(57)【要約】本発明は強陽イオン交換体に酸性条件でペプチドを結合させ、そしてアルカリ条件で溶出することにより濃縮することを含んでなる、無血清培養の細胞上清中の低分子量ペプチドを濃縮するための方法に関する。さらに、配列番号：１あるいは２に示すアミノ酸配列を有するペプチド、およびこれらのペプチドに対する抗体を用いるがんマーカーのスクリーニング方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培養の細胞上清中の低分子量ペプチドを濃縮するための方法で有って、
ａ）強陽イオン交換体に酸性条件でペプチドを結合させ、そして
ｂ）アルカリ条件で溶出することにより濃縮する、
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
２種類以上の培養細胞上清中のペプチドを請求項１に記載の方法で濃縮後、質量分析計で比較分析することを特徴とする、ある種の培養細胞株より特異的に分泌されるペプチドをスクリーニングする方法。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の一部あるいは全部を含んで成る分泌性ペプチド。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部あるいは全部から成る分泌性ペプチド。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の一部あるいは全部を含んで成る分泌性ペプチド。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部あるいは全部から成る分泌性ペプチド。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチドを検出あるいは定量する測定方法。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチドを検出あるいは定量することにより、膵がんの診断を行うための診断キットあるいは診断薬。
【請求項９】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチドに対して結合するプローブ。
【請求項１０】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチドに対して結合親和性を有する抗体。
【請求項１１】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１３】
請求項９に記載のプローブまたは請求項１０もしくは１１に記載の抗体を含む請求項７に記載の測定方法。
【請求項１４】
請求項９に記載のプローブまたは請求項１０もしくは１１に記載の抗体を含む請求項８に記載の診断キットまたは診断薬。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、培養細胞より無血清培地に放出される低分子量ペプチドを検出するための一段階試料調製によるペプチド濃縮法およびマトリックス支援型質量分析法によるディファレンシャルディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）法、その方法を用いた新規膵がんマーカーのスクリーニング、該スクリーニング方法により発見された膵がんマーカーとなるペプチド、該ペプチドに対する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を含んで成る診断薬等に関する。
背景技術
膵がんは後腹膜腔という臨床的に把握の難しい位置に発生する腫瘍である。そのため、従来は治療困難な状態で発見されることが多く、難治性の腫瘍と考えられていた。最近の技術革新によるＵＳ、ＣＴ、ＭＲＩなどの画像診断法や内視鏡検査などにより、診断法は格段に進歩した。しかしながら、診断法の進歩にもかかわらず膵がんの治療成績は期待したほど成果が上がっていない。２ｃｍ以上の腫瘍の切除率、予後はともに悪く、切除率のよい２ｃｍ以下の小膵がん（Ｔ１）症例も発見率が低く、さらに発見されたものでも、Ｓｔａｇｅ  Ｉ症例は５０％に満たず半数以上は既に進行がんの状態にある。この膵がんの治療成績を向上させるためにはより小さいがんを早期に発見することが重要である。
膵がんの早期発見のためには、膵がんの早期診断が重要であるが、現在膵がんを発見するための診断法には前述のＵＳ、ＣＴ、ＭＲＩなどの画像診断法と血中酵素や腫瘍マーカーの測定などがある。血中酵素や腫瘍マーカーの測定は膵がんの発見のために重要なものであるが、血中の膵酵素は膵の炎症等でも上昇し、がん特異性に欠ける。
また腫瘍マーカーであるＣＡ１９−９などの糖鎖抗原は進行性膵がんの診断とモニタリングのマーカーとして役立っているが、早期診断における有用性は満足すべきものではない。ＣＡ１９−９のほかに膵がんの腫瘍マーカーとして、ＣＥＡ、ＳＴ−４３９、Ｓｉａｌｙｌ  ＳＳＥＡ−１（ＳＬＸ）、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ−１２５、ＣＡ−５０などが有用であることが報告されているが、すべてが糖鎖抗原であり、膵の腫瘍から特異的に分泌される物質ではない。そのため、膵がんのマーカーとしての特異性が低いことが問題である。
従来、ある種の腫瘍に特異的な腫瘍マーカーはがん患者の血清中やがん組織から樹立された細胞から分離同定されてきた。この分離同定のためには、これらのマーカー候補の物質を多量に得る必要があったために、検体が多量に必要であり、この中から微量なマーカーを発見しなければならなかった。そのため検体中に多量に存在する物質のみしか発見することができなかった。
がん細胞から選択的に分泌されるペプチドすなわち低分子量蛋白質は、腫瘍マーカーとして役立つ可能性がある。このことは本発明者らが肺小細胞がん（ＳＣＬＣ）に特異的な腫瘍マーカーとしてガストリン放出ペプチド前駆体（ｐｒｏＧＲＰ）が、有用であることを証明したことによって実際のものとなった［Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：２１３６−２１４０（１９９６）］。本発明者らはＧＲＰがＳＣＬＣに選択的に認められるという知見をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で一連のペプチドの産生を検討し明らかにした［Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９９：１０７−１１６（１９８５）］。
そしてＧＲＰの前駆体であるｐｒｏＧＲＰを測定することにより、ＳＣＬＣの早期発見、治療効果のマーカーとして利用することができることを明らかにし、特許として成立している（特許番号２９２５４７９号、特許番号３２１０９９４号）。しかしながら、このｐｒｏＧＲＰの腫瘍マーカーとしての有用性を発見した方法は、ＳＣＬＣ患者の血清と非ＳＣＬＣ患者の血清をＲＩＡ法で測定する方法のため、ｐｒｏＧＲＰ以外にも既知のペプチドの抗体を何種類も作成し、多検体の測定を行わなければならないため、多大な時間と労力を必要とする。また、新しい候補ペプチドを発見することはこの方法ではできない。
発明の開示
本発明は、膵がんのマーカーとなる低分子量のペプチドを発見するための一段階試料調製法とマトリックス支援型質量分析法を組み合わせた方法により、新規な膵がんのマーカーを効率よくスクリーニングする方法を提供する。またこのスクリーニング法を用いて発見した膵がんを診断するためのマーカーを提供する。
がん培養細胞株由来の無血清培養上清は腫瘍マーカー探索のよい出発材料である。そこには現在臨床で使用されている腫瘍マーカーをはじめ、蛋白質由来のペプチド断片や分泌ペプチドが含まれている。マーカーペプチド発見の為にプロテオミクスのアプローチをとる場合、２種類以上培養上清中の分泌ペプチドのプロファイルを比較するため必然的に２次元ゲル電気泳動以外のディファレンシャルディスプレイの方策が必要となってくる。なぜならば通常のゲル電気泳動は１００００  Ｄａ以下ではペプチドの分離検出が困難だからである。
上記の課題を解決するため、本発明は、無血清培養の細胞上清中の低分子量ペプチドを濃縮するための方法で有って、
ａ）  強陽イオン交換体に酸性条件でペプチドを結合させ、そして
ｂ）  アルカリ条件で溶出することにより濃縮する、
ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、２種類以上の培養細胞上清中のペプチドを請求項１に記載の方法で濃縮後、質量分析計で比較分析することを特徴とする、ある種の培養細胞株より特異的に分泌されるペプチドをスクリーニングする方法を提供する。
