(57)【要約】過酸化リン脂質還元活性で例示される酵素活性の実質的本態となる新たなセレノシステイン含有タンパク質を提供する。好適にはアルブミンにセレノシステインを導入した過酸化リン脂質還元活性をもつセレノシステイン含有タンパク質及びその遺伝子で例示される、所望の位置にセレノシステインコドンを持ったセレノシステイン非含有タンパク質のコーディング配列と、その３’側に位置するセレノシステイン挿入配列からなる遺伝子とその発現タンパク質からなる。酸化ストレスに関連した各種疾病に対する病態悪化阻止、予防または治療に適用されうる新たな抗酸化物質が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノシステイン非含有タンパク質を基本骨格とし、当該タンパク質の１以上のシステインがセレノシステインに置換されるかあるいは１以上のセレノシステインの挿入または置換によって形成され、且つ酵素活性を有することを特徴とする組換えセレノシステイン含有タンパク質。
【請求項２】
酵素活性が過酸化リン脂質還元活性である請求項１記載の組換えセレノシステイン含有タンパク質。
【請求項３】
基本骨格となるセレノシステイン非含有タンパク質がアルブミンである、請求項１もしくは請求項２記載の組換えセレノシステイン含有タンパク質。
【請求項４】
配列番号９に記載のアミノ酸配列または該配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖よりなる、請求項１から請求項３のいずれかに記載のセレノシステイン含有タンパク質。
【請求項５】
セレノシステイン非含有タンパク質を基本骨格とし、当該タンパク質の１以上のシステインがセレノシステインに置換されるかあるいは１以上のセレノシステインの挿入または置換によって形成され、且つ酵素活性を有することを特徴とする組換えセレノシステイン含有タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
セレノシステイン非含有タンパク質遺伝子のアミノ酸コーディング配列の所望の位置にセレノシステインのコドンを有し、３’側の非翻訳領域にセレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ配列）を有する、請求項５記載の遺伝子。
【請求項７】
ＳＥＣＩＳ配列がセレノプロテインＰ遺伝子より選択される請求項６記載の遺伝子。
【請求項８】
セレノシステイン非含有タンパク質遺伝子がアルブミン遺伝子である請求項５から請求項７のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項９】
請求項５から請求項８のいずれかに記載の遺伝子を使用して調製される請求項１記載の組換えセレノシステイン含有タンパク質。
【請求項１０】
請求項５から請求項８のいずれかに記載の遺伝子を使用する請求項１記載の組換えセレノシステイン含有タンパク質の調製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は、医療用薬剤の分野に属す新規なタンパク質に関し、詳細にはセレノシステイン非含有タンパク質にセレノシステインを導入して作られた、酵素活性を有する新規な物質に関するものである。さらに詳細には、所望の位置にセレノシステインコドンを有するセレノシステイン非含有タンパク質のコーディング配列と、その３’側に位置するセレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ）からなる遺伝子とその発現タンパク質に関する。好適にはアルブミンにセレノシステインを導入した過酸化リン脂質還元活性を有するセレノシステイン含有タンパク質及びその遺伝子に関する。本願発明は酸化ストレスに関連した各種疾病に対する病態悪化阻止、予防または治療剤等医薬品の提供を可能ならしめるものである。
背景技術
近年、活性酸素種、フリーラジカルによる生体分子の酸化的傷害と疾患の関係が、例えば、老化、炎症、自己免疫疾患、発ガン、虚血再灌流障害、神経変性、動脈硬化、糖尿病、白内障または筋萎縮などで次々と明らかにされてきた。前記のような病態では、病因となる酸化ストレスに対抗するために様々な生体内抗酸化物質が働いている。タンパク質では、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）やカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、セルロプラスミンなど、低分子として、グルタチオン（ＧＳＨ）、ビタミンＥやＣ等が知られている。
また、アルブミンにも抗酸化作用が知られている。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、初め６０９残基のプレプロタンパク質として生合成され、まず、シグナルペプチダーゼによってＮ末端側の１８残基が、さらに、続く６残基が分泌経路を経る間に切断除去され、血漿中には５８５個のアミノ酸残基を持った成熟型アルブミンとして存在する。アルブミンは全血漿タンパク質（７．５−８．０ｇ／１００ｍｌ）の約５０−６０％を占め、血漿中には生体内での全量の約４０％が存在し、残りの６０％は細胞外間腔に存在することから、生体内で量的に重要な抗酸化作用を担っていると考えられている。アルブミンの抗酸化能力は、酸化還元緩衝機能が中心であると言われている。生体や細胞内は嫌気的でかなり酸素濃度の低い状態である。生命現象は、このような還元的な環境下で行われており、そのために、酸化還元状態の絶妙なバランスが必要である。例えばＧＳＨは分子内にＳＨ基を１個有し、これを利用して細胞内を還元状態にしている。アルブミンも３４番目（成熟型アルブミンのＮ末端側から数えて）のシステイン（Ｃｙｓ３４）がフリー（還元型）で、ＧＳＨと同様、その圧倒的な量を利用して、生体内が酸化的な状態に傾くのを防ぎ、生体内を還元状態に保っている。
