(57)【要約】重鎖および軽鎖の、少なくとも定常領域がヒト由来のものに変換された抗体であって、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する組換え抗オステオポンチン抗体が開示されている。この抗体は、自己免疫疾患治療剤、リウマチ治療剤ないしリウマチ性関節炎の治療剤として有用なものであり、自己免疫疾患、リウマチないしはリウマチ性関節炎を治療する方法を提供する。また、このオステオポンチン抗体は、リウマチの診断薬および診断方法にも有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体または当該抗体に起因する抗体断片。
【請求項２】
部分アミノ酸配列としてＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳを含むペプチドを抗原として得られたものである請求項第１項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項３】
ペプチドＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳを抗原として得られたものである請求項第１項または第２項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である請求項第１項ないし請求項第３項の何れかに記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項５】
キメラ抗体である請求項第１項ないし請求項第３項の何れかに記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項６】
下記の重鎖（ａ）および軽鎖（ｂ）を有する請求項第５項記載の抗オステオポンチン抗体。
（ａ）マウス由来の重鎖可変領域およびヒト由来の重鎖定常領域を有する重鎖
（ｂ）マウス由来の軽鎖可変領域およびヒト由来の軽鎖定常領域を有する軽鎖
【請求項７】
重鎖（ａ）のマウス由来の重鎖可変領域が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項第５項または第６項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項８】
軽鎖（ｂ）のマウス由来の軽鎖可変領域が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項第５項または第６項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項９】
重鎖（ａ）の重鎖定常領域が、ヒトＩｇγ１である請求項第５項または第６項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１０】
軽鎖（ｂ）の軽鎖定常領域が、ヒトＩｇκである請求項第５項または第６項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１１】
ヒト化抗体である請求項第１項ないし請求項第３項の何れかに記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１２】
下記の重鎖（ｃ）および軽鎖（ｄ）を有する請求項第１１項記載の抗オステオポンチン抗体。
（ｃ）マウス由来の重鎖可変領域の相補性決定領域およびヒト由来の重鎖可変領域のフレームワーク領域を有する重鎖可変領域ならびにヒト由来の重鎖定常領域を有する重鎖
（ｄ）マウス由来の軽鎖可変領域の相補性決定領域およびヒト由来の軽鎖可変領域のフレームワーク領域を有する軽鎖可変領域ならびにヒト由来の軽鎖定常領域を有する軽鎖
【請求項１３】
重鎖（ｃ）のマウス由来の重鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号２１〜２３に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項第１１項または第１２項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１４】
軽鎖（ｄ）のマウス由来の軽鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号２４〜２６に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項第１１項または第１２項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１５】
重鎖（ｃ）の重鎖可変領域が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項第１１項または第１２項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１６】
軽鎖（ｄ）の軽鎖可変領域が、配列番号３０に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項第１１項または第１２項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１７】
重鎖（ｃ）の重鎖定常領域が、ヒトＩｇγ１である請求項第１１項または第１２項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１８】
軽鎖（ｄ）の軽鎖定常領域が、ヒトＩｇκである請求項第１１項または第１２項記載の抗オステオポンチン抗体。
【請求項１９】
配列番号１９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項２０】
配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項２１】
配列番号２８に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項２２】
配列番号３０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項２３】
請求項第１９項に記載の塩基配列とヒトＩｇγ１遺伝子とを有するベクター。
【請求項２４】
請求項第２０項に記載の塩基配列とヒトＩｇκ遺伝子とを有するベクター。
【請求項２５】
請求項第２１項に記載の塩基配列とヒトＩｇγ１遺伝子とを有するベクター。
【請求項２６】
請求項第２２項に記載の塩基配列とヒトＩｇκ遺伝子とを有するベクター。
【請求項２７】
請求項第２３項および請求項第２４項に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２８】
請求項第２５項および請求項第２６項に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２９】
請求項第５項または第６項記載の抗オステオポンチンキメラ抗体の製造方法であって、請求項第２７項記載の宿主細胞を培養し、培養液から抗オステオポンチンキメラ抗体を採取することを特徴とする抗オステオポンチンキメラ抗体の製造方法。
【請求項３０】
請求項第１１項または第１２項に記載の抗オステオポンチンヒト化抗体の製造方法であって、請求項第２８項記載の宿主細胞を培養し、培養液から抗オステオポンチンヒト化抗体を採取することを特徴とする抗オステオポンチンヒト化抗体の製造方法。
【請求項３１】
請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含む自己免疫疾患治療剤。
【請求項３２】
請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含むリウマチ治療剤。
【請求項３３】
請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含むリウマチ性関節炎の治療剤。
【請求項３４】
請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含む変形性関節症の治療剤。
【請求項３５】
自己免疫疾患患者に、請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
【請求項３６】
リウマチ患者に、請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とするリウマチ性関節炎の治療方法。
【請求項３７】
リウマチ性関節炎患者に、請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とするリウマチの治療方法。
【請求項３８】
変形性関節症患者に、請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とする変形性関節症の治療方法。
【請求項３９】
自己免疫疾患治療剤製造のための請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
【請求項４０】
リウマチ治療剤製造のための請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
【請求項４１】
リウマチ性関節炎の治療剤製造のための請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
【請求項４２】
変形性関節症の治療剤製造のための請求項第１項ないし第６項または第１１項もしくは第１２項の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
【請求項４３】
被検化合物の、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合の阻害程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４４】
被検化合物の、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合の阻害程度を評価することを特徴とするリウマチ治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４５】
被検化合物の、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合の阻害程度を評価することを特徴とするリウマチ性関節炎治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、組換え抗オステオポンチン抗体および該抗体を用いた自己免疫疾患、リウマチおよびリウマチ性関節炎の治療方法に関する。
背景技術
オステオポンチン（以下、「ＯＰＮ」という）は、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖蛋白質であり、ヒトの場合、ｍＲＮＡのスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）の違いから、オステオポンチン−ａ（以下、「ＯＰＮ−ａ」という）、オステオポンチン−ｂ（以下、「ＯＰＮ−ｂ」という）およびオステオポンチン−ｃ（以下、「ＯＰＮ−ｃ」という）の少なくとも３つのアイソフォームが生じ得ることが知られている。（Ｙ．Ｓａｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７２，５５−６３）このうち、ＯＰＮ−ａの前駆体は、後記配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を持ち、分泌により、シグナルペプチドが切断され、Ｉ１７−Ｎ３１４の成熟体ＯＰＮ−ａがつくられると考えられている。また、成熟体ＯＰＮは、生体内のトロンビンにより１６８番目のアルギニン残基のＣ末端側で切断されて、Ｎ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントの２つになる。
上記のＯＰＮは、多種の生理学的病理学的に重要な機能を担っており、例えば、細胞接着、細胞遊走、腫瘍形成、免疫応答および補体が媒介する細胞溶解の阻害等の機能を持っている。この多様な機能は、多種の細胞表面受容体により媒介されている。ＯＰＮは、内部にＲＧＤ配列をもち（例えば、ＯＰＮ−ａでは、１５９〜１６１残基目）、このＲＧＤ配列を認識するαＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５等のインテグリンは、ＯＰＮの主な受容体であり、このうち、αＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５インテグリンは、血管の平滑筋細胞において細胞接着を媒介し、更にαＶβ３は、マクロファージ、リンパ球、内皮細胞および平滑筋細胞等の遊走に関係している。
さらに、これまでの研究から、ＯＰＮは、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を介してα９β１、α４β１およびα４β７インテグリンと結合することも明らかにされているが、これらのうちα４β１は、トロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１はトロンビン切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている（Ｙ．Ｙｏｋｏｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４，３６３２８−３６３３４／Ｐ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５０３，７５−７９／Ｓ．Ｔ．Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５８，３４２−３５１）。これらのα９及びα４、β１及びβ７のインテグリンサブユニットは、相互にアミノ酸配列間の類似性が高い。そして、α４β１及びα４β７インテグリンは、主として、リンパ球と単球で見出されるが、好中球ではごくわずかに発現しているにすぎない。一方、α９β１は、好中球に選択的に高発現しておりＶＣＡＭ−１やＴｅｎａｓｃｉｎ−Ｃなどを介して、好中球遊走に必須の機能を担っている。また、筋肉細胞や上皮細胞、肝細胞などで広く発現している。このように、インテグリンサブユニットα４とα９の細胞質ドメインは、それぞれ微妙に異なった細胞内シグナル伝達経路を通して、互いに協同して炎症部位への白血球の遊走と凝集を促し、それらの浸潤活性を増強することによって、様々な炎症反応に関与していると考えられる。
このように、様々な種類のインテグリンが、白血球の遊走を促進し、炎症反応に関与していることから、これらのインテグリン活性を阻害する薬剤は、潜在的には抗炎症剤としての可能性を有していると思われる。たとえば、インテグリンαＶβ３は、破骨細胞、血管内皮細胞および平滑筋細胞等で発現されており、αＶβ３インテグリンとその様々な結合リガンドとの結合を阻害することにより、例えば関節では、関節破壊抑制作用が期待できることから、抗αＶβ３抗体の開発が実際に行われている。
しかしながら、インテグリンファミリーに属する受容体は、広範な組織で普遍的に発現して生命活動維持に必須の機能を担っていることから、リウマチ性関節炎や変形性関節炎の治療にインテグリンに対する抗体を用いると、他の部位でも同様の阻害がおこる可能性があり、副作用の発生も懸念される。
また、ＷＯ０１／７１３５８にはα４インテグリンとオステオポンチンとの結合を阻害する物質のスクリーニング方法およびスクリーニングで得られた物質を用いた炎症疾患の治療方法等について開示されている。
リウマチ性関節炎の病因としては種々の因子が考えられており、多くの報告があるが確実なものはない。また、その治療法においても、現在知られているものは対症療法的なものであり、必ずしも満足できるものではなかった。
従って、リウマチ性関節炎の病因を明確にし、より優れた治療法を提供することが強く求められており、本発明はこのような課題の解決をその目的とするものである。
また、リウマチ性関節炎は、変形性関節症などと判別し難く、このための診断方法の提供も本発明の課題の一つである。
