(57)【要約】本発明者らは、アスパラギンに隣接するグリシンを他のアミノ酸に置換すれば抗体の活性に影響を与えずに、抗体の脱アミド化を抑制しうることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質中の脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸で置換することを特徴とするタンパク質の安定化方法。
【請求項２】
脱アミド化されるアミノ酸がアスパラギンである、請求項１に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項３】
脱アミド化されるアミノ酸のＣ末端側に隣接するアミノ酸がグリシンである、請求項１に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項４】
タンパク質が抗体である、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項５】
抗体がヒト型化抗体である、請求項４に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項６】
脱アミド化されるアミノ酸が相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在することを特徴とする、請求項４または５に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）がＣＤＲ２である請求項６記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項８】
タンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項９】
タンパク質が免疫グロブリンスーパーファミリーである、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１０】
タンパク質が医薬品である、請求項１から３いずれかに記載のタンパク質安定化方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法により安定化されたタンパク質。
【請求項１２】
抗原結合活性がアミノ酸置換前の抗原結合活性の７０％以上であることを特徴とする、請求項１１記載の安定化されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はタンパク質の安定性を改良する方法に関する。具体的には、タンパク質中の脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸で置換することを特徴とするタンパク質の安定化方法に関する。
背景技術
タンパク質の安定性が低下する原因の一つとして、タンパク質に含まれるアスパラギン等のアミノ酸が時間の経過と共に徐々に脱アミド化されることが挙げられる。タンパク質の中でも、特に抗体を医学的製剤として様々な疾患に対して用いる場合には、長時間安定であることが必要とされるが、実際には時間の経過と共に抗体の活性は低下していく。活性低下の原因は様々であるが、この場合も原因の一つとして抗体に含まれるアスパラギン等のアミノ酸が脱アミド化されることが挙げられる。
したがって、アスパラギンの脱アミド化を抑制すれば、タンパク質を安定化できることから、アスパラギンの脱アミド化を抑制する研究が行われている。アスパラギンの脱アミド化を防ぐには、部位特異的変異によってアスパラギンを他のアミノ酸に置換する方法が最も確実な方法として考えられるが、該置換がタンパク質の活性へ影響を及ぼす可能性がある。例えば、アスパラギンが抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）に存在する場合には、該置換が抗体の結合活性に影響を与えてしまうことが報告されている（Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ：Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８５：３７９−３８９，２００１）。また、内因性血液凝固反応において組織因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）を介した第Ｘ因子の活性化を阻害することにより、外因性血液凝固反応を抑制せずに血栓形成を抑制することが期待されている抗ヒトＴＦ抗体が知られているが（国際公開公報第９９／５１７４３号）、製剤処方されておらず、抗体が不安定化するような条件下では、その活性も時間の経過と共に低下し、その要因として抗ヒトＴＦ抗体の脱アミド化が推測されている。
そこで、抗体の活性に影響を与えずにアスパラギンの脱アミド化を抑制する方法が望まれていた。
発明の開示
タンパク質の活性低下は、医学的・薬学的見地から非常に重要な問題である。特に抗体に関しては、医学的製剤として用いることのできる長時間安定な抗体が、臨床的に必要とされている。特に抗体の活性低下の原因の一つである、抗体に含まれるアスパラギン等のアミノ酸の経時的脱アミド化、主に、脱アミド化されやすいＡｓｎ−Ｇｌｙ配列中のアスパラギンの脱アミド化を抑制することが、抗体を安定化するために求められる。
従来、タンパク質のアミノ酸改変による脱アミド化抑制方法は、製剤処方の選択肢を増やすことにより、多様な剤形・投与経路への適応を容易にし、医薬品の価値や品質等の向上を図るためには有用な技術である。そこで本発明は、タンパク質、特に抗体の活性に影響を与えずにアスパラギンの脱アミド化を抑制する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、タンパク質の活性に影響を与えずにアスパラギンの脱アミド化を抑制する手法の開発において、タンパク質の一例として医薬としての利用が期待されている抗ヒトＴＦ抗体に着目して鋭意研究を行った。まず、抗ヒトＴＦ抗体のＣＤＲに存在し、脱アミド化する可能性のあるアスパラギンをアスパラギン酸に置換した変異抗ヒトＴＦ抗体を組換え体として発現させたところ、抗ヒトＴＦ抗体重鎖（Ｈ鎖）のＣＤＲ２領域に存在するＡｓｎ５４が脱アミド化されることにより、抗ヒトＴＦ抗体のＴＦ結合活性が著しく低下することが示唆された。抗ヒトＴＦ抗体重鎖のＣＤＲ２領域のＡｓｎ５４に隣接するアミノ酸はＧｌｙ５５であり、これら２アミノ酸は脱アミド化が容易に起きやすいＡｓｎ−Ｇｌｙという一次配列をとっていることから、このＧｌｙ５５を他のアミノ酸に置換することで、Ａｓｎ５４の脱アミド化を抑制できる可能性を考えた。そこで、本発明者らは、アスパラギンに隣接するグリシンを他のアミノ酸に置換した変異体を調製し、その変異体の結合活性の測定を行った。その結果、アスパラギンに隣接するグリシンを他のアミノ酸に置換しても活性は低下せず、なおかつ脱アミド化による公知の不安定化を抑制できることを見出した。
すなわち、本発明者らは、アスパラギンの置換を行う代わりに、アスパラギンに隣接するグリシンを他のアミノ酸に置換すれば、抗体の活性に影響を与えないことを見出し、本発明を完成した。
本発明は、より詳細には、
（１）  タンパク質中の脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸で置換することを特徴とするタンパク質の安定化方法、
（２）  脱アミド化されるアミノ酸がアスパラギンである、（１）に記載のタンパク質の安定化方法、
（３）  脱アミド化されるアミノ酸のＣ末端側に隣接するアミノ酸がグリシンである、（１）に記載のタンパク質の安定化方法、
（４）  タンパク質が抗体である、（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質の安定化方法、
（５）  抗体がヒト型化抗体である、（４）に記載のタンパク質の安定化方法、
（６）  脱アミド化されるアミノ酸が相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在することを特徴とする、（４）または（５）に記載のタンパク質の安定化方法、
（７）  相補性決定領域（ＣＤＲ）がＣＤＲ２である（６）記載のタンパク質の安定化方法、
（８）  タンパク質が抗原結合タンパク質である、（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質の安定化方法、
（９）  タンパク質が免疫グロブリンスーパーファミリーである、（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質の安定化方法、
（１０）  タンパク質が医薬品である、（１）から（３）いずれかに記載のタンパク質安定化方法、
（１１）  （１）から（１０）のいずれかに記載の方法により安定化されたタンパク質、
（１２）  抗原結合活性がアミノ酸置換前の抗原結合活性の７０％以上であることを特徴とする、（１１）記載の安定化されたタンパク質、
を提供するものである。
以下に本明細書に規定された用語の定義を示すが、これらは、本明細書中で使用される用語を理解を容易にする目的で記載されたものであり、本発明を限定する目的で用いられるべきではないことは理解されたい。
本明細書中の「タンパク質」という用語は、５アミノ酸以上の、組換えタンパク質、天然のタンパク質、およびアミノ酸同士を人工的に結合して調製された合成ペプチドを意味する。タンパク質は、好ましくは１４残基以上、さらに好ましくは３０残基以上、さらに好ましくは５０残基以上のアミノ酸配列からなる。
本発明の安定化方法における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）、ならびに多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）等が含まれる。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体が特定の抗原に対する特異的結合性を示すのに対して、免疫グロブリンには、抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子が含まれる。天然の抗体および免疫グロブリンは、一般的に約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体であり、２本の同じ軽鎖（Ｌ鎖）および２本の同じ重鎖から成る。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合により連結されているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプの種類によって異なる。重鎖および軽鎖はまた、それぞれ一定間隔の鎖内ジスルフィド橋を有する。各重鎖は一つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、それに連結された多数の定常領域を有する。各軽鎖は一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と並んでおり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖の可変領域のインターフェイスを形成していると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８６：６５１−６６３，１９８５、Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ，Ｈａｂｅｒ  Ｅ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４５９２−４５９６，１９８５）。
脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、その定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型に分類できる。また、「免疫グロブリン」は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づき、異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンには、少なくとも５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そしてさらに、これらのうちのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４や、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類することができる。異なるクラスの重鎖定常領域は、各々α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は周知である。
本明細書中の「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む慣用な（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを要求するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１、Ｍａｒｋｓ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７，１９９１）。本明細書中のモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラスもしくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラスもしくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を有する限り、このような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５，１９８４）。
「抗体変異体」という用語は、１またはそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであっても、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本明細書中の「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖もしくは軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。本発明の方法は、抗体およびその断片の両ポリペプチドに対して等しく適用されるので、これらの用語はときどき交代して使用される。
