(57)【要約】液体中のサイトカインを効率よく吸着除去することが可能な吸着材、ならびに吸着材により液体中のサイトカインを除去する方法を提供する。また、液体中のサイトカインを除去するための吸着器を提供する。水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなるサイトカインの吸着材を得る。このサイトカイン吸着材にサイトカインを含有する液体を接触させることにより液体中のサイトカインを効率よく吸着除去することができる。さらに、液の入口、出口を有し、かつサイトカイン吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填した吸着器により効率よくサイトカインを吸着除去することができる。
2003055545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなる、インターロイキン−４、インターロイキン−１０およびインターロイキン−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着材。
【請求項２】
該水不溶性担体が水不溶性多孔質担体であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の吸着材。
【請求項３】
水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなる、インターロイキン−４、インターロイキン−１０およびインターロイキン−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着材に、体液を接触させることを特徴とする、体液中のインターロイキン−４、インターロイキン−１０およびインターロイキン−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの除去方法。
【請求項４】
液の入口および出口を有し、かつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなる、インターロイキン−４、インターロイキン−１０およびインターロイキン−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着材を充填してなる前記の少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着器。
【請求項５】
体液からインターロイキン−４、インターロイキン−１０およびインターロイキン−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着除去するための、水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなる吸着材の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は体液よりインターロイキン−４（以下、ＩＬ−４という）、インターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０という）およびインターロイキン−１３（以下、ＩＬ−１３という）からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着除去するための吸着材、これを用いた前記サイトカインの吸着除去方法および前記サイトカインの吸着器に関する。
背景技術
免疫担当細胞は免疫応答を引き起こす際に種々の活性物質を産生する。その一部はサイトカインと呼ばれるタンパク質性物質であり、種々の抗原特異的、非特異的免疫炎症反応に深く関わる生体防御因子として非常に重要な役割を果たしている。本来サイトカインは生体の恒常性の維持に必要不可欠なものであるが、炎症などの病態では過剰に産生され、炎症の病態形成、遷延に関わっている。
ＩＬ−４は１９８２年にＨｏｗａｒｄとＰａｕｌにより、またＶｉｔｅｔｔａらによって、Ｂ細胞を活性化する因子として報告された物質である。その後Ｂ細胞以外の細胞にも作用することが明らかとなりＩＬ−４という名称になった。ＩＬ−４は分子量２０ｋＤａの糖タンパク質である。ＩＬ−４の産生細胞としては、Ｔ細胞や肥満細胞などが知られている。ＩＬ−４の機能として、Ｂ細胞の活性化、分化および増殖の誘導、Ｔ細胞の増殖およびＴｈ２細胞への分化の誘導、胸腺細胞増殖誘導、ＮＫ細胞およびＬＡＫ細胞の活性誘導、好酸球性抗腫瘍作用、マクロファージ抗炎症性作用、肥満細胞増殖誘導、線維芽細胞・血管内皮細胞接着分子発現増強、ならびに造血系細胞コロニー形成促進といった多くのものがある。
ＩＬ−１０は１９８９年にＭｏｓｍａｎｎらによりサイトカイン産生を抑制する因子として同定された物質である。当初、ＩＬ−１０はサイトカイン産生抑制因子と呼ばれていたが、これ以外にも多彩な活性を有することが判明しＩＬ−１０と改名された。ＩＬ−１０は分子量３５から４０ｋＤａの同型二量体の糖タンパク質である。ＩＬ−１０の産生細胞としては、Ｔｈ０／Ｔｈ２細胞、活性化Ｔ細胞、単球／マクロファージ、活性化Ｂ細胞、メラニン細胞などが知られている。ＩＬ−１０の機能としては、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生の抑制、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｂ細胞の増殖の誘導、単球ＡＤＣＣ活性の増強、および単球／マクロファージのモノカイン産生抑制といったものがある。
ＩＬ−１３は１９９３年にフランスのＭｉｎｔｙらおよびアメリカのＢｒｏｗｎらによりクローニングされた物質である。ＩＬ−１３遺伝子をＣＯＳ細胞に導入すると分子量１７ｋＤａの糖タンパク質として発現される。ＩＬ−１３の産生細胞としては活性化Ｔ細胞が知られている。ＩＬ−１３の機能としては、ＬＰＳで刺激した単球における炎症性サイトカインの産生抑制、単球の生存日数延長、ならびに単球およびＢ細胞表面でのＣＤ２３およびＭＨＣクラスＩＩの発現誘導といったものがある。
これらＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３といったサイトカインは抗炎症性サイトカインと呼ばれ、その機能として、マクロファージ抗炎症性作用、単球／マクロファージのモノカイン産生抑制、ＬＰＳで刺激した単球における炎症性サイトカインの産生抑制といった抗炎症的な作用を、共通に有している。
