(57)【要約】薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその酵素活性に差がある酵素を利用する、その酵素によって切断される置換基を有し、かつ置換基が切断されることにより活性化されるプロドラッグ。薬物の標的部位としては、例えば、呼吸器官が、副作用発現部位としては、例えば、心臓がそれぞれ挙げられる。薬物の例としては、気管支拡張剤が、酵素の例としては、グリコシダーゼ（例えば、β−グルクロニダーゼ）がそれぞれ挙げられる。更に、置換基は、例えば、単糖又はオリゴ糖からなるグリコシル基である。上記酵素を利用することによって、効果を発生する標的部位と副作用を発現する部位が異なるタイプの薬物の副作用を低減させることが可能となる。
2004000863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
Ｒ−薬物          （１）
（式中、Ｒは薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素によって切断されうる置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化されるものである）
で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩。
【請求項２】
式（２）
Ｒ’−薬物          （２）
（式中、Ｒ’は呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素であるβ−グルクロニダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化される呼吸器官用薬物を意味する）
で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩。
【請求項３】
標的部位が呼吸器官である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
副作用発現部位が心臓である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
薬物が気管支拡張剤である請求項１または２記載の化合物。
【請求項６】
薬物がβ２作用薬である請求項１または２記載の化合物。
【請求項７】
薬物がその構造に水酸基を有するβ２作用薬である請求項１または２記載の化合物。
【請求項８】
薬物がサルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリンのいずれかである請求項１または２記載の化合物。
【請求項９】
酵素がグリコシダーゼである請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
酵素がβ−グルクロニダーゼである請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項１または２記載の化合物。
【請求項１２】
置換基がグルクロニル基である請求項１または２記載の化合物。
【請求項１３】
グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項１１記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１または２記載の化合物の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１または２記載の化合物の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する局所投与用医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１または２記載の化合物の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項１７】
薬物の標的部位と副作用が発現する部位における酵素活性に差がある酵素を利用するプロドラッグであって標的部位のみで効果を発現する医薬組成物を製造するための、式（１）
Ｒ−薬物          （１）
（式中、Ｒは薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素によって切断されうる置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化されるものである）
で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の使用。
【請求項１８】
薬物の標的部位と副作用が発現する部位における酵素活性に差がある酵素を利用するプロドラッグであって標的部位のみで効果を発現する医薬組成物を製造するための、式（２）
Ｒ’−薬物          （２）
（式中、Ｒ’は呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素であるβ−グルクロニダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化される呼吸器官用薬物を意味する）
で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の使用。
【請求項１９】
標的部位が呼吸器官である請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
副作用発現部位が心臓である請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
薬物が気管支拡張剤である請求項１７または１８記載の使用。
【請求項２２】
薬物がβ２作用薬である請求項１７または１８記載の使用。
【請求項２３】
薬物がその構造に水酸基を有するβ２作用薬である請求項１７または１８記載の使用。
【請求項２４】
薬物がサルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリンのいずれかである請求項１７または１８記載の使用。
【請求項２５】
酵素がグリコシダーゼである請求項１７記載の使用。
【請求項２６】
酵素がβ−グルクロニダーゼである請求項１７記載の使用。
【請求項２７】
置換基がグリコシル基である請求項１７または１８の使用。
【請求項２８】
置換基がグルクロニル基である請求項１７または１８の使用。
【請求項２９】
グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランのいずれかの溶剤中、塩基の共存下、水酸基を有するβ２作用薬および糖ハロゲン化物誘導体を反応させ、これをアルカリ加水分解により脱保護する、糖を置換基として持つβ２作用薬の製造方法。
【請求項３１】
塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのいずれかである請求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】
複数の水酸基を有するβ２作用薬と塩基を含む混合物にハロゲン化ベンジル誘導体を添加し、選択的に水酸基を保護したのちグリコシル化し、この中間体をアルカリ加水分解後、水素添加する、糖を置換基として持つβ２作用薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその酵素活性に差がある酵素を利用し、薬物の副作用を低減させることのできるプロドラッグに関するものである。
【背景技術】  いわゆる糖置換基を付与したプロドラッグは数多く研究されてきた。その主な目的は、難溶性の親化合物の溶解度を向上させるためのものや、グルクロン酸抱合体の類推から無毒化をねらったものである。とくに、後者は生体の代謝機構を利用しようとするものである。すなわち、ガン細胞や炎症細胞でβ−グルクロニダーゼやβ−グルコシダーゼのような糖開裂酵素の活性が向上しているという報告をもとに、患部でのみ親化合物を発現させ効果を発現しながら、望ましくない副作用を軽減させるという考えに基づいて設計されたプロドラッグである。以下にそれらの詳細を説明する。
腫瘍組織においてβ−グルクロニダーゼをはじめいくつかのグリコシダーゼの活性が亢進している研究報告が発表されていた（Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０５，６４６−６４７，１９４７，Ｆｉｓｈｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｌｙａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７，８０８−８１４，１９４７，Ｂｏｌｌｅｔ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３８，４５１，１９５９）。他の疾患については、喘息患者で、肺胞マクロファージおよびマスト細胞からのβ−グルクロニダーゼ放出による肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のβ−グルクロニダーゼ活性が亢進する傾向が報告されていたり（Ｔｏｎｎｅｌ等、Ｌａｎｃｅｔ  ８３３９，１４０６−１４０８，１９８３，Ｍｕｒｒａｙ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５，８００−８０４，１９８６）、また、β−グルクロニダーゼとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性がリュウマチ患者の滑液中で亢進していること（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ等、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２，３９３−４００，１９７５）、ＡＩＤＳ患者の血清中のβ−グルクロニダーゼ活性が健常人と比較して高いこと等が報告されており（Ｓａｈａ等、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１９９，３１１−３１６，１９９１）、各種の疾患時においてもグリコシダーゼの活性が亢進あるいは細胞外への放出されることが示唆されている。この中で特に注目すべき酵素であるβ−グルクロニダーゼは、β−グルクロニドを加水分解して、Ｄ−グルクロン酸を遊離させる反応を触媒する酵素であり、肝臓、肺、脾臓、腎臓等の広範囲の臓器あるいはマクロファージ、好酸球等の炎症細胞に存在していることが報告されていた（Ｈａｙａｓｈｉ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１５，８３−９２，１９６７，Ｃｏｎｃｈｉｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７１，３１８−３２５，１９５９）。
癌の化学治療においては、腫瘍以外の正常組織あるいは正常細胞に対する毒性の軽減が重要な課題である。これを解決するために、腫瘍組織に特異的に作用する抗癌剤の開発が数多くなされたが、いずれも期待されたほどの副作用の軽減が見られていなかった。
Ｄｅ  Ｄｕｖｅは腫瘍組織におけるグリコシダーゼを含むリソソーム中の加水分解酵素に着目し、これらの加水分解酵素とそれらの酵素で加水分解されて活性化する抗癌剤のプロドラッグによる化学療法の概念を提案した（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｈ，１０１−１１２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９６１）。Ｃｏｎｎｏｒｓ  ａｎｄ  Ｗｈｉｓｓｏｎは、マウスを用いた実験で、抗癌剤アニリンマスタードの抗癌作用と腫瘍細胞のβ−グルクロニダーゼ活性に高い相関があることを示した（Ｎａｔｕｒｅ  ２１０  ８６６−８６７，１９６６）。Ｓｗｅｅｎｅｙらも、抗癌剤ミコフェノール酸の作用機序は、ミコフェノール酸が臓器でグルクロン酸抱合化され、腫瘍組織においてβ−グルクロニダーゼにより加水分解されることにより活性体であるミコフェノール酸になり抗癌作用を発揮しているとする説を発表した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３１，４７７−４７８，１９７１）。Ｙｏｕｎｇらは、ミコフェノール酸の場合と同様に抗癌剤アニリンマスタードが体内でグルクロン酸抱合化され、腫瘍組織において加水分解されることにより抗癌作用を発揮するという仮説のもとに癌患者で臨床試験を行ったが、抗癌作用と腫瘍組織の酵素活性の間に十分な相関は認められなかった（Ｃａｎｃｅｒ  ３８，１８８７−１８９５，１９７６）。Ｂａｂａらは、マウス乳癌モデルを用い、抗癌剤５−フルオロウラシルのグルクロン酸誘導体を静脈内投与して抑制作用を示す報告をしている（Ｇａｎｎ  ６９，２８３−２８４，１９７８）。