最近、アルブミンには過酸化リン脂質を還元する酵素活性があることが判明し、その活性中心がＣｙｓ３４であることが示された（Ｒ．ＨＵＲＳＴら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３８，７２３（１９９９））。正常な成人男子の場合、アルブミンの約７５％がフリーＣｙｓ３４を持っているが、この割合は、加齢とともに変化し、老人になるほどフリーＣｙｓ３４が減少することが知られている。このバランスは、ある種の疾患では、例えば、慢性の肝臓病や腎不全では還元型のアルブミンが大きく減少していることが認められている。また、酸化ストレス疾患の一種である敗血症患者中のアルブミンでは還元型が健常人に比べて減っており、それに伴って過酸化リン脂質還元活性も低下していることが示されている。このように、生体の恒常性や酸化ストレス疾患でのアルブミンの重要性が認められている。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
しかし、還元型ＳＨ基はアルブミン１分子につき１個であるので、臨床効果を上げるためには大量のアルブミン投与が必要となる。アルブミン製剤の大量投与には倫理的にも生理的にも限界があり、また大量投与にともなう副作用が知られている。例えば、アルブミン濃度４ｇ／ｄｌ以上の投与では、生体のアルブミン合成能が抑制され、免疫抑制をも惹起することがある。また、高濃度や大量の輸注では血圧低下や心不全など心臓への負担が増大する。このような、副作用を防ぐためには、抗酸化能力を高めたアルブミンが必要とされ、アルブミンの機能改変が望まれている。しかし、現実には、そのような機能改変したアルブミンは一切知られていなかった。
なお、本明細書の記述は、「抗酸化物質の全て」吉川敏一編、先端医学社；「臨床アルブミン学」渡邊明治編、メディカルビュー社；「マルチ機能タンパク質：血清アルブミン」恵良聖一著、共立出版；「Ａｌｌ  ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ」Ｔ．Ｐｅｔｅｒｓ，ＪＲ、ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ；「医学大辞典」ＣＤ−ＲＯＭ版、南山堂；「最新医学大辞典」ＣＤ−ＲＯＭ第２版、医歯薬出版、の記述を参考にした。
（その解決方法）
上述の状況の下、本願発明者等は、新たな抗酸化ストレス剤、とりわけ過酸化脂質の関わる疾患に対する治療薬を供するべく鋭意研究した結果、ヒトアルブミンのＣｙｓ３４の代わりに、Ｃｙｓのイオウ（Ｓ）がセレン（Ｓｅ）に置き換わったアミノ酸であるセレノシステイン（以下、「Ｓｅｃ」という）を導入することに成功し、その改変アルブミンに、従来報告されていなかった高活性の過酸化リン脂質還元活性を見出した。このように、Ｓｅｃ非含有タンパク質にＳｅｃを導入することで新たな抗酸化活性を持った物質を作ることができることを見出し、この知見に基づいて本願発明を完成するに至った。
発明を実施するための最良の形態
本願発明の酵素活性を有する新たなタンパク質は、Ｓｅｃ非含有タンパク質を基本骨格とし、当該タンパク質の１以上のＣｙｓがＳｅｃに置換されるかあるいは１以上のＳｅｃの挿入または置換によって形成され、且つ酵素活性を有することを特徴とする組換えＳｅｃ含有タンパク質であり、好適には当該酵素活性は過酸化リン脂質還元活性であり、基本骨格となるＳｅｃ非含有タンパク質はアルブミンである。さらに、本願発明においては前記組換えＳｅｃ含有タンパク質をコードする遺伝子及び当該遺伝子を利用した組換えＳｅｃ含有タンパク質の調製方法をも提供する。
本発明者らは、Ｃｙｓ３４の機能を高めるために、Ｃｙｓ３４のＳをＳｅに変化させることを考案した。Ｓｅは、周期率表で酸素（Ｏ）、Ｓと同族元素でそれらの下に位置し、Ｓｅの性質はＳと原子径の大きさ以外極めて類似した性質をもち、明確な差は認められない。しかし、ＣｙｓのＳをＳｅに置き換えたＳｅｃのセレノールは求核反応により過酸化物を還元できるが、その還元力はＳをもつＣｙｓよりもはるかに強いとされている。また、Ｓｅｃの場合、セレノールのｐＫａは５．２４であるのに対し、ＣｙｓのチオールのｐＫａは８．２５である。すなわち、生体内環境である中性付近では、Ｃｙｓのチオールはほとんど解離していないが、Ｓｅｃのセレノールはほとんどイオン化している。本発明者らは、このようなＳｅとＳの性質の差に着目して、アルブミンの抗酸化機能を強化することが可能であると考えた。
ＣｙｓのＳをＳｅに変換する方法として、大きく３つの方法が考えられる。１番目の方法は、生体や細胞、あるいは無細胞などの蛋白合成系を利用する方法である。前述のようにＳｅとＳは非常に類似した物理的性質を持っているため、過剰の無機Ｓｅ存在下では、アミノ酸の生合成システムが無差別的にＳの代わりにＳｅを取り込んでしまうことがある。すなわち、無機Ｓｅ等として過剰なＳｅ源を生体に直接投与するか、動物細胞や酵母などの真核細胞の細胞培養系に混合させると、ある一定の確率で、ＣｙｓのＳの代わりにＳｅを取り込みＳｅｃが作られる。しかし、この方法ではＳを持っているメチオニンなどもセレノメチオニンになるなど、取り込みをコントロールすることが難しい。
２番目の方法は、化学的な反応によってＳｅｃを導入する方法である。この方法はセリンをターゲットに、このアミノ酸をＳｅｃに化学的修飾で変換する方法である。具体的には、目的のタンパク質を、ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）処理後、Ｈ２Ｓｅ（もしくは、ＮａＨＳｅとＨ２Ｏ２）処理することで、セリンをＳｅｃに変換することができる（Ｚ．Ｐ．ＷｕおよびＤ．Ｈｉｌｖｅｒｔ，１１１，４５１３（１９８９））。この方法を用いて、ＧＳＨ結合抗体の軽鎖のセリンをＳｅｃに変換したり（Ｇ．Ｍ．Ｌｕｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８，１２４０（１９９４））、セレリンプロテアーゼであるスブチリシンの活性中心である２２１番目のセリンをＳｅｃに変換して（Ｚ．Ｐ．ＷｕおよびＤ．Ｈｉｌｖｅｒｔ，１１２，５６４７（１９９０））、ともに過酸化物還元活性のある酵素を作出している。しかし、この方法は、セリンしかターゲットにすることができず、また、部位特異的に修飾を加えることが難しい。
