(57)【要約】核酸増幅方法を用いて核酸の検出を行う際に、測定に要する時間を短縮し、遺伝子等の検査システムを総合的に効率化させるために、採取した生体試料の処理において、採取した生体試料を均質化する工程中あるいは工程を経た後に核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、生体試料から核酸成分の単離精製をしないでおこなう直接核酸増幅方法を用いる。該核酸の分解活性を阻害する手段の導入が酸性ｐＨ、具体的にはｐＨ２．５〜ｐＨ５でなされること、及び核酸増幅反応の反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理することにより、核酸成分の単離精製をしないで直接核酸を増幅する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、生体試料から核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする直接核酸増幅法。
【請求項２】
核酸の分解活性を阻害する手段が、ＲＮＡの分解活性を阻害する手段である請求の範囲第１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
分解活性を阻害する手段の導入が酸性ｐＨでなされる請求の範囲第１項又は第２項に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
酸性ｐＨがｐＨ２．５〜ｐＨ５である請求の範囲第３項に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
採取した生体試料を均質化する工程を経た後に、核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅する請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
核酸増幅反応の反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を用いて生体試料を処理し、核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする直接核酸増幅方法。
【請求項７】
反応阻害物及び／又は核酸成分と塩との相互作用が、イオン結合及び／又は疎水結合による請求の範囲第６項に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
塩がカオトロピック塩である請求の範囲第６項又は第７項に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
塩がトリハロ酢酸のアルカリ金属塩である請求の範囲第６項又は第７項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
塩の種類が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＩ、ＫＩ、ＴＭＡＣｌ（テトラメチルアンモニウムクロライド）、ＴＥＡＣｌ（テトラエチルアンモニウムクロライド）、ＫＳＣＮ、ＣｓＳＣＮ、ＣｓＣｌのいずれか少なくとも１を含む請求の範囲第８項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
塩の種類が、ＣＦ３ＣＯＯＣｓ（トリフルオロ酢酸セシウム）を含む請求の範囲第９項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
塩濃度が１ｍＭ〜２０００ｍＭである請求の範囲第６項〜第１１項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項１３】
核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、さらに核酸増幅反応の反応阻害物と相互作用する塩を用いて生体試料を処理する請求の範囲第６項〜第１２項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項１４】
核酸の分解活性を阻害する手段が、ＲＮＡの分解活性を阻害する手段である請求の範囲第１３項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１５】
分解活性を阻害する手段の導入が酸性ｐＨでなされる請求項の範囲第１２項〜第１４項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項１６】
酸性ｐＨがｐＨ２．５〜ｐＨ５である請求の範囲第１５項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１７】
採取した生体試料を均質化する工程を経た後に核酸成分の単離精製を行わずに行う請求の範囲第６項〜第１６項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項１８】
反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理した生体試料をさらにアニオン性の固体を用いて処理する請求の範囲第６項〜第１７項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項１９】
反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理した生体試料を、核酸成分の分解酵素阻害剤共存下で増幅させる請求の範囲第６項〜第１８項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項２０】
核酸成分の分解酵素阻害剤が、ＲＮａｓｅインヒビターである請求項の範囲第１９項に記載の核酸増幅方法。
【請求項２１】
核酸増幅方法が、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかである請求の範囲第１項〜第２０項のいずれか１に記載の核酸増幅方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項〜第２０項のいずれか１に記載の核酸増幅方法に使用する生体試料の処理方法。
【請求項２３】
請求の範囲第１項〜第２０項のいずれか１に記載の核酸増幅方法に使用する核酸検出用試薬。
【請求項２４】
請求の範囲第１項〜第２０項のいずれか１に記載の核酸増幅方法を使用する核酸検出システム。
【請求項２５】
請求の範囲第２４項に記載の核酸検出システムを使用する核酸の検査装置。
【請求項２６】
請求の範囲第２４項に記載の核酸検出システムを使用する癌転移の検査方法。
【請求項２７】
請求の範囲第２４項に記載の核酸検出システムに使用する核酸検査キット。
【請求項２８】
核酸成分を安定な状態に保つｐＨを有する生体試料処理溶液。
【請求項２９】
ｐＨが２．５−５である請求の範囲第２８項に記載の生体試料処理溶液。
【請求項３０】
さらに、核酸増幅反応の反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を含む請求の範囲第２８項又は第２９項に記載の生体処理溶液。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、核酸増幅手段を用いて、腫瘍や癌の診断、ウイルス、バクテリア等の感染、ならびに各種遺伝子疾患の検出を行う分野において、核酸を含有する生体試料の処理法に関し、核酸成分を生体試料から抽出することなく、直接簡便かつ迅速に遺伝子の検出を可能とする核酸増幅方法に関する。
