【手続補正書】
【提出日】平成14年3月5日(2002.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はＰ２Ｘ３受容体、Ｐ２Ｘ３受容体の活性を変える方法およびこれらの方法の使用に関する。特に、このような方法はたとえば受容体が脱感作されている場合に、受容体の再感作速度を加速するのに用いることができる。さらに本発明は、哺乳動物における痛みの感覚を最小限にするために、受容体拮抗薬、特にＰ２Ｘ３受容体拮抗薬を使用することも含む。
【０００２】
（背景情報）
Ｐ２Ｘ３受容体は、ホモ多量体カチオン透過性イオンチャンネルとして、場合によっては、２つの異なるＰ２Ｘ受容体サブタイプからなるヘテロマーチャンネルとして機能する（Ｌｅｗｉｓ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：４３２−４３５（１９９５）；Ｌｅ他、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １８：７１５２−７１５９（１９９８）；Ｔｏｒｒｅｓ他、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５４：９８９−９９３（１９９８））。１対以上のＰ２Ｘ受容体サブタイプ、Ｐ２Ｘ２およびＰ２Ｘ３は、ラット節状神経節ニューロンにおけるヘテロマーチャンネルとして機能し、そこで独特の薬理的および電気生理的特性を示す（Ｌｅｗｉｓ他、同上（１９９５））。
【０００３】
個々の受容体に関して、ラットＰ２Ｘ２受容体は脊髄、節状および後根神経節にて発現されるが（Ｂｒａｋｅ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：５１９−５２３（１９９４））、ラットＰ２Ｘ３受容体の発現は主に、感覚神経節のニューロンのサブセットに見られる（Ｃｈｅｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：４２８−４３０（１９９５）；Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ他、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３６：１２２９−１２４２（１９９７））。両方の受容体の分布は、痛みの伝達における役割と一致している。Ｐ２Ｘ２およびＰ２Ｘ３受容体サブユニットは、単独で発現された場合に機能性チャンネルを形成し、共発現時に生来の感覚チャンネルに見られる電流に似た特性を持つ、機能性ヘテロ多量体チャンネルも形成できる（Ｌｅｗｉｓ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：４３２−４３５（１９９５））。ラット節状神経節の研究による証拠は、Ｐ２Ｘ２／Ｐ２Ｘ３ヘテロマーチャンネルとＰ２Ｘ２ホモマーチャンネルの両方がＡＴＰが誘発した電流の原因となることを示している（Ｖｉｒｇｉｎｉｏ他、Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）５１０：２７−３５（１９９８）；Ｔｈｏｍａｓ他、Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）５０９（Ｐｔ２）：４１１−４１７（１９９８）；Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：８０６３−８０６７（１９９６）；Ｓｉｍｏｎ他、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５２：２３７−２４８（１９９７））。
【０００４】
Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／Ｐ２Ｘ３受容体を活性化するＡＴＰは、脊髄後角および感覚神経節の主要な求心神経において興奮性神経伝達物質として機能する（Ｈｏｌｔｏｎ他、Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）１２６：１２４−１４０（１９５４））。ＡＴＰ誘発によるＰ２Ｘ受容体の、脊髄中の後根神経節神経末端に対する活性化は、侵害信号に関与する主要な神経伝達物質であるグルタミン酸塩の放出を刺激する（Ｇｕ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：７４９−７５３（１９９７））。したがって、損傷細胞から放出されるＡＴＰは、感覚神経の侵害神経末端上のＰ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ２／Ｐ２Ｘ３受容体を活性化することによって痛みを誘起することがある。このことは、ヒト疱疹ベースモデルにおけるＡＴＰの皮内投与による痛みの誘発（Ｂｌｅｅｈｅｎ、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６２：５７３−５７７（１９８７））、歯髄中の侵害ニューロン上でのＰ２Ｘ３受容体の同定（Ｃｏｏｋ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５０５−５０８（１９９７））、Ｐ２Ｘ受容体拮抗薬が動物モデルにおいて鎮痛性であるとの報告（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ他、Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３５０：６１８−６２５（１９９４））に一致している。この証拠は、Ｐ２Ｘ２およびＰ２Ｘ３が侵害受容体において機能し、これらのヒトＰ２Ｘ受容体の活性調節因子が鎮痛剤として有用であることを示唆している。
【０００５】
アントラキノンスルホン酸誘導体であるシバクロンブルー［すなわちリアクティブブルー−２；２−アントラセンスルホン酸、１−アミノ−４−［［４−［［４−クロロ−６−［（２−スルホフェニル）アミノ］−１，３，５−トリアジン−２−イル］アミノ］−３−スルホフェニル］アミノ］−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−］は、ＡＴＰ媒介信号伝達およびＰ２ＸならびにＰ２Ｙ受容体活性化の阻害剤として、十分に文書で実証されている（Ｒａｌｅｖｉｃ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５０：４１３−４９２（１９９８））。シバオロンブルーは、ラット膀胱平滑筋収縮（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １１５：６３６−６４０（１９９５））、ラット盲腸抑制接合ポテンシャル（Ｍａｎｚｉｎｉ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２７：１９７−２０４（１９８６））、ラット単離歯槽タイプＩＩ細胞からのリン脂質分泌（Ｒｉｃｅ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ９７：１２５８−１６２（１９８９））、ラット耳下腺腺房細胞中のカルシウム流入（Ｓｏｌｔｏｆｆ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １６５：１２７９−１２８５（１９８９））を含む、複数の多様なＡＴＰ媒介生理反応の拮抗薬として作用する。シバクロンブルーも、Ｐ２受容体駆動の内向き流およびＰＣ１２細胞におけるカルシウム流入の拮抗薬として機能する（Ｎａｋａｚａｗａ他、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  ４１８：２１４−２１９（１９８１）；Ｍｉｃｈｅｌ他、Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３５４：５６２−５７１（１９９６）；Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔ，  Ａ．，  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．  １９８：２０８−２１９（１９９６））、ゼノプス卵母細胞におけるヌクレオチド外部活性の抑制剤（Ｚｉｇａｎｓｈｉｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５１：８９７−９０１（１９９６））の両方として機能する。組換ラットＰ２Ｘ１およびＰ２Ｘ２ヌクレオチド受容体も、シバクロンブルーによる阻害に感受性である（Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔ，  Ａ．，  Ｃｈｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．  Ｓｙｍｐ．  １９８：２０８−２１９（１９９６）。
【０００６】
シバクロンブルーのＰ２Ｘ受容体機能に対する影響は主に阻害性であるが、ある報告は、Ｐ２Ｘ４受容体での増強活性について述べている（Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３７：１５７９−１５８６（１９８８））。ラットＰ２Ｘ４受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞において、シバクロンブルーによる前処理は、最大反応に影響を与えずに、ＡＴＰの効力を４倍増大した（Ｍｉｌｌｅｒ他、同上（１９９８））。
【０００７】
外因的に投与したＡＴＰおよびＰ２Ｘ受容体拮抗薬の侵害効果は、実験動物でも証明されている（Ｂｌａｎｄ−Ｗａｒｄ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２２：３６６−３７１（１９９７）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２６：３２６−３３２（１９９９））。損傷感覚求心神経に局在化している、選択的Ｐ２受容体に仲介された異所性ニューロン興奮性の増加も、慢性的な収縮神経損傷後のラットで最近報告された（Ｃｈｅｎ他、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １０：２７７９−２７８２（１９９９））。Ｐ２Ｘ受容体活性化の末梢性侵害作用に加えて、脊髄Ｐ２Ｘ受容体の刺激も、髄腔内（ｉ．ｔ．）投与されたＰ２受容体拮抗薬がげっ歯類において急性および持続性侵害性刺激に対する感度を上昇させる能力によって示されるように、痛覚の原因となる場合がある（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ６６６：１８２−１８８（１９９４）；Ｔｓｕｄａ他、Ｂｒ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２７：４４９−４５６（１９９９）；Ｔｓｕｄａ他、Ｂｒ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２８：１４９７−１５０４（１９９９））。
【０００８】
哺乳類の生理機能における個々のＰ２受容体サブタイプの役割を評価する、入手可能なプリン性リガンドの効用は、酵素分解を受けるＰ２受容体拮抗薬の感受性と、Ｐ２受容体サブタイプ−選択性作働薬および拮抗薬の不足により複雑になっている（Ｋｉｎｇ他、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  １９：５０６−５１４（１９９８）；Ｒａｌｅｖｉｃ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５０：４１３−４９２（１９９８））。しかし、組換哺乳類Ｐ２受容体サブタイプが最近入手できるようになって、特異性Ｐ２受容体サブタイプの薬理学の体系的なキャラクタリゼーションが行えるようになり（Ｋｉｎｇ他、同上（１９９８）；Ｂｉａｎｃｈｉ他、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３７６：１２７−１３８（１９９９））、Ｐ２Ｘ受容体で作用するリガンドの薬理学的選択性がさらに明らかになった。たとえば、マウスへのｉ．ｔ．投与後に抗侵害作用を持つ蛍光ＡＴＰ類似体、２’，３’−Ｏ−（２，４，６−トリニトロフェニル）−ＡＴＰ（ＴＮＰ−ＡＴＰ）は（Ｔｓｕｄａ他、Ｂｒ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２７：４４９−４５６（１９９９）；Ｔｓｕｄａ他、Ｂｒ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２８：１４９７−１５０４（１９９９））、組換ラットＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／３受容体における強力なナノモル拮抗薬であることがわかっている（Ｌｅｗｉｓ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２４：１４６３−１４６６（１９９８）；Ｔｈｏｍａｓ他、Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５０９２：４１１−４１７（１９９８））。
【０００９】
個々のＰ２受容体のサブタイプ−選択性リガンドはまだ同定されていないため、侵害信号の伝達に関与する特異性Ｐ２Ｘ受容体サブタイプを解明しようとする努力は、多くが免疫組織化学手法を用いた、受容体の局在化および機能研究に基づくものである。これらの研究によって、ホモマーＰ２Ｘ３およびヘテロマーＰ２Ｘ２／３受容体サブタイプの両方は、直径の小さい感覚神経の中枢および末梢末端に選択的に局在化されることが示されている（Ｃｈｅｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：４２８−４３１（１９９５）；Ｌｅｗｉｓ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：４３２−４３５（１９９５）；Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ他、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３６：１２２９−１２４２（１９９７）；Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ他、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３６：１２２９−１２４２（１９９７）；Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ他、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １０：３４７０−３４７８（１９９８））。さらに最近のデータは、Ｐ２Ｘ３特異性免疫反応性が、ラット坐骨神経の慢性収縮損傷後に損傷した後根神経節および同側の脊髄後角の両方において著しく増加することを示している（Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ他、Ｐａｉｎ  ８０：２７３−２８２（１９９９））。
【００１０】
総合すれば、受容体を含む（Ｐ２Ｘ３および／またはＰ２Ｘ２／３）Ｐ２Ｘ３の感覚神経への機能的および免疫組織化学的局在化は、これらのＰＸ２受容体が外因性ＡＴＰの侵害性の影響を仲介するのに主要な役割を果たすことを示している。したがって、Ｐ２Ｘ３受容体の活性化を阻害または抑制する化合物は、痛み刺激を阻害する。通常Ｐ２Ｘ３受容体および／またはＰ２Ｘ２／Ｐ２Ｘ３ヘテロマーチャンネルを活性化するＡＴＰなどの化合物に対する受容体拮抗薬は、痛みの伝達をうまく阻害することができる。
【００１１】
上記を考慮すると、Ｐ２Ｘ受容体、たとえばＰ２Ｘ３を調節または制御する能力を与える方法が確実に必要とされている。このような受容体の制御によって、そのような治療が必要な患者の痛みを最小限に押さえる能力が与えられる。
【００１２】
本明細書において上記または以下で引用するすべての米国特許、米国特許出願および出版物は、引用することによってその全体が本明細書に含まれている。
【００１３】
（発明の開示）
本発明は、ヒトＰ２Ｘ３受容体ポリペプチドまたはヒトＰ２Ｘ３受容体をコード化する前記ポリヌクレオチド配列に９０％以上同一のヌクレオチド配列を含むレセプターをコード化する単離されたポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でもよい。さらに詳細には、ＤＮＡは配列番号１５によって表される配列を含むことがある。
【００１４】
本発明は、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も含む。宿主細胞はたとえば、細菌細胞、哺乳類細胞、酵母細胞または両生類細胞でもよい。
【００１５】
加えて本発明は、上述したような、ポリヌクレオチドの転写を指示する１個以上の制御配列に、動作可能に結合されたポリヌクレオチドより成る発現ベクターを含む。該ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むヒトＰ２Ｘ３でもよい。本発明は、この発現ベクターを含む宿主細胞も含む。
【００１６】
さらに本発明は、受容体ポリペプチドであるヒトＰ２Ｘ３を生成する方法を含み、該方法は（ａ）上述した宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に十分な時間と条件によって培養するステップと；（ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップより成る。
【００１７】
本発明は、受容体ポリペプチドである精製されたヒトＰ２Ｘ３も含み、ここでポリペプチドは配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明はその上、Ｐ２Ｘ受容体活性を調節する化合物を同定する方法を含み、該方法は（ａ）ヒトＰ２Ｘ３ポリペプチドを含むＰ２Ｘ受容体を発現する宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）試験化合物をＰ２Ｘ受容体と混合するステップと；（ｃ）（ｉ）Ｐ２Ｘ受容体またはＰ２Ｘ受容体を発現する細胞の活性化に対する試験化合物の影響または（ｉｉ）細胞またはＰ２Ｘ受容体の試験化合物に対する結合のどちらかを測定するステップより成る。細胞は上述したとおりである。ステップ（ｃ）（ｉｉ）の測定は、検出可能部分によって発生した信号を測定して行う。検出可能部分はたとえば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識および酵素より成る群から選択される。ステップ（ｃ）（ｉ）の測定は、放射性標識イオン、色素形成試薬、蛍光プローブまたは電流によって発生する信号を測定して行う。該方法において、ヒトＰ２Ｘ３受容体ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むことがある。
【００１９】
本発明はさらに、試験サンプル中のＰ２Ｘ３受容体の標的ポリヌクレオチドを検出する方法も含み、該方法は（ａ）標的−プローブ錯体を作成するために、標的ポリヌクレオチドを１個以上のヒトＰ２Ｘ３受容体特異性ポリヌクレオチドプローブまたはその補体に接触させるステップと；（ｂ）試験サンプル中の標的−プローブ錯体の存在を検出するステップより成る。
【００２０】
加えて、本発明は、試験サンプル中のヒトＰ２Ｘ３受容体ｍＲＮＡのｃＤＮＡを検出する方法を含み、該方法は（ａ）ｃＤＮＡを精製するために逆転写を行うステップと；（ｂ）ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡを増幅するステップと；（ｃ）試験サンプル中のヒトＰ２Ｘ３受容体の存在を検出するステップより成る。この方法では、検出ステップ（ｃ）は、測定可能な信号を生成可能な検出可能部分を利用することを含む。
【００２１】