３番目の方法は、遺伝子組換え技術を利用する方法である。Ｓｅｃは終止コドンＵＧＡでコードされており、ユニークな機構によって翻訳される（Ｊ．Ｆ．ＡｔｋｉｎｓおよびＲ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７，４６３（２０００））。セレノプロテインのｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）には、ステムループ構造を取りうるセレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ）と呼ばれる配列が存在している。ＳＥＣＩＳを削除すると翻訳が終止することから、この配列の存在がコドンＵＧＡを終止ではなくセレノシステイン挿入として認識させるのに必須であることが知られている（Ｍ．Ｊ．ＢｅｒｒｙらＮａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．３５３，ｐ．２７３（１９９１）；Ｍ．Ｊ．ＢｅｒｒｙらＥＭＢＯ  Ｊ．ｖｏｌ．１２，ｐ．３３１５（１９９３））。真核生物のＵＧＡ翻訳機構には最低３つの因子が関わっていると考えられる。すなわちＵＧＡのアンチコドンを持つＳｅｃ−ｔＲＮＡ（Ｂ．Ｊ．ＬｅｅらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、９７２４（１９８９））、このｔＲＮＡに特異的に結合する伸長因子（ｅＥＦＳｅｃ）（Ｄ．ＦａｇｅｇａｌｔｉｅｒらＥＭＢＯ  Ｊ．１９，４７９６（２０００））およびＳＥＣＩＳに結合するタンパク質（ＳＢＰ２）（Ｐ．Ｒ．ＣｏｐｅｌａｎｄらＥＭＢＯ  Ｊ．１９，３０６（２０００））である。ＡＵＧから翻訳が開始し、ポリペプチドがＵＧＡまで合成されると、ＳＥＣＩＳ−ＳＢＰ２複合体と結合しているｅＥＦＳｅｃからＳｅｃ−ｔＲＮＡが供給される。ポリペプチド鎖にＳｅｃが結合し、Ｓｅｃ挿入後も翻訳は継続し、ＵＧＡ以外の終止コドンで翻訳が終止する。すなわち、３番目の方法は、このようなＳｅｃ含有タンパク質の生合成メカニズムを利用する方法である。これら３つの方法はいずれも、Ｓｅｃ導入方法として使用できるが、最後の方法が、前者２つの方法と比べ、確実に、しかも位置特異的にＳｅｃを導入することができるので、最も好適な方法として挙げられる。
本発明者らは、前述の３番目の原理方法を利用し、抗酸化活性を持ち所望の位置にＳｅｃを有するタンパク質を作出する方法として、Ｓｅｃ非含有タンパク質のコーディング配列遺伝子の所望の位置にＳｅｃのコドンＴＧＡを挿入し、そのコーディング配列の３’側にＳＥＣＩＳ配列を持つ遺伝子を構築し、これを動物細胞で発現させる方法を考案した。さらに詳細には、基本骨格となるタンパク質は、ＧＳＨなどのチオール供与体を介して、過酸化物を還元する活性を少しでも持つＳｅｃ非含有タンパク質なら、どのようなタンパク質、たとえ人工的に作られたアブザイムのような酵素活性をもつ抗体でも、その対象となりうる。
アルブミンがその好適な材料として挙げられる。そのようなタンパク質の中でＳｅｃを導入する位置は、コドンとアミノ酸配列のフレームが一致する位置ならばどの位置でもよく、その数にも左右されない。望ましくは、活性中心となっているＣｙｓやセリンなどのアミノ酸がよく、アルブミンの場合には３４番目のＣｙｓが最適である。そのような望ましい配列を持ったＳｅｃ含有成熟型アルブミンのアミノ酸配列として配列番号９の配列を例示することができる。ＳＥＣＩＳ配列の導入位置はアミノ酸コーディング配列の３’側ならどの位置でもよく、ＳＥＣＩＳ配列も、セレノプロテイン類の遺伝子由来ならどのＳＥＣＩＳ配列でも使用可能である。また、その数にも限定はなく、組合せも自由であるが、セレノプロテインＰの３’非翻訳領域を使用するのが望ましい。
発現調節領域となるプロモーターやエンハンサー、さらにはポリＡ付加シグナルなど遺伝子発現に必要なエレメントには特別な限定はなく、動物細胞用ならいかなるエレメントも使用可能である。そのようにしてデザイン、構築された遺伝子は、リポフェクチン法やエレクトロポレーションなど一般的な方法で、動物細胞に導入することができ、導入すべき動物細胞にも限定はない。しかし、そのような導入細胞の培養条件として、亜セレン酸や他のセレノプロテイン類などＳｅ源となるサプリメントが必要である。
以上述べてきた方法によって、新たな機能タンパク質として、Ｓｅｃを持った新規なタンパク質を作ることが可能である。これらの方法で作られたＳｅｃ含有タンパク質は、抗酸化活性をもつ新規なタンパク質であり、特にアルブミンを基本骨格にしたものはチオール供与体存在下で過酸化リン脂質還元活性をもつ新規タンパク質である。
産業上の利用の可能性
本願発明の新規タンパク質は、活性酸素種、フリーラジカルによる生体分子の酸化的傷害いわゆる酸化ストレスの関わる疾患全般に治療及び予防薬として利用可能である。とりわけ、老化、炎症、発ガン、自己免疫疾患、虚血再灌流障害、神経変性、動脈硬化などの病態に対する好適な治療薬として提供される。例えば、心筋梗塞、脳梗塞や臓器移植など再灌流障害が観察される疾病、ＡＩＤＳ、神経変性症（パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症など）など細胞死や酸化ストレスの関わる疾患、喘息、リウマチなどの免疫疾患、敗血症など炎症性疾患などが挙げられる。また、Ｓｅｃを含有していることから、セレン要求性の高い組織器官（脳神経、心臓、筋肉、免疫系、生殖）に関する疾患にも適応可能である。さらに、従来のアルブミン製剤の対象としていた、出血性や外傷性のショック、侵襲の大きな手術、肝硬変、ネフローゼなどに対しても適応可能である。
