＡｃＧＨＬＴＢプラスミド（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位の間にサブクローニングした。これにより得られたＳＡＲＴ１ＷＴ−ｐＡｃＧＨＬＴＢと名付けられたプラスミドは、６４ｂｐのポリヘドリン５’ＵＴＲおよびＧＳＴ−Ｘ５−（Ｈｉｓ）６−Ｘ３１をコードする遺伝子、これにインフレームでＭＧＳＹＫＥ−−−と融合したＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１（天然のＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１においては下線の位置はセリンであることに注意）、それに続きＳＡＲＴ１  ＯＲＦ２／３’ＵＴＲ、およびポリヘドリン３’ＵＴＲを含んでいる。点変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、表１に示した４対のプライマーを用いてＳＡＲＴ１ＷＴ−ｐＡｃＧＨＬＴＢ中に導入した。ＳＡＲＴ１Δ３’−ｐＡｃＧＨＬＴＢは、ＳＡＲＴ１ＷＴ−ｐＡｃＧＨＬＴＢをＡｆｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、それらの部位の間に、プライマーＳＡＲＴ１  Ｓ５９９５およびＳＡＲＴ１  Ａ６２２１を用いてＰＣＲで増幅した２００ｂｐのＯＲＦ２  ３’端配列をライゲーションすることにより構築した。各プラスミドの変異はＤＮＡシークエンシングにより確認した。ＴＲＡＳ１ＷＴ−ｐＡｃＧＨＬＴＢは、プライマー対ＴＲＡＳ１  Ｓ２３９５およびＴＲＡＳ１  Ａ７８７０を用いてゲノムライブラリークローンλＢ１（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，４５４５−４５５２）から増幅したＴＲＡＳ１  ＯＲＦ１／ＯＲＦ２／３’ＵＴＲ部分を、ｐＡｃＧＨＬＴＢプラスミドのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングして構築した。ＴＲＡＳ１  ＡＰＥを含むＳＡＲＴ１−ｐＡｃＧＨＬＴＢは次のようにして構築した。第一に、ＳＡＲＴ１ＷＴ−ｐＡｃＧＨＬＴＢのＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩ部位を、ＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ切断、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理、およびセルフライゲーションにより除去した。第二に、５’がリン酸化されたプライマーＳＡＲＴ１  Ａ３０２９およびＳＡＲＴ１  Ｓ３６６８を用いて、インバースＰＣＲによりＳＡＲＴ１ＷＴ−ｐＡｃＧＨＬＴＢのＡＰＥドメイン以外の全部を増幅した。増幅産物をセルフライゲーションさせクローニングした。この構築物ＳＡＲＴ１ΔＡＰＥ−ｐＡｃＧＨＬＴＢはＡＰＥドメインを欠失し、その代わり２つのプライマー由来の１つのＮｏｔＩおよび１つのＢｇｌＩＩ部位を含む。第三に、ＴＲＡＳ１  ＡＰＥドメインをＴＲＡＳ１  Ｓ３８４８およびＴＲＡＳ１  Ａ４５２７を用いて増幅し、ＳＡＲＴ１ΔＡＰＥ−ｐＡｃＧＨＬＴＢのＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩ部位の間にクローニングした。
2003064644.tif 000002
（表中の下線はサブクローニングのための制限酵素認識部位、囲みは変異させたヌクレオチド表す）
［実施例２］組み換えＡｃＮＰＶの生成
Ｓｆ９細胞をペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）の存在下、１０％ウシ胎児血清（Ｎｉｈｏｎ−ｎｏｓａｎｋｏｕｇｙｏｕ）を含むＴＣ−１００培地で２７℃で単層培養して増殖させた。ポリヘドリンプロモーターにより駆動される野生型または変異ＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１／ＯＲＦ２／３’ＵＴＲ部分を含む組み換えバキュウロウイルスは、野生型または変異ＳＡＲＴ１−ｐＡｃＧＨＬＴＢプラスミドをＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ  ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にＴｆｘ−２０リポフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＳｆ９細胞にコトランスフェクトすることにより生成させた。４日後に培地を回収し、製造もとのインストラクション（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従ってプラーク精製および続くウイルス増殖を行った。
［実施例３］ＰＣＲアッセイによるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＡＲＴ１レトロ転移の検出
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＡＲＴ１レトロ転移を検出するため、Ｓｆ９細胞中でＡｃＮＰＶからＳＡＲＴ１を発現させ、カイコＳＡＲＴ１がＳｆ９の染色体テロメアリピート中に転移するかをＰＣＲによりモニターした（図１Ａ）。この異種発現系において用いた実施例２に記載の組み換えＡｃＮＰＶでは、ＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１／ＯＲＦ２／３’ＵＴＲ部分がＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれている（図１Ｂ上）。生化学的解析をさらに行うため、ＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１をＧＳＴ−Ｘ５−（Ｈｉｓ）６−Ｘ３１（Ｘはベクター由来のアミノ酸を示す）のＣ末端に融合させ、ＯＲＦ２／３’ＵＴＲの位置はＯＲＦ１に対して自然のままに維持した（実施例１参照）。Ｓｆ９細胞の全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、各ウイルスが、分子量約１１０ｋＤａの予想されるＧＳＴ−Ｈｉｓ６−ＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１融合蛋白質を発現することを確認した（データ省略）。
