(57)【要約】試料中に含まれる核酸を高精度に定量する。  所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイに、核酸を含む試料を作用させる工程と、上記複数の核酸プローブ部それぞれについて核酸プローブと所定の核酸とのハイブリダイズに基づく出力をモニターし、上記複数の核酸プローブ部それぞれについて当該出力が所定の値を超えた時間の正規分布をとる工程と、上記工程で得られた正規分布から求められる最大値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する工程を含む。
2004017068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プロープを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイに、核酸を含む試料を作用させる工程と、
上記複数の核酸プローブ部それぞれについて核酸プローブと所定の核酸とのハイブリダイズに基づく出力をモニターし、当該出力が所定の値を超えた核酸プローブ部の個数について時間毎に分布をとる工程と、
上記工程で得られた分布を正規化して求められる最大値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する工程
を含むことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項２】
上記ＤＮＡマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項３】
上記核酸を含む試料を作用させる工程の際には、上記ＤＮＡマイクロアレイ上で当該核酸を鋳型とした核酸増幅を行うことを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項４】
上記核酸増幅は恒温増幅法により行うことを特徴とする請求の範囲３記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項５】
所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイを取り付ける測定部と、
上記測定部に取り付けたＤＮＡマイクロアレイの各核酸プローブ部からの出力を検出する検出部と、
上記複数の核酸プローブ部について、上記検出部で検出した出力が所定の値を超えた核酸プローブ部の個数について時間毎に分布をとり、正規化して求められる最大値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する演算部と
を備えることを特徴とする核酸検出装置。
【請求項６】
上記ＤＮＡマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、
上記検出部は、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲５記載の核酸検出装置。
【請求項７】
上記ＤＮＡマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間がそれぞれの区画で異なることを特徴とする特許請求の範囲５記載の核酸検出装置。
【請求項８】
所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイ
【請求項９】
上記複数の核酸プローブ部に対応して配設され、所定の核酸と核酸プローブとのハイブリダイズを検出する検出部を有することを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１０】
上記検出部は、絶縁ゲート電界効果トランジスタであることを特徴とする特許請求の範囲９記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１１】
上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１２】
上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部における核酸プローブの密度が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１３】
上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部の面積が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１４】
上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブの長さが異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子診断、ＤＮＡ配列解析、あるいは遺伝子多型解析など、バイオテクノロジーの分野、特に遺伝子検査分野に用いられるＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法及び核酸検出装置、並びにＤＮＡマイクロアレイに関する。
【背景技術】  ヒトゲノムプロジェクトをはじめ各種生物のゲノム塩基配列解析プロジェクトが急速に進展し、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。既にヒトゲノムの全塩基配列が決定されつつある。今後は生体中における遺伝子の機能を明らかにすることにより、各種疾病の診断、医薬品の開発、農作物の品種改良など広範囲な分野で遺伝子関連技術の開発が飛躍的に進むものと思われる。これらの新規分野発展の基礎となるのが、塩基配列情報に加えて遺伝子の発現及び機能情報である。遺伝子の機能及び発現解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる技術として、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイ（以下、両者を総称してＤＮＡマイクロアレイという）がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｎａｎｏｇｅｎ社などで開発されている。しかし、現状のＤＮＡマイクロアレイの多くは蛍光検出を基本原理としているので、レーザや複雑な光学系が必要となり、システムが大型化し高価である。
また、現在開発されているＤＮＡマイクロアレイは、試料中の遺伝子の有無を検出するものである。これに対して、試料中の遺伝子を定量できるＤＮＡマイクロアレイは僅かである。
そこで、本発明は、上述したような実状を鑑み、試料中に含まれる核酸を高精度に定量できるＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法及び核酸検出装置、並びにＤＮＡマイクロアレイを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイに、核酸を含む試料を作用させる工程と、
上記複数の核酸プローブ部それぞれについて核酸プローブと所定の核酸とのハイブリダイズに基づく出力をモニターし、上記複数の核酸プローブ部それぞれについて当該出力が所定の値を超えた時間の度数分布をとる工程と、
上記工程で得られた度数分布から求められる平均値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する工程
を含むことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
