【手続補正書】
【提出日】平成13年1月17日(2001.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】雌性の性的機能障害の処置方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】雌性の性的機能障害の処置又は雌性の性的増強の方法であって、血管拡張作用を有するプロスタノイド化合物を医薬として許容される賦形剤中に含んで成る組成物を、膣に投与することを含んで成る方法（ここで、投与されるプロスタノイド化合物の量は、約０．０５ｍｇ〜約３ｍｇの範囲である）。
【請求項２】投与されるプロスタノイド化合物の量が、約０．０５ｍｇ〜約２ｍｇの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】投与されるプロスタノイド化合物の量が、約０．１２５ｍｇ〜約１ｍｇの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記プロスタノイド化合物が凍結乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記プロスタノイド化合物が、リポソームに包まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記リポソームが凍結乾燥される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記の医薬として許容される賦形剤がメチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記組成物が膣内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記組成物が膣外に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記プロスタノイド化合物が、プロスタグランジンＥ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】投与されるプロスタノイド化合物の量が、約０．０５ｍｇ〜約２ｍｇの範囲にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】投与されるプロスタノイド化合物の量が、約０．１２５ｍｇ〜約１ｍｇの範囲にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】前記プロスタノイド化合物が、リポソームに包まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】前記リポソームが凍結乾燥される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記の医薬として許容される賦形剤がメチルセルロースである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】前記組成物が更に、前記プロスタノイド化合物の生物学的利用能を増強することができる界面活性剤を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】雌性の性的機能障害の処置又は雌性の性的増強の方法であって、凍結乾燥したリポソームのプロスタグランジンＥ−１をメチルセルロース中に含んで成る組成物を、膣に投与することを含んで成る方法（ここで、投与されるプロスタグランジンＥ−１の量が、約０．１２５ｍｇ〜約１ｍｇの範囲にある）。
【請求項１８】患者の膣の血流を増強する方法であって、血管拡張作用を有するプロスタノイド化合物を医薬として許容される賦形剤中に含んで成る組成物を、膣に投与することを含んで成る方法（ここで、投与されるプロスタノイド化合物の量は、約０．０５ｍｇ〜約３ｍｇの範囲にある）。
【請求項１９】投与されるプロスタノイド化合物の量が、約０．０５ｍｇ〜約２ｍｇの範囲にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】投与されるプロスタノイド化合物の量が、約０．１２５ｍｇ〜約１ｍｇの範囲にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】前記プロスタノイド化合物がプロスタグランジンＥ−１である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