ＰＣＲによるｉｎ  ｖｉｖｏレトロ転移アッセイは、以下のようにして行った。６ウェルプレート中の約１×１０６のＳｆ９細胞に、ＳＡＲＴ１を含むＡｃＮＰＶを多重感染度（ｍｏｉ）を細胞あたり１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）で感染させた。後述の共感染実験では、細胞に２つのＡｃＮＰＶを細胞あたり各５ｐｆｕで感染させた。様々な感染後時間（ｈｏｕｒｓ  ｐｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｈｐｉ）で細胞を掻き取り、１０００ｇで５分遠心してペレットにし、ＰＢＳで４℃で２回洗浄し、プロテネースＫおよびＳＤＳを用いる標準的な方法により全ゲノムＤＮＡを精製した（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ＮＹ）。ＰＣＲアッセイは約１０ｎｇのＳｆ９  ＤＮＡを用い、ＴａｑＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の存在下、ＬＡ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。反応液は９４℃で３分変性させ、続いて９８℃  ２０秒、６２℃  ３０秒、７２℃  １分を３５サイクル（ＳＡＲＴ１  ３’境界の場合）または４０サイクル（ＳＡＲＴ１  ５’，ＴＲＡＳ１  ３’，およびＳＡＲＴ１／ＴＲＡＳ１ＡＰＥ  ３’境界の場合）行った。各混合液から１０μｌをＴＢＥバッファー中の２または３％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色により可視化した。ＰＣＲ産物はアガロースゲルから直接またはＲＥＣＯＣＨＩＰ（Ｔａｋａｒａ）を用いて切り出した後、ｐＧｅｍＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。クローニングした産物はＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上でシークエンスを行った。配列解析はＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．７（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて行った。
［実施例４］レトロ転移したＳＡＲＴ１エレメントとテロメアリピートとの間の３’境界は、Ｂｏｍｂｙｘゲノムで見出されるそれと同一である
まず、組み換えＳＡＲＴ１−ＡｃＮＰＶをＳｆ９細胞に感染させた。７、２４、４８、または７２感染後時間（ｈｏｕｒｓ  ｐｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｈｐｉ）に細胞を遠心してペレットにし、洗浄後Ｓｆ９全ゲノムＤＮＡを抽出した。精製したＤＮＡをＰＣＲに供し、転移したＳＡＲＴ１エレメントとＳｆ９テロメアリピートとの間の境界を増幅した。３’境界の増幅には、ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲに相補的な＋６２７６プライマー（表１）と（ＣＣＴＡＡ）６プライマー（配列番号：２０）を用いた（図１Ｂ、上および中央）。５’境界には、同様に、ＧＳＴ遺伝子コード鎖に相補的な＋５９０プライマーと（ＴＴＡＧＧ）６プライマー（配列番号：２１）を用いた。
驚いたことに、たった３５サイクルの３’境界のＰＣＲにより、２４〜７２感染後時間（ｈｐｉ）において強いバンドが観察されたことから、この系では非常に効率的に転移が起こることが示唆された（図２Ａ）。ポリヘドリンプロモーターは２０〜２４ｈｐｉに活性化される（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ）ので、観察された時間経過は正確にポリヘドリンプロモーターの発現を反映している。そのサイズは約４００ｂｐであり、予想されるレトロ転移後の３’境界である３９２ｂｐプラステロメアリピート長とよく一致していた。レーン４の全ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングし、２９クローンについて配列を決定した（図２Ｂ）。２９クローンは全て、＋６２７６および（ＣＣＴＡＡ）６プライマーにより正しく増幅された。それらの中で、２７はポリ（Ａ）テールを持つ全長３’ＵＴＲがテロメアリピートに結合された形で含まれていた。重要なことに、全ての２７クローンのポリ（Ａ）テールはテロメアリピートのＡＧＧに直接つながっており、これはＢｏｍｂｙｘゲノムで見出された境界配列と同一であった（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１５７８−１５８４）。これらの結果は、これらの２７のＳＡＲＴ１クローンはレトロ転移により生じたことを示唆している。
しかしながら他の２クローンは、ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲの５’側半分の１５２ｂｐしか含んでいなかった。それらはテロメアリピートに８ヌクレオチドＧＴＴＧＧＧＴＴ（図２Ｂで下線で示したヌクレオチド）で結合していた。このオクタマー配列はテロメアリピートＧＴＴＡＧＧＴＴとたった１塩基異なるのみであるので、これら２つのＳＡＲＴ１クローンは恐らく内在Ｓｆ９テロメアリピートとの組み換え事象により生じたと考えられる。ヒトＬ１ではしばしば見出される３’隣接配列の転換（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）は観察されなかった（Ｍｏｒａｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，１５３０−１５３４）。