本発明はまた、配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の一部あるいは全部を含んで成る分泌性ペプチドを提供する。このペプチドは、好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部あるいは全部から成る分泌性ペプチドである。
本発明は更に、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の一部あるいは全部を含んで成るペプチドを提供する。このペプチドは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の一部あるいは全部から成る分泌性ペプチドである。
上記いずれかのペプチドは、膵がん細胞から分泌される分泌性のペプチドであり、膵がんのマーカーとなることを特徴とする。
本発明は更に、上記いずれかのペプチドを検出あるいは定量する測定方法を提供する。
本発明は更に、上記いずれかのペプチドを検出あるいは定量することにより、膵がんの診断を行うための診断キットあるいは診断薬を提供する。
本発明はまた、上記いずれかのペプチドに対して結合親和性を有する抗体を提供する。この抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
本発明は更に、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
本発明はまた、上記の抗体を用いる、上記の測定方法を提供する。
本発明は更に、上記の抗体を含む上記の診断キットまたは診断薬を提供する。
発明の実施の形態
マトリックス支援型レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析の近年の進歩を考えてみると、他に比較できないほど正確に分子質量を与えられるこの手法［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｔｓ  １０．２１（１９９７）］を活用できよう。質量分析で得られる質量情報は、特徴的な分子を見いだし、かつ一方で共通して発現している分子を除外するほどに正確であろう。ＭＡＬＤＩ質量分析は感度においても優れているが、試料の調整における問題を回避することはできない［Ｇｏｂｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３４：１０５−１１６（１９９９）］。
また、アフィニティー型ＭＡＬＤＩ質量分析の一種である表面改良型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析プロテインチップの技術を用いることも可能である。ＳＥＬＤＩプロテインチップは、生体試料中に存在する多様な蛋白質をアフィニティー捕獲できるように作成されており、それによって未精製の原液試料も分析可能である［Ｈｕｔｃｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ７：５７６−５８０（１９９３），Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１１６４−１１７７（２０００）］。
バイオマーカー探索の出発材料として、本発明者らはがん培養細胞株の無血清培養上清を対象とした。現在まで、培養細胞由来の培養上清に含まれる低分子量構成要素を包括的に分析する試みはなかった。臨床検体でなく、これらの材料を対象にする理由は、血清は血清アルブミンや免疫グロブリンのような蛋白質を多量に含み、微量にしか存在しない分子の検出を妨げるからである。細胞培養で用いる血清も同様の問題を生じる。第二に、細胞株がｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持されていることは、必ずしも細胞株が本来の腫瘍の形質を喪失していることを意味しないということである。この考え方は、培養株も、現在確立している腫瘍マーカーを頻繁に産生する事実で支持される［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｃ．８２：８２０−８２８（１９９１），Ｉｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７８：５４−６２（１９８７），Ｓｕｊｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ  １：２５０−２５５（１９８８）］。
よって、ＭＡＬＤＩやＳＥＬＤＩによる細胞株培養上清の低分子量構成要素のプロファイリングは、分泌ペプチドの発見に際し実用的なアプローチであるかもしれない。特にＳＥＬＤＩは試料の調製が不要なことより細胞株に基づくバイオマーカー探索アプローチに有利であろう。本発明で最適化したプロトコールによって、本発明者らは１時間の実験で原液数μＬを用いて、初めてディファレンシャルプロファイリング（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を行うことができた。この戦略は標的ペプチドの発見を一層容易にするであろう。
また上記のように原液数μＬで検出が不可能な微量の低分子ペプチドを検出するため、バックグラウンドを上げずにペプチドを濃縮する試料調製法を確立した。検体中の微量ペプチドを濃縮するために、強陽イオン交換膜が装着されているマイクロカラムを用い、試料を酢酸で酸性にし、遠心して上清を回収する。上清をマイクロカラムに添加し、イオン交換膜に結合させる。
これを洗浄後、結合した分析試料はアルカリ性の揮発性の脱離液（アンモニア、水、アセトニトリル＝１：４：５ｖ／ｖ）を添加して遠心して回収する。このステップを反復させることによって、回収率を上げることができる。溶出物をまとめて、減圧乾燥で濃縮する。この調製液をＳＥＬＤＩプロテインチップ上で分析することによって、原液では分析できなかったペプチドも分析可能となった。さらにこの調整法を用いることでＭＡＬＤＩでの分析も可能となった。
さらに考慮すべき点としては、細胞から培地中に分泌されるポリペプチドは総モル濃度で０．０１％を占めるのみでペプチド画分に至ってはさらに少ないことである。無機塩が全体の８５％を占めている。表面改良型レーザー脱離イオン化ＳＥＬＤＩプロテインチップはチップ上での分析対象の捕捉を可能にするが、試料調整法を利用すれば、無機塩のような分析対象外の成分を洗浄し、培養上清に存在するポリペプチドを濃縮できる。
チップを調製後、ＳＥＬＤＩ質量分析計を用いて２０００から１５０００  Ｄａの範囲で分析が行われている。染色ゲル上のスポットに代わり、構成要素はマススペクトル上で分子質量として提示される。本発明者らの知る限り、本発明は培養上清を用いたプロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）的ペプチド分析の最初の事例である。培養上清数μＬを用いるのみで、各細胞株独自の発現パターンを呈するマススペクトルを得られるのは特筆すべきである。
腫瘍マーカー探索の目的でペプチドをディファレンシャルディスプレイする為には、多検体を処理する必要があるので簡単に実施できる操作が望ましい。さらに、培養上清に存在するペプチドを濃縮するのみならず、同時に無機塩等を除外する必要がある。この点でＳＥＬＤＩ  Ｈ４チップは逆相クロマトグラフィーのように分析対象を捕捉して、夾雑物の除去並びに濃縮をチップ上で行えると思われる。本発明では原液無血清培養上清数μＬを用いて、低分子構成要素の発現パターンを知ることができる。
さらに、本発明では標的ペプチドを発見する機会を増大させるためにより存在量の少ないペプチドを検出するための方策を確立した。この一段階調製法の前後でマススペクトルを比較すると、この方法で原液培養上清に１〜１０ｐｍｏｌ／ｍｌ存在するペプチドは効率よく濃縮されているのではないかと見積もられる。しかし、すべてのペプチドが同程度にイオン化されて検出されているわけではない。
通常のイオン交換クロマトグラフィーでは結合した物質は、塩濃度を上昇させて溶出される。しかし、ペプチドよりも無機塩は容易にイオン化するので［Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｔｓ  １０．２１（１９９７）］ペプチドの検出は妨害されてしまう。このため、本発明においては、一段階調製法のなかで塩濃度をあげる方法を使用せず、アセトニトリルとアンモニアを溶出試薬として用いて膜に捕捉されたペプチドを回収する。これらの試薬は揮発性であり、溶出物は無機塩を濃縮させることなく容易に濃縮させることが可能である。
