(57)【要約】重篤な副作用を惹起することなくアレルギー疾患に伴う諸症状を効果的に緩和する抗アレルギー剤を提供することを課題とし、有効成分として、ローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーから採取される蛋白質、又はそれらを含有するローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーを含んでなる抗アレルギー剤を提供することにより解決する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、配列表における番号番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は、抗アレルギー作用を実質的に失わない範囲で、配列表における番号番号３で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基が１個又は２個以上が欠失、置換、挿入、付加された蛋白質を含んでなる抗アレルギー剤。
【請求項２】
有効成分として、配列表における番号番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は、抗アレルギー作用を実質的に失わない範囲で、配列表における番号番号４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基が１個又は２個以上が欠失、置換、挿入、付加された蛋白質を含んでなる抗アレルギー剤。
【請求項３】
ローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーを含んでなる抗アレルギー剤。
【請求項４】
請求の範囲第３項に記載の精製ローヤルゼリーが、ローヤルゼリー水溶性蛋白質画分であることを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項５】
２ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度の試料を用いた本明細書記載のサイトカイン産生抑制試験において、蛋白質無添加の場合に対し、インターロイキン２の相対産生量を８０％以下、又は、インターロイキン４の相対産生量を６０％以下まで低下させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の抗アレルギー剤。
【請求項６】
配列表における番号番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は、抗アレルギー作用を実質的に失わない範囲で、配列表における番号番号３で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基が１個又は２個以上が欠失、置換、挿入、付加された蛋白質を含んでなる組成物を用いることを特徴とするアレルギー抑制方法。
【請求項７】
配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は、抗アレルギー作用を実質的に失わない範囲で、配列表における番号番号４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基が１個又は２個以上が欠失、置換、挿入、付加された蛋白質を含んでなる組成物を用いることを特徴とするアレルギー抑制方法。
【請求項８】
請求の範囲第６項又は第７項に記載の組成物が、ローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーであることを特徴とするアレルギー抑制方法。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載の精製ローヤルゼリーが、ローヤルゼリーの水溶性蛋白質画分であることを特徴とするアレルギー抑制方法。
【請求項１０】
有効成分としての請求の範囲第６項又は第７項に記載の蛋白質を、１日あたり０．０１ｍｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重で摂取又は投与することを特徴とする請求の範囲第６項、第７項、第８項又は第９項に記載のアレルギー抑制方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項に記載の抗アレルギー剤を含んでなる飲食物。
【請求項１２】
請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項に記載の抗アレルギー剤を含んでなる化粧品。
【請求項１３】
請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項に記載の抗アレルギー剤を含んでなる医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗アレルギー剤に関するものであり、より詳細には、有効成分として、ローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーから採取される蛋白質、又は、それら蛋白質を含有するローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーを含んでなる抗アレルギー剤に関するものである。
【背景技術】  近年、食生活などの変化に伴って、アレルギー性疾患の罹患者が増加しており、とりわけ、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、接触過敏症などアトピー性疾患の罹患者の増加が問題となっている。従来、アレルギー疾患の治療においては、抗ヒスタミン剤やステロイド剤などの薬剤が対症療法的に投与されているけれども、これらの薬剤は長期連用による副作用が大きいという問題があった。このような状況に鑑み、アレルギー疾患における諸症状を効果的に緩和することができ、かつ、日常生活に支障をきたすことなく、長期連用し得る治療手段が望まれていた。
一方、最近、ローヤルゼリーに様々な生理活性のあることが認められ、健康食品としての関心が高まっている。ローヤルゼリーは、周知のとおり、ミツバチの巣における王台（女王バチの房）に蓄積された、働きバチの外分泌腺からの乳白色の分泌物であり、女王バチとなるべき幼虫に与えられる餌であると言われている。ローヤルゼリーの化学的組成は生産地や季節などにより、多少の差違はあるものの、水分６５〜７５％、蛋白質１５〜２０％、炭水化物１０〜１５％、脂肪１．７〜６％、灰分０．７〜２％含むとされている。ジェイ・シュミットゾーバ（Ｊ．Ｓｃｈｉｍｉｔｚｏｖａ）等は、ローヤルゼリーに含有する５種類の主要な蛋白質のｃＤＮＡを、ミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）よりクローン化に成功し、それらの塩基配列及びそれらから推定されるアミノ酸配列を明らかにして、これら蛋白質をＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ３、ＭＲＪＰ４、及びＭＲＪＰ５（ＭＲＪＰ：ｍａｊｏｒｒｏｙａｌｊｅｌｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）とそれぞれ命名している。しかしながら、これら蛋白質の生理活性に関しては何ら研究がなされていない。
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、諸種のアレルギー疾患へ適用すると、重篤な副作用を惹起することなく、アレルギー疾患に伴う諸症状を効果的に緩和する手段を提供することを課題とするものである。
【発明の開示】
上記の課題を解決する目的で、本発明者がローヤルゼリーに着目し、鋭意研究したところ、ローヤルゼリーに含まれる低分子又は高分子のある種の成分、具体的には例えば、配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質が、生体内においては、抗体及び／又はサイトカインの産生を著明に抑制することが判明し、重篤な副作用を惹起することなくアレルギー疾患に伴う諸症状を効果的に緩和することを確認した。
即ち、本発明は、有効成分として、ローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーから採取される蛋白質、又は、それら蛋白質を含有するローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーを含んでなる抗アレルギー剤を提供することによって、上記の課題を解決するものである。
さらに、本発明は、上記の抗アレルギー剤を含んでなる飲食物を提供することによって、上記の課題を解決するものである。
さらに、本発明は、上記の抗アレルギー剤を含んでなる化粧品を提供することによって、上記の課題を解決するものである。
さらに、本発明は、上記の抗アレルギー剤を含んでなる医薬品を提供することによって、上記の課題を解決するものである。
【図面の簡単な説明】  第１図は、生ローヤルゼリーに含まれる本発明の抗アレルギー蛋白質の２次元電気泳動パターンを示すものである。
第２図は、ローヤルゼリーの水溶性画分を、ＤＥＡＥ−５ＰＷゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供した際の活性蛋白質の溶出を示すクロマトグラムである。
（○：相対ＩＬ−２産生率、●：相対ＩＬ−４産生率、△：相対細胞増殖率、１：活性蛋白質１溶出フラクション、２：活性蛋白質２溶出フラクション）
第３図は、活性蛋白質１画分を、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）−５ＰＷゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供した際の活性蛋白質の溶出を示すクロマトグラムである。
（○：相対ＩＬ−２産生率、●：相対ＩＬ−４産生率、△：相対細胞増殖率、１：活性蛋白質１−１溶出フラクション、２：活性蛋白質１−２溶出フラクション）
第４図は、ローヤルゼリー又はＲＪＰ７０をＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した際の、血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＥ抗体価を測定した結果を示す図である。
（●：各個体（５匹）のデータ、−：平均値、＊：危険率５％以下で有意差を示すデータ）
第５図は、ローヤルゼリー又はＲＪＰ７０をＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した際の、血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ１抗体価を測定した結果を示す図である。
（●  各個体（５匹）のデータ、−：平均値、＊：危険率５％以下で有意差を示すデータ）
