(57)【要約】本発明により、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する新規な蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質の製造方法、該蛋白質を用いた、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質のスクリーニング方法、該蛋白質と特異的に結合する抗体、および該ＤＮＡに由来するポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは該抗体を含む、癌等の細胞周期が異常を原因とする疾患の診断薬および治療薬を提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する複合体の構成成分であり、分子量が１４０ｋＤａである、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項３】
配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質。
【請求項４】
配列番号２または４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質および以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質を構成成分として含む、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する複合体。
（ａ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｂ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質
（ｃ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号１または３で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養液中で培養し、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質を該培養物中に生成、蓄積させ、該培養物中より該蛋白質を採取することを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の製造法。
【請求項１２】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡおよび以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（ａ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号５または７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号５または７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１４】
請求項９に記載の組換え体ＤＮＡおよび以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（ａ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号５または７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号５または７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の形質転換体を培養液中で培養し、請求項５に記載の複合体を該培養物中に生成、蓄積させ、該培養物中より該複合体を採取することを特徴とする請求項５に記載の複合体の製造法。
【請求項１６】
請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１７】
以下の（ａ）または（ｂ）を用いて、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出または定量を行う方法。
（ａ）請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡおよび請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡ
【請求項１８】
以下の（ａ）または（ｂ）を用いて、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が健常人と比較してｍＲＮＡレベルで増加または減少している疾患の判定または診断を行う方法。
（ａ）請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡおよび請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡ
【請求項１９】
以下の（ａ）または（ｂ）を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が健常人と比較してｍＲＮＡレベルで増加または減少している疾患の診断薬。
（ａ）請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡおよび請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡ
【請求項２０】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよび請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いて、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する方法。
【請求項２１】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよび請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いて、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子が変異を有している疾患を判定または診断する方法。
【請求項２２】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよび請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子が変異を有している疾患の診断薬。
【請求項２３】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡ。
（ａ）配列番号３６で表される配列および該配列と相補的な配列の３’端にそれぞれ２〜４個のヌクレオチドを付加した配列からなる２本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号３４および３５で表される配列からなる２本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号３８で表される配列からなるＲＮＡ
【請求項２４】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の発現を抑制する方法。
（ａ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）請求項２３に記載のＲＮＡ
（ｃ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
【請求項２５】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、細胞内のｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する方法。
（ａ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）請求項２３に記載のＲＮＡ
（ｃ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
【請求項２６】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、細胞内のｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する方法。
（ａ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）請求項２３に記載のＲＮＡ
（ｃ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
【請求項２７】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する、細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療薬。
（ａ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）請求項２３に記載のＲＮＡ
（ｃ）請求項６〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
【請求項２８】
疾患が癌である請求項２６に記載の治療薬。
【請求項２９】
請求項６〜８のいずれかの１項に記載のＤＮＡを導入することにより作製した非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の非ヒトトランスジェニック動物を細胞周期の異常を原因とする疾患のモデル動物として用いる方法。
【請求項３１】
疾患が癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の非ヒトトランスジェニック動物を用いて薬剤を評価する方法。
【請求項３３】
薬剤が抗癌剤である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子が欠損した非ヒト動物。
【請求項３５】
被験試料の存在下および非存在下で、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１とを接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１と請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項３６】
被験試料の存在下および非存在下で、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１を接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項３７】
被験試料の存在下および非存在下で、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１を接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項３８】
被験試料の存在下および非存在下で、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１を接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３９】
疾患が癌である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチンおよびｐ２７Ｋｉｐ１を含む系において被験試料の存在下および非存在下でｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を行う工程、ｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下でのｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項４１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチンおよびｐ２７Ｋｉｐ１を含む系において被験試料の存在下および非存在下でｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を行う工程、およびｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下でのｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項４２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチンおよびｐ２７Ｋｉｐ１を含む系において被験試料の存在下および非存在下でｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を行う工程、およびｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下でのｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を比較する工程を含む、細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４３】
疾患が癌である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４のいずれかの１項に記載の蛋白質、または請求項５に記載の複合体と特異的に結合する抗体。
【請求項４５】
抗体が、ｐ２７Ｋｉｐ１と請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体との結合を阻害する抗体である、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
抗体が、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体が有するｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を阻害する作用を示す抗体である、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４７】
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の抗体を用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または請求項５に記載の複合体を免疫学的に検出又は定量する方法。
【請求項４８】
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の抗体を用いて、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が、健常人と比較して蛋白質レベルで増加または減少している疾患を判定または診断する方法。
【請求項４９】
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の抗体を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が、健常人と比較して蛋白質レベルで増加または減少している疾患の診断薬。
【請求項５０】
請求項４５または４６に記載の抗体を用いて、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する方法。
【請求項５１】
請求項４５または４６に記載の抗体を用いて、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する方法。
【請求項５２】
請求項４５または４６に記載の抗体を有効成分として含有する細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療剤。
【請求項５３】
疾患が癌である、請求項５２に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有するユビキチンリガーゼ蛋白質、該蛋白質を含む複合体、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを導入した形質転換体、該形質転換体を用いた該蛋白質の製造方法、該ＤＮＡに由来するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いた、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出または定量する方法および該蛋白質の発現を抑制する方法に関する。また本発明は、該蛋白質、該複合体または該形質転換体を用いた、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。さらに、該蛋白質と特異的に結合する抗体、該抗体を用いて該蛋白質を免疫学的に検出または定量する方法、該ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは該抗体を含む診断薬、治療薬に関する。
背景技術
真核細胞の細胞周期は、一連のサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ（以下、ＣＤＫと略す）の複合体が適切な時期に適切な順序で活性化されることにより進行する。この酵素活性は種々の機構により制御されている。例えば、サイクリン蛋白質の分解、ＣＤＫのリン酸化、脱リン酸化、ＣＤＫ阻害蛋白質（以下、ＣＫＩと略す）との結合と解離、などがその制御機構に関与している。ＣＫＩによるＣＤＫ／サイクリンの適切な制御は正常な細胞周期の進行に必須であり、この制御の異常は細胞の癌化につながることが明らかになってきている〔Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３，１５０１（１９９９）；ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，２０，１０２０（１９９８）〕。
なかでも細胞周期のＧ１期からＳ期への進行の制御が、細胞癌化の抑制に重要であることが明らかになってきており、その過程で最も重要な役割を担っているのがＣＫＩの一つであるｐ２７Ｋｉｐ１の量の制御である。〔ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４９０，１７９（２００１）；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２６４，１４８（２００１）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８２，８５３（２００１）〕。Ｇ０期からＧ１期、そしてＳ期の移行には、Ｇ１サイクリンとＣＤＫの複合体の活性化が重要であり、ｐ２７Ｋｉｐ１はこの活性化を阻害する活性を有する。正常細胞では、Ｇ０期においてはｐ２７Ｋｉｐ１の発現量は高く、増殖刺激に伴い、Ｇ１後期からＳ期にかけて減少する〔Ｎａｔｕｒｅ，３７２，５７０（１９９４）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９，１８３１（１９９５）〕。ｐ２７Ｋｉｐ１の強制発現で細胞周期はＧ１期に停止し、またｐ２７Ｋｉｐ１のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現抑制は、Ｓ期細胞の割合を増加させる〔Ｃｅｌｌ，７８，５９（１９９４）；Ｃｅｌｌ，７８，６７（１９９４）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，８７７（１９９６）〕。さらにｐ２７Ｋｉｐ１をホモに欠失したマウスは、通常のマウスより大きく、胸腺、精巣、卵巣、子宮、下垂体、副腎、前立腺など多くの組織で過剰な細胞増殖による過形成が認められ、さらに放射線や化学物質による腫瘍形成の頻度が高いことが判明した〔Ｃｅｌｌ，８５，７０７（１９９６）；Ｃｅｌｌ，８５，７３３（１９９６）；Ｃｅｌｌ，８５，７２１（１９９６）；Ｎａｔｕｒｅ，３９６，１７７（１９９８）〕。また、ヒト腫瘍においても、ｐ２７Ｋｉｐ１の発現量と癌の悪性度には相関関係が認められ、乳癌、大腸癌をはじめ、リンパ腫、胃癌、喉頭癌、甲状腺癌、前立腺癌、神経膠腫、肺癌、卵巣腫瘍など、多くの癌種で悪性度の高さとｐ２７Ｋｉｐ１の発現量の間に負の相関関係があることが報告されている〔Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，３，２２２（１９９７）；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，３，２２７（１９９７）；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，３，２３１（１９９７）；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，３，５９３（１９９７）〕。従って、ｐ２７Ｋｉｐ１の発現制御機構を理解し、発現量の調整を行うことは、細胞周期、癌化機構の解明、癌診断薬、治療薬の開発に重要であると考えられる。
ｐ２７Ｋｉｐ１の発現制御は転写レベルではなく、主として転写後、特に蛋白質分解制御によって行われている。特にユビキチン−プロテアソームによる分解系がその中心である〔ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４９０，１７９（２００１）；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２６４，１４８（２００１）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８２，８５３（２００１）〕。
ユビキチン−プロテアソーム系による蛋白質分解は以下のプロセスによる。まず、ユビキチンはユビキチン活性化酵素（Ｅ１）とＡＴＰによりカルボキシ末端のグリシン残基が活性化され、Ｅ１の特定のシステイン残基にチオエステル結合する。次にユビキチンはユビキチン結合酵素（Ｅ２）のシステイン残基に転移される。Ｅ２に結合したユビキチンは、標的蛋白質を特異的に認識するユビキチンリガーゼ（Ｅ３）を介して、標的蛋白質のリジン残基にイソペプチド結合される（標的蛋白質のユビキチン化）。結合したユビキチンの４８番目のリジン残基にさらにユビキチン化反応が繰り返されることによって、基質蛋白質にユビキチンが鎖状に付加される（ポリユビキチン化）。最後に、ポリユビキチン鎖が分解シグナルとして、巨大な蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソームに認識され、標的蛋白質が分解される。この一連の過程からなるユビキチン−プロテアソーム系において最も重要なのが、基質特異性を担うとされるＥ３である〔Ｎａｔｕｒｅ，３７３，８１（１９９５）〕。
ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化するＥ３としては、Ｓｋｐ２、Ｓｋｐ１、Ｃｕｌ１およびＲｂｘ１を構成成分として含む蛋白質複合体であるＳＣＦＳｋｐ２が知られている。なかでもＳｋｐ２がｐ２７Ｋｉｐ１の認識に重要な分子である。Ｓｋｐ２をホモで欠失したマウスは成長遅延、増殖抑制、染色体・中心体異常が見られ、ｐ２７Ｋｉｐ１の蓄積が見られたことからも、Ｓｋｐ２がｐ２７Ｋｉｐ１の分解に関与していることが示唆される〔Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１，１９３（１９９９）；Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１，２０７（１９９９）；ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９，２０６９（２０００）〕。しかし、Ｓｋｐ２遺伝子を欠失したノックアウトマウスにおいて、Ｇ０−Ｇ１移行期におけるｐ２７Ｋｉｐ１の減少はＳｋｐ２が存在しなくても起こることが判明し、Ｇ０−Ｇ１移行期におけるｐ２７Ｋｉｐ１の分解にはＳＣＦＳｋｐ２に依存しない他の未知の経路が存在することが示唆された〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８９３７（２００１）〕。このＧ０−Ｇ１移行期におけるＳＣＦＳｋｐ２に依存しないｐ２７Ｋｉｐ１の分解機構を解明し、それを司るＥ３を同定することは、細胞周期、癌化機構の解明、癌の診断薬および治療薬の開発に極めて重要であると考えられる。
発明の開示
本発明はＳＣＦＳｋｐ２およびその構成成分とは異なる、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する新規なユビキチンリガーゼ蛋白質、該蛋白質を含むユビキチンリガーゼ複合体、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを導入した形質転換体、該形質転換体を用いた該蛋白質の製造方法、該ＤＮＡに由来するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いた、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出または定量する方法および該蛋白質の発現を抑制する方法を提供することを目的とする。また本発明は、該蛋白質、該複合体または該形質転換体を用いた、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質のスクリーニング方法、該蛋白質と特異的に結合する抗体、該抗体を用いて該蛋白質を免疫学的に検出または定量する方法、該ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは該抗体を含む診断薬、治療薬を提供することを目的とする。
本発明者は、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有するユビキチンリガーゼ複合体ＫＰＣを精製し、その構成蛋白質である新規な蛋白質ＫＰＣ１、およびヒトおよびマウスのＫＰＣ１をコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡがコードするＫＰＣ１のアミノ酸配列を明らかにした。さらにＫＰＣ１が単独でｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有するユビキチンリガーゼであること、ＫＰＣ１の活性にはＣ末のＲＩＮＧフィンガー（ＲＩＮＧ−ｆｉｎｇｅｒ）ドメインが必要なこと、ＫＰＣ１を含む複合体を細胞に高発現させることにより、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解が促進されることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（５３）に関する。
（１）ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する複合体の構成成分であり、分子量が１４０ｋＤａである、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質。
（２）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（３）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質。
（４）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質。
（５）請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質および以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質を構成成分として含む、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する複合体。
（ａ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｂ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質
（ｃ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質