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社、ファルマシア社、バイオラド社、シグマ社、ギブコＢＲＬ社製の試薬を使用した。
実施例１
（改変アルブミン遺伝子の構築）
（１）セレノプロテインＰ（ＳｅＰ）３’非翻訳領域を含有するベクター
ヒトＳｅＰ  ｃＤＮＡの５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を、３’末端にＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ認識配列、マウスセレノプロテインＰ  ｐｏｌｙ  Ａ付加シグナルを付加するために、ヒトＳｅＰ  ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドＳｅＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（北海道大学薬学部高橋和彦助教授より供与）を鋳型に下記配列をプライマーとしてＰＣＲを実施した（図１）。
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サーマルサイクラーにはアステックｐｒｏｇｒａｍ  ｔｅｍｐ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ＰＣ−８００を、ＤＮＡポリメラーゼにはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用い、試薬濃度はキット添付プロトコールに従い、温度条件９６℃２０秒、６８℃３分の２５サイクル、６８℃５分の１サイクルでＰＣＲした。得られた約２ｋｂｐの増幅断片をＴＯＰＯ  ＴＡｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の手法に従いｐＣＲ２．１  ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。得られたクローンについて、Ｍ１３  ｒｅｖｅｒｃｅおよびＴ７をプライマーとして、挿入断片の５’末端から約２００ｂｐのＰｖｕＩＩ認識配列までと、３’末端から約１００ｂｐのＢｓｍＩ認識配列までのＤＮＡ配列を解析した。解析結果から正しい配列が付加されたＤＮＡクローンを選択し、ＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、得られた約２．１ｋｂｐの断片をｐＳＰ７２ベクターに組み込んだ（ｐ２０１：図２）。ＳｅＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＰｖｕＩＩ／ＢｓｍＩ消化により得られる２つの内部断片のうち、３’側のＰｖｕＩＩ−ＢｓｍＩ断片（０．９ｋｂｐ）をｐ２０１のＰｖｕＩＩ／ＢｓｍＩ消化後のベクター側を含む断片に挿入した（ｐ２０３：図２）。
（２）ｃ−ｍｙｃ付加ヒト血漿アルブミン（ＨＳＡ）発現ベクター：Ｃ３４Ｃの構築
ＨＳＡ  ｃＤＮＡは、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｍＲＮＡ（サワデーテクノロジー社）より一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社）を用いて調製したｃＤＮＡを鋳型として、以下の配列をもつプライマーで、前述の条件でＰＣＲを行った。
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このＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩサイトにクローニングし（ｐＡＬＢ：図３）、全長をシークエンスしてフレームシフト等のエラーのないことを確認した。
初めに、ｐＡＬＢ内のＸｂａＩサイトを、ＸｂａＩ消化、Ｔ４ポリメレースによる平滑末端化、セルフライゲーションにより、欠失させた。次に、ＨＳＡ  ｃＤＮＡの５’末端にＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列およびＨＳＡのシグナル配列を、３’末端にフラッグとしてｃ−ｍｙｃ遺伝子の一部、ＳｅＰ遺伝子の３’末端非翻訳配列の一部、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＥｃｏＲＩ認識配列を付加するため、ｐＡＬＢを鋳型として下記プライマーを用いてＰＣＲを行った（図３）。ＰＣＲ条件はＬＡＴａｑを用い、９６℃２０秒、６８℃２分を３０サイクル、その他は前述の場合と同様に実施した。
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得られた約１．８ｋｂｐの増幅断片をｐＣＲ２．１ｖｅｃｔｏｒにクローニングし、シークエンス解析により５’末端ＡＴＧからＰｖｕＩＩサイトまでと、３’末端からＳａｃＩサイトまでについて正しい配列を有するクローンを選択した。このクローンをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＰ７２に挿入した。このプラスミドのＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩ消化断片をＰＣＲ前の鋳型ｐＡＬＢのＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩと入れ替えた（ｐ１１０）。
ｐ２０３とｐ１１０をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、ｐ２０３より得られた約３．５ｋｂｐのフラグメントにｐ１１０より得られた約１．９ｋｂｐフラグメントを挿入した（ｐ１１１）。このｐ１１１内のＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩ断片とｐＡＬＢのＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩ断片を入れ替えた後、そのプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、得られた約２．９ｋｂｐのｃ−ｍｙｃ付加ＨＳＡ断片をｐＣＡＧ  ｍｃｓ（特願平８−１６５２４９（再公表公報ＷＯ９７／４６５８３））のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入し（ｐ１１３）、これをＣ３４Ｃ発現ベクターとした。
