(57)【要約】ＷＮＴ−５Ａの機能阻害活性を有する化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤、発毛剤及び育毛剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＮＴ−５Ａの機能阻害活性を有する化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
【請求項２】
ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物がＷＮＴ−５Ａ産生抑制剤である、請求項１に記載の毛乳頭細胞増殖促進剤。
【請求項３】
式（Ｉ）
2003086334.tif 000069
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルカノイル基を示し、
Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは異なって水素原子又は水酸基を示し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は同一又は異なって水素原子、水酸基、ハロゲン原子、Ｃ２−６アルカノイルオキシ基を示すか、又は隣り合う基が一緒になってパイ結合又はエーテル結合を形成するか、あるいはＲ５とＲ８若しくはＲ５とＲ９が一緒になってエーテル結合を形成する。）で表される化合物。
【請求項４】
式（ＩＩ）
2003086334.tif 000070
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルカノイル基を示し、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示し、
Ｒ３ｃ及びＲ３ｄは同一又は異なって水素原子、水酸基又はＣ１−６アルコキシ基を示すか、あるいはＲ３ｃ及びＲ３ｄが一緒になってオキソ基、ヒドロキシイミノ基又はＣ１−６アルコキシイミノ基を形成し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は同一又は異なって水素原子、水酸基、ハロゲン原子、Ｃ２−６アルカノイルオキシ基を示すか、又は隣り合う基が一緒になってパイ結合又はエーテル結合を形成するか、あるいはＲ５とＲ８若しくはＲ５とＲ９が一緒になってエーテル結合を形成する。）で表される化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
【請求項５】
式（ＩＸ）
2003086334.tif 000071
［式中、Ｒ１ａ及びＲ２ａは同一又は異なって水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルカノイル基、
（ＣＨ２）ｐＣＯ−Ｙ−Ｒ１０（式中、Ｙは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ１０は水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は置換若しくは無置換のアリール基を示し、ｐは０又は１を示す。）で表される基、
（ＣＨ２）ｑＲ１１（式中、Ｒ１１は置換若しくは無置換のシクロアルキル基又は置換若しくは無置換のＣ２−１０ヘテロ環を示し、ｑは０又は１を示す。）で表される基、又はＣＯＲ１２（式中、Ｒ１２は置換若しくは無置換のアリール基又は置換若しくは無置換のＣ２−１０ヘテロ環を示す。）で表される基を示し、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示し、
Ｒ３ｅ及びＲ３ｆは同一又は異なって水素原子、水酸基、Ｃ１−６アルコキシ基又はＣ１−６アルカノイルオキシ基を示すか、又はＲ３ｅ及びＲ３ｆが一緒になってオキソ基、ヒドロキシイミノ基又はＣ１−６アルコキシイミノ基を形成し、Ｒ４ａ、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ、Ｒ７ａ、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一又は異なって水素原子、水酸基、ハロゲン原子又は
Ｚ−Ｒ１３（式中、Ｚは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ１３はＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルカノイル基又は置換若しくは無置換のアリール基を示す。）で表される基を示すか、
又は隣り合う基が一緒になってパイ結合又はエーテル結合を形成するか、
あるいはＲ５ａとＲ８ａ若しくはＲ５ａとＲ９ａが一緒になってエーテル結合を形成し、Ｒ６ｂは水素原子を示すか、あるいはＲ３ｅ若しくはＲ３ｆと一緒になってエーテル結合を形成する。］で表される化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
【請求項６】
請求項１、２、４又は５に記載の毛乳頭細胞増殖促進剤を有効成分とする発毛剤又は育毛剤。
【請求項７】
薬学的に有効量のＷＮＴ−５Ａの機能阻害活性を有する化合物をヒトに投与することを特徴とする、発毛又は育毛方法。
【請求項８】
発毛剤又は育毛剤の製造における、ＷＮＴ−５Ａの機能阻害活性を有する化合物の使用。
【請求項９】
ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物を選択することを特徴とする、毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
（ａ）ヒトＷＮＴ−５Ａ発現細胞を化合物を添加した培地を用いて培養する工程：
（ｂ）工程（ａ）で培養したヒトＷＮＴ−５Ａ発現細胞を溶解してＲＮＡを抽出し、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を測定する工程：及び
（ｃ）工程（ｂ）で測定したＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を比較する工程。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、毛乳頭細胞増殖促進剤、発毛剤及び育毛剤に関するものである。具体的には、ＷＮＴ−５Ａの機能阻害物質を有効成分とする毛乳頭細胞増殖促進剤、発毛剤及び育毛剤に関するものである。また、ＷＮＴ−５Ａ機能阻害作用に基づく毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法に関するものである。
背景技術
ヒト毛髪毛包は、角化細胞、毛乳頭細胞、繊維芽細胞及び脂腺細胞等の様々な上皮系及び真皮間様系の細胞から構成されており、これらの細胞間相互作用を介して、毛髪の成長サイクル（毛周期）が調節されている。毛の本体は、毛包角化細胞の増殖／分化（角化）により形成されるが、この毛包角化細胞の増殖、分化及びアポトーシスを制御し、毛周期調節の中心的な役割を担っているのは、毛乳頭である。したがって、発毛剤／育毛剤を開発する上で毛乳頭細胞に対する作用を研究することは重要と考えられる。しかし、これまでに毛乳頭細胞の増殖能及び毛周期調節能を制御する分子機構については、ほとんど明らかにされていない。
一方、ＷＮＴ−５Ａは、ＷＮＴファミリーに属する分泌性糖蛋白質である。ＷＮＴファミリーには、約２０種類の分子が存在し、各分子は線虫から哺乳類まで広く保存されている。これらＷＮＴｓは、胎生期の体軸形成や器官形成を制御する重要な細胞間シグナル分子であることが知られている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４，５９−８８（１９９８）、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１１，３２８６−３３０５（１９９７））。ＷＮＴｓの受容体は、７回膜貫通型のＦｒｉｚｚｌｅｄで、ヒトでは１０種類存在する（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４，５９−８８（１９９８）、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１１，３２８６−３３０５（１９９７））。ＷＮＴとＦｒｉｚｚｌｅｄの結合の組み合わせに依存して、３種類のシグナル伝達経路（ＷＮＴ／β−カテニン経路、ＰＣＰ経路、ＷＮＴ／Ｃａ２＋経路）が存在する（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４，５９−８８（１９９８））。
近年、ＷＮＴ／β−カテニン経路が毛包形成に重要であることが明らかにされた（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．８，２６９１−２７０３（１９９４）、Ｃｅｌｌ  ９５，６０５−６１４（１９９８）、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０７，１３３−１４９（１９９９）、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１４，１１８１−１１８５（２０００）、Ｃｅｌｌ  １０５，５３３−５４５（２００１））。１９９８年には、安定化β−カテニンの皮膚におけるトランスジェニックマウスが作製され、このマウスは毛包新生が亢進し多毛となることが報告された（Ｃｅｌｌ  ９５，６０５−６１４（１９９８））。また、２０００年には、毛乳頭細胞の毛包誘導能の維持に、ＷＮＴ／β−カテニンシグナルが重要であることが報告された（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１４，１１８１−１１８５（２０００））。
しかし、ＷＮＴ−５Ａからのシグナル伝達は、β−カテニン経路ではなく、Ｃａ２＋経路を介することが明らかにされており（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８２，１１４−１２０（１９９７）、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９，６９５−６９８（１９９９））、ＷＮＴ−５Ａと毛包新生との関連性については何ら報告はない。
この他、アフリカツメガエルＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡをヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ５  ｍＲＮＡとともにアフリカツメガエル初期胚に注入すると二次体軸が誘導する（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５，１６５２−１６５４（１９９７））一方、ＷＮＴ−１やＷＮＴ−８  ｍＲＮＡの注入により誘導される二次体軸形成をＷＮＴ−５Ａが抑制するという報告（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３３，１１２３−１１３７（１９９６））や、アフリカツメガエルＷＮＴ−５Ａは、ラットＦｒｉｚｚｌｅｄ２と結合し、Ｃａ２＋経路を介してＣａｍＫＩＩ（Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ）とＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ）が活性化されるなどの報告（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９，６９５−６９８（１９９９））があるが、生理的な意味は未だ解明されておらず、ＷＮＴ−５Ａと発毛／育毛との関連性についても何ら報告はない。
発明の開示
本発明は、毛乳頭細胞の増殖を制御する分子を用いたスクリーニング方法、毛乳頭細胞増殖促進剤並びに新規な作用に基づく発毛剤又は育毛剤を提供することを目的とする。
本発明者らは上記目的のため鋭意研究を行った結果、毛乳頭細胞にＷＮＴ−５Ａが高発現していること、ＷＮＴ−５Ａが毛乳頭細胞の増殖能に関与することを発見した。さらにこの知見に基づき検討を重ねた結果、ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害することにより毛乳頭細胞の増殖を顕著に促進し、毛包の毛球部位を増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の１態様によると、ＷＮＴ−５Ａの機能阻害活性を有する化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する。
また、本発明の他の態様によると、ＷＮＴ−５Ａ産生抑制作用を有する化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する。
また、本発明の他の態様によると、式（Ｉ）
2003086334.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルカノイル基を示し、
Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは異なって水素原子又は水酸基を示し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は同一又は異なって水素原子、水酸基、ハロゲン原子又はＣ２−６アルカノイルオキシ基を示すか、又は隣り合う基が一緒になってパイ結合又はエーテル結合を形成するか、あるいはＲ５とＲ８若しくはＲ５とＲ９が一緒になってエーテル結合を形成する。］で表される化合物を提供する。
また、本発明の他の態様によると、式（ＩＩ）
2003086334.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルカノイル基を示し、
Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示し、
Ｒ３ｃ及びＲ３ｄは同一又は異なって水素原子、水酸基又はＣ１−６アルコキシ基を示すか、あるいはＲ３ｃとＲ３ｄが一緒になってオキソ基、ヒドロキシイミノ基又はＣ１−６アルコキシイミノ基を形成し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は同一又は異なって水素原子、水酸基、ハロゲン原子又はＣ２−６アルカノイルオキシ基を示すか、又は隣り合う基が一緒になってパイ結合又はエーテル結合を形成するか、あるいはＲ５とＲ８若しくはＲ５とＲ９が一緒になってエーテル結合を形成する。］で表される化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する。
また、本発明の他の態様によると、式（ＩＸ）
2003086334.tif 000004
［式中、Ｒ１ａ及びＲ２ａは同一又は異なって水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルカノイル基、
