(57)【要約】Ｍｙｃタンパク質は細胞増殖の偏在性仲介物質であり、Ｅ−ボックスを介した遺伝子発現を活性化する。ｍｉｎａ５３遺伝子は、分子量５３ｋＤａを有するタンパク質をコードしていて、核質および核小体中に存在している。静止期にある細胞が血清によって活性化されたとき、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのレベルの上昇に続き、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡが上昇した。ヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞中において、ｃ−ｍｙｃの発現がＴＰＡによって減少したときには、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡとタンパク質は減少した。活性化ドメインを欠損した変異型ｃ−Ｍｙｃではなく、野生型ｃ−Ｍｙｃの異所性発現はｍｉｎａ５３の発現を上昇した。ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡとタンパク質の発現はｃ−Ｍｙｃの活性の人為的導入によって誘発することもできる。また、ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質中のｃ−Ｍｙｃが活性化したときに、タンパク質合成に対するインヒビターが存在してもｍｉｎａ５３ｍＲＮＡが増加する。一方、ｍｉｎａ５３遺伝子の転写開始部位に近接してＥ−ボックス部位があり、ｍｉｎａ５３プロモーターからの発現は、Ｅ−ボックスを介してｃ−Ｍｙｃによって活性化される。ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、ＴＰＡ処理後ではなく、増殖相のＨＬ６０におけるインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのｍｉｎａ５３プロモーター領域に結合している。その上、ＨｅＬａ細胞中と、高発現するｃ−ｍｙｃを有するラット繊維芽細胞３Ｙ１細胞中でのｍｉｎａ５３発現の特異的抑制は細胞増殖を著しく抑制する。これらの結果を合わせると、ｍｉｎａ５３はＭｙｃ標的遺伝子であり、哺乳動物の細胞増殖への関連を示している。また、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、がん細胞、特に大腸がんや食道がんの細胞や組織中に発現しているタンパク質Ｍｉｎａ５３を特異的に認識することができるので、がん疾患の診断に利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が１０個のエクソンから構成され、最上流側にエクソン１が転写開始部位として存在し、エクソン２に翻訳開始部位が存在し、最後のエクソン１０に停止コドンが存在することを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、エクソン１がエクソン１ａとエクソン１ｂとからなり、エクソン１ｂがエクソン１ａの０．２５ｋｂ下流に存在することを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、エクソン５とエクソン６との間にエクソン５’が存在することを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項４】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が配列番号１で示される塩基配列を有するヒトがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３であることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項５】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が配列番号２で示される塩基配列を有するマウスがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３であることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項６】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が配列番号３で示される塩基配列を有するラットがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３であることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項７】
請求の範囲第１項ないし第６項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が分子量５３ｋＤａを有するタンパク質をコードしていることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項８】
請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が該遺伝子の発現を調節する転写因子であるＭｙｃタンパク質が結合する塩基配列を持っていることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項９】
請求の範囲第１項ないし第８項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、前記タンパク質が核小体に局在していることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項１０】
請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３の発現がｃ−ｍｙｃ遺伝子によって誘発されることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項１１】
請求の範囲第４項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する細胞増殖作用を有するヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３。
【請求項１２】
請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載のがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３をコードしていることを特徴とするプラスミド。
【請求項１３】
請求の範囲第１１項に記載のヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３をコードしていることを特徴とするプラスミド。
【請求項１４】
請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３の特定部位を含むヒトｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡフラグメントを、ルシフェレースｃＤＮＡに結合することを特徴とするレポータープラスミド。
【請求項１５】
請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３または請求の範囲第１１項に記載するヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３もしくはそのフラグメントを抗原として抗体を得ることを特徴とするｍｉｎａ５３もしくはＭｉｎａ５３に対する抗体。
【請求項１６】
請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３もしくはそのフラグメントを用いてＭｉｎａ５３発現調節をするための核酸であることを特徴とするＭｉｎａ５３発現調節のための核酸。
【請求項１７】
タンパク質Ｍｉｎａ５３に対するモノクローナル抗体。
【請求項１８】
タンパク質Ｍｉｎａ５３に対する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いてタンパク質Ｍｉｎａ５３をがん細胞またはがん組織中に検出することを特徴とするタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１８項に記載するタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法において、前記がん細胞が大腸がん細胞または食道がん細胞であることを特徴とするタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１９項に記載するタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法において、前記がん組織が大腸がん組織または食道がん組織であることを特徴とするタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法。
【請求項２１】
タンパク質Ｍｉｎａ５３に対する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて、がん細胞またはがん組織中に発現したタンパク質Ｍｉｎａ５３を染色することを特徴とするタンパク質Ｍｉｎａ５３の染色方法。
【請求項２２】
請求の範囲第２１項に記載するタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現方法において、前記がん細胞が大腸がん細胞または食道がん細胞であることを特徴とするタンパク質Ｍｉｎａ５３の染色方法。
【請求項２３】
請求の範囲第２１項に記載するタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現方法において、前記がん組織が大腸がん組織または食道がん組織であることを特徴とするタンパク質Ｍｉｎａ５３の染色方法。
【請求項２４】
請求の範囲第２１項ないし第２３項のいずれか１項に記載するタンパク質Ｍｉｎａ５３の染色方法によってがん細胞またはがん組織を染色することによってがんを診断することを特徴とするがんの診断方法。
【請求項２５】
請求の範囲第２４項に記載するがんの診断方法において、前記がんが大腸がんまたは食道がんであることを特徴とするがんの診断方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３、タンパク質Ｍｉｎａ５３およびそのモノクローナル抗体に関する。
背景技術
がんは、致命的な自然経過をたどる細胞性腫瘍であり、ヒトの死亡原因の大きな割合を占めていて、それも増加する傾向がある。がん細胞は、元来は正常細胞であり、その正常細胞の遺伝子が、例えば、化学物質や放射線、またはウイルスの感染などの何らかの原因によって、その遺伝子のＤＮＡが傷つき、修復されずに蓄積されると、その正常細胞ががん化すると考えられている。細胞には、傷ついた遺伝子を修復する機構が備わっているが、この仕組みが正常に機能しなければ、異常な遺伝子が蓄積することになる。がんに関係する遺伝子も数多く見つかっていて、かかる遺伝子の中には、がんを促進するがん遺伝子と、がんを抑制するがん抑制遺伝子とがある。
かかるがん関連遺伝の１つのファミリーである前がん遺伝子ｍｙｃファミリーは、特にがんとの関連が古くから知られていて、がんや、個体発生などにおいて重要な役割を果たしている細胞増殖関連の遺伝子であり、この遺伝子の異常がヒトがんにおいて非常に高い割合で見つかっている。
このがん遺伝子ｃ−ｍｙｃファミリーは、主に３つの遺伝子、ｃ−ｍｙｃと、Ｎ−ｍｙｃと、Ｌ−ｍｙｃとから構成されているが、これら３つの遺伝子は、発現する場所とタイミングは異なっているが、基本的には同じ生物学的活性を持つと考えられている。このがん遺伝子ｃ−ｍｙｃの発現は、転写レベルと転写後レベルなどのレベルで高度に調節されている。一般的には、ｃ−ｍｙｃの発現は、細胞増殖に関連していて、静止期にある細胞あるいは分化細胞中においてその発現が低下する。遺伝子増殖、ウイルスプロモーター挿入、染色体の転座もしくはプロモーター突然変異などによって、ｍｙｃファミリー遺伝子が脱調節されて異常に発現することは、ヒトなどの広い範囲の脊椎動物における新形成疾患（いわゆる腫瘍形成等）に関連している（ＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，１−４６；Ｍａｒｃｕ，Ｋ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，８０９−８６０；Ｍｏｒｇｅｎｂｅｓｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９４）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．５，２１−３６；Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，１０９−１８２；Ｇｒａｎｄｏｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６，６５３−９９）。ｃ−ｍｙｃもしくはＮ−ｍｙｃをノックアウトしたマウス胎児は、胚発生中期の間に多臓器発育不全を誘発し死亡する（Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６，２２３５−２２４７；Ｓａｗａｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７，１４４５−１４５５；Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７，６７１−６８２）。これらの結果は、ｍｙｃが細胞発育の中心的調節因子であることを示している（Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｂ．：（１９９６）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，１０９−１８２；Ｇｒａｎｄｏｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６，６５３−９９；Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｂ．：（２００１）Ｇｅｎｅ  ２７７，１−１４）。
このがん遺伝子ｍｙｃファミリーの遺伝子は、種々の遺伝子の発現を調節する転写因子（Ｍｙｃタンパク質）をコードしている（Ｇｒａｎｄｏｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６，６５３−９９；Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｂ．：（２００１）Ｇｅｎｅ  ２７７（Ｏｃｔ  １７；（１−２）：），１−１４）。ｍｙｃファミリー遺伝子がコードしているタンパク質は、ベーシック−ヘリックス−ループ−ヘリックス−ロイシンジッパー（ｂＨＬＨＬＺ）クラスの転写因子の１員である。Ｍｙｃタンパク質とその必須相手のＭａｘとの２量体は、配列特異的ＤＮＡ結合活性を有するヘテロ２量体を形成する。この２量体は、ベーシック部分を介してＥ−ボックス部位（主にＣＡＣＧＴＧエレメント）に結合する。ｍｙｃにはその他に転写活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメインがあり、これらのドメインの働きを通して遺伝子の転写を活性化する。例えば、ＯＤＣ（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，７８０４−７８０８）、ｃｄｃ２５Ａ（Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，５１１−５１７）、ＲＣＣ１（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２３０１−２３１１）、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ２（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ  １５，２０４２−２０４７）、Ｉｄ２（Ｌａｓｏｒｅｌｌａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，５９２−５９８）などのＭｙｃ標的遺伝子が同定されている（Ｄａｎｇ，Ｃ．Ｖ．：（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１−１１）。機能を持つｃ−ｍｙｃ遺伝子を完全に欠損した細胞に、発現遺伝子ライブラリーを導入して正常な増殖を再確立する遺伝子を同定しようとしても、ｃ−ｍｙｃならびにＮ−ｍｙｃが繰り返えされるだけで別の遺伝子は同定することができなかった。これらの結果は、ｍｙｃが単一の遺伝子ではなく複数の遺伝子を制御して細胞増殖を調節していることを示唆している。しかし、がん遺伝子ｍｙｃの機能を解明するのに十分なＭｙｃ標的遺伝子が未だ同定されておらず、ｍｙｃの機能発揮のメカニズムは十分には明らかにされていない。従って、ｍｙｃによって発現調節される新規な遺伝子を同定することは、がん遺伝子ｍｙｃの機能を解明するのに役立つ。
がんのうちでも、大腸がんは、西洋において最も頻繁に発生している。現在では、ある種の大腸がんは全く新しく発生するけれども、ほとんどの大腸がんは既存の腺腫から発生するものと考えられている（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．：Ｃｅｌｌ  １９９０，６１：７５９−７６７；Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｏｏｈａｒａ，Ｔ．：Ｃａｎｃｅｒ  １９８９，６４：９５０−９５５；Ｂｅｄｅｎｎｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  １９９２，６９：８８３−８８８；Ｗａｄａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  １９９６，７７：４４−５０）。すなわち、ほとんどの大腸がんは、正常状態から前がん状態（腺腫）、がん状態へという一連の組織学的変化を徐々にしながら発生することが知られている（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．：ｉｂｉｄ．；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．：Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １９９３，９：１３８−１４１；Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．：Ｃｅｌｌ，１９９６，８７：１５９−１７０）。がんが進行する過程では、一般的には、あまり分化していない（以下、「低分化」ともいう）腫瘍が、中程度に分化した（以下、「中分化」ともいう）腫瘍もしくはそれ以上分化した、つまり高度に分化した（以下「高分化」ともいう）腫瘍よりも速い速度で進行するものと考えられている。
大腸がんに関連した遺伝子を解明する研究によって、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能損失ならびに腫瘍遺伝子の活性化や発現異常が発がんに関与していることが示されている。前がん遺伝子ｍｙｃファミリーｃ−ｍｙｃは、ヒト大腸がんのほとんどで過剰発現されるとの報告があり（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９８６，５３：１−６；Ｓｉｋｏｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  １９８７，５９：１２８９−１２９５）、そのほとんどが腫瘍サプレッサー腺腫様結腸ポリープ症（ＡＰＣ）遺伝子突然変異を有していると報告されている（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｌａｎｃｅｔ  １９９２，３４０：６２６−６３０；Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９９２，１：２２９−２３３；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，；Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，３５９：２３５−２３７）。
近年、ＡＰＣ経路の標的としてｃ−ｍｙｃが特定され、大腸がんにおいてｃ−ｍｙｃを過剰発現する機構を理解するための分子フレームワークが提供されている（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８１：１５０９−１５１２）。ｃ−ｍｙｃ発現がＡＰＣ遺伝子の機能損失によって惹起されたりまたは機能的なＡＰＣ遺伝子産生物によって抑制されたりすることはこのフレームワークを指示している。
大腸発がん発生におけるｃ−ｍｙｃの役割が鋭意調べられているけれども、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の異常発現が発がんに関与する機構は未だ十分には解明されてなく、多くの側面が未だ謎のままである（ＬｕｔｚＷ，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００２，１６０２：６１−７１）。ｃ−ｍｙｃ遺伝子は、多機能性遺伝子であり、細胞分裂、細胞生育、アポトーシスなどの機能に関連している。ｃ−ｍｙｃ遺伝子はまたいくつかの遺伝子の発現を調節するとともに、そのいくつかは発がんに関連している上記機能を仲介する働きをしている。したがって、ｃ−ｍｙｃ遺伝子によって調節される新規遺伝子の機能的情報ならびに発現パターンを解析することは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子によって生起される大腸発がんをより一層理解することに役立つものと考えれる。
大腸がんに加えて、我が国では食道がんも多いがんのひとつである。その患者数は加齢と共に急激に増加する。現在では、食道がんで亡くなる患者数はがんで亡くなる総患者数の約３％に達している。これから迎えつつある高齢化社会において食道がんが更に増えることが危惧され、食道がんも国民の健康を考える上で重要な病気である。
食道がんに関連した遺伝子を解明する研究によって、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能損失ならびに腫瘍遺伝子の活性化や発現異常が発がんに関与していることが示されているが、ｃ−ｍｙｃもその発現異常が報告されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＡＲ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４，５４（７  Ｓｕｐｐｌ）：１９９９ｓ−２００５ｓ）．
本発明者らはｃ−ｍｙｃによって発現が上昇する遺伝子をｃＤＮＡマイクロアレイによって探索した。その結果、本特許事項で扱っている新規がん関連遺伝子を同定した。ｃ−Ｍｙｃ蛋白質はこの遺伝子の発現を調節するプロモーター部分に結合し、この遺伝子の発現を直接上昇することがわかった（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，２７７：３５４５０−３５４５９）。白血病細胞株ＨＬ６０はＴＰＡ（ホルボール２−ミリステート１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ  ２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ））で処理することにより、ｃ−ｍｙｃ発現が減少し増殖しなくなることが分かっている。そこで、未処理あるいは、ＴＰＡで処理した白血病細胞株ＨＬ６０の細胞抽出液を、かかるがん関連遺伝子がコードするタンパク質に特異性を有するポリクローナル抗体を作製し検討したところ、このタンパク質の発現がＴＰＡにより減少することがわかった（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  ｃｈｅｍ  ２００２，２７７：３５４５０−３５４５９）。
