【手続補正書】
【提出日】平成14年1月28日(2002.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】食料品に使用されるグラム陽性菌抑制用の抗菌組成物
【特許請求の範囲】
【請求項１】（ａ）ランチビオティックス（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、ペジオシン（ｐｅｄｉｏｃｉｎ）、およびラクチシン（ｌａｃｔｉｃｉｎ）のクラスのバクテリオシン、および／または分解酵素からなる群から選択される少なくとも１種類のグラム陽性の静菌性または殺菌性化合物を含む第一成分と、（ｂ）ホップ酸（ｈｏｐｓ ａｃｉｄｓ）、ホップ酸誘導体、ホップ樹脂、およびホップ樹脂誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物を含む第二成分とを含む、抗菌性組成物。
【請求項２】（ａ）ランチビオティックスおよび分解酵素からなる群から選択される少なくとも１種類のグラム陽性の静菌性または殺菌性化合物を含む第一成分と、
（ｂ）ホップ酸、ホップ酸誘導体、ホップ樹脂、およびホップ樹脂誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物を含む第二成分とを含む抗菌性組成物。
【請求項３】（ａ）ナイシン（ｎｉｓｉｎ）と、ｂ）リゾチーム（ｌｉｓｏｚｙｍｅ）と、（ｃ）βホップ酸またはβホップ酸誘導体とを含む抗菌性組成物。
【請求項４】第一成分を約３８．５〜９９．８重量部含み、かつ第二成分を約６１．５〜０．２重量部含み、そのすべての重量部が前記組成物の第一および第二成分の合計を基準とする、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項５】第一成分がランチビオティックス約１．０〜２．５重量部と分解酵素約３７．５〜９７．３重量部を含み、かつ第二成分がホップ酸およびホップ酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物約６１．５〜０．２重量部を含み、そのすべての重量部が前記組成物の第一および第二成分の合計を基準とする、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項６】食品中のグラム陽性菌を減少させる方法であって、（ａ）ランチビオティックス、ペジオシン、およびラクチシンのクラスのバクテリオシン、および分解酵素からなる群から選択される少なくとも１種類のグラム陽性の静菌性または殺菌性化合物を含む第一成分と、（ｂ）ホップ酸、ホップ酸誘導体、ホップ樹脂、およびホップ樹脂誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物を含む第二成分とを含む静菌または殺菌に有効な量の組成物で前記食品の食物表面を処理するステップを含む、方法。
【請求項７】食品中のグラム陽性菌を減少させる方法であって、
（ａ）ランチビオティックスおよび分解酵素からなる群から選択される少なくとも１種類のグラム陽性の静菌性または殺菌性化合物を含む第一成分と、
（ｂ）ホップ酸、ホップ酸誘導体、ホップ樹脂、およびホップ樹脂誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物を含む第二成分とを含む静菌または殺菌に有効な量の組成物で前記食品の食物表面を処理するステップを含む、方法。
【請求項８】前記組成物が（ａ）ナイシンと、（ｂ）リゾチームと、（ｃ）βホップ酸またはβホップ酸誘導体とを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】第一成分を約３８．５〜９９．８重量部含み、かつ第二成分を約６１．５〜０．２重量部含み、そのすべての重量部が前記組成物の第一および第二成分の合計を基準とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】第一成分がランチビオティックス約１．０〜２．５重量部と分解酵素約３７．５〜９７．３重量部を含み、かつ第二成分がホップ酸およびホップ酸誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物約６１．５〜０．２重量部を含み、そのすべての重量部が前記組成物の第一および第二成分の合計を基準とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】前記食品が４％を超える脂肪量を含有する固形物である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】前記食品が加工した食肉である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】前記処理ステップが、（ａ）包装容器、フィルム、または包装材料の表面に前記組成物をコーティングするステップと、（ｂ）続いて組成物でコーティングした表面を前記食品と密着させるステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】前記グラム陽性菌がリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属のものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）またはリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｏｃｕａ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記グラム陽性菌が芽胞菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】前記芽胞菌がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・桿菌）ｓｐｐである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記芽胞菌がクロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）ｓｐｐである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、１または複数種のホップス酸抽出物または変性したホップ酸抽出物に加えて、ランチビオティックス、ペジオシン、ラクチシンのクラスのバクテリオシン、および／または分解酵素の範疇由来の１または複数種の安全で適切なグラム陽性の静菌性または殺菌性の調剤を含む組成物で処理することによって食品上の細菌の増殖を阻害または遅らせる方法を開示する。