(57)【要約】本発明は、優れたＳＧＬＴ２阻害作用を示し、高血糖症に起因する疾患の予防または治療薬として有用である、２−（４−メトキシベンジル）フェニル６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの結晶、それを含有する医薬組成物およびそれらの用途を提供する。
2003080635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの結晶。
【請求項２】
粉末Ｘ線回折による回折パターンが、回折角（２θ±０．１）５．６、１３．８、１４．６、１６．８、１７．７および２０．８度に特徴的なピークを有する、請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
粉末Ｘ線回折による回折パターンが、回折角（２θ±０．１）４．７、５．５、７．３、８．６、１４．５および１６．７度に特徴的なピークを有する、請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
高血糖症に起因する疾患を予防または治療するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
高血糖症に起因する疾患の予防または治療剤を製造するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶の使用。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶の治療的有効量を投与することを特徴とする、高血糖症に起因する疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの結晶およびその用途に関する。
〔背景技術〕
式（Ｉ）：
2003080635.tif 000003
で表される２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドは、当該出願人により見出された文献未記載の新規な化合物である。当該化合物は、生体内において活性本体である２−（４−メトキシベンジル）フェニル  β−Ｄ−グルコピラノシドに変換されて優れたＳＧＬＴ２阻害作用を示し、糖尿病、糖尿病性合併症、肥満症などの高血糖症に起因する疾患の予防または治療薬として有用な化合物である。これまで当該化合物の結晶物については知られていない。
〔発明の開示〕
従来、２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドは、アモルファスの形態でしか製造できなかった。このアモルファス形態は、高純度のものを製造するために煩雑な精製工程を要し、工業的生産に不向きであった。またこのアモルファス形態は、保存安定性が悪く、粘稠であるため製剤化するのが困難であった。
そこで、本発明者らは、保存安定性が良好であり、製剤化に適した２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの結晶について鋭意研究を重ねた結果、α型結晶およびβ型結晶の２種類の結晶を見出し、これらの結晶が簡便な精製操作により高純度とすることができ工業的生産に適していること、さらにはこれらの結晶が、予想外にも優れた保存安定性を示し、流動性に優れ製剤化に適した結晶であることを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）  ２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの結晶；
（２）  粉末Ｘ線回折による回折パターンが、回折角（２θ±０．１）５．６、１３．８、１４．６、１６．８、１７．７および２０．８度に特徴的なピークを有する２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの結晶（以下、α型結晶と称する）；
（３）  粉末Ｘ線回折による回折パターンが、回折角（２θ±０．１）４．７、５．５、７．３、８．６、１４．５および１６．７度に特徴的なピークを有する２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの結晶（以下、β型結晶と称する）；
（４）  上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の結晶を有効成分として含有する医薬組成物；
（５）  高血糖症に起因する疾患を予防又は治療するための上記（４）に記載の医薬組成物；
（６）  高血糖症に起因する疾患の予防又は治療剤を製造するための上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の結晶の使用；および
（７）  上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の結晶の治療的有効量を投与することを特徴とする高血糖症に起因する疾患の予防または治療方法に関する。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明の最初の結晶は、アモルファス形態の２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドをエタノールに加熱溶解後、氷冷下で器壁をこすりながら結晶化させた。このようにして得られた結晶はα型結晶およびβ型結晶の混合物であったが、下記に示すような特定の溶媒から晶出させることによりα型結晶およびβ型結晶が純度の高い結晶として製造できるようになった。
すなわち本発明のα型結晶は、任意の形態の２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを、適切な第一の溶媒（良溶媒）に加熱溶解し、必要に応じて第二の溶媒（貧溶媒）を加え、撹拌または放置して結晶を析出させ、次いで析出した結晶を単離し、乾燥することによって製造することができる。
上記第一の溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、アセトンまたはメチルエチルケトンが使用され、必要に応じてこれらの溶媒を２種以上組み合せて使用することができる。第一の溶媒の量は、溶媒の種類によっても異なるが、通常、当該化合物１重量部に対して約２〜約２０重量部が使用される。
