(57)【要約】本発明は、ＶＬＡ４アンタゴニストを用いてフィブロネクチン−ＶＬＡ４間相互作用を阻害することにより白血病細胞の細胞接着依存性抗癌剤耐性の獲得を抑制することを含む急性白血病の治療用医薬組成物、それを用いた急性白血病の治療および／または予防方法を提供する。さらに、急性白血病細胞におけるＶＬＡ４発現率に基づく急性白血病の診断方法も提供する。
2003097097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性白血病患者に投与することにより該疾患を治療し得る、ＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項２】
急性白血病患者に他の抗癌剤投与と併用して投与することにより該疾患を治療し得る、ＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項３】
抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、請求項２記載のＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項４】
抗ＶＬＡ４抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載のＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項５】
抗ＶＬＡ４抗体が抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体である、請求項４記載のＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項６】
抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体がマウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生されるものである、請求項５記載のＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項７】
ＶＬＡ４アンタゴニストが抗ＶＬＡ４ヒト化抗体である、請求項４記載のＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項８】
抗ＶＬＡ４ヒト化抗体が、マウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生される抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体に由来する可変部の少なくとも一部を含み、該抗体の抗原結合性を維持しているものである、請求項７記載のＶＬＡ４アンタゴニスト。
【請求項９】
請求項１記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１０】
請求項２記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１１】
請求項３記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１２】
請求項４記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１３】
請求項５記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１４】
請求項６記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１５】
請求項７記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１６】
請求項８記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物。
【請求項１７】
１種以上の他の抗癌剤をさらに含有する、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
１種以上の他の抗癌剤と併用して投与するための、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１９記載の医薬組成物と１種以上の他の抗癌剤とを含む、急性白血病治療用キット。
【請求項２２】
抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、請求２１記載の急性白血病治療用キット。
【請求項２３】
ＶＬＡ４とフィブロネクチンとの間の相互作用を抑制するための手段を含む、急性白血病の治療方法。
【請求項２４】
他の１種以上の抗癌剤を併用して投与することをさらに含む、請求項２３記載の治療方法。
【請求項２５】
抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、請求項２４記載の治療方法。
【請求項２６】
上記手段がＶＬＡ４アンタゴニストを投与することを含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項２７】
ＶＬＡ４アンタゴニストが抗ＶＬＡ４抗体である、請求項２６記載の治療方法。
【請求項２８】
抗ＶＬＡ４抗体が抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体である、請求項２７記載の治療方法。
【請求項２９】
抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体がマウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生されるものである、請求項２８載の治療方法。
【請求項３０】
抗ＶＬＡ４抗体が抗ＶＬＡ４ヒト化抗体である、請求項２７記載の治療方法。
【請求項３１】
抗ＶＬＡ４ヒト化抗体が、マウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生される抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体に由来する可変部の少なくとも一部を含み、該抗体の抗原結合性を維持しているものである、請求項３０記載の治療方法。
【請求項３２】
急性白血病患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率を測定することにより、該患者の化学療法に対する応答性および該患者の予後を診断するための、抗ＶＬＡ４抗体。
【請求項３３】
抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体である、請求項３２記載の抗体。
【請求項３４】
マウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生されるものである、請求項３３記載の抗体。
【請求項３５】
急性白血病患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率を測定することを包含する、該患者の化学療法に対する応答性および該患者の予後を診断する方法。
【請求項３６】
上記ＶＬＡ４の発現率の測定が、免疫化学的手法により実施されるものである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の抗体を用いる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
上記ＶＬＡ４の発現率の測定が、α４インテグリンｍＲＮＡレベルを検出することにより実施されるものである、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
急性白血病患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率を測定することにより、該患者の化学療法に対する応答性および該患者の予後を診断するための、抗ＶＬＡ４抗体を含む診断用キット。
【請求項４０】
抗ＶＬＡ４抗体が請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の抗体である、請求項３９記載の診断用キット。
【請求項４１】
急性白血病患者の治療および／または予防薬として有用な化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物の存在下または非存在下でフィブロネクチンまたはその誘導体とＶＬＡ４またはその誘導体とを接触させて、それらの相互作用を検出し、フィブロネクチンとＶＬＡ４との相互作用を阻害する試験化合物を特定することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＶＬＡ４アンタゴニスト、特に抗ＶＬＡ４抗体を含有する急性白血病の治療用医薬組成物、それを用いた急性白血病の治療および／または予防方法、ならびに急性白血病細胞におけるＶＬＡ４発現率に基づく急性白血病の予後の診断方法に関する。
背景技術
成人の急性白血病（急性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病の両方を含む）は、化学療法に対する感受性が高く、７０〜８０％の患者が完全寛解（ＣＲ）を得る［１，２］。しかし完全寛解後に再発することが多く、再発後は化学療法に耐性（多剤耐性）となり死亡に至るため、長期無病生存率は２０〜３０％程度である［１−４］。即ち、急性白血病の治癒率を向上させるためには、再発を防止するストラテジーが必要であるが、未だ具体的な再発防止方法は見い出されていない。この再発防止法を見い出すためには、再発機序の解明が不可欠である。最近、通常の化学療法でＣＲを獲得した小児の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者における、再発率の上昇と長期無再発生存率の低下の危険因子として、骨髄の微少残存病変（ＭＲＤ）が重要であることが報告された［５，６］。このことは、急性白血病細胞が骨髄の造血微少環境にあって、化学療法による影響から逃れるための何らかの機序が存在することを伺わせる。
種々の細胞株を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で、多種に渡る正常上皮細胞が、細胞外マトリックスに接着することにより、その増殖や生存が促進されることが報告されている［７，８］。逆に言うと、これらの足場依存性の細胞は、細胞外マトリックスから解離するとアポトーシスに陥るということを示している。幾つかの悪性腫瘍細胞株においても、上記と同様の現象が確認されている［９，１０］。このことから、急性白血病細胞においても、何らかの細胞接着がその細胞増殖および／または細胞の生存に影響を与えている可能性が考えられ、該細胞−細胞外マトリックス間相互作用により、急性白血病細胞化学療法による影響から逃れるための機序が提供されている可能性がある。
事実、最近Ｍｕｄｒｙら［１１］は、Ｂ−ＡＬＬ細胞株であるＪＭ−１とＲＳ４を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で、上記の機序について検討して報告した。即ち、彼らは、ＡＬＬ細胞が、その細胞表面に発現しているα４β１インテグリン（ＶＬＡ４；Ｖｅｒｙ  Ｌａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ４；遅延型抗原４）を介して、骨髄ストローマ細胞に発現しているＶＣＡＭ１（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１；血管細胞接着分子）と接着することにより、シトシンアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）とエトポシド（ＶＰ−１６）によるアポトーシスから回避するということを見い出した。