（６）請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（７）配列番号１または３で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（８）配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（９）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１０）（９）に記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１１）（１０）に記載の形質転換体を培養液中で培養し、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質を該培養物中に生成、蓄積させ、該培養物中より該蛋白質を採取することを特徴とする（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質の製造法。
（１２）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡおよび以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（ａ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号５または７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号５または７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１３）（１２）に記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１４）（９）に記載の組換え体ＤＮＡおよび以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（ａ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号５または７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号５または７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１５）（１３）または（１４）に記載の形質転換体を培養液中で培養し、（５）に記載の複合体を該培養物中に生成、蓄積させ、該培養物中より該複合体を採取することを特徴とする（５）に記載の複合体の製造法。
（１６）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
（１７）以下の（ａ）または（ｂ）を用いて、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出または定量を行う方法。
（ａ）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡおよび（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡ
（１８）以下の（ａ）または（ｂ）を用いて、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が健常人と比較してｍＲＮＡレベルで増加または減少している疾患の判定または診断を行う方法。
（ａ）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡおよび（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡ
（１９）以下の（ａ）または（ｂ）を含む、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が健常人と比較してｍＲＮＡレベルで増加または減少している疾患の診断薬。
（ａ）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡおよび（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡ
（２０）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよび（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いて、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する方法。
（２１）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよび（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを用いて、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子が変異を有している疾患を判定または診断する方法。
（２２）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよび（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子が変異を有している疾患の診断薬。
（２３）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡ。
（ａ）配列番号３６で表される配列および該配列と相補的な配列の３’端にそれぞれ２〜４個のヌクレオチドを付加した配列からなる２本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号３４および３５で表される配列からなる２本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号３８で表される配列からなるＲＮＡ
（２４）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質の発現を抑制する方法。
（ａ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）（２３）に記載のＲＮＡ
（ｃ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
（２５）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、細胞内のｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する方法。
（ａ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）（２３）に記載のＲＮＡ
（ｃ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
（２６）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、細胞内のｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する方法。
（ａ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）（２３）に記載のＲＮＡ
（ｃ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
（２７）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する、細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療薬。
（ａ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）（２３）に記載のＲＮＡ
（ｃ）（６）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ
（ｄ）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列中の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体
（２８）疾患が癌である（２６）に記載の治療薬。
（２９）（６）〜（８）のいずれかの１項に記載のＤＮＡを導入することにより作製した非ヒトトランスジェニック動物。
（３０）（２９）に記載の非ヒトトランスジェニック動物を細胞周期の異常を原因とする疾患のモデル動物として用いる方法。
（３１）疾患が癌である、請求項３０に記載の方法。
（３２）（２９）に記載の非ヒトトランスジェニック動物を用いて薬剤を評価する方法。
（３３）薬剤が抗癌剤である、（３２）に記載の方法。
（３４）（２）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子が欠損した非ヒト動物。
（３５）被験試料の存在下および非存在下で、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１とを接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１と（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
（３６）被験試料の存在下および非存在下で、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１を接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を抑制する物質のスクリーニング方法。
（３７）被験試料の存在下および非存在下で、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１を接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する物質のスクリーニング方法。
（３８）被験試料の存在下および非存在下で、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体とｐ２７Ｋｉｐ１を接触させる工程、該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下での該蛋白質または該複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を比較する工程を含む、細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（３９）疾患が癌である、（３８）に記載の方法。
（４０）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチンおよびｐ２７Ｋｉｐ１を含む系において被験試料の存在下および非存在下でｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を行う工程、ｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下でのｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を抑制する物質のスクリーニング方法。
（４１）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチンおよびｐ２７Ｋｉｐ１を含む系において被験試料の存在下および非存在下でｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を行う工程、およびｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下でのｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を比較する工程を含む、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する物質のスクリーニング方法。
（４２）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチンおよびｐ２７Ｋｉｐ１を含む系において被験試料の存在下および非存在下でｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を行う工程、およびｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を測定する工程、および被験試料の存在下および非存在下でのｐ２７Ｋｉｐ１にとりこまれたユビキチンの量を比較する工程を含む、細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（４３）疾患が癌である、（３８）に記載の方法。
（４４）（１）〜（４）のいずれかの１項に記載の蛋白質、または（５）に記載の複合体と特異的に結合する抗体。
（４５）抗体が、ｐ２７Ｋｉｐ１と（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体との結合を阻害する抗体である、（４４）に記載の抗体。
（４６）抗体が、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体が有するｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を阻害する作用を示す抗体である、（４４）に記載の抗体。
（４７）（４４）〜（４６）のいずれか１項に記載の抗体を用いる、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質または（５）に記載の複合体を免疫学的に検出又は定量する方法。
（４８）（４４）〜（４６）のいずれか１項に記載の抗体を用いて、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が、健常人と比較して蛋白質レベルで増加または減少している疾患を判定または診断する方法。
（４９）（４４）〜（４６）のいずれか１項に記載の抗体を含有する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が、健常人と比較して蛋白質レベルで増加または減少している疾患の診断薬。
（５０）（４５）または（４６）に記載の抗体を用いて、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する方法。
（５１）（４５）または（４６）に記載の抗体を用いて、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制する方法。
（５２）（４５）または（４６）に記載の抗体を有効成分として含有する細胞周期の異常を原因とする疾患または細胞周期を調節することにより症状を軽減できる疾患の治療剤。
（５３）疾患が癌である、（５２）に記載の治療剤。
本明細書においては、本発明において同定されたｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する新規のユビキチンリガーゼ複合体をＫＰＣ（Ｋｉｐ１  ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、ＫＰＣの構成成分である２種の蛋白質を分子量の大きい順にＫＰＣ１およびＫＰＣ２と称する。ＫＰＣ１は単独でｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有するユビキチンリガーゼである。
本発明の蛋白質としては、以下の（１）〜（４）に記載の蛋白質をあげることができる。
（１）ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する複合体の構成成分であり、分子量が１４０ｋＤａである、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質
（２）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（３）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質
（４）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質はヒトＫＰＣ１、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質はマウスＫＰＣ１である。
上記のアミノ酸の付加、欠失、あるいは置換は、部位特異的変異導入法〔Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）；Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）〕を用いて、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
目的の変異（欠失、置換、付加）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ〔Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）〕によっても、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入することができる。すなわち、まず該ＤＮＡの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（３’端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入された該ＤＮＡが増幅する。
配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失または置換したアミノ酸配列からなり、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質としては、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列のＮ末に１〜２５個のアミノ酸を付加したアミノ酸配列からなる蛋白質、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末に配列番号２２で表されるヘキサヒスチジン（以下Ｈｉｓ６と略す）／ＦＬＡＧタグを付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質がｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有するためには、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列のうち１２５４〜１２９１番目に存在するＲＩＮＧフィンガードメインを有し、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）〕、ＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）〕等の当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値あるいは、ＦＡＳＴＡにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
本発明の複合体としては、上記の本発明の蛋白質および以下の（ａ）〜（ｃ）に記載の蛋白質を構成成分として含む、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する複合体があげられる。
（ａ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｂ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質
（ｃ）配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質はヒトＫＰＣ２、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質はマウスＫＰＣ２である。アミノ酸の付加、欠失、置換は上記の配列番号２または４で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の付加、欠失、置換と同様に行なうことができる。配列番号６または８で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失または置換したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合する蛋白質としては、配列番号６または８で表されるアミノ酸配列のＮ末またはＣ末に１〜２５個のアミノ酸を付加したアミノ酸配列からなる蛋白質、例えば配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末に配列番号２３で表されるＨｉｓ６／ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・エピトープ（以下Ｈｉｓ６／ＨＳＶと略す）タグを付加したアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＣ末に配列番号２４で表されるインフルエンザ・ウイルス・ヘマグルチニン・エピトープ（以下ＨＡと略す）タグを付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。また、この蛋白質が配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と会合するためには、配列番号６または８で表されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明のＤＮＡとしては、
（１）本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２）配列番号１または３で表される塩基配列を含むＤＮＡ、
（３）配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）（１）〜（３）のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡなどの本発明のＤＮＡまたはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−２００１）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１または３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（１）〜（３）のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとしては、具体的には配列番号１または３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。（１）〜（３）のＤＮＡは、通常２本鎖ＤＮＡとして得られるので、センス鎖である（１）〜（３）のＤＮＡと同時にアンチセンス鎖として（１）〜（３）のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡも得ることができる。（１）〜（３）の２本鎖ＤＮＡを１００℃で５分間熱した後、氷上で急速に冷却することにより、（１）〜（３）のＤＮＡ（センス鎖）と該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ（アンチセンス鎖）を分離することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＫＰＣ１およびＫＰＣ２の精製と構造決定
（１）ＫＰＣの精製
ＫＰＣは、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を指標にして、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、または血球系の細胞もしくはその培養細胞から、精製することができる。ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性の測定法としては、７．（１）に記載した方法を用いることができる。
ＫＰＣの精製法としては、遠心分離、硫酸アンモニウム水溶液による塩析、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換または陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどを用いるクロマトグラフィーなどを、単独または組み合わせて処理する方法が上げられる。
（２）ＫＰＣ１およびＫＰＣ２の部分アミノ酸配列の決定
精製されたＫＰＣに含まれる構成成分の蛋白質の部分アミノ酸配列の決定は、以下の方法で行うことができる。すなわち、精製したＫＰＣから、ＫＰＣに含まれる構成成分の蛋白質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などで分離し、クマシー染色などで可視化する。各バンドを切り出し、必要に応じてゲル中での還元、Ｓ−カルボキシアミドメチル化、トリプシン等の適当なプロテアーゼによる切断を行なう。適切なカラム、例えばμＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８カラム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）等を用いて、その中に含まれるペプチドを分離回収し、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）等のペプチドシークエンサーを用いた自動エドマン分解法により、部分アミノ酸配列を決定することができる。あるいは、プロテアーゼ処理後のペプチド混合物をＬＣＱイオントラップ質量分析計、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ）質量分析計、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析計等により解析し、アミノ酸配列データベース上の配列のプロテアーゼ消化により理論上得られるペプチドの質量と比較することにより、部分アミノ酸配列を決定することができる〔Ｐａｎｄｅｙ，Ａ．＆  Ｍａｎｎ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，８３７（２０００）〕。
２．ＫＰＣ１およびＫＰＣ２をコードするＤＮＡの調製
（１）ＫＰＣ１およびＫＰＣ２をコードするＤＮＡの調製
得られたＫＰＣ１の部分アミノ酸配列をクエリーに用いて、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｐｅｐｔ、ＰＩＲ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ等のアミノ酸配列データベースを検索することにより、ＫＰＣ１と相同性をもつアミノ酸配列を検索することができる。ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等の塩基配列データベースを各フレームで翻訳したアミノ酸配列に対して検索をかけることにより、ＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡと相同性のある塩基配列を検索することができる。得られた配列がＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）の場合は、得られた配列をクエリーにしてさらに相同性を有する配列、同一のｃＤＮＡクローンに由来するもう一方の端からのＥＳＴの配列を検索することにより、さらにＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡと推定される配列を検索することができる。ＥＳＴの配列を決定したｃＤＮＡクローンを入手し、そのｃＤＮＡ全体の塩基配列を明らかにすることができる。得られたｃＤＮＡの塩基配列を各フレームで翻訳し、ＫＰＣ１の部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）のアミノ酸配列をＫＰＣ１のアミノ酸配列とすることができる。