この試料調製法は、適切な緩衝液に希釈することで他の分析方法にも適している。今日まで培養上清のペプチドの解析報告はなく、膵臓癌に関して培養細胞および臨床検体いずれにおいてもプロテオーム的な解析は報告されていなかった。本発明のデータは膵臓癌の培養上清は細胞から分泌されるペプチドを豊富に含んでいることを示している。
さらに本発明では上記の低分子量のペプチドの濃縮法と疎水性のプロテインチップ質量分析を用いて多数の膵がん由来と非膵がん由来の継代細胞から分泌されているペプチドを比較し、膵がん由来継代細胞より特異的に分泌されている、分子量約３３３５のペプチドを発見した。膵がん由来継代細胞より特異的に分泌されているペプチドはこれらの分子量に限定されるものではなく、さらに比較する継代細胞を増やすことにより、他の分子量のペプチドを発見することも可能である。
膵がん由来継代細胞より特異的に分泌されている、分子量約３３３５のペプチドは膵がん由来細胞の培養上清から単離精製することができる。単離・精製は既知の様々な精製法を組み合わせることにより、必要とされる純度に精製することができる。精製法には、例えば、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水性、等電点、免疫アフィニティー、キレートアフィニティー、逆相などの各クロマトグラフィー、塩析などの分別沈殿等が用いられる。他の方法も可能である。
充分な純度および量の該ペプチドを得た後、そのままプロテインシークエンサーにより、Ｎ末端からアミノ酸配列を決定することができる。Ｎ末端付近以外のアミノ酸配列は、たとえばまず適当なプロテアーゼ等により該ペプチドを分解し、分解産物である部分ペプチドを、逆相クロマトグラフィーなどの精製法により精製し、そのアミノ酸配列をＮ末端から同様に決定し、その配列を組み合わせることにより全体のアミノ酸配列を決定することができる。
このようにして全アミノ酸配列を決定することができるが、それは必ずしも必要ではない。一般的方法にて、一部のアミノ酸配列からペプチドをコードするＤＮＡをクローニングしてその塩基配列を決定し、その配列から該ペプチドのアミノ酸配列を導き出すことも可能である。
さらに最近では、微量のサンプルよりアミノ酸の配列を決定することも可能となっている。たとえばタンデム質量分析を行い、マスタグ法およびｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法の併用によりアミノ酸配列を決定することができる。本発明の分子量約３３３５のペプチドもこのような方法でアミノ酸を決定し、がん抑制遺伝子の候補と考えられているＤＭＢＴ１遺伝子のＣ末端側の２９アミノ酸残基であることがわかった。
ＤＭＢＴ１（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  １）はｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属し、脳腫瘍、肺がんなどの抑制遺伝子の候補として報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００，６０：１７０４−１７１０）。しかしながら、膵がんとＤＭＢＴ１遺伝子が関連あるとの報告はなく、さらに膵がん由来の継代細胞上清中にＤＭＢＴ１遺伝子にコードされたペプチドのＣ末端側の２９アミノ酸残基が放出されている報告もなく、本発明が最初の発見である。
このＤＭＢＴ１遺伝子にコードされているペプチドはＣ末端側の２９アミノ酸残基が膵がん由来の継代細胞から特異的に分泌されており、膵がん患者の検体から検出される可能性が高い。このことはこの２９アミノ酸残基が膵がんの早期発見、および治療のマーカーとして有用であることを示している。さらにこの２９アミノ酸残基の一部あるいは全部を含むポリペプチドも同様に膵がんのマーカーなることが考えられる。ここで、２９アミノ酸残基の一部とは、例えば、連続する１５個以上のアミノ酸、好ましくは連続する２０個以上のアミノ酸、更に好ましくは連続する２５個以上のアミノ酸を意味する。
後述のｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ｂ遺伝子にコードされているペプチドのＣ末側２０アミノ酸もＤＭＢＴ１遺伝子の２９アミノ酸と同様のことが言える。
本発明のペプチドは決定されたアミノ酸と実質的に同一のアミノ酸配列を含んで成る。実質的に同一とは、完全に同一であるか、又は１個もしくは少数個のアミノ酸において修飾されているが、膵がんの診断マーカーとなりうることを意味する。ここで修飾とは、アミノ酸が欠失、付加もしくは他のアミノ酸による置換が行われているか、又はこれらの組合わせによりアミノ酸配列が変更されていることを意味する。さらに糖鎖、脂肪酸の付加も含まれる。
ここで、少数個とは、例えば全アミノ酸数に対して２０％程度以下、好ましくは１０％程度以下、例えば６個以下、好ましくは３個以下を意味する。従って、本発明において実質的に同じアミノ酸配列には、１〜６個、好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されてもよく、なお膵がんのマーカーと成りうるアミノ酸配列も包含される。
本発明はまた、上記のごとき種々のアミノ酸配列を有するペプチドの断片をも含む。これらの断片は、それが膵がんの診断マーカーとして有用か否かに拘らず、抗体の製造のための免疫原として有用である。ここで、断片とは、上記アミノ酸配列中の連続する１２個あるいは１５個以上のアミノ酸の配列、好ましくは連続する２０個以上のアミノ酸の配列、より好ましくは連続する２５個以上のアミノ酸の配列を意味する。
本発明はまた、上記のごときペプチド又はその断片と、他のペプチドとの融合ペプチドをも包含する。融合ペプチドを構成するパートナーとなるペプチドとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ｌａｃＺ等、任意のペプチドが挙げられる。この様な融合ペプチドは、本発明のペプチド又はその断片を組換え技法により効率よく発現させるために有用である。
本発明は、上記ペプチドおよびその断片の誘導体に関する。
本発明のペプチド及びその断片はまた、常法に従って化学合成することもできる。それらの方法は、Ｊａｎｉｓ  Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４）；Ｍ．Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙ及びＡ．Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙ．Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８４）並びにＭ．Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙ．Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８４）に記載されているような方法を包含する。
一般的なペプチド分離の手段、例えば抽出、沈殿、電気泳動および様々な形態のクロマトグラフィー等により、調製した該ペプチド又はその断片を反応混合物から単離精製することができる。
また、遺伝子工学的方法により本発明のペプチド、その断片又はその融合ペプチドを製造する事ができる。この方法においては、所望のペプチド又はポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から目的とするペプチド又はポリペプチドを採取する。このための宿主としては、原核細胞でも真核細胞でもよい。原核細胞は例えば細菌であり、これはグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。
本発明の該ペプチド又はその断片は、それの所望の用途に依存して様々な純度において得ることができる。本明細書中に開示されるペプチド精製技術を使って、または本明細書に記載される抗体による免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいて精製を行うことができる。この免疫アフィニティークロマトグラフィーの概要は、本明細書中に示されている。
本発明のペプチド及びそれをコードするＤＮＡは、種々の用途を有する。すなわちＤＮＡは、それがコードしているペプチドの製造のために使用されるほか、関連のまたは相同の該ペプチドをコードする遺伝子、該ペプチドサブタイプをコードする遺伝子および異なる種の該ペプチドをコードする遺伝子を検出又は同定するのに特に有用である。
本発明はまた、該ペプチドの存在を検出又は定量するための種々の測定系及び診断薬における、該ペプチド、その断片、ペプチド及びそれらの融合生成物の使用にも関する。