本発明者らは、リウマチ患者および変形性関節症患者で、関節腔液のＯＰＮ濃度が高値を示すことを知り、さらにリウマチ患者において、全ＯＰＮに占めるトロンビン開裂型のＮ末端フラグメントの割合が増大することを初めて見出し、ＯＰＮが、これらの疾患の発症に深く関わっていることに思い至った。そして、ＯＰＮのノックアウトマウスを用いた実験によりこの事実を確認した。
また、ＯＰＮをトロンビンで切断したＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントについて、それぞれのフラグメントを区別して認識する抗体を作成し、それらを用いた試験により、リウマチ性関節炎患者では、特にトロンビンにより切断されたＮ末端フラグメントが関節腔内で高濃度を示すことを見出した。
更に本発明者らは、前述のリウマチ性関節炎患者に高い濃度で見出されるＮ末端フラグメントには、ヒト型インテグリンが認識するＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列が共に存在していることに着目し、これら両者の配列を同時にブロックする抗体は、ＯＰＮとインテグリンの結合を幅広く阻害し、リウマチ性関節炎や変形性関節炎の治療に効果があるのではないかと予想した。
上記ＯＰＮは、腎臓・胎盤・卵巣・脳・皮膚などにも分布するが、主として骨組織に発現している。本発明者らは、リウマチ性関節炎の治療に際して、ＯＰＮとインテグリンの結合をＯＰＮ側により特異的な方法で遮断することが望ましいと考えた。その際、炎症には前述の多岐に渡るインテグリンが協同的に関与していると考えられるので、これらの多岐に渡るインテグリンとの結合が、より幅広く遮断されることが有効であると考えた。
そこで、ヒトＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する抗体を作成し、細胞接着および細胞遊走等の実験によりその効果を確認した。さらに、マウスＯＰＮの当該内部配列に対応する合成ペプチドに対する抗体を取得し、マウスの関節炎病態モデルを用いて、そのような抗体の治療薬としての効果を調べた。
すなわち、マウスＯＰＮは、ヒトＯＰＮとアミノ酸配列上で相同な位置にマウスのインテグリンによって認識されるＲＧＤ配列及びＳＬＡＹＧＬＲ配列を有しているので、これらの配列を同時にブロックする抗体として、Ｍ５抗体を取得した。このＭ５抗体とマウスＯＰＮおよびそのトロンビン消化物との結合は、ＲＧＤ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチドで阻害され、またこのＭ５抗体は、ＴＮＦ−αで活性化したマウス脾臓由来の単球の遊走を阻害することが確認された。このＭ５抗体を、マウスのカルバリア（ｃａｌｖａｒｉａ）器官培養系で調べてみたところ、骨破壊の抑制作用が観察された。さらに、マウスのコラーゲン関節炎モデルに、上記抗体を投与してみたところ、明らかに治療効果を示すことが確認された。
以上の結果は、ＲＧＤ配列、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とヒト型インテグリンの結合を同時にブロックする抗体が、ＯＰＮとインテグリンの結合を阻害し、リウマチ性関節炎等の治療に有効であることを強く示唆しており、さらに、若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチのみならず、乾癬性関節炎や乾癬の治療への効果が期待されることを示している。また、臓器移植後の慢性拒絶は、血管や気管支の閉塞性病変を特徴としているが、その組織学的検討から、Ｔ細胞やマクロファージの活性化がサイトカイン、増殖因子の産生、血管内皮細胞障害を引き起こし、さらに血管平滑筋の増殖が線維化などを引き起こすために血管閉塞へ進展して行くと考えられている（Ｐ．Ｆｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）：Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１６，２４０１−２４０６／Ｊ．Ｒ．Ｗａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）：Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８，１４２９−１４４１／Ｓ．Ｒ．Ｌｅｈｔｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７２，１１３８−１１４４）。そして、これらのマクロファージの活性化や血管平滑筋の線維化にはＯＰＮが必須の蛋白として機能することが報告されており（Ａ．Ｏ’Ｒｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）：Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ，８１，３７３−３９０）、本発明のＯＰＮ阻害抗体は、単球や好中球の遊走を抑制することにより、このような線維化に向けての過程を抑制する可能性がある。従って、臓器移植後の慢性拒絶反応を抑制し、臓器生着に寄与し、また、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ぶとう膜炎、ベーチェト病、多発性筋炎、糸状体増殖性腎炎、サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療への効果が期待される。
以上の知見に基づき、本出願人らは、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体を見出し、これについて国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ０２／０３３８２）を行った。
発明の開示
上記抗オステオポンチン抗体は、マウス由来の抗体（以下、「マウス抗体」という）であるが、ヒトのオステオポンチンに対して強い親和性を有することにより、オステオポンチンが持つ末梢血単核球あるいは好中球に対する遊走活性を阻害することができる。これによりこのマウス抗体はヒトのリウマチを始めとする種々の炎症性疾患治療薬としての適用が期待されるが、マウス抗体はマウス由来のものであるため、抗原性の惹起等の安全性および半減期の短縮等の有効性の観点から、ヒトに投与することは現実的には難しいものであった。
そこで本発明者らは、マウス抗体の活性を低下させないまま、遺伝子工学的手法を用いて上記マウス抗体の改変を行ない、より抗原性の問題の少ないオステオポンチンに対する抗体を得るに到った。
すなわち、本発明は以下に記載の［１．］〜［４５．］の発明を提供するものである。
［１．］  ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体または当該抗体に起因する抗体断片。
［２．］  部分アミノ酸配列としてＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳを含むペプチドを抗原として得られたものである［１．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［３．］  ペプチドＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳを抗原として得られたものである［１．］または［２．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［４．］  モノクローナル抗体である［１．］ないし［３．］の何れかに記載の抗オステオポンチン抗体。
［５．］  キメラ抗体である［１．］ないし［３．］の何れかに記載の抗オステオポンチン抗体。
［６．］  下記の重鎖（ａ）および軽鎖（ｂ）を有する［５．］記載の抗オステオポンチン抗体。
（ａ）マウス由来の重鎖可変領域およびヒト由来の重鎖定常領域を有する重鎖
（ｂ）マウス由来の軽鎖可変領域およびヒト由来の軽鎖定常領域を有する軽鎖
［７．］  重鎖（ａ）のマウス由来の重鎖可変領域が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする［５．］または［６．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［８．］  軽鎖（ｂ）のマウス由来の軽鎖可変領域が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする［５．］または［６．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［９．］  重鎖（ａ）の重鎖定常領域が、ヒトＩｇγ１である［５．］または［６．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１０．］  軽鎖（ｂ）の軽鎖定常領域が、ヒトＩｇκである［５．］または［６．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１１．］  ヒト化抗体である［１．］ないし［３．］の何れかに記載の抗オステオポンチン抗体。
［１２．］  下記の重鎖（ｃ）および軽鎖（ｄ）を有する［１１．］記載の抗オステオポンチン抗体。
（ｃ）マウス由来の重鎖可変領域の相補性決定領域およびヒト由来の重鎖可変領域のフレームワーク領域を有する重鎖可変領域ならびにヒト由来の重鎖定常領域を有する重鎖
（ｄ）マウス由来の軽鎖可変領域の相補性決定領域およびヒト由来の軽鎖可変領域のフレームワーク領域を有する軽鎖可変領域ならびにヒト由来の軽鎖定常領域を有する軽鎖
［１３．］  重鎖（ｃ）のマウス由来の重鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号２１〜２３に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする［１１．］または［１２．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１３．］  軽鎖（ｄ）のマウス由来の軽鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号２４〜２６に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする［１１．］または［１２．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１５．］  重鎖（ｃ）の重鎖可変領域が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする［１１．］または［１２．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１６．］  軽鎖（ｄ）の軽鎖可変領域が、配列番号３０に記載のアミノ酸配列であることを特徴とする［１１．］または［１２．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１７．］  重鎖（ｃ）の重鎖定常領域が、ヒトＩｇγ１である［１１．］または［１２．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１８．］  軽鎖（ｄ）の軽鎖定常領域が、ヒトＩｇκである［１１．］または［１２．］記載の抗オステオポンチン抗体。
［１９．］  配列番号１９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
［２０．］  配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
［２１．］  配列番号２８に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
［２２．］  配列番号３０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
［２３．］  ［１９．］に記載の塩基配列とヒトＩｇγ１遺伝子とを有するベクター。
［２４．］  ［２０．］に記載の塩基配列とヒトＩｇκ遺伝子とを有するベクター。
［２５．］  ［２１．］に記載の塩基配列とヒトＩｇγ１遺伝子とを有するベクター。
［２６．］  ［２２．］に記載の塩基配列とヒトＩｇκ遺伝子とを有するベクター。
［２７．］  ［２３．］および［２４．］に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
［２８．］  ［２５．］および［２６．］に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
［２９．］  ［５．］または［６．］記載の抗オステオポンチンキメラ抗体の製造方法であって、［２７．］記載の宿主細胞を培養し、培養液から抗オステオポンチンキメラ抗体を採取することを特徴とする抗オステオポンチンキメラ抗体の製造方法。
［３０．］  ［１１．］または［１２．］記載の抗オステオポンチンヒト化抗体の製造方法であって、［２８．］記載の宿主細胞を培養し、培養液から抗オステオポンチンヒト化抗体を採取することを特徴とする抗オステオポンチンヒト化抗体の製造方法。
［３１．］  ［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含む自己免疫疾患治療剤。
［３２．］  ［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含むリウマチ治療剤。
［３３．］  ［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含むリウマチ性関節炎の治療剤。
［３４．］  ［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を有効成分として含む変形性関節症の治療剤。
［３５．］  自己免疫疾患患者に、［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
［３６．］  リウマチ患者に、［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とするリウマチ性関節炎の治療方法。
［３７．］  リウマチ性関節炎患者に、［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とするリウマチの治療方法。
［３８．］  変形性関節症患者に、［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片を投与することを特徴とする変形性関節症の治療方法。
［３９．］  自己免疫疾患治療剤製造のための［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
［４０．］  リウマチ治療剤製造のための［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
［４１．］  リウマチ性関節炎の治療剤製造のための［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
［４２．］  変形性関節症の治療剤製造のための［１．］ないし［６．］または［１１．］もしくは［１２．］の何れかに記載の抗体または当該抗体に起因する抗体断片の使用。
［４３．］  被検化合物の、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合の阻害程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法。
［４４．］  被検化合物の、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合の阻害程度を評価することを特徴とするリウマチ治療剤のスクリーニング方法。
