(57)【要約】本発明は、高い比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値が小さく、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広く、作用温度、作用ｐＨの範囲が広く、かつ、ハロケトン化合物の酵素的還元反応系に共存させた場合でも失活することなく、補酵素を効率的に再生できるギ酸脱水素酵素を提供する。土壌よりギ酸脱水素酵素生産菌を探索し、上記の工業的利用に適した性質を有する酵素を提供する。また、本酵素の遺伝子を含むＤＮＡ、ベクターとの組換えＤＮＡ及びこのプラスミドによる形質転換体を提供する。さらに、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌株あるいは本菌株由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を用いた形質転換体による本ギ酸脱水素酵素の製造方法、及び、当該酵素を用いた酵素的還元系における補酵素再生方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハロケトン化合物に対して耐性を有し、かつ、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の理化学的性質を有することを特徴とするポリペプチド：
（１）作用：ＮＡＤを補酵素として、ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
（２）分子量：約９×１０４、
（３）ギ酸に対するＫｍ値：１．６ｍＭ、
（４）ＮＡＤに対するＫｍ値：０．０４８ｍＭ、
（５）作用温度の範囲：２０℃〜６５℃、至適温度５０℃〜６０℃、
（６）作用ｐＨの範囲：５．０〜１０．５、至適ｐＨ５．５〜９．５、
（７）温度安定性：５０℃以下、
（８）ｐＨ安定性：４．５〜９．０。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
ハロケトン化合物に対して耐性を有する請求の範囲第２又は３項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物に由来する請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
微生物が、チオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）である請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ｃ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡ：
（ｅ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列表配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求の範囲第７〜９項のいずれかのＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項１１】
ベクターがｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＣ１０１、又は、ｐＵＣＮＴである請求の範囲第１０項記載の組換えプラスミド。
【請求項１２】
組換えプラスミドがｐＦＴ００１である請求の範囲第１０又は１１項に記載の組換えプラスミド。
【請求項１３】
組換えプラスミドがｐＦＴ００２である請求の範囲第１０又は１１項に記載の組換えプラスミド。
【請求項１４】
請求の範囲第１０〜１３項のいずれかに記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１５】
宿主微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から選ばれた微生物である請求の範囲第１４項記載の形質転換体。
【請求項１６】
宿主微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求の範囲第１４項記載の形質転換体。
【請求項１７】
宿主微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１である請求の範囲第１４項記載の形質転換体。
【請求項１８】
形質転換体がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７２）又はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）である請求の範囲第１４項記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするギ酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項２０】
微生物がチオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物である請求の範囲第１９項記載の製造方法。
【請求項２１】
微生物がチオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）である請求の範囲第２０項記載の製造方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１４〜１８項のいずれかに記載の形質転換体を培養し、培養物中にギ酸脱水素酵素を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするギ酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項２３】
酵素的還元反応系に、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する微生物あるいはその処理物を共存させて補酵素を再生する方法。
【請求項２４】
酵素的還元反応が、ハロケトン化合物の酵素的還元反応である請求の範囲第２３項記載の方法。
【請求項２５】
ハロケトン化合物が、α−ハロケトン化合物である請求の範囲第２４項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ハロケトン化合物に対して耐性を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、その遺伝子、及び、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたギ酸脱水素酵素の製造方法、及び、酵素的還元反応系に当該酵素を共存させて補酵素を効率良く再生する方法に関するものである。
背景技術
ギ酸脱水素酵素（酵素番号［ＥＣ１．２．１．２］）は、ギ酸と酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ）より、二酸化炭素と還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）を生成する反応を触媒する酵素である。ギ酸脱水素酵素は、ＮＡＤＨ依存型の酵素反応において補酵素再生に利用した場合、安価なギ酸を利用できること、副産物が二酸化炭素であり系内に蓄積しないこと等の利点をもつ有用な酵素である。さらに、ギ酸、ＮＡＤに対するＫｍ値が小さい酵素は低基質濃度で有効に作用し、また、ギ酸の特異的な微量定量へも利用可能である等、産業上有用な酵素である。
ギ酸脱水素酵素は、高等植物、メタノール資化性酵母、細菌等においてその存在が知られている。酵素が精製され、性質が調べられているものとしては、高等植物であるエンドウ豆由来の酵素（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７７，８４５，１９７５）や、メタノール資化性酵母であるキャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６２，１５１，１９７６）、キャンディダ・メチリカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔｈｙｌｉｃａ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１５２，６５７，１９８５）、キャンディダ・メタノリカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．４８，１３９，１９８７）、クロイッケラ・スピーシーズ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ  ｓｐ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３８，１１１，１９７４）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ：ｖｏｌ．４７，２５４７，１９８３）、リポマイセス・メタノシルビエンシス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｔｈａｎｏｓｉｌｖｉｅｎｓｉｓ：特開昭６０−２４１８８７号公報）等に由来する酵素を挙げることができる。しかし、これらの酵素はいずれも、比活性が低い、ギ酸あるいはＮＡＤに対するＫｍ値が大きい、あるいは作用ｐＨ域が狭い等、工業的な利用には問題を有していた。