より詳細には、この方法はグラム陽性の腐敗または病原性細菌、より具体的には有害な病原性Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの全株を減少または除去するためにナイシン、および／またはリゾチームとβホップ酸を含む組成物を成分として使用すること、または食物表面に塗布することを含む。重要な公衆衛生上の問題は、病原性のリステリア種、具体的にはＬｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが加工食品を通常長期間貯蔵する商用の冷凍温度で増殖する能力を持っていることである。流通の標準条件下で増殖するこの能力は、今日Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを未加工および加工食品に関連した最も大きな公衆衛生上の危険性の１つにしている。いずれの新しい抗菌系も、その配合および温度条件は実際に実施することを考慮して商業上の食料品体系に有効であらねばならない。本発明の新しい組成物は、リステリアの汚染の危険性のある様々な食料品、特に食料品に一般的な冷凍貯蔵および搬送温度において有効である。
【０００２】
２．技術の説明
米国における食物伝染および食中毒の程度は、１９９４年度のＣＡＳＴ報告（Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ： Ｒｉｓｋｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ． １２２， Ｃｏｕｎｓｉｌ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に定量的に記録されており、また過去数年、より優れた報告システムおよびプログラム（ＣＤＣ． １９８８ｃ． １９９７ Ｆｉｎａｌ ＦｏｏｄＮｅｔ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ報告。Ｕ． Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９８年１０月）によって広範に特徴が調べられた。リステリア症およびその他の食物伝染の流行を減らすために様々な研究が行なわれ、食料品用の抗菌成分として作用する組成物が開発された。この研究により開示された個々の化合物は、本質的に単一の化合物では多くの場合効力がないか、あるいは食料品の加工および配合物に使用するには高価すぎるために商業的な利点または用途はあったとしてもわずかであった。今日においてもまだ消費者に重大な健康上の危険をもたらすＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓなどのグラム陽性病原菌のより優れた制御の必要性が存在する。加えてｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ｂａｃｉｌｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、およびｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉ種などの他のグラム陽性腐敗菌は、普通は病にはならないが腐敗を引き起こすことが知られており、往々にして特定の食料品の保存寿命および鮮度を低下させる主要な原因物質である。
【０００３】
病原菌と腐敗菌はどちらも未加工の食材中に見出されることが多いが、加熱加工は細菌の負荷量を劇的に減らすのに役立つ。加工後、大部分の食料品は食料品を取り扱う環境中に病原菌に曝される可能性がある場合、包装、流通、および最終消費以前に再汚染の危険性がある。最も清潔な加工施設においてさえ、特定の病原菌がすでに加工した食料品を通常はきわめて低レベルで汚染する可能性がある。次いで、寒さに耐性のある病原菌、すなわち主として各種リステリア種の場合、最終消費までの流通および貯蔵の間ずっと食物上で阻止されることなく増殖する。食品中でこのような病原菌が増殖すればするほど、その食品の消費者に伝染する危険性は高くなる。調理を必要としない食肉および日常製品の場合、このような食品は摂取の前に利用者によって再加熱または再加工されないので特に問題である。このような例の中で最も起こり得る危険性は、冷凍下で十分に増殖するＬｉｓｔｅｒｉａ種由来のものである。任意の病原菌の多量の摂取は、特に乳児、高齢者、妊婦、および任意の免疫に欠陥のある個体の間で伝染の危険性が増すことが認められる。
【０００４】
１９９８年には米国において恐らく食物が原因のリステリア症によって約５００人の死亡が起きたと推定される。主な食物病原菌の中でリステリア症は最も高い死亡率を示し、Ｍｅａｄｅ等（Ｆｏｏｄ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｉｌｌｎｅｓｓ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ， ＣＤＣ ５：５， １９９９年９〜１０月）によれば２０％を超す。その危険度および大きな社会的費用に照らして食料品中のリステリアの増殖を抑えるシステムが緊急に必要なことは、米国の公衆衛生各部局、食品医成分局（ＦＤＡ）、および米国農業省（ＵＳＤＡ）によって認められている。本発明の主題は、実際の食料品体系中の、特に加工された調理を必要としない食肉製品中のＬｉｓｔｅｒｉａを標的とする新奇な、食料品用（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）の無風味の組成物である。そのような組成物の望ましい効果とは、加工後も生き残る、またはこのような種による汚染の危険性のある食物においてリステリア菌を殺すかまたは数を減らすことである。加えて上述の腐敗型、ならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のあまり一般的でない株を含む他のグラム陽性菌に関連する危険性もまた食品問題として注目されており、このような方法または組成物の恩恵を受ける可能性もある。
【０００５】