しかし、本来ＶＬＡ４はＡＬＬ細胞だけではなく、未熟リンパ球から成熟リンパ球まで、広く正常のリンパ球系細胞に発現していることが知られており［１２］、ＶＬＡ４を介したＶＣＡＭ１への接着による抗癌剤への感受性低下は、Ｂ−ＡＬＬ細胞に特有の現象ではなく、正常リンパ球においても同様の機序が働いている可能性がある。更に、Ｂ−ＡＬＬにおいては、このＶＬＡ４−ＶＣＡＭ１間相互作用が再発や予後に関与するか否かについては、全く検討されていない。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関しても、上記と同様の細胞接着を介した抗癌剤耐性に関する報告が既になされている。即ち、Ｓｍａｄｊａ−Ｊｏｆｆｅらは、ＡＭＬ細胞のＣＤ４４−６ｖが高発現であった患者群とＣＤ４４−６ｖ陰性あるいは低発現の患者群とで、長期生存率および長期無病生存を比べた結果、ＣＤ４４−６ｖ陰性あるいは低発現の患者群では、長期生存率が４８％および長期無病生存率が３８％であり、ＣＤ４４−６ｖが高発現であった患者群より有意に高いと報告した［１３］。彼らは、その機序を解明する目的で、急性前骨髄球性（ＡＰＬ）細胞株であるＨＬ６０とＮＢ４を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検討を行った［１４］。その報告によると、彼らは急性白血病細胞のＣＤ４４をモノクローナル抗体で刺激することで、ＡＰＬ細胞がダウノルビシン（ＤＮＲ）、ミトキサントロンおよびＶＰ−１６等の抗癌剤によるアポトーシスから回避し得ることを見い出した。以上の結果から、彼らは、ＡＰＬ細胞は、骨髄ストローマ細胞表面に発現している細胞外マトリックスであるヒアルロン酸とＣＤ４４分子との結合を介して接着することにより、抗癌剤耐性を獲得することを推測した。
しかし、彼らはＣＤ４４に対する刺激抗体を用いているので、必ずしもリガンドとの結合効果を実際に調べていることにはならず、ヒアルロン酸とＣＤ４４分子との結合による該細胞の細胞外マトリックスへの接着が、抗癌剤耐性の獲得に関与しているということを実証していない。
更に、彼らが実験に用いた細胞はＡＰＬ細胞株のみである。即ち、このＣＤ４４刺激による抗癌剤耐性獲得の機序が、ＡＭＬに普遍的であるか否かについては、未だ不明である。
また、Ｂｅｎｄａｌｌら［１５］は、患者由来の新鮮ＡＭＬ細胞は、ＶＬＡ５を介してフィブロネクチン（ＦＮ）と接着することにより、生存し易くなる事を報告している。しかし、彼らは、この研究においてＡＭＬ細胞の生存に対する幹細胞性因子の影響を検討する目的で、無血清の条件下で培養を行ない、かつ可溶性ＦＮを用いている。この条件は、ｉｎ  ｖｉｖｏの環境を正確に反映するものとは言えず、血清存在下で固相化ＦＮを用いた、よりｉｎ  ｖｉｖｏの環境を反映する環境下での検討を行っていない。さらに、彼らは抗癌剤によって誘発されるアポトーシスへのＶＬＡ５の影響については、全く検討を加えていない。即ち、彼らの実験系でＶＬＡ５−ＦＮ間相互作用が、ＡＭＬ細胞の抗癌剤感受性の低下をもたらすか否かについては不明である。
悪性腫瘍細胞株が細胞接着により抗癌剤耐性を獲得するということは急性白血病以外の悪性腫瘍細胞株においては諸家により既に幾つか報告がある。例えば、Ｄａｍｉａｎｏら［１７］は、多発性骨髄腫由来の細胞株においては、細胞がＦＮと接着することにより、抗癌剤によるアポトーシスから回避し易くなることを報告している。彼らの考察では、抗癌剤によるアポトーシスを回避し易い形質を持つ細胞ではＦＮとの接着にはＶＬＡ４が関与しているとされている。彼らはヒトミエローマ細胞株Ｓ２２６／Ｓから抗癌剤の存在下で生存し得る株を選択的にクローン化するという人為的に設定された人工的な環境下での選択により得られたクローンについての細胞のＶＬＡ４分子の発現量と抗癌剤によるアポトーシスを回避する効果との相関を述べている。しかし、彼らが比較検討に用いた細胞の表面にはＶＬＡ５も発現しており、上記アポトーシスの回避には、ＶＬＡ４のみが必要とされるのかという点について明示されいない。さらに、ＶＬＡ４分子を介した細胞接着が実際に上記アポトーシスの回避効果に関与している直接的な証拠は示していない。
また、Ｓｅｈｔｉらは、小細胞肺癌の細胞株を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系で、該細胞株が、癌細胞に発現している細胞接着因子受容体インテグリンヘテロダイマーである、α２β１（ＶＬＡ２）、α３β１（ＶＬＡ３）およびα６β１（ＶＬＡ６）などのβ１−インテグリン分子と、癌周囲組織に発現しているＦＮ、ラミニンまたはＩＶ型コラーゲンとの接着により抗癌剤耐性を獲得し得ることを見い出している［１６］。しかし、彼らは患者由来の新鮮癌細胞を用いた検討は全く行っていない。また、小細胞肺癌においては、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用は、抗癌剤感受性には影響を与えないとしている。
つまり、腫瘍細胞の種類によって、細胞接着に起因する抗癌剤耐性に関与する細胞接着因子と細胞外マトリックス分子との組み合わせは多様であり、そのいずれが抗癌剤耐性に関与しているかということは、実際に対象とする種類の腫瘍細胞を用いて実験的に実証せざるを得ない。
さらに、樹立細胞株の培養系は、体内に存在する悪性腫瘍細胞の形質を必ずしも正確に反映するとは限らないため、患者由来の新鮮な悪性腫瘍細胞を用いて検討することが必要である。しかしながら、上述のＤａｍｉａｎｏら［１７］の報告およびＳｅｈｔｉら［１６］の報告のいずれも、患者由来の新鮮腫瘍細胞を用いた実験は行っておらず、これまでに、このような患者由来の新鮮な悪性腫瘍細胞を用いて細胞接着に起因する抗癌剤耐性を証明した報告はない。
急性白血病細胞のアポトーシスに関与する細胞接着因子に関する知見としては、ＶＬＡ５を介した細胞接着がＡＭＬ細胞の生存に影響を与えることが報告されている。例えば、前述の通り、Ｂｅｎｄａｌｌら［１５］は、ＶＬＡ５がＡＭＬ細胞のアポトーシスの抑制に作用すると報告しているが、Ｓｕｇａｈａｒａら［１８］は、ＶＬＡ５がアポトーシスの促進に作用することを報告している。上記２つの研究グループが用いたＡＭＬ細胞および実験系は同一ではなく、ＶＬＡ５のＡＭＬ細胞に対する作用は未だ意見の一致が得られておらず、矛盾している。更にＡＭＬ細胞のβ１インテグリンが、抗癌剤により引き起こされるアポトーシスに与える影響については未だ報告されていない。
発明の開示
以上の背景から、本発明者らは最初に、ＶＬＡ４およびＶＬＡ５が急性白血病細胞の抗癌剤によるアポトーシスに与える影響を樹立細胞株を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏの実験で検討すると同時に、急性白血病細胞のＶＬＡ４およびＶＬＡ５の発現が通常の化学療法を受ける急性白血病患者の予後（完全寛解、再発、長期生存、長期無病生存など）に与える影響を検討した。
急性白血病細胞において、ＶＬＡ４とＶＬＡ５が、ＡＭＬ細胞の骨髄ストローマ細胞への接着に関与する接着因子としてＣＤ４４と並んで重要なことは周知の事実である［１−４］。ＶＬＡ４ではα４インテグリンが、ＶＬＡ５ではα５インテグリンが、それぞれβ１インテグリンとのヘテロダイマーを形成しており、ＶＬＡ４とＶＬＡ５はそれぞれ、ＦＮ受容体であり、ＦＮとの相互作用を介して、細胞接着、細胞分化および細胞生存維持等、種々の生物学的な役割に関与していると推測されている。ＶＬＡ４分子を構成するα４インテグリンおよびα５インテグリンはいずれも、Ｃ末端近傍に膜貫通ドメインを有し、それよりＮ末端側が細胞外ドメインである。これら細胞外ドメインには、複数の２価金属結合部位が存在し、この金属結合部位が細胞接着因子との結合に重要であると考えられている。ＶＬＡ４およびＶＬＡ５分子は、正常の骨髄芽球や前骨髄球などの未熟骨髄球系細胞には発現していない。したがって、急性白血病細胞において、ＶＬＡ４とＶＬＡ５を介した骨髄ストローマ細胞への接着が抗癌剤感受性の変化に与える影響を検討することは、急性白血病の再発機序を解明するのみではなく、細胞生物学的にも意義が大きいと考えた。
本発明者らのＡＭＬ細胞株および患者由来の新鮮ＡＭＬ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの検討では、ＡＭＬ細胞上のＶＬＡ４は、骨髄ストローマ細胞の細胞外マトリックス構成成分であるＦＮと相互作用することにより、抗癌剤（シトシンアラビノシド、ダウノルビシン）によるアポトーシスを回避し得ることが判明した。
ＡＭＬ細胞株および患者由来の新鮮ＡＭＬ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検討では、ＡＭＬ細胞上のＶＬＡ４は、骨髄ストローマ細胞の細胞外マトリックス構成成分であるＦＮと相互作用することにより、抗癌剤（シトシンアラビノシド、ダウノルビシン）によるアポトーシスを回避し得ることが判明した。
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにヒトＡＭＬ細胞株を移植して作製したＡＭＬモデルマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏの実験の結果から、実際の骨髄においてＡＭＬ細胞は、ＶＬＡ４を介して抗癌剤による細胞傷害を回避することが確認された。
上記の知見より、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用を阻害し得るＶＬＡ４アンタゴニストが、抗癌剤による細胞傷害のＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用を介した回避を妨害するのに有効であり、抗癌剤によるＡＭＬ細胞のアポトーシスを促進すると考えた。そこで、ＶＬＡ４アンタゴニストとしてＶＬＡ４とＦＮとの相互作用を遮断し得る抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体（ＶＬＡ４Ａｂ）を用いて、それを抗癌剤と併用してＡＭＬモデルマウスに投与したところ、マウスの骨髄のＭＲＤを根絶できることを発見した。また、ＶＬＡ４Ａｂは骨髄に存在するＡＭＬ細胞を末梢血中へ動員させる作用を有することも判明した。
以上の結果から、ＶＬＡ４Ａｂは、化学療法と併用することにより、ＡＭＬの通常の化学療法による治療成績を向上させ得る。
さらに、ＶＬＡ４陰性患者群とＶＬＡ４陽性患者群との完全寛解および予後について比較検討した結果、ＶＬＡ４陰性患者群の通常の化学療法後の完全寛解率は驚くべきことに１００％であり、ＶＬＡ４陽性患者群のそれに比べて有意に高く、かつ再発率も低く、５年生存率と５年無病生存率はともに１００％と極めて良好であった。
このことより、ＶＬＡ４の発現は、ＡＭＬの初回の化学療法（寛解導入療法）に対する抗癌剤耐性の要因であると同時に、長期予後の危険因子であることが明らかになった。したがって、ＡＭＬ患者のＡＭＬ細胞におけるＶＬＡ４の発現量および／またはＶＬＡ４発現率を測定することは、化学療法に対する応答の予測、および該患者の予後の非常に重要な知見をもたらす診断法であり得る。
すなわち、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用により誘導される抗アポトーシス性シグナルカスケードがＡＭＬ細胞の生存に寄与しており、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用を遮断するＶＬＡ４アンタゴニストにより、ＡＭＬ細胞の抗癌剤感受性は顕著に向上し得ることが、樹立細胞株を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび疾患モデルマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの試験より明らかとなった。さらに、ＡＭＬ細胞のＶＬＡ４発現率が高い患者では、抗癌剤による治療後の予後が、ＶＬＡ４発現率が低い患者に比べて有意に不良であることを見出した。
この知見を基に、本発明は、急性白血病細胞の抗癌剤感受性を増大させることによる急性白血病治療のためのＶＬＡ４アンタゴニスト（該アンタゴニストには、低分子化合物および抗体等の高分子物質が含まれる）、該ＶＬＡ４アンタゴニストを含有する治療医薬組成物、および急性白血病細胞におけるＶＬＡ４発現率を測定することによる急性白血病患者の診断方法を提供する。さらに、急性白血病の治療用化合物のスクリーニング方法も本発明により提供される。
、本発明は、以下の１〜４１の態様：
１．  急性白血病患者に投与することにより該疾患を治療し得る、ＶＬＡ４アンタゴニスト、
２．  急性白血病患者に他の抗癌剤投与と併用して投与することにより該疾患を治療し得る、ＶＬＡ４アンタゴニスト、
３．  抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、上記２記載のＶＬＡ４アンタゴニスト、
４．  抗ＶＬＡ４抗体である上記１〜３のいずれか１つに記載のＶＬＡ４アンタゴニスト、
５．  抗ＶＬＡ４抗体が抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体である、上記４記載のＶＬＡ４アンタゴニスト、
６．  抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体がマウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生されるものである、上記５記載のＶＬＡ４アンタゴニスト、
７．  ＶＬＡ４アンタゴニストが抗ＶＬＡ４ヒト化抗体である、上記４記載のＶＬＡ４アンタゴニスト、