この発明は、雌性の性的機能障害の処置又は雌性の性的増強の方法、及び更に特別に、雌性の膣内又は膣外へのプロスタノイド化合物の投与に関する。
【０００２】
発明の背景
近年の研究は、米国の５０〜７４歳の間の約１，０００万人の女性が、２２，９００万回の性交の時に、潤滑の欠如を報告したことを明らかにした。事実、調査した２６０人の女性のうち５８％以上が、性交の際の痛み又は不快感、膣の潤滑の減少、膣の充血の遅れ、覚醒のための時間の増大、オーガズムに達する能力の減少、あるいは陰核の感覚の減少として定義される様な性的機能障害に影響を受けていることが明らかとなった。
【０００３】
この症候群の動物モデルは、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ及びＢｅｒｍａｎによって開発された（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ． １０ Ｓｕｐｐｌ． ２ ： Ｓ８４−９０ ； Ｓ９８−１０１， １９９８。この開示は、引用によって本明細書に組入れられる）。これらの研究者は、膣及び陰核に対する腸骨−下腹部−外陰部の動脈床の血流力学の完全性を評価する診断的研究、並びに脈管形成的な雌性の性的機能障害を有する患者の膣／陰核の血流を増強するための新規の経口／局所の薬理動態的研究に着手した。彼等は、性的機能障害を有する女性が、一般に生理的異常、例えば脈管形成的な雌性の性的機能障害を持ち、これがそれらの全体の性的な健康問題に寄与しているであろうという増大している一連の証拠を観察した。
【０００４】
Ｐａｒｋ等（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ． ９ ： ２７−３７， １９９７ 。この開示は、引用によって本明細書に組入れられる）は、雌性の性的機能障害が下腹部−膣／陰核の動脈床の脈管形成的欠陥に一部関係しうることを示した。この理論を、調節した実験環境下で研究するために、彼等は、膣の充血不足及び陰核の勃起不足の動物モデルを開発した。彼等は、骨盤の神経によって刺激される膣の充血及び陰核の勃起を、雌のコントロールの標準的なダイエットのニュージーランド白ウサギにおいて、大動脈−腸骨の動脈のアテローム性動脈硬化症のバルーン損傷を、雌の０．５％コレステロールダイエットニュージーランド白ウサギにおいて達成した。１６週後、膣壁及び陰核の血流、膣壁及び陰核の海綿静脈洞内圧、膣の長さ、膣の管腔圧、コレステロール及びトリグリセリドの血液濃度、大動脈−腸骨の血管造影並びに膣壁及び陰核の勃起組織の組織学を含む、新規の血流力学的変化性を、前記の２つのウサギの群において記録した。それらの結果は、骨盤の神経の刺激が、膣の血流力学的変化を誘導し、そしてコントロールのウサギと比較して、アテローム性動脈硬化のウサギにおいて、有意に少ない増大が、血流、壁圧及び長さの変化にあった。陰核の勃起性組織の組織学的検査は、海綿静脈洞の動脈のアテローム性動脈硬化的変化並びに散在性の膣及び陰核の線維症を示した。アテローム性動脈硬化の動物における大動脈−腸骨の血管造影は、散在が厳密なアテローム性動脈硬化症の閉塞に適していることを示した。それらは、膣の充血及び陰核の勃起が血液の流入の増大に依存することを結論づけている。
【０００５】
今日、性的な覚醒の疾患を有する女性、特に膣の潤滑の減少及び痛みを伴う挿入があるものの取扱いは、心理学的な、ホルモン及び“人工的な潤滑”の介入に基づいている。膣の充血不足の病態生理学は、部分的に血管の障害に関係しているであろう。
プロスタノイド化合物、例えばプロスタグランジンＥ−１（ＰＧＥ−１）は、添加物として使用され、血流を動脈の血管形成方法において向上させてきた。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ， Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ ａｎｄ Ｌｅｕｋｏｔｏｒｉｅｎｅ Ｒｅｓ．， １７ ： ２６６−７０， １９８７ ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２ ： １９３−９８， １９９８を参照のこと。この開示は、引用によって本明細書に組入れられる。プロスタノイド化合物はまた、雌性の勃起性機能障害の処置において使用されてきた。例えば、開示が引用によって本明細書に組入れられる、米国特許番号第５，７１８，９１７号は、プロスタグランジン含有リポソームを陰茎に投与することを含んで成る、勃起性機能障害の処置方法を開示している。
