(57)【要約】ａ）基板表面に、多数のウエルが設けられている検出用基板、ｂ）この検出用基板、および、ウエルの封着手段を行う要素からなる検出用セット、ならびに、ｃ）検出用基板の各々のウエルに、液相反応の検出を行うための要素を注入し、ウエルの封着手段を用いて、この液相反応の検出を行うための要素を、ウエル内に封入し、各々のウエルにおける液相反応による検出を行う、ｂ）の検出用セットの使用方法を提供することにより、液相反応を、基板上で、現状のマイクロアレイ技術と同様に、集約的に行う手段を提供する。
2003031972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に、多数のウエルが設けられている、検出用基板。
【請求項２】
基板表面に、多数の貫通ウエルが設けられた薄膜が接着されてなる、請求項１記載の検出用基板。
【請求項３】
ウエルが、下記１，２の条件を満たす、請求項１または２記載の検出用基板。
１．ウエルの容積が、０．００１〜１μｌ
２．基板上のウエルの存在密度が、１〜４００００個／ｃｍ２
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの請求項記載の検出用基板、および、ウエルの封着手段を行う要素からなる、検出用セット。
【請求項５】
ウエルの封着手段を行う要素が、薄膜である、請求項４記載の検出用セット。
【請求項６】
ウエルの封着手段を行う要素が、無揮発性の液体である、請求項４記載の検出用セット。
【請求項７】
ウエルの封着手段を行う要素が、事後的に固化可能な素材である、請求項４記載の検出用セット。
【請求項８】
ウエルの封着手段を行う要素が、透明性を有する封着部分を提供可能な要素である、請求項４〜７のいずれかの請求項記載の検出用セット。
【請求項９】
検出用基板の各々のウエルに、液相反応の検出を行うための要素を注入し、ウエルの封着手段を用いて、この液相反応の検出を行うための要素を、ウエル内に封入し、各々のウエルにおける液相反応の検出を行う、請求項４〜８のいずれかの請求項記載の検出用セットの使用方法。
【請求項１０】
液相反応が、鋳型ヌクレオチド鎖に、下記１，２の特徴を有する、第１のヌクレオチド鎖（１）をハイブリダイズさせた後に、第２のヌクレオチド鎖（２）をハイブリダイズさせ、次いで、ヌクレオチド鎖の部分的三重鎖構造を、その３’側で、特異的に切断するヌクレアーゼを作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖の検出用部分を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖における一塩基の相違を検出する方法に基づく反応である、請求項９記載の検出用セットの使用方法。
１．第１のヌクレオチド鎖：鋳型ヌクレオチド鎖に対する相補的なヌクレオチド鎖で、その３’末端の塩基が、検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得るヌクレオチド鎖。
２．第２のヌクレオチド鎖：鋳型ヌクレオチド鎖に対して相補的な「相補的部分」が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチドに対して非相補的な「検出用部分」が、５’側にあり、「相補的部分」の最も５’側の塩基は、検出対象塩基に対して相補的な塩基となっている、複合的ヌクレオチド鎖。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、特定の遺伝子の検出等、生物学的な高感度検出手段に関する発明である。
背景技術
２０世紀における、医学・生物学分野における、最も輝かしい成果の一つとして、ヒト・ゲノム一次構造の解読が挙げられる。
このゲノム解析の成果は、多くの産業分野において活用され、飛躍的な発展がなされることが期待されている。
ヒト・ゲノムの中には、様々な多型マーカーとなるものが認められ、その中でも、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ＳＮＰｓ）が、最も多く存在し、多型マーカーの８０％以上であるともいわれている。現在、このＳＮＰｓを活用した、疾患関連遺伝子の探索や、これに続く新薬の開発、すなわち、ゲノム創薬に期待が高まっている。
また、個人のレベルで見れば、体質の把握等に、ＳＮＰｓの検出を応用することも期待され、いわゆる、オーダーメード医療への途が開かれようとしている。
現在、種々の遺伝子解析の効率化を目的とした、いわゆるマイクロアレイが提供されており、微小なチップ上で、非常に数多くのヌクレオチド鎖に対するハイブリダイズ反応等を行うことにより、特定の遺伝子の機能等が明らかにされつつある。このように、マイクロアレイを用いることにより、数多くの組み合わせが必要なハイブリダイズ反応を、効率良く行うことが可能となり、さらに、従来の方法に比べて、用いる試料の量を、格段に少量にすることができる。
現在用いられているマイクロアレイは、基板上に、多種のプローブやターゲットを固相配置したチップ上で、サンプル由来の均一な溶液を一度にかけて、ハイブリダイゼーションを行うもので、その均一な溶液中の異なる配列を一度で解析可能な、効率的な解析手段である。しかしながら、個別的な液相反応を、極少量のサンプルの使用で済ませて行うためには、現状のマイクロアレイ技術では困難である。
液相反応の検出は、数ｍｌ程度のボリュームまでは、ガラスチューブで、数μｌ程度のボリュームでは、プラスチックチューブや、プラスチックチューブの連結した形式のプレート（９６、３８４、１５３６穴プレート等）が用いられている。このように、液相反応の検出に関しては、ボリュームが数μｌ程度までのみであり、それよりも小さいボリューム（ｎｌレベル）では行われていない。その理由としては、従来から行われている液相反応の検出は、数本〜数十本程度を扱うことが多く、μｌ以下のボリュームで行う意義そのものが余り認められなかったことが挙げられるが、それ以外にも、例えば、１．蒸発による液相の濃度変化が大きくなり、至適条件下での反応を行うことが困難になること、２．正確な液量を取り扱うことが困難であること、３．プラスチックの多くは、それ自体が微弱な自家蛍光を有し、微量計測の場合には、これがバックグラウンドとなって、高感度検出が困難になってしまうこと、４．液量当りの容器との接触面積が大きくなり、溶液中の成分が容器に結合する場合の悪影響が顕著となること、５．各々のウエルにおける単位液量当りの接触面積が大きい故に、容器の微量成分の液相への溶出が、液相反応に悪影響を及ぼす可能性がある、等の技術的な理由が挙げられる。