本発明は、ヒトＰ２Ｘ３受容体またはその一部をコード化し、ヒトＰ２Ｘ３受容体ポリペプチドをコード化する核酸に選択的にハイブリダイズできる単離されたポリヌクレオチドも含み、前記ポリヌクレオチドは配列番号１５の配列またはその一部を含む。ポリヌクレオチドは、組換または合成手法によって生成できる。
【００２２】
本発明は、ヒトＰ２Ｘ３受容体ポリヌクレオチドによってコード化された精製ポリペプチドも含み、前記ポリペプチドは配列番号１６のアミノ酸配列またはその一部を含む。ポリヌクレオチドは、組換または合成手法によって生成できる。
【００２３】
また本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列またはその免疫反応性フラグメントを含む、ヒトＰ２Ｘ３受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体も含む。
【００２４】
本発明は試験サンプル中のヒトＰ２Ｘ３受容体を検出する方法を含むことにも注目する必要があり、該方法は試験サンプルをヒトＰ２Ｘ３受容体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントに、結果として生じる錯体の形成に十分な時間および条件によって接触させるステップと；（ｂ）抗体を含む結果として生じた錯体を検出するステップであって、配列番号１６のアミノ酸またはそのフラグメントを含むヒトＰ２Ｘ３受容体アミノ酸に抗体が特異的に結合するステップより成る。
【００２５】
本発明は加えて、ヒトＰ２Ｘ受容体ポリペプチドまたはその変種をコード化する単離ポリヌクレオチドを含み、該受容体はＰ２Ｘ３である。
【００２６】
本発明は、（ａ）痛みに苦しむ患者を示すステップと；（ｂ）該患者に有効量のＰ２Ｘ３拮抗化合物を投与するステップより成る、痛みを軽減するための治療方法も含む。該拮抗化合物はＰ２Ｘ３へテロマルチマーチャンネルに対して有効である。
【００２７】
さらに本発明はＰ２Ｘ３受容体を活性化する作働薬の効果を増強する方法も含み、該方法は（ａ）前記Ｐ２Ｘ３受容体を含む細胞をトリアゼン染料を用いてインキュベートするステップと；（ｂ）作働薬がＰ２Ｘ３受容体に結合するのに十分な時間と条件によって、インキュベートした細胞を作働薬に曝露するステップより成り、ステップ（ａ）のトリアゼン染料がステップ（ｂ）の作働薬の効果を強化する。受容体は、ヒトまたはげっ歯類などの哺乳類に由来することがある。トリアゼン染料は、たとえばシバクロンブルー、バシレンブルー、リアクティブブルー５およびリアクティブレッド２より成る群から選択される。作働薬はたとえば、アデノシン５’−三リン酸二ナトリウムでもよい。
【００２８】
本発明は、（ａ）Ｐ２Ｘ３発現細胞をトリアゼン染料を用いてインキュベートするステップと；（ｂ）インキュベートした細胞を非選択的Ｐ２受容体拮抗薬に曝露するステップより成る、Ｐ２Ｘ３受容体に対する非選択的Ｐ２受容体拮抗薬の抑制活性を阻害する方法も含み、ここでステップ（ａ）のトリアゼン染料が拮抗薬の抑制活性を阻害する。Ｐ２Ｘ受容体は、げっ歯類やヒトなどの哺乳類から由来することがある。拮抗薬はピリドキサール−１−５−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ）でもよい。トリアゼン染料はシバクロンブルーまたは上述の他のトリアゼン染料の１つでもよい。
【００２９】
本発明はさらに、脱感作されたＰ２Ｘ３受容体発現細胞をトリアゼン染料に曝露することより成る、脱感作されたＰ２Ｘ３受容体発現細胞のＰ２Ｘ３受容体の再感作速度を加速する方法も含み、ここでトリアゼン染料は前記脱感作されたＰ２Ｘ３受容体発現細胞のＰ２Ｘ３受容体の前記再感作速度を加速する。Ｐ２Ｘ３受容体は再度、ヒトやげっ歯類などの哺乳類より由来することがある。トリアゼン染料はシバクロンブルーまたは上述の他のトリアゼン染料の１つでもよい。
【００３０】
哺乳類において抗侵害効果を誘発する方法であって、Ｐ２Ｘ受容体拮抗薬をそのような抗侵害効果を必要とする患者に、抗侵害効果を起こすのに十分な量のＰ２Ｘ受容体を投与するステップより成る方法。ここでも、哺乳類はヒトでもラットでもよい。Ｐ２Ｘ３受容体拮抗薬は、Ｐ２Ｘ３含有受容体に対する抗侵害効果を誘発する。受容体はたとえば、Ｐ２Ｘ３でもよい。拮抗薬はたとえば、２’，３’−Ｏ−（２，４，６−トリニトロフェニル）−ＡＴＰ（ＴＮＰ−ＡＴＰ）でもよい。
【００３１】
（図面の簡単な説明）
図１は、実施例２のＰ２Ｘ３  ５’ＲＡＣＥ生成物の配列（配列番号１３）を表しており、プライマー配列は下線を付け、予測された開始コドン（ＡＴＧ）はボールド体で示す。
【００３２】
図２は、実施例３のＰ２Ｘ３  ３’ＲＡＣＥ生成物の配列（配列番号１４）を表しており、プライマー配列は下線を付け、予測された終止コドン（ＴＡＧ）はボールド体で示す。
【００３３】
図３は、ヒトＰ２Ｘ３受容体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの完全読取枠の配列（配列番号１５）を表す。開始（ＡＴＧ）および終止（ＴＡＧ）コドンはボールド体で示す；プラスミド構成時に導入された、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＮｏｔ  Ｉ（ＧＣＧＣＣＧＣ）を含む５’および３’フランキング配列は下線を付けてある。
【００３４】
図４は、ヒト（ｈＰ２Ｘ３）（配列番号１６）およびラット（ｒ  Ｐ２Ｘ３）（配列番号１７）受容体ポリペプチドの整列させた予測アミノ酸配列を表す。同一残基は囲みで示してある。
【００３５】
図５は、ＡＴＰ刺激を受けたヒトＰ２Ｘ３受容体に仲介されたカルシウム流入に対する、シバクロンブルーの増強効果を示す。Ａ，Ｃａ２＋インジケータＦｌｕｏ−４を装填した１３２１−Ｐ２Ｘ３細胞は、シバクロンブルーの存在時（実線）および不在時（点線）に、ＡＴＰを用いて処理した。相対的な蛍光は、シバクロンブルーの不在時に得られた最大反応のパーセントとして示してある。Ｂ，  ｈＰ２Ｘ３受容体を発現するアフリカツメガエル卵母細胞は、シバクロンブルーの不在時（大きい電流）および存在時（小さい電流）に、ＡＴＰを用いて攻撃した。ＡＴＰの添加は水平棒で表す。
【００３６】
図６は、シバクロンブルー（ＣＢ）が、ＡＴＰに誘発されたｈＰ２Ｘ３受容体活性化の作用強度を濃度依存的に著しく上昇させることを示す。ＡＴＰ濃度効果曲線は、１３２１Ｎ１−ｈｐ２Ｘ３細胞において、Ｆｌｕｏ−４蛍光で決定されるＣａ２＋流入を測定することによって、シバクロンブルーの不在時または存在時に決定した：黒四角，シバクロンブルーなし（ＡＴＰ  ＥＣ５０＝３５６±４７ｎＭ、Ｅｍａｘ＝１０２±３％）；黒三角，１μＭシバクロンブルー（ＡＴＰ  ＥＣ５０＝６４±７ｎＭ＊、Ｅｍａｘ＝２６７±６％＊）；黒逆三角，３μＭシバクロンブルー（ＡＴＰ  ＥＣ５０＝４６±８ｎＭ＊、Ｅｍａｘ＝３３０±５％＊）；黒菱形，１０μＭシバクロンブルー（ＡＴＰ  ＥＣ５０＝６０±１２ｎＭ＊、Ｅｍａｘ＝３４５±６％＊）。データは、１０μＭ  ＡＴＰに対する最大反応のパーセントとして示し、３つの実験の平均（±ｓｅｍ）である（ｐＥＣ５０値に基づく統計解析；対照に比較した場合、＊Ｐ＜０．０５）。
【００３７】
図７は、シバクロンブルーがｈＰ２Ｘ３受容体の活性化を増強する効力が、プロトタイプのＰ２Ｘ３作働薬と同様であることを示している。シバクロンブルー濃度効果曲線は、１３２１Ｎ１−ｈｐ２Ｘ３細胞において、Ｆｌｕｏ−４蛍光で決定されるＣａ２＋流入を測定することによって、４種類のプロトタイプＰ２Ｘ３受容体作働薬それぞれについて決定した。完全な増強作用を仲介するのに必要なシバクロンブルーの半最大濃度は以下のとおりであった：黒逆三角，１０μＭ  ＡＴＰ（シバクロンブルーＥＣ５０＝１．４±０．５μＭ、Ｅｍａｘ＝５０４±１５％）；黒三角，１０μＭ  ２−ｍｅＳＡＴＰ（シバクロンブルーＥＣ５０＝１．４±０．２μＭ、Ｅｍａｘ＝５５５±１８％）；黒四角，１０μＭ  ＢｚＡＴＰ（シバクロンブルーＥＣ５０＝０．９±０．１μＭ、Ｅｍａｘ＝５６２±１２％）；黒菱形，１０μＭ  αβ−ｍｅＡＴＰ（シバクロンブルーＥＣ５０＝１．４±０．２μＭ、Ｅｍａｘ＝５３７±１４％）。データは、１０μＭ  ＡＴＰに対する最大反応のパーセントとして示し、３つの実験の平均（±ｓｅｍ）である。濃度効果曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの４パラメータのロジスティック式を用いて適合させた。
【００３８】
図８は、各種トリアゼン染料を用いたｈＰ２Ｘ３受容体活性の増強作用を示す。構造的に関連した４種類のトリアゼン染料の濃度効果曲線は、１３２１Ｎ１−ｈｐ２Ｘ３細胞におけるＡＴＰ活性化Ｃａ２＋流入を測定して決定した：黒四角，レッド２（ＥＣ５０＝５５±１０μＭ、Ｅｍａｘ＝６００％、固定パラメータ）；黒菱形，バシレンブルー（ＥＣ５０＝１．２±０．６μＭ、Ｅｍａｘ＝３７３±１７％＊）；黒三角，リアクティブブルー５（ＥＣ５０＝１．４±０．５μＭ、Ｅｍａｘ＝５３４±１４％）；黒逆三角，シバクロンブルー（ＥＣ５０＝１．２±０．２μＭ、Ｅｍａｘ＝５６６±１７％）。データは、１０μＭ  ＡＴＰに対する最大反応のパーセントとして示し、３つの実験の平均（±ｓｅｍ）であるｐＥＣ５０値に基づく統計解析；対照に比較した場合、＊Ｐ＜０．０５）。
【００３９】
図９は、シバクロンブルーがＰＰＡＤＳの抑制活性を阻害することを示す。Ａ，ＰＰＡＤＳによるＡＴＰ活性化ｈＰ２Ｘ３受容体活性の抑制に関する濃度効果曲線は、シバクロンブルーの存在時と不在時に決定した。ＰＰＡＤＳおよびシバクロンブルーは、３μＭのＡＴＰを添加する前に、同時に加えた：黒四角，シバクロンブルーなし（ＰＰＡＤＳ  ＩＣ５０＝８．６±３μＭ、Ｅｍａｘ＝１０１±４％）；黒丸，１μＭシバクロンブルー（ＰＰＡＤＳ  ＩＣ５０＝１４±３μＭ、Ｅｍａｘ＝２８０±６％＊）；黒菱形，１０μＭシバクロンブルー（ＰＰＡＤＳ  ＩＣ５０＝５１±４μＭ＊、Ｅｍａｘ＝４３７±６％＊）；黒三角，１００μＭシバクロンブルー（ＰＰＡＤＳ  ＩＣ５０＝２２０±１８６μＭ＊、Ｅｍａｘ＝４８８±９％＊）。挿入、データはシバクロンブルーの各濃度で見られる最大信号に正規化されている。Ｂ，  ３μＭ  ＡＴＰによって活性化されたｈＰ２Ｘ３反応のシバクロンブルーによる増強作用の濃度効果曲線は、ＰＰＡＤＳの存在時と不在時に決定した：黒四角，ＰＰＡＤＳなし（シバクロンブルーＥＣ５０＝３．８±３μＭ、Ｅｍａｘ＝７３８±２２％）；黒三角，５μＭ  ＰＰＡＤＳ（シバクロンブルーＥＣ５０＝４．５±０．３μＭ、Ｅｍａｘ＝６８２±１５％）；黒逆三角，１０μＭ  ＰＰＡＤＳ（シバクロンブルーＥＣ５０＝７．５±０．２μＭ＊、Ｅｍａｘ＝７３０±７％）；黒菱形，５０μＭ  ＰＰＡＤＳ（シバクロンブルーＥＣ５０＝１５±１．４μＭ＊、Ｅｍａｘ＝６５３±１０％）。データは、３μＭ  ＡＴＰに対する最大反応のパーセントとして示し、３つの実験の平均（±ｓｅｍ）であるｐＥＣ５０値に基づく統計解析；対照に比較した場合、＊Ｐ＜０．０５）。
【００４０】
図１０は、シバクロンブルーが、ｈＰ２Ｘ３受容体の脱感作からの回復速度を著しく上昇させることを示している。シバクロンブルーの濃度効果曲線は、非脱感作および急速脱感作１３２１−ｈＰ２Ｘ３細胞にて決定した：黒四角，非脱感作（シバクロンブルーＥＣ５０＝３．８±３μＭ、Ｅｍａｘ＝７３８±２２％）；黒丸，脱感作（シバクロンブルーＥＣ５０＝６．４±０．４μＭ＊、Ｅｍａｘ＝３０２±５％）；データは、３μＭ  ＡＴＰに対する最大反応のパーセントとして示し、３つの実験の平均（±ｓｅｍ）であるｐＥＣ５０値に基づく統計解析；対照に比較した場合、＊Ｐ＜０．０５）。
【００４１】
図１１は、シバクロンブルーが、ｈＰ２Ｘ３受容体の迅速な脱感作からの回復速度を著しく上昇させることを示している。Ａ，１３２１−ｈＰ２Ｘ３細胞は、ＡＴＰまたはＤ−ＰＢＳを用いて前処理し（対照曲線）、過剰な細胞外ＡＴＰを除去するために２回洗浄し、各種濃度のＡＴＰで再攻撃する前に、表示した時間だけインキュベートした。対照曲線（点線）は、偽脱感作した（Ｄ−ＰＢＳ処理）細胞に対するＡＴＰの濃度効果を示す。Ｂ，１３２１−ｈＰ２Ｘ３西郷は、ＡＴＰを用いて前処理し、過剰な細胞外ＡＴＰを除去するために２回洗浄し、各種濃度のＡＴＰで再攻撃する前に、表示した時間だけインキュベートした。対照曲線（点線）は、５０μＭシバクロンブルーで前処理された、偽脱感作した（Ｄ−ＰＢＳ処理）細胞に対するＡＴＰの濃度効果を示す。Ｃ，受容体回復速度を時間に対する非脱感作反応の％の関数として示す。曲線は％ｃｏｎｔｒｏｌ＝ｍａｘ（１−ｅｘｐ（−ｋτ＊ｔｉｍｅ）の解であり、％ｃｏｎｔｒｏｌは非脱感作受容体に比較した受容体活性のパーセンテージであり、ｍａｘは６１．５分で見られた％ｃｏｎｔｒｏｌ活性であり、ｔｉｍｅは分による時間であり、ｋτは時間定数である。ｔ１／２（受容体再感作の時間の半分）は、ｌｎ（０．５）／−Ｋとして計算した。
【００４２】
図１２は、ラットにおける皮内ＢｚＡＴＰの急性侵害効果の時間経過を示す。
【００４３】
図１３は、ラット後足への皮内投与後の、Ｐ２Ｘ受容体拮抗薬の急性侵害効果の用量−反応の測定値を示す（用量グループ当たりｎ＝６）。値は、注射１５分後に発生した累積性侵害的な足のフリンチング（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）反応の＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ビヒクル処理ラットに比較した場合、＊Ｐ＜０．０５。
【００４４】
図１４は、ｒＰ２Ｘ３受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞での１０μＭ  ＢｚＡＴＰ刺激によるカルシウム流入を抑制するための、ＴＮＰ−ＡＴＰ（黒菱形，ＩＣ５０＝４０ｎＭ）、ＴＮＰ−ＡＤＰ（黒四角，ＩＣ５０＝１２０ｎＭ）およびＴＮＰ−ＡＭＰ（黒三角，ＩＣ５０＝３，０００ｎＭ）の濃度効果の測定値を示す。ＲＦＵ＝相対蛍光単位。値は３種類の独立した実験による平均の±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。
【００４５】
図１５は、ＴＮＰ−ＡＴＰ（Ｆ（３，２０）＝８．２０、Ｐ＜０．０５）とＢｚＡＴＰ（１０００ｎｍｏｌ／足）との皮内同時投与の効果は、ラットの急性侵害的な足のフリンチングを濃度依存的に減弱するが、ＴＮＰ−ＡＭＰ（Ｆ（３，２０）＝０．３０、Ｐ＞０．０５）ではそのような減弱が認められないことを示している（用量グループ当たりｎ＝６）。値は、注射１５分後に発生した累積性侵害的な足のフリンチング反応の＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ビヒクル処理ラットに比較した場合、＊Ｐ＜０．０５。
【００４６】
図１６は、ＴＮＰ−ＡＴＰ（黒色棒）と５％ホルマリンとの皮内同時投与の効果は、ラットの急性侵害的な足のフリンチングを減弱したが、ＴＮＰ−ＡＭＰ（灰色棒）ではそのような減弱が認められないことを示している（用量グループ当たりｎ＝６）。フェーズＩは、皮内投与すぐの１５分後に発生した急性の累積性侵害的反応を示す（Ｆ（２，２７）＝５．１５、Ｐ＜０．０５）。フェーズＩＩは、ホルマリン注射の３０分後からの２０分間について記録した、累積性侵害的反応を示す（Ｆ（２，２７）＝６．９７、Ｐ＜０．０５）。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示し、ビヒクル処理ラットに比較した場合、＊Ｐ＜０．０５。
【００４７】
図１７は、ラットのＰ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／３受容体の作働薬活性化に対するシバクロンブルーの効果の測定値を示す。（左パネル）ＢｚＡＴＰ（１μＭ）およびα，β−ｍｅＡＴＰ（１０μＭ）の活性化を向上させるための、シバクロンブルーの代表的な濃度効果曲線（ＥＣ５０＝２μＭ）。（右パネル）ラットＰ２Ｘ２／３受容体のＢｚＡＴＰ（１μＭ）およびα，β−ｍｅＡＴＰ（１０μＭ）の活性化を向上させるための、シバクロンブルーの代表的な濃度効果曲線。ＲＦＵ＝相対蛍光単位。
【００４８】
図１８は、ラットの後足へのＢｚＡＴＰおよびシバクロンブルーの皮内同時投与の侵害効果を示す（Ｆ（１６，  ３５２）＝７．３０、Ｐ＜０．０５）。ビヒクル反応は、生理的食塩水（白四角）または生理的食塩水とＢｚＡＴＰの同時投与（黒丸）の、急性（注射１５分後の累積性反応）の足フリンチング挙動を示している。シバクロンブルー単独の侵害効果は、白四角と点線によって示されている。シバクロンブルーとＢｚＡＴＰの同時投与の効果は、黒丸と実線によって示されている。値は、３つの独立した実験による平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表し（用量グループ当たりｎ＝６）、ＢｚＡＴＰ単独の侵害効果と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、シバクロンブルー単独の侵害効果と比較した場合、＋Ｐ＜０．０５。
【００４９】
図１９は、シバクロンブルーがラットホルマリン試験のフェーズＩおよびフェーズＩＩの両方で侵害性の足フリンチングを増大させることを示している。シバクロンブルー（３０および１００ｎｍｏｌ／足）は、ラット後足にホルマリン（１−５％）とともに皮内に同時投与された。フェーズＩの侵害反応は、投与後の１５分間について記録した。フェーズＩＩの侵害反応は、投与３０分後からの２０分間について記録した。ホルマリン単独の皮内投与用量の増加によって、ビヒクルの注射に比べて侵害反応が著しく上昇する（＊Ｐ＜０．０５）。黒い棒は、ホルマリンまたはビヒクル単独の侵害反応を示す。灰色の棒は、ホルマリンまたはビヒクルが存在する場合のシバクロンブルー（３０ｎｍｏｌ／足）の侵害反応を示す。斜線の棒は、ホルマリンまたはビヒクルが存在する場合のシバクロンブルー（１００ｎｍｏｌ／足）の侵害反応を示す。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表し（用量グループ当たりｎ＝６）、ホルマリン単独と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５（各ホルマリン用量でのビヒクル反応）、ビヒクル単独と比較した場合、＋Ｐ＜０．０５。
【００５０】
（発明の詳細な説明）
主題発明は、Ｐ２Ｘ３受容体、この受容体の核酸配列、受容体のアミノ酸配列、この受容体の生成方法および各種化学薬品（たとえばシバクロンブルーおよび／またはＴＮＰ−ＡＴＰ）の使用によるＰ２Ｘ３受容体の活性の変更方法に関する。受容体を外部的に調節する機能によってたとえば、外傷事故などの後、末期疾患時、手術時、手術後、あるいは患者の痛みを医療提供者が管理しなければならないすべての状況において、痛みなどの感覚を制御することができる。
【００５１】
特に本発明は、受容体の活性を調節する化合物を識別するために、プリン受容体に対する特異的結合について複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法は（ａ）ヒト（または他の哺乳類）のプリン受容体ポリペプチドコード化配列を発現する細胞を提供することと、（ｂ）試験化合物を細胞と混合することと、（ｃ）プリン受容体またはプリン受容体を発現する細胞の活性化に対する試験化合物の効果を測定すること、を含む。
【００５２】
さらに、本発明は試験サンプル中の作働薬または拮抗薬の量を決定する方法を提供する。該方法は（ａ）ヒト（または他の哺乳類）のプリン受容体ポリペプチドコード化配列を発現する細胞を提供することと、（ｂ）試験化合物を細胞と混合することと、（ｃ）プリン受容体またはプリン受容体を発現する細胞の活性化に対する試験化合物の効果を測定すること、を含む。
【００５３】
本発明は、興味のあるプリン受容体をコード化する宿主細胞も含む。宿主細胞は、本発明によって含まれるベクターによって遺伝子組換えされており、クローニングベクターまたは発現ベクターでもよい。該ベクターは、動作可能に結合されたプリン受容体をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、その発現を制御する配列を制御する。宿主細胞はプリン受容体を発現するために、安定に形質移入されることが好ましい。宿主細胞は、すでに外因性プリン受容体発現が欠乏していない場合は、そのように組換えられたプリン受容体ヌル細胞であることがさらに好ましい。
【００５４】
