(57)【要約】下記ステップにより、試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出する。（ａ）前記標的配列に相補的な配列を有する特異的領域と、標的核酸の標的配列に相補的でない配列を有する非特異的領域とを有する核酸からなる第１のプローブと、第１のプローブの非特異的領域の少なくとも一部に相補的な第１の領域と、第１のプローブに相補的な配列を有さないループ領域と、第１のプローブの特異的領域の少なくとも一部に相補的な第２の配列とを有し、第１のプローブとアニールさせたときにループ領域がループを形成することができ、かつ、前記ループの形成を検出可能な標識物質で標識された核酸からなる第２のプローブと、試料とを、第１のプローブと第２のプローブ、及び第１のプローブと標的配列とがアニールする条件で試料と混合し、（ｂ）第１のプローブと第２のプローブにより形成されるループを検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出する方法であって、下記ステップを含む方法：
（ａ）前記標的配列に相補的な配列を有する特異的領域と、標的核酸の標的配列に相補的でない配列を有する非特異的領域とを有する核酸からなる第１のプローブと、第１のプローブの非特異的領域の少なくとも一部に相補的な第１の領域と、第１のプローブに相補的な配列を有さないループ領域と、第１のプローブの特異的領域の少なくとも一部に相補的な第２の領域とを有し、第１のプローブとアニールさせたときにループ領域がループを形成することができ、かつ、前記ループの形成を検出可能な信号を発する標識物質で標識された核酸からなる第２のプローブと、試料とを、第１のプローブと第２のプローブ、及び第１のプローブと標的核酸とがアニールする条件で試料と混合し、
（ｂ）前記標識物質の信号を検出する。
【請求項２】
第２のプローブの第２の領域は、第１のプローブの特異的領域よりも短いことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標識物質が、各々ループ領域を挟んで配置された蛍光物質と、この蛍光物質の近傍にあると蛍光物質の蛍光を消光するクエンチャーであり、第１のプローブと第２のプローブがアニールしてループが形成されているときは蛍光物質の蛍光はクエンチャーにより消光され、第１のプローブが第２のプローブとアニールしていないときは前記蛍光はアニールしているときと比べて消光されないことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記信号の検出を定量的に行い、それによって標的核酸を定量することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出するためのキットであって、
前記標的配列に相補的な配列を有する特異的領域と、標的核酸の標的配列に相補的でない配列を有する非特異的領域とを有する核酸からなる第１のプローブと、第１のプローブの非特異的領域の少なくとも一部に相補的な第１の領域と、第１のプローブに相補的な配列を有さないループ領域と、第１のプローブの特異的領域の少なくとも一部に相補的な第２の配列とを有し、第１のプローブとアニールさせたときにループ領域がループを形成することができ、かつ、前記ループの形成を検出可能な信号を発する標識物質で標識された核酸からなる第２のプローブとを含むキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出する方法及びキットに関する。本発明の方法及びキットは、標的核酸をリアルタイムに検出することができ、生化学等の分野で有用である。
背景技術
試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出する方法として、プローブを用いたハイブリダイゼーション法、及び、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法等が用いられている。また、ＰＣＲ法は、標的核酸の検出やクローニング等、様々な分野で汎用されており、種々の改良法が開発されている。
ＰＣＲ法において、標的配列の増幅と増幅産物の分析を同時に行う、いわゆるリアルタイムＰＣＲが知られている。増幅産物を分析する手段としては、例えば、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブ法（米国特許第５，２１０，０１５号、特表平６−５０００２１号、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，７２７６−７２８０，１９９１）、モレキュラービーコン法（特開平５−１２３１９５号、Ｓａｎｊａｙ  Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １４，Ｍａｒｃｈ  １９９６）、及びインターカレーター法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，４１３−４１７，１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１０２６−１０３０，１９９３、特開平５−２３７０００号）等が知られている。