また、細菌由来で精製されて性質が明らかにされている酵素もいくつか存在するが、それぞれ工業上の利用には問題点を有している。例えば、シュードモナス・スピーシーズ  １０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１０１：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．９９，５６９，１９７９参照）、及び、シュードモナス・オキザラティカス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．８３，４８５，１９７８）由来の酵素は、比活性は比較的高いが、安定剤非存在下では不安定である。モラキセラ・スピーシーズ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７０，３１８９，１９８８，特開昭６３−３１３５８０号公報）由来の酵素は、比活性が低くギ酸に対するＫｍ値が大きい。ハイホマイクロビウム・スピ−シーズ（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．：特開２０００−７８９７０号公報，１９９９年農芸化学会大会発表、１９９９年農芸化学会大会講演要旨２３４ページ）由来の酵素は、比活性が低く作用ｐＨ域が狭い。また、パラコッカス・スピーシーズ（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．：特開平３−６１４８１号公報参照）はギ酸に対するＫｍ値が大きい。
さらに、ハロケトン化合物を還元して得られる生成物（例えば、ハロアルコール等）は、医薬品等の原料として非常に有用な化合物であるが、従来報告されているギ酸脱水素酵素は、いずれもハロケトン化合物が存在すると失活し、ハロケトン化合物の酵素的還元反応系に添加しても補酵素の再生をなし得ないという点も問題であった。ハロケトン化合物の酵素的還元反応系において効率良く補酵素を再生できるギ酸脱水素酵素は現在まで知られていない。
なお、細菌由来のギ酸脱水素酵素としては、ＮＡＤを電子受容体としないもの（酵素番号［ＥＣ１．２．２．１］）、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５０，６６９３，１９７５）、クロストリジウム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５９，３７５，１９８４）、クロストリジウム・サーモアセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５９，１８２６，１９８３）等に由来する酵素も知られているが、これらは補酵素ＮＡＤＨの再生目的には利用できない。
細菌由来のＮＡＤ依存型ギ酸脱水素酵素遺伝子の形質転換体での発現に関しては、シュードモナス・スピーシーズ  １０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１０１：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１８，２０１，１９９３）、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．４４，４７９，１９９５，特開平１０−２３８９６号公報）、パイロコッカスＫＯＤ１（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＫＯＤ１：特開２０００−６９９７１号公報）、ハイホマイクロビウム・スピ−シーズ（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．：特開２０００−７８９７０号公報，１９９９年農芸化学会大会発表、１９９９年農芸化学会大会講演要旨２３４ページ）由来の遺伝子について知られているが、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のギ酸脱水素酵素遺伝子については知られていない。
チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌に関しては、粗酵素液の状態でギ酸脱水素酵素活性があることは知られているものの（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３１，３８９（１９７７））、酵素を精製、単離した報告や性質を明らかにした報告はこれまでになく、また、遺伝子の単離についても報告はなされていない。
発明の要約
本発明は、上記のような従来知られているギ酸脱水素酵素の問題点、即ち、酵素の生産性が低い、比活性が低い、ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値が大きい、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が狭い、作用ｐＨの範囲が狭い等の問題を解決し、かつ、ハロケトン化合物に対して高い耐性を有する工業的に利用可能な優れた性質をあわせもつギ酸脱水素酵素及びその製造方法を提供するものである。また、酵素的還元反応、とりわけ、従来のギ酸脱水素酵素に対しては失活をもたらすようなハロケトン化合物の酵素的還元反応系においても、補酵素を効率良く再生する方法を提供するものである。
本発明者らは上記課題に鑑み、広く土壌よりギ酸脱水素酵素活性を有する微生物を探索した結果、優れた性質を有するギ酸脱水素酵素を高生産するチオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を新たに分離した。そして、当該微生物からギ酸脱水素酵素を単離、精製し、ギ酸脱水素酵素遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成した。さらに、本発明のギ酸脱水素酵素は、ハロケトン化合物に対して耐性であり、ハロケトン化合物の酵素的還元反応系においても補酵素の再生を効率的に行うことが可能となった。
即ち、本発明は、ハロケトン化合物に対して耐性を有し、かつ、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドに関する。
また、本発明は、以下の理化学的性質を有するポリペプチドに関する：
（１）作用：ＮＡＤを補酵素として、ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
（２）分子量：約９×１０４、
（３）ギ酸に対するＫｍ値：１．６ｍＭ、
（４）ＮＡＤに対するＫｍ値：０．０４８ｍＭ、
（５）作用温度の範囲：２０℃〜６５℃、至適温度５０℃〜６０℃、
（６）作用ｐＨの範囲：５．０〜１０．５、至適ｐＨ５．５〜９．５、
（７）温度安定性：５０℃以下、
（８）ｐＨ安定性：４．５〜９．０。
本発明が提供する上記ポリペプチドは、ハロケトンに耐性を有し、かつ、高い比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値が小さく、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広く、作用温度、作用ｐＨの範囲が広い、工業的利用に適した性質をあわせ持つポリペプチドである。
また、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドに関する：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
本発明はまた、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡに関する：