本発明の常法は、別途示さない限り、当業界の技術の範囲内の分子生物学、微生物学、組換ＤＮＡ技術、電気生理学、薬理学の従来技法を採用する。このような技法は文献で十分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ編  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｈａｍｅｓら、編）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｊ．  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒら、編  （１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．）；  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）；  ａｎｄ  ＰＣＲ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、編  （１９９１）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照すること。
【００５５】
本明細書および添付請求項で使用されているように、内容が明らかに別のことを示していない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の言及も含む。したがってたとえば、「ａ  ｐｒｉｍｅｒ」の言及は２個以上のそのようなプライマーを含み、「ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ」の言及は２個以上のそのようなアミノ酸を含む、などのようになる。
【００５６】
定義：
本発明の説明に際して、以下の語を採用し、以下に示すように定義する。
【００５７】
「Ｐ２受容体」という語は、天然または合成にかかわらず、リガンドＡＴＰのプリン性受容体および／または他のプリンまたはピリミジンヌクレオチドを意味する。Ｐ２受容体は「Ｐ２Ｘ」または「Ｐ２Ｙ」受容体として広範に界分類される。これらのタイプは、薬理学、構造および信号形質導入機構が異なる。Ｐ２Ｘ受容体は一般にリガンドゲート制御イオンチャンネルであるが、Ｐ２Ｙ受容体は一般にＧタンパク質結合系を通じて作動する。さらに、そして理論によって限定されることなく、Ｐ２Ｘ受容体は受容体ポリペプチドのマルチマーを含み、該マルチマーは同一または異なるサブタイプのどちらでもよい。結果として、「Ｐ２Ｘ受容体」という語は適宜に、個々の１個以上の受容体サブユニットはもちろん、それによって構成されるホモマーまたはヘテロマー受容体のことも指す。
【００５８】
「サブユニット」という語はプリン受容体を呼ぶのに使用される場合、単独または１個以上の他のポリペプチドとともに機能性プリン受容体を形成するポリペプチドを意味する。プリン受容体が２個以上のポリペプチドサブユニットで構成されている場合、サブユニットは同一（ホモマーマルチマーを形成する）または異なっていても（ヘテロマーマルチマーを形成する）よい。
【００５９】
「Ｐ２Ｘｎ」という語は、ｎが１以上の整数であるＰ２Ｘ受容体サブタイプを意味する。発明の時点で７以上のＰ２Ｘｎ受容体サブタイプが単離および／またはキャラクタリゼーションされている。
【００６０】
「Ｐ２Ｘ３受容体作働薬」は、Ｐ２Ｘ３受容体に結合し、活性化する化合物である。「活性化する」とは、１個以上の薬理学的、生理的または電気生理的反応の誘発を意味する。このような反応は、これに限定されるわけではないが、受容体特異性細胞脱分極の増加を含む。
【００６１】
「Ｐ２Ｘ３受容体拮抗薬」は、Ｐ２Ｘ３受容体に結合し、作働薬による受容体の活性化を阻害する。純粋な拮抗薬は受容体を活性化しないが、一部の物質は作働薬と拮抗薬の特性を混合している。
【００６２】
「ポリヌクレオチド」という語は本明細書で使用されているように、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形式を意味する。この語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この語は二本鎖および一本鎖ＤＮＡはもちろん、二本鎖および一本鎖ＲＮＡも含む。メチルおよび／またはキャッピングなどの修飾、およびポリヌクレオチドの未修飾形も含む。
【００６３】
「変種」という語は、１個以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換において、関連する野生種配列とは異なるオリゴヌクレオチド配列を指すのに用いる。構造保存的突然変異によって発生しなかった場合（以下を参照）、このような変種オリゴヌクレオチドは、「タンパク質変種」として発現され、本明細書で使用されるように、１個以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換において、野生種ポリペプチドと異なるポリペプチド配列を示す。タンパク質変種は一次構造（アミノ酸配列）が異なるが、野生種に対して、二次または三次構造、または機能が著しく異なっている場合も、異なっていない場合もある。
【００６４】
「突然変異体」という語は一般に、遺伝子または染色体の変化の結果として、新しい遺伝子特性または表現型を示す生物または細胞を指す。しかし、ある例では、「突然変異体」は変種タンパク質またはオリゴヌクレオチドに関して使用され、「突然変異」は変種の基礎となる変化を指すことがある。
【００６５】
「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれの、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な対応として定義される。「同一性率」を決定することによって、２個以上のヌクレオチド配列を比較できる。「同一性率」を決定することによって、２個以上のアミノ酸配列も比較できる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ウィスコンシン州マディソン）で利用できるプログラム、たとえばＧＡＰプログラムは、２個のポリヌクレオチドの同一性と２個のポリペプチドの同一性の両方をそれぞれ計算できる。同一性率を計算する他のプログラムは、当業者に既知である。
【００６６】
「類似性」は、適切な場所における２個以上のポリペプチドが同一であるか、電荷または疎水性などの化学的および／または物理的特性を備えている場合、そのポリペプチドのアミノ酸対アミノ酸の正確な比較を意味する。したがって、「類似性率」は比較されたポリペプチド配列間で決定できる。アミノ酸配列の同一性はもちろん、核酸配列の同一性を決定する技術は、当業者に既知であり、（通常はｃＤＮＡ中間体によって）遺伝子のｍＲＮＡの核酸配列を決定すること、それによりコード化されるアミノ酸配列を決定すること、そしてこれを第二のアミノ酸配列と比較することを含む（上の同一性率の説明を参照）。
【００６７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では相互に置き換えて使用され、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の分子鎖を意味する。この語は特定の長さの生成物を指すものではない。そのため、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。この語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの、ポリペプチドの翻訳後の修飾を意味する。加えて、タンパク質フラグメント、類似体、変異または変種タンパク質、融合タンパク質などは、そのようなフラグメントなどがその所期の目的に必要な結合または他の特性を保持している場合、ポリペプチドの意味の範囲内に含まれる。
【００６８】
本明細書で使用されるように「機能上保存的な突然変異」は、誘導体が作成されたポリペプチドに比べて、実質的に活性が変化していない誘導ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドにおける変化を意味する。このような誘導体はたとえば、実質的にその特性に影響を与えない関連分子における、アミノ酸の挿入、欠失または置換を含むことがある。たとえば誘導体は、たちえばＧｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒなどの置換されたアミノ酸の一般的な電荷、疎水性／親水性、側鎖部分および／または立体バルクを保存する置換などの、保存的アミノ酸置換を含むことができる。
【００６９】
「構造上保存的な突然変異」という語は、核酸配列の変化を含むが、変質した変種が誘導されるポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを意味する。このことが起こるのは、特異性アミノ酸が２個以上の「コドン」すなわち３個のヌクレオチドの配列によってコード化されるために、すなわち遺伝子コードの変質による。
【００７０】
「組換宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および、単細胞エンティティとして培養された微生物またはさらに高等な真核細胞系を示す他のそのような語は、組換ベクターまたは転移ＤＮＡの宿主として使用できる、または使用される細胞を指し、細胞にＤＮＡを導入する方法やその後の細胞の素質については重要でない細胞を指す。この語は、形質移入された元の細胞の子孫を含む。初代培養の細胞も、卵母細胞などの細胞と同様に宿主として使用できる。
【００７１】
「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが結合するレプリコンであり、結合したセグメントの複製および／または発現を引き起こすようにする。この語は、発現ベクター、クローニングベクターなどを含む。
【００７２】
「コード化配列」は、ｍＲＮＡに転写される、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード化配列の境界は、５’−末端の翻訳開始コドンと３’−末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード化配列はこれに限定されるわけではないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換ポリヌクレオチド配列を含む。変種または類似体は、コード化配列の一部の欠失、配列の挿入、および／または配列内の１個以上のヌクレオチドの置換によって調製できる。特定部位の突然変異誘発などのヌクレオチド配列の修飾技法は、当業熟練者に周知である。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ他、同上；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、同上；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、同上を参照すること。
【００７３】
「動作可能に結合された」は、説明した構成要素が意図した方法で機能できる関係にある状態を指す。それゆえたとえば、コード化配列に「動作可能に結合された」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード化配列の発現が行われるような方法で結合される。コード化配列は、ポリヌクレオチドの転写を誘発する制御配列に動作可能に結合され、それによって前記ポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現される。
【００７４】
「形質移入」は、挿入に使用する方法、または挿入されるポリヌクレオチドの分子形とは関係なく、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを指す。ポリヌクレオチド自体の挿入および外因性ポリヌクレオチドを構成するプラスミドまたはベクターの挿入が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、細胞によって直接転写および翻訳され、たとえばプラスミドなどの統合されないベクターとして維持されるか、代わりに、宿主ゲノム内に安定に統合されることがある。「形質移入」は一般に、真核細胞に関して用いられるが、「形質転換」は、原核細胞のポリヌクレオチドへの挿入を指すのに用いられる。真核細胞の「形質転換」は、癌性または腫瘍形成状態の形成も指すことがある。
【００７５】
「単離された」という語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す場合、指摘された分子が他の同様な生体巨大分子が実質的にない場合に存在することを意味する。「単離された」という語は本明細書では、７５重量％以上、さらに好ましくは８５重量％以上、またさらに好ましくは９５重量％以上、最も好ましくは９８重量％以上の組成物が単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドであることを意味する。特定のポリペプチドをコード化する「単離されたポリヌクレオチド」は、主題ポリペプチドをコード化しない他の核酸分子を実質的に含まないポリヌクレオチドを指す；しかし、分子は本明細書で定義するように、機能上および／または構造上保存的な突然変異を含むことがある。
【００７６】
「試験サンプル」は本明細書で使用するように、Ｐ２Ｘ３を含むＰ２Ｘ受容体の１つの供給源である、個人の体の構成要素を意味する。これらの試験サンプルは、本明細書で説明する本発明の方法によって評価可能な生体サンプルを含み、全血、組織および細胞調製物などの体液を含む。
【００７７】
本文を通じて、以下の１文字のアミノ酸の省略形を使用する：
アラニン      Ａ      アルギニン        Ｒ
アスパラギン  Ｎ      アスパラギン酸    Ｄ
システイン    Ｃ      グルタミン        Ｑ
グルタミン酸  Ｅ      グリシン          Ｇ
ヒスチジン    Ｈ      イソロイシン      Ｉ
ロイシン      Ｌ      リジン            Ｋ
メチオニン    Ｍ      フェニルアラニン  Ｆ
プロリン      Ｐ      セリン            Ｓ
トレオニン    Ｔ      トリプトファン    Ｗ
チロシン      Ｙ      バリン            Ｖ
【００７８】
上述したように、哺乳類Ｐ２Ｘ３受容体、変種受容体をコード化するポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドサブユニット、これらの受容体を作成する方法を本明細書で提供する。本発明は上のＰ２Ｘ受容体だけではなく、受容体および受容体を発現する細胞を用いた、化合物のスクリーニング方法も含む。さらに、受容体の検出に使用できるポリヌクレオチドおよび抗体を、これらの方法で有用な試薬と同様に提供する。受容体とその発現を調整するのに有用な化合物およびポリヌクレオチドも、以下で開示するように提供する。
【００７９】
１つの好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは上述のヒトＰ２Ｘ受容体ポリペプチド、または保存的アミノ酸置換を含むそのタンパク質変種をコード化する。
【００８０】
上述のヒトＰ２Ｘ受容体およびその変種をコード化するＤＮＡは、合成によって、あるいは技法の組合せによって調製したゲノムまたはｃＤＮＡから誘導できる。次にＤＮＡは、ヒトＰ２Ｘ受容体を発現させるのに用いるか、または当業者に周知の方法を用いてＲＮＡ調製のためのテンプレートとして、または他のＰ２Ｘコード化ヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズ可能であり、その結果、他のＰ２Ｘコード化ヌクレオチド配列を検出できる分子プローブとして使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、同上を参照）。
【００８１】
Ｐ２Ｘ３受容体をコード化するｃＤＮＡは、適切なＤＮＡライブラリから得られる。ｃＤＮＡライブラリは、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ他、（１９７５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７３：３９１６に記載された手順を用いてプローブできる。それゆえｃＤＮＡを次に、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）とプライマー配列を持ちいて修飾および増幅して、ヒトＰ２Ｘ受容体をコード化する特異性ＤＮＡを得ることができる。
【００８２】
さらに詳細には、ＰＣＲは、ＤＮＡ分子内の望ましい配列の反対端に一致する短いオリゴヌクレオチドプライマー（一般に長さ１０〜２０ヌクレオチド）を使用する。プライマー間の配列は既知である必要はない。最初のテンプレートはＲＮＡでもＤＮＡでもよい。ＲＮＡを使用する場合、最初にｃＤＮＡに逆転写される。次にｃＤＮＡを、熱などの周知の技法を用いて変性させ、適切なオリゴヌクレオチドプライマーをモル過剰に添加する。
【００８３】
プライマー伸長は、デオキシヌクレオチド三リン酸またはヌクレオチド類似体の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施する。得られた生成物は、５’−末端にそれぞれプライマーを含み、このプライマーは、元の鎖の新たに合成された補体に共有結合されている。複製分子を再度変性させ、生成物が十分に増幅されるまで、プライマーによってハイブリダイズなどを行う。このようなＰＣＲ法はたとえば、米国特許第４，９６５，１８８号、第４，８００，１５９号、第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号に記載されており、これらの全体は引用することによって本明細書に含まれている。ＰＣＲの生成物はクローニングし、プライマー伸長鎖の分離によって誘導されたＰ２Ｘ受容体ＤＮＡを含むクローンを選択した。選択はプライマーをハイブリダイゼーションプローブとして用いて行える。
【００８４】
あるいはまた、各Ｐ２Ｘ受容体ＤＮＡは、ヒトＲＮＡから始まるＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ転写反応）を、方法を用いて生成できる。ヒトＲＮＡは、特異性Ｐ２Ｘ受容体が発現される、たとえば脳、脊髄、子宮または肺などの細胞または組織から、従来方法を用いて得られる。たとえば、一本鎖ｃＤＮＡは、標準の逆転写酵素手順を用いてテンプレートとしてのヒトＲＮＡから合成され、ｃＤＮＡはＰＣＲを用いて増幅される。これは、ヒト組織ＲＮＡテンプレートからＰ２Ｘ受容体変種を生成する一例に過ぎない。
【００８５】
ヒトＲＮＡの逆転写は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）による試薬と、以下の方法を用いても実施できる：ポリＡ＋下垂体組織から誘導したＲＮＡ（１マイクログラム）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．  カリフォルニア州パロアルト）と１μｌ（５０ナノグラム）のランダムヘキサマープライマーを混合して、最終体積が１２μｌのｄＨ２Ｏとなるようにした。この混合物を７０℃まで１０分間加熱し、氷上で１分間冷却する。以下の成分を加える：２μｌの１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．４、５００ｍＭ  ＫＣｌ）、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、２μｌの０．１Ｍジチオトレイトール。反応は２５℃で５分間平衡化させ、その後１μｌ（２００単位）のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を加え、インキュベーションを２５℃で１０分間継続し、次に４２℃で５０分間行う。代わりに、１０ピコモルのオリゴｄＴプライマーを上の反応混合物中のランダムヘキサマープライマーに換えることができる。この場合、４２℃で２分間、平衡化を行った後、逆転写酵素を加え、インキュベーションを４２℃で５０分間行う。逆転写反応は、７０℃、１５分間のインキュベーションによって停止させ、氷上で冷却する。Ｒｎａｓｅ  Ｈ（１μｌ；２単位）を添加し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートし、氷上で保存する。