［４５．］  被検化合物の、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合の阻害程度を評価することを特徴とするリウマチ性関節炎治療剤のスクリーニング方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明の抗オステオポンチンキメラ抗体および抗オステオポンチンヒト化抗体は、例えば、国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ０２／０３３８２）に記載の、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチンマウス抗体（以下、「ＯＰＮ阻害抗体」という）について、その定常領域を治療対象とするヒトあるいは動物の抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変してキメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）としたり、ヒト化抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０２３９４００またはＥＰ０４５１２６参照）とすることにより得られる。
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなるＬ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ，κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖および２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）および非共有結合によって結び合わされており、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ，ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域（Ｖ領域、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ、可変部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＶＨおよびＶＬと表される。）。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で、定常領域（Ｃ領域、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ、定常部）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される。）。
抗体の抗原決定部位はＶＨおよびＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇのＣ部位の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）にほぼ限られることがわかつており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ、ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）とよばれ、比較的一定である。通常、各可変領域の相補性決定領域の５〜１０個のアミノ酸だけが抗原結合部位を形成している。
抗原と反応する可変領域についてはマウス型を利用し、それ以外の部分をヒト型にしたタンパク質はキメラ抗体とよばれている。ここでは、さらに、オステオポンチンおよびその断片を認識するキメラ抗体を抗オステオポンチンキメラ抗体とよんでいる。さらに、抗原特異的なマウスモノクローナル抗体分子の相補性決定領域（抗原結合部位）以外をすべてヒト免疫グロブリン分子のアミノ酸に置き換えた遺伝子組換えタンパク質はヒト化抗体とよばれている。ここでは、さらに、オステオポンチンおよびその断片を認識するヒト化抗体を抗オステオポンチンヒト化抗体とよんでいる。
本発明の抗オステオポンチンキメラ抗体および抗オステオポンチンヒト化抗体作製のために用いられるＯＰＮ阻害抗体は、ＲＧＤ配列を認識するインテグリン、例えばαｖβ１，αｖβ３，αｖβ５等とＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ，ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリン、例えばα９β１，α４β１、α４β７等とＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ，ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害できるものであればどのような抗体でもよい。ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列とは、ヒトＯＰＮの１６２番目のセリンから１６８番目のアルギニンまでの配列を指し、その相当配列とは、他の哺乳動物のＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲに相当する配列を言い、例えばブタではヒトと同じくＳＶＶＹＧＬＲ、サルではＳＶＡＹＧＬＲ、マウスやラットではＳＬＡＹＧＬＲ、ウシではＳＶＡＹＧＬＫ、ウサギではＳＶＡＹＲＬＫである。
このＯＰＮ阻害抗体は、上記のような性質を保持する抗体であれば、その製法は特に限定されず、例えばＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃや、これらのＮ末端フラグメント、あるいはアミノ酸配列ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を含んでいるペプチド（以下、これらを「ＯＰＮ関連ペプチド」と総称する）を抗原として用いることにより作製できる。なお、ここでいうＯＰＮのフラグメントとは、ＯＰＮがタンパク質分解酵素等により分解されたフラグメントをいい、例えばトロンビンにより分解されたフラグメントをいう。
上記ＯＰＮ阻害抗体は、好ましくは、ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。より好ましくは、例えばこの両配列を連続して有するＯＰＮ−ａの１５３番目バリン残基から１６９番目セリン残基までのペプチド（ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ）を抗原として用い、以下常法に従って処理することによって得ることができる。抗原性を高めるためには、上記ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いることが好ましい。
また、実験動物としてマウスを用い、ＯＰＮに関連する疾患等の研究を行う場合は、マウスのＯＰＮに対応するＯＰＮ阻害抗体を用いることが望ましく、そのような抗体は、好ましくは、ＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。
上記ＯＰＮ関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」という）、サイログロブリン等が挙げられ、このうちＫＬＨおよびサイログリブリンがより好ましい。
上記ＯＰＮ関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９５４）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，１０９０−１０９４）または活性化エステル法（Ａ．Ｅ．Ｋａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４２，３０１−３０９）等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、ＯＰＮ関連ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−高分子化合物結合体が作製される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
また上記反応は、通常、−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から２時間である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ＯＰＮ関連ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。
上記の方法によるＯＰＮ関連ペチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。
次に、上のようにして得られた結合物を抗原として用いる抗体の作製法および当該抗体を用いる免疫化学的測定法について説明する。尚、抗体の調製にあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
上記結合体を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。
すなわち、まず、例えば、ＯＰＮ関連ペプチド−サイログロブリン結合物等の結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤とを混合したものを、免疫原として用いて、哺乳動物を免疫する。
免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回、行うことができる。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して、血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより、ＯＰＮ阻害抗体を得ることができる。
また、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてＯＰＮ阻害抗体を得ることもできる。
上記したモノクローナルＯＰＮ阻害抗体または該抗体産製ハイブリドーマを基に、本発明の抗オステオポンチンキメラ抗体や、抗オステオポンチンヒト化抗体の作製は、前記したように、欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３、欧州特許公開公報ＥＰ０２３９４００、ＥＰ０４５１２６等を参照することにより行われるが、本発明においては、特に国際公開公報ＷＯ９４／２０６３２に記載の方法に準じてマウス抗体からキメラ抗体またはヒト化抗体を作製することが望ましい。
例えば、治療の対象がヒトであり、ＯＰＮ阻害抗体産生動物がマウスの場合には、例えば、マウス抗体の可変領域とヒト抗体定常領域を連結させた抗体（以下、これを「キメラ抗体」という）やマウス抗体の可変領域中の相補性決定領域を中心にヒト抗体に移植した抗体（以下、これを「ヒト化抗体」という）を用いるのが望ましい。さらには、抗体産生のためにはキメラ抗体遺伝子またはヒト化抗体遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いる方法や、ファージディスプレー（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａ）法を用いることもできる。
このようにして得られたＯＰＮ阻害抗体はそのまま用いることができるが、当該抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖のポリペプチドの少なくとも一部を有し、抗原に対して結合活性を有するポリペプチド鎖から構成されるタンパクとして用いたり、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２などのＯＰＮ阻害抗体に起因する抗体断片のかたちで用いることができる。
具体的に、マウス抗体からキメラ抗体を作製するには、まず、マウス抗体の可変領域遺伝子を該抗体産製ハイブリドーマ（例えば本実施例２に記載のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８８３））より常法によりクローニングし、塩基およびそれによってコードされているアミノ酸配列を決定する。このようにして決定したマウス抗体の可変領域遺伝子と抗体のリーダー配列等を、ヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子、好ましくはＩｇＧクラスの抗体の定常領域遺伝子と連結させてキメラ抗体遺伝子を作製する。
次いで、このキメラ抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からキメラ抗体を得ることができる。
上記のようにして決定されたマウス抗体の可変領域遺伝子は、対応するマウス抗体のリーダー配列およびＪ領域に対するプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、可変領域遺伝子断片として得ることができる。この可変領域遺伝子断片の両端にはクローニングのための制限酵素認識部位を連結するのが好ましい。
上記で得られた遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子と連結させてキメラ抗体遺伝子（以下、単に「キメラ抗体遺伝子」という）を作製する。この組み合わせに特別な組み合わせはなく、最終的に抗原との結合活性を発現できる組み合わせであれば、目的に応じてどのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてγ１、γ２、γ３またはγ４、軽鎖としてλまたはκ鎖の定常領域）も選択可能でありる。また、定常領域の機能を強化あるいは低減させるようにデザインされた定常領域遺伝子との組み合わせでも構わない。
上記のようにして得られたキメラ抗体遺伝子と連結される発現ベクターとしては国際公開公報ＷＯ９４／２０６３２に記載のＡＧ−γ１やＡＧ−κ等の発現ベクターが使用できるが、キメラ抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。なお、発現ベクターとしてＡＧ−γ１あるいはＡＧ−κ等の予めＩｇ遺伝子を有するものを利用すれば、これに上記マウス抗体の可変領域遺伝子を挿入するだけでキメラ抗体遺伝子を有する発現ベクターとなるため好ましい。
上記した発現ベクターは、例えばリン酸カルシウム法等により、培養細胞中に導入される。
発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。
上記培養後、培養上清中に蓄積されたキメラ抗体は、例えば、プロテインＡカラムを用いた各種クロマトグラフィーにより精製することができる。
こうして得られたキメラ抗体の抗原活性は、例えば、オステオポンチンペプチド等を用いたＥＬＩＳＡやＢＩＡｃｏｒｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ社）等により測定可能である。
また、本発明においては、例えば以下説明する方法により、上記キメラ抗体よりも、更に、ヒト抗体に近いヒト化抗体を作製することも可能である。
具体的にマウス抗体からヒト化抗体を作製するには、まず、マウス抗体の可変領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸をカバット（Ｋａｂａｔ）らによる分類に従って決定する（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，１９８７）。このマウス抗体の可変領域中のＣＤＲを中心としたアミノ酸を鋳型となるヒト抗体に移植し、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワークを有する可変領域アミノ酸配列を設計する。この可変領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインし、ＰＣＲ法及び遺伝子組換え技術によりデザイン通りの核酸配列を持つ可変遺伝子断片を作製する。そして、この可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子、好ましくはＩｇＧクラスの抗体の定常領域遺伝子と連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。次いで、このヒト化抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からヒト化抗体を得ることができる。