しかしながら、上述したように、人間をはじめとして、多くの生物で、遺伝子を網羅的に解析する意義が生まれてきており、それに対応した、遺伝子にかかわる液相反応が提供されつつある。
そこで、本発明が解決すべき課題は、液相反応を、基板上で、現状のマイクロアレイ技術と同様に、集約的に行う手段を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、この課題の解決に向けて、鋭意検討を行った。その結果、基板の表面に、多数の微細なウエルを設け、各々の微細なウエルにおいて、液相反応の検出を、閉じられた環境を設けて行うことができれば、この課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ａ）基板表面に、多数のウエルが設けられている、検出用基板（以下、本検出用基板ともいう）、並びに、ｂ）本検出用基板、および、ウエルの封着手段を行う要素からなる、検出用セット（以下、本検出用セットともいう）を提供する発明である。また、本発明は、本検出用基板の各々のウエルに、液相反応の検出を行うための要素を注入し、ウエルの封着手段を用いて、この液相反応の検出を行うための要素を、ウエル内に封入し、各々のウエルにおける液相反応による検出を行う、本検出用セットの使用方法（以下、本使用方法ともいう）を提供する発明である。
本使用方法において行われる液相反応の検出の最も好適な態様の一つとして、いわゆる、インベーダー・アッセイ法〔Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）〕、すなわち、鋳型ヌクレオチド鎖に、下記１，２の特徴を有する、第１のヌクレオチド鎖（１）をハイブリダイズさせた後に、第２のヌクレオチド鎖（２）をハイブリダイズさせ、次いで、ヌクレオチド鎖の部分的三重鎖構造を、その３’側で、特異的に切断するヌクレアーゼを作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖の検出用部分を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖における一塩基の相違を検出する方法に基づく反応を挙げることができる。
１．第１のヌクレオチド鎖：鋳型ヌクレオチド鎖に対する相補的なヌクレオチド鎖で、その３’末端の塩基が、検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得るヌクレオチド鎖。
２．第２のヌクレオチド鎖：鋳型ヌクレオチド鎖に対して相補的な「相補的部分」が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチドに対して非相補的な「検出用部分」が、５’側にあり、「相補的部分」の最も５’側の塩基は、検出対象塩基に対して相補的な塩基となっている、複合的ヌクレオチド鎖。
なお、このインベーダー・アッセイ法において、ヌクレオチド鎖同士において「相補的」とは、ヌクレオチド鎖同士がハイブリダイズすることにより、二本鎖を形成し得ることを意味し、必ずしも、ヌクレオチド鎖双方が、１００％相補的塩基であることを意味するものではない。また、個別の塩基同士またはヌクレオチド鎖の特定の塩基に着目して「相補的」とは、対応する双方の塩基が、互いに相補的塩基であることを意味するものとする。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態を説明する。
第１図は、本検出用基板の一実施態様を表した図面である。本検出用基板１０は、原基板１１の表面（片面のみ）１１０上に、ウエル１２を、多数（少なくとも２個以上）設けることにより製造され得る。
ウエル１２の容積は、これらのウエルにおいて行う、液相反応の検出に必要な液相のボリュームに応じて自由に選択されるべきものであり、特に限定されるべきものではない。すなわち、ウエル１２は、液相反応の検出に必要な液相のボリュームよりも、適度に大きな容積であることが必要である。具体的には、この必要な液相のボリュームに対して、１００〜６８００％程度の容積であることが好適である。
本検出用基板１０は、本来、必要な液相のボリュームが、μｌ単位より小さいことが好適な、液相反応の検出を、各々のウエル１２において行うための基板であるから、ウエル１２の、各々の容積は、好適には１μｌ以下、さらに好適には、０．０１μｌ以下程度である。このウエル１２の容積の好適な最低値は、液相反応の測定感度と、ウエル１２を設ける技術に応じて規定されるべきものである。
また、本検出用基板１０における、ウエル１２の、基板単位面積当りの存在密度は、各々のウエル１２の大きさ、ウエル１２を設ける技術、液相反応の検出技術に応じて規定されるべきものであり、特に限定されるべきものではないが、概ね、好適には、１〜４００００個／ｃｍ２程度である。本検出用基板において行われる反応が、後述するインベーダー・アッセイ法である場合、特に好適には、１〜１００００個／ｃｍ２程度である。また、インベーダー・アッセイ法を、「低処理向け」〔検出対象となるＤＮＡの量が少ない場合や、検出目的となる一塩基多型（ＳＮＰ）の数が少ない場合、例えば、検出対象となる個人数が数百人で、検出目的となるＳＮＰが、数個程度である場合等〕として分類される態様で行う場合、極めて好適には、１〜４００個／ｃｍ２未満であり、「高処理向け」〔検出目的となる一塩基多型（ＳＮＰ）の数が多い（例えば、数万個以上）場合〕として分類される態様で行う場合、極めて好適には、４００〜１００００個／ｃｍ２程度である。また、本検出用基板において行われる反応が、低密度のマイクロアレイ法（例えば、発現量を調べるべき遺伝子が数百個程度）、または、低密度のインベーダー・アッセイ法以外の液相反応（免疫反応、ラジオイムノアッセイ法、ホモジーニアスアッセイ法等）（各々の液相反応において、検出対象の種類が数個の場合等）である場合、特に好適には、１〜４００個／ｃｍ２未満である。さらに、本検出用基板において行われる反応が、高密度のマイクロアレイ法（例えば、発現量を調べる遺伝子が数千〜数万個程度）、または、高密度の上記のインベーダー・アッセイ法以外の液相反応（各々の液相反応において、検出対象の種類が数千〜数万個の場合等）である場合、特に好適には、４００〜４００００個／ｃｍ２、極めて好適には、４００〜１００００個／ｃｍ２である。
また、ウエル１２の形状は、特に限定されず、例えば、半球面状、底が半球面状の円筒状、円筒状、すり鉢状、円錐状、角錐状、角柱状等が挙げられる。また、ウエル１２の開口部の大きさは、液相を容易に注入可能な大きさが保たれていることが好適である。具体的には、０．０１〜０．５ｎｍｍ程度（直径）が好適である。