本発明の該ペプチド又はその断片は、上記測定系における、標準物質としても利用可能である。
本発明の該ペプチドおよびその断片は、該ペプチド又はその断片に特異的な抗血清又は抗体産生のための免疫原として使用され得る。精製された該ペプチドは、純度の高くない該ペプチド調製物の免疫により調製されるモノクローナル抗体をスクリーニングするためにも使用され得る。さらに、該ペプチド断片はまた、本発明の抗体を産生するための免疫原としても利用することができる。
本発明は、該ペプチドと親和性を有し、結合するプローブを提供する。本発明においてプローブとは該ペプチドに結合する物質を示す。そのためこのプローブがペプチドに結合することを利用して、検体中のペプチドを検出することが可能である。プローブとしては該ペプチドに親和性のあるリセプター、リガンド、ＤＮＡ、ペプチド、アプタマー、抗体などが考えられる。これらのプローブで検体中のリガンドを捕捉することにより、検出が可能である。またこれらのプローブを酵素などで標識することによっても検出が可能である。以下にプローブとして、抗体を代表例として詳しく説明する。
本発明は、該ペプチドと親和性を有する抗体を提供する。たとえば、本発明は、分子量約３３３５のペプチドへの親和性を有する、又はそれに対して作製された抗体、およびその抗体のフラグメントに関する。抗体は、その天然に存在する型及びその組換え体型の該ペプチド及びその断片に対し、作製することができる。
本発明のペプチドの断片に対する抗体は、免疫原性ペプチドと該断片との接合体により動物を免疫する事により作製することができる。モノクローナル抗体は、所望する抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、該ペプチドに対する結合についてスクリーングされ得る。
本発明のペプチド及びその断片は、免疫原として使用されるべきポリペプチドに融合、または共有結合して、免疫する事ができる。該ペプチド及びそのフラグメントは、種々の免疫原、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド等に融合、又は共有結合して免疫する事ができる。免疫する動物は、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等、免疫し目的の抗体を得る事ができる動物であればその種を選ばない。
ポリクローナル抗血清を調製するための方法の説明には、たとえば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｏｅｂｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｈａｒｐｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｗ．１９６９），Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（Ｄｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９６２）及びＷｉｌｌａｍｓなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ．Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９６７）（これらすべては、引用により本発明書に組込まれる）を参照のこと。典型的な方法は、抗原による動物の過剰免疫を包含する。
本発明のポリクローナル抗体は、常法に従って得ることができる。ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、モルモット等の動物に上記抗原ペプチドを単独で、あるいはアジュバントと混合して定期的に免疫する。望ましくは３回以上の免疫の後、免疫した動物の血液、卵等を採取し、ポリクローナル抗体を回収することができる。
本発明はまた、該ペプチドと結合性を有するモノクローナル抗体を提供する。本発明はさらに、前記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
多くの場合、種々の哺乳類宿主、たとえばマウス、ラットなどのゲッ歯類、霊長類、ヒト等からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのようなモノクローナル抗体を調製するための技法の説明は、Ｓｔｉｔｅｓなど、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（Ｌａｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ．ＣＡ．第４版）及びこの中の引例、及び特に、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）（モノクローナル抗体の１つの作製方法を論じる）に見出され得る。
簡単に要約すれば、マウス、ラット等に上記抗原を単独で、あるいはアジュバントと混合して定期的に免疫する。望ましくは３回以上の免疫の後、例えば脾臓、リンパ節を摘出し、そのＢ細胞を適当な骨髄腫細胞と細胞融合させる。その融合細胞は、インビトロで培養できる「ハイブリドーマ」である。得られたハイブリドーマ細胞を、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ−ＲＰＭＩ１６４０培地等の適当な培養液中で培養する。
培養上清中に産生された抗体を例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等で検出することにより、該ペプチドに対し特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択し、クローン化する。各クローンは、免疫原に対する１つの抗体種を分泌する。得られる個々の抗体種は、免疫原性物質上に認識される特異的部位（エピトープ）に応答して生成される、免疫動物からの単一のＢ細胞の生成物である。
本発明の該ペプチドと反応するモノクローナル抗体は、例えばマウスまたはラット腹腔にハイブリドーマ細胞を移植し、得られた腹水から回収することができる。また、ハイブリドーマ細胞の培養上清から回収することもできる。
回収したモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、硫安沈殿、クロマトグラフィーなどの公知の方法により分離精製することができる。
本発明の抗体はまた、アフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。このアフィニティークロマトグラフィーは、該ペプチドの精製に用いることができる。抗体が固体支持体、たとえば粒子、たとえばアガロース、セファロース又は同様のものに結合されているカラムを調製し、ここで該ペプチドを含む試料をカラムにとおし、カラムが洗浄され、続いて弱い変性剤を流すことにより、精製された該ペプチドが溶出される。
本発明はまた、前記抗体を含んで成る、該ペプチドの測定方法およびその断片の検出法および測定方法を提供する。
該ペプチドの検出系、測定系は、均質（遊離試薬と該ペプチド抗体複合体との間で分離段階を含まない）又は不均質（分離段階を含む）であり得る。
本発明のペプチドの検出系、測定系は典型的には、該ペプチドに結合親和性を有する標識された抗体、該ペプチド源（天然に存在するもの又は組換えのもの）及びラベルされた遊離化合物から結合体を分離するための手段、たとえば該ペプチドを固定するための固相化した該ペプチドに結合親和性を有する抗体を含んで成る。
これらの測定系において、抗体、又は該ペプチドおよびその断片を、共有結合又は非共有結合により直接的又は間接的に標識することによって、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に得ることができる。直接的な標識には、たとえば放射性ラベル、たとえば１２５Ｉ、酵素（アメリカ特許第３，６４５，０９０号）、たとえばペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼ、及び蛍光ラベル（アメリカ特許第３，９４０，４７５号）をなどがある。また、たとえばビオチニル化と、ビオチンへの上記標識群の１つで標識したアビジン、ストレプトアビジンの結合を包含する。たとえば、標識されていない抗体は、その抗体を認識する標識された第２抗体を用いることによって使用され得る。
得られた該ペプチドに対する抗体を用い、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、などの公知の免疫測定法を構築することにより、該ペプチドまたはその断片を検出又は測定することができる。