【００８６】
合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ（１９８４）が述べたＤＮＡ３：４０１などの自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製してもよい。望ましい場合、合成鎖は３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼを用いた処理によって、反応の標準条件を使用して、３２Ｐにより標識してもよい。ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリから単離されたものを含むＤＮＡ配列は、Ｚｏｌｌｅｒ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １０：６４８７が述べているような、特定部位の突然変異誘発を含む既知の方法によって修飾してもよい。簡単に言えば、修飾されるＤＮＡは一本鎖配列としてファージ内にひとまとめにされる。次にＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに変換し、修飾されるＤＮＡの部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、その配列内に望ましい修飾を加える。ファージの各鎖の複製を含む、形質転換された細菌の培養は、プラークを得るために寒天内でプレーティングする。理論的には、新しいプラークの５０％が、突然変異配列を持つファージを含み、残りの５０％が元の配列を持っている。プラークの複製は、ハイブリダイゼーションに適した温度および条件において、正しい鎖によって、標識化された合成プローブにハイブリダイズされるが、未修飾配列によってはハイブリダイズされない。ハイブリダイゼーションによって同定された配列は回収・クローニングされる。あるいは、変種を野生種と区別するのが困難な場合は、配列解析によってクローンを同定する必要がある。いずれの場合も、ＤＮＡは配列確認される。
【００８７】
特異性Ｐ２Ｘ受容体をコード化するＤＮＡ、または特異性Ｐ２Ｘ受容体をコード化するヌクレオチド配列に約６０〜８０％同一であるＤＮＡ、さらに好ましくは特異性Ｐ２Ｘ受容体をコード化するヌクレオチド配列に約９０％同一であるＤＮＡはいったん生成されると、適切な宿主細胞内での複製のために、次にクローニングベクターまたは発現ベクター内に包含される。ベクターの構成には、当業者に既知の方法を使用する。一般に、適切な制限酵素を用いて、これらの市販酵素の製造者が一般に規定する条件下で処理することによって、部位特異性ＤＮＡ開裂を実施する。制限酵素によるインキュベーションの後、抽出によってタンパク質を除去し、沈殿によってタンパク質を回収する。開裂したフラグメントは、当業熟練者に既知の方法に従って、たとえばポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法を用いて分離できる。
【００８８】
粘着末端開裂フラグメントは、混合物中に存在する適切なデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ）を用いた平滑末端でもよい。Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理も使用され、任意の一本鎖ＤＮＡ部分の加水分解を生じる。
【００８９】
連結反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを用いた標準緩衝液と温度条件を使用して実施する。あるいは、望ましくないフラグメントの制限酵素消化を用いて、連結反応を防止することができる。
【００９０】
標準ベクター構成は一般に、特異性抗生物質抵抗性成分を含む。連結反応混合物は適切な宿主に形質転換され、成功した形質転換体は抗生物質抵抗性または他のマーカーによって選択される。次に、形質転換体によるプラスミドは、通常は、Ｃｌｅｗｅｌｌ他、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １１０：６６７（１９７２）によって報告されたクロラムフェニコール増幅の後に、当業者に既知の方法に従って調製できる。ＤＮＡは通常、制限酵素解析および／または配列決定によって単離および分析される。配列決定は、Ｍｅｓｓｉｎｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ９：３０９（１９８１）でさらに述べられている、Ｓａｎｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｎ７４：５４６３（１９７７）の周知のジデオキシ法によるか、Ｍａｘａｍ他、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６５：４９９（１９８０）が報告した方法によってもよい。バンド圧縮による問題は、ＧＣが豊富な領域で見られることがあるが、Ｂａｒｒ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：４２８（１９８６）が報告した方法に従って、たとえばＴ−デアゾグアノシンまたはイノシンを用いて克服される。
【００９１】
宿主細胞は、クローニングベクターまたは発現ベクターである、本発明のベクターによって遺伝子組換される。ベクターはプラスミド、ウィルス粒子、ファージなどの形でもよい。組換された宿主細胞は、プロモータの活性化、形質転換体／トランスフェクタントの選択、またはサブユニットをコード化するポリヌクレオチドの増幅に適するように改良された従来の培養液中で培養できる。温度、ｐＨなどの培養条件は一般に、発現用に選択された宿主細胞によって以前使用された条件に似ており、当業熟練者には明白である。
【００９２】
原核および真核宿主細胞はどちらも、指定された宿主に適合性のある適切な制御配列が使用される場合、望ましいコード化配列の発現に使用できる。たとえば原核宿主の中で、大腸菌がよく使用される。またたとえば、原核生物の発現制御配列はこれに限定されるわけではないが、随意にオペレータ部分を含むプロモータ、リボソーム結合部位を含む。原核宿主と適合性のある転移ベクターはたとえば、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性を付与するオペロンを含むプラスミドｐＢＲ３２２、抗生物質抵抗性マーカーをを付与する配列も含む各種のｐＵＣベクターより誘導できる。これらのマーカーを使用して、選択によって、成功した形質転換体を得ることができる。一般に使用される原核制御配列はこれに限定されるわけではないが、ラクトースオペロン系（Ｃｈａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６（１９７７））、トリプトファンオペロン系（Ｇｏｅｄｄｅｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ８：４０５７（１９８０）によって報告）およびラムダ誘導Ｐ１プロモータならびにリボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８（１９８１））、ｔｒｐおよびｌａｃ  ＵＶ５プロモータの配列から誘導されるハイブリッドＴａｃプロモータ（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２９２：１２８（１９８３））を含む。上述の系は特にＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）と適合性であるが、望ましい場合には、バチルスまたはシュードモナスの菌株などの他の原核宿主も使用できる。
【００９３】
真核宿主は培養系に、酵母および哺乳類細胞を含む。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓは一般に使用される酵母宿主である。酵母適合性ベクターは、栄養要求性変異株に原栄養性を付与したり、野生種菌株に重金属に対する耐性を付与したりして、正しい形質転換体を選択できるようにするマーカーを持っている。酵母適合性ベクターは、２−μの複製起点（Ｂｒｏａｃｈ他、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １０１：３０７（１９８３））、ＣＥＮ３およびＡＲＳ１の組合せ、または適切なフラグメントを宿主細胞ゲノムに包含させる配列などの、複製を行えるようにする他の手段を使用する。酵母ベクターの宿主配列は当業者に既知であり、これに限定されるわけではないが、３−ホスホグリセラレートキナーゼ用のプロモータを含む、解糖酵素の合成用のプロモータが挙げられる。たとえばＨｅｓｓ他、Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｑ．  ７：１４９（１９６８）、Ｈｏｌｌａｎｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８）、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３（１９８０）を参照すること。たとえば、一部の有用な制御系は、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモータまたはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）調節可能プロモータ、またはＣｏｎｓｅｎｓ  ａｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ６１：２６５−２７５（１９８７）で述べられているハイブリッド酵母プロモータＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ、ＧＡＰＤＨからさらに誘導されたターミネータ、分泌が望ましい場合は、酵母アルファ因子によるリーダー配列を含む制御系である。加えて、動作可能に結合される転写調節領域と転写開始領域は、野生種生物において天然に結び付けられないようになっている。
【００９４】
発現のホストとして利用できる哺乳類細胞系は当業者に既知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎなどの受託者から入手できる。これらはこれに限定されるわけではないが、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞およびその他が挙げられる。哺乳類細胞の適切なプロモータは当業者に既知であり、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウィルス（ＡＤＶ）、ウシ乳頭しゅウイルス（ＢＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などによるものなどのウィルスプロモータを含む。哺乳類細胞もターミネータ配列およびポリＡ追加配列を必要とすることがある；発現を増加させるエンハンサ配列も含まれることがあり、遺伝子の増幅を引き起こす配列も望ましいことがある。これらの配列は当業者に既知である。哺乳類細胞における複製に適したベクターはウィルスレプリコン、またはＰ２Ｘ受容体を宿主ゲノム内にコード化する適切な配列を統合できるようにする配列を含むことがある。このような哺乳類発現系の例は、Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ他、Ｅｕｒ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２９０：２３７−２４６（１９９５）で述べられている。
【００９５】
Ｂｒｉｇｇｓ他、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３４：５８３−５９０（１９９５）またはＳｔｕｈｍｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０７：３１９−３４５（１９９２）で述べられているような標準方法を用いる両生類細胞や、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．  １５５５（１９８７）で述べられている方法を用いる昆虫細胞などの他の真核系も、このような系にポリヌクレオチドを導入するための方法と同様に知られている。
【００９６】
バキュロウイルス発現系を、昆虫宿主細胞内に高濃度の組換え体タンパク質を合成するために使用できる。この系は、哺乳動物細胞と同様の様式でのタンパク質の翻訳後修飾を行いながら、高濃度のタンパク質発現を可能にする。これらの発現系は、バキュロウイルス感染に続いて、昆虫細胞内のクローン化した遺伝子の発現を駆動するために活性化する、ウイルスプロモーターを使用する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、（１９９２）、バキュロウイルス発現ベクター：研究室マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、ＩＲＬ／Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００９７】
トランスフェクションは、宿主細胞によるポリヌクレオチドの直接の取り込みおよび類似のものによって、ウイルス中のポリヌクレオチドをパッケージングすることおよび宿主細胞をウイルスで形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法であってよく、これは当業者に既知の方法である。選択したトランスフェクション手順はトランスフェクトすべき宿主に依存し、日常的に行っている者によって決定される。
【００９８】
レセプターの発現は、レセプターに選択的である放射性リガンドの使用によって検出してよい。しかしながら、本技術分野で既知の任意の放射リガンド結合技術を、レセプターを検出するために使用してよい（たとえば、Ｗｉｎｚｏｒら、（１９９５）、リガンド結合の定量的特性化（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ、Ｍｉｃｈｅｌ他、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：５２４−５３２（１９９７））。あるいは、発現を、抗体または機能的測定、すなわち当業者によく既知の方法を用いたＡＴＰ−刺激細胞極性化を用いて検出できる。たとえば、作働薬刺激Ｃａ２＋流動、または作働薬刺激Ｃａ２＋流動の拮抗薬による阻害を、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはＨＥＫ細胞のような組換え体Ｐ２Ｘ２レセプターｃＤＮＡをトランスフェクトした哺乳動物細胞中で測定できる。あるいは、Ｃａ２＋流動を、一過性または安定にＰ２Ｘ３およびレセプターを発現するために組換え体技術を用いて調製した、Ｐ２レセプターを天然には発現していない細胞、たとえば１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫株中で測定できる。
【００９９】
Ｐ２Ｘポリペプチドを、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって、同ポリペプチドを発現している組換え体宿主細胞培養液より回収し、精製する。タンパク質の構造を完成させるのに、必要であれば、タンパク質再折り畳み工程を使用できる。最後に、最終精製工程に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用できる。
【０１００】
本発明に含まれるこれらのポリペプチドは、好ましくはＰ２Ｘ３レセプターに相当するアミノ酸と４０〜６０％類似しており、より好ましくはＰ２Ｘ３レセプターのアミノ酸配列に７０〜８５％類似しており、さらにより好ましくはＰ２Ｘ３レセプターのアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一である。
【０１０１】
本発明のヒトＰ２Ｘレセプターポリペプチドまたはその断片はまた、本技術分野で既知の従来の技術、たとえば固相ペプチド合成のような化学合成によって、合成してよい。一般的に、これらの方法は、固体または液体相合成方法を使用する。たとえば、固相ペプチド合成技術に関して、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｔｈｅｓｉｓ）、２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）およびＧ．Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ペプチド：解析、合成、生物学（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ），エディター  Ｅ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８０），ｐｐ．３−２５４を、そして伝統的な溶液合成に関して、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４）およびＥ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，ペプチド：解析、合成、生物学（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ）上記、Ｖｏｌ．１を参照のこと。
【０１０２】
１つの好ましい系において、それぞれが特定のヒトＰ２Ｘレセプターをコードしている、そこより由来したＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかを、アフリカツメガエル卵母細胞のような細胞内への直接注入によって発現させてよい。この方法を用いて、そのＤＮＡおよびそのｍＲＮＡによってコードされたヒトＰ２Ｘ３レセプターの機能性を以下のように評価することができる。レセプターコードポリヌクレオチドを、機能的なレセプターサブユニットへの翻訳のために卵母細胞内に注入する。発現した変異体ヒトＰ２Ｘ３レセプターを、電圧クランプ法などのような電気生理学的技術を含むさまざまな技術によって卵母細胞中で査定することができる。
【０１０３】
組換え体宿主細胞内で発現したレセプターを、Ｐ２Ｘ３を調節する化合物を同定するために使用してよい。このことに関して、レセプターに対して親和性を示している化合物の結合の特異性を、レセプターを発現している細胞またはこれらの細胞からの膜に対する化合物の親和性を測定することで立証する。これは、細胞、細胞膜または単離したレセプターに対する標識化した（たとえば放射活性）化合物の特異的結合を測定すること、または標準の標識化リガンドの特異的結合を置換する化合物の能力を測定することによって行ってよい。たとえば、上記Ｍｉｃｈｅｌら、を参照のこと。変異体レセプターの発現およびこれらの細胞または膜に結合するか、またはこれらの細胞または膜に対する標識化リガンドの結合を阻害する化合物のスクリーニングにより、このレセプターに対して高い親和性を持つ化合物の迅速な選別が提供される。これらの化合物は、作働薬、拮抗薬、またはレセプターの調節物であってよい。
【０１０４】
