(57)【要約】本発明の目的は、新規な色素蛋白質並びに蛍光蛋白質を提供することである。本発明によれば、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の所定の特性を有する色素蛋白質、並びにヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）及びアザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）由来の所定の蛍光特性を有する蛍光蛋白質が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の下記の特性を有する色素蛋白質。
（１）吸収極大波長が６０５ｎｍである；
（２）６０５ｎｍにおけるモル吸光係数が４７５５０である；
（３）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜１０で安定である：
【請求項２】
以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
【請求項３】
ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の下記の特性を有する色素蛋白質。
（１）吸収極大波長が５５３ｎｍである；
（２）５５３ｎｍにおけるモル吸光係数が２５３００である；
（３）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜１０で安定である：
【請求項４】
以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
【請求項７】
以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
【請求項８】
以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
【請求項９】
以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
【請求項１０】
請求項６から９の何れかに記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項６から１０の何れかに記載のＤＮＡ又は請求項１０に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１から４の何れかに記載の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質。
【請求項１３】
請求項１から４の何れかに記載の色素蛋白質をアクセプター蛋白質として用いてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法。
【請求項１４】
請求項１から４の何れかに記載の色素蛋白質、請求項５から９の何れかに記載のＤＮＡ、請求項１０に記載の組み換えベクター、請求項１１に記載の形質転換体、又は請求項１２に記載の融合蛋白質を含む、吸光試薬キット。
【請求項１５】
ヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。
（１）紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７２ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長が５１８ｎｍ（緑）及び５８１ｎｍ（赤）である；
（２）５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）が９８８００Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７２ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）が６０４００Ｍ−１ｃｍ−１である；
（３）量子収率が０．８０（緑）及び０．３３（赤）である；及び
（４）緑色及び赤色のｐＨ感受性についてのｐＫａは共に５．７である：
【請求項１６】
以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：
【請求項１７】
配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
【請求項１８】
アザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。
（１）紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７８ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長が５１８ｎｍ（緑）及び５８８ｎｍ（赤）である；
（２）５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）が１０２２５０Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７８ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）が７６９５０Ｍ−１ｃｍ−１である；
（３）量子収率（蛍光）が０．４３（緑）及び０．５１（赤）である；及び
（４）緑色（５０８ｎｍ）のｐＨ感受性についてｐＫａが５．８であり、赤色（５７８ｎｍ）のｐＨ感受性についてｐＫａが６．５である。
【請求項１９】
以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：
【請求項２０】
配列番号１１、１３、１５又は１７の何れかに記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
【請求項２１】
以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は、
（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
【請求項２２】
以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２３】
以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は、
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
【請求項２４】
以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１２、１４、１６又は１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２５】
請求項２１から２４の何れかに記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項２６】
請求項２１から２４の何れかに記載のＤＮＡ又は請求項２５に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項２７】
請求項１５から２０の何れかに記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。
【請求項２８】
他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項２７に記載の融合蛍光蛋白質。
【請求項２９】
他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項２７又は２８に記載の融合蛍光蛋白質。
【請求項３０】
請求項２７から２９の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。
【請求項３１】
請求項１５から２０の何れかに記載の蛍光蛋白質、請求項２１から２４の何れかに記載のＤＮＡ、請求項２５に記載の組み換えベクター、請求項２６に記載の形質転換体、又は請求項２７から２９の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な色素蛋白質、より詳細にはベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の新規な色素蛋白質及びその利用に関する。本発明はさらに、新規な蛍光蛋白質、より詳細には、ヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）及びアザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）由来の新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。
【背景技術】  クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
また、ＧＦＰ変異体の他の例として、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）があり、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。また、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｍａ  ｓｐ．）からは赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）も単離されており、ＤａｓＲｅｄが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の４種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。
従来の蛍光蛋白質の量子収率を０に近づけたものが色素蛋白質である。色素蛋白質は、光エネルギーを他のエネルギーに変換する分子を細胞内に導入することができる点で様々な応用が可能である。しかしながら、色素蛋白質の吸収波長特性について報告されている例は少ない。
【発明の開示】
本発明は、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）に由来する、ある特定の波長の光を吸収する新規な色素蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、刺胞動物、特にはイシサンゴの一種であるヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）及びアザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）に由来する新規な一次構造を有する蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、既知の蛍光蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づいて好適なプライマーを設計し、緑色を呈するベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）のｃＤＮＡライブラリーから上記プライマーを用いて新規な色素蛋白質をコードする遺伝子を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の色素蛋白質の光吸収特性及びｐＨ感受性を解析した。