（３）ｃ−ｍｙｃ付加３４番ＣｙｓのＳｅｒ及びＳｅｃ変換ＨＳＡ発現ベクター：Ｃ３４Ｓ及びＣ３４Ｕの構築
ＨＳＡ  ｃＤＮＡ  ５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列およびＨＳＡのシグナル配列を付加し、ＡＴＧから約１１０ｂｐ下流のＣｙｓ３４をコードするコドンＴＧＴをＳｅｒをコードするコドンＴＣＡ、あるいはＳｅｃをコードするコドンＴＧＡに変換するため、ｐＡＬＢを鋳型として、ＰＨ１プライマーと下記プライマーを用いてＰＣＲを行った（図３）。ＰＣＲの条件は前述の場合と同様である。
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得られた約２００ｂｐの増幅断片をｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、シークエンス解析によって正しい配列を有するクローンを選択した。これらを制限酵素ＢｓｔＰＩ／ＰｖｕＩＩで消化し、得られた断片をｐ１１０のＢｓｔＰＩ／ＰｖｕＩＩ消化断片と入れ替えた。得られたクローンをそれぞれｐ１２０（Ｃ３４Ｓ）、ｐ１３０（Ｃ３４Ｕ）とした。ｐ２０３、ｐ１２０およびｐ１３０をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩでそれぞれ消化し、ｐ２０３より得られた約３．５ｋｂｐのフラグメントにｐ１２０、ｐ１３０より得られた約１．９ｋｂｐフラグメントをそれぞれ挿入した（ｐ１２１、ｐ１３１）。ｐ１２１、ｐ１３１内のＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩ断片とｐＡＬＢのＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩ断片を入れ替えた後、そのプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化断片約２．９ｋｂｐをｐＣＡＧ  ｍｃｓのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入した（ｐ１２３、ｐ１３３）。これをそれぞれＣ３４ＳおよびＣ３４Ｕ発現ベクターとした。なお、ｐ１３３のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入断片のＤＮＡ塩基配列を配列番号１１に、その翻訳産物であるアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。
実施例２
（改変アルブミン遺伝子の発現）
（１）発現ベクターの細胞への導入
導入ＤＮＡは以下のようにして調製した。構築した発現ベクターＣ３４Ｃ、Ｃ３４Ｓ、Ｃ３４Ｕで大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換し、２５０ｍｌ  ＬＢ培地（１％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１％ＮａＣｌ）中  ３７℃で一晩振盪培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。得られたプラスミドＤＮＡ溶液より２０μｇを採取し、ＰｖｕＩでベクター上の一カ所を消化切断、アガロース電気泳動により完全消化を確認した後、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ：ＣＨＣｌ３：ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ＝２５：２４：１）処理およびエタノール沈殿によりタンパク除去、核酸抽出し、脱パイロジェンの蒸留水に溶解した。２μｇに相当する断片を細胞１ｗｅｌｌ（２ｘ１０５個）のトランスフェクションに使用した。
導入細胞は以下の手順で準備した。ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ細胞；大日本製薬社）をシャーレ上で６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片（特願平１０−３４７８６３（再公表公報ＷＯ００／３１１３１））、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ハイクローン社）含有ＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）により増殖させた。トリプシンを作用させて細胞を剥離、懸濁し、細胞数を計算後、１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ同培地の細胞液を調製した。培養用６ｗｅｌｌテストプレート（Φ３５ｍｍ）に２ｍｌ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
ＣＨＯ細胞への遺伝子導入には、トランスフェクション用リポフェクチン溶液Ｔｒａｎｓ−ＩＴ  ＬＴ１（ｍｉｒｕｓ社）を使用した。４ｍｌポリスチレンチューブ中、無血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）２００μｌとＬＴ１  １０μｌをゆるやかに混和して室温に５分間放置した。次に導入するＤＮＡ断片２μｇに相当する溶液を添加し、ゆるやかに混和して室温に５分間放置した（ＤＮＡ／リポフェクチン複合体）。６ｗｅｌｌプレートに播いた細胞の培養上清を吸引除去し、新しく同じ培地に交換した。ＤＮＡ／リポフェクチン複合体溶液を全量１ｗｅｌｌの細胞に添加した。ゆるやかに混ぜ、６時間から８時間３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養上清を新しい同培地と交換した。
