(57)【要約】神経可塑性発現の分子機構の研究などに有用な、脳に存在するユビキチン特異的プロテアーゼ及びそれをコードするＤＮＡ。
2003038097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列と相同性が８５％以上の塩基配列を有し、かつユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したユビキチン特異的プロテアーゼを培養物から採取することを含む、ユビキチン特異的プロテアーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１または２記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項１１】
配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２〜１０３６のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、脳に存在するユビキチン特異的プロテアーゼ及びそれをコードするＤＮＡに関する。
背景技術
樹状突起に分布するｍＲＮＡからの局所的蛋白質合成は、発現したシナプス可塑性を維持する上で重要な役割を果たしていると考えられている。シナプス後領域におけるものは特に重要と考えられ、シナプス後肥厚部（ＰＳＤ）に関連するｍＲＮＡの検索が行われている（Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７２：１４７−１５７，１９９９）。しかしながら、その多くは機能が不明である。
発明の開示
本発明は、神経可塑性発現の分子機構の研究などに有用な、ＰＳＤに存在すると思われる蛋白質及びそれをコードするＤＮＡを提供することを課題とする。
本発明者らは、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７２：１４７−１５７，１９９９に記載された機能が不明なｍＲＮＡの一つについて、全長ｃＤＮＡの取得及び発現産物の機能の解明に成功し、本発明を完成するに到った。
すなわち本発明は、以下のものを提供する。
（１）下記（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質。
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する（１）記載の蛋白質。
（３）（１）または（２）記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（４）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有する（３）記載のＤＮＡ。
（５）下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（６）下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列と相同性が８５％以上の塩基配列を有し、かつユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（７）（３）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（８）（３）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
（９）（８）記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したユビキチン特異的プロテアーゼを培養物から採取することを含む、ユビキチン特異的プロテアーゼの製造法。
（１０）（１）または（２）記載の蛋白質に対する抗体。
（１１）配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２〜１０３６のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の蛋白質のうち、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質は、後述の実施例に記載したように、脳に存在するユビキチン特異的プロテアーゼとして特定された蛋白質である。蛋白質には、同一の機能を有する変異体の存在が予測され、また、蛋白質のアミノ酸配列を適宜改変することによって、同一の機能を有する変異体を得ることができる。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質も本発明の蛋白質に包含される。
蛋白質のアミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法などの周知の手段により蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を改変し、塩基配列が改変されたＤＮＡを発現させることによって行うことができる。また、ユビキチン特異的プロテアーゼ活性とは、ユビキチン化された基質蛋白質を特異的に蛋白質分解する活性であり、この活性は公知の方法により測定できる（例えば、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：１５１９−１５３０，１９９７参照）。従って、同一の機能を有するか否かを決定することは当業者であれば容易である。
本発明の蛋白質は、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。
本発明の蛋白質は、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグなどの他の蛋白質と融合させることにより融合蛋白質とされていてもよい。