上記第二の溶媒としては、当該化合物を第一の溶媒に溶かした溶液と混和する溶媒であればよく、例えば、ヘキサン、ヘプタンまたは水が使用される。第二の溶媒の量は、通常、第一の溶媒１重部に対して約０．１〜約５重量部が使用される。
α型結晶を晶出する際の晶出温度は、約５０℃以下、好ましくは約２０〜約５０℃であり、晶出時間は、晶出温度によっても異なるが、通常、約１時間〜約２４時間である。
一方、β型結晶は、任意の形態の２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを、当該化合物１重量部に対して約３重量部〜約１０重量部、好ましくは約４重量部〜約６重量部のメタノールに加熱溶解し、この溶液を約３０℃〜約４０℃の温度で減圧下に濃縮して結晶を析出させ、次いで析出した結晶を単離し、乾燥することによって製造することができる。またβ型結晶は、アモルファス形態の２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを約１２０℃〜約１３０℃の温度に約１〜約４時間保存することによっても製造することができる。
このようにして得られた２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのαおよびβ型結晶は、図１〜２の粉末Ｘ線回折チャートに示すように、以下の特徴的な回折ピークによって識別される：すなわち、
（１）α型結晶は、図１に示すような回折角（２θ±０．１）５．６、１３．８、１４．６、１６．８、１７．７および２０．８度に特徴的なピークを有する；
（２）β型結晶は、図２に示すような回折角（２θ±０．１）４．７、５．５、７．３、８．６、１４．５および１６．７度に特徴的なピークを有する。
本発明のα型結晶およびβ型結晶は、通常の保存条件（例えば、２５℃／６０％相対湿度など）では結晶形が変化することなく保存することができ、かつ化学的に安定である。さらにこれらの結晶は、流動性に優れ取り扱いが容易であり、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などに製剤化することができる。
本発明の結晶を有効成分として含有する医薬組成物を実際の治療に用いる場合、用法に応じ種々の剤型のものが使用される。このような剤型としては、例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、錠剤、カプセル剤、注射剤、液剤、軟膏剤、坐剤、貼付剤などを挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
これらの医薬組成物は、その剤型に応じ製剤学的に公知の手法により、適切な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤などの医薬品添加物と適宜混合または希釈・溶解することにより調剤することができる。
本発明の医薬組成物を実際の治療に用いる場合、その有効成分である本発明の結晶の投与量は患者の年齢、性別、体重、疾患および治療の程度等により適宜決定されるが、経口投与の場合成人１日当たり約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲で、非経口投与の場合は、成人１日当たり約０．０１ｍｇ〜約３００ｍｇの範囲で、一回または数回に分けて適宜投与することができる。
〔実施例〕
本発明の内容を以下の参考例、実施例および試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
尚、各結晶の粉末Ｘ線回折データは、株式会社リガクのＸ線回折装置ＲＩＮＴ２１００を用いて測定した（測定条件；Ｃｕ線、管電圧４０ｋＶ、管電流４０ｍＡ）。
参考例１
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
２−（４−メトキシベンジル）フェノール（４６ｍｇ）および２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−トリクロロアセトイミドイル−α−Ｄ−グルコピラノース（０．１３ｇ）の塩化メチレン（２ｍＬ）溶液に、三フッ化ホウ素−ジエチルエーテル錯体（０．０３３ｍＬ）を加え、室温にて１時間撹拌した。反応混合物をアミノプロピルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：塩化メチレン）にて精製し、２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（０．１１ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ｐｐｍ：１．９１（３Ｈ，ｓ），２．０３（３Ｈ，ｓ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．０８（３Ｈ，ｓ），３．７７（３Ｈ，ｓ），３．８０−３．９５（３Ｈ，ｍ），４．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５，１２．２Ｈｚ），４．２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１２．２Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．１０−５．２５（１Ｈ，ｍ），５．２５−５．４０（２Ｈ，ｍ），６．７５−６．８５（２Ｈ，ｍ），６．９５−７．１０（５Ｈ，ｍ），７．１０−７．２５（１Ｈ，ｍ）
参考例２
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  β−Ｄ−グルコピラノシド
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（０．１１ｇ）のメタノール（４ｍＬ）溶液に、ナトリウムメトキシド（２８％メタノール溶液、０．１２ｍＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：塩化メチレン／メタノール＝１０／１）で精製し、２−（４−メトキシベンジル）フェニル  β−Ｄ−グルコピラノシド（６５ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ  ｐｐｍ：３．３５−３．５５（４Ｈ，ｍ），３．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１，１２．１Ｈｚ），３．７３（３Ｈ，ｓ），３．８０−４．００（２Ｈ，ｍ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．７５−６．８５（２Ｈ，ｍ），６．８５−６．９５（１Ｈ，ｍ），６．９５−７．１０（１Ｈ，ｍ），７．１０−７．２０（４Ｈ，ｍ）