このようにして得られるヒトＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡとしては、ヒトｃＤＮＡのＥＳＴの配列（ジェンバンク登録番号ＢＥ８８５４１９およびＢＥ８８５９１４）をそれぞれ有するＩＭＡＧＥコンソーシアムｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：３９０９１６９およびＩＭＡＧＥ：３９０９２０３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より入手可能）があげられる。
あるいは、上記で得られたｃＤＮＡの塩基配列を元にして、以下のようにしてもＫＰＣ１をコードするＤＮＡを単離することができる。まずＫＰＣ１をコードする領域を含むｃＤＮＡの領域を適当に選択し、選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成する。ＫＰＣ１が発現している組織や細胞からｃＤＮＡを調製する。調製したｃＤＮＡを鋳型とし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲによりＫＰＣ１をコードするＤＮＡを増幅し単離することができる。組織や細胞からのｃＤＮＡの調製、およびＰＣＲはモレキュラー・クローニング第３版に記載の方法に従って行うことができる。
以上のようにして得られるＫＰＣ１をコードするＤＮＡとして、配列番号１で表される塩基配列を有するヒトＫＰＣ１のｃＤＮＡ、配列番号３で表される塩基配列を有するマウスＫＰＣ１のｃＤＮＡをあげることができる。これらのｃＤＮＡがコードするヒトＫＰＣ１、マウスＫＰＣ１はそれぞれ、配列番号２および４で表される新規なアミノ酸配列を有する。ＫＰＣ１をコードするＤＮＡにおいては、ＫＰＣ１をコードする領域の各コドンの塩基配列はｃＤＮＡで用いられているコドンに限られるものではなく、同じアミノ酸をコードするあらゆるコドンの塩基配列を用いることができる。
ＫＰＣ２は、公知のｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＢＤＲ１）〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５，２４３（２０００）〕と同じ蛋白質であった。したがってＫＰＣ２をコードするＤＮＡとしては、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ（ヒトＧＢＤＲ１のｃＤＮＡ）、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ（マウスＧＢＤＲ１のｃＤＮＡ）をあげることができる。これらのｃＤＮＡがコードするヒトＫＰＣ２、マウスＫＰＣ２はそれぞれ、配列番号６および８で表されるアミノ酸配列を有する。
（２）ＫＰＣ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの取得
（１）で得られたＫＰＣ１  ｃＤＮＡの塩基配列をクエリーにして、ジェンバンク等の塩基配列データベースから、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の相同性検索プログラムを用いて、ＫＰＣ１ｃＤＮＡの一部の領域と連続して一致する配列を有するヒトまたはマウスのゲノムＤＮＡを検索することにより、ＫＰＣ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの塩基配列の情報を得ることができる。このような塩基配列として、ジェンバンク登録番号：ＮＴ＿０２２４３９をあげることができる。得られた塩基配列の任意の領域は、その領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡおよびその領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをプライマー、ヒトまたはマウスゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅し単離することができる。ゲノムＤＮＡの調製、およびＰＣＲはモレキュラー・クローニング第３版に記載の方法に従って行うことができる。
また、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法基づいて、マウスあるいはヒトの細胞や組織から単離した染色体ＤＮＡを用いて作製したゲノムＤＮＡライブラリーに対して、（２）で得られたマウスあるいはヒトのＫＰＣ１  ｃＤＮＡをプローブにして、プラーク・ハイブリダイゼーション等の方法でスクリーニングすることにより、ＫＰＣ１遺伝子を含むマウスあるいはヒトのゲノムＤＮＡを得ることができる。
ＫＰＣ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの塩基配列とｃＤＮＡの塩基配列を比較することにより、ＫＰＣ１遺伝子のエキソン／イントロン構造を明らかにすることができる。また、特にｃＤＮＡの５’側の部分をプローブにすることにより、ＫＰＣ１遺伝子の、プロモーターなど転写を制御する領域のゲノムＤＮＡの塩基配列を明らかにすることができる。この配列はＫＰＣ１遺伝子の転写の制御機構を解析するのに役立つ。また、相同性組換えの手法〔Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；Ｃｅｌｌ，５１，５０３（１９８７）〕により、染色体上のＫＰＣ１遺伝子を不活化または任意の配列と置換したクローンを作製することができる。
３．ＫＰＣ１、ＫＰＣ２、ならびにＫＰＣ１およびＫＰＣ２を構成成分として含む複合体の製造法
ＫＰＣ１またはＫＰＣ２は、モレキュラー・クローニング第３版、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法を用いて、上記２．で調製したＫＰＣ１またはＫＰＣ２をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。
すなわち、ＫＰＣ１またはＫＰＣ２をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、ＫＰＣ１またはＫＰＣ２を発現する形質転換体を取得する。該形質転換体を培養することにより、培養物中にＫＰＣ１またはＫＰＣ２が生成蓄積する。該培養物からＫＰＣ１またはＫＰＣ２を単離精製することにより、ＫＰＣ１またはＫＰＣ２を製造することができる。以下（１）〜（３）にＫＰＣ１の製造方法について記載するが、ＫＰＣ２についても、ＫＰＣ２をコードするＤＮＡを用いて同様にして製造することができる。
（１）形質転換体の作製
発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主細胞中でＫＰＣ１をコードするＤＮＡからｍＲＮＡを転写できるプロモーターを含有しているものが用いられる。
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、発現ベクターは宿主原核生物中で自律複製可能であり、プロモーターおよびその下流にリボソーム結合配列およびＫＰＣ１をコードするＤＮＡを挿入するクローニングサイトを有するものを用いる。必ずしも必要ではないが、該クローニングサイトの直後に転写終結配列を配置する方が好ましい。また、形質転換体の選択のため、薬剤耐性遺伝子等のマーカーとなる遺伝子を発現する配列を含むようにする。リボソーム結合配列の下流のクローニングサイトにＫＰＣ１をコードするＤＮＡを挿入する。リボソーム結合配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば、大腸菌宿主のベクターの場合６〜１８塩基）に調節されていることが好ましい。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌を宿主とした場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等をあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。枯草菌を宿主とした場合は、枯草菌のファージであるＳＰＯ１やＳＰＯ２のプロモーター、ＰｅｎＰプロモーター等をあげることができる。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＥＴ１４（ノバジェン社製）、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ（クロンテック社製）ｐＲＳＥＴ  Ａ（インビトロジェン社製）等を例示することができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ  、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）〕、プロトプラスト法〔特開昭６３−２４８３９４；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）〕等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主酵母で転写を行なうプロモーター、転写の終止配列および酵母での形質転換マーカーとなる遺伝子、たとえば薬剤耐性遺伝子やＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２等のアミノ酸合成系の遺伝子を発現できる配列を含有しているものが用いられる。また、発現ベクターの作製や維持を容易にするため、大腸菌内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが好ましい。
プロモーターとしては、酵母中で転写を行なえるものであればいずれのものを用いてもよく、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ１、ガラクトース代謝系遺伝子ＧＡＬ１やＧＡＬ１０等のプロモーター、酸性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５プロモーター、フォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子ＰＧＫプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＡＰプロモーター、ヒートショック蛋白質遺伝子プロモーター、α接合因子遺伝子ＭＦα１プロモーター、銅メタロチオネイン遺伝子ＣＵＰ１プロモーター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのアルコールオキシダーゼ遺伝子ＡＯＸ１のプロモーター等が用いられる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピヒア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９１）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしてば、宿主動物細胞で転写を行なうプロモーター、転写の終止と転写物のポリアデニル化のシグナルの配列を含有しているものが用いられる。またベクターの作製や維持を容易にするため、大腸菌内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが望ましい。プロモーターとしては、動物細胞中で転写を行なえるものであればいずれも用いることができるが、ＳＶ４０の初期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスのＬＴＲ等のウイルス由来の配列、あるいはメタロチオネイン遺伝子やβ−アクチン遺伝子、伸長因子−１などの動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等をあげることができる。またＳＶ４０の初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルスＩのＬＴＲを組み合わせたＳＲαプロモーター等これらのプロモーターを人為的に組み合わせたプロモーターも用いられる。
宿主染色体ＤＮＡにＫＰＣ１をコードするＤＮＡが組み込まれた恒常的なＫＰＣ１発現細胞は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン等の薬剤に対する耐性遺伝子を発現できる配列を含むＫＰＣ１発現ベクターを宿主細胞に導入し、薬剤の存在下で培養することにより選択することができる。また、宿主細胞中でのＫＰＣ１の生産量を上昇させるために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を発現できるような配列を含むＫＰＣ１の恒常的発現ベクターを宿主細胞に導入し、ｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）の濃度を段階的に上げながら培養することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともにＫＰＣ１をコードするＤＮＡのコピー数を増幅させることもできる。このｄｈｆｒ遺伝子を用いた遺伝子増幅を行なう場合の宿主細胞としては、ｄｈｆｒ遺伝子が機能していない細胞、例えばＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９０９６）などを用いる。
具体的な発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クロンテック社）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３，（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）〕、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１（ストラタジーン社製）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＭＳＧ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）〕等があげられる。
宿主細胞としては、ヒト細胞であるＨｅＬａ、ナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）、２９３、アフリカミドリザル腎臓細胞であるＣＯＳ−１やＣＯＳ−７、ハムスターの細胞であるＣＨＯやＢＨＫ、マウス胎児細胞であるＮＨＩ３Ｔ３、マウス・ミエローマ細胞であるＳＰ２／０やＮＳＯ、ラット・ミエローマ細胞であるＹＢ２／０等の細胞株をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
あるいは、発現用ウイルスベクターを利用することもできる。発現用ウイルスベクターとしては、該ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つが欠損しており、パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、宿主細胞で導入するＤＮＡがコードする蛋白質を発現させるために好適なプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、ｐＭＸ−ｐｕｒｏ、ＭＦＧ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３（１９９５）〕、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，３５８７−３５９６（１９９０）〕、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ〔Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８１５０（１９９８）〕、およびｐＡｄｅｘ１〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３８１６（１９９５）〕等をあげることができる。
ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質として、レトロウイルスベクターの場合にはマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等、レンチウイルスベクターの場合にはＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ等、アデノウイルスベクターの場合にはアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ等、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）等の蛋白質をあげることができる。
プロモーターとしては、上記の動物細胞を宿主とする発現ベクターに記載のプロモーターを使用することができる。
活性ペプチド前駆体遺伝子をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入し、組換えウイルスベクターを造成する。造成した該組換えウイルスベクターを、該ウイルスベクターに適合したパッケージング細胞に導入し、組換えウイルスを生産する。
パッケージング細胞としては、該ウイルスベクターが欠損する上記遺伝子のコードするパッケージングに必要なタンパク質を補給できる細胞であればいかなるものも用いることができ、該遺伝子を発現させたヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、レトロウイルスベクターの場合はＰｌａｔ  Ｅ細胞〔Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７，１０６３（２０００）〕を用いることができる。
上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクターの導入法として、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
生産された組換えウイルスを宿主細胞に感染させることにより、宿主細胞にウイルスベクターを導入することができる。宿主細胞としては、上記の動物細胞を宿主とする発現ベクターの宿主細胞と同様のものをあげることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合は、バキュロウイルス発現系〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）〕が用いられる。即ち、トランスファーベクターにＫＰＣ１をコードするＤＮＡを挿入した後、該ベクターとバキュロウイルスを昆虫細胞に同時に導入し、強力なプロモーターであるポリヘドリン遺伝子プロモーター下にＫＰＣ１をコードするＤＮＡが挿入された組換えバキュロウイルスを相同組換えによって作製した後、この組換えバキュロウイルスを再度昆虫細胞に感染させることにより、ＫＰＣ１を発現することができる。
バキュロウイルスとしてはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス、カイコ核多角体病ウイルス等が用いられる。昆虫細胞としてはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞であるＳｆ９およびＳｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。また、カイコ幼虫体をそのまま用いることもできる。トランスファーベクターには、ポリヘドリンプロモーターおよび相同組換えを起こさせるためのバキュロウイルス由来の配列、ベクターの維持・増殖や外来遺伝子の組み込み等の遺伝子操作を大腸菌内で行なうための配列（大腸菌での自律複製可能な配列および薬剤耐性遺伝子）が含まれており、具体的にはｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（ともにインビトロジェン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ９（クロンテック社製）等があげられる。
動物個体を用いてＫＰＣ１を生産することもできる。例えば、公知の方法〔Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）；Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡを導入した非ヒトトランスジェニック動物中にＫＰＣ１を生産することができる。
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
（２）形質転換体の培養
ＫＰＣ１をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、ＫＰＣ１を生成蓄積させ、該培養物よりＫＰＣ１を採取することにより、ＫＰＣ１を製造することができる。
動物細胞を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、イーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ（Ｍｉｍｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ（Ｄａｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。必要に応じてペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製〕、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、Ｇｒａｃｅの昆虫培地〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。培養条件は、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体が動物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育し、ＫＰＣ１を生成蓄積させ、該動物個体よりＫＰＣ１を採取することにより、ＫＰＣ１を製造することができる。すなわち、動物個体の場合、例えば、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、ＫＰＣ１を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりＫＰＣ１を採取することにより、ＫＰＣ１を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養期間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア水などを用いて行う。必要に応じて、培養期間中にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、培養中に必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。インデューサーとしては、例えば、ｌａｃプロモーターを誘導するイソプロピルガラクトシド、ｔｒｐプロモーターを誘導するインドールアクリル酸等があげられる。
（３）発現させた蛋白質の単離精製
上記形質転換体の培養物中に蓄積したＫＰＣ１を単離精製するには、以下のような通常の蛋白質の単離精製法を用いればよい。
ＫＰＣ１が細胞外に分泌される場合には、培地中にＫＰＣ１が蓄積する。従って培養終了後、遠心分離等の手法により細胞を含まない培地のみを回収する。該培地から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ＤＥＡＥセファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）、モノＱ（Ｍｏｎｏ  Ｑ、アマシャム・バイオサイエンシズ社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰセファロース（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、および等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
ＫＰＣ１が、形質転換体の細胞内に蓄積する場合には、培養終了後の培養物から、形質転換体の細胞を遠心分離等の手法により回収し、緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。ＫＰＣ１が細胞内で溶解状態で存在する場合には、該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、上記の培地からの精製単離と同様にして精製標品を得ることができる。また、ＫＰＣ１が細胞内に不溶体を形成して存在する場合は、該無細胞抽出液を遠心分離後、沈殿画分としてＫＰＣ１の不溶体を回収する。このＫＰＣ１の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化した後、該可溶化液を、蛋白質変性剤の濃度を蛋白質が変性しない程度まで希釈するか、あるいは、蛋白質変性剤を含まないかまたは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度まで希薄な溶液に透析し、ＫＰＣ１を正常な立体構造に復元させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９８）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、インビトロ転写・翻訳系を用いてＫＰＣ１を生産することができる。すなわち、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量のＫＰＣ１をコードするＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、ＫＰＣ１を生産することができる。
精製したＫＰＣ１の構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば「遺伝子クローニングのための蛋白質構造解析」（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
（４）ＫＰＣ１およびＫＰＣ２を構成成分として含む複合体の製造方法
ＫＰＣ１およびＫＰＣ２の両者を発現する形質転換体を作製し、（２）に記載の方法に準じて該形質転換体を培養することにより、培養物中にＫＰＣ１およびＫＰＣ２を構成成分として含む複合体（以下、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とよぶこともある）を生成蓄積させ、（３）に記載の方法に準じて該培養物から該複合体を単離精製することにより、該複合体を製造することができる。ＫＰＣ１およびＫＰＣ２の両者を発現する形質転換体は、（１）に記載した方法で作製したＫＰＣ１の発現ベクターとＫＰＣ２の発現ベクターの両者を宿主に導入することにより作製できる。あるいは、ＫＰＣ１の発現ベクターにさらに、プロモーターおよびその下流に接続したＫＰＣ２をコードするＤＮＡからなる発現ユニットを挿入して、ＫＰＣ１およびＫＰＣ２の発現ベクターを作製し、宿主細胞に導入することによっても作製できる。
ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体は、（１）〜（３）に記載の方法に準じて製造したＫＰＣ１およびＫＰＣ２を混合し、インビトロで会合させることによっても製造することができる。
４．ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体の調製
（１）ポリクローナル抗体の調製