しかしながら、総じてこれら抗癌剤の糖誘導体プロドラッグは、標的部位での加水分解が不十分なため、臨床上では満足な結果が得られていない。
次に、腫瘍特異的抗体と各種酵素を結合させたものをあらかじめ投与しておき、その酵素で開裂されて活性体に変換されるプロドラッグを用いるアプローチがなされた。これは、ＡＤＥＰＴ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）と呼ばれ、数多くの研究開発が行われたが、外因性の抗体−酵素複合体が免疫抗原性を持つことやプロドラッグが生体内で十分に活性化されないといった問題があり、成功には至っていない。
そこで、Ｂｏｓｓｌｅｔら（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５，２３４−２３８，１９９２）は、癌細胞で投与した抗癌剤−糖誘導体という構造のプロドラッグが効率的に加水分解を受けるためには、抗癌剤に直接糖を結合するのではなく、スペーサーを介した化合物を合成することと酵素を結合させた免疫抗原性の低い融合蛋白質を発明し、上記の問題を改善しようと試みた。その過程で彼らは、グリコシド−スペーサー誘導体単独でも十分な効果を発揮する誘導体を見出し、抗癌剤以外にも抗炎症剤、免疫抑制剤、Ｃａ拮抗剤、交感神経作動剤等に応用できるプロドラッグとしてグリコシド−スペーサー−ドラッグという構造を開示している（ＵＳ（米国特許）５６２１００２（ｆａｍｉｌｙ  ｐａｔｅｎｔ（対応特許）：ＥＰ（ヨーロッパ特許出願公開）６４２７９９，特開平７−１４９６６７），ＵＳ  ５９３５９９５（ｆａｍｉｌｙ  ｐａｔｅｎｔ：ＥＰ  ７９５３３４，特開平１０−１４９５），ＵＳ  ５９５５１００（ｆａｍｉｌｙ  ｐａｔｅｎｔ：ＥＰ  ５９５１３３，特開平６−２９３６６５））。
特開平６−２９３６６５には、「化合物は、健康な個人においては原則的に細胞の内側に存在するが、上述した病態生理学的条件下においては局所的な細胞外に存在する酵素によって活性化される。」、「本発明によるプロドラッグは、特に活性化状態でマクロファージ、顆粒球および血小板が存在するすべての非一腫瘍学的疾患に対して使用することができる。活性化された状態で、上述した細胞は、主として、本発明によるプロドラッグの部位−特異的活性化を可能にする細胞内酵素を分泌する。」、と記載されている。
また、抗腫瘍剤を活性薬剤とした場合の本引例の物質が腫瘍モデルだけでなく、数種の炎症モデルでも認められたことを根拠に腫瘍におけるのと同様に、炎症細胞が関与する疾患すべてにおいて想定できると述べている。
その例示するところは、「細胞増殖抑制剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡに介在する物質、トポイソメラーゼＩ＋ＩＩを阻害するもの、アルキル化剤、リボソーム不活性化剤、チロシンンホスホキナーゼ阻害剤、分化誘導剤、ホルモン、ホルモンアンゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、細胞増殖抑制剤に対する多面発現抵抗性を変化する物質、カルモジュリン阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ｐ−グリコプロテイン阻害剤、ヘキソキナーゼ調節剤、ｐ−グルタミルシステインシンセターゼ又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ阻害剤、増殖−関連蛋白質阻害剤、免疫抑制作用を有する物質、免疫抑制剤、抗炎症作用を有する物質、非ステロイド性抗炎症物質、抗リウマチ性薬剤、ステロイド、抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用を有する物質、有機酸誘導体、鎮痛剤、局所麻酔薬、抗不整脈剤、Ｃａアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、副交感神経作動剤、交感神経作動剤、ヒトウロキナーゼ阻害作用を有する物質」に及んでいる。
すなわち、本引例のプロドラッグが炎症細胞の関与するあらゆる薬物において機能する可能性があるということが示唆されているが、実際にいずれの薬剤が機能し、いずれの薬剤は機能しないのかについては指標も示唆もない。
実施例には、抗癌剤であるドキソルビシン、ナイトロジエンマスタード、キニンの糖誘導体を用いた抗腫瘍作用とドキソルビシン糖誘導体の抗炎症作用ならびに急性毒性の測定が示されるのみであり、上記のように、数多くの治療薬をあげているものの、抗癌剤以外の薬物についての具体的な薬効薬理を示す実施例は記載されておらず、実際の有効性については未確認であると思われる。例えば、ステロイドの糖誘導体については、これまで多くの研究がなされているけれども、Ｓｕｇａｉら（ＷＯ９５／０９１７７）が指摘しているように、その安定性に問題があることと標的器官以外での酵素的な加水分解による活性体への変換による副作用の発現という問題で開発が困難な状況にある。ドキソルビシンでさえ、長く研究されているが、欧州でいまだ前臨床段階であり臨床的な完成に至っていないのである。
この他、癌以外への応用としては、先に触れたステロイドのグリコシドを用いたプロドラッグの研究が早くから副作用の軽減のために研究開発されてきた。Ｍｅｒｃｋ社のグループが１９６２、１９６４、１９６６年にステロイドのグリコシド誘導体がステロイドの副腎萎縮、体重減少、骨粗鬆症、白血球数減少等の副作用を軽減させるという可能性を示している（ＧＢ１０１５３９６，ＧＢ１０５９５４８，ＵＳ３１８５６８２，Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８６，３９０３−３９０４，１９６４）。しかし、ステロイドのグリコシドプロドラッグは、安定性が極めて悪く、標的組識以外でグリコシド結合が開裂して副作用が発現するといった問題点が判明し、Ｓｕｇａｉら（ＷＯ９５／０９１７７）は、糖の水酸基を保護することにより安定性を向上させ、副作用を軽減させることを試みた。しかしながら、これまでに臨床上の成功には至っていない。ステロイドは、非常に微量で作用を発揮でき、且つ生体内の幅広い組織での多彩な生理作用をもつため、グリコシドプロドラッグ化しても副作用の軽減を達成することは非常に難しい薬剤と言える。
さらに、Ｆｒｉｅｎｄらは、腸内細菌の保有するグリコシダーゼに着目して、潰瘍性大腸炎の治療薬として副作用が問題となるステロイドの糖誘導体という構造のプロドラッグの研究を行っている（ＥＰ  １２３４８５，（ｆａｍｉｌｙ  ｐａｔｅｎｔ：特表昭６０−５０１１０５、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７，２６１−２６６，１９８４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８，５１−５７，１９８５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１０，１５５３−１５６２，１９９３）。しかしながら、これらの試みについても、現在までに臨床的な成功は示されていない。
以上のように、β−グルクロニダーゼをはじめとする生体内の酵素を利用した薬物−糖誘導体というプロドラッグの開発は古くから試みられているが、臨床上の成果には結びついていないのが現状である。
患者数の多い呼吸器官疾患の一つである喘息の治療法として、現在のガイドラインでは、長時間作用型β２作用薬と吸入ステロイドの併用治療を推奨している。
気管支拡張剤であるβ２作用薬の開発の歴史は、当初発見されたβ１及びβ２の両方の受容体に作用するβ作用薬から、サルブタモールを代表とする短時間作用型の第２世代のβ２選択的作用薬へと進化し、サルメテロールを代表とする第３世代の長時間作用型β２作用薬へと発展している。短時間作用型β２作用薬は、喘息の増悪時の治療や運動誘発性気管支攣縮の予防に使用されるべき薬物であるが、喘息患者に対して原因がはっきり特定されていない突然死を含む、血中カリウム濃度低下、血圧、心拍、ＱＴ延長等、骨格筋振戦等の様々な副作用を示す。これらの副作用は、特に、使い過ぎにより発生するものであると考えられている（Ｂｕｒｇｒａｆｆ等、Ｔｈｏｒａｘ  ５６，５６７−５６９，２００１，Ｂｅｎｎｅｔｔ等、Ｔｈｏｒａｘ  ４９，７７１−７７４，１９９４，Ｒａｖｅ、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．９５，２１−２５，２００１）。
【発明の開示】
上述のように、β２作用薬の心拍数増加や血圧変動といった副作用をさらに低減させた薬物の開発は、臨床上極めて重要な課題であると考えられる。一般に短時間作用型β２作用薬は、経口投与よりも、吸入薬として使用される場面が多い。これらは局所的投与経路にもかかわらず、上述のような副作用が散見される。
本発明は、β２作用薬のような、効果を発生する標的部位と副作用を発現する部位が異なるタイプの薬物の副作用を低減させることを課題とする。
従来の技術の欄において説明したように先行技術はいずれも癌あるいは炎症組織等において亢進した酵素活性を利用し、活性体へ変換させるプロドラッグである。一方、本発明は、組織あるいは臓器にある酵素活性において、正常状態においても臓器間に存在する活性の差を利用するプロドラッグである。
本発明者らは、１１−エチル−７，９−ジヒドロキシ−１０，１１−ジヒドロジベンゾ〔ｂ，ｆ〕チエピンのグルクロン酸抱合に関する研究を行ってきた。この化合物は、経口投与後、肝臓で速やかにグルクロン酸抱合を受け、血中では９９％以上グルクロン酸抱合体として存在する。しかし、薬理上のターゲット組織である肺では、薬理活性を示した。研究の結果、この化合物のグルクロン酸抱合体は、肺において脱抱合されることが判明し、β−グルクロニダーゼによって脱抱合された親化合物が活性を示したものと推定された。（詳細は実施例の後に参考例１として記載した。）
ただし、β−グルクロニダーゼ活性の局在に関する各臓器あるいは細胞レベルにおける詳細な研究報告はなかった。そこで、気管支におけるβ−グルクロニダーゼの局在を確認したところ、図１に示すように細気管支の上皮細胞に局在していることを見出した（図１の黒く染まって見えるのがβ−グルクロニダーゼである）。（試験法の詳細は実施例の後に参考例２として記載した。）このように特定の部位にβ−グルクロニダーゼ活性が局在することを見出したことが本発明の基礎となっている。
さらに、β−グルクロニダーゼが、生体中のどのような臓器に多く含まれるかについて調査した。特に、β２作用薬の心臓、血圧への副作用の軽減を考慮した場合、各種臓器の中で肺と心臓におけるβ−グルクロニダーゼ活性を調べることがβ２作用薬のグルクロニドプロドラッグ化において極めて重要であると考え、モルモットの各臓器におけるβ−グルクロニダーゼ活性を測定した。この場合に、実際の喘息状態を想定して、喘息の動物モデルを用いることで喘息状態の時におけるβ−グルクロニダーゼ活性の比較も行った。すなわち、抗原で感作したモルモットと非感作モルモット、さらに抗原感作モルモットを抗原刺激により発作を惹起したときの各臓器のβ−グルクロニダーゼ活性を比較した。その結果を図２に示す。（試験法の詳細は実施例の後に参考例３として記載した。）
図２の肺の結果から明らかなように炎症状態により亢進する酵素活性はごくわずかであり、正常時から存在している酵素活性が組織毎に大きく異なることがわかる。また、β２作用薬の副作用発現部位である心臓においては酵素活性が低いことが確認された。さらに、心臓におけるβ−グルクロニダーゼの局在の有無を確認したところ、図３に示すように全く、β−グルクロニダーゼの活性を示す陽性像が認められなかった（図３の矢印で示した黒い部分は、ヘマトキシリンによる細胞の核染色像を示す）。（試験法の詳細は実施例の後に参考例４として記載した。）