なお、このタンパク質は、後で説明するように、特異的な抗体で間接免疫蛍光染色することによって可視化したところ、細胞内の核中に局在していることが見出されたことから、分子量５３ｋＤａを有するｍｙｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎに因んで、このタンパク質をＭｉｎａ５３と命名するとともに、この遺伝子をｍｉｎａ５３と指称する。
したがって、上記先行技術による知見に基づいて、タンパク質Ｍｉｎａ５３に対する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗本を利用して、ｃ−ｍｙｃ遺伝子によって調節されるこのがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３ならびにそのタンパク質Ｍｉｎａ５３の機能的情報ならびに発現パターンを調べることは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子による発がん機構を解明するのに大いに役立つものと、本発明者らは考えている。
そこで、本発明者は、がん遺伝子ｍｙｃの機能を説明するために、Ｍｙｃ標的遺伝子を同定すべく鋭意検討・研究した結果、そのタンパク質Ｍｉｎａ５３に対する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体（以下、「抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体」ともいう）を作製することに成功した。また、本発明者は、その抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を利用して、正常な大腸組織に比べて、大腸がん細胞においてタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現が増加することを見出すとともに、このタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現が、大腸がんにおける初期事象であり、特異的な特性であることを示した。更に、Ｍｉｎａ５３が大腸がん発生においてある種の役割を果たしている蓋然性を示唆していることも見出した。これらの結果から、ヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３が、特に大腸がんに対するマーカーとして使用することができ、かつ大腸がん疾患を処置するための標的として開発できる可能性があることを見出した。さらに、食道がんに対してもマーカーとして使用することができ、かつ食道がん疾患を処置するための標的として開発できる可能性があることを見出してこの発明を完成した。
発明の開示
この発明は、がん遺伝子ｍｙｃの機能を説明することができるＭｙｃ標的遺伝子であるヒト、マウスならびにラットｍｉｎａ５３遺伝子およびヒト、マウスならびにラットのタンパク質Ｍｉｎａ５３を提供することを目的としている。
この発明は、ｍｉｎａ５３遺伝子をコードしているプラスミドならびにレポータープラスミドを提供することを別の目的としている。
この発明の更に別の目的は、かかる新規なＭｙｃ標的遺伝子によってがん細胞の増殖抑制をする方法を提供することである。
また、この発明は、ｍｉｎａ５３遺伝子またはヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３もしくはそのフラグメントを抗原として得られる抗体を提供することを更に別の目的としている。
更に、この発明は、タンパク質Ｍｉｎａ５３に対して特異性を有するモノクローナル抗体（以下、「抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体」ともいう）を提供することを目的としている。
この発明のまた別の目的は、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いてタンパク質Ｍｉｎａ５３をがん細胞またはがん組織中で検出することからなるタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法提供することである。
この発明は、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて、がん細胞またはがん組織中に発現したタンパク質Ｍｉｎａ５３を染色することからなるタンパク質Ｍｉｎａ５３の染色方法を提供することを更に別の目的としている。
それらに加えて、この発明は、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて、がん細胞またはがん組織中に発現したタンパク質Ｍｉｎａ５３を染色することによってがんを診断することからなるがんの診断方法を提供することを別の目的としている。
これらの上記目的を達成するために、この発明は、新規なＭｙｃ標的遺伝子であるがん関連遺伝子を提供する。
この発明の態様の１つとして、この発明は、がん遺伝子ｍｙｃによって直接発現調節を受けるとともに、配列表の配列番号１に示す塩基配列ならびにアミノ酸配列を有し、かつ、分子量５万３千（５３ｋＤａ）の核タンパク質をコードしているがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３を提供する。また、この発明は、その１つの好ましい態様として、がん細胞の増殖に関連していて、かつ、がん組織において特異的に発現が上昇するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３を提供する。この発明の別の好ましい態様として、分子量５３ｋＤａを有するタンパク質をコードしているがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が提供される。更に、この発明は、その好ましい別の態様として、核酸および核小体に局在していて、かつ、その発現がｃ−ｍｙｃ遺伝子によって誘発されるところのがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３を提供している。
更に、この発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する細胞増殖作用を有するヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を提供する。
したがって、これらの諸機能を利用して、この発明に係るｍｉｎａ５３遺伝子ならびにそのタンパク質であるＭｉｎａ５３タンパク質は後述するように様々な有用な応用ができる。
この発明はまた、配列番号２で示される塩基配列を有するマウスがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３または配列番号３で示される塩基配列を有するラットがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３を提供する。この発明による配列番号２で示される塩基配列を有するマウスがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３および配列番号３で示される塩基配列を有するラットがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３は、その細胞増殖作用を調べるのに有用である。
この発明の別の態様として、この発明に係るがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３をコードしているプラスミドが提供される。この発明はまた、その更に別の態様として、ｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡフラグメントを有するレポータープラスミドを提供している。
また、この発明は、その更に別の態様として、がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３の発現を調節する方法を提供している。
更に、この発明の別の態様として、Ｍｉｎａ５３タンパク質に対する抗体が提供される。この発明に係る抗体は、例えば、がんの診断やがんの治療に利用することができるとともに、がん細胞などの正常でない細胞の診断や、細胞の状態の診断などにも利用することができる。
つまり、この発明は、タンパク質Ｍｉｎａ５３、特にヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３に対して特異性を有する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を提供している。
この発明はまた、その更に別の態様として、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いてタンパク質Ｍｉｎａ５３をがん細胞またはがん組織中に検出することからなるタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法（を提供している。
この発明のより好ましい態様として、タンパク質Ｍｉｎａ５３を、大腸がん細胞または大腸がん組織中に検出することからなるタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法が提供される。
また、この発明は、その更に別の態様として、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて、がん細胞またはがん組織中に発現したタンパク質Ｍｉｎａ５３を染色することからなるタンパク質Ｍｉｎａ５３の染色方法を提供する。更に、この発明は、より好ましい態様として、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて、大腸がん細胞または大腸がん組織中、食道がん細胞または食道がん組織中に発現したタンパク質Ｍｉｎａ５３を染色するタンパク質Ｍｉｎａ５３の染色方法を提供している。
この発明の更に別の態様として、この発明は、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて、がん細胞またはがん組織中に発現したタンパク質Ｍｉｎａ５３を染色することによってがんを診断することからなるがんの診断方法を提供している。この発明はまた、その好ましい態様として、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いてタンパク質Ｍｉｎａ５３を染色することによって大腸がん、食道がんの診断をする方法を提供している。
この発明のその他の目的、特長ならびに利点は、本明細書の下記の記載から明白となるものと理解できる。
発明を実施するための最良の形態
この発明に係るがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３のｃＤＮＡ配列を含むヒトゲノミックＤＮＡ配列はＨＴＧＳ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ：ＡＣ０２６１００，ＡＣ０７３２４５，ＡＣ０２４８９２）で検索することができる。なお、イントロン２（エクソン２とエクソン３との間）の長さはＧｅｎＢａｎｋのデータ中で異なっているので、エクソン２とエクソン３の配列に対応するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲで増幅し、その長さを５．２ｋｂであることを決定した。
この発明に係るがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３は配列表の配列番号１で示される塩基配列ならびにアミノ酸配列を有する。更に詳細には、図１に示すように、この発明のがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３のうち、ヒトｍｉｎａ５３遺伝子は１２個のエクソンから構成され、最上流側に２個のエクソン１ａとエクソン１ｂとは２個の転写開始部位として存在し、エクソン２に翻訳開始部位が存在するとともに、最後のエクソン１０に停止コドン（ＴＡＧ）が存在している。また、エクソン１ｂは、エクソン１ａの０．２５ｋｂ下流に存在する。更に、主ｃＤＮＡの中央部、すなわちエクソン５とエクソン６との間に挿入された１０１ｂｐの配列がエクソン５’として存在しているｃＤＮＡもある。４６４個のアミノ酸（２９７Ｑを欠失している）をコードするｃＤＮＡは、エクソン７の最初の３ｂｐを欠失している。ＵＣＳＣＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒのマッピングデータは、ｍｉｎａ５３遺伝子が第３番染色体（３ｑ１２．１）にマップされている。
また、この発明に係るがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３は、その発現ががん遺伝子ｃ−ｍｙｃによって直接誘発され、また分子量５３ｋＤａを有するタンパク質をコードしていて、そのタンパク質は核質および核小体に存在している。更に、ｍｉｎａ５３の発現を特異的に阻害すると、細胞増殖が著しく抑制される。
この発明に係る新規な遺伝子ｍｉｎａ５３はｃＤＮＡマイクロアレイ手法を使用して同定することができる。使用できるｃＤＮＡマイクロアレイ法としては、ＤＮＡチップ（ｃＤＮＡマイクロアレイ）などの当該技術分野において慣用されている種々の手法を使用することができる。例えば、未処理のＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞（後述する）と、エストロゲンの誘導体４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）で２０時間処理した同細胞から全ＲＮＡを単離することができる。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは回収し、市販のＤＮＡチップを用いて示差ディスプレイに付することができる。ＤＮＡチップには、発現配列タグ（ＥＳＴ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｇｅｄ）クローンを含む約９千種類もしくはそれ以上のｃＤＮＡをプレートすることができる。当然ながら、この発明はかかる技術に一切限定されるものではなく、当該技術において使用できる技術であればいずれの技術であっても使用することができる。
この発明において使用するｃ−ｍｙｃをコードするプラスミドは、当該分野においては慣用されている手法によって作製することができる。使用するプラスミドにしても種々のプラスミドが市販されていて、目的に応じて適宜選択することができる。この発明において使用するｃ−ｍｙｃをコードするプラスミドとしては、例えば、ヒトｃ−ｍｙｃをＣＭＶプロモーターによって発現誘導するＰｃ−ｍｙｃ／ＣＤＭ８（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２３０１−２３１１）あるいはそれを、ＰｓｔＩで消化し、自己ライゲートして作製された活性化ドメインが欠如している変異型ｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードするｐｃ−ｍｙｃ（ｄ４１−１７８）／ＣＤＭ８，ｐＴｃ−ｍｙｃｅｒ／ＢＳのＢｓｔＸＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＣＡＧＧＳ哺乳動物発現ベクターのＥｃｏＲＩフラグメント中に挿入し、ｃ−ｍｙｃｅｒをチキン−アクチンとＣＭＶプロモーターとから構成されたキメラプロモーター下に挿入して作製されたｐｃ−ｍｙｃｅｒ／ＣＡＧＧＳなどを使用することができる。
この発明に係るｍｉｎａ５３をコードするプラスミドも同様に当該分野においては慣用されている手法によって作製することができる。使用するプラスミドにしても同様に種々のプラスミドが市販されていて、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、ヒトｍｉｎａ５３に対するｃＤＮＡを、ヒト赤血球白血病細胞（ＨＥＬ）ライブラリーからの５’−ＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣＡＧＧ−３’（開始コドンのメチオニンの直前にＨｉｎｄＩＩＩ部位を追加）と、５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴ−３’をプライマーとして使用してＰＣＲによって増幅し、増幅したフラグメントを特定のベクター中にクローン化して、それぞれ４６５個ならびに４６４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）ならびにｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６４）とを作製することができる。このｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）のＨｉｎｄＩＩＩ−ｓａＩＩフラグメントからｐＥＧＧＦＰ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）（ＧＦＰ−Ｍｉｎａ５３融合タンパク質を合成する）を作製することができる。また、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩとで消化したｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントからｐｈｍｉｎａ５３／Ｒｃ／ＣＭＶを作製することができる。更に、ヒトｍｉｎａ５３をコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＥＧＦＰ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）からの５’−ＧＣＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣ−３’（ＮｃｏＩ部位を追加）と、５’−ＧＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＣ−３’（ＮｃｏＩ部位を追加）とをプライマーとして用いてＰＣＲで増幅し、増幅したフラグメントを、ＮｃｏＩで消化したＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴに挿入して、ｐＥＴ／ｈｍｉｎａ５３を作製することができる。更に、ｐＥＧＦＰ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）のＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントをベクター）中に挿入して、ｐＧＥＸ−ｈｍｉｎａ５３（ＧＳＴ−Ｍｉｎａ５３融合タンパク質）を作製することもできる。
また、この発明では、ｍｉｎａ５３遺伝子のプロモータ活性を調べるために、その特定部位を含むヒトｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡフラグメントをルシフェレース（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｃＤＮＡに結合して、常法によりレポータープラスミドを構築することができる。ＤＮＡフラグメントがプロモータ活性を有していることはＴ９８Ｇ細胞中でのトランジエント発現アッセイによって調べることができる。
この発明によって、ｃ−Ｍｙｃがｍｉｎａ５３の発現を直接調節していることは明らかである。血清飢餓状態におかれたＴ９８Ｇ細胞が血清で活性化されたとき、ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡのレベルが上昇し、その後続いてｍｉｎａ５３が上昇する。ＨＬ６０細胞中でＴＰＡによるｃ−ｍｙｃの発現が低下すると、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡならびにタンパク質の発現も低下する。ラット繊維芽細胞株３Ｙ１中で、転写活性化ドメインを欠損した変異型ｃ−Ｍｙｃではなく、野生型ｃ−Ｍｙｃが高発現すると、ｍｉｎａ５３の発現が上昇する。ｃ−Ｍｙｃタンパク質がｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質中で活性化されたときに、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡとタンパク質の発現が活性化される。ｃ−ＭｙｃＥＲの活性化によるｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの誘導はタンパク質合成インヒビターであるシクロヘキサミドの存在下でも維持される。トランジェント発現アッセイにおいて、ヒトｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡフラグメントから構築されたレポータープラスミドからの発現は、ｃ−ＭｙｃＥＲの活性化によって上昇した。レポータープラスミド中の予測Ｍｙｃ結合部位（Ｅ−ボックス１：ＣＡＣＧＴＧエレメント）が破壊されたときには、ｃ−ｍｙｃによるレポーター遺伝子発現の刺激上昇は起こらない。一方のＣＡＣＧＴＧエレメント（Ｅ−ボックス１）が突然変異してもほとんど効果を有していないのに対して、他方のＣＡＣＧＴＧエレメント（Ｅ−ボックス２）が突然変異するとｃ−Ｍｙｃによるプロモーター活性上昇が著しく低下することは、ｃ−Ｍｙｃが特異的なＣＡＣＧＴＧエレメントを介してｍｉｎａ５３の発現を活性化させることを示唆している。ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、増殖期のＨＬ６０において、インビボでｍｉｎａ５３遺伝子の上記ＣＡＣＧＴＧエレメントが存在するｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡに結合する。ただし、ＴＰＡによって処理されたＨＬ６０細胞では、ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、ｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡに結合しない。これらの結果はｃ−Ｍｙｃがｍｉｎａ５３の発現を直接誘発していることを示している。
この発明に係る新規遺伝子ｍｉｎａ５３は細胞増殖の調節を行う機能を有している。ヒトと囓歯動物との間にＭｉｎａ５３のアミノ酸配列が高率に保存されていることは、このタンパク質が哺乳動物において重要な役割を果たしていることを示唆している。ｍｉｎａ５３の発現は細胞増殖と深く関係していて、細胞増殖に対するｍｉｎａ５３の役割を示している。Ｍｉｎａ５３の生物学的機能を調べるために、新しい手法、つまりスモール・インターフェアランスＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）手法を、ｍｉｎａ５３の発現を特異的に阻止するために適用したところ、ヒトならびにラットの細胞中でＭｉｎａ５３タンパク質の発現がヒトならびにラットｍｉｎａ５３各々に特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖によってだけ特異的に減少することによって特異的な阻害が明白に示された。他方、Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現は、コントロールｓｉＲＮＡ（ヒトｍｉｎａ５３に対する反転配列）または使用した細胞とは異なる動物のｍｉｎａ５３に対する二本鎖によっては、特異的に減少しなかった。Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現が減少したとき、細胞増殖が著しく阻害されることが、ヒトならびにラットの細胞において観察された。これらの結果は哺乳動物の細胞増殖におけるｍｉｎａ５３の重要性を示している。
ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を段階的にゼロまで低下させたマウスを使用したインビボでの研究によって、ｃ−ｍｙｃ遺伝子は、そのｃ−Ｍｙｃレベルが低下すると多臓器形成不全（細胞数を減少する）による体重低下を引き起こすという働きを有していることが示されている。Ｍｙｃ活性は、マウスにおける細胞周期を再開する活性化Ｔ細胞と繊維芽細胞の細胞分裂する細胞との割合を決定する。最近のタイム−ラプス（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ）顕微鏡によるインビボでの研究によっても、ｍｙｃ遺伝子は、細胞分裂を調節して、細胞周期に入るかもしくは細胞周期から出るかを調節していることが示されている。また、細胞周期の進行に直接関与しているいくつかの遺伝子、例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、Ｉｄ２などがＭｙｃ標的遺伝子として同定され、これらと一致した結果を示している。これらの遺伝子の一つを欠失したマウスは、ｃ−ｍｙｃを欠失したマウスと比較して、より緩やかな結果を示すのに対して、その機能を有するｃ−ｍｙｃ遺伝子を完全に欠損した細胞に、発現遺伝子ライブラリーを導入しても、ｃ−ｍｙｃとＮ−ｍｙｃとを繰り返し同定するだけで、正常な増殖を再確立する遺伝子を同定することはできなかった。これらの結果は、ｍｙｃ遺伝子が、単一の遺伝子ではなく複数の遺伝子を制御して細胞周期を調節していることを示唆している。更に、この発明によって、ｍｉｎａ５３がｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子の一つであり、細胞増殖を調節していることが示されている。したがって、Ｍｉｎａ５３タンパク質は、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、Ｉｄ２などのように細胞周期調節因子と直接相互作用することにより機能している可能性が考えられる。最近の研究では、核小体は真核生物細胞周期の調節に関与しているある種のタンパク質にとっては監獄の様なものとして機能していることが示唆されている。また、タンパク質が核小体中に封鎖封入されることは、そのタンパク質が細胞の別の領域にある標的に到達することを防止しているものと考えられる。
Ｍｉｎａ５３タンパク質は、核に存在し、そのなかでも核小体中に集中している。核小体中にＭｉｎａ５３が局在していることはＭｉｎａ５３タンパク質の活性調節の１つの形態を示しているのかもしれない。
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において、そのＭｙｃ（ｄＭｙｃ）の欠失が細胞生育（細胞質量の蓄積）を低下させ、細胞サイズを縮小するのに対し、ｄＭｙｃの過剰産生が生育割合ならびに細胞サイズを増加することが示されている。このことは、ｄＭｙｃが細胞生育に関与する遺伝子を調節することを示唆している。Ｍｙｃの発現が増加し細胞サイズが大きくなることは哺乳類においても観察されている。例えば、免疫グロブリン重鎖エンハンサーのコントロール下でｃ−ｍｙｃを発現するトランスジェニックマウスでは、Ｂリンパ球細胞の発達の全ての段階において正常なＢリンパ球の細胞サイズを増加させる。この増加はタンパク質合成の増加と関連している。また、リボソーム生合成は、細胞増殖にとって必須であることから、核小体は１９６０年代から「リボソームファクトリー」であるといわれている。最近の報告では、ｍｙｃが、リボソーム生合成の機能を有する大きなセット多数の遺伝子の発現を促進することが示唆されていることもあわせて考えると、Ｍｉｎａ５３が核小体中に局在しているということは、ｍｉｎａ５３がリボソーム生合成において必須の役割を果たしている可能性を示唆している。
また、核小体がある種のｍＲＮＡの加工もしくは核外への移送、シグナル認識粒子ＲＮＡやテロメレースＲＮＡの生合成、スプライセオソームの小さな核ＲＮＡの１種の加工などを含む多くの他の側面に関与していることが示されている。これらの機能はまた細胞増殖にとって必須であると思われる。したがって、Ｍｉｎａ５３はこれらの機能の一つに対して役割を果たしているのかも知れない。
しかしながら、Ｍｉｎａ５３においては、その機能が実験的に示された既知のドメインは見出されていない。ところが、Ｍｉｎａ５３のアミノ酸配列１２８−２７１番は、配列類似性に基づいて最近同定されたドメインＪｍｊＣのアミノ酸配列に良く整合している。ＪｍｊＣドメインはクッピンフォールド（ｃｕｐｉｎｆｏｌｄ）と呼ばれる構造を有する金属含有酵素に見られるが、ＤＮＡ−もしくはクロマチン−結合ドメインと一緒にしばしば見出される。このことから、ＪｍｊＣドメイン含有タンパク質は、クロマチンの構築を調節する酵素ではないかと考えられている。また、このドメインにおけるヒト、ラット、マウスのＭｉｎａ５３の８７％は同じであり、全体の配列でも７２％〜７５％が同じである。このことはこのドメインの機能的重要性を示唆している。したがって、Ｍｉｎａ５３はクロマチン再構築を調節し、種々の遺伝子発現のパターンに著しく影響を及ぼす可能性を持っているものと考えられる。
以上述べたように、ｍｉｎａ５３と細胞増殖との関係が明らかであることから、ｍｉｎａ５３はｍｙｃの重要な標的であると考えられる。
次ぎに、この発明の別の態様に係るタンパク質Ｍｉｎａ５３に対する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体（抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体）について更に詳細に説明する。
この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、大腸がん、肉腫、舌がん、脳腫瘍などのがん細胞中のタンパク質Ｍｉｎａ５３を検出することができ、かつ、高感度で染色することができる。従って、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体などの特異的抗体や、ｍｉｎａ５３遺伝子を含む配列を有するＲＮＡ、ＤＮＡなどを利用することによって、Ｍｉｎａ５３タンパク質や、Ｍｉｎａ５３をコードするｍＲＮＡを組織中で検出し、がん細胞などの正常でない細胞を検出することもできる。Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現量は、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などのＭｉｎａ５３タンパク質に結合する物質を利用して、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッテイング法などの手法によって測定することができる。また、細胞の状態は、例えば、ｍｉｎａ５３遺伝子を含む配列を有するＲＮＡ、ＤＮＡなどを利用して、ノーザンブロッテイング法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡマイクロアレイ法などの各種測定法によって測定することもできる。更に、Ｍｉｎａ５３タンパク質に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などの抗体を利用することにより、当該技術分野において慣用されているＥＬＩＳＡ法などの手法により体内に存在するがん細胞などの正常状態にない細胞の存在の有無やその量を推定もしくは測定して診断を下すことも可能である。
ここに、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、当該技術分野に慣用されている常法に従って作製することができる。つまり、本発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、ポリエチレングリコールを用いた細胞融合法や電気的融合法などの融合方法、センダイウイルスやエプシュタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス等を用いた方法、遺伝子組み換えによる組み換え体や発がんプロモーター等による形質転換体を用いた方法などによっても調製することができる（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５））。特に、ポリエチレングリコールを用いた細胞融合法によるハイブリドーマの樹立が好適である。
ここで、この発明において好適に使用することができるポリエチレングリコールを例にして細胞融合法によるハイブリドーマの樹立についてより詳細に説明する。
この発明において、抗原は、公知の方法により調製することができ、例えば、免疫原となるリコンビナントヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を、大腸菌などを利用して作製し、得られた精製タンパク質を必要に応じてアジュバントなどど混合することにより調製することができる。
次に、調製した抗原を免疫動物に対して免疫する。抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を作製するためには、融合に用いる骨髄腫細胞との相性の問題により、免疫動物としては、近交系動物が確立しているマウスやラットを用いるのが好ましいが、例えば、牛、馬、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなども使用することができる。免疫動物への免疫方法としては、一般的には、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射などの注射によって行うことができる。抗原の投与量は、所望の抗体価が得られ、かつ免疫動物に対して悪影響を与えない量であれば、適宜選択して決定することができる。なお、免疫に際しては、免疫応答を促進するために、免疫原を、必要に応じて、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等のアジュバントと併用することもできる。特に、合成ペプチドを免疫原として使用する場合には、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）等のキャリアタンパク質と架橋剤で結合したものを使用することもできる。
この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製は、常法に従って行うことができる。すなわち、免疫動物に対する最終免疫後、抗体価の上昇を確認して、免疫動物から脾臓を取り出して脾細胞を得る。この脾細胞を、免疫に用いた同種動物由来の継代培養した骨髄種細胞と、融合促進剤の存在下において緩衝液中で融合させてハイブリドーマを作製する。使用できる骨髄腫細胞としては、公知の骨髄腫細胞、例えば、マウス由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ１１−４５，６．ＴＧ１．７など、ラット由来の２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３など；ヒト由来のＳＫＯ−００７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２などが挙げられ、適宜選択して使用することができる。また、脾細胞と骨髄種細胞との細胞数の割合は、通常約１０対１〜約１対１の範囲内、好ましくは約４対１〜約１．５対１の範囲内となるような割合がよい。
融合促進剤としては、ポリエチレングリコールや、センダイウイルス（ＨＶＪ）などが使用できるが、取り扱い易さ、融合効率などの観点から、ポリエチレングリコールを使用するのが好ましく、ポリエチレングリコールのうちでも平均分子量が約１、０００〜５、０００の範囲内にあるものが好ましい。また、このポリエチレングリコールの緩衝液中での濃度は、約４０〜６０重量％の範囲内にあるのが好ましい。また、融合効率を向上させるために、培地には、ジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加することもできる。
この発明による上記した脾細胞と骨髄腫細胞との細胞融合は、電気融合法などの常法に従って行うことができ、通常、両細胞を、細胞融合剤を添加した動物細胞用培地または平衡塩類溶液を、例えば、３７℃の温度で約２分間攪拌下で培養するなどの方法によって行うことができる。使用する動物細胞用培地としては、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ハンクスＭＥＭ培地（Ｈａｎｋｓ’Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）などが挙げられ、平衡塩類溶液としては、例えば、ハンクス液（Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））アール液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などが挙げられる。
上記のようにして得られた細胞混合物から、タンパク質Ｍｉｎａ５３に特異性を有する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を産生する能力を有するハイブリドーマは、常法に従って、次のようにして選別することができる。つまり、かかるハイブリドーマの選別は、まず、細胞融合操作終了後、得られた細胞混合物から脾細胞と骨髄種細胞とを細胞融合したハイブリドーマを分離し、続いてその分離したハイブリドーマから、タンパク質Ｍｉｎａ５３に対して特異性を有する抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを選別することによって行うことができる。
更に具体的には、上記細胞融合操作により得られた細胞混合物からハイブリドーマの分離は、かかる細胞混合物を融合細胞のみが増殖できる培養条件下で培養することによって、所望のハイブリドーマを選択的に増殖させることによって行うことができる。一般的には、該細胞混合物を、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地）などの選別用培地で培養することによって、目的とするハイブリドーマを選択的に増殖することができる。ＨＡＴ培地中での細胞混合物の濃度は、通常、約１×１０６〜１×１０７個／ｍｌの範囲となるように調整するのがよい。このＨＡＴ培地の培養は、通常、二酸化炭素を約５〜８％含む空気中において約３７℃の温度で約１〜４週間静置下にて行うのがよい。
次ぎに、上記のようにして分離したハイブリドーマから、そのハイブリドーマがＭｉｎａ５３に特異性を有する抗体を産生する能力を有するかどうかを判定して、ヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３に対して特異性を有する抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを選別することができる。この判定は、例えば、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、プラーク法，スポット法、凝集反応法、オクタロニー法などによって行うことができる。このようにして選別されたハイブリドーマを、例えば、限界希釈法によってクローニングすることにより、Ｍｉｎａ５３に特異性を有する抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を産生する能力を有する増殖可能なハイブリドーマ株を作製することができる。
このようにして作製された抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を認識することができ、通常の培地で継代培養することが可能であり、かつ、液体窒素中で長時間保存することもできる。
本発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体をかかるハイブリドーマから採取するには、このハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物、例えば、骨髄腫細胞が由来する動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いて得ることができる。
また、本発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体の精製は、上記のようにして得た免疫動物の抗血清や、ハイブリドーマの培養上清ならびに腹水より得られた抗体を、例えば、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の当該分野で通常行われている既知の精製方法によって行うことができる。
なお、インビトロで免疫細胞をヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３またはその一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞融合手法を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることによって、本発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を得ることもできる（Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，５３，２６１（１９８２）；Ｐａｒｄｕｅ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９６，１１４９（１９８３））。
この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体はがん細胞およびがん組織内においてヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を発現することができる。
この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、白血病細胞株ＨＬ６０を用いたウェスタンブロッテングによって、分子質量５３ｋＤａの単一バンドを認識することができる。また、この抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いた免疫ブロッテング分析によって、ＴＰＡで細胞処理をすると、５３ｋＤａのバンドのシグナルが減少するが、これに対して、ＴＰＡ処理によってはβ−アクチンの発現は実質的には減少されないという特異的な減少が確認されている。
なお、本発明者らは、ＨＬ６０細胞を、抗Ｍｉｎａ５３ポリクローナル抗体を用いてＴＰＡで処理することによって、Ｍｉｎａ５３の発現を減少させたことをすでに報告している（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，２７７：３５４５０−３５４５９）。また、ＨＬ６０細胞は、ｃ−ｍｙｃの発現レベルが減少されるＴＰＡによって最終的に分化されることが報告されている（Ｈｏｚｕｍｉ，Ｍ．：ＡｄｖＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９８３，３８：１２１−１６９；Ｈｉｃｋｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８９，２６４：２１８１２−２１８１７））。
更に、ＨｅＬａ細胞中に発現させたグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に細胞融合させたタンパク質を用いた別の実験においても、この抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体が、内在性タンパク質Ｍｉｎａ５３に加えて、新たな単一バンドを発生したことを確認している。
これらの結果は、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体がタンパク質Ｍｉｎａ５３を特異的に認識することを示している。
この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、大腸がん細胞株におけるヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を検出することができる。例えば、３種類の増殖期の大腸がん細胞株、ＨＴ−２９、ＷｉＤｒおよびＳＷ−６２０を用いた抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体による免疫ブロッテング分析の結果、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、３種類すべての細胞株において５３ｋＤａの単一バンドを認識することができた。このことは、これらの細胞株がタンパク質Ｍｉｎａ５３を発現し、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体が、他のタンパク質と交差反応をせず、大腸がん細胞中のタンパク質Ｍｉｎａ５３を特異的に認識していることを示している。
これらの細胞株におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現レベルは、ＴＰＡによって実験的に減少させたＨＬ６０細胞中のタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現レベルよりもより一層高かった。他方、上記３種類の大腸がん細胞株におけるアクチンレベルは、ＴＰＡ処理したＨＬ６０細胞のアクチンレベルよりも高くはなかった。これらの結果は、上記３種類の大腸がん細胞株が最終的に分化したＨＬ６０細胞よりも比較的高いレベルのタンパク質Ｍｉｎａ５３を含んでいることを示唆している。
また、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体と抗ヌクレオリンラビット抗体とを用いた二重細胞免疫蛍光染色によって、タンパク質Ｍｉｎａ５３は、大腸がん細胞内に局在していることが確認されている。抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、細胞ＳＷ−６２０内の核を特異的に染色するとともに、その核質内の核小体に、ヌクレオリンに対するシグナルと重複する強力な点状の染色を施している。その他の２種類の細胞株も同一の免疫蛍光染色パターンを示した。これらの結果は、タンパク質Ｍｉｎａ５３が、本発明者らがＨｅＬａ細胞についてすでに示したものと同様に（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ）、核小体内核質中に凝縮した状態で核内に局在していることを示唆している。
更に、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、がん細胞に加えて、がん組織、例えば、大腸がん組織内のタンパク質Ｍｉｎａ５３を検出することができるとともに、大腸がんのいずれの組織病理学的等級において、つまり、十分に分化した腫瘍、中程度に分化した腫瘍およびあまり分化していない腫瘍においてもタンパク質Ｍｉｎａ５３を検出することができる。
以下に、この発明を実施例によって更に説明をするが、下記実施例は、この発明を説明する目的のために例示的に記載するものであって、この発明を一切限定する意図で記載するものではない。
実施例１：
（ｃ−ｍｙｃをコードするプラスミド）
ヒトｃ−ｍｙｃをＣＭＶプロモーター下に導入したＰｃ−ｍｙｃ／ＣＤＭ８（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２３０１−２３１１）を用いた。またこのプラスミドを、ＰｓｔＩで消化し、自己ライゲートして、活性化ドメインが欠如している変異型ｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードするｐｃ−ｍｙｃ（ｄ４１−１７８）／ＣＤＭ８を作製した。ｐＴｃ−ｍｙｃｅｒ／ＢＳの２ｋｂのＢｓｔＸＩ−ＫｐｎＩフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｅｎｚｙｍｅで平滑化した）を、ｐＣＡＧＧＳ哺乳動物発現ベクターの５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｅｎｚｙｍｅで平滑化し、Ｅ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼによって脱リン酸化した）中に挿入して、ｃ−ｍｙｃｅｒがチキン−アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとから構成されたキメラプロモーター下に挿入したｐｃ−ｍｙｃｅｒ／ＣＡＧＧＳを作製した。