上記３．に記載の方法により取得したＫＰＣ１の全長または部分断片の精製標品、あるいはＫＰＣ１の一部のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより、ＫＰＣ１と特異的に結合するポリクローナル抗体を作製することができる。抗原としてペプチドを用いる場合は、ペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニンや牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢＯＣ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法あるいは、アプライド・バイオシステムズ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、３〜２０週令のラット、マウス、ハムスター等の非ヒトほ乳動物を用いることができる。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に採血して血清を調製し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）〔酵素免疫測定法（第３版）、医学書院（１９８７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）〕等で確認する。抗原の投与量は動物１匹に投与１回当たり５０〜２００μｇが好ましい。
ＥＬＩＳＡの具体的例として、以下の方法をあげることができる。免疫の際、抗原に用いたＫＰＣ１またはペプチドを適当なプレートにコートし、血清を反応させ、さらに抗原を投与した動物のイムノグロブリンに対する抗体をホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗体を反応させる。標識酵素により発色する基質を添加して反応を行ない、発色量を分光光度計により測定し、血清の抗体価とする。
免疫に用いた抗原に対し、血清が充分な抗体価を示した動物より全血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧカラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（２）モノクローナル抗体の調製
（ａ）抗体産生細胞の調製
上記（１）において、免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したマウスまたはラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭで３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ  １６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍＬ  ８−アザグアニンを加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭまたはＰＢＳ（１．８３ｇ／Ｌリン酸水素二ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌリン酸二水素一カリウム、７．６５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、攪拌しながら３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００  ２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ１〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地に０．４ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１５μｍｏｌ／Ｌチミジンおよび０．４μｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり、ＥＬＩＳＡにより、培養上清中のＫＰＣ１に結合する抗体を検出することにより、ＫＰＣ１に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択する。
ＥＬＩＳＡの具体的例として、以下の方法をあげることができる。免疫の際、抗原に用いたＫＰＣ１またはペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、さらにホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（抗体産生細胞がラット由来の場合は抗ラットイムノグロブリン抗体）を反応させる。標識酵素により発色する基質を添加して反応を行ない、発色量を分光光度計により測定して、培養上清中のＫＰＣ１に特異的に結合する抗体を検出する。
選択したハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、上記と同様にして、ハイブリドーマの培養上清中のＫＰＣ１に結合する抗体を検出し、安定して高い抗体生産量を示すハイブリドーマをＫＰＣ１に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得したＫＰＣ１に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナル抗体の精製で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
上記（１）および（２）に記載の方法でＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を得ることができる。また、ＫＰＣ１に代えてＫＰＣ２の全長または部分断片の精製標品、あるいはＫＰＣ２の一部のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として用い、上記（１）および（２）に記載の方法に準じて、ＫＰＣ２と特異的に結合する抗体を得ることができる。
（３）ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体と特異的に結合する抗体
１．または３．（４）に記載の方法で得られるＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の精製標品を抗原として用い、上記（１）および（２）に記載の方法に準じて、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体と特異的に結合する抗体を得ることができる。
ＫＰＣ１またはＫＰＣ２と特異的に結合する抗体も、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体と特異的に結合する抗体として用いられる。
（４）ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する抗体
ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する抗体としては、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が有するｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を阻害する抗体、およびｐ２７Ｋｉｐ１とＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体との結合を阻害する抗体があげられる。
ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が有するｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を阻害する抗体は、７．（１）に記載したｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定する系に、（１）〜（３）に記載した方法で得られたＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体と特異的に結合する抗体を被験試料として添加して、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体のｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定し、添加しない場合と比較して、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の活性が低下した抗体を選択することにより、得ることができる。
ｐ２７Ｋｉｐ１とＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体との結合を阻害する抗体は、８．（２）に記載したｐ２７Ｋｉｐ１とＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体との結合を測定する系に、（１）〜（３）に記載した方法で得られたＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体と特異的に結合する抗体を被験試料として添加して、ｐ２７Ｋｉｐ１とＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体との結合量を測定し、添加しない場合と比較して、結合量が低下した抗体を選択することにより、得ることができる。
５．ＫＰＣ１遺伝子の染色体上の位置
塩基配列データベース上のヒトゲノムＤＮＡの配列には通常、その配列の染色体の位置についての情報が記載されている。例えば、２．（２）で得られたヒトＫＰＣ１ゲノム遺伝子のエキソンを含むヒトゲノムＤＮＡの配列（ジェンバンク登録番号：ＮＴ＿０２２４３９）についてはヒト染色体３ｐ２４．３に位置することがデータベース上に記載されている。したがってヒトＫＰＣ１遺伝子はヒト染色体３ｐ２４．３に位置するということができる。
このようにして得られたＫＰＣ１遺伝子の染色体上の位置の情報は、疾患とＫＰＣ１遺伝子の関連を研究するのに役立つ。例えば、癌では癌抑制遺伝子の存在する可能性の高い染色体上の領域として、多くの癌について高頻度にＬＯＨ（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ：２対の内の一方の遺伝子に見られる染色体欠失）が検出される領域の特定が進んでいるが、このような領域とＫＰＣ１遺伝子が存在する染色体の位置が一致すれば、ＫＰＣ１がこの領域にＬＯＨを持つ癌の発症に関与する可能性があることになる。この場合、このような癌におけるＫＰＣ１遺伝子の変異やＫＰＣ１の発現量を解析することにより、ＫＰＣ１と癌との関連が明らかになれば、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡに由来するポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチド、ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を用いて、９．、１１．または１３．に記載する方法に基づいて、このような癌の診断や治療を行なうことができる。
６．ＫＰＣ１をコードするＤＮＡを導入した非ヒトトランスジェニック動物およびＫＰＣ１遺伝子欠損非ヒト動物の作製
（１）ＫＰＣ１をコードするＤＮＡを導入した非ヒトトランスジェニック動物の作製
ＫＰＣ１をコードするＤＮＡを導入した非ヒトトランスジェニック動物（以下、単にトランスジェニック動物ともいう）は、文献〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０（１９８０）；Ｎａｔｕｒｅ，３４４，５４１（１９９０）；Ｎａｔｕｒｅ，３１５，６８０（１９８５）；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１７，３０３（１９８７）〕に記載の方法に準じて、非ヒト哺乳動物の受精卵へ直接、該動物の細胞内でＫＰＣ１を発現させうるプロモーターの下流にＫＰＣ１をコードするＤＮＡを連結した遺伝子構築物をインジェクションすることにより作製することができる。また、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞を公知の方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４（１９８１）；ＵＳ５４５３３５７；ＵＳ５６７０３７２；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６３，２８８（１９９４）；Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６，５６３（１９９４）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７８４４（１９９６）〕に基づいて樹立し、該胚性幹細胞へ通常の培養細胞への遺伝子導入の場合と同様にして該動物の細胞内でＫＰＣ１を発現させうるプロモーターの下流にＫＰＣ１をコードするＤＮＡを連結した遺伝子構築物を導入後、集合キメラ法や注入キメラ法等の手法によりトランスジェニック動物を作出することができる〔Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）〕。
プロモーターとして、３．（１）に記載の動物細胞での発現ベクターに用いることのできるプロモーターを同様に用いることができる。適切なプロモーターを使用することにより、全身あるいは組織特異的にＫＰＣ１を高発現するトランスジェニック動物を得ることができる。
得られた該トランスジェニック動物は、ＫＰＣ１の活性により、細胞内のｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化および分解が促進するため、細胞周期の異常が引き起こされ、細胞周期の異常を原因とする疾患、例えば癌等の疾患モデルとなると考えられる。また、該トランスジェニック動物に抗癌剤等の薬剤を投与し、該トランスジェニック動物の疾患症状や病理を観察することにより、薬剤の評価を行なうことができる。
（２）ＫＰＣ１遺伝子欠損非ヒト動物の作製
遺伝子欠損をさせる非ヒト哺乳動物のＫＰＣ１遺伝子含むゲノムＤＮＡを２．（２）に記載の方法で単離する。該ゲノムＤＮＡのエキソン部分の全部または一部を欠失させた不活性型ＫＰＣ１遺伝子を含むターゲッティングベクターを作製する。公知の手法〔Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，５０３（１９８７）〕により、ターゲッティングベクターを胚性幹細胞に導入し、染色体上のＫＰＣ１遺伝子と導入した不活性型ＫＰＣ１遺伝子が相同組換えを起こした胚性幹細胞を作製することができる〔Ｎａｔｕｒｅ，３５０，２４３（１９９１）〕。
選択した胚性幹細胞と非ヒト哺乳動物の受精卵を用い集合キメラ法あるいは注入キメラ法を用い生殖系列キメラ個体を作出することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞のＫＰＣ１遺伝子が不活性型ＫＰＣ１遺伝子に置換された個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方のＫＰＣ１遺伝子が不活性型に変異したホモ個体を得ることができる。
ターゲッティングベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲッティングベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）やＰＣＲ等があげられる。
７．ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性およびｐ２７Ｋｉｐ１の分解の測定
（１）ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体のｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性の測定
ユビキチン化反応のインビトロ再構成系〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，２５６３（１９９５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，６８２（１９９５）；Ｃｅｌｌ，９１，２２１（１９９７）〕を利用し、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を用いることにより、以下のようにしてＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が有するｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定することができる。
例えば上記３．に記載の方法により得られる精製したＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を、ｐ２７Ｋｉｐ１、Ｅ１およびＥ２と試験管内で混合したものにユビキチンを添加し反応を行なう。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により、ユビキチン化されたｐ２７Ｋｉｐ１を単離し、ｐ２７Ｋｉｐ１に取り込まれたユビキチンの量を測定する。ｐ２７Ｋｉｐ１に取り込まれたユビキチンの量は、反応時に添加するユビキチンを蛍光、ビオチン、あるいは放射性同位体で標識したものを使用し、該標識に基づいたシグナルを測定する、あるいは抗ユビキチン抗体を用いてユビキチンを検出することにより測定することができる〔Ｎａｔｕｒｅ，３７３，８１（１９９５）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３７７，１９３（１９９５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，６８２（１９９５）〕。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、ｐ２７Ｋｉｐ１を認識する抗体（ｐ２７Ｋｉｐ１と特異的に結合する抗体、またはｐ２７Ｋｉｐ１に付加したタグと特異的に結合する抗体）を利用したイムノブロット解析を行ない、標的蛋白質の分子量の増加を指標にユビキチンの量を測定することもできる〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８９３７（２００１）〕。
また、例えばＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を発現する形質転換体を３．（１）、３．（４）に記載の方法に準じて作製し、該形質転換体あるいは細胞抽出液等の該形質転換体の処理物にユビキチンおよびプロテアソーム阻害剤を添加し、適当な温度で培養または保温することにより、ユビキチン−プロテアソーム系の反応をポリユビキチン化までで停止させる系を、上記のインビトロ再構成系の代わりに利用して測定することもできる。形質転換体の宿主としては、動物細胞等、内在性にｐ２７Ｋｉｐ１、Ｅ１およびＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が利用できるＥ２を発現しているものを用いる。この系においてｐ２７Ｋｉｐ１に取り込まれたユビキチンは、上記のインビトロ再構成系と同様の方法により測定することができる。
（２）ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体に依存したｐ２７Ｋｉｐ１の分解の測定
３．（１）、３．（４）に記載の方法に準じて作製したＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を発現する形質転換体を培養して、経時的に一部を回収し、それぞれの細胞のｐ２７Ｋｉｐ１の含量を測定し、形質転換体の代わりにＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を発現しない宿主を用いた場合のｐ２７Ｋｉｐ１の含量と比較することにより、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体に依存したｐ２７Ｋｉｐ１の分解を測定することができる。形質転換体の宿主としては、動物細胞等、内在性にｐ２７Ｋｉｐ１、Ｅ１、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が利用できるＥ２、およびプロテアソームを発現しているものを用いる。
ｐ２７Ｋｉｐ１の含量は、形質転換体の培養時に培地に放射性同位体で標識したアミノ酸を添加し、ｐ２７Ｋｉｐ１を標識後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない放射活性を測定する、あるいは、ｐ２７Ｋｉｐ１を認識する抗体を用いてイムノブロット解析を行なうことにより測定することができる。〔Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２，２５８７（１９９８）；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１，５６５（１９９８）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１１，３０４６（１９９７）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１１，１５４８（１９９７）〕。
また、細胞抽出液等のＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を発現する上記の形質転換体の処理物、あるいは（１）に記載したインビトロ再構成系からｐ２７Ｋｉｐ１を除きユビキチンおよびプロテアソームを添加した系に、ｐ２７Ｋｉｐ１を添加して反応させ、経時的に一部を回収し、ｐ２７Ｋｉｐ１の含量を測定し、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を発現しない宿主の処理物、あるいはＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を含まない上記のインビトロ再構成系の系を用いた場合のｐ２７Ｋｉｐ１の含量と比較することによりＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体に依存したｐ２７Ｋｉｐ１の分解を測定することができる。ｐ２７Ｋｉｐ１の含量の測定は、上記と同様にして行なうことができる。
８．ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質のスクリーニング方法
ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質は、以下（１）および（２）に示すスクリーニング方法により、取得することができる。
（１）ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を測定することに基づくスクリーニング方法
被験試料の存在下および非存在下でｐ２７Ｋｉｐ１、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチンを含む系でｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化反応を行い、ｐ２７Ｋｉｐ１に取り込まれたユビキチンの量を測定し、比較することにより、ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
すなわち、上記７．（１）に記載したｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定する方法に準じて、ＫＰＣ１もしくはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体、ｐ２７Ｋｉｐ１、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチンを含むインビトロ再構成系またはＫＰＣ１もしくはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を発現する形質転換体もしくは該形質転換体の細胞抽出液等の処理物にユビキチンおよびプロテアソーム阻害剤を添加した系に被験試料を添加した場合、添加しなかった場合それぞれでｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化反応を行い、ｐ２７Ｋｉｐ１に取り込まれたユビキチンの量を測定し、比較する。
被験試料を添加しない場合と比較して、被験試料を添加した場合に、ｐ２７Ｋｉｐ１に取り込まれたユビキチンの量が低下した場合は、被験試料をｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質として選択する。
被験試料としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、抗体、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげることができる。被験試料が単一の物質でなく組織抽出物や細胞培養上清、発酵生産物のように多数の物質の混合物の場合は、選択された被験試料をさらに精製し、各精製画分についてスクリーニングをすることにより、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を阻害する物質を単離、同定することができる。
（２）ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法
被験試料を添加した状態で、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体をｐ２７Ｋｉｐ１と接触させた後、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合量を測定する。被験試料を添加しなかった場合のＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１の結合量と比較し、結合量が低下した場合には、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体、およびｐ２７Ｋｉｐ１の結合を阻害する物質として選択する。被験試料は（１）と同様のものがあげられる。また、被験試料が混合物の場合は該被験試料をさらに精製し、再スクリーニングすることにより、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１の結合を阻害する物質を単離、同定することができる。
ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体をｐ２７Ｋｉｐ１と接触させるには、３．（３）に記載の方法により得られる精製したＫＰＣ１、あるいは１．または３．（４）に記載の方法により得られる精製したＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１をインビトロで混合することで行なえる。また、内在性にｐ２７Ｋｉｐ１を発現している宿主を用いて３．（１）または３．（４）に記載の方法により得られるＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を発現する形質転換体を作製する、あるいは３．（２）に記載の方法に準じてｐ２７Ｋｉｐ１発現用ベクターを作製し、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の発現用ベクターと共導入した形質転換体を作製することにより、細胞内で接触させることができる。被験試料の添加は、上記のインビトロの混合物または形質転換体の細胞抽出液等の処理物に被験試料を添加するか、被験試料を添加した培地で形質転換体を培養することにより行なうことができる。
結合量の測定は、抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体を用いて免疫沈降を行ない、免疫沈降物の中に含まれるＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を、４．に記載の方法で作製したＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を用いたイムノブロット解析により検出することによって、測定することができる。または、ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を用いて免疫沈降を行ない、免疫沈降物の中に含まれるｐ２７Ｋｉｐ１を、抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体を用いたイムノブロット解析により検出することによって、測定することができる。抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体およびＫＰＣ１と特異的に結合する抗体はそれぞれ、ｐ２７Ｋｉｐ１あるいはＫＰＣ１に付加したタグと特異的に結合する抗体を用いることもできる。