８．  抗ＶＬＡ４ヒト化抗体が、マウスハイブリドーマＳＧ／７３株（「独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）」に２００２年５月８日にＦＥＲＭ  ＢＰ−８０３６として寄託されている）またはＳＧ／１７株（「独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）」に２００２年５月８日にＦＥＲＭ  ＢＰ−８０３５として寄託されている）により産生される抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体に由来する可変部の少なくとも一部を含み、該抗体の抗原結合性を維持しているものである、上記７記載のＶＬＡ４アンタゴニスト、
９．  上記１記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１０．  上記２記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１１．  上記３記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１２．  上記４記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１３．  上記５記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１４．  上記６記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１５．  上記７記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１６．  上記８記載のＶＬＡ４アンタゴニストを含有する、急性白血病治療用医薬組成物、
１７．  １種以上の他の抗癌剤をさらに含有する、上記９〜１６のいずれか１つに記載の医薬組成物、
１８．  抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、上記１７記載の医薬組成物、
１９．  １種以上の他の抗癌剤と併用して投与するための、上記９〜１６のいずれか１つに記載の医薬組成物、
２０．  抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、上記１９記載の医薬組成物、
２１．  上記１９記載の医薬組成物と１種以上の他の抗癌剤とを含む、急性白血病治療用キット、
２２．  抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、上記２１または２１記載の急性白血病治療用キット、
２３．  ＶＬＡ４とフィブロネクチンとの間の相互作用を抑制するための手段を含む、急性白血病の治療方法、
２４．  他の１種以上の抗癌剤を併用して投与することをさらに含む、上記２３記載の治療方法、
２５．  抗癌剤が、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンからなる群より選択される、上記２４記載の治療方法、
２６．  上記手段がＶＬＡ４アンタゴニストを投与することを含む、上記２３〜２５のいずれか１つに記載の治療方法、
２７．  ＶＬＡ４アンタゴニストが抗ＶＬＡ４抗体である、上記２６記載の治療方法、
２８．  抗ＶＬＡ４抗体が抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体である、上記２７記載の治療方法、
２９．  抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体がマウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生されるものである、上記２８載の治療方法、
３０．  抗ＶＬＡ４抗体が抗ＶＬＡ４ヒト化抗体である、上記２７記載の治療方法、
３１．  抗ＶＬＡ４ヒト化抗体が、マウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生される抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体に由来する可変部の少なくとも一部を含み、該抗体の抗原結合性を維持しているものである、上記３０記載の治療方法、
３２．  急性白血病患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率を測定することにより、該患者の化学療法に対する応答性および該患者の予後を診断するための、抗ＶＬＡ４抗体、
３３．  抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体である、上記３２記載の抗体、
３４．  マウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生されるものである、上記３３記載の抗体、
３５．  急性白血病患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率を測定することを包含する、該患者の化学療法に対する応答性および該患者の予後を診断する方法、
３６．  上記ＶＬＡ４の発現率の測定が、免疫化学的手法により実施されるものである、上記３５記載の方法、
３７．  上記３２〜３４のいずれか１つに記載の抗体を用いる、上記３７記載の方法、
３８．  上記ＶＬＡ４の発現率の測定が、α４インテグリンｍＲＮＡレベルを検出することにより実施されるものである、上記３５記載の方法、
３９．  急性白血病患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率を測定することにより、該患者の化学療法に対する応答性および該患者の予後を診断するための、抗ＶＬＡ４抗体を含む診断用キット、
４０．  抗ＶＬＡ４抗体が上記３２〜３４のいずれか１つに記載の抗体である、上記３９記載の診断用キット、および
４１．  急性白血病患者の治療および／または予防薬として有用な化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物の存在下または非存在下でフィブロネクチンまたはその誘導体とＶＬＡ４またはその誘導体とを接触させて、それらの相互作用を検出し、フィブロネクチンとＶＬＡ４との相互作用を阻害する試験化合物を特定することを含む、上記方法、
に関する。
本明細書中に用いる場合「ＶＬＡ４アンタゴニスト」という用語は、ＶＬＡ４−フィブロネクチン間相互作用を抑制または阻害する物質を指す。したがって、ＶＬＡ４アンタゴニストは、該相互作用により誘導される細胞内シグナル伝達を遮断または抑制することができる。本明細書におけるＶＬＡ４アンタゴニストは、あらゆる分子量および構造を有する物質であってよく、すなわち、低分子化合物、核酸およびタンパク質などの高分子物質が含まれる。ＶＬＡ４アンタゴニストは、必ずしも必要ではないが、その作用がフィブロネクチン−ＶＬＡ４間の相互作用に特異性が高いものであることが好ましい。ＶＬＡ４アンタゴニストは、種々のものが公知であり、例えば、ＴＢＣ４２５７、ＣＴ−５２１９およびＢＩＯ−１２１１などが挙げられるが、これらに限定はされない。これらは喘息および／またはアレルギー疾患の治療および／または予防薬として注目されているが、急性白血病に関して報告されているものはない。本発明において好ましいＶＬＡ４アンタゴニストとしては、抗ＶＬＡ４抗体が挙げられる。
抗ＶＬＡ４抗体の作製は当業者であれば容易になし得る。限定する意味ではないが、その代表的な作製法を述べると、免疫原としてα４インテグリン分子もしくはβ１インテグリン分子を含有する組成物またはこれらの分子を細胞膜上に担持している細胞を、場合によっては種々のアジュバントと共に、免疫する動物に適量（通常は０．１μｇ〜１ｇ／匹程度）を１回もしくは複数回投与する（該投与は、皮下、静脈内、腹腔投与などで可能であるがこれらに限定はされない）ことにより抗ＶＬＡ４抗体が得られる。ポリクローナル抗体の場合は、免疫化した動物から採血し、所望の組成および純度が得られるまで該血液から精製することができる。モノクローナル抗体の場合は、免疫化した動物から脾臓細胞を得、ミエローマ細胞などとポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて細胞融合してハイブリドーマを得、該ハイブリドーマを培養し、得られた増殖クローンの中から、α４インテグリン分子もしくはβ１インテグリン分子を含有する組成物またはこれらの分子を細胞膜上に担持している細胞を抗原として用いて該抗原に結合する抗体を産生するクローンをスクリーニングすることができる。このようにして得られたハイブリドーマクローンの培養液または該クローンを動物体内に移植して得られる体液（例えば腹水）等からモノクローナル抗体を得ることができる。
これらの抗体作製法に用いる免疫原ならびにスクリーニング用および抗体力価測定用の抗原には、上記α４インテグリン分子もしくはβ１インテグリン分子を含有する組成物またはこれらの分子を細胞膜上に担持している細胞の他に、α４インテグリン分子もしくはβ１インテグリン分子およびこれらの少なくとも一部分を含む分子、または該分子を細胞膜上に担持している細胞などを用いることができる。これらは生物試料から部分的または完全に単離されたものでもよく、遺伝子工学的手法により得られたものでもよい。この他にも、抗体作製法は種々知られており、本明細書中の記載に限定されることなく、当業者であれば、目的および用途に応じた抗体を作製でき、またその抗体を目的および用途に応じた純度および組成が得られるように精製することもできる。
本明細書中に用いる場合「抗ＶＬＡ４抗体」という用語は、上記のようなポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体に限定されることなく、ＶＬＡ４、またはＶＬＡ４を構成するα４インテグリン分子もしくはβ１インテグリン分子のいずれかに結合する抗体を意味する。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および抗体ライブラリー由来の抗体、ならびにその（Ｆａｂ）２フラグメントおよび（Ｆａｂ）フラグメント等を含む抗体分子の可変部を保持しているあらゆる分子を意味する。該分子は、抗体の可変部を保持し、抗原への結合性を有しているものであれば、免疫グロブリンに由来しない分子（アミノ酸鎖、修飾分子などを含む）を含有していてもよい。ＶＬＡ４アンタゴニストとして好ましい抗ＶＬＡ４抗体の例としては、ＶＬＡ４とＦＮとの相互作用を妨害し得る、抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体およびその可変部を保持しているフラグメントが挙げられるが、これらに限定はされない。本発明に用いる「抗ＶＬＡ４抗体」は、ＶＬＡ５分子は認識しないようなα４インテグリン分子に由来する抗原決定基を認識するものが好ましい。α４インテグリン分子の細胞外ドメインに存在する抗原決定基を認識するものが特に好ましい。ＶＬＡ４アンタゴニストとして特に好ましい抗ＶＬＡ４抗体の例としては、マウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株が産生する抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体およびその可変部を保持しているフラグメントが挙げられる。抗体をアンタゴニストとしてヒトに投与する場合、ヒトＶＬＡ４に対するアンタゴニスト作用を有する抗体およびその可変部を保持するフラグメントであって、ヒト体内において異物認識応答を起こさないものが好ましい。従って、一般にヒト化抗体と呼ばれている、キメラ抗体または再構成抗体等が好ましい。キメラ抗体とは、動物由来の抗体の可変部を異種動物（この場合はヒト）の定常領域に接合したものであるが、さらに異種動物（この場合はヒト）における抗原性を低減または消滅させるために、上記可変部の抗原結合性を消失しないようにアミノ酸配列を置換することもできる（特開平７−１９４３８４、特開平８−２８０３８７）。再構成抗体とは、動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）部分のみを異種動物（この場合はヒト）由来の抗体に移植して作製された分子である（特開平１１−４６９４、特開平１１−２４３９５５）。この際、上記可変部または相補性決定領域（ＣＤＲ）部分はマウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株が産生する抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体に由来する可変部の少なくとも一部を含むものであり、該ヒト化抗体は、上記モノクローナル抗体の抗原結合性を維持しているものであることが好ましい。これらのヒト化抗体は、トランスジェニック動物を利用して作製することが可能である。また、この他にも、ファージディスプレーヒト化抗体ライブラリーからＶＬＡ４分子またはα４インテグリン抗体への結合性を指標にスクリーニングした抗体を用いてもよい。これらの方法は当業者には公知である。