公知の免疫測定法の一つの例として、いわゆる競合免疫測定法の応用が考えられる。例えば、検体に放射性同位元素等で標識した該ペプチドを一定量混合し、さらに抗該ペプチド抗体を混合し検体中の該ペプチドおよび標識該ペプチドと反応させる。
検体中の該ペプチドは、標識該ペプチドと競合して抗該ペプチド抗体と反応するため、検体中に該ペプチドが存在する分、標識該ペプチドとの反応が減少する。反応後、抗該ペプチド抗体をあらかじめ固相担体に結合させておくか、抗イムノグロブリン抗体、プロテインＡと抗該ペプチド抗体を反応させること等により、結合、非結合標識該ペプチドを分離する。一般に用いられる方法により結合していない分画を除き、結合した放射性同位元素等の標識を検出する事により該ペプチドを測定することが可能となる。
公知の免疫測定法のもう一つの例として、いわゆる２抗体サンドイッチ系の応用が考えられる。例えば、抗該ペプチド抗体をマイクロタイタープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の免疫測定法に一般に用いられる固相担体に結合させ、これを検体と接触させる事により、検体中の該ペプチドを固相担体上にある抗該ペプチド抗体と反応させる。一般に用いられる方法により結合していない分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗該ペプチド抗体と接触させ、担体上にある抗該ペプチド抗体と結合した該ペプチドと反応させる。
一般に用いられる方法により結合していない分画を洗い、標識されている放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等を検出する事により該ペプチドを測定することが可能となる。この測定系に用いる抗該ペプチド抗体、標識抗ペプチド質抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはその組み合わせ何れを用いる事も可能である。ここで肝要なことは、担体に結合する抗体と該ペプチドとの複合体が標識抗体と結合できるよう、抗体を組み合わせることであり、このような抗体の組み合わせは、前述の系を組み立て、その系に適用してみることにより選択することができる。
また免疫組織染色により、組織中の該ペプチド質またはその断片を検出することができ、さらにその、組織および細胞内での局在様式を知ることができる。免疫組織染色に用いる抗体の標識の例としては、光学顕微鏡用には蛍光色素と酵素、電子顕微鏡用にはフェリチンと金コロイドなどがある。免疫組織染色のためには、例えば典型的には組織切片または細胞をアルコール、アセトン、パラホルムアルデヒドなどの適当な固定剤により固定し、抗該ペプチド抗体をこれに反応させる。洗浄後、直接標識の場合はそのまま、間接標識の場合はさらに標識体と反応させ洗浄した後、蛍光標識の場合は蛍光顕微鏡により、酵素標識の場合は適当な基質との反応後光学顕微鏡により、金属粒子標識の場合は電子顕微鏡により標識の検出を行う。
これらの免疫測定法は、文献においても集約的に論ぜられて来た。
本発明の抗体はまた、診断のためにも有用である。
上記免疫組織染色や免疫測定法によって得られた結果から、ペプチドの組織内および細胞内における存在様式、局在様式を知ることができる。それにより該ペプチドの生理的役割に関する知見が得られると共に、各種疾患との関連性も明らかにできる。疾患との関連は、その疾患における診断薬としての有用性を示唆するものである。
本発明中の例えば分子量約３３３５のペプチドは膵がん由来継代細胞から特異的に発現、分泌されているペプチドである。そのためこのペプチドが膵がん細胞特異的に存在する抗原であれば、がんマーカーとして診断に有用であり得る。
従って上記該ペプチド又はその断片の測定系を診断薬として用いることにより膵がんマーカーとして、検診時等での患者のスクリーニング、疾患の性質の特定、および治療時の治療効果モニタリング等に有用な情報が得られる。
測定対象は例えば、患者の血液、唾液等の体液、尿、便等の排出物、採取した組織、細胞などである。
実施例
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１． 無血清培養上清の調製
細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ライフテクノロジー社）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地でコンフルエントになるまで培養した。培地を吸引後、１０ｍｌずつの無血清培地で３回洗浄し、さらに１時間３７度で培養した。さらに２回洗浄を行い、１０センチ培養ディッシュあたり３ｍｌの培地を加えて、４８時間培養した。
培養上清は遠心で細胞を除去後に、ポリプロピレン管に移し４度で分析まで保管した。タンパク濃度は免疫グロブリンをスタンダードとしてプロテインアッセイキット（バイオラド社）で定量した。ブランクとしては、１０％血清を含む培地を未使用のディッシュに加えて７２時間培養し、その後に上記と同様に洗浄したものを用いた。得られた培地は「細胞不含」培養上清と称する。すべての株はトリパンブルー色素排除法により、９５％以上の細胞が４８時間まで生存していることを確認した。
実施例２． 低分子量蛋白質プロファイリングの為のＳＥＬＤＩ分析の最適化
質量は、サイファージェンＳＥＬＤＩプロテインバイオロジーシステム２（サイファージェンバイオシステムズ社、カリフォルニア州）を用い、１１０のレーザーショットを平均した値で求めた。スペクトルは、ウシインシュリンの１価および２価分子イオンを用いて、外部キャリブレーションを行った（ｍ／ｚ５７３４．５６および２８６７．７８）。ｍ／ｚの値は本文中で言及される時は３桁ないし４桁の有意な数字に四捨五入した。質量の精度は分析範囲において１０００ｐｐｍ（０．１％）よりは優れていた。
低分子量蛋白質を分析するために、疎水性相互作用で蛋白質を捕捉する化学的表面を有するＨ４プロテインチップアレイを用いた。試料結合とマトリックスとの共結晶の為の実験条件はよいマススペクトルをとるために最適化した。生物試料の蛋白質プロファイリングに質量分析法を適用するのは、まだ途上の段階であり、確立したプロトコールは存在しないので最適化はとりわけ重要である。逆相カラムと同様に、Ｈ４チップはまず１ｕｌの１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）で活性化し、引き続き水−ＡＣＮ（９０：１０．ｖ／ｖ）、水−ＡＣＮ（５０：５０，ｖ／ｖ）または０．５％ＴＦＡ含有水−ＡＣＮ（５０：５０，ｖ／ｖ）で処理した。
さらにＭＫＮ−１細胞の条件培地（１スポットあたり２００ｎｇ蛋白質）を試料として添加し、１０分静置の後、チップ表面を洗浄した。スポットは、α−シアノ−４−ハイドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）の飽和溶液を５倍希釈した溶液を添加した。この試薬はポリペプチドの質量分析で通常用いるマトリックスである。０．５％ＴＦＡ含有水−ＡＣＮ（５０：５０，ｖ／ｖ）で処理したスポットが最良のスペクトルを与えた（図２のＣ）。
ＣＨＣＡのかわりに、３，５−ジメトキシ−４−ハイドロキシ桂皮酸（ＳＰＡ）または２，５−ジハイドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）というやはりポリペプチドの質量分析で用いられるマトリックスも検討したが、よい結果は得られなかった。ＣＨＣＡの濃度は、飽和溶液より５倍希釈液を用いる方がシグナル強度が高かった（図２のＤ）。よって、チップの処理は図１に示した方法で最適化された。他の２つの細胞株についても同様の結果が得られた。
実施例３． トリシン電気泳動とＳＥＬＤＩ分析の比較
実施例２のプロトコールを用い、低分子量分子を５つの細胞株において５μＬずつ用いて分析した。蛋白濃度は細胞株によって多様であり（０．０５〜０．８ｍｇ／ｍｌ）、総蛋白量としては１スポットあたり２５０ｎｇから２μｇ分析した計算になる。低分子量蛋白質の分離技術として確立しているトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Ｓｃｈａｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３６８−３７９（１９８７）］でのデータと比較した。トリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うために１００μＬの培養上清を真空乾燥で２０μＬにまで濃縮し、サンプルバッファーに溶解させた。