（２）上記ＤＮＡマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
（３）上記核酸を含む試料を作用させる工程の際には、上記ＤＮＡマイクロアレイ上で当該核酸を鋳型とした核酸増幅を行うことを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
（４）上記核酸増幅は恒温増幅法により行うことを特徴とする請求の範囲３記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
（５）所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイを取り付ける測定部と、
上記測定部に取り付けたＤＮＡマイクロアレイの各核酸プローブ部からの出力を検出する検出部と、
上記複数の核酸プローブ部について、上記検出部で検出した出力が所定の値を超えた時間の度数分布をとり、当該度数分布から求められる平均値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する演算部と
を備えることを特徴とする核酸検出装置。
（６）上記ＤＮＡマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、
上記検出部は、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲５記載の核酸検出装置。
（７）上記ＤＮＡマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間がそれぞれの区画で異なることを特徴とする特許請求の範囲５記載の核酸検出装置。
（８）所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイ
（９）上記複数の核酸プローブ部に対応して配設され、所定の核酸と核酸プローブとのハイブリダイズを検出する検出部を有することを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
（１０）上記検出部は、絶縁ゲート電界効果トランジスタであることを特徴とする特許請求の範囲９記載のＤＮＡマイクロアレイ。
（１１）上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
（１２）上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部における核酸プローブの密度が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
（１３）上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部の面積が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
（１４）上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブの長さが異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明を適用したＤＮＡマイクロアレイを模式的に示す斜視図である。
図２は、ＤＮＡマイクロアレイの要部断面図である。
図３は、本発明を適用した核酸検出装置を模式的に示す構成図である。
図４は、フローセルの要部断面図である。
図５は、フローセルを分解して示す要部断面図である。
図６は、複数の核酸プローブ部からの出力を示す特性図である。
図７は、複数の核酸プローブ部からの出力に基づいて、信号処理回路での処理を行った結果を示す特性図である。
図８は、参照用電界効果トランジスタを用いて、複数の核酸プローブ部からの出力を測定する場合の回路構成図である。
図９は、本発明を適用したＤＮＡマイクロアレイの他の例を模式的に示す斜視図である。
図１０は、ＤＮＡマイクロアレイ上で行う核酸増幅の各工程を模式的に示すＤＮＡマイクロアレイの要部断面図である。
図１１は、核酸プローブから一重鎖核酸が伸長した状態を模式的に示すＤＮＡマイクロアレイの要部断面図である。
図１２は、核酸プローブから伸長した一重鎖核酸がとる高次構造を模式的に示すＤＮＡマイクロアレイの要部断面図である。
図１３は、２種類のプローブを用いてＤＮＡマイクロアレイ上で検出する際の各工程を模式的に示すＤＮＡマイクロアレイの要部断面図である。
図１４は、インターカレータを作用させた状態を示すＤＮＡマイクロアレイの要部断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明をより詳細に説述するために、添付の図面に従ってこれを説明する。以下の図において、同じ機能部分には同じ符号を付けて説明する。
【実施例１】  実施例１として、本発明に係る核酸検出方法を適用して、所定の遺伝子（以下、ターゲット遺伝子と称する）に含まれる一塩基多型を検出する方法を説明する。
図１は、本方法に用いられるＤＮＡマイクロアレイ１の概略斜視図であり、図２は、当該ＤＮＡマイクロアレイ１の要部断面図である。ＤＮＡマイクロアレイ１は、図１に示すように、マトリックス上に配された複数の核酸プローブ部２と、これら複数の核酸プローブ部２に対応して配された絶縁ゲート電界効果トランジスタ３とを備えている。本例のＤＮＡマイクロアレイ１においては、複数の核酸プローブ部２が二分されており（それぞれ第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂとする）、第１の領域３ａでターゲット遺伝子における一方の多型（以下、「第１の多型」という場合もある）を検出し、第２の領域３ｂでターゲット遺伝子における他方の多型（以下、「第２の多型」という場合もある）を検出する。
核酸プローブ部２は、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５の表面に核酸プローブ６を固定化した構造である。絶縁ゲート電界効果トランジスタ４は、例えば、ｐ形シリコン基板７上に配置したキャリアの供給源となるソース８及びキャリアを取り出すドレイン９と、これらｐ形シリコン基板７、ソース８及びドレイン９上に配置したゲート絶縁物５とを備えている。
核酸プローブ６は、検出対象のターゲット遺伝子とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡ又は途中で枝分かれしたＤＮＡの断片からなる。核酸プローブ６は、通常３００個以下の塩基から構成されており、適切な反応条件の下で検出対象のターゲット遺伝子とハイブリダイズでき、オリゴヌクレオチドの場合は８０個以下の塩基長の核酸断片であることが望ましい。
本例のＤＮＡマイクロアレイ１においては、第１の領域３ａにおける核酸プローブ６は、第１の多型であるターゲット遺伝子とハイブリダイズし、第２の多型であるターゲット遺伝子とはハイブリダイズしないような配列を有している。一方、第２の領域３ｂにおける核酸プローブ６は、第２の多型であるターゲット遺伝子とハイブリダイズし、第１の多型であるターゲット遺伝子とはハイブリダイズしないような配列を有している。
ゲート絶縁物５は、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）などの材料を単独又は組み合わせて用い、通常はトランジスタ動作を良好に保つため、酸化シリコン（ＳｉＯ２）の上に窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）を積層する二層構造とすることが好ましい。