本検出用基板１０の素材は、実用に耐えられる程度の剛性を有していれば特に限定されないが、特に、液相反応の検出手段が、蛍光を用いる検出手段である場合には、基板自体が自家蛍光を有さない素材であることが、計測時のバックグラウンドの発生を防御する上で好適である。よって、このような場合の本検出用基板１０の素材は、ガラス、セラミックス、金属、プラスチック等が挙げられる。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂の例を挙げると、まず、主鎖が殆ど炭素からなるポリマーとして、プロピレン系ポリマー（ポリプロピレン等）、４−メチルペンテン１系ポリマー等のオレフィン系ポリマー；ノルボルネン系ポリマー（エチレンノルボルネンコポリマー等）のシクロオレフィン系ポリマー；メチルメタクリレート系ポリマー、イソボルニルメタクリレートのコポリマー、ジシクロペンタニルメタクリル系コポリマー等のアクリル系ポリマー；非結晶のスチレン系ポリマー、シンジオタクチックスチレン系ポリマー、パラｔ−ブチルスチレン系ポリマー、アルファメチルスチレン−メチルメタクリレートコポリマー、ＡＢＳ樹脂等のスチレン系ポリマー；シクロヘキシルマレート系ポリマー、ジメチルイタコネート系ポリマー、硬化塩化ビニル樹脂、フッ素系ポリマー（ビニリデンフルオライド系ポリマー、テトラフルオロエチレン系ポリマー等）のその他のビニル系ポリマー等を挙げることができる。
また、熱可塑性樹脂のうち、主鎖の骨格にヘテロ原子を含むポリマーとして、ポリアセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリスルフォン、芳香族ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、ポリイミド樹脂、トリアセリルセルロース等が挙げられる。
さらに、熱硬化性樹脂の例としては、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂（特に、脂環族エポキシ樹脂）、三次元硬化型ポリウレタン、不飽和アクリル樹脂（エポキシアクリレート樹脂を含む）、メラミン樹脂、三次元化スチレン樹脂、三次元化シリコーン樹脂、アリル樹脂（ジアリルフタレート樹脂、ジエチレングリコールジアリルカーボネート樹脂等）等が挙げられる。
また、必要に応じて、ガラスやプラスチック製の本検出用基板１０において、シリコーン処理、脂肪酸処理等の表面処理を、常法に従い行うことができる。特に、シリコーン処理は、本検出用基板１０における、検出に用いる材料、試薬等の基板表面への吸着を防御するために好適である場合が多い。
シリコーン処理は、常法に従い行うことができる。例えば、ゾル・ゲル法等を応用することにより、コロイダルシリカ、その他のシリコーン原料を加水分解し、硬化触媒、溶剤、レベリング剤、必要に応じて紫外線吸収剤等を添加して調製されるシリコーンコート材を、常法、例えば、好適には、ディップ法や蒸着法、その他、スプレー法、ロールコート法、フローコート法、スピンコート法等により行うことができる。
また、本検出用基板１０に、着色を施して、例えば、検出に蛍光を用いる場合の自家蛍光を防御することや、隣接したウエル同士の蛍光発光による悪影響を防御することが可能である。かかる着色は、必要に応じて、彩度、色相、明度等を選択可能であるが、概ね、黒色であることが好ましく、この場合、炭素等の黒色顔料を基板材料に混合して着色を行うことができる。
本検出用基板１０の具体的な大きさと形状は、自由に規格可能であり、特に限定されないが、マイクロアレイとして汎用されている規格に基づいた設計であることが、現実の使用態様として好適である。すなわち、各種のマイクロアレイ解析機器や関連する分注機等が、かかる規格に合わせて設計されており、本検出用基板１０も、このような規格に合致させた大きさと形状に設計することが好適である。具体的には、日本国で、通常用いられているスライドガラスのサイズである、「縦２６ｍｍ×横７６ｍｍ×厚さ１ｍｍ」近傍の板状形状とすることが好適である。これと同様に、本検出用基板１０を用いる地域〔例えば、米国（縦１インチ×横３インチ程度）やヨーロッパ等〕のマイクロアレイの形状と大きさの規格に対応させて、本検出用基板１０の形状と大きさの設計を行うことが好適である。
本検出用基板１０の製造方法は、第１に、単一の基板上に、直接、ウエルを設ける方法、第２に、基板表面に、多数の貫通ウエルが設けられた薄膜を接着させる方法、に大別される。
第１の製造方法では、例えば、ウエル１２に対応する多数の貫通口を設けた、塩化ビニル等の素材の薄膜をマスクとして、加工前の基板の表面上に貼り、その上から、サンドブラスト法（微細粒子を高速で基板表面に衝突させることによって、基板表面にウエルを形成する方法）、微細な凹凸を設けた型を用いる型押し法や型抜き法、微細なドリルによる加工等の、微細なウエルの形成法により、表面上に、多数のウエル１２が設けられた、本検出用基板１０を製造することができる。
また、型押し法や型抜き法は、本検出用基板１０の素材がプラスチックである場合に好適である。
第２の製造方法では、例えば、ウエル１２として用いる多数の貫通口を設けた薄膜（ウエル１２に対応する厚みを有していることが必要であり、この厚みを確保するために、例えば、複数の薄膜を積層して用いることもできる）を、加工前の基板の表面上に接着させることにより、表面上に、多数のウエル１２が設けられた、本検出用基板１０を製造することができる。
この第２の製造方法において用いる薄膜の素材は、液相反応の検出手段が、蛍光を用いる検出手段である場合には、可能な限り自家蛍光を有さない素材であることが好適であり、例えば、低蛍光性のアクリル、ポリカーボネイト等であることが好適である。
また、第２の製造方法における、薄膜の加工前の基板における接着方法は、特に限定されず、公知の接着剤、例えば、反応型接着剤、紫外線硬化型接着剤、瞬間接着剤、ホットメルト接着剤等を用いることができる。これらの中でも、紫外線照射によって、所望するタイミングで瞬時に硬化を行うことができる、紫外線硬化型の接着剤を用いることが好適である。
このようにして、本検出用基板１０を製造することができる。
本検出用セットは、上述した本検出用基板、および、ウエルの封着手段を行う要素からなる、検出用セットである。
ウエルの封着は、ウエル中に注入した液相が、蒸発することによって、液相の内容物の濃度が変化するのを防御して、至適な反応と正確な検出を行うために必要な要素である。