（２）安定形質転換細胞の獲得
３日間同条件で培養後、０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、１０％ＦＢＳ、６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片合有ＲＰＭＩ１６４０に培地交換した。３日間毎日同培地に培地交換し、その後８日間培地を換えずに培養した。６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌに細胞が密にシートした後、トリプシン処理により細胞を剥離し、液体窒素に保管した。
（３）発現産物の調製
各安定形質転換細胞を１５ｃｍ培養シャーレに１０％ＦＢＳ，６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片含有ＲＰＭＩ１６４０に懸濁して播き込んだ。培養後、ＰＢＳで洗浄し、６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片含有ＡＳＦに培地交換した。親株以外は０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加しておいた。３日間培養後上清１６０ｍｌを回収し、０．２２μｍフィルターで細胞を除いた。分子サイズ１００００カットの限外濾過膜（アミコン社）でＣ３４Ｃは１３８．５倍、Ｃ３４Ｓは８０倍、Ｃ３４Ｕは１３１倍に濃縮した。これを以下に述べるアッセイのサンプルとした。
コントロールの培養上清としては、１０％ＦＢＳ，６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片含有ＲＰＭＩ１６４０を培地として親株を同様にまき、６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片含有ＡＳＦを無血清培地として同様に培養上清を得、最終的に１３０倍に濃縮した。
（４）免疫沈降−ウェスタンブロット
サンプルＮｏ．１：Ｃ３４Ｃ導入細胞培養上清濃縮液（１３８．５倍）、Ｎｏ．２：Ｃ３４Ｕ導入細胞培養上清濃縮液（１３１倍）、Ｎｏ．３：親株ＣＨＯの培養上清濃縮液（１３０倍）、Ｎｏ．４：ＨＳＡ、Ｎｏ．５：ＢＳＡをそれぞれ抗ＨＳＡアフィニティーセファロース（ＢＥＴＨＹＬ社）を用いて次の要領で免疫沈降した。
サンプルそれぞれを１．５ｍｌ試験管中で、Ｔｗｅｅｎ−２０終濃度０．０１％において抗ＨＳＡアフィニティーセファロース２０μｌと混和し、室温で１時間反応させた。その後６０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿したゲルをＰＢＳで洗浄後、さらに０．１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳで洗浄した。遠心後の沈殿に２ｘＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（還元剤不含）を２０μｌ添加、混和して１００℃で５分間熱処理した。遠心後、上清を等量ずつ２本のチューブに分け、ウェスタンブロットのサンプルとした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用１２．５％アクリルアミドゲルを作製し、２枚に免疫沈降したサンプルＮｏ．１〜５と分子量マーカー（Ｒａｉｎｂｏｗ  ｍａｒｋｅｒｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を同じパターンで泳動した。泳動後のゲルをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔに使用した。ブロッティング装置（ＡＴＴＯ社）を使用し、添付のプロトコールにしたがってＰＶＤＦ膜にトランスファーした（それぞれをＡ、Ｂとする）。４％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社）にＰＶＤＦを浸し、３７℃で３０分振盪した。一次抗体としてＡは抗ｃ−ｍｙｃ抗体のビオチンラベルを終濃度各１μｇ／ｍｌになるように、もう一枚のＢは抗ＨＳＡ抗体ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ラベルを終濃度０．２μｇ／ｍｌになるように０．０５％Ｔｗｅｅｎ，４％スキムミルク含有ＰＢＳに溶解し、ＰＶＤＦをこれに浸し、３７℃で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、Ａは４％スキムミルクに浸して室温で５分振盪した。つぎにアビジンＨＲＰ標識試薬として、０．４％スキムミルク含有ＰＢＳＴ中にＶＥＣＳＴＡＴＩＮ（ＶＥＣＴＯＲ社ＰＫ−６１００）の溶液を添付のプロトコールに従って調製し、ＰＶＤＦをこれに浸し、３７℃で３０分反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、Ａ、ＢともにＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて添付のプロトコールに従い化学発光をさせた。Ｘ線フィルム（コニカ社）に感光させ、現像液、定着液（ともにコニカ社）に順次浸して現像した。
その結果を図４に示す。Ａのレーン１および２ではＣ３４ＣおよびＣ３４Ｕ導入細胞の培養上清が抗ｃ−ｍｙｃ抗体と反応しており、レーン３の親株の培養上清とレーン４のＨＳＡおよびレーン５のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は全く反応しなかった。一方Ｂのレーン６、７、９ではＣ３４ＣおよびＣ３４Ｕ導入細胞の培養上清が抗ＨＳＡ抗体と反応しており、レーン８の親株の培養上清およびレーン１０のウシ血清アルブミンは全く反応しなかった。Ｃ３４Ｕ導入細胞の培養上清に検出されたバンドの大きさから、３４番目のＳｅｃでは翻訳が止まらず、３４番目にＳｅｃが挿入されていると考えられた。