核酸プローブ６をゲート絶縁物５表面に固定化するためには、核酸プローブ６の一端をアミノ基（ＮＨ２基）、チオール基（ＳＨ基）、ビオチンなどで化学修飾してもよい。アミノ基で化学修飾した核酸プローブ６を用いる場合は、ゲート絶縁物５の表面をアミノプロピルエトキシシラン、ポリリジンなどで化学修飾して絶縁膜表面にアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネート（ＰＤＣ）と反応させてアミノ基で化学修飾した核酸プローブ６をゲート絶縁物５表面に固定化する。チオール基で化学修飾した核酸プローブ６をゲート絶縁物５表面に固定化する場合は、ゲート絶縁物５上に金薄膜を形成し、チオール基と金との親和性を利用して核酸プローブ６を固定化する。また、ビオチンで化学修飾した核酸プローブ６を固定化する場合には、ゲート絶縁物５表面にストレプトアビジンを導入し、ビオチンとストレプトアビジンの親和性を利用して、核酸プローブ６をゲート絶縁物５表面に固定化する。実際の固定化に際しては、核酸プローブ６を含む溶液を、ゲート絶縁物５表面における所定の領域のみに滴下又はスポットし、ゲート絶縁物５における所望の領域上にのみ核酸プローブ６を固定化する。
一方、ゲート絶縁物５表面に固定化担体を形成し、核酸プローブ６を該固定化担体の表面又は内部に間接的に固定化してもよい。固定化担体の材料としては、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）などを用いることができ、固定化担体をアミノ基やストレプトアビジンなどで化学修飾し、上記したように、それぞれグルタルアルデヒドやＰＤＣ、又はアビジンとの親和性を利用して核酸プローブを固定化担体に固定化することができる。このように固定化担体を介して間接的に絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５上に核酸プローブ６を固定することもできる。
以上のように構成されたＤＮＡマイクロアレイ１では、検査対象の試料を作用させることによって、当該試料中に含まれるターゲット遺伝子と核酸プローブ６とが適切な反応条件のもとでハイブリダイズする。すなわち、試料中に含まれるターゲット遺伝子の多型に応じて、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂのいずれか一方の核酸プローブ６とターゲット遺伝子とで複合体を形成するか、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂの両方において核酸プローブ６とターゲット遺伝子とで複合体を形成する。
検査対象の試料を作用させる際に用いるバッファ溶液のｐＨの適切な条件下では、核酸は負に帯電している。したがって、核酸プローブ６とターゲット遺伝子と複合体形成により、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５近傍で電荷密度が変化し、ゲート絶縁物５の表面電位が変化する。この変化が一般的な絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート電圧変化と同等の作用となり、チャネルの導電率を変化させる。したがって、ソース８及びドレイン９の間を流れるドレイン電流変化として、個々の核酸プローブ部２における複合体の形成を検出することができる。
個々の核酸プローブ部２における複合体の形成を検出する際には、例えば、図３に示すような検出装置１０を用いることができる。検出装置１０は、ＤＮＡマイクロアレイ１を載置するフローセル１２と、フローセル１２に各種溶液を供給するための流路１３と、流路１３の起端部に接続されたハイブリダイゼーション液１４及び洗浄液１５と、ハイブリダイゼーション液１４及び洗浄液１５とフローセル１２との間における流路１３上に配設され、流路１３に供給するハイブリダイゼーション液１４及び洗浄液１５の切り替えを行うバルブ１６と、フローセル１２に対する溶液の供給を制御するポンプ１７と、試料及びインターカレータ等をバルブ１６を介して流路１３に供給するための分注器１８と、流路１３の終端部に接続された廃液ボトル１９と、フローセル１２に載置したＤＮＡマイクロアレイ１からの出力を処理／演算する信号処理回路２０とを備えている。
フローセル１２は、図４に示すように、内部流路２１が形成されている筐体２２と、信号線となるワイヤー２４を介してＤＮＡマイクロアレイ１と電気的に接続されたプリント基板２５と、プリント基板２５と信号処理回路２０とを電気的に接続するピン２６と、内部流路２１からワイヤー２３を隔離する保護キャップ２７と、内部流路２１と流路１３とを連結するためのボルト２８とを備えている。なお、フローセル１２の分解断面図を図５に示す。
筐体２２における内部流路２１は、例えば直径１ｍｍの穴として筐体２２内部に穿設されてなり、筐体２２の略中央部においてＤＮＡマイクロアレイ１と接している。なお、内部流路２１は、ＤＮＡマイクロアレイ１における少なくとも第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂと接している。また、内部流路２１は、内部に流路１３を配設したボルト２８を筐体２２のボルト取付部２９に取り付けることにより流路１３と接続されている。筐体２２のボルト取付部２９は、ボルト２８を取り付けるために、ボルト２８に応じてねじ切りが形成されている。
流路１３における内部流路２１と接する端面には、平坦化処理が施されている。流路１３における内部流路２１と接する端面が平坦化されることによって、ボルト２８を取り付けた状態で流路１３と内部流路２１とを密着させることができ、液漏れを防止できる。
プリント基板２５は、複数の核酸プローブ部２に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ３それぞれの出力を、ワイヤー２４を介して検出することができる。
保護キャップ２６は、例えば、アクリル、ポリプロピレン又はポリカーボネイト等からなり、筐体２２とプリント基板２５との間に配設される。保護キャップ２６は、筐体２２とプリント基板２５との間に配設されることによって、内部流路２１内へのワイヤー２４の露出を防止する。
以上のように構成された検出装置１０においては、フローセル１２に載置したＤＮＡマイクロアレイを用いて、検査対象の試料中に含まれるターゲット遺伝子の多型を同定することができる。具体的には、先ず、流路１３にハイブリダイゼーション液１４のみを供給できるようにバルブ１６を切り替えるとともに、ポンプ１７を駆動する。同時に、分注器１８によりバルブ１６を介して流路１３に対して試料を供給する。これにより、流路１３及びフローセル１２の内部流路２１に、試料を含有するハイブリダイゼーション液１４を供給することができ、ＤＮＡマイクロアレイ１における第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂに対して試料を作用させることができる。
これにより、第１の領域３ａ又は第２の領域３ｂ、若しくは、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂにおいて、試料に含まれるターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有する核酸プローブ６がハイブリダイズ反応する。言い換えると、試料中に含まれるターゲット遺伝子は、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂに含まれる核酸プローブ６のうち、相補的な塩基配列を有する核酸プローブ６とのみハイブリダイズする。なお、反応後、流路１３及び内部流路２１に供給された溶液はポンプ１７により廃液ボトル１９に送られる。
