(57)【要約】本発明は、溶媒中において、ｔｅｒｔ−ロイシンと下記一般式（１）2003074470.tif 000010［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はハロゲン原子を表す。但し、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である化合物は含まない。］で表される置換ベンゼンスルホン酸とを反応させ下記一般式（２）2003074470.tif 000011［式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ置換基を表す。］で表されるｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩とした後、該塩を晶析により分離し、次いで該塩を分解することを特徴とするｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法に関する。本発明によれば、溶媒に対して難溶性となるｔｅｒｔ−ロイシン塩を形成させ、晶析することによりｔｅｒｔ−ロイシンを溶媒中より効率的に回収することができるｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法が提供される。
2003074470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中において、ｔｅｒｔ−ロイシンと下記一般式（１）
2003074470.tif 000007
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はハロゲン原子を表す。但し、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である化合物は含まない。］
で表される置換ベンゼンスルホン酸とを反応させ下記一般式（２）
2003074470.tif 000008
［式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ置換基を表す。］
で表されるｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩とした後、該塩を晶析により分離し、次いで該塩を分解することを特徴とするｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項２】
溶媒が水である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
晶析時の水溶媒のｐＨが０．１〜３．０である請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
ｔｅｒｔ−ロイシンが光学活性体である請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
下記一般式（２）で表されるｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩。
2003074470.tif 000009
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はハロゲン原子を表す。但し、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である化合物は含まない。］
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法及び該製造方法において中間体として得られる新規なｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩に関する。
背景技術
ｔｅｒｔ−ロイシンは非タンパク性のアミノ酸であり、特にその光学活性体は様々なペプチド系医薬品の合成原料として注目されている他、アミノ酸誘導体の不斉合成においても利用されている。
光学活性なｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法としては、化学合成で得られるラセミ体のｔｅｒｔ−ロイシンに光学分割剤を作用させ、生成するジアステレオマー塩を光学分割する方法が種々検討されてきた（例えば、▲１▼Ｔ．Ｔａｎａｂｅら、ブラチン  ザ  ケミカル  ソサエティ  オブ  ジャパン（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，４１，２１７８（１９６８））、▲２▼Ｔ．Ｍｉｙａｚａｗａら、同誌（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，５２，１５３９（１９７９））、▲３▼Ｄ．Ａ．Ｊａｅｇｅｒら、ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０１，７１７（１９７９）、▲４▼特公昭６３−５４７００号公報、▲５▼特開平５−２７１１６９号公報等参照）。
しかし、これらの方法は、光学純度の高い高価な光学分割剤を別途用意して使用しなければならず製造コストの面で必ずしも満足のいくものではなかった。
一方、このような高価な光学分割剤を必要としない方法として、酵素反応を適用し、直接的に光学活性なｔｅｒｔ−ロイシン又はその前駆体を製造する方法が検討されている。例えば、▲６▼２−オキソ−３，３−ジメチル−ブタン酸を酵素法によりアミノ化し、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを製造する方法（Ｇ．Ｋｒｉｘら、ジャーナル  オブ  バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，２９（１９９７））、特許３１８２３９７号公報、米国特許ＵＳ６１９７５５８Ｂ１号公報参照）や▲７▼ＤＬ−５−ｔｅｒｔ−ブチルヒダントインを酵素法によりＮ−カルバミル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換した後、カルバミル基を除去しＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを製造する方法（特開平７−２２２５９３号公報参照）などが報告されている。
このように酵素を使用する方法の場合、反応は通常水溶液中で行われるが、反応溶液中のｔｅｒｔ−ロイシンをいかにして効率的に回収するかについて、上記文献では何ら検討されていない。各種の夾雑物が共存する反応溶液からアミノ酸を分離するための工業的な方法としてはまず晶析により結晶として分離する方法が考えられるが、ｔｅｒｔ−ロイシンは水溶液に対する溶解度が高いため晶析により効率的に回収することが困難であった（例えば、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの水に対する溶解度は１２．７重量％（１０℃）、１Ｎ塩酸水溶液に対する溶解度は２０．４重量％（１０℃）である）。このように、ｔｅｒｔ−ロイシンを溶媒中、特に水溶液中から効率的に回収する方法が求められていた。