さらに、本発明者らは、ヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）及びアザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）由来のｃＤＮＡライブラリーを用いてから発現クローニングを行った結果、新規な蛍光蛋白質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られた蛍光蛋白質の蛍光特性を調べた結果、当該蛍光蛋白質が独特の蛍光特性を有することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。
（１）吸収極大波長が６０５ｎｍである；
（２）６０５ｎｍにおけるモル吸光係数が４７５５０である；
（３）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜１０で安定である：
本発明の別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
本発明の別の側面によれば、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。
（１）吸収極大波長が５５３ｎｍである；
（２）５５３ｎｍにおけるモル吸光係数が２５３００である；
（３）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜１０で安定である：
本発明の別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質をアクセプター蛋白質として用いてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、吸光試薬キットが提供される。
さらに、本発明によれば、ヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。
（１）紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７２ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長が５１８ｎｍ（緑）及び５８１ｎｍ（赤）である；
（２）５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）が９８８００Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７２ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）が６０４００Ｍ−１ｃｍ−１である；
（３）量子収率が０．８０（緑）及び０．３３（赤）である；及び
（４）緑色及び赤色のｐＨ感受性についてのｐＫａは共に５．７である：
本発明の別の態様によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明の別の態様によれば、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、アザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。
（１）紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７８ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長が５１８ｎｍ（緑）及び５８８ｎｍ（赤）である；
（２）５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）が１０２２５０Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７８ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）が７６９５０Ｍ−１ｃｍ−１である；
（３）量子収率（蛍光）が０．４３（緑）及び０．５１（赤）である；及び
（４）緑色（５０８ｎｍ）のｐＨ感受性についてｐＫａが５．８であり、赤色（５７８ｎｍ）のｐＨ感受性についてｐＫａが６．５である。
本発明の別の態様によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明の別の態様によれば、配列番号１１、１３、１５又は１７の何れかに記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は、
（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は、
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１２、１４、１６又は１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。好ましくは、他の蛋白質は、細胞内に局在する蛋白質である。さらに、好ましくは、他の蛋白質は、細胞内小器官に特異的な蛋白質である。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｇ）の吸収スペクトルを測定した結果を示す。横軸は吸収光の波長を示し、縦軸は吸光度を示す。
図２は、本発明のベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｇ）の吸光スペクトルのｐＨ感受性を示す。横軸はｐＨ値を示し、縦軸は吸光度を示す。６０５ｎｍは本発明のベリルイソギンチャク由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｇ）特有の吸光度を示し、２７７ｎｍは一般的に蛋白質定量として使われる吸光度（芳香族アミノ酸の吸光）を示す。つまり、２７７ｎｍの値で蛋白質量が一定である事を示し、６０５ｎｍの値で本発明のベリルイソギンチャク由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｇ）特有の吸光度がｐＨ５〜ｐＨ１０においてほとんど変化しないことを示す。
図３は、本発明のベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｒ）の吸収スペクトルを測定した結果を示す。横軸は吸収光の波長を示し、縦軸は吸光度を示す。
図４は、本発明のベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｒ）の吸光スペクトルのｐＨ感受性を示す。横軸はｐＨ値を示し、縦軸は吸光度を示す。５５３ｎｍは本発明のベリルイソギンチャク由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｒ）特有の吸光度を示し、２７７ｎｍは一般的に蛋白質定量として使われる吸光度（芳香族アミノ酸の吸光）を示す。つまり、２７７ｎｍの値で蛋白質量が一定である事を示し、５５３ｎｍの値で本発明のベリルイソギンチャク由来の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｒ）特有の吸光度がｐＨ５〜ｐＨ１０においてほとんど変化しないことを示す。
図５は、本発明の蛍光蛋白質（Ｋａｅｄｅ）の吸収スペクトルを示す。
図６は、本発明の蛍光蛋白質（Ｋａｅｄｅ）の蛍光スペクトルを示す。
図７は、本発明の蛍光蛋白質（Ｋａｅｄｅ）の遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞を４７０ｎｍで励起して、５１０ｎｍの蛍光で測定した結果を示す。
図８は、ＫａｅｄｅおよびＫａｅｄｅ２の１２．５％アクリルアミドでの電気泳動パターンを示す。Ｋａｅｄｅに比べ低い分子量としてＫａｅｄｅ２のバンドが現れる。
図９は、ＨｅＬａ細胞の形質膜にＫａｅｄｅ（上図）及びＫａｅｄｅ２（下図）をターゲティングされた時の発現パターンを示す。
図１０は、紫（外）光照射依存的Ｋａｅｄｅタンパク質の切断を示す実験結果である。上段の図は、紫（外）光照射依存的ペプチド鎖切断の推移を、１２．５％アクリルアミドゲルによる電気泳動像で示す。Ｋａｅｄｅ蛋白溶液に３６５ｎｍ光照射を行い、２０分ごとにサンプリングしてＳＤＳ／ＰＡＧＥを行った。中段の図は、３６５ｎｍ光照射前（０分）の吸収スペクトルを示す。下段の図は、３６５ｎｍ光照射１４０分後の吸収スペクトルを示す。
図１１は、本発明の蛍光蛋白質（Ｍｏｍｉｊｉ）の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
図１２は、本発明の蛍光蛋白質（Ｍｏｍｉｊｉ）のｐＨ感受性を示す。
図１３は、本発明の蛍光蛋白質（Ｍｏｍｉｊｉ）にＵＶ３６５ｎｍを照射した場合の蛍光スペクトルの変化を示す。
図１４は、本発明の蛍光蛋白質（Ｍｏｍｉｊｉ）にＵＶ３６５ｎｍを照射した場合の吸収スペクトルの変化を示す。
図１５は、ＵＶ照射前後の吸収スペクトルの変化（Ｍｏｍｉｊｉ２）を示す。
図１６は、ＵＶ照射前後の吸収スペクトルの変化（Ｍｏｍｉｊｉ４）を示す。
図１７は、ＵＶ照射前後の吸収スペクトルピークのｐＨによる変化（Ｍｏｍｉｊｉ）を示す。照射前（５０８ｎｍ）照射後（５７８ｎｍ）
図１８は、ＵＶ照射前後の吸収スペクトルピークのｐＨによる変化（Ｍｏｍｉｊｉ２）を示す。照射前（５０８ｎｍ）照射後（５７６ｎｍ）
図１９は、ＵＶ照射前後の吸収スペクトルピークのｐＨによる変化（Ｍｏｍｉｊｉ４）を示す。照射前（５０８ｎｍ）照射後（５８３ｎｍ）
図２０は、３６５ｎｍ光照射時間による蛍光特性変化の推移（Ｍｏｍｉｊｉ）を示す。６μｇ／ｍｌの蛋白溶液で測定した。変異体との差を明確にするために非常に弱い３６５ｎｍの光で光変換を行い４７０ｎｍから６５０ｎｍまでの蛍光スペクトルを測定した。
図２１は、３６５ｎｍ光照射時間による蛍光特性変化の推移（Ｍｏｍｉｊｉ２）を示す。６μｇ／ｍｌの蛋白溶液で測定した。変異体との差を明確にするために非常に弱い３６５ｎｍの光で光変換を行い４７０ｎｍから６５０ｎｍまでの蛍光スペクトルを測定した。
図２２は、３６５ｎｍ光照射時間による蛍光特性変化の推移（Ｍｏｍｉｊｉ４）を示す。６μｇ／ｍｌの蛋白溶液で測定した。変異体との差を明確にするために非常に弱い３６５ｎｍの光で光変換を行い４７０ｎｍから６５０ｎｍまでの蛍光スペクトルを測定した。
図２３は、ＨｅＬａ細胞内での蛍光特性の推移を示す。
Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｉｍｅ  ４１０  ｎｍ  １００ｍｓ
Ｇｒｅｅｎ  ４００ｍｓ，Ｒｅｄ  ５０ｍｓ
ＤＭ  ４２０ＤＣＬＰ
Ｇｒｅｅｎ  Ｅｘ  ４７５ＡＦ２０，Ｅｍ  ５３０ＤＦ３５
Ｒｅｄ  Ｅｘ  ５５０ＤＦ３５，Ｅｍ  ５７５ＡＬＰ
Ｏｂｊｅｃｔ  ｌｅｎｓ  Ｘ４０  Ｕａｐｏ／３４０