培養上皮細胞では、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）にβ−グルクロニダーゼを培地中に放出することが報告されている（Ｓｃａｇｇｉａｎｔｅ等，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９５，１９４−１９８，１９９１）。同様に培養ヒト肺マクロファージも構成的にβ−グルクロニダーゼを培地中に放出することが報告されている（Ｔｒｉｇｇｉａｎｉ等，Ｔｈｅ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，４９０８−４９１５，２０００）。従って、β−グルクロニダーゼが細胞外でその活性を発現するためには、必ずしも、炎症や細胞損傷による放出が必要であるわけではなく、組織の局所においてどれだけ高濃度にβ−グルクロニダーゼが存在しているかにかかると思われる。このような観点から細胞組織学的に考察すると、肺の細気管支上皮細胞周辺のβ−グルクロニダーゼは、驚くべき局所活性を有する場といえる。
本発明者らは、上記の知見を基にβ２作用薬を予めグルクロン酸抱合した化合物を合成し、本グルクロン酸抱合体を吸入せしめることによって、肺の細気管支部分に多く存在するβ−グルクロニダーゼにより脱抱合させ、局所での気管支拡張作用を発揮させ、一部が心臓に到達したとしてもβ−グルクロニダーゼが殆ど存在しない心臓では、β２作用薬特有の副作用が殆ど認められないと考え、実際にβ２作用薬のグルクロニドを合成し、頻用されている抗原誘発型モルモット喘息モデルにおいて、吸入投与した結果、見事に気道収縮抑制作用を示し、続いてラットを用いて、心拍数、血圧に対する副作用を調べた結果、全く影響がないことを明らかにして、本発明を完成させた。
本発明は、式（１）
Ｒ−薬物          （１）
（式中、Ｒは薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素によって切断されうる置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化されるものである）
で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩を提供する。
また、本発明は、式（２）
Ｒ’−薬物          （２）
（式中、Ｒ’は呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素であるβ−グルクロニダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化される呼吸器官用薬物を意味する）
で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩を提供する。
さらに、本発明は、式（１）または式（２）の化合物の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する医薬組成物を提供する。
加えて、本発明は、薬物の標的部位と副作用が発現する部位間における酵素活性に差がある酵素を利用するプロドラッグであって標的部位のみで効果を発現する医薬組成物を製造するための、式（１）または式（２）で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の使用を提供する。
さらに、本発明は、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランのいずれかの溶剤中、塩基の共存下、水酸基を有するβ２作用薬および糖ハロゲン化物誘導体を反応させ、これをアルカリ加水分解により脱保護する、糖を置換基として持つβ２作用薬の製造方法を提供する。
また、本発明は、複数の水酸基を有するβ２作用薬と塩基を含む混合物にハロゲン化ベンジル誘導体を添加し、選択的に水酸基を保護したのちグリコシル化し、この中間体をアルカリ加水分解後、水素添加する、糖を置換基として持つβ２作用薬の製造方法を提供する。
上記式（２）で表される本発明の化合物は、吸入法によって投与した場合、肺の細気管支上皮細胞において切断され活性型が気管支平滑筋に直接作用して薬効を示す薬物であり、白血球等の炎症による細胞の活性化に由来するβ−グルクロニダーゼ活性の亢進によらず、主として上皮細胞由来のβ−グルクロニダーゼ活性によって切断されるプロドラッグである。
したがって、本発明は、式（２）
Ｒ’−薬物          （２）
（式中、Ｒ’は呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素であるβ−グルクロニダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化される呼吸器官用薬物を意味する）
で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の有効量を呼吸器疾患の治療を必要とする患者に投与することを含む、呼吸器疾患の治療方法をも提供することができる。当該治療方法において、呼吸器官用薬物して気管支拡張剤、β２作用薬等が例示され、具体的には、サルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリン等が挙げられる。
本発明の好ましい態様は、水酸基、特にフェノール性水酸基を有するβ２作用薬のＯ−グルクロナイドからなる呼吸器官用プロドラッグである。３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）サルブタモール、３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）サルメテロール、３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）ピルブテロール、３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）フェノテロール、３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）ツロブテロール、４−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）フォルモテロール、３ｏｒ４−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）ヘキソプレンリン、３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）テルブタリン、６ｏｒ７−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）トリメトキノール、３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）オルシプレナリン、３ｏｒ４−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）イソプレナリン、８−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）プロカテロールなどが例示される。
背景技術の欄にて説明した従来技術においては、薬物とグルクロン酸の間にスペーサーを挿入するなどの工夫をしなければ、腫瘍細胞において効率的に薬物とグルクロン酸に、β−グルクロニダーゼによって切断することができなかったが、本発明は、このようなスペーサー配列を挿入しなくても、肺の細気管支の局所に吸入された薬物のグルクロニドが効率的に切断することを証明した。
本発明は、腫瘍組織や炎症組織で亢進したβ−グルクロニダーゼ活性を利用するのではなく、正常状態で非常に高いβ−グルクロニダーゼ活性がある組織を見い出したことにより、完成したものである。細気管支の上皮細胞においては高いβ−グルクロニダーゼ活性が存在するので、効率的に切断させる目的でのスペーサー挿入の必然性はないものと考えられるが、プロドラッグの合成面での簡便性や安定性等のために任意の適切なスペーサーを挿入することは差し支えない。かかるスペーサーを式（１）のＲと薬物の間に挿入した化合物、あるいはかかるスペーサーを式（２）のＲ’と薬物の間に挿入した化合物も本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】  図１は、モルモット肺の細気管支上皮に強くβ−グルクロニダーゼが局在するすることを示す顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
図２は、モルモットにおける各臓器中のβ−グルクロニダーゼ活性を示すグラフである。
図３は、モルモット心臓においてβ−グルクロニダーゼ活性が認められないことを示す顕微鏡写真（倍率５０倍）である。
図４は、モルモットにおける抗原誘発型気道収縮反応に対するサルブタモールグルクロニドの抑制作用を示すグラフである。
図５は、モルモットにおける抗原誘発型気道収縮反応に対するイソプレナリングルクロニドの抑制作用を示すグラフである。
図６は、サルブタモールグルクロニドの血圧及び心拍数に対する影響を示すグラフである。
図７は、イソプレナリングルクロニドの血圧及び心拍数に対する影響を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、従来の技術に示される、癌組織や炎症組織において亢進した酵素活性を利用するもの、あるいは、腸内細菌の有する酵素活性を利用するものと異なり、標的部位と副作用発現部位間の酵素活性の差を利用したプロドラッグである。
したがって、本発明において薬物は標的部位と副作用発現部位が異なる薬物でなければならない。特に副作用発現部位が特定され、限定されている薬物が好ましい。その標的部位と副作用発現部位となる受容体が存在する場所が限定されている各種受容体作用薬、遮断薬等は、本発明の対象薬物となる。また、酵素で切断される置換基を結合する必要から、それに適する構造を持つ薬物であることが好ましい。例えば、β−グルクロニダーゼで切断される糖を結合する場合には水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基を有する化合物が好ましい。特に、物質としての安定性、グルクロニダーゼにより切断されやすい点から、水酸基を有する化合物が適しており、フェノール性の水酸基を有する薬物が最も適している。β２作用薬は水酸基、特にフェノール性水酸基を有する構造であるものが多く、本発明の薬物として適している。
薬物の標的部位とは薬物が薬効を発揮する細胞、組織、臓器、器官等を意味する。また、副作用が発現する部位とは薬物の好ましくない効果が発揮される細胞、組織、臓器、器官等を意味する。
本発明において呼吸器官とは気道および肺を意味する。
標的部位が呼吸器官である場合、本発明の薬物は気管支喘息、小児喘息、慢性気管支炎、急性気管支炎、肺炎、肺気腫、肺結核等の疾患に対する治療剤である。
副作用発現部位が心臓である場合、本発明の薬物はβ２作用薬のように心臓以外の器官を標的器官とし、心臓において副作用を発現する薬物である。
本発明において、気管支拡張剤とは吸入等により、気管支平滑筋に直接あるいは間接的に作用する薬剤である。気管支においては、細気管支の上皮細胞等にβ−グルクロニダーゼが局在しており、そこで薬物が遊離されると平滑筋は上皮細胞のすぐ下にあるため効果的に作用させることができる。
本発明においてβ２作用薬としては、サルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリン等が代表的なものとして例示されるが、これらの誘導体に限らず、β２作用を有する薬物であればよい。
本発明の酵素としては、β−グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ等のグリコシダーゼやアリルスルファターゼが例示される。呼吸器官用剤の場合、特にβ−グルクロニダーゼが好ましい。
