(57)【要約】本発明によれば、新規な基質特異性および基質選択性を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素、並びに、新規な作用および基質特異性を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素が提供される。本発明のシアル酸転移酵素は、癌転移抑制、ウイルス感染防止、炎症反応抑制、神経組織賦活作用を目的とする医薬として用いることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の基質特異性および基質選択性を有することを特徴とする、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素。
基質特異性：末端にＳｉａ  α２，３（６）Ｇａｌ（ここで、Ｓｉａはシアル酸を示し、Ｇａｌはガラクトースを示す）構造をもつ糖を基質とする；
基質選択性：糖脂質およびＮ型糖鎖よりも優先的にＯ型糖鎖に対してシアル酸を取り込ませる：
【請求項２】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素。
（１）配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
【請求項３】
請求項２に記載のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードするＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子。
【請求項４】
下記の何れかの塩基配列を有する請求項３に記載のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号７７番目から１２７０番目で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号７７番目から１２７０番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
（３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号９２番目から１２８５番目で特定される塩基配列；
（４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号９２番目から１２８５番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
【請求項５】
請求項３または４に記載のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項６】
発現ベクターである、請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項７】
請求項５または６に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養し培養物から請求項１または２に記載の酵素を採取することを特徴とする、請求項１または２に記載の酵素の製造方法。
【請求項９】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素活性ドメインから成る蛋白質。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３９８から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３９８から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号６８〜３９８から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号６８〜３９８から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
【請求項１０】
請求項１または２に記載のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項１３】
発現ベクターである、請求項１２に記載の組み換えベクター。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換体を培養し培養物から請求項９または１０に記載の蛋白質を採取することを特徴とする、請求項９または１０に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
以下の作用および基質特異性を有することを特徴とする、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素。
（１）作用；
末端にガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖のガラクトース部分にα２，６の結合様式でシアル酸を転移する。
（２）基質特異性；
末端にガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖を基質とし、ラクトース、及び末端にガラクトースβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖を基質としない。
【請求項１７】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
【請求項１８】
請求項１７に記載のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードするβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子。
【請求項１９】
下記の何れかの塩基配列を有する請求項１８に記載のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列中の塩基番号１７６番目から１７６２番目で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号６に記載の塩基配列中の塩基番号１７６番目から１７６２番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
（３）配列表の配列番号８に記載の塩基配列中の塩基番号３番目から１５７４番目で特定される塩基配列；又は
（４）配列表の配列番号８に記載の塩基配列中の塩基番号３番目から１５７４番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項２１】
発現ベクターである、請求項２０に記載の組み換えベクター。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の形質転換体を培養し培養物から請求項１６または１７に記載の酵素を採取することを特徴とする、請求項１６たは１７に記載の酵素の製造方法。
【請求項２４】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性ドメインから成る蛋白質。
（１）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３〜５２９から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３〜５２９から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
（３）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１〜５２４から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１〜５２４から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
【請求項２５】
請求項１６または１７に記載のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質。
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項２８】
発現ベクターである、請求項２７に記載の組み換えベクター。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項３０】
請求項２９に記載の形質転換体を培養し培養物から請求項２４または２５に記載の蛋白質を採取することを特徴とする、請求項２４または２５に記載の蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は糖鎖合成酵素および該酵素をコードするＤＮＡに関するものである。さらに詳しくは、本発明はムチンなどのＯ型糖鎖のうち、末端にＳｉａα２，３（６）Ｇａｌ（Ｓｉａ：シアル酸、Ｇａｌ：ガラクトース）構造をもつ糖鎖のシアル酸部分にα２，８の結合様式でシアル酸を効率良く転移する酵素（Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素、ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ）および該酵素をコードするＤＮＡ；並びに、オリゴ糖などの糖鎖のうち、末端にＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ：ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン）構造をもつ糖鎖のガラクトース部分にα２，６の結合様式でシアル酸を効率良く転移する酵素（ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ）および該酵素をコードするＤＮＡに関するものである。本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素およびβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素は、癌転移抑制、ウイルス感染抑防止、炎症反応抑制、神経細胞賦活効果を有する薬剤として、あるいは糖鎖にシアル酸を付加することにより生理作用を増加させるための試薬、その他、酵素阻害剤等として有用である。
背景技術
シアル酸は、たとえば細胞−細胞間伝達、細胞基質相互作用、細胞接着などの重要な生理作用を司る物質である。発生、分化の過程に特異的な、あるいは臓器特異的なシアル酸含有糖鎖の存在が知られている。シアル酸は糖タンパク質および糖脂質の糖鎖部分の末端位置に存在しており、これらの部位へのシアル酸の導入は、酵素的にＣＭＰ−Ｓｉａからの転移によってなされる。
このシアル酸の酵素的導入（シアル酸転移）を担う酵素は、シアル酸転移酵素（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と呼ばれるグリコシルトランスフェラーゼ類である。ほ乳類では現在までに１８種類のシアル酸転移酵素の存在が知られているが、これらはシアル酸の転移様式から４つのファミリーに大別される（Ｔｓｕｊｉ，Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，１−１３）。すなわち、α２，３の結合様式でガラクトースにシアル酸を転移するα２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ−ファミリー）、α２，６の結合様式でガラクトースにシアル酸を転移するα２，６−シアル酸転移酵素（ＳＴ６Ｇａｌ−ファミリー）、α２，６の結合様式でＮ−アセチルガラクトサミンにシアル酸を転移するＧａｌＮＡｃ  α２，６−シアル酸転移酵素（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ファミリー）、およびα２，８の結合様式でシアル酸にシアル酸を転移するα２，８−シアル酸転移酵素（ＳＴ８Ｓｉａ−ファミリー）である。
このうちα２，８−シアル酸転移酵素については現在までに５種類の酵素（ＳＴ８Ｓｉａ  Ｉ−Ｖ）についてｃＤＮＡクローニングが行われており、その酵素学的諸性質も明らかになっている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６，２６−３４；Ｋｏｊｉｍａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ，（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０，１−４；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４６２８−１４６３３；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１８，６５８−６６４；Ｋｏｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９３６６−２９３７１）。ＳＴ８Ｓｉａ  ＩはガングリオシドのＧＤ３合成酵素であり、ＳＴ８Ｓｉａ  Ｖは同じくガングリオシドのＧＤ１ｃ，ＧＴ１ａ，ＧＱ１ｂ，ＧＴ３などを合成する酵素である。ＳＴ８Ｓｉａ  ＩＩ，ＩＶは神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のＮ型糖鎖上にポリシアル酸を合成する酵素である。ＳＴ８ＳｉａＩＩＩは糖タンパク質のＮ型糖鎖および糖脂質に見いだされるＳｉａα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造にシアル酸を転移する酵素である。これらの酵素はいずれも糖脂質あるいはＮ型糖鎖を好ましい基質としており、Ｏ型糖鎖に対する活性は、ＮＣＡＭの一つのアイソフォームに見いだされるＯ型糖鎖上にＳＴ８Ｓｉａ  ＩＩ，ＩＶがオリゴシアル酸／ポリシアル酸を合成する例と、脂肪細胞特異的糖タンパク質ＡｄｉｐｏＱのＯ型糖鎖にＳＴ８ＳｉａＩＩＩが作用する例が報告されているだけである（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０，１１１３；及びＳａｔｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２８８４９−２８８５６）。すなわち今までに報告されてきているα２，８−シアル酸転移酵素は、通常Ｏ型糖鎖を好ましい基質としてはおらず、これを好ましい基質とするα２，８−シアル酸転移酵素の存在は知られていなかった。