本明細書中に記載の医薬組成物は、抗ＶＬＡ４抗体またはその他のＶＬＡ４アンタゴニストの他に、薬学的に許容される担体を含み、必要に応じて増粘剤、安定剤および／または可溶化剤などの添加剤を含有することができる。「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されているか、または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることを指し、当業者は容易に理解できる。本発明の医薬組成物は、様々な適切な経路で投与することができるが、静脈内ならびに連続輸液による非経口投与が望ましい。本発明の医薬組成物を含む製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョンをはじめ、様々な用途に適した形態とすることができる。また該組成物は、１回または複数回の用量にて、凍結乾燥粉末またはペレットの形態で、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように混合するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水またはバッファーの入ったアンプルと共に提供されることも有り得る。本発明の医薬組成物が含有するＶＬＡ４アンタゴニストが抗体である場合は、担体には生理的食塩水またはバッファーが特に好ましいがこれらに限定はされない。その組成物の製剤はｐＨが中性付近であることが望ましく、ｐＨ５．０〜ｐＨ７．６の範囲内であることがさらに好ましい。該組成物中に１種以上の他の抗癌剤がさらに含有される場合は、該抗癌剤の抗癌活性を消失させることのない条件で製剤することが望ましい。また、１種以上の他の抗癌剤を上記組成物とは別個に製剤して、それと上記組成物を含む製剤とを組合わせて含む治療用キットとして提供することもできる。このような条件は、当業者であれば、それぞれの抗癌剤の種に応じて、選択することができる。本明細書における「抗癌剤」とは、種々の癌の治療および／または予防に有効なあらゆる物質、即ち腫瘍細胞の増殖を低減し得るかまたは腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示す（その増殖の低減および細胞傷害性の程度は問わない）物質を指す。多種多様な抗癌剤が当業者には公知であり、それらから適宜選択して本発明に使用することができる。抗癌剤の例を少数挙げるならば、シトシンアラビノシド、エトポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、メソトレキセート、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンデシン、６−メルカプトプリン、アクラシノマイシン、プレドニゾロン、サイクロフォスファミドおよびデキサメサゾンなどが挙げられるが、これらに限定はされることなく、現在は抗癌剤としては認知されていないが将来的に抗癌剤としての作用が認められる薬剤、将来において新規開発される抗癌剤も、本明細書中の「抗癌剤」に包含される。さらに、現在は抗癌剤としての作用が知られていないかまたは該作用が微弱であり抗癌剤として認知されていない薬剤が、ＶＬＡ４アンタゴニストと併用することにより十分な抗癌剤としての作用を示す可能性もあり、さらに、ＶＬＡ４アンタゴニストと併用することを前提に新規抗癌剤を開発することにより、ＶＬＡ４アンタゴニストとの併用によってのみ抗癌剤としての作用を示す薬剤が得られる可能性もある。このような薬剤もまた、本明細書中の「抗癌剤」に包含される。また、さらに、ＳＴＩ５７１および抗ＣＤ３３抗体をはじめあらゆる分子標的薬剤と呼ばれる薬剤ならびにオールトランスレチノイン酸および抗ＣＤ４４抗体をはじめとする分化誘導療法剤と呼ばれる薬剤も本明細書中においては「抗癌剤」という用語に包含されることとする。即ち、１種以上の分子標的薬剤および／または分化誘導療法剤を他の抗癌剤（上記に列挙したもの等）を本発明のＶＬＡ４アンタゴニストと併用することもでき、さらには他の抗癌剤と共にＶＬＡ４アンタゴニストと併用することも可能である。また、１種以上の分子標的薬剤および／または分化誘導療法剤をＶＬＡ４アンタゴニストとともに医薬組成物中に含有させることができる。分子標的薬剤および分化誘導療法剤を包含するあらゆる抗癌剤は、その投与においては、抗癌剤それぞれに応じた用量、投与頻度は、患者の症状および状態に応じて、医療従事者の通常の知識で決定され得る。複数の抗癌剤を使用する場合も同様である。
本発明の組成物の治療に有効な量は、標準的な臨床技術により医療従事者により判断することができる。例えば、１種以上の他の抗癌剤と併用する場合は、通常、体重１ｋｇ当たり０．１〜１０００ｍｇの抗ＶＬＡ４抗体を、週に３〜７回の抗癌剤の投与に合わせて投与するとよい。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを随意に利用して、最適用量範囲の特定に役立てることができる。用いる厳密な用量はまた、投与経路および疾患の重篤度にも依存し、実施者の判断および各患者の症状に応じて決定するべきである。本発明の組成物を１種以上の他の抗癌剤と併用して投与する場合は、別個の経路で別個にそれぞれを投与するか、同じ経路で別個に投与するか、または同じ経路で同時に投与するとよい。これらの適切な投与方法は、医療従事者の通常の知識、ならびにモデル動物を用いた試験等により決定することができる。本明細書中に用いる場合「他の抗癌剤投与と併用して投与する」とは、ＶＬＡ４アンタゴニストまたはこれを含有する医薬組成物を、ＶＬＡ４アンタゴニスト以外の抗癌剤の投与と同時に単一の経路で投与すること、あるいは２４時間以下の任意の時間的間隔を開けておよび／または同一もしくは異なる経路で投与することを意味する。時間的間隔を開けて上記アンタゴニストまたは医薬組成物と抗癌剤を投与する場合、いずれを先に投与してもよいが、上記アンタゴニストまたは医薬組成物を先に投与することが好ましい。
本明細書中に用いる場合「治療」という用語は、ＡＭＬ等の疾患の症状（患者によって認識され得るか否かを問わない）の消失、低減または該疾患の進行の遅延をもたらすための行為を指す。本明細書中に用いる場合「患者」という用語は、あらゆる哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
本明細書中に用いる場合、「化学療法」とは、抗癌剤を適切な用量および経路にて投与することによる急性白血病の治療方法を指す。
本明細書中に用いる場合、「化学療法への応答性」とは患者の化学療法による治療効果を指す。「化学療法に対する応答性が高い」という場合、化学療法に対する治療効果が高いことが期待される。さらに、本明細書中に用いる場合、「患者の予後を診断する」とは、完全寛解率、再発率、生存率、無病生存率などを含む患者の予後について予測または評価することを指す。
本明細書中に用いる「発現率」という用語は、試験した細胞集団中で対象とする分子を発現している細胞の占める比率をいう。すなわち、上記の態様における「急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率」という用語は、患者または被検体から採取した血液または骨髄液中に含まれる急性白血病細胞のうち、ＶＬＡ４を発現している細胞の比率を指す。急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率の測定は、抗ＶＬＡ４抗体または抗α４インテグリン抗体を用いて免疫化学的手法により実施することができる。用いる抗体は、モノクローナル抗体がさらに好ましく、マウスハイブリドーマＳＧ／７３株またはＳＧ／１７株により産生される抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体が特に好ましい。例えば、上記抗体と結合する細胞を定量的に検出するための手法は様々なものがあるが、当業者には公知である。例えば、上記抗体を標識（蛍光標識、放射性標識、化学発光標識）を付した二次抗体にさらに結合させることによる検出も可能である。検出には、通常のＥＬＩＳＡ法およびフローサイトメトリー法などを用いるとよいが、これらの方法に限定はされない。あるいは、所定の数の急性白血病細胞中のα４ｍＲＮＡ量を定量的に検出することによりＶＬＡ４の発現率を測定することもできる。該ｍＲＮＡの定量的検出は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法またはノーザンブロット法などがある。いずれの方法も当業者には公知である。後述する実施例４において実証されるように、上記のように測定した急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率と患者の化学療法に対する応答性、完全寛解率、再発率、生存率、無病生存率等を含む予後の間には明確に相関がある。このことより、急性白血病患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現率の測定は、急性白血病患者の診断法として化学療法に対する応答性および予後に対する診断方法となり得る。
さらに、本発明は、急性白血病患者の治療および／または予防薬として有用な化合物をスクリーニングする方法をも提供する。該方法においては、試験化合物の存在下もしくは非存在下でフィブロネクチンとＶＬＡ４とを接触させてフィブロネクチンとＶＬＡ４との相互作用を検出し、該相互作用を阻害する試験化合物を特定することを含む。該方法に用いるＶＬＡ４は部分的もしくは完全に単離または精製されたものを用いてもよく、また細胞表面にＶＬＡ４を発現している細胞を用いてもよい。このような細胞は天然のものでも遺伝子工学的に作製したものでもよい。さらに、ＶＬＡ４の細胞外ドメインまたはフィブロネクチン結合部位を含むＶＬＡ４の誘導体を用いてもよく、場合によっては他の化合物（アミノ酸鎖または修飾物）を含んでいてもよい。フィブロネクチンも、ＶＬＡ４結合部位を含むフィブロネクチン誘導体を用いることができ、場合によっては他の化合物（アミノ酸鎖または修飾物）を含んでいてもよい。フィブロネクチンとＶＬＡ４との相互作用は、様々な公知の方法を用いて検出することができる。蛍光、化学発光、放射性標識もしくは抗原性ペプチド等の任意の標識物を利用することにより、検出は容易になり得る。フィブロネクチンまたはＶＬＡ４もしくはそれらの誘導体を任意の固相プレートまたはビーズ等の固相担体の表面をフィブロネクチンでコートしたものを用いてもよい。細胞表面にＶＬＡ４を発現している細胞を用いる系の場合、上記固相担体上に接着する細胞を顕微鏡下で観察し、その数量またはその形態によりフィブロネクチンとＶＬＡ４との相互作用の程度を評価することもできる。さらには、ＶＬＡ４またはＶＬＡ４を細胞表面に発現している細胞を蛍光、化学発光、放射性標識もしくは抗原性ペプチド等の任意の標識物で標識し、フィブロネクチンへの結合および／または接着をその標識を指標に評価することもできる。この他にも、当業者であれば様々な手法で容易に達成し得る。
発明を実施するための最良の形態
実施例１：樹立細胞株における細胞接着依存性抗癌剤耐性に関する検討
（１）樹立細胞株におけるＶＬＡ４およびＶＬＡ５の発現の検討
急性白血病モデル細胞として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来細胞株Ｕ９３７と急性前骨髄球性白血病細胞（ＡＰＬ）由来細胞株ＨＬ６０を用いた。まず、これらのα４インテグリン、α５インテグリン及びβ１インテグリンの発現をフローサイトメトリー法を用いて測定した。Ｕ９３７とＨＬ６０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手した。これらの培養は、加熱により非働化したウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ））を１０％、Ｌ−グルタミンを１％、ペニシリンおよびストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、培養条件は３７℃、５％ＣＯ２環境下にて行った。抗β１インテグリンモノクローナル抗体（Ａ１Ａ５；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、マウスハイブリドーマＳＧ／７３株より産生されるＶＬＡ４のα４インテグリン分子に結合する抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体ＳＧ／７３またはＶＬＡ５のα５インテグリン分子に結合する抗ＶＬＡ５モノクローナル抗体ＫＨ／７２を一次抗体として１×１０６個の上記２種の細胞それぞれと共にインキュベートした後、ＦＩＴＣ標識ヤギ由来抗ラットＩｇＧ抗体およびを反応させた。ＦＩＴＣで標識された細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー解析に供した。