発明の要約
本発明は、雌性の性的機能障害の処置及び雌性の性的増強の方法を提供する。本発明はまた、患者の膣における血流を増強するための方法を方向づけている。前記方法は、血管拡張作用を有するプロスタノイド化合物を医薬として許容される賦形剤中に含んで成る組成物を、膣に投与することを含んで成る。
【０００６】
前記組成物の好ましい投与量は、３ｍｇ以下のプロスタノイド化合物、更に好ましくは０．０５ｍｇ〜約３ｍｇ、更に好ましくは０．０５ｍｇ〜約２ｍｇ、及びより更に好ましくは約０．１２５ｍｇ〜約１ｍｇのプロスタノイド化合物を含む。好ましい態様において、前記プロスタノイド化合物は、リポソーム内に含まれ、これは好ましくは凍結乾燥され、前記組成物の安定性を増強する。好ましい態様において、前記プロスタノイド化合物は凍結乾燥される。好ましくは、前記プロスタグランジンはプロスタグランジンＥ−１（“ＰＧＥ−１”）である。
詳細な説明
本発明は、雌性の性的機能障害の処置及び雌の性的増強の方法を方向づけている。本明細書で使用される場合、雌性の性的機能障害は、性交の間の痛み又は不快感、膣の潤滑の減少、膣の充血の遅れ、覚醒のための時間の増大、オーガニズムに達する能力の減少、並びに陰核の感覚の減少を含む。本発明はまた、患者の膣における血流の増強のための方法を方向づける。前記方法は、血管拡張作用を有するプロスタノイド化合物を医薬として許容される担体中に含んで成る組成物を、膣外及び／又は膣内に投与することを含んで成る。
【０００７】
本明細書で使用する場合、“膣”の語は、子宮から外陰にわたる交接管だけでなく、陰核、前唇、後唇、大陰唇、及び小陰唇を含む性器を言及する。更に具体的に、陰核は雌性の陰茎におけるものに類似している雌性の、血液を供給し、そして神経が支配する勃起組織を含む。前記組成物の陰核への適用は、雌性の陰茎の血管組織の充血と同一の機構による、陰核の充血を行う血液の供給を増大する。雌性の陰核の勃起組織及び感覚組織の神経支配に対する前記組成物の作用は、相対的な雌性の組織に対するその作用に類似している。
【０００８】
本発明の使用に適しているプロスタノイド化合物は、ＰＧＥ−１，ＰＧＥ−２及びＰＧＥ−３を含むプロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）、ＰＧＡ−１を含むプロスタグランジンＡ（ＰＧＡ）、ＰＧＦ−２を含むプロスタグランジンＦ（ＰＧＦ）、ＰＧＤ−２を含むプロスタグランジンＤ（ＰＧＤ）、プロスタサイクリン、スロンボキサン、ロイコトリエン、６−ケト−ＰＧＥ−１誘導体、カルバサイクリン誘導体、ＰＧＤ−２誘導体など、並びにいずれかのプロスタノイド化合物の合成類似体を含む。ＰＧＥ−１及びＰＧＥ−２が好ましく、そしてＰＧＥ−１が最も好ましい。適当なプロスタノイド化合物の例は、米国特許番号第４，９５５，８７８号に開示されており、この開示は引用によって本明細書に組入れられる。前記プロスタノイド化合物は、好ましくは賦形剤中に結晶、液体又は凍結乾燥形態において提供される。
【０００９】
好ましい投与量は、３ｍｇ以下のプロスタノイド化合物、更に好ましくは０．０５ｍｇ〜約３ｍｇ、更に好ましくは０．０５ｍｇ〜約２ｍｇ、及びより更に好ましくは約０．１２５ｍｇ〜約１ｍｇのプロスタノイド化合物を含む。プロスタノイド化合物の投与量は、膣組織を通じての前記プロスタノイド化合物の素速い吸収によって起こる前記プロスタノイド化合物の潜在的毒性のため、これらの比較的低い濃度で扱われるべきである。
【００１０】
前記の医薬として許容される賦形剤は、前記プロスタノイド化合物の適用を容易にするための化合物である。適当な賦形剤は、例えば、ローション、ゲル及び液体を含む。特に好ましい賦形剤は、ＫＹ  ＪＥＬＬＹの名のもと販売されている様なメチルセルロースである。好ましくは、前記賦形剤は、ほぼ中性のｐＨを有する。賦形剤の他の例は、水、シリコン、ワックス、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール及び糖を含む。前記組成物は、前記担体中で、当業者に知られている方法に従い前記プロスタノイド化合物を均一に混合することによって形成する。
