(57)【要約】試料中の糖化タンパク質を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法を提供する。糖化タンパク質を含む試料をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理することによって、前記糖化タンパク質を分解し、得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することによって、前記糖化タンパク質の量を測定する。スルホン酸化合物としては、ラウリル硫酸ナトリウムが使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解物の製造方法であって、
タンパク質をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理することを特徴とするタンパク質分解物の製造方法。
【請求項２】
タンパク質をスルホン酸化合物およびニトロ化合物の存在下においてプロテアーゼ処理する請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項３】
スルホン酸化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬｉＬＳ）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（ＡＢＳＡ）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＤＳ）、４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＤＡＤＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ハイドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）およびバソフェナントロリンスルホン酸からなる群から選択された少なくとも一つのである請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項４】
前記ニトロ化合物が、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ２）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−デスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＰＳ」という）およびニトロベンゼンからなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲２記載の製造方法。
【請求項５】
プロテアーゼが、メタロプロテナーゼである請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項６】
タンパク質が糖化タンパク質である請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項７】
糖化タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理することによって、前記糖化タンパク質を分解し、得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することによって、前記糖化タンパク質の量を測定する糖化タンパク質の測定方法であって、
スルホン酸化合物の存在下で前記プロテアーゼ処理を行うことを特徴とする糖化タンパク質の測定方法。
【請求項８】
スルホン酸化合物およびニトロ化合物の存在下で前記プロテアーゼ処理を行う請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項９】
スルホン酸化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬｉＬＳ）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（ＡＢＳＡ）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＤＳ）、４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＤＡＤＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ハイドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）およびバソフェナントロリンスルホン酸からなる群から選択された少なくとも一つのである請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項１０】
前記ニトロ化合物が、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ２）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＰＳ」という）およびニトロベンゼンからなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項１１】
プロテアーゼが、メタロプロテナーゼである請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項１２】
酸化還元反応の測定が、前記糖化タンパク質の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの反応によって発生した過酸化水素の量の測定である請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項１３】
酸化酵素によって、発生した前記過酸化水素を還元し、かつ、酸化により発色する基質を酸化させ、前記基質の発色程度を測定することによって、過酸化水素量を測定する請求の範囲１２記載の測定方法。
【請求項１４】
前記発色程度の測定が、前記基質の検出波長における吸光度測定である請求の範囲１３記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、タンパク質を分解する方法、および試料中の糖化タンパク質をプロテアーゼで処理し、前記糖化タンパク質の量を酸化還元反応を用いて測定する方法に関する。
【背景技術】  従来から、試料中の目的のタンパク質（ペプチドを含む）を検出したり、測定に影響を与えるタンパク質の機能を失活させるために、前記タンパク質をプロテアーゼで分解する方法が、各種測定方法等において適用されている。
例えば、糖尿病診断や治療等における重要な指標となる血球中の糖化タンパク質、特に生体血糖値の過去の履歴を反映している赤血球中の糖化ヘモグロビンを、酵素法により測定することが現在試みられており、その際にも糖化タンパク質をプロテアーゼ分解する方法が適用されている。前記酵素法では、溶血試料中の糖化タンパク質の糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を作用させ、過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、このＦＡＯＤ処理後の前記試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および酸化により発色する基質を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記基質との間で酸化還元反応させる。この時、前記基質が、酸化によって発色するため、その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、この結果、試料中の糖化タンパク質量を知ることができる。