Ｕ９３７では、ＶＬＡ４が９５．９％、ＶＬＡ５が９５．４％、β１インテグリンが９４．６％の細胞に検出され、ＶＬＡ４（α４β１インテグリン）およびＶＬＡ５（α５β１インテグリン）ともに陽性であったのに対して、ＨＬ６０では、ＶＬＡ４が９８．８％、ＶＬＡ５が０．８％、β１が９６．０％の細胞に検出され、ＶＬＡ４のみを発現し、ＶＬＡ５は発現していないことが判明した（データは示していない）。即ち、ＶＬＡ４とＶＬＡ５のうち、Ｕ９３７およびＨＬ６０細胞の両方に発現しているのは、ＶＬＡ４のみであることがわかった。
（２）ＦＮ−コートプレート上で培養すると、急性白血病モデル樹立細胞株は抗癌剤による細胞傷害を回避する
Ｕ９３７とＨＬ６０に対する抗癌剤（ＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃ）の細胞傷害作用に与える骨髄ストローマ細胞の細胞外マトリックス構成成分であるＦＮおよびＶＣＡＭ１の影響を検討した。まず最初に、Ｕ９３７（図１、ａ，ｃ）、ＨＬ６０（図１、ｂ，ｄ）を抗癌剤の非存在下で２４時間培養した場合、ＦＮ−コートプレート、ＶＣＡＭ１コートプレートまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コートプレートのそれぞれで培養した場合の生細胞率は、何れも９０％以上であり、有意差を認めなかった（図１）。
上記と同様の培養条件で、ＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃを０〜５００μｇ／ｍｌの濃度でさらに加えて培養すると、抗癌剤非存在下に比べて、両細胞とも、３種類のプレートのいずれで培養した場合でも、ＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃのいずれに対しても、抗癌剤の濃度依存的に生細胞率が低下したが、ＦＮ−コートプレートを用いた場合、ＢＳＡ−コートプレートまたはＶＣＡＭ１−コートプレートを用いた場合に比べて、試験した抗癌剤の濃度全域に渡って、一貫して生細胞率は有意に高値を示した。ＶＣＡＭ１−コートプレートを用いた場合の生細胞率は、ＢＳＡ−コートプレートを用いた場合に比べて、いずれの抗癌剤でも、試験した抗癌剤の濃度全域に渡って、有意差が認められなかった（図１）。
臨床的にＡＭＬ患者にＤＮＲとＡｒａ  Ｃを常用量で単回投与した時のそれらの血中濃度に近似するＤＮＲ  ０．５μｇ／ｍＬとＡｒａ  Ｃ  １０−６Ｍの濃度で、ＦＮ−コートプレートを用いた場合のＵ９３７およびＨＬ６０の生存率と、ＢＳＡ−コートプレートを用いた場合の生細胞率との差は最大となった。生細胞率５０％を示す抗癌剤の濃度（ＬＤ５０）を見ると、いずれの抗癌剤においても、ＦＮ−コートプレートを用いた場合、ＢＳＡ−コートプレートを用いた場合に比べてＬＤ５０値が約１０倍の値を示した。
以上の結果から、ＡＭＬ細胞はＶＬＡ４またはＶＬＡ５−ＦＮ間相互作用を介した細胞接着に依存して薬剤耐性を獲得し得ることが推測される。
次にβ１インテグリン−ＦＮ間相互作用依存性の薬剤耐性の存在の確認とその機序を解析することとした。
なお、後述する実験においては、上記の理由よりＤＮＲは０．５μｇ／ｍＬ、Ａｒａ  Ｃは１０−６Ｍの濃度で用いることとした。
（３）ＦＮ−コートプレート上で培養した急性白血病モデル樹立細胞株は、抗癌剤による細胞傷害およびアポトーシスを回避するが、ＶＬＡ４アンタゴニストである抗ＶＬＡ４抗体はこのＦＮに起因するアポトーシス回避を解除する
上述のように、Ｕ９３７およびＨＬ６０の両細胞株において、ＦＮ−コートプレートでは、抗癌剤存在下においても生細胞率が高く維持され、急性白血病細胞に対する抗癌剤による細胞傷害に対するＦＮ介在性の防御作用が存在することが示唆された。そこで次に、ＶＬＡ４アンタゴニストである抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体の該防御作用に対する影響を調べた。抗α４インテグリンモノクローナル抗体であるＳＧ／７３は、ＶＬＡ４分子のα４インテグリン分子に結合することによりＶＬＡ４に対してアンタゴニストとして作用することを、本発明者らは予備的な実験により確認した（データは示していない）。その結果、ＶＬＡ４アンタゴニストである上記抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体を抗癌剤を含有する培地中にさらに添加した場合、ＦＮ−コートプレートでの培養における生細胞率が、ＢＳＡ−コートプレートでの培養におけるものとほぼ同程度となった（図２ａおよびｂ）。即ち、急性白血病細胞に対する抗癌剤による細胞傷害からのＦＮが介在する防御作用は、抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体（ＶＬＡ４Ａｂ）の添加により解除された。コントロール抗体またはＶＬＡ５のアンタゴニストである抗ＶＬＡ５モノクローナル抗体（ＶＬＡ５Ａｂ）には、抗ＶＬＡ４抗体で見られるような作用は認められなかった。以上の結果より、Ｕ９３７とＨＬ６０はともにＶＬＡ４を介したＦＮへの接着により、ＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃによる細胞死（即ち細胞傷害）から回避するという事実が判明した。
ＤＮＲおよびＡｒａ  Ｃは双方とも、急性白血病細胞に対してアポトーシスを惹起することが良く知られている［１９−２１］。従って、上記の急性白血病モデル細胞株の細胞死がアポトーシスによるものか否かを確認するために、アポトーシス性細胞の表面に発現されることが知られているアネキシンＶの発現をＭＥＢＹＯ−アポトーシスキット（ＭＢＬ，名古屋、日本）を用いて検討した。具体的には、抗癌剤の存在下で培養した後の上記ＡＭＬ細胞株（２×１０５）をＦＩＴＣ標識抗アネキシンＶ抗体で染色した後に、フローサイトメトリーを用いて解析した。ＦＩＴＣ標識抗アネキシンＶ抗体を添加しない同一のサンプルを陰性コントロールとし、該陰性コントロールよりも強い蛍光を発現している細胞をアネキシンＶ陽性細胞と判定してその存在比を算定した。
図２ｂおよびｄに示したように、両細胞株において、抗癌剤非存在下で２４時間培養した後では、ＦＮ−コートプレートを用いた場合はＢＳＡ−コートプレートを用いた場合と比べて、アネキシンＶ陽性細胞（アポトーシス性細胞）の全細胞に対する存在比は有意に低値を示した。抗癌剤の存在下においても、前記いずれのプレートで培養した場合も共に、抗癌剤非存在下に比べてアポトーシス性細胞の存在比の上昇が認められたが、ＦＮ−コートプレートの培養ではＢＳＡ−コートプレートでの培養に比べてアポトーシス性細胞の割合が有意に低かった。また、いずれの培養条件の場合でも、アポトーシス性細胞の割合は生細胞率と相反する傾向を示した。即ち、抗癌剤ＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃによって、Ｕ９３７とＨＬ６０はアポトーシスを起こし、該アポトーシスはＦＮによって回避され得ることが確認された。また、このＦＮによるアポトーシスの回避は、ＶＬＡ４Ａｂの添加により解除されたが、コントロール抗体またはＶＬＡ５アンタゴニストである抗ＶＬＡ５モノクローナル抗体では上記解除は認められなかった。
つまり、上記急性白血病モデル樹立細胞株であるＵ９３７およびＨＬ６０を用いた試験結果より、急性白血病細胞は、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用により、ＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃにより誘導されるアポトーシスから回避することが示唆された。
（４）急性白血病モデル樹立細胞株における、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用により、抗癌剤が誘導するカスパーゼ３および９の活性化ならびにＢｃ１−２のダウンレギュレーションが阻害される
ＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃによって急性白血病細胞がアポトーシスを起こす際にはカスパーゼ３およびカスパーゼ９などのカスパーゼが活性化されることは周知の事実である［１９−２１］。そこで、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用が、急性白血病モデル樹立細胞株であるＵ９３７およびＨＬ６０のＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃによるカスパーゼの活性化に与える影響を検討した。
カスパーゼ３活性の測定には、ＰｈｉＰｈｉＬｕｘ  Ｇ１Ｄ２キット（ＭＢＬ，名古屋，日本）を用いて、フローサイトメトリー法にて測定した。５×１０５個のＵ９３７細胞をＤＮＲまたはＡｒａ  Ｃ（それぞれ、０．５μｇ／ｍＬおよび１０−６Ｍ）と共にインキュベートしたのち、細胞を回収してＰＢＳにて洗浄後、カスパーゼ３基質溶液（１０μＭ）を７５μＬ添加して、３７℃で５％ＣＯ２環境下で１時間インキュベートした。その後、細胞の蛍光強度を、ＦＡＣＳｃａｎで解析した。カスパーゼ３基質溶液を添加していない同一のサンプルを、陰性コントロールとし、該陰性コントロールよりも強い蛍光を発する細胞をカスパーゼ３陽性細胞として測定した。
一方、カスパーゼ９の活性は、カスパーゼ９／Ｍｃｈ６プロテアーゼ比色アッセイキット（ＭＢＬ）を利用し、分光光度計を用いて測定した。簡単に述べると、２×１０６個の細胞を上記抗癌剤を添加または無添加でインキュベート後、細胞を回収してＰＢＳにて洗浄し、［２２］に記載の方法に従って細胞を溶解させた。遠心により残渣を除去し、タンパク質量を定量して、細胞溶解液中のタンパク質の濃度が、４μｇ／ｍｌになるように調製した。カスパーゼ９の基質ペプチド（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（ＬＥＨＤ−ｐＮＡ）（４ｍＭ）を５μｌ添加したプロテアーゼアッセイは、反応バッファー（２００ｍＭ  ＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、４０％  ｖ／ｖ  グリセロール、１０ｍＭ  ジチオトレイトール、および１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０ｍＬ中で行った。サンプルを３７℃で１時間インキュベートし、酵素触媒性のｐ−ニトロアニリドの遊離を４０５ｎｍでの吸光度を分光光度計にて測定することにより、酵素活性を定量した。
いずれの抗癌剤を用いた場合でもカスパーゼ３およびカスパーゼ９の活性は上昇したが、ＦＮ−コートプレートを用いた場合はＢＳＡ−コートプレートを用いた場合に比べてカスパーゼ３とカスパーゼ９の活性は低かった。
抗ＶＬＡ４抗体をＦＮ−コートプレートの細胞にさらに添加することにより、カスパーゼ３およびカスパーゼ９の活性がＢＳＡ−コートプレートと同様のレベルまで回復し、抗ＶＬＡ４抗体によりＦＮの作用が遮断された（ＤＮＲについてのデータは図３ａおよびｂに示し、Ａｒａ  Ｃについてのデータを図４ａおよびｂに示している）。ＨＬ６０についても、Ｕ９３７における上記結果と同様の結果が得られた（データは示していない）。
Ｕ９３７とＨＬ６０の２種の樹立細胞株ともに、ＶＬＡ４を介したＦＮへの接着によりカスパーゼ９およびカスパーゼ３の活性化が抑制されることから、ＡＭＬ細胞において、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用による細胞接着が抗癌剤によるアポトーシスを回避させ得るということがさらに明確に示唆された。
次に、ＶＬＡ４とＦＮとの相互作用でＡＭＬ細胞が抗癌剤によるアポトーシスから免れる機序について試験する目的で、上記と同様の条件下における急性白血病モデル樹立細胞株での、アポトーシス抑制タンパク質であることが公知であるＢｃ１−２の発現量をＦＩＴＣ標識化抗ヒトＢｃ１−２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー法にて検討した。図３ｃにＵ９３７を用いた実験結果を示す。抗癌剤非存在下において、ＦＮによる細胞接着によりＵ９３７のＢｃ１−２発現が亢進した。抗癌剤の存在下では非存在下に比べてＢｃ１−２の発現が低下した。ＦＮ−コートプレートを用いた場合は、ＢＳＡ−コートプレートを用いた場合に比べてＢｃ１−２の発現低下の程度は小さかった。さらに抗ＶＬＡ４抗体を添加することにより、このＦＮ−コートプレートにおけるＢｃ１−２発現量はＢＳＡ−コートプレートと同程度になった。