以上の方法で得られたＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１との結合を阻害する物質は、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害することができる。
（１）または（２）のスクリーニング方法で選択されたｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質は、細胞内で、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制することができる。さらに、このような物質は、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制することにより細胞周期の進行を抑制できるので、細胞周期の異常を原因とする疾患、細胞周期を調節することにより症状を軽減できるような疾患の治療薬として用いることができる。細胞周期の異常を原因とする疾患、細胞周期を調節することにより症状を軽減できるような疾患としては、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができ、上記ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質は、特に癌の治療に有効である。
ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化を阻害する物質の例として、ＲＩＮＧフィンガードメインが欠失したＫＰＣ１、例えば配列番号２の１〜１２５３番目のアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
９．ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの検出あるいは定量を行う方法
（ａ）ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチド、または（ｂ）ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡおよびＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡを用いてＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの検出あるいは定量を行うことができる。ポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むＤＮＡは、ＫＰＣ１をコードする二本鎖ＤＮＡあるいはその連続する２０塩基以上の配列を含む部分断片のアンチセンス鎖ＤＮＡとして得られる。２本鎖ＤＮＡを１００℃で５分間熱した後、氷上で急速に冷却することにより、センス鎖とアンチセンス鎖を分離することができる。また、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡあるいはその連続する２０塩基以上の配列を含む部分断片の３’端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、ＲＮＡポリメラーゼを用いたイン・ビトロの転写系により、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むＲＮＡを得ることができる。ＫＰＣ１をコードするＤＮＡの連続する２０塩基以上の配列を含む部分断片は、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡを適当な制限酵素で切断することにより、またはＫＰＣ１をコードするＤＮＡを鋳型とし、作製したい部分断片の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲにより得ることができる。プライマーはＤＮＡ合成機で合成できる。ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡ、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むＤＮＡはＤＮＡ合成機により調製することができる。
ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの発現量を検出する方法としては、例えば（１）ノーザンハイブリダイゼーション、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション、（３）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（４）ＲＴ−ＰＣＲ、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、（６）ＤＮＡチップ、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ等があげられる。
上記方法に供する検体としては、生体から採取した細胞あるいは各種組織等の生体試料、生体試料から調製した初代培養細胞、各種の培養細胞株、３．（１）に記載した形質転換体等から取得したｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡが用いられる。以後、該ｍＲＮＡおよび全ＲＮＡを検体由来ＲＮＡと称する。検体由来ＲＮＡの調製は、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。（３）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、検体由来ＲＮＡではなく、組織の切片や細胞が用いられる。
ノーザンハイブリダイゼーションでは、検体由来ＲＮＡをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチドを標識したプローブを用いて、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことで、ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡをバンドとして検出することができる。ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程はストリンジェントな条件で行うことが望ましい。
標識プローブは、例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたは５’末端のリン酸化等の方法により放射性同位体、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、化学発光基等を、上記プローブとするポリヌクレオチドに取り込ませることで調製できる。標識プローブの結合量はＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することでＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡを定量することができる。電気泳動、メンブレンの移行、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡの検出については、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。
ＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーションは、組織や細胞から抽出したＲＮＡをメンブラン上に点状にスポットして固定し、プローブとなる標識したポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを行ない、プローブと特異的にハイブリダイズするｍＲＮＡを検出する方法である。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものの用いることができる。ＲＮＡの調製、ＲＮＡのスポット、ハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡの検出については、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、生体から取得した組織のパラフィンまたはクリオスタット切片、あるいは固定化した細胞を検体として用い、標識したプローブとハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行い、顕微鏡観察により、ｍＲＮＡの組織や細胞内での分布や局在を調べる方法である〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５４，４１９（１９９５）〕。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものも用いることができる。偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程はストリンジェントな条件で行うことが望ましい。
ＲＴ−ＰＣＲやデファレンシャル・ハイブリダイゼーションあるいはＤＮＡチップでは、検体由来ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーまたはランダムプライマーおよび逆転写酵素を用いて合成したｃＤＮＡ（以後、該ｃＤＮＡを検体由来ｃＤＮＡと称する）を測定に用いる。検体由来ＲＮＡがｍＲＮＡの場合は、上記いずれのプライマーも用いることができるが、該検体由来ＲＮＡが全ＲＮＡである場合は、オリゴｄＴプライマーを用いることが必要である。ｃＤＮＡの合成は、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。
ＲＴ−ＰＣＲは、検体由来ｃＤＮＡを鋳型とし、ＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列から設計したＫＰＣ１特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行ない、ＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡの断片を増幅することによりｍＲＮＡを検出する方法である。ＫＰＣ１特異的なプライマーとしては、ＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡのポリＡ鎖を除いた適当な領域を選択し、その領域の塩基配列の５’端２０〜１００塩基の配列からなるＤＮＡおよび３’端２０〜１００塩基と相補的な配列からなるＤＮＡの組を用いることができる。プライマーの配列は、プライマー間の結合やプライマー内の結合を起こさず、アニーリング温度で標的ｃＤＮＡと特異的に結合して、変性条件で標的ｃＤＮＡからはずれる等の条件に基づき設計するのが好ましい。アクチンやグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下Ｇ３ＰＤＨと略す）等の細胞の種類や培養条件による発現量の変化がほとんどない蛋白質をコードするｍＲＮＡを内部コントロールとして置くことで、ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの量を定量することが可能である。ｍＲＮＡの定量を行なう場合は、増幅産物が指数関数的に増加している反応サイクルの回数内でＰＣＲを行うことが必要である。この回数は、反応サイクルの回数を段階的に増加させたＰＣＲを行ない、各ＰＣＲで増幅するＤＮＡ断片を回収してゲル電気泳動で定量することで知ることができる。ＰＣＲは、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。
検体由来ｃＤＮＡをプローブとして、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むポリヌクレオチドを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対してハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことで、ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの量の変動を検出することができる。このような原理に基づく方法には、ディファレンシャルハイブリダイゼーション〔Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，７，３１４（１９９１）〕やＤＮＡチップ〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６，６３９（１９９６）〕がある。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上にアクチンやＧ３ＰＤＨなどの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間でのＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの量の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のＲＮＡをもとにそれぞれ異なる標識のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）を用いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、１枚のフィルターあるいは１枚の基盤に２つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせることで正確なＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの定量を行うことができる。
リボヌクレアーゼ保護アッセイでは、まずＫＰＣ１をコードするＤＮＡの３’端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識したＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの混合物）およびＲＮＡポリメラーゼを用いたイン・ビトロの転写系により、標識したアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡを、検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、１本鎖ＲＮＡのみを分解するリボヌクレアーゼＡで消化する。該消化物をゲル電気泳動し、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成することにより消化から保護されたＲＮＡ断片を、ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡとして、検出あるいは定量する。
上記の方法を用いて、ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの量の変動を検出しＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの量が健常人と比較して減少あるいは増加している疾患の判定または診断を行うことができる。
疾患の判定または診断に供する検体としては患者より取得した組織、血液等の生体試料あるいは該生体試料から細胞を取得して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養細胞試料から取得したｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡが用いられる。また、生体試料から取得した組織の切片も用いることもできる。
ＫＰＣ１の発現量がｍＲＮＡレベルで減少あるいは増加している疾患は以下のようにして判定または診断できる。まず、複数の患者および健常者の検体についてＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡの量を上記にあげた検出方法で測定して比較し、患者および健常者の該ｍＲＮＡの量の範囲を決定する。被験者の検体の該ｍＲＮＡの量を、健常者の量の範囲および患者の量の範囲とそれぞれ比較し、どちらの発現レベルの範囲に入るかを調べることにより判定または診断を行う。
ＫＰＣ１の発現量がｍＲＮＡレベルで増加している疾患としては、細胞周期の異常を原因とする疾患をあげることができる。細胞周期の異常を原因とする疾患としては、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができ、上記の方法は、特に癌の判定または診断に有効である。
また、ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡを定量する方法は、細胞障害性ヌクレオシド誘導体（抗腫瘍剤、抗ウイルス剤）の効果の予測等に用いることができる。
各種病態モデル動物において、該ｍＲＮＡを定量することにより、病態における該遺伝子産物の重要性を明らかにすることができる。また、薬剤の有無による該ｍＲＮＡの発現量を比較することにより薬剤を評価することができる。
１０．疾患と関連するＫＰＣ１遺伝子の変異および多型を検出する方法
ＫＰＣ１をコードする遺伝子座中に存在する疾患の原因となる変異の存在の有無を評価するための最も明確な試験は、対照集団からの遺伝子と疾患患者からの遺伝子とを直接比較することである。
具体的には疾患患者ならび健常者から、生体試料あるいは該生体試料から樹立した初代培養細胞由来の試料を集め、該生体試料ならびに該初代培養細胞由来試料中からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する。該ＤＮＡあるいは、該ＤＮＡまたは該ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＫＰＣ１遺伝子が有する塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲにより増幅したＫＰＣ１をコードするＤＮＡ（これらのＤＮＡを以下、検体由来ＤＮＡと称する）を試料ＤＮＡとして用いることができる。
ＫＰＣ１遺伝子に疾患の原因となる変異があるかどうかを検出する方法として、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖と変異対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
ヘテロ二本鎖を検出する方法には、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法〔Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，７，５（１９９１）〕、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法（ＳＳＣＰ解析；ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ）〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６，３２５（１９９３）〕、（３）ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ法、ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）〔Ｈｕｍｎａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）〕、（４）ミスマッチの酵素的切断法〔Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，９，１０３（１９９５）〕、（５）変性ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＤＧＧＥ法）〔Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２８８，１０３（１９９３）〕等の方法が挙げられる。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法は、検体由来ＤＮＡを鋳型とし、ＫＰＣ１遺伝子の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲにより、２００ｂｐよりも小さい断片として該遺伝子断片を増幅し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。ＫＰＣ１遺伝子の変異によりヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりも移動度が遅く、それらは余分なバンドとして検出することができる。Ｈｙｄｒｏｌｉｎｋ、ＭＤＥ等の特製のゲルを用いた方が分離度はよい。２００ｂｐよりも小さい断片の検索ならば、挿入、欠失、ほとんどの１塩基置換を検出可能である。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション多型解析と組み合わせた一枚のゲルで行うことが望ましい。
ＳＳＣＰ解析では、検体由来ＤＮＡを鋳型とし、ＫＰＣ１遺伝子の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲにより、２００ｂｐよりも小さい断片として該遺伝子断片を増幅し、変性後、未変性ポリアクリルアミドゲル中で泳動する。ＰＣＲを行う際にプライマーを放射性同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、ＫＰＣ１遺伝子断片をバンドとして検出することができる。野生型のパターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に泳動すると、変異を持った断片を移動度の違いから検出できる。
ＣＣＭ法では、検体由来ＤＮＡを鋳型とし、ＫＰＣ１遺伝子の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した該遺伝子断片を、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡに放射性同位体あるいは蛍光色素をとり込ませた標識ＤＮＡとハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のＤＮＡの一方の鎖を切断させ変異を検出することができる。ＣＣＭ法は最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
ミスマッチの酵素的切断法は、上記四酸化オスミウムの代わりにＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とリボヌクレアーゼＡと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断する方法である。
ＤＧＧＥ法では、検体由来ＤＮＡを鋳型とし、ＫＰＣ１遺伝子の塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅した該遺伝子断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する。該遺伝子断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。該遺伝子断片に変異がある場合とない場合ではゲル内での移動度が異なることから、変異の存在を検出することが可能である。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けるとよい。
疾患の原因遺伝子を検出する別の方法として、蛋白質短縮試験（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ：ＰＴＴ法）〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０，１（１９９４）〕がある。該試験により蛋白質の欠損を生み出すフレームシフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特異的に検出することができる。ＰＴＴ法では、ＫＰＣ１  ｃＤＮＡのＫＰＣ１をコードする領域の５’末端から２０〜４０塩基の配列にＴ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列をつないだ特殊なプライマーを設計し、該プライマーを用いて検体由来ＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法でｃＤＮＡを作製する。該ｃＤＮＡを用い、イン・ビトロ転写、翻訳を行うとｃＤＮＡがコードする蛋白質が生産される。該蛋白質をゲルに泳動して、該蛋白質の泳動位置が完全長蛋白質に相当する位置にあれば欠損を生み出す変異は存在せず、該蛋白質に欠損がある場合は、完全長蛋白質より短い位置に該蛋白質は泳動され、該位置より欠損の程度を知ることができる。
検体由来ＤＮＡならびに検体由来ｃＤＮＡの塩基配列を決定するために本発明のＤＮＡが有する塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いることが可能である。決定された塩基配列を解析することにより、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡにの原因となる変異があるか否かを判別できる。
ＫＰＣ１遺伝子のコード領域以外の変異は、該遺伝子の付近またはその中のイントロンおよび調節配列のような、非コード領域を検査することによって検出し得る。非コード領域中の変異に起因する疾患は、上記に記載した方法に従い対照検体と比較した場合の、疾患患者における異常なサイズの、または異常な生産量のｍＲＮＡを検出することで確認することができる。
このようにして非コード領域における変異の存在が示唆された該遺伝子については、２．（２）に記載の方法により、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡをハイブリダイゼーションのプローブとして用いてクローン化することができる。非コード領域における変異は上述のいずれかの方法に準じて探索することができる。
見い出された変異は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌｉｎｋａｇｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９４）に記載された方法に従い統計処理を行うことで、疾患との連鎖があるＳＮＰｓ（シングル・ヌクレオチド・ポリモルフィズム）として同定することができる。また、疾患の病歴を持つ家族から、先に示した方法に従いＤＮＡを取得し、変異および多型を検出することで、疾患の原因遺伝子を同定することができる。
１１．ＫＰＣ１遺伝子に変異を有する疾患を判定または診断する方法
ＫＰＣ１遺伝子に変異を有する疾患を判定または診断する方法に用いられるオリゴヌクレオチドとしては、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよびＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドをあげることができる。オリゴヌクレオチドは、オリゴＤＮＡが好ましい。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機により、合成することができる。
ＫＰＣ１遺伝子に変異を有する疾患は、ヒトのいずれかの組織における遺伝子の変異を検出することによって判定または診断し得る。例えば、生殖細胞系に変異がある場合、当該変異を遺伝した個人は、疾患を発症し易い傾向である可能性がある。当該変異は、該個人の体のいずれかの組織からのＤＮＡを試験することによって検出し得る。例えば、採血しその血液の細胞からＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを用い、遺伝子の変異を試験することにより、疾患を判定または診断することができる。また、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を用い、遺伝子の変異を試験することにより、出生前診断を行うことができる。