発明の開示
本発明は、溶媒中、特にｔｅｒｔ−ロイシンに対し良溶媒である水等に溶解したｔｅｒｔ−ロイシンを効率的に回収する方法、具体的には該溶媒に対して難溶性となるｔｅｒｔ−ロイシン塩を形成させ晶析することにより、ｔｅｒｔ−ロイシンを溶媒中より効率的に回収し、該塩を分解処理するｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者等は、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、溶媒中に溶解したｔｅｒｔ−ロイシンを特定の置換ベンゼンスルホン酸塩として晶析することで効率的にｔｅｒｔ−ロイシンを溶媒中より回収できることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は以下の内容を含むものである。
［１］  溶媒中において、ｔｅｒｔ−ロイシンと下記一般式（１）
2003074470.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はハロゲン原子を表す。但し、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である化合物は含まない。］
で表される置換ベンゼンスルホン酸とを反応させ下記一般式（２）
2003074470.tif 000004
［式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ置換基を表す。］
で表されるｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩とした後、該塩を晶析により分離し、次いで該塩を分解することを特徴とするｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
［２］  溶媒が水である上記［１］記載の製造方法。
［３］  晶析時の水溶媒のｐＨが０．１〜３．０である上記［２］記載の製造方法。
［４］  ｔｅｒｔ−ロイシンが光学活性体である上記［１］乃至［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］  下記一般式（２）で表されるｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩。
2003074470.tif 000005
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はハロゲン原子を表す。但し、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である化合物は含まない。］
発明の詳細な説明
以下本発明について、詳細に説明する。
本発明に用いられる一般式（１）で表される置換ベンゼンスルホン酸において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、アルキル基又はハロゲン原子を表すが、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である場合は除かれる。アルキル基としては、好ましくは炭素数が１から４のアルキル基であるメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられ、さらに好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。また、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。
特に好ましい置換ベンゼンスルホン酸（１）の例としては、Ｒ１又はＲ２の少なくとも一つがメチル基、エチル基、または塩素原子である化合物が挙げられる。具体的には、３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｍ−トルエンスルホン酸、ｐ−エチルベンゼンスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸等が挙げられ、好ましくは３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸等が挙げられる。
なお、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である化合物及びＲ１、Ｒ２の置換位置が異なる化合物は、ｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）の結晶を得ることが困難である。
置換ベンゼンスルホン酸（１）は、各種の置換ベンゼンをスルホン化することにより、工業的に容易に調製可能である。また、本発明においては、必ずしも精製された置換ベンゼンスルホン酸（１）を使用する必要はなく、置換ベンゼンをスルホン化した反応液のような粗製物を使用してもよい。また、使用形態は遊離酸として使用する他、本発明で使用する溶媒に可溶性の塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、または、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、あるいはアンモニウム塩等の有機塩基の塩、等の形態で使用してもよい。
本発明の方法に適用するｔｅｒｔ−ロイシンは光学活性体であるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンもしくはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシン、又はラセミ体、あるいはこれらの任意の量比の混合物のいずれでもよい。
本発明において、原料のｔｅｒｔ−ロイシンとして光学活性体を使用する場合、本発明の製造方法により得られるｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）及びｔｅｒｔ−ロイシンも原料と同じ光学活性体となる。また、原料にラセミ体を使用する場合も同様に、ｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）及びｔｅｒｔ−ロイシンはラセミ体が得られる。一方、原料として使用するｔｅｒｔ−ロイシンが、目的とする光学活性体の他、もう一方の光学活性体を一部含む場合、原料により多く含まれる光学活性体を目的物として得ることができ、光学純度の高いｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）及びｔｅｒｔ−ロイシンを得ることも可能である。光学純度を向上させる目的で本発明の方法を使用する場合、原料ｔｅｒｔ−ロイシン中の目的とする光学活性体の含量は、全ｔｅｒｔ−ロイシンに対して好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、さらに好ましくは７５重量％以上であることが好ましい。