しかし、前記糖化部分に作用させるＦＡＯＤは、糖化タンパク質や糖化ペプチドよりも、糖化アミノ酸や、より短いペプチド断片に作用し易い。そこで、予め、糖化タンパク質や糖化ペプチドをプロテアーゼで分解し、ＦＡＯＤを糖化部分に作用し易くすることによって、測定精度の向上を図っている。
しかしながら、プロテアーゼは基質特異性を有し、処理する基質によって分解活性が異なるため、目的のタンパク質の種類によっては、分解に長時間を要し、測定を迅速に行うことができないという問題がある。さらに、前記糖化タンパク質のように、目的のタンパク質が糖化されている場合は、その立体障害等が原因となり分解し難い場合もある。このような理由から、例えば、前述のような糖化タンパク質の測定においても、予め行うプロテアーゼ処理のために、測定全体に時間がかかってしまう。このため、臨床検査等の分野における利用の点からも、前記糖化タンパク質の測定をより迅速に行える方法が求められている。
【発明の開示】
そこで、本発明の目的は、迅速かつ優れた効率で、タンパク質を分解するタンパク質分解物の製造方法、さらに試料中の糖化タンパク質を分解し、前記糖化タンパク質量を測定する方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質分解物の製造方法は、タンパク質をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理することを特徴とする。なお、本発明において「タンパク質」とは、ペプチドも含み、また、「タンパク質分解物」とは、前記ペプチドの分解物を含む。
このように、プロテアーゼ処理をスルホン酸化合物の存在下で行えば、試料中のタンパク質の分解を迅速に行うことができる。
つぎに、本発明の本発明の糖化タンパク質の測定方法は、糖化タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理することによって、前記糖化タンパク質を分解し、得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測定することによって、前記糖化タンパク質の量を測定する糖化タンパク質の測定方法であって、スルホン酸化合物の存在下で前記プロテアーゼ処理を行うことを特徴とする。なお、本発明において、「糖化タンパク質」とは、糖化ペプチドも含む。
従来のスルホン酸化合物の非存在下での方法においては、プロテアーゼによって糖化タンパク質を十分に分解し、ＦＡＯＤを糖化部分に作用し易くするためには、例えば、約６〜４０時間もの間、プロテアーゼ処理する必要があった。このため、前記酵素法により糖化タンパク質を測定するには、長時間を要し、有用な方法とは言い難かった。しかし、本発明の測定方法によれば、短時間で糖化タンパク質等を分解できるため、迅速に糖化タンパク質等の測定を行うことが可能である。本発明の測定方法によれば、例えば、スルホン酸化合物を添加する以外は同じ条件で測定を行った場合、前記スルホン酸化合物の非存在下の場合に比べて、約１０〜２０００倍の範囲で測定時間を短縮できる。このため、本発明の測定方法は、よりいっそう迅速であり、かつ高精度な測定を実現できるため、前述のような臨床医療等における各種検査に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のタンパク質分解物の製造方法および糖化タンパク質の測定方法において、前記スルホン酸化合物としては、例えば、
一般式  Ｒ−ＳＯ３Ｘ
で表わされる化合物が使用できる。前記式において、Ｘは、例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ、Ｈ等であり、Ｒは、疎水基であることが好ましく、例えば、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−、Ｃ６Ｈ５−、Ｃ６Ｈ５−Ｎ＝Ｎ−Ｃ６Ｈ４−、Ｃ６Ｈ５−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ６Ｈ４−等があげられる。前記Ｒにおけるｎは、例えば、１〜２０の範囲である。なお、前記Ｒにおいて、「Ｈ」は、アシル基、ニトロ基、ニトロソ基、フェニル基、アルキル基、アルキルエーテル基等で置換されてもよい。
前記スルホン酸化合物の具体例としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＬＳ」という）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、「ＳＤＢＳ」という）、ラウリル硫酸リチウム（以下、「ＬｉＬＳ」という）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（以下、「ＡＢＳＡ」という）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＤＳ」という）、４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＤＡＤＳ」という）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ハイドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、バソフェナントロリンスルホン酸等が使用でき、より好ましくは、ＳＬＳ、ＳＤＢＳ、ＬｉＬＳである。
これらのスルホン酸化合物は、一般的に溶解性に優れるため、試料中の糖化タンパク質の濃度が高濃度であっても処理が容易であり、また、コストの面でも低価格であるため、非常に有用である。
また、本発明の製造方法および測定方法においては、糖化タンパク質の分解がより一層促進できることから、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の共存下でプロテアーゼ処理を行うことが好ましい。
前記ニトロ化合物としては、特に制限されないが、例えば、ニトロベンゼン化合物やジニトロベンゼン化合物等があげられる。これらの化合物は、ベンゼン環がニトロ基の他に、例えば、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝２〜９）等の置換基を有することが好まし。前記置換基としては、例えば、ハロゲン基、エーテル基、フェニル基などがあげられる。
前記ニトロ化合物の具体例としては、例えば、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ２）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＰＳ」という）、ニトロベンゼン等が使用できる。このようにスルホン酸化合物とニトロ化合物とを共存させる場合、これらの組み合わせは特に制限されない。