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、有効成分として、ローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーから採取される蛋白質、又は、それら蛋白質を含有するローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーを含んでなる抗アレルギー剤に関するものである。本発明に用いるローヤルゼリーとしては、それを分泌するミツバチの種類としては、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、トウヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｃｅｒａｎａ）、オオミツバチ（Ａｐｉｓ  ｄｏｒｓａｔａ）、コミツバチ（Ａｐｉｓ  ｆｌｏｒｅａ）などが、また、その産地としては、日本、南米、北米、豪州、中国、欧州などが挙げられる。これらのローヤルゼリーは、それが、抗アレルギー作用を有する低分子又は高分子の成分、例えば、配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質を含有し、未加工のままか、あるいは適宜の精製工程で処理した上で、ヒトをはじめとする哺乳類に適用したときに、アトピー性アレルギー、組織特異性アレルギー、免疫複合体型アレルギー、遅延型アレルギーなどのアレルギー性疾患の治療、予防に効果を発揮するものである限り、形態、純度、調製方法にかかわりなく、有利に用いることができる。
抗アレルギー剤の用途にもよるけれども、ローヤルゼリーの抗アレルギー作用が弱い場合には、低分子又は高分子の生理活性物質を精製するための方法を適用して精製する。本発明でいう精製ローヤルゼリーとは、生ローヤルゼリーに含まれる成分の一部を精製により部分的に除き、且つ、着目する成分の固形物当たりの含有量を高めたものを意味し、本発明においては、ローヤルゼリー水溶性蛋白質画分が好ましく用いられる。個々の精製方法としては、例えば、濾過、濃縮、乾燥、遠心分離、分別沈澱、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などが挙げられ、必要に応じて、これらは組み合わせて適用される。
本発明で用いるローヤルゼリーにおける抗アレルギー成分の具体例としては、例えば、配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。本発明でいう蛋白質とは、それが配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有し、且つ、生体内において抗アレルギー作用を発揮するものであるかぎり、その純度、由来、調製方法は問わない。好ましい蛋白質としては、例えば、配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられ、その蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量が５５，０００乃至７０，０００ダルトンであって、生物作用として抗体及び／又はサイトカインの産生を抑制するという作用を有している。より好ましい蛋白質としては、例えば配列表における配列番号３又は４に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられ、斯かるアミノ酸配列を有する蛋白質はいずれも生体において抗体及びサイトカイン産生抑制が顕著であり、しかも長期連用しても重篤な副作用を惹起することなく、アレルギー疾患に伴う諸症状を効果的に緩和するので、この発明において極めて有用である。なお、これらの蛋白質は単なる例であって、本発明でいう蛋白質は決してこれらに限定されてはならず、例えば、抗アレルギー作用を実質的に失わない範囲で配列表における配列番号３又は４のいずれかの全アミノ酸配列において、これらアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が欠失、又は他のアミノ酸で置換されるか、あるいは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に、他のアミノ酸が１個又は２個以上挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよいことは言うまでもない。
本発明に用いる配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する抗アレルギー蛋白質は、本来、ローヤルゼリーに含有される蛋白質であり、通常、天然のローヤルゼリーから採取することにより得ることができる。本発明で用いられる抗アレルギー蛋白質は、原料としてのローヤルゼリーから、前記の精製方法の１又は複数を適宜用いて、所望のレベルにまで精製して得ることができる。本発明でいう単離若しくは部分精製された配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質とは、このような各種精製方法を用いて完全に精製・単離されたもの若しくは部分的に精製されたものを意味し、いずれも本発明に有利に用いることができる。
本発明の抗アレルギー剤の有効成分である、配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質は、通常、電気泳動により分子量を測定するなどして識別・定量することができる。電気泳動の方法としては、通常、還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、等電点電気泳動法又はこれらを組み合わせた２次元電気泳動が用いられる。第１図は、ローヤルゼリーの２次元電気泳動による抗アレルギー蛋白質の検出結果を示す。ローヤルゼリー中に存在する配列表における配列番号１の部分アミノ酸配列を有する蛋白質は、還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量約７０キロダルトン（ｋＤａ）のものが主であり、一部、約５５ｋＤａのものが存在する。また、ローヤルゼリー中に存在する配列表における配列番号２の部分アミノ酸配列を有する蛋白質について、同様に還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分子量を測定すると、約５５ｋＤａである。以下、本明細書では、配列表における配列番号１の部分アミノ酸配列を有する蛋白質の内、配列表における配列番号３のアミノ酸配列を有し、且つ、約７０ｋＤａの分子量を有する蛋白質を活性蛋白質１−２又は「ＲＪＰ７０」と、また、配列番号２の部分アミノ酸配列を有する蛋白質の内、配列表における配列番号４のアミノ酸配列を有し、且つ、約５５ｋＤａの分子量を有する蛋白質を活性蛋白質２又は「ＲＪＰ５５」と呼称することがある。
前述したように、本発明に用いる抗アレルギー蛋白質ＲＪＰ７０は配列表における配列番号３の、また、ＲＪＰ５５は配列表における配列番号４のアミノ酸配列をそれぞれ有している。これらのアミノ酸配列をジェイ・シュミットゾーバ（Ｊ．Ｓｃｈｉｍｉｔｚｏｖａ）等著、『セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシーズ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）』、第５４巻、１，０２０乃至１，０３０頁（１９９８年）で報告されているローヤルゼリーの主要蛋白質ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ３、ＭＲＪＰ４、及びＭＲＪＰ５のアミノ酸配列比較したところ、ＲＪＰ７０のＮ末端アミノ酸配列はＭＲＪＰ３のＮ末端アミノ酸配列と、また、ＲＪＰ５５のＮ末端アミノ酸配列はＭＲＪＰ１のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致していた。更に、ジェイ・シュミットゾーバ等は、ＭＲＪＰ３としては分子量６０、６３、６６、７０ｋＤａと、分子量が異なる複数の蛋白質が存在していることを報告しており、本発明に用いる配列表における配列番号１の部分アミノ酸配列を有する蛋白質にも分子量約７０ｋＤａの蛋白質（ＲＪＰ７０）だけでなく、同一の部分アミノ酸配列を有し、約５５ｋＤａの分子量を示す蛋白質が認められている。また、ＲＪＰ５５はＮ末端アミノ酸配列のみならず、分子量においても約５５ｋＤａと、ＭＲＪＰ１と一致している。また、ジェイ  ・シュミットゾーバ等は、ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ３は、ローヤルゼリー蛋白質のそれぞれ約３１質量％、約２６質量％を占めることを明かにしている。従って、本発明に用いるＲＪＰ７０及びＲＪＰ５５はそれぞれＭＲＪＰ３及びＭＲＪＰ１と実質的に同一である可能性が高い。しかしながら、これらの蛋白質は、抗アレルギー作用などの生物作用に関しては、全く検討されていない。
本発明に用いる抗アレルギー蛋白質の調製方法としては、天然のローヤルゼリーから採取する方法以外にも、配列表における配列番号３又は４のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用い、組換えＤＮＡ技術を適用することによって、抗アレルギー蛋白質を調製することもできる。ミツバチはｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡなどのＤＮＡの給源として有利に用いられる。本発明でいう抗アレルギー蛋白質ＲＪＰ７０又はＲＪＰ５５をコードするＤＮＡの具体例としては、本発明者等による遺伝子解析の結果、クローン化された配列表における配列番号５又は６の塩基配列を有するＤＮＡをそれぞれ挙げることができる。ＲＪＰ７０及びＲＪＰ５５と極めて相同性の高いＭＲＪＰ３及びＭＲＪＰ１については、各遺伝子の塩基配列とコードされているアミノ酸配列が既に報告され、遺伝子データベース『ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）』に登録されており、それぞれアクセション番号Ｚ２６３１８（配列表の配列番号７）、ＡＦ０００６３３（配列表の配列番号８）にて閲覧することができる。
上記のセイヨウミツバチからクローン化されたＲＪＰ７０及びＲＪＰ５５をコードするＤＮＡの塩基配列（配列表における配列番号５及び６）を、ＭＲＪＰ３（配列番号７）及びＭＲＪＰ１（配列番号８）とそれぞれ比較すると、ＲＪＰ７０をコードするＤＮＡの塩基配列は計５塩基がＭＲＪＰ３のものと異なっており、この相違に起因してコードされるＲＪＰ７０のアミノ酸配列も計３残基が異なっている。また、ＲＪＰ５５をコードするＤＮＡの塩基配列はＭＲＪＰ１のものと塩基配列が完全に一致している。ただし、ＭＲＪＰ１の塩基配列中１１３４番目の塩基は不明とされているが、ＲＪＰ５５の塩基配列における該当箇所はチミン「ｔ」である。ＲＪＰ７０とＭＲＪＰ３との相違点を表１に示す。
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本発明で用いうる抗アレルギー蛋白質としては、配列表における配列番号５又は６に示す塩基配列にコードされるもの以外にも、配列番号５又は６に示す塩基配列の一部を含み、且つ、配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列をコードするものであればよい。なお、部位特異的変異などの慣用の組換えＤＮＡ技術を適用し、斯かるＤＮＡに塩基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を導入することにより、斯かるＤＮＡが本来的にコードする蛋白質の抗アレルギー作用を実質的に消失しない範囲内で当該蛋白質に１個又は２個以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を導入してアミノ酸配列を改変することも有利に実施できる。抗アレルギー活性を有する蛋白質ＲＪＰ７０とＲＪＰ５５のアミノ酸レベルでの相同性が約６６％であることから、抗アレルギー活性を保持するために、アミノ酸配列の改変は全体の約３５％未満にとどめるのが望ましい。