本発明に使用される溶媒は、ｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）が難溶性となる溶媒であれば特に限定されない。本発明の方法は、特にｔｅｒｔ−ロイシンに対しては良溶媒であるがｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）に対しては貧溶媒として働く溶媒に対して好ましく適用される。このような溶媒としては、例えば水、又はメタノール、エタノール等の水と混和する溶媒と水との混合溶媒等が挙げられる。
本発明の製造方法においては、まず適当な溶媒中でｔｅｒｔ−ロイシンと置換ベンゼンスルホン酸（１）を反応させ、ｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩を形成させ、該塩を晶析により分離する。
塩形成反応において、添加順序は特に限定はなく、例えば、溶媒中に溶解したｔｅｒｔ−ロイシンに置換ベンゼンスルホン酸（１）（またはその溶液）を添加する；溶媒中にｔｅｒｔ−ロイシンおよび置換ベンゼンスルホン酸（１）（またはそれらの溶液）を同時にまたは順次添加する；溶媒中に溶解した置換ベンゼンスルホン酸（１）にｔｅｒｔ−ロイシン（好ましくはその溶液）を添加する等のいずれであってもよい。
本発明で使用される置換ベンゼンスルホン酸（１）の使用量は、特に限定されないが、ｔｅｒｔ−ロイシンに対して通常０．５〜２．０倍モル量、好ましくは０．９〜１．２倍モル量の範囲で使用される。
形成された塩の晶析方法は特に限定されず、例えば、ｔｅｒｔ−ロイシン及び置換ベンゼンスルホン酸（１）を必要により加熱して溶解し、静置又は攪拌下に冷却晶析する方法、または適当な温度条件下で濃縮晶析する方法等が挙げられる。
濃縮晶析を行う場合であって溶媒中に溶解したｔｅｒｔ−ロイシンに置換ベンゼンスルホン酸（１）を添加する場合、置換ベンゼンスルホン酸（１）は、濃縮の前後あるいは濃縮中のどの段階で加えてもよい。
晶析の際の温度は、使用する溶媒の凝固点から沸点まで可能であるが、例えば水を溶媒として使用した場合、好ましい温度範囲は５℃から８０℃である。晶析の際のｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）の濃度は特に限定されないが、好ましくは溶媒に対して５〜７０重量％の範囲である。
水を溶媒として使用する場合、ｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）を効率的に晶析するため、晶析時のｐＨを３以下とするのが好ましい。より好ましいｐＨ範囲はｐＨ０．１〜３．０であり、更にｐＨ０．１〜２．５の範囲が好ましく、特にｐＨ０．５〜２．０の範囲が好適である。ｐＨの調整を行う場合に、ｐＨ調整は塩を形成させる前後、あるいは晶析時等、いずれの時に行ってもよい。ｐＨ調整に使用する酸も特に限定されないが、例えば塩酸、硫酸等の無機酸が好適に用いられる。
晶析の際には必要により種晶を添加してもよい。例えば、原料として使用するｔｅｒｔ−ロイシンが、目的とする光学活性体の他、もう一方の光学活性体を一部含む場合に、目的とする光学活性体の析出をより容易にさせ、光学純度を高める等の目的で、所望の光学活性体と同種の結晶を接種することもできる。
晶析工程で析出したｔｅｒｔ−ロシシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）の結晶は濾過、遠心分離等の通常の固液分離法によって容易に分離することができる。また、分離された結晶は、必要に応じて洗浄、脱水、再結晶等の操作により更に精製を行ってもよい。
このようにして得られたｔｅｒｔ−ロシシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）の結晶を分解処理することにより、ｔｅｒｔ−ロイシンを得ることができる。分解処理は当業者に公知の方法に従って行えばよく、例えば、該塩を水、アルコール類の単独溶媒またはこれらの混合溶媒に溶解あるいは懸濁させ、水酸化ナトリウム、アンモニア、トリエチルアミンまたはピリジンのような塩基で中和する方法、あるいは該塩の水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液するか、又は強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムに通液した後アンモニアで溶離し、得られた貫流液又は溶離液を減圧留去又は晶析する方法等を挙げることができる。
得られたｔｅｒｔ−ロイシンは必要によりアルコール等の適当な溶媒を用いて再結晶によりさらに精製することもできる。
なお置換ベンゼンスルホン酸（１）は化学的に安定な化合物であるので、塩分解後の母液、または樹脂処理の溶離液あるいは貫流液から回収して再利用することもできる。
本発明の製造方法は、例えば、ｔｅｒｔ−ロイシンを酵素を用いて製造する場合等、水が溶媒として用いられる系に特に好ましく用いられる。この場合、酵素法により得られたｔｅｒｔ−ロイシンを含む反応溶液、あるいは酵素法によりｔｅｒｔ−ロイシンの前駆体を得、これをｔｅｒｔ−ロイシンに誘導したｔｅｒｔ−ロイシンを含む反応溶液に、置換ベンゼンスルホン酸（１）を添加し、上述したような晶析方法により晶析を行い、ｔｅｒｔ−ロイシン・置換ベンゼンスルホン酸塩（２）の結晶を得ることができる。この際、酵素反応溶液等に含まれる夾雑物も効率的に淘汰されるため、ｔｅｒｔ−ロイシンを選択的に分離あるいは精製する方法として極めて有用な方法となる。
実施例
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜ＨＰＬＣ分析条件１＞
［カラム］イナートシル  ＯＤＳ−２（４．６φ×２５０ｍｍ）
［カラム槽温度］４０℃
［移動層］Ａ液：０．１ｍｏｌ／ｌ  リン酸二水素カリウム（ｐＨ２．８）−アセトニトリル（９５：５）、Ｂ液：０．１ｍｏｌ／ｌ  リン酸二水素カリウム（ｐＨ２．８）−アセトニトリル（５０：５０）
［グラジェントプログラム］：
2003074470.tif 000006
［流速］１．０ｍｌ／ｍｉｎ
［検出］ＵＶ  ２１０ｎｍ
＜ＨＰＬＣ分析条件２＞
［カラム］ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６φ×１５０ｍｍ）
［カラム槽温度］３０℃
［移動層］２ｍｍｏｌ／ｌ  硫酸銅水溶液−メタノール（９０：１０）
［流速］１．０ｍｌ／ｍｉｎ
［検出］ＵＶ  ２５４ｎｍ
＜実施例１＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析（１）