（ＣＨ２）ｐＣＯ−Ｙ−Ｒ１０（式中、Ｙは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ１０は水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は置換若しくは無置換のアリール基を示し、ｐは０又は１を示す。）で表される基、
（ＣＨ２）ｑＲ１１（式中、Ｒ１１は置換若しくは無置換のシクロアルキル基又は置換若しくは無置換のＣ２−１０ヘテロ環を示し、ｑは０又は１を示す。）で表される基、又はＣＯＲ１２（式中、Ｒ１２は置換若しくは無置換のアリール基又は置換若しくは無置換のＣ２−１０ヘテロ環を示す。）で表される基を示し、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示し、
Ｒ３ｅ及びＲ３ｆは同一又は異なって水素原子、水酸基、Ｃ１−６アルコキシ基又はＣ１−６アルカノイルオキシ基を示すか、又はＲ３ｅとＲ３ｆが一緒になってオキソ基、ヒドロキシイミノ基又はＣ１−６アルコキシイミノ基を形成し、
Ｒ４ａ、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ、Ｒ７ａ、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一又は異なって水素原子、水酸基、ハロゲン原子又は
Ｚ−Ｒ１３（式中、Ｚは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ１３はＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルカノイル基又は置換若しくは無置換のアリール基を示す。）で表される基を示すか、又は隣り合う基が一緒になってパイ結合又はエーテル結合を形成するか、あるいはＲ５ａとＲ８ａ若しくはＲ５ａとＲ９ａが一緒になってエーテル結合を形成し、
Ｒ６ｂは水素原子を示すか、あるいはＲ３ｅ若しくはＲ３ｆと一緒になってエーテル結合を形成する。］で表される化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する。
また、本発明の他の態様によると、上記毛乳頭細胞増殖促進剤を有効成分とする発毛剤又は育毛剤を提供する。
また、本発明の他の態様によると、ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する物質を選択することを特徴とする、毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する物質を選択する方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とする毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法である。
（ａ）ヒトＷＮＴ−５Ａ発現細胞を被検化合物を添加した培地を用いて培養する工程：
（ｂ）工程（ａ）で培養したヒトＷＮＴ−５Ａ発現細胞を溶解してＲＮＡを抽出し、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を測定する工程：及び
（ｃ）工程（ｂ）で測定したＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を比較する工程。
発明の実施の形態
以下、本発明を更に具体的に説明する。
＜ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物＞
本発明において「ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物」（以下、「ＷＮＴ−５Ａ機能阻害剤」ということがある。）とは、ＷＮＴ−５ＡとＷＮＴ−５Ａ受容体の結合を阻害する化合物、又は、ＷＮＴ−５Ａの産生を抑制する化合物を意味し、好ましくはＷＮＴ−５Ａの産生を抑制する化合物である。
ＷＮＴ−５Ａは、ヒト、マウス、ラット、アフリカツメガエル等でその発現が確認されているＷＮＴファミリーに属する分泌性糖蛋白質であるが、医薬品として使用する点からヒトのＷＮＴ−５Ａ（配列番号１）機能を阻害する化合物が好ましい。
ＷＮＴ−５ＡとＷＮＴ−５Ａ受容体の結合を阻害する化合物とは、ＷＮＴ−５Ａ又はＷＮＴ−５Ａ受容体に作用することによりＷＮＴ−５ＡとＷＮＴ−５Ａ受容体の結合を阻害し、ＷＮＴ−５Ａによるシグナル伝達を抑制するものを意味し、好ましくはＣａ２＋経路を介したシグナル伝達を抑制する化合物であり、例えば、ＷＮＴ−５Ａ受容体アンタゴニストを挙げることができる。ＷＮＴ−５Ａ受容体としては、具体的には例えば、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ５（配列番号４）、ラットＦｒｉｚｚｌｅｄ２（配列番号６）を挙げることができる。当該化合物は、ペプチド性でも非ペプチド性でもよいが、作用時間が長い利点がある非ペプチド性の阻害剤が好ましい。また、当該化合物は、標識したＷＮＴ−５Ａ及びＷＮＴ−５Ａ受容体を用いたスクリーニング系により選択することができ、好ましくはＩＣ５０が３０μＭ以下のものであり、更に好ましくは１０μＭ以下のものである。
ＷＮＴ−５Ａ産生を抑制する化合物とは、ＷＮＴ−５Ａ遺伝子の発現を抑制する化合物を意味する。当該化合物は、ペプチド性でも非ペプチド性でもよいが、作用時間が長い利点がある非ペプチド性の阻害剤が好ましい。また、当該化合物は、ＷＮＴ−５Ａ蛋白質量（配列番号１）又はＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量（配列番号２）の減少を指標として選択することができ、好ましくはＨａｒｔｌｅｙらの方法（Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２８（５），６０８−６１６（２０００）、後述する試験例４）に準じた核酸プローブアッセイ方法によりＩＣ５０が３０μＭ以下のものであり、更に好ましくは１０μＭ以下のものである。
特に好ましくは、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＸ）で表される化合物である。
式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＸ）で表される化合物においてＣ１−６アルキル基とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、具体的には、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、２−エチルプロピル基、ヘキシル基等が挙げられる。
Ｃ１−６アルカノイル基とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状のアルカノイル基を意味し、具体的には、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｔ−ブチリル基等を挙げることができる。
Ｃ１−６アルコキシ基とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状のアルコキシ基を意味し、具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチロキシ基、イソペンチロキシ基、ネオペンチロキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチロキシ基、１−メチルブトキシ基、２−メチルブトキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、ヘキシロキシ基、イソヘキシロキシ基等が挙げられる。
Ｃ１−６アルコキシイミノ基とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状のアルコキシイミノ基を意味し、具体的には、例えばＮ−メトキシイミノ基、Ｎ−エトキシイミノ基、Ｎ−プロポキシイミノ基、Ｎ−イソプロポキシイミノ基、Ｎ−ブトキシイミノ基、Ｎ−イソブトキシイミノ基、Ｎ−ペンチルオキシイミノ基、Ｎ−ヘキシルオキシイミノ基等が挙げられる。
Ｃ１−６アルカノイルオキシ基とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状のアルカノイルオキシ基を意味し、具体的には、例えばアセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ピバロイルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ３−１０シクロアルキル基とは、炭素数３〜１０のシクロアルキル基を意味し、具体的には、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基等が挙げられる。
置換Ｃ３−１０シクロアルキル基の例としては、シクロアルキル基の水素原子をハロゲン原子、置換若しくは無置換のＣ１ー１０アルキル基、水酸基、Ｃ１−５ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、メルカプト基、インドリル基、Ｃ１−５アルキルチオ基、アミノ基、アミド基及びＣ１−５アルコキシ基からなる群より選ばれる１つ以上の基で置換されたシクロアルキル基を挙げることができる。
アリール基の例としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセン基等を挙げることができる。
置換アリール基の例としては、アリール基の水素原子をハロゲン原子、置換若しくは無置換のＣ１−１０アルキル基、水酸基、Ｃ１−５ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、メルカプト基、インダゾリル基、インドリル基、Ｃ１−５アルキルチオ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、アミド基、アセチルアミノ基及びＣ１−５アルコキシ基からなる群より選ばれる１つ以上の基で置換されたアリール基を挙げることができる。
Ｃ２−１０ヘテロ環の例としては、フラン、ピロール、チオフェン、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、ピラン、ピリジン、ピペリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、キノリン等を挙げることができる。
置換Ｃ２−１０ヘテロ環の例としては、ヘテロ環の水素原子をハロゲン原子、置換若しくは無置換のＣ１−１０アルキル基、水酸基、Ｃ１−５ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、メルカプト基、インダゾリル基、インドリル基、Ｃ１−５アルキルチオ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、アミド基、アセチルアミノ基及びＣ１−５アルコキシ基からなる群より選ばれる１つ以上の基で置換されたヘテロ環を挙げることができる。
エーテル結合とは、−Ｏ−、式−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｍ及びｎはそれぞれ１〜３の整数を表し、式中のアルキレン基はアルキル基で置換されていてもよい。）又は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（式中、ｍは１〜３の整数を表し、式中のアルキレン基はアルキル基で置換されていてもよい。）を意味する。
パイ結合又はエーテル結合を形成する隣り合う基の組み合わせとしては、（Ｒ４とＲ５）、（Ｒ５とＲ６）、（Ｒ６とＲ７）、（Ｒ７とＲ８及び（Ｒ８とＲ９）を挙げることができる（式（ＩＸ）におけるＲ４ａ〜Ｒ９ａも同様）。
式（ＩＸ）で表される化合物の中でより好ましくは式（Ｉ）で表される化合物であり、更に好ましくはＲ３ａが水素原子であり、Ｒ３ｂは水酸基である化合物である。また、化合物の安定性の点から、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）で表される化合物が好ましい。
［式（ＩＩ）において（Ｒ４とＲ５）及び（Ｒ６とＲ７）がパイ結合を形成する化合物］
2003086334.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ８、Ｒ９及びＸは前記と同意義である。）
［式（ＩＩ）において（Ｒ４とＲ５）がパイ結合を形成し、Ｒ６及びＲ７は水素原子をである化合物］
2003086334.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ８、Ｒ９及びＸは前記と同意義である。）
［式（ＩＩ）において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が水素原子である化合物］
2003086334.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ８、Ｒ９及びＸは前記と同意義である。）
また、式（ＩＸ）で表される化合物のうちＲ３ｅとＲ６ｂが一緒になってエーテル結合を形成し、（Ｒ３ｆとＲ４ａ）及び（Ｒ５ａとＲ６ａ）がパイ結合を形成する化合物（例えば化合物７７など）は、毛乳頭細胞におけるＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの発現を効果的に抑制し、毛乳頭細胞の増殖を促進する点で好ましい。
また、式（ＩＸ）で表される化合物のうちＲ１ａ、Ｒ２ａが、（ＣＨ２）ｐＣＯ−Ｙ−Ｒ１０（式中、Ｙは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ１０は水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は置換若しくは無置換のアリール基を示し、ｐは０又は１を示す。）で表される基である化合物（例えば化合物５２など）やＣＯＲ１２（式中、Ｒ１２は置換若しくは無置換のアリール基又は置換若しくは無置換のヘテロ環を示す。）で表される基である化合物（例えば化合物５８など）は、毛乳頭細胞におけるＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの発現を効果的に抑制し、毛乳頭細胞の増殖を促進する点で好ましい。
また、Ｒ７ａがＺ−Ｒ１３（式中、Ｚは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ１３はＣ２−６アルカノイル基又は置換若しくは無置換のアリール基を示す。）で表される基である化合物（例えば化合物５３など）は、毛乳頭細胞におけるＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの発現を効果的に抑制し、毛乳頭細胞の増殖を促進する点で好ましい。
