(57)【要約】本発明は一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有しても良いＣ２〜Ｃ６のアルケニル基等を示す。）で表わされる２−アミノニトリルをアミンを含む水溶液中でニトリル加水分解活性を有する生体触媒によって加水分解して一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を表わす。）で表わされる２−アミノ酸に変換することを特微とする一般式［ＩＩ］で表わされる２−アミノ酸の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有しても良いＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有しても良いアリール基、置換基を有しても良いアリールオキシ基または置換基を有しても良い複素環基を示し、Ｒが置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基の場合、アミノ基とＲが結合して環を形成してもよい。）で表わされる２−アミノニトリルをアミンを含む水溶液中でニトリル加水分解活性を有する生体触媒によって加水分解して一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を表わす。）で表わされる２−アミノ酸に変換することを特徴とする一般式［ＩＩ］で表わされる２−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
アミンが、一般式［ＩＩＩ］
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３  ［ＩＩＩ］
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して、水素原子、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐のＣ１〜Ｃ８のアルキル基、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐のＣ２〜Ｃ８のアルケニル基、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいピリジル基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のうち任意の２つが結合して５から８員環の環状アミンを形成してもよい。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３に同時に水素が置換した化合物は除く。〕で表わされるモノアミンであることを特徴とする請求の範囲１記載の一般式［ＩＩ］で表される２−アミノ酸の製造方法。
【請求項３】
アミンが一般式［ＩＶ］
2003027303.tif 000012
〔式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、それぞれ独立して、水素原子、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐の炭素数Ｃ１〜Ｃ８のアルキル基、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐の炭素数Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル基、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいピリジル基を表わし、
Ｒ９、Ｒ１０は置換基を有していてもよい炭素数Ｃ１〜Ｃ１０のアルキレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基を表わし、
ｎは０または１〜８の整数を表わし、
ｎが２〜８のときは、Ｒ８、Ｒ１０はそれぞれ複数個存在するが、これらは各々異なっていてもよい。また、Ｒ４もしくはＲ５とＲ６もしくはＲ７が結合して５から８員環の環状ポリアミンを形成してもよい。〕で表わされるポリアミンであることを特徴とする請求の範囲１記載の一般式〔ＩＩ〕で表される２−アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は２−アミノニトリルを原料としてアミンの存在下で生体触媒の作用により２−アミノ酸を製造する方法に関する。本発明により製造される２−アミノ酸は、農医薬用・食品用・飼料添加用などの用途があり広汎に利用される。
背景技術
生体触媒のニトリル加水分解活性を用いた２−アミノ酸の製造方法としては、２−アミノニトリルを原料とする方法（特公昭５８−１５１２０号公報、特表昭６３−５００００４号公報、特開平２−３１６９４号公報、特表平３−５００４８４号公報、特公平３−１６１１８号公報）およびシアンヒドリンを原料とする方法（特開平９−１４０３９１号公報）が知られている。
２−アミノニトリルを原料とする場合は、２−アミノニトリルが水溶液中においてｐＨ９以下ではアンモニアが遊離してシアンヒドリンに変化する性質があり、またｐＨ９を超えるアルカリ域では水和して不可逆的にアミドに変化する性質がある（アナリスト、１１月号、１９８４年、第１０９巻、１４３９〜１４４２頁（ＡＮＡＬＹＳＴ，ＮＯＶＥＭＢＥＲ，１９８４，ＶＯＬ．１０９，ｐｐ１４３９〜１４４２））ため、それらの生成を抑えて収率良く２−アミノ酸を得るためには極めて活性の高い生体触媒を用いることが必要である。ところが既存の生体触媒では触媒活性が十分ではない上に副生したシアンヒドリンをさらに２−ヒドロキシ酸に不可逆的に変換するため、高収率で２−アミノ酸を得ることは困難であった。一方シアンヒドリンを原料として用いる方法では、アンモニアまたはアンモニウム塩の存在下でシアンヒドリンに生体触媒を作用させることにより収率は改善されることが知られていた（特開平９−１４０３９１号公報）ものの生産速度が遅く、アンモニウム塩の添加は実用的でないとされていた。
発明の開示
本発明は、２−アミノニトリルを直接の原料として、生体触媒を用いて効率よく２−アミノ酸を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは生体触媒の２−アミノニトリルに対する加水分解活性を改善する添加剤のスクリーニングの過程で、アミンが生体触媒の加水分解活性を著しく促進する効果を有することを見出した。次いで、アミンの適用ｐＨについて検討したところ、弱酸性〜アルカリ性に及ぶ広いｐＨ領域で活性促進作用を有するのみならず、意外にもｐＨ９以下ではシアンヒドリンからの２−ヒドロキシ酸の生成抑制効果を有し、またｐＨ９を超えるアルカリ領域ではアミドの生成抑制効果を有することを見出した。