【００１１】
好ましい態様において、前記プロスタノイド化合物はリポソーム内に含まれる。本発明のリポソームは、いずれかのリン脂質、糖脂質、誘導脂質などから作製してもよい。適当なリン脂質の例は、ホスファチドコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ジセチルリン酸塩、リソホスファチジルコリン及びそれらの混合物、例えば大豆リン脂質、並びに卵黄リン脂質を含む。適当な糖脂質はセレブロシド、硫黄含有脂質、ガングリオシドなどを含む。適当な誘導脂質は、コール酸、デオキシコール酸などを含む。リポソームを形成するために、本件で好ましい脂質は、卵のホスファチジルコリンである。
【００１２】
前記リポソームは、リポソームを形成するための、いずれかの知られている方法によって形成してもよく、そして知られている方法に従い、プロスタグランジンを詰め込んでもよい。リポソームのプロスタグランジン（ＰＧ）を形成するための、知られている方法は、例えば共にＬｉｐｏｓｏｍｅ  Ｃｏｍｐａｎｙによって譲渡されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８／０１７１４及び欧州特許出願番号ＥＰ０，５１２，９１６Ａ２、並びにＧｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって譲渡された欧州特許出願番号ＥＰ０，４１６，５２７Ａ２に記載されており、そしてそれらの出願に開示された参照は、その全てが引用によって本明細書に組入れられる。形成されるものは、リポソームのＰＧを含んで成るエマルションである。
【００１３】
本発明において使用されるリポソームは、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍ及び好ましくは約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの平均直径を有するのが好ましい。約１４０ｎｍの平均直径が特に好ましい。約１０００ｎｍ以上のリポソームが好ましくないのは、それらを作製するのが難しいからである。約２０ｎｍ以下のリポソームは、使用可能であるが、好ましくないのは、それらを作製するのが難しいからである。
【００１４】
従って、製造される前記リポソームは、それらのサイズを減少させ、そして均質な集団を製造するために好ましくは処理される。これは、従来技術、例えば好ましくは１００〜５００ｎｍの孔サイズのフィルターを通して押し出されることによって達成することができ、ここで前記のフィルターは直線の経路又は曲線の経路の型のいずれかである。前記リポソームを均質なサイズ分布へと、サイズを減少させる他の方法は、超音波露出、フランスの加圧技術、流体力学的剪断、例えばコロイドミル又はＧａｕｌｉｎホモジェナイザーを用いるホモジェナイゼーション、あるいは微小流動化技術である。微小流動化が現在好ましく、そしてＣｏｏｋ等の米国特許番号第４，５３３，２５４号に記載されており、この開示は引用によって本明細書に組入れられる。好ましい微小流動化方法において、リポソームのエマルションは高圧で、小さい直径の開口部を通して力をかけられ、壁上にはね、そしてその後回収される。
【００１５】
本発明の特に好ましい態様において、前記リポソームは、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、約１４０ｎｍの平均直径を有するリポソームの一般的に均質な集団を達成するために、例えば１インチ当たり１４０００〜１６０００ポンドの圧力で製造されたＭ−１１０  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを、１〜１０回、及び好ましくは４回通過する。
【００１６】