酵素が、上述したグリコシダーゼの場合、本発明における単糖とは、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース等から選ばれる糖が例示され、オリゴ糖とは前記単糖２〜５個からなり、それらが互いにα−またはβ−Ｏ−グリコシド結合で結合しているものが例示される。通常、単糖と薬物との結合はα−またはβ−グリコシド結合である。酵素がβ−グルクロニダーゼである場合にはβ−グルクロニル結合が好ましい。
本発明において置換基とは酵素によって切断される糖残基、硫酸基などを意味する。例えば酵素がグリコシダーゼの場合、酵素で切断される糖残基としては、グルクロニル、グルコピラノシル、ガラクトピラノシル、アセチル−グルコサミル、アセチル−ガラクトピラノシル、アセチル−ピラノシル、マンノピラノシル、フコピラノシルなどが例示される。
薬物と置換基を直接、結合させずに、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３，４７５に例示されているようにβ−グルクロニドをトリガーとしスペーサーを介して結合することも可能である。スペーサーとは、薬物と置換基の間に介在させる構造のことである。標的器官において化学的にあるいは酵素的に切断され親化合物がすみやかに発現するものが望ましい。この場合、非選択的に切断されるものが好ましく、単純に加水分解などで切断されるものを用いる。
本発明では、酵素活性の高い標的器官が選択されているので、スペーサーを使用しなくても、実施例に示すように標的組織で十分に薬物が遊離される。したがって、必ずしもスペーサーを必要としないが、選択する薬物、器官、酵素によってはスペーサーを使用すると有利なことがある。
スペーサーを介することにより、容易に酵素で切断できるようになったり、立体障害などのため反応性が低い置換基の場合、容易に変換できるなどの効果が考えられる。ただし、スペーサーおよびその代謝物の毒性などの薬理的性質を明らかにしておく必要が生じる。
スペーサーとしてはエステルやカルバモイルのように化学的には安定でありながら最終的には標的酵素によって分解され親化合物がすみやかに発現するものが古くから汎用されている（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  Ｅｄ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｐ．２６２−２６９，１９８５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。薬物によっては（ＵＳ  ５６２１００２（ｆａｍｉｌｙ  ｐａｔｅｎｔ：ＥＰ  ６４２７９９，特開平７−１４９６６７），ＵＳ  ５９３５９９５（ｆａｍｉｌｙ  ｐａｔｅｎｔ：ＥＰ  ７９５３３４，特開平１０−１４９５），ＵＳ  ５９５５１００（ｆａｍｉｌｙ  ｐａｔｅｎｔ：ＥＰ  ５９５１３３，特開平６−２９３６６５））などに開示されたものも使用できる。
糖またはスペーサーの結合位置としては主としてβ作用薬の例でいえば、フェノール基、イミノ基またはアミノ基が考えられる。これらの置換基を手がかりとして直接または間接に糖部分もしくは硫酸基を結合させプロドラッグとする。
本発明の化合物の具体的な例としては、３−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロン酸）−サルブタモール、４−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロン酸）−イソプレナリン、イソプレナリン−４−Ｏ−サルフェート等が例示される。前二者の製法は実施例に示した。後者はイソプレナリンと三酸化イオウ・トリメチルアミン錯体との反応によって得られる。
本発明のプロドラッグは、局所投与により用いることが好ましい。標的部位、副作用発現部位以外の部位の酵素活性の影響を受ける可能性が低くなり、より効果的なプロドラッグとなる。呼吸器官用剤の場合は、吸入用の医薬組成物として用いるのが好ましい。
本発明のプロドラッグを吸入剤として使用する場合、その吸入剤用添加剤としては、一般に吸入用医薬組成物に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤、固形賦形剤、液状賦形剤、結合剤、滑沢剤、矯味剤、保存剤、安定化剤、懸濁化剤、分散剤、溶剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤などが用いられる。噴射剤としては、液化ガス噴射剤、圧縮ガスなどが用いられる。また、本発明の医薬組成物には、活性成分として本発明プロドラッグ以外の医薬成分を含有していてもよい。
本発明の医薬組成物において、プロドラッグの含有量は、薬物、対象疾患、対象患者の年齢や性別、疾患の状態などによって相違するが、通常医薬組成物全体に対して約０．０１〜９９．９重量％、好ましくは約０．１〜５０重量％、さらに好ましくは約０．５〜２０重量％程度である。吸入剤用添加剤などの各種添加剤の含有量は、対象疾患、対象患者の年齢や性別、疾患の症状などによって相違するが、通常医薬組成物全体に対して約０．１〜９９重量％、好ましくは約１０〜９９重量％、さらに好ましくは約５０〜９９重量％程度、特に好ましくは約７０〜９９重量％程度である。
本発明の医薬組成物を吸入剤として使用する場合、公知の方法を用いて、粉末吸入剤、吸入用懸濁剤、吸入用溶液またはカプセル状吸入剤とし、用時適当な吸入器を用いて適用することができ、特に粉末吸入剤が好ましく用いられる。さらに、本発明の医薬組成物は、エアゾール剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物を使用する場合、適用の際に使用する器具としては、市販の吸入器を用いても良く、例えば、ベントリン・ロタキャップス（ＶＥＮＴＯＬＩＮ  ＲＯＴＡＣＡＰＳ；グラクソ社）、スピンヘラー（登録商標、藤沢薬品工業（株））、インタール・スピンキャップス（ＩＮＴＡＬ  ＳＰＩＮＣＡＰＳ；フィソンズ社）、アトロベント・アンド・ベロテック・インハレッテン（ＡＴＲＯＶＥＮＴ  ＡＮＤ  ＢＥＲＯＴＥＣ  ＩＮＨＡＬＥＴＴＥＮ；ベーリンガー・インゲルハイム社）、フォラディル（ＦＯＲＡＤＩＬ；チバ社）、ベントディスク（ＢＥＮＴＯＤＩＳＫＳ；グラクソ社）、パブライザー（登録商標、帝人（株））、ブリカニル・ターブハラー（ＢＲＩＣＡＮＹＬ  ＴＵＲＢＵＨＡＬＥＲ；アストラ社）、ミアト・インスファレイター（ＭＩＡＴ  ＩＮＳＵＦＦＬＡＴＯＲ）などが例示される。
本発明のプロドラッグは置換基として糖など、通常体内で安全に代謝されるものを結合させただけのものなので、その毒性は薬物自体の毒性以上となる可能性は低い。局所的に投与に適するので、最小有効量の投与で済み、全身的多量投与を避けることができる。したがって、小児であっても容易に安全に服用することができる。特に、吸入剤やエアゾール剤とした時は、格別の局所作用効果を発揮できる。
静脈内投与、筋肉内投与等を行った場合でもプロドラッグとせずに薬物そのままを投与する場合に比べて、はるかに安全性が向上することはいうまでもない。例えば、喘息発作の緊急時にはβ２作用薬を静脈内投与する必要がありうるが、その場合でも心臓ではグルクロニダーゼの活性が低いので、心臓におけるβ２作用薬の副作用は薬物そのままを投与する場合と比較してはるかに低減される。本発明の医薬組成物の投与量は、薬物、対象疾患、年令，体重，症状，投与経路，投与回数などにより異なるが、例えば、β２作用薬の場合、プロドラッグにする前の活性薬物の投与量とほぼ同等の効果を発揮する。
本発明のプロドラッグの製造方法としては、有機化学的グリコシル化および酵素的グリコシル化がある。たとえば、水酸基を保護した糖誘導体をＫｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ反応によって代表されるグリコシド反応（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，２０７，２００１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）によって所望のグリコシド結合を形成させたのち、脱保護により目的とするプロドラッグが得られる。
酵素法でも（ＫＩＳＯ  ＴＯ  ＲＩＮＳＨＯＵ，３０，２４０３，１９９６）糖転移酵素とＵＤＰ−糖誘導体の組み合わせにより同様の結果が得られる。
【実施例】  本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。本発明はこれらの実施例によって何ら限定されない。
【実施例１】サルブタモールグルクロニド（３−Ｏ−（β−Ｄ−，グルクロニル）−サルブタモール）（実施例１の化合物）の製造
2004000863.tif 000003
（１）２−（４−メトキシベンジロキシ）−５−（２−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（４−メトキシベンジロキシ）エチル）ベンジルアルコールの調製
サルブタモール１．４６６ｇ，ＮａＩ  ２５ｍｇ，ＴＨＦ  ５ｍＬの混合物にＮａＨ  ２５０ｍｇを−７８℃で少しずつ加えた。０℃で１５分撹拌したのちに、−７８℃でｐ−メトキシベンジルクロリド（ｐ−ＭｅＯ−ｂｅｎｚｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）１．１２５ｇを添加後、室温で１６時間撹拌した。反応混合物にアセトンを加えて濾過、濃縮後、カラムクロマトグラフィーにて目的物１．２０ｇ（５９％）を得た。
ｎｍｒ（ＣＤＣｌ３）：１．１９（９Ｈ，ｓ），２．６０（２Ｈ，ｍ），２．６２（２Ｈ，ｍ），３．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），３．８１（６Ｈ，ｓ），３．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），３．９３（１Ｈ，ｍ），４．６０−４．７０（２Ｈ，ｍ），４．９９（１Ｈ，ｓ），７．２−７．８（１１Ｈ，ｍ）
（２）ｇｌｙｃｏｓｉｄａｔｉｏｎおよび脱保護
２−（４−メトキシベンジロキシ）−５−（２−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（４−メトキシベンジロキシ）エチル）ベンジルアルコール１．０４ｇ，アセトブロモグルクロン酸メチルエステル（ｂｒｏｍｏ−２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｕｒｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）１．５０ｇ，炭酸銀１．５７７ｇ，ＭＳ４Ａ  １．５７７ｇにジクロロメタン４ｍＬを加え、室温で一晩撹拌した。反応液をセライトで濾過し、濃縮後、カラムクロマトグラフィーで分離し、粗生成物１．６８ｇ（８２％）を得た。これをＭｅＯＨ−ＴＨＦ（５ｍＬ，２：３）で溶解し、２０％ＮａＯＨ（２．５９ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／ｎ−Ｈｅｘ＝１／２）で反応を確認後、氷冷下、酢酸で中和した。Ｐｄ−Ｃ（１００ｍｇ）を加え、水素添加（室温、一晩）した。反応液を濾過後、濃縮し、ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーで目的物（実施例１の化合物）１３８ｍｇ（１２％）を分離した。
ｎｍｒ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．２５（９Ｈ，ｓ），２．８０−２．９４（２Ｈ，ｍ），３．０５−３．３５（４Ｈ，ｍ），４．２５（１Ｈ，ｍ），４．６０（１Ｈ，ｍ），４．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），４．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ  ＆  １．６Ｈｚ），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４０２，２９８０，１６１７，１５０９，１４０６，１２７６，１２００，１１１８，１０７４
【実施例２】イソプレナリングルクロニド（４−Ｏ−（β−Ｄ−グルクロニル）−イソプレナリン）（実施例２の化合物）の製造