背景技術
近年の遺伝子工学及び分子生物学などの分野の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについて、ＤＮＡ又はＲＮＡレベルで診断することが可能になった。特に、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５）やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，９１−９２，１９９１、特許第２６４８８０２号公報及び特許第２６５０１５９号公報記載）及びＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ増幅法、特開２００１−２４２１６９号公報）などの核酸増幅方法により、検出が非常に困難であった生物検体中の極微量の核酸の検出が可能となり、遺伝子解析が飛躍的に容易なものとなった。
ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明で、特開昭６１−２７４６９７号公報に述べられている。ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝病や癌の診断等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、タンパク質、糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることが広く知られている。
ＲＴ−ＰＣＲ法は、例えば腫瘍のＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）又はランダムヘキサマーをプライマーにして逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成し、この一部をＰＣＲ法で増幅し、検出する方法である。この方法を用いた繊維芽細胞腫の診断の例が報告されている（北海道医学雑誌、ｐ．１３５−１４１，Ｖｏｌ．６６（２），１９９１）。ＲＴ−ＰＣＲ法は、分解を受けやすいｍＲＮＡを対象としているため、検体採取後速やかに処理することが必要とされる。また、極めて鋭敏な検出方法なので、他検体とのコンタミネーションを防ぐ注意が大切である。
ＬＡＭＰ法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成する特殊なプライマーを含む２組以上のプライマーによる遺伝子増幅法である。増幅産物は多数の繰り返し構造からなるが、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。ＬＡＭＰ法の増幅産物は公知の２本鎖ＤＮＡの検出法により検出することができるが、その独特な構造をいかした検出方法等が報告されている（特開２００１−２４２１６９号公報、ＷＯ００／２８０８２号国際公開公報）。
また、同じく遺伝子の増幅法であるＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法においては、２本のプライマーのうち一方にＴ７プロモーター配列を有するプライマーを用いることを特徴としている。このためこれらプライマーを標的ＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズさせ、逆転写酵素反応（ＲＮＡ又はＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成）を行うと、Ｔ７プロモーターを有する二本鎖ＤＮＡが合成される。この反応系にＴ７ポリメラーゼを添加すると、Ｔ７プロモーターが活性化し、その下流の遺伝子が発現し、増副産物として大量のＲＮＡが合成される。ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法においては、以上のような増幅サイクルが一定温度で進行する。
核酸増幅手段を用いた核酸検出システムは、採取した生体試料を処理する工程、核酸抽出の工程、測定試薬分注工程、核酸増幅工程及び増幅産物の判定の工程から構成されるのが一般的である。ＰＣＲ法等による核酸増幅に先立って、核酸を抽出する前処理工程が必要となる。その方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノール法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，７２：６１９−６２９，１９６３）、アルカリ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：１５１３−１５２３，１９７９）、あるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。
最近では核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。
また核酸の抽出に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウムを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６−２：６１５−６１９，１９７９）、ヒドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）などが報告されている。これらの方法は有害な有機溶媒などはそれほど使用しないが、そのかわり工程中に遠心分離操作を多く含むため、多数の試料を一度に処理することが困難で、核酸を単離するのに長時間かかるという問題を含んでいる。
このように、従来の核酸単離方法は有機溶媒やアルカリなどの危険な試薬を使用すること、遠心分離操作を必要とし、多数検体の処理が難しいことなどの難点があるが、多数の検体を再現性よく処理し、人的コストを低減させる自動機械化において、さらに大きな問題点が存在する。
核酸抽出の自動機械化を目指したものとして、核酸結合性シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（非特許文献１、特許文献１）がある。これは、核酸結合性シリカ粒子と試料中の核酸を遊離する能力をもつカオトロピックイオンを試料と混合し、試料中の核酸を核酸結合性シリカ粒子に結合させ、固相と液相を分離して、試料中の夾雑物質を除去した後、核酸結合性シリカ粒子に結合した核酸を溶離するというものである。
核酸増幅妨害物質の除去方法として核酸を含有する生体材料を酸処理する方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、ここでは生物材料検体から核酸を抽出する任意の段階において当該検体を酸で処理しうることは記載するものの、試料中の核酸成分の単離精製を行わずに行うことについては記載されていないため、依然として迅速に核酸増幅方法を行うことは困難であった。
核酸増幅反応の阻害を減少する方法として、核酸増幅阻害物がアニオン性固相と結合するように、サンプルをアニオン性固相と接触させる方法が報告されている（特許文献３）。しかしながら、ここでも試料中の核酸成分の単離精製を行わずに行うことについては記載されていないため、依然として迅速に核酸増幅方法を行うことは困難であった。