（ｃ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
本発明はまた、以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡに関する：
（ｆ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｇ）配列表配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
また、本発明は、上記のＤＮＡを含む組換えプラスミドに関する。
また、本発明は、上記の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体に関する。
また、本発明は、上記のポリペプチドを生産する能力を有する微生物、又は上記形質転換体を培養し、培養物中に該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするギ酸脱水素酵素の製造方法に関する。
さらに、本発明は、酵素的還元反応系に、上記のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する微生物あるいはその処理物を共存させて補酵素を再生する方法に関する。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
まず、本発明のポリペプチドについて説明する。本発明のポリペプチドは、ハロケトン化合物に対して耐性を有し、かつ、ギ酸脱水素酵素活性を有するものである。
また、本発明のポリペプチドは、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。
（１）作用：ＮＡＤを補酵素として、ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
（２）分子量：約９×１０４、
（３）ギ酸に対するＫｍ値：１．６ｍＭ、
（４）ＮＡＤに対するＫｍ値：０．０４８ｍＭ、
（５）作用温度の範囲：２０℃〜６５℃、至適温度５０℃〜６０℃、
（６）作用ｐＨの範囲：５．０〜１０．５、至適ｐＨ５．５〜９．５、
（７）温度安定性：５０℃以下、
（８）ｐＨ安定性：４．５〜９．０。
本発明において、ポリペプチドのギ酸脱水素酵素活性の測定は、ギ酸ナトリウム５００ｍＭ、ＮＡＤ  ５ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、３０℃あるいは４０℃でのＮＡＤＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行う。
分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー法により決定する。ギ酸に対するＫｍ値は、上記の活性測定条件下（３０℃、ＮＡＤ  ５ｍＭ）にギ酸ナトリウムの濃度を変化させて活性を測定することにより、また、ＮＡＤに対するＫｍ値は、上記の活性測定条件下（３０℃、ギ酸ナトリウム５００ｍＭ）にＮＡＤの濃度を変化させて活性を測定することにより、決定する。
作用温度、作用ｐＨは、上記の活性測定条件の温度又はｐＨを変えて活性を測定することにより決定する。温度安定性は、該ポリペプチドを各温度で１０分間処理した後の残活性を測定することによって決定する。ｐＨ安定性は、該ポリペプチドを３０℃で２２時間、各ｐＨで処理した後の残活性を測定することによって決定する。
また、本発明のポリペプチドは、ハロケトン化合物に対して耐性を有する。ここでいう「ハロケトン化合物に対して耐性」とは、粗酵素液を１０ｍＭの４−クロロアセト酢酸エチルの存在下、３０℃で５分間インキュベーションした後の残活性が２５％以上であることをいう。
本発明のポリペプチドは、ギ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得できる。従って、本発明のポリペプチドの起源となる微生物としては、メタノール資化性菌あるいはギ酸資化性菌等が好適であり、特に限定されないが、例えばチオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられ、なかでもチオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）が好ましく、より好ましくはチオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株である。
上記のチオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株は、本発明において発明者らが分離、取得した菌株であり、平成１３年７月１９日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。以下に、チオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株の菌学的性質を示す。
１．形態
１）直径０．６μｍ×長さ１．５〜２．０μｍ程度の桿菌
２）グラム染色：陰性。
運動性：なし。
４）胞子の有無：なし。
５）肉汁寒天平板培地培養でのコロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色（半透明）
２．培養的性質
１）肉汁液体培養：懸濁
２）リトマスミルク：不変
３．生理学的性質
１）カタラーゼ：＋
２）オキシダーゼ：＋
３）Ｏ／Ｆ試験：−
４）脱窒反応：＋
５）ＭＲテスト：＋
６）ＶＰテスト：−
７）硫化水素産生：−
８）クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ：−
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ：−
９）無機窒素源の利用
ＮａＮＯ３：−
（ＮＨ４）２ＳＯ４：−
１０）澱粉加水分解：−
１１）硝酸塩還元：−
１２）インドール産生：−
１３）ブドウ糖酸性化：−
１４）アルギニンジヒドロラーゼ：−
１５）ウレアーゼ：−
１６）β−ガラクトシダーゼ：＋
１７）エクスリン加水分解：＋
１８）ゼラチン加水分解：−
１９）生育範囲
ｐＨ
３．０：−
５．０：−
８．０：＋
温度（℃）
３０：＋
５０：−
２０）ビオチン要求性：＋
２１）嫌気的生育：＋
２２）イオウ化合物の利用
元素イオウ：−
チオ硫酸ナトリウム：＋
２３）エタノール酸化：＋ｗ
２４）Ｏ−Ｆ培地による糖類からの酸及びガス生成（酸／ガス）
Ｌ−アラビノース：−／−
Ｄ−グルコース：−／−
Ｄ−フラクトース：−／−
マルトース：−／−
ラクトース：−／−
Ｄ−ソルビトール：−／−
イノシトール：−／−
デンプン：−／−
Ｄ−キシロース：−／−
Ｄ−マンノース：−／−
Ｄ−ガラクトース：−／−
シュークロース：−／−
トレハロース：−／−
Ｄ−マンニトール：＋／−
グリセロール：−／−
２５）基質資化能
ブドウ糖：＋
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−マンノース：−
Ｄ−マンニトール：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：−
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：−
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：−
本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、主炭素源としてのメタノールと、窒素源、無機塩類等の栄養素を含む水性媒体が用いられる。さらに、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス・ティープ・リカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素等が用いられる。
培養は、通常温度範囲２０℃から４０℃で行えるが、２０℃から３０℃が好ましい。また、ｐＨは６．０から９．０で培養できるが、７．０から９．０が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
培養物からの分離精製は、培養終了後に培養液から遠心分離等により菌体を集め、超音波破砕等の手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法等により精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。