１９９２年および１９９３年には米国特許第５，０９６，７１８号および第５，２６０， ０６１号に、加工処理された食品の保存寿命を向上させるためにある種の食料品においてプロピオン酸菌の代謝産物を使用することが開示された。これらの代謝産物はグラム陰性菌に対しては高い効力を示すことが証明されるが、不幸にしてグラム陽性菌に対しては効き目がない。
【０００６】
米国特許第５，２１７，９５０号は、殺菌剤としてナイシンの組成物を使用することを提案した。ナイシンはランチビオティックス、より詳細にはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ菌の様々な株によって天然に産出される抗菌特性をもつポリペプチドである。ナイシンは主としてグラム陽性菌に対して確かに効果があるが、普通のグラム陽性病原菌であるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはグラム陽性菌の他のほとんどの種よりもナイシンに対して耐性を持っている。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するナイシンの活性を高める必要性はよく認識されており、ナイシン自体が抗リステリア剤として商業的に使用されない理由の説明でもある。したがって第５，２１７，９５０号特許は、リステリア種および特定のグラム陰性菌のどちらに対しても広範な活性を生じるようなナイシンと、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）またはその他の酢酸塩もしくはクエン酸塩などのキレート剤との組み合わせを提案している。
【０００７】
米国特許第５，５７３，７９７号、第５，５９３，８００号、および第５，５７３，８０１号には、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓもしくはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓから誘導されるバクテリオシンまたは合成の対応する抗菌剤とキレート剤との組み合わせを含む抗菌性組成物が開示されている。この組成物は、食料品に直接塗布することによって、または食料品の表面と密着して配置される柔軟なフィルム容器の上に組成物を組み込むことによって処理すべき食料品の表面に塗布される。キレート剤は、グラム陰性細胞の外膜中の遊離の二価カチオンを捕縛して抗菌剤の浸透性を向上させる。第５，５７３，８０１号特許の例には調理された食肉表面にナイシンを単独で塗布することが開示されているが、この単一成分の効力は限られているので商業的には採用されていない。
【０００８】
米国特許第５，４５８，８７６号は、抗菌剤としてランチビオティックス（ナイシンなど）とリゾチームの組み合わせを提案している。この例ではリゾチームが細胞壁を分解し、抗菌剤が細菌細胞を損傷もしくは消滅するのにより有効になるように標的細胞の構造的完全性を弱める。特にこの組み合わせはＬｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するナイシンの抗菌効果を改善し、安全かつ適切な使用量でリステリアのかなりの減少をもたらすことが分かっている。
【０００９】
欧州特許公開第０ ４６６ ２４４号は、下記の各群の化合物の少なくとも１つの混合物を含む抗菌特性を改良した組成物について開示している。すなわち（ｉ）細胞壁溶解物質またはその塩、（ｉｉ）抗菌性化合物、および（ｉｉｉ）食品、または化粧用途もしくは衛生用の調剤において使用することが許容される有機酸またはそれらの酸の塩、リン酸塩および縮合リン酸塩または相当する各種の酸、およびその他の金属イオン封鎖剤から選択される補助剤である。好ましくは（ｉ）リゾチーム、（ｉｉ）恐らくバクテリオシン（例えばナイシンまたはペジオシン）、および（ｉｉｉ）恐らく酢酸、ジ酢酸ナトリウム、乳酸、クエン酸、プロピオン酸、酒石酸、オルトリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、トリポリリン酸塩、その他のポリリン酸塩、または置換もしくは非置換アミノ基を含有する金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡである。
【００１０】
欧州特許公開第０ ４５３ ８６０号は、表面のグラム陰性菌を根絶するためにナイシンと、ｐＨが５．５および６．５の間で有効なリン酸緩衝液との組み合わせを提案している。
【００１１】
国際特許公開第ＷＯ９７／２３１３６号は、浸透ショックおよび／または溶液に溶かしたリゾチームおよび／または溶液に溶かしたナイシンのいずれかと組み合わせた低濃度のオルトリン酸のアルカリ金属塩溶液で処理することを含む、細菌による汚染の除去方法を提案している。この引例については、レタスの葉またはニワトリの皮膚上のある種の細菌に対する低濃度のオルトリン酸三ナトリウムとリゾチームの組み合わせ、およびニワトリの皮膚上のある種の細菌に対する低濃度のオルトリン酸三ナトリウムとナイシンの組み合わせを試験した。
【００１２】
オーストラリア特許公開第ＡＵ−Ａ−１８６０４／８８号には、食材保存用の非酵素系防腐剤と共に、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、例えばリゾチームを含む細菌溶解性酵素の産物を使用することが開示されている。この公示の中に記述されている非酵素性防腐剤は、クエン酸およびＥＤＴＡ；アミノ酸、特にシステイン、アラニン、チロシン、およびグリシンなどのアミノ酸；ならびにイノシンの５′−イノシン一リン酸塩、またはピロリン酸四ナトリウム（二リン酸塩）、トリポリリン酸ナトリウム（三リン酸塩）、およびポリリン酸塩などのヌクレオシドやヌクレオチドなどの錯化剤；あるいは硝酸のアルカリ金属塩などの赤化剤である。
【００１３】
米国特許第５，２８６，５０６号には、食物中のＬｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して静菌作用があるため、脂溶性のホップのβ酸抽出物を食料品の重量当たり６ 〜 ５０ ｐｐｍ使用することが記載されている。加えて米国特許第５，３７０，８６３号および第５，４５５，０３８号は、化学的に水素化されるある種のホップ酸誘導体がＬｉｓｔｅｒｉａ種に対して抗菌活性を有する可能性があることを示唆している。しかしながらこれらの抽出物は食料品用（ＧＲＡＳ）ではなく、醸造を除いて食料品に用いることは許されない。