近年、侵襲に対して引き起こされる過剰な生体反応を全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）という新しい概念で包括される病態においては、インターロイキン−１（以下、ＩＬ−１という）、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６という）、インターロイキン−８（以下、ＩＬ−８という）および腫瘍壊死因子−α（以下、ＴＮＦ−αという）といった炎症性サイトカインと呼ばれるタンパク質が過剰に産生され、これらの作用が中心となって全身性の炎症反応が進行し、組織障害および多臓器不全が出現し、ひいては死にいたることが報告されている。
抗炎症性サイトカインはこれら炎症性サイトカインの働きを抑えるとされてきたが、最近、代償性抗炎症性反応症候群（ＣＡＲＳ：ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）という概念で包括される病態においては、過剰な抗炎症性サイトカインが産生され、その結果、免疫反応の抑制が起こり易感染状態となる。そのため敗血症などのように感染があった場合には、臓器障害が併発される。
いずれにしてもサイトカインは本来局所で働くべきものであって、血液中の濃度が上昇することは人体にとって好ましくない。そこで、血液中からこれらサイトカインを除去する方法が望まれている。
炎症性サイトカインと呼ばれる、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αを除去する吸着材については既に開示されている（特開平０８−２５７１１５、特開平０８−２５７３９８）。この中で、水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定してなる吸着材でこれらの炎症性サイトカインが吸着除去できることが示されている。
本発明では、この水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定してなる吸着材で、炎症についての生理活性の性質が前記炎症性サイトカインとは正反対である抗炎症性サイトカインの吸着除去が可能であることを新たに見出した。
本発明の目的は、体液中のＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去しうる吸着材、前記吸着材を用いた溶液中のサイトカインの吸着除去方法およびサイトカイン吸着器を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、体液中のＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去しうる吸着材について鋭意検討した。その結果、水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を固定してなる吸着材が体液中のＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去しうることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系の分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなるＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの吸着材に関する。
好適な実施態様においては、前記水不溶性担体は水不溶性多孔質担体である。
さらに本発明は、水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなる、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの吸着材に、体液を接触させることを特徴とする、体液中のＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの除去方法に関する。
さらに本発明は、液の入口および出口を有し、かつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．５０以上の化合物を固定してなる、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの吸着材を充填してなる前記の少なくとも一種のサイトカインの吸着器に関する。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において「ＩＬ−４」は、分子量が約２０ｋＤａの糖タンパク質である。
また、本明細書において「ＩＬ−１０」は、分子量が約３５から４０ｋＤａの同型二量体の糖タンパク質である。
さらに本明細書において「ＩＬ−１３」は、分子量が約１７ｋＤａの糖タンパク質である。
さらに本明細書において体液とは、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらから得られた分画成分、ならびにそのほかの生体由来の液体成分をいう。
本発明の吸着材は、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を水不溶性多孔質担体に固定化してなる。ｌｏｇＰ値とは、化合物の疎水性のパラメータであり、代表的なオクタノール−水系での分配係数Ｐは以下のように求められる。まず、化合物をオクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等量の水（もしくはオクタノール）を加え、グリッフィン・フラスク・シェイカー（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｆｌａｓｋ  ｓｈａｋｅｒ）（グリッフィン・アンド・ジョージ・リミテッド（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＆  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｌｔｄ．）製）で３０分間振盪する。そののち２０００ｒｐｍで１〜２時間遠心分離し、オクタノール層および水層中の化合物の各濃度を、室温、大気圧下において分光学的またはＧＬＣなどの種々の方法で測定することにより次式から求められる。
Ｐ＝Ｃｏｃｔ／Ｃｗ
Ｃｏｃｔ：オクタノール層中の化合物濃度
Ｃｗ    ：水層中の化合物濃度
本発明の吸着体は、前記のようにして求められるｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を水不溶性担体に固定してなる。
これまでに多くの研究者らにより種々の化合物のｌｏｇＰ値が実測されているが、それらの実測値はシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らによって整理されている（「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ  ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＴＨＥＩＲ  ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」参照）。