実施例２：
（ｍｉｎａ５３をコードするプラスミド）
ヒトｍｉｎａ５３に対するｃＤＮＡを、ヒト赤血球白血病（ＨＥＬ）ライブラリからの５’−ＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣＡＧＧ−３’（開始コドンのメチオニンの直前にＨｉｎｄＩＩＩ部位を追加）と、５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴ−３’をプライマーとして使用してヒト赤白血病細胞（ＨＥＬ）ライブラリーからＰＣＲによって増幅した。増幅した１．４ｋｂのフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社製）中にクローン化して、それぞれ４６５個ならびに４６４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）ならびにｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６４）とを作製した。ｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）の１．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩとｓａｌＩとで切断したｐＧＥＦＰ−ＣＳ（クロンテック社製）を用いて伸長してクローン化し、ｐＥＧＦＰ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）を作製した。ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩとで消化したｐＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）の１．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入して、ｐｍｉｎａ５３／Ｒｃ／ＣＭＶを作製した。ヒトｍｉｎａ５３をコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＥＧＦＰ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）からの５’−ＧＣＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣ−３’（ＮｃｏＩ部位を追加）と、５’−ＧＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＣ−３’（ＮｃｏＩ部位を追加）とをプライマーとして用いて、ヒトｍｉｎａ５３をコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＥＧＦＰ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）からＰＣＲで増幅し、増幅した１．４ｋｂフラグメントを、Ｅ．Ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＮｃｏＩで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼで脱リン酸化した）を用いて伸長に挿入し、ｐＥＴ／ｈｍｉｎａ５３を作製した。ｐＥＧＦＴ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）の１．４ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｅｎｚｙｍｅで平滑化した）を、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｍａｃｉａ）（ＥｃｏＲＩで消化して、Ｋｅｌｅｎｏｗ  Ｅｎｚｙｍｅで平滑化し、Ｅ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼで脱リン酸化した）中に挿入して、ｐＧＥＸ−ｈｍｉｎａ５３を作製した。
実施例３：
（ｍｉｎａ５３のゲノミックＤＮＡフラグメントを有するレポータープラスミド）
そのプロモーター領域からイントロン１に伸長しているヒトｍｉｎａ５３遺伝子のゲノミックＤＮＡフラグメントを、プライマーとして５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＧＣ−３’（ＢａｍＨＩ部位を追加）と、５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣ−３’（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を追加）とを用いて、ヒトｍｉｎａ５３遺伝子のプロモーター領域からイントロン１の一部までのゲノムＤＮＡ断片を、ヒト末梢血由来のＤＮＡを鋳型としＰＣＲで増幅した。その増幅した０．８ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断した後、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断したｐＧＬ３（プロメガ社製）の４．８ｋｂフラグメント中に挿入して、ｐＭｉｎａ（Ｗ）ｌｕｃｉを作製した。ｐＭｉｎａ（Ｗ）ｌｕｃｉをＨｉｎｄＩＩＩとＰｍａＣＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｅｎｚｙｍｅで平滑化し、自己連結して−ｐＭｉｎａ（ｄＥ）ｌｕｃｉを作製した。つぎに、Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）部位指向突然変異システム（プロメガ社製）を用いて、ｐＭｉｎａ（Ｗ）ｌｕｃｉのＥ−ボックス部位に突然変異を導入し、その２個のＥ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧエレメント）の一方もしくは両方をＣＡＣＣＴＧに変異したｐＭｉｎａ（ｍＥ１）ｌｕｃｉと、ｐＭｉｎａ（ｍＥ２）ｌｕｃｉと、ｐＭｉｎａ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉとを作製した。
参考例１：
（その他のプラスミド）
アクチンプロモーターのコントロール下においてハイグロマイシン抵抗遺伝子を含有するｐＡｃｔＨｙｇ  ｐＡｃｔＨｙｇプラスミドはＤｒ．Ｍ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉから贈与されたものである（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４，２３０１−２３１１）。ＣＭＶプロモーターのコントロール下でＲｅｎｉｌｌａｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を含有するｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドは市販されているもの（プロメガ社製）を入手した。
実施例４：
（ＲＮＡの調製とノーザンブロット分析）
ＲＮＡは、ＤＥＰＣで処理した市販のＲＮＡ調製液セット（ナカライテスク社製）を用いて、酸グアニジウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出法によって細胞から単離した。抽出したＲＮＡは、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルを用いて電気泳動をし、ハイボンドＮ（アマシャム社製）に転写し、３２Ｐで標識したｃＤＮＡプローブで検出した。プローブは、市販のＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅラベリングキット（アマシャム社製）を用いて［，，−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。結果はＢＡＳ２００イメージ分析（富士フィルム社製）を用いて定量した。
実施例５：
（プローブＤＮＡの調製）
ｃ−ｍｙｃと、ｍｉｎａ５３と、ＣＤ１８とのＤＮＡプローブは次のようにして調製した。
ｃ−ｍｙｃの調製：
ヒトｃ−ｍｙｃｃＤＮＡを含有するｐｃ−ｍｙｃ／ＣＤＭ８からの１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントを調製した（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２３０１−２３１１）。
ｍｉｎａ５３の調製：
上記ｐＥＧＦＰ／ｈｍｉｎａ５３（４６５）からの５’−ＣＡＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＣ−３’と、５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴ−３’とをプライマーとして使用して、ＰＣＲ法にて増幅して得られた４４２ｂｐのフラグメントを使用した。
ＣＤ１８の調製：
ＴＰＡ１０ｎＭ中で２４時間培養したＨＬ６０細胞から単離した全ＲＮＡからの５’−ＧＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＡＴＴＣ−３’と、５’−ＡＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＡＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＡ−３’とをプライマーとして使用して、ＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅して得られた１．８ｋｂのフラグメント。ＣＤ１８ｃＤＮＡの配列は直接シーケンス法によって確認した。
実施例６：
５’−ＲＡＣＥおよびＲＴ−ＰＣＲプロトコルについて説明する。
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ））
各プライマー１０ｐｍｏｌｅと、ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１．２Ｕと、ｄＮＴＰ２００，，Ｍとを含むＥＸ  Ｔａｑバッファ５０，，ｌを用いて増幅を行った。
（５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５’ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）分析）
ＨＥＬ細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１，，ｇ）から、逆転写反応、２重鎖ｃＤＮＡ合成およびアダプターライゲーションを、マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社製）を用いて行った（Ｋｏｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２，７５０１−７５０５）。第１ＰＣＲは、プライマーとして、ｍｉｎａ５３−ＲＡＣＥ−１（５’−ＧＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣＴＴ−３’）と、ＡＰ１プライマーとを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の初期熱変性後、９６℃での１５秒間の熱変性工程、６８℃での３分間のアニーリング工程と伸張工程とを１サイクルとして２５サイクルの処理をした。上記第１ＲＡＣＥ−ＰＣＲ生産物を１０００倍希釈した液１，，ｌをネストＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ネストＲＡＣＥ−ＰＣＲは、ｍｉｎａ５３−ＲＡＣＥ−２（５’−ＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＣ−３’）と、ＡＰ２プライマーとを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の初期熱変性後、９６℃での１５秒間の熱変性工程、６８℃での４分間のアニーリング工程と伸張工程とを１サイクルとして２５サイクルの処理をした。
（ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ））
ＨＥＬもしくはＲＣＮ−９細胞もしくはマウスの胃の細胞の一本鎖ｃＤＮＡを、市販のスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡ（１，，ｇ）に対して合成した。得られた１重鎖ｃＤＮＡ１，，ｌ（全量２０，，ｌ）をＰＣＲの鋳型として使用した。増幅用のＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとしては、ヒトに対しては、ｍｉｎａ５３ＲＴ−Ｆ（５’−ＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＧＡＡＡＧ−３’）と、ｍｉｎａ５３ＲＴ−Ｒ（５’−ＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＡ−３’）とを、ラットとマウスに対しては、ラットｍｉｎａ５３ＲＴ−Ｆ（５’−ＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＣＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣ−３’）と、ラットｍｉｎａ５３ＲＴ−Ｒ（５’−ＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＴＡＴＴＴ−３’）とを使用した。温度プロファイルは、９８℃での１５秒間の熱変性工程と、６５℃での１分間のアニーリング工程と、７２℃での２分３０秒間の伸張工程を１サイクルとして３５サイクルの処理をした。
実施例７：
（細胞培養）
ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞を非必須アミノ酸と１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有イーグル培地中で培養した。ＨｅＬａ細胞、ラット繊維芽細胞株３Ｙ１およびその誘導体を、１０％ＦＣＳ添加ダルベッコ補正イーグル培地中で培養した。ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ６０を、２０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ラット結腸がん細胞株ＲＣＮ−９を、ＲＩＫＥＮ細胞バンクから入手して、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。Ｍｙｃまたは活性化ドメインを欠損したｃ−Ｍｙｃを発現する３Ｙ１細胞を確立するために、２０，，ｇのｐｃ−ｍｙｃ／ＣＤＭ８もしくはｐｃ−ｍｙｃ（ｄ４１−１７８）／ＣＤＭ９と、０．４，，ｇのｐＡｃｔＨｙｇとを用いて、カルシウム−リン酸方法によって、細胞に遺伝子導入した（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６，６３２−６３８）。得られた細胞は２００，，ｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する培地中で２週間培養した。個々のクローンを単離し、ｃ−Ｍｙｃもしくは変異型ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現を、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を使用してウェスタンブロット分析法によって検出した。クローン３Ｙ１ＭｙｃＡと３Ｙ１ＭｙｃＢ（ｃ−Ｍｙｃタンパク質を発現している）およびクローン３Ｙ１Ｍｙｃ（ｄＴＡＤ）Ａと３Ｙ１Ｍｙｃ（ｄＴＡＤ）Ｂ（大部分の活性化ドメインを欠損している変異型ｃ−Ｍｙｃタンパク質を発現している）が確立された。ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質（Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２）を発現するＴ９８Ｇ細胞を確立するために、２０，，ｇのｐｃ−ｍｙｃｅｒ／ＣＡＧＧＳと、０．４μｇのｐＡｃｔＨｙｇとを用いて、細胞を形質転換し、個々のクローン中のｃ−ＭｙｃＥＲの発現は上記のようにして検出し、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２を確立した。
実施例８：
（ＤＮＡチップ（ｃＤＮＡマイクロアレイ）を用いた示差ディスプレイ）
未処理のＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞とＯＨＴで２０時間処理した細胞から全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを回収し、市販のＤＮＡチップ（インサイト社製）を用いて示差ディスプレイに適用した。発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンを含む約９千種類のｃＤＮＡをチップにプレートした（ＵｎｉＧＥＭＨｕｍａｎＶＶｅｒ．２）。
実施例９：
（トランジェント発現アッセイ）
Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞を１０％ＦＣＳを追加した培地中で生育した。３ｘ１０４個の細胞をデイッシュ（１２ウエルプレート；ウエルの直径：２２ｍｍ）中にプレートし、２０〜２４時間培養した。１，，ｇのレポータープラスミドとインターナルマーカーとして２０ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶをＦｕＧＥＮＥ６試薬（ロッシュ・ダイアグノステイックス社製）を用いて細胞に導入した。レポーター遺伝子導入１日後、ＯＨＴ（最終濃度が０．２．，，Ｍになるように）を添加してＭｙｃＥＲキメラタンパク質を活性化して、更に１７時間培養した。次いで、細胞を回収して、ファイアフライ・ルシフェレース（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ならびにレニラ・レニホルミス・ルシフェレース（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の活性をデュアル−ルシフェレースレポーターアッセイ系（ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社製）を用いて定量した。Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェレース活性値を用いて試料間の遺伝子導入程度を標準化した後、活性化ＭｙｃＥＲを有する細胞からのｆｉｒｅｆｌｙルシフェレース活性を、ＭｙｃＥＲ活性化していない細胞からの活性に対する比率として表した。ＭｙｃＥＲの活性化によらないＯＨＴの効果を標準化するために、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞からの値を、上記Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞と同一方法で処理したＴ９８Ｇ親細胞からの値で割った値を求め、ＭｙｃＥＲキメラタンパク質の活性化に対するレポーター遺伝子の反能性反応性とした。なお、値は４回実験をしてその平均値で表している。
実施例１０：
（クロマチン免疫沈降）
クロマチン免疫沈降実験は、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体ならびにコントロール抗体を使用して行うとともに、抗体を使用しないコントロールも行った。この実験では、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体は２種類使用した。１つはｃ−ＭｙｃのＮ−末端側半分と反応し、もう１つはＣ−末端側半分に主に結合するものである。アッセイは基本的にはすでに発表された方法に従って行った（Ｂｏｙｄ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １７，２５２９−２５３７）。免疫複合体は、非特異的な結合を妨げるように処理をしたプロテインＡビーズ（５０％容量／容量）２０，，ｌを添加することによって回収した。上記文献記載のようにして、ビーズを洗浄し、ＤＮＡフラグメントを溶出し、溶出した溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈降させた。免疫沈降したＤＮＡフラグメントはＰＣＲによって検出した。使用したＰＣＲプライマーは、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧ−３’と、５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣ−３’であり、これらのプライマーを使用してヒトｍｉｎａ５３遺伝子の転写開始部位の近くにＥ−ボックスを含む４８３ｂｐのフラグメントを増幅する。別のプライマーとしては、５’−ＴＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＣ−３’と、５’−ＧＣＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣ−３’とを使用して、第２２番染色体中の検出可能な遺伝子を有しない領域に位置している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ  １５，２０４２−２０４７）Ｅ−ボックスにおけるゲノミック配列を増幅する。このＥ−ボックスは検出可能な遺伝子を有しないクロモソーム中に位置している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ  １５，２０４２−２０４７）。
実施例１１：
（抗体）
ヒトｍｉｎａ５３のＬｙｓ３からカルボキシル基末端までの部分は、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でｐＥＴ／ｈｍｉｎａ５３を用いて発現し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離、精製した。この組換えポリペプチドでラビットを免疫した。ＧＳＴ融合タンパク質ＧＳＴ−Ｍｉｎａ５３をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９中でｐＧＥＸ−ｈｍｉｎａ５３を用いて発現し、グルタチオン・セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって単離した。組換えＧＳＴ−Ｍｉｎａ５３ポリペプチドを結合したセファロース４Ｂを用いてラビットの血清から抗体を上記文献に従って精製した。１個の抗ｃ−Ｍｙｃ抗体はすでに報告したものを用いた。
参考例２：
その他の抗体は市販のものを使用した。その他の抗体としては、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｎ２６２）（サンタクルス社製）、抗ヌクレオリンマウスモノクローナル抗体（Ｃ２３（サンタクルス社製）、ヤギ抗ラビットＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（サンタクルス社製）、アレクサ４８８結合抗マウスＩｇＧ（モレキュラー・プローブ社）およびＣｙｓ結合抗ラビットＩｇＧ（ザイメッド・ラボラトリーズ社製）を使用した。
実施例１２：
（ウェスタンブロット分析および間接免疫蛍光染色）