本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡとしては、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。このＤＮＡは、後述の実施例において、塩基配列が決定されたＤＮＡである。遺伝子には、同一の産物をコードするが塩基配列の異なる遺伝子や同一の機能を有する変異体をコードする対立遺伝子の存在が予測され、また、塩基配列の改変により、同一の産物や同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子を得ることができる。従って、本発明のＤＮＡには、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列に類似する塩基配列を有し、かつ、ユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡも包含される。類似の塩基配列を有するＤＮＡとしては、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列と相同性が８５％以上の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
ストリンジェントな条件としては、０．１％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中５０℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．１％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中２５℃での０．５時間の洗浄が挙げられる。洗浄は、好ましくは、０．１％  ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃での０．５時間の洗浄である。
相同性は、Ｇｅｎｅｔｒｙｘ（ソフトウエア開発株式会社）により算出される値である。
配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列に類似する塩基配列を有するＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１７８〜３２８５の塩基配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡを保持する宿主を突然変異誘発処理し、得られた変異体から、上述のストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または、上述の相同性を有するＤＮＡを選択することにより得ることができる。上述のようにユビキチン特異的プロテアーゼ活性の測定法は公知であり、従って、このようなＤＮＡから、ユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを選択することは当業者にとって容易である。
本発明のＤＮＡは、明らかにされた塩基配列に基づき常法により得ることができる。例えば、化学合成法により合成してもよいし、適宜設定されたプライマーを用いて、本発明のユビキチン特異的プロテアーゼを発現している細胞や組織から調製されたｍＲＮＡから逆転写−ＰＣＲ法により得てもよい。
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターである。本発明のベクターは、常法により本発明のＤＮＡをベクターに挿入することにより得ることができる。本発明のＤＮＡが挿入されるベクターとしては特に制限はなく、例えば、クローニング用ベクターとして通常に使用されるもの、哺乳動物細胞発現用ベクターとして通常に使用されるものが挙げられる。本発明の蛋白質を生産する目的でベクターを使用する場合には、特に発現ベクターが有用である。
本発明の形質転換体は、本発明のＤＮＡにより宿主を形質転換して得られる形質転換体であり、本発明の蛋白質を発現する。
宿主としては、特に制限はなく、動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などが挙げられる。形質転換は、常法により行えばよく、本発明のベクターを導入することによって行うことが好ましい。
本発明の製造法は、本発明の蛋白質すなわちユビキチン特異的プロテアーゼの製造法であり、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したユビキチン特異的プロテアーゼを培養物から採取することを含む。
培養は、形質転換体が本発明の蛋白質を発現する条件で行えばよく、培養物からの本発明の蛋白質の採取は、蛋白質の精製に通常に用いられる、種々のクロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過などの方法を適宜組み合わせて行えばよい。本発明の蛋白質を、ＧＳＴやＨｉｓタグとの融合蛋白質として発現させる場合には、それぞれグルタチオンセファロースカラムやニッケルセファロースカラムを用いて精製することが可能である。
本発明の抗体は、本発明の蛋白質に対する抗体であり、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２〜１０３６のアミノ酸配列を有するペプチド（以下Ｃ末端ペプチドともいう）に対する抗体である。本明細書において「対する抗体」とは、免疫学的に反応する抗体を意味する。
本発明の抗体は、本発明の蛋白質（好ましくはＣ末端ペプチド）を免疫した動物から得ることができる。ポリクローナル抗体であれば上記免疫動物の血清より調製され、モノクローナル抗体であれば上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、本発明蛋白質（好ましくはＣ末端ペプチド）に強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調製される。