ゲル組成は１６．５％Ｔ−３％Ｃを用いた。バンドは銀染色で可視化した。１００μｌの試料を用いても、電気泳動では分子量２万以下では少数しかバンドが検出されなかった（図３）。一方で、ＳＥＬＤＩ分析では、電気泳動で使用する試料量の１／２０で、ｍ／ｚ２万以下の領域で多数のシグナルが見いだされた（図４）。この場合注意すべきは、スペクトル上のピークは、必ずしもそれと同数の分子種が検出されているわけではない点である。その理由は、相対含量の多い蛋白質によっては、多価分子イオンを生成するからである［Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｔｓ  １０．２１（１９９７）］。
このような特性があるが、ＳＥＬＤＩは、低分子量の範囲においてより多くのピークを検出しているようにみえる。ＣＡＰＡＮ−１の培養上清１μｌに人為的に一定量添加したＧＲＰ（分子量２８５９．４）を用いて、感度を評価した。シグナル対ノイズ比３程度で２５ｆｍｏｌのＧＲＰが容易に検出された（図５）。これらの所見は、ＳＥＬＤＩは低分子量蛋白質の検出に優れていることを示唆している。
ＳＥＬＤＩの別な特色は分析所要時間である。トリシン電気泳動は、試料濃縮および検出を含めて、まる一日かかるが、ＳＥＬＤＩ  Ｈ４プロテインチップでは試料調整過程が不要なため、１時間で実験が終了する。通常のＭＡＬＤＩでは、脱塩のような操作が分析前に必須であるが、ＳＥＬＤＩではチップ上で１分で脱塩が可能である。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＺｉｐＴｉｐやＷａｔｅｒｓ社のＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジのような脱塩では、数μＬの試料を再現性よく回収することが困難だった。Ｈ４の優位性は試薬使用量の少なさも特徴的で、おおむね１スポットあたり１０μＬ以下である。
実施例４． 一段階試料調製法
さらにより微量の低分子ペプチドをプロテインチップ質量分析で検出可能とするため、低分子ペプチドの濃縮のため検討を行った。試料添加前に、強陽イオン交換膜が装着されているマイクロカラムであるＭｉｃｒｏｃｏｎ−ＳＣＸ（ミリポア社）は、５００μｌのメタノール、同量の水で順次洗浄した。試料７５０μｌを等量の１％酢酸で希釈し、５分間１４０００ｇで遠心した。
上清は、コンディショニング後のマイクロカラムに添加し、イオン交換膜に結合させた。さらに５００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で洗浄した。結合した分析試料は５０μｌの脱離液（アンモニア、水、アセトニトリル＝１：４：５ｖ／ｖ）を添加して１４０００ｇで３０秒遠心して回収した。このステップは反復させた。溶出物をまとめて、減圧乾燥で３０μｌにまで濃縮した。３μＬを１スポットあたりＳＥＬＤＩプロテインチップ上で実施例５で分析した。
実施例５． 一段階試料調製法後のＳＥＬＤＩプロテインチップ解析
実施例４で調製した試料はＣ１６の逆相Ｈ４プロテインチップアレイ（サイファージェンバイオシステムズ社）上で実施例１で最適化した方法を用いて測定した。
データはＳＥＬＤＩのソフトウエアであるＰＥＡＫＳを用いて解析した。
総蛋白質濃度は細胞株毎に異なり、０．０５ｍｇ／ｍｌから０．９ｍｇ／ｍｌの間であった。２．５μＬの原液培養上清を用いると、疎水性相互作用で対象を捕捉するＨ４チップ上では、ｍ／ｚ５０００以下ではほとんどピークが見えなかった（図６のＡ）。微量分子を発見する機会を増やすためには、分析対象をチップ上に反復して添加すれば解決されるかのように思えた。
しかし、Ｈ４チップを用いても、５μＬを超える試料量では同時に多量の塩もチップ上に持ち込むことになるので分析能力を超えてしまうことになった。実際、１０μＬを超える原液培養上清を添加すると、チップ上では塩が析出することになり、検出されるシグナルの数と強度においてマススペクトルの質が低下した。ペプチド画分を濃縮するために、試料は等量の１％酢酸を加えて酸性にし、アミノ酸とペプチドを捕捉する為に強陽イオン交換膜に結合させた。
結合した物質は、実施例４で記述したようにアルカリ条件下で溶出させ、減圧乾燥器でさらに濃縮をかけた。濃縮物を分析すると、ｍ／ｚ５０００以下の範囲において原液では見いだせなかった複数のピークが明らかになってきた（図６のＢ）。ｍ／ｚで５０００を超えるピークは濃縮はされなかった。
実施例６． 逆相Ｈ４プロテインチップ上でのプロファイリング
２３株の膵がん培養株からそれぞれ培養上清を実施例４の方法で調整し、Ｈ４チップで分析した。対照として、ヒトパピローマウイルス１６のＥ６Ｅ７遺伝子を導入された正常膵導管細胞から樹立されたＨ６Ｃ７およびＨＰＤＥ４細胞［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（２０００）１６２３−１６３１］の培地を検討した。不死化してはいるが、これらの細胞は悪性の導管細胞よりは、正常膵導管細胞の形質に類似しており、ヌードマウス造腫瘍性はない［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（２０００）１６２３−１６３１］。図７では、これら２５株のマススペクトルをシグナル強度依存性に、白黒で表示した。
培養ディッシュと接触した培地からはシグナルは検出されなかったので、殆どのシグナルは細胞由来と考えられる。＃１２＊および＃１４＊の位置で検出されたシグナルは、＃１２およびｍ／ｚ１１７３４のピークのそれぞれ２価分子イオンである（図７）。これらの２価イオンは、マトリックス支援型質量分析で時折観察されるもので、分析ソフトウエアＰＥＡＫＳを用いると、そのように認識される。シグナルは０．１％の精度でディファレンシャルディスプレイの前にマッチさせた。表１は、シグナル対ノイズ比２以上で５以上のがん細胞株で検出されたピークとその２３株における発現をまとめたものである。
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膵がん由来細胞株の５株以上に検出されたものをまとめたコントロールは正常膵導管細胞株である。
＃１２のｍ／ｚ８５６９のピークは、すべての細胞株で認められた。結局、膵臓がん培養株で見いだされた８つの主要シグナル（＃１−２，＃４−６，＃９−１１）は、導管細胞株では検出されなかった（表１）。他の分析法で正常膵導管細胞の培養上清および血清中での発現を検討すべきだが、候補マーカーはこのようなアプローチで発見されるかもしれない。その選択的な分布を確認するために、他の種類のがん細胞の培養上清も同様に分析できるであろう。
実施例７． 膵がん由来培養細胞上清中の蛋白質の分析
実施例４、５および６で行った一段階試料調整法とプロテインチップ質量分析をモディファイし、分析する細胞上清の数を増やし、膵がん由来細胞３６株、胃がん由来細胞１０株、大腸がん由来細胞８株、乳がん由来細胞６株、前立腺がん細胞３株、その他９株、膵導管由来樹立細胞２株、正常膵導管初代培養細胞の無血清培養上清を分析した。
１０センチ培養ディッシュに単層培養した細胞の増殖培地を吸引後、加温した無血清培地に交換する。７時間培養後培地を除去し、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄する。その後、同培地３．５ｍｌをディッシュに加え２４時間培養する。条件培地を回収、遠心後の上清に等量の１％酢酸を添加し、再度遠心し試料とする。試料は強陽イオン交換膜であるＭｉｃｒｏｃｏｎ−ＳＣＸ（ミリポア社）を用いてペプチド成分を濃縮する。メタノールでコンディショニングし、不要成分の除去は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で行なった。
目的成分は、溶出バッファー２５０μｌ（５０％ＡＣＮ：４０％水：１０％アンモニア・Ｋ）で回収する。引き続き遠心エヴァポレーターで有機溶媒を蒸発させる。同試料を質量分析に用いる。細胞種特異的なピークを見出すために、Ｈ４プロテインチップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社）上で質量分析する。同チップを１μｌの１００％ＡＣＮ、さらに１μｌの０．５％ＴＦＡ含有水−ＡＣＮ（５０：５０、ｖ／ｖ、）でコンディショニングし、上記試料２．５μＬを添加する。乾固後、２．５μｌの水で２回洗浄する。マトリックスにはα−シアノ−４ハイドロキシ桂皮酸（α−ｃｙａｎｏ−４ｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ：ＣＨＣＡ）を用いる。マススペクトルは同社のマニュアルにしたがって作成する。すべての試料についてスペクトルを得た後に０．１％の質量誤差で細胞間でピークをマッチさせる。