また疾患を発症した患者から、病巣部位の生体組織を取得してＤＮＡを試験することにより、疾患の種類を判定または診断し、投与する薬物の選択などに利用することができる。組織中の遺伝子の変異を検出するためには、周囲の正常組織から遊離した病巣部位の組織を単離することが有用である。取得した組織をトリプシンなどで処理し、得られた細胞を適当な培地で培養する。培養した細胞からは染色体ＤＮＡならびにＲＮＡを抽出することができる。ＲＮＡからｃＤＮＡを合成できる。
以後、判定または診断を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＤＮＡまたはｃＤＮＡを診断検体由来ＤＮＡと称する。
診断検体由来ＤＮＡを用い、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドおよびＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを利用した疾患の判定または診断を行うには、（１）制限酵素部位の検出、（２）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法（ＡＳＯ：ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、（３）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ（ＡＲＭＳ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、（４）オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（ＯＬＡ）、（５）ＰＣＲ−ＰＨＦＡ（ＰＣＲ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、（６）オリゴＤＮＡアレイを用いる方法〔蛋白質核酸酵素、４３，２００４（１９９８）〕等の方法を用いることができる。
単一塩基変化により制限酵素部位が消失あるいは発生する場合は、診断検体由来ＤＮＡを、ＫＰＣ１  ｃＤＮＡが有する配列に基づき設計したプライマーで増幅し、該制限酵素で消化し、得られた制限酵素切断ＤＮＡ断片を正常人の場合と比較することで簡便に変異を検出することができる。しかし単一塩基変化が起こることはまれであるので、判定または診断目的には、ＫＰＣ１  ｃＤＮＡが有する配列情報ならびに別途同定された変異の情報を組合せることでオリゴＤＮＡプローブを設計し、該オリゴＤＮＡプローブをフィルターに結合させハイブリダイズを行うリバースドットブロット法で変異を検出する。
３０塩基以下の短いオリゴＤＮＡプローブは、完全に対合する配列とだけハイブリダイズするので、この特徴を利用して、対立遺伝子特異的なオリゴＤＮＡプローブを用いて、１塩基の変異を容易に検出することができる。判定または診断目的には、ヒトＫＰＣ１  ｃＤＮＡが有する配列と同定された変異に基づき設計したオリゴＤＮＡをフィルターに結合させ、診断検体由来ＤＮＡからＫＰＣ１  ｃＤＮＡが有する配列を用いて設計したプライマーと標識したｄＮＴＰを用いたＰＣＲで作製したプローブを用いてハイブリダイズを行うリバースドットブロットが用いられることが好ましい。スライドガラスやシリコンなどの基盤に直接、ＫＰＣ１  ｃＤＮＡが有する配列と該変異に基づき設計したオリゴＤＮＡを合成して、高密度のアレイを作ることからなるＤＮＡチップ法は、少量の診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡについて多様な変異をより簡便に検出できるため大規模な診断目的に適した変異検出法である。
塩基変異は、以下のオリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（ＯＬＡ）によっても検出できる。
ＫＰＣ１をコードする遺伝子が有する配列より、変異部位を挟んで該変異部位を３’末端にもつ配列からなるオリゴＤＮＡとその変異部位の３’側に隣接する配列からなるオリゴＤＮＡを２本作製する。該診断検体由来ＤＮＡと上記オリゴＤＮＡとをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後に、ＤＮＡリガーゼで２本のオリゴＤＮＡを連結させる。該診断検体由来ＤＮＡの変異部位に相当する配列がオリゴＤＮＡの配列と一致していれば、２本のオリゴＤＮＡは連結するが、異なっていれば、連結されない。例えば、一方のオリゴＤＮＡにはビオチンを、他方のオリゴＤＮＡにジゴキシゲニンのような異なる標識をつけると、連結反応が起こったかどうかを速やかに検出することが可能である。ＯＬＡは電気泳動や遠心分離操作が不要なために、多くのサンプルを効率的に短期間で判定または診断するのに適した変異検出法である。
また、以下のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法〔Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９５，１９８（１９９６）〕により微量な変異遺伝子を定量的かつ容易に検出することができる。
ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法は、ＰＣＲ、非常に高い特異性を示す液相でのハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡと同様の操作でＰＣＲ産物を検出するＥＤ−ＰＣＲ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の３つを組み合わせたものである。ジニトロフェニル（ＤＮＰ）標識およびビオチン標識したプライマーセットを用いて、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ増幅を行い、両末端標識増幅物を調製する。プライマーセットとしては、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列中の変異部位よりも５’側に存在する連続する２０〜１００塩基の配列を５’端に含むオリゴＤＮＡおよび変異部位よりも３’側に存在する連続する２０〜１００塩基の配列と相補的な配列を５’端に含むオリゴＤＮＡを用いることができる。これに対して、標識を持たない同じ配列を有するプライマーセットと診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに増幅して得た非標識増幅物を２０〜１００倍の大過剰量混合する。そして熱変性後、１℃／５分〜１０分程度の緩やかな温度勾配で冷却し、完全な相補鎖を優先的に形成させる。こうして再形成された標識ＤＮＡはビオチンを介してストレプトアビジン固定化ウェルに捕獲吸着し、ＤＮＰを介して酵素標識抗ＤＮＰ抗体を結合させて酵素による発色反応により検出する。検体中に標識ＤＮＡと同じ配列の遺伝子が存在しない場合は、元の二本鎖の標識ＤＮＡが優先的に再形成されて発色を示す。これに対し、同じ配列の遺伝子が存在する場合は、相補鎖の置換がランダムに生じるため再形成される標識ＤＮＡは減少するので、発色は著しく低下する。これにより、既知の変異・多型遺伝子の検出および定量が可能となる。
ＫＰＣ１遺伝子に変異を有する疾患としては、細胞周期の異常を原因とする疾患をあげることができる。細胞周期の異常を原因とする疾患としては、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができ、本発明の判定または診断方法は特に癌の判定または診断に有効である。
１２．ＫＰＣ１の発現を抑制する方法
（１）ＲＮＡ干渉によりＫＰＣ１の発現を抑制する方法
ＫＰＣ１をコードするＤＮＡの塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列を含む二本鎖ＲＮＡ〔以下ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）とよぶ〕または該配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ〔以下、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）とよぶ〕を用いて、ＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉとよぶ）〔Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４（２００１）〕により、ＫＰＣ１の発現を抑制することができる。ＫＰＣ１の発現の抑制に用いるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（以下それぞれ、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ、ＫＰＣ１  ｓｈＲＮＡともよぶ）は、以下のようにして作製することができる。ＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列中からＡＡで始まる２１〜２７塩基の配列〔ＡＡ（Ｎ）１９−２５、Ｎは任意の塩基〕、好ましくはＡＡ（Ｎ）１９ＴＴからなる配列を選択する。選択する配列は、翻訳領域中の開始コドンより５０塩基以上下流の領域中にあり、ＧＣ含量が３０〜７０％、好ましくは５０％前後の配列であって、他の遺伝子の塩基配列と一致せず、ＫＰＣ１  ｃＤＮＡに特異的な配列がさらに好ましい。選択した配列の末端のＡＡを除いた１９〜２５塩基の配列またはＡＡおよびＴＴを除いた１９塩基の配列（ただし配列中のＴはＲＮＡではＵとする、以下、配列Ｘとよぶ）、および該配列Ｘと相補的な配列それぞれの３’端に２〜４個のヌクレオチド、好ましくは２個のｄＴ（デオキシ体のＴ）またはＵを付加した配列を有する２本のＲＮＡを作製する。配列Ｘとしては、ヒトＫＰＣ１  ｃＤＮＡおよびマウスＫＰＣ１  ｃＤＮＡの塩基配列の１８５２〜１８８２番目に相当する、配列番号３６に示す配列をあげることができる。作製した２本のＲＮＡをアニーリングすることによりｓｉＲＮＡを作製できる。アニーリングは、２本のＲＮＡを適当なバッファー（例えば、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解した後、ヒートブロックまたはサーマサイクラーで９０〜９５℃で１〜５分間加熱した後、２５℃まで４５〜６０分間かけて冷却することにより行うことができる。ＫＰＣ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡとしては、配列番号３６で表される配列および該配列と相補的な配列の３’端にそれぞれ２〜４個のヌクレオチドを付加した配列からなる２本鎖ＲＮＡ、配列番号３４および３５でそれぞれ表される配列からなる２本鎖ＲＮＡをあげることができる。これらのｓｉＲＮＡは、ヒトＫＰＣ１およびマウスＫＰＣ１の発現を抑制することができる。
ｓｈＲＮＡとしては、上記配列Ｘと該配列Ｘと相補的な配列とを、３〜１５塩基からなる適当なスペーサー配列でつないで、３’末端に２〜４個のヌクレオチド、好ましくは２個のｄＴまたはＵを付加した配列を有するＲＮＡを作製する。スペーサー配列の５’端はｄＴｄＴまたはＵＵが好ましい。配列Ｘと配列Ｘと相補的な配列の位置はどちらが先でもよい。ＫＰＣ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡとして、配列番号３８で表される配列からなるＲＮＡをあげることができる。該ｓｈＲＮＡは、ヒトＫＰＣ１およびマウスＫＰＣ１の発現を抑制することができる。ｓｈＲＮＡは細胞内で切断を受けて、ｓｉＲＮＡに変換される。
上記のｓｉＲＮＡに用いる２本のＲＮＡおよびｓｈＲＮＡはＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。また、サイレンサー（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ）ｓｉＲＮＡ作製キット等を利用して、Ｔ７プロモーター配列および作製するＲＮＡの配列を有する２本鎖ＤＮＡを作製し、このＤＮＡを鋳型としたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写系によっても、調製することができる。あるいは、以下のようにして作製できるＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現用ベクターを、培養細胞または生体内の細胞に導入することにより、細胞内でｓｉＲＮＡを発現することができる。ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、Ｕ６プロモーターあるいはＨ１プロモーター等ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを含むｓｉＲＮＡ発現用ベクターに、上記配列Ｘ、ＴＴからはじまる３〜１５塩基からなるスペーサー配列、配列Ｘと相補的な配列およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターとなる４〜６個のＴからなる配列を含むＤＮＡを挿入して作製することができる。細胞内で、Ｕ６プロモーターからのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ反応により、配列Ｘおよび相補的な配列を含むｓｈＲＮＡが合成され、このｓｈＲＮＡが細胞内で切断を受けてｓｉＲＮＡに変換される。ｓｉＲＮＡ発現用ベクターとしては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  １．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．０（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳＵＰＥＲ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社製）等をあげることができる。レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクター〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０（２００２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１００，１８４４（２００３）；Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３，４０１（２００３）〕を用いることもできる。ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現用ベクターとしては、レトロウイルスベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏ  ＩＩのＮｏｔＩ／ＳａｌＩサイト間に、Ｕ６プロモーターおよびその下流に配列番号３７に示す配列をつなげたＤＮＡを挿入して作製したＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現用レトロウイルスベクターをあげることができる。このベクターをヒトまたはマウス細胞に導入することにより、配列番号３４および３５で表される配列を有するｓｉＲＮＡが発現し、ヒトＫＰＣ１またはマウスＫＰＣ１の発現を抑制することができる。
（２）アンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドを利用してＫＰＣ１の発現を抑制する方法
アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）；化学，４６，６８１（１９９１）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，８７（１９９２）；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１５２（１９９２）；細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕、トリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１３２（１９９２）〕に基づき、ＫＰＣ１をコードするＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列（アンチセンス配列）の連続する２０〜１００塩基の配列を含むオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体を細胞あるいは生体に投与することにより、細胞あるいは生体内でのＫＰＣ１遺伝子の転写または翻訳を抑制し、その結果、ＫＰＣ１の発現を抑制することができる。特にＫＰＣ１をコードする領域の開始コドンを含む２０〜１００塩基と相補的な塩基配列が好ましい。また、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼによる分解を受けないオリゴヌクレオチド誘導体が好ましい。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
上記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体はＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドの誘導体はオリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（インビトロジェン社製）、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（インビトロジェン社製）、トランスメッセンジャー・トランスフェクション（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬（キアゲン社製）等のリポソーム系トランスフェクション用試薬を用いて、細胞に導入することができる。また、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、２．に記載した発現ベクターを動物細胞に導入する方法と同様にして、細胞に導入することができる。ウイルスベクターを利用したＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターの場合は、該ベクターを利用して作製した組換えウイルスを投与し、細胞に感染させることにより、導入することができる。動物やヒトに投与する場合は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドの誘導体、あるいはＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターをそのままあるいはリポソーム調製物として、静脈注射等の方法で投与することができる。
ＫＰＣ１は、細胞内のｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化し、その分解を促進するので、（１）および（２）に示した方法によって、ＫＰＣ１の発現を抑制することにより、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制することができる。さらに、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制することにより細胞周期の進行を抑制できるので、該方法は、細胞周期の異常を原因とする疾患、細胞周期を調節することにより症状を軽減できるような疾患の治療に用いることができる。細胞周期の異常を原因とする疾患、細胞周期を調節することにより症状を軽減できるような疾患としては、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができ、特に該方法は癌の治療に有効である。
１３．ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を用いたＫＰＣ１の検出および定量法
４．で得られるＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を用い、抗原抗体反応を行わせることにより、ＫＰＣ１またはＫＰＣ１を含む細胞または組織を免疫学的に検出および定量することができる。測定試料としては、細胞や組織の抽出液、培養上清、血液、尿、唾液等の体液、あるいは組織のパラフィン切片やクリオスタット切片等が用いられる。
免疫学的に検出および定量する方法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫染色法、免疫蛍光染色法、イムノブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ〔単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）、続生化学実験講座５，免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）〕等が挙げられる。
ＲＩＡとは、測定試料に、ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を反応させ、さらに放射性同位体で標識され、かつ該抗体と結合する抗体を反応させた後、抗原抗体複合体を分離してシンチレーションカウンターなどで放射能を測定し、測定試料中のＫＰＣ１を検出および定量する方法である。該抗体と結合する抗体としては、ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体の作製時の免疫動物のＩｇＧと結合する抗体、例えばＫＰＣ１と特異的に結合する抗体がラットを免疫して作製したラット抗体であれば、抗ラットＩｇＧ抗体があげられる。
免疫染色法とは、組織切片や細胞等の測定試料に、ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ等の酵素、ビオチン等で標識した該抗体と結合する抗体を反応させた後、標識物質に応じた発色反応を行い、顕微鏡観察により、測定試料中のＫＰＣ１を検出する方法である。
免疫蛍光染色法は、組織切片や細胞等の測定試料に、ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を反応させ、さらにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ５４６、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質で標識した該抗体と結合する抗体を反応させた後、蛍光顕微鏡観察により、測定試料中のＫＰＣ１を検出する方法である。
イムノブロット（ウェスタンブロット）法とは、測定試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕で分画した後、ＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜にＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチン、放射性同位体等で標識した該抗体と結合する抗体を反応させた後、標識物質に応じた方法で測定試料中のＫＰＣ１をバンドとして検出および定量する方法である。
ドットブロット法とは、測定試料をニトロセルロース膜にドット状にブロッティングし、該膜にＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチン、放射性同位体等で標識した該抗体と結合する抗体を反応させた後、標識物質に応じた方法で測定試料中のＫＰＣ１を検出および定量する方法である。
免疫沈降法とは、測定試料をＫＰＣ１と特異的に結合する抗体と反応させた後、プロテインＡ−セファロース等イムノグロブリンと特異的に結合する担体を加えて反応させ、遠心分離等により、抗原抗体複合体と結合した担体を単離する方法である。担体から抗原抗体複合体を溶出させ、イムノブロット法と同様にして測定試料中のＫＰＣ１を検出する。
サンドイッチＥＬＩＳＡとは、ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を吸着させたプレートに、測定試料を反応させた後、上記抗体とはエピトープが異なるＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を反応させ、さらに該抗体と結合するペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗体を反応させた後、酵素に応じた発色反応を行い、測定試料中のＫＰＣ１を検出および定量する方法である。
１４．ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体の診断および治療への利用
ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を用いて、ＫＰＣ１の発現量の変化を検出し、ＫＰＣ１の発現量が減少または増加している疾患の判定または診断を行なうことができる。ＫＰＣ１の発現量が減少している疾患としては、細胞周期の異常を原因とする疾患、例えば、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができ、特に癌に有効である。
抗体を用いたＫＰＣ１の発現量を定量して判定または診断する方法としては、１３．にあげたＫＰＣ１を検出および定量する方法をあげることができる。
上記方法による判定または診断に供する検体としては、疾患の患者より取得した組織、血液、血清、尿、便、唾液等の生体試料そのものあるいは、該生体試料から取得した細胞ならびに細胞抽出液が用いられる。また、生体試料から取得した組織のパラフィンあるいはクリオスタット切片を用いることもできる。
ＫＰＣ１の発現量の変化を伴う疾患は以下のようにして判定または診断できる。まず、複数の患者および健常者の検体についてＫＰＣ１の発現量を上記にあげた検出方法で測定して比較し、患者および健常者のＫＰＣ１の発現レベルの範囲を決定する。被験者の検体のＫＰＣ１の発現レベルを、健常者の発現レベルおよび患者の発現レベルとそれぞれ比較し、どちらの発現レベルの範囲に入るかを調べることにより判定または診断を行う。
ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体のうち、ｐ２７Ｋｉｐ１とＫＰＣ１との結合を阻害する抗体、あるいはＫＰＣ１が有するｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を阻害する作用を示す抗体は、細胞内のＫＰＣ１のユビキチン化を抑制し、その分解を抑制することができる。さらに該抗体は、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解を抑制することにより、細胞周期の進行を抑制できるので、細胞周期の異常を原因とする疾患、細胞周期を調節することにより症状を軽減できるような疾患の治療に用いることができる。細胞周期の異常を原因とする疾患、細胞周期を調節することにより症状を軽減できるような疾患としては、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができ、該抗体は特に癌の治療に有効である。
１５．ＫＰＣ１をコードする配列に由来するポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を含有する医薬
１２．に記載したＫＰＣ１の発現を抑制するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、１４．に記載したＫＰＣ１と特異的に結合する抗体であって、ｐ２７Ｋｉｐ１とＫＰＣ１との結合を阻害する抗体、あるいはＫＰＣ１が有するｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を阻害する作用を示す抗体は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
ＫＰＣ１をコードするＤＮＡの塩基配列の２０ｂｐ以上の連続した配列と一致する、あるいは相補的な配列を含むポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはＫＰＣ１と特異的に結合する抗体を含有する診断薬の場合は、目的の診断法に応じて、ＫＰＣ１をコードするｍＲＮＡあるいはＫＰＣ１の定量あるいはＫＰＣ１遺伝子の変異の検出を行うのに必要な試薬、例えば緩衝剤、塩、反応用酵素、本発明の抗体と結合する標識された抗体、検出用発色剤等を含んでもよい。