ウェスタンブロッテイングは実質的には上記文献記載のとおりに行った（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，５６０−５６４）。細胞をトリプシン処理し、１００ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、０．１Ｍ  ＤＴＴ、２０％グリセロールを含む３％ＳＤＳ溶液中に回収し、４〜２０％ポリアクリルアミド上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）ミリポアメンブレン（ミリポア社製）に移行した。抗体で処理した後、シグナルをＥＣＬ強化化学発光法（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて検出した。
間接免疫蛍光法のために、６ウエルプレートのガラスカバースリップ上で生育したＨｅＬａ細胞を−２０℃で１０分間メタノール中で固定した。抗Ｍｉｎａ５３ラビット抗体と抗ヌクレオリンマウスモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１２０分間反応した。０．１％スキムミルクＰＢＳ懸濁液で３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＧならびにＣｙ３結合抗ラビットＩｇＧを添加し、３７℃で１２０分間反応し、０．１％スキムミルクＰＢＳ懸濁液で３回洗浄した。最後に、細胞をイムノン（Ｉｍｍｕｎｏｎ）（テルモ・シャンドン社製）中に埋設し、蛍光顕微鏡で観察した。
実施例１３：
（ＲＮＡの調製およびｓｉＲＮＡの細胞中への導入）
２１個のヌクレオチドからなるスモール・インターフェアリング（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖が、ＨｅＬａ細胞を含む哺乳動物の細胞株中で遺伝子発現を特異的に抑制するとの報告が最近なされている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８）。そこで、２１個のヌクレオチドからなるｓｉＲＮＡであって、ヒトｍｉｎａ５３ならびにラットｍｉｎａ５３（１９個のヌクレオチドのうち５個がヒトｍｉｎａ５３のそれとは異なる）に対して特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖２重ラセンを常法にしたがって化学的に合成した。非特異的コントロールとして、ヒトｍｉｎａ５３ｓｉＲＮＡとは逆方向配列を有する二本鎖も同様に合成した。ヒトＭｉｎａ５３およびラットＭｉｎａ５３を標的とするｓｉＲＮＡ配列は、開始コドンの第１ヌクレオチドに対して位置４５−６３を使用し、３’末端に２つのデオキシチミジンを付加している。ｓｉＲＮＡをアニールし、実質的には文献記載の方法と同じ方法で細胞に導入した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８）。ｓｉＲＮＡ導入の２４時間前に、指数関数的生育期の細胞をトリプシン処理し、１２ウエルプレートにプレートした。ｓｉＲＮＡは１ウエルあたりｓｉＲＮＡ２００ｐｍｏｌｅと、市販のオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ライフテクノロジー社）とを用いて細胞に導入した。ただし、ＨｅＬａ細胞は、無血清培地では２０時間以上培養し、３Ｙ１ＭｙｃＢ細胞では同様に１０時間培養し、ｓｉＲＮＡを導入した。
実施例１４：抗ヒトＭｉｎａ５３モノクローナル抗体の作製
（抗原）
大腸菌を利用してリコンビナントヒトＭｉｎａ５３タンパク質を作製した。精製したタンパク質をＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバントシステム（シグマ社）と混合することにより感作用抗原溶液とした。
（免疫スケジュール）
生後８週から１０週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の後ろ足のひらに０．１ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｍｉｎａ５３タンパク質）ずつ、合計一匹当たり０．２ｍｌの上記抗原溶液を注射し１回の感作とした。初回の注射をしてから、３日後、６日後に同様の方法で抗原を注射した。１４日後にアジュバントと混合しない抗原を上記と同量、同様の方法により注射しブースト（Ｂｏｏｓｔ）した。
（Ｂ細胞の回収）
最後の注射（Ｂｏｏｓｔ）から４日後に後ろ足付け根のリンパ節を無菌的に取り出し、滅菌したスライドグラス２枚を使ってリンパ節組織を摺り潰して壊してＢ細胞を回収した。
（細胞融合）
回収したＢ細胞をマウスミエローマ細胞株ＦＯ１細胞と１０：１の割合で混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００を用いて両者を細胞融合した。
（ハイブリドーマの選択）
融合した細胞は９６穴培養皿で培養した。培地は５％Ｂｒｉｃｌｏｎｅ（大日本製薬）、２０％牛胎児血清、ＨＡＴ溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、Ｂ細胞と融合したマウスミエローマ細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に生存させた。この時、ハイブリドーマ生育を助けるため融合していない胸腺細胞と共に培養した。
上記のようにして、４個のハイブリドーマを選別し、このうちの１つ（ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＭＴ／ＨＫ−１）を、平成１５年４月９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９８として寄託している。
実施例１５：抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体活性の測定法
精製したリコンビナントヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液に３〜１０ｇ／ｍｌの濃度になるように調整し、得られた溶液０．１ｍｌをマイクロタイタープレートの各ウエル中に加え、３時間から１昼夜室温で放置した。その後、溶液を捨て、１％スキムミルクを含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液を０．２ｍｌ加えて４℃で保存した（ブロッキング操作）。プレートは２時間から１週間以内に使用した。１％スキムミルク溶液を捨てた後、ＰＢＳでウエルを２回洗浄後、測定に供する溶液０．１ｍｌを加え、３７℃で２時間あるいは４℃で１昼夜インキュベーションした。ウエルを３回ＰＢＳにより洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で２時間あるいは４℃で１昼夜インキュベーションした。その後、ウエルを３回ＰＢＳにより洗浄した後、パーオキシダーゼの基質であるｏ−ＰＤＡ溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミンの０．１Ｍクエン酸塩溶液、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．００５％Ｈ２Ｏ２）を０．１ｍｌ加え、室温で１５分から３０分間放置した後、０．０５ｍｌのオキサレート溶液を加えて反応を停止した。４５０ｎｍでの吸収を測定することにより、パーオキシダーゼ活性を測定した。
上記ハイブリドーマを培養した培地中の抗Ｍｉｎａ５３抗体活性の測定は、培養を始めてから１４日後と２１日後に培養液０．１ｍｌをとり、上記方法により行った。
実施例１６：ウエスタンブロッティング
ＨｅＬａ細胞をＳＤＳ溶液（３％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、２０ｍＭジチオスレイトール、２０％グリセロール）により１００℃で１０分間抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ポリビニリデンジフルオライド微孔性メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。そのメンブレンをハイブリドーマ培養液と３７℃で３０分間反応させた後、洗浄し、さらに西洋ワサビパーオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ溶液と３７℃で３０分間反応させた後、再び洗浄した。シグナルは、市販のエンハンスト・ケミルミネッセンス・テクニック（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））システムにより検出し、ウエスタンブロット解析をした。
実施例１７：抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体の精製
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン．）を２週間程度前にあらかじめ腹腔に注射したマウス（ｂａｌｂ／ｃ）に、上記ハイブリドーマを腹腔に注射した（２ｘ１０６／頭）。１０〜２０日後、１８ゲージ注射針を用いて腹水を回収した。腹水は、硫安分画し、抗体活性を示す画分を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）により透析した。あらかじめ１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に平衡化したＤＥ−５２（ワットマン社）に上記画分を添加し、０−０．２Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をもつ１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）により溶出し、溶出画分中の抗Ｍｉｎａ５３抗体活性を測定した。高い抗Ｍｉｎａ５３抗体活性を持つ画分を集めて精製し、精製抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を得た。
実施例１８：抗ヒトＭｉｎａ５３抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いた組織診断
抗ヒトＭｉｎａ５３マウス抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて、大腸がんを次のようにして染色した。その結果、非がん部組織に比べて、大腸がん部分が強く染色された。
（抗ヒトＭｉｎａ５３マウス抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体による組織染色法）
先ず、ホルマリン固定し、パラフィン包埋したブロックを約３μｍ厚さにスライスし、スライドグラス上にマウントした。このスライドグラス上の切片をキシレンに浸けて３７℃で１５分間放置した。１５分後、新しいキシレンに変えた。このキシレン処理を全部で３回行って脱パラフィン処理を行った。このように脱パラフィン処理を行った切片を、９９％エタノールに浸け、１０分後に新しい９９％エタノールに変えた。このエタノール処理を全部で３回行った後、さらに９５％、９０％、７０％と段階的に含水率の高いエタノールに各５分間ずつ浸けた。更に、水に５分間浸けて水洗した。水洗した切片を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し、抗原性を回復させた。その後、室温に戻してから水洗し、ＰＢＳ溶液に浸漬した。
次ぎに、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ溶液で１回洗った後、試料を３％Ｈ２Ｏ２のＰＢＳ溶液を用いて室温で３０分間処理することにより、内在性のパーオキシダーゼ活性を失活させた。
得られた試料を０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ溶液により２回洗浄し、１％スキムミルクと５％ウサギ血清を含むＰＢＳ溶液を用いて室温で３０分間処理することにより、抗体の非特異的結合を防ぐブロッキング操作を行った。
抗体を１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液により希釈し最終濃度を３．５μｇ／ｍｌにし、上記のようにブロッキング操作をして得られたスライドグラス上の試料の上に添加し、４℃で一夜反応させた。翌日、試料を０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ溶液によって３回洗浄し、ビオチン化した抗マウスＩｇＧウサギ抗体と室温で３０分間反応させた。
反応後、得られた試料を０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ溶液により３回洗浄後、西洋ワサビパーオキシダーゼを結合させたストレプトアビジンと反応させた。得られた試料を０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ溶液により３回洗浄後、３，３？ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質溶液を加え室温放置し、パーオキシダーゼ活性を持つ部分を茶色に発色させた。その後、４分間水洗することにより、パーオキシダーゼ反応を止めた。次いで、ヘマトキシリンで染色した後、スライドグラスを脱水し包埋した。
実施例１９：抗ヒトＭｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いた溶液中のＭｉｎａ５３タンパク質の定量
上記で得られた抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を２つ組み合わせることによりＭｉｎａ５３タンパク質をサンドウイッチして定量をすることができた。
（マイクロタイタープレートによるＭｉｎａ５３の定量）
抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を、西洋ワサビパーオキサイド結合キット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いてキットの指示に従って標識して）西洋ワサビパーオキサイドを結合した抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を調製した。
更に、０．１Ｍクエン酸塩／０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液に０．４ｍｇ／ｍｌの濃度でｏ−ＰＤＡを溶解し、−８０℃で保存し、使用直前に１０００分の１容量の５％過酸化水素水を加えて、ｏ−フェニレンジアミン溶液を調製した。
他方、もう１つの抗体２０μｇ／ｍｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）溶液に溶解し、この溶液をマイクロタイタープレートの各ウエルに５０μｌづつ加え、３７℃で２時間あるいは４℃で一昼夜インキュベーションした。続いて、抗体溶液を捨てた後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液を２００μｌ加え、３７℃で２時間あるいは４℃で一昼夜インキュベーションした。この後、１ウエルあたり試料５０μｌを加え、３７℃で２時間あるいは４℃で一昼夜インキュベーションした。この際、必要に応じて、試料はウシ胎児血清を用いて希釈した。次ぎに、ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、希釈した西洋ワサビパーオキサイドを結合した上記抗体溶液を１ウエルあたり５０μｌ加え、３７℃で２時間あるいは４℃で一昼夜インキュベーションした。更に、ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を１ウエル当たり５０μｌ加え、３７℃で１０−１５分間インキュベートして、その発色を定量した。
実施例２０：
（ウェスタンブロッテング）
ウェスタンブロッテング分析のために、ヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９、ＳＷ−６２０ならびにＷｉＤｒをそれぞれ１０％ＦＣＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地で培養し、ヒト前骨髄細胞白血球細胞株ＨＬ６０を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
このように培養した細胞を、トリプシンおよびＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で処理して集め、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を、３％ＳＤＳ、５０ｍＭジチオスレイトールおよび２０％グリセロールを含む０．１２５ＭトリスＨＣｌバッファ（ｐＨ６．８）溶液に懸濁し、１０分間煮沸して４〜２０％勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて分離した。タンパク質をポリビニリデンジフルオライドミクロボアメンブレンに移し、１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液で処理し非特異的結合部位をブロックした。マウス抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体およびＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で処理した後、エンハンスト・ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）ウェスタンブロッテング試薬システムを用いてシグナルを検出した。ローデイングコントロールとして、メンブレンを剥離バッファで処理した後、抗βアクチンモノクローナル抗体によって再プローブした。
図６Ａはウエスタンブロッテイング分析結果を示している。ウエスタンブロツテイング分析は、ＴＰＡの非存在下で培養したＨＬ６０細胞（レーン１）、ＴＰＡの存在下で培養したＨＬ６０細胞（レーン２）および大腸がん細胞株ＷｉＤｒ（レーン３）、ＨＴ−９０（レーン４）ならびにＳＷ−６２０（レーン５）からそれぞれ調製した細胞溶菌液を電気泳動後、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて行った（上側パネル）。
（間接免疫蛍光染色）
間接免疫蛍光染色するために、上記ＨＴ−２９、ＳＷ−６２０ならびにＷｉＤｒ細胞を、６ウェルプレートのガラスカバースリップ上で生育させ、メタノール中において−２０℃で１０分間固定した。１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液でブロッキングした後、マウス抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体および抗ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）ラビットポリクローナル抗体を添加して、３７℃で１２０分間インキュベーションした。０．１％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８共役抗マウスＩｇＧ抗体およびＣｙｓ３共役抗ラビットＩｇＧ抗体を添加し、３７℃で１２０分間インキュベーションし、０．１％スキムミルクのＰＢＳ溶液で３回洗浄した。最後に、細胞をイムノン（Ｉｍｍｕｎｏｎ）内に包埋して蛍光顕微鏡で観察した。
図６Ｂは、細胞内におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の局在を示している。図６において、大腸がん細胞株ＳＷ−６２０内におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の局在を、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体で間接免疫染色することによって目視観察した結果を示した（ａ）。また、抗ヌクレオリンラビットポリクローナル抗体で染色した結果を目視観察した結果を示した（ｂ）。更に、両者を重ねた画像を示した（ｃ）。
実施例２１：
２４名の原発性大腸腫瘍患者から採取した標品をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した試料を使用した（Ｆｕｊｉｔａｎｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．：Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ  ２０００，１７：３３１−３３８）。これらの標品には、２３例の大腸腺がんが含まれていて、そのいくつかの例は高度に浸潤していて、またいくつかの例はリンパ管浸潤を示していた。また１例は腺腫であった。組織切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色に基づいた組織病理学的勾配システムに従って、高分化、中分化および低分化とに分類した。組織の特徴の概要を表１に示す。
実施例２２：大腸がん細胞の免疫染色
脱パラフィン化した１０％ホルマリン固定・パラフィン包埋大腸がん組織を、ストレプトアビジン−ビオチン・コンプレックス・イムノパーオキシダーゼ法によって免疫染色した（Ｆｕｊｉｔａｎｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ２０００，４８：１６４９−１６５６）。
抗原を回復させるために、切片をマウントしたスライドを、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で２０分間オートクレーブした。３％過酸化水素を含むＰＢＳ溶液、次いで１％スキムミルクと５％ラビット血清を含むＰＢＳ溶液で前処理した後、最終濃度３．５μｇ／ｍｌの抗Ｍｉｎａ５３抗体を含む１％スキムミルク溶液または抗Ｋｉ−６７抗体を、湿ったチェンバー中において４℃で一昼夜反応させた。０．０５％ツイーンのＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、切片を、ビオチン化ラビット抗マウスＩｇＧ抗体、続いてＨＲＰ−ストレプトアビジン・コンジュゲートとインキュベーションした。次いで、３、３−ジアミノベンジジンと過酸化水素を用いて、Ｍｉｎａ５３については４分間、Ｋｉ−６７については２分間発色させた後、水で洗浄して反応を停止させた。ヘマトキシリンで対比染色した後、スライドを脱水し、カバーガラスをかけた後、顕微鏡で観察した。
（免疫組織化学的染色の評価）
下表１に示す染色強度については、各切片を目視観察することによって０から３までの点数で記録した。点数は、最高の染色強度を有する切片を３点とし、最低の染色強度を有する切片を１点とし、染色しなかった切片を０点とした。染色された細胞の割合を推定するために、画像をデジタルカメラで撮影し、表示視界内の陽性細胞の数を数えて、染色細胞の割合（％）で表した。また、下表１における染色インデックスは、染色強度に染色細胞の平均割合％を乗じた値として計算した。
実施例２３：リコンビナントヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３の定量
大腸菌で作製したリコンビナントヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を０．１−１０００ｎｇ／ｍｌの濃度になるようにウシ胎児血清を用いて調整し、ＥＬＩＳＡ法により定量した。その結果、１−１，０００ｎｇ／ｍｌのリコンビナントヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３を定量することができた（図１０）。
実施例２４：
実施例２３に示した方法により正常人からの血液中のＭｉｎａ５３の量を定量したところ、０−５ｎｇ／ｍｌのＭｉｎａ５３を検出した。また、乳がんの患者の血液中に正常値よりも高いレベルである６４ｎｇ／ｍｌのＭｉｎａ５３を検出した（図１１）。
上記実施例から、このＥＬＩＳＡ法は血中のＭｉｎａ５３を定量することができることがわかる。
実施例２５：食道がん細胞の染色