本発明は、２−アミノニトリルを直接の原料として生体触媒の作用により２−アミノ酸を製造する際に、アミンを共存させることにより、副生成物の生成を抑制しつつ極めて高い生産速度で目的の２−アミノ酸を得ることができるという上記知見に基づいて完成に至ったものである。
すなわち本発明は、一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有しても良いＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有しても良いアリール基、置換基を有しても良いアリールオキシ基または置換基を有しても良い複素環基を示し、Ｒが置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基の場合、アミノ基とＲが結合して環を形成してもよい。）で表わされる２−アミノニトリルをアミンを含む水溶液中でニトリル加水分解活性を有する生体触媒によって加水分解して一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を表わす。）で表わされる２−アミノ酸に変換することを特徴とする一般式［ＩＩ］で表わされる２−アミノ酸の製造方法（請求の範囲１）、または
アミンが、一般式［ＩＩＩ］
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３  ［ＩＩＩ］
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して、水素原子、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐のＣ１〜Ｃ８のアルキル基、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐のＣ２〜Ｃ８のアルケニル基、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいピリジル基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のうち任意の２つが結合して５から８員環の環状アミンを形成してもよい。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３に同時に水素が置換した化合物は除く。〕で表わされるモノアミンであることを特徴とする請求の範囲１記載の一般式［ＩＩ］で表される２−アミノ酸の製造方法（請求の範囲２）、または
アミンが一般式［ＩＶ］
2003027303.tif 000002
〔式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、それぞれ独立して、水素原子、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐の炭素数Ｃ１〜Ｃ８のアルキル基、（置換基を有していてもよい）環状もしくは直鎖もしくは分岐の炭素数Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル基、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいピリジル基を表わし、
Ｒ９、Ｒ１０は置換基を有していてもよい炭素数Ｃ１〜Ｃ１０のアルキレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基を表わし、
ｎは０または１〜８の整数を表わし、
ｎが２〜８のときは、Ｒ８、Ｒ１０はそれぞれ複数個存在するが、これらは各々異なっていてもよい。また、Ｒ４もしくはＲ５とＲ６もしくはＲ７が結合して５から８員環の環状ポリアミンを形成してもよい。〕で表わされるポリアミンであることを特徴とする請求の範囲１記載の一般式〔ＩＩ〕で表される２−アミノ酸の製造方法（請求の範囲３）である。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の一般式〔ＩＩ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有しても良いＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有しても良いアリール基、置換基を有しても良いアリールオキシ基または置換基を有しても良い複素環基を示す。）で表わされる２−アミノ酸の製造方法としては、一般式〔Ｉ〕：ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有しても良いＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有しても良いアリール基、置換基を有しても良いアリールオキシ基または置換基を有しても良い複素環基を示す。）で表わされる２−アミノニトリルを、アミンを含む水溶液中でニトリル加水分解活性を有する生体触媒によって加水分解して一般式〔ＩＩ〕で表わされる２−アミノ酸に変換する製造方法であれば特に制限されるものではない。
本発明で使用される生体触媒としては、水溶液中でニトリルを加水分解する活性を有する微生物等の生体の触媒であれば特に制限されるものではなく、かかる生体としては例えばアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バリオボラクス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属に属する微生物が挙げることができ、これらの中でも特に、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９）、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＳＳＣ２０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６２）およびバリオボラクス  パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＩＡＭ１２３７４を好適に例示することができる。
アースロバクターＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９）は独立行政法人産業技術総合研究所に１９９６年２月６日付で寄託されており、その菌学的性質についてはＷＯ９７／３２０３０に記載されている。
またアースロバクターＮＳＳＣ２０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６２）は同じく独立行政法人産業技術総合研究所に２０００年６月２２日付で寄託されており、その菌学的性質についてはＰＣＴ／ＪＰ０１／０６２９１に記載されている。