以下により具体的な実施例をあげて説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］  ｐ２７Ｋｉｐ１に対する新規なユビキチンリガーゼ複合体ＫＰＣの単離、精製とその構成成分の解析
ウサギ網状赤血球抽出液より、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を指標にして新規ユビキチンリガーゼ複合体を分離、精製した。
（１）ｐ２７Ｋｉｐ１のユビキチン化反応のインビトロ再構成系の構築およびｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性の測定
以下に記載する、ユビキチン化反応に必要な分子については、既報の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８９３７（２００１）〕に従い大腸菌で発現、精製した組換え蛋白質を利用した。ユビキチン化反応のＥ１分子である酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｕｂａ１は、Ｎ末、Ｃ末にそれぞれＭｙｃタグ、Ｈｉｓ６タグを融合した蛋白質として、Ｅ２分子であるヒトＵｂｃＨ５ＡはＮ末、Ｃ末にそれぞれＨｉｓ６タグ、ＦＬＡＧタグを融合した蛋白質として、またマウスユビキチンはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質（以下、ＧＳＴ−Ｕｂと略す）として、いずれも大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（ノバジェン社製）で発現し、ＰｒｏＢｏｎｄ  ｒｅｓｉｎｅ（インビトロジェン社製）あるいはグルタチオン−セファロースＣＬ−４Ｂ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）にて精製を行った。反応の基質になるｐ２７Ｋｉｐ１は、マウスｐ２７Ｋｉｐ１をＧＳＴ融合蛋白質として上記大腸菌で発現し、グルタチオンビーズ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）で精製を行った後、さらにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャム・バイオサイエンシズ社）でＧＳＴ部分を切断、除去し、ミニＱカラム（アマシャム・バイオサイエンシズ社）にて精製した標品を利用した。
反応は、活性を測定する試料、５０ｎｇのＵｂａ１、１００ｎｇのＵｂｃＨ５Ａ、３μｇのＧＳＴ−Ｕｂ、５０ｎｇのｐ２７Ｋｉｐ１を含む１０μＬの反応緩衝液〔４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、６０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ、２ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略す）、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ〕中で、２６℃で３０分間行った。
ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性は、反応サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体（モノクローナル抗体、トランスダクション・ラボラトリー社製）を用いたイムノブロット解析により、ユビキチン化されたｐ２７Ｋｉｐ１分子を検出することにより測定した。本方法は、以下に述べる精製フラクションのアッセイだけでなく、組換えＫＰＣ１、ＫＰＣ２、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体のｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を評価するすべての実験に共通する方法として利用した。
（２）ｐ２７Ｋｉｐ１に対する新規なユビキチンリガーゼ複合体ＫＰＣの精製
Ｈｅｒｓｈｋｏらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，８２０６（１９８３）〕で調製したウサギ網状赤血球抽出液（約２０ｇの蛋白質量）を緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（７．４）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール〕で処理したＤＥ５２レジン７００ｍＬと４５分間混合した。直径１０ｃｍのカラムに充填後、緩衝液Ａで洗浄、１００および３００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む緩衝液Ａにて段階溶出を行い、それぞれ１４０ｍＬずつを集めた。
（１）で記載した方法にて、各フラクションのｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定し、活性のあるフラクションを集め、６０％硫酸アンモニウム添加による濃縮を行い、得られた沈殿物を１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む１０ｍＬの緩衝液Ａに懸濁した。緩衝液Ａに対し透析を行い、残留する硫酸アンモニウムを除去後、遠心分離（１２，０００×ｇ、１５分）にて回収された上清を１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む緩衝液Ａにて前処理したスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ゲルろ過カラム（アマシャムバイオサイエンシズ社製）に１０ｍＬ／ｈの速度で通塔した。ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を示すフラクションを集め、６０，０００×ｇで２０分間遠心分離後、得られた上清を緩衝液Ｐ［５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］で前処理したセラミック・ハイドロキシアパタイト・タイプ１カラム（バイオラッド社製）に通塔した。５−３００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムを含む６０ｍＬの緩衝液Ｐによる連続的溶出を行い、２ｍＬずつのフラクションを回収した。
活性を示すフラクション（２０−５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムを含む溶出部分に相当）を集め、４０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む緩衝液Ａに対して透析を行った。６０，０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清を回収し、４０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む緩衝液Ａで前処理したモノＱカラム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）に通塔した。４０−３５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムを含む３０ｍＬの緩衝液Ａによる連続的溶出を行い、１ｍＬずつのフラクションを回収した。活性を示すフラクション（１００−１６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムを含む溶出部分に相当）を集め、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む緩衝液Ａで前処理したスーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）６ゲルろ過カラム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）に通塔し、１ｍＬずつのフラクションを回収した。活性を示すフラクションを集め８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む緩衝液Ａに対して透析後、６０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含む緩衝液Ａで前処理したミニＱ（ＭｉｎｉＱ）カラム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）に通塔した。８０−３５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムを含む４．５ｍＬの緩衝液Ａによる連続的溶出を行い、１５０μｌずつのフラクションを回収した。活性は塩化カリウム濃度１３０−１８０ｍｍｏｌ／Ｌのフラクションに検出された。
第１図には精製プロトコールを、第２図にはスーパーロース６ゲルろ過カラム、第３図にはミニＱカラムでそれぞれ得られた各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛋白質の解析およびｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性の測定の結果を示している。活性と一致する蛋白質として１４０ｋＤａと５０ｋＤａのバンドが確認され、それぞれをＫＰＣ１およびＫＰＣ２とした。
（３）ＫＰＣ１およびＫＰＣ２の部分アミノ酸配列の決定
ＫＰＣ１およびＫＰＣ２を含むフラクションを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシー染色で可視化した後、各バンドを切り出した（第４図）。ゲル中での還元、Ｓ−カルボキシアミドメチル化、トリプシン消化の各処理後、μ  ＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８カラム（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）にてペプチドを分離回収し、エドマン分解によるアミノ酸配列解析を行った。ＫＰＣ１のバンドから得られた１１種のペプチドのアミノ酸配列を配列番号９〜１９に、ＫＰＣ２のバンドから得られた２種のペプチドのアミノ酸配列を配列番号２０および２１に記載した。
［実施例２］  ＫＰＣ１およびＫＰＣ２をコードするｃＤＮＡの単離
実施例１（３）で得られたＫＰＣ１およびＫＰＣ２の部分アミノ酸配列をコードしうる塩基配列を塩基配列データベース・ジェンバンクから検索した。その結果、ＫＰＣ１  ｃＤＮＡと考えられる塩基配列として、ジェンバンク登録番号ＢＥ８８５４１９およびＢＥ８８５９１４のヒトＥＳＴの配列を見出した。これらのＥＳＴの配列を有するＩＭＡＧＥコンソーシアムｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：３９０９１６９およびＩＭＡＧＥ：３９０９２０３を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より入手した。これらのｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡの塩基配列を解析し、ヒトＫＰＣ１  ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにした。配列番号１に、両ｃＤＮＡクローンに含まれるヒトＫＰＣ１  ｃＤＮＡのＫＰＣ１をコードする領域の塩基配列を、配列番号２に、配列番号１で表される塩基配列がコードするヒトＫＰＣ１のアミノ酸配列を示した。配列番号１で表される塩基配列および配列番号２で表されるアミノ酸配列ともに、塩基配列データベースおよびアミノ酸配列データベースには同一の配列はなく、新規な配列であった。ヒトＫＰＣ１のアミノ酸配列中に実施例１（３）で得られたＫＰＣ１の部分アミノ酸配列が存在することが確認された（第５図）。
また、ヒトＫＰＣ１のｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとした塩基配列データベースの相同性解析から、マウスＫＰＣ１  ｃＤＮＡのＫＰＣ１をコードすると推定される領域の５’端の塩基配列と３’端の塩基配列を見出した。これらの配列に基づく配列番号２５および２６で表されるそれぞれの塩基配列からなるＤＮＡ（ＫＰＣ１−Ｍ１、ＫＰＣ１−Ｍ２）をプライマーとし、マウスＴ細胞ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）を鋳型としたＰＣＲにより、マウスＫＰＣ１をコードするｃＤＮＡ断片を増幅し単離した。このＣＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、マウスＫＰＣ１  ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにした。配列番号３にマウスＫＰＣ１  ｃＤＮＡのＫＰＣ１をコードする領域の塩基配列を、配列番号４に配列番号３で表される塩基配列がコードするマウスＫＰＣ１のアミノ酸配列を示した。配列番号３で表される塩基配列および配列番号４で表されるアミノ酸配列ともに、塩基配列データベースおよびアミノ酸配列データベースには同一の配列はなく、新規な配列であった。
ＫＰＣ１はヒト、マウスとも１３１４アミノ酸からなり、１３２〜２５３番目にＳＰＲＹドメインが、Ｃ末に近い１２５４〜１２９１番目にＳＣＦ複合体、ＡＰＣ／Ｃ複合体、ＶＨＬ複合体等のＲＩＮＧ型ユビキチンリガーゼに共通して存在するＲＩＮＧフィンガードメインが存在した（第５図ａ）。
またウサギＫＰＣ２は、その部分アミノ酸配列から、ヒトの神経膠芽腫細胞分化因子関連（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉ  ｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＢＤＲ１）蛋白質〔Ｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５，２４３（２０００）〕のオルソログと推定された。したがって、ヒトＫＰＣ２をコードするｃＤＮＡはヒトＧＢＤＲ１  ｃＤＮＡと同一であり、ヒトＧＢＤＲ１  ｃＤＮＡの塩基配列（ジェンバンク登録番号ＡＦ１７６７９６）に基づく配列番号２７および２８で表されるそれぞれの塩基配列からなるＤＮＡ（ＫＰＣ２−Ｈ１、ＫＰＣ２−Ｈ２）をプライマーとし、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）を鋳型として用いたＰＣＲにより、そのＯＲＦの領域を、ヒトＫＰＣ２をコードするｃＤＮＡ断片として取得した。なお、このＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片は、実施例３に示した昆虫細胞での発現に用いるため、Ｎ末に、プライマーＫＰＣ２−Ｈ１に由来するＨＳＶタグが付加したヒトＫＰＣ２をコードし、５’端にＳｐｅＩサイト、３’端にＸｈｏＩサイトを有する。
また、マウスＫＰＣ２については、塩基配列データベース・ジェンバンクからマウスＧＢＤＲ１  ｃＤＮＡの５’側のＥＳＴの配列（ジェンバンク登録番号：ＢＥ１３７８０８）を見出し、このＥＳＴの配列を有するＩＭＡＧＥコンソーシアムｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：１５４７４８１を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より入手した。このｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡの塩基配列を解析し、マウスＫＰＣ２  ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにした。配列番号７に、このｃＤＮＡクローンに含まれるマウスＫＰＣ２  ｃＤＮＡのＫＰＣ２をコードする領域の塩基配列を、配列番号８に、配列番号７で表される塩基配列がコードするマウスＫＰＣ２のアミノ酸配列を示した。ＫＰＣ２はＮ末側にｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅドメイン、また２ヶ所のｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄドメインを有していた（第５図ａ）。
［実施例３］  組換えＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるｐ２７Ｋｉｐ１のポリユビキチン化
実施例２で取得したｃＤＮＡがコードするヒトＫＰＣ１およびＫＰＣ２が、ｐ２７Ｋｉｐ１を基質とするユビキチンリガーゼ複合体を構成することを検証するため、該ｃＤＮＡを用い組換えＫＰＣ１、ＫＰＣ２を調製し、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体のｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定した。
（１）組換えＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の調製
配列番号２９および３０で表される配列からなるＤＮＡ（ＫＰＣ１−Ｈ−１、ＫＰＣ１−Ｈ−２）をプライマーとし、ヒトＫＰＣ１  ｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：３９０９１６９を鋳型としたＰＣＲにより、Ｎ末にＦＬＡＧタグを付加したヒトＫＰＣ１をコードするＤＮＡを増幅した。一方、昆虫細胞発現用トランスファーベクターｐＢａｃＰＡＫ９（クロンテック社製）のＸｂａＩ／ＸｈｏＩサイト間に、ベクターｐＲＳＥＴ  Ｂ（インビトロジェン社製）Ｈｉｓ６タグをコードする領域含むＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片（約１４０ｂｐ）を挿入した。このベクターのＮｈｅＩ／ＸｈｏＩサイト間に、上記のＫＰＣ１増幅断片を５’にあるＮｈｅＩ、３’端にあるＸｈｏＩで切断後、挿入することにより、ｐＢａｃＰＡＫ９に、Ｎ末に配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるＨｉｓ６／ＦＬＡＧタグを付加したヒトＫＰＣ１をコードするＤＮＡが挿入されたトランスファーベクターを作製した。
また、実施例２で増幅したヒトＫＰＣ２  ｃＤＮＡ断片は、ＨＳＶタダをＮ末に付加したヒトＫＰＣ２をコードしているので、ＫＰＣ１増幅断片を５’端にあるＳｐｅＩ、３’端にあるＸｈｏＩで切断後、同様に、上記のＨｉｓ６タグをコードする領域を挿入したｐＢａｃＰＡＫ９のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩサイト間に挿入することにより、Ｎ末に配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるＨｉｓ６／ＨＳＶタグを付加したヒトＫＰＣ２をコードするＤＮＡが挿入されたトランスファーベクターを作製した。
得られたトランスファーベクターそれぞれとＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現システム（クロンテック社製）とを用いて作製した組換えバキュロウイルスをＳｆ２１細胞に共感染させ、既報の方法〔Ｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３，２９２８（１９９９）〕に従い、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の発現ならびに精製を行った。第６図には、精製したＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離しクマシー染色した結果を示した。
（２）ＫＰＣ１とＫＰＣ２の結合能の確認
ＫＰＣ１およびＫＰＣ２を発現させたＳｆ２１細胞の細胞抽出液について、ＦＬＡＧタグに対する抗体およびプロテインＡ−セファロースビーズ（シグマ社製）を用いてＫＰＣ１を免疫沈降し、共沈するＫＰＣ２の有無をＨＳＶタグに対する抗体で検出した。その結果、ＫＰＣ１に対する免疫沈降物中にＫＰＣ２が検出され、両蛋白質が細胞内で結合していることが明らかになった（第７図）。
（３）ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１の結合
実施例１にて取得した大腸菌発現の組換えｐ２７Ｋｉｐ１と、（１）で調製した組換えＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を混ぜ合わせた。ｐ２７Ｋｉｐ１に対する抗体で免疫沈降を行った後、ＦＬＡＧタグに対する抗体およびＨＳＶタグに対する抗体をそれぞれ用いてＫＰＣ１およびＫＰＣ２を検出した。その結果、免疫沈降物中にＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が含まれることが確認された（第８図）。この結果は、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１が互いに結合する分子であること示している。
（４）組換ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体またはＫＰＣ１によるｐ２７Ｋｉｐ１のポリユビキチン化
ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が実際にｐ２７Ｋｉｐ１のポリユビキチン化におけるユビキチンリガーゼとして機能するかを以下のようにして調べた。（１）で調製した組換えＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体２００ｎｇと５０ｎｇの組換えｐ２７Ｋｉｐ１を用い、実施例１（１）に記載したユビキチン化反応を行ない、反応後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結果を第９図左に示した。Ｅ１（Ｕｂａ１）およびＥ２（ＵｂｃＨ５Ａ）共存下で明らかなポリユビキチン化が検出され、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体がｐ２７Ｋｉｐ１ポリユビキチン化におけるユビキチンリガーゼとして働くことが確認された。
また、（１）で作製したＫＰＣ１発現用トランスファーベクターに由来する組換えバキュロウイルスのみを感染させたＳｆ２１細胞から精製したＫＰＣ１を、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の代わりに用いて同様の反応を行なった。その結果、ＫＰＣ１単独ではＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体と比較して、ユビキチンが１つだけ付加したｐ２７Ｋｉｐ１の量はほとんど変わらないが、ポリユビキチン化したｐ２７Ｋｉｐ１の量は明らかに多く、効率的にｐ２７Ｋｉｐ１がポリユビキチン化を受けることがわかった（第１０図）。したがってＫＰＣ１は、単独でｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有するユビキチンリガーゼであることがわかった。また、ＫＰＣ２は、１つだけユビキチンが付加したｐ２７Ｋｉｐ１をさらにポリユビキチン化する反応を阻害する可能性がある。
ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体のｐ２７Ｋｉｐ１に対する特異性を検証するため、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＤＫインヒビターであるＳｉｃ１に対するポリユビキチン化作用の有無を検討した。Ｓｉｃ１はＨｉｓ６／ＨＰＣ４タグ化蛋白質として既報の方法〔Ｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，６５７（１９９９）〕にて大腸菌で発現した蛋白質を用いた。ｐ２７Ｋｉｐ１の代わりにＳｉｃ１を用いて上記と同様の反応を行い、解析した。その結果、ｐ２７Ｋｉｐ１と異なりＳｉｃ１のポリユビキチン化は見られないことから（第９図右）、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体はｐ２７Ｋｉｐ１に選択性を有するユビキチンリガーゼ複合体であることが確認された。
（５）ｐ２７Ｋｉｐ１のポリユビキチン化におけるＫＰＣ１のＲＩＮＧフィンガードメインの重要性
ＫＰＣ１のＣ末に存在するＲＩＮＧフィンガードメインの機能を調べるため、ＲＩＮＧフィンガードメインを欠損した変異型ＫＰＣ１〔以下ＫＰＣ１（ΔＲ）と称す〕を昆虫細胞で発現させた。配列番号２９および３１で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ＫＰＣ１−Ｈ−１、ＫＰＣ１−Ｈ−３）をプライマーとし、ヒトＫＰＣ１  ｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：３９０９１６９を鋳型としたＰＣＲにより、ＫＰＣ１（ΔＲ）（配列番号２の１〜１２５３番目のアミノ酸配列からなる）のＮ末にＦＬＡＧタグを付加した蛋白質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を５’にあるＮｈｅＩ、３’端にあるＸｈｏＩで切断後、（１）で作製したＨｉｓ６タグをコードする領域を挿入したｐＢａｃＰＡＫ９のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩサイト間に挿入することにより、ｐＢａｃＰＡＫ９に、Ｎ末にＨｉｓ６／ＦＬＡＧタグを付加したＫＰＣ１（ΔＲ）をコードするＤＮＡが挿入されたトランスファーベクターを作製した。このトランスファーベクター、および（１）で作製した、Ｎ末にアミノ酸配列からなるＨｉｓ６／ＨＳＶタグを付加したヒトＫＰＣ２をコードするＤＮＡが挿入されたトランスファーベクターを用いて、（１）と同様にして、ＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体を発現するＳｆ２１細胞を作製した。ＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体を発現するＳｆ２１細胞の細胞抽出液について、（２）と同様に、ＦＬＡＧタグに対する抗体でＫＰＣ１（ΔＲ）を免疫沈降し、共沈するＫＰＣ２の有無を検出した。その結果、ＫＰＣ１（ΔＲ）に対する免疫沈降物中にＫＰＣ２が検出され、ＫＰＣ２との結合にはＲＩＮＧフィンガードメインが関与していないことわかった（第７図）。
ＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体を用いて、（４）に記載した方法によりｐ２７Ｋｉｐ１のポリユビキチン化反応を行った。第１０図に示すように、野生型ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体で見られるユビキチン化がＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体では検出されず、ポリユビキチン化反応においてＫＰＣ１のＲＩＮＧフィンガードメインが必須であることが確認された。
（６）ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるポリユビキチン化反応におけるＥ２の選択性
文献〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３３１１１（２００１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８９３７（２００１）〕に記載の方法に従い、Ｎ末にＨｉｓ６タグを付加した各種組換えヒトＥ２（Ｕｂｃ２Ａ、Ｕｂｃ３、Ｕｂｃ４、ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ８）を調製し、それらを用いたｐ２７Ｋｉｐ１のポリユビキチン化反応により、どのＥ２がＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の反応に関与するかを解析した。その結果、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるユビキチン化反応においてはＵｂｃ４およびＵｂｃＨ５Ａが関与することが明らかになった（第１１図）。