腫瘍や癌の診断、ウイルス、バクテリア等の感染、ならびに各種遺伝子疾患の検出の分野では、以上説明したような核酸増幅方法が実用化されている（臨床検査法提要、第３１版、金原出版株式会社、１９９８年９月２０日発行）。
しかしながら、核酸増幅手段を用いた核酸検出において、測定に要する時間、感度等の面で改良すべき点は多く残されている。
（非特許文献１）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２８−３：ｐ．４９５−５０３，１９９０年
（特許文献１）特許第２６８０４６２号公報
（特許文献２）国際公開ＷＯ０１／００８１３号公報
（特許文献３）特開平０９−１７３０６５号公報
発明の開示
本発明の課題は核酸増幅方法を用いて核酸の検出を行う際に、測定に要する時間を短縮し、遺伝子等の検査システムを総合的に効率化させることである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、生体試料の前処理工程を改善すれば、検査システム全体としての時間が短縮でき、測定感度が上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
１．核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、生体試料から核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする直接核酸増幅法、
２．核酸の分解活性を阻害する手段が、ＲＮＡの分解活性を阻害する手段である前項１に記載の核酸増幅方法、
３．分解活性を阻害する手段の導入が酸性ｐＨでなされる前項１又は２に記載の核酸増幅方法、
４．酸性ｐＨがｐＨ２．５〜ｐＨ５である前項３に記載の核酸増幅方法、
５．採取した生体試料を均質化する工程を経た後に、核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅する前項１〜４のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
６．核酸増幅反応の反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を用いて生体試料を処理し、核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする直接核酸増幅方法、
７．反応阻害物及び／又は核酸成分と塩との相互作用が、イオン結合及び／又は疎水結合による前項６に記載の核酸増幅方法、
８．塩がカオトロピック塩である前項６又は７に記載の核酸増幅方法、
９．塩がトリハロ酢酸のアルカリ金属塩である前項６又は７に記載の核酸増幅方法、
１０．塩の種類が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＩ、ＫＩ、ＴＭＡＣｌ（テトラメチルアンモニウムクロライド）、ＴＥＡＣｌ（テトラエチルアンモニウムクロライド）、ＫＳＣＮ、ＣｓＳＣＮ、ＣｓＣｌのいずれか少なくとも１を含む前項８に記載の核酸増幅方法、
１１．塩の種類が、ＣＦ３ＣＯＯＣｓ（トリフルオロ酢酸セシウム）を含む前項９に記載の核酸増幅方法、
１２．塩濃度が１ｍＭ〜２０００ｍＭである前項６〜１１のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
１３．核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、さらに核酸増幅反応の反応阻害物と相互作用する塩を用いて生体試料を処理する前項６〜１２のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
１４．核酸の分解活性を阻害する手段が、ＲＮＡの分解活性を阻害する手段である前項１３に記載の核酸増幅方法、
１５．分解活性を阻害する手段の導入が酸性ｐＨでなされる前項１２〜１４のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
１６．酸性ｐＨがｐＨ２．５〜ｐＨ５である前項１５に記載の核酸増幅方法、
１７．採取した生体試料を均質化する工程を経た後に核酸成分の単離精製を行わずに行う前項６〜１６のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
１８．反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理した生体試料をさらにアニオン性の固体を用いて処理する前項６〜１７のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
１９．反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理した生体試料を、核酸成分の分解酵素阻害剤共存下で増幅させる前項６〜１８のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
２０．核酸成分の分解酵素阻害剤が、ＲＮａｓｅインヒビターである前項１９に記載の核酸増幅方法、
２１．核酸増幅方法が、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかである前項１〜２０のいずれか１に記載の核酸増幅方法、
２２．前項１〜２０のいずれか１に記載の核酸増幅方法に使用する生体試料の処理方法、
２３．前項１〜２０のいずれか１に記載の核酸増幅方法に使用する核酸検出用試薬、
２４．前項１〜２０のいずれか１に記載の核酸増幅方法を使用する核酸検出システム、
２５．前項２４に記載の核酸検出システムを使用する核酸の検査装置、
２６．前項２４に記載の核酸検出システムを使用する癌転移の検査方法、
２７．前項２４に記載の核酸検出システムに使用する核酸検査キット、
２８．核酸成分を安定な状態に保つｐＨを有する生体試料処理溶液、
２９．ｐＨが２．５−５である前項２８に記載の生体試料処理溶液、
３０．さらに、核酸増幅反応の反応阻害物及び／又は核酸成分と相互作用する塩を含む前項２８又は２９に記載の生体処理溶液、からなる。
発明を実施するための最良の形態
本発明の核酸増幅方法、生体試料の処理方法、核酸検出用試薬等について以下に説明する。
本発明における直接核酸増幅方法とは、被検試料である生体から採取した生体試料をブレンダー等で均質化した後、該生体試料中に含有する核酸を増幅させることが可能な核酸増幅方法をいい、均質化した生体試料から目的とする核酸成分を抽出しないで直接核酸を増幅させることが可能な核酸増幅方法をいう。
本発明における生体試料とは、目的とする核酸の増幅のために生体から得られる試料をいい、具体的には生体から採取した組織、全血、血清、血漿、尿、唾液、体液、分泌物などのヒト又は動物由来の生物材料、その他、植物、微生物などの動物以外の生物材料を包含する。
（生体試料の処理）