上記ヒト化抗体の作製方法において、マウス抗体の可変領域遺伝子中の相補性決定領域遺伝子は、前記キメラ抗体の作製において明らかとなっているマウス抗体の可変領域遺伝子から、前述のカバット（Ｋａｂａｔ）の分類による相補性決定領域の範囲から決定することができる。
一方、鋳型となるヒト抗体のフレームワーク領域遺伝子としては、前記マウス抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列と相同性の高い配列を、例えばヒト抗体のｇｅｒｍｌｉｎｅの中から選び、このアミノ酸配列をコードする塩基配列を常法により作製し、これを用いればよい。
上記したマウス抗体の相補性決定領域遺伝子と鋳型となるヒト抗体のフレームワーク領域遺伝子とを連結してキメラ抗体の作製と同様に遺伝子断片を作製する。この遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子と連結させてヒト化抗体遺伝子（以下、単に「ヒト化抗体遺伝子」という）を作製する。
このヒト化抗体遺伝子の作製につづく、ヒト化抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、抗体の精製等については、上記したキメラ抗体の作製と同様に行うことができる。
なお、一般的に相補性決定領域のアミノ酸だけを置換したヒト化抗体の場合には、オリジナルのマウス抗体よりも抗原結合活性が低下することが多い。そこで、オリジナルのマウスの抗体および相補性決定領域周辺のアミノ酸のいくつかを合わせて移植されることが多い。さらに、結合活性の上昇や親和性向上のために、ヒトフレームワーク領域のみならず可変領域のアミノ酸の改変（１個若しくは複数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失など）を行うことも可能であり、この様にして製造された抗体も本発明のヒト化抗体に含まれる。
上記のこの鋳型ヒト抗体に対してマウス抗体の相補性決定領域を中心としたアミノ酸配列を移植した可変領域を発現する遺伝子を作製し、これを上記キメラ抗体の作製と同様に作製することによりヒト化抗体が得られる。
上記したキメラ抗体およびヒト化抗体（以下、「組換えＯＰＮ阻害抗体」という）は、オリジナルマウス抗体と同等の抗原活性を有し、かつマウス抗体よりも抗原性の惹起や半減期の短縮等の問題が解消されたものとなる。
かくして得られた組換えＯＰＮ阻害抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、リウマチ性関節炎・若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチ・乾癬性関節炎・乾癬等の治療、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶとう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療に用いることができる。
本発明の組換えＯＰＮ阻害抗体は、好ましくは、リウマチ治療剤あるいはリウマチ性関節炎治療剤として用いることができる。これらリウマチ治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい（自己免疫疾患治療剤とする場合もこれに準じればよい）。また製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
上記製剤化に当たっての組換えＯＰＮ阻害抗体の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは組換えＯＰＮ阻害抗体の結合力価等により異なるが、例えば０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
このようにして得られた本発明の治療剤は、有効成分である組換えＯＰＮ阻害抗体がＯＰＮのＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列に強く結合し、ＯＰＮのこの部分とインテグリンとの結合を阻害することによって、結果的にリウマチ及びリウマチ性関節炎やそれ以外の自己免疫疾患の症状の増悪を押さえることができると期待される。
そして、本発明の組換えＯＰＮ阻害抗体は、インテグリン側でなくＯＰＮ側に特異的に結合するものであるため、インテグリンの他の重要な機能を阻害するおそれは少なく、副作用の問題は回避されるものと期待される。
更に本発明の組換えＯＰＮ阻害抗体は、自己免疫疾患治療剤をスクリーニングする目的にも使用することができる。すなわち、前述のように、ＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する化合物は、自己免疫疾患の治療剤となりうる。そこで、例えば、所定量の組換えＯＰＮとインテグリンが存在する測定系内にスクリーニングするべき物質（被検物質）と組換えＯＰＮ阻害抗体とを競合的に加えた反応系を構成し、使用した組換えＯＰＮ阻害抗体の量に対するＯＰＮ−インテグリン間の結合の阻害程度を測定すれば、被検物質の自己免疫疾患治療剤としての利用可能性を評価することができる。
同様に、ＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する化合物は、リウマチないしはリウマチ性関節炎の治療剤となりうるので、組換えＯＰＮ阻害抗体を用いて、上記と同様の反応系を構成すれば、リウマチないしはリウマチ性関節炎のスクリーニングに使用することができる。
更にまた、本発明の組換えＯＰＮ阻害抗体は、リウマチ診断剤として利用することができる。先述のように、リウマチ性関節炎患者の関節では、特にトロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントが高濃度で見出されることが判明している。そこで、この組換えＯＰＮ阻害抗体を用いて検体中のＯＰＮまたはそのＮ末端フラグメントの量を測定すれば、リウマチの診断に役立てることができる。その手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅ．Ｅｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を利用することができる。
上記手法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より好ましい方法の例としては、例えば本発明の組換えＯＰＮ阻害抗体を担体上に固相化し、本発明の組換えＯＰＮ阻害抗体とはＯＰＮ上の異なる部位を認識する抗体を標識化することにより、ＯＰＮまたはそのＮ末端フラグメントを検出することができ、これをリウマチ性関節炎の診断薬とすることができる。
上記抗体を標識するにあたり使用される標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」という）、アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＰ」という）等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
より具体的なＯＰＮアイソフォームの検出方法について、サンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、（ａ）本発明のＯＰＮアイソフォームに対する抗体を担体に固相化し、次いで、（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、（ｃ）これに各種濃度のＯＰＮアイソフォームを含む検体を加え、ＯＰＮアイソフォームー抗体複合体を生成させた後、（ｄ）標識した抗ＯＰＮアイソフォーム抗体を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ、最後に（ｅ）担体に結合した標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中の遊離ＯＰＮアイソフォームの量を決定することができる。
まず、（ａ）工程において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．１−２０μｇ／ｍｌが適している。また、緩衝液の量は、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で、より好ましくは、２０−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
また、（ｂ）工程のブロッキングについては、次の段階で添加する検体中のＯＰＮには抗原抗体反応とは無関係に担体に吸着される部分が存在する場合があるので、そのような非特異的吸着を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ」、大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液としては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適している。
次いで（ｃ）工程において、ＯＰＮアイソフォームを含む検体を固相化抗体と接触させることにより、固相化抗体でＯＰＮアイソフォームを捕捉し、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、３７℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の蛋白質等を除去させる。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。
更に（ｄ）工程において、固相化抗体に捕捉されたＯＰＮアイソフォームの別のエピトープを認識する標識抗体を加え、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の蛋白質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、（ｃ）工程において前記したものが使用される。
上記（ｄ）工程において使用される標識抗体は、（ａ）工程の固相化抗体と異なるエピトープを認識するものであることが要求される。例えば固相化抗体としてＯＰＮアイソフォームの前半領域を認識するポリクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ＨＲＰまたはＡＰ等）を結合した標識抗体としては、ＯＰＮアイソフォームの後半領域を認識するポリクローナル抗体を用いることが好ましい。このように異なる部位を認識する抗体を用いることで、選択スプライシングにより生じるＯＰＮアイソフォームを高感度でかつ特異的に測定できる。
（ｄ）工程において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約５，０００−１０，０００倍、好ましくは最終測定時の最大吸光度が１．５−２．０となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約３７℃で約３０分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体を結合することができる。
最後に（ｅ）工程において、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からＯＰＮの量を算出することができる。
標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）又はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させることにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるＡＰを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
既知の濃度のＯＰＮアイソフォームを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のＯＰＮアイソフォームの濃度を算出できる。
上記した本発明のＯＰＮアイソフォームの検出方法は、ＯＰＮの働きの解明や、ＯＰＮの関連する疾患の診断、治療のために使用されるが、その使用方法の一例としては、トロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントと非切断型ＯＰＮを区別して検出することにより、炎症異常の有無を検出し、例えばリウマチと変形性関節症を区別する炎症異常の検出キットを挙げることができる。
先述のように、リウマチ性関節炎患者の関節腔内では、特にトロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントが高濃度で見出される傾向があるが、変形性関節炎患者ではそのような傾向は有意に低い。このように、関節腔内のＯＰＮ中に占めるＮ末端フラグメントの割合がそれぞれの患者では異なっているので、リウマチと変形性関節症を区別して診断する為には、ＯＰＮ全体の中に占めるＮ末端フラグメントの割合を測定できればよい。
より具体的な例としては、ＯＰＮの３種のアイソフォーム、ＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂおよびＯＰＮ−ｃのすべてに共通に存在する下記３種の配列について、それぞれのペプチドに対する抗体を作製する。
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
（Ｃ＋Ｖ１５３からＳ１６９）（１）
ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ
（Ｋ１７０からＥ１８７＋Ｃ）（２）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ
（Ｉ１７からＱ３１＋Ｃ）    （３）
このうち、配列（１）は、トロンビン切断部位のＮ末端側に存在し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮとＮ末端側フラグメント上で共通に存在する。一方、配列（２）は、トロンビン切断部位よりＣ末端側に存在し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮでは存在するが、Ｎ末端側フラグメントには含まれない。また、配列（３）は、ＯＰＮのＮ末端側１７番目から３１番目までのアミノ残基に対応し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮとＮ末端側フラグメントで共通に存在する。  リウマチ患者と変形性関節症患者の鑑別の為の診断キットは、上記の３種の配列のペプチドそれぞれに対する抗体を利用した２種類の免疫検出試薬から構成することができる。  すなわち、第一の免疫検出試薬では、上記の配列（３）および（２）で表されるペプチドに対する２種の抗体を用いて、検体中の両方の抗体で共通に認識されるトロンビン非切断型ＯＰＮを定量する。その際、例えば、配列（３）のペプチドに対する抗体を担体に固相化し、患者由来の検体と反応させ、洗浄した後、標識抗体として配列（２）のペプチドに対する抗体を加え前述のサンドイッチ法と同様の方法で検出することができる。また、第二の免疫検出試薬では、上記の配列（１）および（３）で表されるペプチドに対する２種の抗体を用いて、検体中の両方の抗体で共通に認識されるトロンビン非切断型ＯＰＮとトロンビン切断により生成したＮ末端側フラグメントを合わせた総量を定量する。その際、例えば、配列（１）のペプチドに対する抗体を担体に固相化し、患者由来の検体と反応させ、洗浄した後、標識抗体として配列（３）のペプチドに対する抗体を加え前述のサンドイッチ法と同様の方法で検出することができる。そして、同一の患者検体に対する上記の２種類の免疫検出試薬による結果を比較照合することにより、該患者における全ＯＰＮ中に占めるトロンビン切断により生成したＮ末端側フラグメントの割合を明らかにすることができ、リウマチと変形性関節症の区別が可能となる。