前記プロスタノイド化合物又はリポソームのプロスタノイド化合物の凍結乾燥は当業界で知られているいずれかの方法によって達成することができる。その様な方法は、例えばＪａｎｏｆｆ等の、米国特許番号第４，８８０，８３６号に開示されており、この開示は引用によって本明細書に組入れられる。リポソームの場合において、凍結乾燥方法は、好ましくは乾燥保護剤の、リポソーム懸濁液への添加を含む。前記の乾燥保護剤はリポソームを安定化し、サイズ及び含有量を、乾燥段階の間、及び再水和を通して維持することができる。好ましい乾燥剤は、デキストロース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、ラクトース、及びトリオースの糖を含む糖類であり、これは好ましくはリポソーム懸濁液の水層の重量当たり、約５％〜約２０％及び好ましくは約１０％の量で加えられる。デキストロース、スクロース及びマルトースが現在好ましい。マンニトールを、前記の糖のいずれかと一緒に使用してもよい。追加の保存剤、例えばＢＨＴ又はＥＤＴＡ、尿素、アルブミン、デキストランあるいはポリビニルアルコールもまた使用できる。
【００１７】
リポソームのＰＧの場合、プロスタグランジンの所望の量を輸送するために必要なリポソームのＰＧの量を決定するために、どの位の量のプロスタグランジンが存在するかを決定する必要があった。標準的なプロスタグランジンＥ−２のＥＬＩＳＡ試験を用いる解析は、プロスタグランジンを重量当たり２０％〜４０％程度の量においてリポソームに加えることができることを確立した。しかしながら、プロスタグランジンが重量当たり約２％〜約３％の量において、リポソームに存在することが好ましい。特に好ましい凍結乾燥したリポソームのＰＧ組成物は、４４ｍｇの卵のホスファチジルコリン、７５ｍｇのマルトース及び１ｍｇのプロスタグランジンＥ−１を含んで成る。
【００１８】
所望ならば、前記組成物は更に界面活性剤を含んで成り、前記プロスタノイド化合物の生物学的利用能を増強することができる。前記の界面活性剤は、前記の医薬として許容される賦形剤と前記プロスタノイド化合物との間の界面張力を減少させ、そしてまた前記プロスタノイド化合物と膣の粘膜との間の界面張力を減少させる。前記プロスタノイド化合物がリポソーム中に包まれているとき、界面活性剤はまた、前記リポソームの消滅を増強することができる。本発明における使用のための適当な界面活性剤調製物は、米国特許番号第５，２０７，２２０号に記載されており、この開示は引用によって本明細書に組入れられる。好ましくは、前記界面活性剤は前記組成物中に、重量当たり約０．０２％〜約２％にわたる量において存在する。
【００１９】
他の薬剤を本発明の組成物中に含めることができ、限定しないが、これは他の血管拡張剤、アルファーアドレナリン作用の阻害剤、プラゾシン、パパベリン、フェントラミン、血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）、エストロゲン及びエストロゲン様化合物、アルファーアドレナリン作用の受容体媒介物、ニトログリセリン化合物などを含む。
例１
凍結乾燥したＰＧＥ−１リポソームの製造
本発明に従うリポソームのＰＧＥ−１を、以下の手順に従い製造した。
【００２０】
１．２２５０ｍｌの水（２回蒸留）をビーカー（保冷）に加え、そして少なくとも３０分間窒素散布にさらす。
２．２２５ｇのマルトース（Ｓｉｇｍａ  Ｍ５８８５）を前記の水に加え、そして混合物を溶解するまで混合する。窒素散布を続ける。混合物のｐＨは４．８１である。
【００２１】
３．別のビーカーにおいて、１０．５９ｇの卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（Ｓｉｇｍａ）を、８．３８ｍｌのエタノール（無水物、Ｓｉｇｍａ  Ｅ３８８４）と合わせ、そして溶解するまで混合する。これに、６７．５ｍｇのＢＨＴを加え、そして溶解するまで混合する。この混合物に、２１６０ｍｇのＰＧＥ−１を加え、溶解するまで混合する。計量容器中に残っているあらゆるＰＧＥ−１を、前記の混合物中にすすぐために、残っている４．１９ｍｌのエタノールを使用する。
【００２２】
４．前記のエタノール溶液を１０ｍｌのガラスのシリンジに入れ、そして前記のマルトース溶液に、１１分以上かけて、窒素散布を続けたまま加える。ｐＨを７．０未満に保つ（ｐＨ４．８１で微小流動化装置に投入する）。測定：混合物は手でふる。実験は全て１〜５℃で行う。
５．微小流動化装置：微小流動化装置１１０Ｆ：９，０００ユニットを４回通過させる。
【００２３】
2004500311.tif 000001
圧力１６，０００  ＰＳＩ
警告−酸性を保ち、温度を保つこと（融点１１５℃）
注意−マルトースの融点は１０２〜１０３℃である。
【００２４】