「抗体断片」という用語は全長抗体の一部のことであり、一般に抗原結合領域または可変領域を指す。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、各１つずつの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、および残りの、容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により、２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）２断片、および残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、一本鎖抗体分子および抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。本明細書中、抗体の「機能性断片」とはＦｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片を指す。
ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖および軽鎖の可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常領域および重鎖の定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点でＦａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常領域の１またはそれ以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を示すものである。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化物のヒンジ部のシステインにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られている。
「ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）、ＶＨ−ＶＬを含む。同じ鎖中で２つの領域間を結合できないくらいに短いリンカーを用いると、２つの領域はもう一方の鎖の定常領域とペアを形成し、２つの抗原結合部位が創り出される。Ｄｉａｂｏｄｙについては、例えば欧州特許第４０４，０９７号、国際公開公報第９３／１１１６１号およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３）により詳細に記載されている。
一本鎖抗体（以下、一本鎖ＦｖもしくはｓＦｖとも呼ぶ）またはｓＦｖ抗体断片には、抗体のＶＨおよびＶＬ領域が含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ＦｖポリペプチドはさらにＶＨおよびＶＬ領域の間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりｓＦｖは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．２６９−３１５，１９９４）参照。
多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常、このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（すなわち二重特異性抗体）、本明細書中では「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長から成る抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）であり得る。
本発明の「ヒト型化抗体」とは、遺伝子工学的に作製される抗体であって、具体的には、その超可変領域のＣＤＲの一部または全部が非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター等）のモノクローナル抗体に由来する超可変領域のＣＤＲであり、その可変領域の枠組領域がヒト免疫グロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒト免疫グロブリン由来の定常領域であることを特徴とする抗体を意味する。ここで、超可変領域のＣＤＲとは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する３つの領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を指す。また、可変領域の枠組領域とは、前記３つのＣＤＲの前後に介在する比較的保存された４領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）のことを指す。すなわち、本発明の「ヒト型化抗体」とは、非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体の超可変領域のＣＤＲの一部または全部以外のすべての領域が、ヒト免疫グロブリンの対応領域と置換された抗体を意味する。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも導入されたＣＤＲまたは枠組構造配列のどちらにも見られない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、さらに抗体の能力を正確に至適化するために行われる。一般に、すべてのヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域を実質的に含む。その中で、すべて、または実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、全部または実質的に全部のＦＲはヒト免疫グロブリン可変領域のものである。最適には、ヒト化抗体はさらに、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ＰＴ，ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７，１９８８）およびＰｒｅｓｔａ，ｅｔ  ａｌ（Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２：５９３−５９６，１９９２）参照のこと。
抗体の可変領域における「可変」という用語は、可変領域中のある部分が抗体間で非常に異なっており、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用されていることを指す。可変な部分は、軽鎖および重鎖の両可変領域中のＣＤＲまたは超可変領域と呼ばれる３つの部分に集中している。ＣＤＲを決定するためには、少なくとも次の２つの方法がある：（１）種間配列変異性に基づく手法（すなわち、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）１９８７）および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づいた手法（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３，１９８９）。可変領域の中でより高度に保存された部分は、ＦＲと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、主としてβシート構造を持ち、３つのループ状連結を形成し、場合によってはβシート構造の部分を形成するＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲによりもう一方の鎖のＣＤＲと非常に近接して保持され、抗体の抗原結合部位の形成に一役買っている（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ、参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与していないが、抗体の抗体依存細胞毒性への参加等の種々のエフェクター機能を示す。
ヒト免疫グロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有しているが、本発明において該ヒト型化抗体の定常領域は、いずれのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域が用いられる。また、ヒト免疫グロブリン由来の可変領域のＦＲについても特に限定されない。
本明細書中の「抗原」には、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を有さない不完全抗原（ハプテンを含む）の両方が含まれる。抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、脂質等の物質が挙げられ、その種類は特に限定されない。抗体を調製する際の免疫原としては、場合により他の分子に結合させた可溶性抗原またはその断片を、抗体を産生するための免疫原として用いることができる。受容体等の膜貫通分子については、これらの断片（例えば、受容体の細胞外領域）を免疫原として用いることができる。また、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として用いてもよい。このような細胞は、天然（例えば、腫瘍細胞株）でもよく、または膜貫通分子を発現するように組換え技術により形質転換した細胞でもよい。抗体の調製には、その他の当業者に公知のいずれの形態の抗原をも使用し得る。
本明細書中でいう「抗原結合タンパク質」は、抗原との結合能を有するタンパク質のことをさす。
本明細書中でいう「免疫グロブリンスーパーファミリー」とは免疫グロブリンの定常または可変ドメインと相同性のあるドメインを一つあるいは複数個含むという構造上の特徴をもつタンパク質である。免疫グロブリンスーパーファミリーには、免疫グロブリン（Ｈ鎖、Ｌ鎖）、Ｔ細胞レセプター（α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖）、ＭＨＣクラスＩ分子（α鎖）、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩ分子（α鎖、β鎖）、ＣＤ３（γ鎖、δ鎖、ε鎖）、ＣＤ４、ＣＤ８（α鎖、β鎖）、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、ＦｃレセプターＩＩ、ｐｏｌｙＩｇレセプター、Ｔｈｙ−１、ＮＣＡＭ、ＭＡＧ（ｍｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｐｏ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＤＧＦレセプターなどが含まれる。
本明細書中でいう「医薬品」とは、疾病や怪我などの治療や予防、体質の改善などの目的で動物に投与される物質のことをいう。
１．タンパク質の安定化のためのアミノ酸の改変
本発明は、タンパク質中の脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸で置換することを特徴とするタンパク質の安定化方法を提供する。本発明において安定化の対象となるタンパク質には、特に制限はない。好適なタンパク質の一例として抗体が挙げられる。抗体としては、医薬としての有用性の観点からヒト化抗体又はヒト抗体が好ましい。
タンパク質中の脱アミド化されるアミノ酸としては、アスパラギン以外にもグルタミンが知られている（Ｓｃｏｔｃｈｌｅｒ  ＪＷ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＡＢ：Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：３１９−３２２，１９７４）。５アミノ酸からなるペプチドで比較すると、アスパラギンの半減期が６〜５０７日であるのに対して、グルタミンの半減期は９６〜３４０９日である。すなわち、グルタミンの脱アミド化反応速度はアスパラギンに比べて非常に遅い（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  Ｒ，Ｋｏｌｂｅ  ＨＶＪ：Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  ６６２：２６１−２７８，１９９４）。抗体製剤に関しては、グルタミンの脱アミド化は検出されていない（Ｈａｒｒｉｓ  ＲＪ，Ｋａｂａｋｏｆｆ  Ｂ，Ｍａｃｃｈｉ  ＦＤ，Ｓｈｅｎ  ＦＪ，Ｋｗｏｎｇ  Ｍ，Ａｎｄｙａ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  ７５２：２３３−２４５，２００１）。しかし、生体内での脱アミド化反応は製剤中よりも加速されることが予想されるため（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＮＥ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＡＢ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１２４０９−１２４１３，２００１）、生体内半減期の長い抗体製剤を開発する場合には、アスパラギンに加えてグルタミンの脱アミド化を抑制することが必要となると考えられる。脱アミド化されるアミノ酸は、好ましくはアスパラギンである。
タンパク質中の脱アミド化されるアミノ酸に隣接し、置換しうるアミノ酸としては、グリシン以外のアミノ酸も考えられる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＮＥ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＡＢ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：４３６７−４３７２，２００１）。しかしながら、特にグリシンはアスパラギンの脱アミド化を引き起こすことが知られている。脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸は、好ましくはグリシンである。
一般に、ＣＤＲにあるアミノ酸を置換すると抗体の活性が失活するが、ＣＤＲに存在するアスパラギンに隣接するアミノ酸を他のアミノ酸で置換しても抗体の活性は維持され、安定性を改善できることが発明者らにより見出された。したがって、本発明においては、ＣＤＲのアスパラギンに隣接するアミノ酸を他のアミノ酸への置換の標的とすることが、効果的である。アスパラギンに隣接するアミノ酸としては、グリシンが置換の標的に適しており、特に脱アミド化されやすい「Ａｓｎ−Ｇｌｙ」配列中に存在するグリシンは、最も好適な標的である。