さらに、ＨＬ６０においても、Ｕ９３７における上記結果と同様の結果が得られた（データは示していない）。
つまり、急性白血病モデル樹立細胞株において、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用によりＢｃ１−２の発現が亢進されること、および抗癌剤によるＢｃ１−２発現の低下をＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用により抑制されることが判明し、これがＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用が抗癌剤により誘導されるアポトーシスから回避させ得る機序として関与していることが強く示唆された。
以上の急性白血病モデル樹立細胞株ＨＬ６０およびＵ９３７を用いた試験の結果から、ＦＮを介する細胞接着が急性白血病細胞のアポトーシスの回避に関与し、抗癌剤による急性白血病細胞のアポトーシス誘導は、ＦＮを介する細胞接着により低減されることが示唆された。そして、ＶＬＡ４アンタゴニストである抗ＶＬＡ４抗体は、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用を介する上記の作用を顕著に阻害したが、ＶＬＡ５アンタゴニストである抗ＶＬＡ５抗体では該阻害効果は認められなかったことから、抗癌剤に誘導される急性白血病細胞のアポトーシスの回避はＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用に依存しており、ＶＬＡ４と同じくＦＮの受容体であるＶＬＡ５は関与していないことが示唆された。
このことより、ＶＬＡ４アンタゴニストによりＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用を遮断することが急性白血病患者の化学療法に対する応答性を向上させ、該疾患の治療において有効であると考えられる。
実施例２：急性白血病患者由来白血病細胞における細胞接着依存性抗癌剤耐性の解析
（１）ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用による細胞接着依存性抗癌剤耐性の解析
前述のＡＭＬ細胞株を用いた検討でＶＬＡ４−ＦＮ相互作用が抗癌剤耐性に寄与するということ（本明細書中では、この現象を「細胞接着依存性抗癌剤耐性」と呼ぶ）が判明したため、札幌医科大学（札幌市、日本）の第４内科で診断を受けた初発性ＡＭＬ患者の中から無作為に抽出した３０人の初発性ＡＭＬ患者について、その急性白血病細胞におけるＶＬＡ４の発現量に基づいて解析した。該患者は、全例６５歳未満（平均年齢４５．５歳）であった。性別は男性１４例、女性１６例であり、ＦＡＢ分類ではＭ０  １例、Ｍ１  ６例、Ｍ２  ７例、Ｍ３  ５例、Ｍ４  ７例、Ｍ５ａ  ４例であった。パフォーマンス状態は０−２と比較的良好であり、白血球数と急性白血病細胞のミエロペルオキシダーゼの陽性率は、症例間でばらつきが認められた。急性白血病細胞の核型は、正常二倍体が１７例、ｉｎｖ（１６）が４例、ｔ（１５；１７）が５例、ｔ（８；２１）が２例、ｄｅｌ（１１）（ｑ１４ｑ２３）が１例、ａｄｄ（２０）（ｑ１３．３）が１例であった。
化学療法を行う前の該患者より採取した血液から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた密度勾配遠心分離により、急性白血病細胞以外の細胞を実質的に含まない単核細胞画分を単離した。該分画方法は当業者には公知である。フローサイトメトリー法では、ＰＥ標識ＣＤ４５抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｔｈ，ＦＬ）を用いてＣＤ４５発現を測定し、ＣＤ４５発現の低い細胞集団にゲートを絞り（芽球細胞ゲート法［２３］参照のこと）、該ゲート内の細胞１０．０００個について解析を行った。急性白血病芽球細胞は有核骨髄細胞のうち平均で約９３％を占めていた。β１インテグリンとヘテロダイマーを形成してＶＬＡ４を構成するα４インテグリンの抗α４インテグリン抗体および標識２次抗体を用いてフローサイトメトリーにて解析し、そのα４インテグリン発現白血球細胞の比率を測定し、ＶＬＡ４の発現率とＤＮＲおよびＡｒａ  Ｃによる患者由来新鮮白血病細胞の細胞傷害の程度との間に関連があるか否かを、３０名のＡＭＬ患者由来新鮮白血病細胞を用いて検討した。その結果、ＦＮ−コートプレートを用いた場合には、ＡＭＬ細胞のＶＬＡ４発現率とＤＮＲ（図５ａ）およびＡｒａ  Ｃ（図５ｂ）で処理後の生細胞率との間には、正の相関があることが明らかとなった。図５ａ，ｂに示した結果から、ＦＮ−コートプレートで培養した時の生細胞率がＢＳＡ−コートプレートで培養した時のそれに比べて高値を示した場合をＶＬＡ４陽性と定義することにしたところ、そのＶＬＡ４発現率の境界は３０％であった。その結果、Ｍ０  １症例，Ｍ１  ２症例，Ｍ２  ３症例，Ｍ４  ２症例，Ｍ５ａ  ２症例の合計１０症例（３３％）はＶＬＡ４陰性群に分類され、Ｍ１  ４症例、Ｍ２  ４症例、Ｍ３  ５症例・Ｍ４  ５症例、Ｍ５ａ  ２症例の合計２０症例（６７％）はＶＬＡ４陽性群に分類された。
ＶＬＡ４陽性であった２０症例のうち最初に入院した患者＃３由来のＡＭＬ細胞（α４インテグリン発現率８７．８％、β１インテグリン発現率８７．２％であった）を用いて、上記実施例と同様の実験を行った結果を図４に示す。急性白血病モデル樹立細胞株（これらがＶＬＡ４陽性であることは前述した）における結果と同様、ＦＮ−コートプレート上で培養した場合、ＢＳＡ−コートプレート上で培養したものと比較して、抗癌剤による細胞死が抑制され、カスパーゼ３およびカスパーゼ９の誘導が抑制され、Ｂｃ１−２発現が亢進していた（図４ａ〜ｅ）。これらのデータは、他の１９名のＶＬＡ４陽性患者由来の細胞においても同様であった（データは示していない）。以上のことより、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用により、患者新鮮ＡＭＬ細胞でも抗癌剤誘導性アポトーシスが抑制されること、即ち細胞接着依存性抗癌剤耐性が示唆された。また、抗ＶＬＡ４抗体の添加により、ＦＮによる抗癌剤誘導性アポトーシスの抑制作用が阻害されたが、抗ＶＬＡ５抗体ではこの阻害効果が認められなかったことも、樹立細胞株における結果と一致していた。
上記患者＃３以外の１９名のＶＬＡ４陽性患者由来の細胞においても例外なく、患者＃３由来の細胞における上記データと同様に細胞接着依存性抗癌剤耐性が認められたのに対して、１０名のＶＬＡ４陰性患者由来の細胞では、例外なく細胞接着依存性抗癌剤耐性を認めなかった（データは示していない）。したがって、２種類の上記樹立細胞株と同様に、患者由来の新鮮急性白血病細胞でも、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用が細胞接着依存性抗癌剤耐性に関与しているという事実が裏付けられ、ＶＬＡ４アンタゴニストである抗ＶＬＡ４抗体が細胞接着依存性抗癌剤耐性を阻害し、該細胞の抗癌剤に対する感受性を回復させた。
（２）細胞接着依存性抗癌剤耐性の機序についてのさらなる解析
ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用による細胞接着依存性抗癌剤耐性の機序をさらに解明すべく、以下の検討を行った。
ＭＤＲ−１（Ｐ−グリコプロテイン）は、ドキソルビシンおよびダウノルビシンなどの薬剤の細胞内からの排除に関与する薬物輸送タンパク質であることが知られている。上記実施例で用いた患者由来急性白血病細胞における、該タンパク質の発現をＦＩＴＣ標識抗ＭＤＲ−１モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー法により解析した。試験した全ての患者由来急性白血病細胞で陰性であり、ＦＮ−コートプレート上で培養した場合でも、その発現は変化しなかった。このことから、ＦＮを介した抗癌剤耐性が、抗癌剤の細胞外排除が亢進された結果ではないと考えられる。
さらに、カスパーゼ３、カスパーゼ９およびＢｃ１−２以外のアポトーシスに関与するタンパク質の発現についても検討した。アポトーシス誘導性受容体タンパク質であるＦａｓ（ＡＰＯ−１またはＣＤ９５とも呼ばれる）の発現についてもＦＩＴＣ標識抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ＭＢＬ）を用いたフローサイトメトリー法にて調べたところ、Ｕ９３７、ＨＬ６０、および２８症例の新鮮急性白血病細胞の何れの細胞でも例外なく抗癌剤の暴露による発現の変化を認めなかった（データは示していない）。癌抑制遺伝子産物であり、アポトーシスに対して抑制的に作用することが知られているｐ５３の発現についても調べた。Ｕ９３７、ＨＬ６０の２種類の細胞株はｐ５３を発現していないため、患者由来の新鮮急性白血病細胞についてのみ、そのｐ５３の発現の動向についてｐ５３  ｐａｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。その結果、抗癌剤の暴露により試験した２５症例の何れの新鮮急性白血病細胞でもｐ５３の発現は増強したが、ＦＮ−コートプレートを用いた場合とＢＳＡ−コートプレートを用いた場合で、その増強の程度に有意な差を認めなかった（データは示していない）。
このことから、ＡＭＬ細胞のＦａｓは上記抗癌剤により誘導されるアポトーシスには関与しておらず、また、ｐ５３は上記アポトーシスには関与しているものの、ＡＭＬ細胞の細胞接着依存性抗癌剤耐性には関与していないと推察される。
以上の患者由来急性白血病細胞についての検討の結果をまとめると、患者由来急性白血病細胞においても、急性白血病モデル樹立細胞株と同様、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用により、抗癌剤誘導性アポトーシスが抑制され、さらにＶＬＡ４アンタゴニストである抗ＶＬＡ４抗体によりＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用によるアポトーシス抑制効果が解除された。また、該アポトーシスには、カスパーゼ３、カスパーゼ９およびＢｃ１−２を介する経路が関与しているが、該経路はＦＮにより不活化され得るということがわかった。この結果から、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用は、急性白血病疾患において注目されるべき作用であり、その予後および治療の改善のための標的となり得る。さらに、ＶＬＡ４アンタゴニストは急性白血病の治療薬としての用途もまた注目されるべきである。
（３）患者由来新鮮急性白血病細胞におけるＶＬＡ４発現率と細胞接着依存性薬物耐性との相関
ＶＬＡ４の発現率と細胞接着依存性薬物耐性の程度との間に関連があるか否かを検討した。図５に前述３０名のＡＭＬ患者由来新鮮急性白血病細胞のα４インテグリンの陽性率と、ＦＮ存在下における抗癌剤による細胞傷害性との関係を示す。ＡＭＬ細胞のα４インテグリンの発現率とＤＮＲ（図５ａ）およびＡｒａ  Ｃ（図５ｂ）で処理した後の細胞の生存率との間には、正の相関が存在することが明らかになった。
このことからも、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用が急性白血病細胞の抗癌剤に対する耐性を誘導し、該相互作用が急性白血病細胞の細胞生存維持に寄与することがさらに示唆された。
実施例３：マウスに移植した急性白血病モデル細胞を用いたｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞接着依存性抗癌剤耐性の検討
（１）Ｕ９３７移植ＡＭＬモデルマウスにおけるＵ９３７細胞の組織分布の解析
次に我々は実際に骨髄において急性白血病細胞がＶＬＡ４を介した機序で抗癌剤による細胞傷害から回避することを確かめるために、Ｕ９３７をＳＣＩＤマウスに移植して作製したＡＭＬモデルマウスを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏの試験を実施した。
ＡＭＬモデルマウスは全身放射線照射（４Ｇｙ）を施したＳＣＩＤマウスに尾静脈からＵ９３７（５×１０６）を注射して移植して作製した。該マウスは、約３週間で、肢部の麻痺などの急性白血病の症状を呈した。なお、以下に提示するｉｎ  ｖｉｖｏ試験のデータは全て、一群１０ずつのマウスを使用して得られたものである。
抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー法および免疫組織学的染色法を用いて試験したところ、移植後７日目のマウスでは、末梢血、骨髄および脾臓のいずれにおいてもＵ９３７は検出されなかった（データは示していない）。そこで、さらに高検出感度を示す方法として、Ｕ９３７の浸潤をヒトＡＬＵ配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法による増幅させることにより検出した。その際のプライマーとしては、ＡＬＵ−５（５’ＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴ３’：配列番号１）およびＡＬＵ−３（５’ＣＧＣＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡ３’：配列番号２）を用いた。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃１分（変性）、５５℃４５秒（アニーリング）および７２℃１分（伸長）で２１サイクルとした。得られた反応生成物を３％アガロースゲル上で電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色することにより可視的に検出した。その結果、移植後７日目のマウスにおいてＵ９３７が骨髄にのみ存在していた（図６ｂ−１）。これらの結果から、移植後７日目のマウスは、骨髄の微小残存病変（ＭＲＤ）のモデルとなり得ることが明らかとなった。
一方、移植後１４日目のマウスでは、Ｕ９３７細胞は末梢血と脾臓ではフローサイトメトリー法では検出されなかったが、骨髄においては単核細胞の約２０％を占めていた。免疫組織学的染色法でも同様に、末梢血と脾臓ではＵ９３７細胞は検出されず、骨髄においてＵ９３７細胞の浸潤が確認された（データは示していない）。移植後１４日目のマウスにおいて、Ｕ９３７の浸潤をヒトＡＬＵ配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法による増幅させることにより検出したところ、試験した全ての臓器（骨髄、末梢血、大脳、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓および卵巣）においてＵ９３７の浸潤が確認された（図６ｂ−２）。
（２）抗ＶＬＡ４抗体がＵ９３７細胞を骨髄から末梢血に動員する
次いで、抗ＶＬＡ４抗体が骨髄に存在するＵ９３７を末梢血中へ動員させ得るか否かについて検討した。移植後１４日目のマウスに抗ＶＬＡ４抗体ＳＧ／１７（ＳＧ／１７株より産生される）（１ｍｇ）を腹腔投与後３時間および１２時間の時点で、骨髄および末梢血中のＵ９３７細胞数をフローサイトメトリーを用いて測定した。ＳＧ／１７抗体は、ＳＧ／７３と同様、ＶＬＡ４分子のα４インテグリン分子に結合することによりＶＬＡ４に対してアンタゴニストとして作用することを、本発明者らは予備的な実験により確認した（データは示していない）。
骨髄および末梢血中のＵ９３７細胞数はコントロールとして用いたアイソタイプ抗体（ＩｇＧ２ａκ）およびビヒクルのみの投与では、ほとんど変化しなかった。抗ＶＬＡ４抗体を投与すると、投与後３時間および１２時間のそれぞれの点において、投与前に比べて、骨髄中のＵ９３７細胞数はそれぞれ５２±１６％および６２±７％に減少し、末梢血中のＵ９３７細胞数はそれぞれ７６０±９７％、５９０±７５％に増加していた（データは示していない）。
以上の結果から、抗ＶＬＡ４抗体は骨髄から末梢血中へとＵ９３７細胞を動員する作用を有することが明らかとなった。即ち、抗ＶＬＡ４抗体により、骨髄におけるＡＭＬ細胞のＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用を介した細胞接着が阻害され、ＡＭＬ細胞が骨髄に留まることができず、末梢血に移動すると考えられ、ＡＭＬ細胞の骨髄への細胞接着は、ＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用に依存していることが示唆される。
（３）抗ＶＬＡ４モノクローナ抗体が、ＡＭＬモデルマウスの化学療法の治療効果を助長し得る
ＶＬＡ４アンタゴニストと化学療法の併用が、化学療法単独に比べて、ＡＭＬモデルマウの生存期間を延長することが可能か否かについて検討した。
上記移植後７日目のマウス（ＭＲＤのモデルマウス）を用いて抗ＶＬＡ４抗体ＳＧ／１７株と抗癌剤とを併用して投与した実験結果を図６ａに示す。ビヒクルと生理的食塩水の併用、コントロール抗体と生理的食塩水の併用、抗ＶＬＡ４抗体と生理的食塩水、ビヒクルと生理的食塩水に溶かしたＡｒａ  Ｃ（２０ｍｇ）、およびコントロール抗体と生理的食塩水に溶かしたＡｒａ  Ｃ（２０ｍｇ）のそれぞれを同時に静脈投与し、各実験群のマウスの平均生存期間を測定したところ、それぞれ２６日、２６日、２７日、３７日および３８日であった。したがって、Ａｒａ  Ｃ投与による上記モデルマウスの生存期間が有意に延長された。そこで、抗ＶＬＡ４抗体（１ｍｇ）をＡｒａ  Ｃを同時に静脈投与すると、Ａｒａ  Ｃ単独投与に比べて有意に生存期間が延長され、抗ＶＬＡ４抗体とＡｒａ  Ｃを投与した群では投与後６２日目の時点でも全マウスが生存していた。
即ち、抗ＶＬＡ４抗体は、Ａｒａ  Ｃとの併用投与により、Ａｒａ  Ｃの効果を助長させ、ＡＭＬマウスの生存期間を有意に延長させた。このことから、ＶＬＡ４アンタゴニストである抗ＶＬＡ４抗体は、化学療法と併用するための非常に有効な急性白血病治療薬としての用途が示唆される。
さらに、移植後７日目のマウスに対して、抗ＶＬＡ４抗体ＳＧ／１７株をＡｒａ  Ｃと併用することにより、骨髄のＭＲＤを根絶し得るか否かを検討した。即ち、移植後７日目のマウスに抗ＶＬＡ４抗体とＡｒａ  Ｃとを併用投与またはＡｒａ  Ｃを単独投与し、２４時間後の骨髄におけるＵ９３７の浸潤の有無をヒトＡＬＵ配列のＰＣＲを用いて検討した。ＰＣＲは前述の通り実施した。その結果、抗ＶＬＡ４抗体とＡｒａ  Ｃの併用投与で治療されたマウスの骨髄ではＵ９３７は消失していた（図６ｂ−３）。一方のコントロール抗体とＡｒａ  Ｃとの併用投与マウスでは、骨髄にＵ９３７が残存していた（図６ｂ−４）。また、上記投与後６２日目においても、ヒトＡＬＵ配列ＤＮＡは検出されず、Ｕ９３７細胞は存在していなかった。
一方、抗ＶＬＡ４抗体を単独で、コントロール抗体を単独で、またはコントロール抗体とＡｒａ  Ｃとを併用して投与されたマウスが後肢麻痺を起こした時点においては、いずれの実験群の全マウスにおいて例外なく、試験した全ての臓器（骨髄、末梢血、大脳、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓および卵巣）においてヒトＡＬＵ配列ＤＮＡが検出され、Ｕ９３７が存在していることが確認された（データは示していない）。
以上のことから、ＭＲＤを有するＶＬＡ４陽性のＡＭＬ症例においては抗ＶＬＡ４抗体を化学療法に併用投与する事でＭＲＤが根絶され、その予後が改善する可能性が示唆される。
実施例４：患者の急性白血病細胞におけるＶＬＡ４発現量と化学療法に対する応答性、完全寛解率、再発率、生存率、無病生存率における予後因子の解明
（１）化学療法に対する応答性
ＶＬＡ４の発現と抗癌剤感受性との関連を解明するため、上記３０人の患者のうちオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）で導入治療を行った５人の急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）患者を除く２５人の患者に限ってＶＬＡ４発現率と完全寛解率との関係を解析した。
まず、ＶＬＡ４陽性患者群とＶＬＡ４陰性患者群との間で、各種パラメーターに差がないことを確認する目的で統計学的な解析を行った。年令、白血球数および急性白血病細胞のミエロペルオキシダーゼ陽性率の比較にはｔ検定を用い、性別、ＦＡＢ分類、パフォーマンス状態および核型の比較にはＦｉｓｈｅｒ検定法を用いた。その結果、性別、年令だけでなく、これまでＡＭＬの危険因子［１，３，２１，２４］として報告されているＦＡＢ分類、パフォーマンス状態、白血球数、急性白血病細胞のミエロペルオキシダーゼ陽性率および核型の何れのパラメーターも両患者群の間で有意な差がないこと（いずれもＰ＞０．０５）が明らかとなった（表１参照）。
2003097097.tif 000003
上記２５人の患者の完全寛解率を検討したところ、１５人のＶＬＡ４陽性患者群の完全寛解率（６０％）はＶＬＡ４陰性患者群のそれ（１００％）に比べて有意に低かった（表２参照、表中＊；Ｐ＝０．０２９、Ｆｉｓｈｅｒ検定法による）。
2003097097.tif 000004
次に我々は、ＡＭＬの再発率について解析した。ＶＬＡ４陰性群では１例の再発も認められないのに対して、ＶＬＡ４陽性群では完全寛解（ＣＲ）を獲得した９症例中５例（５５．６％）に再発を認めた。即ち、ＶＬＡ４陽性群では、ＶＬＡ４陰性群に比べて、ＡＭＬの再発率が有意に高いことが判明した（表３参照、表中＊；Ｐ＝０．０１１，Ｆｉｓｈｅｒ検定法による）。
2003097097.tif 000005
図７ａに、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いた上記の３０人の患者のうち、ＡＰＬ患者以外の２５人全体の予測生存曲線とＶＬＡ４発現量により分類した患者群別の予測生存曲線を示す。２５症例全体の５年予測生存率は５２．２％であり、これまでの報告［１−３］と同等であった。
次にＶＬＡ４発現量により分類した患者群別の５年予測生存率は、１５例のＶＬＡ４陽性患者群の生存率は２５％であり、ＶＬＡ４陰性患者群は１００％であった。ＶＬＡ４陽性患者群では、ＶＬＡ４陰性患者群に比べてその５年予測生存率が有意に低かった（Ｐ＝０．００１１、対数ランク試験）。
次に５年無病生存率の解析結果を図７ｂに示す。上記５年生存率と同様に、ＶＬＡ４陽性患者群の５年無病生存率は４４．４％であり、ＶＬＡ４陰性患者群のそれ（１００％）に比べて、有意に（Ｐ＝０．００９４、対数ランク試験）に低かった。この結果は、上述の再発率の差を反映しているものと考えられる。
ところで、本研究においては、我々はＶＬＡ４のカットオフ値を３０％に設定して便宜的に患者をＶＬＡ４陽性とＶＬＡ４陰性に分類したが、ＶＬＡ４陽性患者群の中にも２年以上生存中の症例が存在した（ｎ＝４）。これら４名のＶＬＡ４の発現率を再確認したところ３７．８−６０．３％であり、２０名のＶＬＡ４陽性患者群の中では低い方から４名であった。
（２）完全寛解率、再発率、生存率、無病生存率における予後因子の解明
完全寛解率、再発率、生存率、無病生存率に影響を与えるパラメーターを解析する目的で、比例推測モデル（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｈａｚａｒｄ  ｍｏｄｅｌ）によるＣＯＸ解析によりパフォーマンス状態、ＦＡＢ分類、年令、白血球数、急性白血病細胞のミエロペルオキシダーゼ陽性率、核型、ＶＬＡ４発現の各パラメーターの検討を行ったが、上記モデルではデータが収束しない為、ステップワイズ判別分析モデルによる単変量解析と多変量解析を行った。
単変量解旋の結果、ＶＬＡ４のみが完全寛解の有無（Ｐ＝０．０２１）、再発の有無（Ｐ＝０．０４３）、長期生存の有無（Ｐ＝０．０００１）、長期無病生存の有無（Ｐ＝０．００４）についての予後因子として影響を与えることが確認された。
更に、単変量解析でＰ値が０．３０以下のパラメーターについて多変量解析を行った。その結果、ＶＬＡ４のみが完全寛解、再発率、長期生存、長期無病生存の予後因子になることが確認され、上述の単変量解析の結果が裏付けられた。
Ｓｍａｄｊａ−Ｊｏｆｆｅら［１３，１４］は、ＣＤ４４−６ｖがＡＭＬの予後不良因子であること、更に、ＣＤ４４−６ｖが抗癌剤によって引き起こされるアポトーシスを抑制することを報告している。そこで、ＣＤ４４とＶＬＡ４とをＡＭＬ症例の予後に対する影響について比較した。新鮮急性白血病細胞のＣＤ４４の発現を測定し得た９症例中６症例がＣＤ４４陽性であった。９症例中８症例がＣＲを獲得した。ＣＤ４４陽性の６症例は、全症例がＣＲを獲得した。ＣＲを獲得できなかった患者＃２３は、ＣＤ４４陰性であり治療開始後３ヵ月で死亡した。ＣＲを獲得した８症例の内、治療開始後最長で約３３ヶ月経過したが未だ一人も再発をきたしていない。完全寛解率はＣＤ４４陽性患者群で１００％，ＣＤ４４陰性患者群で６６．７％であり有意差を認めなかった（Ｐ＝０．３７５，Ｆｉｓｈｅｒ法）。再発率は、ＣＤ４４陽性患者群とＣＤ４４陰性患者群で共に０％であった（表４、表５参照）。上述のように、再発例が１例も存在しなかったため、両患者群の再発率の差を統計学的に解析することは不可能であった。３２ヵ月の時点での生存率は、ＣＤ４４陽性患者群が１００％であり、ＣＤ４４陰性患者群が６６．７％であり有意差を認めなかった（Ｐ＝０．１９６７，対数ランク試験）。以上の結果から、ＣＤ４４の発現は通常の化学療法を受ける患者の予後には影響を与えないと考えられ、ＣＤ４４ではなくＶＬＡ４がＡＭＬの予後不良因子であることが示唆された。