上記実施例で得た抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いて食道がん細胞を染色し、現在ヒト食道がん細胞の染色に使用されている抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体による食道がん細胞の染色による染色具合と比較した。
３８人の食道がん患者からの食道がん組織を、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体あるいは抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体により染色し、それぞれの試料における抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体あるいは抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体の染色インデックスを求めた。本実施例において、染色インデックスは、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体の染色インデックスを横軸に、抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体の染色インデックスを縦軸にとり、それぞれの食道がん組織の価をプロットした。なお、染色インデックスは、染色強度ｘ染色されている細胞の割合により求めた。その結果は図１３に示す。
また、食道がんのがん悪性度と、Ｍｉｎａ５３あるいはＫｉ−６７の染色インデックスとの関係を調べ、その結果を図１２に示す。図１２（Ａ）にはＭｉｎａ５３の染色インデックスと食道がんのがん悪性度との関係を、また図１２（Ｂ）にはＫｉ−６７の染色インデックスと食道がんのがん悪性度との関係を示している。なお、図１２（Ａ）は、Ｍｉｎａ５３の染色インデックスが０〜１．８と、１．９〜４との２つのグループに分け、カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）法により解析した結果を、また、図１２（Ｂ）は、Ｋｉ−６７の染色インデックスが０〜０．６と、０．７〜４．０との２つのグループに分け、カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）法により解析した結果を示している。
結果
上記実施例では、ｃ−Ｍｙｃ活性を条件付に活性化するために、エストロゲン誘発性Ｍｙｃシステムを使用した（Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，６６−６８）。キメラタンパク質ｃ−ＭｙｃＥＲは、ヒトｃ−Ｍｙｃと、ヒトエストロゲンレセプターのエストロゲン結合ドメインとから構成されている。ｃ−ＭｙｃＥＲは、エストロゲンの不存在下で細胞骨格成分に結合している。エストロゲンもしくはその誘導体４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）がキメラタンパク質に結合したとき、細胞骨格から遊離してｃ−Ｍｙｃとして機能する。ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇを異所性ｃ−Ｍｙｃ活性を導入する親細胞として使用した。ｃ−ＭｙｃＥＲタンパク質（Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２）を発現するＴ９８Ｇ細胞株を確立した。
指数関数的に増殖する状態にある細胞を、ＯＨＴの存在下もしくは不存在下で２０時間培養し、全ＲＮＡを単離し、上記に記載したｃＤＮＡマイクロアレイ分析に付した。すでに報告されているＭｙｃ標的遺伝子、つまり、ＯＤＣと、ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）の特定のシグナルは、ｃ−ＭｙｃＥＲの活性に伴って、それぞれ２．６倍と１．６倍増加した。これらの結果は、Ｍｙｃ標的遺伝子がこれらの実験システムにより検出され得ることを示している。
上記実施例において、ｃ−Ｍｙｃの機能を調べるために、ｃ−ＭｙｃＥＲ活性化によって刺激され発現上昇した遺伝子のうちでヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）配列について調べた。その結果、ＥＳＴクローンＷ２７６６６に対するシグナルがｃ−Ｍｙｃ活性によって１．９倍程刺激され発現上昇することが分かった。この上昇率は、ｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子であるＯＤＣとヌクレオリンについてここで測定した値と類似していた。
Ｗ２７６６６の５’−上流部をコードするｃＤＮＡ分子を、ヒト赤血球腫瘍白血病細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＨＥＬ）ライブラリーから５’−ＲＡＣＥプロトコールを用いて単離した。また、５’−末端の配列が異なる２種のｃＤＮＡを単離した。５’−ＲＡＣＥ実験からのヌクレオチド配列とＥＳＴクローンＷ２７６６６のそれに一致するヌクレオチド配列を有するＥＳＴとを用いて、ｍＲＮＡ分子の全配列を予測した。予測分子の５’−末端の配列と３’−末端の配列とに一致するプライマーを使用して、２．３ｋｂ長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲプロトコルによって増幅した。増幅したｃＤＮＡはベクターにクローン化してその配列を決定した。得られたｃＤＮＡの大部分は、５２８００．２８Ｄａの予測分子量を有する４６５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている（配列表の配列番号１）。
また、このタンパク質の細胞内での局在を、特異的な抗体で間接免疫蛍光染色することによって可視化したところ、このタンパク質は核中に局在していることが判明した。更に、大きな固まり状の染色が核中に検出された。抗ヌクレオリン抗体による二重染色では、これらの点が核小体と一致していることが示された。ＧＦＰ融合ｍｉｎａ５３タンパク質を細胞に発現したときにも、この融合タンパク質が核ならびに核小体に蓄積されることが観察された。これらの結果は、Ｍｉｎａ５３が核質ならびに核小体に局在している核タンパク質であることを示している。
４６４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードナるｃＤＮＡ（５２６７２．１５Ｄａの予測分子量を有する）もクローン化した。このタンパク質には主タンパク質の２９７Ｑが欠失している。また１０１ｂｐがｍｉｎａ５３ｃＤＮＡの中央部に挿入されたｃＤＮＡも検出された。挿入配列中に停止コドンがあり、このｃＤＮＡはＭｉｎａ５３タンパク質の１−２６２個のアミノ酸と、１８個の新規なアミノ酸とをコードしている。このｍＲＮＡの量は少ないけれども、このｍＲＮＡ分子は、ヒト赤白血病細胞株（ＨＥＬ）、卵巣ムチン様嚢胞腺がん細胞株（ＭＣＡＳ）、ならびに結腸腺がん細胞株（ＷｉＤｒ）から作成したｃＤＮＡライブラリ中に検出された。
Ｍｉｎａ５３がヒト、ラット、マウスに保存されていることについて調べた結果、ｍｉｎａ５３のオルソローガス遺伝子であると思われるマウスｃＤＮＡがＢｌａｓｔサーチ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ：ＮＭ＿０２５９１０）によって見出された。この配列を基にしてＲＴ−ＰＣＲプロトコルによってマウスｍｉｎａ５３ｃＤＮＡを単離した。この配列は（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ：ＮＭ＿０２５９１０）のものとは塩基配列が異なっており、アミノ酸配列も２つ異なっていた（配列表の配列番号２）。また、３００ｂｐ長を有し、マウスとヒトのｍｉｎａ５３の３’−非翻訳領域に相同するラットＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ：Ｈ３２９３３）も見出された。ラットｍｉｎａ５３ｍＲＮＡを増幅すると、予測されたプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲプロトコルによってラットｍｉｎａ５３ｃＤＮＡを単離した（配列表の配列番号３）。ラットならびにマウスｍｉｎａ５３のオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）は４６５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。ラットならびにマウスｍｉｎａ５３タンパク質のアミノ酸配列は８６％が互いに一致していて、ヒトならびにマウスＭｉｎａ５３タンパク質のそれは７２％が一致していて、ヒトとラットＭｉｎａ５３のそれとは７５％一致していた。このことは、ｍｉｎａ５３が哺乳動物に保存されていることを示している。メチオニン開始コドンの３ｂｐ上流のヌクレオチドは、３種全てのｍｉｎａ５３中いおいて“Ａ”であり、コザック・コンセンサス配列に一致している。ラットｍｉｎａ５３遺伝子やマウスｍｉｎａ５３遺伝子も、ヒトｍｉｎａ５３遺伝子と同様に細胞増殖のメカニズム解明に役立ち、がん細胞の診断法などの研究にも有用である。
上記実施例において、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現についてノーザンブロット分析によって調べたｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現状況を図２に示す。
図２Ａは、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現レベルがＴ９８Ｇ細胞中のｃ−ｍｙｃ発現レベルと関連していることを示している。血清飢餓状態のＴ９８Ｇ細胞を最終濃度が１０％になるように血清を添加して刺激した。ＲＮＡを所定の時間に単離し、同量のＲＮＡをノーザンブロット法によって分析してｍｉｎａ５３とｃ−ｍｙｃｍＲＮＡとを検出した（図２Ａの左側の泳動図）。電気泳動した２８Ｓと１８ＳリボソームＲＮＡを電気泳動した図は、加えたＲＮＡがほぼ同じ量であることを示している。検出されたｍＲＮＡを定量しプロットした（図２Ａの右側のグラフ）。これらの結果は、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現が５倍増加したことを示している。この増加は血清添加後６時間して検出できるようになり、１２時間後に最大になった。ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡ発現量は、血清添加後３時間して検出できるようになり、１２時間して最大となった。これらの結果は、ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの発現上昇に引き続き、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現上昇が起こることを示唆している。
図２Ｂは、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ６０において、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現レベルの低下とｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの消滅とが平行的な関係があることを示している。ＨＬ６０細胞をＴＰＡで分化すると、ｃ−ｍｙｃの発現レベルが減少する。この実験系を使用して、Ｍｙｃ標的遺伝子が、血球細胞分化を伴うＭｙｃの発現低下によって影響されるかどうかを調べた。この実験では、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ６０をＴＰＡ１０ｎＭに接触させて所定の時点でＲＮＡを単離し、同量のＲＮＡをノーザンブロット分析によって分析して、ｍｉｎａ５３と、ｃ−ｍｙｃと、ＣＤ１８ｍＲＮＡとを検出した（図２Ｂの左側の泳動図）。更に、それぞれのｍＲＮＡを定量してプロットした（図２Ｂの右側のグラフ）。
その結果、ＨＬ６０細胞をＴＰＡ１０ｎＭで培養後９時間して、分化マーカーＣＤ１８の発現が増加し始めて、誘発発現量が２４時間目に３倍になったことが観察され、この系中で分化が確認された。ＴＰＡ添加３時間後、ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡレベルが低下し始めて、７時間後に５分の１になった。ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの低下に引き続いて、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの低下が連続して起こり、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡレベルが１２時間後に５分の１になった。これらの実験から、ｍｉｎａ５３の発現パターンがｃ−ｍｙｃの発現と因果関係があることが示された。
次に、ｃ−Ｍｙｃ活性化のｍｉｎａ５３に対する効果を調べた。図２Ｃは、ｃ−ＭｙｃＥＲタンパク質を発現するＴ９８Ｇ細胞（Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞）におけるｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの誘発状態を示している。ここでは、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞と親Ｔ９８Ｇ細胞とを０．２５％血清添加培地で４０分間４０時間培養した後、ＯＨＴ２００ｎＭで処理し、ＲＮＡを所定の時間に単離した。図中、符号＋は、ＯＨＴ添加２０分前にシクロヘキシミド（ＣＨＸ）２０，，ｇ／ｍｌを添加したことを示している。同量のＲＮＡをノーザンブロット法による分析によってｍｉｎａ５３ｍＲＮＡが検出された（図２Ｃの左側の泳動図）。検出されたｍＲＮＡを定量しプロットした（図２Ｃの右側のグラフ）。
図２Ｃに示すように、ＯＨＴで処理したＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞中では、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡのレベルは９時間一定して上昇し、誘発発現量がほとんど３倍ほど増加した。これに対して、Ｔ９８Ｇ親細胞をＯＨＴで処理してもｍｉｎａ５３ｍＲＮＡレベルの刺激は上昇しなかった。ＯＨＴによるＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞中でのｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの誘発発現誘導はタンパク質合成インヒビターであるシクロヘキシミドの存在下でも維持された。一方、シクロヘキシミドで処理しても、Ｔ９８Ｇ親細胞に対してはｍｉｎａ５３ｍＲＮＡレベルに対する効果はほとんど無かった。これらの結果は、ｍｉｎａ５３遺伝子がＭｙｃの直接の標的であることを示している。
Ｍｙｃの活性化によるＭｉｎａ５３タンパク質の発現誘導を図３を参照して説明する。図３は、特異的な抗体を使用したＭｉｎａ５３タンパク質のウェスタンブロッテイング分析を示す図である。まず、図３Ａを参照して、Ｍｙｃの活性化によるＭｉｎａ５３タンパク質の発現上昇を説明する。Ｔ９８ＧおよびＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞をＯＨＴ２００ｎＭの存在下もしくは不存在下で２０時間培養した。ヒトＭｉｎａ５３タンパク質に対する特定の特異的な抗体を使用したウェスタンブロッテイングによりＭｉｎａ５３タンパク質を分析した（左側パネル）。ＨＬ６０細胞を、ＴＰＡ１０ｎＭの存在下もしくは不存在下で２０時間培養して、ヒトＭｉｎａ５３タンパク質に対する特異的な抗体と、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体に対する特異的な抗体とを使用したウェスタンブロッテイングによりＴＰＡ１０ｎＭの存在下もしくは不存在下で２０時間培養した（右側パネル）。タンパク質の染色に対するプロファイルも示した（下側パネル）。
かかる特定の特異的抗体を使用したウェスタンブロッテイングによって、アミノ酸配列から予測されたのと同じ移動度を有するバンドをＴ９８Ｇ細胞とＨＬ６０細胞とにおいて検出した（図３Ａ）。Ｍｉｎａ５３のバンド強度は、ｃ−ＭｙｃＥＲがＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞中でＯＨＴによって活性化されたときに増加した。ＨＬ６０細胞をＴＰＡ１０ｎＭの存在下で２０時間培養した後、ｃ−ＭｙｃとＭｉｎａ５３タンパク質との発現は減少した。
図３Ｂに示すように、ヒトｃ−Ｍｙｃと、その活性化ドメイン（ＴＡＤ）の大部分を欠失している変異ｃ−Ｍｙｃをコードする発現ベクターと、空のベクターとをラット３Ｙ１繊維芽細胞中に導入して安定して発現する細胞株を確立した。３Ｙ１ＭｙｃＡと３Ｙ１ＭｙｃＢとは野生型ヒトｃ−Ｍｙｃを保持発現していて、３Ｙ１Ｍｙｃ（ｄＴＡＤ）Ａと３Ｙ１Ｍｙｃ（ｄＴＡＤ）ＢとはＴＡＤ欠失ｃ−Ｍｙｃを保持発現していて、３Ｙ１ベクターは空のベクターを保持している。抗Ｍｉｎａ５３抗体（上側パネル）と抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（中間パネル）とを使用してウェスタンブロッテイングによってタンパク質を分析した。通常の染色法によるタンパク質のプロファイルも示した（下側パネル）。
ＭｙｃによるＭｉｎａ５３の発現制御は、ラット繊維芽細胞株３Ｙ１中で確認された（図３Ｂ）。ヒトｃ−Ｍｙｃを３Ｙ１細胞に安定して導入したとき、Ｍｉｎａ５３の発現は、ｃ−Ｍｙｃ発現を用量依存的に増加した（３Ｙ１、３Ｙ１ベクター、３Ｙ１ＭｙｃＡおよび３Ｙ１ＭｙｃＢに対するレーンを比較）。また、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）が欠失しているｃ−Ｍｙｃ突然変異体を３Ｙ１細胞に導入したＭｙｃ突然変異体においては、野生型ｃ−Ｍｙｃの発現に匹敵するレベルでＭｉｎａ５３を発現したときには（（３Ｙ１ＭｙｃＡと３Ｙ１Ｍｙｃ（ｄＴＡＤ）Ａとを比較）、Ｍｉｎａ５３の発現は増加しなかった。Ｍｙｃ突然変異体が野生型ｃ−Ｍｙｃの発現よりも遥かに高いレベルで発現しても（３Ｙ１ベクター、３Ｙ１ＭｙｃＢおよび３Ｙ１Ｍｙｃ（ｄＴＡＤ）Ｂのレーンを比較）、Ｍｉｎａ５３の発現は増加しなかった。これらの結果から、ｃ−Ｍｙｃがｍｉｎａ５３の発現をｃ−Ｍｙｃの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を使って活性化していることを示している。
図１Ａは、ヒトｍｉｎａ５３遺伝子の構造の概略を示している。図中、ボックスはエクソンを示し、閉鎖部はオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を示し、開放部は５’未翻訳領域と３’未翻訳領域を示す。ヒトｍｉｎａ５３遺伝子は１２個のエクソンから構成されていて、２個の転写開始部位としてエクソン１ａと１ｂが存在する。転写方向は左側から右側であり、転写はエクソン１ａまたはエクソン１ｂから開始する。エクソン１ｂは、エクソン１ａの０．２５ｋｂ下流に存在する。翻訳開始部位はエクソン２に存在する。停止コドン（ＴＡＧ）はエクソン１０に存在する。４６４個のアミノ酸（２９７Ｑを欠失している）をコードするｃＤＮＡはエクソン７の最初の３ｂｐが欠失している。エクソン５とエクソン６との間に存在するエクソン５’は、主ｃＤＮＡの中央部に挿入された１０１ｂｐの配列をコードしている。
ｍｉｎａ５３ｃＤＮＡ配列を含むヒトゲノミックＤＮＡ配列はＨＴＧＳ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ：ＡＣ０２６１００，ＡＣ０７３２４５，ＡＣ０２４８９２）中に見出すことができる。イントロン２（エクソン２とエクソン３との間）の長さはＧｅｎＢａｎｋのデータと異なっていたので、エクソン２とエクソン３中の配列に対応するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲで増幅し、その長さを５．２ｋｂであることを決定した。ＵＣＳＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒのマッピングデータは、ｍｉｎａ５３遺伝子が第３番染色体（３ｑ１２．１）にマップされていることを示している。
図１Ｂは、エクソン１ｂが２個のＥ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧエレメント）を有していることを示している。これら２個のＥ−ボックスの１番目と２番目とをそれぞれＥ−ボックス１とＥ−ボックス２と命名した。
ｍｉｎａ５３遺伝子のプロモータ活性を調べるために、エクソン１ａから上流の領域と、エクソン１ａと、エクソン１ｂと、イントロン１の１部とを含むヒトｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡフラグメントをファイアーフライ・ルシフェレース（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｃＤＮＡに結合して、レポータープラスミド、ｐＭｉｎａ（Ｗ）ｌｕｃｉを構築した（図１Ｂ）。図中、ｐＭｉｎａ（ｄＥ）ｌｕｃｉは２つのＥ−ボックスを持つ部分を欠損させたレポータープラスミドを、ｐＭｉｎａ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉは２個のＥ−ボックスに変異を導入したレポータープラスミドを、ｐＭｉｎａ（ｍＥ１）ｌｕｃｉはＥ−ボックス１に変異を導入したレポータープラスミドを、ｐＭｉｎａ（ｍＥ２）ｌｕｃｉはＥ−ボックス２に変異を導入したレポータープラスミドを示している。
図１Ｃは、Ｔ９８Ｇ細胞中でのトランジエント発現アッセイによって、ＤＮＡフラグメントがプロモータ活性を有していることを示している。
ｃ−ＭｙｃＥＲをＯＨＴによって活性化すると、ルシフェレース活性は３倍まで増加した。この刺激は、ｍｉｎａ５３ｍＲＮＡに対して観察されたものに匹敵している（図２Ｃ）。
ｐＭｉｎａ（Ｗ）ｌｕｃｉから２個のＥ−ボックスを除去したとき、ルシフェレース活性は、ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質（図２Ｃ、ｐＭｉｎａ（Ｗ）ｌｕｃｉのデータ）を活性化しても増加しなかった。その２個のＥ−ボックスをＣＡＣＧＴＧからＣＡＣＣＴＧに変異したｐＭｉｎａ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉからの発現はｃ−Ｍｙｃの活性化によっても増加しなかった。これらの結果は、ｐＭｉｎａ（Ｗ）ｌｕｃｉの発現がＣＡＣＧＴＧエレメントによって刺激Ｅ−ボックスを介して活性化されることを示している。
どちらのＥ−ボックスＣＡＣＧＴＧエレメントが機能的であるかを決定するために、それぞれのＥ−ボックスの配列をＣＡＣＧＴＧからＣＡＣＣＴＧに変異した異なるＣＡＣＧＴＧエレメントを有するレポータープラスミドｐＭｉｎａ（ｍＥ１）ｌｕｃｉとｐＭｉｎａ（ｍＥ２）ｌｕｃｉとをそれぞれ構築した（図１Ｂ）。図１Ｃに示すように、Ｅ−ボックス１の変異による効果はほとんど無かった。他方、Ｅ−ボックス２を変異した場合、ｃ−Ｍｙｃによる刺激は著しく低下した。これらの結果は、ｃ−ＭｙｃがＥ−ボックス２を介して機能していることを示している。
ＨＬ６０細胞が増殖応答している間ｃ−Ｍｙｃタンパク質がインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で内因性ｍｉｎａ５３遺伝子に結合することを調べるために、文献記載の方法によってクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行なった（Ｂｏｙｄ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２５２９−２５３７；Ｂｏｙｄ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１３８８７−１３８９２）。抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で免疫沈降後、各サンプル中の内因性ｍｉｎａ５３遺伝子フラグメントをＰＣＲでモニターし、ｍｉｎａ５３遺伝子中のエクソン１ｂとイントロン１の部分を特異的に増幅した。