本発明においては、タンパク質の安定性および生物学的活性を低下させない限り、上記の脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸に加えて、それ以外の１もしくは複数のアミノ酸を改変してもよい。タンパク質が抗体である場合、その生物学的活性とは、抗原と特異的に結合する活性を指す。アミノ酸の改変は、タンパク質の性質を保持させる観点から、保存的置換であることが好ましい。
タンパク質のアミノ酸の改変は、タンパク質をコードする遺伝子配列を組み換える方法で行うことができる。遺伝子の組換えには、一般的に知られている手法を用いることができる。
タンパク質が抗体である場合、そのアミノ酸の改変は、以下のように行うことができる。例えば、抗体の１または複数の超可変領域において、１または複数のアミノ酸残基が改変されたバリアント抗体または変異体を作製することができる。それに加えて、抗体配列に変異を加えることによって抗原への抗体変異体の結合親和性が改善されるように、哺乳動物抗体の枠組構造残基に、１または複数の変異（例えば、置換）を導入することができる。改変できる枠組構造残基の例には、抗原に直接、非共有結合により結合する部分（Ａｍｉｔ  ＡＧ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７４７−７５３，１９８６）、ＣＤＲの構造に作用する、および／もしくは影響する部分（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７，１９８７）、ならびに／または、ＶＬ−ＶＨ相互作用に関係する部分（欧州特許第２３９，４００，Ｂ１号）が含まれる。ある態様では、１または複数のこのような枠組構造残基の改変により、抗原に対する抗体の結合親和性が増幅される。
抗体変異体を製造するための有用な方法の一つに「アラニンスキャニング突然変異誘発」（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＢＣ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５，１９８９、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＢＣ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：６４３４−６４３７，１９９１）がある。この方法によると、１もしくはそれ以上の超可変領域残基がアラニン、またはポリアラニン残基により置換され、抗原と該抗原と対応するアミノ酸との相互作用が変化する。置換に対して機能的に感受性を示した超可変領域残基は、その後、置換部位に対してさらに、または別の変異を導入することによってより詳細に区別される。よって、アミノ酸配列変異を導入する部位はあらかじめ決定されているが、変異の種類はあらかじめ決定しておく必要はない。
この方法により製造されたａｌａ変異体を、その生物学的活性についてスクリーニングする。スキャニングする残基により与えられる所望の性質に依存して、他のアミノ酸について同様の置換を試みることもできる。また、改変するアミノ酸残基をより体系的に同定する方法もある。この方法では、第１の哺乳動物種抗原を結合するのに関与する種特異的抗体中の超可変領域残基、および第２の哺乳動物種の相同抗原の結合に関与する超可変領域残基を同定することができる。これを達成するためには、各ａｌａ変異体について第１および第２の哺乳動物種の抗原に対する結合を試験する種特異的抗体の超可変領域残基のアラニン検索を行い、第１の哺乳動物種（例えばヒト）の抗原の結合に関与する超可変領域残基、および第２の哺乳動物種（例えば非ヒト）の抗原の相同体の結合に関与する部分を同定する。好ましくは、第２の哺乳動物種（例えば非ヒト哺乳動物）由来の抗原の結合に明らかに関与するが、第１の哺乳動物種（例えばヒト）由来の抗原の結合には関与しない残基は、改変のための候補となる。別の態様においては、第１および第２の哺乳動物種由来の抗原の結合に明らかに関与する残基が改変のために選択される。このような改変には、残基の欠失、または、１もしくはそれ以上の残基を標的残基に連結させる挿入が含まれるが、通常、改変とは残基を別のアミノ酸に置換することである。
アミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当分野において公知の種々の方法により調製される。これらの方法には、次のものに限定されるわけではないが、種特異的抗体の先に調製した変異体または非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異、ＰＣＲ変異、およびカセット変異が含まれる。変異体の作製において好ましい方法は、部位特異的変異（Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２，１９８５参照）等である。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を、元となった抗体の重鎖もしくは軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と有する。配列の相同性または類似性は、本明細書中では、配列相同性が最大の値を取るように、必要に応じて配列を整列およびギャップを導入した後の候補配列中の種特異的抗体残基と相同（すなわち、同じ残基）、または類似（すなわち、上述の一般的な側鎖特性に基づいた同じグループのアミノ酸残基）するアミノ酸残基の割合として定義される。
代わりに、抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲの系統的な変異により抗体変異体を作製することもできる。このような抗体変異体を作製するための好ましい方法には、ファージディスプレイ（Ｈａｗｋｉｎｓ  ＲＥ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６，１９９２、Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ，ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８，１９９１）を用いたアフィニティ成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を利用した方法が含まれる。バクテリオファージコートタンパク質融合（Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７，１９８５、Ｓｃｏｔｔ  ＪＫ，Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０，１９９０、Ｃｗｉｒｌａ  ＳＥ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２，１９９０、Ｄｅｖｌｉｎ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６，１９９０、Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎによる総説、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２：５９７，１９９２、米国特許第５，２２３，４０９号）は、ディスプレイされたタンパク質またはペプチドの表現型を、それをコードするバクテリオファージ粒子の遺伝子型につなげるのに有用な方法として知られる。また、抗体のＦ（ａｂ）領域をファージ上にディスプレイする方法も知られる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２，１９９０、Ｂａｒｂａｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７９７８，１９９１、Ｇａｒｒａｒｄ，ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３，１９９１）。一価のファージディスプレイは、タンパク質バリアントの一群をバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として、数個のファージ粒子についてバリアントの１つのコピーのみが提示されるようにディスプレイする工程を含む（Ｂａｓｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：３０９，１９９０）。
アフィニティ成熟、または、種々のタンパク質の結合親和性の平衡の改善は、以前より、ヒト成長ホルモン（Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３４：５６４−５７８，１９９３、米国特許第５，５３４，６１７号）、および、抗体のＦ（ａｂ）領域（Ｂａｒｂａｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：３８０９，１９９４、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５４：３９２，１９９５）の例に見られるように突然変異生成、一価ファージディスプレイ、機能分析および好ましい変異の付加により行われている。配列の特定部分が異なる多くの（１０６個）タンパク質バリアントのライブラリーを、特定のタンパク質バリアントをコードするＤＮＡを各々含むバクテリオファージ粒子上に作製することができる。固定された抗原を用いて何サイクルかアフィニティ精製した後、個々のバクテリオファージクローンを単離し、そのディスプレイされたアミノ酸配列をＤＮＡから類推することができる。
２．ポリクローナル抗体の製造
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹膜内（ｉｐ）注射により非ヒト哺乳動物で作られる。免疫化される種に対して免疫原性のタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、仔ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、例えば、マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、塩化チオニル、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＣＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）等の二機能性の薬剤もしくは誘導剤を用いて関連抗原を結合させることもできる。
例えば、１００μｇもしくは５μｇのタンパク質もしくはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスについての量）を３倍量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバントと合わせ、溶液を複数回、皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化する。一カ月後、動物を元のＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの１／５〜１／１０量を複数の部位に皮下注射することにより追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。好ましくは、動物の追加免疫の際には、同じ抗原ではあるが異なるタンパク質に、および／または、異なる交差結合試薬を介して結合されたコンジュゲートを用いる。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養タンパク質融合により作製することもできる。また、免疫応答を増幅するため、ミョウバン等の凝集剤が好ましくは用いられる。選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、および競合分析（例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。
所望のポリクローナル抗体のスクリーニング法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１９８８）に記載されるような慣用の交差結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：１３８８−１３９４，１９９５）を行ってもよい。ポリペプチドまたは抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量化を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて抗体の１もしくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。
３．モノクローナル抗体の製造
モノクローナル抗体は単一の抗原部位を認識する抗体であり、均一な特異性により、一般的に多数の異なる抗原部位を認識する抗体を含むポリクローナル抗体よりも有用である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５）または、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）等により製造することができる。
ハイブリドーマ法では、マウス、または、ハムスターもしくはアカゲザル等の他の適当な宿主動物を免疫化に使用したタンパク質に対して特異的に結合する抗体を産生するが、または、産生できるリンパ球を誘導するために上述と同様に免疫化する。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてリンパ球を免疫化することもできる。その後、リンパ球をポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ．５９−１０３，１９８６）。製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の生育または成長を阻害する１またはそれより多くの物質を含む適当な培養培地に植え、生育させる。例えば、もし親ミエローマ細胞がヒポキサンチングアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマのための培養培地には、典型的には、ＨＧＲＰＴ欠損細胞の生育を阻止する物質ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンが含まれる（ＨＡＴ培地）。