式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、以下の製法を組み合わせることにより製造することができる。
2003086334.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ８、Ｒ９及びＸは前記と同意義である。）
式（ＩＩＩ）の化合物をパラジウム炭素などの触媒存在下、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチルアルコール、メチルアルコールなど）中、水素添加反応を行い、式（ＩＶ）若しくは式（ＩＶ’）の化合物、あるいはこれらの混合物を得る。これらの式（ＩＶ）及び式（ＩＶ’）の化合物はカラムクロマトグラフィーなど通常用いられる分離法にて分離精製することができる。
2003086334.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＸは前記と同意義である。）
式（Ｖ）の化合物を水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウムなどの還元剤と、必要に応じてＬｉＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣｅＣｌ３、ＣａＣｌ２、ＮｉＣｌ等の塩類の共存下有機溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチルアルコール、メチルアルコールなど）中、−２０〜１００℃、好ましくは０〜２０℃で反応させ、式（ＶＩ）の化合物を得る。式（ＶＩ）の化合物はカラムクロマトグラフィーなど通常用いられる分離法にて分離精製することができる。
2003086334.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＸは前記と同意義である。）
式（ＶＩＩ）の化合物を適当な有機溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチルアルコール、メチルアルコールなど）中、酸又は塩基で処理することにより、式（ＶＩＩＩ）の化合物を得る。
また、式（ＩＸ）で表される化合物（１，６０〜７８）の生産は、大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でＰｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ｖａｒ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ＴＦ−０４８０株を好気的条件下で培養することにより行う。
培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物質及び消泡剤を加えることができ、ｐＨは７前後に調整する。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独又は混合して用いる。窒素源としては、例えば肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コーンスティープ・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独又は混合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを単独又は混合して用いる。消泡剤としてはアデカノール、シリコン化合物を用いることができる。培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、ｐＨ４〜１０、２５〜３５℃で２〜５日間、望ましくは２５〜２８℃で３日間培養する。
この培養により生産された１、６０〜７８を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行えばよい。例えば次のような方法が効果的である。すなわち、培養終了後遠心分離又は濾過により培養濾液を得、ダイヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化学社製）などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。菌体は低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。次いでこの菌体抽出液及び吸着樹脂からの溶出液を合わせて減圧濃縮し、残った水層に酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ブタノールなどの有機溶媒を加え抽出し、抽出液を濃縮する。得られた残渣を再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カルムクロマトグラフィー及び逆層分配用ＯＤＳを充填したカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを行うことにより本発明化合物を精製単離することができる。
本発明の有効成分を生産する菌株は、本発明者らが土壌から新たに分離した菌株であり、微生物の名称「ポコニア  クラミドスポリア  バラエティー  クラミドスポリア  ＴＦ−０４８０（Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ｖａｒ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ＴＦ−０４８０）」及び微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３２」として，独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００３年３月１４日に寄託されている。
この菌株の菌学的性状を以下に示す。
１）培地上での生育状態
本菌は、各種寒天平板培地上で良好な生育を示し、試験した培地上で良好又は中程度に胞子を形成する。各種培地上、２６℃、２週間で形成したコロニーの特徴を次の表１に示した。なお色の表示は、Ａ．Ｋｏｒｎｅｒｕｐら著『Ｄｉｚｉｏｎａｒｉｏ  ｄｅｉ  ｃｏｌｏｒｉ』Ｍｕｓｔｅｒｓｃｈｍｉｄｔ（１９７８年）のカラーコードを引用した。
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２）形態
本菌がコーンミール寒天平板上、２６℃、１４日間の培養で形成したコロニーを、光学顕微鏡にて観察した結果、分生子形成様式はフィアロ型であった。分生子形成細胞（フィアライド）は菌糸上に直接単生又は２〜４個が輪生状に生じる、分生子柄は栄養菌糸との区別が不明瞭であった。分生子はフィアライドの先端で複数個形成され、粘塊状となる。フィアライドは先端部分が先細りの円筒形で、表面は平滑、無色、長さは１３−３５μｍ、太さは基部で０．８−１．７μｍ、先端付近では０．５−０．８μｍである。分生子は、楕円形から、まれに亜球形で、多くは基部がわずかに突出する。表面は平滑、無色、大きさは２．２−５．０×１．８−２．８μｍである。また、培地表面や培地上の菌糸から生じた短い柄の先端に淡黄色、多細胞、網状隔壁を有する厚膜胞子（ディクティオクラミドスポア）を単生する。わずかではあるが厚膜胞子は培地中でも形成される。厚膜胞子の大きさは、１４−２０×１２−２２μｍである。なお、培養を１カ月以上延長してもテレオモルフの形態は認められなかった。
３）生理的性質
▲１▼生育温度範囲及び最適温度
本菌株はｐＨ６．０のサブロー液体培地において、１５〜３１℃の範囲で生育し、最適温度は２５〜２７℃である。
▲２▼生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ
本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ３〜１０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。
４）好気性、嫌気性の区別；好気性
上記の形態的特徴及び培養上の性状から、▲１▼Ｋ．Ｈ．Ｄｏｍｓｃｈら著『Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｏｉｌ  ｆｕｎｇｉ  Ｖｏｌ．１』ＩＨＷ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８０年）、及び▲２▼Ｇ．Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ著『Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌ』Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９６８年）等に記載された多くの既知種と本菌の特徴を比較検討した結果、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａやＤｉｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａの分類名称で知られる不完全菌の一菌種と極めて良く一致しており、同一種であることが示唆された。なお、本菌種は、▲３▼Ｒ．Ｚａｒｅ，Ｗ．Ｇａｍｓ  ａｎｄ  Ｈ．Ｃ．Ｅｖａｎｓ『Ａ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｓｔｒａｔａ．Ｖ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｐｏｃｈｏｎｉａ，ｗｉｔｈ  ｎｏｔｅｓ  ｏｎ  Ｒｏｔｉｆｅｒｏｐｈｔｈｏｒａ』７３，１−２，ｐ５１−８６（２００１年）により分子系統学的な再検討が行われ、Ｐｏｃｈｏｎｉａ属を正式属名として再記載されており、さらに本菌のようにＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ型分生子が連鎖しない菌種に対し、Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ｖａｒ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａなる変種名が提唱されている。
以上のことから、本菌株を「ポコニア  クラミドスポリア  バラエティー  クラミドスポリア  ＴＦ−０４８０（Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ｖａｒ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ＴＦ−０４８０）」と命名した。
＜毛乳頭細胞増殖促進剤＞
本発明において「毛乳頭細胞増殖促進剤」とは、毛乳頭細胞の数を増加させる作用を有する医薬又は試薬を意味する。
本発明の毛乳頭細胞増殖促進剤は、ＷＮＴ−５Ａ機能の阻害作用に基づくことを特徴とする。ＷＮＴ−５Ａは、ＷＮＴ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路が活性化するＷＮＴ−１  ｃｌａｓｓのＷＮＴｓ（１、８など）の機能を抑制することから、ＷＮＴ−５Ａの機能の調整あるいはＷＮＴ−５Ａの発現を調整することにより毛乳頭細胞の増殖を制御する。したがって、優れたＷＮＴ−５Ａ機能の阻害作用を有すれば、全く構造の異なる化合物（例えば、化合物２４、化合物７９、化合物７など）であっても、優れた毛乳頭細胞増殖促進作用を有する。
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細胞の増殖は、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば適当な発色基質を用いた生細胞数計測、［３Ｈ］−チミジン取り込み法等を挙げることができる。発色基質としては、ＭＴＴ、ＭＴＳ、ＸＴＴ等のテトラゾリウム塩やアラマーブルーを用いることが好ましい。
＜発毛剤／育毛剤＞
本発明において「発毛剤又は育毛剤」とは、発毛誘導、毛成長促進、脱毛予防などの目的で使用されるものである。本発明の発毛剤／育毛剤を医薬として用いる場合、適用対象としては、例えば円形脱毛症や男性型脱毛症の改善あるいは予防などを挙げることができる。
また、本発明の発毛剤／育毛剤の効果は、ＷＮＴ−５Ａ機能の抑制に基づく毛乳頭細胞増殖促進作用によるものである。かかる作用機序により脱毛部毛乳頭において低下している細胞増殖能を亢進し、発達した毛乳頭組織を形成するため、これまでの育毛剤／発毛剤では効果がえられなかった症状にも有効であることが予想される。
さらに他の作用点を有する発毛剤、育毛剤との組み合わせにより相乗的な効果を期待できる。
本発明の発毛剤／育毛剤は、それぞれの化合物に基づき、種々の投与量及び投与形態で投与することができる。
投与量は、育毛剤の種類、投与形態により異なるが、例えば、式（ＩＸ）で表される化合物を塗布投与（ローション剤、軟膏剤、ゲル剤等）する場合、０．０００１〜１０重量％で投与することができ、好ましくは０．００１〜５重量％、更に好ましくは０．００１〜１重量％である。また、式（ＩＸ）で表される化合物を成人男性に経口投与（散剤、錠剤又はカプセル剤）する場合は、１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日とすることが好ましい。
本発明の発毛剤／育毛剤の投与形態は特に限定されるものではないが、外用での使用では、ＷＮＴ−５Ａ産生抑制剤、例えば式（ＩＸ）で表される化合物、を有効成分とする発毛剤／育毛剤は、水溶性組成物の形態で提供されることが好ましい。このような水溶性組成物の製造には、本発明の効果を損なわない限り医薬品、医薬部外品又は化粧品の製造に用いられる各種の添加物（保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤等）を配合することができる。本発明の発毛剤／育毛剤は、例えばヘアトニック、ヘアオイル、ヘアムース、ゲルなどの調髪用組成物、軟膏などとして提供することが可能である。
本発明の発毛剤及び育毛剤を液剤とする場合には、ＷＮＴ−５Ａ産生抑制剤、例えば式（ＩＸ）で表される化合物、を精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理的食塩水、リンガー溶液、ロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、グリセリン及び慣用される界面活性剤等と適当に組み合わせた滅菌された水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソーム又はエマルジョンとして調製され、頭皮用液状製剤として局所的に投与される。またその際、液状製剤を直接頭皮に塗布してもよく、スプレー等の射出ノズルを用いて塗布してもよい。
本発明の発毛剤及び育毛剤を半固形製剤とする場合には、ＷＮＴ−５Ａ産生抑制剤、例えば式（ＩＸ）で表される化合物を脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤、縣濁化剤等と混和して軟膏、クリーム等の外用として局所投与できる。