（５）ＥＬＩＳＡによる検出
Ｃ３４Ｃ、Ｃ３４Ｕ、Ｃ３４Ｓを導入したＣＨＯ細胞の培養上清中のアルブミン含量を測定した。各濃縮液についてＨＳＡ定量キット（Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ＢＥＴＨＹＬ社）を利用し、添付のプロトコールに従ってＨＳＡとしての量を測定した。その結果、表１に示すように、Ｃ３４Ｃ、Ｃ３４Ｕ、Ｃ３４Ｓのいずれもがアルブミンとして検出できることがわかった。
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実施例３
（改変アルブミンの調製）
各改変アルブミン発現ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で培養、拡張し、１５ｃｍシャーレ３１枚に１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でまき、翌日ＰＢＳで細胞表面を洗浄後、１％ＦＢＳ含有ＡＳＦを３０ｍｌずつ加え、５日間３７℃（５％ＣＯ２）に培養した。培養上清を回収し、培地で１リットルにメスアップ後、０．４５μｍフィルターで濾過した。これをカラムへのアプライ源とした。抗ＨＳＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを１ｍｌ用意し、カラム（直径１．５ｃｍ）に充填後、ＰＢＳで平衡化した。平衡化はＰＢＳ、溶出は０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．８を使用した。溶出時、コレクション用の試験管にフラクション１ｍｌに対し１２０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を入れておいた。すべて０．４５μｍフィルター濾過した。１リットルのタンパク溶液を抗ＨＳＡカラムに１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速でアプライし、アプライ終了後、２５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄した。その後溶出バッファーを同じ速度で流し、１ｍｌ／フラクションで集めた。吸光度Ａ２８０を測定し、ピークの周囲５ｍｌをプールして（図５）、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（ＭＷ  １０，０００ｃｕｔ、ミリポア社）で３００μｌまで濃縮した。各濃縮サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンを図６に示す。なお、タンパク質の染色は銀染色（関東化学社）にて行った。
実施例４
（改変アルブミンのＳｅ含量）
Ｃ３４Ｕの改変アルブミンがＳｅを含んでいるかどうかを調べるために、原子吸光法によるＳｅ定量を行った。原子吸光測定機器としてパーキンエルマ；Ａ  Ａｎａｌｙｓｔ６００を使用した。Ｓｅ標準液としてナカライテスク（株）セレン標準液１０００ｐｐｍを用い、希釈液（０．０４％デオキシコール酸ナトリウム，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液）により希釈して検量線を作製した。Ｃ３４Ｕについては、アルブミンとして１５μｇ／ｍｌ濃度のタンパク溶液を、原子吸光測定用希釈液により２倍希釈したものを検体とした。Ｃ３４Ｃについては、アルブミンとして１５μｇ／ｍｌ濃度では検出限界以下であったので、１．８ｍｇ／ｍｌ濃度のタンパク溶液をＣ３４Ｕと同様に希釈して検体とした。Ｃ３４Ｓについては、アルブミンとして１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のタンパク溶液を同様に希釈して検体とした。各サンプルの測定結果を表２に示す。その結果、Ｃ３４Ｕは予想通りに、アルブミン１分子当たり１個のＳｅを含有していることが示された。
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実施例５
（改変アルブミンの過酸化リン脂質還元活性）
（１）基質
ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＰＣＯＯＨ）：Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，β−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−γ−ｐａｌｍｉｔｏｉｌ（ＰＬＰＣ，シグマ社）１００ｍｇを５ｍＭ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ  Ｎａ（ナカライテスク社）を含む０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）５００ｍｌに溶解し、ｓｏｙｂｅａｎ  ｌｉｐｏｘｙｄａｓｅ（Ｂｉｏｚｙｍｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を添加して３０分間反応させた。反応後、酢酸エチルで抽出し、減圧乾固した後にＭｅＯＨに再懸濁した。これをカラムにＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（φ８．０×２５０ｍｍ，ＴＯＳＯＨ社）を、移動相にＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（９３：７）を用いたＨＰＬＣにより精製した。精製したＰＣＯＯＨの濃度は、ｃｕｍｅｎｅ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ（ナカライテスク社）を標準品としてヨードメトリー法によって決定した。