４１０ｎｍ照射、緑蛍光測定、赤蛍光測定を３秒間隔で行った。
上記条件で測定を行い赤／緑の蛍光値をグラフ化した。
図２４は、１２．５％アクリルアミドゲル（Ｐｓｅｕｄｏ−ｎａｔｉｖｅ  ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）での泳動パターンを青色光で励起してデジタルカメラで撮影した結果を示す。
ＷＴ（Ｍｏｍｉｊｉ）：  四量体
ｄ１６：  二量体
ｍ１６：  単量体
図２５は、３６５ｎｍ光照射前後の蛍光スペクトル（ｄ１６）を示す。
緑蛍光ピーク（５１８ｎｍ）
赤蛍光ピーク（５９１ｎｍ）
図２６は、３６５ｎｍ光照射前後の蛍光スペクトル（ｍ１６）を示す。
緑蛍光ピーク（５１８ｎｍ）
赤蛍光ピーク（５８７ｎｍ）
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の色素蛋白質
本発明の第一の色素蛋白質は、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）吸収極大波長が６０５ｎｍである；
（２）６０５ｎｍにおけるモル吸光係数が４７５５０である；
（３）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜１０で安定である：
本発明の第二の色素蛋白質は、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）吸収極大波長が５５３ｎｍである；
（２）５５３ｎｍにおけるモル吸光係数が２５３００である；
（３）光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜１０で安定である：
ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）は、９６本の触手を有し、規則正しく配列している。また、口盤は触手と同色で口のまわりが赤茶色に彩色されるのが本種の特徴である。体壁には９８列の吸着イボが並び、体壁の下端付近まで分布する。体壁の色には大きな変異があり、褐色系、ブルー系、ピンク系が知られている。ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）は、北海道南部から九州に分布し、潮間帯付近に多産する。
なお、本書中以下の実施例では、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）を出発材料として上記特性を有する色素蛋白質を単離したが、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）以外のイソギンチャクから本発明の色素蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような色素蛋白質も本発明の範囲内である。
本発明の第一の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｇ）は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が６０５ｎｍであり、また、６０５ｎｍにおけるモル吸光係数は４７５５０である。
本発明の第二の色素蛋白質（Ｂｅ−Ｒ）は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が５５３ｎｍであり、また、５５３ｎｍにおけるモル吸光係数は２５３００である。
モル吸光係数は蛍光分子１モルあたりの光子の吸収量を表す。量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。本発明の色素蛋白質の量子収率は極めて低いため、蛍光は殆ど発しない。この性質から、本発明の色素蛋白質は、（１）ＦＲＥＴのアクセプター分子（エネルギー受容体）として用いたり、（２）照射した光のエネルギーを光以外のエネルギーに変換させるシステムの開発に利用したり、あるいは（３）蛋白質のアミノ酸配列に変異を導入して蛍光を発するように改変することなどに用いることができる。
また、本発明の色素蛋白質は、光吸収特性のｐＨ感受性がｐＨ５〜１０で安定であることを特徴とする。即ち、本発明の色素蛋白質では、ｐＨ５〜１０の範囲において吸収スペクトルのピーク値の変動が少ない。従って、本発明の色素蛋白質は、広範囲のｐＨ環境において同様の条件で使用することができ、生体内での使用に際しての制約は少ない。
本発明の色素蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「吸光特性」とは、ある波長の光を吸収できる特性を意味し、例えば、本明細書に示した色素蛋白質と同様に吸収極大波長が６０５ｎｍ又は５５３ｎｍであってもよいし、あるいは吸収極大波長の値がシフトしたものであってもよい。なお、光吸収特性のｐＨ感受性は、ｐＨ５〜１０で安定であることが好ましい。
上記した通り、本発明の配列表の配列番号１又は３に記載したアミノ酸配列を有する色素蛋白質は蛍光をほとんど発しないものである。本発明においては、配列番号１又は３に記載したアミノ酸配列に対して１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を導入することにより、より強い蛍光を発する蛋白質を作製してもよく、このような蛋白質も本発明の範囲内に含まれる。
本発明の色素蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１又は３に記載したアミノ酸配列並びに配列番号２又は４に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて、ベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の色素蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の色素蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明の蛍光蛋白質
本発明の第一の蛍光蛋白質は、ヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７２ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長が５１８ｎｍ（緑）及び５８１ｎｍ（赤）である；
（２）５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）が９８８００Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７２ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）が６０４００Ｍ−１ｃｍ−１である；
（３）量子収率が０．８０（緑）及び０．３３（赤）である；及び
（４）緑色及び赤色のｐＨ感受性についてのｐＫａは共に５．７である：
ヒユサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）は、刺胞動物イソギンチャクの１種で、非常にカラフルな蛍光を示すことを特徴とする。主として、本州中部以南に分布し、内湾の泥底などに生息し、夜間触手を伸ばしてプランクトンなどを捕獲する。色のバリエーションとしては、緑色、褐色又は赤色のものが存在する。
本発明の第一の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７２ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長は５１８ｎｍ（緑）及び５８１ｎｍ（赤）である。また、５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）は９８８００Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７２ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）は６０４００Ｍ−１ｃｍ−１である。
本発明の第一の蛍光蛋白質は、紫外光によって色が変わることを特徴とし、光によって特定の細胞や器官のマーキング（ｏｐｔｉｃａｌ  ｍａｒｋｉｎｇ）が可能である。
本発明の第一の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明の第一の蛍光蛋白質の別の具体例としては、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
本発明の第二の蛍光蛋白質は、アザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７８ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長が５１８ｎｍ（緑）及び５８８ｎｍ（赤）である；
（２）５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）が１０２２５０Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７８ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）が７６９５０Ｍ−１ｃｍ−１である；
（３）量子収率（蛍光）が０．４３（緑）及び０．５１（赤）である；及び
（４）緑色（５０８ｎｍ）のｐＨ感受性についてｐＫａが５．８であり、赤色（５７８ｎｍ）のｐＨ感受性についてｐＫａが６．５である。
アザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）は固着性の単体サンゴで、小型の個体は鉢型で円形であるが、大きくなると楕円形になる。サンゴ個体の中心には大きなスポンジ状の軸柱があり、莢壁から長い障壁がほぼ一定の傾斜で中心に伸びる。隔壁には大きな鋸歯があり、外からもその様子がうかがえる。昼間はポリプを開かない。色彩は普通暗緑色であるが赤色なども稀に見られる。アザミハナガタサンゴ属は約４種が知られているが、日本周辺海域には１種が分布している。
本発明の第二の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が５０８ｎｍ（緑）及び５７８ｎｍ（赤）であり、蛍光極大波長は５１８ｎｍ（緑）及び５８８ｎｍ（赤）である。また、５０８ｎｍにおけるモル吸光係数（緑）は１０２２５０Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７８ｎｍにおけるモル吸光係数（赤）は７６９５０Ｍ−１ｃｍ−１である。
本発明の第二の蛍光蛋白質は、紫外光によって色が変わることを特徴とし、光によって特定の細胞、器官又は蛋白質のマーキング（ｏｐｔｉｃａｌ  ｍａｒｋｉｎｇ）が可能である。