配列表における配列番号５又は６の塩基配列を有するＤＮＡは、本発明の抗アレルギー剤の有効成分である蛋白質を組換えＤＮＡ技術によって製造するために、有利に利用できる。これらＲＪＰ７０又はＲＪＰ５５をコードする配列表における配列番号５又は６の塩基配列を有するＤＮＡを人為的に発現させて、抗アレルギー蛋白質を生成させ、生成した該蛋白質を採取することにより、本発明の抗アレルギー剤の有効成分である抗アレルギー蛋白質を得ることができる。上記のＤＮＡを人為的に発現させるためには、例えば、常法にしたがって、適当な宿主細胞を形質転換してなる形質転換体の飼育又は培養により行うことができ、また、イン・ビトロでのＤＮＡの発現系（イン・ビトロ転写及びイン・ビトロ翻訳）を利用することも随意である。
本発明で用いるＲＪＰ７０又はＲＪＰ５５を組換えＤＮＡ技術を適用して製造する際、用いる形質転換体は、通常、配列表の配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば、配列表における配列番号５又は６の塩基配列を有するＤＮＡを自律複製可能なベクターと連結して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入することにより得ることができる。自律複製可能なベクターは、宿主の種類に応じて慣用のものから適宜選択すればよく、具体的にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、及びｐＢＳ７などのプラスミドベクター、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、及びφ１０５などのファージベクターや、ｐＶＬ１３９３などのバキュロウィルスベクターが挙げられる。このうち、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ、及びλｇｔ・λＢなどが好適である。一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。以上のような自律複製可能なベクターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、選択配列などの、この発明のＤＮＡが個々の宿主において発現するための、あるいは、所期の形質転換の有無を確認するための適宜塩基配列を含んでなる。以上のようなベクターとの連結には斯界で慣用の方法を適宜採用することができる。例えば、リンカーの付加やＰＣＲ法などによる制限酵素認識配列の付加、制限酵素処理、リガーゼ処理などはいずれも有用である。
上記のようなこの発明によるＤＮＡを導入する宿主細胞としては、形質転換体の作製に斯界で慣用される、大腸菌、枯草菌、酵母、黴などの適宜の微生物や、さらには、昆虫などの無脊椎動物、植物、脊椎動物などの細胞のいずれも用いることができる。本発明に用いる蛋白質をより天然型に近い形で提供するためには、昆虫細胞を宿主とするのが比較的望ましい。前記宿主にこの発明のＤＮＡを導入するには、例えば、リン酸−カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウイルス感染法、さらには、必要に応じて、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、及びマイクロインジェクション法などを適宜適用すればよい。斯くして生成される形質転換体から目的とするのクローンを選択するには、導入されたＤＮＡの有無や抗アレルギー蛋白質の産生能を指標として試験すればよい。なお、以上述べた組換えＤＮＡ及び形質転換体に関しては、ジェイ・サムブルック等著、『モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版（１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）に、慣用の材料及び方法が種々詳述されている。
以上のようにして得られる形質転換体は、宿主の種類やＤＮＡの導入の際に用いたベクターの種類に応じて、適宜の条件下で培養すれば、その細胞内又は細胞外に抗アレルギー蛋白質を産生する。培養に用いる培地には、宿主細胞やベクターの種類にもよるけれども、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の培地を使用することができる。個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、又、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。宿主細胞やベクターの種類にもよるけれども、通常、２０乃至６０℃、ｐＨ２乃至１０に保ちつつ、約１乃至６日間培養すれば、抗アレルギー蛋白質を含む培養物が得られる。
上記の組換えＤＮＡ技術を用いて得られる本発明で用いる蛋白質は、そのままの形態で利用可能であるが、通常、使用目的に応じて適宜の操作により精製して利用される。精製方法としては、前記、天然のローヤルゼリーからの採取の場合で述べた斯界で慣用の精製方法を適宜用いることができる。
本発明に用いる配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質は、抗体又はサイトカイン産生を抑制する生物活性を有する。後記する実験例で示すように、本発明者らはＯＶＡを抗原とし、Ａｌｕｍをアジュバントとして免疫したマウス脾臓細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激した際のサイトカイン産生抑制作用を指標にして、ローヤルゼリー中の蛋白質を精製することにより、ローヤルゼリーが示す抗アレルギー活性の主体となる複数の蛋白質をＲＪＰ７０及びＲＪＰ５５として特定することに成功した。これらの蛋白質は、天然のローヤルゼリーの場合と同様に、イン・ビトロ及びイン・ビボの試験において、動物細胞のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩｇＥ、ＩｇＧなどの各種サイトカイン又は抗体の産生を抑制することから、これらサイトカイン及び抗体の産生量の増加によって引き起こされるアレルギーの発症を抑制したり、発症したアレルギー症状を緩和、治療に利用することができる。
本発明の抗アレルギー剤は、ローヤルゼリーにおける抗アレルギー成分である配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質の含量が高いほど、著明な抗アレルギー作用を示す。本発明の抗アレルギー剤に含有する抗アレルギー成分は、高度に精製されたものであっても、部分精製されたものであっても、又は天然のままのものであっても良い。例えば、本発明の抗アレルギー剤は、後記実験例に記載されているサイトカイン産生抑制試験系により、蛋白質濃度２ｍｇ／ｍｌの抗アレルギー剤を用いる場合、当該蛋白質を添加しない場合に比べてＩＬ−２の相対産生量を８０％以下、又は、ＩＬ−４の相対産生量を６０％以下までに低下させることが可能な量の当該蛋白質を、抗アレルギー成分として抗アレルギー剤に含有させるのが望ましい。
本発明の抗アレルギー剤はアレルギー疾患のうち、とりわけアトピー性疾患に伴う諸症状を効果的に緩和する。アトピー性疾患とは皮膚炎、枯草熱、気管支喘息、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、昆虫アレルギー、ダニアレルギーなど、各器官において先天的家族性に現れる過敏性疾患を指し、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）が関与するＩ型アレルギー反応によって発症する疾患も含まれる。
本発明の抗アレルギー剤の使用方法について説明すると、本発明の抗アレルギー剤は経口的に使用しても非経口的に使用しても、抗アレルギー作用を発揮することができる。本発明の抗アレルギー剤の有効な摂取量又は投与量は、対象とするヒトをはじめとする哺乳動物の種類、年齢、性別などに応じて適宜決定すればよく、例えば、配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質の場合、有効成分の質量換算で、体重１ｋｇあたり、通常、０．０１ｍｇ乃至１００ｍｇ／回、望ましくは、０．１ｍｇ乃至５０ｍｇ／回、経口的に１日１回又は数回に分けて、効果に応じて、連日又は１日以上の間隔をおいて摂取するか又は投与すればよい。摂取・投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じて、例えば、経口経路、経管経路、経皮経路、経粘皮経路、経静脈経路などから適宜選択して使用すればよい。本発明の抗アレルギー剤を飲食物の形態にし、これを、経口抗アトピー用剤として用いる場合には、経済性などの点から、後述する実験２の試験系により、サイトカイン産生抑制活性がより高い天然のローヤルゼリーを選別し、これをそのまま用いることもできる。
また、本発明の抗アレルギー剤を、例えば、化粧品などの皮膚外用剤として皮膚に直接塗布する場合、配合するローヤルゼリー由来の抗アレルギー成分の量は、配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質の質量換算で、皮膚外用剤全量中、０．００１乃至１０質量％、好ましくは、０．０１乃至１質量％であり、１日１回又は数回に分けて、効果に応じて、連日又は１日以上の間隔をおいて直接皮膚に塗布すればよい。なお、０．００１質量％未満では、その効果は発揮され難くなり、また、１０質量％を越えると、配合量の割に効果がなく経済的に好ましくないことから、通常、上記の範囲で配合する。
本発明の抗アレルギー剤は、例えば、飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする組成物の形態としても有利に利用できる。斯かる組成物には、ローヤルゼリー若しくは抗アレルギー蛋白質とともに、例えば、シソ属植物及びパフィア（Ｐｆａｆｆｉａ）属植物などの加工物などの抗アレルギー作用を持つ成分も必要に応じて配合することができ、通常、例えば、飲食物分野、化粧品分野、医薬品分野などで有利に用いることができる。更に、必要に応じて、ヒトを含む哺乳類への経口的又は経皮的適用ないしは皮膚外用が許容される成分として、飲食物、化粧品、医薬品等の分野で通常使用される、例えば、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、アミノ酸、繊維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、賦形剤、増量剤、増粘剤、保存剤などの上記で述べた以外の成分を１種又は２種以上含有させることも有利に実施できる。これらの成分は、通常、本発明の抗アレルギー剤の各々の利用分野における必要性に応じて適宜選択される。以上のような成分を含む組成物の形態には特に制限はなく、例えば、粉末、顆粒、錠剤、ペースト、ゼリー、乳液、溶液などの所望の形態で提供される。
前記糖質としては、ブドウ糖、果糖、ラクトース、トレハロース、マルトース、蔗糖、ラクトスクロース、水飴などの糖類、サイクロデキストリン、環状四糖などの環状の糖類、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、還元水飴などの糖アルコール類、アスパルテーム、ステビア抽出物、スクラロースなどの高甘味度甘味料、プルラン、カラギーナンなどの天然多糖類、天然ガム類、合成品のカルボキシメチルセルロースなどの増粘剤などの１種又は２種以上を添加することにより、固状のものにあってはその賦形性に有利に利用できるだけでなく、本発明の抗アレルギー剤の安定化、呈味改善、風味保持などに有利に利用できる。