天然酵素としては、配列表の配列番号１に示されるポリペプチドをあげることができる。
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。
「１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法等、当業者に周知の方法により、アミノ酸を置換、挿入、欠失及び／又は付加することにより取得可能である。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている。
また、「ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
次に、本発明のＤＮＡについて説明する。本発明のＤＮＡは、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡであっても良い。また、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであっても良い。
ここで、「１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／又は付加された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素  増刊  遺伝子増幅ＰＣＲ法  ＴＡＫＫＡＪ  ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編  加藤郁之進鑑訳  ＰＣＲテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の方法により、置換、挿入、欠失及び／又は付加できる程度の数の塩基が、置換、挿入、欠失及び／又は付加されてなる塩基配列を意味する。
さらに、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであっても良い。
「配列番号２又は３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号２又は３に示す塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、又はサザン・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡのことをいう。当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に準じて該ハイブリダイゼーションを実施して、目的とするＤＮＡを容易に取得できる。
本発明のＤＮＡ（ギ酸脱水素酵素遺伝子）は、前述したようなギ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。
まず、ギ酸脱水素酵素活性を有する微生物より精製されたギ酸脱水素酵素のアミノ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサー等で決定する。このアミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマーと、既知のギ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列中で相同性の高い部分の配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマーを合成する。
次に、ギ酸脱水素酵素の起源となる微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体のＤＮＡは、培養された細胞を界面活性剤、ＣＴＡＢ、クロロホルム、フェノール等で溶解、処理後、抽出されたＤＮＡをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿のＤＮＡをエタノールで洗浄することで得られる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照）。
この染色体ＤＮＡを鋳型に、上記のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、目的の遺伝子の一部を取得できる。次に、目的遺伝子の全長を取得するために、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ等の適当な制限酵素で先に得た染色体ＤＮＡを分解したものをアガロースゲル電気泳動して、ＰＣＲで得たギ酸脱水素酵素遺伝子の一部のＤＮＡ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、ギ酸脱水素酵素遺伝子が含まれ、かつ、ギ酸脱水素酵素遺伝子内で上記制限酵素により切断されないＤＮＡ断片をゲル上で検出する。
このＤＮＡ断片をゲルより取得した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ等を用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、前にＰＣＲで得た部分ギ酸脱水素酵素遺伝子の酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、かつ、酵素遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマーを合成し、これらプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末端側とＣ末端側をコードするＤＮＡ断片が取得できる。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、酵素のＮ末端をコードするＤＮＡよりも上流、Ｃ末端をコードするＤＮＡより下流と推定されるＤＮＡの塩基配列にもとづきＤＮＡプライマーを作成して、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでギ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得できる。取得したＤＮＡ断片は、分子量測定と一部の塩基配列の解析により、目的のギ酸脱水素酵素遺伝子の全長が含まれていることを確認する。
次いで、得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとＴ４  ＤＮＡリガーゼ等を用いて結合させることにより、組換えプラスミドを得ることができる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入したギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片部分の塩基配列を解析し、ギ酸脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位を決定し、終止コドンまでをオープンリーディングフレームとして、この塩基配列が既知のギ酸脱水素酵素遺伝子と比較的高い相同性を有すること、コードされるタンパク質が電気泳動によるタンパク質分子量と一致すること等から、目的遺伝子であることを確認する。
このようにして取得したＤＮＡ、又は該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し、形質転換体を得ることができる。
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主−ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を用いることができ、ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージ又はその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣＮＴを挙げることができる。
形質転換体の一例として、上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターに組み込んだ組換えプラスミドｐＦＴ００１、又は、上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）に組み込んだ組換えプラスミドｐＦＴ００２を用いて、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）又はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）を得ることができる。なお、組換えプラスミドｐＦＴ００１は図１で表され、また、組換えプラスミドｐＦＴ００２は図２で表されるものである。