本発明の第二の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明の蛍光蛋白質の別の具体例としては、配列番号１１、１３、１５又は１７の何れかに記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「蛍光を有する」とは、蛍光を発することができる全ての場合を包含し、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、ｐＨ感受性などの諸特性は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と比較して、変動していてもよいし、同様のままでもよい。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載したアミノ酸配列並びに配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて上記したような各種の公知の蛍光蛋白質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（３）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の色素蛋白質及び蛍光蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の第一の色素蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明の第一の色素蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明の第二の色素蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明の第二の色素蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明の第一の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は、
（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明の第一の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明の第二の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は、
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明の第二の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１２、１４、１６又は１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡの作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（４）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスａアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（５）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（６）本発明の色素蛋白質及びそれを含む融合蛋白質の利用
本発明の色素蛋白質は、他の蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質を構築することができる。本発明の色素蛋白質に融合させる他の蛋白質の種類は特に限定されないが、他の分子と相互作用する蛋白質であることが好ましく、例えば、受容体蛋白質又はそのリガンド、あるいは抗原又は抗体などが挙げられる。
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え融合蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本発明の色素蛋白質をコードするＤＮＡおよびそれに融合すべき他の蛋白質をコードするＤＮＡは、本明細書中上記した方法またはそれに準じてそれぞれ入手することができる。次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を産生することができる。
分子間の相互作用を分析する手法の一つとして、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）が知られている。ＦＲＥＴでは、例えば、第一の蛍光蛋白質としてのシアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）で標識した第一の分子と、第二の蛍光蛋白質としての黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）で標識した第二の分子とを共存させることにより、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）をアクセプター分子として作用させ、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）をドナー分子として作用させ、両者の間でＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を生じさせることにより、第一の分子と第二の分子との間の相互作用を可視化することができる。即ち、ＦＲＥＴでは２種類の分子にそれぞれ異なる色素を導入し、エネルギーレベルの高い方の色素（ドナー分子）を選択的に励起し、その色素の蛍光を測定し、もう一方の色素（アクセプター分子）からの長波長蛍光も測定して、それらの蛍光変化量によって分子間の相互作用を可視化する。両方の色素が、２種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少とアクセプター分子の蛍光の増加が１波長励起２波長測光法により観測される。しかし、アクセプター分子に色素蛋白質を用いた場合は、両方の色素が、２種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少を生じ１波長励起１波長測光法により観測することができる。即ち、測定機器の簡易化が可能となる。
本発明の色素蛋白質は、特に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）におけるアクセプター分子としての利用価値が高い。即ち、本発明の色素蛋白質と被験物質との融合体（第一の融合体）を作製する。次いで、該被験物質と相互作用する別の被験物質と別の蛍光蛋白質との融合体（第２の融合体）を作製する。そして、第一の融合体と第２の融合体とを相互作用させ、発する蛍光を分析することにより、上記２種類の被験物質間の相互作用を分析することができる。なお、本発明の色素蛋白質を用いたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）は、試験管内で行ってもよいし、細胞内で行ってもよい。
（７）本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載したアミノ酸配列及び配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片も入手する。
次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記被検アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「ｐＮＥＯ」（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．ＭＯｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）、「ｐＣＡＧＧＳ」（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ．Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））、「ｐＲｃ／ＣＭＶ」（インビトロゲン社製）、「ｐＣＤＭ８」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「ｐＲＳ３０３」，「ｐＲＳ３０４」，「ｐＲＳ３０５」，「ｐＲＳ３０６」，「ｐＲＳ３１３」，「ｐＲＳ３１４」，「ｐＲＳ３１５」，［ｐＲＳ３１６］（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−２７）、「ｐＲＳ４２３」，「ｐＲＳ４２４」，「ｐＲＳ４２５」，「ｐＲＳ４２６」（Ｔ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄａｎｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｓｈｅｒｏ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１２２）などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、Ｌ細胞、ＢａｌｂＣ−３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＲＫ（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」などの酵母細胞や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社アキシオフォト  フィルターセット０９）や画像解析装置（ＡＴＴＯデジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。
本発明の第一の蛍光蛋白質の場合、励起極大波長が５０８ｎｍ、蛍光極大波長が５１８である緑色を検出する場合は、励起光４９０〜５１０ｎｍ、蛍光５１０〜５３０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。また、励起極大波長が５７２ｎｍであり、蛍光極大波長が５８１ｎｍである赤色を検出する場合は、励起光５６０〜５７５ｎｍ、蛍光５７５〜５９０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
本発明の第二の蛍光蛋白質の場合、励起極大波長が５０８ｎｍ、蛍光極大波長が５１８である緑色を検出する場合は、励起光４９０〜５１０ｎｍ、蛍光５１０〜５３０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。また、励起極大波長が５７８ｎｍであり、蛍光極大波長が５８８ｎｍである赤色を検出する場合は、励起光５７０〜５８０ｎｍ、蛍光５８０〜５９５ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
（８）本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した色素蛋白質、融合蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、吸光試薬キットが提供される。さらに本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