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１０モル）を１Ｎ塩酸水溶液１０ｍｌに４０℃で溶解させた。得られた溶液に同温で濃度５１．９重量％の３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸水溶液（他に遊離硫酸４．４重量％、２，３−ジメチルベンゼンスルホン酸４．７重量％対３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸重量、ジキシリルスルホン０．１９重量％対３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸重量及びキシレン０．０６重量％対３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸重量を含有）４．０１ｇ（０．０１１モル）を添加し、１０℃で一晩晶析した。析出結晶を濾過し、５５℃で２時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩２．８７ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．０重量％であり、回収率は９０．０％であった。
＜実施例２＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析（２）
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１０モル）及び３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩２．０８ｇ（０．０１０モル）を１Ｎ塩酸水溶液１０ｍｌに８０℃で溶解させた。得られた溶液を１０℃で一晩晶析した。析出結晶を濾過し、５５℃で１４時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩２．７０ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．２重量％であり、回収率は８４．９％であった。
＜比較例１＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・２，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１０モル）を１Ｎ塩酸水溶液１０ｍｌに４０℃で溶解させた。得られた溶液に同温で２，４−ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩２．０８ｇ（０．０１０モル）を添加し、１０℃で一晩晶析した。しかし、結晶の析出は確認されなかった。
＜比較例２＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ベンゼンスルホン酸塩の晶析
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１０モル）及びベンゼンスルホン酸一水和物１．７６ｇ（０．０１０モル）を１Ｎ塩酸水溶液１０ｍｌに５５℃で溶解させ、１０℃で一晩晶析した。しかし、結晶の析出は確認されなかった。
＜比較例３＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの晶析
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１０モル）を１Ｎ塩酸水溶液１０ｍｌに４０℃で溶解させた後、１０℃で一晩晶析した。しかし、結晶の析出は確認されなかった。
＜参考例１＞
Ｎ−カルバミル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの脱カルバミル化反応
ガス出口、攪拌機、温度計及び反応容器下部に達する導入管を備えた５００ｍｌの四つ口フラスコに、Ｎ−カルバミル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１５．０ｇ（０．０８６モル）と純水２５０ｍｌを仕込み、本スラリーを４０℃まで加温し暫く攪拌した。ここに攪拌下３５重量％塩酸３４．７ｇを添加した後、さらに亜硝酸ナトリウム６．２６ｇを含有する亜硝酸ナトリウム水溶液３１．３ｇを、導入管から定量ポンプを用いて４５分間かけて添加した。添加終了後、同温で１１時間攪拌反応させた。本反応により反応液３２８ｇが得られた。この反応液をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は３．１２重量％であり、収率は９０．６％であった。
＜実施例３＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析及びＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造（１）
参考例１で得られた反応液３２２ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．０７７モル含有）を、減圧濃縮して８０．０ｇの濃縮液を得た。ここに実施例１で使用したのと同一の３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸水溶液３０．４ｇ（３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸０．０８５モル含有）を添加した後、９０℃で均一溶液とした。本溶液を７０℃まで徐冷した後、７０℃から１０℃まで１２時間かけて冷却し、さらに１０℃で１３時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水４ｍｌ及びアセトニトリル３０ｍｌで洗浄後、４０℃で２時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩２０．６ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．０重量％であり、回収率は８３．９％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。さらに、粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、図１に示したような粉末Ｘ線回折図であった。融点は２３０〜２３５℃（分解）であった。