＊ 乗数＋１０．１５８
６．最終生成物のうち２．７ｍｌを取り、約１，０００の６ｍｌのＷｈｅａｔｏｎ  ｅｙｅの滴瓶で凍結乾燥する。
凍結乾燥は、以下のサイクルに従い達成した：
１．実施前に少なくとも１時間、−４５℃以下で放置する。
【００２５】
２．生成物を載せ、そして１２時間−４５℃以下で保つ。
３．５０Ｍまで吸引する。
４．５９℃時間、−２８℃〜−２０℃に保った温度で放置する。
５．続いて２１０時間、−２０℃〜−５℃まで上昇させた温度で放置する。視覚的に、生成物は−２０℃での追加の時間を必要とした。
【００２６】
６．−２２℃に戻して放置し、そして−２２℃〜−１８℃で３６時間保った。
７．＋２５℃に戻して放置し、そして２５℃で４８時間保った。
以下の凍結乾燥サイクルが、より短い時間で同様の結果を与えるであろうことが予想される。
１．実施前に、少なくとも１時間−４５℃以下で放置する。
【００２７】
２．生成物を載せ、−４５℃以下で少なくとも６時間保つ。
３．１００Ｍ以下まで吸引する。
４．−２８℃で５０時間放置する。
５．＋２５で４０〜５０時間放置する。
例２
ウサギでの、ＫＹ  Ｊｅｌｌｙ中のＰＧＥ−１の腔適用
処置用ローションを以下の様に調製した。上述したものと同様の方法で作製されるリポソームのＰＧＥ−１を製造した。異なる濃度のＰＧＥ−１を有する６組の処置用ローションは、１．５，１．０，０．５，０．２５、及び０．１２５ｍｇに等しいＰＧＥ−１の最終量を達成するために、１ｇのＫＹ  Ｊｅｌｌｙ（Ｏｒｔｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なメチルセルロース）と、リポソームのＰＧＥ−１との組合わせ、及びコントロールとしてリポソームＰＧＥ−１無しとの組合わせを作ることによって調製した。処置用ローションは、使用するまで冷蔵した。
【００２８】
３０匹の１０週齢の雌性のウサギをカゴで飼い、そして餌、水を与え、そして毎日観察した。処置用ローションを１４日間にわたって、毎日前記のウサギに与え、そして前記のウサギを毎日観察した。前記ウサギを、最後の投与の１時間後にと殺した。
各ウサギは、１００ｍｇのキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ）及び１００ｍｇのケタミンを筋肉内に、３ｃｃのシリンジ及び２２ゲージの針を用いて与えられた。一旦、ウサギを麻酔し、胸部及び鼠径部をクリップで止め、そして前記動物を手術室に運んだ。血液を心臓穿刺によって採取し、そして７ｃｃのヘパリンチューブに移した。次に、胸部を開き、そして心臓を素速く、そして痛みの無い死を保証するべく摘出した。３つの切片を膣の領域から採取し、そして２ｃｃのホルマリン中に据えた。手術の完了後、前記血液を１０分間遠心し、そして血漿を凍結した。前記の膣の切片を少なくとも２４時間固定し、そして次に染色し、そしてスライドに固定した。
【００２９】
ＰＧＥ−１を含む組成物で処置したウサギにおいて、増大した血管の充血、血管拡張及び充血が、コントロールで処置したウサギと比較して観察された。更に、全身性の作用は、分解生成物の欠如が示す様に、観察されなかった。
例３
局所的なリポソームＰＧＥ−１の再構築研究
凍結乾燥したリポソームのＰＧＥ−１の１．０ｍｇアリコートを、１．０，２．０，４．０及び８．０ｇのＫＹ  Ｊｅｌｌｙのアリコートと混合し、ＫＹ  Ｊｅｌｌｙの存在下でのＰＧＥ−１の安定性を決定した。各調製物を、ボルテックスによって完全に混合した。生じた混合物は、それぞれ１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ及び０．１２５ｍｇ／ｍｌのＰＧＥ−１を含んだ。各調製物の０．５ｇアリコートをエッペンドルフの遠心チューブに、０．５ｍｌのアセトニトリルのアリコートと一緒に移した。各調製物をボルテックスによって完全に抽出した。抽出後、各調製物を遠心し、そして液体の上清を、解析のための自動試料解析機の容器に移した。
【００３０】
更に、１．０ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌの調製物を、組成物のための２ｍｌ及び４ｍｌのアセトニトリルのアリコートを用いて抽出した。異なる調製手順を、活性成分ＰＧＥ−１の正確な同定及び定量のための、最も均質な混合物を生成するであろう最良の抽出方法を決定するために利用した。