【００１４】
最後に、Ｊｏｈｎｓｏｎ等はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３３ （１９９６） １９５〜２０７の中で、多分ホップ酸およびホップ酸誘導体は、β酸が脂肪エマルション中へ移行しまたは閉込められることにより、またその後それらを食物のエマルションの水性部分における細菌の増殖の抑制に利用できないことによりチーズ、食肉、ソース、およびドレッシングなどの脂肪含有食物中ではリステリア種に対して限られた効力しか示さないことを開示している。脂肪含有食物中でβホップ酸が活性を示さないという問題が、それらをリステリアまたはその他のグラム陽性病原菌の制御用の天然の抗菌剤として商業的に使用できないようにしてきた。
【００１５】
上記で引用した参考資料のすべてが、本特許出願の完成に必要な程度まで特に参照により組み込まれる。
【００１６】
上記の教示に照らして当業界では、グラム陽性病原菌の危険性のある共通の食物用途において妥当な使用量で活性を有する殺菌性の組成物で食物を処理する方法に対する必要性が未だに存在している。より具体的には、これらの製品にとって既存の加工実験計画に便利に組み込むことができる効果的な処理に対する必要性が存在している。最後に、ナイシン、リゾチーム、およびホップ酸などの安全、適切、かつ経済的な量の食料品用抗菌成分を使用することにより有害なグラム陽性病原菌をより完全かつ効果的に減少あるいはさらに除去することに対する必要性が存在している。
【００１７】
発明の概要
全く驚くべきことに、１または複数種の下記の種類の材料、すなわちランチビオティックス、ペジオシン、および／またはラクチシンのクラスのバクテリオシン、あるいは分解酵素由来の１または複数種のグラム陽性の静菌性または殺菌性化合物を含む第一成分と、１または複数種の天然のホップ酸もしくはホップ樹脂またはその誘導体を含む第二成分とを有する組成物は、個々の成分または以前に公表された組成物のいずれかの抗菌効果を劇的に凌駕することにより、特にリステリア属の潜在的に有害な細菌に対する優れた抗菌特性を提供することが、ここに発見された。
【００１８】
本発明の一実施形態は、第一成分として（ａ）下記の種類の材料、すなわちランチビオティックス、ペジオシン、およびラクチシンのクラスのバクテリオシン、および／またはリゾチームすなわち卵白由来の天然の酵素から得られる１または複数種のグラム陽性の静菌性または殺菌性化合物、また第二成分として（ｂ）１または複数種のホップ酸もしくはホップ酸誘導体、またはホップ樹脂もしくはホップ樹脂誘導体を含有する抗菌性の組成物を含む。ランチビオティック・バクテリオシン、リゾチーム、およびβホップ酸抽出物を含有する組成物が特に好ましい。
【００１９】
別の実施形態において本発明は、（ａ）１または複数の下記の種類の材料、すなわちランチビオティックス、ペジオシン、およびラクチシンのクラスのバクテリオシン、または分解酵素から得られる１または複数のグラム陽性の静菌性または殺菌性化合物を第一成分として含み、また（ｂ）１または複数種のホップ酸もしくはホップ酸誘導体、またはホップ樹脂もしくはホップ樹脂誘導体を第二成分として含む有効量の組成物で食物の表面を処理するステップを含む、前記食物中で増殖を遅らせ、生菌数を減少させ、またはグラム陽性菌、特にＬｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを完全に除去する方法を提供する。
【００２０】
本発明の目的は、有害な細菌に対して保護されるように、また脂肪を含有する食物上または食物中においてさえ化合物の抗菌活性が維持されるように食品を処理する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、組成物の個々の成分について以前に観察されたものよりもずっと優れた抗菌特性を有する新奇な組成物を提供することである。
【００２２】
これらの、また他の目的は、好ましい実施形態の詳細な説明を参照するに従って当業技術者には容易に明らかになるはずである。
【００２３】
好ましい実施形態の詳細な説明
好ましい実施形態の記述においては理解を容易にするために幾つかの用語を用いる。このような用語は、再引用される実施形態ならびにすべての技術的同義語を包含することを意図しており、ほぼ同じ目的に対してほぼ同じ結果が達成されるようにほぼ同じ方法で運用される。
【００２４】
本発明は、脂肪を含有する食物中においてさえ食物の表面から有害な細菌を減らし、増殖を妨げ、または完全に除去する方法における新奇な抗菌性組成物およびその使用法を提供する。
【００２５】
新奇な抗菌性組成物は、（ａ）１または複数の下記の種類の材料、すなわちランチビオティックス、ペジオシン、およびラクチシンのクラスのバクテリオシン、または分解酵素から得られる１または複数のグラム陽性の静菌性または殺菌性の化合物、および（ｂ）１または複数種のホップ酸もしくはホップ酸誘導体、またはホップ樹脂もしくはホップ樹脂誘導体を含む。
【００２６】
本発明の組成物の第一成分は、グラム陽性の静菌または殺菌活性を有する１または複数種の化合物である。このような化合物には、好ましくはランチビオティックス、ペジオシン、およびラクチシンのクラスのバクテリオシンおよび／または卵白、貝、またはその他の天然の供給源由来のリゾチームが含まれるがこれには限定されない。グラム陽性の静菌または殺菌活性を有する２種類以上の化合物の組み合わせ（例えばナイシンおよびリゾチーム）は、特に本発明の第一成分のより好ましい範囲に該当すると考えられる。
【００２７】