得られた塩５．８４ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．０１８モル含有）を３０℃で純水１６０ｍｌに溶解し、ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学株式会社の商品名）イオン交換樹脂（Ｈ＋型）３０ｍｌを充填したカラムに空間速度（ＳＶ）２で通液し、さらに純水６０ｍｌで洗浄して貫流液及び洗液に３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸を回収した。ＨＰＬＣ分析条件１で分析したところ、３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸の回収率は定量的であった。次に５重量％アンモニア水９０ｍｌで溶離し、さらに純水９０ｍｌで洗浄して溶離液及び洗液を合わせてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収した。溶離画分１７９ｇが得られ、ＨＰＬＣ分析条件１で分析したところ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は１．３３重量％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの回収率は定量的であった。続いて溶離画分を６．９９ｇまで５０℃で減圧濃縮した後、イソプロピルアルコール７０ｍｌを加え、７０℃に昇温して１０分間攪拌した後、１０℃に冷却して３時間晶析した。析出結晶を濾過し、６０℃で４時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン２．３２ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は９９．３重量％であり、塩に対する回収率は９６．５％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。
別途、得られた塩９．５２ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．０３０モル含有）を４５℃で純水２００ｍｌに溶解し、ダイヤイオンＷＡ３０（三菱化学株式会社の商品名）イオン交換樹脂（ＯＨ−型）３０ｍｌを充填したカラムに空間速度（ＳＶ）２で通液し、さらに純水６０ｍｌで洗浄して貫流液及び洗液を合わせてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収した。貫流画分２７４ｇが得られ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は１．４２重量％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの回収率は定量的であった。続いて貫流画分を１１．９ｇまで５０℃で減圧濃縮した後、イソプロピルアルコール９０ｍｌを加え、７０℃に昇温して１０分間攪拌した後、１０℃に冷却して１７時間晶析した。析出結晶を濾過し、６０℃で４時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．７９ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は９９．９重量％であり、塩に対する回収率は９７．０％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。次に５重量％アンモニア水９０ｍｌで溶離し、さらに純水９０ｍｌで洗浄して溶離液及び洗液に３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸を回収した。ＨＰＬＣ分析条件１で分析したところ、３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸の回収率は定量的であった。
＜実施例４＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析及びＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造（２）
純水４５ｍｌにＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．００ｇ（０．０２３モル）、Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．９４ｇ（０．００７モル）及び実施例１で使用したのと同一の３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸水溶液８．２２ｇ（３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸０．０２３モル含有）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を６０℃まで徐冷した後、実施例２で得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩０．２１８ｇを種晶として添加し、６０℃から１０℃まで１０時間かけて冷却し、さらに１０℃で１５時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水４ｍｌ及びアセトニトリル２０ｍｌで洗浄後、４０℃で３時間減圧乾燥してｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩４．８４ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．３重量％であり、用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対する回収率は６４．７％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は９６．７％ｅｅであった。さらに得られた結晶４．５０ｇに純水１０ｍｌを加えて９０℃で溶解させた後、１０℃で一晩晶析した。析出結晶を濾過し、冷水２ｍｌ及びアセトニトリル２０ｍｌで洗浄後、６０℃で３時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩３．８３ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．３重量％であり、回収率は８５．０％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、その粉末Ｘ線回折図は図１に示したのと同様であった。融点は２２９〜２３４℃（分解）であった。