色素蛋白質、蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】実施例Ａ−１：イソギンチャクからの新規色素蛋白遺伝子の単離
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
イソギンチャクより色素蛋白遺伝子の単離を行った。材料には緑色を呈する１個体のベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）を用いた。凍結したベリルイソギンチャクを乳鉢で砕き、湿重量１グラムに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を７．５ｍｌ加えてホモジナイズし、１５００ｘｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム１．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、３分間静置した。７５００ｘｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール３．７５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、１０分間静置した。１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。２．２ｍｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ４μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
2004018671.tif 000002
Ｉはイノシン、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＶはＡ，Ｃ又はＧ、ＤはＡ，Ｇ又はＴ、ＳはＣ又はＧ、ＨはＡ，Ｔ又はＣを示す。
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）    ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                              ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１                            １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ２                            １μｌ
ミリＱ                                              ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）            １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行い、アニーリング温度を１サイクルごとに０．３℃下げた。３０サイクル時の温度は４３℃。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で、３５０ｂｐを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋自由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として（１）で調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを４μｇ使用した。
ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には
2004018671.tif 000003
のプライマーを用いた。
Ｉはイノシンを示す。
二回目の増幅には
2004018671.tif 000004
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された２００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴｄＴプライマーのＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調製したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを３μｌ使用した。
作成したプライマーは、
2004018671.tif 000005
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）    ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                              ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ７                              １μｌ
１０μＭ  オリゴｄＴｐｒｉｍｅｒ                      １μｌ
ミリＱ                                              ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）            １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマ伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
アガロースゲル電気泳動で、増幅された約１０００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号２に示し、全長のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
実施例Ａ−２：大腸菌での蛋白発現
得られた全長の塩基配列より、蛋白のＮ末端に相当する部分でプライマーを作製し、Ｃ末端側はオリゴｄＴプライマーを使用して、実施例Ａ−１の（２）で調製したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
使用プライマー
2004018671.tif 000006
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）      ３μｌ
Ｘ１０  ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー                      ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                  ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ８                              １μｌ
１００μＭ  オリゴｄＴプライマー                        １μｌ
ミリＱ                                                ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）    １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約１１００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＲＳＥＴ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。発現蛋白はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。この色素蛋白質をＢｅ−Ｇと命名する。以下の実施例３では、精製した蛋白の性質を解析した。
実施例Ａ−３：色素蛋白質（Ｂｅ−Ｇ）の性質
（１）光吸収特性の解析
２０μＭ色素蛋白（Ｂｅ−Ｇ）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。緑色個体由来色素蛋白（Ｂｅ−Ｇ）では６０５ｎｍに吸収のピークが認められた（表１、図１）。
2004018671.tif 000007
（２）ｐＨ感受性の測定
５０ｍＭの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スペクトルを測定した（図２）。
各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、５    ：  酢酸バッファー
ｐＨ６        ：  リン酸バッファー
ｐＨ７、８    ：  ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０  ：  グリシンバッファー
図２の結果から分かるように、ｐＨ５〜１０でピークの値は安定していた。
実施例Ｂ−１：イソギンチャクからの新規色素蛋白遺伝子の単離
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
イソギンチャクより色素蛋白遺伝子の単離を行った。材料には赤色を呈する１個体のベリルイソギンチャク（Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）を用いた。凍結したベリルイソギンチャクを乳鉢で砕き、湿重量１グラムに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を７．５ｍｌ加えてホモジナイズし、１５００ｘｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム１．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、３分間静置した。７５００ｘｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール３．７５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、１０分間静置した。１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。３ｍｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ４μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
2004018671.tif 000008
Ｉはイノシン、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＶはＡ，Ｃ又はＧ、ＤはＡ，Ｇ又はＴ、ＳはＣ又はＧ、ＨはＡ，Ｔ又はＣを示す。