ウエルの封着手段としては、薄膜の被覆、無揮発性の液体による被膜形成、事後的に固化可能な素材による被膜形成等が挙げられる。これらのウエルの封着手段を行うことによって、液相の内容が、何らかの反応を起こすことは好ましくない。よって、ウエルの封着手段は、液相に対して無反応性の手段であることが必要である。また、封着後の液相内の反応を、容易に検出するために、一般的には、封着によって、ウエルの内部に対する透明性が、封着部分において可能な限り維持されることが好適である（例えば、ウエル内に生ずる反射光を検出する場合もあり、封着部分以外は、必ずしも透明性を有する必要はない）。なお、かかる透明性は、最低限、ウエル中の液相反応（蛍光等）を、ウエルの外部の検出器が検出可能な程度の透過性を有していることを意味する定義であり、液相反応の種類やウエルの大きさ等に応じて選択することができる。
このような条件を満足する、ウエルの封着手段を行う要素のうち、例えば、薄膜としては、粘着剤付きのプラスチックソール等の薄膜を挙げることができる。また、無揮発性の液体としては、ミネラルオイル、シリコーンオイル等を挙げることができる。また、事後的に固化可能な素材としては、紫外線硬化樹脂等を挙げることができる。
このように、本検出用基板の各々のウエルに、液相反応の検出を行うための要素を注入し、上記のウエルの封着手段を用いて、この液相反応の検出を行うための要素を、ウエル内に封入し、各々のウエルにおける液相反応による検出を行うことができる（本使用方法）。
さらに、本検出用基板全体を、密封された空間に入れ（基板全体が丁度収まるチャンバーを含む）、水または水蒸気を発生する液体を同空間の基板近傍に配置して、空間内の湿度を飽和湿度近傍とすることにより、ウエル内の液相の蒸発を防いで、上記のウエルの封着手段を行った場合と同様の効果を上げることができる。
なお、この液相反応による検出には、ウエル内に液相が封入された状態における検出は勿論のこと、例えば、封着されたウエルに穴を空けて、ウエル内の液相を乾燥後に検出することも包含される。
本発明において行われる液相反応は、特に限定されず、例えば、酵素反応のような蛋白質の触媒反応、抗原抗体反応、蛋白質間の相互作用、物質間の特異的なアフィニティー（ヌクレオチド鎖同士のハイブリダイゼーションを含む）等が挙げられる。
液相反応の検出は、現在、マイクロアレイ技術で用いている手段を利用することにより行うことができる。具体的には、例えば、本検出方法により得られた液相反応後の基板を、高感度な蛍光スキャナーを用いることにより、各ウエルにおける蛍光を検出することができる。また、ラジオアイソトープによる検出、ＥＩＡ法による検出、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ〔ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（米国）製〕のようなホモジーニアスな検出等も行うことができる。
上述したように、本使用方法において行われる液相反応の最も好適な態様の一つとして、いわゆる、インベーダー・アッセイ法〔Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）〕が挙げられる。
第２図は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
第２図において、鋳型ヌクレオチド鎖（多型遺伝子）２１に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖２２をハイブリダイズさせる。
第１のヌクレオチド鎖２２は、鋳型ヌクレオチド鎖２１における、検出対象塩基〔本図では、Ｔ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖２１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖２２の３’末端の塩基は、検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ相補的塩基ではなくても、その塩基が、検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖２１と第１のヌクレオチド鎖２２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖２３をハイブリダイズさせる。
第２のヌクレオチド鎖２３は、鋳型ヌクレオチド鎖２１に対して相補的な「相補的部分」２３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」２３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」２３１の最も５’側の塩基は、検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖２１の検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖２２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」２３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ２４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖２３の検出用部分２３２’〔３’末端が、検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖２１が、多型遺伝子の一方の型であることを検出することができる。
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素２５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）２５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）２５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の一方の型の多型遺伝子の検出が可能である。