免疫抗原としては、本発明の製造法により得られる本発明の蛋白質のフラグメントを用いることができる。あるいは、上記アミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。抗原はキャリア蛋白質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリア蛋白質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリア蛋白質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
免疫される動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与があげられる。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられ、通常には、２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。たとえば、本発明の蛋白質（好ましくはＣ末端ペプチド）をコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、本発明の蛋白質（好ましくはＣ末端ペプチド）を含むサンプルを電気泳動後ニトロセルロース転写膜を用いるイムノブロット法などがあげられる。
このようなウェルから更に例えば限界希釈法によってクローニングを行いクローンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与したＳＣＩＤマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらに本発明の蛋白質（好ましくはＣ末端ペプチド）を用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。血清からのポリクローナル抗体の精製も同様に行うことができる。
モノクローナル抗体はＦｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦａｂ’あるいはＦａｂ画分、あるいはその重合体を用いてもよい。またそのキメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。
本発明の抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中の本発明の蛋白質の定性、定量を行うことができる。免疫学的方法としては、生体試料を必要に応じて適切な処理、たとえば細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行い得る。標識化剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質がいずれも使用できる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  全長Ｄｅｍ  ２１  ｃＤＮＡのクローニング
Ｄｅｍ  ２１二本鎖ｃＤＮＡ（長さ２１５ｂｐ）を、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７２：１４７−１５７，１９９９に報告されたようにして取得した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲラベル化法によりジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識し、ＤＩＧ標識Ｄｅｍ  ２１  ｃＤＮＡプローブを得た。
このプローブを用いた、非刺激ラット脳から調製されたライブラリーのスクリーニングでは、陽性クローンは得られなかった。そこで、高頻度刺激から４時間後に採取された海馬から調製されたオリゴ（ｄＴ）プライムドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
シクロヘキサミドで前処置したラットでの高頻度刺激から４時間後に採取された海馬から調製されたオリゴ（ｄＴ）プライムドｃＤＮＡライブラリー（Ｎｅｕｒｏｎ，１４：４３３−４５５，１９９５）は、東京都神経科学総合研究所の山形博士より恵与された。このライブラリーを、１５０ｍｍプレート当たり５×１０４プラークの密度でプレートし、プレートをデュプリケートしたフィルター（メンブラン）を、ＤＩＧ標識Ｄｅｍ  ２１  ｃＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ  Ｅａｓｙｈｙｂバッファー中で４２℃において一晩行った。メンブランを、０．１％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温において２回洗浄し、次いで０．１％  ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６５℃において１５分間洗浄した。発色は、ＤＩＧ化学発色キット（日本ロシュ社）の指示書に従って行った。候補プラークを選択し、同様に再スクリーニングを行った。陽性ｃＤＮＡクローンのインサートを切り出し、ＤＮＡ配列決定により確認した。この結果、共にプローブ配列を含む、二つの部分的に重複する、異なる長さの二つの陽性クローン（１８’２および１７’１）が得られた。クローン１８’２は、ポリ（Ａ）＋配列およびそのポリ（Ａ）＋の３０ｂｐ上流にＡＡＡＴＴＡＡＡポリアデニル化シグナルを有する２１６３ｂｐのインサートを含んでいた。クローン１７’１は、１８’２と同じ３’配列を有する４３６９ｂｐのインサートを含んでいた。