表２に膵がん３株以上に認められたペプチドの分子量をまとめたものを示す。また膵がん由来細胞株の６株で図８に示すようなマススペクトルが得られた。膵がん由来細胞の細胞上清に他のがん由来の細胞上清に見られない膵がん特異的な分子量約３３３５のペプチドのピークが発現していることが見出された。
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膵がん３株以上に検出されたものをまとめた。
実施例８． 膵がん由来細胞より特異的に分泌される物質の分子量決定および同定
実施例７のプロテインチップおよび通常のＭＡＬＤＩプレート上で見出されたピークのモノアイソトピック質量は四重極ハイブリッド型飛行時間型質量分析計（Ｓｃｉｅｘ社、Ｑ−ＳＴＡＲ）で３３３４．７３７Ｄａと算定された。同ピークは、さらにタンデム質量分析に供し、マスタグ法およびｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法の併用によりＤＭＢＴ１遺伝子のＣ末端フラグメント（ＤＶＧＳＹＱＥＫＶＤＶＶＬＧＰＩＱＬＱＴＰＰＲＲＥＥＥＰＲ）に相当することが判明した。この配列から予測される質量は３３３４．７３９Ｄａである。またＣＡＰＡＮ−１細胞株の培養上清５ｍｌを上記の固相抽出法およびゲルろ過で部分精製した試料を調整した。リジルエンドペプチダーゼで消化し、イオントラップ型タンデム型質量分析計で分析し、ＭａｓｃｏｔおよびＳｅｑｕｅｓｔソフトウエアを用いたデータベース検索により、同じ結果を得た。
実施例９． フェノールレッド不含培地の質量分析に与える影響
ＣＡＰＡＮ−１細胞をフェノールレッドを含む通常のＲＰＭＩ培地、またはフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地で培養し、培養上清２ｍｌを実施例７の試料調製法で５０μｌに調整した。その調製済みサンプルと飽和ＣＨＣＡ溶液を１：２の割合で混合し、そのままＭＡＬＤＩ  ｐｌａｔｅに１μｌを添加した。その後、風乾させＶｏｙａｇｅｒ  Ｄｅ  Ｐｒｏ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で測定した。機械の操作は同社のマニュアルに従った。キャリブレーションは、ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｂ  ｃｈａｉｎ（モノアイソトピック質量３４９３．６５）を外部標準として用いた。
通常のＲＰＭＩ培地で培養したＣＡＰＡＮ−１の培養上清の原液を１μｌとそれぞれの培地の培養上清をＭＡＬＤＩで分析した結果を図９に示す。最も大きなシグナルｍ／ｚ２４２６について比較すると原液ではＳ／Ｎ比が１７．９、通常のＲＰＭＩ培地の培養上清を調製したものでは２０９．９、フェノールレッド不含培地の培養上清を調製したものでは３３１．１となっており、次第にノイズが少なくなっていることがわかる。このように本発明の試料調製法は、質量分析の解析の前処理として有効であり、フェノールレッド不含培地を用いることにより、さらにノイズの減少が見られることがわかる。
本発明の低分子量ペプチドの１段階調製法を他の濃縮法と比較すると、限外濾過による濃縮法は時間がかかる（２ｍｌで約３時間）、濾過膜へのペプチドの吸着が多い、大分子量のタンパクも同時に濃縮されるため、質量分析において低分子量のペプチドの検出を妨げるなどの欠点がある。また凍結乾燥と透析を組み合わせた濃縮法では時間がかかる（半日以上）、塩が濃縮させるので試料容量を減少させることが難しく、透析での脱塩も操作が煩雑なため、塩が質量分析のノイズとして残りやすい。また大分子量のタンパクも濃縮されるため、ペプチドの検出を妨げるなどの欠点がある。本発明の１段階調製法は１０検体を２時間以内に調製可能で、他の方法と比較して、質量分析の前処理に適した方法と考えられる。
実施例１０． １段階試料調製後のＭＡＬＤＩによる解析のＳＥＬＤＩとの比較
ＣＡＰＡＮ−１細胞およびＫＰ３細胞のフェノールレッド不含培地での培養上清２ｍｌを実施例９と同様に試料調製法で５０μｌに調製し、それと飽和ＣＨＣＡ溶液を１：２の割合で混合し、そのままＭＡＬＤＩ  ｐｌａｔｅに１μｌを添加した。その後、風乾させＶｏｙａｇｅｒ  Ｄｅ  Ｐｒｏ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で測定した。機械の操作は同社のマニュアルに従った。キャリブレーションは、ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｂ  ｃｈａｉｎ（モノアイソトピック質量３４９３．６５）を外部標準として用いた。ＳＥＬＤＩでの分析結果との比較を図９に示す。本発明の１段階調製法を用いることにより、ＳＥＬＤＩでの分析結果と同等以上の分析がＭＡＬＤＩでも可能である。また、複数の細胞株間でのピークの比較は通常のソフトでも実施可能である。
実施例１１． ｍ／ｚ２３４０．１のアミノ酸配列の決定
実施例７に記載した方法で、膵がん細胞株３６株中９株にｍ／ｚ２３４０．１のピークが認められたことは表２に記載してあるが、この結果について、再度試験を行ったところ、膵がん細胞由来株３６株中１１株の細胞培養上清中よりｍ／ｚ２３４０．１の分子量のピークが得られた。表２ではその他の細胞培養上清中からはこのピークは検出されなかったが、胃がん由来細胞株をさらに２株追加したところ１株より同様のピークが得られた。つまり膵がん由来細胞株からは３６株中１１株、胃がん由来細胞株からは１２株中１株からｍ／ｚ２３４０．１の分子量のピークが検出され、その他の表２に記載してある各臓器由来の細胞株からはこのピークは検出されなかった。膵がん由来培養細胞でこのｍ／ｚ２３４０．１のピークが検出されたのはＫＬＭ−１，ＫＭＰ３，ＫＭＰ５，ＫＰ１Ｎ，ＫＰ２，ＫＰ３，ＰＫ−８，ＰＫ−４５Ｐ，ＰＫ−５９，ＹＰＫ−３，Ｐａｎｃ１の１１株である。
上記のｍ／ｚ２３４０．１のサンプルをタンデム質量分析に供し、マスタグ法およびｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法の併用により、アミノ酸配列の決定を試みたが、アミノ酸配列が解析できなかった。そのため目的のペプチドの内部配列にシステイン残基が２個あるいはそれ以上存在し、ジスルフィド結合している可能性が考えられたので、定法に従って試料を還元アルキル化した。同反応液をＨ４チップに添加し、質量分析すると２３４０．１のピークは消失し、２４５７のピークが出現した。この質量の差より目的のペプチドは分子内に２個のシステインを持ち、ジスルフィド結合していることが予想された。
なお、反応中で目的ペプチドが分解しないことは、還元アルキル化試薬を含まないバッファー中で等時間反応後も目的ピークが検出されることで確認した。そこで、このピークをタンデム質量分析する為に、実施例７に記載の方法で膵癌培養株ＫＰ３から約２０ｍｌの無血清培養上清を回収し、ペプチドを調整した。還元アルキル化後の試料はゲル濾過クロマトグラフィを用いて過剰な試薬を取り除いた。目的分画についてｏＭＡＬＤＩ−ＱＳＴＡＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でタンデムマススペクトルを測定した。ＭＳ／ＭＳの解析ソフトであるＭＡＳＣＯＴを用いて、データベース検索を行ったところＮＣＦＡＩＲＨＦＥＮＫＦＡＶＥＴＬＩＣＳのｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ＢのＣ末端２０アミノ酸がハイスコアになった。
また、ＱＳＴＡＲの付属のソフトウエアであるＢｉｏａｎａｌｙｓｔで解析するとＲＨＦＥＮＫのシークエンスタグを読み取ることができ、データベース検索を行ったところ、ＮＣＦＡＩＲＨＦＥＮＫＦＡＶＥＴＬＩＣＳの配列に相当することがわかった。さらにＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ＵＣＳＦ）のソフトウエアを用いて同様にデータベース検索を行ったところ、上記の２つのソフトウエアと同様にｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ＢのＣ端２０アミノ酸であることが明らかになった。これらの解析結果から、配列はＮＣＦＡＩＲＨＦＥＮＫＦＡＶＥＴＬＩＣＳであり、二つのシステインはジスルフィド結合で架橋されていると結論した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：３４４９−３４５７，２００１）。モノアイソトピック質量の理論値は２３３９．１２Ｄａである。測定値は２３３９．０３Ｄａであった。