本発明の抗アレルギー剤を配合してなる組成物を製造するには、対象とする動物類やその摂取方法又は投与方法などを考慮して、本発明の抗アレルギー剤と、飲食物、化粧品、医薬品、医薬部外品、飼料、餌料、ペットフードなどの分野において使用可能な１種又は２種以上の成分とを、適宜の配合比率で混合し、適宜、希釈、濃縮、乾燥、濾過、遠心分離などの工程を実施して、所望の形状に成形して抗アレルギー剤を配合してなる組成物を調製すればよい。各成分を配合する順序や、当該工程を実施する時期は、本発明の抗アレルギー剤の効果が損なわれないぎり、その順序や時期に制限はない。
本発明の抗アレルギー剤を配合してなる組成物を飲食物の形態として用いる場合には、例えば、アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベットなどの氷菓、氷蜜などのシロップ、バタークリーム、カスタードクリーム、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのスプレッド及びペースト、チョコレート、ゼリー、キャンディー、グミゼリー、キャラメル、チューインガム、プリン、シュークリーム、スポンジケーキなどの洋菓子、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖菓などの加工果実ないしは加工野菜、まんじゅう、ういろう、あん、羊羹、水羊羹、カステラ、飴玉などの和菓子、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの調味料などが挙げられる。望ましい飲料の形態としては、例えば、合成酒、醸造酒、果実酒、洋酒などの酒類、ジュース、ミネラル飲料、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、スポーツドリンク、ドリンク剤、茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、ココアなどの清涼飲料などが挙げられる。
化粧品の形態として用いる場合には、例えば、ローション、クリーム、乳液、ゲル、粉末、ペースト、ブロックなどの形態で、石けん、化粧石けん、肌洗い粉、洗顔クリーム、洗顔フォーム、フェイシャルリンス、ボディーシャンプー、ボディーリンス、ヘアシャンプー、ヘアリンス、髪洗い粉などの清浄用化粧品、セットローション、ヘアブロー、チック、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアローション、養毛料、染毛料、頭皮用トリートメント、びん付油、つや出し油、髪油、スキ油などの頭髪化粧品、化粧水、バニシングクリーム、エモリエントクリーム、エモリエントローション、パック用化粧料（ゼリー状ピールオフタイプ、ゼリー状ふきとり型、ペースト状洗い流し型、粉末状など）、クレンジングクリーム、コールドクリーム、ハンドクリーム、ハンドローション、乳液、保湿液、アフターシェービングローション、シェービングローション、プレシェーブローション、アフターシェービングクリーム、アフターシェービングフォーム、プレシェーブクリーム、化粧用油、ベビーオイルなどの基礎化粧品、ファンデーション（液状、クリーム状、固型など）、タルカムパウダー、ベビーパウダー、ボディパウダー、パヒュームパウダー、メークアップベース、おしろい（クリーム状、ペースト状、液状、固型、粉末など）、アイシャドウ、アイクリーム、マスカラ、眉墨、まつげ化粧料、頬紅、頬化粧水などのメークアップ化粧品、香水、練香水、粉末香水、オーデコロン、パフュームコロン、オードトワレなどの芳香化粧品、日焼けクリーム、日焼けローション、日焼けオイル、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼け止めオイルなどの日焼け・日焼け止め化粧品、マニキュア、ペディキュア、ネイルカラー、ネイルラッカー、エナメルリムーバー、ネイルクリーム、爪化粧料などの爪化粧品、アイライナー化粧品、口紅、リップクリーム、練紅、リップグロスなどの口唇化粧品、練歯磨、マウスウォッシュなどの口腔化粧品、バスソルト、バスオイル、浴用化粧料などの入浴用化粧品などが挙げられる。
医薬品の形態として用いる場合には、例えば、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リモナーデ剤、リニメント剤、流エキス剤、ローション剤、湿布剤、噴霧剤、塗布剤、浴剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤などが挙げられる。以上のような形態の本発明の抗アレルギー剤を配合してなる組成物を製造するには、目的とする製品を慣用の製造方法にしたがって製造する過程の適宜の時期に本発明の抗アレルギー剤を添加すればよい。ただし、目的とする製品の製造工程に加熱工程がある場合には、製造工程での抗アレルギー作用の減衰を防ぐために、本発明の抗アレルギー剤は、加熱工程の前に添加すべきでなく、例えば、加熱工程の後に３０℃以下、望ましくは常温にまで冷却した後に添加するのが望ましい。以上のような本発明の組成物は、本発明の抗アレルギー剤を、組成物中に、通常、０．０１質量％以上、望ましくは、０．１乃至１００質量％含有する。
本発明の抗アレルギー剤を医薬品としてアレルギー疾患の治療、予防に用いる場合の適応症としては、例えば、前記したアトピー性疾患全般に加えて、金属アレルギー、遅延型接触皮膚炎、食物アレルギー、薬物アレルギー、化学物質過敏症などが挙げられる。また、本発明の抗アレルギー剤は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−αの産生を抑制することから、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、多発性筋炎、慢性関節リューマチ、リューマチ熱、強皮症、多発性結節性動脈炎、活動性慢性肝炎、萎縮性胃炎、自己免疫性溶血性貧血、無精子症、バセドウ病、ベーチェット症候群、ＣＲＴＳ症候群、寒冷凝集素性溶血性貧血、潰瘍性大腸炎、グッドパスチャー症候群、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、特発性アジソン病、特発性血小板減少性紫斑病、若年性糖尿病、白血球減少症、重症筋無力症、発作性寒冷血色素尿症、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変症、シーグレン症候群、交換性眼炎、全身性紅斑性狼そう、ウェジナー肉芽腫症などの症状の緩和・治療にも有利に利用できる。
以上のように本発明の抗アレルギー剤は、抗アレルギー作用を示す上、摂取した生体に悪影響を与えないので、日常的に利用することにより、利用した生体において抗アレルギー作用が効果的に発揮され、重篤な副作用を惹起することなく、その生体の抵抗力の増強によるアレルギー疾患の予防、早期緩和、治療、及び健康な状態の維持などが達成される。したがって、本発明の抗アレルギー剤は、アレルギー疾患を予防・緩和・治療するための飲食物・化粧品・医薬品などとして極めて有用である。特に、化粧品として利用する場合には、皮膚疾患の予防ならびに該疾患に対する治療効果の改善などに奏効する。
最近、ローヤルゼリーが、抗アレルギー作用を発揮することがエイチ・オカ等『バイオセラピー（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ）』、第１４巻、１４５頁乃至１５０頁（２０００年）や、エム・カタオカ等『ナチュラル・メディシンズ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）』、第５５巻、１７４頁乃至１８０頁（２００１年）によって報告されている。しかしながら、これらの報告は、ローヤルゼリーが有する抗アレルギー作用の主体となる物質が、ローヤルゼリーに含まれる蛋白質、糖質、脂質、又はそれら以外の物質のいずれであるか全く言及していない。したがって、抗アレルギー作用の主体物質が配列表における配列番号１又は２のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有する蛋白質であること、及び、サイトカイン産生抑制活性が後記する実験２の試験方法によって高いと認められたローヤルゼリーは、経口投与により、後記実験７で示したように著明な抗アトピー作用を発揮することについてを明らかにしたのは本発明をもって嚆矢とする。
以下に、本発明に用いるローヤルゼリー及び抗アレルギー蛋白質について、具体的な実験例をあげて本発明をさらに詳しく説明する。
実験１：ローヤルゼリー水溶性蛋白質画分の調製
凍結保存していた生ローヤルゼリー（ブラジル産）２５ｇを室温にて融解し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、低分子物質を除去するために同緩衝液５Ｌに対して透析した。次いで、得られた透析内液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分）することにより不溶性物質を除去し、さらにポアサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過して、ローヤルゼリー水溶性蛋白質画分を得た。
実験２：マウス脾臓細胞を用いたサイトカイン産生抑制及び細胞増殖抑制活性の測定
ＯＶＡを抗原とし、Ａｌｕｍをアジュバントとして３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスより回収した脾臓細胞を５×１０６個／ｍｌに調製し、抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍｌ）で固相化した９６ウェルのマイクロプレートに、１００μｌずつ播きこんだ。次いで、実験１で用いた生ローヤルゼリー又は実験１で得たローヤルゼリー水溶性蛋白質画分を、蛋白質濃度２．０ｍｇ／ｍｌ及び４．０ｍｇ／ｍｌに調製し、これを５０μｌずつ添加した。更に、各ウェルに培地を５０μｌ添加し、総液量２００μｌとした。４０時間培養した後に培養上清液を回収し、ＩＬ−２、ＩＬ−４の各サイトカイン量を常法の、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）にて測定した。ローヤルゼリー水溶性蛋白質画分の代わりにリン酸緩衝生理食塩水（以下、本明細書では単にＰＢＳ（−）と略称する。）を用いて同様に行ったものを対照とした。対照のサイトカイン産生量を１００％として生ローヤルゼリー及びローヤルゼリー水溶性蛋白質画分の相対的なサイトカイン産生量をパーセントで表した。結果を表２に示した。
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表２の結果から明らかなように、試験した生ローヤルゼリー及びローヤルゼリー水溶性蛋白質画分は用量依存的にＩＬ−２、ＩＬ−４の産生を抑制した。生ローヤルゼリーの場合、蛋白質濃度２．０ｍｇ／ｍｌのときのＩＬ−２相対産生率及びＩＬ−４相対産生率はそれぞれ１０３％、７３％であった。ローヤルゼリー水溶性蛋白質画分の場合、蛋白質濃度２．０ｍｇ／ｍｌのときのＩＬ−２相対産生率及びＩＬ−４相対質産生率はそれぞれ７６％、５４％であった。これらの結果から、透析、遠心分離などの精製操作を加え、蛋白質以外の糖質などの水溶性低分子物質及び不溶性物質を除くことにより、生ローヤルゼリーに比べて蛋白質当りのサイトカイン産生抑制活性（抗アレルギー活性）を高めたローヤルゼリー標品が得られることが判明した。