得られた塩３．８１ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．０１２モル含有）を４５℃で純水８０ｍｌに溶解し、ダイヤイオンＷＡ３０（三菱化学株式会社の商品名）イオン交換樹脂（ＯＨ−型）３０ｍｌを用いて実施例３と同様に処理し、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収した。貫流画分１５１ｇが得られ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は１．００重量％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの塩に対する回収率は９５．８％であった。続いて貫流画分を９．３３ｇまで５０℃で減圧濃縮した後、イソプロピルアルコール７２ｍｌを加え、７０℃に昇温して３０分間攪拌した後、１０℃に冷却して４時間晶析した。析出結晶を濾過し、６０℃で４時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３３ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は９９．４重量％であり、回収率は８７．９％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。
＜実施例５＞
Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析及びＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造
１Ｎ塩酸水溶液１０ｍｌにＤ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１０モル）及び実施例１で使用したのと同一の３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸水溶液３．５８ｇ（３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸０．０１０モル含有）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃まで徐冷した後、さらに１０℃で２３時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水１ｍｌ及びアセトニトリル５ｍｌで洗浄後、４０℃で３時間減圧乾燥してＤ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩２．５４ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．２重量％であり、回収率は８０．０％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、図２に示したような粉末Ｘ線回折図であった。融点は２３０〜２３５℃（分解）であった。
得られた塩１．８２ｇ（Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．００６モル含有）を４５℃で純水３９ｍｌに溶解し、ダイヤイオンＷＡ３０（三菱化学株式会社の商品名）イオン交換樹脂（ＯＨ−型）３０ｍｌを用いて実施例４と同様に処理し、Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収した。貫流画分１１０ｇが得られ、Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は０．６８２重量％であり、Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシンの回収率は定量的であった。続いて貫流画分を５０℃で濃縮乾固した後、さらに６０℃で４時間減圧乾燥してＤ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．７５１ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は９９．４重量％であり、塩に対する回収率は９９．５％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。
＜実施例６＞
Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析及びＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造
純水１０ｍｌにＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１０モル）及び実施例１で使用したのと同一の３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸水溶液３．５８ｇ（３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸０．０１０モル含有）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃まで徐冷した後、さらに１０℃で２１時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水１ｍｌ及びアセトニトリル５ｍｌで洗浄後、４０℃で３時間減圧乾燥してＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩２．４２ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．３重量％であり、回収率は７６．４％であった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、図３に示したような粉末Ｘ線回折図であった。融点は２１２〜２１８℃（分解）であった。
得られた塩１．８０ｇ（Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．００６モル含有）を４５℃で純水５０ｍｌに溶解し、ダイヤイオンＷＡ３０（三菱化学株式会社の商品名）イオン交換樹脂（ＯＨ−型）３０ｍｌを用いて実施例４と同様に処理し、Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収した。貫流画分１２３ｇが得られ、Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は０．６０６重量％であり、Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの回収率は定量的であった。続いて貫流画分を５０℃で濃縮乾固した後、さらに６０℃で４時間減圧乾燥してＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．７４５ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は９９．４重量％であり、塩に対する回収率は９９．６％であった。
＜実施例７＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−トルエンスルホン酸塩の晶析