また、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素については現在までに１種類の酵素（ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ）についてのみｃＤＮＡクローニングが行われており、その酵素学的諸性質も明らかになっている（Ｈａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ａｎｄ  Ｔｓｕｊｉ，Ｓ．（２００１）ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．）ｐｐ２９５−３００）。ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉは糖タンパク質、オリゴ糖またはガングリオシドなどの末端糖鎖部分にＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造をもつものに対して活性を示すが、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造のほかにラクトース（Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）や場合によってはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ構造でも基質にすることができる基質特異性の広い酵素である。基質特異性が広いということは、例えばＳＴ６Ｇａｌ  Ｉを利用した機能性オリゴ糖などの合成の際に、原材料に不純物が混入していると、それらも基質となって副産物が生じてしまう可能性が考えられる。従ってこの問題を解決するためには、基質特異性に関してより選択性の高い酵素が要求される。しかし現在までにβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性をもち、基質特異性に関してより選択性の高い補乳動物由来の酵素は知られていなかった。
発明の開示
上記した通り、今までに知られているα２，８−シアル酸転移酵素は５種類存在するが、これらはいずれもＮ型糖鎖をもつ糖タンパク質またはガングリオシドなどの糖脂質を主な基質とし、Ｏ型糖鎖をもつ糖タンパク質に対しては活性を全く示さないか、限定的な活性を示すだけであった。本発明の第一の目的は、Ｏ型糖鎖に対し高い活性を示す新規なＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素を提供することである。また、本発明は、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素をコードするｃＤＮＡをクローニングし、該Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素をコードするＤＮＡ配列および該酵素のアミノ酸配列を提供することを目的とする。さらに本発明は、上記のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の構造のうち、活性に係わる部分を大量に蛋白として発現させることを目的とする。
さらにまた上記した通り、哺乳動物で今までに知られているβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素は１種類（ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ）だけである。これは糖タンパク質、オリゴ糖またはガングリオシドなどの末端糖鎖部分にＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造をもつものに対して活性を示すが、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造のほかにラクトース（Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）や場合によってはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ構造でも基質にすることができる基質特異性の広い酵素である。本発明の第二の目的は、この基質特異性が広いという問題点を解決し、オリゴ糖上のＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造に対してより選択性の高い基質特異性を示す新規β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素および該酵素をコードするＤＮＡを提供することである。
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意努力し、マウス脳及び心臓の各ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、またマウス腎臓由来ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素をコードするｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。さらに、本発明者は、ヒトシアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉのアミノ酸配列を用いて、これと相同性を示す新規シアル酸転移酵素をコードしているクローンをｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ（ｄｂＥＳＴ）のデータベースで検索し、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＢＥ６１３２５０，ＢＥ６１２７９７，ＢＦ０３８０５２の各ＥＳＴクローンを取得した。またそれらの塩基配列情報を利用して、ｄｂＥＳＴとヒトゲノムのＨｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅのデータベースを検索し、関連ＥＳＴクローンとゲノム遺伝子の塩基配列情報を取得した。以上の塩基配列情報をもとにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）用のプライマーを作製し、ヒト大腸由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅断片と入手ＥＳＴクローン由来のＤＮＡ断片を連結することによって翻訳領域全長を含むクローンを取得した。そして、該クローンによりコードされるタンパク質がβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性を有していることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の基質特異性および基質選択性を有することを特徴とする、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素が提供される。
基質特異性：末端にＳｉａα２，３（６）Ｇａｌ（ここで、Ｓｉａはシアル酸を示し、Ｇａｌはガラクトースを示す）構造をもつ糖を基質とする；
基質選択性：糖脂質およびＮ型糖鎖よりも優先的にＯ型糖鎖に対してシアル酸を取り込ませる：
好ましくは、本発明により、下記の何れかのアミノ酸配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードするＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子が提供される。
好ましくは、本発明により、下記の何れかの塩基配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号７７番目から１２７０番目で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号７７番目から１２７０番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
（３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号９２番目から１２８５番目で特定される塩基配列；
（４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号９２番目から１２８５番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子を含む組み換えベクター（好ましくは、発現ベクター）；上記した組み換えベクターにより形質転換された形質転換体；並びに上記した形質転換体を培養し培養物から本発明の酵素を採取することを特徴とする本発明の酵素の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素活性ドメインから成る蛋白質が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３９８から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３９８から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号６８〜３９８から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号６８〜３９８から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の細胞外分泌型の蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の細胞外分泌型の蛋白質をコードする遺伝子を含む組み換えベクター（好ましくは、発現ベクター）；上記した組み換えベクターにより形質転換された形質転換体；並びに上記した形質転換体を培養し培養物から本発明の酵素を採取することを特徴とする本発明の蛋白質の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の作用および基質特異性を有することを特徴とする、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素が提供される。
（１）作用；
末端にガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖のガラクトース部分にα２，６の結合様式でシアル酸を転移する。
（２）基質特異性；
末端にガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖を基質とし、ラクトース、及び末端にガラクトースβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖を基質としない。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードするβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、下記の何れかの塩基配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列中の塩基番号１７６番目から１７６２番目で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号６に記載の塩基配列中の塩基番号１７６番目から１７６２番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
（３）配列表の配列番号８に記載の塩基配列中の塩基番号３番目から１５７４番目で特定される塩基配列；又は
（４）配列表の配列番号８に記載の塩基配列中の塩基番号３番目から１５７４番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明の組み換えベクターは、好ましくは、発現ベクターである。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の形質転換体を培養し培養物から本発明の酵素を採取することを特徴とする、本発明の酵素の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性ドメインから成る蛋白質が提供される。
（１）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３〜５２９から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３〜５２９から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
（３）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１〜５２４から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１〜５２４から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明の組み換えベクターは、好ましくは、発現ベクターである。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の形質転換体を培養し培養物から本発明の蛋白質を採取することを特徴とする、本発明の蛋白質の製造方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明の酵素及び蛋白質