ネガティブコントロールとして、ＳＡＲＴ１の予想される逆転写酵素のＣモチーフの活性化部位であるＹＡＤＤの変異体であるＳＡＲＴ１  ２Ｄ６９９Ｖ−ＡｃＮＰＶをＳｆ９に感染させた。この変異体では、ＯＲＦ２  ６９９番目のアミノ酸位置にあるアスパラギン酸残基がバリン残基に置換された（図４Ａ）。この変異体に対するＰＣＲアッセイでは、レトロ転移は全く検出されなかった（図２Ａ，レーン５）。この結果は検出された転移が内在性のＳｆ９  ＳＡＲＴ様エレメントにより媒介されたのではなく、Ｂ．ｍｏｒｉ  ＳＡＲＴ１の、自身のＲＴ活性による確証的なレトロ転移により媒介されたことを示している。
［実施例５］ＳＡＲＴ１のレトロ転移はＲＮＡを介する
４０サイクルのＰＣＲを通した５’境界の増幅では、７２ｈｐｉでバンドが見られた（図３Ａ）。３’境界とは違い、幾つかのバンドが出現した。最も大きいバンド（レーン４の矢印）のサイズは約６００ｂｐで、予想される全長５’転移産物の長さである５９０ｂｐプラステロメアリピートとよく一致していた（図１Ｂ）。従って、本発明者らはこのバンドは全長のレトロ転移を表し、より小さいサイズのバンドは逆転写の中断による５’欠失を表すと予想した。レーン４の全ＰＣＲ産物のクローニングおよびそれに続くシークエンシングにより、本発明者らのこの予想が正しいことが確認された（図３Ｂ）。シークエンシングを行った２４クローンは全て、（ＴＴＡＧＧ）６および＋５９０プライマーで増幅した。全てのクローンで、転移したＳＡＲＴ１の５’端は（ＴＴＡＧＧ）ｎのＴＴの３’に結合しており、これはＢｏｍｂｙｘゲノムにおける挿入位置と同一であった。最も大きいクローンでは、テロメアリピートはポリヘドリンＲＮＡの５’端の配列であるＡＧＧに正確につながっていた（図１Ｂ；Ｐｏｓｓｅｅ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，Ｓ．Ｃ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，１０２３３−１０２４８）。この結果は、組み換えＳＡＲＴ１はＲＮＡを介して転移したことを強く示唆している。他の２３クローンは全て５’が様々に欠失したＳＡＲＴ１エレメントがテロメアリピートに結合したものであることが判明した。ＳＡＲＴ１  ２Ｄ６９９Ｖ−ＡｃＮＰＶを感染させた細胞からは、５’バンドは全く検出されなかった（図３Ａ，レーン５）。また、５’境界のＰＣＲによる検出が成功したことは、第一鎖合成に続き、逆転写された第一鎖ＤＮＡの５’配列と（ＣＣＴＡＡ）ｎとの間で起こるインテグレーションのステップ、および／または（ＴＴＡＧＧ）ｎがプライマーとなる第二鎖ＤＮＡ合成が起こったことを示唆している。
Ｂｏｍｂｙｘゲノムにおいて、本発明者らは以前、ＳＡＲＴ１  ＤＮＡの５’端の重複および異常の例を見出している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１５７８−１５８４の図４参照）。同様の異常な５’配列が観察されるかを調べるため、図３Ａのレーン４の最も大きいサイズのバンド（矢印）から抽出した全長レトロ転移産物を解析した。１６クローンをサブクローニングしてシークエンシングを行ったところ、４つのクローンでは、ポリヘドリンＲＮＡの５’端配列ＡＡＧがテロメアリピートのＴＴに直接結合していることが示された（図３Ｃ）。これは正準な全長レトロ転移を表している。他の１つのクローンでは、テロメアリピート単位から１塩基しか違わない１０−ｍｅｒのリピートである（ＴＣＡＧＧＴＴＡＧＧ）ｎにＳＡＲＴ１がレトロ転移していた。他の１０クローン中、８つは組み換えＳＡＲＴ１エレメントとテロメアリピートとの間に余分なグアニジン（Ｇ）を１つ持っていた。余分なＣまたはＴＣを持つものがそれぞれ１つずつ存在した。Ｇは、５’Ｇキャップの逆転写の結果として共通して生じる可能性がある（Ｈｉｒｚｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３５９７−３５９８；Ｖｏｌｌｏｃｈ，Ｖ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４，９９１−９９６）。あるいは、これらの付加されたヌクレオチドはＳＡＲＴ１  ＲＴのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を表しているのかも知れない。他のクローンでは、説明が困難な２２８ｂｐの未知の配列が付加されていた。これらのバリエーションはＢｏｍｂｙｘゲノムに見出されるバリエーションとは幾分異なっていたが、５’の欠失および異常の存在はやはり、この系におけるＳＡＲＴ１の正準なレトロ転移を支持している。
［実施例６］ＳＡＲＴ１のレトロ転移は３’ＵＴＲおよび両ＯＲＦの保存モチーフを必要とする
ＳＡＲＴ１は２つのＯＲＦ（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）を持つ典型的なＬＩＮＥである。ＯＲＦ１は３つのＣ末端システイン−ヒスチジンモチーフを持ち、ＯＲＦ２は１つのＡＰＥおよび１つのＲＴドメインおよび１つのＣ末端システイン−ヒスチジンモチーフを持つ（図１Ｂ）。これらの保存モチーフがＳＡＲＴ１のｉｎ  ｖｉｖｏでのレトロ転移に必須かを調べるため、本発明者らはこれらの保存モチーフにミスセンス変異を含む一連のＳＡＲＴ１−ＡｃＮＰＶ構築物を生成し、これらのエレメントがテロメアリピート中に転移できるかを測定した（図４Ａ）。本発明者らはまた、ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲ全体を欠くが、下流のポリヘドリンの３’ＵＴＲは残っているＳＡＲＴ１Δ３’−ＡｃＮＰＶ構築物を構築した。これらのエレメントに対し、（ＣＣＴＡＡ）６およびＳＡＲＴ１  ＯＲＦ２に相補的な＋６０９６プライマーを用いて３’境界のＰＣＲアッセイを行った（表１）。