長い方のクローンは、部分的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいたので、・Ｄｅｍ２１の全長ｃＤＮＡを得るため、５’ＲＡＣＥを行い、更なる５’配列を得た。具体的には、カイニン酸で処置したラットの脳から調製されたｍＲＮＡ（０．５μｇ）について、５’ｆｕｌｌ  Ｒａｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（共に宝酒造株式会社）を用いて、逆転写反応による１本鎖ｃＤＮＡの合成、合成されたｃＤＮＡの環化及び環化したｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを２回行った。１回目の５’ＲＡＣＥでは、１７’１のｃＤＮＡ配列に基づいて調製された、逆転写反応用の遺伝子特異的プライマー（配列番号４）ならびにＰＣＲ用のアンチセンスプライマー及びセンスプライマー（配列番号５及び６）を用いた。２回目の５’ＲＡＣＥでは、１回目の５’ＲＡＣＥで得られた塩基配列に基づいて調製された、逆転写反応用の遺伝子特異的プライマー（配列番号７）ならびにＰＣＲ用のアンチセンスプライマー及びセンスプライマー（配列番号８及び９）を用いた。
１回目の５’ＲＡＣＥで、クローン１７’１の５’部分と重複する１．０ｋｂフラグメントが得られた。さらに、２回目の５’ＲＡＣＥにより、第１の５’ＲＡＣＥフラグメントと重複する８００ｂｐのフラグメントが得られた。１７’１のｃＤＮＡ配列及び５’ＲＡＣＥで得られた配列を組み合わせることにより、５７３８ｂｐのｃＤＮＡが得られた。塩基配列を配列番号１に示す。この５７３８ｂｐ配列は、３１１１ｂｐのＯＲＦを含んでいた。上述のように、ポリ（Ａ）＋テールの前には、コンセンサスＡＡＡＴＴＡＡＡポリアデニル化シグナルがある。推測翻訳開始コドンの５’端から１７８塩基の５’部分はＧＣに富み、５’非翻訳領域に一致する。この推測開始コドンの周囲の隣接塩基配列は、−３および＋４のＧでＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１９８６７−１９８７０，１９９１）に一致する。ＣＴに富む配列および推定開始部位の上流にインフレームの終止コドンが存在することは、このＡＴＧが真の開始コドンであることをさらに裏付けている。以上から、得られた５７３８ｂｐのｃＤＮＡは、Ｄｅｍ  ２１の全長ｃＤＮＡを含むものであり、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７２：１４７−１５７，１９９９に報告されていた２１５ｂｐの断片は、ポリ（Ａ）＋を有する全長ｃＤＮＡの３’末端であることが判明した。
完全Ｄｅｍ  ２１  ｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列（配列番号２）の、ＤＤＢＪ  ｎｒデータベースを用いたホモロジー検索では、同一の蛋白質または高い相同性を有する単一の蛋白質種は見い出されなかった。しかし、推定蛋白質は、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）に見られるＣｙｓボックス、Ｈｉｓボックス、Ａｓｐボックス及びＫＲＦボックスなどの保存されたドメインを多数含んでいた。この特徴によれば、Ｄｅｍ  ２１はＵＳＰファミリー酵素の新規なメンバーであると考えられ、従って、Ｄｅｍ  ２１をシナプス性ＵＳＰ（ｓｙｎＵＳＰ）と名付けた。既知のＵＳＰの中で、ｓｙｎＵＳＰは、ヒューマン  ゲノム  オーガニゼーション（ＨＵＧＯ）ノーメンクレチャー  コミッティー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）によりヒトＵＳＰについて提案している命名法でＵＳＰ７と名付けられているＨＡＵＳＰ（ヘルペスウイルス関連ユビキチン特異的プロテアーゼ）に最も類似している。これらの二つの蛋白質の間では、４１３アミノ酸残基に渡り２８％のアイデンティティー及び４０％のシミラリティーがあった。
ｓｙｎＵＳＰは、１０３６アミノ酸からなる蛋白質をコードし、１１８．７８ｋＤａの推測分子量及び５．８３のｐＩを有する。ＵＳＰ活性部位ドメインの他に、データベース検索で、カルボキシル末端領域にロイシンジッパードメインが検出された。ロイシンジッパードメインは、蛋白質−蛋白質相互作用に関与すると考えられているので、ｓｙｎＵＳＰのカルボキシル末端は、ある種の蛋白質−蛋白質相互作用に関与している可能性がある。ｓｙｎＵＳＰは、また、６アミノ酸（（Ｌ／Ｉ）ＬＣＰＨＧ（配列番号３））の二つのリピートをカルボキシル末端部分に有する。データベース検索では、この配列の機能についての情報は得られなかった。
実施例２  発現産物のＵＳＰ活性の確認
ｓｙｎＵＳＰの、モデルユビキチン化蛋白質を切断する活性を、Ｅ．ｃｏｌｉの共発現系を用いて調べた。
ＵＳＰ活性は、基本的に、Ｅｖｅｒｅｔｔら（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：１５１９−１５３０，１９９７）の方法に従って、Ｔ７−ドリブンＩＰＴＧ誘導性ｓｙｎＵＳＰ発現プラスミドを用いて行った。ｐＴ７−ｓｙｎＵＳＰプラスミドを、ｓｙｎＵＳＰの完全なコード領域をＴ７発現プラスミドｐＥＴ３ｄ（ｐＢＲ３２２  Ａｍｐｒレプリコン）のＮｃｏＩ部位に挿入して作製した。Ｔ７−ｓｙｎＵＳＰ発現カセットをｐＡＣＹＣ１８４  Ｃｍｒレプリコン中に含むプラスミドであるｐＡＣＴ７−ｓｙｎＵＳＰを、ｐＴ７−ｓｙｎＵＳＰのＥｃｏＲＶフラグメントをｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏＲＶ部位に挿入することにより構築した。酵母ＵＢＰ２をコードするプラスミドｐＡＣＹＣ−ＵＢＰ（ｐＡＣＹＣ１８４  Ｃｍｒレプリコン）及びＧＳＴ−Ｕｂ５２融合蛋白質をコードするプラスミドｐＧＥＸ−Ｕｂ５２（ｐＢＲ３２２  Ａｍｐｒレプリコン）を、ＵＳＰ及びＵＳＰ基質のポジティブコントロールとして用いた。ＧＳＴ−Ｕｂ５２基質の切断については、ｐＧＥＸ−Ｕｂ５２を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株細胞をさらにｐＡＣＴ７−ｓｙｎＵＳＰまたはｐＡＣＹＣ−ＵＢＰ２のいずれかにより形質転換し、アンピシリン及びクロラムフェニコールの両方に対して耐性のコロニーを生育させた。蛋白質発現をＩＰＴＧにより誘導し、細胞をさらに３時間インキュベートし、ＵＳＰに基質を切断させた。細胞を超音波処理して、水溶性蛋白質の抽出物を調製した。ＧＳＴ融合蛋白質及びそれらの蛋白質分解生成物をグルタチオン−アガロースビーズにより精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クマシーブリリアントブルー染色により検出した。また、Ｃｙｓ９８をＡｌａに置換したｓｙｎＵＳＰ、ならびに、Ｈｉｓボックス、ＬＬＣＰＨＧリピート配列もしくはロイシンジッパーのいずれかからＣ末端側を欠失させたｓｙｎＵＳＰ（図１のａ）についても同様の操作を行った。