Ｔａｑ−Ｍａｎプローブ法では、蛍光物質と、この蛍光物質が発する蛍光を消光するクエンチャーで標識されたプローブが用いられる。このプローブは、標的核酸にハイブリダイズしているときは、蛍光はクエンチャーにより消光されるが、ＰＣＲに用いられるポリメラーゼの５’→３’エキソヌクアーゼ活性により増幅反応時に切断される。その結果、クエンチャーから蛍光物質が遊離して、蛍光を発する。この蛍光によって、二本鎖ＤＮＡ分子の量を知ることができる。
また、モレキュラービーコン法は、標的配列に相補的な配列と、その両側に互いに相補的な配列を有するアームからなり、両端に蛍光物質とクエンチャーが結合したプローブを用いる方法である。このプローブは、標的核酸にアニールしているときは、蛍光物質は蛍光を発するが、標的核酸から解離すると、アームを形成することにより蛍光物質とクエンチャーが接近して消光される。
一方、インターカレーター法は、エチジウムブロマイド等のインターカレーターを用いて、二本鎖ＤＮＡを検出する方法である。
上記のように、リアルタイムにＰＣＲ増幅産物を定量する方法が知られているが、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブ法は、５’→３’エキソヌクアーゼ活性を持たないポリメラーゼを用いる増幅法の場合は適用することができず、モレキュラービーコン法は、プローブの設計が困難であり、また、分子内結合の為検出効率が悪く、インターカレーター法は、配列の特異性がないという問題がある。
発明の開示
本発明は、上記観点からなされたものであり、５’→３’エキソヌクアーゼ活性を持つポリメラーゼを使用しなくても、標的核酸をリアルタイムに、かつ、簡便に定量する方法及びキットを提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、長短二種類のプローブを用いることにより、標的核酸を簡便に定量することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出する方法であって、下記ステップを含む方法：
（ａ）前記標的配列に相補的な配列を有する特異的領域と、標的核酸の標的配列に相補的でない配列を有する非特異的領域とを有する核酸からなる第１のプローブと、第１のプローブの非特異的領域の少なくとも一部に相補的な第１の領域と、第１のプローブに相補的な配列を有さないループ領域と、第１のプローブの特異的領域の少なくとも一部に相補的な第２の領域とを有し、第１のプローブとアニールさせたときにループ領域がループを形成することができ、かつ、前記ループの形成を検出可能な信号を発する標識物質で標識された核酸からなる第２のプローブと、試料とを、第１のプローブと第２のプローブ、及び第１のプローブと標的核酸とがアニールする条件で試料と混合し、
（ｂ）前記標識物質の信号を検出する。
（２）第２のプローブの第２の領域は、第１のプローブの特異的領域よりも短いことを特徴とする（１）の方法。
（３）前記標識物質が、各々ループ領域を挟んで配置された蛍光物質と、この蛍光物質の近傍にあると蛍光物質の蛍光を消光するクエンチャーであり、第１のプローブと第２のプローブがアニールしてループが形成されているときは蛍光物質の蛍光はクエンチャーにより消光され、第１のプローブが第２のプローブとアニールしていないときは前記蛍光はアニールしているときと比べて消光されないことを特徴とする（１）又は（２）の方法。
（４）前記信号の検出を定量的に行い、それによって標的核酸を定量することを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出するためのキットであって、前記標的配列に相補的な配列を有する特異的領域と、標的核酸の標的配列に相補的でない配列を有する非特異的領域とを有する核酸からなる第１のプローブと、第１のプローブの非特異的領域の少なくとも一部に相補的な第１の領域と、第１のプローブに相補的な配列を有さないループ領域と、第１のプローブの特異的領域の少なくとも一部に相補的な第２の配列とを有し、第１のプローブとアニールさせたときにループ領域がループを形成することができ、かつ、前記ループの形成を検出可能な信号を発する標識物質で標識された核酸からなる第２のプローブとを含むキット。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、試料中の、標的配列を有する標的核酸を検出する方法である。標的核酸は、標的配列を有するものであれば特に制限されず、ＤＮＡであってもＲＮＡでもよく、また、一本鎖でも二本鎖でもよい。本発明は、特に二本鎖ＤＮＡの検出に好適に適用される。本発明の好ましい形態においては、標的核酸は定量的に検出される。尚、定量的な検出とは、核酸の絶対量を測定すること、及び、核酸の量をある量に対して相対的に測定することを含む。
標的配列は、通常、標的核酸に特異的な配列であり、この配列に相補的な配列を有するプローブと特異的なハイブリッドを形成し得るものであれば、配列及び長さは特に制限されない。標的配列の長さは、好ましくは６塩基以上、より好ましくは１５塩基以上である。
標的核酸を含む試料としては、特に制限されないが、細胞、組織から抽出した核酸又は核酸混合物、又はこのような核酸又は核酸混合物を鋳型とするＰＣＲ核酸増幅反応液が挙げられる。