純水１８ｍｌにＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．９４ｇ（０．０３０モル）及びｐ−トルエンスルホン酸一水和物５．７１ｇ（０．０３０モル）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃まで徐冷した後、さらに１０℃で２４時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水２ｍｌ及びアセトニトリル１５ｍｌで洗浄後、４０℃で３時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−トルエンスルホン酸塩５．６１ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４３．２重量％であり、回収率は６１．５％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、図４に示したような粉末Ｘ線回折図であった。融点は２２７〜２３３℃（分解）であった。
＜実施例８＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｍ−トルエンスルホン酸塩の晶析
純水１５ｍｌにＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．９４ｇ（０．０３０モル）及びｍ−トルエンスルホン酸一水和物５．７１ｇ（０．０３０モル）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃まで徐冷した後、さらに１０℃で２０時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水１ｍｌ及びアセトニトリル１５ｍｌで洗浄後、４０℃で５時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｍ−トルエンスルホン酸塩５．３４ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４３．２重量％であり、回収率は５８．６％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、図５に示したような粉末Ｘ線回折図であった。融点は２１７〜２２０℃（分解）であった。
＜実施例９＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−エチルベンゼンスルホン酸塩の晶析
純水１５ｍｌにＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．９４ｇ（０．０３０モル）及びｐ−エチルベンゼンスルホン酸５．６０ｇ（０．０３０モル）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃まで徐冷した後、さらに１０℃で１８時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水２ｍｌ及びアセトニトリル１５ｍｌで洗浄後、４０℃で５時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−エチルベンゼンスルホン酸塩７．４２ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．３重量％であり、回収率は７７．８％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、図６に示したような粉末Ｘ線回折図であった。融点は２２１〜２２６℃（分解）であった。
＜実施例１０＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−クロロベンゼンスルホン酸塩の晶析
純水１２ｍｌにＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．９４ｇ（０．０３０モル）及びｐ−クロロベンゼンスルホン酸５．７９ｇ（０．０３０モル）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃まで徐冷した後、さらに１０℃で１８時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水２ｍｌ及びアセトニトリル１５ｍｌで洗浄後、４０℃で５時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−クロロベンゼンスルホン酸塩５．６５ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は３９．５重量％であり、回収率は５６．６％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、図７に示したような粉末Ｘ線回折図であった。融点は２１４〜２１７℃（分解）であった。
＜実施例１１＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析及びＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造（３）
純水３０ｍｌにＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．９４ｇ（０．０３０モル）、Ｌ−アラニン０．４９ｇ（０．００６モル）、Ｌ−アスパラギン酸０．１２ｇ（０．００１モル）、Ｌ−グルタミン酸０．４６ｇ（０．００３モル）及び実施例１で使用したのと同一の３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸水溶液１０．７８ｇ（３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸０．０３０モル含有）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃で２４時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水８ｍｌで洗浄後、６０℃で３時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩７．６３ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．３重量％であり、用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対する回収率は８０．０％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。さらにアミノ酸アナライザーで分析したところ、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−グルタミン酸の含量は、いずれも０．１重量％以下であった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、その粉末Ｘ線回折図は図１に示したのと同様であった。融点は２３０〜２３５℃（分解）であった。