結果を図１のｂに示す。ＧＳＴ−Ｕｂ５２基質蛋白質の発現はＩＰＴＧにより誘導された（レーン１）。ＧＳＴ−Ｕｂ５２蛋白質は、酵母ＵＳＰ２の共発現により、３０ｋＤａのバンドに分解された。分解産物のサイズは、計算により求めたものとよく一致した。従って、上記ＵＳＰ活性アッセイ系の有効性が確認された。野性型（ＷＴ）ｓｙｎＵＳＰを共発現させると、４５  ｋＤａのＧＳＴ−Ｕｂ５２蛋白質の量は減少し、それに付随して３０  ｋＤａの蛋白質分解産物が顕著に増加した（レーン３）。従って、ｓｙｎＵＳＰはＵＳＰ活性を有していることが確認された。ｓｙｎＵＳＰの活性は、Ｃｙｓ９８をＡｌａに置換すること、または、Ｈｉｓボックス、ＬＬＣＰＨＧリピート配列もしくはロイシンジッパーのいずれかからＣ末端側を欠失させることにより消失した（レーン４〜７）。
実施例３  抗体の調製ならびにｓｙｎＵＳＰの細胞下分布および組織分布
ｓｙｎＵＳＰのＣ末端の１５アミノ酸（配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２〜１０３６）からなるペプチド（Ｃ−１５ペプチド）をキーホールリンペットヘモシアニンに結合させ、これを用いてウサギを免疫した。追加免疫を繰り返した後、血清を採取し、Ｃ−１５ペプチドを固定化したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０を用いて抗ｓｙｎＵＳＰ抗体（Ｃ−１５  Ａｂ）をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
精製したＣ−１５  Ａｂの特異性を、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１４１７−２１４２４（２００１）に記載された方法に従って、Ｃｏｓ７細胞で発現した全長ｓｙｎＵＳＰに対するウェスタンブロットを行うことにより試験した。この結果、Ｃ−１５  Ａｂは、発現した１２５  ｋＤａのｓｙｎＵＳＰと特異的に反応し、その相互作用は、過剰のＣ−１５ペプチドを加えることによりブロックされた。
Ｃ−１５  Ａｂを用いて、ｓｙｎＵＳＰの細胞下分布を調べた。細胞下画分は以下のようにして得た。Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７８，８０−９０（２０００）に記載されたようにして、ウィスターラット（６週齢、雄）の前脳からシナプス原形質膜（ＳＰＭ）およびＰＳＤの画分を得た。また、ＰＳＤの単離中に、Ｐ１（核および細胞片を含む画分）、Ｐ２（粗ミトコンドリア画分）およびｓｙｎ（シナプトソーム画分）を得た。さらに、可溶性画分およびデンドリティックリピッドラフト（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ）画分を、それぞれ、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７８，８０−９０（２０００）およびＭｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８９，２０−２８（２００１）に記載されたようにして得た。
各画分を、Ｃ−１５  Ａｂを用いるウェスタンブロットにより分析した。この結果、Ｃｏｓ７細胞で発現した全長ｓｙｎＵＳＰと同じ分子量のバンドが、全ホモジェネート画分、可溶性画分、デンドリティックリピッドラフト画分およびＰＳＤ画分で検出された。なお、ＰＳＤ画分では、異なる大きさの免疫反応するバンドが検出されたが、これらはＣ−１５ペプチドの添加で消失し、また、実験毎に量が変動したので、ｓｙｎＵＳＰの分解物と推定された。
心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、胸腺、胃および小腸から調製された蛋白質について上記と同様にウェスタンブロットを行った。この結果、脳および胸腺で１２５ｋＤａのバンドが検出されたが、胸腺における発現レベルは、脳におけるものより低かった。また、同サイズのバンドが精巣でも検出されたが、その発現レベルは極めて低かった。脳においては、全長よりも短い免疫反応するバンドが検出されたが、これらはＣ−１５ペプチドの添加で消失し、また、実験毎に量が変動したので、ｓｙｎＵＳＰの分解物と推定された。また、肝臓においても、低分子量の領域に免疫反応する２つのバンドが検出された。これらは、Ｃ−１５ペプチドの添加で消失した。他の組織では、免疫反応するバンドは検出されなかった。
産業上の利用の可能性
本発明により、脳に存在するユビキチン特異的プロテアーゼ及びそれをコードするＤＮＡが提供される。これらは、神経可塑性や、神経変性疾患の病態に関する研究において有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、（ａ）発現産物の構造、及び、（ｂ）ユビキチン特異的プロテアーゼ活性の検出結果（電気泳動写真）を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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