全ての試験用調製物を抽出し、そしてＨＰＬＣによって、１５，３０，６０及び１２０分の間隔で、そして１，２及び５日目に解析した。結果を、ＰＧＥ−１の正確な同定及び定量、並びに時間外の濃度の減少における傾向のために評価した。
【００３１】
以下の表１〜４は、各調製物のために得た個々のアッセイの結果を示し、そして図１〜４は、研究の継続時間に及ぶＰＧＥ−１濃度の図的な分布を提供する。前記の結果は、１．０ｍｇ／ｍｌの凍結乾燥したリポソームのＰＧＥ−１局所用生成物が、Ｋ．Ｙ．Ｊｅｌｌｙ中で少なくとも２日間安定であり、そして代謝生成物に分解しないことを示している。
【００３２】
【表１】
2004500311.tif 000002
【００３３】
【表２】
2004500311.tif 000003
【００３４】
【表３】
2004500311.tif 000004
【００３５】
【表４】
2004500311.tif 000005
例４
ＰＧＥ−１を、多重膜リポソーム中に、上文の例１に記載した方法と同様に包んだ。３つの異なる調製物を作製した：コントロール（リポソームのＰＧＥ−１を全く持たない、１ｇのＫＹ  Ｊｅｌｌｙ）、低投与量調製物（１ｇのＫＹ  Ｊｅｌｌｙと均一に混合した０．２５ｍｇのリポソームのＰＧＥ−１）、及び高投与量調製物（１ｇのＫＹ  Ｊｅｌｌｙと均一に混合した２．０ｍｇのリポソームのＰＧＥ−１）。
【００３６】
雌性のニュージーランドウサギを、動物モデルとして使用した。ＭＲＩ研究は、前記のウサギが５週齢のときに、基準線研究として前記コントロール調製物（Ｃ）を膣に適用して開始した。その時、前記ウサギの平均体重は、１５１０±４８６ｇであった。第２の研究は、一週間後の前記ウサギが６週齢のときに、低投与量調製物（ＬＤ）を用いて行った。第２の研究の間の、ウサギの平均体重は、１７４６±４４４ｇであった。第３の研究は２週間後に、前記の基準線研究の後、前記動物が７週齢のときに、高投与量調製物（ＨＤ）を適用して行った。最後の研究の間の動物の平均体重は２０１１±２９７ｇであった。各研究において、全体の膣領域を覆うのに十分なクリームの量、約１ｇ（約２〜３ｍｌ）を使用した。１０匹のウサギを縦方向に３週間、上述した様なコントロール、低い及び高い投与量のものを用いて研究した。
【００３７】
動的ＭＲＩ実験を、全てのウサギで、それらが５，６及び７週齢のときに行った。全ての実験は、ＧＥ  １．５Ｔ  Ｓｉｇｍａ  Ｓｃａｎｎｅｒ上で、ＧＥ  ｌｉｎｅａｒ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  ｈｅａｄ  ｃｏｉｌを用いて行った。前記のウサギを、２５ｍｇ／ｋｇ投与量のケタミンを用いて麻酔した後、２５ゲージのバタフライニードルを対照薬剤の注射のために耳の静脈に据え、そして次に、ウサギをうつぶせで前記のｃｏｉｌに据えた。高速スピンエコー（ＦＳＥ）パルスシークエンス（ＴＲ＝３ｓ、ＴＥ＝１１２ｍｓ、８エコートレイン）を、ローカライザーとしてのＴ２−重みづけイメージ及び解部のイメージを得るために適用した。スピンエコー（ＳＥ）パルスシークエンスを、動的Ｔ１−重みづけイメージを得るために、ショートボーラスとしてのＧｄ−ＤＴＰＡ（ガドリニウム  ジエチレントリアミン五酢酸）（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ，Ｍａｇｎｅｖｉｓ， Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂ． Ｉｎｃ．）の注射前及び後に適用した。前記の動的研究は、リポソームのＰＧＥ−１調製物を適用した１５分後に開始した。
【００３８】
リポソームのＰＧＥ−１の使用に応じての、血流の交代を、動的対照性増強ＭＲＩ及びコンパートメントモデリングを用いて、一般にＳｕ及びＮａｌｃｉｏｇｌｕによって記述された様に監視した（Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｍｅｄ． ３２ （６） ： ７１４−２４， １９９４ ； Ｍａｇｎ． Ｒｅｓ． Ｍｅｄ． ３４ ： ４０２−１１， １９９５ ； Ｍａｇｎ． Ｒｅｓ． Ｍｅｄ． ３９ ： ２５９−６９， １９９８ ； Ｍａｇｎ． Ｒｅｓ． Ｍｅｄ． ３６ ： ８６８−７７， １９９６。 これらの開示は、引用によって本明細書に組入れられる。）。この技術は、血管の容積及び組織の透過性に関する空間的に分離した情報を生じる。生理学的なパラメーターは、各ピクセルのためのシグナル強度時間進行曲線を作成し、そして各点から予備対照基準線の値を引くことによって得られ、各ピクセルのためのシグナル増強曲線をもたらす。次にコンパートメントモデルを、シグナルの増強対時間の進行に適した非直線の最小二乗法を用いることによって、血管の容積及び組織の透過性を導くために使用した。方法の詳細は、Ｓｕ及びＮａｌｃｉｏｇｌｕによる上文の参考文献に記載されている。