核酸の分解活性を阻害する手段を導入するとは、生体試料中に含有される核酸を分解する原因物質、例えば分解酵素の活性を阻害する物質や条件等を、生体試料処理の際に導入することをいう。ここで核酸とはＤＮＡ又はＲＮＡをいい、例えば蛋白質の発現確認のためにはＲＮＡ、特にｍＲＮＡが好ましく適用される。ＲＮＡは、生体成分中に含有されるＲＮＡ分解酵素により分解されやすく、特に不安定である。本発明において核酸の分解活性を阻害する手段とは、具体的には例えばＤＮＡ分解酵素又はＲＮＡ分解酵素の活性を阻害する手段をいう。この場合において、一般的には核酸分解酵素阻害剤の添加等の方法が考えられるが、本発明では核酸の分解活性を阻害しうる手段であればどのような手段であっても良い。例えば、核酸分解酵素の活性を阻害する手段としては、酵素蛋白質の変性により酵素活性を阻害する手段を適用することができる。酵素蛋白質を変性させうる手段としては、蛋白質変性剤の添加、加熱処理、ｐＨの変化に伴う変性処理などが挙げられる。本発明では、酵素蛋白質を変性させ、かつ目的とする核酸成分を安定な状態で確保することが必要である。
そこで、目的とする核酸成分を安定な状態で保つ条件を検討したところ、生体試料処理液のｐＨにより生体試料に含有される核酸の安定性が異なることがわかった。処理溶液は、試料に含まれる核酸分解酵素等の酵素活性が最も高い中性付近では好ましくなく、さらに酸性が強くなれば（ｐＨが低くなれば）、核酸成分、とくにＲＮＡはリン酸ジエステル結合の化学的な分解などにより短い断片に切断されるのでｐＨ２以下も好ましくない。本発明は、中性又はそれより低いｐＨの条件で生体試料の処理を行い、目的とする核酸が安定な条件を見出したことが一つの特徴点である。具体的には、生体試料をｐＨ２．５〜５、好ましくはｐＨ３〜４、さらに好ましくはｐＨ３付近の溶液で処理することで、目的とする核酸成分を安定な状態で確保することができる。
酸性ｐＨの溶液とは、具体的にはグリシン−ＨＣｌ、塩化カリウム−ＨＣｌを含む溶液が挙げられる。
上記生体試料の処理は、核酸増幅反応の反応阻害物と相互に作用する塩の添加により行うこともできる。核酸増幅反応の反応阻害とは、例えばｍＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅させる場合には、ｍＲＮＡからの逆転写活性の抑制、ＤＮＡの複製の抑制等が挙げられる。このような増幅反応の抑制は、例えば目的とすべきＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸が、試料中に含まれる蛋白質に結合する等により起こることが考えられる。
生体試料を酸性ｐＨで処理すると、ＲＮＡ等の核酸成分は（−）に荷電したままであるが、蛋白質は（＋）に荷電する傾向にあるので、核酸成分と蛋白質がイオン結合や疎水結合によって結合する。このような核酸成分と蛋白質の結合を防止するために、核酸成分が蛋白質に結合する前に、蛋白質とイオン結合あるいは疎水結合する物質を処理液に添加すればよい。このような物質を、反応阻害物及び／又は核酸成分と相互に作用する塩ということができる。
反応阻害物及び／又は核酸成分と相互に作用する塩の具体例として、カオトロピックイオンを発生しうる塩、いわゆるカオトロピック塩及びトリハロ酢酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。カオトロピックイオンとは、イオン半径の大きな１価の陰イオンの総称であり、このイオンを水に加えると疎水性分子の水溶性が増加して、疎水性結合を弱める作用を有する。つまり、これらのイオンが、目的核酸成分が反応阻害物にイオン結合あるいは疎水結合するのを弱め、目的核酸成分が反応阻害物に吸着されることを防ぐことにより、核酸増幅反応が効率良く行われることとなる。カオトロピックイオンの具体例として、ＳＣＮ−、Ｉ−、ＣｌＯ４−、ＮＯ３−、Ｂｒ−、Ｃｌ−、ＣＨ３ＣＯ２−、Ｆ−などが挙げられる。このようなイオンを発生しうる塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＲｂＣｌ、ＮａＩ、ＫＩ、ＴＭＡＣｌ、ＴＥＡＣｌ、ＫＳＣＮ、ＣｓＳＣＮ、ＣｓＣｌ等が挙げられ、好ましくはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＩ、ＫＩ、ＴＭＡＣｌ、ＴＥＡＣｌ、ＫＳＣＮ、ＣｓＳＣＮ、ＣｓＣｌである。上記塩の添加は、上記の核酸分解活性を阻害する手段の導入に前後して行うこともでき、同時に行うこともできるが、同時に添加するのが効率良く最も好ましい。
また、トリハロ酢酸のアルカリ金属塩についてもカオトロピック塩と同様な効果により核酸増幅反応の効率化を行うことができる。トリハロ酢酸のアルカリ金属塩の具体例としてトリフルオロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸カリウム、トリフルオロ酢酸セシウム、トリフルオロ酢酸リチウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリクロロ酢酸カリウム、トリクロロ酢酸セシウム、トリクロロ酢酸リチウム、トリクロロ酢酸ルビジウム、トリクロロ酢酸フランシウム等が挙げられ、好ましくはトリフルオロ酢酸セシウムである。上記塩の添加は、上記の核酸分解活性を阻害する手段の導入に前後して行うこともでき、同時に行うこともできるが、同時に添加するのが効率良く最も好ましい。
添加する塩の濃度は、１ｍＭ〜２０００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜５００ｍＭより好ましくは１００ｍＭ〜３００ｍＭである。
核酸増幅反応の反応阻害物と相互に作用する塩により処理した上記生体試料は、アニオン性の固体、すなわち陰性に荷電した固体で処理することができる。アニオン性の固体として、カチオン交換樹脂、例えばカルボキシメチル、ホスホ又はスルホプロピル誘導体化イオン交換マトリックス又はその他のあらゆる陰性に荷電した表面を有する固体、例えば陰性に荷電したシリカ物質を使用することができる。カチオン交換樹脂等のアニオン性の固体で生体試料を処理する方法は公知の方法によることができ、具体的には、カラムクロマトグラフィー法及びバッチ法を適用することができる。例えば試料とアニオン性の粒子を混合し、遠心、静置、磁気分離又は同様の手段によってアニオン性の粒子を上記反応阻害物とともに目的とする核酸成分から分離することができる。
さらに安定性の効果を高めるために、自体公知の界面活性剤を併用して用いても良い。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤などがあり、好ましくは非イオン界面活性剤を使用する。非イオン界面活性剤としては、高級アルコール、アルキルフェノール、脂肪酸などのエチレングリコール、多価アルコールの部分エステル、高級脂肪酸グリセロールエステル、ソルビトールの脂肪酸エステル、ポリプロピレングルコールを疎水性基とし両端にエチレングリコールを親水性基として付加重合させたものなどがある。これらの界面活性剤は単独で又は２種以上併用してもよい。
生体試料は、ホモジナイザー及び／又はブレンダー等を用いて粉砕して均質化させた後、上記の核酸分解活性を阻害する手段及び／又は核酸増幅反応の反応阻害物と相互に作用する塩による処理、及び／又はアニオン性の固体で処理し、測定試料を調製することができる。このようにして得た測定試料は、そのまま本発明の測定方法に使用することができ、この点が本発明の直接核酸増幅方法ということを示す主な特徴点である。均質化した生体試料は、細胞破砕物を除去するために必要に応じて、ろ過、遠心分離等の処理を施すこともできる。
（核酸の増幅工程）