図４Ｂに示したように、これらの変異体は全てｉｎ  ｖｉｖｏで転移できなかった（レーン２〜５、および７）。この結果は、ＯＲＦ２中のＡＰＥおよびＲＴドメイン、ならびにシステイン−ヒスチジンモチーフはｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＡＲＴ１のレトロ転移に欠くことができないことを示している。ＯＲＦ１のシステイン−ヒスチジンモチーフの破壊はやはりレトロ転移を消滅させた。この結果は、多くのＬＩＮＥからレトロウイルスにまで広く保存されているＯＲＦ１のシステイン−ヒスチジンモチーフがレトロ転移に必須であることを示すものである。ＳＡＲＴ１のレトロ転移が３’ＵＴＲも必要としたことは、ＯＲＦ蛋白質によるＲＮＡ  ３’端の配列特異的な認識が、ＳＡＲＴ１のレトロ転移に本質的であることを示唆している。ポリヘドリンの３’ＵＴＲが残っているＳＡＲＴ１Δ３’構築物がレトロ転移しなかったことから、ＳＡＲＴ１がポリ（Ａ）テールのみを認識することはありそうにない。ＳＡＲＴ１  ５’ＵＴＲは、構築物中ではポリヘドリンの５’ＵＴＲに置換されていたので、レトロ転移には不必要であったことが示された。
これらの変異ＳＡＲＴ１−ＡｃＮＰＶは２つの手順、すなわちプラスミドミュータジェネシスとウイルス生成とにより構築された。本発明者らは、各変異体が、予想されるＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１蛋白質を同等量発現することを確認した（データ省略）。しかしながら、この２つのステップにおいて意図しない有害な変異が他のアミノ酸位置に導入されることにより、これらの変異ＳＡＲＴ１エレメントがレトロ転移できなかったのかも知れない。この可能性を排除するため、本発明者らは２つのコントロール実験を行った。１つは、プラスミドミュータジェネシスに対するコントロールとして、２Ｄ６９９Ｖ−ＡｃＧＨＬＴＢのバリン残基をアスパラギン酸に再変異させた（図４Ａ，２Ｖ６９９Ｄ）。得られたプラスミドは野生型ＳＡＲＴ１の塩基配列と同一となるはずである。このプラスミドから作製したＡｃＮＰＶが、野生型のレベルにレトロ転移が回復したことから（図４Ｂレーン６）、２Ｄ６９９Ｖ変異体のレトロ転移の欠損は、プラスミドミュータジェネシスにおいて想定されうる意図しない変異によるものではないことが示された。
もう１つのコントロールとして、本発明者らはこれらの変異ウイルスの２つを同時に感染させ、レトロ転移が起こるかを測定した。もしこれらの変異体が、本発明者らが導入した以外の意図しない変異を持っていないなら、感染させた２つの変異体はＯＲＦ蛋白質およびＲＮＡを互いに供給しあってトランスコンプリメンテーションによりレトロ転移が起こる可能性がある。予測したように、共感染によりＳＡＲＴ１のレトロ転移が起こった（図４Ｂレーン８〜１４）。それぞれのＯＲＦ変異体を共感染させたΔ３’変異体から、大まかに野生型のレベルのシグナルが検出された（レーン８〜１１）。この結果は、Δ３’変異体は、各ＯＲＦ変異体に由来するＲＮＡの３’端に効率的に作用することができる機能的ＯＲＦ蛋白質をなお発現することを示唆している。同様に、ＯＲＦ１変異体である１Ｈ６２６Ｐを各ＯＲＦ２変異体と共に共感染させた場合には、幾分低いレベルのレトロ転移が観察された（レーン１２〜１４）ことから、１Ｈ６２６Ｐは機能的なＯＲＦ２蛋白質を正しく産生し、各ＯＲＦ２変異体から供給されたＯＲＦ１蛋白質と共にトランスコンプリメンテーションによりレトロ転移が達成されたことを示唆している。これらの解析は、各変異体で見られたレトロ転移の欠損は、変異ＡｃＮＰＶ構築の間に起きた実験的なエラーではなく、本発明者らが導入した変異の効果によるものであることを示唆している。
また、ＳＡＲＴ１Δ３’変異体をＯＲＦ変異体と共に共感染させた実験において、もしＳＡＲＴ１がポリ（Ａ）テールのみを認識するとすれば、ＳＡＲＴ１  ＯＲＦ蛋白質はＳＡＲＴ１  ＲＮＡよりも多くの細胞質ｍＲＮＡのポリ（Ａ）にトランスに結合し、ＳＡＲＴ１Δ３’変異体の効率的なレトロ転移は起こらないと考えられるが、実際にはＳＡＲＴ１Δ３’変異体の効率的なレトロ転移が観察されたという結果は、ＳＡＲＴ１のレトロ転移には、ポリ（Ａ）テール以外のＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲが重要であることを支持している。
［実施例７］トランスコンプリメンテーションによるレトロ転移
上記に示した結果は、ＳＡＲＴ１はそれがコードする蛋白質をトランスに他のＳＡＲＴ１  ＲＮＡまたは蛋白質分子に送達することによりレトロ転移できることを示唆している。しかしながら、２つの変異ＤＮＡの間の組み換えを通して生成した野生型ＳＡＲＴ１エレメントにより事後的にレトロ転移が起こったというわずかな可能性も残されている。この可能性を否定するため、Δ３’変異体および２Ｃ１００７Ｇ変異体の共感染に由来する３’ＰＣＲ産物を解析した（図４Ｂレーン１１）。産物のサイズからは、野生型と同じ長さのもののみが転移し、Δ３’エレメントは転移しなかったことが示唆される。プラスミドミュータジェネシスによるＳＡＲＴ１  ２Ｃ１００７Ｇ−ＡｃＧＨＬＴＢ構築において、本発明者らは２Ｃ１００７Ｇ変異体にＡｐａＩ制限酵素認識部位を導入した。もし、レトロ転移がトランスコンプリメンテーションにより２Ｃ１００７Ｇ  ＲＮＡの逆転写を通して起こったのなら、転移したＤＮＡ  ３’端には、３’ＵＴＲ内のＡｐａＩ部位に加え、この変異導入位置に付加的なＡｐａＩ部位を持っているはずである（図５Ａ）。一方、もしレトロ転移が相同組み換えにより生成した野生型ＳＡＲＴＩにより事後的に起こったのなら、レトロ転移したＤＮＡ産物はＡｐａＩ部位を３’ＵＴＲ内に１つのみ有する（図５Ｂ）。そこで、３’境界のＰＣＲを（ＣＣＴＡＡ）６およびＯＲＦ２に相補的な＋５６１６プライマーを用いて行った（図５Ｃ）。野生型ＳＡＲＴ１（レーン１）または２つの変異体の両者を同時に（レーン２）感染させたＳｆ９細胞からは、１．１ｋｂのバンドが検出された。野生型ＰＣＲ産物のＡｐａＩ切断では、約５５０ｂｐの２つのバンドが生じた（レーン４）一方、変異体二重感染からのＰＣＲ産物の切断ではトランスコンプリメンテーションで期待される３つのバンドが生じた（レーン５）。Δ３’単独を感染させた細胞からの増幅では、ＡｐａＩで切断可能なバンドは生成されなかった（レーン３および６）。これらの実験は、２つの変異体の共感染で観察されたＳＡＲＴ１のレトロ転移は、ＤＮＡ組み換えによる野生型ＳＡＲＴ１の再生成によるものではなく、２つの変異ＳＡＲＴ１エレメントの間のトランスコンプリメンテーションによるものであることを示唆している。３’が欠失した産物が存在しないことは、Δ３’変異体には転移に必要とされる不可欠なシスエレメントが欠失していることを示唆している。