また実測値の知られていない化合物についてはアール・エフ・レッカー（Ｒ．Ｆ．Ｒｅｋｋｅｒ）がその著書「ザ・ハイドロフォビック・フラグメンタル・コンスタント（ＴＨＥ  ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ  ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＬ  ＣＯＮＳＴＡＮＴ）」，エルセビア・サイエンティフィック・パブリッシング・カンパニー・アムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．Ｃｏｍ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９７７）中に示している疎水性フラグメント定数ｆを用いて計算した値（Σｆ）が参考となる。疎水性フラグメント定数は数多くのｌｏｇＰ実測値をもとに、統計学的処理を行い決定された種々のフラグメントの疎水性を示す値であり、化合物を構成するおのおののフラグメントのｆ値の和はｌｏｇＰ値とほぼ一致すると報告されている。
ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなるサイトカインの吸着に有効な化合物の探索にあたり、２．５０以上のｌｏｇＰ値を有する化合物を水不溶性担体に固定した結果、化合物としてヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）を水不溶性担体に固定した場合、吸着能は非常に高いことがわかった。この結果より、本発明の吸着材による前記サイトカイン吸着は、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物の固定により担体上に導入された原子団と前記サイトカインとのあいだの疎水性相互作用によるものと考えられる。
本発明において、水不溶性担体に固定化される化合物としては、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物であれば特別な制限なしに用いることができる。ただし、担体上に化合物を化学結合法によって結合する場合、化合物の一部が脱離することが多い。この脱離基が化合物の疎水性に大きく寄与している場合、すなわち脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．５０より小さくなるような場合には、本発明の主旨から考えて、本発明に用いる化合物としては不適当である。この代表例の一つとして、安息香酸イソペンチルエステル（Σｆ＝４．１５）をエステル交換により水酸基を有する担体上に固定する場合があげられる。この場合実際に担体上に固定される原子団はＣ６Ｈ５ＣＯ−であり、この原子団のΣｆは１以下である。このような化合物が本発明で用いる化合物として適当かどうかは、脱離基の部分を水素に置き換えた化合物のｌｏｇＰ値が２．５０以上かどうか、または、脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．５０以上であるかにより判断すれば良い。
ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物の中でも不飽和炭化水素、アルコール、アミン、チオール、カルボン酸およびその誘導体、ハロゲン化物、アルデヒド、ヒドラジド、イソシアナート、グリシジルエーテルなどのオキシラン環含有化合物、ハロゲン化シラン等のように担体への結合に利用できる官能基を有する化合物が好ましい。この様な化合物の代表例としてはｎ−ヘプチルアミン、ｎ−オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、２−アミノオクテン、ナフチルアミン、フェニル−ｎ−プロピルアミン、ジフェニルメチルアミンなどのアミン類、ｎ−ヘプチルアルコール、ｎ−オクチルアルコール、ドデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、１−オクテン−３−オール、ナフトール、ジフェニルメタノール、４−フェニル−２−ブタノールなどのアルコール類ならびにこれらのアルコールのグリシジルエーテル類、ｎ−オクタン酸、ノナン酸、２−ノネン酸、デカン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ジフェニル酢酸、フェニルプロピオン酸などのカルボン酸類ならびにこれらの酸ハロゲン化物、エステル、アミドなどのカルボン酸誘導体、塩化オクチル、臭化オクチル、塩化デシル、塩化ドデシルなどのハロゲン化物、オクタンチオール、ドデカンチオールなどのチオール類、ｎ−オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシランなどのハロゲン化シラン類、ｎ−オクチルアルデヒド、ｎ−カプリンアルデヒド、ドデシルアルデヒドなどのアルデヒド類などがあげられる。
これらの他にも、前記の例示化合物の炭化水素部分の水素原子がハロゲン、窒素、酸素、イオウなどのヘテロ原子を含有する置換基、他のアルキル基などで置換された化合物のうち、ｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物、前述のシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らの総説「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ  ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＴＨＥＩＲ  ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」中の５５５ページから６１３ページの表に示されているｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物などを用いることができるが、本発明においてはこれらのみに限定されるものではない。
なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を組み合わせてもよく、さらにはｌｏｇＰ値が２．５０未満の化合物との組み合わせで用いてもよい。