【００３９】
本研究において、対照薬剤の注射の３分後のシグナル増強は、考慮中の組織からの血流の測定として使用した。対照標準としての膣（ＶＧ）及び脚の筋肉（ＭＳ）を覆う２つの注目の領域（ＲＯＩ）を、解析に使用した。あらゆる全身性の応答を排除するために、我々は膣におけるシグナル増強を脚の筋肉のもので割った。これは、筋肉と比較した膣の、相対的な増強、又は血流を我々に与えた。この値は、各ウサギで、そして全３回の投与で計算した。次に、相対的な血流の増強、ＶＧ／ＭＳは、各投与量で１０匹のウサギにわたって平均化された。
【００４０】
ＭＲイメージは解析されて、そしてそれらは前記の血流量が低投与量調製物でより高かったこと、次に全くＰＧＥ−１を含まないコントロールであったことを示した。前記の結果を図５に示す。低投与量調製物による膣の血流は、コントロールよりも、ｐ＜０．０１の統計的有意性で高く、そして高投与量調製物による膣の血流は、ｐ＜０．００５の統計的有意性でコントロールよりも高かった。膣へのリポソームＰＧＥ−１の適用は、０．２５ｍｇのリポソームＰＧＥ−１を含む調製物で４５．９％の増大を、そして２．０ｍｇのリポソームＰＧＥ−１を含む調製物で５９．５％の増大をもたらした。低投与量調製物と高投与量調製物との間の血流の差異は、統計的に有意ではなかった。更に、脚における血流は、ＰＧＥ−１を含む調製物を膣に適用したときに、有意に変化しなかった。表５は、脚の筋肉における、各時間点での１０匹の全ての群の平均血流を示す。表６は、同一の条件下での脚の筋肉に関する、膣における平均血流を示す。最初の列は、筋肉の血流に関する、ＫＹ  Ｊｅｌｌｙ単独による基準線での相対的な平均の膣の血流を、低投与量での１週目、及び最終的に高投与量での２週目で与える。第２の列は、各測定における標準誤差を与える。
【００４１】
【表５】
2004500311.tif 000006
【００４２】
【表６】
2004500311.tif 000007
上文の記述は、本発明の現在好ましい態様に関して提示した。当業者及びこの発明に関係する技術をもつ者は、記載の構成における変更及び変化が、この発明の原理、精神及び範囲に反することなく実施することができることを理解するだろう。従って、前記の記述は記載した正確な方法のみに関するとして読むべきではないが、むしろ、請求の範囲に一致し、そして支持するものであるとして読むべきであり、ここで請求の範囲は、それらの最大及び正当な範囲である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、安定性の研究の継続時間にわたる、ＰＧＥ−１濃度のグラフによる分布を示す表である。
【図２】
図２は、安定性の研究の継続時間にわたる、ＰＧＥ−１濃度のグラフによる分布を示す表である。
【図３】
図３は、安定性の研究の継続時間にわたる、ＰＧＥ−１濃度のグラフによる分布を示す表である。
【図４】
図４は、安定性の研究の継続時間にわたる、ＰＧＥ−１濃度のグラフによる分布を示す表である。
【図５】
図５は、膣へのＰＧＥ−１組成物の投与による、脚の筋肉と比較したときの膣の筋肉における相対的血流を示す表である。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004500311.tif 000008
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2004500311.tif 000009
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2004500311.tif 000010
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2004500311.tif 000011