実験３：生ローヤルゼリーからの抗アレルギー活性蛋白質の精製及びその理化学的性質
実験３−１：生ローヤルゼリーからの抗アレルギー活性蛋白質の精製
実験２で認められたＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫したマウス脾臓細胞のサイトカイン産生抑制活性を指標として、生ローヤルゼリーから抗アレルギー活性蛋白質を精製した。また、同時に細胞増殖能を、酸化−還元インディケーターである色素（トレック・ダイアグノスティック社製、商品名『アラマー・ブルー（ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）』）を用いて５４４ｎｍを励起波長とし、５９０ｎｍを測定波長として蛍光強度を測定した。実験１で得たローヤルゼリー水溶性蛋白質画分を、『ＤＥＡＥ−５ＰＷ』ゲル（株式会社東ソー製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量５４ｍｌ）に供したところ、サイトカイン産生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有する蛋白質はＤＥＡＥ−５ＰＷゲルに吸着した。蛋白質の溶出を２８０ｎｍの吸光度を測定することにより追跡しながら、吸着した蛋白質を食塩濃度０Ｍから０．３Ｍに上昇するリニアグラジエントで溶出させ、第２図に示すように食塩濃度約０．０８Ｍ付近で溶出する活性蛋白質（第２図における太線１）と、０．１７乃至０．２５Ｍ付近に溶出する活性蛋白質（第２図における太線２）の２種の蛋白質を分離、回収した。便宜上、本明細書では、前者を「活性蛋白質１」と、後者を「活性蛋白質２」と称する。以下、これらを別々の精製工程により精製した結果を示す。
実験３−２：活性蛋白質１の精製
実験３−１で得た活性蛋白質１を含有するフラクションを食塩濃度０．０１Ｍの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、その透析内液を『リソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）Ｑ』ゲル（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量６ｍｌ）に供した。活性蛋白質１はリソースＱゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍに上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．１Ｍ付近で溶出した。活性画分を回収し、その食塩濃度を０．０５Ｍに調製するために、同食塩濃度の緩衝液に対して透析し、その透析内液を『ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）−５ＰＷ』ゲル（株式会社東ソー製）を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィー（ゲル量３．３ｍｌ）に供した。その結果を第３図に示す。活性蛋白質１はヘパリン−５ＰＷゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから１Ｍに上昇するリニアグラジエントで溶出させ、実験２及び実験３−１の方法でサイトカイン産生抑制及び細胞増殖抑制活性を有する画分を調べたところ、第３図における太線１で示される食塩濃度約０．１５Ｍ付近で溶出する活性蛋白質（以下、本明細書では、これを「活性蛋白質１−１」と称する）と、第３図における太線２で示される約０．３５Ｍ付近に溶出する活性蛋白質（以下、本明細書では、これを「活性蛋白質１−２」と称する）の２種が検出された。両者は後述するように同一のＮ末端アミノ酸配列を有しており、活性蛋白質１−２が活性蛋白質１−１よりも分子量が大きく比活性も高いことから、活性蛋白質１−２を選択し、更に精製した。活性蛋白質１−２を含有するフラクションを『スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００』ゲル（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ゲル量３２０ｍｌ）に供し、１．５倍濃度のＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いて溶出した。この活性画分を回収し、ＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫したマウス脾臓細胞のサイトカイン産生抑制及び細胞増殖抑制活性を有する精製活性蛋白質１を得た。活性蛋白質１の各精製ステップに於ける蛋白量、比活性を表３に示す。（但し、表３中、ヘパリン−５ＰＷ回収区以降は活性蛋白質１−２の数値を表す。）
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得られた精製活性蛋白質１を還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下でゲル濃度１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、精製標品の純度を検定したところ、蛋白質バンドは単一で、純度の高い標品であった。
実験３−３：活性蛋白質１の理化学的性質
（１）分子量
実験３−２で得たＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫したマウス脾臓細胞のサイトカイン産生抑制及び細胞増殖抑制活性を有する精製活性蛋白質１−２と、同じく実験３−２で得た部分精製活性蛋白質１−１を実験３−２と同様に還元剤ＤＴＴ存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、同時に泳動した分子量マーカー（アマシャム・バイオサイエンス社製、商品名『ＬＭＷエレクトロフォレシス・キャリブレーション・キット（ＬＭＷ  Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｃａｒｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）』）と比較して当該活性蛋白質の分子量を測定したところ、活性蛋白質１−２は分子量約７０ｋＤａに相当する位置に、また、活性蛋白質１−１は分子量約５５ｋＤａに相当する位置に、それぞれ蛋白質バンドが検出された。
（２）Ｎ末端アミノ酸配列
実験３−２で得た活性蛋白質１−２精製標品及び活性蛋白質１−１部分精製標品のＮ末端アミノ酸配列１０残基を、常法により、プロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製、モデル４７３Ａ）を用いて分析したところ、両者とも同一の、配列表における配列番号１のＮ末端アミノ酸配列を有していた。両者の内、約７０ｋＤａの分子量を有する活性蛋白質１−２を本発明者はＲＪＰ７０と命名した。
実験３−４：活性蛋白質２の精製
実験３−１で得た活性蛋白質２を含有するフラクションを食塩濃度０．０１Ｍの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、その透析内液を『リソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）Ｑ』ゲル（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量６ｍｌ）に供した。活性蛋白質２はリソースＱゲルに吸着し、食塩濃度０．１Ｍから０．４Ｍに上昇するステップグラジエントで溶出させた。活性画分を回収し、活性蛋白質２を含有するフラクションを『スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ゲル量３２０ｍｌ）に供し、１．５倍濃度のＰＢＳ（−）を用いて溶出した。活性画分は２つ認められたものの、両者は還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて同一の約５５ｋＤａの分子量を示し、同一の蛋白質が単量体と多量体として分離したと考えられた。この活性画分を両方まとめて回収し、ＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫したマウス脾臓細胞のサイトカイン産生抑制及び細胞増殖抑制活性を有する精製活性蛋白質２を得た。活性蛋白質２の各精製ステップに於ける蛋白質量、比活性を表４に示す。
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精製活性蛋白質２を還元剤ＤＴＴ存在下でゲル濃度１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、精製標品の純度を検定したところ、蛋白質バンドは単一で、純度の高い標品であった。
実験３−５：活性蛋白質２の理化学的性質
（１）分子量
実験３−４で得た精製活性蛋白質２を実験３−３と同様に還元剤ＤＴＴ存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約５５ｋＤａに相当する位置に蛋白質バンドが検出された。
（２）Ｎ末端アミノ酸配列
実験３−４で得た精製活性蛋白質２のＮ末端アミノ酸配列を、常法により、プロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製、モデル４７３Ａ）を用いて２５残基分析したところ、配列表における配列番号２のＮ末端アミノ酸配列を有していた。活性蛋白質２を本発明者はＲＪＰ５５と命名した。
実験４：ＲＪＰ７０精製標品のサイトカイン産生抑制作用
実験３−２で得たＲＪＰ７０精製標品を用いて、段階希釈法により、１１．７、２３．４、４６．９、９３．８、１８８、及び３７５μｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、実験２と同様に、ＲＪＰ７０精製標品のマウス脾臓細胞に対するサイトカイン産生抑制作用を調べた。また、実験３−１と同様の方法で細胞増殖能を調べた。結果を表５に示した。
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表５から明らかなように、ＲＪＰ７０精製標品は用量依存的にＩＬ−２及びＩＬ−４の産生を抑制し、且つ、細胞の増殖を抑制した。
実験５：ＲＪＰ７０精製標品のＴ細胞又はマクロファージに対する作用と細胞障害性
実験５−１：ＲＪＰ７０精製標品のＴ細胞に対する作用と細胞障害性
ＲＪＰ７０のＴ細胞に対する直接的な作用と細胞障害性を調べるためにマウス脾臓細胞から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激する試験系で活性を確認した。実験２の方法で調製したＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞を１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ＦＣＳでコートしたシャーレで３７℃、１時間保持し、接着性の細胞を除去した。続いて、ヤギ抗マウスＩｇでコートしたシャーレを同様に用いて、Ｂ細胞を除去した。更に、抗マウスＣＤ４抗血清でコートしたシャーレに接着する細胞を回収することにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞を得た（ＣＤ４＋Ｔ細胞含量９１乃至９３％）。