本発明で得られた上記形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）は、平成１３年７月１９日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７２として、また、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）は、平成１３年７月１９日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３として、それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
また、酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プロモーターをもつように改質したベクターを使用することもできる。
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されている。
本発明のギ酸脱水素酵素の製造方法は、上述のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とする。
また、本発明のギ酸脱水素酵素の製造方法は、上述の形質転換体を培養し、培養物中にギ酸脱水素酵素を蓄積させ、これを採取することを特徴とする。
本発明で得られた形質転換体によるギ酸脱水素酵素の生産は、通常の培地を用いて培養を行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩類等の栄養素を含む通常の培地でよい。これに、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロース等の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類等が適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス・ティープ・リカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素等が用いられる。
培養は、温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが、５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
必要に応じて、メタノール、ギ酸、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
酵素的還元反応系に、上述のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する微生物あるいはその処理物を共存させて補酵素を再生することができる。
つまり、酵素的還元反応系に、本発明で得られたギ酸脱水素酵素を共存させて補酵素を効率良く再生することができる。とりわけ、通常のギ酸脱水素酵素に対しては失活をもたらすハロケトン化合物等の酵素的還元反応系においても、当該酵素を共存させて効率良く補酵素を再生することができる。
例えば、本発明で得られたギ酸脱水素酵素を補酵素再生に用いた、４−クロロアセト酢酸エチル等のハロケトンの酵素的還元反応は、以下のように行うことができる。
反応は、水中、もしくは、水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等の有機溶媒中、もしくは、当該有機溶媒と水性媒体との２層系等の適当な溶媒中で行い得る。このような溶媒中に、基質であるハロケトン、補酵素ＮＡＤ、ハロケトンを還元しうる酵素又は該還元活性を有する微生物あるいはその処理物等、及び、本発明のポリペプチド（即ち、ハロケトンに対して耐性を有するギ酸脱水素酵素）又は当該ポリペプチドを生産する微生物あるいはその処理物等を添加し、ギ酸でｐＨ調整下、撹拌することにより反応を行い得る。
ハロケトン化合物としては、使用する還元酵素あるいは微生物の基質となるものであれば特に制限されないが、例えば、４−クロロアセト酢酸エチル、４−ブロモアセト酢酸エチル、４−ヨードアセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢酸メチル、２−クロロアセト酢酸エチル、２−クロロ−１−（３−ピリジニル）−エタノン、［（１Ｓ）−３−クロロ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）プロピル］−カルバミン酸−１，１−ジメチルエチルエステル、２−クロロアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、クロロアセトン、１−（ベンゾイルオキシ）−３−クロロ−２−プロパノン、１−クロロ−３−ヒドロキシ−２−プロパノン等を挙げることができる。好ましくは、４−クロロアセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢酸メチル、２−クロロアセト酢酸エチル、［（１Ｓ）−３−クロロ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）プロピル］−カルバミン酸−１，１−ジメチルエチルエステル、２，３’−ジクロロアセトフェノン、１−（ベンゾイルオキシ）−３−クロロ−２−プロパノン等のα−ハロケトンである。
ハロケトンを還元しうる酵素あるいは微生物としては、例えば、４−クロロアセト酢酸エチルを対応するアルコールに還元しうる組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５９）等を用いることができる。組換え大腸菌であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、平成１３年６月２２日に原寄託され、平成１４年５月２７日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５９として、ブダペスト条約に基づく寄託へと移管された。なお、還元酵素として、アルデヒド脱水素酵素やアミノ酸脱水素酵素、又は、該活性を有する微生物あるいはその処理物を用いれば、生成物として、対応するアルデヒドやアミンを得ることも可能である。
本発明のポリペプチドを生産する微生物としては、前記の形質転換体エシェリヒア・コリＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）やエシェリヒア・コリＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）等を用いることができる。
ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、又はそれらの菌体の磨砕物等を意味する。更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行い得る。
反応は、１０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜６０℃、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５．５〜９．５で行う。また、基質の仕込み濃度は０．１％〜９０％（ｗ／ｖ）であるが、基質を連続的に添加することもできる。反応は、バッチ法又は連続方式で行い得る。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
以上のように、本発明の方法によれば、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルをはじめとするアルコールや、アミン、アルデヒド等を酵素的に製造するための還元反応において、補酵素を効率よく再生させ、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１）チオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株の取得