また、バリオボラクス  パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＩＡＭ１２３７４は東京大学分子細胞生物研究所より容易に入手でき、その菌学的性質についてはインターナショナル  ジャーナル  オブ  システマチック  バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第４１巻、４４５〜４５０ページ（１９９１年）に記載されている。
これらの微生物の培養は、酵素誘導物質、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機栄養源を含む通常の培地で行われる。酵素誘導物質としては、イソブチロニトリル、２−アミノベンゾニトリル等のニトリル化合物、ε−カプロラクタムなどの環状アミド化合物等が使用され、特に２−アミノベンゾニトリルが好ましい。炭素源としてはグルコース等の炭水化物、エタノール等のアルコール類、有機酸その他が適宜用いられる。窒素源としては、アミノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩その他が用いられる。無機イオンとしては、リン酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、硫酸イオン、鉄イオン、その他が必要に応じて使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸など及びこれらを含有するコーンスチープリカー、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、その他が適宜用いられる。培養は好気的条件下に、ｐＨ６〜９、温度２５〜３７℃の適当な範囲に制御しつつ行えばよい。
本発明に用いられる生体触媒としては、上記のように培養した菌体の他、その菌体から調製した固定化菌体、粗酵素もしくは固定化酵素などの菌体処理物が挙げられる。菌体又は酵素を固定化する場合は担体結合法、包括法等の通常行われる固定化技術を適用できる。酵素または粗酵素を調製する場合は、菌体を超音波、高圧ホモジナイザー等によって破砕した後に、硫安塩析、クロマトグラフィー等の通常行われる酵素精製技術が適用できる。また反応に用いた菌体等の生体触媒は実質的な活性低下なしに繰り返し加水分解反応に使用することができる。
本発明で用いられる一般式〔Ｉ〕において、Ｒは水素原子、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有しても良いＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルコキシル基、置換基を有しても良いアリール基、置換基を有しても良いアリールオキシ基または置換基を有しても良い複素環基を表わし、該置換基としては、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、置換基を有していてもよいフェニル基、イミダゾール基、インドール基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ基等を挙げることができる。
置換基を有しても良いＣ１〜Ｃ６のアルキル基としては、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルチオアルキル基又はＣ１〜Ｃ６のヒドロキシアルキル基を、置換基を有しても良いアリール基としてはフェニル基を好適に例示することができる。
一般式〔Ｉ〕で表わされる２−アミノニトリルとしては、公知の２−アミノ酸に対応するニトリル化合物であれば特に制限なく使用できる。
具体的には、２−アミノ−アセトニトリル、２−アミノ−プロピオニトリル、２−アミノ−イソバレロニトリル、２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオニトリル、２−アミノ−３−メチルバレロニトリル、２−アミノ−４−メチルバレロニトリル、２−アミノ−３−ヒドロキシブチロニトリル、２−アミノ−３−メルカプトプロピオニトリル、２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリル、２−アミノフェニルアセトニトリル、２−アミノ−３−フェニルプロピオニトリル、２−ピロリジンカルボニトリル等を挙げることができる。例えば２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルを用いると、有用なアミノ酸であるメチオニンを得ることができる。
これらの２−アミノニトリルは０．０１〜５０重量％の濃度で反応に使用され、必要ならば反応の間、逐次添加あるいは連続添加することができる。
本発明で用いられるアミンは、モノアミン、ポリアミンのいずれでもよい。
モノアミンとしては一般式［ＩＩＩ］
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３    ［ＩＩＩ］
で表わされるアミンを挙げることができ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３としては具体的に、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｓ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｓ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｓ−ヘキシル基、１，１−ジメチル−ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、１−メチルシクロペンチル基、１−メチルシクロヘキシル基等の環状または直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ８のアルキル基、ビニル基、アリル基、２−ブテニル基、１−メチル−２−プロペニル基、４−オクテニル基等の環状または直鎖または分岐のＣ２〜Ｃ８のアルケニル基、フェニル基、ピリジル基等を挙げることができる。
また第二アミン、第三アミンの場合は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のうち任意の２つの炭化水素基が結合して５から８員環の環状アミンを形成してもよい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は更に置換基を有していてもよく、該置換基としてはメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ブトキシ基等のＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、ｉ−プロピリチオ基、ブチルチオ基等のＣ１〜Ｃ６のアルキルチオ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、フェニル基等を挙げることが出来る。