本発明の製造方法および測定方法において、前記プロテアーゼは、特に制限されないが、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロテナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等が好ましい。また、前記分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、前記プロテアーゼは、前記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロテイナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、特定の糖化タンパク質の分解物を選択的に調製できる。
前述のように、本発明のタンパク質分解物の製造方法は、タンパク質をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理することを特徴とする方法である。
前記スルホン酸化合物の添加量は、特に制限されず、例えば、プロテアーゼの種類および添加量、試料の種類、前記試料に含まれるタンパク質の量等によって適宜決定できる。
具体例としては、試料１μＬ当たり、例えば、前記スルホン酸化合物を、０．０１〜１０００μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０３〜２００μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０５〜４０μｍｏｌの範囲である。
また、スルホン酸化合物およびニトロ化合物を共存させる場合は、試料１μｌ当たり、例えば、前記スルホン酸化合物０．００５〜２０μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．００５〜２５μｍｏｌの範囲で添加することが好ましく、より好ましくはスルホン酸化合物０．０２〜４μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．０１〜５μｍｏｌの範囲である。
前記プロテアーゼ処理の条件は、特に制限されないが、例えば、使用する酵素の至適条件に従って設定することが好ましい。前記プロテアーゼがメタロプロテイナーゼの場合には、例えば、温度１０〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜６０分の範囲であり、好ましくは、温度２０〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜１０分の範囲であり、より好ましくは、温度２５〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜５分の範囲である。
つぎに、本発明の糖化タンパク質の測定方法は、前述のように、糖化タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理することによって、前記糖化タンパク質を分解し、得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することによって、前記糖化タンパク質の量を測定する糖化タンパク質の測定方法であって、スルホン酸化合物の存在下で前記プロテアーゼ処理を行うことを特徴とする方法である。
本発明の測定方法において、前記スルホン酸化合物の添加量は、特に制限されず、例えば、プロテアーゼの種類および添加量、試料の種類、前記試料に含まれる糖化タンパク質の量等によって適宜決定できる。
具体例としては、試料１μＬ当たり、例えば、前記スルホン酸化合物を、０．０１〜１０００μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０３〜２００μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０５〜４０μｍｏｌの範囲である。
また、スルホン酸化合物およびニトロ化合物を共存させる場合は、試料１μｌ当たり、例えば、前記スルホン酸化合物０．００５〜２０μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．００５〜２５μｍｏｌの範囲で添加することが好ましく、より好ましくはスルホン酸化合物０．０２〜４μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．０１〜５μｍｏｌの範囲である。
本発明の測定方法において、前記試料は、特に制限されないが、全血、血漿、血清、血球等の血液試料の他に、例えば、尿、髄液、唾液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等もあげられる。この中でも好ましくは、全血等の血液試料や血球試料である。
本発明における測定対象物、すなわちプロテアーゼで分解する糖化タンパク質としては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等があげられ、この中でも好ましくは糖化ヘモグロビンである。血液中のヘモグロビンは、その濃度が約６０〜２００ｇ／Ｌと高く、また、分解が困難であったため、プロテアーゼ処理に数時間〜数日かかっていたが、本発明の測定方法によれば、例えば、２０秒〜２時間でのプロテアーゼ処理が可能になり、糖化ヘモグロビンの測定を迅速に行うことができる。
また、本発明の測定方法においては、スルホン酸化合物だけでなく、糖化タンパク質の分解がより一層促進できることから、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の共存下において、プロテアーゼ処理することが好ましい。
本発明の測定方法において、前記酸化還元反応の測定は、前記糖化タンパク質の糖化部分とＦＡＯＤとの反応によって発生した過酸化水素の量の測定であることが好ましい。そして、この過酸化水素量は、例えば、ＰＯＤ等の酸化酵素によって、発生した前記過酸化水素を還元し、かつ、酸化により発色する基質（以下、「発色基質」という）を酸化させ、前記基質の発色程度を測定することによって、求めることが好ましい。
前記発色基質としては、特に制限されないが、例えば、以下に示すような発色基質が使用できる。これらの発色基質は、通常、４００ｎｍ以上に吸収を持つが、前述のようなスルホン酸化合物やニトロ化合物は、一般的に４００ｎｍ以上に吸収を持たないため、このような発色基質と共に使用しても、測定に誤差が生じるおそれがないためである。
前記発色基質の具体例としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（以下、「ＤＡ−６４」という）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとの組み合せ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’，−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン  ヘキサソディウム塩（以下、「ＴＰＭ−ＰＳ」という）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４，４’、４’’−トリアミノトリフェニルメタン  ヘキサソディウム塩（以下、「ＴＰＭ−ＯＳ」という）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（以下、「ＤＡ−６７」という）、１０−（メチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（以下、「ＭＣＤＰ」という）、１０−（カルボキシアミノメチル−４−ベンゾアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（以下、「ＭＭＸ」という）等があげられる。これらの中でも、例えば、トリアミノトリフェニルメタン系の発色基質が好ましい。