グラム陽性の静菌性化合物の第一クラスはランチビオティックスを含む。用語「ランチビオティックス」は、アミノ酸ランチオニンとその他の「非タンパク質」アミノ酸を含有するナイシンを含むバクテリオシン群を記述するためにＳｃｈｎｅｌｌ等（Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ２７６〜２７８， １９８８）によって造語された。これらバクテリオシンの共通の特性はＫｅｌｌｎｅｒ等（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７７： ５３〜５９， １９８８）によって詳しく調べられ、その中で「・・・多環式ポリペプチド系抗生物質は高含量の不飽和アミノ酸（デヒドロアラニン、デヒドロブトリン）およびチオエーテルアミノ酸（メソ−ランチオニン、（２Ｓ，３Ｓ．６Ｒ）−３−メチルランチオニン）を持っている。さらにリシノアラニン、３−ヒドロキシアスパラギン酸、およびＳ−（２−アミノビニル）−Ｄ−シスチンが幾つかのメンバー中に見出される。」ということを指摘している。この群のメンバーにはナイシン、スブチリン、ｐｅｐ ５、エピデルミン、ガリデルミン、シンナマイシン、Ｒｏ０９−０１９８、ジュラマイシン、およびアンコベニンが含まれる。これらのリボソーム合成されたペプチド系抗生物質は１９〜３４個のアミノ酸を含有し、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ種、乳酸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種を含む様々な微生物によって産生される。その非タンパク質アミノ酸の独特な組成に加えて、それらはその特異性に基づき他のペプチド系抗生物質と区別することができる。一般にバクテリオシン、特にランチビオティックスはきわめて狭い作用スペクトルによって特徴づけられる。したがって細菌のほんの幾つかの種のみが実用的、安全、かつ適切な濃度で特定のバクテリオシンに敏感である。食料品に使用される通常の法律上許容されるレベル（例えば、ある食料品系では純粋なナイシン１２．５ ｐｐｍまで）では、このようなバクテリオシンはせいぜい静菌（すなわち増殖阻害）特性を有するのみである。これは、きわめて少ない使用量でさえ広範な細菌に対して活発な殺菌性を示すポリミキシンＢ１、ならびに大部分の細菌、酵母、また哺乳類の細胞に対してさえ活性な、国際特許公開第ＷＯ８９／００１９４号の中でＪａｙｎｅｓ等によって考察されている「溶菌性ペプチド」などの他の広範なスペクトルをもつペプチド系抗生物質とは対照的である。
【００２８】
ナイシンは、分子量約７０００の二量体として稀に生ずるリボソームでコード化されるペプチドである。これは、その３４個のアミノ酸全体の中にβメチルランチオニン、デヒドロアラニン、およびランチオニンを含む幾つかの変わったアミノ酸を含有する。酸性溶液中でその安定性に寄与するペプチド中に５個の変わったチオ−エーテル連鎖がある。ナイシンは、最も完全に特徴の記述されているバクテリオシンの一つであり、他のランチビオティックス、例えばスブチリンおよびエピデルミンと構造および作用の注目すべき相同性を共有している（Ｂｕｃｈｍａｎ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２６３ （３１）： １６２６０〜１６２６６ （１９８８））。ナイシンの最新の解説、その物性および使用法には、Ｔ． Ｒ． Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒの解説「Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ」， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７０： ３３７〜３４９ （１９８８）、Ａ． Ｈｕｒｓｔ の解説「Ｎｉｓｉｎ」， Ａｖｄ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７： ８５〜１２１ （１９８１）、および米国特許第４，７４０，５９３号がある。ナイシンは、類似のアミノ酸組成を表す幾つかの密接に関係する物質、およびある限定された範囲の抗菌活性を記述する集団名称である。この現象は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｉｏｓｉｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｍ． Ｗｏｏｄｂｉｎｅ編）ｐｐ．１０３〜１３０ （１９８８） の中でＥ． Ｌｉｐｉｎｓｋａによって考察されている。
【００２９】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓと闘うためにナイシンを使用することについては、Ｍ． Ｄｏｙｌｅの論文「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ」， Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４２ （４）： １６９〜１７１ （１９８８） に報告されている。この参考文献は、生物の増殖の初期抑制（約１２時間）について記述し、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは５．０ ほどの低いｐＨで増殖することができ、またアルカリ性ｐＨにも耐性があってｐＨ ９．６で増殖する能力を有することを報告している。
【００３０】
ナイシンは、標準化された２．５重量％の調剤としてＲｈｏｄｉａ Ｉｎｃ．からＮｏｖａｓｉｎ（商標）の商標で市販されている。タンパク質を含有するランチビオティックスもまた、ある幾つかの品種のチェダーチーズまたはアメリカンチーズ中に、またＭＩＣＲＯＧＡＲＤ（登録商標）ＭＧ３００として知られる発酵させた脱脂乳製品中に少量の発酵副産物として存在する可能性がある。実際にはランチビオティックスは、食物に使用する場合の安全性および適応性に基づいて活性成分（ナイシン）約１〜約１００ ｐｐｍの量（処理に用いられる溶液重量で）、好ましくは１〜１２．５ ｐｐｍの量が食品に添加される。
【００３１】
ランチビオティックスを好ましい組み合わせで使用する別法として、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ菌の代謝物、特にペジオシンを代わりに使用すると効き目の大きい結果を得ることができることがまた知られている。ペジオシンは食物に使用することが認可されていないが、将来的には商業用途に受け入れられる可能性はまだある。加えて、ラクチシン、特にアイルランド特許出願第９８０５００号に記載のラクチシン３１４７と呼ばれる連鎖球菌バクテリオシンの新しいクラスは、グラム陽性菌に対する同様の活性をもたらす可能性がある。ランチビオティックスと同様にペジオシンおよびラクチシンのどちらも主として限られた範囲のグラム陽性菌に対して静菌活性を有することが知られている。
【００３２】