本発明の発毛剤及び育毛剤を固形製剤とする場合には、ＷＮＴ−５Ａ産生抑制剤、例えば式（ＩＸ）で表される化合物、を適当な添加剤と適宜混合して、散剤、粉剤等の外用剤として、又は、溶剤に用時溶解又は懸濁して頭皮に塗布するための固形製剤としてもよい。
また、経口での使用する場合には、ＷＮＴ−５Ａ産生抑制剤、例えば式（ＩＸ）で表される化合物、を製剤上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤など）、希釈剤、溶解補助剤などと配合して得られる医薬組成物を通常の方法に従って製剤して得られる錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、溶液剤などの形態で提供されることが望ましい。
なお、これらの製剤化は、通常の製剤化技術を使用することができる
＜スクリーニング方法＞
本発明はまた、ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物を選択することを特徴とする、毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法である。
ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物（以下、「ＷＮＴ−５Ａ機能阻害剤」ということがある。）を選択するとは、例えば、ＷＮＴ−５Ａ産生抑制剤を選択、即ちスクリーニングすることでもよく、また、ＷＮＴ−５Ａ受容体アンタゴニストを選択することでもよい。
本発明のスクリーニング方法に供される被検物質としては、任意の物質を使用することができる。被検物質の種類は特に限定されず、個々の低分子化合物でよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。また、化合物ライブラリー、コンビナトリアルライブラリーであってもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。スクリーニングの対象とする化合物は、医薬品として用いる観点から分子量３０００以下であることが好ましく、塗布／経口投与を可能とする観点から、分子量６００以下の低分子化合物であることが好ましい。
▲１▼ＷＮＴ−５Ａ受容体アンタゴニストのスクリーニング方法
ＷＮＴ−５Ａ受容体アンタゴニストのスクリーニング方法において、標識したＷＮＴ−５Ａ蛋白質及びＷＮＴ−５Ａ受容体を用いて、該標識を検出又は測定することにより、ＷＮＴ−５Ａ蛋白質とＷＮＴ−５Ａ受容体の結合の形成の有無を調べてもよい。標識としては、放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等）、酵素（アルカリフォスファターゼ、ホースラディシュパーオキシターゼ等）、蛍光物質（フルオロセインイソチオシアネート等）等を挙げることができる。これらは市販のものを入手することができ、公知の方法によって標識される。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ系の１つの具体例は、非細胞系において行われる。具体的にはＷＮＴ−５Ａ蛋白質又はＷＮＴ−５Ａ受容体のいずれか一方を支持体に結合させ、ここにもう一方と被検物質を加え、インキュベートした後洗浄して支持体に結合した蛋白質に対するもう一方の蛋白質の結合を検出又は測定すればよい。
蛋白質を結合させる支持体としては、例えば不溶性の多糖類、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、合成樹脂、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等が挙げられる。より具体的にはそれらを原料として製造される市販のビーズ、プレートが用いられる。
▲２▼ＷＮＴ−５Ａ産生抑制化合物のスクリーニング方法
ＷＮＴ−５Ａ産生抑制化合物のスクリーニングは、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量又はＷＮＴ−５Ａ蛋白質量を指標として行うことができる。また、ＷＮＴ−５Ａ遺伝子のプロモーター領域にレポーター遺伝子を連結して発現量を検出することもできる。ＷＮＴ−５Ａ遺伝子のプロモーターとしては、配列番号３を使用することが好ましい。
レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ遺伝子（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＵＳ遺伝子（β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ＬＵＣ遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ＣＡＴ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子を挙げることができる。
ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を指標とした場合としては、例えば、ヒトＷＮＴ−５Ａ発現細胞を用い、被検物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒのインキュベータ内で数時間培養後、細胞を溶解してＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲなどを用いてＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を測定することにより、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を減少させる活性を有する物質を探索することができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡに特異的なものであれば特に制限はなく、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの配列から設計することができるが、好ましくは、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＡＧＴＧＧＣ（配列番号８）及びＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＧＡＴＧＴＣＧＧＡＡＴＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡ（配列番号９）である。
ＷＮＴ−５Ａ蛋白質量を指標とした場合としては、例えば、ヒトＷＮＴ−５Ａ発現細胞を用い、被検物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒのインキュベータ内で数時間培養後、培養培地を用いて又は細胞を溶解して蛋白質を抽出し、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）等を用いてＷＮＴ−５Ａ蛋白質量を測定することにより、ＷＮＴ−５Ａ蛋白質発現量を減少させる活性を有する物質を探索することができる。
以下、実験例に基づき本発明を更に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１（化合物３、４）
ラディシコール（化合物１：１０．８ｇ）を酢酸エチル（１４０ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（ウェットタイプ）（２５５ｍｇ）を加え、水素置換（１気圧）し室温で３時間撹拌した。パラジウム炭素を濾過後、濾液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１で溶出させることで、目的化合物４（３．４３ｇ）を得、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２で溶出させることで、目的化合物３（４．１４ｇ）を得た。
実施例２（化合物７、８）
化合物３（６０２．５ｍｇ）をメタノール（１３ｍｌ）に溶解し、塩化セリウム（ＩＩＩ）７水和物（２．１４ｇ）を加え、室温で３０分間撹拌した。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（１８０ｍｇ）を氷冷しながら徐々に加えた後、室温で５分間撹拌した。反応液に飽和リン酸水素二ナトリウム（４０ｍｌ）を加え水（４０ｍｌ）で希釈した後、有機溶媒を減圧留去した。残った水層を酢酸エチル（３００ｍｌ×２）で抽出し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（２０ｃｍ×２０ｃｍ，１．０ｍｍ厚、クロロホルム：メタノール＝９３：７で展開、酢酸エチルで溶出）により粗精製した。得られた粗精製物を高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝６５：３５で溶出）により精製し、目的化合物（化合物７：１４４．９ｍｇ、化合物８：１３．８ｍｇ）を得た。
実施例３（化合物９，１０）
化合物４（２６．５ｍｇ）をメタノール（５ｍｌ）に溶解し、塩化セリウム（ＩＩＩ）７水和物（１００ｍｇ）を加え、室温で３０分間撹拌した。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（６０ｍｇ）を氷冷しながら徐々に加えた後、室温で３０分間撹拌した。反応液に飽和リン酸水素二ナトリウム（１２ｍｌ）を加え水（２０ｍｌ）で希釈した後、有機溶媒を減圧留去した。残った水層を酢酸エチル（３０ｍｌ×２）で抽出し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（２０ｃｍ×２０ｃｍ，０．２５ｍｍ厚、クロロホルム：メタノール＝９４：６で展開、酢酸エチルで溶出）により精製し、目的化合物（化合物９：５．７ｍｇ、化合物１０：８．８ｍｇ）を得た。
実施例４（化合物５）
ラディシコール（９１．５ｍｇ）をメタノール（５ｍｌ）に溶解し、塩化セリウム（ＩＩＩ）７水和物（８８ｍｇ）を加え、室温で１０分間撹拌した。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（６０ｍｇ）を氷冷しながら徐々に加えた後、室温で３０分間撹拌した。反応液に飽和リン酸水素二ナトリウム（２０ｍｌ）を加え水（２０ｍｌ）で希釈した後、有機溶媒を減圧留去した。残った水層を酢酸エチル（５０ｍｌ×３）で抽出し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（２０ｃｍ×２０ｃｍ，０．５ｍｍ厚、クロロホルム：メタノール＝９：１で展開、酢酸エチルで溶出）により精製し、目的化合物５（２７．２ｍｇ）を得た。
実施例５（化合物２）
ラディシコール（１５．３ｍｇ）をピリジン（１．５ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（４ｍｌ）を加え室温で６．５時間撹拌した後、反応液に氷水（２０ｍｌ）を加え酢酸エチル（２０ｍｌ）で抽出した。酢酸エチル層を水（２０ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（２０ｃｍ×２０ｃｍ，０．５ｍｍ厚、クロロホルム：メタノール＝９５：５で展開、酢酸エチルで溶出）により精製し、目的化合物２（１８．５ｍｇ）を得た。
実施例６（化合物１１）
ラディシコール（１９．０ｍｇ）をジメチルスルホキシド（１ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（３ｍｇ）とヨウ化メチル（４ｍｌ）を加え室温で６．５時間撹拌した。反応液に水（２０ｍｌ）を加え酢酸エチル（２０ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（２０ｃｍ×２０ｃｍ，０．５ｍｍ厚、クロロホルム：メタノール＝９５：５で展開、酢酸エチルで溶出）により精製し、目的化合物１１（１５．３ｍｇ）を得た。
実施例７（化合物１６、１７、１９、２３）
ラディシコール（９３０ｍｇ）を１，４−ジオキサン（１４ｍｌ）に溶解し、１規定塩酸（１２ｍｌ）を加え室温で２時間撹拌した後、水（４０ｍｌ）で希釈し酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。酢酸エチルを無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（２０ｃｍ×２０ｃｍ，１．０ｍｍ厚、クロロホルム：メタノール：ｎ−ヘキサン＝５：１：５で展開、酢酸エチルで溶出）により粗精製した。得られた粗精製物を高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝７０：３０〜４０：６０、グラジエントで溶出）により精製し、目的化合物（化合物１６：１１．４ｍｇ、化合物１７：１９．４ｍｇ、化合物１９：３２．６ｍｇ、化合物２３：１０３．７ｍｇ）を得た。
実施例８（化合物１２、１３）
ラディシコール（２３２．６ｍｇ）を１，４−ジオキサン（４ｍｌ）に溶解し、１規定塩酸（１ｍｌ）を加え室温で３０分間撹拌した後、１規定水酸化ナトリウムで中和した。溶媒を減圧濃縮後メタノールを２０ｍｌ加えて溶解させ、綿栓濾過後メタノールを減圧留去した。得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝６５：３５で溶出）により精製し、目的化合物（化合物１２：４２．６ｍｇ、化合物１３：１０．４ｍｇ）を得た。
実施例９（化合物１８）
５ｍｌのジメチルホルムアミドに１ｍｌのオキシ塩化リンを氷冷しながら滴下した後、室温で３０分間撹拌した。この溶液をラディシコール（９８．５ｍｇ）のジメチルホルムアミド溶液（４ｍｌ）に氷冷しながら徐々に加えた後、室温で２４時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で希釈した後、水（１００ｍｌ×３）で洗浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（２０ｃｍ×２０ｃｍ，０．５ｍｍ厚、クロロホルム：メタノール＝９４：６で展開、酢酸エチルで溶出）により精製し、目的化合物（化合物１８）（６１．８ｍｇ）を得た。
実施例１０（化合物１４、１５）
ラディシコール（３７８ｍｇ）を１，４−ジオキサン（４ｍｌ）に溶解し、１規定塩酸（１ｍｌ）を加え室温で２０分間撹拌した後、１規定水酸化ナトリウムで中和した。溶媒を減圧濃縮後メタノールを２０ｍｌ加えて溶解させ、綿栓濾過後メタノールを減圧留去した。得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝７０：３０で溶出）により精製し、目的化合物（化合物１４：１０．７ｍｇ、化合物１５：９．９ｍｇ）を得、同時に化合物１２（４０．６ｍｇ）も得られた。