検出装置１０では、核酸プローブ６とターゲット遺伝子とがハイブリダイズ（複合体形成）すると、絶縁ゲート電界効果トランジスタ３においてドレイン電流変化として現れる。検出装置１０では、絶縁ゲート電界効果トランジスタ３におけるドレイン電流変化をプリント基板にて検出し、信号処理回路２０に対して信号を出力することができる。特に、検出装置１０では、複数の核酸プローブ部２を備えるため、複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ３それぞれからの複数の信号を信号処理回路２０に対して出力する。
このとき、複数の核酸プローブ部２では、核酸プローブ６とターゲット遺伝子とのハイブリダイズに時間差が生じる。したがって、複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ４からの信号出力にも時間差が生じることとなる。例えば、３つの絶縁ゲート電界効果トランジスタ４からの信号は、図６に示すように、それぞれ時間差をもって出力されることとなる。
信号処理回路２０では、このように時間差をもった複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ４からの複数の信号について、スレッシュホールド値を超えた時間を測定し、時間を横軸とし、スレッシュホールド値を超える出力が測定された核酸プローブ部２の個数を縦軸として度数分布をとる。そして、信号処理回路２０では、得られた度数分布における平均値を、複数の核酸プローブ部２における出力時間とする。
測定時間を横軸とし、スレッシュホールド値を超える出力が測定された核酸プローブ部２の個数を縦軸として度数分布をとると、例えば、図７に示すように、正規分布をとることとなる。この場合、信号処理回路２０は、度数分布の平均値（この場合は正規分布の最大値）として、Ｔ３を出力時間とする。したがって、信号処理回路２０によれば、第１の領域３ａに含まれる複数の核酸プローブ部２から得られる出力時間と、第２の領域３ｂに含まれる複数の核酸プローブ部２から得られる出力時間とを得ることができる。
そして、検出装置１０では、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂからのそれぞれの出力時間に基づいて、ターゲット遺伝子における多型を判別することができる。すなわち、ターゲット遺伝子が第１の多型のみを有するホモ型である場合、第１の領域３ａのみから出力時間を得ることができ、逆に、ターゲット遺伝子が第２の多型のみを有するホモ型である場合、第２の領域３ｂのみから出力時間を得ることができる。また、ターゲット遺伝子が第１の多型と第２の多型とを有するヘテロ型の場合、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂ両方から出力時間を得ることができる。このように、検出装置１０によれば、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂの出力時間からターゲット遺伝子の多型を判別することができる。
検出装置１０によれば、単一の核酸プローブ部により多型を判別する場合と比較して、測定誤差を小さくすることができ、より正確な判別を行うことができる。
ところで、検出装置１０では、上述したように、信号処理回路２０にて出力時間を得ることによりターゲット遺伝子の多型を判別できるだけでなく、以下のようにしてターゲット遺伝子の多型を判別してもよい。すなわち、信号処理回路２０は、所定時間経過後において信号を出力した絶縁ゲート電界効果トランジスタ４の割合を、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂについてそれぞれ算出し、比較する。その結果、第１の領域３ａにおける割合が第２の領域３ｂにおける割合と比較して大である場合、ターゲット遺伝子は第１の多型のみを有するホモ型であると判別でき、逆に、第２の領域３ｂにおける割合が第１の領域３ａにおける割合と比較して大である場合、ターゲット遺伝子は第２の多型のみを有するホモ型であると判別できる。また、第１の領域３ａにおける割合と第２の領域３ｂにおける割合とが同等の場合、ターゲット遺伝子は第１の多型及び第２の多型を有するヘテロ型であると判別できる。
なお、例えば、第１の多型の存在を迅速に検出したい場合には、第１の領域３ａに含まれる核酸プローブ部２のうちで、少なくとも１以上の核酸プローブ部２からの出力を得た時点で検出第１の多型の存在を判定しても良い。このように判定することによって、試料中に第１の多型が含まれるか否かを迅速に判定することができる。
一方、検出装置１０は、図８に示すように、参照電極３０及び参照用電界効果トランジスタ３１と、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４からの出力及び参照用電界効果トランジスタ３１の出力の差動をとる差動測定回路３２とを備えるものであっても良い。この場合、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物表面には、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を含まない核酸３３を固定化している。これにより、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物表面に固定化された核酸は、ターゲット遺伝子とハイブリダイズしない。
参照電極３０は、例えば、所定組成・濃度の内部溶液に銀／塩化銀電極又はかんこう電極を浸漬してなり、内部流路２１に供給される溶液に摂食する位置に配設される。参照電極３０は、例えば、フローセル２１内部に配設することができる。
このように構成された検出装置１０では、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４におけるドレイン電流変化を表面電位として駆動回路３４で検知し、参照用電界効果トランジスタ３１におけるドレイン電流変化を表面電位として駆動回路３５で検知する。差動測定回路３２は、駆動回路３４及び駆動回路３５それぞれにおける表面電位の差動をとり、差分を絶縁ゲート電界効果トランジスタ４からの信号として信号処理回路２０に出力する。
このような差動測定を行って絶縁ゲート電界効果トランジスタ４からの信号を出力することによって、各絶縁ゲート電界効果トランジスタ４の電気的特性の違いや、周囲の温度や光の変化による出力値の変化を補償することができ、また、試料中の荷電粒子がゲート絶縁物５上に非特異的に吸着することによる出力値の変化を相殺することができる。これにより、検出装置１０では、ターゲット遺伝子と核酸プローブ６のハイブリダイゼーションによる出力変化のみを精度良く検出することができる。
また、参照用電界効果トランジスタ３１は、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４と同じ基板に集積することが好ましい。参照用電界効果トランジスタ３１を絶縁ゲート電界効果トランジスタ４と同じ基板に集積することによって、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４と参照用電界効果トランジスタ３１とにおける電気的特性を揃えることができる。