本発明の吸着材における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり水不溶性であることを意味する。また、本発明における水不溶性担体は粒状、板状、繊維状、中空糸状等があるが形状は問わず、その大きさもとくに限定されない。
たとえば、本発明の吸着材が粒状である場合、平均粒子径は５μｍ以上、１０００μｍ以下であることが好ましい。平均粒子径が５μｍより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に細胞が通過し得る間隔が得られない傾向にある。平均粒子径が１０００μｍをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から平均粒径は２５μｍ以上、１０００μｍ以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から４０μｍ以上、６００μｍ以下が特に好ましい。特に、体液が血液である場合には、血球が通過しやすい点から平均粒径は２００μｍ以上、１０００μｍ以下であることが好ましく、吸着能が得られる点から２００μｍ以上、６００μｍ以下がさらに好ましい。また、圧力損失の増大を引き起こさないなどの理由から、粒径分布は狭い方が好ましい。
また、本発明の吸着材が繊維状でかつ中空である場合、その内径は１μｍ以上、５００μｍ以下であることが好ましい。内径が１μｍより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に細胞が通過しない傾向にある。内径が５００μｍをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から内径が２μｍ以上、５００μｍ以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から５μｍ以上、２００μｍ以下が最も好ましい。
本発明の吸着材における水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例としてあげられる。
なかでも、親水性担体が非特異吸着が比較的少なく、サイトカインの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水の接触角が６０度以下の担体を指す。水の接触角の測定方法は種々知られているが、たとえば池田がその著書（実験化学選書・コロイド化学，第４章，界面の熱力学，７５頁から１０４頁，裳華房（１９８６））に示しているごとく、化合物の平板上に水滴を置き測定する方法が最も一般的である。上記の方法で測定した水の接触角が６０度以下である化合物としては、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。
これらの水不溶性担体は、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち多孔構造を有する担体であることがより好ましい。多孔構造を有する担体には、基礎高分子母体が微小球の凝集により１個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間（マクロポアー）を有する担体だけでなく、基礎高分子母体を構成する１個の微小球内の核と核との集塊の間に形成される細孔を有する担体、あるいは三次元構造（高分子網目）を有する共重合体が親和性のある有機溶媒で膨潤された状態の時に存在する細孔（ミクロポアー）を有する担体が含まれる。
また吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体は、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。
これらの好ましい要件を満たす担体として、多孔質セルロースゲルがあげられる。多孔質セルロースゲルは、（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合体液を高速で流しても圧密化したりしないので高流速で流すことが可能となり、また細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい、（２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基を多数存在し、非特異的吸着も少ない、（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量が得られる、（４）安全性が合成高分子ゲル等に比べて高いなどの優れた点を有しており、本発明に用いる最も適した担体の１つである。しかしながら本発明においてはこれらのみに限定されるものではなく、さらに上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
またこのような多孔構造を有する水不溶性担体は、吸着対象の物質はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他のタンパク質の侵入はできる限り起こらない特徴を有することがより好ましい。すなわち本発明の吸着材の吸着対象であるＩＬ−４は分子量約２０ｋＤａのタンパク質であり、ＩＬ−１０は分子量約３５から４０ｋＤａのタンパク質、さらにＩＬ−１３は分子量約１７ｋＤａのタンパク質であるため、これらのタンパク質を効率よく吸着するためには前記サイトカインはある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他のタンパク質の侵入はできる限り起こらないことがより好ましい。細孔内に侵入可能な物質の分子量の目安としては、排除限界分子量が一般に用いられている。排除限界分子量とは成書（たとえば、波多野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人）などに述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子の内最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。排除限界分子量は一般に球状タンパク質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられているが、本発明に用いる担体の場合、球状タンパク質を用いて得られた値を用いるのが適当である。
種々の排除限界分子量の担体を用いて検討した結果、前記サイトカインの吸着に適当な球状タンパク質の排除限界分子量の範囲は５千以上６０万以下であることが明らかとなった。すなわち球状タンパク質の排除限界分子量が５千未満である担体を用いた場合には、前記サイトカインの吸着量は小さくその実用性が低下し、また６０万を超えるものでは、前記サイトカイン以外のタンパク質（主としてアルブミン）の吸着が大きくなり、選択性の点でその実用性が低下する。従って本発明に用いる担体の球状タンパク質の排除限界分子量は５千以上、６０万以下が好ましい。より効果的な吸着量と選択性が得られる点から６千以上、４０万以下がさらに好ましく、１万以上、３０万以下が最も好ましい。