実施例１１（化合物２０、２１、２２）
化合物３（９６．３ｍｇ）を１，４−ジオキサン（２ｍｌ）に溶解し、１規定塩酸（２．５ｍｌ）を加え室温で１６時間撹拌した後、１規定水酸化ナトリウムで中和した。溶媒を減圧濃縮後メタノールを２０ｍｌ加えて溶解させ、綿栓濾過後メタノールを減圧留去した。得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝４５：５５で溶出）により精製し、目的化合物（化合物２０：９．３ｍｇ、化合物２１：２２．０ｍｇ、化合物２２：２６．２ｍｇ）を得た。
実施例１２（化合物２５、２６）
化合物７（３４ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解し、水酸化カリウム（３ｍｇ）とヨウ化メチル（５００μｌ）を加え室温で４．５時間撹拌した。反応液に水（２０ｍｌ）を加え酢酸エチル（２０ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３８：６２）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物２５（６．４ｍｇ，３９ｍｉｎ）、化合物２６（１４．５ｍｇ，２９ｍｉｎ）を得た。
実施例１３（化合物２７）
化合物７（５５ｍｇ）をピリジン（１ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（３ｍｌ）を加えた後、室温で１７時間撹拌した。反応液に水（５０ｍｌ）を加え酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（６０：４０）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を減圧濃縮して、化合物２７（６４．７ｍｇ，１８ｍｉｎ）を得た。
実施例１４（化合物２８、２９）
化合物８（１３１ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解し、水酸化カリウム（３ｍｇ）とヨウ化メチル（２ｍｌ）を加え室温で７時間撹拌した。反応液に水（４０ｍｌ）を加え酢酸エチル（４０ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３８：６２）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物２８（１４．２ｍｇ，５２ｍｉｎ）、化合物２９（３１．７ｍｇ，３７ｍｉｎ）を得た。
実施例１５（化合物３０）
化合物８（７２ｍｇ）をピリジン（２ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（２ｍｌ）を加えた後、室温で１７時間撹拌した。反応液に水（５０ｍｌ）を加え酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（５３：４７）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を減圧濃縮して、化合物３０（４５．５ｍｇ，３０ｍｉｎ）を得た。
実施例１６（化合物３１）
ラディシコール（１０．８ｇ）を酢酸エチル（１４０ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（ウェットタイプ）（２５５ｍｇ）を加え、水素置換（１気圧）し室温で３時間撹拌した。パラジウム炭素を濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］にて精製し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（２：１）で溶出させることで、化合物４（３．４３ｇ）を得、またｎ−ヘキサン：酢酸エチル（３：２）で溶出させることで、化合物３（４．１４ｇ）を得た。化合物３と化合物４の間の画分（３．０８ｇ）の一部（５００ｍｇ）を少量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３８：６２）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物３（１７７．８ｍｇ）とともに化合物３１（２０．７ｍｇ，２３ｍｉｎ）を得た。
実施例１７（化合物３２，３３，３４）
ラディシコール（１１．９ｇ）を酢酸エチル（１６０ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（ウェットタイプ）（３００ｍｇ）を加え、水素置換（１気圧）し室温で３時間撹拌した。パラジウム炭素を濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］にて精製し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（２：１）で化合物４を溶出させ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（３：２）で化合物３を溶出させた。さらにｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１）で溶出した画分を減圧濃縮し、粗精製物（９３６ｍｇ）を得た。得られた粗精製物を少量のアセトンに溶解し、、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３４：６６）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、３つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物３２（１７．４ｍｇ，１７ｍｉｎ）、化合物３３（４９．４ｍｇ，１８ｍｉｎ）及び化合物３４（３４７．４ｍｇ，２１ｍｉｎ）を得た。
実施例１８（化合物３５）
ラディシコール（２１０ｍｇ）をピリジン（４ｍｌ）に溶解し、室温でヒドロキシルアミン塩酸塩（１８０ｍｇ）を加えた後、４０℃に昇温し２．５時間撹拌した。室温に戻した後、水（１００ｍｌ）を加え酢酸エチル（８０ｍｌ）で抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）、厚さ０．５ｍｍ］にてクロロホルム−メタノール（９０：１０）を展開溶媒として精製し、Ｒｆ値が０．６５の部分を回収して酢酸エチルで抽出、減圧濃縮して化合物３５（４０．０ｍｇ）を得た。
実施例１９（化合物３６，３７，３８，３９）
ラディシコール（１１．９ｇ）を酢酸エチル（１６０ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（ウェットタイプ）（３００ｍｇ）を加え、水素置換（１気圧）し室温で３時間撹拌した。パラジウム炭素を濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］にて精製し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（２：１）で溶出した画分を減圧濃縮し、化合物４を主成分とする画分（１５３７ｍｇ）を得た。この画分をメタノール（２１ｍｌ）／テトラヒドロフラン（７ｍｌ）に溶解し、塩化セリウム（ＩＩＩ）７水和物（２１３０ｍｇ）を加え、室温で３０分間撹拌した。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（７９０ｍｇ）を氷冷しながら徐々に加えた後、室温で１０分間撹拌した。反応液を水（３０ｍｌ）で希釈した後１規定塩酸水溶液を加えｐＨを中性にした後、さらに水（３０ｍｌ）で希釈する。水層を酢酸エチル（１００ｍｌ×２）で抽出し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去し、ガム状物質（１．４６ｇ）を得た。得られた物質をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、ｎ−ヘキサンで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（４００ｍｌ）に吸着させた。ｎ−ヘキサン−酢酸エチルの混合溶媒で順次溶出し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：１）で化合物４を溶出させた後、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（３：２）で溶出し、画分（１）（１９０ｍｇ）、画分（２）（３９８ｍｇ）をそれぞれ減圧濃縮することで得た。
画分（１）を少量のテトラヒドロフランで溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３５：６５）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、３つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物９（８７．２ｍｇ）とともに化合物３６（１１．３ｍｇ，２０ｍｉｎ）、化合物３８（１０．１ｍｇ，２５ｍｉｎ）を得た。
また画分（２）を少量のテトラヒドロフランで溶解し、画分（１）と同条件で分取高速液体クロマトグラフィーにて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物３７（１９．８ｍｇ，２５ｍｉｎ）、化合物３９（２３．２ｍｇ，２７ｍｉｎ）を得た。
実施例２０（化合物４０，４１）
化合物７（６１ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解し、水酸化カリウム（５ｍｇ）と１−ブロモブタン（１ｍｌ）を加え室温で３．５時間撹拌した。反応液に水（２０ｍｌ）を加え酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）を移動層として（６０：４０）〜（９０：１０）のグラジエントをかけ、分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物４０（２５．６ｍｇ，３３ｍｉｎ）、化合物４１（２１．４ｍｇ，４０ｍｉｎ）を得た。
実施例２１（化合物４２，４３）
化合物７（６７ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解し、水酸化カリウム（５ｍｇ）と１−ブロモヘキサン（１ｍｌ）を加え室温で３．５時間撹拌した。反応液に水（２０ｍｌ）を加え酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）を移動層として（６０：４０）〜（９０：１０）のグラジエントをかけ、分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物４２（２４．９ｍｇ，３８ｍｉｎ）、化合物４３（３２．９ｍｇ，５３ｍｉｎ）を得た。
実施例２２（化合物４４）
化合物７（６２ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解し、水酸化カリウム（５ｍｇ）と１−ブロモプロパン（１ｍｌ）を加え室温で１．５時間撹拌した。反応液に水（２０ｍｌ）を加え酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）を移動層として（４５：５５）〜（８５：１５）のグラジエントをかけ、分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を減圧濃縮して、化合物４４（４５．３ｍｇ，３８ｍｉｎ）を得た。
実施例２３（化合物４５）
化合物７（６４ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解し、水酸化カリウム（５ｍｇ）と２−（ブロモメチル）シクロヘキサン（２ｍｌ）を加え室温で７時間撹拌した。反応液に水（２０ｍｌ）を加え酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）を移動層として（６５：３５）〜（８５：１５）のグラジエントをかけ、分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を減圧濃縮して、化合物４５（２４．７ｍｇ，７０ｍｉｎ）を得た。
実施例２４（化合物４６）
化合物７（２００ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、臭化水素酸（５ｍｌ）を加え１１０℃で６時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（１５０ｍｌ）を加え炭酸水素ナトリウム（１５０ｍｌ×２）で洗浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣を少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）を移動層として（３８：６２）〜（５０：５０）のグラジエントをかけ、分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を分取し減圧濃縮して、化合物４６（１７．０ｍｇ，１８ｍｉｎ）を得た。
実施例２５（化合物４７）
化合物６２（１５４ｍｇ）を酢酸エチル（５ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（ウェットタイプ）（３０ｍｇ）を加え、水素置換（１気圧）し室温で９０分間撹拌した。パラジウム炭素を濾過後、濾液を減圧濃縮して、化合物４７（１３４．８ｍｇ）を得た。
実施例２６（化合物４８）
化合物６１（２１１ｍｇ）を酢酸エチル（１１ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（ウェットタイプ）（４２ｍｇ）を加え、水素置換（１気圧）し室温で９０分間撹拌した。パラジウム炭素を濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣（１８４ｍｇ）を分取薄層クロマトグラフィー［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）、２０ｃｍ×２０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍ］にてクロロホルム−メタノール（９５：５）を展開溶媒として精製し、Ｒｆ値が０．５の部分を回収して酢酸エチルで抽出した後、減圧濃縮して化合物４８（１５９．７ｍｇ）を得た。
実施例２７（化合物４９，５０）