図４に示すように、２個の異なる抗ｃ−Ｍｙｃ抗体は、増殖期のＨＬ６０細胞からｍｉｎａ５３遺伝子を免疫沈降したが、ＴＰＡと共に培養すると、ＨＬ６０からはｍｉｎａ５３遺伝子断片が免疫沈降されなかった。また、ｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡフラグメントを精製し検出した場合、非特異的抗体がｍｉｎａ５３ＤＮＡフラグメントを免疫沈降しなかったので、ｍｉｎａ５３遺伝子に結合するｃ−Ｍｙｃに依存していることが確認された。更に、染色体２２中の検出可能な遺伝子がいずれもない染色体領域に位置しているＥ−ボックス近傍のゲノムフラグメントは、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体によって免疫沈降しなかったので、ｍｉｎａ５３遺伝子で検出された結合は特異的であることが確認できた。これらの結果は、増殖期のＨＬ６０細胞中において、ｃ−Ｍｙｃがｍｉｎａ５３遺伝子に特異的に結合していることを示している。
以下、Ｍｉｎａ５３がＨｅＬａ細胞の増殖と、ｃ−Ｍｙｃを著しく発現する３Ｙ１細胞との増殖に関与していることを図５を参照して説明する。
ｍｉｎａ５３の生物学的機能を調べるために、上述したように、ｓｉＲＮＡ二本鎖を使用してＭｉｎａ５３タンパク質の発現を特異的に阻害し、ｓｉＲＮＡを導入して４０時間後Ｍｉｎａ５３タンパク質をモニターした。
図５Ａで示すように、Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現は、ヒト細胞株であるＨｅＬａ細胞中においてヒトｍｉｎａ５３に特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖によって特異的に減少した。これに対して、非特異的なｓｉＲＮＡ、つまり、ｍｉｎａ５３とは逆方向の配列を有する二本鎖（コントロール）と、ラットｍｉｎａ５３に特異的な二本鎖によっては、Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現は減少しなかった。つまり、Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現は、ｃ−Ｍｙｃを著しく発現するラット３Ｙ１細胞（３Ｙ１ＭｙｃＢ）においてはラットｍｉｎａ５３に特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖によって特異的に減少するのに対して、コントロールとしてのｓｉＲＮＡとヒトｍｉｎａ５３に特異的な二本鎖によっては減少しなかった。
図５Ｂに示すように、Ｍｉｎａ５３の発現が減少したときには、細胞増殖は非常に抑制される。つまり、ＨｅＬａ細胞と３Ｙ１ＭｙｃＢ細胞の増殖はヒトならびにラットＭｉｎａ５３それぞれに特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖の導入によってほとんど完全に停止する。
また、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、タンパク質Ｍｉｎａ５３の発現をウェスタンブロッティング分析で調べたところ、白血病細胞株ＨＬ６０を用いたウェスタンブロッテング分析によって、分子質量５３ｋＤａの単一バンドを認識することができることを示した（図６Ａ、レーン１）。また、上記抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いた免疫ブロッテング分析によって、ＴＰＡで細胞を処理しても、５３ｋＤａのバンドのシグナルが減少した（図６Ａ、レーン２）。これに対して、ＴＰＡ処理によってはβ−アクチンの発現は実質的には減少されないという特異性が確認された（図６Ａ、レーン１、２）。
他方、ＨｅＬａ細胞中に発現させたグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に細胞融合させたタンパク質を用いた別の実験においては、この抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体が、内在性タンパク質Ｍｉｎａ５３に加えて、ＨｅＬａ細胞中に発現させたグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に細胞融合させたタンパク質Ｍｉｎａ５３についても単一バンドを発生した。
更に、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗本を用いた免疫ブロッテング分析によって、３種類の増殖期の大腸がん細胞株ＨＴ−２９、ＷｉＤｒおよびＳＷ−６２０を用いて、大腸がん細胞株におけるヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現を調べた結果、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、３種類すべての細胞株において５３ｋＤａの単一バンドを認識した（図６Ａ、レーン３−５）。このことは、これらの細胞株がタンパク質Ｍｉｎａ５３を発現し、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体が、他のタンパク質と交差反応せずに大腸がん細胞中のタンパク質Ｍｉｎａ５３を特異的に認識していることを示している。
一方、これらの細胞株におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現レベルは、ＴＰＡによって実験的に減少させたＨＬ６０細胞中のタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現レベルよりもより一層高かった（図６Ａ、レーン２−５）。他方、上記３種類の大腸がん細胞株におけるアクチンレベルは、ＴＰＡ処理したＨＬ６０細胞のアクチンレベルよりも高くはなかった。これらの結果は、上記３種類の大腸がん細胞株が最終的に分化したＨＬ６０細胞よりも比較的高いレベルのタンパク質Ｍｉｎａ５３を含んでいることを示唆している。
その上、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体と抗ヌクレオリンラビット抗体とを用いた二重細胞免疫蛍光染色法によって、大腸がん細胞内におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の局在状態を調べたところ、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、細胞ＳＷ−６２０内の核を特異的に染色するとともに、その核質内の核小体に、ヌクレオリンに対するシグナルと重複する強力な点状の染色を示した。その他の２種類の細胞株も同一の免疫蛍光染色パターンを示した。これらの結果から、タンパク質Ｍｉｎａ５３は、本発明者らがＨｅＬａ細胞についてすでに示したように（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ）、核小体に凝縮した状態で核内に局在していることを示している。
（大腸がん組織内におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現）
この発明の抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を使用して、大腸がん組織内のタンパク質Ｍｉｎａ５３を検出するとともに、ＨＥ染色法を使ってがん領域を識別した。図７Ａに示す切片には中程度に分化した大腸がん細胞が含まれていた。図７Ｂに示すように、がん領域内のタンパク質Ｍｉｎａ５３は顕著に染色されているのに対し、腫瘍周辺の非腫瘍上皮細胞はほとんど染色されていなかった。染色は、主に核内に見出され（図７ＥおよびＦ）、さらに大腸がん細胞株において得られた結果（図７Ｂ）と同様のパターンを示す点状の染色（おそらく核小体）が見出された。該抗体を使用せずに切片を培養したとき（図７Ｄ）または過剰量の組換えタンパク質Ｍｉｎａ５３の存在下で培養したときには、この核内の染色は認められなかった。がん組織の切片のいくつかでは、がん細胞が主ながん領域から離れて局在する上皮細胞の直下のリンパ管内に見出された。この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、これらのがん細胞を顕著に染色したのに対して、その周囲の非がん細胞をわずかに染色しただけであった（図８Ａ）。また、大腸の深層にあるリンパ腺中に浸入した細胞も、タンパク質Ｍｉｎａ５３に対して強い免疫反応を示していたのに対して、その周囲の非腫瘍性細胞は染色されていなかった（図８Ｂ）。更に、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、深部に侵入した腫瘍を染色するとともに（図８Ｃ）、繊維間質内のほとんど分化していない腫瘍細胞を識別しているのに対して（図８Ｃ）、これら腫瘍細胞周囲の非腫瘍細性胞を染色しなかった。これらの結果は、浸潤したりまたは転移した腫瘍中にもタンパク質Ｍｉｎａ５３が高発現されていていることを示している。
（大腸がんの組織病理学的等級におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現）
大腸腺がん患者と、腺腫患者からの標品中にタンパク質Ｍｉｎａ５３を免疫組織化学的染色法によって検出した。その概要は表１に示している。表１に示すように、タンパク質Ｍｉｎａ５３は、大腸がんのすべての組織病理学的等級において発現しており、つまり、十分に分化した腫瘍（図９Ａ）、中程度に分化した腫瘍（図７Ｂ）およびあまり分化していない腫瘍（図２Ｆ）のいずれにおいても顕著に染色されていた。また、それらの平均染色インデックスはそれぞれ２．２８、１．７８および１．８５であった（表１）。これらの結果は、十分に分化した腫瘍は中程度に分化した腫瘍やあまり分化していない腫瘍に比べてより高い染色強度を示す傾向がわずかにあるけれども、腫瘍の病理学的等級と染色強度との間には因果関係がないことを示唆している。更に、タンパク質Ｍｉｎａ５３は腺腫において高発現されることから（図９Ｃ）、タンパク質Ｍｉｎａ５３の発現上昇は、大腸がん発生の一般的かつ比較的初期の事象であることを示唆している。その上、染色はすべての場合において核に限られている（図７Ｅおよび図７Ｆ）。
要約すると、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を使用して大腸がん細胞株と大腸がん組織中におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３の発現を調べたところ、調べた３種類の大腸がん細胞株でＭｉｎａ５３の顕著な発現が認められ、また、調べたほとんどすべての大腸がん組織においてＭｉｎａ５３の発現上昇が認められた。また、タンパク質Ｍｉｎａ５３は、いずれの組織病理学的等級の大腸がん、つまり、十分に分化した等級、中程度に分化した等級ならびにあまり分化していない等級の腫瘍において発現したのに対して、ほとんどの非がん細胞においてはＭｉｎａ５３に対する染色はほとんどもしくは全く認められなかった。更に、がん細胞におけるＭｉｎａ５３発現の上昇は、がん細胞の場所に無関係に観察された。換言すれば、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、リンパ管侵入ならびに隔離腫瘍細胞において、タンパク質Ｍｉｎａ５３に対して著しい染色が観察された。
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（がん組織中におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３とＫｉ−６７との間の染色パターンの比較）
連続切片を抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体（ＭＩＢ１）を用いて染色して、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体での染色パターンと比較した。すでに報告されているように（Ｃａｔｔｏｒｅｔｔｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９２，１６８：３５７−５６３；Ｊａｎｓｓｏｎ，Ａ，Ｓｕｎ，Ｘ．Ｆ．：ＡＰＭＩＳ１９９７，１０５：７３０−７３４；Ｓａａｒｎｉｏ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８，１５３：２７９−２８５）、抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体と抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体とは大腸がん細胞を強力に染色した（図７Ｃ、９Ｂ）。ほとんどの場合において、Ｋｉ−６７とＭｉｎａ５３に対する抗体は、図７Ｂ、図８Ｃ、図９Ａならびに図９Ｂおよび表１と同様に、がん細胞を染色した。
顕微鏡視野内における染色細胞の割合をＫｉ−６７とＭｉｎａ５３について調べたところ、両者に対する抗体の間には違いが見出され、大部分の場合においては、Ｍｉｎａ５３を発現している細胞の割合は、Ｋｉ−６７を発現している細胞の割合よりも多かった（図９Ａ、Ｂ）。これに対して、２、３の場合においては、Ｍｉｎａ５３を発現している細胞の割合がＫｉ−６７を発現している細胞の割合と同様であった（表１）。
なお、一つの場合（患者番号３）においては、調べた切片は３種類の異なる形のがんを含んでいたので、複雑な染色パターンが得られた。あまり分化していない上皮がん細胞とムチン様腺がん細胞を有する２つの領域では、タンパク質Ｍｉｎａ５３とＫｉ−６７との両者に対して陽性の細胞の割合は同様に高かった（表１）。これに対して、第３の領域においては、腫瘍は、膵臓の小葉がんに類似した形態学的構造を有していて、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体によってはほんのわずかしか染色されなかったのに対して、抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体によっては強力に染色された。しかしながら、陽性の細胞の割合は上記２つの領域と比較して低かった（表１）。腺腫の場合には、形成異常の領域内のほとんどすべての細胞は抗Ｍｉｎａ５３抗体によって強く染色されているのに対して、抗Ｋｉ−６７抗体によっては抗Ｍｉｎａ５３抗体の場合程高率には細胞が染色されてなかった（図９Ｃ、Ｄ）。わずかな例外があるけれども、これらの結果は、Ｍｉｎａ５３を発現する細胞の割合がＫｉ−６７を発現する細胞の割合よりも特徴的に高いことを示唆している。
（非腫瘍大腸組織におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３とＫｉ−６７との間の染色パターンの比較）
非腫瘍大腸組織のある領域においては、Ｋｉ−６７に対する抗体は細胞を強力に染色していたのに対して、Ｍｉｎａ５３に対する抗体はそれらの細胞を非常に弱くしか染色していなかった。抗Ｋｉ−６７抗体による染色は、活発に増殖をしていると思われる腺窩の下部３分の１の部分に存在する細胞の核内において観察された（図９Ｆ）。また、非腫瘍大腸組織の腺窩における染色強度は、がん領域において見出された細胞とは実質的には異なっていなかった（図９Ｂ、Ｆ）。他方、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、これらの細胞の核をわずかにしか染色せず、その染色強度はがん領域中に見出された細胞よりも一層弱いものであった（図９Ａ、Ｅ）。更に、高い有糸分裂活性を有する細胞を含むリンパ瀘胞の胚中心は、Ｋｉ−６７に対する抗体によって強力に染色されたけれども、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体によっては非常に弱くしか染色されなかった（図９Ｇ、Ｈ）。
上記の結果から、細胞増殖マーカーとして繁用されているＫｉ−６７に比較して、がん細胞は、タンパク質Ｍｉｎａ５３をより高い割合で発現することが確認された。Ｋｉ−６７に対する抗体は、下部腺窩ならびにリンパ瀘胞の胚中心の細胞を含む、がん細胞ならびにある種の十分に増殖している正常細胞を強力に染色した。他方、Ｍｉｎａ５３に対する抗体はこれらの非腫瘍領域中の細胞を稀にしか染色しなかった。
これらの結果は、Ｍｉｎａ５３の高発現を大腸がんの典型的な特長と見なすことができることを示している。したがって、Ｍｉｎａ５３の発現は大腸がんに対するマーカーとして使用することができるとともに、正常組織に浸潤したがん細胞を見出すのにも有用であると考えられる。それに加えて、タンパク質Ｍｉｎａ５３に対する染色は予後のマーカーとしても有用であると考えられる。
６０％以上の大腸がんにおいて、がん発生の初期から、ＡＰＣ遺伝子内での体性突然変異が見出される（Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９９２，１：２２９−２３３；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，３５９：２３５−２３７）。また、βカテニンの突然変異は、ＡＰＣ突然変異が欠如している大腸腫瘍中に見出されている（Ｍｏｒｉｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７，２７５：１７８７−１７９０；Ｓｐａｒｋｓ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８，５８：１１３０−１１３４）。ＡＰＣタンパク質の主要な機能は、グリコーゲンシンテーゼキナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）とアクシンタンパク質と連携した遊離βカテニン量の調節であると考えられている（Ｈｉｎｏｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００，２７５：３４３９９−３４４０６）。ＡＰＣの機能損失、アクシンの不活性化（Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８０：５９６−５９９）またはβカテニンを活性化する突然変異（Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．：Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １９９９，９：１５−２１）は、βカテニンの細胞内蓄積をもたらすことになり、核に転位したときには、幾種類かの特異的な標的遺伝子の発現を増加することになるＴ細胞因子（Ｔｃｆ）依存転写のアクティベーターとして有用である（Ｒｏｏｓｅ，Ｊ．，Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．：ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ  １９９９，１４２４：Ｍ２３−Ｍ３７）。
最近、ＡＰＣ経路の標的としてのｃ−ｍｙｃが同定され、ｃ−ｍｙｃがＡＰＣ遺伝子の機能損失によってまたはβカテニンの過剰発現によって惹起されることが示された（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：ｉｂｉｄ）。したがって、ＡＰＣもしくはアクシンの不活性化による突然変異またはβカテニンの活性化による突然変異は、ｃ−ｍｙｃの過剰発現を導くことになり、その結果Ｍｉｎａ５３の発現が高くなるものと考えられる。したがって、Ｍｉｎａ５３は、大腸がん発生に関係しているＡＰＣ／βカテニン経路の下流の間接標的であると思われる。
これらの結果は、Ｍｉｎａ５３の高発現が大腸がんの典型的な特長と見なすことができることを示している。したがって、Ｍｉｎａ５３の発現は、大腸がんに対するマーカーとして使用することができるとともに、正常組織に浸潤したがん細胞を見出すのに有用であると考えられる。それに加えて、Ｍｉｎａ５３の染色は予後のマーカーとしても有用であると考えられる。
その上、タンパク質Ｍｉｎａ５３の発現パターンを、細胞増殖のバイオマーカーとして広く使用されているＫｉ−６７の発現パターンと比較すると、ほとんどのがん組織において、Ｍｉｎａ５３を発現している細胞の割合が、Ｋｉ−６７を発現している細胞の割合よりも特長的に高いことが判明した（表１）。このことは、遺伝子Ｍｉｎａ５３がＭｙｃ標的遺伝子であるという事実に基づいていると思われる。ｃ−ｍｙｃは、増殖細胞の細胞サイクルのいずれの相中においても連続的に発現している（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．：ＥＭＢＯ  Ｊ  １９８５，４：２００９−２０１５；Ｗａｉｔｚ，Ｗ．，Ｌｏｉｄｌ，Ｐ．：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９１，６：２９−３５）。これに対して、Ｋｉ−６７は、後期Ｇ１相、Ｓ相、Ｍ相およびＧ２相の増殖中の細胞内で優先的に発現している（Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９８３，３１：１３−２０；Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８４，１３３：１７１０−１７１５）。Ｍｉｎａ５３は、ｃ−ｍｙｃによって生起されるので、Ｍｉｎａ５３ががん組織中においてＫｉ−６７よりもより広範に発現されていることは理屈に適っている。
十分に生育した腺窩における細胞は、Ｋｉ−６７に対する抗体によって強く染色されたのに対して、タンパク質Ｍｉｎａ５３に対する抗体によっては弱くしか染色されなかった。また、非腫瘍性であるが増殖している細胞を含むリンパ瀘胞の胚中心内の細胞は、抗Ｍｉｎａ５３抗体によって弱くしか染色されないが、抗Ｋｉ−６７抗体によって強く染色された。本発明者らは、ｃ−ｍｙｃが高度に発現している２種類の培養した細胞株、つまりヒト子宮頚がんＨｅＬａ細胞ならびにラット線維芽細胞における細胞増殖のためＭｉｎａ５３が重要な因子であることをすでに示している（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：ｉｂｉｄ）。従って、タンパク質Ｍｉｎａ５３は、いくつかの限られたタイプの細胞においてだけ細胞増殖のために重要な役割を果たしているのかもしれない。あるいは、腺窩ならびにリンパ瀘胞の胚中心の正常細胞は、より少ない量のＭｉｎａ５３で増殖するかまたはタンパク質Ｍｉｎａ５３と同様の機能を有する別のタンパク質を発現している可能性がある。いずれの場合でも、がんでない細胞に比べてがん細胞が抗Ｍｉｎａ５３抗体によって強力に染色されるので、Ｍｉｎａ５３はがん発生との関係を有していると考えられる。
更に、食道がん組織を、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体によって染色して得られた染色インデックスを、ヒト食道がんを染色するために現在使用されている抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体によって染色して得られた染色インデックスと比較したところ、その染色程度には相関が見られたけれども、明らかな違いが認められた。つまり、図１３に示すように、抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体による染色程度が高いものでは、ほとんど抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体の染色程度が高かった。これに対して、抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体による染色程度がほとんど見られないものでも、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体の染色程度が高いものがあった。このことは、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体が抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体よりも食道がん組織をよく染色することを示している。