さらに、検出装置１０では、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４と同数の参照用電界効果トランジスタ３１を必要とせず、複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ４からの出力を得るに際して、１つの参照用電界効果トランジスタ３１を共通に使用することができるため、少なくとも１以上の参照用電界効果トランジスタ３１を有していればよい。
さらに、参照用電極３０は、電位測定の基準として使用することによって、参照用電界効果トランジスタ３１と絶縁ゲート電界効果トランジスタ４との表面電位を安定に測定することができる。
ところで、上述した検出装置１０では、試料中のターゲット遺伝子を定量することもできる。試料中のターゲット遺伝子を定量する場合には、予め濃度既知のターゲット遺伝子を含む複数のサンプルを用いて同様に測定し、これら複数のサンプルについて出力時間を求めておく。そして、測定対象の試料における出力時間と、複数のサンプルについての出力時間とを比較することによって、測定対象の試料に含まれるターゲット遺伝子を定量することができる。
この場合、特に、複数の核酸プローブ部２を用いて出力時間を測定することから、例えば、ターゲット遺伝子の非特異的なハイブリダイズに起因するノイズ成分による定量誤差を補正することができる。したがって、測定装置１０によれば、測定対象の試料中に含まれるターゲット遺伝子を高精度に定量することができる。
また、検出装置１０は、図９に示すように、第１の領域３ａ及び第２の領域３ｂからなる第１の区画と、第３の領域３ｃ及び第４の領域３ｄからなる第２の区画と、第５の領域３ｅ及び第６の領域３ｆからなる第３の区画と、第７の領域３ｇ及び第８の領域３ｈからなる第４の区画とを備えるＤＮＡマイクロアレイ１を用いても良い。これら第１の領域３ａ乃至第８の領域３ｈは、それぞれ複数の核酸プローブ部２を有している。第１の領域３ａ、第３の領域３ｃ、第５の領域３ｅ及び第７の領域３ｇは、ターゲット遺伝子における第１の多型とハイブリダイズする核酸プローブ６を固定化してなる。また、第２の領域３ｂ、第４の領域３ｄ、第６の領域３ｆ及び第８の領域３ｈは、ターゲット遺伝子における第２の多型とハイブリダイズする核酸プローブ６を固定化してなる。
また、第１の区画、第２の区画、第３の区画及び第４の区画においては、ターゲット遺伝子を含む核酸と核酸プローブ６とがハイブリダイズするまでの時間が、互いに異なるよう調節されている。具体的には、第１の区画における核酸プローブ６の固定化密度、第２の区画における核酸プローブ６の固定化密度、第３の区画における核酸プローブ６の固定化密度を及び第４の区画における核酸プローブ６の固定化密度をそれぞれ異なる密度とすることによって、各区画でハイブリダイズする時間が異なることとなる。また、第１の区画における核酸プローブ部２の面積、第２の区画における核酸プローブ部２の面積、第３の区画における核酸プローブ部２の面積及び第４の区画における核酸プローブ部２の面積を異なる面積とすることによって、各区画でハイブリダイズする時間が異なることとなる。さらに、第１の区画における核酸プローブ６の長さ（塩基長）、第２の区画における核酸プローブ６の長さ（塩基長）、第３の区画における核酸プローブ６の長さ（塩基長）及び第４の区画における核酸プローブ６の長さ（塩基長）を異なる長さ（塩基長）とすることによって、各区画でハイブリダイズする時間が異なることとなる。
図９に示したＤＮＡマイクロアレイ１を用いた場合、第１の区画乃至第４の区画のそれぞれについて、信号処理回路２０から出力時間を測定する。第１の区画乃至第４の区画においてハイブリダイズする時間が異なるため、測定した出力時間として最適な区画を選択することができる。言い換えれば、ターゲット遺伝子を含む核酸と核酸プローブ６とのハイブリダイズまでの時間が短すぎても長すぎても、定量に際しての誤差が大きくなる。したがって、最適な区画を選択し、選択した区画に含まれる核酸プローブ部２からの信号を用いて出力時間を測定することによって、高精度に定量を行うことができる。
なお、図９に示したＤＮＡマイクロアレイ１を用いた場合でも、第１の多型の存在を迅速に検出したい場合には、第１の領域３ａ、第３の領域３ｃ、第５の領域３ｅ及び第７の領域３ｇのいずれかの領域に含まれる核酸プローブ部２のうちで、少なくとも１以上の核酸プローブ部２からの出力を得た時点で検出第１の多型の存在を判定しても良い。図９に示したＤＮＡマイクロアレイ１を用いた場合には、試料中に第１の多型が含まれるか否かをより迅速に判定することができる。
【実施例２】  実施例２としては、試料中にターゲット遺伝子が含まれているか否かを検出するシステムについて説明し、併せて、試料中にターゲット遺伝子が含まれている場合にターゲット遺伝子を定量するシステムについて説明する。
実施例２では、ＤＮＡマイクロアレイ１として、検出対象のターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を少なくとも３’末端に有する核酸プローブ６の５’末端をゲート絶縁物２表面に固定化たものを使用する。
本例では、試料として組織断片や白血球から抽出したヒト染色体を含む溶液を使用することができる。特に、本例においては、固定化された核酸プローブ６をプライマーとし当該試料に含まれるヒト染色体を鋳型として、複数の核酸プローブ部２上で核酸増幅をそれぞれ行い、対応する複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ４によって当該核酸増幅をモニターする。
具体的には、先ず、流路１３に核酸増幅に必要な試薬を供給できるようにバルブ１６を切り替えるとともに、ポンプ１７を駆動する。同時に、分注器１８によりバルブ１６を介して流路１３に対してヒト染色体を含む溶液を供給する。これにより、流路１３及びフローセル１２の内部流路２１に、ヒト染色体を含む溶液及び核酸増幅に必要な試薬を供給することができる。
次に、核酸増幅をＤＮＡマイクロアレイ１上で行う。具体的に図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように、ヒト染色体を含む溶液に、ターゲット遺伝子を含むＤＮＡ断片３８が含まれる場合に、核酸プローブ６をプライマーとした核酸増幅が行われる。すなわち、先ず図１０（ａ）に示すように、ゲート絶縁物２を所定温度に制御することによって、核酸プローブ６とＤＮＡ断片３８におけるターゲット遺伝子の一部とがハイブリダイズ（アニーリング）する。次に、図１０（ｂ）に示すように、ゲート絶縁物２を所定温度に制御すると、核酸増幅に必要な試薬に含まれる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）によって、ＤＮＡ断片３８を鋳型として核酸プローブ６の３’末端から伸長反応が行われる。伸長反応の後にゲート絶縁物２を所定温度に制御すると熱変性してＤＮＡ断片３８を乖離させることができる。そして、再び、ゲート絶縁物２を所定温度に制御することによって、図１０（ｃ）に示すように、異なる核酸プローブ６とＤＮＡ断片３８におけるターゲット遺伝子の一部とがハイブリダイズ（アニーリング）する。次に、図１０（ｄ）に示すように、再びゲート絶縁物２を所定温度に制御すると、核酸増幅に必要な試薬に含まれる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）によって、ＤＮＡ断片３８を鋳型として核酸プローブ６の３’末端から伸長反応が行われる。