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）    ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                              ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１                            １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ２                            １μｌ
ミリＱ                                              ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）            １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行い、アニーリング温度を１サイクルごとに０．３℃下げた。３０サイクル時の温度は４３℃。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で、３５０ｂｐを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として（１）で調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを４μｇ使用した。
赤色の個体由来のＤＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には
2004018671.tif 000009
のプライマーを用いた。
Ｉはイノシンを示す。
二回目の増幅には
2004018671.tif 000010
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された２００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴｄＴプライマーのＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調製したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを３μｌ使用した。
作成したプライマーは
2004018671.tif 000011
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）    ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                              ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ７                              １μｌ
１０μＭ  オリゴｄＴｐｒｉｍｅｒ                      １μｌ
ミリＱ                                              ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）            １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマ伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
アガロースゲル電気泳動で、増幅された約１０００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号４に示し、全長のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。
実施例Ｂ−２：大腸菌での蛋白発現
得られた全長の塩基配列より、蛋白のＮ末端に相当する部分でプライマーを作製し、Ｃ末端側はオリゴｄＴプライマーを使用して、実施例Ｂ−１の（２）で調製したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
使用プライマー
2004018671.tif 000012
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）    ３μｌ
Ｘ１０  ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー                    ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ８                            １μｌ
１００μＭ  オリゴｄＴプライマー                      １μｌ
ミリＱ                                              ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）  １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約１１００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＲＳＥＴ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。発現蛋白はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。この色素蛋白質をＢｅ−Ｒと命名する。以下の実施例３では、精製した蛋白の性質を解析した。
実施例Ｂ−３：色素蛋白質（Ｂｅ−Ｒ）の性質
（１）光吸収特性の解析
２０μＭ色素蛋白、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。赤色の個体由来色素蛋白（Ｂｅ−Ｒ）では５５３ｎｍに吸収のピークが認められた（表２、図３）。
2004018671.tif 000013
（２）ｐＨ感受性の測定
５０ｍｌの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スペクトルを測定した（図４）。
各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、５    ：  酢酸バッファー
ｐＨ６        ：  リン酸バッファー
ｐＨ７、８    ：  ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０  ：  グリシンバッファー
図４の結果から分かるように、ｐＨ５〜１０でピークの値は安定していた。
実施例Ｃ−１：サンゴからの新規蛍光蛋白遺伝子（Ｋａｅｄｅ）の単離
色彩に富む蛍光を放つヒユサンゴＴｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉから、蛍光蛋白遺伝子を以下の手順で単離した。
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
凍結したヒユサンゴをＭｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井器械）を用いて変性溶液中で砕き、フェノール／クロロホルムを加え、遠心して蛋白質、ＤＮＡとＲＮＡを分離する。ＲＮＡを含む水層をｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌに加え遠心すると、沈殿としてｔｏｔａｌ  ＲＮＡが得られる。
（２）ＲＮＡの精製
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｍＲＮＡを分離した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡにＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈ｓｕｐｅｒ〉を加え、加熱してＲＮＡの２次構造を壊してから、３７℃でＲＮＡとＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴを結合させる。洗浄後、加熱、遠心すると、ｍＲＮＡが溶出された上清が得られる。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴを取り除いた上、ｅｔｈａｎｏｌとＮａＣｌでｍＲＮＡ沈殿させ、水に溶した。
（３）ｃＤＮＡの作製
ＴｉｍｅＳａｖｅｒとＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘ（共にＡｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてｃＤＮＡ断片を作製した。
ｍＲＮＡを加熱して２次構造を壊した後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＭｉｘにＤＴＴとＮｏｔＩ−ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒと共に加え、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄを合成する。更にそれをＳｅｃｏｎｄ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘに加え、ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄを合成し、付属のスパンカラムで精製する。精製したｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃＤＮＡの両端にＥｃｏＲＩ  ａｄａｐｔｏｒを付け、ＮｏｔＩで３’側のみカットする。もう一度スパンカラムで精製して、ｃＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ）を得た。
（４）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ
ｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトを設け、作製したｃＤＮＡを挿入、大腸菌のＪＭ１０９  ＤＥ３株に導入して、ＬＡプレートで培養した。この株では蛋白が合成されるため、ＵＶを照射した時に蛍光を発するコロニーを単離した。
その結果、約１３万個から２個の蛍光を持つコロニーを得た。塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定し、このクローンをＫａｅｄｅと命名した。Ｋａｅｄｅのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に記載し、塩基配列を配列表の配列番号６に記載する。
（５）蛍光特性の解析
（ａ）蛋白の発現と精製