2004000863.tif 000004
イソプレナリン塩酸塩１．００ｇ，１Ｎ−ＮａＯＨ（４．００ｍＬ）の混合物に、アセトブロモグルクロン酸メチルエステル（Ｂｒｏｍｏ−２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｕｒｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）１．２８ｇをアセトン４．１６ｍＬにとかしたものをすこしずつ０℃で加え、室温で静置した。１Ｎ−ＮａＯＨ（２．４６ｍＬ）を随時加えながら、ｐＨ７付近に保ち室温で２日間反応させた。濃縮後、２０％ＮａＯＨ（２ｍＬ）を加えて室温で３０分撹拌した。冷却後、酢酸を注意深く加え、酸性にしＨＰ−２０カラムで分離後、さらにＬＨ−２０カラムで分離し、実施例２の化合物を得た。収量８１ｍｇ（５．２％）．
ｎｍｒ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．２２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．８２−２．９６（２Ｈ，ｍ），３．０５−３．３５（４Ｈ，ｍ），３．３０（１Ｈ，ｍ），４．７０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．７０（１Ｈ，ｍ），６．８０−７．５０（３Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４０２，１６１７，１５０９，１４００，１２８７，１０６８，
【実施例３】３−（β−Ｄ−グルクロニロキシ）メチル−４−ヒドロキシ−α−｛［（４−メトキシ−α−メチルフェネチル）アミノ］メチル｝ベンジルアルコール
2004000863.tif 000005
実施例１と同様の製法にて標記化合物を得た。
ｎｍｒ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），２．８２−２．９６（２Ｈ，ｍ），３．０５−３．３５（４Ｈ，ｍ），３．３０（１Ｈ，ｍ），３．７１（３Ｈ，Ｓ），４．４５（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４７（１Ｈ，ｍ），６．６０−７．３０（７Ｈ，ｍ）
【実施例４】《β２作用薬グルクロニドの薬理活性》
１．試験方法
β２作用薬であるサルブタモール及びイソプレナリンのグルクロニドの気管支拡張作用を調べるために、ｏｖａｌｂｕｍｉｎで感作したモルモットの喘息モデルを用い
2004000863.tif 000006
Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．，１９５，７１−７５，１９４０）。
〈感作〉
感作開始１および８日目、モルモットにｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ５００μｇ／０．５ｍＬを両足に筋肉内投与、百日咳ワクチン１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ／匹を腹腔内投与するすることにより能動的に感作した。感作開始１５日目にｏｖａｌｂｕｍｉｎ  １０および１００μｇ／ｓｉｔｅを背部に皮内投与して感作状態をチェックした。皮内感作６時間後の感作チェックで陽性になった動物のみ試験に使用した。
〈投与方法〉
被験物質は、超音波ネブライザーの霧化量を小にして薬液を霧化し、エアロゾルを発生させ、エアロゾルを曝露チャンバー（Ｍ．Ｉ．Ｐ．Ｓ．社）に導き、エアーポンプ（ＳＰＰ−３ＧＡ，ＴＥＣＨＮＯ  ＴＡＫＡＴＳＵＫＩ社）を用いて３Ｌ／ｍｉｎで吸引し、ｏｖａｌｂｕｍｉｎチャレンジの４０分前に１０分間モルモットに吸入投与した。
〈気道内圧測定〉
感作開始１９〜２３日目、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で麻酔した。気管にカニュレーションを行った。気管カニューレを介して人工呼吸器に接続し、人工呼吸（換気量１０ｍＬ／ｋｇ，換気回数５０回／分）下で通気圧の変化を気管カニューレに接続した差圧トランスデューサー（Ｖａｌｉｄｙｎｅ，Ｇｏｕｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を介してレコーダー（ＷＴ−６４５Ｇ，日本光電株式会社）上に気道内圧として記録した。気道内圧はｏｖａｌｂｕｍｉｎ投与１０分後まで気道内圧を測定した。次に左右の総経静脈内にカニュレーションを行った。左側のカニュレーションよりガラミン（１０ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＬ／ｋｇの容量で静脈内投与し、自発呼吸が消失したことを確認した。その後，ｏｖａｌｂｕｍｉｎを静脈内投与（３００μｇ／ｋｇ）し，抗原抗体反応を惹起した。気道内圧の測定ポイントは、惹起前、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ惹起後１，３，５，７および１０分とした。気道内圧の増加率は，惹起後の各測定時間の測定値より惹起前の測定値を差し引き、各測定時間における最大閉塞に対する割合を百分率で表した。
〈試験材料〉
被験物質としてサルブタモールグルクロニド、イソプレナリングルクロニドを使用した。サルブタモールグルクロニドは白色粉末およびイソプレナリングルクロニドは茶褐色結晶であり，いずれも−８０℃で遮光下にて保存した。比較対照物質としては、各々サルブタモール硫酸塩（以後、サルブタモールと表わす）およびイソプレナリン塩酸塩（以後、イソプレナリンと表わす）を使用した。サルブタモールおよびイソプレナリンは白色粉末であり、いずれも遮光下で室温保存した。被験物質および比較対照物質は，必要量を秤量して生理食塩溶液（大塚製薬工場株式会社，Ｌｏｔ  Ｎｏ．１Ｄ７８，１Ｅ８４）に溶解し、用時調製とした。被験物質と比較対照物質の溶液中の濃度は、モル濃度で等量になるようにした。いずれの溶液も室温で２４時間ほぼ安定であった。
なお、サルブタモールグルクロニド及びイソプレナリングルクロニドは、調製後３０分以内に使用した。この他，ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．１２０Ｋ７００１）、ｇａｌｌａｍｉｎｅ（ｇａｌｌａｍｉｎｅ  ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｉｄｅ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．７６Ｈ１１０６）、ペントバルビタールナトリウム（東京化成株式会社，Ｌｏｔ  Ｎｏ．ＧＩ０１）、百日咳ワクチン（和光純薬工業株式会社，Ｌｏｔ  Ｎｏ．ＳＥＫ７８８０）、および生理食塩液（株式会社大塚製薬工場，Ｌｏｔ  Ｎｏ．１Ｄ７８，１Ｅ８４）を使用した。
各試験群の構成を表１に示す。
2004000863.tif 000007
〈統計学的解析処理方法〉
得られた試験成績は、気道内圧について平均値および標準誤差で表示した。有意差検定は２群間の比較の場合は対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。多群の比較の場合はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｅｓｔを行った。いずれも有意水準は５％とした。気道抵抗の上昇に対する各被験物質の抑制率は、対照群の抑制率を０％とした時の対照群に対する抑制率として算出した。
２．結果
サルブタモール及びサルブタモールグルクロニドの抗原誘発型即時型喘息反応に対する影響を検討した結果を図４に示す。結果は、方法に記述したように、抗原であるｏｖａｌｂｕｍｉｎの投与前（ｐｒｅ）の気道内圧に対する増加率で表した。なお、図中のｐｒｅとは、ガラミンを投与し、自発張力を消失させ、安定した時点を指し、ｏｖａｌｂｕｍｉｎの投与開始約５−１０分前を意味するものである。ｏｖａｌｂｕｍｉｎの静脈内投与により抗原抗体反応が惹起された対照群のモルモットでは、抗原惹起の１分後には気道内圧は速やかに上昇し、３分後に最大約４４％の増加を示した。サルブタモールを０．０５％の濃度で吸入させた群では、抗原惹起の３分後に約３％の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して約９２％の有意な抑制を示した。一方、サルブタモールグルクロニドを０．０７２％の濃度で吸入させた群でも同様に、３分後に約２０％の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して５６％の有意な抑制を示した。
一方、イソプレナリン及びイソプレナリングルクロニドの抗原誘発型即時型喘息反応に対する影響を検討した結果を図５に示す。実験条件、結果の表わし方は、サルブタモールの場合と同様である。イソプレナリンを０．１％の濃度で吸入させた群では，抗原惹起の３分後に約１２％の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して約７３％の有意な抑制を示した。一方、イソプレナリングルクロニドを０．１５７％の濃度で吸入させた群でも同様に、３分後に約１０％の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して７７％の有意な抑制を示した。
以上のことから、サルブタモールグルクロニド及びイソプレナリングルクロニドは、吸入投与によりモルモットの即時型喘息反応を有意に抑制することができることを明らかにした。本結果と細気管支の上皮組織にβ−グルクロニダーゼ活性が強く存在する結果（図１）から、サルブタモールグルクロニド及びイソプレナリングルクロニドは、吸入投与により気道に入り、肺の細気管支周辺でβ−グルクロニダーゼにより加水分解され、活性体であるサルブタモール及びイソプレナリンに変換されて抗喘息作用を発揮したものと考えられる。
【実施例５】《β２作用薬グルクロニドの副作用に対する影響》
薬物としてβ２作用薬のイソプレナリンとサルブタモールを使用し、これらのβ２作用薬とそのグルクロニド（実施例１と実施例２）の心臓に対する影響を確認した。
１．試験方法
試験は、Ｃｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）ラットを用い、各群６匹にて実施した。
〈血圧及び心拍数の測定〉
手術は酸素，笑気及びイソフルランの混合ガスの麻酔下で行い、総頸動脈にヘパリン（１００Ｕ／ｍＬ）含有の生理食塩液を満たしたポリエチレン製チューブ（ＰＥ５０，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の一方を挿入して留置し、他方を背中の頸部あたりを通して曝露用チャンバーの上部に設置したカニューラシーベル（インステック社製）に接続した。このカニューラシーベルからポリエチレン製チューブを介して圧力トランスデューサー（Ｐ２３ＸＬ，Ｇｏｕｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）に接続する。なお、背中からカニューラシーベルに至るポリエチレン製チューブの周りは金属製スプリングの中を通して，動物による損傷を防止した。
薬物の投与は、曝露用チャンバーを作製し、チャンバー内で血圧測定用のカニューレを総頸動脈に留置した状態のラットに全身吸入曝露で行った。この方法は全身吸入曝露で汎用されているものである。
圧力トランスデューサー（Ｐ２３ＸＬ，Ｇｏｕｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）からの信号をプレッシャープロセッサーシグナルコンディショナー（Ｇｏｕｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）に導き，サーマルアレイレコーダー（ＲＳ３４００，Ｇｏｕｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）上に記録する。血圧及び心拍数は投与開始前から投与終了後２０分まで連続的に記録した。投与開始は，覚醒後１時間以上経過し，測定パラメータが安定してから実施した。
〈試験材料〉