本発明の核酸の増幅法は、公知のものが適用され、特に限定されない。例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特表平４−５００７５９号公報）、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法等の核酸増幅法及びＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＮＶＡＤＥＲ法、ＣＰＴ（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）法、ＰＡＬＳＡＲ法等の核酸増幅法の一種であるシグナル増幅法にも適用することができる。好ましくはＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法であり、より好ましくはＲＮＡを増幅するＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法において、特に効果的に適用される。
（増幅産物の検出）
通常反応終了後の増幅産物は、自体公知の方法によって検出することができ、特に限定されない。例えば、アガロースゲル電気泳動法、蛍光標識を使用したプローブにより検出するリアルタイム検出法、ＤＮＡ合成の際の副生成物の濁りによる検出等、必要に応じて制限酵素による切断パターンの確認や、直接シークエンス解析で塩基配列を決定する方法、その他多くの方法から選択して適用することができる。また、非特異的な増幅バンドが多くて特異バンドの判別が困難な場合は、目的とする増幅域内のプローブを用いたサザンブロット法等により特異バンドを確認することができる。本発明においても、これらの公知の方法を適用することができる。
（対象核酸）
上記の手段を適用しうる目的の核酸は特に限定されないが、微量の核酸成分を増幅させることにより、疾患の有無を判断する臨床検査の場において広く適用される。例えば、癌あるいは腫瘍関連マーカーの発現の確認、遺伝子関連の疾患、ウイルス又は微生物の感染の有無の判断等に適用される。
癌あるいは腫瘍関連マーカーとしては、例えば癌患者の癌組織及び癌の発生した臓器の正常部位において同等に発現しているが診断対象の組織では癌の転移がない限りその発現が認められないもの、あるいは癌組織において発現が強く認められるもの等が挙げられる。癌患者の癌組織及び癌の発生した臓器の正常部位において同等に発現しているものの例として、サイトケラチン類、具体的にはサイトケラチン１８、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０等が挙げられる。また、癌組織において発現が強く認められるものの例としてＣＥＡなどの腫瘍マーカーが挙げられる。診断対象の組織中の各蛋白質に由来するｍＲＮＡを確認することにより癌細胞の転移を確認することができる。
上記の特定患者に認められる癌組織由来のｍＲＮＡを確認するためには、癌組織、癌の発生した臓器の正常部位あるいは診断対象の組織のいずれにおいても同等に発現している蛋白質のｍＲＮＡの量を指標とする場合がある。このような例として具体的にはβ−アクチン、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡなどが挙げられる。
本発明の方法を適用することにより、迅速に癌のリンパ節転移や腹腔内転移等を診断することが可能となる。例えば、乳癌などは、ＱＯＬ（生活の質：Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）の向上のため、手術におけるリンパ節郭清範囲は可能な限り小さくすることが望ましい。また、食道癌では、リンパ節転移の部位により開腹、開胸、頚部切開の選択が必要になる。前立腺癌では、リンパ節転移があれば摘出手術は中止し、ホルモン療法を行うなどの手術の続行あるいは中止の意思決定がなされる。さらに、胃癌では、リンパ節への癌転移の有無により郭清範囲が異なり、術式が大きく変動し、術後の治療方針の指針、例えば抗癌剤の投与あるいは放射線療法の選択の指針となる。このような場合に、術中に採取した生体組織を用いて癌転移を迅速に診断することができれば、短い時間の手術においてもリンパ節郭清範囲決定、術式の変更、補助療法の選択などを行うことができ、患者にとって最適な治療を受けることが可能となる。本発明の検査システムを癌転移の術中迅速診断方法として適用することができる。
遺伝子関連の疾患としては、遺伝性疾患の検査、例えば加齢に伴い発症する遺伝性疾患の発症リスクの予測、具体的には緑内障、家族性大腸癌、高血圧、糖尿病などの発症リスクを判断する場合に適用される。また、ウイルス又は微生物の感染の有無の判断は、生体組織、例えば血液などに含まれる感染原因物質の核酸配列の有無を迅速に検査することができる。
（試薬、検査キット及び検査システム）
本発明は、直接核酸増幅方法を行うために必要な各種の試薬類、具体的には、生体試料処理液、逆転写酵素、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、本発明のために使用されるプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類を提供することができる。さらに、これらの試薬のうち生体試料処理液及び他の少なくとも１つの試薬を組み合わせてキットとして提供することができる。
本発明は、直接核酸増幅方法の他、生体試料処理方法、処理方法を含む核酸検出用試薬、キット及び核酸検出システム全体に及ぶ。また、本システムを適用する装置、癌転移の検査方法にも及ぶ。具体的には、例えば癌患者の手術中に、生体から採取した組織について本システムを適用することが可能であり、手術の間に他の組織への癌転移の確認をすることができる。
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
ＲＮＡを安定に保つ条件について検討した。
１）材料及び方法
（１）試料の調製
マウスからリンパ節をとり、ホモジナイザー及びブレンダーを用いて組織を粉砕し、均質化した組織を４℃で遠心分離（１２０００ｒｐｍ×５分）して上清をとった。市販の抽出用試薬（ＴＲＩＺＯＬ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて上清からＲＮＡを抽出した。
抽出して得たＲＮＡ  ５１３μｇ／ｍｌの水溶液について、以下の各種緩衝液注での保存安定性を調べた。各種緩衝液７μｌに、上記マウスＲＮＡ溶液２μｌを加え、室温で１０分間静置した。その後、電気泳動用緩衝液１μｌを加えてアガロースゲル電気泳動により、ＲＮＡの安定性を調べた。
（２）緩衝液
▲１▼２００ｍＭ塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ１．０）＋０．１％ノニデットＰ−４０（非イオン性界面活性剤：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）
▲２▼２００ｍＭ塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）＋０．１％ノニデットＰ−４０
▲３▼２００ｍＭ塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）＋０．１％ノニデットＰ−４０
▲４▼２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）＋０．１％ノニデットＰ−４０