本発明では、標的核酸の検出に２種類のプローブが用いられる（図１参照）。第１のプローブ（以下、「プローブ１」ともいう）は、標的配列に相補的な配列を有する特異的領域と、標的核酸の標的配列に相補的でない配列を有する非特異的領域とを有する核酸からなる（図１Ａ）。このような構造から、プローブ１は、標的核酸にハイブリダイズしたときに、非特異的領域は、一本鎖のままフラップを形成する（図１Ｂ）。非特異的領域の長さは、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１０〜３０塩基である。
第２のプローブ（以下、「プローブ２」ともいう）は、前記プローブ１の非特異的領域の少なくとも一部に相補的な第１の領域と、プローブ１に相補的な配列を有さないループ領域と、プローブ１の特異的領域の少なくとも一部に相補的な第２の領域とを有し、プローブ１とアニールさせたときにループ領域がループを形成することができ、かつ、前記ループの形成を検出可能な信号を発する標識物質で標識された核酸からなる（図１Ａ）。
尚、図１には、５’側に特異的領域を、３’側に非特異的領域を有するプローブ１と、第１の領域、ループ領域及び第２の領域を５’側から順に有するプローブ２の例が示されている。本発明においては、プローブ１は３’側に特異的領域を、５’側に非特異的領域を有し、プローブ２は第１の領域、ループ領域及び第２の領域を３’側から順に有していてもよい。
第１の領域は、プローブ１の非特異的領域の少なくとも一部に相補的な配列を有し、好ましくは、非特異的領域の全体に相補的な配列を有する。一方、第２の領域は、プローブ１の特異的領域の少なくとも一部に相補的な配列を有し、好ましくは特異的領域よりも短い。第２の領域を特異的領域よりも短くすることによって、プローブ１は、プローブ２よりも、標的核酸に優先的にアニールすることができる。第２の領域の長さは、好ましくは６塩基以上、より好ましくは６〜２０塩基である。あるいは、第２の領域は、特異的領域よりも、好ましくは１塩基以上、より好ましくは４塩基以上短くすることが望ましい。
ループ領域は、プローブ１と相補的な配列を有さない領域であり、好ましくは標的核酸とも相補的な配列を有さない。ループ領域は、プローブ２がプローブ１に結合しているときはループ状の突出部を形成するが、プローブ２とプローブ１が解離すると、ループ構造は解消される（図１Ｃ）。プローブ２は、ループの形成を検出可能な信号を発する標識物質で標識される。標識物質は、具体的には例えば、各々ループ領域を挟んで配置されるエネルギー供与体とエネルギー受容体からなる。エネルギー供与体及びエネルギー受容体は、例えば、蛍光物質と、この蛍光物質が発する蛍光を消光するクエンチャーが挙げられる。クエンチャーは、蛍光物質の近傍にあると蛍光を消光するが、蛍光物質との距離が一定以上になると消光しなくなる。このような蛍光物質及びクエンチャーを用いると、プローブ１とプローブ２がアニールしてループが形成されているときは蛍光物質の蛍光はクエンチャーにより消光され、プローブ１がプローブ２とアニールしていないときは蛍光は消光されない。したがって、蛍光物質からの蛍光を測定することにより、ループの形成、すなわちプローブ１とプローブ２とのハイブリダイゼーションの状態を検出することができる。蛍光物質としては、例えばフルオロセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオレセイン系の色素等を、クエンチャーとしては例えばテトラメチルローダミンイソチオシアネイト（ＴＲＩＴＣ）、スルフォローダミン１０１の塩化スルフォン酸誘導体（商品名：テキサスレッド）等のローダミン系の色素等が挙げられる。これらのうち、好ましい組合せは、ＦＩＴＣとテキサスレッドである。これらの標識物質は、これらの標識物質が結合したオリゴヌクレオチドを用いてプローブ２の化学合成を行うことにより、配列中の任意の部位に導入することができる。蛍光物質及びクエンチャーは、どちらが５’側にあってもよい。
ループ領域の配列及び長さは、プローブ１とプローブ２がアニールしたときにループ構造が形成され、ループ構造が形成されたときと解消されたときとで標識物質からの信号が異なるものであれば特に制限されない。尚、ループ領域は、ループ領域がプローブ２の第１の領域及び第２の領域と部分二本鎖を形成せず、かつ、ループ領域内で部分二本鎖を形成しないように設計することが好ましい。ループ領域の長さは、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは２０塩基以上である。標識物質は、通常、ループ領域の両末端塩基から３塩基内、好ましくは両末端塩基に結合していることが望ましい。
上記のようなプローブ１、プローブ２及び試料とを、プローブ１とプローブ２、及びプローブ１と標的核酸とがアニールする条件で混合する。但し、前記のような各プローブの構造から、プローブ１は、プローブ２よりも、標的核酸と優先的にアニールする。混合の順序は特に問わず、例えば、プローブ１とプローブ２を混合した後、試料を加える。また、プローブ１とプローブ２を予め混合したものを用意しておいてもよい。また、プローブ１及び又は試料を含まない反応液をコントロールとして用いることが好ましい。
プローブ１とプローブ２は、好ましくは１：１のモル比で混合される。プローブ１とプローブ２の最終的な反応液中の濃度は、各々好ましくは０．１μＭ以上である。