実験３−２の方法で得たＲＪＰ７０精製標品と、このＣＤ４＋Ｔ細胞を用い、実験２と同様にしてサイトカイン産生抑制作用を調べた。ＲＪＰ７０精製標品を段階希釈法により、３１．３、６２．５、１２５、２５０μｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの産生抑制作用を調べた。ＲＪＰ７０精製標品に代えてＰＢＳ（−）を用いた以外は同様に処理したものを対照とし、対照のサイトカイン産生量を１００としたときの相対値を算出した。また、トリパンブルー色素排除法により、用いたＣＤ４＋Ｔ細胞の生細胞と死細胞の数を調べ、次式で生存細胞比率（％）を求め、細胞障害性の指標とした。結果を表６に示した。
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表６から明らかなように、ＲＪＰ７０はＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた系でもマウス脾臓細胞の系（実験４）とほぼ同様な傾向でＩＬ−２、ＩＬ−４の産生を抑制し、また、ＩＦＮ−γの産生も抑制した。このとき、生存細胞の比率は対照と同等であり、ＲＪＰ７０に細胞障害性は認められなかった。
実験５−２：ＲＪＰ７０精製標品のマクロファージに対する作用と細胞障害性
ＲＪＰ７０のマクロファージに対する直接的な作用と細胞障害性を調べるために、マウス腹腔から採取したマクロファージをリポポリサッカライド（ＬＰＳ）及びＩＦＮ−γで刺激する試験系で活性を確認した。マウス末梢マクロファージを調製するために、３％ブリューウェルのチオグリコレート培地をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に２ｍｌ注射し、３乃至４日後に腹水を採取した。腹水を１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して、細胞濃度１×１０６個／ｍｌにした後、プラスチック製シャーレに１０ｍｌずつ播種した。５％炭酸ガス雰囲気中で３７℃で２時間培養した後、培地を除去して、２回上記培地で濯ぎ、シャーレに付着しなかった細胞を除去し、シャーレに残った付着細胞を上記培地でセルスクレーパーを用いて回収し、マクロファージとして今後の実験に用いた。実験３−２の方法で得たＲＪＰ７０精製標品と、このマクロファージを用い、実験２と同様にしてサイトカイン産生抑制作用を調べた。ＲＪＰ７０精製標品を段階希釈法により、１５０、３００、６００μｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生抑制作用を調べた。ＲＪＰ７０精製標品に代えてＰＢＳ（−）を用いた以外は同様に処理したものを対照とし、対照のサイトカイン産生量を１００としたときの相対値を算出した。また、トリパンブルー色素排除法により、用いたマクロファージの生細胞と死細胞の数を調べ、上記数式１で生存細胞比率（％）を求め、細胞障害性の指標とした。結果を表７に示した。
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表７から明らかなように、ＲＪＰ７０はマクロファージを用いた系において、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ存在下でのＴＮＦ−αの産生を抑制した。一方、同じ炎症性サイトカインとして分類されるＩＬ−６の産生を抑制しなかった。このとき、生存細胞の比率は対照と同等であり、ＲＪＰ７０に細胞障害性は認められなかった。
実験６：  ローヤルゼリー及びＲＪＰ７０精製標品の抗体産生抑制作用
ローヤルゼリー又はＲＪＰ７０の投与が、ＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫したマウスの抗体産生に及ぼす影響を調べた。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、日本チャールスリバー株式会社）各５匹に対し、一週間おきに３回、ＯＶＡ２μｇ／Ａｌｕｍ３ｍｇを腹腔内投与にて免疫した。ローヤルゼリーは実験１で用いたものを使用し、ＰＢＳ（−）に溶解したものをマウス１匹当たり１回に５０μｇとなるように、また、ＲＪＰ７０は実験３−２の方法で得たものを使用し、同じくＰＢＳ（−）に溶解した精製標品をマウス１匹当たり１回に０．５、５、５０μｇとなるようにして、３回行われた各免疫操作（ＯＶＡ／Ａｌｕｍ投与）の２日前、６時間前の２回にわたり、計６回、腹腔内投与した。また、対照としてＰＢＳ（−）を用いて同様に行った。試験群を表８にまとめた。
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３回目の免疫から一週間後に採血し、血清中の各種抗体濃度を酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）により測定した。抗ＯＶＡ−ＩｇＥ抗体価はキャプチャードＥＩＡ法により測定し、標準血清（６４０Ｕ／ｍｌ）を用いて作成した検量線より算出した。また、抗ＯＶＡ−ＩｇＧ１抗体価は間接ＥＩＡ法により測定し、標準血清（１２８，０００Ｕ／ｍｌ）を用いて作成した検量線より算出した。各測定値の統計処理は対照群と試験群の間で分散性を検討し、Ｔ検定或いはウェルヒ（Ｗｅｌｃｈ）法により有意差検定を行った。１群５匹での各測定値の中に他とかけ離れた値がある場合にはスミルノフ（Ｓｍｉｒｎｏｖ）の棄却検定に従った。測定した結果を、抗ＯＶＡ−ＩｇＥ抗体価について第４図に、また、抗ＯＶＡ−ＩｇＧ１抗体価について第５図に示した。
第４図から明らかなように、ローヤルゼリーとＲＪＰ７０のいずれにも抗ＯＶＡ−ＩｇＥ抗体価を低下させる作用が認められた。ローヤルゼリー投与群の抗ＯＶＡ−ＩｇＥ抗体価は対照（ＰＢＳ（−）投与群）と比較して、６１％の有意な抑制が認められた。また、ＲＪＰ７０精製標品投与群では投与量に依存して抗ＯＶＡ−ＩｇＥ抗体価が低くなり、その抑制率は０．５μｇ／匹投与群で１３％、５μｇ／匹投与群で３９％、５０μｇ／匹投与群で６７％であった。また、第５図から明らかなように、抗ＯＶＡ−ＩｇＧ１抗体価もＩｇＥの場合とほぼ同様に、ローヤルゼリー投与群及びＲＪＰ７０精製標品のすべての投与群で４６〜８２％の有意な抑制が認められた。
以上の結果より、本発明に用いるローヤルゼリー及びＲＪＰ７０にはＩｇＥ、ＩｇＧ１抗体の産生を抑制する作用があり、アレルギー反応を抑制することが確認された。
実験７：アトピー性皮膚炎の発症抑制作用
Ｎｃ／Ｎｇａマウス（雌、５週齢、日本チャールスリバー社販売）に対して、ピクリルクロライドを塗布することによりアトピー性皮膚炎と酷似する皮膚炎を誘発させて作成したアトピー性皮膚炎モデルマウスを用いて、実験１で用いた生ローヤルゼリー及び実験３−２の方法で得たＲＪＰ７０のアトピー性皮膚炎の発症抑制作用を調べた。まず、バリカンで剃毛したマウスの腹部及び胸部にエタノール：アセトン（容量比４：１）の混合液に５％（ｗ／ｖ）の濃度に溶解したピクリルクロライド溶液を塗布して初回感作を行った。初回感作より４日めにオリーブ油に１％（ｗ／ｖ）の濃度に溶解したピクリルクロライド溶液を麻酔したマウス背部及び耳介に塗布した。その後、１週間おきにさらに計５回、同溶液を背部及び耳介に塗布した。実験１で用いた生ローヤルゼリー（１．０ｍｇ／マウス）又は実験３−２の方法で得たＲＪＰ７０精製標品（０．３ｍｇ／マウス）を、胃ゾンデを用いて初期感作の３日前より１日に１回、週５回、６週間、１０匹のマウスに経口投与した。対照としてＰＢＳ（−）を同様に１０匹のマウスに経口投与した。ピクリルクロライドによる初回感作から３週めより週に２回、皮膚症状（掻痒症、発赤・出血、浮腫、擦傷・組織欠損、痂皮形成・乾燥）を肉眼にて判定し、評価した。
生ローヤルゼリー投与群及びＲＪＰ７０投与群は対照群と比べて有意に症状が軽く、アトピー性皮膚炎の発症を抑制していた。この結果は本発明に用いるローヤルゼリー及び抗アレルギー蛋白質ＲＪＰ７０が、アトピー性のアレルギー症状を緩和する作用を有する物質であることを示している。
実験８：急性毒性試験
５質量％アラビアガムを含む生理食塩水にＲＪＰ７０又はＲＪＰ５５の適量をそれぞれ溶解した後、常法に従いろ過除菌した。これらを体重２０乃至２５ｇのｄｄＹマウス（１０匹／群）の腹腔内に注射投与するか、胃ゾンデにより経口投与した後、７日間に亙って経過を観察した。その結果、いずれの試料、いずれの投与経路によっても、試みた最大投与量である１０ｍｇ／ｋｇ体重においても死亡例が認められなかった。この結果は本発明に用いる抗アレルギー蛋白質ＲＪＰ７０及びＲＪＰ５５が、ヒトを含む哺乳類に常用しても安全な物質であることを示している。
実験９：ＲＪＰ７０及びＲＪＰ５５をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のクローニング
実験９−１：ミツバチからの全ＲＮＡの調製
全ＲＮＡの調製は、通常のグアニジンチオシアネート／酸性フェノール：クロロフォルム法を採用したＲＮＡ調製キット（アンビオン社製、商品名『トータリーＲＮＡキット（ＴＯＴＡＬＬＹ  ＲＮＡ  ｋｉｔ）』）を用い、キットに添付された説明書に従って行った。まず、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  Ｌ．）の成虫１２匹の頭部を変性溶液に浸し、ホモジナイザーで破砕して抽出液１０ｍｌを得た。等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（容量混合比２５：２４：１）溶液を加えて混和し、遠心分離して得た上層部分に、０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、抽出液と等量の酸性フェノール：クロロホルム溶液の順に添加・攪拌し、遠心分離して上層部分を回収した。これに、イソプロパノール液を加えて−２０℃で１時間保持し、遠心して得られた沈殿物を、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で洗浄・乾燥後、３００μｌの０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液で溶解した。７０℃で１０分間熱処理後、１５０μｌの７．５Ｍ塩化リチウムと５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液を添加し、−２０℃で１時間保持した。遠心後の沈殿物は、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で洗浄・乾燥後、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に溶解し、１８６μｇの全ＲＮＡを調製した。
実験９−２：ＲＪＰ７０をコードするｃＤＮＡのクローニング