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞において、安定で高いレベルで抗体を産生し、そして、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性の細胞である。これらの中で好ましいミエローマセルラインは、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）より入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）から入手できるＳＰ−２、またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウスミエローマラインである。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトｈｅｔｅｒｏｍｙｃｌｏｍａセルラインも、ヒトモノクローナル抗体の産生に用いられてきた（Ｋｏｚｂａｒ：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：３００１，１９８４、Ｂｒｏｄｅｕｒ，ｅｔ  ａｌ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．５１−６３，１９８７）。
次に、ハイブリドーマ細胞を培養した培地中の、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、または放射免疫分析（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合分析により測定する。所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限定的希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により生育させる（Ｇｏｄｉｎｇ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ．５９−１０３，１９８６）。この目的に適した培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０である。さらに、ハイブリドーマ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物中の腹水腫瘍として生育させることもできる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、好ましくは培養培地、腹水液、または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィー等の慣用な免疫グロブリン精製方法により分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法、例えばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組み換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０）により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより、抗体または抗体断片を単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１）およびＭａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７，１９９１）は、各々、ファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離について記載する。次の文献は、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造（Ｍａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３，１９９２）について、そして、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ：Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：２２６５−２２６６，１９９３）について記載する。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の定常領域のコード配列をそれに対するマウス配列に代えて置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１，１９８４）、または免疫グロブリンポリペプチドを共有結合により結合させることにより改変することができる。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、１つの抗原に対して特異性を有する抗原結合部位、および異なる抗原に対して特異性を有する抗原結合部位を有するキメラ二特異性抗体を構築するため、抗体の定常領域で置換するか、または抗体の抗原結合部位の可変領域を置換する。
４．抗体断片の製造
従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７，１９９２、Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１，１９８５）が、現在は組換え技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片の形態に化学的結合させることもできる（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７，１９９２）。さらにまた別の方法としては、Ｆ（ａｂ’）２断片を直接、組換え宿主培養物から単離することもできる。その他、一本鎖抗体および一本鎖抗体等の断片の作製方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。
５．多特異性抗体の製造
当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現を含むものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９，１９８３）。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ（クワドローマ）は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するものを選択する必要がある。選択はアフィニティクロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常領域配列に融合する。該定常領域配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域のうち、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。それぞれの鎖の存在割合が同じでないほうが得られる抗体の収量が上がる場合には、別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入したほうが、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖−軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる。該分離方法については、国際公開公報第９４／０４６９０号参照。二特異性抗体の作製方法については、さらに、Ｓｕｒｅｓｈ，ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０，１９８６）の方法を参照することができる。組換え細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らし、ヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常領域のＣＨ３を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の１もしくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きな側鎖のアミノ酸を小さな側鎖のアミノ酸（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて、第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（国際公開公報第９６／２７０１１号）。
二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開公報第９１／００３６０号、国際公開公報第９２／００３７３号、欧州特許第０３０８９号）。このようなヘテロ共役抗体の作製に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号にもそのような例が記載されている。
また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずＦ（ａｂ’）２断片を作製し、同一分子内でのジフルフィド形成を防ぐために、断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にＦ（ａｂ’）２断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のＦ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体をＦａｂ’−チオールに再還元した後、Ｆ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体およびＦａｂ’−チオールを等量混合し、二特異性抗体を製造する。
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体を製造し、単離する方法も、種々報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７−１５５３，１９９２）。まず、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体ヘテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変領域（ＶＬ）に重鎖可変領域（ＶＨ）を、これら２つの領域間でのペアを形成できないくらいに短いリンカーを介して連結することで、相補的な別のＶＬおよびＶＨ領域とペアを形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させる方法もある（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３）。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）を用いたダイマーについても報告されている（Ｇｒｕｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：５３６８，１９９４）。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている（Ｔｕｔｔ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：６０，１９９１）。
６．ヒト化抗体の製造
ヒト化抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。用いるヒト抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公知である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１，１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６，１９９７、特表平４−５０４３６５号公報、特表平７−５０９１３７号公報、日経サイエンス  ６：４０−５０，１９９５、国際公開公報９４／２５５８５号、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９，１９９４、特表平６−５００２３３号公報等）。該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、具体的には次のような手順により製造することができる。
（１）非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等）で置換することによる、該動物内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が機能的に不活性化されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（２）非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等）で置換することによる、該動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子（特にκ鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（３）酵母人工染色体（ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；ＹＡＣ）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターに用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（４）ＹＡＣ等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（５）前記（１）〜（４）のノックアウト非ヒト哺乳動物およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物を任意の順序で交配することにより、非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能的に不活性化され、かつヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域およびヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所望の領域が共に非哺乳動物染色体上に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程。