被験物質は実施例３と同様に調製した。
各試験群の構成を表２に示す。
2004000863.tif 000008
〈統計学的解析処理方法〉
各群の代表値は，平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で表示した。各群の平均値は，Ｔｕｋｅｙの多重比較検定で有意差検定を行った。なお、有意水準は５％とした。
２．結果
サルブタモール及びサルブタモールグルクロニドの心臓機能、特に血圧／心拍数に対する影響を検討した結果を図６に示す。なお、図中のｐｒｅとは、薬物の吸入投与開始直前を意味するものである。  サルブタモール吸入投与直後から、血圧の低下及び心拍数の上昇が認められた。吸入終了後、５分後に７５ｍｍＨｇまでの血圧低下を示し、これは、吸入前（ｐｒｅ）の約２６％の低下であった。また、心拍数に関しても同様の傾向が認められ、５分後に最大約３６％の上昇を示した。経時的に測定した３０分間の中で最大の血圧低下率と心拍数増加率は、各々２７％と３９％であった。このように、サルブタモールの吸入が、血圧及び心拍数に顕著な影響を示すことが明らかとなった。これに対して、同様の試験をサルブタモールグルクロニドで実施した結果、対照群（生理食塩水の吸入）と同様に、全く影響が認められなかった。
一方、イソプレナリンもサルブタモールと同様に、吸入投与直後から血圧の低下及び心拍数の上昇が認められ、吸入終了後、５分後に７２ｍｍＨｇまでの血圧低下を示し、これは、処理前の約２７％の低下であった。また、心拍数に関しても同様の傾向が認められ、５分後に約４９％の上昇を示した（図７）。経時的に測定した３０分間の中で最大の血圧低下率と心拍数増加率は、各々２８％と５０％であった。このように、イソプレナリンの吸入が、血圧及び心拍数に顕著な影響を示すことが明らかとなった。これに対して、同様の試験をイソプレナリングルクロニドで実施した結果、対照群と同様に、全く影響が認められなかった。特にイソプレナリンは、β１作用を有し、心臓への副作用が強いことが知られている。本発明により、β２作用薬グルクロニドを用いることによってβ２作用薬の有する心臓への影響を完全になくすことが可能となることが示された。これらの結果から、サルブタモール及びイソプレナリンのグルクロニドは、サルブタモール及びイソプレナリンの血圧／心拍に対して影響を及ぼすという重篤な副作用を消失させることを明らかにした。
参考例１
β−アゴニストに属するサルブタモール、イソプレナリンを実施例として用いて本特許を説明したが、この概念が実施例に示す二つの化合物だけでなく、他の構造的に全く異なる化合物においても同様の傾向、即ち、グルクロン酸化された薬物が、標的組織において水解され活性を発現しうるという例を提示する。
１１−エチル−７，９−ジヒドロキシ−１０，１１−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］チエピンは、平滑筋を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの収縮抑制試験で効果を示す化合物である。ブタ気管平滑筋標本を高濃度ＫＣｌあるいは、カルバコールで誘発した平滑筋収縮をＩＣ５０＝５μＭ程度で抑制する。本化合物を経口投与した場合、１０ｍｇ／ｋｇで、即時型喘息モデルで気道収縮抑制作用を示した（実施例３と同一の実験系）。その後、本化合物の代謝に関する検討を開始したところ、本化合物は、経口投与後、吸収され、速やかにグルクロン酸抱合化を受けることが判明した。マウス、ラット、モルモット、イヌ、サルにおいて、投与後の血中分析の結果、いずれの動物種においても９９％以上がグルクロン酸抱合体であった。この結果から、抱合体に活性が存在する可能性を考慮して、Ｏ−グルクロニドを合成した。合成したＯ−グルクロニドは、先に述べたｉｎ  ｖｉｔｒｏの平滑筋を用いた収縮抑制試験で全く効果を示さなかった。一方、先に述べた、モルモットの感作モデルを用いてＯ−グルクロニドの効果を静脈内投与で確認したところ、気道収縮抑制作用を確認することができた。これは、静脈内に投与されたＯ−グルクロニドが、肺の組織に到達した後に、水解されて、未変化体に戻ったために、気道収縮抑制作用を示した結果であると推察される。
このように、β−アゴニストとは、全く異なる構造の化合物でも、同様の結果が認められたことは、グルクロン酸抱合化した化合物が、肺で効率的に水解され活性を発現する可能性を強く示している。
以下に「発明の開示」の欄で説明した図１、２、３について詳細を示す。
参考例２
《図１：肺におけるβ−グルクロニダーゼの局在》
肺及び心臓におけるβ−グルクロニダーゼの局在について酵素組織化学的な手法を用いて解析した。
１．試験方法
モルモット肺の組織標本を作成し、Ｆｉｓｈｍａｎらの方法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１２，２９８−３０５，１９６４）に基づいて、β−グルクロニダーゼに対する基質ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩ  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを用いて活性染色を実施した。摘出した肺を４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、クリオスタットにより４−６μｍの凍結切片を作成した。基質液は、ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩ  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ  ２８ｍｇを０．０５Ｍ重炭酸ソーダ１．２ｍＬに加えて溶解し、０．２Ｎ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を１００ｍＬまで加えて作成した。染色液は、４％亜硝酸ナトリウム液０．３ｍＬにパラロザリン液０．３ｍＬを加えて、ジアゾ化し、この液に基質液１０ｍＬを加えて、ｐＨを５．２に調整した後、蒸留水を加えて２０ｍＬにメスアップし、最後にろ紙でろ過して調整した。切片に染色液をのせて、３７℃、２時間反応させた。反応後、常法に従って、洗浄、脱水、封入した。
２．結果
肺の凍結切片を作製し、組織をβ−グルクロニダーゼ活性により活性染色した結果を図１に示す（倍率１００倍）。図１においてＡ〜Ｃは次の細胞を示す。
Ａ：肺の細気管支の上皮細胞
Ｂ：平滑筋細胞
Ｃ：肺胞マクロファージ
図１に示すように、肺の細気管支の上皮細胞（図中のＡで示した領域）と肺胞マクロファージ（図中のＣ）に強い陽性像が認められた（黒く染まってみえる部分がβ−グルクロニダーゼの活性を示す）。
肺胞マクロファージのβ−グルクロニダーゼ活性が高いこと（Ｈａｙａｓｈｉ、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１５，８３−９２，１９６７，Ｂａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．１，５０５−５１５，１９６９）は報告されているが、細気管支を構成する上皮細胞にβ−グルクロニダーゼが局在するという報告はなかった。β−グルクロニダーゼが、肺の細気管支という外部と接触する領域において特に強く発現していることが示された。
肺のβ−グルクロニダーゼ活性に最も大きく関与する細胞群は、炎症系の細胞ではなく、細気管支の上皮細胞である可能性が示唆された。
参考例３
《図２：各臓器中のβ−グルクロニダーゼ活性に関する検討》
各臓器中のβ−グルクロニダーゼ活性の程度と喘息モデル動物における本酵素活性の変動を調べる目的で、即時型喘息モデルとして確立されている感作モルモットを作成し、未感作モルモットとの各臓器の酵素活性を比較した。また、感作モルモットでは、抗原惹起した個体と惹起しない個体における酵素活性の比較も行った。
１．試験方法
〈感作〉
感作開始１および８日目、６週齢のＳｔｄ：Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモットにｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）５００μｇ／０．５ｍＬを両足に筋肉内投与、百日咳ワクチン１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ／匹を腹腔内投与することにより能動的に感作した。
〈抗原惹起〉
初回の感作後１９−２３日目に感作モルモットに２％ＯＶＡ溶液を５分間吸入させ、抗原惹起を誘導した。惹起後、４時間後に各臓器を回収した。
〈β−グルクロニダーゼ活性の測定〉
未感作モルモット群、感作モルモット群、感作モルモットの抗原惹起群の３群（各々２個体）から各臓器を摘出し、生理食塩を５０倍容量加えて、ホモジナイズし、１２０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃で冷遠心分離後の上清をサンプルとした。各サンプル中のβ−グルクロニダーゼ活性は、常法に従ってｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを基質として用い、遊離したｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを４０５ｎｍで比色定量する方法で測定した（Ｈａｅｂｅｒｌｉｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１０，１５５３−１５６２，１９９３）。各サンプル中の蛋白濃度は、市販キットを用いて測定した。β−グルクロニダーゼの比活性は、各臓器の場合には、蛋白１ｍｇあたり１分間に遊離する反応物質量として表した。各臓器の比活性は平均値で示した。
２．結果
未感作モルモット群、感作モルモット群、感作モルモットの抗原惹起群の３群の各臓器中のβ−グルクロニダーゼ活性を図２に示した。未感作モルモット群の各臓器のβ−グルクロニダーゼ活性は、肺（１５ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ）、肝臓（２０．７ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ）、脾臓（１４．２ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ）で高く、心臓（１．９ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ）、脳（２．６ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ）、筋肉（１．２ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ）で低い値を示した。この結果は、これまで報告されているラットやマウス等の各臓器における酵素活性の報告と同様の傾向であった（Ｃｏｎｃｈｉｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７１，３１８−３２５，１９５９，Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４，８９１−９０９，１９８６，Ｈｏｏｇｅｒｂｒｕｇｇｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４３，６０９−６１４，１９８７）。
一方、感作モルモット群においては、未感作モルモット群の酵素活性と比較して各臓器の酵素活性に差が認められなかった。この結果は、感作状態においては、未感作の場合と各臓器中の酵素活性には影響がないことを示唆する。さらに、抗原惹起した感作モルモット群においても各臓器の酵素活性は未感作モルモット群、抗原惹起しない感作モルモット群と比較して顕著な差が認められなかった。
これらの結果から、肺は、β−グルクロニダーゼ活性が非常に高い組織であり、肺組織中のβ−グルクロニダーゼは、抗原感作による喘息モデルにおいて上昇しないことを確認した。
参考例４
《図３：心臓におけるβ−グルクロニダーゼの局在》
１．試験方法
試験方法は、《図１：肺におけるβ−グルクロニダーゼの局在》で記述したものと同様である。ただし、対比染色としてヘマトキシリンによる細胞核の染色を行った。