発現したレセプターをまた、Ｐ２Ｘレセプター活性を調節する化合物に関して選別するために使用してよい。Ｐ２Ｘ活性を調節する化合物の同定のための１つの方法には、特定のヒトＰ２Ｘレセプターポリペプチドを発現している細胞を提供すること、試験化合物をこの細胞と結合させること、およびそのＰ２Ｘレセプター活性における試験化合物の効果を測定することが含まれる。細胞は、微生物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、両生類細胞、昆虫または他のレセプターを発現している細胞であってよい。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞または両生類細胞である。したがって、たとえば、試験化合物を、適切な応答、たとえばＰ２Ｘプリノレセプターが宿主細胞に発現している場合の、カルシウムイオン増加による細胞脱分極の刺激または細胞内カルシウム濃度の上昇、Ｐ２Ｙプリノレセプターが発現した場合の細胞内カルシウムイオン濃度および／またはイノシトールリン脂質加水分解の増加およびイノシトールリン酸の形成などを誘発するその能力に関して、またはＰ２ＸまたはＰ２Ｙプリノレセプター作働薬または拮抗薬に対する応答を調製する化合物の能力について評価する。
【０１０５】
細胞内カルシウム濃度は、カルシウムイオン感受性蛍光指示体を用いて解析してよい。細胞蛍光を蛍光計を用いてモニタしてよい。カルシウムイオン感受性蛍光色素の例には、たとえばｑｕｉｎ−２（たとえばＴｓｉｅｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９４：３２５（１９８２）を参照のこと）、ｆｕｒａ−２（たとえばＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０（１９８５）を参照のこと）、カルシウムグリーン−１、ｉｎｄｏ−１（たとえば、上記Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、を参照のこと）、ｆｌｕｏ−３（たとえば、Ｋａｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８１７９（１９８９）を参照のこと）、およびｒｈｏｄ−２（たとえばＴｓｉｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．アブストラクト８９ａ（１９８７）を参照のこと）および、これらの非特異的エステラーゼ−加水分解可能アセトキシメチルエステルが含まれ、これらはすべて市販されている（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），Ｅｕｇｅｎｅまたはシグマ  ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１０６】
一般的にＰ２Ｘｎプリノレセプターを発現するために遺伝子工学的に作製した細胞の膜脱分極は、膜電位の変化に感受性である蛍光色素を用いてモニタしてよい。たとえば、電位感受性蛍光色素が、脱分極している膜内に分割し、結果として細胞内蛍光の検出可能な増加となる。そのような膜電位感受性蛍光色素の例には、３，３’−ジフェニルオキサカルボシアニンヨー化物（ＤｉＯＣ５）および３，３’−ジプロピルチアジカルボシアニンヨー化物（ＤｉＳＣ３）のようなカルボシアニン類、ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）ペンタメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（５））またはビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）ペンタメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（５））または類似のもののようなオキソノール類が含まれる。
【０１０７】
ｉｎ  ｓｉｔｕでこれらの色素の蛍光放射を較正するために、蛍光放射を消光する薬剤を使用してよい。したがって、たとえば抗フルオレセイン（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））はｐＨ７．０でのｆｌｕｏ−３の５ｎＭ溶液の蛍光のおよそ８７％を消光し、この色素の蛍光放射を較正するのに使用してよい。アセトキシメチルエステル色素誘導体を使用する場合、エステルの不完全な加水分解により、蛍光であるが、カルシウムイオンに不感受性の蛍光指示体となる可能性がある。そのような条件に対するコントロールには、飽和量のカルシウムイオンを、イオノフォアによって細胞内に輸送し、最大蛍光応答を実施すること、およびすべてのアセチルメチルエステルが加水分解された場合、指示体の蛍光を消光するための、マグネシウムイオンの細胞内への輸送が含まれる。そのようなイオンが細胞内に輸送できるような１つの方法は、Ａ２３１８７（たとえば、Ｐｒｅｓｓｍａｎら、（１９７６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４５：５０１を参照のこと）（シグマ  ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、その臭素処理した誘導体（たとえばＤｅｂｅｒら、（１９８５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４６：３４９）（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））または本技術分野でよく既知の他のイオノフォアのような、イオノフォアの使用である。
【０１０８】
さらに、試験化合物から得られた蛍光データを、それぞれが既知のカルシウムイオン濃度を含んでいる較正剤系列により作製されている較正曲線と比較することによって、細胞の蛍光放射より細胞内カルシウムイオンの量を定量することが好ましい可能性がある。したがって、カルシウムイオンスタンダードを、そこから望ましいスタンダード濃度（群）を達成するように作製してよい、たとえばＣａＣｌ２の保存溶液を調製することで、濃度範囲を持つように作製する。カルシウムイオン感受性蛍光指示体色素の存在下でのスタンダードの蛍光放射を、スタンダード曲線を構築するために使用し、アッセイ中で遺伝子工学的に作製した細胞の細胞内カルシウムイオン濃度をスタンダード曲線より決定する。あるいは、先にカルシウムイオノフォアで処理した細胞を、スタンダード曲線を作製するために使用した指示体色素とカルシウムイオンスタンダードと共にインキュベートする。
【０１０９】
アッセイは、手動で、または自動化系を使用して構築してよい。ヒトプリノレセプターリガンドを同定している高能力機能性スクリーニングアッセイに対しては、自動化系が好ましい。そのような自動化系の例には、れぞれのウェル中でヒトプリノレセプターポリペプチドをコードし、発現するように遺伝子工学的に作製した細胞を培養する９６ウェル培養プレートを提供することが含まれる。このプレートは、蛍光イメージングプレート読みとり器（「ＦＬＩＰＲ」）内にのせ、９６ウェルそれぞれでの細胞内カルシウム流動の速度を同時に測定する。そのようなＦＬＩＰＲはモレキュラー  デバイセス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．），Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）より市販されている。ＦＬＩＰＲは、流体を９６ウェルプレートのそれぞれのウェル内におよびウェルから定量的に輸送可能であり、したがってカルシウムイオン感受性蛍光指示体色素、候補化合物、プリノレセプター作働薬、たとえばＡＴＰ、ＵＴＰ、２−メチルチオＡＴＰ、または類似のもの、および／またはプリノレセプター拮抗薬、たとえばスラミン、シバクロンブルー、ＰＰＡＤＳまたは類似のものを添加するのに使用できる。ＦＬＩＰＲは、アッセイの経過中いたる所で蛍光データを回収する。
【０１１０】
同様の様式において、試験試料中のプリノレセプター作働薬または拮抗薬を、手動または自動化系を使用して測定してよい。本方法を実施するための自動化系は、プリノレセプターを発現している遺伝子工学的に作製した細胞を各ウェルで培養する、９６ウェル培養プレートを提供することを含む。蛍光指示体色素、試験試料、および／またはプリノレセプター作働薬を、それぞれのウェルに加え、それぞれのウェルからの蛍光放射をＦＬＩＰＲによって同時にモニタする。
【０１１１】
Ｐ２Ｘプリノレセプター薬物を、中枢神経系また末梢神経系条件、たとえばてんかん、痛み、鬱、神経変性疾患などを限定しないが含むさまざまな疾患において、そして生殖系の異常、喘息、末梢血管疾患、高血圧、免疫系異常、過敏性腸症候群または早漏において可能性のある治療薬剤と見なされている。
【０１１２】
さらに、ＤＮＡ、またはそこから派生したＲＮＡを、特異的Ｐ２Ｘレセプターを発現しているＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブを設計するのに使用できる。本明細書で使用するところの、語句「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、以上で定義したような、ポリヌクレオチドを含む構造を指し、標的ポリヌクレオチド中に存在する核酸配列に相補的な核酸配列を含む。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチド類似体を含んでよい。そのようなプローブは、野生型および変異体Ｐ２Ｘレセプターをコードしている配列間に存在する可能性のある小さな差を与えるそのような識別を行うことができる方法を設計することが困難である可能性があるという条件付きで、Ｐ２Ｘおよび野生型メッセージからＰ２Ｘ４変異体を見分けるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリッド形成アッセイで有用であり得る。あるいは、ＰＣＲに基づいたアッセイを、配列解析のために試料ＲＮＡまたはＤＮＡを増幅するのに使用できる。
【０１１３】
さらに、それぞれの特定のＰ２Ｘポリペプチドまたはその断片（類）を、本技術分野でよく既知の技術を用いてモノクローナル抗体を調製するのに使用できる。特定のＰ２Ｘレセプターまたは関連断片は、以下で概論した組換え体技術を用いて入手することができ、すなわち、レセプターまたは断片を発現している組換え体細胞を、回収および単離できるレセプターまたは断片量を産出するように培養できる。あるいは、特定のＰ２Ｘポリペプチドまたはその断片（類）を、本技術分野で既知のような従来のポリペプチド合成技術を用いて合成できる。特定のＰ２Ｘポリペプチドに対する特異性および選択性を提示しているモノクローナル抗体は、測定可能および検出可能な部位、たとえば蛍光部位、放射標識、酵素、化学ルミネセンス標識および類似のもので標識でき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで使用できる。そのような抗体を、免疫−診断目的のために野生型または変異体Ｐ２Ｘレセプターポリペプチドを同定するのに使用できることが理論づけられている。たとえば、抗体が、脳組織中のアミロイドｂ１−４０  ｖ．１−４２を検出するために作製された（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１３：５７５−５８０、また、Ｓｕｚｕｋｉら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１３３６−１３４０、Ｇｒａｖｉｎａら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７０１３−７０１６、およびＴｕｒｎｅｔら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：８９６６−８９７０も参照のこと）。
【０１１４】
レセプター活性のアロステリック調節
ＡＴＰおよび他のＰ２Ｘレセプター作働薬によるＰ２Ｘレセプターの活性化は、細胞膜を横切るイオン勾配を調整し、Ｃａ２＋、Ｎａ＋およびＫ＋を含む陽イオンの細胞質濃度を調節し、細胞膜電位の調整に役割を果たす。
【０１１５】
レセプター活性化のアロステリック調節により、一般的に、レセプターの第二の部位への結合による作働薬誘導レセプター活性化が増強される。シバクロンブルーに関して、本発明は、このＲ２Ｘレセプター作働薬が、ヒトまたはラットのような哺乳動物中に存在するＰ２Ｘ３レセプターの効果をアロステリックに調節する能力を持つという発見に関連する。
【０１１６】
さらにとりわけ、ヒトＰ２Ｘ３レセプターを発現している細胞中で、シバクロンブルーは、ＡＴＰ−活性化Ｃａ２＋流動および膜貫通電流の程度および強度のおよそ３〜７倍の増加を仲介する能力を持つ。最大能力を仲介するのに必要なシバクロンブルー半最大濃度はｈＰ２Ｘ３レセプターを活性化するのに用いた作働薬に依存する。シバクロンブルーが作働薬強度およびＰ２Ｘ３レセプター活性の絶対的程度を増強するので、これらのアロステリック活性は、Ｐ２Ｘ４レセプターにおけるシバクロンブルーの先に報告された効果とは明らか違う（Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５４：５６２−５７１（１９９８））。したがって、他のリガンドゲート制御イオンチャンネルの特性と一致して、Ｐ２Ｘ３レセプター活性は、内因的なアゴニストからは異なったリガンドによってアロステリック的に調節されうる。
【０１１７】
アンタゴニストにおけるシバクロンブルーの効果に関して、たとえば非選択的Ｐ２レセプター作働薬であるＰＰＡＤＳは、シバクロンブルー濃度−効果曲線の右側への移動を引き起こし、一方でシバクロンブルーの濃度の増加がＰＰＡＤＳ作働薬効果を減衰させる。
【０１１８】
Ｐ２Ｘ３レセプターのラット相同物は、シバクロンブルーへの曝露において、以上および実施例で示したものと同様の結果示し、このことは、シバクロンブルーの調節活性が種依存的でないことを示唆している。
【０１１９】
シバクロンブルー仲介Ｐ２Ｘ３レセプター増強の機構が、エクトヌクレオチダーゼにおけるそのすでに記載された阻害効果の二次的結果ではないことに注意すべきである（Ｓｔｏｕｔ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３６：９２７−９３４（１９９５））。シバクロンブルー仲介エクト−ＡＴＰａｓｅ活性が寄与因子であった場合、シバクロンブルーはそれのみで、培地中の内因性ＡＴＰの濃度の増加によって作働薬様活性を仲介する可能性があることが予想される。しかしながら、以下の実施例に相当するデータによってはっきりするように、ｈＰ２Ｘ３レセプター活性においてシバクロンブルーの本質的な効果は存在しない。さらに、エト−ＡＴＰａｓｅ阻害の結果としての内因性アゴ二ストの蓄積は、Ｐ２Ｘ３レセプターのみというよりも、すべてのＰ２レセプターサブタイプに効果が期待される。
【０１２０】
ＡＴＰに加えて、本発明にしたがって、シバクロンブルーを、たとえば２−ｍｅＳＡＴＰ、ＢｚＡＴＰおよびαβ−ｍｅＡＴＰを含む他のＰ２Ｘレセプター作働薬によるｈＰ２Ｘ３レセプター活性化を増強するために使用してよい。それぞれの場合、総増強作用を調節するのに必要なシバクロンブルーの半最大濃度は同様であり、このことはレセプターにおけるシバクロンブルーの効果が、作働薬に依存しないことを示している。したがって医療従事者によって好ましいと判断されるような任意の作働薬を、シバクロンブルーと組み合わせて使用してよい。
【０１２１】
最大Ｐ２Ｘ３レセプターシグナルの程度の増加を調節するのに加えて、シバクロンブルーは、ＡＴＰ濃度−応答曲線の左側への移動を引き起こすことによって、作働薬強度を増強する。とりわけ、３μＭシバクロンブルーの存在下で、ＡＴＰはシバクロンブルーがない状態よりも７倍強力であり、このことは、シバクロンーブルーがｈＰ２Ｘ３レセプターに対するＡＴＰの親和性および／または効力に影響を与える可能性があり、または多重結合レセプターに対するＡＴＰ結合の共同性を増強するのに役に立つことを示唆している。
【０１２２】
シバクロンブルーの調節活性は、非競合的Ｐ２Ｘ３拮抗薬、ＰＰＡＤＳの阻害効力が、シバクロンブルーの濃度と逆相関するという発見によって確証されるうる。シバクロンブルーは、Ｐ２Ｘ３レセプター活性化の程度を増強する一方で、ＰＰＡＤＳ濃度−効果曲線の右側への移動を引き起こし、このアロステリック調節剤が作働薬活性を減少させることを示している。シバクロンブルーのこの効果は、ＡＴＰ濃度に依存せず、したがって、レセプター占有の明らかな増加の結果ではない。
【０１２３】
作働薬濃度−効果曲線のシバクロンブルー−仲介左側移動および拮抗薬濃度−効果曲線の右側移動は、シバクロンブルーが、Ｐ２Ｘ３レセプター活性のアロステリック調節物として機能するという結論を支持する。さらに、ＰＰＡＤＳ−仲介阻害とシバクロンブルー−仲介増強作用の相互排他性が、Ｐ２Ｘ３レセプター機能を調節する調節リガンド間の複合体相互作用を示唆している。
【０１２４】
以上で記述したシバクロンブルーの調節効果は、ラットおよびヒトＰ２Ｘ３レセプター両方で観察することができ、Ｃａ２＋の活性の少なくとも１０００倍であり、このことは、内因的に発現したＰ２Ｘ３レセプターが低および高親和性相互作用の多様性による機能的調節を受ける可能性があることを示唆している。
【０１２５】
脱分極に続くレセプター回復の促進
ｈＰ２Ｘ３レセプターにおけるＡＴＰの効果を増強することに加えて、シバクロンブルーはまた、急激に脱分極したレセプターに対するＡＴＰ−応答性を復帰させるその能力によって見られたように、脱分極からのｈＰ２Ｘ３レセプター回復の速度をおよそ６倍増加させる能力を持っている。したがって、本発明にしたがって、シバクロンブルーを、脱分極相に続くＰ２Ｘ３レセプターの脱感作の速度を増加させるために、患者に投与してよい。
【０１２６】
さらに、シバクロンブルーによるヒトおよびラット両方のＰ２Ｘ３レセプターの増強作用は、レセプター脱感作の促進と同時に起こる。したがって、本発明にしたがって、同時にレセプターを再感作している間に、レセプターを増強する可能性がある。
【０１２７】
脱感作からの回復の明らかな速度が、５０μＭのシバクロンブルーの存在下で６倍増加する。脱感作後の不応答期間の半減期の減少は、内因的に発現したＰ２Ｘ３レセプターが、その機能的回復を促進する調節機構に従属している可能性を示唆している。
【０１２８】
シバクロンブルーのＰ２Ｘ３レセプターへの結合が、迅速な構造的変化を導き、結果としてＡＴＰ−仲介Ｐ２Ｘ３レセプター活性化の増強となることが信じられている。この構造的変化はまた、アロステリック調節および機能的脱感作が、連続して起こり、共通の活性機構を共有しうるように、よりゆっくりとした、レセプターの脱分極状態における長期間の効果を仲介する。
【０１２９】
以上を考慮して、本発明は、シバクロンブルーが、作働薬強度および効力を増強し、同様に急性作働薬誘導脱感作に続くレセプター再感作を促進することで、ヒトおよびラットＰ２Ｘ３レセプターを選択的に調節するという新規発見に関する。したがって、もし望むならば、たとえば感覚障害試験で、レセプターを調節し、同様に脱感作を促進するために、またはこれらの２つの効果の内のどちらかを実施するために、シバクロンブルーを患者に投与してよい。
【０１３０】
治療的な関わり合い
本発明にしたがって、たとえば侵害受容（すなわち痛みの感覚）を減少させるために患者にＰ２レセプター拮抗薬を末梢に投与してもよい。たとえば、ＴＮＰ−ＡＴＰ（すなわち強力なＰ２Ｘレセプター作働薬）を、患者での急性または持続性の侵害受容を減少させるために使用してよい。
【０１３１】
末梢に投与したＴＮＰ−ＡＴＰは、末梢侵害神経伝達へのＰ２Ｘ３および／またはＰ２Ｘ２／３レセプター両方の寄与に対する証拠を提供するホルマリン（すなわち炎症刺激）試験において、急性および持続性侵害受容両方を減ずる。この観点は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／３レセプター活性化を特異的に増強する、およびｉｎ  ｖｉｖｏで急性および持続性侵害受容両方を増強するシバクロンブルーの能力によって支持される。
【０１３２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのシバクロンブルーの前侵害受容性効果は、Ｐ２Ｘ３レセプター機能を変更しない、他のスルホン酸アントラキノン誘導体、リアクティブオレンジは皮内ホルマリンの侵害受容性効果を増強しないので、薬理学的に特別であることが明らかである。
【０１３３】