このように、ゲート絶縁物２の温度制御によって、ＤＮＡ断片３８を鋳型として核酸プローブ６の３’末端からの伸長反応が順次行われる。測定対象の試料にターゲット遺伝子を含むＤＮＡ断片３８が含まれる場合、核酸プローブ部２において伸長反応が進む結果、当該核酸プローブ部２に対応する絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５近傍で電荷密度が変化し、ゲート絶縁物５の表面電位が変化する。この変化が一般的な絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート電圧変化と同等の作用となり、チャネルの導電率を変化させる。したがって、検査装置１０によれば、ソース８及びドレイン９の間を流れるドレイン電流変化として、個々の核酸プローブ部２における伸長反応の進行を検出することができる。
本例においても、単一の核酸プローブ部によりターゲット遺伝子を検出する場合と比較して、複数の核酸プローブ部２を用いているために誤差を小さくすることができ、試料中のターゲット遺伝子の量が少ない場合であっても正確に検出することができる。
ところで、上述した検出装置１０では、試料中のターゲット遺伝子を定量することもできる。試料中のターゲット遺伝子を定量する場合には、予め濃度既知のターゲット遺伝子を含む複数のサンプルを用いて同様に測定し、これら複数のサンプルについて出力時間を求めておく。そして、測定対象の試料における出力時間と、複数のサンプルについての出力時間とを比較することによって、測定対象の試料に含まれるターゲット遺伝子を定量することができる。
この場合、特に、複数の核酸プローブ部２を用いて出力時間を測定することから、例えば、ターゲット遺伝子の非特異的なハイブリダイズに起因するノイズ成分による定量誤差を補正することができる。したがって、測定装置１０によれば、測定対象の試料中に含まれるターゲット遺伝子を高精度に定量することができる。
具体例について以下に示す。
先ず第１の具体例としては、Ｂ型肝炎ＤＮＡ（Ｈｅｐａｔａｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ）の存在の有無を１種類のプローブで調べるために、５’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ６を絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５に固定化した。
ＨＢＶプローブ（ｉ）：５’−ｇｃｇ  ｇａｔ  ｃｃｇ  ｔｇｇ  ａｇｔ  ｔａｃ  ｔｃｔ  ｃｇｔ  ｔｔｔ  ｔｇｃ−３’
参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物にはＨＢＶプローブ（ｉ）と異なる配列を有する核酸３３、例えばすべてＡから構成される３０塩基長の核酸３３を固定化する。なお、この核酸３３は、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物に固定化せず、５’末端をアミノ基で修飾したものであってもよい。
試料は、キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ）を用いて、血清中からＢ型肝炎ＤＮＡを抽出したものを使用した。Ｂ型肝炎ＤＮＡ、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ社製），０．４μＭのｄＮＴＰ、５ＵのＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を含む試料溶液１００μｌを分注器１８よりフローセル１２に導入し、以下の（１）〜（３）の工程でゲート絶縁物５を加熱・冷却する。
（１）熱変性：９４℃×３分
（２）熱変性：９４℃×３０秒、アニーリング：５５℃×３０秒及び伸長反応：７２℃×３０秒を１サイクルとして４０サイクル
（３）伸長反応：７２℃×１０分
上記（１）〜（３）工程の終了後、ゲート絶縁物５の温度を上げるか、またはアルカリ性溶液を分注器１８よりフローセル１２に導入して二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させた。その後、洗浄液を分注器１８よりフローセル１２に導入して、基板に固定化されていない核酸、未反応の核酸及び各種成分をＤＮＡマイクロアレイ１から除去した。次に、緩衝液を分注器１８よりフローセル１２に導入して、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４の出力値を信号処理回路２０により測定した。
第１の具体例では、信号処理回路２０における出力値は、核酸増幅によりＨＢＶプローブ（ｉ）の３’末端から一重鎖核酸が伸張した結果の出力値であり、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物に固定した核酸３３と比較して塩基数が多いことにより検出が可能である。図１１に、核酸プローブ６から一重鎖核酸が伸長した状態と、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物に固定した核酸３３とを模式的に示す。
第１の具体例では、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料を用いた場合、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４と参照用電界効果トランジスタ３１とにおける表面電位の差動出力は２．８ｍＶであった。一方、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含まない試料を用いた場合には、同様に測定した差動出力は０．４ｍＶであった。この結果から、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料とＢ型肝炎ＤＮＡを含まない試料とで有意な差が得られた。
次に、第２の具体例としては、Ｂ型肝炎ＤＮＡ（Ｈｅｐａｔａｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ）の存在の有無を高感度に検出するため、試料中のターゲット遺伝子の存在により進行する増幅反応によって、高次構造をとるような核酸プローブ６を絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５に固定化した。第２の具体例で使用した核酸プローブ６は、Ｂ型肝炎ＤＮＡに相補的な塩基配列を有し、５’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ６を用いた。
ＨＢＶプローブ（ｉｉ）：５’−ｃａｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ａｇｇ  ａｔｇ  ａａｇ  ａｇｇ  ａａｔ  ａｔｇ  ａｔａ  ｇｇａ  ｔｇｔ  ｇｔｃ  ｔｇｃ  ｇｇｃ  ｇｔｔ  ｔ−３’
なお、本例においても、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物にはＨＢＶプローブ（ｉｉ）と異なる配列を有する核酸３３、例えばすべてＡから構成される３０塩基長の核酸３３を固定化する。
第２の具体例においても、第１の具体例と同じ試薬及び反応条件で、上述した（１）〜（３）工程を行う。その後、同様に、基板に固定化されていない核酸、未反応の核酸及び各種成分をＤＮＡマイクロアレイ１から除去するとともに信号処理回路２０により出力値を測定した。