▲５▼酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）＋０．１％ノニデットＰ−４０
▲６▼５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋０．１％ノニデットＰ−４０
▲７▼緩衝液を加えない場合（Ｈ２Ｏ）
（３）ＲＮＡの検出（アガロース電気泳動）
アガロースゲル電気泳動は、１％アガロース、ＴＥＡ緩衝液を用い、１レーンあたり１μｇとなるようにＲＮＡを添加し、通常の手法で行った。
２）結果
その結果を図１に示した。ｐＨ３．０より中性側の緩衝液中では、ＲＮＡは分解されず、安定であることが示された。ｐＨ２．２より酸性の緩衝液中では、ＲＮＡは分解され、ＲＮＡのバンドが認められなかった。
ｐＨ３．０の緩衝液がＲＮＡを安定化し、ＲＮＡ試料調製用緩衝液として最も効果的であることがわかった。
（実施例２）
乳癌患者からリンパ節を採取し、サイトケラチン（ＣＫ１８及びＣＫ１９）のｍＲＮＡの有無を、ヒト粗製ＲＮＡ試料及び精製ＲＮＡ試料についてＲＴ−ＰＣＲ法で確認した。
１）材料及び方法
（１）試料の調製
ヒトリンパ節を５０ｍＭ塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）＋０．１％ノニデットＰ−４０の緩衝液に懸濁し、ホモジナイザー及びブレンダーを用いて該ヒトリンパ節の組織を粉砕し、均質化した組織を４℃で遠心分離（１２０００ｒｐｍ×５分）して上清をとり、粗製ＲＮＡ試料とした。さらに、実施例１と同様に、市販の抽出用試薬（ＴＲＩＺＯＬ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて粗製ＲＮＡ試料からＲＮＡを抽出し、精製ＲＮＡ試料とした。
（２）使用したプライマー又はプローブの配列
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2003060116.tif 000003
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法
ＲＴ−ＰＣＲは、アプライドバイオシステムズ社のＲＴ−ＰＣＲマスター試薬を用いて行った。
測定キット：ＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）
ｃＤＮＡ合成：ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を用いて合成した。
▲１▼ＣＫ１８の増幅
逆転写用プライマー：配列番号１に記載のプライマーを用いた。
ＰＣＲ用プライマー：配列番号１及び２に記載のプライマーを各々最終濃度３００ｎＭとなるように用いた。
ＤＮＡポリメラーゼ：Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
▲２▼ＣＫ１９の増幅
逆転写用プライマー：配列番号３に記載のプライマーを用いた。
ＰＣＲ用プライマー：配列番号３に記載のプライマーを最終濃度３００ｎＭ及び配列番号４に記載のプライマーを最終濃度９００ｎＭとなるように用いた。
ＤＮＡポリメラーゼ：Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
▲３▼ＰＣＲ処理
４８℃で３０分間逆転写反応後、９５℃で１０分間保持した。
その後、９５℃：１５秒間、６０℃：１分間のＰＣＲ操作を４０サイクル行った。
（４）核酸の検出
ヒトＣＫ１８及びＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅産物を標的２本鎖ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＴａｑＭａｎプローブによる蛍光法により検出した。ＴａｑＭａｎプローブは、ＣＫ１８には配列番号５、ＣＫ１９には配列番号６のオリゴヌクレオチドで、各々５’末端にＦＡＭ、３’末端にＴＡＭＲＡをラベルしたものを用いた。アプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いて、反応液中の蛍光強度の増加をリアルタイムで測定した。
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２）結果
以上の結果、臨床的な結果（ＨＥ染色組織診）とＲＴ−ＰＣＲによる測定結果が一致し、ＣＫ１８及びＣＫ１９のｍＲＮＡについて各々増幅が認められた。また、粗製ＲＮＡ試料についてもｍＲＮＡから３００及び１９００コピーの核酸の増幅が認められた（表１）。
このことから、試料調製用液としてノニデットＰ−４０を含むｐＨ３．０の緩衝液を使用すると、ＲＮＡを抽出することなくＲＴ−ＰＣＲ法において増幅が認められ、結果としてＲＮＡ検出に要する時間が短縮可能となった。
（実施例３）
乳癌患者からヒトリンパ節を採取し、ＨＥ染色により臨床的に癌転移が認められている検体について乳癌のマーカーであるＣＫ１９ｍＲＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ法で検出した。
１）材料及び方法
（１）試料の調製
ヒトリンパ節を緩衝液に懸濁し、ホモジナイザー及びブレンダーを用いて組織を可溶化した。均質化した組織を４℃で遠心分離（１２０００ｒｐｍ×５分）して上清（ライセート）をとり、粗製ＲＮＡ試料とした。組織の懸濁に５０ｍＭ塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）＋０．１％ノニデットＰ−４０の緩衝液又は５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）緩衝液を用いた。さらに実施例１及び２と同様に、市販の抽出用試薬（ＴＲＩＺＯＬ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて粗製ＲＮＡ試料からＲＮＡを抽出し、精製ＲＮＡ試料とした。
（２）ＲＴ−ＬＡＭＰ法による増幅
ＣＫ１９の増幅は、次の配列：７〜１２に示す６種のプライマーを含む以下の組成に粗製ＲＮＡ溶液あるいは精製ＲＮＡ溶液２μｌを添加し、６５℃で１時間加温して行った。
（３）プライマー
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（４）反応液組成
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（５）核酸の検出
ヒトＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅産物を２本鎖ＤＮＡに特異的に結合するエチジウムブロマイドによる蛍光法により検出した。反応液中の蛍光強度の変化はプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いてリアルタイムに測定した。
２）結果
調製用緩衝液として、塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）＋ノニデットＰ−４０を使用した場合の結果及びグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）緩衝液を使用した場合の、各ＲＴ−ＬＡＭＰ法により核酸増幅処理を行った結果を図２及び図３に示した。
グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）緩衝液の場合は、精製したＲＮＡ試料では増幅が認められたが、粗製ＲＮＡ試料の場合には増幅されなかった。一方、塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）＋ノニデットＰ−４０緩衝液の場合は、精製ＲＮＡ試料及び粗製ＲＮＡ試料のいずれにおいても増幅が認められた。
このことから、調製用緩衝液として、ノニデットＰ−４０を含むｐＨ３．０の緩衝液を使用すると、ＲＮＡを精製することなくＲＴ−ＬＡＭＰ法において増幅が認められ、結果としてＲＮＡ検出に要する時間が短縮可能となった。
（実施例４）
リンパ節検体を破砕して可溶化する際に塩類を添加し、粗製ＲＮＡ試料を用いて増幅反応を行う際の夾雑物による増幅の阻害を低減する条件について検討した。
１）材料および方法
（１）試料の調製
マウスリンパ節を緩衝液中でブレンダーを用いて破砕し、均質化した。また、これとは別に培養細胞（ＫＡＴＯＩＩＩ）を緩衝液中で可溶化し、均質化した。均質化したこれらの溶液を混合し、粗製ＲＮＡ試料として用いた。これらの均質化には、１００ｍＭのトリフルオロ酢酸セシウムを含むあるいは含まない１％ノニデットＰ−４０含有２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）緩衝液を用いた。
（２）ＲＴ−ＬＡＭＰによる増幅
ＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅は、次の配列：７〜１０に示す４種のプライマーを含む以下の組成にて、６５℃で１時間加温して行った。各反応液には、上記ＫＡＴＯＩＩＩ細胞培養細胞可溶化試料およびマウスリンパ節可溶化試料を適当な比率で混合し、一反応液にＫＡＴＯＩＩＩ細胞２０個に相当する試料が入り、また、夾雑物量のパラメーターとして共存タンパク量が設定した量になるように調製した。
（３）プライマー
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（４）反応液組成
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（５）核酸の検出
反応系に共存させたエチジウムブロマイドの蛍光により検出した。アプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いて、反応液中の蛍光強度の変化をリアルタイムに測定した。
２）結果
粗製ＲＮＡ試料を調製するための緩衝液として、１００ｍＭトリフルオロ酢酸セシウムおよび１％ノニデットＰ−４０を含む２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）緩衝液を使用した場合の結果およびトリフルオロ酢酸セシウムを含まず１％ノニデットＰ−４０を含む２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）緩衝液を使用した場合の結果を図４に示す。横軸には、一反応液中に含まれる夾雑タンパク量を示し、縦軸にはＤＮＡ増幅の立ち上がり時間を示す。粗製ＲＮＡ試料を調製するための緩衝液中に１００ｍＭのトリフルオロ酢酸セシウムが存在する場合には、一反応液中の夾雑タンパク量が８μｇ近くにまで増えてもＤＮＡ増幅の立ち上がり時間はほとんど変化しない。これに対し、トリフルオロ酢酸セシウムが存在しない場合は、夾雑タンパクの量が増えるにつれて明らかにＤＮＡ増幅の立ち上がり時間は遅延する。すなわち、核酸増幅反応が夾雑タンパクにより阻害されていることを示す。これらのことから粗製ＲＮＡ試料調製用緩衝液に１００ｍＭトリフルオロ酢酸セシウムを含有させることで夾雑タンパクによる増幅反応の阻害を低減することができ、結果として一反応液に添加できる粗製ＲＮＡ試料溶液を増やすことができ、感度の向上が可能となった。
（実施例５）
リンパ節検体から調製した粗製ＲＮＡ試料を用いて増幅反応を行う際にＲＮａｓｅインヒビターを添加することでＲＮａｓｅによる標的ｍＲＮＡの分解を防ぎ、検出感度の向上を図ることを検討した。
１）材料および方法
（１）試料の調製
乳癌患者リンパ節を１００ｍＭのトリフルオロ酢酸セシウムを含むあるいは含まない１％ノニデットＰ−４０含有２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）緩衝液中でブレンダーを用いて破砕し、均質化した。均質化したこの溶液をそのままあるいは、均質化に用いた緩衝液を用いて５倍、あるいは５０倍に希釈して粗製ＲＮＡ試料として用いた。
（２）ＲＴ−ＬＡＭＰ法による増幅
β−アクチンの増幅は、次の配列番号１３〜１８に示す６種のプライマーを含む以下の組成に上記粗製ＲＮＡ試料２μｌを添加し、６５℃で１時間加温して行った。
（３）プライマー
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（４）反応液組成
2003060116.tif 000013
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（５）核酸の検出
増幅産物は反応系に共存させたエチジウムブロマイドの蛍光により検出した。アプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いて、反応液中の蛍光強度の変化をリアルタイムに測定した。
２）結果
増幅反応液にＲＮａｓｅインヒビターを添加した場合と添加していない場合の結果を図５及び図６に示す。横軸には、反応時間を示し、縦軸には蛍光強度を示す。反応液中にＲＮａｓｅインヒビターを含む場合にはヒトリンパ節を均質化して調製した粗製ＲＮＡ試料、５倍希釈した試料、５０倍希釈した試料についても阻害がかからず、増幅反応が起こることがわかる。これに対して、反応液中にＲＮａｓｅインヒビターが含まれない場合には、増幅反応に阻害がかかり、特に希釈していない粗製ＲＮＡ試料を用いた場合には、増幅がほとんど起こらないことがわかる。これらのことから反応液中に２５ＵのＲＮａｓｅインヒビターを添加させることで粗製ＲＮＡ試料中に含まれる夾雑物による増幅反応の阻害を低減することができ、結果として一反応液に添加できる粗製ＲＮＡ試料溶液を増やすことができ、感度の向上が可能となった。
（実施例６）
リンパ節検体を破砕し、均質化する緩衝液中に１００ｍＭトリフルオロ酢酸セシウムを含み、増幅反応液中に２５ＵのＲＮａｓｅインヒビターを含む条件で実際に乳癌患者リンパ節を用いてこれらを添加することの効果を確認した。
１）材料および方法
（１）試料の調製
乳癌患者リンパ節を１００ｍＭのトリフルオロ酢酸セシウムを含むあるいは含まない１％ノニデットＰ−４０含有２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）緩衝液中でブレンダーを用いて破砕し、均質化した。均質化したこの溶液を均質化に用いた緩衝液を用いて５倍希釈し粗製ＲＮＡ試料として用い、ＲＴ−ＬＡＭＰによる増幅反応を行った。また、粗製ＲＮＡ試料中に含まれるＣＫ１９ｍＲＮＡのコピー数を測定するために粗製ＲＮＡ試料から実施例１と同様に、市販の抽出用試薬（ＴＲＩＺＯＬ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いてＲＮＡを抽出精製し、精製ＲＮＡ試料としてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは実施例１と同様の条件にて行った。