［実施例８］ＬＩＮＥの間でＡＰＥドメインを交換すると挿入部位特異性が改変される
ＬＩＮＥのレトロ転移の必須のステップは標的部位のＤＮＡへのニックの導入であり、このＤＮＡが逆転写のためのプライマーとして働くと考えられている。バクテリア内で発現させたＡＰＥドメイン蛋白質は標的部位の配列を含むオリゴヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断する（Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７，９０５−９１６）ことから、このドメインは標的切断に責任があると考えられる。ＡＰＥドメインはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける標的ＤＮＡの切断に重要（Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７，９０５−９１６）であったが、ＡＰＥドメインに提唱されているこの機能はｉｎ  ｖｉｖｏのレトロ転移の文脈では証明されていない。そこで本発明者らは、本発明の系を用いて新しいアプローチを開発した。ＴＲＡＳ１は別のレトロトランスポゾンであり、テロメアリピートに対してＳＡＲＴ１とは逆方向に特異的な塩基位置で挿入されている（図１Ｂ，Ｏｋａｚａｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，４５４５−４５５２）。これら２つのエレメントの挿入配列の違いを利用して、ＳＡＲＴ１  ＡＰＥドメインをＴＲＡＳ１  ＡＰＥドメインに置換し、他のＳＡＲＴ１部分は自然のままに維持したキメラＳＡＲＴ１−ＴＲＡＳ１ＡＰＥエレメントを構築した（図６Ａ）。もしＴＲＡＳ１  ＡＰＥドメインがこのキメラレトロトランスポゾンの標的部位を決定するなら、このエレメントはテロメアリピート中にＳＡＲＴ１と同じではなくＴＲＡＳ１と同じ塩基位置に挿入するはずである。
まず、ＳＡＲＴ１がテロメアリピート中に、テロメアリピートに対して特異的な方向性で挿入するかを調べた。＋６２７６プライマーを、（ＴＴＡＧＧ）６および（ＣＣＴＡＡ）６プライマーのいずれかと組み合わせて３’ＰＣＲアッセイを行った（図６Ｂ）。ＳＡＲＴ１の挿入方向から期待されるように、（ＣＣＴＡＡ）６プライマーを用いた場合はバンドが検出され、（ＴＴＡＧＧ）６プライマーを用いた場合は検出されなかった。
次に、ＴＲＡＳ１がｉｎ  ｖｉｖｏでレトロ転移することができるか、そしてＴＲＡＳ１の挿入はＳＡＲＴ１と反対の方向特異性を示すかを調べた。ＴＲＡＳ１  ＯＲＦ１／ＯＲＦ２／３’ＵＴＲ部分をｐＡｃＧＨＬＴＢプラスミドのポリヘドリンプロモーターの下流にクローニングし、ＴＲＡＳ１を発現するＡｃＮＰＶを生成した（図１Ｂ，下）。ＴＲＡＳ１の３’ＵＴＲに相補的なＴＲＡＳ１＋６０２２プライマーを、（ＴＴＡＧＧ）６および（ＣＣＴＡＡ）６プライマーのいずれかと組み合わせて３’ＰＣＲアッセイを行った（図６Ｂ）。ＳＡＲＴ１とは対照的に、（ＴＴＡＧＧ）６プライマーを用いた場合にバンドが検出され、（ＣＣＴＡＡ）６プライマーを用いた場合は検出されなかった。このバンドをクローニングし配列を決定した（図６Ｃ）。５クローンの全てにおいて、ＴＲＡＳ１  ３’端はテロメアリピートと隣接しており、そのポリ（Ａ）テールが（ＣＣＴＡＡ）ｎのＡＡの５’に結合していた。この挿入位置はＢｏｍｂｙｘゲノムで見られる位置と正確に同一である。保存されたアミノ酸残基を変異させたところ、レトロ転移は失われた（データ省略）。従って、ＴＲＡＳ１はやはりレトロ転移能を有しており、ＳＡＲＴ１とは反対の挿入方向特異性を有している。
次に本発明者らは、キメラのＳＡＲＴ１−ＴＲＡＳ１ＡＰＥエレメントを構築し、ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲと相補的な＋６２７６プライマーをテロメアリピートプライマーのいずれかと組み合わせて用いて３’ＰＣＲでアッセイを行った。図６Ｂに示したように、このエレメントはＴＲＡＳ１と同じ挿入方向性を示し、ＳＡＲＴ１とは反対であった。ＰＣＲ産物のクローニングおよびそれに続くシークエンシングにより、シークエンシングを行った８クローン全てで、このエレメントはＴＲＡＳ１と正確に同じヌクレオチド位置に挿入したことが実証された（図６Ｃ）。この結果により、ＡＰＥドメインがＬＩＮＥのレトロ転移における標的部位選択の主要な決定要因であるというｉｎ  ｖｉｖｏの証拠が提供された。
［実施例９］外来遺伝子を持つレトロ因子の作製およびそのレトロ転移
外来遺伝子としてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＡｍｐ領域をＰＣＲにより増幅し、増幅産物をｐＺＥｒＯ−２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に組み込んだ。得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化してセルフライゲーションすることによりＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトを除去した。また、Ａｍｐコード領域中に、カイコのアクチン遺伝子由来のイントロンを挿入した。得られたプラスミドを鋳型にして、ＯｒｉからＡｍｐ遺伝子までを含む断片をＰＣＲにより増幅し、増幅断片をｐＺＥｒＯ−２．１のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に組み込んだ。