ポリアミンとしては、一般式［ＩＶ］
2003027303.tif 000003
を挙げることができ、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８としては、具体的に、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｓ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｓ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｓ−ヘキシル基、１，１−ジメチル−ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、１−メチルシクロペンチル基、１−メチルシクロヘキシル基等の環状または直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ８のアルキル基、ビニル基、アリル基、２−ブテニル基、１−メチル−２−プロペニル基、４−オクテニル基等の環状または直鎖または分岐のＣ２〜Ｃ８のアルケニル基、フェニル基、ピリジル基を挙げることができる。
Ｒ９としてはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等の炭素数Ｃ１〜Ｃ１０のアルキレン基、フェニレン基を挙げることができる。
ｎは０または１〜８の整数を表わし、
ｎが２〜８のときは、Ｒ８、Ｒ１０はそれぞれ複数存在することになるが、これらは各々異なっていてもよい。
また、Ｒ４もしくはＲ５と、Ｒ６もしくはＲ７が、結合して５から８員環の環状ポリアミンを形成してもよい。
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０は更に置換基を有していてもよく、該置換基としてはヒドロキシル基、カルボキシル基、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等のアルキル基を挙げることが出来る。
モノアミンの具体例としては、２−アミノエタノール、２−アミノ−１−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、１−アミノ−２−プロパノール、２−アミノ−１−ブタノール、３−アミノ−１−ブタノール、３−アミノ−２−ブタノール、４−アミノ−１−ブタノール、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、セリン、ホモセリン、スレオニン等を挙げることができる。
ポリアミンの具体例としては、エチレンジアミン、１，２−ジアミノプロパン、１，２−ジアミノ−２−メチルプロパン、１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、プトレスシン、カダベリン、１，２−ジアミノシクロヘキサン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、Ｎ−メチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルエチレンジアミン、３−（メチルアミノ）プロピルアミン、ピペラジン、スペルミジン、スペルミン、リジン、オルニチン等を挙げることができる。
これらのアミンのうち、比較的安価で生体触媒の活性促進効果が高い点で、２−アミノエタノール、３−アミノ−１−プロパノール、スレオニン、エチレンジアミン、１，２−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノプロパン、ジエチレントリアミン、３−（メチルアミノ）プロピルアミン、リジン又はそれらの混合物が好ましい。
これらのアミンは、塩酸等の強酸又は酢酸等の弱酸と組み合わせて緩衝液成分として用いることができる。また２種類以上を組み合わせても使用できる。
また、これらのアミンは０．１ｍＭから飽和濃度の範囲で使用できるが、２ｍＭ〜１０００ｍＭで使用することが２−アミノ酸の変換効率の点で好ましい。
本発明で使用される水溶液としては上記のアミンを含むものであれば、他に無機塩、有機酸塩、有機塩基または有機溶媒を含んでいても良く、あるいは水と２相に分離しても良い。
本発明に用いられる生体触媒による加水分解反応は、アミンを含む水性溶媒中で上記の生体触媒を一般式［Ｉ］で表わされる２−アミノニトリルに作用させることによって行われる。生体触媒は乾燥重量に換算して、通常０．００１〜１０重量％の濃度で使用され、反応終了後は濾過、遠心分離又は限外濾過膜濃縮法によって回収して繰り返し加水分解反応に使用することもできる。また、加水分解反応における反応ｐＨは、特に限定されるものではないが、適当な緩衝剤または酸もしくはアルカリによって５〜１２の間に保てばよい。反応の温度は４〜８０℃、好ましくは２０〜６０℃に保てばよい。かかる加水分解反応により、用いた２−アミノニトリルに対応する２−アミノ酸が反応液中に生成される。
一般式［ＩＩ］で表わされる２−アミノ酸としては、例えば、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、フェニルグリシンなどが挙げられる。これら２−アミノ酸は生体触媒の光学選択性によってＤ型、Ｌ型あるいはラセミ体のアミノ酸として得られる。生成された２−アミノ酸は、濾過、濃縮、抽出、イオン交換樹脂などの常法によって分離精製することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を挙げて詳細に述べる。
実施例１  （ＮＳＳＣ１０４株によるＤＬ−メチオニンの製造）
（ＮＳＳＣ１０４株の培養）
酵母エキス０．５％、グルコース０．５％、リン酸水素二カリウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％、食塩０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２％、硫酸第一鉄０．００１％及びε−カプロラクタム０．５％を含む培地２ｍｌを試験管にとり１２１℃で２０分間滅菌した。下記の組成の培地２０ｍｌを１００ｍｌ容量のバッフル付き三角フラスコに入れた。アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ１０４株を前記の試験管に一白金耳植菌し、３３℃で一晩振盪培養した後、その０．２ｍｌを前記のバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、さらに４日間３３℃で振盪培養した。