さらに、担体にはリガンドの固定化反応に用いうる官能基を有していることが好ましい。これらの官能基の代表例としては水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、スクシニルイミド基、酸無水物基などがあげられるが、これらに限定されるわけではない。
本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環用の吸着材として使用する場合には、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要であり、そのためには充分な機械的強度が要求される。したがって本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。ここでいう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルの場合、後記参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ２までの直線関係にあるものをいう。
本発明の吸着材はｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物を水不溶性多孔質担体に固定して得られるが、その固定化方法としては公知の種々の方法を特別な制限なしに用いることができる。しかしながら、本発明の吸着材を体外循環治療に供する場合には、滅菌時あるいは治療時においてのリガンドの脱離溶出を極力抑えることが安全上重要であり、そのためには共有結合法により固定化することが好ましい。
本発明の吸着材におけるｌｏｇＰ値が２．５０以上の化合物の固定量は、１μｍｏｌ／ｇ−湿重量以上、５０００μｍｏｌ／ｇ−湿重量以下が好ましい。固定量が１μｍｏｌ／ｇ−湿重量より少ないと、前記サイトカインの吸着が充分でなくなる傾向にある。固定量が５０００μｍｏｌ／ｇ−湿重量をこえると、液体が血液である場合に、血小板などの粘付着が起こる傾向にある。効果的な吸着能力があり、血小板付着がより少ないという点から５μｍｏｌ／ｇ−湿重量以上、３０００μｍｏｌ／ｇ−湿重量以下がさらに好ましい。
本発明による吸着材を用いて体液中より前記サイトカインを吸着除去する方法には種々の方法がある。最も簡便な方法としては体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着材を混合して前記サイトカインを吸着除去した後、吸着材を濾別して前記サイトカインが除去された体液を得る方法がある。次の方法は体液の入口と出口を有し、出口には体液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法がある。いずれの方法も用いることができるが、後者の方法は操作も簡便であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液、とくに血液から効率よくオンラインで前記サイトカインを除去することが可能であり、本発明の吸着材はこの方法に適している。
ここでいう体外循環回路では本発明の吸着材を単独で用いることもできるが、他の体外循環治療システムとの併用も可能である。併用の例としては、人工透析回路などがあげられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。
つぎに、前記サイトカイン吸着材を用いた本発明のサイトカイン吸着器を、一実施例の概略断面図である図１に基づき説明する。図１中、１は液体の流入口、２は液体の流出口、３は本発明のサイトカイン吸着材、４および５は液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記サイトカイン吸着材は通過できないフィルター、６はカラム、７はサイトカイン吸着器を示す。しかしながら、サイトカイン吸着器はこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口、出口を有し、かつサイトカイン吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填したものであれば、どのようなものでもよい。
前記流出防止具には、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターがあげられる。また、容器の形状、材質、大きさにはとくに限定はないが、形状としては筒状容器が好ましい。容器の材質として好ましいのは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。容器の容量は５０ｍｌ以上、１５００ｍｌ以下で、直径は２ｃｍ以上、２０ｃｍ以下が好ましい。容器の容量が５０ｍｌより小さいと吸着量が充分でなく、１５００ｍｌより大きいと体外循環量が多くなるので好ましくない。容器の直径が２ｃｍより小さいと線速が大きくなるため圧力損失が大きくなり好ましくない。２０ｃｍより大きいと取り扱いにくくなるうえ線速が小さくなるため凝固の危険性があり好ましくない。効果的な吸着量があり、安全性に優れているという点から容量は１００ｍｌ以上、８００ｍｌ以下で、直径は３ｃｍ以上、１５ｃｍ以下がさらに好ましく、容量は１５０ｍｌ以上、４００ｍｌ以下で、直径は４ｃｍ以上、１０ｃｍ以下が特に好ましい。
以下、実施例において本発明についてさらに詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
参考例
両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）にアガロース材料（バイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製のＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系高分子材料（東ソー（株）製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１００μｍ）およびセルロース材料（チッソ（株）製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を図２に示す。