（７）ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるポリユビキチン化反応に対するｐ２７Ｋｉｐ１のリン酸化の影響
ｐ２７Ｋｉｐ１の細胞内局在と分解調節は、ｐ２７Ｋｉｐ１の２個所のアミノ酸部位でのリン酸化（１０番目のセリン、１８７番目のスレオニン；それぞれＳｅｒ−１０，Ｔｈｒ−１８７と略す）が重要であることが報告されている。ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるポリユビキチン化反応に対するそれらアミノ酸のリン酸化の影響を見る目的で、リン酸化部位のアミノ酸を置換した変異型ｐ２７Ｋｉｐ１を作製し、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるポリユビキチン化を解析した。
変異型ｐ２７Ｋｉｐ１として、Ｓｅｒ−１０、Ｔｈｒ−１８７をそれぞれアラニンに置換したもの（それぞれＳ１０Ａ、Ｔ１８７Ａと称す）とグルタミン酸に置換したもの（それぞれＳ１０Ｅ、Ｔ１８７Ｅと称す）を、実施例１（１）に記載した組換えｐ２７Ｋｉｐ１の調製と同手法により調製した。これら変異型ｐ２７Ｋｉｐ１を基質としてポリユビキチン化反応を行った結果、すべての変異型において野生型ｐ２７Ｋｉｐ１同様、ユビキチン化が行われることが確認された（第１２図）。この結果から、従来の分解制御機構と異なりＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体によるｐ２７Ｋｉｐ１の分解調節においてはこれらアミノ酸のリン酸化は関与していないことがわかり、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体による反応が新規なメカニズムであることを支持する結果といえる。
［実施例４］  免疫蛍光染色法によるＫＰＣ１およびＫＰＣ２の細胞内局在解析
実施例２（１）で作製したＫＰＣ１の発現用トランスファーベクターの、Ｈｉｓ６／ＦＬＡＧタグを付加したＫＰＣ１をコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を、レトロウイルス発現用ベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，３９３８（１９９７）〕のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイト間に挿入し、ＫＰＣ１発現用レトロウイルスベクターを作製した。また、配列番号３２および３３で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ＫＰＣ２−Ｈ−３、ＫＰＣ２−Ｈ−４）をプライマーとし、実施例２で増幅したヒトＫＰＣ２  ｃＤＮＡ断片を鋳型にしたＰＣＲにより、Ｃ末に配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるＨＡタグを付加したＫＰＣ２をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を５’端にあるＢａｍＨＩおよび３’端にあるＸｈｏＩで切断後、同様にｐＭＸ−ｐｕｒｏのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイト間に挿入し、ＫＰＣ２発現用レトロウイルスベクターを作製した。
これらの組換えレトロウイルス発現用ベクターをそれぞれ、既報〔Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７，１０６３（２０００）〕に従いＰｌａｔ  Ｅ細胞にトランスフェクトすることにより組換えレトロウイルスを作製した。得られた組換えウイルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）に共感染させ、１０μｇ／ｍＬピューロマイシンを含む培地で選択することにより、組換えＫＰＣ１およびＫＰＣ２を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を作製した。細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社）および抗ＨＡ抗体（サンタクルーズ社）を用いた免疫蛍光染色法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３３１１１（２００１）〕により、ＫＰＣ１およびＫＰＣ２の細胞内局在を解析した。
その結果、両蛋白質は共通して細胞質に局在し、核内には局在しないことが明らかになった。ｐ２７Ｋｉｐ１は細胞周期Ｇ０−Ｇ１期において核内から細胞質へと輸送されること〔ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６６７２（２００１）〕、またｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性が細胞質由来の粗精製分画に存在する〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８９３７（２００１）〕という、従来の報告と一致しており、本結果は、ＫＰＣ１、ＫＰＣ２が細胞質に局在し、Ｇ０−Ｇ１期に核から細胞質に移行したｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化するという仮説を支持する結果である。
［実施例５］  ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の過剰発現によるｐ２７Ｋｉｐ１の分解に対する影響
実施例２（１）で作製したＫＰＣ１の発現用トランスファーベクターの、Ｈｉｓ６／ＦＬＡＧタグを付加したＫＰＣ１（ΔＲ）をコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を、発現用レトロウイルスベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイト間に挿入し、ＫＰＣ１（ΔＲ）発現用レトロウイルスベクターを作製した。実施例４と同様の方法で、ＫＰＣ１（ΔＲ）およびＫＰＣ２を高発現したＮＩＨ３Ｔ３細胞を作製した。
この細胞、実施例４で作製したＫＰＣ１およびＫＰＣ２を高発現したＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびコントロール用のｐＭＸ−ｐｕｒｏベクターから作製した組換えレトロウイルスを感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、細胞内でのｐ２７Ｋｉｐ１の分解に対するＫＰＣの機能を調べた。接触阻害により細胞周期Ｇ０に同調した細胞を細胞密度約４０％で蒔き直すことにより細胞周期Ｇ１へのエントリーを可能にし、それ以後のｐ２７Ｋｉｐ１量をイムノブロットにより経時的に解析した（第１３図ａ）。ＫＰＣ１およびＫＰＣ２を高発現した細胞ではコントロール細胞に比べ、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解が早く起きること、またＫＰＣ１（ΔＲ）およびＫＰＣ２の発現細胞では逆に分解が遅れることが確認された。この結果は、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体が、細胞内でのｐ２７Ｋｉｐ１のＧ０−Ｇ１期における分解に関与することを示すと同時にＫＰＣ１（ΔＲ）がドミナントネガティブ型分子として機能することを示している。
同様の実験を、蛋白質の核外移行を阻害する薬剤ｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ存在下で行った結果、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解速度に差がないことがわかり、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体を介したｐ２７Ｋｉｐ１の分解調節は、ｐ２７Ｋｉｐ１の核から細胞質への移行が重要であることが確認された（第１３図ｂ）。
［実施例６］  ＫＰＣ１と特異的に結合する抗体およびＫＰＣ２と特異的に結合する抗体
マウスＫＰＣ１のＮ末端から３００アミノ酸を含むＫＰＣ１の部分断片、マウスＫＰＣ２をそれぞれ抗原として、ウサギを免役し、抗血清を採取することにより、ＫＰＣ１と特異的に結合するポリクローナル抗体およびＫＰＣ２と特異的に結合するポリクローナル抗体を得た。実施例７および第１４図に示すように、これらの抗体を用いたイムノブロットにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で内在性に発現しているＫＰＣ１およびＫＰＣ２を、それぞれ検出することができた。
［実施例７］  ＲＮＡｉによるＫＰＣ１の発現の抑制およびそのｐ２７Ｋｉｐ１の分解および細胞の増殖に対する影響
発現用レトロウイルスベクターｐＭＸ〔Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４（１９９６）〕のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩサイト間にピューロマイシン耐性遺伝子を挿入し、ベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏ  ＩＩを作製した。ｐＭＸ−ｐｕｒｏ  ＩＩのＮｏｔＩ／ＳａｌＩサイト間に、マウスＵ６プロモーターおよびその下流に配列番号３７で表される配列をつなげたＤＮＡを挿入し、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現用レトロウイルスベクターを作製した。該ベクターを導入した細胞は、マウスＫＰＣ１遺伝子（配列番号３）の１８５２〜１８７２番目の配列を標的とするｓｉＲＮＡを発現する。また、コントロールとして、ｐＭＸ−ｐｕｒｏ  ＩＩのＮｏｔＩ／ＳａｌＩサイト間に、マウスＵ６プロモーターおよびその下流に配列番号３９に示す配列をつなげたＤＮＡを挿入し、改良型のグリーン蛍光蛋白質であるＥＧＦＰ〔Ｇｅｎｅ，１７３，３３（１９９６）〕のｓｉＲＮＡ発現用レトロウイルスベクターを作製した。該ベクターを導入した細胞は、ＥＧＦＰ遺伝子のコード領域の１２６〜１４６番目の配列を標的とするｓｉＲＮＡを発現する。これらの発現用レトロウイルスベクターを用いて、実施例４と同様にして組換えレトロウイルスを作製し、得られた組換えウイルスをそれぞれＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させ、１０μｇ／ｍＬピューロマイシンを含む培地で選択することにより、マウスＫＰＣ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをそれぞれ発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を作製した。実施例６で作製した抗マウスＫＰＣ１抗体を用いたイムノブロット解析により、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較して、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＫＰＣ１の発現が特異的に抑制されていることが確認された。なお、ＫＰＣ２の発現は、どちらのＮＩＨ３Ｔ３細胞も同程度で、抑制はみられなかった（第１４図）。
これらのＮＩＨ３Ｔ３細胞を、接触阻害により細胞周期Ｇ０に同調した後、細胞密度約４０％で蒔き直すことにより細胞周期Ｇ１へ進入させ、以後の細胞のｐ２７Ｋｉｐ１量をイムノブロットにより経時的に解析した（第１４図）。コントロールとして、ＧＳＫ−３βの蛋白質量も同時に解析した。その結果、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞では、時間の経過とともに、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解が見られるのに対し、マウスＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解が抑制されていることが確認された。コントロールのＧＳＫ−３βの分解は、どちらの細胞でも特に見られなかった。
また、これらのＮＩＨ３Ｔ３細胞を、０．１％血清を含む培地で培養し、ｐ２７Ｋｉｐ１、サイクリンＡ、ＫＰＣ１、ＫＰＣ２およびＧＳＫ−３βの蛋白質量ならびに細胞数を経時的に解析した（第１５図および第１６図）。蛋白質量は、イムノブロットにより測定した。その結果、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較して、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解が抑制されることにより、時間の経過とともにｐ２７Ｋｉｐ１がより多く蓄積すること、ｐ２７Ｋｉｐ１により活性化および分解が阻害されるサイクリンＡの分解が促進されていることが確認された。ＫＰＣ１、ＫＰＣ２およびコントロールのＧＳＫ−３βの蛋白質量の変化は、どちらの細胞でも特に見られなかった。また、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞では、細胞数が経時的に増加し、細胞周期が進行していると考えられるのに対し、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞では、細胞数の増加が見られず、細胞周期の進行が抑制されていた。したがって、ＲＮＡｉによってＫＰＣ１の発現を抑制することにより、ｐ２７Ｋｉｐ１の分解の抑制、サイクリンＡの分解の促進、細胞周期の進行の抑制、および細胞の増殖の抑制をすることができた。
産業上の利用可能性
本発明により、ｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有する新規なユビキチンリガーゼ蛋白質、該蛋白質を含むｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を有するユビキチンリガーゼ複合体、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、および該蛋白質を認識する抗体が提供される。本発明は、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等の細胞周期の異常を原因とする疾患、細胞周期を調節することにより症状を軽減できるような疾患、特に癌の診断、治療等に有用である。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−発明者：中山敬一；嘉村巧
配列番号２２−Ｈｉｓ６／ＦＬＡＧタグ
配列番号２３−Ｈｉｓ６／ＨＳＶタグ
配列番号２４−ＨＡタグ
配列番号２５−ＰＣＲプライマーＫＰＣ１−Ｍ１
配列番号２６−ＰＣＲプライマーＫＰＣ１−Ｍ２
配列番号２７−ＰＣＲプライマーＫＰＣ２−Ｈ１
配列番号２８−ＰＣＲプライマーＫＰＣ２−Ｈ２
配列番号２９−ＰＣＲプライマーＫＰＣ１−Ｈ−１
配列番号３０−ＰＣＲプライマーＫＰＣ１−Ｈ−２
配列番号３１−ＰＣＲプライマーＫＰＣ１−Ｈ−３
配列番号３２−ＰＣＲプライマーＫＰＣ２−Ｈ−３
配列番号３３−ＰＣＲプライマーＫＰＣ２−Ｈ−４
配列番号３４−ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡセンス鎖
配列番号３５−ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖
配列番号３６−ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ用の配列Ｘ
配列番号３７−ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターに挿入したＤＮＡ
配列番号３８−ＫＰＣ１  ｓｈＲＮＡ
配列番号３９−ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ発現ベクターに挿入したＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  第１図は、ウサギ網状赤血球抽出液からのＫＰＣの精製プロトコールを示す。
第２図  第２図の上段は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６ゲルろ過カラムで得られた各フラクションの、インビトロ再構成系によるｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性の測定を示す。左のｐ２７、ｐ２７−（ＧＳＴ−Ｕｂ）１、ｐ２７−（ＧＳＴ−Ｕｂ）２、ｐ２７−（ＧＳＴ−Ｕｂ）３、ｐ２７−（ＧＳＴ−Ｕｂ）ｎはそれぞれ、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＴ−Ｕｂが１個付加したｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＴ−Ｕｂが２個付加したｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＴ−Ｕｂが３個付加したｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＴ−Ｕｂが３個以上付加したｐ２７Ｋｉｐ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の位置を示す（以下の図面でも同様）。フラクションの上に、分子量マーカーがゲルろ過で溶出されるフラクションの位置を示す。下段は、同じフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシー染色した結果を示す。左に分子量マーカーの位置、右にＫＰＣ１およびＫＰＣ２の位置を示す。
第３図  第３図は、第２図と同様に、上段は、ミニＱカラムで得られた各フラクションの、インビトロ再構成系によるｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性の測定を、下段は同じフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシー染色した結果を示す。左に分子量マーカーの位置、右にＫＰＣ１およびＫＰＣ２の位置を示す。
第４図  第４図は、ウサギ網状赤血球抽出液から精製したＫＰＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシー染色した結果を示す。左に分子量マーカーの位置、右にＫＰＣ１およびＫＰＣ２の位置および、それぞれから得られた部分ベプチドのアミノ酸配列を１文字表記で示す。
第５図  第５図ａはＫＰＣ１およびＫＰＣ２の構造を示す。ＳＰＲＡＹはＳＰＲＡＹドメインを、ＲＩＮＧはＲＩＮＧフィンガードメインを、ＵＢＬはユビキチン様（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ）ドメインを、またＵＢＡはユビキチン結合（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインをそれぞれ示している。第５図ｂは、ヒトＫＰＣ１のアミノ酸配列を示す。精製サンプルのペプチド解析から得られた配列と一致する部分を下線で、ＳＰＲＹドメイン、ＲＩＮＧフィンガードメインをそれぞれ白黒反転および枠囲みで示し、ＲＩＮＧフィンガードメイン中の亜鉛結合部位と予測される配列に＊を記す。
第６図  第６図は、昆虫細胞で発現させ、精製した組換えＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシー染色した結果を示す。左に分子量マーカーの位置、右に発現させたＨｉｓ６／ＦＬＡＧタグ付加ＫＰＣ１およびＨｉｓ６／ＨＳＶタグ付加ＫＰＣ２の位置を示す。
第７図  第７図は、昆虫細胞で発現させたＫＰＣ１およびＫＰＣ１（ΔＲ）とＫＰＣ２の細胞内での会合を免疫沈降により解析した結果を示す。ＷＴは野生型ＫＰＣ１、ΔＲはＫＰＣ１（ΔＲ）を、＋はＫＰＣ２をそれぞれ発現させたこと、−は発現させなかったことを示す。左は、細胞抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右は抗ＦＬＡＧ抗体（ＫＰＣ１およびＫＰＣ１（ΔＲ）と結合）による免疫沈降物についてそれぞれ、上段は抗ＦＬＡＧ抗体、下段は抗ＨＳＶ抗体（ＫＰＣ２と結合）によるイムノブロット解析を示す。
第８図  第８図は、昆虫細胞で発現させたＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１のインビトロでの結合を免疫沈降により解析した結果を示す。＋は添加、−は非添加を示す。左は、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体とｐ２７Ｋｉｐ１の混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右は抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体による免疫沈降物についてそれぞれ、上段は抗ＦＬＡＧ抗体（ＫＰＣ１と結合）、中段は抗ＨＳＶ抗体（ＫＰＣ２と結合）、下段は抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体によるイムノブロット解析を示す。
第９図  第９図は、昆虫細胞で発現させたＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体のｐ２７Ｋｉｐ１およびリン酸化Ｓｉｃ１（Ｓｉｃ１−Ｐ）をユビキチン化する活性を測定した結果を示す。＋はインビトロ再構成系の各成分、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体、ＳＣＦＣｄｃ４（図中でＳＣＦ  Ｃｄｃ４と表記）の添加、−は非添加を示す。左はｐ２７Ｋｉｐ１を基質とした場合、右はＳｉｃ１−Ｐを基質として添加し、それぞれ抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体、抗ＨＰＣ４抗体（Ｓｉｃ１−Ｐと結合）によりイムノブロット解析した場合を示す。Ｓｉｃ１−Ｐ、Ｓｉｃ１−Ｐ−（ＧＳＴ−Ｕｂ）１、Ｓｉｃ１−Ｐ−（ＧＳＴ−Ｕｂ）ｎはそれぞれ、Ｓｉｃ１−Ｐ、ＧＳＴ−Ｕｂが１個付加したＳｉｃ１−Ｐ、ＧＳＴ−Ｕｂが２個以上付加したＳｉｃ１−ＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の位置を示す。
第１０図  第１０図は、昆虫細胞で発現させたＫＰＣ１、ＫＰＣ１（ΔＲ）、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体、ＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体のｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定した結果を示す。ＷＴは野生型ＫＰＣ１、ΔＲはＫＰＣ１（ΔＲ）を、＋はＫＰＣ２をそれぞれ発現させたこと、−は発現させなかったことを示す。反応の＋はインビトロ再構成系の反応を行った場合、−はインビトロ再構成系の構成成分を添加せず反応を行わなかったことを示す。
第１１図  第１１図は、Ｅ２として各レーンの上に示す種々の蛋白質を用いたときに、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体がｐ２７Ｋｉｐ１をユビキチン化する活性を測定した結果を示す。（−）は、Ｅ２を添加しなかった場合の結果を示す。
第１２図  第１２図は、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体の、ｐ２７Ｋｉｐ１およびｐ２７Ｋｉｐ１のリン酸化部位変異体（Ｓ１０Ａ、Ｔ１８７Ａ、Ｓ１０Ｅ、Ｔ１８７Ｅ）をユビキチン化する活性を測定した結果を示す。反応の＋はインビトロ再構成系の反応を行った場合、−はインビトロ再構成系の構成成分を添加せず反応を行わなかったことを示す。
第１３図  第１３図は、ＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体、ＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体を高発現させた細胞におけるｐ２７Ｋｉｐ１の分解を解析した結果を示す。第１３図ａはｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｂ非存在下、第１３図ｂはｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｂ存在下で蛋白質の核外移行を阻害した場合を示す。左はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析で上段は抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体、下段は抗ＧＳＫ−３β抗体によるイムノブロットを示す。右は、ｐ２７Ｋｉｐ１の量の経時的な分解を表すグラフで、横軸は時間、縦軸は０時間を１００％としたときの残存するｐ２７Ｋｉｐ１の量（％）を示し、○はＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体、□はＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体をそれぞれ発現させた細胞、▲はコントロールのベクターのみを導入した細胞での結果を示す。ＫＰＣ１（ＷＴ）−ＫＰＣ２はＫＰＣ１−ＫＰＣ２複合体、ＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２はＫＰＣ１（ΔＲ）−ＫＰＣ２複合体をそれぞれ発現させた細胞、コントロールはコントロールのベクターのみを導入した細胞を表す。
第１４図  第１４図は、ＲＮＡｉによるＫＰＣ１の発現の抑制とｐ２７Ｋｉｐ１の分解を解析した結果を示す。上段は、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞におけるＫＰＣ１およびＫＰＣ２の発現の解析を示す。左は抗ＫＰＣ１抗体、右は抗ＫＰＣ２抗体によるイムノブロットを示し、ＫＰＣ１はＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞、ＥＧＦＰは、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞における解析を示す。下段は、ＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞におけるｐ２７Ｋｉｐ１の経時的な分解の解析を示す。上の２つの段は抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体、下の２つの段は抗ＧＳＫ−３β抗体を用いたイムノブロットを示し、ＲＮＡｉ：ＫＰＣ１はＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞、ＲＮＡｉ：ＥＧＦＰは、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞における解析を示す。
第１５図  第１５図は、ＲＮＡｉによりＫＰＣ１の発現を抑制した細胞の、各種蛋白質の量を経時的に解析した結果を示す。上から２段ずつそれぞれ、抗ｐ２７Ｋｉｐ１抗体、抗サイクリンＡ抗体、抗ＧＳＫ−３β抗体、抗ＫＰＣ１抗体、抗ＫＰＣ２抗体を用いたイムノブロットによる、レーンの上に示す各時間における蛋白質量の解析を示す。ＫＰＣ１はＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞、ＥＧＦＰは、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞における解析を示す。
第１６図  第１６図は、ＲＮＡｉによりＫＰＣ１の発現を抑制した細胞の、細胞増殖を示すグラフで、横軸は時間（ｈ）、縦軸は細胞数を示す。■はＫＰＣ１  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞、●は、コントロールのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞における細胞数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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