本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素は、以下の基質特異性および基質選択性を有することを特徴とする。
基質特異性：末端にＳｉａα２，３（６）Ｇａｌ（ここで、Ｓｉａはシアル酸を示し、Ｇａｌはガラクトースを示す）構造をもつ糖を基質とする；
基質選択性：糖脂質およびＮ型糖鎖よりも優先的にＯ型糖鎖に対してシアル酸を取り込ませる：
上記した基質特異性及び基質選択性は、本明細書に記載した実施例で取得されたマウスおよびヒト由来のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素について実証された性質である。本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の由来はマウスおよびヒト由来のものに限定されるものではなく、同型のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素が他の哺乳類の組織に存在し、かつ、それらのＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素が互いに高度の相同性を有していることは当業者に容易に理解される。
このようなＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素は、上記した基質特異性及び基質選択性を有することを特徴とするものであり、すべて本発明の範囲に属するものである。
このような酵素としては、哺乳類組織由来の天然型酵素やその変異体、または以下の実施例で作製したようなＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒し、遺伝子組み換え技術により製造された細胞外分泌型蛋白質などを挙げることができるが、これらはいずれも本発明の範囲に包含されるものである。
本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の一例としては、下記の何れかのアミノ酸配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素が挙げられる。
（１）配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
さらに、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の活性ドメイン、あるいはそのアミノ酸配列の一部を改変又は修飾して得られるＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質は全て本発明の範囲に包含されることを理解すべきである。このような活性ドメインの好ましい例としては、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列の２６〜３９８または配列番号３に記載したアミノ酸配列の６８〜３９８により特定されるＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の活性ドメインを挙げることができる。また、配列表の配列番号１または配列番号３に記載したアミノ酸配列の２６〜１００前後までの配列はステムと呼ばれる領域なので活性には必ずしも必須ではないと考えられる。従って、配列表の配列番号１または配列番号３に記載したアミノ酸配列の１０１〜３９８の領域をＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素の活性ドメインとして使用してもよい。
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素活性ドメインから成る蛋白質が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３９８から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３９８から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号６８〜３９８から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号６８〜３９８から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
一方、本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素は、以下の作用および基質特異性を有することを特徴とする。
（１）作用；
末端にガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖のガラクトース部分にα２，６の結合様式でシアル酸を転移する。
（２）基質特異性；
末端にガラクトースβ１，４Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖を基質とし、ラクトース、及び末端にガラクトースβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン構造をもつ糖鎖を基質としない。
上記した作用及び基質特異性性は、本明細書に記載した実施例で取得されたヒトおよびマウス由来のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素について実証された性質である。本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の由来はヒトまたはマウス由来のものに限定されるものではなく、同型のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素が他の哺乳類の組織に存在し、かつ、それらのβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素が互いに高度の相同性を有していることは当業者に容易に理解される。
このようなβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素は、上記した作用および基質特異性を有することを特徴とするものであり、すべて本発明の範囲に属するものである。
このような酵素としては、哺乳類組織由来の天然型酵素やその変異体、またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒し、遺伝子組み換え技術により製造された細胞外分泌型蛋白質などを挙げることができるが、これらはいずれも本発明の範囲に包含されるものである。
本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の一例としては、下記の何れかのアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素が挙げられる。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
さらに、本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメイン、あるいはそのアミノ酸配列の一部を改変又は修飾して得られるβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質は全て本発明の範囲に包含されることを理解すべきである。このような活性ドメインの好ましい例としては、配列表の配列番号５に記載したアミノ酸配列の３３〜５２９により特定されるβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインを挙げることができる。また、配列表の配列番号５に記載したアミノ酸配列の３１〜２００前後までの配列はステムと呼ばれる領域なので活性には必ずしも必須ではないと考えられる。従って、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列の２０１〜５２９の領域をβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインとして使用してもよい。
同様に、活性ドメインの好ましい例としては、配列表の配列番号７に記載したアミノ酸配列の３１〜５２４により特定されるβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインを挙げることができる。また、配列表の配列番号７に記載したアミノ酸配列の３１〜２００前後までの配列はステムと呼ばれる領域なので活性には必ずしも必須ではないと考えられる。従って、配列表の配列番号７に記載したアミノ酸配列の２０１〜５２４の領域をβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインとして使用してもよい。
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性ドメインから成る蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性ドメインから成る蛋白質が提供される。
（１）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３〜５２９から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３３〜５２９から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
（３）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１〜５２４から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１〜５２４から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有するアミノ酸配列：
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本発明の酵素又は蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１から８に記載したアミノ酸配列および塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて適当なｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
例えば、配列番号１および配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素をコードするｃＤＮＡ、並びに配列番号５および配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素をコードするｃＤＮＡを単離する方法は以下の実施例に詳細に説明されている。もっとも、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素をコードするｃＤＮＡの単離方法はこれらの方法に限定されることはなく、当業者は下記の実施例に記載された方法を参照しつつ、この方法を適宜修飾ないし変更することにより、容易に目的のｃＤＮＡを単離することができる。
また、本発明の酵素をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の酵素をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の酵素を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
さらに、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質も本発明に含まれる。
本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素およびβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素は、発現後に細胞内に留まり、細胞外に分泌されない場合がある。また、細胞内濃度が一定以上になると、酵素の発現量が低下するという可能性がある。上記のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移活性およびβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移活性を有効に利用するために、本酵素の活性を維持し、かつ発現時に細胞から分泌される可溶性形態の蛋白を製造することができる。このような蛋白としては、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性に関与するＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する蛋白質を挙げることができる。例えば、マウス免疫グロブリンＩｇＭのシグナルペプチドや、プロテインＡとの融合蛋白は本発明の分泌型蛋白の好ましい態様である。