ヘアピン型プローブ２５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖２３の検出用部分２３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣合うさらに５’側の一塩基は、検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分２３２’が、ヘアピン型プローブ２５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分２３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ２５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ２４が作用して、ヘアピン型プローブ２５における、蛍光色素２５１と蛍光消光物質２５２の間が切断され、蛍光色素２５１が遊離し、蛍光消光物質２５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖２１が、上記の多型遺伝子の一方の型であることを検出することができる。
これに対して、鋳型ヌクレオチド２１の検出対象塩基が、一方の型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、他方の型〔Ｇ（グアニン）〕であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖２２と第２のヌクレオチド鎖２３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、さらに、ヘアピン型プローブ２５における蛍光色素２５１と蛍光消光物質２５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖２１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。
また、鋳型ヌクレオチド２１が、一方の型のＳＮＰと他方の型のＳＮＰを有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分２３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分を検出することにより、ＳＮＰｓ等を検出することも可能である。さらに、ここでは、ＳＮＰｓを有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三重鎖構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応であり、本発明のような微量液相反応を行う場合においては、最も好適な液相反応である。また、この方法は、オーダーメード医療の鍵となるＳＮＰｓを効率良く検出可能な方法として、非常に有用であり、このアッセイ法に、本発明を適用することにより、効率的・綱羅的に、ＳＮＰｓを検出することの、産業上における意義は、非常に大きい。
液相反応のうち、核酸や蛋白質等を、各々のウエルを形成する面に吸着させるべき液相反応を、本検出用基板において行うことも、本検出用基板では、基板面の単位面積当りの表面積が、多数のウエルが設けられている故に大きく、核酸や蛋白質の固定密度を高くすることが可能であり、好適である。この核酸や蛋白質の固定密度の向上は、本検出用基板におけるウエルを形成する面を、サンドブラストによる研磨加工や、フッ素酸処理等により粗くした場合に、一層顕著にすることができる。本検出用基板において、このような核酸や蛋白質の固定密度を向上させて、基板におけるこれらの物質の結合容量を増大させることにより、液相反応の検出時におけるダイレクトレンジを上昇させることが可能である。
現在用いられているマイクロアレイ等で核酸を固定する場合には、多数のピンに核酸溶液を浸してスライド上に打ちつける必要があるが（各種アレイヤーが市販されている）、この方法では、ピンのぶれにより、スポット位置がばらつくことが、しばしば認められる。このような場合、後でシグナルを蛍光スキャナー等で検出した後に、解析ソフトウエアで、特定シグナルの位置決め（グリッディング：「必ずデータが出るＤＮＡマイクロアレイ実験マニュアル」（羊土社）、第１０６頁等参照）に時間がかかり、非効率的であることや、データの精度に対する悪影響が懸念される場合もある。
本検出用基板では、各ウエルの位置が固定されており、上記グリッディング操作を、著しく効率的に行うことが可能であり、位置ずれがないので、データの精度を安定化することができる。
本検出用基板における、検出に用いる液相の分注操作は、例えば、米国Ｃａｒｔｅｓｉａｎ社のインクジェット式微量分注機ｓｙｎＱＵＡＤＴＭを用いて行うことができるが、この他、ナノリッターレベルの微量高精度分注機を用いることも可能である。これらは、分注位置を、縦横上下について、数マイクロメーターレベルでコントロールすることが可能である。また、本検出用基板において、上述したようなピンタイプのアレイヤーを用いる場合でも、ピン先のぶれが、基板上のウエルの範囲内でのぶれであれば、スポットは各ウエル内に収まり、問題なくグリッディングを行うことができる。
実施例
以下に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
なお、下記の実施例において、多型遺伝子を示す、Ａ１・Ａ２、Ｂ１・Ｂ２、Ｃ１・Ｃ２は、当該多型遺伝子の一方と他方の別を示すための記号として用いている。
試験例１
厚さが０．１μｍ程度のプラスチックシール（市販のポリカーボネイトシール、以下、同様である）に、パンチャーで、直径６ｍｍの穴を空け、スライドグラス（ガラス製）に貼り付けた。このようにして、スライドグラス上に設けた穴において、インベーダー・アッセイを行った。
すなわち、鋳型ヌクレオチド鎖（以下、ターゲット配列ともいう）として、薬剤代謝酵素ＣＹＰ４５０２Ｄ６〔Ａ１型とＡ２型の２種類、（  ）内は、検出対象塩基〕の一部をコードするヌクレオチド鎖（合成ＤＮＡ）：
2003031972.tif 000003
を用い、第１のヌクレオチド鎖（以下、インベーダーオリゴともいう、Ａ１型とＡ２型で共通の合成ＤＮＡ）として、
2003031972.tif 000004
を用い、第２のヌクレオチド鎖（以下、シグナルプローブともいう、Ａ１型とＡ２型の２種類）として、
2003031972.tif 000005
を用いた、インベーダーアッセイを、上記のスライドグラスの穴において行った。インベーダーアッセイに必要な、インベーダー試薬は、全て、ＴＷＴ社の調製済の試薬を用いた。