コーンスチープリカー            ２．０％  （濾過滅菌）
スクロース                      １．０％  （１２１℃で２０分間滅菌）
ε−カプロラクタム              ０．５％  （１２１℃で２０分間滅菌）
ｐＨ                            ７．２  （２Ｎ苛性ソーダで調整）
（ＤＬ−メチオニンの生成）
得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ１０４株の培養液を遠心分離し、イオン交換水で洗浄した後、乾燥菌体濃度で０．４％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと１５０ｍＭエチレンジアミンを含む水溶液（ｐＨ１１．３）に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加４時間後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるメチオニンの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：エタノール／水／トリフルオロ酢酸＝５／９５／０．０４）を用いて定量した結果、１２５ｍＭのＤＬ−メチオニンの蓄積を確認した。
実施例２  （ＮＳＳＣ２０４株によるＤＬ−メチオニンの製造）
（ＮＳＳＣ２０４株の培養）
酵母エキス０．５％、グルコース０．５％、リン酸水素二カリウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％、食塩０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２％、硫酸第一鉄０．００１％及び２−アミノベンゾニトリル０．０３％を含む培地２ｍｌを試験管にとり１２１℃で２０分間滅菌した。下記の組成の培地２０ｍｌを１００ｍｌ容量のバッフル付き三角フラスコに入れた。アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株を前記の試験管に一白金耳植菌し、３３℃で一晩振盪培養した後、その０．２ｍｌを前記のバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、さらに４日間３３℃で振盪培養した。
コーンスチープリカー          ２．０％  （濾過滅菌）
スクロース                    １．０％  （１２１℃で２０分間滅菌）
２−アミノベンゾニトリル      ０．０３％  （１２１℃で２０分間滅菌）
ｐＨ                          ７．２  （２Ｎ苛性ソーダで調整）
（ＤＬ−メチオニンの生成）
得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株の培養液を遠心分離し、イオン交換水で洗浄した後、乾燥菌体濃度で０．１％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと２５ｍＭ  １，３−ジアミノプロパンを含む水溶液（ｐＨ１１．２）に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加４時間後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるメチオニンの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：エタノール／水／トリフルオロ酢酸＝５／９５／０．０４）を用いて定量した結果、１２５ｍＭのＤＬ−メチオニンの蓄積を確認した。
実施例３（ＩＡＭ１２３７４株によるＤＬ−メチオニンの製造）
（ＩＡＭ１２３７４株の培養）
０．３％肉汁、０．５％ペプトン及び０．５％食塩を含む培地２ｍｌを試験管に、下記の組成の培地２０ｍｌを１００ｍｌ容量のバッフル付き三角フラスコに入れ、各々１２１℃で１５分間滅菌した。バリオボラクス  パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＩＡＭ１２３７４株を前記の試験管に一白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養した後、その０．２ｍｌを前記のバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、さらに５日間３０℃で振盪培養した。
酵母エキス                      ０．５％
グリセロール                    ０．５％
リン酸一カリウム                ０．１％
リン酸二カリウム                ０．１％
食塩                            ０．０２％
硫酸マグネシウム７水塩          ０．０２％
ε−カプロラクタム              ０．５％
ｐＨ                            ７．２（２Ｎ苛性ソーダで調整）
（ＤＬ−メチオニンの生成）得られたバリオボラクス  パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＩＡＭ１２３７４株の培養液を遠心分離し、イオン交換水で洗浄した後、乾燥菌体濃度で２％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと１２５ｍＭ  ３−アミノ−１−プロパノールを含む水溶液（ｐＨ１１．７）に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加１０時間後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるメチオニンの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：エタノール／水／トリフルオロ酢酸＝５／９５／０．０４）を用いて定量した結果、１２０ｍＭのＤＬ−メチオニンの蓄積を確認した。
実施例４  （エチレンジアミンとＤＬ−メチオニンの生成速度の関係）