これまでにクローニングされたシアル酸転移酵素は、他のグリコシルトランスフェラーゼと同様のドメイン構造を有している。すなわち、ＮＨ２末端の短い細胞質中尾部、疎水性のシグナルアンカードメイン、蛋白分解感受性を有するステム（ｓｔｅｍ）領域、及びＣＯＯＨ−末端の大きな活性ドメインを有する（Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｙ，Ｋ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１５−１７６１８，１９８９）。本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の経膜ドメインの位置を調べるためには、カイト及びドゥーリトル（Ｋｙｔｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，１０５−１３２，１９８２）の方法に従って作成した疎水性分布図を利用することができる。また、活性ドメイン部分の推定には、各種のフラグメントを導入した組換えプラスミドを作成して利用することができる。このような方法の一例は、例えばＰＣＴ／ＪＰ９４／０２１８２号の明細書に詳細に記載されているが、経膜ドメインの位置の確認や活性ドメイン部分の推定方法は、この方法に限定されることはない。
Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白の製造のためには、例えばシグナルペプチドとして免疫グロブリンシグナルペプチド配列を用い、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインに対応する配列を該シグナルペプチドにインフレーム融合させればよい。このような方法としては、例えば、ジョブリンの方法（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｇｅｈｒｋｅ，Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３２５，６２２−６２５，１９８７）を利用することができる。また、本明細書の実施例に詳細に説明されているように、マウス免疫グロブリンＩｇＭのシグナルペプチドやプロテインＡとの融合蛋白を製造してもよい。もっとも、シグナルペプチドの種類やシグナルペプチドと活性ドメインの結合方法、または可溶化の方法は上記方法に限定されることはなく、当業者は、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分を適宜選択することができるし、それらを利用可能な任意のシグナルペプチドと適宜の方法により結合することにより細胞外分泌型の蛋白を製造することができる。
（２）本発明の遺伝子
本発明によれば、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子、並びにβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子が提供される。
本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号７７番目から１２７０番目で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号７７番目から１２７０番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
（３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号９２番目から１２８５番目で特定される塩基配列；
（４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列中の塩基番号９２番目から１２８５番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号６に記載の塩基配列中の塩基番号１７６番目から１７６２番目で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号６に記載の塩基配列中の塩基番号１７６番目から１７６２番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
（３）配列表の配列番号８に記載の塩基配列中の塩基番号３番目から１５７４番目で特定される塩基配列；又は
（４）配列表の配列番号８に記載の塩基配列中の塩基番号３番目から１５７４番目で特定される塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
さらに、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素の活性ドメインから成る蛋白質、並びに該活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移またはβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移を触媒する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子も本発明の範囲に属する。
本発明の遺伝子の取得方法は上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２４ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体及びそれを用いた蛋白質の製造
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の酵素を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
実施例１：Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素
本発明の具体例に用いた試薬、試料類は以下の通りである。Ｆｅｔｕｉｎ，ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ，ｂｏｖｉｎｅ  ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎ（ＢＳＭ），α１−ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｖｏｍｕｃｏｉｄ，ｌａｃｔｏｓｙｌ  ｃｅｒａｍｉｄｅ（ＬａｃＣｅｒ），ＧＭ３，ＧＭ１ａ，ＧＤ１ａ，ＧＤ１ｂ，ＧＴ１ｂ，ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，６’−ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ，３’−ｓｉａｌｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４はＳｉｇｍａ社から購入した。３’−ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ，６’−ｓｉａｌｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入した。Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ），ＧＭ４，Ｇａｌ，Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は和光純薬から購入した。ＧＤ３は雪印乳業から購入した。ＧＱ１ｂはＡｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。ＣＭＰ−［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃ（１２．０ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。シアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  ＩＩ，ＩＩＩ）はＧｌｙｋｏ  Ｉｎｃ社から購入した。Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ（Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｆ）は宝酒造から購入した。［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰはＮＥＮ社から購入した。ヒトＭｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。ＧＭ１ｂ，およびそのｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｏｇであるＧＳＣ−６８，２，３−ｓｉａｌｙｌｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ（２，３−ＳＰＧ），２，６−ｓｉａｌｙｌｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ（２，６−ＳＰＧ）は木曽真教授（岐阜大学農学部）から、ＮｅｕＡｃ  α２，３Ｇａｌ，ＮｅｕＡｃ  α２，６Ｇａｌは石田秀樹博士（野口研究所）から寄贈されたものを使用した。抗ＧＤ３モノクローナル抗体ＫＭ６４１は協和発酵、設楽研也、花井陳雄両博士から寄贈されたものを使用した。また抗ＮｅｕＡｃ  α２，８ＮｅｕＡｃ  α２，３Ｇａｌ抗体Ｓ２−５６６は生化学工業より購入した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。ＢＳＭ，α１−ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｖｏｍｕｃｏｉｄの脱シアル化（アシアロ）糖タンパク質は、これらを０．０２Ｎ  ＨＣｌ中８０度、１時間で処理することにより調製した。
マウスシアル酸転移酵素ＳＴ８Ｓｉａ  Ｖのアミノ酸配列を用いて、これと相同性を示す新規シアル酸転移酵素をコードしているクローンをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ（ｄｂＥＳＴ）のデータベースで検索したところ、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＢＥ６３３１４９，ＢＥ６８６１８４，ＢＦ７３０５６４の各クローンが得られた。これらの塩基配列情報をもとに２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧ−３’（図１Ａの塩基番号１００１−１０２０に相当）（配列番号９），５’−ＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＴＴＣＣ−３’（図１Ａの塩基番号１２３２−１２５１の相補鎖に相当）（配列番号１０）を作製し、Ｉｓｒａｅｌの方法に従い（Ｉｓｒａｅｌ，Ｄ．Ｉ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，２６２７−２６３１）、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用してマウス脳および心臓の各ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、新規シアル酸転移酵素の一部をコードしているクローンがそれぞれのｃＤＮＡライブラリーから１個ずつ得られた。全長クローンを得るため、さらに２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＧＧ−３’（図１Ａの塩基番号６８−８７に相当）（配列番号１１），５’−ＴＡＣＴＡＧＣＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧ−３’（図１Ａの塩基番号７２５−７４６の相補鎖に相当）（配列番号１２）を作製し、マウス腎臓由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により両合成ＤＮＡ間部分のＤＮＡを増幅した。この増幅断片とマウス脳ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンを連結することにより、全長クローンを得た。このｃＤＮＡは３９８アミノ酸からなる予測分子量４５，３９９のＩＩ型膜タンパク質をコードする単一の翻訳領域を有していた。またそのアミノ酸配列にはシアル酸転移酵素に保存されているシアリルモチーフが存在していた。本タンパク質は既知マウスシアル酸転移酵素の中ではＳＴ８Ｓｉａ  Ｉ，Ｖとそれぞれアミノ酸配列レベルで４２．０％，３８．３％の相同性を示した（図２Ａ）。なお以下に示すようにこのタンパク質はα２，８−シアル酸転移酵素活性を有していたことから、これを本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩと命名した。
一方、他の哺乳動物においてもこれと同様の酵素が存在するのかを調べるため、マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの配列情報を利用して、上記と同様にデータベースを検索したところ、ヒトやラットにも同様の酵素が存在することが確認できた。図１ＢにヒトのＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの配列情報を示す。マウスとヒトのＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩではアミノ酸配列レベルで８２．４％の相同性を示した（図２Ｂ）。
つぎにＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの酵素学的諸性質を調べるため、分泌型タンパク質の製造を行った。まずマウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩについて、それぞれＸｈｏＩサイトを含む２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＴＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣ−３’（図１Ａの塩基番号１４１−１７０に相当）（配列番号１３），５’−ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡＣＧＴＴＡＡＧＣＣＧＴＴ−３’（図１Ａの塩基番号１２６３−１２９３の相補鎖に相当）（配列番号１４）を用い、クローニングした全長ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により、マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの活性ドメインをコードするＤＮＡ断片を増幅した。これをＸｈｏＩで切断後、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＳＡのＸｈｏＩサイトに挿入した。この発現ベクターをｐｃＤＳＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩと命名した。
またヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩについては、まずＨｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＣｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＣＸ−１由来ｃＤＮＡを鋳型として、２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＣＡＡＴＴＧＡＣＡＴＡＴＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＣＴＣ−３’（図１Ｂの塩基番号２９３−３１５に相当）（配列番号１５），５’−ＴＡＣＴＡＡＣＡＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（図１Ｂの塩基番号７４０−７６１の相補鎖に相当）（配列番号１６）を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片、および２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＴ−３’（図１Ｂの塩基番号６０８−６２７に相当）（配列番号１７），５’−ＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣ−３’（図１Ｂの塩基番号１４０７−１４２６の相補鎖に相当）（配列番号１８）を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を、両増幅ＤＮＡ断片が共通に有するＥｃｏＲＩサイトを利用して連結し、ヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの活性ドメインをコードするＤＮＡ断片を得た。これをクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した後、ＭｕｎＩとＸｈｏＩで切り出し、この切り出し断片をｐｃＤＳＡのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、発現ベクターｐｃＤＳＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩと命名した。
ｐｃＤＳＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩおよびｐｃＤＳＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩは、それぞれマウス免疫グロブリンＩｇＭのシグナルペプチドとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ，およびマウスまたはヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの活性ドメイン（マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩではアミノ酸番号２６−３９８、ヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩではアミノ酸番号６８−３９８）からなる分泌型融合タンパク質をコードする。
各発現ベクターとリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＯＳ−７細胞でその一過性発現を行った（Ｋｏｊｉｍａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０，１−４）。ここでそれぞれの発現ベクターを導入した細胞から細胞外に分泌された本発明のタンパク質をＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ（マウス）およびＰＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ（ヒト）と命名した。ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ、ＰＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩはＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に吸着させて培地より回収した。シアル酸転移酵素活性はＬｅｅらの方法に準じて以下のように行った（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１１９５８−１１９６７）。５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４，１００μＭ  ＣＭＰ−［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃ，糖鎖（糖脂質の場合は０．５ｍｇ／ｍｌ，糖タンパク質、オリゴ糖は１ｍｇ／ｍｌになるように添加）、およびＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩまたはＰＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ懸濁液を含む反応液（１０μｌ）を３７度で３−２０時間インキュベートし、その後、糖脂質についてはＣ−１８カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  １００ｍｇ；Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて精製したものを試料として、オリゴ糖、糖タンパク質については反応産物をそのまま試料として解析を行った。オリゴ糖、糖脂質はシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社）にスポットし、エタノール：ピリジン：ｎ−ブタノール：水：酢酸＝１００：１０：１０：３０：３の展開溶媒（オリゴ糖用）、または１−プロパノール：アンモニア水：水＝６：１：２．５の展開溶媒（オリゴ糖用）、またはクロロホルム：メタノール：０．０２％  ＣａＣｌ２＝５５：４５：１０の展開溶媒（糖脂質用）で展開した。糖タンパク質の場合はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析を行った。これらの放射活性をＢＡＳ２０００ラジオイメージアナライザー（フジフィルム）で可視化し、定量した。
表１にＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ、ＰＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの基質特異性を示す。
2003064655.tif 000002
2003064655.tif 000003
ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩはＧＭ４，ＧＭ３，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂ，ＧＭ１ｂ，ＧＳＣ−６８，２，３−ＳＰＧ，２，６−ＳＰＧなど、非還元末端にＮｅｕＡｃα２，３（６）Ｇａｌ−という構造をもつ糖脂質に対して活性を示した。このうちＧＭ３を基質とした場合、その反応産物はα２，３−，α２，６−結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  ＩＩ）では導入シアル酸が切断されなかったが、α２，３−，α２，６−，α２，８−，α２，９−結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  ＩＩＩ）では、導入シアル酸が切断された（図３Ａ）。またこの反応産物は抗ＧＤ３モノクローナル抗体ＫＭ６４１を用いたＴＬＣ免疫染色（Ｓａｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５２３，２３０−２３５）によってα２，８結合を介してシアル酸が導入されたＧＤ３であることが確認されたことから（図３Ｂ）、ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩはシアル酸をα２，８−の結合様式で転移することが明らかになった。
一方、糖タンパク質を基質とした場合（表１）、ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩはＯ型糖鎖のみを含有するＢＳＭに対して最も高い活性を示した。Ｏ型糖鎖、Ｎ型糖鎖を含有するＦｅｔｕｉｎ、Ｎ型糖鎖のみを含有するＯｖｏｍｕｃｏｉｄに対しても活性を示したが、Ｏｖｏｍｕｃｏｉｄに対する活性はＯ型糖鎖を含むタンパク質に比べると低かった。なお、ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩはアシアロ糖タンパク質に対しては全く活性を示さなかった。また単糖およびオリゴ糖を基質とした実験により（表１）、ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩが基質として認識する最小糖鎖単位はＮｅｕＡｃ  α２，３（６）Ｇａｌであることが明らかになった。
Ｆｅｔｕｉｎを基質としたとき、ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩによってあらたに導入されたシアル酸の大部分はＯ型糖鎖に取り込まれていることがＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ処理によって明らかになった（図４）。すなわちＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩを用いてＦｅｔｕｉｎを［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃでシアル化し、これをＮ型糖鎖をペプチド部分から遊離するＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅで処理すると、大部分（８２．７％）の放射能活性はこのＦｅｔｕｉｎに保持されたままであった。このことはＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩによって導入されたシアル酸の大部分はＯ型糖鎖に取り込まれたことを示す。一方、Ｎ型糖鎖を受容体基質とするマウスＳＴ８Ｓｉａ  ＩＩＩを用いて同様の実験を行ったところ、放射活性は完全に消失した。
さらにＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの基質特異性および選択性を明らかにするため、ＢＳＭとＧＭ３に対するＫｍ値、Ｖｍａｘ値を求めた。ＢＳＭに対してはＫｍ値＝０．０３ｍＭ，Ｖｍａｘ値＝２３．８ｐｍｏｌ／ｈ／（ｍｌ酵素液）で、Ｖｍａｘ／Ｋｍ値は７９３であった。一方、ＧＭ３に対してはＫｍ値＝０．５ｍＭ，Ｖｍａｘ値＝０．６７ｐｍｏｌ／ｈ／（ｍｌ酵素液）で、Ｖｍａｘ／Ｋｍ値は１．３４であった。以上の結果は、ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩにとってＯ型糖鎖が糖脂質やＮ型糖鎖よりはるかに好ましい基質であることを示している。
上記の酵素学的諸性質については、活性値に多少の差はあるもののＰＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩについても当てはまることから（表１、図３Ａ、図４）、各種動物由来のＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩが従来のα２，８−シアル酸転移酵素とは異なる基質特異性を有することが示されたといえる。
またマウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩについては、その全長クローンの細胞内における酵素活性についても調べた（図５）。マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの全長をコードする領域を含む１．４ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を、発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶのＮｏｔＩ−ＡｐａＩサイトに挿入したものをｐＲｃ／ＣＭＶ−ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩと命名し、これをリポフェクトアミンを用いてＣＯＳ−７細胞に導入した。この細胞よりガングリオシドを抽出し、ＮｅｕＡｃ  α２，８ＮｅｕＡｃ  α２，３Ｇａｌ構造を認識するモノクローナル抗体Ｓ２−５６６を用いてＴＬＣ免疫染色を行ったところ（図５Ａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ導入細胞において有意にＮｅｕＡｃ  α２，８ＮｅｕＡｃ  α２，３Ｇａｌ構造を有するガングリオシド量が増加していたことが明らかになった。また細胞内の糖タンパク質についても、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ導入細胞ではＯ型糖鎖上に新たにＮｅｕＡｃ  α２，８ＮｅｕＡｃ  α２，３Ｇａｌ構造が形成されていた（図５Ｂ）。以上の結果は、マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩが生体内においてα２，８−シアル酸転移酵素として機能していることを示している。