なお、シグナルプローブの検出用部分の検出には、上述したヘアピン型プローブ（ＦＲＥＴプローブ）を用いた。Ａ１型のターゲット配列においてのみ、部分的三重鎖切断酵素（クリベース）によって切り出される、シグナルプローブの検出用部分を検出するためのＦＲＥＴプローブの蛍光物質は、ＦＡＭ（緑色のシグナル）を用い、Ａ２型のターゲット配列に対応する、ＦＲＥＴプローブの蛍光物質は、ＲＥＤ（赤色のシグナル）を用いた。
インベーダーアッセイに用いる液相（以下、アッセイ溶液ともいう）は、ターゲット配列を２．３３ｆＭ、インベーダーオリゴ０．０７μＭ、シグナルプローブ０．７μＭおよびインベーダー試薬（クリベース６．７ｎｇ／μｌ，ＭｇＣｌ２  ７．３ｍＭ，ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ）を含んでおり、このアッセイ溶液０．１５μｌを、上記のスライドグラスに設けた穴にスポットした。
スポット後、速やかに、穴の空いていない、上記のプラスチックシールを、スライドグラスに設けた穴の上面に封着後、マイクロアレイ用の反応容器（ＢＭ機器製「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ」）を、６３℃で６時間反応させて、マイクロアレイ用の蛍光レーザースキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００：米国Ｐａｃｋａｒｄ社製）で解析した。なお、蛍光物質に対する励起光は、ＦＡＭが４８８ｎｍで、ＲＥＤが５９４ｎｍであり、蛍光フィルターは、ＦＡＭが５２２ｎｍで、ＲＥＤが６１４ｎｍを用いた。
その解析像を、第３図に示す。第３図において、ＴＣＷは、Ａ１型のターゲット配列を用いた系のスポットであり、ＦＡＭのシグナルである緑色の発色〔選択されたシグナルを、わかりやすく表現するために用いられる、コンピュータソフト（ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ：米国Ｐａｋｃａｒｄ社製）によって着色される擬似発色である。よって、どのような発色で表されるかは、選択されたシグナルの種類ではなく、コンピュータソフトにおいて定められた設定の中から自由に選択可能であり、同一のシグナルであっても異なる発色として表される場合がある。以下、本実施例の欄において同様である。）が認められた。また、ＴＣＭは、Ａ２型のターゲット配列を用いた系のスポットであり、ＲＥＤのシグナルである赤色の発色が認められた。さらに、ＮＴＢは、ターゲット配列を添加しない対照系であり、バックグラウンドの蛍光のみが認められた。
このように、スライドグラス上に、薄膜により設けたウエルにおいて、液相反応を、ウエルの封着手段を行う要素である透明な薄膜を用いてウエル内に封入した状態で行うことにより、液相反応であるインベーダーアッセイの反応が正常に進行し、所望するインベーダーアッセイ法における蛍光反応をポジティブに検出することができた。すなわち、本検出用プレートのウエルに準じた環境において、ターゲット配列に対して、インベーダーオリゴとシグナルプローブが、正確に効率良くハイブリダイズ（核酸同士のハイブリダイズ反応が正常に進行すること）し、クリベースが、正確で効率良く、部分的三重鎖の３’側を切断したこと（酵素反応が正常に進行すること）が示された。このことは、本検出用セットを用いて、液相反応による種々の検出を、微量反応系において懸念される溶液の蒸発等による悪影響を排除した形態で行い得ることを示している。
試験例２
本試験では、合成ＤＮＡではなく、さらに多様性に富むヒトゲノムＤＮＡを、ターゲット配列として、本検出用セットにおいて、インベーダーアッセイ法を行った。
上記のプラスチックシールを４枚重ねとして積層して、各々のフィルム同士を接着して、厚手のプラスチックシールとして、パンチャーを用いて、直径４ｍｍの貫通穴を、５ｍｍ程度の間隔をおいて複数個設けた。この貫通穴付きフィルムを、試験例１で用いたのと同じスライドグラスの上に、試験例１と同様にして貼り付けて、基板表面に、複数のウエルが設けられている、本検出用基板を作出した。
インベーダー溶液は、ターゲット配列を、ヒトゲノムＤＮＡとした以外は、試験例１と同様の構成で調製して、下記のような試験系で、試験例１と同じ要領で、インベーダーアッセイを行った（インベーダー溶液のスポット量は、１つのウエル当り、０．１５μｌ程度である）。このヒトゲノムＤＮＡにおけるインベーダーアッセイの結果を、第４図に示す。
第４図は、ヒトゲノムＤＮＡをターゲット配列として用いたインベーダー・アッセイ系を示している。１行目と２行目のゲノムＤＮＡ量が、１スポット当り、約１．５ｎｇ（０．３７ｚｍｏｌ）で、それぞれ異なる人のゲノムＤＮＡを使用した（Ａ列が、Ａ１型ホモの薬剤代謝酵素ＣＹＰ４５０２Ｄ６遺伝子を有するヒトゲノムＤＮＡ；Ｂ列が、ヘテロの上記薬剤代謝酵素遺伝子を有するヒトゲノムＤＮＡ；Ｃ列が、Ａ２型ホモの上記薬剤代謝酵素遺伝子を有するヒトゲノムＤＮＡである）。３行目のスポットは、１行目と同じ構成のヒトゲノムＤＮＡを、ターゲット配列として用いているが、ゲノムＤＮＡの添加量が、それぞれ異なっている（３−Ａ：１０ｎｇ、３−Ｂ：９．５ｎｇ、３−Ｃ：１４．７ｎｇ）。４行目は、対照群であり、４−Ａは、試験例１で用いたＡ１型のターゲット配列（０．３５ｚｍｏｌ）、４−Ｂは、同じくＡ２型のターゲット配列（０．３５ｚｍｏｌ）を用いたスポットであり、４−Ｃは、ターゲット配列を用いていないスポットである。
第４図（１）は、ＲＥＤの蛍光発色のみを行った結果を示したものである。Ａ２型ホモ群であるＣ列（１〜３行目）とＡ１型とＡ２型のヘテロ接合体群（以下、特に断わらない限り、ヘテロ群という）であるＢ列（１〜３行目）は、赤色に蛍光発色しているが、Ａ１型ホモ群であるＡ列（１〜３行目）は、発色がほとんど認められなかった。
また、第４図（２）は、ＦＡＭの蛍光発色のみを行った結果を示したものである。Ａ１型ホモ群であるＡ列（１〜３行目）とヘテロ群であるＢ列（１〜３行目）は、緑色に蛍光発色しているが、Ａ２型ホモ群であるＣ列（１〜３行目）は、発色がほとんど認められなかった。
さらに、第４図（３）は、ＲＥＤとＦＡＭの蛍光発色を、双方行った結果を示したものである。Ａ１型ホモ群であるＡ列（１〜３行目）は、ＦＡＭの蛍光発色による緑色が顕著に認められ、Ａ２型ホモ群であるＣ列（１〜３行目）は、ＲＥＤの蛍光発色による赤色が顕著に認められた。これに加えて、ヘテロ群であるＢ列（１〜３行目）では、ＦＡＭとＲＥＤの双方の発色に基づく、黄色〜橙色の蛍光発色が認められた。第４図（１）（２）では、ホモとヘテロを区別することが困難であるが、この（３）においては、ホモとヘテロを明確に区別することができた。
試験例３