実施例２によって得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株の培養液を遠心分離し、乾燥菌体濃度で０．１％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと第１表に示した濃度のエチレンジアミンを含む０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ１１）に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加３０分後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるメチオニンの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：１０ｍＭリン酸二水素カリウム−１５ｍＭリン酸−３ｍＭヘキサンスルホン酸ナトリウム−２．０Ｍアセトニトリル水溶液）を用いて定量し、乾燥菌体１ｇ当たりのＤＬ−メチオニン生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）並びにＤＬ−メチオニンアミド生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）を計算した。結果を第１表に示す。第１表から１０ｍＭ〜２５０ｍＭのエチレンジアミンの添加によりＤＬ−メチオニンの生成速度が著しく向上すると共にＤＬ−メチオニンアミドの副生速度が低下することがわかる。
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実施例５  （１，３−ジアミノプロパン濃度とＤＬ−メチオニンの生成速度の関係）
実施例２によって得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株の培養液を遠心分離し、乾燥菌体濃度で０．１％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと第２表に示した濃度の１，３−ジアミノプロパンを含む０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ１１）に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加３０分後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるメチオニン及びメチオニンアミドの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：１０ｍＭリン酸二水素カリウム−１５ｍＭリン酸−３ｍＭヘキサンスルホン酸ナトリウム−２．０Ｍアセトニトリル水溶液）を用いて定量し、乾燥菌体１ｇ当たりのＤＬ−メチオニン生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）並びにＤＬ−メチオニンアミド生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）を計算した。結果を第２表に示す。第２表から２ｍＭ〜１００ｍＭの１，３−ジアミノプロパンの添加によりＤＬ−メチオニンの生成速度が著しく向上すると共にＤＬ−メチオニンアミドの副生速度が低下することがわかる。
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実施例６  （３−アミノ−１−プロパノール濃度とＤＬ−メチオニンの生成速度の関係）
実施例１によって得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ１０４株の培養液を遠心分離し、イオン交換水で洗浄した後、乾燥菌体濃度で０．３％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと第３表に示した濃度の３−アミノ−１−プロパノールを含む０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ１１）に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加３０分後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるＤＬ−メチオニンの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：１０ｍＭリン酸二水素カリウム−１５ｍＭリン酸−３ｍＭヘキサンスルホン酸ナトリウム−２．０Ｍアセトニトリル水溶液）を用いて定量し、乾燥菌体１ｇ当たりのＤＬ−メチオニンの生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）並びにＤＬ−メチオニンアミド生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）を計算した。結果を第３表に示す。第３表から２５ｍＭ〜２００ｍＭの３−アミノ−１−プロパノールの添加によりＤＬ−メチオニンの生成速度が著しく向上すると共にＤＬ−メチオニンアミドの副生速度が低下することがわかる。
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実施例７  （ＤＬ−メチオニンの生成速度と反応ｐＨの関係）
実施例２によって得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株の培養液を遠心分離し、乾燥菌体濃度で０．１％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと第４−１表に示したｐＨの０．１５Ｍエチレンジアミン−塩酸を含む緩衝液に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加３０分後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるメチオニン、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸及びメチオニンアミドの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：１０ｍＭリン酸二水素カリウム−１５ｍＭリン酸−３ｍＭヘキサンスルホン酸ナトリウム−２．０Ｍアセトニトリル水溶液）を用いて定量し、乾燥菌体１ｇ当たりのＤＬ−メチオニン生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）及びＤＬ−メチオニンアミド生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）を計算した。また対照として０．２Ｍリン酸水素二カリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液及び０．２Ｍ塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液を用いて同様の実験を行った。結果を第４−１表，第４−２表及び第４−３表に示す。これらの表から、エチレンジアミン−塩酸緩衝液を用いることにより、ｐＨ６〜１１の範囲でＤＬ−メチオニンの生成速度が著しく向上すると共に、ｐＨ９を超える領域ではＤＬ−メチオニンアミドの副生速度が著しく低減し、ｐＨ９以下では２−ヒドロキシ酸の副生速度が大きく低減することがわかる。