なお、マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩは腎臓、心臓、脾臓などで主に発現しているが（図６Ａ）、ヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩは胎盤や胎児の各種臓器、および各種腫瘍細胞などにおいて主に発現している（図６Ｂ）。
実施例２：β−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素
本発明の具体例に用いた試薬、試料類は以下の通りである。Ｆｅｔｕｉｎ，ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ，ｂｏｖｉｎｅ  ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎ（ＢＳＭ），α１−ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｖｏｍｕｃｏｉｄ，ｌａｃｔｏｓｙｌ  ｃｅｒａｍｉｄｅ（ＬａｃＣｅｒ），ＧＡ１，ＧＭ３，ＧＭ１ａ，Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ，Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ，Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４，β−ガラクトシダーゼ（牛精巣由来）はＳｉｇｍａ社から購入した。Ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ，ラクトースは和光純薬から購入した。ＣＭＰ−［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃ（１２．０ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，シアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  Ｉ，ＩＩ）はＧｌｙｋｏ  Ｉｎｃ社から購入した。［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰはＮＥＮ社から購入した。ヒトおよびマウスＭｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。ＢＳＭ，α１−ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｖｏｍｕｃｏｉｄの脱シアル化（アシアロ）糖タンパク質は、これらを０．０２Ｎ  ＨＣｌ中８０度、１時間で処理することにより調製した。
ヒトシアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉのアミノ酸配列を用いて、これと相同性を示す新規シアル酸転移酵素をコードしているクローンをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ（ｄｂＥＳＴ）のデータベースで検索したところ、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＢＥ６１３２５０，ＢＥ６１２７９７，ＢＦ０３８０５２の各ＥＳＴクローンが得られた。これらについてはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより該当クローンを入手した。またそれらの塩基配列情報を利用して、さらにｄｂＥＳＴとヒトゲノムのＨｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅのデータベースを検索したところ、関連ＥＳＴクローンとゲノム遺伝子の塩基配列情報が得られた（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．Ｈ９４０６８，ＡＡ５１４７３４，ＢＦ８３９１１５，ＡＡ２１０９２６，ＡＡ３８５８５２，Ｈ９４１４３，ＢＦ３５１５１２（以上ＥＳＴクローン），ＡＣ０１６９９４（ゲノム配列））。以上の塩基配列情報をもとにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）用のプライマーを作製し、ヒト大腸由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ここで得られた増幅断片と入手ＥＳＴクローン由来のＤＮＡ断片を連結することによって翻訳領域全長を含むクローンを得た（図７Ａ）。このｃＤＮＡは５２９アミノ酸からなる予測分子量６０，１５７のＩＩ型膜タンパク質をコードする単一の翻訳領域を有していた。なお膜貫通ドメインは疎水性分布図によりアミノ酸番号１２−３０の領域に存在することが予測された（図７Ｂ）。本タンパク質のアミノ酸配列にはシアル酸転移酵素に保存されているシアリルモチーフが存在していた。また本タンパク質は既知ヒトシアル酸転移酵素の中ではＳＴ６Ｇａｌ  Ｉとアミノ酸レベルで最も高い相同性（４８．９％）を示したが（図９Ａ）、他のファミリーのシアル酸転移酵素とは２１−３６％程度の相同性を示したに過ぎなかった。なお以下に示すようにこのタンパク質はβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性を有していたことから、これを本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩと命名した。またヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩには、ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔと考えられるシアリルモチーフＳの途中から配列が異なるｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのクローンも存在していた（図７Ａ）。
一方、他の哺乳動物においてもこれと同様の酵素が存在するのかを調べるため、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの配列情報を利用して、上記と同様にデータベースを検索したところ、マウスにも同様の酵素が存在することが確認できた。そこでマウスのクローンについてもクローニングを行うことにした。マウス１４日目胎児由来ｃＤＮＡを鋳型として、２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴＡＣＡＴＣＣＣＡＧ−３’（図８Ａの塩基番号３２１−３５０に相当）（配列番号１９），５’−ＣＧＡＴＴＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧ−３’（図８Ａの塩基番号８６４−８９３の相補鎖に相当）（配列番号２０）を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片、および２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＣＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＧＣＣＣＴＴＣＴＣＧ−３’（図８Ａの塩基番号７７４−８０３に相当）（配列番号２１），５’−ＡＣＣＴＴＡＴＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＴＴＣ−３’（図８Ａの塩基番号１５８２−１６１１の相補鎖に相当）（配列番号２２）を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を、両増幅ＤＮＡ断片が共通に有するＫｐｎＩサイトを利用して連結し、さらにこれに２種類の合成ＤＮＡ，５’−ＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣ−３’（図８Ａの塩基番号１−３０に相当）（配列番号２３），５’−ＣＧＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＧ−３’（図８Ａの塩基番号３８１−４１０の相補鎖に相当）（配列番号２４）を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を、両ＤＮＡ断片が共通に有するＡｏｒ５１ＨＩサイトを利用して連結して、マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの全長をコードするＤＮＡ断片を得、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）に挿入した。図８ＡにマウスのＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの配列情報を示す。マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩは５２４アミノ酸からなり、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩより５アミノ酸ほどステム領域に相当する部分が短かった。なお本タンパク質の膜貫通ドメインは、疎水性分布図によりアミノ酸番号１２−３０の領域に存在することが予測された（図８Ｂ）。ヒトとマウスのＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩではアミノ酸配列レベルで７７．１％の相同性を示した（図９Ｂ）。
つぎにＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの酵素学的諸性質を調べるため、分泌型タンパク質の製造を行った。まずヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩについて、ＸｈｏＩサイトを含む合成ＤＮＡ，５’−ＴＣＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＧＣＴＧ−３’（図７Ａの塩基番号２５５−２８４に相当）（配列番号２５）を用いて膜貫通ドメイン直下流にＸｈｏＩサイトを導入し、これとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）由来のＸｈｏＩサイトを用いてＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩのステム領域と活性ドメインをコードするＸｈｏＩ断片を調製した。これを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＳＡのＸｈｏＩサイトに挿入した。この発現ベクターをｐｃＤＳＡ−ｈＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩと命名した。またマウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩについては、上記クローニングの際に用いた合成ＤＮＡ，５’−ＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣ−３’（図８Ａの塩基番号１−３０に相当）（配列番号２３）のかわりに、ＭｕｎＩサイトを含む合成ＤＮＡ，５’−ＣＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣ−３’（図８Ａの塩基番号８３−１１２に相当）（配列番号２６）を用いてマウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩのステム領域と活性ドメインをコードするＭｕｎＩ−ＸｈｏＩ断片を調製した。これをｐｃＤＳＡのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、発現ベクターｐｃＤＳＡ−ｍＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩと命名した。
ｐｃＤＳＡ−ｈＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩおよびｐｃＤＳＡ−ｍＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩは、それぞれマウス免疫グロブリンＩｇＭのシグナルペプチドとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ，およびマウスまたはヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの活性ドメイン（ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩではアミノ酸番号３３−５２９、マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩではアミノ酸番号３１−５２４）からなる分泌型融合タンパク質をコードする。