本試験では、ウエルをさらに集約的にスライドグラスにおいて設けて、ヒトゲノムＤＮＡを、ターゲット配列として、本検出用セットにおける、インベーダーアッセイ法を行った。
横７６ｍｍ×縦２６ｍｍ×厚さ１ｍｍのスライドグラス（ガラス製）において、上述したサンドブラスト法で、ウエルをさらに集約的に、このスライドグラス上に設けけた。すなわち、口径が０．５ｍｍで、容量が０．１μｌ程度のウエルを、ウエルの中心同士の間隔を０．７ｍｍとして、３２列・１００行で、総計３２００個、１スライド上に設け、これに蒸着法により、ごく薄いシリコーンコーティングを行って、本検出基板を作出した。
インベーダー溶液は、ターゲット配列を、ヒトゲノムＤＮＡ〔コレステロールエステル転送蛋白（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＥＴＰ）〕遺伝子として、ヒトゲノムＤＮＡの中に含まれるターゲット配列と、インベーダーオリゴとシグナルプローブを以下の配列として調製した。
ターゲット配列（ヒトゲノムＤＮＡの中に含まれる）
2003031972.tif 000006
インベーダーオリゴ（合成ＤＮＡ）
2003031972.tif 000007
シグナルプローブ（合成ＤＮＡ）
2003031972.tif 000008
なお、シグナルプローブの検出用部分の検出には、上述したヘアピン型プローブ（ＦＲＥＴプローブ）を用いた。Ｂ１型のターゲット配列においてのみ、部分的三重鎖切断酵素（クリベース）によって切り出される、シグナルプローブの検出用部分を検出するためのＦＲＥＴプローブの蛍光物質は、ＦＡＭ（赤色のシグナル）を用い、Ｂ２型のターゲット配列に対応する、ＦＲＥＴプローブの蛍光物質は、ＲＥＤ（緑色のシグナル）を用いた。
まず、ターゲット配列としてのヒトゲノムＤＮＡをウエルにスポットし（ウエル各々について、Ｂ１型ホモ  約２．０ｎｇ、または、ヘテロ  約１．３６ｎｇ、または、Ｂ２型ホモ  約１．０ｎｇを、実験計画に従って配置した）、９５℃で５分間の熱変性を行った。次いで、熱変性したヒトゲノムＤＮＡがスポットされているウエルに、さらに、アッセイ溶液〔インベーダーオリゴ０．０７μＭ、シグナルプローブ０．７μＭおよびインベーダー試薬（クリベース６．７ｎｇ／μｌ，ＭｇＣｌ２  ７．３ｍＭ，ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ）を含んでいる〕を、約０．１μｌを、各々のウエルにスポットした。
スポット後、速やかに、穴の空いていない、試験例１で用いたのと同じ素材のプラスチックシールを、スライドグラスのウエルが設けられた面の上面に封着後、マイクロアレイ用の反応容器（ＢＭ機器製「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ」）を、６３℃で６時間反応させて、マイクロアレイ用の蛍光レーザースキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００／米国Ｐａｃｋａｒｄ社製）で解析した。なお、蛍光物質に対する励起光は、ＦＡＭが４８８ｎｍで、ＲＥＤが５９４ｎｍであり、蛍光フィルターは、ＦＡＭが５２２ｎｍで、ＲＥＤが６１４ｎｍを用いた。
なお、ヒトゲノムＤＮＡやアッセイ溶液のスポットは、微細ピペットチップを用いて行った。
このヒトゲノムＤＮＡにおけるインベーダー・アッセイの結果（ウエルにおける蛍光物質の発色状態）を、第５図に示す。
第５図における、左側のＷｉｌｄで示されている４スポットの着色群は、ターゲット配列として、ＣＥＴＰ  Ｂ１型ホモのヒトゲノムＤＮＡを用いた群である。いずれのスポットも、赤色のＦＡＭの発色が明らかであり、本試験系においてＣＥＴＰ  Ｂ１型ホモのヒトゲノムＤＮＡが検出され得ることを示している。
また、右側のＭｕｔａｎｔで示されている４スポットの着色群は、ターゲット配列として、ＣＥＴＰ  Ｂ２型ホモのヒトゲノムＤＮＡを用いた群である。いずれのスポットも、緑色のＲＥＤの発色が明らかであり、本試験系においてＣＥＴＰ  Ｂ２型のヒトゲノムＤＮＡが検出され得ることを示している。
また、中央のＨｅｔｅｒｏで示されている４スポットの着色群は、ターゲット配列として、ＣＥＴＰヘテロ接合体のヒトゲノムＤＮＡを用いた群である。いずれのスポットも、ＦＡＭの発色を示す赤色と、ＲＥＤの発色を示す緑色の中間色に該当する橙色の発色が明らかであり、本試験系においては、ＣＥＴＰヘテロ型であっても、これを検出可能であることが示されている。
なお、この試験例３において、アッセイ溶液のスポット後、プラスチックシートを、基板上に封着する代わりに、マイクロアレイ用の反応容器（ＢＭ機器製「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ」）内に封入する水の量を４０μｌとして、同様に６３℃で６時間の反応を行ったところ、上記と同様に、ヒトゲノムＤＮＡにおいて、ＣＥＴＰ遺伝子の、Ｂ１型ホモ、Ｂ２型ホモ、ヘテロの別を検出することができた。これに対して、プラスチックフィルムの封着をせずに、通常通り（上記のプラスチックフィルムを封着した例においても同様）、水５μｌを封入したところ、各ウエルの液相が蒸発してしまい、上記のような検出をすることができなかった。
上述した試験例２・３の知見から、例えば、数多く設けた本検出用基板のウエルに、ヒトゲノムＤＮＡを、微量ずつスポットして、これに、様々な検出対象塩基の検出がデザインされた、インベーダー・アッセイ法による検出を行うことにより、網羅的にＤＮＡ検体提供者のＳＮＰｓを検出することが可能であることがわかる。
試験例４
本試験では、ウエルを、一層集約的に、カーボンを含有させたポリカーボネート製のチップにおいて設けて、ヒトゲノムＤＮＡを、ターゲット配列として、本検出用セットにおける、インベーダーアッセイを行った。
横７６ｍｍ×縦２７ｍｍ×厚さ１．６ｍｍのチップ（１％カーボン含有ポリカーボネート製）において、射出成形により、ウエルをさらに集約的に、このチップ上に設けた。すなわち、表面の開口部が一辺０．４５ｍｍの正方形で、深さが０．６５ｍｍ、底面が一辺０．０５ｍｍの正方形の、テーパーが設けられた四角柱状の、容量が４９．３ｎｌのウエルが、１チップ当たり５０４０（１２０×４２）個設けられた、上記チップを、本検出基板として作製した。
インベーダー溶液は、ターゲット配列を、ヒトゲノムＤＮＡ〔ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ  Ａ  ＤＮＡ〕遺伝子として、ヒトゲノムＤＮＡの中に含まれるターゲット配列と、インベーダーオリゴとシグナルプローブを以下の配列として調製した。