前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記トリンダー試薬と組み合わせる化合物としては、前記４−アミノアンチピリンの他に、例えば、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。
本発明において、前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ２−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ２      ．．．（１）
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４                    ．．．（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ              ．．．（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ５−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７    …（４）
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ３−ＮＨ）ｎ−Ｈ                ．．．（５）
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ              ．．．（６）
以下に、本発明の糖化タンパク質の測定方法について、具体的な例を上げて説明するが、これらの実施形態には制限されない。
（実施形態１）
本発明の糖化タンパク質の測定方法について、測定対象物が血球中の糖化タンパク質である例をあげて説明する。
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用でき、この中でも前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
溶血用の界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル  エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン  ソルビタン  アルキル  エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン  アルキル  エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血できる。
つぎに、前記溶血試料を、前記スルホン酸化合物の存在下で前記プロテアーゼ処理することにより糖化タンパク質を分解し、糖化タンパク質分解物を調製する。このように糖化タンパク質をプロテアーゼで処理するのは、前述のように後の処理に使用するＦＡＯＤがタンパク質および長いポリペプチド鎖に作用し難いため、これらを分解して糖化部分に作用し易くするためである。前述のように、スルホン酸化合物存在下でプロテアーゼ処理すれば、短時間で、かつ高い分解効率で糖化タンパク質を分解できるため、プロテアーゼ処理時間が短くても、ＦＡＯＤは十分に糖化部分に作用できる。なお、より分解を促進できることから、後述するように、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の存在下で処理してもよい。
前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液の種類は、特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシンアミド緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液等が使用でき、そのｐＨは、ｐＨ５〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは６〜１０の範囲、特に好ましくは７〜９の範囲である。
前記プロテアーゼは、前述のように、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ等が使用できる。前記プロテアーゼの添加割合は、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、０．１〜１０体積％の場合、プロテアーゼを０．１〜１００ｇ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．３〜５０ｇ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．５〜２０ｇ／Ｌの範囲である。
また、分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、プロテアーゼは、前述のように、例えば、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、前記プロテアーゼが、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼであることが好ましい。これらのプロテアーゼの添加割合は、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、０．１〜１０体積％の場合、プロテアーゼを０．１〜５０ｇ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．３〜３０ｇ／Ｌの範囲、特に好ましくは１〜２０ｇ／Ｌの範囲である。具体的には、プロテアーゼがメタロプロテイナーゼの場合、血球濃度０．３〜５体積％の前処理溶液に、０．１〜３０ｇ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．３〜２０ｇ／Ｌの範囲、特に好ましくは１〜１０ｇ／Ｌの範囲である。
前記スルホン酸化合物の添加割合は、例えば、プロテアーゼ処理溶液中の血球濃度が、１体積％の場合、濃度０．０００１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０００３〜６０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．００１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的には、前記スルホン酸化合物がＳＬＳであり、プロテアーゼ処理溶液中の血球濃度が、１体積％の場合、濃度０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２〜６０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