上述のように、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等）で相同組換えにより置換することにより該遺伝子座が再構成できないように不活性化することができる。該相同組換えを用いた不活性化には、例えば、ポジティブネガティブセレクション（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；ＰＮＳ）と呼ばれる方法を用いることができる（日経サイエンス  ５：５２−６２，１９９４）。また、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の機能的な不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成でき、免疫グロブリン軽鎖（例えばκ鎖）の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域もしくはＣ領域の一部、またはＪ領域およびＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
トランスジェニック動物は、通常の方法により製造することができる（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、第７章（エル・アイ・シー）ｐｐ．３６１−４０８，１９９０）。具体的には、例えば、正常な非ヒト動物胚盤胞に由来するヒポキサンチングアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）陰性胚性幹（ＥＳ）細胞を、該ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子またはその一部、ならびにＨＲＰＴ遺伝子が挿入されたＹＡＣベクターを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合する。該外来遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をＨＡＴセレクションにより選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を別の正常非ヒト哺乳動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：７３８０−７３８４，１９８０、米国特許第４，８７３，１９１号）。該胚盤胞を仮親となる別の非ヒト哺乳動物の子宮に移植することにより、キメラトランスジェニック非ヒト哺乳動物が誕生する。該キメラ動物を正常な非ヒト哺乳動物と交配させ、ヘテロトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得る。該ヘテロ動物同士を交配することにより、メンデルの法則に従い、ホモトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖および軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより宿主を形質転換して得られる遺伝子組換え宿主であって、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する宿主を培養することにより、培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は受精卵以外の真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞である。
本発明の方法により安定化された抗体の抗原結合活性は、特に限定はされないが、アミノ酸置換前の活性の７０％以上を有していることが好ましく、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましいのは９０％以上である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例によりいかなる意味でも限定されるものではない。
［実施例１］  抗ヒトＴＦ抗体Ａｓｎ５４置換変異体のＴＦとの結合活性および中和活性の測定
国際公開公報第９９／５１７４３号に記載されているヒト組織因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）に対するヒト型化抗体は、内因性血液凝固反応におけるＴＦを介した第Ｘ因子の活性化を阻害することにより、外因性血液凝固反応を抑制せずに血栓形成を抑制することが期待されている。この抗ヒトＴＦ抗体は、ヒト型化重鎖バージョンｉ（配列番号：２５、図１）およびヒト型化軽鎖バージョンｂ２（配列番号：２６、図１）を含んでおり、重鎖可変領域内のＣＤＲ２に存在するＡｓｎ５１およびＡｓｎ５４、重鎖可変領域内のＦＲ１に存在するＡｓｎ２８など、脱アミド化される可能性のある複数のアスパラギンを有している。特にＡｓｎ５４はＡｓｎ−Ｇｌｙ配列を有しており、脱アミド化が起こりやすいと考えられる。
該抗体は、製剤処方されておらず、抗体が不安定かするような条件下では、溶液ｐＨ依存的にＴＦに対する結合活性が低下し、低ｐＩ分子種が増加することが観察されている。塩基性が強くなると変性が強くなることから、この結合活性の低下と低ｐＩ分子種の増加は、抗ヒトＴＦ抗体を構成するアミノ酸の脱アミド化に起因するものと予想されており、さらに、抗原結合活性の低下も併せて観察されることから、ＣＤＲ領域において脱アミド化が起こっていることが考えられる。
これらの知見に基づき、国際公開公報第９９／５１７４３号に記載されている抗ヒトＴＦ抗体の重鎖可変領域内のＣＤＲ２に存在するＡｓｎ５１およびＡｓｎ５４、ならびに重鎖可変領域内のＦＲ１に存在するＡｓｎ２８をアスパラギン酸に置換した変異体（Ｎ５１Ｄ変異体、Ｎ５４Ｄ変異体、Ｎ５１Ｄ／Ｎ５４Ｄ二重変異体、およびＮ２８Ｄ変異体の４種類）を作製し、ＴＦとの結合活性および中和活性を測定した。
抗体のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｗｕ  ＴＴ，Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ，Ｆｏｅｌｌｅｒ  Ｃ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  ｅｄ．（ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）１９９１）の表記に従った。
１．抗ヒトＴＦ抗体変異体発現ベクターの構築
抗ヒトＴＦ抗体の重鎖可変領域（ＡＨｉ）が組み込まれたクローニングベクターｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉ（図２Ａ）と抗ヒトＴＦ抗体発現ベクターｐＮ５ＫＧ４Ｐ−ＡＨｉ−ＡＬｂ２を、ｄａｍ−／ｄｃｍ−である大腸菌ＳＣＳ１１０より精製した。
ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉ上で、ＡｓｎをコードするコドンをＡｓｐに置換する操作を行った。すなわち、それぞれのＡｓｎをコードする領域を含む３０ｂｐ程度の断片を制限酵素で切り出し、塩基置換を入れた合成オリゴＤＮＡで作製した断片に入れ替えた（図２Ｂ）。Ａｓｎ５１およびＡｓｎ５４を改変するためには、ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉをＸｂａ  ＩおよびＢａｌ  Ｉで消化し、抗ヒトＴＦ抗体の重鎖可変領域内ＣＤＲ２にあるＡｓｎ５１とＡｓｎ５４をそれぞれ、もしくは両方をＡｓｐに変えるように、コドンを一塩基対置換するように設計した断片を組み込んだ。Ａｓｎ２８を改変するためには、ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉをＭｒｏ  ＩおよびＥｃｏＴ２２  Ｉで消化し、抗ヒトＴＦ抗体の重鎖可変領域内ＦＲ１にあるＡｓｎ２８をＡｓｐに変えるように、コドンを一塩基対置換するように設計した断片を組み込んだ。
配列の確認は、発現ベクターを構築するステップごとに行った。クローニングベクター上で目的の配列を確認し、Ｎｈｅ  ＩとＳａｌ  Ｉで消化して得られた断片を、Ｎｈｅ  ＩとＳａｌ  Ｉで消化した抗ヒトＴＦ抗体発現ベクターの重鎖可変領域と入れ替え、再度配列を確認した。目的の配列が得られたことを確認した後に、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍａｘｉ  ｃｏｌｕｍｎを用いて、Ｎ５１Ｄ変異体発現ベクター、Ｎ５４Ｄ変異体発現ベクター、Ｎ５１Ｄ／Ｎ５４Ｄ二重変異体発現ベクター、およびＮ２８Ｄ変異体発現ベクターの４種類の抗ヒトＴＦ抗体変異体発現ベクターを精製した。
２．ＣＯＳ−７細胞における抗ヒトＴＦ抗体変異体の一過性発現
構築した各変異体の発現ベクターおよびオリジナル抗ヒトＴＦ抗体発現ベクター、計５種類をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法によりＣＯＳ−７細胞に導入し、一過性に発現させた。ＣＯＳ−７細胞をＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄した後、約０．３〜１．０×１０７細胞／ｍｌとなるようにＰＢＳに懸濁した。１０μｇの抗ヒトＴＦ抗体変異体発現ベクターと共に０．４ｃｍキュベットに移し、１．５ｋＶ、２５μＦの条件でｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った。１０分間静置した後、３０ｍｌの１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に懸濁した。翌日、死細胞などを培地と共に除去し、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を新たに５０ｍｌ加えた。細胞を３日間培養した後、培養上清を回収した。
３．抗ヒトＴＦ抗体変異体の発現量の測定
３−１  ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡによる発現量の測定
遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌずつ播き、一晩固相化した。同様に、検量線用として、ＤＭＥＭ培地で１〜１０００ｎｇ／ｍｌに段階希釈した抗ヒトＴＦ抗体（Ｌｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１）を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌずつ播き、固相化した。ＥＬＩＳＡ用希釈バッファーでブロッキングした後、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を反応させ、ＴＭＢで発色させた。２Ｍ硫酸で反応を停止し、ＡＲＶＯ−ＳＸ５を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。検量線用に播いた抗ヒトＴＦ抗体（Ｌｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１）の値から、培養上清中の抗ヒトＴＦ抗体量を算出した。
ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡの結果、表１に示すように、抗ヒトＴＦ抗体の濃度は約６５〜１００ｎｇ／ｍｌ、総発現量は約３〜５μｇであった。
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４．抗ヒトＴＦ抗体各変異体の精製
回収した各５０ｍｌの培養上清から、アフィニティクロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ  Ｑ）により各変異体を精製した。
４−１  アフィニティクロマトグラフィー
以下の条件でアフィニティクロマトグラフィーを行った。
システム：ＳＭＡＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク）
カラム：ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ（０．７ｃｍφ×２．５ｃｍ、１ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテク）
平衡化緩衝液：Ｄ−ＰＢＳ（−）
洗浄用緩衝液：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
溶出用緩衝液：５０ｍＭ酢酸（ｐＨ２〜３）
０．５Ｍリン酸２ナトリウム溶液でサンプルのｐＨを７．４に調整した後、セントリプレップ−５０で５倍に濃縮し、１０ｍｌ（１０Ｃ．Ｖ．）の平衡化緩衝液で平衡化したカラムに流速１ｍｌ／分で添加した。５ｍｌ（５Ｃ．Ｖ．）の洗浄用緩衝液を用いて流速０．５ｍｌ／分で洗浄した後、５ｍｌ（５Ｃ．Ｖ．）の溶出用緩衝液で溶出し、０．５ｍｌずつ１０画分に分けて回収した。抗体を含む４画分を合わせて、０．１ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅを添加してｐＨ６〜７に中和した。
４−２  陰イオン交換クロマトグラフィー
次に、以下の条件で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。
システム：ＳＭＡＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク）
カラム：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＰＣ  １．６／５（０．１６ｃｍφ×５ｃｍ、０．１ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテク）
緩衝液Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
緩衝液Ｂ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ
アフィニティクロマトグラフィーによるＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ溶出画分に０．１ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅを添加し、ｐＨ８〜９に調整して、サンプルを調製した。流速２００μｌ／分でサンプルを添加した後、流速５０μｌ／分にて、０％Ｂ／５分、０〜６０％Ｂ／３０分、６０〜１００％Ｂ／１０分、１００％Ｂ／１０分のグラジエントプログラムでグラジエント溶出した。５０μｌずつ分画し、抗体を含む２〜４画分を合わせて活性測定に供した。
アフィニティクロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの結果、０．５〜１．０μｇの抗体を得た。各変異体の陰イオン交換クロマトグラムを図３〜５に、各変異体のクロマトグラムを重ね合わせたものを図６に示す。また、タンパク質量、回収率を表２に示す。Ｎ５４Ｄ変異体およびＮ５１Ｄ／Ｎ５４Ｄ二重変異体はほぼシングルピークとして得られたが、オリジナル抗ヒトＴＦ抗体、Ｎ５１Ｄ変異体、Ｎ２８Ｄ変異体はサブピークを生じ、特にＮ５１Ｄ変異体は２本のサブピークを生じた上にその含量も高かった。
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５．ＴＦ結合活性の測定
ｂｉｏｔｉｎ化抗ヒトＴＦ抗体を用いたｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡによりＴＦ結合活性を測定した。抗ヒトＴＦ抗体各変異体をＣＯＳ−７細胞で発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティクロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製したものをサンプルとして使用した。オリジナル抗ヒトＴＦ抗体、Ｎ２８Ｄ変異体およびＮ５１Ｄ変異体については、陰イオン交換クロマトグラフィーで認められたサブピークについても測定した。抗ヒトＴＦ抗体原体にはＬｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１を使用した。
ｓｈＴＦをｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（以下ＣＢ）で２０ｎＭに調整し、９６穴プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置した。ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（以下ＲＢ）で３回洗浄した後、ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（以下ＤＢ）を２００μｌ／穴ずつ分注し、室温で２時間放置してブロッキングした。ＤＢを除去した後、１０，０００倍希釈したｂｉｏｔｉｎ化抗ヒトＴＦ抗体を含むＤＢにて２倍段階希釈したサンプルを１００μｌ／穴ずつ加え、室温で１時間放置した。ＲＢで３回洗浄した後、ＤＢにて５，０００倍希釈したＡＬＰ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅを１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。ＲＢで５回洗浄した後、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（以下ＳＢ）で１ｍｇ／ｍｌに調整したＳＩＧＭＡ１０４を分注し、室温で３０分間放置して発色させ、マイクロプレートリーダーにより測定波長４０５ｎｍ、対照波長６５５ｎｍで測定した。
結合活性の評価は以下のように行った。オリジナル抗ヒトＴＦ抗体の濃度（対数変換値）−吸光度について直線回帰し、スタンダード直線を求めた。このスタンダード直線を用いて、６２．５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲に含まれる各サンプルの吸光度をスタンダード抗体濃度（Ｃｃ）に換算した。Ｃｃを添加した抗体濃度（Ｃａ）で除し、同一の結合活性を示すスタンダード抗体に対するサンプル濃度比を求め、結合活性とした。
結合活性の測定結果を図７および表３に示す。各変異体の結合活性はいずれもオリジナル抗ヒトＴＦ抗体より低下していた。ＣＤＲ２に存在し、最も脱アミド化の可能性が高いと考えられるＡｓｎ５４の変異体（Ｎ５４Ｄ変異体）の結合活性は、オリジナル抗ヒトＴＦ抗体の約１０％に低下していた。Ａｓｎ５４と同じくＣＤＲ２に存在するＡｓｎ５１の変異体（Ｎ５１Ｄ変異体）の結合活性はオリジナル抗ヒトＴＦ抗体の約５０％であり、Ｎ５４Ｄ変異体よりも結合活性の低下の程度は小さかった。Ａｓｎ５１およびＡｓｎ５４の両アミノ酸の変異体であるＮ５１Ｄ／Ｎ５４Ｄ二重変異体の結合活性は、Ｎ５４Ｄ変異体よりもさらに低下していた。一方、ＦＲ１に存在するＡｓｎ２８の変異体（Ｎ２８Ｄ変異体）の結合活性は、オリジナル抗ヒトＴＦ抗体の約９４％とわずかな低下が見られたのみであった。これらのことから、ＣＤＲ２に存在するＡｓｎ５１、Ａｓｎ５４の脱アミド化、特にＡｓｎ５４の脱アミド化は、結合活性を大きく低下させることが示唆された。
また、オリジナル抗ヒトＴＦ抗体、Ｎ２８Ｄ変異体およびＮ５１Ｄ変異体で見られたサブピーク（ピーク２）の結合活性をメインピーク（ピーク１）と比較したところ、いずれにおいてもサブピークの結合活性はメインピークよりも低下していた。
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６．ＴＦ中和活性の測定
ｈＴＦ（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ）、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａおよびＦａｃｔｏｒ  Ｘを用いてＴＦ中和活性を測定した。抗ヒトＴＦ抗体各変異体は、結合活性を測定したものと同じく、ＣＯＳ−７細胞で発現させてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティクロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーで精製したものを使用した。抗ヒトＴＦ抗体原体にはＬｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１を使用した。
Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳ（ｐＨ７．４９）、以下ＡＢ）を用いて、凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａを０．１ＰＥＵ／ｍｌに、またＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓを１２０倍（ｖ／ｖ）に希釈した。これらの混合溶液を６０μｌ／穴ずつプレートに分注し、室温で６０分間静置した。ＡＢでＦａｃｔｏｒ  Ｘを０．２５ＰＥＵ／ｍｌに希釈したＡＢＸをサンプルの希釈に用い、目的の濃度に希釈したサンプルを４０μｌ／穴ずつプレートに分注した。室温で３０分間静置した後、５００ｍＭ  ＥＤＴＡを１０μｌ／穴ずつ加えて反応を停止した。発色基質であるＳ−２２２２の水溶液１に対して、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ  Ｈ２Ｏを１および０．６ｍｇ／ｍｌヘキサメチリンブロマイド水溶液を２の割合で混合し、Ｓ−２２２２混合液を調製した。Ｓ−２２２２混合液を５０μｌ／穴ずつプレートに分注し、室温で静置した。３０分後にマイクロプレートリーダーにより測定波長４０５ｎｍ、対照波長６５５ｎｍで測定した。
中和活性の測定結果を図８および表４に示す。抗ヒトＴＦ抗体原体をスタンダードとして各変異体の濃度を算出し、抗ヒトＴＦ抗体原体に対する中和活性比を求めた。なお、中和活性比は、すべてのサンプルにおいて測定可能であった２５０ｎｇ／ｍｌの添加濃度を基準とした。オリジナル抗ヒトＴＦ抗体およびＮ２８Ｄ変異体は、抗ヒトＴＦ抗体原体とほぼ同等の中和活性を保持しており、ＦＲに存在するＡｓｎ２８の脱アミド化は中和活性の低下に影響しないと考えられた。
一方、Ｎ５１Ｄ変異体およびＮ５４Ｄ変異体では、抗ヒトＴＦ抗体原体に対する中和活性比がそれぞれ６５．６％および１９．９％にまで低下しており、抗ヒトＴＦ抗体のＣＤＲに存在するＡｓｎ５１およびＡｓｎ５４の脱アミド化が中和活性の低下を引き起こすことが強く示唆された。
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以上の結果から、製剤処方されておらず、抗体が不安定化するような条件下での、溶液ｐＨ依存的なＴＦに対する結合活性の低下と低ｐＩ分子種の増加は、主にＣＤＲ２領域に存在するＡｓｎ５４の脱アミド化によるものであることが判明した。
［実施例２］  抗ヒトＴＦ抗体Ｇｌｙ５５置換変異体のＴＦとの結合活性および中和活性の測定
国際公開公報第９９／５１７４３号に記載されている抗ヒトＴＦ抗体は、ヒト型化重鎖バージョンｉ（配列番号：２５、図１）およびヒト型化軽鎖バージョンｂ２（配列番号：２６、図１）を含んでいる。そのアミノ酸配列を基に、ＣＤＲ２のループを構成する上で重要なアミノ酸と考えられる重鎖ＣＤＲ２内のＧｌｙ５５を他の１９種のアミノ酸に換えた変異体を作製し、ＴＦへの結合活性を測定した。また、Ｇｌｙ５５をＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓに置換した変異体について、中和活性および脱アミド化を観察した。
抗体のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｗｕ  ＴＴ，Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ，Ｆｏｅｌｌｅｒ  Ｃ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  ｅｄ．（ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）１９９１）の表記に従った。
１．抗ヒトＴＦ抗体変異体発現ベクターの構築
抗ヒトＴＦ抗体重鎖可変領域（ＡＨｉ）が組み込まれたクローニングベクターｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉ（図９Ａ）と抗ヒトＴＦ抗体発現ベクターｐＮ５ＫＧ４Ｐ−ＡＨｉ−ＡＬｂ２を、ｄａｍ−／ｄｃｍ−である大腸菌ＳＣＳ１１０より精製した。
ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉ上で、Ｇｌｙ５５をコードするコドンを他のアミノ酸に置換する操作を行った。このとき、３番目のコドンをＣに固定できる１５種類のアミノ酸については、Ａｓｎ５４−Ｇｌｙ５５をコードする領域を含む３０ｂｐ程度の断片をｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉのユニークサイトであるＸｂａ  Ｉ−Ｂａｌ  Ｉで切り出し、Ｇｌｙ５５をコードするコドンの３’端の２塩基をランダムな核酸とした合成オリゴＤＮＡで作製した断片を組み込んだ（図９Ｂ）。Ｘｂａ  Ｉ−Ｂａｌ  Ｉ断片は、抗ヒトＴＦ抗体重鎖可変領域内のＣＤＲ２にあるＧｌｙ５５の１番目と２番目のコドンがランダムな塩基配列となるようにｖｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）で３’端の２塩基を伸長した後、Ｘｂａ  Ｉで消化して作製した。この方法により、哺乳類でコドン使用頻度の高い１５種類の変異体を１回の操作で作製することが可能と考えられたが、最適反応条件を見出せなかったため、実際には８種類の変異体しか作製できなかった。そこで、これら以外の変異体について、他の制限酵素部位を使用して構築することにした。
Ｇｌｙ５５の３番目のコドンを変換する必要があるアミノ酸、および上記の方法で作製できなかった変異体については、ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉのＥｃｏＲ  ＩサイトをＨｉｎｄ  ＩＩＩに変えたものを作製し、ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉのユニークサイトであるＡｐｏ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉで消化した後、合成オリゴＤＮＡで作製した断片を組み込んだ。すなわち、Ｘｂａ  Ｉ−Ｂａｌ  Ｉ以外の制限酵素部位としては、Ａｐｏ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉが使用可能と考えられたが、Ａｐｏ  Ｉはベクター上のＥｃｏＲ  Ｉサイトを切断してしまうため、まずＥｃｏＲ  ＩサイトをＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトに変えて、ＥｃｏＲ  Ｉサイトを除去した。Ａｐｏ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉ断片は約５５ｂｐなので、Ｇｌｙ５５をコードするコドンを他のアミノ酸に変えた塩基配列の前後が合わせて１６ｂｐ程度重なるように合成オリゴＤＮＡを作製し、アニーリングさせた後、Ｖｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで伸長し、Ａｐｏ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉで消化して作製した（図９Ｃ、表５）。
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Ｘｂａ  Ｉ−Ａｐｏ  Ｉサイトを用いた抗ヒトＴＦ抗体変異体構築のためのプライマーを示す。
なお、表５に記載の塩基配列を配列番号：１から２４に示した。
クローニングベクター上で構築した１９種類の抗ヒトＴＦ抗体変異体の配列をシークエンサーにより確認した。また、Ｎｈｅ  ＩとＳａｌ  Ｉで消化して得られた変異重鎖可変領域を、Ｎｈｅ  ＩとＳａｌ  Ｉで消化した抗ヒトＴＦ抗体発現ベクターの重鎖可変領域と入れ替え、変異体発現ベクターを構築して再度配列を確認した。目的の配列が得られたことを確認した後に、大腸菌ＤＨ５αを用いて抗ヒトＴＦ抗体変異体発現ベクターを増やし、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍａｘｉ  ｃｏｌｕｍｎを用いて精製し、配列確認を行った。こうして、１９種類の抗ヒトＴＦ抗体変異体発現ベクターを得た。