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以上の結果から、急性白血病細胞のＶＬＡ４発現率はその予後に多大な影響を与えることが判明した。ＶＬＡ４発現率が低い患者では化学療法による完全寛解率が高く、さらに完全寛解後の再発率は無いかまたは非常に低く、かつ生存率および無病生存率ともに高く、予後の経過も良好であることが推測できる。これに対して、ＶＬＡ４発現率が高い患者は、化学療法による完全寛解率が低く、完全寛解後の再発率が比較的高く、かつ生存率および無病生存率ともに低く、予後の経過により一層注意を払う必要がある。このように、急性白血病患者の急性白血病細胞のＶＬＡ４発現率を測定することは、急性白血病の診断および治療方法の選択における極めて有益な指標を提供する手段となり得ることが実証された。
産業上の利用の可能性
以上の実施例が明確に示すように、ＶＬＡ４アンタゴニストである抗ＶＬＡ４抗体により、ＶＬＡ４発現急性白血病細胞の抗癌剤に対する感受性を増強する効果を有する。したがって、ＶＬＡ４アンタゴニストを抗癌剤と併用して投与することが、急性白血病患者の治療、再発予防および良好な予後の維持に有効である。該アンタゴニストを含む組成物は、抗癌剤と併用するための、急性白血病の治療および／または予防薬として利用できる。
さらに、急性白血病患者の急性白血病細胞のＶＬＡ４発現率は、急性白血病の診断および治療方法の選択における極めて有益な指標となり得る。したがって、急性白血病患者の急性白血病細胞のＶＬＡ４発現率を測定することは、該患者の化学療法への応答性、その有効性、該患者の予後を予測するための有効な診断方法である。上記実施例において使用したマウス抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体は、上記診断のための試薬として非常に有用である。
本明細書に引用された全ての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする、また添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは、当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、化学療法感受性に対する細胞外マトリックスタンパク質の影響を示す図である。ａおよびｂは、急性白血病モデル細胞株Ｕ９３７細胞（ａ）およびＨＬ６０細胞（ｂ）におけるダウノルビシンに誘導される細胞傷害性への細胞外マトリックスタンパク質の影響を調べたものである。ｃおよびｄは、Ｕ９３７細胞（ｃ）およびＨＬ６０細胞（ｄ）におけるＡｒａ  Ｃに誘導される細胞傷害性への細胞外マトリックスタンパク質の影響を調べたものである。○：ＦＮ−コートプレート；□：ＶＣＡＭ１−コートプレート；●：ＢＳＡ−コートプレート。
図２は、急性白血病モデル細胞株が、ＶＬＡ４介在性のＦＮへの接着によって、抗癌剤に誘導される細胞傷害性およびアポトーシスを回避するが、ＶＬＡ５介在性のＦＮへの接着では、該回避が認められないことを示す図である。ａおよびｂは、Ｕ９３７細胞における、抗癌剤に誘導される細胞傷害性（ａ）およびアポトーシス（ｂ）に対するβ１インテグリン−ＦＮ間相互作用の影響を示す。ｃおよびｄは、ＨＬ６０細胞における、抗癌剤に誘導される細胞傷害性（ｃ）およびアポトーシス（ｄ）に対するＦＮの影響ならびにそれに対する抗ＶＬＡ４抗体または抗ＶＬＡ５抗体の作用を示す。ＦＮ−コートプレート（黒塗り）またはＢＳＡ−コートプレート（白塗り）内で細胞をＳＧ／７３抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体（ＶＬＡ４Ａｂ）、ＫＨ／７２抗ＶＬＡ５モノクローナル抗体（ＶＬＡ５Ａｂ）またはマウスＩｇＧ１（コントロール抗体）のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、さらに２４時間インキュベートした。ＦＮ−コートプレート中（斜線）またはＢＳＡ−コートプレート（ドット）内で細胞をＶＬＡ４Ａｂ、ＶＬＡ５Ａｂまたはコントロール抗体のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、培地にダウノルビシンを添加して２４時間インキュベートした。ＦＮ−コートプレート中（格子）またはＢＳＡ−コートプレート（横縞）内で細胞をＶＬＡ４Ａｂ、ＶＬＡ５Ａｂまたはコントロール抗体のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、培地にＡｒａ  Ｃを添加して２４時間インキュベートした。生細胞およびアネキシンＶ陽性アポトーシス性細胞を測定した。プレ（縦縞）は、インキュベーション前の生存ＡＭＬ細胞またはアポトーシス性ＡＭＬ細胞の比率である。有意差はｔ検定により求めた（＊：Ｐ＜０．０５）。
図３は、急性白血病モデル細胞株における抗癌剤に誘導されるアポトーシスのＦＮ−ＶＬＡ４間相互作用介在性阻害の機序についての解析データを示す図である。ａおよびｂは、Ｕ９３７細胞における、抗癌剤に誘導されるカスパーゼ３（ａ）およびカスパーゼ９（ｂ）の活性化に対するＦＮの影響ならびにそれに対する抗ＶＬＡ４抗体または抗ＶＬＡ５抗体の作用の測定結果を示している。ｃは、Ｕ９３７細胞における、抗癌剤に誘導される細胞内Ｂｃ１−２のダウンレギュレーションに対するＦＮの影響ならびにそれに対する抗ＶＬＡ４抗体または抗ＶＬＡ５抗体の作用の測定結果を示している。５回の実験を行ったがいずれも同様の結果を示した。ＦＮ−コートプレート（黒塗り）またはＢＳＡ−コートプレート（白塗り）内で細胞をＳＧ／７３抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体（ＶＬＡ４Ａｂ）、ＫＨ／７２抗ＶＬＡ５モノクローナル抗体（ＶＬＡ５Ａｂ）またはマウスＩｇＧ１（コントロール抗体）のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、さらに２４時間インキュベートした。ＦＮ−コートプレート中（ａおよびｂ中、斜線）またはＢＳＡ−コートプレート（ａおよびｂ中、ドット）内で細胞をＶＬＡ４Ａｂ、ＶＬＡ５Ａｂまたはコントロール抗体のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、培地にダウノルビシンを添加して２４時間インキュベートした。ＦＮ−コートプレート中（ａおよびｂ中、格子）またはＢＳＡ−コートプレート（ａおよびｂ中、横縞）内で細胞をＶＬＡ４Ａｂ、ＶＬＡ５Ａｂまたはコントロール抗体のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、培地にＡｒａ  Ｃを添加して２４時間インキュベートした。それぞれについて、カスパーゼ３陽性細胞（ａ）、カスパーゼ９活性および細胞内Ｂｃ１−２発現細胞を測定した。プレ（ａおよびｂ中、縦縞）は、インキュベーション前のカスパーゼ３陽性細胞およびカスパーゼ９活性のパーセントである。ａおよびｂにおける有意差はｔ検定により求めた（＊：Ｐ＜０．０５）。
図４は、患者由来の新鮮ＡＭＬ細胞は、ＶＬＡ４介在性のＦＮへの接着によって抗癌剤に誘導される細胞傷害性およびアポトーシスを回避するが、ＶＬＡ５介在性のＦＮへの接着では、該回避が認められないことを示す図である。ａおよびｂは、患者＃３由来の新鮮ＡＭＬ細胞における、抗癌剤に誘導される細胞傷害性（ａ）およびアポトーシス（ｂ）に対するＦＮの影響ならびにそれに対する抗ＶＬＡ４抗体または抗ＶＬＡ５抗体の作用を示す。ｃおよびｄは、患者＃３由来の新鮮ＡＭＬ細胞における、抗癌剤に誘導されるカスパーゼ３（ｃ）およびカスパーゼ９（ｄ）の活性化に対するＦＮの影響ならびにそれに対する抗ＶＬＡ４抗体または抗ＶＬＡ５抗体の作用を示す。ｅは、患者＃３由来の新鮮ＡＭＬ細胞における、抗癌剤に誘導される細胞内Ｂｃ１−２のダウンレギュレーションに対するβインテグリン−ＦＮ間相互作用の影響の測定結果を示している。５回の実験を行ったがいずれも同様の結果を示した。ＳＧ／７３抗ＦＮ−コートプレート（ａ〜ｄ中、黒塗り）またはＢＳＡ−コートプレート（（ａ〜ｄ中、白塗り）内で細胞をＳＧ／７３抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体（ＶＬＡ４Ａｂ）、ＫＨ／７２抗ＶＬＡ５モノクローナル抗体（ＶＬＡ５Ａｂ）またはマウスＩｇＧ１（コントロール抗体）のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、２４時間インキュベートした。ＦＮ−コートプレート中（（ａ〜ｄ中、斜線）またはＢＳＡ−コートプレート（（ａ〜ｄ中、ドット）内で細胞をＶＬＡ４Ａｂ、ＶＬＡ５Ａｂまたはコントロール抗体のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、培地にドウノルビシンを添加して２４時間インキュベートした。ＦＮ−コートプレート中（（ａ〜ｄ中、格子）またはＢＳＡ−コートプレート（（ａ〜ｄ中、横縞）内で細胞をＶＬＡ４Ａｂ、ＶＬＡ５Ａｂまたはコントロール抗体のいずれかを含む培地中で１時間プレインキュベートした後、培地にＡｒａ  Ｃを添加して２４時間インキュベートした。それぞれについて、生細胞率、アネキシンＶ陽性アポトーシス性細胞率、カスパーゼ３陽性細胞率、カスパーゼ９活性および細胞内Ｂｃ１−２発現細胞を測定した。プレ（（ａ〜ｄ中、縦縞）は、インキュベーション前の生細胞率、アポトーシス細胞、カスパーゼ３陽性細胞およびカスパーゼ９活性のパーセントである。ａ〜ｄにおける有意差はｔ検定により求めた（＊：Ｐ＜０．０５）。
図５は、新鮮ＡＭＬ細胞のＶＬＡ４発現率と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗癌剤による細胞傷害性との相関を示す図である。白丸はＢＳＡ−コートプレートを用いた時のデータで、黒丸はＦＮ−コートプレートを用いた時のデータである。ＦＮ−コートプレートを用いて実験した場合、患者由来のＡＭＬ細胞のダウノルビシン（ａ）またはＡｒａ  Ｃ（ｂ）で処理した後の細胞生存率とα４インテグリン陽性細胞の存在率との間には正の相関が認められた。一方、ＢＳＡ−コートプレートを用いた場合には、細胞生存率とα４インテグリン陽性細胞の存在率との間には全く相関を認めなかった。
図６は、Ｕ９３７細胞を移植したＳＣＩＤマウスにおける化学療法と、抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体を用いた抗細胞接着療法とを組合わせた結果を示す図である。ａは、Ｕ９３７細胞の移植後７日目に、ＳＧ／１７抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体（ＶＬＡ４Ａｂ）および／またはＡｒａ  Ｃで処理したＳＣＩＤマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存曲線である。細かい破線はビヒクルおよび通常の生理的食塩水で処理したマウス、白塗りの四角（□）はビヒクルおよびＡｒａ  Ｃで処理したマウス、実線はＩｇＧ２ａκ（コントロール抗体）および通常の生理的食塩水で処理したマウス、黒塗りの四角（■）はコントロール抗体およびＡｒａ  Ｃで処理したマウス、三角（▲）はＶＬＡ４  Ａｂおよび通常の生理的食塩水で処理したマウス、荒い破線はＶＬＡ４  ＡｂおよびＡｒａ  Ｃで処理したマウスである。下図ｂは、抗癌剤およびＶＬＡ４  Ａｂでの処理によるマウスの組織におけるＵ９３７の浸潤への影響を示している。ｂ−１）は、Ｕ９３７細胞の注射後７日目のＳＣＩＤマウスの各組織へのＵ９３７の浸潤を示し、ｂ−２）は、Ｕ９３７細胞の注射後１４日目のＳＣＩＤマウスの各組織へのＵ９３７の浸潤を示す。ｂ−３）は、Ｕ９３７細胞の注射後７日目のマウスをＶＬＡ４  ＡｂおよびＡｒａ  Ｃで処理した２４時間後の各組織へのＵ９３７の浸潤を示し、ｂ−４）はＵ９３７細胞の注射後７日目のマウスをコントロール抗体およびＡｒａ  Ｃで処理した２４時間後の各組織へのＵ９３７の浸潤を示す。ｂ５）は、Ｕ９３７細胞の注射後７日目のマウスをＶＬＡ４ＡｂおよびＡｒａ  Ｃで処理した６２日後の各組織へのＵ９３７の浸潤を示す。＊：Ｐ＜０．００１；＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
図７は、ＡＭＬ患者の生存率とＶＬＡ４の発現率の相関を示す図である。ａは、全体の生存率（＊：Ｐ＝０．００１１（対数ランクテスト）を示し、ｂは無病生存率（＊：Ｐ＝０．００９４（対数ランクテスト）を示す。
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【国際調査報告】
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