グラム陽性の殺菌性タンパク質の第二クラスは分解酵素、特にリゾチームを含み、これは食料品用の抽出プロセスで卵アルブミンから最も普通に得られるのみならず北極地方のイタヤガイ、ヒトの乳汁、涙、およびその他の天然の供給源から入手可能である。リゾチームを殺菌剤として使用する場合は、約５０〜約５００ ｐｐｍ（処理に使用される溶液重量で）、好ましくは約５０〜約２００ ｐｐｍの量を主として熟成チーズ中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍを阻害するために食品に添加する。リゾチームはこのレベルでは他のグラム陽性菌に対しては殺菌性ではないが、広範囲のグラム陽性菌の細胞壁を除去するためにもっと高レベル（１０００ ｐｐｍを超す、一般には２０００ ｐｐｍ以上）で用いられてきた。
【００３３】
リゾチーム（ムラミダーゼ、ムコペプチドＮ−アセチルムカモイルヒドロラーゼ、１，４−β−Ｎ−アセチルヘキソサミノダーゼ Ｅ．Ｃ． ３．２．１．１７）は様々な供給源から単離された粘膜溶解酵素であり、十分に特徴が調べられている。卵白リゾチームは１９２２年にＷ． Ｆｌｅｍｉｎｇにより最初に発見され配列決定された最初のタンパク質であって、Ｘ線結晶学を用いて三次元構造が提唱され、また詳細な作用機構が提案された。グラム陽性菌に対するその抗菌活性は、例えばＦｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２６ （４）： ３５９〜３９５ （１９８８） 中のＣＲＣ Ｃｒｉｔ． ＲｅｖｉｅｗｓでＶ． Ｎ． Ｐｒｏｃｔｅｒ等の解説により十分な記録が残されている。卵白リゾチームの分子量は約１４，３００〜１４，６００であり、等電点はｐＨ １０．５〜１０．７である。これは４つのジスルフィド架橋によって相互に結合したアミノ酸１２９個から構成される。類似の酵素がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｌｉ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４およびヒトの涙などの多様な生産者を含む異なる供給源から単離され、特徴が調べられた。わずかに違いがある（例えばヒトのリゾチームはアミノ酸１３０個を有する）にもかかわらず、アセチルヘキソサミンポリマーの加水分解能力は本質的に同じままである。したがって本発明の目的に対して用語リゾチームは、アセチルヘキソサミンおよび関係のあるポリマーを加水分解する能力を有するこれらの細胞壁またはペプチドグリカン破壊酵素を含むことを意図している。
【００３４】
リゾチームは、細菌および真菌の増殖を弱めまたは阻害することが知られており、ヨーロッパでは様々なチーズ中の腐敗性生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍの増殖を制御するために用いられる。他の様々な食物の保存用途に使用することもまた提案され、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を阻害する（また、ある場合には殺す）ことが報告されている（Ｈｕｇｈｅｙ等の論文、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５３： ２１６５〜２１７０ （１９８７））。卵アルブミンから得られた１ ｍｇ当たり約２０，０００ Ｓｈｕｇａｒ単位の活性をもつリゾチームは、ＮｏｖａＧＡＲＤ（商標）という商標でＲｈｏｄｉａから市販されている。
【００３５】
要約すると、この新規な組成物の第一成分は、好ましくは先に記載したランチビオティックスと分解酵素の組み合わせであり、特にナイシンと卵白リゾチームの組み合わせがより好ましい。
【００３６】
新規な組成物の第二成分は、１または複数種のホップ酸もしくはホップ酸誘導体、またはホップ樹脂もしくはホップ樹脂誘導体、またはこれらの幾つかもしくはすべての組み合わせである。ビールの製造に用いられるホップの苦味成分、具体的にはβ酸は、特に上記静菌性および／または殺菌性化合物と組み合わせると食品の殺菌剤として役立つことがここに判明した。ホップに含まれている苦味のある酸の最も有力なグループはα酸類およびβ酸類であり、またそれぞれフムロン類およびルプロン類とも呼ばれている。両者ともビールの苦味に寄与するがα酸はβ酸よりずっと苦く、大部分の食品では使用は望ましくない。ホップ抽出物の生産者は、様々なクロマトグラフ法により工業的にα酸とβ酸を単離し、また最近では超臨界条件下で液体炭酸を用いて２つの酸のフラクションを分離する技術が開発されている。この操作の副産物が、β酸を約６１重量％含有し、残りが基本的にホップ樹脂からなる生成物である。この副産物はマルトデキストリンまたは別の食料品用キャリヤで標準化し、噴霧乾燥し、抗菌性の食料品用成分として使用することができる。好ましいβホップ酸組成物は、βホップ酸を１重量％含有する天然の風味抽出物として市販されている。
【００３７】
ホップに含まれているα酸類は一般にフムロン、コフムロン、およびアドフムロンとして知られており、一方ホップに含まれているβ酸類は一般にルプロン、コルプロン、およびアドルプロンとして知れれている。米国特許第５，４５５，０３８号に開示されているヘキサヒドロコルプロンおよびテトラヒドロイソフムロンなどの抗菌特性の証明されているホップ酸またはホップ樹脂を化学的に変性した誘導体が、本発明との関連で使用するために特に検討される。またホップ酸またはホップ樹脂の酸性塩の形態の使用が、本発明との関連で使用するために特に検討対象として考慮に入れられる。
【００３８】
実際にはホップ酸または樹脂もしくはその誘導体は、活性成分の量約０．１〜約５０ ｐｐｍ（処理に使用される溶液重量で）、より好ましくは約０．４０〜約２０ ｐｐｍが食品に添加される。
【００３９】
本発明の組成物中に存在してもよいその他の添加剤には下記の材料があるがこれには限定されない。すなわち、チトサンまたはその誘導体などの別の抗菌剤および／またはキレート剤、天然または合成の調味料、精油および／または風味料、染料および／または着色料、ビタミン類、無機物、栄養素、酵素、グアーガムおよびキサンタンガムなどの結合剤。特に好ましい実施形態においてグアーガムは、抗菌成分と処理される食物表面の結合を促進するために本発明の組成物中に存在する。これら材料の添加は本発明の成功にとって重要とは考えられず、当業技術者内でいろいろ考えられるはずである。
【００４０】
本発明の抗菌性組成物は、微生物による分解を受けやすい任意の食品と共に使用することができる。これらには、その派生製品を含む果実および野菜、穀物および穀物から得られる製品、日常食料品、食肉、鶏肉、および魚介が含まれるがこれには限定されない。特に好ましい実施形態において、この組成物は食肉、鶏肉、および／または魚介と共に使用され、より具体的にはホットドッグ、ソーセージ、ローストビーフ、七面鳥の肉、コーンビーフ、およびデリミートなどの脂肪を含有した調理済みの食肉と共に使用される。