このプラスミドに、ＳＡＲＴ１の３’−ＵＴＲ全長（配列番号：５２）を含むＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片を挿入した。ＳＡＲＴ１  ３’−ＵＴＲ全長を含む断片は、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を含むプライマー対ＳＡＲＴ１Ｓ６２２１ＥｃｏＲＩ（５’−ｔｔｔｔｔｔｇａａｔ  ｔｃｇｇａｃｃｇｔｃ  ｇｇｇｃｇｔｃ−３’／配列番号：５３）およびＳＡＲＴ１Ａ６７０４ＢｇｌＩＩＢａｍＨＩ（５’−ｔｔｔｔｔｔｇｇａｔ  ｃｃａｇａｔｃｔｔｔ  ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ  ｔｔｔｔｔｔｔｇｇｔ  ａｔｃｇａ−３’／配列番号：５４）を用いてＰＣＲにより増幅した。Ａｍｐ遺伝子から３’−ＵＴＲまでを含むＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片を切り出し、ＳＡＲＴ１のＯＲＦ１（ＧＦＰ融合）およびＯＲＦ２をコードするバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧＨＬＴ  Ｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）のＯＲＦ２ストップコドンの直下に導入して、得られたプラスミドをＴ−ｓｐと名付けた（図７）。
このプラスミドには最終的にＳＡＲＴに由来しない外来遺伝子として２１６３ｂｐの遺伝子断片が組み込まれている。このプラスミドから作製したバキュロウイルスをＳｆ９細胞とＢｍＮ４細胞に感染し、細胞に導入した配列が染色体中のテロメア反復配列に挿入されたかどうかをＳＡＲＴ内部のプライマー（Ｔｓｐ−Ｓ１０３７７，Ｓ８４９９，１００９８）とテロメア反復配列中のプライマー（ＣＣＴＡＡ）５Ｔ５などとの組み合わせにより、ＰＣＲ法によって検出した。
ＰＣＲ解析の結果、図８に示すようにカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ）のＢｍＮ細胞およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）のＳｆ９細胞のいずれにも外来遺伝子をもったＳＡＲＴの組み込みが確認された。このことは、ＡｃＮＰＶの宿主域の広さを検証する結果であり、より広範囲な動物細胞への導入も示唆している。ＢｍＮ細胞では２４時間程度からわずかに転移し、９６時間で最大の効率となった。一方、Ｓｆ９細胞では７２時間で最大の導入効率が観察された。この結果は、少なくとも２．５ｋｂ程度の外来遺伝子のゲノムへの導入がこの方法により可能であることを示している。実施例１１に示すように、ＳＡＲＴ１の３’ＵＴＲの５’側領域約７０ベース、および３’領域の約８０ベースは転移に必須ではない。従って、３’領域も外来遺伝子を導入するための部位の候補となる。ｎｏｎＬＴＲレトロトランスポゾンでは３’側から５’側への逆転写がおこることから、５’側での欠損（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）がおこることが多い。図７のように外来遺伝子をレトロトランスポゾンの最下流に挿入すれば、５’側での欠損の危険性が少ないため、長大な外来遺伝子を導入しても少なくともその部分の転移については欠損が生じる可能性は少ない点で有利である。
［実施例１０］トランス相補を利用した３’ＵＴＲ領域を保持する外来遺伝子のレトロ転移
（方法）
ＳＡＲＴの完全長３’ＵＴＲの上流にショウジョウバエｈｓｐプロモーター領域制御下に発現するＥＧＦＰ領域を組み込んだベクター（ｈｓｐ  ｐＥＧＦＰ１−ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲ）（図９）を作成した。このプラスミドをＳｆ９細胞にリポフェクション法によってトランスフェクションした後２４時間後に、３’ＵＴＲ欠損型のＳＡＲＴを組み込んだＡｃＮＰＶベクター（ＳＡＲＴ１Δ３’−ＡｃＧＨＬＴＢ）を感染させ、感染から７２時間後にＤＮＡを抽出してテロメアへの転移がおこったか否かをＰＣＲ法によって確認した。コントロールとしては、プラスミドのみ、または逆転写酵素欠損株（ＳＡＲＴ１  ２Ｄ６９９Ｖ−ＡｃＧＨＬＴＢ）の感染の２種類を用いた。
（結果）
ｈｓｐ  ｐＥＧＦＰ１−ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲとＳＡＲＴ１Δ３’−ＡｃＧＨＬＴＢを共感染させた細胞からのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで検出されたバンドを切り出して、配列決定を行った。その結果（表１）、２２クローンのすべてがテロメア反復配列に挿入されていた。従って、バキュロウイルスによって発現されたＳＡＲＴの蛋白質により、プラスミド上の３’ＵＴＲが認識され、その上流部分も逆転写によって転移したと考えられる。この結果は、プラスミドをトランスフェクトさせるだけで、トランス相補性を利用して、簡便に外来遺伝子をゲノムの標的部位に転移させることが可能であることを示した。逆転写は３’ＵＴＲの３’末端からはおこっておらず、３’ＵＴＲの領域の中間から後半にかけての部位からおこっていた。特に過半数は３’ＵＴＲ後半部の６４６２からおこっており、このサイトが逆転写の開始のための認識と関わっていることが予想される。この結果は、ｐｏｌｙＡを欠損させた場合のＬＩＮＥの転移の結果によく似ていることから、３’ＵＴＲ保持プラスミドにレトロ因子の蛋白質をトランスに作用させるときは、ｐｏｌｙＡを含む完全なＬＩＮＥと比べ、逆転写酵素開始複合体が別の領域を認識するなど、メカニズム上の差があるのかもしれない。コントロールとして、プラスミドのみのトランスフエクション実験、または逆転写酵素欠損型のＳＡＲＴとの共感染実験では、テロメア反復配列への転移は観察されなかった。
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［実施例１１］ＳＡＲＴ１の３’ＵＴＲ欠失変異体のレトロ転移活性