参考例３
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシド
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  β−Ｄ−グルコピラノシド（０．０７５ｇ）の２，４，６−トリメチルピリジン（２ｍＬ）溶液に、室温にてクロロギ酸エチル（０．０４ｍＬ）を加えた。室温にて１６時間撹拌後、反応混合物に飽和クエン酸水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。抽出物を水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲル分取薄相クロマトグラフィー（展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝１０／１）により精製し、目的とするバンドをかき取った後、塩化メチレン／メタノールにより溶出した。得られた溶出液を減圧下に溶媒留去し、アモルファス形態の２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（０．０３２ｇ）を得た。このものは、粉末Ｘ線回折測定の結果、識別可能なピークを示さなかった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ  ｐｐｍ：１．２３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．３０−３．６５（４Ｈ，ｍ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），４．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ），４．０５−４．２０（２Ｈ，ｍ），４．２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，１１．７Ｈｚ），４．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，１１．７Ｈｚ），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．７５−６．８５（２Ｈ，ｍ），６．８５−７．０５（２Ｈ，ｍ），７．０５−７．２（４Ｈ，ｍ）
実施例１
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのα型結晶
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  β−Ｄ−グルコピラノシド（２２０ｇ）および２，６−ルチジン（１３６ｍＬ）のアセトン（８３４ｍＬ）溶液に、撹拌下、５〜１０℃の温度でクロロギ酸エチル（８４ｍＬ）を滴下し、約１０℃〜２０℃にてさらに４時間撹拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、有機層を分離した。有機層を１０％クエン酸水溶液、食塩水、１０％重曹水溶液、食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別し、減圧下に溶媒留去した。濃縮物（３２６ｇ）をエタノール（１０３９ｍＬ）に加熱溶解し、活性炭（１１ｇ）を加え５分間撹拌した後、不溶物をセライト濾過した。ろ液にｎ−ヘキサン（２０４６ｍＬ）を約３０〜約４０℃の温度で約４５分間かけて滴下し、室温で１７時間静置した。この混合物を氷冷下でさらに２時間撹拌した後、析出した結晶を濾取し、２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの粗結晶（２０２ｇ）を得た。
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  β−Ｄ−グルコピラノシド（２２０ｇ）および２，６−ルチジン（１３６ｍＬ）を用いて上記と同様の操作を行い、２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの粗結晶をさらに２００ｇ得た。これらの粗結晶を合わせ、その３００ｇをイソプロパノール（４２６０ｍＬ）およびメチルエチルケトン（２２５ｍＬ）に加熱溶解し、活性炭（１５ｇ）を加え１５分間撹拌した後、熱時濾過した。このろ液に、約５０℃でα型結晶の種晶を加え、撹拌下、約３５℃まで約１時間かけて冷却し、さらに室温で一晩静置した。この混合物を氷冷下でさらに２時間撹拌し、析出した結晶を濾取した。得られた結晶を冷イソプロパノールで洗浄し、減圧下、約６０℃で１２時間乾燥して結晶（２４０ｇ）を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折図は図１に示す通りであり、α型結晶であることが確認された。
実施例２
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのα型結晶
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（５．０ｇ）およびエタノール（３０ｍＬ）の混合物を６０〜６５℃に加熱し、完全に溶解するまで撹拌した。この混合物を４０〜４５℃まで冷却し、同温度で１時間撹拌し、さらに２０〜３０℃で１時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下、約７０℃で４時間乾燥し、結晶（３．３３ｇ）を得た。この結晶は、粉末Ｘ線回折測定の結果、α型結晶であることが確認された。
実施例３
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのα型結晶
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（９０．０ｇ）およびアセトン（３００ｍＬ）の混合物を４０〜４５℃に加熱し、完全に溶解するまで撹拌した。この混合物を３５℃まで冷却し、２５〜３５℃の温度でｎ−ヘキサン（３００ｍＬ）を滴下した。この混合物を３０〜３５℃で１５分間撹拌した後、さらにｎ−ヘキサン（３００ｍＬ、３００ｍＬ）をそれぞれ２０分、５分間かけて加え、室温にて一夜撹拌した。析出した結晶を濾取し、アセトン−ヘキサン（１：３）で洗浄した。減圧下、約７０℃で５時間乾燥し、結晶（８１．９ｇ）を得た。この結晶は、粉末Ｘ線回折測定の結果、α型結晶であることが確認された。