実施例
次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。なお、本実施例において市販のキットあるいは試薬を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
実施例  １
ＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白のクローニング、構築、精製および
試薬：
クローニング及び蛋白精製については、基本的に、文献（Ｓ．Ｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）：Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７７，４８７−４９８）に記載の方法に従って行った。ヒトＯＰＮのアイソフォームであるａ，ｂについては、そのｃＤＮＡを次のようにして得た。ヒト腎癌細胞株であるＮＲＣ−１２細胞から調整したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それを鋳型とし、下記ＯＰＮ−５、ＯＰＮ−３プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、それぞれシグナルペプチド領域を含むヒトＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂの全長をコードするｃＤＮＡを得た。次に、上記文献に記載したようにして、このようにしてクローニングしたＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ  ｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ４Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＥＣ２．５．１．１８）遺伝子と同じリーディングフレームとなるように挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を用いてＧＳＴ融合蛋白として発現させた（以下、このようにして得られたＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白を、それぞれ、「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ」，「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ」という）。
2003027151.tif 000002
ヒトＯＰＮ−ｃアイソフォームをコードするｃＤＮＡについては、上記のＯＰＮ−ａ  ｃＤＮＡを鋳型とし、二段階ＰＣＲにより作製した。一段階目はＯＰＮ−５と下記のＯＰＮｃｔ−３プライマー、下記のＯＰＮｃｔ−５とＯＰＮ−３プライマーでそれぞれＰＣＲを行い、二つのＰＣＲ産物を混ぜ、熱を加え徐々に冷却することによりアニールさせ、酵素を加えて伸長させた。次いで二段階目として、ＯＰＮ−５とＯＰＮ−３プライマーでＰＣＲを行うことによりシグナルペプチド領域を含むヒトＯＰＮ−ｃの全長をコードするｃＤＮＡを得た。このアイソフォームｃ  ｃＤＮＡは、アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴ融合蛋白を作製した（以後、「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃ」という）。
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ＯＰＮ−ａのトロンビン開裂部位よりアミノ末端側半分（Ｍ１−Ｒ１６８）をコードするｃＤＮＡは、上記のＯＰＮ−ａ  ｃＤＮＡを鋳型として、ＯＰＮ−５と下記のＯＰＮｎｈ−３プライマーを用いてＰＣＲをうことによって、得られた。アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴタンパク質を作製した（以後、「ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ」という）。
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ＯＰＮ−ａのトロンビン開裂部位よりカルボキシル基側のオステオポンチンタンパク質（ｈＯＰＮ  Ｃ  ｈａｌｆ）は、二段階ＰＣＲによりＯＰＮ−ａ  ｃＤＮＡを鋳型として作製した。一段階目はＯＰＮ−５、下記のＯＰＮｃｈ−３プライマー、下記のＯＰＮｃｈ−５とＯＰＮ−３プライマーでそれぞれＰＣＲを行った。二段階目はＯＰＮ−５とＯＰＮ−３プライマーでＰＣＲを行うことによりカルボキシル基側ＯＰＮタンパク質を作製した。アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴタンパク質を作製した（以後、「ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆ」とする）。
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種々の組換えＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白は、常法に従って大腸菌より調製し、上記文献で述べた方法によりグルタチオン−セファローズカラムを使用して、精製した。このうち、ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ蛋白については、連結部分をプレシジョン・プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ；アマーシャム・ファーマシア・バイオテック社）で開裂させることによって、ＧＳＴ蛋白部分を取り除き、ＯＰＮのアミノ末端側半分（Ｉ１７−Ｒ１６８）のみから構成される蛋白（以下、「ｎＯＰＮ」という）を得た。
一方、ＯＰＮ−ａの全長  （Ｍ１−Ｎ３１４）をコードするｃＤＮＡについては、さらに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロゲン社）に挿入し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬（株）社）にトランスフェクトした（以下、「ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ細胞」という）。
この細胞より得られた糖鎖結合型のＯＰＮ−ａ（以下、「ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ」という）については、以下のようにして精製した。即ち、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ細胞の培養上清をＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６Ｂカラム（アマルシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、ＵＬＴＲＯＧＥＬ  ＡｃＡ４４カラム（ＢｉｏＳｅｐｒａ  ＳＡ社）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに付し、これに引き続いて、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣカラム（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社）での逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
免疫感作や結合の研究に用いた種々のペプチドは、シグマ・ゲノシス・ジャパン社から入手し、あるいは、ペプチド合成機（モデル４３２Ａ、パーキンエルマーライフサイエンス社）でＦｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）法により化学合成した後、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーで精製することにより得た。
実施例  ２
マウスモノクローナル抗体の製造：
下に示すような、ヒトＯＰＮの内部配列に対応する合成ペプチドを用意し、免疫に使用した。
2003027151.tif 000007
このうち、ペプチド１は、それぞれαｖβ３とα９β１インテグリンレセプターを認識するＲＧＤとＳＶＶＹＧＬＲ配列を有する。
これらのペプチドを、サイログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）と結合させ、常法に従ってマウスの免疫に用いた。続いて、免疫されたマウスから脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を分離し、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３と細胞融合に付した。そして、文献（Ｍ．Ｋｉｎｅｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，３７２１−３７２８）に述べた方法により、免疫に使用したペプチドに反応するハイブリドーマを選択した。
ペプチド１および２で免疫したマウスから、それぞれ２Ｋ１および４Ｃ１と名付けたモノクローナル抗体を得た。なお、モノクローナル抗体２Ｋ１を産生するハイブリドーマについて、２００１年６月２０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７８８３として寄託した。また、モノクローナル抗体５３（ｍＡｂ５３）は、全長組換えヒトＯＰＮで免疫することにより得られたものである（Ｄ．Ｓ．Ｂａｕｔｉｓｔａ  ａｔ  ａｌ．，（１９９４）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２３２８０−２３２８５）。
実施例  ３
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物とマウスモノクローナル抗体の
反応性：
実施例２で得られたマウスモノクローナル抗体２Ｋ１（以下、「マウス２Ｋ１抗体」という）および４Ｃ１のＯＰＮおよびそのトロンビン消化物に対する結合能をウエスタンプロット法を用いて試験した。マウス２Ｋ１抗体はＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆと反応することがわかった。また、４Ｃ１抗体はＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｃｈａｌｆと反応することがわかった。更に、これらのモノクローナル抗体は、大腸菌から生産した糖鎖非結合型の組換えＯＰＮと結合するばかりでなく、糖鎖結合型ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ蛋白及びそのトロンビン消化物（以下、「トロンビン開裂ＯＰＮ」という）とも反応した。
実施例  ４
マウスモノクローナル抗体によるＯＰＮに対する細胞接着の阻害：
マウスモノクローナル抗体がＯＰＮに対する細胞の接着を阻害するかどうかを以下の方法で調べた。まず、９６穴プレートを、４℃で一晩、種々の濃度のＣＨＯ／ＯＰＮ−ａでプレコートし、次いで１０分間、３７℃の条件で０．５％ＢＳＡのＰＢＳにより非特異的接着をブロックするための処理を行った。ヒト線繊維芽細胞ＴＩＧ−７またはインテグリンα９サブユニットｃＤＮＡで形質転換したＳＷ４８０細胞（以下、「α９形質転換ＳＷ４８０細胞」という）を、０．２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭに懸濁させ、細胞懸濁液（細胞濃度は、５×１０４細胞／ウエル）２００μｌを、種々の濃度のモノクローナル抗体または合成ペプチドの存在または不存在下でＣＨＯ／ＯＰＮ−ａまたはｎＯＰＮでプレコートした９６穴プレートに注入し、１時間、３７℃でインキュベートした。
培地をプレートから除去し、全てのウエルを０．２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭで２回洗浄した。接着した細胞は固定し、２０％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。
全てのウエルは、水で３回すすぎ、接着した細胞は２０％酢酸により転溶させた。各ウエルから得られた結果物の上清をイムノリーダーで分析し、５９０ｎｍの吸収をウエルに接着した細胞の相対的数を求めるために測定した。全てのアッセイは、３回行い、少なくとも３つの独立した実験を行った。示される値は、少なくとも３つの別々の実験の平均である。
ＴＩＧ−７はＯＰＮに良く接着することが知られているが、図１のＡに示されているように、この接着は明らかにＧＲＧＤＳＰペプチド（１００μｇ／ｍｌ）で阻害され、コントロールペプチド（ＯＰＮのＣ末部分であるＫ２９６−Ｎ３１４）（１００μｇ／ｍｌ）で阻害されないので、ＲＧＤ依存である。また、図１のＢに示すように、２００μｇ／ｍｌのマウス２Ｋ１抗体はＯＰＮに対する細胞接着を阻害することが明らかになった。更に、図１のＣに示すように、マウス２Ｋ１の細胞接着阻害効果は、ｍＡｂ５３が示すものに匹敵し、濃度依存的である。なお、マウス２Ｋ１およびｍＡｂ５３は、ＴＩＧ−７細胞のビトロネクチン（ＶＮ）やフィブロネクチン（ＦＮ）への接着は阻害しない。
図２は、ｎＯＰＮおよびビトロネクチンと、α９形質転換ＳＷ４８０細胞との接着に対するモノクローナル抗体の阻害を示した図面である。図２のＡに示すように、１μｇ／ｍｌのビトロネクチンとα９形質転換ＳＷ４８０細胞との接着は、２００μＭのＧＲＧＤＳＰペプチド（ＲＧＤ）で阻害されることからＲＧＤ依存である。３μｇ／ｍｌのｎＯＰＮに対するα９形質転換ＳＷ４８０細胞の接着は、２００μＭのＧＲＧＤＳＰペプチド（ＲＧＤ）と抗α９β１モノクローナル抗体であるＹ９Ａ２（Ａ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）：Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，６６４−６７２）を併用することにより阻害されることから、ＲＧＤ依存および非依存性の接着である。また、図２のＢは、α９形質転換ＳＷ４８０細胞とｎＯＰＮおよびビトロネクチンの接着に対するマウス２Ｋ１抗体の影響を示している。α９形質転換ＳＷ４８０細胞とビトロネクチンの接着は、マウス２Ｋ１抗体により阻害されないが、ｎＯＰＮとの接着はマウス２Ｋ１抗体により阻害される。この結果、マウス２Ｋ１抗体はＲＧＤ依存性の接着阻害能を保持していることが判明した。
実施例  ５
マウスモノクローナル抗体によるＯＰＮ−誘導単球遊走の阻害：
Ｕ９３７細胞を用いた細胞遊走試験は、ＣｈｅｍｏＴｘ１０１−８システム（ニューロプローブ社）を用いて行った。細胞は、０．１％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭで２×１０６／ｍｌとなるように調整し、フィルター（ポアサイズ８μｍ）の上層に加え、下層にはＯＰＮタンパク質を加えた。
ＣｈｅｍｏＴｘプレートは、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間静置した。静置後、フィルターをメタノールで固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ−Ｅ）で染色した。フィルターの裏面まで遊走した細胞数を顕微鏡下、倍率４００倍で算定した。試験は３回行い、その平均をデータとした。この結果を図３に示す。