２．結果
心臓の凍結切片を作製し、組織をβ−グルクロニダーゼ活性により活性染色した結果を図３に示す（倍率５０倍）。図３において矢印は、ヘマトキシリン染色された細胞の核を示す。図３に示すように、モルモット心臓切片において、β−グルクロニダーゼ活性を示す陽性像は認められなかった。
【産業上の利用の可能性】
薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素活性を利用して、非標的器官に対する薬物の副作用を低減させることのできるプロドラッグを提供することができる。心臓に対する副作用が発現しないβ２作用薬の提供を可能にした。さらに、本発明は、従来β作用薬の使用が制限されている心臓疾患を有する患者に対してもβ作用薬を安心して使用することを可能にした。
【図１】
2004000863.tif 000009
【図２】
2004000863.tif 000010
【図３】
2004000863.tif 000011
【図４】
2004000863.tif 000012
【図５】
2004000863.tif 000013
【図６】
2004000863.tif 000014
【図７】
2004000863.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月19日(2004.4.19)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する器官が標的部位である薬物の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することにより該薬物の副作用を軽減するプロドラッグ。
【請求項２】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項１記載のプロドラッグ。
【請求項３】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項１記載のプロドラッグ。
【請求項４】置換基がグルクロニル基である請求項３記載のプロドラッグ。
【請求項５】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項４記載のプロドラッグ。
【請求項６】薬物がフェノール性水酸基を有する薬物である請求項１ないし５いずれか記載のプロドラッグ。
【請求項７】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する呼吸器官が標的部位である呼吸器官用剤の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することにより該呼吸器官用剤の副作用を軽減するプロドラッグ。
【請求項８】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項９】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１０】置換基がグルクロニル基である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１１】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項１０記載のプロドラッグ。
【請求項１２】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１３】副作用発現部位が心血管系である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１４】請求項７記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項１５】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項１４記載の吸入用医薬組成物。
【請求項１６】β２作用薬の標的部位である呼吸器官と副作用発現部位である心血管系に注目し、呼吸器官に存在する酵素であって、その酵素活性が正常時から標的部位では高く、心血管系では低い関係にあるβ−グルクロニダーゼを選択し、β−グルクロニダーゼで切断される官能基をβ２作用薬に結合することにより呼吸器官用剤であるβ２作用薬の副作用を軽減したプロドラッグ。
【請求項１７】β２作用薬がその構造に水酸基を有するβ２作用薬である請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項１８】薬物がサルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリンのいずれかである請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項１９】置換基がグルクロニル基である請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項２０】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項１９記載のプロドラッグ。
【請求項２１】グルクロニル基がスペーサーを介在しないで薬物と結合している請求項１９記載のプロドラッグ。
【請求項２２】請求項１６記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２３】請求項１７記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２４】請求項１８記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２５】請求項２１記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２６】（削除）
【請求項２７】（削除）
【請求項２８】（削除）
【請求項２９】（削除）
【請求項３０】アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランのいずれかの溶剤中、塩基の共存下、水酸基を有するβ２作用薬および糖ハロゲン化物誘導体を反応させ、これをアルカリ加水分解により脱保護する、糖を置換基として持つ請求項１７のβ２作用薬のプロドラッグの製造方法。
【請求項３１】塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのいずれかである請求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】複数の水酸基を有するβ２作用薬と塩基を含む混合物にハロゲン化ベンジル誘導体を添加し、選択的に水酸基を保護したのちグリコシル化し、この中間体をアルカリ加水分解後、水素添加する、糖を置換基として持つβ２作用薬のプロドラッグの製造方法。
【請求項３３】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する器官が標的部位である薬物の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することによりプロドラッグとし、該薬物の副作用を軽減する方法。
【請求項３４】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項３３記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３５】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項３３記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３６】置換基がグルクロニル基である請求項３５記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３７】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項３６記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３８】薬物がフェノール性水酸基を有する薬物である請求項３３ないし５いずれか記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３９】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する呼吸器官が標的部位である呼吸器官用剤の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することによりプロドラッグとし、該呼吸器官用剤の副作用を軽減する方法。
【請求項４０】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４１】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４２】置換基がグルクロニル基である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４３】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項４２記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４４】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４５】副作用発現部位が心血管系である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４６】請求項３９記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物として吸入投与させることにより該薬物の副作用を軽減する方法。
【請求項４７】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項４６記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４８】β２作用薬の標的部位である呼吸器官と副作用発現部位である心血管系に注目し、呼吸器官に存在する酵素であって、その酵素活性が正常時から標的部位では高く、心血管系では低い関係にあるβ−グルクロニダーゼを選択し、β−グルクロニダーゼで切断される官能基をβ２作用薬に結合することによリプロドラッグとし、該β２作用薬の副作用を軽減する方法。
【請求項４９】β２作用薬がその構造に水酸基を有するβ２作用薬である請求項４８記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５０】薬物がサルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリンのいずれかである請求項４８記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５１】置換基がグルクロニル基である請求項４８記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５２】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項５１記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５３】請求項４８記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物として吸入投与することにより該薬物の副作用を軽減する方法。




【手続補正書】
【提出日】平成16年7月9日(2004.7.9)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する器官が標的部位である薬物の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することにより該薬物の副作用を軽減するプロドラッグ。
【請求項２】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項１記載のプロドラッグ。