第２の具体例において、出力値は、核酸増幅によりＨＢＶプローブ（ｉｉ）の３’末端から一重鎖核酸が伸張するとともに高次構造を形成した結果の出力値であり、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物に固定した核酸３３と比較して塩基数が多く、かつ高次構造が異なることにより検出が可能である。図１２に、核酸プローブ６から一重鎖核酸が伸長した状態と、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物に固定した核酸３３とを模式的に示す。第２の具体例では、図１２に示すように、試料中にＢ型肝炎ＤＮＡが含まれる場合、伸長反応が進行する結果、核酸プローブ６の３’末端が高次構造、この場合ステム構造及びループ構造を取ることとなる。このステム構造は、伸長反応によって合成された一本鎖核酸とＨＢＶプローブ（ｉｉ）の５’末端から３０塩基までとが相補的であるために形成される。また、ループ構造は、ＨＢＶプローブ（ｉｉ）の３’末端側から１９塩基で形成される。
第２の具体例において、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料を用いた場合、絶縁ゲート電界効果トランジスタ４と参照用電界効果トランジスタ３１とにおける表面電位の差動出力は４．８ｍＶであった。一方、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含まない試料を用いた場合には、同様に測定した差動出力は０．５ｍＶであった。この結果から、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料とＢ型肝炎ＤＮＡを含まない試料とで有意な差が得られた。さらに、第１の具体例と比較して、第２の具体例では、核酸プローブ６が伸長反応の結果として高次構造と形成するため、より高感度に出力値が得られた。
次に、第３の具体例としては、Ｂ型肝炎ＤＮＡ（Ｈｅｐａｔａｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ）の存在の有無を２種類のプローブで検出するため、５’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ６を絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５に固定化した。
ＨＢＶプローブ（ｉ）：５’−ｇｃｇ  ｇａｔ  ｃｃｇ  ｔｇｇ  ａｇｔ  ｔａｃ  ｔｃｔ  ｃｇｔ  ｔｔｔ  ｔｇｃ−３’
ＨＢＶプローブ（ｉｉｉ）：５’−ｇｃａ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｃｔａ  ａｃａ  ａｃａ  ｇｔａ  ｇｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇ−３’
なお、本例においても、参照用電界効果トランジスタ３１のゲート絶縁物にはＨＢＶプローブ（ｉｉ）と異なる配列を有する核酸３３、例えばすべてＡから構成される３０塩基長の核酸３３を固定化する。
第３の具体例においても、第１の具体例と同じ試薬及び反応条件で、上述した（１）〜（３）工程を行う。第３の具体例における核酸増幅を図１３（ａ）〜（ｄ）に示す。なお、図１３（ａ）〜（ｄ）では、ＨＢＶプローブ（ｉ）を核酸プローブ６ａとして表し、ＨＢＶプローブ（ｉｉｉ）を核酸プローブ６ｂとして表す。検査対象の試料にＢ型肝炎ＤＮＡを含む場合には、図１３（ａ）に示すように、ゲート絶縁物２を所定温度に制御することによって、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含むＤＮＡ断片３８が核酸プローブ６ａとハイブリダイズ（アニーリング）する。次に、図１３（ｂ）に示すように、ゲート絶縁物２を所定温度に制御すると、核酸増幅に必要な試薬に含まれる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）によって、ＤＮＡ断片３８を鋳型として核酸プローブ６ａの３’末端から伸長反応が行われる。次に、図１３（ｃ）に示すように、ゲート絶縁物２を所定温度に制御すると熱変性してＤＮＡ断片３８を乖離させることができ、核酸プローブ６ａの３’末端から伸長した領域の一部が核酸プローブ６ｂとハイブリダイズ（アニーリング）する。次に、図１３（ｄ）に示すように、再びゲート絶縁物２を所定温度に制御すると、核酸プローブ６ａの３’末端から伸長した領域を鋳型として核酸プローブ６ｂの３’末端から伸長反応が進行し、最終的に核酸プローブ６ａと核酸プローブ６ｂとの間で核酸二重鎖が形成される。
次に、分注器１８によりバルブ１６を介して流路１３に対して緩衝液を導入し、ＤＮＡマイクロアレイ１上の未反応の試料等を除去する。その後、分注器１８によりバルブ１６を介して流路１３に対してエチジウムブロマイドやヘキスト３３２５８（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）等のインターカレータ３９を含む溶液を導入する。これにより、図１４に示すように、核酸プローブ６ａと核酸プローブ６ｂとの間で形成された核酸二重鎖に、インターカレータ３９が挿入されることとなる。インターカレータ３９は二本鎖の核酸とのみ反応して結合し、一本鎖の核酸には結合しない。核酸二重鎖にインターカレータ３９を挿入した後、第１の具体例と同様にして信号処理回路２０により出力値を測定した。
その結果、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料を用いた場合には、差動出力は５．６ｍＶであった。Ｂ型肝炎ＤＮＡを含まない試料を用いた場合には、差動出力は０．４ｍＶであった。このように、第３の具体例においても、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料とＢ型肝炎ＤＮＡを含まない試料とで有意な差が得られた。一方、インターカレータ３９を使用せず、図１３（ｄ）に示した核酸二重鎖の状態で測定した場合には、差動出力は２．２ｍＶであった。この結果から、インターカレータ３９は電荷を有しているのでインターカレータ３９を含む溶液を作用させることにより、約２倍の高感度化を図ることができた。
次に、第４の具体例としては、Ｂ型肝炎ＤＮＡ（Ｈｅｐａｔａｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ）の存在の有無を２種類のプローブ及び鎖置換型のＤＮＡ合成酵素を用いて検出するため、５’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ６を絶縁ゲート電界効果トランジスタ４のゲート絶縁物５に固定化した。
ＨＢＶプローブ（ｉｉ）：５’−ｃａｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ａｇｇ  ａｔｇ  ａａｇ  ａｇｇ  ａａｔ  ａｔｇ  ａｔａ  ｇｇａ  ｔｇｔ  ｇｔｃ  ｔｇｃ  ｇｇｃ  ｇｔｔ  ｔ−３’
ＨＢＶプローブ（ｉｖ）：５’−ｔｃｃ  ｔｃｔ  ａａｔ  ｔｃｃ  ａｇｇ  ａｔｃ  ａａｃ  ａａｃ  ａａｃ  ｃａｇ  ａｇｇ  ｔｔｔ  ｔｇｃ  ａｔｇ  ｇｔｃ  ｃｃｇ  ｔａ−３’