図３ａは、表示された濃度における、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆに対するＵ９３７細胞の細胞遊走を示す。また、図３ｂは、５０μｇ／ｍｌの抗原特異精製されたマウス２Ｋ１抗体、ｍＡｂ５３または対照であるマウスＩｇＧの存在または不存在下、１０μｇ／ｍｌの各ＯＰＮを用いた阻害アッセイである。
図３ａおよび図３ｂに示されるように、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆは、ヒト単球細胞Ｕ９３７の遊走を濃度依存的に誘導する（Ａ）。マウス２Ｋ１抗体は、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆにより誘導された単球細胞遊走を明らかに阻害する。これに対し、ｍＡｂ５３は、全長ＯＰＮにより誘導される単球細胞遊走を阻害するだけである（Ｂ）。
参考例  １
ＯＰＮと関節炎誘発：
関節炎におけるＯＰＮの働きを明らかにするため、常法に従ってＯＰＮ遺伝子欠損マウス（Ｓ．Ｒ．Ｒｉｔｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）：Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１３（７），１１０１−１１１１）を人工的に作製し、正常なマウスと比較実験を行った。
ＯＰＮ遺伝子欠損マウス（ＯＰＮ−／−）と正常マウス（ＯＰＮ＋／＋）のそれぞれに、関節炎を引き起こす薬剤として市販されている関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル（商品名：関節炎用カクテル、Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ登録商標  ｍＡｂ，Ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｍＡｂ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、岩井化学薬品社製）を用い、製品添付書類に従い投与し、関節炎を惹起し、その程度を観察した。対照としては、両マウスに生理食塩水を投与したものを用いた。
関節炎の程度は、下記に従った関節炎スコアと、投与１０日後のリストの腫れで比較した。この結果を図４および図５に示す。
図４から明らかなように、関節炎用カクテル／リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」という）を投与された正常マウスでは、４日目から関節炎スコアが上昇し、１０日目で最高（１２以上）に達した。これに対し、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスでは、５日目から関節炎スコアは上昇するものの、最高でも４以下であった。また、生理食塩水を投与した群では、いずれも関節炎スコアの上昇が見られなかった。
また、図５に見るように、リストの腫れ（手首の腫れ）もＯＰＮ遺伝子欠損マウスは正常マウスに比べて明らかに弱く、関節炎に対しＯＰＮが関係していることが明らかである。
実施例  ６
マウス２Ｋ１抗体のヒト末梢血白血球遊走に対する阻害活性：
下記方法により、マウス２Ｋ１抗体のサイトカイン活性化ヒト末梢血白血球遊走に対する阻害活性を調べた。好中球遊走阻害活性についての結果を表１に、単球遊走阻害活性についての結果を表２にそれぞれ示す。
＜実験方法＞
健常人ヒト末梢血からフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）法にて単核球画分と好中球画分を分離した（Ｐ．Ｍ．Ｄａｆｔａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５７，１２−２０）。単球はフィコールと血清の中間層を採取し、フラスコにて３７℃で１時間培養した後に付着した細胞を用いた。単球画分を採取した残りの赤血球層に３％デキストラン−ＰＢＳを５倍量加えて赤血球を凝集させてから、１５０×ｇ、４℃で５分間遠心した。
凝集した赤血球が沈殿し、上清には好中球が懸濁状態で存在するので、この画分を５００×ｇ、室温で２０分間遠心すると好中球が得られた。このようにして得られた単球と好中球をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。
遊走実験は４８−ウエル  マイクロ  ケモタキシス  チャンバー（ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｃｈａｍｂｅｒ）（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．製）を用いて行った。トロンビン開裂ＯＰＮに、マウス２Ｋ１抗体を種々の濃度で添加したものを予め３７℃で１５分間放置してから、ローワー  チェンバー（Ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）に加えた（ヒトＯＰＮ最終濃度は  １０μｇ／ｍＬ）。その上からポリカーボネートフィルター（ポアサイズ５μｍ）を載せて、さらにアッパー  チェンバー（Ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）に５０μＬの細胞懸濁液（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を加えた。
３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養してから、ポリカーボネートフィルターを取り外して、フィルター上側表面の細胞を除去してから、フィルターの裏側に浸潤した細胞をディフークイック（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ）（Ｂａｘｔｅｒ社製）にて染色した。染色した細胞数を４０倍の倍率下で計測した。この結果は６ウエルの平均細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ３）±ＳＤとして示した。
＜実験結果＞
マウス２Ｋ１抗体は、ＴＮＦ−αで活性化したヒト末梢血好中球および単球のトロンビン開裂ＯＰＮに対する遊走を阻害した。
好中球遊走阻害：
【表１】
2003027151.tif 000008
単球遊走阻害：
【表２】
2003027151.tif 000009
実施例  ７
キメラ２Ｋ１抗体発現プラスミドの作製：
国際公開番号ＷＯ９４／２０６３２の国際公開公報に記載の抗ＨＩＶモノクローナル抗体（Ｃ２５抗体）のキメラ抗体の作製方法に準じて、実施例２で得られたマウス２Ｋ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子をヒトＩｇγ１遺伝子に、軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子をヒトＩｇκ遺伝子に連結してマウス−ヒトのキメラ２Ｋ１抗体（以下、「キメラ２Ｋ１抗体」あるいは「Ｃ２Ｋ１抗体」ということもある）を作製した。
まず、マウス２Ｋ１抗体産生ハイブリドーマからＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社）を用いてｍＲＮＡを抽出し、それを鋳型として用い、ｐｄ（Ｎ）６  Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ及びＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｅａｄｓ（ともにＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
次に、このｃＤＮＡを鋳型として用い、カバット（Ｋａｂａｔ）らによるＶ領域及びＪ領域の核酸配列の分類（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，１９８７）に従ってデザインした、下に示すマウス２Ｋ１抗体のＶＨ遺伝子のリーダー配列に合致するプライマーとＶＨ遺伝子のＪ領域に合致するプライマーを用い、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）でＶＨ領域を増幅した。
2003027151.tif 000010
ここで用いたリーダー領域に対するプライマーとＪ領域に対するプライマーは、それぞれクローニングのための、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列を含んでいる。
一方、ＶＬ遺伝子についてもＶＨ遺伝子の場合と同様に、下記に示すリーダー配列に合致するプライマーとＪ領域に合致するプライマーを用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位を両端に持つＶＬ遺伝子断片を得た。
2003027151.tif 000011
このようにして得たＶＨ、ＶＬ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（ともに宝酒造）で消化し、それぞれを、発現ベクターであるＡＧ−γ１、ＡＧ−κ（国際公開公報ＷＯ９４／２０６３２）に組み込んだ。このうち、ＡＧ−γ１はβアクチンプロモーター、ヒト免疫グロブリン定常領域γ１鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を持ち、γ１遺伝子の上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の間にマウス２Ｋ１抗体ＶＨ遺伝子を挿入することにより、キメラ２Ｋ１抗体の重鎖を発現するプラスミドとなる。また、ＡＧ−κはβアクチンプロモーター、ヒト免疫グロブリン定常領域κ鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を持ち、同じくκ遺伝子の上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の間にマウス２Ｋ１抗体ＶＬ遺伝子を挿入することにより、キメラ２Ｋ１抗体の軽鎖を発現するプラスミドとなる。
これらの発現プラスミドを常法により大腸菌ＨＢ１０１株に導入して大量培養し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
実施例  ８
キメラ２Ｋ１抗体の発現：
上記実施例７で精製したキメラ２Ｋ１抗体の重鎖、軽鎖発現プラスミドを混合して、一般的に行われるリン酸カルシウム法によりＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にトランスフェクションした。０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び透析によりヌクレオチドを除いたＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１０％添加したＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でセレクションすることにより、キメラ２Ｋ１抗体を産生する形質転換細胞を得た。
この細胞を２％の透析済ＦＣＳを添加したＭＥＭ培地５００ｍＬ中で培養し、得られた培養上清をプロテインＡカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に通した後、ＰＢＳに対して透析を行うことにより精製キメラ２Ｋ１抗体を得た。精製キメラ２Ｋ１抗体の濃度は、ＤＣプロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて決定した。最終的に１．４ｍｇの精製抗体を得ることができた。
実施例  ９
キメラ２Ｋ１抗体のヒト末梢血単核球遊走に対する阻害活性：
上記実施例８で得られた精製キメラ２Ｋ１抗体のサイトカイン活性化末梢血単核球遊走に対する阻害活性を次のようにして調べた。
まず、健常人よりヘパリン採血した血液をＲＰＭＩ１６４０培地にて２培希釈した。希釈した血液をフィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；ファルマシア社）に重層し、４００×ｇで室温にて３０分間遠心した。血漿とフィコール−パックの境界に見える白い層を回収し、単核球として用いた。このようにして得られた単核球ををヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。
遊走実験は４８−ウエル  マイクロ  ケモタキシスチャンバー（ｍｉｃｒｏ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｃｈａｍｂｅｒ；ニューロ  プローブ  インク社）を用いて行った。ヒトＯＰＮをウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃、２時間反応させて切断した。２Ｋ１キメラ抗体を種々の濃度で添加したものを予め３７℃で１５分間放置してから、下側チャンバーに加えた（ヒトＯＰＮ最終濃度は１０μｇ／ｍＬ）。その上からポリカーボネートフィルター（ポアサイズ５μｍ）を載せて、さらに上側チャンバーに５０μＬの細胞懸濁液（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を加えた。
３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養してから、ポリカーボネートフィルターを取り外して、上側フィルター表面の細胞を除去してから細胞をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｂａｘｔｅｒ社）にて染色した。上側フィルター表面の細胞数を４０倍の倍率下で計測し、結果は６ウエルの平均細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ３）±ＳＤとして示した。
この結果、表３に示すようにキメラ２Ｋ１抗体は、ＴＮＦ−αで活性化したヒト末梢血好中球およびモノサイトのトロンビン切断型ＯＰＮに対する遊走を阻害した。
単核球遊走阻害活性：
【表３】
2003027151.tif 000012
実施例  １０
キメラ２Ｋ１抗体のＫＤ値測定
次のようにして、キメラ２Ｋ１抗体のＫＤ値を測定した。まず、ヒトオステオポンチン部分ペプチドＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲを、ビオチナイラーションキット（（株）同仁化学研究所）でビオチン化した。ＢＩＡＣＯＲＥ−２０００にセンサーチップＳＡをセットし、リガンド（Ｂｉｎ−ＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ）を２３ＲＵ結合させた。続いて、マウス２Ｋ１抗体をアナライトとして流し、図６ａに示すセンサーグラムを得た。また、キメラ２Ｋ１抗体をアナライトとして流し、図６ｂに示すセンサーグラムを得た。ここで、それぞれの図の横軸は時間、縦軸は、相対的レスポンス（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＲＵ）を表している。これらのセンサーグラムのデータはＢＩＡＣＯＲＥ社解析ソフトＢＩＡ  エバリュエーション  バージョン３．０により１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）バインデングのグローバル  フィッティングで解析した。この結果を図６に示す。図６ａはマウス２Ｋ１抗体の様々な濃度におけるセンサーグラムであり、図６ｂはキメラ２Ｋ１抗体の様々な濃度におけるセンサーグラムである。
この測定の結果、マウス２Ｋ１抗体のＫＤ値は１．２×１０−１０Ｍであり、キメラ２Ｋ１抗体のＫＤ値は９．２×１０−１１Ｍであった。キメラ２Ｋ１抗体は、マウス２Ｋ１抗体のキメラ化によるアフィニティーの低下は認められなかった。
実施例  １１
ヒト化２Ｋ１抗体遺伝子の作製：