レトロ転移に必要な３’ＵＴＲ領域を検索するため、実施例１のＧＳＴ−（Ｈｉｓ）６を融合させたＳＡＲＴ１の３’ＵＴＲを、図１０に示したように様々に欠失させたプラスミドを構築した。このプラスミドから実施例２と同様に組み換えＡｃＮＰＶを生成させ、実施例３の同様のレトロ転移アッセイを行った。３’ＵＴＲの下流のポリＡ（Ａ２０）を欠失させてもレトロ転移活性は維持されたが、転移効率は有意に低下した。図１０に示したように、３’ＵＴＲの３’端から８４塩基または１６８塩基を欠失させてもレトロ転移は起こり、３’ＵＴＲの５’端から７１塩基を欠失させてもレトロ転移が起こったことから、これらの配列は転移に必須ではないことが示された。しかしＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲの５’端から７１〜２９３塩基を欠失させると、レトロ転移活性が消失した。さらに３’ＵＴＲの５’端から７１番目〜２９３番目の塩基配列を含むＲＮＡはレトロ転移を起こすことができたことから、この領域にレトロ転移活性に必須の配列が含まれることが示唆された。
産業上の利用の可能性
本発明により、トランスコンプリメンテーションによるＬＩＮＥのレトロ転移を利用して効率的に核酸を細胞の染色体に導入することが可能となった。またＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインを標的特異的ＬＩＮＥのエンドヌクレアーゼドメインに置換することにより、ＬＩＮＥに標的特異性を付与することが可能となった。ウイルスをベースとして構築された標的特異的ＬＩＮＥの遺伝子導入ベクターは、高い効率で宿主染色体にレトロ転移する。本発明のレトロ転移系は、宿主に害の少ない遺伝子送達を可能にする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｉｎ  ｖｉｖｏのＳＡＲＴ１レトロ転移のＰＣＲアッセイを示す図である。（Ａ）ＰＣＲアッセイの模式的概観。六角形は、Ｓｆ９細胞に感染させたＳＡＲＴ１を発現するＡｃＮＰＶを表す。図示したように、ＳＡＲＴ１はＳｆ９染色体のテロメアリピート中にレトロ転移することが期待される。黒い矢印は転移したＳＡＲＴ１とテロメアリピートとの間の境界を検出するためのＰＣＲで用いたプライマーを示す。（Ｂ）アッセイの詳細図。Ｓｆ９のテロメアリピート（ＴＴＡＧＧ／ＣＣＴＡＡ）ｎを中央に示す。ＡｃＮＰＶから発現されるＳＡＲＴ１の模式的構造を上に示した。ＯＲＦ１／ＯＲＦ２／３’ＵＴＲは灰色のボックスで示す（スケールは実際と比例していない）。ＡＰＥおよびＲＴはそれぞれエンドヌクレアーゼドメインおよび逆転写酵素ドメインを表す。垂直線は両ＯＲＦのＣ末端付近のシステイン−ヒスチジンモチーフを表す。ＯＲＦ１は後の生化学的解析のためにインフレームでベクター由来のＧＳＴ−（Ｈｉｓ）６遺伝子と融合していることに注意。黒い長方形は転写を駆動するポリヘドリンプロモーターを表す。ヌクレオチド位置は、転写開始部位（ＴＡＡＧのＡ）を＋１として番号を付けている。白い矢印は、図２においてＳＡＲＴ１  ３’端とテロメアリピートとの間の境界を増幅するために用いられるプライマー対＋６２７６および（ＣＣＴＡＡ）６を示す。太い黒い矢印は、図３において５’境界の増幅に用いられるプライマー対＋５９０および（ＴＴＡＧＧ）６を示す。図６においてアッセイされるＡｃＮＰＶから発現されるＴＲＡＳ１の構造も下に示す。ＲＨはＲＮａｓｅ  Ｈドメインを表す。点線の矢印で示すように、ＳＡＲＴ１とＴＲＡＳ１はＴＴとＡＧＧヌクレオチドの間に、テロメアリピートに対して互いに逆方向に挿入されている。ポリ（Ａ）テールとテロメアリピートの繰り返しの特性のため、正確な挿入位置は１塩基の不確定性があり、標的部位の重複は同定されていないことに注意。
図２は、レトロ転移したＳＡＲＴ１エレメントの３’境界解析を示す写真および図である。（Ａ）転移したＳＡＲＴ１の３’端とテロメアリピートとの間の境界のＰＣＲ増幅。野生型ＳＡＲＴ１または２Ｄ６９９Ｖを発現するＡｃＮＰＶを感染し、７、２４、４８、および７２感染後時間（ｈｐｉ）にＳｆ９ゲノムＤＮＡを抽出した。精製したＤＮＡは、図１Ｂに記載したプライマー対＋６２７６および（ＣＣＴＡＡ）６を用いたＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した。分子量サイズマーカーを右端のレーンに泳動し、その幾つかについて塩基対のサイズが図示されている。（Ｂ）パネル（Ａ）のレーン４に示された３’境界ＰＣＲ産物からの２９クローンの塩基配列。それぞれのタイプの数（クローンの数）が右に示されている。ヌクレオチド位置は、ポリヘドリン転写開始部位を＋１として示されている。テロメアリピートとホモロジーがある８ヌクレオチドには下線を引いてある。
図３は、レトロ転移したＳＡＲＴ１エレメントの５’境界解析を示す写真および図である。（Ａ）転移したＳＡＲＴ１の５’端とテロメアリピートとの間の境界のＰＣＲ増幅。ＡｃＮＰＶを感染させたＳｆ９細胞のゲノムＤＮＡを、図１Ｂに示したプライマー対＋５９０および（ＴＴＡＧＧ）６で増幅した。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した。分子量サイズマーカーを右端のレーンに泳動し、その幾つかについて塩基対のサイズが図示されている。（Ｂ）パネル（Ａ）のレーン４の全５’境界ＰＣＲ産物からの２４クローンの塩基配列が示されている。それぞれのタイプの数（クローンの数）が右に示されている。ヌクレオチド位置は、ポリヘドリン転写開始部位を＋１として示されている。（Ｃ）５’異常のあるＳＡＲＴ１レトロ転移。パネル（Ａ）のレーン４の矢印で示された全長５’境界ＰＣＲ産物を精製してクローニングし、１６クローンのシークエンスを行った。ボックスで示したヌクレオチドは組み換えＳＡＲＴ１またはテロメアリピートのいずれの部分でもない。