本例では、Ｂ型肝炎ＤＮＡ、０．１ｍＭのｄＮＴＰ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２，３２ＵのＢｓｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）を含む試料溶液１００μｌを分注器１８よりフローセル１２に導入し、６５℃でゲート絶縁物５をインキュベートすることによって恒温増幅反応を行った。なお、この恒温増幅反応は、図１０（ａ）〜（ｄ）に示した場合と同様に進行する。また、本例においても、第３の具体例と同様にして核酸二重鎖にインターカレータ３９を挿入した後に信号処理回路２０により出力値を測定した。
その結果、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料を用いた場合には、差動出力は５．８ｍＶであった。一方、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含まない試料を用いた場合には、差動出力は０．３ｍＶであった。このように、第４の具体例においても、Ｂ型肝炎ＤＮＡを含む試料とＢ型肝炎ＤＮＡを含まない試料とで有意な差が得られた。一方、インターカレータ３９を使用しない状態で出力値を測定した場合には、差動出力は２．４ｍＶの大きさであった。この結果から、インターカレータ３９を含む溶液を作用させることにより、約２倍の高感度化を図ることができた。
【産業上の利用可能性】  以上詳細に説明したように、本発明では、複数の核酸プローブ部からの出力をモニターし、出力が所定の値を超えた核酸プローブ部の個数について時間毎に分布をとることによって、目的とする核酸を検出するとともに定量することができる。本発明によれは、目的とする核酸を高精度に検出できるとともに、高精度に定量することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月11日(2002.12.11)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイに、核酸を含む試料を作用させる工程と、
上記複数の核酸プローブ部それぞれについて核酸プローブと所定の核酸とのハイブリダイズに基づく出力をモニターし、当該出力が所定の値を超えた核酸プローブ部の個数について時間毎に分布をとる工程と、
上記工程で得られた分布を正規化して求められる最大値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する工程
を含むことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項２】上記ＤＮＡマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項３】上記核酸を含む試料を作用させる工程の際には、上記ＤＮＡマイクロアレイ上で当該核酸を鋳型とした核酸増幅を行うことを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項４】上記核酸増幅は恒温増幅法により行うことを特徴とする請求の範囲３記載のＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
【請求項５】所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるＤＮＡマイクロアレイを取り付ける測定部と、
上記測定部に取り付けたＤＮＡマイクロアレイの各核酸プローブ部からの出力を検出する検出部と、
上記複数の核酸プローブ部について、上記検出部で検出した出力が所定の値を超えた核酸プローブ部の個数について時間毎に分布をとり、正規化して求められる最大値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する演算部と
を備えることを特徴とする核酸検出装置。
【請求項６】上記ＤＮＡマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、
上記検出部は、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲５記載の核酸検出装置。
【請求項７】上記ＤＮＡマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間がそれぞれの区画で異なることを特徴とする特許請求の範囲５記載の核酸検出装置。
【請求項８】所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間が異なるＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項９】上記複数の核酸プローブ部に対応して配設され、所定の核酸と核酸プローブとのハイブリダイズを検出する検出部を有することを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１０】上記検出部は、絶縁ゲート電界効果トランジスタであることを特徴とする特許請求の範囲９記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１１】（削除）
【請求項１２】上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部における核酸プローブの密度が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１３】上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部の面積が異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１４】上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブの長さが異なることを特徴とする特許請求の範囲８記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１５】所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記核酸プローブ部の面積が異なるＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１６】上記複数の核酸プローブ部に対応して配設され、所定の核酸と核酸プローブとのハイブリダイズを検出する検出部を有することを特徴とする特許請求の範囲１５記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１７】上記検出部は、絶縁ゲート電界効果トランジスタであることを特徴とする特許請求の範囲１６記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１８】上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間が異なることを特徴とする特許請求の範囲１５記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１９】上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部における核酸プローブの密度が異なることを特徴とする特許請求の範囲１５記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２０】上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブの長さが異なることを特徴とする特許請求の範囲１５記載のＤＮＡマイクロアレイ。




【国際調査報告】
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