実験９−１で得た全ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）を５μｌ、０．２μｇ／μｌのランダムヘキサマーを５μｌ、及びＤＥＰＣ処理水５０μｌを０．５ｍｌ容チューブに入れ、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製、商品名『ＤＮＡサーマルサイクラー４８０』）を用いて、７０℃で５分間加熱後、４℃に急冷させた。これに、５倍濃度ＲＴ−ＰＣＲ反応液を２０μｌ、１００ｍＭジチオトレイトールを１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰを５μｌ、２００Ｕ／μｌのモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素（インビトロジェン社製）を５μｌ加え、２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間保持して逆転写反応を行い、第１ストランドｃＤＮＡを含む水溶液を得た。次いで、ジェンバンクデータベースより入手したＭＲＪＰ３のｃＤＮＡ塩基配列の情報に基づき合成した、配列表における配列番号９の塩基配列を有するセンスプライマーと、配列表における配列番号１０の塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用いて常法に従い、ＰＣＲによる増幅を行った。逆転写反応産物２μｌに、宝酒造社製の１０倍濃度ＥｘＴａｑ反応液を５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）を１μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを４μｌ、上記センスプライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、上記アンチセンスプライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ加え、滅菌水で５０μｌとした。反応は、９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で３分間の順で３５サイクル行った。ＰＣＲ産物を０．９％アガロースゲル電気泳動に供したところ、約１，６００ｂｐ付近に増幅されたＤＮＡ断片のバンドが検出された。常法により、この増幅ＤＮＡ断片をゲルから抽出し、回収した。この一部を、クローニングキット（ストラタジーン社製、『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ』）を用い、添付の説明書に従って操作して、プラスミドベクター『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ（＋）』との連結反応に供した。連結反応産物の一部で、大腸菌コンピテントセル（ストラタジーン社製、『ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｋａｎ』）を、添付の説明書に従って操作し、形質転換した。形質転換した大腸菌は、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含んだＬＢ（１％塩化ナトリウム、１％トリプトン、０．５％酵母エキス）−２％寒天平板培地に接種し、３７℃にて１６時間培養した。出現したコロニーを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１６時間振とう培養し、常法により、菌体より組換えＤＮＡを調製した。通常のジデオキシ法により、ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル３７３Ａ）を用いて塩基配列解析を行ったところ、ＲＪＰ７０ｃＤＮＡは配列表における配列番号５の塩基配列を有していた。なお、配列表における配列番号３のアミノ酸配列は、配列表における配列番号５の塩基配列に並記したアミノ酸配列から分泌シグナル配列に相当する２０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を除いた、成熟型蛋白質のアミノ酸配列である。
実験９−３：ＲＪＰ５５をコードするｃＤＮＡのクローニング
ジェンバンクデータベースより入手したＭＲＪＰ１のｃＤＮＡ塩基配列の情報に基づき合成した、配列表における配列番号１１の塩基配列を有するセンスプライマーと、配列表における配列番号１２の塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用い、ＰＣＲ反応を９４℃で３０秒間、４６℃で３０秒間、７２℃で３分間の順で５サイクル、引き続き、９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で３分間の順で３５サイクル行った以外は、実験９−２と同様にしてＲＪＰ５５ｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列解析を行った。クローニングしたＲＪＰ５５ｃＤＮＡは配列表における配列番号６の塩基配列を有していた。なお、配列表における配列番号４のアミノ酸配列は、配列表における配列番号６の塩基配列に並記したアミノ酸配列から開始コドンＡＴＧがコードするメチオニンを１残基除いた、成熟型蛋白質のアミノ酸配列である。
実験１０：組換えＤＮＡ技術による抗アレルギー蛋白質の生産
実験１０−１：ＲＪＰ７０組換えバキュロウィルスの調製
実験９−２で得たＲＪＰ７０の完全長ｃＤＮＡについて、ＢＤ  ファーミンジェン社製の『ＢＤバキュロゴールド・トランスフェクション・キット（ＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）』を用い、昆虫細胞での蛋白質発現用組換えバキュロウィルスを調製した。実験９−２で得られた組換えＤＮＡは、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩにて消化後、０．９％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動を行い、１，６００ｂｐ付近のＲＪＰ７０ｃＤＮＡ断片をゲルより抽出・精製した。これを、宝酒造社製の『ライゲーション・キット  バージョン２』を用いて、バキュロウィルス・トランスファーベクター『ｐＶＬ１３９３』のポリヘドリン・プロモーター下流のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位に連結させた。連結反応産物の一部で、宝酒造社製の大腸菌コンピテントセル『ＪＭ１０９』株を、添付の説明書に従って操作し、形質転換した。形質転換した大腸菌は、４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含んだＬＢ−２％寒天平板培地に接種し、３７℃にて１６時間培養した。出現したコロニーを、４０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１６時間振とう培養後、常法により、菌体から組換えＤＮＡを調製し、ＲＪＰ７０ｃＤＮＡの挿入を確認後、ＲＪＰ７０組換えベクター『ｐＶＬ１３９３−ｒｊｐ７０−４』を作製した。次に、キットの添付説明書の操作方法に従い、Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１、ヨトウガ由来）を用いて、組換えウィルスの作製を行った。Ｓｆ９は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加のＴＣ１００培地（インビトロジェン社製）を用い、６穴プレートに１×１０６個／ウェルで播種し、１０分間付着させ、上清除去後、０．５ｍｌのトランスフェクション・バッファーＡ液（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ合有グレース培地）に置換した。これに、あらかじめ１．５μｇの『ｐＶＬ１３９３−ｒｊｐ７０−４』と０．２５μｇの『ＢＤバキュロゴールド・バキュロウィルスＤＮＡ』を混合して５分間反応させた後に、０．５ｍｌのトランスフェクション・バッファーＢ液（１２５ｍＭ塩化カルシウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．１）を添加した混合液を、０．５ｍｌ／ウェルで添加し、２７℃で４時間感染させた。対照として、野性型バキュロウィルスを含むバッファーＢ液を同様の方法で０．５ｍｌ／ウェルで別途Ｓｆ９昆虫細胞に添加し、感染させた。次に、各ウェルを１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加ＴＣ−１００培地で１回洗浄後、同培地２ｍｌを添加し、更に２７℃で６日間培養を行った。各培養液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を回収し、ＲＪＰ７０組換えバキュロウィルス調製液あるいはウィルスコントロール液とした。更にそれぞれのウィルスの力価を上げるため、Ｓｆ９細胞１×１０７個に上記の調製液を５０乃至２００μｌ添加し、２７℃で１週間感染させ、遠心分離して得た上清を、蛋白質発現用のＲＪＰ７０組換えウィルス液及びウィルスコントロール（野生型ウィルス）液として調製した。
実験１０−２：ＲＪＰ７０組換え蛋白質の調製
蛋白質発現用細胞として、昆虫細胞株（インビトロジェン社製、イラクサギンウワバ由来、『Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ』）を用いた。昆虫細胞株は、Ｌ−グルタミン（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）を添加したエクスプレスファイブ無血清培地（インビトロジェン社製）を用いて１×１０８個／１０ｍｌに調製し、実験１０−１で得たＲＪＰ７０組換えウィルス液を２００μｌ添加し、１０分毎に攪拌しながら１時間感染させた。次に、エクスプレスファイブ無血清培地を４０ｍｌ添加後、２７℃で１週間培養を行った。培養上清は、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してウィルスを除去し、分画分子量３０キロダルトンの限外ろ過膜（ミリポア社製、商品名『ウルトラフリー１５  ＵＦＶ２ＢＴＫ１０＜３００００』）で遠心濃縮し、続いて『セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５Ｍ』ゲル充填カラム（アマシャムバイオサイエンス社製、商品名『ＰＤ−１０』）を用いて１．５倍濃度のＰＢＳ（−）に交換し、アッセイに使用可能な組換えＲＪＰ７０液を調製した（回収した培養上清の２０倍濃縮液）。また、ＲＪＰ７０組換えウィルスの替わりにウィルスコントロール液を用いた以外は上記と同様に操作して、対照として用いる試料液を調製した。
実験１０−３：組換えＲＪＰ７０のサイトカイン産生抑制活性
実験２で示した活性測定方法により、組換えＲＪＰ７０のＩＬ−２及びＩＬ−４産生抑制作用を調べた。実験１０−２で得た組換えＲＪＰ７０液及び対照に、それぞれ０．５倍量の滅菌水を加えたものを原液として活性測定を行い、対照のサイトカイン産生量を１００％とした時の相対値を算出して、ＲＪＰ７０の活性を評価した。結果を表８に示した。
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表８から明らかなように、組換えＲＪＰ７０液は、用量依存的にＩＬ−２及びＩＬ−４の産生を抑制した。このことはＲＪＰ７０蛋白質が抗アレルギー作用を有することを示している。
以下に、具体的な実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：抗アレルギー剤