【請求項３】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項１記載のプロドラッグ。
【請求項４】置換基がグルクロニル基である請求項３記載のプロドラッグ。
【請求項５】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項４記載のプロドラッグ。
【請求項６】薬物がフェノール性水酸基を有する薬物である請求項１ないし５いずれか記載のプロドラッグ。
【請求項７】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する呼吸器官が標的部位である呼吸器官用剤の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することにより該呼吸器官用剤の副作用を軽減するプロドラッグ。
【請求項８】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項９】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１０】置換基がグルクロニル基である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１１】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項１０記載のプロドラッグ。
【請求項１２】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１３】副作用発現部位が心血管系である請求項７記載のプロドラッグ。
【請求項１４】請求項７記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項１５】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項１４記載の吸入用医薬組成物。
【請求項１６】β２作用薬の標的部位である呼吸器官と副作用発現部位である心血管系に注目し、呼吸器官に存在する酵素であって、その酵素活性が正常時から標的部位では高く、心血管系では低い関係にあるβ−グルクロニダーゼを選択し、β−グルクロニダーゼで切断される官能基をβ２作用薬に結合することにより呼吸器官用剤であるβ２作用薬の副作用を軽減したプロドラッグ。
【請求項１７】β２作用薬がその構造に水酸基を有するβ２作用薬である請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項１８】薬物がサルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシブレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリンのいずれかである請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項１９】置換基がグルクロニル基である請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項２０】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項１９記載のプロドラッグ。
【請求項２１】グルクロニル基がスペーサーを介在しないで薬物と結合している請求項１９記載のプロドラッグ。
【請求項２２】請求項１６記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２３】請求項１７記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２４】請求項１８記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２５】請求項２１記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。
【請求項２６】（削除）
【請求項２７】（削除）
【請求項２８】（削除）
【請求項２９】（削除）
【請求項３０】アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランのいずれかの溶剤中、塩基の共存下、水酸基を有するβ２作用薬および糖ハロゲン化物誘導体を反応させ、これをアルカリ加水分解により脱保護する、糖を置換基として持つ請求項１７のβ２作用薬のプロドラッグの製造方法。
【請求項３１】塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのいずれかである請求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】複数の水酸基を有するβ２作用薬と塩基を含む混合物にハロゲン化ベンジル誘導体を添加し、選択的に水酸基を保護したのちグリコシル化し、この中間体をアルカリ加水分解後、水素添加する、糖を置換基として持つβ２作用薬のプロドラッグの製造方法。
【請求項３３】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する器官が標的部位である薬物の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することによりプロドラッグとし、該薬物の副作用を軽減する方法。
【請求項３４】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項３３記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３５】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項３３記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３６】置換基がグルクロニル基である請求項３５記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３７】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項３６記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３８】薬物がフェノール性水酸基を有する薬物である請求項３３ないし５いずれか記載の副作用を軽減する方法。
【請求項３９】グリコシダーゼが正常時から高濃度で局在化している上皮細胞を有する呼吸器官が標的部位である呼吸器官用剤の副作用部位に着目し、該副作用部位の正常時におけるグリコシダーゼ活性が低い場合に、グリコシダーゼで切断される官能基を該薬物に結合することによりプロドラッグとし、該呼吸器官用剤の副作用を軽減する方法。
【請求項４０】置換基が単糖またはオリゴ糖のグリコシル基である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４１】グリコシダーゼがβ−グルクロニダーゼである請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４２】置換基がグルクロニル基である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４３】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項４２記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４４】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４５】副作用発現部位が心血管系である請求項３９記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４６】請求項３９記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物として吸入投与させることにより該薬物の副作用を軽減する方法。
【請求項４７】薬物がフェノール性水酸基を有する呼吸器官用剤である請求項４６記載の副作用を軽減する方法。
【請求項４８】β２作用薬の標的部位である呼吸器官と副作用発現部位である心血管系に注目し、呼吸器官に存在する酵素であって、その酵素活性が正常時から標的部位では高く、心血管系では低い関係にあるβ−グルクロニダーゼを選択し、β−グルクロニダーゼで切断される官能基をβ２作用薬に結合することによりプロドラッグとし、該β２作用薬の副作用を軽減する方法。
【請求項４９】β２作用薬がその構造に水酸基を有するβ２作用薬である請求項４８記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５０】薬物がサルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、フェノテロール、ツロブテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシブレナリン、メトキシフェナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソブレナリンのいずれかである請求項４８記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５１】置換基がグルクロニル基である請求項４８記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５２】グルクロニル基と薬物の結合がβ結合である請求項５１記載の副作用を軽減する方法。
【請求項５３】請求項４８記載のプロドラッグの有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物として吸入投与することにより該薬物の副作用を軽減する方法。
【請求項５４】β２作用薬がその構造に水酸基を有するβ２作用薬であり、その水酸基にグルクロニル基が結合されたＯ−グルクロナイドである請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項５５】β２作用薬がその構造にフェノール性水酸基を有するβ２作用薬である請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項５６】β２作用薬がその構造にフェノール性水酸基を有するβ２作用薬であり、そのフェノール性水酸基にグルクロニル基が結合されたＯ−グルクロナイドである請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項５７】プロドラッグが、３−０−（β−Ｄ−グルクロニル）サルブタモール、３−０−（β−Ｄ−グルクロニル）サルメテロール、３−０−（β−Ｄ−グルクロニル）ピルブテロール、３−０−（β−Ｄ−グルクロニル）フェノテロール、３−０−（β−Ｄ−グルクロニル）ツロブテロール、４−０−（β−Ｄ−グルクロニル）フォルモテロール、３  ｏｒ  ４−０−（β−Ｄ−グルクロニル）ヘキソプレンリン、３−０−（β−Ｄ−グルクロニル）テルブタリン、６  ｏｒ  ７−０−（β−Ｄ−グルクロニル）トリメトキノール、３−０−（β−Ｄ−グルクロニル）オルシプレナリン、３  ｏｒ  ４−０−（β−Ｄ−グルクロニル）イソプレナリン、８−０−（β−Ｄ−グルクロニル）プロカテロールのいずれかである請求項１６記載のプロドラッグ。
【請求項５８】請求項５７記載のプロドラッグの１種または２種以上の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および／または他の活性化合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。




【国際調査報告】
2004000863.tif 000016
2004000863.tif 000017
2004000863.tif 000018
2004000863.tif 000019
2004000863.tif 000020
2004000863.tif 000021
2004000863.tif 000022
2004000863.tif 000023