実施例４
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのβ型結晶
参考例３で得られたアモルファス形態の２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（５．０ｇ）をオーブン中にて１２５℃で３時間加熱した。室温まで冷却し、結晶（４．９６ｇ）を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折図は、図２に示す通りであり、β型結晶であることが確認された。
実施例５
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのβ型結晶
２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１．０ｇ）をメタノール（５ｍＬ）に加熱溶解し、この溶液を約４０℃の温度で減圧下濃縮して結晶を析出させた。この結晶を取りだし、減圧下、約７０℃で５時間乾燥し、結晶（０．９ｇ）を得た。この結晶は、粉末Ｘ線回折測定の結果、β型結晶であることが確認された。
試験例１
安定性試験
α型結晶およびβ型結晶を下記の条件に保存し、以下の条件のＨＰＬＣにより残存率を測定し、粉末Ｘ線回折により結晶形の変化の有無を調べた。
ＨＰＬＣ条件：
検出波長；  ２２５ｎｍ
カラム；    Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３
カラム温度；３０℃
移動相；    ０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）：アセトニトリル混液（５８：４２→３０：７０）
流速；      １．０ｍＬ／ｍｉｎ
保存条件１；４０℃／７５％相対湿度、密栓状態、２ヶ月
保存条件２；６０℃、密栓状態、２ヶ月
その結果、本発明のα型結晶およびβ型結晶は、残存率および結晶形に変化が見られず、優れた保存安定性を示した。
試験例２
ヒトＳＧＬＴ２活性阻害作用確認試験
１）ヒトＳＧＬＴ２発現プラスミドベクターの作製
ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ：ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）を用いて、ヒト腎臓由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｏｒｉ  ｇｅｎｅ製）をオリゴｄＴをプライマーとして逆転写し、ＰＣＲ増幅用ｃＤＮＡライブラリーを作製した。上記ヒト腎ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１及び２で示される下記のオリゴヌクレオチド０７０２Ｆ及び０７１２Ｒをプライマーに用い、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いたＰＣＲ反応によりヒトＳＧＬＴ２をコードするＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をクローニング用ベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にこのキットの標準法に従いライゲーションした。常法により大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（東洋紡（株）製）に導入した後、形質転換株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で選択した。この形質転換株の１つからプラスミドＤＮＡを抽出精製し、配列番号３及び４で示される下記のオリゴヌクレオチド、０７１４Ｆおよび０７１５Ｒをプライマーとして用い、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いたＰＣＲ反応によりヒトＳＧＬＴ２をコードするＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）により精製した。この精製したＤＮＡ断片を融合化蛋白質発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ／Ｈｉｓ−Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）の対応する制限酵素部位に組み込んだ。常法により大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（東洋紡（株）製）に導入した後、形質転換株を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で選択した。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出精製し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ／Ｈｉｓ−Ｂのマルチクローニング部位に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を調べた。Ｗｅｌｌｓらにより報告されたヒトＳＧＬＴ２（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２６３，ｐｐ．４５９−４６５（１９９２））に対し、このクローンは１塩基の置換（４３３番目のイソロイシンをコードするＡＴＣがＧＴＣに置換）を有していた。この結果４３３番目の残基のイソロイシンがバリンに置換したクローンを得た。このカルボキシ末端側最終残基のアラニンの次から配列番号５で示されるペプチドを融合化したヒトＳＧＬＴ２を発現するプラスミドベクターをＫＬ２９とした。
2003080635.tif 000004
２）ヒトＳＧＬＴ２一過性発現細胞の調製