化合物６１（２３３ｍｇ）をメタノール（１０ｍｌ）／テトラヒドロフラン（２ｍｌ）に溶解し、塩化セリウム（ＩＩＩ）７水和物（７５４ｍｇ）を加え、室温で３０分間撹拌した。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（２３６ｍｇ）を氷冷しながら徐々に加えた後、室温で１０分間撹拌した。反応液を水（３０ｍｌ）で希釈した後１規定塩酸水溶液（３ｍｌ）を加えｐＨを中性にした後、さらに水（３０ｍｌ）で希釈する。水層を酢酸エチル（１００ｍｌ×２）で抽出し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去し、白色粉末（２６７ｍｇ）を得た。得られた粉末を少量のメタノールで溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（４５：５５）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物４９（４９．３ｍｇ，１９ｍｉｎ）、化合物５０（１８４．６ｍｇ，２１ｍｉｎ）を得た。
実施例２８（化合物５１）
化合物６２（１９１ｍｇ）をメタノール（１０ｍｌ）／テトラヒドロフラン（４ｍｌ）に溶解し、塩化セリウム（ＩＩＩ）７水和物（６４１ｍｇ）を加え、室温で３０分間撹拌した。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（２１６ｍｇ）を氷冷しながら徐々に加えた後、室温で１０分間撹拌した。反応液を水（３０ｍｌ）で希釈した後１規定塩酸水溶液（３ｍｌ）を加えｐＨを中性にした後、さらに水（３０ｍｌ）で希釈する。水層を酢酸エチル（１００ｍｌ×２）で抽出し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去し、無色油状物質（１８２ｍｇ）を得た。得られたオイルを少量のメタノールで溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３０：７０）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を減圧濃縮して、化合物５１（１３７．３ｍｇ，２９ｍｉｎ）を得た。
実施例２９（化合物５２）
ラディシコール（２０５ｍｇ）をアセトン（１０ｍｌ）に溶解し、Ｓ−クロロアセチルチオフェノール（３３０ｍｇ）及び炭酸カリウム（３１０ｍｇ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０ｇ、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：２）により粗精製した。得られた粗精製物を高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝６５：３５で溶出）により精製し、化合物５２（１０５ｍｇ）を得た。
実施例３０（化合物５３）
ラディシコール（４０６ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍｌ）に溶かし、氷冷下トリエチルアミン（５７．６ｍｇ）及びチオフェノール（２６０ｍｇ）を加え、引き続き氷冷下一晩攪拌した。反応液に希塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧乾固させた。得られた残渣のうちの２３８ｍｇを高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝６５：３５で溶出）により精製し、化合物５３（４６．０ｍｇ）を得た。
実施例３１（化合物５４，５５）
ラディシコール（３７８ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍｌ）に溶かし、氷冷下トリエチルアミン（５６．４ｍｇ）及びチオ酢酸（１６３ｍｇ）を加え、引き続き氷冷下一晩攪拌した。反応液に希塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧乾固させた。得られた残渣のうちの２３８ｍｇを高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝６５：３５で溶出）により精製し、化合物５４（４９．０ｍｇ）、化合物５５（１５．７ｍｇ）を得た。
実施例３２（化合物５６）
ラディシコール（１３１ｍｇ）をアセトン（１０ｍｌ）に溶解し、ブロモ酢酸メチル（２１９ｍｇ）及び炭酸カリウム（１８３ｍｇ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応液に希塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥して、減圧乾固させた。得られた残渣を酢酸エチルより再結晶して化合物５６（８１．８ｍｇ）を得た。
実施例３３（化合物５７）
化合物７（１１６ｍｇ）をアセトン（１０ｍｌ）に溶解し、ブロモ酢酸メチル（３３０ｍｇ）及び炭酸カリウム（２７６ｍｇ）を加え、室温で３日間攪拌した。反応液に希塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧乾固させた。得られた残渣を酢酸エチルより再結晶して化合物５７（２７．７ｍｇ）を得た。
実施例３４（化合物５８）
ラディシコール（１０３ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍｌ）に溶解し、ニコチン酸（１９０ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２７０ｍｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（３７．７ｍｇ）を加え、室温で３．５時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧乾固させた。得られた残渣をアセトン−水より再結晶して化合物５８（９４．５ｍｇ）を得た。
実施例３５（化合物５９）
化合物５６（３１２ｍｇ）をメタノール（６０ｍｌ）に懸濁し、水酸化カリウム（２０６ｍｇ）−水（２０ｍｌ）を加え室温で１５分攪拌した。反応液に希塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧乾固させた。得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー（２０φ×２５０ｍｍ，ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，水（酢酸添加、ｐＨ３．５）：アセトニトリル＝６５：３５で溶出）により精製し、化合物５９（１０．６ｍｇ）を得た。
実施例３６（化合物６０，６１，６２，６３，６８，７０）
グルコース２．０％、マンニトール４．０％、オートミール２．０％、酵母エキス０．４％、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．００１％、硫酸亜鉛（ＩＩ）７水和物０．００１％、硫酸マンガン（ＩＩ）４−５水和物０．００１％、硫酸銅（ＩＩ）５水和物０．０００５％からなるｐＨ６の無菌液体培地にＰｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ｖａｒ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ  ＴＦ−０４８０株を接種し、２６℃、７２時間振盪培養した。次に５０Ｌ容ジャー１基を用いて、種培養と同じ組成の無菌培地３０Ｌに前記種培養液３００ｍｌを接種し、２６℃、１４４時間撹拌通気培養した。培養終了後培養液を遠心分離し、菌体と上清に分離した。上清を１．５ＬのＨＰ−２０（商品名、三菱化学社製）に吸着させ、水で洗浄した後３Ｌのメタノールで溶出した。この溶出液を減圧濃縮後、得られた水層を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮し褐色シロップ状物質６０ｇを得た。
培養エキスの一部（３０ｇ）をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、ｎ−ヘキサンで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（１６００ｍｌ）に吸着させた。ｎ−ヘキサン−酢酸エチルの混合溶媒で順次溶出し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）溶出画分（１３０ｍｇ）、（２：１）溶出画分（１）（１．８８ｇ）、（２）（７８０ｍｇ）、（１：２）溶出画分（３．５６ｇ）を得た。ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）溶出画分（１３０ｍｇ）を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（５５：４５）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物６３（２３．５ｍｇ，２０ｍｉｎ）、化合物７０（４．８ｍｇ，２４ｍｉｎ）を得た。
またｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：１）溶出画分（１）（１．８８ｇ）をアセトン（３０ｍｌ）で再結晶し、化合物６１（２７７ｍｇ）を得、溶出画分（２）（７８０ｍｇ）を分取薄層クロマトグラフィー［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）、２０ｃｍ×２０ｃｍ、厚さ１ｍｍ］にてｎ−ヘキサン−アセトン（３：２）を展開溶媒として精製し、Ｒｆ値が０．４の部分を回収して酢酸エチルで抽出した後、減圧濃縮して化合物６０（８０．３ｍｇ）を得た。次にｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：２）溶出画分（３．５６ｇ）をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、クロロホルムで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（８８０ｍｌ）に吸着させた。クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出し、クロロホルム−メタノール（９８：２）溶出画分（９２６ｍｇ）を得、アセトン−メタノール（１ｍｌ／３ｍｌ）で再結晶することで化合物６２（３３９ｍｇ）を得た。またクロロホルム−メタノール（９７：３）溶出画分（１．４２ｇ）をセファデックスＬＨ−２０（商品名、アマシャムファルマシアバイオテク社製）（メタノール、９００ｍｌ）のカラムクロマトグラフィー、続いてアセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３０：７０）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を減圧濃縮して、化合物６８（４．５ｍｇ，２１ｍｉｎ）を得た。
実施例３７（化合物６４，６５，７１，７２，７６）
実施例３６と同様にして得た培養エキスの一部（３０ｇ）をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、クロロホルムで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（７００ｍｌ）に吸着させた。クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出し、クロロホルム−メタノール（９３：７）溶出画分を２つに分け、画分（１）（１５６ｍｇ）、（２）（１６４ｍｇ）とした。画分（１）を少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３０：７０）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、４つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物６４（３５．４ｍｇ，２１ｍｉｎ）、化合物７２（１３．７ｍｇ，２７ｍｉｎ）、化合物７１（６．６ｍｇ，２９ｍｉｎ）、化合物６５（４．１ｍｇ，３３ｍｉｎ）を得た。また画分（２）を同条件の分取高速液体クロマトグラフィーにて精製し、得られた画分を分取し減圧濃縮して、化合物７１（３．７ｍｇ）とともに化合物７６（４．５ｍｇ，２０ｍｉｎ）を得た。
実施例３８（化合物６９，７４）
実施例３６と同様にして得た培養エキス（３９．５ｇ）をｎ−ヘキサン（３００ｍｌ×２）で溶解し、生成する沈殿を濾過し溶媒を除去した。得られた沈殿（８．１ｇ）をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、クロロホルムで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（６５０ｍｌ）に吸着させた。クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出し、クロロホルム−メタノール（８８：１２）溶出画分（３１８ｍｇ）を得た。得られた画分を少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（３０：７０）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、化合物７４（１５．３ｍｇ，１９ｍｉｎ）、化合物６９（８．０ｍｇ，３８ｍｉｎ）を得た。
実施例３９（化合物６６）
実施例３６と同様にして得た培養エキス（３９．５ｇ）をｎ−ヘキサン（３００ｍｌ×２）で溶解し、生成する沈殿を濾過し溶媒を除去した。得られた沈殿（８．１ｇ）をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、クロロホルムで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（６５０ｍｌ）に吸着させた。クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出し、クロロホルム−メタノール（１００：０）溶出画分（１．５ｇ）を得た。続いてｎ−ヘキサン−酢酸エチルの混合溶媒でシリカゲルカラム（６２０ｍｌ）を行い、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：１）溶出画分（３２１ｍｇ）を得た。得られた画分を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（４５：５５〜７０：３０、グラジエント）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、化合物６６（１４．４ｍｇ，３４ｍｉｎ）を得た。
実施例４０（化合物７３，７７，７８）