（２）反応溶液の調製
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ３Ｎａ（ナカライテスク社）、１０ｍＭ  ＮａＮ３（ナカライテスク社）、０．０２５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光社）、０．３ｍＭ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ  Ｎａ、２ｍＭ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＨ、ナカライテスク社）を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の反応溶液を調製し、下に示した濃度になるようにサンプルを添加した。３７℃で１０分間反応後、基質として６０ｎｍｏｌ／ｍｌとなるようにＰＣＯＯＨを加えて反応を開始した。
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（３）ＨＰＬＣ用サンプルの調製
各時間（０，２，４，８，２４時間）反応後、反応溶液から３０μｌを回収し、２−ｐｒｏｐａｎｏｌ  ２７０μｌに懸濁した。その後、１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、得られた上清をＨＰＬＣ添加サンプルとした。
（４）ＨＰＬＣによるＰＣＯＯＨ定量
カラムはＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（φ４．６×２５０ｍｍ，ＴＯＳＯＨ社）を、移動相は１０ｍＭ  ｃｏｌｉｎｅ  ｃｌｏｒｉｄｅ（和光社）を含むＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（７５：２１：４）を用い、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。（３）で得られたＨＰＬＣ添加サンプル５０μｌをＨＰＬＣカラムに添加した。ＰＣＯＯＨとその還元体であるＰＣＯＨの検出は、共役ジエンの吸収極大である２３４ｎｍの吸収を測定して行った。標品として精製したＰＣＯＯＨと、これをテトラヒドロホウ酸ナトリウム（和光社）で還元したＰＣＯＨを用い、これらのピークの面積を基準として反応溶液中のＰＣＯＯＨ、ＰＣＯＨを定量した。
（５）結果
ＰＣＯＯＨ量の経時変化と還元体であるＰＣＯＨの経時変化を図７に示す。いずれのサンプルを用いた場合にも、反応時間に依存したＰＣＯＯＨの減少、ＰＣＯＨの増加が見られた。各時間におけるＰＣＯＯＨ減少量とＰＣＯＨ増加量はほぼ一致していることから、ＰＣＯＯＨは還元されてＰＣＯＨになっていると考えられる。各サンプルを加えた場合のＰＣＯＨ増加量からコントロールであるＧＳＨのみを添加した場合のＰＣＯＨ増加量を差し引き、各サンプルに対し、近似曲線を引き、その傾きから、単位時間あたりのＰＣＯＯＨ還元量（ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｌ）を算出した（表３）。その値から各サンプルの比活性を求めた。結果を表３に示す。Ｃ３４Ｕの比活性は８．４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。この値はコントロールであるＣ３４Ｃ（０．０７０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）の約１２０倍、ＨＳＡ（０．０１７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）の約５００倍であった。
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（従来技術より有効な効果）
本願発明により得られた新規タンパク質は、活性酸素種、フリーラジカルによる生体分子の酸化的傷害いわゆる酸化ストレスの関わる疾患、とりわけ、老化、炎症、発ガン、自己免疫疾患、虚血再灌流障害、神経変性、動脈硬化などの病態に対する好適な治療および予防薬として提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はヒトセレノプロテインＰ  ｃＤＮＡの挿入されたプラスミドのマップを
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図２は改変アルブミン遺伝子の構築工程を表す模式図である。
図３は改変アルブミン遺伝子の構築工程を表す模式図である。
図４は発現された改変アルブミンのウエスタンブロットを示す写真である。なお、図中の（Ａ）および（Ｂ）において各レーンは以下のとおりである。（Ａ）レーン１：Ｃ３４Ｃ、レーン２：Ｃ３４Ｕ、レーン３：ｉｎｔａｃｔ  ＣＨＯ、レーン４：化血研ＨＳＡ、レーン５：ＢＳＡ、（Ｂ）レーン６：Ｃ３４Ｃ、レーン７：Ｃ３４Ｕ、レーン８：ｉｎｔａｃｔ  ＣＨＯ、レーン９：化血研ＨＳＡ、レーン１０：ＢＳＡ。
図５は改変アルブミン（Ｃ３４Ｕ）発現細胞の培養上清を抗ＨＳＡ抗体カラムに通液した際の溶出パターンを示す図である。
図６は調製された各改変アルブミンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンを示す写真である。なお、図６において★は溶出画分を表す。
図７は改変アルブミンの過酸化リン脂質還元活性の経時変化を示す図であり、上段のグラフはＰＣＯＯＨ量の経時変化を、下段のグラフはＰＣＯＨ量の経時変化をそれぞれ表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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