ヒトＳＧＬＴ２発現プラスミドＫＬ２９を電気穿孔法によりＣＯＳ−７細胞（ＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ  ＲＣＢ０５３９）に導入した。電気穿孔法はジーンパルサーＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用い、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ：ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）５００μＬに対しＣＯＳ−７細胞２×１０６個とＫＬ２９  ２０μｇを含む０．４ｃｍキュベット内で０．２９０ｋＶ、９７５μＦの条件下行った。遺伝子導入後、細胞を遠心分離により回収し細胞１キュベット分に対し１ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地を加え懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェルプレートの１ウェルあたり１２５μＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下一晩培養した後、１０％ウシ胎仔血清（三光純薬（株）製）１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ：ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ：ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ：ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）を１ウェルあたり１２５μＬずつ加えた。翌日まで培養しメチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み阻害活性の測定に供した。
３）メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み阻害活性の測定
試験化合物をジメチルスルホキシドに溶解し、取り込み用緩衝液（１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭメチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、１０ｍＭ２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸、５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む緩衝液ｐＨ７．４）で希釈し、阻害活性測定用の検体とした。ヒトＳＧＬＴ２一過性発現ＣＯＳ−７細胞の培地を除去し、１ウェルあたり前処置用緩衝液（１４０ｍＭ塩化コリン、２ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸、５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む緩衝液ｐＨ７．４）を２００μＬ加え、３７℃で１０分間静置した。前処置用緩衝液を除去し、再度同一緩衝液を２００μＬ加え、３７℃で１０分間静置した。作製した検体５２５μＬに７μＬのメチル−α−Ｄ−（Ｕ−１４Ｃ）グルコピラノシド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え混合し、測定用緩衝液とした。対照群用に試験化合物を含まない測定用緩衝液を調製した。また試験化合物非存在下並びにナトリウム非存在下の基礎取り込み測定用に塩化ナトリウムに替えて１４０ｍＭの塩化コリンを含む基礎取り込み測定用緩衝液を同様に調製した。前処置用緩衝液を除去し、測定用緩衝液を１ウェルあたり７５μＬずつ加え３７℃で２時間静置した。測定用緩衝液を除去し、洗浄用緩衝液（１４０ｍＭ塩化コリン、２ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭメチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、１０ｍＭ  ２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸、５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む緩衝液ｐＨ７．４）を１ウェルあたり２００μＬずつ加えすぐに除去した。この洗浄操作をさらに２回行い、０．２Ｎ水酸化ナトリウムを１ウェルあたり７５μＬずつ加え細胞を可溶化した。可溶化液をピコプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に移し、１５０μＬのマイクロシンチ４０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加えマイクロプレートシンチレーションカウンター  トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ）にて放射活性を計測した。対照群の取り込み量から基礎取り込み量を差し引いた値を１００％とし、取り込み量の５０％阻害する濃度（ＩＣ５０値）を濃度−阻害曲線から最小二乗法により算出した。その結果は以下の表１に示す通りである。
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〔産業上の利用可能性〕
本発明のα型結晶およびβ型結晶は、簡便な精製操作により容易に高純度とすることができるので工業的生産に適しており、優れた保存安定性を有するので一定の品質の医薬品を製造し、供給する上で有用である。さらに当該結晶は、流動性に優れ取り扱いが容易であるので製剤化に適している。それ故、本発明のα型結晶およびβ型結晶は、医薬品原体として極めて好適である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で得られた２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのα型結晶の粉末Ｘ線回折図である。縦軸はＸ線の強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は回折角（２θ）を示す。
図２は、実施例４で得られた２−（４−メトキシベンジル）フェニル  ６−Ｏ−エトキシカルボニル−β−Ｄ−グルコピラノシドのβ型結晶の粉末Ｘ線回折図である。縦軸はＸ線の強度（ｃｐｓ）を示し、横軸は回折角（２θ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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