図４は、ＳＡＲＴ１レトロ転移におけるＯＲＦおよび３’ＵＴＲの必要性を示す図および写真である。（Ａ）様々な変異ＳＡＲＴ１−ＡｃＮＰＶの模式的説明。各ミスセンス変異のアミノ酸位置が示されている。例えば、１Ｈ６２６Ｐ変異体においては、ＯＲＦ１の６２６番目のアミノ酸位置にあるヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基がプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）に置換されている。この位置はＯＲＦ１中に３つ連続するＣＣＨＣモチーフの最初のヒスチジン残基に対応する。ＳＡＲＴ１  ＯＲＦ１の最初のメチオニンを１番目としたが、ＯＲＦ２の場合は最初のメチオニンの前にある重複したＯＲＦ領域中のアミノ酸残基も数に数えた。全３’ＵＴＲおよびポリ（Ａ）配列を欠くが、続くポリヘドリン３’ＵＴＲは含んでいる変異体はΔ３’と示されている。３’境界の増幅に用いたプライマー対＋６０９６および（ＣＣＴＡＡ）６は白い矢印で示されている。（Ｂ）野生型または変異ＳＡＲＴ１エレメントを含むＡｃＮＰＶの単独の感染（レーン１〜７）または２種の変異ＳＡＲＴ１−ＡｃＮＰＶの同時共感染（レーン８〜１４）を行ったＳｆ９細胞における３’境界ＰＣＲアッセイ。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した。分子量サイズマーカーを左端のレーンに泳動した。
図５は、共感染させたＳＡＲＴ１変異体Δ３’および２Ｃ１００７Ｇはトランスコンプリメンテーションによりレトロ転移することを示す図および写真である。（Ａ）トランスコンプリメンテーションの機構。Δ３’に由来するＯＲＦ蛋白質が２Ｃ１００７Ｇ  ＳＡＲＴ１  ＲＮＡに作用し、レトロ転移した２Ｃ１００７Ｇ  ＤＮＡを生じる。（Ｂ）他の可能性。ＯＲＦ２  Ｃ末端付近での２つの変異体間のＤＮＡ組み換えにより野生型ＳＡＲＴ１が生じ、レトロ転移できるようになる。（Ａ）および（Ｂ）において、Δ３’および２Ｃ１００７Ｇの模式的な構造が示されている。２Ｃ１００７Ｇはシステイン−ヒスチジンモチーフ（野生型およびΔ３’において垂直線で示す）を欠き、その代わりＯＲＦ２  Ｃ末端付近に付加的なＡｐａＩ部位を含むことに注意。３’境界のＰＣＲで用いられるプライマー＋５６１６および（ＣＣＴＡＡ）６を白い矢印で示した。ＰＣＲ産物の理論的なＡｐａＩ切断断片がプライマーの上に水平線として示されている。（Ｃ）非切断（レーン１〜３）またはＡｐａＩ切断（レーン４〜６）した３’境界ＰＣＲ産物。分子量サイズが右に示されている。
図６は、ＳＡＲＴ１／ＴＲＡＳ１キメラレトロトランスポゾンにおける標的部位改変を示す図および写真である。（Ａ）ＳＡＲＴ１、ＴＲＡＳ１、およびＡＰＥがＴＲＡＳ１  ＡＰＥに置換されたＳＡＲＴ１の模式的構造。ＳＡＲＴ１およびＴＲＡＳ１に由来する部分はそれぞれ灰色および黒で示されている。”ＲＨ”はＴＲＡＳ１  ＲＮａｓｅ  Ｈドメインを示す。白い矢印は、（ＣＣＴＡＡ）６または（ＴＴＡＧＧ）６を組み合わせて用いられる＋６２７６プライマー（ＳＡＲＴ１およびキメラエレメント用）およびＴＲＡＳ１＋６０２２プライマーを表す。ＡＰＥドメインのＮおよびＣ末端境界の導出アミノ酸配列を下に示す。”ＡＡＡＡ”および”ＤＬＥ”はプラスミド構築において用いたリンカーに由来する。ＡＰＥドメインの境界は以前の系統学的研究（Ｍａｌｉｋ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，６，７９３−８０５）に基づいている。（Ｂ）３つのレトロトランスポゾンの３’境界の方向特異的な増幅。ＰＣＲに用いた（ＣＣＴＡＡ）６および（ＴＴＡＧＧ）６プライマーはそれぞれ”ＣＣＴＡＡ”および”ＴＴＡＧＧ”と示されている。（Ｃ）パネル（Ｂ）の３’境界ＰＣＲ産物の塩基配列。ＳＡＲＴ１の３’境界の配列は図２Ｂに記載されていることに注意。クローンの数が右に示されている。
図７は、外来遺伝子を持つレトロ因子の作製を示す図である。ＳＡＲＴ１（ＯＲＦ１にＧＳＴ遺伝子を融合）のＯＲＦ２と３’ＵＴＲの間に、レトロ因子とは逆方向に外来遺伝子を挿入した。このレトロ因子をコードするプラスミドをＴ−ｓｐと名付けた。
図８は、外来遺伝子を持つレトロ因子の転移を示す写真である。Ｔ−ｓｐからバキュロウイルスを作製し、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ）のＢｍＮ細胞およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）のＳｆ９細胞に感染させた。ＰＣＲにより染色体に組み込まれたレトロ因子を検出したところ、いずれの細胞でも外来遺伝子を持つレトロ因子の組み込みが確認された。ＢｍＮ細胞では２４時間程度からわずかに転移し、９６時間で最大の効率となった。一方、Ｓｆ９細胞では７２時間で最大の導入効率が観察された。
図９は、ＳＡＲＴの３’ＵＴＲの上流にショウジョウバエｈｓｐプロモーター領域制御下に発現するＥＧＦＰ遺伝子を組み込んだベクター（ｈｓｐ  ｐＥＧＦＰ１−ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲ）の構築（Ａ）およびこのベクターからのトランス相補によるレトロ転移のアッセイ手順を示す図である。ｈｓｐ  ｐＥＧＦＰ１−ＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲをＳｆ９細胞にリポフェクション法によってトランスフェクションした後２４時間後に、３’ＵＴＲ欠損型のＳＡＲＴを組み込んだＡｃＮＰＶベクターを感染させ、感染から７２時間後にＤＮＡを抽出してテロメアへの転移がおこったか否かをＰＣＲ法によって確認した。
図１０は、ＳＡＲＴ１の３’ＵＴＲを様々に欠失させ、レトロ転移活性を調べた結果を示す図である。３’ＵＴＲの下の番号は塩基の位置を示す。ここで用いられた組み換えＳＡＲＴ１は３’ＵＴＲの５’端に隣接してＮｏｔＩ部位が挿入されており、天然のＳＡＲＴ１  ３’ＵＴＲとは塩基の位置が２ヌクレオチドずれていることに注意。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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