なお、家族性英国痴呆症のアミロイド病変から精製された３４アミノ酸からなるペプチド（Ｎａｔｕｒｅ，３９９；７７６−７８１，１９９９）は、この配列を完全に含んでいる。痴呆に関連するペプチドは、本症の家系においてｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ｂの終止コドンのＴＧＡがＡＧＡに変異をおこしたために下流にＲＴＶＫＫＮＩＩＥＥＮの１１アミノ酸が付加されており、細胞外に分泌されることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：３４４９−３４５７，２００１）。
しかしながら、膵がんとｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ｂ遺伝子が関連しているとの報告はなく、さらに膵がん由来の継代細胞の培養上清中に野生型のｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ＢペプチドのＣ末端側ＮＣＦＡＩＲＨＦＥＮＫＦＡＶＥＴＬＩＣＳの２０アミノ酸が放出されている報告もない。このペプチドは膵がん由来の継代細胞から特異的に分泌されており、膵がん患者の血液や尿などの体液あるいは癌の組織などから特異的に検出される可能性が高い。このことはこの２０アミノ酸残基のペプチドをサンプル中から検出することが膵がんの早期発見、および治療のマーカーとして有用であることを示している。詳細な説明に前述したＤＭＢＴ１遺伝子にコードされたペプチドのＣ末端残基２９アミノ酸と同様に利用法が考えられる。
実施例１２． ＤＭＢＴ１のＣ末ペプチドに対する抗体の取得
ＤＭＢＴ１に対する抗体はＤＭＢＴ１のＮ末側の２６−４０アミノ酸に対するモノクローナル抗体が報告されている。（Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１７０４−１７１０，２０００）。しかしながら、その他の抗体の報告はない。実施例８でアミノ酸配列を決定したＤＭＢＴ１のＣ末側の２９アミノ酸配列のうちＤＭＢＴ１の２４１５−２４２６アミノ酸にあたるＬＱＴＰＰＲＲＥＥＥＰＲのアミノ酸を定法に従いペプチド合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ、定法に従いウサギ２羽に３回の免疫を行った。この血清をＬ１２９抗血清として以下の実験に用いた。
実施例１３． 免疫沈降ＳＥＬＤＩ  ＭＳによる細胞上清中のペプチドの確認
実施例１２で取得した抗体を用い、膵がん由来細胞上清中のペプチドの免疫学的な同定を行った。細胞上清５００μｌを１００倍希釈したＬ１２９抗血清と４℃で一晩反応させた。その後２０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と３０分反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、１０μｌの０．２％ＴＦＡで結合した物質を溶出した。溶出した溶液の４μｌを用い、ＳＥＬＤＩ  Ｈ４チップを用いて解析した。
その結果１０％ＦＣＳの存在下で培養したＣａｐａｎ−１の培養上清をＬ１２９抗血清により免疫沈降し、ＳＥＬＤＩ  ＭＳにより解析すると図１１に示すように、ｍ／ｚ３３３５のピークが検出されたが、コントロールとして行った免疫前の抗血清ではｍ／ｚ３３３５のピークは検出されなかった。また図１２に示すようにＣａｐａｎ−１のほかにもＳＵＩＴ−４，ＰＳＮ−１，ＹＰＫ−２，ＰＫ−１細胞の培養上清からもＬ１２９抗血清を用いて免疫沈降によりｍ／ｚ３３３５のピークが検出されたが、他の培養細胞の上清中からは検出されなかった。この結果は実施例７および図８の結果と一致している。
ここで得られた抗体はＤＭＢＴ１のＣ末側の２９アミノ酸を認識することは明らかである。この抗体をプローブとして用いることによりＤＭＢＴ１のＣ末側の２９アミノ酸をヒトの血清、尿、組織などの検体中から捕捉し検出することが可能である。またこの抗体を用いてＤＭＢＴ１のＣ末側の２９アミノ酸を検出することにより、膵がん患者の早期発見による診断、あるいは治療の効果を判定する予後のマーカーなどに利用できる。本実施例ではＤＭＢＴ１の２４１５−２４２６アミノ酸にあたるＬＱＴＰＰＲＲＥＥＥＰＲに対して抗体を作成したが、配列番号１に記載したＤＭＢＴ１のＣ末側の２９アミノ酸に対する抗体も同様の利用が可能である。
実施例１４． Ｌ１２９抗血清によるＤＭＢＴ１のウエスタンブロッティング
ＤＭＢＴ１蛋白の細胞での発現を調べるために、Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１７０４−１７１０，２０００）の方法に従いウエスタンブロットを行った。Ｃａｐａｎ−１細胞のｃｅｌｌｌｙｓａｔｅをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜に転写し、Ｌ１２９抗血清を用いて検出した。図１３に示すようにＬ１２９抗血清はＤＭＢＴ１全長の２４２６アミノ酸の蛋白質を認識する。この抗体はＤＭＢＴ１の２４１５−２４２６アミノ酸にあたるＬＱＴＰＰＲＲＥＥＥＰＲを含むＤＭＢＴ１であれば、全長であってもＣ末の２９アミノ酸であっても結合することが明らかであり、Ｃ末の２９アミノ酸を含むＤＭＢＴ１の分解産物が検体中に存在する場合もこの抗体をプローブとして用いることにより、検出が可能である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、培養上清中の低分子量タンパク質プロファイリングに最適化したＨ４プロテインチップのプロトコールを示す。
図２は、３通りの異なる前処理を行った場合に得られたＳＥＬＤＩマススペクトルの比較を示す。それぞれのスポットは１００％ＡＣＮで処理し、（Ａ）Ｈ２０−ＡＣＮ（９０：１０，ｖ／ｖ）、（Ｂ）Ｈ２０−ＡＣＮ（５０：５０，ｖ／ｖ）、または（Ｃ）０．５％ＴＦＡ−ＡＣＮ（５０：５０，ｖ／ｖ）を用いて平衡化した。（Ｄ）は、（Ｃ）と同様の前処理をしたが、マトリックスとして飽和ＣＨＣＡを用いた。
図３は、ＳＥＬＤＩ分析との比較のため、トリシンＰＡＧＥ分析の結果を示す。これは、銀染色後のトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
図４は、トリシンＰＡＧＥ分析との比較のため、ＳＥＬＤＩ分析の結果を示し、ｍ／ｚ２，０００〜２０，０００のＳＥＬＤＩマススペクトルである。ＡはＭＤＡ−ＭＢ−３６１の結果を示し、ＢはＭＤＡ−ＭＢ−２３１の結果を示し、ＣはＭＫＮ−１の結果を示し、ＤはＴ−４７Ｄの結果を示し、そしてＥはＣａｐａｎ−１の結果をしめす。
図５は、１μＬのＣａｐａｎ−１培養上清に添加したＧＲＰ（２５−１００  ｆｍｏｌ／ｓｐｏｔ）の検出を示す。
図６は、強陽イオン交換膜を用いた試料調整によるシグナル検出の増強の結果を示すチャートである。図中、Ａは未処理の培養上清（２．５μｌ）の結果を示し、そしてＢはＳＣＸ処理した試料（３μｌ）の結果をしめす。
図７は、培養細胞２５株から得られたマススペクトルを示す。それぞれの培地は実施例に記載されているように処理し、３μＬをＨ４チップで分析した。アステリスクは二価イオンを示している。
図８は、膵がん由来継代細胞株６株より得られたマススペクトルを示す。プロトコールは実施例７に従った。
図９はフェノールレッドを含有する培養上清と含有しない培養上清から試料調整した際のシグナルの違いを示す。１）は原液１μｌ、２）はフェノールレッドを含むＲＰＭＩ培養上清５０μｌ相当分、３）はフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培養上清５０μｌ相当分をＭＡＬＤＩで解析したチャートを示す。
図１０はＣａｐａｎＩ，ＫＰ３の培養上清を試料調整後にＳＥＬＤＩとＭＡＬＤＩで解析した結果を示す。
図１１はＤＭＢＴ１の２４１５−２４２６番目のアミノ酸にあたるペプチドＬＱＴＰＰＲＲＥＥＥＰＲに対する血清と陰性対照である免疫前の抗血清でＣａｐａｎ−１の細胞上清を免疫沈降し、ＳＥＬＤＩ  Ｈ４チップで質量分析を行った結果を示す。
図１２はＬ１２９抗血清を用いてＣａｐａｎ−１、ＳＵＩＴ−４、ＰＳＮ−１、ＹＰＫ−２、ＰＫ−１細胞の細胞上清を免疫沈降しＳＥＬＤＩ  Ｈ４チップで質量分析を行った結果を示す。
図１３はＣａｐａｎ−１細胞のＣｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅをＬ１２９抗血清を用いウエスタンブロットにより解析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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