まとめると、以上を考慮し、以下に示す実施例によって明らかになるように、カプサイシン−感受性一次感覚神経上にとても局在している（Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：１２２９−１２４２（１９９７））、ＡＴＰ−ゲート制御Ｐ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／３レセプターの活性化は、侵害受容神経伝達に寄与している。Ｐ２Ｘレセプター作働薬の末梢投与は、研究室動物で急性侵害受容応答を起こし、本明細書で例示したようなカラゲーナン、ホルマリンおよびカプサイシンを含む他の毒性刺激の侵害受容効果を増強する（また、Ｂｌａｎｄ−Ｗａｒｄ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈｒｍａｃｏｌ．１２２：３６６−３７１（１９９７）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２６：３２６−３３２（１９９９）、Ｓａｗｙｎｏｋ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３０：１１５−１２１（１９９７）、Ｔｓｕｄａ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２７：４４９−４５６（１９９９）、Ｔｓｕｄａ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２８：１４９７−１５０４（１９９９）も参照のこと）。末梢に投与したＴＮＰ−ＡＴＰが、ラットホルマリン試験での急性および持続性侵害受容両方を減衰させるという証明が、Ｐ２Ｘ３および／またはＰ２Ｘ２／３レセプター両方の末梢侵害受容神経伝達への寄与に関する証拠を提供する。この概念はさらに、シバクロンブルーの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／３レセプター活性化を選択的に増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏで急性および持続性の痛みの両方を増強させる能力によって支持される。したがって、ＴＮＰ−ＡＴＰおよびシバクロンブルーによる、Ｐ２レセプター作働薬（ＢｚＡＴＰ）によって、または炎症刺激（ホルマリン）によって産出された侵害受容応答の薬理学的な調節により、侵害受容神経伝達におけるＰ２Ｘ３および／またはＰ２Ｘ２／３レセプター活性化の特異的な役割に関する証拠が提供される。
【０１３４】
以下で示した実施例は、本発明を実施するための特別な実施様態に関する。実施例は例示的な目的のためので提供され、任意の方法において、本発明の意図を制限するつもりはない。
【０１３５】
使用した数（たとえば量、温度など）に関連して、精度を保証するために努力がなされるが、しかしいくつかの実験的誤差および標準偏差がもちろん許容される。
【０１３６】
実施例１
Ｐ２Ｘ３ポリペプチドをコードすると考えられるヒトｃＤＮＡ配列の確認
ラットＰ２Ｘ３受容体の予想アミノ酸配列（ＮＣＢＩ配列番号１１０３６２３）を用いて、同様のポリペプチドについてコードしていると考えられるヒトＤＮＡ配列について調べた。６種類全ての可能な読取枠にＤＮＡ配列をダイナミックに翻訳することで、蛋白配列でヌクレオチドデータベースを検索することが可能なＴＢＬＡＳＴＮデータベース研究ツール（Ａｌｔｓｈｕｌ （１９９３）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６： ３９０−３００）を用いた。遺伝子バンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）配列標識部位（ＳＴＳ）データベースを調べることで、ラットＰ２Ｘ３受容体の領域と高い相同度を有するポリペプチドをコードすると予想される読取枠を含む長さ２２９塩基対であるヒトゲノム断片が明らかになった。この断片について寄託された配列（遺伝子バンク寄託番号Ｇ０３９０１）は以下の通りであった。
【０１３７】
【化１】
2004500021.tif 000001
上記配列中、「Ｎ」は塩基Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのいずれかを表す。
【０１３８】
実施例２
ＰＸ２３ｃＤＮＡの５’末端の確認
この受容体について完全読取枠を単離すべく、Ｇ０３９０１の配列に基づいて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法で用いるプライマーを設計した。下記の反応で用いたプライマーは以下の通りであった。
【０１３９】
【化２】
2004500021.tif 000002
【０１４０】
配列Ｇ０３９０１が一部を構成しているゲノム領域由来のｃＤＮＡの５’末端を確認するため、ＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５： ８９９８−９００２）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ段階から確認したｃＤＮＡの延長を、５’ＲＡＣＥ（登録商標）試薬系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて行った。ヒト脳下垂体組織由来のポリＡ＋ＲＮＡ（カタログ番号６５８９４−１、ロット番号６０８０１６７；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）１ｍｇを、上記のキットで提供された試薬を用いる反応で使用し、ＲＮＡ１μＬ（１μｇ）をプライマー３ａｓ  ３μＬ（３ｐｍｏｌ）およびＲｎａｓｅを含まない水（ジエチルピロカルボン酸すなわちＤＥＰＣで処理した水）１１μＬと混合し、７０℃で１０分間加熱し、次に氷上で１分間経過させた。１０倍反応緩衝液（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．４、５００ｍＭ  ＫＣｌ）２．５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２３μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μＬおよび０．１Ｍ  ＤＴＴ２．５μＬを加えた。混合物を４２℃で２分間インキュベートしてから、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ（登録商標）逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１μＬを加えた。反応液を４２℃でさらに３０分間、７０℃で１５分間、氷上で１分間インキュベートした。ＲＮａｓｅＨ  １μＬ（２単位）を加え、５５℃で２０分間インキュベートした。ｃＤＮＡを、キットに入っていたガラスマックス（ＧｌａｓｓＭａｘ（登録商標））カラムを用いて精製した。カラムから蒸留水（ｄＨ２Ｏ）５０μＬにｃＤＮＡを溶出させ、凍結乾燥し、ｄＨ２Ｏ  ２１μＬに再懸濁させた。以下の反応でｃＤＮＡのテーリングを行った。すなわち、ｄＨ２Ｏ  ７．５μＬ、反応緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．４、５００ｍＭ  ＫＣｌ）２．５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １．５μＬ、２ｍＭ  ｄＣＴＰ  ２．５μＬ、ｃＤＮＡ  １０μＬを９４℃で３分間、氷上で１分間、次に３７℃で１０分間インキュベートした。最後に、混合物を７０℃で１０分間インキュベートしてから氷上に置いた。
【０１４１】
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を以下の段階で行った。１０倍ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）５μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μＬ、アンカープライマー１μＬ（１０ｐｍｏｌ）、プライマー５ａｓ  １μＬ（１０ｐｍｏｌ）およびｄＨ２Ｏ  ３５μＬを含む反応液に、ｃＤＮＡ  ５μＬを入れた。反応液を１分間９５℃まで加熱し、８０℃に２分間維持し、その間にアンプリタック（Ａｍｐｌｉｔａｑ（登録商標））ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）０．５μＬ（２．５単位）を加えた。９４℃で１５秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で１分間という条件下に反応を３５周期行った。
【０１４２】
増幅後、製造業者の説明に従って、キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）（登録商標）ＰＣＲ産物精製システム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）を用いて、反応生成物を精製した。生成物をＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ８．０）５０μＬでカラムから溶出し、溶出液１μＬをＰＣＲでの鋳型ＤＮＡとして用いて、後の単離用の特異的生成物のレベルを上昇させた。再増幅には、１０倍ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液５μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μＬ、汎用増幅プライマー１μＬ（１０ｐｍｏｌ）、プライマー４ａｓ  １μＬ（１０ｐｍｏｌ）およびｄＨ２Ｏ  ４０．５μＬも含めた。反応液を９５℃で１分間加熱し、８０℃に維持しながらアンプリタック（登録商標）ポリメラーゼ０．５μＬ（２．５単位）を加えた。９４℃で１５秒間、５０℃で２０秒間、７２℃で１分間という条件下に反応を３５周期行った。増幅生成物を、０．８％アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、長さ約１．３キロ塩基対の支配的生成物を検出した。この生成物をゲルから掻き取り、キアクイック（登録商標）精製システムを用いて精製した。生成物をｄＨ２Ｏ  ５０μＬでカラムから溶出し、凍結乾燥して容量１０μＬとした。
【０１４３】
得られたＤＮＡ３μＬを、１４℃で終夜インキュベートしたｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）とともに連結反応に用いた。連結生成物を用いて、標準的な製造業者プロトコールに従って、クローニングキットから大腸菌の形質転換を行った。プラスミドのＥｃｏＲＩ消化を用いて、得られたクローンの挿入サイズを測定し、ＰＣＲ生成物に近い大きさの挿入物を含むクローンについて、蛍光染料−読み終り暗号試薬（プリズム（Ｐｒｉｓｍ；登録商標）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）およびアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３型ＤＮＡ配列決定装置を用いて配列決定を行った。ｐＣＲ２．１ベクターからのＥｃｏＲＩ部位を含む５’ＲＡＣＥ生成物の配列を図１に示してある（配列番号１３）。増幅配列（ａｍｐｌｉｍｅｒ）（汎用増幅プライマーおよびプライマー４ａｓへの相補配列）の配列に下線を施してある。
【０１４４】
実施例３
Ｐ２Ｘ３ｃＤＮＡの３’末端の確認
ヒトＰ２Ｘ３受容体をコードする読取枠の終止コドン周囲の配列を確認するため、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の３’ＲＡＣＥ（登録商標）システムを、ＳＴＳ  Ｇ０３９０１に対して設計されたプライマーとともに用いた。下垂体組織由来のポリＡ＋ＲＮＡ（５００ｎｇ）（上記の実施例２参照）を以下のような反応で用いた。そのＲＮＡとアダプタープライマー１０ピコモルを最終容量１２μＬのｄＨ２Ｏ中で混合した。この混合物を７０℃で１０分間加熱し、次に氷上で１分間冷却した。１０倍ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．４、５００ｍＭ  ＫＣｌ）２μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２２μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μＬおよび０．１Ｍジチオトレイトール２μＬという成分を加えた。反応液を４２℃で２分間平衡としてから、スーパースクリプトＩＩ（登録商標）逆転写酵素１μＬ（２００単位）を加え、４２℃でのインキュベーションを５０分間続けた。反応液を７０℃で１５分間インキュベートすることで反応停止し、氷上で冷却した。ＲｎａｓｅＨ（１μＬ；２単位）を加え、混合物を３７℃で２０分間インキュベートし、氷上で保存した。
【０１４５】
Ｐ２Ｘ３ｃＤＮＡの３’末端の増幅を、以下の反応で行った。１０倍ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液５μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １μＬ、プライマー１ｓ  １μＬ（１０ピコモル）、簡易汎用増幅プライマー（ＡＵＡＰ）１μＬ（１０ピコモル）およびｄＨ２Ｏ  ３９．５μＬを含むＰＣＲ混合物中で、上記で合成した第１のｃＤＮＡ鎖２μＬを用いた。反応液を１分間にわたり９５℃まで加熱し、８０℃で２分間維持しながら、その間にアンプリタック（登録商標）ポリメラーゼ０．５μＬ（２．５単位）を加えた。９４℃で１５秒間、５４℃で２０秒間、７２℃で２分間という条件下に反応を３５周期行った。その周期後、反応液を７０℃で１０分間インキュベートし、４℃で保存した。
【０１４６】
増幅後、製造業者の説明に従って、キアクイック（登録商標）ＰＣＲ産物精製システムを用いて、反応生成物を精製した。生成物をＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ８．０）５０μＬでカラムから溶出し、溶出液１μＬをＰＣＲでの鋳型ＤＮＡとして用いて、後の単離用の特異的生成物のレベルを上昇させた。再増幅には、１０倍ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液５μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μＬ、ＡＵＡＰ  １μＬ（１０ｐｍｏｌ）、プライマー２ｓ  １μＬ（１０ｐｍｏｌ）およびｄＨ２Ｏ  ４０．５μＬも含めた。反応液を９５℃で１分間加熱し、８０℃に維持しながらアンプリタック（登録商標）ポリメラーゼ０．５μＬ（２．５単位）を加えた。９４℃で１５秒間、５４℃で２０秒間、７２℃で２分間という条件下に反応を３５周期行った。増幅生成物を、０．８％アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、長さ約７００塩基対の支配的生成物を検出した。この生成物をゲルから掻き取り、キアクイック（登録商標）精製システムを用いて精製した。生成物をｄＨ２Ｏ  ５０μＬでカラムから溶出し、凍結乾燥して容量１０μＬとした。
【０１４７】
得られたＤＮＡ３μＬを、１５℃で３．５時間インキュベートしたｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに連結反応に用いた。連結生成物を用いて、クローニングキットから大腸菌の形質転換を行った。プラスミドのＥｃｏＲＩ消化を用いて、得られたクローンの挿入サイズを測定し、ＰＣＲ生成物に近い大きさの挿入物を含むクローンについて、蛍光染料−読み終り暗号試薬（プリズム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびアプライド・バイオシステムズ３７３型ＤＮＡ配列決定装置を用いて配列決定を行った。ｐＣＲ２．１ベクターからのＥｃｏＲＩ部位を含む３’ＲＡＣＥ生成物の配列を図２に示してある（配列番号１４）。この配列において、増幅配列（ＡＵＡＰおよびプライマー２ｓへの相補配列）の配列に下線を施してある。
【０１４８】
実施例４
ヒトＰ２Ｘ３の完全読取枠を含むｃＤＮＡの単離
ヒトＰ２Ｘ３メッセージの開始コドンおよび終止コドン周囲の配列に関するデータを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを設計・合成して、ｍＲＮＡの完全読取枠のＲＴ−ＰＣＲができるようにした。５’ｈＰ２Ｘ３および３’ｈＰ２Ｘ３と称されるこれらプライマーの配列は上記で示してある。実施例３に記載の下垂体ｃＤＮＡの一部（２μＬ）についてＰＣＲ増幅を行った。増幅において校正熱安定ポリメラーゼ（クローニングＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて、高忠実性増幅ができるようにした。反応混合物は、ｃＤＮＡ  ２μＬ、１０倍クローニングＰｆｕポリメラーゼ反応緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍＬヌクレアーゼを含まないウシ血清アルブミン）５μＬ、ｄＮＴＰミックス１μＬ、５’ｈＰ２Ｘ３プライマー１μＬ（１０ピコモル）、３’ｈＰ２Ｘ３プライマー１μＬ（１０ピコモル）およびｄＨ２Ｏ  ３９．５μＬからなるものであった。反応液を１分間にわたり９５℃まで加熱し、８０℃で２分間維持しながら、その間にクローニングＰｆｕポリメラーゼ０．５μＬ（１．２５単位）を加えた。９４℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で３．５分間という条件下に反応を３５周期行った。その周期後、反応液を７０℃で１０分間インキュベートした。
【０１４９】
反応生成物を０．８％アガロースゲルで分離し、約１．２ｋｂの生成物を掻き取り、キアクイック（登録商標）ゲル精製システムを用いて精製した。ＤＮＡをｄＨ２Ｏ  ５０μＬで溶出し、凍結乾燥し、ｄＨ２Ｏ  １０μＬに再懸濁した。このＤＮＡ  １μＬを再増幅反応で用い、その反応でも１０倍Ｐｆｕ反応緩衝液５μＬ、ｄＮＴＰミックス１μＬ、５’ｈＰ２Ｘ３プライマー１μＬ（１０ピコモル）、３’ｈＰ２Ｘ３プライマー１μＬ（１０ピコモル）およびｄＨ２Ｏ  ４０．５μＬを含有させた。反応液を１分間にわたり９５℃まで加熱し、８０℃で２分間維持しながら、その間にクローニングＰｆｕポリメラーゼ０．５μＬ（１．２５単位）を加えた。９４℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で３．５分間という条件下に反応を１５周期行った。その周期後、反応液を７０℃で１０分間インキュベートした。
【０１５０】
反応生成物を０．８％アガロースゲルで分離し、約１．２ｋｂの生成物を掻き取り、キアクイック（登録商標）ゲル精製システムを用いて精製した。ＤＮＡをｄＨ２Ｏ  ５０μＬで溶出し、凍結乾燥し、ｄＨ２Ｏ  １５μＬに再懸濁した。得られた精製ＰＣＲ生成物３μＬを、ｐＣＲスクリプト（ｐＣＲｓｃｒｉｐｔ；登録商標）クローニングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いる連結反応で用い、その液ではｐＣＲスクリプト（登録商標）ＡｍｐＳＫ（＋）ベクター０．５μＬ（５ｎｇ）、ＳｒｆＩ制限酵素１μＬ（５単位）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＬ（４単位）およびｄＨ２Ｏ  ３μＬも含有させた。反応混合物を室温で１時間、次に６５℃で１０分間インキュベートした。
【０１５１】
標準的な製造業者のプロトコールに従い、この反応生成物１μＬを用いて、ＸＬ−２ブルー万能細胞（ＸＬ−２ ｂｌｕｅ ｕｌｔｒａｃｏｍｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の形質転換を行った。得られたクローンを制限分析によってスクリーニングし、蛍光染料−読み終り暗号試薬（プリズム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびアプライド・バイオシステムズ３１０型ＤＮＡ配列決定装置を用いて配列決定を行った。完全読取枠の配列を図３に示してある（配列番号１５）。本発明のヒトＰ２Ｘ３の予想される蛋白配列（配列番号１６）と相当するラットポリペプチドのもの（配列番号１７）との比較を図４に示してある。