【００４１】
この新規な組成物は、食物表面の細菌の量を減少させるために調理前または後に食物表面に簡単に塗布される。実際に食物表面へ問題の組成物を塗布するには、直接塗布または間接塗布のいずれであってもよい。用語「食物表面」の使用は、処理される食品の若干またはすべての内部または外部表面が含まれるものと規定する。
【００４２】
本発明による組成物は、食物の脂肪相中で活性が失われるのを極力抑えるために、ホットドッグまたはボローニャソーセージなどのブレンドされた食品の外側、あるいはローストビーフの断片などの固形食物の外側に塗布することによって最も簡単に使用される。別法では組成物は、調理前または後のソースまたはサルサなどの食品のエマルションまたは未加工成分中に含ませてもよく、あるいは注入またはタンブリングによりハムなどの固形製品の内部に含ませてもよい。さらに他の実施形態において、組成物をマリネ、ブレッディング、調味料の擦りつけ、グレーズ、着色剤の混合物などとして塗布することができ、その基本条件は抗菌性組成物が細菌による分解を受けやすい表面で利用されることである。好ましい実施形態において組成物は、組成物を食品包装材料または包装容器に塗布し、その後その包装材料を食物表面に貼りつけることにより間接的に食物表面と接するように配置することができる。直接であろうと間接であろうと表面処理の方法を用いることは、脂肪を含む食品の脂肪相中に失われるのを極力少なくすることによる利益が得られる。使用される静菌または殺菌に最適な有効量は、処理される特定の食品の組成および食物表面に組成物を塗布するために用いられる方法に左右されることになるが、それは簡単な実験によって決めることができる。本発明の好ましい実施形態において抗菌性組成物は、ランチビオティックス、ペジオシン、ラクチシンのクラスのバクテリオシン、および分解酵素からなる群から選択される少なくとも１種類の静菌性または殺菌性化合物を含む第一成分を約３８．５〜９９．８重量部と、ホップ酸、ホップ酸誘導体、ホップ樹脂、およびホップ樹脂誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物を含む第二成分を約６１．５〜０．２重量部含む。この重量部はすべて、組成物の第一および第二成分の全重量を基準にしている。
【００４３】
第一成分が２種類の化合物を含む本発明の特に好ましい組成物の実施形態において組成物は、第一成分としてランチビオティックスを約１．０〜２．５重量部と分解酵素を約３７．５〜９７．３重量部、また第二成分としてホップ酸、ホップ酸誘導体、ホップ樹脂、およびホップ樹脂誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物を約６１．５〜０．２重量部含むことが好ましい。この重量部はすべて、組成物の第一および第二成分の全重量を基準にしている。
【００４４】
下記の非限定的実施例は、本発明を構成する広範な抗菌性組成物を例示するものである。
【００４５】
実施例１
ナイシンの調剤Ｎｏｖａｓｉｎ（商標）、リゾチーム、およびβホップ酸の単独または組み合わせの阻害効果を示すために、表１に示すように２種類のグラム陽性菌株をトリプチカーゼダイズブイヨン、ｐＨ ６．０中で、３０℃、４８時間試験した。試験は、Ｎｏｖａｓｉｎ（商標）、リゾチーム、およびβホップ酸（ＢＨＡ）の驚くべき相乗効果を実証する。表１は、同じ濃度のＮｏｖａｓｉｎ（商標）、リゾチーム、およびＢＨＡの組み合わせが、各成分単独または２種類の成分の組み合わせよりも著しく優れた阻害効果を有することを示す。任意の単一成分処理または２成分処理の場合、対数１〜３の減少が観察されるのみであるのに、３成分の組み合わせは両方の株で対数５の減少を示す。
【００４６】
【表１】
2004506403.tif 000001
【００４７】
実施例２
本発明の組成物のインビボの効力を実証するためにホットドッグにＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種する。ホットドッグを、（１）Ｎｏｖａｓｉｎ（商標）、リゾチーム、およびＢＨＡ、または（２）Ｎｏｖａｓｉｎ（商標）およびＢＨＡのいずれかを含有する懸濁液中に浸漬し、次いでその表面にＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種した。次いでホットドッグを無菌の袋に詰め、１０℃で１３日間保った。各試料採取日にホットドッグを無菌の生理的食塩水で洗浄し、Ｌｉｓｔｅｒｉａ菌数を得るために樹脂をＬｉｓｔｅｒｉａ選択寒天の上に塗布する。リンス液１ ｍｌをＢＨＩブイヨンに移し、２４時間インキュベートし、続いてＬｉｓｔｅｒｉａ選択寒天の上に塗布することによりホットドッグの強化を行なう。強化後Ｌｉｓｔｅｒｉａ選択寒天の上でカウント零を示す処理物を陰性とみなし、全処理試料に対する分数として記録する。
【００４８】
表２は、Ｎｏｖａｓｉｎ（商標）およびＢＨＡの浸漬がホットドッグ上の最初のＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの数をかなり減少させるのに対し、３成分の組み合わせは直接平板培養または強化回復法のどちらによっても事実上検出されないレベルまでＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの数を減少させることを示している。この３成分の組み合わせでは、少数の損傷した細胞を回復させるために用いられる感受性強化法を適用した後の陰性の結果（３／３）によって立証されるように、増殖能力のあるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生存は観察されなかった。新奇な３成分の組み合わせで処理された試料はすべて、強化後でさえＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに関して陰性であったという発見は、本出願の最も予期せざる発見である。このような発見が、これら抗菌性成分の任意の１つを用いて本明細書に記載の安全かつ適切な使用レベルで報告されたことは未だかってない。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
実施例３