本発明の、ギ酸脱水素酵素を高生産するチオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株は以下のようにして分離した。各地より採取した土壌サンプルを０．９％食塩水に懸濁し、その上清を、メタノールを単一炭素源とする表１の組成の液体培地７ｍｌに１％植菌して３０℃で好気的に振とう培養した。
2003031626.tif 000002
菌の生育が認められた培養液について、６００ｎｍの吸光度で菌濃度を測定した。この培養液１．５ｍｌを遠心分離して得た菌体を、基質溶液０．５ｍｌ（０．１Ｍ  リン酸バッファー、０．５Ｍ  ギ酸ナトリウム、１ｍＭ  ＮＡＤ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７）に懸濁し、３０℃で２０時間振とうして菌体反応を行った後、遠心して得た上清のＮＡＤＨの生成量を３４０ｎｍで測定した。この値を菌濃度で割った値が高いものを、ギ酸脱水素酵素高活性菌として選択した。次に、選択した菌の培養液５ｍｌを遠心分離して得た菌体を０．５ｍｌの０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁、超音波破砕、遠心分離して上清を粗酵素液として得た。
粗酵素液のギ酸脱水素酵素活性の測定は、ギ酸ナトリウム  ５００ｍＭ、ＮＡＤ  ５ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、３０℃でのＮＡＤＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。
また、タンパク質の定量はＢＳＡを標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，ｖｏｌ．７２，２４８，１９７６参照）により行った。
ギ酸脱水素酵素のα−ハロケトン耐性は、粗酵素液１５０μｌと２０ｍＭの４−クロロアセト酢酸エチル１５０μｌを混合して３０℃で５分間インキュベーションした後に、上述と同様にギ酸脱水素酵素活性を測定して処理前の活性と比較することにより評価した。
次に、粗酵素液の比活性が高く、かつ、４−クロロアセト酢酸エチルに高い耐性を有するものについて、培養液よりモノコロニー法でギ酸脱水素酵素活性菌株を純化し、得られた純化菌株を用いて、上述と同様に培養して粗酵素液を調製後、ギ酸脱水素酵素活性、タンパク質濃度、ハロケトン耐性を測定した。そして、各菌株の粗酵素液比活性とハロケトン耐性を比較し、高比活性でハロケトン耐性が高いギ酸脱水素酵素を生産する菌株としてチオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）を得た。
（実施例２）ギ酸脱水素酵素の単離・精製
チオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株のコロニーを、表２の組成の培地７ｍｌに植菌して、２８℃で２日間、好気的に振とう培養した。この培養液をフラスコあたり１００ｍｌの表３の本培養培地に、培地液量の１％植菌して２８℃で７日間、好気的に振とう培養した。
2003031626.tif 000003
2003031626.tif 000004
2003031626.tif 000005
培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）とＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心した。上清に硫酸アンモニウム２５〜６０％飽和で塩析する沈殿を遠心で取得した。この画分を１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に溶解、同バッファーで透析後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーを行い、同バッファーで洗浄後、１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で溶出して、活性のあるフラクションを集めた。これに２４％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた後、ＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で２４〜０％飽和の硫酸アンモニウムのグラジエントをかけて溶出した。得られた活性画分に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して、遠心により得た沈殿を１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に溶解して、同バッファーで透析を行った。透析後、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、同バッファーで洗浄後、同バッファーで０．５Ｍ〜０ＭのＮａＣｌのグラジエントをかけて溶出した。得られた活性画分を限外濾過膜（分画分子量１０，０００）を用いて濃縮した後、１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で透析を行った。透析後、Ｇｉｇａｐｉｔｅ（生化学工業社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む２ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で洗浄後、１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で溶出した。得られた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、ギ酸脱水素酵素は単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。
（実施例３）酵素の性質
実施例２で得られた精製ギ酸脱水素酵素の性質を以下のようにして調べた。
［比活性］
得られたギ酸脱水素酵素の活性測定は、ギ酸ナトリウム５００ｍＭ、ＮＡＤ  ５ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、３０℃あるいは４０℃でのＮＡＤＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。このとき１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。また、タンパク質の定量は、ＢＳＡを標準タンパク質としてＬｏｗｒｙ法で行った。精製したギ酸脱水素酵素の比活性は、７．６ｕ／ｍｇタンパク質（３０℃）、１３．３ｕ／ｍｇタンパク質（４０℃）であった。
［Ｋｍ値の測定］
ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値を以下のようにして求めた。即ち、ギ酸に対するＫｍ値は、上記の比活性測定条件下（３０℃、ＮＡＤ  ５ｍＭ）にギ酸ナトリウムの濃度を変化させて活性を測定することにより、また、ＮＡＤに対するＫｍ値は、上記の比活性測定条件下（３０℃、ギ酸ナトリウム５００ｍＭ）にＮＡＤの濃度を変化させて活性を測定することにより決定した。図３、図４において、Ｖは酵素の反応速度、Ｓは基質濃度、横軸の切片は−１／Ｋｍを示す。図３に示す結果から、ギ酸に対するＫｍ値は１．６ｍＭ、図４からＮＡＤに対するＫｍ値は０．０４８ｍＭであった。
［作用温度の範囲・至適温度］
作用温度の範囲と至適温度を調べた。３０℃での活性を１００％とした場合の各温度での相対活性のグラフを図５に示した。なお、各温度において、ｐＨは７で一定とした。本酵素は２０〜６５℃の範囲でよく作用し、至適温度は５０℃〜６０℃であった。
［作用ｐＨの範囲・至適ｐＨ］
作用ｐＨの範囲と至適ｐＨを調べた。ｐＨ５．６での活性を１００％とした場合の各ｐＨでの相対活性のグラフを図６に示した。なお、各ｐＨにおいて、温度は３０℃で一定とした。本酵素はｐＨ５．０〜１０．５の範囲で作用し、至適ｐＨは５．５〜９．５であった。
［温度安定性］
温度安定性を調べた。本酵素を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中、各温度で１０分間処理した後の残活性を測定し、０℃の活性を１００％として示したのが図７である。本酵素は５０℃以下で安定であった。
［ｐＨ安定性］
ｐＨ安定性を調べた。本酵素を３０℃で２２時間、各ｐＨで処理した後の残活性を測定し、ｐＨ７．５の活性を１００％として示したのが図８である。本酵素はｐＨ４．５〜９．０の間で比較的安定であった。
［分子量の測定］