マウス２Ｋ１抗体のＶＨ及びＶＬ中の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸の移植先となる鋳型ヒト抗体は、マウス２Ｋ１抗体のＶＨ、ＶＬのフレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸配列に対して、それらと相同性の高いアミノ酸配列を持つヒト抗体のｇｅｒｍｌｉｎｅの中から選んだ。具体的には、鋳型ヒトＶＨとしてはＤＰ−８８（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ４９８０４）にＪＨ６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ６９８６６）を組み合わせたもの、鋳型ヒトＶＬとしてはＤＰＫ−１３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ９３６３１）にＪκ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ３９９９０４）を組み合わせたもの及びＤＰＫ−１８（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ９３６３５）にＪκ２を組み合わせたものを選んだ。マウス２Ｋ１抗体のＶＨアミノ酸配列（配列番号１９）およびＶＬアミノ酸配列（配列番号２０）と、これらの鋳型ヒト抗体のＶＨ、ＶＬアミノ酸配列との比較をそれぞれ図７及び図８に示した。ＣＤＲの範囲は前述のカバットらの分類における記述に準じた。
ＶＨのＣＤＲは下記のアミノ酸配列を有するものであった。
2003027151.tif 000013
また、ＶＬのＣＤＲは下記のアミノ酸配列を有するものであった。
2003027151.tif 000014
上記の鋳型ヒト抗体のＶＨ、ＶＬに、マウス２Ｋ１抗体のＶＨ、ＶＬから必要なアミノ酸配列を移植してヒト化抗体を作製した。具体的には、ＣＤＲアミノ酸配列をマウス２Ｋ１抗体のＣＤＲアミノ酸配列で置換したアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインし、次項に記すように、ＰＣＲ及び遺伝子組換え技術によりデザイン通りの核酸配列を持つ遺伝子断片を作製した。ＶＬについてはＦＲ２のみ、マウス２Ｋ１抗体との相同性がより高いＤＰＫ１３のアミノ酸配列を採用し、他のＦＲ部分はＤＰＫ１８のものを採用した。ＶＨについてはＦＲ４のみＪＨ６のアミノ酸配列を採用し、他のＦＲ部分はＤＰ−８８のものを採用した。
上記で作製したヒト化２Ｋ１抗体（以下、「Ｒ２Ｋ１抗体」ということもある）のＶＨ、ＶＬアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を、それぞれ図９（配列番号２７および２８）及び図１０（配列番号２９および３０）に記載した。ここで、抗体のリーダー配列としては、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／２０６３２に記載の、ヒト化抗ＨＩＶモノクローナル抗体（ＲＣ２５抗体）で使用されていたのと同じものを使用した（図９および図１０の下線部）。また、ＶＨ、ＶＬをコードする塩基配列の両端には、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ認識部位が付加されている。
実際に、図９及び図１０に示した塩基配列を持つＤＮＡ断片を得るために、オリゴＤＮＡを材料としたＰＣＲによる全合成を行った。具体的にはＶＨについては、図１１に示したように、図９のＶＨの塩基配列の全長をカバーするように６本のオリゴＤＮＡ（配列番号３１〜３６）をデザインして合成し、それらを用いて次の手順でＰＣＲを行った。すなわち、まず６種類のオリゴＤＮＡを各々１０ｐｍｏｌずつ混合したものを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用いて、９６℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分のステップを１０サイクル繰り返した。次に、このＰＣＲ産物の１μＬを鋳型として用い、図１１の下線部の配列を持つオリゴＤＮＡ（配列番号３７及び３８）をプライマーとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９６℃で２０秒、７２℃で３分のステップを２５サイクル繰り返すことにより、ＶＨの全長を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターとライゲーションした後、大腸菌に導入することによりクローニングした。得られた大腸菌クローンからＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、それを鋳型として用い、Ｍ１３−Ｍ４プライマーとＭ１３−ＲＶプライマー（ともに宝酒造）とＣＥＱ  ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いてシークエンシング反応を行い、ＣＥＱ２０００オートシークエンサー（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）により、クローニングされているＤＮＡの塩基配列を解読することにより、図９のデザイン通りの塩基配列を持つクローンを得た。
ＶＬの場合は、図１２に示した６本のオリゴＤＮＡ（配列番号３９〜４４）を用いて、上記と同様に１０サイクルのＰＣＲを行った後、その増幅産物を鋳型として用い、図１２の下線部の配列を持つオリゴＤＮＡ（配列番号４５および４６）をプライマーとして、上記と同様の２５サイクルのＰＣＲを行った。その後、ＶＨの場合と同様の操作を行うことにより、図１０のデザイン通りの塩基配列を持つクローンを得た。
実施例  １２
ヒト化２Ｋ１抗体発現プラスミドの作製：
実施例７に記載したキメラ２Ｋ１抗体発現プラスミドの作製の場合と同様にして、ヒト化２Ｋ１抗体発現プラスミドを作製した。実施例１１で作製したヒト化２Ｋ１抗体のＶＨ、ＶＬ遺伝子を持つクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、それをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化して得られたＶＨ、ＶＬのＤＮＡ断片を、それぞれ前述の発現ベクターＡＧ−γ１、ＡＧ−κに組み込んだ。こうして得られた、ヒト化２Ｋ１抗体の重鎖、軽鎖の発現プラスミドを大腸菌に導入して大量培養し、それをもとにトランスフェクション用の重鎖、軽鎖発現プラスミドＤＮＡを精製した。
実施例  １３
ヒト化２Ｋ１抗体の発現：
実施例１２で調製したヒト化２Ｋ１抗体の重鎖、軽鎖発現プラスミドを混合して、リン酸カルシウム法によりＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にトランスフェクションした。０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ及び透析済ＦＣＳを１０％添加したＭＥＭ培地で３日間培養して得られた培養上清を用いて、その中に含まれるヒト化２Ｋ１抗体の抗原結合活性をＥＬＩＳＡ法により確認した。まず、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社）とプロテインＡ−ＨＲＰ（ＺＹＭＥＤ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを行って、培地中に含まれるヒト化２Ｋ１抗体濃度を測定した。この際、市販のヒトＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）の希釈系列を作製し、それを標準試料とした。また前述のキメラ２Ｋ１抗体についても上記のＥＬＩＳＡによる濃度測定を行った。
実施例  １４
キメラ２Ｋ１抗体およびヒト化２Ｋ１抗体とオステオポンチンペプチドとの結合性確認：
実施例１３で決定したヒト化２Ｋ１抗体及びキメラ２Ｋ１抗体の濃度に基づいて、ヒト化２Ｋ１抗体とキメラ２Ｋ１抗体のオステオポンチンペプチド（ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ）に対する結合活性を、今らのＥＬＩＳＡ法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８８：４２０−４３２（２００２））を参考にして比較した。
ＢＳＡにオステオポンチンペプチドを架橋したもの（ＢＳＡ−ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ）を固定したマイクロタイタープレートに対して、ヒト化２Ｋ１抗体及びキメラ２Ｋ１抗体の希釈系列を反応させ、ＢＳＡ−ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳに結合した抗体にプロテインＡ−ＨＲＰを反応させ、最終的にＴＭＢ（同仁化学研究所）を反応させた後、４５０ｎｍの波長における吸光度を測定した。
また、ネガティブコントロールとして、単にＢＳＡだけを固定したプレートに対する反応も同様に測定した。これらの結果を図１３に示した。
なお、図１３において横軸は抗体濃度、縦軸は吸光度であり、●はキメラ２Ｋ１抗体のＢＳＡ−ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳに対する結合性を、■はヒト化２Ｋ１抗体のＢＳＡ−ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳに対する結合性を示している。またネガティブコントロールとして、キメラ２Ｋ１抗体のＢＳＡに対する結合性（○）と、ヒト化２Ｋ１抗体のＢＳＡに対する結合性（□）も示した。
この結果、ヒト化２Ｋ１抗体とキメラ２Ｋ１抗体は、ＢＳＡに対する結合性を示さず、ＢＳＡ−ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳに対してのみ結合性を示したことから、これらの抗体の結合性はオステオポンチンペプチドに特異的であることが判った。また、両抗体のＢＳＡ−ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳへの結合性は同等であることも判った。
前述のように、キメラ２Ｋ１抗体とオリジナルのマウス２Ｋ１抗体は同等の抗原結合活性を持つことに基づけば、本願発明で作製したヒト化２Ｋ１抗体がオリジナルのマウス２Ｋ１抗体と同等の活性を持つことは明らかである。
実施例  １５
Ｍ５抗体の製造：
下に示すような、マウスＯＰＮの内部配列（Ｃ＋Ｖ１３８からＲ１５３）に対応する合成ペプチドを用意し、免疫に使用した。
2003027151.tif 000015
このペプチドをサイログログリンと結合し、これを用い常法に従ってウサギを免疫した。免疫されたウサギの抗血清を採取し、Ｍ５ペプチドＮ末のシステインとチオールセファロースビーズ（アマシャムファルマシアバイオテック社）とをジスルフィド結合により結合させたカラムを用いてＭ５抗体を製造した。
実施例  １６
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物とＭ５抗体の反応性：
実施例１５で得られたＭ５抗体のＯＰＮ、およびそのトロンビン消化物に対する結合能はウエスタンブロット法を用いて試験した。用いたＯＰＮはＣＨＯ細胞から生産されたグリコシル化フォームの組換えマウスＯＰＮを用いた。Ｍ５抗体はＯＰＮおよびそのトロンビン消化物と反応した。
実施例  １７
Ｍ５抗体によるＯＰＮに対する細胞接着の阻害：
Ｍ５抗体がＯＰＮに対する細胞接着を阻害するかどうかを、文献（Ｓ．Ｋｏｎｅｔ  ａｌ．，（２００２）：Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８４（２），４２０−４３２）に述べた方法で調べた。ＯＰＮは、プレシジョン・プロテアーゼ（アマシャムファルマシアバイオテック社）によりＧＳＴ部を除去した全長マウスＯＰＮ（以下、「ｍＯＰＮ／ｄｅ−ＧＳＴ」という）を使用した。細胞はマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。
図１４に示されているように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞はｍＯＰＮ／ｄｅ−ＧＳＴに対し濃度依存的に接着する。また、図１５に示すように、この接着は明らかにＧＲＧＤＳＰペプチド（１００μｇ／ｍＬ）で阻害されるので、ＲＧＤ依存である。図１６に示すように、２００μｇ／ｍＬのＭ５抗体はＯＰＮに対する細胞接着を阻害することが明らかとなった。
実施例  １８
Ｍ５抗体のマウス脾臓由来単核球遊走に対する阻害活性：
下記方法により、Ｍ５抗体のサイトカイン活性化マウス脾臓由来単球遊走に対する阻害活性を調べた。この結果を表４に示す。
＜実験方法＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞をスライドガラスですり潰して単細胞にしてから、フラスコにて３７℃で１時間培養して付着した細胞を単球として用いた。この単球をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。遊走実験は、前記実施例６のヒトの場合と同様の方法で行った。
＜実験結果＞
Ｍ５抗体は、全長マウスＯＰＮ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）をウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ社製）にて切断した得られたトロンビン切断型マウスＯＰＮに対するＴＮＦ−αで活性化したマウス脾臓由来単球の遊走を阻害した。
【表４】
2003027151.tif 000016
実施例  １９
Ｍ５抗体の骨破壊抑制作用：
下記方法により、Ｍ５抗体のマウスカルバリア器官培養系における骨破壊抑制作用を調べた、この結果を表５に示す。
＜実験方法＞
生後１日目の仔マウスの頭蓋骨を切り出し、その半分を大きさを揃えてから２４ウエルプレートの各ウエルに入れた。これらに、ヒトパラチロイドホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ＰＴＨ）（１−３４）を最終濃度が１０ｎＭになるようにＤ−ＭＥＭ培養液（１０％ウシ血清添加）に添加したものを加えて骨破壊を引き起こした。Ｍ５抗体は、最終濃度２００μｇ／ｍＬになるように添加した。３７℃で１週間培養した後に、骨から培養液中へ遊離したカルシウム量をカルシウムＥテストワコー（和光純薬）にて定量した。
＜実験結果＞
ＰＴＨ未添加では、７．０２ｍｇ／ｍＬのカルシウム値を示したが、ＰＴＨ添加により、９．１１ｍｇ／ｍＬと骨からのカルシウムの遊離促進が見られた。Ｍ５抗体を２００μｇ／ｍＬの濃度で添加しておくと、骨吸収が約７０％阻害されることが確認された。
【表５】
2003027151.tif 000017
実施例  ２０
Ｍ５抗体のマウスコラーゲン関節炎モデルにおける効果：
下記方法により、Ｍ５抗体のマウスコラーゲン関節炎モデルにおける効果を調べた。関節炎スコアについての結果を表６に、足浮腫に対する結果を表７に、体重変化についての結果を表８に、摂餌量変化についての結果を表９にそれぞれ示す。
＜実験方法＞
関節炎の惹起には、コラーゲンに特異的な４つのエピトープを認識する関節炎惹起抗体カクテル（商品名：関節炎用カクテル、Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ登録商標  ｍＡｂ，Ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｍＡｂ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、岩井化学薬品社製）を用いた。マウスに、この関節炎カクテルを静脈内投与し、その３日後にＬＰＳ（１００μｇ）を腹腔内投与することにより惹起した。関節炎はＬＰＳ投与後３日目から観察され、６日目で最大となった。