表３に示すように、Ｎｏｖａｓｉｎ、リゾチーム、およびβホップ酸の単独または組み合わせの阻害効果を示すために桿菌属の２種類のグラム陽性の芽胞菌をトリプチカーゼダイズブイヨン、ｐＨ ６．０中で、３０℃、４８時間試験した。試験は、芽胞菌に対するＮｏｖａｓｉｎ、リゾチーム、およびβホップ酸（ＢＨＡ）の驚くべき相乗効果を実証する。表３は、同じ濃度のＮｏｖａｓｉｎ、リゾチーム、およびＢＨＡの組み合わせが、いずれかの成分単独または３種類のうち２種類の成分のみよりも著しく優れた阻害効果を有することを示す。３成分方式の組み合わせは接種されたすべての芽胞を完全に殺すのに、単一成分または２成分で処理した場合はかなりの除去が観察されるが完全ではない。したがってＮｏｖａｓｉｎ、リゾチーム、およびＢＨＡの組成物が芽胞菌に対して相乗的な殺菌活性を示すことがここに結論として実証される。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
実施例４
熱を加えられたハムに対する本発明の組成物の有効性を表４で実証する。熱を加えられたハムの表面にＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種し、次いでＮｏｖａｓｉｎ（商標）、リゾチーム、およびＢＨＡ（処理Ａ）、またはリゾチームおよびＢＨＡ（処理Ｂ）のいずれかを表面に噴霧することにより局所的な処理を行なった。次いでハムを収縮包装し、無菌の袋に入れて真空包装し、華氏４０度（４℃）で６０日間貯蔵した。各試料採取日にハムを無菌の緩衝液で洗浄し、樹脂をＬｉｓｔｅｒｉａ選択寒天の上に塗布して増殖能力のあるＬｉｓｔｅｒｉａ菌数を決定する。リンス液１ ｍｌを脳心臓浸出液（ＢＨＩ）のブイヨンに移し、２４時間インキュベートし、続いてＬｉｓｔｅｒｉａ選択寒天の上に塗布することにより検出可能な平板菌数未満のリステリア菌数の試料に対して強化法を実施した。強化後のＬｉｓｔｅｒｉａ選択寒天の上で否定的（１ ｍｌ 当たり１個未満）な菌数を有する処理物は陰性とみなし、全処理試料に対する分数として記録する。
【００５３】
表４は、対照群が１０，０００倍（対数４）に増加したのに、３成分の組み合わせは接種されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを直接平板培養または強化回復法のどちらによっても検出されないレベルまで減少したことを示している。２成分方式の「リゾチームプラスＢＨＡ」の組み合わせは阻害効果は示したが、殺菌性としてではなかった。３成分の組み合わせにおいては、強化、すなわちきわめて少数の増殖能力のある細胞または損傷した細胞を回復させるために用いられる手法を適用した後の陰性の結果によって立証されるように、増殖能力のあるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生存は観察されなかった。したがってこのデータは、好ましい３成分組成物の局所的な塗布により、熱を加えられたハムなど高脂肪の加工食料品中のＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを完全に除去することができることを実証している。
【００５４】
【表４】
2004506403.tif 000004
【００５５】
実施例５
フランクフルトソーセージをＬｉｓｔｅｒｉａから保護するための本発明の組成物の有効性。ホットドッグのエマルションを含有するセルロース製包装容器の中に組成物を組み込むことにより、調理の間にＮｏｖａｓｉｎおよびＢＨＡの組成物をフランクフルトソーセージの表面に送達した。調理ののち包装容器を剥ぎ、次いで仕上がったフランクフルトソーセージの表面にＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種し、無菌の袋に真空包装した。包装され接種されたフランクフルトソーセージを華氏４０度（４℃）で６０日間以上貯蔵し、各試料採取の時点で新鮮な包装容器を開封した。各試料採取時に無菌の緩衝液を用いてフランクフルトソーセージをその包装容器と一緒に洗浄し、次いでＬｉｓｔｅｒｉａ選択寒天の上に塗布して増殖能力のあるＬｉｓｔｅｒｉａの菌数を決定した。
【００５６】
表５は、２成分の組み合わせが６１日を超える期間Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を阻害し、インキュベーションの終わりには対照と比較して対数４（１０，０００倍）を超すリステリアの減少をもたらしたことを示す。このデータは、好ましい２成分組成物の塗布を送達する包装容器がフランクフルトソーセージ上のＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生長を妨ぎ、組成物を送達し、それによってフランクフルトソーセージおよびソーセージの安全性を向上する実用的な方法である可能性があることを実証する。より重要なことはこの表面塗布の方法が、典型的なホットドッグエマルションの高脂肪の環境においてさえ、成分の活性を十分に実現させることを可能にする。これとは対照的に、この組成物を調理前のホットドッグエマルション中に成分として使用する場合には抗菌活性は劇的に低下し（データは示さない）、これは有意な量の脂肪を含有する食物中でのナイシンの活性の喪失（Ｍｕｒｉａｎａ， Ｐ． Ｍ．およびＫａｎａｃｈ， Ｌ．の論文、Ｕｓｅ ｏｆ Ｎｉｓａｐｌｉｎ ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｓｐｏｉｌａｇｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｂｕｔｔｅｒｍｉｌｋ Ｒａｎｃｈ Ｄｒｅｓｓｉｎｇ， Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ５８， Ｎｏ．１０， １９９５）およびホップ酸の活性の喪失（Ｊｏｈｎｓｏｎ等の論文、１９９６年）を実証した以前の著者達による観察と一致している。したがって開示した表面塗布の方法は、高い脂肪量（４ ｗ／ｗ％を超す）を含有する食物中で本発明の組成物の効力を最大にする驚くべき手段を明らかにする。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
本発明を詳細かつその好ましい実施形態を参照して記述したが、これにより特許請求の範囲の領域を逸脱することなく修正形態および変形形態が可能であることは明らかであろう。