２．ＣＨＯ細胞における抗ヒトＴＦ抗体変異体の一過性発現
構築した抗ヒトＴＦ抗体重鎖内Ｇｌｙ５５変異体発現ベクターおよびＧｌｙ５５未置換体（Ｇｌｙ５５Ｇｌｙ）発現ベクター、計２０種類をｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法によりＣＨＯ細胞に導入し、一過性に発現させた。ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞は、１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２気相下にて培養した。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを行う前日に、ＣＨＯ細胞を１×１０５細胞／穴となるように１２穴プレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２下にて培養した。
１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）に６μｌのＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ社）を加え、５分間静置した後、各１μｇの抗ヒトＴＦ抗体重鎖内Ｇｌｙ５５変異体発現ベクターｐＮ５ＫＧ４Ｐ−ＡＨｉ−Ａｌｂ２−Ｇ５５Ｘ（Ｘ：２０種類の各アミノ酸）が入ったチューブに加えた。そのまま２０分間放置し、ＦｕＧＥＮＥ６／ＤＮＡ複合体を形成させた。前日に播種したＣＨＯ細胞の培地を除去した後、１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ培地を新たに２ｍｌ／穴ずつ添加した。さらに、ＦｕＧＥＮＥ６／ＤＮＡ複合体をそれぞれｔｒｉｐｌｉｃａｔｅでプレートに添加した。
３７℃、５％ＣＯ２下で１日培養した後、プレートをＰＢＳで洗浄した。１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ培地を３ｍｌ／穴ずつ添加して培地交換を行った。３７℃、５％ＣＯ２下で７日間培養した後、約９ｍｌの抗ヒトＴＦ抗体変異体含有培養上清を１５ｍｌチューブに移し、１０００ｐｐｍで５分間遠心して、限外濾過により約１０倍に濃縮した。得られた培養上清を抗ヒトＴＦ抗体重鎖内Ｇｌｙ５５Ｘａａ変異体サンプルとした。
３．ＴＦ結合活性の測定
抗ヒトＴＦ抗体重鎖内Ｇｌｙ５５Ｘａａ変異体サンプルのｈｕｍａｎ  ＩｇＧ含量を測定し、それぞれのサンプルのＩｇＧ濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように調整した。
ｂｉｏｔｉｎ化抗ヒトＴＦ抗体を用いたｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡによりＴＦ結合活性を測定した。ｓｈＴＦをＣＢで２０ｎＭに調整し、９６穴プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置した。ＲＢで３回洗浄した後、ＤＢを２００μｌ／穴ずつ分注し、室温で２時間放置してブロッキングした。ＤＢを除去した後、最終濃度で１０，０００倍希釈したｂｉｏｔｉｎ化抗ヒトＴＦ抗体を含むＤＢにて２倍段階希釈したサンプルおよびスタンダードを１００μｌ／穴ずつ加え、室温で１時間放置した。ＲＢで３回洗浄した後、ＤＢにて８，０００倍希釈したＡＬＰ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅを１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。ＲＢで３回洗浄した後、ＳＢで１ｍｇ／ｍｌに調整したＳＩＧＭＡ１０４を分注し、室温で約２０分間放置して発色させ、マイクロプレートリーダーにより測定波長４０５ｎｍ、対照波長６５５ｎｍで測定した。
結合活性は、以下の手順に従って５０％活性を示す濃度を求めて比較した。サンプル（−）、ｂｉｏｔｉｎ化抗体（＋）の吸光度を１００％として各測定点の吸光度を％に換算した。各サンプルの５０％値を挟む２点を基に、濃度（対数変換値）−吸光度（％）の直線回帰式を求め、吸光度が５０％となる濃度を算出し、数式１より各サンプルの結合活性を算出した。
数式１：結合活性＝（スタンダード抗体の５０％活性濃度）／（サンプルの５０％活性濃度）×１００
図１０に、抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（Ｌｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１）で作製した検量線を基に算出した抗ヒトＴＦ抗体濃度換算値を示した。ＣＨＯ細胞で発現させたＧｌｙ５５未置換体（Ｇｌｙ５５Ｇｌｙ）は、抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋとほぼ同等のＴＦ結合活性を保持していた。Ｇｌｙ５５変異体では、Ｇｌｙ５５Ｖａｌ、Ｇｌｙ５５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ５５Ｐｒｏにおいて結合活性の低下が認められた。
抗ヒトＴＦ抗体重鎖Ｇｌｙ５５変異体のＴＦ結合活性を詳細に検討するために、以下の検討を行った。すなわち、抗ヒトＴＦ抗体変異体を用い、２５〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲内でサンプル添加量を変化させ、ＴＦ結合活性をｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ法により測定した。なお、サンプル量不足のため、Ｇｌｙ５５ＡｓｎおよびＧｌｙ５５Ａｓｐについては実施しなかった。
測定結果を図１１に示す。今回検討した１８種類の抗ヒトＴＦ抗体重鎖Ｇｌｙ５５変異体中では、Ｇｌｙ５５Ｖａｌ、Ｇｌｙ５５Ｉｌｅ、およびＧｌｙ５５ＰｒｏのＴＦ結合活性が、抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（Ｌｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１）やＧｌｙ５５未置換体（Ｇｌｙ５５Ｇｌｙ）に比べて著しく低下していることが確認された。しかしながら、それ以外の１５種類の変異体については、ＴＦ結合活性に顕著な差は見出せなかった。したがって、Ｇｌｙ５５を他のアミノ酸に変えても、ＴＦ結合活性は維持できると考えられた。
４．ＴＦ中和活性の測定
ＡＢを用いて、凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａを０．１ＰＥＵ／ｍｌに、またＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓを１２０倍（ｖ／ｖ）に希釈した。これらの混合溶液を６０μｌ／穴ずつプレートに分注し、室温で６０分間静置した。１０ｍＭリン酸バッファーで２倍段階希釈したサンプルを、２０μｌ／穴ずつ分注した後、ＣａＣｌ２溶液でＣａＣｌ２濃度を１０ｍＭに調整したＡＢを用いて０．５ＰＥＵ／ｍｌに希釈した凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ溶液を２０μｌ／穴ずつプレートに分注した。室温で３０分間静置した後、５００ｍＭ  ＥＤＴＡを１０μｌ／穴ずつ加えて反応を停止した。テストチーム発色基質Ｓ−２２２２溶液とポリブレン溶液を１：１で混合した溶液を５０μｌ／穴ずつプレートに分注して、室温で静置した。３０分後にマイクロプレートリーダーにより測定波長４０５ｎｍ、対照波長６５５ｎｍで測定した。
中和活性は、以下の手順に従って５０％活性を示す濃度を求めて比較した。サンプル（−）、凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ（＋）の吸光度を１００％、サンプル（−）、凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ（−）の吸光度を０％として、各測定点の吸光度を％に換算した。各サンプルの５０％値を挟む２点を基に、濃度（対数変換値）−吸光度（％）の直線回帰式を求め、吸光度が５０％となる濃度を算出し、数式２より各サンプルの中和活性を算出した。
数式２：中和活性（ＩＣ５０）＝（スタンダード抗体の５０％活性濃度）／（サンプルの５０％活性濃度）×１００
５．ＣＨＯ細胞を用いた抗ヒトＴＦ抗体変異体の安定発現系の構築
Ｇｌｙ５５をＬｅｕ（脂肪族アミノ酸）、Ｐｈｅ（芳香族アミノ酸）、Ｇｌｕ（酸性アミノ酸）、Ｌｙｓ（塩基性アミノ酸）、Ｉｌｅ（分枝脂肪族アミノ酸）に置換したＧｌｙ５５Ｌｅｕ、Ｇｌｙ５５Ｐｈｅ、Ｇｌｙ５５Ｇｌｕ、Ｇｌｙ５５Ｌｙｓ、Ｇｌｙ５５Ｉｌｅの５種類の変異体について、安定発現系を構築することにより、抗ヒトＴＦ抗体変異体の活性を比較するのに十分な量を産生させた。
５−１  ＣＨＯ細胞への遺伝子導入
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞をＰＢＳで洗浄した後、約１×１０７細胞／ｍｌとなるようにＰＢＳに懸濁した。１０μｇの抗ヒトＴＦ抗体重鎖内Ｇｌｙ５５変異体発現ベクターｐＮ５ＫＧ４Ｐ−ＡＨｉ−Ａｌｂ２−Ｇ５５Ｘと共に０．４ｃｍキュベットに移し、１．５ｋＶ、２５μＦの条件でｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った。１０分間静置した後、２００ｍｌの１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ核酸（−）培地に懸濁した。１０枚の９６穴プレートに２００μｌ／穴ずつ播き、培養した。
５−２  遺伝子導入された細胞の選択
９６穴プレート培養において細胞の生育が見られた穴の抗体発現量をｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで比較した。ｈＩｇＧ発現量が高かった１０穴ずつ７０穴の細胞を１２穴プレートに植え継ぎ、１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ核酸（−）培地で培養した。細胞が１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ核酸（−）培地に馴化し、良好な生育が見られた段階で、抗ヒトＴＦ抗体変異体の発現量をｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで測定した。各変異体について４穴ずつ選択し、５０ｍｌフラスコに植え継いだ。１０ｎＭ  ＭＴＸを含む１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ核酸（−）培地に交換し、抗体産生量を増幅させた。
５−３  無血清培地を用いた大量培養による抗ヒトＴＦ抗体変異体の産生
抗ヒトＴＦ抗体変異体クローンの中からｈＩｇＧ発現量の高いものを１クローンずつ選択し、１０ｎＭ  ＭＴＸを含む培地を用いて６本の１７５ｃｍ２フラスコで培養した。サブコンフルエントになったところで、１５０ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ無血清培地に交換し、７日間培養した。培養上清を回収し、０．２２μｍフィルターで培地を処理した後、精製まで−８０℃で保存した。
５−４  サンドイッチＥＬＩＳＡによる抗ヒトＴＦ抗体変異体の発現量の測定
抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体を９６穴プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置した。ＲＢで３回洗浄した後、ＤＢを２００μｌ／穴ずつ分注し、室温で２時間放置してブロッキングした。ＤＢを除去した後、ＤＢもしくは抗ヒトＴＦ抗体変異体産生細胞から抗体を回収する際に用いた培地にて適当に希釈したサンプルおよびスタンダードを１００μｌ／穴ずつ加え、室温で２時間放置した。ＲＢで３回洗浄した後、ＤＢにて１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識化抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。ＲＢで１０回洗浄した後、発色試薬を１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で約１０分間放置した。２Ｎ硫酸を５０μｌ／穴ずつ添加して発色反応を停止した後、マイクロプレートリーダーにより測定波長４５０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍで吸光度を測定した。
この結果、Ｇｌｙ５５Ｇｌｙ以外の変異体については、数ｍｇずつの抗ヒトＴＦ抗体変異体を得ることができた（表６）。
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６．抗ヒトＴＦ抗体各変異体の精製
各変異体の含まれた大量培養上清から、ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラムとＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムを用いて各変異体を精製した。
６−１  精製用アフィニティクロマトグラフィー
以下の条件で低温室にてアフィニティクロマトグラフィーを行った。
システム：ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ
カラム  ：ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ（１．６ｃｍφ×２．５ｃｍ、５ｍｌ）
平衡化緩衝液：Ｄ−ＰＢＳ（−）
洗浄用緩衝液：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
溶出用緩衝液：５０ｍＭ酢酸（ｐＨ２〜３）
サンプルは、０．５Ｍリン酸２ナトリウム溶液でｐＨを７．４に調整した後、カラムに添加した。抗ヒトＴＦ抗体原体は１．５ｍｌ（１６．５ｍｇ）を５０ｍｌの洗浄用緩衝液で希釈した。流速５ｍｌ／分、２５ｍｌ（５Ｃ．Ｖ．）の溶出用緩衝液で溶出し、１．２５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅを添加してｐＨ６〜７に中和した。
６−２  精製用陰イオン交換クロマトグラフィー
次に、以下の条件で低温室にて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。