前記スルホン酸化合物は、そのまま使用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、溶媒に溶解したスルホン酸化合物化合物溶液として使用することが好ましい。前記溶液の濃度は、スルホン酸化合物の種類等により適宜決定でき、例えば、１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液としては、例えば、前述の緩衝液等が使用できる。なお、前記スルホン酸化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記スルホン酸化合物存在下におけるプロテアーゼ処理の条件は、特に制限されないが、例えば、温度１０〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜６０分の範囲であり、好ましくは、温度２０〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜１０分の範囲であり、より好ましくは、温度２５〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜５分の範囲である。
このようにスルホン酸化合物存在下で試料のプロテアーゼ処理を行えば、試料中の糖化タンパク質の分解を促進できるため、短時間で、かつ優れた分解効率で糖化タンパク質の分解物を得ることができる。
また、このプロテアーゼ処理は、前述のようにスルホン酸化合物だけでなく、スルホン酸化合物とニトロ化合物との共存下で行うことにより、さらにプロテアーゼによる分解を促進できる。
ニトロ化合物の添加割合は、特に制限されず、例えば、スルホン酸化合物の添加量、プロテアーゼ量等に応じて適宜決定できるが、プロテアーゼ処理溶液中の血球濃度が、１体積％の場合、例えば、濃度０．０１〜２５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素に、ＰＯＤおよび前記発色基質を添加して、前記基質の発色反応を行い、その発色程度を測定する。前記過酸化水素にＰＯＤを作用させれば、過酸化水素は還元され、かつ前記発色性基質は酸化されて発色する。前記酸化により発色した基質の発色程度と生成した過酸化水素量との間には相関関係があるため、前記発色程度を測定することによって、過酸化水素の量が測定できるのである。
前記発色性基質としては、前述のような基質が使用でき、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
前記発色反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜２０，０００ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００１〜１ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ６〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
前記発色反応において、例えば、前記発色基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
このような本発明の測定方法によれば、前述のように迅速に測定を行うことができる。また、従来法では、プロテアーゼ処理を短時間にすると、測定精度が低下するおそれがあったが、本発明の測定方法によれば、短時間でも優れた精度で測定できる。
【実施例】  つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
（実施例１、比較例１）
この実施例は、スルホン酸化合物存在下で糖化ヘモグロビンをプロテアーゼ処理し、その分解物の糖化程度を、発色基質ＴＰＭ−ＰＳを用いて測定した例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。なお、下記第１試薬におけるスルホン酸化合物としては、ＳＬＳ（ナカライテスク社製）を使用した。
（測定試料の調製）
ヘモグロビン凍結乾燥品を精製水で溶解し、ヘモグロビン濃度５０ｇ／Ｌ、ＨｂＡｌｃ濃度６．５％のヘモグロビン溶液（ＨｂＡｌｃ：Ｌｏｗ）と、ヘモグロビン濃度５０ｇ／Ｌ、ＨｂＡｌｃ濃度１１．５％のヘモグロビン溶液（ＨｂＡｌｃ：Ｈｉｇｈ）とを調製した。そして、これらの各ヘモグロビン溶液６０μＬと精製水２４０μＬとを混合して、ＨｂＡｌｃ濃度６．５％の試料（以下、「試料Ｌｏｗ」という）とＨｂＡｌｃ濃度１１．５％の試料（以下、「試料Ｈｉｇｈ」という）とした。
（第１試薬）
スルホン酸化合物                                                  ６．４ｍＭ
界面活性剤（ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル）          １．８５ｇ／Ｌ
ＣＨＥＳ−ＣＨＥＳ・Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．４）                        ４０ｍＭ
ＭＯＰＳ−ＭＯＰＳ・Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．４）                        １５ｍＭ
（第２試薬）
メタロプロテアーゼ（アークレイ社製）                              ２．０ＭＵ／Ｌ
ＣａＣｌ２                                                        ２．５ｍＭ
ＮａＣｌ                                                            ５０ｍＭ
ＭＯＰＳ−ＭＯＰＳ・Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）                      １．０ｍＭ
（第３試薬）
ＦＡＯＤ（アークレイ社製）                                          １８ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ（キッコーマン社製）                                          ６７ＫＵ／Ｌ
ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）                                    ０．２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）                              ３００ｍＭ
（方法）