各発現ベクターとリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＯＳ−７細胞でその一過性発現を行った（Ｋｏｊｉｍａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０，１−４）。ここでそれぞれの発現ベクターを導入した細胞から細胞外に分泌された本発明のタンパク質をＰＡ−ｈＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（ヒト）およびＰＡ−ｍＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（マウス）と命名した。ＰＡ−ｈＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＰＡ−ｍＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩはＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に吸着させて培地より回収した。シアル酸転移酵素活性はＬｅｅらの方法に準じて以下のように行った（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１１９５８−１１９６７）。５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４，１００μＭ  ＣＭＰ−［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃ，基質糖鎖（糖脂質の場合は０．５ｍｇ／ｍｌ，糖タンパク質、オリゴ糖は１ｍｇ／ｍｌになるように添加）、およびＰＡ−ｈＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩまたはＰＡ−ｍＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ懸濁液を含む反応液（１０μｌ）を３７度で３−２０時間インキュベートし、その後、糖脂質についてはＣ−１８カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  １００ｍｇ；Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて精製したものを試料として、オリゴ糖、糖タンパク質については反応産物をそのまま試料として解析を行った。オリゴ糖、糖脂質はシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社）にスポットし、１−プロパノール：アンモニア水：水＝６：１：２．５の展開溶媒（オリゴ糖用）またはクロロホルム：メタノール：０．０２％  ＣａＣｌ２＝５５：４５：１０の展開溶媒（糖脂質用）で展開した。糖タンパク質の場合はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析を行った。これらの放射活性をＢＡＳ２０００ラジオイメージアナライザー（フジフィルム）で可視化し、定量した。
表２にＰＡ−ｈＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＰＡ−ｍＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの基質特異性を示す。
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両酵素ともオリゴ糖に対しては、非還元末端にＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造をもつものに対してのみ活性を示した（図１０）。またこの構造を持つと考えられる糖タンパク質に対しても弱い活性を示した。一方、糖脂質については、調べた範囲内では両酵素の基質となるものはなかった。また比較のためにヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉのオリゴ糖に対する活性を調べたところ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造をもつオリゴ糖のほかに、ＬａｃｔｏｓｅやＬａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅなどに対しても活性を示した（図１０）。またＳＴ６Ｇａｌ  Ｉは糖タンパク質や糖脂質に対しても広い活性を示した（表２）。以上のことはＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩがＳＴ６Ｇａｌ  Ｉよりも基質特異性に関してより選択性が強いことを意味する。なおヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩのｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔであるｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのタンパク質については、酵素活性が認められなかった（図１０）。
ＰＡ−ｈＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩおよびＰＡ−ｍＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩによりＧａｌ  β１，４ＧｌｃＮＡｃにシアル酸を転移した場合、その反応産物の導入シアル酸はＳＴ６Ｇａｌ  Ｉの場合と同様にα２，３−結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  Ｉ）では切断されなかったが、α２，３−，α２，６−結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  ＩＩ）では切断された（図１１Ａ）。またこの反応産物はＴＬＣにおいて６’−ｓｉａｌｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅと同じ移動度を示したこと、さらにガラクトシダーゼ処理ではＴＬＣにおいて移動度に変化が認められなかったことから（図１１Ｂ）、α２，６結合を介してガラクトースにシアル酸が導入された６’−ｓｉａｌｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅであると考えられた。以上によりＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩはシアル酸をα２，６−の結合様式でガラクトースに転移することが明らかになった。なおその特に好ましい基質としては、非還元末端にＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造をもつオリゴ糖と考えられた。
またヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ，ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの様々な組織における発現パターンを、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ特異的プライマー（５’−ＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２７）および５’−ＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧ−３’（配列番号２８）、ＰＣＲ増幅断片の大きさは３７２ｂｐ）とＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ特異的プライマー（５’−ＡＧＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧ−３’（図７Ａの塩基番号１２６４−１２８６に相当）（配列番号２９）および５’−ＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＧＧ−３’（図７Ａの塩基番号１７４５−１７６５に相当）（配列番号３０）、ＰＣＲ増幅断片の大きさは５０２ｂｐ）を用いてＰＣＲ法で調べた（図１２Ａ）。ヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉはほとんどの組織で発現していたが、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩは小腸、大腸、胎児脳を除く組織での発現は非常に低いか、全く認められなかった。さらにヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉは各種腫瘍細胞で発現していたが、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの発現は検出できなかった（図１２Ｂ）。またマウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの発現様式について、マウス  ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ特異的プライマー（５’−ＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣ−３’（図８Ａの塩基番号１−３０に相当）（配列番号２３）および５’−ＣＧＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＧ−３’（図８Ａの塩基番号３８１−４１０の相補鎖に相当）（配列番号２４）、ＰＣＲ増幅断片の大きさは４１０ｂｐ）を用いて同様に調べたところ、脳および胎生期でその発現が認められたが、その他の組織での発現は非常に低いか、全く認められなかった（図１２Ｃ）。以上の結果はＳＴ６Ｇａｌ  ＩとＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩが生体内で異なる役割を果たしていることを示唆する。
産業上の利用の可能性
本発明により新規酵素としてＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素、および該酵素の活性部分を有し細胞外に分泌される新規蛋白質が提供される。本発明の酵素および蛋白質は、Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素活性を有するので、例えば、蛋白にヒト型の糖鎖を導入する試薬として有用である。また、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素は、ヒトに特異的な糖鎖を欠く遺伝性疾患の治療のための医薬として有用である。さらに、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素は、癌転移抑制、ウイルス感染防止、炎症反応抑制、神経組織賦活作用を目的とする医薬としても用いることが可能である。さらにまた、本発明のＯ−ｇｌｙｃａｎ  α２，８−シアル酸転移酵素は、薬剤等にシアル酸を付加することにより生理作用を増加させるための研究用試薬などとして有用である。
さらに本発明により新規酵素としてβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素、および該酵素の活性部分を有し細胞外に分泌される新規蛋白質が提供される。本発明の酵素および蛋白質はβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素活性を有するので、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ構造をもつオリゴ糖などのガラクトース上にα２，６の結合様式でシアル酸をより選択的に導入することが可能になった。本発明のβ−ガラクトシドα２，６−シアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩは、本酵素が合成する特異的な糖鎖を欠く遺伝性疾患の治療薬として、また癌転移抑制、ウイルス感染抑防止、炎症反応抑制、神経細胞賦活効果を有する薬剤として、あるいは糖鎖にシアル酸を付加することにより生理作用を増加させたり、糖鎖分解酵素の分解活性を阻害する研究用試薬などとして有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウスおよびヒトのＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ  ｃＤＮＡの塩基配列と予測アミノ酸配列を示す。膜貫通ドメインは下線、シアリルモチーフＬは二重線、シアリルモチーフＳは破線で示してある。シアリルモチーフＶＳで保存されているヒスチジンとグルタミン酸は四角で囲ってある。Ｎ型糖鎖が結合すると予想されるアスパラギンには上線を付してある。Ａ，マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ。Ｂ，ヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ。
図２は、アミノ酸配列の比較を示す。
Ａは、マウスシアル酸転移酵素ＳＴ８Ｓｉａ  Ｉ，ＳＴ８Ｓｉａ  Ｖ，ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩのアミノ酸配列の比較を示す。各シアル酸転移酵素間で保存されているアミノ酸は四角で囲ってある。シアリルモチーフＬは二重線で、シアリルモチーフＳは破線で示してある。シアリルモチーフＶＳで保存されているヒスチジンとグルタミン酸にはアスタリスクを付してある。
Ｂは、マウス（ｍ）およびヒト（ｈ）のＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩのアミノ酸配列の比較を示す。両酵素間で保存されているアミノ酸は四角で囲ってある。
図３は、結合特異性の解析を示す。