図２に示すごとく、トヨパールＨＷ−６５およびセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、ＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。本明細書においては前者のごとく、圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ２までの直線関係にあるものを硬質材料という。
実施例１
セルロース系多孔質ゲルであるセルロファインＧＣ−２００ｍ（チッソ（株）製、粒径４５〜１０５μｍ、球状タンパク質の排除限界分子量１４０，０００）１７０ｍｌに水を加えて全量３４０ｍｌとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０ｍｌを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン３１ｍｌを加え、４０℃で攪拌下２時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ化ゲルを得た。
このエポキシ化ゲル１０ｍｌにｎ−ヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）２００ｍｇを加え、エタノール中、４５℃で静置下、６日間反応させ、固定化した。反応終了後、エタノール、水の順に充分洗浄し、ｎ−ヘキサデシルアミン固定化ゲルを得た（ｎ−ヘキサデシルアミン固定量：４５μｍｏｌ／ｇ−湿重量）。
この固定化ゲル０．５ｍｌに対し、健常人血清（大日本製薬（株）製）にヒト遺伝子組換えＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３（いずれもアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を加えて調製したサイトカイン加健常人血清３ｍｌを加え、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後の上清の各サイトカイン濃度をヒトＩＬ−４測定キット、ヒトＩＬ−１０測定キットおよびＩＬ−１３測定キット（いずれもバイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｅｃｅ）社製）を用いて測定した。結果を表１に示す。
実施例２
ｎ−ヘキサデシルアミンをｎ−オクチルアミン（ｌｏｇＰ＝２．９０）に、固定化反応の媒体をエタノールから５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液に変えたほかは実施例１と同様にしてｎ−オクチルアミン固定化ゲルを得た（ｎ−オクチルアミン固定量：４３μｍｏｌ／ｇ−湿重量）。この固定化ゲルを用いて実施例１と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表１に示す。
比較例１
ｎ−オクチルアミンをｎ−ヘキシルアミン（ｌｏｇＰ＝２．０６）に変えたほかは、実施例２と同様にしてｎ−ヘキシルアミン固定化ゲルを得た（ｎ−ヘキシルアミン固定量：４６μｍｏｌ／ｇ−湿重量）。この固定化ゲルを用いて実施例１と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表１に示す。
比較例２
ｎ−オクチルアミンをｎ−ブチルアミン（ｌｏｇＰ＝０．９７）に変えたほかは、実施例２と同様にしてｎ−ブチルアミン固定化ゲルを得た（ｎ−ブチルアミン固定量：４８μｍｏｌ／ｇ−湿重量）。この固定化ゲルを用いて実施例１と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表１に示す。
比較例３
リガンドを固定化していないセルロファインＧＣ−２００ｍを用いて実施例１と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表１に示す。
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表１より、実施例１および２では比較例１、２および３と比べて、上清中の各サイトカイン濃度が大きく低下していることがわかる。
実施例３
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて、酢酸セルロースの球形のヒドロゲル粒子を得た。このヒドロゲル粒子を水酸化ナトリウム水溶液と混和し、加水分解反応を行い、セルロースのヒドロゲル粒子（平均粒子径４６０μｍ、球状タンパク質の排除限界分子量５万）を得た。実施例１と同様に、エピクロルヒドリンを反応させ、さらにｎ−ヘキサデシルアミンを固定化し、ｎ−ヘキサデシルアミン固定化粒子を得た（ｎ−ヘキサデシルアミン固定量：３５μｍｏｌ／ｇ−湿重量）。この固定化粒子を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表２に示す。
実施例４
ｎ−ヘキサデシルアミンをｎ−オクチルアミンに、固定化反応の媒体をエタノールから５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液に変えたほかは実施例３と同様にしてｎ−オクチルアミン固定化粒子を得た（ｎ−オクチルアミン固定量：３３μｍｏｌ／ｇ−湿重量）。この固定化粒子を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表２に示す。
比較例４
実施例３で作製した、リガンドを固定化していないセルロースのヒドロゲル粒子を用いて実施例１と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表２に示す。
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表２より、実施例３および４では比較例４と比べて、上清中の各サイトカイン濃度が大きく低下していることがわかる。
産業上の利用可能性
本発明の方法による水不溶性担体にｌｏｇＰ値２．５０以上の化合物を固定化した吸着材を用いることで、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のサイトカイン吸着器の一実施例の概略断面図である。図１において、１は液体の流入口、２は液体の流出口、３は本発明のサイトカイン吸着材、４および５は液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記サイトカイン吸着材は通過できないフィルター、６はカラム、７はサイトカイン吸着器を示す。
図２は、３種類の材料を用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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