得られた全長ｃＤＮＡのＮ末端にＢａｍＨＩサイトを、Ｃ末端にＥｃｏＲＩサイトを設け、ｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にｉｎ  ｆｒａｍｅでサブクローニングして、大腸菌のＪＭ１０９  ＤＥ３株で発現させた。発現蛋白はＮ末端のＨｉｓ−ｔａｇを利用して、Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
（ｂ）吸収スペクトルとモル吸光係数、蛍光スペクトルと量子収率
この蛍光蛋白質は、ＵＶを照射することで吸収及び蛍光スペクトルが緑から赤に長波長シフトする。図５は、精製蛋白のＵＶ照射前後の吸収スペクトルを示す（実線が前、点線が後）。モル吸光係数は、蛋白濃度と吸収極大での吸光度より求めた（表３）。
蛍光スペクトルは、ＵＶ照射前後を４８０ｎｍで励起して測定し（図６）、量子収率をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）と比較して算出した（表３）。
Ｋａｅｄｅの蛍光特性を以下の表３に示す。
2004018671.tif 000014
（ｃ）ｐＨ感受性の特性
緑、赤それぞれにつきｐＨ４〜１１のバッファー中での吸収スペクトルを測定した。緑、赤共にｐＨ９を境に吸収は徐々に落ちてくる。吸収極大の変化から算出したｐＫａを上記の表３中に示した。
実施例Ｃ−２：哺乳類細胞への新規蛍光蛋白の遺伝子導入
ＨｅＬａ細胞にＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いてＫａｅｄｅの遺伝子を導入した。図７は、４７０ｎｍで励起して５１０ｎｍの蛍光で測定したもので、導入後９時間前後で蛍光が確認できる。哺乳類細胞中でも、ＵＶを照射すると蛍光が長波長にシフトする。
実施例Ｃ−３：Ｋａｅｄｅの二量体化
Ｋａｅｄｅは四量体を形成するため、他の蛋白質を融合させた際に発現パターンに異常が見られる場合がある。そこで、Ｋａｅｄｅの１５８番目のトレオニン（Ｔ）をアルギニン（Ｒ）に、１６０番目のアラニン（Ａ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換し、二量体変異体を作製した。この変異体をＫａｅｄｅ２とした。Ｋａｅｄｅ２のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号７及び８にそれぞれ示す。１２．５％アクリルアミドゲルのサンプルを煮沸しない電気泳動（Ｐｓｅｕｄｏｎａｔｉｖｅ  ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）において、Ｋａｅｄｅ２はＫａｅｄｅよりも低分子としてバンドが検出された（図８）。また、ＨｅＬａ細胞の細胞形質膜にＫａｅｄｅ、Ｋａｅｄｅ２を発現させたとき、Ｋａｅｄｅは明らかに正常でない発現パターンを示した。しかし、Ｋａｅｄｅ２に於いては正常に細胞形質膜にターゲティングされた発現パターンを示した（図９）。
実施例Ｃ−４：紫（外）光照射依存的Ｋａｅｄｅタンパク質の切断
紫（外）光照射によるＫａｅｄｅの緑から赤への蛍光特性変換はタンパク質の切断を伴う。１２．５％アクリルアミドゲルの電気泳動の結果は、３６５ｎｍ光照射により２７ｋＤａのＫａｅｄｅ分子が１７ｋＤａと１０ｋＤａのペプチド鎖に切断される事を示し（図１０上段）、且つ、３６５ｎｍ光照射により５０８ｎｍの吸収値が減少し、５７２ｎｍの吸収値が増加するという緑から赤への蛍光特性変換と一致することを示した（図１０中段、下段）。この性質はタンパク質の切断を光によりコントロールする技術となる。タンパク質を光によって切断する技術はこれまでに報告されていない。またこの切断はタンパク質内でのβ脱離反応であるが、タンパク質内のβ脱離反応、あるいはアミド基が脱離基となるβ脱離反応はこれまでに報告されていない。
実施例Ｄ−１：珊瑚からの新規蛍光蛋白遺伝子（Ｍｏｍｉｊｉ）の単離
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはアザミハナガタサンゴ（Ｓｃｏｌｙｍｉａ  Ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ）を用いた。アザミハナガタサンゴをハンマーで砕き、砕いたサンゴ１０グラムに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を１５ｍｌ加えて攪拌し、１５００ｘｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム３ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後３分間静置した。７５００ｘｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール７．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後１０分間静置した。１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて、１７０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。２３０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ３μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
2004018671.tif 000015
ＲはＡ又はＧを示し、ＹはＣ又はＴを示し、ＶはＡ，Ｃ又はＧを示し、ＤはＡ，Ｇ又はＴを示す。
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）  ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                              ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１                          １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ２                          １μｌ
ミリＱ                                            ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）          １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行い、アニーリング温度を１サイクルごとに０．３℃下げた。３０サイクル時の温度は４３℃。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で予想された大きさの３５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてＸ−ｇａｌ存在下でブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として１）で調整したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを３μｇ使用した。
ＤＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には
2004018671.tif 000016
のプライマーを用いた。
Ｉはイノシンを示す。
二回目の増幅には
2004018671.tif 000017
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された４００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてＸ−ｇａｌ存在下でブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴｄＴプライマーのＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調整したｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを３μｌ使用した。
2004018671.tif 000018
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）  ３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑバッファー                            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                              ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ３                            １μｌ
１０μＭ  ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ            １μｌ
ミリＱ                                            ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）          １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
アガロースゲル電気泳動で、増幅された５００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてＸ−ｇａｌ存在下でブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（７）全長ｃＤＮＡの取得
得られた全長の塩基配列より蛍光蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを決定した。Ｎ末端、Ｃ末端に相当する部分でプライマーを作製し、（２）で調製したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って全長のｃＤＮＡを得た。このクローンをＭｏｍｉｊｉと命名した。Ｍｏｍｉｊｉのアミノ酸配列を配列表の配列番号９に記載し、塩基配列を配列表の配列番号１０に記載する。
使用プライマー
2004018671.tif 000019
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）    ３μｌ
Ｘ１０  ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー                    ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                ４μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ４                              １μｌ