Ｍ５抗体については、ＬＰＳ投与直前と３日後に、４０μｇ，１５０μｇまたは４００μｇの用量で静脈内投与した。そのコントロール群にはウサギＩｇＧ投与群（投与量：４００μｇ）をおいた。また、抗マウスＴＮＦ−α抗体については、ＬＰＳ投与直前と３日後に、２００μｇ／マウスの用量で静脈内投与した。そのコントロール群にはラットＩｇＧ投与群（投与量：２００μｇ）をおいた。また、ＭＴＸについては、ＬＰＳ投与日から一日一回の頻度で経口（投与量：３．２ｍｇ／ｋｇ）で投与した。その際、ＭＴＸは、０．５％  メチルセルロース溶液５ｍｌに溶解したものを用いた。そのコントロール群としては、０．５％  メチルセルロース溶液５ｍｌをおいた。
評価は、１群５匹ずつで、関節炎スコア、足浮腫、体重変化、摂餌量の４項目に関して行った。
＜実験結果＞
Ｍ５抗体は、表６から表９に示すようにマウス関節炎モデル（治療効果）に対し、関節炎スコアの改善、発症遅延や足浮腫の改善など明確な抑制作用を示した。関節炎の発症は、用量依存的に抑制され、その程度は、抗マウスＴＮＦ−α抗体（投与量：２００μｇ／マウス）投与による効果を上回るものであった。これに対して、ＭＴＸはほとんど薬効を示さなかった。
さらに、本モデルのノーマル群では、ＬＰＳ投与後３日間で、約３ｇという著しい体重減少が観察され、この傾向は、減少率はやや緩和されるものの、３−６日目まで続いた。これに対し、Ｍ５抗体（１５０μｇ，４００μｇ）投与群及び抗マウスＴＮＦ−α抗体投与群では、明らかな体重減少の改善が認められた。また、摂餌量については、ＬＰＳ投与後３日目までは、いずれの薬剤についても激しい体重減少が観察されたが、３−６日目にかけては、Ｍ５抗体投与群及び抗マウスＴＮＦ−α抗体投与群で改善が認められた。関節スコアに対する効果を表６に、足浮腫抑制効果を表７に、体重変化および摂餌量変化をそれぞれ表８および表９に示す。
【表６】
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【表７】
2003027151.tif 000019
【表８】
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【表９】
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実施例  ２１
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドの入手：
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をオースペップ（Ａｕｓｐｅｐ  Ｉｎｃ．，Ｐａｒｋｉｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より購入した。それらのアミノ酸配列は、下記の（１）から（３）の通りである。
2003027151.tif 000022
実施例  ２２
免疫用抗原の作製：
免疫原として、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体をＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法により、以下のようにして作製した。なお、結合体を作るにあたり、サイログロブリンとＯＰＮ関連フラグメントペプチドとＥＭＣＳのモル比をそれぞれ１：３００：４００とした。
実施例２１の各ＯＰＮ関連フラグメントペプチド４ｍｇを、それぞれ約１ｍｌの蒸留水に溶解した。一方、１ｍｌの０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に５ｍｇのサイログロブリンを溶解したものと、ジメチルホルムアミドで溶解したＥＭＣＳ８０μｇ／μｌとをそれぞれ上述モル相当量になるように混合し、サイログロブリン−ＥＭＣＳ複合体溶液を作製した。この複合体溶液を３つに分け、その各々に上記ＯＰＮ関連フラグメントペプチド溶液を上述モル相当量加えることにより、ＥＭＣＳで架橋されたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイクログロブリンとの結合体溶液を作製した。
この結合体溶液を、ＰＢＳを用いて透析し、結合体として１０μｇ／μｌになるように濃度調製した。このようにして得られたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体を免疫用抗原として用いた。
実施例  ２３
スクリーニング用抗原の作製：
スクリーニング用ＯＰＮタンパク質として、ＧＳＴとヒトＯＰＮアイソフォームとの融合蛋白であるＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃ、トロンビン開裂部位よりアミノ基側のＯＰＮフラグメント（ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ）、及びカルボキシル基側のＯＰＮフラグメント（ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆ）は、それぞれ実施例１に述べた方法により調製し、抗血清のＯＰＮに対する反応性に用いた。
実施例  ２４
免疫感作：
免疫用抗原として、実施例２２において得られたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体を用い、ウサギに免疫を行った。免疫は、１週間、または２週間おきに結合体溶液１００μｌ（１００μｇ）を投与することにより行った。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。８回免疫後、採血を行い、血清を分離しこれを抗血清とした。
実施例  ２５
抗血清のＯＰＮに対する反応性：
実施例２１で調製したＯＰＮ関連フラグメントペプチドを１０μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に希釈し、５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートに固相した。ＰＢＳにて洗浄、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％  ＮａＮ３溶液でブロッキングした後、実施例２４で得た抗血清の１００倍希釈液を順次２倍希釈し、ウェルに５０μｌ入れ、３７℃にて３０分間反応させた。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて４回洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＩＢＬ社）を５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、０．４ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）と０．０３％過酸化水素水を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ、室温で１５分間遮光状態で放置し、発色させた。発色後、１Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
一方、実施例２３で調製したＯＰＮタンパク質を用いて、ウエスタンブロット法にて抗血清の反応性を調べた。その結果、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ１およびｈＯＰＮ５に対する抗血清は、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆに反応するが、ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆには反応しなかった。一方、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３に対する抗血清は、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｃｈａｌｆに反応するが、ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆには反応しなかった。
実施例  ２６
抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの
結合体作製：
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３とｈＯＰＮ１に対する抗体とＨＲＰとの結合体作製は以下のように作製した。各抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体２０ｍｇをペプシン消化し、ゲル濾過することにより抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントを精製し、２−メルカプトエタノールを用いることによりＦ（ａｂ’）２フラグメントをＦａｂ’フラグメントに還元した。ＨＲＰとＥＭＣＳとを、３７℃で６０分反応させ、ゲル濾過することによりＨＲＰ−ＥＭＣＳ結合体を作製し、さらにこれと抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体Ｆａｂ’フラグメントとを４℃で一晩反応させ、ゲル濾過することによりＥＭＣＳ架橋による抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの結合体を作製した。
実施例  ２７
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築：
サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートと標識抗体の組合せで１−３、５−１の２種類の系を作製した。このうち、１−３系は以下のように作製した。１０μｇ／ｍｌのＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ１に対する抗体を１００μ１ずつ９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。４℃一晩反応させた後、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。実施例２６で作製したＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３に対する抗体とＨＲＰとの結合抗体を標識抗体とした。このようにｈＯＰＮ１に対する抗体を用いた固相プレートとｈＯＰＮ３に対する抗体を用いた標識抗体の組合せを１−３系とした。
同様にして、ｈＯＰＮ５に対する抗体を用いた固相プレートと、ｈＯＰＮ１に対する抗体を用いた標識抗体の組合せを５−１系として構築した。
実施例  ２８
サンドイッチＥＬＩＳＡ系による被験者におけるオステオポンチンの測定：
ＯＰＮタンパク質の測定は以下のように行った。１−３系及び５−１系のサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートに被験者から採取した血漿および関節腔液サンプルを含む溶液を１００μｌ加え、３７℃で一時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄、それぞれの系に特異的な標識抗体を１００μｌ加え、４℃で３０分反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液を１００μｌ加え、室温、遮光下３０分放置した。１Ｎ硫酸で反応を止め、吸光度４５０ｎｍで測定した。
上記の方法により測定したリウマチ患者関節腔液（１３例）のＯＰＮ値を表１０に、変形性関節症患者関節腔液（１２例）のＯＰＮ値を表１１に示す。また、リウマチ患者血漿（１６例）のＯＰＮ値を表１２に、変形性関節症患者血漿（７例）のＯＰＮ値を表１３に、正常人血漿（６例）のＯＰＮ値を表１４に示す。
これらの結果から明らかなように、血漿中ＯＰＮ値との比較において、１−３の系では、リウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者および健常人間で、有意差は認められなかった。しかしながら、５−１の系では、リウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者ともに健常人との比較において、その測定値は有意に高く、その程度はリウマチ性関節炎患者に優位であった。このことは、５−１の系が反映する総ＯＰＮ量が関節炎全般における診断の有効性を示唆するものである。
一方、リウマチ性関節炎患者および変形性関節症患者の関節腔液のＯＰＮ値は、血漿におけるＯＰＮ値と比較して上昇しており、局所でのＯＰＮ産生が強く示唆された。
また、関節腔液中ＯＰＮ値のリウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者間での比較において、１−３および５−１のいずれの系でも、リウマチ性関節炎患者は、変形性関節症患者と比較し、ＯＰＮ値が有意に高かった。
さらに新しい指標として１−３系／５−１系のＯＰＮ値比の検討を行った。この指標は、トロンビン開裂ＯＰＮの割合を比較することができる。リウマチ性関節炎患者の血漿および関節腔液のＯＰＮ値は１以下、変形性関節症患者では２以上となり、有意差が認められた。したがって、１−３系／５−１系のＯＰＮ値を利用することにより、リウマチ患者と変形性関節症患者を区別することが可能となる早期の検査方法として利用できる。
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＯＰＮに対するＲＧＤ依存性細胞接着の阻害を示す図面である。
図２は、マウス２Ｋ１抗体による、α９形質転換ＳＷ４８０細胞とｎＯＰＮのＲＧＤ依存性、およびＲＧＤ非依存性細胞接着の阻害を示す図面である。
図３ａは、ＯＰＮ−誘導細胞遊走を示す図面である。
図３ｂは、ＯＰＮ−誘導細胞遊走の、抗体による抑制を示す図面である。
図４は、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスと正常マウスのそれぞれに、関節炎惹起抗体カクテル／ＬＰＳを投与した場合の関節炎スコアの経時変化を示す図面である。
図５は、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスと正常マウスのそれぞれに、関節炎惹起抗体カクテル／ＬＰＳを投与した場合の手首の腫れを比較した図面である。
図６ａは、マウス２Ｋ１抗体をアナライトとした場合のＢＩＡＣＯＲＥ−２０００のセンサーグラムを示した図面である。
図６ｂは、キメラ２Ｋ１抗体をアナライトとした場合のＢＩＡＣＯＲＥ−２０００のセンサーグラムを示した図面である。
図７は、マウス２Ｋ１抗体と鋳型ヒト抗体のＶＨアミノ酸配列の比較を示した図面である。
図８は、マウス２Ｋ１抗体と鋳型ヒト抗体のＶＬアミノ酸配列の比較を示した図面である。
図９は、ヒト化２Ｋ１抗体のＶＨアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列を示した図面である。
図１０は、ヒト化２Ｋ１抗体のＶＬアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列を示した図面である。
図１１は、ヒト化２Ｋ１抗体のＶＨ塩基配列を増幅するためのプライマーの設計を示す図面である。
図１２は、ヒト化２Ｋ１抗体のＶＬ塩基配列を増幅するためのプライマーの設計を示す図面である。
図１３は、ヒト化２Ｋ１抗体およびキメラ２Ｋ１抗体の濃度に基づくオステオポンチンペプチドに対する結合活性を示す図面である。
図１４は、マウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の濃度依存的な接着を示す図面である。
図１５は、マウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の接着をＧＲＧＤＳＰペプチドが阻害することを示す図面である。
図１６は、Ｍ５抗体によるマウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の接着阻害を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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