Ａは、マウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの分泌型組み換えタンパク質ＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩによりＧＭ３を［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃでシアル化し、それをα２，３−，α２，６−結合特異的なシアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  ＩＩ）、α２，３−，α２，６−，α２，８−，α２，９−結合特異的シアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  ＩＩＩ）で処理した反応産物をＨＰＴＬＣで展開（展開溶媒はクロロホルム：メタノール：０．０２％ＣａＣｌ２＝５５：４５：１０）した結果（上段）、およびヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩの分泌型組み換えタンパク質ＰＡ−ｈＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩにより３’−ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅを［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃでシアル化し、それをＮＡＮａｓｅ  ＩＩ，ＮＡＮａｓｅ  ＩＩＩで処理した反応産物をＨＰＴＬＣで展開（展開溶媒は１−プロパノール：アンモニア水：水＝６：１：２．５）した結果（下段）を示す。
Ｂは、ＧＭ３をＰＡ−ｍＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩによりシアル化した反応産物のＴＬＣ免疫染色の結果を示す。レーン１，ＧＤ３（１μｇ）；レーン２，ＧＭ３（１μｇ）；レーン３，反応産物。抗ＧＤ３モノクローナル抗体ＫＭ６４１およびＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）で反応させた後、ＥＣＬで発色した。
図４は、ＳＴ８Ｓｉａ  ＩＩＩまたはＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩによって［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃを取り込ませたＦｅｔｕｉｎをＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅで処理した結果を示す。［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃを取り込ませたＦｅｔｕｉｎをＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析後、ＢＡＳ２０００ラジオイメージアナライザーで可視化した。
図５は、ＣＯＳ−７細胞においてマウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ全長ｃＤＮＡを過剰発現させたときの影響を示す。
Ａは、抗ＮｅｕＡｃα２，８ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌ抗体Ｓ２−５６６を用いてＴＬＣ免疫染色を行った結果を示す。レーン１，ＧＤ３標準物質（０．５μｇ）；レーン２，ＧＱ１ｂ標準物質（０．５μｇ）；レーン３，コントロールのＣＯＳ−７細胞（３０ｍｇ）から抽出した酸性糖脂質画分；レーン４，マウス全長ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ−ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩを導入したＣＯＳ−７細胞（３０ｍｇ）から抽出した酸性糖脂質画分。
Ｂは、ＣＯＳ−７細胞またはｐＲｃ／ＣＭＶ−ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩを導入したＣＯＳ−７細胞からミクロソーム画分を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後（４５μｇ／レーン）、ＰＶＤＦ膜に転写してＳ２−５６６抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す。レーン１，コントロールのＣＯＳ−７細胞から調製したミクロソーム画分；レーン２，ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩを導入したＣＯＳ−７細胞から調製したミクロソーム画分；レーン３，コントロールのＣＯＳ−７細胞から調製したミクロソーム画分をＮ−グリカナーゼ処理したもの；レーン４，ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩを導入したＣＯＳ−７細胞から調製したミクロソーム画分をＮ−グリカナーゼ処理したもの。ＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ  ｃＤＮＡの導入により生じたＳ２−５６６抗体に認識されるバンドの主なものについては、アスタリスクを付してある。
図６は、マウスおよびヒトのＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ遺伝子の発現様式を示す。
Ａは、マウス各種臓器より調製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（約２μｇ／レーン）を用いてマウスＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ遺伝子の発現様式をノーザン解析した結果を示す。
Ｂは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲ法によりヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ遺伝子の発現様式を解析した結果を示す。ヒトＳＴ８Ｓｉａ  ＶＩ特異的プライマーとして、５’−ＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＴ−３’（図１Ｂの塩基番号６０８−６２７に相当）（配列番号１７）および５’−ＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣ−３’（図１Ｂの塩基番号１４０７−１４２６の相補鎖に相当）（配列番号１８）を用いた（ＰＣＲ増幅断片の大きさは８１９ｂｐ）。
図７は、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ  ｃＤＮＡの塩基配列と予測アミノ酸配列、およびその疎水性分布図を示す。
Ａは、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ  ｃＤＮＡの塩基配列と予測アミノ酸配列を示す。膜貫通ドメインは下線、シアリルモチーフＬは二重線、シアリルモチーフＳは破線で示してある。シアリルモチーフＶＳで保存されているヒスチジンとグルタミン酸は四角で囲ってある。Ｎ型糖鎖が結合すると予想されるアスパラギンには上線を付してある。
Ｂは、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの疎水性分布図を示す。Ｎ末端側の大きな疎水性領域は膜貫通ドメインと予測される。
図８は、マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ  ｃＤＮＡの塩基配列と予測アミノ酸配列、およびその疎水性分布図を示す。
Ａは、マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ  ｃＤＮＡの塩基配列と予測アミノ酸配列を示す。膜貫通ドメインは下線、シアリルモチーフＬは二重線、シアリルモチーフＳは破線で示してある。シアリルモチーフＶＳで保存されているヒスチジンとグルタミン酸は四角で囲ってある。Ｎ型糖鎖が結合すると予想されるアスパラギンには上線を付してある。
Ｂは、マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの疎水性分布図を示す。Ｎ末端側の大きな疎水性領域は膜貫通ドメインと予測される。
図９は、アミノ酸配列の比較を示す。
Ａは、ヒトシアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ  ＩとＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩのアミノ酸配列の比較を示す。両シアル酸転移酵素間で保存されているアミノ酸は四角で囲ってある。シアリルモチーフＬは二重線で、シアリルモチーフＳは破線で示してある。シアリルモチーフＶＳで保存されているヒスチジンとグルタミン酸にはアスタリスクを付してある。
Ｂは、ヒト（ｈ）およびマウス（ｍ）のＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩのアミノ酸配列の比較を示す。両酵素間で保存されているアミノ酸は四角で囲ってある。
図１０は、オリゴ糖に対する活性を示す。様々なオリゴ糖を基質（１０μｇ／レーン）として酵素反応を行い、その反応産物をＨＰＴＬＣで解析（展開溶媒は１−プロパノール：アンモニア水：水＝６：１：２．５）した結果を示す。
図１１は、結合特異性の解析を示す。
Ａは、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ（上段）、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（中段）、およびマウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（下段）を用いてＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃでシアル化し（レーン１）、それをα２，３−結合特異的シアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  Ｉ，レーン２）、α２，３−，α２，６−結合特異的シアリダーゼ（ＮＡＮａｓｅ  ＩＩ，レーン３）で処理した反応産物をＨＰＴＬＣで展開（展開溶媒は１−プロパノール：アンモニア水：水＝６：１：２．５）した結果を示す。
Ｂは、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ（上段）、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（中段）、およびマウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（下段）を用いてＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを［１４Ｃ］−ＮｅｕＡｃでシアル化し（レーン１）、それをβ−ガラクトシダーゼで処理した反応産物（レーン２）、およびコントロールとしてＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃをβ−ガラクトシダーゼで処理した後に酵素反応を行った試料（レーン３）をＨＰＴＬＣで展開（展開溶媒は１−プロパノール：アンモニア水：水＝６：１：２．５）した結果を示す。レーン２のバンドがブロードなのは、β−ガラクトシダーゼ溶液中に含まれている高濃度の硫酸アンモニウムの影響による。
図１２は、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ，ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩおよびマウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ遺伝子の発現パターンの解析を示す。ヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ，ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ特異的プライマーとヒト組織（Ａ）またはヒト腫瘍細胞（Ｂ）のＭｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、両遺伝子の発現パターンをＰＣＲ法で解析した。ＰＣＲは９４度１分、５０度１分、７２度１分３０秒を１サイクルとし、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子については２５サイクル、ヒトＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ，ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ遺伝子については４０サイクル行って、反応産物をアガロースゲル電気泳動で解析した。Ｓｋ．ｍｕｓｃｌｅ，ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ；Ｐ．ｂｌ．ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ，ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ。Ｃは、マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩの発現パターンを、マウスＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ特異的プライマーとマウス組織のＭｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、ＰＣＲ法で解析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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