２０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ５                              １μｌ
ミリＱ                                              ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）  １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １分（ＰＡＤ）
９４℃  ３０秒（変性）
５２℃  ３０秒（プライマーの鋳型へのアニーリング）
７２℃  １分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７分（最後の伸長）
４℃で保持
実施例Ｄ−２：大腸菌での蛋白発現
実施例Ｄ−１（７）で増幅された７００ｂｐのバンドをアガロースゲルの電気泳動で、切り出し、精製してｐＥＴ２８  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ部位に挿入して、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトし、産生させた蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。以下、実施例Ｄ−３で、精製した蛋白（Ｍｏｍｉｊｉ）の性質を解析した。
実施例Ｄ−３：蛍光蛋白の解析
（１）蛍光特性の解析
蛍光蛋白（Ｍｏｍｉｊｉ）２０μＭ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＫＣｌ溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した。さらに上記の緩衝液で２０倍希釈し、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを測定した。別にＢｒａｄｆｏｒｄ法で求めた蛋白質濃度と吸収スペクトルのピークの値より、５０８ｎｍと５７８ｎｍにおけるモル吸光係数を計算した。４５０ｎｍの吸収が０．００２となるように蛍光蛋白を同緩衝液で希釈し、４５０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルを測定した。ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を同様に４５０ｎｍの吸収が０．００２となるようにして蛍光スペクトルを測定し、両スペクトルの面積比から今回クローニングされた蛍光蛋白の蛍光の量子収率を求めた。ＥＧＦＰの蛍光の量子収率を０．６とした。測定結果等は表４及び図１１に示す。
2004018671.tif 000020
（２）ＵＶによるスペクトル変化の測定
本発明の蛍光蛋白（Ｍｏｍｉｊｉ）はＵＶ（３６５ｎｍ付近）の照射により、蛍光、及び、吸収スペクトルが変化するため、その変化を測定した。蛍光蛋白を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＫＣｌ溶液で希釈して、３６５ｎｍの光を照射し、３６５ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルを測定した。また蛍光蛋白２０μＭ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＫＣｌ溶液を用いて、３６５ｎｍの光を照射した後の吸収スペクトルを測定した。測定結果等は図１３及び図１４に示す。なお、蛍光スペクトルと吸収スペクトルの測定を行ったときの３６５ｎｍの光量が違うため、蛍光スペクトルと吸収スペクトルの変化と時間は一致しない。
（３）ｐＨ感受性の測定
ｐＨ４から１１の緩衝液で吸収スペクトルをとりｐＨ感受性（ｐＫａ）を測定した。
各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、５    ：  酢酸バッファー
ｐＨ６、１１  ：  リン酸バッファー
ｐＨ７、８    ：  ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０  ：  グリシンバッファー
測定結果等は表４及び図１２に示す。
実施例Ｄ−４：Ｍｏｍｉｊｉの蛍光特性の改良
Ｍｏｍｉｊｉの８６番目のグルタミン酸（Ｅ）をリジン（Ｋ）に１１１番目のアスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１４２番目のグルタミン（Ｑ）をプロリン（Ｐ）に、２０３番目のアルギニン（Ｒ）をヒスチジン（Ｈ）にアミノ酸置換する事によりモル吸光係数の値が１０２２５０（５０８ｎｍ）から１２７２００（５０５ｎｍ）に上昇し、緑から赤への紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持したまま、緑の蛍光が明るくなった（表５、図１５及び２１）。また、紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わった赤い蛍光を放つ分子は、野生型（Ｍｏｍｉｊｉ）のそれにくらべて低いｐＨに抵抗性をもった（図１７及び１８）。この変異体をＭｏｍｉｊｉ２とした。Ｍｏｍｉｊｉ２のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号１１及び１２にそれぞれ示す。
2004018671.tif 000021
実施例Ｄ−５：Ｍｏｍｉｊｉの光照射依存的な蛍光特性の改良
Ｍｏｍｉｊｉの１９７番目のイソロイシン（Ｉ）をメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換した。この変異体をＭｏｍｉｊｉ４とした。Ｍｏｍｉｊｉ４のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号１３及び１４にそれぞれ示す。紫（外）光照射依存的な緑から赤への蛍光変化が３６５ｎｍ光照射後１分からＭｏｍｉｊｉ４では観測されたが、野生型（Ｍｏｍｉｊｉ）に於いては３６５ｎｍ光照射後１０分がＭｏｍｉｊｉ４の１分間照射に相当し、明らかにＭｏｍｉｊｉ４が野生型（Ｍｏｍｉｊｉ）より光照射依存的蛍光特性変換効率が高いことを示した（図１６、２０及び２２）。ＨｅＬａ細胞にＭｏｍｉｊｉ、Ｍｏｍｉｊｉ４を発現させて、細胞内での４１０ｎｍ光照射による緑から赤への蛍光特性の変化（Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ）を測定した結果も、光照射依存的蛍光特性変換効率がＭｏｍｉｊｉ４のほうが良いことを示した。紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わった赤い蛍光を放つ分子は、野生型（Ｍｏｍｉｊｉ）のそれにくらべて低いｐＨに抵抗性を持ち、特性変換光照射前の緑の蛍光を放つ分子は低いｐＨに感受性となった（図１７及び１９）。
実施例Ｄ−６：Ｍｏｍｉｊｉの二量体の作製
１２．５％アクリルアミドゲルを用いてＭｏｍｉｊｉを煮沸せずに電気泳動（Ｐｓｅｕｄｏｎａｔｉｖｅ  ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）を行うとＭｏｍｉｊｉは四量体を形成していることを示した。Ｍｏｍｉｊｉの１１番目のアスパラギン（Ｎ）をアルギニン（Ｒ）に、２９番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に、１２２番目のチロシン（Ｙ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１３６番目のリジン（Ｋ）をアスパラギン（Ｎ）に、１３８番目のグルタミン（Ｑ）をロイシン（Ｌ）に、１４２番目のグルタミン（Ｑ）をプロリン（Ｐ）に、１５９番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、１６１番目のアラニン（Ａ）をセリン（Ｓ）に、１９０番目のチロシン（Ｙ）をトレオニン（Ｔ）に、１９２番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、１９６番目のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）にアミノ酸置換し、２２４番目から２２９番目までの６アミノ酸を削除する事により二量体となった（図２４）。Ｍｏｍｉｊｉと同様に緑から赤への紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持していた（図２５）。この変異体をｄ１６とした。ｄ１６のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号１５及び１６にそれぞれ示す。
実施例Ｄ−７：Ｍｏｍｉｊｉの単量体の作製
Ｍｏｍｉｊｉの１１番目のアスパラギン（Ｎ）をアルギニン（Ｒ）に、２９番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に、９５番目のイソロイシン（Ｉ）をトレオニン（Ｔ）に、１０１番目のイソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）に、１０３番目のイソロイシン（Ｉ）をトレオニン（Ｔ）に、１２２番目のチロシン（Ｙ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１２４番目のバリン（Ｖ）をトレオニン（Ｔ）に、１３８番目のグルタミン（Ｑ）をロイシン（Ｌ）に、１４２番目のグルタミン（Ｑ）をプロリン（Ｐ）に、１５９番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、１６１番目のアラニン（Ａ）をセリン（Ｓ）に、１７４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をメチオニン（Ｍ）に、１９０番目のチロシン（Ｙ）をトレオニン（Ｔ）に、１９２番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、１９６番目のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に、２１２番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）にアミノ酸置換し、２２４番目から２２９番目までの６アミノ酸を削除する事により単量体となった（図２４）。Ｍｏｍｉｊｉと同様に緑から赤への紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持していた（図２６）。この変異体をｍ１６とした。ｍ１６のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号１７及び１８にそれぞれ示す
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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