実施例３６と同様にして得た培養エキス（５００ｇ）をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、クロロホルムで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（６０００ｍｌ）に吸着させた。クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出し、クロロホルム−メタノール（９５：５）溶出画分（５７ｇ）を得、その一部（１８ｇ）をさらにｎ−ヘキサン−酢酸エチルの混合溶媒でシリカゲルカラム（８００ｍｌ）を行い、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：１）溶出画分を２つに分け、画分（１）（１２６ｍｇ）、（２）（９８５ｍｇ）とした。画分（１）を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（５５：４５）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、得られた画分を減圧濃縮して、化合物７８（１３．４ｍｇ，２６ｍｉｎ）を得た。また画分（２）を移動層をアセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（４５：５５）とした分取高速液体クロマトグラフィーにて精製し、２つの画分を分取しそれぞれ減圧濃縮して、化合物７３（３８．１ｍｇ，１０ｍｉｎ）、化合物７７（６７．２ｍｇ，２６ｍｉｎ）を得た。
実施例４１（化合物６７，７５）
実施例３６と同様にして得た培養エキス（５００ｇ）をクロロホルム−メタノール（４：１）の混合溶媒に溶解し、クロロホルムで湿潤させて調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）］のカラム（６０００ｍｌ）に吸着させた。クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出し、クロロホルム−メタノール（９５：５）溶出画分（５７ｇ）を得、その一部（１８ｇ）をさらにｎ−ヘキサン−酢酸エチルの混合溶媒でシリカゲルカラム（８００ｍｌ）を行い、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：２）溶出画分（８９０ｍｇ）を得た。得られた画分を少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル−水（ｐＨ３．５、酢酸）（４０：６０）を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３４３（２０φ×２５０ｍｍ）、検出ＵＶ吸収２５４ｎｍ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、２つの画分を分取し得られた画分を減圧濃縮して、化合物６７（１７．４ｍｇ，１１ｍｉｎ）とともにセミピュアサンプル（２３．９ｍｇ）を得た。セミピュアサンプルを分取薄層クロマトグラフィー［Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）、２０ｃｍ×２０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍ］にてクロロホルム−メタノール（９０：１０）を展開溶媒として精製し、Ｒｆ値が０．５の部分を回収して酢酸エチルで抽出後、減圧濃縮して化合物７５（４．３ｍｇ）を得た。
上記実施例にて合成した化合物及び精製した化合物並びにそのデータを表２に示す。
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試験例１  毛乳頭細胞におけるＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの発現
ヒト毛乳頭細胞は、東洋紡から購入し、１２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（インビトロジェン）を用いて培養した。ヒト毛包角化細胞は、荒瀬らの方法（Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．２，６６−７０（１９９１））に従って、抜毛髪から分離しＫＧＭ−２（三光純薬）を用いて培養した。
継代５回目の毛乳頭細胞及び継代２回目の毛包角化細胞を、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１０ｃｍシャーレに播種し、二晩培養した。培地を除去し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５０ｎｇ、ＷＮＴ−５Ａ又はｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）特異的なプライマー（ＷＮＴ−５Ａ  ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＡＧＴＧＧＣ（配列番号８）、ＷＮＴ−５Ａ  ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＡＴＧＴＣＧＧＡＡＴＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡ（配列番号９）、ＧＡＰＤＨ  ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号１０）、ＧＡＰＤＨ  ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号１１））各０．４μＭ、及びＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ（インビトロジェン）を用いて、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ添付のプロトコールに従い、全量２５μｌの反応系で、５０℃で３０分間ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ合成を行った後、９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２３又は２０サイクル繰り返し、各ｃＤＮＡ断片を増幅した。
この反応液を、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色した。結果を図１に示す。
毛乳頭細胞（ＤＰＣ）由来のＲＮＡを用いた場合は、ＷＮＴ−５Ａ特異的なプライマーを用いた２３サイクルのＰＣＲにおいて、顕著なｃＤＮＡ断片の増幅が認められた。一方、毛包角化細胞（ＨＦＣ）由来のＲＮＡを用いた場合は、同条件において、増幅産物は認められなかった。
試験例２  ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少活性の測定
ヒト毛乳頭細胞は、東洋紡から購入し、１２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（インビトロジェン）を用いて培養した。
継代５回目の毛乳頭細胞を、１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１２穴プレートに播種し、一晩培養した。化合物無添加培地、又は化合物１、２、３、４、５、７、９又は２４添加培地と交換し、更に２４時間、培養を行った。培養終了時、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５０ｎｇ、ＷＮＴ−５Ａ又はＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（ＷＮＴ−５Ａ  ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＡＧＴＧＧＣ（配列番号８）、ＷＮＴ−５Ａ  ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＡＴＧＴＣＧＧＡＡＴＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡ（配列番号９）、ＧＡＰＤＨ  ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号１０）、ＧＡＰＤＨ  ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号１１））各０．４μＭ、及びＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ（インビトロジェン）を用いて、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ添付のプロトコールに従い、全量２５μｌの反応系で、５０℃で３０分間ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ合成を行った後、９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で３０秒，５５℃で３０秒，７２℃で３０秒を２３又は２０サイクル繰り返し、ＷＮＴ−５Ａ又はＧＡＰＤＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。
この反応液を、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色した。結果を図２に示す。
ＷＮＴ−５Ａ特異的なプライマーを用いた２３サイクルのＰＣＲにおいて、化合物無添加で培養した場合と比較して、化合物を添加した培養では、ＷＮＴ−５Ａ  ｃＤＮＡ断片の増幅が顕著に減少した。
一方、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマーを用いた２０サイクルのＰＣＲにおいて、ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ断片の増幅は、化合物の添加の有無に関わらず、変動が認められなかった。
試験例３  毛乳頭細胞増殖促進活性試験
ヒト毛乳頭細胞は、東洋紡から購入し、１２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（インビトロジェン）を用いて培養した。
継代５回目の毛乳頭細胞を、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにスフェロイド培養用９６穴プレートに播種し、一晩培養した。化合物無添加培地、又は化合物１、２、３、４、５、７、９又は２４添加培地と交換し、更に７２時間培養を行った。培養終了時の細胞数をＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（和光純薬）を用いて測定した。即ち、培養終了５時間前に培地の１／１０量のＷＳＴ−１試薬を培地に添加し、培養終了時、培地の吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６２０ｎｍ）を測定した。細胞数と吸光度は、細胞数０．２５〜４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの範囲で正の相関関係が認められた。
その結果、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少活性を有する化合物が、毛乳頭細胞の増殖を促進する活性を有することが明らかになった（図３）。図中の値は、対照群６ｗｅｌｌ、化合物添加群３ｗｅｌｌの平均値である。対照群と化合物添加群との比較にはスチューデントのｔ検定を用いた。
＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１
上記実験例により、ＷＮＴ−５Ａがヒト毛乳頭細胞に発現していること、ヒト毛乳頭細胞のＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量が本発明に係る化合物により減少すること、更に、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少活性を有する化合物が、毛乳頭細胞の増殖を促進する活性を有することが示された。
試験例４：化合物（表２）のＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少活性（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ法によるｍＲＮＡの定量）
ヒト毛乳頭細胞は、東洋紡から購入し、１２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（インビトロジェン）を用いて培養した。
継代５回目の毛乳頭細胞を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６穴プレートに播種し、一晩培養した。化合物無添加培地、又は化合物添加培地と培地交換し、更に２４時間、培養を行った。培養終了後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（バイエルメディカル）を用いて、Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２８（５），６０８−６１６（２０００））により、ＷＮＴ−５Ａ又はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を定量した。即ち、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ添付のプロトコールに従い、Ｌｙｓｉｓ  Ｍｉｘｔｕｒｅを用いて細胞を溶解し、溶解液をＣａｐｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに添加した。更に、ＷＮＴ−５Ａ又はＧＡＰＤＨ特異的なプローブセットを添加し、５３℃で２０時間、反応させた。０．０３％Ｌａｕｒｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅを含む０．１×ＳＳＣを用いてプレートを洗浄後、ｂＤＮＡからなる増幅プローブを添加し、４６℃で１時間反応させた。プレートを洗浄後、続いてＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識した標識プローブを添加し、４６℃で１時間反応させた。プレートを洗浄後、基質Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓを添加し、４６℃で３０分間反応後、化学発光量をＷＡＬＬＡＣ  １４２０ＡＲＶＯＳＸを用いて測定した。
ＷＮＴ−５Ａ特異的なプローブセットは、ヒトＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの蛋白質翻訳領域の塩基配列に基づいて設計した。Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＣＥ）として１０本のプローブ（配列番号１２−２１）を、Ｌａｂｅｌ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＬＥ）として３１本のプローブ（配列番号２２−５２）を、Ｂｌｏｃｋｅｒとして９本のプローブ（配列番号５３−６０）を使用した。