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実施例８  （各種アミンの添加濃度とＤＬ−メチオニンの生成速度の関係）
実施例２によって得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株の培養液を遠心分離し、乾燥菌体濃度で０．１％（Ｗ／Ｗ）となるように１３３ｍＭの２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルと第５表に示した濃度のアミンを含む水溶液に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加３０分後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるメチオニン及びメチオニンアミドの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：１０ｍＭリン酸二水素カリウム−１５ｍＭリン酸−３ｍＭヘキサンスルホン酸ナトリウム−２．０Ｍアセトニトリル水溶液）を用いて定量し、乾燥菌体１ｇ当たりのＤＬ−メチオニン生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）並びにＤＬ−メチオニンアミド生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃ）を計算した。なお対照実験としてアミン非添加の場合は、ｐＨを揃えるために０．１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ１０又はｐＨ１１）を添加した。結果を第５表に示す。第５表に示したアミンを添加することにより、ＤＬ−メチオニンの生成速度が著しく向上すると共に、ＤＬ−メチオニンアミドの副生速度が低減することがわかる。
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実施例９  （ＮＳＳＣ２０４株によるフェニルグリシンの製造）
（フェニルグリシンの生成）
実施例２で得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株の培養液を遠心分離し、イオン交換水で洗浄した後、乾燥菌体濃度で０．０１％（Ｗ／Ｗ）となるように３３ｍＭの２−アミノフェニルアセトニトリルと１５０ｍＭのエチレンジアミンを含む水溶液に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加６時間後に反応液を２倍体積のイオン交換水で希釈して生成物を溶解した後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるフェニルグリシンの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：１０ｍＭリン酸二水素カリウム−１５ｍＭリン酸−３ｍＭヘキサンスルホン酸ナトリウム−２．０Ｍアセトニトリル水溶液）を用いて定量した結果、３１ｍＭのフェニルグリシンの蓄積を確認した。
実施例１０（１，３−ジアミノプロパンとフェニルグリシンの生成速度の関係）
実施例２によって得られたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ２０４株の培養液を遠心分離し、乾燥菌体濃度で０．００２％（Ｗ／Ｗ）となるように３３ｍＭの２−アミノフェニルアセトニトリルと第６表に示した濃度の１，３−ジアミノプロパンを含む０．１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ１１）に懸濁し、３５℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加３０分後に遠心分離して菌体を除去し、残った反応液に含まれるフェニルグリシンの濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  東ソー製、キャリア：１０ｍＭリン酸二水素カリウム−１５ｍＭリン酸−３ｍＭヘキサンスルホン酸ナトリウム−２．０Ｍアセトニトリル水溶液）を用いて定量し、乾燥菌体１ｇ当たりのフェニルグリシン生成速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇｄｃを計算した。結果を第６表に示す。第６表から２〜１５ｍＭの１，３−ジアミノプロパンの添加によりフェニルグリシンの生成速度が著しく向上することがわかる。
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産業上の利用可能性
本発明によれば、２−アミノニトリルを直接の原料としてニトリル加水分解活性を有する生体触媒をアミンの存在下で用いることにより、副生成物の生成を抑制しつつ極めて高い生産速度で効率よく目的の２−アミノ酸を得ることができる。
寄託番号          ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９
寄託の日付        １９９６年２月６日
寄託機関の名称    独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）
寄託機関のあて名  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
寄託番号          ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６２
寄託の日付        ２０００年６月２２日
寄託機関の名称    独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）
寄託機関のあて名  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
【国際調査報告】
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