市販のα，α−トレハロースの含水結晶（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）８．５質量部と、実験３−２の方法で精製し、実験３−２で物理化学的性質を明らかにしているＲＪＰ７０精製標品の凍結真空乾燥品１．５質量部とを均一に混合し、粉砕機を用いて粉末にした。この粉末を０．４２ｍｍφメッシュの篩を通過したものを回収し、本発明の抗アレルギー剤を得た。実験２に準じて試験し、当該抗アレルギー剤がサイトカインの産生を抑制することを確認した後、常温で１０日間保存して再度実験２に準じて試験し、安定してサイトカインの産生を抑制する抗アレルギー作用を示すことを確認した。
当該抗アレルギー剤を打錠機を用いて１錠あたり約２００ｍｇの錠剤に成形した。本品は、常温保存の後も安定して抗アレルギー作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示す抗アレルギー剤である。本品は、まろやかな甘味を示すので、日常的に利用する健康食品としても有用である。
実施例２：抗アレルギー剤
以下の成分を以下の配合で均一に混合した後、実施例１に準じて操作して、粉末形態の本発明の抗アレルギー剤を調製した。なお、ＲＪＰ７０及びＲＪＰ５５に関しては実験３−２及び３−４の方法で精製し、実験３−３及び３−５で物理化学的性質を明らかにしている精製標品を凍結真空乾燥して得た蛋白質としての質量部で混合した。調製後、実験２に準じて試験し、当該抗アレルギー剤が常温保存後も安定してサイトカインの産生を抑制し、抗アレルギー作用を示すことを確認した。
α，α−トレハロース（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）
７．７質量部
ＲＪＰ７０精製標品の凍結乾燥粉末                            １．０質量部
ＲＪＰ５５精製標品の凍結乾燥粉末                            ０．４質量部
糖転移ヘスペリジン（株式会社林原商事販売、商品名『αＧヘスペリジンＰＳ』）
４質量部
プルラン（株式会社林原商事販売、商品名『プルランＰＦ−２０』）
０．５質量部
この抗アレルギー剤を、打錠機を用いて１錠あたり約３００ｍｇの錠剤に成形した。本品は、常温保存の後も安定して抗アレルギー作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示す抗アレルギー剤である。本品は、まろやかな甘味を示すので、日常的に利用する健康食品としても有用である。
実施例３：抗アレルギー剤
以下の成分を以下の配合で均一に混合した後、実施例１に準じて操作して、粉末の形態の本発明の抗アレルギー剤を調製した。なお、部分精製ローヤルゼリーとしては、実験３−１の方法で『ＤＥＡＥ−５ＰＷ』ゲル（株式会社東ソー製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにて部分精製した活性蛋白質１画分を凍結真空乾燥して得た蛋白質としての質量部で混合した。調製後、実験２に準じて試験し、当該抗アレルギー剤が常温保存後も安定してサイトカインの産生を抑制し、抗アレルギー作用を示すことを確認した。
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名『ファイントース』）
７．５質量部
部分精製ローヤルゼリーの凍結乾燥粉末                        １．５質量部
マルチトール                                                ０．８質量部
Ｌ−トリプトファン                                          ０．２質量部
本品は、常温保存の後も安定して抗アレルギー作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示す抗アレルギー剤である。本品は、まろやかな甘味を示すので、日常的に利用する健康食品としても有用である。
実施例４：健康飲料
無水結晶マルトース（（株）林原商事販売、商品名『ファイントース』）５００質量部、実施例３の抗アレルギー剤１００質量部、粉末卵黄１９０質量部、脱脂粉乳２００質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８５質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部及びニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製した。この配合物２５質量部を精製水１５０質量部に均一に分散・溶解させ、１５０ｇずつ褐色ガラス瓶に封入した。
本品は、抗アレルギー作用を安定して示す上、栄養源が補足されているので、健康維持、成長促進、アレルギーの予防、症状の緩和、治療の促進などを目的とする健康飲料として有利に利用できる。なお、本品は、ヒトのみならず、家畜などの動物のための経口摂取又は経管投与用組成物としても有利に利用できる。
実施例５：チューインガム
ガムベース３質量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水結晶マルチトール（株式会社林原商事販売、商品名『結晶マビット』２質量部とキシリトール２質量部及び実施例２で得た抗アレルギー剤４質量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合した。常法によってロールにより練り合わせている間に実験３−２の方法で得たＲＪＰ７０を０．５質量部加え、更に練り合わせた後、成形、包装して製品を得た。
本品はテクスチャー、呈味、風味良好であり、抗アレルギー作用をも有するため、日常的に利用するチューインガムとして有利に利用できる。
実施例６：皮膚外用クリーム
以下の成分を、以下の配合にしたがって、常法により加熱しつつ混合した。
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン                ２．０質量部
自己乳化型モノステアリン酸グリセリン                        ５．０質量部
べヘニン酸エイコサニル                                      １．０質量部
流動パラフィン                                              １．９質量部
トリオクタン酸トリメチロールプロパン                      １０．０質量部
上記の混合物に、抗アレルギー剤を除く以下の成分を以下の配合にしたがって添加・混合し、３０℃以下にまで冷却した後に、さらに抗アレルギー剤を以下の配合で加え、ホモジナイザーにより乳化して、皮膚外用クリームを製造した。
１，３−ブチレングリコール                                  ５．０質量部
乳酸ナトリウム液                                          １０．０質量部
パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．１質量部
モモ葉エキス                                                １．５質量部
精製水                                                    ６２．２質量部
実施例１の方法で得た抗アレルギー剤粉末                      １．０質量部
本クリームは、優れた保湿性を示す上、アトピー性皮膚炎などのアレルギー症状を緩和するので、皮膚外用クリームとして有用である。
実施例７：液剤
生理食塩水に実験３−２の方法で精製し、実験３−３で物理化学的性質を明らかにしているＲＪＰ７０精製標品を濃度０．１質量％になるよう溶解した後、溶液を常法にしたがって精密ろ過により滅菌して液剤を得た。
本品は花粉症などのアレルギー疾患を緩和・治療するための注射剤、点眼剤、点鼻剤などとして有用である。
実施例８：トローチ錠
以下の成分を以下の配合で均一に混合した後、実施例１に準じて操作して、粉末の形態の本発明の抗アレルギー剤を調製した。調製後、実験２に準じて試験し、当該抗アレルギー剤が常温保存後も安定してサイトカインの産生を抑制し、抗アレルギー作用を示すことを確認した。
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名『ファイントース』）
３０質量部
澱粉                                                          ３０質量部
実験３−２の方法で得たＲＪＰ７０精製標品の凍結乾燥粉末
１０質量部
結晶セルロース                                                １９質量部
ヒドロキシプロピルメチルセルロース                            １０質量部
ステアリン酸マグネシウム                                        １質量部
当該抗アレルギー剤を、打錠機を用いて直径１６ｍｍ、厚さ４ｍｍの１錠あたり約１．０ｇのトローチ剤に成形した。本品は、常温保存の後も安定して抗アレルギー作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示すトローチ剤である。本品は、まろやかな甘味を示すので、アトピー性アレルギーの予防、症状の緩和、治療の促進などを目的として日常的に利用する経口抗アトピー用トローチ剤として有用である。
実施例９：錠剤
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名『ファイントース』）９質量部と、実験２の試験方法によりサイトカイン産生抑制活性が高レベルで認められた生ローヤルゼリー（ブラジル産）１質量部とを均一に混合し、この混合物を２５℃で一夜静置した後、粉砕機を用いて粉末にした。この粉末を０．４２ｍｍφメッシュの篩を通したものを回収し、本発明の抗アレルギー剤を得た。
当該抗アレルギー剤を打錠機を用いて１錠あたり約３００ｍｇの錠剤に成形した。本品は、常温保存の後も安定して抗アレルギー作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示す抗アレルギー剤である。本品は、まろやかな甘味を示すので、アトピー性アレルギーの予防、症状の緩和、治療の促進などを目的として日常的に利用する経口抗アトピー用剤として有用である。
【産業上の利用の可能性】
以上説明したように、本発明は、ローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーから採取される蛋白質、又は、それら蛋白質を含有するローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーが、ヒトを含む哺乳類に対して、顕著に抗体産生及びサイトカイン産生を抑制することにより抗アレルギー作用を示すという全く独自の知見に基づき、抗アレルギー作用を有する蛋白質又はそれらを含有するローヤルゼリー又は精製ローヤルゼリーを用いた抗アレルギー剤としての用途を開発するものである。本発明の抗アレルギー剤は、重篤な副作用の懸念がないので、ヒトを含む哺乳類が簡便かつ快適に、アトピー性疾患をはじめとするアレルギー疾患、自己免疫疾患の諸症状の予防・緩和・治療のために利用することができる。また、以上のような特長を有する本発明の抗アレルギー剤は、飲食物、化粧品、医薬品としての形態で利用することも有利に実施できる。
本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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