また、ＧＡＰＤＨ特異的なプローブセットとして、ｂＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ（ＸｅｎｏＴｅｃｈ  ＬＬＣ，ＢＯ９６０）を使用した。
ＷＮＴ−５Ａ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量は、化合物無添加対照に対する相対値（％）として表し、ｍＲＮＡ量を５０％に減少させる化合物濃度（ＩＣ５０値）を算出して、化合物によるｍＲＮＡ減少活性の指標とした。
ＷＮＴ−５Ａ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に及ぼす化合物の影響を表３に示す。表中の値は２ｗｅｌｌの平均値である。これらの化合物は、毛乳頭細胞において、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を減少させた。最も活性の強い化合物のＩＣ５０値は０．１２μＭであった。ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少のＩＣ５０値においては、同時に測定したＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量には減少が認められなかった。
2003086334.tif 000036
試験例５：化合物（表２）の毛乳頭細胞増殖促進活性
ヒト毛乳頭細胞は、東洋紡から購入し、１２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（インビトロジェン）を用いて培養した。
継代５回目の毛乳頭細胞を、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにスフェロイド培養用９６穴プレートに播種し、一晩培養した。化合物無添加培地、又は化合物添加培地と交換し、更に７２時間、培養を行った。培養終了時の細胞数をＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（和光純薬）を用いて測定した。即ち、培養終了５時間前に培地の１／１０量のＷＳＴ−１試薬を培地に添加し、培養終了時、培地の吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６２０ｎｍ）を測定した。細胞数と吸光度は、細胞数０．２５〜４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの範囲で正の相関関係が認められた。
ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少活性を有する化合物が、毛乳頭細胞の増殖に及ぼす影響を、表４に示す。表中の値は、対照群６ｗｅｌｌ、化合物添加群３ｗｅｌｌの平均値である。対照群と化合物添加群との比較にはスチューデントのｔ検定を用いた。
＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１
ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少活性を有する化合物はいずれも、１６μＭにおいて顕著な毛乳頭細胞増殖促進活性を示した。ＩＣ５０値が１μＭ未満の、強いＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ減少活性を示す化合物１，２，１８，３５，５２，５３，及び５８については、１μＭにおいても有意な増殖促進活性を示した。
2003086334.tif 000037
試験例６：サル皮膚器官培養におけるＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの減少
カニクイザル（オス、６年齢）の背部皮膚を採取し、実体顕微鏡下で５ｍｍ×８ｍｍに分割後、各皮膚組織片を、化合物無添加又は化合物７若しくは化合物３を添加した、１０μｇ／ｍｌのＩｎｓｕｌｉｎ（シグマ）、１０ｎｇ／ｍｌのＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（クラボウ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ’ＭｅｄｉｕｍＥ（インビトロジェン）を用いて培養した。
培養１１日目に皮膚組織片から毛包を分離し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ２００ｎｇ、ＷＮＴ−５Ａ又はＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（ＷＮＴ−５Ａ  ｓｅｎｓｅ：ＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＡＧＴＧＧＣ（配列番号８）、ＷＮＴ−５Ａ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＧＡＴＧＴＣＧＧＡＡＴＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡ（配列番号９）、ＧＡＰＤＨ  ｓｅｎｓｅ：ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号１０）、ＧＡＰＤＨ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号１１））各０．４μＭ、及びＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ（インビトロジェン）を用いて、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ添付のプロトコールに従い、全量２５μｌの反応系で、５０℃で３０分間ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ合成を行った後、９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で３０秒，５５℃で３０秒，７２℃で３０秒を４０又は３０サイクル繰り返し、ＷＮＴ−５Ａ又はＧＡＰＤＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。
この反応液を、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動し、サイバーグリーンＩ（タカラ）にて染色した。結果を図４に示す。
ＷＮＴ−５Ａ特異的なプライマーを用いた４０サイクルのＰＣＲにおいて、化合物無添加で培養した場合と比較して、化合物７又は化合物３を添加した培養においては、ＷＮＴ−５Ａ  ｃＤＮＡ断片の増幅が顕著に減少した。
一方、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマーを用いた３０サイクルのＰＣＲにおいて、ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ断片の増幅は、化合物の添加の有無に関わらず、変動が認められなかった。
試験例７：サル皮膚器官培養におけるＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）陽性細胞の増加
カニクイザル（オス、６年齢）の背部皮膚を採取し、実体顕微鏡下で５ｍｍ×８ｍｍに分割後、各皮膚組織片を、化合物無添加又は化合物７若しくは化合物３を添加した、１０μｇ／ｍｌのＩｎｓｕｌｉｎ（シグマ）、１０ｎｇ／ｍｌのＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（クラボウ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ’ＭｅｄｉｕｍＥ（インビトロジェン）を用いて培養した。
培養３０日目に、皮膚組織片を１０％中性ホルマリンを用いて室温で固定した。パラフィン切片を作製し、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳを加え室温で３０分間放置し、更に０．１Ｍのクエン酸緩衝液で煮沸処理を行った。抗ＰＣＮＡ抗体（ダコジャパン、２００倍希釈）と４℃で一晩反応させ、続いてビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後、ＡＢＣ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｋｉｔ（ベクター）と反応させ、ＡＥＣ  ｓｕｂｓｔａｒａｔｅ（シグマ）を用いて発色させた。
その結果、毛包及び表皮基底層の細胞において、特異的なポジティブ反応が認められた。毛包においては、休止期毛包、成長期毛包のいずれにおいても、毛乳頭及びダーマルシーズにおけるＰＣＮＡ陽性細胞数が、化合物７又は化合物３の添加培養により顕著に増加した（図５）。
試験例８：サル皮膚器官培養における毛球部径の増大
カニクイザル（オス、６年齢）の背部皮膚を採取し、実体顕微鏡下で５ｍｍ×８ｍｍに分割後、各皮膚組織片を、化合物無添加又は化合物７若しくは化合物３を添加した、１０μｇ／ｍｌのＩｎｓｕｌｉｎ（シグマ）、１０ｎｇ／ｍｌのＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（クラボウ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ’ＭｅｄｉｕｍＥ（インビトロジェン）を用いて培養した。
培養３０日目に、各皮膚組織片に含まれる全ての毛包を分離し、毛球部の直径を実体顕微鏡下で測定した。
結果を図６及び７に示す。表中の数値は、各皮膚組織片に含まれる全ての毛包の毛球部径の平均値±ｓ．ｅ．である。対照群と化合物添加群との比較にはスチューデントのｔ検定を用いた。＊：Ｐ＜０．０５
また、図は毛球部径の分布を示すヒストグラムである。各皮膚組織片に含まれる全ての毛包を、図中に示した毛球部径のグループに各々分類し、各グループに分類された毛包の数を、組織片から分離した毛包総数に対する相対値（％）で表した。図６は化合物７添加培養の影響を示す。化合物７の存在下で３０日間培養した皮膚片に含まれる毛包の毛球部径の平均値は、化合物無添加対照と比較して有意に高値であった。分布をみると、化合物無添加対照においては１４０μｍ以上１７０μｍ未満の毛球部径を有する毛包が最も多かったが、化合物７添加においては１７０μｍ以上２００μｍ未満の毛球部径を有する毛包の割合が最大であった。１７０μｍ以上の毛球部径を有する毛包の割合は、化合物無添加対照では５７．６％であったが、化合物７添加では８２．４％に増加した。
一方、図７は化合物３添加培養の影響を示す。化合物７の場合と同様に、化合物３存在下で３０日間培養した皮膚片に含まれる毛包の毛球部径の平均値は、化合物無添加対照と比較して有意に高値であった。分布は、化合物無添加対照においては１７０μｍ以上２００μｍ未満の毛球部径を有する毛包が最も多かったが、化合物３添加においては２００μｍ以上２３０μｍ未満の毛球部径を有する毛包の割合が最大であった。１７０μｍ以上の毛球部径を有する毛包の割合は、化合物無添加対照では５５．８％であったが、化合物３添加では７４．５％に増加していた。
実験例９：ベニガオザル発毛試験
脱毛症状が認められるベニガオザル（雄、１４年齢）の前頭部に、化合物７を０．３％含むローション１ｍＬを、１日１回、週５回、６ヶ月間、塗布投与した。塗布開始前に、前頭脱毛部にタトウーによるマーキングを行い、タトウーを含む同部位の皮膚拡大写真を、塗布開始前及び６ヶ月間塗布後に撮影した。
化合物７を含むローションの６ヶ月間塗布前後の皮膚拡大写真を、図８に示す。塗布前は、細い軟毛が多いのに対し、６ヶ月間塗布後の同部位では、軟毛の数が減少し、太い硬毛の数の増加が認められた。化合物７を含むローションの６ヶ月間の塗布により、ベニガオザルの前頭部における脱毛症状に明らかな改善が認められた。
上記の実験例により、ＷＮＴ−５Ａがヒト毛乳頭細胞に発現していること、ヒト毛乳頭細胞のＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量が本発明に係る化合物により減少すること、更に、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量減少活性を有する化合物が、毛乳頭細胞の増殖を促進する活性を有することが示された。
また、本発明に係る化合物は、サル皮膚器官培養においても、毛包のＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を減少させること、休止期毛包、成長期毛包のいずれにおいてもＰＣＮＡ染色陽性の増殖性細胞を顕著に増加させること、更に、毛包の毛球部径を増大させることが示された。
更に、本発明に係る化合物は、男性型脱毛症のモデル動物であるベニガオザルにおいて、脱毛症状の改善作用を有することが示された。
したがって、毛乳頭細胞の増殖を促進する化合物は、脱毛部毛包の毛乳頭において低下している細胞増殖能を亢進させることにより、発達した毛乳頭組織の形成に寄与し、その結果として発毛が促進される。
産業上の利用可能性
ＷＮＴ−５Ａ機能阻害剤、例えば、ＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を減少させる活性を有する化合物又はその医薬上許容される塩は、毛乳頭細胞増殖活性を有し、新規な作用機序による発毛剤／育毛剤として有用である。
本発明は、ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物が、脱毛症の改善剤若しくは予防剤になるという、今までにない全く新しい概念を提供するものであり、ＷＮＴ−５Ａの機能を阻害する化合物のスクリーニングは、新規な発毛剤／育毛剤の開発に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、毛乳頭細胞にＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡが発現していることを示す電気泳動図を表す。
図２は、被検化合物が毛乳頭細胞においてＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡ量を減少させることを示す電気泳動図を表す。
図３は、被検化合物が毛乳頭細胞の増殖促進活性を有することを示すグラフを表す。
図４は、サル皮膚器官培養におけるＷＮＴ−５Ａ  ｍＲＮＡの減少を示す電気泳動図である。
図５は、サル皮膚器官培養における休止期毛包及び成長期毛包のＰＣＮＡ染色の結果を表す。
図６は、化合物７がサル皮膚器官培養における毛球部径を増大させることを示すヒストグラムを表す。
図７は、化合物３がサル皮膚器官培養における毛球部径を増大させることを示すヒストグラムを表す。
図８は、ベニガオザル発毛試験における６ヶ月間塗布前後の皮膚拡大写真を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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