【０１５２】
実施例５
アフリカツメガエル卵母細胞中の組換えＰ２Ｘ３受容体の発現および電気泳動分析
アフリカツメガエルの卵母細胞を準備し、本発明の受容体ＤＮＡを注射し、前述の手順（Ｂｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９５）， ｓｕｐｒａ）に従って、２電極電圧クランプを用いて受容体応答を測定した。卵母細胞は、１００μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む通常のバース（Ｂａｒｔｈ）液（９０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ、０．６６ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．７４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  ＮａＮ−（２−ヒドロキシ−エチル）−ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（「ＨＥＰＥＳ」）緩衝液、最終ｐＨ７．５５）中１７〜１８℃に維持した。しかしながら一部の実験では、細胞の電位を意図的に変動させて、応答電流−電圧の関係を確認した。卵母細胞から２００〜４００μｍ内に配置したコンピュータ制御電磁弁およびプッシュプル式アプリケータを用いて、作働薬を簡単に加えた。作働薬投与と同時に、コンピュータによって応答を記録した。プッシュプル式アプリケータに作働薬とともに拮抗薬を入れ、作働薬投与前に３分間以上にわたって過融解することで浴に加えた。ピーク振幅を測定することで、応答を測定した。
【０１５３】
卵母細胞中に注射するためのＤＮＡは、実施例２に記載の方法に従って製造したｐＣＤＮＡ３．１からのＰ２Ｘ３挿入物であった。製造業者の説明に従ってキアゲンマキシプレプ（ＱＩＡｇｅｎ ｍａｘｉｐｒｅｐ）ＤＮＡ製造システムを用いて、クローンを成長させ、大量製造した。ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。
【０１５４】
ヒトＰ２Ｘ３受容体の機能分析用に、上記の方法に従って製造したヒトＰ２Ｘ３ＤＮＡ１０ｎｇをアフリカツメガエル卵母細胞の核に注射した。注射後、１００μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む通常のバース液中で２〜７日間にわたって卵母細胞をインキュベートした。次に１０μＭ  ＡＴＰに対する応答を記録した。
【０１５５】
上記の発現および分析の結果は、本発明の受容体が機能性であることを示している。ヒトＰ２Ｘ３ＤＮＡを注射した卵母細胞は、混合伝導度カチオン電流（１００〜６０００ｎＡ）を示すことでＡＴＰの細胞外投与に対して応答した。該当する量の水を注射した卵母細胞は、ＡＴＰに応答しなかった。０．７μＭという大体のＡＴＰ  ＥＣ５０が、これら卵母細胞からの濃度−応答関係（０．０１〜１０００μＭ）から得られた。ＡＴＰ誘発電流−電圧関係も、これらの卵母細胞から記録した。これらは約０ｍＶの逆電位を示し、負の膜電位で顕著な内向き整流が記録された。
【０１５６】
別のＰ２Ｘ受容体作働薬であるα，β−メチレン−ＡＴＰは、ＡＴＰによって喚起されたものと同様の最大電流を誘発した。ただし、それの強度はわずかに低かった（ＥＣ５０＝２．１μＭ）。第３のＰ２Ｘ受容体作働薬である２−メチルチオ−ＡＴＰの投与は、ＡＴＰおよびα，β−メチレン−ＡＴＰよりわずかに強力であった（ＥＣ５０＝０．４μＭ）。非特異的Ｐ２Ｘ受容体拮抗薬であるスラミンまたはピリドキサール−ホスフェート−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ）を投与することで、応答の機能的拮抗を測定した。いずれの拮抗薬も、ＡＴＰ（０．３μＭ）誘発電流の完全遮断を生じ、スラミンの方がＰＰＡＤＳ（ＩＣ５０＝１μＭ）と比較して高い効力（ＩＣ５０＝０．３μＭ）を示した。
【０１５７】
要約すると、アフリカツメガエル卵母細胞へのヒトＰ２Ｘ３受容体ＤＮＡの注射によって、細胞表面での機能性Ｐ２Ｘ３受容体の発現とこれら受容体のリガンド依存性非特異的カチオンチャンネルとしての機能が生じた。これらの受容体は細胞外Ｐ２受容体作働薬に応答し、効力の順位は２−メチルチオ−ＡＴＰ＞ＡＴＰ＞α，β−メチレン−ＡＴＰであった。これらは内向き整流をも示し、Ｐ２受容体拮抗薬であるＰＰＡＤＳおよびスラミンの両方によって遮断される。
【０１５８】
実施例６
シバクロンブルー曝露後の細胞内カルシウムレベルの測定
記載がある場合、本実施例およびその後の全ての実施例について、以下の材料、細胞系および培地を使用する。
【０１５９】
材料
アデノシン５’−トリリン酸二ナトリウム（ＡＴＰ）、２−メチルチオ−ＡＴＰ四ナトリウム（２−ｍｅＳＡＴＰ）およびαβ−メチレンＡＴＰ二リチウム（αβ−ｍｅＡＴＰ）はリサーチ・バイオケミカルズ・インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ）から入手した。２’および３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰテトラエチルアンモニウム塩（混合異性体）（ＢｚＡＴＰ）およびシバクロンブルーは、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。Ｇ４１８硫酸塩は、カルバイオケム−ノババイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から入手した。ダルベッコの調整イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（４．５ｍｇ／ｍＬグルコースおよび４ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、ハイクローン・ラボラトリーズ社（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｌｏｇａｎ， Ｕｔａｈ）から入手した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（１ｍｇ／ｍＬグルコースおよび３．６ｍｇ／Ｌピルビン酸Ｎａを含有、フェノールレッドは含有せず）、ハイグロマイシンおよびリポフェクタミンは、ライフ・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）から入手した。フルオ−４ＡＭ（Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ）は、モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）から購入した。
【０１６０】
安定な細胞系および細胞培地
ラットＰ２Ｘ３受容体ｃＤＮＡは、以前発表された配列（Ｇａｒｃｉａ−Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ． Ｒｅｓ．．， ４７： ５９−６６ （１９９７））と１００％同一であった。ヒトＰ２Ｘ３受容体は、ガルシア−グッツマンら（Ｇａｒｃｉａ−Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ （１９９７））が報告したものと実質的に同一であった（遺伝子バンク寄託番号Ｙ０７６８３）。唯一の例外は、アルギニンがコードされていたアミノ酸残基１２６であった。発表されている配列はこの位置にプロリンがコードされている。ヒトＰ２Ｘ３受容体クローニングの多重複製によって同じ配列が生じたことから、認められた相違はクローニングアーチファクトや配列決定の誤りによるものではないことが示唆された。ｒＰ２Ｘ３およびｈＰ２Ｘ３受容体（それぞれ１３２１ｒＸ３−３および１３２１ｈＸ３−１１）を安定に発現する１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫細胞を、標準的な脂質介在トランスフェクション法を用いて構築した。いずれの細胞系も、１０％ＦＢＳならびに１３２１ｒＸ３−３および１３２１ｈＸ３−１１細胞、３００μｇ／ｍＬＧ４１８；および１３２１ｒＸ２−１細胞、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンのような抗生物質を含むＤ−ＭＥＭ中で維持した。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で細胞を成長させた。
【０１６１】
細胞内Ｃａ２＋レベルの測定
サイトゾルＣａ２＋濃度における作働薬介在の上昇に基づいて、Ｐ２Ｘ受容体機能を測定した。蛍光Ｃａ２＋キレート染料（フルオ−４）を、蛍光画像平板読取装置（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ （ＦＬＩＰＲ）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いる９６ウェル法での細胞内Ｃａ２＋の相対レベルの指標として用いた。細胞を９６ウェル黒色壁組織培養プレートで集密状態まで成長させ、アセトキシメチルエステル（ＡＭ）型のフルオ−４（１μＭ）のＤ−ＰＢＳ液を加えて２３℃で１〜２時間経過させた。シバクロンブルー（４倍濃度５０μＬ）を加え、３分後に作働薬（４倍濃度５０μＬ）を加えた（最終容量＝２００μＬ）。各実験を通して１〜５秒間隔で蛍光データを収集した。
【０１６２】
図５ａに示したデータは、基底線蛍光と比較した相対蛍光単位でのピーク上昇に基づいたものである。全ての細胞種についての濃度−効果曲線は、シバクロンブルー非存在下で測定した最大ＡＴＰ介在信号のパーセントとして示してある。濃度応答データを、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）での４パラメータロジスティックヒル式を用いて解析した。データはいずれも平均±測定標準誤差（ｓｅｍ）として表している。ｐＩＣ５０値に基づくスチュデントのｔ検定（Ｐ＜０．０５）を用いて統計解析を行った。
【０１６３】
データから明らかなように、ＡＴＰ活性化によって細胞質Ｃａ２＋に急速かつ一時的上昇が生じた。Ｃａ２＋流入曲線の形状は、アフリカツメガエル卵母細胞で測定された電気生理学的データ（下記の実施例９参照）と定性的に類似しており、既報の所見（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）と一致していた。シバクロンブルー（１０μＭ）とともに細胞を３分間前インキュベーションすることで、Ｃａ２＋流入（図５ａ）および膜間電流（図５ｂ）の両方で測定した最大ＡＴＰ活性化応答（Ｅｍａｘ）の大きさに３〜７倍の上昇があった。シバクロンブルーが介在することで、ラットＰ２Ｘ３受容体同族体を発現する細胞を用いた最大ＡＴＰ応答における同様の３０７倍の強化があった（データは示していない）。
【０１６４】
パイロット試験から、シバクロンブルー効果の開始は１分未満で起こったことが示されたことから、３分間の投与前期間を選択して、完全な活性を得るようにした。シバクロンブルー単独では、２００μＭ以下の濃度でＣａ２＋流入に対する固有の効果は示されず、１ｍＭ以下の濃度ではアッセイ緩衝液（ｐＨ７．２）のｐＨに対して測定可能な影響を与えなかった。１ｍＭ以下のシバクロンブルー濃度は１３２１Ｎ１細胞で発現されるｈＰ２Ｘ１、ｈＰ２Ｘ２およびｈＰ２Ｘ７受容体の作働薬活性化に変化を与えなかったことから（データは示していない）、シバクロンブルーの強化効果はＰ２Ｘ３受容体に対して特異的であった。シバクロンブルー（１０μＭ）は、既報のように（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、最大以下濃度の作働薬存在下で、ｈＰ２Ｘ４受容体介在Ｃａ２＋流入のＡＴＰ活性化強化を促進した。しかしながら、最大ＡＴＰ活性化ｈＰ２Ｘ４応答には上昇は認められなかった。
【０１６５】
実施例７
シバクロンブルーへの曝露後における受容体電気生理学の特性決定
電気生理学
アフリカツメガエル卵母細胞で発現されるｈＰ２Ｘ３受容体サブタイプについて、標準的な２電極電圧クランプ法を用いて特性決定を行った。すなわち、卵母細胞から覆っている胞細胞を剥離し、各卵母細胞に対してｃＤＮＡ  １２ｎＬ（１μｇ／μＬ）の核内注射を行った。卵母細胞を用いて注射後１〜５日間の記録を行い、９６  ＮａＣｌ、２．０  ＫＣｌ、１．８  ＣａＣｌ２、１．０  ＭｇＣｌ２、５．０ピルビン酸Ｎａおよび５．０  Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）（単位はｍＭ）を含む標準記録液で潅流した（３．５ｍＬ／分）。電極（１．５〜２．０ＭΩ）を１２０ｍＭ  ＫＣｌで満たした。潅流室中で卵母細胞付近に配置した電磁駆動薬剤投与ピペットを用いてＡＴＰを加えた。ＡＴＰを３．５分ごとに加え、投与時間は代表的には５秒間続くようにした。薬剤ピペットからＡＴＰを同時投与する前に少なくとも３分間にわたって、シバクロンブルーを浴に入れた。細胞を−６０ｍＶで電圧クランプした。データを取得し、ｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて解析を行った。
【０１６６】
図５ｂのデータから明らかなように、シバクロンブルー（１μＭ）によって、１μＭ  ＡＴＰ活性化電流のピーク振幅が対照の２１３±４９％まで強化された（図５ｂ）。ｈＰ２Ｘ３受容体介在膜間電流のＥｍａｘに対するシバクロンブルーの効果は長期的であったことから、シバクロンブルーへの短時間の（１分間）曝露から９分間まで完全強化が認められた。シバクロンブルー強化効果の開始は急速であった（＜１分；データは示していない）。シバクロンブルーとＡＴＰを同時投与することで、３分間の前インキュベーション期間後に観察されたものより見かけの強度およびＥｍａｘは低かったが、Ｃａ２＋流入信号の強化が生じた。シバクロンブルー（１０μＭ）には、ＡＴＰ活性化Ｃａ２＋フラックス応答の動態（図５ａ）やｈＰ２Ｘ３受容体の急性脱感作動態（図５ｂ）に対する見かけ上の効果はなかった。
【０１６７】
シバクロンブルーによるＡＴＰ活性化ヒトＰ２Ｘ３受容体の強化は濃度依存的であり（図６）、半最大応答（ＥＣ５０）の観察値は１．４±０．５μＭであった（図６）。ＡＴＰ活性化ｈＰ２Ｘ３受容体応答のＥｍａｘ上昇以外に、シバクロンブルーはＡＴＰ濃度−効果曲線の濃度依存的左方向移動も引き起こした（図６）。３μＭのシバクロンブルーが存在した場合に、ＡＴＰ活性化ｈＰ２Ｘ３受容体信号の大きさは３倍強上昇し（Ｅｍａｘ＝３３０±５％）、ＡＴＰのＥＣ５０は３５６±１００ｎＭから４６±８ｎＭまで低下した（図６）。
【０１６８】
強化に介在するのに必要なシバクロンブルーのＥＣ５０は、ｈＰ２Ｘ３受容体を活性化するのに用いられる作働薬とは無関係に類似していた。いずれもＰ２Ｘ３受容体に対する作働薬であることが知られている最大（１０μＭ）濃度のＡＴＰ、ＢｚＡＴＰ、２−ｍｅＳＡＴＰまたはαβ−ｍｅＡＴＰによるｈＰ２Ｘ３受容体活性化のＥｍａｘは、全てのシバクロンブルー濃度で同様であった（図７）。シバクロンブルーは、以前にＡＤＰ、ＵＴＰおよびＵＤＰ（１００μＭ、データは示していない）などのＰ２Ｘ３受容体で不活性であることが示されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ （１９９７）； Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３７６： １２７−１３８ （１９９９））ヌクレオチドに対して作働薬活性を示さなかった。シバクロンブルーの強化効果は、タプシガルギンを用いた細胞内Ｃａ２＋蓄積の消耗によって影響されなかったが、過剰の細胞外ＥＧＴＡ存在下で完全に消失したことから、ＡＴＰ活性化応答の強度上昇は細胞膜を通るＣａ２＋流量上昇によるものであったことが示唆された（データは示していない）。
【０１６９】
実施例８
ＡＴＰによる受容体活性化に対するトリアゼン染料の強化能力
バシレンブルー（ｂａｓｉｌｅｎ ｂｌｕｅ）、リアクティブブルー５、リアクティブレッド２、リアクティブオレンジ１４およびリアクティブイエロー２などの構造的にシバクロンブルーと関係があるトリアゼン染料について、ＡＴＰによるｈＰ２Ｘ３受容体活性化強化能力を調べた（図８）。リアクティブオレンジ１４およびリアクティブイエロー２はほとんど強化活性を示さなかったが、バシレンブルー、リアクティブブルー５およびリアクティブレッド２は、有意なｈＰ２Ｘ３受容体強化を介在した。アントラキノンスルホン酸誘導体であるバシレンブルーおよびリアクティブブルー５は、シバクロンブルーと同様のｈＰ２Ｘ３受容体強化の半最大濃度を示した（それぞれＥＣ５０値は１．２±０．６μＭおよび１．４±０．５μＭ）。リアクティブレッドは、ＡＴＰによるｈＰ２Ｘ３受容体活性化の強化剤としての効力は有意に低かった（ＥＣ５０＝５０±１０μＭ）（図８）。調べたトリアゼン染料で本来蛍光性のものはなく、１ｍＭ以下の濃度でアッセイ緩衝液のｐＨに影響するものはなかった。
【０１７０】
実施例９
ＰＰＡＤＳの阻害活性に対するシバクロンブルーの効果およびシバクロンブルーの強化活性に対するＰＰＡＤＳの効果
非選択的Ｐ２受容体拮抗薬であるＰＰＡＤＳによるｈＰ２Ｘ３受容体の阻害が既報の報告で示されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４７： ５９−６６ （１９９７））。シバクロンブルー非存在下でＰＰＡＤＳは、ＡＴＰ介在ｈＰ２Ｘ３活性化を阻害し、半最大濃度（ＩＣ５０）は８．６±３μＭであった（図９ａ）。１０μＭシバクロンブルーでｈＰ２Ｘ３発現細胞を前処理することで、ＰＰＡＤＳの最大ＡＴＰ活性化シグナル（Ｅｍａｘ＝４３７±６％）および見かけのＩＣ５０（５１±３μＭ）の両方が上昇した。シバクロンブルーがＡＴＰの有効強度を高めることでこの効果を介在するか否かを確認するため、１、３、１０または３０μＭのＡＴＰを用いて実験を行った。いずれのＡＴＰ濃度でもシバクロンブルーによって、ＰＰＡＤＳ濃度−効果曲線に同様の濃度依存的右方向移動が生じた。例えば、シバクロンブルー非存在下では、各ＡＴＰ濃度でのＰＰＡＤＳの見かけのＩＣ５０値は３．６４±１．１μＭ（１μＭＡＴＰ）、３．１１±１．０μＭ（３μＭＡＴＰ）、４．８１±１．１μＭ（１０μＭＡＴＰ）、２．６７±０．７μＭ（３０μＭＡＴＰ）であり、ＰＰＡＤＳがＰ２Ｘ３受容体で非競合的拮抗薬であることが確認された。同様に、１００μＭ以下のシバクロン濃度で、ＰＰＡＤＳはＡＴＰと非競合的であることが認められた（データは示していない）。従って、ＰＰＡＤＳの阻害効力に対するシバクロンブルーの効果はＡＴＰ濃度依存的であることが認められ、シバクロンブルーとＰＰＡＤＳがｈＰ２Ｘ３受容体で相互排他効果を示すことが示唆された。
【０１７１】
この実験に関して、ｈＰ２Ｘ３受容体のシバクロンブルー強化に対するＰＰＡＤＳの効果を求めた（図９ｂ）。ＰＰＡＤＳによってシバクロンブルー濃度−効果曲線の濃度依存的な右方向への移動が生じ、同時にＡＴＰ活性化の初期強度が低下した（図９ｂ）。ＡＴＰ活性化ｈＰ２Ｘ３受容体を完全に阻害するのに５０μＭＰＰＡＤＳで十分であったが、シバクロンブルーは、濃度依存的にＰＰＡＤＳの阻害活性を打ち消した。
【０１７２】
実施例１０
非脱感作受容体および急性脱感作受容体における受容体活性調節剤としてのシバクロンブルーの効果
ｈＰ２Ｘ３受容体活性の調節剤としてのシバクロンブルーの効力を、非脱感作受容体および急性脱感作受容体で求めた（図１０）。１３２１Ｎ１−ｈＰ２Ｘ３細胞を１分間にわたって１０μＭＡＴＰに曝露して、ｈＰ２Ｘ３受容体の急性脱感作を行った。図１０に示したように、非脱感作ｈＰ２Ｘ３受容体を完全に強化するのに必要なシバクロンブルーのＥＣ５０は１．１±０．２μＭであった（図１０）。しかしながら、急性脱感作ｈＰ２Ｘ３受容体は、シバクロンブルー介在強化に対する感受性が低いように見えたことから（ＥＣ５０＝６．４±０．５μＭ）、最大シグナルを得るには１００μＭシバクロンブルーが必要であった。ｈＰ２Ｘ３受容体の初期状態（非脱感作または急性脱感作）とは無関係に、シバクロンブルー前処理によって最終的には同様の作働薬活性化最大活性が得られたことから、受容体蓄積の程度はいずれの条件下でも同等であることが示唆された（図１０）。