ゲルろ過クロマトグラフィー法により分子量を決定したところ、約９×１０４（９×１０４±５×１０３）であった。
（実施例４）ギ酸脱水素酵素遺伝子の単離
まず、実施例１と同様の方法でチオバシラス  エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株を培養して得た菌体を、界面活性剤、ＣＴＡＢ、クロロホルム、フェノール等で溶解、処理後、抽出されたＤＮＡをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿のＤＮＡをエタノールで洗浄することにより、染色体ＤＮＡを調製した（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照）。目的のギ酸脱水素酵素遺伝子を取得するには、まず、精製されたギ酸脱水素酵素のアミノ末端のアミノ酸配列を気相プロテイン・シークエンサー等で決定して、このアミノ酸配列にもとづいて設計した配列表の配列番号４に示すＤＮＡミックスプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１）と、既知のギ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列中で相同性の高い部分の配列にもとづいて設計した配列表の配列番号５に示すＤＮＡミックスプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。なお、配列表の配列番号４及び５において、ｎはアデニン、グアニン、シトシン又はチミンを示し、ｒはアデニン又はグアニンを示し、ｙはシトシン又はチミンを示す。この結果、目的のギ酸脱水素酵素遺伝子の一部を取得した。次に、目的遺伝子の全長を取得するために、制限酵素ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩで、先に得た染色体ＤＮＡを分解したものをアガロースゲル電気泳動して、ＰＣＲで得たギ酸脱水素酵素遺伝子の一部のＤＮＡ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果、用いた制限酵素でギ酸脱水素酵素遺伝子が切断されず、かつ、ギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が小さいのは、ＥｃｏＲＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩで分解した場合に検出されたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むバンドであった。これらのＤＮＡ断片をゲルより取得した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得た、ＥｃｏＲＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩ分解物由来のＤＮＡを鋳型に、前にＰＣＲで得た部分ギ酸脱水素酵素遺伝子の酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、酵素遺伝子の外側方向へ向けた配列表の配列番号６及び７に示すＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３、Ｐｒｉｍｅｒ−４）を合成し、インバースＰＣＲを行った。これにより、既に取得した酵素の部分遺伝子にはなかったさらに外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、配列表配列番号８に示す酵素のＮ末端をコードするＤＮＡよりも上流と推定される塩基配列に、制限酵素ＰｓｔＩの切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５）と、配列表配列番号９に示すＣ末端をコードするＤＮＡより下流と推定される塩基配列に、制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−６）を用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでギ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片（配列表配列番号２）を取得した。得られたＤＮＡ断片の分子量と一部の塩基配列��解析から、ギ酸脱水素酵素遺伝子の全長（配列表配列番号３）が含まれていることを確認した。
（実施例５）ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドの作成と遺伝子の解析
実施例４で得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣ１９とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図１の制限酵素地図で表され、ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＴ００１を取得した。なお、図中のＦＤＨ遺伝子とは、本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。
取得したプラスミドｐＦＴ００１を用いて、実施例４で得られたＰｓｔＩとＥｃｏＲＩの切断部位にはさまれたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。この結果、精製したギ酸脱水素酵素を用いて決定したＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位を決定し、終止コドンまでをオープンリーディングフレームとして、この塩基配列が既知のギ酸脱水素酵素遺伝子と相同であること、コードされるタンパク質が電気泳動によるタンパク質分子量と一致することを確認した。このようにして得られた、ギ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列表配列番号２に、オープンリーディングフレームの塩基配列を配列表配列番号３に、塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号１に示した。
（実施例６）ギ酸脱水素酵素遺伝子を大量発現する組換えプラスミドの作成
実施例４で得られたギ酸脱水素酵素遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩの切断部位を結合させた配列を持つ配列番号１０及び１１に示すプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−７，Ｐｒｉｍｅｒ−８）を用いて、この間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することで配列表配列番号３に示されるオープンリーディングフレームのＤＮＡ断片を取得した。
このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＰｓｔＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）とＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図２の制限酵素地図で表され、ギ酸脱水素酵素遺伝子をｐＦＴ００１よりも多く発現できるように設計された組換えプラスミドｐＦＴ００２を取得した。なお、図中のＦＤＨ遺伝子とは、本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。
（実施例７）ギ酸脱水素酵素の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例５及び実施例６で得られた組換えプラスミドｐＦＴ００１とｐＦＴ００２を、それぞれエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、表４に示す寒天培地にプレーティングして、ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）又はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）をコロニーとして取得した。
2003031626.tif 000006
得られた形質転換体のコロニーを、表５に示す液体培地１０ｍｌに植菌後、３７℃で２０時間、振とうして好気的に培養した。
2003031626.tif 000007