（２）ＲＴ−ＬＡＭＰによる増幅
ＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅は、次の配列：７〜１２に示す６種のプライマーを含む以下の組成にて、６５℃で１時間加温して行った。トリフルオロ酢酸セシウム共存下で均質化した粗製ＲＮＡ試料を用いる場合には反応液中にＲＮａｓｅインヒビターを添加して増幅反応を行った。
（３）プライマー
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（４）反応液組成
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（５）核酸の検出
増幅産物は反応系に共存させたエチジウムブロマイドの蛍光により検出した。アプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いて、反応液中の蛍光強度の変化をリアルタイムに測定した。
２）結果
増幅反応液にトリフルオロ酢酸セシウムおよびＲＮａｓｅインヒビターを添加した場合と添加していない場合の結果を表２に示す。表の左半分にはトリフルオロ酢酸セシウムおよびＲＮａｓｅを含まない場合の結果を示す。右半分にはトリフルオロ酢酸セシウムおよびＲＮａｓｅの両者を用いた場合の結果を示す。両者を持ちない場合には４検体についてＲＴ−ＬＡＭＰによりＣＫ１９ｍＲＮＡを検出することができなかったが、両者を用いた場合には４検体中３検体についてＣＫ１９ｍＲＮＡを増幅して検出することができた。このことから実際のヒトリンパ節検体について破砕・可溶化する際にトリフルオロ酢酸を共存させ、反応液中にＲＮａｓｅインヒビターを添加することが検出感度の向上に有効であることが確認できた。
2003060116.tif 000018
（実施例７）
血清検体を直接用いたＲＴ−ＰＣＲを用いてトリフルオロ酢酸セシウムの効果を確認した。
１）材料及び方法
（１）試料の調製
ヒト血清にｐＨ８．０の２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液あるいは１００ｍＭトリフルオロ酢酸セシウムを含む２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）を加え、さらにＫＡＴＯＩＩＩ細胞由来の精製ＲＮＡ試料を添加しＲＮＡ試料として用いた。試料中のタンパク量は０から３３μｇ／μｌとなるように調整した。また、ＣＫ１９ｍＲＮＡは全てのＲＮＡ試料中５０００コピー／μｌとなるように調整した。
（２）使用したプライマーおよびプローブの配列
2003060116.tif 000019
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法
ＲＴ−ＰＣＲは、アプライドバイオシステムズ社のＲＴ−ＰＣＲマスター試薬を用いて行った。
測定キット  ：ＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）
ｃＤＮＡ合成：ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を用いて合成した。
▲１▼ＣＫ１９の増幅
逆転写用プライマー：配列番号１９に記載のプライマーを用いた。
ＰＣＲ用プライマー：配列番号１９に記載のプライマーを最終濃度３００ｎＭ及び配列番号２０に記載のプライマーを最終濃度９００ｎＭとなるように用いた。
ＤＮＡポリメラーゼ：Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
▲３▼ＰＣＲ処理
４８℃で３０分間逆転写反応後、９５℃で１０分間保持した。
その後、９５℃：１５秒間、６０℃：１分間のＰＣＲ操作を４０サイクル行った。
（４）核酸の検出
ヒトＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅産物を標的２本鎖ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＴａｑＭａｎプローブによる蛍光法により検出した。ＴａｑＭａｎプローブは、ＣＫ１９には配列番号２１のオリゴヌクレオチドで、各々５’末端にＦＡＭ、３’末端にＴＡＭＲＡをラベルしたものを用いた。アプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いて、反応液中の蛍光強度の増加をリアルタイムで測定した。
２）結果
血清成分を含むＲＮＡ試料をトリフルオロ酢酸セシウム含有緩衝液（ｐＨ３）で調製した場合の結果、及び中性緩衝液（ｐＨ８）で調製した場合のＲＴ−ＰＣＲの結果を図７に示す。図中の四角のプロットはトリフルオロ酢酸セシウムを含む酸性緩衝液（ｐＨ３）を用いた場合、ひし形のプロットは中性緩衝液（ｐＨ８）を用いた場合の結果を示す。また、縦軸にはＲＴ−ＰＣＲ反応における増幅の立ち上がりサイクル数、横軸には反応液中に存在する血清タンパク量を示す。血清タンパクが含まれる場合、中性緩衝液で調製したＲＮＡ試料では増幅反応の阻害が起こり増幅の立ち上がりサイクル数が増えるが、トリフルオロ酢酸セシウムを含む酸性緩衝液で調製したＲＮＡ試料では阻害の程度が小さくサイクル数はあまり増えないことがわかる。これらのことからトリフルオロ酢酸セシウムを含有する酸性緩衝液（ｐＨ３）を用いてＲＮＡ試料を調製することはＲＴ−ＬＡＭＰによる増幅における反応阻害の防止に有効であるだけにとどまらず、ＲＴ−ＰＣＲ反応にも有効であることが確認できた。
産業上の利用可能性
以上説明したように、核酸を増幅してＲＮＡを検出する方法において、本発明の検体の調製条件により、ＲＴ−ＰＣＲ法及びＲＴ−ＬＡＭＰ法において、粗製ＲＮＡ試料でも測定可能であることが確認され、核酸増幅手段を用いた測定時間の短縮化が達成できた。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、抽出したＲＮＡの安定性を示した説明図である（実施例１）。
第２図は、塩化カリウム−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）＋０．１％ノニデットＰ−４０緩衝液で調製した検体について、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＣＫ１９ｍＲＮＡの遺伝子産物増幅タイムコースを示した説明図である（実施例３）。
第３図は、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）緩衝液で調製した検体について、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＣＫ１９ｍＲＮＡの遺伝子産物増幅タイムコースを示した説明図である（実施例３）。
第４図は、トリフルオロ酢酸セシウム添加の有無によるＣＫ１９ｍＲＮＡの遺伝子産物の増幅立ち上がり時間を比較した図である（実施例４）。
第５図および第６図は、ＲＮａｓｅインヒビターの添加の有無によるβ−アクチンｍＲＮＡの遺伝子産物増幅を比較した図である（実施例５）。
第７図は、緩衝液のｐＨの違いによるＣＫ１９ｍＲＮＡの遺伝子産物の増幅立ち上がりサイクル数を比較した図である（実施例７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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