前記試料Ｌｏｗおよび試料Ｈｉｇｈのそれぞれについて測定を行った。まず、前記測定試料０．１４μＬに前記第１試薬８．２６μＬを添加した後、さらに、前記第２試薬７５．６μＬを混合して、３７℃で５分間放置した。そして、この混合液に前記第３試薬１８．９μＬを混合し、３７℃でインキュベートして発色反応を行った。そして、第３試薬を添加してから２．５分後における、反応液の吸光度を商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製）で測定した。測定波長は、主波長５７１ｎｍ、副波長８０５ｎｍとした。一方、比較例としては、第１試薬のスルホン酸化合物を添加してない以外は、前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。なお、試料に第１試薬および第２試薬を混合した時点での、試料１μＬに対するスルホン酸化合物の添加量は、０．３７８μｍｏｌであった。
2004007760.tif 000002
前記表１に示すように、実施例１によれば、試料Ｈｉｇｈの吸光度および試料Ｌｏｗの吸光度は、それぞれ比較例よりも高い値が得られた。これは、スルホン酸化合物の存在下でプロテアーゼ処理することによって、糖化ヘモグロビンの分解が促進されたため、糖化部分に対して、ＦＡＯＤが作用し易くなったからである。つまり、実施例によれば、分解の促進によって、ＦＡＯＤが比較例よりも多くの糖化部分に作用し易くなったため、測定精度が向上したといえる。
また、実施例によれば、試料Ｈｉｇｈの吸光度と試料Ｌｏｗの吸光度との差は、比較例よりも高い値が得られた。前記試料Ｈｉｇｈは、同じヘモグロビン濃度であっても、試料Ｌｏｗに比べてＨｂＡｌｃ濃度が高い。つまり、ヘモグロビンの糖化量が大きいため、試料Ｈｉｇｈの吸光度は、理論上、ＨｂＡｌｃで濃度に比例して、試料Ｌｏｗの吸光度よりも大きな値となる。しかし、比較例によると、スルホン酸化合物非存在下でプロテアーゼ処理しており、糖化ヘモグロビンが分解され難いため、試料のＨｂＡｌｃ濃度が異なるにも拘わらず、試料Ｈｉｇｈと試料Ｌｏｗとの吸光度差が７．１ｍＡｂｓと低い値であった。これに対して、スルホン酸化合物存在下でプロテアーゼ処理した実施例によれば、試料Ｈｉｇｈと試料Ｌｏｗとの吸光度差が比較例に比べて約２倍〜３倍に増加した。このことからも、前述と同様の理由により、実施例の方法により測定感度および測定精度が向上したといえる。
【実施例２】  この実施例は、スルホン酸化合物存在下で糖化ヘモグロビンをプロテアーゼ処理し、その分解物の糖化程度を、発色基質ＤＡ−６４を用いて測定した例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。
（第１試薬）
スルホン酸化合物（ＳＬＳ：ナカライテスク社製）                    ６．４ｍＭ
界面活性剤（ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル）          １．８５ｇ／Ｌ
ＣＨＥＳ−ＣＨＥＳ・Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．４）                        ４０ｍＭ
ＭＯＰＳ−ＭＯＰＳ・Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．４）                        １５ｍＭ
（第２試薬）
ニトロ化合物                                        ０．９ｍＭ又は１．８ｍＭ
メタロプロテアーゼ（アークレイ社製）                              ２．０ＭＵ／Ｌ
ＣａＣｌ２                                                        ２．５ｍＭ
ＮａＣｌ                                                            ５０ｍＭ
ＭＯＰＳ−ＭＯＰＳ・Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）                      １．０ｍＭ
前記ニトロ化合物としては、２，４−ＤＮＡ（和光純薬工業社製）、ｐ−ＮＡ（和光純薬工業社製）、ｐ−ＮＰ（和光純薬工業社製）、ＮａＮＯ２（ナカライテスク社製）、２，４−ＤＮＨ（和光純薬工業社製）をそれぞれ使用した。なお、ニトロ化合物を二種類添加する場合は、それぞれの濃度を０．９ｍＭとし、合計１．８ｍＭとした。
（第３試薬）
ＦＡＯＤ（アークレイ社製）                            １８ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ（キッコーマン社製）                            ６７ＫＵ／Ｌ
ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）                        ７０μＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）                ３００ｍＭ
（方法）
前記実施例１で調製した試料Ｌｏｗおよび試料Ｈｉｇｈのそれぞれについて測定を行った。測定試料０．１４μＬに前記第１試薬８．２６μＬを添加した後、さらに、前記第２試薬７５．６μＬを混合して、３７℃で５分間放置した。そして、この混合液に前記第３試薬１８．９μＬを混合し、３７℃でインキュベートして発色反応を行った。そして、５分後の吸光度を商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製）で測定した。測定波長は、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍとした。一方、比較例２としては、第１試薬のスルホン酸化合物、第２試薬のニトロ化合物を添加してない以外は、前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表２に示す。なお、下記表２において「Ｈｉｇｈ−Ｌｏｗ（ｍＡｂｓ）」は、試料Ｈｉｇｈの吸光度から試料Ｌｏｗの吸光度を引いた値である。
2004007760.tif 000003
前記表２に示すように、実施例２によれば、実施例１と同様に、試料Ｈｉｇｈの吸光度および試料Ｌｏｗの吸光度は、それぞれ比較例よりも高い値が得られた。また、試料Ｈｉｇｈの吸光度と試料Ｌｏｗの吸光度との差も、比較例２よりも高い値が得られた。以上のことから、前記実施例１と同様に、スルホン酸化合物およびニトロ化合物存在下でプロテアーゼ処理することによって、糖化ヘモグロビンの分解が促進され、これによって測定感度および測定精度が向上したといえる。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明の測定方法は、前記スルホン酸化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行うことによって、短時間でタンパク質等を分解できるため、迅速に糖化タンパク質等の測定を行うことが可能である。このため、よりいっそう高精度な測定を実現でき、本発明の測定方法は、前述のような臨床医療等における各種検査に有用である。
【国際調査報告】
2004007760.tif 000004
2004007760.tif 000005
2004007760.tif 000006
2004007760.tif 000007