【０１７３】
実施例１１
ｈＰ２Ｘ３受容体発現細胞をＡＴＰ（１０μＭ）で１分間前処理することで脱感作し、洗浄して細胞外ＡＴＰを除去し、シバクロンブルーの存在下または非存在下に各種期間にわたってインキュベーションした後に、脱感作受容体にＡＴＰを再負荷した。図１１ａは、脱感作直後（時間１．５分）には第２のＡＴＰ負荷に対するｈＰ２Ｘ３応答がないことを示している。脱感作とその後のＡＴＰ負荷の間のインキュベーション時間を延長すると、ｈＰ２Ｘ３受容体活性が徐々に回復することが認められ、６１．５分までに対照（非脱感作）シグナルに近づいた。
【０１７４】
ＡＴＰ誘発脱感作後のインキュベーション期間中における５０μＭシバクロンブルー添加は、ＡＴＰの見かけの効力および脱感作からの回復速度の両方を高めるように見えた（図１１ｂ）。シバクロンブルーとともに１５分間インキュベーションした後には、脱感作細胞は対照（非脱感作）細胞と比較してほぼ完全な活性を示したことから、脱感作後の不応期がかなり短いことが示された。留意すべき点として、インキュベーション緩衝液にシバクロンブルーを含有させることで、ｉ）脱感作からのｈＰ２Ｘ３受容体の回復速度が上昇し、ｉｉ）最終Ｅｍａｘが上昇し、ｉｉｉ）作働薬の効力が上昇した（図１１ｂ）。
【０１７５】
図１１ｃには、５０μＭシバクロンブルー存在下および非存在下での対照（非脱感作）シグナルのパーセントとしての急性脱感作後の各種時点での最大受容体シグナルを示してある（図１１ａおよびｂにおける点線参照）。不応期の半期（ｔ１／２）計算値（６０分で認められた活性の５０％を回復するのに要する時間と定義）は、シバクロンブルー非存在下で１５．９分（Ｋｔ＝０．０４３６／分）であり、存在下で２．６分（Ｋｔ＝０．２６２６／分）であった。このようにシバクロンブルーは、脱感作からのｈＰ２Ｘ３受容体の回復速度を６倍上昇させる。
【０１７６】
実施例１２
ＢｚＡＴＰの侵害受容効果
被験者：
体重２３０〜３５０ｇの雄スプレーグ−ドーリーラット成体（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）をケージ当たり５匹の群で飼育し、飼料および飲料水は自由に摂取させた。動物は、６：００〜１８：００時間の１２時間明−暗周期とした。動物は各実験につき１回のみ用いた。実験プロトコールおよび動物取り扱い手順はいずれも、施設内動物ケア・使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ： ＩＡＣＵＣ）による承認を受けた。
【０１７７】
薬剤
硫酸モルヒネを入手し（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、０．９％生理食塩水に溶かした。アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム（ＡＴＰ）、２−メチルチオ−ＡＴＰ四ナトリム（２−ｍｅＳＡＴＰ）およびαβ−メチレンＡＴＰ二リチウム（αβ−ｍｅＡＴＰ）はリサーチ・バイオケミカルズ・インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ）から入手した。２’および３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰテトラエチルアンモニウム塩（混合異性体）（ＢｚＡＴＰ）およびシバクロンブルー（リアクティブブルー−２）は、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。ＴＮＰ−ＡＴＰおよびフルオ−４ＡＭは、モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）から購入した。化合物はいずれも溶解したばかりであり、０．９％生理食塩水で希釈した。Ｇ４１８硫酸塩は、カルバイオケム−ノババイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から入手した。ダルベッコの調整イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（４．５ｍｇ／ｍＬグルコースおよび４ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、ハイクローン・ラボラトリーズ社（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｌｏｇａｎ， Ｕｔａｈ）から入手した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（１ｍｇ／ｍＬグルコースおよび３．６ｍｇ／Ｌピルビン酸Ｎａを含有、フェノールレッドは含有せず）、ハイグロマイシンおよびリポフェクタミンは、ライフ・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）から入手した。
【０１７８】
侵害受容試験
化学誘発持続性疼痛のホルマリン試験について既報の手順を用いて、侵害受容応答を評価した（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ ６０： ９１−１０２ （１９９５）； Ｔｊｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ ５１： ５−１７ （１９９２））。実験を行ったことのない動物を個々のプレキシガラスケージに入れ、３０分間試験環境に馴致させた。その期間後動物には、ホルマリン溶液（１％、２．５％、５％）、各種用量のＢｚＡＴＰ単独、またはＴＮＰ−ＡＴＰもしくはシバクロンブルーとの併用を、インシュリンゲージ（２９Ｇ１／２）針を用いて右後足の背側表面に皮下注射した。注射容量は全ての投与で５０μＬとした。急性侵害受容を評価するため、薬剤投与直後に動物を観察し、１分間にわたって萎縮（ｆｌｉｎｃｈ）行動（足の引き込み）の回数を記録した。薬剤注射から最初の１５〜２０分間にわたって、順次５分間隔でさらに観察を行った（Ｉ相、ホルマリン試験の急性相）。一部の実験については、ホルマリン注射から３０分後に観察を開始し、その後２０分間続けた（ＩＩ相、ホルマリン試験の持続相）。各実験について、個別の実験群および対照群でラット６匹を用いた。平均累積萎縮応答を分散分析によって解析し、フィッシャーの最小有意差検定（ＧＢ−ＳＴＡＴ、Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ， ＭＤ）を用いて後見的（ｐｏｓｔ ｈｏｃ）比較を行った。統計的有意差をＰ＜０．０５で求めた。
【０１７９】
ラット後足の背側表面へのＢｚＡＴＰの皮膚内投与（１００〜１０００ｎｍｏｌ／足）によって、用量依存性足萎縮応答が生じた（図１２）。１０００ｎｍｏｌ／足のＢｚＡＴＰ後の侵害受容足萎縮の大きさは、５％ホルマリンの急性皮膚内投与（ホルマリン試験のＩ相）後に観察されたものと同等であった。この効果の期間は短期であり、足萎縮応答の大半が薬剤注射後の最初の５分間に起こった。薬剤投与後２０分までで、Ｂｚ誘発足萎縮応答数に関しては、媒体注射動物との間で有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。ＢｚＡＴＰによっては、皮膚内ホルマリン投与（ホルマリン試験のＩＩ相）後に特徴的に認められるような長期防衛的（ｎｏｃｉｆｅｎｓｉｖｅ）足萎縮行動の第２相は生じなかった（データは示していない）（Ｔｊｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ ５１： ５−１７ （１９９２）； Ｓａｗｙｎｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３３０： １１５−１２１ （１９９７））。皮膚内ＢｚＡＴＰがラットにおいて防衛的挙動を起こす能力は、全身投与モルヒネがＢｚＡＴＰ（１０００ｎｍｏｌ／足）誘発後足萎縮を用量依存的に（ＥＤ５０＝４ｍｇ／ｋｇ皮下注射）低減する能力によって裏付けられた（データは示していない）。
【０１８０】
ＢｚＡＴＰの侵害受容効果は、他のＰ２受容体作働薬よる代謝分解に対する感受性が低いα，β−ｍｅＡＴＰなどの他のＰ２受容体作働薬の場合と同様であった（図１３）（Ｒａｌｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５０： ４１３−４９２ （１９９９））。ＡＴＰおよび２ｍｅＳＡＴＰなどの他のヌクレオチド作働薬も急性侵害受容足萎縮を生じたが（図１３）、調べた用量での最大応答はＢｚＡＴＰの場合に認められたものより有意に小さかった（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ３７６： １２７−１３８ （１９９９））、ＡＤＰの皮膚内投与によっては侵害受容応答は生じなかった（Ｐ＞０．０５）。このｉｎ ｖｉｖｏ活性パターンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えラットＰ２Ｘ３受容体を活性化する表現型Ｐ２受容体作働薬の以前の薬理的評価と一致する（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ （１９９９））。これらＰ２受容体作働薬についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力の順位は、ＢｚＡＴＰ（ＥＣ５０＝３２ｎＭ）＞２ｍｅＳＡＴＰ（ＥＣ５０＝２２０ｎＭ）＞ＡＴＰ（ＥＣ５０＝３４０ｎＭ）＞α，β−ｍｅＡＴＰ（ＥＣ５０＝５１０ｎＭ）＞＞ＡＤＰ（ＥＣ５０＞１０００００ｎＭ）であった（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ （１９９９））。ヒトＰ２Ｘ３受容体についても同様の薬理的プロファイルが認められた（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ （１９９９））。
【０１８１】
実施例１３
ＴＮＰ−ＡＴＰの抗侵害受容効果
上記の実施例１２は、ラットに対してＴＮＰ−ＡＴＰを投与するのに使用されるプロトコールを提供する。
【０１８２】
結果に関して、新規なＰ２Ｘ受容体拮抗薬であるＴＮＰ−ＡＴＰは、ラットＰ２Ｘ３受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞でＢｚＡＴＰ刺激カルシウム電流を強力に阻害した（実施例１参照）。ヒトＰ２Ｘ３受容体についての示したように（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２４： １４６３−１４６６ （１９９８））、末端リン酸基を順次除去することで、ラットＰ２Ｘ３受容体での拮抗薬効力が大幅に低下し、ＴＮＰ−ＡＭＰは３０μＭ以下の濃度ではほとんど阻害活性を示さない。これらＰ２Ｘ受容体拮抗薬における効力についての同様の順位が、ラットＰ２Ｘ２／３受容体でも認められた（データは示していない）。
【０１８３】
皮膚内ＴＮＰ−ＡＴＰ（３０〜３００ｎｍｏｌ／足）とＢｚＡＴＰ（１０００ｎｍｏｌ／足）をラット後足の背部表面に併用投与することで、侵害受容足萎縮行動に有意（Ｐ＜０．０５）かつ用量依存的な低下が生じた（図１５）。ＴＮＰ−ＡＴＰとＢｚＡＴＰの併用によってＢｚＡＴＰ誘発足萎縮行動は低下しなかったことから、ＴＮＰ−ＡＴＰの抗侵害受容効果は薬理的に特異的であるように思われる。
【０１８４】
同様に、ＴＮＰ−ＡＴＰと５％ホルマリンをラット後足の皮膚表面に併用投与することで、ホルマリン試験の急性（Ｉ相）部分において防衛行動に用量依存的な低下が生じた（図１６）。さらに、ホルマリン試験の持続期（ＩＩ相）でもＴＮＰ−ＡＴＰの抗侵害受容効果が明らかであり、ホルマリン誘発足萎縮における有意な３０％低下がＴＮＰ−ＡＴＰの両用量（３０および１００ｎｍｏｌ／足）で認められた。ＢｚＡＴＰに対する抗侵害受容活性と一致して、ＴＮＰ−ＡＴＰによって、ホルマリン試験の急性（Ｉ相）成分および持続性（ＩＩ相）成分の両方で侵害受容応答が弱められたが、ＴＮＰ−ＡＭＰではそれは認められなかった。
【０１８５】
実施例１４
実施例６には、ラットＰ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／３受容体に対するシバクロンブルーの効果を評価するのに使用するプロトコールを記載してある。
【０１８６】
認められた結果に関して、ヒトＰ２Ｘ３受容体でのアロステリック作用と一致して（上記実施例１および２参照）、シバクロンブルーによって、ラットＰ２Ｘ３受容体を発現する１３２１Ｎ１細胞でＢｚＡＴＰ（１μＭ）およびα，β−ｍｅＡＴＰ（１０μＭ）の両方で刺激したカルシウム電流（それぞれＥＣ３０値＝５８０ｎＭおよび７２０ｎＭ）において濃度依存性上昇が生じた（図１７）。シバクロンブルーの最大促進効果が１００μＭ以下の濃度で観察されたが、それより高い濃度のシバクロンブルーでは結果が変動し、概してラットＰ２Ｘ３受容体の作働薬活性化促進における効果が低かった（データは示していない）。この後者の現象は、シバクロンブルーの固有の拮抗薬活性によるものと考えられる（Ｒａｌｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５０： ４１３−４９２ （１９９８））。
【０１８７】
０．３〜１０μＭの濃度範囲でのシバクロンブルーによっても、ＢｚＡＴＰ（１μＭ）およびα，β−ｍｅＡＴＰ（１０μＭ）によるラットＰ２Ｘ２／３受容体の活性化が促進された（図１７）。しかしながらこれらの効果は二相的であり、１０μＭを超えるシバクロンブルー濃度ではＰ２Ｘ２／３受容体の作働薬介在活性化の促進が低かった。さらに、３０μＭを超えるシバクロンブルー濃度では、α，β−ｍｅＡＴＰのラットＰ２Ｘ２／３受容体の活性化と拮抗した。シバクロンブルーはラットＰ２Ｘ２／３受容体のＢｚＡＴＰ介在およびα，β−ｍｅＡＴＰ介在の両方の活性化に対して同様の効果を示しており、α，β−ｍｅＡＴＰはＰ２Ｘ２受容体を活性化しないことから、これら二相効果に対する相同Ｐ２Ｘ２受容体の寄与は異なるように思われる（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７７： ４３２−４３５ （１９９５）； Ｂｉｎａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３７６： １２７−１３８ （１９９９））。これら所見と一致して、シバクロンブルーはラットＰ２Ｘ２受容体のＡＴＰ誘発活性化のみを阻害することが認められた（ＩＣ５０＝８μＭ）（データは示していない）。
【０１８８】
さらにシバクロンブルーについては以前に、ヒトＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２およびＰ２Ｘ７受容体の作働薬活性化を促進しないことが示されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９１： １１３５−１１４２ （１９９９））。
【０１８９】
シバクロンブルーによってＰ２Ｘ３受容体活性化に１０倍の促進が生じたが、Ｐ２Ｘ２／３受容体活性化では最大で２．５〜４．５倍のみの上昇が観察された。これらの異なる効果についての正確な理由は未解明であるが、シバクロンブルーの固有の拮抗薬活性（Ｒａｌｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５０： ４１３−４９２ （１９９８））が、Ｐ２Ｘ３受容体およびＰ２Ｘ２／３受容体の見かけのアロステリック促進の強さにおいて認められる差に寄与するものと考えられる。
【０１９０】
実施例１５
シバクロンブルーの侵害受容促進効果
特定濃度のシバクロンブルーは、上記で示した結果から明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでラットのＰ２Ｘ３およびＰ２Ｘ２／３受容体の活性化を選択的に促進できることから、さらに試験を行って、シバクロンブルーがラットにおけるＢｚＡＴＰの侵害受容効果を促進する能力を調べた。図１２に示したデータと一致して、ラット後足へのＢｚＡＴＰ単独の皮膚内投与（１０〜３００ｎｍｏｌ／足）によって、侵害受容挙動に用量依存的上昇が生じた（図１７ａ〜ｄ）。シバクロンブルー単独の皮膚内投与（１０〜３００ｎｍｏｌ／足）によって、１００ｎｍｏｌ／足の用量で軽度であるが統計的に有意な侵害受容応答のみを生じた（図１８ａ〜ｄ）。
【０１９１】
ラット後足へのシバクロンブルーとＢｚＡＴＰの皮膚内併用投与により、ＢｚＡＴＰ単独での侵害受容効果と比較して侵害受容足萎縮行動に有意かつ二相の効果を生じた（図１８ａ〜ｄ）。低用量のＢｚＡＴＰでは（１０ｎｍｏｌ／足）、シバクロンブルーによって、ＢｚＡＴＰ単独の効果と比較して、侵害受容応答に小さいが統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）促進が生じた（図１８ａ）。シバクロンブルーの侵害受容促進効果は、侵害受容性の非常に小さい用量のＢｚＡＴＰ（３０ｎｍｏｌ／足）と組み合わせた場合に有意に大きくなった（図１７ｂ）。それより高い用量のＢｚＡＴＰ（１００ｎｍｏｌ／足）では、シバクロンブルーが侵害受容を促進する能力は、３０ｎｍｏｌ／足の用量のみで認められた（図１７ｃ）。
【０１９２】
それとは対照的に、シバクロンブルーと高用量のＢｚＡＴＰ（３００ｎｍｏｌ／足）とを皮膚内併用投与した場合、ＢｚＡＴＰ単独の侵害受容効果と比較して、用量依存的な足萎縮応答阻害が生じた（図１８ｄ）。
【０１９３】
実施例１６
シバクロンブルーによるホルマリン侵害受容の促進
皮膚内ＢｚＡＴＰの侵害受容効果を促進する上で、中間用量のシバクロンブルー（３０および１００ｎｍｏｌ／足）が最も効果的であることが認められたことから、これらの用量のシバクロンブルーについて、ホルマリン試験で侵害受容を促進する能力も調べた。ホルマリン試験の急性期（Ｉ相）では、皮膚内シバクロンブルー単独で、有意かつ用量依存的な侵害受容応答が生じた（図１６ａ）。皮膚内シバクロンブルー（３０および１００ｎｍｏｌ／足）と各種濃度のホルマリン（１、２．５および５％）を併用しても、ホルマリン単独の効果と比較して、ホルマリン試験の急性相（Ｉ相）での侵害受容が大きくなった（図１９ａ）。しかしながら、ホルマリンとシバクロンブルーの侵害受容効果間に有意な相互作用はみとめられなかったことから（Ｐ＞０．０５）、これらの効果はホルマリンと相加的であるように思われた（図１９ａ）。
【０１９４】
ホルマリン試験の持続的侵害受容成分（ＩＩ相）の間、皮膚内シバクロンブルー単独では、有意な（Ｐ＜０．０５）侵害受容応答は生じなかった（図１９ｂ）。しかしながら、シバクロンブルー（３０および１００ｎｍｏｌ／足）とホルマリン（１および２．５％）とを併用投与することで、単独で投与したホルマリンまたはシバクロンブルーの侵害受容効果と比較して、有意に大きい足萎縮行動が生じた（図１９ｂ）。ホルマリン試験のこの持続性部分では、ホルマリンとシバクロンブルーの侵害受容効果間で相加性より有意に（Ｐ＜０．０５）に大きい相互作用によって示されるように、シバクロンブルーは、１％および２．５％ホルマリンの侵害受容効果を高めた。非常に低い侵害受容用量のホルマリン（１％）では、シバクロンブルーの侵害受容促進効果は二相性であり、３０ｎｍｏｌ／足のシバクロンブルーによって、それより高用量のシバクロンブルー（１００ｎｍｏｌ／足）の場合と比較して、持続的侵害受容に有意に大きい促進が生じた（図１９ｂ）。５％ホルマリンを皮膚内投与することで、それより低用量のホルマリンと比較して有意に大きい侵害受容が生じたが、シバクロンブルーとその用量のホルマリンを併用投与しても、足萎縮行動はそれ以上促進されなかった。
【０１９５】
アロステリックにＰ２Ｘ３受容体活性化を調節しない構造的に類似のシバクロンブルー類縁体であるリアクティブオレンジは（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９１： １１３５−１１４２ （１９９９））、皮膚内投与後に単独では侵害受容を起こさず（３０および１００ｎｍｏｌ／足）、ホルマリンと併用投与した場合に急性または持続性の侵害受容足萎縮に対して効果を示さなかったことから、シバクロンブルーの侵害受容促進効果は薬理的に特異的であるように思われる。