プローブ１、プローブ２及び試料を混合した後は、そのままプローブ１とプローブ２、及びプローブ１と標的核酸とがアニールする条件に置いてもよいし、一旦熱変性処理を行った後、前記条件に置いてもよい。
上記反応液を、一定時間経過後、好ましくは平衡状態状態に達した後に、標識物質の信号を検出する。より好ましくは、信号の検出は経時的に行う。前記条件は、例えば、プローブ１とプローブ２のＴｍより３〜１０℃低い温度が挙げられる。最適な条件は、何段階か温度を変えて、信号の検出を経時的に行い、コントロールとの差異が最も明確になる条件を選択することにより、容易に決定することができる。蛍光物質としてＦＩＴＣを、クエンチャーとしてテキサスレッドを用いた場合、信号の検出は、ＦＩＴＣに由来する蛍光波長５１５ｎｍの蛍光強度を測定することにより行われる。蛍光強度の測定は、市販の装置を用いて測定することができる。測定結果を図２及び図３に例示する。これらの結果については、実施例において詳述する。
標識物質の信号の検出を定量的に行うことによって、標的核酸の量を定量することができる。
本発明のキットは、上記標的核酸を検出するために用いられるものであり、プローブ１及びプローブ２を含むキットである。各プローブは、溶液であっても、凍結乾燥品であってもよい。また、各プローブは、各々別の容器に入れられていてもよいし、同一の容器に混合物として入れられていてもよい。本発明のキットは、さらに、各プローブ又は試料を溶解又は希釈するための緩衝液を含んでいてもよい。
本発明の方法及びキットは、核酸増幅反応液中の増幅産物のリアルタイムな定量に好適に用いることができる。本発明のキットは、このような標的核酸を核酸増幅法により増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいてもよい。このプライマーは、各プローブとは別個の容器に入れられる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
プローブ１（配列番号１）、プローブ２（配列番号２）、及び標的オリゴヌクレオチド（配列番号３）を合成した。各オリゴヌクレオチドの合成は、株式会社日本バイオサービスに依頼した。プローブ２の塩基番号２１のヌクレオチド（Ｔ）はＦＩＴＣで、塩基番号５２のヌクレオチド（Ｔ）はテキサスレッドで各々標識されている。尚、標的オリゴヌクレオチドは、ヒトアミリン遺伝子の部分配列である。
プローブ１の塩基番号１〜２８は、標的オリゴヌクレオチドの塩基番号６〜３３に相補的である。また、プローブ１の塩基番号１１〜３３、及び塩基番号３５〜５５は、プローブ２の塩基番号５２〜７４及び塩基番号１〜２１に、それぞれ相補的である。尚、配列番号２の塩基番号５７〜７４は、配列番号３の６〜２３と相同である。
各オリゴヌクレオチドは、ＴＥ緩衝液に５μＭとなるように溶解した。１．５ｍｌチューブに、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造（株）Ｌｏｔ．Ａ６５０１−１）２．２μｌ、滅菌蒸留水１９．８μｌ、プローブ２溶液（５μＭ）１μｌを加え、よく混合し、反応機（Ｃｅｐｈｅｉｄ社  Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ）用の２５μｌ容チューブに２３μｌづつ分注した。各チューブに、プローブ１溶液（５μＭ）又はＴＥ緩衝液１μｌを加え、さらに、標的オリゴヌクレオチド溶液（５μＭ）又はＴＥ緩衝液１μｌを加え、反応液を得た。この操作は、室温で行った。
上記反応液、又は上記反応液を９４℃で３分加熱処理したものをＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒにセットし、４７℃に調整し、波長５０５〜５３７ｎｍの蛍光を測定した。加熱処理しない反応液の結果を図１に、加熱処理したものの結果を図２に示す。
プローブ２のみでは蛍光が認められたが、プローブ１を加えた場合は、著しく消光された。プローブ２に、プローブ１とともに標的オリゴヌクレオチドを加えた場合は、その中間の強度の蛍光が観察された。この結果は、加熱処理の有無に関わらず、同様であった。
以上のように、標的配列が存在しない場合に比べて、標的配列が存在すると高い強度の蛍光が観察されたことから、プローブ１はプローブ２よりも標的配列に優先的に結合し、プローブ２の一部は遊離していることが確かめられた。
産業上の利用の可能性
本発明により、標的核酸をリアルタイムに、かつ、簡便に定量することができる。本発明の方法は、５’→３’エキソヌクアーゼ活性を持つポリメラーゼを必要としないので、種々の反応系に適用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の概念を示す概略図である。Ｆは蛍光物質を、Ｑはクエンチャーを表す。
図２は、反応液の蛍光強度の経時的変化を示すグラフ図（加熱処理しないもの）である。
実線：プローブ１＋プローブ２＋標的オリゴヌクレオチド
点線：プローブ１＋プローブ２
一点鎖線：プローブ２
図３は、反応液の蛍光強度の経時的変化を示すグラフ図（加熱処理したもの）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2003100095.tif 000008
2003100095.tif 000009
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