得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＦＤＨ酵素液を取得した。得られた酵素液０．１ｍｌを、１Ｍギ酸Ｎａ（０．１Ｍリン酸バッファー中でｐＨ７）１．５ｍｌ、０．１Ｍ  ＮＡＤ  ０．１５ｍｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）１．２５ｍｌと混合して、３０℃で３４０ｎｍの吸光度変化をみたところ、ＮＡＤＨの生成による吸光度の増加が認められ、両形質転換体にギ酸脱水素酵素活性があることが確認された。
（実施例８）ギ酸脱水素酵素のハロケトン耐性
本酵素と他のＦＤＨにおける各種ハロケトンに対する耐性を以下の方法により測定した。実施例７で得られたＫＮＫ６５ＭＡのＦＤＨ遺伝子を組み込んだｐＦＴ００２を保持する組換え菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した表５に示す液体培地１００ｍｌに植菌後、３７℃で２０時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＦＤＨ酵素液を取得した。
同様の方法で、ＫＮＫ６０７株のＦＤＨ（ＷＯ０２／４６４２７参照）を発現する組換え菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００２）も培養し、形質転換体のＦＤＨ酵素液を取得した。さらにキャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ（ＡＴＣＣ  ３２１９５））を、実施例１に示した培地（ただしｐＨ６．０）１００ｍｌに植菌後、２８℃で７２時間、振とうして好気的に培養し、同様にＦＤＨ酵素液を取得した。
上記のように調製した３つの無細胞抽出液に、表６に示す２０ｍＭの各種ハロケトン体（ただし、［（１Ｓ）−３−クロロ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）プロピル］−カルバミン酸−１，１−ジメチルエチルエステルは２ｍＭ、１−（ベンゾイルオキシ）−３−クロロ−２−プロパノンは１０ｍＭ）を等量添加し、３０℃で５時間静置した後（ただし、２−クロロアセトフェノンは２８．５時間静置した）のＦＤＨ残存活性を測定した。ＦＤＨ活性は実施例７で示した方法に従って測定した。
表６に示すように、本酵素は、他のＦＤＨに比べ各種ハロケトン化合物に対して高い耐性を有することが確認された。ＦＤＨの残存活性は、無処理の各無細胞抽出液の活性を１００％とした時の処理後の残存活性率で示した。
2003031626.tif 000008
（実施例９）４−クロロアセト酢酸エチルの酵素的還元系に、ＦＤＨ遺伝子を導入した組換え大腸菌を共存させて補酵素を再生する方法
実施例７で得たＫＮＫ６５ＭＡ株由来のＦＤＨを発現する大腸菌ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）と、ＫＮＫ６０７株のＦＤＨ（ＷＯ０２／４６４２７参照）を発現する大腸菌ＨＢ１０１株（ｐＦＡ００２）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した６０ｍｌの表５に示す液体培地に接種し、３７℃で９時間振とう培養した培養液を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した１００ｍｌの表５に示す液体培地に１％植菌して、３７℃で４６時間振とう培養した。培養液を遠心により５倍濃縮し、超音波破砕してＦＤＨ酵素液を取得した。また、４−ハロアセト酢酸エステルを還元する酵素として組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５９）を５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した１００ｍｌの表５に示す培地に接種し、３７℃で２３時間振とう培養後の１０倍濃縮菌体を調製して、それを破砕した。５倍濃縮したＦＤＨ酵素液６ｍｌに、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）破砕液９．２５ｍｌ、ＮＡＤ＋２５ｍｇ、ギ酸ナトリウム１ｇ、４−クロロアセトン酢酸エチル６ｇを添加し、イオン交換水１４．７５ｍｌ、酢酸ブチル３０ｍｌを加えて総量６０ｍｌに調製した。５Ｍのギ酸水溶液でｐＨ６．５に調製しつつ、３０℃で撹拌しながら、３．５時間反応を行った。反応終了後、反応液を酢酸ブチルで抽出し、抽出物の分析を行ったところ、当該酵素であるＫＮＫ６５ＭＡ株由来のＦＤＨを利用して補酵素を再生したものは、転換率１００％で４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが生成していた。一方ＫＮＫ６０７株由来のＦＤＨを利用したものは、転換率２６％で４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成していた。
４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量はガスクロマトグラフィーで行った。ＰＥＧ−２０Ｍ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ  ＤＭＣＳ  １０％  ８０／１００ｍｅｓｈ（ジーエルサイエンス社製）を充填したガラスカラム（ＩＤ３ｍｍ×１ｍ）を用い、１５０℃でクロマトグラフィーを行い、検出はＦＩＤにより行った。
産業上の利用可能性
本発明では、高い比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値が小さく、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広く、作用温度、作用ｐＨの範囲が広く、かつハロケトン耐性が高い工業的利用に適したギ酸脱水素酵素が提供される。また、本酵素の遺伝子を含むＤＮＡ、ベクターとの組換えＤＮＡ及びこのプラスミドによる形質転換体が提供される。さらに、この優良かつ新規な性質を有する酵素の効率的な製造方法、及び、ハロケトン等の酵素的還元反応系に当該酵素を共存させて補酵素を効率的に再生する方法が提供される。
【配列表】
2003031626.tif 000009
2003031626.tif 000010
2003031626.tif 000011
2003031626.tif 000012
2003031626.tif 000013
2003031626.tif 000014
2003031626.tif 000015
2003031626.tif 000016
2003031626.tif 000017
2003031626.tif 000018
2003031626.tif 000019
2003031626.tif 000020
2003031626.tif 000021
2003031626.tif 000022
2003031626.tif 000023
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＴ００１の制限酵素地図である。
図２は、本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＴ００２の制限酵素地図である。
図３は、本発明のギ酸脱水素酵素のギ酸に対するＫｍ値を求めるためのグラフである。
図４は、本発明のギ酸脱水素酵素のＮＡＤに対するＫｍ値を求めるためのグラフである。
図５は、本発明のギ酸脱水素酵素の作用温度の範囲と至適温度を求めるためのグラフである。
図６は、本発明のギ酸脱水素酵素の作用ｐＨの範囲と至適ｐＨを求めるためのグラフである。
図７は、本発明のギ酸脱水素酵素の温度安定性を求めるためのグラフである。
図８は、本発明のギ酸脱水素酵素のｐＨ安定性を求めるためのグラフである。
【図１】
2003031626.tif 000024
【図２】
2003031626.tif 000025
【図３】
2003031626.tif 000026
【図４】
2003031626.tif 000027
【図５】
2003031626.tif 000028
【図６】
2003031626.tif 000029
【図７】
2003031626.tif 000030
【図８】
2003031626.tif 000031
【国際調査報告】
2003031626.tif 000032
2003031626.tif 000033
2003031626.tif 000034
2003031626.tif 000035