次に、食道がんの手術後の生存月数とＭｉｎａ５３の染色インデックスとＫｉ−６７の染色インデックスとの間に相関関係が見られるかを、生存月数が確認できる３３例について調べたところ、図１２に示すように、生存月数とＭｉｎａ５３の染色インデックスの間には明らかな相関関係が認められた（ｐ＜０．０１１）。これに対して、Ｋｉ−６７ではそのような相関関係は認められなかった。
そこで、食道がん患者をＭｉｎａ５３発現が高いグループと低いグループの２つに分け、それぞれのグループをカプラン−マイヤー法により解析したところ、図１２（Ａ）の結果に示すように、２つのグループでは累積生存率に明らかな相違が認められた。これに対して、Ｋｉ−６７についても同様の解析を行ったところ、図１２（Ｂ）に示すように、Ｍｉｎａ５３のようなハッキリとした違いは認められなかった。そこで、食道がん患者の手術後の生存月数とＭｉｎａ５３の染色インデックスあるいはＫｉ−６７の染色インデックスとの関係を表２に示す。
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上記の結果から、Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体による染色程度は食道がんの悪性度と関係することが示唆しているものと考えられる。
また、タンパク質Ｍｉｎａ５３のアミノ酸配列の１２８から２７１の領域にＪｍｊＣドメインという部分がある（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：ｉｂｉｄ）。このドメインは、多くの遺伝子の間での配列の類似性に基づいて最近同定されたものであり、ＪｍｊＣドメインを持つ蛋白質はほとんどの場合ＤＮＡ結合もしくはクロマチン結合ドメインを持っている（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，Ｐｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．：Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２００１，２６：７−９）。このＪｍｊＣドメインは、クピンフォールド（ｃｕｐｉｎ  ｆｏｌｄ）を採用しているものと予測され、クロマチン再構築を規制する金属酵素の候補である（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ，Ｐ．Ｍ．，Ｐｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．：ｉｂｉｄ）。各腫瘍は、そのいずれもが腫瘍を進行させる一連の遺伝子的ならびに遺伝子配列の変化を伴わない変化による独立したプロセスの結果である（Ｆｅａｒｎｈｅａｄ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ  ２００２，６４：２７−４３）。遺伝子配列の変化を伴わない変化の一つであるクロマチン再構築は、遺伝子の発現に影響を及ぼし、がん発生の一因となりうる。Ｍｉｎａ５３が核内に局在していることは、タンパク質Ｍｉｎａ５３がクロマチン再構築により腫瘍の進行に関わっている可能性を支持しているように思われる。しかしながら、このことを明らかにするには、クロマチン再構築がＭｉｎａ５３の真の機能であるかどうかを決定する必要がある。
がん遺伝子が活性化することが発がんと関連していることはあきらかであるから、かかるがん遺伝子の不活性化を目標としたヒトのがんに対する処置についての薬理学的戦略も重要となってくる。かかる戦略に基づいてがん遺伝子を不活性にするように設計された医薬品が開発されがんの処置も一段と発展することが期待される。しかしながら、かかる医薬品を長期間使用すると、その医薬品はまた正常細胞に対しても致命的なシグナル経路を切断することになり、重篤な毒性を及ぼすことも考えられる（Ｊａｉｎ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９７：１０２−１０４）。また、最近の研究によって、ｍｙｃファミリーのがん遺伝子は、細胞生育の中心的な調節因子と考えられ、それらのがん遺伝子が臓器発達ならびに再生を含む正常な生物学的プロセスにおいても決定的に必要であることが明らかにされてきている（Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ，Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｂ．：Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６：１０９−１８２；Ｇｒａｎｄｏｒｉ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．：Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２０００，１６：６５３−６９９；Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｂ．：Ｇｅｎｅ  ２００１，２７７：１−１４；Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９２，６：２２３５−２２４７；Ｓａｗａｉ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９３，１１７：１４４５−１４５５）。上述したように、ｃ−ｍｙｃは様々な遺伝子の発現を調節し、特異的なＭｙｃ標的遺伝子はＭｙｃのそれぞれの機能において実質的な役割を果たしているものと考えられる。
産業上の利用可能性
この発明によって同定したｃ−Ｍｙｃによって調節される新規ながん関連遺伝子ｍｉｎａ５３は、がん遺伝子ｍｙｃによって直接発現調節されていること、核に存在する分子量５万３千のタンパク質Ｍｉｎａ５３をコードしていること、細胞増殖に関連していること、がん組織において特異的に発現が上昇していること、などによってがん関連分野において種々の応用が可能である。つまり、この発明に係る新規な遺伝子ｍｉｎａ５３は、がん細胞において特異的に発現が上昇することからがんの診断に応用が可能である。また、がん細胞の増殖抑制がＭｉｎａ５３タンパク質の発現を抑制することにより観察されることから、遺伝子治療などによりｍｉｎａ５３遺伝子の発現を抑制したり、またはＭｉｎａ５３活性を特異的に抑制することができる新薬の開発にも応用できることになる。
また、この発明に係るｍｉｎａ５３遺伝子ならびにその産物は、がん細胞などの正常でない細胞の診断およびかかる細胞の増殖を制御することも可能である。
更に、この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体によって、ヒト大腸がん細胞においてタンパク質Ｍｉｎａ５３が高発現していること、またヒト大腸がん組織においては正常上皮に比べて原発のがん組織や筋層やリンパ管に侵入していたがん細胞でタンパク質Ｍｉｎａ５３が高発現していることを確認することができる。Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現は、細胞増殖マーカーとして繁用されているＫｉ−６７タンパク質の発現と良く似ていて、細胞増殖マーカーとして有効に利用することができるが、がん細胞におけるＭｉｎａ５３タンパク質発現に対する陽性細胞の比率はＫｉ−６７タンパク質のものに比べて高いことが確認された。更に、大腸正常上皮の細胞分裂が盛んな領域では、Ｋｉ−６７の強い発現が見られたのに対し、Ｍｉｎａ５３の発現は高くはなかった。その上、リンパ瀘抱の胚中心（正常組織）に強いＫｉ−６７発現が見られたが、Ｍｉｎａ５３発現は高くなかった。これらのことから、Ｍｉｎａ５３タンパク質はＫｉ−６７よりもがん特異性が高いと思われる。
これらの結果から、Ｍｉｎａ５３の発現が大腸がんの初期事象であるとともに、Ｍｉｎａ５３の高発現を大腸がんの典型的な特長と見なすことができることが示されているので、Ｍｉｎａ５３の発現を大腸がんに対するマーカーとして利用することができる。また、Ｍｉｎａ５３の発現を正常組織に浸潤したがん細胞を検出するのにも利用することができるものと考えられる。更に、Ｍｉｎａ５３が染色できることは予後のマーカーとしても有用であると考えられる。
同様に、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、食道がん細胞を、現在ヒト食道がん細胞の染色に使用されている抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体よりもよく染色することを確認した。さらに、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体による食道がん細胞の染色具合によって食道がんの悪性度を診断することも可能である。
この発明に係る抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体は、大腸がん、食道がん、舌がん、乳がん、肉腫、脳腫瘍などのがん細胞を良く染色することができることから、Ｍｉｎａ５３を各種がんの診断に利用することも可能である。一方、Ｍｉｎａ５３タンパク質の発現を抑制すると、細胞増殖を強く抑制することができることから、Ｍｉｎａ５３活性を抑えることによってがん治療への応用も可能である。
一方、Ｍｉｎａ５３タンパク質やＭｉｎａ５３をコードするｍＲＮＡを組織中で検出し、がん細胞などの正常でない細胞を検出して診断に利用することができる。このような場合には、特異的抗体、例えば、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などのＭｉｎａ５３タンパク質に結合する物質や、ｍｉｎａ５３遺伝子を含む配列を有するＲＮＡ、ＤＮＡなどを利用することもできる。
また、この発明においては、組織片に含まれるＭｉｎａ５３の発現量を、例えば、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などのＭｉｎａ５３タンパク質に結合する物質を利用して、ＥＬＩＳＡ法、ウェスターンブロット法もしくは関連手法によって測定することにより、細胞の状態を測定することもできる。更に、ｍｉｎａ５３遺伝子を含む配列を有するＲＮＡ、ＤＮＡなどを利用しても、ノーザンブロッテイング法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｃＤＮＡマイクロアレイ法などの各種測定法によって細胞の状態を診断することもできる。この発明においてはまた血中、尿中などのＭｉｎａ５３タンパク質の量を測定することによってもがん細胞を診断することが可能である。
更に、Ｍｉｎａ５３タンパク質に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などの抗体を利用することにより、当該技術分野において慣用されているＥＬＩＳＡ法などの手法により体内に存在するがん細胞などの正常状態にない細胞の存在の有無やその量を推定もしくは測定して診断をすることも可能である。
その上、この発明では、がん細胞などの正常状態にない細胞の増殖を制御することも可能である。Ｍｉｎａ５３活性を抑制するためには、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）法、アンチセンス核酸法、プロモーターの相同配列の核酸導入法、プロモーターのデコイ法、リボザイム法などを利用することができるとともに、Ｍｉｎａ５３に結合する物資（例えば、抗体などのタンパク質やより低分子の化合物など）も利用することができる。また、Ｍｉｎａ５３のタンパク質や核酸配列に利用しうる物質、例えば、特異的抗体やｍｉｎａ５３発現を抑制するｓｉＲＮＡなどや、上記物質を選択するためのスクリーニングなどの方法も利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、この発明に係るヒトｍｉｎａ５３遺伝子の構造を示す図である。図１Ａはヒトｍｉｎａ５３遺伝子のゲノミック構成を示す図であり、図１Ｂはレポータープラスミドを示す図であり、図１ＣはＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞を使用したトランジエント発現アッセイの結果を示す図である。
図２はｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現レベルを示す図である。図２Ａはｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現レベルがＴ９８Ｇ細胞中のｃ−ｍｙｃ発現レベルと関連していることを示す図であり、図２Ｂはヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞におけるｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現レベルの低下とｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの消滅との関係を示す図であり、図２ＣはＭｙｃＥＲタンパク質を発現するＴ９８Ｇ細胞（Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞）におけるｍｉｎａ５３ｍＲＮＡの発現誘導を示す図である。
図３はＭｉｎａ５３のウエスタンブロッテイング分析結果を示す図である。図３Ａ左はＭｙｃの活性化によるＭｉｎａ５３タンパク質の発現上昇を説明する図であり、図３Ａ右はＴＰＡによりＭｙｃ発現を減少させたときのｃ−Ｍｙｃタンパク質およびＭｉｎａ５３タンパク質の発現減少を説明する図であり、図３Ｂはラット細胞にヒトｃ−Ｍｙｃあるいは遺伝子発現上昇能を失った変異体ｃ−Ｍｙｃを発現させたときのＭｉｎａ５３タンパク質の発現変化（Ｍｙｃによる発現上昇）を示す図である。
図４はＨＬ６０細胞を使用したクロマチン免疫沈降実験結果を示す図である。
図５はＲＮＡ干渉によるＭｉｎａ５３タンパク質発現の減少とその細胞増殖に及ぼす効果を示す図である。図５ＡはＲＮＡ干渉によるＭｉｎａ５３タンパク質発現の減少を示す図であり、図５ＢはＲＮＡ干渉によりＭｉｎａ５３タンパク質発現が減少した細胞の細胞増殖を示す図である。図中、黒丸印はヒトｍｉｎａ５３に特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖を導入した細胞の様子を示す。黒三角印はラットｍｉｎａ５３に特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖を導入した細胞の様子を示す。白丸印はコントロールｓｉＲＮＡ二本鎖を導入した細胞の様子を示す。
図６Ａは、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体を用いたタンパク質Ｍｉｎａ５３のウエスタンブロツテイング分析結果を示す図であり、図６Ｂは細胞内局在の状態を示す図である。
図７は、大腸がん組織におけるタンパク質Ｍｉｎａ５３とＫｉ−６７との免疫組織化学的染色血かを示す図である。図７Ａは中分化腫瘍を含む切片のＨＥ染色を示す図である。図７Ｂは、図７Ａでの連続切片を示す図であり、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体によって染色することにより、がん領域におけるＭｉｎａ５３の発現上昇を示している。また、隣接非腫瘍組織はほとんど染色されなかったことを示している。図７Ｃは抗Ｋｉ−６７抗体によって染色した図７Ａでの連続切片を示す図である。図７Ｄは一次抗体を使用していない図７Ａにおけるコントロールとしての切片を示す図である。図７ＥはＭｉｎａ５３の特徴的核局在を示している図７Ｂに示す切片の拡大図である。図７Ｆは抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体による低分化腫瘍の染色を示す図である。図中、スケールは、３００μｍ（図７Ａ−Ｄ）、５０μｍ（図７Ｅ）および７５μｍ（図７Ｆ）である。
図８は、浸潤および転移している腫瘍におけるＭｉｎａ５３の免疫組織化学的発現を示す図である。図８Ａは、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体によって染色した上皮下のリンパ管に侵入したがん細胞を示している。図８Ｂは、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体で染色した大腸深層にあるリンパ管中のがん細胞を示している。図８Ｃは深部に浸潤している腫瘍細胞を染色した図である。図８Ｄは、抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体によって染色した繊維性基質中の腫瘍細胞を示している。スケールは、７５μｍ（図８Ａおよび図８Ｄ）、１５０μｍ（図８Ｂ）、３００μｍ（図８Ｃ）である。
図９は、がん性、腺腫様ならびに非腫瘍性大腸組織の連続切片を抗Ｍｉｎａ５３モノクローナル抗体（左側）と抗Ｋｉ−６７クローナル抗体（右側）で染色した場合の染色パターンの比較を示す図である。図９Ａは、高分化腫瘍におけるＭｉｎａ５３の染色をＫｉ−６７の染色（図９Ｂ）と比較した図を示す。図９Ｃは、腺腫におけるＭｉｎａ５３の染色を、Ｋｉ−６７を染色した図９Ｄと比較した図を示す。図９Ｅは、正常腺窩における上皮細胞のＭｉｎａ５３に対する染色を、Ｋｉ−６７を染色した図９Ｆと比較した図を示す。図９Ｇは、リンパ瀘胞の胚中心におけるＭｉｎａ５３の染色を、Ｋｉ−６７を染色した図９Ｈと比較した図を示す。スケールは、７５μｍ（図９Ａ−Ｆ）と、１５０μｍ（図９Ｇと図９Ｈ）である。
図１０は、リコンビナントタンパク質Ｍｉｎａ５３の定量線を示すグラフである。
図１１は、ヒト血液中のタンパク質Ｍｉｎａ５３の定量を示すグラフである。
図１２は、Ｍｉｎａ５３またはＫｉ−６７の発現と累積生存率を示すグラフである。（Ａ）はＭｉｎａ５３の発現と累積生存率との関係を示し、（Ｂ）はＫｉ−６７の発現と累積生存率との関係を示す。
図１３は、食道がん組織に対するＭｉｎａ５３とＫｉ−６７との発現度合いの比較を示すプロット図である。
【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月11日(2005.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が１０個のエクソンから構成され、最上流側にエクソン１が転写開始部位として存在し、エクソン２に翻訳開始部位が存在し、最後のエクソン１０に停止コドンが存在することを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項２】  前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が配列番号１で示される塩基配列を有するヒトがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３である、請求の範囲第１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項３】  配列番号２で示される塩基配列を有するマウスがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３、または配列番号３で示される塩基配列を有するラットがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３であることを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項４】  前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が分子量５３ｋＤａを有するタンパク質をコードしている、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項５】  前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３が、該遺伝子の発現を調節する転写因子であるＭｙｃタンパク質が結合する塩基配列を持っている、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項６】  前記タンパク質が核小体に局在している、請求の範囲第４項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項７】  前記がん関連遺伝子ｍｉｎａ５３の発現がｃ−ｍｙｃ遺伝子によって誘発されることを特徴とする、請求の範囲第５項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【請求項８】  配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する、細胞増殖作用を有するヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３。
【請求項９】  配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、細胞増殖作用を有するマウスタンパク質Ｍｉｎａ５３。
【請求項１０】  配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する、細胞増殖作用を有するラットタンパク質Ｍｉｎａ５３。
【請求項１１】  請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載のがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３を含有していることを特徴とするベクター。
【請求項１２】  請求の範囲第８項に記載のヒトタンパク質Ｍｉｎａ５３をコードしていることを特徴とするベクター。
【請求項１３】  請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３の特定部位を含むヒトｍｉｎａ５３ゲノミックＤＮＡフラグメントが、機能可能にルシフェレースｃＤＮＡに結合していることを特徴とするレポータープラスミド。
【請求項１４】  請求の範囲第１１項または第１２項に記載するベクターを含有する形質転換体。
【請求項１５】  請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３もしくはそのフラグメントを用いてＭｉｎａ５３発現調節をするための核酸であることを特徴とするＭｉｎａ５３発現調節のための核酸。
【請求項１６】  タンパク質Ｍｉｎａ５３に対する抗体。
【請求項１７】  モノクローナル抗体である請求の範囲第１６項に記載の抗体。
【請求項１８】  請求の範囲第１７項に記載するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１９】  ハイブリドーマがＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９８である請求の範囲第１８項に記載するハイブリドーマ。
【請求項２０】  請求の範囲第１７項に記載するモノクローナル抗体を用いてタンパク質Ｍｉｎａ５３をがん細胞またはがん組織中に検出することを特徴とするタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法。
【請求項２１】  前記がんが大腸がんまたは食道がんである、請求の範囲第２０項に記載するタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法。
【請求項２２】  請求の範囲第２０項に記載するタンパク質Ｍｉｎａ５３の検出方法によってがんを診断することを特徴とするがんの診断方法。
【請求項２３】  前記がんが大腸がんまたは食道がんである、請求の範囲第２２項に記載するがんの診断方法。
【請求項２４】  がんの予後を診断することを特徴とする、請求の範囲第２２項または第２３項に記載する診断方法。
【請求項２５】  請求の範囲第１項に記載するがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３において、エクソン５とエクソン６との間にエクソン５’が存在することを特徴とするがん関連遺伝子ｍｉｎａ５３。
【国際調査報告】
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