ターゲット配列（ヒトゲノムＤＮＡの中に含まれる）
2003031972.tif 000009
インベーダーオリゴ（合成ＤＮＡ）
2003031972.tif 000010
シグナルプローブ（合成ＤＮＡ）
2003031972.tif 000011
上記のチップの各々のウエルへの試薬と試料の分注は、米国Ｃａｒｔｅｓｉａｎ社のＰＳ４５００システムを用いて行った。すなわち、当該システムを用いて、１ウエル当たり、
計４５ｎｌを分注した。
各ウエル当たりのＤＮＡ量は、以下の通りである。
１）（第６図の第１列のウエルに分注）
Ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  ＦＡＭ（Ｃ１型）：０．０４５ｚｍｏｌ／ｗｅｌｌ
２）（第６図の第２列のウエルに分注）
Ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  ＦＡＭ（Ｃ２型）：０．０４５ｚｍｏｌ／ｗｅｌｌ
３）（第６図の第３列のウエルに分注）
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｇ１）＜ｈｏｍｏ  ｆｏｒ  ＲＥＤ＞：０．９ｎｇ／ｗｅｌｌ
４）（第６図の第４列のウエルに分注）
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｇ１）＜ｈｅｔｅｒｏ  ｆｏｒ＞：０．９ｎｇ／ｗｅｌｌ
５）（第６図の第５列のウエルに分注）
Ｎｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｌａｎｋ（Ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ）：０．５ｎｇ／ｗｅｌｌ
また、インベーダー試薬中の酵素は、米国ＴＷＴ社のＣｌｅａｖａｓｅ  ＸＩを、０．３３ｎｇ／ｗｅｌｌで使用し、反応液中の、他の成分は、
１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、０．０７μＭ  インベーダーオリゴ、０．７μＭ  シグナルプローブ（Ｃ１型）、０．７μＭ  シグナルプローブ（Ｃ２型）、０．３７μＭ  Ｃｙ５である。
第６図に示す各ウエルには、上記１）−５）のＤＮＡを、列ごとに区別して加えて風乾させた後、各ウエルにインベーダー試薬を分注した。なお、上記のＤＮＡのうち、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡは、熱変性済みのものを用いた。また、インベーダー試薬の分注時には、乾燥を避けるために、湿度を１００％に設定した。
インベーダー試薬の分注後には、ウエル表面に、プラスチックフィルム（アプライドバイオシステム社のＯｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｃｏｖｅｒｓ等の市販品を用いることができる）を貼り、乾燥を防ぎつつ、６３℃で３時間反応を行った。
反応後の、用いた各蛍光色素に対する読みとり条件は、
ａ）ＦＡＭ：レーザー波長４８８ｎｍ、蛍光用フィルター５２２ｎｍ
ｂ）ＲＥＤ：レーザー波長５４３ｎｍ、蛍光用フィルター５９２ｎｍ
ｃ）Ｃｙ５：レーザー波長６３３ｎｍ、蛍光用フィルター６７０ｎｍ
各蛍光シグナルを読みとり後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ付属のソフトウエア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」で、ＦＡＭのシグナルを緑に、ＲＥＤのシグナルを赤に着色して画像化を行った（第６図）。
第６図において、ＦＡＭ用のコントロールが緑として（第１列）、ＲＥＤ用のコントロールが赤として（第２列）、正しく認識され得ることがわかる。ゲノムＤＮＡについては、ＲＥＤに対するホモ接合性のＤＮＡ（Ｇ１）については、赤に呈色されており（第３列）、ヘテロ接合性のＤＮＡ（Ｇ２）については、緑と赤の中間色として、黄色に呈色されていた（第４列）。
このように、事前のＤＮＡ試料の内容に則り、予想される呈色が、上記本検出基板において、インベーダー・アッセイを行うことにより、認められた。
第７図は、第６図で得られた画像を数直化して、グラフ化を行った図面である。第７図において、横軸はＦＡＭの蛍光強度、縦軸はＲＥＤの蛍光強度を示している。これらの蛍光強度は、分注量の補正のため、ＦＡＭ、ＲＥＤのそれぞれについて、Ｃｙ５シグナルの強度で除したものである。この第７図においては、１）ＦＡＭ用のコントロール、２）ＲＥＤ用のコントロールとゲノムＤＮＡ、３）ヘテロのゲノムＤＮＡ、４）ネガティブコントロールが、それぞれ、明瞭にグループ化され、遺伝子型の判定を行うことが可能であることが示された。
このように、本検出用基板とインベーダー・アッセイ法を組み合わせることによって、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を行わないにもかかわらず、ヒトゲノムＤＮＡを、１ｎｇ以下のオーダーにおいても、遺伝子多型解析を安定して行うことが可能であり、かつ、効率的な処理が可能であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、液相反応を、基板上で、現状のマイクロアレイ技術と同様に、集約的に行う手段が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本検出用基板についての概略を示した図面である。
第２図は、インベーダー・アッセイ法の概略を示した図面である。
第３図は、インベーダー・アッセイ法を液相反応として用いた、本発明についての予備試験の結果を示した写真である。
第４図は、インベーダー・アッセイ法を液相反応として用いた、本発明に係わる第１の試験の結果を示した写真の一つである。
第５図は、インベーダー・アッセイ法を液相反応として用いた、本発明に係わる第２の試験の結果を示した写真である。
第６図は、インベーダー・アッセイ法を液相反応として用いた、本発明に係わる第３の試験の結果を示した写真である。
第７図は、インベーダー・アッセイ法を液相反応として用いた、本発明に係わる第３の試験の結果を、解析した結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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