システム：ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ
カラム：ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（０．７ｃｍφ×２．５ｃｍ、１ｍｌ）
緩衝液Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、４℃）
緩衝液Ｂ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、４℃）／１Ｍ  ＮａＣｌ
アフィニティクロマトグラフィーによるＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ溶出画分に１．２５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅを添加し、ｐＨ８〜９に調整して、サンプルを調製した。流速１ｍｌ／分にて０ｍＭ  ＮａＣｌ（５Ｃ．Ｖ．）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５＋５Ｃ．Ｖ．）、１Ｍ  ＮａＣｌ（１０Ｃ．Ｖ．）のステップ溶出を行い、２５０ｍＭ  ＮａＣｌステップの前半５Ｃ．Ｖ．（５ｍｌ）を回収した。
Ｇｌｙ５５Ｇｌｙ以外の抗ヒトＴＦ抗体変異体については、それぞれ５００μｇ以上得ることができた（表５）。Ｇｌｙ５５Ｇｌｙが得られなかったことから、抗ヒトＴＦ抗体と比較するために、代わりに抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（Ｌｏｔ  Ｎｏ．９９Ｄ０１）を同様の操作で精製して用いることにした（表５）。
７．分析用陰イオン交換クロマトグラフィー
以下の条件で室温にて陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、サンプルを分析した。
システム：ＳＭＡＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ
カラム：ＭｏｎｏＱ  ＰＣ１．６／５（０．１６ｃｍφ×５ｃｍ、０．１ｍｌ）
緩衝液Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２０℃）
緩衝液Ｂ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２０℃）／５００ｍＭ  ＮａＣｌ
流速５０μｌ／分にて、０％Ｂ／５分、０〜６０％Ｂ／３０分、６０〜１００％Ｂ／１０分、１００％Ｂ／１０分のグラジエントプログラムでグラジエント溶出した。サンプルはＵＶ換算で２μｇを緩衝液Ａで５０μｌに３〜５０倍希釈し、うち２５μｌを分析に供した。
精製した抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）と抗ヒトＴＦ抗体各変異体を分析用陰イオン交換クロマトグラフィーで分析した結果、導入したアミノ酸変異に依存した溶出時間の変化は見られるものの、ほぼ単一ピークであることが確認された（図１２）。
８．アミノ酸変異による抗ヒトＴＦ抗体の脱アミド化抑制
脱アミド化反応を見るために、脱アミド化しやすい中性領域での緩衝液を用いて、加熱条件下で加速試験を行った。
８−１  緩衝液置換
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）を緩衝液として使用し、ＰＤ−１０脱塩カラムでサンプルの緩衝液置換を行った。カラムを平衡化した後、２．５ｍｌのサンプルを２本のカラムに添加し、３．５ｍｌの緩衝液で溶出した。
８−２  加速試験用サンプル調製
ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる定量値を基に、抗ヒトＴＦ抗体各変異体サンプルを１００μｇ／ｍｌとなるように希釈した。緩衝液には２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた。０．２２μｍフィルターを通し、１ｍｌずつ５ｍｌバイアルに充填した。
８−３  加速試験
精製した抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）と抗ヒトＴＦ抗体変異体について、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）溶液中で、４０℃にて４週間加速試験を行った。０、１、２、４週間の各ポイントでサンプルを取り出し、活性についてはＴＦ結合活性、ＴＦ中和活性の比較をそれぞれ行い、脱アミド化については分析用陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析した。
活性の比較には、ＧＰＣのモノマー画分を指標として再度定量した値（表７）を用いた。すなわち、以下の条件で室温にて抗体の定量を行った。
システム：Ｗａｔｅｒｓ（６００Ｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、６１６  Ｐｕｍｐ、４８６  Ｔｕｎａｂｌｅ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ、７１７  ｐｌｕｓ  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）
カラム：ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（０．７８ｃｍφ×３０ｃｍ、ガードカラム０．６ｃｍφ×４ｃｍ）
緩衝液：５０ｍＭリン酸ナトリウム／３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）  １００μｌ（１０μｇ相当量）の加速品をサンプルに用いて、流速０．５ｍｌ／分で分析した。
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この結果、加速試験前のＴＦ結合活性は、抗ヒトＴＦ抗体変異体を一過性発現させたときと同様に、Ｇｌｙ５５Ｉｌｅが抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（Ｌｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１）の２６％程度と低く、９９Ｄ０１に比べると著しく活性が損なわれていた（図１３Ａ）。Ｇｌｙ５５Ｌｅｕ、Ｇｌｙ５５Ｇｌｕ、Ｇｌｙ５５Ｐｈｅ、Ｇｌｙ５５Ｌｙｓについては、９９Ｄ０１とほぼ同等の活性を保持していた（図１３Ａ）。４週間の加速試験後、９９Ｄ０１では加速試験前の約６０％に活性が低下しているのに対して、抗ヒトＴＦ抗体変異体は加速試験前の８０％以上の活性を維持していた（図１３Ｂ）。
分析用陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて脱アミド化を分析すると、９９Ｄ０１では脱アミド化された分子種と考えられるピークが明らかに増大していたが、抗ヒトＴＦ抗体変異体ではほとんど観察されなかった（図１４）。経時的なＴＦ中和活性の変化では、９９Ｄ０１が比較的大きな活性低下を示した（図１５）。
これらの結果より、Ｇｌｙ５５の置換によりＡｓｎ５５の脱アミド化が抑制されており、アミノ酸置換は特にＧｌｙ５５ＬｅｕおよびＧｌｙ５５Ｐｈｅが好ましいと考えられた。
９．加速実験前後のＴＦ中和活性
９９Ｄ０１および抗ヒトＴＦ抗体各変異体のＴＦ中和活性を図１６に示す。Ｇｌｙ５５ＧｌｕとＧｌｙ５５Ｉｌｅはそれぞれ４１％、１３％程度と低い活性を示したが、他の３種類の抗ヒトＴＦ抗体変異体については５６〜７４％であり、９９Ｄ０１（６６％）と同程度の活性を保持していた。
９９Ｄ０１および抗ヒトＴＦ抗体各変異体の加速試験による経時的な活性低下の変化量を検討するために、図１５から各サンプルのＩＣ５０値の対初期値を算出した（図１７）。なお、Ｇｌｙ５５Ｉｌｅの４０℃−４週間加速試験後サンプルに関しては、ＩＣ５０値を算出できなかったため、２週間目までの結果を示した。４０℃−４週間加速試験後には、９９Ｄ０１のＴＦ中和活性は初期値の約４０％にまで低下していた。これに対して、Ｇｌｙ５５を他のアミノ酸に置換した各変異体については、４０℃−４週間加速試験後でも初期値の５０〜７０％のＴＦ中和活性を維持していた。
以上の結果から、抗体中のアスパラギンに隣接するグリシンを他のアミノ酸に置換しても抗体の活性は低下せず、なおかつ脱アミド化による不安定化を抑制できることが見出された。
産業上の利用の可能性
本発明者らは、アスパラギンに隣接するグリシンを他のアミノ酸に置換すれば、抗体の活性に影響を与えないことを見出した。本発明を抗体に対して適用することにより、活性低下の少ない抗体を製造することができ、長時間にわたる安定性が求められる医学的製剤等においても使用できる抗体が得られる。また、本発明は、抗体以外のタンパク質に対しても適用することが可能であり、これによりタンパク質の活性に影響を与えずに、脱アミド化を抑制しうるものと考えられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、国際公開公報第９９／５１７４３号に記載されている抗ヒトＴＦ抗体に含まれるヒト型化重鎖バージョンｉおよびヒト型化軽鎖バージョンｂ２のアミノ酸配列を示した図である。脱アミド化される可能性のある複数のアスパラギン（Ａｓｎ２８、Ａｓｎ５１、Ａｓｎ５５）を四角で囲み、示す。
図２は、抗ヒトＴＦ抗体の重鎖可変領域（ＡＨｉ）が組み込まれたクローニングベクターｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉを示した図である。
Ａ：ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉベクターの全体図、Ｂ：重鎖可変領域のＮｈｅ  Ｉ−Ｓａｌ  Ｉ断片図。
図３は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体およびオリジナル抗ヒトＴＦ抗体の陰イオン交換クロマトグラムを示した図である。
Ａ：９９Ｄ０１、Ｂ：オリジナル（ネイティブ）。
図４は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体およびオリジナル抗ヒトＴＦ抗体の陰イオン交換クロマトグラムを示した図である。
Ｃ：Ｎ２８Ｄ、Ｄ：Ｎ５１Ｄ。
図５は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体およびオリジナル抗ヒトＴＦ抗体の陰イオン交換クロマトグラムを示した図である。
Ｅ：Ｎ５４Ｄ、Ｆ：Ｎ５１Ｄ／Ｎ５４Ｄ。
図６は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体およびオリジナル抗ヒトＴＦ抗体の陰イオン交換クロマトグラムを重ね合わせて示した図である。
図７は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体およびオリジナル抗ヒトＴＦ抗体の結合活性を示した図である。
図８は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体およびオリジナル抗ヒトＴＦ抗体の中和活性を示した図である。
図９は、抗ヒトＴＦ抗体の重鎖可変領域（ＡＨｉ）が組み込まれたクローニングベクターｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉを示した図である。なお、図９に記載の塩基配列を配列番号：２７、２８に示した。
Ａ：ｐＣＶＩＤＥＣ−ＡＨｉベクターの全体図、Ｂ：重鎖可変領域のＸｂａ  Ｉ−Ｂａｌ  Ｉ断片図、Ｃ：重鎖可変領域のＸｂａ  Ｉ−Ａｐｏ  Ｉ断片図。
図１０は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体の結合活性の比較を示した図である。抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（Ｌｏｔ  Ｎｏ．００Ｃ０１）で作製した検量線を基に算出した抗ヒトＴＦ抗体濃度換算値を示す。
ブランク：１０％ＦＣＳ−α−ＭＥＭ培地、コントロール：ＣＨＯ細胞培養上清、Ｇ〜Ｐ：抗ヒトＴＦ抗体重鎖内Ｇｌｙ５５各変異体。
図１１は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体の結合活性を示した図である。
図１２は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体および抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）の溶出プロファイルを示した図である。
図１３は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体および抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）について加速試験前後の結合活性および初期値との比を示した図である。
図１４は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体および抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）について加速試験前後の陰イオンクロマトグラフおよび中和活性を示した図である。
Ａ：９９Ｄ０１（Ｇ５５Ｇ）、Ｂ：Ｇ５５Ｌ、Ｃ：Ｇ５５Ｉ、Ｄ：Ｇ５５Ｆ、Ｅ：Ｇ５５Ｅ、Ｆ：Ｇ５５Ｋ。
図１５は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体および抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）について加速試験前後の陰イオンクロマトグラフおよび中和活性を示した図である。
Ａ：９９Ｄ０１（Ｇ５５Ｇ）、Ｂ：Ｇ５５Ｌ、Ｃ：Ｇ５５Ｉ、Ｄ：Ｇ５５Ｆ、Ｅ：Ｇ５５Ｅ、Ｆ：Ｇ５５Ｋ。
図１６は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体および抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）について加速試験前の中和活性を示した図である。
図１７は、抗ヒトＴＦ抗体各変異体および抗ヒトＴＦ抗体ｂｕｌｋ（９９Ｄ０１）について加速試験前後の中和活性を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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