得られた塩４．２８ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン０．０１３モル含有）を７０℃で純水１００ｍｌに溶解し、ダイヤイオンＷＡ３０（三菱化学株式会社の商品名）イオン交換樹脂（ＯＨ−型）３０ｍｌを用いて実施例３と同様に処理し、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収した。貫流画分１５９ｇが得られ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は１．０９重量％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの塩に対する回収率は９７．５％であった。続いて貫流画分を７．５８ｇまで５０℃で減圧濃縮した後、イソプロピルアルコール４５ｍｌを加え、７０℃に昇温して３０分間攪拌した後、１０℃に冷却して３時間晶析した。析出結晶を濾過し、６０℃で４時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．５４ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は９９．３重量％であり、回収率は８８．６％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。さらにアミノ酸アナライザーで分析したところ、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−グルタミン酸は検出されなかった。
＜実施例１２＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析（３）
純水３０ｍｌにＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．９４ｇ（０．０３０モル）、Ｌ−アラニン１．０４ｇ（０．０１２モル）及び実施例１で使用したのと同一の３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸水溶液１０．７８ｇ（３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸０．０３０モル含有）を添加した後、８０℃で均一溶液とした。本溶液を１０℃で２４時間晶析した。析出結晶を濾過し、冷水４ｍｌ及びアセトニトリル１５ｍｌで洗浄後、６０℃で３時間減圧乾燥してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩７．４２ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．３重量％であり、用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対する回収率は７７．８％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。さらにアミノ酸アナライザーで分析したところ、Ｌ−アラニンは検出されなかった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、その粉末Ｘ線回折図は図１に示したのと同様であった。融点は２３０〜２３５℃（分解）であった。
＜実施例１３＞
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の晶析（４）
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．９４ｇ（０．０３０モル）、Ｌ−アラニン１．４１ｇ（０．０１２モル）に、Ｌ−グルタミン酸０．５１ｇ（０．００３モル）を追加した以外は実施例１２と同様に実施し、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩７．０８ｇを得た。この結晶をＨＰＬＣ分析条件１で分析したところＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの含量は４１．２重量％であり、用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対する回収率は７４．０％であった。また、ＨＰＬＣ分析条件２で分析したところ、光学純度は１００％ｅｅであった。さらにアミノ酸アナライザーで分析したところ、Ｌ−アラニン及びＬ−グルタミン酸の含量は、いずれも０．１重量％以下であった。粉末Ｘ線回折法（線源としてＣｕＫα線使用）で測定したところ、その粉末Ｘ線回折図は図１に示したのと同様であった。融点は２３０〜２３５℃（分解）であった。
産業上の利用可能性
本発明によれば、水等のｔｅｒｔ−ロイシンに対する良溶媒中に溶解したｔｅｒｔ−ロイシンを特定の置換ベンゼンスルホン酸塩として晶析し、該塩を分解処理することでｔｅｒｔ−ロイシンを効率的に製造することができる。特に、本発明の方法は酵素反応溶液等の夾雑物を含む水溶液中からｔｅｒｔ−ロイシンを選択的に分離あるいは精製する目的で好適に用いることができる。また置換ベンゼンスルホン酸は精製して用いる必要もなく、安価であるため、本発明の方法は工業的にも優れた方法である。
本出願は、日本で出願された特願２００２−６１０８２を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の粉末Ｘ線回折図である。
図２は、Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の粉末Ｘ線回折図である。
図３は、Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・３，４−ジメチルベンゼンスルホン酸塩の粉末Ｘ線回折図である。
図４は、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−トルエンスルホン酸塩の粉末Ｘ線回折図である。
図５は、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｍ−トルエンスルホン酸塩の粉末Ｘ線回折図である。
図６は、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−エチルベンゼンスルホン酸塩の粉末Ｘ線回折図である。
図７は、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ｐ−クロロベンゼンスルホン酸塩の粉末Ｘ線回折図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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